【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年3月7日(2005.3.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  複合DNAメチル化フィンガープリントの調製方法
【特許請求の範囲】
【請求項1】  組織および細胞群の挙動を予知し、発現の変化した遺伝子を同定するための組織および細胞型の特性化、分類および区分方法であって、
任意の組織試料から得られ、それ自体公知の方法で処理され、断片化処理されるかまたは制限エンドヌクレアーゼにより切断処理されたゲノムDNAにおいて、塩基シトシンがそれ自体公知の方法で重亜硫酸塩溶液による処理でウラシルに変換されるが、5-メチルウラシルは変換されず；
上記処理ゲノムDNA分画が極めて短い、または縮重オリゴヌクレオチド、または重亜硫酸塩処理の前に切断DNAの末端に連結されたアダプターオリゴヌクレオチドに対して相補性であるオリゴヌクレオチドの使用により増幅され、全体としてグアニンに富んだDNA鎖上の残存シトシン量、および/または増幅分画由来のシトシンに富んだDNA鎖上のグアニン量がハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ反応により検出され、その反応はこの様な分析で得られ、データ処理アルゴリズムに自動的に用いられるたデータが、分析された細胞材料の表現型に関する結論を引き出すことを可能にする様な反応であることを特徴とする方法。
【請求項2】  表現型で同一または類似の細胞または組織由来のDNA試料に関する数回または多数回の上記試験の上記解析から得られたデータが、ニューラルネットワークまたは他の評価アルゴリズムを用いる訓練フェーズにおいて、そのDNAが調べられた細胞の発現型と関連付けられるか；
発現型とメチル化状態との関係に関する評価パターンにおいてこの訓練フェーズに含まれるデータが、未知の起源のDNA試料のメチル化状態の発生により、そのDNAが調べられた細胞の表現型を導くために用いられるか；または
既知の細胞型のDNAのメチル化状態に関する評価パターンにおいてこの訓練フェーズに含まれるデータが、試験されたDNA中でこの訓練フェーズで測定されたメチル化状態とは異なるシトシン位置を同定するために用いられることを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載の方法。
【請求項3】  重亜硫酸塩、およびその認識配列内の5'-CpG-3'周辺配列内にシトシンを含む制限エンドヌクレアーゼ処理の前にDNAが切断し、5'-CpG-3'周辺配列内のシトシンが5'位置で未メチル化型である様な認識配列でのみDNAが切断することを特徴とする特許請求の範囲第1項に記載の方法。
【請求項4】  ゲノムDNAがそれ自体公知の方法で重亜硫酸塩溶液で修飾される前に、このゲノムDNAが制限エンドヌクレアーゼで切断し；
得られた末端は連結反応により、アダプターとも呼ばれる公知の、短い二重鎖DNA配列を備え；
重亜硫酸塩で処理されたアダプターに対し相補性であるオリゴヌクレオチドを、すべてのDNA断片、またはこの方法で製造された、または全てのフラグメント全体から発生するサブ集団を重亜硫酸塩処理後に増幅する目的で使用することを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項5】  シトシンをウラシルに転換すると同時にメチルシトシンを得る目的で、ゲノムDNA試料と重亜硫酸塩溶液の反応を0℃から100℃の間の反応温度を周期的に変化させて行うことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項6】  重亜硫酸塩処理前にDNA試料を小さい分子のみを透過し得る加熱可能多孔性キャピラリーに移し、キャピラリーの中で試薬を透析により添加、除去することにより重亜硫酸塩処理以後の反応工程を行うことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項7】  重亜硫酸塩処理前のDNA試料を小さい分子が不透過性の加熱可能キャピラリーに移し、キャピラリーの中で連結したキャピラリーを通して試薬を供給することにより試薬を添加、除去して、重亜硫酸塩処理以後の反応工程を行うことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項8】  重亜硫酸塩処理以後のポリメラーゼ反応を重亜硫酸塩処理と同じキャピラリー中、またはこのキャピラリーに接続したキャピラリー中、またはこのキャピラリーに接続した容器中で行うことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項9】  重亜硫酸塩処理DNA試料とのポリメラーゼ反応が行われるキャピラリー中で、生成した断片群の長さによる分離も行われることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項10】  処理されたDNAを後者から重亜硫酸塩の沈殿によって分離することを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項11】  重亜硫酸塩処理ゲノムDNA試料の増幅のため、2つのクラスのオリゴヌクレオチドが組み合わされる方法であって、1つのクラスのオリゴヌクレオチドは5'-CpG-3'周辺配列中の塩基以外は塩基シトシンまたはその類似体を含まないか、極めて僅かな量を含むか、または増幅に必須でないオリゴヌクレオチド領域のみに含み；他のクラスのオリゴヌクレオチドは5'-CpG-3'周辺配列中の塩基以外は塩基グアニンまたはその同族体を含まないか、極めて僅かな量を含むか、または増幅に必須でないオリゴヌクレオチド領域、例えば5'-領域等の領域にのみに含み、2つのクラスのオリゴヌクレオチドは
a)  極めて短いため、それぞれが2つのクラスの1個のみの代表を含む増幅において、100個以上の異なった断片が増幅されるか、
b)  いわゆる縮重位置を非常に多く含むため、2つのクラスそれぞれの1個のみの代表による増幅において、100個以上の異なった断片が増幅されるか、または
c)  非常に多数が使用されるため、増幅において100個以上の異なった断片が増幅されることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項12】  各反応毎に処理され増幅されたDNAと、異なったオリゴヌクレオチドとを、ポリメラーゼ反応の目的で各調合毎に混合する方法であって、オリゴヌクレオチドは
その5'-末端でアダプターと相補性であるか、重亜硫酸塩で処理されたオリゴヌクレオチドの増幅に対し一般的に相補性であり、
各反応においてその3'-終点で異なり、
その可変3'-末端は既知のアダプター配列またはオリゴヌクレオチド配列の下流で開始し、かつ
その可変3'-終点は既知のアダプター配列を超えて2から12ヌクレオチド分だけ未知のテンプレートDNA配列中へ延びていることを特徴とする特許請求の範囲第4項または第11項記載の方法。
【請求項13】  オリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ反応が開始し、そのオリゴヌクレオチドは重亜硫酸塩処理DNAと相補性である反応は、dATP、dTTPおよびdCTPの3種のヌクレオチド、またはこれらの3種のヌクレオチドの類似体に加えて、
塩基シトシンに相補性であり、ポリメラーゼによる取り込み後、鎖のそれ以上の伸長を防止するヌクレオチド類似体を含むか、または
塩基シトシンに相補性であるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まないことを特徴とする請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項14】  オリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ反応が開始し、そのオリゴヌクレオチドは重亜硫酸塩処理DNAと相補性である反応は、dATP、dTTPおよびdCTPの3種のヌクレオチド、またはこれらの3種のヌクレオチドの同族体に加えて、三種のヌクレオチド、および
塩基シトシンに相補性であり、ポリメラーゼによる取り込み後、鎖のそれ以上の伸長を防止するヌクレオチド類似体を含むか、または
塩基シトシンに相補性であるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まないことを特徴とする特許請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項15】  DNA試料中で先にメチルシトシンが含まれていた位置におけるポリメラーゼ反応の停止は、特異的に停止したポリメラーゼ反応生成物を検出し得る様な方法でそれ自体が修飾されているターミネータにより行われることを特徴とする特許請求の範囲第12項記載の方法。
【請求項16】  請求の範囲3から15の適当な組み合せに由来する個々の反応調合物の異なった断片混合物が、MALDI-TOFまたはその他のマススペクトロメーターのイオン源の各点に用いられ、個々の反応の断片組成はすべてのDNA断片の分子量測定により決定されることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項17】  請求の範囲3から15の適当な組み合せに由来する個々の反応調合物の異なった断片の混合物が、ゲル電気泳動の個々のレーンに用いられ、個々の反応の断片組成はすべてのDNA断片の分子量測定により決定されることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項18】  それによりポリメラーゼ反応が開始する請求の範囲第12項で定義されるオリゴヌクレオチドがそれぞれ、異なった配列と異なった化学標識を有するオリゴヌクレオチドとカップリングし、その化学的および/または物理的性質が標準クロマトグラフィーまたはマススペクトロメトリー法により異なった標識の検出と区分を可能にすることを特徴とする特許請求の範囲第4項または第11項記載の方法。
【請求項19】  第1増幅工程で調製された、重亜硫酸塩処理試験DNAの断片分画が、複数の化学的に異なった標識を受けたオリゴヌクレオチドと同時に混合され；
これらのオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ反応のプライマーとして反応調合物中で使用され；
得られた断片の複合混合物が、第1分析工程で長さによる電気泳動調合物として用いられ；かつ
得られた電気泳動由来の断片混合物の複合混合物が、各長さの分画中でオリゴヌクレオチドを特性化する化学標識の有無を検出するクロマトグラフィーまたはマススペクトロメトリー分析に用いられることを特徴とする特許請求の範囲第18項記載の方法。
【請求項20】  塩基シトシンまたはその類似体を含まない、または5'-CpG-3'周辺配列中にのみそれを含む、または試料DNAとのハイブリダイゼーションに必須でない領域のみにそれを含む表面；または
塩基グアニンまたはその類似体を含まない、または5'-CpG-3'周辺配列中にのみそれを含む、または試料DNAとのハイブリダイゼーションに必須でない領域のみにそれを含む表面にオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項21】  重亜硫酸塩で処理され、請求の範囲第4項または第11項記載の方法により増幅されたDNA試料が
