(57)【要約】  生細胞群を含むサンプル液流に測定用レーザ光を照射し、測定用レーザ光の照射を受けて、サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得し、取得された光情報に基づき、各光情報に対応する生細胞が、不要生細胞または目的生細胞のいずれであるかをそれぞれ判別し、判別結果に応じて、サンプル液中の生細胞群のうち不要生細胞と判別された生細胞に対してのみパルス電圧を印加し、不要生細胞に損傷を与えて死細胞とする。
2008153056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞分別処理方法であって、
複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群を含み、前記生細胞群の各生細胞がそれぞれ離間して一直線上に流れるサンプル液流を形成するステップと、
前記サンプル液流に測定光を照射するステップと、
前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得するステップと、
前記取得するステップによって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるかをそれぞれ判別するステップと、
前記判別するステップにおける判別結果に応じて、前記サンプル液流中の前記不要生細胞に対応する部分にパルス電界を発生させることで、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とするステップと、
を有することを特徴とする生細胞分別処理方法。
【請求項２】
前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させ、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とする請求項１記載の生細胞分別処理方法。
【請求項３】
前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核に電界がかかり、前記細胞核内部のＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が損傷を受けるよう、パルス幅が設定されている請求項２記載の生細胞分別処理方法。
【請求項４】
前記パルス幅は、１．０×１０−６（秒）より短い請求項３記載の生細胞分別処理方法。
【請求項５】
前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させて前記不要生細胞内にパルス電流を生じさせ、前記パルス電流によるジュール熱によって前記不要生細胞にアポトーシスを起こさせる請求項４に記載の生細胞分別処理方法。
【請求項６】
前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核と比較して前記不要生細胞の細胞膜により高い電界がかかり、前記細胞膜が不可逆破壊されるよう、パルス幅およびピーク電圧が設定されている請求項２記載の生細胞分別処理方法。
【請求項７】
前記パルス幅は、１．０×１０−６（秒）と同等またはそれより長い請求項６記載の生細胞分別処理方法。
【請求項８】
前記不要生細胞の細胞膜にかかる電界が１ｋＶ／ｃｍ以上であり、前記ピーク電圧は１０Ｖ以上である請求項７記載の生細胞分別処理方法。
【請求項９】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、
前記サンプル液中、前記回収容器の内壁面に付着した細胞を、前記目的生細胞として回収するとともに、前記回収容器の内壁面に付着せず前記サンプル液に浮遊する細胞を、前記死細胞として分別して回収するステップと、を有する請求項１〜８のいずれかに記載の生細胞分別処理方法。
【請求項１０】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、
前記回収容器中の前記サンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、前記サンプル液中の前記目的生細胞のみを培養することで、前記サンプル液中の前記死細胞の割合を減少させるステップと、を有する請求項１〜８のいずれかに記載の生細胞分別処理方法。
【請求項１１】
細胞分別処理機能を有するフローサイトメータであって、
複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群を含むサンプル液が内部を流れるフローセルと、
前記フローセル内の特定領域にパルス電界を発生させる電界発生部と、
前記フローセル内の前記サンプル液流に測定光を照射する測定光照射部と、
前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得する光情報取得部と、
前記光情報取得手段によって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるか、をそれぞれ判別する生細胞判別部と、
前記生細胞判別手段における判別結果に応じ、前記電界発生手段による前記パルス電界の発生タイミングを制御する制御部と、を有し、
前記制御部が、前記フローセル内の前記特定領域を前記不要生細胞が通過するタイミングで、前記電界発生部によって前記特定領域に前記電界を発生させて、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることを特徴とする、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ。
【請求項１２】
前記電界発生部は、前記フローセルの特定領域を挟むように配置された２つの電極と、
前記２つの電極間にパルス電圧を印加するパルス電圧印加部と、
を有して構成されている請求項１１記載の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群のうち、特定の生細胞に処理を行うフローサイトメータ、および、上記生細胞群から目的生細胞を分別して回収する生細胞分別処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば癌などの研究における細胞や染色体の解析には、従来は顕微鏡が用いられていた。しかし、顕微鏡による解析では、大量のデータを集めて統計的に検討するのに、非常に多くの手間と時間を要していた。現在、多くの場合、細胞や染色体の解析には、短時間に多くのサンプル（細胞や染色体）を解析し、信頼性の高い統計データを得ることを可能とする、フローサイトメータが用いられている。フローサイトメータでは、抗体が蛍光染色された細胞などのサンプル粒子を含むサンプル液の流れであるサンプル液流を形成し、このサンプル液流にレーザ光を照射して、流れる大量のサンプル粒子の１つ１つから放出される蛍光や散乱光を測定し、信頼性の高い統計データを得ることができる。このようなフローサイトメータは、医療分野における研究などに広く利用されている。【０００３】
ところで、今後の医療分野において大きな期待がかかっているのは、再生細胞ともいわれる幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を用いた治療である。幹細胞とは、生体を構成する細胞の生理的な増殖・分化などの過程において、自己増殖能と、特定の機能を持つ細胞に分化する能力とをあわせ有する細胞である。すなわち、幹細胞は、自分自身が増える複製能力と、ほかの細胞になる能力を備えている細胞である。幹細胞には、胚から取り出される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成人から取り出される成体幹細胞、胎児から取り出される胎児性幹細胞など、様々な種類がある。この幹細胞を、けがや病気で傷んだ臓器などの細胞に分化させることができれば、移植して修復に使えることから、再生医療の分野等で研究が盛んになっている。【０００４】
胚性幹細胞や胎児性幹細胞などから幹細胞を取り出すには、胚を壊してしまう（殺してしまう）必要があるといった倫理的な問題を有している。このため、現在の再生医療に関する研究の多くは、生きている人（子どもまたは成人）から、その体を傷つけることなく幹細胞を採取することができる成体幹細胞に関するものとなっている。成体幹細胞の研究には、当然ながら、成体幹細胞が必要である。成体幹細胞は、骨髄や血液、目の角膜や網膜、肝臓、皮膚などで見つかるものであるが、見つかることは非常にまれであり、通常、採取した大量の細胞サンプルの中から、ごく微量しか見つけることはできない。例えば、骨髄間質の中には、骨、軟骨、脂肪、筋肉、腱、神経など多くの組織に分化できる間葉系幹細胞と呼ばれ細胞が存在しており、病気や外傷などによる組織欠損に対する再生医療において注目されている。しかしながらこの細胞は骨髄中には１０万個に１個の割合でしか存在していない。そのため欠損組織の再生を行うためには一度体外で培養して細胞を増やす必要がある。そのためには、この骨髄中の複数の細胞の中から、ごく微量の幹細胞を分離・抽出する必要がある。大量の細胞サンプルの中から、なるべく短時間に、ごく微量の成体幹細胞を分離・抽出するために、現在、上記フローサイトメータを用いた細胞の分離・回収システム（セルソータ）が利用されている。【０００５】
例えば、下記非特許文献１には、このようなセルソータの一例について記載されている。図４は、下記非特許文献１記載のセルソータ１００について説明する概略構成図である。セルソータ１００では、大量の細胞サンプル１０２を含んだサンプル液を、ノズル１０３からジェット流１０４として出射する。これら大量の細胞サンプル１０２には、わずかながら幹細胞が含まれており、大量の細胞サンプル１０２には、このような幹細胞を特徴づけるための蛍光ラベリングが施されている。セルソータ１００は、このジェット流１０４に測定用のレーザ光１０６を照射して、大量の細胞サンプル１０２に対して順次レーザ光１０６を照射する。そして、光電子増倍管１０８および光電子増倍管１１０を有する図示しない評価手段によって、個々の細胞サンプル１０２から発せられる各種散乱光や蛍光の情報を取得する。そして、図示しない評価手段において、レーザ光１０６を照射した細胞サンプルが、幹細胞サンプルであるか否かを判定する（なお、下記非特許文献１では、幹細胞を多く含んだサンプル細胞の集団部分を特定している）。ここまでは、一般的なフローサイトメータの構成であるが、セルソータ１００では、特定した細胞を分離（ソーティング）する機能を有している。セルソータ１００では、例えば図示しない圧電素子等によってノズル１０３を高周波で振動させ、ジェット流１０４を強制的に液滴１１２とする。この液滴１１２を形成する際、幹細胞サンプルなどの特定の細胞サンプルが液滴に入った瞬間に、この特定液滴に対して、プラス（＋）またはマイナス（−）（図示例ではプラス）の電荷をかける（チャージする）。【０００６】
液滴１１２は、２枚の電場形成電極板１１４および１１６によって形成された水平方向の電場１１８の間を順次通過する。この際、チャージされた液滴１１２のみが、この水平方向の電場によって落下方向を変えて（偏向して）落下し、所望の試験管１２０に回収される。このようにして、幹細胞サンプルなどの特定の細胞サンプル１０２のみが、試験管１２０に回収される。チャージされなかったその他の細胞サンプル１０２は、鉛直に落下して、廃液受け１２２に回収される。【０００７】
【非特許文献１】“超高速セルソータＭｏＦｌｏＴＭによる幹細胞の新しい分析・分離方法”、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成１９年２月１９日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.takara-bio.co.jp/goods/bioview/pdfs/42/42_15-16.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記非特許文献１のように、サンプル液をジェット流にするためには、ノズルの出口部分の直径を例えば２５（μｍ）と著しく小さくする必要がある。上記非特許文献１の例では、直径が数（μｍ）〜２０（μｍ）程度の細胞が、この狭い出口部分を通過する際に物理的剪弾力を受けるので、必要である幹細胞までもが損傷を受けてしまう可能性が高かった。また、強制的に液滴とする際の高周波振動によっても、損傷を受けてしまう可能性があった。また、細胞サンプルが含まれる液滴をチャージして、しかも高電場をかけた場合、幹細胞などの必要な細胞にまで電気的な衝撃が加わり、この必要な細胞まで損傷を受けてしまうといった問題もあった。このようなセルソータを用いて幹細胞サンプルを分離して、所望の臓器などの細胞に分化させるとしても、分離した幹細胞サンプルが損傷を受けている場合、うまく分化しなかったり、あるいは不良細胞（例えば癌細胞）が発現してしまうなど、多様かつ危険な問題が発生する可能性を完全には排除できない。このため、細胞に損傷を与えることができないような慎重を要する研究分野では、依然としてこのような高速セルソータを用いることができなかった。【０００９】
