(57)【要約】  高速で画像取得できる顕微鏡装置を提供する。可干渉光源と、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段３と、瞳共役面近傍に配置され、前記複数の光束のうち２光束を位相変調させる位相変調手段５とを有し、前記２光束を、標本１３面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、前記標本の回折光を結像する結像光学系と、撮像手段２１と、前記撮像手段により前記空間変調の位相を変調する度に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段２２とを有する顕微鏡装置であって、前記位相変調手段５は、前記照明光に対して透明な平行平板に、領域ごとに通過する際に発生する位相差が異なるように設定された光学部材を光軸を回転軸に回転することにより前記２光束の相互位相差を変化させる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
可干渉光源と、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記瞳共役面にそれぞれ集光される前記複数の光束のうち２光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記２光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記照明光によって変調を受けた前記標本からの光を結像する結像光学系と、
撮像手段と、
前記撮像手段により前記２光束を位相変調する毎に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置であって、
前記位相変調手段は、領域毎に通過の過程で異なる位相差が発生するように設定された光学部材であり、前記光学部材を回転することにより前記２光束の相互位相差を変化させるものであり、以下の条件を満足する位相変調手段であることを特徴とする顕微鏡装置。
（１）前記領域の数Ｘと、前記空間変調の変調回数Ｎとは、以下の式を満たす。
Ｘ＝[Ｎ／２]＋１    …（１）
ただし、[  ]はガウスの記号であり、中に記載された数値を超えない最大の整数を示す。
（２）(a)前記光学部材の回転軸から見た、前記２光束の各見込み角のうち大きい方の角度をθとするとき、
(b)前記各領域は、前記回転軸を中心とし、中心角の最小値がθであり、最大値が｛２π−（Ｘ−１）θ｝である扇形であって、その半径が、前記２光束のうち前記回転中心から遠いものを包含するような半径である扇形領域のうち、前記２光束が通過する領域を、前記回転軸を中心として回転させることにより包含可能であり、
(c)かつ、前記各領域は、互いに重なり合うことがない。
【請求項２】
可干渉光源と、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記瞳共役面にそれぞれ集光される前記複数の光束のうち３光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記３光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記照明光によって変調を受けた前記標本からの光を結像する結像光学系と、
撮像手段と、
前記撮像手段により前記３光束を位相変調する毎に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置であって、
前記位相変調手段は、領域毎に通過の過程で異なる位相差が発生するように設定された光学部材であり、前記光学部材を回転することにより前記３光束の相互位相差を変化させるものであり、以下の条件を満足する位相変調手段であることを特徴とする顕微鏡装置。
（１）前記領域の数Ｘと、前記空間変調の変調回数Ｎとは、以下の式を満たす。
Ｘ＝Ｎ  （Ｎが奇数のとき）
Ｘ＝Ｎ＋１  （Ｎが偶数のとき）      …  （２）
（２）(a)前記光学部材の回転軸から見た、前記２光束の各見込み角のうち一番大きい角度をθとするとき、
(b)前記各領域は、前記回転軸を中心とし、中心角の最小値がθであり、最大値が｛π−（Ｘ−１）θ｝である扇形であって、その半径が、前記３光束のうち前記回転中心から遠いものを包含するような半径である扇形領域のうち、前記３光束が通過する領域を、前記回転軸を中心として回転させることにより包含可能であり、
(c)前記領域のうち１つは、前記３光束を同時に透過させるような形状とされており、
(d)かつ、前記各領域は、互いに重なり合うことがない。
【請求項３】
