(57)【要約】    【課題】  体液試料、特に血清等に存在する大腸癌マーカポリペプチド、及び該大腸癌マーカを検出する大腸癌の診断方法を提供する。    【解決手段】  配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチド；並びに配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料から検出することを特徴とする、大腸癌の診断方法である。    【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチド。
【請求項２】
下記(1)又は(2)のポリペプチドを含み、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド断片：
(1)  配列番号１、２、３、及び５いずれか１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(2)配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１５アミノ酸残基を含む、請求項２記載のポリペプチド断片。
【請求項４】
少なくとも２０アミノ酸残基を含む、請求項２記載のポリペプチド断片。
【請求項５】
少なくとも２５アミノ酸残基を含む、請求項２記載のポリペプチド断片。
【請求項６】
配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料から検出することを特徴とする、大腸癌の診断方法。
【請求項７】
前記体液試料が、血清又は血漿である、請求項６記載の大腸癌の診断方法。
【請求項８】
前記体液試料から、キャリアタンパク質を除去する工程をさらに含む、請求項６又は７記載の大腸癌の診断方法。
【請求項９】
被験者から得た体液試料と、前記大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体とを接触させる工程を有する、請求項６〜８のいずれか１項記載の大腸癌の診断方法。
【請求項１０】
被験者から得た体液試料を、質量分析することにより、該大腸癌マーカポリペプチドを検出する、請求項６〜８のいずれか１項記載の大腸癌の診断方法。
【請求項１１】
同位体元素でラベルされ、かつ配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む比較用大腸癌マーカポリペプチドを用いる、請求項１０記載の大腸癌の診断方法。
【請求項１２】
前記同位体が酸素原子、炭素原子、水素原子又は窒素原子である、請求項１１記載の診断方法。
【請求項１３】
配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料から検出することを特徴とする、大腸癌転移の診断方法。
【請求項１４】
前記体液試料が血清又は血漿である、請求項１３記載の大腸癌転移の診断方法。
【請求項１５】
前記体液試料からキャリアタンパク質を除去する工程をさらに含む、請求項１３又は１４記載の大腸癌転移の診断方法。
【請求項１６】
配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体である、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
請求項２記載のポリペプチド断片を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を製造する方法。
【請求項１９】
配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を少なくとも１種含有する、大腸癌診断用キット。
【請求項２０】
配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を少なくとも１種含有する、大腸癌転移の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌マーカポリペプチド、特に血清等に存在する大腸癌マーカポリペプチド、及び該大腸癌マーカポリペプチドを検出する大腸癌の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺癌、胃癌、及び肝臓癌とともに、大腸癌は発生率が高く、近年の食生活欧米化に伴いその発生率は急速に上昇している。そして、従来、大腸癌は便潜血反応検査、X線造影検査、及び大腸内視鏡検査などを行い、次いでバイオプシーによる組織学的検査による診断が行われてきた。【０００３】
しかし、便潜血反応検査は、大腸癌からの出血が間欠的であるため、偽陰性の判定となる割合が高く、また逆に、痔疾、歯肉炎、潰瘍、アスピリン使用などが陽性の判定を引き起こすため、不必要な侵襲的な再検査が行われるという欠点がある。また、X線造影検査、及び大腸内視鏡検査などは、費用も高く、患者に負担と苦痛を与えるという欠点があった。【０００４】
そこで、非侵襲的で、患者に苦痛を与えない大腸癌の検査方法の研究が行われた。例えば、血液試料から癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を検出することで進行した大腸癌の存在を検出する方法（特許文献５）があるが、初期の大腸腫瘍を検出するためには信頼できる試験ではない。また、大腸癌における免疫反応を示す抗原としてのある種の大腸癌関連ポリペプチドを同定する、大腸癌を含む癌の診断方法（特許文献１）、大腸癌マーカをコードするcDNAを利用する大腸癌及びポリープのような結腸疾患の診断方法（特許文献２）、特定の糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードする大腸癌マーカ遺伝子を利用する大腸癌の検出方法（特許文献３）、並びにAPC遺伝子、K-ras遺伝子、β-カテニン遺伝子及びB-raf遺伝子中の選択された領域中の変異解析を行うことができるプライマーを用いて、大腸癌細胞及び／又は大腸癌前駆細胞の非侵襲的早期検出を行う方法（特許文献４）などがある。しかし、これらの大腸癌の検査方法も、精度、実施容易性、費用などの面から臨床的な診断方法を変えるに到るものではなかった。【０００５】
【特許文献１】特表2004-534218号公報
【特許文献２】特表2004-537971号公報
【特許文献３】特開2006-136319号公報
【特許文献４】特表2007-505609号公報
【特許文献５】米国特許第005,741,650 A号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、大腸癌マーカポリペプチド、特に血清等に存在する大腸癌マーカポリペプチド、該大腸癌マーカポリペプチドを検出する大腸癌の診断方法、該診断用の抗体、及び該診断方法に用いるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、診断に有用な大腸癌マーカを得るため検討した結果、細胞性検体、特に生検によって得られる細胞を対象に検査を行うのは効率が悪く、かつ被験者に負担を強いることになるので、体液試料、特に血清等に含まれる大腸癌マーカを早期の大腸癌診断に用いるのが好ましく、かつ容易に検査できると考え研究を行った。その結果、発明者らは、大腸癌患者の血清に大腸癌マーカとなる４種類のペプチドが含まれていることを見出した。【０００８】
したがって、本発明は、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを提供する。本明細書中において、配列番号１、２、３、又は５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを。それぞれ大腸癌マーカポリペプチドA、B、Ｄ及びＣ、又は大腸癌マーカA、B、Ｄ及びＣと表記する。【０００９】
また、本発明は、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導する、下記(1)又は(2)のポリペプチドを含むポリペプチド断片を提供する。
