(57)【要約】  HB-EGFに対する中和活性を有するモノクローナル抗体が開示される。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、HB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質に結合しない抗体である。また、本発明のモノクローナル抗体を有効成分として含む癌治療剤および細胞増殖抑制剤、ならびに本発明のモノクローナル抗体を投与することを特徴とする癌の治療方法も提供される。本発明の癌治療剤により治療しうる癌には、膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌または脳腫瘍が含まれる。
2008047914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HB-EGFに対する中和活性を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
以下（１）から（２９）のいずれかに記載の抗体；
（１）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）（１）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（３）（１）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（５）（４）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（６）（４）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（７）（１）に記載のＨ鎖、および（４）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（８）（２）に記載のＨ鎖、および（５）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（９）（３）に記載のＨ鎖、および（６）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１０）ＣＤＲ１として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１１）（１０）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１２）（１０）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１３）ＣＤＲ１として配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３２に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（１４）（１３）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（１５）（１３）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（１６）（１０）に記載のＨ鎖、および（１３）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１７）（１１）に記載のＨ鎖、および（１４）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１８）（１２）に記載のＨ鎖、および（１５）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１９）ＣＤＲ１として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２０）（１９）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２１）（１９）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２２）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（２３）（２２）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（２４）（２２）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（２５）（１９）に記載のＨ鎖、および（２２）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（２６）（２０）に記載のＨ鎖、および（２３）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（２７）（２１）に記載のＨ鎖、および（２４）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（２８）（１）から（２７）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（２７）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（２９）（１）から（２７）のいずれかに記載の抗体が結合するHB-EGFタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
【請求項３】
配列番号５９に記載のHB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質に結合しない抗体である請求項１又は２のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号５９に記載のHB-EGFを発現する細胞が、RMG-1又は配列番号５９に記載のHB-EGFを組換え発現するBa/F3、DG44若しくはSKOV-3のいずれかから選択される請求項３のモノクローナル抗体。
【請求項５】
抗体が低分子化抗体である請求項１から４のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１から５のモノクローナル抗体を有効成分として含む癌治療剤。
【請求項７】
癌が膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌または脳腫瘍である請求項６の癌治療剤。
【請求項８】
請求項１から５のモノクローナル抗体を有効成分として含む細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
細胞が膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、メラノーマ細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞または脳腫瘍細胞である請求項８の細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療方法および抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（Heparin-binding  epidermal  growth  factor-like  growth  factor;  HB-EGF)は、EGFリガンドファミリーに属する増殖因子である。HB-EGF遺伝子を欠失させたノックアウトマウスは、心臓肥大を伴う心機能不全など極めて重篤な表現形を呈し、生後すぐに死亡する（非特許文献１）。このことからHB-EGFは胎生期の心臓の形成に深く関与していることが示されている。一方、成人においても、その発現は、肺、心臓、脳、骨格筋など比較的広範な組織に分布しており（非特許文献２）、HB-EGFは胎生期ばかりでなく、成人においても生体機能の維持に極めて重要な役割を担っている（非特許文献３）。【０００３】
HB-EGFは、生体内においては、HB-EGFを発現する細胞の細胞表面上に発現する膜型HB-EGF(以下proHB-EGFと指称する。)と、細胞から遊離して存在する分泌型HB-EGF(以下sHB-EGFまたは活性型HB-EGFと指称する。)の２つの異なる構造体として存在する。図１に、proHB-EGFおよびsHB-EGFの構造の模式図を示す。proHB-EGFの前駆体タンパク質は208アミノ酸から成り、N末からシグナルペプチド、プロペプチド、ヘパリン結合ドメイン、EGF様ドメイン、ジャクスタ膜ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインによって構成される。proHB-EGFの前駆体タンパク質のシグナルペプチドが切断された後に、proHB-EGFが1型膜タンパク質として発現する。proHB-EGFはその後エクトドメインシェディングと呼ばれるプロテアーゼ消化を受け、73〜87個のアミノ酸残基からなるsHB-EGFとして細胞外に切り出される。このsHB-EGFは、２つのドメイン、すなわちヘパリン結合ドメインとEGF様ドメインだけから構成されており、活性型リガンドとしてEGF受容体(Her1)、および、EGF受容体4(Her4)に結合する。その結果、その下流にあるERK/MAPKシグナル経路を介して、NIH3T3細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、腎尿細管細胞など様々な細胞に対し増殖を誘導する（非特許文献４）。エクトドメインシェディングを受ける部位に変異を入れ、proHB-EGFだけを発現させた細胞は、増殖能が著しく低下する。またproHB-EGFしか発現しないトランスジェニックマウスは、HB-EGFノックアウトマウスと同様の表現系を示す。これらのことからHB-EGFの増殖因子としての機能は、分泌型HB-EGFが主に担っていると考えられている（非特許文献５及び６）。【０００４】
一方、proHB-EGFも生体内においてsHB-EGFとは異なるユニークな機能を担っていることが知られている。当初、proHB-EGFはジフテリア毒素(DT)の受容体として機能していることが知られていた(非特許文献７及び８)。しかし、その後の研究により、proHB-EGFは細胞表面でDRAP27/CD9、さらにはインテグリン（integrin）α3β1、ヘパリンサルフェートなどの分子と複合体を形成し、細胞接着や移動（migration）に関与していることが明らかにされた。また、proHB-EGFは、ジャクスタクライン機構により、EGF受容体（以下、EGFRと指称する）を介して、近隣の細胞の増殖抑制および細胞死を誘導することが明らかにされている。このように、EGFRに対するリガンドとしてのHB-EGFは、膜型であるproHB-EGFと分泌型であるsHB-EGFで、まったく正反対のシグナルを伝えていることが知られている（非特許文献５及び８）。【０００５】
HB-EGFは、癌細胞など様々な細胞株に対し、細胞増殖、細胞運動、浸潤を強く促進する活性を有する。さらに、HB-EGFの発現が、正常組織に比べて膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、および、脳腫瘍など広範な癌種で上昇していることが報告されており、このことからHB-EGFが癌の増殖・悪性化に強く関与していることが明らかにされている（非特許文献４及び１０）。【０００６】
従って、これらの知見をもとに、HB-EGFの活性を阻害することにより、癌細胞の増殖を抑制する試みがなされている。抗HB-EGF中和抗体を利用したHB-EGFの作用を抑制する試みは、3T3細胞に対するDNA合成の抑制効果（非特許文献１１）、ケラチノサイトに対する増殖抑制効果（非特許文献１２）、グリオーマ細胞に対する増殖抑制効果（非特許文献１３）、ミエローマ細胞に対するDNA合成抑制効果(非特許文献１４)、などがすでに報告されている。【０００７】
一方、HB-EGFに特異的に結合する弱毒化ジフテリア毒素（CRM197）をHB-EGF阻害剤として利用した試みもなされている。実際、卵巣癌細胞株を移植したゼノグラフト（xenograft）マウスモデルを用いた薬効試験では、CRM197投与群において優位な腫瘍縮小効果が確認されており（非特許文献１５）、さらに、癌患者においてもCRM197を用いた臨床試験がなされている（非特許文献６）。【０００８】
このようにHB-EGFが抗癌剤の標的分子として有用であることは明らかであり、実際にCRM197のようなHB-EGF阻害分子の薬効試験もこれまで実施されている。しかしながら、CRM197はヒトの体内には本来存在しない毒素であり、従ってCRM197そのものの臨床利用においては、その毒性ばかりでなく抗原性の問題が極めて大きな課題であると考えられる。【０００９】
一方、前述したとおりHB-EGFの活性を阻害しうる中和抗体は古くから実際に存在するものの、いずれもヤギの抗血清より精製したポリクローナル抗体であり、臨床での使用は不可能である。そのため、高い中和活性を持ち、臨床応用に必要なヒト型化と高い生産性が実現可能なHB-EGF中和モノクローナル抗体が医療の場で求められている。【００１０】
しかしながら、抗HB-EGF中和抗体の臨床応用を考えた場合、前述のとおりHB-EGFはHB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質であるproHB-EGFとして生体内で広範な正常組織にも発現していることから、抗体とエフェクター細胞の作用による抗体依存性細胞障害活性（Antibody  Dependent  Cell-mediated  Cytotoxicity。以下、ADCC活性と指称する。）、補体依存性細胞障害活性（Complement  Dependent  Cytotoxicity。以下、CDC活性と指称する。）といった毒性が懸念される。さらに、正常組織における抗体の吸収作用によって起こる血中濃度の低下、および抗体の腫瘍集積効率の低下といった問題がクリアすべき課題として挙げられる。【００１１】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【非特許文献１】Iwamoto  R,Yamazaki  S,Asakura  M  et  al.Heparin-binding  EGF-like  growth  factor  and  ErbB  signaling  is  essential  for  heart  function.Proc  Natl  Acad  Sci  USA  2003;100:3221-6.
【非特許文献２】Abraham  JA,Damm  D,Bajardi  A,Miller  J,Klagsbrun  M,Ezekowitz  RA.Heparin-binding  EGF-like  growth  factor:characterization  of  rat  and  mouse  cDNA  clones,protein  domain  conservation  across  species,and  transcript  expression  in  tissues.Biochem  Biophys  Res  Commun  1993;190:125-33.
【非特許文献３】Karen  M.,Frontiers  in  Bioscinece  3,288-299,1998
【非特許文献４】Raab  G,Klagsbrun  M.Heparin-binding  EGF-like  growth  factor.Biochim  Biophys  Acta  1997;1333:F179-99.
【非特許文献５】Yamazaki  S,Iwamoto  R,Saeki  K  et  al.Mice  with  defects  in  HB-EGF  ectodomain  shedding  show  severe  developmental  abnormalities.J  Cell  Biol  2003;163:469-75.
【非特許文献６】Ongusaha  P.,Cancer  Res  (2004)  64,5283-5290.
【非特許文献７】Iwamoto  R.,Higashiyama  S.,EMBO  J.13,2322-2330.(1994)
【非特許文献８】Naglich  JG.,Metherall  JE.,Cell  69,1051-1061.(1992)
【非特許文献９】Iwamoto  R,Handa  K,Mekada  E.Contact-dependent  growth  inhibition  and  apoptosis  of  epidermal  growth  factor  (EGF)  receptor-expressing  cells  by  the  membrane-anchored  form  of  heparin-binding  EGF-like  growth  factor.J  Biol  Chem  1999;274:25906-12.
