【手続補正書】
【提出日】平成15年9月19日(2003.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】キメラグルコーストランスポーターを発現する組換型サッカロミセス・セレビシェ
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ５ｍＭ以上のサッカライド、好ましくは２％のグルコースの濃度条件及び好気性条件下において、野生型酵母よりも低いレベルのエタノールを生産し、野生型酵母の少なくとも３０％の成長速度を示す、修飾サッカロミセス・セレビシェ酵母。
【請求項２】  前記酵母が、０．６ｇ／ｌ未満のエタノールを生産する、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】  前記酵母が、０．２５ｇ／ｌ未満、好ましくは０．１２ｇ／ｌ未満のエタノールを生産する、請求項１に記載の酵母。
【請求項４】  前記酵母が、野生型酵母と比較して５０％未満のエタノールを生成する、請求項１に記載の酵母。
【請求項５】  前記酵母が、野生型酵母の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の成長速度を示す、請求項１乃至４いずれか１項に記載の酵母。
【請求項６】  前記酵母が、酵母の遺伝物質に安定に形質転換されるキメラのヌクレオチド配列（キメラ構成体）を含む、請求項１乃至５いずれか１項に記載の酵母であって、該構成体が、第１のサッカライドトランスポーターをコードするヌクレオチド配列からの少なくとも第１の配列又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列、及び異なる第２のサッカライドトランスポーターをコードするヌクレオチド配列からの第２の配列又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列を含み、該サッカライドが好ましくはグルコースである、前記酵母。
【請求項７】  請求項６に記載の酵母であって、前記キメラ構成体が、
Ａ−Ｂ
の型を有する配列を有し、式中、
Ａは、ヌクレオチド塩基ｗ乃至ｘを含む前記第１の配列であり；
Ｂは、ヌクレオチド塩基（ｘ＋ｙ）乃至ｚを含む前記第２の配列であり；
式中、Ａ及びＢは、前記異なるサッカライドトランスポーターのヌクレオチド配列から又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列から誘導され；
ｗは、前記第１の配列が誘導される、ヌクレオチド配列内の１番目の位置であって、ｘより小さく、好ましくは１乃至５０であり；
ｘは、前記第１の配列が誘導される、ヌクレオチド配列内の２番目の位置であって、ｗより大きく、好ましくは５００乃至８５０の数であり；
ｙは整数で、好ましくは３未満であり；
ｘ＋ｙは、前記第２の配列が誘導される、ヌクレオチド配列内の１番目の位置であって；
そして、ｚは、前記第２の配列が誘導される、ヌクレオチド配列内の２番目の位置であって、ｘ＋ｙより大きく、好ましくは１６００乃至１７１３であり；
ここで、前記値は、前記サッカライドトランスポーターのヌクレオチド配列（例えば、ＨＸＴ１又はＨＸＴ７或いはそれに類似の配列）内の位置に該当する、該酵母。
【請求項８】  前記第１のサッカライドトランスポーターが、高親和性の、酵母サッカロミセスのサッカライドトランスポーターであり、前記第２のサッカライドトランスポーターが、低親和性の、酵母サッカロミセスのサッカライドトランスポーターである、請求項６又は７に記載の酵母。
【請求項９】  前記トランスポーターが、好ましくはサッカロミセス・セレビシェからの、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ及びＹＪＲ１６０ｃから成るリスト、又はそれらの配列に関連する配列或いはそれらの配列から誘導される配列から選択される、請求項６乃至８いずれか１項に記載の酵母。
【請求項１０】  請求項６乃至９いずれか１項に記載の酵母であって、キメラ構成体が、好ましくはサッカロミセス・セレビシェからの、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ及びＹＪＲ１６０ｃのいずれか１をコードする、１以上の配列又はその配列の一部、
又は、室温で、６×ＳＳＣ／５０％ホルムアミドの非厳格な結合条件下で前記配列又はその一部を交配させて、高厳格条件（例えば、２×ＳＳＣ、６５℃、ここで、ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）下で洗浄する配列、
又は、前記配列又はその一部と少なくとも９５％の配列同一性を示す配列、
又は、前述の配列のいずれかと相補的な配列、
を含み、その配列又は配列の一部が、請求項６乃至９いずれか１項で規定される１番目又は第２の配列を含む、該酵母。
【請求項１１】  請求項６乃至９いずれか１項に記載の酵母であって、キメラ構成体が、好ましくはサッカロミセス・セレビシェからの、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ及びＹＪＲ１６０ｃのいずれか１からなる1以上の配列又はその配列の一部、
又は、前記配列又は配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性を示す配列
を含むアミノ酸配列をコードする配列を含み、
当該配列又は配列の一部は、請求項６乃至９いずれか１項で規定される１番目又は第２の配列を含み得るヌクレオチド配列によりコードされる、該酵母。
【請求項１２】  前記低親和性トランスポーターがＨＸＴ１又は３であり、前記高親和性トランスポーターがＨＸＴ２、４、６、７又はＧＡＬ２Ｐである、請求項８乃至１１いずれか１項に記載の酵母。
【請求項１３】  前記構成体が、ＨＸＴ１及びＨＸＴ７からの配列、又はそれらに関連する配列、或いはそれらから誘導される配列を含む、請求項６乃至１２いずれか１項に記載の酵母。
【請求項１４】  ｘが、ＨＸＴ１又はＨＸＴ７の３番目乃至９番目の膜貫通伸張により包含されるヌクレオチド配列又は類似の配列中の位置であり、好ましくはｘ＝５２５−５７５及び／又は７２０−７７０である、請求項７乃至１３いずれか1項に記載の酵母。
【請求項１５】  ｘ＝５５１又は７４１、ｗ及びｙ＝１、及びｚ＝１７１３である、請求項７乃至１４いずれか1項に記載の酵母。
【請求項１６】  前記キメラ構成体が、合計１０乃至１４の膜貫通ドメインを有するキメラポリペプチドをコードする、請求項６乃至１５いずれか1項に記載の酵母。
【請求項１７】  前記キメラ構成体が、少なくとも１のトランスポーター分子からなるヌクレオチド配列又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列からの２以上の配列又は、２以上のトランスポーターのヌクレオチド配列又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列からの配列を含む、請求項６乃至１６いずれか1項に記載の酵母。
【請求項１８】  請求項１２に記載の酵母であって、前記構成体が、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−２３１、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド２３２−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−３９１、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド３９２−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−４４９、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド４５０−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−５５１、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド５５２−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−６２７、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド６２８−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−７４１、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド７４２−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−１０１０、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド１０１１−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−１１０８、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド１１０９−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−１２１４、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド１２１５−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−１２９３、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド１２９４−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−１４３８、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド１４３９−１７１３、
ＨＸＴ１からのヌクレオチド１−１５０４、及びＨＸＴ７からのヌクレオチド１５０５−１７１３、
又は、前記構成体と機能的に等価な核酸分子、を含む該酵母。
【請求項１９】  前記キメラ構成体が導入される酵母細胞が、サッカライド移送特性のないヌル菌株である、請求項６乃至１８いずれか1項に記載の酵母。
【請求項２０】  前記構成体が、配列ＩＤ番号１７又は１８をコードするヌクレオチド配列又は配列ＩＤ番号１９又は２０のヌクレオチド配列或いは前記配列の機能的等価物を含む、請求項６乃至１９いずれか１項に記載の酵母。
【請求項２１】  前記機能的に等価な分子が、前記構成体と、又は請求項１０に定義される条件下において配列ＩＤ番号１９又２０と、ハイブリッド化し、又は、前記構成体の配列或いは配列ＩＤ番号１９又２０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１８又は２０に記載の酵母。
【請求項２２】  寄託番号ＤＳＭ（ドイツ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）１３８３２又はＤＳＭ１３５５５を各々有する、サッカロミセス・セレビシェＫＯＹ．ＴＭ４Ｐ又はＫＯＹ．ＴＭ６Ｐ、又はそれらの機能的等価物で示される、請求項２０又は２１に記載の酵母。
【請求項２３】  請求項６乃至２２のいずれか1項に規定のキメラヌクレオチド配列又はその相補的配列を含む核酸分子。
【請求項２４】  請求項２３で規定される核酸分子を含むベクター又は宿主細胞。
【請求項２５】  請求項２３で規定される核酸分子によりコードされる配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に等価な蛋白質。
【請求項２６】  請求項１乃至２２のいずれか1項で規定される酵母細胞に外因性の遺伝物質を挿入して生成物を生産する酵母細胞を提供する方法であって、該方法は、前記物質（好ましくはベクター内に含まれる）を前記細胞に導入する工程を少なくとも含み、前記外因性物質は、前記生成物又はその一部をコードするか又は、前記生成物又はその一部の生成を直接又は間接に促進するポリペプチド又はその一部をコードするか、或いは該ポリペプチド又は生成物の発現に影響する、該方法。
【請求項２７】  前記生成物が、高分子量又は低分子量の代謝産物、嵩高な又は微細な化学物質、食品原料、機能性食品、又は治療剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】  前記生成物が、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、糖、小さな多価アルコール、又はＣＯ２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】  請求項２６乃至２８のいずれか1項に記載の方法で得ることができる酵母細胞。
【請求項３０】  高濃度のサッカライド、好ましくはグルコースの存在下、嫌気性条件下で請求項１乃至２２のいずれか1項、又は請求項２９で規定される酵母細胞を成長させることを含む、生成物の調製方法。
【請求項３１】  生成物を分離しそして形成される工程を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】  請求項３１に記載の方法で得られる生成物。
【請求項３３】  前記生成物が、低アルコール又は非アルコール飲料である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３４】  前記生成物が、低アルコール又は非アルコール飲料である、請求項３２に記載の生成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、変性サッカライド（特にヘキソース）移送特性を有する酵母及びその使用に関する。
【０００２】
（発明の目的）
本発明の目的は、変性サッカライド（特にヘキソース）移送特性を有するが、同時に、好気性条件下、高いサッカライド（特にヘキソース）濃度で、アルコール、特にエタノールの生成を回避する酵母を得ることである。
【０００３】
（発明の背景）
酵母解糖（糖をピルビン酸塩に転化する経路）は、酵母の細胞蛋白質の５０−７０％が解糖作用酵素から構成されるという事実により立証されてきたように、大きな容量を有する。この経路は非常に複雑な方法で、異なる部分的に不確定なメカニズムで制御されていることは驚くにあたらない（“Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ： Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．Ｇａｎｃｅｄｏ ａｎｄ  Ｓｅｒｒａｎｏ著（１９８９年）中の１−３７頁、ＦｒａｅｎｋｅｌのＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９８２年）、“Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ”、Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ編、第２版、第３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｅｎｔｉａｎ（１９９７年）中の２０５−２５９頁、Ｅｎｅｒｇｙ−ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ＬａｎｃａｓｔｅｒＰＡ中のＹｅａｓｔ ｓｕｇａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）。これらのいくつかは、ヒト及び高等植物までの他の生物からの解糖経路と共有されているようであるが、それ以外は酵母に特有のようである。
【０００４】
酵母解糖の調節は、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）及びピルビン酸キナーゼ等の経路における鍵酵素のアロステリック制御を経て起こる（Ｂｌａｚｑｕｅｚ等、１９９３年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３２９、５１−５４頁；Ｂｏｌｅｓ等、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０、６５−７６頁；Ｃａｍｐｂｅｌｌ−ＢｕｒｋとＳｈｕｌｍａｎ、１９８７年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１、５９５−６１６頁；ＤａｖｉｓとＢｒｉｎｄｌｅ、１９９２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、４７２９−４７３５頁；ＧａｎｃｅｄｏとＳｅｒｒａｎｏ、１９８９年、ｓｕｐｒａ；Ｈｅｉｎｉｓｃｈ等、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、１５９２８−１５９３３頁）。長い間、ＰＦＫは解糖系における（単一の）速度制限工程と考えられた。代謝制御解析理論の発達により、これは簡略化しすぎであることが示された（Ｆｅｌｌ、１９９７年、“Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”中、Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ、ＬｏｎｄｏｎとＭｉａｍｉ）。
【０００５】