表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされ、そのオリゴヌクレオチドは既知の方法で表面の各点毎に既知である様に固定化され、そのオリゴヌクレオチド配列はその点に正確に位置決めされ、ハイブリダイゼーションに必須である領域中でオリゴヌクレオチドと試料DNAが完全に相補性である場合、増幅された試料DNAと固定化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを生じるか、または適当な洗浄工程後のみ残存することを特徴とする特許請求の範囲第20項記載の方法。
【請求項22】  上記請求の範囲で定義された少なくとも2個の成分（例えば重亜硫酸塩で処理されたDNAの増幅用オリゴヌクレオチドとタンパク質用マトリックスに固定化されたオリゴヌクレオチドとの組み合せ）がDNAを重亜硫酸塩で処理するために組み合わされ、この処理されたDNAの増幅、およびその結果、癌の臨床的に妥当な診断が行える様に哺乳動物ゲノムの100CpGジヌクレオチドのメチル化状態の検出が行われることを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第21項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明の方法は癌の鑑別診断の新しい可能性を提供する。その方法は発癌と多遺伝子性遺伝病の病原のより深い理解を可能にする。さらにその方法は、発病に係わる全ての遺伝子の同定に関連する。今まで、細胞分化と高等器官の分化は本質的に理解されていなかった。本発明の方法は知識をかなり増加させることを約束する。
【0002】
分子生物学における最近の方法論の開発により十分に研究された観察レベルには、遺伝子そのもの、遺伝子のRNAへの翻訳、およびその結果得られるタンパク質が含まれる。個人の成長の過程で何時遺伝子のスイッチが押されるか、ある細胞中で遺伝子の活性化と阻害がどのように制御されるかは、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度と性質の高度の確率と関連している。この点に関し、病原性の状態が個々の遺伝子またはゲノムのメチル化パターンの変化で表されると仮定することは合理的である。
【0003】
現状の技術では個々の遺伝子のメチル化パターンを研究する方法が可能である。この方法のより最近の進歩では、微量の出発原料の分析も可能であるが、測定点の総数は理論値である少なくとも107測定点のうちのせいぜい二桁に止まっている。本発明の方法を用いると、任意の所望数の測定点で必要なゲノムのどのセクションでも調べることが初めて可能になる。従って、本発明の方法は、他のどの方法でも測定することができなかった全てのタイプの遺伝子病の原因を特定することができ、新しい治療戦略と新薬に対する標的タンパク質の同定を可能にする。
【0004】
【従来の技術】
細胞表現型の分子分析
遺伝子発現はRNAレベルまたはタンパク質レベルで研究することができる。双方のレベルは原理的に重要な発現型パラメーターを反映する。2次元ゲルを用いるタンパク質分析（McFarrel法）は約15年前から知られている。これらの分析法を用いて数千のタンパク質のクロマトグラフ上の位置の解析を行うことができる。この様なエレクトロフェノグラムはごく初期からデータ処理装置で既に処理されるか、評価されている。原理的にこの方法の正当性は高いが、2つの点でRNA解析に基づく最近の遺伝子発現法より劣っている。
【0005】
特に少量の細胞由来の制御に重要なタンパク質の検出は、その方法の感度が低すぎるため不可能である。事実、核酸と比べて、タンパク質を増幅することはできない。さらに、この方法が非常に複雑で自動化し難く、きわめて高価である。対照的にRNA分析はかなりの利点を示し、PCRを使用することによりより感度が高くなる。何よりも、重要と認められるRNA分子種はその配列から即座に同定できる。
【0006】
既知の配列による個々のRNAの発現過剰または発現不足は容易に検出し得るが、本明細書で説明する用途に関しては、それらは例外的に適用できるのみである。
【0007】
「鑑別表示」法はせいぜい発現の半定量研究が可能なのみである。PCRで増幅された発現産生物はゲル電気泳動で分離されるが、その適用はゲル電気泳動の分解能で制約される。さらにその方法の感度は不十分であり、日常の診断用には向かない（Liang、P. およびPardee、A. B.、Science 257、967-971）。
【0008】
発現過剰または発現不足の確率が高い遺伝子はしばしば引算法で同定される。この方法では、調べるべき細胞または組織のcDNAクローンがプレートされる。クローンに対し、cDNAが比較材料としてハイブリダイゼーションされる。この方法を用いて調製された発現パターンの信頼性は低い。
【0009】
アメリカの「ヒトゲノムプロジェクト」の活動の一つでは、発現遺伝子を組織的に配列決定している。これから得られるデータを発現チップを構築するために用いることができ、一回の実験で細胞または組織のすべての発現配列を研究することが可能になる。
【0010】
癌疾病の解析
遺伝子の突然変異は常に細胞の変性である癌を誘発する。これらの突然変異の原因は外因性の影響であるか、または細胞内の出来事であると思われる。わずかな例外では、しばしばゲノムのより大きな領域に影響を及ぼす個々の突然変異（転座、欠失）が細胞を変性させるが、ほとんどの場合は異なった遺伝子の一連の変移が含まれ、悪性の疾病をもたらすのはそれらの組み合せの影響のみである。DNAレベルの結果はまた、RNAおよびタンパク質レベルに反映する。この意味で、多くの場合RNAの量とタイプがいくつかの他のRNA種の合成量に影響するので、疾病が多発する確率が高い。このことは対応するタンパク質の合成速度を変化させ、一方では代謝制御が行われず、従って制御と反制御機構を開始させる。その結果は極めて特異的な（しかし非常に測定し難い）方法で変化する問題の細胞の遺伝子発現パターンに表れる。その特異性はある癌腫、癌腫の段階、および癌腫の悪性度に対応する。今までのところ、この様な現象は自然科学の範囲外である。事実、遺伝子の発現および細胞の代謝を総合的に調べることは不可能であった。チップ技術が始めてこの様な可能性を提供した（Schena、M.ら、Science 270、467-470）。
【0011】
腫瘍の初期診断の問題を分子レベルで解決しようとするする場合、現在では極めて僅かな例外を除いて克服し難い困難に直面する。その理由は、ほとんどの腫瘍では分子レベルの出来事、すなわち異なった突然変異の知識が断片的であり、研究者が臨床検査材料中で何を探すのかを知らないからである。このことは、ポリメラーゼ連鎖反応の極めて高い感度と特異性を応用することが絶対的に不可能であることを意味している。その例は実際には個々に単一の正確に調べられた突然変異で定義されているある種の消化器腫瘍、Ewing肉腫、およびある形の白血病である。これらの例では何百万の正常細胞中の変性細胞を同定することが可能である。しかしながら、これらの見かけ上は確実に同定される腫瘍グループ内でもその挙動に差があるため、別な未知の遺伝子パラメーター（例えば個人の遺伝的背景等）が重要な役割を果たすという結論に導かなければならない。免疫学的腫瘍マーカーは有用な補助パラメーターであるが、それらは他の通常の診断パラメーターに加えてささやかな寄与をするに過ぎない。しかしながら、疑わしい細胞の予備選択に用いることはできる。
【0012】
組織学は変性組織の同定に重要で無視できない役割を果たすが、初期診断では正確でない。
【0013】
従って、ほとんどの腫瘍は分子レベルの診断目的に対して十分にその特性が分かっていないため、一般に病態のサブ分類または危険度によるサブ分類を行う可能性はない。しかしながらこの様なサブ分類は治療法の選択を更に改善し、とりわけ有効な新薬および遺伝子治療を開発するために不可欠のものである。
【0014】
高等器官の細胞の数、タイプおよび可能な安定状態の性質
最近では、放置した場合、複合制御システム（その優れた例は細胞認識である）は最小限の複合性以上、および最大限の接続性以下（任意の一定の成分が接続する成分の平均数）の限られた数の安定状態でのみ存在し得ることを示す数が増加している（Kauffman、S. A.、Origins of Order、Oxford University Press、1993年）。この意味で、この言葉は一般的な現象の選択の概念であると理解すべきである。生物学的制御システムとしての細胞と関連して、分化状態または細胞型に言及することもできる。この様な関連性は示されておらず、生物学的システムの可能な状態の限界さえも示されていないが、実際的な意味は極めて重要であると思われる。すなわち、ある生物の細胞の定常的な情報内容（実際にはこの様な定常性は1つの種内に存在する）に関して限られた数の安定状態しかないとすると、変性細胞もこの様な状態の一つ、または可能な状態間の転移状態であると思われる。現状ではこれらの状態を分子に基づいて定義する可能性はない。現状の技術によれば、個々の状態と細胞の挙動とを関連付ける可能性はほとんどない。しかしながら、この様な解析は疾病の診断と予後に決定的な寄与をすると考えられる。病的細胞の可能な状態と現状の治療法との間を関連付けることも可能である。さらに、この様な方法が治療時期の選択に決定的に影響することもあり得る。例えば、癌細胞が可能な状態間の転移状態であることを発見できた場合、この様な細胞群は治療の結果による選択圧力を受け易く、従ってより容易に治療から逃れ得ると仮定することができる。この様なシナリオ内、またはこの様な転移状態内にある細胞群の柔軟性はかなり増加し、容易に選択圧力が取り除かれる可能な安定状態に入り込み、治療の効果がなくなると思われる。状態によって細胞および細胞群を分類する方法はまた、この様な問題を認識し、理解し、できれば解決することに寄与すると思われる。しかしながら現状の技術によれば、限られた状態数のみの細胞が存在するかどうかを決定することは不可能である。その結果、細胞群をその状態に関する抽出基準に従って区別し、これらの状態を細胞のある挙動で予知することは不可能である。
【0015】
遺伝性疾患
現在、ヒトゲノムの遺伝子地図は2500のいわゆるマイクロサテライトで構成されている。これらの装置は多数の遺伝子、通常はその欠損が遺伝子病をもたらす遺伝子を、リンケージ毎に解析し、それらを同定するための位置決めに用いられる。これにより単一欠損遺伝子により発症する一般的な遺伝子病が明らかにされ、遺伝学者の観点では多遺伝子性疾病もこの方法で理解できるはずである。多くの多遺伝子性疾患が一般的であるが、あまりにも普通であるのでそれらはいわゆる多発性疾病に含まれている。喘息と糖尿病がその例である。多くの癌腫タイプも含まれる。リンケージ解析の上記の戦略を用いることは、膨大な初期の成功を生じる。多くの場合、糖尿病、精神分裂症、アテローム硬化症および肥満等の重要な多遺伝子性疾患の多くの原因遺伝子が見出されている。分子生物学の実験室技術の適用性の他に、それぞれの病気に罹っている比較的多数の患者とその親族が利用できることが遺伝的説明に不可欠である。多遺伝子病のリンケージ解析に最初に用いられた数百人の患者数は1桁少ない可能性が高いことが、過去2年間に明らかとなった。この事は通常の遺伝子の全範囲が説明されなければならないあらゆる場合に当てはまる。この様なリンケージ解析に必要な手作業のレベルが異常に高いため、多遺伝子病の解析の進歩は非常に遅いと考えられる。社会的、経済的に重要性の多いのは正にこれらの病気であるので、別な戦略が考えられている。
【0016】
DNAチップ
