(57)【要約】  溶解性が向上し、短時間で調製され、迅速に臨床現場で使用されうるフィブリノゲン製剤およびそれを用いる組織接着剤を提供する。フィブリノゲンを主成分とし、アルブミン、非イオン性界面活性剤、塩基性アミノ酸またはその塩、および酸性アミノ酸またはその塩および中性アミノ酸またはその塩から選択される少なくとも２種のアミノ酸またはその塩を含有することを特徴とする固体状フィブリノゲン製剤。また、本発明の固体状フィブリノゲン製剤は、その構成成分を医療用基材に固定化することによりフィブリノゲン固定化基材とすることができる。さらに、当該フィブリノゲン固定化基材を、トロンビンを主成分とする成分と組み合わせて、フィブリン接着剤とすることもできる。
2008117746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンを主成分とし、以下の各成分を含有することを特徴とする固体状フィブリノゲン製剤：
ａ）アルブミン
ｂ）非イオン性界面活性剤
ｃ）塩基性アミノ酸またはその塩および
ｄ）酸性アミノ酸またはその塩および中性アミノ酸またはその塩の中から選択される少なくとも２種のアミノ酸またはその塩。
【請求項２】
当該塩基性アミノ酸またはその塩が、アルギニンまたはその塩、およびリジンまたはその塩のいずれかである請求項１に記載の固体状フィブリノゲン製剤。
【請求項３】
当該酸性アミノ酸またはその塩がグルタミン酸、アスパラギン酸、またはそれらの塩で、当該中性アミノ酸またはその塩がイソロイシン、ロイシン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、またはそれらの塩のいずれかである請求項１に記載の固体状フィブリノゲン製剤。
【請求項４】
当該ｄ）成分が、以下の少なくとも２のグループから選択される少なくとも２種のアミノ酸またはその塩である請求項３に記載の固体状フィブリノゲン製剤：
ｄ−１）グルタミン酸、またはアスパラギン酸
ｄ−２）イソロイシン、またはロイシン
ｄ−３）グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、またはグルタミン。
【請求項５】
当該ｃ）成分およびｄ）成分の組み合わせが、下記のいずれかである請求項１から４のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤：
・アルギニン、グルタミン酸およびイソロイシン、またはそれらの塩
・アルギニン、グルタミン酸およびグリシン、またはそれらの塩
・アルギニン、グリシンおよびイソロイシン、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・リジン、イソロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、ロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、アラニンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、セリンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、トレオニンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グルタミンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グリシンおよびアスパラギン酸、またはそれらの塩。
【請求項６】
血液凝固第ＸIII因子、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、またはアプロチニンから選択される少なくとも一つをさらに含有する請求項１から５のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤を、トロンビンを主成分とする成分と組み合わせることを特徴とするフィブリン接着剤。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤の構成成分を医療用基材に固定化することを特徴とするフィブリノゲン固定化基材。
【請求項９】