このように、細胞の取り扱いに慎重を要する分野では、例えば、上記セルソータ１００の試験管１２０自体を、所定のタイミングで移動させることで、液滴１１２に含まれて落下する特定細胞サンプルを、分離・回収していた。しかし、試験管１２０自体の移動速度は、ジェット流１０４が液滴化された液滴１１２の落下速度に比べて著しく小さい速度しか達成できない。大量のサンプルを高速度に流した場合、大量の細胞サンプルに対して、ごくわずかな特定細胞サンプルしか取得することしかできない。また、試験管１２０の移動速度に応じて、サンプルの流速度を著しく低くした場合は、細胞の分離・抽出に多くの時間を要する。【００１０】
本発明は、上記従来の問題点に着目してなされたものであり、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、不要生細胞を分別して処理することを可能とする、生細胞分別処理機能を有するフローサイトメータを提供することを目的とする。また、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、目的生細胞のみを分別して回収することを可能とする、生細胞分別処理方法を提供することを目的とする。また、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、目的生細胞のみを分別して培養することを可能とする、生細胞分別処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記問題を解決するために、本発明は、生細胞分別処理方法であって、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群を含み、前記生細胞群の各生細胞がそれぞれ離間して一直線上に流れるサンプル液流を形成するステップと、前記サンプル液流に測定光を照射するステップと、前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得するステップと、前記取得するステップによって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるかをそれぞれ判別するステップと、前記判別するステップにおける判別結果に応じて、前記サンプル液流中の前記不要生細胞に対応する部分にパルス電界を発生させることで、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とするステップと、を有することを特徴とする生細胞分別処理方法を提供する。【００１２】
その際、前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させ、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることが好ましい。さらに、その際、前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核に電界がかかり、前記細胞核内部のＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が損傷を受けるよう、パルス幅が設定されていることが好ましい。このとき、前記パルス幅は、１．０×１０−６（秒）より短いことが好ましい。
その際、前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させて前記不要生細胞内にパルス電流を生じさせ、前記パルス電流によるジュール熱によって前記不要生細胞にアポトーシスを起こさせることが好ましい。【００１３】
また、前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核と比較して前記不要生細胞の細胞膜により高い電界がかかり、前記細胞膜が不可逆破壊されるよう、パルス幅およびピーク電圧が設定されていることが好ましい。その際、前記パルス幅は、１．０×１０−６（秒）と同等またはそれより長いことが好ましい。前記不要生細胞の細胞膜にかかる電界が１ｋＶ／ｃｍ以上であり、前記ピーク電圧は１０Ｖ以上であることが好ましい。【００１４】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、前記サンプル液中、前記回収容器の内壁面に付着した細胞を、前記目的生細胞として回収するとともに、前記回収容器の内壁面に付着せず前記サンプル液に浮遊する細胞を、前記死細胞として分別して回収するステップと、を有することが好ましい。【００１５】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、前記回収容器中の前記サンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、前記サンプル液中の前記目的生細胞のみを培養することで、前記サンプル液中の前記死細胞の割合を減少させるステップと、を有することが好ましい。【００１６】
また、本発明は、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータであって、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群を含むサンプル液が内部を流れるフローセルと、前記フローセル内の特定領域にパルス電界を発生させる電界発生部と、前記フローセル内の前記サンプル液流に測定光を照射する測定光照射部と、前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得する光情報取得部と、前記光情報取得手段によって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるか、をそれぞれ判別する生細胞判別部と、前記生細胞判別手段における判別結果に応じ、前記電界発生手段による前記パルス電界の発生タイミングを制御する制御部と、を有し、前記制御部が、前記フローセル内の前記特定領域を前記不要生細胞が通過するタイミングで、前記電界発生部によって前記特定領域に前記電界を発生させて、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることを特徴とする、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータを提供する。【００１７】
その際、前記電界発生部は、前記フローセルの特定領域を挟むように配置された２つの電極と、前記２つの電極間にパルス電圧を印加するパルス電圧印加部と、を有して構成されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータは、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に不要生細胞を分別し、この不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることができる。また、本発明の生細胞分別処理方法では、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して回収することができる。また、本発明の生細胞分別処理方法では、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例について説明する概略斜視図である。
【図２】図１に示すフローサイトメータの光学ユニットおよび電圧印加ユニットの構成および動作についてより詳細に説明する、概略側面図である。
【図３】（ａ）および（ｂ）は、図１に示すフローサイトメータのフローセルに設けられた電極およびその近傍を拡大して示す概略側面図である。
【図４】従来の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例である、セルソータについて説明する概略構成図である。
【符号の説明】
【００２０】
１０  フローサイトメータ
１１  生細胞群
１２  分析サンプル
１２ａ  幹細胞
１２ｂ  不要生細胞
１３  死亡細胞
１５  シース流
１７  サンプル液流
２０  液流形成ユニット
２２  液体供給装置
２５  分析サンプル液タンク
２７  シース液タンク
３２  フローセル
３４  外部管路
３６  サンプル液流管
４０  光学ユニット
４２  測定レーザ光照射部
４４、４６  受光部
５０  分析ユニット
５２  データ取得部
５４  データ処理・判別部
６０  電圧印加ユニット
６２  パルス電圧発生器
６４ａ、６４ｂ  電極
７０  制御装置
７２  印加タイミング制御部
８２  細胞膜
８４  細胞質
８６  核膜
８８  核質
１００  セルソータ
１０２  細胞サンプル
１０３  ノズル
１０４  ジェット流
１０６  レーザ光
１０８、１１０  光電子増倍管
１１２  液滴
１１４、１１６  電場形成電極板
１２０  試験管
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ、および細胞分別処理方法について、添付の図面に示される好適実施例を基に詳細に説明する。図１は、本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例である、フローサイトメータ１０について説明する概略斜視図である。【００２２】
フローサイトメータ１０は、液流形成ユニット２０、光学ユニット４０、分析ユニット５０、電圧印加ユニット６０、各部の動作シーケンスを制御する制御装置７０、回収容器８０とを有して構成されている。フローサイトメータ１０は、大量の不要生細胞（幹細胞以外の細胞）に、目的生細胞である幹細胞がごく僅かだけ含まれる生細胞群について、各細胞毎に幹細胞であるか否かを判別し、幹細胞でない（すなわち不要生細胞）と判別された生細胞に対してのみパルス電圧を印加し、不要生細胞に損傷を与えて死細胞とする装置である。フローサイトメータ１０は、また、パルス電圧が印加された後の、死細胞と幹細胞とが含まれるサンプル液を回収するための回収容器８０を備えており、回収容器８０の内壁面に付着せずサンプル液に浮遊する細胞を、死細胞として分別して回収する機能や、回収容器８０中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、サンプル液中の幹細胞のみを分別して培養することで、サンプル液中の死細胞の割合を減少させる機能も有する。【００２３】
フローサイトメータ１０は、例えば、ヒトの骨髄から抽出した生細胞群など、大量の生細胞の中に、ごく少ない割合ながら幹細胞を含んだ（含む可能性が高い）生細胞群から、幹細胞を分別する、いわゆるソーティング機能を有する装置（ソーティングシステム）である。本実施形態では、このように、フローサイトメータ１０を用いて、例えば、ヒトの骨髄から抽出した生細胞群など、大量の生細胞の中に、ごく少ない割合ながら幹細胞を含んだ（含む可能性が高い）生細胞群から、幹細胞を分別し、各種の処理を施す。なお、本発明における目的生細胞は、幹細胞であることに限定されない。【００２４】
上述したように、ヒトの骨髄の中には、間葉系幹細胞と呼ばれ細胞が、１０万個に１個の割合でしか存在していない。フローサイトメータ１０を用いて行なう細胞分別処理においては、このような生細胞群に対して、予め、蛍光色素を用いて一様に染色処理（蛍光ラベル）を施すことで、幹細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付けておく。幹細胞は、いわゆるＭＤＲ（Ｍｕｌｔｉ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の働きで、細胞内に取り込んだ色素を吐き出す性質をもっている。特定の蛍光色素を用い、所定の条件で生細胞群を染色処理した場合、このＭＤＲの機能によって、幹細胞についてはほとんど染色されない（色素を吐き出した）状態となる。フローサイトメータ１０で行う細胞分別処理には、このように、細胞における蛍光色素の染色状態の違いによって、幹細胞１２ａとその他の不要生細胞１２ｂとを識別可能に特徴付けた生細胞群１１を用いる。生細胞群１１において、各細胞が、それぞれ幹細胞１２ａであるか不要生細胞１２ｂであるかについては、生細胞群１１をフローサイトメータ１０に導入する時点では不明であることは言うまでもない。本明細書では、幹細胞１２ａと不要生細胞１２ｂとを、（特に、幹細胞であるか不要生細胞であるか不明である状態において）共に分析サンプル１２として記載する。なお、本実施形態では、幹細胞の有するＭＤＲ機能を利用して、幹細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付けているが、本発明において、蛍光色素によって目的細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付ける手法は、特に限定されない。【００２５】
