(57)【要約】  本発明の核酸増幅装置は、核酸増幅容器を加温する熱源と、開口部が設けられた筐体と開口部を開閉するシャッターと核酸増幅容器を搭載して遠心する遠心機とを備え、熱源は筐体内に配置されており、遠心機は、開口部の開口面を通る直線を回転軸として、核酸増幅容器を回転させるものであり、シャッターは、開口部を閉じたとき、遠心機の位置を固定するものである。また、核酸増幅容器を加温する熱源及び核酸増幅容器に対して二本鎖核酸を解離させる刺激を与えるヒートブロックを備え、熱源は、核酸増幅容器を連続して加温するものであり、ヒートブロックは、熱源による加温が行なわれている状態で、間欠的に刺激を与えるものである。これにより、簡便かつ短時間で核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供する。
2008102772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅容器を加温するための加温手段と、
開口部が設けられた筐体と、
上記開口部を開閉するための開閉手段と、
核酸増幅容器を搭載して遠心する遠心手段とを備え、
上記加温手段は上記筐体内に配置されており、
上記遠心手段は、上記開口部の開口面を通る直線を回転軸として、上記核酸増幅容器を回転させるものであり、
上記開閉手段は、上記開口部を閉じたとき、上記遠心手段の位置を固定するものであることを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項２】
上記遠心手段における核酸増幅容器を搭載する部位は、
上記遠心手段の回転により描かれる円の接線方向に平行な直線を軸に、回動するものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
上記遠心手段は、複数の核酸増幅容器を、直線状に並べて搭載可能に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
上記遠心手段には、上記核酸増幅容器を搭載するための貫通孔が形成されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項５】
上記開閉手段は、上記開口部上をスライドして開閉するものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項６】
上記遠心手段は基板を備え、上記核酸増幅容器を搭載する部位が上記基板上に設けられており、
上記開閉手段は、上記開口部を閉じたとき、上記基板に重畳する領域で上記基板に接するように形成されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項７】
上記加温手段は、上記筐体内の気体を加温するものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項８】
生体試料から核酸増幅反応に供する核酸を抽出する核酸抽出手段と、
上記核酸抽出手段によって抽出された核酸を、上記遠心手段に搭載された核酸増幅容器に注入するための分注手段とをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項９】
核酸増幅容器に対して二本鎖核酸を解離させる刺激を与えるための変性手段をさらに備え、
上記加温手段は、上記核酸増幅容器を連続して加温するものであり、
上記変性手段は、上記加温手段による加温が行なわれている状態で、さらに、間欠的に上記刺激を与えるものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１０】
上記変性手段は、熱、電磁波及び超音波からなる群から少なくとも一つの刺激を発するものであることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅装置。
【請求項１１】
上記変性手段は、マイクロ波を発するものであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸増幅装置。
【請求項１２】
上記変性手段は、上記核酸増幅容器を加温するヒートブロックであることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅装置。
【請求項１３】
上記ヒートブロックには穴が設けられており、上記変性手段は、上記核酸増幅容器に上記刺激を与えるとき、当該穴に当該核酸増幅容器の底を包含するように移動するものであることを特徴とする請求項１２に記載の核酸増幅装置。
【請求項１４】
さらに、上記核酸増幅容器内から発せられる光を検出するための光検出手段を備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１５】
上記変性手段は、上記光検出手段によって検出する光で融解曲線解析をするために、上記刺激の強度の調整を行なうものであることを特徴とする請求項１４に記載の核酸増幅装置。
【請求項１６】
上記加温手段は、上記光検出手段によって検出する光で、融解曲線解析をするための温度調整を行なうものであることを特徴とする請求項１４に記載の核酸増幅装置。
【請求項１７】
核酸増幅容器を加温するための加温手段と、
当該核酸増幅容器に対して二本鎖核酸を解離させる刺激を与えるための変性手段とを備え、
上記加温手段は、上記核酸増幅容器を連続して加温するものであり、
上記変性手段は、上記加温手段による加温が行なわれている状態で、さらに、間欠的に上記刺激を与えるものであることを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項１８】
上記加温手段は、気体を加温するものであることを特徴とする請求項１７に記載の核酸増幅装置。
【請求項１９】
上記変性手段は、熱、電磁波及び超音波からなる群から少なくとも一つの刺激を発するものであることを特徴とする請求項１７に記載の核酸増幅装置。
【請求項２０】
上記変性手段は、マイクロ波を発するものであることを特徴とする請求項１７に記載の核酸増幅装置。
【請求項２１】
上記変性手段は、上記核酸増幅容器を加温するヒートブロックであることを特徴とする請求項１８に記載の核酸増幅装置。
【請求項２２】
上記ヒートブロックには穴が設けられており、上記変性手段は、上記核酸増幅容器に上記刺激を与えるとき、当該穴に当該核酸増幅容器の底を包含するように移動するものであることを特徴とする請求項２１に記載の核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅装置に関するものである。より詳しくは、簡易な構造で、核酸増幅反応の自動化に適しており、さらに核酸増幅反応を短時間でおこなうことが可能な核酸増幅装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅反応はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている。例えば、医学分野では、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列に基づいた診断が注目を集めており、農業分野では遺伝子組み換え作物の判定等でＤＮＡ鑑定が活用されている。【０００３】
ＰＣＲは、一般に、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離する反応（以下、「変性反応」と表記する。）、解離して生じた一本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング反応（以下、「アニーリング反応」と表記する。）、アニーリングした一本鎖ＤＮＡとプライマーとの二本鎖ＤＮＡの伸長反応（以下、「伸長反応」と表記する。）を繰り返すことにより行なう。具体的には、従来、ＰＣＲ反応液を個々のマイクロチューブに入れて、昇温又は冷却を繰り返すことで、上記各反応に必要な反応温度に調整する方法が主に用いられてきた。【０００４】
しかし、ＰＣＲを行なうためには、この温度の調整の繰り返し、微量のサンプルを扱うこと等により、煩雑な作業及び多大な時間を要する。例えば、上述のマイクロチューブを用いる方法では、マイクロチューブを加温する部材自体の温度の調整に時間を要する。そのため、上記温度の調整の繰り返しを行なうために、約２〜３時間を要する。【０００５】
そこで、近年、より簡便かつ短時間にＰＣＲを行なうための技術が提案されている（特許文献１〜６）。【０００６】
特許文献１及び２には、空気等の気体を熱媒とすることで、変性反応等のための温度調整を行なう装置が開示されている。具体的には、ヒーターで加熱した空気をＰＣＲ反応液の周囲に送り込むことで、それぞれの反応温度に調整している。これにより、ヒートブロック等を用いるより迅速に温度調整が可能になるとされている。核酸増幅容器としては、キャピラリーサンプルチューブ、予め核酸増幅反応液の注入口及び貯留部が設けられたディスクが用いられている。キャピラリーサンプルチューブは、ＰＣＲ反応液の貯留部位が極めて細く形成されているため、温度調整の時間を短縮することができる。また、上記ディスクを用いる場合は、予めＰＣＲ反応液を注入して、ディスクを回転させることで遠心力によって当該貯留部位にＰＣＲ反応液を充填することができる。また、当該装置では、キャピラリーサンプルチューブ等に含まれたＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段も備えている。つまり、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用いれば、リアルタイムにＰＣＲの結果を確認することができる。【０００７】
特許文献３及び４には、ＰＣＲによって得られる二本鎖核酸に結合して蛍光を発する蛍光染料を用いて、当該蛍光を検出することで、迅速にＰＣＲの結果を確認する技術が開示されている。【０００８】
特許文献５には、ＰＣＲによって得られる二本鎖核酸に結合する化合物と、当該化合物が当該二本鎖核酸に結合したときに発する蛍光が変化する反応分子で標識したプライマーとを用いるＩＦＰ法が開示されている。当該蛍光の変化を検出することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。【０００９】
特許文献６には、３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプライマーを用いてＰＣＲを行なうＱ−Ｐｒｏｂｅ法が開示されている。これにより、当該蛍光の変化を確認することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。
【特許文献１】日本国公表特許公報「特表２０００−５１１４３５（公表日：２０００年９月５日）」
【特許文献２】日本国公表特許公報「特表２０００−５１２１３８（公表日：２０００年９月１９日）」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開平５−１８４３９７（公開日：１９９３年７月２７日）」
【特許文献４】日本国公開特許公報「特開平１０−２１０４６４（公開日：１９９８年８月４日）」