多分酵母に特異的であるが、中心をなす重要な制御機構は、ヘキソキナーゼのレベルで働き、トリハロース代謝を包含する（ＴｈｅｖｅｌｉｎとＨｏｈｍａｎｎ、１９９５年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２０、３−１０頁）。トリハロース−６−ホスフェートシンターゼの不活性化は、トリハローゼ堆積の欠乏を引起すが、特に、グルコース上で成長する場合に、成長欠陥も引起す（Ｇｏｚａｌｅｚ等、１９９２年、Ｙｅａｓｔ、８、１８３−１９２頁；Ｖａｎ  Ａｅｌｓｔ等、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８、９２７−９４３頁）。同じ酵素欠乏の、Ｓ．セレビシェの突然変異体での異種のトリハローズ−６−ホスフェートシンターゼの発現は、少なくとも部分的にはグルコース上での成長及びグルコースの流れ込みに加えてトリハローズ−６−ホスフェートシンターゼのレベルを回復する（Ｂｏｎｉｎｉ等、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１５、２６１−２６８頁）。
【０００６】
また、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＮＡＤ＋、及びＰｉ等の他の代謝物質及び／又は共代謝物質は、アロステリック制御及び所謂“熱力学的制御”（あるいは、“濃度”又は“代謝物質制御”）等の異なるレベルで包含され得る（ＧａｎｃｅｄｏとＳｅｒｒａｎｏ、１９８９年、ｓｕｐｒａ）。ＡＴＰ含有量と解糖流量の間に強い“負の”相関が見出され、それは流量のアロステリック制御をさし示す。最近の研究では、透過した細胞中でのＡＴＰ阻害の標的は主に、ホスホフルクトキナーゼ及びピルビン酸キナーゼのレベルであることが示された（Ｌａｒｓｓｏｎ等、２０００年、Ｙｅａｓｔ、１６、７９７−８０９頁）。
【０００７】
解糖酵素及び解糖酵素のタンパク分解をコードする遺伝子の発現を変性することは、他のレベルの調節と制御であり、解糖制御を考慮すると、それは理解から程遠い（“Ｙｅａｓｔ ｓｕｇａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎとＥｎｔｉａｎ編、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ、中のＨｏｈｍａｎｎ、１９９７年、１８７−２１１頁；Ｌａｒｓｓｏｎ等、１９９７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９、７２４３−７２５０頁）。
【０００８】
酵母Ｓ．セレビシェは著しい代謝柔軟性を有し、これは厳しい嫌気性条件下で醗酵成長することができる数少ない酵母の１つである（Ｖｉｓｓｅｒ等、１９９０年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５６（１２）、３７８５−３７９２頁）。好気性条件の間で、同時に比較的高い外部グルコース濃度で、クラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）効果が働き、醗酵性糖での好気性成長の間でもエタノールの産出にいたる（Ｆｒａｅｎｋｅｌ、１９８２年、ｓｕｐｒａ；ＧａｎｃｅｄｏとＳｅｒｒａｎｏ、１９８９年、ｓｕｐｒａ）。クラブトリー効果の多くの原因が出されてきた。第一に、増大した細胞外（又は細胞内）レベルのグルコースが、呼吸経路の重要な要素の活性抑圧を引起し、代わりに醗酵経路を経るプロセスに至ることが示唆された。別の説明は、その効果は、単に解糖経路の負荷によって起こり、醗酵プロセスへの炭素源のシャント（ｓｈｕｎｔ）に至ることを示唆する。
【０００９】
上述の通り、グルコース抑制（＝（炭素）異化代謝産物抑制）は、醗酵性糖での成長の間の好気性エタノール生成についての説明の一部であり得る（Ｆｒａｅｎｋｅｌ、１９８２年、ｓｕｐｒａ；ＧａｎｃｅｄｏとＳｅｒｒａｎｏ、１９８９年、ｓｕｐｒａ；Ｇａｎｃｅｄｏ、１９９２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０６、２９７−３１３頁）。グルコース抑制の主要な効果は、異なる源が利用できる場合、グルコースとフラクト−スは好ましい炭素源であることである。グルコース抑制に含まれる全系列の遺伝子があり、抑制の程度はグルコース取込み容量と関係する。このことは、グルコース利用率は適切なグルコースシグナルの強度を決定することを示唆する（Ｇａｎｃｅｄｏ、１９９８年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６２、３３４−３６１頁）。
【００１０】
しかし、グルコース流量より細胞外（又は細胞内）グルコース濃度がグルコース抑制を誘発することが提案されてきた（Ｍｅｉｊｅｒ等、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２４１０２−２４１０７頁）。グルコースが細胞内部で検出されると、トランスポーターが初期のシグナルの発生でのみならず、かかるシグナルの保持においても間接的な役割をもつ（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ等、１９９７年、Ｂｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４５、３２４−３３３頁；Ｗａｌｓｈ等、１９９４年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７６、９５３−９５８頁）。
【００１１】
細胞内グルコース濃度は、従来報告されたものよりもずっと高い（約１．５ｍＭ）ことが最近示された。この濃度はグルコースの流れ込みを５０％まで低減するのに十分である（Ｔｅｕｓｉｎｋ等、１９９８年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０、５５６−５６２頁）。この研究の著者は、細胞内グルコースがグルコースの輸入の調節、従って解糖の有力な候補であると結論づけている。
【００１２】
異なる外部の糖濃度の間で、酵母細胞は、高い（Ｋｍが約１−３ｍＭ）又は低い（Ｋｍが約１０−５０ｍＭ）親和性糖取込みシステムを示す（ＢｉｓｓｏｎとＦｒａｅｎｋｅｌ、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、１７３０−１７３４頁；Ｗａｌｓｈ等、１９９４年、ｓｕｐｒａ）。低いグルコース媒体で成長する細胞は、高い親和性成分と低い親和性成分の両方をしばしば示す（ＢｉｓｓｏｎとＦｒａｅｎｋｅｌ、１９８３年、ｓｕｐｒａ）。グルコースは、異なる特定のキャリア蛋白質により促進された拡散によって酵母細胞に移送される（Ｂｉｓｓｏｎ等、１９９３年、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８、２５９−３０８頁）。
【００１３】
遺伝的研究は、ヘキソーストランスポーターをコードする２０の相同の遺伝子を含む遺伝子系統、ＨＸＴ系統を含意する（Ｋｒｕｃｋｅｂｅｒｇ、１９９６年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６６、２８３−２９２頁；Ｄｉｄｅｒｉｃｈ等、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、１５３５０−１５３５９頁；ＯｚｃａｎとＪｏｈｎｓｔｏｎ、１９９９年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６３、５５４−５６９頁）。ＨＸＴ系統は、主要な促進因子上位系統（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する（Ｐａｏ等、１９９８年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６２、１−３４頁）。該系統の異なる類は、外部グルコース濃度に依存して、異なるレベルに発現する（Ｄｉｄｅｒｉｃｈ等、１９９９年、ｓｕｐｒａ）。ＨＸＴ１は高いグルコース濃度で誘導され、一方、ＨＸＴ２、ＨＸＴ４、及びＨＸＴ６−７は低いグルコース濃度で誘導され、ＨＸＴ３はグルコース濃度に関係なく誘導される。更に、ＨＸＴ１−７の転写は細胞外グルコース濃度に関係する。また、窒素利用度及び嫌気性度／好気性度等の他の条件が、ＨＸＴ系統の類の発現に影響する（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇ等、１９９５年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６、１５７−１６７頁；Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ等、１９９７年、ｓｕｐｒａ；Ｄｉｄｅｒｉｃｈ等、１９９９年、ｓｕｐｒａ）。
【００１４】
ＨＸＴ系統は、ガラクトーストランスポーターをコードするＧＡＬ２（グルコースも移送する）と、高及び低グルコース濃度の推測上のセンサーを各々コードするＳＮＦ３とＲＧＴ２も含む（Ｄｉｄｅｒｉｃｈ等、１９９９年、ｓｕｐｒａ；ＯｚｃａｎとＪｏｈｎｓｔｏｎ、１９９９年、ｓｕｐｒａ）。推測上のセンサー蛋白質は、多分グルコースレセプターとして働き、細胞質中にあると予測されている異常に長いＣ末端テールを含む（Ｏｚｃａｎ等、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２４２８−１２４３２頁；Ｏｚｃａｎ等、１９９８年、ＥＭＢＯ．Ｊ．、１７、２５６６−２５７３頁）。
【００１５】
エタノールの生成量を増大するため、特にアルコール飲料及び蒸留酒を製造するために、ＨＸＴ遺伝子を含むＤＮＡ構成体を構成することによる（特に、ＨＸＴ１及び／又はＨＸＴ３遺伝子を用いることによる）サッカロミセス・セレビシェの変性は、ＥＰ−Ａ−０７８５２７５より従来から知られていた。
【００１６】
しかし、好気性条件下でほとんど又は全くアルコールを生成せず、さらに依然成長を示すサッカロミセス酵母は知られていなかった。
【００１７】
数千年の間、酵母はアルコール飲料の調製に使用されてきており、将来、このプロセスは、再生可能燃料としてのエタノールの生産にとってより重要となるであろう。しかし、アルコール以外のより多くの生成物が、酵母によって再生可能源から潜在的に製造され得る。例えば、精化学薬品、非アルコール飲料、及び蛋白質又は低分子代謝産物等の同種又は異種の化合物のような他の貴重な物質が生産され得、多くの場合生産される。
【００１８】
他の技術（例えば、化石原料（例えば、精化学薬品等のいくつかの製品を製造するための基礎として用いられ得る、石油等）を用いて）に基づく製造プロセスと成功裏に競合するため、最も高い可能な収率が必要とされる。潜在的な問題は、グルコースのような“良い”炭素源は、所望の物質の合成に要求される遺伝子の抑制をしばしば引起すことである。その結果、収率は低いか、製品は形成さえされ得ない。これらの効果を克服、又は少なくとも最小化するため、バッチ供給（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）栽培法又はケモスタット中での成長等の異なる培養法がしばしば用いられ、炭素源（例えばグルコース）濃度の一般的増加（これは抑制に至り得る）を回避する。
【００１９】
しかし、今回驚くべきことに、酵母の糖類移送能力の適切な改良により、炭素源として高濃度の糖類（例えば、グルコース等の醗酵性の糖）の存在下であっても、良好な成長と炭素源の消費を維持しながら、サッカロミセス・セレビシェの醗酵経路によるプロセスが回避され得ることが見出された。本分野の他の研究者は、このような有利な特性のある酵母を産出していない。
【００２０】
（発明の開示）
従って、本発明は、好気性条件及び高い糖類濃度で醗酵経路によるプロセスの既存の問題に対する解決策を提供する。それは、本発明の構成体を含む酵母がクラブトリー効果から解放される（例えば、グルコース抑制から解放される）と考えられるためである。従って、醗酵が大きく欠けている（例えば、グルコース抑制の不足により）場合、洗練された栽培技術にたよることなく、高収率で異なる物質を得ることができる。
【００２１】
従って、本発明は、特定のヘキソース移送特性を有する、非アルコール生成のサッカロミセス・セレビシェの菌株に関し、それにより、ヘキソース移送遺伝子における変化が、前記非エタノール生成特性を得る１つの方法を与える。
【００２２】
以下に記載する発明は、従って、特に、グルコース及び／又はガラクトース（好ましくはグルコース）などのサッカライドトランスポーター間の、特に好ましくは、高親和性（例えば、ＨＸＴ７）及び低親和性（例えば、ＨＸＴ１）のサッカロミセス・セレビシェ酵母のヘキソーストランスポーター間のキメラ構成体に関する。
【００２３】
パン酵母製造のような伝統的な方法以外にも、工業的応用には、蛋白質又は低分子代謝産物などの同種又は異種物質、嵩高な及び微細な化学物質、酵母エキスを含む食品原料、機能性食品、及び治療剤などの製造が含まれる。
【００２４】
従って、第一の観点では、本発明は、５ｍＭ以上のサッカライド、好ましくは２％のグルコースの濃度条件及び好気性条件下において、野生型酵母よりも低いレベルのアルコール（特に、エタノール）を生産し、野生型酵母の少なくとも３０％の成長速度を示す、修飾サッカロミセス酵母を提供するものである。
【００２５】
さらに、本発明は、好気性成長及び高ヘキソース濃度下において非アルコールを生成し、改変されたヘキソース輸送特性を有するサッカロミセス・セレビシェの菌株を提供する。好ましくは、前記サッカロミセス・セレビシェは、本明細書に記載する異種及び／又は同種の発現物質を有する。
【００２６】
好ましくは、前記酵母は、野生型と比較して、５０％未満（例えば、３０、２０、又は１０％未満）のアルコール（特に、エタノール）、特に好ましくは、５％未満（例えば、３、２、又は１％未満）のアルコール（特に、エタノール）、を生成する。都合の良いことに、これは、アッセイの条件における、０．６ｇ／ｌ未満（例えば、０．２５ｇ／ｌ未満）、特に好ましくは、０．１５ｇ／ｌ以下（例えば、０．１２ｇ／ｌ以下）のアルコール（特に、エタノール）レベルと一致し得る。
【００２７】
好ましくは、前記酵母は、野生型酵母と比較して、少なくとも３０％、３５、４０、４５、５０、６０、７０、又は８０％（好ましくは、少なくとも６０、７０、又は８０％）の世代時間、例えば、４．５時間未満、３．９、３．５、又は３．０時間未満の世代時間、又はこれらと等価な成長速度を示す。
【００２８】
それゆえ、特に好ましい特徴では、本発明は、５ｍＭ以上のサッカライド、好ましくは２％のグルコースの濃度条件及び好気性条件下において、０．１５ｇ／ｌ以下のアルコール（特に、エタノール）を生産し、野生型酵母の５０％より大きい成長速度を示す、修飾サッカロミセス酵母を提供する。
【００２９】
本発明の修飾酵母は、例えば、野生型酵母の５０％未満、例えば４０％以下、例えば、５ｍｍｏｌ未満のグルコース／（ｇ バイオマス 時間）の減少されたグルコース消費を示すことができ、しかしながら、好ましくは、野生型と比較して、２０％より多く、例えば３０、４０、又は５０％より多く消費する。
【００３０】
好ましくは、本発明の酵母の成長収率は、野生型の少なくとも３０％、例えば、３０乃至１２０％、例えば、４０又は５０％より大きく、好ましくは６０、８０、又は１００％より大きく、例えば、０．２０、０．３５、０．４０、又は０．５０ｇバイオマス／ｇのグルコースより大きい。
【００３１】
好ましくは、本発明の酵母の酸素消費は、野生型酵母と比較して改良され、すなわち、野生型酵母の少なくとも１００％、好ましくは、少なくとも１５０、１７５、又は２００％であり、例えば、２、２．５、３、又は４ｍｍｏｌ Ｏ２／（ｇ バイオマス 時間）である。
【００３２】
特に好ましくは、本発明の酵母は、改変されたサッカライド（例えば、ヘキソース、グルコース）輸送特性を示す。その他のサッカライド（特に、ガラクトース及び／又はマルトース）の輸送もまた影響を受け得る。
【００３３】
酵母のサッカライド輸送特性の改変は、自然輸送分子（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に関する外因性分子を導入することにより簡便に達成される。特に好ましくは、公知のトランスポーター分子の部分間のキメラ構成体は、酵母細胞中に発生及び取込まれることができ、それによりそれらのサッカライド輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、及び好気性条件下における呼吸及び醗酵経路の使用に影響を与え得る。
【００３４】
Ｈｘｔ系統及びその他のサッカライドトランスポーターは、非常に似ているトポロジーを持ち、１２の膜貫通ドメインを有する蛋白質である。出願人は、異なる分子の部分を結合させることが、改変された輸送特性を示す機能性トランスポーター分子を提供することを見出した。理論と結合させようとすること無しに、そのようなキメラによりグルコース抑制の解除が生じ、それゆえ、呼吸経路の使用が拡大され、アルコール生成が減少するようである。
【００３５】
以下において詳細に記載するように、種々のキメラ分子を生成し、サッカロミセス・セレビシェのゲノムに取込んだ。特に、Ｈｘｔ１及びＨｘｔ７の部分間にキメラ構成体を含む２つの修飾酵母の開発及び試験について記載する。
【００３６】
第１の修飾酵母（ＫＯＹ．ＴＭ６、本明細書においてはＫＯＹ．ＴＭ６Ｐとしても引用する）の場合では、２つの遺伝子間の融合は、膜貫通領域６（ＴＭ６）をコードする領域に生じさせた。この菌株（ＫＯＹ．ＴＭ６Ｐ）は、酸素存在下でのグルコースにおける成長の間に抑制解除された性質を示す。すなわち、ほんの微量のエタノール（２％グルコースにおける成長の間に０．１２ｇ／ｌ未満）が生成する。同時に、世代時間が３．８時間、糖消費速度が３．１−３．９ｍｍｏｌ／（ｇ バイオマス 時間）、及び成長収率が０．４１ｇバイオマス／ｇグルコースである比較的高い成長速度が得られる。
【００３７】
第２の修飾酵母（ＫＯＹ．ＴＭ４、本明細書においてはＫＯＹ．ＴＭ４Ｐとしても引用する）は、膜貫通領域４をコードする領域において遺伝子が付着した構成体を含む。この修飾酵母はＫＯＹ．ＴＭ６と非常に似通った成長特性を示し、世代時間が３乃至３．９時間及び成長収率が０．３４ｇバイオマス／ｇグルコースである成長速度を有する。