液流形成ユニット２０は、液体供給装置２２と、流管部３０とを有して構成されている。液体供給装置２２と流管部３０は、配管２４によって接続されている。液体供給装置２２内には、分析サンプル液を貯溜しておく分析サンプル液タンク２５、シース液を貯溜しておくシース液タンク２７とを有している。流管部３０は、サンプル液がシース液に囲まれて内部を流れるフローセル３２と、フローセル３２にシース液を供給するフローセル３２と連続した外部管路３４と、外部管路３４の内部に設けられて、フローセル３２にサンプル液を供給するサンプル液流管３６とを有している。液体供給装置２２のサンプル液タンク２５はサンプル液流管３６に、シース液タンク２７は外部管路３４に、配管２４を介してそれぞれ接続されている。フローセル３２の出口には、回収容器８０が設けられている。【００２６】
この液体供給装置２２は、図示しないエアポンプを各タンク毎に備えている。フローサイトメータ１０では、シース液タンク２７内部を図示しないエアポンプによって加圧することで外部管路３４内部にシース液を供給し、外部管路３４およびフローセル３２内を図１中上側から下側に向けて流れるシース流１５（図２参照）を形成する。そして、サンプル液タンク２５を図示しないエアポンプによって加圧することで、サンプル液流管３６の内部にサンプル液を供給し、サンプル液流管３６の図中下側の開口端である吐出口３８から、シース流１５の中にサンプル液を吐出する。【００２７】
フローセル３２では、サンプル液は、シース流１５中に吐出された段階で流体力学的絞り込みが生じ、シース流１５に囲まれたサンプル液の流れは非常に細くなり、分析サンプル１２それぞれが流れの方向に離間して１列に並んだ、サンプル液流１７を形成する。本実施形態のフローサイトメータ１０では、サンプル液流などの分析サンプル１２それぞれが、ほぼ均等に所定の間隔（例えば１０μｍ）だけ離間して流れるように、液体供給装置２２などの動作（エアポンプの圧力など）が調整されている。すなわち、フローセル３２では、分析サンプル１２は１列となり、１個ずつ順番に所定の速さＶ（ｍ／秒）でフローセル３２中を流れる。このフローセル３２には、光学ユニット４０の測定レーザ光照射部４２によってレーザ光が照射されており、このレーザ光を横切るようにして分析サンプル１２は１個づつ順番に流れる。【００２８】
光学ユニット４０は、フローセル３２にむけて測定用のレーザ光を照射する測定レーザ光照射部４２と、フローセル３２を流れる（サンプル液流１７に含まれて流れる）分析サンプル１２による散乱光を受光し、受光した散乱光に応じた信号を出力する受光部４４と、フローセル３２を流れる分析サンプル１２から発光した蛍光を受光し、受光した蛍光に応じた信号を出力する受光部４６と、を有している。受光部４４および４６は分析ユニット５０に接続されており、出力された光信号は分析ユニット５０に送られる。【００２９】
図２は、光学ユニット４０および電圧印加ユニット６０の構成および動作についてより詳細に説明する、概略側面図である。測定レーザ光照射部４２は、フローセル３２を流れるサンプル液流１７に向けて特定波長のレーザ光を出射する測定レーザ光照射部４２と、測定レーザ光照射部４２から出射された測定用レーザ光を整形してフローセル３２内のサンプル液流１７に導く、レンズなどからなるレーザ光整形・調整部６４とを備えて構成されている。測定レーザ光照射部４２は、図示しないレーザ電源に接続されており、制御装置１０の制御の下、フローセル３２内を流れる、分析サンプル１２が１列に並んだサンプル液流１７に向けて、測定用レーザ光を連続的に出射する。測定レーザ光照射部４２から出射される測定用レーザ光は、分析サンプル１２に付着された（特に不要生細胞１２ｂ内に取り込まれて付着している）蛍光色素を励起させて特定波長範囲の蛍光を発生させる、特定波長のレーザ光である。測定レーザ光照射部４２としては、固体レーザや半導体レーザなどの、周知のレーザ装置を用いればよい。【００３０】
受光部４４は、フローセル３２を挟んで測定レーザ光照射部４２と対向するように配置されており、フローセル３２を通過する分析サンプル１２によるレーザ光の前方散乱光を連続して受光し、受光した前方散乱光の強度に応じたアナログ電気信号を出力する。一方、受光部４６は、レーザ光照射部４２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ、外部管路３０中の分析サンプル１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、レーザ光を受けて分析サンプル１２から発せられた蛍光を受光して、受光した蛍光の強度に応じたアナログ電気信号を出力する。受光部４４および受光部４６における光検出およびアナログ電気信号の出力には、例えばＰＭＴ（photomultiplier tube）を用いればよい。【００３１】
分析ユニット５０は、データ取得部５２と、データ処理・判別部５４とを有して構成されている。データ取得部５２は、受光部４４および受光部４６から出力されたアナログ信号を受け取り、このアナログ信号をＡＤ変換してデジタル信号として出力する。データ処理・判別部５４は、データ取得部５２から出力されたデジタル情報を処理して、例えば、各分析サンプル１２の染色具合（生細胞中の蛍光色素量の程度）を示す情報（染色量情報）を導出する。データ処理・判別部５４は、さらに、この染色量情報に基づいて、染色量情報に対応する分析サンプル１２が、不要生細胞または幹細胞のいずれであるか判別する。本実施形態では、上述のように、不要生細胞１２ｂに比べて、幹細胞１２ａは染色具合（生細胞中の蛍光色素量の程度）が低いので、比較的染色具合が低いことを表す染色量情報（例えば、染色量の表す値が所定の閾値以下など）に対応する分析サンプル１２を、幹細胞１２ａであると判別する。【００３２】
データ処理・判別部５４は、判別結果を、制御装置７０の印加タイミング制御部７２（タイミング制御部７２）に送信する。なお、分析ユニット５０には、ディスプレイやプリンタなど、図示しない出力装置が接続されており、データ処理部５４における解析結果を表示出力することが可能となっている。なお、本実施形態では、光情報から細胞の染色具合の程度を導出することで、幹細胞であるか不要生細胞であるかを判別していたが、本発明の生細胞の判別時に用いる、目的生細胞と不要生細胞との判別基準については、特に限定されない。本発明の生細胞の判別時に用いる、取得した蛍光情報などの光情報に施す処理の内容や、目的細胞を特定するためのアルゴリスムなどは、特に限定されない。【００３３】
電圧印加ユニット６０は、パルス電圧発生器６２と、フローセル３２の管壁にそれぞれ対向して設けられた、パルス電圧発生器６２の出力端子とそれぞれ接続された電極６４ａおよび６４ｂとを有して構成されている。パルス電圧発生器６２は、制御ユニット７０の印加タイミング制御部７２の制御の下、電極６４ａおよび６４ｂとの間にパルス電圧を印加する。パルス電圧発生器６２は、例えば１．０×１０−９（秒）〜１．０×１０−６（秒）程度のパルス幅でパルス電圧を出力することが可能な、公知のパルス電圧発生手段である。【００３４】
電極６４ａおよび電極６４ｂは、測定レーザ光の照射位置Ａ（図２参照）から、サンプル液流１７の流方向の下流側に十分離間した位置（例えば、１．０ｍｍ以上離間した位置）に配置されている。例えば、電極６４ａおよび電極６４ｂの中央部分に対応する電極位置Ｂ（図２参照）と測定レーザ光の照射位置Ａとは、予め設定された距離Ｄ（ｍ）だけ離間しているとし、サンプル液流１７の速度、すなわち分析サンプル１２の移動速度Ｖ（ｍ／秒）であるとしたとき、１つの分析サンプル１２は、測定レーザ光の照射を受けたタイミングからＴ＝Ｄ／Ｖ（秒）だけ経過したタイミングで、電極位置Ｂを通過することになる。分析ユニット５０では、光情報を取得してから、少なくともこのＴ（秒）経過するまでの間に、取得した光情報に対応する分析サンプルが、不要生細胞か幹細胞かを判別して、印加タイミング制御部７２に判別結果を送信する。【００３５】
印加タイミング制御部７２は、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取った場合、この不要生細胞１２ｂにパルス電圧が印加されるよう、パルス電圧発生器６２の動作を制御する。逆に、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取った場合、この幹細胞１２ａにはパルス電圧が印加されないよう、パルス電圧発生器６２の動作を制御する。【００３６】
具体的には、印加タイミング制御部７２は、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取ると、所定の時間範囲（対応する分析サンプル１２が、後述する有効電界領域Ｅを確実に通過する時間範囲）だけ、パルス電圧発生器６２に電圧を印加させる（すなわち、電極６４ａと電極６４ｂとの間にパルス電圧を印加させる）。また、印加タイミング制御部７２は、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取ると同時に、所定の時間範囲（対応する分析サンプル１２が、後述する有効電界領域Ｅを確実に通過する時間範囲）においては、パルス電圧発生器６２がパルス電圧を印加しないように制御する。【００３７】
上記所定の時間範囲は予め設定されていてもよく、例えば、印加タイミング制御部７２に上記Ｔ＝Ｄ／Ｖ（秒）の情報や、後述する有効電界領域Ｅ（図３を参照）の大きさの情報も設定されており、印加タイミング制御部７２が比較的高い処理能力を有する場合など、以下のようにしてパルス電圧の印加を制御すればよい。例えば、印加タイミング制御部７２は、送信された判別結果を受け取ったタイミングから、分析ユニット５０における各処理時間の影響を加味して、この判別結果に対応する分析サンプル１２（すなわち幹細胞１２ａ）が測定レーザ光の照射位置Ａを通過したタイミングを同定する。さらに、印加タイミング制御部７２は、幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取った場合は、少なくとも、この同定したタイミングからＴ＝Ｄ／Ｖ（秒）だけ経過したタイミング（すなわち、上記対応する分析サンプル１２が、電極位置Ｂを通過するタイミング）を同定する。さらに、有効電界領域Ｅの大きさに基いて、電極位置Ｂを通過するタイミングを含む所定の時間範囲（対応する１つの分析サンプル１２が、有効電界領域Ｅを通過している時間範囲）を求める。印加タイミング制御部７２は、幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取った場合は、少なくとも、この所定の時間範囲（対応する分析サンプル１２が、後述する有効電界領域Ｅを確実に通過する時間範囲）では、パルス電圧発生器６２がパルス電圧を印加しないように制御する。【００３８】
図３（ａ）および（ｂ）は、フローセル３２内を移動する不要生細胞１２ｂに対するパルス電圧の印加について説明する図であり、図２に示すフローセル３２の電極６４ａおよび６４ｂ近傍を拡大して示す図である。電極６４ａおよび６４ｂは、フローセル３２の管壁に固定されている。電極６４ａおよび６４ｂが、例えばシース流１５のシース液に接触すると、シース液やサンプル液が激しく電気分解を起こし、フローセル３２内の必要な生細胞（すなわち幹細胞１２ａ）まで損傷を与える可能性があるので、電極６４ａおよび電極６４ｂは、シース液やサンプル液に直接は接触せず、絶縁物を介して接触している。図３（ａ）および（ｂ）では、電極６４ａおよび６４ｂの一部がフローセル３２の管壁に埋め込まれる形で固定されており、例えば石英などの絶縁物であるフローセル３２の管壁の一部を、シース液と電極６４ａおよび６４ｂとの間に配置する構成としている。【００３９】
本実施形態では、図３（ａ）に示すように、パルス電圧を印加するための電極は、いわゆるダイポール構造となっており、対向する２つの電極６４ａおよび６４ｂで構成されている。パルス電圧発生器６２によって、電極６４ａおよび６４ｂとの間にパルス電圧が印加されると、電極６４ａおよび６４ｂとの間に電界が発生する。シース流１５のシース液およびサンプル液流１７のサンプル液はともに導電性を有し、フローセル３２内部には電界が生じる。例えば、電極６４ａがより高い電位、電極６４ｂがより低い電位となるよう、１．０×１０−９（秒）〜１．０×１０−６（秒）程度のパルス幅でパルス電圧が印加されたとすると、１．０×１０−９（秒）〜１．０×１０−６（秒）程度のパルス幅で、電極６４ａから電極６４ｂに向かう電気力線で表される電界（パルス電界）が発生する。【００４０】
