(57)【要約】被験対象である野生種のバラが園芸種のバラと交雑しているか否かを検定する方法において、当該被験対象バラから得られた個体に指標となるトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子が存在するか否かを調べ、当該トランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子が存在すれば、当該被験対象バラは園芸種のバラと交雑していると判定することを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象である野生種のバラが園芸種のバラと交雑しているか否かを検定する方法において、当該被験対象である野生種のバラに、指標となるトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子が存在するかを調べることを特徴とする方法。
【請求項２】
被験対象である野生種のバラに指標となるトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子が存在しなければ被験対象である野生種のバラは園芸種のバラと交雑していないと判断する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験対象である野生種のバラに指標となるトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子が存在すれば、被験対象である野生種のバラは園芸種のバラと交雑していると判断する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
母系が野生種のバラであり、父系が園芸種のバラである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記園芸種のバラが、遺伝子を導入したバラである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子が、花色に関連する遺伝子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記花色に関連する遺伝子が、スミレ科パンジー由来のフラボノイド３′，５′−水酸化酵素遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記指標遺伝子の検出を、当概遺伝子の核酸のハイブリダイゼーションを介して行なう、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記検出をＰＣＲによる特異的増幅により行なう、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲを、フォワードプライマー：ＣＡＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣ（配列番号：３）及びリバースプライマー：ＴＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＣ（配列番号：４）により行なう、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記野生種のバラが、トランスポゾンを持たないＫＳＮ遺伝子をホモに有するバラである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記野生種のバラが、ノイバラ、テリハノイバラ、ハマナス、オオタカネバラ、カラフトイバラ、オオフジイバラ、アズマイバラ、ヤマテリハノイバラ、ヤマイバラ、カカヤンバラ、ヤエヤマノイバラ、ナニワイバラ、サンショウバラ、タカネバラ、ツクシイバラ、モリイバラ、フジイバラ、ヤブイバラ、ニオイイバラ、又はミヤコイバラである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記園芸種のバラが、トランスポゾンが挿入されたＫＳＮ遺伝子をホモに有するバラである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記園芸種のバラが、ハイブリッドティー、フロリバンダ、又はミニバラである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
被験対象である野生種のバラが園芸種のバラと交雑しているか否かを検定する方法において、指標となるトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子を増幅するためのプライマー対であって、配列番号１：に示す塩基配列の部分と同一又は実質的に相補的な塩基配列を有するプライマーと、配列番号：２に示す塩基配列の部分と同一又は実質的に相補的な塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対。
【請求項１６】