Affimetrixの原理は全ての開発の中で最も進歩している（例えば米国特許第5,593,839語彙、第5,999,695号または第5,631,734号）。しかしながら、他の多くの企業および研究プロジェクトが特定用途用の様々な性質を持ったDNAチップを作成している（例えば米国特許第5,667,667号、5,525,464または5,492,806、または例えばGoffeau、A.、Nature 385、202-203；Weiler、J.およびHoheisel、J.、Anal. Biochem. 243、218-227；Chee、M.ら、Science 274、610-614）。最も最近の文献では市販のHIVチップについて既に報告しており、完全なHIVゲノムの試験が可能である。試験すべき試料の蛍光標識PCR産物が400,000オリゴヌクレオチドまでハイブリダイゼーションされている。信号の評価はCCDカメラを用いて行われる。対立遺伝子特異性ハイブリダイゼーションに対するこの様なシステムの既知の容量が長い間使用されてきた。このことは、試料が特定のヌクレオチドに対し絶対的に相補性である場所においてのみ、信号がハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の最後に維持されることを意味している。突然変異を検出するための既知の遺伝子配列の試験が成功するのは、全配列の全ての部分領域がマトリックス上のオリゴヌクレオチド配列の形で存在し、正常配列からの可能な変位のすべてについても同様のことが言えるからである。チップ法の効率は、一部には多数の遺伝子または遺伝子座に対する配列情報が2つの単純な作業、すなわちハイブリダイゼーションと洗浄により得られるという事実のためである。
【0017】
長さ測定解析法
本発明の方法のいくつかの実施態様の変法では、操作の最後に極めて迅速で正確な分子量測定が必要である。フラグメントの長さの測定は数万のデータポイントに対して行わなければならないので、極めて効率の良い測定システムが要求される。現状の技術によれば、可能なシステムには自動配列決定装置（米国特許第4,811,218号）、キャピラリー電気泳動（例えばWoolleyら、Anal. Chem. 68、4081-4086）、MALDI-TOF（Siegert、C. W.ら、Anal. Biochem. 253、55-56）および化学標識による分離（WO 95/04160）が含まれる。かなりの変更と本発明による方法の新規ロジックへ取り込むことが必要であるが、現状の技術ではこれらの方法が実施される。
【0018】
マススペクトロメトリー法
短いDNA配列の分子量をMALDＩ-TOFマススペクトロメーターで正確に測定することができる。さらに現状技術ではこれらの解析法をプライマー延長反応と組み合せる方法がある。例えばこの方法では、特定の配列を持ったオリゴヌクレオチドがDNA試料とハイブリダイゼーションされ、4個のヌクレオチドの内の1個のみが反応毎に添加される。ポリメラーゼによるハイブリダイゼーション後にヌクレオチドの内のどれがオリゴヌクレオチドの3'-末端に附加されたかを知れば、オリゴヌクレオチドの3'-終点より後ろの塩基の同一性を決めることができる。この方法の変法には、4個の可能な塩基の内の2個のみを含む繰り返し配列の長さを決める方法が含まれる。この方法では、生じる塩基と相補性である天然ヌクレオチド、および上記のように変化した追加ヌクレオチドの1個または双方が、繰り返し配列の後で反応が停止する様に重合反応のターミネーターとして添加される。通常、ターミネーターはddNTPである。長さの測定から、繰り返し配列の長さが導かれる。
【0019】
メチル化分析
ゲノム塩基シトシンの5'-メチルシトシンへの変換は、現在最も重要で最も良く調べられた発生遺伝学パラメーターである。現在、細胞と個体の広範囲の遺伝子型を決定する方法が存在するが、大量に発生するエピ表現型の情報を生成し評価するためのこれに匹敵する方法はない。
【0020】
原理的には、配列周辺配列中のシトシンの5-メチル化状態を決定するための原理的に異なる方法は三つある。
【0021】
第一の方法は原理的に「メチル化感受性」制限エンドヌクレアーゼ（RE）の使用に基づいている。REの特徴は、通常4から8塩基長のDNA配列に切れ目を入れることである。この様な切れ目の位置はゲル電気泳動、膜への転写およびハイブリダイゼーションにより検出することができる。メチル化感受性とは、認識配列内のある塩基が、工程を続けるためにはメチル化されていない必要があることを意味する。従って、制限切断後のバンドパターンは、DNAのメチル化パターンによって変化する。しかしながらメチル化され得るほとんどのCpGはREの認識配列の外に在り、調べることができない。
【0022】
この方法の感度は極めて低い（Bird、A. P.、Southern、E. M.、J. Mol. Biol. 118、27-47）。ある変法ではこの方法をPCRと組み合せ、認識配列がメチル化型である場合のみ、認識配列の両端に位置するプライマーによる増幅が切断後に行われる。この場合、理論的には感度は標的配列の単一分子にまで増加するが、個々の位置を調べるには大変なコストが必要になる（Shemer、R.ら、PNAS 93、6371-6376）。
【0023】
第2の変法は、Maxam-Gilbert配列決定反応のモデルを用いる全DNAの部分的化学切断、それにより発生した末端へのアダプターの連結、総合プライマーによる増幅、およびゲル電気泳動による分離に基づいている。この方法を用いて、1000個以下の塩基対サイズを有する既知の領域を調べることができる。しかしながら、この方法は極めて複雑で信頼性が低いため、実用的にはもはや用いられていない（Ward、C.ら、J. Biol. Chem. 265、3030-3033）。
【0024】
5-メチルシトシンの存在を決めるための新しいDNA分析法は、重亜硫酸塩とシトシンの特異的反応に基づいている。シトシンは適当な条件でウラシルに変換されるが、ウラシルは塩基対に関するかぎりチミンと等価であり、同時に他の塩基に対応する。5-メチルシトシンは変化しない。その結果、最初はそのハイブリダイゼーション挙動によりシトシンと区別できないメチルシトシンが、「通常の」分子生物学技術で検知できる様に、最初のDNAが変換される。これらの技術の全ては、完全に明らかにされた塩基対に基づいている。感度に関する限り、DNAの拡散と再構成を防止することを意図し（重亜硫酸塩は単一鎖DNAのみと反応する）、すべての沈降および精製工程を迅速透析で置き換える（Olek、A.ら、Nucl. Acids. Res. 24、5064-5066）、アガロースマトリックス中で分析されるDNAを含む方法により、現状の技術が定義される。この方法を用い、個々の細胞を調べることができるが、それはこの方法の潜在能力を示している。しかしながら、長さで約30塩基対までの個々の領域のみが調べられているが、数千の可能なメチル化反応を同定するための細胞の分析は不可能である。その上、この方法は少量の試料から微少な断片を高い信頼性で分析することができない。拡散を防止しているにも係わらず、試料はマトリックス中で失われる。
【0025】
重亜硫酸塩技術の使用
現在、いくつかの例外（例えばZeschnigk、M.ら、Eur. J. Hum. Gen. 5、94-98；Kubota、T.ら、Nat. Genet. 16、16-17）を除いて、重亜硫酸塩技術は研究で用いられているのみである。しかしながら、重亜硫酸塩処理後の既知の遺伝子の短い特定の断片は日常的に増幅され、完全に配列決定されるか（Olek、A.およびWalter、J.、Nat. Genet. 17、275-276）、または個々のシトシン位置の存在が「プライマー伸長反応」（Gonzalgo、M. L.およびJones、P. A.、Nucl. Acids Res. 25、2529-2531）または酵素切断（Xiong、Z.およびLaird、P. W.、Nucl. Acids Res. 25、2532-2534）により検出されている。これらの全ての参考文献は1997年以後のものである。例えばニューラルネットワーク等の評価アルゴリズムをほとんど経由せず、複合遺伝子病に関係する表現型データと関連付けるために複合メチル化パターンを用いる概念は、これらの文献中で言及されていない。その上、上記の疑念は現状技術の方法論では実行することができない。
【0026】
【発明が解決しようとする課題】
まとめると、現状の技術は本発明の方法で解決される弱点を有する。
【0027】
【課題を解決するための手段】
上記問題は組織および細胞群の挙動を予知し、発現の変化した遺伝子を同定するための組織および細胞型の性格付け、分類および区分方法であって、
任意の組織試料から得られ、それ自体公知の方法で処理され、断片化されるかまたは制限エンドヌクレアーゼにより切断処理されたゲノムDNAにおいて、塩基シトシンがそれ自体公知の方法で重亜硫酸塩溶液による処理でウラシルに変換されるが、5-メチルウラシルは変換されず；
上記処理ゲノムDNA分画が極めて短い、または変性オリゴヌクレオチド、または重亜硫酸塩処理の前に切断DNAの末端に連結されたアダプターオリゴヌクレオチドに対して相補性であるオリゴヌクレオチドの使用により増幅され、
全体としてグアニンに富んだDNA鎖上の残存シトシン量、および/または増幅分画由来のシトシンに富んだDNA鎖上のグアニン量がハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ反応により検出され、この様な分析で得られ、データ処理アルゴリズムに自動的に用いられるたデータが、分析された細胞材料の表現型に関する結論を引き出すことを可能にすることを特徴とする方法によって解決される。
【0028】
本発明によれば、表現型で同一または類似の細胞または組織由来のDNA試料に関する数個または多数の上記試験の上記解析から得られたデータが、ニューラルネットワークまたは他の評価アルゴリズムを用いる訓練フェーズにおいて、そのDNAが調べられた細胞の表現型と関連付けられるか；
遺伝型とメチル化状態との関係に関する評価パターンにおいてこの訓練フェーズに含まれるデータが、未知の起源のDNA試料のメチル化状態の発生により、そのDNAが調べられた細胞の表現型を導くために用いられるか；または
既知の細胞型のDNAのメチル化状態に関する評価パターンにおいてこの訓練フェーズに含まれるデータが、試験されたDNA中でこの訓練フェーズで決定されたメチル化状態とは異なるシトシン位置を同定するために用いられることが有利である。
【0029】
さらに、本発明によれば重亜硫酸塩、およびその認識配列内の5'-CpG-3'周辺配列内にシトシンを含む制限エンドヌクレアーゼ処理の前にDNAが切断し、5'-CpG-3'周辺配列内のシトシンが5'位置で未メチル化型である様な認識配列でのみDNAが切断することが有利である。
【0030】
さらに、本発明によればゲノムDNAがそれ自体公知の方法で重亜硫酸塩溶液で修飾される前に、このゲノムDNAが制限エンドヌクレアーゼで切断し；
得られた末端は連結反応により、アダプターとも呼ばれる公知の、短い二重鎖DNA配列を備え；
重亜硫酸塩で処理されたアダプターに対し相補性であるオリゴヌクレオチドを、すべてのDNA断片、またはこの方法で製造された、または全てのフラグメント全体から発生する部分集団を重亜硫酸塩処理後に増幅する目的で使用することが有利である。
【0031】
この意味で、シトシンをウラシルに転換するためのゲノムDNAプローブと重亜硫酸塩溶液の反応を、同時にメチルシトシンを0℃から100℃の間の反応温度の周期的変化の下に保って行うことが有利である。
【0032】
また、重亜硫酸塩処理前にDNA試料を小さい分子のみを透過し得る加熱可能多孔性キャピラリー内で切断し、キャピラリーの中で試薬を透析により添加、除去することにより重亜硫酸塩処理以後の反応工程を行うことが好ましい。
【0033】
さらに、本発明によれば重亜硫酸塩処理前のDNA試料を小さい分子が不透過性の加熱可能キャピラリーに移し、キャピラリーの中で連結したキャピラリーを通して試薬を供給することにより試薬を添加、除去して、重亜硫酸塩処理以後の反応工程を行うことが有利である。
【0034】
さらに、本発明によれば重亜硫酸塩処理以後のポリメラーゼ反応を重亜硫酸塩処理と同じキャピラリー中、またはこのキャピラリーに接続したキャピラリー中、またはこのキャピラリーに接続した容器中で行うことが有利である。
