(57)【要約】泌尿器系悪性腫瘍の検出を行うための検出マーカー及び診断キット並びに泌尿器系悪性腫瘍の判定方法を提供する。ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎからなる泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカーによるものとする。【選択図】図１
2008032761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎからなる泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカー。
【請求項２】
抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を含有する泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカー。
【請求項３】
抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を含有する泌尿器系悪性腫瘍の検出キット。
【請求項４】
細胞を採取し、採取した前記細胞におけるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量を求める泌尿器系悪性腫瘍の判定方法。
【請求項５】
非癌部組織における細胞と判定対象の組織における細胞を採取し、
前記非癌部組織における細胞と前記判定対象の組織における細胞におけるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量をそれぞれ求め、
それらの比又は差を求める泌尿器系悪性腫瘍の判定方法。
【請求項６】
前記ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量をウエスタンブロット又は免疫組織化学染色法の少なくともいずれかで求める請求項４又は５記載の泌尿器系悪性腫瘍の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカー及びそれを用いた検出キット並びに泌尿器系悪性腫瘍の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。食道、肺、子宮頸癌、泌尿器（腎臓、尿管、膀胱）などに発生した癌は自覚症状が少なく、発見時には病状が進行している危険性が高いためより早期発見がより重要である。【０００３】
ところで、癌の簡便かつ確実な判断を可能とする方法として、癌組織特異的タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験体への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験体に対しても広範囲に実施することが可能である。例えば、下記特許文献１には、糖タンパク質３９の腫瘍マーカーとしての利用が開示されている。また、下記特許文献２には、新規抗原ペプチドを用いた癌診断のためのマーカーが開示されている。【０００４】
【特許文献１】特開平７−５１０６５号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０１８６７９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１に記載の技術は胃癌に関する技術であって、泌尿器系悪性腫瘍についてまで適用できるものではない。また特許文献２に記載の技術も大腸癌に関する技術であって、泌尿器系悪性腫瘍についてまで適用できるものではなく、また検討されていない。【０００６】
以上、本発明は、泌尿器系悪性腫瘍の検出を行うための検出マーカー及び診断キット並びに泌尿器系悪性腫瘍の判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討を行っていたところ、細胞間接着で重要な役割を果たすタンパク質ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現が泌尿器系悪性腫瘍、特に膀胱癌の組織において低下していることに基づきなされた。【０００８】
即ち、本発明の一手段に係る泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカーは、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎからなる。【０００９】
また、本発明の他の一手段に係る泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカーは、抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を含有する。【００１０】
また、本発明の他の一手段に係る泌尿器系悪性腫瘍の検出キットは、抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を含有する。【００１１】
また、本発明の他の一手段に係る泌尿器系悪性腫瘍の判定方法は、細胞を採取し、採取した細胞におけるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量を求める。なおこの手段において、限定されるわけではないが、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量を求める方法としてウエスタンブロット又は免疫組織化学染色法の少なくともいずれかを用いることが好ましい。【００１２】
また本発明の他の一手段に係る泌尿器系悪性腫瘍の判定方法は、非癌部組織における細胞と判定対象の組織における細胞を採取し、非癌部組織における細胞と前記判定対象の組織における細胞におけるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量をそれぞれ求め、それらの比又は差を算出する。なおこの手段において、限定されるわけではないが、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量を求める方法としてウエスタンブロット又は免疫組織化学染色法の少なくともいずれかを用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
以上、本発明は、泌尿器系悪性腫瘍の検出を行うための検出マーカー及び診断キット並びに泌尿器系悪性腫瘍の判定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は多くの異なる態様による実施が可能であり、以下に示す実施形態に狭く限定されるものではない。【００１５】
（ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎからなる検出マーカー）
