(57)【要約】センチネルリンパ節を特異的に検出する熱応答性磁性体ナノ粒子を含むＭＲＩ用造影剤の提供。上限臨界溶液温度及び／又は下限臨界溶液温度を有する熱応答性高分子で磁性粒子を被覆した、平均粒子径が７０〜１００ｎｍの熱応答性磁性体ナノ粒子を含む、センチネルリンパ節に高密度に集積するセンチネルリンパ節造影剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上限臨界溶液温度及び／又は下限臨界溶液温度を有する熱応答性高分子で磁性粒子を被覆した、平均粒子径が７０〜１００ｎｍの熱応答性磁性体ナノ粒子を含む、センチネルリンパ節に高密度に集積するセンチネルリンパ節造影剤。
【請求項２】
磁性体ナノ粒子が、酸化ニッケル粒子、フェライト粒子、マグネタイト粒子、コバルト鉄酸化物粒子、バリウムフェライト粒子、炭素鋼粒子、タングステン鋼粒子、ＫＳ鋼粒子、希土類コバルト磁石粒子及びヘマタイト粒子からなる群から選択される粒子である請求項１記載のセンチネルリンパ節造影剤。
【請求項３】
下限臨界溶液温度が４０℃以上である、請求項１又は２に記載のセンチネルリンパ節造影剤。
【請求項４】
熱応答性高分子が、アクリルアミド又はアクリルアミドの誘導体の重合体又は共重合体、あるいはポリアクリルアミドの誘導体を含有する高分子である請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンチネルリンパ節造影剤。
【請求項５】
熱応答性高分子が、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含む高分子である請求項４に記載のセンチネルリンパ節造影剤。
【請求項６】
ＭＲＩ撮影に用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のセンチネルリンパ節造影剤。
【請求項７】
癌組織周囲に投与すると、癌組織部位からリンパ管へ流入し、該癌組織に最も近いセンチネルリンパ節に高濃度に滞留し集積する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンチネルリンパ節造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＩ）によるセンチネルリンパ節の造影に用いる造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
センチネルリンパ節は、癌組織からのリンパ流が最初に流入するリンパ節、すなわち原発癌からリンパ管へ癌細胞が侵入した場合の該リンパ管への侵入位置から最も近いリンパ節であり、センチネルリンパ節に流入したリンパ液は、さらに２次リンパ節に流入した後、全身のリンパ流に乗る。病理学的にセンチネルリンパ節に癌細胞の侵入がなければ、癌の転移はないと診断することができる。一方、センチネルリンパ節に癌細胞の侵入が認められる場合は、癌の転移が生じたと診断され、広い領域の外科的手術を施す必要がある。従って、癌診断や癌の外科的治療の際に、センチネルリンパ節を的確に同定検出する診断技術を確立することが要求されている。
従来、センチネルリンパ節を同定する方法として、放射性アイソトープ注入後のガンマプローブによる検出（特許文献１を参照）、インジゴカルミン等の色素を用いた色素注入（非特許文献１を参照）、蛍光物質注入（特許文献２及び３を参照）、ヨウ化銀粒子を用いたＸ線造影（特許文献４を参照）、マイクロバブル投与後の超音波撮像（特許文献５を参照）、アルブミン投与後の超音波撮像（特許文献６を参照）、コロイド鉄粒子注入後のＭＲＩ（特許文献７を参照）などが利用されていた。これらの物質は、癌組織に投与した後一定時間センチネルリンパ節に滞留し、それを検出することによりセンチネルリンパ節の検出が可能であるとされていた。
しかしながら、従来の方法は、センチネルリンパ節のみだけでなく、２次リンパ節にも滞留し、２次リンパ節とセンチネルリンパ節の区別をつけることができなかった。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／１２０７１号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−２６９４３９号公報
【特許文献３】特開２００５−１３２８０５号公報
【特許文献４】特開２００６−２２５３４６号公報
【特許文献５】特開２００６−５０３８６１号公報
【特許文献６】特開２００３−２３８４５０号公報
【特許文献７】特開平１０−１２０５９７号公報
【非特許文献１】Ａ．Ｅ．Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２０，１９９４，３９１−４０１
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、センチネルリンパ節を特異的に検出する熱応答性磁性体ナノ粒子を含むＭＲＩ用造影剤の提供を目的とする。
本発明者等は、センチネルリンパ節を他のリンパ節と区別して検出し得る試薬について鋭意検討を行なった。本発明者等は、平均粒子径が７０〜１００ｎｍのナノサイズの粒子がセンチネルリンパ節に選択的に集積しやすいことを見出し、さらに粒子を磁性体粒子とすることによりＭＲＩによりセンチネルリンパ節を的確に見出せることを見出した。さらに、磁性体ナノ粒子の表面を高分子物質で被覆することにより、磁性体ナノ粒子の生体内での分散・凝集を制御することができることを見出した。さらに、特に高分子物質として、一定の温度で相転移し得る高分子物質を用いることにより、任意の温度での分散・凝集を制御することができることを見出し、本発明のセンチネルリンパ節の造影剤に関する発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  上限臨界溶液温度及び／又は下限臨界溶液温度を有する熱応答性高分子で磁性粒子を被覆した、平均粒子径が７０〜１００ｎｍの熱応答性磁性体ナノ粒子を含む、センチネルリンパ節に高密度に集積するセンチネルリンパ節造影剤。
