(57)【要約】【課題】【解決手段】式１で示されるフラボノン類単量体を必須成分として含有することを特徴とする人ガン細胞成長抑制効果を有する組成物にあり、  【化１】2009031195.tif 000012有意量の投与により、人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）らの成長作用を抑制することができる。
2009031195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１で示されるフラバノン(flavanone)類単量体を必須成分として含有することを特徴
とする人ガン細胞成長抑制効果を有する組成物。
【化１】
2009031195.tif 000011
【請求項２】
人ガン細胞が人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）から選ばれた１種である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
式１で示されるフラバノン類単量体が乾草から抽出されたものである請求項１記載の
組成物。
【請求項４】
式１で示されるフラバノン類単量体がイソリキリチゲニンをイソメラーゼの作用で閉環
して酸素複素環を形成して製造したものである請求項１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然植物乾草中の活性物質乾草リキリチゲニン（以下、L-geninと略称する）を必須成分とするがん治療及び調整予防効果を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾草は漢方薬品の一成分または食品の添加成分として広く使用されており、近年、乾草中の各種成分について系統立てた研究が行われているが、乾草中の抗がん活性成分の研究については未だ不十分である。現在、乾草中の三テルペン類化合物とフラボン類化合物は抗腫瘍の主要な活性成分と考えられており、その内、三テルペン類化合物、特に乾草グリシリジン、乾草グリシリジン酸の抗腫瘍研究は比較的多く行われている。他方、乾草フラボン類化合物については乾草フラボン類化合物混合物に抗がん作用、抗突然変異と抗酸化作用があることが発表されている（傅乃武らは研究）に過ぎない。他方、乾草中のフラバノン類単量体に属する化合物リキリチゲニンについては、抗ウイルス作用、例えばHIV感染治療やC型肝炎ウイルスに対して有効であることが発表されている（Cranceらの研究）が、抗腫瘍作用およびそのメカニズムについては検討されていない。
【特許文献１】なし
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明者らは、乾草中のフラバノン類単量体：リキリチゲンニン（甘草素liquiritigenin）とリクイリチン（liquiri）に対して、鋭意研究を重ね、リキリチゲニンが人体外の腫瘍細胞実験により人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）に対し、がん細胞の成長を著しく抑制する作用があることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
式１で示されるフラバノン類単量体を必須成分として含有することを特徴とする
人ガン細胞成長抑制効果を有する組成物にある。
【化１】
2009031195.tif 000003
【発明の効果】
【０００５】
式１で示されるフラバノン類単量体は以下の有意量の投与により、人肝臓ガン細胞
（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）らの成長作用を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
(実施例１)
式１で示されるフラバノン類単量体について以下の実験結果を得た。
一．細胞株及び選別方法
細胞株：人肺がん細胞Ａ５４９
人低分化胃腺がん細胞  ＢＧＣ−８２３
人肝臓がん細胞ＳＭＭＣ−７７２１
人早幼粒細胞白血病細胞ＨＬ−６０
方法：
１．指数成長期状態が良好な細胞１瓶、０．２５％のトリポシン消化液を入れることで消化された貼壁細胞を剥離させる、数２〜４×１０4／ｍＬを計り、細胞懸液を作成する。２．細胞懸液を９６個孔のプレートと１８０個孔のプレートに其々摂取し、低温のＣＯ2の培養器に置き、２４時間培養する。
３．液を換え、実験しようとする薬物を２０／孔に入れて、７２時間に培養する。
４．ＭＴＴを９６個孔のプレートに２０／孔に入れ、培養器の中で４時間を培養する。
５．上の清液を吸い去れ、ＤＭＳＯを１５０／孔に入れ、プレートに５分間揺れ振動させる。
６．酸素連鎖性免疫吸着測定器を用いて、波長５７０ｎｍのとこ其々孔の吸光値を測定し、細胞の抑制率を計算する。