【非特許文献１０】Miyamoto  S,Cancer  Sci.97,341-347  (2006)
【非特許文献１１】Blotnick  S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  (1994)  91,2890-2894
【非特許文献１２】Hashimoto  K.,J.Biol.Chem.(1994)  269,20060-20066.
【非特許文献１３】Mishima  K.,Act  Neuropathol.(1998)  96,322-328.
【非特許文献１４】Wang  YD.Oncogene  (2002)  21,2584-2592.
【非特許文献１５】Miyamoto  S.,Cancer  Res.(2004)  64,5720-
【非特許文献１６】Buzzi  S.,Cancer  Immunol  Immunother  (2004)  53,1041-1048.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、抗HB-EGF抗体とその用途を提供することを課題とする。より詳細には、抗HB-EGF抗体を用いた癌を治療する新規方法、抗HB-EGF抗体を含む新規な細胞増殖抑制剤および抗癌剤、ならびに新規な抗HB-EGF抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は癌細胞で高発現しているHB-EGFに対する中和活性を有する抗体が癌細胞の増殖活性を有意に阻害することを見出した。さらに、当該中和活性を有する抗体がHB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質には結合しないことを見出した。更には以上の知見により、本発明者は、抗HB-EGF抗体が卵巣癌をはじめとしたHB-EGFが発現亢進する癌の治療に有効であることを見出して、本発明を完成させた。【００１４】
本発明者らは、HB-EGFタンパク質をマウスに免疫し、これまでまったく報告のなかったHB-EGFによる細胞増殖誘導能を阻害するモノクローナル抗体を得た。また、発明者は得られた中和抗体が、HB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質であるproHB-EGFには結合せず、HB-EGFを発現する細胞から遊離して存在する分泌型HB-EGF(sHB-EGF)にしか結合活性を有さないことを明らかにした。本発明に係る抗体に特有の性質により、従来の課題であった、抗体によるADCC活性やCDC活性などの毒性、および、血中濃度・腫瘍集積率の低下といった解決すべき課題が解決された。【００１５】
すなわち、本願は以下の〔１〕〜〔２９〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体とその低分子化抗体を提供するものである。
〔１〕ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔２〕〔１〕に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔３〕〔１〕に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔４〕ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔５〕〔４〕に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔６〕〔４〕に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔７〕〔１〕に記載のＨ鎖、および〔４〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔８〕〔２〕に記載のＨ鎖、および〔５〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔９〕〔３〕に記載のＨ鎖、および〔６〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔１０〕ＣＤＲ１として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔１１〕〔１０〕に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔１２〕〔１０〕に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔１３〕ＣＤＲ１として配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３２に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔１４〕〔１３〕に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔１５〕〔１３〕に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔１６〕〔１０〕に記載のＨ鎖、および〔１３〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔１７〕〔１１〕に記載のＨ鎖、および〔１４〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔１８〕〔１２〕に記載のＨ鎖、および〔１５〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔１９〕ＣＤＲ１として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔２０〕〔１９〕に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔２１〕〔１９〕に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
〔２２〕ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔２３〕〔２２〕に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔２４〕〔２２〕に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
〔２５〕〔１９〕に記載のＨ鎖、および〔２２〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔２６〕〔２０〕に記載のＨ鎖、および〔２３〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔２７〕〔２１〕に記載のＨ鎖、および〔２４〕に記載のＬ鎖を含む抗体、
〔２８〕〔１〕から〔２７〕のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、〔１〕から〔２７〕のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
〔２９〕〔１〕から〔２７〕のいずれかに記載の抗体が結合するHB-EGFタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。【００１６】
さらに本発明は、配列番号５９に記載のHB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質に結合しない抗体である上記〔１〕から〔２９〕に記載のモノクローナル抗体を提供する。特に、配列番号５９に記載のHB-EGFを発現する細胞がRMG-1又は配列番号５９に記載のHB-EGFを組換え発現するBa/F3、DG44若しくはSKOV-3のいずれかから選択される細胞であって当該細胞に結合しない抗体である上記〔１〕から〔２９〕に記載のモノクローナル抗体を提供する。【００１７】
さらに、本発明はHB-EGFタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する癌治療剤を提供する。好ましくは、HB-EGFタンパク質に結合する抗体は中和活性を有する抗体である。更に好ましくは、当該中和活性を有する抗体はHB-EGFを発現する細胞には結合しない抗体である。また好ましくは、癌は膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌または脳腫瘍である。特に好ましくは卵巣癌である。【００１８】
別の態様においては、本発明は、HB-EGF発現細胞とHB-EGFタンパク質に結合する抗体とを接触させることによりHB-EGFタンパク質を発現する細胞の増殖を抑制する方法を提供する。好ましくは、HB-EGFタンパク質に結合する抗体は中和活性を有する抗体である。また好ましくは、HB-EGFタンパク質を発現する細胞は癌細胞である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るHB-EGFタンパク質に特異的な抗体を用いれば、HB-EGFタンパク質を発現する卵巣癌のみならず、HB-EGFタンパク質を発現する膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、メラノーマ細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、膀胱癌細胞または脳腫瘍細胞などの各種の癌細胞の細胞障害剤又は細胞増殖抑制剤として使用することができる。【００２０】
更に、本発明に係る細胞障害活性を有する抗HB-EGF抗体は、卵巣癌や膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、膀胱癌または脳腫瘍などの各種の癌に対する治療薬として使用することができる。【００２１】
加えて、本発明に係る抗体をコードする遺伝子及び当該遺伝子により形質転換された組換え細胞は、上記記載の効果、及びより好適な効果を奏する組換え抗体を作製するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】proHB-EGF、sHB-EGF及び免疫原として使用したHB-EGF＿Fcの構造を模式的に示した図である。
【図２ａ】HB-EGFのEGFR-BaF3細胞に対する結合により当該細胞に及ぼす影響を模式的に示した図である。
【図２ｂ】EGFR-BaF3細胞のHB-EGFに対する濃度依存的な増殖を示したグラフである。
【図３ａ】EGFR＿Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する各種HB-EGF抗体（HA-1、HA-3、HA-9、HA-10及びHA-20）の中和活性を示すグラフである。
【図３ｂ】EGFR＿Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する各種HB-EGF抗体（HB-10、HB-13、HB-20、HB-22及びHC-74）の中和活性を示すグラフである。
【図３ｃ】EGFR＿Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する各種抗体（HC-15、HC-19、HC-26及びHC-42）の中和活性を示すグラフである。
【図４】各HB-EGF中和抗体の可変領域の配列の比較である。
【図５】抗体HA-20、HB-20及びHC15の活性型HB-EGFに対する結合活性を示すグラフである。
【図６】抗体HA-20、HB-20及びHC15のproHB-EGFに対する結合活性を示すヒストグラムである。
【図７】HB-EGFとEGFRとの結合をHB-EGF抗体が固相上で阻害する状態を模式的に示した図である。
【図８】ELISAによるEGFRとHB-EGFとの結合様式の解析モデルを模式的に示す図である。
【図９】ELISAによるEGFRとHB-EGFとの結合様式の解析モデルにより検出されるHB-EGFの濃度曲線を示したグラフである。
【図１０】抗体HA-20、HB-20及びHC15によるEGFRに対するHB-EGFの結合阻害を示したグラフである。
【図１１】抗体HA-20、HB-20及びHC15によるEGFR＿Ba/F3細胞に対する増殖抑制を比較したグラフである。
【図１２ａ】８％ＦＣＳ存在下の培地における抗体HA-20、HB-20及びHC15による卵巣癌細胞株RMG-1に対する増殖抑制を示したグラフである。
【図１２ｂ】２％ＦＣＳ存在下の培地における抗体HA-20、HB-20及びHC15による卵巣癌細胞株RMG-1に対する増殖抑制を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
HB-EGFの分子型
HB-EGFは、EGFリガンドファミリーに属する増殖因子であり、ヒトHB-EGFをコードする遺伝子配列およびHB-EGFのアミノ酸配列は、それぞれGenBank登録番号NM＿001945（配列番号：５９）、及びNP＿001936（配列番号：６０）に開示されている。本発明において、HB-EGFタンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。本発明において、断片とは、広義の意味においてはHB-EGFタンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のHB-EGFタンパク質の機能を有していなくてもよい。特定の断片の一態様として、本明細書中で用いられるsHB-EGFは、生体内において、HB-EGFを発現する細胞の細胞表面上に発現するproHB-EGFが、エクトドメインシェディングと呼ばれるプロテアーゼ消化を受けた結果生成される、73〜87個のアミノ酸残基からなる分子である。【００２４】
配列番号６０で示される208アミノ酸から成るproHB-EGF分子中の149番目のプロリン残基をカルボキシル末端として、及び63番目のアスパラギン残基、73番目のアルギニン残基、74番目のバリン残基又は77番目のセリン残基をアミノ末端としてその構造中に有する複数のsHB-EGF分子が知られている。【００２５】
抗HB-EGF抗体の作製
本発明の抗HB-EGF抗体は、HB-EGFタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体であればよく、その由来、種類および形状は問われない。具体的には、非ヒト動物に由来するモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ならびに、遺伝子工学的手法により取得しうるヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが使用できる。【００２６】
本発明の抗HB-EGFモノクローナル抗体は、公知の手段を用いて取得できる。本発明の抗HB-EGF抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。【００２７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。まず、HB-EGFタンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させて、ハイブリドーマを得る。更に、このハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗HB-EGF抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。【００２８】
具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、HB-EGF遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるHB-EGFタンパク質が取得できる。ヒトHB-EGF遺伝子の塩基配列は、GenBank登録番号NM＿001945（配列番号：５９）などに開示されている。すなわち、HB-EGFをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトHB-EGFタンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のHB-EGFタンパク質も同様に使用できる。生成は通常のイオンクロマトグラフィやアフィニティクロマトグラフィなどの複数のクロマトグラフィを単数回又は複数回、組み合わせて又は単独で使用することにより生成することができる。また、本発明で用いられるように、HB-EGFタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば抗体のFc断片やペプチドタグ等を利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を前記の様に発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular  Cloning  2nd  ed.(Sambrook,J.et  al.,Molecular  Cloning  2nded.,9.47-9.58,Cold  Spring  Harbor  Lab.Press,1989)に記載されている。【００２９】
