【手続補正書】
【提出日】平成17年7月7日(2005.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチンビタマーを製造する方法であって、
（ａ）リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを有する細菌を、リシン、リシンアナログ、又はリシン前駆体に富む環境で培養し；そして
（ｂ）該ビオチンビタマーを回収する、
ことを含む方法。
【請求項２】
ビオチンビタマーを製造する方法であって、
（ａ）リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを有し、リシン産生について脱調節されている細菌を培養し；そして
（ｂ）該ビオチンビタマーを回収する、
ことを含む方法。
【請求項３】
細菌が、ｂｉｏＡ発現に加えて少なくとも１つのビオチン合成経路の段階について脱調節されている、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
該細菌が、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）−利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを産生するように更に操作されている、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように操作された細菌であって、特に該細菌が、ｂｉｏＡ発現に加えて少なくとも１つのビオチン合成段階の操作による脱調節によってビオチンビタマーを過剰産生するように更に操作されている細菌。
【請求項６】
リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように操作された細菌であって、該細菌が、リシンを過剰産生するように更に操作されている細菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビオチンビタマーの生合成の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Escherichia coli及びBacillus sphaericusにおけるビオチン生合成は、生化学的及び分子生物学的レベルの両方で研究されている（DeMoll, 1996. In F.C. Neidhardt et al.（編）, E. coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Bioilogy, Second edition ed., vol. 1., pp. 704-709, ASM Press, Washington, D.C.; Perkins et al., In A.L. Sonenshein et al.（編）, In Bacillus subtilis and Other Gram Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics, pp. 319-334, American Society of Microbiology, Washington, D.C.; Eisenberg, 1987. In F. Neidhardt et al.（編）, E. coli and Salmonella typhimurium, pp. 544-550. American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Cronan, Cell 58: 427-429, 1989, Izumi et al., Agric. Biol. Chem. 45: 1983-1989; Gloeckler et al., Gene 87: 63-70, 1990）が、ビオチン合成におけるいくつかの段階、及びその成分は、まだ解明されていない（Ohshiro et al., Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1738-1741, 1994; Ifuku et al., Eur. J. Biochem. 224: 173-178, 1994; Florentin et al., C.R. Acad. Sci. Paris 317: 485-488, 1994; Birch et al., J. Biol. Chem. 270: 19158-19165, 1995; Sanyal et al., Biochemistry 33: 3625-3631, 1995）。ピメロイル−ＣｏＡのビオチンへの変換に関与するいくつかの酵素が、これらの細菌種の両方から単離され、特徴解析されている（Ploux et al., Biochem. J. 283: 327-321, 1992; Izumi et al., Agric. Biol. Chem. 45: 1983-1989, 1981; Eisenberg, supra, Huang et al., Biochemistry 34: 10985-10995, 1995）。ｂｉｏＦの生成物であるＫＡＰＡシンターゼは、ピメロイル−ＣｏＡ、及びアラニンの８−アミノ−７−ケトペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）への変換を触媒する。ｂｉｏＡの生成物であるＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼが、次にドナーからＫＡＰＡへアミノ基を運んで、７，８−ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）をもたらす。デチオビオチンシンタ−ゼ（ｂｉｏＤ）は、ウレイド環を閉環して、デチオビオチン（ＤＴＢ）を生成し、最終的にｂｉｏＢの生成物であるビオチンシンターゼが、フラボドキシン（Birch et al., supra; Ifuku et al., supra）、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（Florentin, C.R. Acad. Sci. Paris 317: 485-488, 1994; Ohshiro et al., supra; Sanyal et al., supra; Birch et al., supra）、フェロドキシンＮＡＤＰ+レダクターゼ（Birch et al., supra; Sanyal et al., Arch. Biochem. Biophys. 326: 48-56, 1996）、及び多分システイン（Florentin, C.R. Acad. Sci. Paris 317: 485-488, 1994; Birch et al., supra; Sanyal et al., supra）を含むその他の多数の成分と一緒になって機能して、デチオビオチンをビオチンに変換する。ＫＡＰＡ、ＤＡＰＡ、ＤＴＢ及びビオチンの化合物は、集合的に、又は単独で、ビタマー又はビオチンビタマーと称される。
【０００３】
E. coliにおいては、これらの酵素をコードする遺伝子は、ＢｉｒＡリプレッサー（Cronan, Cell 58: 427-429, 1989）と相互作用する単一のオペレーターにより制御される、２つの異なる転写オペロンに位置する。B. sphaericusにおいては、遺伝子は、２つの異なるオペロンに位置する（Gloeckler et al., supra）。ピメロイル−ＣｏＡの合成に関与する、経路の初期の段階は、まだあまりよく理解されていない（Ifuku et al., Eur. J. Biochem. 224: 173-178, 1994; Sanyal et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2637-2638, 1994）。B. sphaericusは、ピメリン酸をピメロイルＣｏＡに変換する酵素であるピメロイル−ＣｏＡシンセターゼ（ｂｉｏＷ）を含む（Gloeckler et al., Gene 87: 63-70, 1990）（Ploux et al., Biochem. J. 287: 685-690, 1992）。E. coliは、この酵素を持っておらず、ビオチン合成の中間体としてピメリン酸を利用することができない（Gloeckler et al., supara; Ifuku et al., Eur. J. Biochem. 224: 173-178, 1994; Sanyal et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2637-2638, 1994）。E. coliは、ｂｉｏオペロンに位置するｂｉｏＣと、そのほかのｂｉｏ遺伝子とは結合していないｂｉｏＨの２つの遺伝子を有し、両方とも、ピメロイル−ＣｏＡに至るビオチン生合成の初期の段階に関与していると考えられているが、その正確な役割は不明である（Eisenberg, supra; Lemoine et al., Mol. Micro. 19: 645-647, 1996）。
