【手続補正書】
【提出日】平成16年8月30日(2004.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞における標的化された遺伝子組換え方法であって、該方法は、以下：
該宿主細胞に、選択された宿主標的遺伝子座に標的化されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸分子を導入する工程；
該宿主細胞内での該ＺＦＮの発現を誘導する工程；および、
選択された宿主ＤＮＡ配列が該宿主標的遺伝子座にて変異を示す、組換え宿主細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記変異は、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞にドナーＤＮＡを挿入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ドナーＤＮＡは、前記宿主細胞中で産生される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ドナーＤＮＡは、医薬品、ホルモン、タンパク質、栄養補助食品または化学薬品からなる群より選択される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞は、単細胞生物、多細胞生物由来の細胞および卵母細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞は、昆虫細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記昆虫は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ群、Ｄｉｐｔｅｒａ群、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ群、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ群、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ群、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ群、またはＯｒｔｈｏｐｔｅｒａ群から選択される目のメンバーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記昆虫は、ショウジョウバエ、蚊および地中海ミバエからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記多細胞生物は、植物である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物は、単子葉類および双子葉類からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、Ｂｒａｓｓｉｃａファミリーのメンバー、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物は、樹木である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記多細胞生物は、哺乳動物である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物は、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、イヌおよびネコからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多細胞生物は、鳥類である、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記多細胞生物は、魚類である、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記魚類は、ゼブラフィッシュ、マスおよびサケからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記多細胞生物は、菌類である、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異は、単細胞生物の生殖系列細胞、多細胞生物の生殖系細胞、単細胞生物の体細胞、および多細胞生物の体細胞からなる群より選択される細胞において生じる、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞における標的化された遺伝子組換え方法であって、該方法は、以下：
特定の宿主標的遺伝子座に優先的に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを選択する工程；
該結合ドメインに作動可能に連結されて該宿主細胞に導入された場合、二本鎖ＤＮＡを切断する、ＤＮＡ切断ドメインを選択する工程；
該宿主細胞における発現を誘導する制御エレメントを選択する工程；
該結合ドメインおよび該切断ドメインをコードするＤＮＡと、該制御エレメントとを作動可能に連結して、ＤＮＡ構築物を作製する工程；
該ＤＮＡ構築物を標的宿主細胞に導入する工程；ならびに、
該宿主ＤＮＡ中の該標的遺伝子座において組換えを示す少なくとも１つの宿主細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
ドナーＤＮＡを前記宿主細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ドナーＤＮＡは、前記宿主細胞中で産生される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ドナーＤＮＡは、医薬品、ホルモン、タンパク質、栄養補助食品および化学薬品からなる群より選択される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、３つのジンクフィンガーから構成される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ジンクフィンガーは、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記制御エレメントは、熱ショック誘導性制御エレメントからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞は、単細胞生物、多細胞生物由来の細胞、配偶子細胞、または卵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的細胞は、宿主生物の配偶子細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞は、昆虫細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記昆虫は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ群、Ｄｉｐｔｅｒａ群、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ群、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ群、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ群、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ群、およびＯｒｔｈｏｐｔｅｒａ群からなる群より選択される目のメンバーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記昆虫は、ショウジョウバエ、蚊および地中海ミバエからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記多細胞生物は、植物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記植物は、単子葉類および双子葉類からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、Ｂｒａｓｓｉｃａファミリーのメンバー、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物は、樹木である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記多細胞生物は、哺乳動物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物は、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、イヌおよびネコからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記多細胞生物は、鳥類である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記多細胞生物は、魚類である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
