(57)【要約】  本発明は、簡便、高純度、高収率で（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを単離精製及び分離除去する方法の提供を課題とする。具体的には、本発明は、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩の精製方法を開示する：（ａ）混合物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩を、式Ｑ−ＣＨＯ［式中、Ｑは、それぞれ置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す。］で表されるアルデヒド化合物又はその等価体と反応させて、式（１）で表される化合物2008102671.tif 000012［式中、Ｑは上記で定義したとおりである。］  に変換する工程、（ｂ）有機溶媒を用いて式（１）で表される化合物を抽出する工程、及び（ｃ）式（１）で表される化合物を（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩に変換する工程。
2008102671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩の精製方法。
（ａ）混合物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩を、式：Ｑ−ＣＨＯ［式中、Ｑは、置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す。］で表されるアルデヒド化合物又はその等価体と反応させて、式（１）で表される化合物
【化１】
2008102671.tif 000010
［式中、Ｑは上記で定義したとおりである。］
に変換する工程、
（ｂ）有機溶媒を用いて式（１）で表される化合物を抽出する工程、及び
（ｃ）式（１）で表される化合物を（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩に変換する工程。
【請求項２】
工程（ａ）において、式：Ｑ−ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物を反応に用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の抽出工程により、式（１）で表される化合物から不純物を除去することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
式（１）において、Ｑが、置換基を有してもよい、フェニル基、シクロヘキシル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、フリル基又はピロリル基である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
式（１）において、Ｑが置換基を有してもよいフェニル基である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｑが置換基を有する場合の該置換基が、
（ｉ）炭素数１〜６のアルキル基、
（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコキシ基、
（ｉｉｉ）炭素数２〜７のアルカノイル基、
（ｉｖ）炭素数６〜１０のアリール基、
（ｖ）炭素数６〜１０のアリールオキシ基、
（ｖｉ）ハロゲノ基、
（ｖｉｉ）炭素数１〜６のハロゲノアルキル基、
（ｖｉｉｉ）ニトロ基、
（ｉｘ）ホルミル基、及び
（ｘ）シアノ基
（但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、炭素数１〜１０のアルキル基の置換基とはならない）からなるグループから選ばれる、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）の有機溶媒が、少なくとも１種の酢酸アルキルである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）において、水、炭素数１〜４のアルキルで置換されていてもよいヒドロキシルアミン、アンモニア、炭素数１〜４のアルキルアミン、炭素数２〜８のジアルキルアミン、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基及び炭素数２〜７のアルカノイル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいヒドラジン、及び炭素数１〜６のアルキルで置換された第四級アンモニウムハライド、並びにそれらの化学的に許容しうる塩からなるグループから選ばれる少なくとも１種の求核試剤を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩への変換を、少なくとも１種の酢酸アルキル中で行う、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の酢酸アルキルが酢酸エチルである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩の分離除去方法。
（ａ）混合物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩を、式Ｑ−ＣＨＯ［式中、Ｑは、置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す。］で表されるアルデヒド化合物又はその等価体と反応させて、式（１）で表される化合物
【化２】
2008102671.tif 000011
［式中、Ｑは上記で定義したとおりである。］
に変換する工程、及び
（ｂ）有機溶媒を用いて式（１）で表される化合物を抽出する工程。
【請求項１２】
工程（ａ）において、式：Ｑ−ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物を反応に用いる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
式（１）において、Ｑが、置換基を有してもよい、フェニル基、シクロヘキシル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、フリル基又はピロリル基である、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
式（１）において、Ｑが置換基を有してもよいフェニル基である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｑが置換基を有する場合の該置換基が、
（ｉ）炭素数１〜６のアルキル基、
（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコキシ基、
（ｉｉｉ）炭素数２〜７のアルカノイル基、
（ｉｖ）炭素数６〜１０のアリール基、
（ｖ）炭素数６〜１０のアリールオキシ基、
（ｖｉ）ハロゲノ基、
（ｖｉｉ）炭素数１〜６のハロゲノアルキル基、
（ｖｉｉｉ）ニトロ基、
（ｉｘ）ホルミル基、及び
（ｘ）シアノ基
（但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、炭素数１〜１０のアルキル基の置換基としては用いられない）
からなるグループから選ばれる、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）の有機溶媒が、少なくとも１種の酢酸アルキルである、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ヒドロキシイソロイシンの単離精製法に関するものであり、さらに詳しくは、アミナール体への変換を利用した、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの単離精製法及び分離除去法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ヒドロキシイソロイシンは非タンパク性アミノ酸のひとつであり、フェヌグリーク（コロハ）（Trigonella foenum-graecum L.）種子等から抽出されることが知られている（非特許文献１、２、３）。
この４−ヒドロキシイソロイシンについては、血糖値依存的なインスリン分泌促進活性（特許文献１、非特許文献４）、インスリン感受性の増強作用（特許文献２、３、非特許文献５）、筋中でのグリコーゲン生成促進活性（特許文献４、非特許文献６）、肌や頭皮の保護作用（特許文献５）、脂肪吸収抑制作用（特許文献６）、抗肥満作用（特許文献７）等が報告されており、これらの作用を利用した医薬品、健康食品素材、香粧品素材等として有用である。さらには各種医薬品の合成中間体としても有用である。
現在、４−ヒドロキシイソロイシンを得る手段としては、フェヌグリーク種子からの抽出（特許文献８、９、非特許文献１、２、３）と化学合成（特許文献１０、１１、非特許文献７）が知られている。
抽出法ではサポニン類や他のアミノ酸と分離するために、シリカゲルやイオン交換樹脂によるクロマトグラフィー操作や、再結晶等の煩雑な操作が必要である。特に、フェヌグリーク種子に含まれる４−ヒドロキシイソロイシンは、上述の作用発揮の観点からより重要な立体異性体とされる（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン以外に、別の立体異性体である（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンが約９：１の割合で含有されており（非特許文献２）、クロマトグラフィーや再結晶を繰り返し用いても、このような立体異性体を分離することは容易ではない。
特許文献８では脱脂したフェヌグリーク種子１００ｇからイオン交換樹脂によるクロマトグラフィーと再結晶により純度９９％の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを０．６ｇ得ているが、この回収率は高くないと思われる。特に再結晶は、その特性から目的物のろ液への減損を免れず、行うごとに回収率は低下していくからである。
合成法においても、副反応等により立体異性体が含まれることが多く、そのような不純物を除去するために、ＨＰＬＣや再結晶といった煩雑な操作が必要である。このような操作には、コスト面や設備面からのスケールアップの難しさや、収率の低下が伴う。
このように従来の４−ヒドロキシイソロイシン精製法には課題があり、より効率の良い簡便な方法が望まれていた。
【特許文献１】欧州特許第587476号明細書