(1)  配列番号１、２、３、及び５いずれか１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(2)配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドである。【００１０】
さらに、本発明は、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料、特に血清又は血漿から検出することを特徴とする、大腸癌の診断方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料、特に血清又は血漿から検出することを特徴とする、大腸癌転移の診断方法を提供する。【００１１】
さらに、本発明は、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を提供する。
さらに、本発明は、前記ポリペプチド断片を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を製造する方法を提供する。【００１２】
さらに、本発明は、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を、少なくとも１種含有する、大腸癌診断用キットを提供する。
さらに、本発明は、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、大腸癌転移の診断用キットを提供する。【００１３】
（定義）
本明細書中において、「低分子量タンパク質」とは、分子量３０,０００以下、好ましくは分子量２０，０００以下のタンパク質をいう。また、特に断らない限り「低分子量タンパク質等」とは、低分子量タンパク質、及びペプチドの双方を意味する。例を挙げると、極微量存在するペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイン等の生理活性タンパク質、特に機能がない極微量のバイオマーカタンパク質、及びペプチドなどがある。これらは腎臓を通過して尿中に一部排泄されるため、血液のみならず尿を検体として測定することも可能な場合もある。【００１４】
本明細書中において、「血漿」とは、ＥＤＴＡ又はヘパリンなどを加えて遠心分離した血液凝固系が作用し難い、又は作用しない上清をいう。
本明細書中において「血清」とは、血液から凝固成分をとり除いた部分である。新鮮な血液を放置すると血液凝固がおこり、ついで血球ならびにフィブリンは塊状に収縮し、透明な琥珀色の血清を遊離する。その成分はほぼ血漿からフィブリノゲンを除いたものにあたる。【００１５】
本明細書中において、血清等の「主要タンパク質」及び「キャリアタンパク質」とは、血清中の高含量のタンパク質をいう。例を挙げると、アルブミン(分子量66kDa)、免疫グロブリン(150〜190kDa)、トランスフェリン(80kDa)、ハプトグロビン(＞85kDa)、リポタンパク質(数100kDa)などがある。
本明細書中において、「SDS」とは、ドデシル硫酸ナトリウム(sodium dodecyl sμlfate)を意味する。
本明細書中において、「PAGE」とは、ポリアクリルアミド  ゲル電気泳動(polyacrylamide gel electrophoresis)を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（大腸癌マーカポリペプチドの検索）
本発明者らは、大腸癌の早期発見に有用で、かつ生検等の細胞試料でなく、採取の容易な体液試料に存在する大腸癌マーカを発見するため、大腸癌患者から採取した血清を用いて大腸癌マーカの検索を行った。該大腸癌マーカの探索、同定、及び評価の方法は、後述する実施例に記載されているとおりである。
なお、本発明の大腸癌マーカポリペプチドＡ，Ｂ、Ｄ及びＣの最終的な同定は、実施例４に示すようにタンデム型ＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）質量分析により行った。該質量分析法の概念を次に説明する。【００１７】
図１に4残基のペプチドの開裂パターンを示す。開裂したペプチドはその開裂部分に応じて呼び方が変わる。例えば、主鎖のペプチド結合部分で開裂したペプチド断片でペプチドのN端の１アミノ酸残基を含むペプチド断片をB1、N端を含む2アミノ酸残基を含むペプチド断片をB2、同様にN端から3アミノ酸残基を含む物をB3と呼ぶ。これに対してペプチドのC端の１アミノ酸残基をY1、C端を含む2アミノ酸残基を含むペプチド断片をY2、3アミノ酸残基を含む物をY3と呼ぶ。B1からB3のペプチド断片をB系列、Y1からY3のペプチド断片をY系列と呼ぶ。A,X、C,Zで切断されたペプチド断片に関しても同じようにA系列、X系列、C系列、Z系列と呼び、含まれるアミノ酸残基数に応じて番号をつける。【００１８】
今回使用したMALDI-TOF-MS分析計のMS／MSは低エネルギー解離であり、主にペプチド結合部分で開裂されるためB系列、Y系列が強く出る。図１のMS/MSスペクトルでは、前記B系列とY系列のペプチド断片のm/zに対応する信号（出力データ）が強く出る。より大きな開裂エネルギーによる開裂ではA,X, C,Z系列も増えてくるため、MS/MSスペクトルはより複雑となる。開裂のエネルギーは質量分析計のタイプによって異なる。UCSFが提供している質量スペクトラム解析用ホームページ(ProteinProspector: http://prospector.ucsf.edu/)ではアミノ酸配列を入力するとそのペプチドのmonoaisotopic
massやMS/MSパターン、タンパク質の酵素消化パターンを計算することが出来る。
本発明の大腸癌マーカポリペプチドは、ポリペプチドのm/zとB系列とY系列のペプチド断片のm/zに対応する出力データを解析することにより同定したものであり、実施例４に対応する図１３、図１４及び図１５にその出力データ一覧表を示した。【００１９】
(大腸癌マーカポリペプチドの検出）
本発明の大腸癌マーカは、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドであり、これを検査対象者の体液試料、特に血清又は血漿から検出することにより大腸癌の診断、及び／又は転移を判断することができる。
本発明で用いる検出方法は、特に制限されないが、例えば、該大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体を作成し、該抗体との抗原抗体反応により本発明の大腸癌マーカを検出する方法、又は近年進歩が著しいプロテオーム的手法としてよい。【００２０】
（腸癌ポリペプチドマーカ検出用抗体）
本発明の抗体は、大腸癌マーカポリペプチドの検出に用いることが出来る、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。特にモノクローナル抗体では特異性に優れた抗体を選択することが可能となる。
免疫感作は常法により行うことができ、例えば抗原を、例えば７〜３０日間隔で２〜３回投与するのが好ましい。抗原の投与量は１回当たり、例えばマウスでは約０．０５〜２ｍｇ程度とする。投与経路も特に限定する必要はなく、皮下、皮内、腹膜腔内、静脈、筋肉内を適宜選択できる。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができる。【００２１】
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、抗体価の上昇後、１００μｇ〜１０００μｇの抗原で追加免疫することができる。最後の投与から通常１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明の大腸癌マーカポリペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。【００２２】
