(57)【要約】  本発明は、キサントフィルまたはそのエステルを有効成分として含む、赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物および認知症を予防または治療するための組成物、ならびに哺乳動物の赤血球におけるキサントフィルまたはそのエステルの濃度を測定することを含む、認知症の診断方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントフィルまたはそのエステルを有効成分として含む、赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物。
【請求項２】
キサントフィルまたはそのエステルを有効成分として含む、認知症を予防または治療するための組成物。
【請求項３】
キサントフィルがルテインである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
認知症がアルツハイマー病である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
食品組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳動物の赤血球におけるキサントフィルまたはそのエステルの濃度を測定することを含む、認知症の診断方法。
【請求項７】
キサントフィルがルテインである、請求項６に記載の診断方法。
【請求項８】
認知症がアルツハイマー病である、請求項６または７に記載の診断方法。
【請求項９】
哺乳動物にキサントフィルまたはそのエステルの有効量を投与することを含む、赤血球の脂質過酸化を抑制する方法。
【請求項１０】
哺乳動物にキサントフィルまたはそのエステルの有効量を投与することを含む、認知症を予防または治療する方法。
【請求項１１】
赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物を調製するための、キサントフィルまたはそのエステルの使用。
【請求項１２】
認知症を予防または治療するための組成物を調製するための、キサントフィルまたはそのエステルの使用。
【請求項１３】
キサントフィルがルテインである、請求項１１または１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物および方法、認知症を予防または治療するための組成物および方法、ならびに認知症の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本において、何らかの介護・支援を必要とする認知症者（認知症性老人自立度II以上）は2002年現在で149万人（65歳以上人口比で6.3%）であり、2045年には378万人（同10.4%）と推定されている。2002年の要介護（要支援）認定者のおよそ2人に1人が認知症者である。全世界では、60歳以上の認知症の人は2001年で2430万人であり、2040年には8100万人に増加すると推定されている。このように増加の一途を辿ると予想される認知症は深刻な社会問題となっている。この認知症の原因としての割合が最も高いアルツハイマー病は、症状の進行を遅延させる薬が一つ販売されているが、現在、根本的な治療法はないのが現状である。従って、アルツハイマー病の発症や進行を抑える有効成分の開発が待望されている。【０００３】
本発明者らは、生体膜脂質の一次酸化生成物である脂質ヒドロペルオキシドを高感度かつ選択的に定量できる化学発光検出-HPLC法を開発した。これを用いアルツハイマー病患者を含む認知症患者の血液を分析すると、赤血球膜に過酸化リン脂質の異常な蓄積（平均値で健常者の2.8倍）を発見した（非特許文献１および２）。従って、アルツハイマー病などの認知症患者は過酸化した赤血球（老化赤血球）が多く体内を循環していると言える。【０００４】
アルツハイマー病患者の赤血球については、変形能の減少や凝集の増加といった血液レオロジーの変化が報告されている。赤血球の脂質過酸化は血液レオロジーの悪化（赤血球の硬直や凝集）に関与し、血液レオロジーを変化させたラットは認知機能が低下したと報告されている。近年のβ-アミロイドの研究により、こうした赤血球の異常は血中のβ-アミロイドが赤血球に曝されるためだと考えられるようになってきた。よって、β-アミロイドを介した赤血球の脂質過酸化（老化）により血液レオロジーが変化し、脳血流量の減少を引き起こし脳への酸素運搬が減少することもアルツハイマー病の発症や悪化に関わる経路の一つと考えられた。本発明者らは、赤血球の脂質過酸化を防止できる成分を検索したところ、抗酸化物質としてよく知られるα-トコフェロールにその効果はなかった。
【非特許文献１】Miyazawa T. Membrane phospholipid hydroperoxides as estimated by chemiluminescence: the effect of dietary polyunsaturated fatty acids. In: Sinclair A, Gibon R. ed. Essential Fatty Acids and Eicosanoids. Am. Oil Chem. Soc. Champaign, IL, (1993) 383-388.
