【手続補正書】
【提出日】平成17年4月26日(2005.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
請求項1〜13のいずれか一項記載のレトロウイルスに基づくベクター系の使用を含む、遺伝子治療用ベクター系の安全性を向上させる方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
簡潔にいえば、neoを有するPBSノックアウトベクターおよびピューロマイシン耐性遺伝子（pac）を有するレスキューベクターは、次のようにして作製される。pac遺伝子は、BamHIおよびBsmIの制限酵素部位を各々含む以下のプライマーによりpPUR（Clontech Laboratories, Inc.）からPCR増幅された：
FW Pac ampli
2004533827.tif 000001
（配列番号：1）Rev Pac ampli
2004533827.tif 000002
（配列番号：2）。増幅された634bpの断片は、標準的なクローニングの手法により、BamHI-BsmIで切断された（neoに隣接する制限酵素部位）pPBSPro476Psi Akv-neoおよびpPBSMut476Psi Akv-neoに挿入されたが、後者は、以前に記述されたとおり（PBS-Umu、Mikkelsenら、J.Virol.72:6967-78、1998 generating pPBSPro476PsiAkv-pac and pPBSMut47PsiAkv-pac）、欠失したプライマー結合部位を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
MLEV、即ち、以前に記述されたMLV様内在性ウイルス（GenBankアクセッション番号AF041383；Mieleら、J.Virol.、70:944-51、1996）の465bpのパッケージング領域は、元のMLEVリーダー配列（Mikkelsenら、J.Virol.、74:600-10、2000）の一部分である、機能性グルタミンPBSを有するpPBSGln465MLEVPsiAkv-neoから、以下のプライマーを用いてPCR増幅された：
Fw MLEV ampli
2004533827.tif 000003
（配列番号：3）及びRev MLEV ampli
2004533827.tif 000004
（配列番号：4）。MLEV-Psi断片は、重複伸長（overlap extension）および、Akv LTRを含む断片を用いたPCRにより結合された。Akv LTR PCR断片は、プライマー：
Akv U5 fw
2004533827.tif 000005
（配列番号：5）及びAkv rev
2004533827.tif 000006
（配列番号：6）を用いたPCR、及び、プライマー：
Overlap fw
2004533827.tif 000007
（配列番号：7）及びOverlap rev
2004533827.tif 000008
（配列番号：11）を用いた重複反応から誘導された。重複伸長反応により、pMLEVleaderAkv-pacを作製するpPBSPro476 Psi Akv-pacの適切な位置にクローニングされた、Akv-MLEVのキメラ断片（U5領域にあるAkv-MLEV連結部）が生じた（図2c参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
代替的パリンドロームであるループモチーフ（代替的パリンドロームであるキッシングループに対応するKL-altpal）は、Akvに対応する以下のセンスオリゴヌクレオチド、または、対応する、MLEVの291-330位（Van Beverenら、In "RNA tumor viruses" [N. Weiss、H. Teich、H. Varmus、およびJ.M. Coffin編]、第2巻、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y、1985）を用いたPCR媒介性変異導入によって、pPBSPro476PsiAkv-neo、pPBSMut476PsiAkv-neo、及びpMLEVleaderAkv-pacのキッシングループ配列に導入された（pPBSPro476PsiAkv-neo KL-altpal、pPBSMut476PsiAkv-neo KL-altpal、pMLEVleaderAkv-pac KL-altpalが産生される）：
代替的パリンドローム5'-ATCGAT-3'（配列番号：9）を導入するON1
2004533827.tif 000009
（配列番号：8）（改変されたループ配列は下線）
。Akv-Psi
2004533827.tif 000010
（配列番号：10）又はMLEV-Psi
2004533827.tif 000011
（配列番号：11）のいずれかの最も3'側の部分（617位〜638位）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に、363bpのPCR断片が作製され、隣接するSpeIとBamHIの制限酵素部位の中で切断され、各々のベクターの適切な部位にクローニングされた。pPBSMutMLEVleaderAkv-pacを作製するために、PBSMutおよび465bpのMLEV-Psiを含むBstBI-BamHI切断PCR断片は、PBSMut配列中のBstBI及び、Psiからすぐ下流のBamHIを含む、pPBSMut476PsiAkv-pacにクローニングされた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
