【手続補正書】
【提出日】平成16年4月14日(2004.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換またはプラスミドコピー数制御に関連する少なくとも1つのウイルスタンパク質をコードするmRNAに生理的条件下において特異的な的にハイブリダイズするか、またはウイルスポリアデニル化シグナルまたはコア、プレ-コアまたはポリメラーゼコード配列にハイブリダイズし、少なくとも1つの配列が配列番号：37〜66またはそれらの相同配列からなる群より選択される、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項２】
mRNAがE6/E7mRNAである、請求項1に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項３】
mRNAがパピローマウイルスRNAまたはB型肝炎ウイルスRNAである、請求項1または2に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項４】
配列番号：37〜66または関連するHPVもしくはHBVの相同配列からなる群より選択される配列と生理的条件下において特異的にハイブリダイズする、少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項５】
核酸分子がDNAzyme、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項６】
核酸分子がDNAzymeである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項７】
核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項８】
核酸分子がリボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項９】
核酸分子がヌクレアーゼ分解に抵抗性である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項１０】
核酸分子の3'末端が修飾されており、ヌクレアーゼ分解に抵抗性で、かつ3'末端に3'-3'逆位Tを有する、請求項9に記載の少なくとも1つの核酸分子の精製調製物。
【請求項１１】
請求項1〜10に記載の核酸分子のいずれかと、薬学的に許容されうる担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項11に記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、パピローマウイルス性状態または肝炎ウイルス性状態を治療する方法。
【請求項１３】
投与が頚部への局所適用を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
投与が表皮への局所適用を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子が美容剤として製剤化される、請求項11に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
核酸分子は、パピローマウイルスまたはB型肝炎ウイルスに感染した細胞に細胞毒性または細胞増殖抑制作用を生ずるのに十分な量が製剤化される、請求項11または15に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
細胞がパピローマウイルスによって形質転換される、請求項16に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
細胞がB型肝炎ウイルスによって形質転換される、請求項16に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
核酸分子が局所投与用に製剤化される、請求項16〜18に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
核酸が軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたはローションに製剤化される、請求項19に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
核酸分子がリポソーム製剤または脂質製剤に製剤化される、請求項11または15〜20のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
パピローマウイルス性状態が、疣、子宮頚部異形成、子宮頚癌、上皮内癌および喉頭パピローマからなる群より選択される、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
投与が上皮細胞に対する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
上皮細胞が、扁平上皮、皮膚上皮および粘膜上皮からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
1つ以上の核酸が、リポソームでの送達のために製剤化される、請求項11および15〜21のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
リポソームが、肝臓に組織特異的に取り込まれることができる、請求項25に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
リポソームがアシアロフェチュイン（asialofetutuin）または1つ以上の糖を使用して修飾される、請求項26に記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、関連HPVまたはHBV株の配列番号：37〜66からなる群より選択される配列または相同配列に生理的条件下において特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸分子の精製調製物に関する。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、好ましくは、本出願の開示内容に同定されている標的部位と、少なくとも約70%または75%または80%または85%または86%または87%または88%または89%または90%または91%または92%または93%または94%または95%または96%または97%または98%または99%一致する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