例えば、図３（ａ）に示すダイポール構造の電極間に電界が印加された場合、生細胞を死細胞とするに十分な強度を有する有効電界領域Ｅは、電極位置Ｂを中心としたある程度の拡がりをもってフローセル３２内に形成される。有効電界領域Ｅは、１つの分析サンプル１２が、この有効電界領域Ｅを通過している最中に、外の分析サンプル１２が有効電界領域Ｅに存在しないよう、十分に小さく形成されている。例えば分析サンプル１２の移動速度、すなわちサンプル液流１７の流速を５．０（ｍ／秒）、１秒間に流す分析サンプル１２の数を５０００個とすると、サンプル液流１７中における分析サンプル１２間の距離は、平均で約１．０×１０−３（ｍ）となる。この場合、有効電界領域Ｅの、サンプル液の流方向に沿った方向の拡がりが１．０×１０−３（ｍ）より十分に小さくなるよう、電極６４ａおよび６４ｂの大きさや、印加電界の大きさが調整されている。なお、本発明では、有効電界領域Ｅの、サンプル液の流方向に沿った方向の拡がりを抑制するために、図３（ｂ）に示すように、パルス電圧を印加するための電極６４ａおよび６４ｂに加えて電界調整用電極６６ａおよび６６ｂを設けて、いわゆる多重電極構造としてもよい。【００４１】
フローセル３２内を移動する不要生細胞１２ｂに対して、十分大きな強度のパルス電界が作用すると、不要生細胞１２ｂは損傷を受けて死細胞となる。不要生細胞１２ｂにパルス電界が作用することで（すなわち、パルス電圧を印加することで）、不要生細胞１２ｂが死細胞となるには、主に２つの形態がある。第１の形態は、パルス幅が１．０×１０−６（秒）以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加することで、不要生細胞１２ｂの細胞膜８２に電界を集中させ、この細胞膜８２に修復不能な穴を生じさせることで、不要生細胞１２ｂを死細胞とする形態である。細胞膜８２に修復不能な穴が生じれば、細胞質８４は細胞外へ流れ出て、不要生細胞１２ｂは死に至る。また、第２の形態は、パルス幅が１．０×１０−６（秒）より短い、比較的狭いパルス幅のパルス電圧を印加することで、不要生細胞１２ｂの細胞核８８にも電界を作用させ（言い換えると、電界を進入させ）、細胞核８８に含まれるＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に損傷を与え、不要生細胞１２ｂを死細胞とする形態である。第２の形態によれば、例えば、ＤＮＡに元々プログラミングされているアポトーシスを引き起こし、不要生細胞１２ｂを死細胞とすることができる。この場合、不要生細胞１２ｂに対して、十分大きな強度のパルス電界が作用するので、パルス電界に対応したパルス電流が、不要生細胞１２内の特に細胞核８８に流れ、パルス電流によるジュール熱によってＤＮＡに損傷を与え、アポトーシスを引き起こす。【００４２】
一般的な細胞である不要生細胞１２ｂや幹細胞１２ａは、核質８８が核膜８６で包まれてなる核と細胞質８４とが、細胞膜８２に包まれた構造となっている。核質８８には、ＤＮＡが含まれる染色体が存在している。このような不要生細胞１２ｂを等価回路で表すと、細胞膜８２および核膜８８部分は、抵抗とキャパシタとで表現され、キャパシタの誘電率は比較的高い。すなわち、このような不要生細胞１２ｂの等価回路において、細胞膜８２および核膜８８部分は、主にキャパシタとして作用する。このような等価回路全体に印加されるパルス幅が大きい（すなわち印加電圧の周波数が低い）と、キャパシタは電荷を蓄積し、比較的大きな電圧が作用する。一方、パルス幅が小さい（すなわち印加電圧の周波数が高い）ほど、キャパシタには電荷は蓄積されず、等価回路全体に電圧が作用する。不要生細胞１２ｂの場合も同様であり、パルス幅が１．０×１０−６（秒）以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加すると、上記第１の形態のように、不要生細胞１２ｂの細胞膜８２に電界が集中する。逆に、パルス幅が１．０×１０−６（秒）より小さい、比較的狭いパルス幅のパルス電圧を印加すると、上記第２の形態のように、不要生細胞１２ｂの細胞核８８にも電界が作用する（言い換えると、電気エネルギーが進入する）。【００４３】
ここで、第１の形態のように、細胞膜８２に電界を集中させて穴を形成しても、電界が比較的小さい場合、細胞膜８２が有する自己修復機能によって、形成した穴は短時間で修復してしまう。すなわち、第１の形態のように細胞膜８２に穴を形成する場合、細胞膜８２に作用する電界が比較的小さいと、不要生細胞１２ｂを死細胞とすることができない。第１の形態のように細胞膜８２に穴を形成して不要生細胞１２ｂを死細胞とする場合、細胞の自己修復機能によって修復できない穴を形成する必要がある。このような穴を形成するには、細胞膜８２の組織を十分に破壊できる程度の、十分強い電界を印加することが必要である。本願発明では、パルス幅が１．０×１０−６（秒）以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加する場合、細胞膜８２に作用する電界は１ｋＶ／ｃｍ以上と十分強いことが好ましい。一般的なフローセルの直径は１００〜４００（μｍ）であり、パルス電圧を印加するための電極間距離も、同等の１００〜４００（μｍ）とすることができるので、パルス電圧のピーク値は、例えば１０（Ｖ）以上とすることが好ましい。なお、サンプル液やシース液にかかる電界があまりに強すぎると、衝撃波が生じたりサンプル液やシース液が突然沸騰したりして、フローセルが破壊されてしまう可能性もある。このような装置の損壊を防止するために、パルス電圧のピーク値は１０００（Ｖ）以下であることが好ましい。すなわち、本発明では、パルス幅が１．０×１０−６（秒）以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加する場合、パルス電圧のピーク値は、例えば１０（Ｖ）以上、１０００（Ｖ）以下にすることが好ましい。【００４４】
上述のように、第２の形態では、例えば、ＤＮＡに元々プログラミングされているアポトーシスを引き起こし、不要生細胞１２ｂを死細胞とする。アポトーシスとは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞の自殺のことをいう。このアポトーシスに対し、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死は、ネクロシス(necrosis)または壊死（えし）と呼ばれる。上記第１の形態のように、細胞膜に不可逆的に穴が形成されて起こる細胞の死は、このネクロシスにあたる。【００４５】
細胞にアポトーシスを生じさせるには、ＤＮＡに損傷を与えることが必要である。第２の形態では、パルス幅が１．０×１０−６（秒）より小さい、比較的狭いパルス幅のパルス電圧を印加することで、不要生細胞１２ｂの細胞核８８にも電界を作用させ（言い換えると、電界を進入させ）、細胞核８８に含まれるＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に損傷を与える。第２の形態では、細胞核８８になるべく大きな電界がかかるよう、言い換えると、不要生細胞１２ｂのなるべく深部にまで電気エネルギーが侵入するよう、パルス幅は、１．０×１０−７（秒）未満と、なるべく小さい方が好ましい。【００４６】
パルス電圧によって生細胞を損傷して死細胞とする本願発明では、例えば１．０×１０−９（秒）〜１．０×１０−６（秒）程度と、十分小さいパルス幅のパルス電圧の１つによって、１つの細胞を死細胞とすることができる。すなわち、１パルス毎に１つの細胞を死細胞とすることもできる。例えば、１．０×１０−９（秒）のパルス幅でパルス電圧を印加する場合、最大で、１秒間に１．０×１０９個もの細胞を、死細胞とすることができる。パルス電圧発生装置によってパルス電圧を連続して出力する際、パルス幅が短くなるほど、すなわち周波数が高くなるほど、１つ１つのパルス電圧は低めに抑えられる。上述のように、フローサイトメータ１０では、直径１００（μｍ）〜４００（μｍ）といった非常に細いフローセル３２の管壁に電極６４ａおよび６４ｂを設け、電極間距離１００（μｍ）〜４００（μｍ）と非常に近接した電極６４ａおよび６４ｂの間にパルス電圧を印加する。これにより、１つ１つのパルス電圧は低めに抑えられたとしても、電極間に発生する電界の強度は、細胞を死細胞とする程度に十分大きくすることができる。【００４７】
フローサイトメータ１０では、印加タイミング制御部７２が、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が不要生細胞１２ｂであるとの判別結果を受け取った場合、この不要生細胞１２ｂにパルス電圧が印加されるよう、パルス電圧発生器６２の動作を制御することで、サンプル群１２のうちの不要生細胞１２ｂは、確実に死亡細胞とされる。また、逆に、分析ユニット５０のデータ処理・判別部５４から、測定レーザ光に照射された分析サンプル１２が幹細胞１２ａであるとの判別結果を受け取った場合、この幹細胞１２ａにはパルス電圧が印加されないよう、パルス電圧発生器６２の動作を制御するので、サンプル群１２のうちの幹細胞１２ａは、損傷を一切受けることなく、確実に有効電界領域Ｅを通過する。【００４８】
有効電界領域Ｅを通過した分析サンプル１２は、回収容器８０内に落下する。例えば、生細胞は、一般的に、接触した物体に付着（着床）する性質を有している。このため、回収容器８０の壁面には、パルス電圧の印加によって死亡細胞１３となっていない分析サンプル１２、すなわち幹細胞１２ａのみが付着している状態となる。パルス電圧の印加によって死亡細胞１３となった細胞は、回収容器８０内のサンプル液に浮遊している状態となる。この浮遊状態の死亡細胞１３（不要生細胞１２ｂであったもの）を除去することで、回収容器８０内に目的生細胞である幹細胞１２ａのみを分離して、回収することができる。フローサイトメータ１０は、このような、回収容器８０の内壁面に付着せずサンプル液に浮遊する細胞を、死亡細胞１３として分別して回収し、回収容器８０内に目的生細胞である幹細胞１２ａのみを分離・回収する分離・回収機構を有していることが好ましい。【００４９】
また、回収容器８０中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施せば、サンプル液中の死亡細胞（不要生細胞１２ｂであったもの）は培養される（増殖する）ことなく、サンプル液中の生細胞のみが培養される（増殖する）。このように、サンプル群１１中の不要生細胞１２ｂを、パルス電圧によって確実に死亡細胞としているので、サンプル液に培養処理を施すことで、サンプル群１１中の幹細胞１２ａのみを分別して培養することができ、サンプル液中の死亡細胞１３の割合を減少させることができる。このような培養処理によって、ほとんど全ての細胞が幹細胞１２ａからなる細胞群を得ることができる。フローサイトメータ１０は、このような、回収容器８０中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施すことができる培養装置を有していることが好ましい。フローサイトメータ１０は、以上のような構成となっている。【００５０】
本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータによれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に不要生細胞を分別し、この不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることができる。また、本発明の生細胞分別処理方法の一態様によれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して回収することができる。また、本発明の生細胞分別処理方法の他の態様によれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して培養することができる。【００５１】
上記実施形態では、電極間にパルス電圧を印加することで、細胞にパルス電界を作用させて死細胞とした。本発明では、サンプル液流中の不要生細胞に対応する部分にパルス電界を発生させ、例えばサンプル液自体に電界を作用させてもよい。例えば、上記フローサイトメータ１０において、電極６４ａと６４ｂとの間に発生する電界強度を、１．０×１０３（Ｖ）〜１．０×１０４（Ｖ）と極端に大きくした場合、シース液やサンプル液内で放電が生じ、例えばサンプル液内に衝撃波が生じる。この衝撃波によって、不要生細胞１２ｂの細胞膜が破壊（付加逆破壊）されれば、不要生細胞１２ｂは死細胞となる。また、さらに極端に大きな電界がサンプル液に作用すると、サンプル液はプラズマ状態となって紫外線が発生する。この紫外線によって不要生細胞１２ｂの細胞核８８、さらにはＤＮＡにまで損傷を生じさせることもできる。本願発明では、このように、サンプル液自体にパルス電界を作用させることで、不要生細胞を死細胞としてもよい。【００５２】
以上、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ、および細胞分別処理方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良および変更を行ってもよいのはもちろんである。
【図１】
