(57)【要約】  固体基板上に固定化された有機分子が多様な方向に存在することを可能とし、有機分子と作用物質との込み入った相互作用を検出することを可能とし、また、方向性に制限がかからないことから構造活性相関の解析をも可能とし、しかも、その製造は簡便、かつ安価に実現することのできる新しい有機分子固定化マイクロアレイとその製造方法並びにこれを用いた作用物質と有機分子との相互作用の検出方法を提供する。  作用物質との相互作用を検出するための有機分子を固定化したマイクロアレイであって、Ａ：基板にはＢ：有機担体が分子間力相互作用により固定化されていると共に、Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子が固定化されているマイクロアレイとする。好適な態様では、このマイクロアレイを用いてテラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過、反射および干渉の少なくともいずれかの測定により分析する。
2008093647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用物質との相互作用を検出するための有機分子を固定化したマイクロアレイであって、
Ａ：基板にはＢ：有機担体が分子間力相互作用により固定化されていると共に、Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子が固定化されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
分子間力相互作用は、疎水性相互作用、静電的相互作用およびイオン性相互作用のうちの少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子がコンジュゲート（共有結合）により固定化されていることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子が、エステル結合、アミド結合、ウレア結合、ウレタン結合およびアセタール結合のうちの少なくともいずれかのコンジュゲート（共有結合）により固定化されていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
Ｂ：有機担体は、ポリマーまたはオリゴマー、もしくは環状化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
Ｂ：有機担体は、ポリアルキレングリコール類、ポリエーテル類、脂肪酸類、ペプチドまたはポリペプチド類、アミノ酸のオリゴマーまたはポリマー、ステロイド類、テルペン類、多環芳香族化合物、ポルフィリン類、および糖鎖類のうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
Ｂ：有機担体は、平均分子量が４５０以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはポリエチレンオキシド、もしくは炭素数８以上の長鎖脂肪酸類であることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
Ａ：基板は、有機メンブレンであることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
Ａ：有機メンブレンはセルロース系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ジエン系ポリマー、フッ素系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、またはポリアリーレン系ポリマーであることを特徴とする請求項８に記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
Ａ：有機メンブレンは、ニトロセルロース（ＮＣ）またはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）であることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のマイクロアレイの製造方法であって、次の工程を含むことを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
＜１・１＞Ｂ：有機担体にＣ：有機分子を固定化し、
＜１・２＞Ａ：基板に固定化する。
【請求項１２】
請求項１から１０のうちのいずれか一項に記載のマイクロアレイの製造方法であって、次の工程を含むことを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
＜２・１＞Ａ：基板に、Ｂ：有機担体を固定化し、
＜２・２＞Ｂ：有機担体にＣ：有機分子を固定化する。
【請求項１３】
請求項１から１０のうちのいずれか一項に記載のマイクロアレイを用いて、Ｃ：有機分子と作用物質との相互作用を検出することを特徴とするマイクロアレイ検出方法。
【請求項１４】
有機分子がその相互作用により作用物質を結合している状態を分析する方法であって、前記有機分子を基板表面に反応結合により、もしくは担体との結合を介して固定化し、テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過、反射および干渉の少なくともいずれかの測定により分析することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項１５】
有機分子は、これとコンジュゲート（共有結合）する担体を介して基板表面に固定化されていることを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項１６】
担体は有機担体であって、基板の表面に分子間力相互作用により固定されていることを特徴とする請求項１５に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項１７】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過吸収の測定により結合状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の相互作用分析方法。
【請求項１８】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過光のスペクトル変化の測定により結合状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項１９】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過、その後の反射と再透過の吸収の測定により結合状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項２０】
近接場光を用い、全反射光の角度変化を測定して結合状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項２１】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波は、周波数が０．０１〜５００ＴＨｚの範囲内であることを特徴とする請求項１４から２０のいずれか一項に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項２２】
相互作用により結合している状態の作用物質と基板表面に反応結合もしくは担体との結合を介して固定されている有機分子とにテラヘルツ（ＴＨｚ）波を照射するテラヘルツ照射部と、照射されたテラヘルツ波の透過、反射および干渉の少くともいずれかを測定する検出部とを備えていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析装置。
【請求項２３】
テラヘルツ照射部は、周波数０．０１〜５００ＴＨｚの範囲のテラヘルツ（ＴＨｚ）波を照射することを特徴とする請求項２２に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析装置。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の装置における検出部での検出結果に基づいて画像を生成する画像構成部とその画像を表示する画像表示部とを備えていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析画像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体成分や天然物、アレルギー成分、細胞、抗体、糖鎖、タンパク質、無機物、有機化合物等の作用物質との相互作用を検出するための有機分子を固体基板に固定化した新規なマイクロアレイとその製造方法、並びにこれを用いた有機分子と作用物質との相互作用の検出方法に関するものである。【０００２】
また本発明は、相互作用によって固体基板の表面に結合する有機分子と作用物質、たとえばタンパク質、核酸、抗体等の作用物質の相互作用を分析可能とする新しい有機分子と作用物質の相互作用分析方法とそのための分析装置並びに分析画像装置に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
有機分子を用いて展開する生物学研究は化学遺伝学もしくは（広義には）ケミカルバイオロジーと呼ばれている。こうした研究は、薬となりうるような特異的で活性の強い有機分子を用いて進められることが多く、基本的には創薬のシーズとなりうるような未知の分子標的を見出すことにその目標を据えているが、相互作用する有機分子とタンパク質をはじめとする各種生体成分との組み合わせを見出す過程の中で、直接的に創薬へと展開される場合もある。このような研究を進める上で必要なのは、ある機能未知の生体成分に特異的に相互作用する有機分子であり、これを見出すために、例えば９６穴のマイクロプレート中で有機分子をスクリーニングする方法が採用されてきている。また、これをより効率化するために、有機分子を基板上に固定化する技術が開発され、ガラス基板による有機分子マイクロアレイ、金基板による表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、ろ紙を基板に使ったマクロアレイなどが報告されている。【０００４】
しかしながら、これらの従来の固定化技術に共通する問題点は、基板上の有機分子の向きが一方向に固定されているところにある。それは、これらの従来の技術がいずれも基板上の官能基に有機分子の官能基を共有結合させているためである。これを解決するために、基板上の官能基によらない有機分子の固定化法として、光反応による共有結合形成で有機分子アレイをガラス上に作成する方法が開発されている（たとえば非特許文献１）が、その場合でも、実際に基板上の有機分子がランダムな向きで並んでいることは証明されていない。しかも特異な光反応性基を用いることが必要であって、マイクロアレイとしては
汎用性に制限があり、その作製が簡便、容易ではないという問題がある。【０００５】
また、各種の糖鎖を疎水性アミンとのシッフ塩基形成によってコンジュゲート（共有結合）させ、それをメンブレン上にスポットして糖アレイを作成し、これを用いて抗体やレクチンとの相互作用を検出したことが報告されている（非特許文献２）が、この場合には化学的に弱い、収率の低いシッフ塩基形成によるコンジュゲート（共有結合）形成が行われていることが大きな問題であり、さらには、コンジュゲート（共有結合）したものは精製してからアレイ作成に用いなければならないため、面倒で負担が大きいという欠点がある。【０００６】
そして、ＳＰＲでは基板の作製にコストがかかるという問題がある。【０００７】
しかも従来のガラスアレイの方法やＳＰＲでは高価なアレイヤー装置が必要である場合が多い。さらに、ろ紙アレイでは担体が弱いことなどが欠点として挙げられる。【０００８】
また、こうした従来のハードな基板を用いるアレイでは、生体高分子の相互作用点が、もし込み合った位置にある場合においては、アレイ上の小分子が相互作用点まで到達できない、という問題点もあった。【０００９】
