(57)【要約】【課題】  本発明は、一酸化窒素合成酵素活性化剤、並びに、その投与方法及び投与量を見出すことを課題とする。【解決手段】  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤。特に、血中、冠動脈内、又は、静脈内に投与されることを特徴とする、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤等。【選択図】なし
2008129851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【請求項２】
ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する血管拡張剤。
【請求項３】
虚血又は虚血／再灌流による障害を治療又は予防するための、請求項２に記載の血管拡張剤。
【請求項４】
冠動脈拡張剤である、請求項２又は請求項３に記載の血管拡張剤。
【請求項５】
ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する血圧低下剤。
【請求項６】
血液中に投与されることを特徴とする、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する虚血性疾患又は虚血／再灌流後の筋細胞障害の治療薬又は予防薬。
【請求項７】
静脈内又は冠動脈内に投与されることを特徴とする、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する虚血性疾患又は虚血／再灌流後の筋細胞障害の治療薬又は予防薬。
【請求項８】
虚血性疾患又は虚血／再灌流後の筋細胞障害が、虚血性心疾患又は虚血／再灌流後の心筋細胞障害である、請求項６又は請求項７に記載の治療薬又は予防薬。
【請求項９】
５０ｎｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の治療薬又は予防薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性疾患は動脈硬化、臓器移植、循環障害、外科手術時の止血等により、臓器や組織に供給される血流が著しく停滞することにより生じる疾患である。また、虚血状態の臓器や組織は、血流を再開する（再灌流）ことにより再酸素化に曝されると、炎症反応を惹起し、虚血再灌流障害を引き起こすことが知られている。特に、心筋組織は、主に好気性代謝に依存しており、その酸素需要は冠動脈から供給を受けている。心筋組織は、他の組織と比較して酸素消費量が多く、心臓における冠動脈血からの酸素摂取率は、安静時においてもほぼ最大の約７５％程度といわれている。このため、冠循環において心筋酸素需要が増加した場合には、酸素摂取率の増加により調節することが難しく、主に冠血流量の増加により調節されている。【０００３】
このように、心筋は虚血に対して脆弱であることから、血管攣縮、血栓、動脈硬化等により冠動脈が閉塞されると、心筋細胞が障害を受けることが知られている。その結果、心筋は一時的な虚血状態から狭心症の発作を起こし、また、長期間にわたる血流障害により心筋梗塞を引き起こす。このように心筋の虚血に由来して生じる心臓疾患を虚血性心疾患と呼んでいる。【０００４】
虚血性心疾患の治療においては、心臓負荷を軽減するβ遮断薬や持続性硝酸薬、及び、冠血管拡張作用を有するカルシウム拮抗薬や硝酸薬等の治療薬等による薬物療法が行われている。また、死亡率が３０％前後にもなる急性心筋梗塞等においては、血栓溶解剤の投与や、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡまたはＰＯＢＡ）、ロータブレータ、方向性冠動脈粥腫切除術（directional coronary atherectomy：ＤＣＡ）、ステント等の冠動脈インターベンションによる再灌流療法が有効であると考えられている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、及び、非特許文献３参照）。しかし、これらの治療により虚血状態は改善されるものの、一時的な虚血状態に陥ったことによる細胞障害等により、虚血状態が改善した後も心臓の機能が完全に回復しないという問題があった。依然として心疾患は世界中で主要な死因となっており、より効果的な治療薬が求められている。【０００５】
また、冠動脈インターベンション等の再灌流療法により太い冠動脈の狭窄が解除された後も、再疎通により強い炎症反応やアポトーシス等が生じて心筋が障害を受け（再灌流障害）、又は、致死性不整脈が出現することにより突然死が起き、治療施行後も病院内死亡率は約１０％と高いことが知られている。また、たとえ再灌流治療が成功しても広範な心筋障害が残存した場合は重篤な心機能不全により、心不全に陥りやすく、致死性不整脈による突然死の危険性が常に付きまとっている。このように、急性期の初期治療による再灌流障害や障害面積拡大の予防は、きわめて重要と考えられている。これまで再灌流障害を引き起こす原因として、好中球等の炎症性細胞の活性化や血管内皮細胞によるサイトカインや接着分子等の一過性の亢進等が考えられているが、再灌流障害を予防又は治療するための真のターゲットは見出されていなかった。【０００６】
一酸化窒素合成酵素（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）は、Ｌ−アルギニンを基質として一酸化窒素（ＮＯ）を産生する酵素であり、神経型（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＮＯＳ：ｎ−ＮＯＳ）、誘導型（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＮＯＳ：ｉ−ＮＯＳ）、血管内皮型（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＮＯＳ：ｅＮＯＳ）が知られている。ｅＮＯＳにより産生されたＮＯは、血管内皮細胞に主に分布しており、血管平滑筋細胞の可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化してｃＧＭＰの増加を促すことにより血管を弛緩させる。虚血性疾患及び虚血再灌流障害においては、ｅＮＯＳ由来のＮＯが、血小板凝集抑制作用、白血球の血管内皮への接着・浸潤抑制作用（接着因子発現抑制作用）、ＮＦ−κＢ活性抑制作用、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用、スーパーオキシド消去作用等、血管系に対する保護作用を有することが報告されている。再灌流後は血管内皮細胞が障害を受けることにより、ｅＮＯＳを介したＮＯ産生が低下することが知られており、虚血（再灌流）時における、適量のＮＯの供給は、局所の虚血と正常の境界域の血流維持や、再灌流後の炎症細胞浸潤を調節して細胞傷害を抑制するため、虚血（再灌流）の治療方法として注目されている。【０００７】