【特許文献２】国際公開第2001/015689号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2005/039626号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2005/021596号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2004/087091号パンフレット
【特許文献６】特開2006-89449号公報
【特許文献７】米国特許出願第2006/0223884号明細書
【特許文献８】米国特許第5470879号明細書
【特許文献９】国際公開第2005/084323号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第2004/099120号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第2006/051000号パンフレット
【非特許文献１】Phytochemistry, vol.12, 1707-1711, 1973
【非特許文献２】Phytochemistry, vol.15, 325, 1976
【非特許文献３】Phytochemistry, vol.28, 1835-1841, 1989
【非特許文献４】Diabetes, Vol. 47, Issue 2 206-210, 1998
【非特許文献５】American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism,Vol.287, E463-E471, 2004
【非特許文献６】Amino Acids, vol.28, 71-76, 2005
【非特許文献７】European Journal of Organic Chemistry, vol.5, 834-839, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、簡便に、高純度かつ高収率で、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩（以下、「（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ」と称することもある）を単離精製する方法の提供を目的とする。
又、本発明は混合物から簡便に（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンを分離除去する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンをアミナール体に変換して有機溶媒抽出することにより、その立体異性体や、粗抽出物由来のサポニン類や他のアミノ酸等の他の化合物から、当該アミナール体を簡便かつ良好に分離できること等を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩の精製方法。
（ａ）混合物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩を、式：Ｑ−ＣＨＯ［式中、Ｑは、置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す。］で表されるアルデヒド化合物又はその等価体と反応させて、式（１）で表される化合物【０００５】
【化１】
2008102671.tif 000003
【０００６】
［式中、Ｑは上記で定義したとおりである。］
に変換する工程、
（ｂ）有機溶媒を用いて式（１）で表される化合物を抽出する工程、及び
（ｃ）式（１）で表される化合物を（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩に変換する工程。
〔２〕工程（ａ）において、式：Ｑ−ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物を反応に用いる、上記〔１〕記載の方法。
〔３〕工程（ｂ）の抽出工程により、式（１）で表される化合物から不純物を除去することを特徴とする、上記〔１〕記載の方法。
〔４〕式（１）において、Ｑが、置換基を有してもよい、フェニル基、シクロヘキシル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、フリル基又はピロリル基である、上記〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔５〕式（１）において、Ｑが置換基を有してもよいフェニル基である、上記〔４〕記載の方法。
〔６〕Ｑが置換基を有する場合の該置換基が、
（ｉ）炭素数１〜６のアルキル基、
（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコキシ基、
（ｉｉｉ）炭素数２〜７のアルカノイル基、
（ｉｖ）炭素数６〜１０のアリール基、
（ｖ）炭素数６〜１０のアリールオキシ基、
（ｖｉ）ハロゲノ基、
（ｖｉｉ）炭素数１〜６のハロゲノアルキル基、
（ｖｉｉｉ）ニトロ基、
（ｉｘ）ホルミル基、及び
（ｘ）シアノ基
（但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、炭素数１〜１０のアルキル基の置換基とはならない）
からなるグループから選ばれる、上記〔４〕又は〔５〕記載の方法。
〔７〕工程（ｂ）の有機溶媒が、少なくとも１種の酢酸アルキルである、上記〔１〕記載の方法。
〔８〕工程（ｃ）において、水、炭素数１〜４のアルキルで置換されていてもよいヒドロキシルアミン、アンモニア、炭素数１〜４のアルキルアミン、炭素数２〜８のジアルキルアミン、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基及び炭素数２〜７のアルカノイル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいヒドラジン、及び炭素数１〜６のアルキルで置換された第四級アンモニウムハライド、並びにそれらの化学的に許容しうる塩からなるグループから選ばれる少なくとも１種の求核試剤を用いる、上記〔１〕記載の方法。
〔９〕工程（ｃ）の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩への変換を、少なくとも１種の酢酸アルキル中で行う、上記〔１〕記載の方法。
〔１０〕少なくとも１種の酢酸アルキルが酢酸エチルである、上記〔９〕記載の方法。
〔１１〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩の分離除去方法。
（ａ）混合物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩を、式Ｑ−ＣＨＯ［式中、Ｑは、置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す。］で表されるアルデヒド化合物又はその等価体と反応させて、式（１）で表される化合物【０００７】
【化２】
2008102671.tif 000004
【０００８】
［式中、Ｑは上記で定義したとおりである。］
に変換する工程、及び
（ｂ）有機溶媒を用いて式（１）で表される化合物を抽出する工程。
〔１２〕工程（ａ）において、式：Ｑ−ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物を反応に用いる、上記〔１１〕記載の方法。
〔１３〕式（１）において、Ｑが、置換基を有してもよい、フェニル基、シクロヘキシル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、フリル基又はピロリル基である、上記〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕式（１）において、Ｑが置換基を有してもよいフェニル基である、上記〔１３〕記載の方法。
〔１５〕Ｑが置換基を有する場合の該置換基が、
（ｉ）炭素数１〜６のアルキル基、
（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコキシ基、
（ｉｉｉ）炭素数２〜７のアルカノイル基、
（ｉｖ）炭素数６〜１０のアリール基、
（ｖ）炭素数６〜１０のアリールオキシ基、
（ｖｉ）ハロゲノ基、
（ｖｉｉ）炭素数１〜６のハロゲノアルキル基、
（ｖｉｉｉ）ニトロ基、
（ｉｘ）ホルミル基、及び
（ｘ）シアノ基
（但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、炭素数１〜１０のアルキル基の置換基としては用いられない）
からなるグループから選ばれる、上記〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１６〕工程（ｂ）の有機溶媒が、少なくとも１種の酢酸アルキルである、上記〔１１〕記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩の単離精製方法として有用であり、クロマトグラフィーや再結晶よりも効率的に、高収率で、高純度の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを提供することができる。
より具体的には、フェヌグリーク抽出液、微生物を培養して得た発酵液等由来の４−ヒドロキシイソロイシン含有混合物から、効率的に（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを単離することができる。又、化学合成で得られた４−ヒドロキシイソロイシン含有混合物から、効率的に（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを単離することができる。
又、本発明の方法は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの分離除去方法としても有用であり、化合物の混合物中から、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを効率的に除くことができる。結果として、混合物中の他の化合物、例えばその立体異性体である（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン又はその化学的に許容しうる塩（以下、「（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ」と称することもある）の純度を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法において、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンは、化学的に許容しうる塩の形態であってもよい。当該「化学的に許容しうる塩」としては、本発明の方法に悪影響を及ぼさない塩であれば特に限定されないが、例えば、アンモニア；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属；アルミニウム；亜鉛；トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミン；アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸；塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸；酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸等との塩が挙げられる。【００１１】