フォワードプライマー：ＣＡＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣ（配列番号：３）及びリバースプライマー：ＴＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＣ（配列番号：４）からなる、請求項１５に記載のプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は野生種のバラにおける園芸種のバラとの交雑の有無を検定する手法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
花卉産業においては新しい形質を持った花は常に珍重されるため、このような花き植物の開発は産業上重要である。主に交配を用いた品種改良により、さまざまな形質を有する品種が育種されてきた。しかしながら、交配による品種改良は、利用できる遺伝子資源が交配可能な近縁の植物に限定されているため、導入できる色や形質は限定される場合が多く、単一の植物種が多種多様な色や形質を有することはまれである。色で例えれば、青いバラ、カーネーション、黄色のアサガオ、ゼラニウムなどは交配による品種改良では開発することができなかった。
しかしながら、遺伝子組換えを用いればさまざまな遺伝子を種の壁を超えて任意の植物に導入し、植物の代謝等を人為的に改変することでより多彩な形質を実現することができる。例えば、デルフィニジンを花弁で生産できないバラやカーネーションにおいて、デルフィニジンを合成するために必要なフラボノイド３′，５′−水酸化酵素遺伝子を発現させることにより、デルフィニジンを生産させ、自然にはない青い花を作製した例がある（Ｔａｎａｋａ  ２００６）。
しかしながら、このように人為的に作出された遺伝子組換え植物の研究開発、栽培、流通などは日本では「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（カルタヘナ法）を遵守して行うことが求められている。他の国でも同様の法律に基づき、遺伝子組換え植物の野外での栽培などは規制されている。特に、花粉に稔性を有し、かつ交雑可能な近縁野生種が日本国内に多数存在する植物においては、交雑性、つまり、組換え植物から近縁野生種への遺伝子拡散の可能性について評価を行うことが義務付けられる。
バラのように我が国に近縁野生種が多数自生し、さらにそれらが多花で結実性に富む場合、園芸種と近縁野生種との交雑の有無については、解析量が膨大となるため、簡便で正確な解析技術の確立が求められる。これまでの報告では、マイクロサテライトを分子マーカーとして利用したもの（Ｄｅｂｅｎｅｒ  ２００３，２００６）が報告されている。その他、フローサイトメトリーを利用した倍数性の決定による同定法によっても解析できうる。しかしながら、いずれの方法も正確性や汎用性、簡便さにかけるという問題があった。また、現在のバラの園芸種は８種類程度の野生種を人為的に交雑することにより作られたものであるため園芸種と野生種とを区別するＤＮＡマーカーを得るのは容易でなかった。
本発明において指標遺伝子となるＫＳＮ遺伝子は、ロサ・キネンシス・スポンタネア（Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ  ｓｐｏｎｔａｎｅａ）から取得されたバラの四季咲き性に関与する遺伝子であり、この遺伝子は一季咲きのバラのＫＳＮ遺伝子に約９ｋｂのトランスポゾンが挿入されて生じたものである。トランスポゾンの挿入により当該遺伝子の発現が抑制され、茎頂における花芽の形成抑制が解除されるため、花芽形成が促進され、四季咲き性となることが報告されている（岩田ら、公開番号２００６−１４９２０２）。
園芸種のバラはトランスポゾンの挿入された当該遺伝子をホモで有することがすでに調べられている。一方野生種のバラは原則としてトランスポゾンを含まないＫＳＮ遺伝子をホモで有している。
なお、ロサ・キネンシス（Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）はバラの園芸種の祖先となった野生種の１つで一季咲きであり、ロサ・キネンシス・スポンタネア（Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ  ｓｐｏｎｔａｎｅａ）はこれの突然変異系統で四季咲きである。
【特許文献１】特開２００６−１４９２０２号公報
【発明の開示】
【０００３】
バラの野生種におけるバラの園芸種との交雑の有無を検定する方法はこれまでにも報告はあるが、汎用性に欠けていた。その他にも考え得る方法はあるものの、簡便性や正確性に欠けていた。これらの欠点を解決でき、バラのように結実性があり、近縁野生種が多数存在する植物について、野生種が園芸種と交雑しているか否かを検定する方法が求められている。
