(57)【要約】食物アレルギー応答に関連する遺伝子の塩基配列のうち、少なくとも一部の塩基配列にハイブリダイズすることができる塩基配列を含む、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用オリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドが基盤に配置された、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用マイクロアレイ、ならびに該マイクロアレイを用いたアレルギー性の判定方法。
2008069342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食物アレルギー応答に関連する遺伝子の塩基配列のうち、少なくとも一部の塩基配列にハイブリダイズすることができる塩基配列を含む、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
食物アレルギー応答に関連する遺伝子が、ＩＬ−１α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１８遺伝子、ＣＣＬ２遺伝子、ＣＣＬ３遺伝子、ＣＣＬ４遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子及びＴＮＦα遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定が、Ｉ型アレルギー又はＩＶ型アレルギーに対するものである請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが基盤に配置された、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用マイクロアレイ。
【請求項５】
複数の貫通孔を有し、それら貫通孔にゲルが保持されているマイクロアレイであって、前記ゲルに請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが保持されている、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用マイクロアレイ。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドプローブが１０００種類以下である、請求項４又は５に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
以下の工程を含む、被験物質のアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性の判定方法：
（１）  被験物質を実験動物に投与し若しくは接触させ、及び／又は被験物質を細胞に接触させる工程、
（２）  実験動物及び／又は細胞から生体関連物質を抽出する工程、並びに
（３）  前記生体関連物質又はその調製物を、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ又は請求項４〜６のいずれかに記載のマイクロアレイに接触させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品成分のアレルゲン性及び／又はアレルギー性を判定するために用いられるオリゴヌクレオチドプローブ及びそれらが配置されたマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食経験のない作物の食品への導入や、特定食品の消費量の増加など、食生活の変化に伴い、食物アレルギーの危険性が増大しつつある。現在、日本人の１〜３％程度は、食物アレルギーの患者であると推定されている（国民生活センター）。また、食の安全性及び信頼性に関する消費者のニーズは年々拡大してきており、特にアレルゲンの含有に関しては、特定物質について加工食品の原材料表示が義務づけられている。このように、食品中のアレルゲンと安全性の関係は深刻化しつつあるのが現状であり、未知のアレルゲンに対する簡便で再現性の良いアレルゲン性の判定法の開発が必要とされている。
また、アレルギー患者の増大に伴い、食品に含まれる成分には、安全性の高いアレルギー抑制又は緩和作用を有するものであることが求められており、食品のアレルギー惹起作用を科学的に解明し、アレルギーを起こさない食品の開発を目指すことも重要である。
従来、アレルゲン性の判定法としてはＥＬＩＳＡ法が用いられていた。しかしながら、この方法は既知のアレルゲン性物質を検出するに止まり、未知の物質についてはアレルゲンを検出することができない。このため、食されたことが全くない未知の作物のアレルゲン性を判定するには、長期間の動物への投与により推測する以外に方法が無く、簡便なアレルゲン性の判定法はこれまでに知られていない。また、食品成分のアレルゲン性や抗アレルギー作用を判定する場合、種々の食品の複合的効果、すなわち複数の食品を併用して食するとアレルゲン性が変化するという効果について考慮する必要があるが、これをＥＬＩＳＡ法で行うことは実質上困難であり、このような変化を確認するには、複数の遺伝子の発現挙動を解析することで初めて可能となると考えられる。
近年、ヒトゲノム解読を初めとする生物ゲノム情報に関する研究の進展は著しく、特に医療の分野ではこの情報を応用して実際の診断又は治療活動に活かすべく、ポストゲノム研究が極めて盛んに行われている。このポストゲノム研究やその応用分野において、極めて有効なツールとして認識されているものは、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップとも呼ぶ）である。ＤＮＡマイクロアレイとは、微少な面積を有する区画に多数の遺伝子断片を貼り付けたツールであり、核酸同士のハイブリダイゼーション反応によってある試料中の遺伝子断片の有無や量等を検出することで、複数の遺伝子の発現挙動を簡便に解析することが可能である。