2008153056.tif 000003
【図２】
2008153056.tif 000004
【図３】
2008153056.tif 000005
【図４】
2008153056.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月25日(2009.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞分別処理方法であって、
複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群の各生細胞が一直線上に離間して、流速Ｖで単位時間当たりＮ個流れるサンプル液流を形成するステップと、
前記サンプル液流に測定光を照射するステップと、
前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得するステップと、
前記取得するステップによって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるかをそれぞれ判別するステップと、
前記判別するステップにおける判別結果に応じて、Ｖ／Ｎで定まる間隔よりも狭い領域にパルス電界を発生させることで、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とするステップと、を有し、
前記死細胞とするステップでは、前記パルス電界を発生させる電極の外側に設けられた電極により該パルス電界の拡がりを抑制することを特徴とする生細胞分別処理方法。
【請求項２】
前記サンプル液流は、管壁が絶縁物であるフローセル内に形成され、
前記死細胞とするステップでは、前記管壁に少なくとも一部が埋め込まれた電極により、前記パルス電界を発生させることを特徴とする請求項１記載の生細胞分裂処理方法。
【請求項３】
前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させ、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とする請求項１又は２に記載の生細胞分別処理方法。 
【請求項４】
前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核に電界がかかり、前記細胞核内部のＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)が損傷を受けるよう、パルス幅が設定されている請求項３記載の生細胞分別処理方法。 
【請求項５】
前記パルス幅は、１．０×１０−６(秒)より短い請求項４記載の生細胞分別処理方法。
【請求項６】
前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させて前記不要生細胞内にパルス電流を生じさせ、前記パルス電流によるジュール熱によって前記不要生細胞にアポトーシスを起こさせる請求項５に記載の生細胞分別処理方法。
【請求項７】
前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核と比較して前記不要生細胞の細胞膜により高い電界がかかり、前記細胞膜が不可逆破壊されるよう、パルス幅およびピーク電圧が設定されている請求項３記載の生細胞分別処理方法。 
【請求項８】
前記パルス幅は、１．０×１０−６(秒)と同等またはそれより長い請求項７記載の生細胞分別処理方法。 
【請求項９】
前記不要生細胞の細胞膜にかかる電界が１ｋＶ/ｃｍ以上であり、前記ピーク電圧は１０Ｖ以上である請求項８記載の生細胞分別処理方法。 
【請求項１０】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、
前記サンプル液中、前記回収容器の内壁面に付着した細胞を、前記目的生細胞として回収するとともに、前記回収容器の内壁面に付着せず前記サンプル液に浮遊する細胞を、前記死細胞として分別して回収するステップと、を有する請求項１〜９のいずれかに記載の生細胞分別処理方法。 
【請求項１１】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、
前記回収容器中の前記サンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、前記サンプル液中の前記目的生細胞のみを培養することで、前記サンプル液中の前記死細胞の割合を減少させるステップと、を有する請求項１〜９のいずれかに記載の生細胞分別処理方法。
【請求項１２】
細胞分別処理機能を有するフローサイトメータであって、
複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群の各生細胞が一直線上に離間して、流速Ｖで単位時間当たりＮ個流れるサンプル液流が内部を流れるフローセルと、
Ｖ／Ｎで定まる間隔よりも狭い領域にパルス電界を発生させる電界発生部と、
前記フローセル内の前記サンプル液流に測定光を照射する測定光照射部と、
前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得する光情報取得部と、
前記光情報取得手段によって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるか、をそれぞれ判別する生細胞判別部と、
前記生細胞判別手段における判別結果に応じ、前記電界発生部による前記パルス電界の発生タイミングを制御する制御部と、を有し、
前記電界発生部は、前記フローセル内の前記領域を挟むように配置された２つの電極と、前記２つの電極間にパルス電圧を印加するパルス電圧印加部と、前記２つの電極を挟むように配置された２つの電界調整用電極と、を有し、
前記制御部が、前記フローセル内の前記領域を前記不要生細胞が通過するタイミングで、前記電界発生部によって前記領域に前記電界を発生させて、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることを特徴とする、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ。
【請求項１３】
前記２つの電極の少なくとも一部は前記フローセルの管壁に埋め込まれ、該管壁は絶縁物であることを特徴とする請求項１２記載の細胞分裂処理機能を有するフローサイトメータ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群のうち、特定の生細胞に処理を行うフローサイトメータ、および、上記生細胞群から目的生細胞を分別して回収する生細胞分別処理方法に関する。 
【背景技術】
【０００２】
例えば癌などの研究における細胞や染色体の解析には、従来は顕微鏡が用いられていた。しかし、顕微鏡による解析では、大量のデータを集めて統計的に検討するのに、非常に多くの手間と時間を要していた。現在、多くの場合、細胞や染色体の解析には、短時間に多くのサンプル(細胞や染色体)を解析し、信頼性の高い統計データを得ることを可能とする、フローサイトメータが用いられている。フローサイトメータでは、抗体が蛍光染色された細胞などのサンプル粒子を含むサンプル液の流れであるサンプル液流を形成し、このサンプル液流にレーザ光を照射して、流れる大量のサンプル粒子の1つ1つから放出される蛍光や散乱光を測定し、信頼性の高い統計データを得ることができる。このようなフローサイトメータは、医療分野における研究などに広く利用されている。
【０００３】
ところで、今後の医療分野において大きな期待がかかっているのは、再生細胞ともいわれる幹細胞(stem cell)を用いた治療である。幹細胞とは、生体を構成する細胞の生理的な増殖・分化などの過程において、自己増殖能と、特定の機能を持つ細胞に分化する能力とをあわせ有する細胞である。すなわち、幹細胞は、自分自身が増える複製能力と、ほかの細胞になる能力を備えている細胞である。幹細胞には、胚から取り出される胚性幹細胞(ES細胞)、成人から取り出される成体幹細胞、胎児から取り出される胎児性幹細胞など、様々な種類がある。この幹細胞を、けがや病気で傷んだ臓器などの細胞に分化させることができれば、移植して修復に使えることから、再生医療の分野等で研究が盛んになっている。
【０００４】
胚性幹細胞や胎児性幹細胞などから幹細胞を取り出すには、胚を壊してしまう(殺してしまう)必要があるといった倫理的な問題を有している。このため、現在の再生医療に関する研究の多くは、生きている人(子どもまたは成人)から、その体を傷つけることなく幹細胞を採取することができる成体幹細胞に関するものとなっている。成体幹細胞の研究には、当然ながら、成体幹細胞が必要である。成体幹細胞は、骨髄や血液、目の角膜や網膜、肝臓、皮膚などで見つかるものであるが、見つかることは非常にまれであり、通常、採取した大量の細胞サンプルの中から、ごく微量しか見つけることはできない。例えば、骨髄間質の中には、骨、軟骨、脂肪、筋肉、腱、神経など多くの組織に分化できる間葉系幹細胞と呼ばれ細胞が存在しており、病気や外傷などによる組織欠損に対する再生医療において注目されている。しかしながらこの細胞は骨髄中には10万個に1個の割合でしか存在していない。そのため欠損組織の再生を行うためには一度体外で培養して細胞を増やす必要がある。そのためには、この骨髄中の複数の細胞の中から、ごく微量の幹細胞を分離・抽出する必要がある。大量の細胞サンプルの中から、なるべく短時間に、ごく微量の成体幹細胞を分離・抽出するために、現在、上記フローサイトメータを用いた細胞の分離・回収システム(セルソータ)が利用されている。
【０００５】
例えば、下記非特許文献1には、このようなセルソータの一例について記載されている。図4は、下記非特許文献1記載のセルソータ100について説明する概略構成図である。セルソータ100では、大量の細胞サンプル102を含んだサンプル液を、ノズル103からジェット流104として出射する。これら大量の細胞サンプル102には、わずかながら幹細胞が含まれており、大量の細胞サンプル102には、このような幹細胞を特徴づけるための蛍光ラベリングが施されている。セルソータ100は、このジェット流104に測定用のレーザ光106を照射して、大量の細胞サンプル102に対して順次レーザ光106を照射する。そして、光電子増倍管108および光電子増倍管110を有する図示しない評価手段によって、個々の細胞サンプル102から発せられる各種散乱光や蛍光の情報を取得する。そして、図示しない評価手段において、レーザ光106を照射した細胞サンプルが、幹細胞サンプルであるか否かを判定する(なお、下記非特許文献1では、幹細胞を多く含んだサンプル細胞の集団部分を特定している)。ここまでは、一般的なフローサイトメータの構成であるが、セルソータ100では、特定した細胞を分離(ソーティング)する機能を有している。セルソータ100では、例えば図示しない圧電素子等によってノズル103を高周波で振動させ、ジェット流104を強制的に液滴112とする。この液滴112を形成する際、幹細胞サンプルなどの特定の細胞サンプルが液滴に入った瞬間に、この特定液滴に対して、プラス(+)またはマイナス(-)(図示例ではプラス)の電荷をかける(チャージする)。
【０００６】
液滴112は、2枚の電場形成電極板114および116によって形成された水平方向の電場118の間を順次通過する。この際、チャージされた液滴112のみが、この水平方向の電場によって落下方向を変えて(偏向して)落下し、所望の試験管120に回収される。このようにして、幹細胞サンプルなどの特定の細胞サンプル102のみが、試験管120に回収される。チャージされなかったその他の細胞サンプル102は、鉛直に落下して、廃液受け122に回収される。
【０００７】
非特許文献 1: “超高速セルソータMoFloTMによる幹細胞の新しい分析・分離方法”、[online]、[平成19年2月19日検索]、インターネット
<URL:http://www.takara-bio.co.jp/goods/bioview/pdfs/42/42_15-16.pdf>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記非特許文献1のように、サンプル液をジェット流にするためには、ノズルの出口部分の直径を例えば25(μm)と著しく小さくする必要がある。上記非特許文献1の例では、直径が数(μm)~20(μm)程度の細胞が、この狭い出口部分を通過する際に物理的剪弾力を受けるので、必要である幹細胞までもが損傷を受けてしまう可能性が高かった。また、強制的に液滴とする際の高周波振動によっても、損傷を受けてしまう可能性があった。また、細胞サンプルが含まれる液滴をチャージして、しかも高電場をかけた場合、幹細胞などの必要な細胞にまで電気的な衝撃が加わり、この必要な細胞まで損傷を受けてしまうといった問題もあった。このようなセルソータを用いて幹細胞サンプルを分離して、所望の臓器などの細胞に分化させるとしても、分離した幹細胞サンプルが損傷を受けている場合、うまく分化しなかったり、あるいは不良細胞(例えば癌細胞)が発現してしまうなど、多様かつ危険な問題が発生する可能性を完全には排除できない。このため、細胞に損傷を与えることができないような慎重を要する研究分野では、依然としてこのような高速セルソータを用いることができなかった。
