【手続補正書】
【提出日】平成17年1月28日(2005.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  以下の段階を含む、臍帯血から神経細胞を生産する方法：
a. 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階であって、該単核細胞が多能性幹細胞または前駆細胞を含む段階；および
b. 該幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な期間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階aで得られた該単核細胞を増殖させる段階。
【請求項２】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、BDNF、GDNF、NGF、FGF、TGF、CNTF、BMP、LIF、GGF、TNF、IGF、CSF、KIT、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、SHC、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】  分化促進物質が、レチノイン酸とNGFの混合物である、請求項1記載の細胞。
【請求項４】  分化促進物質が、中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される胎児または成体のニューロン細胞を含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】  以下の段階を含む、臍帯血から神経細胞を生産する方法：
a. 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階であって、該単核細胞が多能性幹細胞または前駆細胞を含む段階；
b. 該単核細胞試料内の多能性幹細胞または前駆細胞を選択および単離する段階；および
c. 幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な期間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階bで得られた幹細胞または前駆細胞を増殖させる段階。
【請求項６】  選択および単離段階bが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、CDマーカーを含む細胞を分離する、請求項5記載の方法。
【請求項７】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、BDNF、GDNF、NGF、FGF、TGF、CNTF、BMP、LIF、GGF、TNF、IGF、CSF、KIT、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、SHC、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項８】  以下の段階を含む、臍帯血から神経細胞を生産する方法：
a. 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階であって、該単核細胞が多能性幹細胞または前駆細胞を含む段階；
b. 該単核細胞試料内の多能性幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な期間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階aで得られた該単核細胞を増殖させる段階；および
c. 該単核細胞試料内の多能性幹細胞または前駆細胞から、CDマーカーを有する単核細胞試料を本質的に除去することによって、該神経細胞を選択および単離する段階。
【請求項９】  選択および単離段階cが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、CDマーカーを含む細胞を分離する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、BDNF、GDNF、NGF、FGF、TGF、CNTF、BMP、LIF、GGF、TNF、IGF、CSF、KIT、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、SHC、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】  分化促進物質が、中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される胎児または成体のニューロン細胞を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】  以下の段階を含む、臍帯血から得た単核細胞試料から濃縮された神経細胞試料を生産する方法：
a. 該単核細胞試料から増殖する全ての細胞を本質的に除去するために有効な量の抗増殖物質の影響下に単核細胞を置く段階；
b. 段階aで残った非増殖細胞を、分裂促進剤に暴露し、多能性幹細胞または前駆細胞の群を含む、分化した細胞および休止期の細胞の群を提供する段階；および
c. 段階bで得られた該分化した細胞および休止期の細胞の群を増殖させて、休止期の細胞を選択的に増殖させ、分化した細胞を本質的に排除する段階。
【請求項１３】  段階cで得られた細胞群を、多能性幹細胞または前駆細胞において神経の表現型を誘導するために有効な分化促進物質とインキュベートする段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】  抗増殖物質がAra-Cである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】  分裂促進因子が、上皮成長因子およびアメリカヤマゴボウマイトジェンからなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１６】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、BDNF、GDNF、NGF、FGF、TGF、CNTF、BMP、LIF、GGF、TNF、IGF、CSF、KIT、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、SHC、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】  分化促進物質が、9-シスレチノイン酸、全トランス型レチノイン酸(all transretinoic acid)、およびそれらの混合物からなる群より選択されるレチノイン酸である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】  少なくとも1つの有効量の神経分化促進物質と共に、臍帯血またはその単核細胞画分を含む組成物であって、該臍帯血またはその単核細胞画分が多能性幹細胞または前駆細胞を含み、かつ、該神経分化促進物質の量が、多能性幹細胞または前駆細胞において神経の表現型を誘導するのに有効な量である組成物。
