(57)【要約】  本発明は、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである方法およびそのための組成物、ヘルパーＴ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防方法およびそのための医薬組成物などに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、方法。
【請求項２】
ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のうちの少なくとも２つに結合する能力を有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＷＴ１ペプチドがさらにＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するものである、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＷＴ１ペプチドがアミノ酸配列：Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ（配列番号：２）を含むペプチドである、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加が、ＷＴ１ペプチドの添加、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの添加、または該発現ベクターを含む細胞の添加により行われる、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、ＷＴ１ペプチドを含む組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、組成物。
【請求項８】
ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、対象における癌の治療または予防方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、方法。
【請求項９】
ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化することにより、癌を治療または予防するための、ＷＴ１ペプチドを含む医薬組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、医薬組成物。
【請求項１０】
ＷＴ１ペプチドに特異的に結合する抗体であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、抗体。
【請求項１１】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象のいずれかにおけるＷＴ１ペプチドの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）抗ＷＴ１抗体を該対象由来試料と反応させ、次に、
（ｂ）該試料に含まれるＷＴ１ペプチドと特異的に結合する該抗ＷＴ１抗体の存在または量を調べる、
工程を含む、方法。
【請求項１２】
ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加してヘルパーＴ細胞を活性化し、活性化したヘルパーＴ細胞を対象に投与する工程を含む、癌の治療または予防方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子に結合する能力を有するものである、方法。
【請求項１３】
癌を治療または予防するための、ＷＴ１ペプチドを用いて活性化されたヘルパーＴ細胞を含む医薬組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、医薬組成物。
【請求項１４】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象のいずれかにおけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を該対象由来試料と反応させ、次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するヘルパーＴ細胞の存在または量を調べる、
工程を含む、方法。
【請求項１５】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５陽性、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２陽性対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドを用いて末梢血単核球、浸潤性リンパ球、腫瘍細胞、腹水中の細胞、胸水中の細胞、脳脊髄液中の細胞、骨髄細胞、またはリンパ節細胞を刺激し、
（ｂ）サイトカイン産生またはヘルパーＴ細胞の反応の存在または量を調べる、
工程を含み、サイトカイン産生またはヘルパーＴ細胞の反応の存在または量の増大がＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである方法およびそのための組成物、ヘルパーＴ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防用医薬組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＴ１遺伝子（Wilms' tumor 1 gene）は、小児の腎癌であるウイルムス腫瘍の責任遺伝子として同定された遺伝子であり（非特許文献１および２）、ジンクフィンガー構造を有する転写因子である。当初、ＷＴ１遺伝子は癌抑制遺伝子であるとされたが、その後の研究（非特許文献３、４、５および６）により、造血器腫瘍や固形癌においてはむしろ癌遺伝子として働くことが示された。【０００３】
ＷＴ１ペプチドを用いて末梢血単核球をインビトロで刺激することにより、ペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導され、これらのＣＴＬは、内因性にＷＴ１を発現する造血器腫瘍や固形癌の癌細胞を傷害することが示された。ＣＴＬはＷＴ１ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に結合した複合体の形で認識するので、かかるＷＴ１ペプチドはＭＨＣクラスＩのサブタイプにより異なる（特許文献１、非特許文献７、特許文献２、３および４）。【０００４】
ＣＴＬが有効に誘導されるためには、癌抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の存在が重要である（非特許文献８）。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子と抗原ペプチドとの複合体を認識して誘導・活性化される。活性化されたヘルパーＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、あるいはインターフェロンなどのサイトカインを産生し、Ｂ細胞の増殖、分化、成熟を助ける。また、活性化ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞の他のサブセット（Ｔｃ、ＴＤ細胞など）の増殖、分化、成熟を促進する機能を有する。このように、活性化ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞の増殖・活性化を促進することにより免疫系を活性化する機能を有することから、癌免疫療法においてＭＨＣクラスＩＩ結合性の抗原ペプチド（ヘルパーペプチド）を介してヘルパーＴ細胞の機能を増強し、癌ワクチンの効果を増強することが有用であると考えられている（非特許文献９）。ＷＴ１に関して現在分かっているヘルパーペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１分子に結合するもの（非特許文献１０）、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子に結合するものおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合するもの（特許文献５）であり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子に結合するＷＴ１ペプチドを見出す必要があった。【０００５】
また、ヘルパーペプチドには、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ヘルパーＴ細胞を誘導し得るpromiscuous helper peptideが存在することが示されている（非特許文献１１および１２）。しかしながら、３種類以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、十分な効果を示すpromiscuous helper peptideを同定するのは大変困難であった。
【特許文献１】国際公開２００３／１０６６８２号公報
【特許文献２】国際公開２００５／０９５５９８号公報
【特許文献３】国際公開２００７／０９７３５８号公報
【特許文献４】国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７４１４６
【特許文献５】国際公開２００５／０４５０２７号公報
【非特許文献１】Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69.
