(57)【要約】生体分子を信頼性を確保したまま網羅的に分離分析するために、生化学サンプルの前処理を省略することができ、且つ、分離能をできるだけ高くすると同時に検出感度を高くできる分離溶媒及び分離方法を開発すること。本発明は、チアジアゾールを含む溶媒に生体分子を可溶化するステップを含むことを特徴とする生体分子の分離分析方法と、チアジアゾールを含むことを特徴とする生体分子の分離分析用液体組成物と、該分離分析用液体組成物を含む生体分子分離分析用キットとを提供する。本発明の生体分子の分離分析方法は、前記溶媒に可溶化された生体分子を電気泳動法で分離するステップを含む場合がある。本発明の生体分子の分離分析方法は、前記溶媒に可溶化された生体分子をクロマトグラフィー法で分離するステップを含む場合がある。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアジアゾールを含む溶媒に生体分子を可溶化するステップを含むことを特徴とする生体分子の分離分析方法。
【請求項２】
前記溶媒に可溶化された生体分子を電気泳動法で分離するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の分離分析方法。
【請求項３】
前記電気泳動法はキャピラリー電気泳動法であることを特徴とする請求項２に記載の分離分析方法。
【請求項４】
前記電気泳動法で分離された生体分子を固体支持体に不動化させるステップを含むことを特徴とする請求項２又は３に記載の分離分析方法。
【請求項５】
前記溶媒に可溶化された生体分子をクロマトグラフィー法で分離するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の分離分析方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィー法は液体クロマトグラフィー法であることを特徴とする請求項５に記載の分離分析方法。
【請求項７】
前記液体クロマトグラフィー法は高速液体クロマトグラフィー法であることを特徴とする請求項６に記載の分離分析方法。
【請求項８】
前記生体分子は核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の分離分析方法。
【請求項９】
前記チアジアゾールは、１，２，５−チアジアゾールであることを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載の分離分析方法。
【請求項１０】
チアジアゾールを含むことを特徴とする生体分子の分離分析用液体組成物。
【請求項１１】
前記分離分析は電気泳動法によって実施されることを特徴とする請求項１０に記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１２】
前記分離分析はキャピラリー電気泳動法によって実施されることを特徴とする請求項１１に記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１３】
前記分離分析はクロマトグラフィー法によって実施されることを特徴とする請求項１０に記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１４】
前記クロマトグラフィー法は液体クロマトグラフィー法であることを特徴とする請求項１３に記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１５】
前記液体クロマトグラフィー法は高速液体クロマトグラフィー法であることを特徴とする請求項１４に記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１６】
前記生体分子は核酸核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１０ないし１５のいずれかに記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１７】
前記チアジアゾールは、１，２，５−チアジアゾールであることを特徴とする請求項１０ないし１６のいずれかに記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１８】
請求項１０ないし１７のいずれかに記載の分離分析用液体組成物を含むことを特徴とする生体分子分離分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の分離分析方法と、該分離分析方法に用いる溶媒と、該溶媒を含む分離分析用キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の機能を細胞レベルで明らかにするために、生体内のタンパク質、ペプチド、核酸、アミノ酸、糖質、神経伝達関連物質などの解析、分析が行われている。これらの生体内物質の分析で必要となる分離化学的要素は、検出感度と多成分を同時に網羅的に分析することである。これまで、その手段として、平板ゲルを利用したもの、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動に代表されるように、カラムを利用した分析方法が使われてきた。【０００３】