ＤＮＡマイクロアレイは、現在、フォトリソグラフィー法やスポッティング法により製造されたものが主に研究用ツールとして使用されているが、繊維と樹脂の技術を応用した本出願人独自のプラットフォームとして「繊維型ＤＮＡマイクロアレイ（商品名ジェノパール）」（文献１〜３）が開発され上市されている（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｇｅｎｏｍｅ／）。この繊維型ＤＮＡマイクロアレイは、独自の製造方法の採用により、高精度のＤＮＡマイクロアレイを低コストで大量生産できる点が特徴である。また、アレイの製造工程における操作は熟練を必要としないため、検査従事者の個人差などによる検査結果のばらつき等がなく、さらには実験動物毎の個体差を加味する必要がない。したがって、上記繊維型ＤＮＡマイクロアレイを使用すると正確なデータを簡便に取得することができる。
ところで、アレルギーの発症や抑制に関わる研究として、これまでに、アレルギー抑制効果に関わる炎症性サイトカイン産生抑制効果や脱顆粒抑制効果等を示す食品成分を明らかにすると共に、その詳細な作用機構の検討及び解明が進められている（文献４）。その結果、アレルギーの発症や抑制に関連する遺伝子に関する基礎的な知見が得られている。
近年、遺伝子組み換え食品や食に供されたことがない物質の中には、アレルゲン性や抗アレルギー性が未知のものが多い。しかしながら、これらの食品等は市場に多く流通しているのが現状である。従って、食品のアレルゲン性及び抗アレルギー性を知ることは、アレルギー体質を有する者にとって極めて重要である。これらのアレルゲン性等を有するか否かは、数ヶ月以上にわたりアレルギー性未知の食品等を実験動物に長期継続投与して、アレルギー症状を観察することによって判断される。しかし、このように時間を費やす検討を行っても、得られる結果は推測の域を超えなかった。
参照文献
１．特許第３５１５４７０号明細書
２．特許第３５１０８８２号明細書
３．特許第３５１５５７０号明細書
４．Ｋｏｂｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，１１（１）１２３−１３０（２００４）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、食品成分のアレルゲン性又は抗アレルギー性を判定する簡便かつ再現性の高い遺伝子群の提供及びそれらが配置されたＤＮＡマイクロアレイを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、食品成分によるアレルギーの発症又は抑制に関する知見と、ＤＮＡマイクロアレイ技術とを組み合わせることで、食品成分のアレルゲン又は抗アレルギー性を再現性良く判定する効率的で簡便かつ再現性の高い遺伝子群を見出した。また、それらが配置されたＤＮＡマイクロアレイを開発することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は食物アレルギー応答に関連する遺伝子の塩基配列のうち、少なくとも一部の塩基配列にハイブリダイズすることができる塩基配列を含む、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用オリゴヌクレオチドプローブである。
食物アレルギー応答に関連する遺伝子としては、例えばＩＬ−１α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１８遺伝子、ＣＣＬ２遺伝子、ＣＣＬ３遺伝子、ＣＣＬ４遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子及びＴＮＦα遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。また、本発明において、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定は、例えばＩ型アレルギー又はＩＶ型アレルギーに対するものである。
さらに、本発明は、上記オリゴヌクレオチドプローブが基盤に配置された、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用マイクロアレイである。
さらに、本発明は、複数の貫通孔を有し、それら貫通孔にゲルが保持されているマイクロアレイであって、前記ゲルに上記オリゴヌクレオチドプローブが保持されている、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用マイクロアレイである。
本発明のマイクロアレイにおいて、オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは１０００種類以下である。
さらに、本発明は、以下の工程を含む、被験物質のアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性の判定方法である：
（１）  被験物質を実験動物に投与し若しくは接触させ、及び／又は被験物質を細胞に接触させる工程、
（２）  実験動物及び／又は細胞から生体関連物質を抽出する工程、並びに
（３）  前記生体関連物質又はその調製物を、前記オリゴヌクレオチドプローブ又は前記マイクロアレイに接触させる工程。
