【手続補正書】
【提出日】平成17年2月2日(2005.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの各々が、HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも３つのHLA-DR分子、ならびにHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に、1000 nM未満の結合活性で結合し、ペプチドの混合物が全ての前記対立遺伝子に結合することを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチドの混合物。
【請求項２】
前記ペプチドが、何れかのHIV-1株のNefタンパク質を起源とすることを特徴とする請求項１で請求したペプチドの混合物。
【請求項３】
前記ペプチドが、Bru株(13)に関して、Nefタンパク質の1〜36位に対応するペプチド、(Nef1ペプチド)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4ペプチド)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4ペプチド)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5ペプチド)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10ペプチド)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2ペプチド)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12ペプチド)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13ペプチド)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1ペプチド)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2ペプチド)、183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3ペプチド)、187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4ペプチド)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5ペプチド)からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または請求項２で請求したペプチドの混合物。
【請求項４】
次の混合物：
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物；
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3) からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5)からなる混合物
からなる群から選択されることを特徴とする請求項３で請求のペプチドの混合物。
【請求項５】
少なくとも１つの医薬的に容認されうる賦形剤、および任意に少なくとも１つのアジュバントと組み合わせた請求項１〜４のいずれか１つで請求した少なくとも１つのペプチドの混合物を含むことを特徴とする免疫原組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、リポペプチドの形態であるか、または遺伝子治療のための組換えウイルスもしくはウイルスベクターに組み込まれているか、またはタンパク質に含まれているか、または化学的に修飾されていることを特徴とする請求項５で請求の免疫原組成物。
【請求項７】
前記ペプチドの混合物を、：
−１つ以上のCD8+エピトープを含む１つ以上のペプチドまたはリポペプチドと、および/または
−HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、あるいはHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、1000 nM未満の結合活性で結合する、CD4+エピトープを含む他のペプチドと、および/または、
−複合CD4+エピトープからなる他のペプチドと、および/または
−Ｂエピトープに指向された抗体によって特異的に認識される１つ以上のＢエピトープを含む１つ以上のペプチドまたはリポペプチドと
組み合わされることを特徴とする請求項５または請求項６で請求の免疫原組成物。
【請求項８】
CD4+エピトープを含むペプチドが、
HIV-1 Nefタンパク質の37-71位(Nef3)、113-128位(Nef7)、117-132位(Nef8)、132-147位(Nef9)および155-185位(Nef11)に対応するペプチドからなる群から選択されることを特徴とする請求項７で請求の免疫原組成物。