【００３８】
それゆえ、好ましい特徴において、本発明の酵母は、好ましくは以下に定義するように、酵母の遺伝物質に安定に形質転換されるキメラのヌクレオチド配列（キメラ構成体）を含み、当該該構成体は、異なるサッカライド（例えば、グルコース及び／又はガラクトース（好ましくは、グルコース））トランスポーターをコードする２以上の核酸配列を含み、すなわち、当該構成体は、第１のサッカライドトランスポーターをコードするヌクレオチド配列からの少なくとも第１の配列（又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列）、及び異なる第２のサッカライドトランスポーターをコードするヌクレオチド配列からの第２の配列（又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列）を含み、さらに当該サッカライドは好ましくはグルコースである。
【００３９】
特に好ましくは、構成体は、少なくとも１の高親和性及び１の低親和性（好ましくは酵母サッカロミセスの、好ましくはサッカロミセス・セレビシェの）ヘキソーストランスポーターの間であり、上述したように前記第１及び第２のサッカライドトランスポーターを形成する。好ましくは、トランスポーターは、好ましくはサッカロミセス・セレビシェからの、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ及びＹＪＲ１６０ｃから、又はそのような分子の配列に関連する配列或いはそれらの配列から誘導される配列から選択される。特に、その他の種又は属からの（例えば、バクテリア、植物、又は動物からの）相似の及び関連する配列は、キメラを生成するために使用され得る。
【００４０】
それゆえ、本発明は、好ましくは、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ及びＹＪＲ１６０ｃのグループから成る１以上の機能性ヘキソーストランスポーターの結合を含むサッカロミセス・セレビシェを提供する。特に好ましくは、前記サッカロミセス・セレビシェは、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７のグループから成る１以上の機能性ヘキソーストランスポーターの結合を含む。
【００４１】
そのような分子のアミノ酸配列は、Ｐ３２４６５（ＨＸＴ１）、Ｐ２３５８５（ＨＸＴ２）、Ｐ３２４６６（ＨＸＴ３）、Ｐ３２４６７（ＨＸＴ４）、Ｐ３８６９５（ＨＸＴ５）、Ｐ３９００３（ＨＸＴ６）、Ｐ３９００４（ＨＸＴ７）、Ｓ５０７７１（ＨＸＴ８）、Ｓ５０７０８（ＨＸＴ９）、Ｓ４８３１３（ＨＸＴ１０）、Ｓ４９６００（ＨＸＴ１１）、Ｓ５０３５６（ＨＸＴ１２）、Ｓ５０５２０（ＨＸＴ１３）、Ｓ６３２９９（ＨＸＴ１４）、Ｓ６７８０９（ＨＸＴ１５）、Ｓ５７１８７（ＨＸＴ１６）、Ｓ６３４０５（ＨＸＴ１７）、Ｐ１３１８１（ＧＡＬ２）、Ａ３１９２８（ＳＮＦ３）、Ｓ６７６８４（ＲＧＴ２）、Ｓ６４６２４（ＡＧＴ１）、Ｓ６７８１２（ＹＤＬ２４７ｗ）及びＳ５７１９０（ＹＪＲ１６０ｃ）に記載されている。ここで、受託番号がＳ又はＡから始まるものについてはＰＩＲデータベースを、Ｐから始まるものについてはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースを参照のこと。
【００４２】
上述のアミノ酸配列と関連する或いはそれらから誘導される１以上の配列から構成されるキメラ（又は、上述の配列と関連する或いはそれらから誘導される１以上の配列をコードするヌクレオチド配列から構成されるキメラ構成体）も、本発明の範囲に含まれる。例えば、１以上の自然に生じる配列が、異なる自然に生じる分子から誘導されると組合されることができ、又は、各々が異なる分子と関連する２以上の配列間の組合せを用いることができる。
【００４３】
特に好ましくは、本発明の又は本発明における使用のためのキメラをコードするヌクレオチド配列は、
好ましくは前述のサッカロミセス・セレビシェからの、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ及びＹＪＲ１６０ｃのいずれか１をコードする、（特に以下に記載の）１以上の配列又はその配列の一部、
又は、室温で、６×ＳＳＣ／５０％ホルムアミドの非厳格な結合条件下で前記配列又はその一部を交配させて、高厳格条件（例えば、２×ＳＳＣ、６５℃、ここで、ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）下で洗浄する配列、
又は、前記配列又はその一部と少なくとも８０％、好ましくは９０又は９５％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を示す配列（これらは、例えば、デフォルト値（ｄｅｆａｕｌｔ  ｖａｌｕｅ）及び可変パムファクター、及び６ヌクレオチドのウインドウを有する１２．０のギャップクリエーションペナルティーセット（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｅｔ）及び４．０のギャップエクステンションペナルティーセット（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｅｔ）、を有するＧＣＧパッケージを用いたＦＡＳＴＡ  Ｓｅａｒｃｈによって測定される）、
又は、前述の配列のいずれかと相補的な配列、
を含む。そのような配列又は配列の一部は、以下に記載する１番目又は第２の配列を含み得る。
【００４４】
上記“一部（部分、ｐｏｒｔｉｏｎｓ）”は、好ましくは、少なくとも３０％の野生型配列（例えば、少なくとも５０、７０、又は９０％の当該配列）を含み、例えば、３００以上の塩基、好ましくは５００以上又は６００以上の塩基を含む。しかし、キメラが複数の部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）から構成される場合は、より短い部分も考慮され得る。そのような場合、当該部分は、例えば５０乃至２００塩基を有することができる。アミノ酸配列と関連して言及される部分は、上記ヌクレオチド配列によりコードされる類似の長さ（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｌｅｎｇｔｈ）を含み、例えば１００以上の残基、好ましくは１８０又は２００より多い残基、又は１５乃至６５残基のようなより短い部分（ｓｈｏｒｔｅｒ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を含む。
【００４５】
別の観点から、特に好ましくは、本発明の又は本発明における使用のためのキメラをコードするヌクレオチド配列は、
好ましくは前述のサッカロミセス・セレビシェからの、ＨＸＴ１乃至ＨＸＴ１７、ＧＡＬ２、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ及びＹＪＲ１６０ｃの（特に以下に記載の）いずれか１からなる1以上の配列又はその配列の一部、
又は、前記配列又はその一部と少なくとも８０％、好ましくは９０又は９５％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を示す配列（これらは、例えば、可変パムファクター、及び１２．０のギャップクリエーションペナルティーセット（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｅｔ）及び４．０のギャップエクステンションペナルティーセット（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｅｔ）、及び２のアミノ酸のウインドウを有するＦＡＳＴＡ  ｐｅｐ−ｃｍｐを用いたＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ配列データバンクを用いて測定される）、
を含み得るアミノ酸配列をコードする。そのような配列又は配列の一部は、以下に記載する１番目又は第２の配列を含み得るヌクレオチド配列によりコードされる。
【００４６】
好ましくは、キメラを構成するのに使用される核酸配列が、自然発生（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）配列（及び、好ましくは上述の系統に分類される配列）と関連し或いはそれから誘導される場合、当該関連し、又は誘導される配列が、機能的に等価な蛋白質、又は前駆体、又はそれらの一部をコードする。
【００４７】
それゆえ、好ましくは、本発明は上述のサッカロミセス・セレビシェに拡張され、それは１以上の機能性ヘキソーストランスポーター遺伝子の組合せを含み、ＤＮＡ配列は、当該ＤＮＡ配列がヘキソース（例えば、グルコース）を輸送可能な蛋白質をなおコードするような方法において１以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加によりこれらの遺伝子から誘導される。
【００４８】
本発明は、また、前述及び後述の蛋白質と機能的に等価な蛋白質、例えば自然発生分子（又は、例えば機能的等価物と関連し或いはそれから誘導される配列）の組合せにより形成される蛋白質をコードするキメラ構成体にも拡張され、そこでは当該組合せは、例えば置換、欠失、又は付加によってさらに修飾され、以下に記載する機能的に等価な蛋白質、又は前駆体、又はそれらの一部をコードする配列を提供し、さらに、好ましくは当該機能的に等価な蛋白質は上述の同一性を満たし、例えば組合せによって形成される配列に対し少なくとも９８％の同一性を有する。また、前記コードされた配列は、上述の同一性又はハイブリッド形成条件（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を満たす。
【００４９】
それゆえ、さらなる特徴において、本発明は、本明細書中に記載の修飾された組換型サッカロミセス・セレビシェを提供するものであり、それは本明細書中に記載のサッカライドトランスポーター、好ましくはＨＸＴ１及びＨＸＴ７、又はそれらの誘導形質転換体（例えば、機能的に等価な核酸分子）のいずれか１の遺伝子から誘導される修飾遺伝子（例えば、本明細書中に記載のキメラ構成体）を発現する。
【００５０】
それゆえ、本発明は、本明細書中に記載のキメラヌクレオチド配列又はそれらと機能的に等価の核酸分子を含み、好ましくは上述の同一性及び／又はハイブリッド形成条件を満たすヌクレオチド配列、及び同様の物を含む修飾酵母細胞を提供するものである。
【００５１】
好ましくは、キメラは、低親和性トランスポーター（好ましくは、ＨＸＴ１又はＨＸＴ３）及び高親和性トランスポーター（好ましくはＨＸＴ２、４、６、７、又はＧＡＬ２Ｐ、特に好ましくはＨＸＴ６又は７）の間に形成される。
【００５２】
特に好ましくは、キメラ構成体は、ＨＸＴ１及びＨＸＴ７、又は関連する或いはそれらから誘導される配列間に形成され、酵母を形質転換し本発明の酵母を提供するために用いられる。好ましくは、ＨＸＴ１のＮ末端部分はＨＸＴ７のＣ末端部分と接合されるが、さらに、Ｎ末端のＨＸＴ７とＣ末端のＨＸＴ１との形成も本発明の範囲内に含まれる。
【００５３】
それゆえ、キメラ（すなわち、キメラ構成体）をコードするヌクレオチド配列は、
Ａ−Ｂ
の型を有する配列を含み、式中、
Ａは、ヌクレオチド塩基ｗ乃至ｘを含む第１の成分（すなわち、前記第１の配列）であり；
Ｂは、ヌクレオチド塩基（ｘ＋ｙ）乃至ｚを含む第２の成分（すなわち、前記第２の配列）であり；
式中、Ａ及びＢは、別個の分子（例えば、ＨＸＴ１及びＨＸＴ７）から、すなわち異なるサッカライドトランスポーターのヌクレオチド配列から又はそれに関連する配列或いはそれから誘導される配列から誘導され；
ｗは、前記第１の成分が誘導されるヌクレオチド配列（例えば、上記のＨＸＴ１又はＨＸＴ７、又は類似の配列）内の１番目の位置であって、ｘより小さく、好ましくは１乃至３００（例えば１乃至５０）、特に好ましくは１乃至１０（例えば１）であり；
ｘは、前記第１の成分が誘導される、ヌクレオチド配列内の２番目の位置であって、ｗより大きく、好ましくは３００乃至１２５０（例えば、５００乃至８５０）の数であり；
ｙは整数で、好ましくは１０未満であり、例えば、５未満、３未満、１であり；
ｘ＋ｙは、前記第２の成分が誘導されるヌクレオチド配列（例えば、上記のＨＸＴ１又はＨＸＴ７、又は類似の配列）内の１番目の位置であって；
そして、ｚは、前記第２の成分が誘導される、ヌクレオチド配列内の２番目の位置であって、ｘ＋ｙより大きく、好ましくは８００乃至１７１３であり、特に好ましくは１２００乃至１７１３、例えば、１６００乃至１７１３、１６７５乃至１７１３である；
ここで、前記値は、前記サッカライドトランスポーターのヌクレオチド配列（例えば、ＨＸＴ１又はＨＸＴ７或いはそれに類似の配列）内の位置に該当する。
【００５４】
サッカロミセス・セレビシェのトランスポーター分子は、１２の膜貫通配列を含む。好ましい特徴では、共同してキメラを形成する２以上の部分間の連結点は、３番目乃至９番目の膜貫通伸張の配列内である。それゆえ、好ましくは、ｘは、ＨＸＴ１又はＨＸＴ７の３番目乃至９番目の膜貫通伸張により包含されるヌクレオチド配列又は類似の配列中の位置であり、特に好ましくは４００乃至９００（例えば、５２５乃至８００）であり、例えば、５２５−５７５及び／又は７２０−７７０、特に好ましくは５４５−５６０及び／又は７３５−７５０である。さらに、ｙは好ましくは１であり、ｚは好ましくは上述した範囲である。
【００５５】
好ましくは、本発明のキメラは合計１２の膜貫通ドメイン（例えば、ｗが１０未満及びｘが１６７５乃至１７１３）を有する。これは、例えば、第１のトランスポーターからの当該１２のドメインのうちのいくつか（例えば、ドメイン１乃至３−９、又はそれらの一部）と第２のトランスポーターからの残りのドメイン（３−９乃至１２、又はそれらの一部）を組合せることにより達成され得る。しかしながら、より多い又はより少ない膜貫通ドメインも考慮され、所望ならば１以上の膜貫通ドメインの間にリンカーを置くこともできる。従って、好ましくは、本発明の前記キメラは、６乃至１８（例えば、１０乃至１４）の膜貫通ドメインを含み、それらは前述の２以上のトランスポーター分子から誘導される。
【００５６】
上述の前記キメラは、２以上の成分、例えば複数の部分、例えば、本明細書中に記載の１以上のトランスポーター分子からなるヌクレオチド配列の２以上の配列、又は、２以上のトランスポーターのヌクレオチド配列の配列を含み得る。この場合、当該部分は、好ましくは、任意に前記部分間に１以上のリンカー基を有する膜貫通構造（例えば、１０−１４、好ましくは１２の膜貫通構造）を保持するために平衡して供給される。リンカー基は、また、それがキメラの機能性に影響を与えなければ、上記ＡとＢの間（すなわち、ｙが１以上であり得る）にも挿入され得る。
【００５７】
特に好ましくは、ｘが５５１又は７４１、ｗ及びｙ＝１、及びｚ＝１７１３である。さらに、ｘは６６８であることもできる。そのような核酸分子にコードされるキメラポリペプチドを配列ＩＤ番号１７及び１８に記載する。このような配列、これらを含む配列、（好ましくは、上述の同一性の要件を満たす）機能的に等価なポリペプチド、及び上記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、は本発明の好ましい観点を形成する。好ましい特徴において、前記コードする核酸配列を配列ＩＤ番号１９及び２０に記載する。これらの形成を発現する酵母細胞も、また、本発明の好ましい観点を形成する。特に、本発明の更なる観点は、サッカロミセス・セレビシェＫＯＹ．ＴＭ４Ｐ又はＫＯＹ．ＴＭ６Ｐ、又はそれらから誘導される形質転換体（特に、それぞれ寄託番号ＤＳＭ１３８３２、ＤＳＭ１３５５５を有するもの）、で表される修飾された組換型サッカロミセス・セレビシェに及ぶものである。
【００５８】
上述のヌクレオチド配列、上述のキメラ蛋白質をコードする配列、及びそれらと相補的な配列を含む核酸分子は、本発明の更なる観点を形成する。そのような核酸分子にコードされる配列を含む蛋白質又はポリペプチドも、本発明の更なる観点を形成する。さらに、本発明は、上述の機能的に等価な蛋白質に加え、脱グリコシル化又はグリコシル化などにより化学的に修飾されたアミノ酸を有する蛋白質にも拡張される。特に、これらの変異蛋白質は、機能性に影響を与えることなしに基質の後合成／分離修飾、例えば、特定の残基のある程度のグリコシル化、メチル化などによって調製され得る。α−アミノ酪酸、ペニシラミン、ピログルタミン酸、又は、立体配置的に制限された類似体であるＴｉｃ（Ｐｈｅの置換体）、Ａｉｂ（Ａｌａの置換体）、又はピペコリン酸（Ｐｒｏの置換体）、などの非標準（ｎｏｎ−ｓｔａｎｄａｒｄ）アミノ酸を用いることができる。
【００５９】
本発明の核酸分子は、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ（好ましくは、ＤＮＡ）であることができ、前述の縮重し、実質的に同一であり、ハイブリッド形成した配列も含み得る。しかし、理想的には、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡが用いられる。
【００６０】
そのような外因性分子は、いずれかの適切な方法によって酵母細胞中に導入され得る。適切な形質転換又は形質移入の技術は、文献に十分に記載されている。上述の核酸分子は、発現調節配列、すなわちそのような組換えＤＮＡ分子を含む媒介物又はベクターをクローニングする組換えＤＮＡに連結され得る。特に、適切な核酸分子は、細胞中の適切な発現のためにベクター中に導入され得る。さらに、裸（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡを細胞中に直接導入することもできる。都合のよいことに、本明細書に記載の酵母細胞の形質転換には、酢酸リチウム形質転換法（Ｂｕｒｋｅら、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１０３−１０５頁、、２０００年）、又は凍結融解（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ）法又はスフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）法、又はその他の適切な技術（Ｄｏｈｍｅｎら、Ｙｅａｓｔ、７巻、６９１−６９２頁、、１９９１年、などを参照）が有効である。