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための単なる例示であって、本発明をこの実施形態にのみ限定することは意図されない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することが可能である。
なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。
本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−３２７８５２号明細書の内容を包含する。
本発明により、食品成分によるアレルギー発症又は抑制作用の有無を効率的かつ効果的に判定をすることができるオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイが提供される。また、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイは、未知の食品成分のアレルゲン性を判定又は検査したり、機能性食品成分の開発段階におけるアレルゲン性又は抗アレルギー性作用を判定するための簡便なツールとしても使用することができる。
本発明において、食品成分のアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性の判定方法は、数日から数週間程度の短い期間にアレルギー性の未知の食品等を投与した実験動物又は培養細胞から核酸を抽出し、これを本発明で見出した遺伝子群やそれらを配置したマイクロアレイに接触させることを特徴とする。本発明の方法により、アレルギー性等の評価の短時間化、省力化、結果の安定化が実現し、さらに、数種の食品の複合効果を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＴＰＣＫで発現抑制された遺伝子群を示す図である。
図２は、ＬＰＳ及びＯＶＡを用いてアレルギー惹起の様子を判定した結果を示す図である。
図３は、ＬＰＳ及びＯＶＡを用いてアレルギー惹起の様子を判定した結果を示す図である。
図４は、ＬＰＳ及びＰＭＡを用いてアレルギー惹起の様子を判定した結果を示す図である。
図５は、ＬＰＳ及びＰＭＡを用いてアレルギー惹起の様子を判定した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、アレルゲンを含む食品又はアレルゲンを含むと思われる食品候補物質を食し、又はこれら食品等に接触したときに変動する遺伝子に着目することにより完成されたものであり、これらの遺伝子又はその一部にハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが配置されたマイクロアレイに関するものである。すなわち、本発明は、複数の食物アレルギー応答に関連するオリゴヌクレオチドプローブが配置されたマイクロアレイである。
「食物アレルギー応答」とは、経口摂取若しくは経鼻吸入された食物成分、又は皮膚に接触した食物成分が原因となって過剰な免疫応答を起こし、食物を摂取等した個体において種々の体調の異常を誘起する障害反応をいう。食物アレルギーには、（ａ）アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体により即時型の症状を引き起こすもの、あるいは（ｂ）アレルゲン特異的炎症性Ｔ細胞、好酸球又はマクロファージによる遅延型の腫脹又は組織破壊を起こすものがある。食物アレルギーは、消化管、気道、皮膚に発症し易く、特にアトピー性皮膚炎と深く関連すると考えられている。ここで、アレルゲンを含む食物としては、例えば卵、乳、食肉（牛肉、鶏肉、豚肉等）、穀物（大豆、米、小麦、ソバ、ゴマ、落花生等）、やまいも、魚介類（あわび、いか、いくら、えび、かに、さけ、さば等）、果物（オレンジ、キウイフルーツ、もも、りんご、いちじく等）などが挙げられる。
また、アレルゲンとしては、例えば、卵においてはオボアルブミン、オボムコイドなど、乳においてはカゼイン、βラクトグロブリンなど、小麦においてはグリアジン、αアミラーゼインヒビターなど、落花生においては２Ｓアルブミンなど、魚介類においてはパルブアルブミン、トロポミオシンなどが挙げられる。
本発明において、「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、アレルギー応答の促進又は抑制に関連して発現量が変化する遺伝子を検出するための探査針となるものをいう。このようなプローブとして、例えばアレルゲンを有する食物の摂取によって免疫応答が生じ、アレルギー物質が産生されるときに発現量が変化する遺伝子、あるいはアレルギー反応を抑えるために抑制物質が産生されるときに発現量が変化する遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドが挙げられる（以下、プローブという）。
検出の目的となる遺伝子は、アレルギー応答の促進又は抑制に関連して発現量が変化する遺伝子等であれば特に限定されるものではないが、各種サイトカイン、ヒスタミン等に関連する遺伝子群であることが好ましい。とりわけ、食物アレルギーとして代表的なＩ型アレルギー及びＩＶ型アレルギーを判別するのに有用な最小単位の遺伝子群である。
ここで、「Ｉ型アレルギー」とは、抗原（アレルゲン）との接触後即座に反応が起こるアレルギーである。ＩｇＥクラスの抗体は、そのＦｃ部で肥満細胞上のＦｃεレセプターに結合する。これに抗原が結合すると、Ｆｃレセプター同士が抗原分子を通して結合する。これにより、肥満細胞からヒスタミンが細胞外に放出され、ロイコトリエン、血小板活性化因子などのケミカルメディエーターが合成及び放出される。ケミカルメディエーターは、血管透過性亢進、平滑筋収縮、白血球走化などをもたらし、その結果組織反応によって症状が発現する。