また従来、固体基板の表面、あるいは固体基板に固定された物質との特有の相互作用による結合状態からタンパク質、核酸、抗体等の作用物質を分析することが行われてきているが、この従来の分析においては、蛍光、発光等のための標識物質を用いて、特有の相互作用で固体基板上に結合している作用物質を標識化して分析する標識化分析法が代表的なものとして知られている。【００１０】
だが、この標識化による蛍光、発光等による分析法の場合には、標識化のための試薬の選択、準備、そして染色、発色処理という標識化のための操作が必要であって、分析時間の短縮による高効率化やコスト低減の点で大きな制約があった。また、標識化のために、分析対象とする作用物質の範囲にも制約があった。【００１１】
また、このような標識化による分析法の問題点を解消するものとして、標識化を行わずに無標識で分析を行うＳＰＲ法も知られている。しかしながら、このＳＰＲにおいても上記の標識化方法と同様に固体基板の表面に作用物質と相互作用する有機分子等の物質を固定化しておくことが必要であるが、ＳＰＲではこの際の固体基板の表面を金属薄膜として構成する必要があり、この金属薄膜への有機分子等の固定は容易ではなく、しかも金属薄膜を表面に有する固体基板は高価であるという問題がある。【００１２】
そして、従来では、たとえばガラス基板を用いたマイクロアレイによる上記の標識化分析法においても、またＳＰＲ法においても、ハイスループット分析するためには高価なアレイヤー装置が別途に必要になるとともに、固体基板上に、有機分子等の物質を固定する際には改善すべき課題が残されてもいた。たとえば、洗浄時の流れ落ちを防ぎ、定量的分析を可能とするための改善策である。また、通常、有機分子等の物質は固体基板に対して一定の方向で固定されているために、作用物質との反応性に制約があり、高感度分析の支障になっていたことがある。このことの改善等も求められていた。【００１３】
一方、近年になって、可視光と電波の間に残された技術的に未開拓な電磁波としてのテラヘルツ波（ＴＨｚ波）を生体関連分子のセンシングやイメージングに用いることが注目されてきており、実際にも、ガラススライド上においてビオチン−アビジン相互作用をテラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過光を用いて分析したこと（非特許文献３）や、シリコン基板上に作製したＴｉ／Ａｕ配線上にＤＮＡサンプルをスポットして分析したこと（非特許文献４）が報告されている。しかし、前者の報告においてはフェムト秒レーザーという非常に高価なレーザーを用いたＴＨｚシステムを利用した方式（ＴＨｚ−ＴＤＳ）により位相差を用いて分析しているため、大掛りなシステムであって、実際的な一般性を欠いている。また、後者の場合には、配線を導波路として利用し、共振器を形成することで分析可能とするものであるが、実際上は基板の再利用は困難で、分析の都度高度な技術を要する基板作成が必要になるという問題点がある。【００１４】
また、凍結乾燥した状態の検体に０．１〜１０ＴＨｚ周波数帯域のテラヘルツ（ＴＨｚ）波を照射して透過画像を生成させる方法（特許文献１）も提案されている。だが、この方法においては凍結乾燥という大きな制約がある。【００１５】
さらにまた、ＲＮＡについて、ペレットやフィルムを作製し、ＴＨｚ−ＴＤＳで分析したこと（非特許文献５）も報告されている。しかし、これは基板に滴下、乾燥させて測定しただけの結果であって、実用性に乏しい。しかも、基板上で乾燥させる場合、液体のサンプルはリング状に乾燥するので非常に不均一な信頼性の乏しいデータしか得られず定量測定が困難であった。そこで、この問題点を改善するための方策として、フィルタメンブレンに設けたウエルに滴下した生体分子試料をその乾燥後にＴＤＳシステムでテラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過光を測定して分析することが試みられている（非特許文献６）。だが、この場合でも、メンブレン上に載せたサンプルを測定しているだけであって、たとえば生体高分子等との相互作用を分析する際には欠かせない反応処理や、そのための洗浄などの作業プロセスについては全く考慮されていない。このため、実際の分析においては載せているサンプルが洗浄処理等により流れてしまい、相互作用を分析するための反応処理も困難である。【００１６】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波による分析は、従来の標識化分析における問題点を解消して、基板に固定した未知成分としての有機分子と既知の作用物質との相互作用、あるいはその逆の関係での相互作用を無標識で分析可能とする新しい可能性を拓き、さらには標識化した場合であっても、従来技術の問題点を克服して更に高感度に定性−定量分析でき、これらいずれの場合もイメージングも可能とするものと期待されるが、実際に作用物質を高感度で分析可能とするためには、上記従来の標識化分析法やＳＰＲ法の場合と同様に、被験試料としての生体高分子等の作用物質と有機分子との相互作用による結合状態を安定して、簡便、かつ低コストに、ハイスループット分析を可能とするように形成し、しかも、これらをテラヘルツ（ＴＨｚ）波分析に適したものとすることが解決すべき大きな課題であった。また、このような問題の解決に沿って、テラヘルツ（ＴＨｚ）波分析の好適な手法をイメージング（画像形成）をも可能とするように技術として確立することも重要な課題となっていた。
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed., 42, 5584-5587(2003)
【非特許文献２】Nature Biotechnology, 20, 1011-1017(2002)
【非特許文献３】Phys. Med. Biol., 47(2002) 3789-3795
【非特許文献４】Appl. Phys. Lett., 80(2002) 154-156
【非特許文献５】Optocs Express, 13(2005) 5250-5215
【非特許文献６】平成１８年度社団法人日本分光学会「テラヘルツ分光学会シンポジウム  テラヘルツ分光の最先端−テラヘルツ分光で見えるもの見えないもの−講演要旨集」（平成１８年１１月２日）、第４６−５１頁
【特許文献１】特開２００６−８４４２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、以上のとおりの背景から、従来の問題点を解消して、固体基板上に固定化された有機分子が多様な方向に存在することを可能とし、有機分子と作用物質との込み入った相互作用を検出することを可能とし、また、方向性に制限がかからないことから構造活性相関の解析をも可能とし、しかも、その製造は簡便、かつ安価に実現することのできる新しい有機分子固定化マイクロアレイとその製造方法、さらにはこれを用いた作用物質と有機分子との相互作用の検出方法を提供することを課題としている。【００１８】
また本発明は、従来の標識化分析法、そして無標識分光法の問題点を解消し、生体関連分子のハイスループット分析を、簡便、かつ低コストに、高感度な分光分析としてＴＨｚ（テラヘルツ）波を利用することにより可能とし、さらにはイメージング（画像形成）まで可能とする新しい有機分子と作用物質の相互作用分析方法とそのための装置を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、上記の課題を解決するものとして、以下のことを特徴としている。【００２０】
第１：作用物質との相互作用を検出するための有機分子を固定化したマイクロアレイであって、
Ａ：基板にはＢ：有機担体が分子間力相互作用により固定化されていると共に、Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子が固定化されているマイクロアレイとする。【００２１】
第２：分子間力相互作用は、疎水性相互作用、静電的相互作用およびイオン性相互作用のうちの少なくともいずれかであるマイクロアレイとする。【００２２】
第３：Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子がコンジュゲート（共有結合）により固定化されているマイクロアレイとする。【００２３】
第４：Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子が、エステル結合、アミド結合、ウレア結合、ウレタン結合およびアセタール結合のうちの少なくともいずれかのコンジュゲート（共有結合）により固定化されているマイクロアレイとする。【００２４】
第５：Ｂ：有機担体は、ポリマーまたはオリゴマー、もしくは環状化合物であるマイクロアレイとする。【００２５】
第６：Ｂ：有機担体は、ポリアルキレングリコール類、ポリエーテル類、脂肪酸類、ペプチドまたはポリペプチド類、アミノ酸のオリゴマーまたはポリマー、ステロイド類、テルペン類、多環芳香族化合物、ポルフィリン類、および糖鎖類のうちの少なくとも１種であるマイクロアレイとする。【００２６】
第７：Ｂ：有機担体は、平均分子量が４５０以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはポリエチレンオキシド、もしくは炭素数８以上の長鎖脂肪酸であるマイクロアレイとする。【００２７】
第８：Ａ：基板は、有機メンブレンであるマイクロアレイとする。【００２８】
第９：Ａ：有機メンブレンはセルロース系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ジエン系ポリマー、フッ素系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、またはポリアリーレン系ポリマーであるマイクロアレイとする。【００２９】
第１０：Ａ：有機メンブレンは、ニトロセルロース（ＮＣ）またはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）であるマイクロアレイとする。【００３０】
第１１：上記いずれかのマイクロアレイの製造方法であって、次の工程を含むこととする。【００３１】
＜１・１＞Ｂ：有機担体にＣ：有機分子を固定化し、
＜１・２＞Ａ：基板に固定化する。【００３２】
第１２：上記いずれかのマイクロアレイの製造方法であって、次の工程を含むこととする。【００３３】
＜２・１＞Ａ：基板に、Ｂ：有機担体を固定化し、
＜２・２＞Ｂ：有機担体にＣ：有機分子を固定化する。【００３４】
第１３：上記いずれかのマイクロアレイを用いて、Ｃ：有機分子と作用物質との相互作用を検出する。【００３５】
第１４：有機分子がその相互作用により作用物質を結合している状態を分析する方法であって、前記有機分子を基板表面に反応結合により、もしくは担体との結合を介して固定化し、テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過、反射および干渉の少なくともいずれかの測定により分析することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００３６】
第１５：有機分子は、これとコンジュゲート（共有結合）する担体を介して基板表面に固定化されていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００３７】
第１６：担体は有機担体であって、基板の表面に分子間力相互作用により固定されていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００３８】
第１７：テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過吸収の測定により結合状態を分析することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００３９】
第１８：テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過光のスペクトル変化の測定により結合状態を分析することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００４０】
