【手続補正書】
【提出日】平成15年2月20日(2003.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極表面へのナノ粒子の移動を加速する方法であって、
特異的結合対の荷電第１メンバーに結び付けられた少なくとも１種類のナノ粒子と、特異的結合対の第２のメンバーを有する電極表面とを提供するステップと、
ナノ粒子と電極表面を、特異的結合対の第１メンバーと第２メンバー間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させるステップと、
電極表面へのナノ粒子の移動を加速し、結合対の第１メンバーと第２メンバー間の結合を促進するよう、ナノ粒子を電界にかけるステップと、から成る方法。
【請求項２】
特異的結合対が抗体／抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特異的結合対が受容体／リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
電極表面に結び付けられた、１または複数の部分を有する核酸を検出する方法であって、
オリゴヌクレオチドを付着させた１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、１または複数の種類のナノ粒子の各々の上のオリゴヌクレオチドが核酸の少なくとも１または複数の部分のうちの１つの配列に相補的な配列を有するステップと、
核酸とナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
ナノ粒子の電極表面への移動を加速するためにナノ粒子を電界にかけるステップと、
検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
【請求項５】
核酸が少なくとも２つの部分を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
表面に結び付けられた１または複数の部分を有する核酸を検出する方法であって、
核酸をオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有し、接触が、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
ナノ粒子の表面への移動を加速させるためにナノ粒子を電界にかけるステップと、
ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
【請求項７】
核酸が少なくとも２つの部分を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記接触条件には凍結と融解が含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記接触条件には加熱が含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な変化は固体表面上で観察される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
検出可能な変化は肉眼で観察可能な色の変化である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
色の変化が固体表面上で観察される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ナノ粒子が金から形成されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ナノ粒子が金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子であり、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドはナノ粒子に付着していない端部で蛍光分子で標識される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
核酸が少なくとも２つの部分を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
核酸は第１部分と第２部分の間に位置する第３部分を有し、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列は、核酸の該第３部分に相補的な配列を有さず、
核酸を、核酸の該第３部分に相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドとさらに接触させ、前記接触が、フィラーオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸がウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸が疾患関連遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
核酸が細菌ＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
核酸が真菌ＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
核酸が合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、構造的に修飾された天然または合成ＲＮＡ、もしくは構造的に修飾された天然または合成ＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
核酸が生物源のものである、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
核酸がポリメラーゼ連鎖反応増幅法の産物である、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
核酸が制限酵素でのＤＮＡの開裂によって得られた断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】
核酸を第１および第２種類のナノ粒子と同時に接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
