【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
【図１Ａ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO癌細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、0.5 μMの各オリゴヌクレオチド（AS5、AS6、AS7、AS8、AS9、AS10）、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図１Ｂ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、それぞれAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチド（0.1 μMまたは0.5 μM）で、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図１Ｃ】EGFRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したGEO細胞におけるEGFR発現を示すウェスタンブロット。GEO細胞を、それぞれAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチド（0.1 μMまたは0.5 μM）で、または0.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで3日間処理した。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトEGFRアクチビンモノクローナル抗体で選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図２Ａ】AS23オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する成長抑制作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図２Ｂ】AS24オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する成長阻害作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図２Ｃ】スクランブル配列を有する対照オリゴヌクレオチドの、軟寒天上で成長させたヒト癌細胞系列GEO、ZR-75-1、OVCAR-3、およびMCF-10A rasに対する作用を示す、細胞培養アッセイ法の結果。
【図３Ａ】スクランブル配列オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン1）；AS23オリゴヌクレオチド（0.1 μM、レーン2）；AS23オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン3）；MAb C225（1 μg/ml、レーン4）；またはMAb C225（5 μg/ml、レーン5）で3日間処理したGEO癌細胞におけるp27の発現を示すウェスタンブロット。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を12% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトp27 MAbで選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬を用いて可視化した。
【図３Ｂ】スクランブル配列オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン1）；AS23オリゴヌクレオチド（0.1 μM、レーン2）；AS23オリゴヌクレオチド（0.5 μM、レーン3）；MAb C225（1 μg/ml、レーン4）；またはMAb C225（5 μg/ml、レーン5）で3日間処理したZR-75-1癌細胞におけるp27の発現を示すウェスタンブロット。等量（50 μg/レーン）のタンパク質抽出物を12% SDS-PAGEで分離し、抗ヒトp27 MAbで選び出した。免疫反応タンパク質は、増強化学発光（ECL）試薬で可視化した。
【図４Ａ】ヒトGEO癌細胞をAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドで処理したときのプログラム細胞死の用量依存的な誘導を示す棒グラフ。GEO細胞を、各用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモノクローナル抗体で3日間毎日処理した（0.1 μM AS23（バー1）；0.5 μM AS23（バー2）；1 μM AS23（バー3）；2.5 μM AS23（バー4）；0.1 μM AS24（バー5）；0.5 μM AS24（バー6）；1 μM AS24（バー7）；2.5 μM AS24（バー8）、0.25 μg/ml MAb C225（バー9）；0.5 μg/ml MAb C225（バー10）；1 μg/ml MAb C225（バー11）；5 μg/ml MAb C225（バー12）。C＝無処理対照、S＝2.5 μMのスクランブル配列オリゴヌクレオチドで処理した細胞）。アポトーシスの解析は、処置を開始してから4日後に実施した。データは、4回の実験の平均（±標準偏差）を示す。
【図４Ｂ】ヒトZR-75-1癌細胞をAS23オリゴヌクレオチドおよびAS24オリゴヌクレオチドで処理したときのプログラム細胞死の用量依存的な誘導を示す棒グラフ。GEO細胞を、各用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモノクローナル抗体で3日間毎日処理した（0.1 μM AS23（バー1）；0.5 μM AS23（バー2）；1 μM AS23（バー3）；2.5 μM AS23（バー4）；0.1 μM AS24（バー5）；0.5 μM AS24（バー6）；1 μM AS24（バー7）；2.5 μM AS24（バー8）、0.25 μg/ml MAb C225（バー9）；0.5 μg/ml MAb C225（バー10）；1 μg/ml MAb C225（バー11）；5 μg/ml MAb C225（バー12）。C＝無処理対照、S＝スクランブル配列オリゴヌクレオチド（2.5 μM）で処理した細胞）。アポトーシスの解析は、処置を開始してから4日後に実施した。データは、4回の実験の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ａ】シスプラチンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｂ】ドキソルビシンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｃ】パクリタキセルと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図５Ｄ】トポテカンと組み合わせたときのAS23（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のEGFR-ASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ａ】シスプラチンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｂ】ドキソルビシンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｃ】パクリタキセルと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【図６Ｄ】トポテカンと組み合わせたときのAS24（0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM）が、軟寒天上におけるGEO細胞の成長に及ぼす成長抑制作用を示す図。細胞を各濃度の細胞毒性薬で1日目に処理した後に、各濃度のASオリゴヌクレオチドで2〜4日間毎日処理した。コロニーの数を10〜14日後にカウントした。データは3回の異なる実験（各3回実施）の平均（±標準偏差）を示す。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> HYBRIDON, INC.
<120> EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES
<130> HD-A0309
<140> JP   2002-587576
<141> 2002-05-07
<150> US   60/289,055       
<151> 2001-05-07  
<150> US   60/289,149       
<151> 2001-05-07  
<160> 29
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 1
acactgcctg agagttgccc                                             20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 2
ccatcaccac ctcacacctc                                             20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 3
ggtcttggtc aatgtctggc                                             20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 4
tctacttcca tcttgtcagg                                             20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 5
gtccactctt gtcctcaatg                                             20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 6
tccaacactt gaccatcacc                                             20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 7
ctggctccag ctctacttcc                                             20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 8
tggactgtgc cttctcctcc                                             20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 9
gctctcatct cttcataccc                                             20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 10
ctcttcttga cagtctgatg                                             20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 11
actttaatgc agactggaat                                             20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 12
gtcctcaatg actttaatgc                                             20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 13
agcttgaaaa ctctgccgtc                                             20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 14
tatgatctgt cacagcttga                                             20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 15
ttgctcagat gctgggcagg                                             20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 16
cttcataccc ttgctacgat                                             20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 17
cccctgaaaa gctctcatct                                             20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 18
cctgatgtcc aggcccctga                                             20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 19
ggaaacaaag gcacacataa                                             20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 20
cagtctgatg ggaaacaaag                                             20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 21
cctccctttc ctcttcttga                                             20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 22
tgctaggttt cctccctttc                                             20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic hybrid DNA-RNA 20-mer oligonucleotide
<400> 23
uaugatctgt cacagcuuga                                             20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic hybrid DNA-RNA oligonucleotide
<400> 24
ugctaggttt cctcccuuuc                                             20
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 25
actcctccat actga                                                  15
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 26
acaagtatca gagcc                                                  15
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 27
gtggtggtag cagagctgcc tattg                                       25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic oligonucleotide directed to different regions of
EGFR mRNA
<400> 28
tgacacagga tgtttgatcc accac                                       25
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> synthetic hybrid DNA-RNA oligonucleotide
<400> 29
ucgcacccat ctctctccuu c                                           21