第１９：テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過、その後の反射と再透過の吸収の測定により結合状態を分析することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００４１】
第２０：近接場光を用い、全反射光の角度変化を測定して結合状態を分析することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００４２】
第２１：上記テラヘルツ（ＴＨｚ）波は、周波数が０．０１〜５００ＴＨｚの範囲内であることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法とする。【００４３】
第２２：相互作用により結合している状態の作用物質と基板表面に反応結合もしくは担体との結合を介して固定されている有機分子とにテラヘルツ（ＴＨｚ）波を照射するテラヘルツ照射部と、照射されたテラヘルツ波の透過、反射および干渉の少くともいずれかを測定する検出部とを備えていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析装置とする。【００４４】
第２３：テラヘルツ照射部は、周波数０．０１〜５００ＴＨｚの範囲のテラヘルツ（ＴＨｚ）波を照射することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析装置とする。【００４５】
第２４：上記装置における検出部での検出結果に基づいて画像を生成する画像構成部とその画像を表示する画像表示部とを備えていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析画像装置とする。
【発明の効果】
【００４６】
上記のとおりの本発明のマイクロアレイによれば、分子間力相互作用をもって基板に固定された有機担体に対して有機分子がその固定によって多様な方向に存在することから、作用物質との相互作用がより効率的に進行し、検出の感度も大きく向上することになる。しかも、方向性に制限がかからないことから、構造活性相関の解析も可能となる。さらに、有機分子と作用物質との込み入った相互作用を検出することも可能となる。【００４７】
また、本発明の製造方法によれば、スポット固定化も可能であって、簡便、かつ、安価なものとして実現される。【００４８】
そして標識化した任意の作用物質との相互作用を可視化することも可能である。【００４９】
さらにまた、本発明のマイクロアレイによれば化学反応の追跡にも適用が可能で、その場合においても、反応は高収率で進行する必要はなく、用いた試薬は基板の洗浄時に取り除かれ、サンプルをあらかじめ精製しておく必要もない。【００５０】
また本発明によれば、相互作用による生体高分子等の作用物質との結合状態が測定検出の対象とされる有機分子は固体基板の表面に反応結合により、もしくは担体との結合を介して固定化されてテラヘルツ（ＴＨｚ）波照射されるこから、生体関連分子等のハイスループット分析を安定して、信頼性が高く、簡便、かつ低コストに実現でき、高感度な定性または定量分析、もしくは定性・定量分析として可能とされる。すなわち、本発明によれば、従来の標識化分析における問題点を解消し、しかもこれまでのテラヘルツ（ＴＨｚ）分析の課題を解決して、基板に固定した未知成分としての有機分子と既知の作用物質との相互作用、あるいはその逆の関係での相互作用の分析を無標識で高感度に行うこと、さらには、標識化した場合であっても、従来の問題を解消して高感度に分析することを可能とする。そしてその分析は、イメージング（画像形成）としても実現される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】テラヘルツ（ＴＨｚ）波による透過吸収の検出の形態を示した図である。
【図２】テラヘルツ（ＴＨｚ）波による透過光のスペクトル変化の検出形態を示した図である。
【図３】Δfの画像化の形態を示した図である。
【図４】強度変化Δｌの画像化の形態を示した図である。
【図５】テラヘルツ（ＴＨｚ）波による透過、反射、再透過の検出形態を示した図である。
【図６】近接場光を用いる検出形態を示した図である。
【図７】Ｃｙ３−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（４）およびＭＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（５）の蛍光検出による可視化の結果を示した図である。
【図８】biotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（７）およびＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）のストレプトアビジンとの相互作用の蛍光検出による可視化の結果を示した図である。
【図９】実施例２（例２−２）の場合の透過画像を示した図である。
【図１０】図９の場合の吸光度画像のSmoothing処理の結果を示した図である。
【図１１】biotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（７）およびＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）のアルカリホスファターゼ−ＢＣＩＰ検出による可視化の結果を示した図である。
【図１２】biotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（７）およびＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）のアルカリホスファターゼ−化学発光検出による可視化の結果を示した図である。
【図１３】ＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）のアルカリホスファターゼ−化学発光検出による可視化の結果を示した図である。
【図１４】図１３の画像データを用いてピーク分析した結果を示した図である。
【図１５】ジゴキシン類（９）（１０）（１１）のアルカリホスファターゼ−化学発光検出による可視化の結果を示した図である。
【図１６】実施例２（例２−５）の場合の透過画像（吸光度）と透過反射画像（吸光度）を示した図である。
【図１７】ＰＥＧシートに固定化されたbiotinの蛍光検出による可視化の結果を示した図である。
【図１８】ビオチンエステル化反応の追跡の結果を示した図である。
【図１９】固定化された糖誘導体とレクチンとの相互作用を蛍光検出した結果を示した図である。
【図２０】固定化された糖誘導体とレクチンとの相互作用をテラヘルツ（ＴＨｚ）波を検出した結果を透過画像と透過反射画像として示した図である。
【図２１】固定化された糖誘導体とレクチンとの相互作用を蛍光検出した結果を示した図である。
【図２２】固定化された糖誘導体とレクチンとの相互作用をテラヘルツ（ＴＨｚ）波により検出した結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本発明の実施の形態について以下に説明する。【００５３】
本発明のマイクロアレイにおいては、前記のとおり、
Ａ：基板、Ｂ：有機担体、Ｃ：有機分子をもって構成されており、ＡとＢ、すなわち、基板には有機担体が分子間力相互作用により固定化されている。また、ＢとＣ、すなわち有機担体には有機分子が固定化されている。【００５４】
通常、Ｃ：有機分子そのものは、固体であるＡ：基板と全く相互作用しないか、あるいは極めて弱い相互作用しかしない。このため、洗浄によって有機分子は容易に離れてしまう。しかしながら、本発明では、Ａ：基板に対してＢ：有機担体が分子間力相互作用により固定化されていると共に、Ｂ：有機担体にＣ：有機分子が固定化されていることから、有機分子は基板に確実に、安定して固定化される。この場合の有機分子の固定化は、その方向を多様なものとすることが可能である。【００５５】
ここで、Ａ：基板に対してＢ：有機担体を固定するための分子間力相互作用は、いわゆるコンジュゲート（共有結合）等の化学的な結合作用とは本質的に異なるものであって、疎水性相互作用、静電的相互作用、イオン性相互作用のうちのいずれかのものとして考慮される。物理的な結合形成と言ってもよい。【００５６】
疎水性相互作用は、疎水結合(hydrophobic bonding)と呼ばれているものであって、水との間の相互作用が弱く、水との親和力が弱い性質を持つ物質、もしくはその性質を持つ官能基（疎水基）を有している物質が相互に集合して安定化することを意味している。これは、積極的に相互に引用を作用し合ったり、結合し合ったりする性格のものではなく、相互に集合して存在することが熱力学的に安定した状態となることを意味している（たとえば、（株）東京化学同人発行「化学大辞典」（１９８９年第１版）第１３１３頁参照）。【００５７】
また、静電的相互作用は、いわゆる静電気的な相互作用である。また、イオン性相互作用は、イオンの存在に由来する相互作用である。【００５８】
Ｂ：有機担体との間でこのような分子間力相互作用が形成されるＡ：基板は、安価に入手、製造しやすいもので、かつ、取り扱いしやすいものとして選定すればよく、光透過性のものとすることで、可視化にも良好なものとすることができる。【００５９】
このような基板としては、たとえば有機ポリマーやシリコン、金属、あるいはセラミックス等の無機物であってよい。有機ポリマーは、たとえばメンブレン（膜状体）、フィルム、シート、あるいはバルク、もしくは織布や不織布等の形態であってよい。【００６０】
いずれの場合であっても、本発明の基板には、有機溶媒耐性をもつものが用いられる。【００６１】
本発明においては、以上のような基板として、たとえばポアサイズが０．５μｍ以下の有機ポリマーのメンブレンが好適なものとして考慮される。【００６２】
このような有機メンブレンとしては、たとえばセルロース系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ジエン系ポリマー、フッ素系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマー、ナイロン等のポリアミド系ポリマー、ポリエーテル系ポリマー、ポリエーテルスルホン系ポリマー、ポリアリーレン系ポリマー等の各種のホモポリマー、あるいはコポリマーのものとして選定することができる。より具体的には、たとえば、ニトロセルロース（ＮＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等を好適なものとして例示することができる。【００６３】
このようなメンブレン、たとえばニトロセルロースメンブレンやＰＶＤＦ等を用いた場合には、作用物質を滴下した時に浸み込み、メンブレンの内部に浸透することから、この内部の状態もテラヘルツ（ＴＨｚ）波測定での検出結果に反映されるため、より高い精度での分析が可能になるという特徴も発揮される。【００６４】
本発明の基板における有機担体との分子間相互作用については、その疎水性の程度を判別することによって疎水性相互作用が主となるものかどうかがわかる。その判別のための手段としては、対象とする物質を水と混じり合わない有機溶媒に溶解して水と混合し、平衡に達した時の双方での濃度の差（有機溶媒中の濃度／水中の濃度、すなわち分配係数）、あるいはこれを常用対数で表示したＬｏｇＰを用いることができる。有機溶媒としてはｎ−オクタノールを用いることが多い。コンピューターでの分子構造からの予測計算の方法としてＣｌｏｇＰ法がある。あるいはまた、逆相クロマトグラフィーでも疎水性の程度を知ることができる。【００６５】
たとえば、分子量２４００として計算すると、ＣｌｏｇＰは以下のような値となる。【００６６】
ＰＶＤＦ：５１．６３
ナイロン：１０．３８
ＰＴＦＥ：４７．９４
ポリエチレン：１０５．２４
ポリエステル（ＰＥＴ）：１６．２６
ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）：２４．３０
ポリカーボネート：５２．１４
たとえばこれらのことを実験的知見に照らしてみると、ポリマーを基板とする場合、分子量２４００としたＣｌｏｇＰの値が１０以上であれば本発明において有効な「疎水性」であると判断してよい。一方、ＣｌｏｇＰ値が次のように、
