【手続補正書】
【提出日】平成17年4月18日(2005.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）テンプレートを提供する工程であって、該テンプレートは、
（ｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第１のループを形成する、３’末端に位置する第１の領域および第１の相補領域、を含む、３’末端部分、
（ｉｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第２のループを形成する、５’末端に位置する第２の領域および第２の相補領域、を含む、５’末端部分、ならびに
（ｉｉｉ）該３’末端部分および該５’末端部分を接続する領域、
を有する、工程；
Ｂ）該第１の領域および該第１の相補領域が互いにアニーリングして該第１のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの３’末端を該テンプレートの５’末端へと伸長させて、該第２の相補領域および第２の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第３のループを形成する、３’末端に位置する第３の領域および第３の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程；
Ｃ）３’末端で該第１のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列および５’末端で該第１の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの第１のループにアニーリングさせる、工程；
Ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートに相補的な新規テンプレートを形成し、それによって、工程Ｂ）における該伸長の間に形成された該テンプレート伸長を置換する、工程；
Ｅ）該第３の領域および該第３の相補領域が互いにアニーリングして該第３のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートの３’末端を該伸長したテンプレートの５’末端へとさらに伸長させ、それによって、該伸長したテンプレートから該新規テンプレートを置換する、工程；ならびに
Ｆ）該新規テンプレートを、工程Ａ）におけるテンプレートとして使用して工程Ａ）〜Ｅ）を繰り返して、該核酸を増幅する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記提供工程Ａ）が、さらに以下の工程：
Ａ１）第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする３’末端部分、および該サンプル一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、工程；
Ａ２）適切なポリメラーゼを使用して、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、第１の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第１の一本鎖核酸分子は、（ｉ）該サンプル一本鎖核酸分子の少なくとも一部に相補的な領域、および（ｉｉ）該第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端部分を含む５’末端部分を含む、工程；
Ａ３）該サンプル一本鎖核酸分子から該第１の一本鎖核酸分子を置換する工程；
Ａ４）第２のオリゴヌクレオチドプライマーを該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングする３’末端部分、および該第１の一本鎖核酸分子の任意の領域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、工程；
Ａ５）適切なポリメラーゼを使用して、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、前記テンプレートを形成する、工程；ならびに
Ａ６）該第１の一本鎖核酸分子から該テンプレートを置換する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記工程Ａ１）の前記アニーリング工程の間に使用される前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー、または前記工程Ａ４）の前記アニーリング工程の間に使用される前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記工程Ｃ）の前記アニーリング工程の間に使用される前記オリゴヌクレオチドプライマーと同じである、方法。
【請求項５】
サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項１に従う増幅方法を実行する工程であって、前記テンプレートが、該標的ヌクレオチド配列を含む、工程、および
該標的ヌクレオチド配列が該増幅方法の産物中に存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記決定する工程が、以下：
前記増幅方法の産物を、前記第１のループまたは前記第２のループに相補的なヌクレオチド配列を含むプローブと合わせる、工程；および
該プローブと該増幅方法の産物との間のハイブリダイゼーションが生じるか否かを観察する、工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記増幅方法を実行する前記工程が、核酸についての検出器の存在下で実施され、ここで、該検出する工程は、該検出器のシグナルの変化を検出する工程を包含する、方法。
【請求項８】
方法であって、以下：
Ａ）テンプレートを提供する工程であって、該テンプレートは、以下：
（ｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第１のループを形成する、３’末端に位置する第１の領域および第１の相補領域、を含む、３’末端部分、
（ｉｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第２のループを形成する、５’末端に位置する第２の領域および第２の相補領域、を含む、５’末端部分、ならびに
（ｉｉｉ）該３’末端部分および該５’末端部分を接続する領域、
を有する、工程；
Ｂ）該第１の領域および第１の相補領域が互いにアニーリングして該第１のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの３’末端を該テンプレートの５’末端へと伸長させて、該第２の相補領域および第２の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第３のループを形成する、３’末端に位置する第３の領域および第３の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程；