細胞の抑制率％＝  陰性対象組ＯＤ値−実験物組ＯＤ値  ×１００％
陰性対象組ＯＤ値
【表１】
2009031195.tif 000004
【表２】
2009031195.tif 000005
【表３】
2009031195.tif 000006
【表４】
2009031195.tif 000007
表４．の結果は乾草リキリチゲニン(liquiritigenine) が濃度２５０μmol/L 、５００μmol/L の時，胃がん細胞に対する抑制率はそれぞれ５４．８％、５８．１％であることを示している。
【表５】
2009031195.tif 000008
表５．の結果は乾草リキリチゲニン(liquiritigenine) が濃度２５０μmol/L 、５００μmol/L の時，胃がん細胞に対する抑制率はそれぞれ４２．０％、８９．９％であることを示している。
【表６】
2009031195.tif 000009
表６．の結果は乾草リキリチゲニン(liquiritigenine) が濃度１２５μmol/L 、５００μmol/L の時，胃がん細胞に対する抑制率はそれぞれ５７．６％、９１．９％であることを示している。
以上の表を見ると、乾草リキリチゲニン(liquiritigenine) が濃度２００μmol/L 、５００μmol/L 、１５００μmol/L である時，肝臓がん細胞に４８時間作用し、それぞれの抑制率は２３．５％、４５．２％、８４．０％、であることが分かった。肝臓がん細胞(SMMC7721)に著しい抑制作用を示している。その抑制作用は乾草三テルペン類の単量体（モノマー）グリシリジン酸よりずっと高い。【０００７】
(製造例)
本発明のフラバノン類単量体（式１）は乾草から直接抽出して生成することができる
が、式１で示されるリキリチゲニンはイソリキリチゲニンをイソメラーゼの作用で閉環し
て酸素複素環を形成して製造することができる。なお、イソリキリチゲニンは次のようにして合成することができる。
1、合成の工程条件の選択
（1）簡単にイソリキリチゲニン（isoliquiritigenin）合成するには、2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（dihydroxyacetophenone）とジヒドロキシベンズアルデヒド（Dihydroxybenzaldehyde）と原料とし、ルイス塩基（Lewis base）の触媒作用の情況下、縮合反応（condensation reaction）でワンステップ合成できる。その化学反応式は：
【化２】
2009031195.tif 000010
2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（dihydroxyacetophenone）とジヒドロキシベンズアルデヒド（Dihydroxybenzaldehyde）のmol比は1:1.5〜1:3であり、好ましくは1:1.8〜1:2である。
（2）溶剤の選択
2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（dihydroxyacetophenone）とジヒドロキシベンズアルデヒド（Dihydroxybenzaldehyde）を溶解可能な有機溶剤を選んで使用することができる。低級アルコール、例えば、イソプロピルアルコール（isopropyl alcohol）、N−ブチルアルコール（n-butyl alcohol）、イソプロピルエーテル（isopropyl ether）、N,N−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide）、ジメチルスルフォキシド（dimethyl sulphoxide）、ジオキサン（dioxane）、エチレングリコールモノメチルエーテル（ethylene glycol monomethyl ether）、エチレングリコールジメチルエーテル（ethylene glycol dimethyl ether）等の溶剤。イソプロピルアルコール（isopropyl alcohol）、N−ブチルアルコール（n-butyl alcohol）、ジオキサン（dioxane）などが好ましい。
（3）触媒剤の選択
比較的に強いアルカリ性試薬を用いて触媒反応をしなければならず、ナトリウム・アルコキシド（sodium alkoxide）、水酸化アルカリ或は水素化ナトリウム（sodium hydride）などを使用できる。好ましくは低級アルコールのナトリウム塩を使用する。
（4）反応時間及び温度
同じ温度下、反応時間が比較的に長いほうが生産率の向上に有利である。反応温度は80〜150℃であり、反応時間は24〜36時間である。
（5）抗酸化剤（antioxidant）の選択