本発明の他の特定の態様において、コンセンサスリボソーム結合部位（
2004525602.tif 000001
（配列番号：9）ここで、Xは任意のヌクレオチドである）を、毒性剤をコードする核酸のすぐ上流に挿入することができ、毒性剤の発現が増加する。本発明は、毒性剤またはリボザイムの発現を調節するための、プロモーターとリボザイム進入部位とを組み合わせての使用を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
DNAzymeの触媒中心は、RNA基質に対する酵素活性を有する数多くの可能な配列のいずれかから選択することができる。一態様において、触媒中心の配列は、
2004525602.tif 000002
（配列番号：10）である。他の触媒中心の配列は、例えば、Joyceらに付与された米国特許第5,807,718号に開示されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
5.1.6.  核酸の相同性
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルの相同性または同一性は、配列の類似性検索のために適合されているプログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxによって使用されるアルゴリズムを使用したBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析を含む、当業者に周知の任意の方法によって判定することができる（Karlinら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2264-2268およびAltshul、1993、J. Mol. Evol. 36、290-330、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている）。BLASTプログラムに使用される方法は、最初に質問配列とデータベース配列との類似したセグメントを考慮し、次いで同定されている全ての整合の統計的有意さを評価し、最後に予め選択しておいた有意さの閾値を満足する整合だけをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題に関する考察は、参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Altschulら、1994、Nature Genetics 6、119-129を参照。本出願の目的のためには、ヒストグラム（histogram）、記述（description）、アライメント（alignment）、予想（expect）（すなわち、データベース配列との整合を報告するための統計的有意さ閾値）、カットオフ値（cutoff）、行列（matrix）およびフィルター（filter）の検索パラメーターをデフォルト設定に使用することができる。blastp、blastx、blastn、tblastnおよびtblastxによって使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである(参照として全体の内容が本明細書に組み入れられている、Henikoffら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、10915-10919)。blastnでは、スコアリングマトリックスは、N(すなわち、ミスマッチ残基のペナルティスコア)に対するM(すなわち、整合している残基対のリワードスコア)の比で設定され、MおよびNのデフォルトスコアは、それぞれ、5および-4である。4つのblastnパラメーターは以下のように調整された：Q=10(ギャップ形成ペナルティ)、R=10（ギャップ伸長ペナルティ）、wink=1(質問配列の全てのwink番目の位置においてワードヒット（word hit）を形成する)およびgaps=16(ギャップを入れた整列が形成されるウィンドウ幅を設定する)。相当するBlastpパラメーターの設定は、Q=9、R=2、wink=1およびgaps=32であった。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間のベストフィット（Bestfit）比較は、DNAパラメーターGAP=50(ギャップ形成ペナルティ)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティ)を使用し、タンパク質比較の相当する設定はGAP=8およびLEN=2である。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、本出願の開示の標的部位と少なくとも約70%一致する配列である。関連HPVまたはHBV株の相同配列は、さらに好ましくは、本出願の開示内容に同定されている標的部位と、少なくとも75%または80%または85%または86%または87%または88%または89%または90%または91%または92%または93%または94%または95%または96%または97%または98%または99%一致する。例えば、配列番号：44および配列番号：49として同定された標的配列は、関連のHPV株の相同配列である（それぞれ、HPV16およびHPV11）。結果として、関連HPVまたはHBV株の標的部位はそれらの相同性に基づいて同定可能である。相同部位は、関連ウイルスのタンパク質配列を整列させ、ついで相同または対応する標的部位を見つけるために、基礎となる核酸配列を整列させることによっても同定することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