【0035】
重亜硫酸塩処理DNA試料とのポリメラーゼ反応が行われるキャピラリー中で、生成した断片群の長さによる分離が行われることも有利である。
【0036】
さらに、処理されたDNAは重亜硫酸塩を後者から沈殿によって分離することが有利である。
【0037】
さらに、本発明によれば重亜硫酸塩処理ゲノムDNA試料の増幅のため、2つのクラスのオリゴヌクレオチドが組み合わされる方法であって、1つのクラスのオリゴヌクレオチドは5'-CpG-3'周辺配列中の塩基以外は塩基シトシンまたはその類似体を含まないか、極めて僅かな量を含むか、または増幅に必須でないオリゴヌクレオチド領域のみに含み；他のクラスのオリゴヌクレオチドは5'-CpG-3'周辺配列中の塩基以外は塩基グアニンまたはその同族体を含まないか、極めて僅かな量を含むか、または増幅に必須でないオリゴヌクレオチド領域、例えば5'-領域等の領域にのみに含み、2つのクラスのオリゴヌクレオチドは
a)  極めて短いため、それぞれが2つのクラスの1個のみの代表を含む増幅において、100個以上の異なった断片が増幅されるか、
b)  いわゆる縮重位置を非常に多く含むため、2つのクラスそれぞれの1個のみの代表による増幅において、100個以上の異なった断片が増幅されるか、または
c)  非常に多数が使用されるため、増幅において100個以上の異なった断片が増幅されることが好ましい。
【0038】
各反応毎に処理され増幅されたDNAと、異なったオリゴヌクレオチドとを、ポリメラーゼ反応の目的で各調合毎に混合する方法であって、オリゴヌクレオチドは
その5'-末端でアダプターと相補性であるか、重亜硫酸塩で処理されたオリゴヌクレオチドの増幅に対し一般的に相補性であり、
各反応においてその3'-末端で異なり、
その可変3'-末端は既知のアダプター配列またはオリゴヌクレオチド配列の下流で開始し、かつ
その可変3'-末端は既知のアダプター配列を超えて2から12ヌクレオチド分だけ未知のテンプレートDNA配列中へ延びていることが最適であると考えることが好ましい。
【0039】
この意味で、オリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ反応が開始し、そのオリゴヌクレオチドは重亜硫酸塩処理DNAと相補性である反応は、dATP、dTTPおよびdCTPの3種のヌクレオチド、またはこれらの3種のヌクレオチドの類似体に加えて、
塩基シトシンに相補性であり、ポリメラーゼによる取り込み後、鎖のそれ以上の伸長を防止するヌクレオチド類似体を含むか、または
塩基シトシンに相補性であるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まないことが特に好ましい。
【0040】
さらに、本発明によればオリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ反応が開始し、そのオリゴヌクレオチドは重亜硫酸塩処理DNAと相補性である反応は、dATP、dTTPおよびdCTPの3種のヌクレオチド、またはこれらの3種のヌクレオチドの同族体に加えて、三種のヌクレオチド、および
塩基シトシンに相補性であり、ポリメラーゼによる取り込み後、鎖のそれ以上の伸長を防止するヌクレオチド類似体を含むか、または
塩基シトシンに相補性であるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まないこと好ましい。
【0041】
この意味でDNA試料中で先にメチルシトシンが含まれていた位置におけるポリメラーゼ反応の停止は、特異的に停止したポリメラーゼ反応生成物を検出し得る様な方法でそれ自体が修飾されているターミネータにより行われることが特に好ましい。
【0042】
さらに、本発明によれば、適当な組み合せに由来する個々の反応調合物の異なった断片混合物が、MALDI-TOFまたはその他のマススペクトロメーターのイオン源の各点に用いられ、個々の反応の断片組成はすべてのDNA断片の分子量測定により決定される方法が提供される。
【0043】
さらに、適当な組み合せに由来する個々の反応調合物の異なった断片の混合物が、ゲル電気泳動の個々のレーンに用いられ、個々の反応の断片組成はすべてのDNA断片の分子量測定により決定されることが好ましい。
【0044】
それによりポリメラーゼ反応が開始する本発明で定義されるオリゴヌクレオチドがそれぞれ、異なった配列と異なった化学標識を有するオリゴヌクレオチドとカップリングし、その化学的および/または物理的性質が標準クロマトグラフィーまたはマススペクトロメトリー法により異なった標識の検出と区分を可能にする方法が提供される。
【0045】
この意味で、第1増幅工程で調製された、重亜硫酸塩処理試験DNAの断片分画が、複数の化学的に異なった標識を受けたオリゴヌクレオチドと同時に混合され；
これらのオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ反応のプライマーとして反応調合物中で使用され；
得られた断片の複合混合物が、第1分析工程で長さによる電気泳動調合物として用いられ；かつ
得られた電気泳動由来の断片混合物の複合混合物が、各長さの分画中でオリゴヌクレオチドを特性化する化学標識の有無を検出するクロマトグラフィーまたはマススペクトロメトリー分析に用いられることが特に有利である。
【0046】
さらに、本発明によれば塩基シトシンまたはその類自体を含まない、または5'-CpG-3'周辺配列中にのみそれを含む、または試料DNAとのハイブリダイゼーションに必須でない領域のみにそれを含む表面；または塩基グアニンまたはその類似体を含まない、または5'-CpG-3'周辺配列中にのみそれを含む、または試料DNAとのハイブリダイゼーションに必須でない領域のみにそれを含む表面にオリゴヌクレオチドが用いられる方法が提供される。
【0047】
この意味で、本発明によれば重亜硫酸塩で処理され、増幅されたDNA試料が
表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされ、そのオリゴヌクレオチドは既知の方法で表面の各点毎に既知である様に固定化され、そのオリゴヌクレオチド配列はその点に正確に位置決めされ、ハイブリダイゼーションに必須である領域中でオリゴヌクレオチドと試料DNAが完全に相補性である場合、増幅された試料DNAと固定化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを生じるか、または適当な洗浄工程後のみ残存することを特徴とすることが好ましい。
【0048】
本発明の別な目的は、上記で定義された少なくとも2個の成分（例えば重亜硫酸塩で処理されたDNAの増幅用オリゴヌクレオチドとタンパク質用マトリックスに固定化されたオリゴヌクレオチドとの組み合せ）がDNAを重亜硫酸塩で処理するために組み合わされ、この処理されたDNAの増幅、およびその結果、癌の臨床的に妥当な診断が行える様に哺乳動物ゲノムの100CpGジヌクレオチドのメチル化状態の検出が行われることを特徴とするキットである。
【0049】
本方法は、極めて大量の細胞の挙動の診断に有用なパラメーターを決定する問題を解決する。この目的のため、細胞解析の全く新しい概念を考案し、全く新しい評価機構をこの分析と結び付け、さらにデータ生成の技術的基盤を用意しなければならない。この方法はシトシンメチル化の情報内容を初めて使用し、従ってその目的に必要な分析方法とそれに付随する評価アルゴリズムを利用可能にする。本発明による方法は従って、遺伝し得る欠陥に侵された細胞の場合は、現状の技術による方法を用いても理論的に決定できないか、または決定することが極めて困難である2次的に取り込まれた遺伝子座を発見するために用いられる。この方法は、その遺伝的（多分、エピ遺伝的）変化が塩基配列中の実際の変化を含まない、遺伝的に変化した遺伝子座を提供する。この様にして、本発明による方法は新しい治療戦略の標的を明確にする。さらにこの方法は、（エピ）遺伝子型と表現型の間に、現状技術で可能なものより更にずっと正確な関連を確立する様な方法で、変性した細胞を分類する問題を解決する。その上、本発明による方法は変性した細胞の予想される将来の挙動と、この様な細胞が体内または体外から刺激される反応を予知することを可能にする。最後に、この方法はまた癌疾患に対する最善の治療法選択の助けになる。さらに、この方法により、（差異が現状技術で決定される範囲で）表現型では類似しているが遺伝子型では異なる、腫瘍細胞が共有する遺伝的および/または生化学的特徴が決定される。本発明の方法のクレームが立脚する仮定は、最も異なった遺伝子型が極めて類似したエピ遺伝子型となり、従って極めて類似した表現型となるということである。従って、提案された方法はまた、塩基配列の変化では生じない、または間接的に生じる腫瘍細胞中のこの様な変化を検出することができる。
【0050】
【発明の実施の形態】
提案された方法は、現状技術の異なった方法の組み合せと改良により、定義された問題を革新的な方法で解決する。それ自体公知である本発明によるこれらの方法の若干の変更は、全く新しい全体的な方法が創製される様に、それらを新しい要請に適応させる目的の役に立つが、それらの方法は好ましい変法を参照し、実施態様例により以下に説明される。
【0051】
重亜硫酸塩溶液処理のためのDNA試料の前処理
組織または細胞の単離、および後者からのDNAの抽出等の基本的な工程はそれ自体公知の方法で行われる。しかしながら、それ以降の分析のためのDNAの抽出は、重亜硫酸塩処理の様な好ましい変法の場合、環境との接触を防止するオイル層の上で行われる。このアプローチの目的は、極めて少量の出発量でも再現性が保証される様に、DNAの損失を低く保つことである。細胞または組織からのDNAの抽出はまた、以下に述べる様にキャピラリー中で直接行うことができ、キャピラリー中で以後の反応も行える。しかしながら、抽出容積の限界は、提案する方法の必須の要件ではない。
【0052】
抽出されたDNAを未処理の形で重亜硫酸塩処理、断片化処理、および制限酵素による特定の切断に用いることができる。
【0053】
この時点で本発明による方法は二つの異なった変法にサブ分類される。個々のメチルシトシン位置の最終検出がオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションで行われる一つの変法は、この時点ではDNAの追加1次処理を必要としない。DNA試料のゲノム全体の増幅が、アダプターに相補性である、DNA末端に連結され重亜硫酸塩処理された試料を用い、オリゴヌクレオチドを経由して行われることが特徴である第2の変法では、この様なアダプターを切断したDNAの個々の断片に連結することが必要である。アダプターは短い二重鎖DNA分子であり、一般的に単一鎖突出部を有する。突出部は切断DNA試料の末端と相補性であり、そのため、この様なアダプターを適当なリガーゼによりDNA断片の両端に附加することができる。この目的のため、ある程度の量のアダプターを添加しなければならないが、それは断片の末端の数に関して過剰に存在する様な量である。しかしながら、アダプターの試料断片への連結は、原理的には相補性単一鎖突出部がなくても行い得る。個々の反応は原理的に現状技術の範囲であり（Sambrookら、Molecular Cloning：A laboratory manual、CSHLP、1989年）、これ以上説明しない。アダプターの連結とそれに続くゲノム全体の増幅の組み合せは、原理的に革新的であり、文献や特許文献では言及されていない。
【0054】
重亜硫酸塩法の本発明による変更
本発明による方法のすべての変法の基礎は、単一鎖DANN（原文による；正しくはDNA）の重亜硫酸塩による修飾法である。しかしながら、本発明による方法の変法のいくつかを可能にするためには、重亜硫酸塩法の若干の変更が必要である。
【0055】