【非特許文献２】Miyazawa T, Suzuki T, Yasuda K, Fujimoto K, Meguro K, Sasaki H. Accumulation of phospholipid hydroperoxides in red blood cell membranes in Alzheimer disease. In: Yagi K, Kondo M, Niki E, Yoshikawa T. ed. Oxygen Radicals. Elsevier, Amsterdam, (1992) 327-330
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題は、赤血球の脂質過酸化を防止し、認知症を予防または治療する手段を提供すること、ならびに認知症の診断方法を提供することである。
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を行った結果、赤血球におけるキサントフィル濃度が赤血球過酸化リン脂質量と負の相関を示すこと、キサントフィルが赤血球に移行しやすいこと、ならびに赤血球におけるキサントフィル濃度を高めることで過酸化リン脂質の蓄積を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）キサントフィルまたはそのエステルを有効成分として含む、赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物。
【０００９】
（２）キサントフィルまたはそのエステルを有効成分として含む、認知症を予防または治療するための組成物。
【００１０】
（３）キサントフィルがルテインである、（１）または（２）に記載の組成物。
【００１１】
（４）認知症がアルツハイマー病である、（２）に記載の組成物。
【００１２】
（５）食品組成物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
【００１３】
（６）哺乳動物の赤血球におけるキサントフィルまたはそのエステルの濃度を測定することを含む、認知症の診断方法。
【００１４】
（７）キサントフィルがルテインである、（６）に記載の診断方法。
【００１５】
（８）認知症がアルツハイマー病である、（６）または（７）に記載の診断方法。
【００１６】
（９）哺乳動物にキサントフィルまたはそのエステルの有効量を投与することを含む、赤血球の脂質過酸化を抑制する方法。
【００１７】
（１０）哺乳動物にキサントフィルまたはそのエステルの有効量を投与することを含む、認知症を予防または治療する方法。
【００１８】
（１１）赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物を調製するための、キサントフィルまたはそのエステルの使用。
【００１９】
（１２）認知症を予防または治療するための組成物を調製するための、キサントフィルまたはそのエステルの使用。
【００２０】
（１３）キサントフィルがルテインである、（１１）または（１２）に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アルツハイマー病患者および健常者における赤血球カロテノイド濃度をUV-HPLCで測定したときのUV-HPLCチャートの一例を示す。
【図２】アルツハイマー病患者および健常者における赤血球カロテノイド濃度を測定した結果を示す。
【図３】赤血球における過酸化リン脂質量をCL-HPLCで測定したときのCL-HPLCチャートの一例を示す。
【図４】ルテインを6名の健常者に4週間与え、摂取前と摂取2、4週間後に、12時間絶食した健常者から採取し、赤血球キサントフィル濃度と過酸化リン脂質量を測定した結果を示す。
【発明の実施の形態】
【００２２】
本発明者らは赤血球におけるキサントフィル濃度が過酸化リン脂質量と負の相関を示すこと、ならびに赤血球におけるキサントフィル濃度を高めることで過酸化リン脂質の蓄積を抑制できることを見出した。本発明は上記知見に基づくものである。従って、一実施形態において本発明は、キサントフィルを有効成分として含む、赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物に関する。
【００２３】
