(57)【要約】  本発明は、育種マーカーを用いた分子選抜方法を利用して、α酸を高含有するホップ株、さらには、α酸に加えて、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを併せて高含有するホップ株、を短期間に選抜することを目的としている。本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いる育種マーカーを提供する。（ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第８９９番目はｔ）の第８９９番目の塩基を含む２０〜１５８７の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示される、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いる育種マーカー。
（ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第８９９番目はｔ）の第８９９番目の塩基を含む２０〜１５８７の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２】
さらに、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の選抜に用いる、請求項１記載の育種マーカー。
【請求項３】
α酸を多く含むホップ株の選抜方法であって、
被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
前記ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化して、消化ゲノムＤＮＡ断片を得る消化ステップと、
前記消化ゲノムＤＮＡ断片を分離し、前記（ａ）又は前記（ｂ）に示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、
前記ゲノムＤＮＡ断片の少なくとも１つのサイズが約１１．３ｋｂｐである場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項４】
α酸を多く含むホップ株の選抜方法であって、
被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項５】
前記特定ステップは、
前記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、
前記ＤＮＡを制限酵素ＰｓｈＢＩで消化して、消化ＤＮＡ断片を得る消化ステップと、
前記配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチドと第９００番目のヌクレオチドの間で切断された場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップと、
を備える、請求項４記載の選抜方法。
【請求項６】
前記特定ステップは、
前記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、
前記ＤＮＡを制限酵素ＰｓｈＢＩで消化して、消化ＤＮＡ断片を得る消化ステップと、
前記消化ＤＮＡ断片の少なくとも１つのサイズが約４６０ｂｐである場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップと、
を備える、請求項４記載の選抜方法。
【請求項７】
さらに、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の選抜方法である、請求項３〜６のいずれか一項記載の選抜方法。
【請求項８】
α酸を多く含むホップ株の選抜に用いるプライマーセットであって、
配列表の配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーと、
配列表の配列番号３に示される塩基配列を含むプライマーと、
から構成される、プライマーセット。
【請求項９】
さらに、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株を選抜に用いる、請求項８記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ホップ株の選抜方法並びにホップ株の選抜に用いる育種マーカー及びプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップは、ビールに爽快な苦味と香りを与えるビールの主要原料である。ホップ中の苦味成分としては、フムロン、コフムロン及びアドフムロン等のα酸、並びにルプロン、コルプロン及びアドルプロン等のβ酸が知られている。α酸は抗菌活性、抗癌活性及び抗炎症作用等を有し、β酸は鎮静作用等を有し、いずれもが薬用資源としても注目されていている（非特許文献１）。【０００３】
ビールにおけるホップ香り成分としてはテルペン類が挙げられる。ビールの香りに関わるホップ由来のテルペン類の詳細については明らかとなっていないが、ミルセンはホップ毬花中のテルペン類の主成分となっている（非特許文献２）。【０００４】
キサントフモールは、ホップ特有のフラボノイドとして発見されたが、ガン細胞の増殖抑制作用、抗酸化作用、抗高脂血症作用及び骨分解抑制作用等のさまざまな薬理作用を有することが明らかになり、薬用資源として注目されている（非特許文献１）。【０００５】
ホップにおけるα酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールの含量は、ホップの品質を判断する上で重要な指標とされ、従来のホップの育種では、特にα酸やキサントフモールを多く含むホップ株を選抜することに主眼が置かれてきた。【０００６】
有用植物の育種方法としては、優良株を交配して得られた交配後代を目的の形質を表現するまで栽培して選抜する方法の他に、交配後代のゲノムＤＮＡを種子や実生苗の段階で調べて、育種マーカー（ＤＮＡマーカー）を指標に選抜する分子選抜方法が利用されつつある。【０００７】
【非特許文献１】Ｇｅｒｈａｅｕｓｅｒ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００５年、４１巻、１３号、ｐ．１９４１−１９５４
【非特許文献２】Ａｏｓｈｉｍａら、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ.、２００６年、５巻、５４号、ｐ．２５１４−２５１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、毬花を付けないホップの雄株については遺伝的な研究がほとんどなされておらず、雌株であってもホップの苦味や香り等に関する上記成分の生合成に関与する遺伝子はほとんど明らかにされていない。このため、α酸、さらには、β酸、ミルセンおよび／又はキサントフモールの含量に着目したホップ株の選抜を行なうには、育種マーカーを指標にした分子選抜方法が利用できないのが現状であった。【０００９】
