(57)【要約】  本発明は、ラクリチンの、安定かつ大量供給可能な手段に関し、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターであって、当該ヌクレオチドがサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルに作動可能に連結されているベクター、前記ベクターを細胞に導入してなるラクリチン発現細胞、前記ラクリチン発現細胞を培地中で培養する工程、および培養上清中のラクリチンを単離する工程を含む組換えラクリチンの製造方法、ならびに前記ラクリチン発現細胞を含有する眼疾患治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクリチンをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターであって、当該ヌクレオチドがサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルに作動可能に連結されているベクター。
【請求項２】
さらにβグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンを含有する請求項１記載のベクター。
【請求項３】
さらに選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含有する請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のベクターを動物細胞に導入してなるラクリチン発現細胞。
【請求項５】
動物細胞が株化ヒト角膜上皮細胞である請求項４記載のラクリチン発現細胞。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項に記載のベクターを動物細胞に導入する工程を含む、ラクリチン発現細胞の製造方法。
【請求項７】
動物細胞が株化ヒト角膜上皮細胞である請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
請求項４または５記載のラクリチン発現細胞を培地中で培養する工程、および培養上清中のラクリチンを単離する工程を含む組換えラクリチンの製造方法。
【請求項９】
請求項４または５記載のラクリチン発現細胞を含有する眼疾患治療剤。
【請求項１０】
眼疾患が角結膜上皮障害またはドライアイである請求項９記載の治療剤。
【請求項１１】
眼疾患治療剤を製造するための、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーター、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含有し、かつ当該ヌクレオチドが作動可能に連結されているベクターを動物細胞に導入してなるラクリチン発現細胞の使用。
【請求項１２】
ベクターがさらにβグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンを含有するものである請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
ベクターがさらに選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含有するものである請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
眼疾患が角結膜上皮障害またはドライアイである請求項１１〜１３いずれかに記載の使用。
【請求項１５】
眼疾患の治療を必要とする対象に、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーター、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含有し、かつ当該ヌクレオチドが作動可能に連結されているベクターを動物細胞に導入してなるラクリチン発現細胞の有効量を投与することを含む、眼疾患の治療方法。
【請求項１６】
ベクターがさらにβグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンを含有するものである請求項１５記載の治療方法。
【請求項１７】
ベクターがさらに選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含有するものである請求項１５または１６に記載の治療方法。
【請求項１８】
眼疾患が角結膜上皮障害またはドライアイである請求項１５記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクリチン高発現細胞に関する。詳しくは、ドライアイ等の眼疾患の治療に有効成分として用いられるラクリチンの供給手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
涙液は、眼において種々の重要な役割を果たしている。例えば、涙液の果たす役割として、角結膜の湿潤性を保持することによる角膜及び結膜上皮細胞の保護、感染防止、角膜の透明性維持、角膜への栄養補給などが知られている。涙液の分泌障害により生じる疾患としては、ドライアイ等の眼疾患が知られ、ドライアイでは、例えば、人工涙液の補給、ヒアルロン酸などの保湿性の高い粘弾性物質の点眼などの処置が施されている。しかしながら、これらの対症療法では症状を緩和し得るが、根本的な治療とはなり得ない。涙液は上述の通り種々の役割を果たしており、眼疾患を改善し得ると考えられるので、涙腺に作用し、涙液分泌を促進する物質の開発が所望されている。【０００３】
