【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｒＰｓｃプリオン蛋白またはその代用物で汚染された表面、懸濁液または溶液を
（１）プリオン蛋白を、非感染性分子量を有するフラグメントに開裂するのに有効な１種以上の酵素と、
（２）前記ＰｒＰｓｃプリオン蛋白を高次構造変性(conformational unfolding)するが、１種以上の前記酵素を変性(denaturing)しないように選択される１以上の作用因子と
の組み合わせを用いて同時に処理する工程を含む不活性化方法。
【請求項２】
前記処理が、開裂後に、予め決められた分子量よりも小さな分子量を有するタンパク質フラグメントの予め決められた割合をもたらすように選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
開裂後のタンパク質フラグメントのうち少なくとも９０％が２７ｋＤａ以下の分子量を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
開裂後のタンパク質フラグメントのうち少なくとも９０％が２５ｋＤａ以下の分子量を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
開裂後のタンパク質フラグメントのうち少なくとも９０％が２３ｋＤａ以下の分子量を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記組み合わせに
（３）プリオン蛋白の開裂を妨げることなく、１種以上の前記酵素の変性を促進または保護するように選択された１以上の作用因子
が更に含まれている請求項１記載の方法。
【請求項７】
条件が再生（refolding）より変性（unfolding）を有利に行うように選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
高次構造変性するように選択された１以上の前記作用因子が、照射、電界、磁界、エネルギー性の振動およびこれらの組み合わせから成る群より選択される１以上の作用因子を包含する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
エネルギー性の振動が、超音波、電磁波または機械的な振動のうち１以上である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
１種以上の前記酵素が、タンパク質分解酵素およびタンパク質分解活性を有する酵素から選択される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
変性を促進するように選択される１以上の前記作用因子が、熱、ｐＨ、タンパク質を変性させ易い有機溶媒、カオトロピック剤、タンパク質を結合させ易い界面活性剤、強いタンパク質変性剤である無機塩、Ｓ−Ｓ結合を切断させる試薬、アミノ酸の親水性残渣に対して強い親和性を有する物質、アミノ酸の疎水性残渣に対して強い親和性を有する物質、表面での吸着を促進する物質、アニオン性界面活性剤およびこれらの組み合わせから成る群より選択される請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記変性作用因子が、求核性溶媒、弱いプロトン性安定化溶媒、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、双性イオンおよび両性界面活性剤、バッファー、界面活性なホモ-コポリマーまたはブロック-コポリマー、硫酸化物、デオキシコール酸エステル(deoxycholate)、グリコサミノグリカンおよびこれらの組み合わせから成る群より選択される請求項６および請求項６に従属する請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（１）プリオン蛋白を、非感染性分子量を有するフラグメントに開裂するために有効に選択される１種以上の酵素と、
（２）ＰｒＰｓｃプリオン蛋白を高次構造変性するが、１種以上の前記酵素を変性しないように選択される１以上の作用因子と
を含有する、ＰｒＰｓｃプリオン蛋白またはその代用物で汚染された表面を処理するための組成物。
【請求項１４】
１以上の前記作用因子が、開裂後に、予め決められた分子量よりも小さな分子量を有するタンパク質フラグメントの予め決められた割合をもたらすように選択される請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
１以上の前記作用因子が、開裂後のタンパク質フラグメントのうち少なくとも９０％が２７ｋＤａ以下の分子量を有するように選択される請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
１以上の前記作用因子が、開裂後のタンパク質フラグメントのうち少なくとも９０％が２５ｋＤａ以下の分子量を有するように選択される請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
１以上の前記作用因子が、開裂後のタンパク質フラグメントのうち少なくとも９０％が２３ｋＤａ以下の分子量を有するように選択される請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
プリオン蛋白の開裂を妨げることなく、１種以上の前記酵素の変性を促進または保護するように選択される１以上の作用因子
を更に含有する請求項１３記載の組成物。
【請求項１９】
ＰｒＰｓｃプリオン蛋白またはその代用物で汚染された表面を、請求項１３〜１８のいずれかに記載の組成物を用いて処理する方法。