本発明の毒性剤は、寄生虫の成長、細菌、ウイルスの生活周期等に必要な必須の遺伝子、遺伝産物または過程を標的とするように操作することができ、発現は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターで駆動させることができる。本発明の毒性剤またはトランス作用性触媒リボザイムは、多種多様の細胞RNA、腫瘍または癌関連RNA、細菌RNA、寄生虫RNA等を標的とするように操作することができる。例えば、リボザイム標的部位を本明細書において表10、11および12に示す。毒性剤またはトランス作用性リボザイムは、寄生虫の成長、細菌、ウイルスの生活周期等に必要な非細胞性RNAを標的とすることができ、発現は、組織特異的または病原菌特異的プロモーターで駆動させることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
毒性剤の致死試験は、doc、gef、chpBKおよびkicBは全て大腸菌に対して殺菌性であることを明らかにした（図4参照）。詳細には、毒性タンパク質の発現が抑制される条件下においてコロニーを液体培地で増殖させた。IPTGで1時間誘発することによってタンパク質を発現させた後、IPTGを欠損する寒天上で培養物を終夜培養した。コロニーが見られないのは、タンパク質が致死的であることを示している（結果の表3も参照）。構築物を大腸菌に形質転換し、1 mM IPTGが存在する場合または存在しない場合において寒天上で培養した。等量のDNA（500 ng）を緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis)にも形質転換した。模擬の形質転換も「DNAなし」で実施した。+はコロニーが100より多いことを示し、-は検出可能なコロニーがないことを示す。実験は少なくとも2回反復し、同じ結果を得た。全ての薬剤は大腸菌に致死的であったが、docだけは4種全てにおいて毒性であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
【表３】  広域宿主範囲プラスミドを使用した大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis)における毒性タンパク質の評価
2004525602.tif 000003
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
緑膿菌に対する毒性
docおよびchpBKは緑膿菌に毒性であることが証明された。特に注目すべきことは、docはグラム陰性菌（大腸菌および緑膿菌）およびグラム陽性菌（黄色ブドウ球菌およびE.フェーカリス(E. faecalis)）の両方に広域スペクトル活性を有したことである（上記表3参照）。表3からわかるように、毒性剤docは試験した全ての細菌種を死滅させた。doc、gef、chpBKおよびkicBは全て大腸菌を死滅させることができた。chpBKは大腸菌および緑膿菌を死滅させた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５４】
pac部位がpacABCオペロン内に存在している結果として、改変されたファージは、pacase酵素とトランス相補性である必要があった。pacABC相補プラスミドの構成を示す（図10および表4）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５５】
【表４】  pacABC相補プラスミドの構成
2004525602.tif 000004
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
P1ビリオンによる治療薬のインビボ送達
表5に掲載した5匹の動物モデル全てを本明細書において例示する。LD50は、大腸菌および緑膿菌の腹膜炎モデルにおいて確立されており、必要な菌量は多い(107〜108細菌細胞/動物)。さらに、マウスにおけるシュードモナス感染症の嚢胞性繊維症モデルは、この疾患に特徴的な日和見肺感染症を治療するための、本発明の毒性剤および方法の効率を証明するために使用される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
【表５】  原核細胞による遺伝子治療の動物モデル
2004525602.tif 000005
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
第２に、地元の病院の臨床単離株のランダム試料にこの株が存在することは、溶菌性ファージに抵抗性であるが、毒性剤ファージ送達系に感受性である病原菌株ヒト集団中にが存在することを証明した。詳細には、以下の表6に示すように、大腸菌の3つの臨床単離株を、P1 DNAで形質導入される能力（クロラムフェニコール耐性の獲得で示される）および伝達プラスミドDNAで形質される能力（カナマイシン耐性の獲得で示される）について、大腸菌の実験株C600を比較した。3つの臨床単離株は全て伝達プラスミドで形質導入されたが、2つだけがP1で溶原性になった。これらの結果は、ファージ抵抗性機序はP1  ウイルスDNAの形質導入を抑制しており、伝達プラスミドのEC-4細胞への送達を抑制できなかったことを示している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
【表６】  臨床単離株-P1形質導入の感受性
2004525602.tif 000006
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
【表７】  マウスモデルに使用した、以下の様式での治療用製剤
2004525602.tif 000007
総動物数：11２匹のマウス/モデル×2モデル＝224匹のマウス
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
【表８】  用量依存の証明は以下のように実施される
2004525602.tif 000008
総動物数：36匹のマウス/モデル/薬剤×8薬剤×2モデル＝576匹のマウス
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８３】
【表９】  以下の様式での治療用製剤をラットモデルに使用する
