(57)【要約】  表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（SELDI-TOF-MS）を用いて血液透析患者の特有の血清プロテオームパターンを解析した。血清フェリチンのレベルと有意な相関を示す三つのペプチドを2,192、2,789、および2,851m/zに見いだした。2,192および2,789m/zの分子サイズは、それぞれヘプシジン-20および-25で報告されたサイズとよくマッチしており、後者は合成ヘプシジン-25のサイズと完全に一致した。血清中の生理活性ヘプシジンを検出することで、鉄代謝異常を診断することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常の診断方法。
【請求項２】
被験者から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患の診断方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別方法；
（ａ）被験薬剤を投与された対象から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（ａ）と同じ作業を行う工程、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比較結果に基づき、対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い活性型ヘプシジンの量を導く被験薬剤を選別する工程。
【請求項４】
対象から経時的に採取された血液から調製された各々の血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法。
【請求項５】
放射線治療又は骨髄移植が行われた対象から経時的に採取された血液から調製された各々の血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、骨髄機能回復を判別する方法。
【請求項６】
前記鉄代謝異常が、IL‐6を介した鉄代謝異常である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記IL‐6を介した鉄代謝異常が、キャッスルマン病における貧血である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記鉄代謝異常が、骨髄機能の異常によって生じる鉄代謝異常である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記活性型ヘプシジンが、ヘプシジン20及び／又はヘプシジン25である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程が、以下の工程を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法；
（ａ）以下の（１）及び／又は（２）の活性型ヘプシジンに結合する性質を有する担体、および、血清サンプルを混合する工程、および
（１）ヘプシジン20
（２）ヘプシジン25
（ｂ）担体に結合した活性型ヘプシジンの量を測定する工程。
【請求項１１】
前記工程（ａ）が、上記担体に実質的にpI値が8以上のポリペプチドのみが結合する条件下で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
活性型ヘプシジンが、SELDI-TOF-MS法によって検出される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
【請求項１４】
鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患していない対象と比較して、血清中の活性型ヘプシジンの量が増加又は減少している対象に投与するために用いる、鉄代謝異常を引きおこす疾患の予防または治療に使用するための薬剤。
【請求項１５】
被験者から採取された血液より精製された、実質的にpI値が8以上であるポリペプチドを含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法に使用するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型ヘプシジンを指標とした、鉄代謝異常の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄代謝の調節に関する現在の理解は、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、フェリチン、鉄調節タンパク質、二価金属輸送体1、フェロポルチンおよびヘプシジンを含むいくつかの重要なタンパク質の生物学に基づいている（非特許文献１から４）。これらの因子のうち、血漿トランスフェリンおよびフェリチンは一般に、それぞれ総鉄結合能力および全般的な鉄保存の指標として臨床的に測定されている。ペプチドヘプシジンは肝臓によって産生されるが、食物に含まれる鉄の腸からの吸収ならびにマクロファージからの鉄の放出を調節することにより、血漿鉄レベルを制御する。さらに、ヘプシジンは炎症によって誘導される抗菌活性を有する急性相反応体でもある（非特許文献５から７）。鉄代謝、炎症、貧血、および低酸素症におけるヘプシジンの役割を確認しているほとんどの試験はマウス実験または培養実験で行われており（非特許文献５および８）、したがってヒト疾患におけるその役割は不明である。【０００３】
血液透析患者において、腎性貧血はヒト組換えエリトロポエチンの投与により臨床上軽減することができる（非特許文献９）が、これらの患者における鉄代謝の正確なメカニズムはほとんど知られていない。いくつかの臨床試験で、ヘプシジンの量が尿（非特許文献６および１０から１３）もしくは血清（非特許文献１４から１６）中のプロヘプシジンのレベル、または肝臓におけるmRNA発現のレベル（非特許文献１０）に基づいて推定された。しかし、血清プロヘプシジン濃度はいかなる赤血球指数または鉄の状態とも明白な相関を有しておらず（非特許文献１４）、プロヘプシジンの濃度はその蓄積によって上昇しうることが報告されている。加えて、プロヘプシジンは酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって測定されるが、これは生理活性を持たず、特定の機能はまったく確認されていない。ヘプシジン-20、-22、および-25はプロヘプシジンから変換酵素によって切断された活性体である（非特許文献６）。しかし、密に折りたたまれた構造のヘプシジン生理活性体に対する特異抗体を開発することに伴う困難が主な原因で、ヘプシジンの生理活性体の定量的評価に関する報告はわずかしかない（非特許文献１７）。【０００４】
ヘプシジンは鉄代謝の重要な調節因子であり、肝臓で発現され、血中に分布し、尿中に排出される。これまでに、ヘプシジンを指標とした診断法が報告されている（特許文献１から４）が、血清中のヘプシジンの生理活性体を測定する、信頼性があって実用的な方法は開発されていない。【０００５】
SELDIによる登録商標ProteinChip System（Ciphergen Biosystems, Inc. Freemont, CA, USA）アレイ技術を用いて、免疫学的状態、癌、神経学的状態、心血管状態、および涙腺の疾患などの広範な疾患における適切なバイオマーカーがうまく検出されている（非特許文献１８から２１）。SELDI技術は伝統的な固相抽出クロマトグラフィと直接レーザー脱離イオン化質量分析検出との組み合わせに基づいており、前処理をしていない生物体液の必要量は最小限ですむ。この技術は、疾患と対照との間の、血清、尿、涙、または脳脊髄液などの様々な体液における個々のタンパク質またはタンパク質群の発現におけるわずかな差を評価することを可能にする。さらに、これは高処理量の能力、タンパク質をピコモルからフェントモルの範囲で検出するための非常に高い感度、低分子量、すなわち20kDaよりも小さいタンパク質の高い分解能、および操作の容易さを含むいくつかの利点を有する。【０００６】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Andrews NC. Best Pract Res Clin Haematol. 2005;18:159-169.
【非特許文献２】Philpott CC. Hepatology. 2002;35:993-1001.
【非特許文献３】Fleming RE. Curr Opin Gastroenterol. 2005;21:201-6.
【非特許文献４】Ganz T. Blood. 2003;102:783-788.
【非特許文献５】Pigeon C, Ilyin G, Courselaud B, et al. J Biol Chem. 2001 16;276:7811-7819.
【非特許文献６】Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. J Biol Chem. 2001;276:7806-7810.
【非特許文献７】Krause A, Neitz S, Magert HJ, et al. FEBS Lett. 2000;480:147-150.
【非特許文献８】Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. J Clin Invest. 2002;110:1037-1044.
【非特許文献９】National Kidney Foundation. Am J Kidney Dis. 1997;30(Suppl 3):S192-240.
【非特許文献１０】Detivaud L, Nemeth E, Boudjema K, et al. Blood. 2005;106:746-748.
【非特許文献１１】Kemna E, Tjalsma H, Laarakkers C, Nemeth E, Willems H, Swinkels D. Blood. 2005 Jul 19; [Epub ahead of print]
【非特許文献１２】Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. J Clin Invest. 2004;113:1271-1276.
【非特許文献１３】Nemeth E, Valore EV, Territo M, Schiller G, Lichtenstein A, Ganz T. Blood. 2003;101:2461-2463.
【非特許文献１４】Taes YE, Wuyts B, Boelaert JR, De Vriese AS, Delanghe JR. Clin Chem Lab Med. 2004;42:387-9.
【非特許文献１５】Kulaksiz H, Gehrke SG, Janetzko A, et al. Gut. 2004 May;53(5):735-43.
