(57)【要約】  本発明の目的は、性ホルモン感受性の癌に対する抗腫瘍剤を提供することである。  本発明により、ヒドロキシクエン酸(HCA)が、性ホルモン感受性の癌細胞の生育を抑制することが示された。HCAは、従来、急性毒性試験では、クエン酸よりも安全であることが示されており、HCAを有効成分として含有する本発明の抗腫瘍剤は、従来公知の抗腫瘍剤より副作用が小さいものと期待される。また、HCAを含む医薬組成物は、癌のみならず、性ホルモン感受性の細胞の増殖に起因するその他の疾患の治療にも役立つと考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシクエン酸、またはその塩を有効成分として含有する、性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象に治療上有効量のヒドロキシクエン酸、またはその塩を投与する工程を含む、性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための方法。
【請求項６】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、ヒドロキシクエン酸、またはその塩の使用。
【請求項１０】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、請求項９記載の使用。
【請求項１２】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための、ヒドロキシクエン酸、またはその塩。
【請求項１４】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、請求項１３記載のヒドロキシクエン酸、またはその塩。
【請求項１５】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、請求項１３記載のヒドロキシクエン酸、またはその塩。
【請求項１６】
性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、請求項１５記載のヒドロキシクエン酸、またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシクエン酸(HCA)の新規用途に関する。より詳細には、HCAを有効成分として含有する、前立腺癌等の性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための医薬組成物、並びにそれを用いて疾患を予防及び/または治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシクエン酸（HCA；1,2-ジヒドロキシプロパン-1,2,3-トリカルボン酸）は、ガルシニア・カンボジア(Garcinia cambogia)等のガルシニア属の果皮に含まれ、脂肪合成抑制作用を持つことが知られている(非特許文献１)。ガルシニア・カンボジアは、東南アジア原産のオトギリソウ科植物であり、古くからスパイス・保存料として利用されており、現在は、その脂肪合成抑制作用によりダイエット素材としても良く知られている。HCAを成分とした、肥満抑制効果をうたった医薬品を含む様々な商品が開発されている(特許文献１〜７;非特許文献２)。また、HCAは、アフリカ原産植物ハイビスカス・サブダリファ(Hibiscus subdariffa)にも含まれている。ハイビスカスは、鹿児島県においても広く植栽されており、観賞用のみならず、ハイビスカスティーとして飲用にも供されている。【０００３】
2つの不斉中心を有するため、HCAには(2S,3S)、（2S,3R）、(2R,3S)、及び(2R,3R)の4種類の異性体が存在する。(2S,3S)型HCAは、ガルシニア・カンボジアに含まれ、ハイビスカス・サブダリファには(2S,3R)型のHCAが含まれることが知られている。残りの2つの型は、現在までのところ、自然界においては見出されていない。これらの異性体のうち、(2S,3S)型のものが、ラット肝臓におけるATPクエン酸リアーゼの阻害作用が最も強いと報告されている(非特許文献３)。【０００４】
HCAは、クエン酸をオキサロ酢酸及びアセチルCoAに分解するクエン酸回路から脂肪合成経路へのミトコンドリア外分解を触媒するアデノシン三リン酸(ATP)クエン酸リアーゼの阻害剤であることが報告されている（非特許文献４）。HCAは、クエン酸の水素が水酸基に置換された構造を持っている。このような、クエン酸と類似した構造を有していることから、HCAは、クエン酸代謝と拮抗し、クエン酸代謝産物であるアセチルCoAの体内量を減少させ、さらには、細胞における脂肪酸、及びコレステロール産生を減少させると考えられている（非特許文献５）。【０００５】