2004525602.tif 000009
総動物数：36匹のマウス/薬剤×8薬剤＝278匹のマウス
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９６】
真核細胞の配列を用いる設計を使用して、a)反復B2転写物（B2）；b)RNAポリメラーゼI(po1I)；c)B型肝炎ウイルス(HBV)；d)ソニックヘッジホッグ(SH）e)ヒトパピローマウイルスE6/E7タンパク質(HPV)；f)RNAポリメラーゼII(polII)、g)インスリン様増殖因子1(IGF1)；h) 網膜芽細胞腫タンパク質(RB)；i)およびj)多触媒性プロテイナーゼαサブユニットC3およびC9(それぞれ、C3およびC9）；k)テロメラーゼ(tel)；l)形質転換増殖因子β(TGFβ)、m)カタラーゼ(CAT)；n) ペルオキシソーム増殖結合受容体(PpaTα)；ならびにo)チトクロームP450 1E1(p4501E1)；KiSS-1、NudC、アンドロゲン受容体およびSF-1転写因子も評価した。標的RNA(遺伝子座の名称およびアクセッション番号)ならびに選択された標的部位を示す（表10）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９７】
【表１０】  標的とされたRNAおよび標的部位の要約
2004525602.tif 000010
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９８】
【表１１】  ライブラリー選択によるHPV E6/E7標的RNAの同定される部位
2004525602.tif 000011
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９９】
【表１２】  ライブラリー選択により同定されるHBV RNA上の部位
ヌクレオチドトリプレットおよび部位
2004525602.tif 000012
＊ X75664、X75657、X75665、X75663およびX75658を含むが、これらに限定されない。
# X75664、X75657、X75656およびX75665を含むが、これらに限定されない。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３００】
HBV、Pol IおよびPTEN mRNAの特定の標的部位に向かうリボザイムを構築し、表13および14に掲載する。表13に関しては、接頭語「Rz-」の次の数は関連するmRNAの切断部位を示す。表14は、標的部位に結合するリボザイムのRNA配列に相当する隣接配列を同定している。これらの隣接配列は触媒中心の5'側および3'側に見られ、配列
2004525602.tif 000013
（配列番号：11）を有する。本発明のトリプルリボザイムのシスエレメントは開示されている関連のベクターに見られる。好ましい態様において、2つのリボザイム（同一または異なる）を、両者の間に短い（3〜15 nt）リンカーを入れて組み合わせることができる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０１】
1回の代謝回転条件を使用して、sRzおよびmRzの触媒活性を求めた。少量の[32P]で標識した標的RNAを5 mM MgCl2、20 mM  Tris-HCl( pH 7.4)において37℃において40または200 nM Rzと共に30分間インキュベーションし、切断産物を変性性PAGEで分離した（HBV標的Rzsのインビトロ切断結果は図23および24参照）。sRzのうち3つは、30分間の切断反応中、「高い」活性を示し、40 nM Rzを使用したとき標的RNAの39〜44%を切断し、200 nM Rzを使用したとき標的RNAの48〜71%を切断した。sRzの1つおよびmRzの1つは、「中程度」活性を示し、それらは40 nM Rzにおいて標的RNAの8〜10%または200 nMにおいて10〜15%を切断する。別のmRzは不活性であった。追加の実験において、Rz濃度を1.6 nMに低下しても、活性が高い3つのsRzの切断産物がPAGEにより見られた（データは示していない）。全体として、sRzの92%が効率的な活性レベルを示し、54%は活性が高く、38%は活性が中程度であった。一方、mRzはどれも活性が高くなく、50%は中程度または低い活性を示し、50%は不活性であった（表13）。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０２】
【表１３】  Rzの相対的な触媒活性の要約
2004525602.tif 000014
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０６】
777および885 CLIP構築物を用いた2つの追加の反復実験も、HBVの分泌の顕著な低下を示したが（参照として本明細書に組み入れられている、米国仮出願番号第60/251,810号の図11、パネルE）、HbsAg分泌およびHBV RNA転写物の低下はばらつきが大きかった。関連の実験において、別のHBVリボザイム、pCHOPベクターのシスエレメントから遊離されるとき、配列
2004525602.tif 000015
（配列番号：12）を有するHBV Rz881は、リポソームに複合体形成して（Templetonら、1997)、腹腔内注射するとき、マウス肝臓細胞からのHBV分泌およびマウス肝臓細胞におけるHBV複製を低下することが示されている。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０８】
【表１４】  リボザイム隣接配列
2004525602.tif 000016
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１７】
HPV16-Dz57と名づけられる、HPV16に特異的なDNAzymeの好ましい態様は以下のようである：
2004525602.tif 000017
（配列番号：36）
触媒中心に下線をつけ、隣接5'側および3'側配列は、生理的条件下において、配列番号：37として同定される標的配列にハイブリダイズする。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１８】