【００６１】
適切な発現ベクターは、適切な調節配列、例えば、本発明の核酸分子を有するマッチング読み取りフレームに連結された、翻訳調節領域（例えば、開始及び停止コドン、リボソーム結合部位）及び転写調節領域（プロモーター−オペレーター領域、末端終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｏｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ））などを含む。適切なベクターには、プラスミド及びウイルス（バクテリオファージ及び真核生物ウイルスのいずれも含む）が含まれ得る。適切なウイルスベクターには、バキュロウイルス、さらにアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペス及びワクシニア／ポックスウイルスが含まれる。その他の多くのベクターが、当該技術分野において説明されている。
【００６２】
種々の技術が知られており、発現のために細胞中にベクターを導入するのに用いられ得る。前記ベクターが形質移入される、そのようなベクター及び真核又は原核細胞（好ましくは、酵母細胞）は、本発明の更なる観点を形成する。
【００６３】
上述のように、本発明の核酸分子、又はそれを含むベクターは、真核又は原核細胞のいずれにも導入されることができるが、特に酵母細胞、特に好ましくはサッカロミセス・セレビシェに導入され得る。そのような細胞は、野生型細胞と一致するものでも良い。しかし、都合のよいことに、前記細胞は、キメラ分子に関する核酸物質の封入の前においても、修飾され得る（例えば、改変された組換え型に相当する）。
【００６４】
従って、好ましい実施態様において、野生型細胞の表現型は、サッカライド（特に、グルコース）を輸送する分子についてのヌル菌株（ｎｕｌｌ  ｓｔｒａｉｎ）を生成するために、すなわち、厳しく制限されたサッカライド輸送特性を有する又は有しないヌル菌株を提供するために修飾される。例えば、好ましくは、２ｎｍｏｌ グルコース／分／ｍｇバイオマス 未満のグルコース捕捉を示す。これは、遺伝子型を修飾して、１以上のＨＸＴ１−１７、Ｇａｌ２、Ｓｔｌ１、及びグルコース親和性及び輸送特性を有する３のマルトーストランスポーター（すなわち、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ／ＭＰＨ２、及びＹＪＲ１６０ｃ／ＭＰＨ３）をコードする遺伝子を除去又は改変することによって、又は１以上のこれらの遺伝子の発現を変えることによって（すなわち、１以上の必須の転写因子又は翻訳因子を削除することによって）、又は１以上の発現トランスポーターの機能を減じることによって、達成され得る。都合のよいことに、上述の遺伝子の全て、これらの遺伝子に影響を与える調節システム、又は発現蛋白質は、輸送に利用可能な活性化トランスポーターがないように改変され、又は減じられ得る。しかしながら、さらに、トランスポーター、それらの遺伝子、又はそれらの発現のサブセット（ｓｕｂ−ｓｅｔ）は、影響を受けることができ、好ましくは、それは少なくともＨＸＴ１−４、６、７、及びＧＡＬ２である。これらの効果は、上述のように、例えば、トランスポーターの遺伝子を改変することによって、又は、遺伝子の転写或いは翻訳に影響を与えることによって、又は、優性ネガティブ変異体の方法論によって、達成され得る。本明細書に記載のキメラをコードする核酸分子は、その後、サッカライド輸送表現型を提供するためにヌル菌株中に導入され得る。
【００６５】
構成体及び特に上述の特性を有するサッカロミセス菌株は、代謝経路を操作でき望ましくない副生成物を避けることができる調製方法についての道具として、大きな可能性を有している。エタノールを全く生成しない酵母菌が長い間求められてきた。それゆえ、本発明における新規な菌株は、特性評価の今後の努力において、例えば、サッカロミセス・セレビシェにおけるグルコースの好気性成長の間における抑制機構の解明のために、非常に貴重な道具となりえるであろう。さらに、好気性バッチ培養の間における高い糖濃度での成長の場合でさえ、エタノールを全く生成しない菌株は、工業的使用についての開発の観点からも非常に興味深いものである。
【００６６】
従って、本発明のサッカロミセス細胞は、醗酵過程におけるアルコール及びその他の生成物の生成が望ましくないいずれの工程においても用いられ得る。そのような工程には、例えば、非アルコール性の高分子及び低分子の代謝産物、又は、嵩高い（ｂｕｌｋ）及び微細な（ｆｉｎｅ）化学物質などの低分子量又は高分子量の化合物、食品原料、機能性食品、治療剤、及び非アルコール性又は低アルコール飲料、の製造が含まれる。
【００６７】
これらの生成物は、本発明の非修飾酵母により生成される場合もある。例えば、非アルコール性或いは低アルコール飲料（例えば、フルーツジュース）は、炭素源を含む適切なサッカライドを用いて生成され得る。この方法により、低又は非アルコール性のワイン、ビール、又はその他の飲料を得ることができる。好ましくは、非アルコール性飲料は、本明細書で定義するアルコールレベルを有する。しかし、好ましい特徴では、ビールは、（重量／体積で）１％未満、特に好ましくは０．５％未満のアルコールレベルのものが生成され、同様に、ワインは、（重量／体積で）１０％未満、特に好ましくは２．５％又１％未満のアルコールレベルのものが生成され得る。
【００６８】
代替的に、そのような生成物は、目的の生成物をコードする外因性遺伝物質の導入により生成することができる。さらに、細胞の代謝活性に影響する外因性遺伝物質を用いることができ、所望の生成部を生成するために（又は、生成を増加させるために）細胞の代謝過程を片寄らせる（ｂｉａｓｉｎｇ）ことにより、酵母細胞の生成物を生成させる（または、生成を増加させる）ことができる。さらなる代替として、細胞の代謝活性に影響を与え所望の生成物の生成を与えるために、内因性遺伝物質を修飾することもできる。
【００６９】
上述の遺伝子工学の生成は、遺伝子工学の前に前記酵母細胞において自然に生じ得るが、改良された生成のために前記工学の後に行うこともできる。そのような場合、外因性物質は、例えば、代謝過程に（直接的に、又は間接的に）含まれる蛋白質を、又は異化過程のインヒビターをコードすることができ、そのような蛋白質（例えば、誘導又は構成性プロモーター）の発現の調節的制御（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を提供し得る。
【００７０】
内因性遺伝物質の修飾は、代謝過程に影響を与えるために実行することができ、例えば、蛋白質又はインヒビターをコードする配列、又は調節的制御を提供する配列を修飾し、前記成分の機能を生じさせることができる。
【００７１】
しかしながら、好ましい観点では、生成物は、（本発明の構成体の封入の前に）前記酵母細胞により生成され得るが、上述のように、外因性遺伝物質の修飾又は内因性遺伝物質の修飾の後に生成させると生成量が増える。それゆえ、好ましい特徴では、本発明の酵母により生成され得る生成物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、糖、小さな多価アルコール、及び二酸化炭素である。
【００７２】
従って、目的の生成物又はその一部、又は目的の生成物の生成を直接的或いは間接的に促進するポリペプチドをコードする外因性或いは内因性遺伝物質、又はそれらの発現に影響する外因性或いは内因性遺伝物質は、（外因性遺伝物質の場合には、所望ならば、細胞のゲノム中への安定な形質転換により）本発明の酵母細胞中に挿入又はそれを修飾し得る。細胞は、その後、好気性条件下、高サッカライド濃度において、成長し、生成物が得られる。
【００７３】
従って、さらなる観点において、本発明は、上述の酵母細胞に外因性物質を挿入して、外因性遺伝物質を含む本発明の酵母細胞を生産する方法を提供するものであって、当該方法は、（例えば、形質転換によって）前記遺伝物質（好ましくはベクター内に含まれる）を前記細胞に導入する工程を少なくとも含む。好ましくは、外因性物質は、生成物、又は生成物の生成を可能にする生成物をコードし、又はその発現を制御する。さらに、前記外因性物質は、前記生成物或いはそれらの１部をコードし、又は、前記生成物或いはそれらの１部の直接的な或いは間接的な生成を促進するポリペプチド（又は、それらの1部）をコードし、又は、前記生成物或いはポリペプチドの発現に影響を与える。そのような生成物は、上述したように、高分子及び低分子の代謝産物、又は、嵩高い及び微細な化学物質などの低分子量又は高分子量の化合物、食品原料、機能性食品、又は治療剤であることができる。この方法により得ることのできる細胞は、本発明の更なる観点を形成する。
【００７４】
これらの、さらに修飾された酵母は、その後、酵母細胞から分離されることができる所望の生成物の生成に用いることができる。それゆえ、更なる観点において、本発明は、低分子量又は高分子量の代謝産物を含む物質の調製及び製造において、好ましくは、嵩高い及び微細な化学物質、食品原料、機能性食品、治療剤、又は非アルコール性飲料の調製及び製造において、好気性条件及び高ヘキソース濃度の下でもエタノールを生成しない、修飾されたヘキソース輸送特性を有するサッカロミセス・セレビシェの使用を提供する。
【００７５】
別の観点からは、本発明は、さらに、上述の遺伝物質を含む本発明の酵母において、ポリペプチド、アミノ酸、糖、又は多価アルコールなどの生成物を調製する方法であって、高サッカライド（好ましくは、グルコース）濃度において、好気性条件下で前記酵母細胞を成長させる工程を含む、当該方法を提供する。別の好ましい特徴では、上述のように、さらなる修飾はされていないが低いレベルのアルコールを生成し、それにより適切な培養液において成長する場合に目的の生成物（例えば、低アルコール或いは非アルコール性飲料）を生成する、本発明の酵母によって生成物が生成される。好ましい特徴では、それゆえ、上述のように生成された生成物は、分離され、本発明のさらなる観点を形成する。
【００７６】
成長、アルコール生成、サッカライドの消費、又は本明細書に記載するその他のパラメーターの測定において、以下の実験条件が用いられる。これらのパラメーターは３０℃の好気性（Ｏ２の制限の無い）条件下で指数的成長の期間において評価され、その他の条件は、２％グルコースの存在するＰＨ５．００のＶｅｒｄｕｙｎらによって用いられた培養液中（Ｙｅａｓｔ、8巻、５０１−５１７頁、、１９９２年）において、１．５リットルの醗酵槽中に０．３乃至０．７（好ましくは０．３）ｇ 乾燥バイオマス／ｌの開始培養、１５００ｒｐｍでの攪拌、０．５ｖｖｍ（１分当り、容器体積当りの空気の体積）の空気流入量である。
【００７７】
バイオマス量（乾燥重量）は、以下のように測定する：５ｍｌを培養から分離し、予め乾燥重量を計測しておいたチューブの中で十分なｒｐｍで５分間遠心分離をし、実質上全ての細胞をペレットにする。ペレットは、５ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、再びペレットにする。そのペレットを、温度平衡まで１１０℃で２４時間乾燥し、秤量する。
【００７８】
二酸化炭素及び酸素モニター型１３０８、Ｂｒｕｅｌ  ａｎｄ  Ｋｊａｅｒ、Ｎａｅｒｕｍ、Ｄｅｎｍａｒｋを用いる連続的なガス分析は、酸素消費量の計算に有効である。
【００７９】
グルコース及びエタノールの測定は、以下の試料で行う：培養の１．５ｍｌの試料を１５０００ｇで１分間遠心分離し、上澄みを分析までの間−２０℃で冷凍する。濃度は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙの酵素結合キットを用いて測定する。
【００８０】
本明細書において、“修飾”酵母という語は、野生型酵母から誘導され又はそれに関連するが、それらの表現型変異及び、好ましくは遺伝子型変異も示す酵母に適用する。好ましくは、遺伝子型は、特にサッカライド輸送分子をコードする遺伝子について、修飾され、それにより改変された表現型を生じる。都合のよいことに、これは、組換えにより、現存の遺伝情報を除去及び／又は修飾すること、及び／又は外因性遺伝配列を改変及び／又は組み込むことによって達成され得る。好ましくは、修飾は、少なくとも、本明細書に記載のキメラ核酸分子の封入に関する。しかしながら、さらなる修飾も考慮することができ、好ましくは、当該修飾は、例えば、グルコースを輸送することができない或いはそれを行う能力が厳しく制限されている酵母細胞の創造によって、キメラの挿入以前にサッカライド輸送分子にさらに影響を与える。これらの組換え生物は、本発明の好ましい特徴を形成する。さらに、例えば、所望の生成物又はそれらの１部をコードする遺伝物質の導入などの、付加的な遺伝子修飾も考慮され得る。
【００８１】
本明細書において、“野生型”という語は、修飾酵母がそれから誘導され又はそれと関連する酵母菌株について適用する。本発明の酵母のアルコール％、成長などを野生型と比較して参照する場合には、前記野生型は、本発明の構成体の挿入前又はあらゆる方法でのゲノムの修飾前において、未修飾であり自然発生である酵母に適用する。すなわち、野生型は、例えば、構成体が挿入されるヌル菌株には適用されず、むしろヌル菌株がそれから生じる自然発生の酵母について適用される。従って、本発明が修飾サッカロミセス・セレビシェ酵母に関する場合、野生型とは、修飾されるサッカロミセス・セレビシェ菌株である。野生型配列は、本明細書で定義される野生型の微生物中に生ずるものに適用する。
【００８２】
“サッカロミセス”という語は、修飾される野生型酵母の属に適用する。“サッカロミセス・セレビシェ”という語は、好ましくは修飾される特定の種に適用され、それらの種に属する全ての菌株を含む。
【００８３】
本明細書において、“アルコール”という語は、グリセロール及びエタノールなどのアルコール類の生成部に適用する。しかしながら、本明細書に記載の試験においては、エタノールレベルを調べる。グリセロールは、エタノールに比べると、総アルコール量におけるほんのわずかな部分しか寄与しない。“エタノールを生成しない（Ｎｏｎ−ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）”という語は、アッセイの条件下で、上述の量（例えば、０．１２ｇ／ｌ以下）のエタノールを生成する酵母に適用する。
【００８４】
アルコール（特に、エタノール）のｇ／ｌレベルは、不連続の時間点で継続して測定する場合の試験条件下において、培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ）１リットル当りの生成量に適用する。最大レベルは、一般に、バッチ培養の間におけるグルコース欠乏の直前に得られる。
【００８５】
“好気性条件”という語は、酸素が制限されず、それゆえ呼吸経路が使用可能な培養条件について適用する。“好気性成長（ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ）”という語は、例えば、６１０ｎｍにおける吸光度の増加が観測され、そのような条件下でバイオマス量が増加する成長に適用する。
【００８６】
“トランスポーター”という語は、細胞外の培養液から細胞内に又はその逆に輸送される分子の輸送において役割を担う、すなわち、その細胞膜を横切っての通過（例えば、拡散）を生じさせる分子について適用する。しかしながら、本発明のキメラの生成において、ＳＮＦ３及びＲＧＴ２、及びそれらに関する又はそれらから誘導される配列、などのサッカライドレセプターも用いることができ、それがキメラの生成に用いられ得るトランスポーターに関する限りにおいて、それらはトランスポーターの定義範囲に含まれ得る。
【００８７】
“ヘキソース”又は“サッカライド”輸送特性という語は、本発明の修飾酵母が細胞外の培養液からサッカライドを取込む能力について適用する。
【００８８】
“機能性ヘキソーストランスポーター”という語は、自然発生の分子又は本明細書に記載の機能的に等価の変異体であって、上述のようにサッカライドを輸送することができるトランスポーター分子に適用する。本発明のキメラを生成するのに用いられ得る機能性ヘキソーストランスポーターに関しては、トランスポーターの定義に従い、そのような機能性ヘキソーストランスポーターは、サッカライドレセプターの機能を有する分子にも拡張される。
【００８９】
“ヘキソーストランスポーター遺伝子”という語は、細胞膜を横切ってヘキソースを通過（例えば、拡散）させる蛋白質をコードする遺伝子、例えば、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、又はＨＸＴ６遺伝子を意味する。
【００９０】
“サッカライド（糖類）”という語は、本発明の野生型或いは修飾されたサッカロミセス酵母によって炭素源として用いられる得る、単糖類、二糖類又は多糖類に適用する。好ましくは、サッカライドは、単糖類（特に好ましくは、グルコース、フルクトース、マンノース、又はガラクトース）、又はマルトースなどの二糖類である。好ましくは、そのようなサッカライドは、自然発生のＤ体である。試験条件下での使用では、Ｄ−グルコースなどの自然発生の、誘導されたものではないＤ体のサッカライドを用いる。“ヘキソース”という語は、上述の単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、及びガラクトース）について適用する。
【００９１】