【非特許文献１６】Dallalio G, Fleury T, Means RT. Br J Haematol. 2003;122:996-1000.
【非特許文献１７】Hunter HN, Fulton DB, Ganz T, Vogel HJ. J Biol Chem. 2002;277:37597-37603.
【非特許文献１８】Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Lancet. 2002;359:572-577.
【非特許文献１９】Sanchez JC, Guillaume E, Lescuyer P, et al. Proteomics. 2004;4:2229-2233.
【非特許文献２０】Stanley BA, Gundry RL, Cotter RJ, Van Eyk JE. Dis Markers. 2004;20:167-78.
【非特許文献２１】Tomosugi N, Kitagawa K, Takahashi N, Sugai S, Ishikawa I. J Proteome Res. 2005;4:820-825.
【特許文献１】特開2005-134387号公報
【特許文献２】US 2004/0096987 A1
【特許文献３】US 2004/0096990 A1
【特許文献４】US 2006/0019339 A1
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、鉄代謝異常のマーカータンパク質を見出し、そのマーカータンパク質を利用した発明を提供することを課題とする。より具体的には、活性型ヘプシジンを指標とした鉄代謝異常の診断方法、活性型ヘプシジンを指標とした鉄代謝異常を引きおこす疾患の診断方法、該疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別方法、該疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法、骨髄機能回復を判別する方法、および、これら方法に用いるキットまたは組成物を提供することを目的とする。また、鉄代謝異常を引きおこす疾患の予防または治療に使用するための薬剤の新規用途を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは表面改良型レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（SELDI-TOF-MS）を用いて血液透析患者の特有の血清プロテオームパターンを解析した。1,000から15,000m/zの範囲で観察された114のピークのうち、血清フェリチンのレベルと有意な相関を示す三つのペプチドを2,192、2,789、および2,851m/zに見いだした。三つのうちの二つ、すなわち2,192および2,789m/zの分子サイズは、それぞれヘプシジン-20および-25で報告されたサイズとよくマッチしており、後者は合成ヘプシジン-25のサイズと完全に一致した。さらに、これら二つのペプチドは強い陽イオン性で、四つの内部ジスルフィド架橋を有しており、これらがヘプシジンの生理活性体であるとの証拠となるものであった。これらのペプチドの血清レベルは鉄投与中に上昇し、反復性の出血によって低下し、また急性尿路感染症の患者では上昇した。したがって、血清中の生理活性ヘプシジンを検出することで、鉄代謝異常を診断することが可能である。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕から〔１５〕を提供するものである。
〔１〕被験者から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常の診断方法。
〔２〕被験者から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患の診断方法。
〔３〕以下の工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別方法；
（ａ）被験薬剤を投与された対象から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（ａ）と同じ作業を行う工程、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比較結果に基づき、対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い活性型ヘプシジンの量を導く被験薬剤を選別する工程。
〔４〕対象から経時的に採取された血液から調製された各々の血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法。
〔５〕放射線治療又は骨髄移植が行われた対象から経時的に採取された血液から調製された各々の血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、骨髄機能回復を判別する方法。
〔６〕前記鉄代謝異常が、IL‐6を介した鉄代謝異常である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記IL‐6を介した鉄代謝異常が、キャッスルマン病における貧血である〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記鉄代謝異常が、骨髄機能の異常によって生じる鉄代謝異常である〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記活性型ヘプシジンが、ヘプシジン20及び／又はヘプシジン25である、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程が、以下の工程を含む、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法；
（ａ）以下の（１）及び／又は（２）の活性型ヘプシジンに結合する性質を有する担体、および、血清サンプルを混合する工程、および
（１）ヘプシジン20
（２）ヘプシジン25
（ｂ）担体に結合した活性型ヘプシジンの量を測定する工程。
〔１１〕前記工程（ａ）が、上記担体に実質的にpI値が8以上のポリペプチドのみが結合する条件下で行われる、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕活性型ヘプシジンが、SELDI-TOF-MS法によって検出される、〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
〔１４〕鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患していない対象と比較して、血清中の活性型ヘプシジンの量が増加又は減少している対象に投与するために用いる、鉄代謝異常を引きおこす疾患の予防または治療に使用するための薬剤。
〔１５〕被験者から採取された血液より精製された、実質的にpI値が8以上であるポリペプチドを含む、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法に使用するための組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】質量荷電比範囲2,000から4,000m/zの代表的血清プロファイリングを示す図である。ケース1および2は血液透析患者で、ケース3および4は腎機能正常者であった。2,192、2,789、および2,851m/zのピークがケース1で観察され、ケース2および4では観察されなかった。ケース3では、2,789m/zのピークがわずかに増大した。
【図２】各ピークの強度とフェリチンとの間の相関を示す図である。血液透析患者の血清フェリチンのレベルと2,192（A）、2,789（B）、もしくは2,851m/zの強度（C）、または腎機能正常者（D）の2,789m/zの強度（B）との間に有意な相関が見られた。
【図３】2,192および2,789m/zのピークを有するペプチドの特徴評価を示す図である。pI（A）の評価を陽イオンCM10チップをpH8から10の範囲で用いて実施した。両方のペプチドはチップにpH10で結合した。分離精製した血清2,789m/zのピークは（B-最上図）、DTT処理で還元されたのち、2,797m/zに新しいピークとして現れ（B-中図）、ペプチドの分子量が還元後に8Da増えた。さらに、ヨードアセタミド処理でアルキル化されたのち、3,253m/zに新しいピークとして現れ、分子量が456Da増えた（B-最下図）。
【図４】精製2,789m/zをプロテインチップに結合させ、CID tandem MSでアミノ酸配列を解析した図である。産生イオンのMascot検索によるアミノ酸配列は、ヘプシジン−25に一致した。
【図５】ヘプシジン−２５の判定量的測定法の検量線を示す図である。合成ヘプシジン−２５を4,  16,  64,  256nMを2789ｍ/ｚを含まない血清に加えプロテインチップで測定するとCV値は20-30％ながら、r=0.9の相関が得られ、判定量的測定法として臨床応用が可能であった。