［２］  磁性体ナノ粒子が、酸化ニッケル粒子、フェライト粒子、マグネタイト粒子、コバルト鉄酸化物粒子、バリウムフェライト粒子、炭素鋼粒子、タングステン鋼粒子、ＫＳ鋼粒子、希土類コバルト磁石粒子及びヘマタイト粒子からなる群から選択される粒子である［１］のセンチネルリンパ節造影剤。
［３］  下限臨界溶液温度が４０℃以上である、［１］又は［２］のセンチネルリンパ節造影剤。
［４］  熱応答性高分子が、アクリルアミド又はアクリルアミドの誘導体の重合体又は共重合体、あるいはポリアクリルアミドの誘導体を含有する高分子である［１］〜［３］のいずれのセンチネルリンパ節造影剤。
［５］  熱応答性高分子が、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含む高分子である［４］のセンチネルリンパ節造影剤。
［６］  ＭＲＩ撮影に用いる、［１］〜［５］のいずれかのセンチネルリンパ節造影剤。
［７］  癌組織周囲に投与すると、癌組織部位からリンパ管へ流入し、該癌組織に最も近いセンチネルリンパ節に高濃度に滞留する、［１］〜［６］のいずれかのセンチネルリンパ節造影剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−０６５４３５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子の温度による相転移の状態を示す図である。
図２は、ラット盲腸粘膜、センチネルリンパ節及び２次リンパ節における熱応答性磁性体ナノ粒子の集積の状態を示す写真である。
図３は、ラット盲腸粘膜、センチネルリンパ節及び２次リンパ節における熱応答性磁性体ナノ粒子の集積部位及び時期を示す図である。
図４は、本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子を用いたＭＲＩによりセンチネルリンパ節の造影の結果を示す写真である。
図５は、センチネルリンパ節及びセンチネルリンパ節以外のリンパ節におけるシグナル強度の経時的変化を示す図である。
図６は、本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子の投与部位を示す図である。
図７は、色素を用いた腸間膜リンパ節の同定の結果を示す写真である。
図８は、盲腸への熱応答性磁性体ナノ粒子の投与方法を示す写真である。
図９は、熱応答性磁性体ナノ粒子を投与した腋窩リンパ節のＭＲＩ画像を示す写真である。
図１０は、熱応答性磁性体ナノ粒子を投与した腋窩リンパ節における経時的信号値変化を示す図である。
図１１は、ラット盲腸への熱応答性磁性体ナノ粒子の投与中手順を示す図である。
図１２は、熱応答性磁性体ナノ粒子を投与した腸間膜リンパ節の病理学的所見を示す写真である。
図１３は、熱応答性磁性体ナノ粒子を投与した腸間膜リンパ節でのＭＲＩ画像を示す写真である。
図１４は、熱応答性磁性体ナノ粒子を投与した腸間膜リンパ節での信号値の変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のセンチネルリンパ節造影剤は、ナノサイズの熱応答性（熱感受性又は熱応答性）を有する、熱応答性磁性体ナノ粒子を含む造影剤である。
該熱応答性磁性体ナノ粒子のサイズは、平均粒子径が５０〜１５０ｎｍ、好ましくは５０〜１２０ｎｍ、さらに好ましくは７０〜１００ｎｍである。この範囲の粒子径であれば、細網内皮系に取り込まれることなく毛細血管等の生体組織を通過することができ、リンパ節中にも進入することができる。粒子径は、例えば、光散乱度計を用いて測定することができる。本発明において、「粒子」とは完全な球形の粒子だけではなく、楕円や不定形の不完全な球形の粒子も含まれる。センチネルリンパ節造影剤に含まれる磁性体ナノ粒子の粒系は均一であるのが好ましいが、上記の粒子径の範囲内に所定の粒度分布を有していればよい。
本発明に使用する磁性体ナノ粒子の素材は、常温で磁性を示す物質であれば有機物質であっても無機物質であってもよい。本発明においては以下のものに特定されるものではないが、磁性を示す物質として具体的には、酸化ニッケル粒子、フェライト粒子、マグネタイト粒子、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石のナノ粒子、及びヘマタイト粒子などを挙げることができる。
本発明の磁性体ナノ粒子は、熱応答性高分子により被覆されている。熱応答性高分子とは、熱により相転移（ゾル−ゲル変換）を起こし、一定の温度を境に、不溶性又は溶解性となり得る高分子をいう。熱応答性高分子で磁性体ナノ粒子を被覆することにより、外部刺激（熱）によって、表面の熱応答性高分子が相転移を起こすので、磁性体ナノ粒子自体が、凝集又は分散し、磁気応答性が変化する。すなわち、環境すなわち生体内の昇温により、磁性体ナノ粒子は親水性から疎水性へ変化し、集積し粒子塊を形成する。一方、環境の降温により磁性体ナノ粒子は疎水性から親水性へと変化し、粒子塊は消失する。例えば、本発明の熱応答性を有する磁性体ナノ粒子を含む水溶液を加温した場合、一定の温度に達すると、磁性体ナノ粒子は熱応答性高分子の凝集により凝集塊を形成する。凝集塊を形成すると、磁気性ナノ粒子を体内から短時間で回収することができる。一方、磁性体ナノ粒子を含む水溶液を一定温度以下にさらすと、凝集した磁性体ナノ粒子は再び分散する。