【特許文献５】日本国公表特許公報「特表２００３−５００００１（公表日：２００３年１月７日）」
【特許文献６】日本国公開特許公報「特開２００１−２８６３００（公開日：２００１年１０月１６日）」
【発明の開示】
【００１０】
ＰＣＲに必要な作業工程の自動化をすれば、ＰＣＲの操作を簡便に行なうことができる。しかしながら、上記従来の構成では、ＰＣＲの作業工程を自動化するためには装置が大型化、複雑化するという問題を有する。また、上記従来の構成では、ＰＣＲの温度調整に長時間を要するという問題をも有する。
【００１１】
特許文献１及び２に開示の装置では、キャピラリーサンプルチューブ内又はディスク内の蛍光を、蛍光検出器を用いて自動的に検出するために、キャピラリーサンプルチューブ等の位置固定をする部品を別途設ける必要があり、部品数が増える。また、核酸増幅容器としてキャピラリチューブを用いる装置の場合、別途、遠心機によって試料等を充填する工程が必要となる。つまり、キャピラリチューブは、液溜部が細いため、試料等を当該液溜部に充填するためには、注入口に注いだ上で遠心機にかける工程が必要となり、当該工程を行なった上で、装置に搭載する必要がある。これらの工程を自動化するためには、遠心機からＰＣＲ装置まで、キャピラリチューブを運搬する手段が必要となるなど、装置が複雑化する。さらに、これらの装置では、高温に加熱された空気がそのまま装置外に放出されることを防ぐために装置を閉鎖するための部品も必要である。このようにＰＣＲ装置は多数の部品が必要とされ、作業工程を自動化するためにはさらに多くの部品が必要となり、構造が複雑になる。
【００１２】
また、特許文献１及び２の開示の装置は、キャピラリチューブを用いる装置及び上記ディスクを用いる装置のいずれも、装置内の気体を熱媒としている。そのため、気体を変性反応等の各反応温度に調整する工程を繰り返す必要があり、気体が当該核反応温度に調整されるまでに長時間を要する。
【００１３】
特許文献３〜６に開示の技術は、核酸増幅反応の結果を簡便に確認するための技術であり、温度調整に要する時間の短縮、装置の複雑化を解決するために資する技術ではない。
【００１４】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、より簡便かつ短時間で核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することにある。さらに具体的な本発明の目的としては、核酸増幅反応液の充填から核酸増幅反応までの作業の自動化に適した構造で、かつ簡易な構造の核酸増幅装置を提供して、さらには、温度調整の効率を向上して核酸増幅反応に要する時間を短縮した核酸増幅反応装置を提供することにある。
【００１５】
本発明に係る核酸増幅装置は、上記課題を解決するために、核酸増幅容器を加温するための加温手段と、開口部が設けられた筐体と、上記開口部を開閉するための開閉手段と、核酸増幅容器を搭載して遠心する遠心手段とを備え、上記加温手段は上記筐体内に配置されており、上記遠心手段は、上記開口部の開口面を通る直線を回転軸として、上記核酸増幅容器を回転させるものであり、上記開閉手段は、上記開口部を閉じたとき、上記遠心手段の位置を固定するものであることを特徴としている。
【００１６】
上記の構成によれば、上記開閉手段によって、上記開口部の開閉及び上記遠心手段の位置固定をも行なう。これにより、部品数が削減できて、構造を簡易にすることができる。
【００１７】
また、上記遠心手段の位置の固定によって、これに搭載された核酸増幅容器の位置も固定されることで、例えば、核酸増幅容器に対してヒートブロック等を直接接触させて加温したり、核酸増幅容器内の蛍光を検出したりするときに、必要な部品の位置調整が容易となる。つまり、核酸増幅容器の位置を基準とする部品の移動の、自動的な制御が容易となる。
【００１８】
よって、核酸増幅反応液の充填から核酸増幅反応までの作業の自動化に適した構造で、かつ簡易な構造の核酸増幅装置を提供することができる。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記遠心手段の、核酸増幅容器を搭載する部位は、上記遠心手段の回転により描かれる円の接線方向に平行な直線を軸に、回動するものであることがより好ましい。
【００２０】
上記遠心機は、核酸増幅容器を搭載する部位が上述のように回動するものである。そのため、遠心するときには、核酸増幅容器の底よりも注入口を回転軸に近づけるように回動させることで、又は、スイング式にしておき、遠心に伴って自動に回動させることで、核酸増幅容器の注入口から底に向けた遠心力を生じさせて、注入した核酸増幅反応液を底に充填することができる。そして、遠心しないときには、例えば従来公知のマイクロチューブ及びキャピラリチューブの注入口は上を向かせることができるため、核酸増幅容器に対する核酸増幅反応液の注入が容易となる。
【００２１】
つまり、核酸増幅反応液の注入の自動化に適した核酸増幅装置を提供することができる。
【００２２】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記遠心手段は、複数の核酸増幅容器を、直線状に並べて搭載するように形成されていることがより好ましい。
【００２３】
上記核酸増幅容器を直線状に並べて搭載できるため、様々な部品の構造を簡略化することができる。例えば、核酸増幅容器を搭載する部位が上記筐体外にある場合、複数の核酸増幅容器の核酸増幅反応液が貯留されている部位を上記筐体内に配置するために、開閉手段には穴等を設ける必要があるが、これを直線状の切れ込み等にすればよい。また、例えば、蛍光検出を行なうための部品を上記筐体内に設ける場合、当該部品に直線状の溝を形成して、溝の中に当該部位が入るようにすれば、当該部品を直線状にずらしていくだけで、複数の核酸増幅容器の蛍光を逐次検出することができる。
【００２４】
このように、上記の構成によれば、より構造の簡易な核酸増幅装置を提供することができる。
【００２５】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記遠心手段には、上記核酸増幅容器を搭載するための貫通孔が形成されていることがより好ましい。
【００２６】
上記貫通孔を貫通する管状の核酸増幅容器を用いれば、核酸増幅容器の底、即ち核酸増幅反応液が貯留している部位を、上記筐体内に曝露することができる。これにより、上記筐体内に配置された上記加熱手段によって、より効率的に温度調整を行なうことができる。
【００２７】
よって、より短時間で核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００２８】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記開閉手段は、上記開口部上をスライドして開閉するものであることがより好ましい。
【００２９】
上記開閉手段をスライドさせるだけで、上記開口部の開閉を行なうことができるため、開閉のための操作及び構造を簡易にすることができる。また、例えば、一辺を軸として回動させる扉状の開閉手段を採用する場合に比べて、使用するときに必要なスペースを省スペースにすることができる。
【００３０】
よって、より簡易な構造で簡便に扱うことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００３１】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記遠心手段は基板を備え、上記核酸増幅容器を搭載する部位が上記基板上に設けられており、上記開閉手段は、上記開口部を閉じたとき、上記基板に重畳する領域で上記基板に接するように形成されていることがより好ましい。
【００３２】
上記基板と上記開閉手段とが重なる領域が接することで、上記筐体を閉鎖空間にすることができる。つまり、上記基板と上記開閉手段とが重なる領域の面を、例えばそれぞれ平らにする等、接触するように形成すればよいので、上記開閉手段及び上記基板の構造を簡易にすることができる。
【００３３】
よって、より構造の簡易な核酸増幅装置を提供することができる。
【００３４】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記加温手段は、上記筐体内の気体を加温するものであることがより好ましい。
【００３５】
上記筐体内の気体によって、核酸増幅容器の温度調整をすることができる。気体は分散性に優れているため、気体を熱媒とすることで、複数の核酸増幅容器間に加えられる熱のムラが無くなり、温度調整を均一に行なうことができる。
【００３６】
よって、複数の核酸増幅容器を用いたとき、加えられる熱の均一性が高い核酸増幅装置を提供することができる。
【００３７】
本発明に係る核酸増幅装置では、生体試料から核酸増幅反応に供する核酸を抽出する核酸抽出手段と、上記核酸抽出手段によって抽出された核酸を、上記遠心手段に搭載された核酸増幅容器に注入するための分注手段とをさらに備えることがより好ましい。
【００３８】
上記核酸抽出手段によって、核酸を抽出することができ、さらに抽出した核酸を上記分注手段で上記核酸増幅容器に注入することができる。
【００３９】
よって、生体試料からの核酸の抽出から核酸増幅反応までを一つの装置で行なうことが可能な核酸増幅反応装置を提供することができる。
【００４０】
本発明に係る核酸増幅装置では、核酸増幅容器に対して二本鎖核酸を解離させる刺激を与えるための変性手段をさらに備え、上記加温手段は、上記核酸増幅容器を連続して加温するものであり、上記変性手段は、上記加温手段による加温が行なわれている状態で、さらに、間欠的に上記刺激を与えるものであることがより好ましい。
【００４１】
上記の構成によれば、温度調整を短時間で行なうことができる。
【００４２】
まず、変性反応からアニーリング反応及び伸長反応への移行のための温度調整が短時間で行なうことが可能な理由について、アニーリング反応及び伸長反応を共に６５℃で行なうシャトルＰＣＲの場合を例にして説明する。
【００４３】
上記核酸増幅容器の上記筐体内に配置された部位は、６５℃で連続して加温されている。そして、上記変性手段による刺激は、核酸増幅容器に対する６５℃の加温が行なわれている状態で与えられる。つまり、核酸増幅反応液が貯留されている部位に、変性反応のための刺激が与えられているときでも、その他の部位は６５℃に加温される。そのため、当該刺激が解除されたとき、上記加温手段による加温と、６５℃に加温されていたその他の部位の影響とによって、核酸増幅反応液が貯留されている部位は速やかに６５℃に調整される。
【００４４】
一方、従来のように核酸増幅容器を変性反応のための反応温度（例えば９５℃）に加温して、次に６５℃に加温する工程を、単に繰り返す場合、９５℃に加温したときに核酸増幅容器では、核酸増幅反応液が貯留されている部位のみならず、他の部位も９５℃に加温される。そのため、６５℃に加温するときにも、核酸増幅反応液が貯留されている部位周囲の９５℃に加温された領域の影響によって、当該部位が６５℃になるまでに長時間を要する。
【００４５】