セルロース：−２９．７６
ニトロセルロース：−３．２４
のように負の数値として求められるものは、疎水性相互作用ではなく、静電的相互作用を主にもたらすものと考えることができる。【００６７】
なお、疎水性の測定については、
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E7%96%SE%E6%B0%B4%E6%80%A7を参照することができる。【００６８】
そして本発明においては、疎水性の基板とするために、各種の素材の表面を、たとえばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の疎水化剤や、その他の手段によって疎水化表面処理したものであってもよい。【００６９】
一方、ポリアニオンやポリカチオンでポリマー等の表面を修飾した場合には、イオン性の相互作用、さらにはこれに疎水性の相互作用を与えることができる。【００７０】
本発明においては、基板と有機担体とが化学的に共有結合するものや、親水性基等の存在による極めて強い結合をもたらすものは好ましくない。本発明の所期の目的、そして効果の実現が難しいからである。【００７１】
基板が以上のような疎水性等の分子間力相互作用を実現するものとして本発明の有機担体も選択されることになる。【００７２】
本発明におけるＢ：有機担体は、Ａ：基板との相互作用による結合、固着等による固定を可能とするものであるが、一般的には、ポリマーまたはオリゴマー、もしくは芳香族化合物や複素環化合物、糖類等の環状化合物であることが好ましい。ここで、オリゴマーとポリマーとの区別については厳密ではなく、繰り返し単位がおよそ１０以下のものをオリゴマーとし、それ以上のものをポリマーとすることができる。より具体的には、本発明におけるＢ：有機担体としては、ポリアルキレングリコール類、ポリエーテル類、脂肪酸類、ペプチドまたはポリペプチド類、アミノ酸、特にβ−アミノ酸のオリゴマーまたはポリマー、ステロイド類、テルペン類、多環芳香族化合物、ポルフィリン類、糖鎖類等のうちから選定することができる。さらに好適には、たとえば、平均分子量が４５０以上７００００以下のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）あるいはポリエチレンオキシドや、その一方端の水酸基のエーテルあるいはエステル化物、炭素数８以上の長鎖脂肪酸を考慮することができる。ここで、たとえばポリエチレングリコールやポリエチレンオキシド等のポリエーテル類の分子量が４５０以上であるとｌｏｇＰの実験値は１０を超え、「疎水性」と判別され、疎水性相互作用を形成するのに有効なものであることがわかる。また、脂肪酸でも、アルキル鎖が炭素（Ｃ）数８であるとＣｌｏｇＰは２．６８と算定され、８以上のものであれば十分に疎水性相互作用を形成することになる。【００７３】
一方、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）や脂肪酸は、上記のセルロースやニトロセルロース等の間では静電的相互作用に寄与するものとも考えられる。【００７４】
Ａ：基板に疎水性等の分子間力相互作用によって結合、固着等により固定化されるＢ：有機担体は、Ｃ：有機分子を固定化するが、この固定化は、化学的あるいは物理的な結合や付着、固着等であってよい。たとえば、化学的なコンジュゲート（共有結合）の形成による結合や、イオン結合、水素結合、静電結合等であってよい。なかでも、より強固な固定化を可能とするものとして、コンジュゲート（共有結合）可能なものであることが好適に考慮される。このコンジュゲート（共有結合）は各種のものであってよいが、より簡便に、汎用性のあるものとしては、エステル結合、アミド結合、ウレア結合、ウレタン結合、フェノール基との結合、アセタール結合等が好適に考慮される。これらのコンジュゲート（共有結合）を形成するための官能基、たとえばヒドロキシ基（ＯＨ）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、アミノ基（ＮＨ2）カルボニル基（−ＣＯ−）等を、Ｂ：有機担体とＣ：有機分子が各々有していることが望ましい。【００７５】
一方、Ｃ：有機分子についてはその種類に特に限定はない。作用物質との相互作用を検討するために必要な各種の、低分子もしくは高分子の有機分子であってよい。たとえば、実施例にも示したビオチン(biotin)や、digoxin, digoxigenin等の生理活性天然物の各種のものであってよい。また、アルコール類、フェノール類、カルボン酸類、アミン類、糖類、アミノ酸、ペプチド類、タンパク質、ポリエーテル類等の各種のものが考慮される。これら有機分子については、繰り返し構造のない化合物であって、分子量が約４０００以下のものであることが好適に考慮される。そして、いずれの場合も、Ｂ：有機担体とコンジュゲート（共有結合）できる官能基を持つもの、あるいはその官能基を導入した誘導体であることが好ましい。【００７６】
これらのＣ：有機分子との相互作用検出のための作用物質も各種であってよい。たとえば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、レクチン、抗体、ビタミン、ホルモン、環境ホルモン、細胞、糖鎖、天然または合成の有機化合物、無機化合物や金属、アレルギー成分等であってよい。【００７７】
そして、本発明のマイクロアレイは、前記のように、
＜１・１＞Ｂ：有機担体にＣ：有機分子を固定化し、次いで、
＜１・２＞Ａ：基板に所要のパターンで固定する方法、あるいは、
＜２・１＞Ａ：基板に、Ｂ：有機担体を固定化し、次いで、
＜２・２＞Ｂ：有機担体にＣ：有機分子を固定化する方法によって、簡便、かつ、安価に製造することができる。【００７８】
これらの固定については、所要のパターンによるスポット固定（dot-blotting）することも可能である。この場合のスポット固定の手段については各種の方法であってよく、従来公知の手段も適宜に採用される。Ａ：疎水性基板としての有機メンブレン等への固定化の方法としては、このスポッティング法をはじめとして、インクジェット法、マイクロコンタクトプリンティング法、エレクトロスプレーデポジション法（ＥＳＤ）、フォトリソグラフィー法等の各種の方法が考慮される。【００７９】
また、泳動したＣ：有機分子、あるいはＢ：疎水性有機担体に固定化されたＣ：有機分子の転写による方法も考慮される。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）ブロッティング法による転写や、電気泳動等によるゲルからの転写、ペーパークロマトグラフィーからの転写等である。これらのいずれの手段も本発明においては考慮される。【００８０】
なお、＜２・１＞＜２・２＞の方法では、＜２・２＞においてＣ：有機分子を所要パターンでスポット固定してもよいし、あらかじめ＜２・１＞においてＢ：有機担体をパターン固定しておいてもよい。【００８１】
本発明においては、以上のマイクロアレイの製造においても、前記のとおり、Ｂ：有機担体としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）類が好適な形態として考慮されるが、この場合のＰＥＧとしては、その平均分子量（ＭＷ）はたとえば４５０〜３５０００の範囲のものが好ましく、Ｃ：有機分子との固定化をコンジュゲート（共有結合）の形成により行う場合には、このコンジュゲート（共有結合）は、たとえは、エステル化、アセタール化、アミド化、ウレア化、もしくはウレタン化として実施することができる。そして、たとえばこのための末端官能基ＰＥＧが具備していることが望ましい。反応条件については例示すると、縮合剤としては以下のものが例示される。【００８２】
エステル結合：ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）、ＥＤＣ塩酸塩、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＨｆＣｌ4（四塩化ハフニウム）、Ｂｕ3Ｐ（トリブチルホスフィン）、ランタニドトリフラート、ＥＥＤＱ（Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン）
アセタール形成：ヨウ素、ＮＩＳ（Ｎ−ヨードコハク酸イミド）、ＩＣｌ（塩化ヨウ素）
反応溶媒には、塩化メチレン、クロロホルム、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、メチルアルコール、水、エーテル、ＴＨＦ、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、トリフルオロエタノール、ベンゼン、トルエン、ピリジン、ヘキサン、あるいはこれらの２種以上の混合溶媒が考慮される。反応温度は、通常は、常温（１０℃〜２５℃）程度でよいが、さらに加温または冷却してもよい。【００８３】
たとえば以上のような本発明のマイクロアレイを用いての有機分子と作用物質との相互作用の検出には従来公知の方法をはじめとして各種の手段が採用されてよい。たとえば、蛍光検出やアルカリホスファターゼ活性の検出、ペルオキシダーゼ活性の検出、化学発光検出、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法や金コロイド染色による検出、分光分析による検出等が考慮されてよい。そして、これらの検出においてはその可視化も可能である。【００８４】
特に本発明では、上記のマイクロアレイを用いての有機分子と作用物質との相互作用の検出にテラヘルツ（ＴＨｚ）波を利用する態様が好適である。そしてまた、テラヘルツ（ＴＨｚ）波を利用した本発明に係る有機分子と作用物質の相互作用の分析方法とそのための装置においては、たとえば以下のような多様な無標識、あるいは標識化の形態として有機分子と生体高分子等の作用物質との結合状態での相互作用の分析が可能とされる。
＜１＞透過吸収の測定
たとえば図１に例示したように、テラヘルツ光源（１０１）からのテラヘルツ（ＴＨｚ）波を試料（１０２）に照射し、その透過吸収を検出器（１０３）により検出する。その結果を画像として表示装置（１０４）に表示する。テラヘルツ（ＴＨｚ）波の照射光、そして透過光は放物面鏡（１０５）を介して導かれる。多素子の検出器（１０３）を用いることで、画像化はより解像度の高いものとすることができる。
＜２＞透過光のスペクトル変化
また、図２に例示したように、テラヘルツ光源（１０１）からのテラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過にともなうスペクトルの変化を検出器（１０３）やセンサー（１０６）等によって測定検出し、有機分子と作用物質との相互作用の有無を屈折率の変化で検出することやその量を分析することができる。【００８５】
この場合、集光と単一素子による検出で画像化することも可能となる。【００８６】
この画像化については、たとえば図３に示したように分光スペクトル情報を利用して周波数変化量Δｆについて画像化することや、図４に示したようには単色光源の透過強度変化Δｌを画像化することもできる。【００８７】
つまり、単色光源での分析が可能となる。
＜３＞透過、反射と再透過
図５に例示したように、たとえば担体メンブレン等を用いる場合、テラヘルツ（ＴＨｚ）波がメンブレン内を透過しながらタンパク質などの吸収を受け、反射部材で反射した後再びタンパク質などの吸収を受けるようにすことができる。この場合には、実効的に２倍の光路長さを伝播することになるため、微小な差異を高感度で測定できることになる。集光系、平行光のいずれの光学系でも可能である。もちろん、メンブレン等の表裏が図５と逆でも可能である。（試料が反射部材側でも可）。
＜４＞近接場光を用いた方法
図６のように、近接場光を用い、強度の変化や屈折率変化による全反射光の角度変化で有機分子と作用物質との相互作用の有無や定量測定が可能となる。図中のメンブレン上の試料（サンプル）はプリズム側にあっても測定可能である。画像化のためには、プリズム上でサンプルを移動させるか、検出器を多素子として結像系を組むことが考慮される。【００８８】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波は波長が長い電磁波であることから、近接場光の染み出し量が多く、感度の良い分析が可能になる。また、波長が長い故に、薄い基板を透過し、その上に固定された有機分子による作用物質との相互作用を分析するのに適している。【００８９】