ラクリチン（Lacritin）は、涙液分泌促進因子または成長因子様タンパク質として同定されたタンパク質である（特許文献１及び非特許文献１参照）。ラクリチンについては、以下１）〜５）が報告されている：
１）ラクリチンは、角膜上皮細胞や涙腺腺房細胞の成長因子としての活性を有していること；
２）ラクリチンは、涙液タンパク質分泌促進効果を有していること；
３）ラクリチンは、涙腺、耳下腺、小唾液腺、顎下腺、甲状腺及び角膜上皮等の組織に由来する細胞で発現していること；
４）ラクリチンを含有する点眼剤が、ドライアイ症候群、シェーグレン症候群又は角膜上皮創傷等の眼疾患の治療に利用できる可能性があること；
５）ラクリチン受容体を発現させた細胞を用い、ラクリチンに依存するカルシウムのシグナルを指標とすることで、ラクリチンやラクリチン受容体に結合する化合物を探索できること。【０００４】
このように、ラクリチンの効用について多大な期待が寄せられつつあるが、ラクリチンまたはラクリチン受容体を天然に発現する細胞は特定の限られた組織にのみ存在すること、ならびに、天然ラクリチンは糖鎖修飾されているが、動物細胞を使用し、糖鎖修飾されたラクリチンを大量に得る手段は確立されていないのが現状である。
【特許文献１】国際公開第02/065943号パンフレット
【非特許文献１】Sanghi, S. et al., Journal of Molecular Biology 310, pp.127-139 (2001年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、動物細胞を使用し、ラクリチンを安定かつ大量に供給可能な手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、ラクリチンをコードするヌクレオチドを特定のベクターに組み込むことにより、これまでにない高発現量の細胞株を樹立することに成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。【０００７】
〔１〕ラクリチンをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターであって、当該ヌクレオチドがサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルに作動可能に連結されているベクター。
〔２〕さらにβグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンを含有する〔１〕記載のベクター。
〔３〕さらに選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含有する〔１〕または〔２〕に記載のベクター。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のベクターを動物細胞に導入してなるラクリチン発現細胞。
〔５〕動物細胞が株化ヒト角膜上皮細胞である〔４〕記載のラクリチン発現細胞。
〔６〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のベクターを動物細胞に導入する工程を含む、ラクリチン発現細胞の製造方法。
〔７〕動物細胞が株化ヒト角膜上皮細胞である〔６〕記載の製造方法。
〔８〕〔４〕または〔５〕記載のラクリチン発現細胞を培地中で培養する工程、および培養上清中のラクリチンを単離する工程を含む組換えラクリチンの製造方法。
〔９〕〔４〕または〔５〕記載のラクリチン発現細胞を含有する眼疾患治療剤。
〔１０〕眼疾患が角結膜上皮障害またはドライアイである〔９〕記載の治療剤。
〔１１〕眼疾患治療剤を製造するための、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーター、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含有し、かつ当該ヌクレオチドが作動可能に連結されているベクターを動物細胞に導入してなるラクリチン発現細胞の使用。
〔１２〕ベクターがさらにβグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンを含有するものである〔１１〕記載の使用。
〔１３〕ベクターがさらに選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含有するものである〔１１〕または〔１２〕に記載の使用。
〔１４〕眼疾患が角結膜上皮障害またはドライアイである〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の使用。
〔１５〕眼疾患の治療を必要とする対象に、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーター、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含有し、かつ当該ヌクレオチドが作動可能に連結されているベクターを動物細胞に導入してなるラクリチン発現細胞の有効量を投与することを含む、眼疾患の治療方法。