【非特許文献２】Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20.
【非特許文献３】Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review.
【非特許文献４】Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84.
【非特許文献５】Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76.
【非特許文献６】Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505.
【非特許文献７】Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107.
【非特許文献８】Gao FG et al., Cancer Res. 2002 Nov 15;62(22):6438-41.
【非特許文献９】Zeng G, J Immunother. 2001 May;24(3):195-204
【非特許文献１０】Knights AJ et al., Cancer Immunol Immunother. 2002 Jul;51(5):271-81.
【非特許文献１１】Sotiriadou R et al., Br J Cancer. 2001 Nov 16;85(10):1527-34.
【非特許文献１２】Hural JA et al., J Immunol. 2002 Jul 1;169(1):557-65.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決課題は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子に結合する能力を有するＷＴ１ペプチドを用いて、ヘルパーＴ細胞を活性化する方法およびそのための組成物、ならびにヘルパーＴ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防用医薬組成物などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合するＷＴ１ペプチドのうち、アミノ酸配列：Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓを有するＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子にも結合することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、方法、
（２）ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のうちの少なくとも２つに結合する能力を有するものである、（１）記載の方法、
（３）ＷＴ１ペプチドがさらにＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するものである、（１）または（２）記載の方法、
（４）ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するものである、（１）から（３）のいずれか記載の方法、
（５）ＷＴ１ペプチドがアミノ酸配列：Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ（配列番号：２）を含むペプチドである、（１）から（４）のいずれか記載の方法、
（６）ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加が、ＷＴ１ペプチドの添加、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの添加、または該発現ベクターを含む細胞の添加により行われる、（１）から（５）のいずれか記載の方法、
（７）ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、ＷＴ１ペプチドを含む組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、組成物、
（８）ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、対象における癌の治療または予防方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、方法、
（９）ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化することにより、癌を治療または予防するための、ＷＴ１ペプチドを含む医薬組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、医薬組成物、
（１０）ＷＴ１ペプチドに特異的に結合する抗体であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、抗体、
（１１）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象のいずれかにおけるＷＴ１ペプチドの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）抗ＷＴ１抗体を該対象由来試料と反応させ、次に、
（ｂ）該試料に含まれるＷＴ１ペプチドと特異的に結合する該抗ＷＴ１抗体の存在または量を調べる、
工程を含む、方法、
（１２）ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加してヘルパーＴ細胞を活性化し、活性化したヘルパーＴ細胞を対象に投与する工程を含む、癌の治療または予防方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子に結合する能力を有するものである、方法、
（１３）癌を治療または予防するための、ＷＴ１ペプチドを用いて活性化されたヘルパーＴ細胞を含む医薬組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、医薬組成物、
（１４）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象のいずれかにおけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を該対象由来試料と反応させ、次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するヘルパーＴ細胞の存在または量を調べる、
工程を含む、方法、
（１５）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５陽性、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２陽性対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドを用いて末梢血単核球、浸潤性リンパ球、腫瘍細胞、腹水中の細胞、胸水中の細胞、脳脊髄液中の細胞、骨髄細胞、またはリンパ節細胞を刺激し、
（ｂ）サイトカイン産生またはヘルパーＴ細胞の反応の存在または量を調べる、