本発明の一態様は、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎからなる泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカーである。後述する実験例において明らかなように、泌尿器系悪性腫瘍、特に膀胱癌癌細胞においてはタンパク質ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現が有意に低下しているため、タンパク質ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎを検出マーカーとすることで、泌尿器系悪性腫瘍細胞であるか否かを判定できる。【００１６】
患者から採取する細胞としては、限定されるわけではないが、血液、尿、喀痰、擦過細胞診などから採取する細胞を用いることができる。また、発現量を解析する方法としては、限定されるわけではないが、プロテオーム解析、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色法等を用いることができる。【００１７】
また、判定をより確実なものとするため、非癌部組織における細胞と泌尿器系悪性腫瘍細胞ではないかと疑われる細胞の双方を採取し、それぞれの細胞におけるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量をそれぞれ求め、それらの比又は差を算出することも好ましい態様である。【００１８】
（抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を含む検出マーカー及びこれを用いた検出キット）
また、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎに特異的に反応する抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を用いてこれを検出マーカーとして用いる態様も考えられる。抗体としてはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよく、この作製は周知の方法を採用することができ特には限定されない。【００１９】
またこの抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を担体に保持させて検出キットとすることもできる。担体は、抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を保持できる限り限定されるわけではないが、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド等の有機高分子化合物、アガロースゲル、セルロース等の多糖類、ガラス、シリカゲル等の無機物が好ましい。【００２０】
また、担体の形状としても上記機能を奏する限りにおいて限定されず、使用状態に応じて適宜選択可能であるが、例えば板状、粒子状、繊維状、フィルム状、カプセル状等が好ましい。【００２１】
（実験例）
上記実施形態の効果について確認するため以下の実験を行った。以下図面を用いて説明する。【００２２】
（組織試料の調整）
組織試料は、組織試料採取前にいかなる抗癌補助療法も受けていない５症例の膀胱癌患者それぞれから癌部組織及び非癌部組織を採取することによって得た。ここで「癌部組織」とは、膀胱癌病変部であって肉眼的に変性の無い部位における組織であり、「非癌部組織」とはこの膀胱癌病変部から３ｃｍ以上離れた組織をいう。なお組織試料は、採取後１時間以内に２０％ホルマリン液にて固定し、パラフィンに包埋し常温にて保存した。【００２３】
（免疫組織化学染色）
膀胱癌手術症例５例の手術切除組織標本より４μｍ厚の薄切切片を作成し、免疫組織化学染色を行った。ＤＡＫＯ抗原賦活用クエン酸緩衝液（Ｓ２０３１）（ＤＡＫＯ  Ｊａｐａｎ，京都）を用いて９５℃にて４０分間抗原賦活処理を行った後、０．３％  Ｈ２Ｏ２／メタノール溶液１５分室温にて処理．ＰＢＳにて３回洗浄の後１％ブタ血清／ＰＢＳ  １時間でブロッキング、５０倍希釈（１％  ＢＳＡ/ＰＢＳ）抗−ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）３０分間（室温）にて一次抗体反応を行いＰＢＳにて洗浄後ＤＡＫＯ  ＬＳＡＢ＋キット（ＤＡＫＯ  Ｊａｐａｎ，京都）にてマニュアルに従いＤＡＢ発色にて検出した。３０秒間ヘマトキシリンで核染色を行った後１００％エタノールおよびキシレンで脱水透徹、マリノールとカバーグラスで封入し、観察した。【００２４】
ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎはｐｌａｋｉｎ族に属するタンパク質であり、重層扁平上皮で表層に分化した角化細胞の細胞膜表面に発現する蛋白として見つかった。なお、増殖型類天疱瘡ではｐｅｒｉｐｌａｋｉｎに対する自己抗体の産生が分かっており、抗原であるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎとの抗原抗体反応が発症に関わっていることが分かりつつある。【００２５】
発現量の変化だけでなく細胞内の局在の変化も観察した。手術標本切片より抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を用いた免疫組織化学染色を示す（図１参照）。非癌部粘膜においてはｐｅｒｉｐｌａｋｉｎは主に非癌細胞の細胞膜に発現しているが、対照的に癌部ではｐｅｒｉｐｌａｋｉｎは発現していなかった。特に表層型の早期癌の症例ではその発現により癌部と非癌部の境界が明瞭に認識できた。１例の癌部においてはｐｅｒｉｐｌａｋｉｎが若干発現しているのが確認されたが、これらの症例ではｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現は細胞質内であり、局在が変化していた。【００２６】
（考察）
以上の結果により、デスモソーム関連の１９５ｋＤａのタンパク質であるｐｅｒｐｌａｋｉｎが泌尿器系悪性腫瘍、より好ましくは膀胱癌において発現の低下を示すことが示された。以上、上記実施形態について効果の確認することができ、検出マーカー及びそれを用いた診断キット等を提供することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】膀胱癌組織における抗Ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を用いた免疫組織化学染色によるＰｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現解析の画像。
【図１】
2008032761.tif 000003
【国際調査報告】
2008032761.tif 000004
2008032761.tif 000005