分析対象物質を網羅的に分析する能力を示す分析化学的パラメーターに理論段数がある。理論段数はピークの広がりを保持時間、もしくは泳動時間で割り算した商で与えられる。この値は大きいほど、その対象物質のピークのピーク幅が広がらないということを示しており、分離能、つまり、網羅的に分離する能力が優れていることになる。キャピラリー電気泳動では１，０００，０００、高速液体クロマトグラフィーでは３０，０００程度である。【０００４】
理論段数が大きくなると、網羅的に分離できる物質の種類が多くなるだけだはなく、それぞれの物質についての検出感度もよくなる傾向がある。ここで、傾向が有ると書いたのは、対象物質の絶対量との関係から、例えば、分子が数個程度しかない場合には、理論段数の増加による感度の向上は期待できないためである。絶対量が分子数にして１０００個以上の場合には、分離の効果、理論段数の増加による検出感度の向上は期待できる。【０００５】
高い分離能が得られることは、検出感度のみならず、検出方法に関しても貢献できる。例えば、非特許文献１に説明されるとおり、マススペクトロスコピーを検出部分として使用する場合に、イオン化されやすさの程度が異なる複数の物質が混合された場合でも、それぞれの物質を分離することによって検出が可能になるなどの効果が見られる。
【非特許文献１】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｈａｒａ，  Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｔｏｈｒｕ  ｉｋｅｇａｍｉ，  Ｋａｚｕｋｉ  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｎｏｂｕｏ  Ｔａｎａｋａ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７８，  ７６３２−７６４２，  （２００６）  ところで、生体物質の分析、特に、核酸やタンパク質のクロマトグラフィーや電気泳動を利用して網羅的に分析するには、最低でもサンプルを数μリットル用意し、さらに、核酸の場合にＰＣＲ法を用いる等何らかの増幅の方法でその量を増やして分析を行う。網羅的に分析を行うことは、例えば、非特許文献２及び３に説明されるとおり、キャピラリー電気泳動を用いた分析において、１本鎖ＤＮＡであれば５０〜１０００まで、２本鎖のＤＮＡであれば１００ｂｐ〜１００００ｂｐまでの範囲で、それぞれの分解能が１ｂｐの塩基を分離することが可能であるとされている。しかし、２本鎖のＤＮＡを分析する際にはその長さで５，０００ｂｐを超える長さを持つものを、分離能が１ｂｐで、分離するのは困難である。
【非特許文献２】Ａ．Ｓ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｎａｇａｒｉａｎ，  Ａ．  Ｐａｕｌｕｓ，  Ａ．  Ｇｕｔｔｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｋａｒｇｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５，  ９６６０  （１９８８）
【非特許文献３】Ａ．  Ｇｕｔｍａｎ，  Ａ．  ＳＤ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｄ．  Ｎ．  Ｈｅｉｇｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｋａｒｇｅｒ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６２，  １３７  （１９９０）  電気泳動を行う際に平板ゲルに長時間（少なくても１２時間以上）、矩形波を印加することによって分離分析を行うことがある。また、非特許文献４に説明されるとおり、キャピラリー電気泳動を利用した分離で、パルス波を利用し、４０，０００ｂｐまでの長さのＤＮＡまでを分離した例は見られるが、その場合には、分解能は１００ｂｐ程度であり、１塩基の違い（例えば、１０，０００と１０，００１ｂｐの違い）を分離することはできない。さらに、一本鎖のＤＮＡやＲＮＡを分離するためにはサンプルの前処理として、４Ｍ以上の高濃度の尿素を利用して変性を行い、一本鎖のＤＮＡ、またはＲＮＡの分析を行うのが一般的である。
【非特許文献４】Ｙ．  Ｋｉｍ，  Ｍ．Ｄ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １７，  １５２−１６０  （１９９６）  サンプルの前処理を省略して分離を行うことが可能になれば、分析の速度及び正確性を向上することができる。特に、サンプルの処理から生まれる不確実性を排除できるために、分離分析の信頼性が向上する。
【０００６】
ところで、核酸やタンパク質の分析に通常利用される緩衝液に有機溶媒、ホルムアミドやジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を混合して分離を行った例は、例えば、特許文献１や非特許文献５に開示されるとおり、ＤＮＡのシークエンスを調べる際に、ＤＭＳＯを混合することによって、７Ｍの尿素を混合した場合と比較して、ＤＮＡの分離がよくなった例は見られる。同様にして、メタノールやエタノールなどを利用したもの、ホルムアミドを利用したものが見られるが、アルコール類はＤＮＡに対して弱い変性の効果しかなく、静電的な不和が生じるために分析が安定しない、また、ホルムアミドについては、ホルムアミド自身が電解質溶液中で、特に温度安定性が悪いので、分離媒体としての使用には問題がある。