遺伝子組換え植物の遺伝子拡散の可能性を調べるために、膨大な個体数について交雑の有無を検定するような場合には、野生種のバラが、遺伝子導入された園芸種のバラを花粉親として交雑しているか否かを簡便に検定できる方法が特に必要である。従って、本発明は、被験体である野生種のバラが、遺伝子導入された園芸種のバラの花粉と交雑しているか否かを簡便に検定できる方法を提供使用とするものである。
本発明者らは、上記の課題を達成すべく種々検討した結果、野生種のバラにおいては、トランスポゾンを有するＫＳＮ遺伝子は園芸種のバラと交雑した場合にのみ検出されると着想し、トランスポゾンを有するＫＳＮ遺伝子を指標とすることにより、上記の課題が達成されることを見出し本発明を完成した。
従って、本発明は、被験対象である野生種のバラが園芸種のバラと交雑しているか否かを検定する方法において、当該被験対象バラにトランスポゾンを有するＫＳＮ遺伝子が存在するか否かを調べ、当該ＫＳＮ遺伝子が存在すれば、当該被験対象バラは園芸種のバラと交雑していると判定することを特徴とする方法を提供する。
通常、組換え植物の生物多様性影響評価試験におけるバラの園芸種と野生種の交雑においては、園芸種の花粉が飛散して周辺野生種と交雑することが問題である。従って、本発明の方法においては、典型的には、母方が野生種のバラであり、父方が園芸種のバラである。また、典型的には、前記園芸種のバラは、遺伝子を導入した遺伝子組換えバラであり、この場合の遺伝子としては、例えば、色に関連する遺伝子、例えばスミレ科パンジー由来のフラボノイド３′，５′−水酸化酵素遺伝子である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＰＣＲ法によるＫＳＮ遺伝子の検出の結果を示す。ＰＣＲにて検出された、イントロンを含むＫＳＮ遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子（内在性コントロール）の特異的増幅産物の位置を矢印で示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
園芸種と野生種
通常、園芸種のバラは４倍体（４ｘ）であり、四季咲きである。これに対して、野生種のバラは、通常２倍体（２ｘ）であり、一季咲きである。
園芸種のバラは、ハイブリッドテイー、フロリバンダ、ミニバラのように分類されるが、いずれも通常、トランスポゾンが挿入されたＫＳＮ遺伝子をホモに有する。即ち、本発明でいう園芸種のバラは、トランスポゾンが挿入されたＫＳＮ遺伝子をホモに有するバラを意味する。
一方、野生種のバラとして日本に自生するものには、ノイバラ、テリハノイバラ、ハマナス、オオタカネバラ、カラフトイバラ、オオフジイバラ、アズマイバラ、ヤマテリハノイバラ、ヤマイバラ、カカヤンバラ、ヤエヤマノイバラ、ナニワイバラ、サンショウバラ、タカネバラ、ツクシイバラ、モリイバラ、フジイバラ、ヤブイバラ、ニオイイバラ、又はミヤコイバラなどがあり、通常、トランスポゾンが挿入されていないＫＳＮ遺伝子をホモに有する。即ち、本発明でいう野生種のバラは、トランスポゾンが挿入されていないＫＳＮ遺伝子をホモに有するバラを意味する。
指標遺伝子
本発明の方法において、指標遺伝子としては、
（１）指標遺伝子は園芸種のバラには必ず存在し、生来の野生種のバラには存在しない。
（２）園芸種のバラは４倍体（４ｘ）であり、交雑の指標となる遺伝子は、４本の相同染色体の内、少なくとも３個に存在する必要があり、４本の相同染色体全てに存在することが好ましい。園芸種のバラは４倍体（４ｘ）であり、一方、生来の野生種のバラは２倍体（２ｘ）である。よって、園芸種のバラから生じる配偶子は通常２ｘ、野生種のバラの場合はｘであり、これらが交雑した結果生ずる雑種は３倍体（３ｘ）となる。このことから、交雑の指標遺伝子は、園芸種のバラの相同遺伝子の内、少なくとも３本に存在している必要があるが、園芸種のバラから不均一な減数分裂によって１倍体（ｘ）の配偶子が生ずる可能性も否定できないことを考えると、確実な検定のためには、４本全ての相同染色体に指標遺伝子が存在するのが好ましい。
（３）指標遺伝子の塩基配列の部分配列と同じ配列が、染色体の他の部分に存在しない。
被験植物に指標遺伝子が存在するか否かを検定するためには、通常、当該遺伝子を増幅する必要があり、このためには、標的遺伝子の部分に相補的な１対のプライマーを用いるＰＣＲ法が便利である。この場合に、当該プライマーとハイブリダイズする配列が、標的遺伝子以外に存在すれば、本来の標的遺伝子が存在しない場合であっても、その遺伝子が存在すると判断できる結果が得られる。従って、この要件は、プライマーの設計との関連において重要である。
具体的な指標遺伝子
上記の要件を満たす遺伝子としてトランスポゾンが挿入されたＫＳＮ遺伝子が上げられる。バラの四季咲きに関する遺伝子として報告されるＫＳＮ遺伝子（公開公報２００６−１４９２０２）．は、野生種において５１９アミノ酸をコードする完全な遺伝子として存在するが、園芸種においてはイントロン部分に約９ｋｂのトランスポゾンが挿入されていることが明らかとなっている。即ち、このトランスポゾンは野生種には存在せず、園芸種には必ず存在するから、このトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子は、前記（１）の要件を満たす。