一般に、体重の増加と共に腫瘍、特にホルモンが関与する腫瘍になるリスクが高まることが知られており、HCAを含む種々の肥満の治療または予防に使用される物質を用いて、肥満と関連した腫瘍を間接的に予防する可能性が模索されている(非特許文献４)のみであり、HCAが腫瘍細胞の生育を抑制することは、これまでのところ報告されていない。HCAは、腫瘍細胞との関連では、腫瘍細胞の代謝を研究する際に、ATP-クエン酸リアーゼの阻害剤として使用されているのみである(非特許文献６〜１０)。【０００６】
前立腺癌は、世界的にみて非常に発症頻度の高い疾患である。特にアメリカでは、男性の癌の中、罹患数が1位であり、死亡数でも2位となっている。日本においても、高齢化、食生活の欧米化、及び癌の早期発見が可能なPSA検査の普及等により、1975年には2千人程度の患者数であったのが、2000年には約23,000人に増加している。前立腺癌の発生には、男性ホルモンが関与しており、加齢によるホルモンバランスの変化が影響していると考えられている。主に外腺に発生するが、癌発生の初期の段階では、自覚症状がほとんどないため、発見が遅れる場合もある。進行すると、最終的には骨や他臓器に転移し、治癒が困難となる。
【特許文献１】特開2005-263706号
【特許文献２】特開2002-306130号
【特許文献３】特開平11-001431号
【特許文献４】特表2004-526738号
【特許文献５】特表2003-507400号
【特許文献６】特表2002-538075号
【特許文献７】特表2001-503744号
【非特許文献１】Lewis (1969) Meth. Enzy. 13: 613-619
【非特許文献２】Mol.Cell Biochem. (2002) 238(1-2): 89-103
【非特許文献３】Sullivan et al. (1977) J. Biol. Chem. 252(21): 7583-7590
【非特許文献４】Watson et al. (1969) Arch. Biochem. Biophys. 135: 209-217
【非特許文献５】J.Biol.Chem. (1971) 246: 629-632
【非特許文献６】J.Nutr. (2002) 132: 3451S-3455S
【非特許文献７】Am.J.Physiol. (1995) 269: C22-C27
【非特許文献８】Biochim.Biophys.Acta(1981) 638(1): 75-79
【非特許文献９】Biochem.J. (1990) 272(1): 181-186
【非特許文献１０】Biochem.Mol.Biol.Int. (1996) 40(5): 1047-1056
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、前立腺癌は全米において男性の癌罹患率が最も高いことが知られており、日本においても、食生活の欧米化に伴い年々増加の一途をたどっている。近年のファーストフードに代表される高脂肪食への食生活の転換が、前立腺癌発症のリスクを高めていると考えられている。しかしながら、高脂肪食が前立腺癌の発生と増殖にどのような機序により作用しているのかは、これまでのところ不明である。そこで、本発明者らは、前立腺癌におけるアンドロゲン非依存性増殖能の獲得と脂質代謝のメカニズムの関連について考察した。本発明の目的は、前立腺癌の発症、及び前立腺癌の細胞のアンドロゲン非依存性増殖能の獲得を阻止する組成物及びそれを用いた治療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
性ホルモンに対して感受性の器官で生じるある種の癌、例えば、前立腺におけるアンドロゲン感受性(依存性)前立腺癌、及び乳房組織におけるエストロゲン感受性乳癌は、性ホルモンに対する特異的受容体により調節されている。最近、性ホルモンにより誘導される脂質生成の増幅が、腫瘍の増殖に重要な役割を果たすことが見出された。さらに、疫学的研究により、過剰な栄養摂取とこれらのホルモン感受性癌の発生との間に何等かの関わりがある可能性が示されている。【０００９】
また、正常な前立腺は、前立腺液の主要成分である大量のクエン酸を産生し、分泌する。前立腺肥大症(benign prostate hyperplasia;BPH)及び/または前立腺癌の病変域では、ミトコンドリアにおけるクエン酸生産の減少は見られないのに、ATP依存性膜クエン酸ポンプの機能不全によりクエン酸分泌能が明らかに低減している。このことから、細胞内の過剰なクエン酸が、BPH及び/または前立腺癌の病変域における細胞の過増殖に関与している可能性が示唆された。【００１０】
細胞の脂肪酸合成、及びコレステロール合成等の脂質生成では、ミトコンドリアのTCA回路で生成された細胞質中のクエン酸が、アセチルCoAを作るための最初の基質となる。HCAは、クエン酸のアナログであり、クエン酸からアセチルCoAへの変換を触媒するリンゴ酸酵素(クエン酸-ATPリアーゼ)の拮抗阻害剤として働き、細胞における脂肪酸及びコレステロールの合成を減少させる。そのような作用からHCAは、広くダイエット食品に利用されている。【００１１】