そして、水分が含まれている場合の分析も可能であるという大きな特徴もある。【００９０】
たとえば以上のいずれの形態においても、本発明の分析装置としては、テラヘルツ光源を含む照射部と検出部を必須とし、また、画像化のためには、検出部での検出結果から画像を生成する画像構成部と画像表示部とを備えることを必須としている。なお、テラヘルツ光源としては、たとえばテラヘルツ（ＴＨｚ）波パラメトリック発信器、光注入型テラヘルツ（ＴＨｚ）波パラメトリック発信器、量子カスケードレーザー、光混合型ＴＨｚ波発生装置、差周波混合テラヘルツ（ＴＨｚ）波発生装置、自由電子レーザー、後進波管等の各種の手段を用いてよい。そして、本発明の分析方法、そのための分析装置においては、テラヘルツ（ＴＨｚ）波の周波数としては、一般的には０．０１〜５００ＴＨｚの範囲内であることが、また、より実際的には０．１〜１０ＴＨｚの周波数帯域を好適に考慮することができる。【００９１】
また、検出器も各種のものであってよい。たとえば、集電素子、ポロメータ、基板吸収型超伝導テラヘルツ波検出素子、量子ドット型テラヘルツ波検出素子を用いることができる。これらのうち集電素子としてはＤＴＧＳのほかに、たとえばＬｉＴａＯ3（タンタル酸リチウム）、ＰＺＴ（圧電素子）、ＴＧＳ（硫酸トリグリシン）、ＰｂＴｉＯ3磁気配向膜（チタン酸鉛配向膜）、ＰＶＦ2（ポリフッ化ビニリデン）を用いることができる。また、ボロメータとしては、たとえばシリコンボロメータ、ＩｎＳｂボロメータ（インジウムアンチモンボロメータ）を用いることができる。さらにテラヘルツ光源と波検出器に代えて、テラヘルツ（ＴＨｚ）波の発生器と検出器が一体となったシステムとして、たとえばフェムト秒パルスレーザー半導体ンテナを用いたテラヘルツ波時間領域分光システムを用いることもできる。このシステムは、２つの半導体アンテナを備えており、一方の半導体アンテナからテラヘルツ波を出射し、他方の半導体アンテナによりテラヘルツ波を検出する。【００９２】
画像構成部は、たとえばコンピュータであって、たとえば微小信号検出器から順次入力される電子信号に基づいて試料の各点におけるテラヘルツ波の透過強度を算出する。一方画像構成部は、たとえば二次走査ステージに接続され、二次元走査ステージの移動動作を制御するとともに、二次元走査ステージの初期位置からの移動量を検出して二次元走査ステージの位置を算出する。画像構成部では、所定時間ごとにテラヘルツ波の透過強度と二次元走査ステージの位置を関連づけて、透過画像として展開し、その結果を画像表示部（たとえばＣＲＴディスプレイ、液晶ディスプレイ）に出力する。この画像表示部では、透
過強度を濃淡に置き換えた試料の透過画像が表示される。【００９３】
以上の例示説明は透過測定の場合のものであるが、他の場合についても同様に各種の技術手段をもって適宜に構成される。【００９４】
このようなテラヘルツ（ＴＨｚ）波の利用による分析は、上記した本発明のマイクロアレイ、すなわち、A：基板にはＢ：有機担体が分子間力相互作用により固定化されていると共に、Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子が固定化されているマイクロアレイが好適に用いられるが、本発明に係るテラヘルツ（ＴＨｚ）波の利用による分析には、試料としての、生体高分子等の作用物質が相互作用により結合する有機分子を反応結合により、あるいは担体を介しての結合により基板に固定したものを用いることができる。【００９５】
ここで、たとえば反応結合とは、金（Ａｕ）基板に対してのチオール基（ＳＨ基）を有する化合物を用いた反応による結合や、シリコン、酸化亜鉛等の無機基板に対しての自己組織化膜（ＳＡＭ膜）の形成による有機分子の固定化、金、銀、シリコン、亜鉛、チタン、あるいはこれらの酸化物等の無機材に特異的に結合するペプチドやタンパク質等を用いた結合等の公知手段によるもの等であってよいが、もちろんこれに限定されることはない。また、担体との結合を介して固定では、有機分子と担体とが化学的に、あるいは物理的に結合していることを意味している。【００９６】
本発明においては、この担体を用いる方法がより好適なものとして考慮される。この場合、担体は、有機物または無機物のいずれでもよいが、これを有機担体として、基板に固定し、マイクロアレイを構成することがより好適なものとして考慮される。より実際的には、上記したように、Ａ：基板にはＢ：有機担体が分子間力相互作用により固定化されていると共に、Ｂ：有機担体にはＣ：有機分子が固定化されていることを特徴とするマイクロアレイとすることである。【００９７】
たとえば上記のマイクロアレイを用いての有機分子と作用物質との相互作用の検出に本発明のＴＨｚ波が用いられることになるが、上記のマイクロアレイの場合には、固定化された有機分子が多様な方向に存在することから、作用物質との相互作用がより効率的に進行し、検出の感度も大きく向上することになる。しかも、方向性に制限がかからないことから、構造活性相関の解析も可能となる。さらに、有機分子と作業物質との込み入った相互作用を検出することも可能となる。【００９８】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん以下の例によって発明が限定されることはない。
【実施例】
【００９９】
＜実施例１＞
有機分子を、コンジュゲート（共有結合）の形成によって疎水性有機担体としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ)に導入した。
（例１−１）
次式に沿って蛍光色素Ｃｙ３を導入してＣｙ３−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（４）を合成した。【０１００】
【化１】
2008093647.tif 000003
【０１０１】
まず、平均分子量（ＭＷ）３４００のＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（１）（１３．９ｍｇ、０．００７７０ｍｍｏｌ）およびＣｙ３（３）（８．８ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（０．１ｍＬ）の攪拌溶液に、室温においてＤＣＣ（２．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン：ＤＭＡＰ（０．２ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を添加した。【０１０２】
１９時間後、シリカゲル（０．５ｇ、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3＝１０：９０）で濾過し、ＰＥＧ含有フラクションを減圧下に濃縮した。さらに、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex  Ｇ−２５、ＭｅＯＨ）により精製して、Ｃｙ３−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（４）（１４．９ｍｇ、２９％重量収率、赤色固形物）を得た。【０１０３】
【表１】
2008093647.tif 000004
【０１０４】
（例１−２）
次式【０１０５】
【化２】
2008093647.tif 000005
【０１０６】
に沿って、ＭＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（５）を合成した。【０１０７】
すなわち、まず、平均分子量（ＭＷ）５０００のＭＰＥＧ−ＯＨ（２）（５４．０ｍｇ、０．０１０８ｍｍｏｌ）およびＣｙ３（３）（１２．３ｍｇ、０．０２１６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（０．１ｍＬ）攪拌溶液に、室温においてＤＣＣ（３．３ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．３ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を添加した。【０１０８】
２２時間後、例１−１と同様に処理して、ＭＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（５）（６１．１ｍｇ、１００％重量収率）（赤色固形物）を得た。1ＨＮＭＲスペクトルからの実効収率は９８％であった。【０１０９】
【表２】
2008093647.tif 000006
【０１１０】
（例１−３）
次式【０１１１】
【化３】
2008093647.tif 000007
【０１１２】
に沿って、ＰＥＧとビオチン(biotin)からbiotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（７）を合成した。【０１１３】
まず、平均分子量（ＭＷ）３４００のＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（１）（５０．０ｍｇ、０．０１４７ｍｍｏｌ）およびビオチン（６）（７．２ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．３ｍＬ）攪拌溶液に、室温においてＤＣＣ（４．６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を添加した。【０１１４】
４日後に、減圧下にトルエンとの共沸により濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィー（Sephadex  Ｇ−２５、ＭｅＯＨ）により精製して、biotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（５２．７ｍｇ、４１％重量収率）（無色固形物）を得た。【０１１５】
【表３】
2008093647.tif 000008
【０１１６】
（例１−４）
次式【０１１７】
【化４】
2008093647.tif 000009
【０１１８】
に沿って、ＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）を合成した。【０１１９】
平均分子量（ＭＷ）５０００のＭＰＥＧ−ＯＨ（２）（５１．６ｍｇ、０．０１００ｍｍｏｌ）およびビオチン（６）（４．９ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）攪拌溶液に、室温においてＤＣＣ（３．１ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を添加した。【０１２０】
１２時間後、例１−３と同様に処理して、ＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）（５０．０ｍｇ、９６％）（無色固形物）を得た。1ＨＮＭＲスペクトルからの実効収率は６５％であった。【０１２１】
【表４】
2008093647.tif 000010
【０１２２】
（例１−５）
次式【０１２３】
【化５】
2008093647.tif 000011
【０１２４】
に沿って、ＭＰＥＧとジゴキシン(digoxin)からＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digoxin（９）を合成した。【０１２５】
まず、平均分子量（ＭＷ）５０００のＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−ＯＨ（１２．８ｍｇ、０．００２５６ｍｇ）とジゴキシン（２．００ｍｇ、０．００２５６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（０．２５ｍＬ）攪拌溶液に、室温においてＤＣＣ（２．６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．６ｍｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）を添加した。【０１２６】