【０００９】
このように、細胞の取り扱いに慎重を要する分野では、例えば、上記セルソータ100の試験管120自体を、所定のタイミングで移動させることで、液滴112に含まれて落下する特定細胞サンプルを、分離・回収していた。しかし、試験管120自体の移動速度は、ジェット流104が液滴化された液滴112の落下速度に比べて著しく小さい速度しか達成できない。大量のサンプルを高速度に流した場合、大量の細胞サンプルに対して、ごくわずかな特定細胞サンプルしか取得することしかできない。また、試験管120の移動速度に応じて、サンプルの流速度を著しく低くした場合は、細胞の分離・抽出に多くの時間を要する。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題点に着目してなされたものであり、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、不要生細胞を分別して処理することを可能とする、生細胞分別処理機能を有するフローサイトメータを提供することを目的とする。また、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、目的生細胞のみを分別して回収することを可能とする、生細胞分別処理方法を提供することを目的とする。また、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、目的生細胞のみを分別して培養することを可能とする、生細胞分別処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記問題を解決するために、本発明は、生細胞分別処理方法であって、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群の各生細胞が一直線上に離間して、流速Ｖで単位時間当たりＮ個流れるサンプル液流を形成するステップと、前記サンプル液流に測定光を照射するステップと、前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得するステップと、前記取得するステップによって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるかをそれぞれ判別するステップと、前記判別するステップにおける判別結果に応じて、Ｖ／Ｎで定まる間隔よりも狭い領域にパルス電界を発生させることで、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とするステップと、を有し、前記死細胞とするステップでは、前記パルス電界を発生させる電極の外側に設けられた電極により該パルス電界の拡がりを抑制することを特徴とする生細胞分別処理方法を提供する。
また、前記サンプル液流は、管壁が絶縁物であるフローセル内に形成され、前記死細胞とするステップでは、前記管壁に少なくとも一部が埋め込まれた電極により、前記パルス電界を発生させることが好ましい。
【００１２】
その際、前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させ、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることが好ましい。さらに、その際、前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核に電界がかかり、前記細胞核内部のDNA(deoxyribonucleic acid)が損傷を受けるよう、パルス幅が設定されていることが好ましい。このとき、前記パルス幅は、1.0×10-6(秒)より短いことが好ましい。
その際、前記死細胞とするステップでは、前記不要生細胞にパルス電界を作用させて前記不要生細胞内にパルス電流を生じさせ、前記パルス電流によるジュール熱によって前記不要生細胞にアポトーシスを起こさせることが好ましい。
【００１３】
また、前記死細胞とするステップにおいて前記不要生細胞に作用させるパルス電界は、前記不要生細胞の細胞核と比較して前記不要生細胞の細胞膜により高い電界がかかり、前記細胞膜が不可逆破壊されるよう、パルス幅およびピーク電圧が設定されていることが好ましい。その際、前記パルス幅は、1.0×10-6(秒)と同等またはそれより長いことが好ましい。前記不要生細胞の細胞膜にかかる電界が1kV/cm以上であり、前記ピーク電圧は10V以上であることが好ましい。
【００１４】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、前記サンプル液中、前記回収容器の内壁面に付着した細胞を、前記目的生細胞として回収するとともに、前記回収容器の内壁面に付着せず前記サンプル液に浮遊する細胞を、前記死細胞として分別して回収するステップと、を有することが好ましい。
【００１５】
さらに、前記パルス電圧の印加によって損傷を受けた前記死細胞と前記目的生細胞とが含まれる、前記パルス電圧が印加された後の前記サンプル液を回収容器に回収するステップと、前記回収容器中の前記サンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、前記サンプル液中の前記目的生細胞のみを培養することで、前記サンプル液中の前記死細胞の割合を減少させるステップと、を有することが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータであって、複数の不要生細胞と複数の目的生細胞とが混合してなる生細胞群の各生細胞が一直線上に離間して、流速Ｖで単位時間当たりＮ個流れるサンプル液流が内部を流れるフローセルと、Ｖ／Ｎで定まる間隔よりも狭い領域にパルス電界を発生させる電界発生部と、前記フローセル内の前記サンプル液流に測定光を照射する測定光照射部と、前記測定光の照射を受けて、前記サンプル液流の各生細胞それぞれから発する、散乱光および蛍光の少なくともいずれか一方の光情報それぞれを取得する光情報取得部と、前記光情報取得手段によって取得された光情報に基づき、各光情報に対応する前記生細胞が、前記不要生細胞または前記目的生細胞のいずれであるか、をそれぞれ判別する生細胞判別部と、前記生細胞判別手段における判別結果に応じ、前記電界発生部による前記パルス電界の発生タイミングを制御する制御部と、を有し、前記電界発生部は、前記フローセル内の前記領域を挟むように配置された２つの電極と、前記２つの電極間にパルス電圧を印加するパルス電圧印加部と、前記２つの電極を挟むように配置された２つの電界調整用電極と、を有し、前記制御部が、前記フローセル内の前記領域を前記不要生細胞が通過するタイミングで、前記電界発生部によって前記領域に前記電界を発生させて、前記不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることを特徴とする、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータを提供する。
【００１７】
また、前記２つの電極の少なくとも一部は前記フローセルの管壁に埋め込まれ、該管壁は絶縁物であることを特徴とする請求項１２記載の細胞分裂処理機能を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータは、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に不要生細胞を分別し、この不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることができる。また、本発明の生細胞分別処理方法では、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して回収することができる。また、本発明の生細胞分別処理方法では、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例について説明する概略斜視図である。
【図２】図1に示すフローサイトメータの光学ユニットおよび電圧印加ユニットの構成および動作についてより詳細に説明する、概略側面図である。
【図３】(a)および(b)は、図1に示すフローサイトメータのフローセルに設けられた電極およびその近傍を拡大して示す概略側面図である。
【図４】従来の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例である、セルソータについて説明する概略構成図である。
【符号の説明】
【００２０】
10 フローサイトメータ
11 生細胞群
12 分析サンプル
12a 幹細胞
12b 不要生細胞
13 死亡細胞
15 シース流
17 サンプル液流
20 液流形成ユニット
22 液体供給装置
25 分析サンプル液タンク
27 シース液タンク
32 フローセル
34 外部管路
36 サンプル液流管
40 光学ユニット
42 測定レーザ光照射部
44、46 受光部
50 分析ユニット
52 データ取得部
54 データ処理・判別部
60 電圧印加ユニット
62 パルス電圧発生器
64a、64b 電極
70 制御装置
72 印加タイミング制御部
82 細胞膜
84 細胞質
86 核膜
88 核質
100 セルソータ
102 細胞サンプル
103 ノズル
104 ジェット流
106 レーザ光
108、110 光電子増倍管
112 液滴
114、116 電場形成電極板
120 試験管 
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ、および細胞分別処理方法について、添付の図面に示される好適実施例を基に詳細に説明する。図1は、本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータの一例である、フローサイトメータ10について説明する概略斜視図である。
【００２２】
フローサイトメータ10は、液流形成ユニット20、光学ユニット40、分析ユニット50、電圧印加ユニット60、各部の動作シーケンスを制御する制御装置70、回収容器80とを有して構成されている。フローサイトメータ10は、大量の不要生細胞(幹細胞以外の細胞)に、目的生細胞である幹細胞がごく僅かだけ含まれる生細胞群について、各細胞毎に幹細胞であるか否かを判別し、幹細胞でない(すなわち不要生細胞)と判別された生細胞に対してのみパルス電圧を印加し、不要生細胞に損傷を与えて死細胞とする装置である。フローサイトメータ10は、また、パルス電圧が印加された後の、死細胞と幹細胞とが含まれるサンプル液を回収するための回収容器80を備えており、回収容器80の内壁面に付着せずサンプル液に浮遊する細胞を、死細胞として分別して回収する機能や、回収容器80中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施し、サンプル液中の幹細胞のみを分別して培養することで、サンプル液中の死細胞の割合を減少させる機能も有する。
【００２３】
フローサイトメータ10は、例えば、ヒトの骨髄から抽出した生細胞群など、大量の生細胞の中に、ごく少ない割合ながら幹細胞を含んだ(含む可能性が高い)生細胞群から、幹細胞を分別する、いわゆるソーティング機能を有する装置(ソーティングシステム)である。本実施形態では、このように、フローサイトメータ10を用いて、例えば、ヒトの骨髄から抽出した生細胞群など、大量の生細胞の中に、ごく少ない割合ながら幹細胞を含んだ(含む可能性が高い)生細胞群から、幹細胞を分別し、各種の処理を施す。なお、本発明における目的生細胞は、幹細胞であることに限定されない。
【００２４】
上述したように、ヒトの骨髄の中には、間葉系幹細胞と呼ばれ細胞が、10万個に1個の割合でしか存在していない。フローサイトメータ10を用いて行なう細胞分別処理においては、このような生細胞群に対して、予め、蛍光色素を用いて一様に染色処理(蛍光ラベル)を施すことで、幹細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付けておく。幹細胞は、いわゆるMDR(Multi Drug Resistance)の働きで、細胞内に取り込んだ色素を吐き出す性質をもっている。特定の蛍光色素を用い、所定の条件で生細胞群を染色処理した場合、このMDRの機能によって、幹細胞についてはほとんど染色されない(色素を吐き出した)状態となる。フローサイトメータ10で行う細胞分別処理には、このように、細胞における蛍光色素の染色状態の違いによって、幹細胞12aとその他の不要生細胞12bとを識別可能に特徴付けた生細胞群11を用いる。生細胞群11において、各細胞が、それぞれ幹細胞12aであるか不要生細胞12bであるかについては、生細胞群11をフローサイトメータ10に導入する時点では不明であることは言うまでもない。本明細書では、幹細胞12aと不要生細胞12bとを、(特に、幹細胞であるか不要生細胞であるか不明である状態において)共に分析サンプル12として記載する。なお、本実施形態では、幹細胞の有するMDR機能を利用して、幹細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付けているが、本発明において、蛍光色素によって目的細胞とその他の不要生細胞とを識別可能に特徴付ける手法は、特に限定されない。