このようにして精製されたHB-EGFタンパク質を哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。HB-EGFの部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる：
ヒトHB-EGFのアミノ酸配列より化学合成によって取得されたペプチド；
ヒトHB-EGF遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド；
ヒトHB-EGFタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。【００３０】
部分ペプチドとして用いるHB-EGFの領域および大きさは限定されるものではない。好ましい領域はHB-EGFの細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号：６０のアミノ酸配列において２２−１４９番目）から選択することができる。感作抗原とするペプチドを構成するアミノの数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８〜５０、好ましくは１０〜３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。【００３１】
該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。【００３２】
公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered  Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。更に、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。【００３３】
このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。【００３４】
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。【００３５】
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用することができる：
P3（P3x63Ag8.653）（J.Immunol.（1979）123,1548-1550）
P3x63Ag8U.1（Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology（1978）81,1-7）
NS-1（Kohler.G.and  Milstein,C.Eur.J.Immunol.（1976）6,511-519）
MPC-11（Margulies.D.H.et  al.,Cell（1976）8,405-415）
SP2/0（Shulman,M.et  al.,Nature（1978）276,269-270）
FO（de  St.Groth,S.F.etal.,J.Immunol.Methods（1980）35,1-21）
S194（Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.（1978）148,313-323）、
R210（Galfre,G.et  al.,Nature（1979）277,131-133）等。【００３６】
基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler.G.and  Milstein,C.、Methods  Enzymol.（1981）73,3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。【００３７】
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。【００３８】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。【００３９】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。【００４０】
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、HB-EGFを認識する抗体を国際公開WO03/104453に記載された方法によって作成することもできる。【００４１】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実施的に同質なHB-EGFタンパク質が好適に使用できる。たとえばHB-EGFの細胞外ドメイン、あるいは当該領域を構成する部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、抗原として利用することができる。【００４２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をHB-EGFタンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。この方法によって得られる抗HB-EGF抗体は、HB-EGFタンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。【００４３】
さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるHB-EGFタンパク質を投与することによって、抗HB-EGFヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞からHB-EGFタンパク質に対するヒト抗体を単離することによってもできる（国際公開WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602参照）。更に不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトHB-EGFを異物と認識する。したがって、ヒトHB-EGFに対するヒト抗体を容易に得ることができる。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。【００４４】
当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。【００４５】
本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme,A.M.et  al.,Eur.J.Biochem.（1990）192,767-775参照）。【００４６】
たとえば、抗HB-EGF抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗HB-EGF抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる：
グアニジン超遠心法（Chirgwin,J.M.et  al.,Biochemistry（1979）18,5294-5299）；
AGPC法（Chomczynski,P.et  al.,Anal.Biochem.（1987）162,156-159）。【００４７】
抽出されたmRNAは、mRNA  Purification  Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep  mRNA  Purification  Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。cDNAは、AMV  Reverse  Transcriptase  First-strand  cDNA  Synthesis  Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、5'-Ampli  FINDER  RACE  Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman,M.A.et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1988）85,8998-9002、Belyavsky,A.et  al.,Nucleic  Acids  Res.（1989）17,2919-2932）を利用することができる。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。【００４８】
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認できる。【００４９】
可変領域をコードする遺伝子を得るために、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使ったPCR法を利用することもできる。まず抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば１０以上、あるいは３０以上、好ましくは５０以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。【００５０】
得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文(J.Mol.Biol.(1991)222,581-597)などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法を行う。【００５１】
具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。【００５２】
重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、HB-EGFに対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。【００５３】
本発明の抗体のHB-EGFへの結合は、特異的であることがさらに好ましい。HB-EGFに結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングすることができる。
(１)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をHB-EGFに接触させる工程、
(２)HB-EGFと抗体との結合を検出する工程、および
(３)HB-EGFに結合する抗体を選択する工程。【００５４】
抗体とHB-EGFとの結合を検出する方法は公知である。具体的には、担体に固定したHB-EGFに対して被験抗体を反応させ、次に抗体を認識する標識抗体を反応させる。洗浄後に担体上の標識抗体が検出されれば、当該被験抗体のHB-EGFへの結合を証明できる。標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性タンパク質、あるいはFITC等の蛍光物質を利用することができる。抗体の結合活性を評価するためにHB-EGFを発現する細胞の固定標本を利用することもできる。【００５５】
結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv(scFv)とすることができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、scFvを表面に発現するファージを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するscFvを濃縮することができる。【００５６】
本発明において抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の全長をコードしていてもよいし、あるいは抗体の一部をコードしていてもよい。抗体の一部とは、抗体分子の任意の部分を言う。以下、抗体の一部を示す用語として、抗体断片を用いる場合がある。本発明における好ましい抗体断片は、抗体の相補鎖決定領域(complementarity  determination  region;CDR)を含む。更に好ましくは、本発明の抗体断片は、可変領域を構成する３つのCDRの全てを含む。【００５７】
目的とする抗HB-EGF抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素が好ましい。上記のように消化された抗HB-EGF抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターを得ることができる。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させることによって、キメラ抗体を得ることができる。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来の生物が異なることを言う。したがって、マウス−ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト−ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入して、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。【００５８】
具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列を配置しておくことができる。両者を同じ組み合わせの制限酵素で消化し、インフレームで融合させることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。【００５９】
本発明の抗HB-EGF抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗HB-EGF抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。【００６０】
抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。H鎖とL鎖を組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換(co-transfect)することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO94/11523参照）。【００６１】
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる：
（１）哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby  hamster  kidney）、Hela、Veroなど；
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など；
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など。【００６２】
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana  tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。【００６３】
更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる：
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces  serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia  pastoris）などのPichia属；
糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus  niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属。【００６４】
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E.  coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。【００６５】
哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させた発現ベクターを構築することができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human  cytomegalovirus  immediate  early  promoter/enhancer）を挙げることができる。【００６６】
