【手続補正書】
【提出日】平成17年4月5日(2005.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管に生物試料を採取し、
(b)  核酸を含む沈殿を形成し、
(c)  段階(b)の沈殿を上清から分離し、
(d)  前記の段階(c)の沈殿を緩衝液で溶解し、懸濁液を形成し、
(e)  自動機器を使って前記の段階(d)の懸濁液から核酸を単離し、
(f)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(g)  自動機器を使って前記の段階(f)の分散混合試薬内で前記の段階(e)で単離した核酸を分散/分布させ、および
(h)  自動装置中で前記段階(g)の核酸/RT-PCR混合試薬を使って転写物の生体内レベルを測定する段階、
を含む生物試料からの生体内RNAの定量法。
【請求項２】
段階(a)と(b)を同時に実施する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記の段階(a)の化合物が4級アミン界面活性剤を含む請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記の4級アミンがシュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の段階(a)の化合物が、PAXgene(商標)血中RNA採取管に含まれるような、細胞RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物である請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記の段階(a)の採取管が開放または閉鎖採血管である請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の段階(d)の緩衝液がグアニジンチオシアネート含有緩衝液である請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記のグアニジンチオシアネート含有緩衝液が、MagNA Pure LC mRNA単離キットＩ(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)が提供するような、溶解緩衝液である請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記の段階(e)の核酸の単離をRNA捕捉ビーズを使って実施する請求項1〜8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の段階(e)、段階(f)および/または段階(g)の自動機器がMagNA Pure LC装置(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)である請求項1〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記の生体内レベルをリアルタイムPCRを使って測定する請求項1〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記定量を生物試料100μlを使って実施する請求項1〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
(a)  PAXgene(商標)血中RNA採取管に生物試料を採取し、
(b)  界面活性剤/核酸複合体をグアニジンイソチアネート緩衝液で解離し、
(c)  再現性のある自動機器を使ってmRNAおよび/または総RNAを抽出し、
(d)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(e)  自動機器を使って段階(d)の分散混合試薬内に段階(c)で単離した核酸を分散/分布させ、および
(f)  リアルタイムPCRによってRNAを定量し、その場合、RTとPCRを一段階で実施する段階、
を含む生物試料からの生体内RNAの定量法。
【請求項１４】
(a)  随意に、生物試料用採取管と、
(b)  RNAの分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物と、
(c)  自動RNA単離用試薬と
(d)  RT-PCR同時反応用混合試薬またはそれの個別の化合物で、前記混合試薬の自動分散が可能な試薬と、
(e)  随意に、前記RT-PCR反応を実施する特異的オリゴヌクレオチドと、および
(f)  随意に、自動RNA単離法、混合試薬の自動分散およびRT-リアルタイムPCR用単離核酸の分散の方法、並びに、自動RNA分析法について説明している解説マニュアル
を含む生物試料からの定量可能な生体内RNAを単離するキット。
【請求項１５】
前記の品目(b)の化合物が請求項3〜5のいずれか１項に記載の方法に規定したような化合物である請求項14に記載のキット。
【請求項１６】
さらに、請求項7または8に記載の方法に規定したように緩衝液を提供する請求項14および15に記載のキット。
【請求項１７】
(a)  PAXgene(商標)血中RNA採取管と、
(b)  グアニジンイソチオシアネート緩衝液と、
(c)  自動RNA単離用試薬と、
(d)  RT-PCR同時反応用混合試薬またはそれの個別の化合物で、前記混合試薬の自動分散が可能な試薬と、
(e)  随意に、前記RT-PCT反応を実施する特異的オリゴヌクレオチドと、および
(f)  随意に、自動RNA単離法、RT-リアルタイムPCRのための混合試薬の自動分散および単離した核酸の分散の方法、並びに、自動RNA分析法について述べた解説マニアル
を含む生物試料からの定量可能な生体内RNAを単離するキット。
【請求項１８】
生物試料からのDNAの定量法で、請求項1〜13のいずれか１項の方法に従ってRNAの定量を実施する場合該方法を使用し、RT反応を省略し、段階(a)の化合物がDNAを分解から保護することも行うDNAの定量法。
【請求項１９】
生物試料からの定量可能なDNAを単離するキットで、前記のRT反応実施用の混合試薬/化合物を含まない請求項14〜17のいずれか１項に記載の単離キット。
【請求項２０】
生物試料中に存在する生物因子中の生体内核酸レベル変化のモニタリング/検出用の、請求項1〜13のいずれか１項、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２１】
前記生物因子を真核細胞、原核細胞、ウイルスおよびファージから成る群から選択する、請求項20に記載の方法またはキットの使用。
【請求項２２】
