(57)【要約】細菌由来のチトクロームP-450遺伝子を組み込んだ大腸菌を用いた微生物変換系においてみられる変換効率の低さを改善する手段の提供を目的とする。大腸菌に、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来の電子伝達系をコードする遺伝群aciBCを組み込むとともに、細菌由来のチトクロームP-450遺伝子の5'末端側に、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のアルカン酸化性チトクロームP-450であるAciAのN末端48アミノ酸等をコードするポリヌクレオチドを付加した組換え大腸菌を作製し、これを微生物変換に使用することにより、疎水性または両親媒性の基質化合物を非常に効率よくその目的化合物に変換することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌に、細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子、aciBおよびaciCを組み込んだ形質転換体。
【請求項２】
細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子の5'末端側の開始コドンを削除し、さらにその5'末端側に配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその類縁体を付加した請求項１記載の形質転換体。
【請求項３】
チトクロームP-450酵素をコードする遺伝子が放線菌由来である請求項１記載の形質転換体。
【請求項４】
細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子、aciBおよびaciCを担持する、自律複製型または組み込み複製型のプラスミド。
【請求項５】
細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子の5'末端側の開始コドンを削除し、さらにその5'末端側に配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその類縁体を付加した請求項４記載のプラスミド。
【請求項６】
チトクロームP-450酵素をコードする遺伝子が放線菌由来である請求項４または請求項５記載のプラスミド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体を用いた微生物変換方法であって、基質化合物に一原子酸素添加することを特徴とする方法。
【請求項８】
基質化合物がビタミンＤ3、4-コレステン-3-オン(4-cholesten-3-one)およびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００７年３月１日出願の日本特願２００７−５０９３６号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、大腸菌に異種生物由来のチトクロームP-450遺伝子、電子伝達系遺伝子等を組み込んだ形質転換株およびそれらを用いた基質化合物の微生物変換方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般に化合物を製造する手段としては、化学合成法と酵素合成法が挙げられる。多くの医薬品原料となり得る化合物を製造するためには、原料化合物の位置特異的もしくは立体特異的な修飾を効率的に行うことが不可欠である。これらの反応については酵素合成法が優れていることが知られている。【０００４】
しかしながら、酵素を実用的な触媒として工業レベルで使うには、酵素の持つ本質的な限界を考慮しなければならない。それは酵素寿命が短い点と触媒作用に補酵素を必要とする点である。これまでに酵素を用いた製造プロセス設計では、如何に酵素寿命を引き伸ばして酵素活性を持続させるかに多くの注意が払われてきた。また、酵素合成法に用いられる多くの酵素は、その触媒作用に補酵素を必要としており、例えば酸化還元の酵素反応ではNADHなどのピリジンヌクレオチドを必要とする。これら補酵素は一般に高価であるため、工業レベルで酵素反応を行う場合は補酵素の添加が経済的に大きな問題となる。【０００５】
これら酵素反応の限界を克服するための解決策として、微生物、特に大腸菌の細胞を酵素反応の場として用いる戦略が立てられている。つまり、大腸菌を酵素の遺伝子で形質転換することで、細胞内で目的の酵素を多量に発現させることができる。このことは連続的に酵素を細胞内で生産することを意味し、細胞が生きている限り酵素活性を維持することができる。さらに、細胞内の様々な代謝反応によって、酵素反応に必要な補酵素が再生されることが可能である。【０００６】
このような大腸菌の形質転換体を培地中で培養し、培養物に基質化合物を接触させ、修飾された該化合物を得る「微生物変換」によって様々な医薬品原料となり得る化学物質を生産することが試みられている。特に、チトクロームP-450遺伝子によって形質転換した大腸菌を用いた、疎水性または両親媒性の化合物の微生物変換による酸化反応は、医薬品製造において重要である。【０００７】