前記位相変調手段は、空間変調に不要な照明光を遮蔽する遮蔽手段を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記位相変調手段は、空間変調に不要な照明光を減光する減光手段を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡装置に関し、特に面内方向の超解像を実現できる高解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料の微小構造の観察や計測の分野において、より高い空間分解能での観測が求められている。試料の面内分解能を高める方法として、試料からの回折光のうち、高い空間周波数成分の光を結像させるため、試料面近傍で、あるいは照明光学系中の試料面と共役な位置で、それぞれ回折光あるいは照明光にある種の変調を加え、結像光学系中の試料面と略共役な位置において、与えた変調に対応する復調を行う手法がある。この例として古くはLukoszの方法（W.Lukosz,"Optical systems with resolving powers exceeding  the clasical limit.II",Journal of the Optical Society of America,Vol.37,PP.932(1967)）（非特許文献１）などがあり、最近では、特開平１１−２４２１８９号公報（特許文献１）、ＵＳ  ＲＥ３８３０７号公報（特許文献２）に開示されている方法がある。【０００３】
Lukoszの方法では、試料近傍及び結像光学系中の試料面と略共役な位置に、共役な格子定数を持つ回折格子を1つずつ配置し、それらを共役的に動かす。試料面近傍に配置された回折格子は、本来結像光学系の対物レンズに入射することのできない回折光を像面に到達させることができる。結像光学系中の試料面と略共役な位置に配置された回折格子により、試料面近傍の回折格子による回折光が復調され、本来の回折成分として結像される。本来結像に寄与しなかった高い空間周波数成分を持つ光が試料面近傍の回折格子により像面に到達するため、通常より高い空間分解能を得ることができるというものである。【０００４】
特開平１１−２４２１８９号公報に開示されている第６の実施形態は、蛍光観察装置に適用した例であり、その光学系は、可干渉光源から発した照明光を回折格子等の光束分割手段によって分割後、照明光束を対物レンズの瞳位置に集光させ、対物レンズから角度の異なる平行光束として射出させ、観察物体近傍で重なり合い干渉縞を形成する。【０００５】
この方法は、Lukoszが回折格子を標本近傍に配置することによって行った空間変調の代わりに、照明光によって空間変調を行っている。その効果はLukoszの方法と同様に、本来結像光学系のみでは伝達できなかった観察物体の形状情報の空間周波数成分を含む回折光を結像に関与させることができる。そして分割した照明光束の位相を相対的に変調して、干渉縞を観察物体上で移動させて複数の画像を取得し、画像演算処理による像形成を可能にしている。具体的には、回折格子を光軸と垂直に移動させることによって、あるいは別の例では、照明光の一方の光路に楔形プリズムを挿入し、それを光軸と垂直な方向に移動することによって位相変調を行っている。【０００６】
ＵＳ  ＲＥ３８３０７号公報に開示されている方法では、可干渉光源からの照明光を光ファイバを用いて導入後、回折格子等の光束分割手段によって分割し、その後照明光束を対物レンズの瞳位置に集光させ、観察物体近傍で干渉縞を形成する。縞状に変調された照明光により、本来結像光学系のみでは伝達できなかった観察物体の形状情報の高周波成分を結像に関与させることができる。そして同様に複数の画像を取得し、画像演算処理による像形成を行っている。この方法では、１枚の画像を形成するために、照明光束に位相変調を与えた複数の画像を取得するだけでなく、照明光の干渉縞の向きも変えて画像取得している。その理由は、高周波成分が結像に関与できるのは、照明光の干渉縞の方向と同じ方向を持った構造のみであるため、２次元に広がる標本の形状を再現するには、干渉縞の方向を変換して複数の画像を取得して合成する必要があるからである。
【特許文献１】特開平１１−２４２１８９号広報
【特許文献２】ＵＳ  ＲＥ３８３０７号公報
【非特許文献１】Journal of the Optical Society of America,Vol.37,PP.932(1967)
【非特許文献２】M.G.L.Gustafsson, D.A.Agard, J.W.Sedat  ”Doubling the lateral resolution of wide-field fluorescence microscopy using structured illumination” , Proceedings of the SPIE − The International Society for Optical Engineering (2000) vol.3919, p.141-50.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これら従来の方法では、位相変調を行う素子（回折格子等）を光軸と垂直方向に移動することにより位相変調を行う構成であったため、画像取得を高速に行うことができなかった。特に、観察対象が生きている生物標本の場合は、高速での画像取得が必須であるが、従来の方法では不十分であった。【０００８】
Lukoszの方法では、試料側と結像面側の２つの回折格子を同期して連続的に動かす必要があり、その機構が非常に複雑となる。【０００９】
ＵＳ  ＲＥ３８３０７号公報に開示の方法では、２次元の超解像を得るためには回折格子を回転するが、仮に120°ごとに干渉縞の向きを３方向変換するとして、上記回折格子の動きは次のようになる。すなわち、基準位置で画像取得、光軸と垂直な方向に直線的にリニアアクチュエータによってステップさせて２枚画像取得、光軸位置に戻し、回転モータによって120°回転させ画像取得、光軸と垂直方向にステップさせて２枚取得、光軸位置に戻し、回転モータによって基準から240°の向きまで回転させ画像取得、光軸と垂直方向にステップさせて２枚取得、光軸位置に戻し、回転モータによって基準位置に戻す。【００１０】