Ｃ）３’末端で該第１のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で該テンプレートの該第１の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの該第１のループにアニーリングさせる、工程；
Ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートに相補的な新規テンプレートを形成する工程；ならびに
Ｅ）該新規テンプレートを該伸長したテンプレートから置換する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記新規テンプレートが、（ｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第２のループを形成する、３’末端に位置する前記第２の領域および前記第２の相補領域、を含む、３’末端部分、（ｉｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第１のループを形成する、５’末端に位置する前記第１の領域および前記第１の相補領域、を含む、５’末端部分、および（ｉｉｉ）該３’末端部分および該５’末端部分を接続する領域、を有し、該方法は、さらに以下の工程：
Ｆ）該第２の領域および第２の相補領域が互いにアニーリングして該第２のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該新規テンプレートの該３’末端を該新規テンプレートの該５’末端へと伸長させて、該第１の相補領域および第１の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第３のループを形成する、第３の領域および第３の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程；
Ｇ）３’末端で該第２のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で該第２の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長した新規テンプレートの該第２のループにアニーリングさせる、工程；ならびに
Ｈ）鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長した新規テンプレートに沿って該第２のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートと実質的に同じ第３のテンプレートを形成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、以下：
Ｉ）前記新規テンプレートから前記第３のテンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記第３のテンプレートを使用して、前記工程Ｂ）〜Ｈ）を繰り返す工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、前記工程Ｄ）の伸長工程が、前記テンプレートの５’末端に相補的な前記テンプレート伸長中の配列を置換して、前記第３の領域および前記第３の相補領域を互いにアニーリングさせて、前記第３のループを形成させる方法であって、該方法は、以下：
該伸長したテンプレートの該３’末端を該テンプレートの該５’末端へと伸長させ、それによって、工程Ｅ）の該新規テンプレートを置換する、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
３’末端で該第３のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で該第３の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、該第３のループにアニーリングさせる、工程；ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長させる、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタミンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応溶液中のベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタミンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応溶液中のベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
特定の核酸配列を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程：
Ｉ．該特定の核酸配列、
ＩＩ．該特定の核酸配列のための第１の初期プライマーまたは核酸構築物であって、該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が以下の２つのセグメントを含む、第１の初期プライマーまたは核酸構築物：
（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および
（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントと非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の該第１の部分の３’側に位置する第２の部分と同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、それによって、均衡条件下または限定サイクリング条件下で、第２のプライマー伸長が生成されて、第１のプライマー伸長を置換するように、第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への次の結合を提供し得る、セグメント；および
ＩＩＩ．該第１の初期プライマーとは異なる第２の初期プライマーまたは核酸構築物であって、以下の２つのセグメントを含む、第２の初期プライマーまたは核酸構築物：
（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の相補体の第１の部分に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および