本明細書で用いられる“成長速度（ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ）”という語は、数学的に、世代時間（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）に関するものであり、μ＝ｌｎ（２）／Ｇの関係を有する。ここで、μは比成長速度、Ｇは世代時間である。野生型酵母と比較した世代時間の比（％）の値は、同様に、好ましい成長速度（％）を与える。
【００９２】
“世代時間”は、時間で測定され、倍化時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）、例えば、培養の間に生成される各世代にかかる時間について適用され、そこで、世代はバイオマスの乾燥重量の増加を参照することにより測定される。ＯＤ６１０（６１０ｎｍの吸光度）を参照して世代時間を算出するその他の実験を行う。その場合、ＴＭ６では２．９の値が得られ、ＴＭ４では２．５の値が得られた。しかし、本文における定義は、上述の乾燥重量の測定を用いて求められた値について適用する。
【００９３】
“グルコース消費速度”は、試験条件の間に外部の培養液から消費されたグルコース量について適用され、それゆえ、少なくとも２つの時間点における培養液中のグルコースの測定及びこれらの時間点の間の時間において消費されるグルコースの計算により評価する。この値は、ｍｍｏｌグルコース／（ｇバイオマス 時間）で与えられ、ここで「ｇ バイオマス」は、培養中の酵母の乾燥重量に適用される。
【００９４】
“バイオマス”という語は、培養中の酵母の乾燥重量を持つと考えられる重量に適用される。
【００９５】
サッカロミセス・セレビシェの成長についての文脈において用いられる“高ヘキソース”濃度という語は、１ｍＭを超えるヘキソース濃度、好ましくは培養液中において５ｍＭを超える、特に好ましくは５０ｍＭより大きいヘキソース濃度（例えば、１％又は２％以上のヘキソース、好ましくはグルコース）について適用する。しかしながら、試験条件においては、２％グルコース（すなわち、１１１ｍＭ）の値を用いる。同様の定義が、高サッカライド濃度又は高グルコース濃度にも適用される。本明細書で述べるように、生成物は、種々の高いレベルのサッカライド（例えば、１、２、５、１０、又は２０％サッカライド）において生成され得る。特に、本明細書に記載の飲料を生成する場合は、より高いサッカライドレベルが用いられ得る。
【００９６】
本明細書において、“指数的成長”という語は、バイオマスの倍化の指数関数的速度について適用される。
【００９７】
本明細書において、“キメラ”という語は、２以上の異なる分子から誘導される２以上の配列（成分配列）、好ましくは各々が異なる分子から誘導される２つの配列、を含む核酸分子又はポリペプチドについて適用される。従って、そのようなキメラは、そのような配列の組合せの結果を提供する。前述のように、前記成分配列（又は、それが一部となっている親配列）は、自然発生、又は、そのような自然発生配列と関連する或いはそれらから誘導され得る。都合のよいことに、分離した成分配列は、各自の配列が互いに連結することによって結合され得るが、代替的に、特に当該配列が高い相同性である場合には、別の技術を用いてキメラを得ることもできる。それは、例えば、実際は２つの別個の配列間のキメラを反映する配列に達する特定の分子中における適切な部位の変異によって得られる。
【００９８】
“キメラ構成体”という語は、上述のキメラをコードし又は提供するヌクレオチド配列を少なくとも含む、所望ならば、付随的に機能性要素を含むフランキング配列（例えば、プロモーター配列）を付加的に含む、核酸分子について適用する。
【００９９】
“安定に形質転換される（ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）”という語は、本明細書に記載の酵母細胞中への本発明の構成体の封入（好ましくは、ゲノムへの挿入）であって、前記構成体のコード領域が発現でき、本発明のキメラをコードする構成体又はそれらの１部が酵母細胞の子孫に存在するような前記封入について適用する。
【０１００】
本明細書において、“低親和性”トランスポーターという語は、本明細書の実施例１に記載の条件下において、２０ｍＭより大きい（例えば、５０−１００ｍＭの）Ｋｍでグルコースを結合するトランスポーターについて適用する。“高親和性”トランスポーターという語は、２０ｍＭ未満、好ましくは１０ｍＭ未満（例えば、１−２ｍＭ）のＫｍを有するトランスポーターについて適用する。
【０１０１】
本明細書に記載のヌクレオチド又はアミノ酸配列“に関する或いはそれから誘導される”配列は、これらの配列に関して置換、欠失、又は付加などによって修飾された配列について適用する。好ましくは、本明細書の記載のように、そのような配列は機能的な等価物である。特に好ましくは、前述したように、所定の同一性又はハイブリッド形成特性を有する。
【０１０２】
本明細書において、“機能的に等価な”蛋白質という語は、天然の又は自然発生の蛋白質に関する或いはそれから誘導される蛋白質であって、そこにおいてアミノ酸配列が単一の又は複数のアミノ酸の置換、付加、及び／又は欠失により修飾されるが、それにもかかわらず同様の機能を維持する、すなわち、１以上のサッカライド分子（例えば、グルコース）を自然発生分子の場合より少ない又はより多い程度輸送することができる当該蛋白質について適用する。そのような蛋白質は、１以上の塩基の適切な置換、付加、及び／又は欠失により産生される“機能的に等価な核酸分子”によってコードされる。好ましくは、当該機能的に等価な蛋白質又は核酸分子は、前述の同一性及び／又はハイブリッド形成条件を満たす。
【０１０３】
アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合蛋白質は、“付加”変異体の意味の範囲内含まれ、それはキメラ部分に融合されたさらなる蛋白質又はポリペプチドをも含む。
【０１０４】
そのような上述の機能的に等価な変異体には、自然の生物学的変異（例えば、対立遺伝子変異体、又は、種の範囲内での、或いは植物、動物、バクテリアなどの異なる属における地理的変異）及び公知技術を用いて調製される誘導体が含まれる。例えば、機能的に等価な蛋白質をコードする核酸分子は、欠失、ランダム変異誘発、又は、核酸の酵素切断及び／又はライゲーションを含む部位特異的変異誘発の公知技術を用いる組換え形成において、又は化学合成によって、生成され得る。特に、本発明におけるキメラの生成のための機能的に等価な蛋白質をコードする核酸分子は、本明細書に記載される特定の分子以外の異なる属又は種における類似体まで拡張される。
【０１０５】
自然発生蛋白質の“前駆体”は、基質を産生するためのプロテオリシス（蛋白質分解）などにより処理されるより大きな蛋白質であることができる。そのような前駆体は、蛋白質分解開裂により活性化されるチモーゲン（すなわち、酵素の不活性前駆体）の形態をとり得る。
【０１０６】
機能的に等価な蛋白質の“一部（部分、ｐｏｒｔｉｏｎｓ）”は、上述のとおりであり、それら自体では必ずしも親分子の活性を示さない。好ましくは、これらの一部は、本明細書に記載の同一性（類似する領域に関する）、又はハイブリッド形成条件を満たす。生成物の一部は、その他の実存物（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）と結合した場合に所望の生成物を形成する部分について適用する。
【０１０７】
“生成物又はそれらの一部の直接的或いは間接的な生成を促進するポリペプチド又はそれらの一部”は、本発明の酵母細胞での発現において、（例えば、生成に影響を与える経路を改変すること又はそれに寄与することによって）生成物又はそれらの一部の生成を生じさせる分子、又は分子或いは錯体の一部について適用する。
【０１０８】
ポリペプチドは、それが当該発現において調節制御を発揮する場合に、生成物又はポリペプチドの発現に影響を与える。
【０１０９】
以下の実施例は、以下に参照される図の説明のためだけのものである。
【０１１０】
実施例１：ＨＸＴ１及びＨＸＴ７のキメラを含む修飾サッカロミセス・セレビシェ菌株の生成
酵母ＨＸＴ系統は、哺乳類Ｇｌｕｔ１と明確な類似性を有する。この蛋白質は、細胞質内に位置するＮ−及びＣ−末端を持つ１２の膜貫通ドメインを有するので（Ｍｕｅｃｋｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９１巻、７１３−７２５頁、、１９９４年）、酵母ヘキソーストランスポーターは、同様のトポロジーを有すると考えられる。このトポロジーにおいて、Ｎ及びＣ末端は細胞内に位置し、当該末端と結合する配列は、膜を両方向に通過し、種々の長さの細胞内又は細胞外ループにより相互に連結した１２の膜貫通領域を与える。膜貫通領域においてＨＸＴ７と融合するＮ末端のＨＸＴ１を含むキメラを生成した。例えば、膜貫通領域６において融合されるＫＯＹ．ＴＭ６Ｐ（本発明の技術革新）は、Ｎ−末端から膜貫通領域６の中程までＨＸＴ１と同一である（それに対し、蛋白質の残りの部分はＨＸＴ７と等価である）。
【０１１１】
これにより、全てゲノム中に組込まれた計１２の（ＴＭ１からＴＭ１２と呼ぶ）構成体が得られる。
【０１１２】
材料及び方法
菌株
糖類トランスポーターの遺伝子についての欠失を有するＣＥＮ．ＰＫ菌株は、グルコース上でも成長を示す（Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４６４巻、１２３−１２８頁、、１９９９年）。これにより、付加的なＨＸＴ遺伝子（合計で１７の遺伝子）は、さらなる（下記参照）遺伝子と同様、グルコース輸送についての真正ヌル菌株ＥＢＹ．ＶＷ４０００を得るために除去される（Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅら、ｓｕｐｒａ、１９９９年）。ＨＸＴ８−１７の生理学的役割については、これまでのところ説明がなされていないが（ただし、ＨＸＴ９及び１１については、多剤耐性に含まれることが報告されている）、全ての条件の間それらは確かにサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）ではない。ｈｘｔ５欠失変異体は、グルコース培養液において明確な表現形を示さない。それはグルコースの存在しない細胞において発現するが、それはおそらく利用可能になった場合には糖類の迅速な利用を確実にするためである。酵母からの、又はその他の生物からの１又は複数の特定のヘキソーストランスポーターの再導入を、特定のトランスポーターの捕捉速度論及び糖消費速度論の研究に用いることができるため、完全なヌル菌株は有益である。それゆえ、ヌル菌株は、第一に、特定の酵母又は異種ヘキソーストランスポーターの性質を研究するための道具となる。
【０１１３】
野生型菌株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃは、以下の遺伝標識、Ｍａｔａ ｌｅｕ２−５２、１１２ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−２８９、ｈｉｓ３−Δ１、ＭＡＬ２−８ｃ ＳＵＣ２、を有する。この菌株を、標識遺伝子を１つずつ形質転換で導入することにより、プロトン放出（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ）させた。“ヌル変異体”ＥＢＹ．ＶＷ４００３（Ｍａｔａ ｌｅｕ２−５２、１１２ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−２８９、ｈｉｓ３−Δ１、ＭＡＬ２−８ｃ ＳＵＣ２ ＨＸＴ１−１７Δ、Ｇａｌ２Δ、Ｓｔｌ１Δ、グルコース親和性を有する３欠失マルトーストランスポーター、すなわち、ＡＧＴ１、ＹＤＬ２４７ｗ、及びＹＪＲ１６０ｃ；ゲノムカセットＰｒｏ−ＨＸＴ７：：ＵＲＡ３）は、いずれのグルコース濃度においても成長できない。全ての公知のヘキソーストランスポーター及び推定のトランスポーターにおいて除去される“ヌル菌株”を与えるための菌株における欠失は、ｌｏｘ Ｐ／Ｃｒｅ組換え酵素系を用いて構築した（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２４巻、２５１９頁、、１９９６年）。菌株は、形質転換によりプロトン放出させた（ＫＯＹ．ＶＷ１００）。
【０１１４】
キメラ
ＰＣＲに基づく方法“ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  オーバーラップ−エクステンション法（ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）”を用いて、  ＨＸＴ１及びＨＸＴ７の間のキメラを得た（Ｈｉｇｕｓｈｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１６巻、７３５１−７３６７頁、、１９８１年、及び、Ｈｏら、Ｇｅｎｅ、７１巻、５１−５９頁、、１９８９年）。共に融合される部分は、最終的には互いにアニールできるが、初めは別個に増幅させた。ＰＣＲの第２段階において、フランキングプライマーを、２つの別個の生成物のアニールが行われた場合に増幅できるようにするためのみに用いた。
【０１１５】
ＴＭ４の調製のために、ＴＭ４のＨＸＴ１部分は、以下のプライマーを用いてプラスミドｐＴＨＸＴ１−２から増幅させた（Ｒｅｉｎｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、ｓｕｐｒａ、１９９７年、の文献には、ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片がｐＴＨＸＴ１−２と逆向きであるｐＴＨＸＴ１−１の生成が記載されている）。
【０１１６】
正プライマー：
５’−ＣＡＡＡＧＡＡＴＡＡ  ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣ  ＡＡＡＡＡＧＴＴＴＴ  ＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡ  ＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴ  ＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴ  ＣＣＣＧＡＴＣＴＡＡ  ＴＡ−３’
逆プライマー：
５’−ＧＧＡＧＡＴＡＡＡＡ  ＣＧＧＣＡＡＴＡＣＣ  ＡＣＣＧＡＣＡＣＣＴ  ＡＡＡＣＣＡ−３’
ＴＭ４のＨＸＴ７部分は、以下を用いてプラスミドＰ２１から増幅させた（Ｒｅｉｎｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６巻、１５７−１６７頁、、１９９５年）。
【０１１７】
正プライマー：
５’−ＴＧＧＴＴＴＡＧＧＴ  ＧＴＣＧＧＴＧＧＴＡ  ＴＴＧＣＣＧＴＴＴＴ  ＡＴＣＴＣＣ−３’
逆プライマー：
５’−ＴＴＴＧＴＡＧＡＣＧ  ＴＧＧＧＴＣＴＧＣＡ  ＧＧＣＡ−３’
ＴＭ６の調製のために、ＴＭ６のＨＸＴ１部分は、以下のプライマーを用いてプラスミドｐＴＨＸＴ１−２から増幅させた。
【０１１８】
正プライマー：
５’−ＣＡＡＡＧＡＡＴＡＡ  ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣ  ＡＡＡＡＡＧＴＴＴＴ  ＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡ  ＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴ  ＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴ  ＣＣＣＧＡＴＣＴＡＡ  ＴＡ−３’
逆プライマー
５’−ＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡ  ＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡ  ＣＣＡＡＴＣＡＴＡＡ  ＡＴＡＡＧＧＣＣＣＡ  Ｇ−３’
ＴＭ６のＨＸＴ７部分は、以下を用いてプラスミドＰ２１から増幅させた
正プライマー：
５’−ＣＴＧＧＧＣＣＴＴＡ  ＴＴＴＡＴＧＡＴＴＧ  ＧＴＧＧＴＡＴＧＡＣ  ＡＴＴＴＧＴＴＣＣＡ  Ｇ−３’
逆プライマー：
５’−ＴＴＴＧＴＡＧＡＣＧ  ＴＧＧＧＴＣＴＧＣＡ  ＧＧＣＡ−３’
最初の２つの別々の反応からの生成物は混合され、ＨＸＴ１反応からの正プライマー及びＨＸＴ７反応からの逆プライマーを用いてＰＣＲを実施した。２つの第一反応からの生成物は重なり領域（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するように作られるので、ＨＸＴ１及びＨＸＴ７部分が互いに融合されている生成物が得られる。
【０１１９】
６番目の膜貫通領域においてＨＸＴ１とＨＸＴ７を融合することにより、構成体ＫＯＹ．ＴＭ６Ｐを得た。Ｎ−末端はＨＸＴ１の１−７４１ｂｐを含み、Ｃ−末端はＨＸＴ７の７４２−１７１３ｂｐを含む。構成体ＴＭ４は、ＴＭ６構成体と同様の方法で得たが、２つの遺伝子はＴＭ領域４において融合させた。ＴＭ４については、ＨＸＴ１の１−５５１ｂｐ及びＨＸＴ７の５５２−１７１３ｂｐを含む。
【０１２０】
これらの構成体をＫＯＹ．ＶＷ１００菌株に導入し、当該導入の前にＵＲＡ３を導入することによりプロトトロフィック（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）させた。ヌル変異体で用いられるカセットは、ＨＸＴ３−６−７遺伝子クラスター内に位置し、ＨＸＴ７：：Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３：：ＨＸＴ７ターミネーターの構成的プロモーターを含み、そしてそれらを以下のように調製した。
【０１２１】