さらに、α酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールは、ホップの毬花中のルプリン腺毛に特異的に蓄積するものであるため、これらの成分を多く含むホップ株を選抜するには、播種後、毬花が着生するまで待つ必要があり、これらの形質を安定させるためには、少なくとも数年の栽培期間が必要であった。【００１０】
そこで本発明は、育種マーカーを用いた分子選抜方法を利用して、α酸を高含有するホップ株を短期間で選抜することを目的とする。さらに本発明は、α酸に加えて、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを併せて高含有するホップ株を短期間に選抜することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いる育種マーカーを提供する。
（ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第８９９番目はｔ）の第８９９番目の塩基を含む２０〜１５８７の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド【００１２】
本発明者らは、ホップ毬花のルプリン腺毛由来のｃＤＮＡライブラリーから、α酸を多く含むホップ株に共通して認められる多型として、配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの第８９９番目の塩基（ｔ）を見出した。ホップにおいて汎用性のあるα酸の育種マーカーの報告はこれまでなかったが、上記の育種マーカーは、様々なホップ系統を交配して得た交配後代において、α酸を高含有するホップ株を選抜できることが判明した。さらに、この育種マーカーで選抜したホップ株は、α酸に加えて、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールについても高含有していることが明らかとなった。【００１３】
ホップ株の育種において、上記の育種マーカーと同一の配列を有するホップ株を選抜すれば、ホップが生育して毬花を形成するまで待つことなく、種子又は実生苗の段階でα酸を多く含むホップ株を選抜できる。また、この育種マーカーがあれば、これまでは勘と経験に頼っていた交配系統の組合せを、ゲノム情報に基づいて客観的に決定できる。さらに、この育種マーカーは、α酸に加えて、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを併せて高含有するホップ株の選抜にも好ましく使用できる。【００１４】
ここで「α酸を多く含むホップ株」とは、任意の交配後代集団を上記の育種マーカーと同一の配列を有するか否かで分割した場合に、α酸含量の平均値が高くなる集団に含まれるホップ株のことをいう。同様に、「さらに、β酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株」とは、任意の交配後代集団を上記の育種マーカーと同一の配列を有するか否かで分割した場合に、α酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールの含量の平均値が高くなる集団に含まれるホップ株のことをいう。【００１５】
また本発明は、α酸を多く含むホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化して、消化ゲノムＤＮＡ断片を得る消化ステップと、消化ゲノムＤＮＡ断片を分離し、上記（ａ）又は上記（ｂ）に示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、このゲノムＤＮＡ断片の少なくとも１つのサイズが約１１．３ｋｂｐである場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップとを備える選抜方法を提供する。【００１６】
この選抜方法では、（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドをプローブとして用い、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉによる制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；以下、ＲＦＬＰと略す。）を調べることにより、α酸を多く含むホップ株又はα酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株を選抜できる。ゲノム断片のサイズを視覚的に識別できるため、ゲノムＤＮＡの塩基配列を調べることなく、α酸を多く含むホップ株又はα酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株を客観的かつ迅速に選抜できる。【００１７】
また本発明は、α酸を多く含むホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップとを備える選抜方法を提供する。【００１８】
上記特定ステップは、上記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＰｓｈＢＩで消化して、消化ＤＮＡ断片を得る消化ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチドと第９００番目のヌクレオチドの間で切断された場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップとを備えることが好ましい。【００１９】
この選抜方法では、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目を含むＤＮＡ断片が増幅されるため、サザンハイブリダイゼーションを行う必要がない。消化ステップで得られた消化ＤＮＡ断片を、例えば、電気泳動でＤＮＡ断片のサイズに基づいて分画すれば、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチドと第９００番目のヌクレオチドの間で切断されたか否かを容易に判断でき、α酸を多く含むホップ株又はα酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株を選抜できる。【００２０】
また、上記特定ステップは、上記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＰｓｈＢＩで消化して、消化ＤＮＡ断片を得る消化ステップと、消化ＤＮＡ断片の少なくとも１つのサイズが約４６０ｂｐである場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップとを備えることが好ましい。【００２１】
