【手続補正書】
【提出日】平成16年6月14日(2004.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極表面に固定されている捕獲プローブ核酸とそれに相補的な試料核酸間のハイブリッド化を、核酸結合物質を利用して二重らせんまたは一重らせん核酸に対する特異的な静電気的中性化を電気化学的な方法で検出することを含む核酸ハイブリッド化検出方法において、
(ａ)電極表面に捕獲プローブを固定してオリゴプレートを形成する段階と、
(ｂ)前記電極表面に固定された捕獲プローブに試料核酸を反応させて電極表面でハイブリッド化反応を誘導する段階と、
(ｃ)前記ハイブリッド化反応させた電極表面に界面活性剤と陽電荷性核酸結合物質を同時にまたは段階的にハイブリッド化された核酸またはハイブリッド化されない捕獲プローブに反応させて、ハイブリッド化された二重らせん形態の核酸またはハイブリッド化されない捕獲プローブ核酸の電荷量または電荷状態を変化させる段階と、
(ｄ)電解質条件で電極表面の電流または電荷量を測定して前記電極表面に固定された捕獲プローブのハイブリッド化の有無を確認する段階とを含むことを特徴とする核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項２】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項３】
前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端は、チオール基であることを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項４】
前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端は、アミン基であることを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項５】
前記電極の材料は、金、白金、銀、炭素、銅、ニッケル、クロム及びパラジウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項６】
前記核酸結合物質は、インターカレータ、インターカレーティング蛍光染料、アクリジン系化合物、クロロキン、キニン（quinine）、ノヴァナトロン、ドキソルビシン、一重らせん結合蛋白質及びレックＡ蛋白質からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項７】
前記インターカレーティング蛍光染料は、１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]]−、テトラアイオダイド、１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]]−、テトラアイオダイド、４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデンメチリジン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデン−１−プロペン−１−イル−３−イリデン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド）、ＥｔＢｒ（３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フェニル−、ブロマイド）、３−メチル−２−[[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]メチル]−、ジアイオダイド、３−メチル−２−[３−[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]−１−プロペニル]−、ジアイオダイド及びＳＹＢＲグリーンからなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項６に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項８】
前記アクリジン系化合物は、３，６−ジアミノアクリジン、３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウムクロライド、アクリジンオレンジ及びアクリジンイエローからなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項６に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項９】
前記界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項１０】
前記検出方法が、前記（c）段階の後にオリゴプレートに熱、電圧または音波を加える段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【請求項１１】
前記固定された捕獲プローブのハイブリッド化の有無を確認する電気化学的方法は、循環電圧電流法、電流測定またはクロノクーロメトリーであることを特徴とする請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
上記の目的を達成するために本発明は、(ａ)電極表面に捕獲プローブを固定してオリゴプレートを形成する段階と、(ｂ)前記電極表面に固定された捕獲プローブに試料核酸を反応させて電極表面でハイブリッド化反応を誘導する段階と、(ｃ)前記ハイブリッド化反応させた電極表面に界面活性剤と陽電荷性核酸結合物質を同時にまたは段階的にハイブリッド化された核酸またはハイブリッド化されない捕獲プローブに反応させて、ハイブリッド化された二重らせん形態の核酸またはハイブリッド化されない捕獲プローブ核酸の電荷量または電荷状態を変化させる段階と、(ｄ)電解質条件で電極表面の電流または電荷量を測定して前記電極表面に固定された捕獲プローブのハイブリッド化の有無を確認する段階とを含むことを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
この請求項１によれば、前記（ａ）段階、前記（ｂ）段階、前記（ｃ）段階及び前記（ｄ）段階を含むことによって、核酸結合物質を利用した二重らせんまたは一重らせん核酸に対する特異的な静電気的中性化を電気化学的な方法で電極表面に固定されている捕獲プローブ核酸とそれに相補的な試料核酸間のハイブリッド化を検出することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端は、チオール基であることを特徴とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
この請求項３に記載の発明よれば、前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端がチオール基であることによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端は、アミン基であることを特徴とする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
この請求項４に記載の発明によれば、前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端がアミン基であることによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記電極の材料は、金、白金、銀、炭素、銅、ニッケル、クロム及びパラジウムからなる群より選択されることを特徴とする。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
この請求項５に記載の発明によれば、前記電極の材料を白金などから選択することによって、良好な測定の感度を得ることができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
請求項６に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記核酸結合物質はインターカレータ、インターカレーティング蛍光染料、アクリジン系化合物、クロロキン、キニン（quinine）、ノヴァナトロン、ドキソルビシン、一重らせん結合蛋白質及びレックＡ蛋白質からなる群より選択されることを特徴とする。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
この請求項６に記載の発明によれば、前記結合物質にインターカレータ、インターカレーティング蛍光塗料などを選択することによって、これらが核酸に結合して前記電極表面の電荷状態を変化させることができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
