(57)【要約】  本発明によれば、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組換え体DNA、該組換え体DNAで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のDNA。
［１］請求項１記載の蛋白質をコードするDNA
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするDNA
【請求項３】
請求項２記載のDNAを含有する組換え体DNA。
【請求項４】
請求項３記載の組換え体DNAを有する形質転換体。
【請求項５】
形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
微生物がエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する、請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項８】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項７記載の製造法。
【請求項９】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、または請求項１記載の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する、ジペプチドの製造法。
【請求項１０】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項９記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
L-アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性を有する蛋白質としては、バチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素（特許文献１参照）、ストレプトマイセス・アルボラス（Streptomyce salbulus）由来のジケトピペラジン合成酵素（特許文献２参照）およびラルストニア・ソラナセラム（Ralstonia solanacearum）由来の蛋白質（特許文献３参照）が知られている。【０００３】
しかしながら、上記酵素の基質特異性に起因し、生成効率が十分でないジペプチドもあるため、該酵素とは基質特異性が異なる新たなジペプチド合成酵素が求められている。
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)UA159株、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae) ATCC BAA-334株、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）ATCC27088株、フォトラブズス・ルミネセンス(Photrhabdus luminescens)DSM15139株およびトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)ATCC35405株の染色体DNAの塩基配列はいずれも公知であり、それぞれの染色体DNAについてORFが推定されている（非特許文献３〜７参照）。しかしながら、ストレプトコッカス・ミュータンスのSMU1321c、ストレプトコッカス・ニューモニエのSP0885、アクチノバシラス・プルロニューモニエのAple02000835、フォトラブズス・ルミネセンスのPlu1218およびトレポネーマ・デンティコラのTDE2209にコードされる蛋白質の機能およびこれらのORFが実際に機能を有する蛋白質をコードしているか否かについては知られていない。
【特許文献１】国際公開第2004/058960号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2005/103260号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2006/101023号パンフレット
【非特許文献１】J. Ind. Microbiol., 2, 201-208 (1987)
【非特許文献２】Enzyme. Microbial. Technol., 29, 400-406 (2001)
【非特許文献３】http://gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php?spid=Smut_UA159
【非特許文献４】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=5281
【非特許文献５】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=5199
【非特許文献６】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=347
【非特許文献７】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=381
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組換え体DNA、該組換え体DNAで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、およびジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（２）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のDNA。
［１］上記（１）の蛋白質をコードするDNA
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するDNA
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするDNA
（３）上記（２）のDNAを含有する組換え体DNA。【０００６】
（４）上記（３）の組換え体DNAを有する形質転換体。
（５）形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、上記（４）の形質転換体。
（６）微生物がエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である、上記（５）の形質転換体。【０００７】
（７）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する、上記（１）の蛋白質の製造法。
（８）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（４）〜（６）のいずれか１つの形質転換体である、上記（７）の製造法。【０００８】
（９）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記（１）の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する、ジペプチドの製造法。
（１０）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記（４）〜（６）のいずれか１つの形質転換体である、上記（９）の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いてジペプチドを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、および
［３］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。【００１１】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(1989),Third Edition(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press（以下、モレキュラー・クローニング第２版、第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００１２】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００１３】
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号1〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００１４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がジペプチド合成活性を有するためには、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。【００１５】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。【００１６】
また、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。アミノ酸配列の相同性は、上記したようにBLASTやFASTAを用いて決定することができる。【００１７】
本発明の蛋白質が、ジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばDNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、１種以上のアミノ酸、好ましくはL-アミノ酸およびグリシンから選ばれる２種のアミノ酸、およびATPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをHPLC等により分析する方法をあげることができる。
２．本発明のDNA
本発明のDNAとしては、
［１］上記１の［１］〜［３］の本発明の蛋白質をコードするDNA、
［２］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するDNA、および
［３］配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするDNA、
