(57)【要約】  本発明は、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体に関する。本発明はまた、本発明の耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体の使用にも関する。本発明はさらに、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を用いる、ビオチンと連結した物質の精製、濃縮、検出、捕捉などの技術分野に関する。本発明の固体担体に用いるビオチン結合性タンパク質は耐熱性を有しているので、７０℃以上の温度に暴露することを伴うアッセイ系での使用において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体担体であって、以下：
ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
ｃ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；および
ｄ）配列番号１または３の塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
からなる群より選択される耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた、前記固体担体。
【請求項２】
７０℃ないし９０℃の加熱処理後もビオチン結合能を保持する、請求項１に記載の固体担体。
【請求項３】
７０℃ないし９０℃の加熱条件下においてもビオチン結合能を有する、請求項１に記載の固体担体。
【請求項４】
固体担体が、セルロース、テフロンTM、ニトロセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素およびそれらの組合せ、からなる群より選択される材料で主に構成される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の固体担体。
【請求項５】
固体担体が、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブおよびセンサーチップからなる群より選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の固体担体。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の固体担体の使用であって、７０℃ないし９０℃の加熱条件下に暴露することを特徴とする、前記使用。
【請求項７】
ビオチンと連結した物質の分離、濃縮、捕捉、精製、および／または検出方法であって、以下の工程：
１）請求項１ないし６のいずれか１項に記載の固体担体とビオチンと連結した物質を接触させて、当該固体担体にビオチンと連結した物質を結合させ；
２）当該固体担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し；そして
３）当該固体担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することにより当該物質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および／または、当該物質を検出する；
を含んでなり、ここで、前記工程の少なくとも１つは７０℃〜９０℃の加熱条件下で行う、前記方法。
【請求項８】
加熱条件が、７５℃〜８５℃である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ビオチンと連結した物質が、ビオチンと連結した核酸である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体に関する。本発明はまた、本発明の固体担体の使用に関する。本発明はさらに、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を用いる、ビオチンと連結した物質の精製、濃縮、検出、捕捉などの技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Ｋｄ＝１０-15〜-14 M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている（Green, (1975), Adv. Protein Chem.,  29: 85-133；Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67）。アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパクで、等電点は１０を越える。アビジンは、その高い塩基性、あるいは糖鎖の影響で、ＤＮＡ等に対する非特異的結合が問題となり、これがアビジン使用の限定要因となっている。一方、ストレプトアビジンは放線菌（Streptomyces avidinii）由来で、等電点は中性付近で糖鎖を含まない。両タンパク質とも、４量体を形成し、１つのサブユニット当たり１分子のビオチンと結合する。分子量は６０ｋＤａ程度である。【０００３】
タマビジン（タマビジン１：配列番号２）は、イネいもち病菌Ｍ．ｇｒｉｓｅａに対して抗菌性を示すタンパク質として、食用キノコタモギタケから精製された第３のビオチン結合タンパク質であり、その遺伝子構造も明らかにされた（ＷＯ  ０２／０７２８１７）。またそのホモローグ（タマビジン２：配列番号４）も同キノコから同定され、組換えタンパク質の生産にも成功した（ＷＯ  ０２／０７２８１７）。タマビジンホモローグは、大腸菌発現とイミノビオチンカラムを用いた精製により容易に生産でき、これはアビジンやストレプトアビジンの生産系と比較して大きな利点である。【０００４】
アビジンを大腸菌で発現させた場合、可溶性タンパク質の収量は５０ｍｌ当たり５０  μｇ程度と少ない（Airenne et al., 1994, Gene, 144: 75-80）。そのため現在ではバキュロウィルスを使った昆虫細胞の系が使われている（Airenne et al., 1997, Protein exp. Purif., 9: 100-108）。また、ストレプトアビジンを大腸菌で発現させた場合、組換えタンパク質は不溶性の封入体を形成する。この封入体を高濃度のグアニジン塩酸で可溶化した後、透析による段階的なグアニジン塩酸の除去によってタンパク質のリフォールディングがおき、可溶性で活性のある組換えストレプトアビジンが得られる（Sano and Cantor, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 142-146）。このように、アビジンやストレプトアビジンの生産には多くの労力と時間を要する。一方、タマビジンホモローグを大腸菌で発現させた場合、５０ｍｌの培養当たり１ｍｇの組換えタンパク質が得られた。これはビオチン結合タンパク質の生産効率としては高い値であり、タマビジンホモローグタンパクの潜在的有用性を示している。【０００５】
これまでに試薬や診断薬の分野においては、アビジン、もしくはストレプトアビジンが結合した固体担体、例えば磁性ビーズや、マイクロプレート、あるいはセンサーチップ等が開発されているが、非特異的結合が低く、かつ高温域における安定性を有するものは未だ報告されていない。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ  ０２／０７２８１７号パンフレット
【非特許文献１】Green, 1975, Adv. Protein Chem.,  29: 85-133
【非特許文献２】Green, 1990, Methods Enzymol., 184: 51-67
【非特許文献３】Airenne et al., 1994, Gene, 144: 75-80
【非特許文献４】Airenne et al., 1997, Protein exp. Purif., 9: 100-108