【図６】血清ペプチドの血液透析によるクリアランスを示す図である。2,192（A）、2,789（B）、および2,851m/z（C）のペプチドの強度は血液透析後に有意に低下した。2,192、2,789、および2,851m/zペプチドの血液透析による除去率はそれぞれ45±19、46±23、および52±30％であった。
【図７】2192および2789m/zに対する鉄の状態の影響を示す図である。8週間の間に静脈内鉄投与した患者では、フェリチンが11.3から273ng/mlに増加するとともに、2192および2789m/zピークの発現も増大した（A、C）。4ヶ月の間に月経出血によりフェリチンが202から28ng/mlに低下した患者（B、D）では、2192および2789m/zピークの発現も減少した。
【図８】腎盂腎炎患者における2,192、2,436および2,789m/zのピークの変化を示す図である。尿試料（図A）と血清試料（図B）の2,192および2,789m/zの発現は抗生物質による１７日間の治療で減少した。尿試料でのみ2,436m/zが観察された。2,192、2,436および2,789m/zはそれぞれヘプシジン−20、−22、−25に相当する。
【図９】2,789m/zのペプチドの強度とIL-6との間の相関を示す図である。血清IL-6濃度はSLE患者1名を除くすべての血液透析患者で20pg/ml未満であった。血液透析患者（●、n＝40）では、2,789m/zとIL-6との間に相関は見られなかったが、SLE、腎盂腎炎、肺炎、および敗血症（○、n＝16）の患者では、2,789m/zとIL-6との間に良好な相関が見られた（r＝0.6）。
【図１０】ケース１に対するトシリズマブ投与前後のヘプシジン−25、フェリチン、ヘモグロビン、アルブミンの変動を示す図である。
【図１１】ケース２に対するトシリズマブ投与前後のヘプシジン−25、フェリチン、ヘモグロビン、アルブミンの変動を示す図である。
【図１２】ケース１に対するトシリズマブ投与前後の尿ヘプシジン−25および、尿ヘプシジン−20の変動を示す図である。
【図１３】SCT治療前後の網赤血球数の変動を示す図である。Case1, 4, 6, 10では網赤血球数回復の遅延が認められている。
【図１４】SCT治療前後のIL-6の変動を示す図である。IL-6は、Case3,4,6を除いた7例においてweek+1でpeakを認めた。
【図１５】SCT治療前後の血清ヘプシジン−25の変動を示す図である。Week0, Week+2でヘプシジン値のpeakを認めた2例を除き、8例においてweek+1でpeakを認めた。Case1, 4, 6, 10ではweek+4の時点においてもヘプシジン値の著明な高値を認めた。正常者の上限は30AUである。
【００１１】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、被験者から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常の診断方法を提供する。
本発明の診断方法では、被験者から採取された血液より調製された血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量が、対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量より高い場合もしくは低い場合に、鉄代謝異常が生じていると診断される。また、当該鉄代謝異常の診断により、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患している又は該疾患に罹患するリスクが高いかどうかの診断、抗癌剤や免疫抑制剤等の投与、放射線療法、骨髄移植等による骨髄の造血機能の異常によって生じる鉄代謝異常の診断が可能である。骨髄の造血機能が高い場合には、活性型ヘプシジン量が低くなり、造血機能が低い場合には活性型ヘプシジン量は高くなる。
被験者がヒトである場合、疾患の診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。）によって行われるが、本発明の診断方法によって得られる活性型ヘプシジンの量に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の診断方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。【００１２】
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別方法を提供する。
（ａ）被験薬剤を投与された対象から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（ａ）と同じ作業を行う工程、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比較結果に基づき、対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い活性型ヘプシジンの量を導く被験薬剤を選別する工程
対象がヒトである場合、疾患の治療に最適な薬剤は、通常、医師によって選別されるが、本発明の薬剤の選別方法によって得られるデータは、医師による薬剤の選別に役立つものである。よって、本発明の薬剤の選別方法は、医師による薬剤の選別に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。【００１３】
また、本発明の薬剤の選別方法において、各々の被験薬剤は同一の対象に投与される。複数種（2種類以上）の被験薬剤について、本発明の薬剤の選別方法を実施することにより、複数種の被験薬剤から最適な薬剤を選別することができる。
本発明の薬剤の選別方法は、より詳細には、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患している対象であって、活性型ヘプシジンの量が増加している対象の治療に最適な薬剤の選別方法であって、以下の（１）から（４）の工程を含む方法である。
（１）被験薬剤を投与された対象から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（２）工程（１）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（１）と同じ作業を行う工程、
（３）工程（１）および工程（２）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（４）工程（３）の比較結果に基づき、対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い量まで、活性型ヘプシジンの量を減少させる被験薬剤を選別する工程【００１４】
また、本発明の薬剤の選別方法は、より詳細には、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患している対象であって、活性型ヘプシジンの量が減少している対象の治療に最適な薬剤の選別方法であって、以下の（１）から（４）の工程を含む方法である。
（１）被験薬剤を投与された対象から採取された血液より調製された血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（２）工程（１）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（１）と同じ作業を行う工程、
（３）工程（１）および工程（２）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（４）工程（３）の比較結果に基づき、対照血清サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い量まで、活性型ヘプシジンの量を増加させる被験薬剤を選別する工程【００１５】
また、本発明は、対象から経時的に採取された血液から調製された各々の血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法を提供する。
本発明の薬剤の投与時期を判別する方法では、測定される活性型ヘプシジンの量が、最初の測定時より増加または減少した場合に、薬剤を投与する時期であると判別される。【００１６】
対象がヒトである場合、薬剤の投与時期は、通常、医師によって判別されるが、本発明の薬剤の投与時期を判別する方法によって得られるデータは、医師による薬剤の投与時期の判別に役立つものである。よって、本発明の薬剤の投与時期を判別する方法は、医師による薬剤の投与時期の判別に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
本発明の薬剤の投与時期を判別する方法において、対象とは、例えば、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患しているおそれがある対象である。【００１７】
また、本発明は、対象から経時的に採取された血液から調製された各々の血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、鉄代謝異常を引きおこす疾患の治療に使用するための薬剤の投与量を判別する方法を提供する。