【請求項９】
有利には、請求項１〜４に規定したようなペプチドをエンコードする配列を含むことを特徴とする免疫原組成物。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１つで請求の免疫原組成物を含むことを特徴とする抗HIVワクチン。
【請求項１１】
−白人集団で支配的である少なくとも１つのHLA II分子（HLA-DR）に関して（第一および/または第二遺伝子）、1000 nM未満の結合活性を有し、HIV Nefタンパク質由来のペプチドに特異的なCD4+Tリンパ球にて認識されうるCD4+エピトープを含み、ならびに
−Bru株に関して、Nefタンパク質の次のフラグメント：
Nefタンパク質の1〜36位に対応するフラグメント(Nef1)、3〜17位に対応するフラグメント(Nef1.1)、8〜22位に対応するフラグメント(Nef1.2)、11〜25位に対応するフラグメント(Nef1.3)、14〜28位に対応するフラグメント(Nef1.4)、Nefタンパク質の37〜71位に対応するフラグメント(Nef3)、66〜94位に対応するフラグメント(Nef4)、68〜82位に対応するフラグメント(Nef4.1)、74〜88位に対応するフラグメント(Nef4.4)、77〜91位に対応するフラグメント(Nef4.5)、79〜93位に対応するフラグメント(Nef4.6)、83〜97位に対応するフラグメント(Nef4.7)、113〜128位に対応するフラグメント(Nef7)、117〜132位に対応するフラグメント(Nef8)、132〜147位に対応するフラグメント(Nef9)、137〜168位に対応するフラグメント(Nef10)、137〜151位に対応するフラグメント(Nef10.1)、139〜153位に対応するフラグメント(Nef10.2)、141〜155位に対応するフラグメント(Nef10.3)、146〜160位に対応するフラグメント(Nef10.5)、155〜185位に対応するフラグメント(Nef11)、175〜190位に対応するフラグメント(Nef12)、182〜198位に対応するフラグメント(Nef13)、178〜192位に対応するフラグメント(Nef13.1)、181〜195位に対応するフラグメント(Nef13.2)、183〜197位に対応するフラグメント(Nef13.3)、187〜201位に対応するフラグメント(Nef13.4)、189〜203位に対応するフラグメント(Nef13.5)、および191〜205位に対応するフラグメント(Nef13.6)
からなる群から選択される
ことを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１つで請求のペプチドの混合物からなる群から選択されるか、または請求項１１で請求のペプチドの１つであり、前記ペプチドは任意にラベルされるか、またはマルチマーの複合体の形態で複合体化されていてもよいことを特徴とする診断薬。
【請求項１３】
請求項１〜４または請求項１１で規定したようなNefペプチドに特異的なCD4+ T細胞の存在を、ELISPOTアッセイ、T細胞増殖アッセイまたはマルチマーの複合体を用いるアッセイを使って検出する工程を含むことを特徴とする個体の免疫状態を評価する方法。
【請求項１４】
少なくとも次の工程：
−分類すべき細胞の懸濁液を、請求項１〜４または請求項１１で規定したようなNefペプチド/溶解性であるビオチン化されたHLAII分子の複合体から形成され、そして蛍光色素でラベルされたストレプトアビジンに共役した１つ以上の四量体と１〜３時間培養または接触させ、
−フローサイトメトリーにて解析し、そして
−四量体でラベルされた細胞を分類する
を含むことを特徴とするHIV特異的Tリンパ球を分類する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、Nefタンパク質起源のペプチド混合物、およびそのペプチド混合物の（インビボで抗HIV CD4+ Tリンパ球の生産を刺激することができ、その結果AIDSに対するワクチンとして有用な免疫原組成物での）薬剤としての、またはHIV特異的Tリンパ球を診断するための試薬、特に血液反応陽性の患者または抗レトロウイルス治療を受けている患者の免疫状態を評価するための試薬としての応用に関する。
CD4+ T リンパ球は、提示細胞による抗原の分解由来であり、クラスII主要組織適合性複合体（MHCII）の分子にて提示されるペプチドフラグメントをこのリンパ球に選択的に認識させる再編成されたTレセプターを有する。これらペプチドフラグメントが有し、Tリンパ球にて効果的に認識される決定因子を、Tエピトープと称する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
結局、本発明の対象は、ペプチドの各々が、HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも３つのHLA-DR分子、ならびにHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に、1000 nM未満の結合活性で結合し、ペプチド混合物が全ての前記対立遺伝子に結合することを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチド混合物である。