【０００４】
B. subtilisは、E. coli及びB.sphaericusのｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤ、及びｂｉｏＦ遺伝子の相同染色体（ホモログ）を含む。これらの４種類の遺伝子は、B. sphaericusのｂｉｏＷ遺伝子の相同染色体と共に、ｂｉｏＷＡＦＤＢの順で、単一のオペロンに配列しており、更に２つの遺伝子ｂｉｏＩ及びｏｒｆ２が続いている（Bower et al., J. Bacteriol. 178: 4122-4130, 1996）。ｂｉｏＩ及びｏｒｆ２は、一般的には、ほかの公知のビオチン生合成遺伝子とは似ていない。ｂｉｏＩ遺伝子は、チトクロムＰ４５０と似たタンパク質をコードし、E. coliのｂｉｏＣ又はｂｉｏＨのいずれかにおける突然変異を補うことができる（Bower et al., supra）。ｂｉｏＩに突然変異が生じると、B. subtilisは、ビオチンの非存在下では、ほとんど生育することができない。ｂｉｏＩ突然変異株のブラジトロフ（bradytroph）表現型は、ピメリン酸によって打ち勝つことができ、これによってｂｉｏＩの生成物は、ピメリン酸合成の前の段階で、機能することが示唆される（Bower et al., supra）。
【０００５】
B. subtilisのｂｉｏオペロンでは、推定上の栄養（vegetative）プロモーター配列が先行し、B. sphaericusのｂｉｏ調節領域と相同性を有する２回対称の領域をちょうど下流に有する（Bower et al., supra）。ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ翻訳融合物の解析により、ビオチンオペロンの発現は、ビオチン及びB. subtilisのｂｉｒＡ遺伝子によって調節されることが示されている。ビオチン合成について脱調節されている株は、ヨーロッパ特許公開第６３５５７２号に記載されているように、プロモーター及び調節領域を、構成プロモーターで置き換えることによって操作することができ、ビオチン及びビオチンビタマーの産生は、更にB. subtilisの染色体への脱調節された遺伝子の組込み及び増幅によって改良することができる。ヨーロッパ特許公開第６３５５７２号に記載されているＢＩ２８２株が、このような株の一例である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＫＡＰＡのＤＡＰＡへの変換が、ピメリン酸で流加培養された操作細胞を用いたビオチン生合成において重大な障害であることをわれわれは発見した。ビオチン生合成に対するそのほかの制御因子を除くと、ＫＡＰＡのＤＡＰＡへの変換は、ＫＡＰＡ産生にペースをあわすことができず、その結果、ＫＡＰＡは増大するが、最終産物がそれに合わせて増大することはない。われわれはまた、障害の重大な因子が、ＫＡＰＡのＤＡＰＡへの変換に利用されるアミノドナーの利用と認識であることを発見した。一般的には、適当な量のアミノドナーを提供することは、障害に打ち勝つための重要な手段である。更に、ＫＡＰＡからＤＡＰＡを産生する反応で移送されるアミノ基の供給源としてリシン及び関連化合物を利用することのできるＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼは、下流のビオチンビタマー、特にデチオビオチン（ＤＴＢ）の生合成の収率を有意に改善することができる。利用可能なアミノトランスフェラーゼによって使用されうる高濃度のアミノドナーを提供することによって、上述の障害が実質的に改善されると考えられる。例えば、そのＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼが、アミノドナーとしてリシンを利用する細菌によるビオチンビタマーの微生物学的生産量は、リシンを発酵培地に含めるか、又はリシン生合成経路を脱調節するかそのいずれかにより十分量のリシンを利用可能にすることによって、劇的に改善することができる。このような手段は、B. subtilis及びその関連微生物（B. subtilisに代表されるBacillus spp.のクラスターのメンバーを含む）のＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの利用にも適用することができる。クラスターとしては、例えばB. subtilis、B. pumilus、B. licheniformis、B. amyloliquefaciens、B. megaterium、B. cereus、及びB. thuringiensisが挙げられる。B. subtilisクラスターのメンバーは、B. sphaericus及びB. stearothermophilusに代表されるクラスターの、より遠い関連Bacillus spp.とは、遺伝子的にも代謝的にも異なる（Priest, In Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, supra pp. 3-16, ここに参考のために援用する；Stackebrant, et al. J. Gen. Micro. 133: 2523-2529, 1987）。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明の一面は、一般的には、リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを有する細菌を、リシン、リシン前駆体、又はリシンアナログに富む環境で培養することによって、ビオチンビタマーを生合成（例えば、酵素により、又は操作された細胞を用いた発酵により）する方法に関する。次に所望のビオチンビタマーを環境から回収する。アミノドナーが、所与のアミノトランスフェラーゼによって利用されるその能力は、E. coliのＤＡＰＡ感受性株をＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性の測定に用いるEisenberg and Stoner (1971, infla)の記載の方法に基づいたバイオアッセーなどの適当なアッセーによって評価することができるが、これらに限定されるものではない。代表的には、細菌は、１つ又はそれ以上のビオチン合成経路（例えば、ヨーロッパ特許公開第６３５５７２号に記載されている）について、脱調節することができる。ＤＡＰＡアミノトランスフェーゼは、細胞の野性型遺伝物質により、細胞に導入された外来の核酸により、又はその両方により、産生させることができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ここで使用する「リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ」は、アミノドナーとして、リシン、又はリシンに変換される化合物、又はリシンに替わることのできる化合物を利用して、８−アミノ−７−ケトペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）をジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）に変換することのできるＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを意味する。
【０００９】
ここで使用する「富む環境」は、表示した分子の濃度が、標準的な培養条件下でのそれよりも高く、かつビオチンビタマーの過剰産生がない場合での細胞成育が制限されるのを避けるのに必要な濃度以上であることを意味する。
【００１０】
回収し、精製するビオチンビタマー生成物は、ビオチン、デチオビオチン、又はジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）であることができる。デチオビオチン又はＤＡＰＡを回収する場合には、回収されたデチオビオチン又はＤＡＰＡをビオチンに変換する工程が、本方法には更に含まれる。