また、モノクローナル抗体は、抗体産生細胞をクローニングすることによって得ることができる。一般的には、免疫動物から回収した抗体産生細胞を適当な融合パートナーと細胞融合させることによってハイブリドーマを形成し、HAT培養液によって癌細胞のハイブリドーマを選択した後、産生される抗体の活性を指標としてスクリーニングを行う。続いて、得られたハイブリドーマを常法に基づき、適当な培地中で培養後、該培養液を精製することによりモノクローナル抗体を得ることができる。【００２３】
本発明で、免疫動物として使用できるのは、非ヒト哺乳動物、例えば、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット、マウス、ウサギなどがあり、特にラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類が好ましい。マウスを免疫動物とするときには、融合パートナーとしては、マウス由来のミエローマ細胞が好しい。【００２４】
前記非ヒト哺乳動物を感作するのに用いる抗原として、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導し、かつ下記(1)又は(2)のポリペプチドを含むポリペプチド断片を用いることができる。
(1)  配列番号１、２、３、及び５いずれか１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(2)  配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドである。【００２５】
また、該抗原は、少なくとも１５アミノ酸残基を含む、好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基を含む、さらに好ましくは少なくとも２５アミノ酸残基を含む、前記ポリペプチド断片とすることができる。
これらのポリペプチド断片は、該断片をコードするcDNAを組み込んだベクターを宿主に導入して作成するか、又は化学合成で作成することができる。【００２６】
（組み換え法による作成）
組み換え法では、例えば、本明細書記載の配列番号７〜１４のcDNAを組み込んだベクターを作成し、適当な宿主細胞に導入、形質転換した後、該形質転換細胞を培養し、培養液等を精製することにより、該抗体誘導に用いるポリペプチド断片を作成することができる。【００２７】
該宿主細胞は、哺乳動物の遺伝子を発現し得る細胞であれば特に限定されず、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞等を用いることができる。例えば、脊椎動物細胞であれば、サルの細胞であるCOS細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ATCC CRL-1650）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO細胞、ATCC CCL-61）やそのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub,
G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）、間葉系幹細胞や骨軟骨系の培養細胞株を用いることができる。また、昆虫細胞であれば、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Sf-9またはSf-21）やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog.ｉ: 391-396）等を用いることができる。【００２８】
また、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用できる。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するPCR3.1（Invitrogen社製）、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864）等のほか、レトロウィルスベクターpLCNX（Clontech, K1060-1）等を用いることができる。【００２９】
該宿主細胞として、COS細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製起点を有し、COS細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびRNAスプライス部位を備えたものが好ましい。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（DEAE）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、及び電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）等によりCOS細胞に取り込ませることができる。【００３０】
また、宿主細胞としてCHO細胞や293細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質G418耐性マーカーとして機能するneo遺伝子を発現し得るベクター、例えば、pRSVneo（Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やpSV2neo（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）等をコ・トランスフェクトし、G418耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。【００３１】
また、昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Sf-9またはSf-21）やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog.ｉ: 391-396）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（AcNPV）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したpVL1392/1393を用いることができる（Kidd,ｉ. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 420, 137-159）。さらに、バキュロウイルスのP10や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、AcNPVのエンベロープ表面蛋白質GP67の分泌シグナル配列を目的蛋白質のN末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174）。
前記組換え細胞は、常法にしたがい培養することにより、その細胞膜上に目的の蛋白質を産生する。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。【００３２】
（化学合成法による作成）