一方、チトクロームP-450遺伝子がコードするチトクロームP-450酵素（以下、単にP-450酵素ともいう）は、還元型で一酸化炭素を結合して450nm付近にソーレー吸収帯(soret band)を示す一群のプロトヘム含有蛋白質の総称である。P-450酵素は多くの動植物組織、カビ、酵母のミクロソーム、一部の動物組織のミトコンドリアの内膜に結合しているほか、ある種の細菌、カビでは可溶性の形で存在している。【０００８】
P-450酵素は、様々な基質特異性を有する。多種多様な有機化合物を基質とし得る異常に広い基質特異性を示す酵素がある一方で、比較的限られた種類の有機化合物としか反応しない基質特異性のかなり厳密な酵素も存在する。また反応部位に対する立体特異性(stereo-specificity)や位置特異性(regio-specificity)にも優れた選択性を示す場合がある。そして、P-450酵素の具体的な機能としては、一原子酸素添加反応を触媒することによって、該P-450酵素を発現する細胞内において、生体内異物(xenobiotic)の水酸化、エポキシ化、脱アルキル化、脱窒などの様々な反応に関与することが知られている。【０００９】
特に細菌由来のP-450酵素の一部は、実際に有用化合物の工業生産に利用されている。代表的な例の一つが、放線菌ストレプトミセス・カルボフィラス(Storeptomyces carbophilus)のP-450酵素であり、基質であるコンパクチン(compactin)の6β位を水酸化し、生成物として高脂血症の治療薬であるプラバスタチンを生成する（非特許文献１参照）。さらに、放線菌シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のP-450酵素を利用してビタミンＤ3の1α位と25位を水酸化して活性型ビタミンＤ3を生産する方法も実用化されている。これら細菌由来のP-450酵素は、それに電子を供給する電子伝達系（フェレドキシンとフェレドキシン還元酵素）と共役して初めてその一原子酸素添加反応を触媒することができる。【００１０】
このような細菌由来のチトクロームP-450酵素を用いた化合物の微生物変換は、その酵素を発現している細菌の培養液または菌体を用いて行われてきた。特に、放線菌由来のP-450酵素をコードする遺伝子については、当該遺伝子を、宿主として適した放線菌ストレプトミセス・リビダンス(Storeptomyces lividans)に導入してその酵素活性を発現させた培養液も用いられている。しかしながら、このような遺伝子をもつ放線菌による基質化合物の微生物変換は、放線菌特有の性質として、培養および基質化合物の目的生成物への変換にかなりの時間を要する。また、酵素によっては効果的に酵素発現量を増やすための発現誘導条件の検討が必要である。さらに、基質化合物や目的生成物を代謝あるいは分解する反応系が変換に用いる放線菌に存在する場合があり、このことが副産物の生成や基質化合物および目的生成物の減少などを引き起こし、目的生成物の生産性を低下させる一因となっている。【００１１】
これらの理由から、培養に要する時間が比較的短く、しかも基質化合物および目的生成物を代謝あるいは分解する反応系が少ないとみなせる大腸菌を宿主とした、細菌由来のチトクロームP-450遺伝子（特に放線菌由来のチトクロームP-450遺伝子）を機能的に発現できる系の構築が望まれていた。このような系として、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)に由来するP-450camの電子伝達系をコードするcamAB遺伝子を共発現し、多様な放線菌のチトクロームP-450遺伝子を機能的に発現させる系が提案されている（特許文献１参照）。しかし、この系による微生物変換活性は非常に低く、工業生産に利用するには不十分なものであった。【００１２】
一方、細菌に属するアシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のCYP153Aファミリーに属するアルカン酸化性チトクロームP-450酵素をコードするaciA遺伝子およびその電子伝達系をコードする遺伝子群aciBCを大腸菌で発現し、n-オクタンの微生物変換を行い、24時間で約2.2g/Lの1-オクタノールを蓄積させた例が報告されている（非特許文献２参照）。この1-オクタノールの生産速度は既知の微生物変換反応に比べ最大であり、この変換速度は24時間持続されつづけた。【００１３】
［特許文献１］国際公開第2003/087381号パンフレット、その英文ファミリーUS 2006234337 A1
［非特許文献１］Cloning, characterization and expression of the gene encoding cytochrome P-450sca-2 from Streptomyces carbophilus involved in production of pravastatin, a specific HMG-CoA reductase inhibitor. Gene. 1995 Sep 22;163(1):81-85.
［非特許文献２］Production of alpha, omega-alkanediols using Escherichia coli expressing a cytochrome P-450 from Acinetobacter sp. OC4. Biosci Biotechnol Biochem. 2006 Jun;70(6):1379-1385.