次いで、４１時間後に減圧濃縮し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Sephadex  Ｇ２５、ＭｅＯＨ）により精製して、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digoxin（９）（１４．５ｍｇ、９８％）（無色固形物）を得た。1ＨＮＭＲスペクトルにより、コンジュゲート（共有結合）は、digoxinの水酸基との間でランダムに形成されていることと、実効収率が５１％（０．０９４ｍｍｏｌ／ｇ）であることが確認された。
（例１−６）
次式【０１２７】
【化６】
2008093647.tif 000012
【０１２８】
に沿って、ＭＰＥＧとジゴキシゲニン(digoxigenin)からＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−digoxigenin （１０）を合成した。【０１２９】
平均分子量（ＭＷ）５０００のＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−ＯＨ（１２．８ｍｇ、０．００２５６ｍｍｏｌ）およびジゴキシゲニン（１．００ｍｇ、０．００２５６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（０．２５ｍＬ）攪拌溶液に、室温においてＤＣＣ（２．６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．６ｍｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）を添加した。【０１３０】
２０時間後に、例１−５と同様に処理して、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digoxigenin（１０）（１３．８ｍｇ、１００重量％）（無色固形物）を得た。1ＨＮＭＲスペクトルによると、実効収率は、３−Ｏ−コンジュゲート（１０ａ）が３０％、１２−Ｏ−コンジュゲート（１０ｂ）が７０％であること（total ０．１８６ｍｍｏｌ／ｇ）が確認された。
（例１−７）
次式【０１３１】
【化７】
2008093647.tif 000013
【０１３２】
のように、ＭＰＥＧとジギトキシゲニン(digitoxigenin)からＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digitoxigenin（１１）を合成した。【０１３３】
まず、平均分子量（ＭＷ）５０００のＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−ＯＨ（１３．４ｍｇ、０．００２６７ｍｍｏｌ）とジギトキシゲニン（１．００ｍｇ、０．００２６７ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（０．２０ｍＬ）攪拌溶液に、室温においてＤＩＣ（０．００２１ｍＬ、０．０１３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０６ｍｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）を添加した。【０１３４】
２０時間後に、例１−６と同様に処理して、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digitoxigenin（１１）（１４．５ｍｇ、１００重量％）（無色固形物）を得た。1ＨＮＭＲスペクトルによると、実効収率は、１００％（０．１８６ｍｍｏｌ／ｇ）であった。
（例１−８）
次式【０１３５】
【化８】
2008093647.tif 000014
【０１３６】
に沿って、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＭＴＭ（１２）と、各種のＲＯＨ（アルコール、フェノール類）を用いることで、収率９０％以上において、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＯＲ（１３）を得た。
＜実施例２＞
有機分子を疎水性有機担体にコンジュゲートしたものを疎水性有機メンブレンに固定化した。なお、ドットブロットによるスポット固定の手段としては、疎水性有機メンブレンの下に方眼シートを置き、下方の光源から照らした状態においてドットブロットを行っている。【０１３７】
固定化の手順は、次のプロセスを基準とした。【０１３８】
【表５】
2008093647.tif 000015
【０１３９】
すなわち、ＰＥＧ又はＭＰＥＧにコンジュゲートした有機分子のＣＨＣｌ3（１×１０-2、２×１０-3、４×１０-4、８×１０-5、１．６×１０-5Ｍ）の溶液（０．１×１０-3ｍＬ）を、ＮＣ（ニトロセルロース）またはＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）のメンブレン（７５ｍｍ×７５ｍｍ）に、ドットブロットした。【０１４０】
次いで、定着液（１０ｍＬ）に１０分間浸漬し、その後水洗（１０ｍＬ、２×１ｍｉｎ、その後２×５ｍｉｎ）した。【０１４１】
固定化メンブレンをスキムミルク溶液（１０ｍＬ）に６０分間浸漬して溶液を攪拌した。【０１４２】
ここで、メンブレンには上記のようにニトロセルロース（ＮＣ，GE Healthcare Bio-Sciences、Hybond−ＥＣＬ、１００％  nitrocellulose、ポアサイズ：０．２０×１０-3ｍＬもしくは０．４５×１０-3ｍＬ）、もしくはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ，GE Healthcare Bio-Sciences、Hybond−Ｐ、１００％  polyvinylidene difluoride、ポアサイズ：０．２０×１０-3ｍＬもしくは０．４５×１０-3ｍＬ）を用いる。また、以下の溶液を調製して用いる。【０１４３】
【表６】
2008093647.tif 000016
【０１４４】
（例２−１）
実施例１における例１−１、例１−２において調製したＣｙ３−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（４）およびＭＰＥＧ−Ｏ−Ｃｙ３（５）を用いて、次の手順でＮＣメンブレンにドットブロットして固定化した。【０１４５】
【表７】
2008093647.tif 000017
【０１４６】
スキムミルク溶液の処理後にはＤＢＢ（１０ｍＬ、６×５ｍｉｎ）による洗浄と水洗（１０ｍＬ、１ｈ）を行い、Whatman paperの間で、１２０分間乾燥した。【０１４７】
添付した図７は、Ｃｙ３由来の蛍光を観察した結果を示したものである（ＦＵＪＩＦＩＬＭ，ＦＬＡ−２０００、４７３ｎｍ）。図７においては以下のものを示している。【０１４８】
【表８】
2008093647.tif 000018
【０１４９】
図７に示したように、色素（Ｃｙ３）をＰＥＧ／ＭＰＥＧコンジュゲートとすることによる固定化では、濃度依存的に固定化されていることがわかる。また、可視光で見るよりは蛍光による検出の方が明らかに高感度である。この例はＰＥＧ／ＭＰＥＧサポートによる小分子の固定化技術の基礎を示すものである。
（例２−２）
実施例１における例１−３、例１−４において調製したbiotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（７）、ＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）を用いて、次の手順でＰＶＤＦメンブレンにドットブロットして固定化した。【０１５０】
【表９】
2008093647.tif 000019
【０１５１】
そして、この例においては、固定化されたビオチンとストレプトアビジンとの相互作用を蛍光検出法およびＴＨｚ波による透過測定により検出した。【０１５２】
すなわち、表９のとおり、スキムミルク溶液の浸漬に続いてストレプトアビジン（streptavidin-Alexa ６３３）（２．０ｍｇ／ｍＬ in Water、３．３×１０-3ｍＬ）含有のスキムミルク溶液（１０ｍＬ）に室温において６時間浸漬し、ＤＢＢ（１０ｍＬ、６×５ｍｉｎ）および水（１０ｍＬ、１ｈ）で洗浄した。Whatman paperを用いて乾燥した後に、蛍光検出およびＴＨｚ波による透過測定を行った。ＴＨｚ波による透過測定では、周波数帯２ＴＨｚを用い、ＴＨｚ−ＴＤＳにより測定した。【０１５３】
図８は、蛍光検出の結果を示したものである。６３３ｍｍＵＶ光での検出結果を示しており、biotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（７）、ＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）の場合の各種の濃度でのブロット（０．１×１０-3ｍＬ）の蛍光が観察されている。【０１５４】
図８に示したビオチン−ストレプトアビジン相互作用の蛍光による検出では、８×１０−５−５×１０-2Ｍの範囲で検出が可能であり、明らかに濃度依存的である。【０１５５】
ビオチン（６）の場合に全くストレプトアビジン由来の蛍光が検出されないのは、そこにブロッティングしたビオチン（６）が洗浄操作で流れ去ってしまったためと考えることができ、ＰＥＧ／ＭＰＥＧコンジュゲートとすることによる小分子固定化の有効性をよく示すものである。【０１５６】
図９は、ＴＨｚ波による透過測定の結果を透過画像として示したものである。なお、図中の白線は傷を示している。また図１０は、２ＴＨｚの吸光度画像をＳmoothing処理した結果を示しており、たとえば、この図１０のＹ＝８８ＮＯラインの吸光度変化にも見られるように、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用の検出では、８×１０−５−５×１０-2Ｍの範囲で検出が可能であり、明らかに濃度依存的であることがわかる。【０１５７】
また、ビオチン（６）の場合に全くストレプトアビジン由来の透過画像が検出されないのは、そこにブロッティングしたビオチン（６）が洗浄操作で流れ去ってしまったためと考えることができ、ＰＥＧ／ＭＰＥＧコンジュゲートとすることによる小分子固定化の有効性をよく示すものである。
（例２−３）
次の手順で、例２−２と同様のビオチンを固定化し、ストレプトアビジンとの相互作用をアルカリホスファーゼ−ＢＣＩＰ検出法により検出した。【０１５８】
【表１０】
2008093647.tif 000020
【０１５９】
この場合には、ＤＢＢ洗浄後に、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（１．０ｍＬ）により２０分間インキュベートし、その後、水洗している。【０１６０】
図１１は、０．１×１０-3ｍＬでのブロットについての５×１０-2Ｍの場合のアルカリホスファーゼ−ＢＣＩＰ検出による可視化の結果を示している。
（例２−４）
次の手順で、例２−２と同様のビオチンをブロット（０．１×１０-3ｍＬ）固定化し、ストレプトアビジンとの相互作用をアルカリホスファーゼ−化学発光検出法によりストレプトアビジンとの相互作用を検出した。【０１６１】
【表１１】
2008093647.tif 000021
【０１６２】
すなわち、スキムミルク溶液への浸漬に続いて、ストレプトアビジン、アルカリホスファーゼコンジュゲート（１．０ｍｇ／ｍＬ in water ，８．３×１０-4ｍＬ）を含有するスキムミルク溶液（１．０ｍＬ）に室温で６時間浸漬し、ＤＢＢ洗浄した。そして、ＣＤＰ−ｓｔａｒ溶液（０．５ｍＬ）でインキュベートした。【０１６３】
図１２は、化学発光検出の結果を示したものである。【０１６４】
図１２に示したビオチン−ストレプトアビジン相互作用のアルカリホスファターゼ活性−化学発光による検出は、文献通りＢＣＩＰを用いた場合（図１１）よりもずっと高感度で、１×１０-5Ｍ〜１×１０-2Ｍの範囲で濃度依存的に検出が可能であった。この感度は、蛍光による検出（図８）と同等か、若干高いレベルにある。【０１６５】