【非特許文献５】Sano and Cantor, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 142-146
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体を提供することを目的とする。本発明はさらに、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を用いる、ビオチンと連結した物質の精製、濃縮、検出、捕捉などの方法を提供することを目的とする。その際、本発明の固体担体の使用を提供する。また、本発明は、７０℃以上の高温に暴露することを伴うアッセイ系に用いることが可能なビオチン結合性タンパク質を連結した固体担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
「タマビジン」は、担子菌タモギタケ由来のビオチン結合性タンパク質であり、タマビジン１およびタマビジン２の２種類がある（ＷＯ  ０２／０７２８１７を参照）。本発明者らは、鋭意研究の結果、タマビジン２は、ビオチンに対して、従来のアビジン、ストレプトアビジンと同様に、非常に高い親和性を有していることを明らかにした。即ち、タマビジン２とビオチンは、多くの抗原抗体反応のおよそ１０００倍の強さの親和性を有していることを明らかにした。また、従来のアビジンにおいて問題となっている、非特異結合性（ＤＮＡに対する）が、殆どないことを実証した。さらに、タマビジン２は、ストレプトアビジンよりも１０℃以上耐熱性が強いことを見出し、この性質はタマビジン２を固体担体に結合させた後も、維持されることを発見した。さらに本発明者らは、鋭意研究の結果、タマビジン１はビオチンに強く結合し、さらにストレプトアビジンよりも５℃耐熱性が強いことを見出した。これらの研究の結果、本発明者らは高温条件においてもビオチン結合活性を保持する、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体を提供することが可能であることを見いだし、本発明に想到した。よって、本発明は、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体、およびその使用、ならびに、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を用いる、ビオチンと連結した物質の精製、濃縮、検出、および捕捉方法を提供する。【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。【０００９】
耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体
本発明は、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させた固体担体を提供する。【００１０】
本明細書において、耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、タマビジン１、タマビジン２、またはそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号１もしくは配列番号３の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号１もしくは配列番号３の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性および耐熱性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、タマビジン１、タマビジン２、およびそれらの変異体を総称して、単にタマビジンと呼ぶことがある。【００１１】
タマビジン１または２の変異体は、配列番号２または４のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性および耐熱性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。【００１２】
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、場合により、１または数個のアミノ酸を意味してもよい。【００１３】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。【００１４】
なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、次いで連結する方法もある。【００１５】
タマビジン１または２の変異体はさらに、配列番号２または４のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性および耐熱性を有するタンパク質であってもよい。【００１６】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。【００１７】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。【００１８】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１��−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。【００１９】
タマビジン１または２の変異体はまた、配列番号１または３の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性および耐熱性を有するタンパク質であってもよい。【００２０】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６−７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Stark's solution）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。【００２１】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。【００２２】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のhybridization bufferにBlocking試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を二回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。【００２３】
タマビジン１または２の変異体のビオチン結合活性および耐熱性は、公知の手法のいずれかにより測定することが可能である。例えば、Ｋａｄａら（Biochim. Biophys. Acta., 1427: 44-48 (1999)）に記載されるように蛍光ビオチンを用いる方法により測定してもよい。この方法は、ビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用したアッセイ系である。あるいは、表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサーなど、タンパク質とビオチンの結合を測定することが可能なセンサーを用いて、変異体タンパク質のビオチン結合活性を評価することもできる。耐熱性は、上記のビオチン結合活性を評価する際に、測定温度を変化させて測定することで評価することができる。【００２４】
本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、ビオチンに対して高い親和性を有しており、その解離定数Ｋdは１０-8 Mのオーダー以下、好ましくは１０-9 Mのオーダー以下、１０-10 Mのオーダー以下、１０-11 Mのオーダー以下、１０-12 Mのオーダー以下、１０-13 Mのオーダー以下である。典型的には、その解離定数Ｋdは１０-13〜１０-9 Mのオーダーであってよい。【００２５】