ゲノム発現カセットの構築（配列ＩＤ番号：２１）：
ＰＣＲ標的技術による修飾を用いて、３９２ｂｐのＨＸＴ７プロモーター断片を、菌株ＥＢＹ．ＶＷ４０００のゲノム（Ｗｉｅｃｚｏｒｋｅら、ｓｕｐｒａ、１９９９年）、ＨＸＴ３−６−７の遺伝子クラスター領域に組込み、とても強力な構成的ＨＸＴ７プロモーター−ターミネーター発現カセットを得た（Ｈａｕｆら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２６巻、６８８−６９８頁、、２０００年、参照）。−３９２乃至＋３０の領域をコードする構成的ＨＸＴ７の部分と共にＨＸＴ７プロモーターの部分を、プライマーＰＲＯＨＸＴ７−１及びＰＲＯＨＸＴ７−２（下記参照）、及び鋳型としてのプラスミドｐ２１−ＰＳＴ（Ｒｅｉｎｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、ｓｕｐｒａ、１９９５年）を用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ生成物を、両端においてＳｐｅＩにより切断し、２番目のｌｏｘＰ部位の後部にあるプラスミドｐＵＧ６のＳｐｅＩ（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら、ｓｕｐｒａ、１９９６年）中に適当な配向でクローン化した。これによりプラスミドｐＵＧ６−ｋＰＨＸＴ７が得られた。その後、このプラスミドを鋳型として用い、プライマーＩＮＴＰＨ７−１及びＩＮＴＰＨ７−２を用いたＰＣＲによって、短い相同性配列によりＨＸＴ３プロモーター（−７７０から−７２０）及びＨＸＴ７ターミネーター領域と隣接するｋａｎＭＸ−ＨＸＴ７ｐ標識カセットを含むＤＮＡ分子を得た。２．４ｋｂのＰＣＲ生成物を、菌株ＥＢＹ．ＶＷ４０００中に形質転換させ（この菌株のＨＸＴ３−６−７遺伝子クラスターは、ｌｏｘＰ部位により置換される）、ＹＰマルトース寒天平板におけるＧ４１８（２００ｍｇ／リットル）に対する耐性を選択し、及びＨＸＴ３プロモーター−ｌｏｘＰ領域をｋａｎＭＸ−ＨＸＴ７ｐカセットにより置換するために用いた。プラスミドｐＳＨ４７を用いた形質転換の後に、ｋａｎＭＸ標識を上述のように除去し（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら、ｓｕｐｒａ、１９９６年）、菌株ＥＢＹ．ＶＷ４００２を得た。
【０１２２】
ＨＸＴ遺伝子は、プライマーＣ１−ＩＨＸＴ７及びＣ４−ＩＨＸＴ７を用いてプラスミドｐ２１−ＰＳＴからＰＣＲにより増幅させた。菌株ＥＢＹ．ＶＷ４００２のＨＸＴ７プロモーター−ターミネーター発現カセットに対する短い相同性配列を含むＰＣＲ生成物を、この菌株中に形質転換させ、ＹＰグルコース寒天平板における成長を選択した。相同組換えによるゲノム発現カセットへの組込みによって、菌株ＪＢＹ０２（ＨＸＴ７＋）を得た。菌株ＥＢＹ．ＶＷ４００２においてＦＯＡ（５−フルオロオルト酸、坑選択可能標識）発現カセットを構築するために、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３  ＯＲＦを、プライマーＩ−ＫＵＲＡ３１及びＩ−ＫＵＲＡ３２（下記参照）を用いて菌株ＭＳ７−６２（ローマのＣ．Ｆａｌｃｏｎｅから入手）からＰＣＲにより増幅させた。これにより、短い相同性配列によりＨＸＴ７プロモーター及びＨＸＴ７ターミネーター領域と隣接するＫｌＵＲＡ  ＯＲＦを有するＤＮＡ分子を得た。ＤＮＡ断片を菌株ＪＢＹ０２中に形質転換させ、ウラシルを含まないが炭素源としてマルトースを含む合成培地における成長を選択した。これにより、ゲノム的に組込まれたＨＸＴ７プロモーター（−３９２−＋１）−ＫｌＵＲＡ３−ＨＸＴ７ターミネーター発現カセットを含む菌株ＥＢＹ．ＶＷ４００３を得た。この菌株を形質転換によりプロトン放出させた（ＫＯＹ．ＶＷ１００）。
【０１２３】
【配列１】
2004501643.tif 000001
2004501643.tif 000002
【０１２４】
異なる遺伝子又は構成体の組込みは、相同組換えを用いて行った。組換えは、ＹＰグルコース（ＹＰＤ２％グルコース）プレート上、及びＵＲＡ３の外部組換え（ｏｕｔ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を選別するためにＹＮＢ２％マルトース５−ＦＯＡプレートに添付されたレプリカを選択した。菌株をプロトン放出させるため、ＵＲＡ３を形質転換及び相同組換えにより再導入した。
【０１２５】
菌株に組込まれたキメラ又は野生型遺伝子は、ヘキソーストランスポーターのみを構成する。
【０１２６】
本実験で用いたプロトン放出菌株は、野生型ＫＯＹ．ＰＫ２−１Ｃ８３、“ヌル変異体”ＫＯＹ．ＶＷ１００、ＫＯＹ．ＶＷＴＭ６Ｐ、ＫＯＹ．ＶＷ１０１Ｐ、及びＫＯＹ．ＶＷ１０２Ｐである。
【０１２７】
用いた菌株及び産生させた菌株を、以下の表にまとめる。
【０１２８】
【表１】
2004501643.tif 000003
2004501643.tif 000004
【０１２９】
ＴＭ６の蛋白質配列を以下に示す（配列表１７）。
【０１３０】
【配列２】
2004501643.tif 000005
【０１３１】
上記の２７９の位置に、ＴＭ６はチロシン残基を含む（太字で示した）。このことは、当該残基がセリンであるＨＸＴ１における自然発生配列についての修飾を表している。従って、その他のトランスポーターのこの残基又は類似する残基における修飾は、本発明のさらなる好ましい特徴を形成する。しかしながら、上記の配列における２７９の位置がセリン残基である配列もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３２】
ＴＭ４の蛋白質配列を以下に示す（配列表１８）。
【０１３３】
【配列３】
2004501643.tif 000006
【０１３４】
同定された機能性構成体は、ＴＭ１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２である。本発明の好ましい観点を形成するこれらの構成体は、以下のＨＸＴの一部を用いて得られる：１−２３１（ＴＭ１）、１−３９１（ＴＭ２）、１−４４９（ＴＭ３）、１−５５１（ＴＭ４）、１−６２７（ＴＭ５）、１−７４１（ＴＭ６）、１−１０１０（ＴＭ７）、１−１１０８（ＴＭ８）、１−１２１４（ＴＭ９）、１−１２９３（ＴＭ１０）、１−１４３８（ＴＭ１１）、１−１５０４（ＴＭ１２）。その他の部分は、ＨＸＴ７を構成する（例えば、ＴＭ１の場合は、２３２−１７１３）。ＴＭ７，８，９についての形質転換体は、未だ同定されていない。
【０１３５】
サッカロミセス・セレビシェＫＯＹ．ＴＭ６Ｐは、ブタペスト条約の下、２０００年６月２０日にドイツ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託した（寄託番号ＤＳＭ１３５５５）。
【０１３６】
サッカロミセス・セレビシェＫＯＹ．ＴＭ４Ｐは、ブタペスト条約の下、２０００年１１月６日にドイツ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託した（寄託番号ＤＳＭ１３８３２）。
【０１３７】
成長の特性評価
結果
好気性成長：グルコース上の好気性バッチ培養の間におけるサッカロミセス・セレビシェに典型的な、ジオーキシーの成長挙動を図１に示す。これは、前述した条件で、すなわち、５ｍＭグルコースの存在するＰＨ５．００のＶｅｒｄｕｙｎらによって用いられた培養液中（ｓｕｐｒａ、１９９２年）において、１．５リットルの醗酵槽中に０．３乃至０．７ｇ 乾燥バイオマスの開始培養、１５００ｒｐｍでの攪拌、０．５ｖｖｍ（１分当り、容器体積当りの空気の体積）の空気流入量である。図１で観測された第１の段階では、グルコースの消費、及びそれに付随するエタノール及びバイオマスの生成によるものである。第２の段階の間、エタノールは、主な炭素源及びエネルギー源として働く。しかしながら、ＫＯＹ．ＴＭ６Ｐの成長では、単一の成長段階が見られる（図２）。明らかに、エタノールの生成が全く無しに、糖は即時に二酸化炭素と水に転化する、すなわち、抑制解除条件が行き渡っている。この条件のとき、３．８時間の世代時間が得られた。この値は、バイオマス対時間のセミログプロットを示す図７より求めることができる。最大エタノール濃度は、２０ｇ／ｌのグルコース濃度を用いた場合、０．１２ｇ／ｌ未満であった。また、グリセロール及び酢酸などのその他の通常の副生成物は、無視できる量であった。二酸化炭素生成率と酸素消費率の連続的なオンライン測定から、呼吸商（ＲＱ＝二酸化炭素生成率／酸素消費率）が１に近いことが明らかになったという事実によっても、抑制解除条件が確認された（図３）。
【０１３８】
ＫＯＹ．ＴＭ４Ｐも、また、ＫＯＹ．ＴＭ６Ｐと非常に似た成長挙動を示した（図５）。吸光度対時間のセミログプロットから算出した世代時間は、３から３．９時間であった（図６）。観測された最大エタノール生成は、２０ｇ／ｌのグルコース濃度を用いた場合、０．１５ｇ／ｌであった。ＫＯＹ．ＴＭ６Ｐと同様、グリセロール及び酢酸は非常に低濃度であった。
【０１３９】
嫌気性成長：菌株ＫＯＹ．ＴＭ６Ｐは、嫌気性条件においてエタノールを生成することができる。しかしながら、かなりの活性度の初期段階の後に（特定の成長及びエタノール生成速度により示唆されるように）、同定されていない因子が制限されると考えられる。必要とされることが知られているサプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を培養に加えたので，この因子は必須ステロールのエルゴステロールなどであることはできない。
【０１４０】
捕捉速度論
グルコース捕捉のアッセイは、放射性標識グルコースを用いて行った（Ｗａｌｓｈら、ｓｕｐｒａ、１９９４年）。細胞は、２％グルコースを含む定められた培養液で成長させた。細胞は、ＯＤ６１０＝１において回収した。細胞を洗浄し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液において蛋白質濃度がほぼ８−１５ｍｇ／ｌとなるよう再度懸濁させた。細胞を放射性標識グルコースと共に約５秒間温置し、細胞内グルコース量を液体シンチレーション計測器により測定した。
【０１４１】
ＨＸＴ１発現菌株（最も豊富な低親和性輸送蛋白を発現する）は、野生型における低親和性捕捉成分と同様の捕捉速度論を示した。驚くべきことに、最も豊富な高親和性輸送蛋白を発現するＨＸＴ７発現菌株は、野生型及びＨＸＴ１発現菌株と同様の成長挙動を示した（データは示していない）。はっきりとした相違は、後者のほうが、培養が呼吸醗酵から呼吸成長へシフトする場合にジオーキシー段階においてかなり鋭い転移を示したということであった。言い換えると、野生型及びＨＸＴ１菌株に比べてかなり小さい，ＨＸＴ７菌株における捕捉系のＶｍａｘは、グルコース消費速度又は成長速度を制限していないようである。むしろ、菌株が示す捕捉についてのＫｍが、グルコースからその他の炭素源及びエネルギー源への円滑な代謝シフトを決める因子であると考えられる。しかしながら、ＴＭ菌株について得られたより小さいＶｍａｘ値が成長を制限しないようであっても、成長速度を減少させた（データは示していない）。
【０１４２】
【表２】
2004501643.tif 000007
【０１４３】
本実施例で述べた種々の菌株について得られた結果を、以下にまとめる。
【０１４４】
【表３】
2004501643.tif 000008
【０１４５】
配列表１７：
サッカロミセス・セレビシェＫＯＹ．ＴＭ６ＰにおけるＨＸＴ１の１−７４１ｂｐ及びＨＸＴ７の７４２−１７１３のヘキソーストランスポーター領域
【０１４６】
【配列４】
2004501643.tif 000009
【０１４７】
配列表１８：
サッカロミセス・セレビシェＫＯＹ．ＴＭ４ＰにおけるＨＸＴ１の１−５５１ｂｐ及びＨＸＴ７の５５２−１７１３のヘキソーストランスポーター領域
【０１４８】
【配列５】
2004501643.tif 000010
【０１４９】
配列表１９：ＴＭ４のヌクレオチド配列
【０１５０】
【配列６】
2004501643.tif 000011
【０１５１】
配列表２０：ＴＭ６のヌクレオチド配列
【０１５２】
【配列７】
2004501643.tif 000012
【０１５３】
配列表２１：発現カセット配列のヌクレオチド配列
【０１５４】
【配列８】
2004501643.tif 000013
【０１５５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Gothia Yeast Solutions AB
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cccgatctaa ta                                                         72
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<213>  Artificial/Unknown
<220>
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<223>  Primer
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ctggaacaaa tgtcatacca ccaatcataa ataaggccca g                         41
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<223>  Primer
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ggactagtga tatctctcgt aggaacaatt tcgg                                 34
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<220>
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ggactagttg ctctgcaata gcagcgtc                                        28
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<220>
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<223>  Primer
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ggtgatgacg                                                            70
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<213>  Artificial/Unknown
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer
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aagtttcttt gtctccgtcc cactcaactt tctgagaaca aatgatccat tttttgatta     60
aaattaaaaa aac                                                        73
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<213>  Artificial/Unknown
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer
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cctgcgtgtt cttctgaggt tc                                              22
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<221>  misc_feature
<223>  Primer
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tttgtagacg tgggtctgca ggca                                            24
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<212>  DNA
<213>  Artificial/Unknown
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Primer
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caaagaataa acacaaaaac aaaaagtttt tttaatttta atcaaaaaat gtccacaaaa     60
tcatatacca gtag                                                       74
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<212>  DNA
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<221>  misc_feature
<223>  Primer