本明細書においてキサントフィルは、カロテノイドのなかで水酸基、カルボニル基、エポキシ基、メトキシ基などの形で酸素を含む一群の色素をさす。キサントフィルには、例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、フコキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチンが含まれる。これらを単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明においてキサントフィルは、好ましくはルテインである。キサントフィルのエステルは、例えば、長鎖脂肪酸とのモノエステルまたはジエステルであり、好ましくは、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などの炭素数12〜18の脂肪酸とのモノエステルまたはジエステルである。キサントフィルは、合成のものを用いてもよいし、天然物（クロレラや緑黄色野菜など）からの抽出物を用いてもよい。
【００２４】
赤血球の脂質過酸化を抑制するとは、赤血球に存在する脂質、特にリン脂質、より具体的には赤血球膜を構成するリン脂質の過酸化を抑制することをさす。赤血球膜は脂質二重層からなり、その主な構成成分はホスファチジルコリン（PC）とホスファチジルエタノールアミン（PE）である。従って、本明細書において赤血球の脂質過酸化とは、好ましくは、赤血球膜を構成するホスファチジルコリン（PC）とホスファチジルエタノールアミン（PE）の過酸化をさす。赤血球膜を構成するこれらのリン脂質が過酸化されると、PCからはホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（PCOOH)、PEからはホスファチジルエタノールアミンヒドロペルオキシド（PEOOH）が生じる。これらはいずれも、リン脂質のグリセロール骨格のsn2位にヒドロペルオキシド型の不飽和脂肪酸を持つ。従って、PCOOHとPEOOHを超高感度かつ特異的に定量できる化学発光検出-高速液体クロマトグラフィ（CL-HPLC）により赤血球の脂質過酸化を検出することができる（T. Miyazawa, T. Suzuki, K. Fujimoto, K. Yasuda, J. Lipid Res., 33, 1051-1059 (1992)；T. Miyazawa, K. Fujimoto, T. Suzuki, K. Yasuda, Methods Enzymol., 233, 324-332 (1994)）。この方法は、HPLCで脂質クラスを分別し、それぞれの脂質クラス中のヒドロペルオキシド（-OOH）基をシトクロムCとルミノールの混液から成る発光試薬と反応させ、ポストカラムの化学発光検出器で検出するものである。
【００２５】
赤血球の脂質過酸化（老化）により血液レオロジーが変化し、脳血流量の減少を引き起こし脳への酸素運搬が減少することも認知症の発症や悪化に関わっていることが報告されている。また、このような赤血球は、リン脂質膜に酸素が多く分布する状態にあり、酸化ヘモグロビンからの酸素解離が阻害され脳組織の慢性的な酸素不足がもたらされることも、認知症の発症や悪化に関わっていると考えられている（S.B. Solerte, G. Ceresini, E. Ferrari, M. Fioravanti, Neurobiol. Aging, 21, 271-281 (2000); R.S. Ajmani, E.J. Metter, R. Jaykumar, D.K. Ingram, E.L. Spangler, O.O. Abugo, J.M. Rifkind, Neurobiol. Aging, 21 257-269 (2000)）。従って、一実施形態において本発明は、キサントフィルを有効成分とする認知症を予防または治療するための組成物に関する。
【００２６】
本明細書において認知症は、重症の感染および毒素を含む種々の疾患が原因の知覚または意識の障害を伴わず、一般的には脳の組織的疾患に関連する、認知および知的機能の進行的な損失により特徴付けることができる状態に関して使用する。失見当識、記憶、判断および知力障害ならびに軽い感情変化により特徴付けられる。認知症には、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ認知症、初老期認知症、老人性認知症、緊張病性認知症、透析認知症(透析エンセファロパシー症候群)、癲癇認知症、破瓜病性認知症、レヴィー小体痴呆(びまん性レヴィー小体病)、多梗塞性認知症(血管性認知症)、麻痺性認知症、外傷後認知症、早発認知症、一次性認知症、中毒性認知症および血管性認知症が含まれるが、これらに限定されない。本発明の認知症を予防または治療するための組成物は、特にアルツハイマー病の予防または治療に好適である。
【００２７】
本明細書において、認知症の予防には、認知症の発症を抑えることおよび遅延させることが含まれ、認知症の治療には、認知症を治癒すること、症状を改善することおよび症状の進行を抑えることが包含される。
【００２８】
以下、キサントフィルを有効成分とする赤血球の脂質過酸化を抑制するための組成物、ならびに認知症を予防または治療するための組成物を合わせて本発明の組成物と称する。
【００２９】