本発明の薬剤の投与量を判別する方法では、測定される活性型ヘプシジンの量が、最初の測定時より増加または減少した場合に、適切な投与量であると判別される。【００１８】
対象がヒトである場合、薬剤の投与量は、通常、医師によって判別されるが、本発明の薬剤の投与量を判別する方法によって得られるデータは、医師による薬剤の投与量の判別に役立つものである。よって、本発明の薬剤の投与量を判別する方法は、医師による薬剤の投与量の判別に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
本発明の薬剤の投与量を判別する方法において、対象とは、例えば、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患しているおそれがある対象である。【００１９】
本発明の薬剤の選別方法、および薬剤の投与時期または投与量を判別する方法において、被験薬剤とは、鉄代謝異常を引きおこす疾患の治療剤として公知のものである。そのような治療剤としては、例えば、エリスロポエチン、抗IL-6剤、鉄剤等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
さらに、本発明は、放射線治療又は骨髄移植が行われた対象から経時的に採取された血液から調製された各々の血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、骨髄機能回復を判別する方法を提供する。
骨髄機能回復を判別する方法において、測定される活性型ヘプシジンの量が、骨髄機能が正常な対象から採取された血液から調製された血清サンプル中の活性型ヘプシジン量と比較して、高い場合には回復が遅延しており、同等である場合には、骨髄機能が回復したと判別される。
対象がヒトである場合、骨髄機能が回復したか否かは、通常、医師によって判別されるが、本発明の骨髄機能回復を判別する方法によって得られるデータは、医師による骨髄機能が回復したか否かの判別に役立つものである。よって、本発明の骨髄機能回復を判別する方法は、医師による骨髄機能が回復したか否かの判別に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。【００２０】
本発明の方法は、医療機関で調製された血清サンプルを用いて実施される。あるいは、本発明の方法は、医療機関で採取された血液を用いて実施される。後者の場合、本発明の方法の実施者は、当業者に公知の方法を使用して血液から血清サンプルを調製することができる。例えば、採取された血液を遠心処理し、血清部分を回収する。得られた血清は、特に前処理することなく、適当な濃度に希釈してサンプルとすることができる。【００２１】
本発明において、被験者または対象は、好ましくはヒト、ラット、マウスであるが、これに制限されるものではなく、例えば、サル、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ハムスター等の非ヒト動物も含まれる。【００２２】
本発明において、「活性型ヘプシジン」とは、例えば、被験者または対象がヒトの場合、ヘプシジン20（配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）及び／又はヘプシジン25（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を指す。また、本発明において、「活性型ヘプシジン」とは、例えば、被験者または対象がラットの場合、ヘプシジン（配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を指し、被験者または対象がマウスの場合、ヘプシジン-1（配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）及び／又はヘプシジン-2（配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を指す。【００２３】
また、本発明において、「鉄代謝異常」には、鉄代謝異常を引きおこす疾患による場合のほか、抗癌剤等の投与、放射線療法、骨髄移植等により骨髄機能の異常をきたす場合も含まれる。また、本発明において、「鉄代謝異常」には、IL‐6を介した鉄代謝異常（例えば、キャッスルマン病における貧血）および骨髄機能の異常によって生じる鉄代謝異常も含まれる。また、「鉄代謝異常を引きおこす疾患」には、活性型ヘプシジン高値を示す疾患と活性型ヘプシジン低値を示す疾患が含まれる。活性型ヘプシジン高値を示す疾患としては、ヘモジデローシス、炎症性疾患、悪性腫瘍、肝炎、動脈硬化、心筋梗塞、糖尿病、関節リュウマチ、腎不全、骨髄機能障害等が例示できるが、これらに限定されるものではない。また、活性型ヘプシジン低値を示す疾患としては、遺伝性ヘモクロマトーシス、鉄欠乏性貧血、溶血性貧血、消化器官出血（例えば、消化器腫瘍、消化器潰瘍等）等が例示できるが、これらに制限されない。【００２４】
本発明の方法において、「血清サンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程」は、例えば、以下の工程を含む。
（ａ）以下の（１）及び／又は（２）の活性型ヘプシジンに結合する性質を有する担体、および、血清サンプルを混合する工程、および
（１）ヘプシジン20
（２）ヘプシジン25
（ｂ）担体に結合した活性型ヘプシジンの量を測定する工程。
上記（ａ）の工程を行う際、上記担体に実質的にpI値が8以上のポリペプチドのみが結合する条件下で行うことが好ましい。例えば、陽イオン交換基を有するCM10のようなチップを用いて、ｐH8以上で希釈したサンプルをチップと接触させた後、ｐH8以上の洗浄緩衝液で洗浄することにより得ることができる。pI値が8以上のポリペプチドが陽性荷電を有するよう調整することで、活性型ヘプシジン測定の際のノイズが減少し、鉄代謝異常の診断、鉄代謝異常に起因する疾患の診断や当該疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別が、より正確で、簡便に行うことが可能となるが、好ましくはpI値9.2以上、更に好ましくはpI値10以上である。【００２５】
このような方法としては、質量分析法等が例示できる。質量分析法としては、例えば、SELDI-TOF-MS法、MALDI-TOF-TOF法などを挙げることができるが、好ましくは、SELDI-TOF-MS法である。
SELDI-TOF-MS法とは、飛行時間型質量分析計に使用するチップ表面に担体を固定し、この担体が固定化されたチップ表面と被検試料を接触させ、適当な条件で洗浄した後、該チップ表面に捕捉されたタンパク質の質量を該飛行時間型質量分析計で測定する方法である。
SELDI-TOF-MSは、表面改良型レーザー脱離イオン化法（surface-enhanced laser desorption/ionization: SELDI）を使用した飛行時間型質量分析計（time of flight-mass spectrograph: TOF-MS）の略である。
チップ表面に担体を固定したものは、一般的には、プロテインチップと称される。本発明のプロテインチップとしては、例えば、疎水性型、陽イオン交換型、陰イオン交換型、金属イオン型、順相型等の化学的性質を有するケミカルチップ、特異的な結合（相互作用）を分析するために用いられる活性化型チップ、抗体型、レセプター型、ＤＮＡ型等のバイオロジカルチップが例示できるが、好ましくは、陽イオン交換基がチップに固定化されたケミカルチップ（より好ましくはCM10）、金属イオンがチップに固定化されたケミカルチップ（より好ましくはIMAC30-Cu）、または、疎水性基がチップに固定されたケミカルチップ（より好ましくはH4）が挙げられる。CM10は、チップ表面にカルボキシメチル基が結合されたチップであり、IMAC30-Cuは、チップ表面にNTAが結合されたチップであり、H4は、C16 逆相カラムと同様の結合特性を有するチップである。【００２６】
また、本発明においては、ヘプシジン20またはヘプシジン25に結合する抗体がチップに固定化されたバイオロジカルチップも使用することができる。通常、抗体は、カルボニルジイミダゾールまたはエポキシ活性基を介してチップに固定される。【００２７】
SELDI-TOF-MS法は、通常、下記（１）から（５）の工程を含むが、本発明のSELDI-TOF-MS法は、活性型ヘプシジンが検出できる限り、これら工程に限定されるものではない。
（１）プロテインチップに対して血清サンプルを添加する工程
プロテインチップに対して緩衝液で希釈した（本実施例の場合20倍に希釈）血清サンプルを添加し、インキュベートする（本実施例の場合30分間）。
（２）サンプル添加後のプロテインチップを洗浄する工程
チップ表面を洗浄し、チップ表面に結合していないタンパク質等を除去する。
（３）洗浄後のプロテインチップに対してエネルギー吸収分子（EAM）を添加する工程