この選抜方法では、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行なうため、目的とするＤＮＡ断片のみが効率的かつ特異的に増幅される。さらに、消化ステップで得られた消化ＤＮＡ断片をＤＮＡ断片のサイズに基づいて分画すれば、約４６０ｂｐの断片の有無を容易に判断でき、α酸を多く含むホップ株又はα酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株を選抜できる。【００２２】
また本発明は、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されるプライマーセットを提供する。【００２３】
上記プライマーセットを用いれば、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目を含むＤＮＡ断片のみを特異的に増幅できる。上記プライマーセットは、α酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の選抜に好適に利用できる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、α酸を多く含むホップ株の育種マーカーを提供でき、この育種マーカーは、α酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の育種マーカーとしても利用できる。また本発明によれば、ホップが毬花を形成し、安定した形質を表現するまで待つことなく、ホップの種子又は実生苗を用いて、α酸を多く含むホップ株又はα酸並びにミルセン及び／又はキサントフモールを併せて高含有するホップ株を客観的かつ迅速に選抜できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ホップ株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、ゲノムサザンハイブリダイゼーションをすることにより得られたＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型を示す図である。
【図２】l型ｇ７Ｈ０１とｍ型ｇ７Ｈ０１の塩基配列のホモロジーを解析した図である。
【図３】ホップ株のＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析を行うことにより得られたＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型を示す典型的なバンドパターンを示す図である。
【図４】ホップの１１系統のゲノムＤＮＡを解析して得られたＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型を示した図である。
【図５】ホップの１１系統のゲノムを解析して得られたＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２７】
本発明の育種マーカーは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示され、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いることを特徴としている。
（ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第８９９番目はｔ）の第８９９番目の塩基を含む２０〜１５８７の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド【００２８】
「育種マーカー」とは、育種に使用するＤＮＡマーカーであって、目的とする形質に関与する遺伝子の近傍のゲノムに存在し、この遺伝子と共に行動するＤＮＡ配列のことをいう。育種マーカーは、被検植物の種子や実生苗のゲノムＤＮＡを用いて、病気に対する抵抗性等の肉眼では分からない形質や成熟期に現れる形質の有無を判定できる。育種マーカーは、遺伝子そのものであっても、遺伝子そのものでなくてもよい。【００２９】
「α酸」とは、フムロンとその同族体を主体としたホップの苦みのもとになる物質の総称であり、コフムロン及びアドフムロン等が含まれる。また、「β酸」とは、ルプロンとその同族体を主体としたホップの苦みのもとになる物質の総称であり、コルプロン及びアドルプロン等が含まれる。【００３０】
本明細書では、「ホップ」とは、アサ科の多年生の植物（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ  Ｌ）の植物体そのもののことをいい、「毬花」とは、ホップの雌株にできる雌花であって、雌花序が松かさ状の房となったもののことをいう。また、「ホップ株」とは、ホップを交配して得られた交配後代の各１個体のことをいう。【００３１】
「ポリヌクレオチド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基が糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド)が複数個結合した分子のことをいう。【００３２】
上記の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って、配列表の配列番号５の塩基配列情報をもとに合成した標識ＤＮＡプローブを用いて、ホップのゲノムライブラリーからクローニングできる。【００３３】
さらに、（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドは、ホップの葉等の組織から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号５の塩基配列情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いれば、ＰＣＲ法で合成できる。さらに、（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの部分配列をＤＮＡ合成機で合成し、酵素的手法及びサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせ、目的とするサイズのポリヌクレオチドとすることもできる。【００３４】
上記の育種マーカーは、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いることができるが、α酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の選抜に用いることが好ましい。【００３５】