また、ＭＰＥＧ−Ｏ−biotinのアルカリホスファーゼ活性−化学発光検出により可視化された図１３の結果について、この画像データをImageJ(ver.１．３７ｖ)（Rasband, W.S.,ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http//rsb.info.nih.gov/iJ/,1997-2006）を用いてピーク分析した結果を図１４に示す。【０１６６】
明らかな濃度依存性が確認できる。
（例２−５）
次の手順で、例１−５、例１−６、例１−７のＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digoxin （９）、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digoxigenin （１０）、ＭＰＥＧ−Ｏ−ＡＡｃ−Ｏ−digitoxigenin （１１）の各々を用いてブロット（０．１×１０-3ｍＬ）固定化し、アルカリホスファーゼ化学発光検出法により、および上記例２−２と同様にしてテラヘルツ（ＴＨｚ）波により相互作用を検出した。【０１６７】
【表１２】
2008093647.tif 000022
【０１６８】
図１５は、アルカリホスファーゼ化学発光検出法による可視化の結果を示したものである。【０１６９】
また、図１６は、ＴＨｚ波による透過画像（吸光度）と透過反射画像（吸光度）を示したものである。
＜実施例３＞
有機分子をＰＥＧの性質を利用してメンブラン上に固定化する方法には、すでに述べた有機分子−ＰＥＧコンジュゲートを作成してブロットする方法のほかに、コンジュゲート作製をメンブラン上で行ってしまう方法も実用的である。ここではあらかじめメンブランをＰＥＧ類の溶液に浸すことで表面をＰＥＧ類で修飾した「ＰＥＧシート」を作成する。これに固定化したい有機分子と縮合剤の混合溶液をブロットし、一定時間インキュベートする。この方法によれば、もし固定化したい有機分子群がＰＥＧ類によりコンジュゲートされていない場合には、少ない労力で、手早くメンブランマクロアレイを作成することができる。【０１７０】
たとえば次の手順により、有機分子としてのビオチン等を固定化し、ストレプトアビジンとの相互作用による蛍光検出することができ、また、ストレプトアビジンとの相互作用テラヘルツ（ＴＨｚ）波により検出することができる。【０１７１】
【表１３】
2008093647.tif 000023
【０１７２】
より具体的には、まず平均分子量（ＭＷ）３４００のＰＥＧ（５００ｍｇ）のメタノール／水（１：１、１０ｍＬ）の溶液に、ＰＶＤＦメンブレン（１５ｍｍ×１５ｍｍ）を、室温において１０分間浸漬する。その後、水洗（１０ｍＬ、２×１ｍｉｎ、その後２×５ｍｉｎ）し、whatman paperの間で１２０分間乾燥する。これにより、ＰＥＧシートを得る。【０１７３】
一方、ビオチン（９．７８ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ−ＨＣｌ（８．２４ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．９６ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．４ｍＬ）のブロッティング溶液を調製する。【０１７４】
このものの０．１×１０-3ｍＬを用いて、上記のＰＥＧシート上にブロットする。次いで、室温で４０時間インキュベートする。【０１７５】
乾燥後、定着液（１０ｍＬ）に１０分間浸漬する。水洗（１０ｍＬ、２×１ｍｉｎ、次いで２×５ｍｉｎ）し、その後、スキムミルク溶液（１０ｍＬ）に６０分間浸漬し、さらに、ストレプトアジビン−Alexa ６３３（２．０ｍｇ／ｍＬ in Water、３．３×１０-3ｍＬ）含有のスキムミルク溶液に６時間浸漬する。【０１７６】
ＤＢＢ（１０ｍＬ、６×５ｍｉｎ）で洗浄し、水洗（１０ｍＬ、１時間）し、Whatman paperで１２０分間乾燥する。【０１７７】
図１７は、蛍光検出（６３３ｎｍ）による可視化の結果を示したものである。【０１７８】
また、実施例２の例２−２の場合と同様にしてストレプトアジビンとの相互作用をＴＨｚの透過画像として確認することができた。
＜実施例４＞
有機反応の追跡にも本発明のマイクロアレイを用いることができる。たとえば、前記のbiotin−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−biotin（７）およびＭＰＥＧ−Ｏ−biotin（８）の合成反応混合物をあらかじめ試料として用意する。【０１７９】
これらの試料（０．１×１０-3ｍＬ）を、ＰＶＤＦメンブレン（６５ｍｍ×５５ｍｍ）に、ドットブロットする。次いで定着液（１０ｍＬ）に１０分間浸漬し、水洗（１０ｍＬ、２×１ｍｉｎ、次いで２×５ｍｉｎ）する。【０１８０】
スキムミルク溶液（１０ｍＬ）に室温で６０分間浸漬し、さらに、ストレプトアビジン−Alexa ６３３（２．０ｍｇ／ｍＬ in Water、１．６７×１０-3ｍＬ）を含有するスキムミルク溶液（１．０ｍＬ）に、室温で６時間浸漬する。【０１８１】
ＤＢＢ（１０ｍＬ、６×５ｍｉｎ）および水（１０ｍＬ、１時間）で洗浄し、Whatman paperの間で乾燥する（１２０分間）。【０１８２】
図１８（ａ）は、蛍光検出（６３３ｎｍ）の結果を、時間変化とともに可視化した結果を示したものである。図１８（ｂ）は、ドットブロットのマップを示している。【０１８３】
この図１８（ａ）（ｂ）から、ビオチン(biotin)エステル化反応の度合いを追跡することができる。【０１８４】
また、実施例２の例２−２の場合と同様にして、透過検出を時間変化とともに観察することで、ビオチン(biotin)エステル化反応の度合いを追跡することができた。
＜実施例５＞
有機分子としての糖鎖を、コンジュゲート（共有結合）の形成によって疎水性有機担体としての長鎖のアルキル鎖を有する脂肪酸化合物に導入した。
（例５−１）
次式に沿って、ラクトース（Ｌａｃ）を導入した。【０１８５】
【化９】
2008093647.tif 000024
【０１８６】
Lactose octanoylhydrazone (Lac-C8)
Lactose (20.0mg, 0.0555mmol)およびoctanoylhydrazide (17.6mg, 0.111mmol)を0.1M 酢酸ナトリウム-酢酸 (pH 2.5)/メタノール/クロロホルム(2:5:3, 1mL)に溶解し、50℃で4日間攪拌した。減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、lactose octanoylhydrazone (21.0mg, 0.00433mmol, 78%)を白色固体として得た。１H NMR (300MHz, CD3OD) δ 4.32 (d, J = 7.5Hz, 1H), 3.95-3.34 (m, 12H), 3.23 (dd, J = 9.0, 9.0Hz, 1H), 2.16 (dd, J = 8.1, 6.6Hz, 2H), 1.61 (br, 2H), 1.31 (br, 8H), 0.90-0.87 (m, 3H); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 195.7, 176.0, 149.1, 104.7, 91.5, 80.1, 77.4, 76.7, 76.3, 74.6, 72.2, 71.7, 70.2, 62.6, 62.0, 35.4, 32.8, 30.3, 30.0, 26.8, 23.7, 15.0.
Lactose stearylhydrazone (Lac-C18)
Lactose (20.0mg, 0.0555mmol)およびstearylhydrazide (66.7mg, 0.222mmol)を0.1M 酢酸ナトリウム-酢酸 (pH 2.5)/メタノール/クロロホルム(6:4:0.4, 1mL)に溶解し、50℃で4日間攪拌した。減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、lactose stearylhydrazone (10.4mg, 0.0017mmol, 30%)を白色固体として得た。１H NMR (300MHz, CD3OD) δ 4.32 (d,J = 7.5Hz, 1H), 3.96-3.44 (m, 12H), 3.23 (dd,J = 8.7, 8.7Hz, 1H), 2.15 (ddd, J=8.4, 8.4, 7.5Hz, 2H), 1.61-1.59 (m, 2H), 1.28 (br, 28H), 0.89 (t,J = 6.6Hz, 3H).
（例５−２）
次式に沿って、Lacto−Ｎ−tetraoseを導入した。【０１８７】
【化１０】
2008093647.tif 000025
【０１８８】
Lacto-N-tetraose octanoylhydrazone (4-C8)
Lacto-N-tetraose (0.5mg, 0.71μmol)およびoctanoylhydrazide (1.12mg, 7.06μmol)を0.1M 酢酸ナトリウム-酢酸 (pH 2.5)/メタノール/クロロホルム(6:5:2, 0.3mL)に溶解し、室温で二週間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、蒸留水(0.2mL)を加え、クロロホルム(0.3mL×3)により抽出した。有機層を減圧濃縮後、lacto-N-tetraose octanoylhydrazone (0.488mg, 0.575μmol, 81%, 純度 76.7%)を白色固体として得た。HRMS (ESI, positive) calcd for C3 4 H5 2N3O2 1 [(M+H)+] 848.3870, found 848.3845.
Lacto-N-tetraose stearylhydrazone (4-C18)
Lacto-N-tetraose (0.50mg, 0.71μmol)およびstearylhydrazide (2.04mg, 7.06μmol)を0.1M 酢酸ナトリウム-酢酸 (pH 2.5)/メタノール/クロロホルム(6:5:2, 0.3mL)に溶解し、室温で二週間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、蒸留水(0.2mL)を加え、クロロホルム(0.3mL×3)により抽出した。有機層を減圧濃縮後、lacto-N-tetraose stearylhydrazone (0.702mg, 0.71μmol, quant, 純度 22.7%)を白色固体として得た。HRMS (ESI, positive) calcd for C4 4 H8 2N3O2 1 [(M+H)+] 988.5435, found 988.5390.
（例５−３）
次式に沿って、Lacto−Ｎ−fucopentaoseを導入した。【０１８９】
【化１１】
2008093647.tif 000026
【０１９０】
Lacto-N-fucopentaose octanoylhydrazone (5-C8)
Lacto-N-fucopentaose(0.5mg, 0.59μmol)およびoctanoylhydrazide (0.890mg, 5.86μmol)を0.1M 酢酸ナトリウム-酢酸 (pH 2.5)/メタノール/クロロホルム(6:5:2, 0.3mL)に溶解し、室温で二週間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、蒸留水(0.2mL)を加え、クロロホルム(0.3mL×3)により抽出した。有機層を減圧濃縮後、lacto-N-tetraose octanoylhydrazone (0.469mg, 0.472μmol, 80%, 純度 83%)を白色固体として得た。HRMS (ESI, positive) calcd for C4 0 H7 2N3O2 5 [(M+H)+] 994.4449, found 994.4412.