これらの事実に基づき、本発明者らは、HCAにより脂質生成を阻害することにより、BPH及び前立腺癌を予防、及び治療できるのではないかと考え、鋭意研究を行った。その結果、HCAが、正常組織の細胞の生育には影響を与えないが、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞及びエストロゲン感受性の乳癌細胞等の性ホルモン感受性の癌細胞の生育を、in vitroで抑制することが示された。【００１２】
そこで、本発明は、ヒドロキシクエン酸、またはその塩を有効成分として含有する医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患に対して効果を発揮するものである。より詳細には、前立腺癌、乳癌、前立腺肥大、子宮内膜症、後腹膜繊維腫症、副腎腫瘍、及び一部の睾丸腫瘍等が、本発明の組成物により治療可能な性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患として挙げられる。さらに、本発明により、本発明の医薬組成物を用いてこれらの疾患を予防及び/または治療する方法が提供された。【００１３】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１６〕を提供するものである。
〔１〕  ヒドロキシクエン酸、またはその塩を有効成分として含有する、性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための医薬組成物。
〔２〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、前記〔１〕記載の医薬組成物。
〔３〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、前記〔１〕記載の医薬組成物。
〔４〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、前記〔１〕記載の医薬組成物。
〔５〕  対象に治療上有効量のヒドロキシクエン酸、またはその塩を投与する工程を含む、性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための方法。
〔６〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、前記〔５〕記載の方法。
〔７〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、前記〔５〕記載の方法。
〔８〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、前記〔７〕記載の方法。
〔９〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、ヒドロキシクエン酸、またはその塩の使用。
〔１０〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、前記〔９〕記載の使用。
〔１１〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、前記〔９〕記載の使用。
〔１２〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、前記〔１１〕記載の使用。
〔１３〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患を治療するための、ヒドロキシクエン酸、またはその塩。
〔１４〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が癌である、前記〔１３〕記載のヒドロキシクエン酸、またはその塩。
〔１５〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺における疾患である、前記〔１３〕記載のヒドロキシクエン酸、またはその塩。
〔１６〕  性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患が前立腺癌である、前記〔１５〕記載のヒドロキシクエン酸、またはその塩。
【発明の効果】
【００１４】
前立腺癌においては、PSA検査スクリーニング・バイオプシー等で発見された初期のものは、ほとんど全てのケースにおいて、ホルモン感受性(依存性)と考えられており、臨床治療として薬物療法を選択した場合には、現時点ではホルモン療法のみが行われることが多い。HCAは、本願において、性ホルモン感受性の癌細胞の生育を阻害するが、正常細胞の生育には影響しないことが示された。ホルモン依存性の癌にのみ有効であるということは、一般的な抗癌剤のターゲットとされる他の増殖性の臓器（例えば、骨髄のような造血系及び生殖系）に対する影響（副作用）が少ないものと考えられる。