チップ表面に捕捉されたタンパク質のイオン化を促進するために、エネルギー吸収分子（Energy Adsorption Molecule: EAM）をチップに添加して、乾燥させる。本発明のEAMとは、レーザー脱離／イオン化源由来のエネルギーを吸着でき、それから接触する分析分子の脱離とイオン化に寄与できる分子を表す。本発明のEAMとしては、プロテインチップシステムで使用できるEAMであれば、特に制限なく使用することができる。例えば、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸（SPA）、シアノ−ヒドロキシ−ケイ皮酸（CHCA）およびジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、ならびにヒドロキシアセト−フェノン誘導体などが例示できる。より好ましくはCHCAである。
上記のプロテインチップの表面に血清サンプル中のタンパク質を結合させる際、pI値が8以上、好ましくは9.2以上、更に好ましくは10以上のポリペプチド以外のポリペプチド等をできる限り除去する若しくは予め除去しておくことにより、活性型ヘプシジンを測定する際のノイズが減少し、鉄代謝異常の診断、鉄代謝異常を引きおこす疾患の診断や当該疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別が、より正確で、簡便に行うことが可能となる。上記の除去方法は、特に限定されるものではないが、例えば、CM10等の陽イオン交換基が固定化されたケミカルチップにpH8〜10の条件下で吸着させることによって活性型ペプシジンの測定に適したサンプルを得ることが可能である。【００２８】
（４）タンパク質の質量と量を測定する工程
TOF-MSによって、タンパク質の質量数を測定する。EAM添加後のプロテインチップに対して、UVパルスレーザーを照射することにより、エネルギーを受けてイオン化したタンパク質は、一定の電圧で加速されて真空管の対極にあるイオン検出器に向かって飛行する。イオン検出器は、検出したイオンの情報を、質量対電荷の割合（質量電荷比m/z）へと翻訳する。また、シグナル強度も検出される。従って、タンパク質の質量（mass）と量（quantity）の両方が決定されうる。また、「タンパク質の量」は、データ出力画面において、ピークの高さで判断する。このような測定には、Protein Chip(SELDI-TOF-MS, サイファージェン社)、AXIM-TOF2（MALDI-TOF-TOF，島津製作所）等を使用することができる。【００２９】
（５）タンパク質の発現解析を行う工程
SELDI-TOF-MS法では、通常、測定や解析に使用するソフトウエアがインストールされたコンピューターが使用される。当該コンピューターによって、データを分析し、検出されたタンパク質の数を表示し、検出されたタンパク質についてのシグナル強度および決定された分子量を表示できる。また、当該コンピューターは、生じたデータを種々のフォーマットにて表示しうる。本発明においては、標準的なスペクトルが表示され得るが、有用なフォーマットとしては、Biomarker Wizard（サイファージェン社）、Biomarker PatternsTM Software(ＢＰＳ)（サイファージェン社）等を使用することができる。このような解析には、Protein Chip(SELDI-TOF-MS, サイファージェン社)、AXIM-TOF2（MALDI-TOF-TOF，島津製作所）等を使用することができる。【００３０】
本発明は、また、上記診断方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、例えば、上記診断方法に用いるプロテインチップ、洗浄溶液、指示書などが含まれる。【００３１】
本発明は、また、鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患していない対象と比較して、血清中の活性型ヘプシジンの量が増加又は減少している対象に投与するために用いる、鉄代謝異常を引きおこす疾患の予防または治療に使用するための薬剤を提供する。
鉄代謝異常を引きおこす疾患に罹患していない対象と比較して、血清中の活性型ヘプシジンの量が増加又は減少しているか否かは、上述の方法で確認できる。
本発明の薬剤は、血清中の活性型ヘプシジンの量が増加又は減少している対象に投与されることを特徴とする。このような薬剤としては、エリスロポエチン、抗IL-6剤、鉄剤等が例示できるが、これらに限定されるものではない。【００３２】
これら薬剤の投与方法、投与量、有効成分以外の医薬的に許容される担体などは公知である。本発明では、それら公知の情報を利用することができる。
投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。非経口投与による投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。【００３３】
本発明の薬剤は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。【００３４】
また、本発明は、被験者から採取された血液より精製された、実質的にpI値が8以上であるポリペプチドを含む、本発明の方法に使用するための組成物を提供する。「実質的にpI値が8以上のポリペプチドを含む組成物」を用いることによって、活性型ヘプシジン測定の際のノイズが減少し、鉄代謝異常の診断、鉄代謝異常を引きおこす疾患の診断や当該疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別が、より正確で、簡便に行うことが可能となる。pI値が8以上のポリペプチドを含む組成物であれば、所望の効果を得ることが可能であるが、好ましくはpI値9.2以上、更に好ましくはpI値10以上である。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕
1  材料と方法
1.1  試験参加者
血清試料を40名の血液透析患者から透析前後に採取した。患者はすべて週3回の透析治療を受けていた。加えて、血清試料を急性腎盂腎炎（2名）、肺炎（2名）、および敗血症（2名）患者ならびに16名の腎機能正常者から採取した。鉄欠乏症のために静脈内鉄投与を受けた急性腎盂腎炎の患者2名および血液透析患者2名から採取した血清および尿の連続試料も分析した。鉄の状態および貧血の臨床評価のために、赤血球数（RBC）、ヘモグロビン（Hb）、ヘマトクリット（Ht）、血漿鉄、およびフェリチンを評価した。血清試料を遠心分離（3,000rpm）にかけて分離し、分析まで-80℃で保存した。血清および/または尿のタンパク質プロファイリング分析について、すべての参加者から告知に基づく同意を得た。【００３６】
1.2  血清および尿タンパク質のSELDI-TOF-MS解析
予備的試験のために、弱い陽イオン交換、強い陰イオン交換、および二価陽イオン銅を結合するタンパク質分子の金属固定化アフィニティークロマトグラフィを含む、様々な表面特性を有する複数のタイプのプロテインチップを用いた。金属固定化アフィニティークロマトグラフィの登録商標ProteinChipアレイ（IMAC 30-Cu）が血清および尿のタンパク質種検出において再現性があったため、本発明者らは最終的にすべての試験でこれを選んだ。SELDI解析を、製造者のマニュアルに従い、若干の変更を加えて実施した。すなわち、血清および尿試料を結合緩衝液（リン酸緩衝化食塩水、pH7.4）でそれぞれ20倍および10倍希釈した。バイオプロセッサーを用いて、希釈試料40μlを100mM硫酸銅結合緩衝液で前処理したIMAC 30-Cuチップの異なるアレイに添加し、室温で絶えず水平振盪しながら30分間インキュベートした。再現性を確認するために、各試料をIMAC 30-Cuチップ上の二つの別のスポットに添加した。結合緩衝液で5分間の洗浄を三回行って結合していないタンパク質を除去した。アレイを水400μlで二回洗浄し、風乾し、50％アセトニトリルおよび0.5％トリフルオロ酢酸中のアルファ-シアノ-4-ヒドロキシ-ケイ皮酸（CHCA；Ciphergen）0.5μlを表面に二回加えた。次に、アレイをCiphergen登録商標ProteinChip Reader PBS IIで解析した。CHCAを加えたタンパク質をイオン化し、それらの分子質量をTOF解析により求めた。アレイ表面に捕捉された各タンパク質/ペプチドの質量と電荷の比（m/z）を外部較正した標準：Arg8-バソプレシン（1,084.25Da）、ソマトスタチン（1,637.9Da）、ダイノルフィン（2,147.5Da）、ウシインスリンベータ鎖（3,495.94Da）、ヒトインスリン（5,807.65Da）、ウシユビキチン（8,564.8Da）、およびウシチトクロムC（12,230.9Da）によって求めた。試料の質量スペクトルを、レーザー強度180および検出器感度10で平均80のレーザーショットを用いて得た。合成ヘプシジン-25（ペプチド研究所、大阪）を2,789Daのマーカーとして用いた。ピーク強度からのデータを、Biomarker Wizard（Ciphergen 登録商標ProteinChip Software 3.1.1）を用いて全イオン量により標準化し、スポット上に添加した試料濃度のばらつきを補償した。【００３７】