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gcacaaatta gagcgtgatc atgaattaat aaaagtgttc gcaaattaat ggggagcgct     60
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<220>
<221>  misc_feature
<223>  Chimera of HXT1 (1 to 741) and HXT7 (742 to 1713). Tyr at 279 can
<400>  17
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Asn Ser Tyr Glu Leu Glu Ser Gly Arg Ser Lys Ala Met Asn Thr Pro
20                  25                  30
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Arg Arg Phe Gly Met Lys His His Asp Gly Ser His Tyr Leu Ser Lys
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Val Arg Thr Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Ile
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Gly Gly Ile Val Leu Ala Lys Leu Gly Asp Met Tyr Gly Arg Arg Ile
130                 135                 140
Gly Leu Ile Val Val Val Val Ile Tyr Thr Ile Gly Ile Ile Ile Gln
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Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Ile
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Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Thr Val Leu Ser Pro Met Leu Ile
180                 185                 190
Ser Glu Val Ala Pro Ser Glu Met Arg Gly Thr Leu Val Ser Cys Tyr
195                 200                 205
Gln Val Met Ile Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Phe
210                 215                 220
Gly Thr Lys Asn Tyr Ser Asn Ser Val Gln Trp Arg Val Pro Leu Gly
225                 230                 235                 240
Leu Cys Phe Ala Trp Ala Leu Phe Met Ile Gly Gly Met Thr Phe Val
245                 250                 255
Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Ala Glu Val Gly Lys Ile Glu Glu Ala
260                 265                 270
Lys Arg Ser Ile Ala Val Tyr Asn Lys Val Ala Val Asp Asp Pro Ser
275                 280                 285
Val Leu Ala Glu Val Glu Ala Val Leu Ala Gly Val Glu Ala Glu Lys
290                 295                 300
Leu Ala Gly Asn Ala Ser Trp Gly Glu Leu Phe Ser Ser Lys Thr Lys
305                 310                 315                 320
Val Leu Gln Arg Leu Ile Met Gly Ala Met Ile Gln Ser Leu Gln Gln
325                 330                 335
Leu Thr Gly Asp Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys
340                 345                 350
Ala Val Gly Leu Ser Asp Ser Phe Glu Thr Ser Ile Val Leu Gly Ile
355                 360                 365
Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Val Gly Ile Tyr Val Val Glu Arg Tyr
370                 375                 380
Gly Arg Arg Thr Cys Leu Leu Trp Gly Ala Ala Ser Met Thr Ala Cys
385                 390                 395                 400
Met Val Val Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr Arg Leu Trp Pro Asn Gly
405                 410                 415
Gln Asp Gln Pro Ser Ser Lys Gly Ala Gly Asn Cys Met Ile Val Phe
420                 425                 430
Ala Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Phe Ala Thr Thr Trp Ala Pro Ile Pro
435                 440                 445
Tyr Val Val Val Ser Glu Thr Phe Pro Leu Arg Val Lys Ser Lys Ala
450                 455                 460
Met Ser Ile Ala Thr Ala Ala Asn Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ile Gly
465                 470                 475                 480
Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Gly Ala Ile Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr
485                 490                 495
Val Phe Met Gly Cys Leu Val Phe Met Phe Phe Tyr Val Leu Leu Val
500                 505                 510
Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Thr Leu Glu Glu Val Asn Thr Met Trp
515                 520                 525
Glu Glu Gly Val Leu Pro Trp Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Pro Ser
530                 535                 540
Arg Arg Gly Ala Asn Tyr Asp Ala Glu Glu Met Thr His Asp Asp Lys
545                 550                 555                 560
Pro Leu Tyr Lys Arg Met Phe Ser Thr Lys
565                 570
<210>  18
<211>  570
<212>  PRT
<213>  Artificial/Unknown
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Chimera of HXT1 (1 to 551) and HXT7 (552 to 1713)
<400>  18
Met Asn Ser Thr Pro Asp Leu Ile Ser Pro Gln Lys Ser Asn Ser Ser
1               5                   10                  15
Asn Ser Tyr Glu Leu Glu Ser Gly Arg Ser Lys Ala Met Asn Thr Pro
20                  25                  30
Glu Gly Lys Asn Glu Ser Phe His Asp Asn Leu Ser Glu Ser Gln Val
35                  40                  45
Gln Pro Ala Val Ala Pro Pro Asn Thr Gly Lys Gly Val Tyr Val Thr
50                  55                  60
Val Ser Ile Cys Cys Val Met Val Ala Phe Gly Gly Phe Ile Phe Gly
65                  70                  75                  80
Trp Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val Ala Gln Thr Asp Phe Leu
85                  90                  95
Arg Arg Phe Gly Met Lys His His Asp Gly Ser His Tyr Leu Ser Lys
100                 105                 110
Val Arg Thr Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Ile
115                 120                 125
Gly Gly Ile Val Leu Ala Lys Leu Gly Asp Met Tyr Gly Arg Arg Ile
130                 135                 140
Gly Leu Ile Val Val Val Val Ile Tyr Thr Ile Gly Ile Ile Ile Gln
145                 150                 155                 160
Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Ile
165                 170                 175
Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Ala Val Leu Ser Pro Met Leu Ile
180                 185                 190
Ser Glu Val Ser Pro Lys His Leu Arg Gly Thr Leu Val Ser Cys Tyr
195                 200                 205
Gln Leu Met Ile Thr Ala Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Phe
210                 215                 220
Gly Thr Lys Asn Tyr Ser Asn Ser Val Gln Trp Arg Val Pro Leu Gly
225                 230                 235                 240
Leu Cys Phe Ala Trp Ala Leu Phe Met Ile Gly Gly Met Thr Phe Val
245                 250                 255
Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Ala Glu Val Gly Lys Ile Glu Glu Ala
260                 265                 270
Lys Arg Ser Ile Ala Val Ser Asn Lys Val Ala Val Asp Asp Pro Ser
275                 280                 285
Val Leu Ala Glu Val Glu Ala Val Leu Ala Gly Val Glu Ala Glu Lys
290                 295                 300
Leu Ala Gly Asn Ala Ser Trp Gly Glu Leu Phe Ser Ser Lys Thr Lys
305                 310                 315                 320
Val Leu Gln Arg Leu Ile Met Gly Ala Met Ile Gln Ser Leu Gln Gln
325                 330                 335
Leu Thr Gly Asp Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys
340                 345                 350
Ala Val Gly Leu Ser Asp Ser Phe Glu Thr Ser Ile Val Leu Gly Ile
355                 360                 365
Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Val Gly Ile Tyr Val Val Glu Arg Tyr
370                 375                 380
Gly Arg Arg Thr Cys Leu Leu Trp Gly Ala Ala Ser Met Thr Ala Cys
385                 390                 395                 400
Met Val Val Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr Arg Leu Trp Pro Asn Gly
405                 410                 415
Gln Asp Gln Pro Ser Ser Lys Gly Ala Gly Asn Cys Met Ile Val Phe
420                 425                 430
Ala Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Phe Ala Thr Thr Trp Ala Pro Ile Pro
435                 440                 445
Tyr Val Val Val Ser Glu Thr Phe Pro Leu Arg Val Lys Ser Lys Ala
450                 455                 460
Met Ser Ile Ala Thr Ala Ala Asn Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ile Gly
465                 470                 475                 480
Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Gly Ala Ile Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr
485                 490                 495