また、伸長反応から変性反応への移行も迅速に行なうことができる。つまり、変性手段は間欠的に使用するものであるため、使用していない間に刺激を与えるための準備をすることができる。例えば、変性手段としてヒートブロックを用いる場合、予め９５℃に調整しておくことが可能であるし、後述のように電磁波を用いる場合は、電磁波を放出する準備をしておくことができる。
【００４６】
このように、上記の構成によれば、短時間で核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅反応装置を提供することができる。
【００４７】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記変性手段は、熱、電磁波及び超音波からなる群から少なくとも一つの刺激を発するものであることがより好ましい。
【００４８】
上記刺激のいずれかであれば、速やかに核酸増幅反応液に与えることができる。つまり、上記刺激が熱の場合は、上記変性手段を予め所定の温度に暖めておけばよい。上記変性手段は、間欠的に、変性反応のためだけに用いるものなので、従来のＰＣＲ装置のようにアニーリング反応及び伸長反応の反応温度に調整する必要が無いからである。また、電磁波及び超音波は、所望のタイミングで迅速に発生させることが可能である。つまり、伸長反応から変性反応へ、極めて迅速に移行することができる。
【００４９】
よって、より短時間に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅反応装置を提供することができる。
【００５０】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記変性手段は、マイクロ波を発するものであることがより好ましい。
【００５１】
マイクロ波は、極めて効率よく二本鎖核酸を解離させることが可能であり、また、所望のタイミングで迅速に発生させることができる。そのため、伸長反応から変性反応へ、極めて迅速に移行することができ、かつ、変性反応の時間を短時間にすることができる。
【００５２】
よって、より短時間に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅反応装置を提供することができる。
【００５３】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記変性手段は、上記核酸増幅容器を加温するヒートブロックであることがより好ましい。
【００５４】
上記ヒートブロックを、核酸増幅反応容器の核酸増幅反応液が貯留された部位の近傍に配置又は当該部位に接触させることで、変性反応を行なうことができる。そして、当該ヒートブロックを、予め変性反応に必要な温度に調整しておけば、迅速に変性反応を行なうことができる。
【００５５】
よって、より迅速に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００５６】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記ヒートブロックには穴が設けられており、上記変性手段は、上記核酸増幅容器に上記刺激を与えるとき、当該穴に当該核酸増幅容器の底を包含するように移動するものであることがより好ましい。
【００５７】
上記ヒートブロックの穴に、核酸増幅容器の底、即ち核酸増幅反応液が充填された部位を包含させることで、当該部位及びその周囲の狭い範囲にのみ集中的に変性反応のための温度を加温することができ、他の部位には上記加温手段でアニーリング反応及び伸長反応のための温度を連続的に加温し続けることができる。これにより、変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各反応間の移行を極めて短時間に行なうことができる。
【００５８】
よって、より迅速に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００５９】
本発明に係る核酸増幅装置では、さらに、上記核酸増幅容器内から発せられる光を検出するための光検出手段を備えることがより好ましい。
【００６０】
上記光検出手段によって、核酸増幅反応の結果を確認することができる。
【００６１】
よって、核酸増幅反応液の充填から、核酸増幅反応の結果の確認までを一つの装置で行なうことが可能な、核酸増幅装置を提供することができる。
【００６２】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記変性手段は、上記光検出手段によって検出する光で融解曲線解析をするための、上記刺激の強度の調整を行なうものであることがより好ましい。
【００６３】
上記変性手段によって上記刺激の強度を徐々に上げていくことができる。そのため、例えば、ＩＦＰ法、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を行なうことの可能な核酸増幅反応液を用いて、上記光検出手段によって蛍光等を検出することで、当該強度と核酸増幅反応後の二本鎖核酸の解離との関係を解析することができる。
【００６４】
よって、一つの装置で、核酸反応液の充填から融解曲線解析までを行なうことができる核酸増幅装置を提供することができる。
【００６５】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記加温手段は、上記光検出手段によって検出する光で融解曲線解析をするための温度調整を行なうものであることがより好ましい。
【００６６】
上記加温手段によって、徐々に温度を上昇させることができる。そのため、例えば、ＩＦＰ法、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を行なうことの可能な核酸増幅反応液を用いて、上記光検出手段によって蛍光等を検出することで、当該温度と核酸増幅反応後の二本鎖核酸の解離との関係を解析することができる。
【００６７】
よって、一つの装置で、核酸反応液の充填から融解曲線解析までを行なうことができる核酸増幅装置を提供することができる。
【００６８】
本発明に係る核酸増幅装置は、上記課題を解決するために、核酸増幅容器を加温するための加温手段と、当該核酸増幅容器に対して二本鎖核酸を解離させる刺激を与えるための変性手段とを備え、上記加温手段は、上記核酸増幅容器を連続して加温するものであり、上記変性手段は、上記加温手段による加温が行なわれている状態で、さらに、間欠的に上記刺激を与えるものであることを特徴としている。
【００６９】
上記の構成によれば、温度調整を短時間で行なうことができる。
【００７０】
まず、変性反応からアニーリング反応及び伸長反応への移行のための温度調整が短時間で行なうことが可能な理由について、アニーリング反応及び伸長反応を共に６５℃で行なうシャトルＰＣＲの場合を例にして説明する。
【００７１】
上記核酸増幅容器の上記筐体内に配置された部位は、６５℃で連続して加温されている。そして、上記変性手段による刺激は、核酸増幅容器に対する６５℃の加温が行なわれている状態で与えられる。つまり、核酸増幅反応液が貯留されている部位に、変性反応のための刺激が与えられているときでも、その他の部位は６５℃に加温される。そのため、当該刺激が解除されたとき、上記加温手段による加温と、６５℃に加温されていたその他の部位の影響とによって、核酸増幅反応液が貯留されている部位は速やかに６５℃に調整される。
【００７２】
一方、従来のように核酸増幅容器を変性反応のための反応温度（例えば９５℃）に加温して、次に６５℃に加温する工程を、単に繰り返す場合、９５℃に加温したときに核酸増幅容器では、核酸増幅反応液が貯留されている部位のみならず、他の部位も９５℃に加温される。そのため、６５℃に加温するときにも、核酸増幅反応液が貯留されている部位周囲の９５℃に加温された領域の影響によって、当該部位が６５℃になるまでに長時間を要する。
【００７３】
また、伸長反応から変性反応への移行も迅速に行なうことができる。つまり、変性手段は間欠的に使用するものであるため、使用していない間に刺激を与えるための準備をすることができる。例えば、変性手段としてヒートブロックを用いる場合、予め９５℃に調整しておくことが可能であるし、後述のように電磁波を用いる場合は、電磁波を放出する準備をしておくことができる。
【００７４】
このように、上記の構成によれば、短時間で核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅反応装置を提供することができる。
【００７５】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記加温手段は、気体を加温するものであることがより好ましい。
【００７６】
上記筐体内の気体によって、核酸増幅容器の温度調整をすることができる。気体は分散性に優れているため、気体を熱媒とすることで、複数の核酸増幅容器間に加えられる熱のムラが無くなり、温度調整を均一に行なうことができる。
【００７７】
よって、複数の核酸増幅容器を用いたとき、加えられる熱の均一性が高い核酸増幅装置を提供することができる。
【００７８】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記変性手段は、熱、電磁波及び超音波からなる群から少なくとも一つの刺激を発するものであることがより好ましい。
【００７９】
上記刺激のいずれかであれば、速やかに核酸増幅反応液に与えることができる。つまり、上記刺激が熱の場合は、上記変性手段を予め所定の温度に暖めておけばよい。上記変性手段は、間欠的に、変性反応のためだけに用いるものなので、従来のＰＣＲ装置のようにアニーリング反応及び伸長反応の反応温度に調整する必要が無いからである。また、電磁波及び超音波は、所望のタイミングで迅速に発生させることが可能である。つまり、伸長反応から変性反応へ、極めて迅速に移行することができる。
【００８０】
よって、より短時間に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅反応装置を提供することができる。
【００８１】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記変性手段は、マイクロ波を発するものであることがより好ましい。
【００８２】
マイクロ波は、極めて効率よく二本鎖核酸を解離させることが可能であり、また、所望のタイミングで迅速に発生させることができる。そのため、伸長反応から変性反応へ、極めて迅速に移行することができ、かつ、変性反応の時間を短時間にすることができる。
【００８３】
よって、より短時間に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅反応装置を提供することができる。
【００８４】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記変性手段は、上記核酸増幅容器を加温するヒートブロックであることがより好ましい。
【００８５】
上記ヒートブロックを、核酸増幅反応容器の核酸増幅反応液が貯留された部位の近傍に配置又は当該部位に接触させることで、変性反応を行なうことができる。そして、当該ヒートブロックを、予め変性反応に必要な温度に調整しておけば、迅速に変性反応を行なうことができる。