1.3  ペプチドのpI値
陽イオン登録商標ProteinChipアレイ（CM 10）上でpI値を評価した。一つの血清試料の6つの一定分量を、pH8から10の範囲の0.4間隔のTris/HCl緩衝液で希釈した。【００３８】
1.4  ジチオスレイトール（DTT）による還元とヨードアセタミドによるアルキル化
試料を5mM DTT（25mM 炭酸アンモニウム）により70℃で2分間還元し、内部ジスルフィド架橋の数を検出した。DTT還元は、切られたそれぞれのジスルフィド架橋に対し、二つの水素原子を添加して二つの遊離スルフヒドリル基を形成するため、分子量は２Da増加する。さらに、50mMヨードアセタミド（25mM 炭酸アンモニウム）によるアルキル化（室温、30分間）では、分子量がさらに114Da増加する。【００３９】
1.5  透析患者血清からの血清2,789m/zの分離精製
CM ceramic hyper DF spin columnにpH8条件下で血清を吸着させ、洗浄後に500mMNaClで溶出し、2,789m/zを疎精製した。この抽出物を、さらに逆相HPLCで分画し、2,789m/zが精製されていることを、プロテインチップで確認した。精製2,789m/zをプロテインチップに結合させ、インターフェイスに装着させCID tandem MSでアミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列の検索にはMascotを用いた。【００４０】
1.6  IL-6濃度
血清IL-6の濃度を酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）キット（R&D, Quantikine HS, Minneapolis, MN, USA）により、製造者のプロトコ-ルに従って分析した。【００４１】
1.7  統計解析
対応のある変数の統計解析を、対応のあるパラメトリックt-検定を用いて実施した。連続変数の間の直線関係を試験するために、ピアソン相関係数を算出した。両側対立仮説に基づいてp値を算出し、0.05未満の場合に有意と考えた。【００４２】
2  結果
2.1  鉄代謝に関連するタンパク質
図1は、二名の血液透析患者および二名の腎機能正常者から得た血清のm/z範囲2,000から4,000の代表的タンパク質質量スペクトルを示しており、それらのピークパターンの差を明らかにしている。62名のスペクトルから、Biomarker Wizardソフトウェアは1,000から15,000m/zの範囲で自動的に114ピークを検出した。
鉄代謝に関連するタンパク質を明らかにするために、各ピークの強度とRBC、Hb、Ht、血清鉄、またはフェリチンとの間の相関係数を算出した（表1）。【００４３】
【表１】
2008047485.tif 000002
【００４４】
血清フェリチンに対して、114ピークのうちの3つだけ−2,192、2,789、および2,851m/z−の強度が良好な、すなわち0.8よりも大きい相関係数を有していた（それぞれr＝0.93、0.83、および0.80）（図2、パネルA、B、およびC）。RBC、Hb、Ht、または血清鉄のいずれとも有意な相関を示すピークはなかった。これらのピーク強度の血清フェリチンとの相関は腎機能正常者でも観察された（図2D）。血液透析患者の2,789m/zピークのレベルは同レベルのフェリチンを有する腎機能正常者のものよりも高かった（図2B、D）。血清2,192および2,789m/zピークの強度間でも有意な相関が認められ（r＝0.9）、これら二つの分子は同じメカニズムで調節されていることが示唆される。
タンパク質データベース（SWISS PROT）から検索することにより、本発明者らは2,192m/zおよび2,789m/zのピークはそれぞれヒトヘプシジン-20（理論分子量還元型：2,199.78Da）およびヘプシジン-25（2,797.41Da）の分子量にほぼ相関していることを見いだした。以前の報告（Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. J Biol Chem. 2001;276:7806-7810.）では、ヘプシジン-20およびヘプシジン-25のMALDIによる分子量はそれぞれ2,191.77および2,789.40Daであった。2,851m/zのピークはデータベース上では得られなかった。【００４５】
2.2  血清2,192および2,789m/zのpIについての特徴評価
陽イオンプロテインチップCM 10を2,192および2,789m/zピークのpI評価に用いた。希釈および洗浄緩衝液はpH8.0から10.0の範囲のTris/HClであった。いずれのペプチドもpH10でチップに結合したままであり（図3A）、これらが強い陽イオンペプチドであることを示唆している。【００４６】
2.3  血清2,789m/zの分離精製
透析患者血清から血清2,789m/zの分離精製を試みた。陽イオンプロテインチップCM 10では、pH8条件下で2,789m/zは結合し、500mMNaClで溶出された。この条件をCM ceramic hyper DF spin columnに応用し、2,789m/zを疎精製した。さらに、逆相HPLCで分画し、2,789m/zが精製されていることを、 プロテインチップで確認した（図3B-最上図）。【００４７】
2.4  精製2,789m/zのジスルフィド架橋についての特徴評価
分離精製した血清2,789m/zのピークは（図3B-最上図）、DTT処理で還元されたのち、2,797m/zに新しいピークとして現れ（図3B-中図）、ペプチドの分子量が還元後に8Da増えたことを示している。さらに、ヨードアセタミド処理でアルキル化されたのち、3,253m/zに新しいピークとして現れ、456Da分子量が増えた（図3B-最下図）。この結果は、2,879m/zのペプチドが四つの内部ジスルフィド結合を含むことを示唆するものであった。【００４８】
2.5  精製2,789m/zの同定
精製2,789m/zをプロテインチップに結合させ、CID tandem MSで解析した。産生イオン（図４）のMascot検索によるアミノ酸配列は、ヘプシジン−２５に一致した。
2.6  ヘプシジン−２５の判定量的測定法
合成ヘプシジン−２５を4,  16,  64,  256nMを2789ｍ/ｚを含まない血清に加えプロテインチップで測定するとCV値は20-30％ながら、r=0.9の相関が得られ（図５）、判定量的測定法として臨床応用が可能であった（図12）。正常者のヘプシジン−２５の値は30強度（AU）以下であった。【００４９】
2.7  血液透析による三つのペプチドピークのクリアランス
図６は、血液透析前後の2,192、2,789、および2,851m/zピークのレベル変化を示している。同時に測定した血液尿素窒素の除去率は、これらの患者では71.4％±2.4％であったが、これに比べて2,192、2,789、および2,851m/zペプチドの血液透析による除去率（それぞれ45±19、46±23および52±30％）はそれらの小さいサイズにもかかわらず満足のいくものではなかった。【００５０】
2.8  2,789m/zのピークの鉄負荷後の経時変化
図7A,Cは、重度の貧血のために鉄40mgを週に二回8週間、静脈内に投与した、72歳の女性から得た血清の連続プロファイリングを示している。2,789m/zのピークの強度は鉄の投与によって徐々に増大し、血清フェリチンのレベルは11.3から273ng/mlに上がった。一方、月経による出血がある34歳の女性（図７B,D）では、フェリチンのレベルは4ヶ月の間に202から28ng/mlに下がり、2,789m/zのピークの強度も徐々に低下した。いずれのケースでも、2,192および2,789m/zのピークを除き、ピークパターンに顕著な変化は認められなかった。これら二ケースの透析条件はこれらの期間中は同じであった。【００５１】
2.9  急性腎盂腎炎患者からの血清および尿の連続分析
急性腎盂腎炎患者からの血清および尿のタンパク質プロファイリングを図８に示している。患者を抗生物質で治療した。血清および尿の試料いずれにおいても、治療前に検出された2,192および2,789m/zのピークは徐々に低下した。第0日および第17日のフェリチンのレベルはそれぞれ343.7および230.6ng/mlであった。【００５２】
2.10  2,192および2,789m/zのピーク強度と血清IL-6濃度との関連
血清IL-6濃度は、全身性エリテマトーデス（SLE）でグルココルチコイドによる治療を受けている患者1名を除き、すべての血液透析患者で20pg/ml未満であった（図９）。急性腎盂腎炎、SLE、肺炎、および敗血症の患者の血清IL-6レベルは2,789m/zピークの強度と良好な相関を示した（r＝0.6）。【００５３】
3  考察