特定の疾患の診断を目的とした、生物試料中の生物因子の生体内核酸変化のモニタリング/検出用の、請求項1〜13のいずれか１項、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２３】
疾患治療用医薬品の生産のために化合物をスクリーンすることを目的とした、生物試料中の生物因子の生体内核酸変化のモニタリング/検出用の、請求項1〜13のいずれか１項、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法で同定可能な化合物。
【請求項２５】
前記疾患が免疫関連疾患であることを特徴とする請求項22もしくは23に記載の方法またはキットの使用。
【請求項２６】
化合物の検出/モニタリング/スクリーニング用の方法またはキットの使用で、前記化合物を、真核細胞、原核細胞、ウイルス、ファージ、寄生体、薬物 (天然エキス、有機分子、ペプチド、タンパク質、核酸)、医療、ワクチンおよび移植片から成る群から選択できる免疫調節化合物である請求項23に記載の方法またはキットの使用。
【請求項２７】
エピトープ特異性CTLまたは免疫関連転写物の検出/モニタリング用の、請求項1〜13のいずれか１項、または請求項18に記載の方法の使用、または、請求項14〜17のいずれか１項、または請求項19に記載のキットの使用。
【請求項２８】
(a)  免疫調節因子を対象に適用し、
(b)  前記対象から全血を採取し、
(c)  随意に、段階(b)の全血試料中に存在する血球に、段階(a)で適用したものと同一/類似および/または異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(d)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に段階(c)のパルス適用血球または段階(b)のパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用/非適用血球に添加し、
(e)  核酸を含む沈殿を形成し、
(f)  段階(e)の沈殿を上清から分離し、
(g)  緩衝液を使って前記の段階(f)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(h)  自動機器を使って前記の段階(g)の懸濁液から核酸を単離し、
(i)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(j)  自動機器を使って段階(i)の分散混合試薬内に、段階(h)で単離した核酸を分散/分布させ、
(k)  自動装置で段階(j)の分散溶液中のエピトープ特異性CTL-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(l)  前記対象の免疫学的体質を改変できる薬剤を同定し、その場合、段階(a)の薬剤がすでに対象中に存在する場合、段階(a)を省略する段階
を含むエピトープ特異性CTLの分析によって対象の免疫学的体質を改変できる因子を同定する方法。
【請求項２９】
(a)  免疫調節因子を対象に適用し、
(b)  前記対象から全血を採取し、
(c)  随意に、段階(b)の全血試料中に存在する血球に、段階(a)で適用したものと同一/類似および/または異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(d)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に段階(c)のパルス適用血球または段階(b)のパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用/非適用血球に添加し、
(e)  核酸を含む沈殿を形成し、
(f)  段階(e)の沈殿を上清から分離し、
(g)  緩衝液を使って前記の段階(f)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(h)  自動機器を使って前記の段階(g)の懸濁液から核酸を単離し、
(i)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(j)  自動機器を使って段階(i)の分散混合試薬内に、段階(h)で単離した核酸を分散/分布させ、
(k)  自動装置で段階(j)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(m)  前記対象の免疫学的体質を改変できる薬剤を同定し、その場合、段階(a)の薬剤がすでに対象中に存在する場合、段階(a)を省略する段階
を含む対象の免疫学的体質を改変できる因子を同定する方法。
【請求項３０】
(a)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に対象から全血を採取、もしくは、前記化合物を血球に添加し、
(b)  核酸を含む沈殿を形成し、
(c)  段階(b)の沈殿を上清から分離し、
(d)  緩衝液を使って前記の段階(c)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(e)  自動機器を使って前記の段階(d)の懸濁液から核酸を単離し、
(f)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(g)  自動機器を使って段階(f)の分散混合試薬内に、段階(e)で単離した核酸を分散/分布させ、
(h)  自動装置で段階(g)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、および
(i)  免疫-関連転写物の生体内レベルの変化を検出/モニターし、および
(j)  免疫系に影響を与える疾患の診断/予後判定/モニタリングを行う段階
を含む対象の免疫系に影響を与える臨床状態の診断/予後判定/モニタリングの方法。
【請求項３１】
(a)  対象から全血を採取し、
(b)  段階(a)の全血試料中に存在する血球に、前記対象中にあるものと同一/類似/異なる免疫調節因子と共に、パルスを適用し、
(c)  RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を含む採取管内に、段階(b)のパルス適用血球またはパルス非適用血球を採取、もしくは、前記化合物をパルス適用細胞に添加し、
(d)  核酸を含む沈殿を形成し、
(e)  段階(d)の沈殿を上清から分離し、
(f)  緩衝液を使って前記の段階(e)の沈殿を溶解し、懸濁液を形成し、
(g)  自動機器を使って前記の段階(f)の懸濁液から核酸を単離し、
(h)  自動機器を使ってRT-PCR用混合試薬を分散/分布させ、
(i)  自動機器を使って段階(h)の分散混合試薬内に、段階(g)で単離した核酸を分散/分布させ、