【００８６】
よって、より迅速に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００８７】
本発明に係る核酸増幅装置では、上記ヒートブロックには穴が設けられており、上記変性手段は、上記核酸増幅容器に上記刺激を与えるとき、当該穴に当該核酸増幅容器の底を包含するように移動するものであることがより好ましい。
【００８８】
上記ヒートブロックの穴に、核酸増幅容器の底、即ち核酸増幅反応液が充填された部位を包含させることで、当該部位及びその周囲の狭い範囲にのみ集中的に変性反応のための温度を加温することができ、他の部位には上記加温手段でアニーリング反応及び伸長反応のための温度を連続的に加温し続けることができる。これにより、変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各反応間の移行を極めて短時間に行なうことができる。
【００８９】
よって、より迅速に核酸増幅反応を行なうことが可能な核酸増幅装置を提供することができる。
【００９０】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置の概略構成を示す斜視図である。
【図２】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置が備える本体の構成を模式的に示す斜視図である。
【図３】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置が備える本体がキャピラリチューブを搭載した様子を模式的に示す斜視図である。
【図４】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置が備える遠心機によって、キャピラリチューブの反応液貯留部に試料等を充填する様子を模式的に示す斜視図である。
【図５】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置が備えるシャッターが閉じた状態の本体を模式的に示す斜視図である。
【図６】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置によって、変性反応を行なっているときの本体を模式的に示す斜視図である。
【図７】本発明の実施形態に係るＰＣＲ装置が備える蛍光検出部によってＰＣＲの結果を確認している状態の本体を模式的に示す斜視図である。
【図８】融解曲線解析の原理を模式的に示す図である。
【図９】本発明の他の実施形態に係るＰＣＲ装置の本体の構造を模式的に示す斜視図である。
【図１０】本発明の実施例における電気泳動の結果を示す図である。
【符号の説明】
【００９２】
１    ＰＣＲ装置（核酸増幅装置）
２、３０    本体
３    ケース（筐体）
４    シャッター（開閉手段）
５    遠心機（遠心手段）
５ａ    バケット支持板
５ｂ    バケット
５ｃ    シャフト
５ｄ    遠心駆動部
６    熱源（加温手段）
７    ヒートブロック（変性手段）
８    加熱抽出装置（核酸抽出手段）
９    分注アーム（分注手段）
１０    蛍光検出部（光検出手段）
２０    キャピラリチューブ（核酸増幅容器）
Ｌ１    直線（回転軸）
Ｌ２、Ｌ３  直線（軸）
【発明を実施するための最良の形態】
【００９３】
〔実施の形態１〕
本発明の一実施形態について図１ないし図８に基づいて説明すると以下の通りである。【００９４】
（ＰＣＲ装置１の構成）
まず、図１を用いて本実施の形態に係るＰＣＲ装置１（核酸増幅装置）の概略構成について説明する。図１は本実施の形態に係るＰＣＲ装置１の概略構成を示す斜視図である。なお、図１には、ＰＣＲ装置１に搭載されたキャピラリチューブ２０（核酸増幅容器）、ピペットチップ２２、抽出用チューブ２３をも示している。また、図１では、ケース３内の説明をするため、ケース３の輪郭を二点鎖線にて示し、その内部を示している。【００９５】
図１に示すようにＰＣＲ装置１は、本体２、加熱抽出装置８（核酸抽出手段）、分注アーム９（分注手段）、ピペットチップホルダー２１を備えている。【００９６】
本体２は、ケース３（筐体）、シャッター４（開閉手段）、遠心機５（遠心手段）、熱源（加熱手段）６、ヒートブロック７（変性手段）を備えている。キャピラリチューブ２０は遠心機５に搭載することができる。【００９７】
なお、本体２の構成については、後で図２に基づいて詳述する。【００９８】
加熱抽出装置８は、生体試料から核酸増幅反応に供する核酸を抽出する核酸抽出手段として機能するものである。加熱抽出装置８は、本体２の脇に備えられている。加熱抽出装置８には穴が複数設けられており、当該穴に抽出用チューブ２３を搭載することができる。さらに、搭載した抽出用チューブ２３を加熱することができる。つまり、抽出用チューブ２３に生体試料を入れて、加熱抽出装置８によって当該生体試料から核酸の抽出に必要な加熱処理を行なうことで、核酸の増幅を行なう。ＰＣＲ装置１には、種々の生体試料を用いることができ、その種類は特に限定されるものではない。例えば、各種臓器等の組織、血液、喀淡等を挙げることができる。また、臓器等を構成する細胞の核内の核酸を核酸増幅反応の対象にしてもよく、生態試料に含まれる微生物、ウィルス等が有する核酸を対象にしてもよい。【００９９】
なお、抽出用チューブ２３としては、核酸の抽出等に用いる従来公知の反応容器を用いればよく、加熱抽出装置８によって加熱される温度に耐性を有するものである限り、特に限定されるものではない。【０１００】
ピペットチップホルダー２１は、ピペットチップ２２を予め搭載しておくための容器である。ピペットチップホルダー２１としては、従来公知のピペットチップを搭載するホルダーを用いればよい。ピペットチップホルダー２１は、加熱抽出装置８の脇に備えられている。図１は、複数のピペットチップ２２が搭載されている状態を示している。【０１０１】
分注アーム９は、加熱抽出装置８によって抽出された核酸を、後述する遠心機５に搭載されたキャピラリチューブ２０に注入する機能を有するものである。分注アーム９は、ピペットチップホルダー２１、加熱抽出装置８、本体２上を自在に動くことができるように設けられている。また、作業者が予め設定する条件に応じて、自動的にピペットチップ２２を着脱することができる。つまり、分注アーム９は、ピペットチップホルダー２１上に移動して、ピペットチップ２２を先端に搭載して、その後、加熱抽出装置８上に移動して抽出用チューブ２３から、生体試料から抽出された核酸を吸入して、キャピラリチューブ２０上に移動して、キャピラリチューブ２０に注入する。【０１０２】
なお、本実施の形態では、加熱抽出装置８、分注アーム９、ピペットチップホルダー２１を備える場合について説明したが、本発明に係る核酸増幅装置はこれに限定されるものではない。例えば、核酸の抽出及び分注アームによる試料等の運搬は、人手によって行なってもよく、別途、既存のオートサンプラー等を外付けしてもよい。ピペットチップホルダーも、既存のものを用いればよい。【０１０３】
本実施の形態１では、核酸増幅容器としてキャピラリチューブ２０を用いる。キャピラリチューブ２０は、細い管状の部位と、当該部位の断面積より広い面積を有するように形成された注入口とで形成されている。注入口に注入されたＰＣＲ反応液は、後述のように遠心機５によって上記細い管状の部位の底に移動され、充填される。なお、以下、キャピラリチューブ２０等の核酸増幅容器の、核酸増幅反応液が充填される部位を、説明の簡単のため「反応液貯留部」と表記する。【０１０４】
キャピラリチューブ２０の材質としては、特に限定されるものではない。例えば、本発明者らは後述の実施例において、ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１のキャピラリを用いた。当該キャピラリはガラス製である。このように、キャピラリチューブ２０としては、従来公知の市販品を用いればよい。【０１０５】
また、後述のように、遠心機５のキャピラリチューブ２０を搭載する部位には貫通孔が形成されている。そのため、当該貫通孔にキャピラリチューブ２０を差し込むと、ＰＣＲ反応液貯留部は、注入口の反対側に貫通する。そのため、反応液貯留部はケース３内に曝露される。これにより、ケース３内の気体で直接加温されるため、より短時間で温度調整をすることができる。【０１０６】
キャピラリチューブ２０には蓋をする必要が無い。注入口付近は外気の温度に近い温度で保たれているため、反応液貯留部からＰＣＲ反応液が蒸散しても、上昇するに伴い液化して、再度反応液貯留部に戻るからである。ただし、厳密な滅菌状態を維持するとき、増幅後の核酸の飛散を厳密に阻止する必要があるとき等では、必要に応じて蓋をすればよい。【０１０７】
なお、本発明に係る核酸増幅装置に用いる核酸増幅容器は、キャピラリチューブ２０のように細い管状構造を有するものに限定されるものではない。従来公知のマイクロチューブ等を用いてもよい。本実施の形態に係るＰＣＲ装置１でもマイクロチューブを用いてもよい。このとき、例えば、バケット５ｂを着脱式にして、マイクロチューブに対応させた径の貫通孔又は凹部を設けたバケットに付け替えて、マイクロチューブを用いればよい。【０１０８】
（本体２の構成）
次に、本体２の構成について図２を用いてより詳細に説明する。図２は、本体２の構成を模式的に示す斜視図であり、搭載するキャピラリチューブ２０をも示している。また、図２では、ケース３内の説明をするため、ケース３の輪郭を二点鎖線にて示し、その内部を示している。【０１０９】
図２に示すように、本体２は、上述のようにケース３、シャッター４、遠心機５、熱源６、ヒートブロック７を備え、さらに、蛍光検出部１０、ファン１１ａ、１１ｂを備えている。【０１１０】
ケース３は本発明に係る核酸増幅装置が備える筐体として機能するものである。ケース３には開口部が設けられている。開口部の開口面はシャッター４により開閉される。【０１１１】
シャッター４は、ケース３の開口部の開閉手段として機能するものである。シャッター４は、ケース３の開口部が設けられている面上に、２枚設けられている。２枚のシャッター４は、それぞれ矢印Ａ方向にスライドすることができる。これにより、上記開口面を開閉することができる。シャッター４をスライドさせるための構造は特に限定されるものではなく、例えば、上記開口部の縁に、シャッター４がスライドする方向を規定するための溝を設けて、シャッター４に、当該溝に嵌合する突起部等を設ければよい。【０１１２】
２枚のシャッター４には、それぞれ、キャピラリチューブ２０をケース３内に導くための凹部４’及び後述する遠心機５のシャフト５ｃに接触しないための凹部４”が設けられている。つまり、バケット５ｂの貫通孔に差し込まれたキャピラリチューブ２０の反応液貯留部は、この凹部４’を介してケース３内に配置される。【０１１３】
シャッター４が閉じたとき、シャッター４の表面は、後述する遠心機５のバケット支持板５ａ及びバケット５ｂの下面に密着する。これにより、シャッター４は遠心機５の位置を固定することができる。【０１１４】