ミッドカイン（midkine：以下、「ＭＫ」という）は、胚性癌細胞のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された細胞増殖因子又は細胞分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである（例えば、非特許文献４及び非特許文献５参照）。ＭＫのアミノ酸配列は、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）と５０％の相同性を示し、これらはヘパリン結合性のファミリータンパク質であると考えられている。本発明者らはこれまで、ＭＫが上述の虚血性細胞障害及び虚血／再灌流後の心筋細胞障害を予防及び治療する効果があること（特許文献１参照）、並びに、ＭＫの虚血性細胞障害及び虚血／再灌流後の心筋細胞障害の予防及び治療効果の一部がアポトーシス抑制作用に基づくこと（特許文献２、特許文献３、特許文献４及び非特許文献６参照）を見出した。また、ＭＫのファミリータンパク質であるＰＴＮは血管新生作用を有することが報告されており、ＭＫは、ファミリータンパク質であるＰＴＮ同様に血管新生作用を有すると考えられている（特許文献５参照）。【０００８】
これまで本発明者らは、ＭＫのアポトーシス抑制作用を利用した虚血／再灌流後の心筋細胞障害の治療効果を検証する方法として、モデルマウスに対し浸透圧ポンプを用いてＭＫ投与を行ってきた（特許文献４参照）。しかし、浸透圧ポンプによる投与は薬剤の効果をｉｎ  ｖｉｖｏで評価する場合には利用しやすい方法であるが、実際のヒトの治療においては用いることができないことから、ヒトの治療又は予防に応用するための最適な投与方法を確立する必要があった。【０００９】
更に、細胞増殖因子による虚血性心疾患の治療においては、冠動脈内又は静脈内等の血管内への投与では心筋に薬物が届きにくいことから十分な効果が得られないことが報告されていた（非特許文献７及び非特許文献８参照）。このため、心筋への薬剤の取り込み効率を上げるため、心筋への直接注射、高圧逆行性冠静脈投与（非特許文献９参照）、及び、冠動脈内への急速注入（非特許文献１０及び非特許文献１１）等、各種投与方法が工夫され検証されている。しかし、これらの投与方法は、複雑であるため実用化が困難であり、効果も十分ではないことから、未だ効率的な投与方法が見出されておらず、より簡便で治療効果の高い投与方法が求められていた。
【特許文献１】国際公開第１９９９／１６４６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０００／０２５７８号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−６８１２２号公報
【特許文献４】国際公開第２００６／０６２０８７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第１９９９／０５３９４３号パンフレット
【非特許文献１】TheNew England Journal of Medicine (2007); 356: 47-54
【非特許文献２】J.Am. Coll Cardio. (2000); 36: 2056-63
【非特許文献３】Am.Heart J. (2004); 148: S29-33
【非特許文献４】Kadomatsu,K. et al.: (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun., 151:p.1312-1318
【非特許文献５】Tomokura, M. etal.: (1999) J.Biol. Chem, 265: p.10765-10770
【非特許文献６】Mitsuru Horiba,et al.: (2006) Circulation, 114: p.1713-1720
【非特許文献７】MRoger J. Laham,et al.: (2003) Catheterization and Cardiovascular Interventions, 58: p.375-381
【非特許文献８】Timothy D.Henry, et al.: (2003) Circulation, 107: p.1359-1365)
【非特許文献９】William F. Fearon,et al.: (2004) Catheterization and Cardiovascular Interventions, 61: p.422-428
【非特許文献１０】Michael Simons,et al.: (2002) Circulation, 105: p.788-793)
【非特許文献１１】John J. Lopez,et al.: (1998) Cardiovascular Research, 40: p.272-281)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｅＮＯＳ活性化剤、並びに、その投与方法及び投与量を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＭＫを低酸素状態に曝した血管内皮細胞に作用させることにより、ｅＮＯＳを活性化させる作用があることを見出した。また、本発明者らは、ＭＫにより活性化されたｅＮＯＳ由来のＮＯにより血管拡張が引き起こされることを確認した。更に、本発明者らは、ＭＫを投与することにより血圧が低下することを確認した。これらの知見から、本発明者らは、ＭＫが、虚血及び虚血／再灌流における血管拡張や血流維持に利用できること、及び、虚血／再灌流における障害の予防及び／又は治療に利用できることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
また、本発明者らは、ＭＫを局部的に投与することにより、虚血性心疾患及び虚血／再灌流障害が劇的に改善することを見出した。特に、本発明者らは、虚血性心筋細胞障害モデル動物の冠動脈内にＭＫを投与した場合において、虚血細胞障害領域特異的にＭＫが集積することを見出し、ＭＫが虚血障害部位への集積能力を有することを見出した。本発明者らは更に検討を進めた結果、驚くべきことにＭＫの虚血障害部位への集積は、虚血領域への局部的に投与された場合に限らず、虚血領域から離れた部位において血中に投与された場合にも観察されることを見出した。即ち、本発明者らは、虚血性細胞障害を誘発したモデル動物の静脈に投与されたＭＫが、虚血障害部位特異的に集積することを見出した。特に、本発明者らは、虚血性心筋細胞障害を誘発したモデル動物の静脈内にＭＫを投与すると、心臓の虚血障害部位特異的にＭＫの集積が認められること、並びに、心臓の非障害部位及び他の臓器にはＭＫの集積が認められないことを見出し、ＭＫの優れた虚血障害部位への集積能力を見出し、本発明を完成させた。【００１３】