（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントと非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の該相補体の該第１の部分の３’側に位置する第２の部分に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、それによって、均衡条件下または限定サイクリング条件下で、第２のプライマー伸長が生成され、そして第１のプライマー伸長を置換するように、次のプライマーの第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該相補体の第１の部分への次の結合を提供し得る、セグメント；および
ＩＶ．基質、緩衝液、および鎖置換活性を有するテンプレート依存性重合化酵素
を、添加する工程；ならびに、
均衡条件下または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、および鎖置換活性を有するテンプレート依存性重合化酵素の存在下、該特定の核酸配列と、該その相補体と、該第１および該第２の初期プライマーまたは核酸構築物とをインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非直線的に増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記工程のいずれか、またはすべてを繰り返すことをさらに包含する、請求項１９に記載の増幅する方法。
【請求項２１】
溶融温度調節因子を提供することをさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応溶液中のベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程：
請求項２０に記載の増幅する方法を実施する工程、および
前記特定の核酸配列のアンプリコンが、該増幅する方法の生成物中に存在するか否かを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記決定する工程が：
前記増幅する方法の生成物を、前記特定の核酸配列の第１の部分または該特定の核酸配列の相補体の第１の部分に相補的な核酸を含むプローブと組み合わせること；および
ハイブリダイゼーションが、該プローブと、該増幅する方法の生成物との間で生じるか否かを観察すること、を包含する、方法。
【請求項２６】
標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程：
（ｉ）標的核酸の鎖を添加する工程であって、該標的の鎖が、少なくとも５つの非同一の部分を有し、該少なくとも５つの非同一の部分が、該標的の鎖上の３’から５’の方向に、第１の部分、該第１の部分の５’側に位置する第２の部分、該第２の部分の５’側に位置する第３の部分、該第３の部分の５’側に位置する第４の部分および該第４の部分の５’側に位置する第５の部分を含む、工程；
（ｉｉ）該標的の鎖の第１の部分に相補的である第１の３’プライミングセグメント、および該標的の鎖の第２の部分に同一である第１の５’テイルセグメントを含む、順方向プライマーを添加する工程；
（ｉｉｉ）鎖置換活性をもつテンプレート依存性ポリメラーゼを添加する工程；
（ｉｖ）該標的の鎖の第５の部分に同一である第２の３’プライミングセグメント、および該標的の鎖の第４の部分に相補的である第２の５’テイルセグメントをも含む、逆方向プライマーを添加する、工程；および
（ｖ）反応溶液を、増幅および鎖置換重合の条件下で、かつ増幅および鎖置換重合に適切な試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。
【請求項２７】
標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下：
（ｉ）標的核酸の鎖を添加する工程であって、該標的核酸の鎖が、少なくとも５つの非同一の部分を有し、該少なくとも５つの非同一の部分が、該標的の鎖上の３’から５’の方向に、第１の部分、該第１の部分の５’側に位置する第２の部分、該第２の部分の５’側に位置する第３の部分、該第３の部分の５’側に位置する第４の部分および該第４の部分の５’側に位置する第５の部分を含む、工程；
（ｉｉ）第１の３’プライミングセグメントおよび第１の５’テイルセグメントを含む、順方向プライマーを添加する工程であって、
ここで、該第１の３’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第１の部分に相補的であり、そして少なくとも該標的の鎖の第２の部分に沿って、テンプレート依存性ポリメラーゼで伸長されて、テンプレートを形成し得、そして
ここで、該第１の５’テイルセグメントが、該標的の鎖の第２の部分と同一である、工程；
（ｉｉｉ）該ポリメラーゼを添加する工程であって、該ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、工程；
（ｉｖ）第２の３’プライミングセグメントおよび第２の５’テイルセグメントを含む、逆方向プライマーを添加する、工程であって、
ここで、該第２の３’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第５の部分と同一であり、そして少なくとも該標的の鎖の第４の部分に相補的であるテンプレートの領域に沿って、該ポリメラーゼで伸長されて、アンプリコンを形成し得、そして
ここで、該第２の５’テイルセグメントが、該標的の鎖の第４の部分に相補的である、工程；および
（ｖ）反応溶液を、増幅および鎖置換重合の条件下で、かつ増幅および鎖置換重合に適切な試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。
【請求項２８】
前記工程（ｉ）〜（ｖ）のいずれか、またはすべてを繰り返すことをさらに包含する、請求項２６または２７に記載の増幅する方法。
【請求項２９】
溶融温度調節因子を提供する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶融温度調節因子が、有効量のベタインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記反応溶液中のベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程：
請求項２８に記載の増幅する方法を実施する工程、および
前記標的の鎖のアンプリコンが、該増幅する方法の生成物中に存在するか否かを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記決定する工程が：
前記増幅する方法の生成物を、前記標的の鎖の第１の部分または該標的の鎖の第５の部分に相補的な核酸を含むプローブと組み合わせること；および
ハイブリダイゼーションが、該プローブと、該増幅する方法の生成物との間で生じるか否かを観察すること、を包含する、方法。
【請求項３４】