一般に、本発明のDNAzymeは、触媒中心の配列に5'側および3'側隣接配列を加えることによって作製した。5'側および3'側隣接配列は、関心のある標的配列に相補的であるように設計される。例えば、表15に同定されている標的配列（配列番号：37〜66）は、開示されている標的部位の各々に特異的なDNAzymeを設計するために使用することができる。表15は、標的mRNAのセンス方向に相当するDNA配列を示す。表16のDNAzymeは、表15の逆相補性である隣接配列を有する。各標的配列（配列番号：37〜66）の下線は、DNAzymeによって標的部位に相当するRNAが切断される切断部位である。本発明のDNAzymeは、特定の標的配列中の関心のある下線をつけた切断部位に隣接するがこれを含まない核酸を同定し、切断部位に隣接する標的配列に結合する相補的核酸配列を設計することによって設計される。相補的配列は、当技術上周知の技法を使用して化学的に合成し、DNAzymeの触媒中心の5'および3'末端に結合することができる。DNAzymeの触媒中心の5'および3'末端に結合する相補的核酸配列は、5'側および3'側隣接配列が生理的条件下において関心のある標的部位に特異的にハイブリダイズするので、関心のある標的部位に特異性を提供する。DNAzymeの触媒中心に結合する5'側および3'側隣接配列は、6〜15ヌクレオチド長であってもよく、さらに好ましくは、それらは7〜10ヌクレオチド長であってもよく、さらにより好ましくは、それらは8〜9ヌクレオチド長であってもよい。本発明の特定の態様において、表16に記載のするDNAzyme（配列番号：67〜79）は、それぞれ、配列番号：37〜49として開示されているHPV標的配列に特異的であるように設計される。当業者に明らかであるように、本出願の標的配列に特異的であるDNAzymeの設計は、上記に詳細に記載されている方法を使用して実施することができる。本明細書の具体的な例示は本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１９】
【表１５】  標的配列
2004525602.tif 000018
2004525602.tif 000019
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
【表１６】  HPV標的に特異的なDNAzyme。各配列の下線をつけた太字の部分は、DNAzymeの触媒中心であり、5'側および3'側隣接配列は標的配列にハイブリダイズする。
2004525602.tif 000020
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２１】
11.  実施例：遺伝子組換えマウスのHBV部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
以下の表17〜22のデータに示すように、DNAzyme
2004525602.tif 000021
配列番号：80）またはその触媒的に不活性な相対物（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド、
2004525602.tif 000022
（配列番号：81））は、ヒトHBVを発現する遺伝子組換えマウスにおいて、すなわち、インビボにおいてHBV複製および分泌を低下する際に効果的であった。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２２】
【表１７】  HBV遺伝子組換えマウスにおける血清HBVゲノム等価物に対するDNAzyme(Dz879)または触媒的に不活性な相対物(m879)の影響
50 ugのDz879またはm879を、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で、1週間あたり2回、2週間投与し、最後の治療の48時間後に屠殺した。明らかなように、Dz879およびm879は共に、2週間の処置後インビボにおいてHBV分泌の低下に効果的であった。しかし、おそらくアシアロフェチュインに対する免疫応答のため、この影響は5週間後には低下した。
2004525602.tif 000023
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２３】
【表１８】  HBV遺伝子組換えマウスの肝臓におけるHBVコア（Core）Agに対するDz879およびm879の影響
Dz879およびm879は、記載されているように、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で投与した。肝組織を採取し、固定し、処理し、中心静脈周囲においてHBVコア抗原について免疫組織化学的分析を実施した。明らかなように、2週間後、HBVコア抗原の染色は劇的に低下した。また、染色の強度も大幅に低下し、細胞質染色数によって示されるものよりさらに顕著な影響を示している。
動物：雌遺伝子組換えマウス（初代細胞 1.3.32）
処置計画：2回/１週間、（火曜日、金曜日）×2または5週間
ウイルス：ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路：腹腔内注射
薬剤：ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間：2または5週間
2004525602.tif 000024
ａ 染色された細胞質数/中心静脈内腔の総細胞数  平均5本の血管を計数した。
ｂ 各処理群の動物数
ｃ 最初の処理後の日数
＊ 未処理と比較して、P<0.05
＊＊＊ 未処理と比較して、P<0.001。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２４】
【表１９】  HBV遺伝子組換えマウスにおけるHBV RNA転写物に対するDz879およびm879の影響
Dz879およびm879は、記載されているように投与し、肝組織をRNA
について抽出した。RNAは、ノーザンブロット分析およびその次に実施したデンシトメトリーによって分析した。結果は、HBV RNA転写物レベルの顕著な低下を示した（細胞培養物の結果の場合と同様に、全ての転写物）。