「ＩＶ型アレルギー」とは、抗体の関与なしに抗原とＴ細胞との反応によってもたらされる組織傷害をいう。Ｔ細胞がインターロイキン（ＩＬ）等のリンホカインを産生し、これによりマクロファージや好中球の浸潤、血管透過性亢進による血漿の滲出、繊維芽細胞の増殖などがもたらされる。
本発明においては、このようなアレルギーに関連する遺伝子群を対象とする。これらの遺伝子群としては、ＩＬ−１（インターロイキン）α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＩＬ−８遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子、ＩＬ−１８遺伝子、ＣＣＬ２（ケモカイン）遺伝子、ＣＣＬ３遺伝子、ＣＣＬ４遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＰＴＧＳ２（プロスタグランジン−エンドペルオキシド合成酵素２）およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子）α遺伝子が好ましく、より好ましくは、ＩＬ−１α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１８遺伝子、ＣＣＬ２遺伝子、ＣＣＬ３遺伝子、ＣＣＬ４遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子及びＴＮＦα遺伝子である。これらの遺伝子は、その１種又は複数種を組み合わせて用いることができる。好ましくは、これらの遺伝子すべての挙動を観察し判定に使用する。
本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、これら遺伝子の塩基配列のうち、少なくとも一部の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。すなわち、本発明のプローブは、上記遺伝子の塩基配列に対して相補的となるように設計され、被験試料中の遺伝子とのハイブリダイゼーションを行なったときにハイブリダイズすることができるものを意味する。
このようなプローブは、上記遺伝子のｃＤＮＡを調製し、そのままマイクロアレイに配置しても良い。しかし、タンパク質やペプチドの種類が異なっていても、それらのタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡの中には塩基配列が類似する領域が存在することがある。したがって、選択したプローブの塩基配列によっては、配列が互いに類似する場合が生じ、そのような塩基配列では複数の遺伝子を区別して検出することができない。そのため、プローブは、目的遺伝子に特異的な塩基配列となるような領域を選択してその領域の塩基配列を設計することが好ましい。プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加えて、３末端からの距離が１５００塩基以内であり、Ｔｍ（融解温度）が６０〜８０℃であること、プローブ中のＧＣ塩基含量が４０〜６０％、及び二次構造の形成しやすさを加味した上で設計を行うことが好ましい。これらの条件については後述する表１に示されている。
前記の塩基配列を設計するためには、配置するプローブの由来となる遺伝子間において、塩基配列同士のホモロジーを既存のプログラムを用いて検索し、相同性の低い箇所を選択すればよい。プローブの塩基配列を設計するに際して選択し得る相同性は３０％以下であり、好ましくは２５％以下、さらに好ましくは１０％以下である、ここで、設計されるプローブの長さは１０〜２００塩基、好ましくは１０〜１００塩基である。プローブは、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成することにより作製することができる。そのようなプローブは例えば、Ｐｒｏｂｅ  Ｑｕｅｓｔ（登録商標：ダイナコム社製）により設計することができる。
プローブは、上記のとおり試料とのハイブリダイゼーションをおこなったときに検出目的遺伝子とハイブリダイズすることができるものである。したがって、プローブを設計する際に、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを考慮する必要がある。ストリンジェンシーをある程度緊密にすることによって、遺伝子間で類似する塩基配列領域が存在しても、他の異なる領域を区別してハイブリダイズすることができる。また、遺伝子間の塩基配列がほとんど異なる場合は、ストリンジェンシーを緩やかに設定することができる。
このようなストリンジェンシーの条件としては、例えば緊密条件の場合は６５℃〜６８℃の条件下でのハイブリダイゼーションであり、ゆるやかな条件の場合は３７℃から５５℃の条件下でのハイブリダイゼーションである。
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５０℃」、「０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、４２℃」、「０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、６５℃」、「０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、６８℃」、「０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．０６Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、６５℃」等の条件を挙げることができる。