請求項８に記載のフィブリノゲン固定化基材を、トロンビンを主成分とする成分と組み合わせることを特徴とするフィブリン接着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用医薬品の分野に関し、詳細には組織接着剤の構成成分であるフィブリノゲンおよびフィブリノゲン製剤に関する。さらに詳細には、フィブリノゲンを主成分とし、アルブミン、非イオン性界面活性剤、塩基性アミノ酸、および酸性アミノ酸または中性アミノ酸から選択される２種以上のアミノ酸を含有することを特徴とする、溶解性に優れた固体状フィブリノゲン製剤およびそれを用いる組織接着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、いわゆる凝固カスケードの最終段階に存在する非常に重要な凝固因子である。フィブリノゲンは、例えば損傷後の凝固系の活性化において、トロンビンによりその可溶性形態から、止血および創傷治癒に重要な寄与をする不溶性のフィブリンに変換される。【０００３】
フィブリノゲンは止血および創傷治癒に対して重要性を有し、例えば先天性および後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法で静脈投与製剤として臨床的に使用され、血液中のフィブリノゲン濃度を高めることによって重篤な出血を阻止する。さらに、近年、フィブリノゲンはトロンビンと混合させることにより、外科手術において肝臓又は脾臓のような軟部器官の縫合代用の接着剤として、または縫合補助剤として使用されていると同時に、その他幅広い臨床の現場で応用されている。【０００４】
このような製剤は、傷または組織表面への接着能力を有し、接着部位または接ぎ合わされた傷の引っ張り強度を高めるとともに、生体内で完全に吸収されるものであり、傷の治癒を促進する特性を持つ。【０００５】
特許文献１の記載により明らかなように、フィブリノゲンおよび血液凝固第XIII因子（第XIII因子）を含有する組織接着剤の製造方法が公知である。第XIII因子はトロンビンによってカルシウムイオンの存在下に活性化され（活性化XIII因子）、この活性化XIII因子は、フィブリン分子間にイソペプチド結合による架橋、すなわちγダイマーを形成し、フィブリン凝塊の物理的強度と安定性を高める。そのため、組織接着剤として汎用されているフィブリン接着剤中には、精製された第XIII因子が付加的に添加されたものか、フィブリノゲンの調製を通じて原料から混入してくるものかは別にして、実質的に必要な量の第XIII因子が含まれている。ここでいう実質的に必要な量とは、γダイマーを生じる濃度である（非特許文献１）。【０００６】
組織接着剤は溶液状態では安定とは言えず、冷凍保存液または凍結乾燥粉末の形で製剤化されたものが、医療現場において利用されている。したがって、入手可能な市販の製剤は、適用前に解凍するか、凍結乾燥品から再水和する必要があり、いずれの方法でもかなり時間が浪費される。【０００７】
また、フィブリン接着剤としての接着作用を十分に得るためには、フィブリノゲンを高濃度に溶解させることが必要であり、凝固しうるフィブリノゲン濃度は高濃度であるほど有利である。ところが、このような高濃度フィブリノゲン溶液をフィブリノゲン凍結乾燥物から調製するにはかなりの時間を要し、緊急を要する外科手術での使用に適さないという問題があった。フィブリノゲン凍結乾燥物の溶解操作等、調製に時間を要した場合は患者に悪影響を及ぼすことも危惧される。【０００８】
また、高濃度に調製されたフィブリノゲン溶液は、凍結乾燥粉末を再水和する際に泡立ちが起きやすい。再水和後のフィブリノゲン液は一旦注射器のような塗布用器具に移されるが、液の泡立ちは更なる準備時間の延長をもたらすため、臨床現場ではより消泡性の良い製剤が求められている。【０００９】
これらの理由から、医師の側からは、特に外科処理を含む救急状況においては、迅速に利用できることが決定的に重要であるが故に、調製時間の短縮が求められている。【００１０】
既述の理由から、凍結乾燥品の再水和時間の改善のために、夥しい施行がなされてきた。例えば、特許文献２には、加温、攪拌を連結した装置を用いることによる凍結乾燥医薬品の溶解性を向上する方法および手順が記載されているが、依然として十分とは言い難い。【００１１】
難溶解性タンパク質は、ある種の添加物によってその溶解性が改善されえることが知られている。例えば、特許文献３には、尿素またはグアニジン残基を有する物質を含有する凍結乾燥したフィブリノゲン組成物が開示されている。同様に、特許文献４において、少なくとも１種の生物学的に適合し得る界面活性剤を含有する凍結乾燥したフィブリノゲン組成物が開示されている。しかしながら、いずれかの方法を用いて調製された市販製剤においても、凍結乾燥粉末からの再水和にはかなりの時間を必要とすることから、更なる溶解時間の改善が求められている。【００１２】
【特許文献１】特公昭６３−４０５４６号公報
【特許文献２】カナダ特許１,１８２,４４４号公報
【特許文献３】特公平４−７３２８号公報
【特許文献４】特開平２−３６８７２号公報