本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、公知の卵白由来のアビジンやストレプトアビジンと比較して高い耐熱性を有する。ここで、耐熱性とは、高温域でのタンパク質安定性および高温域におけるビオチン結合活性の双方をいう。【００２６】
高温域でのタンパク質安定性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析においてタンパク質バンドの発色が室温の場合と比較して５０％消失する温度として評価することができる。本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビオチン結合性タンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析においてタンパク質バンドの発色が室温の場合と比較して５０％消失する温度は、７１℃より高く、好ましくは７５℃以上、７７．５℃以上、８０℃以上、８２．５℃以上、８５℃以上、８７℃以上、であってよい。【００２７】
高温域におけるビオチン結合活性は、ビオチンの結合が室温の場合と比較して５０％減少する温度として評価することができる。本発明の固体担体に連結させる耐熱性タンパク質について、ビオチンの結合が室温の場合と比較して５０％減少する温度は、７３℃より高く、好ましくは７５℃以上、７８℃以上、８０℃以上、８２．５℃以上、８５℃以上、であってよい。【００２８】
本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、担子菌由来のタンパク質を精製することにより、または組換えタンパク質として得ることができる。【００２９】
本発明において、耐熱性ビオチン結合性タンパク質を連結させる固体担体は、固体または不溶性材料（例えば、濾過、沈殿、磁性分離などにより反応混合物から分離することができる材料）である担体であれば特に限定されない。【００３０】
固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロンTM、ニトロセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素またはそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。【００３１】
固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。【００３２】
本発明の一態様において、磁性ビーズは、約２５ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、磁性ビーズは約５０ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有する。磁性ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。いくらかの細菌スポアは約１μｍのオーダーのサイズを有するので、かかるスポアを捕捉するための好ましいビーズは１μｍよりも大きい直径を有する。【００３３】
本発明の一態様において、セファロースなどの高架橋球形アガロースからなるビーズは、約２４μｍ〜約１６５μｍの範囲の直径を有しうる。好ましい態様では、高架橋球形アガロースビーズは約２４μｍ〜約４４μｍの範囲の直径を有する。高架橋球形アガロースビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。【００３４】
疎水性表面を有する固体担体の例には、Polysciences, Warrington, PA または Spherotech, Liberville, IL から市販されているものなどのポリスチレンラテックスビーズが挙げられる。【００３５】
シリカ（ＳｉＯ2）−処理またはシリカ（ＳｉＯ2）ベースの固体担体の例には、Polysciences, Warrington, PAから入手可能な、超常磁性シリカビーズ等が挙げられ、これは、核酸（例えばＤＮＡ）を捕捉するために使用されうる。あるいは、Dynal Biotechから市販されているＭ−２８０等も使用されうる。【００３６】
親水性表面を有する磁性ビーズは、増殖期の細菌細胞、核酸および他の成分を捕捉するために使用されうる。かかる磁性ビーズの例としては、Ｂｉｏｍａｇ（登録商標）カルボキシルの名称でPolysciences, Warrington, PAから市販されているビーズまたはBangs Laboratory, Inc., Fishers, IN の名称ＭＣ０２Ｎ／２９２８を有するビーズが挙げられる。あるいは、Dynal Biotechから市販されているＭ−２７０等が使用されうる。【００３７】
耐熱性ビオチン結合性タンパク質と固体担体の連結は、当業者に公知のタンパク質と固体担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、固体担体表面をカルボキシル基が露出するよう修飾し、当該カルボキシル基とタンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、タンパク質と固体担体を連結することができる。または、例えば、固体担体表面のカルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性エステル化された固体担体とタンパク質とを一級アミノ基を含まないｐＨ６．５〜９の緩衝液中で混和することにより、固体担体表面のカルボキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることができる。【００３８】
あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート) やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、固体担体表面のアミノ基とタンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、固体担体表面のアミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。【００３９】
本発明の固体担体に連結される耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、高温域でのタンパク質安定性およびビオチン結合性を保持する。このため、本発明の固体担体は、従来最も使用されていたストレプトアビジンよりも高い温度で、ビオチン結合能を保持したまま処理することができる。本発明の固体担体は、７０℃ないし９０℃、好ましくは７５℃ないし９０℃、８０℃ないし９０℃、８５℃ないし９０℃、７０℃ないし８５℃、７０℃ないし８０℃、７５℃ないし８０℃、７５℃ないし８５℃、７５℃ないし８７．５℃、の加熱条件下に暴露する処理を受けた場合にも、ビオチン結合能を保持したまま使用することができる。このことは、例えば、より高い温度での核酸ハイブリッド形成やその後の洗浄を行うことができる、即ち、より高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションが可能となることを意味する。本発明の固体担体の使用により、非特異的なハイブリッド形成を極力抑制することが可能なアッセイ系を構築することが可能である。あるいは、例えば、固体担体にタマビジンを連結させる際に、高温の処理が必須の方法を選択することも可能となる。さらには、タマビジンに耐熱性タンパク、酵素、または蛍光色素などを結合させる際、あるいは結合後ビオチン修飾物と反応させる際に、高温を用いて、より特異的な反応をさせることも可能である。【００４０】
