(57)【要約】  ヒトフィブリノペプチドＡの分解産物あるいはヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖の分解産物をマーカーペプチドとして利用することによりアルコール性肝障害を的確にかつ迅速に診断することができる。
2008105215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１から４のアミノ酸配列を有するヒトフィブリノーゲン由来分解産物であるペプチドから選ばれるアルコール性肝障害診断用マーカーペプチド。
【請求項２】
アルコール性肝障害が疑われる患者から得た検体中の、請求項１記載の１種またはそれ以上のアルコール性肝障害マーカーペプチドの存否を検出しあるいはその量を測定して、アルコール性肝障害発症可能性、アルコール性肝障害あるいはアルコール性肝障害の予後を診断する方法。
【請求項３】
検体中のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否の検出あるいはその量の測定を質量分析法により行なう請求項２の診断方法。
【請求項４】
質量分析計で得られるスペクトルのパターン分析により診断する請求項３の診断方法。
【請求項５】
質量分析をレーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により行う請求項４の診断方法。
【請求項６】
検体中のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否の検出あるいはその量の測定を、該ペプチドに対する抗体を用いた免疫測定法により行う請求項２の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール性肝障害診断用マーカーペプチドおよびそれを利用したアルコール性肝障害診断方法に関する。更に詳細には、本発明は、質量分析を利用した血清試料のプロテオーム解析の結果、習慣飲酒に伴って増減し従ってアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドとして利用できることが見出された複数の血清ペプチドおよびそれらのペプチドの存否の検出あるいは定量により問題飲酒者等のアルコール性肝障害発症可能性、アルコール性肝障害、アルコール性肝障害の予後等を診断する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルコールによる臓器障害の診断の第一歩は正確な飲酒歴の把握であるが、アルコール依存は否認の病気といわれ、常習飲酒家が、その飲酒量を正確に申告しないのは古今東西変わりがない。従って、その裏づけとなる客観的なマーカーが必要である。習慣飲酒のマーカーとして最も広く測定されているのはγ―ＧＴＰ（ＧＧＴ）であるが、飲酒家がＧＧＴ高値を示す場合でも、その値は肝障害の重症度や積算飲酒量とは必ずしも相関せず、またアルコール飲用後のＧＧＴの変化には個体差があり、大量飲酒後にも増加しないいわゆるノンリスポンダーが相当数存在する。【０００３】
一方、飲酒習慣がない場合でも肥満に伴う脂肪肝、ある種の薬剤の常用者など飲酒以外の要因でＧＧＴが上昇する場合も多く、人間ドック等などにおいてＧＧＴ高値、即ち飲酒家といった短絡的指導が行われる場合も少なくない。従って、ＧＧＴに相補的な検査として糖鎖欠損トンランスフェリン（ＣＤＴ）が北欧の研究者達により開発され、欧米の文献（非特許文献１）ではその有用性が強調されているが、日本人を対象とした成績では飲酒マーカーとしてのＣＤＴはＧＧＴのノンレスポンダーの１０％程度を拾いあげるにとどまっている。【０００４】
エタノールの第一代謝産物であるアセトアルデヒドは反応性に富み、種々の蛋白との間で各種のアセトアルデヒド付加体を形成する。例えばアセトアルデヒド−ヘモグロビン付加体をＥＬＩＳＡ法などにより検出する試みがなされている（非特許文献２）。糖尿病におけるＨｂＡ１ｃのように飲酒量を過去にさかのぼって推測しうる興味深いマーカーと期待されるものもあるが、感度に難があり実用化していない。【０００５】
習慣飲酒は慢性肝障害の２大要因のひとつである。わが国の肝硬変症例において、純粋にアルコールのみに起因する症例の割合は１０〜１５％に過ぎないとされている。しかし、これは主として大学病院などを対象にして得られたデータであり、２００万人を超えると予想されるアルコール依存症の存在を考えると、医療機関を受診する機会がないアルコール性肝障害患者が多数潜在していると予想される。また、習慣飲酒は脳出血、高血圧、痛風などの増悪因子でもあり、問題飲酒者を早期にかつ的確にスクリーニングすることは極めて重要である。しかし、上記のように、現在存在するいわゆる飲酒マーカーにおいて感度・特異度において決定的なものはなく、新たなマーカーを検索することが求められている。
網羅的発現タンパク解析の手法として一般的なのは二次元タンパク電気泳動であるが、低分子量蛋白またはペプチドの検出に難がある。近年、ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）やｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  （ＳＥＬＤＩ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーが開発され、新規腫瘍マーカーの検出など臨床応用が始まっている（非特許文献３）。従ってこれらのプロテオミクス技術などを活用して網羅的に新たなマーカーを検索することが求められている。
【非特許文献１】Ａｎｔｏｎ  ＲＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｃｏｌｉｓｍ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｅｓ．，２００２；２６：１２１５−１２２２
【非特許文献２】Ｎｉｏｍｏｌａ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１９９１；８７：１３６７−１３７４１
【非特許文献３】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ＥＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００２；３５９：５７２−５７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、問題飲酒者などのアルコール性肝障害を早期にしかも的確にスクリーニングしうる新規マーカーを見出し、その測定系を確立し、医療に役立てることを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題に関して鋭意検討した結果、本発明を完成した。即ち、本発明者らはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを応用し、アルコール性肝障害で入院した患者において経時的に採取された血清検体を用い、習慣飲酒に伴って増減する新規の血清蛋白を同定することに成功した。そしてこれらの血清蛋白はアルコール性肝障害診断マーカーペプチドとして利用できることを見出し本発明を完成させた。【０００８】
従って、本発明は、配列表の配列番号１から４のアミノ酸配列を有するヒトフィブリノーゲン由来分解産物であるペプチドから選ばれるアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドに関する。
