【手続補正書】
【提出日】平成16年10月26日(2004.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  植物において生理疾患に対する耐性を高める方法であって、前記方法は、
(１)  植物のゲノム中にベクターを組み込み;
(２)  前記植物を生長させる;
ことを含んで成り、前記ベクターは、
(Ａ)  アンチセンスヌクレオチド配列、
(Ｂ)  前記アンチセンスヌクレオチド配列が発現されるように、当該アンチセンスヌクレオチド配列に対して作用可能式に連結された調節配列、
を含んで成り、前記アンチセンスヌクレオチド配列は、
(ｉ)  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼの３´末端をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで、前記老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼをコードするＤＮＡ分子が配列番号：３１とハイブリダイズする)、
(ii)  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子の３´末端によってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも一部分、
(iii)  老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分(ここで、前記老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子が配列番号：１１、配列番号：１３及び／又は配列番号：１５とハイブリダイズする)、
(iv)  老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応する部分、又は、
(ｖ)  (ｉ)もしくは(ii)と、(iii)もしくは(iv)との組み合わせ、
に対して実質上相補的であり、これによって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が転写され、そして前記ＲＮＡ配列に結合し、これにより前記老化により誘導されるデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子、老化により誘導されるｅＩＦ−５Ａ遺伝子、又はその両方の発現が阻害される、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】  前記疾患が尻腐れ（blossom end rot）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  植物及びその子孫であって、ここで前記植物は、老化により誘導されるデオキシヒプシンシンターゼ、老化により誘導されるｅＩＦ−５Ａ、又はその両方の発現が阻害又は減少している細胞に由来し、ここで前記細胞は、
(１)  細胞のゲノム中にベクターを組み込み;
(２)  前記細胞を増殖させる;
ことによって生産され、前記ベクターは、
(Ａ)  アンチセンスヌクレオチド配列、
(Ｂ)  前記アンチセンスヌクレオチド配列が発現されるように、当該アンチセンスヌクレオチド配列に対して作用可能式に連結された調節配列、
を含んで成り、前記アンチセンスヌクレオチド配列は、
(ｉ)  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼの３´末端をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分(ここで、前記老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼをコードするＤＮＡ分子が配列番号：３１とハイブリダイズする)、又は
(ii)  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子の３´末端によってコードされるＲＮＡ配列の対応する部分、
(iii)  老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分(ここで、前記老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子が配列番号：１１、配列番号：１３及び／又は配列番号：１５とハイブリダイズする)、
(iv)  老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応する部分、又は、
(ｖ)  (ｉ)もしくは(ii)と、(iii)もしくは(iv)との組み合わせ、
に対して実質上相補的であり、これによって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が転写され、そして前記ＲＮＡ配列に結合し、これにより前記老化により誘導されるデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子、老化により誘導されるｅＩＦ−５Ａ遺伝子、又はその両方の発現が阻害される、
ことによって生産される細胞由来の植物及びその子孫。
【請求項４】  前記植物がトマトである、請求項３に記載の植物及び子孫。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明は更に、植物において内生の老化により誘導されるＤＨＳの発現を阻害する方法に関する。前記方法は:
（１） 植物のゲノムにベクターを組み込み;
（２） 前記植物を生長させる;
ことを含んで成り、そのベクターが含んで成るのは、
（Ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド、
（Ｂ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドが        発現されるように当該アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポ        リヌクレオチドに作用可能式に連結された調節配列、
であり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは、（ｉ）老化により誘導される内生のＤＨＳをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の少なくとも一部分(ここで老化により誘導されるＤＨＳをコードする前記ＤＮＡ分子が配列番号：１、配列番号：５及び/又は配列番号：９とハイブリダイズする)、又は
（ii）老化により誘導される内生のＤＨＳ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の少なくとも一部分、
に対して相補的であり、これによって前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが転写され、そして転写産物が前記内生のＲＮＡに連結し、これにより前記老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現が阻害される方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明は更に、植物において老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する方法に関する。前記方法は:
（１）植物のゲノムにベクターを組み込み;
（２）前記植物を生長させる;
ことを含んで成り、そのベクターが含んで成るのは、
（Ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド、
（Ｂ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドが発現されるように当該アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドに作用可能式に連結された調節配列、
であり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは、（ｉ）老化により誘導される内生のｅＩＦ−５ＡをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分(ここで老化により誘導されるｅＩＦ−５Ａをコードする前記ＤＮＡ分子が配列番号：１１、配列番号：１５及び/又は配列番号：１７又はこれらの組み合わせとハイブリダイズする)、又は
（ii）老化により誘導される内生のｅＩＦ−５Ａ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の少なくとも一部分、
に対して相補的であり、これによって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが転写され、そして転写産物が前記内生のＲＮＡに連結し、これにより前記老化により誘導されるｅＩF−５Ａ遺伝子の発現が阻害される方法である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
プラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡ配列決定
Sambrook ら（Supra）により記載されたアルカリ溶解の方法を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。ジデオキシ配列決定法、Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 : pp. 5463-5467を用いて完全長陽性ｃＤＮＡクローンの配列を決定した。オープンリーディングフレームはコンパイルされており、そしてＢＬＡＳＴサーチ（GenBank, Bethesda, MD ）を用いて解析して、ＢＣＭ  Ｓｅｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒ：多数配列アライメントパターン誘導多数アライメント法（Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method）(F. Corpet, Nuc. Acids Res. 16 : pp 10881〜10890 (1987) を参照のこと）を用いることで、コード遺伝子の誘導アミノ酸配列と最も相同的な５つのタンパク質のアライメントを得た。誘導生成アミノ酸配列中に存在する機能モチーフをMulti Finderによって同定した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
実施例３
老化している花におけるトマトＤＨＳ遺伝子の誘導
トマト植物の固い花のつぼみ及び開いた、老化した花を収穫して、ＲＮＡを実施例２のように単離した。１．２％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で１０μｇのＲＮＡを分画化してナイロンメンブレン上に移した。ランダムプライム32Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長ＤＨＳ ｃＤＮＡ（配列番号：１）を用いて４２℃で一晩メンブレンを標識した。次いで、そのメンブレンを室温で１５分に渡り０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で１回洗い、そして０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で１５分ごと３回洗った。−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにメンブレンをさらした。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
実施例５
凍結によるトマトの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の誘導
鉢にあるトマト植物（７〜８週齢）を生長チャンバー（growth chamber）中で２日、３日、６日に渡り６℃にさらした。暗期８時間及び明期１６時間の光周期にした。植物を温室に移して再加温した。生長チャンバーから取り除いた後、再加温しなかった植物はすぐに収穫した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
凍結温度にさらされたトマトの葉から単離したＲＮＡのノーザンブロットである。図９Ａはエチジウムブロマイドで染色した総ＲＮＡのゲルである。各レーンには１０μｇのＲＮＡが含まれる。図９Ｂは、32Ｐ−ｄＣＴＰで標識したトマトの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡで標識したノーザンブロットのオートラジオグラフである。図９Ｃには葉分散体の電導度として測定した対応する漏出データを示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
ポリＡ尾部及び５′末端の非コーディング領域を含まないカーネーションＤＨＳ完全長（１３８４塩基対）ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号：９）である。誘導アミノ酸は以下のヌクレオチド配列（３７３個のアミノ酸）（配列番号：１０）に示されている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６】
野生型（右）及びアンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現するトランスジェニックトマト植物（左）の写真である。トランスジェニック植物における葉のサイズの増加及び植物サイズの増加を示している。苗木を土に移植した１８日後にこの写真はとられた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７】
野生型（左）及びアンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現するトランスジェニックトマト植物（左）の写真である。トランスジェニック植物における葉のサイズの増加及び植物サイズの増加を示している。苗木を土に移植した３２日後にこの写真はとられた。