本発明は、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤、及び、血液中へ投与されることを特徴とするミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する虚血性疾患治療剤に関する。本発明は、より詳細には、以下の発明に関する。
（１）  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤、
（２）  虚血又は虚血／再灌流による細胞障害を治療又は予防するための、請求項１に記載の一酸化窒素合成酵素活性化剤、
（３）  虚血又は虚血／再灌流による細胞障害が、心筋の虚血又は虚血／再灌流による細胞障害である、請求項２に記載の一酸化窒素合成酵素活性化剤、
（４）  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体がミッドカイン又はプレイオトロフィンである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の一酸化窒素合成酵素活性化剤、
（５）  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する血管拡張剤、
（６）  虚血又は虚血／再灌流による細胞障害を治療又は予防するための、（５）に記載の血管拡張剤、
（７）  冠動脈拡張剤である、（５）又は（６）に記載の血管拡張剤、
（８）  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体がミッドカイン又はプレイオトロフィンである、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の血管拡張剤、
（９）  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する血圧低下剤。
（１０）  虚血又は虚血／再灌流による細胞障害を治療又は予防するための、請求項８に記載の血圧低下剤、
（１１）  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体がミッドカイン又はプレイオトロフィンである、（９）又は（１０）に記載の血管拡張剤、
（１２）  一酸化窒素合成酵素を活性化することを特徴とする、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する、虚血性疾患又は虚血／再灌流障害の治療薬又は予防薬、
（１３）  虚血性疾患又は虚血／再灌流障害が、虚血性心疾患又は心筋虚血／再灌流障害である、（１２）に記載の治療薬又は予防薬、
（１４）  虚血性疾患又は虚血／再灌流障害が、心不全、心筋梗塞、又は、狭心症である、（１２）に記載の治療薬又は予防薬、
（１５）  血液中に投与されることを特徴とする、（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載の治療薬又は予防薬、
（１６）  静脈内又は冠動脈内に投与されることを特徴とする、（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載の治療薬又は予防薬、
（１７）  ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体がミッドカイン又はプレイオトロフィンである、（１２）〜（１６）のいずれか１項に記載の治療薬又は予防薬、
（１８）  血液中に投与されることを特徴とする、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する虚血性疾患又は虚血／再灌流後の細胞障害の治療薬又は予防薬、
（１９）  静脈内又は冠動脈内に投与されることを特徴とする、ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する虚血性疾患又は虚血／再灌流後の細胞障害の治療薬又は予防薬、
（２０）  虚血性疾患又は虚血／再灌流後の筋細胞障害が、虚血性心疾患又は虚血／再灌流後の心筋細胞障害である、（１８）又は（１９）に記載の治療薬又は予防薬、
（２１）ミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体がミッドカイン又はプレイオトロフィンである、（１８）〜（１９）のいずれか１項に記載の治療薬又は予防薬、及び、
（２２）  ５０ｎｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする、（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の治療薬又は予防薬。【００１４】
本発明において、「ミッドカインファミリータンパク質」とは、ＭＫ、又は、ＭＫの機能を発現している部位の配列が近似しておりかつＭＫの機能と類似した機能を有するタンパク質又はペプチドのことである。進化的に近いタンパク質同士であっても必ずしもアミノ酸配列全体のホモロジー高いとは限らないことから、アミノ酸配列のホモロジーが低いタンパク質であっても、ＭＫの機能と類似した機能を有するタンパク質は、ＭＫファミリータンパク質に含まれる。また、アミノ酸配列全体の長さがＭＫと異なるタンパク質又はペプチドも、ＭＫファミリータンパク質に含まれる。ＭＫファミリータンパク質としては、例えば、ＭＫ、ＭＫ様タンパク質（国際公開２００４／０５２９２８号公報参照）、及び、ＰＴＮ（ＭＫとのホモロジー５０％）を挙げることができる。また、ＭＫファミリータンパク質としては、ＭＫとのホモロジーが高くかつＭＫの１以上の機能を有するタンパク質又はペプチド、及び、ＭＫとストリンジェントな条件でハイブリダイズしかつＭＫの1以上の機能を有するタンパク質又はペプチドを挙げることができる。【００１５】
上記において、「ＭＫとのホモロジーが高い」とは、ＭＫと構造上近いことを意味する。ここで、構造とは、一次構造（アミノ酸配列）、二次構造、又は、三次構造のことである。ＭＫと一次構造（アミノ酸配列）のホモロジーが高くかつＭＫの１以上の機能を有するタンパク質又はペプチドとして、好ましくは、ＭＫとのアミノ酸配列のホモロジーが、２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、更に好ましくは４０％以上であり、より更に好ましくは５０％以上であり、より更に好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は、９８％以上である。アミノ酸配列のホモロジーは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。また、ＭＫの立体構造は既に報告されている（Iwasaki, W. et