つまり、回転とシフトを組み合わせて都合９枚の画像を取得し、その後演算処理によって１枚の標本像が得られるわけである。このとき、上記回折格子をリニアアクチュエータごと回転させる場合と、回折格子のみ回転させて、直線的にステップさせる方向は常に基準角度の１方向とする場合がある。前者は回転させるものの質量が大きくなるため大きい駆動トルクが必要であることから、すばやく停止させることが困難である。後者は回転角を正確に測定して、正確な量を換算してステップさせなければならず、測定演算時間が必要である。【００１１】
特開平１１−２４２１８９号公報に開示されている方法では、楔形プリズムを一方の光路に挿入して、光軸に垂直に移動する方法も同様に、２光束の回転に伴って移動機構付き楔形プリズムを回転させるか、または角度を測定して移動量を換算する必要があり、停止時間または測定演算時間が必要である。【００１２】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、空間変調した照明光を用いて標本形状の高周波成分まで結像に関与させ、取得画像を演算処理することで与えた空間変調を復調して、高解像な標本像を得る超解像顕微鏡であって、高速で画像取得できる顕微鏡装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するための第１の手段は、可干渉光源と、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記瞳共役面にそれぞれ集光される前記複数の光束のうち２光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記２光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記照明光によって変調を受けた前記標本からの光を結像する結像光学系と、
撮像手段と、
前記撮像手段により前記２光束を位相変調する毎に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置であって、
前記位相変調手段は、領域毎に通過の過程で異なる位相差が発生するように設定された光学部材であり、前記光学部材を回転することにより前記２光束の相互位相差を変化させるものであり、以下の条件を満足する位相変調手段であることを特徴とする顕微鏡装置である。【００１４】
（１）前記領域の数Ｘと、前記空間変調の変調回数Ｎとは、以下の式を満たす。
Ｘ＝[Ｎ／２]＋１    …（１）
ただし、[  ]はガウスの記号であり、中に記載された数値を超えない最大の整数を示す。【００１５】
（２）(a)前記光学部材の回転軸から見た、前記２光束の各見込み角のうち大きい方の角度をθとするとき、
(b)前記各領域は、前記回転軸を中心とし、中心角の最小値がθであり、最大値が｛２π−（Ｘ−１）θ｝である扇形であって、その半径が、前記２光束のうち前記回転中心から遠いものを包含するような半径である扇形領域のうち、前記２光束が通過する領域を、前記回転軸を中心として回転させることにより包含可能であり、
(c)かつ、前記各領域は、互いに重なり合うことがない。【００１６】
前記課題を解決するための第２の手段は、可干渉光源と、前記可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段と、瞳共役面近傍に配置され、前記瞳共役面にそれぞれ集光される前記複数の光束のうち３光束を位相変調させる位相変調手段とを有し、前記３光束を、標本面近傍で干渉させることにより干渉縞構造に空間変調した照明光を照射する照明光学系と、
前記照明光によって変調を受けた前記標本からの光を結像する結像光学系と、
撮像手段と、
前記撮像手段により前記３光束を位相変調する毎に撮像された画像を演算処理することにより標本像を生成する画像処理手段とを有する顕微鏡装置であって、
前記位相変調手段は、領域毎に通過の過程で異なる位相差が発生するように設定された光学部材であり、前記光学部材を回転することにより前記３光束の相互位相差を変化させるものであり、以下の条件を満足する位相変調手段であることを特徴とする顕微鏡装置である。【００１７】
（１）前記領域の数Ｘと、前記空間変調の変調回数Ｎとは、以下の式を満たす。
Ｘ＝Ｎ  （Ｎが奇数のとき）
Ｘ＝Ｎ＋１  （Ｎが偶数のとき）      …  （２）【００１８】
（２）(a)前記光学部材の回転軸から見た、前記２光束の各見込み角のうち一番大きい角度をθとするとき、
(b)前記各領域は、前記回転軸を中心とし、中心角の最小値がθであり、最大値が｛π−（Ｘ−１）θ｝である扇形であって、その半径が、前記３光束のうち前記回転中心から遠いものを包含するような半径である扇形領域のうち、前記３光束が通過する領域を、前記回転軸を中心として回転させることにより包含可能であり、
(c)前記領域のうち１つは、前記３光束を同時に透過させるような形状とされており、
(d)かつ、前記各領域は、互いに重なり合うことがない。【００１９】
前記第１の手段、第２の手段において、（１）、（２）の条件は、構造化照明において、２光束、又は３光束の相互の位相状態を変化させて撮像する際に、１枚の位相板の回転で必要な位相状態を実現するための最小の領域数を決定する条件である。【００２０】
