【手続補正書】
【提出日】平成17年10月25日(2005.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  外因的に添加したトロンボモジュリンの存在下にサンプルの潜在的抗血液凝固能を測定する方法であって、
ａ) サンプル、好ましくは血漿サンプルに、以下の試薬：
ｉ) トロンビンと複合体を形成することが可能で、この複合体はサンプル中のプロテインＣ（プロテインＣは内因性プロテインＣもしくは外因的に添加されたプロテインＣのいずれであってもよい）を活性化できる外因性トロンボモジュリン、
ii) さらに中間インキュベーションなしにプロトロンビンの活性化を誘導するアクティベーター（ここでプロトロンビンは内因性プロトロンビンもしくは外因的に添加されたプロトロンビンのいずれであってもよい）、
iii) リン脂質、
iv) カルシウムイオン、および
ｖ) 血液凝固試験の最適化に一般的に使用される他の付加的試薬
を添加する工程、
ｂ) プロトロンビンアクティベーター含有試薬の添加により反応を開始させる工程、ならびに
ｃ) フィブリン血餅形成までの時間の測定または標識トロンビン基質の変換速度によって決定されるトロンビン基質の変換速度を測定することによりトロンビンの形成を定量する工程
を包含する方法。
【請求項２】  測定された変換速度は、活性化プロテインＣは形成も添加もされない血液凝固時間の測定のための試験アッセイにおける変換速度と関連させる請求項１記載の方法。
【請求項３】  測定された変換速度は、請求項１記載の方法と同様に行うがトロンボモジュリンは添加しない試験アッセイにおける変換速度と関連させる請求項２記載の方法。
【請求項４】  プロテインＣ活性化活性（ＰＣaＡ）に加えて、アンチトロンビンIII（ＡＩＴＡ）によるトロンビンの阻害を加速する作用も有するトロンボモジュリンを使用する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】  工程ａ）ii）におけるアクティベーターの濃度が、トロンボモジュリンの不存在下における正常血漿の血液凝固時間が少なくとも２０秒、最高３００秒、好ま
しくは３０〜１５０秒になるように選択される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】  工程ａ）ii）におけるアクティベーターとして、それ自体は熟練者に周知であり、天然のヒトまたは動物起源の胎盤、肺臓もしくは脳から得られるかまたは組換え技術によって調製されるトロンボプラスチン試薬を使用する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】  トロンボモジュリンは別個の試薬中に、アクティベーターを含有する試薬とは別個に、サンプルに添加される請求項１記載の方法。
【請求項８】  用いられるトロンボモジュリンが、ヒト、動物、組換えまたは合成起源のいずれでもよく、好ましくはヒトまたはウサギ起源、特に好ましくはウサギ起源である請求項１記載の方法。
【請求項９】  組換えによって調製されるトロンボモジュリンの場合において、トロンビン不活性化作用はグリコサミノグリカン好ましくはヘパリン硫酸に連結させることによって回復される請求項８記載の方法。
【請求項１０】  組換えによって調製されるトロンボモジュリンの場合において、トロンビン不活性化作用はグリコサミノグリカン好ましくはヘパリン硫酸を添加することによって回復される請求項８記載の方法。
【請求項１１】  連結は組換えまたは合成によって行われる請求項９記載の方法。
【請求項１２】  試薬中のトロンボモジュリンの量が、トロンボモジュリンの存在下において正常血漿での血液凝固時間が３００秒未満、特に好ましくは１５０秒未満であり、トロンボモジュリンを添加しない場合の血液凝固時間と比較した差がトロンボモジュリンを添加しない場合のこの血液凝固時間の少なくとも４０％、好ましくは１００〜３００％になるように選択される少なくとも請求項１記載の方法。
【請求項１３】  トロンボモジュリンの濃度が、試験アッセイの最終容量に基づいて０.５〜５０μg／ml、好ましくは１〜１０μg／mlである請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】  血餅の形成を遅延させるため、既知の凝集阻害剤が試験操作中に添加される請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】  プロテインＣシステムまたはアンチトロンビンIIIシステムの機能には関与しない精製血液凝固因子が、試薬（単数または複数）への添加により置換される請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】  フィブリノーゲン、血液凝固VII因子、血液凝固IX因子、血液凝固Ｘ因子および／またはプロトロンビン（血液凝固II因子）を試薬（単数または複数）に、サンプルに基づいて濃度５０〜２００％、好ましくは７０〜１５０％に達するような濃度で添加される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】  サンプル中のアンチトロンビンIIIの欠損または障害を排除するため、アンチトロンビンIIIを、１種または２種以上の試薬中に、サンプルの量に基づいて濃度５０〜２００％、好ましくは７０〜１５０％に達する量で存在させる請求項１５記載の方法。