〔１６〕ベクターがさらにβグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンを含有するものである〔１５〕記載の治療方法。
〔１７〕ベクターがさらに選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含有するものである〔１５〕または〔１６〕に記載の治療方法。
〔１８〕眼疾患が角結膜上皮障害またはドライアイである〔１５〕記載の治療方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のベクターによると、動物細胞に導入された場合に、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターから転写されたＲＮＡにＳＶ４０後期ポリＡシグナルを利用してポリＡが付加されたラクリチンｍＲＮＡが安定かつ高レベルに産生されることから、当該動物細胞でラクリチンを高発現可能なベクターとして有用である。本発明のラクリチン発現細胞によると、前記ベクターが導入されていることから、組換えラクリチンの供給源として細胞シートの形態で、または大量培養して単離精製した組換えラクリチンの形態で利用することができる。本発明のラクリチン発現細胞の製造方法によると、本発明のベクターを用いてラクリチンを高発現可能な細胞を容易に製造することができる。また、本発明の眼疾患治療剤によると、前記ラクリチン発現細胞を有効成分として含有することから、ラクリチンの不足に起因する眼疾患の予防または治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、分泌ラクリチンタンパク質の発現量をイムノブロット法により比較した結果を示す図である。
【図２】図２は、分泌ラクリチンタンパク質をイムノブロット法により検出した結果を示す図である。像の左側に泳動マーカーの分子量（ｋＤａ）を示す。
【図３】図３は、ラクリチン高発現細胞株と空ベクター導入細胞株の細胞数を比較したグラフである。
【図４】図４は、ラクリチン高発現細胞株と空ベクター導入細胞株のムチン１６の発現をイムノブロット法により調べた結果を示す図である。
【図５】図５は、角膜創傷治癒に対するラクリチン高発現細胞株の効果を示すグラフである。
【図６】図６は、分泌ラクリチンタンパク質の発現量をイムノブロット法により比較した結果を示す図である。像の左側に泳動マーカーの分子量（ｋＤａ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のベクターは、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターであって、当該ヌクレオチドがサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルに作動可能に連結されていることを特徴とする。【００１１】
本発明において「ラクリチン」とは、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類などの動物に由来するラクリチンがあげられるが、例えば、ヒト又はヒト細胞への使用を意図する場合には、ヒトラクリチン（例えば、GenBank/EBIデータバンクのアクセッション番号NM_033277（ｃＤＮＡ）及びay005150（ゲノミック）参照）が好ましい。ラクリチンは、角膜上皮細胞または涙腺腺房細胞の増殖を促進する限り、１以上（例えば、１〜１００、好ましくは１〜５０、より好ましくは１〜２０、さらにより好ましくは１〜１０）のアミノ酸が置換、付加、欠失または修飾された変異体であってもよい。ラクリチン変異体が角膜上皮細胞または涙腺腺房細胞の増殖を促進するか否かは、前記細胞を培養中の培地にラクリチン変異体を所定濃度（例えば、１ｎＭ程度）加えて培養を続けた場合に、ラクリチン変異体を加えない場合に比べて、有意に細胞数が増加することを確認することにより判断することができる。また、ラクリチンは、天然のラクリチンと識別可能なように、あるいは精製を容易ならしめるために、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ等のエピトープが付加されたラクリチンであってもよい。【００１２】
「ラクリチンをコードするポリヌクレオチド」は、上記ラクリチンをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ等のいかなるポリヌクレオチドであってもよい。ベクターに連結するためには、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、ラクリチンを発現する細胞から常法により単離して得られた天然のヌクレオチドであってもよく、GenBank等のデータバンクに登録された塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて増幅して得られた合成ヌクレオチドであってもよい。【００１３】