【非特許文献１】Dickneite, G., et al., Pharma Medica 21(9), p.105-118 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような状況下、本発明の課題は、従来技術と比較して調製時間が短縮され、より迅速に臨床現場で使用されうるフィブリノゲン製剤およびそれを用いる組織接着剤を提供することを目的とするものである。【００１４】
上記課題の中で問題となるのは、従来技術と同様に使用でき、さらに調製時間の短縮が必要とされる点である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
そこで、本願発明者らは上述の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、フィブリノゲンを主成分とした組成中に、アルブミン、非イオン性界面活性剤、塩基性アミノ酸、および酸性アミノ酸または中性アミノ酸から選択される２種以上のアミノ酸を共存させることにより、再水和時間を著しく短縮させることに成功し、本発明を完成させるに至った。【００１６】
本発明は固体状態で安定であり、調製時間を短縮するフィブリノゲン製剤として、下記の発明を含むものである。
（１）フィブリノゲンを主成分とし、以下の各成分を含有することを特徴とする固体状フィブリノゲン製剤：
ａ）アルブミン
ｂ）非イオン性界面活性剤
ｃ）塩基性アミノ酸またはその塩および
ｄ）酸性アミノ酸またはその塩および中性アミノ酸またはその塩の中から選択される少なくとも２種のアミノ酸またはその塩。
（２）当該塩基性アミノ酸またはその塩が、アルギニンまたはその塩、およびリジンまたはその塩のいずれかである上記（１）に記載の固体状フィブリノゲン製剤。
（３）当該酸性アミノ酸またはその塩がグルタミン酸、アスパラギン酸、またはそれらの塩で、当該中性アミノ酸またはその塩がイソロイシン、ロイシン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、またはそれらの塩のいずれかである上記（１）に記載の固体状フィブリノゲン製剤。
（４）当該ｄ）成分が、以下の少なくとも２のグループから選択される少なくとも２種のアミノ酸またはその塩である上記（３）に記載の固体状フィブリノゲン製剤：
ｄ−１）グルタミン酸、またはアスパラギン酸
ｄ−２）イソロイシン、またはロイシン
ｄ−３）グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、またはグルタミン。
（５）当該ｃ）成分およびｄ）成分の組み合わせが、下記のいずれかである上記（１）から（４）のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤：
・アルギニン、グルタミン酸およびイソロイシン、またはそれらの塩
・アルギニン、グルタミン酸およびグリシン、またはそれらの塩
・アルギニン、グリシンおよびイソロイシン、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・リジン、イソロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、ロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、アラニンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、セリンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、トレオニンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グルタミンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グリシンおよびアスパラギン酸、またはそれらの塩。
（６）血液凝固第ＸIII因子、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、またはアプロチニンから選択される少なくとも一つをさらに含有する上記（１）から（５）のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤。
（７）上記（１）から（６）のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤を、トロンビンを主成分とする成分と組み合わせることを特徴とするフィブリン接着剤。
（８）上記（１）から（６）のいずれかに記載の固体状フィブリノゲン製剤の構成成分を医療用基材に固定化することを特徴とするフィブリノゲン固定化基材。