また、本発明の固体担体に連結する耐熱性ビオチン結合性タンパク質は、ＤＮＡに対する非特異結合がほとんどないため、当該技術分野に公知の卵白由来のアビジンにおいて問題となっているＤＮＡに対する非特異結合性の問題を回避することもできる。【００４１】
耐熱性ビオチン結合性タンパク質を用いた、ビオチンと連結した物質の分離、濃縮、精製、検出および／または捕捉方法
本発明は、ビオチンと連結した物質の分離、濃縮、捕捉、精製、および／または検出方法であって、以下の工程：
１）本発明のタマビジンを連結した固体担体と、ビオチンと連結した物質を接触させて、当該固体担体にビオチンと連結した物質を結合させ；
２）当該固体担体に結合しなかった夾雑物を洗浄し；そして
３）当該固体担体に結合したビオチンと連結した物質を回収することにより当該物質を分離、濃縮、捕捉もしくは精製し、および／または、当該物質を検出する；
を含んでなる、前記方法を提供する。好ましい態様において、本発明の方法における上述した工程の少なくとも１つは７０℃ないし９０℃の加熱条件下で行う、より好ましくは、７５℃ないし９０℃、８０℃ないし９０℃、８５℃ないし９０℃、７０℃ないし８５℃、７０℃ないし８０℃、７５℃ないし８０℃、７５℃ないし８５℃、７５℃ないし８７．５℃、の加熱条件下で行うことを含む。【００４２】
本発明の方法において、ビオチンと連結した物質とは、ビオチンと直接的または間接的に連結した物質の双方をいう。ビオチンと物質の直接的な連結は、共有結合による連結によって達成される。ビオチンと物質の間接的な連結は、ビオチンと共有結合により連結したリガンドに対して、さらに物質が、共有結合、イオン結合、水素結合、または疎水性相互作用により連結することによって達成される。間接的な連結の具体的な例には、ビオチン化抗体を用いる場合の抗原抗体反応による抗原分子の連結や、ビオチン化核酸プローブを用いる場合の核酸のハイブリダイゼーションによる相補的な核酸の連結などが挙げられる。【００４３】
好ましい態様において、本発明の方法における少なくとも１つの工程は７０℃ないし９０℃の加熱条件下で行われるので、ビオチンと物質の間接的な連結は、本発明の方法において使用する温度条件下において連結が保持されることが好ましい。例えば、ビオチンと物質の間接的な連結として核酸のハイブリダイゼーションを用いる場合は、ハイブリダイズするヌクレオチドの長さは、少なくとも２０ヌクレオチド以上、好ましくは、少なくとも２５ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、３５ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、であってよい。【００４４】
本発明の方法において使用するタマビジンを連結された固体担体を構成する材質およびその形状は、分離、濃縮、精製、検出および／または捕捉したい物質の特性に応じて選択されうる。【００４５】
また、本発明の方法の各工程に用いる、緩衝液の組成、適用する温度などは、分離したい物質の性質等を考慮して、当業者が適宜設定することができる。本発明の方法により分離、濃縮、捕捉、および／または精製した物質の検出方法は、当該物質の性質に応じて、当業者が適宜選択することができる。【００４６】
本発明の方法は、これらに限定されるわけではないが、例えば、核酸の検出（特開２００３−１２５８００）、サンプルから核酸を単離するための装置および方法（ボートリンら、ＷＯ２００４／００５５５３）、核酸増幅法：ハイブリダイゼーションシグナル増幅法（ＨＳＡＭ）（ザンら、ＷＯ１９９８／００４７４５）、あるいはウイルスやウイルスゲノムの濃縮等（玉造, 2004, BIO INDUSTRY, 21(8): 39-47）に倣った方法であってよい。あるいは、細胞や微生物の検出・捕捉・濃縮に用いることもできる。【００４７】
例えば、体液中のウイルスを濃縮する場合、まず、検体を適当な緩衝液中で、ウイルス表層抗原に特異的に結合する抗体をビオチン化したものとインキュベートする。抗体のビオチン化は例えばＰｉｅｒｃｅ等から市販されているキットを用いて行うことができる。次に、本発明のタマビジンを連結した固体担体、例えば磁性ビーズ、を加え、混合する。最後に磁石を用いて、ウイルス−抗体−ビオチン−タマビジン−磁性ビーズの複合体を凝集させ、上清を除去し、適当な緩衝液で数回の洗浄を行った後、磁石をはずし、所望の緩衝液に懸濁し、ウイルスの濃縮を完了する。【００４８】
あるいは、体液中のウイルスゲノムＤＮＡを濃縮する場合、まず検体を、ウイルス粒子を破壊する適当な溶液中に入れ、ウイルスからゲノムＤＮＡを抽出せしめる。さらに必要であれば、このゲノムを一本鎖化するステップを入れる。続いて、ウイルスゲノムの一部分に相補的な数十ないし数百塩基の一本鎖オリゴＤＮＡをビオチン化したもの、あるいはウイルスゲノムの一部分に相補的な鎖を有する数十ないし数百塩基の二本鎖ＤＮＡをビオチン化し熱変性させたもの、とインキュベートし、ビオチン化オリゴＤＮＡとウイルスゲノムをハイブリダイゼーションさせる。本発明のタマビジンを連結した固体担体を用いる場合、従来のアビジンまたはストレプトアビジンを連結した固体担体を用いる場合よりも高い温度、例えば、７０℃ないし９０℃、好ましくは７５℃ないし９０℃、８０℃ないし９０℃、８５℃ないし９０℃、７０℃ないし８５℃、７０℃ないし８０℃、または７５℃ないし８０℃、７５℃ないし８５℃、７５℃ないし８７．５℃、の温度範囲が適用可能である。ハイブリダイゼーション温度に上記のような高い温度を適用することにより、非特異的なＤＮＡの結合が抑制され、所望のウイルスゲノム以外のＤＮＡが極力混入しない、より特異性の高いウイルスゲノムの濃縮が可能となる。次に、本発明のタマビジンを連結した固体担体、例えば磁性ビーズ、を高温状態のサンプル（ビオチン化オリゴＤＮＡが特異的にウイルスゲノムを捕捉している状態）に加え、混合する。最後に磁石を用いて、ウイルスゲノム−オリゴＤＮＡ−ビオチン−タマビジン−磁性ビーズの複合体を凝集させ、上清を除去し、適当な緩衝液で数回の洗浄を行った後、磁石をはずし、所望の緩衝液に懸濁し、ウイルスゲノムの濃縮を完了する。この後、ウイルスゲノムの検出は、例えばＰＣＲ（Ｓａｉｋｉ et al. (1985) Science 230: 1350-1354）等を用いて行うことができる。タマビジンは、従来のアビジン、ストレプトアビジンよりも、ビオチン非存在下における耐熱性が高く、しかもＤＮＡに対する非特異的な結合がほとんどない。従って、例えば上記のような方法によるＤＮＡの特異的な濃縮に好適である。
【発明の効果】
【００４９】
本発明の固体担体に連結されるタマビジンは、高温域でのタンパク質安定性およびビオチン結合性を保持する。このため、本発明の固体担体は、従来最も使用されていたストレプトアビジンよりも高い温度で、ビオチン結合能を保持したまま処理することができる。本発明の固体担体を使用することにより、高温域での処理を含むアッセイ系を構築することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、タマビジン２、ストレプトアビジンおよびアビジンのＤＮＡに対する非特異結合試験の結果を示す写真（Ａ）およびグラフ（Ｂ）である。
【図２】図２は、タマビジン２の耐熱性（タンパク質安定性）をストレプトアビジンと比較して評価した結果を示す。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図２Ｂはそのタンパク質バンドの定量結果を示すグラフである。
【図３】図３は、タマビジン２（Ａ）、ストレプトアビジン（Ｂ）およびアビジン（Ｃ）の耐熱性（蛍光ビオチン結合活性）を示すグラフである。
【図４】図４は、タマビジン２磁性ビーズ（Ａ）、市販のストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｂ）、ストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｃ）、およびアビジン磁性ビーズ（Ｄ）の耐熱性（蛍光ビオチン結合活性）を示すグラフである。