本実施例において、本発明者らは体の鉄の状態によって調節される血清タンパク質を同定するためにSELDI技術を用い、血清フェリチンのレベルとの相関に基づき2,192、2,789、および2,851m/zのペプチド群を見いだした。これらのペプチドの2,192および2,789m/zの二つのサイズは、Parkら（Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. J Biol Chem. 2001;276:7806-7810.）によって報告されたヘプシジン-20および-25のものとほぼ厳密に一致した。さらに、これらのペプチドは強い陽イオン性で、4つの内部ジスルフィド架橋を有しており、これらの特徴はヘプシジンの活性体のものと一致していた。したがって、2,192および2,789m/zの二つのペプチドはそれぞれヘプシジン-20および-25であると結論づけられた。これら二つのペプチドのピーク強度は鉄負荷および炎症によって増大した。加えて、本発明者らは2,851m/zにもう一つのペプチドを同定し、そのピーク強度は血液透析患者の血清フェリチンのレベルと明らかな相関を示した。【００５４】
ヘプシジンは鉄のホメオスタシスにとっての重要な分子であるため、その血清濃度の測定は貧血およびヒト疾患における鉄過負荷の鑑別診断にとって有用なツールとなりうる（Ganz T. Best Pract Res Clin Haematol. 2005;18:171-82.）。生理活性ヘプシジンではなく、プロヘプシジンの血清濃度はELISAで測定された（Taes YE, Wuyts B, Boelaert JR, De Vriese AS, Delanghe JR. Clin Chem Lab Med. 2004;42:387-9.、Kulaksiz H, Gehrke SG, Janetzko A, et al. Gut. 2004 May;53(5):735-43.）。しかし、これまでのところ、血清ヘプシジンの生理活性体を定量する、信頼性があって実用的な方法は開発されておらず、これはおそらくヘプシジン-20、-22、および-25に対する特異抗体を開発することに伴う困難が原因と考えられる。MALDI-TOF質量分析に基づき、Parkら（Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. J Biol Chem. 2001;276:7806-7810.）はヘプシジン-20、-22、および-25が尿中の主要な形であると報告した。最近、Kemnaら（Kemna E, Tjalsma H, Laarakkers C, Nemeth E, Willems H, Swinkels D. Blood. 2005 Jul 19; [Epub ahead of print]）は親水性順相チップ（NP20）を用いたSELDI技術により尿ヘプシジンを分析するための半定量法を報告した。彼らは鉄欠乏性貧血、遺伝性血色素症、および敗血症患者からの尿試料を分析し、ヘプシジン-20、-22、および-25の分子量に対応する三つのピークを検出した。しかし、彼らはこの方法では血清中のヘプシジンの生理活性体を検出することはできなかった。【００５５】
本実施例では、本発明者らは血清中のヘプシジン-20およびヘプシジン-25に対応するピークを検出した。肝臓で産生されるプロヘプシジンは、循環中に見られるヘプシジンの生理活性体を生成するために、特異的なプロテアーゼで処理する必要がある（Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. J Biol Chem. 2001;276:7806-7810.）。したがって、血清分析から得られたデータは鉄代謝のさらなる理解のために非常に重要である。Nemethら（Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. J Clin Invest. 2004;113:1271-1276.）は、食事性鉄の刺激効果がヘプシジンの発現を速やかに誘導し、腸からの鉄の吸収が速やかに低減することを示したが、この「粘膜阻止現象」における血清中のヘプシジンの動態は不明なままである。SELDI技術は血清中のヘプシジンの速い動態を解析するために有用であると思われる。【００５６】
以前の試験（Taes YE, Wuyts B, Boelaert JR, De Vriese AS, Delanghe JR. Clin Chem Lab Med. 2004;42:387-9.、Kulaksiz H, Gehrke SG, Janetzko A, et al. Gut. 2004 May;53(5):735-43.、Dallalio G, Fleury T, Means RT. Br J Haematol. 2003;122:996-1000.）において、ELISAで測定した血清プロヘプシジンレベルの上昇が腎不全で見いだされたが、血清プロヘプシジン濃度と体の鉄の状態との間に関連性はなかった。本発明者らの試験において、血液透析患者のヘプシジン-20および-25に対応する二つのピークのレベルも、同じ血清フェリチンレベルを有する腎機能正常者のものよりも高かった。透析患者で、2,789m/zペプチド（ヘプシジン-25）はその小さいサイズにもかかわらず46％だけが透析によって除去され、血清中に蓄積されることになった。しかし、このペプチドの血清レベルは血清フェリチンの濃度と高い相関を示した。この相関は、同じ透析条件下の患者の鉄負荷後の連続試料でも観察された。Nemethら（Nemeth E, Valore EV, Territo M, Schiller G, Lichtenstein A, Ganz T. Blood. 2003;101:2461-2463.）も、炎症の貧血および敗血症において、尿ヘプシジン排出は血清フェリチン濃度とよく相関していることを報告した。これらの知見は、血清中のヘプシジンの発現は体の鉄の状態ならびにフェリチンによって調節されている可能性を示唆している。細胞系における鉄の毒性は主に、反応性酸素種の生成に関与する鉄の能力に起因し、フェリチンは細胞内の不安定な鉄プールを捕捉し、緩衝して、細胞を保護する（Torti FM, Torti SV. Blood. 2002;99:3505-3516.）。一方、ヘプシジンは腸からの鉄の吸収を阻害することにより、鉄の毒性を予防すると考えられる。したがって、鉄過負荷の状態では、活性ヘプシジンはフェリチンと共に、鉄ホメオスタシスの維持において生理的に重要な役割を果たしていると考えられる。【００５７】
現在のところ、鉄負荷に加えて、ヘプシジンは貧血、低酸素症、および炎症によって誘導され（Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. J Clin Invest. 2002;110:1037-1044.）、これらの刺激はすべてフェリチンの発現も誘導する（Torti FM, Torti SV. Blood. 2002;99:3505-3516.）ことがよく知られている。ヘプシジンと炎症との関連性はより明らかになりつつある（Lee P, Peng H, Gelbart T, Wang L, Beutler E. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:1906-1910.）。テルペンチンによって誘導された炎症モデルにおいて、肝臓におけるヘプシジンmRNAの発現は野生型マウスでは増大したが、IL-6ノックアウトマウスでは増大しなかった（Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. J Clin Invest. 2004;113:1271-1276.）ため、IL-6は炎症におけるヘプシジン産生誘導の主要なサイトカインであると思われる。ヒトによる試験は二つだけで、ヘプシジンの尿中排出は炎症性の貧血、副睾丸炎を伴う急性感染症（Nemeth E, Valore EV, Territo M, Schiller G, Lichtenstein A, Ganz T. Blood. 2003;101:2461-2463.）、および重度の敗血症（Kemna E, Tjalsma H, Laarakkers C, Nemeth E, Willems H, Swinkels D. Blood. 2005 Jul 19; [Epub ahead of print]）の患者において大きく増大することが報告された。Nemethら（Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. J Clin Invest. 2004;113:1271-1276.）は、ヒト腎機能正常者へのIL-6の注入により、尿中のヘプシジン排出の急速な増加が起こることを報告した。しかし、ヘプシジンとIL-6との間の相関に対する臨床データはこれまで報告されていない。本実施例において、急性腎盂腎炎、肺炎、および敗血症におけるIL-6の血清レベル増大は、フェリチンおよびヘプシジン両方の血清レベル増大を伴っていた。これらの知見は、ヒト疾患においてIL-6がフェリチンおよびヘプシジン両方の増加を引き起こすことを示している。Rogers（Rogers JT. Blood. 1996;87:2525-2537.）は、フェリチンH-サブユニットおよびL-サブユニットのmRNAのレベルは変化しないままであるが、フェリチンサブユニット合成は増大するため、IL-6はフェリチンの発現を翻訳レベルで誘導することを報告した。ヘプシジンの場合、IL-6はヘプシジン発現をmRNAレベルで誘導する（Nemeth E, Valore EV, Territo M, Schiller G, Lichtenstein A, Ganz T. Blood. 2003;101:2461-2463.）。しかし、鉄過負荷によるヘプシジン誘導のメカニズムは不明のままである（Ganz T. Best Pract Res Clin Haematol. 2005;18:171-82.）。【００５８】