また、このトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子は、園芸種のバラの４つの遺伝子の全てに存在する、従って、この遺伝子は前記の要件（２）を満たす。
このトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子は又、プライマーの選択により前記要件（３）を満たす。
プライマー及びプローブ
ＫＳＮ遺伝子（配列番号：１）、及びその中に挿入されているトランスポゾンの塩基配列（配列番号：２）は既に知られている。このトランスポゾンが挿入されたＫＳＮ遺伝子は、園芸種のバラにのみ特異的に存在する。このトランスポゾンが挿入されたＫＳＮ遺伝子をＰＣＲによって検出するためには、配列番号：１に示す配列と同一又は実質的に相補的な配列を有する１つのプラマーと、他方、配列番号：２に示す配列と同一又は実質的に相補的な配列を有する１つのプライマーとを対にして用いる必要がある。更に、プライマーとしての一般的な条件を満たす必要があり、いずれのプライマーも、サイズが１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上であり、且つ５０塩基以下、好ましくは３０塩基以下のオリゴヌクレオチドである。
本発明の目的からして、トランスポゾン中の増幅すべき領域は特に限定されないが、プライマー対の両者が当該トランスポゾン以外の部分とハイブリダイズすることは好ましくない。このような要件を満たすプライマー対の一例として、フォワードプライマー：ＣＡＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣ（配列番号：３）及びリバースプライマー：ＴＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＣ（配列番号：４）が挙げられる。
指標遺伝子の検出
バラからのＤＮＡの抽出、ＰＣＲなどによる増幅、及び増幅産物の検出は、常法に従って行なうことができる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例に従って発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００３）１３２，１６５２−１６６３に依った。
参考例１．ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）解析によるバラの園芸種特異的遺伝子の取得
野生種のバラにおける園芸種のバラとの交雑の有無を判定するため、ＲＡＰＤ解析による遺伝子多型の検出を利用し、園芸種のバラにのみ特異的に存在する遺伝子の取得を試みた。野生種（ミヤコイバラ）及び園芸種（ラバンデ及びＷＫＳ８２）のそれぞれの葉よりＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて、製造者が推奨する方法に従いゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ、任意のプライマー（ベックス社製コモンプライマーセット（ＣＭＮ−Ａ００））２μＭ、ｄＮＴＰ混合物０．４ｍＭ、１×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ０．０５ＵからなるＰＣＲ反応液を調整した。
反応は、９４℃で５分間反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させた。得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、野生種と園芸種間での泳動パターンを比較した。園芸種でのみ特異的に検出されたバンドをアガロースゲルより切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  Ｔｕｒｂｏ  Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）にて製造者が推奨する方法に従い精製を行った。最後にこれらをｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングし、シークエンス解析により配列の決定を行った。
各増幅フラグメントの配列を解析した。各フラグメントの両端にあるコモンプライマー配列を含む２０ｍｅｒ前後のオリゴプライマーを作成し、園芸種（ラバンデ、ＷＫＳ８２）でのみ特異的に増幅産物が検出されるオリゴプライマーの組み合わせを検討した。ミヤコイバラ、ラバンデ、ＷＫＳ８２の各ゲノムＤＮＡ  １０ｎｇを鋳型として、各オリゴプライマー２μＭ、１×ｄＮＴＰ混合物、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ０．０５μＭ、からなるＰＣＲ反応液を調整した。反応は、９４℃で５分間反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させた。得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、園芸種でのみ特異的に増幅産物が検出されるオリゴプライマーの組み合わせを検討した。その結果、園芸種でのみバンドを与えると考えられるオリゴプライマーの組合せを選び、以下、参考例２で示す実験を行った。