前記魚類は、ゼブラフィッシュ、マスおよびサケからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記多細胞生物は、菌類である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
前記組換えは、単細胞生物の生殖細胞系、多細胞生物の生殖細胞系、単細胞生物の体細胞および多細胞生物の体細胞からなる群より選択される細胞において生じる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、３つのジンクフィンガーから構成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４９】
前記切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項５０】
前記制御エレメントは、熱ショック誘導性制御エレメントからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞は、単細胞生物、多細胞生物由来の細胞、および卵母細胞からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞は、昆虫細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記昆虫は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ群、Ｄｉｐｔｅｒａ群、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ群、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ群、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ群、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ群、およびＯｒｔｈｏｐｔｅｒａ群からなる群より選択される目のメンバーである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記昆虫は、ショウジョウバエ、蚊および地中海ミバエからなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記多細胞生物は、植物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記植物は、単子葉類、および双子葉類からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、Ｂｒａｓｓｉｃａファミリーのメンバー、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記植物は、樹木である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記多細胞生物は、哺乳動物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物は、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、イヌおよびネコからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記多細胞生物は、鳥類である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
前記鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウからなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記多細胞生物は、魚類である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記魚類は、ゼブラフィッシュ、マスおよびサケからなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記多細胞生物は、菌類である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
前記組換えは、単細胞生物の生殖細胞系、多細胞生物の生殖細胞系、単細胞生物の体細胞および多細胞生物の体細胞からなる群より選択される細胞において生じる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡ構築物は、１つ以上の選択マーカーをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項６８】
前記選択マーカーは、ポジティブ選択、ネガティブ選択およびポジティブとネガティブの両方の選択からなる群より選択されるマーカーを発現する細胞についてポジティブ選択を提供する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
植物細胞における標的化された遺伝子組換え方法であって、該方法は、以下：
該植物細胞に、選択された植物標的遺伝子座に標的化されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸分子を導入する工程；
該植物細胞内での該ＺＦＮの発現を誘導する工程；および、
選択された植物ＤＮＡ配列が該植物標的遺伝子座にて変異を示す、組換え植物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７０】
前記変異は、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入からなる群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記植物細胞にドナーＤＮＡを挿入する工程をさらに包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記ドナーＤＮＡは、前記植物細胞中で産生される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ドナーＤＮＡは、医薬品、ホルモン、タンパク質、栄養補助食品または化学薬品からなる群より選択される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記植物細胞は、単子葉類および双子葉類からなる群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、Ｂｒａｓｓｉｃａファミリーのメンバー、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記植物は、樹木である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
植物細胞における標的化された遺伝子組換え方法であって、該方法は、以下：
特定の植物標的遺伝子座に優先的に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを選択する工程；
該結合ドメインに作動可能に連結されて該植物細胞に導入された場合、二本鎖ＤＮＡを切断する、ＤＮＡ切断ドメインを選択する工程；
該植物細胞における発現を誘導する制御エレメントを選択する工程；
該結合ドメインおよび該切断ドメインをコードするＤＮＡと、該制御エレメントとを作動可能に連結して、ＤＮＡ構築物を作製する工程；
該ＤＮＡ構築物を標的植物細胞に導入する工程；ならびに、
該植物ＤＮＡ中の該標的遺伝子座において組換えを示す少なくとも１つの植物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７８】
ドナーＤＮＡを前記植物細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ドナーＤＮＡは、前記植物細胞中で産生される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ドナーＤＮＡは、医薬品、ホルモン、タンパク質、栄養補助食品および化学薬品からなる群より選択される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、３つのジンクフィンガーから構成される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記ジンクフィンガーは、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーからなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記制御エレメントは、熱ショック誘導性制御エレメントからなる群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