本発明の組成物の投与対象は、哺乳動物である。本明細書において哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。投与対象は、好ましくは、サルおよびチンパンジーなどの霊長類、より好ましくはヒトである。認知症に罹患しているヒト、認知症と診断されているヒト、認知症の可能性があるヒト、認知症を予防する必要があるヒトに本発明の組成物を投与することが特に好ましい。
【００３０】
本発明の組成物は、特に制限されないが、例えば、医薬組成物として、および食品組成物として調製することができる。
【００３１】
本発明の組成物を医薬組成物として調製する場合は、通常、キサントフィルおよび好ましくは薬学的に許容される担体を含む製剤として調製する。医薬組成物は、経口により、非経口により、例えば、皮下に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に、および鼻腔内に投与される。
【００３２】
薬学的に許容される担体とは、一般的に、本発明の有効成分とは反応しない、不活性の、無毒の、固体または液体の、増量剤、希釈剤またはカプセル化材料等をいい、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒または分散媒体などが挙げられる。
【００３３】
医薬組成物は、好ましくは経口投与製剤の形態である。当該形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤などが挙げられる。
【００３４】
医薬組成物はさらに医薬分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用できる。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン (BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸等が挙げられる。必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）を加えてもよい。
【００３５】
医薬組成物は、徐放性皮下インプラントの形態で、または標的送達系（例えば、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソームおよびミクロスフェア）の形態で、非経口で投与してもよい。
【００３６】
本発明の組成物を食品組成物として調製する場合、その形態は特に制限されず、飲料も包含される。健康食品および機能性食品も包含される。健康食品および機能性食品は、具体的には、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、流動食等の各種製剤形態とすることができる。製剤形態の食品組成物は、適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）を加えた後、慣用の手段を用いて製造することができる。さらに、食品組成物は、スープ類、ジュース類、乳飲料、ココア飲料、ゼリー状飲料などの液状食品組成物、プリン、ヨーグルトなどの半固形食品組成物、パン、菓子、うどんなどの麺類、クッキー、チョコレート、キャンディ、せんべいなどの菓子、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類等の形態もとりうる。
【００３７】
食品組成物には、種々の食品添加物、例えば、酸化防止剤、香料、各種エステル類、有機酸類、有機酸塩類、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、酸味料、果汁エキス類、野菜エキス類、花蜜エキス類、pH調整剤、品質安定剤などの添加剤を単独、あるいは併用して配合してもよい。
【００３８】
本発明の組成物の投与量は、投与方法、年齢、症状等により適宜決定することができるが、キサントフィルの質量に換算して、1日あたり、体重1 kgあたり、経口投与で通常0.01〜2mg、好ましくは0.1〜0.2mgである。
【００３９】
本発明の組成物におけるキサントフィルの含有量は、上記投与量を達成するように適宜決定できる。例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤およびカプセル剤等の形態の場合は、通常0.35〜70質量％、好ましくは3.5〜7質量％の量でキサントフィルを含む。
【００４０】
本発明の組成物には、例えば、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンB12、ビタミンB2、ビタミンB1、β−カロテン、アスタキサンチン、トコトリエノール、ミネラル類（カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛等）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、プラズマローゲン、イチョウ葉エキス、ワインポリフェノール 、緑茶カテキン、テアフラビン、シソ油、DHA（ドコサヘキサエン酸）、クロレラ等の機能性成分などを適宜加えてもよい。