参考例２．特異的遺伝子の検出を指標とした後代における交雑有無の判定
野生種のバラに園芸種のバラの花粉を人為的に受粉させ得られた個体について、参考例１にて取得した園芸種特異的と考えられるオリゴプライマーの組合せに特異的な遺伝子の検出を指標として交雑の有無について検定した。取得した各後代の葉よりＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて製造業者が推奨する方法に従いゲノムＤＮＡを抽出した。
次にこれを鋳型とし、プライマー２μＭ、ｄＮＴＰ混合物０．４ｍＭ、１×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ０．０５Ｕを反応に供した。反応は、９４℃で５分反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させた。得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的バンドの検出の有無を確認した。しかしながら、個体の形態は明らかに中間的形質を示したにも関わらず、特異的バンドの検出の有無との相関性は得られなかった。このことから、今回得たＲＡＰＤマーカーは４本の相同染色体全てに含まれるものではなく、園芸種の４本の相同染色体の内、一部の染色体上にのみ存在する遺伝子配列に由来するものであることが推察された。即ち、交雑の有無の指標として不適当であると判断した。
実施例１．ＫＳＮ遺伝子の検出を指標とした後代における交雑有無の判定
野生種のバラに園芸種のバラの花粉を受粉させ、得られた個体について、四季咲き性を有するバラで特異的に検出されることが知られているトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子（ＷＯ２００４／０７００３６）の検出を指標として交雑の有無について検定した。本遺伝子上に正鎖のプライマーを、挿入されているトランスポゾン上に逆鎖のプライマーを設計し、トランスポゾンの挿入の有無による判定ができるように作製した。
人工交配により得られた各後代の葉よりＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて製造業者が推奨する方法に従いゲノムＤＮＡを抽出した。次にこれを鋳型とし、フォワードプライマーＫＳＮ１Ｆ３：５′−ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＧＣ−３′（配列番号：３）及びリバースプライマーＫＳＮｌｎｓＲ３：５′−ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＴＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＴＧＣ−５′（配列番号：４）各０．２μＭ、ｄＮＴＰ混合物０．２ｍＭ、１×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ０．６２５Ｕの合計２．５ｍｌからなる反応を作製し、反応に供した。反応は、９４℃で５分反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させた。得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約１．２ｋｂの特異的バンド検出の有無を確認した。また、バンドが検出された個体の形態が、園芸種と野生種の中間的形質を示すことを確認した。
このように、形態から園芸種のバラと野生種のバラとの交雑種であると判断できる個体について、トランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子が存在することが確認できた。このことから、トランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子を持たない個体は、園芸種のバラと野生種のバラとの交雑種ではないと判断できることが判明した。この特徴を鑑みれば、母系としてトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子を持たない種を用いた場合、後代の個体におけるトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子の有無を確認すれば、交雑個体であるかを判定でき得ることが示された。
実施例２．野生種のバラにおけるＫＳＮ遺伝子の存在の有無の判定