（９）上記（８）に記載のフィブリノゲン固定化基材を、トロンビンを主成分とする成分と組み合わせることを特徴とするフィブリン接着剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、従来技術と比較して短時間で液状に再水和される固体状のフィブリノゲン製剤の提供が可能となった。本発明により得られたフィブリノゲン製剤は、再水和時間が短縮されたことにより、緊急時に、より迅速に使用できるという優れた利点を有する。さらに界面活性剤の添加による消泡効果により、再構成後のフィブリノゲン液の抜き取りを迅速に行うことができ、更なる調製時間の短縮がもたらされるという利点も有する。【００１８】
また、本発明により得られるフィブリノゲン組成物を基材に予め固定化した製剤とすることにより、溶解液での再水和無しに、患部に直接適用可能なフィブリノゲン製剤の提供も可能となる。本発明によるフィブリノゲンが固定化された基材は適応部位のわずかな水分で迅速に溶解するために、より短時間で強い接着力を発揮することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のフィブリノゲン組成と従来技術に基づくフィブリノゲン組成における再水和時間を比較した図。
【００２０】
【図２】再水和時間短縮に必要な添加剤を示す図。
【００２１】
【図３】本発明のフィブリノゲン組成の各アミノ酸を置換した場合の再水和時間を示す図。
【００２２】
【図４】本発明のフィブリノゲン組成と従来技術に基づくフィブリノゲン組成における抗張力を比較した図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の固体状フィブリノゲン製剤は、好適な緩衝液、例えば塩化ナトリウム、クエン酸３ナトリウムを含む溶液中に、フィブリノゲンを主成分とし、実質的に必要な量のアルブミン、非イオン性界面活性剤、塩基性アミノ酸、および酸性アミノ酸または中性アミノ酸から選択される２種以上のアミノ酸を含有する。【００２４】
本製剤に含まれるフィブリノゲンの濃度は、好ましくは40mg/mL以上、さらに好ましくは80mg/mL以上であることが好ましい。【００２５】
本製剤に含まれるアルブミンは、血清アルブミンが好ましい。本製剤がヒトに適用される場合、ヒト血清アルブミンであることが好ましい。本製剤に含まれるアルブミンの濃度は、5mg/mL以上であることが好ましい。上限については、当業者が常識的に判断しうる濃度で適宜判断されればよく、特に限定されるものではないが、例えば15mg/mLの濃度である。【００２６】
また、本製剤に含まれる非イオン性界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド等の脂肪酸系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルグリコシド等の高級アルコール系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のアルキルフェノール系界面活性剤が挙げられる。中でも、Tween系界面活性剤やTriton系界面活性剤は好適な一例である。このような好適な非イオン界面活性剤の一例として、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート（Tween80）やチロキサポールが挙げられる。【００２７】
当該非イオン性界面活性剤の濃度は、各々の界面活性剤の臨界ミセル濃度以上が必要であり、0.1mg/mL以上であることが好ましい。上限については、当業者が常識的に判断しうる濃度で適宜判断されればよく、特に限定されるものではないが、例えば0.5mg/mLの濃度である。【００２８】
また、本製剤に含まれる塩基性アミノ酸としては、アルギニンまたはその塩、およびリジンまたはその塩のいずれかから選択される。【００２９】
また、本製剤に含まれる酸性アミノ酸または中性アミノ酸として、酸性アミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはそれらの塩で、中性アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、またはそれらの塩で、これらアミノ酸のいずれかから２種以上が選択される。【００３０】
さらに、当該酸性アミノ酸または中性アミノ酸として、以下の少なくとも２のグループから少なくとも２種のアミノ酸またはその塩が選択される：
（１）グルタミン酸、またはアスパラギン酸
（２）イソロイシン、またはロイシン
（３）グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、またはグルタミン。【００３１】
さらに、上記塩基性アミノ酸と当該酸性アミノ酸または中性アミノ酸との好ましい組み合わせの例を以下に示す：
・アルギニン、グルタミン酸およびイソロイシン、またはそれらの塩