本発明のベクターで使用されるプロモーターは、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターであり、当該エンハンサー／プロモーターは、市販のベクターに組み込まれており、制限酵素等を用いて常法により市販ベクター（例、ｐｃＤＮＡベクター（インビトロジェン社）、ｐＣＩ-ｎｅｏベクター（プロメガ社））から切り出して、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドと連結することができる。【００１４】
本発明のベクターで使用されるポリＡシグナルは、ＳＶ４０後期ポリＡシグナルである。当該ポリＡシグナルは、市販のベクター（例、ｐＣＩ-ｎｅｏベクター（プロメガ社））に組み込まれており、制限酵素等を用いて常法により市販ベクターから切り出して、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドと連結することができる。【００１５】
本発明のベクターにおいて、ラクリチンをコードするポリヌクレオチドは、前記サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０後期ポリＡシグナルに作動可能に連結されている。ここで、「作動可能に連結」とは、目的の細胞においてラクリチンをコードするポリヌクレオチドが前記エンハンサー／プロモーターから転写され、転写物にポリＡのテールが付加されるように連結されていることをいう。ベクター中のかかる連結は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、市販のｐＣＩ-ｎｅｏベクターのマルチクローニングサイトの適当な制限酵素部位にラクリチンをコードするポリヌクレオチドをクローニングする方法があげられる。【００１６】
また、本発明のベクターは、さらにイントロン配列を含むことが好ましい。該イントロン配列としては、βグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンが挙げられる。【００１７】
本発明のベクターは、さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）を含有することもできる。好ましい選択マーカー遺伝子は、ネオマイシン耐性遺伝子である。【００１８】
本発明のベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、プラスミドベクターが好ましい。【００１９】
本発明に用いられる具体的なベクターとしては、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ社）、ｐＣＭＶＴＮＴベクター（プロメガ社）、またはＦｌｅｘｉベクター（プロメガ社）などにラクリチンをコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターが挙げられるが、好ましくはｐＣＩ−ｎｅｏベクターにラクリチンをコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。【００２０】
本発明のラクリチン発現細胞は、本発明のベクターを細胞に導入して得られるものである。【００２１】
導入対象の細胞としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類などの動物に由来する細胞があげられる。当該細胞は、涙腺細胞、耳下腺細胞、小唾液腺細胞、顎下腺細胞、甲状腺細胞、角膜細胞、胸腺細胞、結膜細胞等の細胞であってもよい。また、当該細胞は、初代培養細胞、初代培養細胞から誘導された細胞株、幹細胞等の未分化細胞の培養により得られる細胞（例えば、分化細胞）、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などであってもよい。ヒトへの適用と移植片としての利用を考慮すれば、導入される細胞は、株化ヒト角膜上皮細胞であることが好ましい。株化ヒト角膜上皮細胞は、Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995, 36, 614-621に記載の方法に準じて、ヒト角膜細胞から樹立することが可能である。【００２２】
本発明のベクターの細胞への導入方法としては、自体公知の方法、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、リポソーム、陽イオン性脂質等の脂質を使用する方法などが用いられ得る。また、該ベクターは、導入される細胞のゲノムに組み込まれていても、組み込まれていなくてもよい。本発明のベクター中に選択マーカーが含まれている場合、選択マーカーに応じた培養条件を設定することにより、本発明のベクターが導入された細胞を容易に選別することができる。【００２３】
本発明のベクターの細胞への導入後、ラクリチンが発現している細胞を常法によりクローニングすることにより、本発明のラクリチン発現細胞が得られる。本発明は、かかるラクリチン発現細胞の製造方法を提供する。【００２４】
本発明の眼疾患治療剤は、本発明のラクリチン発現細胞を含有することを特徴とする。ラクリチン発現細胞を含有する場合、当該眼疾患治療剤は、任意の媒体などを含有することができる。任意の媒体としては、例えば、細胞培養培地、培地添加剤などがあげられる。【００２５】