【特許文献１】特開平９−１４５６７３号公報
【非特許文献５】Ｌｅｖ  Ｋｏｔｌｅｒ，  Ｈｕｉ  Ｈｅ，  Ａｒｔｈｕｒ  Ｗ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｂｅｒｒｙ  Ｌ．  Ｋａｒｇｅｒ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３，  ３０６２−３０７０，  （２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞内や組織内の核酸やタンパク質を信頼性を確保したまま網羅的に分離分析するためには、生化学サンプルの前処理を省略することができ、且つ、分離能をできるだけ高くすると同時に検出感度を高くできる分離溶媒及び分離方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、チアジアゾールを含む溶媒に生体分子を可溶化するステップを含むことを特徴とする生体分子の分離分析方法を提供する。【０００９】
本発明の生体分子の分離分析方法は、前記溶媒に可溶化された生体分子を電気泳動法で分離するステップを含む場合がある。前記電気泳動法はキャピラリー電気泳動法の場合がある。【００１０】
本発明の生体分子の分離分析方法は、前記電気泳動法で分離された生体分子を固体支持体に不動化させるステップを含む場合がある。【００１１】
本発明の生体分子の分離分析方法は、前記溶媒に可溶化された生体分子をクロマトグラフィー法で分離するステップを含む場合がある。前記クロマトグラフィー法は液体クロマトグラフィー法の場合がある。前記液体クロマトグラフィー法は高速液体クロマトグラフィー法の場合がある。【００１２】
本発明の方法で分離分析される生体分子は、核酸核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸又はこれらの誘導体の場合がある。【００１３】
本発明の生体分子の分離分析方法に用いるチアジアゾールは、１，２，５−チアジアゾールの場合がある。【００１４】
本発明は、チアジアゾールを含むことを特徴とする生体分子の分離分析用液体組成物を提供する。【００１５】
本発明の液体組成物は、電気泳動法によって実施される分離分析に用いられる場合がある。前記電気泳動法はキャピラリー電気泳動法の場合がある。【００１６】
本発明の液体組成物は、クロマトグラフィー法によって実施される分離分析に用いられる場合がある。前記クロマトグラフィー法は液体クロマトグラフィー法の場合がある。前記液体クロマトグラフィー法は高速液体クロマトグラフィー法の場合がある。【００１７】
本発明の液体組成物が可溶化する生体分子は、核酸、タンパク質、アミノ酸又はこれらの誘導体の場合がある。本発明の液体組成物に含まれるチアジアゾールは１，２，５−チアジアゾールの場合がある。【００１８】
本発明は、本発明の分離分析用液体組成物を含む生体分子分離分析用キットを提供する。【００１９】
本明細書においてチアジアゾールとは、１，２，３−チアジアゾール（１，２，３−Ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ）、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５チアジアゾールのうち少なくとも１つをいう。チアジアゾールは特開２００５−２１１８８９号公報に開示されるとおり、有機溶媒と均一に混合するだけでなく、ＤＭＳＯ、ホルムアルデヒド等の試薬の存在下では水にも溶解するので、疎水性及び親水性の物質をよく抽出できる。加えて、ハロゲン系溶媒の代替溶媒としても優れている。また、チアジアゾールは、分離溶媒のｐＨの変化の影響をほとんど受けない。【００２０】
本発明の分離分析方法は、電気泳動法、クロマトグラフィー法のほか、核酸の雑種形成に基づく分離分析方法を含むが、これらに限られない。本発明の電気泳動法は、平板ゲル電気泳動（スラブ電気泳動）、濾紙電気泳動法、ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、未変性ポリアクリルアミド電気泳動（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動法、等電点電気泳動（クロマトフォーカシング）法、免疫電気泳動法及びキャピラリー電気泳動法を含むが、これらに限られない。本発明のキャピラリー電気泳動法は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、ミセル導電電気泳動（ＭＥＫＣ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＺＥ）、キャピラリーゲル等速電気泳動（ＣＧＩＴＰ）、キャピラリーゲル等電点電気泳動（ＣＧＩＥＦ）及びキャピラリーゲルＳＤＳ電気泳動（ＳＤＳ‐ＣＧＥ）法を含むが、これらに限られない。電気泳動の電流の向きは、一定の場合のほか、異なる向きに異なる電場を矩形波状に繰り返し印加するパルスフィールド電気泳動の場合がある。パルスフィールドキャピラリー電気泳動における電流の向きは順方向（Ｆ）及び逆方向（Ｂ）の２つの向きであるが、パルスフィールド平板ゲル電気泳動における電流の向きは２つまたは３つ以上の向きの場合がある。本発明のクロマトグラフィー法は、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーを含むが、これらに限られない。【００２１】