前記標的の鎖の第２の部分が、前記第１の部分の３’末端から約１００ヌクレオチドより少なく離れており、そして前記第５の部分が、前記第４の部分の３’末端から約１００ヌクレオチドより少なく離れて位置している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２８に記載の方法であって、前記第１の３’プライミングセグメントが、前記標的の鎖の第１の部分またはそのアンプリコンにアニールし、そして、前記順方向プライマーが、少なくとも、前記標的の鎖の第３の部分またはアンプリコンに伸長されるとき、前記第１の５’テイルセグメントが、該標的の鎖の第２の部分またはアンプリコンを超えて伸長した伸長順方向プライマーの一部分にアニールし、それによって、次の順方向プライマーの第１の３’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第１の部分またはアンプリコンに結合することを可能にする、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記第２の３’プライミングセグメントが、前記標的の鎖の第５の部分またはそのアンプリコンの相補体上の該標的の鎖またはそのアンプリコンのテンプレートにアニールし、そして、前記逆方向プライマーが、テンプレート上を、少なくとも、前記標的の鎖の第３の部分の相補体またはアンプリコンに伸長されるとき、前記第２の５’テイルセグメントが、該標的の鎖の第４の部分の相補体またはアンプリコンを超えて伸長した伸長逆方向プライマーの一部分にアニールし、それによって、次の逆方向プライマーの第２の３’プライミングセグメントが、該標的の鎖の第５の部分の相補体またはアンプリコン上のテンプレートに結合することを可能にする、方法。
【請求項３７】
請求項２８に記載の方法であって、前記順方向プライマーが、前記標的の鎖またはそのアンプリコン上で少なくとも部分的に伸長され、そして、伸長された後、それが伸長される前より該標的の鎖またはアンプリコンとのより弱い結合を有する、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記逆方向プライマーが、前記標的の鎖またはそのアンプリコンのテンプレート上で少なくとも部分的に伸長され、そして、伸長された後、それが伸長される前より該テンプレートとのより弱い結合を有する、方法。
【請求項３９】
請求項２８に記載の方法であって、（ａ）前記第１の部分の３’側上の前記標的の鎖にアニールする第１の標準プライマー、および（ｂ）前記第５の部分の相補体の３’側上の該標的の鎖のテンプレートにアニールする第２の標準プライマーを提供する工程をさらに包含し、
ここで、該第１の標準プライマーおよび該第２の標準プライマーが、鎖置換重合を補助して開始する、方法。
【請求項４０】
前記条件が、限定サイクリング条件である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記条件が、実質的に均衡条件である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記条件が、実質的に等温である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２８に記載の方法であって、サーマルサイクラーを採用しない、方法。
【請求項４４】
前記条件が、前記標的の鎖のその相補体からの初期熱変性を除いて実質的に均衡である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
請求項２８に記載の方法であって、その全体が任意の熱変性なくして実施される、方法。
【請求項４６】
請求項２８に記載の方法であって、その全体が９２℃未満の温度で実施される、方法。
【請求項４７】
請求項２８に記載の方法であって、前記標的の鎖のその相補体からの初期熱変性を除いて、実質的に均衡な条件下、７０℃未満の温度で実施される、方法。
【請求項４８】
請求項２８に記載の方法であって、実質的に均衡条件下、７０℃未満の温度で実施される、方法。
【請求項４９】
前記実質的に非同一の部分が実質的に非類似である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５０】
標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程：
（Ａ）該標的核酸の鎖のアンプリコンを添加する工程であって、該アンプリコンが、以下を含む非同一な領域を含む工程：
（ｉ）３’末端における、３’末端領域、該３’末端領域に隣接する第１の３’内部領域、および該第１の３’内部領域に隣接する第２の３’内部領域であって、ここで、該３’末端領域および該第２の３’内部領域が相補的であり、そして互いにアニールして増幅条件下でループを形成する、領域、
（ｉｉ）５’末端における、５’末端領域、該５’末端領域に隣接する第１の５’内部領域、および該第１の５’内部領域に隣接する第２の５’内部領域であって、ここで、該５’末端領域および該第２の５’内部領域が相補的であり、そして増幅条件下で互いにアニールしてループを形成する、領域、および
（ｉｉｉ）該第２の３’内部領域を、該第２の５’内部領域に連結する、中央領域；
（Ｂ）鎖置換活性を有するテンプレート依存性ポリメラーゼを添加する工程；
（Ｃ）順方向プライマーおよび逆方向プライマーを添加する工程であって、
該順方向プライマーが、該３’末端領域に相補的である第１の５’テイルセグメント、および該第１の３’内部領域に相補的である第１の３’プライミングセグメントを含み；
該逆方向プライマーが、該５’末端領域に同一である第２の５’テイルセグメント、および該第１の５’内部領域と同一である第２の３’プライミングセグメントを含む、工程；および
（Ｄ）反応混合物を、増幅および鎖置換重合のために適切な条件下、増幅および鎖置換重合のための試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。
【請求項５１】
標的核酸を非直線的に増幅する方法であって、以下の工程：
（Ａ）該標的核酸の鎖のアンプリコンを提供する工程であって、該アンプリコンが、以下を含む実質的に非同一な領域を含む工程：
（ｉ）３’末端における、３’末端領域、該３’末端領域に実質的に隣接する第１の３’内部領域、および該第１の３’内部領域に実質的に隣接する第２の３’内部領域であって、ここで、該３’末端領域および該第２の３’内部領域が相補的であり、そして互いにアニールして増幅に適切な条件下でループを形成する、領域、
（ｉｉ）５’末端における、５’末端領域、該５’末端領域に実質的に隣接する第１の５’内部領域、および該第１の５’内部領域に実質的に隣接する第２の５’内部領域であって、ここで、該５’末端領域および該第２の５’内部領域が相補的であり、そして増幅に適切な条件下で互いにアニールしてループを形成する、領域、および
（ｉｉｉ）該第２の３’内部領域を、該第２の５’内部領域に連結する、中央領域；
（Ｂ）順方向プライマー、逆方向プライマーまたはその両方を提供する工程であって、