より詳細には、プローブを添加して１時間以上６５℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０中、６５℃で２０分の洗浄を４回、最後に、０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２Ｍ  ＮａＣｌ、６５℃で１０分の洗浄を１回行う方法もある。ハイブリダイゼーション、あるいは洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件を設定することができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））等を参照することができる。
本発明において、検出目的遺伝子の塩基配列は、上記した各遺伝子の塩基配列そのものである必要はなく、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。したがって、検出目的遺伝子は、上記表に記載の配列番号により示される塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれの遺伝子の活性（インターロイキン１としての活性、ＣＣＬ１としての活性等）を有する変異型遺伝子も対象とすることができ、プローブは、このような変異型遺伝子の塩基配列を基礎として設計することもできる。「ストリンジェントな条件」は、前記と同様の条件を適用することができる。
上述の「プローブ」は、基盤に複数配置される。プローブが配置された基盤は一般的にＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイと称される。基盤としては、ガラス板、樹脂板、シリコン板等が挙げられる。配置の方法としては、基盤を予め化学修飾することにより基盤表面に官能基を露呈させ、その官能基に対してスポッティングによりプローブを配置する方法（スポッティング法）、あるいはシリコン基盤状に光誘起固層反応によって逐次プローブを合成する方法（フォトリソグラフィー法）が知られている。
また、複数の貫通孔を有し、それら貫通孔にゲルが保持されているマイクロアレイ（以下、貫通孔アレイと称す。）も好適に使用される。貫通孔アレイとは、例えば、以下の方法により製造できる（特開２０００−７８９９８号参照）。
（１）  樹脂製のブロックにレーザー等で平行の穴が形成されるように穿つ。
（２）  その穴にプローブを含むゲル前駆体溶液を導入し、穴内でゲル化反応を実施する。
（３）  樹脂製ブロックを穴を横切断する方向で切断を繰り返す。
また、貫通孔アレイの好ましい例としては、中空繊維型マイクロアレイが例示できる（特開２０００−２４５４６１号公報、特開２００１−２３９５９４号公報、特開２００３−３４４４００号公報参照）。中空繊維型マイクロアレイは高精度で低価格なマイクロアレイを実現することができるため、本発明では中空繊維型マイクロアレイを用いることが好ましい。中空繊維型マイクロアレイは、例えば以下の工程を順次行うことにより製造できる。
（１）  中空繊維を目的の配列パターンと同一パターンの孔を有する複数個の治具の孔に通すことで繊維を整列させる。
（２）  治具の間隔を目的の幅に広げた後、繊維間にマトリクス樹脂を充填して繊維束を固定する。これにより、繊維束が樹脂により固定されたブロック（配列体）を得ることができる。
（３）  各繊維の中空部に、プローブを含むゲル前駆体溶液を導入し、中空部内でゲル化反応を実施し、ゲルにプローブを固定する。
（４）  繊維の長手方向と交叉する方向で切断する。
この切断は、ブロックを長手方向と交叉する方向でスライスすることを意味し、これにより、配列体の薄片を得ることができる。この薄片の繊維部分にプローブが固定されている。
上記繊維型マイクロアレイの製造方法は、特開２００１−２３９５９４号公報に記載されており、当該公報を参照することにより繊維型マイクロアレイを製造することができる。またその中空部にはアクリルアミド等のゲルが保持され、オリゴヌクレオチド（プローブ）はそのゲルに固定（保持）されていることが好ましい。そのような固定により、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面マイクロアレイに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。
さらにマイクロアレイに配置されているプローブの種類の数は、一マイクロアレイ上（中）に１０００種類以下、好ましくは５００種類以下、さらに好ましくは２５０種類以下が好ましい。このように配置された遺伝子数を制限することにより、本発明で見出した上述の遺伝子をより高感度で検出することが可能となる。ここで、本明細書において、プローブの種類は塩基配列によって区別される。したがって、同じ遺伝子由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。
次に被験物質のアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性の検査方法について説明する。
本発明は、以下の工程を含む、被験物質のアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性の検査方法である。
（１）  被験物質を実験動物に投与若しくは接触させ、及び／又は被験物質を細胞に接触させる工程、
（２）  実験動物及び／又は細胞から生体関連物質を抽出する工程、並びに