［非特許文献３］Production of human metabolites of cyclosporin A, AM1, AM4N and AM9, by microbial conversion. J Biosci Bioeng. 2005 Apr; 99(4):390-395
上記特許文献１および非特許文献１〜３の全記載は、ここに特に開示として援用される。【００１４】
本発明の課題は、細菌由来の、特に放線菌由来のチトクロームP-450遺伝子を組み込んだ大腸菌を用いた微生物変換系においてみられる変換効率の低さを改善する手段を提供することである。
【発明の開示】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決するために様々な検討を加えた結果、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株(NITE P-125)由来の電子伝達系をコードする遺伝群aciBCを組み込むとともに、細菌由来のチトクロームP-450遺伝子の5'末端側に、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のアルカン酸化性チトクロームP-450であるAciAのN末端48アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加することにより、基質化合物を非常に効率よくその目的化合物に変換できることを見出し、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［８］に関する。
[１]大腸菌に、細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子、aciBおよびaciCを組み込んだ形質転換体。
[２]細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子の5'末端側の開始コドンを削除し、さらにその5'末端側に配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその類縁体を付加した[１]記載の形質転換体。
[３]チトクロームP-450酵素をコードする遺伝子が放線菌由来である[１]記載の形質転換体。
[４]細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子、aciBおよびaciCを担持する、自律複製型または組み込み複製型のプラスミド。
[５]細菌由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子の5'末端側の開始コドンを削除し、さらにその5'末端側に配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその類縁体を付加した[４]記載のプラスミド。
[６]チトクロームP-450酵素をコードする遺伝子が放線菌由来である[４]または[５]記載のプラスミド。
[７][１]〜[３]のいずれかに記載の形質転換体を用いた微生物変換方法であって、基質化合物に一原子酸素添加することを特徴とする方法。
[８]基質化合物がビタミンＤ3、4-コレステン-3-オン(4-cholesten-3-one)およびシクロスポリンからなる群より選択される、［７］記載の方法。
【００１７】
以下に本願明細書において記載する用語、記号等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。
本願明細書において用いる「aciB」とは、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のフェレドキシンをコードする配列番号２の塩基1から塩基321までの連続した塩基配列で示される遺伝子またはその類縁体を意味する。
【００１８】
本願明細書において用いる「aciC」とは、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のフェレドキシン還元酵素をコードする配列番号２の塩基1978から塩基3192までの連続した塩基配列で示される遺伝子またはその類縁体を意味する。
【００１９】
本願明細書において用いる「形質転換体」とは、遺伝子組換え技術を用いて特定の微生物に別の生物由来の遺伝子を発現可能な形態で導入した微生物を意味し、それに用いる遺伝子導入の手法は、プラスミド等のベクターを用いた遺伝子組換えだけでなく、相同組換え等の手法も包含する。
【００２０】
本願明細書において用いる「微生物変換方法」とは、形質転換体を培地中で培養し、培養物に基質化合物を接触させ、該化合物を修飾して目的化合物に変換し、それを取得する方法を意味する。
本発明にいう「微生物変換」とは、形質転換体を培地中で培養し、培養物に基質化合物を接触させ、該化合物に一酸素原子を添加する反応を意味する。
【００２１】
本願明細書において用いる「基質化合物」とは、その構造中にチトクロームP-450により一酸素原子添加が可能な炭素原子を有する疎水性または両親媒性の化合物を意味する。例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン等のアルカン化合物、トルエン、フェノール、クメン等の芳香族化合物、コレステロール、テストステロン、4-コレステン-3-オン（4-cholesten-3-one）、デヒドロエピアンドロステロン、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3等のステロイド類、ロイシルロイシン、ロイシルバリン、ポリロイシン、ポリバリンなどの直鎖ペプチド類、プロリルフェニルアラニン、ロイシルアラニン等のジペプチドが環化縮合したジケトピペラジン類、シクロスポリン、エキノマイシン等の生理活性を有する環状ペプチド類、ピネン、カンフェン、リモネン、ゲラニオール等のモノテルペン類、アンブロサン、カリオフィラン、ドリマン等のセスキテルペン類、アビエチン酸、ジベレリン酸等のジテルペン類、ダンマラン、ホパン、ラノスタンなどのトリテルペン類、コンパクチン等のスタチン類、タイロシン、FK-506、エリスロマイシン等のマクロライド類、その他各種薬物、あるいはそれらの前駆体、代謝物、誘導体等が挙げられる。
【００２２】
本願明細書において用いる「遺伝子（ポリヌクレオチド）の類縁体」とは、元の遺伝子（ポリヌクレオチド）と実質的に同等の機能を有し、
(1) 元の遺伝子（ポリヌクレオチド）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(2) 元の遺伝子（ポリヌクレオチド）の塩基配列との相同性が70％以上である塩基配列を有するポリヌクレオチド、
(3) 元の遺伝子（ポリヌクレオチド）の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、または
(4) 遺伝暗号の縮重のため、元の遺伝子（ポリヌクレオチド）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、(1)項から(3)項までのいずれかの項で定義されたポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と同じ配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００２３】
また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、元の遺伝子（ポリヌクレオチド）をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0Mの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２４】
