【手続補正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明製造方法における求核性試薬は求核剤と呼ばれる試薬であって、化学大辞典（株式会社東京化学同人発行）によると「核すなわち電子不足反応中心に対して高い親和性をもつ試剤である。一般に非共有電子対をもち、負電荷をもつものもあり、他の分子を攻撃し結合を形成する場合、結合電子2個を供与する試剤である。広い意味ではルイス塩基としての挙動を示す試剤である。」と定義付けられている。しかし、本発明製造方法における「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」とはこのような求核剤であって、更にヒアルロン酸のカルボキシル基の炭素原子に親和性を有し、結合の形成に電子対を供与する攻撃性を有し、具体的には該カルボキシル基と結合することができる物質である。本発明製造方法における好ましい「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」の例としては、例えば蛍光標識物質（4-アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等）、アミノ酸（例えばロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキサム酸等）又はその誘導体（例えばメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル等、又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルアミン等）が結合したアミノ酸（ロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキサム酸等））或いはその重合体（すなわちペプチド、タンパク質等（例えばエンケファリン、ブラジキニン、オキシトシン、アンジオテンシン等）、縮合剤（水溶性カルボジイミド（例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDCI・HCl）、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド-メト-p-トルエンスルホネート、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチルカルボジイミド塩酸塩等)）、その他の医薬品（メトトレキセート、ダウノマイシン、マイトマイシンC、シトシンアラビノシド、アドリアマイシン、ベスタチン等）又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン）が結合した医薬品（インドメタシン、アセメタシン、サラゾスルファピリジン、メトトレキセート、ベスタチン等）、脂肪酸（プロピオン酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等）にスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン等）が結合したスペーサー結合脂肪酸が好ましくは挙げられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
上記の塩基（有機塩基又は無機塩基）の使用量や処理時間は目的とする親水性の程度（後述のフィルター通過性の有無を親水性の程度の判定基準とする）に応じて適宜調節される。例えばヒアルロン酸１ｇ相当量に対して炭酸水素ナトリウム２５０ｍｇを使用する場合は４〜６時間、炭酸水素ナトリウム５００ｍｇ以上を使用する場合は２〜４時間攪拌処理することで親水性が充分に高められたヒアルロン酸誘導体が得られる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明物質における求核性試薬は求核剤と呼ばれる試薬であって、化学大辞典（株式会社東京化学同人発行）によると「核すなわち電子不足反応中心に対して高い親和性をもつ試剤である。一般に非共有電子対をもち、負電荷をもつものもあり、他の分子を攻撃し結合を形成する場合、結合電子2個を供与する試剤である。広い意味ではルイス塩基としての挙動を示す試剤である。」と定義付けられている。しかし、本発明物質における「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」とはこのような求核剤であって、更にヒアルロン酸のカルボキシル基の炭素原子に親和性を有し、結合の形成に電子対を供与する攻撃性を有し、具体的には該カルボキシル基と結合することができる物質である。本発明物質における好ましい「カルボキシル基と結合しうる求核性試薬」の例としては、例えば蛍光標識物質（4-アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等）、アミノ酸（例えばロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキサム酸）又はその誘導体（例えばメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル等、スペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルアミン等）が結合したアミノ酸（ロイシン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン、フェニルアラニン、トラネキムサム酸等））或いは重合体（ペプチド、タンパク質等（例えばエンケファリン、ブラジキニン、オキシトシン、アンジオテンシン等）、縮合剤（水溶性カルボジイミド（例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDCI・HCl）、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド-メト-p-トルエンスルホネート、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチルカルボジイミド塩酸塩等)）、その他の生理活性物質（メトトレキセート、ダウノマイシン、マイトマイシンC、シトシンアラビノシド、アドリアマイシン、ベスタチン等）又はスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン）を結合した生理活性物質（インドメタシン、アセメタシン、サラゾスルファピリジン、メトトレキセート、ベスタチン等）、脂肪酸（プロピオン酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等）にスペーサー（アミノアルキルアルコール又はアルキルジアミン等）が結合したスペーサー結合脂肪酸が好ましくは挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に詳説する。
試験例
フィルター通過性試験
１．０重量％で被検物質を溶解した５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を調製する。２４℃条件下５．０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下で多孔質フィルター（孔径０．４５μｍで直径２５ｍｍ）に上記で調製した被検物質の溶液を通過させ、１分間あたりの通過量（ｍｌ）を測定する。２ｍｌ以上通過した場合を「○」、２ｍｌ未満通過した場合「△」、通過しない場合を「×」で示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
（２）被検物質の調製（アルカリ処理を行って調製）
（１）の２２．５ｍＬ抜き出した残りの反応液に炭酸水素ナトリウムを５００ｍｇ加え、４時間３０分攪拌した。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム６．０ｇを加え攪拌した。エタノール５００ｍＬに加え沈殿させ、沈殿物を８０％エタノールで４回、エタノールで３回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥した。８３０ｍｇの橙色固体を得た。カルボキシル基への４−アミノフルオレセインの導入率は０．３％だった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
（２）グルタミン導入ヒアルロン酸
重量平均分子量９０万のヒアルロン酸２００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ／二糖単位）を水３０ｍＬ／ジオキサン１５ｍＬに溶解させた後、２ＭのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド水溶液２５０μＬ、１Ｍ  ＥＤＣＩ・ＨＣｌ水溶液２５０μＬ、０．５Ｍグルタミン塩酸塩水溶液５００μＬを順次加え、一晩攪拌する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
反応液に炭酸水素ナトリウムを２００ｍｇ加え、３時間攪拌する。反応液に酢酸を加え中和後、塩化ナトリウム２００ｍｇを加え攪拌し、エタノール１００ｍＬに加え沈殿させて沈殿物を得る。沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄し、４０℃にて一晩真空乾燥し、１７６ｍｇの白色固体として、本発明物質であるグルタミン導入ヒアルロン酸を得ることができる。アミノ酸分析により測定すると導入率は２．４％である。