前記植物は、単子葉類および双子葉類からなる群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
前記植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、Ｂｒａｓｓｉｃａファミリーのメンバー、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからなる群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記植物は、樹木である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、３つのジンクフィンガーから構成される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＤＮＡ構築物は、１つ以上の選択マーカーをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９１】
前記選択マーカーは、ポジティブ選択、ネガティブ選択およびポジティブとネガティブの両方の選択からなる群より選択されるマーカーを発現する細胞についてポジティブ選択を提供する、請求項９０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６０／３５１，０３５号（２００２年１月２３日出願）およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０２０１２（２００３年１月２２日出願）による優先権を主張する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
（発明の背景）
遺伝子標的化（相同組換えによる遺伝子置換または遺伝子変異のプロセス）は、非常に有用であるが、代表的には、宿主細胞の遺伝物質に所望の変化を導入するためには非効率的な技術である。標的化された産物についての強力な選択が適用され得る場合にのみ、所望の変化の回収が可能である。遺伝子標的化の効率を改善するための一般的方法は、より広範囲の生物へのこのツールの拡大と同様、多くの場合において有益である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
以前に実証された遺伝的形質転換方法は非常に好首尾であるが、標的化された組換えを伴わない形質転換は、導入されたＤＮＡのランダム挿入に関連した問題を伴い得る。ランダム組換えは、必須遺伝子の不活化または導入された遺伝子の異常発現をもたらし得る。遺伝的形質転換に関連したさらなる問題としては、複数の組込みに起因したモザイク性が挙げられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
細胞または生物の、標的化された遺伝子組換えまたは変異が、現在望ましい。なぜなら、完全なゲノム配列が、多数の生物について決定されており、より多くの配列が日々入手されているからである。特定の遺伝子座に変異を導く能力が、特定の遺伝子の機能を研究することを大いに補助するだけでなく、標的化された遺伝子組換えもまた、治療適用および農業的適用を有する。現在利用可能な技術よりも一般的で、効率的で、そして／または再現可能である、標的化された遺伝子組換えの方法が必要とされる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
特定の実施形態では、この組成物および方法は、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸分子を細胞または生物に導入し、そして選択された内因性ＤＮＡ配列が切断されており、かつ変異を示す、得られる細胞または生物を同定することによる、宿主生物の形質転換を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
好ましい実施形態では、このような方法は、以下の工程を包含する：変異される特定の宿主ＤＮＡ遺伝子座へと優先的に結合し得るジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを選択する工程；非特異的ＤＮＡ切断ドメインに作動可能に連結されて宿主細胞中に導入された場合に２本鎖ＤＮＡを切断し得る非特異的ＤＮＡ切断ドメインをさらに選択する工程；宿主細胞中での発現を誘導し得るプロモーター領域をさらに選択する工程；ならびに結合ドメインおよび切断ドメインをコードするＤＮＡと、プロモーター領域とをさらに作動可能に連結して、ＤＮＡ構築物を生成する工程。次いで、このＤＮＡ構築物は、標識宿主細胞中に導入され、そして宿主ＤＮＡ中の標的遺伝子座での組換えを示す、少なくとも１つの宿主細胞が同定される。特定の実施形態では、このＤＮＡ結合ドメインは、３つのＣｉｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーの結合ドメインを含む。別の実施形態では、この切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の切断ドメインを含む。１つの実施形態では、誘導性熱ショックプロモーターは、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の多くの変更およびバリエーションが、本明細書中に記載されるように存在する。本発明は、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコ）における標的化された遺伝子組み換えを例示する。ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、ヌクレオチド配列は、ゲノムのほとんどについて既知である。他の生物由来のゲノム配列の大きいセグメントは、速いペースで既知になっている。本明細書中に開示されるような本発明の方法を実施するために必要なエレメントは、任意の細胞または生物における適用のために適合され得る。従って、本発明は、任意の細胞または生物における標的化された遺伝子組み換えのための一般的方法を提供する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
表Ｉ：本発明の実施形態に従って、熱ショックに曝した雄性を、ａｔｔａｃｈｅｄ−Ｘ［Ｃ（１）ＤＸ］雌性と交配し、そして熱ショックに曝した雌性をＦＭ６（ｙ）雄性と交配することによって回復された、生殖系列変異体の数を示す。少なくとも１つの生殖系列変異体を生じた、スクリーニングした全ての熱ショックに曝した親の％を、所定のｙの数の列に括弧内に示す。回復された変異体ハエの総数を、総ｙの列に与え、そして全ての候補子孫の％として示す（括弧内）。ハエ１匹当たりの変異体子孫の数は、１〜１５まで変動した。
表２：コントロールに対する、タバコプロトプラストにおけるＺＦＮ媒介組換えの有効性を示す。プロトプラストを、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）およびβ−グルクロニダーゼ活性（ＧＵＳ＋）について試験した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を壊すために使用され得る。特定の遺伝子におけるこのような破壊を有する細胞は、このような遺伝子の機能を有さない生物を作製するために選択され得る。このような細胞において、遺伝子は完全にノックアウトされ得る。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得るか、または植物の場合には、新規の表現型を作製し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡの挿入をさらに提供し得る。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。この実施形態の例は、膵細胞の個体群において、活性プロモーターおよびインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、このようなＤＮＡ構築物を糖尿病を被る個体に挿入することである。次いで、外因性ＤＮＡを含む膵細胞のこの個体群は、インシュリンを生成し、それによって糖尿病患者を助ける。さらに、このようなＤＮＡ構築物は作物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物の生成を引き起こし得る。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼまたはヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、または誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成し得る。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離され得る。トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物は、これらの遺伝的変更を用いて作製され得る。組織型特異的ベクターまたは細胞型特異的ベクターはまた、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用され得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