本発明のラクリチン発現細胞を含有する眼疾患治療剤は、哺乳動物等の動物に移植することも可能である。この場合、ラクリチン発現細胞は、移植用の細胞シート、細胞層または組織均等物（以下、必要に応じて「移植片」と省略する）として提供されてもよい。移植片の作製に関する技術は、例えば、WO03/084431、WO03/026712、WO03/009783、WO00/29553、WO96/13974、特開2003-38170、特開2001-161353、US20020039788等に詳述されている。また、ラクリチン発現細胞は、種類および移植が意図される動物の種類に応じて、異種移植、同種異系移植または同種同系移植を可能とする。本発明のラクリチン発現細胞は、ラクリチンの投与が所望される眼疾患の予防・治療剤として用いられ得る。適用が所望される眼疾患としては、例えば、ドライアイ症候群、シェーグレン症候群、角結膜上皮障害、マイボーム腺機能不全、乾性角結膜炎、眼瞼炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、ＶＤＴ（Visual Display Terminal）作業に関連したドライアイなどがあげられる。好ましくは、前記眼疾患は角結膜上皮障害またはドライアイである。【００２６】
また、本発明のラクリチン発現細胞は角膜創傷治癒促進剤として利用できる。【００２７】
別の実施形態では、本発明のラクリチン発現細胞は、細胞増殖の促進剤であり得る。該細胞により増殖が促進される細胞としては、例えば、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、涙腺細胞等の眼細胞、涙腺腺房細胞、唾液腺腺房細胞、胸腺腺房細胞等の腺房細胞などがあげられ、好ましくは角膜上皮細胞である。【００２８】
別の実施形態では、本発明のラクリチン発現細胞は、涙液等の分泌液の分泌促進剤であり得る。例えば、該細胞は、ラクリチンを高発現することによって涙腺細胞からの涙液分泌能の向上を可能とする。【００２９】
別の実施形態では、本発明のラクリチン発現細胞は、ムチン分泌促進剤であり得る。該細胞は、ムチンの分泌を促進し、分泌されたムチンが涙液層を眼表面に保持する役割を果たすことによって、角膜上皮を保護することを可能とする。【００３０】
本発明は、前記ラクリチン発現細胞を用いることを特徴とする組換えラクリチンの製造方法を提供する。当該製造方法は、前記ラクリチン発現細胞を培地中で培養する工程、および培養上清中のラクリチンを単離する工程を含む。【００３１】
ラクリチン発現細胞を培地中で培養する工程
細胞培養は、ラクリチン発現細胞に適した培地および栄養成分、ならびに温度、湿度、ＣＯ２濃度等の培養環境および培養時間を適宜選択して行うことができる。ラクリチン発現細胞が株化ヒト角膜上皮細胞の場合も細胞に適した培地および栄養成分、ならびに温度、湿度、ＣＯ２濃度等の培養環境および培養時間を適宜選択して行うことができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度等の条件下で培養することができる。【００３２】
培養上清中のラクリチンを単離する工程
前記培養工程において、ラクリチン発現細胞からラクリチンが培地に分泌される。本工程では、培地を回収し、培養上清からラクリチンを単離する。通常、遠心分離により培養上清を得て、培養上清から自体公知の方法、例えば、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ラクリチン抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製することができる。【００３３】
このようにして得られた組換えラクリチンは、医薬上許容されうる担体ともに常法により製剤化して、ラクリチンを必要とする眼疾患の治療剤として提供することができる。【００３４】
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどがあげられるが、それらに限定されるものではない。【００３５】
組換えラクリチンの投与量は、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されない。【００３７】
実施例１  ヒトラクリチン遺伝子を含有するｐCI-neoベクターの構築
ヒトラクリチン遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの配列をPCR法を用いて増幅した。PCRは、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて１分のサイクルを３５回繰り返し行ない、cDNAからラクリチン遺伝子断片を増幅した。予めForward側のプライマー（5’- GGT GGT TCT CGA GGC CAC CAT GAA ATT TAC CAC TCT CCT CT-3’：配列番号１）にはXhoIの制限部位を、Reverse側のプライマー（5’-GGT GGT T TCT AGA AT CAG CTC ATG CCC ATG GTT TTA ATA GAC-3’：配列番号２）にはXbaIの制限部位を含むような配列を挿入しておき、増幅したヒトラクリチン遺伝子断片を各制限酵素で切断した後、pCI-neo mammalianベクター（プロメガ株式会社）に組み込んだ。その後、ラクリチンを組み込んだベクターを大量に得るため、One Shotコンピテントセル（インビトロジェン株式会社）を用いて、前記ラクリチン遺伝子含有ベクターを大腸菌TOP10に形質転換した。大腸菌からのベクター精製は、Plasmid purification kits（キアゲン株式会社）を使用した。