工程を含み、サイトカイン産生またはヘルパーＴ細胞の反応の存在または量の増大がＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を示す、方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合するＷＴ１ペプチドを用いて、ヘルパーＴ細胞を活性化する方法およびそのための組成物、ならびにヘルパーＴ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防用医薬組成物などが得られるので、かかるＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるインビボおよびインビトロでのヘルパーＴ細胞の活性化、さらには癌の治療および予防などが可能となる。上記５種類のＭＨＣクラスＩＩサブクラスにより、日本人の約９０％がカバーされるので、非常に広範囲の対象においてヘルパーＴ細胞を活性化し、癌を治療および／または予防できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＴＡ２８．１細胞により産生されたＩＦＮ−γの量を示すグラフである。図の縦軸はＩＦＮ−γ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。グラフは、左より、「ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性対象由来末梢血単核球をＷＴ１ペプチド不存下で培養した場合」、「ＴＡ２８．１細胞をＷＴ１ペプチド存在下で培養した場合（黒色）」、「ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陰性対象由来末梢血単核球をＷＴ１ペプチド不存下で培養した場合」、「ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陰性対象由来末梢血単核球をＷＴ１ペプチドの存在下で培養した場合」にそれぞれ対応する。
【図２】図２は、ＴＡ２８．１細胞により産生されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の量を示すグラフである。図の縦軸は濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。グラフは、左より、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０の値である。
【図３】図３は、Ｅ１５．２細胞により産生されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の量を示すグラフである。図の縦軸は濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。グラフは、左より、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０の値である。
【図４】図４は、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１／＊０５０１陽性単核球によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の産生を示す。図の横軸はＩＦＮ−γを、縦軸はＩＬ−１７を示す。図４ａは、ＷＴ１ペプチドを用いて刺激しなかった細胞、図４ｂは、ＷＴ１ペプチドを用いて刺激した細胞をそれぞれ表す。
【図５】図５は、ＴＡ２８．１細胞の増殖を示すグラフである。図の縦軸はｃｐｍ（×１０４）を示す。グラフは、左より、「ＴＡ２８．１細胞をＷＴ１ペプチドでパルスしていない末梢血単核球と共培養した場合」、「ＴＡ２８．１細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と共培養した場合（黒色）」、「ＴＡ２８．１細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＭＨＣクラスＩ抗体の存在下で共培養した場合」、「ＴＡ２８．１細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の存在下で共培養した場合（斜線）」、「ＴＡ２８．１細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体の存在下で共培養した場合」、「ＴＡ２８．１細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体の存在下で共培養した場合」にそれぞれ対応する。
【図６】図６は、Ｅ１５．２細胞の増殖を示すグラフである。図の縦軸はｃｐｍ（×１０４）を示す。グラフは、左より、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスしていないＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性対象由来末梢血単核球と共培養した場合」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性対象由来末梢血単核球と共培養した場合（黒色）」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスしていないＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陰性対象末梢血単核球と共培養した場合」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陰性対象由来末梢血単核球と共培養した場合」にそれぞれ対応する。
【図７】図７は、Ｅ１５．２細胞の増殖を示すグラフである。図の縦軸はｃｐｍを示す。グラフは、左より、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスしていない末梢血単核球と共培養した場合」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と共培養した場合（黒色）」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＭＨＣクラスＩ抗体の存在下で共培養した場合」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の存在下で共培養した場合」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体の存在下で共培養した場合」、「Ｅ１５．２細胞をＷＴ１ペプチドでパルスした末梢血単核球と抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体の存在下で共培養した場合（斜線）」にそれぞれ対応する。
【図８】図８は、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１／＊０５０１陽性単核球の増殖を示すグラフである。図の縦軸はｃｐｍを示す。グラフは、左より、「ＷＴ１ペプチドを用いた刺激を行わなかった場合」、「ＷＴ１ペプチドを用いた刺激を行った場合」にそれぞれ対応する。
【図９】図９は、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１／＊０５０１陽性単核球の増殖が抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体で抑制されることを示す。図の縦軸はｃｐｍを示す。グラフは、左より、「ＷＴ１ペプチドを用いた刺激を行わなかった場合」、「ＨＩＶ由来対照ペプチドを用いて刺激を行った場合」、「ＷＴ１ペプチドを用いて刺激を行った場合」、「抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の存在下でＷＴ１ペプチドを用いて刺激を行った場合」、「抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体の存在下でＷＴ１ペプチドを用いて刺激を行った場合」、および「抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体の存在下でＷＴ１ペプチドを用いて刺激を行った場合」にそれぞれ対応する。