あるいは、上記の方法は、生殖細胞内で利用され、計画された様式で挿入が生じ、後の全ての細胞分裂が、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成する細胞を選択し得る。例えば、植物コード配列の部位特異的ＤＮＡ挿入、欠失、または改変は、植物に対する新規の特性（例えば、疾患またはペストに対する耐性）を与え得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
さらに、本発明の組成物および方法は、植物において使用され得る。組成物および方法が、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物または双子葉植物）において使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、植物（例えば、イネ科植物、マメ科植物、デンプン原料、アブラナ科メンバー、ハーブおよびスパイス、油料作物、観葉植物、木材および繊維、果実、薬用植物、有毒植物、トウモロコシ、ワタ、トウゴマおよび任意の他の作物種）において使用され得る。代替の実施形態において、本発明は、植物（例えば、サトウキビ、コムギ、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、テンサイ、キャッサバ、オオムギ、ダイズ、サツマイモ、アブラヤシの実、トマト、ソルガム、オレンジ、ブドウ、バナナ、リンゴ、キャベツ、スイカ、ココナッツ、タマネギ、綿実、アブラナおよびヤムにおいて使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明は、ナス科（例えば、タバコ、トマト、ジャガイモおよびコショウ）のメンバーにおいて使用され得る。他の実施形態において、本発明は、有害な観葉植物（例えば、セイヨウキョウチクトウ、任意のイチイ種およびシャクナゲ）において使用され得る。特定の実施形態において、アブラナ科はシロイヌナズナである。別の実施形態において、この植物種は、タバコである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明の目的のために、用語「組換え」は、所定の位置の遺伝物質が、他の遺伝物質との相互作用の結果として改変されるプロセスを示すために使用される。本発明の目的のために、用語「相同性組換え」は、相同または同一である遺伝物質のセグメントの間の相互作用の結果として生じる組換えを示すために使用される。対照的に、本発明の目的のために、用語「非相同的組換え」は、相同でも同一でもない遺伝物質のセグメントの間の相互作用の結果として生じる組換えを示すために使用される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、非相同性組換えの１つの例である。
本発明の目的のために、用語「栄養補助食品」は、食品または食品の一部であり、医学的利点または健康上の利点（疾患の予防および処置を含む）を提供する、任意の物質をいう。例示的な「栄養補助食品」としては、単離された栄養分、ダイエットサプリメント、植物性製品などが挙げられる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、標的遺伝子座で二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことによって、宿主細胞において標的化された遺伝子組み換えまたは標的化された変異を指向し得る、キメラタンパク質分子である。本発明のＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含み、ここで、ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つのジンクフィンガーを含み、ＤＮＡ切断ドメインに作動可能に連結される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、キメラタンパク質分子のＮ末端にあり、ＤＮＡ切断ドメインは、この分子のＣ末端に位置される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本発明のジンクフィンガードメインは、任意のクラスまたは型のジンクフィンガーに由来し得る。特定の実施形態において、ジンクフィンガードメインは、例えば、ジンクフィンガー転写因子ＴＦＩＩＩＡまたはＳｐ１によって、一般的に代表される、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２型のジンクフィンガーを含む。好ましい実施形態において、ジンクフィンガードメインは、３つのＣｙｓ２Ｈｉｓ２型ジンクフィンガーを含む。
ＺＦＮのＤＮＡ認識特異性および／または結合特異性は、細胞性ＤＮＡの任意の選択された部位で標的化された遺伝子組換えを達成するように変更され得る。このような改変は、公知の分子生物学的合成技術および／または化学的合成技術を使用して達成され得る。広範な種々のＤＮＡ認識特異性および／または結合特異性を有するジンクフィンガーを含むＺＦＮは、本発明の範囲内である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
特定の実施形態において、ＺＦＮは、３つのＣｙｓ２Ｈｉｓ２型ジンクフィンガーを含み、ＤＮＡ切断ドメインは、ＩＩ型制限酵素（ＦｏｋＩ）に由来する。この実施形態に従って、各ジンクフィンガーは、ＺＦＮ  ＤＮＡ結合ドメインに対する９ｂｐの認識配列を作製するＤＮＡの３連続塩基対と接触する。実施形態のＤＮＡ切断ドメインは、二本鎖ＤＮＡの効果的な切断のための２つのＺＦＮ  ＤＮＡ切断ドメインの二量体化を必要とする。このことは、有効に標的化された遺伝子組換えのために、非常に近位にある２つの逆転された認識（標的ＤＮＡ）部位に対して必要条件を課す。標的部位内の全ての位置が、特異的に接触される場合、これらの必要条件は、ＤＮＡの１８塩基対全ての認識を増強する。２つの部位の間には、空間が存在しても良い。特定の実施形態において、本発明のＺＦＮの認識部位の間の空間は、６〜３５ｂｐのＤＮＡに等価であり得る。２つの認識部位の間のＤＮＡの領域は、本明細書中で「スペーサー」と称される。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ＺＦＮの切断ドメインと認識ドメインとの間のリンカーは、存在する場合、選択されたアミノ酸残基の配列を含み、その結果、得られたリンカーは、可撓性である。または、最大の標的部位特異性について、リンカーのない構築物が、作製される。リンカーのない構築物は、認識部位に結合し、次いで、６ｂｐ離れた認識部位の間で切断するための強い優先性を有する。しかし、０と１８との間のアミノ酸長のリンカー長を有する場合、ＺＦＮ媒介性切断は、５〜３５ｂｐ離れた認識部位の間に存在する。所定のリンカー長について、結合および二量体化の両方に一致する認識部位の間の距離に対する制限が存在する。特定の実施形態において、切断ドメインと認識ドメインとの間にリンカーは存在せず、標的位置は、互いに関して逆転された方向で、６ヌクレオチドのスペーサーによって分離された２つの９ヌクレオチド認識部位を含む。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明の特定の実施形態に従って、遺伝子組換えまたは変異を標的化するために、２つの９ｂｐジンクフィンガーＤＮＡ認識配列が、宿主ＤＮＡ中に同定されなければならない。これらの認識部位は、互いに関して逆転された方向にあり、約６ｂｐのＤＮＡによって分離される。次いで、ＺＦＮは、標的位置でＤＮＡを特異的に結合するジンクフィンガーの組み合わせを設計および生成し、次いで、ＩＩ型制限酵素の切断ドメインにジンクフィンガーを連結することによって生成される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
（標的化された遺伝子組換えまたは変異）
本発明の方法は、任意の細胞または生物の標的化された遺伝子組換えまたは変異のために使用され得る。最低限の必要条件は、遺伝物質を細胞または生物に導入するための方法（安定な形質転換または一過性形質転換のいずれか）、内因性標的領域に関する配列情報、ならびに標的遺伝子座を認識および切断するＺＦＮ構築物を含む。本発明のいくつかの実施形態に従って、例えば、相同組換え、ドナーＤＮＡもまた必要とされる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本発明の別の実施形態に従って、同定可能なマーカーをコードするＤＮＡもまた、ＤＮＡ構築物と共に含まれる。このようなマーカーは、その存在または非存在が、宿主細胞または宿主生物に検出可能な表現型を運搬する遺伝子または配列を含み得る。種々の型のマーカーとしては、選択マーカー、スクリーニングマーカーおよび分子マーカーが挙げられるがこれらに限定されない。選択マーカーは、通常、発現して、生物を、特性のセットの環境条件に耐性または感受性にする表現型を運搬し得る遺伝子である。スクリーニングマーカーはまた、容易に検出可能かつ識別可能な性質である表現型を運搬し得、例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはβ−ガラクトシダーゼである。マーカーは、陰性選択マーカーでも、陽性選択マーカーでもあり得る。特定の実施形態において、このような陰性選択マーカーは、ｃｏｄＡである。分子マーカーは、例えば、オリゴヌクレオチドプロービングによって唯一同定され得る配列特性（例えば、ＲＦＬＰ（制限フラグメント長多型）またはＳＳＲマーカー（単一反復配列））である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