また、その他に本発明の抗体の発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。【００６７】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277,108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic  Acids  Res.（1990）18,5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。【００６８】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341,544-546;FASEBJ.（1992）6,2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240,1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。【００６９】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei,S.P.et  al.,J.Bacteriol.（1987）169,4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素のグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。【００７０】
発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカー挿入することができる。具体的には、次のような選択マーカーを利用することができる。
アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、
チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、
ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等【００７１】
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。【００７２】
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies  A  Laboratory  Manual.Ed  Harlow,David  Lane,Cold  Spring  Harbor  Laboratory,1988）。【００７３】
また、組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert,K.M.et  al.,Bio/Technology（1994）12,699-702）。本発明の組み換え抗体のC領域として、動物抗体由来のＣ領域を使用できる。例えばマウス抗体のH鎖C領域としては、Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεが、L鎖C領域としてはCκ、Cλが使用できる。また、マウス抗体以外の動物抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物抗体が使用できる。これらの配列は公知である。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、C領域を修飾することができる。本発明において、抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体を言う。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体をを発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。例えばH鎖においては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、およびCεをC領域として利用することができる。またL鎖においてはCκ、およびCλをC領域として使用できる。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾することができる。【００７４】
一般にキメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成される。これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity  determining  region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework  region）およびヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。【００７５】
たとえば本発明に基づいて作成された抗HB-EGFマウスモノクローナル抗体HA-20、HB-20又はHC-15の可変領域と、ヒト定常領域を構成するアミノ酸配列と連結することによって得られるマウス−ヒトキメラ抗体は、本発明におけるモノクローナル抗体として好ましい。すなわち本発明は、次のアミノ酸配列を含むH鎖とL鎖とを含む、マウス−ヒトキメラモノクローナル抗体を提供する。
H鎖：配列番号：１０に記載のアミノ酸配列中１〜３３０位のアミノ酸配列
L鎖：配列番号：２０に記載のアミノ酸配列中１〜１０７位のアミノ酸配列【００７６】
抗体の可変領域は、通常、４つのフレーム(FR)にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity-determining  region;CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。【００７７】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。【００７８】
具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap  Extension  PCRが公知である。Overlap  Extension  PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において遊離であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。【００７９】
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。【００８０】
最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP239400、国際公開WO96/02576参照）。【００８１】
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato,K.et  al.,Cancer  Res,1993,53,851-856）。【００８２】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作する。次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞融合させることによって、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体が取得できる（特公平1-59878参照）。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。【００８３】
また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することにより所望のヒト抗体が取得できる（国際公開WO93/12227,WO92/03918，WO94/02602,WO94/25585，WO96/34096,WO96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のＶ領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製できる。該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより該ヒト抗体が取得できる。これらの方法は既に公知である（国際公開WO92/01047,WO92/20791,WO93/06213,WO93/11236,WO93/19172,WO95/01438,WO95/15388）。【００８４】
本発明の抗体には、HB-EGFタンパク質に結合する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、HB-EGFタンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。【００８５】
低分子化抗体は、全長抗体(whole  antibody、例えばwhole  IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含む。HB-EGF抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにHB-EGF抗原への結合能を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single  chain  Fv）、ディアボディー（Diabody）、sc(Fv)2（single  chain(Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。【００８６】
抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co,M.S.et  al.,J.Immunol.（1994）152,2968-2976、Better,M.&Horwitz,A.H.Methods  in  Enzymology（1989）178,476-496、Plueckthun,A.&Skerra,A.Methods  in  Enzymology（1989）178,476-496、Lamoyi,E.,Methods  in  Enzymology（1989）121,652-663、Rousseaux,J.et  al.,Methods  in  Enzymology（1989）121,663-669、Bird,R.E.et  al.,TIBTECH（1991）9,132-137参照）。【００８７】
消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる：
パパイン消化：F(ab)2またはFab；
ペプシン消化：F(ab’)2またはFab’；
プラスミン消化：Facb。【００８８】
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger  P  et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:6444-6448(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。【００８９】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston,J.S.et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,1988,85,5879-5883.)。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。【００９０】
Ｖ領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される：
前記抗体のH鎖またはH鎖Ｖ領域をコードするDNA配列、および
前記抗体のL鎖またはL鎖Ｖ領域をコードするDNA配列。【００９１】
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5’側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。【００９２】
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson  et  al,J  Immunol.Methods  1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。【００９３】
また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。【００９４】
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］【００９５】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein  Engineering,9(3),299-305,1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、更に好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。【００９６】
ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：６１）
Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号：６２）
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：６３）
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：６４）
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：６５）
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：６６）
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：６７）
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：６８）
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：６３）)n
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：６４）)n
［nは１以上の整数である］【００９７】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば前記ペプチドリンカーの長さを決定するｎは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１または２である。【００９８】
本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる:
［ＶＨ］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［ＶＬ］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［ＶＨ］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［ＶＬ］【００９９】
あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してV領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。
N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、
ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、および
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など。【０１００】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明において好ましい低分子化抗体はDiabody又はsc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co,M.S.et  al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M.and  Horwitz,A.H.,Methods  Enzymol.(1989)178,476-496;Pluckthun,A.and  Skerra,A.,Methods  Enzymol.(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,Methods  Enzymol.(1986)121,652-663;Rousseaux,J.et  al.,Methods  Enzymol.(1986)121,663-669;Bird,R.E.and  Walker,B.W.,Trends  Biotechnol.(1991)9,132-137参照）。【０１０１】
