【手続補正書】
【提出日】平成16年12月24日(2004.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  標的種に結合する試験化合物を同定するための高処理量スクリーニング方法であって、
少なくとも１つの試験化合物及び少なくとも１つの標的種を含んで成る、多数の試験混合物を、測定できる程度への前記標的種の少なくとも一部の変性を引き起こすのに効果的である等温変性条件下でインキュベートし；
前記少なくとも1つの試験化合物の存在下で個々の標的種の変性シグナルを検出し；そして
少なくとも１つの試験化合物の存在下での個々の標的種の前記変性シグナルと、前記少なくとも1つの試験化合物の不在下での同じ標的種の変性シグナルとを、前記同じ等温変性条件下で比較する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】  前記標的種が、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである請求項１記載の方法。
【請求項３】  前記標的種がタンパク質である請求項２記載の方法。
【請求項４】  前記化合物が、前記標的種に対して特異的に結合する請求項１記載の方法。
【請求項５】  前記化合物が、共有結合、疎水性結合、イオン結合又は水素結合相互作用を通して、前記標的種に結合する請求項１記載の方法。
【請求項６】  前記変性シグナルの検出が、蛍光シグナル、UV吸光度の変化、モル楕円率、赤外線スペクトルのスペクトルシフト、NMRスペクトルのスペクトルシフト、又は支持体材料上での移動度の変化、を検出することを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項７】  前記変性シグナルの検出が、蛍光シグナルを検出することを含んで成る請求項６記載の方法。
【請求項８】  前記等温変性条件が、DSC(示差走査熱量測定法)により測定される場合、標的種のTm値に等しいか、又はTm値よりも約10℃高いか又は低い温度を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項９】  前記等温変性条件が、DSC(示差走査熱量測定法)により測定される場合、標的種のTm値に等しいか、又はTm値よりも約10℃まで低い温度を含んで成る請求項８記載の方法。
【請求項１０】  少なくとも１つの試験化合物、少なくとも1つの標的種、及び少なくとも1つのレポーター分子を、等温変性条件下でインキュベートすることをさらに含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項１１】  前記試験化合物及びレポーター分子の濃度が、比較できる高さのものである請求項１記載の方法。
【請求項１２】  前記試験化合物の濃度が、標的種の濃度よりも少なくとも10倍高い請求項11記載の方法。
【請求項１３】  前記レポーター分子が、蛍光レポーター分子である請求項10記載の方法。
【請求項１４】  個々の試験混合物が、１つの標的種を包含する請求項１記載の方法。
【請求項１５】  個々の試験混合物が、少なくとも２種の試験化合物を包含する請求項１記載の方法。
【請求項１６】  個々の試験混合物が、２〜10種の試験化合物を包含する請求項15記載の方法。
【請求項１７】  タンパク質に結合する試験化合物を同定するための高処理量スクリーニング方法であって、
少なくとも１つの試験化合物、少なくとも１つのレポーター分子、及び少なくとも１つのタンパク質を含んで成る、多数の試験混合物を、測定できる程度への前記標的種の少なくとも一部の変性を引き起こすのに効果的である等温変性条件下でインキュベートし；
前記少なくとも1つの試験化合物の存在下で個々のタンパク質の変性シグナルを検出し；そして
少なくとも１つの試験化合物の存在下での個々のタンパク質の前記変性シグナルと、前記少なくとも1つの試験化合物の不在下での同じタンパク質の変性シグナルとを、前記同じ等温変性条件下で比較する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１８】  前記レポーター分子が、蛍光レポーター分子である請求項17記載の方法。
【請求項１９】  個々の試験混合物が、１つの標的種を包含する請求項１記載の方法。
【請求項２０】  個々の試験混合物が、少なくとも２種の試験化合物を包含する請求項１記載の方法。
【請求項２１】  等温変性条件下で試験化合物が標的種に結合可能か否かを測定するためのシステムであって、
（ａ）（i）少なくとも1つの試験化合物；及び
（ii）少なくとも1つの標的種
を含有する混合物を含む区画、前記等温変性条件は前記標的種の少なくとも一部を測定可能な範囲まで変性させるのに効果的である；
（ｂ）等温変性条件を与える手段；及び
（ｃ）少なくとも1つの試験化合物の存在下における各標的種の変性シグナルの検出手段であって、それによって、前記少なくとも1つの試験化合物の不在下における前記標的種の変性シグナルと比較した場合の、前記少なくとも1つの試験化合物の存在下における前記標的種の前記変性シグナルの低下が、前記標的種と前記少なくとも1つの試験化合物の間の結合を示すものである；
を含むシステム。
【請求項２２】  前記標的種が、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである請求項21記載のシステム。
【請求項２３】  前記標的種がタンパク質である請求項22記載のシステム。
【請求項２４】  前記化合物が、前記標的種に対して特異的に結合する請求項21記載のシステム。
【請求項２５】  前記化合物が、共有結合、疎水性結合、イオン結合又は水素結合相互作用を介して、標的種に結合する請求項21記載のシステム。
【請求項２６】  前記変性シグナルの検出が、蛍光シグナル、UV吸光度の変化、モル楕円率の変化、赤外線スペクトルのスペクトルシフト、NMRスペクトルのスペクトルシフト、又は支持体材料上での移動度の変化、を検出することを含む請求項21記載のシステム。
【請求項２７】  前記変性シグナルの検出が、蛍光シグナルを検出することを含む請求項26記載のシステム。