野性種のバラが本発明の検定方法の被験対象となり得るかを判断することを目的として、各野性種のバラにおけるトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子の存在の有無を評価した。野性種のバラとして、ノイバラ、テリハノイバラ、ハマナス、オオタカネバラ、カラフトイバラ、ヤマイバラ、ヤエヤマノイバラ、ナニワイバラ、サンショウバラ、ツクシイバラ、モリイバラ、フジイバラ、ヤブイバラ、ミヤコイバラを用い、実施例１に記載の方法に従いトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子（ＷＯ２００４／０７００３６）の存在の有無を検定した。
その結果、いずれの野生種のバラからもトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子の特異的増幅産物（増幅予想サイズ；約１．２ｋｂ）は検出されなかった。一方、内在性コントロールとしたＧＡＰＤＨ遺伝子は全野生種で増幅産物が検出された。よって、これら野生種のバラにおいてトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子の存在は認められなかった。
以上より、トランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子を指標とする本発明の方法は、野性種のバラを被験対象として好適に用いることができると判断された。
実施例３．人工交配により得られた後代における園芸種のバラとの交雑有無の検証
母系が野生種のバラであり、父系が園芸種のバラである後代個体について、本発明の検定方法を用いて交雑の有無を評価した。
常法に従い、野生種の開花直前に除雄、袋かけをした後、雌しべが十分に成熟した時点で晴天日の午前中に宿主（ＷＫＳ８２）あるいは組換え体（ＷＫＳ８２／１３０−４−１及びＷＫＳ８２／１３０−９−１）の花粉を付着させた。その後、他の花粉が付着しないように再度袋かけを行い、種子形成の有無を調査した。なお、花粉は開裂前の葯を回収後、シリカゲルを入れたデシケータ内で１日間室温放置し、翌日開裂した葯から回収した新鮮な花粉を用いた。
交雑母本として、野生種はノイバラ（Ｒ．ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ  Ｔｈｕｎｂ．ｅｘ  Ｍｕｒｒａｙ）、テリハノイバラ（Ｒ．ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ  Ｃｒ▲ｅ▼ｐ．）、ハマナス（Ｒ．ｒｕｇｏｓａ  Ｔｈｕｎｂ．ｅｘ  Ｍｕｒｒａｙ）を用いた。
交配後２ヶ月以上経過した時点で、生理落果せず、結実が認められた果実について種子形成の有無を確認した。さらに得られた種子を回収し、４℃で３ヶ月間低温処理した後、播種した。これらにおける宿主あるいは組換え体との交雑の有無、導入遺伝子の伝達の有無を確認するため、実施例１の方法に従いＰＣＲ法にて解析を行った。
また、種子を低温処理した場合、通常は１ヶ月程度で発芽が認められるが、３ヶ月経過してもその一部しか発芽が認められなかった。そこで、発芽しなかった播種種子の一部を再回収し、種子を用いて同様の解析を行った。再回収した種子より、Ｎｕｃｌｅｏｎ  ＰＨＹＴＯＰＵＲＥ  ｆｏｒ  ＰＬＡＮＴ  ＤＮＡ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、製造業者推奨の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。さらにＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてこれを増幅後、トランスポゾンの挿入されたＫＳＮ遺伝子の有無を指標としたＰＣＲ解析により、宿主あるいは組換え体との交雑の有無、導入遺伝子の伝達の有無について解析を行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。
ＧＡＰＤＨ遺伝子特異的プライマー
2008117860.tif 000002
結果を表１および表２に示した。結実率は宿主、組換え体いずれを花粉親とした場合でも極めて低かった。得られた実生をＰＣＲ法にて解析したが、トランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子は検出され、宿主あるいは組換え体と野生種との交雑は認められたものの、組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。さらに、発芽しなかった播種種子を再回収し、種子の充実について観察を行ったところ、そのほとんどが「しいな（種子の中身がないもの）」であり、正常な胚が確認できた個体はごくわずかであった。これらについても同様にＰＣＲ法にて解析を行ったが、トランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子は検出され、宿主あるいは組換え体と野生種との交雑は認められたものの、組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。このことから、組換え体の花粉細胞中に導入遺伝子が含まれていない等の理由により、導入遺伝子が後代に伝達されなかったものであると考えられた。