該ポリペプチド断片の化学合成は、当分野で周知の化学的方法によって行うことができる。例えば、固相技術を用いるペプチド合成は、バッチ式或いは連続的なフロープロセスによって行うことができる。連続的なフロープロセスでは、αアミノ保護及び側鎖保護アミノ酸残基をリンカーを介して不溶性の高分子支持物に連続的に追加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカーを、ポリ（スチレン-co-ジビニルベンゼン）に結合させて支持レジンを形成する。このアミノ酸残基は、酸不安定Boc(t-butyloxycarbonyl)法、若しくは塩基不安定Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)法によって保護されたN-α-である。保護されたアミノ酸のカルボキシル基をリンカーのアミンに結合して、この残基を固相支持レジンに結合させる。Boc若しくはFmocを用いた場合、トリフルオロ酢酸若しくはピペリジンを用いて保護基を除去する。カップリング試薬若しくは予め活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、追加する各アミノ酸を結合された残基に付加してから、レジンを洗浄する。完全長のペプチドは、連続的な保護の停止、即ち誘導体化アミノ酸を結合させて合成し、ジクロロメタン及び／またはN、N-ジメチルホルムアミドで洗浄する。このペプチドは、ペプチドカルボキシル末端とリンカーとの間で切断され、ペプチド酸またはペプチドアミドが作られる（Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook, San Diego CA pp. S1-S20）。ABI 431 A ペプチドシンセサイザー（Applied Biosystems）などの装置を用いて、ペプチドを自動合成することができる。合成したポリペプチド断片を高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その組成をアミノ酸解析またはシークエンシングによって確認することができる（Creighton (1984) Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY）。【００３３】
得られた抗体の検定は、ELISAやリポソーム溶解検定法を利用するのが好ましい。ELISAでは、反応性を観察すべき抗原を感作したマイクロプレートを用意し、これにハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウエルを洗浄し、イムノグロブリンに対する２次抗体を更に反応させる。最終的にウエルに結合した２次抗体を測定すれば、培養上清中に存在する抗体の抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。【００３４】
リポソーム溶解検定法とは、抗原を感作したリポソームに抗体が反応すると、補体の作用によってリポソームが溶解する現象を利用した方法である。該リポソームは、たとえばジセチルホスフェート（dicetyl-phosphate；以下DCPと省略する）、ジミリストイルホスファチジルコリン（以下DMPCと省略する）、コレステロールに加えて試験すべきリン脂質抗原から構成されたものである。これらの脂質成分を適当な有機溶媒で溶解後に乾燥させてリピッドフィルムとし、水系溶媒に加えて強く撹拌すると、多層ラメラ構造のリポソームを生じる。こうして調製されたリポソームでは、膜の構成成分としてリン脂質抗原が取りこまれる。そのため現実の細胞膜に存在する形に近い状態で抗原構造が提示されることが期待できるので、モノクローナル抗体のスクリーニングには好適である。該リポソームの内部には、その溶解の標識となる蛍光色素を封入しておくのが好ましい。該蛍光色素には、4-メチルウンベリフェロンやカルセイン等が用いられる。補体の存在下でこのリポソームを構成するリン脂質抗原に抗体が結合すると、リポソームが破壊され内部の蛍光色素が流出されるので、抗体の存在は液相の蛍光増大として観察される。【００３５】
（大腸癌マーカポリペプチドの検出）
本発明では、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料、好ましくは血清又は血漿から検出することにより、大腸癌の診断方法を提供する。本発明のマーカが１種以上陽性を示す量で存在する場合、大腸癌に罹患、又はその前段階に到っていると考えることができる。【００３６】
また、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、大腸癌を外科的又はその他の手段で除去した被験者から得た体液試料から検出することにより、大腸癌の転移を診断することができる。すなわち、大腸癌が除去されていれば被験者の血清などには通常、該大腸癌マーカは存在しない、又は存在量は低いが、転移により除去部位以外に大腸癌が転移していれば、該大腸癌マーカが陽性を示す量で存在する。【００３７】
（特異的抗体を使った検出方法）
先に記載した方法で得た、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を、被験者から得た体液試料と接触させることにより、本発明の大腸癌マーカポリペプチドを検出することができる。当該抗原抗体反応は、周知の常法で行うことができる。該常法の例を挙げると、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、及び蛍光活性化セルソーター法（FACS）がある。該大腸癌マーカポリペプチドの検出には、２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる（Coligan 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New
York NY）。【００３８】
当該抗体を使った検出方法を実施するため、本発明では、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を少なくとも１種含有する、大腸癌診断用キット、及び大腸癌転移の診断用キットを提供する。【００３９】
（プロテオーム的手法を使った検出方法）
本発明の大腸癌マーカポリペプチドＡ、B、D及びCは、それぞれアミノ酸配列、及び分子量が明らかになっているので、被験者から得た血清等の体液試料から質量分析により検出することができる。当該質量分析は、液体クロマト質量分析法(LC-MS分析法)、又はマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF-MS分析法)により行うことができる。【００４０】
MALDI-TOF-MS分析により検出を行う場、液体試料中に含まれるタンパク質及びポリペプチドの質量分析データを得て、該データ中に本発明の大腸癌マーカに対応する質量に対応する出力（ピーク）があるか否かを調べることにより、大腸癌マーカの有無を調べることができる。【００４１】
該MALDI-TOF-MS分析により大腸癌マーカの有無を調べる手順は次のとおりである。まず、体液試料を前処理して、該試料に含まれるタンパク質及びポリペプチド成分を濃縮、又は凍結乾燥し、その後、適当なマトリックスと混合し、試料プレート上で乾燥させる。該試料を質量分析計の高真空内に導入する。該試料スポットをレーザで照射し、イオンを気相中に脱離させるとともに、飛行時間を測定する計時装置を始動させる。イオンは電場によって同じ運動エネルギーで加速され、電場内の自由飛行管を飛翔する間に質量電荷比に対応して分離される。該イオンはイオンの質量電荷比に依存した異なる時間に検出器に到達する。データシステムにより検出器のすべてのパラメーターを制御して時間毎の検出シグナルを獲得することにより、質量電荷比に依存したイオンの到達順位を示すデータ処理が可能となる。所定のスペクトル計によって試料に含まれるタンパク質及びポリペプチドのプロファイルを得た後、該プロファイル中に本発明の大腸癌マーカポリペプチドに対応する出力データの有無を調べることで、該大腸癌マーカを検出することができる。【００４２】
なお、酸素原子、炭素原子、水素原子及び窒素原子などの同位体元素でラベルした、配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む比較用大腸癌マーカポリペプチドを用いることにより、検出（定性）の精度を向上させ、かつ定量的な分析が可能となる。