別の実施形態において、相同組換えは、以下のように使用され得る。最初に、組み込みの部位が、宿主細胞において選択される。次いで、組み込み部位から下流および上流に配置された配列に相同な配列が、ゲノムに組み込まれるべき選択された遺伝子に隣接して、遺伝子構築物に含まれる。隣接とは、この文脈において、単に、標的の相同配列が、選択された遺伝子の上流（５’）と下流（３’）との両方に位置することを意味する。次いで、この構築物が細胞に導入され、従って、細胞の配列と構築物との間の組換えを可能にする。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
任意の所定の細胞における相同組換え頻度は、多数の要因によって影響を受ける。異なる細胞または生物は、これらの細胞において起こる相同組換えの量に関して変動し、および起こる相同組換えの相対割合もまた、種によって変動性である。ドナーと標的との間の相同な領域の長さは、相同組換え事象の頻度に影響を与え、相同領域がより長いほど、この頻度はより大きい。相同組換えを観察するために必要とされる、相同領域の長さもまた、種に特異的である。しかし、相同組換え事象の頻度の差異は、起こる組換えの選択の感度によってずらされ得る。ドナー−標的相同性の長さまたはドナー−標的相同性の程度についての絶対的な制限は、固定され得ないが、評定され得る潜在的な事象の数、および相同組換え事象についての選択の感度に依存することが、理解される。例えば、培養された細胞において、１０９の事象をスクリーニングすることが可能である場合、１０９個の細胞における１つの組換えを同定し得る選択が、有用な結果を得る。生物がより大きい場合、またはより長い世代時間を有し、その結果、１００の個体のみが単一の試験において評定され得る場合、組換え頻度がより高くなくてはならず、かつ選択感度がさほど重要であってはならない。本発明の方法は、染色体外ドナーＤＮＡの存在下で、相同組換えの効率を劇的に増加させる（実施例を参照のこと）。本発明は、迅速な世代時間を有するか、または感受性の選択系が利用可能である、細胞または生物の場合、あるいは単細胞であるかまたは培養中で増殖し得、そして成体生物に再生または組み込みされ得る多能性細胞株が存在する生物について、最も容易に実施され得る。迅速な世代時間とは、本発明において、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に付いて実証された平均である。植物細胞（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は、培養において増殖し得、次いでインタクトな生物に再生または組み込みされ得る、多能性細胞の１つの例である（タバコは、別である）。これらの細胞または生物は、それらのそれぞれのクラスの代表であり、そして本発明がこれらのクラスにわたってどのように適用され得るかを実証する。本発明は、生物の形質転換のために使用される方法とは無関係に作動可能であることが、当業者によって理解される。さらに、本発明が、植物および昆虫のような異種の生物に対して適用可能であるという事実は、本発明の、生存生物に対する一般的な広範な適用可能性を実証する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
（実施例１：標的化された変異の導入）
（ジンクフィンガー設計）
一対のＺＦＮを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのｙｅｌｌｏｗ（ｙ）遺伝子における染色体標的遺伝子座について設計しそして構築した。ジンクフィンガーは、一般的に、ＤＮＡのＧリッチ領域に優先的に結合し、そして全ての５’−ＧＮＮ−３’トリプレットに結合するフィンガーの大規模な研究が、行われている。結合部位は、ＺＦＮによる有効な切断のために、互いに対して逆方向でなければならないため、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ｙ）の染色体標的遺伝子座を、（ＮＮＣ）３．．．（ＧＮＮ）３の形態の逆方向認識配列について検索した。このような部位は、成分９マー認識部位の間で６ｂｐの間隔のエキソン２において同定され、これは、付加されたリンカーもスペーサーも結合ドメインと切断ドメインとの間に有さないＺＦＮによる特異的認識および切断のために最適なスペーサーである。２つのＺＦＮの特異的認識配列は、Ｂｉｂｉｋｏｖａら、２００２、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１１６９−１１７５に記載される。ＤＮＡ配列である、５’−ＧＣＧＧＡＴＧＣＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＣＧＧＴＡＧＣＧ−３’（配列番号２）を認識するジンクフィンガーをコードするＤＮＡを、Ｄｒｓ．Ｄａｖｉｄ  ＳｅｇａｌとＣａｒｌｏｓ  Ｂａｒｂａｓ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。次いで、このジンクフィンガーをコードするＤＮＡを、変異誘発性ＰＣＲプライマーを使用して改変し、そして３つのジンクフィンガーの２セット（一方を、ｙＡ（ｙ遺伝子標的の成分９マーの１つ（５’−ＧＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号３））を認識する）と呼び、そして他方を、ｙＢ（ｙ遺伝子標的の他の成分９マー（５’−ＧＣＧＧＴＡＧＧＣ−３’（配列番号４））を認識する）と呼ぶ）の各々を作成した。２つのフィンガーが、ｙＡにおいて改変されたが、ｙＢにおいては１つのフィンガーしか改変されなかった。ジンクフィンガーの得られた両方の３フィンガーセットの各々をコードするＤＮＡを、ＤＮＡ認識ドメインと切断ドメインとの間に介在リンカーＤＮＡを有さない、ｐＥＴ１５ｂ発現プラスミド中のＦｏｋＩ  ＤＮＡ切断ドメインとインフレームにクローニングした。両方のキメラＺＦＮタンパク質を発現させ、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーで精製し、そして完全ｙ遺伝子を保有するｐＳ／Ｇプラスミドを使用して、インビトロで切断活性について試験した。２つのＺＦＮは共に、二本鎖切断（ＤＳＢ）を、ｙ遺伝子を保有する１０．７ｋｂのプラスミドＤＮＡ中の推定部位で構成した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
（Ｐエレメントベクターおよびハエ幼虫の形質転換）
次いで、ｙＡ  ＺＦＮコード配列およびｙＢ  ＺＦＮコード配列の両方を、改変ｐｈｓｐ７０プラスミドのＢａｍＨＩ部位とＳａｌＩ部位との間にＺＦＮ  ＤＮＡを挿入することによって、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｈｓｐ７０熱ショックプロモーターの後ろに別々にクローニングした。熱ショックプロモーターおよびＺＦＮ  ＤＮＡ配列を保有するフラグメントを、部分ＨｉｎｄＩＩＩ消化および完全ＡｐａＩ消化によって切除し、そして市販のクローニングベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のこれらの同じエンドヌクレアーゼ部位の間にクローニングした。挿入物の配列の確認の後、これを、ＮｏｔＩで消化することにより切り出し、そしてｒｙ＋ＰエレメントベクターｐＤＭ３０に挿入した。得られたｙＡプラスミドおよびｙＢプラスミドを、Ｐ−トランスポサーゼ発現プラスミドのｐπ２５．ｌｗｃと共に、ｖ  ｒｙ胚中に別々に注入し、そして孵化した成体を、交配させて、ｒｙ＋生殖細胞系列形質転換体についてスクリーニングした。ｒｙ＋挿入を、各ＺＦＮを有する複数の独立した形質転換体に特異的な染色体に対してマッピングした。両方の平衡化したホモ接合性のストックを、ほとんどの場合に生存率の問題を有さず、ｙＡおよびｙＢを保有するいくつかの株について作製した。２つのＺＦＮの遺伝子を、（以下の実施例に記載されるようにして）成熟ハエの適切な交雑種と合わせ、そしてその子孫に、これらのハエが入ったガラス容器を３５℃の水浴に１時間漬けることによって、交配の開始後４日で熱ショックを与えた。成体が孵化すると、これらを、体細胞ｙ変異の証拠についてスクリーニングした。各ヌクレアーゼを含む交雑種由来のコントロール容器を、別々に熱ショックに供し、そしてｙＡ＋ｙＢハエ（これは熱ショックを受けていない）もまたスクリーニングした。