また、本発明のα酸を多く含むホップ株の選抜方法は、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化して、消化ゲノムＤＮＡ断片を得る消化ステップと、消化ゲノムＤＮＡ断片を分離し、上記（ａ）又は上記（ｂ）に示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、このゲノムＤＮＡ断片の少なくとも１つのサイズが約１１．３ｋｂｐである場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップとを備えることを特徴とする。【００３６】
このような選抜方法としては、例えば、ＲＦＬＰを利用した方法が挙げられる。具体的には、ゲノムＤＮＡ中に制限酵素の認識部位に変異が生じたり、塩基挿入又は塩基欠損が生じていたりした場合に、当該制限酵素で処理した後に生じるＤＮＡ断片の大きさを比較して、目的とする形質を有するか否かを判定する方法である。【００３７】
検出ステップでは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されたゲノミックサザンハイブリダイゼーション法に従って、（ａ）又は（ｂ）に示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出できる。具体的には、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化した被検ホップの消化ゲノムＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分画し、分画したゲノムＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファーし、標識した（ａ）又は上記（ｂ）に示されるポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、プローブの標識を指標にハイブリダイズしたバンドを検出できる。【００３８】
プローブの標識方法としては、例えば、クレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）又はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５'端を３２Ｐ等でリン酸化することにより標識する方法が挙げられる。【００３９】
判断ステップでは、例えば、被検ホップ株由来の消化ゲノムＤＮＡ断片をＤＮＡサイズマーカーと共に電気泳動し、ナイロンメンブレンにトランスファーする際に、ウェルの位置とサイズマーカーが移動した位置をナイロンメンブレンにマーキングしておけば、ウェルからの移動距離とＤＮＡサイズマーカーのサイズとの関係から、ハイブリダイズした被検ホップ株由来の消化ゲノムＤＮＡ断片のサイズを計算できる。被検ホップ株由来の消化ゲノムＤＮＡ断片が１１．３ｋｂｐ付近で検出されれば、この被検ホップ株はα酸を多く含む株であると判断できる。【００４０】
また、本発明のα酸を多く含むホップ株の選抜方法は、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップとを備えることを特徴とする。【００４１】
上記特定ステップは、上記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＰｓｈＢＩで消化して、消化ＤＮＡ断片を得る消化ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチドと第９００番目のヌクレオチドの間で切断された場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップとを備えることが好ましい。【００４２】
このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅させたＤＮＡ断片中に制限酵素の認識部位に変異が生じたり、塩基挿入又は塩基欠損が生じていたりした場合に、当該制限酵素で処理した後に生じるＤＮＡ断片の大きさを比較して、目的とする形質を有するか否かを判定する方法である。【００４３】
上記のＰＣＲステップで用いるプライマーは、配列表の配列番号５に示される塩基配列を基に１８〜５０の連続した塩基配列を選択し、ＤＮＡ合成機で合成できる。プライマーのサイズは、１８塩基以上３０塩基以下であることが好ましく、２０塩基以上２２塩基以下であることがさらに好ましい。【００４４】
判断ステップでは、例えば、制限酵素ＰｓｈＢＩで消化した被検ホップ株由来の消化ＤＮＡ断片をＤＮＡサイズマーカーと共にアガロース電気泳動又はポリアクリルアミド電気泳動で分画し、ＤＮＡサイズマーカーのウェルからの移動距離とサイズマーカーの塩基配列のサイズとの関係から、被検ホップ株由来の消化ＤＮＡ断片のサイズを計算できる。被検ホップ株由来の消化ＤＮＡ断片のサイズが明らかとなれば、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第８９９番目のヌクレオチドと第９００番目のヌクレオチドの間で切断されたか否かを判定することができ、切断が確認できた場合に被検ホップ株はα酸を多く含む株であると判断できる。尚、電気泳動後のゲル中に存在する消化ＤＮＡ断片及びサイズマーカーは、例えば、臭化エチジウム又はサイバーグリーン等で処理することにより、ＵＶ照射下で検出できる。【００４５】
また、上記特定ステップは、被検ホップ株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＰｓｈＢＩで消化して、消化ＤＮＡ断片を得る消化ステップと、消化ＤＮＡ断片の少なくとも１つのサイズが約４６０ｂｐである場合に、α酸を多く含む株であると判断する判断ステップとを備えることが好ましい。【００４６】
上記のＰＣＲステップで用いるプライマーは、配列表の配列番号２に示される塩基配列及び配列表の配列番号３に示される塩基配列を基にそれぞれＤＮＡ合成機で合成できる。【００４７】
判断ステップでは、例えば、制限酵素ＰｓｈＢＩで消化した被検ホップ株由来の消化ＤＮＡ断片を、ＤＮＡサイズマーカーと共にアガロース電気泳動又はポリアクリルアミド電気泳動で分画し、ＤＮＡサイズマーカーのウェルからの移動距離とサイズマーカーの塩基配列のサイズとの関係から、被検ホップ株由来の消化ＤＮＡ断片のサイズを計算することができる。その結果、被検ホップ株由来の消化ＤＮＡ断片が４６０ｂｐ付近で検出されれば、この被検ホップ株はα酸を多く含む株であると判断できる。尚、電気泳動後のゲル中に存在する消化ＤＮＡ断片及びサイズマーカーは、例えば、臭化エチジウム又はサイバーグリーン等で処理することにより、ＵＶ照射下で検出できる。【００４８】
尚、本発明の選抜方法は、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いることができるが、α酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の選抜に用いることが好ましい。【００４９】