更に、本発明は、アルコール性肝障害が疑われる患者から得た検体中の、上記の１種またはそれ以上のアルコール性肝障害マーカーペプチドの存否を検出しあるいはその量を測定して、アルコール性肝障害発症可能性、アルコール性肝障害あるいはアルコール性肝障害の予後を診断する方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のマーカーペプチドの存否を検出しあるいはその量を測定することにより、例えば、習慣飲酒者や問題飲酒者がアルコール性肝障害を発症する可能性を診断することもでき、飲酒が要因のアルコール性肝障害、例えば、肝炎、肝硬変などを診断することもでき、また通常のアルコール性肝障害を診断することもできる。更には、アルコール性肝障害の治療経過などを診断することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明によりアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドとして利用できることが見出されたペプチドは、配列表の配列番号１から４のアミノ酸配列を有するヒトフィブリノーゲン由来分解産物であるペプチドから選ばれる。【００１１】
次にそれぞれのペプチドを説明する。
配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（以下１．４ｋＤａペプチドと記載することもある）は、理論分子量が１４６５．４である。１．４ｋＤａペプチドは、１５個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、ヒトフィブリノペプチドＡ分解産物である。サンプル中の１．４ｋＤａペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは高くなり、そうでないときは、その濃度が低くなるかほとんど検出できない。
配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（以下１．５ｋＤａペプチドと記載することもある）は、その理論分子量は１５４５．６である。１．５ｋＤａペプチドは、セリンがリン酸化されている１５個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、ヒトフィブリノペプチドＡ分解産物である。サンプル中の１．５ｋＤａペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは高くなりやすく、そうでないときは、その濃度が低くなるかほとんど検出できない。
配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド（以下１．６ｋＤａペプチドと記載することもある）は、その理論分子量は１６１６．６である。１．６ｋＤａペプチドは、セリンがリン酸化されている１６個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、ヒトフィブリノペプチドＡ分解産物である。サンプル中の１．６ｋＤａペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは高くなりやすく、そうでないときは、その濃度が低くなるかほとんど検出できない。
配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド（以下２．６ｋＤａペプチドと記載することもある）は、その理論分子量は２６５９．６である。２．６ｋＤａペプチドは、２５個のアミノ酸が結合したポリペプチドであり、フィブリノーゲンα−Ｅ鎖（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  ｃｈａｉｎ）分解産物である。サンプル中の２．６ｋＤａペプチドの濃度は、アルコール性肝障害があるときは低くなりやすいか検出しにくく、そうでないときは、濃度が高くなりやすい。【００１２】
以上に説明した本発明により見出されたアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドに基づいてアルコール性肝障害の診断が可能になる。即ち、アルコール性肝障害が疑われる患者から得た検体中の、上記アルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否を検出しあるいはその量を測定して、アルコール性肝障害発症可能性、アルコール性肝障害あるいはアルコール性肝障害の予後を診断することができる。
本発明で用いることのできる検体としては、アルコール性肝障害が疑われる患者から採取した血清、血漿、血液、尿などが挙げられる。
本発明のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否の検出あるいはその量の測定は、現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、質量分析法、免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などが挙げられる。【００１３】
質量分析法としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により行う方法、ＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）による質量分析法が挙げられる。レーザーイオン化飛行時間型質量分析計としては、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）などを例示できる。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法は、ＭＡＬＤＩと飛行型質量分析計を組み合わせたプロテオーム解析法であり、例えば、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のクリント・プロットシステムＴＭ・マス・スペクトロメーターを使用することができる。この場合、例えば、磁気ビーズ、好ましくは陽イオン磁気ビーズにサンプルを加え、本発明のマーカーを吸着させ、次いで、それを溶出し、溶出液にマトリックス溶液を加えアンカーチップにアプライしてシステムに適用することにより、マーカー濃度の存否、高い低いを読み取ることができる。
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法は、ＳＥＬＤＩと飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーであり、例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  社により開発されたプロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ，Ｉｎｃ）を使用することができる。その詳細はＷＯ  ０１／２５７９１  Ａ２号公報、特開２００１−２８１２２２号公報等に詳しい。この場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。