核酸を、第２種類のナノ粒子と接触させる前に、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと接触およびハイブリダイズさせる、請求項６に記載の方法。
【請求項２７】
第１種類のナノ粒子が基板に付着される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
検出可能な変化は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションによって生じる、請求項４または６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５５】
（ａ）ナノ粒子−核酸−タンパク質共役体の調製
ナノ粒子−核酸共役体を、実施例３に記載したように調製する。これらの共役体を調製するために用いたオリゴヌクレオチド修飾因子は、以下の配列を有する：５’ＳＨ（ＣＨ２ ）６ −Ａ１０−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ３’（２）（配列番号７４）。図５６に示すように、ビオチン標識オリゴヌクレオチド（１）［３’−ビオチン−ＴＥＧ−Ａ１０−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ５’］（配列番号７３）を、ビオチン  ＴＥＧ  ＣＰＧ支持体（グレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；カタログ番号２０−２９５５−０１）を用いて文献の手順により調製する。ストレプトアビジン／ＤＮＡ共役体を作製するために、ストレプトアビジンを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液中の１当量のビオチン修飾オリゴヌクレオチドと、攪拌器にて室温で２時間反応させた。異なる数のオリゴヌクレオチドと複合化したストレプトアビジンを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）及び０．５％／分  勾配の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌによる流速１ｍＬ／分のイオン交換ＨＰＬＣで分離しながら、ＤＮＡのＵＶシグナルを２６０ｎＭ及び２８０ｎＭでモニタリングした。ストレプトアビジン／ビオチン修飾オリゴヌクレオチド混合物は、４５分、５６分、６７分、及び７１分に、それぞれ１：１、２：１、３：１、及び４：１オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体に対応する４つのピークを示した。ストレプトアビジン／オリゴヌクレオチドの１：１複合体（１０μＭ、５μＬ）を単離して、０．３Ｍ  ＰＢＳ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７）中のリンカーＤＮＡ［５’ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣＧ３’］（３）（配列番号７６）（１０μＭ、５μＬ）と予備混合し、その後その混合物を０．３Ｍ  ＰＢＳ中のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体（１０ｎＭ、１３０μＬ）に添加して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体を調製した。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、ストレプトアビジン／オリゴヌクレオチド、及びリンカーＤＮＡを含有する溶液を、ドライアイス中で１０分間凍結させ、解凍してＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させた。１２時間後に、その溶液を１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清を除去した。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体の赤色油状沈殿物を、０．３Ｍ  ＰＢＳ緩衝液に再分散させた。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６０】
（ａ）実験
オリゴヌクレオチド修飾１３ｎｍ  Ａｕ粒子（２−Ａｕ）及びリンカーＤＮＡ（３）を調製するための方法は、他の文献で報告されている。これらの共役体を調製するために用いるオリゴヌクレオチド修飾因子は、以下の配列を有する：５’ＳＨ（ＣＨ２ ）６ −Ａ１０−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ３’（配列番号７５）。リンカーＤＮＡ（３）は、以下の配列を有する：［５’ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣＧ３’］（配列番号７６）。Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８年，第１２０巻，１９５９ページを参照されたい。Ａｕ粒子（２−Ａｕ）及びリンカーＤＮＡ（３）は、使用の前に０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、０．３Ｍ  ＰＢＳ）に保存した。ビオチン修飾ＤＮＡ（２）は、ビオチン  ＴＥＧ  ＣＰＧ支持体（グレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて合成し、文献の方法により精製した。Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８年，第１２０巻，１９５９ページ；Ｔ．Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｉｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１年を参照されたい。ストレプトアビジンは、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）から購入し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（３０Ｍ、ｐＨ７．２）に溶解した。