(j)  自動装置で段階(i)の分散溶液中の免疫-関連転写物の生体内レベルを検出/モニター/分析し、
(k)  免疫-関連転写物の生体内レベルの変化を検出/モニターし、および
(l)  免疫系に影響を与える疾患の診断/予後判定/モニタリングを行う段階
を含む対象の免疫系に影響を与える臨床状態の診断/予後判定/モニタリングの方法。
【請求項３２】
免疫関連疾患を、自己免疫、関節リウマチ、多発性硬化症、癌(例、癌免疫療法)、免疫不全症(例、AIDS)、アレルギー、移植片拒絶反応または移植片対宿主疾患(GVHD)(例、移植)から成る群から選択し、あるいは免疫調節化合物または免疫調節因子が前記疾患のいずれかに影響を与え；あるいは、免疫関連転写物またはエピトープ特異性CTL関連またはTヘルパーリンパ球関連転写物の変化が、前記疾患のいずれかの存在を示唆し；あるいは、免疫学的状態が前記疾患のいずれか１の状態を示す請求項25〜31のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項３３】
前記免疫関連転写物がケモカイン、サイトカイン、増殖因子、細胞傷害マーカー、転写因子、TNF関連サイトカインレセプター上科構成物およびそれらのリガンド、アポトーシスマーカー、イムノグロブリン、T-細胞レセプター、および既知または発見対象の免疫系の活性化または抑制に関連するいずれか１のマーカーをコードする核酸から成る群から選択される請求項32に記載の使用または方法。
【請求項３４】
前記核酸が、IL-1ra、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、TGF-β、並びに、免疫応答に関与する、もしくは、関与しないいずれか１のインターロイキンまたはサイトカインから成る群から選択されるマーカーをコードする請求項33に記載の使用または方法。
【請求項３５】
前記のエピトープ特異性CTL-関連またはTヘルパーリンパ球関連転写物を、サイトカイン、サイトカインレセプター、サイトトキシン、炎症または抗炎症メディエーター、TNF-関連サイトカインレセプター上科構成物およびそれらのリガンド、G-タンパク結合レセプターおよびそれらのリガンド、チロシンキナーゼレセプターおよびそれらのリガンド、転写因子、並びに、細胞内シグナリング経路に関与するタンパク質をコードする核酸から成る群から選択される請求項32に記載の使用または方法。
【請求項３６】
前記核酸が、グランザイム、パーフォリン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、イムノグロブリンおよびイムノグロブリン上科レセプター、FasおよびFas-リガンド、T-細胞レセプター、ケモカインおよびケモカインレセプター、タンパクーチロシンキナーゼC、タンパクーチロシンキナーゼA、シグナル伝達性転写因子(STAT)、NF-kB、T-bet、GATA-3、Oct-2から成る群から選択されるマーカーをコードすることを特徴とする請求項35に記載の使用または方法。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
しかし、この種の検査での大きな難点は、特に、低レベルRNAまたは不安定RNAの検出を目的とする場合、RNAが試験管内で不安定な点である。RNAの小分画のみの分解でさえ、生体内レベルの解釈が変わってしまう可能性がある。ある転写物は、１つの細胞中に低コピーで存在することが知られている；他の転写物は、その3'-末端に「AU-リッチ」配列を有し、体内リボヌクレアーゼによる該転写物の急速分解を促進する。RNAは試料採取後数時間以内にかなり急速分解することが研究によって立証されている。さらに、特定種のRNAは、いったん試料を採取すると、遺伝子誘導プロセスを介して増加する。RNA分解も、試験管内遺伝子誘導も、共に、生体内遺伝子転写物数の過大または過小評価を招く可能性がある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
生物試料採取時のRNA分解および/または遺伝子誘導の抑制は、生体内転写物レベルの決定に使用できるRNAプールの回収に不可欠である。PAXgene(商標)血中RNAシステムを使って細胞RNAを精製できることは事実である；それでもなお、本発明は、真の生体内レベルをこのシステム「自体」では測定できないことを証明している(実施例2参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は、細胞外および/または細胞内RNA分解および/または遺伝子誘導を抑制する化合物を使って、安定化した生物試料から調製したRNAプールから出発した時に初めて、核酸の生体内レベルを測定/決定/定量できることを本発明の中で証明している；その場合、核酸の単離を自動装置で実施し、それによって、RT-PCR反応に使用する混合試薬と単離した核酸を自動装置を使って分散させ、それによって自動装置で転写物レベルの決定を実施する。本発明によれば、この手法だけが再現性を持って生体内RNAを定量できる。誤差を避けるために、前記方法で実施する段階数を最小まで減少させる。「誤差」は、ピペット操作、処理上および/または計算上の誤差、あるいは、当業者が起こし得る任意の誤差であると思われる。この点で、本発明は、一段階でRTおよびPCR反応を実施することを提言する。本発明の方法は、より多くの中間段階を組み合わせると、一層正確になる。例えば、本発明の方法では、段階(a)と段階(b)を組み合わせることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の方法によれば、吸光度の測定を実施する必要がなく、核酸濃度の計算で生じる誤差を排除している。これに反して、PAXgene(商標)血中RNAキットを使うと、吸光度測定を行う必要がある。これは、やはり、本発明に記載の方法が、後者のシステムに比較して信頼性があり、正確であることを示している。本発明のこの、さらに良好な精度を、表3に示す再現性試験で示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本方法の段階(c)の上清からの沈殿の「分離」は、遠心分離、濾過、吸収または当業者に既知の他の手段で実施できる。前記沈殿は、細胞、細胞/残屑、核酸またはそれらの混合物であることができる。考え方の基本は、核酸含有因子(即ち、生物因子)を外部原因/パルス/シグナルと接触させないようにすることである。これは、核酸含有因子の固定、溶解および/または崩壊によって、あるいは、当業者に既知の他の任意の手段によって実施できる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の方法の段階(d)で使用する緩衝液は、前記方法の段階(c)で得た沈殿を溶解する緩衝液であることができる。