をあげることができる。【００１８】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いるDNAとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のDNAをあげることができ、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いられるDNAとしては少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のDNAをあげることができる。【００１９】
DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。【００２０】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmo/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００２１】
ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより、上記した様々な条件を設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記したいずれかのDNAの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAをあげることができる。【００２２】
塩基配列の相同性は、上記したBLASTまたはFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。
上記したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするDNAであることは、該DNAを発現する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、並びに１種以上のアミノ酸、好ましくはL-アミノ酸およびグリシンから選ばれる２種のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
３．本発明の製造法で用いられる微生物および本発明の形質転換体  
本発明の製造法に用いられる微生物は、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物であればいずれでもよいが、該微生物としては、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、アクチノバシラス(Actinobacillus)属、フォトラブズス(Photorhabdus)属、またはトレポネーマ(Treponema)属に属する微生物をあげることができ、より好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、アクチノバシラス・プルロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)、フォトラブズス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)およびトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)をあげることができ、さらに好ましくは配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有するストレプトコッカス・ミュータンスATCC25175株、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有するストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-334株、配列番号３で表される蛋白質を生産する能力を有するアクチノバシラス・プルロニューモニエATCC27088株、配列番号４で表される蛋白質を生産する能力を有するフォトラブズス・ルミネセンスDSM15139株および配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する能力を有するトレポネーマ・デンティコラATCC35405株をあげることができる。【００２３】
本発明の形質転換体としては、上記２のDNAを含む組換え体DNAを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができ、宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは細菌、より好ましくは原核細胞、さらに好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物をあげることができる。
４．本発明のDNAの調製
本発明のDNAは、例えば、配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブまたはプライマーＤＮＡを用いた微生物の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションまたは微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press(1990)]により取得することができる。
上記のサザンハイブリダイゼーションの染色体ＤＮＡライブラリーまたはＰＣＲの鋳型としては、
（１）配列番号６で表される塩基配列を有するDNAを取得するためには、ストレプトコッカス属に属する微生物、好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスに属する微生物、より好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスATCC25175、
（２）配列番号７で表される塩基配列を有するDNAを取得するためには、ストレプトコッカス属に属する微生物、好ましくはストレプトコッカス・ニューモニエに属する微生物、より好ましくはストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-334、
（３）配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡを取得するためには、アクチノバシラス属に属する微生物、好ましくはアクチノバシラス・プルロニューモニエに属する微生物、より好ましくはアクチノバシラス・プルロニューモニエATCC27088、
（４）配列番号９で表される塩基配列を有するDNAを取得するためには、フォトラブズス属に属する微生物、好ましくはフォトラブズス・ルミネセンスに属する微生物、より好ましくはフォトラブズス・ルミネセンスDSM15139、および
（５）配列番号１０で表される塩基配列を有するDNAを取得するためには、トレポネーマ属に属する微生物、好ましくはトレポネーマ・デンティコラに属する微生物、より好ましくはトレポネーマ・デンティコラATCC35405の染色体ＤＮＡを用いることができる。【００２４】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号1〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体DNA、cDNAライブラリー等から上記した方法により本発明のDNA、または本発明の製造法に用いられるDNAを取得することもできる。【００２５】
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。【００２６】
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、アプライドバイオシステムズ社製Applied Biosystems 3400 DNA合成機等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。【００２７】
上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するDNAをあげることができる。
本発明のDNAを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００２８】
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリDH1、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリNo.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリNM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。【００２９】
組換え体DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を有するDNAを含有する組換え体DNAを保有する微生物であるEscherichia coli BL21(DE3)/pSMU1321c、BL21(DE3)/pSP0885、BL21(DE3)/pAple0835、BL21(DE3)/pPlu1218およびBL21(DE3)/pTDE2209をあげることができる。
５．本発明の形質転換体の製造法
本発明のDNAをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。【００３０】
該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。【００３１】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００３２】
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。【００３３】
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００３４】
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。【００３５】
本発明のDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体DNAとしては、例えばpSMU1321c、pSP0885、pAple0835、pPlu1218およびpTDE2209をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Serratia）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス属（Alicyclobacillus）、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum） ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.） ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができる。【００３６】