例えば、図１７に示すように、本発明の大腸癌マーカポリペプチドＡのアラニン及びグリシンの炭素原子を同位体である１３C炭素原子に置換することで、比較用の標準マーカポリペプチドＡを得ることができる。そして該標準ポリペプチドマーカＡを試料に一定量加えて質量分析することにより、図１８に示すように強度１の基準出力データを得ることができる。該基準出力データは常に一定の位置に現れるものであるから、大腸癌マーカポリペプチドＡ検出（定性）の基準になる。また、図１８に示すように該基準出力データと比較することにより、大腸癌摘出手術の後では、明らかに大腸癌マーカポリペプチドＡの減少が確認できる。また、大腸癌摘出手術の後で、大腸癌マーカポリペプチドＡの減少が確認されなければ、該大腸癌の転移が疑われることになる。【００４３】
（体液試料、特に血清及び血漿の前処理）
なお、前記大腸癌マーカポリペプチドを検出する前に、該体液試料、特に血清及び血漿から主要タンパク質を除去し、該大腸癌マーカポリペプチドを濃縮するのが好ましい。被験者から得た血清等には、比較的分子量の大きい主要タンパク質が含まれており、本発明の大腸癌マーカポリペプチドの検出を妨害、又は検出感度を著しく低下させることがある。特に、該検出にプロテオーム的手法を用いる場合、キャリアタンパク質を含む主要タンパク質の影響は大きい。該主要タンパク質の除去には、本発明者らが平成19年8月8日に出願した特願2007-206602記載の方法が好ましい。すなわち、
(a)  被験者から得た体液試料、特に血清等に、尿素及びチオ尿素を含む試薬１、及びジチオスレイトール(DTT)を含む試薬２を加えて混合し、ついで有機溶媒９０%以上含む試薬3に滴下して、混合する工程；
(b)  工程（a）で得られた混合溶液を低温下で攪拌する工程；
(c)  工程(b)で得られた攪拌溶液を低温下で遠心分離し、上清を除去する工程；
(d)  (c)で得られた沈降物に有機溶媒及び酸を含む試薬４を加えて混和する工程；
(e)  工程(d)で得られた混合溶液を低温下で攪拌する工程；及び
(f)  工程(e)で得られた攪拌溶液を低温下で遠心分離し、上清を回収する工程により処理することでキャリアタンパク質を含む主要タンパク質を除去する方法である。また該方法は、さらに、(g)工程(f)で回収した上清を凍結乾燥する工程を含んでいてもよい。【００４４】
なお、試薬１における濃度は尿素１〜８Ｍ、かつチオ尿素０．５〜３Ｍ、好ましくは尿素３〜８Ｍ、かつチオ尿素１〜３Ｍであり、かつ試薬２におけるＤＴＴの濃度は５ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍである。また、試薬３の有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノール、2プロパノール、アセトニトリル、及びこれらの混合物からなる群から選ばれたもの、好ましくはアセトンである。【００４５】
また、試薬４の有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びこれらの混合物からなる群から選ばれたもの、好ましくはアセトニトリルであり、かつ前記酸は、塩酸、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)、ギ酸、酢酸、及びトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）からなる群から選ばれたものであり、かつ該有機溶媒の濃度が５０〜９９％である。好ましい試薬４の酸は、塩酸であり、その濃度は５ｍM〜５００mMとするのが好ましい。【００４６】
また、前記工程(g)で得られた上清の凍結乾燥物に、ＴＦＡ、塩酸、ギ酸、酢酸、及びＴＣＡからなる群から選ばれた成分、好ましくはＴＦＡを０．１〜２０％を含有する試薬５を加え、本発明の大腸癌マーカポリペプチドの分析用試料を作成することができる。
【実施例】
【００４７】
健常者血清８検体、及び大腸癌罹患者血清８検体を用意し、図２に示すフローチャートに従い大腸癌マーカポリペプチドを探索した。続いて、得られた大腸癌マーカポリペプチドの評価を行った。【００４８】
（実施例１）  大腸癌マーカポリペプチド成分の濃縮
本実施例では、図３に示すフローチャートに従い、大腸癌マーカポリペプチド成分の濃縮を行った（以下、この濃縮方法をK法という。）。
まず、用意した血清検体１０μlを分取し、試薬１(7M尿素, 2Mチオ尿素)18μlと試薬２(200mM DTT) 2 μlを加え、Vortexで混和した。その際、該血清、試薬１、及び試薬2は全て4℃に冷やして使用した。ついで該混合溶液を、4℃に冷却した高純度アセトンからなる1.2 mlの試薬3に滴下し、該滴下後すぐにvortexを用いて混和し、ついで4℃の環境で1時間撹拌した。該攪拌後、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で１５分間遠心分離し（19,000g）、得られた上清を完全に除去した。次いで、残留沈殿物に4℃の試薬4 (アセトニトリル70%, 塩酸12 mM、残部水) 200μlを加え、4℃で1時間撹拌したのち、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で１５分間遠心分離し（19,000g）、得られた上清を血清のポリペプチド濃縮溶液として回収した。
次いで、該濃縮溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物に試薬5 (99.9% H2O, 0.1% TFA) 80μlを加えて溶解した。【００４９】
（実施例２）  血清ポリペプチドの逆相HPLCによる分画
実施例１で得られた健常者血清（N１〜N８）及び大腸癌患者血清（P１〜P８）のポリペプチド濃縮溶液を、それぞれ逆相HPLCにより分画した。該分画は逆相HPLCの溶出時間２５〜８５分部分を１分間隔で６０分画に分取した。その分析条件を図４に、分析結果を図５に示す。【００５０】
（実施例３）  逆相HPLCで得た画分のポリペプチドの検索
実施例２で得た各画分を、MALDI-TOF-MS（Matrix - Assisted Laser Desorption Ionization Time - Of - Fright Mass Spectrometer:
マトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析計, 型番：Voyager-DE PRO, メーカー：Applied Biosystems社，USA ）により分析し、大腸癌患者血清P１〜P8に特異的に存在するポリペプチドを探索した。まず、MALDI-TOF-MS用サンプルプレート上で各画分のサンプル1μlと マトリックス 0.5μlを混ぜて風乾した後、MALDI-TOF-MS分析を行った。該マトリックスとして、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA; Nacalai Tesque社製) を
50%CH3CN - 0.1%TFAで溶解した飽和溶液を用いた。【００５１】
当該MALDI-TOF-MS分析で示された、各画分における健常者血清N１〜N８及び大腸癌患者血清P１〜P8のポリペプチドの存在を、図６〜図９に示す。各図における白丸は、健常者血清N１〜N８中に存在するポリペプチドを示し、灰色の丸は、大腸癌患者血清P１〜P8中に存在するポリペプチドを示す。各丸はその存在を明確にするため、少しずつスライドさせて表示されており、各丸の大きさはMALDI-TOF-MS分析のピークの強度を示す。また、図６〜図９の縦軸は質量／価数を横軸はHPLCの画分の番号を示す。【００５２】
図６〜図９に示された各画分のポリペプチドの分布を調べた結果、第６画分、第１５画分、及び第１８画分に健常者にはなく、大腸癌患者特異的なポリペプチドの分布が見られた。すなわち、図１０に大腸癌患者血清特異的に増加しているペプチド4種類のMSスペクトルを示す。図中のスペクトルは以下の通りである。【００５３】
図１０に示されているように、MALDI-TOF-MS法のスペクトルにより、各サンプルの画分No.６のスペクトルの一部（m/z=2092, 及び2163）、画分No.１５のスペクトルの一部（m/z=2188）、及び画分No.１８のスペクトルの一部（m/z=3505）に大腸癌患者血清特異的なペプチドが検出されている。【００５４】