【００２５】
液流形成ユニット20は、液体供給装置22と、流管部30とを有して構成されている。液体供給装置22と流管部30は、配管24によって接続されている。液体供給装置22内には、分析サンプル液を貯溜しておく分析サンプル液タンク25、シース液を貯溜しておくシース液タンク27とを有している。流管部30は、サンプル液がシース液に囲まれて内部を流れるフローセル32と、フローセル32にシース液を供給するフローセル32と連続した外部管路34と、外部管路34の内部に設けられて、フローセル32にサンプル液を供給するサンプル液流管36とを有している。液体供給装置22のサンプル液タンク25はサンプル液流管36に、シース液タンク27は外部管路34に、配管24を介してそれぞれ接続されている。フローセル32の出口には、回収容器80が設けられている。
【００２６】
この液体供給装置22は、図示しないエアポンプを各タンク毎に備えている。フローサイトメータ10では、シース液タンク27内部を図示しないエアポンプによって加圧することで外部管路34内部にシース液を供給し、外部管路34およびフローセル32内を図1中上側から下側に向けて流れるシース流15(図2参照)を形成する。そして、サンプル液タンク25を図示しないエアポンプによって加圧することで、サンプル液流管36の内部にサンプル液を供給し、サンプル液流管36の図中下側の開口端である吐出口38から、シース流15の中にサンプル液を吐出する。
【００２７】
フローセル32では、サンプル液は、シース流15中に吐出された段階で流体力学的絞り込みが生じ、シース流15に囲まれたサンプル液の流れは非常に細くなり、分析サンプル12それぞれが流れの方向に離間して1列に並んだ、サンプル液流17を形成する。本実施形態のフローサイトメータ10では、サンプル液流などの分析サンプル12それぞれが、ほぼ均等に所定の間隔(例えば10μm)だけ離間して流れるように、液体供給装置22などの動作(エアポンプの圧力など)が調整されている。すなわち、フローセル32では、分析サンプル12は1列となり、1個ずつ順番に所定の速さV(m/秒)でフローセル32中を流れる。このフローセル32には、光学ユニット40の測定レーザ光照射部42によってレーザ光が照射されており、このレーザ光を横切るようにして分析サンプル12は1個づつ順番に流れる。
【００２８】
光学ユニット40は、フローセル32にむけて測定用のレーザ光を照射する測定レーザ光照射部42と、フローセル32を流れる(サンプル液流17に含まれて流れる)分析サンプル12による散乱光を受光し、受光した散乱光に応じた信号を出力する受光部44と、フローセル32を流れる分析サンプル12から発光した蛍光を受光し、受光した蛍光に応じた信号を出力する受光部46と、を有している。受光部44および46は分析ユニット50に接続されており、出力された光信号は分析ユニット50に送られる。
【００２９】
図2は、光学ユニット40および電圧印加ユニット60の構成および動作についてより詳細に説明する、概略側面図である。測定レーザ光照射部42は、フローセル32を流れるサンプル液流17に向けて特定波長のレーザ光を出射する測定レーザ光照射部42と、測定レーザ光照射部42から出射された測定用レーザ光を整形してフローセル32内のサンプル液流17に導く、レンズなどからなるレーザ光整形・調整部64とを備えて構成されている。測定レーザ光照射部42は、図示しないレーザ電源に接続されており、制御装置10の制御の下、フローセル32内を流れる、分析サンプル12が1列に並んだサンプル液流17に向けて、測定用レーザ光を連続的に出射する。測定レーザ光照射部42から出射される測定用レーザ光は、分析サンプル12に付着された(特に不要生細胞12b内に取り込まれて付着している)蛍光色素を励起させて特定波長範囲の蛍光を発生させる、特定波長のレーザ光である。測定レーザ光照射部42としては、固体レーザや半導体レーザなどの、周知のレーザ装置を用いればよい。
【００３０】
受光部44は、フローセル32を挟んで測定レーザ光照射部42と対向するように配置されており、フローセル32を通過する分析サンプル12によるレーザ光の前方散乱光を連続して受光し、受光した前方散乱光の強度に応じたアナログ電気信号を出力する。一方、受光部46は、レーザ光照射部42から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ、外部管路30中の分析サンプル12の移動方向に対して垂直方向に配置されており、レーザ光を受けて分析サンプル12から発せられた蛍光を受光して、受光した蛍光の強度に応じたアナログ電気信号を出力する。受光部44および受光部46における光検出およびアナログ電気信号の出力には、例えばPMT(photomultiplier tube)を用いればよい。
【００３１】
分析ユニット50は、データ取得部52と、データ処理・判別部54とを有して構成されている。データ取得部52は、受光部44および受光部46から出力されたアナログ信号を受け取り、このアナログ信号をAD変換してデジタル信号として出力する。データ処理・判別部54は、データ取得部52から出力されたデジタル情報を処理して、例えば、各分析サンプル12の染色具合(生細胞中の蛍光色素量の程度)を示す情報(染色量情報)を導出する。データ処理・判別部54は、さらに、この染色量情報に基づいて、染色量情報に対応する分析サンプル12が、不要生細胞または幹細胞のいずれであるか判別する。本実施形態では、上述のように、不要生細胞12bに比べて、幹細胞12aは染色具合(生細胞中の蛍光色素量の程度)が低いので、比較的染色具合が低いことを表す染色量情報(例えば、染色量の表す値が所定の閾値以下など)に対応する分析サンプル12を、幹細胞12aであると判別する。
【００３２】
データ処理・判別部54は、判別結果を、制御装置70の印加タイミング制御部72(タイミング制御部72)に送信する。なお、分析ユニット50には、ディスプレイやプリンタなど、図示しない出力装置が接続されており、データ処理部54における解析結果を表示出力することが可能となっている。なお、本実施形態では、光情報から細胞の染色具合の程度を導出することで、幹細胞であるか不要生細胞であるかを判別していたが、本発明の生細胞の判別時に用いる、目的生細胞と不要生細胞との判別基準については、特に限定されない。本発明の生細胞の判別時に用いる、取得した蛍光情報などの光情報に施す処理の内容や、目的細胞を特定するためのアルゴリスムなどは、特に限定されない。
【００３３】
電圧印加ユニット60は、パルス電圧発生器62と、フローセル32の管壁にそれぞれ対向して設けられた、パルス電圧発生器62の出力端子とそれぞれ接続された電極64aおよび64bとを有して構成されている。パルス電圧発生器62は、制御ユニット70の印加タイミング制御部72の制御の下、電極64aおよび64bとの間にパルス電圧を印加する。パルス電圧発生器62は、例えば1.0×10-9(秒)~1.0×10-6(秒)程度のパルス幅でパルス電圧を出力することが可能な、公知のパルス電圧発生手段である。
【００３４】
電極64aおよび電極64bは、測定レーザ光の照射位置A(図2参照)から、サンプル液流17の流方向の下流側に十分離間した位置(例えば、1.0mm以上離間した位置)に配置されている。例えば、電極64aおよび電極64bの中央部分に対応する電極位置B(図2参照)と測定レーザ光の照射位置Aとは、予め設定された距離D(m)だけ離間しているとし、サンプル液流17の速度、すなわち分析サンプル12の移動速度V(m/秒)であるとしたとき、1つの分析サンプル12は、測定レーザ光の照射を受けたタイミングからT=D/V(秒)だけ経過したタイミングで、電極位置Bを通過することになる。分析ユニット50では、光情報を取得してから、少なくともこのT(秒)経過するまでの間に、取得した光情報に対応する分析サンプルが、不要生細胞か幹細胞かを判別して、印加タイミング制御部72に判別結果を送信する。
【００３５】
印加タイミング制御部72は、分析ユニット50のデータ処理・判別部54から、測定レーザ光に照射された分析サンプル12が不要生細胞12bであるとの判別結果を受け取った場合、この不要生細胞12bにパルス電圧が印加されるよう、パルス電圧発生器62の動作を制御する。逆に、分析ユニット50のデータ処理・判別部54から、測定レーザ光に照射された分析サンプル12が幹細胞12aであるとの判別結果を受け取った場合、この幹細胞12aにはパルス電圧が印加されないよう、パルス電圧発生器62の動作を制御する。
【００３６】
具体的には、印加タイミング制御部72は、分析ユニット50のデータ処理・判別部54から、測定レーザ光に照射された分析サンプル12が不要生細胞12bであるとの判別結果を受け取ると、所定の時間範囲(対応する分析サンプル12が、後述する有効電界領域Eを確実に通過する時間範囲)だけ、パルス電圧発生器62に電圧を印加させる(すなわち、電極64aと電極64bとの間にパルス電圧を印加させる)。また、印加タイミング制御部72は、分析ユニット50のデータ処理・判別部54から、測定レーザ光に照射された分析サンプル12が幹細胞12aであるとの判別結果を受け取ると同時に、所定の時間範囲(対応する分析サンプル12が、後述する有効電界領域Eを確実に通過する時間範囲)においては、パルス電圧発生器62がパルス電圧を印加しないように制御する。
【００３７】
上記所定の時間範囲は予め設定されていてもよく、例えば、印加タイミング制御部72に上記T=D/V(秒)の情報や、後述する有効電界領域E(図3を参照)の大きさの情報も設定されており、印加タイミング制御部72が比較的高い処理能力を有する場合など、以下のようにしてパルス電圧の印加を制御すればよい。例えば、印加タイミング制御部72は、送信された判別結果を受け取ったタイミングから、分析ユニット50における各処理時間の影響を加味して、この判別結果に対応する分析サンプル12(すなわち幹細胞12a)が測定レーザ光の照射位置Aを通過したタイミングを同定する。さらに、印加タイミング制御部72は、幹細胞12aであるとの判別結果を受け取った場合は、少なくとも、この同定したタイミングからT=D/V(秒)だけ経過したタイミング(すなわち、上記対応する分析サンプル12が、電極位置Bを通過するタイミング)を同定する。さらに、有効電界領域Eの大きさに基いて、電極位置Bを通過するタイミングを含む所定の時間範囲(対応する1つの分析サンプル12が、有効電界領域Eを通過している時間範囲)を求める。印加タイミング制御部72は、幹細胞12aであるとの判別結果を受け取った場合は、少なくとも、この所定の時間範囲(対応する分析サンプル12が、後述する有効電界領域Eを確実に通過する時間範囲)では、パルス電圧発生器62がパルス電圧を印加しないように制御する。
【００３８】
図3(a)および(b)は、フローセル32内を移動する不要生細胞12bに対するパルス電圧の印加について説明する図であり、図2に示すフローセル32の電極64aおよび64b近傍を拡大して示す図である。電極64aおよび64bは、フローセル32の管壁に固定されている。電極64aおよび64bが、例えばシース流15のシース液に接触すると、シース液やサンプル液が激しく電気分解を起こし、フローセル32内の必要な生細胞(すなわち幹細胞12a)まで損傷を与える可能性があるので、電極64aおよび電極64bは、シース液やサンプル液に直接は接触せず、絶縁物を介して接触している。図3(a)および(b)では、電極64aおよび64bの一部がフローセル32の管壁に埋め込まれる形で固定されており、例えば石英などの絶縁物であるフローセル32の管壁の一部を、シース液と電極64aおよび64bとの間に配置する構成としている。
【００３９】
本実施形態では、図3(a)に示すように、パルス電圧を印加するための電極は、いわゆるダイポール構造となっており、対向する2つの電極64aおよび64bで構成されている。パルス電圧発生器62によって、電極64aおよび64bとの間にパルス電圧が印加されると、電極64aおよび64bとの間に電界が発生する。シース流15のシース液およびサンプル液流17のサンプル液はともに導電性を有し、フローセル32内部には電界が生じる。例えば、電極64aがより高い電位、電極64bがより低い電位となるよう、1.0×10-9(秒)~1.0×10-6(秒)程度のパルス幅でパルス電圧が印加されたとすると、1.0×10-9(秒)~1.0×10-6(秒)程度のパルス幅で、電極64aから電極64bに向かう電気力線で表される電界(パルス電界)が発生する。
【００４０】