組換え体DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）等を用いることができる。【００３７】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイミセス（Schwanniomyces）属、ピチア（Pichia）属、またはキャンディダ（Candida）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）等をあげることができる。【００３８】
組換え体DNAの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチウム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。【００３９】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００４０】
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはナマルバ KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。【００４１】
組換え体DNAの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。【００４２】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。【００４３】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393(Orbigen社製)、pBlueBacIII（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。【００４４】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。【００４５】
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Bombyx mori） N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等をあげることができる。【００４６】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００４７】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる方法（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
６．本発明の蛋白質の製造法
上記３の微生物または形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００４８】
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞を宿主として本発明の蛋白質を発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。【００４９】
上記微生物または形質転換体を培地に培養する方法は、微生物または上記宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
上記３の微生物、エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００５０】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００５１】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜11.0に、好ましくは5.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００５２】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００５３】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle）のMEM培地[Science, 122, 501 (1952)]、DMEM培地[Virology, 8, 396 (1959)]、199培地[Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【００５４】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace's Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。【００５５】
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００５６】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。【００５７】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００５８】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００５９】
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。【００６０】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００６１】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００６２】
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００６３】
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００６４】
また、本発明の蛋白質をFlagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Flag抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。【００６５】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明のジペプチドの製造法
上記３の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記１の本発明の蛋白質と１種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用いられる１または２種のアミノ酸としては、L-アミノ酸、グリシン（Gly）およびβ−アラニン（β-Ala）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばL-アラニン（L-Ala）、L-グルタミン（L-Gln）、L-グルタミン酸（L-Glu）、L-バリン（L-Val）、L-ロイシン（L-Leu）、L-イソロイシン（L-Ile）、L-プロリン（L-Pro）、L-フェニルアラニン（L-Phe）、L-トリプトファン（L-Trp）、L-メチオニン（L-Met）、L-セリン（L-Ser）、L-スレオニン（L-Thr）、L-システイン（L-Cys）、L-アスパラギン（L-Asn）、L-チロシン（L-Tyr）、L-リジン（L-Lys）、L-アルギニン（L-Arg）、L-ヒスチジン（L-His）、L-アスパラギン（L-Asp）、L-オルニチン（L-Orn）およびL-シトルリン（L-Cit）をあげることができる。【００６６】
上記製造法に用いられる好ましいアミノ酸としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記H群のアミノ酸の組み合わせ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記I群のアミノ酸の組み合わせ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記J群のアミノ酸の組み合わせ、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記K群のアミノ酸の組み合わせ、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記L群のアミノ酸の組み合わせをあげることができる。【００６７】
H群：L-Phe、L-Tyr、L-TrpおよびL-Hisより選ばれる1種のアミノ酸と、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸の組み合わせ、並びにL-LeuとL-Cysの組み合わせ、好ましくはL-PheとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-TyrとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-HisとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Met、L-Pro、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、並びにL-CysとL-Leuとの組み合わせ、より好ましくはL-PheとL-Val、L-Leu、L-Ile、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ
I群：L-Phe、L-TyrおよびL-Trpより選ばれる1種のアミノ酸とL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-LeuとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-ArgおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、並びにL-ProとL-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、好ましくはL-PheとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-His、L-Lys、L-ArgおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-LeuとL-Ala、L-Ser、L-ThrおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、並びにL-ProとL-Hisとの組み合わせ、より好ましくはL-PheまたはL-Trpと、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、並びにL-ProとL-Hisとの組み合わせ
J群：L-Leu、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-TrpおよびL-Hisより選ばれる1種のアミノ酸とL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、並びにL-Lys、L-HisおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とL-Cysとの組み合わせ、好ましくはL-LeuとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、L-MetとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、L-PheまたはL-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-TyrとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-His、L-Lys、L-Argおよび Glyより選ばれる１種のアミノ酸との組み合わせ、並びにL-HisとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、より好ましくはL-PheまたはL-TyrとL-Val、L-LeuおよびL-Ileより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ
K群：L-Phe、L-TrpまたはL-TyrとL-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-AspおよびL-Glnより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、並びにL-GlnとL-Phe、L-Trp、L-Tyr、L-Glu、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、好ましくはL-GlnとL-Phe、L-Trp、L-TyrおよびL-Gluより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、より好ましくはL-PheまたはL-Tyrと、L-Glnとの組み合わせ、並びにL-GluとL-Glnとの組み合わせ
L群：GlyまたはL-AlaとL-Met、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trpより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-SerとL-GlnまたはL-Ornとの組み合わせ、L-ThrとL-Glu、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Citおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-CysとL-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Argおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-GluとL-Val、L-LeuおよびL-Ileより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-IleとL-Phe、L-Tyr、L-TrpおよびL-Citより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-ProとL-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Citおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-Phe、L-TyrまたはL-TrpとL-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Gln、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、L-GlnとL-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、β-Alaのみ、並びにL-Citのみ、好ましくはGlyまたはL-AlaとL-Proとの組み合わせ、L-CysとL-Gluとの組み合わせ、並びにL-ProとL-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ、より好ましくはL-Proと、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸との組み合わせ
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。【００６８】
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源としてATPを用いることができ、ATPは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。【００６９】
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp 、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyおよびβ-Alaから選ばれる１種または２種のアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記M群のジペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記N群のジペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記O群のジペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記P群のジペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は下記Q群のジペプチドの、１種または２種のアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチドをあげることができる。【００７０】
M群：L-Phe、L-Tyr、L-TrpおよびL-Hisより選ばれる1種のアミノ酸と、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-LeuとL-Cysとからなるジペプチド、好ましくはL-PheとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-TyrとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-CysおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-HisとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Met、L-Pro、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-CysとL-Leuとからなるジペプチド、より好ましくはL-PheとL-Val、L-Leu、L-Ile、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド
N群：L-Phe、L-TyrおよびL-Trpより選ばれる1種のアミノ酸とL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-LeuとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-ArgおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-ProとL-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、好ましくはL-PheとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-His、L-Lys、L-ArgおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-LeuとL-Ala、L-Ser、L-ThrおよびGlyより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-ProとL-Hisとからなるジペプチド、より好ましくはL-PheまたはL-Trpと、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-ProとL-Hisとからなるジペプチド