該順方向プライマーが、該３’末端領域に実質的に相補的である第１の５’テイルセグメント、および該第１の３’内部領域に実質的に相補的である第１の３’プライミングセグメントを含み；
該逆方向プライマーが、該５’末端領域に実質的に同一である第２の５’テイルセグメント、および該第１の５’内部領域と実質的に同一である第２の３’プライミングセグメントを含む、工程；
（Ｃ）鎖置換活性を有するテンプレート依存性ポリメラーゼを用い、該アンプリコンの３’末端を、５’末端に伸長し、それによって、増幅に適切な条件下、各々がループを形成し得る３つのセクションを含む伸長したアンプリコンを形成する、工程；および
（Ｄ）反応混合物を、増幅および鎖置換重合のために適切な条件下、そして増幅および鎖置換重合のために適切な試薬とインキュベートする工程、を包含する、方法。
【請求項５２】
前記工程（Ａ）−（Ｄ）のいずれか、またはすべてを繰り返すことをさらに含む、請求項５０または５１に記載の増幅する方法。
【請求項５３】
溶融温度調節因子を提供することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記反応溶液中のベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程：
請求項４５に記載の増幅する方法を実施する工程、および
前記標的の鎖のアンプリコンが、該増幅する方法の生成物中に検出可能に存在するか否かを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、前記決定する方法が、以下の工程：
該増幅する方法の生成物を、前記第１の３’内部領域または前記第１の５’内部領域に相補的な核酸を含むプローブと組み合わせる工程；および
ハイブリダイゼーションが、該プローブと該増幅する方法の生成物との間で生じるか否かを観察する工程、を包含する、方法。
【請求項５８】
前記第２の３’内部領域が、前記３’末端領域から約１００ヌクレオチドより少なく離れており、そして前記第２の５’内部領域が、前記５’末端領域から約１００ヌクレオチドより少なく離れている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５２に記載の方法であって、前記順方向プライマーが、前記アンプリコンまたはそのテンプレート上で少なくとも部分的に伸長され、伸長された後、それが伸長される前より該アンプリコンまたはテンプレートとのより弱い結合を有する、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記逆方向プライマーが、前記アンプリコンまたはそのテンプレート上で少なくとも部分的に伸長され、伸長された後、それが伸長される前より該アンプリコンまたはテンプレートとのより弱い結合を有する、方法。
【請求項６１】
前記条件が、限定サイクリング条件である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記条件が、実質的に均衡条件である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記条件が、実質的に等温である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項５２に記載の方法であって、サーマルサイクラーを採用しない、方法。
【請求項６５】
前記条件が、初期熱変性を除いて実質的に均衡である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６６】
前記方法全体が、いかなる熱変性もなしに実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法全体が、９２℃より下の温度で実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６８】
前記方法が、開始熱変性を除いて実質的に均衡な条件下で７０℃より下の温度で実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６９】
前記方法が、実質的に均衡な条件下で７０℃より下の温度で実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項７０】
前記実質的に非同一の領域が、実質的に類似しない、請求項５２に記載の方法。
【請求項７１】
その５’末端および３’末端にステムおよびループの形成を有する一本鎖核酸分子を作製する方法であって、以下の工程：
第１のオリゴヌクレオチドプライマーをサンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする３’末端部分、および該サンプル一本鎖核酸分子の該アニーリング領域の３’側に位置する任意の領域と同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、工程；
鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、第１の一本鎖核酸分子を形成させる工程であって、該第１の一本鎖核酸分子が、互いにアニーリングしてループを形成する、第１の領域および５'末端に位置する第１の相補的な領域を含む５'末端部分を含む、工程；
該サンプル一本鎖核酸分子から該第１の一本鎖核酸分子を置換する工程；
第２のオリゴヌクレオチドプライマーを該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングする工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングする３’末端部分、および該該第１の一本鎖核酸分子の該アニーリング領域の３’側に位置する任意の領域と同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、工程；
鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、第２の一本鎖核酸分子を形成させる、工程であって、該第２の一本鎖核酸分子が、（ｉ）該第１の一本鎖核酸分子の５’末端部分に相補的な３’末端部分であって、該３’末端部分は、互いにアニーリングして第１のループを形成する、３’末端に位置する該第１の領域および該第１の相補的な領域を含む、３'末端部分、ならびにｉｉ）互いにアニーリングして第２のループを形成する、５’末端に位置する第２の相補的な領域および第２の領域を含む、５'末端部分、を含む、工程；ならびに
該第１の一本鎖核酸分子から該第２の一本鎖核酸分子を置換する工程、
を包含し、それにより、該第２の一本鎖核酸分子が、該３’末端部分および該５’末端部分の両方で形成されるステムおよびループの形成を伴うコンフォメーションをとる、方法。
【請求項７２】