これらの方法に用いられるプロテインチップとしては、本発明のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドを吸着できるチップであれば特に限定しない。例えば、疎水性やイオン交換などのペプチドに親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、目的のペプチドに対する抗体を固定化したチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。【００１４】
ＥＳＩ法の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体クロマトグラフィー等の分離手段と直結した質量分析計に付するのが好ましいことが多い。
免疫測定法としては、本発明のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作成し、従来知られているペプチドを測定する免疫測定法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
これらの方法以外にも、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などが挙げられる。これらの方法も既に当業者に周知であり、それらの周知の方法をそのまま採用することができる。【００１５】
以上に説明した方法により、アルコール性肝障害が疑われる患者から得た検体中のアルコール性肝障害診断用マーカーペプチドの存否を検出しあるいはその量を測定することにより、アルコール性肝障害発症可能性、アルコール性肝障害あるいはアルコール性肝障害の予後等のアルコール性肝障害に関連する状況（以下、アルコール性肝障害等と記載することもある）を診断することができる。本発明のマーカーは、配列表の配列番号１から４のアミノ酸配列を有するペプチドのいずれかの存否を検出しあるいはその量を測定することによりアルコール性肝障害等の診断をすることも有効であるが、さらに、本発明のマーカーを組み合わせて診断してもよい。また、本発明のマーカーに加えて、従来知られているγ‐ＧＴＰ等の他の診断薬と併せて、アルコール性肝障害等を診断してもよい。
本発明の診断方法は、上記した質量分析により行う場合には、質量分析計によって得られるスペクトルのパターン分析によって診断することもできる。本発明の診断方法は、例えば、習慣飲酒者や問題飲酒者がアルコール性肝障害を発症する可能性を診断することもでき、飲酒が要因のアルコール性肝障害、例えば、肝炎、肝硬変などを診断することもでき、また通常のアルコール性肝障害を診断することもできる。更には、アルコール性肝障害の治療経過などを診断することもできる。本発明の診断方法は、特にアルコール性肝障害の診断に適している。【００１６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
ＷＣＸ  ＣｌｉｎＰｒｏｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓを用いる肝臓疾患
診断用マーカー蛋白質の同定
インフォームド・コンセントを行った患者血清を使用して、ＷＣＸ  ＣｌｉｎＰｒｏｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を用いて血清中の新規肝障害マーカーを探索した。ＷＣＸ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ＢｅａｄｓとはＷｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓのことであり、検体中の正電荷物質を結合させるという特徴を持っている。検体としてアルコール性肝障害患者入院直後及び禁酒３ヶ月後の血清を用いた。【００１８】
（１）方法
以下にＷＣＸ  ＣｌｉｎＰｒｏｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ実験操作法を簡単に述べる。チューブに１０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）、１０μｌのビーズ溶液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）と５μｌの血清を加え、５分間インキュベーションした。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）に置き、１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒからチューブを外し、１００μｌの洗浄液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒにチューブを立て、前後に１０回チューブを移動させた。１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を３回繰り返した。１０μｌの溶出液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒに立て、２分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。１０μｌのＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を溶出液に加えた。Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは０．３ｇ／Ｌα−シアノ−４−ヒドロキシシンナミノ酸（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）をエタノール（Ｗａｋｏ）／アセトン（Ｗａｋｏ）（２：１）で溶かした溶液を用いた。１０μｌの溶出液に２０μｌのＭａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１μｌをＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）にアプライした。作製したＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐはＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。【００１９】
（２）結果
図１に代表的なアルコール性肝障害患者血清の入院直後及び禁酒３ヶ月後のデータを示す。Ａｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐから脱離したサンプルの蛋白質の分子量を横軸に、その分子量で検出器に到達した分析物の量を反映するピークを縦軸で表すことができる。よって図１から明らかなように、アルコール性肝障害患者の入院時のデータでは、分子量１．４ｋＤａ蛋白質、１．５ｋＤａ蛋白質及び１．６ｋＤａ蛋白質のピークが観察されたが、入院後はほとんど観察されないことが判明した。一方、アルコール性肝障害患者の禁酒３ヶ月後のデータでは、分子量２．６ｋＤａ蛋白質のピークが観察されたが、入院直後はほとんど観察されないことが判明した。従って、この１．４ｋＤａペプチド、１．５ｋＤａペプチド、１．６ｋＤａペプチド及び２．６ｋＤａペプチドを指標として、アルコール性肝障害を診断できることが判った。
【実施例２】
【００２０】
マーカーペプチドの同定【００２１】
（１）１．４ｋＤａペプチドの同定