本発明の精製方法あるいは分離方法において、その対象となる混合物は（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを含有する化学物質混合物であればよく、その含有率や他の物質の組成はなんら制限されない。本発明方法の対象となる混合物としては、植物組織抽出物、動物組織抽出物、微生物を培養して得た醗酵液、化学合成後の反応液由来の混合物等が挙げられる。
また、本発明の精製方法は、比較的純粋な（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ粗製物中のわずかな不純物を除去する場合にも適用することができる。
本発明の精製方法において、その結果として得られる（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの純度は精製前より向上していれば良く、特に制限はないが、本方法の好ましい態様においては、実質的に純粋な、例えば、１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）で測定した際に不純物ピークが観測されない、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬが提供される。【００１２】
本発明の式（１）で表される化合物は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬのアミナール体であり、式（１）中、Ｑは、置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す。
上記「置換基を有してもよい炭素数６〜１４のアリール基」の「炭素数６〜１４のアリール基」としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基等が挙げられ、好ましくは炭素数６〜１０のアリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基等）、より好ましくはフェニル基が挙げられる。
上記「置換基を有してもよい炭素数１〜１０のアルキル基」の「炭素数１〜１０のアルキル基」としては、炭素数１〜１０の直鎖又は分枝鎖のアルキル基、好ましくは炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等）が挙げられる。
上記「置換基を有してもよい炭素数３〜１０のシクロアルキル基」の「炭素数３〜１０のシクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられ、好ましくは炭素数５〜８のシクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等）、より好ましくはシクロヘキシル基が挙げられる。【００１３】
上記「置換基を有してもよい５〜１０員のヘテロ環基」の「５〜１０員のヘテロ環基」としては、例えば炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜４個含む５〜１０員の芳香族複素環基又は非芳香族複素環、及びその縮合環基が挙げられる。
当該芳香族の複素環基又はその縮合環基としては、２−又は３−チエニル、２−又は３−フリル、１−、２−又は３−ピロリル、１−、２−、４−又は５−イミダゾリル、２−、４−又は５−オキサゾリル、２−、４−又は５−チアゾリル、１−、３−、４−又は５−ピラゾリル、３−、４−又は５−イソオキサゾリル、３−、４−又は５−イソチアゾリル、１，２，４−トリアゾール−１−、３−、４−又は５−イル、１，２，３−トリアゾール−１−、２−又は４−イル、１Ｈ−テトラゾール−１−又は５−イル、２Ｈ−テトラゾール−２−又は５−イル、２−、３−又は４−ピリジル、２−、４−又は５−ピリミジニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−又は７−インドリル、２−、３−、４−、５−、６−又は７−ベンゾフリル、２−、３−、４−、５−、６−又は７−ベンゾチエニル、１−、２−、４−、５−、６−又は７−ベンズイミダゾリル、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−キノリル、１−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−イソキノリル等が挙げられる。
当該非芳香族の複素環基又はその縮合環基としては、２−又は３−ジヒドロチエニル、２−又は３−ジヒドロフリル、１−、２−又は３−ピロリニル、１−、２−、４−又は５−イミダゾリニル、２−、４−又は５−オキサゾリニル、２−、４−又は５−チアゾリニル、１−、３−、４−又は５−ピラゾリニル、３−、４−又は５−イソオキサゾリニル、３−、４−又は５−イソチアゾリニル、１，２，４−トリアゾリン−１−、３−、４−又は５−イル、１，２，３−トリアゾリン−１−、２−又は４−イル、１Ｈ−テトラゾリン−１−又は５−イル、２Ｈ−テトラゾリン−２−又は５−イル、２−、３−又は４−ジヒドロピリジル、２−、４−又は５−ジヒドロピリミジニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−又は７−ジヒドロインドリル、２−、３−、４−、５−、６−又は７−ジヒドロベンゾフリル、２−、３−、４−、５−、６−又は７−ジヒドロベンゾチエニル、１−、２−、４−、５−、６−又は７−ジヒドロベンズイミダゾリル、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−ジヒドロキノリル、１−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−ジヒドロイソキノリル、２−又は３−テトラヒドロチエニル、２−又は３−テトラヒドロフリル、１−、２−又は３−テトラヒドロピラニル、１−、２−又は３−ピロリジニル、１−、２−、４−又は５−イミダゾリジニル、２−、４−又は５−オキサゾリジニル、２−、４−又は５−チアゾリジニル、１−、３−、４−又は５−ピラゾリジニル、３−、４−又は５−イソオキサゾリジニル、３−、４−又は５−イソチアゾリジニル、１，２，４−トリアゾリジン−１−、３−、４−又は５−イル、１，２，３−トリアゾリジン−１−、２−又は４−イル、１Ｈ−テトラゾリジン−１−又は５−イル、２Ｈ−テトラゾリジン−２−又は５−イル、２−、３−又は４−ピペリジニル、１−又は２−ピペラジニル、１−、２−又は３−モルホリニル、１−、２−又は３−チオモルホリニル、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−テトラヒドロキノリル、１−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−テトラヒドロイソキノリル等が挙げられる。
当該「ヘテロ環基」としては、チエニル基、フリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、ピリジル基、インドリル基、ベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ジヒドロチエニル基、ジヒドロフリル基、テトラヒドロチエニル基、テトラヒドロフリル基、テトラヒドロピラニル基等が好ましく、より好ましくはチエニル基、フリル基、ピリジル基等が挙げられる。【００１４】
別の実施態様では、Ｑは、置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す。【００１５】
上記Ｑが表す「置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基」の置換基としては、例えば、次のものが挙げられる：
（ｉ）炭素数１〜６のアルキル基、
（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコキシ基、
（ｉｉｉ）炭素数２〜７のアルカノイル基、
（ｉｖ）炭素数６〜１０のアリール基、
（ｖ）炭素数６〜１０のアリールオキシ基、
（ｖｉ）ハロゲノ基、
（ｖｉｉ）炭素数１〜６のハロゲノアルキル基、
（ｖｉｉｉ）ニトロ基、
（ｉｘ）ホルミル基、及び
（ｘ）シアノ基
（但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、炭素数１〜１０のアルキル基の置換基とはならない）。【００１６】
別の実施態様では、上記置換基は、
（ｉ）炭素数１〜６のアルキル基、
（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコキシ基、
（ｉｉｉ）炭素数２〜７のアルカノイル基、
（ｉｖ）炭素数６〜１０のアリール基、
（ｖ）炭素数６〜１０のアリールオキシ基、
（ｖｉ）ハロゲノ基、
（ｖｉｉ）炭素数１〜６のハロゲノアルキル基、
（ｖｉｉｉ）ニトロ基、および
（ｉｘ）ホルミル基、
（但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、炭素数１〜１０のアルキル基の置換基とはならない）から選択される。【００１７】
上記「（ｉ）炭素数１〜６のアルキル基」は、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基である。
上記「（ｉｉ）炭素数１〜６のアルコキシ基」は、上記「炭素数１〜６のアルキル基」が酸素原子と結合してなる基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等が挙げられ、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基である。