前記特異的ペプチドの解析結果を図１１及び１２に示す。図１１は、図１０の各大腸癌マーカポリペプチドのMSスペクトル（健常者血清Ｎ１〜Ｎ8、大腸癌患者血清Ｐ１〜Ｐ8）の平均スペクトルである。また図１２は、これらのMSピークの強度の平均と標準偏差を表すグラフ（左）と各大腸癌マーカポリペプチドのMSピークの強度から求めたP値（右）を示し、そのＰ値はm/z=2092(A), m/z=2163(B), m/z=2188(C), m/z=3505(D) に対して、それぞれ0.0013, 0.0021, 0.0006, 0.0047であった。これらの結果に対応するポリペプチドを大腸癌マーカポリペプチドと判断した。【００５５】
（実施例４）  大腸癌マーカポリペプチドの同定
実施例３で得られた大腸癌マーカポリペプチドA、Ｂ、Ｄ及びＣの同定を行った。
（大腸癌患者血清の濃縮と分画）
同定においてはMSスペクトルの強度を大きくするために、大腸癌患者血清20μlを使用した点を除き、実施例１と同じ方法でポリペプチド等の濃縮を行った。【００５６】
すなわち、図３に示すK法のフローチャートに従い、大腸癌血清検体２０μlを分取し、試薬１(7M尿素, 2Mチオ尿素) 36μlと試薬２(200mM DTT) 4μlを加え、Vortexで混和した。その際、該血清、試薬１、及び試薬2は全て4℃に冷やして使用した。ついで該混合溶液を、4℃に冷却した高純度アセトンからなる1.8 mlの試薬3に滴下し、該滴下後すぐにvortexを用いて混和し、ついで4℃の環境で1時間撹拌した。該攪拌後、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で１５分間遠心分離し（19,000g）、得られた上清を完全に除去した。次いで、残留沈殿物に4℃の試薬4 (アセトニトリル70%, 塩酸12 mM、残部水) 800μlを加え、4℃で1時間撹拌したのち、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で１５分間遠心分離し（19,000g）、得られた上清を血清のポリペプチド濃縮溶液として回収した。【００５７】
次いで、該濃縮溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物に試薬5 (99.9% H2O, 0.1% TFA) 80μlを加えて溶解した。
次いで、得られた血清ポリペプチド濃縮溶液を逆相HPLCにより分画した。該分画は逆相HPLCの溶出時間２５〜８５分部分を１分間隔で６０分画に分取した。その分析条件は図４に示したとおりである。【００５８】
（ポリペプチドマーカのMS及びMS／MSスペクトル測定）
前記ポリペプチドマーカA, B, C及び Dの存在する凍結乾燥した分画物（A,B: 画分No.6, C:画分No.15, 及びD:画分No.18）を10μlの溶媒（50% アセトニトリル/ 0.1% TFA）に溶かした。該溶液1μlを取り、MALDI-TOF-MS分析し、MS スペクトル及び前記ペプチドマーカA, B, C及び DのMS/MSスペクトルを測定した。該測定は、タンデムMSスペクトル(MS/MSスペクトル)が測定できるMALDI-TOF-MS（Autoflex II TOF/TOF: Bruker Daltonics社、米国）を使用して行った。【００５９】
（MS及びMS／MSスペクトルの解析）
該測定によって得た、前記ペプチドマーカA, B, C及び DのMSスペクトル（正確な分子量）とMS/MSスペクトルから、MSスペクトル解析ソフトウエア Mascot (Matrix Science社, 米国) を利用し、NCBIデータベースで検索することにより各ペプチドマーカの同定を行った。ペプチドマーカA, B, D及びCのMascot Score はそれぞれ126, 106, 92, 162 であり、この結果から、各ペプチドの同定の信頼性はきわめて高いと考えられる。【００６０】
なお、本実施例のMSスペクトル解析ソフトウエア Mascotを利用した各ペプチドマーカの同定作業は下記の手順で行った。
まず、NCBIデータベース中の全タンパク質のアミノ酸配列の中から、対象ペプチドマーカのMSスペクトルから得られた分子量に、ある誤差範囲内で一致するペプチド断片を全てリストアップする。ここで該誤差範囲はMSスペクトル測定の質量精度に依存する。本実施例では観測されたm/z±100ppmを誤差範囲とした（m/zは質量とイオン価数の比、MSスペクトルの横軸はの値に対応）。【００６１】
次にリストアップされたポリペプチド全てのMS/MSスペクトルをシミュレートした。ここでシミュレートされたMS/MSスペクトルと、測定された対象ポリペプチドのMS/MSスペクトルを比較して、その一致程度をスコアとして評価した。該リストしたポリペプチドをスコアの高いものからそのペプチドの含まれるタンパク質とそのアミノ酸配列をスコアとともに表示した。【００６２】
各ポリペプチドの同定結果をそれぞれ図１３, 図１４及び図１５に示す。これらの結果から、大腸癌ペプチドマーカA、C及びDが配列番号１、５及び３に対応するポリペプチドであることが明らかになった。なお、図１３，１４及び１５には大腸癌マーカポリペプチドA、C及びDに対応するペプチド断片のB系列とY系列のm/zに対応する出力データ一覧を示した。本発明の大腸癌マーカは、該出力データを解析することにより同定したものである。なお、大腸癌マーカポリペプチドＢのデータはないが、該ポリペプチドＢはポリペプチドＡのN末端側にAla残基が付いたものであり、「Mascot Search による同定とポリペプチドＡのMS/MSスペクトルのB系列フラグメントの一致から、アミノ酸配列の確認を行うことができた。【００６３】
さらに、大腸癌ポリペプチドマーカA、C及びDの化学合成品を調製し、MS並びにMS／MS分析した結果、前記血清から得られた大腸癌ポリペプチドマーカA、C及びDと同様のMS／MSスペクトルを観測した。このことから、大腸癌マーカポリペプチドA、C及びDの同定結果が正しいことが確認できた。これらのMS／MSスペクトルデータを図２１に示した。【００６４】
（実施例５）  大腸癌ペプチドマーカの評価 
大腸癌摘出手術前と手術後の大腸癌患者血清中のペプチドマーカAの存在量の定量解析により、本発明の大腸癌ペプチドマーカを評価した。
一人の大腸癌患者の大腸癌摘出手術前と手術後の血清中のペプチドマーカAの存在量を安定同位体（13C）標識ペプチドマーカAを使用して定量解析を行った。その実験フローチャートを図１６に示す。この方法ではポリペプチド中の一部のアミノ酸の主鎖のカルボニル炭素を安定同位体炭素（13C）に置換した。このため質量以外の性質、つまりK法での濃縮効率、逆相HPLCの溶出時間、質量分析時のイオン化効率は同じである。したがって図１６に示すとおり、K法処理前の血清に一定量の13C標識ペプチドAを一定量導入し、MSスペクトル上でペプチドマーカAと13C標識ペプチドマーカAの強度を比較することにより、本来の血清中に存在するペプチドマーカAの存在量を定量することが出来る。【００６５】
図１８に13C標識ペプチドマーカAを使って大腸癌摘出手術前及び手術後の同一患者血清中に含まれているペプチドマーカAの濃度を定量解析した結果を示す。13C標識ペプチドマーカAと本来血清中に存在するペプチドマーカAのMSスペクトルの強度比は手術前に0.63：1であったが、手術後は0.15：1に減少していた。このことから血清中に存在するペプチドマーカAの濃度は手術前に15.8 fmol/mlであったものが、手術後に3.8 fmol/mlに減少していることがわかる。この実験を4回繰り返した結果、再現性は非常に高くCV値は5%以下であった。
この結果から、血清中のペプチドマーカAの存在量は体内の大腸癌の有無（または存在量）に相関しており、大腸癌診断マーカとしての十分な有効性があると評価できる。【００６６】
（実施例６）  １人の大腸癌患者血清における３種類のポリペプチドマーカＡ，Ｃ及びＤの定量とその結果  
まず、本発明のペプチドＡ、Ｃ及びＤと、その安定同位体標識ペプチドを用意した。該標識ペプチドと標識に用いた同位体は次のとおりである。