・アルギニン、グルタミン酸およびグリシン、またはそれらの塩
・アルギニン、グリシンおよびイソロイシン、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・リジン、イソロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、ロイシン、グリシンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、アラニンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、セリンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、トレオニンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グルタミンおよびグルタミン酸、またはそれらの塩
・アルギニン、イソロイシン、グリシンおよびアスパラギン酸、またはそれらの塩。【００３２】
また、本製剤に含まれる各アミノ酸またはその塩の濃度は、2mg/mL以上であることが好ましい。特に好ましいアミノ酸の組み合わせの例である、アルギニン、イソロイシン、グリシンおよびグルタミン酸の場合、その濃度はそれぞれ、3mg/mL、3mg/mL、2mg/mLおよび2.5mg/mL以上であることが好ましい。上限については、当業者が常識的に判断しうる濃度で適宜判断されればよく、特に限定されるものではないが、例えばそれぞれ、36mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、30mg/mLの濃度である。【００３３】
本発明のフィブリノゲン製剤は、フィブリン凝塊の物理的強度と安定性を高めることを目的として、付加的に第XIII因子が添加されうる。本製剤に含まれる第XIII因子の濃度は、フィブリン分子間にイソペプチド結合による架橋、すなわち、γダイマーを生じさせうる濃度の第XIII因子を含有させる必要があり、例えば製剤1mLあたり0.4単位以上であることが好ましい。【００３４】
本発明に使用されるフィブリノゲン、アルブミン、第XIII因子を製造する方法は特に限定されることはなく、例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組み換え技術により作製する方法などによって製造することができる。【００３５】
本発明に係る製剤の主成分であるフィブリノゲンは公知の方法で調製される。そのようなものとして、例えば冷エタノール沈澱法にグリシンによるフィブリノゲンの溶解度低下効果を組み合わせた方法（Blomback,B.およびBlomback,M., Arkiv Kemi, 10, p.415-443 (1956)）およびグリシンを単独で使用するグリシン沈澱法（Kazal,L.A.ら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 113, p.989-994 (1963)）等が報告されている。また、フィブリノゲンは遺伝子組換え法により作製されたものを用いてもよい。【００３６】
第XIII因子は公知の方法で調製される。そのようなものとして、例えば、血漿から精製する方法（Curtis, CG., Lorand,L., Methods Enzymol., 45, p.177-191 (1976)）が報告されている。また、第XIII因子は遺伝子組換え法により作製されたものを用いてもよい。【００３７】
本発明のフィブリノゲン製剤は、バイアルに収容された剤型以外に、医療用基材に固定化することにより、フィブリノゲン固定化基材としても使用可能である。【００３８】
具体的には、本発明の組成からなるフィブリノゲン溶液中に医療用基材を浸漬後、凍結乾燥等により乾燥することにより、フィブリノゲン固定化基材が調製できる。【００３９】
当該基材の例としては、医療用として使用可能であるものであれば特に限定されることはない。例えばそのような例として、セルロース、セルロース誘導体、コラーゲン、ゼラチン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸−乳酸共重合体、ポリグルタミン酸、アミロースなどが挙げられる。その形状としては、モノフィラメント、綿、紙、不織布、織物、編物などの繊維集合体、フィルム、スポンジなどが挙げられる。本発明の実施例において使用される生体吸収性材料であるポリグリコール酸の不織布は、その好適な一例である。【００４０】
また、本発明のフィブリノゲン製剤およびフィブリノゲン固定化基材は、単独で使用されるのみならず、トロンビンを主成分とする成分と組み合わせることにより、ヒトおよび動物組織の生物学的接着剤（フィブリン接着剤）を構成し、幅広い臨床の現場で応用される。【００４１】