反応に使用される原料は何れもフェノール類（phenols）であって、アルカリ性の環境下で酸化及び変質し易く、窒素ガスを入れると同時に反応系に抗酸化剤をいれなければならない。常用される抗酸化剤にはブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)、その他の抗酸化剤が使用できる。
2、汚染除去工程の選択
（1）脱色剤の選択
活性炭、活性白土、シリカゲル（silica gel）、活性酸化マグネシウム或は活性酸化アルミニウムを使用して脱色することができる。活性炭の脱色効果がもっとも優れている。（2）再結晶（recrystallization）溶剤の選択
イソリキリチゲニンとその異性体の乾草グリシリジンが混在しているので、混合溶剤を用いて再結晶汚染除去を行う必要がある。その中、常用する混合溶剤には、ベンゼンーエチルアセテート(ethyl acetate)、クロロホルムーエチルアセテート（chloroform−ethyl acetate)、ベンゼンーメチルアルコールなどがあり、その中で、体積比はベンゼンとクロロホルムが100、エチルアセテート、メチルアルコール或はエチルアルコールは6〜10である。なお、ベンゼンーエチルアセテートの効果がもっとも良い。
具体的実施方式
窒素ガスが通る四口フラスコにおいて、140mlのN−ブチルアルコール、ジヒドロキシベンズアルデヒド20gを加え、室温下で金属ナトリウムのシート4.0g、1gの抗酸化剤を加え、ゆっくり攪拌しながら水浴させ、全部溶解するまで加熱する。105℃まで上昇すると、15gの2,4-ジヒドロキシアセトフェノンをゆっくり80mlのN−ブチルアルコール溶液に一滴ずつ加え、激しく攪拌し、この温度下で28時間反応させた後冷却する。
氷水浴に18％の塩酸を中性になるまで加える。反応液は二層に分かれる。有機相を取って活性炭で脱色させ、遠心し、有機層を洗浄液が薄くなるまで水洗いする。減圧して溶剤を回収し、乾燥させると16.5gのサーモンピンク色のイソリキリチゲニンの粗品を得た。それはイソリキリチゲニンと乾草グリシリジンの混合物である。
ベンゼン：エチルアセテートの体積比が100：80のベンゼンーエチルアセテートの混合溶剤200gを製造し、粗品のイソリキリチゲニンと乾草グリシリジンの混合物をこの溶液の中で加熱溶解させ、熱いうちにその中の不溶物を濾過し、温度を下げてイソリキリチゲニンを析出させ、濾過した後、ベンゼンだけで充分に洗浄し、乾燥させて8.2g（0.03mol）の黄色のイソリキリチゲニンを得る。そのHPLC分析含有量≧96％であり、その紫外、赤外、核磁気共鳴、マススペクトル分析は標準商品と同じであった。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明に係るリキリチゲニンはそのまま又は付形剤とともに、液体、錠剤、顆粒、ゼリー等の形態で提供することもできるし、あるいは食品添加物として飲料、各種食品に添加され、所定の抗がん効果を発揮することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月29日(2009.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１で示されるリキリチゲニンを必須成分とすることを特徴とする人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）成長抑制剤。
【化１】
2009031195.tif 000013
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
式１で示されるリキリチゲニンを必須成分とすることを特徴とする人肺ガン細胞（Ａ５４９）成長抑制剤。
【化１】
2009031195.tif 000014
【請求項６】
式１で示されるリキリチゲニンを必須成分とすることを特徴とする人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）成長抑制剤。
【化１】
2009031195.tif 000015
【請求項７】
式１で示されるリキリチゲニンを必須成分とすることを特徴とする人低分化胃線ガン細胞（ＢＣＧ−８２３）成長抑制剤。
【化１】
2009031195.tif 000016
【請求項８】
式１で示されるリキリチゲニンを必須成分とすることを特徴とする人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）成長抑制剤。
【化１】
2009031195.tif 000017
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は天然植物甘草中の活性物質甘草リキリチゲニン（以下、Ｌ−ｇｅｎｉｎと略称する）を必須成分とするガン細胞成長抑制剤に関する。
背景技術