上記「（ｉｉｉ）炭素数２〜７のアルカノイル基」は、上記「炭素数１〜６のアルキル基」がカルボニル基と結合してなる基であり、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、イソプロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｓｅｃ−ブチルカルボニル基、イソブチルカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル基、ペンチルカルボニル基、ヘキシルカルボニル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、イソプロピルカルボニル基である。【００１８】
上記「（ｉｖ）炭素数６〜１０のアリール基」としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基等が挙げられ、好ましくはフェニル基である。
上記「（ｖ）炭素数６〜１０のアリールオキシ基」は、上記「炭素数６〜１０のアリール基」が酸素原子と結合してなる基であり、例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられ、好ましくはフェノキシ基である。【００１９】
上記「（ｖｉ）ハロゲノ基」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、好ましくはフッ素原子、塩素原子、臭素原子である。
上記「（ｖｉｉ）炭素数１〜６のハロゲノアルキル基」は、上記「炭素数１〜６のアルキル基」が、置換可能な数、好ましくは１〜５個の１種又はそれ以上の上記「ハロゲノ基」で置換されてなる基であり、例えば、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、モノクロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、クロロフルオロメチル基、１−フルオロエチル基、１，１−ジフルオロエチル基、１，１，１−トリフルオロエチル基、ペンタフルオロエチル基、ペンタクロロエチル基等が挙げられ、好ましくはトリフルオロメチル基、トリクロロメチル基である。
上記「炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基」が上記置換基（ｉ）〜（ｘ）から選ばれる置換基を有する場合、特に断りがない限り、当該置換基の位置及び数は限定されない。上記置換基（ｉ）〜（ｘ）の数が２個以上の場合、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよい。但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、「炭素数１〜１０のアルキル基」の置換基とはならない。
また、上記「炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜１０のアルキル基又は５〜１０員のヘテロ環基」が上記置換基（ｉ）〜（ｉｘ）から選ばれる置換基を有する場合、特に断りがない限り、当該置換基の位置及び数は限定されない。上記置換基（ｉ）〜（ｉｘ）の数が２個以上の場合、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよい。但し、上記（ｉ）及び（ｖｉｉ）は、「炭素数１〜１０のアルキル基」の置換基とはならない。【００２０】
Ｑとしては、ある程度の嵩高さと脂溶性を有する基が好ましく、より具体的には、それぞれ置換基を有してもよい、フェニル基、シクロヘキシル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、フリル基及びピロリル基が好ましく、置換基を有してもよいフェニル基がより好ましい。これらの基において、置換基を有する場合の当該「置換基」としては、例えば、上記（ｉ）〜（ｘ）から選ばれる置換基等が挙げられる。
別の実施態様では、Ｑとしては、それぞれ置換基を有してもよい、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、フリル基及びピロリル基が好ましい。
Ｑとしては特に、ニトロフェニル基、フェニル基、シクロヘキシル基が好ましい。
別の実施態様では、Ｑとしては特に、ニトロフェニル基、フェニル基が好ましい。【００２１】
次に、本発明の方法をより詳しく説明する。
本発明の方法は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬが、アミナール化反応により、式（１）で表される化合物、すなわち、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬのアミナール体（１）（以下、単に「式（１）で表される化合物」又は「アミナール体（１）」という場合もある）に良好に変換され、かつ、式（１）の化合物が、有機溶媒中に良好に抽出されるとの知見に基づいて完成されたものである。
例えば、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを含有する溶液にアルデヒド化合物又はその等価体を加えると、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬのアミナール体（１）が生成する。（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬはそのままでは有機溶媒に抽出することが困難であるが、生成したアミナール体（１）は、脂溶性が向上し、有機溶媒に容易に抽出されうるようになる。これによりアミナール体（１）の抽出、分液操作による精製が可能になる。
一方、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの立体異性体である（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬは、上記の反応において、対応するアミナール体をほとんど形成しない。すなわち（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬと（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬとの混合物を用いて、通常の条件下でアミナール化を行うと（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬのみが選択的にアミナール化される。これにより、本発明の精製方法は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬに構造的に極めて類似した化合物である（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの除去すらも可能とする。【００２２】
以下に、本発明の方法の各工程を詳細に説明する。
（ａ）工程
本発明の方法では、先ず、（ａ）工程において、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを含有する混合物をアミナール化反応に供する。
アミナール化反応は、混合物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを、式Ｑ−ＣＨＯ（Ｑは上記で定義したとおりである）で表されるアルデヒド化合物又はその等価体と反応させることにより行われる。この際、その等価体ではなくアルデヒド化合物そのものを用いるのが好ましい。
ここで、アルデヒド化合物の等価体とは、本アミナール化反応においてアルデヒド化合物Ｑ−ＣＨＯ（Ｑは上記で定義したとおりである）と同様に働く合成等価体である。そのようなアルデヒド化合物の等価体としては、式Ｑ−ＣＨＯで表される化合物（Ｑは上記で定義したとおりである）に対応する、アセタール体、ヘミアセタール体、アミナール体、ジハロゲノメチル体等があり、アセタール体及びヘミアセタール体が特に好ましい。より具体的には、式Ｑ−ＣＨ（ＯＲ’）ＯＲ”[Ｑは上記で定義したとおりであり、Ｒ’は水素原子、メチル基又はエチル基を表し、Ｒ”はメチル基又はエチル基を表すか、或いはＲ’とＲ”とは結合してエチレン基を形成しても良い。]で表されるアセタール又はヘミアセタール化合物が挙げられる。
式Ｑ−ＣＨＯで表されるアルデヒド化合物又はその等価体は、混合物中の４−ヒドロキシイソロイシン含量に対し、１〜５当量を添加することが好ましい。ここで、「混合物中の４−ヒドロキシイソロイシン含量」とは、混合物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの含量を示し、混合物中に（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬとその立体異性体（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬとが含まれる場合は、これらの含量の合計を示す。
上記反応は、必要により塩基存在下で行ってもよい。当該塩基は、無機塩基又は有機塩基のいずれでもよく、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、アンモニア水等の有機塩基等が好ましい。
反応液中の塩基の濃度は約０．１ｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌが好ましく、混合物中の４−ヒドロキシイソロイシン含量に対し、約１〜１０当量程度が好ましい。
上記反応は、必要により溶媒中で行ってもよい。当該反応溶媒としては、水、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、イソプロパノールもしくは１，４−ジオキサン、又はそれらの任意の比率による混合溶媒が好ましい。
上記反応の反応温度は、０℃〜５０℃が好ましい。【００２３】
（ｂ）工程
次に、（ｂ）工程において、得られたアミナール体（１）を、適切な有機溶媒を用いて抽出する。
アミナール体（１）を抽出する有機溶媒としては、例えば、酢酸アルキル、ヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム等の水と任意に混合しない溶媒及びその２種以上の混合物が挙げられ、少なくとも１種の酢酸アルキルが好ましい。当該「酢酸アルキル」としては、例えば、酢酸の炭素数１〜１０のアルキルエステルが挙げられ、酢酸の炭素数１〜４のアルキルエステル（例、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等）がより好ましい。
この際、好適には、アミナール体（１）の有機溶媒抽出の前に、反応後の混合物を、必要に応じて水や塩基を加えて、アルカリ性の水性溶液として、有機溶媒洗浄するとよい。未反応で残ったアルデヒド又はその等価体等は、有機溶媒（例、上記で説明した酢酸アルキル等）に抽出することにより取り除くことができる。