（３）  前記生体関連物質又はその調製物を、上述のオリゴヌクレオチド又はマイクロアレイに接触させる工程。
「アレルゲン性」とは、摂食時にアレルゲンとして機能し、結果としてアレルギー応答を引き起こす食品の性質をいう。「アレルゲン」とは、アレルギー反応を引き起こす原因物質をいう。アレルゲンはマクロファージにより処理されて抗原認識Ｔ細胞に提示され、抗原特異的なＴ細胞や抗体産生を誘導する。なお、誘導される細胞又は抗体の種類、及びアレルギー反応の症状は、感作される生体側の条件により（例えば、遺伝子要因、栄養状態）、あるいはアレルゲンの侵入経路により異なる。
「抗アレルギー性」とは、アレルギー応答を抑制する性質を意味する。このアレルギーの応答には数多くのステップが含まれるため、それぞれのステップにおいてアレルギーを抑制できる可能性がある。従って、抗アレルギー性を有する物質は、アレルギー応答を抑制する限り、アレルギーの発症のいかなるステップに機能してもよい。抗アレルギー性を有する成分を含む食物としては、例えば、茶などが挙げられ、抗アレルギー性を有する成分としては、緑茶カテキンなどが挙げられる。
第一の工程では、被験物質を実験動物に投与若しくは接触させ、及び／又は細胞に接触させる。「被験物質」とは、検査の対象となる物質である。例えば食物、それをホモジネートした溶液、その粗精製物等が挙げられる。実験動物に被験物質（被験食品）を投与又は接触する形態は限定されるものではなく、経口投与及び非経口投与（注射、経皮等）のいずれでもよい。また、細胞に接触させる態様は、例えば細胞培養液中に候補物質を添加すること、候補物質とともに細胞を培養することのいずれをも意味するものである。被験物質を実験動物に投与する期間は数日間の短期投与でよい。細胞を使用する場合は、細胞周期の時期に限定されるものではなく、いずれのフェーズの細胞を使用しても良い。
被験物質を非経口投与する場合（特に注射のとき）は、被験物質は液体であり、また、被験物質を細胞に接触させる場合も、通常は液体培養を行う。従って、飲料などの液体食品を被験物質とするときは液体のまま又は適当な緩衝液に希釈して用いることができ、固体を被験物質とするときは適当な緩衝液又は培養液中でホモジネートし、その後培養又は投与に適する濃度に希釈することができる。
細胞の種類としては、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好塩基球、マクロファージ、肥満細胞などのアレルギー関連細胞等が挙げられる。抗アレルギー性を解析する場合は、まず、アレルギー様の状態を惹起し得る候補物質を実験動物に投与若しくは接触させ、及び／又は細胞に接触させる。この工程により、例えばＩＬ−１α遺伝子、ＩＬ−１β遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１８遺伝子、ＣＣＬ２遺伝子およびＴＮＦα遺伝子の全部又は一部の遺伝子の発現が亢進するが、それに続いてアレルギー抑制効果のある被検物質を実験動物に投与若しくは接触させ、及び／又は細胞に接触させることで、上記の遺伝子の全部又は一部において亢進が抑制されるか否かを解析する。
第二の工程では、実験動物及び／又は細胞から生体関連物質を抽出する。生体関連物質とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、ペプチド核酸、脂質、抗体等である。それらの抽出方法は当業者により適宜選択される。
第三の工程では、抽出した生体関連物質又はその調製物を上述のプローブ又はマイクロアレイに接触させる。本発明の方法は、上記接触後にプローブ又はその調製物から発せられたシグナルを検出し、そのシグナルの検出結果に基づいて被験物質のアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性を判定する工程を含む。「調製物」とは、例えば抽出した生体関連物質をＲＩ、蛍光等で標識したもの、ＰＣＲ、Ｔ７増幅法を使用して増幅した核酸類、断片化した核酸等である。生体関連物質又はその調製物を遺伝子又はマイクロアレイに接触させることにより、プローブとの反応性を観察することができる。
反応条件は使用する生体関連物質の種類、プローブの種類等により適宜選択される。反応終了後、適当な検出手段により、生体関連物質とプローブとの反応性を評価する。例えば生体関連物質が蛍光標識されている場合は、蛍光顕微鏡により蛍光強度を測定することによりアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性の評価を行う。ここで「評価」とは、例えば測定した蛍光強度から発現量を定量化し、対照区と比較することにより被験物質に暴露した際に発現している特定の遺伝子の種類、及びその発現量を特定することである。
本発明のプローブは、Ｉ型アレルギー又はＩＶ型アレルギーに対するアレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定に使用することができる。
本発明のプローブ又はマイクロアレイを使用することによって、簡便なアレルゲン性の判定及び検査をすることが可能となるため、アレルゲン性のある食品に適正表示をすることが容易となる。これは、健全な食生活の構築、アレルギー予防、食品企業への信頼感の構築に役立ち、産業の進展に結びつく。
また、本発明によって簡便に抗アレルギー性の判定及び検査をすることが可能となるため、医薬品、食品の研究開発現場で候補物質のスクリーニングに用いることができる。従って、本発明によって、新規医薬品、新規機能性食品開発の効率化又は迅速化、開発リスクの低減、開発費用の削減ができる点で、本発明のプローブ、マイクロアレイ及び方法は極めて有用である。
