【手続補正書】
【提出日】平成16年8月18日(2004.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】  
【請求項１】  複合タンパク質混合物中の標的タンパク質および以下の式
R*(F-L)-X
（式中、Xは生成物が形成される前に存在しているリガンドであるか、またはそのリガンドを提供する反応性の官能基に添加されたリガンドであり、
Lは結合基または連結基であり、
Fはタンパク質メンバーの活性部位で反応性の官能基であり、かつ
Rは1kDa未満の置換基であり、
*はRがFまたはLの一部でありうることを意味する）
の少なくとも一つの活性に基づくプローブとの、少なくとも一個の共有結合生成物を含む組成物。
【請求項２】  Fがアシル基であり、かつRが脱離基である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】  Fが、アルキル化官能基、アシル化官能基、ケトン官能基、エポキシド官能基アルデヒド官能基、スルホニル官能基およびホスホリル官能基からなる群より選択される請求項1記載の組成物。
【請求項４】  Fがスルホニル基である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】  Fがフルオロホスホニル基である、請求項1記載の組成物。
【請求項６】  Fがフルオロホスホリル基である、請求項1記載の組成物。
【請求項７】  Xが電磁気シグナルを産生する、請求項1記載の組成物。
【請求項８】  Xがオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の組成物。
【請求項９】  標的タンパク質が酵素であり、かつ同じ触媒活性を持つ酵素群のメンバーである、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】  酵素がヒドロラーゼである、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】  Fが、セリンヒドロラーゼの活性部位で反応性のスルホニル基である、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】  リンカーが開裂可能なリンカーである、請求項1記載の組成物。
【請求項１３】  Rが、アルキル、シクロアルキル、複素環およびアリール、ならびにそれらの置換されたメンバーからなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
【請求項１４】  Fがエポキシドである、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】  以下の式
R(F-L)-X
（式中、Xは相互受容体に結合するためのリガンドであり、
Lは該ライブラリーの各メンバーにおいて同じである、結合基または連結基であり、
Fは標的酵素の活性部位で反応性のスルホニル基であり、かつ
Rは、ライブラリーの各メンバーで異なる、Fに結合する1kDa未満の有機基である）
の複数のメンバーを含む、組み合わせ化学ライブラリー。
【請求項１６】  ライブラリーのメンバーは、標的酵素に対して異なるオン速度を有する、請求項15記載の組み合わせ化学ライブラリー。
【請求項１７】  以下の式
R(F-L)-X
（式中、Fはスルホニルであり、
Lは1〜3のアミド基またはポリオキシアルキレンからなるアルキレン連結基であり、
Xはビオチンであり、かつ
RはFに結合してスルホン酸エステルを形成し、かつアリールまたはヘテロアリールである）
の複数のメンバーを含む、組み合わせ化学ライブラリー。
【請求項１８】  一つのメンバーRに対して、ヘテロアリールがピリジルまたはチオフェニルである、請求項15記載の組み合わせライブラリー。
【請求項１９】  以下の式
R(F-L)-X
（式中、Xは相互受容体に結合するためのリガンドであり、
Lは連結基であり、
Fは標的酵素の活性部位で反応性のスルホニル基であり、かつ
Rはライブラリーの各メンバーで異なる、Lの鎖にある1kDa未満の有機基である）
の複数のメンバーを含む、組み合わせライブラリー。
【請求項２０】  ライブラリーのメンバーは、標的酵素に対して異なるオン速度を有する、請求項18記載の組み合わせ化学ライブラリー。
【請求項２１】  以下の式
R*(F-L)-X
（式中、Xは相互受容体に結合するためのリガンドであり、
Lは連結基であり、
Fは標的酵素の活性部位で反応性のフルオロホスホニル基またはフルオロホスホリル基であり、かつ
Rは1kDa未満の基である）
の複数のメンバーを含む、組み合わせ化学ライブラリー。
【請求項２２】  ライブラリーのメンバーが、標的酵素に対して異なるオン速度を有する、請求項21記載の組み合わせ化学ライブラリー。
【請求項２３】  少なくとも一つの活性に基づくプローブを用いて、生物学的試料に由来するタンパク質のプロテオーム混合物中の、関連する標的タンパク質の群に対する、候補化合物の生物活性を決定するための方法であって、各プローブが、標的タンパク質の群に対して特異的な反応性の官能基およびリガンドを含んでおり、以下の段階を含む方法：
少なくとも一つの該プローブを、該標的タンパク質と反応させるための条件下で、該プロテオーム混合物の非処理部分、および非共有結合剤で不活性化された部分と結合させる段階、
少なくとも一つのプローブと結合したタンパク質を、各混合物から分離する段階、ならびに