この緩衝液は、核酸含有因子の溶解または溶解進行などの追加作用を有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明によれば、これらの採取管の内容物は、4級アミン界面活性剤を含むことができる。そのため、本発明によれば、4級アミン界面活性剤は、本発明の方法の段階(a)で使用できる。生物試料中の核酸を安定化する4級アミン界面活性剤の使用は、これまでに、米国特許5,010,183に記述されている。この特許は、生物学的材料の混合物からのDNAまたはRNAを精製する方法を提供している。前記方法は、RNAまたはDNAを含有する混合物に陽イオン洗浄剤を、細胞を溶解するのに十分な量で添加する段階を含み、混合物中に汚染したタンパク質および脂質を可溶化し、核酸と該洗浄剤の間に疎水性複合体を形成する。従って、該洗浄剤との、RNAまたはDNAを含む複合体は、可溶化汚染物質から分離される。もっと最近の特許では、同発明者は、米国特許5,010,183で述べた界面活性剤と他の市販界面活性剤がRNAの非効率的な沈殿と血球の不完全な溶解をきたす、と述べている。この目的のために陽イオン界面活性剤の改良が必要であるので、米国特許5,010,183の発明者は、選択した4級アミンを含む水性陽イオン界面活性剤溶液の使用に関し、血液を含めた生物試料からのRNAの新規単離法を探究した(米国特許5,985,572)。生物試料からのRNAを安定化することのできる新規水性4級アミン界面活性剤は、WO94/18156とWO02/00599にも述べられている。本発明のどの方法にも使用できる様々な、可能性のある界面活性剤の合成は、上に引用したまたは関連の特許に公にされた説明に従って実施できる。本発明の方法で使用できる4級アミンの1例は、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムである(米国特許5,985,572)。別法として、前記陽イオン洗浄剤は、本発明の実施例1に示すように、Catrimox-14(商標)(米国特許5,010,183)であることができる。さらに、前記生物試料を安定化させるため、前記出願は、カラムクロマトグラフィーなどの従来の技術を使った核酸の単離を述べている。供給元は、PAXgene(商標）血中RNA採取管とPAXgene(商標）血中RNAキット(カラムクロマトグラフィーにも適用)の併用を義務付けているので、PAXgene血中RNA採取管に存在する化合物が前記のクロマトグラフィー法だけに適合するという印象を与えている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明の実施例において、PAXgene血中RNA採取管内で形成される沈殿は、MagNA Pure LC mRNA単離キットI(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)が提供する、溶解緩衝液に溶解する。そのため、本発明では、本発明の方法で使用できる、可能な緩衝液の１つは、MagNA Pure LC mRNA単離キットI(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)が提供する、グアニジンチオシアネート含有溶解緩衝液である、と提案する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明によれば、いったんMagNA Pure LC mRNA単離キットIが提供するものなどの溶解緩衝液に段階(d)の沈殿を溶解すると、本発明の方法は、MagNA Pure LC mRNA単離キットIについて述べたとおりの手順に従うことができる。溶解緩衝液中カオトロピック塩の存在下で試料を溶解した後、ストレプトアビジンコート磁気粒子をビオチン標識オリゴdTと合わせて添加することによって、mRNAが該粒子の表面に結合する。この後、デオキシリボヌクレアーゼ消化段階を行う。次に、マグネットと数段階の洗浄によってmRNAを非結合物質から分離する。最後に、精製されたmRNAを溶離する。この単離キットは、「ウォークアウェイ（Walk away）」システムとして、純型mRNAの自動単離を可能にする。該キットによって、遺伝子発現分析上、あらゆる主要な下流への適用に適した良質で完全なmRNAの単離が可能になる。使用する試料材料に応じた様々なプロトコルが提供される。MagNA Pure LC装置台に試料を直接セットできる。全血を使用する場合、試料中に存在する細胞を優先的に手動で溶解する。次に、mRNA単離を後回しにするか、該装置で直接処理を進めることができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明は、本実施例において、本発明に記載の方法の段階(e)、段階(f)および/または段階(g)で、自動機器としてMagNA Pure LC装置(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)を使用すると、転写物の正確な/真の生体内レベルの決定に使用できる貯留RNAを生成することを証明している。ストレプトアビジン-ビオチン系または同等の系によってオリゴdTをコートした磁気ビーズなどのRNA捕捉ビーズを本発明の方法で適用し、細胞残屑からmRNAを分離できる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
上記のように、血液試料を使用する場合、本発明の方法の段階(a)の後に優先的に赤血球を溶解する。MagNA Pure LC mRNA単離キットI(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)の設計では、白血球からmRNAを単離する前に赤血球を溶解、除去できる可能性がある。それでもなお、この段階があるために、mRNAの分解を避けるだけの速さで試料を処理することはできない。本発明者等は、MagNA Pure装置上でMagNA Pure LC mRNA単離キットと結合してPAXgene(商標）血中RNA採取管を使用することを決定した。PAXgene(商標）血中RNA採取管の使用は、懸濁して、MagNA Pure LC mRNA単離キットの溶解緩衝液に可溶になるとは思われない核酸沈殿を生じる。しかし、本発明者等は、それが実際には可能であることを見いだした。この観察に従って、本発明者等は、PAXgene(商標）血中RNA採取管の使用を自動RNA単離システムの使用と組み合わせた。驚くべきことに、本発明者等は、この組み合わせが可能であり、この組み合わせが生物試料からのmRNA定量の高性能技術を提供することを見いだした。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