一方、本発明の方法の原理的な変法は出発原料の全量が微量である（極限では僅か細胞1個または数十個）という事実のみでなく、本法のいくつかの変法では、実際、微量の断片の使用が要求されるという事実に基づいている。さらに、本発明による方法を臨床診断に日常的に応用するためには、出来るだけ高度の再現性が得られる様に、全ての工程を自動化することが必要になる。
【0056】
従って、重亜硫酸塩法の全ての工程は、「外界」から完全に保護して微量容積で行われなければならない。本方法で重亜硫酸塩反応をアガロースマトリックスで行うことは、断片の拡散に関して改善されているが、反応は今でも極めて大容量の重亜硫酸塩水溶液中で行われている。その結果、少量の重要なDNA断片が溶液中に拡散する可能性があり、従って以後の分析では失われてしまう。
【0057】
本発明による方法には外部容積を用いずに重亜硫酸塩法を行うことが含まれる。例えば、重亜硫酸塩反応が僅か1から10mlの容積のオイル中で行われ、従って全ての成分を、それらが1個の水滴となり、その中で以後の反応工程が行われるオイルの下のロボットでピペットすることができる。現状技術で必要な濃度の重亜硫酸塩溶液を調製することの困難さ、およびより低い重亜硫酸塩濃度、より短い反応時間を用いる現状技術のジレンマの解決がDNA試料に深刻な損傷を与えるという事実は、本発明の方法により解決される。
【0058】
この方法は、重亜硫酸塩反応の異なった反応工程は平衡反応であると言う事実を利用している。これらの平衡は異なった温度では、シトシンのスルホン化とその後の脱アミノ化という二つの重要な反応工程にとっては正しい側（スルホン化および脱アミノ化）にある。個々の平衡を達成するために適用される動力学を考慮すれば、重亜硫酸塩反応を温度を変化させる周期的条件で行うことが有利であることは明らかである。本発明の方法の好ましい変法の全ては、4℃（10分）から50℃（20分）の変化でなる。しかしながら、他の全ての温度、およびある温度での反応時間も本発明による方法に含まれる。例えば、ある条件下ではかなり短い反応時間を制御することが有利であった。また、脱アミノ化工程（50℃以上の高温）とその後の繰り返しスルホン化工程の間の非常な高温で試験されるDNAを再度変性する工程を挿入することが有用、かつ原理的に新規である。高分子量DNAでは変性温度は一般に90℃以上であるが、より低くてもよく、本発明の保護の範囲である。これには二つの理由がある。一方では、極めて短いDNA断片が試験される変法がある。他方では、既に生じているシトシンのウラシルへの変換の結果として、各反応周期においてDNA鎖間の相補性が減少している。従って、周期反応プロトコールは非常に複雑な様相となる。例えば、第1周期で変性温度は90℃以上であり得るが、後の周期では温度はより低い値に制御される。あらゆる状況で、多段反応は極めて多数の試験シリーズを行うことにより最適化することができる。従って、クレームされた本発明の保護の範囲は、一般的に周期的に行われた重亜硫酸塩反応と関連性がなければならない。
【0059】
上記問題の現状の技術における別な解決法は、一つ以上の工程をキャピラリー中に移すことである。原理的に、二つの変法が有る。キャピラリーは1) 不透過性、または2) 非常に薄い透析チューブの様にある溶媒に対し透過性であり得る。
【0060】
1)による変法は、上記実施例に記載される通り、DNA、重亜硫酸塩およびラディカル阻止剤を含む液滴を加熱・冷却可能なキャピラリーにより外部から水溶液中に導入することができる。この方法では、液滴をキャピラリー内の液体またはガス相で隔離することができる。全ての反応がこのキャピラリー中で行われ、追加試薬を入り口コネクターを通して添加することができる。変法1)によるこのキャピラリーは外部に対して閉じられているので、以後の反応のためのマトリックス溶液を添加する必要があり、そのため上記問題を生じ、本発明による解決が必要になる。
【0061】
2)による変法は、最初にDNA溶液のみが多孔性キャピラリーを通して導かれ、本発明による工程または他の工程を用いる対応する予備処理により前処理される。キャピラリーそのものは、キャピラリー内の反応工程に必要な容器からの溶液を通過させる。はっきり言えば、この変法の場合、キャピラリー内のDNA溶液は最初に重亜硫酸塩溶液中を通り、それに加えて、周期的温度変化または一定温度に曝される。別な工程では、重亜硫酸塩反応終了後、キャピラリーは透析溶液中、次いでアルカリ溶液、最後に別な透析液中を通過する。キャピラリー中の重亜硫酸塩処理のこれらの工程後、本発明の方法の別な変法が用意され、同じキャピラリー中でPCRおよびプライマー伸長工程が行われる。本発明によるプライマー伸長用の異なったプライマーが特定の化学修飾により標識される場合、これらすべてのPCRおよびプライマー伸長工程直後に、同じキャピラリーの延長としてキャピラリー電気泳動も行うことができる。電気泳動では伸長生成物が長さによって分離され、その後のマススペクトロメトリー、クロマトグラフィー、または光学分析を用いて集められたサイズの分画をその標識により分離し、第2分析次元でスペクトルまたはクロマトグラムの結果を得る。
【0062】
重亜硫酸塩、およびPCRおよび/または伸長反応にキャピラリーを使用することはまた、本発明による他の検出法の使用を簡単にする。実際、断片を増幅直後にキャピラリー中に導くことができ、以下に更に説明する様に、キャピラリーはその内壁上に個々のメチルシトシンに特異的であるオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションパートナーとして有している。
【0063】
本発明の方法のまた別な変法は、透析以外による高分子量重亜硫酸塩の除去に基づいている。この変法の利点は、今までに説明した変法に付け加えられる欠点を除外するものである。
【0064】
アガロース中の透析はすべて、手順の一部を大容量の水溶液中で行わせる。その結果、拡散によりDNA断片を損失する危険がある。変法のキャピラリー中で生じる問題の一つは、微量のDNAの場合は有意義であるDNA断片の僅かな割合がキャピラリーの内壁に結合し、その結果、分析用としては失われることである。
【0065】
従って、DNA抽出をオイル層の下で微量で行う方法が提案される。この方法の好ましい変法では、容積は1μLである。当然、この方法は小容積、または大容積を使用することにより変化しない。従って、これらの方法もまた、クレームで保護された範囲に入る。DNAは変生している（記載通り）。必要な濃度の重亜硫酸塩溶液が大容量の重亜硫酸塩溶液の添加によって加えられる（例えば4μL）が、その量は適正な処理に必要な量より若干多く、そのため、必要な最終濃度とpHはオイルの下で自動的に達成される。続いて、重亜硫酸塩が上記の方法の一つによって行われる。
【0066】
次の方法の工程では（本発明による方法の好ましい変法）少量のモル数の塩、例えば水酸化バリウムが溶液に添加されるが、その陽イオンは重亜硫酸塩と不溶性の塩を形成し、溶液から沈殿除去される。この溶液を添加することはまた、第1反応工程でスルホン化と脱アミノ化が行われたシトシンの脱スルホン化が行われる値にpHを増加させる効果がある。極めて迅速に行われる脱スルホン化反応中に、沈殿した重亜硫酸塩は短時間の遠心分離により試料水溶液から分離される。しかしながら、以下の性質を有する塩を使用することが好ましい。陽イオンは重亜硫酸塩と塩を形成し、その塩は増幅工程の条件下でも不溶性のままであり、かつ決して増幅工程に有害な効果を持たない。さらに、この様な工程中で溶液から沈殿しないどのイオンの量も、イオンが存在して増幅工程を阻害することがない様な量でなければならない。しかしながら、増幅工程中のこの様な塩の阻害の可能性も、極度に正確に調製された、極度に正確にピペット可能な塩溶液を用いることにより避けることができる。等量の塩を使用するとにより、潜在的に阻害し得るイオンを定量的に除去することができる。次に使用する増幅用緩衝液と相補性のある重亜硫酸塩カリウムその他の対イオンを使用することも、以下に述べる増幅反応のための緩衝液交換を簡略化する。
【0067】
次の工程で、以下の性質を有する追加容積の溶液をオイルの下に添加する。塩組成は以下の通りである。オイルの下に位置する処理済みDNAの溶液と混合中に、塩濃度とpH値は酵素増幅工程が可能な値に達する。この意味では、任意の起源の熱安定性ポリメラーゼを使用することが可能である。使用されるポリメラーゼのタイプは本質的でなく、既存の緩衝条件に応じて可変であり、従ってすべてのこの様なポリメラーゼの使用がクレームで保護される。第2に、この溶液は全てのヌクレオチドおよび必要なオリゴヌクレオチドプライマー用のポリメラーゼを含む。この溶液を添加後、同じ反応溶液中で増幅が直接行われる。この方法では、全ての工程中で外界との接触は不可能であり、極少量の試料も失われない。
【0068】
重亜硫酸塩処理DNAのゲノム全体の増幅
個々の場合の数千から数百万のメチルシトシン位置の検出には、試料ゲノムの全ての可能な配列の大部分の増幅が必要になる。本発明による方法のこの部分は、「予備処理」の節で既に行われている様に原理的に異なる二つの変法にサブ分類する必要がある。
【0069】
これらの工程の第1の変法は、重亜硫酸塩処理前のアダプターの断片化されたDNAへの連結に基づいている。最も簡単な形では、アダプター配列に相補性であり、重亜硫酸塩処理後に存在するオリゴヌクレオチドがこの目的のために用いられる。この工程では、このオリゴヌクレオチドをアダプター配列の任意の領域にハイブリダイゼーションすることができる。これらの成分とのポリメラーゼ反応の場合は、このことは理論的には両端にアダプターを有する全ての断片の増幅を導く。例えば、これは制限エンドヌクレアーゼで優先切断部を生成する全ての断片であり得る。しかしながら、本発明の方法のある変法では、1回のこの様な増幅で生成する個々の断片の数が限られるため、少数回の増幅周期後に反応を異なった部分反応にサブ分割する必要がある。これらの部分反応はオリゴヌクレオチドで行うことができ、そのうちのいくつかは適切なアダプター配列を超えて、すなわち1個から4塩基分だけ異なった断片の未知の配列中へ伸長する。異なった反応のオリゴヌクレオチドは、それぞれの1個が全ての未知の配列の一部をカバーし、異なった反応中のこれら全てのオリゴヌクレオチド全体が、理論的には既知のアダプター配列の後ろに位置する全ての可能な配列をカバーする様に選ばれる。例えば、4つの反応を設定することができるが、それにより既知のアダプター相補性配列の後ろの3'-終点における第1反応のオリゴヌクレオチドが基準となるアデニン、第2シトシン、第3グアニンおよび第4チミンを含む。当然、この原理はまた4つ以上の異なった反応に適用することができ、それによりオリゴヌクレオチドの3'-終点における配列は1個以上の塩基を包含する。ここでオリゴヌクレオチドの3'-終点もいわゆる縮重位置を有することができる。このことは、1個の位置で同様な効率を有する1個以上の塩基がオリゴヌクレオチドにリンクしているか、または複数のオリゴヌクレオチドが非縮重配列と交じり合っていることを意味する。従って、全ての可能な配列が、4の乗数でない全反応数でカバーされ得る。
【0070】
この方法で各反応中の全ての断片のサブポピュレーションが増幅され、個々の断片が高い信頼性で高度に増幅される結果となる。原理的に反応の段階的なサブ分割も可能であり、最初の増幅周期数は全ての配列をカバーする1個のオリゴヌクレオチドで行われるが、その後の反応は例えば、反応毎に1個の特異的3'-塩基を有する4回個の反応にサブ分割され、その後数個の追加増幅周期を行い、その後もう1個のサブ分割が行われる。これの基本的な点は、添加したオリゴヌクレオチド量を正確に測定することである。理想的には一定量のオリゴヌクレオチドが各シリーズの増幅周期に加えられ、それは反応中に完全に、またはほとんど完全に使い尽くされる。次いで各周期の反応混合物を直接、自動的に別な工程へ移すことができる。