本発明により、細菌由来のチトクロームP-450遺伝子、特に放線菌由来のチトクロームP-450遺伝子を効率よく発現することのできる発現系が提供され、その発現系を用いて各種の基質化合物を水酸化等の反応に付し、効率よく目的化合物に変換することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（形質転換体の作製）
本発明においては、宿主となる大腸菌に特に制限はない。プラスミドやファージDNAなどのベクターと挿入遺伝子の増殖に用いることのできる大腸菌であればよく、例えば、宿主−ベクター系を用いる組換えDNA実験において、宿主として汎用される市販の大腸菌を都合よく利用できる。このような宿主大腸菌に、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のフェレドキシンをコードする配列番号２の塩基1から塩基321までの連続した塩基配列で示されるaciB遺伝子と、同じ株由来のフェレドキシン還元酵素をコードする配列番号２の塩基1978から塩基3192までの連続した塩基配列で示されるaciC遺伝子を組み込み形質転換体を作製する。【００２６】
aciBおよびaciCを宿主に組み込む方法は、特に制限はなく、例えば、それらの遺伝子を適当なベクター中に挿入してプロトプラスト法、エレクトロポレーション法により宿主に組み込むことができる。用いることのできるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。自律複製性ベクターのpUC18、pKK223-3、pETduet-1等を好ましい例として挙げることができる。発現ベクターにおけるそれらの遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、公知のものから適宜選択することができる。【００２７】
（細菌由来のチトクロームP-450）
細菌由来であって、本発明の目的に沿うチトクロームP-450遺伝子であれば、いかなるチトクロームP-450遺伝子をも本発明に使用することができるが、特に放線菌由来のチトクロームP-450遺伝子を好適に使用することができる。限定されるものでないが、本発明の発現系に組み入れることを企図しているチトクロームP-450遺伝子としては、一原子酸素添加反応を触媒する機能を有し、少なくとも一部のDNAの配列決定が行われており、各配列情報が遺伝子データベース（EMBLおよびGenBank）から入手できるものを挙げることができる。中でもCYP105ファミリーおよびCYP107ファミリーに分類されるチトクロームP-450は、異化代謝に関与するものが多いとされ、特に微生物変換において有益であると推定される。【００２８】
放線菌由来のチトクロームP-450遺伝子としては、例えば、Actinomadura verrucosospora由来のベルコペプチン(vercopeptin)生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Amycolatopsis mediterranei由来のリファマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Amycolatopsis mediterranei由来のバルヒマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Kitasatospora griseospola由来のテルペンテシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Micromonospora griseorubida由来のマイシナマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Microtetraspora recticatena由来のコンパクチン水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Mycobacterium smegmatis mc2155由来のピペリジン、ピロリジン分解に関与するチトクロームP-450遺伝子、Myxococcus xanthus由来のポリケタイド抗生物質TAの生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Pseudonocardia autotrophica由来のビタミンＤ3水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Rhodococcus erythropolis由来のチオカルバメート系農薬分解に関与するチトクロームP-450遺伝子、Rhodococcus fascians (D188)由来の植物生理活性物質合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Rhodococcus ruber由来のエチル-tert-ブチルエーテル分解に関与するチトクロームP-450遺伝子、Saccharopolyspora erythraea由来のエリスロマイシン水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces acidiscabies由来のサクストミン(thaxtomin A)生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces ansochromogenes由来のニッコーマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces antibioticus由来のオレアンドマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces antibioticus由来のシモサイクリノン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces avermitilis由来のエバーメクチンのフラン環形成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces avermitilis由来のオリゴマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces avermitilis由来のポリケタイド-4生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces avermitilis由来のポリケタイド-9生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces avermitilis由来のother-type ポリケタイド生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces avermitilis由来のポリエンマクロライド生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces avermitilis由来のペプチド-7生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces carbophilus由来のコンパクチン水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces clavuligerus由来のクラブラン酸生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces fluvus由来のコンパクチン水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces fradiae由来のタイロシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces griseolus由来のスルフォニルウレア系農薬分解に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces griseolus由来のスルフォニルウレア系農薬分解に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces hygroscopicus由来のラパマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus由来のFK520生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces lavendulae由来のマイトマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces lavendulae由来のコンプレスタチン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces maritimus由来のエンテロシン生��成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces natalensis由来のピマリシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces nodosus由来のアンフォテリシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces nogalater由来のノガラマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces noursei由来のナイスタチン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces peucetius由来のダウノルビシン水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces peucetius subsp. caesius由来のダウノマイシン水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces rishiriensis strain DSM40489由来のクママイシン A1(coumermycin A1)の生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces sp.由来のFK-506水酸化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces spheroides由来のノボビオシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces tendae由来のニッコーマイシン(nikkomycin)生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces thermotolerans由来のカルボマイシンのエポキシ化に関与するチトクロームP-450遺伝子、Streptomyces venezuelae由来のピクロマイシン、メチマイシン生合成に関与するチトクロームP-450遺伝子等が挙げられる。【００２９】
また上述した放線菌由来のP-450遺伝子を、上述のaciBおよびaciCをもつ大腸菌に組み込む際に、そのP-450遺伝子の5'末端側の開始コドンを削除し、さらにその5'末端側に配列番号１のアミノ酸1からアミノ酸50までの連続したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその類縁体を付加すると、さらに効率よく基質化合物を目的化合物に変換することができる。なお、配列番号１のポリペプチドは、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のアルカン酸化性チトクロームP-450酵素であるAciAのN末端48アミノ酸部分と、SpeIサイトが翻訳されたアミノ酸であるThrとSerとを含む50アミノ酸からなるポリペプチドである。【００３０】
（形質転換体の培養）
こうして作製された形質転換体は、必要により誘導物質を添加する等して、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適当な栄養培地中で培養する。このような栄養培地は、適当な炭素源、窒素源、無機塩および天然有機栄養物等より成り、炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、ソルビトール、有機酸類等を、窒素源としてはアンモニア、尿素、硫安、硝安、酢安等の化合物をそれぞれ一種または二種以上使用することができる。また無機塩としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などの塩類を使用することができる。さらに使用菌の生育促進効果を持つ天然有機栄養物としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などを用いることができ、さらにビタミン類、核酸類を少量含有させることもできる。【００３１】
（形質転換体を用いた微生物変換）
次いでこれらの遺伝子が発現した菌体を基質化合物と接触させ、変換反応をさせる。変換反応の温度は、形質転換体の至適温度を考慮して、適宜決定できる。また反応時間も、目的化合物への変換率（反応の進行度合い）等を考慮して適宜決定することができる。例えば、20〜37℃で、1〜5日が好適である。さらに、反応様式は、バッチ式でも連続式でも、いずれの形式でも実施することができる。【００３２】
（目的生成物の単離および精製）
生成した目的生成物の単離および精製は、一般に微生物代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用できる。例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、トルエン等を用いた有機溶媒抽出、ダイヤイオンHP-20などの疎水性吸着樹脂を用いた吸脱着処理、セファデックスLH-20等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知のあらゆる方法がこれにあたる。また、ここに示した方法に特に限定されるものではない。これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、目的化合物を単離精製することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント(％)は、培地の説明においては重量パーセント、HPLCの移動相の説明においては、容量パーセントを示す。【００３４】
実施例１：プラスミドの構築
(1)pETAciBC-SD vector
以下、全てのPCR反応はKOD#PLUS-DNA polymerase（東洋紡社）を用いて行った。プラスミドpDolABC（非特許文献２参照）を制限酵素NcoIおよびBamHIで処理し、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のフェレドキシンをコードする遺伝子aciBを含むDNA断片を得た。この断片を大腸菌プラスミドベクター pETduet-1(Novagen社)のNcoIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドAとした。さらに、pDolABCを鋳型とし、プライマー1（配列番号６参照）とプライマー2（配列番号７参照）を用いてPCRを行い、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のフェレドキシン還元酵素をコードする遺伝子aciCを含むDNA断片を増幅し、制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理した。この断片をプラスミドAのBamHIおよびHindIII部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドBとした。【００３５】