そのようなペプチド混合物は、驚くことに、保護すべき白人集団の極めて大多数で、増殖型CD4+ T応答（CD4+ Tリンパ球の刺激）および、CTL応答の刺激も得ることができる；それゆえ、そのような混合物がワクチンで使用できる「普遍的な」免疫原組成物に対する第一歩を構成すると考えることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
また、本発明の対象は、少なくとも１つの医薬的に容認されうる賦形剤、および任意に少なくとも１つのアジュバントと組み合わせた先に規定したような少なくとも１つのペプチド混合物を含むことを特徴とする抗-HIV免疫原組成物である。
使用されるアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはスクアレンのようなワクチン組成物で従来使用されている賦形剤である。
前記免疫原組成物の有利な実施形態に関して、前記ペプチドは、リポペプチドの形態であるか、または遺伝子治療のための組換えウイルス、ウイルスベクター（アデノウイルス（adenovirus）など）に組み込まれているか、またはタンパク質、特に組換えタンパク質（Leclerc C.ら、 Int. Rev. Immunol.、1994、11、2、123-132、Janssen R.ら、Int. Rev. Immunol.、1994、11、2、113-121)に含まれているか、または化学的に修飾されている。後者の場合、それらは、例えばDアミノ酸、擬似ペプチド結合物、またはＣもしくはＮ末端の修飾物のような非天然の修飾物を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
前記免疫原組成物のその他の有利な実施形態に関して、前記ペプチド混合物を、
−（細胞毒性Tリンパ球にて特異的に認識され、そしてHLA I分子にて提示される）１つ以上のCD8+エピトープ、より詳しくは、HIV-１タンパク質由来のCD8+エピトープ（表２参照）を含有する１つ以上のペプチドまたはリポペプチドと、および/または
−HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、あるいはHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、1000 nM未満の結合活性で結合する、HIV-1 Nefタンパク質の37-71位(Nef3)、113-128位(Nef7)、117-132位(Nef8)、132-147位(Nef9)、または155-185位(Nef11)に対応するペプチドのような、CD4+エピトープを含む他のペプチドと、および/または、
−破傷風毒素TT（830-846位)のペプチド、インフルエンザ ヘマグルチニンHAのペプチド(307-319位)、PADRE（Pan DR Epitope、Alexandre J.ら、Immunity、1994、1、9、751-761)、HIV-1 Nefペプチド45-69、およびシュードモナス 熱帯マラリア（Plasmodium falciparum）のLSA３ペプチドのような、複合CD4+エピトープからなる他のペプチドと、および/または
−Ｂエピトープに対する抗体によって特異的に認識される１つ以上のＢエピトープ、より好ましくはHIV-１タンパク質由来のＢエピトープを含む１つ以上のペプチドまたはリポペプチドと、
組み合わされる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
前記混合物に含まれる本発明によるNefペプチドは、有利には、：
−目的のHLA-DR分子、つまり所定の集団の５％より多くに含まれる分子、特にHLA、DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子を精製し、
−そして、様々な濃度のNefタンパク質の配列を完全にカバーする重複するフラグメント、およびビオチンのような非放射能ラベルと結合され、配列が前記ペプチドとは異なるペプチドフラグメントからなる試薬R1またはトレーサーと、精製されたHLA-DR分子を培養し、そこで試薬R1またはトレーサーは、目的のHLA-DR分子の１つに関して、親和性を示し、200 nM未満の濃度で使用できるように選択され、
−得られた複合体を、全てのHLA-DRに特異的な抗体でプレコートされたELISA型プレート上に移し、
−ストレプトアビジン−ホスファターゼのような適切な共役体、および蛍光基質を使って、プレートの底に付着したHLA-DR分子/試薬R1複合体を明らかにし、
−異なるエピトープ、すなわちNefタンパク質とHLA-DR分子との相互作用の様々な領域の最も代表的なエピトープを含むペプチドを選択し、そして
−最も適したペプチドを、それらが、試薬R1の結合の50％を抑制するこれらペプチドの濃度（IC50）に相当する1000 nM未満の結合活性を示す対立遺伝子の頻度の関数として選択する