【0071】
異なった原理の別な変法では、アダプターをプレカットDNAへ連結する必要がない。現状の技術では数個の方法が規定され、ゲノム全体のDNAの増幅を行うが、その成功度は様々である。これらの方法の全ては、本発明による方法では変更しなければならない。我々は3つの異なった方法の使用を試験した。まず最初に、好ましい変法として、我々は記載された「DOPE」技術の変法を用いた。文献に記載された方法とは対照的に、我々は各増幅で複数の異なったオリゴヌクレオチドを使用したが、そのオリゴヌクレオチドは2つのクラスにサブ分割することができる。これらのクラスは、一つのクラスでは塩基グアニンが、他のクラスでは塩基シトシンが発現していないか、ほとんど発現していないか、または5'-領域にのみ発現していることが特徴である。これらの塩基がこれらのオリゴヌクレオチドの配列の全てに存在した場合、それらは通常5'-ＣpG-3'配列の周辺配列中にある。この目的は、オリゴヌクレオチドのこれらのクラスのそれぞれが、重亜硫酸塩処理後に存在する2個の（G-リッチ）鎖上にハイブリダイゼーションするか、またはこれらの鎖からポリメラーゼ反応によりコピーされた（C-リッチ）対立鎖上にハイブリダイゼーションすることである。これらの2種の配列クラスの代表の組み合せにより、重亜硫酸塩処理DNAの増幅を行うことが可能である。5'-CpG-3'配列の外側のシトシンは鋳型DNA中でほとんどの場合ウラシルに変換されなければならず、従って効率の良い増幅のためには重亜硫酸塩処理鎖とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド中にグアニンは必要でない。対立鎖上でも、同じことがグアニンに言える。これらのクラスのオリゴヌクレオチドで5'-CpG-3'周辺配列中にグアニンまたはシトシンが存在する場合、これらのオリゴヌクレオチドも潜在的にメチル化される位置とハイブリダイゼーションし得る可能性が導かれる。提案された方法では、これは無用である。しかしながら、欠点が非常に少ないため、この方法のかなりの部分もこの方法で実行することが出来ると言うことも起こり得る。従って、本発明の保護の範囲はこの様なオリゴヌクレオチドも含むべきである。本発明を実施するためには原理的に不利であるが、個々のグアニンが5'-CpG-3'周辺配列の外側に存在することも同様に考えられる。通常このことは、増幅に必要なオリゴヌクレオチドの標的DNAとのハイブリダイゼーション中、塩基が対になっていない位置を導入し、それがほとんどの場合増幅の効率を減少させるので望ましくない。それにも係わらず、この鎖由来の1個または数個のグアニン塩基を含むオリゴヌクレオチドによる増幅は、理想的ではないが可能である。しかしこの様な増幅は本発明の本質を満たすので、いくつかのグアニンを使用しているため厳密にはこのクラスに入らないこの様なオリゴヌクレオチドを利用することも、本発明の保護の範囲に入るべきである。このタイプを除く必要であるのは、特に我々が用いた第2の技術である。この技術では、原理的には3'-領域で上記配列クラスの内の一つに入るオリゴヌクレオチドが用いられる。しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドの5'-領域中にいわゆる「配列タグ」が取り付けられ、それが更に増幅するための次の工程で使用される。この変法中の増幅の第1周期で、原理的���上記クラスの一つに入るオリゴヌクレオチドの3'-領域が広い範囲の断片を増幅するために用いられる。次の工程で、今までに増幅された各断片は配列タグに対応する配列を3'-末端に有する。アダプターに相補性であるオリゴヌクレオチドによる増幅と同様に、これらの配列はオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションパートナーとして用いられ、それがその後の増幅に用いられる。当然、この第1オリゴヌクレオチドの配列タグは3'-領域で第1クラスに属するオリゴヌクレオチドの5'-領域中にグアニンを、第2クラスに属するオリゴヌクレオチドの5'-領域中にシトシンを含むことができる。
【0072】
オリゴヌクレオチド、またはその3'-領域によって二つのクラスの内の一つに属するオリゴヌクレオチドは、別々に構築することができる。DOPE法の我々の変法は、3'-領域に所定の塩基配列画存在する二つの配列クラスのオリゴヌクレオチドの組み合せを使用する。本発明の方法の範囲内であるこの塩基配列は、2から20塩基の間の長さを有する。この配列の前に通常5から20塩基長の能ochH"位置のセクションが第1クラスに、能ochD"位置が第2クラスに位置している。オリゴヌクレオチドの合成において、このことはクラス能ochH"の場合、これらの位置に3種の塩基A、GまたはTの内の1種が取り込まれ、3種の塩基A、GまたはTがクラス能ochD"に取り込まれていることを意味する（本発明の趣旨に影響しない上記例外も特許の保護範囲に含まれる）。このセクション（5'）の前に、特定の配列を有する別なセクションが位置することができる（しかし必須ではない）。これらのオリゴヌクレオチドが重亜硫酸塩処理DNAの増幅の対応する条件下で使用された場合、オリゴヌクレオチドの特定の領域にわたって定義される全ゲノム分画は再現性のある方法で増幅することができる。配列タグを使用する場合、オリゴヌクレオチドの5'-領域は定義された配列となり、二つの配列クラスの定義が破られる。オリゴヌクレオチドが3'-領域に領域能ochH"および能ochD"を含むか、任意の形のクラス能ochH"または能ochD"の塩基と交互に並ぶ定義された塩基を含む場合、全体の目的のためにはオリゴヌクレオチドも本発明の保護の範囲に含まれる必要がある。
【0073】
さらに、本発明の保護の範囲はまた、本発明の方法の全体的な概念の範囲内で用いられ、5'-終点で「ヘアピン」構造をとる増幅プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド；上記説明中に暗示される塩基対の挙動と同様な塩基対挙動を示す、例えばPNA（タンパク質−核酸）に基づくオリゴヌクレオチド等の分子；化学的に修飾したオリゴヌクレオチド；および天然ヌクレオチド以外のヌクレオチドで合成された修飾または未修飾オリゴヌクレオチドも含む必要がある。
【0074】
CpGジヌクレオチドのメチル化状態の検出
（DNAチップ上のメチル化CpGの検出）
その最終の形で、本発明による方法がDNAチップの使用に基づくことが可能である。従って、DNAチップの使用は本発明の方法の好ましい変法である。原理的に、重亜硫酸塩処理DNAに至るまで、今までに述べた本発明の方法の変法を使用することが可能である。好ましい変法において本発明の方法の実施に用いられたチップは以下の形式を有する：この目的のために提供される少なくとも1000個、一般に10万個以上の内の一つの表面上で、オリゴヌクレオチドが公知の方法でその場で合成されるか、またはマイクロピペットまたはナノピペット、またはスタンプ様装置、またはミクロ流体ネットワークで添加される。各オリゴヌクレオチドは1個のCpGに特異的である。このことは、オリゴヌクレオチドに含まれるCpG位置がメチル化されている場合、標的DNAとのみハイブリダイゼーションするか、またはこの位置が特異的にメチル化されていないことを意味する。従って、各位置には少なくとも2個のオリゴヌクレオチドが用いられる。異なったオリゴヌクレオチドの数には上限がなく、ゲノムに含まれる全CpGヌクレオチドの8倍以上であってもよい。DNAチップの全ての点に対して、どのオリゴヌクレオチド配列がそこに位置するかが正確に知られている。
【0075】
本発明による方法から、この様なDNAチップの正常な占有状態に必須の修飾が導かれる。ゲノムまたは発現配列と相補性であるオリゴヌクレオチドが、現状の技術によるDNAチップ上に位置している。このことは、平均して全てのオリゴヌクレオチドがゲノムDNAの塩基組成、または生物の発現配列の塩基組成に対応することを意味している。この様なDNAチップ上に位置するほとんどのオリゴヌクレオチドにとって、すなわち平均してすべての4個の塩基にに関して、グアニンとシトシン塩基の割合はゲノムおよび/または発現配列の割合に対応する。
【0076】
本発明による方法の内容では、この状況は異なっている。原理的に、8個のクラスのオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドでカバーされた各配列毎に合成することができる。重亜硫酸塩処理の結果、最初は相補性であった上部および下部鎖（Watson-Crick鎖、またはコードおよび鋳型鎖とも呼ばれる）がもはや相補性でなくなる様な方法で、DNAが修飾される。このことは、双方の鎖に対するオリゴヌクレオチドを合成し得ることを意味する。2種の鎖をこの方法で相互に内部標準として使用し得るので、この可能性はある。配列の部分的に有意な差異のため、個々の場合で適合するオリゴヌクレオチドを有する2種の異なった鎖のハイブリダイゼーション挙動は異なっている。この結果、双方の鎖上で同じ結果となった場合、このことが独立に確認されたと考え得るという結果となる。試験すべき各点におけるメチルシトシンとシトシンの量を定量する必要がある。個々のCpG位置に対する異なったハイブリダイゼーション反応の結果として、双方の鎖を使用することにより、オリゴヌクレオチドの異なったハイブリダイゼーションパラメーターとは独立のデータの定量が可能になる。これによりバックグラウンド誤差が最少になる。
【0077】
重亜硫酸塩処理後、2本の鎖は異なっているが、それは処理後に増幅がそれぞれの場合で行われ、そのために2本の鎖のそれぞれで相補性対立鎖の新たな合成が再び影響されるからである。重亜硫酸塩処理後、最初の鎖が相互に相補性でないことと同様に、2本の対立鎖も相互に相補性でない。増幅中に新たに合成された対立鎖も、最初の異なった鎖（対立鎖が合成されない鎖）と相補性でない。従って、二つの異なったハイブリダイゼーション標的が、個々のCpG位置に対して製造される。これらの4本の鎖はすべて同じ情報を含むが（ここでは対称的メチル化、すなわちCpG位置の両方の鎖でのメチル化を仮定する）、それらは異なった配列を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする。この方法で、任意のCpG位置上で得られる全ての情報が独立に4回確認される。それにも係わらず、4個の異なったオリゴヌクレオチドに対する信号強度を直接、ある位置のメチル化度と関連させることはできない（システムの使用により発生する実験値の場合をのぞいて）。実際、酵素増幅において異なった断片も異なった効率で増幅され、従って信号強度は必ずしもメチル化度と関連せず、むしろそれはCpG位置を含む断片の増幅効率にも関連しているという状況である。従って、全ての場合で4本の鎖に対する二つの可能なオリゴヌクレオチド、すなわち一方では試験すべきCpG位置がメチル化（CpGを含む）されている場合のみハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド、他方では未メチル化CpG位置（従ってCpGを含まない）の場合のみハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド、を解析しなければならない。DNA鎖の2つの可能な変異体、すなわちメチル化された、およびメチル化されない変異体がほとんど同じ効率で増幅され、比較される。すべての4本の鎖について相補性情報が利用できるので、4本の鎖すべてを全体の結果を確認するために用いることができる。本発明による方法の内容では、オリゴヌクレオチドを他の方法から区別する主な基準は、それぞれの場合でオリゴヌクレオチドが4種の塩基のうちの3種のみを含むということである。最初のDNAに相補性であるオリゴヌクレオチドは塩基Cのみを含み、塩基Gを含まない。これらのオリゴヌクレオチドの半分のみが正確に1個のグアニンを、CpG周辺配列中のそのメチル化状態を試験すべき正確な位置に含む。最初のDNAの対立鎖に相補性であり、増幅で生成する第2クラスのオリゴヌクレオチドは、反対に塩基シトシンをそのメチル化状態を試験すべき位置のみに含む。それらによって試験される位置がメチル化されていない場合、標的DNAのみとハイブリダイゼーションするこれらのオリゴヌクレオチドは、シトシンもグアニンも含まない（鎖による）。当然、提案された方法の範囲内では、説明した8個のクラスのオリゴヌクレオチドも他の点に関しては可変である。1つのクラスの数個の代表を、メチル化可能な個々の位置を調べるために同時に使用することも可能である。例えば、オリゴヌクレオチド内の各側上の潜在的メチル位の各側上にいくつの塩基が含まれているかは、全ての場合で明らかでない。メチル化可能な位置は、正確にオリゴヌクレオチドの中央である必要はない。従って、試験すべき各点に関して多くの順列が可能である。