低分子量タンパク質/ペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンおよび大きいタンパク質のタンパク質分解断片などの、いくつかの生理的に重要な因子群からなる（Tirumalai RS, Chan KC, Prieto DA, Issaq HJ, Conrads TP, Veenstra TD. Mol Cell Proteomics. 2003;2:1096-1103.）。興味深いことに、血清中の分子量15,000Da未満の114の小タンパク質は腎機能正常者でも検出されたが、これらのペプチドは腎ろ過の推定カットオフサイズよりも小さい。さらに、2,192および2,789m/zの二つのペプチド（それぞれヘプシジン-20および-25）は、陰イオン性の糸球体基底膜を通してろ過されるのに十分陽イオン性であった。このことは、これらのペプチドが大きいタンパク質複合体の一部であるか、または不明の特別な保持メカニズムを有している可能性を示唆している。急性腎盂腎炎において、これら二つのペプチドは血清だけでなく尿中でも検出された。しかし、尿ヘプシジンが血液からろ過されるか、または腎臓から生じているかは明らかではない。少なくとも、ヘプシジンは腎尿細管細胞中で発現される（Kulaksiz H, Theilig F, Bachmann S, et al. J Endocrinol. 2005;184:361-370.）ため、部分的には腎臓から放出される。腎間質における感染は腎尿細管細胞によって産生されるプロヘプシジンを活性化すると考えられる。【００５９】
結論として、SELDIの結果は2,192および2,789m/zはそれぞれヘプシジン-20および-25であることを示している。これらのペプチドは腎機能低下に伴って一部蓄積するが、これらのペプチドの血清中の濃度は血清フェリチンのレベルによって表される体の鉄の状態とよく相関していた。これらのペプチドは尿路感染中にも誘導された。本発明者らのデータは、SELDIが血清および尿の両方においてヘプシジンの生理活性体を検出および半定量するための有用なツールであることを示している。【００６０】
〔実施例２〕
multi-centric type のCastleman病（多発型のキャッスルマン病）（MCD）は、リンパ節症、発熱、および小赤血球性貧血を含む様々な全身症状を発現するまれなリンパ増殖性障害である。血清インターロイキン-6（IL-6）レベルの上昇が一般的な特徴の一つであり、MCDの症状を緩和するために、抗IL-6受容体抗体であるトシリズマブ(登録商標アクテムラ)が治療に用いられている。MCDにおいて観察される小赤血球性貧血の病因は、鉄代謝の重要な調節物質であるヘプシジンの発現増加に関連することを意味しており、IL-6は、肝臓におけるヘプシジンの産生を刺激することが知られている。
本発明者らは、トシリズマブ(登録商標アクテムラ)による治療を開始したCastleman病の２症例の、治療開始前後における血清・尿中のヘプシジンを、治療前7日から治療開始１４日まで経時的に測定した。測定は実施例１と同様にして行った。【００６１】
【表２】
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Castleman病の２症例の治療前検査所見【００６２】
いずれの症例においても、トシリズマブの初回投与後1日以内に血清中ヘプシジン-25の発現低下が観察され、これは小赤血球性貧血が改善する前、ならびにCRPおよび血清フェリチンレベルの双方が減少する前であった。この結果は、ヘプシジンの発現が、臨床の状況においてIL-6経路によって非常に迅速によって制御されることを示している。
より具体的には、治療により高CRP血症・貧血・低アルブミン血症は改善し、血清フェリチン値は緩やかに低下した（ケース１：図10、ケース２：図11）。 初回のトシリズマブ投与翌日には血清中ヘプシジン-25が劇的に低下した。これはCRPやフェリチンの低下に先行してみられた。 症例１では尿検体も解析した（図１２）（。尿中のヘプシジン-20、ヘプシジン-25ともに第3日には劇的に減少した。トシリズマブ投与後にみられた、血清フェリチンの低下に先行するヘプシジン値の速やかな低下は、IL-6がヘプシジンを介して鉄代謝を制御しているという仮説を支持する。同時に、ヘプシジンの血清中での半減期が短いことも示している。トシリズマブは、Castleman病のみならず、IL-6を介したヘプシジン増加と鉄代謝異常を伴う貧血の改善に有用であると考えられる。また、Mass-spectrometry による ヘプシジン 測定系は、Castleman病におけるトシリズマブの治療効果を判定する上で役立つと考えられる。【００６３】
〔実施例３〕
ヘプシジンは、腸管からの鉄吸収を減少させて、鉄貯蔵部位からのその放出を遮断することによって鉄代謝を調節する、肝臓において産生されるペプチドである。しかし、ヘプシジン産生を調節する正確なメカニズムは、まだ解明されていない。最近、何人かの研究者が、赤血球産生の際のヘプシジン産生の抑制が、貧血、低酸素症、またはエリスロポエチンによって直接引き起こされるのではなく、未知の造血因子によって引き起こされると推測した。骨髄機能は、造血幹細胞移植（SCT）の際の化学療法の条件によって完全に抑制されることから、SCTの前後で血清ヘプシジンレベルを評価することは意味をなすはずである。
本発明者らは、白血病のために自己および同種異系SCTを受けた症例10例において、ヘプシジン、インターロイキン-6（IL-6）、および鉄代謝に関係する他の血清因子の血清レベルを、SCT当日の1週間前（-1週）から4週間後（+4週）までモニターした。ヘプシジンペプチドの主要な活性型であるヘプシジン-25の血清レベルを、SELDI-TOF質量分析を用いて半定量的に測定した。【００６４】
【表３】
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白血病患者の骨髄移植データ【００６５】
SCTの-１週前(W-1)から開始した前処置療法により、網赤血球数は+0週から+1週で低下しており、骨髄機能はほぼ完全に抑制されていた。網赤血球数は+2週から回復しているが、Case1, 4, 6, 10では回復の遅延が認められた（図１３）。また血清IL-6レベルは、ほとんどの症例において＋１週目でピークとなりその後低下しており、SCT処置の影響が大きいことを示した（図１４）。
一方、前処置療法前の-1週目でのヘプシジンレベルは、正常範囲（平均値±SD；65.4±41.6 AU）と比較して既に高かったが、SCT当日の後さらに増加した（図１４）。ヘプシジンのピークレベルは、8例において+1週目（167.1±67 AU）で観察され、他の2例はそれぞれ、+0週目（153 AU）および+2週目（267 AU）でピークを示した。網状赤血球の定着と共に、ヘプシジン値は徐々に減少したが、造血回復が遅延していたCase1, 4, 6, 10ではヘプシジン値は高い傾向があった。これらは、網赤血球数で示唆される骨髄機能の抑制状態とヘプシジンの発現が相関していることを示した。さらに、IL-6が正常な前処置療法前にすでにヘプシジンが上昇していることや、血清IL-6の上昇が起こらない症例においても、血清ヘプシジン-25の明確なピークが+1週目で観察されたことから、SCTの際の血清ヘプシジンレベルが、IL-6によって部分的に発現が増加する可能性があるが、SCT後の初期段階で増加した他の造血因子によっても発現が増加する可能性があることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によって、鉄代謝異常を診断する新たな方法が提供された。本発明の診断方法は、血中の活性型ヘプシジンのみを直接測定することが可能であるため、ヘプシジンと鉄のトランスポーターであるフェロポルチンとの結合準備状態を直接測定することができる。このため、従来技術と比較して、より臨床に即した正確な鉄代謝異常の診断が可能である。また、鉄代謝異常の変化をリアルタイムで検査することが可能である。これにより、例えば、鉄代謝異常を引きおこす疾患の診断、当該疾患の治療薬を投与する時期及び投与量の判別、骨髄の造血機能の評価（例えば、抗癌剤等、副作用として骨髄機能を低下させる薬剤の投与や放射線療法を実施した際の造血機能、骨髄移植を行った際の造血機能）を行うことが可能である。また、IL-1やIL-6等を標的とした抗炎症薬等、鉄代謝異常を引きおこす疾患に対する治療薬を投与した際の効果を判定することが可能であるため、当該疾患の治療に最適な薬剤の選別が可能となる点で利点を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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