以下に、試験例および実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に何等限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
試験例：試験および方法
（１）フィブリノゲン凍結乾燥粉末の調製
フィブリノゲンは、国内献血血漿を冷融解して得られるクリオプレシピテートから、冷エタノール沈殿およびグリシン沈殿法を組み合わせて調製した。凍結乾燥に用いるフィブリノゲン溶液は、フィブリノゲンを塩化ナトリウムを含むクエン酸緩衝液で溶解し、各添加剤を加えて調製した（終濃度の1/4濃度にて調製）。調製したフィブリノゲン溶液は、無菌ろ過し、最終容器(ガラス瓶)に12mLずつ分注した。次いで、それらを凍結乾燥し、最終容器を気密的に密封した。【００４３】
（２）再水和時間
再水和時間は、凍結乾燥粉末に溶媒(H2O)3mLを加えた時点から、23〜26℃で完全に溶解するまでに必要な時間として測定した。凍結乾燥粉末の溶解方法として、溶媒を加えたバイアルビンを手で激しく振盪する方法を用いた。溶解後の凝固可能なタンパク質(フィブリノゲン)の含有量が、80mg/mL〜90mg/mLとなるように調製した。再水和時間は各々４個の測定値の平均値（±SD）として示した。【００４４】
（３）消泡時間
消泡時間は、凍結乾燥粉末の溶解後に室温で静置した時点から、溶解時に生じた泡が消えて、フィブリノゲン溶液の液面が見えるまでの時間として測定した。消泡時間は各々３回の測定値の平均値（±SD）として示した。【００４５】
（４）凝固可能なタンパク質（フィブリノゲン）の含有量
凝固可能なタンパク質（フィブリノゲン）の含有量は、厚生省告示「生物学的製剤基準」収載の、乾燥人フィブリノゲン小分け製品の試験である凝固性たん白質含量および純度試験にしたがって測定した。簡単に記載すると、試料にトロンビンを加えて沈殿したタンパク質量を定量する方法である。実施例に用いた材料の純度（全タンパク質量あたりの凝固可能なタンパク質量の比）は90％以上であった。また、実施例に示すフィブリノゲンの含有量は各々２回の測定値の平均値として示した。【００４６】
（５）シート状フィブリノゲンの調製
シート状フィブリノゲンは、シート状の医療用基材であるポリグリコール酸シート（グンゼ：ネオベール(登録商標)）に50μL/cm2のフィブリノゲン溶液を浸漬後、凍結乾燥を行い調製した。なお、フィブリノゲンシートに対して50μL/cm2の生理食塩水で再水和した際に、再水和後のフィブリノゲンの濃度が、最終的に80mg/mL〜90mg/mLとなるように調製した。【００４７】
（６）シート状フィブリノゲンへの生理食塩水の浸潤時間
浸潤時間は、シート状フィブリノゲン(２×２cm)に200μLの生理食塩水を滴下し、静置状態でシートに生理食塩水がなじむまでの時間（秒）として測定した。浸潤時間は各々３回の測定値の平均値（±SD）として示した。【００４８】
（７）抗張力試験
シート状フィブリノゲンの抗張力は、ASTM（American Society for Testing and Materials）に記載の方法（F2258：Standard Test）をもとに、その方法の一部を改変して確認した。まず、ブタ真皮を２枚用意し、それぞれ異なる治具に固定した（2.5×2.5cm）。次に、30U/mLトロンビンの300μLをブタの真皮表面になじませた後に、シート状フィブリノゲン（2.5×2.5cm）を挟み、１〜５分間静置した。静置後、移動速度２mm/minで上下方向への引き剥がしを行い、抗張力を測定した。溶解後の凝固可能なタンパク質（フィブリノゲン）の含有量が、80mg/mL〜90mg/mLとなるように調製した。【００４９】
（８）その他の試薬
以下の実施例で使用したNaClは、全て富田製薬より購入したものを使用した。また、クエン酸３ナトリウム２水和物、セリン、トレオニン、グルタミン、ロイシン、アラニン、イソロイシンは和光純薬から購入した。グリシン、アルギニン一塩酸塩、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、リジン一塩酸塩、チロキサポール（トリトンWR-1339）はナカライテスク、Tween80は日本油脂より購入したものを使用した。アルブミンは、財団法人化学及血清療法研究所で国内献血血漿より精製したものを使用した。【００５０】
実施例１：従来技術と比較した再水和時間
フィブリノゲンを主成分とし、実質的に必要な量のアルブミン、中性アミノ酸としてイソロイシン、グリシン、塩基性アミノ酸としてアルギニン一塩酸塩、酸性アミノ酸としてグルタミン酸ナトリウム、および界面活性剤としてTween80またはチロキサポールを含有するフィブリノゲン凍結乾燥粉末を調製し、溶媒添加時の再水和時間を測定した。【００５１】