この条件を満たさないと、分割する領域数が増えることになる。それは、製作する際のマスクの形状を複雑にしたり、工程数を増やすことにつながり、製作コストを上昇させる。又、領域数が増えるということは、必然的に一つの領域の中心角が狭くなるということであり、製作公差が厳しくなる。【００２１】
前記課題を解決するための第３の手段は、前記第１の手段又は第２の手段であって、前記位相変調手段は、空間変調に不要な照明光を遮蔽する遮蔽手段を有することを特徴とするものである。【００２２】
前記課題を解決するための第４の手段は、前記第１の手段又は第２の手段であって、前記位相変調手段は、空間変調に不要な照明光を減光する減光手段を有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、空間変調した照明光を用いて標本形状の高周波成分まで結像に関与させ、取得画像を演算処理することで与えた空間変調を復調して、高解像な標本像を得る超解像顕微鏡であって、高速で画像取得できる顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の第１．１の実施の形態である顕微鏡装置の光学系の概略を示す図である。
【図２】実施形態１．１で用いる位相板を光軸方向から見た図である。
【図３】光軸に垂直な方向から見た０次高次カット板を示す図である。
【図４】実施形態１．２で用いる位相板の概要を示す図である。
【図５】実施形態１．３で用いる位相板の概要を示す図である。
【図６】実施形態１．５で用いる位相板の概要を示す図である。
【図７】実施形態１．６で用いる位相板の概要を示す図である。
【図８】実施形態１．７で用いる位相板の概要を示す図である。
【図９】位相板の領域分割の変形例を示す図である。
【図１０】本発明の第２．１の実施の形態である顕微鏡装置の光学系の概要図を示す図である。
【図１１】実施形態２．１で用いる位相板の概要を示す図である。
【図１２】実施形態２．２で用いる位相板の概要を示す図である。
【図１３】位相板の領域分割の変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００２５】
１…光ファイバ、２…コレクタレンズ、３…回折格子、４…レンズ、５…位相板、６…０次高次カット板、６ａ…斜光部、６ｂ…透過部、７…レンズ、８…視野絞り、９…レンズ、１０…励起フィルタ、１１…ダイクロイックミラー、１２…対物レンズ、１３…標本、１４…バリアフィルタ、１５…第２対物レンズ、１６…撮像面、２１…撮像手段、２２…演算装置、２３…画像表示装置、３１…フィルタ、４１…回転機構、４２…回転機構、３０１…回折格子、６０１…高次カット板、
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態の例を図を用いて説明する。なお、以下においては、前出の図に示された構成要素と同じ構成要素には、同じ符号を付してその説明を省略することがある。【００２７】
本発明の実施の形態においては、瞳共役位置近傍に配置した位相変調素子の回転によって位相変調を可能にしたことが特徴である。その理由は、２光束又は３光束が空間的に完全に分離されている位置は瞳共役位置であり、それぞれの光束が集光しているから光束断面が非常に小さいため、配置する素子のサイズが小さくて済み、また、ノイズ（光束分割手段として回折格子を用いた場合には、０次回折光および不要な高次の回折光）を除去し、必要な光束のみを通過させる光束選択作用を併せ持つことができるからである。位相変調素子を配置する場所は瞳共役位置が最適であるが、本発明の作用効果に、設計上問題となるような影響を及ぼさない限り、瞳位置からわずかにずれた範囲(近傍)でもよい。【００２８】
（第１．１実施形態）
図１は、本発明の第１．１の実施の形態である顕微鏡装置の光学系の概略を示す図である。図示しない光源からの光は光ファイバ１にて導かれ、コレクタレンズ２によって平行光に変換される。回折格子３によって回折光を生じさせ、フィルタ３１を透過させた後、レンズ４により瞳共役面を形成する（この瞳共役面は後に述べる対物レンズ１２の瞳共役面でもある）。【００２９】
回折格子３は図１の紙面の垂直方向に１次元の周期構造をもっており、濃度（透過率）で構造をつけても、段差（位相差）で構造を持たせてもよいが、位相型の方が±１次光の回折効率が高いので好ましい。【００３０】
瞳共役面近傍には、位相板５が配置されている。図２は、位相板５を光軸方向から見た図である。この位相板５は図２（200）に示すように５ａ、５ｏの２つの領域に分割されている。そして、画像処理に必要な位相変調を行うために位相板５は光軸を軸として回転して、２光束がそれぞれ領域５ａと５ｏを順次通過することで、２光束の相互の位相差を変調するものである。【００３１】
その手段は、光路外に配置した回転モータにより歯車等を介して、位相板５を光軸中心に回転させることで行うが、位相板５を回転させる方法はこれに限ったものではない。これにより、２光束が瞳共役位置を通過する際に、所定の位相差を与えることができる。本実施の形態では領域５ａに所定厚さのSiＯ２膜を蒸着して、領域５ｏを通過する光に対して、位相が２π／３だけ遅れるようにしてある。【００３２】
屈折率ｎの膜で、波長λの光の位相差φを生じさせる膜厚ｔは、
ｔ＝φ×λ／｛２×π×（ｎ−１）｝