本発明のプライマーセットは、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されることを特徴とする。【００５０】
このプライマーセットは、配列表の配列番号２に示される塩基配列及び配列表の配列番号３に示される塩基配列を基にそれぞれＤＮＡ合成機で合成できる。【００５１】
尚、このプライマーセットは、α酸を多く含むホップ株の選抜に用いることができるが、α酸並びにミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の選抜に用いることが好ましい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５３】
１．実験方法
１）ホップ毬花に含まれるα酸、β酸及びキサントフモールの定量：
ホップ毬花に含まれるα酸、β酸及びキサントフモールの量は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＳＢＣ）による公定法の変法を用いて測定した。具体的には、まず、１００ｍＬの共栓三角フラスコに１ｇの粉砕したホップ毬花を入れ、そこに４ｍＬのメタノール及び２０ｍＬのジエチルエーテルを加えて３０分間振盪した。その後、８ｍＬの０.１Ｍ塩酸をそこに加えて１０分間振盪し、静置後、エーテル層から０.２ｍＬを採取し、そこにメタノールを加えて１０ｍＬとし、その一部を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣの分析条件については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＢＣ）による公定法７．７に従って行い、３１４ｎｍの波長でα酸、β酸及びキサントフモールの検出を行ない定量した。【００５４】
２）ホップ毬花に含まれるミルセンの定量：
ホップ毬花に含まれるミルセンの定量は、以下の手順で行なった。まず、１０ｍＬの共栓遠心管に１ｇの粉砕したホップ毬花を入れ、６ｍＬのｎ−ヘキサンを加えて４５分間振盪し、３，０００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離した後、１．５ｍＬの上澄を１０ｍＬの共栓遠心管に採取した。その後、３ｍＬの５％炭酸カリウムを加え、５分間振盪した後、３，０００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離し、上澄をガスクロマトグラフィーで分析した。ガスクロマトグラフィーはＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社のＨＰ５８９０、カラムはＪ＆Ｗ社のＤＢ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ×１．０μｍ）、検出系は水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）を用いた。キャリアーガスは、ヘリウム（２．２ｍＬ／ｍｉｎ）を用い、オーブンの温度プログラムは、５０℃で１分間保温後、５０℃から２５０℃に５℃／分で加熱し、２５０℃で３分間保温するようにセットした。【００５５】
３）ホップ毬花のルプリン腺毛由来全ＲＮＡ及びｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡの調製：
まず、ホップ雌株の毬花を凍結状態で粉砕し、メッシュ径２５０μｍの篩を透過した画分をルプリン腺毛画分とした。次に、ルプリン腺毛画分を液体窒素中でホモジナイズし、２％ＣＴＡＢ溶液（２％  セチルトリメチルアンモニウムブロミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、５％  β−メルカプトエタノール、０.１Ｍ  トリス、ｐＨ９.５）を加えて懸濁し、６５℃で１０分間保温した後にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。得られた水溶性画分に１／３倍量の１０Ｍ  塩化リチウムを加えて一晩放置し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿をＲＮａｓｅフリーの滅菌水で溶解した。その後、この溶液に１／３倍量の１０Ｍ  塩化リチウムを再度加えて一晩放置し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿をＲＮａｓｅフリーの滅菌水で溶解して全ＲＮＡサンプルとした。  【００５６】
得られた全ＲＮＡサンプルは、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより定量し、タカラバイオ社のＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  Ｓｕｐｅｒを用い、添付のプロトコールに従って、ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡを調製した。【００５７】
４）ホップ毬花のルプリン腺毛由来ｃＤＮＡライブラリーの作製：
ＢＤバイオサイエンス社のＣｒｅａｔｅｒ  ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、得られたホップ毬花のルプリン腺毛由来ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡからホップ毬花のルプリン腺毛由来ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡライブラリーの作製手順は、上記キットに添付されたプロトコールに従って行なった。【００５８】
２．実験結果
（実施例１）α酸、β酸、ミルセンの含量に関与するＤＮＡマーカーの探索
まず、ホップ毬花（品種Ｓａａｚ）のルプリン腺毛由来ｃＤＮＡライブラリーからランダムにクローンを選び、各クローンに導入されているルプリン腺毛由来ｃＤＮＡを鋳型に、ジゴケシゲニン（ＤＩＧ）標識ｄＵＴＰの存在下でＰＣＲを行い、ＤＩＧ標識プローブを作製した。ＰＣＲによるＤＩＧ標識プローブの作製は、ロシュ・ダイアグノスティクス社のＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キットを用いた。【００５９】
次に、サッポロビール株式会社が保有するホップの品種Ｃｈｉｎｏｏｋと品種ＳａＭとの交配後代１１０個体からそれぞれゲノムＤＮＡを抽出し、上記のＤＩＧ標識プローブと制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＸｂａＩとの組み合わせでＲＦＬＰ解析を行い、α酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールの含量と相関性を示す多型を検出する育種マーカーの探索を行なった。ゲノムＤＮＡの抽出及びゲノミックサザンハイブリダイゼーションの手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って行なった。【００６０】