このように、ケース３の開口部の開閉手段であるシャッター４によって、遠心機５の位置固定、ひいてはキャピラリチューブ２０の位置固定をも行なうことができる。これにより、部品数が削減できて、構造を簡易にすることができる。キャピラリチューブ２０の位置が固定されることで、キャピラリチューブ２０の位置のズレ等を補正する必要が少ないため、後述するヒートブロック７及び蛍光検出部１０の移動制御を簡易に行なうことができる。【０１１５】
シャッター４とバケット支持板５ａ及びバケット５ｂとが重畳する領域が接することで、シャッター４による遠心機５の位置固定を行なう構成は、構造が簡易であるため好ましい。このような構成は、例えば、シャッター４とバケット支持板５ａ及びバケット５ｂとの対向する面をそれぞれ平坦にすることで実現できる。【０１１６】
また、シャッター４が閉じたとき、凹部４’及び４”はそれぞれ閉じられた状態となる。つまり、凹部４’の上には、バケット５ｂの貫通孔及びキャピラリチューブ２０が位置しているため、これによって閉じられる。凹部４”の上にはバケット支持板５ａが位置しているため、これによって閉じられる。従って、シャッター４が閉じることで、ケース３の開口部は完全に塞がれ、ケース３を密閉することができる。ケース３が密閉されることで、ケース３内から熱が漏れることを防ぐことができ、加温による温度調整の効率がさらに向上する。【０１１７】
本発明に係る核酸増幅装置が備える開閉手段の構成としては、シャッター４のようにスライド式の板状部材を２枚設けるという構成が、部品の構造が簡易で、省スペースであるという観点から好ましい。なお、開閉手段の構成は、これに限定されるものではなく、例えば一枚の蓋を、遠心手段上にかぶせて、密着させることで、遠心手段の位置を固定する等の構成にしてもよい。シャッター４の材料としては、ウレタンを用いている。ウレタンを用いれば、筐体内を好適に密閉状態にすることができる。また、ウレタンは、断熱性にも優れているため、ケース３内からの熱のロスを、さらに好適に防ぐことができる。本発明に係る核酸増幅装置が備える開閉手段の材料は、特に限定されるものではないが、開口手段は、外気に触れる面積の広い部材でもあるので、ウレタン等のように断熱性の高い材料で形成することが好ましく、中でもウレタンが好ましい。【０１１８】
遠心機５はキャピラリチューブ２０を遠心するものである。遠心機５は、バケット支持板５ａ、バケット５ｂ、シャフト５ｃ、遠心駆動部５ｄを備えている。バケット支持板５ａはバケット５ｂを支持するものであり、板状構造を有している。バケット５ｂは、キャピラリチューブ２０を搭載する部位として機能するものであり、バケット支持板５ａに２個設けられている。２個のバケット５ｂは、それぞれ板状構造を有している。つまり、バケット支持板５ａ及びバケット５ｂによって１枚の基板が形成されているといえる。そして、シャッター４が閉じたとき、上述のようにバケット支持板５ａ及びバケット５ｂの下面がシャッター４の表面に密着することで、バケット支持板５ａ及びバケット５ｂの位置が固定され、ひいては遠心機５の位置が固定される。【０１１９】
また、バケット支持板５ａ及びバケット５ｂは、ケース３の開口面より上に位置している。これにより、分注アーム９がＰＣＲ反応液の分注を行なうとき、分注アーム９の移動の制御が容易となる。つまり、例えばケース３の中にバケット５ｂが設けられた場合、分注アーム９に搭載したピペットチップ２２も、ケース３内まで移動させる必要があるが、これに比べて、ケース３の上にバケット５ｂを設けることで、移動を容易に制御することができる。つまり、このように遠心手段の、核酸増幅容器を搭載する部位を、筐体の開口面及び開閉手段より上に設けることで、分注作業が容易となり、自動化もしやすくなる。【０１２０】
バケット５ｂにはキャピラリチューブ２０を搭載するための貫通孔が設けられている。貫通孔とすることで、キャピラリチューブ２０内の反応液貯留部が、ケース３内に配置される。そのため、直接キャピラリチューブ２０を加温することができるため好ましい。【０１２１】
また、バケット５ｂはシリコンで形成されている。そのため、上記貫通孔にキャピラリチューブ２０を搭載したとき、キャピラリチューブ２０の側面は上記貫通孔の側面に密着する。これは、上述のようにケース３の機密性の確保にも資するものであり、さらに、キャピラリチューブ２０の位置ずれを防止して、位置を正確に固定することができる。ただし、バケット５ｂの材料はこれに限定されるものではない。【０１２２】
上記貫通孔は、それぞれのバケット５ｂ上に複数設けられており、直線状に並んでいる。つまり、キャピラリチューブ２０を、それぞれのバケット５ｂ上に直線状に並べて搭載することができる。これによりシャッター４に設けられた凹部４’の構造を、直線状に適応した形にすればよく、構造を簡略化することができる。【０１２３】
なお、本発明に係る核酸増幅装置において、核酸増幅容器を搭載する部位の形状は貫通孔に限定されるものではない。例えば、貫通していない穴を遠心手段上に設けて、穴の底が筐体内に位置する構成にしてもよい。このとき、開閉手段の形状は、当該遠心手段の外縁に嵌合する形状等にして、当該穴の設けられた部材の底面は筐体内に配置されるようにすれば、当該穴に搭載された核酸増幅装置は、筐体内の加温手段によって好適に加温される。【０１２４】
また、貫通孔の配置は直線状に限定されるものではなく、例えば円状に並べてもよい。このとき開閉手段は、上述のように上からかぶせて遠心手段を固定するような構成にすればよい。【０１２５】
バケット５ｂは、従来公知のスイング式遠心機のように、遠心機５の遠心による回転に伴ってスイングする。スイングによる動作の詳細については後述する。【０１２６】
シャフト５ｃはバケット支持板５ａ及びバケット５ｂを回転させる駆動軸として機能するものである。シャフト５ｃはバケット支持板５ａの中央を貫通して設けられている。また、シャフト５ｃはケース３内を通り、ケース３の底面を貫通して、ケース３の下で遠心駆動部５ｄに連結している。つまり、遠心駆動部５ｄはケース３の下に設けられている。【０１２７】
遠心駆動部５ｄは、シャフト５ｃを回転させるものである。シャフト５ｃの回転によってバケット支持板５ａ及びバケット５ｂが回転する。バケット５ｂは、この回転に伴い、搭載したキャピラリチューブ２０の注入口から反応液貯留部に向けて遠心力が働くように回動することができる。なお、遠心機５の具体的な動作については後で詳述する。【０１２８】
熱源６は、本発明に係る核酸増幅装置が備える加温手段として機能するものである。熱源６は、ケース３内の気体を加温することで、キャピラリチューブ２０を、ＰＣＲ反応液の伸長反応及びアニーリング反応に必要な温度に加温するものである。当該加温は、ＰＣＲ反応が行なわれている間、連続して行なわれる。これにより、キャピラリチューブ２０の反応液貯留部は、間欠的に変性反応に必要な温度となるように加温される。なお、熱源としては、コイル式ヒーター、ハロゲンランプ等を用いるとよい。【０１２９】
また、熱源６は、後述する融解曲線解析を行なうときの温度調整にも用いることができる。つまり、当該温度調整に必要な範囲の温度に、ケース３内の気体を加温することができる。ここで、本明細書において「融解曲線解析」とは、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離するための温度等の刺激が、その塩基配列によって異なることを利用して、核酸増幅反応の結果を確認するための解析方法を意図している。例えば、上述のＩＦＰ法又はＱ−Ｐｒｏｂｅ法を利用することで、当該刺激の強度と発せられる蛍光との関係によって、二本鎖核酸の増幅の有無及び当該二本鎖核酸の配列の種類を解析することができる。なお、融解曲線解析のための上記刺激とは、温度に限定されるものではなく、例えば、超音波及び電磁波等の二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させることが可能な刺激を意図する。【０１３０】
ヒートブロック７は、本発明に係る核酸増幅装置が備える変性手段として機能するものである。ヒートブロック７は、ケース３内に二個設けられており、それぞれ複数の穴７ａが形成されている。ヒートブロック７の温度は、二本鎖核酸を解離させるために必要な温度に調整することができる。つまり、ＰＣＲ装置１では、ヒートブロック７による加温によって変性反応を行なう。【０１３１】
それぞれのヒートブロック７には、突起した筒状構造を複数有している。この筒状構造の数及び配置は、遠心機５に設けられた貫通孔の数及び配置に対応している。上述の穴７ａは、当該筒状構造の先端に形成されている。そして、穴７ａにはキャピラリチューブ２０の反応液貯留部を包含することができる。【０１３２】
また、ヒートブロック７は、２本の移動軸によって移動することができる。これにより、キャピラリチューブ２０の反応液貯留部を当該穴に包含したり、当該穴から出したりすることができる。ヒートブロック７の動作の詳細については後述する。【０１３３】
なお、本発明に係る核酸増幅装置が備える変性手段の構成は、上述のヒートブロック７のような構成に限定されるものではなく、核酸増幅容器の反応液貯留部に変性反応の反応温度を加温することができる構成であればよい。単に直方体形状のヒートブロックに、核酸増幅容器を入れることができる穴を設けるだけでもよい。【０１３４】
本実施の形態では、ヒートブロック７によって、二本鎖核酸を解離させる刺激として熱を与える、即ち、ＰＣＲ反応液を変性反応に必要な温度に加温することで、変性反応を行なう場合について説明するが、これに限定されるものではない。つまり、本発明に係る核酸増幅装置が備える変性手段は、二本鎖核酸を解離させる刺激を発するものであればよい。上記刺激としては、熱の他に、電磁波、超音波等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、二種以上を併せて用いてもよい。また、電磁波の中でもマイクロ波が好ましい。マイクロ波は高エネルギーであるため、短時間で変性反応を行なうことができる。また、マイクロ波は液体の温度を上げやすいため、核酸増幅反応液の温度を上昇させることもできる。よって、核酸増幅反応液のみが変性反応温度になるような刺激を効率よく与えることができる。なお、上記刺激として電磁波を採用する場合、電磁波を発する装置としては、例えばマグネトロン等を用いてもよい。上記刺激として超音波を採用する場合、超音波を発する装置としては、例えば超音波発振器等を用いてもよい。【０１３５】
蛍光検出部１０は、本発明に係る核酸増幅装置が備える光検出手段として機能するものである。蛍光検出部１０はケース３内に２個設けられている。蛍光検出部１０には、溝が形成されており、また、矢印Ａ方向に移動することができる。蛍光検出部１０が移動すると、キャピラリチューブ２０は当該溝を通る。そして、キャピラリチューブ２０が当該溝内にあるときに、蛍光検出部１０は、キャピラリチューブ２０内から発せられる光を検出する。検出した光によるＰＣＲの結果の解析方法については後に詳述する。【０１３６】