このような熱応答性高分子として、水溶液中で下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）又は上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子が挙げられる。ＬＣＳＴ（下限臨界溶液温度）とは、特定温度以下では溶解状態を維持するが、その特定温度以上の溶液中では不溶性となり凝集する温度をいい、ＵＣＳＴ（上限臨界溶液温度）とは、特定温度以上では溶解状態を維持するが、その特定温度以下の溶液中では不溶性となり凝集する温度をいう。例えば、「高分子混合物が水溶液中で下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する」とは、ある特定温度（ＬＣＳＴ）以下の溶液中では均一に分散するが、溶液の温度を特定温度（ＬＣＳＴ）以上にすると高分子間コンプレックスを形成して凝集することを意味する。
熱応答性高分子は、下限臨界溶液温度を有するもの及び上限臨界溶液温度を有するものに区別される。
上限臨界溶液温度を有する高分子としては、以下の高分子が挙げられる。
（Ａ）  アクリロイルグリシンアミドのホモポリマー、アクリロイルグリシンアミドと重合性モノマーの共重合ポリマー、アクリロイルグリシンアミドとＮホルミルアクリルアミドの共重合ポリマー、アクリルアミドとＮホルミルアクリルアミドの共重合ポリマー、及びアクリルアミドとＮアセチルアクリルアミドの共重合ポリマーなど。
これらの中でも下記一般式（１）で表されるモノマー（以下「モノマー（１）」と称する）を重合させて得られたポリマー、さらに、該モノマー（１）と一般式（２）で表されるモノマー（以下「モノマー（２）」と称する）とを重合させて得られたポリマーが好適に本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子に使用することができる。
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一般式（１）中、Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示し、好ましくは水素原子である。Ｒ１２は単結合又は炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、好ましくはメチレン基である。
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一般式（２）中、Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示し、好ましくは水素原子である。Ｒ１４は水素原子、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。アルキル基としては炭素数１〜５の直鎖のアルキル基が好ましく、アルコキシル基及びアルキルアミノ基のアルキル基部分としては、炭素数１〜５の直鎖のアルキル基が好ましい。アリール基としては、フェニル基、及びナフチル基等が挙げられ、複素環基となるものとしてはピリミジン等が挙げられる。
上限臨界溶液温度を有する高分子の重合において、モノマー（１）とモノマー（２）の他に、親水性モノマー及び疎水性モノマーから選ばれた１種以上を用いた場合には、その種類及び使用割合を変えることによって上限臨界溶液温度を制御することが可能である。
使用するモノマーが親水性であるのか、若しくは疎水性であるのかの分類は、重合に用いるモノマー（１）の親水性を基準として行う。つまり、重合に用いるモノマー（１）よりも親水性であるものは親水性モノマーであり、疎水性であるものは疎水性モノマーである。また、重合に用いるモノマー（１）が複数である場合には、その中で最も親水性であるモノマーを基準に分類を行えばよい。
重合に用いるモノマー（１）の種類により異なり、一概に特定することはできないが、具体的にその例を挙げれば、本発明において使用する親水性モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、及びアリルアミンなどを挙げることができ、疎水性モノマーとしては、アルキル（メタ）アクリレート、スチレン、エチレン、プロピレン、アセチレン等の不飽和炭化水素、アルキルビニルエーテル、及びアルキル（メタ）アクリルアミドなどを挙げることができる。
上限臨界溶液温度を有する高分子の重合に親水性モノマーを用いた場合、上限臨界溶液温度は低下する傾向にあり、反対に疎水性モノマーを用いた場合、上限臨界溶液温度は上昇する傾向にある。
上限臨界溶液温度を有する高分子の重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー（１）：モノマー（２）：その他のモノマー＝９５〜２０：１〜６０：０〜４０の割合であり、好ましくは９５〜５０：１〜５０：０〜２０の割合である。
（Ｂ）  ポリ−Ｎ−アセチルアクリルアミドとポリエチレングリコールの混合物、あるいはＮ−アセチルアクリルアミドと親水性又は疎水性モノマーとの共重合体とポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミドとの混合物など。
上記のＮ−アセチルアクリルアミドと共重合する親水性モノマーとしては、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、アリルアルコール等を挙げることができる。また、Ｎ−アセチルアクリルアミドと共重合する疎水性モノマーとしては、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、スチレン、Ｎ−アルキル（好ましくは炭素数３以上のアルキル）アクリルアミド、塩化ビニル、エチレン、プロピレン等を挙げることができる。
上記親水性又は疎水性モノマーは、Ｎ−アセチルアクリルアミドに対して、０．５〜８０％の共重合比であることが好ましく、特に５〜７０％の共重合比であることが好ましい。