【請求項２８】  前記等温変性条件が、示差走査熱量測定法により測定される場合、前記標的種のTm値に等しいか、又はTm値よりも約10℃高いか又は低い温度を含む請求項21記載のシステム。
【請求項２９】  前記等温変性条件が、示差走査熱量測定法により測定される場合、前記標的種のTm値に等しいか、又はTm値よりも最大で約10℃低い温度を含む請求項28記載のシステム。
【請求項３０】  少なくとも1つの試験化合物、少なくとも1つの標的種、及び少なくとも1つのレポーター分子を、等温変性条件下でインキュベートすることをさらに含む請求項21記載のシステム。
【請求項３１】  前記試験化合物及び前記レポーター分子の濃度が、比較可能な規模である請求項21記載のシステム。
【請求項３２】  前記試験化合物の濃度が、前記標的種の濃度と比較して少なくとも10倍高い請求項31記載のシステム。
【請求項３３】  前記レポーター分子が、蛍光レポーター分子である請求項30記載のシステム。
【請求項３４】  各試験混合物が、1つの標的種を包含する請求項21記載のシステム。
【請求項３５】  各試験混合物が、少なくとも2種の試験化合物を包含する請求項21記載のシステム。
【請求項３６】  各試験混合物が、2〜10種の試験化合物を包含する請求項35記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、チミジル酸キナーゼ（TK）のDSC走査を示す。チミジル酸キナーゼの熱溶解プロフィールは、前記実施例に記載のようにして決定された。
【図２】
図２は、種々の蛍光色素によりモニターされる場合のTKの等温変性を示す。等温変性実験は、0.5μMのタンパク質濃度を用いて、53℃の温度で、前記実施例に記載のようにして行われた。DDSの濃度は１μMであり、１，８−ANSは２μMであり、そしてタンパク質色素は次の通りであった：Nano Orangeは１：650倍希釈で存在し、そしてSYPRO Orange及びSYPRO Redの両者は１：10,000倍希釈で存在した。
【図３】
図３は、TKによるSYPRO Orange及びNano Orangeの滴定を示す。固定された量の色素、すなわち250nMのDBS及び１：2600希釈度のNano Orangeが、上昇する量のチミジル酸キナーゼによりT＝23℃で滴定され、そして蛍光の上昇が記録された。使用される発光/励起波長は、表１に与えられる。
【図４】
図４は、SYPRO Orangeによりモニターされるチミジン一リン酸（TMP）の存在下でTKの等温変性の時間依存性を示す。SYPRO Orange蛍光によるTKの等温変性をモニターリングするための実験的変性条件は、前記実施例に記載される。緩衝液2ml中、前記反応混合物は、0.5μMのタンパク質、20,000倍希釈度でのSYPRO Orange及び示される濃度でのTMPを含んだ。TMPは、タンパク質の添加の時点で反応混合物に存在した。データは、等式11を用いて分析され、そして実線は実験データへの理論的適合性を表す。
【図５】
図５は、TMPによる等温変性に対するTKの安定化の用量依存性を示す。TMP/TK相互作用の用量依存性が、運動曲線の直線傾斜及び結果に記載されるような一次速度定数の両者を用いて計算された。二次Langmuirモデルを用いて、傾斜及び速度定数値から解離定数を計算した。実践は、実験データ点への理論的適合性を表す。一次速度定数により測定される場合のチミジル酸キナーゼのTMP用量依存性安定化が、図５Aに及び図５Bにおける初期速度により示される。
【図６】
図６は、TKのCD（円二色性）構造の等温変性の効果を示す。次に、生来の及び等温的に変性されたTKのCDスペクトルが前記実施例に記載のようにして取られ；空白の丸＝生来のタンパク質；黒丸＝53℃で等温変性されたTK。
【図７】
図７は、CDによりモニターされるTKの等温変性の時間の依存性を示す。25mMのTMPの添加を伴なって又はそれを伴わないで53℃でのTK等温変性の時間依存性が、前記実施例に記載のようにしてCDにより追跡された。そのデータは一次速度モデルを用いて分析され、そして実践は実践データ点に対する理論的適合性を表す。
【図８】
図８は、UV濃色性によりモニターされるTKの等温変性の時間依存性を示す。TK等温変性の時間依存性が、前記実施例に記載のようにして、280nmでの吸光度上昇によりモニターされた。データは、等式４（上記）を用いて分析され、そして実線は、実験データ点に対する理論的適合性を表す。
【図９】
図９は、ストロメルシンのDSC走査を示す。ストロメルシンの熱溶解プロフィールが前記実施例に記載のようにして決定された。
【図１０】
図10Aは、SYPRO Orange蛍光によりモニターされるストロメルシンの等温変性の時間依存性を示す。競争インヒビターPNU−143988の添加を伴なって又はそれを伴なわないで75℃でのストロメルシン等温変性の時間依存性が、前記実施例に記載のようにして、SYPRO Orange蛍光の上昇により追跡された。対照反応についてのデータは等式４により分析され、そして阻害された反応についてのデータは等式11を用いて分析された。1.5及び５μMのPNU−143988の存在下での代表的なデータがまた示されている。実線は、実験データ点に対する理論的適合性を表す。
【図１１】
図10Bは、トリプトファン蛍光によりモニターされるストロメルシンの等温変性の時間依存性を示す。ストロメルシンの等温変性の時間依存性は、検出のために固有のトリプトファン蛍光の上昇を用いての検出によりT＝75℃でモニターされた。データは等式11を用いて分析された。実線は、実験データ点に対する理論的適合性を表す。
【図１２】
図11は、SYPRO Orangeによりモニターされるストロメルシンの等温変性の初期速度及び速度定数に対するPNU−143988の効果を示す。競争インヒビターPNU−143988の添加を伴なって、又はそれを伴なわないで75℃でのストロメルシン等温変性の時間依存性が、前記方法に記載のようにして、SYPRO Orange蛍光の上昇により追跡された。図11A＝初期速度；図11B＝速度定数。