【００１１】
本発明の別の一面においては、細菌株は、アミノドナーから８−アミノ−７−ケトペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）へアミノ基を移送することのできるＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰生産することによってＫＡＰＡ→ＤＡＰＡの障害を解消するように操作されている。本発明の好ましい実施態様においては、細菌株は、ＫＡＰＡからＤＡＰＡへの段階以外のビオチン生合成の段階を脱調節することによって、ビオチンビタマーを過剰生産するように更に操作されている。
【００１２】
ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡの障害を更に解消するために、細菌株を更に操作して、異なるアミノドナー（例えば、リシン及びＳＡＭ）に対応して、複合的にＤＡＰＡ−アミノトランスフェラーゼを産生させてもよい。これらの活性は、以下に詳細に記載するように、アッセーし、識別することができる。要約すると、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ変換のレベルは、ビタマーのバイオアッセー、並びにリシン、メチオニン、又はリシン及びメチオニンの存在下での細菌の生育による生成物のバイオオートグラフィーによって測定することができる。
【００１３】
ここで使用する「ＳＡＭ利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ」は、アミノドナーとして、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、又はＳＡＭに変換される化合物、又はＳＡＭに替わることができる化合物を利用して、８−アミノ−７−ケトペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）をジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）に変換することのできるＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを意味する。
【００１４】
別の実施態様においては、メチオニン及びリシン、又はそれらのアナログを培地に加える。
【００１５】
リシンに富む環境を提供する一つの方法は、ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ反応においてＫＡＰＡにアミノ基を与えることのできるリシン又はリシン相同物（ホモログ）を培養物に多く含ませることである。リシン相同物としては、リシン、（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）及びそのほかのリシン相同物（ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼにとってアミノドナーとして作用することができる）が挙げられる。リシンに富む環境を提供する別の方法は、リシン産生に対する野性型の制御を有意に減少させるように、細菌を突然変異させる、又は細菌を操作することによって、リシン産生について細菌を脱調節させることである。例えば、リシン合成の段階の脱調節としては、リシン合成酵素の転写若しくはその他の発現制御の調節を低下又は除去する、あるいはリシン合成酵素を改変してリシン生合成に対する制御を低下又は除去することが挙げられる。脱調節としては、リシン合成経路における出発物質である化合物を過剰生産させ、そしてリシンの生分解を阻害することも挙げられる（Amino acids: Biosynthesis and Genetic Regulations, E. Hermann and R. Somerville（編） Addison Wesley, Reading, MA 1983, pp. 147-172, 213-244, 417）。
【００１６】
ビオチン合成の段階の脱調節としては、ビオチン合成酵素の転写若しくはそのほかの発現の制御の調節を低下又は除去する、あるいはビオチン合成酵素を改変してこの酵素が触媒するビオチン合成反応に対する制御を低下又は除去することが挙げられる。また、ビオチン合成経路における出発物質である化合物を過剰生産させ、そして所望のビオチンビタマーの生分解を阻害することが挙げられる。
【００１７】
意図的かつ特異的に野性型ゲノムを改変することによって細菌を操作して、所望の生合成表現型を得る（例えば操作を行っていない微生物である対応する野性型よりもリシンをより合成させる、あるいはビオチン生合成経路における障害を除去する）ことができる。
【００１８】
ＤＴＢのビオチンへの変換法としては、ＤＴＢのビオチンへの生化学的変換；ＤＴＢのビオチンへの生物的変換のために操作された細菌にＤＴＢを供給する（Fujisawa et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57: 740-744, 1993）；ビオチンのＤＴＢからのin vitro合成（Birch et al., J. Biol. Chem. 270: 19158-19165, 1995; Fujisawa et al., FEMS Microbiology Letters 110: 1-4, 1993; Ifuku et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56: 1780-1785, 1992; Birch, WO 94/08023）、又は化学合成が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】
したがって、本発明の目的は、ビオチンビタマーを製造する方法であって、
（ａ）リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを有する細菌を、リシン、リシンアナログ、又はリシン前駆体に富む環境で培養し；そして
（ｂ）該ビオチンビタマーを回収する、
ことを含む方法
を提供することである。
【００２０】
本発明の目的はまた、ビオチンビタマーを製造する方法であって、
（ａ）リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを有し、リシン産生について脱調節された細菌を培養し；そして
（ｂ）該ビオチンビタマーを回収する、
ことを含む方法
を提供することである。更に本発明の目的は、リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように細菌が操作されている上述のこのような方法、そしてより詳細にはリシン、リシンアナログ、又はリシン前駆体を、外来的に培養物に添加するこのような方法；及びビオチンビタマーが、ビオチン、ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）、もしくはデチオビオチンであり、ビオチンビタマーがデチオビオチンである場合デチオビオチンの回収後、別の発酵、生化学的反応、もしくは化学反応により、回収されたデチオビオチンをビオチンに変換し、そしてビオチンを回収することを更に含むこのような方法、及び細菌が、リシンアナログである例えばＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性であるこのような方法を提供することである。
【００２１】
更に本発明の目的は、細菌が、ｂｉｏＡ発現に加えて少なくとも１つのビオチン合成経路の段階について脱調節されている上述のこのような方法、そして該細菌が、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）−利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを産生するように更に操作されているこのような方法、詳細にはメチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、又はＳＡＭアナログを培養物に添加するこのような方法を提供することである。
【００２２】