【図１０】図１０は、種々の濃度のＷＴ１ペプチドを用いたときのＥ１５．２細胞の増殖を示すグラフである。図の縦軸はｃｐｍ（×１０４）を、横軸はＷＴ１ペプチドの濃度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、１の態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、方法に関するものである。本発明において、ＷＴ１ペプチドとは、配列番号：１に示されるヒトＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列の一部分からなるペプチド、かかるアミノ酸配列の一部分を構成するアミノ酸のうち１個ないし数個が置換、修飾、または欠失されたアミノ酸配列からなるペプチドであってＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するペプチド、あるいはそれらのペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にアミノ酸、ペプチド、またはそれらのアナログのような種々の物質の結合したペプチドをいう。上記種々の物質は、例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的にＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合できる形態となる。また、かかる種々の物質は、本発明のＷＴ１ペプチドの溶解性を調節するもの、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるもの、所定の組織・器官に特異的に本発明のＷＴ１ペプチドをデリバリーするもの、抗原提示細胞の取り込み効率を増強させるものであってもよく、あるいは抗原提示細胞が由来する対象が有するＭＨＣクラスＩ分子と同じサブタイプのクラスＩ分子に拘束性のＷＴ１ペプチドであってもよい。【００１２】
本発明のＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである。従って、上記ＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子の少なくとも２つに結合する能力を有するもの、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子とそれらの分子以外のＨＬＡクラスＩＩ分子にさらに結合する能力を有するもの、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するもの、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するもの、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するもの、あるいはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するものなどであってもよい。アミノ酸配列：Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ（配列番号：２）を有するＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有するので、かかるアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドが好ましい。一般に、ＭＨＣクラスＩＩ結合性ペプチドは１０〜２５個のアミノ酸からなることから、ＷＴ１ペプチドは、好ましくは、１０〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。【００１３】
本発明のＷＴ１ペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。【００１４】
本発明のＷＴ１ペプチドはまた、ＷＴ１ペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。【００１５】
抗原提示細胞とは、樹状細胞などのＭＨＣクラスＩＩ分子と共に上記ＷＴ１ペプチドをヘルパーＴ細胞などに提示することができる細胞をいう。従って、抗原提示細胞が由来する対象は、添加されるＷＴ１ペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩのサブクラスと同じサブクラス（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２）を有するものでなければならない。【００１６】
一般的に、ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ・ＣＤ３複合体が抗原提示細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して抗原ペプチドを認識すること、およびＴ細胞表面のインテグリンが抗原提示細胞表面のインテグリンリガンドで刺激されることにより、活性化される。本発明において、ヘルパーＴ細胞の活性化とは、ヘルパーＴ細胞の活性化ばかりでなく、ヘルパーＴ細胞の誘導・増殖を含むものとする。上述の通り、活性化ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞の誘導・増殖・活性化を促進することにより、免疫系を活性化する機能を有することから、本発明のヘルパーＴ細胞の活性化方法を、癌などの治療の補助療法として用いることもできる。あるいは、インビトロにおいて本発明の方法を用いて活性化されたヘルパーＴ細胞を癌などの治療または予防において用いることもでき、あるいはこれらの補助剤として用いることもできる。ヘルパーＴ細胞の活性化は、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカインの産生、分泌量を測定することなどにより、評価することができる。【００１７】
ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加は、ＷＴ１ペプチドを添加することにより直接的に、あるいはＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの添加により、または該発現ベクターを含む細胞の添加により間接的に行われてもよい。ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む細胞は、当業者によく知られた方法により得られる。【００１８】
本発明は、もう１つの態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、ＷＴ１ペプチドを含む組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、組成物に関するものである。本発明の組成物が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象に投与されると、対象のヘルパーＴ細胞が活性化されることにより、対象の免疫系が活性化される。また、ＷＴ１遺伝子は、各種の癌や腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高発現しているので、本発明の組成物を癌の治療または予防の補助剤として用いることもできる。あるいは、本発明の組成物を用いて活性化されたヘルパーＴ細胞を例えば、上記の癌の治療の補助剤として用いることもできる。【００１９】