さらに、従来の急性毒性試験では、HCAは、クエン酸よりも安全であることが示されていること、及び以前よりダイエット食品に用いられている点から考慮しても、例えば、前立腺癌の治療に用いた場合には、従来公知の抗腫瘍剤と比べ、副作用の少ないより安全な抗腫瘍剤となると期待され、癌治療の初期の段階において、ホルモン治療の代わり、或いは、ホルモン治療と併用することができる薬物となるものと期待される。さらに、HCAはイン・ビボにおいて、コレステロール合成を抑制することが知られていることから、内因性のステロイドホルモン(アンドロゲン、エストロゲン等)合成もHCA投与により減少させることも期待できる。従って、例えば、前立腺癌等のホルモン依存性腫瘍に対しては、本剤による腫瘍細胞の増殖抑制という直接作用の他、ホルモン合成の阻害による腫瘍細胞の増殖抑制の効果も期待でき、HCAは相乗的に作用する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】HCAの前立腺癌に対する効果を示す図である。表示される各条件(2mM HCA若しくはコントロールの2mMクエン酸の存在下または不在下)において癌細胞(A:LNCaP、B:PC-3、C:DU145)を培養した。全ての培養に、HCA及びクエン酸の溶媒として用いた1％容量の0.05％HClが含まれた。96時間培養した後に行ったMTTアッセイの結果を示す。
【図２】HCAの乳癌生育に対する効果を示す図である。表示される各条件(2mM HCA、6.5nMエストロゲン、若しくは両方の存在下または不在下)においてMCF-7細胞を培養した。全ての培養に、HCAの溶媒として用いた1％容量の0.05％HCl、及びエストロゲンの溶媒として用いた0.1％DMSOが含まれた。96時間培養した後に行ったMTTアッセイの結果を示す。
【００１６】
〔発明の実施の形態〕
本発明により、HCAまたはその塩を有効成分とする医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、性ホルモンに対して感受性の細胞の増殖を原因とする疾患を治療するのに有用である。従って、本発明によりさらに、本発明の組成物を用いた性ホルモンに対して感受性の細胞の増殖を原因とする疾患を予防及び/または治療する方法が提供される。【００１７】
HCAには、(2S,3S)、(2S,3R）、(2R,3S)、及び(2R,3R)の4種類の異性体が存在する。本発明の組成物に使用されるHCAは、上記いずれかの異性体またはその混合物、そのラクトン型、またはいずれかの塩である。HCAのナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、及びカルシウム塩等が知られており、いずれを利用することもできる。【００１８】
本発明の組成物を用いることができる性ホルモン感受性細胞の増殖を原因とする疾患（ステロイドホルモン感受性増殖性疾患）としては、これらに限定されるわけではないが、前立腺癌、乳癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、後腹膜繊維腫症、副腎腫瘍、一部の睾丸腫瘍を挙げることができる。本発明の組成物は、このような疾患を含む性ホルモン感受性細胞の増殖に起因する疾患の治療を目的として、ヒト、並びにイヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ネコ、ハムスター、ヒツジ、ブタ、マウス、モルモット、ラット、及びサル、チンパンジー、ヒヒ等の類人猿を含む他の哺乳動物に対して投与することができる。【００１９】
本発明の医薬組成物は、HCAまたはその塩に加え、その作用を阻害しない他の薬剤を含んでいてもよい。例えば、本発明の医薬組成物が、癌治療に用いられるものである場合には、HCAまたはその塩の他に、別の抗腫瘍剤が添加されていてもよい。特に、HCAと組み合わせでの前立腺癌のホルモン療法は、今後、重要な方法論になる可能性が期待できる。一次的な奏効率(癌のサイズの変化等)は相加的に上昇する程度のものと考えられるが、HCAにより、内分泌療法に伴う合併症である男性機能不全及び男性乳癌等のリスクの低減のみならず、実験的に女性ホルモン作用により誘発される可能性が示唆されている前立腺肥大症の悪化に対する懸念をも払拭できる。従って、HCAの前立腺癌ホルモン療法における併用は、二次的な奏効率(QOL向上、致死率の低下等)を高めるものと期待される。【００２０】
本発明の組成物は、経口または非経口（局所投与、皮下投与、筋肉内、静脈内、経直腸経鼻、経気管支等）に投与することができる。経口投与を目的とする場合、例えば、組成物をエリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、散剤、シロップ剤、糖衣錠、及び粉末等の形態に、公知の手法に従って調製することができる。また、非経口投与を目的とする場合には、例えば、注射または点滴用の溶液、坐剤等の形態とすることができる。【００２１】