（安定同位体標識ペプチド）
＊下線のアミノ酸を下表の安定同位体標識アミノ酸（FMOC体）を使って化学合成
安定同位体標識ペプチドA
DEAGSEADHEGTHSTKRGHA  （配列番号：１）(分子量の増加分：17)            
安定同位体標識ペプチドC 
VNPFRPGDSEPPPAPGAQRAQ（配列番号：５）(分子量の増加分： 22)
安定同位体標識ペプチドD  
SETESRGSESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRG （配列番号：３）(分子量の増加分： 16)
【表１】
2009025080.tif 000002
該大腸癌患者の血清に、該血清１μｌ当たり、安定同位体標識ペプチドA2，C2及びD2をそれぞれ５０fmol、２．５fmol及び２５fmolを加えた。次いで、実施例１と同じ方法で前記大腸癌マーカポリペプチド成分を濃縮し、実施例２と同じ方法で該ポリペプチド成分を逆相HPLCにより６０分画に分取した。ポリペプチドマーカＡ，Ｃ及びＤを含む分画を濃縮した後、MALDI-TOF-MS分析を行った。該分析データを図22に示した。データＡから、ポリペプチドマーカＡの血清中濃度は約120 ng/ml、データＣからポリペプチドマーカＣは約４ng/ml、かつデータＤからポリペプチドマーカＤは約60 ng/mlであることが判った。【００６７】
（実施例７）  大腸癌患者血清における３種類のポリペプチドマーカＡ，Ｃ及びＤの診断応用可能性の評価
大腸癌摘出手術前と手術後の大腸癌患者５人の血清中のペプチドマーカＡ，Ｃ及びＤの存在量の定量解析により、本発明の大腸癌ペプチドマーカを再評価した。該評価には、実施例６と同じ安定同位体標識ペプチド、及び解析手順を用いた。なお、該血清１ml当り、安定同位体標識ペプチドＡ２、Ｃ２及びＤ２をそれぞれ25fmol、5fmol及び50ｆmolを加えた点だけが相違している。【００６８】
下記表２に大腸癌摘出手術前及び手術後の５人の患者血清中に含まれているポリペプチドマーカＡ，Ｃ及びＤの濃度を定量解析した結果を示した。表２に示されているように患者１〜５では、手術前はポリペプチドマーカＡ，Ｃ及びＤの濃度は高く、手術後はその濃度は明らかに下がっている。この結果から、血清中における、本発明のポリペプチドマーカの存在量は体内の大腸癌の有無（または存在量）に相関しており、大腸癌診断マーカとしての十分な有効性があると考えられる。
【表２】
2009025080.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】タンデム型ＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）質量分析における4残基のペプチドの開裂パターンを示す。
【図２】本発明の大腸癌マーカポリペプチド探索の手順を示すフローチャートである。
【図３】血清に含まれる大腸癌マーカポリペプチド成分の濃縮手順を示すフローチャートである。該濃縮方法をK法と呼ぶ。
【図４】実施例２で血清から得たポリペプチド濃縮溶液を、逆相HPLCにより分画した際の分析条件を示す。
【００７０】
【図５】実施例３で、逆相HPLCで得たポリペプチドの分画を示す。
【図６】実施例３で、逆相HPLCで得たポリペプチドの各分画を MALDI-TOF-MS分析した結果であり、各画分における健常者血清N１〜N８及び大腸癌患者血清P１〜P8のポリペプチドの存在を示す。図６〜図９における白丸は、健常者血清N１〜N８中に存在するポリペプチドを示し、灰色の丸は、大腸癌患者血清P１〜P8中に存在するポリペプチドを示す。
【図７】実施例３で、逆相HPLCで得たポリペプチドの各分画における健常者血清N１〜N８及び大腸癌患者血清P１〜P8のポリペプチドの存在を示す。
【図８】実施例３で、逆相HPLCで得たポリペプチドの各分画における健常者血清N１〜N８及び大腸癌患者血清P１〜P8のポリペプチドの存在を示す。
【図９】実施例３で、逆相HPLCで得たポリペプチドの各分画における健常者血清N１〜N８及び大腸癌患者血清P１〜P8のポリペプチドの存在を示す。
【００７１】
【図１０】MALDI-TOF-MS法のスペクトルにより、画分No.６のスペクトルの一部（m/z=2092, 及び2163）、画分No.１５のスペクトルの一部（m/z=2188）、及び画分No.１８のスペクトルの一部（m/z=3505）に大腸癌患者血清特異的なペプチドが検出されていることを示すデータである。
【図１１】各大腸癌マーカポリペプチドのMSスペクトル（健常者血清Ｎ１〜Ｎ8、大腸癌患者血清Ｐ１〜Ｐ8）の平均スペクトルを示したグラフである。
【図１２】各大腸癌マーカポリペプチドのMSピークの強度の平均と標準偏差を示すグラフ（左）と、各大腸癌マーカポリペプチドのMSピークの強度から求めたP値（右）を示し、そのＰ値はm/z=2092(A), m/z=2163(B), m/z=2188(C), m/z=3505(D) に対して、それぞれ0.0013, 0.0021,0.0006, 0.0047であった。
【図１３】大腸癌マーカポリペプチドAの同定結果を示すデータである。この結果から、大腸癌ペプチドマーカAは、配列番号１に対応するポリペプチドであることが明らかになった。
【００７２】
【図１４】大腸癌マーカポリペプチドCの同定結果を示すデータである。この結果から、大腸癌ペプチドマーカCは、配列番号５に対応するポリペプチドであることが明らかになった。
【図１５】大腸癌マーカポリペプチドDの同定結果を示すデータである。この結果から、大腸癌ペプチドマーカDは、配列番号３に対応するポリペプチドであることが明らかになった。
【図１６】安定同位体標識ポリペプチドを使ったマーカポリペプチドAの定量解析のフローチャートを示す。
【図１７】安定同位体標識ポリペプチドの概念図である。
【図１８】13C標識ペプチドマーカAを使って大腸癌摘出手術前及び手術後の同一患者血清中に含まれているペプチドマーカAの濃度を定量解析した結果を示す。
【図１９】図１９は大腸癌ポリペプチドマーカーの同定のためのタンデムMS測定（MS/MS測定）の結果であり、同定したペプチドが実際にそのペプチドであることを裏付けるデータである。図１９の(a)及び(b)はそれぞれペプチド B及びＡのMS/MSスペクトルである。さらに、そのMS/MSスペクトル測定結果を解釈した結果を示している。図13〜図15はペプチドA, C, Dのこのデータの解釈をまとめた表である。
【図２０】図２０は大腸癌ポリペプチドマーカーの同定のためのタンデムMS測定（MS/MS測定）の結果であり、同定したペプチドが実際にそのペプチドであることを裏付けるデータである。図２０の(c)及び(d)はそれぞれペプチドＣ及びＤのMS/MSスペクトルである。さらに、そのMS/MSスペクトル測定結果を解釈した結果を示している。図13〜図15はペプチドA, C, Dのこのデータの解釈をまとめた表である。
【図２１】図２１の(a)〜(c)はそれぞれペプチドＡ,Ｃ及びＤの同定結果から得られたアミノ酸配列をもとに化学合成したペプチドのMS/MSスペクトルの測定結果（黒色スペクトル、下段）と、図１９の(a)及び, 図２０の(c)及び (d)のMS/MSスペクトル（灰色スペクトル、上段）を比較して示したものである。本図は、本発明のペプチドが、先に同定されたアミノ酸配列に間違いないことを示している。
【図２２】図２２は１人の大腸癌患者血清中における大腸癌ポリペプチドマーカＡ,Ｃ及びＤの存在量を示す、MS/MSスペクトルデータである。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
（配列番号：１）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドＡのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはフィブリノーゲンα鎖の第６０５残基〜第６２４残基の部分ペプチドである。