al.: (1997) EMBO J. 16, p.6936-6946）ことから、二次構造又は三次構造におけるＭＫとのホモロジーは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、３Ｄ−１Ｄ、スレッディング等のホモロジーモデリングを利用することにより決定することができる。ＭＫと二次構造又は三次構造のホモロジーが高くかつＭＫの１以上の機能を有するタンパク質又はペプチドの配列類似率は、好ましくは４０％以上であり、より好ましくは５０％以上であり、より更に好ましくは、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は、９０％以上である。【００１６】
また、上記において、「ＭＫとハイブリダイズする」とは、当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でＭＫとハイブリダイズすることを意味する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法を挙げることができる。【００１７】
本発明において、「ミッドカイン誘導体」とは、人工的に又は天然により生じたＭＫ由来の物質であって、ＭＫの機能を示す物質又は生体内において分解されてＭＫの機能を示す物質のことであり、例えば、ＭＫのアミノ酸配列を置換、欠失若しくは付加したＭＫの変異体若しくは改変体、ＭＫを化学的に修飾したＭＫの誘導体、又は、ＭＫのプロドラッグを挙げることができる。このうち、ＭＫのアミノ酸配列を置換、欠失若しくは付加したＭＫの変異体若しくは改変体において、置換、欠失若しくは付加するアミノ酸の数は、好ましくは、１〜３０個、より好ましくは、１〜２０個、更に好ましくは、１〜１０個、より更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個である。このようなＭＫ誘導体としては、例えば、糖修飾ＭＫ（例えば、日本特許公開２０００−１８４８９１号公報参照）、非糖修飾ＭＫ、ＭＫの数個のアミノ酸配列を置換、欠失若しくは付加したＭＫの変異体若しくは改変体、化学修飾ＭＫ、短縮型ＭＫ（米国特許公開２００４／０２１９６１４号公報参照）、ＭＫのＣ−フラグメント（ＭＫの６２〜１２１番目のアミノ酸よりなるＣ末端側のペプチド）、ＭＫのＮ−フラグメント（ＭＫの１〜５２番目のアミノ酸よりなるＮ末端側のペプチド）、ＭＫのＣ−ドメイン（ＭＫの６２〜１０４番目のアミノ酸からなるペプチド）、及び、ＭＫのＮ−ドメイン（ＭＫの１５〜５２番目のアミノ酸からなるペプチド）、ＭＫのＮ−テイル（ＭＫの１〜１４番目のアミノ酸からなるペプチド）、ＭＫのＣ−テイル（ＭＫの１０５〜１２１番目のアミノ酸からなるペプチド）を挙げることができる。【００１８】
上記において、「ＭＫの機能」とは、ミッドカインが有する機能であれば特に限定は無く、例えば、細胞増殖機能、アポトーシス抑制機能、ヘパリン結合能、細胞遊走能、分化誘導能、又は、ｅＮＯＳ活性化機能を挙げることができる。ＭＫの機能として、好ましくは、アポトーシス抑制機能又はｅＮＯＳ活性化機能であり、より好ましくは、ｅＮＯＳ活性化能である。【００１９】
本発明において、「一酸化窒素合成酵素活性化剤」とは、ＮＯＳを活性化させる目的で使用する薬剤であれば特に限定はない。本発明における、「一酸化窒素合成酵素活性化剤」として、好ましくは、血管内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）活性化剤である。また、本発明の一酸化窒素合成酵素活性化剤は、明示されているか否かを問わずＮＯＳを活性化させる目的で使用するものであれば、全て包含するものである。例えば、本発明の一酸化窒素合成酵素活性化剤は、活性化された一酸化窒素合成酵素により産生されるＮＯの作用を利用する薬剤を包含する。このような薬剤としては、例えば、血小板凝集抑制剤、接着因子発現抑制剤、ＮＦ−κＢ活性抑制剤、血管平滑筋細胞の増殖抑制剤、スーパーオキシド消去剤、血管保護剤、血管拡張剤、虚血若しくは虚血／再灌流による細胞障害、及び、虚血性疾患を挙げることができ、好ましくは、血管拡張剤、心筋の虚血若しくは虚血／再灌流による細胞障害、又は、虚血性心疾患である。【００２０】
本発明において、「虚血又は虚血／再灌流による細胞障害」とは、動脈硬化、血管攣縮、血栓、臓器移植、循環障害、外科手術時の止血等により血流が滞ることにより、血管内皮細胞や臓器を構成する細胞が受ける障害のことであり、例えば、細胞膜損傷、ミトコンドリア浮腫、細胞浮腫、細胞壊死、アポトーシス等を挙げることができる。また、虚血／再灌流による細胞障害は、虚血領域に限らず遠隔臓器にも障害を与えることが知られているが、本発明における、虚血／再灌流による細胞障害は、虚血を生じた臓器に限定されるものではない。【００２１】
本発明において、「心筋の虚血又は虚血／再灌流による細胞障害」とは、虚血又は虚血／再灌流による細胞障害であって、冠動脈が動脈硬化、血管攣縮、血栓、臓器移植、循環障害、外科手術時の止血等により閉塞若しくは遮断されることで心筋が虚血状態に陥ること、又は、虚血に陥った心筋の血流が回復することにより引き起こされる細胞障害である。本発明における、「心筋の虚血／再灌流による細胞障害」は、心筋の虚血／再灌流を原因として引き起こされる細胞障害であれば、心筋における細胞障害に限定されず、全身の細胞障害をも包含するものである。【００２２】
本発明において、「虚血性疾患」とは、血管が血管攣縮、血栓、動脈硬化等により閉塞又は遮断されることにより虚血を生じる疾患のことであり、虚血を生じる臓器としては、例えば、脳、心臓、末梢、脊髄、腎臓、肝臓、及び、腸管（大腸）等を挙げることができる。虚血性疾患としては、例えば、脳梗塞、脳卒中等の虚血性脳疾患、心筋梗塞等の虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、虚血後急性腎不全、肝温虚血再灌流障害、虚血性腸疾患、及び、虚血性大腸炎等を挙げることができ、好ましくは、虚血性心疾患である。【００２３】
本発明において、「虚血性心疾患」とは、血管攣縮、血栓、動脈硬化等により冠動脈の虚血を生じる疾患のことであり、例えば、狭心症（不安定狭心症、安定狭心症、冠攣縮性狭心症）、心筋梗塞（ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞）、無症候性心筋虚血、虚血性心筋症、及び、虚血性心不全を挙げることができる。また、虚血状態の解除による再灌流後に生じる血管再狭窄も、冠動脈の虚血を生じる疾患であり、本発明の虚血性心疾患に含まれる。更に、本発明の虚血性心疾患とは、冠動脈の高度狭窄又は閉塞による高度虚血時の不可逆性心筋障害及び当該障害に起因する疾患を含む。【００２４】