本発明によれば、前記核酸は、グランザイム、パーフォリン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、イムノグロブリンおよびイムノグロブリンスーパーファミリーレセプター、FasおよびFasリガンド、T-細胞レセプター、ケモカインおよびケモカインレセプター、タンパクーチロシンキナーゼC、タンパクーチロシンキナーゼA、シグナル伝達性転写因子(STAT)、NF-kB、T-bet、GATA-3、Oct-2から成る群から選択できるマーカーをコードできる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
Hartelらは、最近、末梢血中のサイトカインmRNAの自然産生に対する細胞精製手順の影響を分析した(Hartelら、2001)。彼らは、新鮮単離末梢血単核細胞(PBMC)が、同一人から新鮮採取した全血よりも高いレベルのIL-2、IL-4およびTNF-α mRNAを発現することを示したが、IFN-γ mRNAレベルの差は認められなかった。異なる6名のIFN-γの比較を実施し、異なる結果を認めた。全ドナーの全血中にIFN-γ mRNAの顕著な発現が認められ、これは、PBMCでは、明らかに減少する(図2.1)。得られた結果とHartelらの結果の差は、これらのHartelらの結果が定量的リアルタイムPCR技術を使用したという事実があるにもかかわらず、全血からの総RNAの単離に使用した手順と関連付けることができた。Hartelらは、等張塩化アンモニウム処理によって2時間以内に溶血させたヘパリン化血液を使用した。本方法では、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムを使用した。これは、Catrimox-14(商標)(Qiagen, Westburg, Leusden, オランダ)と呼ばれる陽イオン界面活性剤試薬で、血液と直接混合して、抗凝固剤を使用しないというものである(DahleとMacfarlane、(1993)；Schmidtら、(1995)）。さらに、この試薬は、試料採取後1分で核酸沈殿とヌクレアーゼ阻害を誘発する。これは、生体内mRNA状態に最も近いと思われる総RNAの調合液を提供する。これは、3'非翻訳領域に位置するAU-リッチ配列によって内在ヌクレアーゼに感受性を示すサイトカインmRNAにとって特に重要である。リアルタイムPCR技術を使うと、実際、末梢血IFN-γ mRNAが自然に、かつ、急速に分解し、レベルは、血液採取から1時間ですでに、約50%減少することが認められた。しかし、この現象は、全サイトカインには、必ずしも当てはまらない。IL-10 ｍRNAレベルが、血液採取後、少なくとも5時間は安定であると判明したからである(図2.2)。さらに、PBMCの場合と比較して、全血IL-10 mRNAレベルの有意差は認められなかった(図2.1)。
Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002で使用したリアルタイムPCR用オリゴヌクレオチド
【表１】
2005514065.tif 000001
Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002で使用した標準調製品用オリゴヌクレオチド
【表２】
2005514065.tif 000002
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
Catrimox-14(商標)溶解後に得られた核酸ペレット(図2.1の説明参照)は、ChomczynskiとSacchi(1987)が述べたグアニジウム/チオシアネート溶液、並びに、市販のもの、例えばTripure(商標)(Roche Diagnositic, Molecular Biochemicals, ブリュッセル、ベルギー)などに溶解し、この界面活性剤の使用を特に容易にする。これは、Catrimox-14(商標)による第一段階を除いて、RNA単離手順が全血と細胞で同一であることを意味する。別法として、PAXgene(商標)血中RNA採取管(Qiagen、Westburg、Leusden、オランダ)をCatrimox-14(商標)の代わりに使用できた。この場合、得られるペレットは、図2.2の説明でCatrimox-14(商標)について述べるように、「MagNA Pure LC mRNA単離キットI」の溶解緩衝液に溶解できる。ヒト単核血球によるIL-10 mRNAの自然産生の特徴付け(Stordeurら、(1995))、およびOKT3モノクロナール抗体による生体内組織因子mRNA誘導のモニタリング(Pradierら、(1996))は、Catrimox-14の使用が成功した2例である。全血へのイオノフォアA23187+フォルボールミリステートアセテートの添加後、強力なIL-2 mRNA誘導も認められており(表示せず)、これは、全血に関する採取管内試験へのその使用を示唆している。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
本実施例で行なった観察は、末梢血サイトカインmRNAを正確に定量するために、できるだけ速やかに溶解した全血からRT-PCRを実施することの重要性を強調している。この目的で、Catrimox-14などの試薬やPAXgene(商標)血中RNA採取管に含まれる添加剤の使用は、リアルタイムRT-PCRと共に、現在まで最良の手順であると思われる。そうすることによって、イオノマイシンやフィトヘムアグルチニンなど、採取管内で強力な刺激物質を使用することなく、末梢血球の自然状態の検討が可能であると思われる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
全実験は、PAXgene(商標)血中RNAシステム (Qiagen)が推奨するとおりにPAXgene(商標)血中RNA採取管に直接採取した末梢静脈血から実施した(即ち、血液2.5 mlを詳細不明の試薬6.9 mlを含む採取管内に真空採取した)。溶解完了後、採取管の内容物を2本の他の採取管に移した：PAXgene血中RNAキットに4.7mlを、MagNA Pure抽出に0.4mlを使用した。残りのライセートは、廃棄した。これらの2本の採取管を2,000 gで10分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、核酸ペレットを以下の方法で処理した。
