【手続補正書】
【提出日】平成16年11月11日(2004.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼ活性を測定するための方法であって、
(a)ATP、試験されるプロテインキナーゼ、および試験されるプロテインキナーゼによりリン酸化され得る基質を含む第1の溶液、並びに、前記試験されるキナーゼおよび試験される前記プロテインキナーゼによりリン酸化され得る基質の非存在下でATPを含む第2の溶液を準備する工程；
(b)工程(a)において形成された反応混合物のそれぞれにおけるATPおよび/またはADPの濃度あるいはその経時的変化速度を、生物発光反応を使用して測定する工程；および
(c)ATPおよび/またはADPの濃度に関する情報を使用して、試験されるプロテインキナーゼの活性を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
プロテインキナーゼの活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
(a)ATP、プロテインキナーゼ、試験される化合物、および試験されるプロテインキナーゼによりリン酸化され得る基質を含む第1の溶液、並びに、前記試験される化合物の非存在下でATP、前記プロテインキナーゼ、および前記プロテインキナーゼによりリン酸化され得る基質を含む第2の溶液を準備する工程；
(b)工程(a)において形成された反応混合物のそれぞれにおけるATPおよび/またはADPの濃度あるいはその経時的変化速度を、生物発光反応を使用して測定する工程；および
(c)ATPおよび/またはADPの濃度に関する情報を使用して、第1の溶液および第2の溶液におけるプロテインキナーゼの活性を決定する工程、
(d)プロテインキナーゼを調節する化合物を同定するために、第1の溶液におけるプロテインキナーゼの活性を第2の溶液におけるプロテインキナーゼの活性と比較し、それにより、第1の溶液におけるプロテインキナーゼの活性が第2の溶液におけるプロテインキナーゼの活性と異なる場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの調節因子として同定される工程
を含む方法。
【請求項３】
(a)における前記第1の溶液および第2の溶液を準備することが、残りの試薬を含む溶液に前記基質を添加することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程(a)の第1の溶液および第2の溶液が実質的に細胞を含まない、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第1の溶液におけるキナーゼの活性が第2の溶液におけるキナーゼの活性よりも低い場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの阻害剤として同定される、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第1の溶液におけるキナーゼの活性が第2の溶液におけるキナーゼの活性の50%未満である場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの阻害剤として同定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第1の溶液におけるキナーゼの活性が第2の溶液におけるキナーゼの活性よりも高い場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの活性化剤として同定される、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第1の溶液におけるキナーゼの活性が第2の溶液におけるキナーゼの活性よりも少なくとも50%高い場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの活性化剤として同定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程(a)から工程(c)までを、異なるキナーゼおよびその対応する基質を毎回使用して1回以上繰り返すことをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１０】
キナーゼが工程(a)に先立って活性化される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程(a)の第1の溶液および第2の溶液が緩衝液を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
緩衝液がHepes緩衝液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程(a)および工程(b)が連続して行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程(a)において形成された反応混合物が、工程(c)の前に、室温において1時間反応させられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程(a)において形成された反応混合物に、キナーゼと基質との反応を停止させる試薬を加える追加の工程(b')が、工程(a)の後であって工程(b)の前に行われることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
停止試薬が、リン酸、EGTAおよびEDTAからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程(b')において形成された混合物のpHをpH7.0に調節する追加の工程(b")が、工程(b')の後であって工程(b)の前に行われることを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程(b")が、Hepes緩衝液を加えることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程(a)および工程(b)が同時に行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程(b)が、
(i)ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬を前記反応混合物に加えること(ただし、前記ルシフェリンまたはその誘導体はATP存在下のルシフェラーゼとの生物発光反応で光を発する)、ならびに
(ii)生じた生物発光反応によって放射される光の強度またはその経時的変化をATP濃度を基準として測定すること、
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程(ｂ)が、工程(ii)において測定される光の強度が実質的に一定のレベルに達した後に行われる下記の工程:
(iii)ADPをATPに変換する試薬を加える工程、
(iv)ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬を工程(iii)の前記反応混合物に加える工程、および
(v)生じた生物発光反応によって放射される光の強度を測定する工程、
をさらに含み、
工程(v)における光の強度と工程(ii)における光の定常状態での強度との差が工程(ii)の反応混合物におけるADP濃度の測定値である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
キナーゼがJNK-1であり、基質がGST-c-junである、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
キナーゼがMAPキナーゼ-1(ERK-1)であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
キナーゼがMAPキナーゼ-2(ERK-2)であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
キナーゼがPKAであり、基質がKemptideである、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
キナーゼがJNK-2であり、基質がGST-c-junである、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
キナーゼがMEK-1であり、基質が不活性型MAPキナーゼ-2(ERK-2)である、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
キナーゼがJNK2α2であり、基質がATF-2である、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
キナーゼがJNK2α2であり、基質がc-junである、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
キナーゼがSAPK-3であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
キナーゼがSAPK-4であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
キナーゼがraf-1であり、基質が不活性型MEK-1である、請求項２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２から３２のいずれか一項に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項３４】
(a)ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬であって、前記のルシフェリンまたはその誘導体がATP存在下のルシフェラーゼとの生物発光反応で光を発する生物発光試薬、
(b)プロテインキナーゼ、
(c)前記プロテインキナーゼによってリン酸化され得る基質、および
(d)ATP
を含む、請求項２または３に記載の方法において使用されるキット。
【請求項３５】
生物発光試薬、キナーゼ、基質および/またはATPを再構成または希釈または溶解するための1つ以上の緩衝液をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記キナーゼと前記基質との反応を停止させることができる試薬をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
ADPをATPに変換する1つ以上の試薬をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
ADPをATPに変換する試薬がピルビン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸を含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
2つ以上の異なるキナーゼおよびそれらの基質をさらに含む、請求項３４から３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
1つまたは複数の試薬が凍結乾燥形態で提供される、請求項３４から３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
マルチウエル・マイクロタイター・プレートをさらに含む、請求項３４から４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
マルチウエル・マイクロタイター・プレートが96個以上のウエルを含有する、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
実施例1から13を参照して実質的には本明細書中に記載されるような、無細胞系においてプロテインキナーゼ活性を測定するための方法。
【請求項４４】
実施例14を参照して実質的には本明細書中に記載されるような、プロテインキナーゼの活性を調節する化合物を同定するための方法。