さらに、本発明は、前記プローブ又はマイクロアレイを含む、アレルゲン性及び／又は抗アレルギー性判定用キットを提供する。
本発明のキットは、上記マイクロアレイ以外に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、蛍光試薬、制限酵素、各種緩衝液、滅菌水、洗浄剤、界面活性剤、実験操作マニュアル（説明書）等が挙げられる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
マイクロアレイの製造
１．配置プローブの調製
まず、実験に使用するマイクロアレイとして貫通孔型のマイクロアレイを選び、ＤＮＡマイクロアレイに配置するためのプローブ核酸分子として、表１に記載した配列情報をもつ５’末端ビニル化核酸分子（６５ｍｅｒ）を用いた。
表１．においてＮｏ．１０４はＩＬ−１α遺伝子に対応するプローブであり、Ｎｏ．１０５がＩＬ−１β遺伝子、Ｎｏ．１０７がＩＬ−２遺伝子、Ｎｏ．１０３がＩＬ−１８遺伝子、Ｎｏ．１９がＣＣＬ２遺伝子、Ｎｏ．２４がＣＣＬ３遺伝子、Ｎｏ．２５がＣＣＬ４遺伝子、Ｎｏ．２６がＣＣＬ５遺伝子及びＮｏ．２０８がＴＮＦα遺伝子に対応するプローブである。
【表１】
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【実施例２】
【０００７】
１．検体試料調製
本実施例においては、アレルギー様の状態を惹起できる物質としてＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を用い、アレルギー様の状態に対し抑制効果のある物質としてＴＰＣＫ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ：Ｌ−（ｔｏｓｙｌａｍｉｄｏ−２−ｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ）を用い、細胞としてＲＡＷ２４６．７細胞（マウスマクロファージ由来培養細胞）を用いた。
ＲＡＷ２４６．７細胞をＬＰＳ刺激単独、及びＬＰＳ刺激且つＴＰＣＫ１００ｐｍｏｌ存在下で６時間培養し、それぞれ細胞を回収し、それぞれＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出はＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて実施した。ＬＰＳ刺激の単独刺激群はアレルギー惹起モデル群、ＴＰＣＫ共存下での培養群がアレルギー抑制モデル群とした。
それぞれの群のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、本発明のマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせるＢｉｏｔｉｎ標識ａＲＮＡを調製し、ハイブリダイゼーションに供した。Ｂｉｏｔｉｎ標識ａＲＮＡの調製はＭｅｓｓａｇｅ  Ａｍｐ  ＩＩ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、所定の方法に従って実施した。
２．マイクロアレイよるアッセイ
ハイブリダイゼーションバッファー溶液を以下のように調製した。
（０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液：１０００ｍｌ）
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ    １２０ｍｌ
１Ｍ  ＮａＣｌ            １２０ｍｌ
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０    １００ｍｌ
蒸留水で１０００ｍｌにメスアップ
Ｂｉｏｔｉｎ標識ａＲＮＡを、ハイブリダイゼーションバッファー溶液（０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液）に１５μｇ／１５０μｌに懸濁させ、三菱レイヨン社製マイクロアレイ（ＧｅｎｏＰａｌＴＭ）を使用して６５℃で１７時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後チップは、洗浄バッファー溶液（０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液）を用いて６５℃で２０分間の洗浄を２回行い、最後に２ｘＳＳＣで１０分間洗浄した。チップの検出は三菱レイヨン社製検出器を用いて行った。
蛍光標識は、あらかじめ蒸留水によって１ｍｇ／ｍｌに溶解したＣｙ５−Ｓｔｒｅｐｔａｖｄｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を１／５００に蒸留水で希釈した溶液５ｍｌに、マイクロアレイを３０分間浸漬させることで行った。浸漬後のマイクロアレイは５ｍｌの０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液によって５分間、４回洗浄に供した後、三菱レイヨン製ＤＮＡチップ検出器により、蛍光強度を測定した。
３．ＤＮＡチップよる解析結果
測定した蛍光強度は、各群ＧＡＰＤ遺伝子（ＮＭ＿００８０８４）の蛍光強度を基準として補正を行い、各群における対象遺伝子の蛍光強度を比較した。
その結果、ＧＡＰＤ遺伝子の（ＬＰＳ単独刺激群の蛍光強度値／ＴＰＣＫ刺激群の蛍光強度値）は（１４７１５７／１４５９５３）であり、比は１．０１であった。そのためＧＡＰＤの相対的発現差をｌｏｇ（底は２）で表した場合０となり、その他の遺伝子の結果について、相対的発現差を求めた（図１）。