【請求項１８】  単一または多重障害を選択的に決定するために、試験において一緒に検出されない血液凝固因子を含有する溶液が、この方法に使用される前に血漿サンプルに添加される請求項１記載の方法。
【請求項１９】  タンパク質の障害または欠損を選択的に診断するために、サンプルを、この方法に使用する前に、このタンパク質５％未満を含有する血漿で１：２〜１：２０、好ましくは１：３〜１：５、特に好ましくは１：４に前希釈する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】  数種のタンパク質の障害または欠損を選択的に診断するために、サンプルをこの方法に使用する前に、これらのタンパク質それぞれの５％未満を含有する血漿で１：２〜１：２０、好ましくは１：３〜１：５、特に好ましくは１：４に前希釈する請求項１８記載の方法。
【請求項２１】  抗−リン脂質抗体を選択的に診断するために、サンプルを方法に使
用する前に、リン脂質および／または血小板を０.０１〜１％の濃度で含有する水溶液により１：２〜１：２０、好ましくは１：３〜１：５、特に好ましくは１：４の比に前希釈する請求項１８記載の方法。
【請求項２２】  アンチトロンビンIIIの抗血液凝固活性を測定するために、サンプルをアンチトロンビンIII欠損血漿で１：２〜１：１０、好ましくは１：４の比に前希釈する請求項１８記載の方法。
【請求項２３】  サンプルの基質変換速度がトロンボモジュリンの存在下および不存在下に測定され、この差または２つの値の商を正常血漿または血漿プールで得られた差または商と関連させる請求項１記載の方法。
【請求項２４】  血栓症の危険が高い患者の同定のための請求項１記載の方法の使用。
【請求項２５】  抗血液凝固療法のモニタリングのための請求項１記載の方法の使用。
【請求項２６】  患者サンプル中のプロテインＣ活性化活性（ＰＣaＡ）およびトロンボプラスチンのアンチトロンビンIII（ＡＩＴＡ）によるトロンビンの阻害の促進をもたらす活性の比の測定によって患者のトロンボモジュリンのグリコシル化を検出および定量化するための請求項１記載の方法の使用。
【請求項２７】  トロンボモジュリンの２つの活性が、サンプル中で直接測定される請求項２６記載の使用。
【請求項２８】  ２つの活性が測定される前に内因性のトロンボモジュリンをサンプルから単離する請求項２６記載の使用。
【請求項２９】  ａ）サンプルと接触させる、トロンボモジュリンに対する抗体で被覆された試験ストリップ、ｂ）インキュベートした試験ストリップを洗浄する洗浄溶液、ｃ）プロテインＣの活性化を測定するための試薬、およびｄ）トロンビンの不活性化を測定するための試薬からなる請求項２６記載の方法に使用する試験キット。
【請求項３０】  プロテインＣを活性化するために試験ストリップをその中で最初にインキュベートする１つの試薬ではトロンビン、プロテインＣおよび塩化カルシウムからなり、第２の試薬はトロンビンを不活性化し、形成されたプロテインＣの量を試験ストリップの着色の強度によって測定するための、アンチトロンビンIII、ヘパリンおよび／またはヒルジンならびに色素原プロテインＣ基質からなる請求項２９記載のプロテインＣ活性化を測定するための一連の試薬。
【請求項３１】  試験ストリップを導入する１つの試薬は、アンチトロンビンIIIからなり、ついでトロンビンを加え、インキュベーション期間の後、残ったトロンビン活性を色素原トロンビン基質の添加により試験ストリップの着色強度を測定することによって決定する請求項２９記載のトロンビンの不活性化を測定するための一連の試薬。
【請求項３２】  試験ストリップの代わりにトロンボモジュリンに対する抗体で被覆されたマイクロタイタープレートを使用する請求項２６〜３１のいずれかに記載の試験キット。
【請求項３３】  糖尿病もしくはホモシステイン血症の患者からの血液、血漿または組織中のトロンボモジュリンのグリコシル化の程度を、その疾患および／または血栓易発症性の重症度を評価するために測定する請求項２６記載の方法の使用。
【請求項３４】  動脈硬化症の患者からの血液、血漿または組織中のトロンボモジュリンのグリコシル化の程度を、その疾患および／または血栓易発症性の重症度を評価するために測定する請求項２６記載の方法の使用。
【請求項３５】  サンプルのＡＴ III活性およびプロテインＣシステム活性を、外因的に添加したトロンボモジュリンの存在下に測定する方法であって、以下の工程：
ａ) サンプル、好ましくは血漿サンプルに以下の試薬：
ｉ) プロテインＣの活性化活性（ＰＣaＡ）に加えて、アンチトロンビンIII（ＡＩＴＡ）によるトロンビンの阻害を促進する作用を有するか、あるいはそれにＡＩＴＡ作用を再構築するためにヘパリンを添加した外因性のトロンボモジュリン、
ii) さらに中間インキュベーションを行わなくても、プロトロンビンの活性化を誘導してトロンビンを形成する少なくとも１種のアクティベーター（ここでプロトロンビンは内因性プロトロンビンもしくは外因的に添加したプロトロンビンのいずれであってもよい）、
iii) リン脂質、
iv) カルシウムイオン、および
ｖ) 血液凝固試験の最適化に一般的に使用される他の付加的試薬
を添加する工程、および
ｂ) フィブリン血餅形成までの時間または標識トロンビン基質の変換速度を測定することによって決定される、トロンビン基質の変換速度を測定することによってトロンビンの形成を決定する工程
を包含する方法。
【請求項３６】  サンプルを正常ＡＴ III活性５％未満を含有する血漿により１：２〜１：２０、好ましくは１：３〜１：５、特に好ましくは１：４の比に希釈して、ＡＴ III活性を選択的に測定する請求項３５記載の方法。