Val Phe Met Gly Cys Leu Val Phe Met Phe Phe Tyr Val Leu Leu Val
500                 505                 510
Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Thr Leu Glu Glu Val Asn Thr Met Trp
515                 520                 525
Glu Glu Gly Val Leu Pro Trp Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Pro Ser
530                 535                 540
Arg Arg Gly Ala Asn Tyr Asp Ala Glu Glu Met Thr His Asp Asp Lys
545                 550                 555                 560
Pro Leu Tyr Lys Arg Met Phe Ser Thr Lys
565                 570
<210>  19
<211>  1713
<212>  DNA
<213>  Artificial/Unknown
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Chimera of HXT1 (1 to 551) and HXT7 (552 to 1713)
<400>  19
atgaattcaa ctcccgatct aatatctcct cagaaatcca attcatccaa ctcatatgaa     60
ttggaatctg gtcgttcaaa ggccatgaat actccagaag gtaaaaatga aagttttcac    120
gacaacttaa gtgaaagtca agtgcaaccc gccgttgccc ctccaaacac cggaaaaggt    180
gtctacgtaa cggtttctat ctgttgtgtt atggttgctt tcggtggttt catatttgga    240
tgggatactg gtaccatttc tggttttgtt gctcaaactg attttctaag aagatttggt    300
atgaagcacc acgacggtag tcattacttg tccaaggtga gaactggttt aattgtctct    360
atttttaaca ttggttgtgc cattggtggt atcgtcttag ccaagctagg tgatatgtat    420
ggtcgtagaa tcggtttgat tgtcgttgta gtaatctaca ctatcggtat cattattcaa    480
atagcctcga tcaacaagtg gtaccaatat ttcattggta gaattatctc tggtttaggt    540
gtcggtggta ttgccgtttt atctcctatg ttgatttctg aagtatcccc aaagcattta    600
aggggtactt tagtctcttg ctaccaattg atgattactg ccggtatttt cttgggttac    660
tgtaccaact tcggtactaa gaactactcc aactctgtgc aatggagagt tccattaggt    720
ttgtgttttg cctgggcttt gtttatgatt ggtggtatga catttgttcc agagtctcca    780
cgttatttgg ctgaagtcgg taagatcgaa gaagccaaac gttctattgc cgtttctaac    840
aaggttgctg ttgatgatcc atctgttttg gctgaagtcg aagctgtctt ggctggtgta    900
gaggcagaga aattagctgg taatgcatcc tggggtgaat tgtttagtag caagacaaag    960
gtccttcagc gtttgatcat gggtgctatg attcaatctc tacaacaatt gacaggtgat   1020
aactatttct tctactatgg tactactatt ttcaaggctg ttggtttgag tgactctttc   1080
gaaacctcta ttgtcttggg tattgttaac tttgcttcca cctttgttgg tatttacgtt   1140
gttgagagat atggtcgtcg tacttgtttg ctatggggtg ctgcatccat gactgcttgt   1200
atggttgtct atgcttccgt gggtgtcacc agattatggc caaatggtca agaccaacca   1260
tcttccaagg gtgctggtaa ctgtatgatt gtctttgcct gtttctatat tttctgtttt   1320
gctactacat gggctccaat tccttatgtc gttgtttctg aaactttccc attgagagtc   1380
aagtctaagg ctatgtctat tgctacagct gctaattggt tgtggggttt cttgattggt   1440
ttcttcactc catttattac tggtgctatt aacttctact acggttacgt tttcatgggc   1500
tgtttggtct tcatgttctt ctatgttttg ttagttgttc cagaaactaa gggtttgact   1560
ttggaagaag tcaacaccat gtgggaagaa ggtgttctac catggaagtc tgcctcatgg   1620
gttccaccat ccagaagagg tgccaactac gacgctgaag aaatgactca cgatgacaag   1680
ccattgtaca agagaatgtt cagcaccaaa taa                                1713
<210>  20
<211>  1713
<212>  DNA
<213>  Artificial/Unknown
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Chimera of HXT1 (1 to 741) and HXT7 (742 to 1713)
<400>  20
atgaattcaa ctcccgatct aatatctcct cagaaatcca attcatccaa ctcatatgaa     60
ttggaatctg gtcgttcaaa ggccatgaat actccagaag gtaaaaatga aagttttcac    120
gacaacttaa gtgaaagtca agtgcaaccc gccgttgccc ctccaaacac cggaaaaggt    180
gtctacgtaa cggtttctat ctgttgtgtt atggttgctt tcggtggttt catatttgga    240
tgggatactg gtaccatttc tggttttgtt gctcaaactg attttctaag aagatttggt    300
atgaagcacc acgacggtag tcattacttg tccaaggtga gaactggttt aattgtctct    360
atttttaaca ttggttgtgc cattggtggt atcgtcttag ccaagctagg tgatatgtat    420
ggtcgtagaa tcggtttgat tgtcgttgta gtaatctaca ctatcggtat cattattcaa    480
atagcctcga tcaacaagtg gtaccaatat ttcattggta gaattatctc tggtttaggt    540
gtcggtggta tcacagtttt atctcccatg ctaatatctg aggtcgcccc cagtgaaatg    600
agaggcacct tggtttcatg ttaccaagtc atgattactt taggtatttt cttaggttac    660
tgtaccaatt ttggtaccaa gaattactca aactctgtcc aatggagagt tccattaggt    720
ttgtgtttcg cctgggcctt atttatgatt ggtggtatga catttgttcc agagtctcca    780
cgttatttgg ctgaagtcgg taagatcgaa gaagccaaac gttctattgc cgtttataac    840
aaggttgctg ttgatgatcc atctgttttg gctgaagtcg aagctgtctt ggctggtgta    900
gaggcagaga aattagctgg taatgcatcc tggggtgaat tgtttagtag caagacaaag    960
gtccttcagc gtttgatcat gggtgctatg attcaatctc tacaacaatt gacaggtgat   1020
aactatttct tctactatgg tactactatt ttcaaggctg ttggtttgag tgactctttc   1080
gaaacctcta ttgtcttggg tattgttaac tttgcttcca cctttgttgg tatttacgtt   1140
gttgagagat atggtcgtcg tacttgtttg ctatggggtg ctgcatccat gactgcttgt   1200
atggttgtct atgcttccgt gggtgtcacc agattatggc caaatggtca agaccaacca   1260
tcttccaagg gtgctggtaa ctgtatgatt gtctttgcct gtttctatat tttctgtttt   1320
gctactacat gggctccaat tccttatgtc gttgtttctg aaactttccc attgagagtc   1380
aagtctaagg ctatgtctat tgctacagct gctaattggt tgtggggttt cttgattggt   1440
ttcttcactc catttattac tggtgctatt aacttctact acggttacgt tttcatgggc   1500
tgtttggtct tcatgttctt ctatgttttg ttagttgttc cagaaactaa gggtttgact   1560
ttggaagaag tcaacaccat gtgggaagaa ggtgttctac catggaagtc tgcctcatgg   1620
gttccaccat ccagaagagg tgccaactac gacgctgaag aaatgactca cgatgacaag   1680
ccattgtaca agagaatgtt cagcaccaaa taa                                1713
<210>  21
<211>  1693
<212>  DNA
<213>  Artificial/Unknown
<220>
<221>  misc_feature
<223>  Expression cassette
<400>  21
tctcgtagga acaatttcgg gcccctgcgt gttcttctga ggttcatctt ttacatttgc     60
ttctgctgga taattttcag aggcaacaag gaaaaattag atggcaaaaa gtcgtctttc    120
aaggaaaaat ccccaccatc tttcgagatc ccctgtaact tattggcaac tgaaagaatg    180
aaaaggagga aaatacaaaa tatactagaa ctgaaaaaaa aaaagtataa atagagacga    240
tatatgccaa tacttcacaa tgttcgaatc tattcttcat ttgcagctat tgtaaaataa    300
taaaacatca agaacaaaca agctcaactt gtcttttcta agaacaaaga ataaacacaa    360
aaacaaaaag tttttttaat tttaatcaaa aaatgtccac aaaatcatat accagtagag    420
ctgagactca tgcaagtccg gttgcatcga aacttttacg tttaatggat gaaaagaaga    480
ccaatttgtg tgcttctctt gacgttcgtt cgactgatga gctattgaaa cttgttgaaa    540
cgttgggtcc atacatttgc cttttgaaaa cacacgttga tatcttggat gatttcagtt    600
atgagggtac tgtcgttcca ttgaaagcat tggcagagaa atacaagttc ttgatatttg    660
aggacagaaa attcgccgat atcggtaaca cagtcaaatt acaatataca tcgggcgttt    720
accgtatcgc agaatggtct gatatcacca acgcccacgg ggttactggt gctggtattg    780
ttgctggctt gaaacaaggt gcgcaagagg tcaccaaaga accaagggga ttattgatgc    840
ttgctgaatt gtcttccaag ggttctctag cacacggtga atatactaag ggtaccgttg    900
atattgcaaa gagtgataaa gatttcgtta ttgggttcat tgctcagaac gatatgggag    960
gaagagaaga agggtttgat tggctaatca tgaccccagg tgtaggttta gacgacaaag   1020
gcgatgcatt gggtcagcag tacagaaccg tcgacgaagt tgtaagtggt ggatcagata   1080
tcatcattgt tggcagagga cttttcgcca agggtagaga tcctaaggtt gaaggtgaaa   1140
gatacagaaa tgctggatgg gaagcgtacc aaaagagaat cagcgctccc cattaatttg   1200
cgaacacttt tattaattca tgatcacgct ctaatttgtg catttgaaat gtactctaat   1260
tctaatttta tatttttaat gatatcttga aaagtaaata cgtttttaat atatacaaaa   1320
taatacagtt taattttcaa gtttttgatc atttgttctc agaaagttga gtgggacgga   1380
gacaaagaaa ctttaaagag aaatgcaaag tgggaagaag tcagttgttt accgaccgca   1440
ctgttattca caaatattcc aattttgcct gcagacccac gtctacaaat tttggttagt   1500
ttggtaaatg gtaaggatat agtagagcct ttttgaaatg ggaaatatct tctttttctg   1560
tatcccgctt caaaaagtgt ctaatgagtc agttatttct ttcttactca tcgcccgtca   1620
cttaaaagaa gaaaaattac tttcatgatg cgaagcgaaa aaaattttta gcttcaattt   1680
tcacaatgca tct                                                      1693
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、プロトン放出ＫＯＹ．ＰＫ２−１Ｃ８３野生型菌株のサッカロミセス・セレビシェの成長周期についての異なる段階における、酸素消費及び二酸化炭素生成を示したものである。
【図２】
図２は、プロトン放出ＴＭ６−発現菌株のサッカロミセス・セレビシェの成長周期についての異なる段階における、酸素消費及び二酸化炭素生成を示したものである。
【図３】
図３は、ＴＭ６−発現菌株によるグルコースの好気性成長の間におけるバイオマス成長の程度を与える、吸光度対時間のセミログプロットを示したものである。
【図４】
図４は、ＴＭ６−発現菌株によるグルコースの好気性成長の間におけるＲＱの連続的モニタリングによる、二酸化炭素生成率と酸素消費の比率の連続的なオンラインプロットを示したものである。
【図５】
図５は、ＫＯＹ．ＴＭ４Ｐについてのオンライン熱発生測定を示したものである。
【図６】
図６は、ＴＭ４−発現菌株によるグルコースのバイオマス成長の程度を与える、吸光度対時間のセミログプロットを示したものである。
【図７】
図７は、Ａ）ＴＭ６及びＢ）ＴＭ４についてのバイオマス（ｇ／ｌ）／時間（ｈ）のセミログプロットを示したものである。