（Ｃ）  アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ′−メタクロイルトリメチレンアミド、アクロイルグリシンアミド、アクロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクロイルニペコタミド及びアクロイルメチルウラシル等からなる群から選ばれる少なくとも１種の単量体からなるポリマーなど。また、これらの少なくとも２種の単量体からなるコポリマーも利用できる。これらのなかでも、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ′−メタクロイルトリメチレンアミド、アクロイルグリシンアミド、アクロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクロイルニペコタミド及びアクロイルメチルウラシルからなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましく利用できる。
下限臨界溶液温度を有する高分子としては、以下の高分子が挙げられる。
（Ａ）  ポリ−Ｎ−アセチルアクリルアミドとポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミドとの混合物など。
詳細には、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体及びその共重合体、ポリＮ置換メタクリルアミド誘導体及びその共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリＮビニルアルキルアミド、及びポリＮ−イソプロピルアクリルアミドなどが挙げられる。
重合により下限臨界溶液温度を有する高分子を形成するモノマーとしては、例えば、Ｎ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ置換メタクリルアミド誘導体、ビニルメチルエーテル、プロピレンオキサイド、エチレンオキサイド、Ｎビニルアルキルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（下記一般式（３））等が挙げられる。
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さらに詳細には、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。また、これらの重合体及びこれらの少なくとも２種の単量体からなるコポリマーも利用できる。これらのなかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種の単量体からなるポリマーが好ましい。
上限臨界溶液温度及び下限臨界溶液温度の両方を示す熱応答性高分子として、ポリビニルアルコールとポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミドとの混合物、あるいはポリビニルアルコールとポリエチレングリコールとの混合物が挙げられる。これらの混合物で、磁性体ナノ粒子を被覆した場合、上限臨界溶液温度以下、下限臨界溶液温度以上の温度において、磁性体ナノ粒子塊を形成する。
本発明に使用する磁性体ナノ粒子の調製方法について、マグネタイトを用いた場合を例にとって説明する。オレイン酸ナトリウムとドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムとを用いてマグネタイトを二重のミセルとし、このミセルを水溶液中に分散させることにより、粒径が数十ｎｍである磁性マグネタイトナノ粒子を得ることができる。この方法はバイオカタライシス（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁に記載の方法である。
本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子は、熱応答性高分子により被覆された磁性体ナノ粒子であり、ナノサイズであることから、該磁性体ナノ粒子それ自体も熱応答性を有する。
本発明における熱応答性磁性体ナノ粒子及び熱応答性高分子の臨界溶液温度とは、具体的には、該熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子を水に対して１重量％の割合で水に添加した熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子含有水を加熱して清澄状態とし、次いで該熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子含有水の温度を１分あたり１℃の割合で降下させて行き、該熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子含有水の可視光透過率が、清澄状態時の１／２の値になった時点の温度である（図１）。
該熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子含有水の可視光透過率が、清澄状態時の１／２の値になって、さらに昇温又は降温してもある温度範囲で１／２の値が保持される場合がある。この温度範囲の上限を昇温時の上限臨界溶液温度といい、同下限を降温時の下限臨界溶液温度という。この両者の差（温度範囲）をスイッチング範囲という。このスイッチング範囲は狭ければ狭いほど良く、本発明においては１０℃以下であることが好ましく、より好ましくは０℃である。
本発明において、上限又は下限臨界溶液温度を有する高分子による磁性体ナノ粒子の被覆、すなわち固定化は、何れの作用によるものであってもよく、物理的な吸着であっても、水素結合や共有結合などの化学結合によるものであってもよい。固定化方法として具体的には、磁性体ナノ粒子の存在下に熱応答性高分子を重合する方法、溶媒中において熱応答性高分子と磁性体ナノ粒子とを接触させる方法、磁性体ナノ粒子にＳＨ基などの官能基を有するカップリング剤を結合させ、該官能基を基点として熱応答性高分子をグラフト重合させる方法などを挙げることができる。その中でも、磁性体ナノ粒子の存在下に熱応答性高分子を重合する方法で得られた本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子は、その含有液中において溶解と析出・凝集との繰返しを行った場合であっても、固定化された熱応答性高分子が該磁性体ナノ粒子から脱離しにくいので、好ましい。