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ｙについて同定可能なドナーＤＮＡを作製するために、ジンクフィンガーについてのｙＡ認識部位およびｙＢ認識部位を、２つのインフレーム停止コドンおよび１つのＸｈｏＩ部位で置換した。これらの変更を、所望の配列を有するＰＣＲプライマーを用いる増幅によって導入した。野生型ｙに対して、２１ｂｐを欠失させ、ｙＡ認識部位の３ｂｐのみを残し、そして９ｂｐ置換は、この２つのインフレーム停止コドンを挿入し、そしてＸｈｏＩ部位を挿入した。この変異体（ｙＭ）は、ｙ遺伝子座に対して全体で８ｋｂの相同性を有する。これをＰエレメントベクターに挿入し、そしてハエゲノムに導入した。ｙＭ配列は、ＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＲＴ）およびメガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの認識部位に隣接し、ドナーの切り出しおよび線状化を可能にする。この手段によるインサイチュでの線状染色体外ドナーＤＮＡの生成は、組換えにおいてその有効性を増強することが示されている。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
ＺＦＮ誘導標的化遺伝子組換えの結果は、いくつかの局面において、標的化切断を行うことなく得られた結果とは異なる。第一に、雄性生殖系列および雌性生殖系列の両方において誘導変異が見い出されたが、他の研究者らによる以前の試行では、雌のみが良好な頻度を有していた。明らかに、標的におけるＤＳＢの存在は、インタクトな染色体に対して効率的ではない雄における組換えプロセスを活性化する。雌においてより低い標的化頻度が観察されることは、切断されていない相同Ｘ染色体との組換えによりブレークを修復する可能性を反映し得る。第二に、誘導変異の全体頻度は、末端ありドナー（ｅｎｄｓ−ｉｎ  ｄｏｎｏｒ）を有する雌においてｙで早期に見られたよりも、線状ＤＮＡ実験および環状ＤＮＡ実験における雄で約１０倍高かった：１／５００生殖体に対して約１／５０生殖体。雌性生殖系列においてさえ、ＺＦＮ誘導変異の頻度は、１／２００生殖体であり、そしてこれらの３／４は、遺伝子置換体であった。従って、相同ドナー（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｄｏｎｏｒ）の存在は、染色体外ドナーとの相互作用を除外しない。第三には、標的化された相同組換え体に加えて、ＮＨＥＪに起因する欠失および挿入もまた観察された。このような産物は、標的切断がない場合には、予期も観察もされなかった。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
（実施例３：）
（標的化された変異の導入を刺激するためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるキメラＺＦＮの発現）
実験設計：本発明の方法は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＴＲＡＮＳＰＡＲＥＮＴ  ＴＥＳＴＡ  ＧＬＡＢＲＡ１遺伝子（ＴＴＧ１、遺伝子番号ＡＴ５Ｇ２４５２０（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＪ１３３７４３）を標的化し、そしてノックアウトするのに用いられる。この遺伝子のＥＳＴは配列決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｆ２００５５，Ｆ２００５６）。この遺伝子は、ＷＤ４０反復を含むタンパク質をコードする。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
さらに、ｔｔｇ１変異体は、フラボノイド生成を欠損している。フラボノイドは複雑なクラスの化合物であり、紫色アントシアニン色素およびタンニンを含む。ＴＴＧ１タンパク質は、酵素ジヒドロフラボノールレダクターゼの合成を正に調節し、この酵素は、アントシアニンおよびタンニンの両方の生成に必要とされる。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
さらに、ｔｔｇ１変異体は、外根毛を生じる。野生型では、根毛は、発毛芽細胞のみから生じる。対照的に、ｔｔｇ１変異体では、根毛は発毛芽細胞および無毛芽細胞の両方により生じる。結果として、根がより毛様に見える。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
（ジンクフィンガーの設計）
ＴＴＧ１遺伝子を、以下の形状の配列について走査した：
ＮＮＹ  ＮＮＹ  ＮＮＹ  ＮＮＮＮＮＮ  ＲＮＮ  ＲＮＮ  ＲＮＮ
ここで、ＹはＴまたはＣのいずれかであり、ＲはＡまたはＧであり、そして、Ｎは任意の塩基である。この同定された配列は、ＡまたはＧから対向する方向（すなわち対向する鎖に）で開始され、正確に６ｂｐ離れるトリプレットからなった。このことは、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識および切断のための好ましい構造であることが示されている。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
第１のこれらの部位に結合するように設計された結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを、オリゴヌクレオチド合成および伸長、または変異促進性プライマーを用いるＰＣＲのいずれかにより構築する。得られたコード配列を、プラスミドベクターにインフレームで挿入し、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが２つのＺＦＮコード配列（ＺｎＴＴＧ１ＡおよびＺｎＴＴＧ１Ｂ）を生じる。コードタンパク質を、Ｅ．Ｃｏｌｉ中に発現させ、部分的に精製する。回収したＺＦＮを、ＴＴＧ１遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを切断する能力について、インビトロで試験する。このアッセイにおける成功は、いずれかのＺＦＮ単独によっては切断されないが、２つのＺＦＮの混合物によって予測される部位で切断されることにより証明される。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
（形質転換：）
ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ａ遺伝子およびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂ遺伝子を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を使用してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのゲノムに導入する。こうするために、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１ＡおよびＢ遺伝子を、ハイグロマイシン耐性選択マーカーを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター（ｐＣＡＭＢＩＡ１３８０）に挿入する。次いで、ｐＣＡＭＢＩＡ  ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１クローンを、標準のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換手順を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞に導入し、次いで、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１ＡおよびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂ遺伝子を、標準の花浸漬方法を用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に導入する。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
（スクリーニング方法３：）
ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ａ遺伝子およびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂ遺伝子を、ヘテロ接合性のｔｔｇ１変異体（すなわち、遺伝型ｔｔｇ１／ＴＴＧ１）に導入する。雄性不妊１（ｍｓ１）植物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ溶液に導入する（注釈：ｍｓ１座とｔｔｇ１座は連結しており、第５染色体上で６ｃＭ離れている）。次いで、浸漬した植物を、ホモ接合性のｔｔｇ１−１植物由来の花粉で受粉させる。交雑した植物を成熟させ、得られたＴ１／Ｆ１種子を回収し、そして、Ｔ１／Ｆ１種子をハイグロマイシンの存在下で発芽させる。生き残ったＴ１／Ｆ１実生は、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１トランスジーンを有し、ｔｔｇ１座でヘテロ接合性（すなわち、遺伝型ＭＳ１−−ｔｔｇ１−１／ｍｓ１−−ＴＴＧ１）である。Ｔ１／Ｆ１植物は、上記のように熱処理される。細胞のサブセットにおいて、野生型の対立遺伝子がノックアウトされ、ホモ接合性のｔｔｇ１（すなわち、遺伝型ｔｔｇ１−１／ｔｔｇ１−ｋｏ）細胞のセクターが生じる。これらの変異体セクターは、いくつかの表現型（例えば、無毛の葉（無毛表現型）、明るい葉（アントシアニンマイナス表現型）および黄色種子（透明殻表現型））を可視化することにより検出可能（従って、標的化遺伝組換え事象）である。変異体セクターから組織を回収し、上で議論したＰＣＲ−クローニング−配列決定ストラテジーを使用して標的化を検証する。変異体セクターから、Ｔ２種子を回収し、Ｔ２植物に成長させる。Ｔ２世代において、表現型を検証する：ノックアウト対立遺伝子（すなわちｔｔｇ１−ｋｏ）についてホモ接合性の植物はまた、ｍｓ１変異体についてもホモ接合性であり、従って、雄性不妊（すなわち、遺伝型ｍｓ１−−ｔｔｇ１−ｋｏ／ｍｓ１−−ｔｔｇ１−ｋｏ）である。二重変異体（表現型的にｔｔｇ１およびｍｓ１）由来の組織を回収し、上で議論したＰＣＲ−クローニング−配列決定ストラテジーを使用して標的化について検証する。
（実施例４：タバコ細胞におけるＺＦＮによる組換えの促進）
（実験設計）
本発明の方法を使用して、タバコ細胞において人工的に導入された標的遺伝子を、組換えによって修復した。選択可能な表現型とスクリーニング可能な表現型との両方を植物細胞に与える標的遺伝子を、構築した。次いで、この標的遺伝子を、変異によって非機能的にし、そしてタバコ植物中に安定に形質転換した。次いで、標的遺伝子を認識するジンクフィンガーアレイを、ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインに融合した。組換えが生じた場合、その標的遺伝子における変異を補正し得るドナーＤＮＡ分子もまた、構築した。
（ジンクフィンガーヌクレアーゼの作製）
マウス転写因子であるＺｉｆ２６８由来のジンクフィンガードメインを、使用した。このＺｉｆ２６８のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡを、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする配列に融合して、Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合体を作製した。このＺｉｆ２６８  ＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼドメインを、ＰＣＲおよび重複オリゴヌクレオチドを使用して合成した。これら両方の配列を、双子葉植物についてのコドン偏位（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ）と一致するように改変した。これら２つのドメインを連結して、Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合体を得た。植物中での発現のために、このＺｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合体を、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターの後ろおよびＮＯＳ転写ターミネーターの上流に配置することによって、改変した。核局在化シグナルおよびＡｃＶ５エピトープタグを、このＺｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合体のＮ末端に加えて、そのタンパク質を植物核に指向し、そして免疫ブロット分析による検出を可能にした。
（標的遺伝子の作製）
Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合タンパク質が植物染色体を切断し得、組換えを増強し得るか否かを試験するために、Ｚｉｆ２６８結合部位を有する標的遺伝子を作製した。この標的遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）とネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子との間の転写融合体であった。機能的ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ融合タンパク質は、カナマイシン耐性を与え、適切な基質中でインキュベートした場合、ＧＵＳ活性を表す細胞は、青色になる。このＧＵＳ遺伝子を、構成的プロモーターの下流に配置した。逆転写依存性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）試験を補助するために、人工イントロン（ＡＩ）を、ＧＵＳコード配列に挿入して、ＧＵＳ発現を測定した；スプライシングしたｍＲＮＡから産生されたＲＴ−ＰＣＲ産物は、それらを汚染するゲノムＤＮＡと区別するのを可能にするイントロンを欠損している。ＧＵＳコード配列を、ＮＰＴＩＩに融合し、ＮＯＳターミネーターの上流に配置した。次いで、その標的遺伝子を、ＧＵＳとＮＰＴＩＩとの両方の活性部位に対するコード領域を含む６００塩基の配列を欠失させることによって、非機能的にした。Ｚｉｆ２６８に対する認識部位を、欠失部位に挿入した。次いで、変異したＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子を、タバコ細胞中に安定に形質転換して、トランスジェニックタバコカルスを作製した。１２種の独立したトランスジェニック植物を再生し、そしてその一次形質転換体（これは、ＰＣＲ分析によって、変異体ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子を保有した）を、引き続く全ての実験に使用した。この標的遺伝子の機能を、組換えによって回復させ得、それによって、Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩがインビボで標的遺伝子を切断し得、組換え頻度を増強し得るか否かを試験することを可能にした。
（実験結果）
１２種の独立したトランスジェニック植物を、タバコカルスから再生した。これらの一次形質転換体を、引き続く全ての実験において使用した。ＰＣＲ分析は、１２種全ての植物が変異体ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子を保有することを確証した。このＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子が、転写を助長する染色体環境下にあるか否かを試験するために、葉組織から単離されたＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。それらのプライマーは、ＡＩのいずれかの側にあり、それによって、そのＰＣＲ産物は、ＲＮＡと汚染されたゲノムＤＮＡ（またはスプライシングされていないｍＲＮＡ）とを識別することができた。１２種のトランスジェニック植物のうちの９種が、ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩマーカーの強い発現を示した。３種の植物が、不明瞭な結果を生じ、ＲＮＡとゲノムＤＮＡとの両方について予測されるサイズに対応するバンドを表示した。
次いで、Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合体を、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためにベクターにクローニングした。発現の誘導後、タンパク質の存在を、免疫ブロット分析によって確認した。数マイクロタイターのＥ．ｃｏｌｉ溶解物を、Ｚｉｆ２６８認識部位を含む標的ベクターとともにインキュベートすることによって、この融合タンパク質の活性を、インビトロで試験した。標的ベクターを、効率的に切断した。
（ドナーＤＮＡ分子の構築）
欠損ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子を補正するために、ＧＵＳおよびＮＰＴＩＩの活性部位に対する野生型配列を用いて、ドナーＤＮＡ分子を作製した。欠損した染色体標的遺伝子での組換えの際に、このドナー分子は、機能を回復する。このドナー分子は、染色体標的と４．３ｋｂの相同性を共有し、かつＧＵＳおよびＮＰＴＩＩの活性部位をコードするさらなる６００塩基を含んでいた。非正統的組換えによる植物染色体への組み込みがカナマイシン耐性またはＧＵＳ活性を与える機会を最小限にするように、このドナー分子は、プロモーターおよびＧＵＳに対するコード配列の一部を欠損していた。さらに、推定組換え体の分子特徴を補助するように、このドナーＤＮＡ分子は、ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ構築物を有さない診断的制限エンドヌクレアーゼ部位を有していた。
（ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびドナーＤＮＡの導入後の抗菌耐性細胞の選択）
タバコプロトプラストを、変異体ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子を有するトランスジェニック植物から作製した。１０種の植物を、この研究において使用し（１、３〜６および８〜１２で表される）；植物番号９および植物番号１２を用いて、２回の独立した実験を行った（表２）。各エレクトロポーション実験に関して、１×１０６のプロトプラストを使用した。プラスミドＤＮＡを、エレクトロポーション前に、制限酵素で直線化した。このプロトプラストを、機能的ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ融合体、ドナーＤＮＡ、Ｚｉｆ２６８：ＦｏｋＩ融合タンパク質をコードするＤＮＡのいずれか、またはそれら両方を用いて、エレクトロポーションした。このＺＦＮプラスミドを、最大で３５μｇのＤＮＡを使用して、ドナーＤＮＡに、５：１モル濃度過剰で与えた。ＺＦＮおよびドナーＤＮＡの量を、コントロール実験と試験実験との間で一定に保った。
エレクトロポーション後、これらの細胞を、カルス誘導培地上で６日間回復させた。次いで、カナマイシンを、５０μｇ／ｍｌのレベルにて、この培地に加えた。約２０日後、カナマイシン耐性細胞の数を計数した（表２）。各耐性カルスを、ＧＵＳ活性について染色した。ドナーＤＮＡまたはＺＦＮをコードするＤＮＡのみを使用したコントロール実験において、いずれの場合においても、ＧＵＳ活性は観察されなかった。
（潜在的な組換え事象の分子特徴）
推定組換え体において、その標的遺伝子を、ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子における欠損にまたがる領域を増幅するように設計されたプライマー対を使用するＰＣＲによって特徴付けした。非正統的組換えによって染色体に組み込まれるドナーＤＮＡ分子の増幅を防止するために、一方のプライマーは、標的に対して特異的であり、そして他方のプライマーは、標的とドナーＤＮＡとの両方における配列に相補的であった。さらに、市販の高忠実度のＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を使用した。このキットは、増幅の間に、標的遺伝子とドナーＤＮＡとの間の鎖転移（ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を防止する界面活性剤を含んでいる。
ＤＮＡを、植物番号６を用いて行った実験から得られたＫａｎｒカルスから調製した。これらは、７種のＫａｎｒＧＵＳ＋カルスおよび５種のＫａｎｒＧＵＳ−カルスを含んだ。これら１２種のカルスを、ドナーとＺＦＮコードＤＮＡとの両方のエレクトロポーションによって作製した。２回のＰＣＲ反応を、各ＤＮＡ調製物を用いて行い、両方の反応の結果は、一致していた。６種のＫａｎｒＧＵＳ＋カルスが、一貫してＰＣＲ産物（これは、相同組み換え事象を持続する）を産生した。残りのＧＵＳポジティブカルスがＰＣＲ産物を産生できなかったのは、ＰＣＲ反応の失敗または標的遺伝子の再配置が原因であった。５種のうち３種のＫａｎｒＧＵＳ−カルスが、インタクトな染色体標的遺伝子（すなわち、組換えを受けない遺伝子）について予測されるサイズのＰＣＲ産物を産生した。ＰＣＲ産物を産生しない、プライマー結合部位の一方または両方を含む２種のＫａｎｒＧＵＳ−カルスは、持続性欠損を有し得る。
６種のＫａｎｒＧＵＳ＋ポジティブカルス由来のＰＣＲ産物を配列決定して、それらの産物が、それらの機能が組換えによって再構成される標的遺伝子に起因することを確認した。それらのＰＣＲ産物は、診断用配列マーカーを有し、このマーカーは、それらの産物が染色体標的遺伝子由来であることを示した。これらはまた、ドナーＤＮＡ分子内で操作される内部制限エンドヌクレアーゼ部位を有していた。
（全結果）
ＤＮＡを取り込んだ１０種の植物細胞のうちの約１種が、標的化された組換え事象を持続することが見出された。この組換え頻度は、植物において以前に報告されたどの組換え頻度よりも高い。
（コントロール実験）
タバコプロトプラストを機能的ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩレポーターを用いてエレクトロポーションすることによって、非正統的組換えをモノタリングした（表２、「機能的」）。ＮＰＴＩＩ耐性の頻度は、１０−３の処理細胞（４．５×１０−３）であると推定される。
ドナーＤＮＡの組み込みの表現型結果を、コントロール実験においてモニタリングした。この実験において、タバコプロトプラストを、ドナーＤＮＡのみを用いてエレクトロポーションした。カナマイシン耐性は、約１０−４の処理細胞（３．２×１０−４）の頻度で観察された。この値を非正統的組換え頻度と比較した場合、このドナーＤＮＡ上でのプロモーターの欠損は、カナマイシン耐性において、１０倍低下された。Ｋａｎｒ細胞は、ＧＵＳ活性に対してポジティブではなかった。ドナーＤＮＡのみを使用した実験におけるＫａｎｒＧＵＳ＋細胞の欠損は、染色体ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩ遺伝子において補助されていない組み換え頻度が、処理プロトプラストの総数よりも少ない（＜１．２×１０−７）ことを示唆している。
第二のコントロール実験を行った。この実験において、タバコプロトプラストを、Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合タンパク質のみをコードするＤＮＡで形質転換した。ＫａｎｒＧＵＳ＋カルスは、回復されなかった。このことは、それ自体でのＺｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合が、相同組換えと一致した表現型を与えなかったことを示した。このＺｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ構築物はまた、細胞生存度に影響を及ぼさなかった。なぜなら、プロトプラストのプレーティング効率は、ＺＦＮ構築物を用いて処理しても、ＺＦＮ構築物を用いずに処理しても異ならなかったからである。
（Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合体およびドナーＤＮＡ）
コントロール実験とは対照的に、Ｚｉｆ２６８：：ＦｏｋＩ融合体とドナーＤＮＡとの両方を用いたタバコプロトプラストのエレクトロポーションは、多量のカナマイシン耐性細胞を生じた（ドナーＤＮＡを単独で使用した場合、３倍を超える頻度で生じた）。多量のカナマイシン耐性細胞はまた、ＧＵＳ＋であった。ドナーＤＮＡおよびＺＦＮコードＤＮＡを別々に使用した場合、ＧＵＳ＋細胞は全く得られなかったので、ＫａｎｒＧＵＳ＋細胞の数を、相同組換え頻度として収集し得る。この頻度は、９．１×１０−５である。
組換え頻度は、代表的に、相同事象に対する非相同事象の割合として報告されている。機能的ＧＵＳ：：ＮＰＴＩＩレポーターで処理した細胞において、ＫａｎｒＧＵＳ＋の頻度は、１．０×１０−３であった。これは、非相同組換え頻度または非正統的組換え頻度の測定値であるので、それによって、相同事象に対する非相同事象の割合は、１．０×１０−３を９．１×１０−５で除算することによって表され得る。この数は、１０−１と概算される。言い換えると、ＤＮＡを取り込んだ１０種の植物細胞のうち約１種の植物細胞が、相同組換え事象を受けた。カナマイシン耐性マーカーは、組換え頻度を測定するのにより感受性であるようであった。しかし、カナマイシンマーカーを用いて組換え頻度を算出する際に、ドナーＤＮＡ単独によって引き起こされるバックグラウンド事象の数を、考慮しなければならない。この計算値を、表２において示す。カナマイシンマーカーに基づく相同組換え頻度は、７．８×１０−４と概算される。機能的遺伝子構築物を使用した非正統的組換えによって得られたカナマイシン耐性の頻度（４．５×１０−３）と比較した場合、ＤＮＡを取り込んだ６種の細胞のうちの約１種の細胞が、カナマイシン耐性を与える相同組換えを受けたことが、結論付けられ得る。
染色体切断に起因する、植物における組換えの増強は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ（Ｉ−ＳｃｅＩ）の使用によって、以前まで報告されてきた。ＺＦＮによる組換えの増強は、これらの以前の報告よりも、少なくとも１桁大きい。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
【表１】
2005519631.tif 000001
（表２．タバコプロトプラストにおけるＺＦＮ媒介組換え）
【表２】
2005519631.tif 000002
各実験で、１×１０６のプロトプラストを使用した。
カナマイシン耐性マーカーに基づく相同組換え頻度の平均推定値は、以下である：
１０９９．５  −  ３２３．２５／１０５  ＝  ７７．６２×１０−５。