請求項７の記載の発明は、請求項６に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記インターカレーティング蛍光染料は１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]]−、テトラアイオダイド、１，１´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル]]ビス[４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]]−、テトラアイオダイド、４−[（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）メチル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、４−[３−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサゾルイリデン）−１−プロペニル]−１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−、ジアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデンメチリジン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド、２，２´−[１，３−プロパンジイルビス[（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル−１（４Ｈ）−ピリジニル−４−イリデン−１−プロペン−１−イル−３−イリデン]]ビス[３−メチル]−、テトラアイオダイド）、ＥｔＢｒ（３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フェニル−、ブロマイド）、３−メチル−２−[[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]メチル]−、ジアイオダイド、３−メチル−２−[３−[１−[３−（トリメチルアンモニオ）プロピル]−４（１Ｈ）−ピリジニルイデン]−１−プロペニル]−、ジアイオダイド及びＳＹＢＲグリーンからなる群より選択されることを特徴とする。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
この請求項７に記載の発明によれば、前記インターカレーティング蛍光染料の化合物を選択することによって、より良好に安定的に核酸に結合して前記電極表面の電極を変化させることができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
請求項８に記載の発明は、請求６に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記アクリジン系化合物は３，６−ジアミノアクリジン、３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウムクロライド、アクリジンオレンジ及びアクリジンイエローからなる群より選択されることを特徴とする。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
この請求項８に記載の発明によれば、前記アクリジン系化合物を選択することによって、より良好に核酸に結合して前記電極表面の電極を変化させることができる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
請求項９に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において前記界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることを特徴とする。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
この請求項９に記載の発明によれば、ドデシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることによって、より良好に簡便に非特異的な結合を良好に処理することができる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
請求項１０に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記検出方法が前記（ｃ）段階の後にオリゴプレートに熱、電圧または音波を加える段階をさらに含むことを特徴とする。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
この請求項１０に記載の発明によれば、前記（c）段階の後にオリゴプレートに、熱、電圧または音波を加える段階をさらに含むことによって、最も良好に簡便に非特異的な結合を処理することができる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
請求項１１に記載の発明は、請求項１に記載の核酸ハイブリッド化検出方法において、前記固定された捕獲プローブのハイブリッド化の有無を確認する電気化学的方法は、循環電圧電流法、電流測定またはクロノクーロメトリーであることを特徴とする。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
この請求項１１に記載の発明によれば、前記固定された捕獲プローブのハイブリッド化の有無を確認する電気化学的手法は、循環電圧電流などであることによって、良好かつ簡便に核酸ハイブリット化検出をすることができる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
請求項１に記載の発明によれば、前記（ａ）段階、前記（ｂ）段階、前記（ｃ）段階及び前記（ｄ）段階を含むことによって、核酸結合物質を利用した二重らせんまたは一重らせん核酸に対する特異的な静電気的中性化を電気化学的な方法で電極表面に固定されている捕獲プローブ核酸とそれに相補的な試料核酸間のハイブリッド化を検出することができるので、電気化学的方法を利用して、他の検出方法よりも、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法をすることができる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
請求項２に記載の発明によれば、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであることによって、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいても電気化学的方法を利用してハイブリッド化したＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるので、他の検出方法よりも、簡単安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
この請求項３に記載の発明よれば、前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端がチオール基であるによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができるので、電気化学的方法を利用して、安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
この請求項４に記載の発明によれば、前記電極表面に固定された捕獲プローブの末端がアミン基であることによって、捕獲プローブが安定的に結合し、捕獲プローブに作業電極間の直接的な接触を防止することができるので、電気化学的方法を利用して、安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
この請求項５に記載の発明によれば、前記電極の材料を白金などから選択することによって、良好な測定の感度を得ることができるので、安定的で感度の良い測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
この請求項６に記載の発明によれば、前記結合物質にインターカレータ、インターカレーティング蛍光塗料などを選択することによって、これらが核酸に結合して作業電極表面の電荷状態を変化させることができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
この請求項７に記載の発明によれば、前記インターカレーティング蛍光染料の化合物を選択することによって、より良好に安定的に核酸に結合して作業電極表面の電極を変化させることができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
この請求項８に記載の発明によれば、前記アクリジン系化合物を選択することによって、より良好に核酸に結合して作業電極表面の電極を変化させることができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
この請求項９に記載の発明によれば、デシル硫酸ナトリウムまたはトリトンＸ系化合物であることによって、より良好に簡便に非特異的な結合を良好に処理することができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
請求項１０に記載の発明によれば、(ｃ)段階の後にオリゴプレートに、熱、電圧または音波を加える段階をさらに含むことによって、最も良好に簡便に非特異的な結合を良好に処理することができるので、より安定的に核酸ハイブリッド化ができるとともに安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法をすることができる。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
この請求項１１に記載の発明によれば、前記固定された捕獲プローブのハイブリッド化の有無を確認する電気化学的手法は、循環電圧電流などであることによって、良好かつ簡便に核酸ハイブリット化検出を行うことができるので、より安定的な測定でき、簡単で安価な費用で核酸ハイブリッド化の検出方法を行うことができる。