【請求項１９】  分化促進物質が添加される細胞培地をさらに含む、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体の中脳細胞または線条体細胞、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、グリア成長因子(GFF)、神経成長因子(NGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、骨形成蛋白質(BMP)、白血病阻害因子(LIF)、グリア成長因子(GGF)、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロン、インスリン様成長因子(IGF)、コロニー刺激因子(CSF)、KIT受容体幹細胞因子(KIT-SCF)、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、グリア細胞を欠如したサイレンサー因子、ニューロン限定サイレンサー因子、SRCホモロジー-2-ドメイン含有トランスフォーミング蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項18記載の組成物。
【請求項２１】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体の中脳細胞または線条体細胞、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、グリア成長因子(GFF)、神経成長因子(NGF)、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項18記載の組成物。
【請求項２２】  分化促進物質が、レチノイン酸、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、グリア成長因子(GFF)、および神経成長因子(NGF)の混合物からなる群より選択される、請求項18記載の組成物。
【請求項２３】  分化促進物質を添加した細胞培地をさらに含む、請求項20記載の組成物。
【請求項２４】  分化促進物質が、レチノイン酸と神経成長因子の混合物である、請求項18記載の組成物。
【請求項２５】  以下の段階を含む、神経表現型マーカーを有する細胞の濃縮された単核細胞試料を含む薬学的組成物を生産する方法：
a. 臍帯血から単核細胞試料を得る段階であって、該単核細胞が幹細胞および前駆細胞を含む段階；および
b. 幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な時間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階aで得られた単核細胞を増殖させる段階；および
c. 段階bで得られた該細胞を、薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と組み合せる段階。
【請求項２６】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、BDNF、GDNF、NGF、FGF、TGF、CNTF、BMP、LIF、GGF、TNF、IGF、CSF、KIT、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、SHC、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】  分化促進物質が、レチノイン酸とNGFの混合物である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】  神経細胞が、中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２９】  以下の段階を含む、臍帯血から得られた神経細胞を含む、薬学的組成物を生産する方法：
a. 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階であって、該単核細胞が幹細胞および前駆細胞を含む段階；および
b. 該単核細胞試料内の多能性幹細胞または前駆細胞を選択および単離する段階；
c. 幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な時間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階bで得られた該幹細胞または前駆細胞を増殖させる段階；および
d. 段階cで得られた該細胞を、薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と組み合せる段階。
【請求項３０】  選択および単離段階bが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、CDマーカーを含む細胞を分離する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、BDNF、GDNF、NGF、FGF、TGF、CNTF、BMP、LIF、GGF、TNF、IGF、CSF、KIT、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、SHC、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３２】  以下の段階を含む、臍帯血から得られた神経細胞を含む、薬学的組成物を生産する方法：
a. 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階であって、該単核細胞が多能性幹細胞および前駆細胞を含む段階；
b. 該単核細胞試料内の多能性幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な時間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階aで得られた該単核細胞を増殖させる段階；