［０００２］
甘草は漢方薬品の一成分または食品の添加成分として広く使用されており、近年、甘草中の各種成分について系統立てた研究が行われているが、甘草中の抗がん活性成分の研究については未だ不十分である。現在、甘草中の三テルペン類化合物とフラボン類化合物は抗腫瘍の主要な活性成分と考えられており、その内、三テルペン類化合物、特に甘草グリシリジン、甘草グリシリジン酸の抗腫瘍研究は比較的多く行われている。他方、甘草フラボン類化合物については甘草フラボン類化合物混合物に抗がん作用、抗突然変異と抗酸化作用があることが発表されている（傅乃武らは研究）に過ぎない。他方、甘草中のフラバノン類単量体に属する化合物リキリチゲニンについては、抗ウイルス作用、例えばＨＩＶ感染治療やＣ型肝炎ウイルスに対して有効であることが発表されている（Ｃｒａｎｃｅらの研究）が、抗腫瘍作用およびそのメカニズムについては検討されていない。
特許文献１：なし
発明の開示
発明が解決しようとする課題
［０００３］
そこで、本発明者らは、甘草中のフラバノン類単量体：リキリチゲニン（甘草素ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）とリクイリチン（ｌｉｑｕｉｒｉ）に対して、鋭意研究を重ね、リキリチゲニンが人体外の腫瘍細胞実験により人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）に対し、がん細胞の成長を著しく抑制する作用があることを発見した。
課題を解決するための手段
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
［０００４］
したがって、本発明は、式１で示されるリキリチゲニンを必須成分とすることを特徴とする人ガン細胞成長抑制剤にある。
［化１］
2009031195.tif 000018
発明の効果
［０００５］
式１で示されるリキリチゲニンは以下の有意量の投与により、人肝臓ガン細胞（ＳＭＭＣ７７２１）、人肺ガン細胞（Ａ５４９）、人胃ガン細胞（ＳＧＣ７９０１）、人低分化胃腺ガン細胞（ＢＧＣ−８２３）、人結腸ガン細胞（ＬＯＶＯ）及び人早幼粒細胞白血病細胞（ＨＬ−６０）らの成長作用を抑制することができる。
発明を実施するための最良の形態
［０００６］
（実施例１）
式１で示されるリキリチゲニンについて以下の実験結果を得た。
一．細胞株及び選別方法
細胞株：人肺がん細胞Ａ５４９
人低分化胃腺がん細胞  ＢＧＣ−８２３
人肝臓がん細胞ＳＭＭＣ−７７２１
人早幼粒細胞白血病細胞ＨＬ−６０
方法：
１．指数成長期状態が良好な細胞１瓶、０．２５％のトリポシン消化液を入れることで消化された貼壁細胞を剥離させる、数２〜４×１０４／ｍＬを計り、細胞懸液を作成する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
2009031195.tif 000019
［表３］
2009031195.tif 000020
［表４］
2009031195.tif 000021
表４．の結果は甘草リキリチゲニン（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎｅ）が濃度２５０μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌの時，胃がん細胞に対する抑制率はそれぞれ５４．８％、５８．１％であることを示している。
［表５］
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
2009031195.tif 000022
表５．の結果は甘草リキリチゲニン（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎｅ）が濃度２５０μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌの時，胃がん細胞に対する抑制率はそれぞれ４２．０％、８９．９％であることを示している。
［表６］
2009031195.tif 000023
表６．の結果は甘草リキリチゲニン（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎｅ）が濃度１２５μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌの時，胃がん細胞に対する抑制率はそれぞれ５７．６％、９１．９％であることを示している。
以上の表を見ると、甘草リキリチゲニン（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎｅ）が濃度２００μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌ、１５００μｍｏｌ／Ｌである時，肝臓がん細胞に４８時間作用し、それぞれの抑制率は２３．５％、４５．２％、８４．０％、であることが分かった。肝臓がん細胞（ＳＭＭＣ７７２１）に著しい抑制作用を示している。その抑制作用は甘草三テルペン類の単量体（モノマー）グリシリジン酸よりずっと高い。