該候補化合物の生物活性の指標として、非処理部分および不活性化された部分に由来するタンパク質の各結合体の量を、該標的タンパク質と比較する段階。
【請求項２４】  リガンドが相互受容体を持ち、かつ分離する段階が、支持体に結合した該相互受容体に該リガンドを結合することによる、請求項23記載の方法。
【請求項２５】  リガンドが、電磁シグナルの結果として検出可能である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】  プローブが以下の式からなる、請求項23記載の方法：
R*(F-L)-X
（式中、Xは相互受容体に結合するためのリガンド、または相互官能基と反応してリガンドを添加するための化学的反応性の官能基であり、
Lは連結基であり、
Fは標的酵素の活性部位で反応性の官能基であり、かつ
RはH、または関連する標的タンパク質の群に対して特異的親和性を提供する1kDa未満の部分であり、
*はRがFまたはLの一部でありうることを意味する。）
【請求項２７】  Fはスルホニル基であり、かつRはH以外でありFに結合している、請求項26記載の方法。
【請求項２８】  Fはフルオロホスホニル基またはフルオロホスホリル基である、請求項26記載の方法。
【請求項２９】  LおよびXの少なくとも一つは非天然量の少なくとも一つの同位体を含み、かつ以下の追加の段階を含む、請求項23記載の方法：
結合体からプローブの少なくとも一部分を遊離させる段階、および同位体の差異によって該部分を同定する段階。
【請求項３０】  タンパク質のプロテオーム混合物が細胞のプロテオームである、請求項23または26記載の方法。
【請求項３１】  プローブに結合したタンパク質を同定する段階をさらに含む、請求項23または26記載の方法。
【請求項３２】  以下の式
R*(F-L)-X
（式中、Xは相互受容体に結合するため、および／または検出可能なシグナルを提供するためのリガンドであり、
Lは脂肪族の連結基であり、
Fは関連する標的酵素の活性部位で反応性の官能基であり、かつ
RはH、または関連する標的酵素の群に対して特異的親和性を提供する1kDa未満の部分であり、
*はRがFまたはLの部分でありうることを意味する）
の少なくとも一つのプローブを用いて、生物学的供給源に由来するタンパク質のプロテオーム混合物中の、関連する標的酵素の群に対する候補化合物の生物活性を決定するための方法であって、以下の段階を含む方法：
少なくとも一つの該プローブを、関連する標的酵素の群と反応させるための条件下で、該混合物の非処理部分および非共有結合剤で不活性化した部分と結合させる段階、
少なくとも一つの該プローブと結合した酵素を、各混合物から分離する段階、ならびに
該候補化合物の生物活性の指標として、非処理部分および不活性化された部分に由来する結合体の各量を、関連する標的酵素の群と比較する段階。
【請求項３３】  Fはスルホニル基であり、かつRはH以外であってFに結合している、請求項32記載の方法。
【請求項３４】  Fはフルオロホスホニル基またはフルオロホスホリル基である、請求項32記載の方法。
【請求項３５】  生物学的供給源に由来するタンパク質の複合混合物中の、関連する標的タンパク質の群に対する候補化合物の生物活性を決定する方法であって、
該プロテオーム混合物の第1部分を、該ライブラリーのメンバーを該標的タンパク質と反応させるための条件下で、活性に基づくプローブの組み合わせ化学ライブラリーと結合させる段階、
該プロテオーム混合物の第2部分を、該ライブラリーのメンバーを該標的タンパク質と反応させるための条件下で、該候補化合物および該ライブラリーと結合させる段階、
該プロテオーム混合物の各部分から、該ライブラリーのメンバーと結合したタンパク質を分離する段階、ならびに
該標的タンパク質を伴う該候補化合物の生物活性の指標として、該第1部分由来の結合体の各量を、該第2部分由来の結合体の量と比較する段階
を含み、ここで組み合わせ化学ライブラリーが以下の式の複数のメンバーを含む方法：
R*(F-L)-X
（式中、Xは該ライブラリーの各メンバーで同じであるリガンドであり、
Lは該ライブラリーの各メンバーで同じである結合基または連結基であり、
Fは関連する標的タンパク質群の活性部位で反応性の官能基であり、この官能基は該ライブラリーの各メンバーで同じであり、
Rは該ライブラリーの各メンバーで異なる、1kDa未満の基であり、かつ
*はRがFまたはLの一部でありうることを意味する。）
【請求項３６】  複合混合物が細胞のプロテオームである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】  ライブラリーの各メンバーが、関連する標的タンパク質群に対して異なるオン速度を有する、請求項35記載の方法。
【請求項３８】  Fが、アルキル化剤、アシル化剤、ケトン、エポキシド、アルデヒド、スルホニル、およびリン酸化剤からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３９】  Fが、フルオロホスホニル基およびフルオロホスホリル基からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項４０】  Fがスルホニル基である、請求項35記載の方法。
【請求項４１】  スルホニル基がスルホネートである、請求項40記載の方法。
【請求項４２】  Xがビオチンであり、Lが1〜3のアミド基またはポリオキシアルキレンを含むアルキレン連結基であり、さらにRはFに結合してスルホン酸エステルを形成し、かつアリールまたはヘテロアリールである、請求項40記載の方法。