よって、本組換え体と野生種（ノイバラ、テリハノイバラ、ハマナス）が交雑したとしても、組換え体の花粉細胞中に導入遺伝子が含まれていない等の理由から、導入遺伝子が後代に伝達される可能性はないと考えられた。
なおテリハノイバラについては、いずれの種子も正常な胚を確認できなかった。
このように、本発明の検定方法を用いることにより、野生種のバラと園芸種のバラとの交雑の有無を極めて簡便に評価することができた。また、一般に、組換え体の花粉細胞中に導入遺伝子が含まれていない等の理由により導入遺伝子が後代に伝達されない場合には、交雑の解析に困難を伴うことが多い。しかしながら、本発明の検定方法を用いれば、交雑の有無を簡便に判断できる。よって、本発明の検定方法により、まず交雑の有無を判断し、交雑していると判断される場合には、さらに導入遺伝子の伝達の有無を調べることで、導入遺伝子が、交雑親の生殖細胞に存在しているか否かの推測が可能である。
【表１】
2008117860.tif 000003
【表２】
2008117860.tif 000004
実施例４．自然条件下における野生種のバラと園芸種のバラとの交雑の有無の検証
本発明の検定方法を用いて、自然条件下における野生種のバラと園芸種のバラとの交雑の有無を評価した。
屋外において、宿主あるいは組換え体から１ｍ、５ｍの距離に野生種（ノイバラ）を配置し、自然条件下での野生種との交雑性について調査した。本試験は宿主及び組換え体とノイバラが同時期に開花している条件下で実施した。なお、本試験開始以前に開花したノイバラの花については試験開始時に全て取り除いた後、所定の位置に配置した。
試験終了後３ヶ月以上経過した時点で、生理落果せず、結実が認められた果実について種子形成の有無を確認した。さらに得られた種子を回収し、４℃で３ヶ月間低温処理した後、播種した。これらにおける宿主あるいは組換え体との交雑の有無、導入遺伝子の伝達の有無を確認するため、実施例１の方法に従い、ＰＣＲ法にて解析を行った。
結果を表３に示した。いずれの地点から採集した種子より得られた実生においてもトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子は検出されず、宿主あるいは組換え体とノイバラとの交雑は認められなかった。
よって、自然条件下で本組換え体と野生種（ノイバラ）が交雑する可能性はないか、あっても極めて低いことが示唆された。
このように、本発明の検定方法を用いることにより、野生種のバラと園芸種のバラとの交雑の有無を極めて簡便に評価することができた。また、一般に、組換え体の花粉細胞中に導入遺伝子が含まれていない等の理由により導入遺伝子が後代に伝達されない場合には、交雑の解析に困難を伴うことが多い。しかしながら、本発明の検定方法で交雑の有無を簡便に判断できることから、交雑による導入遺伝子の伝達の有無についても、解析を容易に行うことができた。
【表３】
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実施例５．自生する野生種のバラから採取した種子における園芸種のバラとの交雑の有無の検証
本発明の検定方法を用いて、自然条件下における自生する野生種のバラと園芸種のバラとの交雑の有無を評価した。
自生する野生種のバラから、採取した種子より実施例３の方法に従い、トランスポゾンの挿入されたＫＳＮ遺伝子の有無を指標としたＰＣＲ解析により、園芸種のバラとの交雑の有無を検証した。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。
結果及び考察
結果を図１及び表４に示した。
計１７ヵ所から採集した約１８００種子について解析を行ったが、いずれの種子からもトランスポゾンを含むＫＳＮ遺伝子の特異的増幅産物（増幅予想サイズ；約１．２ｋｂ）は検出されなかった。一方、内在性コントロールとしたＧＡＰＤＨ遺伝子は全個体で増幅産物が検出された。
以上より、自生する野生種のバラから採集した全ての種子について、園芸種との交雑は無いと判断された。
このように、本発明の検定方法を用いることにより、野生種のバラと園芸種のバラとの交雑の有無を極めて簡便に評価することができた。
【表４】
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［配列表］
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【図１】
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【国際調査報告】
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