また、磁性体ナノ粒子の存在下、上記のモノマー（１）のみ、若しくはモノマー（１）とモノマー（２）とを重合させる方法、並びに磁性体ナノ粒子の存在下、親水性モノマー及び疎水性モノマーから選ばれた１種以上、モノマー（１）、及びモノマー（２）を重合させる方法も行なうことができる。具体的には、各モノマーを、磁性体ナノ粒子をけん濁させた溶液へ添加し、窒素置換下、攪拌しながら重合開始剤（例えば過硫酸アンモニウムや過硫酸カリウム）及び重合促進剤（例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を添加し、数時間攪拌することで熱応答性高分子が物理吸着した磁性体ナノ粒子を調製することが出来る。
さらに、磁性体ナノ粒子と熱応答性高分子を多価アルコール又は多価アルコール誘導体を介して結合させることもできる。磁性体ナノ粒子上の鉄イオンと、多価アルコール又は多価アルコール誘導体の有する水酸基、カルボキシル基、リン酸基等との結合により、磁性体ナノ粒子と多価アルコール又は多価アルコール誘導体とが結合される。多価アルコール又は多価アルコール誘導体の有する水酸基は、熱応答性高分子との結合に利用される。多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し、鉄イオンと結合可能なアルコール構造体であれば、特に制限なく使用することができる。例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトールが挙げられる。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシ基を有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。本発明に用いる多価アルコール誘導体は、修飾により、カルボキシル、アミノ、エポキシ、チオール、メタクリル又はアクリル等の反応性官能基や重合性基が導入された多価アルコールが使用できる。
上記のように、本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子の被覆に用いる熱応答性高分子は、例えば、アクリルアミド又はアクリルアミド誘導体の重合体又は共重合体、あるいはポリアクリルアミドの誘導体を含む高分子である。ここで、アクリルアミドの誘導体とはアクリルアミドの構造を有する化合物、アクリルアミドの基が置換された化合物等をいう。また、ポリアクリルアミドの誘導体とは、ポリアクリルアミド構造を有する化合物、ポリアクリルアミドの基が置換された化合物等をいう。
本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子は、生体内に投与し、分散状態を保持させたまま、センチネルリンパ節に集積・滞留させるため、生体の体温付近の温度では凝集せずに、分散状態を保っていることが望ましい。従って、下限臨界溶液温度を有する高分子で被覆した場合、その下限臨界溶液温度は３７℃以上、好ましくは３８℃以上、３９℃以上又は４０℃以上であり、さらに好ましくは４１℃以上、４２℃以上又は４３℃以上である。また、上限臨界溶液温度を有する高分子で被覆した場合、その上限臨界溶液温度は、３６℃以下、好ましくは３５℃以下又は３４℃以下、さらに好ましくは３３℃以下である。
また、本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子は、センチネルリンパ節の造影終了後に、凝集させて回収する。この際、下限臨界溶液温度を有する高分子で被覆した磁性体ナノ粒子の場合は、体温又は磁性体ナノ粒子が集積している部位の温度を下限臨界溶液温度以上に上昇させることにより凝集させることができ、上限臨界溶液温度を有する高分子で被覆した磁性体ナノ粒子の場合は、体温又は磁性体ナノ粒子が集積している部分の温度を上限臨界溶液温度以下に低下させることにより凝集させることができる。一般的に、生体において体温又は部分的な温度を上昇させる方が容易であり、生体にとって悪影響は少ないので、本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子は、下限臨界溶液温度を有するものが好ましい。本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子の下限臨界溶液温度及び上限臨界溶液温度は、上記の記載に従って、被覆する熱応答性高分子を適宜選択することにより任意に設定することができる。下限臨界溶液温度が３７℃以上の熱応答性高分子として、上記の高分子のうち、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含む高分子が挙げられる。
上限臨界溶液温度又は下限臨界溶液温度は、該熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子を水に対して１重量％の割合で水に添加した熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子含有水を加熱して清澄状態とし、次いで該熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子含有水の温度を１分あたり１℃の割合で降下させて行き、該熱応答性磁性体ナノ粒子又は熱応答性高分子含有水の可視光透過率が、清澄状態時の１／２の値になった時点の温度を測定すればよい。この際、溶液のｐＨは６〜８好ましくは７〜７．５で測定する。
本発明の磁性体ナノ粒子は、例えば以下の方法で調製することができる。