O群：L-Leu、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-TrpおよびL-Hisより選ばれる1種のアミノ酸とL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-Lys、L-HisおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とL-Cysとからなるジペプチド、好ましくはL-LeuとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる１種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-MetとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる１種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-PheまたはL-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-TyrとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-His、L-Lys、L-Argおよび Glyより選ばれる１種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-HisとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Glyおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、より好ましくはL-PheまたはL-TyrとL-Val、L-LeuおよびL-Ileより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド
P群：L-Phe、L-TrpまたはL-TyrとL-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-AspおよびL-Glnより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、並びにL-GlnとL-Phe、L-Trp、L-Tyr、L-Glu、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、好ましくはL-GlnとL-Phe、L-Trp、L-TyrおよびL-Gluより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、より好ましくはL-PheまたはL-Tyrと、L-Glnとからなるジペプチド、並びにL-GluとL-Glnとからなるジペプチド
Q群：GlyまたはL-AlaとL-Met、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trpより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-SerとL-GlnまたはL-Ornとからなるジペプチド、L-ThrとL-Glu、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Citおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-CysとL-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Argおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-GluとL-Val、L-LeuおよびL-Ileより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-IleとL-Phe、L-Tyr、L-TrpおよびL-Citより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-ProとL-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Citおよびβ-Alaより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-Phe、L-TyrおよびL-Trpより選ばれる１種のアミノ酸とL-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Gln、L-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、L-GlnとL-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、β-Alaのみからなるジペプチド、並びにL-Citのみからなるジペプチド、好ましくはGlyまたはL-AlaとL-Proとからなるジペプチド、L-CysとL-Gluとからなるジペプチド、並びにL-ProとL-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド、より好ましくはL-ProとL-His、L-LysおよびL-Argより選ばれる1種のアミノ酸とからなるジペプチド
（２）微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養物としては、該微生物または形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該微生物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。【００７１】
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（１）と同様のアミノ酸をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。【００７２】
基質として用いるアミノ酸は、上記（１）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（１）と同様、ATPを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。【００７３】
また上記製造法においては、必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ガラクトース含有複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常0. 1〜50 g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられる。【００７４】
ジペプチドの生成反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、上記（１）と同様のジペプチドをあげることができる。
上記（１）および（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。【００７５】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７６】
ジペプチド合成酵素発現株の造成
（１）ストレプトコッカス・ミュータンス ATCC25175株由来ジペプチド合成酵素発現株の造成
ストレプトコッカス・ミュータンスATCC25175株の染色体DNAより、配列番号６で表される塩基配列を有するDNA断片を以下のようにして取得した。【００７７】
ストレプトコッカス・ミュータンスATCC25175株をBL寒天培地[58g/l BL寒天培地（日水製薬社製）、直径8.5cmシャーレを３枚使用]に塗布して30℃で二晩静置培養した。３枚のシャーレ上に生育した菌体を、ディスポーサブルエーゼを用いて3mlの滅菌脱イオン水に懸濁し、遠心分離により集菌した菌体からUltraClean(TM) Microbial DNA Isolation Kit（エムオーバイオラボラトリーズ社製）を用いて染色体DNAを調製した。【００７８】
配列番号１１および１２で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、鋳型としてストレプトコッカス・ミュータンスATCC25175株の染色体DNAを用いてPCRを行った。PCRは、0.1μgの染色体DNA、0.3μmol/lの各プライマー、1 unitsのKOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）、5μLのKOD plus DNAポリメラーゼ用×10緩衝液（東洋紡社製）、各200μmol/lのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）、1mmol/l のMgSO4を含む反応液50μLを調製し、94℃で2分間加温した後、94℃で15秒間、55℃で30秒間、68℃で1分40秒間の工程を30回繰り返し、さらに68℃で2分間加温することにより行った。【００７９】
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、約1.2kbのDNA断片が増幅していることを確認した。残りの反応液からPureLink(TM) PCR Purification kit（インビトロジェン社製）を用いて該DNA断片を精製し、50μlの滅菌超純水に溶解した。
次に、上記で得られたDNA溶液10μlを用い、該DNA断片を制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断した後アガロースゲル電気泳動を行い、PureLink(TM) PCR Purification kitを用いて、約1.2kbのDNA断片を回収した。【００８０】
発現ベクターpColdI（タカラバイオ社製）0.5μgを制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行って制限酵素による切断を確認した後、上記と同様の方法により約4.4kbのDNA断片を回収した。
上記で得られた約1.2kbのDNA断片および約4.4kbのDNA断片を、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて16℃で4時間反応させ組換え体ＤＮＡを取得した。【００８１】
該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（東洋紡社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)］によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーを、PCR反応溶液[0.4μmol/lの配列番号１２で表される塩基配列を有する合成DNA、0.4μmol/lのpCold-F Primer(タカラバイオ社製)、1unitのZ-taq（タカラバイオ社製）、2μlの10xZ-taq Buffer（タカラバイオ社製）、各200μmol/lのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）]に懸濁し、PCRを行った。PCTは、96℃で2分間加温した後、96℃で10秒間、50℃で10秒間、72℃で50秒間の工程を30回繰り返し、さらに72℃で5分間加温することにより行った。アガロースゲル電気泳動により、約1.2kbのDNA断片が増幅されていることを確認した。【００８２】