前記伸長工程が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて実施される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項７１に記載の方法であって、ここで、前記サンプル一本鎖核酸分子から前記第１の一本鎖核酸分子を置換する前記工程が、以下の工程：
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置の３’側の位置で、該サンプル一本鎖核酸分子に第３のオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程；ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、該第３のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、該サンプル一本鎖核酸分子から該第１の一本鎖核酸分子を置換する工程、
を包含する、方法。
【請求項７４】
請求項７１に記載の方法であって、ここで、前記第１の一本鎖核酸分子から前記第２の一本鎖核酸分子を置換する前記工程が、以下の工程：
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置の３’側の位置で、該第１の一本鎖核酸分子に第４のオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程；ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、該第４のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、該第１の一本鎖核酸分子から該第２の一本鎖核酸分子を置換する工程、
を包含する、方法。
【請求項７５】
前記置換の各々が、熱変性によって実行されている、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記サンプル一本鎖核酸分子がＲＮＡであり、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する工程が、逆転写活性を有する酵素により行われる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記反応溶液中のベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１の一本鎖核酸分子を置換する工程が、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端部分が前記サンプル一本鎖核酸分子にアニールする場所から始まって、該第１の一本鎖核酸分子の３’末端へと続いて行われる、請求項７１に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２の一本鎖核酸分子を置換する工程が、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端部分が、第１の一本鎖核酸分子にアニールする場所から始まって、該第２の一本鎖核酸分子の３’末端へと続いて行われる、請求項７１に記載の方法。
【請求項８２】
以下を含む核酸分子をコピーする方法であって、該方法は、
Ａ）請求項７１に記載の方法に従って、第２の一本鎖核酸分子を調製し、それにより、テンプレートを形成する工程；
Ｂ）第１の領域および第１の相補領域が互いにアニーリングして第１のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの３’末端を該テンプレートの５’末端へと伸長させて、それぞれ３’末端に位置する、第２の相補領域および第２の領域を含み、適切な条件下で互いにアニーリングして第３のループを形成する、テンプレート伸長を形成する、工程；
Ｃ）３’末端で該第１のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で該テンプレートの該第１の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの該第１のループにアニーリングさせる、工程；ならびに
Ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、工程（Ａ）において形成された該テンプレートに相補的な新規テンプレートを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項８３】
請求項８２に記載の方法であって、
Ｅ）前記伸長したテンプレートから前記新規テンプレートを置換する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の方法であって、前記工程（Ｄ）の伸長工程は、前記工程（Ｂ）の伸長の間に形成された前記テンプレート伸長を置換して、前記第２の相補的領域および前記第２の領域が互いにアニーリングして第３のループを形成することを可能にし、前記工程（Ｅ）の置換する工程が、該伸長したテンプレートの３’末端を該テンプレートの５’末端へと伸長させ、それによって、前記新規テンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項８５】
請求項８４に記載の方法であって、該方法は、以下の工程：
３’末端で前記第３のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で前記テンプレートの前記第２の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、該第３のループにアニールさせる工程；ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長させる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項８６】
請求項８３に記載の方法であって、前記テンプレートとして、工程（Ｄ）において形成された前記新規テンプレートを使用して、前記工程（Ｂ）〜（Ｅ）を繰り返す工程、をさらに包含する、方法。
【請求項８７】
前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
反応溶液中の前記ベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
キットであって、以下：
第１のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、（ｉ）サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングし、そして該サンプル一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第１の一本鎖核酸分子を合成するための合成起点として働く、３’末端ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）該第１の一本鎖核酸分子の任意の領域に相補的な５’末端ヌクレオチド配列を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー；