硫酸第一鉄（７水和物）及び亜硝酸ナトリウムを蒸留水中で混合し、約４０℃で撹拌する。その後、濃アンモニウムを添加し、不溶物を集め、蒸留水で２回洗浄することにより、マグネタイトが得られる。得られたマグネタイトを蒸留水に添加し、溶液の温度を約８０℃とした後、オレイン酸ナトリウムを添加し、同温度で撹拌する。その後、塩酸でｐＨを約５．５に調整し、得られた不溶物をろ過により集め、蒸留水で洗浄することにより、オレイン酸の層を有するマグネタイトを得ることができる。これに再度、蒸留水を添加し、溶液の温度を約７０℃とした後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し一晩撹拌することにより、磁性体ナノ粒子が得られる。
さらに、この磁性体ナノ粒子を使用して、熱応答性高分子で被覆された本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子を、例えば以下の方法により調製することができる。
（１）Ｎ−アクリロイルグリシンアミドと重合性モノマーによる被覆
上記のようにして調製した磁性体ナノ粒子、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド、メタクロイルトリメチレンアミド及び蒸留水を混合し約５０℃で撹拌し、過硫酸カリウムを添加し、室温でさらに攪拌する。得られた黒色透明溶液を一昼夜透析することにより、Ｎ−アクリロイルグリシンアミドと重合性モノマーで被覆された熱応答性磁性体ナノ粒子を得ることができる。
（２）Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと重合性モノマーによる被覆
上記のようにして調製した磁性体ナノ粒子、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メタクロイルトリメチレンアミド及び蒸留水を混合し室温で撹拌し、過硫酸カリウムを添加し、室温でさらに攪拌する。得られた黒色透明溶液を一昼夜透析することにより、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと重合性モノマーで被覆された熱応答性磁性体ナノ粒子を得ることができる。得られた溶液の下限臨界溶液温度を測定したところ、３１℃であった。この下限臨界溶液温度は、生理食塩水中や１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でもほとんど変化しない。
上記の調製法は、一例であり、用いる被覆する熱応答性高分子の種類を変更し、同様の方法で、種々の熱応答性磁性体ナノ粒子を調製することが可能である。また、上限臨界溶液温度、下限臨界溶液温度も熱応答性高分子を適宜選択することにより所望の温度に設定することができる。
なお、本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子を作製する際に用いる熱応答性高分子は、上限及び下限臨界溶液温度に大きな影響を与えない化合物が結合していてもよい。このような化合物として、例えば、ビオチン、アビジン等が挙げられる。
上記の熱応答性高分子で被覆した熱応答性磁性体ナノ粒子は、粒子径が５０〜１５０ｎｍ、好ましくは５０〜１２０ｎｍ、さらに好ましくは７０〜１００ｎｍである限り、本発明のセンチネルリンパ節造影剤として用いることができる。本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子として、例えば、国際公開第ＷＯ０２／１６５２８号パンフレット、国際公開第ＷＯ０２／１６４９６号パンフレット、国際公開第ＷＯ０２／０１６５７１号パンフレット、特開２００５−８２５３８に記載の粒子を用いることができる。また、市販のサーマ・マックス（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ［登録商標］）（マグナビート社）を用いることもできる。サーマ・マックスには臨界溶液温度が異なるものが各種ある（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＢ  Ｂｉｏｔｉｎ（４２）、Ｔｈｅｒｍａ−ＭＡＸ  ＬＡ、Ｔｈｅｒｍａ−ＭＡＸ  ＬＣ、Ｔｅｒｍａ−ＭＡＸ  ＬＡｍ、Ｔｈｅｒｍａ  Ｍａｘ  ＬＰＡ、Ｔｈｅｒｍａ  Ｍａｘ  ＬＰＧ、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＢ  Ｂｉｏｔｉｎ等）。これらについて、臨界溶液温度を上記の方法で測定し、適切な臨界溶液温度を有するものを用いることができる。サーマ・マックスの中でも、下限臨界溶液温度が４２℃であり、４２℃で凝集するタイプのものが好ましい。４２℃で凝集するタイプは、３８℃では凝集し難く分散した状態で存在する。
本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子を含む、センチネルリンパ節の造影剤は、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＩ）のための造影剤として用いることができる。
該造影剤は、磁性体ナノ粒子の他に薬学的に許容できる成分を含んでいてもよい。このような成分として、殺菌剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、保存剤等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、グリシン、アラニン等の通常のＬ−型アミノ酸、グルコース、マンノース等の単糖類、ショ糖、マルトース等の二糖類、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール類、デキストラン等の多糖類などを挙げることができる。また、殺菌剤としては、ベンザルコニウム塩、クロルヘキシジン塩、パラオキシ安息香酸エステル類等を挙げることができる。緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、あるいはこれらの塩等を挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類等を挙げることができる。キレート剤としては、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示される。その他、アセチルトリプトファンナトリウム、カプリル酸ナトリウムなどを挙げることができる。なお、ｐＨ値についてはｐＨ調整試薬によりｐＨ６〜８程度の範囲に調整することが好ましい。