本発明の組成物は、HCAまたはその塩に加え、投与される方法に応じて必要とされる薬理学的に許容される担体または溶媒を含むことができる。例えば、錠剤及びカプセル剤を調製する場合には、甘味剤(サッカリン、ショ糖、ラクトース等)、結合剤（アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、ゼラチン、トラガカントゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等）、香料(チェリー、ペパーミント等)、湿潤剤(アラビアゴム、高分子物質溶液、シロップ、セルロース溶液、澱粉糊等)、潤滑剤(固形ポリエチレングリコール、コロイド状シリカ、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク等)、潤沢剤(ステアリン酸及びその塩、タルク、鉱物油等)、着色剤、賦形剤(結晶性セルロース等)、分散剤、崩壊剤(カルボキシスターチナトリウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等)、膨潤剤(アルギニン酸、コーンスターチ、ゼラチン等)、保存剤等を添加することができる。さらに、カプセル剤の場合には、植物油等の液性の担体を使用することもできる。その他、必要に応じ、吸着剤(カオリン、ベントナイト、リン酸ジカルシウム等)、再吸収剤(四級塩等)、及び溶解遅延剤(硬化ヒマシ油、パラフィン、ワックス等)等を添加してもよい。【００２２】
シロップ剤、及びエリキシル剤は、各々、活性成分を非毒性の水溶液またはアルコール溶液に溶解することにより調製することができる。また懸濁剤とは、適当な非毒性担体中に、活性成分が分散された状態の薬剤形態を指す。これらの形態の組成物を得るため、必要に応じ、エトキシ化されたイソステアリルアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトールエステル類等を乳化剤として使用することができる。【００２３】
注射及び点滴による投与を目的とする場合には、生理的食塩水及び滅菌水の他、塩化ナトリウム、グルコース、D-ソルビトール、D-マンニトール、及びD-マンノース等の等張液、溶解剤(安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等)及び緩衝液(リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等)を含むゴマ油または大豆油等の油性溶液に薬剤成分が溶解された形態とすることができる。その際、必要に応じ、溶解剤として、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール等の多価アルコール、並びに、ポリソルベート及びHCO-50等の非イオン性界面活性剤を使用してもよい。さらに、鎮痛剤(塩酸プロカイン等)、安定剤(フェノール、ベンジルアルコール等)、抗酸化剤等を必要に応じ添加することもできる。また、粉末状態または凍結乾燥した活性成分を、注射直前に適当な溶液を用いて投与前に溶解する形態としてもよい。【００２４】
坐剤は、疎水性または親水性の基剤(カカオ脂、パルミチン酸ミリスチルエステル等の高級エステル類、ポリエチレングリコール等)に活性成分を練り合わせることによって得ることができる。【００２５】
急性毒性試験では、HCAは、クエン酸より安全であることが証明されている(特表2005-513107号公報)。(−)ヒドロキシクエン酸マグネシウムの毒性は、ラット腹腔内経路により2g/kg超であり、経口投与で7g/kg超である(特表2001-503744号公報)。抗腫瘍作用の発現がみられる用量は、イン・ビボにおいて、HCAのカルシウム塩で、急性毒性発現のHCA投与量の1/10を下回る200μg/ml（2ｍM強に相当）と推定され、抗腫瘍作用発現を目的としたHCAの投与は、安全域内で行えるものと考えられる。本発明の医薬組成物の投与量は、投与する患者の性別、体重、年齢、並びに、症状の種類及び程度、投与経路等を考慮して決定される。例えば、ヒトに対し経口投与する場合、(−)ヒドロキシクエン酸として、約8〜約12g/日以上、好ましくは約30〜約60g/日以上投与することができ、例えば、この分量を数回(例えば、2〜3回)に分けて投与してもよい(体重60kgの場合)。ヒト以外の動物に投与する際には、60kgの体重当りの量から換算した用量を用いることができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００２６】
以下、試験例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこの試験例により如何なる意味でも限定されるものではない。
(1) 材料
クエン酸及びHCA（和光純薬）は、各々、0.5N塩酸に溶解し、200mMの最終濃度に調製した。アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌セルラインとして、LNCaP(ATCC CRL-1740)、ホルモン非感受性ヒト前立腺癌セルラインとして、PC-3(ATCC CRL-1435)及びDU145(ATCC HTB-81)を使用した。LNCaP、PC-3及びDU145は、10％仔ウシ血清(FBS)及び2％ペニシリン・ストレプトマイシンを補ったRPMI1640培地で維持した。全ての細胞株は、37℃、5％CO2の条件で培養した。【００２７】