ベクター構築物の説明：
pPBSMutKL-nonpalAkv-neo及びpMLEVleaderKL-nonpalAkv-pac：
非パリンドロームであるループモチーフ（KL-nonpal）は、Akvに対応する以下のセンスオリゴヌクレオチドを用いたPCR媒介性変異導入により、pPBSMut476Psi Akv-neo及びpMLEVleaderAkv-pac（実施例2参照）のキッシングループ配列に挿入された：
非パリンドローム配列5'-TAGGAT-3'（配列番号：13）を、Akv-Psi
2004533827.tif 000012
（配列番号：10）、又は、MLEV-Psi
2004533827.tif 000013
（配列番号：11）のいずれかの最も3'側の部分（617位〜638位）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒に導入する、ON4
2004533827.tif 000014
（配列番号：12）（代替的ループ配列に下線を付した）。363bpのPCR断片が作製され、隣接するSpeI及びBamHIの制限酵素部位内で切断されて、各々の適当な部位にクローニングされ、pPBSMutKL-nonpalAkv-neo及びpMLEVleaderKL-nonpalAkv-pacが得られた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
pMLEVleader KL-matchnonpalAkv-pac：
pMLEVleader KL-matchnonpalAkv-pacは、pPBSMutKL-nonpalAkv-neoのKL-nonpal配列に相補的な非パリンドロームループ配列である5'-ATCCTA-3' KL-(matchnonpal）（配列番号：15）の導入のために、ON7
2004533827.tif 000015
（配列番号：14）及びON9を用いて構築された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
pPBSPRO 1230 linker Akv neo：
ColE1要素であるRNAI又はRNAIIをベクターに挿入する前に、pPBSpro linker 1230 Akv Neoベクターが構築された（図3A）。マルチクローニング部位（MCS）が設計され、pPBSPRO linker 1230 Akv Neo構築物のAkv誘導リーダー領域の下流に隣接して挿入される。さらに7ヌクレオチドがリーダー領域の5'末端から欠失され、これにより、リーダー領域が233ヌクレオチドに減少された。これは、以下の2つのPCR断片を作製することによって達成された。
A：pPBSPRO240 Akv neo鋳型上の、上流プライマー
2004533827.tif 000016
（配列番号：16）及び下流プライマー
2004533827.tif 000017
（配列番号：17）
B：pPBSPRO244ψAkv-Neo鋳型上の上流プライマー
2004533827.tif 000018
（配列番号：18）及び下流プライマー
2004533827.tif 000019
（配列番号：29）
2つの断片は混合され、断片A由来の上流プライマーおよび断片B由来の下流プライマーを用いて、重複伸長産物が作製された。リーダー領域のSpeI部位とneo遺伝子のBclI部位を用いる標準的な技術を用いて、断片がpPBSPRO240 Akv-Neoにクローニングされ、その結果、pPBSPRO 1230-linker Akv neoが作製された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
pPBSPRO RNAII 112 Akv neo及びpPBSPRO RNAII 201 Akv neoを作製するために、以下の3つのPCR断片を作製した。
断片C：pBR322鋳型（アクセション番号J01749）上の、pBR322鋳型（アクセッション番号J01749）上の上流プライマー
2004533827.tif 000020
（配列番号：19）及び下流プライマー
2004533827.tif 000021
（配列番号：20）
断片D：pBR322鋳型（アクセッション番号J01749）上の、上流プライマー
2004533827.tif 000022
（配列番号：19）及び下流プライマー
2004533827.tif 000023
（配列番号：21）
断片E：pBR322鋳型上の、上流プライマー
2004533827.tif 000024
（配列番号：22）及び下流プライマー
2004533827.tif 000025
（配列番号：23）
3つのPCR断片はゲル精製され、XhoI（プライマーの上流に局在）及びNotI（プライマーの下流に局在）により切断される。これらの部位はまた、pPBSPRO-1230-1inker Akv neoにおける新たに作製されたリンカーのMCS内に存在し、断片は、標準的なクローニング手法によって、このベクターにクローニングされた。したがって、断片Cのクローニングにより、pPBSPRO RNAII 201 Akv neoが作製され、断片Dのクローニングにより、pPBSPRO RNAII 112 Akv neoが作製され、断片Eのクローニングにより、pPBSPRO RNAI 108 Akv neoが作製された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
pPBSPRO RNAI 108 Akv pac、pPBSPRO RNAII 112 Akv pac、pPBSPRO RNAII 201 Akv pac及びpPBSPRO 1230 linker Akv pac：