［０００７］
（製造例）
本発明のリキリチゲニン（式１）は甘草から直接抽出して生成することができ
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
比較的に強いアルカリ性試薬を用いて触媒反応をしなければならず、ナトリウム・アルコキシド（ｓｏｄｉｕｍａｌｋｏｘｉｄｅ）、水酸化アルカリ或は水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｉｄｅ）などを使用できる。好ましくは低級アルコールのナトリウム塩を使用する。
（４）反応時間及び温度
同じ温度下、反応時間が比較的に長いほうが生産率の向上に有利である。反応温度は８０〜１５０℃であり、反応時間は２４〜３６時間である。
（５）抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）の選択
反応に使用される原料は何れもフェノール類（ｐｈｅｎｏｌｓ）であって、アルカリ性の環境下で酸化及び変質し易く、窒素ガスを入れると同時に反応系に抗酸化剤をいれなければならない。常用される抗酸化剤にはブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、その他の抗酸化剤が使用できる。
２、汚染除去工程の選択
（１）脱色剤の選択
活性炭、活性白土、シリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ）、活性酸化マグネシウム或は活性酸化アルミニウムを使用して脱色することができる。活性炭の脱色効果がもっとも優れている。
（２）再結晶（ｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）溶剤の選択
イソリキリチゲニンとその異性体の甘草グリシリジンが混在しているので、混合溶剤を用いて再結晶汚染除去を行う必要がある。その中、常用する混合溶剤には、ベンゼン−エチルアセテート（ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）、クロロホルム−エチルアセテート（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）、ベンゼン−メチルアルコールなどがあり、その中で、体積比はベンゼンとクロロホルムが１００、エチルアセテート、メチルアルコール或はエチルアルコールは６〜１０である。なお、ベンゼン−エチルアセテートの効果がもっとも良い。
具体的実施方式
窒素ガスが通る四口フラスコにおいて、１４０ｍｌのＮ−ブチルアルコール、ジヒドロキシベンズアルデヒド２０ｇを加え、室温下で金属ナトリウムのシート４．０ｇ、１ｇの抗酸化剤を加え、ゆっくり攪拌しながら水浴させ、全部溶解するまで加熱する。１０５℃まで上昇すると、１５ｇの２，４−ジヒドロキシアセトフェノンをゆっくり８０ｍｌのＮ−ブチルアルコール溶液に一滴ずつ加え、激しく攪拌し、この温度下で２８時間反応させた後冷却する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
氷水浴に１８％の塩酸を中性になるまで加える。反応液は二層に分かれる。有機相を取って活性炭で脱色させ、遠心し、有機層を洗浄液が薄くなるまで水洗いする。減圧して溶剤を回収し、乾燥させると１６．５ｇのサーモンピンク色のイソリキリチゲニンの粗品を得た。それはイソリキリチゲニンと甘草グリシリジンの混合物である。
ベンゼン：エチルアセテートの体積比が１００：８０のベンゼン−エチルアセテートの混合溶剤２００ｇを製造し、粗品のイソリキリチゲニンと甘草グリシリジンの混合物をこの溶液の中で加熱溶解させ、熱いうちにその中の不溶物を濾過し、温度を下げてイソリキリチゲニンを析出させ、濾過した後、ベンゼンだけで充分に洗浄し、乾燥させて８．２ｇ（０．０３ｍｏｌ）の黄色のイソリキリチゲニンを得る。そのＨＰＬＣ分析含有量≧９６％であり、その紫外、赤外、核磁気共鳴、マススペクトル分析は標準商品と同じであった。
産業上の利用可能性
［０００８］
本発明に係るリキリチゲニンはそのまま又は付形剤とともに、液体、錠剤、顆粒、ゼリー等の形態で提供することもできるし、あるいは食品添加物として飲料、各種食品に添加され、所定の抗がん効果を発揮することができる。
【国際調査報告】
2009031195.tif 000024
2009031195.tif 000025
2009031195.tif 000026
2009031195.tif 000027