本発明の抗体としてはHB-EGFを認識する任意の抗体を利用することができる。たとえば、以下（１）から（２９）に記載の抗体が好ましい抗体として例示できる。これらの抗体は、例えば、全長抗体、低分子化抗体、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体等であってもよい。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）（１）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（３）（１）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（５）（４）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（６）（４）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（７）（１）に記載のＨ鎖、および（４）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（８）（２）に記載のＨ鎖、および（５）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（９）（３）に記載のＨ鎖、および（６）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１０）ＣＤＲ１として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１１）（１０）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１２）（１０）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１３）ＣＤＲ１として配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３２に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（１４）（１３）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（１５）（１３）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（１６）（１０）に記載のＨ鎖、および（１３）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１７）（１１）に記載のＨ鎖、および（１４）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１８）（１２）に記載のＨ鎖、および（１５）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（１９）ＣＤＲ１として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２０）（１９）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２１）（１９）に記載のＨ鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２２）ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（２３）（２２）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（２４）（２２）に記載のＬ鎖であって、ＣＬとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖を含む抗体、
（２５）（１９）に記載のＨ鎖、および（２２）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（２６）（２０）に記載のＨ鎖、および（２３）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（２７）（２１）に記載のＨ鎖、および（２４）に記載のＬ鎖を含む抗体、
（２８）（１）から（２７）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（２７）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（２９）（１）から（２７）のいずれかに記載の抗体が結合するHB-EGFタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。【０１０２】
上記（１）に記載の「ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖」におけるＶＨとしては、配列番号：４８に記載のアミノ酸配列を有するＶＨが例示できる。【０１０３】
また、上記（４）に記載の「ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖」におけるＶＬとしては、配列番号：５０に記載のアミノ酸配列を有するＶＬが例示できる。【０１０４】
また、上記（１２）に記載の「ＣＤＲ１として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖」におけるＶＨとしては、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨが例示できる。【０１０５】
また、上記（１５）に記載の「ＣＤＲ１として配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３２に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖」におけるＶＬとしては、配列番号：５４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬが例示できる。【０１０６】
また、上記（２３）に記載の「ＣＤＲ１として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖」におけるＶＨとしては、配列番号：５６に記載のアミノ酸配列を有するＶＨが例示できる。【０１０７】
また、上記（２６）に記載の「ＣＤＲ１として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖」におけるＶＬとしては、配列番号：５８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬが例示できる。【０１０８】
上記（２８）に記載の抗体において、「同等の活性」とは、EGFR＿Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する抑制効果が少なくともEC50値で50nM以下であり、HB-EGFとEGFRとの結合を、抗体濃度50μg/ml添加時で少なくとも80%以上阻害する活性をいう。上記（２８）に記載の抗体の好ましい態様は、ＣＤＲ以外の領域に改変を有する抗体である。一例として、上記（２８）に記載の抗体のうち、「（１）に記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）に記載の抗体と同等の活性を有する抗体」の好ましい態様は、「（１）に記載の抗体と同等の活性を有し、（１）に記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、およびＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体」である。上記（２８）に記載の抗体のうち、その他の抗体の好ましい態様も同様に表現することができる。【０１０９】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,T.et  al.(1995)Gene  152,271-275、Zoller,MJ,and  Smith,M.(1983)Methods  Enzymol.100,468-500、Kramer,W.et  al.(1984)Nucleic  Acids  Res.12,9441-9456、Kramer  W,and  Fritz  HJ(1987)Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Proc  Natl  Acad  Sci  USA.82,488-492、Kunkel(1988)Methods  Enzymol.85,2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と同等の活性を有する抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と同等の活性を有する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）であると考えられる。【０１１０】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。【０１１１】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,D.F.et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81,5662-5666、Zoller,M.J.and  Smith,M.,Nucleic  Acids  Research(1982)10,6487-6500、Wang,A.et  al.,Science  224,1431-1433、Dalbadie-McFarland,G.et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79,6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いとされている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。【０１１２】
また本発明は、上記（２９）に記載の、本発明で開示された抗HB-EGF抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。すなわち本発明は、HA-20、HB-20、HC-15抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体と、その用途に関する。このような抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。【０１１３】
被検抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたHB-EGFタンパク質を、候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗HB-EGF抗体が添加される。ウェル中のHB-EGFタンパク質に結合した本発明の抗HB-EGF抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被検抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被検抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗HB-EGF抗体のHB-EGFタンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、被検抗体のHB-EGFタンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。【０１１４】
ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。【０１１５】
更に被検抗体が本発明の抗HB-EGF抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合した抗体の量を、その抗体の定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体の量を測定することができる。【０１１６】
候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０-５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、抗HB-EGF抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗HB-EGF抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。【０１１７】
抗HB-EGF抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体としては、例えば、上記（２９）に記載の抗体が挙げられるが、これに限定されるものではない。【０１１８】
また、上記（１）から（２９）に記載の抗体には、上述の通り、一価抗体だけでなく、多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。【０１１９】
異なる抗原結合部位を有する多価抗体として、以下の抗体が例示できるが、本発明の抗体は、これら抗体に限定されるものではない。
（Ａ）上記（７）に記載のＨ鎖とＬ鎖の対（以下、ＨＬ対と称する）、および、上記（１６）又は（２５）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｂ）上記（８）に記載のＨＬ対、および、上記（１７）又は（２６）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｃ）上記（９）に記載のＨＬ対、および、上記（１８）又は（２７）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｄ）上記（７）に記載のＨＬ対、および、上記（２８）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｅ）上記（８）に記載のＨＬ対、および、上記（２８）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｆ）上記（９）に記載のＨＬ対、および、上記（２８）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｇ）上記（７）に記載のＨＬ対、および、上記（２９）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｈ）上記（８）に記載のＨＬ対、および、上記（２９）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｉ）上記（９）に記載のＨＬ対、および、上記（２９）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｊ）上記（１６）に記載のＨＬ対、および、上記（２５）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｋ）上記（１７）に記載のＨＬ対、および、上記（２６）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｌ）上記（１８）に記載のＨＬ対、および、上記（２７）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｍ）上記（１６）に記載のＨＬ対、および、上記（２８）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｎ）上記（１７）に記載のＨＬ対、および、上記（２８）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｏ）上記（１８）に記載のＨＬ対、および、上記（２８）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｐ）上記（１６）に記載のＨＬ対、および、上記（２９）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｑ）上記（１７）に記載のＨＬ対、および、上記（２９）に記載のＨＬ対を含む抗体
（Ｒ）上記（１８）に記載のＨＬ対、および、上記（２９）に記載のＨＬ対を含む抗体【０１２０】
さらに、本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合させた抗体修飾物として使用することもできる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。【０１２１】