次に、プラスミドBの二つのT7 プロモーターのうち後ろ側の一つを取り除く為に、プラスミドBを制限酵素EcoRVおよびNotIで処理し、BKL Kit（宝酒造社）を用いて平滑化後、T4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドCとした。一方、シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー3（配列番号８参照）とプライマー4（配列番号９参照）を用いてPCRを行い、スペーサーDNA配列となるDNA断片を増幅し、制限酵素BglIIおよびBamHIで処理した。この断片をプラスミドCのBglIIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-SD vectorとした。【００３６】
(2)pETAciBC-50AABP195
アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー5（配列番号10参照）とプライマー6（配列番号11参照）を用いてPCRを行い、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のアルカン酸化性P-450酸化酵素AciAのN末端48アミノ酸部分をコードするDNAを含むDNA断片（配列番号２の塩基398から塩基1891までの遺伝子）を増幅し、制限酵素NdeIおよびSpeIで処理した。一方、ダクチロスポランギウム・バリエスポラム(Dactylosporangium variesporum) IFO14104(ATCC31203)株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー7（配列番号12参照）とプライマー8（配列番号13参照）を用いてPCRを行い、BP195遺伝子を増幅し、制限酵素SpeIおよびBamHIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-SD vectorのNdeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-50AABP195とした。【００３７】
(3)pETAciBC-BP195
ダクチロスポランギウム・バリエスポラム(Dactylosporangium variesporum) IFO14104株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー8とプライマー9（配列番号14参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つBP195遺伝子を増幅し、制限酵素NdeIおよびBamHIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-SD vectorのNdeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-BP195とした。【００３８】
(4)pETAciBC-50AABP194
ダクチロスポランギウム・バリエスポラム(Dactylosporangium variesporum) IFO14104株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー10（配列番号15参照）とプライマー11（配列番号16参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つBP194遺伝子を増幅し、制限酵素SpeIおよびBamHIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-50AABP195のSpeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-50AABP194とした。【００３９】
(5)pETAciBC-BP195
ダクチロスポランギウム・バリエスポラム(Dactylosporangium variesporum) IFO14104株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー11とプライマー12（配列番号17参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つBP194遺伝子を増幅し、制限酵素NdeIおよびBamHIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-SD vectorのNdeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-BP194とした。【００４０】
(6)pETAciBC-50AAvdh
シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー13（配列番号18参照）とプライマー14（配列番号19参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つvdh遺伝子（配列番号３参照）を増幅し、制限酵素SpeIおよびBglIIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-50AABP195のSpeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-50AAvdhとした。【００４１】
(7)pETAciBC-vdh
シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー14とプライマー15（配列番号20参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つvdh遺伝子を増幅し、制限酵素NdeIおよびBglIIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-50AAdvbAのNdeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-vdhとした。【００４２】
(8)pETcamAB-vdh
シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー16（配列番号21参照）とプライマー17（配列番号22参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つvdh遺伝子を増幅し、制限酵素NdeIおよびSpeIで処理した。これらのDNA断片をシュードモナス・プチダ由来のフェレドキシン還元酵素とフェレドキシンと共発現させるベクターpT7NS-camAB（特許文献１参照）のNdeIおよびSpeI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETcamAB-vdhとした。【００４３】
(9)pETcamAB-BP195
ダクチロスポランギウム・バリエスポラム(Dactylosporangium variesporum) IFO14104株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー9とプライマー18（配列番号23参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つBP195遺伝子（配列番号４参照）を増幅し、制限酵素NdeIおよびSpeIで処理した。これらのDNA断片をpT7NS-camABのNdeIおよびSpeI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETcamAB-BP195とした。【００４４】