ファン１１ａ及び１１ｂは、ケース３内の気体を撹拌するためのものである。これにより熱源６によるケース３内の気体の加温効率が上昇して、ＰＣＲ装置１の起動時におけるウォームアップ時間を短くすることができる。また、ヒートブロック７の周囲の気体が、ヒートブロック７の温度の影響を受けることを抑制することができる。ファン１１ａ及び１１ｂとしては従来公知のファンを用いればよく特に限定されるものではない。【０１３７】
ファン１１ａはケース３内の底に設けられている。また、ファン１１ｂはケース３内の側壁に設けられている。ファン１１ａはファン駆動部１１ａ’によって回転する。つまり、ファン駆動部１１ａ’が回転することで、上述のシャフト５ｃを囲うように形成されている歯車が回転する。この歯車とファン１１ａとは連結しており、当該歯車の回転によりファン１１ａも回転する。同様に、ファン１１ｂも図示しないファン駆動部によって回転する。ファン１１ａ及び１１ｂによって、ケース３内の気体が撹拌される。【０１３８】
（本体２の動作）
図１及び３〜７を用いて、本体２の動作について説明する。なお、本実施の形態１では、伸長反応及びアニーリング反応を同一の温度で行なう、シャトルＰＣＲを行なう場合について説明するが、これに限定されるものではない。また、ＰＣＲの結果の確認を、融解曲線解析によって行なう場合について説明するが、これに限定されるものではない。【０１３９】
まず、図１を用いて加熱抽出装置８によって、生体試料から核酸抽出を行なう工程について説明する。【０１４０】
図１に示すように加熱抽出装置８に抽出用チューブ２３を搭載して、抽出用チューブ２３に生体試料を入れて、これを加熱することで核酸を抽出する。【０１４１】
抽出用チューブ２３には、ＰＣＲに供する生体試料を入れる。生体試料は、予め人手によって入れてもよく、別途分注アームを設けるか、分注アーム９を用いて運んでもよい。【０１４２】
抽出用チューブ２３は必要な数だけ予め搭載しておけばよい。抽出用チューブ２３を過熱する温度は、生体試料の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、ピロリ菌の検査であれば、感染している可能性のある組織を懸濁させた溶液を入れて、８５〜１００℃で２〜５分間加熱すれば核酸を抽出することができる。また、生体試料の種類によっては、他の処理装置及び／又は試薬を併用してもよい。例えば、増幅対象の核酸が結核菌由来のものである場合は、アルカリ処理を行なうための試薬及び容器を併用すればよく、ウィルス由来のものである場合は、カラム（ビーズ）法を行なうための機器を併用すればよい。【０１４３】
核酸の抽出が終わった後は、分注アーム９を用いて、後述する遠心機５上に搭載されたキャピラリチューブ２０に核酸を注入する。【０１４４】
次に、図３を用いて、本体２がキャピラリチューブ２０を搭載する様子について説明する。図３は本体２がキャピラリチューブ２０を搭載した様子を模式的に示す斜視図であり、図３の（ａ）はキャピラリチューブ２０を搭載した本体２の外観を示し、図３の（ｂ）は、説明の簡単のために、ケース３の底面以外の面及びシャッター４を取り除いた状態の本体２を示す。【０１４５】
図３の（ａ）に示すように、キャピラリチューブ２０を搭載するとき、シャッター４は開いた状態である。これは、後に行なう遠心に速やかに移行するためであるが、これに限定されるものではない。つまり、キャピラリチューブ２０の搭載をも分注アーム９等を用いて自動的に行なう場合等、バケット５ｂ上の貫通孔の位置を固定しておくことが好ましいときには、シャッター４を閉じて遠心機５を固定しておけばよい。また、シャッター４を閉じて遠心機５を固定すれば、キャピラリチューブ２０の位置が固定されるので、後述の、抽出した核酸の分注等をより正確に行なうことができる。【０１４６】
図３の（ｂ）に示すように、キャピラリチューブ２０を搭載するとき、ヒートブロック７及び蛍光検出部１０は、後に行なうキャピラリチューブ２０の遠心で、キャピラリチューブ２０に当たらない位置に配置されている。ヒートブロック７は矢印Ｂ１及びＢ２方向に移動することができ、蛍光検出部１０は矢印Ｂ１方向に移動することができる。矢印Ｂ１は、バケット５ｂ上に設けられた貫通孔の列によって形成される線分に平行な方向であり、矢印Ｂ２は鉛直方向を示している。【０１４７】
キャピラリチューブ２０を搭載した後は、上述した分注アーム９等を用いて、キャピラリチューブ２０の注入口に、抽出した核酸を注入する。また併せて核酸増幅反応に必要な試薬を注入する。当該試薬の注入は、分注アーム９を用いてもよく、別途人手で行なってもよい。【０１４８】
次に図４を用いて、キャピラリチューブ２０の注入口に注入された試料等を、キャピラリチューブ２０の反応液貯留部に充填する動作について説明する。図４は、遠心機５によって、キャピラリチューブ２０の反応液貯留に試料等を充填する様子を模式的に示す斜視図であり、図４の（ａ）は遠心機５による遠心が行なわれているときの本体２の外観を示し、図４の（ｂ）は、説明の簡単のために、ケース３の底面以外の面及びシャッター４を取り除いた状態における、遠心機５による遠心が行なわれているときの本体２を示す。【０１４９】
図４の（ａ）に示すように、シャフト５ｃが、直線Ｌ１を回転軸として矢印Ｃ方向に回転駆動する。これによりバケット支持板５ａ及びバケット５ｂは矢印Ｃ方向に回転する。【０１５０】
さらに、当該回転に伴って、２個のバケット５ｂはそれぞれ、直線Ｌ２及びＬ３を軸として回動する。直線Ｌ２及びＬ３は当該回転により描かれる円の接線に平行な直線である。換言すれば、２個のバケット５ｂは、従来公知のスイング式遠心機のように、それぞれスイングする。これにより、キャピラリチューブ２０の注入口は反応液貯留部より回転軸に近い位置で回転することになる。そして、当該注入口から当該反応液貯留部の向きに遠心力が生じて、当該注入口に注入されていた試料等は当該反応液貯留部に充填される。【０１５１】
本発明に係る核酸増幅装置が備える遠心機は、スイング式に限定されるものではなく、核酸増幅容器を遠心できるものであればよい。より具体的には、回転軸が、核酸増幅容器の反応液貯留部より注入口に近い位置となるものであればよい。好ましくは、回転により描かれる円の接線に平行な直線を軸に回動するものがよい。当該回動は遠心機５のように、回転に伴って自然にスイングによって実現してもよく、回動させる角度を手動で設定できるものであってもよい。回動させることにより、核酸増幅反応中等の遠心を行なわないときには核酸増幅容器を鉛直に搭載しておくことができる。核酸増幅容器が鉛直方向に搭載されていると、例えばキャピラリチューブ２０を用いる場合、注入口が上を向くので核酸増幅反応液の注入が容易となる。【０１５２】
また、直線Ｌ１はケース３の開口部の開口面と垂直に交わる直線である。このように筐体の開口部の開口面を通る直線を回転軸とするように遠心手段を設けることで、開口面に近い箇所で遠心を行なうことができる。つまり、筐体内の加温手段に近い位置で遠心するため、遠心後の核酸増幅反応に移行しやすい。ひいては核酸増幅装置の構造を簡易にすることができる。【０１５３】
この回転のとき、図４の（ｂ）に示すように、キャピラリチューブ２０がヒートブロック７等の部品に衝突することはない。これは上述のように、これらの部品が予めキャピラリチューブ２０に衝突しない位置に移動しているためである。【０１５４】
なお、反応液貯留部にＰＣＲ反応液を充填するために行なう遠心の回転数は特に限定されるものではないが、例えば１０００〜５０００ｒｐｍで行なえばよい。後述する実施例において、本発明者らは３０００ｒｐｍで行なっている。【０１５５】
遠心が終わると、回動していたバケット５ｂは元の位置に戻り、キャピラリチューブ２０は長さ方向が鉛直方向に並行になる位置で止まる。【０１５６】
次に図５を用いて、シャッター４でケース３の開口部を閉じる動作について説明する。図５は、シャッター４が閉じた状態の本体２を模式的に示す斜視図であり、図５の（ａ）はシャッター４が閉じた状態の本体２の外観を示し、図５の（ｂ）は、説明の簡単のために、ケース３の底面以外の面及びシャッター４を取り除いた状態における、シャッター４が閉じているときの本体２を示す。【０１５７】
図５の（ａ）に示すように、２枚のシャッター４は、それぞれ矢印Ａ１方向及びＡ２方向にスライドする。これより、ケース３に設けられた開口部は閉じられ、ケース３は密閉される。また、シャッター４が上記開口部を閉じたとき、バケット支持板５ａ及びバケット５ｂの下面とシャッター４の表面とが重畳する領域で、これらは密着する。これにより、遠心機５の位置は固定される。【０１５８】
図５の（ｂ）に示すように、シャッター４が閉じた状態では、キャピラリチューブ２０は長さ方向が鉛直方向になるように固定されている。また、バケット５ｂの材質はシリコンであるため、キャピラリチューブ２０はバケット５ｂに対する位置がずれにくく、バケット５ｂはシャッター４によって位置が固定されている。そのため、キャピラリチューブ２０の位置は固定される。【０１５９】
次に、図６を用いて、変性反応を行なっているときの本体２の動作について説明する。図６は、変性反応を行なっているときの本体２を模式的に示す斜視図であり、図６の（ａ）は変性反応を行なっているときの本体２の外観を示し、図６の（ｂ）は、説明の簡単のために、ケース３の底面以外の面及びシャッター４を取り除いた状態における、変性反応を行なっているときの本体２を示す。【０１６０】
図６の（ａ）に示すように、変性反応が行なわれているときの本体２の外観と、上述したシャッター４が閉じたときの本体２の外観とは同じである。つまり、キャピラリチューブ２０の位置は固定されているので、後述のようにヒートブロック７で、正確にキャピラリチューブ２０を加温することができる。【０１６１】
ヒートブロック７は、図６の（ｂ）に示す矢印Ｂ１方向及びＢ２方向の２本の移動軸で移動することができる。そして、変性反応が行なわれているときには、図６の（ｂ）に示すように、ヒートブロック７は、上述のＰＣＲ反応液の充填等を行なっていたときに位置していた場所から、矢印Ｂ１及びＢ２方向に移動して、ヒートブロック７に設けられた穴７ａでキャピラリチューブ２０の底を包含する。換言すれば、穴７ａでキャピラリチューブ２０の反応液貯留部が包含される。これにより、反応液貯留部は変性反応に必要な温度に加温される。【０１６２】
ＰＣＲを開始すると同時に、熱源６は熱を発し始める。これにより、ケース３内の気体を、後述する伸長反応及びアニーリング反応の反応温度に加温している。これにより、ケース３内のキャピラリチューブ２０の、穴７ａに包含されていない部位は、伸長反応及びアニーリング反応の反応温度に加温される。なお、ファン１１ａ及び１１ｂは、熱源６が熱を発し始めると同時に回転を始め、ケース３内の気体は撹拌される。【０１６３】
次に、図５を用いて、伸長反応及びアニーリング反応を行なっているときの本体２の動作について説明する。図５は上述のように、シャッター４を閉じたときの本体２の様子を示すものであるが、伸長反応及びアニーリング反応を行なっているときの、本体２内における各部品の位置は、図５に示す本体２と同様であるため、図５を援用して説明する。【０１６４】
伸長反応及びアニーリング反応時には、キャピラリチューブ２０は、ヒートブロック７に包含されていない。そして、熱源６が、ケース３内の気体を伸長反応及びアニーリング反応の反応温度に加温するための熱を発し続け、ファン１１ａ及び１１ｂは回転してケース３内の気体を撹拌している。これによりキャピラリチューブ２０は周囲の気体によって、伸長反応及びアニーリング反応の反応温度に加温される。【０１６５】