a) PAXgene(商標)血中RNA採取管＋PAXgene(商標)血中RNAキット....水で洗浄した後、該当する説明書で推奨するとおりに総RNA抽出用BR1緩衝液に溶解した。PAXgene(商標)血中RNAシステムの手順は、次のとおりである：血液試料(2.5 ml)をPAXgene血中RNA採取管に採取し、希望すれば、室温で保存または運搬できる。RNA単離は、PAXgene血中RNA採取管内にペレットを形成する遠心分離段階で開始する。該ペレットを洗浄し、プロテイナーゼKを添加し、タンパク消化を起こす。アルコールを添加して、結合条件を調整し、該試料をPAXgene(商標)血中RNAキットが提供するスピンカラムにかける。短時間の遠心分離の間に、RNAをPAXgene(商標)血中RNAキットが提供するシリカゲル膜に選択的に結合させ、汚染物を通過させる。洗浄段階後、至適化した緩衝液でRNAを溶出する。Stordeurら(「Cytokine mRNA Quantification by Real Time PCR」J Immunol Methods, 259 (1-2)：55-64, 2002)の記述どおりにIFN-γおよびβ-アクチン mRNAの逆転写およびリアルタイムPCRを実施した。
-b) PAXgene(商標)血中RNA採取管+ +MagNA Pure LC mRNA単離キットI-...MagNA Pure LC mRNA単離キットの溶解緩衝液300μlに溶解した。次に、Roche Diagnostics, Molecular Biochemicalsの指示に従って、最終溶出量100μl中のｍRNAの抽出および精製をMagNA Pure LC装置で実施した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
結論：
実施例2は、MagNA Pure LC mRNA単離キットIと組み合わせてPAXgene(商標)血中RNA採取管を使用できること、また、さらに正確にいうと、そのキットに含まれる溶解緩衝液中にPAXgene(商標)血中RNA採取管からの沈殿を溶解でき、この溶解緩衝液を必ず該キットの他構成要素と使用しなければならないことを示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
移植片拒絶反応のモニタリングは、本質的に、患者の尿または血液中で、もしくは、移植臓器の生検標本の分析時に測定するマーカー(腎臓移植の場合、血中尿素窒素-BUN-またはクレアチニン)の検出に基づく。しかし、これらの指標は、拒絶反応メカニズムがすでに十分に進行した時だけ検出される。事実、移植拒絶反応は、移植臓器の劣化に先行する免疫メカニズムの産物である。移植臓器が損傷を受ける前のこれらの免疫メカニズムの検出は、ごく初期の免疫抑制療法を適応させることによって移植臓器の損失をかなり減少させることができると思われる。一方、拒絶反応の不顕性症状発現(臨床徴候の誘発がない)が移植後に頻発することも認識されている。これらの拒絶反応の不顕性症状発現は、慢性拒絶反応の場合であるといえる。ある著者らは、臓器拒絶反応の早発免疫マーカーの検出、また、特に、ドナーの同種異系抗原に対抗する被移植者の同種異系反応性T-リンパ球の循環内での検出を検討している。方法には、本質的に、レシーバーのリンパ球増殖の連続測定、または、各種方法(ELISA、ELISPOT、フローサイトメトリーなど)によるサイトカイン産生の測定との混合培養の併用がある。より最近では、他の著者らは、拒絶反応メカニズムの早期誘発を強調するのに十分な感受性のあるリンパ球活性化マーカーパターンの特徴付けを観察している。T活性化した細胞傷害活性化T-リンパ球 (グランザイムB、パーフォリン、各種サイトカイン)が発現する遺伝子の、高感度定量PCR法によるmRNAの検出は、拒絶反応の誘発を測定する優れた手段であることが認められた。この目的で、本発明によれば、各種のサイトカインをコードするメッセンジャーを検討でき、優先標的は、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、グランザイムおよびFasFas-リガンドであることができる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
生体内試験用血液採取。末梢血中mRNAレベルの正確な定量実施のために、血液試料2.5 mlを即時細胞溶解および核酸調製用として、PAXgene(商標)採取管に採取した。mRNA抽出まで該採取管を室温で保存して、mRNAは、この血液ライセート中で約5日間安定である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
全血の試験管内培養。ヘパリン化全血200μlについて、試験管内全血LPS刺激または破傷風トキソイド再免疫誘発を実施し、遅くとも血液採取後4時間目に開始した。完全細胞溶解とmRNA安定化を誘発するPAXgene(商標)採取管試薬500μlを添加して、培養を停止した。これによって、試験管内、生体内両試験での同一mRNA抽出プロトコルの使用が可能になった。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
mRNA抽出。PAXgene(商標)採取管に、または、全血培養終了時に得た血液ライセートを短時間で混合し、その一部300μlを1.5 mlのエッペンドルフ管内、最大速度(機器に応じて12,000~16,000 g)で5分間遠心分離した。上清を廃棄し、核酸ペレットをMagNA Pure(商標)mRNAキット(Roche Applied Science)に含まれる溶解緩衝液300μl中で渦動攪拌して完全に溶解させた。その後、製造会社の説明書に従って(Rocheのプロトコル「mRNA 1 細胞」、最終溶出量100μl)、MaNA Pure(商標)装置(Roche Applied Science)でこのキットを使って、この溶液300μlからmRNAを抽出した。抽出されたmRNAの品質は、かつてノーザンブロット分析で証明した (Roche Applied Science、未公表データ)。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