(10)pETcamAB-BP194
ダクチロスポランギウム・バリエスポラム(Dactylosporangium variesporum) IFO14104株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー12とプライマー19（配列番号24参照）を用いてPCRを行い、ビタミンＤ3の25位を水酸化する機能を持つBP194遺伝子（配列番号５参照）を増幅し、制限酵素NdeIおよびSpeIで処理した。これらのDNA断片をpT7NS-camABのNdeIおよびSpeI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETcamAB-BP194とした。なお、実施例1に示した各プラスミドの概略を図1に示した。【００４５】
実施例２：ビタミンＤ3から25-ヒドロキシビタミンＤ3への微生物変換
実施例１で調製したプラスミドpETAciBC-50AAvdh, pETAciBC-vdh, pETcamAB-vdh, pETAciBC-50AABP195, pETAciBC-BP195, pETcamAB-BP195, pETAciBC-50AABP194, pETAciBC-BP194およびpETcamAB-BP194を用いて大腸菌BL21star(DE3)(Invitogen社)を形質転換し、得られた株をそれぞれBLstar/50AAvdh, BLstar/vdh, BLstar/camvdh, BLstar/50AABP195, BLstar/BP195, BLstar/camBP195, BLstar/50AABP194, BLstar/BP194およびBLstar/camBP194とした。【００４６】
これらの株をカルベニシリンナトリウム(100μg/mL)を含むＭ９SEED液体培地（3.39％ Na2HPO4、1.5％ KH2PO4、0.25％塩化カルシウム、0.5％塩化アンムニウム、1％カザミノ酸、0.002％チミン、0.1mM塩化カルシウム、0.1mM硫酸鉄、0.4％グルコース、0.001mM塩化マグネシウム）に接種し、25℃で24時間220rpmで振とう培養した。この培養液200μLをカルベニシリンナトリウム(100μg/mL)とOvernight Express Autoinduction Systems(Novagen社)を含むＭ９Main液体培地（3.39％ Na2HPO4、1.5％ KH2PO4、0.25％塩化ナトリウム、0.5％塩化アンムニウム、1％カザミノ酸、0.002％チミン、0.1mM塩化カルシウム、0.1mM硫酸鉄、80μg/mL 5-アミノレブリン酸）25mLに添加した後、25℃で24時間220rpmで振とう培養した。遠心により菌体を回収し、5mLのCV2緩衝液（50mMリン酸カリウム緩衝液、2％グリセリン、50μg/mLカルベニシリン、0.1M IPTG）に懸濁し、培養液に対して５倍濃縮した菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液1mLにビタミンＤ3の1％DMSO溶液を25μL（終濃度250μg/mL）およびPMCD（終濃度0.75％）を添加し、28℃で24時間220rpmで振とう培養した。【００４７】
その後、この反応液にメタノール2mLを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で3,500rpmで10分間遠心することにより得られた上清をHPLCで分析し、基質のビタミンＤ3が水酸化されることにより生成した25-ヒドロキシビタミンＤ3を検出した。この結果を表１に示した。なお、以下に示す表中の「野生型P-450」は、微生物から取得された配列を改変されていないP-450酵素を意味し、「50アミノ酸付加型P-450」は、配列番号１記載の50アミノ酸からなるポリペプチドが付加されたP-450酵素を意味する。【００４８】
【表１】
2008105512.tif 000002
【００４９】
なお、HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：J' sphere ODS-H80 (YMC, Inc.), 75mm x 4.6mmI.D.
移動相：A; アセトニトリル
B; イオン交換水
グラジエント時間設定：  0分 移動相A/B =30:70
13.00分 移動相A/B =30:70
14.00分 移動相A/B =100:0
21.00分 移動相A/B =100:0
22.00分 移動相A/B =70:30
25.00分 移動相A/B =70:30【００５０】
流速：1.0mL/分
検出：UV  265nm
インジェクション容量：10μL
カラム温度：40℃
分析時間：25分
保持時間：25-ヒドロキシビタミンＤ3       8.8分
ビタミンＤ3                   21.0分【００５１】
表１から明らかなとおり、ビタミンＤ3の25位水酸化反応において、野生型vdhとcamABをBL21star(DE3)株で発現させた従来法による菌株を用いた場合と比較した25-ヒドロキシビタミンＤ3の蓄積量は、電子伝達系をcaｍABからaciBCに置き換えたことで5.2倍、さらに配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加したvdhを発現させたことで11.1倍に向上した。また、野生型BP195とcamABをBL21star(DE3)株で発現させた菌株を用いた場合と比較した25-ヒドロキシビタミンＤ3の蓄積量は、caｍABをaciBCに置き換えたことで2.2倍、さらに配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加したBP195を発現させたことで14.0倍に向上した。同様に、野生型BP194とcamABをBL21star(DE3)株で発現させた菌株を用いた場合と比較した25-ヒドロキシビタミンＤ3の蓄積量は、camABをaciBCに置き換えたことで3.6倍、さらに配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加したBP194を発現させたことで6.6倍に向上した。【００５２】
実施例３：4-コレステン-3-オン(4-cholesten-3-one)から25-ヒドロキシ4-コレステン-3-オン(4-cholesten-3-one)への微生物変換
前述の大腸菌BLstar/50AABP195, BLstar/BP195, BLstar/camBP195を用い、ビタミンＤ3から25-ヒドロキシビタミンＤ3への微生物変換と同様に菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液1mLに1％ 4-cholesten-3-oneのメタノール溶液を25μL（終濃度250μg/mL）およびPMCD（終濃度0．75％）を添加し、25℃で24時間220rpmで振とう培養した。その後、この反応液にメタノール2mLを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で3,500rpmで10分間遠心することにより得られた上清をHPLCで分析し、基質の4-cholesten-3-oneが水酸化されることにより生成した25-hydroxy 4-cholesten-3-oneを検出した。得られた結果を実施例２の一部および実施例４のデータと一緒に表２に示した。【００５３】
なお、HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：Inertsil ODS/3 50mm x 4.6mmI.D.