本発明において、「心筋虚血／再灌流障害」とは、心臓が一過性の虚血状態を経た後に血流が再開した場合に生じる障害のことである。虚血の原因としては、例えば、心臓外科手術における大動脈遮断、狭心症、心筋梗塞、心移植時のドナー心の保存等による一過性の心筋虚血を挙げることができる。また、障害としては、例えば、細胞膜損傷、ミトコンドリア浮腫、細胞浮腫、細胞壊死、アポトーシス、心筋細胞死、心筋収縮能低下、不整脈、ｎｏ−ｒｅｆｌｏｗ現象、心不全を挙げることができる。【００２５】
本発明において、「血中に投与される」とは、本発明の治療薬又は予防薬が血液中に投与されることを目的とした薬剤であることを意味する。血液中への投与方法は、血液中への投与が可能な方法であれば、特に限定はなく、例えば、注射、翼状針又は留置針による点滴、カテーテル等により投与することができる。また、投与される部位は静脈でも動脈でもよく、このような静脈又は動脈としては、冠動脈、腕静脈等の末梢静脈、上大静脈又は下大静脈等の中心静脈を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のＭＫファミリータンパク質若しくはＭＫ誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤は、ＮＯＳ（特にｅＮＯＳ）を活性化する作用があることから、ＮＯの産生により改善する疾患及び症状（特に、虚血性疾患）の治療又は予防に有用である。特に、本発明のミッドカインファミリータンパク質若しくはミッドカイン誘導体を有効成分として含有する一酸化窒素合成酵素活性化剤は、血中に投与された場合には、虚血障害部位に集積することから、ＮＯに起因する偏頭痛等の副作用が少ない治療薬又は予防薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】バルーンカテーテルによる冠動脈の閉塞部位を表す写真である。
【図２】心臓超音波検査の結果を示す写真である。
【図３】左室造影の結果を表す写真である。赤い線で示された部分は拡張期左心室を示し、青い線で示された部分は収縮期左心室を示す。
【図４】開胸時の心臓の状態を写した写真を示す。白い部分は細胞障害部位を示す。
【図５】左心室切片のエバンスブルー及びＴＴＣ染色の結果を示す。エバンスブルー染色による青い染色領域は正常領域を示し、ＴＴＣ染色による赤い染色領域は虚血領域にありながらも梗塞・壊死には陥っていない部分を示す。
【図６】梗塞領域／虚血リスク領域（ＩＳ／ＡＡＲ）の割合を表すグラフを示す。図中、縦軸は梗塞領域／虚血リスク領域を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図７】左室駆出率（ＬＶＧ  ＥＦ）を表すグラフを示す。図中、縦軸は左室駆出率を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、ＰＯＳＴは閉塞直後、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図８】異常収縮領域率（％ＡＣＳ）を表すグラフを示す。図中、縦軸は異常収縮領域率を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、ＰＯＳＴは閉塞直後、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図９】左室拡張末期圧（ＬＶＥＤｐ）を表すグラフを示す。図中、縦軸は左室拡張末期圧を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、ＰＯＳＴは閉塞直後、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図１０】収縮期中隔壁厚増加率（％ＩＶＳＴ）を表すグラフを示す。図中、縦軸は収縮期中隔壁厚増加率を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、ＰＯＳＴは閉塞直後、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図１１】圧微分最大値（ｄＰ／ｄＴ  ｍａｘ、ｐｅａｋ  ｄＰ／ｄＴ）を表すグラフを示す。図中、縦軸は圧微分最大値を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、ＰＯＳＴは閉塞直後、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図１２】超音波検査の結果から算出したＥ／ｅ’を表すグラフを示す。図中、縦軸は算出したＥ／ｅ’を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、ＰＯＳＴは閉塞直後、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図１３】血液中のトロポニンＴの濃度を表すグラフを示す。図中、縦軸はトロポニンＴの血中濃度を表す。横軸においてＰＲＥは閉塞前、ＰＯＳＴは閉塞直後、２４ＨＲは閉塞解除２４時間後を表す。
【図１４】閉塞解除２４時間後のブタ心臓虚血領域切片の写真である。左上は蛍光標識ＭＫの発色（赤色）を示し、右上は同視野の心筋組織を示す。左下はそれらを重ね合わせた画像である。虚血領域心筋にて冠動脈注射した蛍光標識ＭＫの強い発色が認められる。
【図１５】同じブタ心臓の非虚血領域の写真である。左上は蛍光標識ＭＫの発色を示し、右上は同視野の心筋組織を示す。左下はそれらを重ね合わせた画像である。非虚血領域においては蛍光標識ＭＫの発色がほとんど認められない。
【図１６】閉塞解除２４時間後のマウス心臓切片の蛍光標識ＭＫを検出した写真である。
【図１７】閉塞解除２４時間後のマウス肝臓（左）及び腎臓（右）切片の蛍光標識ＭＫを検出した写真である。
【図１８】低酸素／再酸素化したＨＵＶＥＣをウェスタンブロット解析した際のｅＮＯＳ及びリン酸化ｅＮＯＳ（ｐｅＮＯＳ）のバンドを示す。
【図１９】低酸素／再酸素化したＨＵＶＥＣをウェスタンブロット解析した際のｅＮＯＳ及びリン酸化ｅＮＯＳ（ｐｅＮＯＳ）のバンドを示す。
【図２０】ＭＫ投与前及び投与後のブタ冠動脈造影写真を示す。ＰＲＥはＭＫ投与前、ＰＯＳＴはＭＫ投与後の写真を表す。