洗浄後の水層に酸性溶液を加えて弱酸性とすれば、アミナール体（１）のカルボキシル基の解離が抑えられ、適当な有機溶媒で抽出することができる。なお、この際未反応の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬは水層に残るため、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬのアミナール体（１）のみが高純度で有機溶媒中に抽出されるので、両者を効率的に分離することができる。
適応できる酸性溶液としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、酪酸、乳酸、シュウ酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸等、脂溶性の低い酸の水溶液が好ましい。
上記のようにして、アミナール体（１）から未反応のアルデヒド又はその等価体、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ等の不純物を除去することができる。
有機溶媒抽出されたアミナール体（１）は、次の（ｃ）工程の脱アミナール反応に進む前に、晶析、スラリー洗浄、乾燥等の通常用いられる精製方法によりさらに精製することができる。【００２４】
（ｃ）工程
次に、（ｃ）工程において、アミナール体（１）を脱アミナール反応に供することにより、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬに復元する。
アミナール体（１）の脱アミナール反応の方法は特に限定されず、例えば、アミナール体（１）を、上記（ｂ）工程で得られた含水の抽出溶媒中で静置するだけでも、脱アミナール化が進行して（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬに変換される。
好適には、この脱アミナール反応は、求核試剤を用いて行われる。
適応できる求核試剤としては、水、炭素数１〜４のアルキル基で置換されていてもよいヒドロキシルアミン（例、ヒドロキシルアミン）、アンモニア、炭素数１〜４のアルキルアミン（例、メチルアミン）、炭素数２〜８のジアルキルアミン（例、ジメチルアミン）、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基及び炭素数２〜７のアルカノイル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいヒドラジン（例、ヒドラジン、メチルヒドラジン、フェニルヒドラジン、アセチルヒドラジン）、炭素数１〜６のアルキル基で置換された第四級アンモニウムハライド（例、テトラブチルアンモニウムフルオリド、テトラブチルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムブロミド、テトラブチルアンモニウムヨージド）等が好ましく、ヒドロキシルアミン、メチルアミン及びヒドラジンが特に好ましい。
脱アミナール反応は、必要に応じて、溶媒中で行う。当該溶媒としては、反応に悪影響を与えないものであればいかなる溶媒も用いることができ、例えば、エステル系溶媒（例、上記（ｂ）工程の説明で例示したものと同様の酢酸アルキル）、炭化水素系溶媒（例、ヘキサン、ヘプタン）、エーテル系溶媒（例、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル）、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例、ジクロロメタン、クロロホルム）、アルコール系溶媒（例、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、又はそれらの混合溶媒が好ましく、少なくとも１種の酢酸の炭素数１〜４のアルキルエステルがより好ましく、酢酸エチルが最も好ましい。（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬは酢酸エチルへの溶解度が低く、濃度等を適当に設定すれば、反応後その結晶を析出物として容易に得ることができる。【００２５】
なお、特に、式（１）中のＱが、置換基を有してもよい、炭素数６〜１４のアリール基又は５〜１０員のヘテロ環基を表す場合、脱アミナール反応は、接触還元によっても好適に行われる。
当該接触還元に適応できる金属触媒としては、パラジウム、ロジウム、プラチナ等が好ましい。
当該接触還元に適応できる反応溶媒としては、水、メタノール、エタノールもしくは酢酸エチル、又はそれらの混合溶媒が好ましい。
このようにして復元された（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬは、再晶析、スラリー洗浄、乾燥等の通常用いられる精製方法によりさらに精製してもよい。
このようにして単離精製された（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬは、医薬品（糖尿病治療剤等）、健康食品素材、香粧品素材等として有用であり、さらには各種医薬品の合成中間体としても有用である。【００２６】
例えば、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを糖尿病予防・治療剤として使用する場合には、そのまま或いは自体公知の方法に従って、医薬的に許容し得る担体とともに混合した医薬組成物として、経口もしくは非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、坐薬、注腸、軟膏、貼布、舌下、点眼、吸入等のルート）により投与することができる。上記目的のために用いる投与量は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により決定されるが、経口もしくは非経口のルートにより、通常成人一日あたりの投与量として経口投与の場合で１μｇ〜１０ｇ、非経口投与の場合で０．０１μｇ〜１ｇを用い、１日１回〜数回投与する。また、上記医薬組成物中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの含有量は、組成物全体の約０．０１重量％〜１００重量％である。【００２７】
上記医薬組成物における医薬的に許容し得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、水溶性高分子、塩基性無機塩；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、発泡剤、香料等の添加物を用いることもできる。
このような医薬組成物の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、液剤、糖衣剤、デポー剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、舌下剤、貼付剤、口腔内崩壊剤（錠）、吸入剤、注腸剤、軟膏剤、貼り布剤、テープ剤、点眼剤が挙げられ、普通の製剤助剤を用いて常法に従って製造することができる。【００２８】
上記医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。
例えば、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを経口用製剤として調製する場合には、賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例えば錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、糖衣剤、デポー剤、又はシロップ剤等とする。賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース等が、結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドン等が、崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチン等が、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては、医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤又は顆粒剤には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差しつかえない。
注射剤を調製する場合には必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。【００２９】
また、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬは前述のとおり、糖尿病の予防・治療剤として用いることが出来るが、通常用いられる他の糖尿病治療剤、糖尿病合併症の予防・治療剤と併用して用いることも出来る。通常用いられる糖尿病治療剤、糖尿病合併症の予防・治療剤とは、例えば、インスリン製剤、インスリン誘導体、インスリン様作用剤、インスリン分泌促進剤、インスリン抵抗性改善剤、ビグアナイド剤、糖新生阻害剤、糖吸収阻害剤、腎糖再吸収阻害剤、β３アドレナリン受容体アゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）類縁体、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、アルドース還元酵素阻害剤、終末糖化産物生成阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害薬、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬、抗高脂血症薬、食欲抑制剤、リパーゼ阻害薬、血圧降下剤、末梢循環改善薬、抗酸化剤、糖尿病性神経障害治療薬等の１種又は２種以上の組み合わせや混合物が挙げられる。【００３０】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬと組み合わせて使用される薬剤は、混合して一剤とするか、それぞれを別途製剤化するか、又はそれぞれを別途製剤化したものを一つの容器に梱包した組み合わせ製剤（セット、キット、パック等）としてもよい。【００３１】
併用する場合の投与形態は特に限定されず、例えば、（１）単一の製剤としての投与、（２）別製剤の同一投与経路での同時投与、（３）別製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）別製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）別製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与等が挙げられる。【００３２】