その結果、ルプリン腺毛由来のｃＤＮＡクローン７Ｈ０１（以下、７Ｈ０１）と制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉとの組み合わせで検出された多型（以下、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型）が、α酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールの含量と相関性を示すことが判明し、育種マーカーとして利用できることが示唆された。【００６１】
そこで、７Ｈ０１が、品種Ｃｈｉｎｏｏｋと品種ＳａＭとの交配後代以外の広い範囲のホップ系統においても、α酸、β酸、ミルセン又はキサントフモールの含量と相関性を示す育種マーカーとして利用できるか否かについて、実施例２で調べた。尚、７Ｈ０１の塩基配列は、配列表の配列番号１に示した通りである。【００６２】
（実施例２）α酸、β酸、ミルセン又はキサントフモールの含量と、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型との相関性：
サッポロビール株式会社が保有するホップ系統のうち１１系統（大満州、Ｍ９１６００１００３、０００４Ｂ、９７１１７４、９８０５７３、モニカ、Ｍ８４３５０１２４６、９８０６９０、北鮮在来、マリア、９８１１１６）を選択し、これらを交配して得られた交配後代のホップ毬花に含まれるα酸、β酸、ミルセα酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールの含量を調べ、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型との相関性について調べた。【００６３】
交配は、大満州×Ｍ９１６００１００３、０００４Ｂ×９７１１７４、０００４Ｂ×９８０５７３、モニカ×Ｍ８４３５０１２４６、モニカ×９８０５７３、大満州×９８０６９０、北鮮在来×９８０６９０、マリア×９８１１１６の組み合わせで行い、得られた交配後代の毬花に含まれるα酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールの含量について調べた。【００６４】
ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型とα酸、β酸、ミルセン又はキサントフモールの含量との相関性の有無は、交配の組み合わせで得られた交配後代をＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型ごとに群分けし、群ごとに各成分の含量の平均値を求め、Ｔ検定により統計的有意差の有無を調べて判断した。尚、Ｔ検定を行う際には、各ホップ系統の組み合わせ毎にＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型間で分析値の分散に差があるか否かをＦ検定により調査し、分散に差がない場合は等分散を仮定した検定を行ない、分散に差がある場合は分散が等しくないと仮定した検定を行なった。また、７Ｈ０１のα酸、β酸、ミルセン又はキサントフモールの含量に対する影響を表す寄与率は、遺伝分散／母分散として求めた。遺伝分散は、対象とする７Ｈ０１の遺伝子型以外の要因（他の遺伝子座の影響や環境による影響）を受けてない仮定の集団の分散とした。すなわち、母集団の平均値をＸＰ、母分散をＶＰ、遺伝子型１、２、・・・の集団の平均値をＸ１、Ｘ２、・・・、各遺伝子型の個体数をＮ１、Ｎ２とすると、遺伝分散（ＶＧ）及び寄与率（Ｈ）は以下の式で求められる。
遺伝分散（ＶＧ）＝（（ＸＰ−Ｘ１）２×Ｎ１＋（ＸＰ−Ｘ２）２×Ｎ２＋・・・）／（Ｎ１＋Ｎ２＋・・・）
寄与率（Ｈ）＝ＶＧ／ＶＰ【００６５】
図１は、ホップ株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、ゲノムサザンハイブリダイゼーションをすることにより得られた、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型を示す図である。各交配の組み合わせで得られた交配後代は、ｌｌ型、ｌｍ型、ｍｍ型の３種類のパターンを示した。【００６６】
表１及び表２は、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型とα酸含量の相関について示した表である。交配後代の多型パターンがｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせを表１に、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせを表２にまとめた。α酸含有率は、毬花の乾燥質量に対する毬花に含まれるα酸質量の割合で示した。【００６７】
【表１】
2008035702.tif 000002
【００６８】
【表２】
2008035702.tif 000003
【００６９】
その結果、ｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてα酸含有率を比較すると（表１）、いずれの交配の組み合わせであってもｌｍ型を示す群でα酸含有率が高く、５つの交配の組み合わせのうち４つの組み合わせで統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。一方、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてα酸含有率を比較すると（表２)、群間でほとんど差が認められず、統計的にも有意差は認められなかった。【００７０】
これらの結果より、ｍ型のゲノムを少なくとも一つ含むホップ株は、ｍ型のゲノムを含まないホップ株よりα酸を多く含むことが示唆された。【００７１】
表３及び表４は、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型とβ酸含量の相関について示した表である。交配後代の多型パターンがｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせを表３に、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせを表４にまとめた。β酸含有率は、毬花の乾燥質量に対する毬花に含まれるβ酸質量の割合で示した。【００７２】
【表３】
2008035702.tif 000004
【００７３】
【表４】
2008035702.tif 000005
【００７４】