【図２１】ＭＫ投与による血圧変化のグラフである。縦軸は血圧、横軸は時間を表す。Ｌｏｗ  ｄｏｓｅは５μｇ／ｋｇ投与を、Ｍｉｄｄｌｅ  ｄｏｓｅは５０μｇ／ｋｇ投与を、Ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅは５００μｇ／ｋｇ投与の時間帯を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明における、ＭＫファミリータンパク質若しくはＭＫ誘導体は、当該物質をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。例えば、細胞増殖因子又はアポトーシス抑制因子としてＭＫを用いる場合、ＭＫをコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、当該ベクターをピキア酵母に導入して発現させ、その培養上清から採取することにより、組み換えＭＫとして調製することができる（特開平９−９５４５４号公報参照）。【００２９】
本発明の薬剤を医薬として使用する場合、単独で投与しても良いし、他の薬剤と共に投与してもよい。本発明の薬剤と共に使用することができる他の薬剤としては、本発明の治療薬又は予防薬の効果を失わせることの無い薬剤であれば特に限定は無く、好ましくは、心疾患の治療薬若しくは予防薬又は血栓の形成を阻害する治療薬又は予防薬であり、例えば、β遮断薬、持続性硝酸薬、カルシウム拮抗薬、硝酸薬、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等を挙げることができる。【００３０】
本発明の薬剤の製剤は、患者に投与することができる製剤であれば特に限定は無く、好ましくは、注射剤である。本発明の薬剤の剤形は、例えば、液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の薬剤を注射剤として使用する場合、必要に応じて、プロピレングリコール、エチレンジアミン等の溶解補助剤、リン酸塩等の緩衝材、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition」APhA Publications社参照）を加えることができる。また、本発明の治療薬又は予防薬を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。【００３１】
本発明の薬剤の投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、好ましくは、血中又は心筋に投与する。具体的には、血管内（例えば、静脈内、冠動脈内）又は虚血領域の心筋に投与することができる。本発明の薬剤の投与方法としては、注射又は静脈点滴注射による静脈内投与、カテーテルによる静脈内又は動脈内投与、及び、カテーテル筋肉注射による心筋内投与を挙げることができる。本発明の薬剤は、再灌流術前、再灌流術前から術後にかけて、又は、再灌流術後に投与することができる。本発明の薬剤を予防薬として使用する場合には、再灌流術前、又は、再灌流術前から術後にかけて投与することが好ましい。また、本発明の薬剤は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、本発明の薬剤の投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。本発明の薬剤の投与方法として、好ましくは、再灌流術前から術後にかけて５分間〜１時間の持続投与、又は、再灌流術後に５分間〜１時間の持続投与であり、より好ましくは、再灌流術前から術後にかけて５分間〜１５分間の持続投与、又は、再灌流術後に５分間〜１５分間の持続投与である。【００３２】
本発明の薬剤の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量は、例えば、虚血性疾患又は虚血／再灌流障害の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量として、好ましくは、１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、１０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇである。
【実施例】
【００３３】
実施例１．ＭＫの冠動脈内投与による虚血／再灌流後の心筋細胞障害治療効果（閉塞前後に亘る投与）
（１）ＭＫの調製
ヒトＭＫｍＲＮＡを、ウイルムス腫瘍由来の培養株細胞Ｇ−４０１より調製した（Tsutsui, J. ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.
176, 792-797, 1991）。プライマーとして、制限酵素EcoRIに認識される配列（5'-GAATTC-3'）を含むように設計した、センスＰＣＲプライマー：5'-GCGGAATTCATGCAGCACCGAGGCTTCCTC-3'、及び、アンチセンスＰＣＲプライマー：5'-GCGGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3'を用い、ヒトＭＫｍＲＮＡを鋳型として、９３℃→３７℃→７２℃の温度変化を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを行い、ＭＫコーディング領域の両端にＥｃｏＲＩ認識部位をもつヒトＭＫｃＤＮＡを調製した。【００３４】
ＭＫｃＤＮＡ及び酵母ピキア・パトリスＧＳ１１５（Pichia pastoris GS115、以下、「ピキア酵母ＧＳ１１５」という）用発現ベクターｐＨＩＬ３０１（ヒスチジン及びネオマイシン耐性遺伝子含有、特開平２−１０４２９２号、欧州特許公開０３３９５６８号公報参照）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて結合させ、組み換え発現ベクターを作製した。【００３５】
エレクトロポレーション法を用いて、上記で調製した組み換え発現ベクターをピキア酵母ＧＳ１１５（インビトロジェン社製）へ導入した。ベクターを導入したピキア酵母ＧＳ１１５を、ヒスチジンを含まない、Ｇ４１８含有培地で培養することにより、目的のＭＫ遺伝子を持つ複数のクローンを得た。得られた当該クローンを、メタノールで誘導しながら培養を行った。培養上清を採取し、ウサギ抗マウスＭＫポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット解析を行うことにより、当該クローンがＭＫを分泌するかどうか確認した。【００３６】
誘導により、当該クローンの培養上清中にＭＫを分泌するクローンの１つをT3L-50-4Pと名付け、このクローンを培養した（特開平７−３９８８９号公報参照）。培養上清を回収し、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、高純度ＭＫを得た。【００３７】
（２）虚血モデル動物の作成及びＭＫの投与