伸長反応及びアニーリング反応が終わった後は、上述の変性反応を再度行ない、これを使用者が予め設定したサイクル数繰り返すことでＰＣＲは完了する。【０１６６】
以上に説明したように、ＰＣＲ装置１では、熱源６及びヒートブロック７によって、キャピラリチューブ２０を連続的に伸長反応及びアニーリング反応に必要な温度に加温しながら、反応液貯留部を間欠的に、変性反応に必要な温度に加温することができる。これにより、キャピラリチューブ２０全体を、それぞれの反応温度に加温する工程を繰り返すことに比べて、極めて短時間でＰＣＲ反応液の温度調整を行なうことができる。【０１６７】
ここで、本実施の形態のように、核酸増幅容器の少なくとも一部を常に伸長反応及びアニーリング反応に必要な温度に連続して加温しながら、反応液貯留部を、間欠的に変性反応に必要な温度に加温することで、温度調整時間が短縮できる理由について説明する。説明の便宜のため、伸長反応及びアニーリング反応を６５℃で行ない、変性反応を９５℃で行なう場合について説明する。【０１６８】
従来、核酸増幅容器を９５℃に加温して、次に６５℃に加温するという作業を、単に繰り返すという方法が広く行なわれてきた。しかし、この方法では、核酸増幅反応液を９５℃に加温したとき、反応液貯留部のみならず、その周囲に９５℃に加温される領域が存在する。そして、核酸増幅反応液を６５℃に冷却する場合、反応液貯留部の周囲の９５℃に加温された領域の影響によって、核酸増幅反応液が６５℃に冷却されるまでに時間を要する。【０１６９】
一方、ＰＣＲ装置１のように、核酸増幅容器を連続的に６５℃に加温して、反応液貯留部のみを間欠的に９５℃に加温する場合では、当該部位を９５℃に加温しても、他の部位は６５℃に加温されている。そのため、当該部位周囲の９５℃に加温される領域は少なくなる。つまり、反応液貯留部及びその近傍の狭い領域のみが９５℃に加温されて、他の領域は６５℃に加温された状態が維持される。そのため、反応液貯留部を６５℃に冷却するとき、その周囲の９５℃に加温された領域の影響を少なくすることができ、短時間で反応液貯留部を６５℃にすることができる。【０１７０】
このように、核酸増幅容器を連続して６５℃に加温しながら、反応液貯留部を、間欠的に９５℃に加温することで、単に核酸増幅容器全体を９５℃に加温する工程及び６５℃に加温する工程を繰り返すだけに比べて温度調整時間が短縮できる。【０１７１】
また、反応液貯留部を６５℃に加温した後、さらに９５℃に加温する場合、ＰＣＲ装置１のように、予め９５℃に調整されたヒートブロック７で間欠的に包含することで、反応液貯留部を迅速に９５℃に加温することができる。つまり、予め９５℃に調整されたヒートブロック７で、反応液貯留部を直接加温することで、反応液貯留部を局所的に加温して、ＰＣＲ反応液を迅速に９５℃にすることができる。【０１７２】
本発明者らは、迅速かつ効率的にＰＣＲ反応を行なうための装置を提供すべく、検討を行なったところ、ＰＣＲによる核酸増幅効率には、各反応間における温度変化も増幅効率に影響を及ぼすことを見出した。より詳細には、伸長反応及びアニーリング反応の後、変性反応を行なうまでの温度変化は急激な変化でもよく、変性反応後、伸長反応及びアニーリング反応を行なうまでの温度変化は、前者の温度変化に比べて緩やかに行なうほうが好ましいことを見出した。本発明では、変性手段で間欠的に変性反応のための刺激を付加することで急激に変性反応を生じさせて、次に、変性手段による当該刺激の付加を解除することで、急激な変性反応の発生に比べて比較的緩やかに、加温手段による温度調整を行なうことで、伸長反応及びアニーリング反応を行なっている。つまり、連続的に伸長反応及びアニーリング反応のための加温をして、間欠的に変性反応の刺激を与えるという構成を有する核酸増幅装置は、この新たな知見により得た好ましい条件を実現するために、本発明者らが鋭意検討した結果想到した全く新しい核酸増幅装置である。【０１７３】
また、ＰＣＲ装置１では、ケース３内の気体及びヒートブロック７という二つの熱媒を用いている。二つの熱媒を交互に用いることで、上述の連続的なアニーリング反応及び伸長反応の反応温度への加温及び間欠的な変性反応を行なうという条件を実現することができる。さらに、熱媒自体の温度調整に要する時間を短縮することができるため、ＰＣＲ反応に要する時間をさらに短縮することができるという効果も得ることができる。従来当業者は、わざわざ熱媒を二つ用いるということには想到しなかった。これは、一般に古くから用いられているヒートブロックのみのＰＣＲ装置及び気体のみを熱媒とする特許文献１及び２の装置のように、熱媒は一種類で充分と考えられていたためであるといえる。しかし、本発明者らは、あえて熱媒を二種類用いることで、上記条件を実現することができることにも想到した。この熱媒を二種類用いるという構成も、当業者といえども容易に想到し得ない構成である。【０１７４】
次に図７を用いて、蛍光検出部１０によってＰＣＲの結果を確認する動作について説明する。図７は、蛍光検出部１０によってＰＣＲの結果を確認している状態の本体２を模式的に示す斜視図であり、図７の（ａ）は蛍光検出部１０によってＰＣＲの結果を確認している状態の本体２の外観を示し、図７の（ｂ）は、説明の簡単のために、ケース３の底面以外の面及びシャッター４を取り除いた状態における、蛍光検出部１０によってＰＣＲの結果を確認している状態の本体２を示す。【０１７５】
図７の（ａ）に示すように、ＰＣＲの結果を確認しているときの本体２の概観と、上述したシャッター４が閉じたときの本体２の概観との変化は無い。つまり、キャピラリチューブ２０の位置は固定されているので、後述のように蛍光検出部１０で、正確にキャピラリチューブ２０内の蛍光を検出してＰＣＲの結果の確認を行なうことができる。【０１７６】
図７の（ｂ）に示すように、蛍光検出部１０でキャピラリチューブ２０内の蛍光を検出する前に、ヒートブロック７は矢印Ｂ１方向であって、蛍光検出部１０とは逆の方向に移動する。これにより蛍光検出部１０は、蛍光検出部１０に設けられた溝の中に、キャピラリチューブ２０内の反応液溜部が入るように、矢印Ｂ１方向に移動することができる。そして、個々のキャピラリチューブ２０内の反応液溜部から発せられる蛍光を順次検出する。【０１７７】
また、上述のように本実施の形態１では、融解曲線解析によりＰＣＲの結果を確認するものである。融解曲線解析では、ＰＣＲ後にキャピラリチューブ２０の温度を、所定の温度から徐々に上げることが必要となる。ＰＣＲ装置１では、この温度の上昇を、熱源６によって行なう。例えば、ＰＣＲの終了後、蛍光検出部１０が個々のキャピラリチューブ２０からの光検出を行なうごとに、熱源６はケース３内の気体の温度を、所定の温度から徐々に高い温度に上昇させる。または、熱源６によって、ケース３内の気体の温度を、所定の温度から徐々に高い温度に上昇させながら、蛍光検出部１０を、矢印Ｂ１方向に繰り返し往復運動させて光検出を行なっても、すべてのキャピラリチューブ２０について同時に融解曲線解析を行なうこともできる。【０１７８】
このように、本実施の形態では、熱源６により融解曲線解析のための温度調整を行なったが、これに限定されるものではない。つまり、本発明に係る核酸増幅装置では変性手段を用いても融解曲線解析を行なうことができる。例えば、ヒートブロック７によって融解曲線解析のための温度調整を行なってもよい。このとき、ヒートブロック７に、キャピラリチューブ２０内のＰＣＲ反応液から発せられる蛍光を透過するための窓部を設けて、当該窓部を介して蛍光検出部１０によって当該蛍光を検出すればよい。当該窓部の構成は特に限定されるものではなく、透明性の高い材質で設けてもよく、貫通孔を設けるだけでもよい。【０１７９】
また、本発明に係る核酸増幅装置では融解曲線解析を応用したＰＣＲの結果の確認を行なうことも可能である。例えば、変性手段が超音波及び電磁波等を発するものである場合、出力を徐々に上げて、出力と二本鎖ＤＮＡの解離との関係を検出することで、ＰＣＲの結果を確認することができる。【０１８０】
ここで、図８を用いて、融解曲線解析の原理について説明する。図８は融解曲線解析の原理を模式的に示す図であり、図８の（ａ）はＩＦＰ法による融解曲線解析の原理を示し、図８の（ｂ）はＱ−Ｐｒｏｂｅ法による融解曲線解析の原理を示し、図８の（ｃ）は融解曲線解析でＰＣＲの結果を確認した結果の一例を示す。【０１８１】
図８の（ａ）に示すようにＩＦＰ法では、特許文献５に記載のように、二本鎖ＤＮＡに結合する化合物と、当該化合物が当該二本鎖ＤＮＡに結合したときに、発する蛍光が変化する反応分子で標識したプライマーとを用いる。つまり、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離した状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよく、解離していない状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよい。【０１８２】
図８の（ｂ）に示すようにＱ−Ｐｒｏｂｅ法では、特許文献６に記載のように、３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプライマーを用いてＰＣＲを行なう。ＰＣＲ後に温度を徐々に上昇させて、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離すると、消光していた蛍光色素が再度発光する。この蛍光を検出すれば、ＰＣＲの確認を行なうことができる。【０１８３】
図８の（ｃ）に示すように融解曲線解析の結果は、温度及び蛍光強度の変化量によってアウトプットすればよい。図８の（ｃ）は縦軸を蛍光強度の変化量としている。これは、上述のＩＦＰ法では、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離した状態で、上記反応分子が発する蛍光を検出した場合を示す。また、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法での蛍光色素の発光を検出した場合でもある。ＩＦＰ法で、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出する場合は、解離した状態で発する蛍光を検出した場合と比べて、蛍光強度の変化量の正負が反対になる。つまり、得られる表の形は、図８の（ｃ）に示す表の各線の形を、温度軸を対象に反転させた形となる。換言すれば、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出して、縦軸を、蛍光強度の変化量のマイナスとすれば、図８の（ｃ）に示す表の各線の形と同じになる。【０１８４】
また、図８の（ｃ）では３通りの試料に対してＰＣＲを行なった結果を示している。つまり、形成される二本鎖ＤＮＡの配列によって解離する温度が異なるため、各線のピークを示す温度が異なることが試料中に含まれたＤＮＡの塩基配列が異なっていたことを示している。実線及び破線の結果を示した試料には、それぞれ異なる塩基配列を有する標的核酸が、１種類ずつ含まれていたことを示す。一点鎖線の結果を示した試料には、実線及び破線の結果を示した試料に含まれていた標的核酸が共に含まれていたことを示す。【０１８５】