(2)細胞増殖/生存検査
細胞の増殖及び生存を定量するために、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを改変して行った。より詳細には、5×104個の細胞を12ウェル培養プレートで、2mM HCA(和光純薬)若しくは2mMクエン酸(和光純薬)を含むか、または薬剤を含まない1ml完全RPMI1640培地(10％FBS及び2％ペニシリン・ストレプトマイシン添加)中で培養した。培養を96時間行った後、100μlのMTT溶液(5mg/ml)を添加し、さらに3時間培養した。細胞を回収し、1mlジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。試料溶液の波長570nmにおける光学密度をマイクロプレートリーダー(イムノミニNJ-2300；コスモ・バイオ(株))を用いて測定した。【００２８】
接着非依存性の細胞増殖について評価するため、1×104個の細胞を、1.5g/mlでエタノールに溶解したポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(polyHEMA)によりコートした12ウェルプレート上、1mlメチルセルロース(1.2%)中で2週間培養した。細胞増殖、及び／またはアノイキスに対する試験化合物の効果を定量するため、MTTアッセイを行った。【００２９】
(3)アガロース電気泳動によるDNA断片化分析(DNAラダー)
DNA断片化検査のため、7×105個の細胞を10cmディッシュ(Nunc Inc.)に接種し、各条件下において96時間培養した。細胞を回収し、1500rpmで遠心した。ペレットをPBSで洗浄し、200μlの溶解バッファー(0.5%Triton X-100, 10mM EDTA, 10mM Tris-Cl (pH7.5))に4℃で30分間回転しながら溶解した。溶解物を遠心し、上清に、400μg/mlの最終濃度でRNaseを添加し、37℃で1時間培養した。続いて、400μg/mlの最終濃度でプロテイナーゼKを添加し、さらに37℃で2時間培養した。DNA沈殿は、2.5容量のイソプロパノール、及び1/5量の5M NaClを添加し、-30℃で12時間インキュベートすることにより行った。得られたDNA試料は、0.5mg/mlエチジウムブロマイドを含有する1.5％ゲル上で電気泳動し、紫外蛍光励起により明視化した。【００３０】
(4)結果
(4-1)HCAのアンドロゲン感受性前立腺癌の増殖に対する阻害効果
MTTアッセイの結果、HCAは、2mMの用量でアンドロゲン感受性前立腺癌セルラインLNCaPの細胞生長に対して明らかな阻害効果を示すが、アンドロゲン非感受性セルラインPC-3及びDU145の生育は阻害しないことが判明した(図1a)。接着非依存性細胞増殖についてのメチルセルロースアッセイ、及びアガロース電気泳動によるDNA断片化度合いの測定により、細胞死及び細胞増殖について試験した結果から、HCAの存在によりアノイキスを促進できることが示された(図1b及び1c)。【００３１】
(4-2)HCAの抗腫瘍の作用機構
HCAは、さらにエストロゲン存在下においてさえも、エストロゲン感受性乳癌細胞(MCF-7)の生育に対して阻害効果を示した(図2)。さらに、癌のホルモン療法において使用される薬剤と、HCAとを組み合わせて使用したところ、HCAは、ホルモンの抗腫瘍効果を妨げることなく、癌細胞の生育を相加的に阻害した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明により、HCAが、アンドロゲン感受性の癌細胞の生育を抑制することが明らかとなり、前立腺癌の進行及び転移を抑制する抗腫瘍剤となり得る可能性が示された。このようにアンドロゲン感受性の細胞の増殖を抑制することから、HCAが、前立腺肥大症(benign prostate hyperplasia;BPH)の予防にも効果を示すことが期待される。また、HCAは、エストロゲン感受性乳癌細胞の生育に対しても阻害効果を示したことから、前立腺癌に対するホルモン治療により引き起こされる「男性乳癌」を予防できる可能性がある。この結果はまた、アンドロゲンのみならず、その他の性ホルモンに対して感受性の癌、及び癌以外の過形成疾患に対してもHCAが有効である可能性を示唆するものである。よって、本発明により、性ホルモン感受性細胞の増殖に起因する疾患に対して有効な医薬組成物、並びに、それを用いた疾患の予防及び治療方法が提供された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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