【0078】
極端な場合、試験すべき位置はオリゴヌクレオチドの一端に位置しているか（これは既に本発明の方法の変法の構成員であるが）、または3'-終点の後ろでもあり得る。従って、シトシンまたはグアニンの存在（従って最初の試料のメチル化の存在）は単純なハイブリダイゼーションでは検出されず、プライマー伸長で検出される。本発明の方法のこの変法では、ヌクレオチド3燐酸が修飾されるが、この様なヌクレオチドを3'-末端に取り込むことは可能であるが、このヌクレオチドを超えて更に伸長することはできない。一般に、4種のヌクレオチドの一つ毎に異なった標識を有する4種のヌクレオチド3燐酸の2',3'-ジデオキシ類自体が、標的DNAに加えられ、チップ上でオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされる。ハイブリダイゼーションを直接検出する代わりに、ポリメラーゼを加え、各点で正確に1個のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの3'-末端で合成される。ヌクレオチドの3'-末端に取り込まれたヌクレオチドと相補性であるヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの前のオリゴヌクレオチド5'-位置とハイブリダイゼーションした標的DNA上に位置するヌクレオチドに正確に対応する。我々の方法では、この位置はメチル化可能な最初のDNA中の位置である。従って、DNA試料中の位置（鎖による）がメチル化された場合、Cはこの位置に有り；Gがオリゴヌクレオチドに加えられる。dGTP（またはこのヌクレオチドの類自体）が明確に標識され、全ての位置のオリゴヌクレオチド配列が既知の場合（これは必須条件である）、グアニン取り込みの検出を最初の試料中のメチル基の存在の検出に使用し得る。アデニンが同じオリゴヌクレオチドに附加した場合、チミンの検出が成功し、同様に、調べた位置がメチル化されていないことが示される。標識ddNTPシトシンおよびチミンを除いて、同じことが増幅で調製した対立鎖上に生じる。本発明のこの変法において、双方の配列クラスのオリゴヌクレオチドはシトシンもグアニンも含まない。それにも係わらず、この規則は例外の場合は破られる（例えば、1つの位置が常にメチル化されているか、常にメチル化されていない場合、またはその位置のメチル化状態がオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション挙動に影響しない場合）。さらに、オリゴヌクレオチド内の1個または数個の「ミスマッチ位置」が、それらが原理的に有害な効果を有するにも係わらず、本発明の方法の必須の要求に合致する。厳密に言えば配列クラスに属さないが、本発明の方法の必須の構成要素を満たすオリゴヌクレオチドが特許の保護範囲に含まれなければならない。その上、オリゴヌクレオチドのDNAチップの表面上への附加が、表面に附加したオリゴヌクレオチドの遺伝子配列と相補性であるオリゴヌクレオチド上の配列タグを経由して生じることができる。この様なオリゴヌクレオチドは、DNA試料とのハイブリダイゼーションが利用できる領域中のみで定義された配列クラスに属する。さらに、DNAチップの表面上のハイブリダイゼーションパートナーとして用いられるオリゴヌクレオチドも、例えばPNA（タンパク質−核酸）に基づくオリゴヌクレオチド、化学修飾オリゴヌクレオチド、および天然ヌクレオチド以外のヌクレオチドで合成された修飾、または未修飾オリゴヌクレオチド等の、上記説明中で暗示される塩基対挙動と類似の塩基対挙動を示す場合、本発明の保護の範囲に含まれ得る。
【0079】
当然このことは、試験される位置を有するか、プライマー延長鎖上に1個の塩基のみを有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに直接的に基づく本発明の方法の全ての変法に適用される。一般に1つの位置のみが試験され、この位置はまたオリゴヌクレオチド全体のシトシンまたはグアニン含有率を有する。それにも係わらず、個々の場合ではこの規則の例外は重要でなく、従ってそれらもまた本発明の目的である。
【0080】
DNAチップ（若干変性している可能性がある）上のプライマー伸長反応における異なった標識を有するヌクレオチド類自体の検出も、多様な方法で行われる。好ましい変法はヌクレオチドがチップ（当然、蛍光ラベルチップ）に結合していることを示す、公知の方法によるCCDカメラを用いる検出である。この意味では、上記の本発明の方法の変法では、ヌクレオチド類自体それぞれが異なった色で標識され、どのヌクレオチドが各位置に取り込まれたかを検出することが可能である。
【0081】
しかしながら、他の重要な変法は4種のヌクレオチド類自体のそれぞれを化学分子で標識することで構成され、次にMALDI-TOFのレーザー照射に暴露することにより光化学的（または発生熱または類似の方法により）にヌクレオチドから分離され、次いで直接イオン化され分子量が測定される。MALDI-TOF装置のレーザーはチップの各位置上を正確に狙うことができ、従って問題の場所でどの分子量変化を生じたかを各位置毎に決めることができる。しばしば（この変法におけるメチル化された、およびメチル化されない標的DNAが同じオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、メチル化状態は取り込まれたヌクレオチドを標識することにより決定されるため）、各位置で2個の標識が検出され（これは当然、蛍光標識にも適用される）、メチル化度を測定するためには2個の信号を定量し比較しなければならない。
【0082】
しかしながら、現在好ましい本発明の方法の変法では、蛍光による検出が用いられている。さらに、ハイブリダイゼーションが直接検出され、プライマー伸長反応は行われない。
【0083】
（プライマー伸長反応生成物の長さのマススペクトロメトリー測定によるメチル化状態の検出）
本発明の方法の変法の開発により、MALDIに基づくマススペクトロメーターを用いる長さのマススペクトロメトリー測定による、スルフィド処理DNA中の非常に多数のシトシンおよび/またはグアニンの検出が可能になった。この方法のために変更された、この技術の基礎は先に説明されている。
【0084】
提案された方法では、我々は、それらが上記で定義された2つの配列クラスの1つに属するため、重亜硫酸塩処理DNAの2本の鎖の1本のみとハイブリダイゼーションする確率が高いオリゴヌクレオチドを使用する。本発明の変法で使用されるオリゴヌクレオチドは、上記増幅法の任意の1つで調製された増幅混合物由来のシトシンおよび/またはグアニンの検出を行うことができる。このことは原理的に、重亜硫酸塩処理前に試料の断片に連結されたアダプターと相補性であるオリゴヌクレオチド、および他の方法で増幅された断片上の未同定位置でハイブリダイゼーションされたオリゴヌクレオチドを使用し得ることを意味している。
【0085】
本発明の方法の好ましい変法には、その制限断片にアダプターが連結される（次いで重亜硫酸塩処理後に増幅される）DNA試料、またはその5'-領域に一定の配列タグを含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションされたDNA試料の使用が含まれる。この目的のため、2本の鎖、すなわち最初の重亜硫酸塩修飾鎖と増幅中に新たに合成された鎖の重亜硫酸塩処理後、シトシンまたはグアニンに関する含有量が、2本の鎖の内の1本を特異的に認識するプライマー伸長反応のためのオリゴヌクレオチドを調製し得る様に異なっている様な方法でアダプターが合成される。このことは、この場合もオリゴヌクレオチドの2つの配列クラスが区別し得ることを意味している。使用されたオリゴヌクレオチドは、その3'-領域が既知のアダプター配列を過ぎ、制限エンドヌクレアーゼで認識される配列を過ぎ、従って既知の配列を過ぎてDNA試料の未知の領域まで伸長する性質を有している。オリゴヌクレオチドの段階的伸長で先に説明した様に、全体的な増幅が連続的にサブ分割された別々な反応で行われる場合、本発明で定義されるオリゴヌクレオチドもこの既知の領域を超えて伸長する。この意味で、オリゴヌクレオチドは未知領域中へ2から20塩基分だけ伸長し得る。最初の、または最初の全体的な増幅由来の断片の混合は、ここでサブ分割され、各（サブ）反応のために異なったオリゴヌクレオチドと混合される。各サブ反応では、どのオリゴヌクレオチドが加えられたかが分かっており、サブ反応は添加されたオリゴヌクレオチドの配列のみで異なっている。オリゴヌクレオチドの配列が正確に決められているか、または個々の位置が先に定義された縮重ヌクレオチド位置能ochH"または能ochD"で占められているかはここでは重要でない。縮重位置を使用することにより、未知領域中に伸長するより長い領域を使用することができ、この様な反応中に生成した伸長断片の数とタイプのより正確な制御と増加が可能になる。
【0086】
全ての異なったサブ反応により、以下の成分を有するポリメラーゼ反応が行われる。シトシンが少ない鎖（重亜硫酸塩処理DNAの最初の鎖に対応）とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを含む反応はヌクレオチドdATP、dCPT、dTTP、および塩基対挙動に関する限りヌクレオチドdGTPと類似のターミネーター、例えばddGTPまたは機能的に等価のヌクレオチド等を含む。他の配列クラスのオリゴヌクレオチドとの反応は、dATP、dGPTおよび塩基対挙動に関してヌクレオチドdGTPと類似のターミネーター、例えばddCTPまたは機能的に等価なヌクレオチドで構成される。次いで、オリゴヌクレオチドで出発し、1本の鎖（シトシンが少ない）上には第１番目のシトシンまで、他の鎖上では第1グアニンまでの新規DNA鎖を合成するためにポリメラーゼ反応が用いられる。
【0087】
マススペクトロメトリーによる分析のためには、天然起源のヌクレオチドの代わりに化学的手段により既知の方法で修飾されたヌクレオチドを、伸長産物のマススペクトロメトリーによるその後の分析を促進するために使用することも適当である。この目的のため、我々の変法では天然ヌクレオチドのホスフォチオエート類自体が使用される。それらは次の工程でアルキル化され、それによりDNAのバックローディングが省かれ、分析の質と感度が増加する。しかしながら、他の変更も、それがこの目的で行われたならば、本発明の保護の範囲に入る。さらに、用いられたオリゴヌクレオチドのローディングの変更と同時に、そのハイブリダイゼーション性が改善され変更される。
【0088】
本発明の方法の変法の目的は、複雑であるか、または単に複雑であるため、ゲル電気泳動で分離されるか、長さによるマススペクトロメトリー分析でより正確に分離される個々の反応中の断片群の調製である。その結果、未知の配列領域中に伸長するオリゴヌクレオチド部分の長さ全体にわたり合成された断片の数と、反応当り1断片からせいぜい数千の異なった断片の間であるように縮重度を制御することが必要である。