動物：雌遺伝子組換えマウス（初代細胞 1.3.32）
処置計画：2回/１週間、（火曜日、金曜日）2週間
ウイルス：ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路：腹腔内注射
薬剤：ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間：2または5週間
2004525602.tif 000025
ａ ノーザンブロット分析±標準偏差を使用して、HBV RNAの平均シグナルをGAPDHハウスキーピング遺伝子のシグナルで割ったもの
ｂ 各処理群の動物数
＊ 未処理と比較して、P<0.05
注：5週間処理群のRNA試料は強度が低く、測定困難であった。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２５】
【表２０】  遺伝子組換えマウスのHBV肝臓DNAに対するDz879およびm879の影響
Dz879およびm879は、アシアロフェチュインコーティングしたリポソームの形態で投与した。肝組織をDNAについて抽出し、HBVゲノムDNAをクロスオーバーPCRで定量した。Dz879およびm879の投与により、HBV肝DNAは劇的に低下した。
動物：雌遺伝子組換えマウス（初代細胞 1.3.32）
処置計画：2回/１週間、（火曜日、金曜日）×2または5週間
ウイルス：ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路：腹腔内注射
薬剤：ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間：2または5週間
2004525602.tif 000026
ａ 各処理群の動物数
ｂ 最初の処理後の日数
ｃ 別の実験の対照(ISA-2、対照)
ｄ 不良調製試料、不良結果
＊ 未処理と比較して、P<0.05
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２６】
【表２１】  遺伝子組換えマウスにおけるHBV肝DNAに対するDz879または対照DNAzymeの影響
これは、肝HBV DNAに対するDNAzymeの顕著な影響を示す反復実験を示す。さらに別の実験は、DNAzymeの触媒中心またはオリゴヌクレオチドから一リン酸ヌクレオチドへの迅速な分解が偽薬群において観察される影響の一因であるかどうかを判定するために実施されている。遺伝子発現分析は、例えば、デオキシシチジンキナーゼの発現の増加を示すと同時に、サイトカインがそれらの影響の原因でないことを示している。
動物：雌遺伝子組換えマウス（初代細胞 1.3.32）
処置計画：以下参照
ウイルス：ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路：腹腔内注射
薬剤：ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間：3週間
2004525602.tif 000027
ａ 各処理群の動物数。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２７】
【表２２】  遺伝子組換えマウスにおけるHBVコア抗原染色に対するDz879または対照DNAzymeの影響
動物：雌遺伝子組換えマウス（初代細胞 1.3.32）
処置計画：以下参照
ウイルス：ヒトB型肝炎ウイルス
処置経路：腹腔内注射
薬剤：ペンシルバニア州で製造され、USUに送付
実験期間：3週間
2004525602.tif 000028
ａ 各処理群の動物数。
ｂ 最初の処理後の日数
＊ P<0.05、群17と比較
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２８】
12.  実施例：ワタオウサギにおけるパピローマ増殖を阻止するためのマルチリボザイムの用途
DNAzymeを、モデルのワタオウサギ系においても試験した。ワタオウサギの一部の皮膚を軽く剃毛し、 ショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)の懸濁液を適用した。10日目以降、DNAzymeの生理食塩液を、30μg/日で、4週間局所適用し、次いで60μg/日をさらに2週間局所適用した。以下のDNAzymeを個別に、および混合物として試験した：群L1(配列番号：82)、群L2(配列番号：83)、群L3(配列番号：84)。DNAzymeの標的部位は、以前に同定されたHPV部位との相同性によって選択した。触媒機能が欠損しているDNAzyme（群mL2、配列番号：85）も試験した。次いで、パピローマを測定し、平均容積を算出した。図25に示すように、個々のDNAzymeおよび触媒機能が欠損したDNAzymeは、パピローマ増殖阻止に効果的ではなかった。しかし、3つのDNAzyme全ての混合物（L1/L2/L3）は、パピローマ増殖の低下に効果が高かった。
2004525602.tif 000029
(配列番号：82)は、ヌクレオチド614に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)（GenBank（商標）アクセッション番号AJ404003）のLS1DNAzymeである。
2004525602.tif 000030
(配列番号：83)は、ヌクレオチド935に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)（GenBank（商標）アクセッション番号AJ404003）のLS2DNAzymeである。
2004525602.tif 000031
(配列番号：84)は、ヌクレオチド1006に切断部位を有するショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)（GenBank（商標）アクセッション番号AJ404003）のDNAzyme、LS3である。
2004525602.tif 000032
(配列番号：85)は、ショープ乳頭腫ウイルス(Shope papilloma Virus)（GenBank（商標）アクセッション番号AJ404003）の触媒機能欠損DNAzyme、mLS2である。