本発明のＷＴ１ペプチドは上述の通り、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子の少なくとも２つに結合する能力を有するもの、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子とそれらの分子以外のＭＨＣクラスＩＩ分子にさらに結合する能力を有するものなどであってもよい。従って、抗原提示細胞が、本発明のＷＴ１ペプチドが結合できるＭＨＣクラスＩＩサブクラス陽性の対象由来のものであれば、本発明の組成物によるヘルパーＴ細胞の活性化効果を得ることができる。【００２０】
本発明の組成物は、上記ＷＴ１ペプチド以外に、例えば、担体、賦形剤、あるいは添加剤などを含んでいてもよい。本発明の組成物に含まれるＷＴ１ペプチドは、ＷＴ１ペプチド特異的にヘルパーＴ細胞を活性化することから、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＷＴ１ペプチドを含むか、あるいはこれらと共に適用されてもよい。【００２１】
本発明の組成物の適用方法は、所望のヘルパーＴ細胞の活性化程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができる。当該適用方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などにより対象に投与すること、あるいは抗原提示細胞培養液に添加することなどが挙げられるが、これらに限らない。本発明の組成物に含まれるＷＴ１ペプチドの量、組成物の形態、適用回数などは、所望のヘルパーＴ細胞の活性化程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができる。【００２２】
本発明は、さらなる態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞を含む組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、組成物に関するものである。ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞については上述の通りである。【００２３】
本発明は、別の態様において、上記組成物を製造するためのＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞の使用に関するものである。【００２４】
本発明は、なおさらなる態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、ＷＴ１ペプチドを含むキットであって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、キットに関するものである。好ましくは、該キットは上記ヘルパーＴ細胞の活性化方法に用いられる。本発明のキットは、ＷＴ１ペプチドの他に、例えば、抗原提示細胞の取得手段、ヘルパーＴ細胞の活性の評価手段などを含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ヘルパーＴ細胞を効率よく活性化することができる。【００２５】
本発明は、別の態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞を含むキットであって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、キットに関するものである。【００２６】
本発明は、もう１つの態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化する工程を含む、対象における癌の治療または予防方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、方法に関するものである。本発明の方法は、ヘルパーＴ細胞を活性化することにより対象の免疫系を活性化し、対象における癌を治療または予防する方法である。ＷＴ１ペプチドの抗原提示細胞への添加は、ＷＴ１ペプチドを添加することにより直接的に、あるいはＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの添加により、または該発現ベクターを含む細胞の添加により間接的に行われてもよい。【００２７】
上述の通り、ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかとＷＴ１ペプチドとの複合体を認識するので、対象は、ＷＴ１ペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象である。また、上述の通り本発明のＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子の少なくとも２つに結合する能力を有するもの、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子とそれらの分子以外のＭＨＣクラスＩＩ分子にさらに結合する能力を有するものなどであってもよい。従って、このような場合、本発明のＷＴ１ペプチドが結合できるＭＨＣクラスＩＩサブクラス陽性の対象において癌を治療または予防することもできる。治療または予防される癌は、いずれのものであってもよく、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を含む。また、本発明の方法は、ＭＨＣクラスＩ分子拘束性ＷＴ１ペプチドを用いた癌の治療または予防方法またはそのための医薬組成物と併用されてもよい。【００２８】
本発明は、なお別の態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化することにより、対象における癌を治療または予防するための、ＷＴ１ペプチドを含む医薬組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、医薬組成物に関するものである。ＷＴ１遺伝子は、各種の癌や腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高発現しているため、本発明の医薬組成物を癌の治療または予防のために用いることができる。【００２９】
本発明のＷＴ１ペプチドは上述の通り、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子の少なくとも２つに結合する能力を有するもの、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子および／またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子とそれらの分子以外のＭＨＣクラスＩＩ分子にさらに結合する能力を有するものなどであってもよい。従って、抗原提示細胞が、本発明のＷＴ１ペプチドが結合できるＭＨＣクラスＩＩサブクラス陽性の対象由来のものであれば、本発明の医薬組成物により癌を治療または予防することができる。【００３０】
本発明の医薬組成物が、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象のいずれかに投与されると、該医薬組成物に含まれるＷＴ１ペプチドにより、ヘルパーＴ細胞が活性化されることにより、対象の免疫系が活性化され、癌を治療または予防することができる。従って、本発明の医薬組成物は、上記癌の治療または予防方法またはそのための医薬組成物と併用されてもよい。【００３１】