で表される。【００３３】
実施の形態では光源の波長を532nmとしたので、SiＯ２の532nmに対する屈折率1.46から、位相差２π／３に相当する膜厚は、385nmである。【００３４】
本実施の形態ではSiＯ２膜を蒸着して製作したが、光源波長の透過率が十分ある材質であれば他の材料でもよく、例えばMgＦ２膜などでもよい。また、SiＯ２基板をエッチングしたり機械的に研削／研磨することにより、上記の段差を作製して、位相差を生じさせることもできる。【００３５】
さて、±１次光が通過する領域に対して図２（211）に示す回転角で位相板５の回転を止めると、＋１次光は−１次光に対し２π／３だけ位相が遅れるので、＋１次光と−１次光の位相差は−２π／３である。さらに回転して図２（212）の位置では、位相差は０、さらに回転して図２（213）の位置では、位相差は＋２π／３である。このようにして、以下のように位相板５を回転して２光束の位相差を２π／３ずつ３ステップ変調することが可能である。
【表１】
2009031418.tif 000003
【００３６】
図２（221）（222）（223）は、回折格子を回転させて２光束の方向を６０°回転させた状態である。前述と同様に位相板５を120°ずつ回転して、２光束の位相差を３ステップ変調することが可能である。図２（231）（232）（233）は２光束の光束をさらに６０°回転させた状態を示し、この場合も同様に位相板を120°ずつ回転して２光束の位相差を３ステップ変調可能である。【００３７】
ここで、位相変化量が不均等の場合は標本が縞模様に退色してしまうため、できるだけ均等に周期の１／３ずつ位相差を変化させることが望ましい。【００３８】
図１に示される０次高次カット板６は、位相板５に近接して配置されている。近接とは、ある程度離れてもよいことを示し、光学特性の変化が設計条件により許される範囲である。図３に光軸方向から見た０次高次カット板６を示す。６ａは遮光部で、０次光や不要な高次光をカットする働きをしている。６ｂは透過部で、必要な光束が通過する有効径を確保している。【００３９】
図３では領域６ａを遮光部材とし、０次光や不要な高次光をもれなく遮断するようにしているが、この構成に限るものではなく、位相板５を製作する際に、不要な光束が通過する領域に遮光膜を蒸着し、位相板５と０次高次カット板６を一体化させることもできる。【００４０】
又、０次光や不要な高次光をカットするのでなく、カット板の代わりに減光板を使用し、不要な光を弱めるようにしてもよい。【００４１】
図１において、位相板５および０次高次カット板６を通過した光は、レンズ７によって視野絞り８の位置に標本共役面を形成したのち、レンズ９および励起フィルタ１０、落射照明系と結像系を分割合成するダイクロイックミラー１１を介して対物レンズ１２の瞳Ｐに２つのスポットを形成する。この２つのスポットは対物レンズ１２の瞳Ｐの概ね最外周部に形成され、対物レンズ１２から射出する際には、対向する最大ＮＡの角度の平行光束となって標本１３面を照射する。このとき、２光束は可干渉であるため等間隔の干渉縞の構造を持って標本面を照射するのである。この、縞構造を持った照明光を構造化照明光と呼ぶ。【００４２】
この構造化照明光で標本１３を照明すると、照明光の周期構造と標本１３の周期構造が干渉してモアレ干渉縞を生成するが、そのモアレ干渉縞は標本１３の高周波の形状情報を含んでいながらもとの周波数より低周波であるため対物レンズ１２に入射することができる。そして結像した画像を取得し、既知の照明光の周期構造を演算、復元処理することにより、未知である標本の形状をもとめ可視化する技術が構造化照明超解像顕微鏡の原理である。【００４３】
標本１３からの光は、対物レンズ１２を通って平行光に変換されたのち、ダイクロイックミラー１１を透過して、バリアフィルタ１４を介し、第２対物レンズ１５によってＣＣＤカメラなどの撮像手段２１の撮像面１６上に標本像を形成する。【００４４】
ただしこの取得画像は、先にも述べたように変調された照明光で照明された結果の画像であるから、画像記憶・演算装置２２によって公知の画像演算手段により画像処理され逆の変調をかけて復元することで標本像を得て、画像表示装置２３に標本の超解像画像を表示することができる。【００４５】
画像処理で元画像を復元する際には、同じ標本に対して、照明の干渉縞の位相を３回以上変調させて撮影するとよい。それは、変調画像には標本の周波数成分が構造化照明によって回折された情報のうち０次成分、＋１次成分、−１次成分の３つの未知のパラメータがあるからで、演算処理で未知数を求めるためには、未知数の数以上の情報が必要になるからである。【００４６】
本実施形態の配置においては、２光束の方向を回転させる回転機構４１と、位相変調を行う回転機構４２を分離させた配置にしたため、それぞれ小さな駆動トルクで回転させることが可能で、回転と停止を高速に行うことができる。また位相板５においては、回転速度と露光時間を同期させることにより、停止せずに画像を露光することが可能である。すなわち、一方の光束が領域５ａ内にある間（図２（211）の状態）に露光が完了し、撮像素子から画像演算装置に画像が転送されている間も、位相板５は回転を続け、次の露光が開始される際は図２（212）の状態にあり、さらに３枚目の露光時はもう一方の光束が領域５ａ内（図２（213）の状態）にあるという状態である。その場合は領域５ａの扇形の中心角を図２よりも小さくし９０度程度にすると等速回転になるので好ましい。【００４７】