本発明の組成として、再水和後の組成が84mg/mL濃度以上のフィブリノゲン、17.5mg/mLのNaCl、12mg/mLのクエン酸３ナトリウム２水和物、10mg/mLのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、0.2mg/mLのTween80または0.3mg/mLのチロキサポール、イソロイシン、グリシン、アルギニン一塩酸塩、グルタミン酸ナトリウムを含む組成のフィブリノゲン凍結乾燥粉末を調製し、上記の方法に従って再水和時間を測定した。また従来技術として、既に市販されているフィブリン糊接着剤（３種）の添付文書に記載のフィブリノゲン組成を参照して凍結乾燥粉末を調製し、同じく再水和時間を測定し、本発明の組成の再水和時間と比較した。【００５２】
表１に組成と各成分の濃度、ならびに溶解後の凝固可能なタンパク質（フィブリノゲン）の含有量を示す。また、図１で、本発明の組成（No.1〜No.3）と従来技術に基づく組成（従来技術１〜従来技術３）の再水和時間を示す。その結果、本発明の組成（No.1〜No.3）では、従来技術１、従来技術２、および従来技術３と比較して再水和時間の著しい短縮が見られた（図１参照）。これにより、本発明の組成に係る技術が従来技術に対して優位であることが示された。【００５３】
【表１】
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【００５４】
実施例２：再水和時間の短縮に必要な添加剤
再水和後の組成が、84mg/mL濃度以上のフィブリノゲン、17.5mg/mLのNaCl、および12mg/mLのクエン酸３ナトリウム２水和物に加えて、4mg/mLのイソロイシン（I）、2mg/mLのグリシン（G）、12mg/mLのアルギニン一塩酸塩(R)、10mg/mLのグルタミン酸ナトリウム（E）、10mg/mLのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン：Al）、および0.2mg/mLのTween80（De）の全てを含む組成（IGRE-AlDe）、ならびにそのIGRE-AlDeから、ＨＳＡ、イソロイシン、グリシン、アルギニン一塩酸塩、グルタミン酸ナトリウム、またはTween80のいずれか一つを除いた組成（各IGRE-De、GRE-AlDe、IRE-AlDe、IGE-AlDe、IGR-AlDe、IGRE-Al）のフィブリノゲン凍結乾燥粉末を調製し、上記方法に従い再水和時間を測定した。また従来技術として、実施例１で使用した従来技術１から３の組成からなるフィブリノゲン凍結乾燥粉末を調製し、再水和時間を測定し、上記組成の再水和時間と比較した。【００５５】
表２に組成と各成分の濃度、ならびに溶解後の凝固可能なタンパク質（フィブリノゲン）の含有量を示す。また、図２に再水和時間の測定値を示す。その結果、IGRE-AlDe、GRE-AlDe、IRE-AlDe、IGR-AlDeでは従来技術（従来技術１〜従来技術３）と比べ、短時間で再水和し、なかでも、IGRE-AlDeは、最も早い再水和時間を示した。一方、IGRE-De、IGE-AlDe、IGRE-Alの再水和時間は、従来技術と同等であった。このことから、本発明における再水和時間の短縮には、アルブミン、アルギニン、界面活性剤が必須であり、また、イソロイシン、グリシン、グルタミン酸のうち、少なくとも２つを含む必要があることが示された。【００５６】
【表２】
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【００５７】
実施例３：アミノ酸を置き換えた場合の再水和時間
再水和後の組成が、実施例２で調製したIGRE-AlDe、ならびにIGRE-AlDeの４つのアミノ酸を一つずつ他のアミノ酸に置換した組成のフィブリノゲン凍結乾燥粉末を調製し、各組成の再水和時間を測定した。また従来技術として、実施例１の従来技術２と同じ組成のフィブリノゲン凍結乾燥粉末を調製し、本発明による組成との再水和時間を比較した。【００５８】
IGRE-AlDeのアミノ酸を置換した組成
・イソロイシン（I）の置換
イソロイシン（I）を中性アミノ酸のロイシン（L）に置換（LGRE-AlDe）。
・グリシン（G）の置換
グリシン（G）を中性アミノ酸のアラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、グルタミン（Q）に置換（各IARE-AlDe、ISRE-AlDe、ITRE-AlDe、IQRE-AlDe）。
・アルギニン（R）の置換
アルギニン（R）を、アルギニンと同様、塩基性アミノ酸に分類されるリジン（K）に置換（IGKE-AlDe）。
・グルタミン酸（E）の置換