c. 該試料内の該多能性幹細胞または前駆細胞から、CDマーカーを有する単核細胞試料を本質的に除去することによって、神経の表現型を有する細胞を選択および単離する段階；および
d. 段階cで単離された神経の表現型を有する細胞を、薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と組み合せる段階。
【請求項３３】  選択および単離段階cが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、CDマーカーを含む細胞を分離する、請求項32記載の方法。
【請求項３４】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、BDNF、GDNF、NGF、FGF、TGF、CNTF、BMP、LIF、GGF、TNF、IGF、CSF、KIT、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、SHC、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３５】  分化促進物質が、レチノイン酸と神経成長因子の混合物である、請求項記32載の組成物。
【請求項３６】  神経の表現型を有する細胞が、中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３７】  臍帯血から得られた多能性幹細胞または前駆細胞を、幹細胞または前駆細胞の表現型を神経の表現型に変化させるために有効量の分化促進物質に曝露する段階を含む、神経細胞を生産する方法。
【請求項３８】  分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体の中脳細胞または線条体細胞、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、グリア成長因子(GFF)、神経成長因子(NGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、骨形成蛋白質(BMP)、白血病阻害因子(LIF)、グリア成長因子(GGF)、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロン、インスリン様成長因子(IGF)、コロニー刺激因子(CSF)、KIT受容体幹細胞因子(KIT-SCF)、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、グリア細胞を欠如したサイレンサー因子、ニューロン限定サイレンサー因子、SRCホモロジー-2-ドメイン含有トランスフォーミング蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】  有効量の分化促進物質の存在下において、神経細胞が、神経発生に関連する遺伝子発現の増加と、血球系の発生に関連する遺伝子発現の減少の両方を示す、臍帯血から得られる単離された神経細胞。
【請求項４０】  神経形成に関連する遺伝子が、神経突起増殖促進蛋白質、グリピカン-4、β-チューブリンフォールディングコファクターD、プロ-ガラニン、FE65stat様蛋白質、神経膠線維性酸性蛋白質、ニューロン由来オーファン受容体、ニューロンペントラキシンII、ニューロン成長蛋白質43、ニューロンPAS1、ニューロンDHP感受性で電圧依存的なカルシウムチャネルα-1Dサブユニット、骨形成蛋白質1、グルタミン酸レチナールトランスポーターEAAT5、TrKC、ニューロン特異的（γ）エノラーゼのENO2遺伝子、腫瘍随伴性感覚ニューロン障害患者の血清により認識されるヒト脳蛋白質、骨形成蛋白質2A、ニューロンPAS2、生存運動ニューロン偽遺伝子、グリア増殖因子2、神経細胞接着分子エキソンSEC、フォリスタチン関連蛋白質、微小管結合蛋白質2、小胞アセチルコリントランスポーター、神経フィラメントサブユニットM、神経フィラメントサブユニットNF-L、Musashi 1、骨形成蛋白質11、およびテナシン-Cからなる群より選択され；ならびに、血球系の発生に関連する遺伝子が、HLAクラスI遺伝子座C重鎖、マクロファージ受容体MARCO、アトラクチン、α-1 II型コラーゲン、白血球イムノグロブリン様受容体-8、胸腺細胞抗原CD1c、エリスロポエチン受容体、エリスロポエチン、単核白血球走化性蛋白質-2、リンパ球活性化に関与するCD4関連蛋白質のLAG-3 mRNA、インターロイキン-7受容体、I型補体受容体、T細胞受容体、p50-NF-κ Bホモログ、リンパ球特異的蛋白質チロシンキナーゼ、リンパ球活性化に関与するCD4関連蛋白質のLAG-3 mRNA、赤血球膜蛋白質Rh30A、赤血球膜蛋白質バンド4.2、白血球IgG受容体、および赤芽球マクロファージ蛋白質からなる群より選択される、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４１】  神経細胞がヒト細胞である、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４２】  神経細胞が造血幹細胞ではない、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４３】  神経細胞がCD34抗原を発現しない、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４４】  神経細胞が多能性神経前駆細胞である、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４５】  神経細胞がインビボでニューロンおよびグリア細胞に分化する、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４６】  有効量の分化促進物質の存在下で、神経細胞がニューロンおよびグリア細胞に分化する、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４７】  神経細胞に、該神経細胞内で発現されるポリヌクレオチドが導入された、請求項39記載の単離された神経細胞。
【請求項４８】  有効量の分化促進物質の存在下において、神経前駆細胞が、神経発生に関連する遺伝子発現の増加と、血球系の発生に関連する遺伝子発現の減少の両方を示す、臍帯血から得られる単離されたヒト多能性神経前駆細胞。
【請求項４９】  請求項1記載の方法により生産された神経細胞。
【請求項５０】  請求項5記載の方法により生産された神経細胞。
【請求項５１】  請求項8記載の方法により生産された神経細胞。
【請求項５２】  請求項12記載の方法により生産された、濃縮された神経細胞試料。
【請求項５３】  請求項25記載の方法により生産された薬学的組成物。