本明細書において、分子篩物質とは、ゲル電気泳動法における泳動ゲル、キャピラリー電気泳動法におけるキャピラリー内部に充填するゲル、ポリマー等のサンプルの泳動に篩い効果を出すための充填剤をいう。【００２２】
本明細書において、生体分子とは、自然界又は実験室の生物に存在する分子と、その誘導体とをいう。したがって、生体分子には、核酸、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸の他、実験室で製造される放射能、蛍光色素その他の物質で標識された核酸、タンパク質及びアミノ酸と、モルフォリノオリゴヌクレオチドその他の修飾核酸と、糖タンパク質その他の修飾タンパク質と、アミノ酸数個が連結したペプチドと、ペプチド又はアミノ酸の水酸化、メチル化、リン酸化、エステル化等による誘導体とを含むが、これらに限られない。【００２３】
本発明の分離分析方法における、電気泳動法で分離された生体分子を固体支持体に不動化させるステップとは、サザンブロット法及びノザンブロット法のように、電気泳動法で分離された生体分子を毛管現象や電気泳動を利用して分子篩物質からフィルター膜その他の固体支持体に移動させて、生体分子の分離パターンを保持しつつ該固体支持体に不動化させることをいう場合がある。あるいは、固体支持体を移動させながら電気泳動によって分子篩物質から溶出した生体分子を一定体積ずつ、あるいは、連続的に固体支持体に付着させることによって生体分子の分離パターンを実質的に保持しつつ固体支持体に不動化させることをいう場合がある。生体分子が固体支持体に不動化される原理には、架橋反応による共有結合及び静電気力が含まれるが、これらに限られない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（Ａ）はＤＭＳＯを添加して、（Ｂ）は１，２，５−チアジアゾールを添加して、それぞれＤＮＡをキャピラリー電気泳動及びパルスフィールドによって分離した結果を示す波形図。
【図２】（Ａ）はＤＭＳＯを添加して、（Ｂ）は１，２，５−チアジアゾールを添加して、それぞれＤＮＡをキャピラリー電気泳動及びパルスフィールドによって分離した結果を示す波形図。
【図３】（Ａ）は尿素を添加して、（Ｂ）はホルムアルデヒドを添加して、（Ｃ）は１，２，５−チアジアゾールを添加して、それぞれＲＮＡをキャピラリーゲル電気泳動によって分離した結果を示す波形図。
【図４】（Ａ）はＤＭＳＯを添加して、（Ｂ）は１，２，５−チアジアゾールを添加して、それぞれＲＮＡをキャピラリーゲル電気泳動によって分離した結果を示す波形図。
【図５】（Ａ）はテトラヒドロフラン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ，  ＴＨＦ）を添加して、（Ｂ）は１，２，５−チアジアゾールを添加して、それぞれＲＮＡをキャピラリーゲル電気泳動によって分離した結果を示す波形図。
【図６】（Ａ）はアセトニトリルを添加して、（Ｂ）は１，２，５−チアジアゾールを添加して、それぞれＲＮＡをキャピラリーゲル電気泳動によって分離した結果を示す波形図。
【図７】（Ａ）はアセトンを添加して、（Ｂ）は１，２，５−チアジアゾールを添加して、それぞれＲＮＡをキャピラリーゲル電気泳動によって分離した結果を示す波形図。
【図８Ａ】標準溶媒を利用して、蛍光標識ＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィでグラジエント溶離により分離した結果を示す波形図。
【図８Ｂ】１，２，５−チアジアゾールを添加した標準溶媒を利用して、蛍光標識ＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィでグラジエント溶離により分離した結果を示す波形図。
【図９】（Ａ）は標準組成のゲル及びランニングバッファーを利用して、（Ｂ）はＤＭＳＯのみを添加したゲル及びランニングバッファーを利用して、（Ｃ）は１，２，５−チアジアゾールを添加したゲル及びランニングバッファーを利用して、それぞれを１５〜１５０ｋＤａの分子量マーカータンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した結果を示す波形図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に示す実施例によって本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の詳細な説明のために一例として示すものであり、これらの実施例によって本発明の範囲が制限されると理解するべきではない。
【実施例１】
【００２６】
１ｋｂ以上のＤＮＡのキャピラリー電気泳動による分析