からなるHLA-DR/ペプチド結合アッセイを用いて選択された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
事実、免疫化のための裸のDNAの使用は、効果的なワクチン手法を構成する；それは、タンパク質抗原をエンコードする裸のDNAをワクチン化される宿主生物に注入することからなる；このDNAは、宿主細胞にて抗原の持続合成および、免疫系に対するこの抗原の長期提示をさせる。
また、本発明の対象は、先に規定したような免疫原組成物を含むことを特徴とするワクチンである。
また、本発明の対象は、
−先に規定したような白人集団で支配的である少なくとも１つのHLA II分子（HLA-DR）に関して（第１遺伝子および/または第２遺伝子）、1000 nM未満の結合活性を有し、HIV Nefタンパク質由来のペプチドに特異的なCD4+Tリンパ球にて認識され、そしてこのペプチドに特異的なCD4+Tリンパ球を刺激しうるCD4+エピトープを含み、ならびに
−Bru株に関するNefタンパク質の次のフラグメント：
Nefタンパク質の1〜36位に対応するフラグメント(Nef1)、3〜17位に対応するフラグメント(Nef1.1)、8〜22位に対応するフラグメント(Nef1.2)、11〜25位に対応するフラグメント(Nef1.3)、14〜28位に対応するフラグメント(Nef1.4)、Nefタンパク質の37〜71位に対応するフラグメント(Nef3)、66〜94位に対応するフラグメント(Nef4)、68〜82位に対応するフラグメント(Nef4.1)、74〜88位に対応するフラグメント(Nef4.4)、77〜91位に対応するフラグメント(Nef4.5)、79〜93位に対応するフラグメント(Nef4.6)、83〜97位に対応するフラグメント(Nef4.7)、113〜128位に対応するフラグメント(Nef7)、117〜132位に対応するフラグメント(Nef8)、132〜147位に対応するフラグメント(Nef9)、137〜168位に対応するフラグメント(Nef10)、137〜151位に対応するフラグメント(Nef10.1)、139〜153位に対応するフラグメント(Nef10.2)、141〜155位に対応するフラグメント(Nef10.3)、146〜160位に対応するフラグメント(Nef10.5)、155〜185位に対応するフラグメント(Nef11)、175〜190位に対応するフラグメント(Nef12)、182〜198位に対応するフラグメント(Nef13)、178〜192位に対応するフラグメント(Nef13.1)、181〜195位に対応するフラグメント(Nef13.2)、183〜197位に対応するフラグメント(Nef13.3)、187〜201位に対応するフラグメント(Nef13.4)、189〜203位に対応するフラグメント(Nef13.5)、および191〜205位に対応するフラグメント(Nef13.6)
からなる群から選択される
ことを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチドである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
結局、また、本発明の対象は、先に規定したようなペプチド混合物からなる群から選択されるか、または先に規定したようなペプチドの１つであることを特徴とする診断薬である。前記ペプチドは任意に、ラベルされるか、またはマルチマーの複合体の形態で複合体化されていてもよい。
好ましくは、前記診断薬は、Nef1、Nef4、Nef10、Nef12およびNef13ペプチドから得られるペプチド混合物からなる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
また、本発明の対象は、先に規定したようなNefペプチドに特異的なCD4+ T細胞の存在を検出する工程を含むことを特徴とする個体の免疫状態を評価する方法である；有利には、前記検出を次のアッセイの１つを使って行う：増殖アッセイ、ELISPOTアッセイ[例えば、国際出願WO 99/51630またはGahery-Segardら(11)を参照]、または前記Nefペプチドから構成されるマルチマーの複合体の存在での、フローサイトメトリー。
より正確には：
★増殖アッセイに関して：
細胞の懸濁液（PBMC、CD8+細胞を欠いたPBMC、本発明によって選択されたペプチドとインビトロで培養する工程を介して前もって富化されたTリンパ球、またはクローン化Tリンパ球）を、選択されたペプチド、および必要に応じて、適切な提示細胞（例えば、樹状細胞、オートロガスまたはヘテロガスなPBMC、EBVウイルスを使った感染後に得られるようなリンパ芽球状の細胞、あるいは遺伝学的に修飾された細胞）の存在下で、３〜５日間培養する。細胞の増殖を、トリチウム化されたチミジンを細胞のDNAに取り込むことで測定する。本発明に従って選択されたペプチドは、最初の懸濁液におけるこれらペプチドに特異的な細胞の存在を明らかにさせることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
★ELISPOTアッセイに関して：