【請求項２０】
表面が、医療用または手術用装置の表面である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
表面が、食品調製用または病院の作業面である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
本出願明細書の実施例に実質上記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
発明の開示
第一の態様によれば、本発明は、ＰｒＰｓｃプリオン蛋白またはその代用物で汚染された表面を、
（１）プリオン蛋白を非感染性分子量を有するフラグメントに開裂するのに有効な１種以上の酵素と、
（２）前記ＰｒＰｓｃプリオン蛋白を高次構造変性するが１種以上の前記酵素を変性しないように選択される１以上の作用因子と
の組み合わせを包含する処方を用いて同時に処理する工程を含む不活性化方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
第二の態様によれば、本発明は、
（３）プリオン蛋白の開裂を妨げることなく、１種以上の前記酵素の変性を促進または保護するように選択された１以上の作用因子
を更に含む前記第一の態様の方法を提供する。好ましくは、条件は再生より変性が有利になるように選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本明細書において「プリオン代用物（prion surrogate）」はＦＤＡの定義に従い、即ちβ−ホールディング（folding）の存在による同様のタンパク質分解酵素耐性を有するタンパク質である。ここで、「作用因子」は、アニオン性界面活性剤、ｐＨ調節剤などの化学試薬と、圧力、温度、照射などの物理的および／または熱力学的条件および本発明で要求されるような折りたたみ(folding)または変性を促進する他のエネルギー的な影響に有効な非化学的因子の両者を包含する。折りたたみ作用因子は、「再生(refolding)」作用因子とも呼ばれる。変性(unfolding)作用因子は、「変性(denaturing)」因子とも呼ばれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
（９）特定の表面、および空気／液体界面などのように、ゼオライトを含む界面への吸着。これらは、限定的ではないが、例えば微分割アルミナ、シリカおよび他のクロマトグラフおよび静止相を包含する。
（１０）超音波エネルギー、赤外線およびマイクロ波照射、高い圧力、そして電界および／または磁界の作用にプロトンを付す事は、変性（再生）を促進することができ、しかも浸透または攪拌が有効なことがある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、ラエムリ・ユーケイー(Laemmli U. K.)著、ネイチャー、227、680〜685頁（1970年）に記載の方法を用いて行った。タンパク質溶液を、２％ＳＤＳを含有する試料バッファー中で２分間煮沸した。1.5ｍｍのポリアクリルアミドスラブゲル（８〜１２％）１レーンにつきタンパク質10ミリリットルを添加して、非還元条件に付した（すなわち、試料バッファー中にはβ-メルカプトエタノールがなかった）。染料前面がゲルの底部に達するまで、電気泳動を150Ｖで１時間行った。次に、ゲルを取り出して、クーマシーブリリアントブルーＲ-250（シグマ社製）または銀染料（バイオ-ラッド(Bio-Rad)社製）を用いた染色によってタンパク質バンドを可視化した。タンパク質の分子量は、予備染色した低分子量マーカー（バイオ-ラッドマーカー１６１−０３１８）を用いて得られた較正曲線を使用することにより求めた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
変性剤と酵素の組み合わせ作用後に14.4ＫＤａ（リソザイムの分子量）以上の分子量を有するフラグメントが検出されなければ、タンパク質の開裂は十分であると考えられた。これは、処理が代用物に有効であったことを示している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
14.4ＫＤａ以上の分子量を有するペプチドフラグメントがあれば、結果は陽性と記録された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
表１は、対象実験１−１〜６−１において、分子量14.4ｋＤａ以上のフラグメントが検出され、同様にＰｒＰｓｃが検出されたことを示している。しかし、実験１−２〜６−２では、分子量14.4ｋＤａ以上のフラグメントが検出されず、またＰｒＰｓｃが検出されなかった。
１−１は、１−２が変性剤（３％ＤＯＢＳ）を含んで70℃、30分で有効であったことから、１−２とは異なる。
２−２および３−２はそれぞれ超音波処理を包含する点で、２−１および３−１と異なる。２−２では、変性剤３％ＤＯＢＳを２５％Terric164（折りたたみ剤）と組み合わせることにより、40ｋＨｚで超音波処理しながら25℃で有効であった。３−２では、変性剤としての10％ＳＤＳと折りたたみ剤としての両性界面活性剤を用いることにより、2.6ｍＨｚで同様の結果が得られた。
４−２は、ホウ砂をＳＤＳと組み合わせて、より高温で行った点で、４−１とは異なる。
５−２は、ホウ素を用いずにＤＯＢＳとTritonＸ-100を組み合わせた点で、５−１とは異なる。
６−２は、ＤＭＳＯの濃度を可逆的な変性（0.05％）から不可逆性変性（0.5％）へ増加させた点で、６−１とは異なる。