熱応答性磁性体ナノ粒子は凍結乾燥品として供給されてもよく、この場合は使用時に水、生理食塩水、適当な緩衝液に再溶解して用いればよい。
熱応答性磁性体ナノ粒子の水溶液は、癌部位、癌の周囲に局所投与するのが好ましい。癌の周囲に投与された本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子は、癌周囲のリンパ流に乗り、センチネルリンパ節に流入し、そこで滞留し、２次リンパ節等の他のリンパ節に流入することなく、センチネルリンパ節の特異的な造影を可能にする。投与後、一定時間経過後にＭＲＩ装置により、磁性体ナノ粒子の集積を測定し、磁性体ナノ粒子が集積しているリンパ節をセンチネルリンパ節と判断することができる。
本発明は、熱応答性磁性体ナノ粒子を生体に投与し、センチネルリンパ節を特異的に造影し、センチネルリンパ節を同定する方法を本願する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
熱応答性磁性体ナノ粒子のセンチネルリンパ節への集積
以下の３種類の熱応答性磁性体ナノ粒子を用いた。
１．３６℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ３６、マグナビート社製）
２．４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子（Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ４２、マグナビート社製）
３．デキストラン・マグネタイト（リゾビスト注（商標）、日本シェーリング社）
これらは、市販品をそのままの濃度で用いた。
図１に、３６℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子及び４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子の相転移の状態を示す。
各々ラット１頭当たり０．０４ｍＬを５箇所、計０．２ｍＬを盲腸漿膜下に投与した。投与後、５分、１２時間、２４時間、又は７日間経過後にラットを犠牲にし、盲腸粘膜、及びリンパ節を摘出し、ベルリンブルーにより組織染色した。リンパ節がセンチネルリンパ節か２次リンパ節かは、色素（リンファズリン（商標））０．０４ｍＬを注入して経時的に観察して１次、２次を決定した。
図２に２４時間後の染色像を示す。図２に示すように、低温凝集型はリンパ節への集積は認められなかった。また、デキストラン・マグネタイトは盲腸組織、センチネルリンパ節及び２次リンパ節のいずれにも集積した。高温凝集型は、２次リンパ節には集積せず、盲腸粘膜に多少集積し、センチネルリンパ節に集中的に集積した。
図３に各粒子の集積部位及び集積時期を示す。センチネルリンパ節への４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子の集積は、投与後１２時間〜１日後に認められた。
３種のナノ粒子は体温による凝集性に差があり、凝集し粒径に違いが生じ滞留性の違いになったものと考えられる。高温凝集型は体温によって適度に凝集し停滞する大きさになったものと考えられ、センチネルリンパ節を標的とする磁性体として有用であった。
【実施例２】
【０００７】
ＭＲＩを用いたセンチネルリンパ節の造影
ラット右側前腋下線胸部皮下に鉄磁性体を局注し、それぞれ投与前、投与後２０分、４０分、６０分、８時間後、２４時間後にＭＲＩを撮り画像を作製した。図４にＭＲＩによる造影像を示す。図に示すように、時間が経過するにつれて右側腋下リンパ節に鉄が蓄積され黒くなり、その濃さが強くなった（図４の矢印部分）。一方、左側の腋下リンパ節ではそのような変化は認められなかった。右側腋下リンパ節は、局注部である右側前腋下線胸部皮下に最も近接したセンチネルリンパ節であり、本実施例は本発明の熱応答性磁性体ナノ粒子が局注部に近接したリンパ節のみに集積し滞留することを示しており、局注部が癌周囲である場合、癌部に近接したセンチネルリンパ節に集積し滞留することを示している。
図５は、ＭＲＩ撮像を元にセンチネルリンパ節（右側腋下リンパ節）及び非センチネルリンパ節における鉄磁性体の集積度を数値化したものである。ＭＲＩのｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｓｉｔｙを投与前を１００として投与後のｉｎｔｅｎｓｉｔｙを相対比を求めて経時的にその変化をあらわした。値が低いほど、鉄磁性体が集積していることを示す。図５中、ＳＬＮはセンチネルリンパ節を示し、Ｎｏｎ−ＳＬＮは、非センチネルリンパ節を示す。
【実施例３】
【０００８】
センチネルリンパ節転移モデルを用いた造影
方法
（１）腋窩リンパ節での検討
３６℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子、４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子及びフェリデックス（栄研化学−田辺製薬）を同濃度（０．６ｍｇ／ｍＬ）に調整し、それぞれをラット胸壁に０．５ｍＬずつ投与した（図６）。投与は右胸壁皮下に鉄材を投与することにより行った。経時的に腋窩リンパ節をＭＲＩにて撮像した。ＭＲＩによる撮像は、投与前、投与２０分後、４０分後、６０分後及び２４時間後に行った。