その結果、ｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてβ酸含有率を比較すると、いずれの交配の組み合わせであってもｌｍ型を示す群でβ酸含有率が高く、５つの交配の組み合わせのうち２つの組み合わせで統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。一方、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてβ酸含有率を比較すると、３つの組み合わせ中２つの組み合わせにおいて、ｍｍ型を示す群でβ酸含有率が高く、北鮮在来×９８０６９０の組み合わせでは統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。しかしながら、残りの１つの組み合わせにおいては、ｌｍ型を示す群でわずかながらβ酸含有率が高くなり、ｌｍ型を示す群とｍｍ型を示す群の間に大きな違いは認められなかった。【００７５】
これらの結果より、ｍ型のゲノムを少なくとも一つ含むホップ株は、ｍ型のゲノムを含まないホップ株よりβ酸を多く含むことが示唆された。【００７６】
表５及び表６は、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型とミルセン含量の相関について示した表である。交配後代の多型パターンがｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせを表５に、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせを表６にまとめた。ミルセン含有率は、毬花の乾燥質量に対する毬花に含まれるミルセン質量の割合で示した。【００７７】
【表５】
2008035702.tif 000006
【００７８】
【表６】
2008035702.tif 000007
【００７９】
その結果、ｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてミルセン含有率を比較すると、いずれの交配の組み合わせであってもｌｍ型を示す群でミルセン含有率が高く、５つの交配の組み合わせのうち３つの組み合わせで統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。一方、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてミルセン含有率を比較すると、３つの組み合わせ中２つの組み合わせで、ｌｍ型を示す群でミルセン含有率が高く、大満州×９８０６９０の組み合わせでは統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。しかしながら、残りの１つの組み合わせでは、ｍｍ型を示す群でミルセン含有率が統計的に有意に高く（ｐ＜０．０１）、ｌｍ型を示す群とｍｍ型を示す群の間に大きな違いは認められなかった。【００８０】
これらの結果より、ｍ型のゲノムを少なくとも一つ含むホップ株は、ｍ型のゲノムを含まないホップ株よりミルセンを多く含むことが示唆された。【００８１】
表７及び表８は、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型とキサントフモール含量の相関について示した表である。交配後代の多型パターンがｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせを表７に、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせを表８にまとめた。キサントフモール含有率は、毬花の乾燥質量に対する毬花に含まれるキサントフモール質量の割合で示した。【００８２】
【表７】
2008035702.tif 000008
【００８３】
【表８】
2008035702.tif 000009
【００８４】
その結果、ｌｌ型とｌｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてキサントフモール含有率を比較すると、５つの交配の組み合わせのうち４つの組み合わせにおいて、ｌｍ型を示す群でキサントフモール含有率が高く、そのうちの２つの組み合わせでは統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。一方、ｌｍ型とｍｍ型に分かれた組み合わせの交配後代の各群においてキサントフモール含有率を比較すると、いずれの組み合わせにおいてもｌｍ型を示す群とｍｍ型を示す群の間に統計的有意差は認められず、両群のキサントフモール含有率に大きな違いは認められなかった。【００８５】
これらの結果より、ｍ型のゲノムを少なくとも一つ含むホップ株は、ｍ型のゲノムを含まないホップ株よりキサントフモールを多く含むことが示唆された。【００８６】
（実施例４）７Ｈ０１を含むゲノムＤＮＡ断片のクローニング
ｍ型のゲノムを少なくとも一つ含むホップ株は、α酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールを多く含むことが示唆されたため、７Ｈ０１の塩基配列を利用して、ｍ型のゲノムＤＮＡ断片とｌ型のゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、両者の塩基配列の違いからα酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールの含量と相関する多型の探索を試みた。【００８７】
まず、７Ｈ０１の両末端領域の配列を基に以下のプライマーを設計した。
ｐ７Ｈ０１−Ｆプライマー：５’−ＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＧＧＣＧ−３’（配列番号２）
ｐ７Ｈ０１−Ｒプライマー：５’−ＣＡＡＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号３）【００８８】
次に、ｌ型とｍ型の両方のゲノムを保有する品種Ｃｈｉｎｏｏｋと、ｍ型のみを保有する品種ＳａＭとからゲノムＤＮＡを抽出し、ｐ７Ｈ０１−Ｆプライマーとｐ７Ｈ０１−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行い、特異的に増幅されるゲノムＤＮＡ断片をクローニングした。その後、品種ＣｈｉｎｏｏｋのゲノムＤＮＡからクローニングしたＤＮＡ断片については複数のクローンについて、品種ＳａＭのゲノムＤＮＡからクローニングしたＤＮＡ断片については単一のクローンについて、その塩基配列を解析した。ＰＣＲはタカラバイオ社のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、製造元のプロトコールに従って行なった。塩基配列の解析は、マクロジェン社の委託解析サービスを利用して行なった。【００８９】