このように融解曲線解析を行なうことでＰＣＲによる増幅及び試料中に含まれていた標的核酸の塩基配列の種類等を判別することができる。そして、上述のいずれの解析もＰＣＲ装置１を用いれば、熱源６による温度調整及び蛍光検出部１０による蛍光の検出によって好適に行なうことができる。使用者がＰＣＲ装置１を用いて融解曲線解析を行なう場合は、蛍光検出部１０により得られた蛍光に基づいて融解曲線解析を行なうためのソフトウェアをインストールしたコンピューター等の解析手段を用いればよい。【０１８６】
以上にＰＣＲ装置１の動作について説明した。各動作における遠心機５の駆動、ヒートブロック７及び蛍光検出部１０の移動は、従来公知のコンピューター等の制御手段をＰＣＲ装置１に内蔵させる等して制御すればよい。ＰＣＲ装置１では、遠心機５によってキャピラリチューブ２０の位置が固定されるため、キャピラリチューブ２０の位置ズレを補正する必要性が少なく、特にヒートブロック７及び蛍光検出部１０の移動の制御を簡易に行なうことができる。【０１８７】
〔実施の形態２〕
本発明の実施の他の形態について図９に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、説明の便宜上、実施の形態１にかかる構成要素と同様の機能を有する構成要素には同一の番号を付し、その説明を省略する。本実施の形態では、主に、上記実施の形態１との相違点について説明するものとする。図９は、本実施の形態に係るＰＣＲ装置の本体３０の構造を模式的に示す斜視図であり、図９の（ａ）は本体３０の外観を示し、図９の（ｂ）は、説明の簡単のために、ケース３の底面以外の面及びシャッター４を取り除いた状態における、本体３０を示す。【０１８８】
本体３０と、上述した本体２との相違は、ヒートブロック７を備えていない点である。つまり、本体３０では、ＰＣＲ反応液に対する、変性反応、伸長反応及びアニーリング反応のそれぞれの反応温度への温度調整を熱源６のみで行なう。【０１８９】
具体的には、まず図９の（ａ）に示すようにバケット５ｂ上にキャピラリチューブ２０を搭載する。次に、上記実施の形態１と同様に、キャピラリチューブ２０に試料等を注入した後、遠心駆動部５ｄによってシャフト５ｃを回転させることで、キャピラリチューブ２０の遠心を行なって、反応液貯留部に試料等を充填する。次に、シャッター４を閉じて遠心機５を固定する。【０１９０】
次に、熱源６によるケース３内の気体の加温を開始することで、ＰＣＲを開始する。図９の（ｂ）に示すファン１１ａ及び１１ｂも、熱源６による加温の開始と同時に回転を始めて、ケース３内の気体を撹拌する。熱源６が、ケース３内の気体を、変性反応、アニーリング反応、伸長反応のそれぞれの反応温度に繰り返して加温することで、キャピラリチューブ２０内の試料は、それぞれの反応温度に繰り返し調整されてＰＣＲが進行する。【０１９１】
ＰＣＲの終了後は、上記実施の形態１と同様に、蛍光検出部１０によって、キャピラリチューブ２０内から発せられる蛍光を検出することで、ＰＣＲの結果を確認することができる。
【実施例】
【０１９２】
〔実施例：ＣｙｔｏＣｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の検出〕
（ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出するプライマーの合成）
まず、正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを合成した。正鎖プライマーの塩基配列を配列番号１に、逆鎖プライマーの塩基配列を配列番号２に示す。【０１９３】
正鎖プライマー及び逆鎖プライマーは、ＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製；３９２型）を用いて、添付のマニュアルに従い、ホスホアミダイト法により合成した。合成した正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを、アンモニア水に溶解して、５５℃の環境下で、一晩静置することによって、脱保護した。その後、ＯＰＣカラム（パーキンエルマー社製）にて精製した。なお、プライマーの合成は、ＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼してもよい。【０１９４】
（ＰＣＲによるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の解析）
ＰＣＲに供するサンプルとして、ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法によって得たＤＮＡ溶液（以下、「サンプル」と表記する）を用いた。【０１９５】
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、全量を２５μｌとして、正鎖プライマー ２０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー ２０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液 ２．５μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ２μｌ、５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．５μｌ及びサンプルを、溶解しているＤＮＡが１００ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇとなるように混合し、残部は水とした。【０１９６】
ＰＣＲには上記実施の形態１で説明したＰＣＲ装置１を用いた。また、核酸増幅反応容器としてキャピラリ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。【０１９７】
熱源６はケース３内の気体を６５℃に加温するように設定して、ヒートブロック７は１００℃に調整した。【０１９８】
まず、キャピラリの注入口に、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌを注入した。次に、３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液をキャピラリの底に移動させた。【０１９９】
ＰＣＲの条件は、ヒートブロック７をキャピラリに５秒間接触させて、次にヒートブロック７をキャピラリから離して１０秒間維持する動作を３５サイクル行なった。【０２００】
また、比較のため、従来品であるチューブ型ＰＣＲ装置（ＡＢＩ社製、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００型）を用いてＰＣＲを行なった。当該ＰＣＲには調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌを供した。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒を３５サイクル行なった。【０２０１】
（アガロースゲル電気泳動による核酸増幅の確認）
ＰＣＲ反応後、それぞれのＰＣＲ装置からＰＣＲ反応液５μｌを回収した。次に、回収したＰＣＲ反応液を、３％アガロースゲルによる電気泳動に供した。電気泳動では、１００Ｖの電圧を印加して、６０分間行なった。その結果を図１０に示す。図１０は本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、レーン１〜４はＰＣＲ装置１を用いたＰＣＲの結果を示し、レーン５〜８はチューブ型ＰＣＲ装置によるＰＣＲの結果を示す。また、レーン１及び５は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１００ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン２及び６は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１０ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン３及び７は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。また、レーン４及び８は比較のためサンプルの代わりに水を混合したＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。【０２０２】
図１０に示すように、ＰＣＲ装置１は従来品のチューブ型ＰＣＲ装置より、高感度にＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出することができた。これは、本発明の一実施形態であるＰＣＲ装置１を用いれば約１０分間という短時間で、従来品による７５分間を要するＰＣＲ以上の感度でＰＣＲを行なうことができたことを示している。【０２０３】
本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。【０２０４】
本発明に係る核酸増幅装置は、以上のように、核酸増幅容器を加温するための加温手段と、開口部が設けられた筐体と上記開口部を開閉するための開閉手段と核酸増幅容器を搭載して遠心する遠心手段とを備え、上記加温手段は上記筐体内に配置されており、上記遠心手段は、上記開口部の開口面を通る直線を回転軸として、上記核酸増幅容器を回転させるものであり、上記開閉手段は、上記開口部を閉じたとき、上記遠心手段の位置を固定するものである。よって、核酸増幅反応液の充填から核酸増幅反応までの作業の自動化に適した構造で、かつ簡易な構造の核酸増幅装置を提供することができるという効果を奏する。【０２０５】
また、本発明に係る核酸増幅装置は、以上のように、核酸増幅容器を加温するための加温手段及び当該核酸増幅容器に対して二本鎖核酸を解離させる刺激を与えるための変性手段を備え、上記加温手段は、上記核酸増幅容器を連続して加温するものであり、上記変性手段は、上記加温手段による加温が行なわれている状態で、さらに、間欠的に上記刺激を与えるものである。よって、温度調整の効率を向上して核酸増幅反応に要する時間を短縮した核酸増幅反応装置を提供することができるという効果を奏する。【０２０６】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明に係る核酸増幅装置及び核酸増幅容器は、極めて迅速かつ簡便に核酸増幅反応を行なうことができる。遺伝子解析等の遺伝子をモニタリングすることにより行われるバイオアッセイなど、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いるあらゆる産業で利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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