（２）盲腸リンパ節での検討
色素（イソスルファンブルー）投与により、腸間膜リンパ節を同定した（図７）。その後、３６℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子、４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子及び５５℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子をラット盲腸粘膜に０．０４ｍＬを５箇所計０．２ｍＬずつ投与し、腸間膜におけるセンチネルリンパ節及び２次リンパ節への磁性体の移行を病理学的に評価した（図８）。さらに、腸間膜リンパ節のＭＲＩ撮像を行なった。この際、投与から５分後、１、４、８、２４時間後、２、３、５及び７日後に腸間膜リンパ節を切除して行った。
結果
（１）腋窩リンパ節での検討
４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子及びフェリデックスを投与した群で腋窩リンパ節の信号低下を認めたが、３６℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子を投与した群では信号低下を認めなかった（図９及び１０）。信号低下のピークを比較すると、フェリデックスは１時間以内にピークを認め、その後信号値は回復する傾向を認めた。４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子では２４時間後に信号低下のピークを認めた。信号低下のピークは４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子の方が顕著であり、フェリデックスよりも４２℃で凝集する高温凝集型鉄磁性体ナノ粒子の方が造影効果は高かった。病理学的所見ではＭＲＩ所見に一致した磁性体の集積を認めた。３６℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子は投与局所にて凝集したためにリンパ管へ移行せず、その一方で４２℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子は投与局所ですべて凝集しないためにリンパ管に流入したものと考えられた。
（２）盲腸リンパ節での検討
図１１に実験のプロトコールを略記した。病理学的所見では、３６℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子は胸壁投与時と同様にリンパ節へ移行しなかった。４２℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子はセンチネルリンパ節での集積が認められたものの、２次リンパ節へは移行しなかった。５５℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子もセンチネルリンパ節で集積したものの、２次リンパ節への移行するものも一部に認められた。４２℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子は体温によって凝集し、センチネルリンパ節に停滞する大きさになったものと考えられ、センチネルリンパ節を標的とする磁性体として有用と考えられた。５５℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子は体温では凝集しないため、センチネルリンパ節のみに停滞せず２次リンパ節へ流出したものと考えられた（図１２）。４２℃で凝集する低温凝集型鉄磁性体ナノ粒子を盲腸粘膜に投与して２４時間後に腸間膜のＭＲＩを撮像すると、センチネルリンパ節の信号低下を認める一方で、２次リンパ節では信号低下を認めなかった（図１３及び１４）。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明の熱応答性高分子で被覆された平均粒子計７０〜１００ｎｍの磁性体ナノ粒子は、センチネルリンパ節に選択的に集積し、２次リンパ節等のそれ以外のリンパ節には集積しない。従って、本発明の上記磁性体ナノ粒子をＭＲＩを用いたセンチネルリンパ節の造影剤として用いることができ、癌の転移等の的確な診断に利用することができる。ＭＲＩによるセンチネルリンパ節の同定は、空間分解能が高く、放射性物質が不要であるという利点を有する。本発明の造影剤により、センチネルリンパ節を特異的に検出することができ、癌の転移等の診断に利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図１１】
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【図１４】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月15日(2009.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上限臨界溶液温度及び／又は下限臨界溶液温度を有する熱応答性高分子で磁性粒子を被覆した、平均粒子径が70〜10nmの熱応答性磁性体ナノ粒子を含み、下限臨界溶液温度が40℃以上であり、熱応答性高分子がアクリルアミド又はアクリルアミドの誘導体の重合体又は共重合体、あるいはポリアクリルアミドの誘導体を含有する高分子であり、磁性体ナノ粒子が酸化ニッケル粒子、フェライト粒子、マグネタイト粒子、コバルト鉄酸化物粒子、バリウムフェライト粒子、炭素鋼粒子、タングステン鋼粒子、KS鋼粒子、希土類コバルト磁石粒子及びヘマタイト粒子からなる群から選択される粒子である、MRI撮影に用いるための、センチネルリンパ節に高密度に集積するセンチネルリンパ節造影剤。
【国際調査報告】
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