【請求項４３】  ヘテロアリールがピリジルまたはチオフェニルである、請求項42記載の方法。
【請求項４４】  関連する標的タンパク質の群がセリンヒドロラーゼであり、かつFがフルオロホスホニル基またはフルオロホスホリル基である、請求項35記載の方法。
【請求項４５】  関連する標的タンパク質の群がシステインヒドロラーゼであり、かつFがα-ハロカルボニルである、請求項35記載の方法。
【請求項４６】  関連する標的タンパク質の群が、その活性部位にシステイン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸を持つ酵素であり、かつFがスルホン酸ジエステル、またはエポキシドである、請求項35記載の方法。
【請求項４７】  関連する標的タンパク質の群が還元酵素であり、かつFがアルキンである、請求項35記載の方法。
【請求項４８】  関連する標的タンパク質の群が金属酵素であり、かつFがα-ハロヒドロキサミン酸である、請求項35記載の方法。
【請求項４９】  関連するタンパク質の群の活性な標的メンバーの存在を、一個または複数のプロテオーム混合物中で決定するための方法であって、関連するタンパク質は活性部位での結合に対して共通の官能基を持つことに関連しており、
該標的メンバーに該プローブを結合させるための条件下で、各プロテオーム混合物の第1部分を、活性な場合の関連するタンパク質群の活性部位に対して特異的な反応性の官能基を含む、活性に基づくプローブと結合させる段階、
該プローブを該標的メンバーに結合させるための該条件下で、該非特異的不活性化に供した該各該プロテオーム混合物の第2の不活性化部分を、該プローブと結合させる段階、
該プロテオーム混合物の各部分における該プローブと結合した、標的メンバーの存在を決定する段階
を含み、
それによって該標的メンバーを、活性型の該プロテオーム混合物の第1部分における標的メンバーおよび不活性型の該プロテオーム混合物の第2部分におけるより少量の標的メンバーに結合させた場合に、活性な標的メンバーの存在を決定する方法。
【請求項５０】  活性な標的メンバーを特徴づける追加の段階を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５１】  特徴づける段階が、活性な標的メンバーを分解する段階、および質量分析法によって得られる画分を測定する段階を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】  プローブが検出可能な標識を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５３】  プロテオーム混合物が無傷の細胞にある、請求項49記載の方法。
【請求項５４】  個々のキャピラリー動電分析またはキャピラリーHPLCを同時に用いて、プローブと結合した標的メンバーの存在について分析する段階をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項５５】  プローブがリガンドを含み、決定する段階が、結合体中のリガンドを支持体に結合させて該結合体を単離することによる、請求項49記載の方法。
【請求項５６】  反応性の官能基がフルオロホスホネートまたはフルオロホスホロエートであり、かつ関連するタンパク質の群がセリンヒドロラーゼである、請求項49記載の方法。
【請求項５７】  関連するタンパク質の群がシステインヒドロラーゼであり、かつ活性な官能基がα-ハロケトンである、請求項49記載の方法。
【請求項５８】  関連するタンパク質の群が、システイン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のうちの少なくとも一つをその活性部位に含む酵素であり、かつ活性な官能基がスルホン酸エステルまたはエポキシドである、請求項49記載の方法。
【請求項５９】  関連するタンパク質の群がアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、かつ活性な官能基がスルホン酸エステルである、請求項49記載の方法。
【請求項６０】  関連するタンパク質の群が金属酵素であり、かつ活性な官能基がα-ハロヒドロキサミン酸である、請求項49記載の方法。
【請求項６１】  関連するタンパク質の群が還元酵素であり、かつ活性な官能基がアルキンである、請求項49記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６】
2003530365.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
2003530365.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2003530365.tif 000003
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2003530365.tif 000004
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
2003530365.tif 000005
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２１】
2003530365.tif 000006
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
2003530365.tif 000007