このように、高速で照明光の位相変調を行うことができるため、生きた生体標本の高解像度の像を得ることができる。【００４８】
本実施の形態の場合、撮像する位相差が３ステップ、領域の数は２であるから、[ξ]がξを超えない整数を表すとして、
[Ｎ／２]＋１＝[（３／２）]＋１＝  ２
となり条件式（１）を満たす。【００４９】
なお、本実施の形態の配置では、０次高次カット板６を瞳共役位置に配置し、位相板５を瞳共役位置より標本側に配置したが、本発明はこれに限定されるものではなく、順序を逆にして光源側に位相板５を配置してもよいし、双方をそれぞれ異なる瞳共役位置に置いてもよい。【００５０】
（第１．２実施形態）
続いて本発明の第１．２の実施の形態の説明を行う。なお、本実施形態及び以下の第１．３〜第１．６実施形態においては、顕微鏡装置の構成そのものは、第１．１実施の形態と同じであり、位相板５の部分が異なるのみである。本実施の形態は、撮像する位相差を４ステップにする場合である。【００５１】
画像処理の際の未知数は先に述べた通り３つであるが、顕微鏡像の撮影には、照明ムラや振動の影響、各種収差による影響、撮像素子のノイズ等、画質を劣化させる要因が多くある。したがって、データを多く取得し、最小二乗法等のノイズ低減処理を行うことが好ましい。【００５２】
図４に本実施の形態の位相板５２の例を示す。位相板５２は５２ａ，５２ｂ、５２ｏの３つの領域から構成され、５２ａは５２ｏより位相がπ／２遅れるような、また５２ｂは５２ｏより位相がπ遅れるような厚さでSiＯ２膜を蒸着してある。本実施の形態によれば、以下に示すように位相板５２の回転位置４ポジションで２π／４ずつ４ステップの位相変調が可能である。
【表２】
2009031418.tif 000004
【００５３】
２光束を６０°回転させた（421）〜（424）、（431）〜（434）についても同様である。【００５４】
本実施の形態の場合、撮像する位相差が４ステップ、領域の数は３であるから、
[Ｎ／２]＋１＝[４／２]＋１＝  ３
となり条件式（１）を満たす。【００５５】
本実施の形態では５２ａは５２ｏより位相がπ／２遅れるとしたが、３π／２遅れる厚さにしても得られる位相差の組み合わせは同様になる。ただし、一般に膜厚が厚くなると厚みのムラが生じやすくなるので、製作容易性を考慮して、できるだけ膜厚が薄くなるように設定することが好ましい。【００５６】
（第１．３実施形態）
次に本発明の第１．３の実施の形態について説明する。本実施の形態は第１．２の実施の形態と同じ４ステップの例であるが、領域の角度分割を変えたものである。【００５７】
図５に本実施の形態の位相板５３の例を示す。位相板５３においては、領域５３ａ、５３ｂの扇形の中心角を９０°に設定した。ただし、第１．２の実施の形態と異なり、５３ｏに対する５３ａの厚みを位相差π／４分とし、５３ｏに対する５３ｂの厚みを３π／４分とした。【００５８】
本実施の形態によれば、以下に示すように位相板５２の回転位置４ポジションで２π／４ずつ４ステップの位相変調が可能である。
【表３】
2009031418.tif 000005
【００５９】
２光束を６０°回転させた（521）〜（524）、（531）〜（534）についても同様である。【００６０】
本実施形態の場合、撮像する位相差が４ステップ、領域の数は３であるから、
[Ｎ／２]＋１＝[４／２]＋１＝３
となり条件式（１）を満たす。【００６１】
本実施の形態は第１．２実施の形態に比べ、同じ分割数ながら領域の中心角が大きいので、連続回転に好適である。【００６２】
（第１．４実施形態）
次に本発明の第１．４の実施の形態について説明する。本実施の形態は、位相差を５ステップにする例である。図６に本実施の形態の位相板５２の例を示す。位相板５４において、５４ｏに対する５４ａの厚みを位相差２π／５相当とし、５４ｏに対する５４ｂの厚みを位相差４π／５相当とする。【００６３】
本実施の形態によれば、以下に示すように位相板５４の回転位置５ポジションで２π／５ずつ５ステップの位相変調が可能である。
【表４】
2009031418.tif 000006
【００６４】
２光束を６０°回転させた場合についても同様である。【００６５】
本実施の形態の場合、撮像する位相差が５ステップ、領域の数は３であるから、
[Ｎ／２]＋１＝[５／２]＋１＝３
となり条件式（１）を満たす。【００６６】
（第１．５実施形態）
次に本発明の第１．５の実施の形態について説明する。本実施の形態は、位相差を６ステップにする例である。図７に本実施の形態の位相板５５の例を示す。位相板５５において、５５ｏに対する５５ａの厚みを位相差２π／６相当、５５ｏに対する５５ｂの厚みを４π／６相当、５５ｏに対する５５ｃの厚みを６π／６相当とする。【００６７】
本実施の形態によれば、以下に示すように位相板５５の回転位置６ポジションで２π／６ずつ６ステップの位相変調が可能である。
【表５】
2009031418.tif 000007
【００６８】
２光束を６０°回転させた場合についても同様である。【００６９】
本実施の形態の場合、撮像する位相差が６ステップ、領域の数は４であるから、
[Ｎ／２]＋１＝[６／２]＋１＝４
となり条件式（１）を満たす。【００７０】
（第１．６実施形態）