食肉用ブタ（オス、約４０ｋｇ）に気管内挿管後、イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を吸入させて麻酔管理した。心臓超音波（心エコー）にてＭモード画像を記録後、Pig tailカテーテルを左室内に留置して左室拡張末期圧（Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＬＶＥＤｐ）測定を行った。更に、冠動脈造影、左室造影（Ｌｅｆｔ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏ  Ｇｒａｐｈｙ：ＬＶＧ）、左室内圧測定後、ＰＴＣＡ用バルーンカテーテルにて左冠動脈Ｄ１−Ｄ２間を４５分間閉塞した（図１）。閉塞４０分後にＰＴＣＡワイヤー用内腔を通じて冠動脈内へのＭＫ（５０nｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ）投与を開始し、閉塞解除５分後まで１０分間持続投与を行った。対象群は同量の生理食塩水を同様に連続投与した。投与終了後、心エコー検査を行った。また、Pig tailカテーテルによりＬＶＥＤｐ測定を行った。更に、冠動脈造影、ＬＶＧ、左室内圧測定を行った。更に、血液検査を２時間おきに行った。【００３８】
翌日、再び、気管内挿管後、イソフルランを吸入させて麻酔管理した。心エコーにてＭモード画像を記録後、Pig tailカテーテルによりＬＶＥＤｐ測定を行った。更に、冠動脈造影、ＬＶＧ、左室内圧測定、血液検査を行った。その後、開胸手術を行い、写真を撮影後、塩化カリウムにて心停止させ、心臓を摘出した。摘出した心臓の冠動脈閉塞部を結紮後、大動脈弓空隙部から５％エバンスブルーを逆行性に５ｍｌ注射することにより、非虚血部を染色した。その後左心室を５つの薄片にスライスし、左心室の虚血性リスク領域を、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）を用いて染色した。【００３９】
（３）結果
５μｇ／ｋｇ投与の結果を図２〜図１３に示す。なお、以下の結果において、対象群と比較してｐ＜０．０５である場合に有意差があると判定した。また、５０nｇ／ｋｇ投与においても、症状の悪化を防ぐ効果が得られた（非図示）。【００４０】
心臓超音波検査の結果を図２に示す。心臓超音波検査において、ＭＫ治療群は非治療群と比較して有意な心機能の改善を認めた。また、左室造影の結果を図３に示す。左室造影においても、ＭＫ治療群は非治療群と比較し、心室壁運動が良好であった。更に、左室拡張末期圧、収縮期最大圧増加率、心拍出量等において、ＭＫ治療群は非治療群よりも有意な治療効果を示した。このことから、ＭＫの血中投与は虚血及び再灌流による心筋細胞障害による心機能低下を抑制していることが示された。【００４１】
開胸時の心臓の写真を図４に示す。図中、白い部分は細胞障害部位を示す。対象群においては、虚血領域全体にわたって白い細胞障害部位が認められるのに対し、ＭＫ投与群においては、霜降り状に正常心筋の残存が認められた。このことから、ＭＫの血中投与は虚血及び再灌流による心筋細胞障害を抑制していることが示された。【００４２】
左心室虚血性リスク領域の、エバンスブルー染色及びＴＴＣ染色の結果を図５に示す。図５において、エバンスブルーによる青い染色領域は正常領域を示し、それ以外の領域は虚血リスク領域を示す。虚血リスク領域のうち、ＴＴＣ染色により赤く染まらない白い領域は梗塞領域（細胞障害領域）を示す。図５より、対象群において白い梗塞領域が非常に大きな比率を占めているのと比較して、ＭＫ投与群においては、白い梗塞領域が少ないことから、病理標本において、心筋障害面積がＭＫ治療群にて有意に縮小されている事を確認した。【００４３】
また、虚血リスク領域に対する梗塞領域の割合（梗塞領域（Ｉｎｆａｒｃｔ  Ｓｉｚｅ）／虚血リスク領域（Ａｒｅａ  Ａｔ  Ｒｉｓｋ）：ＩＳ／ＡＡＲ）を図６に示す。図６に示すとおり、冠動脈閉塞解除から約２４時間後において、ＭＫ投与群のＩＳ／ＡＡＲは対象群と比較して有意に改善していた。このことから、ＭＫの血中投与により、虚血による細胞障害が有意に抑制されることが示された。【００４４】
左室造影及び一回拍出量（ＳＶ）の結果から左室駆出率（一回拍出量／拡張終期容量の比率）（Ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＥＦ）、及び、異常収縮領域率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔ：％ＡＣＳ）を計算したものを、それぞれ図７及び図８に示す。これらの図に示すとおり、冠動脈閉塞解除から約２４時間後において、ＭＫ投与群のＥＦ及び％ＡＣＳは対象群と比較して有意に改善していた。【００４５】
Pig tailカテーテルによる、左室拡張末期圧（Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＬＶＥＤｐ）測定の結果を図９に示す。図９に示すとおり、ＭＫ投与群は対象群と比較して有意に左室拡張末期圧が低下していた。【００４６】
また、超音波検査により収縮期中隔壁厚増加率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｅｐｔｕｍ  ｔｈｉｃｋｉｎｇ：％ＩＶＳＴ）を測定した結果を図１０に示す。図１０に示すとおり、ＭＫ投与群は対象群と比較して有意に収縮期壁厚増大率が回復していた。【００４７】
更に、左室収縮速度を表す圧微分（ｄＰ／ｄＴ）の最大値（ｄＰ／ｄＴ  ｍａｘ又はｐｅａｋ  ｄＰ／ｄＴ）を計算したものを図１１に示す。図１１に示すとおり、ＭＫ投与群は対象群と比較して、有意にｄＰ／ｄＴの低下が抑制されていた。【００４８】
左室の拡張能を評価するため、心臓超音波検査において組織ドプラ法により僧帽弁輪部移動速度を測定し、計測したＥ波及びｅ’波の波高値から、Ｅ／ｅ’の値を算出した。結果を図１２に示す。左室流入血流速波形のＥ波は心不全が進むと大きくなり、Ｅ／ｅ’の増大は、左室拡張末期圧の上昇した心不全と診断できるところ、図１１に示すとおり、ＭＫ投与群は対象群と比較して有意に左室拡張末期圧の上昇が抑制されていた。【００４９】
血液検査において測定したトロポニンＴの濃度を図１３に示す。トロポニンＴは、心筋に含まれる収縮調節タンパク質のひとつであり、心筋が障害を受けると細胞質から血中に遊出して血液検査により検出される。本実験の結果、図１３に示すとおり、狭窄から２４時間後において、ＭＫ治療群のトロポニンＴ値は有意に低値を示した。【００５０】
また、実験中のブタの生存率は、対象群が生存率５５．６％（９匹中４匹が死亡）であるのに対し、ＭＫ投与群では生存率８５．７％（７匹中１匹が死亡）であり、生存率においても、ＭＫ投与群が優れていることが示された。【００５１】