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific  antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。すなわち本発明において、二重特異性抗体はHB-EGF分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のHB-EGFに対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞障害作用を期待できる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。【０１２２】
また本発明においては、HB-EGF以外の抗原を認識する二重特異性抗体を組み合わせることもできる。たとえば、HB-EGFと同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、HB-EGFとは異なる抗原を認識するような二重特異性抗体を組み合わせることができる。【０１２３】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。【０１２４】
抗体の結合活性、中和活性及び増殖抑制活性
抗体の抗原結合活性の測定には公知の手段を使用することができる（Antibodies  A  Laboratory  Manual.  Ed  Harlow,David  Lane,Cold  Spring  Harbor  Laboratory,1988）。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。更に、細胞に発現する抗原に対する抗体の結合活性を測定する手法としては、例えば、前記Antibodies  A  Laboratory  Manual中の359-420ページに記載されている方法が挙げられる。【０１２５】
また、緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原と当該抗原に対する抗体との結合を測定する方法として、特にフローサイトメーターを使用した方法を好適に用いることが出来る。使用するフローサイトメーターとしては例えば、FACSCantot（登録商標）  II,FACSAria（登録商標）,FACSArray（登録商標）,FACSVantage（登録商標）  SE,FACSCalibur（登録商標）（以上、BD  Biosciences社）や、EPICS  ALTRA  HyPerSort,  Cytomics  FC  500,  EPICS  XL-MCL  ADC  EPICS  XL  ADC,  Cell  Lab  Quanta/Cell  Lab  Quanta  SC（以上、Beckman  Coulter社）などを挙げることができる。【０１２６】
被検HB-EGF抗体の抗原に対する結合活性の好適な測定方法の一例として、HB-EGFを発現する細胞と反応させた被検抗体を認識するFITC標識した二次抗体で染色後、FACSCalibur(BD社)により測定を行い、その蛍光強度をCELL  QUEST  Software(BD社)を用いて解析する方法を挙げることができる。本方法によれば、「HB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質に結合しない」とは、HB-EGFを発現する細胞の膜型HB-EGFに対して結合した被検抗体を認識する抗体を認識するFITC標識した二次抗体で染色後、FACSCaliburにより測定を行った場合において、その蛍光強度をCELL  QUEST  Softwareを用いて解析する方法によって得られるGeometric  meanの値（被検Geo-Mean値）を、市販の抗体（例えばR&D社、AF-259-NA）あるいはHC15などの膜型HB-EGFに強く反応する抗体の結合活性（対照Geo-Mean値）と比較することによって判断することが出来る。即ち、本明細書においては、被検Geo-Mean値が対照Geo-Mean値の少なくとも10%、好ましくは5%、更に好ましくは2%より小さければ、被検抗体は「HB-EGFを発現する細胞の細胞表面上のHB-EGFタンパク質に結合しない」ものとする。Geo-Mean値(Geometric  means)を求める計算式は、CELL  QUEST  Software  User's  Guide(BD  biosciences社)に記載されている。【０１２７】
本発明の抗体は、好ましくは中和活性を有する抗体である。一般的に、中和活性とは、ウイルスや毒素など、細胞に対して生物学的活性を有するリガンドの当該生物学的活性を阻害する活性を言う。即ち、中和活性を有する物質とは、当該リガンド又は当該リガンドが結合する受容体に結合し、当該リガンドと受容体の結合を阻害する物質を指す。中和活性によりリガンドとの結合を阻止された受容体は、当該受容体を通じた生物学的活性を発揮することができなくなる。このような中和活性を有する抗体は一般に中和抗体と呼ばれる。ある被検物質の中和活性は、リガンドの存在下における生物学的活性をその被検物質の存在又は非存在下条件間で比較することにより測定することができる。【０１２８】
本発明に係るHB-EGFの主要な受容体として考えられているものはEGFレセプターである。この場合、リガンドの結合により二量体を形成し、細胞内に存在する自らのドメインであるチロシンキナーゼを活性化する。活性化されたチロシンキナーゼは自己リン酸化によりリン酸化チロシンを含むペプチドを形成し、それらに様々なシグナル伝達のアクセサリー分子を会合させる。それらは主にPLCγ（ホスフォリパーゼCγ）、Shc、Grb2などである。これらのアクセサリー分子のうち、前二者は更にEGFレセプターのチロシンキナーゼによりリン酸化を受ける。EGFレセプターからのシグナル伝達における主要な経路はShc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPKキナーゼ/MAPキナーゼの順にリン酸化が伝達される経路である。更に副経路であるPLCγからPKCへの経路が存在すると考えられている。こうした細胞内のシグナルカスケードは細胞種毎に異なるため、目的とする標的細胞毎に適宜標的分子を設定することができ、上記の因子に限定されるものではない。生体内シグナルの活性化を測定することにより、中和活性を評価することができる。生体内シグナルの活性化の測定キットは市販のものを適宜使用することができる（例えば、プロテインキナーゼC活性測定システム（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）等）。【０１２９】
また、生体内シグナルカスケードの下流に存在する標的遺伝子に対する転写誘導作用を指標として、生体内シグナルの活性化を検出することもできる。標的遺伝子の転写活性の変化は、レポーターアッセイの原理によって検出することができる。具体的には、標的遺伝子の転写因子又はプロモーター領域の下流にGFP（Green  Fluorescence  Protein）やルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を配し、そのレポーター活性を測定することにより、転写活性の変化をレポーター活性として測定することができる。【０１３０】
更に、EGFレセプターを介するシグナル伝達は、通常は細胞増殖を促進する方向に働くため、標的とする細胞の増殖活性を測定することによって、本発明の抗体の中和活性を評価することができる。以下の実施例においては後者の細胞増殖活性を評価することによって本発明の中和抗体の中和活性を評価しているが、本方法に限定されるものではなく、適当な標的細胞毎に前記に挙げた方法を適宜採用し評価することができる。【０１３１】
その増殖がHB-EGFによって促進される細胞の増殖に対する、抗HB-EGF抗体の中和活性に基づく抑制効果を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、培地中に添加した[3H]ラベルしたチミジンの生細胞による取り込みをＤＮＡ複製能力の指標として測定する方法が用いられる。より簡便な方法としてトリパンブルー等の色素を細胞外に排除する能力を顕微鏡下で計測する色素排除法や、ＭＴＴ法が用いられる。後者は、生細胞がテトラゾリウム塩であるＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl  tetrazolium  bromide)を青色のホルマザン産物へ転換する能力を有することを利用している。より具体的には、被検細胞の培養液にリガンドと共に被検抗体を添加して一定時間を経過した後に、ＭＴＴ溶液を培養液に加えて一定時間静置することによりＭＴＴを細胞に取り込ませる。その結果、黄色の化合物であるＭＴＴが細胞内のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により青色の化合物に変換される。この青色生成物を溶解し呈色させた後にその吸光度を測定することにより生細胞数の指標とするものである。ＭＴＴ以外に、ＭＴＳ、ＸＴＴ、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８等の試薬も市販されており（nacalai  tesqueなど）好適に使用することができる。活性の測定に際しては、対照抗体として抗HB-EGF抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞増殖抑制活性を有しない結合抗体を、抗HB-EGF抗体と同様に使用して、抗HB-EGF抗体が対照抗体よりも強い細胞増殖抑制活性を示すことにより活性を判定することができる。【０１３２】
本明細書の実施例においては、活性を評価するための細胞として、その増殖がHB-EGFによって促進される細胞としては、卵巣癌細胞であるRMG-1細胞株や、配列番号７８でそのポリペプチド配列が示されるヒトEGFRの細胞外ドメインと配列番号８４でそのポリペプチド配列が示されるマウスGCSF受容体の細胞内ドメインをインフレームで融合した融合タンパク質であるhEGFR/mG-CSFR（配列番号８６）をコードする遺伝子を発現する様に結合したベクターによって形質転換されたマウスBa/F3細胞が例示されている。しかし、活性を評価するための細胞は、これらに限定されるものではなく、その増殖がHB-EGFによって促進される細胞であればいずれの細胞も好適に使用できる。【０１３３】
また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、腫瘍担持マウスモデルを用いることができる。例えば、その増殖がHB-EGFによって促進される癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被検抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞増殖抑制活性を評価することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗HB-EGF抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことにより細胞増殖抑制活性を判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞増殖抑制活性の評価・測定に当たって被検動物中のＴリンパ球の関与を除くことができる。【０１３４】
また、本発明で用いられる抗体のより好ましい態様として、ADCC活性やCDC活性などのエフェクター活性を有さない抗体を挙げることができる。当該エフェクター活性の制御は、抗体のアイソタイプやサブタイプ、更には抗体がキメラ抗体やヒト型化抗体の場合では使用するFc領域の由来によって制御することが可能である。ADCC活性を有さない抗体のアイソタイプとしてはヒト抗体であればIgM抗体が、サブタイプとしてはIgG4抗体等が挙げられる（Clinical  Aspects  of  Immunology,5th  Ed.,1799-1830,1993）。CDC活性を有しない抗体のサブタイプとしては、IgG4抗体等が好適に用いられる。ADCC活性及びCDC活性のいずれも有しないIgG4抗体をより好適な抗体として挙げることができる。【０１３５】
また、マウス抗体及びラット抗体であればIgG1抗体がADCC活性及びCDC活性のいずれも有しない抗体として使用することができる。【０１３６】
また、前記記載の方法によってキメラ抗体やヒト型化抗体を遺伝子工学的手法を用いて作製する際に、使用するFc領域として上記記載の抗体のアイソタイプ又はサブタイプから由来するFc領域をコードする抗体遺伝子を使用することにより、エフェクター活性を調節することができる抗体を適宜作製することが可能である。【０１３７】
細胞増殖抑制剤
本発明は、その増殖がHB-EGFによって促進される細胞とHB-EGFタンパク質に結合する抗体とを接触させることにより当該細胞の増殖を抑制する方法を提供する。HB-EGFタンパク質に結合する抗体は、本発明の細胞増殖抑制剤に含有されるHB-EGFタンパク質に結合する抗体として上述したとおりである。抗HB-EGF抗体と接触させる細胞はHB-EGFが発現している細胞であれば特に限定されないが、好ましくは膵臓癌、肝臓癌、食道癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌または脳腫瘍である。【０１３８】
本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているHB-EGF発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。この場合において、添加される抗体の形状としては、溶液又は凍結乾燥等により得られる固体等の形状が適宜使用できる。水溶液として添加される場合にあっては、純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。添加する濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは1pg/mlから1g/mlの範囲であり、より好ましくは1ng/mlから1mg/mlであり、更に好ましくは1μg/mlから1mg/mlが好適に使用されうる。【０１３９】
また本発明において「接触」は更に、別の態様では、HB-EGF発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にHB-EGFを発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物細胞増殖阻害剤および抗癌剤が全身または局部的に投与できる。また、被験動物の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の抗体投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。【０１４０】
その増殖がHB-EGFによって促進される細胞の増殖に対する、抗HB-EGF抗体の接触による抑制効果を評価又は測定する方法として、上述した中和活性測定法と同等の試験を実施することが可能である。この場合、リガンドの存在下と非存在下での活性を比較することにより、当該細胞がオートクライン様式で増殖しているのか否かについて確認することができる。生体内において細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、上述した生体内における中和活性測定法と同等の試験を実施することにより当該活性の評価又は測定を行うことが可能である。【０１４１】
医薬組成物
別の観点においては、本発明は、HB-EGFタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を特徴とする。又、本発明はHB-EGFタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤を特徴とする。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。【０１４２】
本発明において、HB-EGFタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤は、HB-EGFタンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む細胞増殖を抑制する方法、または、細胞増殖抑制剤の製造におけるHB-EGFタンパク質に結合する抗体の使用と表現することもできる。【０１４３】
また、本発明において、HB-EGFタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤は、HB-EGFタンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法、または、抗癌剤の製造におけるHB-EGFタンパク質に結合する抗体の使用と表現することもできる。【０１４４】
本発明において、「HB-EGFに結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗HB-EGF抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗HB-EGF抗体の含有率を制限するものではない。【０１４５】