RT-PCR分析に全血を使用した場合に遭遇する難点の1つは、RNA抽出の前に起こる細胞溶解である。血漿や赤血球には大量のタンパク質が存在するので、全血からRNAを単離する方法の大半は、RNA抽出実施前の、分析対象mRNAの細胞性発生源の精製または赤血球の排除に関する。これらの中間段階は、mRNA分解および/または遺伝子誘導を伴い、それによって、mRNAレベルの変化を伴う可能性がある。さらに、血液を採取するという簡単なことが、一部のmRNAの分解を招く可能性がある。これは、3'非翻訳領域に位置するAU-リッチ配列により、内在ヌクレアーゼに感受性を示すサイトカインmRNAに特に当てはまる。末梢血IFN-γ mRNAレベルが、実際、血液採取から1時間後にすでに約50%減少したことは、先に立証されている(Stordeurら、(2002) J. Immunol Meth. 261：195)。これは、細胞全体の溶解と同時に核酸沈殿を誘発するCatrimox-14(商標)(Qiagen, Westburg, Leusden, オランダ)と呼ばれる陽イオン界面活性剤であるシュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムなどの4級アミン界面活性剤を使って回避できる。本実施例は、驚くべき事に、PAXgene(商標)採取管で得られる核酸沈殿物をグアニジン/チオシアネート溶液に溶解できることを観察している。前記溶液の例は、mRNA単離用MagNA Pure(商標)LCキット(Roche Applied Science)から提供される溶解緩衝液である。これに促されて、我々は、PAXgene(商標)採取管のMagNA Pure(商標)装置を併用するに到った。この併用は、PCR反応混合液の全成分を自動調製できることによる、後者の装置の高い再現性と精度を活用できる。
【０１２０】
【図１．１】  破傷風トキソイドへの免疫応答の生体外モニタリング
【図１．２】  実施例3において準拠したストーリー
【図１．３】  実施例4において準拠したストーリー
【図１．４】  実施例5において準拠したストーリー
【図２．１】  末梢血中のIFN-γおよびIL-10 mRNAを自発的に産生するRT-PCR。
様々な健康なボランティア6名の全血およびPBMCから、既述のとおりに、総RNAを抽出した(1欄〜6欄)。全血：全血0.6 mlに、試料採取後1分以内にCatrimox-14(商標)6 mlを混合した。次に、該試料を12000 gで5分間遠心分離した。生じた核酸ペレットを水で慎重に洗浄し、Tripure(商標)1 mlに溶解した。その後、Tripure(商標)の製造会社の解説書に従ってRNA抽出を実施した。PBMC：ヘパリン化静脈血15 mlから標準手順に従って細胞を調製し、RNA抽出用Tripure(商標) 1 ml中に溶解した。既述に従い(Stordeurら、(1995)、Pradierら(1996))、総RNA 1μgからの全試料について、IFN-γ、IFN-10およびハウスキーピング遺伝子HPRT用RT-PCRを実施した。
【図２．２】  全血中のIFN-γおよびIL-10 mRNA安定性に対するリアルタイムPCR。
クエン酸化静脈血試料を健康なドナーから採取した。この試料の一部100μlに、血液採取後1分以内にCatrimox-14(商標）900 μlを混合し、1時間毎に5時間、該血液試料の一部づつを採取する間、単に室温に保った。生じた核酸ペレット(図2.1の説明参照)を「MagNA Pure LC mRNA単離キット1」(Roche Diagnostics, Molecular Biochemicals)の溶解緩衝液300μlに溶解した。製造会社の解説書に従って、MagNA Pure LC装置(Roche Diagnostic、Molecular Biochemicals)によってｍRNAを抽出した(最終溶出量：100μl）。「Lightcycler−RNAマスターハイブリダイゼーションプローブキット」(Roche Diagnostics、Molecular Biochemicals)に述べられた標準手順に従って、逆転写とリアルタイムPCRを一段階で実施した。これをmRNA調製液5μlから始めた。プライマーおよびプローブ配列、およびPCR条件は、Stordeurら、J Immunol Methods, 259 (1-2)；55-64, 2002)、並びに、表1および2に述べられている。結果は、一人の代表的なドナーにつき、β-アクチンに対して規格化したmRNAコピー数で表す。
【図３】  本発明が提案する方法と比較したPreAnalytix推奨の全血からのRNA抽出法の概略比較。
【図４】  破傷風トキソイドによるサイトカイン血中ｍRNA生体外誘導。
7年前に破傷風ワクチンの接種を受けた健康なボランティアから採取した全血500μlに破傷風トキソイド(10μg/ml、Aventis)を添加した。5% CO2雰囲気下、37℃での異なる時間経過後、PAXgene採取管に含まれる試薬1.4 mlを添加した。得られたライセートを使って、MagNA Pure装置で総RNAを単離し、RT-PCRを本発明で述べるとおりに実施した。
【図５】  LPSによる全血刺激後のIL-1βおよびIL-1 RA mRNA反応速度論。
ヘパリン化血液200μlをLPS 10 ng/mlと0(培養開始)、0.5、1、2および6時間培養した。培養終了時、完全細胞溶解と核酸沈殿のために、PAXgene(商標)採取管の試薬500μlを添加した。その後、IL-1β、IL-1RAおよびβ-アクチン mRNAについてのRTおよびリアルタイムPCRを、本発明で述べるとおりに一段階で実施した。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。5件の独立した実験の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図６】  直線回帰：出発血液量におけるmRNAコピー数。
各種全血量(20〜200μl、X軸)を、LPS 10ng/mlの存在下で6時間培養した。培養終了時、本発明で述べる通りにIL-1βおよびβ-アクチン mRNAについてのRTおよびリアルタイムPCRを実施した。Y軸は、生コピー数を表す。直線は、直線回帰に関するものである。6件の実験中、代表的な1件を示す。
【図７】  破傷風トキソイドによる全血刺激後のmRNAサイトカイン反応速度論。
少なくとも5年前に破傷風のワクチン接種を受けた健康なボランティア5名からヘパリン化血液を採取した。ドナー毎に、全血の一部200μlづつを破傷風トキソイド10μg/mlと共に0(培養開始)、4、8、16、24および48時間培養した。培養終了時、PAXgene(商標)採取管に含まれる試薬500μlを添加し、本発明の方法論によって各種転写物を定量した。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。5件の独立した実験の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図８】  LPS静脈内注射後の血中サイトカインmRNAの生体内調節。
5名の健康なボランティアに単回量4 ng/kgのLPSを注射した。LPS注射の10分前、並びに、0.5、１、1.5、2、3および6時間後、血液試料2.5 mlをPAXgene(商標）採取管に採取した。サイトカインmRNAの定量は、本発明の方法に従った。結果を、β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。各時点の平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図９】  抗破傷風ワクチン応答の経過観察。