（配列番号：２）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドＢのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはフィブリノーゲンα鎖の第６０４残基〜第６２４残基の部分ペプチドである。
（配列番号：３）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドDのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはフィブリノーゲンα鎖の第５４２残基〜第５７４残基の部分ペプチドである。
（配列番号：４）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドA、B及びDのアミノ酸配列を含む、フィブリノーゲンα鎖のアミノ酸配列である。対応遺伝子の名称はＦＧＡである。
（配列番号：５）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドＣのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはジキシン(Zyxin)の第３６残基〜第５６残基の部分ペプチドである。
（配列番号：６）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドCのアミノ酸配列を含む、ジキシンのアミノ酸配列である。対応遺伝子の名称はＺＹＸである。【００７４】
（配列番号：７）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドＡのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：８）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドBのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：９）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドDのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：１０）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドCのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。【００７５】
（配列番号：１１）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドＡのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：１２）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドBのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：１３）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドDのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：１４）  本発明の大腸癌マーカポリペプチドCのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月17日(2009.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチド。
【請求項２】
下記（１）又は（２）のポリペプチドを含み、配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド断片：
（１）配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１５アミノ酸残基を含む、請求項２記載のポリペプチド断片。
【請求項４】
少なくとも２０アミノ酸残基を含む、請求項２記載のポリペプチド断片。
【請求項５】
少なくとも２５アミノ酸残基を含む、請求項２記載のポリペプチド断片。
【請求項６】
配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料から検出することを特徴とする、大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項７】
前記体液試料が、血清又は血漿である、請求項６記載の大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項８】
前記体液試料から、キャリアタンパク質を除去する工程をさらに含む、請求項６又は７記載の大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項９】
被験者から得た体液試料と、前記大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体とを接触させる工程を有する、請求項６〜８のいずれか１項記載の大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項１０】
被験者から得た体液試料を、質量分析することにより、該大腸癌マーカポリペプチドを検出する、請求項６〜８のいずれか１項記載の大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項１１】
同位体元素でラベルされ、かつ配列番号１、２、３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む比較用大腸癌マーカポリペプチドを用いる、請求項１０記載の大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項１２】
前記同位体が酸素原子、炭素原子、水素原子又は窒素原子である、請求項１１記載の大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項１３】
配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を、被験者から得た体液試料から検出することを特徴とする、大腸癌転移の可能性を示す大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項１４】
前記体液試料が血清又は血漿である、請求項１３記載の大腸癌転移の可能性を示す大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項１５】
前記体液試料からキャリアタンパク質を除去する工程をさらに含む、請求項１３又は１４記載の大腸癌転移の可能性を示す大腸癌マーカ陽性者の検出方法。
【請求項１６】
配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体である、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
請求項２記載のポリペプチド断片を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を製造する方法。
【請求項１９】
配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を少なくとも１種含有する、大腸癌診断用キット。
【請求項２０】
配列番号１又は２のアミノ酸配列のみを含む、又は配列番号３、及び５のいずれか１のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を少なくとも１種含有する、大腸癌転移の診断用キット。
【国際調査報告】
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