ＷＣＸ  ＣｌｉｎＰｒｏｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ実験によって見出された１．４ｋＤａペプチドについて、チューブに１０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）、１０μｌのビーズ溶液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）と５μｌの血清を加え、５分間インキュベーションした。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）に置き、１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒからチューブを外し、１００μｌの洗浄液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒにチューブを立て、前後に１０回チューブを移動させた。１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を３回繰り返した。１０μｌの溶出液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒに立て、２分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。１０μｌのＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を溶出液に加えた。Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは０．３ｇ／Ｌα−シアノ−４−ヒドロキシシンナミノ酸（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）をｅｔｈａｎｏｌ（Ｗａｋｏ）／ａｃｅｔｏｎｅ（Ｗａｋｏ）（２：１）で溶かした溶液を用いた。１０μｌの溶出液に２０μｌのＭａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１μｌをＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）にアプライした。作製したＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐはＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。そのデータを取得後、ＭａｓｃｏｔＴＭ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）検索を行った結果、ヒトフィブリノペプチドＡの分解産物であることがわかった。１．４ｋＤａぺプチドのＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図２に示す。また、１．４ｋＤａぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。【００２２】
（２）１．５ｋＤａペプチドの同定
ＷＣＸ  ＣｌｉｎＰｒｏｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ実験によって見出された１．５ｋＤａペプチドについて、チューブに１０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）、１０μｌのビーズ溶液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）と５μｌの血清を加え、５分間インキュベーションした。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）に置き、１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒからチューブを外し、１００μｌの洗浄液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒにチューブを立て、前後に１０回チューブを移動させた。１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を３回繰り返した。１０μｌの溶出液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒに立て、２分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。１０μｌのＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を溶出液に加えた。Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは０．３ｇ／Ｌα−シアノ−４−ヒドロキシシンナミノ酸（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）をエタノール（Ｗａｋｏ）／アセトン（Ｗａｋｏ）（２：１）で溶かした溶液を用いた。１０μｌの溶出液に２０μｌのＭａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１μｌをＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）にアプライした。作製したＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐはＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。そのデータを取得後、ＭａｓｃｏｔＴＭ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）検索を行った結果、ヒトフィブリノペプチドＡの分解産物であることがわかった。１．５ｋＤａペプチドのＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図３に示す。また、１．５ｋＤａぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示した。【００２３】
（３）１．６ｋＤａペプチドの同定
ＷＣＸ  ＣｌｉｎＰｒｏｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ実験によって見出された１．６ｋＤａペプチドについて、チューブに１０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）、１０μｌのビーズ溶液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）と５μｌの血清を加え、５分間インキュベーションした。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）に置き、１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒからチューブを外し、１００μｌの洗浄液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒにチューブを立て、前後に１０回チューブを移動させた。１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を３回繰り返した。１０μｌの溶出液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒに立て、２分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。