本発明の医薬組成物は、有効成分として上記ＷＴ１ペプチド以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物に含まれるＷＴ１ペプチドは、抗原提示細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して、ヘルパーＴ細胞を活性化することから、本発明の医薬組成物は、さらにヘルパーＴ細胞の活性化剤、増殖剤、誘導剤などを含んでいてもよく、あるいはＭＨＣクラスＩ拘束性ＷＴ１ペプチドを含んでいてもよい。【００３２】
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができるが、１回当たりの投与量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇである。【００３３】
本発明は、さらなる態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加して、ヘルパーＴ細胞を活性化することにより、対象における癌を治療または予防するための、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞を含む医薬組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、医薬組成物に関するものである。【００３４】
本発明は、さらなる態様において、上記医薬組成物を製造するためのＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞の使用に関するものである。【００３５】
本発明は、もう１つの態様において、ＷＴ１ペプチドに特異的に結合する抗体であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、抗体に関するものである。本発明の抗体は、当業者に既知の手段・方法を用いて製造され得る。本発明の抗体を、種々の癌の診断、予後診断等に使用することができる。【００３６】
本発明は、別の態様において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象におけるＷＴ１ペプチドの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）抗ＷＴ１抗体を該対象由来試料と反応させ、次に、
（ｂ）該試料に含まれるＷＴ１ペプチドと特異的に結合する該抗ＷＴ１抗体の存在または量を調べる、
工程を含む、方法に関するものである。例えば、上記抗ＷＴ１抗体をＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象由来試料とインキュベーションする、あるいはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象に投与し、次に該抗ＷＴ１抗体の例えば、位置、部位、量等を決定することで、癌の診断、予後診断などが可能になる。本発明の抗ＷＴ１抗体は、本発明のＷＴ１ペプチドを特異的に認識することができる抗体をいう。抗ＷＴ１抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗ＷＴ１抗体は標識されていてもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。標識することで、ＷＴ１ペプチドの存在または量の決定が容易かつ迅速になる。【００３７】
本発明は、なお別の態様において、上記抗ＷＴ１抗体を必須構成成分として含む、ＷＴ１ペプチドの存在または量を決定するためのキットに関するものである。【００３８】
また、上述のＷＴ１ペプチドの存在または量の決定において、ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有する場合、かかるＭＨＣクラスＩＩサブクラスを有する対象において、ＷＴ１ペプチドの存在または量を決定することも可能となる。【００３９】
本発明は、もう１つの態様において、癌を治療または予防するための、ＷＴ１ペプチドを用いて活性化されたヘルパーＴ細胞を含む医薬組成物であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、医薬組成物に関するもである。活性化ヘルパーＴ細胞によってＢ細胞およびＴ細胞が誘導・増殖・活性化されることにより、癌が治療または予防される。従って、本発明のこの態様の医薬組成物を、他の癌の治療または予防方法またはそのための医薬組成物と併用してもよい。また、ＷＴ１ペプチドを用いたヘルパーＴ細胞の活性化とは、ＷＴ１ペプチドによる直接的な活性化ばかりでなく、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または該発現ベクターを含む細胞による間接的な活性化を含む。【００４０】
本発明の医薬組成物は、有効成分として活性化ヘルパーＴ細胞以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。本発明の医薬組成物に含まれるヘルパーＴ細胞の量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。【００４１】
本発明は、別の態様において、ＷＴ１ペプチドを抗原提示細胞に添加してヘルパーＴ細胞を活性化し、活性化したヘルパーＴ細胞を対象に投与する工程を含む、癌の治療または予防方法であって、該ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子のいずれかに結合する能力を有するものである、方法に関するものである。【００４２】
本発明は、別の態様において、上記活性化ヘルパーＴ細胞を含む医薬組成物の製造におけるＷＴ１ペプチドの使用に関するものである。【００４３】
本発明は、さらなる態様において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象のいずれかにおけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を該対象由来試料と反応させ、次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するヘルパーＴ細胞の存在または量を調べる、
工程を含む、方法に関するものである。対象由来試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液、リンパ液などの体液、組織などが挙げられる。ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体は、例えば、ビオチンストレプトアビジン法などの当業者に既知の方法を用いて、例えば、テトラマー、ペンタマーなどの形態にされていてもよい。かかる複合体を認識するヘルパーＴ細胞の存在または量は、当業者に既知の方法により測定することができる。本発明のこの態様において、上記複合体は標識されたものであってもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。標識することで、ヘルパーＴ細胞の存在または量の決定が容易かつ迅速になる。本発明のこの態様の方法を用いて、癌の診断、予後診断などが可能になる。【００４４】
従って、本発明はまた、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象のいずれかにおけるヘルパーＴ細胞の存在または量を決定するための、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を含む組成物を提供する。【００４５】