本発明の医薬組成物（例えば、細胞増殖抑制剤、抗癌剤。以下同様。）に含有される抗体はHB-EGFタンパク質と結合する限り特に制限はなく、本明細書中に例示されたいずれの抗体も用いることができる。【０１４６】
本発明の医薬組成物の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。【０１４７】
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Science,  latest  edition,  Mark  Publishing  Company,Easton,U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。【０１４８】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2006-286824号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【０１４９】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【０１５０】
免疫
１−１．免疫原の調整
１−１−１．HB-EGF発現ベクターの作成
HB-EGF発現ベクターを構築するため、まずHB-EGF遺伝子のクローニングを以下のとおり行った。まずヒト心臓cDNA（human  marathon  ready  cDNA,クロンテック）を鋳型にしてPyrobest  Taq  polymerase(タカラ）を用いて以下の条件でRT-PCRを行い、全長HB-EGF遺伝子をクローニングした。
EGF-1：ATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG（配列番号：６９）
EGF-2：TCAGTGGGAATTAGTCATGCCC（配列番号：７０）
（94℃  30秒、65℃  30秒、72℃  60秒：35サイクル）
次に、得られたPCR産物を鋳型にして、以下の条件で再度PCRを行い、5'端、3'端にそれぞれSalI、NotI切断配列が付加された全長HB-EGF  cDNA断片を得た。
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG（配列番号：７１）
EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC（配列番号：７２）
（94℃  30秒、65℃  30秒、72℃  60秒：25サイクル）
これをSalI、NotIで切断し、同じくSalI、NotIで切断した動物細胞用発現ベクター（pMCN）に挿入し、HB-EGF発現ベクター（pMCN＿HB-EGF）を構築した。【０１５１】
１−１−２．HB-EGF＿Fc融合タンパク質発現ベクターの作成
HB-EGF中和抗体を取得するための免疫原として、HB-EGFの細胞外領域とマウスIgG2a  Fc領域との融合タンパク質（HB-EGF＿Fc）を用いた。図１に免疫用融合タンパク質の構造を示す。【０１５２】
マウスFc領域とHB-EGFとの融合タンパク質の発現ベクターの構築を以下のとおり行った。まずHB-EGF発現ベクター（pMCN＿HB-EGF）を鋳型にしてPyrobest  Taq  polymerase(タカラ）を用いて以下の条件でPCRを行った。
EGF-5：AAAGAATTCCACCATGAAGCTGCTGCCGTC（配列番号：７３）
EGF-6：TATCGGTCCGCGAGGTTCGAGGCTCAGCCCATGACACCTC（配列番号：７４）
（94℃  30秒、68℃  30秒、72℃  30秒：25サイクル）
次に、得られたPCR産物をEcoRI、CpoIで切断した。このDNA断片を、マウスIgG2a＿Fcを有する動物細胞用発現ベクター（pMCDN＿mIgG2a＿Fc）のEcoRI、CpoI間に挿入し、HB-EGF-Fc発現ベクター（pMCDN＿HB-EGF-Fc）を構築した。【０１５３】
１−１−３．HB-EGF＿Fc産生株の樹立
pvuIで切断することにより直鎖化したHB-EGF-Fc発現ベクター（pMCDN＿HB-EGF-Fc）15μgを、PBS(-)に懸濁したDG44細胞(1x107細胞/mL,800μL)に1.5kV,25μFDでエレクトロポレーション（Gene  Pulser;BioRad）により導入した。ペニシリン/ストレプトマイシン(PS)を含む生育培地（CHO-S-SFM  II,invitrogen）で適当な細胞数に希釈した後、96ウェルプレートに撒き、翌日G418(geneticin,invitrogen)を500μg/mLになるように添加した。約2週間後に単一クローンからなるウェルを顕微鏡下で選別し、培養上清10μLずつを用いてSDS-PAGEを行った。PVDF膜にブロッティング後、ヤギ抗HB-EGF抗体（R&D:AF-259-NA）、HRP-抗ヤギ抗体（BIOSOURCE:ACI3404）でウエスタンブロットを行い、HB-EGF-Fcを産生する細胞株のスクリーニングを行った。最も産生量の高い株を選び拡大培養を行った。【０１５４】
１−１−４．HB-EGF＿Fcタンパク質の精製
得られたHB-EGF＿Fc産生株の培養上清からHi  Trap  Protein  G  HP  1mLカラム(Amersham  Biosciences  #17-0404-01)を用いてHB-EGF＿Fcタンパク質の精製を行った。培養上清を流速1mL/minで吸着させ、20mLの20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、3.5mLの0.1M  Glycine-HCl(pH2.7)で溶出した。溶出分画は、あらかじめ1M  Tris-HCl(pH9.0)を50μLずつ加えたエッペンドルフチューブに0.5mLずつ回収した。OD280nmを測定し、目的タンパク質が含まれている分画をまとめ、PBS(-)を加えて全量2.5mLとした後、PD-10カラム(Amersham  Biosciences  #17-0851-01)を用いてPBS(-)にバッファー置換した。精製したタンパク質は0.22μmフィルター(MILLIPORE  #SLGV033RS)を通し、4℃で保存した。【０１５５】
１−２．免疫
初回免疫ではCOMPLETE  ADJUBANT（DIFCO:DF263810）で、二回目以降はIMCOMPLETE  ADJUBANT（DIFCO:DF263910）によりHB-EGF＿Fcタンパク質のエマルジョンを作成し、これを50μg/mouseで各マウス[(MRL/lpr,オス,4週齢)(balb/c,メス,６週齢)：いずれも日本チャールスリバーより購入]３匹ずつに皮下注射により免疫した（テルモシリンジ1mL、針26G）。初回免疫から２週間後に２回目の免疫を実施し、以降１週間おきに計４〜５回免疫を行った。最終免疫では、HB-EGF＿Fc(50μg)を100μlのPBSに懸濁し、尾静脈注射により免疫を行い、その３日後に細胞融合を実施した。【０１５６】
１−３．ハイブリドーマの作成
細胞融合は以下のように行った。マウスより脾臓を無菌的に摘出し、medium  1(RPMI1640+PS)中ですりつぶして単一細胞懸濁液にした。これを70μmのナイロンメッシュ（Falcon）に通して脂肪組織等を取り除き、細胞数をカウントした。得られたB細胞をマウスミエローマ細胞（P3U1細胞）と、およそ2:1の細胞数比になるように混合し、1mLの50%PEG(Roche,cat#:783  641)を加えて、細胞融合を行った。融合した細胞をmedium  2[RPMI1640+PS,10%  FCS,HAT(Sigma,H0262),5%  BM  condimed  H1(Roche:#1088947)]に懸濁し、適当枚数(10枚)の96ウェルプレートに200μL/ウェルで分注し、37℃で培養した。1週間後に培養上清を用いて、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。なお、2匹のBalb/cマウス由来のハイブリドーマをそれぞれHAシリーズ、HBシリーズとし、Mrl/lprマウス（1匹）由来のハイブリドーマをHCシリーズとし、解析を行った。【０１５７】
抗HB-EGF中和抗体のスクリーニング
２−１．ヒトHB-EGF発現細胞株の樹立
２−１−１．HB-EGF＿DG44株の樹立
HB-EGFを発現するDG44細胞株の樹立を以下のとおり行った。まず、1-1-1で構築したHB-EGF発現ベクター（pMCN＿HB-EGF）15μgをpvuIで切断し、1-1-3と同様の手法によりDG44細胞にエレクトロポレーションにより導入した。その後、G418耐性株をピックアップし、各細胞をヤギ抗HB-EGF抗体（R&D）、FITC標識抗ヤギIgG抗体で染色した。FACSキャリバー（ベクトンディッキンソン）で、細胞表面に発現するHB-EGFを解析し、発現量の高いクローンを選択した。【０１５８】
２−１−２．HB-EGF＿Ba/F3株の樹立
HB-EGFを細胞膜上で発現するBa/F3細胞株の樹立を以下のとおり行った。細胞膜上に発現するHB-EGFはプロテアーゼによってプロセッシングを受け、培養液中に切り出されることが知られている。そこでまず、プロテアーゼ切断部位に変異を持つ、proHB-EGF発現ベクターの構築を行った。【０１５９】
pMCN-HB-EGFを鋳型にして、Pyrobest  Taq  polymerase(タカラ）を用いて以下の２つの条件で別々にPCRを行った。
PCR反応１
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG（配列番号：７１）
EGF-7：CGATTTTCCACTGTGCTGCTCAGCCCATGACACCTCTC（配列番号：７５）
（94℃  30秒、68℃  30秒、72℃  30秒：20サイクル）
PCR反応２
EGF-8：TGGGCTGAGCAGCACAGTGGAAAATCGCTTATATACCTA（配列番号：７６）
EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC（配列番号：７２）
（94℃  30秒、68℃  30秒、72℃  30秒：20サイクル）【０１６０】
次に、PCR反応１、２で得られた２つのDNA断片を混合し、Pyrobest  Taq  polymerase(タカラ）を用いて、リコンビネーション反応（94℃  30秒、72℃  60秒：5サイクル）を行った後、さらにこの反応液1μlを鋳型にして、以下の条件でPCRを行った。
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG（配列番号：７１）
EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC（配列番号：７２）
（94℃  30秒、68℃  30秒、72℃  60秒：22サイクル）
得られたPCR産物をSalI,NotIで切断後、同じくSalI、NotIで切断した動物細胞用発現ベクター（pMCN）に挿入し、proHB-EGF発現ベクター（pMCN-MHB-EGF）を構築した。【０１６１】
次にproHB-EGFを発現するBa/F3細胞株の樹立を以下のとおり行った。まず、構築したproHB-EGF発現ベクター（pMCN-MHB-EGF）15μgをpvuIで切断し、PBS(-)に懸濁したBa/F3細胞(1x107細胞/mL,800μL)に0.33kV,950μFDでエレクトロポレーション（Gene  Pulser;BioRad）により導入した。これら細胞は、1ng/ml  IL-3,500μg/ml  G418を含む培地（RPMI1640,10%  FCS,PS）で96ウェルプレート中で培養を行い、2週間後にG418耐性株をピックアップした。各細胞をヤギ抗HB-EGF抗体（R&D）、FITC標識抗マウスIgG抗体（BECKMAN  COULTER:PN  IM0819）で染色し、FACS（ベクトンディッキンソン）により細胞表面HB-EGFの発現量の高いクローンを選択した。【０１６２】
２−２．HB-EGF発現SKOV-3細胞の樹立
HB-EGFを発現するSKOV-3細胞株の樹立を以下のとおり行った。卵巣癌細胞株であるSKOV-3(ATCCより購入)は10%  FCS,ペニシリン/ストレプトマイシン（P/S）を含有する生育培地（Mc'Coy  5A  medium,invitrogen)で培養を行った。
1-1-1で構築したHB-EGF発現ベクター（pMCN＿HB-EGF）15μgをpvuIで消化した。その後、PBS(-)に懸濁したSKOV-3細胞(1x107細胞/mL,800μL)に1.5kV,25μFDの条件化においてエレクトロポレーション（Gene  Pulser;BioRad）により導入した。前記生育培地で適当な細胞数に希釈した後、96ウェルプレートに播種した。翌日G418(geneticin,invitrogen)を500μg/mLになるように添加した。約2週間後にG418耐性単一クローンを選別し、ウエスタンブロットにより、HB-EGFを発現する細胞株のスクリーニングを行った。最も産生量の高い株を選び、後の実験に使用した。【０１６３】
２−３．HB-EGF依存的に増殖するEGFR＿Ba/F3細胞株の樹立
２−３−１．pCV-hEGFR/G-CSFRの構築
本発明の抗体の活性を評価するために、ヒトEGFRの細胞外領域とマウスG-CSFRの細胞内領域のキメラ受容体（hEGFR/mG-CSFR）を発現するベクターを構築した。図２ａに、HB-EGFがこのキメラ受容体を発現する細胞に結合したときの当該細胞に及ぼす影響を模式的に示す。
ヒト上皮成長因子レセプター(EGFR)の細胞外領域をコードする遺伝子のクローニングは、ヒト肝臓cDNA（Marathon  Ready  cDNA,CLONTECH）を鋳型に以下のプライマーセットを用いたPCRにより実施した。ヒトEGFRの塩基配列（MN＿005228)およびアミノ酸配列（NP＿005219)を、それぞれ配列番号７７および７８に示す。
EGFR-1：ATGCGACCCTCCGGGACGGC（配列番号：７９）
EGFR-2：CAGTGGCGATGGACGGGATCT（配列番号：８０）
（94℃  30秒、65℃  30秒、72℃  2分：35サイクル）
増幅したcDNA（約２Kb）をアガロースゲルより切り出し、pCR-TOPOベクター(invitrogen)に挿入した。このプラスミドに挿入された断片の塩基配列を解析し、得られたEGFR遺伝子が正しい配列を有していることを確認した。次に、上記で得られたプラスミドを鋳型にして、以下のプライマーセットを用いてPCRを行った。
EGFR-5
TTGCGGCCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGC（配列番号：８１）
EGFR-6
ACCAGATCTCCAGGAAAATGTTTAAGTCAGATGGATCGGACGGGATCTTAGGCCCATTCGT（配列番号：８２）
（94℃  30秒、68℃  30秒、72℃  2分：25サイクル）【０１６４】
この操作により、5'にNotIサイトを、3'にBglIIサイトを有するEGFR細胞外領域をコードする遺伝子断片を得た。これを、NotI-BglIIで切断し、pCV＿mG-CSFRのNotI-BamHI間に挿入した。【０１６５】
発現プラスミドベクターpCVは、pCOS1（国際特許公開番号WO98/13388）のpoly(A)付加シグナルをヒトG-CSF由来のものに置換し構築した。pEF-BOS（Mizushima  S.et  al.(1990)Nuc.Acid  Res.18,5322）をEco  RI及びXba  Iで切断し、ヒトG-CSF由来のpoly(A)付加シグナル断片を得た。この断片をpBacPAK8（CLONTECH）にEco  RI/Xba  I部位で挿入した。これをEco  RIで切断したのち両端を平滑化し、Bam  HIで消化した。これにより、5'末端にBam  HI部位が付加し、3'末端が平滑化されたヒトG-CSF由来のpoly(A)付加シグナルを含む断片を得た。この断片とpCOS1のpoly(A)付加シグナル部分をBam  HI/Eco  RV部位で置換し、これをpCVとした。【０１６６】
pCV＿mG-CSFRはpCV上にマウスG-CSF受容体の細胞質内領域である623番目のアスパラギン残基からC末端までを含む。マウスG-CSF受容体の塩基配列（M58288）を配列番号：８３、アミノ酸配列番号（AAA37673）を配列番号：８４に示す。ただし、pCV＿mG-CSFRの挿入配列中のN末端領域においてコードするcDNA配列に制限酵素サイトであるBamHIサイトを作出したことから配列番号８４における632番目のグリシン残基がグルタミン酸残基に置換されているものである。【０１６７】
pCV＿mGCSFR中に挿入された遺伝子断片の塩基配列を確認し、ヒトEGFRの細胞外領域とマウスG-CSFRの細胞内領域のキメラ受容体（hEGFR/mG-CSFR）を発現するベクター（pCV＿hEGFR/mG-CSFR）の構築を終了した。【０１６８】
本発現ベクターが発現するタンパク質、すなわちヒトEGFR/マウスG-CSFRキメラ受容体の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８５および８６に示す。【０１６９】