なお、pCI-neoベクターは、プロモーターとしてサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターを含有し、ポリＡシグナルとしてＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含有し、さらにβグロブリン遺伝子のイントロンと免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからなるキメライントロンおよびネオマイシン耐性遺伝子を含有するものである。【００３８】
比較例１  ヒトラクリチン遺伝子を含有するpcDNA3.1 TOPOベクターの構築
実施例１で増幅したヒトラクリチン遺伝子断片をTA cloning法を利用し、pcDNA3.1 TOPOベクター（インビトロジェン株式会社）に組み込んだ。その後、実施例１と同様に、そのベクターを大腸菌TOP10に形質転換した。
なお、pcDNA3.1 TOPOベクターは、プロモーターとしてサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターを含有し、ポリＡシグナルとしてBGHポリアデニレーションシグナルを含有し、さらにネオマイシン耐性遺伝子を含有するものである。【００３９】
実施例２  ベクター間によるラクリチンタンパク質の分泌量の比較
FreeStyle 293細胞発現キット（インビトロジェン株式会社）を用いて、実施例１と比較例１で作製したベクターによるラクリチンタンパク質の分泌量の違いを比較した。まず、ラクリチン遺伝子を含む各ベクターを293細胞に導入し、４８時間振とう培養した（FreeStyle 293細胞発現キット）。培養終了後、培地を回収し、限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。濃縮した培養液は、12% NuPAGE gel（インビトロジェン株式会社）で電気泳動し（MES緩衝液、200V、35分間）、その後、ブロッティングバッファー（20% MeOH, Tris-glycine buffer）を用いて、ブロッティングを行なった（100V, 90分間）。マーカーは、プレシジョンPlusブルースタンダード（バイオラッド株式会社）を使用した。メンブレンのブロッキングと抗体の希釈には５％スキムミルク入りのTTBSを用いた。１次抗体はanti-lacritin抗体(タカラバイオ株式会社にて製造)を2000倍希釈して抗体反応を行い、２次抗体はanti-rabbit IgG-HRP conjugate(サンタクルズ株式会社)を5000倍希釈して用いた。検出はECL plus (GE healthcare bioscience株式会社)を用い、Chemi-Doc（バイオラッド株式会社）で画像の取り込みを行った。取り込んだ画像は、Scion Imageを用いて、その強度を測定した。【００４０】
その結果、図１に示すように、実施例１で作製したpCI-neoベクターを用いてラクリチンを導入した細胞では、比較例１で作製したpcDNA3.1 TOPOベクターを用いて導入した細胞に比較し、ラクリチンタンパク質の分泌量が増加した。pCI-neoベクターを導入した細胞からのラクリチンタンパク質の分泌量は、pcDNA3.1 TOPOベクターを導入した細胞からの分泌量の約13倍であった。【００４１】
実施例３  ラクリチン高発現細胞株の樹立
実施例１で作製したベクターを使用し、ラクリチン高発現安定株の樹立を行った。株化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T：Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995, 36, 614-621に記載された方法にて調製され得る）に、Lipofectamine（インビトロジェン株式会社）を用いて、実施例１で作製されたベクターを導入した。その後、Geneticin（インビトロジェン株式会社）存在下で培養することにより、染色体中にラクリチンが導入された細胞株を得た。【００４２】
実施例４  高発現細胞株から分泌されるラクリチンタンパク質の発現
実施例３で樹立したラクリチン高発現細胞株からのラクリチンタンパク質の分泌を確認するため、イムノブロット法を用いて確認を行なった。
実施例３で樹立したラクリチン発現細胞株1×107個を、２２５cm２のフラスコに播種し、翌日に培地をOpti-MEM（インビトロジェン社）に交換し、４８時間培養した。培養終了後、培地を回収し、限外ろ過フィルターを用いて、培地を100倍濃縮した。濃縮した培養液は、12% NuPAGE gelで電気泳動し（MES緩衝液、200V、35分間）、その後、ブロッティングバッファー（20% MeOH, Tris-glycine buffer）を用いて、ブロッティングを行なった（100V, 90分間）。メンブレンのブロッキングと抗体の希釈は５％スキムミルク入りのTTBSを用いた。１次抗体はanti-lacritin抗体(タカラバイオ株式会社)を2000倍希釈して抗体反応を行い、２次抗体はanti-rabbit IgG-HRP conjugate(サンタクルズ株式会社)を5000倍希釈して用いた。検出はECL plus (GE healthcare bioscience株式会社)を用い、Chemi-Doc（バイオラッド株式会社）で画像を取り込んだ。【００４３】