さらに、本発明は、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を含む、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性対象におけるヘルパーＴ細胞の存在または量を決定するためのキットを提供する。【００４６】
また、上述のヘルパーＴ細胞の存在または量の決定において、ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有する場合、かかるＭＨＣクラスＩＩサブクラスを有する対象において、ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定することも可能となる。このような場合、ＷＴ１ペプチドとＷＴ１ペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体が用いられる。【００４７】
本発明は、さらなる態様において、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を用いて、ヘルパーＴ細胞を得る方法であって、
（ａ）試料と該複合体を反応させ、次に、
（ｂ）該試料中に含まれる該複合体を認識するヘルパーＴ細胞を得る、
工程を含む、方法に関するものである。複合体については上述の通りである。試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが挙げられる。複合体を認識するヘルパーＴ細胞の取得は、例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳなど当業者に既知の方法を用いて行うことができる。得られたヘルパーＴ細胞を培養し、種々の癌の治療または予防に用いることも可能になる。【００４８】
従って、本発明はまた、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を用いて、ヘルパーＴ細胞を得る方法により得ることのできる、ヘルパーＴ細胞に関するものである。【００４９】
さらに、本発明は、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子との複合体を含む、ヘルパーＴ細胞を得るためのキットに関するものである。【００５０】
また、上述のヘルパーＴ細胞の取得において、ＷＴ１ペプチドがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５分子および／またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２分子に結合する能力を有する場合、かかるＭＨＣクラスＩＩサブクラスとＷＴ１ペプチドの複合体を認識するヘルパーＴ細胞の取得も可能となる。このような場合、ＷＴ１ペプチドとＷＴ１ペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体が用いられる。【００５１】
本発明は、別の態様において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５陽性、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２陽性対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ＷＴ１ペプチドを用いて末梢血単核球、浸潤性リンパ球、腫瘍細胞、腹水中の細胞、胸水中の細胞、脳脊髄液中の細胞、骨髄細胞、またはリンパ節細胞を刺激し、
（ｂ）サイトカイン産生またはヘルパーＴ細胞の反応の存在または量を調べる、
工程を含み、サイトカイン産生またはヘルパーＴ細胞の反応の存在または量の増大がＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を示す、方法に関するものである。本発明の方法において用いる末梢血単核球、浸潤性リンパ球、腫瘍細胞、腹水中の細胞、胸水中の細胞、脳脊髄液中の細胞、骨髄細胞、およびリンパ節細胞などの細胞は健常人由来であっても、あるいは癌患者由来であってもよい。健常人由来のこれらの細胞を用いることにより、例えば、癌に罹患しているかどうか、あるいはその素因を有するかどうかを診断することなどが可能になる。また、癌患者由来のこれらの細胞を用いることにより、例えば、癌患者においてＷＴ１免疫療法が効果を有するかどうかを予測することなどが可能になる。ＷＴ１ペプチドを用いたこれらの細胞の刺激は、インビトロまたはインビボのいずれにおいて行われてもよいが、簡便であるなどの理由から、インビトロが好ましい。サイトカイン産生またはヘルパーＴ細胞の反応が存在するか、あるいはサイトカイン産生量またはヘルパーＴ細胞の反応の量は既知の方法により調べることができる。【００５２】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００５３】
１．抗原提示細胞の調製
健常人の血液提供者（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性）の末梢血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し１％  ＡＢ型血清（Nabi,Miami,FL）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培養液（Cambrex社）を用いて６穴プラスチックプレートに１×１０７細胞／ウェルの密度にて播種し、２時間培養した。その後、浮遊細胞を除去し、残った付着細胞を１０００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−４（PeproTech社）、１０００  ＩＵ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（PeproTech社）、１％  ＡＢ型血清、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培養液で培養した。２日目と４日目に培養液を交換し、ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦを添加し、６日目に１００  ＩＵ／ｍｌ  ＴＮＦ−αを加え、抗原提示細胞を成熟化させた。【００５４】
２．ＷＴ１ペプチド特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導
同じ血液提供者からＣＤ４陽性Ｔ細胞分離用ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（StemCell社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。２４穴プレートの各ウエルに、このＣＤ４陽性Ｔ細胞（３×１０６個）を入れ、これを２０μｇ／ｍｌ  ＷＴ１ペプチド（配列番号：２）でパルスし２５Ｇｙ放射線照射した自己抗原提示細胞（３×１０５個）で刺激し、刺激の次の日に２０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した。刺激したＣＤ４陽性Ｔ細胞を、同じように一週間おきに、２０μｇ／ｍｌ  ＷＴ１ペプチドでパルスした抗原提示細胞を用いて刺激した。また、２回目の刺激以降は１日おきにＩＬ−２入りの培地に交換した。計３回の刺激により誘導されたＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陽性Ｔ細胞を、それぞれＴＡ２８．１細胞、Ｅ１５．２細胞とする）を実験に用いた。【００５５】