２−３−２．HB-EGF依存性細胞株の樹立
pvuIで切断することにより直鎖化したキメラ受容体（hEGFR/mG-CSFR）発現ベクター（pCV＿hEGFR/mG-CSFR）15ugを、0.33kV,950μFDでBa/F3細胞にエレクトロポレーション(Gene  Pulser;BioRad)により導入した。この細胞を10ng/ml  HB-EGF、500μg/ml  G418を含む培地(RPMI1640,10%  FCS,PS)で2週間培養し、出現したコロニーをピックアップした。【０１７０】
次に、得られた細胞株がHB-EGFの濃度依存的に増殖することを以下の実験により確認した。EGFR＿Ba/F3細胞を0〜100ng/mlのHB-EGF(R&D,259-HE)存在下で1x103細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒き、3日間培養した。その後細胞数をWST-8試薬（cell  counting  kit-8,同仁）を用いて、添付の文書にしたがって計測した。【０１７１】
その結果、樹立した細胞株（EGFR＿Ba/F3）は、HB-EGFの濃度依存的に増殖が促進されることが確認された（図２ｂ）。【０１７２】
２−４．ハイブリドーマのスクリーニング
２−４−１．HB-EGF結合抗体のスクリーニング（一次スクリーニング）
抗HB-EGF中和抗体を取得するため、まずHB-EGFに結合する抗体のスクリーニングを行った。結合抗体のスクリーニングにはELISA,FACSを用いた。【０１７３】
２−４−１−１．ELISA
HB-EGFタンパク質(R&D,259-HE)を１μg/mlでコーティングしたELISA用プレート（NUNC）に、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、1時間インキュベートした。その後、アルカリフォスファターゼ（AP）標識抗マウスIgG(ZYMED:#62-6622)で1時間反応後、1mg/mlの基質（SIGMA:S0942-50TAB）を加え発色させた。プレートリーダー（BioRad社）によりOD405を測定し、ELISA陽性ウェルを選抜した。【０１７４】
２−４−１−２．FACS
HB-EGF＿Ba/F3細胞（約1x105細胞）にハイブリドーマの培養上清を加え、4℃で1時間インキュベートした。その後FITC標識抗マウスIgG抗体（BECKMAN  COULTER:PN  IM0819）を加え、4℃で30分インキュベートした。その後、各ハイブリドーマ培養上清の細胞表面のHB-EGFへの結合活性をFACS（ベクトンディッキンソン）にて解析した。【０１７５】
２−４−１−３．限界希釈
ELISA、または、FACS解析でHB-EGFへの結合活性を有するクローンを単一クローン化するため、限界希釈(LD)を行った。陽性ウェルの細胞数を測定し、3細胞/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種した。約10日間培養し、コロニーが出現したウェルの培養上清について、再びELISAあるいはFACSにより結合活性を解析した。これら一連の作業により、HAシリーズでは5種類の、HBシリーズでは4種類の、そしてHCシリーズでは5種類のHB-EGF結合活性を有する単一クローンを得た。【０１７６】
２−４−１−４．サブタイプの決定
抗体のサブタイプ決定はIsoStrip(Roche  #1  493  027)を用いて行った。サブタイプ決定にはPBS(-)で10倍希釈したハイブリドーマの培養上清を用いた。【０１７７】
【表１】
2008047914.tif 000003
【０１７８】
２−４−２．抗体の精製
得られた単一クローンのハイブリドーマの培養上清80mLからHi  Trap  Protein  G  HP  1mLカラム(Amersham  Biosciences  #17-0404-01)を用いて抗体を精製した。ハイブリドーマ上清を流速1mL/minで吸着させ、20mLの20mM  Phosphate  buffer(pH7.0)で洗浄した後、3.5mLの0.1M  Glycine-HCl(pH2.7)で溶出した。溶出分画は、あらかじめ1M  Tris-HCl(pH9.0)を50μLずつ加えたエッペンドルフチューブに0.5mlずつ回収した。OD280nmを測定し、抗体が含まれている分画をまとめ、PBS(-)を加えて全量2.5mLとした後、PD-10カラム(Amersham  Biosciences  #17-0851-01)を用いてPBS(-)にバッファー置換した。精製した抗体は0.22μmフィルター(MILLIPORE  #SLGV033RS)を通し、以下詳細に各精製抗体の性質について検討を行った。【０１７９】
２−４−３．EGFR＿Ba/F3細胞の増殖中和活性の解析(二次スクリーニング)
各精製抗体を用いて、EGFR＿Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する中和活性を解析した。EGFR＿Ba/F3細胞をHB-EGF(80ng/ml)存在下で2x104細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒き、各精製抗体を0〜200ng/mlで添加した。3日間培養後、WST-8(cell  counting  kit-8)を用いて細胞数を測定した。【０１８０】
その結果、HAシリーズではHA-20が、HBシリーズではHB-20が、そしてHCシリーズではHC-15が強い中和活性を有することが分かった（図３ａ−ｃ）。【０１８１】
HB-EGF中和抗体（HA-20,HB-20,HC-15）の性質の解析
３−１．HA-20、HB-20、HC-15の可変領域のクローニングとアミノ酸配列の解析
ハイブリドーマ約5x106個からTrizol(#15596-018,Life  technologies)を用いてtotal  RNAを精製した。得られたtotal  RNA  1μgよりSMART  RACE  cDNA  Amplification  Kit(CLONTECH  #PT3269-1)を用い、添付のマニュアルにしたがって全長cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型にして、Advantage  2  PCR  Enzyme  System(CLONTECH  #PT3281-1)を用い、以下の条件でPCRを行って各抗体の重鎖(VH)、および軽鎖(VL)の可変領域をコードする遺伝子を増幅した。
軽鎖可変領域のクローニング用プライマー
UPM⇔k(VL-k)
UPM：Kitに添付
VL-k:GCT  CAC  TGG  ATG  GTG  GGA  AGA  TG（配列番号：９１）
重鎖可変領域のクローニング用プライマー
HA-20：UPM⇔VH-G1
HB-20,HC-15：UPM⇔VH-2a
UPM：Kitに添付
VH-G1:GGG  CCA  GTG  GAT  AGA  CAG  ATG（配列番号：９２）
VH-2a:CAG  GGG  CCA  GTG  GAT  AGA  CCG  ATG（配列番号：９３）
94℃  5秒,72℃  2分,5サイクル
94℃  5秒,70℃  10秒,72℃  2分,5サイクル
94℃  5秒,68℃  10秒,72℃  2分,27サイクル
上記操作により増幅した遺伝子断片をpCRII-TOPO(Invitrogen  TOPO  TA-cloning  kit,#45-0640)にTA-クローニングし、その後それぞれのインサートについて塩基配列を確認した。確認された可変領域の配列を図４に示す。【０１８２】
３−２．活性型HB-EGFに対する結合活性の解析
得られた3種類の抗体（HA-20,HB-20,HC-15）の活性型HB-EGFタンパク質への結合活性を比較するため、以下の実験を行った。HB-EGFタンパク質(R&D,259-HE)を１μg/mlでコーティングしたELISA用プレート（NUNC）に、HA-20、HB-20、HC-15抗体を各濃度で反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ（AP）標識抗マウスIgG(ZYMED:#62-6622)で1時間反応後、1mg/mlの基質（SIGMA:S0942-50TAB）を加え発色した。その後、プレートリーダーでOD405を測定し、得られた各抗体の結合曲線をもとに、50%の結合を示す抗体濃度（ED50）を算出した。その結果、活性型HB-EGFへの結合活性は、ED50値が0.2〜1.4
nMであり、いずれも強い結合活性を有することが分かった（図５）。【０１８３】
【表２】
2008047914.tif 000004
【０１８４】
３−３．proHB-EGFに対する結合活性の解析
次に、得られた３つの抗体のproHB-EGFに対する結合活性を解析した。内在性にHB-EGFを発現していることが知られている卵巣癌細胞株  RMG1細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より購入）は、１０%FCSを含む生育培地(Ham's  F12  medium,invitrogen)で培養した。HB-EGFを強制発現させた細胞である、Ba/F3細胞（HB-EGF＿Ba/F3）、HB-EGF発現DG44細胞（HB-EGF＿DG44）、及びSKOV-3細胞（HB-EGF＿SKOV-3）並びにHB-EGFを内示的に発現しているRMG1細胞に対し、各抗体（10μg/ml）を4℃で1時間反応させ、さらにFITC標識抗マウスIgG抗体（BECKMAN  COULTER:PN  IM0819）で染色を行った。その後、各抗体の細胞表面のHB-EGFへの結合をFACS（ベクトンディッキンソン）にて解析した。【０１８５】
図６に、抗体HA-20、HB-20及びHC15のBa/F3、DG44及びSKOV-3細胞に強制発現させたproHB-EGF、およびRMG1細胞で内在性に発現するproHB-EGFに対する結合活性をFACS解析により比較したヒストグラムを示す。一次抗体非存在下の染色パターン（コントロール）を灰色の波形で、各抗体存在下での染色パターンを実線で示す。横軸が染色強度、縦軸が細胞数を表す。図６に示されるように、HB-20、HC-15は、強制発現させた細胞膜上のHB-EGF、及び卵巣癌株で内在的に発現している細胞膜上のHB-EGFを認識したのに対し、HA-20は、まったく結合しないかあるいは非常に弱い結合しか示さなかった。このことから、HA-20は、活性型HB-EGFには強く結合するものの、proHB-EGFは認識しない抗体であることが明らかになった。【０１８６】
３−４．中和活性の解析
３−４−１．EGFR/HB-EGF結合阻害作用の固相解析
３−４−１−１．EGFR-Fcタンパク質の調整
HB-EGFとその受容体であるEGFRとの結合を固相条件で確認できるELISA系を構築するため、まず受容体タンパク質としてEGFRの細胞外領域とヒトIgG1のFc領域との融合タンパク質（EGFR-Fc）の調整を行った。図７にHB-EGFとEGFRとの結合をHB-EGF抗体が固相上で阻害する状態を模式的に示す。【０１８７】
最初に、EGFR-Fc発現ベクターの構築を行った。実施例2-3-1.で構築したpCV＿hEGFR/mG-CSFRを鋳型にして、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
EGFR-7:GTTAAGCTTCCACCATGCGACCCTCCGGGAC（配列番号：９４）
EGFR-8:GTTGGTGACCGACGGGATCTTAGGCCCATTCGTTG（配列番号：９５）
（94℃  30秒、72℃  30秒：25サイクル）【０１８８】
増幅したEGFR細胞外領域をコードする遺伝子断片を、BstEIIとHindIIIで切断し、これを、pMCDN2-FcのBstEII-HindIII間に挿入した。挿入された遺伝子断片の塩基配列を確認し、ヒトEGFRの細胞外領域とヒトIgG1のFc領域との融合タンパク質（EGFR-Fc）を発現するベクター（pMCDN2＿EGFR-Fc）の構築を終了した。本発現ベクターが発現するタンパク質、すなわちEGFR-Fcの塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９６および９７に示す。【０１８９】
次に、EGFR-Fcタンパク質産生細胞株の樹立を以下のとおり行った。まずEGFR-Fc発現ベクター（pMCDN2＿EGFR-Fc）15μgをpvuIで切断し、DG44細胞にエレクトロポレーションにより導入した。その後、G418耐性株の培養上清中に産生されたEGFR-Fcタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。すなわち、各培養上清10μlをSDS-PAGEにより分離し、これをPVDF膜ブロットし、HRP標識抗ヒトIgG抗体（アマシャム、NA933V）で目的タンパク質の検出を行った。産生量の最も高いクローンを選び、これを拡大培養して培養上清の回収を行った。【０１９０】
EGFR-Fcタンパク質の精製は以下のとおり行った。得られたEGFR-Fc産生株の培養上清をHi  Trap  Protein  G  HP  1mLカラム(Amersham  Biosciences  #17-0404-01)に流速1mL/minで吸着させた。これを20mLの20mM  リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、3.5mLの0.1M  グリシン-HCl(pH2.7)で溶出した。回収した分画のうち10μlずつをSDS-PAGEにより分離し、ウエスタンブロット、および、クマシーブリリアントブルー（CBB）染色により目的タンパク質が含まれている分画を確認し、PD-10カラム(Amersham  Biosciences  #17-0851-01)を用いてPBS(-)にバッファー置換した。精製したタンパク質は0.22μmフィルター(MILLIPORE  #SLGV033RS)を通し、4℃で保存した。【０１９１】
３−４−１−２．ELISAによるHB-EGFとEGFRの結合解析
抗ヒトIgG抗体をコートしたELISAプレートに、精製したEGFR-Fcを0.5μg/mlで1時間反応させた。これに、HB-EGF(R&D,259-HE)を、0〜250ng/mlで1時間反応させ、その後、ビオチン標識抗HB-EGF抗体（R&D,BAF259）とAP標識ストレプトアビジン（ZYMED,#43-8322）によりEGFR-Fcに結合したHB-EGFタンパク質を検出した。図８にELISAによるEGFRとHB-EGFとの結合様式の解析モデルを示す。その結果、この固相系により、EGFRに結合するHB-EGFをおよそ4ng/mlの濃度から検出できることが分かった（図９）。【０１９２】
３−４−１−３．抗体によるHB-EGFとEGFRの結合阻害活性の解析
2-4-2で得られた抗体の、HB-EGFとEGFRとの結合阻害活性に関して、上記固相評価系を用いた解析を行った。EGFR-Fcを固相化したELISAプレートに、HB-EGF(50ng/ml)と各抗体を添加し、室温で1時間反応した。プレートをTBS-Tで洗浄し、EGFRに結合しているHB-EGFを上記手法により検出した（図１０）。【０１９３】
その結果、いずれの抗体においても、濃度依存的な結合阻害活性が認められ、特にHA-20、HB-20、HC-15で強い結合阻害活性が確認された。【０１９４】
３−４−２．EGFR＿Ba/F3細胞の増殖抑制活性
HA-20、HB-20、HC-15についてEGFR＿Ba/F3細胞のHB-EGF依存的な増殖に対する中和活性を比較した。上記と同様にEGFR＿Ba/F3細胞をHB-EGF(80ng/ml)存在下で2x104細胞/ウェルで96ウェルプレートに撒き、各精製抗体を添加した。3日間培養後、WST-8(cell  counting  kit-8)を用いて細胞数を測定し、増殖曲線を作成した。そしてこの結果をもとに、最大抑制効果の50%の抗体濃度（EC50値）を算出した。【０１９５】
その結果、EGFR＿Ba/F3細胞の増殖抑制効果が最も強かったのがHC-15(EC50=3.8nM)で、次いでHA-20(EC50=32.6nM)、HB-20(EC50=40.3nM)であった（図１１）。【０１９６】
【表３】
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【０１９７】
３−４−３．RMG-1細胞に対する増殖抑制活性
RMG-1細胞に対する中和活性の解析は以下のとおり行った。96ウェルプレートにRMG-1細胞を、6x103細胞/ウェルで、8%あるいは2%FCSを含むHam's  F12  medium中に撒き、そこへ各抗体を添加した。１週間培養後に、WST-8試薬により細胞数を測定した。【０１９８】
その結果、HA-20は、抗体濃度依存的にRMG-1細胞の増殖を抑制した（図１２）。この増殖抑制活性はFCS濃度が２%のときに特に顕著に認められた。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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