【図５】図５は、タマビジン２磁性ビーズ（ＡおよびＣ）、市販のストレプトアビジン磁性ビーズ（ＢおよびＤ）、の耐熱性（蛍光ビオチン結合活性）を示すグラフである。
【図６】図６は、タマビジン２セファロースビーズの耐熱性（蛍光ビオチン結合活性）を示すグラフである。
【図７】図７は、タマビジン１の蛍光ビオチン結合活性を示すグラフである。
【実施例】
【００５１】
実施例１：タマビジン２（ＴＭ２）
１−１．タマビジン２の特徴づけ
タマビジン２の大腸菌発現と精製
タマビジン２（ＴＭ２）をコードするＤＮＡ（配列番号３）を発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａに組込んで大腸菌で発現させると、発現したＴＭ２の殆どが可溶性画分に蓄積し、発現量も多い（ＷＯ  ０２／０７２８１７）。ＴＭ２タンパク質を、組換え大腸菌から、Ｈｏｆｍａｎｎら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4666-4668, 1980）の方法に従ってイミノビオチンアガロース（Ｓｉｇｍａ）を充填したカラムを用いて精製した。具体的には、ＷＯ  ０２／０７２８１７に記載されている大腸菌に対して、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、３７℃で５時間発現誘導をかけた後集菌し、ペレットを５０ｍＭ  Ｃａｐｓ  ｐＨ１１．０，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌに懸濁し、超音波によって菌体を破壊した。遠心後の上清を、５０ｍＭ  Ｃａｐｓ  ｐＨ１１．０，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した自作のイミノビオチンカラム（高さ３ｃｍ、体積０．５ｍｌ）にアプライした。５ｍｌの５０ｍＭ  Ｃａｐｓ  ｐＨ１１．０，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄後、１．５−２ｍｌの５０ｍＭ  ＮＨ4ＯＡｃ  ｐＨ４．０で溶出した。精製タンパク質の収量は５０ｍＬの培養液からおよそ１ｍｇであった。【００５２】
質量分析
タマビジン２を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、０．１％ＴＦＡ，５０％ＭｅＣＮ飽和溶液に溶解し、このサンプル溶液をＺｉｐＴｉｐ  Ｃ４（Millipore）にて精製を行い、ＭＡＬＤＩプレートに直接アプライした。風乾後、マトリックス溶液（シナピン酸）を重層した。さらに風乾後、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ（島津製作所）に搭載し、質量分析を行った（引き出し電圧：２０ｋＶ、飛行モード：Ｌｉｎｅａｒ、検出イオン：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）。その結果、ｍ／ｚ＝１５１４６．３（単量体に相当）、３０３３５．０（二量体に相当）、６０９３２．０（四量体に相当）が観測された。さらに、ビオチン結合型のタマビジン２の場合、四量体に相当するピークが大きくなった。この結果から、タマビジン２は４量体で、質量６０９３２と判断した。タンパク質のＮ末端配列を解析したところ、翻訳開始メチオニンの次のセリンがＮ末端であることが判明した。遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）を用いて、タマビジン２の開始メチオニンを除く、１４０アミノ酸からなるポリペプチドの等電点を計算すると、７．３６であった。【００５３】
分子吸光係数
タマビジン２の分子吸光係数は理論値として、Ａ280＝４１７５０Ｍ-1ｃｍ-1ｓｕｂｕｎｉｔ-1（０．２５ｍｇ／ｍＬで０．６８）である。実際にタマビジン２を精製し、酢酸アンモニウムに透析したサンプルを、凍結乾燥させ（酢酸アンモニウムは完全昇華）、秤量したところ３ｍｇであった。このサンプルを２０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．５）に溶解し、濃度を０．２５  ｍｇ／ｍＬに調製して、Ａ280を測定したところ、０．６７の実測値を得た。これは理論値の９８％に相当した。これにより、Ａ280を測定することでタマビジン濃度を簡便に測定することが可能となった。【００５４】
蛍光ビオチンによる活性測定
蛍光ビオチンによるタマビジン２のビオチン結合活性の測定を、Ｋａｄａら（Biochim. Biophys. Acta., 1427: 44-48, (1999)）の方法に従って行った。２００μＬアッセイバッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））中に、精製したＴＭ２が０ｐｍｏｌから４８６ｐｍｏｌまで段階的に含まれるように調整をした。この溶液に２０ｐｍｏｌ／μＬ蛍光ビオチン溶液（biotin-4-fluorescein:  Molecular Probe）５０μＬ（１ｎｍｏｌ）を混和し、室温で１０分間放置後、Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて蛍光強度を測定した。その結果、１ｎｍｏｌの蛍光ビオチンに０．２７４ｎｍｏｌのＴＭ２が結合した。すなわち、１ｍｏｌのタマビジンに３．６ｍｏｌの蛍光ビオチンが結合した。このことから、タマビジン１分子に蛍光ビオチン４分子（サブユニット当たり１分子）結合することが示された。同様にストレプトアビジンは、１ｍｏｌに対して３．４ｍｏｌの蛍光ビオチンに結合した。【００５５】
１−２．タマビジン２（ＴＭ２）の非特異結合性
ウサギ抗ＴＭ２抗体の精製
大腸菌で発現させたタマビジン２（ＴＭ２）タンパク質をイミノビオチンカラムで精製したもの、および、これをさらにゲル精製したものを抗原に用い、二種類の抗体を作成した。アルカリフォスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体を用いたウェスタン法による検出感度は、精製組換えタマビジン２標品に対して、およそ０．５ｎｇであった。以上の結果から特異性およびタイターともに高い抗体が完成したと結論した。なお抗タマビジン２抗体−タマビジン１の交差反応は、低いものの検出された（本来の抗原に対して１／２０程度）。【００５６】
抗ＴＭ２抗体（イミノビオチンカラム精製のみを行った抗原から作成した抗体）は、さらに以下のようにして精製した。ＴＭ２  ４０μｇを１５％アクリルアミドゲル  ２枚を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパクをニトロセルロース膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ）２枚に転写した。膜を３％  ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液にて室温で１時間振とうさせることによりブロッキングを行った。続いて、室温で一晩、抗ＴＭ２抗体（イミノビオチンカラム精製のみを行った抗原から作成した抗体、１０００倍希釈）と反応させた後、ＴＭ２が転写されている部位を切り取り、溶出緩衝液（０．２Ｍ  グリシン、  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ２．８）中で室温２０分間振とうさせた。溶出緩衝液の１／１０容量の１Ｍ  トリス溶液で中和後、同量の１０×ＴＢＳ緩衝液を加え４℃で保存した。【００５７】
ＤＮＡに対する非特異結合性
タマビジン２（ＴＭ２）のＤＮＡに対する非特異結合試験