Lacto-N-fucopentaose stearylhydrazone (5-C18)
Lacto-N-fucopentaose(0.50mg, 0.59μmol)およびstearylhydrazide(1.75mg, 5.86μmol)を0.1M 酢酸ナトリウム-酢酸 (pH 2.5)/メタノール/クロロホルム(6:5:2, 0.3mL)に溶解し、室温で二週間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、蒸留水(0.2mL)を加え、クロロホルム(0.3mL×3)により抽出した。有機層を減圧濃縮後、lacto-N-tetraose stearylhydrazone (0.388mg, 0.342μmol, 58%, 純度 35.5%)を白色固体として得た。HRMS (ESI, positive) calcd for C5 0 H9 0N3O2 5 [(M+H)+] 1133.2548, found 1132.8397
＜実施例６＞
実施例５の例５−１から例５−３までの導入の結果得られた糖鎖と長鎖アルキル鎖脂肪酸化合物とのコンジュゲート体である糖誘導体を、実施例２における表５に示したプロセスと同様にして疎水性有機メンブレンに固定化した。【０１９１】
次いで、固定化された７つの糖誘導体のアレイをレクチン（congerin I）と相互作用させ、それを473nmにて蛍光検出した。図１９は、その結果を示したものである。いずれの化合物も濃度依存的に相互作用の強さが変化しており、特異的な相互作用が検出されていると言うことができる。例えば4×10-4Mの濃度で比較すると、これまで知られているように、二糖であるラクトースよりも四糖の方が相互作用が強く、五糖はさらに強い、ということが明確にわかる。また、同じラクトースにあっても、アルキル鎖とコンジュゲートした方が蛍光が強く、さらに炭素鎖18（C18）の方が炭素鎖8（C8）でコンジュゲートしたものよりも蛍光が強い。これは相互作用の強さに差が出ているのではなく、メンブレン上に保持されている化合物の量に差が出ているためであり、疎水性の強い化合物がより強く固定化されるという本発明の性質によるものである。【０１９２】
このように、ガラスアレイでは一般に検出することが困難であるとされる糖とレクチンの弱い相互作用が検出できるということは、本発明の特徴のひとつである。【０１９３】
また、固定化された７つの糖誘導体のアレイをレクチン（congerin I）と相互作用させ、それを実施例２と同様にしてＴＨｚ波長により検出した。図２０は、その結果を透過画像（吸光度）並びに透過反射画像（吸光度）として示したものである。いずれの化合物も濃度依存的に相互作用の強さが変化しており、特異的な相互作用が検出されていると言うことができる。二糖であるラクトースよりも四糖の方が相互作用が強く、五糖はさらに強い、ということが明確にわかる。また、炭素鎖18（C18）の方が炭素鎖8（C8）でコンジュゲートしたものよりも蛍光が強い。これは相互作用の強さに差が出ているのではなく、メンブレン上に保持されている化合物の量に差が出ているためであり、疎水性の強い化合物がより強く固定化されるという本発明の性質によるものである。
＜実施例７＞
（例７−１）
下記スキーム１〜３に従って糖鎖のポリエチレングリコールコンジュゲートを合成した。二段階のclick型反応を経由し、アジド基を有するトリエチレングリコールリンカーをオキシム形成反応によって糖鎖の還元末端に導入し、このアジド基にHuisgen反応によってPEGを導入した。【０１９４】
一段階目の反応は糖鎖をよく溶解するアセトニトリル−酢酸緩衝液中で行うことができ、対象糖鎖の構造にかかわらず好収率でリンカー導入を行うことができる。二段階目の反応では生物活性をほとんど有さないことが明らかとなっているトリアゾール環が形成される。【０１９５】
この合成において用いられるリンカー7はスキーム１に示すようにして合成した。市販のトリエチレングリコール1をモノトリチル化して2へと導き、残った水酸基をN-ヒドロキシフタルイミドとの光延反応によって3へ変換した。フタルイミド部分をヒドラジン処理によって除去し、生じたアミノ基を常法によってBoc化した。得られた4のトリチル基を接触水素化によって除去して5を得たのちに、DPPAを用いるアジド化（DEAD, PPh3）を施して6とした。最後に、Boc基の脱保護をTFAにより行い、リンカー7を得ることができた。【０１９６】
【化１２】
2008093647.tif 000027
【０１９７】
リンカー7とラクトースとの反応、さらにモデル化合物9を用いたHuisgen反応について、得られた知見をスキーム２に示す。【０１９８】
【化１３】
2008093647.tif 000028
【０１９９】
ラクトースに対して室温、pH 2.5でリンカー7を反応させると、オキシム形成反応は２日以内に終了し、8をほぼ定量的に得ることができた。同様な結果は糖鎖としてマルトースを用いた場合にも得ることができた。生成物8は高極性で取扱いが困難である上に、オキシム官能基部分における異性体混合物として生成する。したがってこの反応の評価はLC-MSによってのみ行い、その後に反応混合物を濃縮して次のHuisgen反応に用いた。【０２００】
Huisgen反応によるトリアゾール環形成は無触媒でも進行するが、アセチレン化合物9を用いた本実施例では、硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムを共存させると反応が速やかに進行することが明らかになった。反応は６０℃で１２時間、さらに室温で３〜４日間処理して行った。この反応についてもLC-MSによって生成物を分析し、8が完全に消費されてトリアゾール化合物10がきれいに生成していることが確認できている。以上の反応条件を利用して、次にPEGとのコンジュゲート形成を行った。スキーム３にラクトースとPEGとのコンジュゲート合成を示す。【０２０１】
【化１４】
2008093647.tif 000029
【０２０２】
ここで用いたPEGは平均分子量が5000のポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（MPEG）である。MPEGアセチレン12は、既知のカルボン酸11（特願2003-383694）とプロパルギルアミンをアミド縮合させることによって定量的に得た。これに8を既出の条件（8→10）で反応させ、13とした。13はMPEGの性質を生かし、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーもしくはシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって迅速かつ容易に得ることができた。1H NMRスペクトルを分析し、反応進行率は91.5%、ローディング量は0.167 mol/gであると決定した。【０２０３】
【表１４】
2008093647.tif 000030
【０２０４】
（例７−２）
スキーム４に従ってマルトースのMPEGコンジュゲート化を行った。【０２０５】
【化１５】
2008093647.tif 000031
【０２０６】
手順はスキーム３に示したラクトースのものと全く同じであり、コンジュゲート15を得ることができた。1H NMRスペクトルを分析し、反応進行率は75.0%の、ローディング量は0.136 mmol/gであると決定した。【０２０７】
【表１５】
2008093647.tif 000032
【０２０８】
＜実施例８＞
ラクトースおよび実施例７で合成したそのコンジュゲート10, 13を用いた糖鎖アレイとレクチンであるコンジェリンＩとの相互作用検出を実施例６と同様の方法で試みた。【０２０９】
【表１６】
2008093647.tif 000033
【０２１０】
すなわち、ラクトースおよび10, 13のメタノール溶液をそれぞれについて６種類ずつ調製し、0.2 mLずつPVDFメンブレン上に一連でドット・ブロットした。固定化・洗浄・ブロッキングを順次行い、FITCにより標識されたコンジェリンＩとビニール袋の中で20時間インキュベートした。メンブレンを洗浄し、風乾して蛍光およびテラヘルツ波によって分析した。結果を図２１、図２２にそれぞれ示す。【０２１１】
図２１、図２２のいずれの検出法においても得られた結果から相互作用は濃度依存的であり、特異的な相互作用が検出されたと判断することができる。【０２１２】
図２１の蛍光検出に関しては、ラクトースのMPEGコンジュゲート13のみが4 x10-4 Mの濃度でコンジェリンＩとの相互作用を示した。【０２１３】
図２２のテラヘルツ波分析では、図２１よりも高感度に相互作用検出が可能であった。すなわち、MPEGコンジュゲート13では8 x10-5 Mの濃度で相互作用が検出できることが明らかになった。低分子量コンジュゲート10も4 x10-4 Mの濃度で検出されたが、コンジュゲートされていないラクトースは1 x10-2 Mの高濃度においてもその相互作用は検出されなかった。これは実施例６における結果と一致するものである。【０２１４】
図２２の結果は、コンジュゲート化が糖鎖の固定化に有効であることを示すもので、特に平均分子量5000のMPEGが優れていること、それに対して低分子量コンジュゲートは固定化収率がやや下がることを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１４】
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【図１５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月28日(2008.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波により作用物質との相互作用を検出するための有機分子を固定化したマイクロアレイであって、有機メンブレンに有機担体が分子間力相互作用により固定化されていると共に、有機担体には有機分子がコンジュゲート（共有結合）により固定化されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
分子間力相互作用は、疎水性相互作用、静電的相互作用およびイオン性相互作用のうちの少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
有機担体には有機分子が、エステル結合、アミド結合、ウレア結合、ウレタン結合およびアセタール結合のうちの少なくともいずれかのコンジュゲート（共有結合）により固定化されていることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
有機担体は、ポリマー、オリゴマー、または環状化合物であることを特徴とする請求項１、２、４のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
有機担体は、ポリアルキレングリコール類、ポリエーテル類、脂肪酸類、ペプチドまたはポリペプチド類、アミノ酸のオリゴマーまたはポリマー、ステロイド類、テルペン類、多環芳香族化合物、ポルフィリン類、および糖鎖類のうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項１、２、４、５のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
有機担体は、平均分子量が４５０以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド、または炭素数８以上の長鎖脂肪酸類であることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
有機メンブレンはセルロース系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ジエン系ポリマー、フッ素系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、またはポリアリーレン系ポリマーであることを特徴とする請求項１、２、４〜７のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
有機メンブレンは、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）であることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１１】
請求項１、２、４〜７、９、１０のいずれかに記載のマイクロアレイの製造方法であって、有機分子をコンジュゲート（共有結合）により有機担体に固定化する工程と、有機分子を固定化した有機担体を分子間力相互作用により有機メンブレンに固定化する工程とを含むことを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
【請求項１２】
請求項１、２、４〜７、９、１０のいずれかに記載のマイクロアレイの製造方法であって、有機担体を分子間力相互作用により有機メンブレンに固定化する工程と、有機メンブレンに固定化した有機担体にコンジュゲート（共有結合）により有機分子を固定化する工程とを含むことを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
【請求項１３】
請求項１、２、４〜７、９、１０のいずれかに記載のマイクロアレイを用いて、有機分子と作用物質との相互作用を検出することを特徴とするマイクロアレイ検出方法。
【請求項１４】
請求項１、２、４〜７、９、１０のいずれかに記載のマイクロアレイを用いて、テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過、反射および干渉の少なくともいずれかの測定により、有機分子がその相互作用により作用物質と結合している状態を分析することを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過吸収の測定により有機分子がその相互作用により作用物質と結合している状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項１８】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過光のスペクトル変化の測定により有機分子がその相互作用により作用物質と結合している状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項１９】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波の透過、その後の反射、および再透過による吸収の測定により有機分子がその相互作用により作用物質と結合している状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項２０】
近接場光を用い、全反射光の角度変化を測定して、有機分子がその相互作用により作用物質と結合している状態を分析することを特徴とする請求項１４に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項２１】
テラヘルツ（ＴＨｚ）波は、周波数が０．０１〜５００ＴＨｚの範囲内であることを特徴とする請求項１４、１７〜２０のいずれかに記載の有機分子と作用物質の相互作用分析方法。
【請求項２２】
請求項１、２、４〜７、９、１０のいずれかに記載のマイクロアレイにおける、相互作用により結合している状態の作用物質と有機分子とにテラヘルツ（ＴＨｚ）波を照射するテラヘルツ照射部と、照射されたテラヘルツ波の透過、反射および干渉の少なくともいずれかを測定する検出部とを備えていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析装置。
【請求項２３】
テラヘルツ照射部は、周波数０．０１〜５００ＴＨｚの範囲のテラヘルツ（ＴＨｚ）波を照射することを特徴とする請求項２２に記載の有機分子と作用物質の相互作用分析装置。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の装置における検出部での検出結果に基づいて画像を生成する画像構成部とその画像を表示する画像表示部とを備えていることを特徴とする有機分子と作用物質の相互作用分析画像装置。
【国際調査報告】
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