(57)【要約】  不妊を主訴とする患者および健常男性から精液を採取し、それぞれの検体について、精液量、精子濃度、精子運動率、精子生存率を測定するとともに、精子に結合したSPMIを抗SPMI抗体を用いて検出し、SPMI結合量、SPMI結合率を算出した。その結果、一定以上のSPMI結合量もしくは一定以上のSPMI結合率の検体群には、患者由来の検体のみが含まれることがわかった。SPMI結合量およびSPMI結合率をもとめることにより、精子無力症を診断することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した検体中の精子に結合した精子運動抑制因子（seminal plasma motility inhibitor, SPMI）を検出してSPMI結合量およびSPMI結合率を求める工程を含む、精子無力症の診断方法。
【請求項２】
被験者から採取した検体中の精子に結合した精子運動抑制因子を検出してSPMI結合量およびSPMI結合率を求める工程を含む、精子の質の低下を検出する方法。
【請求項３】
被験者から採取した検体中の精子に結合した精子運動抑制因子（seminal plasma motility inhibitor, SPMI）を検出してSPMI結合量およびSPMI結合率を求め、これらに基づいて被験者の状態を決定することを含む、精子無力症の検査方法。
【請求項４】
下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）被験者から採取した検体を抗SPMI抗体または抗セミノジェリン抗体と接触させ、検体中の精子に結合したSPMIを検出し、SPMI結合量およびSPMI結合率を算出する工程
（ｂ）該SPMI結合量およびSPMI結合率が健常人男性におけるSPMI結合量およびSPMI結合率よりも多い場合に、該被験者の精子の質が低下していると判定する工程
【請求項５】
該抗SPMI抗体または抗セミノジェリン抗体が、SPMIまたはセミノジェリンの配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を認識する抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗SPMI抗体および精子標識用試薬を含む、精子無力症診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子無力症の新規診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
精子無力症は、男性不妊症のうち精子の運動性が低下した症例である。精子無力症の診断は、一般的には、精液中の精子を顕微鏡下で観察し、正常な運動能を有する精子の割合（運動率）を検査する。しかしこの方法は、運動能の評価において観察者の主観が入る余地があり、観察者間または同一観察者においても評価が変わり得るため、必ずしも信頼性が高いとはいえない点で難がある。また、男性不妊症患者の場合、精液採取から検査までの処理時間が結果に大きく影響する場合があり、施設外での委託検査が困難であった。【０００３】
セミノジェリン（Semenogelin, Sg）は精嚢から分泌されるタンパク質で、精液射出の際に、精子や前立腺液と混合される。ヒトセミノジェリンには52kDのセミノジェリンI（SgI）と71kDまたは76kD（糖鎖付加型）のセミノジェリンII（SgII）が知られており、SgIとSgIIは複合体となって精液凝塊の主要構造を形成する。精液は射出後十数分で液化するが、この液化は、セミノジェリンがprostate specific antigen （PSA）によって分解され低分子化することによって起こると考えられている。【０００４】
精子運動抑制因子（seminal plasma motility inhibitor, SPMI）はセミノジェリンがPSAによって分解された一断片である。SPMIは精子の運動性をコントロールする活性を有し（非特許文献１）、精子無力症の一因と考えられている。精子の運動に影響する蛋白やイオン等の報告は散見されるが、精子無力症と因果関係がはっきりとしている因子は他にない。SPMIと精子無力症との関連については、本発明者等によって、SPMIが精子無力症患者の精子の膜構造が欠損した部位に結合していること、精漿中のSPMI濃度と精子運動率との間に弱い相関関係が見られるものの、一方、健常者において精子運動不良群と良好群との間で、SPMI濃度の平均に有意な差は無かったことが報告されている（非特許文献２）。【０００５】
SPMIは精漿に特異的に存在することから、SPMI検出によって法医学試料中の精液の存在を同定する方法が開発されている（特許文献１、２）。しかし一方、精子無力症の一因と目されているにもかかわらず、SPMI検出と精子無力症診断を結びつける報告は、これまでにみあたらない。
【特許文献１】特開2000-283982
【特許文献２】特開2004-2279
【非特許文献１】J Androl. 1988;9:377-383.