ＴＭ２のＤＮＡに対する非特異結合性を解析した。２×ＳＳＣ緩衝液で１０μｇから０．３μｇまで段階希釈したサケ精子ＤＮＡをアルカリ変性させ、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Amersham Biosceinces）に吸着させた。５×デンハルト液（０．１％ＢＳＡ、０．１％フィコール、０．１％ポロビニルプロリドン）で膜をブロッキングした後、２５μｇ／ｍＬのＴＭ２、ストレプトアビジン、およびアビジン溶液に室温で９０分間浸した。その後、膜をＴＴＢＳ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液）によって、室温で５分間３回洗浄した。０．５％スキムミルク、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液で１時間、膜をブロッキングした。１次抗体として、ＴＭ２には前述した方法で精製したウサギ抗ＴＭ２抗体を、ストレプトアビジンにはウサギ抗ストレプトアビジン抗体（ＳＩＧＭＡ）を、アビジンにはウサギ抗アビジン抗体（Ａｂｃａｍ）を、抗体価が同等になるように希釈して用いた。１次抗体との抗原抗体反応は、１晩室温で行った。膜をＴＴＢＳ緩衝液によって室温で５分間３回洗浄後、２次抗体として、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ）（１００００倍希釈）を用い、室温で１時間反応させた。膜をＴＴＢＳ緩衝液によって室温で５分間３回洗浄後、Alkaline Phosphatase substrate kit II、vector Black（フナコシ）にて発色させ、Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）で定量化した。その結果、アビジンはＤＮＡの濃度依存的に染色強度が増加したのに対して、ＴＭ２、ストレプトアビジンの染色強度はＤＮＡ濃度に強い影響を受けなかった（図１Ａ、Ｂ）。この結果から、タマビジン２のＤＮＡに対する非特異活性はほとんどなく、ストレプトアビジンと同等であることが示された。これはタマビジン２のアビジンに対する優位性を示すものである。【００５８】
１−３．タマビジン２とビオチンとの相互作用解析
ビアコアバイオセンサーを用いたタマビジン２（ＴＭ２）とビオチンとの相互作用のカイネティックス分析
高精製度のＢＳＡ  （Ｓｉｇｍａ）２ｍｇとＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）１ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム  ｐＨ８．０中で溶解し、４℃で２時間インキュベーションした。ＮＨＳ−ビオチン(EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin)はあらかじめ少量のＤＭＳＯに溶解してから加えた。これを透析チューブ（ＭＷＣＯ  ６−８，０００）に入れ、５０ｍＭ  炭酸ナトリウム  ｐＨ６．７に対して４℃で一晩透析した。こうして作成したビオチン−ＢＳＡコンジュゲート（ＭＷ  ６７ｋＤａ，３０μＭ）をビアコア（登録商標）バイオセンサーのリガンド（センサーチップへ貼り付ける物質）とした。一方、アナライト（流路系に流す物質）として組換えタマビジン２を調製し、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）による分子間相互作用の分析を行った。ビオチン−ＢＳＡ、およびネガティブコントロールとしたＢＳＡは、アミンカップリング法によってＣＭ５センサーチップに固定化した。固定化量は、２００ＲＵ程度になる様に調節した。ＢＳＡを固定化したチップは、フローセル１と３に、ビオチン−ＢＳＡを固体化したチップは、フローセル２と４に配置した。タマビジン２は、フローセル１と２に、ストレプトアビジンは、フローセル３と４に、流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間、ランニングバッファー［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％  Surfactantat20（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）］中にロードした。その後、６０分間、サンプルの解離をモニターした。なお、結合したタマビジン２、ならびにストレプトアビジンを解離させることは不可能であったため、測定では再生操作を行わず、低濃度側から７段階の測定を行った（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、および２００ｎＭ）。ＢＳＡのデータはレファレンスとして、ＢＳＡ−ビオチンのデータから差し引いた。測定は２５℃で行った。得られたセンサーグラムから、解析ソフトウェア BIAevaluation ver.4.1を用いて、１：１結合モデルを用いて、反応速度論的解析を行い、結合速度定数（ｋa）と解離速度定数（ｋd）を計算した。解離定数（Ｋd）  は、ｋd／ｋaから求めた。【００５９】
なお、再生操作を行わない場合、各濃度の測定を行うごとにＲｍａｘ（アナライトの最大結合量）が減少するが、解析時にはＲｍａｘをローカルフィッティングして濃度ごとに算出を行った。また、１：１結合モデルに近似できたアナライト濃度のデータのみを採用した。【００６０】
組換えタマビジン２とビオチンとのＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー）による分子間相互作用のカイネティックス分析結果は表１の通りである。【００６１】
【表１】
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得られたタマビジン２の解離定数は、１０-12 Mのオーダーで、今回我々の測定したストレプトアビジンの解離定数と同じオーダーであった。この結果によって、タマビジン２は、アビジン、ストレプトアビジンに次ぐ、ビオチンと非常に高い親和性をもつタンパク質であることが明らかとなった。タマビジン２は、現在広く応用されているアビジン−ビオチン技術に応用が可能であると考えられる。【００６２】
１−４．タマビジン２の耐熱性
タマビジン２（ＴＭ２）の耐熱性を、ストレプトアビジンまたはアビジンとの比較で解析した。【００６３】
タンパクの安定性
０．２μｇ／μＬ  ＴＭ２、および０．２μｇ／μＬ  ストレプトアビジンを１０μＬ（２μｇ）ずつ室温、５０、６０、７０、８０、９０、９９℃で２０分間加熱した。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清の可溶性タンパクを等量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８，１２％  ２−メルカプトエタノール，２％  ＳＤＳ，２０％  グリセロール）と懸濁し、９５℃で１０分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパクバンドはＣＢＢ染色によって検出した。Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて定量マーカー（LMW ELECTROPHORESIS CALIBRATION KIT; Pharmacia Biotech）をもとに検量線を作成し、タンパク質バンドを定量化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２Ａに、タンパク質バンドの定量結果を図２Ｂに示す。５０％のタンパク質が消失する温度は、ストレプトアビジンが７１℃であるのに対し、タマビジン２は８７℃であった。この結果、タマビジン２は、ストレプトアビジンと比較して耐熱性が１５℃以上高いことが明らかとなった。また、タマビジン２はビオチンを加えると、耐熱性が極めて強くなり、９５℃処理後も、４量体が解離しなくなった。【００６４】
ビオチン結合活性
ビオチン結合性タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用して、タマビジン２の高温度条件下におけるビオチン結合能を、ストレプトアビジン、アビジンと比較した。【００６５】