品種Ｃｈｉｎｏｏｋ由来の複数のクローンの塩基配列のうち、品種ＳａＭ由来のクローンの塩基配列と異なるものをｌ型の７Ｈ０１を含むゲノムＤＮＡ断片（以下、l型ｇ７Ｈ０１）の塩基配列とし、品種ＳａＭ由来のクローンの塩基配列をｍ型の７Ｈ０１を含むゲノムＤＮＡ断片（以下、ｍ型ｇ７Ｈ０１）の塩基配列とした。l型ｇ７Ｈ０１の塩基配列は、配列表の配列番号４に示し、ｍ型ｇ７Ｈ０１の塩基配列は、配列表の配列番号５に示した。【００９０】
図２は、l型ｇ７Ｈ０１とｍ型ｇ７Ｈ０１の塩基配列のホモロジーを解析した図である。その結果、図２中に矢印で示したｍ型ｇ７Ｈ０１の第８９９番目のヌクレオチドに一塩基多型が認められ、この一塩基多型は制限酵素ＰｓｈＢＩによる切断で識別できることが判明した。【００９１】
（実施例５）ｌ型ｇ７Ｈ０１とｍ型ｇ７Ｈ０１の間に認められた一塩基多型の解析
ｍ型ｇ７Ｈ０１には制限酵素ＰｓｈＢＩによる切断で識別可能な一塩基多型が存在することが判明したので、この一塩基多型を利用して、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型と同様に、α酸、β酸、ミルセン及びキサントフモールを多く含むホップ株の選抜が可能であるか否かについて検討を加えた。【００９２】
まず、ホップの１１系統（大満州、Ｍ９１６００１００３、０００４Ｂ、９７１１７４、９８０５７３、モニカ、Ｍ８４３５０１２４６、９８０６９０、北鮮在来、マリア、９８１１１６）のゲノムＤＮＡを用いて、制限酵素ＰｓｈＢＩと、ｐ７Ｈ０１−Ｆプライマー及びｐ７Ｈ０１−Ｒプライマーからなるプライマーセットとの組み合わせでＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析を行い、得られる多型（以下、ＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型）を検出した。【００９３】
具体的には、ホップの１１系統の各ゲノムＤＮＡを鋳型に、ｐ７Ｈ０１−Ｆプライマーとｐ７Ｈ０１−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行ってＤＮＡを合成し、引き続きこのＤＮＡを制限酵素ＰｓｈＢＩで消化し、消化したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動で分画し、アガロースゲル中で分画されたＤＮＡ断片のバンドパターンを調べた。ＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型の解析では、４６０ｂｐ付近のバンドと６８０ｂｐ付近のバンドが検出された場合に、当該ゲノムＤＮＡはｍ型ゲノムを有し、１１３８ｂｐ付近のバンドが検出された場合に、当該ゲノムＤＮＡはｌ型ゲノムを有していることとなる。【００９４】
図３は、ホップ株のＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析を行うことにより得られたＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型を示す典型的なバンドパターンであり、図４は、ホップの１１系統のゲノムＤＮＡを解析して得られたＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型を示した図である。【００９５】
その結果、９８０６９０、９８１１１６はｍ型ゲノムのみを有するホップ系統であり、Ｍ９１６００１００３、９７１１７４、９８０５７３、Ｍ８４３５０１２４６はｌ型ゲノムのみを有するホップ系統であり、大満州、０００４Ｂ、モニカ、北鮮在来、マリアは、ｍ型ゲノムとｌ型ゲノムの双方を有するホップ系統であることが示唆された。【００９６】
次に、ホップの同じ１１系統のゲノムＤＮＡを用いて、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉと、７Ｈ０１の組み合わせでＲＦＬＰ解析を行い、得られるＥｃｏＴ２２Ｉ／ｇ７Ｈ０１多型を調べることにより、上記のＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型による判定結果が正しいか否かについて検討した。【００９７】
具体的には、ホップの１１系統の各ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで切断し、消化したゲノムＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動で分画し、分画したゲノムＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファーし、標識した７Ｈ０１をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、プローブの標識を指標にハイブリダイズしたバンドを検出した。【００９８】
図５は、ホップの１１系統のゲノムを解析して得られたＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型を示した図である。【００９９】
その結果、９８０６９０、９８１１１６はｍ型ゲノムのみを有するホップ系統であり、Ｍ９１６００１００３、９７１１７４、９８０５７３、Ｍ８４３５０１２４６はｌ型ゲノムのみを有するホップ系統であり、大満州、０００４Ｂ、モニカ、北鮮在来、マリアは、ｍ型ゲノムとｌ型ゲノムの双方を有するホップ系統であることが判明した。【０１００】
以上の結果より、ＰｓｈＢＩ／ｇ７Ｈ０１多型の解析は、ＥｃｏＴ２２Ｉ／７Ｈ０１多型の解析と同様に、ホップ株がｍ型ゲノムを有するか否かの判定に使用できることが判明し、α酸を多く含むホップ株又はα酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の選抜方法に使用できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明によれば、α酸を多く含むホップ株の育種マーカーを提供でき、この育種マーカーは、α酸並びにβ酸、ミルセン及び／又はキサントフモールを多く含むホップ株の育種マーカーとしても利用できる。また本発明によれば、ホップが毬花を形成し、安定した形質を表現するまで待つことなく、ホップの種子又は実生苗を用いて、α酸を多く含むホップ株又はα酸並びにミルセン及び／又はキサントフモールを併せて高含有するホップ株を客観的かつ迅速に選抜できる。
【図１】
2008035702.tif 000010
【図２】
2008035702.tif 000011
【図３】
2008035702.tif 000012
【図４】
2008035702.tif 000013
【図５】
2008035702.tif 000014
【配列表】
2008035702000001.app
【国際調査報告】
2008035702.tif 000015
2008035702.tif 000016