１，２，５−  チアジアゾールを含む緩衝液として０．５Ｘ  ＴＢＥ（ｐＨ  ８，１）に溶解し、下記の表１にあるような組成比で分離溶媒を調整し、キャピラリー電気泳動の方法によりＤＮＡの分離分析を行った結果、ＤＮＡの長さが９，０００と１０，０００ｂｐ及び、１４，０００と１５，０００ｂｐにおいてチアジアゾールを添加した場合に優れた分離を示した。図１におけるＤＮＡの長さの帰属は図中の数字で示す。
サンプル：１ｋｂ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｕｌｅｒ，  ＢｉｏＲａｄ  （１  ｋｂ−  １５  ｋｂ）
使用した分離溶媒の組成比【００２７】
【表１】
2009028692.tif 000003
【００２８】
（注）分離溶媒全体に対しての重量比（ｗ／ｗ）または体積比（ｖ／ｖ）
キャピラリー電気泳動条件：５０ｍｍＸ５０ｍｍ角柱キャピラリー、内部ポリアクリルアミド処理、有効長８ｃｍ、電場強度２００Ｖ／ｃｍ（Ｆ）  -１００Ｖ／ｃｍ（Ｂ）  ５０Ｈｚ  （パルスフィールド）
ＨＥＣ：ヒドロキシエチルセルロース
【実施例２】
【００２９】
ＤＮＡのキャピラリーゲル電気泳動による分離
１，２，５−チアジアゾールを含む緩衝液として、０．５ＸＴＢＥ緩衝液を、以下の表２にあるような組成比で作成し、キャピラリー電気泳動の方法によって分離を行った。サンプルとしてＴａｋａｒａ１００ｂｐラダー，ＤＮＡ  ＭＷ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍａｋｅｒ，  ＣｏｄｅＮｏ．  ３４０７Ａ  （１００，  ２００，  ３００，  ４００，  ５００，  ６００，  ７００，  ８００，  ９００，  １０００，  １５００ｂｐ）を使用した。標識試薬として、ＤＮＡにインタカレートするＳＹＢＲ−ＧＲＥＥＮＩＩを溶媒の全量に対して１％（ｖ／ｖ）、あらかじめ混合した。【００３０】
【表２】
2009028692.tif 000004
【００３１】
分離溶媒（Ａ）及び（Ｂ）による電気泳動の結果の波形図を図２の（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ示す。以下の表３は、ＤＭＳＯのみを含む分離溶媒（Ａ）を用いる条件と、チアジアゾールを含む分離溶媒（Ｂ）を用いる条件（かっこ内）とにおける７００、８００、９００、１０００及び１５００ｂｐのバンドの泳動時間、理論段数及び分離度を比較した結果をまとめたものである。チアジアゾールを含む分離溶媒（Ｂ）を用いる条件のほうがＤＭＳＯのみを含む分離溶媒（Ａ）を用いる条件より泳動時間は短く、理論段数及び分離度は上回っていた。【００３２】
【表３】
2009028692.tif 000005
【実施例３】
【００３３】
ＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動による分離（１）
分離溶液として４Ｍ尿素を含むの緩衝液を含むＨＥＣポリマー緩衝溶液を利用した分離分析（Ａ）及びホルムアルデヒドを含むＨＥＣポリマー溶液（Ｂ）、及び、ホルムアルデヒドと１，２，５−チアジアゾールを含むＨＥＣポリマー緩衝液（Ｃ）を用いてＲＮＡのサイズマーカー（表４の注を参照せよ。）を前処理を行わずに分離した結果を図３に示す。ＲＮＡの分離について、１，２，５−チアジアゾールを添加した分離溶媒を利用した場合に優れた分離結果を得た。加えて、検出強度は約２倍であった。【００３４】
【表４】
2009028692.tif 000006
【００３５】
（注）分離溶媒全体に対しての重量比（ｗ／ｗ）または体積比（ｖ／ｖ）
分離条件：５０ｍｍＸ５０ｍｍ角柱キャピラリー、内部ポリアクリルアミド処理、電場強度１００Ｖ／ｃｍ，  有効長８ｃｍ、インジェクション１秒
図２におけるそれぞれのピークにおけるＲＮＡの長さの帰属は１：１００，  ２００  ｎｔ，  ２：  ３００  ｎｔ，  ３：  ４００ｎｔ，  ４：  ５００ｎｔ，  ５：  ６００  ｎｔ，  ６：  ８００  ｎｔ，  ７：  １，０００  ｎｔ，  ８：  １，５００  ｎｔ，    ９：  ２，０００  ｎｔ，  １０：  ３，０００  ｎｔ，    １１：  ４，０００  ｎｔ，  １２：  ６，０００  ｎｔである。
ＲＮＡサンプル：Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ０．１−１  ｋｂ，  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ０．２−１０  ｋｂ  （Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ＵＳＡ）
【実施例４】
【００３６】
ＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動による分離（２）
実施例３と同様の実験において、分離溶媒を以下の表５に示す組成比にし、ＲＮＡの分離実験を行った結果を図４に示す。１，２，５−チアジアゾールを添加した分離溶媒を利用した場合に明らかに優れた分離と検出感度を得た。
【００３７】
【表５】
2009028692.tif 000007
【００３８】
（注）分離溶媒全体に対しての重量比（ｗ／ｗ）または体積比（ｖ／ｖ）