【００４１】
哺乳動物に本発明の組成物の有効量を投与することにより、すなわち、哺乳動物にキサントフィルの有効量を投与することにより、赤血球の脂質過酸化を抑制すること、ひいては認知症を予防または治療することができる。
【００４２】
従来の認知症薬は治療目的の薬であり、それ故、副作用が懸念される。一方、キサントフィルは、食経験が豊富な安全な食品成分であり、通常の食生活のなかで栄養指導などを通じで、認知症の発症を予防し、また症状の進行を遅延できる点で有利である。
【００４３】
本発明者らは、赤血球におけるキサントフィル濃度が過酸化リン脂質量と負の相関を示すこと、さらには認知症患者の赤血球におけるキサントフィル濃度が健常者と比較して有意に低いことを見出した。従って、一実施形態において本発明は、哺乳動物の赤血球におけるキサントフィル濃度、好ましくはルテイン濃度を測定することを含む、認知症、好ましくはアルツハイマー病の診断方法に関する。ここで、赤血球におけるキサントフィル濃度は、例えば、ヘモグロビン1 gあたりのキサントフィルのモル数（mol/g Hb）として測定できる。本発明における認知症の診断には、認知症に罹患しているかどうかの診断および認知症に罹患する可能性の診断が含まれる。
【００４４】
一実施形態において本発明の診断方法は、哺乳動物の血液から赤血球を分離する工程、赤血球からキサントフィルを抽出する工程、およびキサントフィルを測定する工程を含む。血液からの赤血球の分離は、例えば、採取した血液を遠心処理することにより実施できる。分離した赤血球は、生理的リン酸緩衝液等を加えてさらに遠心処理して上清を取り除く工程を繰り返すことにより洗浄することが好ましい。赤血球は、キサントフィルを抽出する前に、溶血処理を行うことが好ましい。
【００４５】
赤血球からのキサントフィルの抽出に使用する抽出溶媒は、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、アセトニトリル、シクロヘキサン、トルエン、酢酸エチルなどのエステル、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル、ならびにメタノール、エタノール、イソプロパノールなどの炭素数１〜６の低級アルコールなどを使用できる。抽出溶媒として、ヘキサンとジクロロメタンの混合物（ヘキサン/ジクロロメタン、好ましくはヘキサン：ジクロロメタン＝5:1（v/v））を用いるのが好ましい。抽出溶媒に、さらにピロガロール（エタノール溶液）と水酸化カリウム水溶液を加えるのが好ましい。ピロガロールの添加により、抽出過程での赤血球キサントフィルの分解を防ぐことができる。水酸化カリウム水溶液は、夾雑物である赤血球タンパク質などを分解し、赤血球からのキサントフィルの抽出率向上に寄与する。
【００４６】
抽出後、抽出溶媒を除去し、残渣をヘキサン/アセトン（ヘキサンとアセトンとの混合物）に溶解させ、クロマトグラフィ、好ましくはシリカゲルカラムクロマトグラフィにより不純物を除去することが好ましい。
【００４７】
より具体的には、赤血球からのキサントフィルを抽出する工程は、以下の工程を含む：
赤血球に水を加えて赤血球を溶血させる工程、
ピロガロール（エタノール溶液）、水酸化カリウム（KOH）水溶液、ヘキサン/ジクロロメタン溶液（好ましくは、5:1（v/v））、およびジブチルヒドロキシトルエンを加えて混合する工程、
上層（ヘキサン/ジクロロメタン層）を回収し、ヘキサン/ジクロロメタンによる抽出を繰り返す工程、
上層を合わせ、溶媒を除去する工程、
残渣をヘキサン/アセトン（好ましくは、2:1（v/v））に溶解させ、クロマトグラフィ、好ましくはシリカゲルカラムクロマトグラフィで不純物を除去する工程、ならびに
ヘキサン/アセトン（好ましくは、2:1（v/v））を流し、溶離液を回収する工程。
【００４８】
抽出したキサントフィルを測定する方法は特に制限されず、慣用の方法で実施でき、例えば、高速液体クロマトグラフィを用いる方法が挙げられる。具体的には、UV-HPLC、多波長UV-HPLC、高速液体クロマトグラフィ-質量分析装置（LC-MS、LC-MS/MS）、蛍光検出-高速液体クロマトグラフィ（FL-HPLC）、光散乱検出-高速液体クロマトグラフィ（HPLC-ELSD）、電気化学検出-高速液体クロマトグラフィ等で測定することができる。UV-HPLCを用いる場合、カラムとしては、C8カラム、C18カラム、C30カラム、シリカカラム、フェニルカラム等である。例えば、YMC社製 C30カラム（Carotenoid S-5μm 4.6×250 mm）を使用できる。また、UV-HPLCの測定条件は、適宜決定すればよいが、例えば、以下の条件で実施することができる。