３．ＩＦＮ−γの測定
ＴＡ２８．１細胞、およびＴＡ２８．１細胞が由来する人から得た末梢血単核球を、２０μｇ／ｍｌ  ＷＴ１ペプチドの存在下で２４時間培養した。培養後、上清中のＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡキットを用いて定量した。対照として、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陰性対象由来の末梢血単核球を用いた。結果を図１に示す。ＴＡ２８．１細胞が、ＷＴ１ペプチドをＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子特異的に認識し、ＩＦＮ−γ産生量を増大する（活性化する）ことが確認できた。【００５６】
さらに、ＴＡ２８．１細胞およびＥ１５．２細胞がＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生しないことをＥＬＩＳＡキットを用いて確認した。結果を図２および３に示す。ＴＡ２８．１およびＥ１５．２細胞がＴｈ１細胞であることを確認した。【００５７】
ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１／＊０５０１陽性単核球を用いて以下の実験を行った。細胞をＸ−ＶＩＶＯ（１％  ＡＢ型血清）に懸濁し、２０μｇ／ｍｌ  ＷＴ１ペプチド、１０μｇ／ｍｌ  Brefeldin Aおよび０．５μｇ／ｍｌ  ＣＤ２８／４９ｄを添加して、３７℃、５％  ＣＯ２にて４時間インキュベートした。対照として、ＷＴ１ペプチドを添加しないでインキュベートした細胞を用いた。バッファーで洗浄後、抗ＣＤ３−ｐｅｒＣＰ抗体および抗ＣＤ４−ＡＰＣ抗体を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。バッファーで洗浄後、BD Cytofix/Cytopermを用いて細胞を固定・透過処理した（４℃、２０分間）。BD perm/wash bufferで洗浄後、抗ＩＮＦ−γ−ＦＩＴＣ（BD, clone: B27）および抗ＩＬ−１７−ＰＥ（eBioscience, clone: eBio64DEC17）を添加して４℃にて３０分間インキュベートした。バッファーで洗浄後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて細胞の解析を行った。結果を図４に示す。ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陽性単核球が増殖し、かつＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７を産生することを確認した。【００５８】
４．増殖アッセイ
増殖アッセイは［３Ｈ］−チミジン取り込み法により行った。ＴＡ２８．１細胞（３×１０４個）と、ＷＴ１ペプチドでパルスし放射線照射した末梢血単核球（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１陽性；１×１０５個）を９６穴プレートで共培養した。共培養して８０時間後に、３７ｋＢｑ／ウェル  ［３Ｈ］−チミジン（Amersham Biosciences社）を添加し、さらに１６時間インキュベーションしてβシンチレーションカウンターで測定した。測定値は、カウント／分（ｃｐｍ）で表す。対照としてペプチドでパルスしていない末梢血単核球を用いた。また、活性化シグナルがＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子特異的であることを確認するために、抗ＭＨＣクラスＩ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体を用いた。結果を図５に示す。ＴＡ２８．１細胞が、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１を介したシグナルにより活性化されて、増殖することを確認した。かかる増殖は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体により抑制されることから、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１特異的であることをさらに確認した。【００５９】
同様に、Ｅ１５．２細胞を用いて増殖アッセイを行った。対照として、さらにＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１陰性対象由来の末梢血単核球も用いた。結果を図６および７に示す。Ｅ１５．２細胞が、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１を介したシグナルにより活性化されて増殖することを確認した。かかる増殖は、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体により抑制されることから、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１特異的であることをさらに確認した。【００６０】
さらに、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１／＊０５０１陽性単核球を用いて増殖アッセイを行った。対照として、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１陰性対象由来の末梢血単核球も用いた。結果を図８および９に示す。ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１／＊０５０１陽性単核球が、ＷＴ１ペプチドとＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１を介したシグナルにより活性化されて増殖することを確認した。かかる増殖は、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体により抑制されることから、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１特異的であることをさらに確認した。【００６１】
さらに、Ｅ１５．２細胞の増殖アッセイを種々の濃度のＷＴ１ペプチドを用いて行った。用いたＷＴ１ペプチドの濃度は、０．０８、０．４、２、１０、５０、１００および１５０μｇ／ｍｌであった。結果を図１０に示す。ＷＴ１ペプチドが濃度依存性にＥ１５．２細胞を増殖させることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明により、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９０１分子、またはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１分子に結合する能力を有するＷＴ１ペプチドを用いて、ヘルパーＴ細胞を活性化する方法およびそのための組成物、ならびにヘルパーＴ細胞を活性化することによる癌の治療および／または予防用医薬組成物などが提供されるので、医薬品等の分野、例えば、ＷＴ１遺伝子を高発現している種々の造血器腫瘍、固形癌の予防薬または治療薬の開発、製造分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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