最終的には、本発明の目的は、リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように操作された細菌であって、特に該細菌が、ｂｉｏＡ発現に加えて少なくとも１つのビオチン合成段階の操作による脱調節によってビオチンビタマーを過剰産生するように更に操作されている細菌、及びリシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように操作された細菌であって、該細菌が、リシンを過剰産生するように更に操作されている細菌を提供することである。
【００２３】
本発明を実施するためには、例えば以下の株を用いることができる：ＢＩ９０、ＢＩ９６、ＢＩ６０３、ＢＩ６４１、及びＢＩ６４２。これらの株は、１９９７年７月１１日にthe American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）にブダペスト条約の条件下で寄託されており、以下の受託番号が付与されている：それぞれＡＴＣＣ５５９９９、２０２０００、２０２００３、２０２００２、及び２０２００１。
【００２４】
以下に表の簡単な説明を記載する。
表１は、反応混合物へのアミノドナーである可能性のある物質の添加によるＢＩ６１１の抽出物のＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼアッセーのデータを示す。
表２は、反応混合物へのリシン又はリシン関連化合物の添加後のＢＩ６１１の抽出物のＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼアッセーの結果を示す。
表３は、リシン６g/リットルの存在下、ベンチスケールの発酵器で生育したＢＩ２８２及びＢＩ６０３のビオチン及びビタマー産生量を示す。
表４は、バッチ培養及び流加培養における、メチオニン３g/リットルの存在下、ベンチスケールの発酵器で生育したＢＩ２８２、ＢＩ９６及びＢＩ９０のビオチン及びビタマー産生量を示す。
表５Ａ〜５Ｂは、リシン６g/リットル及びメチオニン３g/リットルの存在下又は非存在下、ベンチスケールの発酵器で生育したＢＩ６０３及びＢＩ９０株のビオチン及びビタマー産生量を示す。
表６は、異なるリシン供給法を用いたビオチン及びビタマー産生のアッセーの結果を示す。
表７は、公知のB. subtilisのリシン脱調節突然変異株を示す。
表８は、ピメリン酸の存在下で生育した、ＡＥＣに対して耐性である細菌株のビオチン及びビタマー産生のアッセーの結果を示す。
表９は、ベンチスケールの発酵器におけるビオチン及びビタマー産生のための培地の組成を示す。
表１０は、ビオチン及びＤＴＢに関するアビジン−ＨＡＢＡ置換アッセーについて記載している。
【００２５】
以下に、本発明の好ましい実施態様について簡略に記載する。
【００２６】
B. subtiliのピメリン酸流加培養による発酵の間に、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ変換の障害が発生する。以下に記載する実験では、B. subtilisでは、ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼは、アミノドナーとしてリシンを利用している一方、B. sphaericus (Izumi et al., Agric. Biol. Chem. 45: 1983-1989, 1981)、Brevibacterium divaricatum、Salmonella typhimirium、Aerobacter aerogenes、Bacillus roseus、Micrococcus roseus、Sarcina marginata (Izumi et al., Agr. Biol. Chem. 39: 175-181, 1975)、E. coli (Eisenberg et al., J. Bacteriol. 108: 1135-1140, 1971)、及びS. marcescensのＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼのためのアミノドナーとして有用な化合物は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であることをわれわれは発見した。
【００２７】
E. coli及びB. sphaericusでは、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡの変換は、ｂｉｏＡ遺伝子の生成物であるＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼによって触媒され、これは、基質としてＳＡＭ及びＫＡＰＡを利用する（Eisenberg et al., J. Bacteriol. 108: 1135-1140, 1971; Izumi et al., Agric. Biol. Chem. 45: 1983-1989, 1981; Stoner et al., J. Biol. Chem. 250: 4037-4043, 1975; Stoner et al., J. Biol. Chem. 250: 4029-4036）。B. subtilisのアミノトランスフェラーゼは、E. coliのそれと３３％の相同性を有し、E. coliのｂｉｏＡ突然変異株に相補的であるため、上記の反応は、B. subtilisにおいても同様であると推測されていた。しかし、B. subtilisの酵素のin vitroアッセーの結果、驚くべきことに、B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼにとっては、リシンが、アミノドナーであることが発見された。更に、B. subtilisのビオチン産生株（ＢＩ２８２など）の発酵培地にリシン（２〜１０g/リットル）を添加すると、産生されるＫＡＰＡの量が減少し、有意な量のデチオビオチン（ＤＴＢ）が蓄積される。ＤＴＢをビオチンに変換するためには、各種発酵、又は化学的方法を使用することができる。
【００２８】
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼにとっては、ＳＡＭは、有意なアミノドナーではないという観察結果により、この障害を解消するための手段がもたらされた。真のアミノドナーの探求が行われた。２６種類の異なるアミノ酸と関連化合物を試験した後、リシンだけが、B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼによるＫＡＰＡのＤＡＰＡへのin vitro変換を劇的に刺激することが認められた。以降の試験で、Ｄ−及びＬ−リシン、並びにリシンアナログ、（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）が、B. subtilisの酵素にとってアミノドナーとして機能することが認められた。したがって、本発明では、これらのうちいずれでもこれを組み合わせても使用することができる。リシンをアミノドナーとして利用するそのほかのアミノトランスフェラーゼも知られている（Tobin et al., 1991, J. Bacteriol. 173: 6223-6229; Coque et al., 1991, J. Bacteriol. 173: 6258-6264; Soda et al., 1968. Biochemistry 7: 4102-4109; Soda and Misono, 1968, Biochemistry 7: 4110-4119; Schmidt et al., 1988, FEMS Microbiol. Lett. 49: 203; Lowe and Rowe, 1986. Mol. Biochem. Parasitol. 21: 65）が、その他の公知のＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼは、リシンを利用していない。E. coli及びB. sphaericusの両者のＢｉｏＡ酵素は、ＳＡＭを利用している（Eisenberg et al., J. Bacteriol. 108: 1135-1140, 1971; Izumi et al., Agric. Biol. Chem. 45: 1983-1989, 1981; Stoner et al., J. Biol. Chem. 250: 4037-4043, 1975; Stoner et al., J. Biol. Chem. 250: 4029-4036）。
【００２９】