これらは、ネオマイシン耐性遺伝子（neo）がピューロマイシン耐性遺伝子（pac）に置換されていることを除けば、上述のpPBSPRO Akv neoベクターと類似している。pac遺伝子は、G418耐性を与えるneo遺伝子と同様な様式で、安定に形質転換された哺乳動物細胞を選択するための主要な選択マーカーとして用いられ得る。pac遺伝子は、NotI制限酵素部位を含むプライマー
2004533827.tif 000026
（配列番号：24）及びBsmI制限酵素部位を含むプライマー
2004533827.tif 000027
（配列番号：25）を用いて、pPUR（Clontech Laboratories, Inc.)(アクセッション番号U07648）からPCR増幅された。増幅された644bpのPCR産物は、NotI及びBsmIで切断され、NotI-BsmIで切断された（neoに隣接した制限酵素部位）pPBS PRO linker 1230 Akv neo、pPBSPRO RNAI 108 Akv neo、pPBSPRO RNAII 112 Akv neo、及びpPBSPRO RNAII 201 Akv neoに挿入された。これにより、pPBSPRO 1230 linker Akv pac構築物、pPBSPRO RNAI 108 Akv pac構築物、pPBSPRO RNAII 112 Akv pac構築物及びpPBSPRO RNAII 201 Akv pac構築物が作製された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
ベクター構築物の説明：
pPBSproΔTGG Akv neo：
変異型PBS配列の次のクローニングを容易にするために、Srf1及びNru1の制限酵素部位が、pPBSpro内の952位及び1018位にそれぞれ形成され、この部位にはSrf1部位及びNru1部位の半分が存在する。Srf1及びNru1の制限酵素部位を含むDNA断片は、二段階PCR及び重複伸長によって得られた。150ngのpPBS proがPCR反応（PCR1）のための鋳型として用いられたが、ここでは25pmolのプライマー148760
2004533827.tif 000028
（配列番号：26）及び25pmolのプライマーA6600
2004533827.tif 000029
（配列番号：27）が、標準的なPCR反応条件（15サイクル：94℃で1分間；60℃で1分間；73℃で2分間、次に73℃で5分間）下で用いられた。PCR2については、プライマーが25pmolのプライマー147654
2004533827.tif 000030
（配列番号：28）及び25pmolのプライマー137599
2004533827.tif 000031
（配列番号：29）に置換されたことを除いて、同一のPCR条件であった。PCR1及びPCR2により、各々、930bp及び720bpの産物が得られた。1.25UのPfu1を含む標準的PCR条件下において、各々200ngのPCR産物1及び2を用いた重複伸長反応によって、2つのPCR断片が結合された。次のサイクルパラメーターが用いられた：73℃で5分間、ならびに、94℃で1分間；60℃で2分間；73℃で2分間を5サイクル、その後、73℃で5分間。エンドプライマーA6600及び135799の各10pmolが、反応及び反復サイクルに加えられた。得られた1650bpの産物はゲル電気泳動により精製され、抽出された。産物は、EcoRI及びBamHIにより切断されて、EcoRI及びBamHIにより切断されたpPBSproに標準的ライゲーションにより挿入され、これによりpPBSpro Srf1/Nru1構築物が得られた。TGG配列が欠失したPBSを含むDNA断片は、オリゴヌクレオチド150500
2004533827.tif 000032
（配列番号：30）及び150501
2004533827.tif 000033
（配列番号：31）の各100pmolを混合することにより得られた。オリゴヌクレオチドは95℃で5分間加熱され、ゆっくりと室温まで冷やすことで再アニーリングされた。PBSpro Srf1/Nru1は、Srf1及びNru1で切断された。最終濃度0.5mM dATPの存在下、T4DNAポリメラーゼの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性によって、切断されたベクターの3'末端配列が除去された（Sampathら、Gene 190：5-10、1997；Aslanidis and Jong、Nucl.Acids.Res. 18：6089-74、1990に記載）。DNA断片は標準的ライゲーションによりベクターに挿入され、これによりpPBSproΔTGG Akv neoが得られた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
ウイルス構築物の説明： 
PCR変異導入は、AkvBにおけるDIS1様パリンドローム領域（pal-1）を修飾するために行われた。AkvBは、CAの110位で修飾されたAkv-MLVのB-トロピック誘導体であり、かつこれは、AkvBU3-EGFPのU3領域のCellII部位に位置するIRES-EGFPカセットを欠失していることを除いては、AkvBU3-EGFP（Aagaardら、J.Gen.Virol.、83:439-442、2002）と同質遺伝子型である。Akv/AkvBにおける209位〜218位のパリンドローム
2004533827.tif 000034
（配列番号：32）は、中心部位の6個において、代替的パリンドローム
2004533827.tif 000035