【0089】
好ましい変法では個々の反応が別々にマススペクトロメーターのイオン源の一定の座標上に適用される。次いでマススペクトロメトリー分析により個々の座標の断片スペクトルを測定する。マススペクトロメーターのイオン源上の数千座標までであり、スペクトル当り数百断片であり、そのそれぞれがシトシンまたはグアニン位置をメチル化の指示体として評価する場合は、数十万の個々のCpGジヌクレオチドまで評価することが可能である。
【0090】
同様な方法で、断片群から生成した断片スペクトルの検出も行われ、上記オリゴヌクレオチドプライマーによりアダプターの連結なしで断片群が増幅される。この変法の場合は、アダプターに対し相補性である配列は除外され、その代わりに数個の縮重を含む5'-領域が用いられる。
【0091】
重亜硫酸塩処理DNAが3'-領域に上記（5'）配列タグを含むオリゴヌクレオチドと予備増幅される場合は、上記節に述べた様にオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する定常領域として、アダプター配列と同様にDNAも使用することができる。
【0092】
（化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドのマススペクトロメトリー検出によるシトシンのメチル化状態の検出）
本発明の方法の別な変法では、それ自体公知であるが、ある配列のマススペクトロメトリーによる同定を、オリゴヌクレオチドに加えられた化学修飾の検出により間接的に行う。
【0093】
上記のマススペクトロメトリーで検出する変法では、それぞれ1個または数個のオリゴヌクレオチド配列を用いる多くの異なったプライマー伸長反応が行われる。原理的に、異なった分析可能な断片の極限数は、多くの異なった反応（およびMALDIイオン源上の座標）へサブ分割することにより達成される。
【0094】
各プライマー配列に化学修飾が行われる場合、MADLI単独以外の他の分析技術を用いる場合は、この分離は省略される。
【0095】
実際には、このことは使用される全ての異なったプライマーに合成中に既に用いられた反応、またはその後、原理的にその反応が二つの要求を満たすことを意味する。一方では、生成した断片の長さによる分離が妨げられてはならない。他方では、修飾のタイプが、キャピラリー電気泳動後の第2の分析工程で長さによる分離の認識が可能なものでなければならない。従って、修飾のタイプは第2工程での分析のタイプに依存する。好ましい実施変法では、プライマーの5'-末端に短いペプチド配列が備えられ、それが多くの通常の分析法で次の工程で分離される。この様な変法の大きな利点の一つは、最初の非特異的増幅工程においても、その量がその後の反応にわたって分布する必要がないため、かなり少量のDNAの全量が増幅されなければならないことである。上記変法で個々の反応へ分離することにより行われる2次元の分離は、本発明の方法の実行による本発明の方法の好ましい変法で達成されるが、生成した断片の分離は最初にキャピラリー電気泳動で行われる。この意味で、正しい結果を得るためには、断片における化学修飾が断片の泳動挙動に影響するかしないかは、長さによる1回だけの分離が可能である限り本質的でない。キャピラリー電気泳動の末端に達する各分画では、同じ電気泳動挙動を示す多くの断片が見出され、それらはそれぞれの5'-領域（伸長反応に用いられたプライマー領域中の）の化学修飾でのみ異なる。その電気泳動挙動によって分離されるこれらの断片群は、第2工程で化学修飾の有無について調べられる。ここで本発明の方法の好ましい変法は、キャピラリー電気泳動の溶出容積を高速原子爆撃マススペクトロメーター（FAB-MS）、電子スプレーイオン化マススペクトロメーター（ESI-MS）への直接注入、MALDIマススペクトロメーター上への導入、または等価の分析装置である。
【0096】
はっきり言えば、この様な変法は例えば以下の様に行われる。DNAを記載通り細胞から調製し、制限エンドヌクレアーゼでプレカットし、アダプターを準備し、小さい分子に対して多孔性であり、その中で透析による試薬の添加および除去により重亜硫酸塩反応の反応工程が行われる加熱可能なキャピラリーを通過させる。ここで、全体の反応の容積は微量である。重亜硫酸塩反応を行った後、キャピラリーは他の導入キャピラリーと繋ぎ合わせることにより増幅に必要な試薬を受け取り、同じ加熱可能なキャピラリー中で増幅を行うことができる。しかしながら、増幅をキャピラリー中でなく、これらのキャピラリーに接続した容器中で行うことも可能である。ゲノム分画全体の増幅後、記載通り第2の線状伸長工程が行われるが、その工程はその分子量で区別され、重亜硫酸塩修飾アダプターと相補性である化学修飾されたオリゴヌクレオチドで行われる。次の工程は、キャピラリーの別な区分中で、可能であれば硫酸アンモニウム等のマススペクトロメトリー分析に対応できる緩衝液に対する更に別な透析による伸長生成物の長さによる分離である。
【0097】
それぞれの分画をマススペクトロメーターのイオン源の座標上へ置き、次いで各座標を分子量の異なる化学修飾体の有無について調べる。この変法では、装置上の理由で非常に大きなイオン源を有するMALDI-TOFを使用することが好ましく、それにより非常に大きな数の異なった座標を短い間隔で並べることができる。
【0098】
極めて一般的に言えば、本明細書に述べる様に数多くの測定点を仕上げる必要から、記載された方法は全ての測定点を2次元で作成するので、本発明の方法の別な変法も可能である。MALDI-TOFのイオン源上の個々の「サブ反応」の分析の変法に記載される様に、DNAチップ上でこれらの二次元測定点は空間的に配置される。キャピラリー電気泳動による変法では、2次元測定点は異なった基準で分離する2つの分離法の連続的な結合により行われる。この様な方法のいくつかの別な変法があり、それらも本発明による全体的な概念に対応するので、本発明の保護の範囲に入らなければならない。本発明による方法の趣旨内で非常に多数の測定点で行われる測定では、各測定点に関してその起源が何であるかを知ることは絶対に必要なことではない。この方法の多数の応用では、膨大な量の抽出データを細胞の発現型と関連付けることで十分である。その結果、非常に広い範囲の可能な分析法が存在する。しかしながら一般的に、生じたハイブリダイゼーションの結果が間接手段で検出されるキャピラリー電気泳動（その結果そのものは1次元分析である）が、全ての変法で必要である。
【0099】
全体のデータの解析
メインクレームは一般的に言えば、複合メチル化フィンガープリント、および評価アルゴリズムによる試験細胞の発現型特性との関連のための方法に関する。しかしながら、元になる請求項も、メチル化データ作成に適した全ての方法に、本発明によるこれらのデータの評価を行うことを目的として適用されるが、それはデータの作成と組み合せて使用することが、本発明のレベルに達する因子であるからである。
【0100】
上記の全ての工程の最後に、膨大な数の測定点が得られる。3つの異なったタイプの数値が作成される。全ての分析した染色体上にメチル化型または非メチル化型で存在する、位置に関する純プラス−マイナス信号は多分、メチル化され得る検出可能位置の最大グループとはならない。非常に多数の位置は、上記方法で説明しなければならない様な信号を発生する。
【0101】
原理的に、純プラス−マイナス信号の解析はかなり簡単である。解析の戦略は以下の様である。起源が分かっている多くのDNA試料（例えば免疫蛍光法で単離された同じ発現型の抗体標識細胞由来）から、多数の試験でデータが作成され、その再現性が試験される。第1工程で個々の位置における差異が生物学的に有意であるかどうかを決めるための評価を行わないので、再現性のある結果が得られない位置はその他全部から、論理手法で分離される。これらの一連の試験は異なったタイプの細胞について行う必要がある。これらの一連の試験の結果は、全体的には未知であるが、細胞型の任意の対の比較でそのメチル化状態に再現性のある差を生じる多数のCpGジヌクレオチドである必要がある。2つの細胞型の直接の比較で異なっている位置の全てが、その差に関するこの様な比較の全てで有用ではない。少なくとも1回の細胞型の比較で区別できる位置をすべて解析するとすれば、試験された各細胞型に対する特性パターンを確立し得る。この方法で起源未知のDNA試料をある細胞型に特定することができる。これらのパターンは全ての試験された位置で必ずしも一定である必要はない。この時点で、個々の試料の一つからのある細胞のメチル化パターンがどの程度特性の平均からずれているかを評価（実際、本発明による方法はこの様な評価の基礎を始めて提供する）することはできない。
【0102】
理想的な場合、細胞型毎に発生したパターンは一定であるので、この様な組織はたいした費用もかけずに同定できる。定義された特性信号座標を有する所定のマトリックスを、試料をある細胞に同定するために直接使用することができる。最も複雑な場合は、ある細胞型に対して特徴的であるのは信号の個々の定義し得るパターンでなく、むしろ基本的に特徴的である多くのこの様なパターンが存在するが、見かけ上はこの様に特定できないパターンである。実際、またメチル化状態の現状の技術からは導かれないが、非常に異なっている様に見えるパターンが非常に類似した機能を含んでいることも可能である。しかしながら、本発明の方法は実際、この様な状況の評価の可能性を初めて提供したので、この時点ではこの困難さの程度に関して何も言うことができない。従って、この場合あり得るのは、従来の方法を用いて、いわば目視によって、ある試料を起源に割り当てることができないということである。この場合、提案された方法は一連の試験で測定されたデータで「ニューラルネットワーク（NN）を訓練する」ことを含んでいる。実際は、この事は以下の様に思われる。細胞DNA試料を用いて非常に多数の一連の試験を行い、NNの入力レベルに供給する。同時に、試料のメチル化データを用いてNNに試料の起源に関するデータを提供する。するとニューラルネットワークは十分な数の試験後、いわばどのパターンがどの細胞に属するかを学習する。この方法で、人の理解と通常のアルゴリズムでは全く混沌としているように思われる、極めて複雑で一見不透明なパターンを分類することができる。
【0103】
しかしながら、既に述べたように、得られたパターンがどの様に複雑で見かけ上混沌としているかを予言することはできない。記述したものの間の全ての場合が可能である。従って、未知の起源の使用した細胞型を分類することが可能であるために、一連の試験中の未知の起源の細胞型に対する複雑なメチル化パターンの割り当てを使用する全ての方法が、本発明の目的である。
【0104】
異常な起源の細胞の分析では、データの解析は確かにより複雑になると思われる。提案された方法の目的は、未知の疾病細胞型の分類を可能にすることである。試験試料のメチル化データを用いて、一連の試験を通して試験細胞の発現型パラメーターをNNおよび/または他の評価システムで利用可能にしなければならず、この意味で、これらの発現型データのどれがメチル化パターンと関連付けられる必要があるか、どれがこの様な関連の周辺配列内で合理的なデータを生み出すかは、全く明瞭でない。この様な場合、原理的には分類可能であるが、見かけ上混沌としたデータ量に由来する困難が増大する。変質細胞の場合、異なった発生遺伝型状態が同様な発現型特性を導くと思われる。この様な状況は、NNにより特に良く認識され、提案された方法の主な目的の一つである新規の正確に区別された発現型を導き出す。従って、メチル化パターンと発現型データの関連のためのメチル化データの解析において、ニューラルネットワークの異なったタイプの使用を特許の保護範囲に明確に含むことが望ましい。しかしながら、より簡単な状況も本発明の本質を満足し、それらも特許の保護範囲から除外してはならない。