ストレプトアビジン／ＤＮＡ共役体（１−ＳＴＶ）を作製するために、ストレプトアビジンを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液中の８当量のビオチン−オリゴヌクレオチド共役体１と攪拌器にて室温で２時間反応させた。ビオチン−オリゴヌクレオチド共役体は、配列［３−ビオチン−ＴＥＧ−Ａ１０−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ５’］（配列番号７３）を有している。ＤＮＡに対するストレプトアビジンの割合が異なる混合物（１：０．４、１：１、１：４）も、ＨＰＬＣ分析のために調製した。ストレプトアビジン／ＤＮＡ共役体は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）及び０．５％／分  勾配の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌによる流速１ｍＬ／分のイオン交換ＨＰＬＣで過剰のＤＮＡから分離しながら、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでＤＮＡのＵＶシグナルをモニタリングした。１：０．４ストレプトアビジン／ＤＮＡ混合物は、４５分，５６分に２つのピークを、１：１混合物は４５分、５６分、６７分、及び７１分に、それぞれ１：１、２：１、３：１、及び４：１オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体に対応する４つのピークを示した。１：４混合物は、３番目のピーク（６７分）及び４番目のピーク（７１分）の強度が増大することを除けば、同様の位置に４つのピークを示した。１：８ストレプトアビジン／ＤＮＡ混合物のＨＰＬＣスペクトルは、２つの主なピーク、つまり１つは５９分の未反応のＤＮＡのもの、もう一方は７１分の４：１オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン��合体のものを示した。加えて、３：１複合体にあたる６７分のショルダーも存在した。精製したストレプトアビジン−ビオチン化ＤＮＡ共役体は、濃縮して、限外濾過（セントリコン３０）により０．３Ｍ  ＰＢＳに分散させた。ＴＥＭ、熱変性実験、及びＳＡＸＳ測定用の凝集体は、ストレプトアビジン−オリゴヌクレオチド共役体（１−ＳＴＶ）、金ナノ粒子ＤＮＡ共役体（２−Ａｕ）、及びリンカーＤＮＡ（３）を含有する溶液をドライアイス中で１０分間凍結することにより調製し、測定する前に解凍して、ハイブリダイゼーションを促進させた。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６４】
Ａｕナノ粒子／タンパク質アセンブリは、ハイブリダイゼーション誘導性アセンブリとは逆に、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用によっても形成することができる。例えば、典型的な実験において、１（０．２４ｍＭ、１．３μＬ）、３（１０μＭ、３２μＬ）、及び２−修飾ナノ粒子（Ａｕナノ粒子濃度：９．７ｎＭ、２６０μＬ）を、０．３Ｍ  ＰＢＳ緩衝液中で混合して、ビオチン修飾Ａｕ粒子を生成した。この混合物を６０℃に１０分間加熱し、その後室温に冷却して、ハイブリダイゼーションを促進させた。２４時間後に、１、３、及び２−修飾Ａｕナノ粒子を含有する溶液を、０．３Ｍ  ＰＢＳ中のストレプトアビジン（１０μＭ、４．２μＬ）に添加し、５０℃に加熱して、ナノ粒子凝集体を形成した。溶液の色は、凝集体の形成を示す紫色に変化し、溶液温度をＴｍ（６５℃）を超えて上昇させることにより、凝集体を２−修飾Ａｕ粒子、１−修飾ストレプトアビジン、及び３に解体することができた。小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）［Ｓ．Ｊ．Ｐａｒｋ，Ａ．Ａ．Ｌａｚａｒｉｄｅｓ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｐ．Ｗ．Ｂｒａｚｉｓ，Ｃ．Ｒ．Ｋａｎｎｅｗｕｒｆ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０００年，第３９巻，３８４５ページ；Ａ．Ｇｕｉｎｉｅｒ、Ｆ．Ｇ．，Ｓｍａｌｌ  Ａｎｇｌｅ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５年；Ｂ．Ａ．Ｋｏｒｇｅｌ，Ｄ．Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｂ  １９９９年，第５９巻，１４１９１ページ］のデータを、Ａｕ及びストレプトアビジン部分構造（１−ＳＴＶ、２−Ａｕ）と２つの異なる長さのＤＮＡリンカー（２４量体（３）及び４８量体）とから形成した凝集体について回収し、Ａｕ−Ａｕアセンブリ及び同様の連結オリゴヌクレオチド（２−Ａｕ、４−Ａｕ、２４量体リンカー（３）、４８量体リンカー）を基にした凝集体のものと比較した（図５９）。４８量体リンカーは、：１及び２に相補的な１２量体の付着末端を含有する５’ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ（配列番号２９）及び３’ＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＣＧＴ（配列番号３０）からなる２本鎖であった（２本鎖領域は下線で示す）。ＳＡＸＳ実験を設計するために、上記実験で用いられ、ＤＮＡハイブリダイゼーションでより高い接近容易性を提供した１，２，及び４のＡ１０スペーサ［Ｌ．Ｍ．Ｄｅｍｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｇ．Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年，第７２巻，５５３５ページを参照］を除去して、より強固なシステムを生成した。ＤＮＡにより連結された凝集体は、比較的明確な回折ピークを示し、Ａｕ−ＳＴＶ凝集体は、同じリンカーから形成されたＡｕ−Ａｕ凝集体よりも小さなｓ値で回折ピークを呈した。これは、Ａｕ−ＳＴＶシステムでのＡｕ粒子間距離がより大きいことを示唆している。その上、Ａｕ−Ａｕ及びＡｕ−ＳＴＶアセンブリの両者でリンカーとして２４量体ＤＮＡの代わりに４８量体ＤＮＡを用いた場合��回折ピークはより小さなｓ値にシフトする（図５９）。