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの特徴解析を行ったところ、リシンに対するＫmが高いことが示され、これが、ＫＡＰＡで阻害される基質であった。われわれは、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ転換の障害が、リシンが不十分であるか、又はＫＡＰＡ／リシン比が不適当であることによって惹起され、発酵培地にリシンを添加することによって、この障害を解消できるとの結論を得た。
【００３０】
ピメリン酸（１g/リットル）に加えてリシンを添加（６g/リットル）して培養した場合、操作B. subtilis株ＢＩ２８２(bio::〔Ｐ15ｂｉｏ〕7-8)は、ＤＴＢ産生の著しい増大（＞１０倍）を示した。これらの発酵条件下で、ＢＩ２８２は、約３００〜７００mg/リットルものＤＴＢを産生した。発酵培地と条件を確保することによって、ほぼ全部のＫＡＰＡを、ＤＴＢに変換することができた。また、E. coliのｂｉｏＡ遺伝子〔B. subtilisのｖｅｇプロモーターで転写され、合成 B. subtilisリボゾーム結合部位（ＰｖｅｇｂｉｏＡecカセット）から翻訳される〕を有するシングルコピーカセットを含むＢＩ２８２の誘導体であるＢＩ９０株を、リシン６g/リットル、メチオニン３g/リットル（E. coli ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼは、ＳＡＭを利用し、メチオニンは、ＳＡＭの前駆体であるため）、及びピメリン酸１g/リットルの存在下発酵させたところ、ＫＡＰＡ→ＤＴＢ変換が＞９０％となり、ＤＴＢ産生は、６００〜９００mg/リットルと高レベルであった。バイオオートグラフィーにより、測定可能な量のＫＡＰＡが存在しないことが確認された。これらのデータにより、ピメリン酸を添加した発酵では、少なくともある程度は、アミノドナーの細胞内濃度が不十分であるため、ＫＡＰＡの蓄積が惹起されたことが示された。培地中のリシン濃度を上昇させることによって、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ変換の障害が解消され、ＤＴＢ産生が有意に改善される。
【００３１】
ＢＩ２８２に突然変異を導入することにより、リシン生合成経路を脱調節することができる（図４を参照）。ビオチン産生株の２つのリシンアナログ（ＡＥＣ）耐性株の発酵実験では、リシンを添加しなくても、ＤＴＢ力価に著しい改善が見られた。しかし、リシンはこれらの突然変異株においてはそれでも制限的である。リシン供給を排除する必要があるのであれば、リシン生合成を更に脱調節するために更なる突然変異を加える必要がある。このような突然変異としては、１）アスパルトキナーゼＩ、II、又はIIIのいずれか、又は全部の発現の脱調節、２）フィードバック耐性アスパルトキナーゼＩ、II、又はIII、３）ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの発現の脱調節、４）フィードバック耐性ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、あるいは５）上記の組み合わせをもたらすそれらが挙げられる（Bacillus subtilis and other Gram Positive Bacteria. (1993) A. Sowenstein J. Hoch, R. Losick（編） pp.237-267. American Society for Microbiology. Washington, D.C.）。
【００３２】
【実施例】
実施例１
ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ酵素アッセー
ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼのアッセーは、１９７１年にEisenberg and Stonerが記載している（J. Bacteriol. 108: 1135-1140）。本アッセーでは、基質であるＫＡＰＡを、補因子であるピリドキサール５′−ホスファート及び細胞抽出物の存在下、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）とインキュベートした。E. coliｂｉｏＡ株を用いたプレートバイオアッセーにおいて産生されたＤＡＰＡの量を測定した。アッセーを行う株の多くの抽出物は、有意な量のビオチンとデチオビオチン（これらが、バイオアッセーに用いるE. coliインジケーター株に供給される）を含むため、アッセー混合物にストレプトアビジン（８mg/ml）を添加した。痕跡量のビオチン及びデチオビオチン混入物は、これらをアビジン−アガロースカラムを通過させることによって、基質として用いるＫＡＰＡ調製物から除去した。バイオアッセーにおいてＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性を測定するために、E. coliｂｉｏＡ１０９株（ＭＥＣ１）を用いた。Eisenbergによりアッセーのために開発されたこのE. coliｂｉｏＡ株は、その他のｂｉｏＡ突然変異株よりもＤＡＰＡに対して数倍高い感受性を示すと報告されている。EisenbergのＤＡＰＡ感受性株は、エール大学のE. coli Genetic Stock Centerから入手した。
【００３３】
実施例２
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼは、アミノドナーとしてＳＡＭを利用しない。
B. subtilisＢｉｏＡタンパク質を過剰発現するように操作したB. subtilis株ＢＩ２８２を、ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性についてアッセーした。ＢＩ２８２は、ヨーロッパ特許公開第６３５５７２号に記載されているようにｂｉｏ遺伝子座において増幅されたＰ15ｂｉｏカセットを有する。ｂｉｏオペロンの欠失したB. subtilis株、ＢＩ９（Dbio::neo）は、ネガティブコントロールとして含めた。それぞれのアッセーで産生されたＤＡＰＡの量を測定できるように、濃度の判明しているＤＡＰＡ溶液をバイオアッセープレート上にスポットした。測定可能なＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性が、ＢＩ２８２抽出物には認められたが、ＢＩ９抽出物には認められなかった。
酵素反応は、少なくとも６０分間は、時間に対してほぼ直線的であった。薄層クロマトグラフィーにより反応生成物は、ＤＡＰＡであることが示された。抽出物を沸騰させるか、又は凍結し解凍することによって酵素活性を破壊したが、１０％ＤＭＳＯの存在下で抽出物を凍結することは、酵素を安定化すると考えられた。活性は、ＫＡＰＡの有無に依存していたが、驚くべきことにＳＡＭの有無には依存していなかった。しかし、本来のｂｉｏＡ遺伝子を有さないが、E. coli又はS. marcescensのいずれかから誘導されたｂｉｏＡ遺伝子を含有するB. subtilis株からアッセーした抽出物は、外来のＳＡＭの有無に依存したＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性を有していた。われわれは、B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼは、E. coli又はS. marcescensの酵素とは異なるアミノドナーを利用していると結論した。使用したアッセー条件下では、B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの特異的活性は、E. coli又はS. marcescensのそれよりも１００倍も低いことが認められた。この特異的活性の低さは、抽出物中のアミノドナーの濃度の制限のためであろう。
【００３４】
実施例３
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼによるアミノドナーとしてのリシンの認識
反応混合物にその他のアミノドナーを添加することによって、B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性を刺激することができるかどうかを調べるために、各種アミノドナーを、酵素活性に対するin vitroでの刺激能についてスクリーニングした。B. subtilis株（ｂｉｏオペロンを有さないが、ｂｐｒ遺伝子座に組込まれたカセットによりファージＳＰ０１−２６プロモーターから転写されるB. subtilisｂｉｏＡ遺伝子の複数のコピー（４−６）を有する）、ＢＩ６１１（Dbio::cat,bpr;;〔P26bioA〕4-6）から調製した、細胞を含まない抽出物を透析して、内因性のレベルのアミノドナーを除去し、抽出物を、標準的アミノ酸、及び数種のその他のアミン化合物のそれぞれの存在下でアッセーした。試験した２６種類の化合物のうち、Ｌ−リシン塩酸塩(純度＞９８％)だけが、ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性を刺激した（表１）。以降の実験において、各種リシン誘導体及びアナログを、活性の刺激について試験した（表２）。より精製したＬ−リシン調製物（純度＞９９％）が活性刺激能を示すことにより、Ｌ−リシンが、この酵素にとって真のアミノドナーであるとの結論が支持され、真のアミノドナーは、リシン調製物中の不純物であるとの可能性は疑問視された。Ｌ−リシンアナログ、（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）が活性刺激能を有することにより更に、Ｌ−リシンが、B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼにとって真のアミノドナーであるとの結論が支持された。（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システインの構造は、γ炭素が硫黄原子で置換されている以外は、Ｌ−リシンと同一である。
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼがアミノドナーとしてリシンを利用することによって、この酵素は、アミノドナーとしてＳＡＭを利用する、その他の細菌のＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（E. coli、S. marcescens、及びB. sphaericus由来）と区別することができる。
【００３５】
実施例４
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの動力学的研究
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの動力学的特性を、ＢＩ６１１（Dbio::cat,brp::〔P26bioA〕4-6）から調製した細胞を含まない粗抽出物を用いて検討した。ＫＡＰＡ及びリシンからのＤＡＰＡの産生は、時間に対してほぼ直線的であることが示された。基質の生成物への変換は、20分間で約１０〜４０％であった。標準的な20分間の反応中に産生されたＤＡＰＡの合計量は、反応混合物に添加したタンパク質の量に直接比例していた。アミノ基転移反応に最適なpHは、pH８．６であると決定された。リシン濃度を、飽和レベル（１９mM）で一定に保持すると、ＫＡＰＡ濃度（＜２０mM）と特異活性の間に直線的相関が認められた(図１)。酵素活性は、２０〜８０mMの間のＫＡＰＡ濃度で一定となり、阻害活性は、８０mMを越えるＫＡＰＡ濃度で観察された。ＫＡＰＡによる基質阻害は、Eisenberg and Stoner (1971, J. Bacteriol. 108: 1135-1140)により、E. coliＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼについても証明されている。E. coliの酵素は、２０mM以上の濃度でＫＡＰＡによる阻害を受ける。ＫＡＰＡ濃度を一定に保つと、B. subtilisｂｉｏＡ酵素活性とリシン濃度（０〜２０mM）との間に、ほぼ直線的な相関が証明された。２０〜４０mMの間の濃度で、リシンについては酵素は飽和状態になった。
ＫＡＰＡによるB. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの基質阻害により、E. coliＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼで認められているように（Stoner et al., J. Biol. Chem. 250: 4037-4043, 1975）、二重置換又はピンポン反応のメカニズムについての証拠が得られた。この結論を支持する更なる証拠も、図２に示した実験により得られた。ＫＡＰＡ濃度を、４種類の異なる固定したリシン濃度で変化させ、当初の速度データを集め、二重逆数型でプロットした。この線は、ＫＡＰＡが低濃度である領域では、ほぼ平行であり、これによってピンポン型反応メカニズムが示される（Stoner et al., J. Biol. Chem. 250: 4037-4043）。
B. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの反応におけるリシン及びＫＡＰＡの見かけのＫm値は、それぞれ２〜２５mM及び１〜５mMの範囲であると測定された。E. coli ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼのＫＡＰＡに対するＫmは、Stoner and Eisenberg (1975, J. Biol. Chem. 250: 4037-4043)によって、１．２mMであると以前に評価されている。リシンに対するＫmは、正確に測定するのが困難である。ＫＡＰＡは、リシンが低濃度である場合では、活性部位への結合を、リシンと競合すると推定されている基質阻害物質であるからである。しかし、リシンに対するB. subtilisＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの見かけのＫm（２〜２５mM）は、Stoner and Eisenberg (1975, J. Biol. Chem. 250: 4037-4043)が測定したように、ＳＡＭに対する精製E. coli酵素のＫm（０．２mM）よりも有意に高かった。
【００３６】
実施例５
増強されたB. subtilis、E. coli又はS. marcescens ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性を有する株の発酵
操作されたビオチン産生株の発酵が、適当なアミノドナーについて制限されるかどうかを試験するために、適当なｂｉｏＡカセットを含む株の発酵物に、リシン、メチオニン（ＳＡＭの前駆体）、又はリシンプラスメチオニンを加える一連の実験を行い、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ変換のレベルを、ビタマーバイオアッセー及びバイオオートグラフィーにより測定した。
発酵はいずれも、溶解酸素コントロール、グルコース供給制限バッチ発酵法を用い、コンピューター制御の１４リットルのChemap発酵器中で行った。発酵は、表９に示した培地を用いて行った。ピメリン酸、リシン、及びメチオニンもまた、表示したように、バッチ培養及び流加培養した。ＨＡＢＡ−アビジン置換アッセーは、振とうフラスコ及び発酵試料中のデチオビオチン及びビオチンの合計量を測定するために用いた。この化学的アッセーとビオチン濃度を測定するバイオアッセー（ヨーロッパ特許公開第６３５５７２号及びTanaka et al., J. Micro. Methods 6: 237-247, 1987に記載されているように）を組み合わせることによって、デチオビオチン産生を更に測定することができる。
ＨＡＢＡ−アビジン置換アッセーは、１）ＨＡＢＡは、溶液中で遊離している場合よりもアジビンと結合している場合に、５００nmでより強力に吸光し、２）ＤＴＢ又はビオチンは、定量的に、アビジンから、ＨＡＢＡと置換するという事実に基づいている。本アッセーを、表１０に記載する。ＨＡＢＡアッセーは、デチオビオチン（ＤＴＢ）２〜１４mg/リットルで直線的である。
全ビタマーを、ＫＡＰＡの分解を防ぐために加圧滅菌前に酸性化した発酵試料中、ＤＴＢ同等物として測定した。全ビタマーは、ヨーロッパ特許公開第６３５５７２号に記載されているように測定した。
【００３７】
実施例６
増強されたB. subtilisｂｉｏＡ活性を有する株のリシン流加発酵
ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ産生に対するリシン流加の効果を、B. subtilis ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰発現するＢＩ２８２及びＢＩ６０３株を用いて検討した。ＢＩ２８２は、ｂｉｏ遺伝子座に組込まれたマルチコピーカセット（Ｐ15ｂｉｏ）のすべてのビオチン生合成遺伝子を過剰発現する。ＢＩ６０３は、ｂｐｒ遺伝子座に組込まれた、更なるｂｉｏＡカセット（Ｐ26ｂｉｏＡ）の複数のコピー（更に、ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの濃度を上昇させる）を含むＢＩ２８２の誘導体である。表３（上）は、バッチ培養及び流加培養の両方における、ピメリン酸１g/リットル、及びリシン６g/リットルで生育させたＢＩ６０３及びＢＩ２８２の光学濃度と、ビオチン及びビタマー産生を示す。バッチ培養及び流加培養においてリシンによりＢＩ６０３及びＢＩ２８２によって産生された全ビタマーは、それぞれ約１３００mg/リットル及び１０００mg/リットルであった。３種類の発酵によるビオチン産生は、同程度であった（２０〜２２mg/リットル）。リシンのバッチ発酵におけるＨＡＢＡビタマー（ビオチン＋ＤＴＢ）の濃度は、リシンを用いない以前の発酵に比べて、著しく高かった。代表的には、ＢＩ２８２及びＢＩ６０３は、２０〜４０mg/リットルのＨＡＢＡビタマーを産生した。リシンの添加により、ＢＩ６０３によるＨＡＢＡビタマー産生量は、５７０mg/リットルまで、ＢＩ２８２によるＨＡＢＡビタマー産生量は、３３０mg/リットルまで上昇した。ビオチン力価に基づくと、リシンの流加培養によって産生されたＨＡＢＡビタマーのほとんどは、デチオビオチンの形であると考えられた。ビオチンはデチオビオチンから得られるため、ＨＡＢＡ力価は、細胞内のデチオビオチンの全産生量を示している（簡単に述べると、デチオビオチン産生量とＨＡＢＡビタマー力価は、相互に交換して用いることができる）。ＢＩ６０３の３０時間発酵試料のバイオオートラジオグラフィーにより、デチオビオチンの蓄積が確認され、ＤＡＰＡは、大量には蓄積されないことが示された（約１０mg/リットル）。
【００３８】
実施例７
増強されたE. coli又はS. marcescensＢｉｏＡ活性を有する株のメチオニン流加発酵
ＳＡＭの前駆体であるメチオニン流加のＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ変換に対する効果を、それぞれE. coli又はS. marcescens ATCC 31809 ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ酵素を発現するＢＩ９０及びＢＩ９６株の発酵により検討した。ＢＩ９０（bio::〔P15bio〕7-8 sacB::〔PvegbioAec〕1）及びＢＩ９６（bio::〔P15bio〕7-8 sacB::〔PvegbioAsm〕1）は、それぞれE. coli PvegbioAec又はS. marcescens PvegbioAsmカセット（ｓａｃＢ遺伝子座に組込まれた）のシングルコピーを含むＢＩ２８２の誘導体である。バッチ培養及び流加培養の両方に、ピメリン酸１g/リットル及びメチオニン３g/リットルを加え；グラム陰性ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼのみによるＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ変換に対する効果を観察するために、これらの発酵物に外因性のリシンは、加えなかった。ネガティブコントロールとして、操作されたグラム陰性ｂｉｏＡ遺伝子を含まないＢＩ２８２もまた、同一条件下で生育させた。表４に示したように、ＢＩ９０、ＢＩ９６、及びＢＩ２８２の全ビタマー産生量は、同程度であった。ビオチン産生量は、通常よりもやや少なかった（５〜１０mg/リットル）。ＢＩ９０及びＢＩ９６のメチオニン流加発酵物中のＨＡＢＡビタマー（ビオチン＋ＤＴＢ）の濃度は、コントロールであるＢＩ２８２の発酵物よりも高かった。S. marcescens ATCC 31809 PvegbioAsmカセットを発現するＢＩ９６は、ＢＩ２８２よりも３〜４倍ものＨＡＢＡビタマーを産生した。E. coli PvegbioAecカセットを発現するＢＩ９０は、５〜６倍高い濃度のＨＡＢＡビタマーを産生した。操作B. subtilisｂｉｏＡ遺伝子を発現する株の、以前のリシン流加発酵物と同様に、ＨＡＢＡビタマーのほとんどは、デチオビオチンであった。増強されたE. coli又はS. marcescens ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性を有する株の発酵物へのメチオニンの添加により、多分、細胞中のＳＡＭ濃度が上昇したことによって、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡの遮断が低下した。更に、ＢＩ９０又はＢＩ９６の発酵物にリシン及びメチオニンの両方を流加した場合、これらの株で、操作されたＰ15ｂｉｏオペロンから作られるB. subtilisＢｉｏＡ酵素が、不十分量のリシンにより制限される程度まで、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡの変換が、増加するであろう。
【００３９】
実施例８
増強されたB. subtilis及びE. coliＢｉｏＡ活性を有する株のリシン及びメチオニン流加発酵
E. coli及びB. subtilis ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼの両方を発現する株であるＢＩ９０の発酵物における、リシン、及びＳＡＭの前駆体であるメチオニンの両者を組み合わせた場合の、ＫＡＰＡ→ＤＡＰＡ変換に対する効果を、バッチ培養及び流加培養の両方にピメリン酸１g/リットル、リシン６g/リットル及びメチオニン３g/リットルを加えることによって検討した。コントロールの発酵として、ＢＩ６０３を、バッチ培養及び流加培養により、リシン６g/リットルの存在下、又は非存在下で生育させた。表５Ａに示したように、リシンを添加しなかったＢＩ６０３は、ＨＡＢＡビタマーをわずかしか産生せず（３０mg/リットル）、そのうち約１０mg/リットルは、デチオビオチンであった。しかし、リシンを添加した場合、ＢＩ６０３におけるデチオビオチン産生量は、１０倍以上増大した（５１０mg/リットル）。更に、リシンとメチオニンの両方と共にＢＩ９０を発酵させると、リシンのみと共にＢＩ６０３を発酵させた場合よりも、約２倍のデチオビオチン（９３０mg/リットル）が得られた。リシン及びメチオニン、並びにピメリン酸１g/リットルと共に培養したＢＩ９０培養物におけるデチオビオチン産生の範囲は、約６００〜９００mg/リットルであったが、いずれの場合でも、ＫＡＰＡの大部分が、ＤＴＢに変換されていた。
これらの株に残存しているＫＡＰＡの量を、インジケーターとしてE. coliｂｉｏＨを用いたバイオオートグラフィーにより３０時間発酵試料を分析することによって確認した（図３及び表５Ｂ）。E. coliＭＥＣ１インジケーターを用いた別のバイオオートグラフィーでは、ＤＡＰＡは、大量には検出されず（リシン及びメチオニンの場合、ＢＩ９０で１５mg/リットル、リシンの場合、ＢＩ６０３で４０mg/リットル；表６、下）、ＢＩ６０３の以前のリシン流加培養と一致していた（表３、下）。
【００４０】
実施例９
アンベレックス（Amberex）基本培地中で生育した、増強されたB. subtilis ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ活性を有する株のリシン流加発酵
ＶＹの替わりにアンベレックスを含む発酵培地（表６）中で生育させたＢＩ２８２におけるビオチン、ＤＴＢ（ＨＡＢＡビタマー）及びビタマー産生に対する、異なる量のリシン添加の効果を検討した。このような発酵条件下、バッチ培養及び流加培養の培地にリシン７．５g/リットルを添加すれば、ＫＡＰＡ→ＤＴＢのほぼ１００％変換を得るのに十分であった。流加培養物により多量（２４．８g/リットル）のリシンを添加する必要はなかった。リシン及びピメリン酸を添加した発酵により、リシンを添加しなかった場合のＢＩ２８２の発酵（６０mg/リットル）よりも、約１０倍のＤＴＢ（６６０〜７８０mg/リットル）が産生された。リシンを添加せずに発酵した場合は、１０倍高量のＤＴＢ（４〜５mg/リットルのビオチン）が得られた発酵に比べて、２〜３倍のビオチン（１２mg/リットル）が産生された。
【００４１】
実施例１０
リシンを過剰産生するＢＩ２８２誘導体の構築