移動相：A; アセトニトリル
B; 0.85％ リン酸水溶液
グラジエント時間設定：0分 移動相A/B =40:60
5.00分 移動相A/B =100:0
8.00分 移動相A/B =100:0
8.30分 移動相A/B =40:60
11.00分 移動相A/B =40:60
流速：1.2mL/分
検出：UV  235 nm
インジェクション容量：40μL
カラム温度：40℃
分析時間：11分
保持時間：25-hydroxy 4-cholesten-3-one       4.97分
4-cholesten-3-one                  7.45分【００５４】
実施例４：シクロスポリンAからAM1への微生物変換
前述の大腸菌BLstar/50AABP195, BLstar/BP195, BLstar/camBP195を用い、ビタミンＤ3から25-ヒドロキシビタミンＤ3への微生物変換と同様に菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液1mLに1％シクロスポリンAのDMSO溶液を25μL（終濃度250μg/mL）を添加し、28℃で24時間220rpmで振とう培養した。その後、この反応液にメタノール2mLを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で3,500rpmで10分間遠心することにより得られた上清をHPLCで分析し、基質のシクロスポリンAが水酸化されることにより生成したAM1（非特許文献３参照）の生産を検出した。得られた結果を実施例２の一部および実施例３のデータと一緒に表２に示した。【００５５】
【表２】
2008105512.tif 000003
【００５６】
なお、HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：Zorbax SB C-18 100mm x 4.6mmI.D.
移動相：A; 水
B; アセトニトリル
グラジエント時間設定：   0分 移動相A/B =50:50
8.00分 移動相A/B =90:10
8.30分 移動相A/B =50:50
8.31分 移動相A/B =40:60
10.00分 移動相A/B =40:60
流速：1.0mL/分
検出：UV  215nm
インジェクション容量：40μL
カラム温度：80℃
分析時間：10分
保持時間：AM1                4.53分
シクロスポリンA    6.47分【００５７】
表２から明らかなとおり、ダクチロスポランギウム・バリエスポラム由来のチトクロームP-450遺伝子BP195を用いた各種化合物の水酸化反応において、野生型BP195とcamABをBL21star(DE3)株で発現させた従来法による菌株を用いた場合と比較した本発明の方法による各水酸化体の蓄積量は、ビタミンＤ3だけでなく、他の基質の場合においても増加することが確認できた。【００５８】
すなわち、基質として4-コレステン-3-オンを用いた場合、野生型BP195とcamABをBL21star(DE3)株で発現させた菌株を用いたときと比較した25-ヒドロキシ 4-コレステン-3-オンの蓄積量は、電子伝達系をcaｍABからaciBCに置き換えるか、あるいは配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加したBP195を発現させることで1.6倍に向上した。また、基質としてシクロスポリンAを用いた場合、同様にシクロスポリンAの水酸化体であるAM1の蓄積量は、caｍABをaciBCに置き換えたことで1.2倍、さらに配列番号１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加したBP195を発現させたことで8.3倍に向上した。
【産業上の利用の可能性】
【００５９】
本発明は、酵素合成法を利用する化合物の製造分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、pETAciBC-プラスミドの概略図である。
【図１】
2008105512.tif 000004
【配列表】
2008105512000001.app
【国際調査報告】
2008105512.tif 000005
2008105512.tif 000006
2008105512.tif 000007
2008105512.tif 000008