次に本発明の第１．６の実施の形態について説明する。本実施の形態は、位相差を６ステップにする例である。図８に本実施の形態の位相板５６の例を示す。位相板５６において、５６ｏに対する５６ａの厚みを位相差π／６相当、５６ｏに対する５６ｂの厚みを３π／６相当、５６ｏに対する５６ｃの厚み５π／６相当とする。本実施の形態によれば、以下に示すように位相板５６の回転位置６ポジションで２π／６つ６ステップの位相変調が可能である。
【表６】
2009031418.tif 000008
【００７１】
２光束を６０°回転させた場合についても同様である。【００７２】
本実施の形態の場合、撮像する位相差が６ステップ、領域の数は４であるから、
[Ｎ／２]＋１＝[６／２]＋１＝４
となり条件式（１）を満たす。本実施の形態は、第１．５の実施の形態に比べて領域の中心角が大きいので、連続回転に向いている。【００７３】
以上の実施の形態においては、何れの場合も、位相板５の分割は以下のように行う必要がある。まず、分割された各領域を、２つの光束が通過できる必要がある。各領域は、位相板の回転軸から見た、２光束の各見込み角のうち大きい方の角度をθとするとき、回転軸を中心とし、中心角の最小値がθである扇形であって、その半径が２光束のうち回転中心から遠いものを包含するような半径である扇形領域のうち、２光束が通過する領域を、回転軸を中心として回転することにより包含可能でなければならない。【００７４】
このような領域を（Ｘ−１）個有すると、最低でも中心角が（Ｘ−１）θの扇形領域が使用される。よって、１つの領域が含有する扇形領域の中心角の最大値は｛２π−（Ｘ−１）θ｝となる。又、当然のこととして、各領域は重なってはならない。【００７５】
以上の実施の形態においては、いずれも領域は扇形としたが、この条件を満足すれば、例えば図９に示すような領域区分とすることができる。図９において小さな黒丸は＋１次光、小さな白丸は−１次光を示す。図９（ａ）、図９（ｂ）とも２つの領域に区分されているが、位相板を光軸を中心として回転させることにより、各領域とも上記の条件を満たす。【００７６】
又、図９（ｃ）は３つの領域に区分されているが、領域ａは、本発明に対して何ら作用効果を及ぼさない無効領域であり、無いのと同じである。実際の位相板の製造にあたっては、このような無効領域をいろいろな形式で含ませることができるが、特許請求の範囲、及び課題を解決する欄で言う領域には、このような無効領域を含まない。【００７７】
（第２．１実施形態）
図１０に、本発明の第２．１の実施の形態である顕微鏡装置の光学系の概要図を示す。この実施の形態の、図１に示す第１．１の実施の形態との違いは、回折格子３０１と高次カット板６０１である。すなわち、本実施の形態では、回折格子３０１による回折光のうち０次と±１次の３光束を使用して、標本１３上に３光束干渉縞を生成する。【００７８】
回折格子３０１の回折光の強度比はおおよそ０次：＋１次：−１次＝１：１：１となるように、位相格子のデューティー比を設定してある。回折格子３０１の回折光の強度比は前記のように０次：＋１次：−１次＝１：１：１となるのが望ましいが、製造誤差等で望ましい強度比にならなかった際には、高次カット板６０１の内側にＮＤフィルター等を設置して光量を調節してもよい。【００７９】
標本１３上には、±１次の２光束による干渉縞と、０次と１次、０次と−１次による前記干渉縞の２倍の周期の干渉縞が合成されて存在する。このうち０次と１次、０次と−１次による干渉はどちらも対となる入射光が光軸に対して対称ではないため光軸方向にも干渉縞を作り、その結果合成波は標本１３上でｘｙ方向（光軸に直角な方向）だけでなくｚ方向（光軸方向）にも構造を持った干渉縞となる。【００８０】
この３光束干渉縞で構造化照明された標本は、２光束干渉縞で構造化照明された実施の形態と同じｘｙ方向の変調に加えてｚ方向にも変調されている。そのため、変調画像を取得して、適切な画像演算を施すと、ｚ方向の解像力も向上されたいわゆるセクショニング画像が得られる。【００８１】
このことは、M.G.L.Gustafsson, D.A.Agard, J.W.Sedat  ”Doubling the lateral resolution of wide-field fluorescence microscopy using structured illumination” , Proceedings of the SPIE − The International Society for Optical Engineering (2000) vol.3919, p.141-50.（非特許文献２）に説明されている。【００８２】
３光束干渉による構造化照明の画像復元演算には未知数が５つある。（それは、標本のもつ空間周波数情報が構造化照明によって回折する各成分のうち、変調画像に含まれるものは、波数空間のｆＺ＝０平面内にある０次成分、±１次成分の３つ、波数空間のｆＺ≠０平面内にある４つの成分の都合７つの成分であるが、標本のｚ方向すなわち光軸方向の構造の調査はステージのｚ送りなどによる光学系に対する標本の相対的な移動で実現できるので、波数空間におけるｆＺ≠０平面内の成分のうちｆｚの符合のみが異なる２対についてはそれぞれ分離する必要がないからである。）したがって最低５枚の位相変調画像を取得する必要がある。そしてその位相変調量は、以下のようにするのが好ましい。
【表７】
2009031418.tif 000009
【００８３】