（配列番号：33）（変異に下線を付した）に、以下のように修飾された。
上流プライマーA
2004533827.tif 000036
（配列番号：34）（Akvゲノムに対して-1140位における骨格に位置し、-747位のAsnIの上流に位置する）及び、下流プライマーB
2004533827.tif 000037
（配列番号：35）（Akvの242位〜193位に及び、下線の付されたpal-1領域における6ヌクレオチドのミスマッチを有する）を用いて、AkvBプラスミドから増幅された1382bpのPCR断片は、プライマーA及びDを用いるPCR反応において、上流プライマーC
2004533827.tif 000038
（配列番号：36）（Akvの219位〜242位に及び、プライマーBと24 ntの重複を有する）及び、下流プライマーD
2004533827.tif 000039
（配列番号：37）（Akvの403-379の範囲に位置し、302位のSpeI部位から下流に位置する）を用いてAkvBから増幅された184bpのPCR断片によるPCR重複伸長反応に用いられた。得られた1542 bp PCR破片およびAkvBプラスミドは、AsnI及びSpeIで切断され、その後、得られた断片は、標準的なクローニングの手法を用いて、AkvB-altpalを作製するために、線状化されたAkvBプラスミドにクローニングされた。 
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
ベクターの説明：
pPBSx2MLEVPsi Akv-neo：
pPBSx2MLEVPsi Akv-neoは、実施例2で記載されたpPBSGlnMLEVPsi Akv-neoから構築される。2つのPCR産物が作製された。PCR産物A：pPBSGlnMLEVPsi Akv-neo鋳型上で、プライマーON1
2004533827.tif 000040
（配列番号：38）及びON2
2004533827.tif 000041
（配列番号：29）を用いた。PCR産物B：Lundら、J. Virol.71:1191-1195、1997に記載された、pPBSx2 Akv-neo鋳型上で、プライマーON3
2004533827.tif 000042
（配列番号：39）及びON4
2004533827.tif 000043
（配列番号：40）を用いた。PCR産物A及びBは、ゲルで精製された。第三のPCR産物Cは、PCR産物A及びBの混合物からなる鋳型において、ON5
2004533827.tif 000044
（配列番号：7）及びON6
2004533827.tif 000045
（配列番号：41）を用いて、重複PCRにより作製された。PCR産物Cは、精製され、制限酵素EcoRI及びBarnHIで切断され、標準的なクローニングの手法により、EcoRI及びBarnHIで切断されたpPBSProAkvΔPsiプラスミド（Mikkelsen、J.Gen.Virol. 80:2957-67.1999に開示）にクローニングされた。これにより、修飾PBS及びMLEVパッケージングシグナルを有するpPBSx2MLEVPsi Akv-neoプラスミドが作製された。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
インビボ解析：
ベクター構築物各10μgは、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、BOSC23パッケージング細胞（Pearら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90：8392-6、1993）にトランスフェクションさせた。pPBSx2MLEV Akv-neoベクターについては、5μgのpUC19（相補性なし）又は、人工tRNAをコードする5μgのptRNAx2（Lundら、J.Virol.71:1191-1195、1997に記載の相補性）のいずれかを追加してトランスフェクションを行ったが、pPBSGlnMLEVPsi Akv-neoの場合には、5 μgのpUC19は、トランスフェクション混合物に含有されていた。上清はNIH3T3繊維芽細胞を形質導入するために用いられ、G418耐性コロニーはつづいて、Lovmandら（1994）に開示されるように、計数されて、選択された。pPBSx2MLEV Akv-neoで形質導入されたNIH細胞については、6つの別々のコロニーを選択して播種したが、一方でpPBSGlnMLEVPsi Akv-neoベクターを含む耐性コロニーをプールした。プール由来のNIH細胞及び6個のクローンは、細胞5000個/cm2で再播種され、1mlあたり6μgのポリブレン（Sigma Chemical Co.、St.Louise、U.S.A.）の存在下、複製可能な完全長のAkvウイルス（Etzerodtら、J.Virol.134:196-207、1984）で重感染された。感染後日数（dpi）7日目に、コンフルエントな細胞由来の上清が回収され、neo力価は、新しいNIH細胞の形質導入により測定された。pPBSx2MLEV Akv-neoの可動化後に生じるneo遺伝子を含むNIHコロニーを別々に選択して播種した。PBSリーダー領域に隣接するプライマー（上流プライマーU3
2004533827.tif 000046
（配列番号：42）、及び、下流プライマーneo
2004533827.tif 000047
（配列番号：29））を用いるPCR及び配列決定のために、ゲノムDNAを調製した（DNAzol、Molecular Reserch Center Inc、Cincinnati、U.S.A.）。