その結果、図２に示すように、pCI-neoベクターを用いてラクリチン遺伝子を導入した高発現細胞株は、25kDaの位置にラクリチンタンパク質の分泌を示すバンドが検出された。一方、pCI-neoベクターのみを導入した細胞では、培養液中にバンドは検出されなかった。【００４４】
実施例５  ラクリチン高発現細胞の増殖実験
ラクリチン高発現細胞において、分泌されたラクリチンの機能を確認するため、細胞増殖効果を検討した。24 well plateに実施例３で樹立したラクリチン発現細胞株（5×103個）を播種した。翌日、Geneticin含有のEpiLife培地（クラボウ株式会社）に交換し、試験を開始した。培養はトータルで６日間行い、途中３日目で培養液を一度交換した。細胞数のカウントは、血球計算盤を用いて、培養６日目に計測した。結果を図３に示す。【００４５】
その結果、ラクリチン高発現細胞株は、ベクターのみを導入した細胞株と比較して、高い増殖能を有することが判明した。すなわち、分泌されたタンパク質が角膜上皮細胞に作用することによって、細胞の増殖能が亢進したと考えられる。【００４６】
実施例６  ムチン16発現亢進試験
ムチンは、涙液の量的・質的恒常性を維持するために、重要なタンパク質である。そこで、ラクリチン高発現細胞株を用いて、膜型ムチンの一つであるムチン16の発現に対するラクリチンタンパク質の効果を検討した。
6ウエルプレートに、実施例３で樹立したラクリチン発現細胞株（2×105個）を播種し、細胞がコンフルエントになる前日に、培養液を血清なしのDMEM/F12（インビトロジェン株式会社）に交換した。その翌日、再び新しい培地に交換後、３日間細胞を培養した。その後、細胞をRIPA緩衝液（50mM Tris, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 1% NP-40, 150mM NaCl、complete protein inhibitor cocktail(Rhoche)）を用いて溶解し、ソニケーターで細胞破砕後、12000回転、15分間、4℃で遠心分離し、可溶性のタンパク質を回収した。回収したサンプルのタンパク質濃度を測定後、40-50μgの可溶性タンパク質を4-12% NuPAGE gelで電気泳動し（MOPS buffer, 200V, 70分間）、その後ブロッティングバッファー（0.02% SDS, 20% MeOH, Tris-glycine buffer）を用いて、100Vで60分間のブロッティングを行った。メンブレンのブロッキングと抗体の希釈は５％スキムミルク入りのTTBSを用いた。１次抗体はOC125(Dako株式会社)を1000倍希釈で抗体反応を行い、２次抗体はanti-mouse IgG-HRP conjugate(サンタクルズ株式会社)を5000倍希釈で用いた。検出はECL plus(GE healthcare bioscience株式会社)を用い、Chemi-Docで画像の取り込みを行った。【００４７】
その結果、図４に示すように、空のベクターを導入した細胞株に比較し、ラクリチン高発現細胞株では、どの時点においてもムチン16の発現量が増加していた。すなわち、分泌されたラクリチンが角膜上皮細胞に作用することによって、ムチン16の発現を亢進したと考えられる。【００４８】
実施例７  角膜創傷治癒実験
角膜創傷治癒モデルを使用し、ラクリチン高発現細胞株の創傷治癒効果を検討した。plateの前処置として、１インチの円形にカットしたプレートシール（サンプラテック株式会社）を24 well plateの底面の中心にくるように貼付した後、2〜3 時間UVを照射し、滅菌した。その後、DMEM/F-12/5% FBS培地を用いて、5〜16×104個/mLになるように実施例３で樹立したラクリチン発現細胞株を懸濁し、あらかじめ前処置した24 well plateの各ウェルに500μLずつ播種した（2.5〜8×104 個/well）。その後、細胞がコンフルエントに達するまで、37℃、5% CO2下で３日間培養した。細胞がコンフルエントになった後、24 well plateにあらかじめ貼付しておいたプレートシールを慎重に除去した。次に培養上清を除去した後、血清不含、Geneticin含有のDMEM/F12を500μLずつウェルに分注した。その後３日間37℃、5% CO2下で培養した。細胞の創傷治癒効果を評価するため、10% ホルマリンで固定後、1%のクリスタルバイオレットで染色し、残存する上皮欠損部の面積をコンピュータ画像上で測定した。【００４９】
その結果、図５に示すように、空のベクターを導入した細胞株では、欠損エリアが約90％であったが、ラクリチン高発現細胞株では、欠損エリアが約70％であった。すなわち、分泌されたラクリチンが角膜上皮細胞に作用することによって、角膜創傷治癒促進効果を示したと考えられる。【００５０】
比較例２  ヒトラクリチン遺伝子を含有するｐBApo-CMVベクターの構築