【実施例５】
【００３９】
ＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動による分離（３）
実施例３と同様の実験において、分離溶媒を以下の表６に示す組成比にし、ＲＮＡの分離実験を行った結果を図５に示す。１，２，５−チアジアゾールを添加した分離溶媒を利用した場合に明らかに優れた分離と検出感度を得た。
【００４０】
【表６】
2009028692.tif 000008
【００４１】
（注）分離溶媒全体に対しての重量比（ｗ／ｗ）または体積比（ｖ／ｖ）
【実施例６】
【００４２】
ＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動による分離（４）
実施例３と同様の実験において、分離溶媒を以下の表７に示す組成比にし、ＲＮＡの分離実験を行った結果を図６に示す。１，２，５−チアジアゾールを添加した分離溶媒を利用した場合に明らかに優れた分離と検出感度を得た。
【００４３】
【表７】
2009028692.tif 000009
【実施例７】
【００４４】
ＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動による分離（５）
実施例３と同様の実験において、分離溶媒を以下の表８に示す組成比にし、ＲＮＡの分離実験を行った結果を図７に示す。１，２，５−チアジアゾールを添加した分離溶媒を利用した場合に明らかに優れた分離と検出感度を得た。
【００４５】
【表８】
2009028692.tif 000010
【実施例８】
【００４６】
蛍光標識ＰＴＨアミノ酸の高速液体クロマトグラフィによる分離
高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−２２００，  Ｌ−２３５０，  Ｌ−２４００，  Ｌ−２１３０）を使用して、サンプルとして和光ケミカルＰＴＨ−アミノ酸（アミノ酸分析用、１６９−１２２７３  ＰＴＨ−ａｍｉｎｏＡｃｉｄｓ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用して、以下に示す溶出液を利用して分析を行った。
グラジエント：溶離液Ａ／Ｂ  ０／１００  →  ４５ｍｉｎ  ６０／４０  →  ６０ｍｉｎ  ６０／４０
Ｏｖｅｎ：４０℃
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：  ５ｕｌ
Ｃｏｌｕｍｎ：  Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８  ２．５ｕｍ  ４．６ｘ５０ｍｍ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：  ＵＶ  ２５４  ｎｍ
Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ：  １  ｍｌ／ｍｉｍ
標準溶媒（Ａ）及び１，２，５−チアジアゾールを添加した標準溶媒（Ｂ）を利用して、それぞれ蛍光標識ＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィでグラジエント溶離により分離した結果を図８に示す。図８の波形図のピークの１ないし２０の帰属は以下のとおりである。
１：  ＰＴＨ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  ＰＴＨ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ
２：ＰＴＨ−Ｓｅｒｉｎｅ
３：ＰＴＨ−Ｇｌｙｓｉｎｅ
４：  ＰＴＨ−Ａｒｇｉｎｅ
５：  ＰＴＨ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
６：  ＰＴＨ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ
７：  ＰＴＨ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ
８：  ＰＴＨ−Ａｌａｎｉｎｅ，  ＰＴＨ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ
９：  ＰＴＨ−Ａｍ−Ｉ
１０：  ＰＴＨ−Ａｍ−ＩＩ
１１：  ＰＴＨ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ
１２：  ＰＴＨ−  Ａｓｐａｒｔｉｃ  Ａｃｉｄ
１３：  ＰＴＨ−Ｐｒｏｌｉｎｅ
１４：  ＰＴＨ−Ｖａｌｉｎｅ，  ＰＴＨ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ
１５：  ＰＴＨ−Ｎｏｒｖ
１６：  ＰＴＨ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，  ＰＴＨ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ
１７：  ＰＴＨ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
１８：  ＰＴＨ−Ｌｅｕｃｉｎｅ
１９：  ＰＴＨ−Ｎｏｒｌ
２０：  ＰＴＨ−Ｌｙｓｉｎｅ