組み合わせて使用される薬剤の具体的な化合物や処置すべき好適な疾患について下記の通り例示するが、本発明の内容はこれらに限定されるものではない。【００３３】
インスリン製剤としては、ＮＰＨ、レンテ、ウルトラレンテ、経肺吸収可能なインスリン等が挙げられる。
インスリン誘導体とは、インスリンから誘導されるタンパク質又はペプチドでインスリン作用を保持しているものをいい、例えばリスプロ、Ｂ１０Ａｓｐ、ｇｌａｒｇｉｎｅ等が挙げられる。
インスリン様作用剤とは、細胞への糖取り込み促進作用等のインスリンの生理作用を、ある程度インスリンに依存せずに発揮することによって、血糖降下作用を発揮する、インスリン誘導体以外のものをいい、例えばインスリン受容体キナーゼ刺激薬（例えばＬ−７８３２８１、ＴＥＲ−１７４１１、ＣＬＸ−０９０１、ＫＲＸ−６１３等）、バナジウム等が挙げられる。【００３４】
インスリン分泌促進剤とは、膵臓β細胞に作用し、血液中へのインスリン分泌を増加させることによって、血糖降下作用を発揮するものをいい、例えばスルホニルウレア剤（例えば、トルブタミド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリクラジド、グリメピリド、グリピジド、グリベンクラミド（グリブリド）等）、メグリチニド類（例えば、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド等）、スルホニルウレア剤・メグリチニド類以外のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤（例えばＢＴＳ−６７−５８２等）等が挙げられる。【００３５】
インスリン抵抗性改善剤とは、インスリンの標的組織におけるインスリンの作用を増強することによって、血糖降下作用を発揮するものをいい、例えば、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（ＰＰＡＲ）γアゴニスト（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン等のチアゾリジンジオン系化合物、或いはＧＩ−２６２５７０、ＧＷ−１９２９、ＪＴＴ−５０１、ＹＭ−４４０等の非チアゾリジンジオン系化合物等）、ＰＰＡＲγアンタゴニスト（例えばｂｉｓｐｈｅｎｏｌ  Ａ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ、ＬＧ−１００６４１等）、ＰＰＡＲαアゴニスト（クロフィブラート、ベザフィブラート、クリノフィブラート等のフィブラート系化合物、或いは非フィブラート系化合物等）、ＰＰＡＲα／γアゴニスト（例えばＫＲＰ−２９７等）、レチノイドＸ受容体アゴニスト（例えばＬＧ−１００２６８等）、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト（例えばＨＸ５３１等）、プロテインチロシンホスファターゼ−１Ｂ阻害剤（例えばＰＴＰ−１１２等）等が挙げられる。【００３６】
ビグアナイド剤とは、肝臓における糖新生抑制作用や組織での嫌気的解糖促進作用或いは末梢におけるインスリン抵抗性改善作用等によって、血糖降下作用を発揮するものをいい、例えば、メトホルミン、フェンホルミン、ブホルミン等が挙げられる。
糖新生阻害剤とは、主に糖新生を阻害することによって、血糖降下作用を発揮するものをいい、例えば、グルカゴン分泌抑制剤（例えばＭ＆Ｂ  ３９８９０Ａ等）、グルカゴン受容体アンタゴニスト（例えばＣＰ−９９７１１、ＮＮＣ−９２−１６８７、Ｌ−１６８０４９、ＢＡＹ２７−９９５５等）、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤等が挙げられる。【００３７】
糖吸収阻害剤とは、食物中に含まれる炭水化物の消化管における酵素消化を阻害し、体内への糖の吸収を阻害又は遅延することによって、血糖降下作用を発揮するものをいい、例えば、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボース、ボグリボース、ミグリトール等）、α−アミラーゼ阻害剤（例えばＡＺＭ−１２７等）等が挙げられる。
腎糖再吸収阻害剤とは、腎尿細管中の糖の再吸収を阻害することによって、血糖降下作用を発揮するものをいい、例えば、ナトリウム依存性グルコース輸送体阻害剤（例えばＴ−１０９５、フロリジン等）等が挙げられる。【００３８】
β３アドレナリン受容体アゴニストとは、脂肪細胞におけるβ３アドレナリン受容体を刺激し、脂肪酸酸化を亢進させてエネルギーを消費させることによって、肥満症、高インスリン血症の改善作用を発揮するものをいい、例えば、ＣＬ−３１６２４３、ＴＡＫ−６７７等が挙げられる。
グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）類縁体としては、例えば、エキセンジン−４、ＮＮ−２２１１等が挙げられ、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニストとしては、例えば、ＡＺＭ−１３４等が挙げられ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤としては、例えば、ＮＶＰ−ＤＰＰ−７２８等が挙げられる。グルカゴン様ペプチド−１類縁体、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤及びグルカゴン様ペプチド−１は、細胞におけるグルカゴン様ペプチド−１の作用を模倣又は増強することによって、糖尿病改善作用を発揮するものをいう。
アルドース還元酵素阻害剤とは、糖尿病性合併症の処置に好ましいもののうち、糖尿病性合併症を発症する組織において認められる、高血糖状態の持続に起因するポリオール代謝経路の亢進によって過剰に蓄積される細胞内ソルビトールを、アルドース還元酵素を阻害することによって低下させるものをいい、例えば、エパルレスタット、トルレスタット、フィダレスタット、ゼネレスタット等が挙げられる。【００３９】
終末糖化産物生成阻害剤とは、糖尿病性合併症の処置に好ましいもののうち、糖尿病状態における高血糖状態の持続によって亢進する終末糖化産物の生成を阻害することによって細胞障害を軽減させるものをいい、上記糖尿病合併症予防・治療剤もこのカテゴリーに含まれるが、上記糖尿病合併症予防・治療剤と併用する場合は、上記糖尿病合併症予防・治療剤以外であって、例えば、ＮＮＣ−３９−００２８、ＯＰＢ−９１９５等が挙げられる。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３阻害薬としては、例えば、ＳＢ−２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４等が挙げられ、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬としては、例えばＣＰ−９１１４９等が挙げられる。【００４０】
抗高脂血症薬としては、例えば、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素阻害剤（例えばプラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン等）、フィブラート系薬剤（例えばクロフィブラート、ベザフィブラート、シンフィブラート等）、胆汁酸排泄促進薬等が挙げられる。
食欲抑制薬としては、例えば、シブトラミン、マジンドール等が挙げられ、リパーゼ阻害薬としては、例えば、オルリスタット等が挙げられる。
血圧降下剤としては、例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（例えばカプトプリル、アラセプリル等）、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（例えばカンデサルタンシレキセチル、バルサルタン等）、カルシウム拮抗薬（例えばシルニジピン、アムロジピン、ニカルジピン等）、利尿薬（例えばトリクロルメチアジド、スピロノラクトン等）、交感神経遮断薬（例えばクロニジン、レセルピン等）等が挙げられる。
末梢循環改善薬としては、例えば、イコサペント酸エチル等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、リポ酸、プロブコール等が挙げられる。
糖尿病性神経障害治療薬としては、例えば、メコバラミン、塩酸メキシレチン等が挙げられる。【００４１】
また、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬは食品添加物としても有用である。
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを含有する食品組成物は、糖尿病の予防・治療用食品として有用である。【００４２】
本明細書中で用いる「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品をも含むものであり、さらにダイエタリーサプリメントも包含される。【００４３】
本明細書に記載の食品組成物の形態は特に限定はなく、経口摂取できる形態であればいずれの形態であってもよい。
例えば、粉末、顆粒、タブレット、ハードカプセル、ソフトカプセル、液体（飲料、ゼリー飲料等）、キャンディ、チョコレート等を挙げることができ、いずれも、当該技術分野で自体公知の方法により製造することができる。
食品組成物における（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの含量は、指示された範囲の適当な用量が得られるように適宜決められる。【００４４】
上記食品組成物は、必要に応じて、他の食品添加剤を使用することができる。このような食品添加剤としては、味を調整改良する果汁、デキストリン、環状オリゴ糖、糖類（果糖、ブドウ糖等の単糖類及び多糖類）、酸味料、香料、抹茶粉末等、またテクスチャーを改善する乳化剤、コラーゲン、全粉乳、増粘多糖類や寒天等、更にはビタミン類、卵殻カルシウム、パントテン酸カルシウム、その他ミネラル類、ローヤルゼリー、プロポリス、蜂蜜、食物繊維、アガリクス、キチン、キトサン、フラボノイド類、カロテノイド類、ルテイン、漢方生薬、コンドロイチン、各種アミノ酸等の通常健康食品等の成分として使用されているものを挙げることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（試験例）
［分析条件］
（１）１Ｈ−ＮＭＲ：Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００ＶＸ（３００ＭＨｚ）にて測定した。
（２）ＬＣＭＳ：