ヒトラクリチン遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの配列をPCR法により増幅した。PCRは、94℃にて30秒、55℃にて30秒、68℃にて１分のサイクルを25回繰り返し行ない、cDNAからラクリチン遺伝子断片を増幅した。予めForward側のプライマー（5’- AAC CGG ATC CGC CAC CAT GAA ATT TAC CAC TCT CCT CT-3’：配列番号３）にはBamHIの制限部位を、Reverse側のプライマー（5’- CCC CAA GCT TCA TGC CCA TGG TTT TAA TAG AC-3’：配列番号４）にはHind IIIの制限部位を含むような配列を挿入しておき、増幅したヒトラクリチン遺伝子断片を各制限酵素で切断した後、pBApo-CMV Neoベクター（タカラバイオ株式会社）に組み込んだ。その後、ラクリチンを組み込んだベクターを大量に得るため、MAX Efficiency DH5α コンピテントセル（インビトロジェン株式会社）を用いて、前記ラクリチン遺伝子含有ベクターを大腸菌DH5αに形質転換した。大腸菌からのベクター精製は、Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit（インビトロジェン株式会社）を使用した。
なお、ｐBApo-CMVベクターは、プロモーターとしてサイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターを含有し、ポリＡシグナルとして単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリＡシグナルを含有し、さらにネオマイシン耐性遺伝子を含有するものである。【００５１】
比較例３  ヒトラクリチン遺伝子を含有するpEF6 TOPOベクターの構築
比較例２で増幅したヒトラクリチン遺伝子断片をTA cloning法を利用し、pEF6 TOPOベクター（インビトロジェン株式会社）に組み込んだ。その後、ラクリチンを組み込んだベクターを大量に得るため、One shot TOP10 コンピテントセル（インビトロジェン株式会社）を用いて、ラクリチン遺伝子含有pEF6 TOPOベクターを大腸菌TOP10に形質転換した。
なお、pEF6 TOPOベクターは、プロモーターとしてhEF-1α遺伝子プロモーターを含有し、ポリＡシグナルとしてBGHポリアデニレーションシグナルを含有し、さらにブラストシジン耐性遺伝子を含有するものである。【００５２】
実施例８  ベクター間によるラクリチンタンパク質の分泌量の比較
FreeStyle 293細胞発現キット（インビトロジェン株式会社）を用いて、実施例１、比較例２および比較例３で作製したベクターによるラクリチンタンパク質の発現量の違いを比較した。まず、ラクリチン遺伝子を含む各ベクターを293細胞に導入し、48時間および72時間振とう培養した（FreeStyle 293細胞発現キット）。培養終了後、培地を回収し、限外ろ過フィルターを用いて濃縮した。濃縮した培養液は、12% NuPAGE gel（インビトロジェン株式会社）で電気泳動し（MES緩衝液、200V、35分間）、その後、ブロッティングバッファー（20% MeOH, Tris-glycine buffer）を用いて、ブロッティングを行なった（100V, 90分間）。メンブレンのブロッキングと抗体の希釈には５%スキムミルク入りのTTBSを用いた。一次抗体はanti-lacritin抗体（タカラバイオ株式会社にて製造）を2000倍希釈して抗体反応を行い、２次抗体はanti-rabbit IgG-HRP conjugate（サンタクルズ株式会社）を5000倍希釈して用いた。検出はECL plus（GE healthcare bioscience株式会社）を用い、Chemi-Doc（バイオラッド株式会社）で画像の取り込みを行った。【００５３】
その結果、図６に示すように、実施例１で作製したpCI-neoベクターを用いてラクリチンを導入した細胞では、ラクリチンを示すバンドが検出されたが、比較例２および３で作製したｐBApo-CMVベクターおよびpEF6 TOPOベクターを用いて導入した細胞では、ラクリチンのバンドは全く検出されなかった。すなわち、pCI-neoベクターでラクリチンタンパク質を発現させると、その分泌量が著しく増加することが判明した。 
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のベクターは、動物細胞において、ラクリチンを高発現可能なベクターとして有用である。本発明のラクリチン発現細胞は、組換えラクリチンの供給源として細胞シートの形態で、または大量培養して単離精製した組換えラクリチンの形態で利用することができる。本発明のラクリチン発現細胞の製造方法は、本発明のベクターを用いてラクリチンを高発現可能な細胞を容易に製造することができる。また、本発明の眼疾患治療剤は、前記ラクリチン発現細胞を有効成分として含有することから、ラクリチンの不足に起因する眼疾患の予防または治療に有用である。【００５５】
本発明は、２００７年２月２８日出願の日本国特許出願、特願２００７-０４９９３６を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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