例えば、図3(a)に示すダイポール構造の電極間に電界が印加された場合、生細胞を死細胞とするに十分な強度を有する有効電界領域Eは、電極位置Bを中心としたある程度の拡がりをもってフローセル32内に形成される。有効電界領域Eは、1つの分析サンプル12が、この有効電界領域Eを通過している最中に、外の分析サンプル12が有効電界領域Eに存在しないよう、十分に小さく形成されている。例えば分析サンプル12の移動速度、すなわちサンプル液流17の流速を5.0(m/秒)、1秒間に流す分析サンプル12の数を5000個とすると、サンプル液流17中における分析サンプル12間の距離は、平均で約1.0×10-3(m)となる。この場合、有効電界領域Eの、サンプル液の流方向に沿った方向の拡がりが1.0×10-3(m)より十分に小さくなるよう、電極64aおよび64bの大きさや、印加電界の大きさが調整されている。なお、本発明では、有効電界領域Eの、サンプル液の流方向に沿った方向の拡がりを抑制するために、図3(b)に示すように、パルス電圧を印加するための電極64aおよび64bに加えて電界調整用電極66aおよび66bを設けて、いわゆる多重電極構造としてもよい。
【００４１】
フローセル32内を移動する不要生細胞12bに対して、十分大きな強度のパルス電界が作用すると、不要生細胞12bは損傷を受けて死細胞となる。不要生細胞12bにパルス電界が作用することで(すなわち、パルス電圧を印加することで)、不要生細胞12bが死細胞となるには、主に2つの形態がある。第1の形態は、パルス幅が1.0×10-6(秒)以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加することで、不要生細胞12bの細胞膜82に電界を集中させ、この細胞膜82に修復不能な穴を生じさせることで、不要生細胞12bを死細胞とする形態である。細胞膜82に修復不能な穴が生じれば、細胞質84は細胞外へ流れ出て、不要生細胞12bは死に至る。また、第2の形態は、パルス幅が1.0×10-6(秒)より短い、比較的狭いパルス幅のパルス電圧を印加することで、不要生細胞12bの細胞核88にも電界を作用させ(言い換えると、電界を進入させ)、細胞核88に含まれるDNA(deoxyribonucleic acid)に損傷を与え、不要生細胞12bを死細胞とする形態である。第2の形態によれば、例えば、DNAに元々プログラミングされているアポトーシスを引き起こし、不要生細胞12bを死細胞とすることができる。この場合、不要生細胞12bに対して、十分大きな強度のパルス電界が作用するので、パルス電界に対応したパルス電流が、不要生細胞12内の特に細胞核88に流れ、パルス電流によるジュール熱によってDNAに損傷を与え、アポトーシスを引き起こす。
【００４２】
一般的な細胞である不要生細胞12bや幹細胞12aは、核質88が核膜86で包まれてなる核と細胞質84とが、細胞膜82に包まれた構造となっている。核質88には、DNAが含まれる染色体が存在している。このような不要生細胞12bを等価回路で表すと、細胞膜82および核膜88部分は、抵抗とキャパシタとで表現され、キャパシタの誘電率は比較的高い。すなわち、このような不要生細胞12bの等価回路において、細胞膜82および核膜88部分は、主にキャパシタとして作用する。このような等価回路全体に印加されるパルス幅が大きい(すなわち印加電圧の周波数が低い)と、キャパシタは電荷を蓄積し、比較的大きな電圧が作用する。一方、パルス幅が小さい(すなわち印加電圧の周波数が高い)ほど、キャパシタには電荷は蓄積されず、等価回路全体に電圧が作用する。不要生細胞12bの場合も同様であり、パルス幅が1.0×10-6(秒)以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加すると、上記第1の形態のように、不要生細胞12bの細胞膜82に電界が集中する。逆に、パルス幅が1.0×10-6(秒)より小さい、比較的狭いパルス幅のパルス電圧を印加すると、上記第2の形態のように、不要生細胞12bの細胞核88にも電界が作用する(言い換えると、電気エネルギーが進入する)。
【００４３】
ここで、第1の形態のように、細胞膜82に電界を集中させて穴を形成しても、電界が比較的小さい場合、細胞膜82が有する自己修復機能によって、形成した穴は短時間で修復してしまう。すなわち、第1の形態のように細胞膜82に穴を形成する場合、細胞膜82に作用する電界が比較的小さいと、不要生細胞12bを死細胞とすることができない。第1の形態のように細胞膜82に穴を形成して不要生細胞12bを死細胞とする場合、細胞の自己修復機能によって修復できない穴を形成する必要がある。このような穴を形成するには、細胞膜82の組織を十分に破壊できる程度の、十分強い電界を印加することが必要である。本願発明では、パルス幅が1.0×10-6(秒)以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加する場合、細胞膜82に作用する電界は1kV/cm以上と十分強いことが好ましい。一般的なフローセルの直径は100~400(μm)であり、パルス電圧を印加するための電極間距離も、同等の100~400(μm)とすることができるので、パルス電圧のピーク値は、例えば10(V)以上とすることが好ましい。なお、サンプル液やシース液にかかる電界があまりに強すぎると、衝撃波が生じたりサンプル液やシース液が突然沸騰したりして、フローセルが破壊されてしまう可能性もある。このような装置の損壊を防止するために、パルス電圧のピーク値は1000(V)以下であることが好ましい。すなわち、本発明では、パルス幅が1.0×10-6(秒)以上と、比較的広いパルス幅のパルス電圧を印加する場合、パルス電圧のピーク値は、例えば10(V)以上、1000(V)以下にすることが好ましい。
【００４４】
上述のように、第2の形態では、例えば、DNAに元々プログラミングされているアポトーシスを引き起こし、不要生細胞12bを死細胞とする。アポトーシスとは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞の自殺のことをいう。このアポトーシスに対し、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死は、ネクロシス(necrosis)または壊死(えし)と呼ばれる。上記第1の形態のように、細胞膜に不可逆的に穴が形成されて起こる細胞の死は、このネクロシスにあたる。
【００４５】
細胞にアポトーシスを生じさせるには、DNAに損傷を与えることが必要である。第2の形態では、パルス幅が1.0×10-6(秒)より小さい、比較的狭いパルス幅のパルス電圧を印加することで、不要生細胞12bの細胞核88にも電界を作用させ(言い換えると、電界を進入させ)、細胞核88に含まれるDNA(deoxyribonucleic acid)に損傷を与える。第2の形態では、細胞核88になるべく大きな電界がかかるよう、言い換えると、不要生細胞12bのなるべく深部にまで電気エネルギーが侵入するよう、パルス幅は、1.0×10-7(秒)未満と、なるべく小さい方が好ましい。
【００４６】
パルス電圧によって生細胞を損傷して死細胞とする本願発明では、例えば1.0×10-9(秒)~1.0×10-6(秒)程度と、十分小さいパルス幅のパルス電圧の1つによって、1つの細胞を死細胞とすることができる。すなわち、1パルス毎に1つの細胞を死細胞とすることもできる。例えば、1.0×10-9(秒)のパルス幅でパルス電圧を印加する場合、最大で、1秒間に1.0×109個もの細胞を、死細胞とすることができる。パルス電圧発生装置によってパルス電圧を連続して出力する際、パルス幅が短くなるほど、すなわち周波数が高くなるほど、1つ1つのパルス電圧は低めに抑えられる。上述のように、フローサイトメータ10では、直径100(μm)~400(μm)といった非常に細いフローセル32の管壁に電極64aおよび64bを設け、電極間距離100(μm)~400(μm)と非常に近接した電極64aおよび64bの間にパルス電圧を印加する。これにより、1つ1つのパルス電圧は低めに抑えられたとしても、電極間に発生する電界の強度は、細胞を死細胞とする程度に十分大きくすることができる。
【００４７】
フローサイトメータ10では、印加タイミング制御部72が、分析ユニット50のデータ処理・判別部54から、測定レーザ光に照射された分析サンプル12が不要生細胞12bであるとの判別結果を受け取った場合、この不要生細胞12bにパルス電圧が印加されるよう、パルス電圧発生器62の動作を制御することで、サンプル群12のうちの不要生細胞12bは、確実に死亡細胞とされる。また、逆に、分析ユニット50のデータ処理・判別部54から、測定レーザ光に照射された分析サンプル12が幹細胞12aであるとの判別結果を受け取った場合、この幹細胞12aにはパルス電圧が印加されないよう、パルス電圧発生器62の動作を制御するので、サンプル群12のうちの幹細胞12aは、損傷を一切受けることなく、確実に有効電界領域Eを通過する。
【００４８】
有効電界領域Eを通過した分析サンプル12は、回収容器80内に落下する。例えば、生細胞は、一般的に、接触した物体に付着(着床)する性質を有している。このため、回収容器80の壁面には、パルス電圧の印加によって死亡細胞13となっていない分析サンプル12、すなわち幹細胞12aのみが付着している状態となる。パルス電圧の印加によって死亡細胞13となった細胞は、回収容器80内のサンプル液に浮遊している状態となる。この浮遊状態の死亡細胞13(不要生細胞12bであったもの)を除去することで、回収容器80内に目的生細胞である幹細胞12aのみを分離して、回収することができる。フローサイトメータ10は、このような、回収容器80の内壁面に付着せずサンプル液に浮遊する細胞を、死亡細胞13として分別して回収し、回収容器80内に目的生細胞である幹細胞12aのみを分離・回収する分離・回収機構を有していることが好ましい。
【００４９】
また、回収容器80中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施せば、サンプル液中の死亡細胞(不要生細胞12bであったもの)は培養される(増殖する)ことなく、サンプル液中の生細胞のみが培養される(増殖する)。このように、サンプル群11中の不要生細胞12bを、パルス電圧によって確実に死亡細胞としているので、サンプル液に培養処理を施すことで、サンプル群11中の幹細胞12aのみを分別して培養することができ、サンプル液中の死亡細胞13の割合を減少させることができる。このような培養処理によって、ほとんど全ての細胞が幹細胞12aからなる細胞群を得ることができる。フローサイトメータ10は、このような、回収容器80中のサンプル液に対して生細胞を培養可能な培養処理を施すことができる培養装置を有していることが好ましい。フローサイトメータ10は、以上のような構成となっている。
【００５０】
本発明の細胞分別処理機能を有するフローサイトメータによれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に不要生細胞を分別し、この不要生細胞に損傷を与えて死細胞とすることができる。また、本発明の生細胞分別処理方法の一態様によれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して回収することができる。また、本発明の生細胞分別処理方法の他の態様によれば、目的とする生細胞には一切の損傷を与えることなく、大量の生細胞が含まれる生細胞群から、短時間かつ高精度に、目的生細胞を分別して培養することができる。
【００５１】
上記実施形態では、電極間にパルス電圧を印加することで、細胞にパルス電界を作用させて死細胞とした。本発明では、サンプル液流中の不要生細胞に対応する部分にパルス電界を発生させ、例えばサンプル液自体に電界を作用させてもよい。例えば、上記フローサイトメータ10において、電極64aと64bとの間に発生する電界強度を、1.0×103(V)~1.0×104(V)と極端に大きくした場合、シース液やサンプル液内で放電が生じ、例えばサンプル液内に衝撃波が生じる。この衝撃波によって、不要生細胞12bの細胞膜が破壊(付加逆破壊)されれば、不要生細胞12bは死細胞となる。また、さらに極端に大きな電界がサンプル液に作用すると、サンプル液はプラズマ状態となって紫外線が発生する。この紫外線によって不要生細胞12bの細胞核88、さらにはDNAにまで損傷を生じさせることもできる。本願発明では、このように、サンプル液自体にパルス電界を作用させることで、不要生細胞を死細胞としてもよい。
【００５２】
以上、細胞分別処理機能を有するフローサイトメータ、および細胞分別処理方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良および変更を行ってもよいのはもちろんである。
【国際調査報告】
2008153056.tif 000007
2008153056.tif 000008
2008153056.tif 000009