第２のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子に該第１のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置より３’側に位置する、該サンプル一本鎖核酸分子の領域にアニーリングするヌクレオチド配列を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマー；
第３のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、（ｉ）該第１のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して調製された該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングし、そして該第１の一本鎖核酸分子に少なくとも部分的に相補的な第２の一本鎖核酸分子を合成するための合成起点として働く、３’末端ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）該第２の一本鎖核酸分子の任意の領域に相補的な５’末端ヌクレオチド配列を含む、第３のオリゴヌクレオチドプライマー；
鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
該プライマーを伸張させるために該ＤＮＡポリメラーゼによって使用される、１つ以上のヌクレオチド、
を備える、キット。
【請求項９１】
請求項９０に記載のキットであって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに備え、該第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第１の一本鎖核酸分子に前記第３のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする位置より３’側に位置する、該第１の一本鎖核酸分子の領域にアニーリングするヌクレオチド配列を含む、キット。
【請求項９２】
前記キットの残りの構成要素を使用して調製された、核酸合成生成物の検出のための、検出器をさらに備える、請求項９０に記載のキット。
【請求項９３】
５’末端および３’末端においてステムおよびループの形成を有する、一本鎖核酸分子を作製する方法であって、以下：
第１の一本鎖核酸分子を添加する工程であって、該第１の一本鎖核酸分子は、互いにアニーリングしてループを形成する、５’末端に位置する第１の領域および第１の相補領域、を含む、５’末端部分を含む、工程；
第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、第１の一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングする３’末端部分、および該第１の一本鎖核酸分子の該アニーリング領域の３’側に位置する任意の領域と同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、工程；
鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、第２の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第２の一本鎖核酸分子は、（ｉ）該第１の一本鎖核酸分子の５’末端部分に相補的な３’末端部分であって、該３’末端部分は、互いにアニーリングして第１のループを形成する、３’末端に位置する第１の領域および第１の相補領域、を含む、３’末端部分、ならびに（ｉｉ）互いにアニーリングして第２のループを形成する、５’末端に位置する第２の領域および第２の相補領域、を含む、５’末端部分を含む、工程；
該第１の一本鎖核酸分子から、該第１の一本鎖核酸分子に該第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端部分がアニーリングした位置から該第２の核酸分子の３’末端まで続く該第２の一本鎖核酸分子を置換する工程であって、該第１の一本鎖核酸分子からの該第２の一本鎖核酸分子の置換の際に、該第２の一本鎖核酸分子が、該第１のループを形成する３’末端部分および該第２のループを形成する５’末端部分を有するコンフォメーションを呈する、工程；
を包含する、方法。
【請求項９４】
前記伸長工程が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して実行される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記アニーリング工程および前記伸長工程が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記溶融温度調節因子が、有効濃度のベタインを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
反応溶液中の前記ベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
核酸をコピーする方法であって、以下：
Ａ）請求項９３に記載の方法に従って、第２の一本鎖核酸分子を調製し、それによりテンプレートを形成する工程；
Ｂ）該第１の領域および第１の相補領域が互いにアニーリングして該第１のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該テンプレートの３’末端を該テンプレートの５’末端へと伸長させて、該第２の相補領域および第２の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第３のループを形成する、３’末端に位置する第３の領域および第３の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程；
Ｃ）３’末端で該第１のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で該テンプレートの該第１の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長したテンプレートの該第１のループにアニーリングさせる、工程；ならびに
Ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長したテンプレートに沿って該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、工程（Ａ）において形成されたテンプレートに相補的な新規テンプレートを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項９９】