該DNA断片の塩基配列を公知の方法で決定し、配列番号６で表される塩基配列を有することを確認した。
上記により、該形質転換体が、pColdIのcspAプロモーター下流に配列番号６で表される塩基配列を有する約1.2kbのDNA断片が連結されているプラスミドを保持していることを確認した。【００８３】
該形質転換株を100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）によりプラスミドを調製し、得られたプラスミドをpSMU1321cと命名した。
pSMU1321cを用いてエシェリヒア・コリ BL21(DE3)株（ノバジェン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【００８４】
該形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pSMU1321cと命名した。
（２）ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-334由来ジペプチド合成酵素発現株の取得
ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-334株の染色体DNAより、配列番号７で表される塩基配列を有するDNA断片を以下のようにして取得した。【００８５】
配列番号１３および１４で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-334株の染色体DNA（American Type Culture Collection(以下ATCCと略す)より購入可能）を鋳型としてPCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の組成の反応液を調製し、同様の反応条件で行った。
アガロースゲル電気泳動により約1.2kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、反応液からPureLink(TM) PCR Purification kitを用いて該DNA断片を精製し、50μlの滅菌超純水に溶解した。【００８６】
次に、上記で得られたDNA溶液10μlを用い、該DNA断片をEcoRIおよびHindIIIで切断した後アガロースゲル電気泳動を行い、PureLink(TM) PCR Purification kitを用いて、約1.2kbのDNA断片を回収した。
pColdI 0.5μgをEcoRIおよびHindIIIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行って制限酵素による切断を確認した後、上記と同様の方法により約4.4kbのDNA断片を回収した。【００８７】
上記で得られた約1.2kbのDNA断片および約4.4kbのDNA断片を、ライゲーションキットを用いて16℃で4時間反応させ組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養した。【００８８】
生育してきた形質転換体のコロニーを、PCR反応溶液[0.4μmol/lの配列番号１４で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡ、0.4μmol/lのpCold-F Primer、1unitのZ-taq、2μlの10xZ-taq Buffer、200μmol/lのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）]に懸濁し、（１）と同様の条件でPCR反応を行い、アガロースゲル電気泳動により、約1.2kbのDNA断片が増幅されていることを確認した。【００８９】
該DNA断片の塩基配列を公知の方法で決定し、配列番号７で表される塩基配列を有することを確認した。
上記により、該形質転換体が、pColdIのcspAプロモーター下流に、配列番号７で表される塩基配列を有する約1.2kbのDNA断片が連結されているプラスミドを保持していることを確認した。【００９０】
該形質転換株を100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、得られたプラスミドをpSP0885と命名した。
pSP0885を用いてエシェリヒア・コリ BL21(DE3)株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【００９１】
該形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pSP0885と命名した。
（３）アクチノバシラス・プルロニューモニエATCC 27088株由来ジペプチド合成酵素発現株の取得
アクチノバシラス・プルロニューモニエATCC 27088株の染色体DNA（ATCCより購入可能）より、配列番号８で表される塩基配列を有するDNA断片を以下のようにして取得した。【００９２】
配列番号１５および１６で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、アクチノバシラス・プルロニューモニエATCC 27088株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の組成の反応液を調製し、同様の反応条件で行った。
アガロースゲル電気泳動により約1.2kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、反応液からPureLink(TM) PCR Purification kitを用いて該DNA断片を精製し、50μlの滅菌超純水に溶解した。【００９３】
次に、上記で得られたDNA溶液10μlを用い、該DNA断片をBamHIおよびHindIIIで切断した後アガロースゲル電気泳動を行い、PureLink(TM) PCR Purification kitを用いて、約1.2kbのDNA断片を回収した。
pColdI 0.5μgをBamHIおよびHindIIIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行って制限酵素による切断を確認した後、上記と同様の方法により約4.4kbのDNA断片を回収した。【００９４】
上記で得られた約1.2kbのDNA断片および約4.4kbのDNA断片を、ライゲーションキットを用いて16℃で4時間反応させ組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養した。【００９５】
生育してきた形質転換体のコロニーを、PCR反応溶液[0.4μmol/lの配列番号１６で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡ、0.4μmol/lのpCold-F Primer、1unitのZ-taq、2μlの10xZ-taq Buffer、200μmol/lのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）]に懸濁し、（１）と同様の条件でPCR反応を行い、アガロースゲル電気泳動により、約1.2kbのDNA断片が増幅されていることを確認した。【００９６】
該DNA断片の塩基配列を公知の方法で決定し、配列番号８で表される塩基配列を有することを確認した。
上記により、該形質転換体が、pColdIのcspAプロモーター下流に配列番号８で表される塩基配列を有する約1.2kbのDNA断片が連結されているプラスミドを保持していることを確認した。【００９７】
該形質転換株を100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、得られたプラスミドをpAple0835と命名した。
pAple0835を用いてエシェリヒア・コリ BL21(DE3)株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【００９８】
該形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pAple0835と命名した。
（４）フォトラブズス・ルミネセンスDSM15139株由来ジペプチド合成酵素発現株の取得
フォトラブズス・ルミネセンスDSM15139株（DSM: Deutsche Sammlung von Microorganism und Zellkulturen GmbHより購入可能）の染色体DNAより、配列番号９で表される塩基配列を有するDNA断片を以下のようにして取得した。【００９９】
まず、フォトラブズス・ルミネセンスDSM15139株より、（１）と同様の方法で、染色体DNAを調製した。
配列番号１７および１８で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、フォトラブズス・ルミネセンスDSM15139株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の組成の反応液を調製し、同様の反応条件で行った。【０１００】
アガロースゲル電気泳動により約1.5kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、反応液からPureLink(TM) PCR Purification kitを用いて該DNA断片を精製し、50μlの滅菌超純水に溶解した。
次に、上記で得られたDNA溶液10μlを用い、該DNA断片をBamHIおよびHindIIIで切断した後アガロースゲル電気泳動を行い、PureLink(TM) PCR Purification kitを用いて、約1.5kbのDNA断片を回収した。【０１０１】
pColdI 0.5μgをBamHIおよびHindIIIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行って制限酵素による切断を確認した後、上記と同様の方法により約4.4kbのDNA断片を回収した。
上記で得られた約1.5kbのDNA断片および約4.4kbのDNA断片を、ライゲーションキットを用いて16℃で4時間反応させ組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養した。【０１０２】