【００４９】
カラムオーブン温度：10〜30℃、好ましくは15〜25℃
ポンプ流速：0.5〜2 mL/min、好ましくは0.8〜1.5 mL/min
移動相A：メタノール/ t-ブチルメチルエーテル/水(酢酸アンモニウムを含む)
移動相B：メタノール/ t-ブチルメチルエーテル/水(酢酸アンモニウムを含む)
検出波長：463 nm
キサントフィルを測定することによる認知症診断法の有利な点として、健康診断などの血液検査で、簡便かつ迅速に、認知症の発症を早期に予期できるようになる点が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。【００５１】
（実施例１）アルツハイマー病患者および健常者における赤血球カロテノイド濃度の測定
アルツハイマー病患者（24名; 男性11名、女性13名）とその健常配偶者（24名; 男性13名、女性11名）について、赤血球カロテノイド濃度を測定した。赤血球カロテノイド濃度の測定は以下のように実施した。【００５２】
1-1．赤血球からのPacked cells（洗浄赤血球）の調製
12時間絶食した被検者の血液12 mLをEDTA採血した。血液を遠心（1000 g、10分、4℃）して、赤血球6 mLを得た。赤血球を洗浄するために、5容（30 mL）の生理的リン酸緩衝液（pH 8.0）を加え遠心（2300 g、10分、4℃）し、上清を取り除いた。この操作を3回繰り返し、Packed cells（洗浄赤血球） 4 mLを得た。【００５３】
1-2．赤血球からのカロテノイド抽出と定量
Packed cells（洗浄赤血球） 2 mLに水2 mLを加えて赤血球を溶血させた。これに、80 mMピロガロール（エタノール溶液）4 mL、1 μM内部標準エキネノン（エタノール溶液）50 μL、1.8 M水酸化カリウム（KOH）水溶液0.8 mL、100 mMドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水溶液1.0 mL、ヘキサン/ジクロロメタン溶液（5:1、v/v、1.2 mM ジブチルヒドロキシトルエン；BHTを含む）12 mLを加えた。この混合物を氷中で5分間超音波にかけ、3分ボルテックス後に遠心（1000 g、10分、4℃）した。上層（ヘキサン/ジクロロメタン層）を梨型フラスコに回収し、ヘキサン/ジクロロメタンによる抽出をもう一度繰り返した。上層を合わせ、窒素下で溶媒を除去した。残渣をヘキサン/アセトン（2:1、v/v）3 mLに溶解させ、不純物を除去するためにSep-Pak（登録商標）Plus Silica Cartridges（Waters）に供した。さらに7 mLのヘキサン/アセトン（2:1、v/v）を流し、溶離液10 mLを回収した。窒素下で溶媒を除去して得られた残渣をメタノール/t-ブチルメチルエーテル溶液（2:3、v/v）100 μLに再溶解した。そのうち50 μLを下記のUV-HPLC分析に供し、赤血球カロテノイドを定量した。なお、光によるカロテノイドの異性化や分解を防ぐために、すべての抽出操作は黄色の蛍光灯であるFL20S.Y-F（松下電器産業）の下で行った。得られるUV-HPLCチャートの一例を図１に示す。【００５４】
UV-HPLC分析条件
カラム：C30 Carotenoid（5 μm、4.6 x 250 mm、YMC）
カラムオーブン：860-CO（JASCO）  温度：20℃
ポンプ：880-PU (JASCO)  流速：1 mL/min
移動相A：メタノール/ t-ブチルメチルエーテル/水 = 83:15:2 (v/v/v、3.9 mM 酢酸アンモニウムを含む)
移動相B：メタノール/ t-ブチルメチルエーテル/水= 8:90:2 (v/v/v、2.6 mM 酢酸アンモニウムを含む)
UV検出器：NANOSPACE SI-1 (SHISEIDO)
検出波長：463 nm
【表１】
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UV-HPLCの測定結果を図２に示す。図２から、認知症患者では、健常者に比べ、赤血球キサントフィル濃度、特に赤血球ルテイン濃度が有意に低いことがわかる（P<0.005）。キサントフィル以外のカロテノイド（すなわち、α-カロテン、β-カロテン、リコペン）についても、認知症患者と健常者の間に差はみられるが、キサントフィルほど大きな差ではなかった。【００５５】
（実施例２）赤血球におけるキサントフィル濃度と過酸化リン脂質量の測定
健常者20名の赤血球総キサントフィル（ルテイン＋ゼアキサンチン＋β−クリプトキサンチン）濃度、ならびに過酸化リン脂質量を測定した。赤血球総キサントフィル濃度の測定は、実施例１の赤血球カロテノイド濃度の測定法と同様の方法により実施した。過酸化リン脂質量の測定は、以下のように実施した。【００５６】