約０．２５μｇ／μＬのＴＭ２とストレプトアビジンを、室温、５０、６０、７０、８０、９０℃で２０分間加熱後、１５０μＬ  アッセイバッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））中に０μＬから２７μＬの加熱処理したＴＭ２、またはストレプトアビジンを段階的に含む溶液を調製した。この溶液に５ｐｍｏｌ／μＬ蛍光ビオチン溶液（ビオチン−４−フルオレセイン：Molecular Probe）５０μＬ（２５０ｐｍｏｌ）を混和し、室温で２０分間放置後、Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて蛍光強度を測定した。【００６６】
ビオチン結合性タンパク質の耐熱性試験は以下の通りに実施した。約０．２５μｇ／μＬのビオチン結合性タンパク質を、室温、５０、６０、７０、８０、９０℃で２０分間加熱後、１５０μＬ  アッセイバッファー中に０μＬから１２μＬの加熱したビオチン結合性タンパク質を段階的に含む溶液に調製した。この溶液に２ｐｍｏｌ／μＬ蛍光ビオチン溶液  ５０μＬ（１００ｐｍｏｌ）を混和し、室温で２０分間放置後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて蛍光強度をＥｘ＝４６０ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにて測定した。【００６７】
結果を図３に示す。その結果、ＴＭ２における蛍光ビオチンとの結合は、７０℃以下では室温と変化はみられず、８０℃で８２％の活性を保持していた。一方、ストレプトアビジンと蛍光ビオチンとの結合活性は７０℃で４０％、８０℃で８０％減少した。また、アビジンと蛍光ビオチンとの結合活性は７０℃で１０％、８０℃で７０％減少した。蛍光強度の減少割合が、加熱していないサンプルの５０％になる温度は、ＴＭ２は８５℃であるのに対し、ストレプトアビジンは７３℃、アビジンは７８℃であった。【００６８】
１−５．タマビジン２固定化担体の耐熱性
タマビジン２磁性ビーズの作成
カルボキシル基で表面をコートされた磁性ビーズ（Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynal社）３００μｌを０．０１Ｎ  水酸化ナトリウム  ３００μｌで１０分間洗浄後、さらに超純水  ３００μｌで１０分間３回洗浄した。洗浄済みの磁性ビーズに、冷超純水で溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロライド（ＥＤＣ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を最終濃度０．２Ｍになるように添加し３０分間、室温で振とうした。その後、冷超純水  ３００μｌ、続いて５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）３００μｌで磁性ビーズを洗浄し、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）に置換した０．６ｍｇ／ｍｌ  ＴＭ２を３００μｌ（１８０μｇ）混和した。室温で３０分間振とうさせることにより、共有結合にてＴＭ２と磁性ビーズを結合させた。磁石で磁性ビーズを回収し、上清を除去した。次に５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．０）３００μｌでビーズの未反応カルボキシル基を消去後、０．５％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液３００μｌで磁性ビーズをブロッキングした。ＰＢＳ緩衝液  ３００μｌで磁性ビーズを懸濁し、磁性ビーズを完成させた。ストレプトアビジンおよびアビジンについても同様に磁性ビーズを作成した。【００６９】
タマビジン２磁性ビーズの加熱試験
（ｉ）耐熱性
蛍光ビオチンを用いて、ＴＭ２磁性ビーズの耐熱性を、上記で作製したストレプトアビジン磁性ビーズおよびアビジン磁性ビーズ、ならびに、市販のストレプトアビジン磁性ビーズ（Dynabeads M-270 Streptavidin、Dynal）と比較した。【００７０】
各磁性ビーズをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、室温、７０、７５、８０、８５、９０℃で２０分間加熱した。１５０μＬ  アッセイバッファー中に、加熱した各磁性ビーズを０μＬから１６μＬまで段階的に含む溶液を調製した。この溶液に１ｐｍｏｌ／μＬ  ビオチン−４−フルオレセイン溶液  ５０μＬ（５０ｐｍｏｌ）を混和し、室温で２０分間放置後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００を用いて上清の蛍光強度をＥｘ＝４６０ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにて測定した。【００７１】
結果を図４に示す。その結果、ＴＭ２磁性ビーズにおいて、蛍光ビオチンとの結合は７５℃以下では室温と変化がみられず、８０℃で７３％、８５℃で６４％の活性があった。ストレプトアビジン磁性ビーズは８０℃で７０％失活し、市販のストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）は８０℃で９０％失活した。また、アビジン磁性ビーズは８０℃で３５％、８５℃で５５％失活した。蛍光強度の減少割合が、加熱してないサンプルの５０％になる温度は、ＴＭ２は８７℃であるのに対し、ストレプトアビジンは７８℃、ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ）は７２℃、アビジンは８４℃であった。【００７２】
（ｉｉ）高温域におけるビオチン結合活性
ビオチン結合性タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用して、ＴＭ２磁性ビーズの高温度条件下におけるビオチン結合能を、市販のストレプトアビジン磁性ビーズと比較した。【００７３】
ＴＭ２磁性ビーズは、カルボキシル基で表面をコートされた磁性ビーズ（Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynal社）にＴＭ２を共有結合させることによって作成した。また、市販のストレプトアビジン磁性ビーズは、Dynabeads M-270 Streptavidin（Dynal社）を使用した。ＴＭ２磁性ビーズは２×１０9ビーズ／３０ｍｇ／ｍＬであり磁性ビーズ１ｍｇ当り３３３ｐｍｏｌの蛍光ビオチンが結合する。また、市販のストレプトアビジン磁性ビーズは６．７×１０8ビーズ／１０ｍｇ／ｍＬであり磁性ビーズ１ｍｇ当り６２５ｐｍｏｌの蛍光ビオチンが結合する。【００７４】
ＴＭ２磁性ビーズ、および市販のストレプトアビジン磁性ビーズ３００μＬをＰＢＳ緩衝液３００μＬで２回洗浄し、再びＰＢＳ緩衝液３００μＬ中に懸濁した。それぞれの磁性ビーズを４２μＬずつ７本に分注した。１ｐｍｏｌ／μＬ蛍光ビオチン溶液（ビオチン−４−フルオレセイン：Molecular Probe社）５０μＬ（５０ｐｍｏｌ）をアッセイバッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））１５０、１４９、１４８、１４６、１４２、１４０、１３４μＬにそれぞれ添加し、室温、５０、６０、６５、７０、８０、９５℃で１０分間プレインキュベーションした。続いて、両磁性ビーズを室温、５０、６０、６５、７０、８０、９５℃で５分間プレインキュベーション後、１、２、４、８、１０、１６μＬを５０ｐｍｏｌ  蛍光ビオチン溶液に添加して最終容積２００μＬとし、それらを各温度で２０分間加熱し続けた。この間、ピペッティングにより３回混合液を懸濁した。その後、敏速に磁石で磁性ビーズを回収し、上清の蛍光強度をＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いてＥｘ＝４６０ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにて測定した（実験１）。実験２として、実験１と同様に、室温、７０、７５、８０、８５、９０℃を解析した。【００７５】