われわれは、別の方法、つまり内部のリシン生合成能を押し上げることによって細胞のリシン貯蔵量を増加させようと試みた。Brevibacter及びCorynebacterの株を開発して、リシン約８０g/リットルを産生させた。これにより、ＤＴＢ合成を刺激するために必要な程度までリシンを過剰生産させるようB. subtilisを操作することが可能なはずである。このためには、２つの基本的な方法がある：
１）リシン生合成について脱調節されている公知の突然変異株を集め、ビオチン産生株に、関連する突然変異を導入する、及び
２）ビオチン産生株のバックグラウンドにおいて直接リシンアナログ耐性について選択することによって、リシン産生について脱調節されている突然変異株を単離する。
【００４２】
実施例１１
B. subtilisの公知のリシン脱調節突然変異株
B. subtilisについてアスパラギン酸からリシンへの生合成経路を、図４に概略する。２つの制御される段階は、アスパルトキナーゼによって触媒される第一の段階と、リシンのみに至る最初の段階であり、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）デカルボキシラーゼによって触媒される最後の段階である。両方の段階は、フィードバック阻害により、そして遺伝子発現のレベルにおいて調節される。調節される酵素の概要を、表７に示す。
リシン合成の脱調節に至る突然変異の４つの型が知られている:
１）ＤＡＰ耐性アスパルトキナーゼＩ；
２）構成的アルパルトキナーゼII；
３）リシン耐性ＤＡＰデカルボキシラーゼ；及び
４）公知のリシン遺伝子のいずれにも結合していない、定義されていない、Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）耐性突然変異。
これらの公知の突然変異を表７にまとめた。後者の３者はいずれも、ＡＥＣ耐性表現型を有しているため、それぞれを、形質導入、形質転換、又はコングレッション（congression）によって、ビオチン産生株に導入することができる。
【００４３】
実施例１２
ビオチン産生株バックグラウンドにおける直接的なリシン過剰生産株の単離
リシン脱調節突然変異株の４種類の古典的な例のうち３例を、リシンアナログ耐性について選択することによって単離した。B. subtilis株であるＰＹ７９（Youngman et al., Plasmid 12: 1-9, 1984）、ＢＩ２８２及びＢＩ６０３を、４種類のリシンアナログに対する感受性について、なにも添加しない、トレオニン添加、又はＤＡＰ及びトレオニン添加の最少培地上で試験した。添加物の目的は、リシン感受性アスパルトキナーゼIIをコードするｌｙｓＣ遺伝子の選択を目指すことである。いかなる条件下でも生育を阻害した唯一のアナログは、ＡＥＣであった。３種類の株はいずれも、同様の挙動を示した；いずれも、３種類の培地いずれにおいても、ＡＥＣに感受性であった。
突発的ＡＥＣ耐性突然変異株を、ＰＹ７９、ＢＩ２８２及びＢＩ６０３から単離した。これらの株における突然変異は、ｌｙｓＣ構成的突然変異株であると考えられた。文献によると、ほとんどのＡＥＣ耐性突然変異株は、この型だからである。それぞれの親株から得られた１１の突然変異株を、最少培地中、リシン分泌について試験した。用いたアッセーは、B. subtilis１Ａ６１５(trpC2 lys::Tn917)をインジケーター株として用いた生物学的アッセーであった。親株のいずれも、アッセーで検出できるだけのリシンを分泌しなかった（＜２mg/リットル）。しかし、１１のＰＹ７９突然変異株のうち１０株は、リシンを２０〜７０mg/リットルの範囲で分泌し、１株のＢＩ２８２突然変異株は、３０mg/リットルを、１株のＢＩ６０３突然変異株は、２６mg/リットルのリシンを分泌した。ＢＩ６４１−及びＢＩ６４２と称するＢＩ２８２及びＢＩ６０３突然変異株を、リシンを流加しない発酵器中、そのビオチン産生について試験し、リシンを流加した場合のＢＩ２８２と比較した。表５、６及び８に示すように、ＢＩ６４１及びＢＩ６４２は、リシンの非存在下で、それぞれの親株よりも多量のＤＴＢを産生したが、リシン６g/リットルを流加した場合ほどではなかった。リシン生合成は上述したように、第二のリシン脱調節突然変異を導入することによって、更に脱調節することができる。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
【表２】
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【００４６】
【表３】
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【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【００４９】
【表６】
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【００５０】
【表７】
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【００５１】
【表８】
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【００５２】
【表９】
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【００５３】
【表１０】
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【００５４】
【表１１】
1999127887.tif 000011
【００５５】
本発明は以下の実施態様を含む：
Ａ．  ビオチンビタマーを製造する方法であって、
（ａ）リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを有する細菌を、リシン、リシンアナログ、又はリシン前駆体に富む環境で培養し；そして
（ｂ）該ビオチンビタマーを回収する、
ことを含む方法。
Ｂ．  ビオチンビタマーを製造する方法であって、
（ａ）リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを有し、リシン産生について脱調節されている細菌を培養し；そして
（ｂ）該ビオチンビタマーを回収する、
ことを含む方法。
Ｃ．  リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように細菌が操作されている、上記AまたはBに記載の方法。
Ｄ．  リシン、リシンアナログ、又はリシン前駆体を、外来的に培養物に添加する、上記Ａ〜Ｃのいずれかに記載の方法。
Ｅ．  ビオチンビタマーが、ビオチン、ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）もしくはデチオビオチンであり、又はビオチンビタマーがデチオビオチンである場合デチオビオチンの回収後、別の発酵、生化学的反応、もしくは化学反応により、回収されたデチオビオチンをビオチンに変換し、そしてビオチンを回収することを更に含む、上記Ａ〜Ｃのいずれかに記載の方法。
Ｆ．  細菌が、リシンアナログ、又はリシンアナログであるＳ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）に耐性である、上記Ａ〜Ｄのいずれかに記載の方法。
Ｇ  細菌が、ｂｉｏＡ発現に加えて少なくとも１つのビオチン合成経路の段階について脱調節されている、上記Ａ又はＢに記載の方法。
Ｈ．  該細菌が、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）−利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを産生するように更に操作されている、Ａ〜Ｆのいずれかに記載の方法。
Ｉ．  メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、又はＳＡＭアナログを培養物に添加する、上記Ｈに記載の方法。
Ｊ．  リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように操作された細菌であって、特に該細菌が、ｂｉｏＡ発現に加えて少なくとも１つのビオチン合成段階の操作による脱調節によってビオチンビタマーを過剰産生するように更に操作されている細菌。
Ｋ．  リシン利用ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼを過剰産生するように操作された細菌であって、該細菌が、リシンを過剰産生するように更に操作されている細菌。
Ｌ．  上記Ａ〜Ｉのいずれかに記載の方法で製造されたビオチンビタマー。