生育してきた形質転換体のコロニーを、PCR反応溶液[0.4μmol/lの配列番号１８で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡ、0.4μmol/lのpCold-F Primer、1unitのZ-taq、2μlの10xZ-taq Buffer、200μmol/lのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）]に懸濁し、（１）と同様の条件でPCR反応を行い、アガロースゲル電気泳動により、約1.5kbのDNA断片が増幅されていることを確認した。【０１０３】
該DNA断片の塩基配列を公知の方法で決定し、配列番号９で表される塩基配列を有することを確認した。
上記により、該形質転換体が、pColdIのcspAプロモーター下流に約1.5kbのDNA断片が連結されているプラスミドを保持していることを確認した。
該形質転換株を100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、得られたプラスミドをpPlu1218と命名した。【０１０４】
pPlu1218を用いてエシェリヒア・コリ BL21(DE3)株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
該形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pPlu1218と命名した。
（５）トレポネーマ・デンティコラATCC 35405株由来ジペプチド合成酵素発現株の造成
トレポネーマ・デンティコラATCC 35405の染色体DNAより、配列番号１０で表される塩基配列を有するDNA断片を以下のようにして取得した。【０１０５】
配列番号１９および２０で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、鋳型としてトレポネーマ・デンティコラATCC 35405株の染色体DNA（ATCCより購入可能）を用いてPCRを行った。PCRは、（１）と同様の組成の反応液を調製し、（１）と同様の反応条件で行った。
アガロースゲル電気泳動により約1.6kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、反応液から該DNA断片を回収し、50μlの滅菌超純水に溶解した。【０１０６】
次に、上記で得られたDNA溶液10μlを用い、該DNA断片をBamHIおよびHindIIIで切断した後アガロースゲル電気泳動を行い、（１）と同様に1.6kbのDNA断片を回収した。
pColdI 0.5μgをBamHIおよびHindIIIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行って制限酵素による切断を確認した後、上記と同様の方法により約4.4kbのDNA断片を回収した。
上記で得られた約1.6kbのDNA断片および約4.4kbのDNA断片を、ライゲーションキットを用いて16℃で4時間反応させ組換え体ＤＮＡを取得した。【０１０７】
該組換え体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーを、PCR反応溶液[0.4μmol/lの配列番号２０で表される塩基配列を有する合成DNA、0.4μmol/lのpCold-F Primer、1unitのZ-taq、2μlの10xZ-taq Buffer、各200μmol/lのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）]に懸濁し（１）と同様の条件でPCR反応を行い、アガロースゲル電気泳動により、約1.2kbのDNA断片が増幅されていることを確認した。【０１０８】
該DNA断片の塩基配列を公知の方法で決定し、配列番号１０で表される塩基配列を有することを確認した。
上記により、該形質転換体が、pColdIのcspAプロモーター下流に約1.6kbのDNA断片が連結されているプラスミドを保持していることを確認した。
該形質転換株を100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製し、得られたプラスミドをpTDE2209と命名した。【０１０９】
pTDE2209を用いてエシェリヒア・コリ BL21(DE3)株（ノバジェン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
該形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pTDE2209と命名した。
【実施例２】
【０１１０】
ジペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例１で得られたエシェリヒア・コリ BL21(DE3)/pSMU1321c、BL21(DE3)/pSP0885、BL21(DE3)/ pAple0835、BL21(DE3)/ pPlu1218、BL21(DE3)/ pTDE2209をそれぞれ100μg/mlのアンピシリンを含む10mlのＬＢ培地が入った試験管に接種し、30℃で一晩振盪培養した。得られた培養液のうち500μlを、それぞれ100μg/mlのアンピシリンを含む50mLのＬＢ培地が入った200ml三角フラスコに接種した。30℃で3時間振盪培養した後、終濃度が0.4mmol/lになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)を各フラスコに添加し、さらに15℃で一晩振盪培養した。該培養液を遠心分離し、菌体を取得した。【０１１１】
該湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、HisTrap（アマシャム社製）を用いてHisタグが付加した蛋白質を精製した。
【実施例３】
【０１１２】
Hisタグ付加蛋白質を用いたジペプチドの生産
（１）ストレプトコッカス・ミュータンス由来ジペプチド合成酵素を用いたジペプチド生産
実施例２で、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pSMU1321cを用いて得られたHisタグ付加蛋白質を100μg/l、100mmol/lのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、20mmol/lの硫酸マグネシウム、20mmol/lのATP、それぞれ20mmol/l のL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp 、Gly、β-AlaおよびL-Citから選ばれる２種のアミノ酸または40mmol/lのL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp 、Gly、β-AlaおよびL-Citから選ばれる１種のアミノ酸からなる反応液を調製し、30℃で24時間反応を行った。反応終了後、反応液中に遊離したリン酸量をデタミナーL IP（協和メデックス社製）を用いた定量、CE/MS（Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry)分析およびFMOC(fluorenylmethyl chloroformate)誘導化反応を利用したHPLC分析の３種の方法で生成物の分析を行った。【０１１３】
CE-MS分析は、Agilent CE /MS system (アジレントテクノロジーズ社製)を測定装置として用いた。キャピラリー電気泳動には、長さ100cm、内径50μmの石英ガラス製キャピラリーを用い、1 mol/l のギ酸を緩衝液とし、20℃、電圧30kV の条件で電気泳動した。
質量分析は、キャピラリー電圧を3500Vとし、300℃の窒素ガスを乾燥ガスとして用いた。5 mmol/l の酢酸アンモニウム（50%メタノールに溶解）をシース液として流速を10μl/minとし、70から500までの分子量を検出する条件で分析した。【０１１４】
FMOC誘導体化は、反応液1μlに49μlの0.1mol/lホウ酸緩衝液（水酸化ナトリウムでpH9.0に調整）を加えて混合した後、50μlの1.5mg/mlのFMOCアセトン溶液を加え、室温にて30分間反応させることに行った。反応終了後、反応液に500μlの25％（v/v）アセトニトリル溶液（20 mmol/lのL-プロリン、pH8.0の0.25mol/lのホウ酸緩衝液）を加えてHPLC分析の試料とした。HPLC分析は、基本的に以下の条件で行ったが、検出するジペプチドに応じて適宜、下記の溶液ＡのpHや濃度勾配スケジュールを多少変更した。【０１１５】
分離カラムは、Develosil ODS-HG-5（野村化学社製）を使用し、カラム温度は40℃、流速は1.0ml/分とした。
移動層は、溶液Ａ［20mmol/l リン酸水素アンモニウム溶液（アンモニア水でpH5.0に調整）：メタノール＝85：15］および溶液Ｂ（アセトニトリル：水＝9：1）を用い、分析開始から2分までは、溶液Ａ：溶液Ｂ＝75：25、2から21分までは、21分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝55：45になるように直線的に溶液Ｂの割合を増やし、21から36分までは36分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝45：55になるように直線的に溶液Ｂの割合を増やし、36から37分までは37分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝1：99になるように直線的に溶液Ｂの割合を増やし、37から39分までは溶液Ａ：溶液Ｂ＝1：99で保持し、39から44分までは44分になったときに溶液Ａ：溶液Ｂ＝72：25になるように直線的に溶液Ｂの割合を減少させ、44から50分までは溶液Ａ：溶液Ｂ＝75：25とした。【０１１６】
ジペプチドの検出は、254nmの励起光による、606nmの発光を検出することにより行った。
その結果、遊離したリン酸の定量による方法では、
（ａ）L-PheとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｂ）L-TyrとL-Ala，L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Pro、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｃ）L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｄ）L-HisとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Met、L-Pro、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、および