（ＨＰＬＣ）：Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ｓｅｒｉｅｓ１１００
カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ１８  ３．５μｍ  ４．６×５０ｍｍ
移動相：０．０５％ＴＦＡ含有水と０．０４％ＴＦＡ含有アセトニトリル
グラジエント：５分間で０．０４％ＴＦＡ含有アセトニトリルが５％から９８％まで直線的に増加する条件
流速：２ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ検出器（２１０ｎｍ〜３００ｎｍ）
（Ｍａｓｓ）：Ｗａｔｅｒｓ社  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍを用いてＥＳＩ及びＰＤＡを検出した。【００４６】
実施例１：フェヌグリーク種子からの（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの精製
（工程１）４−ヒドロキシイソロイシン粗製物（ＨＩＬ粗製物）の抽出
フェヌグリーク種子（５ｇ）をミルで摩砕し、ヘキサン（５０ｍｌ）で脱脂した。次いで７０％エタノール水溶液（５０ｍｌ）で一晩浸漬した後、残渣をろ別し、７０％エタノール（６０ｍｌ）で洗浄した。ろ液を減圧留去してＨＩＬ粗製物を得た。
（工程２）ｐ−ニトロベンズアルデヒドによるアミナール化と有機溶媒抽出
上記で得られたＨＩＬ粗製物を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）と混合し、ｐ−ニトロベンズアルデヒド（０．２ｇ）のアセトニトリル（３ｍｌ）溶液を加えて２５℃で一晩撹拌した。アセトニトリルを減圧留去した後、酢酸エチル（関東化学株式会社１級９９％以上）（５０ｍｌ）で過剰なアルデヒドを洗浄した。得られた水層を１Ｍクエン酸水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、該乾燥剤をろ別してアミナール体、（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸、の酢酸エチル溶液を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２８１［Ｍ＋Ｈ］＋
（工程３）脱アミナール化
上記工程で得られた（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸の酢酸エチル溶液に５０％ヒドロキシルアミン水溶液（０．１ｍｌ）を加えて３日間静置し、析出した結晶をろ取して（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（３０ｍｇ）を得た。本結晶はＬＣＭＳにて１ピークであり、さらに１Ｈ−ＮＭＲでも不純物ピークが認められず、高純度の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬであることが確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３  Ｈｚ），１．７５−１．８３（１Ｈ，ｍ），３．７０（１Ｈ，ｍ），３．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １４８［Ｍ＋Ｈ］＋【００４７】
実施例２：４−ヒドロキシイソロイシン立体異性体混合物のｐ−ニトロベンズアルデヒドによるアミナール化（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸の合成）【００４８】
【化３】
2008102671.tif 000005
【００４９】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンと（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンの約１：１混合物（０．４ｇ）と５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）を混合し、ｐ−ニトロベンズアルデヒド（０．４１ｇ）のアセトニトリル（２０ｍｌ）溶液を加えて一晩撹拌した。アセトニトリルを減圧留去した後、酢酸エチルで過剰なアルデヒドを洗浄した。得られた水層を１Ｍ塩酸水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。該乾燥剤をろ別した後、手早く溶媒を減圧留去し、（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬに対応する立体異性体）（０．３ｇ）を得た。得られた固体はＬＣＭＳにて１ピークであり、さらに１Ｈ−ＮＭＲでも、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬに対応する立体異性体由来のピークは認められなかった。また得られた化合物の絶対配置はそのＮＯＥＳＹスペクトルからも支持された。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝１．００（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．３４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．４５−１．５８（１Ｈ，ｍ），３．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），３．６０−３．７０（１Ｈ，ｍ），５．３９（１Ｈ，ｓ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），８．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２８１［Ｍ＋Ｈ］＋【００５０】
ＮＯＥＳＹスペクトルを測定した結果、下記のようなクロスピークが観測された。【００５１】
【化４】
2008102671.tif 000006
【００５２】
すなわち、得られた化合物は、以下の立体配置を有する（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸であることが確認された。【００５３】
【化５】
2008102671.tif 000007
【００５４】
実施例３：ヒドロキシルアミンによる脱アミナール反応【００５５】
【化６】
2008102671.tif 000008
【００５６】
実施例２と同様の操作で得られた（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２ｍｌ）に溶解し、５０％ヒドロキシルアミン水溶液（０．０１ｍｌ）を加えて２時間撹拌した。析出した結晶をろ取し、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（７ｍｇ）を得た。得られた結晶はＬＣＭＳにて１ピークであり、さらに１Ｈ−ＮＭＲでも不純物ピークが認められず高純度の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンであることが確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．７５−１．８３（１Ｈ，ｍ），３．７０（１Ｈ，ｍ），３．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １４８［Ｍ＋Ｈ］＋【００５７】
実施例４：メチルアミンメタノール溶液による脱アミナール反応
５０％ヒドロキシルアミン水溶液の代わりに４０％メチルアミンメタノール溶液(０．０１４ｍｌ)を用いて実施例３に準じて操作を行うことにより、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ（４ｍｇ）を得ることができた。得られた結晶はＬＣＭＳにて１ピークであり、さらに１Ｈ−ＮＭＲでも不純物ピークが認められず、高純度の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンであることが確認された。【００５８】
実施例５：ヒドラジン一水和物による脱アミナール反応
５０％ヒドロキシルアミン水溶液の代わりに、ヒドラジン一水和物（０．０１ｍｌ）を用いて実施例３に準じて操作を行うことにより、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ（２０ｍｇ）を得ることができた。得られた結晶はＬＣＭＳにて１ピークであり、さらに１Ｈ−ＮＭＲでも不純物ピークが認められず、高純度の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンであることが確認された。【００５９】
実施例６：４−ヒドロキシイソロイシン立体異性体混合物のシクロヘキシルアルデヒドによるアミナール化（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−シクロヘキシル−５，６−ジメチル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸の合成）【００６０】
【化７】
2008102671.tif 000009
【００６１】
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬと（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの約３：２混合物（０．１ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２．３ｍｌ）に溶解し、シクロヘキシルアルデヒド（０．０７６ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．３ｍｌ）溶液を加えて一晩撹拌した。アセトニトリルを減圧留去した後、酢酸エチルで過剰なアルデヒドを洗浄した。得られた水層を２Ｍクエン酸水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ別した後、手早く溶媒を減圧留去し、（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−シクロヘキシル−５，６−ジメチル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸（０．０６７ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝１．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．０７−１．４０（６Ｈ，ｍ），１．６０−２．００（９Ｈ，ｍ），３．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），３．４２−３．５０（１Ｈ，ｍ），４．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２４２［Ｍ＋Ｈ］＋【００６２】