6名の健康なボランティアを選択し、抗破傷風リコールを与えた。破傷風トキソイド10μg/mlを伴って(黒丸)、あるいは、伴わなず(白丸)に20時間培養した全血からIL-2 mRNAレベルを定量し、リコール時(0日)、リコール14日前、並びに、3、7、14、21および90日後(横軸)に実施した。β-アクチン mRNAコピー100万個当たりのmRNAコピー数で表す。6枚のパネル(No.1〜6)は、それぞれ、6名の各ドナーの個々のデータを示す(パネル1枚がドナー1名)。
【図１０】  実施例7、8、9、10および11において準拠した手順の要約
【図１１】  MagNA Pureでの自動ｍRNA抽出および混合試薬調製。出発生体材料と検出されたコピー数の直接相関。
【図１２】  MagNA Pureでの自動ｍRNA抽出および混合試薬調製。
Y軸は、生コピー数を表す。直線は、直線回帰のものである。
【図１３】  癌免疫療法に参加した患者の症例報告の要約。
1999年7月、黒色腫と診断された。2001年8月、多重転移が認められ、2002年4月、患者は、睾丸摘出直後、癌ワクチン投与に加わった。ワクチンは、アジュバント配合によるMAGE-3精製タンパク(黒色腫細胞により特異的に発現する抗原)の複数回の注射から成った。
【図１４】  ワクチン接種プロトコルとリアルタイムPCRによる免疫応答のモニタリングの概略図示。
患者に3回のワクチン注射を行い、9週間の間に週1回血液試料を採取した。各患者の全血の一部200μlづつを、MAGE-3タンパク10μg/mlまたは陰性対照TRAP(プラスモジウムファルシパルムplasmodium falciparum抗原)10μg/mlの存在下で培養した。培養終了時、実施例6で述べたように、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加し、IL-2 mRNAの定量が可能であった。結果を図15に示す。
【図１５】  MAGE-3ワクチンブースト(急増)後のMAGE-3刺激全血に高めのIL-2 mRNAレベルが認められる。
Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-2 mRNAコピー数を表し、X軸は、血液試料を採取した週を表す。ワクチン注射液は、0、2および6週に投与した。褐赤色のカラムはMAGE-3の存在下で培養した全血に関するもので、青色カラムは、TRAPの存在下で培養した全血に関するものである。
【図１６】  アレルゲンとの全血培養後のIL-4 mRNA定量を実施した実験の概略図示。
ネコアレルギーの被験者と健康な被験者2名から血液試料を採取した。その後、様々な培養時間で、ネコアレルゲン(即ち、Feld 1)の不在下または存在下で全血を培養し、培養の終了時にPAXgene採取管に含まれる試薬を添加し、実施例6に述べたとおりにIL-4 mRNA定量が可能になった。結果を図17に示す。
【図１７】  Feld1アレルゲンは、ネコアレルギー被験者に由来する全血中で、非アレルギー被験者と比較して高めのIL-4 mRNAレベルを有意に誘発する。
Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-4 mRNAコピー数を表し、X軸は各種培養時間を表す。緑色カラムは、アレルゲンと共に培養した正常全血に認められるIL-4 mRNAレベルを、赤色カラムと黄色のカラムは、アレルギー被験者の全血に認められるIL-4 mRNAレベルを表す(それぞれ、Feld1の存在下および不在下で培養した血液)。
【図１８】  この全血系におけるFeld1への応答は、特異的で、用量に関係する。
アレルギー被験者からの全血を、1)濃度を増加させたFeld1の存在下(赤色のカラム)；2)別のアレルゲン、β-ラクトグロブリン(BLG)10μg/mlの存在下(青色のカラム)；3)架橋IgE(緑色のカラム)の存在下で2時間培養した。Y軸は、β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-4 mRNAコピー数を表す。
【図１９】  Feld１による全血刺激後のIL-4 ｍRNAは、健康な対照に比較して、ネコアレルギー患者の方が高い。
スライド9〜11で述べる実験は、健康な被験者10名(CTRカラム)とネコアレルギー患者10名(ALLカラム）の血液試料について繰り返したものである。全血を、10μgのFeld1の存在下、もしくは、陽性対照の架橋IgEの存在下で2時間培養した。平均値と平均値の標準誤差を示す。
【図２０】  精製GAD65タンパクとの全血培養後のIL-2 mRNA定量について実施した実験の概略図示。
血液試料をI型糖尿病患者6名と健康な被験者5名から採取した。全血を、10μg/mlのGAD65の不在下または存在下で18時間培養した後、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加して培養を停止させた。実施例6で述べるとおりにIL-2 mRNAレベルを定量した。結果を図21に示す。
【図２１】  I型糖尿病患者の全血は、GAD65刺激後、健康被験者に比較して高いIL-2 mRNAレベルを示す。
結果は、GAD65不在下で培養した全血中に認められたIL-2 mRNAコピー数に相対的に計算し、β-アクチンに対して補正した該コピー数で表す。対数目盛を使用する。平均値および平均値の標準誤差を表す。健康ドナー：CTRカラム；自己免疫糖尿病患者：PATカラム。
【図２２】  異種反応性T-細胞応答の評価を目的に、非血縁樹状突起細胞(DC)との全血培養後のIL-2 mRNA定量について実施した実験の概略図示。
非血縁の健康なボランティア2名(MTとMA)の樹状突起細胞をIL-4およびGM-CSFの存在下で試験管内発生させた。各ドナーからの全血試料を、他のドナー(1)の樹状突起細胞群の存在下、または、自身(2）の樹状突起細胞の存在下で培養した。両ドナーの全血試料を混合し(3）、同時に、両樹状突起細胞調製液を混合した(4)。12時間の培養後、PAXgene採取管に含まれる試薬を添加して培養を停止させた。実施例6で述べたとおりにIL-2 mRNAレベルを定量した。結果を図23に示す。
【図２３】  全血中でのIL-2 mRNA定量による異種反応性T-細胞応答の評価。
β-アクチンmRNAコピー100万個当たりのIL-2 mRNAコピー数を表す。条件は、左から右に：ドナーMAの全血単独、ドナーMAの全血＋ドナーMAのDC、ドナーMAの全血＋ドナーMTのDC、ドナーMTの全血単独、ドナーMTの全血＋ドナーMTのDC、ドナーMTの全血＋ドナーMAのDC、ドナーMTの全血＋ドナーMAの全血、ドナーMTのDC＋ドナーMAのDCである。