実施例２．ＭＫの冠動脈内投与による虚血／再灌流後の心筋細胞障害治療効果（閉塞後投与）
（１）ＭＫの作成、虚血モデル動物の作成及びＭＫの投与
ヒトＭＫは、実施例１と同様の方法により調製した。実施例１に従い作成したモデル動物に、５μｇ／ｋｇのＭＫ又は生食を閉塞解放５分後から１０分間の持続投与し、その他は実施例１と同様の方法により実験を行った。【００５２】
（２）結果
閉塞中からの投与開始と閉塞解放後からの投与開始ではＭＫ投与群、生食投与群ともその結果において著明な差は認めず、閉塞解放後の投与によってもＭＫの細胞障害治療効果が得られることが示された（非図示）。【００５３】
実施例３．ＭＫの冠動脈内投与による集積部位の検出
（１）蛍光標識ＭＫの調製及び投与
ヒトＭＫは、実施例１と同様の方法により調製した。調製後のＭＫに蛍光色素ローダミンを結合させて蛍光標識ＭＫを調製した。蛍光標識ＭＫを、５μｇ／ｋｇとなるように、実施例１と同様の方法で食肉用ブタ（オス、約４０ｋｇ）に投与した。投与から２４時間後、心臓を取り出し、心筋組織を蛍光顕微鏡により観察して蛍光標識ＭＫの集積を検出した。【００５４】
（２）結果
結果を、図１４及び図１５に示す。図１４に示すとおりブタ心臓の障害心筋部位に蛍光標識ＭＫの集積を認めるのに対し、図１５に示すとおりブタ心臓の正常部位では蛍光標識ＭＫの集積は認められなかった。このことから、心臓障害時に冠動脈投与したＭＫは、心筋の障害部分に特異的に集積することが示された。【００５５】
実施例４．ＭＫの静脈内投与による集積部位の検出
（１）蛍光標識ＭＫの調製及び投与
ヒトＭＫは、実施例１と同様の方法により調製した。調製後のＭＫに蛍光色素ローダミンを結合させて蛍光標識ＭＫを調製した。Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝背景を持つマウスにペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔をかけ、人工呼吸用装置（モデルＳＮ−４８０−７）で維持した。開胸手術の後、左前降下冠状動脈（ＬＡＤ）をＰＥ−１０チューブで結紮した。結紮１時間後に結紮を取り除いて血流を回復させ、モデル動物とした。血流回復後直ぐに蛍光標識ＭＫを静脈内投与し、投与から２４時間後、臓器を取り出して蛍光顕微鏡で各組織の蛍光標識ＭＫの集積を検出した。【００５６】
（２）結果
結果を図１６及び図１７に示す。図１６に示すとおり、心臓の障害心筋部位に蛍光標識ＭＫの集積が認められる一方、心臓の正常部位では蛍光標識ＭＫの集積は認められなかった。また、図１７に示すとおり、肝臓や腎臓等の心臓以外の臓器においても蛍光標識ＭＫの集積は認められなかった。このことから、ＭＫを静脈内投与した場合にも心臓の障害心筋部位特異的にＭＫが集積することが示され、静脈内投与によっても心筋細胞障害を予防又は治療できることが示された。【００５７】
実施例５．ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の低酸素／再酸素化モデルにおけるＭＫのｅＮＯＳ活性化能の測定
（１）ＨＵＶＥＣの低酸素／再酸素化及びＭＫの投与
タカラバイオ株式会社から入手したＨＵＶＥＣ（HUVEC
Pooled Cambrex CCS 2519）を、6.0×105細胞／ウェルで、35×10mm ディッシュ(BD
Falcon 351008 ）に播種した。ＥＢＭ−２（Cambrex社）の完全培地を2.5ｍｌ加え、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４時間培養した。その後、ＥＢＭ−２培地を成長因子非含有培地に交換し、、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で９時間培養後、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２、３７℃の低酸素条件下で３時間培養した。その後、ＭＫ投与群においては、実施例１と同様の方法により調整したＭＫをＥＢＭ−２倍地で１００ｎｇ／ｍｌに希釈した後、２．５ｍｌ／ウェル加え、対象群においては、（コントロールで投与した物質）を２．５ｍｌ／ウェル加えた後、再び２０％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３時間培養した。培養終了後の細胞を回収してホモジナイズした後、イムノブロッティングを行うことにより、細胞内のｅＮＯＳ及びリン酸化されたｅＮＯＳ（１１７７番目のセリンのリン酸化）のバンドを調べた。【００５８】
（２）結果
結果を図１８及び図１９に示す。これらの図に示すとおり、本実験では、対象群と比較してＭＫ投与群において、顕著なｅＮＯＳのリン酸化が見られた。本実験で用いた低酸素条件は虚血状態の実験的なモデルであることから、本実験の結果により、虚血状態においてＭＫがｅＮＯＳのリン酸化を引き起こすことが示された。また、ｅＮＯＳのリン酸化は、血管拡張を引き起こすことが知られていることから、ＭＫは虚血性疾患においてｅＮＯＳをリン酸化することにより細胞保護作用を発揮すると考えられる。【００５９】
実施例６．ブタ冠動脈拡張試験
（１）ブタ冠動脈測定
ブタ冠動脈造影後、冠動脈内にＭＫ（５μｇ／ｋｇ）を実施例１と同様、ＰＴＣＡワイヤー用内腔を通じて１０分間持続投与した。投与後に再度冠動脈造影を行いMK投与前、投与後のブタ冠動脈の状態を比較検討した。
（２）結果
結果を図２０に示す。ＰＲＥはＭＫの冠動脈内注入前の冠動脈造影を、ＰＯＳＴはＭＫの冠動脈内注入後の冠動脈造影を示す。これらの冠動脈造影の結果から、ＭＫ投与後に血管造影上、肉眼的に明らかな冠動脈と毛細血管の拡張が認められた。【００６０】
実施例７．ラット血圧試験
（１）ＭＫ投与及び血圧測定方法
ラット（Wister、SLC社）に気管内挿管後、人工呼吸管理下で開胸した。心臓を露出後、心尖部より心内圧測定カテーテル（Millar社）を挿入した。下大静脈に点滴ルートを確保した後、ＭＫ（５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ）を持続注射してミラーカテーテルにより血圧の変動をリアルタイムで測定した。
（２）結果
結果を図２１に示す。本実験によって、ラットの静脈内へＭＫを５００μｇ／ｋｇ投与することにより血圧が低下することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の治療薬又は予防薬は、虚血性心疾患又は虚血／再灌流後の心筋細胞障害を予防又は治療するための薬剤として有用である。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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