【手続補正書】
【提出日】平成16年3月9日(2004.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ：
【化１】
2002535977.tif 000001
で示される化合物の、以下の式II：
【化２】
2002535977.tif 000002
（式中Rはアルカリ金属またはアンモニウムのイオンである）で示される基質化合物からの微生物学的製造方法であって、
(a)  式II化合物を6β位でヒドロキシル化することができる糸状カビMortierella maculata種の株を同化性の炭素および窒素源と鉱物塩を含む培地上で培養する、
(b)  変換対象の基質をMortierella maculataの生育した培養物に供給する、
(c)  基質を生物変換完了まで発酵させる、
(d)  式Ｉ化合物を培養液から分離する、および
(e)  式Ｉ化合物を単離する
という工程を含む製造方法。
【請求項２】
前記培地が栄養ブロスである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
式Ｉ化合物を培養液から分離する工程が陰イオン交換樹脂への吸着により行われる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
式Ｉ化合物を培養液から分離する工程が水不混和性の有機溶媒による抽出により、次いで中間物としてのそのラクトン誘導体または第2級アミン塩の分離により行われる、請求項2記載の方法。
【請求項５】
式Ｉ化合物を培養液から分離する工程が発酵液の有機溶媒抽出物から得られるアルカリ性水性抽出物の非イオン吸着樹脂クロマトグラフィーによる精製によって行われる、請求項2記載の方法。
【請求項６】
Mortierella maculata株がハンガリー／ブダペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに登録番号NCAIM(P)F 00126で預託されているMortierella maculata n.sp. E-97株である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
Mortierella maculata株がハンガリー／ブダペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに登録番号NCAIM(P)F 00127で預託されているMortierella maculata n.sp. E-97/15/13株である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
変換に使用される株のヒドロキシラーゼ酵素が8-デ-(2-メチル-ブチリル)コンパクチンまたはコンパクチンによって誘導される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
基質としての式II化合物が供給工程に沿って培養物に添加され、かつ供給工程が培養物のpHに依存し、その量は培養液容量の0.5〜1.0%であることを特徴とする、請求項2記載の方法。
【請求項１０】
発酵工程がグルコース、フルクトースおよびグリセリンからなる群より選択される炭素源を含む培地で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
発酵工程が大豆ミール、ペプトン、カゼイン、酵母エキスおよび食肉エキスからなる群より選択される窒素源を含む培地で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
生物変換時に形成される式Ｉ化合物が培養液から、培養ろ液および菌糸体洗浄水からの陰イオン交換樹脂への吸着、樹脂からの式Ｉ化合物の溶出、式Ｉ化合物のラクトン形態への完全な変換、ラクトン誘導体の単離、ラクトン誘導体の水酸化ナトリウムによる加水分解、および式Ｉ化合物の非イオン吸着樹脂上での脱塩によって分離されることを特徴とする、請求項2記載の方法。
【請求項１３】
陰イオン交換樹脂がポリスチレン−ジビニルベンゼン骨格を備える第4級アンモニウム活性基をもち、培養ろ液からの式Ｉ化合物の分離に使用される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
生物変換時に形成される式Ｉ化合物が、あらかじめpH 3.5〜3.7へと酸性化されている培養液から、または培養ろ液から、水不混和性の有機溶媒により酸形態で抽出される、請求項4記載の方法。
【請求項１５】
水不混和性の有機溶媒が酢酸エチルである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
水不混和性の有機溶媒が酢酸イソブチルである、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
式Ｉ化合物が有機溶媒から水酸化ナトリウム水溶液中にナトリウム塩形態で抽出されかつ非イオン吸着樹脂上で精製される、請求項5記載の方法。
【請求項１８】
式Ｉ化合物を、アルキル-、シクロアルキル-、アラルキル-またはアリール-置換基をもつ第2級アミンにより抽出物から結晶形態で沈殿させることを特徴とする、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
結晶体の第2級アミン塩を炭素原子数1〜4の酢酸アルキルエステルと水の混合液中に懸濁させ、その懸濁液に当量の水酸化ナトリウムを水溶液にして加えて有機物相と水性相が形成されるようにし、有機物相と水性相を分離させ、水性相を酢酸イソブチルで洗浄し次いで活性炭で清澄処理し、その水溶液を凍結乾燥させることを特徴とする、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
アルキルエステルがイソブチルエステルである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
結晶体の第2級アミン塩を炭素原子数1〜4のアルコールに懸濁させ、水酸化ナトリウムのエタノール溶液を加えることによりその懸濁液から式Ｉ化合物の溶液を調製し、その溶液からアセトンにより式Ｉ化合物を沈殿させることを特徴とする、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
炭素原子数1〜4のアルコールがエタノールである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
結晶体の第2級アミン塩を炭素原子数1〜4のアルカンカルボン酸の炭素原子数1〜4個のアルキルエステルと炭素原子数1〜4のアルコールとの混合液に溶解させ、水酸化ナトリウムを加えることによりその溶液から式Ｉ化合物を結晶形態で沈殿させることを特徴とする、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
混合液が酢酸エチル−エタノール混合液である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
プラバスタチンが発酵液から、酸形態の式Ｉ化合物ジベンジルアミン塩を経由して単離される、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
式Ｉ化合物の酸誘導体がそのジシクロヘキシルアミン塩を経由して精製される、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
式Ｉ化合物の酸誘導体がそのジオクチルアミン塩を経由して精製される、請求項19記載の方法。
【請求項２８】
式Ｉ化合物が、ゲルクロマトグラフィー使用のHPLCで測定して少なくとも99.5%の純度に精製される、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
Mortierella maculata株が25℃〜30℃で培養される、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
ハンガリー／ブダペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに登録番号NCAIM (P)F 001266で預託されているMortierella maculata n.sp.E-97株の生物学的純粋培養物。
【請求項３１】
ハンガリー／ブダペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに登録番号NCAIM (P)F 001267で預託されているMortierella maculata n.sp.E-97/15/13株の生物学的純粋培養物。
【請求項３２】
以下の式II：
【化３】
2002535977.tif 000003
（式中Rはアルカリ金属またはアンモニウムのイオンである）で示される化合物を6β位でヒドロキシル化することができるMortierella菌株であって、本質的にハンガリー／ブダペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに登録番号NCAIM (P)F 001266で預託されているMortierella maculata n.sp.E-97の新規株からなる菌株。
【請求項３３】
以下の式II：
【化４】
2002535977.tif 000004
（式中Rはアルカリ金属またはアンモニウムのイオンである）で示される化合物を6β位でヒドロキシル化することができるMortierella菌株であって、本質的にハンガリー／ブダペストのNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganismsに登録番号NCAIM (P)F 001267で預託されているMortierella maculata n.sp.E-97/15/13の新規株からなる菌株。
【請求項３４】
結晶形態におけるプラバスタチンのナトリウム塩。
【請求項３５】
その融点が、170℃〜173℃の範囲内にある、請求項34に記載のプラバスタチンのナトリウム塩。
【請求項３６】
結晶形態にあるプラバスタチンのナトリウム塩の製造方法であって、以下の工程：
a)  低級脂肪族アルコール中にプラバスタチンとナトリウム・カチオンを含有する溶液を用意し；
b)  上記溶液に酢酸エチルを添加し；
c)  上記溶液からプラバスタチンのナトリウム塩を結晶化させる、
を含む方法。
【請求項３７】
前記低級脂肪族アルコールが、エタノールである、請求項36に記載の方法。