実施例７：ヒドロキシルアミンによる（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−シクロヘキシル−５，６−ジメチル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸の脱アミナール反応
実施例６で得られた（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−シクロヘキシル−５，６−ジメチル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸（０．０６７ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍｌ）に溶解し、５０％ヒドロキシルアミン水溶液（０．０１７ｍｌ）を加えて２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣に酢酸エチルを加え、不溶な結晶をろ取して（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシン（２８ｍｇ）を得た。得られた結晶はＬＣＭＳにて１ピークであり、１Ｈ−ＮＭＲでも不純物ピークが認められず高純度の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシイソロイシンであることが確認された。【００６３】
実施例８：ＨＩＬの立体異性体混合物のベンズアルデヒドによるアミナール化（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−フェニル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸の合成）
（工程１）ベンズアルデヒドによるアミナール化と有機溶媒抽出
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬと（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの約１：１混合物（０．１ｇ）を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２．７ｍｌ）に溶解し、ベンズアルデヒド（０．０８４ｇ）のアセトニトリル（２．７ｍｌ）溶液を加えて一晩撹拌した。アセトニトリルを減圧留去した後、酢酸エチル（関東化学株式会社１級９９％以上）で過剰なアルデヒドを洗浄した。得られた水層を１Ｍクエン酸水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ別し、（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−フェニル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸の酢酸エチル溶液を得た。
（工程２）接触還元による脱アミナール反応
酢酸エチル層を室温、開放系で静置して、高純度（１Ｈ−ＮＭＲ及びＬＣＭＳ）の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ（１２ｍｇ）を析出結晶として得た。さらに、該結晶をろ取により取り除いた後のろ液中のアミナール体を以下のようにして（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬへと変換した。
ろ液の溶媒を減圧留去し、残渣に水とメタノールの１：２混合溶媒、触媒量の１０％パラジウム炭素を加え、系中を水素で置換して一晩撹拌した。パラジウム炭素をろ別した後、減圧濃縮と凍結乾燥により（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬ（４０ｍｇ）を得た。本凍結乾燥品はＬＣＭＳにて１ピークであった。【００６４】
実施例９：種々のアルデヒドによるアミナール化
実施例６に記載と同様の方法で以下の化合物を得た。
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−フェニル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．３５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．６３−１．７８（１Ｈ，ｍ），３．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），３．６８−３．７４（１Ｈ，ｍ），５．４７（１Ｈ，ｓ），７．４０−７．４４（３Ｈ，ｍ），７．５４−７．６０（２Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２３６［Ｍ＋Ｈ］＋【００６５】
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−ピリジル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝０．９８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．３４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．４２−１．５８（１Ｈ，ｍ），３．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），３．６０−３．６８（１Ｈ，ｍ），５．３１（１Ｈ，ｓ），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），８．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２３７［Ｍ＋Ｈ］＋【００６６】
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−５，６−ジメチル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２７０［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−メトキシフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２６６［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−メチルフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２５０［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ３０４［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（４−フルオロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２５４［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（４−シアノフェニル）−５，６−ジメチル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２６１［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−２−（２−クロロフェニル）−５，６−ジメチル−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２７０［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（２−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２８１［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（３−ニトロフェニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２８１［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（２−チエニル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２４２［Ｍ＋Ｈ］＋
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５，６−ジメチル−２−（２−フリル）−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−４−カルボン酸
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ２２６［Ｍ＋Ｈ］＋
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の方法によれば、効率的に、高収率で、高純度の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ＨＩＬを得ることができる。得られた（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ＨＩＬは、例えば、医薬品（糖尿病治療剤等）、健康食品素材、香粧品素材等として有用であり、さらには各種医薬品の合成中間体としても有用である。
また、本発明の方法は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬの分離除去方法としても有用であり、化合物の混合物中から、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−ＨＩＬを効率的に除くことができる。
本出願は日本で出願された特願２００７−０４２７１１および特願２００７−１４４５７８を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。また、本明細書で引用した特許文献および非特許文献は、引用したことによってその内容の全てが開示されたと同程度に本明細書中に組み込まれるものである。
【国際調査報告】
2008102671.tif 000013
2008102671.tif 000014
2008102671.tif 000015
2008102671.tif 000016