１０μｌのＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を溶出液に加えた。Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは０．３ｇ／Ｌα−シアノ−４−ヒドロキシシンナミノ酸（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）をエタノール（Ｗａｋｏ）／アセトン（Ｗａｋｏ）（２：１）で溶かした溶液を用いた。１０μｌの溶出液に２０μｌのＭａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１μｌをＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）にアプライした。作製したＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐはＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。そのデータを取得後、ＭａｓｃｏｔＴＭ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）検索を行った結果、ヒトフィブリノペプチドＡの分解産物であることがわかった。１．６ｋＤａペプチドのＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図４に示す。また、１．６ｋＤａぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示した。【００２４】
（４）２．６ｋＤａペプチドの同定
ＷＣＸ  ＣｌｉｎＰｒｏｔ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ実験によって見出された２．６ｋＤａペプチドについて、チューブに１０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）、１０μｌのビーズ溶液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）と５μｌの血清を加え、５分間インキュベーションした。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）に置き、１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。続いてＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒからチューブを外し、１００μｌの洗浄液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒにチューブを立て、前後に１０回チューブを移動させた。１分間ビーズを片側に集め、上清をピペットで除去した。この操作を３回繰り返した。１０μｌの溶出液（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を加え、ビーズを懸濁させた。チューブをＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒに立て、２分間ビーズを片側に集め、その上清を新しいチューブに移した。１０μｌのＳｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）を溶出液に加えた。Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは０．３ｇ／Ｌα−シアノ−４−ヒドロキシシンナミノ酸（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）をエタノール（Ｗａｋｏ）／アセトン（Ｗａｋｏ）（２：１）で溶かした溶液を用いた。１０μｌの溶出液に２０μｌのＭａｔｒｉｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１μｌをＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）にアプライした。作製したＡｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐはＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。そのデータを取得後、ＭａｓｃｏｔＴＭ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）検索を行った結果、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖の分解産物であることがわかった。２．６ｋＤａペプチドのＡｕｔｏＦｌｅｘ  ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ）で読み取ったデータ及びアミノ酸配列を図５に示す。また、２．６ｋＤａぺプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】独国Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社の磁性ビーズとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を組み合わせたＣｌｉｎＰｒｏｔ  ｓｙｓｔｅｍＴＭを利用し、陽イオン磁気ビーズ（ＷＣＸ  ｂｅａｄｓ）を使用して測定されたアルコール性肝障害患者血清の測定結果である。入院時から治療に伴い経時的に、（１）１．４ｋＤａペプチド、（２）１．５ｋＤａペプチド、（３）１．６ｋＤａペプチドの血中濃度が上昇しており、一方、（４）２．６ｋＤａペプチドの血中濃度が減少している様子がわかる。
【図２】独国Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を利用して、１．４ｋＤａペプチドを同定した結果を示す。この結果から、１．４ｋＤａペプチドはヒトフィブリノペプチドＡの分解産物であることがわかる。
【図３】独国Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を利用して、１．５ｋＤａペプチドを同定した結果を示す。この結果から、１．５ｋＤａペプチドはヒトフィブリノペプチドＡの分解産物であることがわかる。
【図４】独国Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を利用して、１．６ｋＤａペプチドを同定した結果を示す。この結果から、１．６ｋＤａペプチドはヒトフィブリノペプチドＡの分解産物であることがわかる。
【図５】独国Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を利用して、２．６ｋＤａペプチドを同定した結果を示す。この結果から、２．６ｋＤａペプチドはヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖の分解産物であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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