実験１の結果を図５ＡおよびＢに、実験２の結果を図５ＣおよびＤに示す。その結果、ＴＭ２磁性ビーズにおいて、蛍光ビオチンとの結合は７０℃以下では室温と変化がみられず、８０℃、８５℃ではそれぞれ、７５％、６２％の活性を保持していた（図５Ａ）。一方、市販のストレプトアビジン磁性ビーズにおいては、蛍光ビオチンとの結合は、８０℃では６０％から８０％消失した（図５Ｂ）。蛍光強度の減少割合が加熱していないサンプルの５０％になる温度は、ストレプトアビジン（Dynal）が７７．５℃であるのに対し、タマビジン２は８７．５℃であった。【００７６】
ＴＭ２セファロースビーズの作成
表面のカルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性エステル化されたセファロースビーズ （直径３４μｍ）HiTrap NHS-activated HP（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを冷１ｍＭ 塩酸 １０ｍｌで洗浄後、さらに冷超純水 １ｍｌで洗浄した。このセファロースビーズに、予め０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）中で透析をした１ｍｇ／ｍｌ ＴＭ２を１ｍｌ混和した。室温で３時間振とうさせることによりＴＭ２とセファロースビーズを結合させた。次に５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌにて未反応の活性基を消去後、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ緩衝液 ５ｍｌでセファロースビーズをブロッキングした。ＰＢＳ緩衝液 １ｍｌでセファロースビーズを懸濁しＴＭ２セファロースビーズを完成させた。【００７７】
ＴＭ２セファロースビーズの加熱試験
蛍光ビオチンを用いて、ＴＭ２セファロースビーズの耐熱性を検証した。ＴＭ２セファロースビーズをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、室温、７０、７５、８０、８５、９０℃で２０分間加熱した。１５０μＬ アッセイバッファー中に、加熱したセファロースビーズを０μＬから１６μＬまで段階的に含む溶液を調整した。次に３ｐｍｏｌｓ／μｌ ビオチン−４−フルオレセイン溶液 ５０μｌ(１５０ｐｍｏｌ)を混和し、室温で２０分間放置後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００を用いて上清の蛍光強度をＥｘ＝４６０ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにて測定した。【００７８】
その結果、蛍光ビオチンとの結合は８０℃以下では室温と変化がみられず、８５℃で６４％の活性があった。また、蛍光強度の減少割合が、加熱してないサンプルの５０％になる温度は８６℃であり、ＴＭ２を固定化した磁性ビーズと同等の耐熱性を示した（図６）。
実施例２：タマビジン１（ＴＭ１）
２−１．タマビジン１の特徴づけ
タマビジン１の大腸菌発現と精製
タマビジン１をコードするＤＮＡ（配列番号１）を、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａに組込んで大腸菌で発現させると、発現したタマビジン１タンパク質の殆どが可溶性画分に蓄積し、その発現量はタマビジン２と同じレベルに多かった。そこで組換えタマビジン１に関して、以下のように精製を試みた。発現誘導後、集菌した大腸菌のペレットを２０ ｍＭ  Ｋｐｉ  ｐＨ７．０に懸濁し、超音波によって菌体を破壊した。１５０００ｒｐｍで１０分間の遠心後の上清を、７０℃で１０分間処理した。熱処理後さらに遠心分離操作を行い、その上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌに置換した。このサンプルを同バッファーで平衡化したイオン交換カラムMonoQ HR5/5 (Phaemacia)にアプライし、組換えタマビジン１をカラム素通り画分として回収した。タンパク質の回収量は培養液５０ｍＬ当たりおよそ１ｍｇであった。【００７９】
質量分析
タマビジン１の質量分析を実施例１と同様に行った。その結果、ｍ／ｚ＝１５９６１．６（単量体に相当）、３１９２２．５（二量体に相当）が観測された。単量体の質量は、タマビジン１をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動した後の分子量に良く一致した。一方、タマビジン１にビオチンを過剰量添加し、インキュベートした後のサンプルのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動像と、同じ処理を施したタマビジン２の泳動像との比較分析から、タマビジン１は４量体であることが示唆された。遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）を用いて、全長１４３アミノ酸からなるタマビジン１の等電点を計算すると、６．２３であった。【００８０】
ビオチンとの結合性
上記７０℃熱処理後の遠心後上清のタマビジン１の蛍光ビオチン結合活性を測定した。方法はタマビジン２の場合に準じた。蛍光ビオチンとのインキュベーションは室温で行った。結果を図７に示す。タマビジン１は、７０℃処理後においても蛍光ビオチンと結合することが明らかとなった。【００８１】
２−２．タマビジン１の耐熱性
タンパク質の安定性
０．２μｇ／μＬの濃度の精製タマビジン１を１０μＬ（２μｇ）ずつ室温、５０、６０、７０、８０、９０、９９℃で２０分間加熱した。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清の可溶性タンパクを等量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，１２％  ２−メルカプトエタノール，２％  ＳＤＳ，２０％  グリセロール）と懸濁し、９５℃で１０分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパクバンドはＣＢＢ染色によって検出した。Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて定量マーカー（LMW ELECTROPHORESIS CALIBRATION KIT; Pharmacia Biotech）をもとに検量線を作成し、タンパク質バンドを定量化した。その結果、タマビジン１の５０％のタンパク質が消失する温度は、７６℃であった。この結果、タマビジン１は、上述のストレプトアビジンと比較して耐熱性が５℃高いことが明らかとなった。また、タマビジン１はビオチンを加えると、耐熱性が極めて強くなり、９５℃処理後も、４量体が解離しなくなった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の固体担体に連結されるタマビジンは、高温域でのタンパク質安定性およびビオチン結合性を保持するため、本発明の固体担体は、高温域での処理を含むアッセイ系に利用可能である。高温域での処理を含むアッセイ系は、特異性の高い物質の分離、濃縮、精製、検出および／または捕捉を可能にするため、一連のプロトコルの迅速化に貢献する。また、タマビジンは、卵白由来のアビジンやストレプトアビジンと比較して生産効率が高いため、本発明の固体担体は、市販のビオチン結合性タンパク質を連結した固体担体と比較してコスト面でも有利である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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