Ｅ）前記新規テンプレートを前記伸長したテンプレートから置換する工程、をさらに包含する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
請求項９９に記載の方法であって、前記工程（Ｄ）の伸長工程が、前記工程（Ｂ）の伸長工程の間に形成されるテンプレート伸長を置換し、前記第３の領域および前記第３の相補領域を互いにアニーリングさせて第３のループを形成させ、前記工程（Ｅ）の置換工程が、以下：前記伸長したテンプレートの３’末端を該テンプレートの５’末端に向かって伸長し、それにより新規テンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１０１】
請求項１００に記載の方法であって、以下：
３’末端で前記第３のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で前記テンプレートの第３の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、該第３のループにアニーリングさせる、工程；ならびに
鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長させる、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１０２】
請求項９９に記載の方法であって、前記新規テンプレートが、（ｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第１のループを形成する、５’末端に位置する前記第１の領域および前記第１の相補領域、を含む、５’末端部分、ならびに（ｉｉ）適切な条件下で互いにアニーリングして第２のループを形成する、３’末端に位置する前記第２の領域および前記第２の相補領域、を含む、３’末端部分、を有し、該方法は、さらに以下の工程：
Ｆ）該第２の領域および第２の相補領域が互いにアニーリングして該第２のループを形成する場合、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該新規テンプレートの該３’末端を該新規テンプレートの該５’末端へと伸長させて、該第１の相補領域および第１の領域とそれぞれ実質的に同じであり、適切な条件下で互いにアニーリングして第３のループを形成する、第３の領域および第３の相補領域を含むテンプレート伸長を形成する、工程；
Ｇ）３’末端で該第２のループの少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、および５’末端で該テンプレートの該第２の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、該伸長した新規テンプレートの該第２のループにアニーリングさせる、工程；
Ｈ）鎖置換活性を有するポリメラーゼによって、該伸長した新規テンプレートに沿って該第２のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、該テンプレートと実質的に同じ第３のテンプレートを形成する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の方法であって、以下：
Ｉ）前記新規テンプレートから前記第３のテンプレートを置換する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１０４】
請求項１０３に記載の方法であって、前記第３のテンプレートを使用して、前記工程（Ｂ）〜（Ｉ）を繰り返す工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１０５】
前記伸長工程の各々が、溶融温度調節因子の存在下で実行される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記溶融温度調節因子が、有効な濃度のベタインを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記反応溶液中のベタインの濃度が、約０．５５Ｍである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
５’末端および３’末端にステムおよびループの形成を有する一本鎖核酸分子を作製する方法であって、該方法が、以下：
第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、該サンプル一本鎖核酸分子にアニーリングする３’末端部分、および該サンプル一本鎖核酸分子の該アニーリング領域の３’側に位置する任意の領域と同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、工程；
鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、第１の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第１の一本鎖核酸分子は、互いにアニールしてループを形成する、５’末端に配置される第１領域および第１の相補性領域を含む５’末端部分を含む、工程；
該サンプル一本鎖核酸分子から該第１の一本鎖核酸分子を置換する工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端部分が該サンプル一本鎖核酸分子にアニールする場所から始まり、そして該第１の一本鎖核酸分子の３’末端へと続く、工程；
第２のオリゴヌクレオチドプライマーを該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングさせる工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、該第１の一本鎖核酸分子にアニーリングする３’末端部分、および該第１の一本鎖核酸分子の該アニーリング領域の３’側に位置する任意の領域と同じヌクレオチド配列を含む５’末端部分を含む、工程；
鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーをその３’末端から伸長させて、第２の一本鎖核酸分子を形成する工程であって、該第２の一本鎖核酸分子は、（ｉ）該第１の一本鎖核酸分子の５’末端部分に相補的な３’末端部分であって、該３’末端部分は、互いにアニールして第１のループを形成する、３’末端に配置される第１領域および第１の相補性領域を含む、３’末端部分、および（ｉｉ）５’末端部分であって、該５’末端部分は、互いにアニールして第２のループを形成する、５’末端に配置される第２領域および第２の相補性領域を含む、５’末端部分を含む、工程；ならびに
該第１の一本鎖核酸分子から該第２の一本鎖核酸分子を置換する工程であって、これによって、該第２の一本鎖核酸分子が３’末端部分および５’末端部分の両方において形成されるステムおよびループの形成を有するコンフォメーションをとる、工程、
を包含する、方法。