グルタミン酸（E）を、グルタミン酸と同様、酸性アミノ酸に分類されるアスパラギン酸（D）に置換（IGRD-AlDe）。【００５９】
表３に組成と各成分の濃度、ならびに溶解後の凝固可能なタンパク質（フィブリノゲン）の含有量を示す。また、図３に再水和時間の測定値を示す。その結果、イソロイシンはロイシンへの置換が可能であり（図３左上）、グリシンはアラニン、セリン、トレオニン、グルタミンへの置換が可能であった（図３右上）。また、アルギニンはリジンへの置換が可能であり（図３左下）、グルタミン酸はアスパラギン酸への置換が可能であった（図３右下）。表４に４つの各アミノ酸に対して置換可能と判断されたアミノ酸を示す。すなわち、本発明によるフィブリノゲン凍結乾燥粉末に添加されるアミノ酸は、先の表１および表２に記載したイソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸の４つに限られるものではなく、これらアミノ酸を同一特性を有する他のアミノ酸で代替可能であることが示された。【００６０】
【表３】
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【００６１】
【表４】
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【００６２】
実施例４：界面活性剤の添加による消泡効果
再水和後の組成が、実施例２で調製したIGRE-AlDe、ならびにIGRE-AlDeからTween80またはアミノ酸を一つ除いた組成からなるフィブリノゲン凍結乾燥粉末を調製し、再水和後の消泡時間を測定した。【００６３】
表５に組成と各成分の濃度、溶解後の凝固可能なタンパク質（フィブリノゲン）の含有量、ならびに消泡時間を示す。その結果、界面活性剤を含む組成IGRE-AlDe、IGRE-AlDe（Tween80をチロキサポールに置換）、GRE-AlDe、IRE-AlDe、IGR-AlDeではいずれも2.5〜6分程度で消泡が確認できたのに対し、界面活性剤を含まない組成IGRE-Alは、消泡に121分を必要とした。このことから、界面活性剤の添加により、フィブリノゲン凍結乾燥粉末の再水和後に発生する泡が速やかに消失することが示された。【００６４】
【表５】
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【００６５】
実施例５：シート状フィブリノゲンの浸潤性および抗張力
実施例２で調製したIGRE-AlDe、そのIGRE-AIDeからイソロイシンまたはグルタミン酸を除いた組成（各GRE-AlDe、IGR-AlDe）、そして既に市販されているフィブリン糊接着剤の組成（従来技術１〜従来技術３）のフィブリノゲン溶液を用いて調製したシート状フィブリノゲンの浸潤時間および抗張力を測定した。【００６６】
表６に組成と生理食塩水添加後の各成分の濃度、ならびに浸潤時間を示した。また、図４に抗張力試験の結果を示した。その結果、本発明による組成（IGRE-AlDe、GRE-AlDe、IGR-AlDe）を用いて調製したシート状フィブリノゲンでは、従来技術の組成（従来技術１〜従来技術３）と比べて極めて短時間で生理食塩水が浸潤し、しかも高い抗張力が得られることが示された。【００６７】
この結果は、事実上、従来技術で一般的に用いられている、溶解液による凍結乾燥粉末の溶解という操作無しでも、高い接着力が得られることを示すものである。すなわち、本発明の組成を使用した固体状フィブリノゲン製剤の使用により、短時間で強い接着力を発揮する製剤の提供が可能となることが期待される。【００６８】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明により、従来技術と比較して短時間で液状に再水和される固体状のフィブリノゲン製剤の提供が可能となった。本発明により得られたフィブリノゲン製剤は、再水和時間が短縮されたことにより、緊急時に、より迅速に使用できるという優れた利点を有する。さらに界面活性剤の添加による消泡効果により、再構成後のフィブリノゲン液の抜き取りを迅速に行うことができ、更なる調製時間の短縮がもたらされるという利点も有する。【００７０】
また、本発明により得られるフィブリノゲン組成物を基材に予め固定化した製剤とすることにより、溶解液での再水和無しに、患部に直接適用可能なフィブリノゲン製剤の提供も可能となる。本発明によるフィブリノゲンが固定化された基材は適応部位のわずかな水分で迅速に溶解するために、より短時間で強い接着力を発揮することを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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