図８Ａ及びＢに示すとおり、ＰＴＨアミノ酸の保持時間は１，２，５−チアジアゾールを添加した標準溶媒のほうが標準溶媒よりも短く、ピークにおけるＳ／Ｎ比が優れていた。
【実施例９】
【００４７】
タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離
１，２，５−チアジアゾールを含むゲルを、以下の表９にあるような組成比で作成し、１，２，５−チアジアゾールを含む緩衝液として、１Ｘ  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＳＤＳ緩衝液を、以下の表１０にあるような組成比で作成し、平板ゲル電気泳動の方法によって以下の表１１に示す電気泳動条件で分離を行った。サンプルとしてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｌａｄｄｅｒ（ａｍＲｅｓｃｏ）を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、染色を行った画像をデジタルカメラ（ＦｉｎｅＰｉｘ  Ｆ１０、ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）で取り込み、Ｍａｔｌａｂソフトウェアを利用して画像の強度を評価することによって定量化を行った。【００４８】
【表９】
2009028692.tif 000011
【００４９】
【表１０】
2009028692.tif 000012
【００５０】
【表１１】
2009028692.tif 000013
【００５１】
泳動結果の波形図を図９に示し、（１）〜（７）の各ピークの幅及び強度を以下の表１２に泳動条件ごとに比較した結果を示す。これらの結果から、チアジアゾールを添加した緩衝液での各バンドの凝集及び絶対強度が優れ、高い分解能を得た。【００５２】
【表１２】
2009028692.tif 000014
【００５３】
以上の実施例から、本発明には以下の長所がある。すなわち、チアジアゾールを含む溶媒に生体分子を可溶化するステップを含む生体分子の分離分析方法及びチアジアゾールを含む生体分子の分離分析用液体組成物は、従来の分離分析方法及び生体分子の分離分析用液体組成物と比較するとより短時間に分析を実行することができ、理論段数及び／又は分離度が優れている。アミノ酸分析法においては、保持時間が短く、Ｓ／Ｎ比が優れており、タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法においても各バンドの凝集及び絶対強度が優れ、高い分解能が得られた。
【図１】
2009028692.tif 000015
【図２】
2009028692.tif 000016
【図３】
2009028692.tif 000017
【図４】
2009028692.tif 000018
【図５】
2009028692.tif 000019
【図６】
2009028692.tif 000020
【図７】
2009028692.tif 000021
【図８Ａ】
2009028692.tif 000022
【図８Ｂ】
2009028692.tif 000023
【図９】
2009028692.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月31日(2009.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアジアゾールを含む溶媒に生体分子を可溶化するステップと、前記溶媒に可溶化された生体分子を電気泳動法で分離するステップとを含むことを特徴とする生体分子の分離分析方法。
【請求項２】
前記電気泳動法はキャピラリー電気泳動法であることを特徴とする請求項１に記載の分離分析方法。
【請求項３】
前記電気泳動法で分離された生体分子を固体支持体に不動化させるステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の分離分析方法。
【請求項４】
前記生体分子は核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の分離分析方法。
【請求項５】
前記チアジアゾールは、１，２，５−チアジアゾールであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の分離分析方法。
【請求項６】
チアジアゾールを含むことを特徴とする電気泳動法による生体分子の分離分析用液体組成物。
【請求項７】
前記分離分析はキャピラリー電気泳動法によって実施されることを特徴とする請求項６に記載の分離分析用液体組成物。
【請求項８】
前記生体分子は、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項６又は７に記載の分離分析用液体組成物。
【請求項９】
前記チアジアゾールは、１，２，５−チアジアゾールであることを特徴とする請求項６ないし８のいずれかに記載の分離分析用液体組成物。
【請求項１０】
請求項６ないし９のいずれかに記載の分離分析用液体組成物を含むことを特徴とする生体分子分離分析用キット。
【国際調査報告】
2009028692.tif 000025
2009028692.tif 000026