図１より、ＬＰＳ刺激によって亢進した遺伝子群であるＢｌｎｋ，Ｃａｍｋ２ｄ，Ｃａｓｐ１１，ＣＣＬ２，ＣＣＬ５，Ｆ５２，Ｇｂｐ１，ＩＬ−１０ｒａ，ＩＬ−１８，ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，Ｌｙｎ，Ｔｒａｆ１，Ｔｒｉｍ３０がＴＰＣＫ刺激によって抑制されていることが示された。
【実施例３】
【０００８】
本実施例においては、アレルギー様の状態を惹起できる物質としてＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：グラム陰性菌由来リポ多糖類）及びＯＶＡ（卵白アルブミン：ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を用いた。なお、ＬＰＳは炎症反応を惹起させる、いわばＩＶ型アレルギーに特徴的な反応を誘起することができる。またＯＶＡを経口投与することで食物アレルギーのアレルゲンとなり、Ｉ型アレルギーに特徴的な反応を誘起することができる。
それら物質を、以下の条件でマウスに投与し、脾臓を採取し、脾臓細胞中のｍＲＮＡをマイクロアレイで測定した。結果は図２及び図３に示した。
＜実験条件＞
・使用マウス  Ｃ５７ＢＬ  ♀  ８週令
〔ＬＰＳ〕
・経口投与条件：１回投与、０日のみ、１０ｍｇ／ｍｌを０．２ｍｌマウスに経口投与。
４時間後に脾臓を摘出。
〔ＯＶＡ〕
・経口投与条件：２回投与、０日、８日目、１０ｍｇ／ｍｌを  ０．２ｍｌマウスに経口投与。
・２１日後に脾臓を摘出。
〔ＲＮＡの抽出及び標識化〕
・実施例２と同様に処理を行った。
マイクロアレイよるアッセイ及びＤＮＡチップよる解析結果は、実施例２と同様に行った。
その結果、ＬＰＳ刺激で顕著に発現するのはＩＬ−１α．ＩＬ−１β，ＣＣＬ２，ＣＣＬ３，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＴＮＦαであることが分かった。またＯＶＡ投与時にはＩＬ−２，ＩＬ−１８が亢進することが分かった（図２）。
即ち、ＩＶ型アレルギーの場合は（ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＴＮＦα，ＣＣＬ２等）が亢進し、Ｉ型アレルギーの場合はＩＬ−２、ＩＬ−１８が亢進することが示唆され、これらの遺伝子発現を観察することにより、食物アレルギーの型の判定を行うことが可能となった。
【実施例４】
【０００９】
本実施例においては、アレルギー様の状態を惹起できる物質としてＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：グラム陰性菌由来リポ多糖類）及びＰＭＡ（１２−Ｏ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を用いた。なお、ＬＰＳは炎症反応を惹起させる、いわばＩＶ型アレルギーに特徴的な反応を誘起することができる。またＰＭＡは各種サイトカイン分泌を促進し、ＩＶ型アレルギーとは異なる反応を誘起する。
それら物質を、以下の条件でマウス細胞に添加して刺激した。これらの細胞群よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、各遺伝子のｍＲＮＡ発現をマイクロアレイで測定した。結果は図４及び図５に示した。
・使用細胞  ＲＡＷ２６４．７細胞（マウスマクロファージ様細胞）
＜実験条件＞
〔ＬＰＳ〕
・１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞にＬＰＳを最終濃度  １０μｇ／ｍｌで添加して刺激、６時間後細胞を回収してＲＮＡを抽出
〔ＰＭＡ〕
・１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞にＰＭＡを最終濃度  １μｇ／ｍｌで添加して刺激、６時間後細胞を回収してＲＮＡを抽出
〔ＲＮＡの抽出及び標識化〕
・実施例２と同様に処理を行った。
マイクロアレイよるアッセイ及びＤＮＡチップよる解析結果は、実施例２と同様に行った。
その結果、ＬＰＳ刺激では図４の遺伝子群は顕著に発現が亢進しているが、ＰＭＡ刺激ではＩＬ−１α、ＩＬ−２，、ＣＣＬ２はそれほど上昇が認められない。
この結果よりＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＣＣＬ２を観察することはアレルギーのタイプ判別に有効であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明により、食品成分によるアレルギー発症又は抑制作用の有無を効率的かつ効果的に判定をすることができるオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイが提供される。また、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及びマイクロアレイは、未知の食品成分のアレルゲン性を判定又は検査したり、機能性食品成分の開発段階におけるアレルゲン性又は抗アレルギー性作用を判定するための簡便なツールとしても使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００１１】
配列番号１〜２２１：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2008069342.tif 000094
【図５】
2008069342.tif 000095
【国際調査報告】
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