こうすると、０次と±１次回折光の干渉による縞が１周期位相変化する間に、±１次回折光の干渉による縞は２周期位相が変わる。前述のように、位相変化量が不均等の場合でも画像演算は可能だが標本が縞模様に退色してしまうというデメリットが生じる。【００８４】
上記の５ステップの位相変調を、瞳共役位置近傍に配置した位相板５を、光軸を回転軸に回転することで行う。図１１に本実施の形態の位相板５７の例を示す。位相板５７において、５７ｏに対する５７ａの厚みを位相差１６π／５相当、５７ｏに対する５７ｂの厚みを１４π／５相当、５７ｏに対する５７ｃの厚み８π／５相当、５７ｏに対する５７ｄの厚みを２π／５相当とする。【００８５】
本実施の形態によれば、下表に示すように位相板５７の回転位置５ポジションで、±１次光は４π／５ずつ５ステップ、１次と０次、０次と−１次の位相差は２π／５ずつ５ステップそれぞれの位相変調が可能である。
【表８】
2009031418.tif 000010
【００８６】
２光束を６０°回転させた場合についても同様である。【００８７】
本実施の形態の場合、３光束干渉で撮像する位相差が５ステップ、領域の数は５であるから、
Ｎ＝  ５
となり条件式（２）を満たす。【００８８】
（第２．２実施形態）
この実施の形態においては、顕微鏡の構成は図１０に示す第２．１実施の形態のものと同じであり、位相板５の構成が違うのみである。この実施の形態においては位相差は６ステップとし、図１２に使用する位相板５８の構成を示す。位相板５８において、５８ｏに対する５８ａの厚みを位相差２０π／６相当、５８ｏに対する５８ｂの厚みを１８π／６相当、５８ｏに対する５８ｃの厚み１６π／６相当、５８ｏに対する５８ｄの厚み１０π／６相当、５８ｏに対する５８ｅの厚みを２π／６相当、５８ｏに対する５８ｆの厚みを４π／６相当とする。【００８９】
本実施の形態によれば、下表に示すように位相板５７の回転位置５ポジションで、±１次光は４π／６ずつ６ステップ、１次と０次、０次と−１次の位相差は２π／６ずつ６ステップそれぞれの位相変調が可能である。
【表９】
2009031418.tif 000011
【００９０】
２光束を６０°回転させた場合についても同様である。【００９１】
本実施の形態の場合、３光束干渉で撮像する位相差が６ステップ、領域の数は７であるから、
Ｎ＝６＋１＝７
となり条件式（２）を満たす。【００９２】
以上の第２．１の実施の形態。第２．２の実施の形態においては、何れの場合も、位相板５の分割は以下のように行う必要がある。まず、分割された各領域を、３光束のうち回転中心から遠い２つの光束が通過できる必要がある。そのためには、各領域は、位相板の回転軸から見た、３光束の各見込み角のうち一番大きい角度をθとするとき、回転軸を中心とし、中心角の最小値がθである扇形であって、その半径が３光束のうち回転中心から最も遠いものを包含するような半径である扇形領域のうち、３光束の回転中心から遠い２光束が通過する領域を、回転軸を中心として回転させることにより包含可能でなければならない。【００９３】
又、１つの領域には、３光束を同時に透過させるような形状とされている必要がある。通常、０次光は光軸を通るので、この領域は光軸を含むように形成される必要がある。この領域によって、位相板５の領域は２つの部分に区分され、各部分はさらにそれぞれ（Ｘ−１）／２区分されることになる。よって、１つの領域が含有する扇形領域の中心角の最大値は｛π−（Ｘ−１）θ／２｝となる。又、当然のこととして、各領域は重なってはならない。【００９４】
この条件を満足すれば、例えば図１３に示すような領域区分とすることができる。図１３において小さな黒丸は＋１次光、小さな白丸は−１次光、小さなハッチングをした丸は０次光を示す。図１３（ａ）は５つの領域に区分されているが、位相板を光軸を中心として回転させることにより、各領域とも上記の条件を満たす。【００９５】
又、図１３（ｂ）は７つの領域に区分されているが、領域ｂは、本発明に対して何ら作用効果を及ぼさない無効領域であり、無いのと同じである。実際の位相板の製造にあたっては、このような無効領域をいろいろな形式で含ませることができるが、特許請求の範囲、及び課題を解決する欄で言う領域には、このような無効領域を含まない。【００９６】
なお、以上の実施の形態においては、可干渉光源からの光束を複数の光束に分割する光束分割手段として回折格子を用いているが、光分割手段としては、回折格子のみならず、偏光ビームスプリッタ、ハーフミラーや、入口が１つで出口が複数のバンドル光ファイバ等を使用することができる。
【図１】
2009031418.tif 000012
【図２】
2009031418.tif 000013
【図３】
2009031418.tif 000014
【図４】
2009031418.tif 000015
【図５】
2009031418.tif 000016
【図６】
2009031418.tif 000017
【図７】
2009031418.tif 000018
【図８】
2009031418.tif 000019
【図９】
2009031418.tif 000020
【図１０】
2009031418.tif 000021
【図１１】
2009031418.tif 000022
【図１２】
2009031418.tif 000023
【図１３】
2009031418.tif 000024
【国際調査報告】
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