2-1．赤血球からの脂質抽出
実施例１の1-1と同様に調製したPacked cells（洗浄赤血球） 1.5 mLを50 mLのねじ口ガラス遠沈管に入れ、0.1 mM EDTA-2Na水溶液を1.5 mL加えて静かに攪拌した。15分氷中に放置後、イソプロパノール15 mLを加えて静かに攪拌した。30分氷中に放置し、クロロホルム15 mLを加えた。ボルテックス後に30分氷中に放置し、遠心（1000 g、10分、4℃）した。一層の抽出液を梨型フラスコに回収し、エバポレーターで溶媒を除去した。得られた残渣をクロロホルム/メタノール（2:1、v/v）2.5 mLに溶解し、試験管に移した。これに水0.5 mLを加え、ボルテックス、遠心（1000 g、10分、4℃）した。得られた下層を別の試験管に移し、残りの上層にクロロホルム/メタノール（10:1、v/v）1.8 mLを加えた。同様にボルテックス、遠心し、得られた下層を先ほどの下層と合わせた。窒素下で溶媒を除去し、重量法で総脂質量を測定した。残渣である赤血球総脂質をクロロホルム/メタノール（2:1、v/v）100 μLに再溶解した。【００５７】
2-2．赤血球過酸化リン脂質の測定
化学発光-高速液体クロマトグラフィ（CL-HPLC）により、赤血球の過酸化リン脂質（ホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（PCOOH）とホスファチジルエタノールアミンヒドロペルオキシド（PEOOH））を測定した。このCL-HPLC装置は、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）と化学発光検出器（CL）を組み合わせたものである。HPLCにより、PCOOHとPEOOHを他の脂質成分より分離後、これらと発光試薬を反応させ、ヒドロペルオキシド基由来の化学発光を検出定量するものである。具体的には、上記で得られた赤血球総脂質のクロロホルム/メタノール（2:1、v/v）溶液40 μLを、CL-HPLCに供して、過酸化リン脂質を定量した。得られるCL-HPLCチャートの一例を図３に示す。【００５８】
CL-HPLC分析条件
HPLCポンプ：880-PU（JASCO）
HPLCカラム：Finepak SIL-NH2、4.6 mmID×250 mm（JASCO）
移動相：イソプロピルアルコール/メタノール/水（130/45/25、v/v/v）
流速：1.0 mL/min
カラムオーブン：860-CO（JASCO）  温度：40℃
発光試薬：50 mMホウ酸緩衝液（pH 10）に2 μMのルミノール（和光純薬工業）と25 μMのチトクロームc（Sigma、type VI）を溶解して作成。【００５９】
流速：1.8 ml/min
化学発光検出器：CLD-100（東北電子産業）
その結果、赤血球総キサントフィル濃度は過酸化リン脂質量と負の相関を示した（r = -0.46、P = ＜0.05）。これは、赤血球キサントフィル濃度を高めることで過酸化リン脂質の蓄積を抑制できることを示唆している。【００６０】
実施例３  キサントフィルの投与
摂取したキサントフィルが実際に赤血球に移行するか、そして過酸化リン脂質の蓄積を抑制するかを検討するために、ヒト赤血球キサントフィルのなかで最も多いルテインを6名の健常者（男性3名、女性3名）に4週間与えた。被験者にルテインを含むカプセル1粒を4週間毎日朝食後摂取してもらった。これはルテイン9.7 mg/日（日常摂取量の2.1倍）を摂取したことになる。血液は摂取前と摂取2、4週間後に、12時間絶食した健常者からEDTA採血で12 mL採取した。得られた血液から赤血球を分離し、赤血球ルテイン濃度と過酸化リン脂質量を測定した。赤血球ルテイン濃度と過酸化リン脂質量の測定は、実施例１および２と同様に実施した。【００６１】
続いて、ゼアキサンチンについても、（0.7 mg/日、日常摂取量の約2倍）の摂取量で同様に試験した。【００６２】
摂取前の赤血球ルテイン濃度は平均160 pmol/g ヘモグロビンであり、摂取2週間目でその濃度は有意に上昇し、4週間後には449 pmol/g ヘモグロビン（摂取前の2.8倍）に達した（図４）。一方、過酸化リン脂質量は摂取前と比べ摂取4週間で有意に減少した。摂取したルテインが赤血球に積極的に移行蓄積し、過酸化リン脂質の蓄積を抑制したことが示された。【００６３】
摂取前の赤血球ゼアキサンチン濃度は平均52 pmol/g ヘモグロビンであり、4週間後には71 pmol/g ヘモグロビンと有意ではない（P = 0.08）が上昇する傾向がみられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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