ELISPOTアッセイは、本発明に従って選択されたペプチドに特異的で、γ-IFNを分泌するT細胞の存在を明らかにさせることができる。
さらに正確には、Gahery-Segardら、2000 (11)に記載の方法に従って、T細胞を、本発明に従って選択されるペプチドとの患者からのPMBCの培養後にγ-IFNの分泌を測定することで明らかにする。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
★マルチマーの複合体、特に四量体の複合体の使用に関して：
−生物学的なサンプル、好ましくは末梢血単核細胞（PBMC）を、先に規定したようなNefペプチド−先に規定したような可溶性でビオチン化されたクラスIIHLA分子の複合体から生産された四量体の複合体と接触させるようにする、そして
−ラベルされた細胞を、フローサイトメトリーにて解析する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
有利には、生物学的なサンプルを前記複合体に接触させる前に、抗CD4抗体と接触させることで、CD4+ T細胞を富化して前記サンプルを富化させる。
四量体を、例えばE.J. Novakら(J. Clin. Investig.、1999、104、R63-R67)またはM.J.Kurodaら(J. Virol.、2000、74、18、8751-8756)で明記したように調製する。
要約すると、四量体を、溶解性でビオチン化されたHLAII分子を、10倍過剰の本発明に従って同定され、そして選択されたNefペプチドと共に、0.15MのNaClを含むpH4.5〜7の10ｍMのリン酸クエン酸緩衝液中で、37℃で72時間培養することで生産する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
四量体化形態は、HLAII分子よりも４倍少ない量（モルに対するモル）で、蛍光色素でラベルされたストレプトアビジン調製物に加えることで得られる。混合物を、周温で、一晩培養する。
これらの四量体を使用するため、細胞（PBMC、CD8+細胞を欠いたPBMC、本発明によって選択されたNefペプチドとインビトロで培養する工程を介して前もって富化されたＴリンパ球、またはクローン化Ｔリンパ球）の懸濁液を、１つ以上の四量体（10〜20mg/ml）と１〜３時間接触させる。洗浄後、懸濁液をフローサイトメトリーにて解析する：四量体を使った細胞のラベル化を、これら構築物が蛍光性であることを用いて可視化する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
フローサイトメトリーは、ラベルされていない細胞から四量体でラベルされた細胞を分離し、よって細胞分類を行うことを可能にする。
そして、また本発明の対象は、少なくとも次の工程：
−分類すべき細胞の懸濁液を、先に規定したようなNefペプチド/溶解性で、ビオチン化されたHLAII分子の複合体から形成され、そして蛍光色素でラベルされたストレプトアビジンに共役した１つ以上の四量体に１〜３時間培養または接触させ、
−フローサイトメトリーにて解析し、そして
−四量体でラベルされた細胞を分類する
を含むことを特徴とするHIV特異的Ｔリンパ球を分類する方法である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
−HLA-DR/ペプチド結合アッセイ
HLA-DR分子に対するペプチドの結合についてのアッセイは、最初にHLA-DR分子上でHill（16）によって開発された免疫酵素顕色を使った競合アッセイである。それらを、多くのサンプルを同じ実験で研究することを可能にする96穴プレート上で行う。つまり、精製されたHLA-DR分子を、トレーサーとなるビオチン化されたペプチド、および様々な濃度の試験ペプチドと培養する。
培養24〜72時間後、サンプルを中和し、そして各々100μlのサンプルを、HLA-DR分子に特異的な単一形態の抗体を予めコートしたELISAプレート上に移す。HLA-DR分子に特異的な単一形態の抗体を介してプレートの底に付着するHLA-DR分子/ビオチン化ペプチド複合体を、ストレプトアビジン−ホスファターゼ共役体と蛍光基質によって明らかにする。各々のペプチドの活性を、ビオチン化されたペプチドの結合の50％を抑制するこのペプチドの濃度（IC50）で特徴付ける。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
培養物を、5％CO2を含む雰囲気内で、37℃で24時間培養する。
そして、プレートを洗浄し、ヒトγ-IFNに特異的な100μlのウサギ抗血清と２時間培養する。
洗浄後、ビオチンに共役した抗ウサギIgG抗体と、アルカリホスファターゼに共役したストレプトアビジンを、連続して１時間加える。
最後に、スポットを、アルカリホスファターゼに対する色素基質を使って明らかにする。ネガティブコントロールを、ペプチドを含まないウエルで得る。ポジティブコントロールを、イオノマイシン（500ng/ml）およびフィトヘマグルチニン（PHA）（10μg/ml）のような有糸分裂促進剤を含むウエルで供給する。