（ｅ）L-LeuとL-Cysが結合したジペプチド、
が生成したことがわかった。【０１１７】
また、CE-MS分析では、
（ｆ）L-PheとL-Ala、L-Cys、L-Val、L-Met、L-Phe、L-Trp、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｇ）L-TyrとL-CysまたはGlyが結合したジペプチド、
（ｈ）L-TrpとL-Ala、L-Cys、L-Leu、L-Met、L-Hisまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｉ）L-HisとL-Ala、L-Ser、L-Cys、L-Met、L-Pro、L-Gln、L-His、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチドおよび
（ｊ）L-LeuとL-Cysが結合したジペプチド、
が生成したことがわかった。【０１１８】
さらに、HPLC分析では、19.6μmol/lのL-Phe-L-Valおよび３１．５μmol/lのL-Phe-L-Argが生成したことがわかった。
（２）ストレプトコッカス・ニューモニエ由来ジペプチド合成酵素を用いたジペプチド生産
実施例２で、BL21(DE3)/pSP0885を用いて得られたHisタグ付加蛋白質を用いて、（１）と同様の条件でジペプチド生成反応を行った。【０１１９】
その結果、遊離したリン酸の定量による方法では、
（ａ）L-PheとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｂ）L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｃ）L-LeuとＬ-Ser、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-HisまたはGlyが結合したジペプチド、
（ｄ）L-TyrとL-Asn、L-GlnまたはL-Hisが結合したジペプチドおよび、
（ｅ）L-HisとL-Proが結合したジペプチド、
が生成したことがわかった。【０１２０】
また、CE-MS分析では、
（ｆ）L-PheとL-Cys、L-Phe、L-His、L-ArgまたはGlyが結合したジペプチド、
（ｇ）L-TrpとL-Ala、L-Cys、L-Arg、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｈ）L-LeuとGlyが結合したジペプチド、および
（ｉ）L-HisとL-Proが結合したジペプチド、
が生成したことがわかった。【０１２１】
さらに、HPLC分析では、0.12μmol/lのL-Pro-L-Hisおよび1.24μmol/lのL-Phe-L-Argが生成したことがわかった。
（３）アクチノバシラス・プルロニューモニエ由来ジペプチド合成酵素を用いたジペプチド生産
実施例２で、BL21(DE3)/ pAple0835を用いて得られたHisタグ付加蛋白質を用いて、（１）と同様の条件でジペプチド生成反応を行った。【０１２２】
その結果、遊離したリン酸の定量による方法では、
（ａ）L-LeuとL-Ser、L-Cys、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｂ）L-MetとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｃ）L-PheとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｄ）L-TyrとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Pro、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｅ）L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Ile、L-Pro、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｆ）L-HisとL-Ala、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Val、L-Pro、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Orn、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチドおよび
（ｇ）L-LysとL-Cysが結合したジペプチド、
が生成したことがわかった。【０１２３】
また、CE-MS分析では、
（ｈ）L-LeuとL-Cys、L-Met、L-Trp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｉ）L-MetとL-Cys、L-Val、Ｌ−Ｉｌｅ、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Gln、L-His、L-Arg、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｊ）L-PheとL-Ala、L-Ser、L-Cys、L-Val、L-Ile、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、Ｌ−Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Ｇｌｙまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｋ）L-TyrとL-Ala、L-Cys、L-ArgまたはGlyが結合したジペプチド、
（ｌ）L-TrpとL-Ala、L-Ser、L-Cys、L-Val、L-Ile、L-Trp、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Arg、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｍ）L-HisとL-Ala、L-Ser、L-Cys、L-Val、L-Asn、L-Gln、L-His、L-Lys、L-Arg、L-Cit、Glyまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
が生成したことがわかった。【０１２４】
さらに、HPLC分析では、92.5μmol/lのL-Phe-L-Valが生成したことがわかった。
（４）フォトラブズス・ルミネセンス由来ジペプチド合成酵素を用いたジペプチド生産
実施例２で、BL21(DE3)/pPlu1218を用いて得られたHisタグ付加蛋白質を用いて、（１）と同様の条件でジペプチド生成反応を行った。
その結果、遊離したリン酸の定量による方法では、
（ａ）L-TyrとL-Tyr、L-Trp、L-AspまたはL-Glnが結合したジペプチドおよび
（ｂ）L-GlnとL-Phe、L-GluまたはL-Argが結合したジペプチド、が生成したことがわかった。【０１２５】
また、CE-MS分析では、L-GlnとL-PheまたはL-Gluが結合したジペプチドが生成したことがわかった。
さらに、HPLC分析では、4.00μmol/lのL-Phe-L-Gln、0.06μmol/lのL-Glu-L-Glnおよび0.10μmol/lのL-Gln-L-Gluが生成したことがわかった。
（５）トレポネーマ・デンティコラ由来ジペプチド合成酵素を用いたジペプチド生産
実施例２で、BL21(DE3)/pTDE2209を用いて得られたHisタグ付加蛋白質を用いて、（１）と同様の条件でジペプチド生成反応を行った。【０１２６】
その結果、遊離したリン酸の定量による方法では、
（ａ）GlyとL-Met、L-ProまたはL-Tyrが結合したジペプチド、
（ｂ）L-SerとL-GlnまたはL-Ornが結合したジペプチド、
（ｃ）L-ThrとL-Glu、L-Lys、L-Citまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｄ）L-CysとL-Cys、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Pro、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Gln、L-Hisまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｅ）L-LeuとL-Gluが結合したジペプチド、
（ｆ）L-IleとL-PheまたはL-Citが結合したジペプチド、
（ｇ）L-ProとL-Tyr、L-His、L-Lys、L-Orn、L-Citまたはβ-Alaが結合したジペプチド、
（ｈ）L-PheとL-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-Asp、L-Gln、L-HisまたはL-Lysが結合したジペプチド、
（ｉ）L-TyrとL-AspまたはL-Glnが結合したジペプチド、
（ｊ）L-GlnとL-Argが結合したジペプチド、
（ｋ）L-Cit-L-Cit、および
（ｌ）β-Ala-β-Ala、が生成したことがわかった。【０１２７】
また、CE-MS分析では、
（ｍ）GlyとL-Proが結合したジペプチド、
（ｎ）L-GluとL-Cysが結合したジペプチドおよび
（ｏ）L-ProとL-Hisが結合したジペプチド、
が生成したことがわかった。【０１２８】
さらに、HPLC分析では、0.16μmol/lのL-Pro-L-Hisが生成したことがわかった。
以上により、本発明の蛋白質は、１種または２種のアミノ酸をペプチド結合で結合させ、種々のジペプチドを生成する活性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いてジペプチドを製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３０】
配列番号１１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２０−人工配列の説明：合成DNA
【配列表】
2008056759000001.app
【国際調査報告】
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