【非特許文献２】J Androl. 2003 Nov-Dec;24(6):878-84.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、精子無力症の新規診断方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。本発明者等は、不妊を主訴とする患者および健常男性から精液を採取し、それぞれの検体について、精液量、精子濃度、精子運動率、精子生存率を測定するとともに、精子に結合したSPMIを抗SPMI抗体を用いて検出し、SPMI結合量、SPMI結合率を算出した。すると、一定以上のSPMI結合量および一定以上のSPMI結合率の検体群には、患者由来の検体のみが含まれることがわかった。これまでは、SPMIは精子無力症の一因と考えられながらも、精漿中のSPMI検出では精子無力症の診断が困難であることを示唆する結果ばかりが報告されてきた。本発明者等による今回の知見は、視点を変え、SPMIにより作用を受けると考えられる精子側の要因に着目したため導かれた結果である。したがって本発明は、SPMI結合量およびSPMI結合率をもとに精子無力症を診断する方法に関し、具体的には、以下の発明を提供するものである。
（１）被験者から採取した検体中の精子に結合した精子運動抑制因子（seminal plasma motility inhibitor, SPMI）を検出してSPMI結合量およびSPMI結合率を求める工程を含む、精子無力症の診断方法、
（２）被験者から採取した検体中の精子に結合した精子運動抑制因子を検出してSPMI結合量およびSPMI結合率を求める工程を含む、精子の質の低下を検出する方法、
（３）下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、上記（１）または（２）に記載の方法、
（ａ）被験者から採取した検体を抗SPMI抗体または抗セミノジェリン抗体と接触させ、検体中の精子に結合したSPMIを検出し、SPMI結合量およびSPMI結合率を算出する工程
（ｂ）該SPMI結合量およびSPMI結合率が健常人男性におけるSPMI結合量およびSPMI結合率よりも多い場合に、該被験者の精子の質が低下していると判定する工程
（４）該抗SPMI抗体または抗セミノジェリン抗体が、SPMIまたはセミノジェリンの配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を認識する抗体である、上記（３）に記載の方法、
（５）抗SPMI抗体および精子標識用試薬を含む、精子無力症診断用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】精子無力症患者および健常人男性における精子運動率とSPMI結合率との関係を示すグラフである。
【図２】精子無力症患者および健常人男性における精子生存率とSPMI結合率との関係を示すグラフである。
【図３】精子無力症患者および健常人男性におけるSPMI結合量とSPMI結合率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、被験者から採取した検体中の精子に結合した精子運動抑制因子（seminal plasma motility inhibitor, SPMI）を検出してSPMI結合量およびSPMI結合率を求める工程を含む、精子無力症の診断方法を提供する。精子無力症は、男性不妊症のうち精子の運動性が低下した症例である。本発明の方法は、検体中の精子とSPMIとの結合を検出し、SPMI結合量およびSPMI結合率を求めることにより、被験者の精子の質を客観的に判断することができる。【００１０】
また、本発明は、被験者から採取した検体中の精子に結合した精子運動抑制因子（seminal plasma motility inhibitor, SPMI）を検出してSPMI結合量およびSPMI結合率を求め、これらに基づいて被験者の状態を決定することを含む、精子無力症の検査方法を提供する。【００１１】
SPMIは、セミノジェリンのPSA分解産物である（14kDa）。SPMIのアミノ酸配列を下記に示す。
Sg-I由来SPMI: NKQEGRDHDKSKGHFHRVVIHHKGGKAHRGTQNPSQDQGNSPSGKGISSQY（配列番号：２）
Sg-II由来SPMI: YKQEGRDHDKSKGHFHMIVIHHKGGQAHHGTQNPSQDQGNSPSGKGLSSQC（配列番号：３）
セミノジェリンは精嚢から分泌されるタンパク質で、ヒトにおいてはセミノジェリンI（462アミノ酸残基、52kDa）、セミノジェリンII（582アミノ酸残基、71kDaまたは糖鎖付加により76kDa）が存在する。セミノジェリンの遺伝子配列およびアミノ酸配列は公知であり、セミノジェリンI：アクセッションNo.BC007096、セミノジェリンII：アクセッションNo.M81652でデータベースに登録されている。セミノジェリンIとセミノジェリンIIはアミノ酸配列で約80％の相同性がある。本発明のSPMIはセミノジェリンIまたはIIのどちらの分解産物であってもよい。SPMIは、セミノジェリンIおよびIIのアミノ酸配列の第85位から第136位に相当する。【００１２】
本発明における検体は、被験者から採取した精液、または精液から精漿を分離した洗浄精子である。検体の由来となる動物種はヒトを含む霊長類である。
検体中の精子に結合したSPMIは、抗SPMI抗体を用い、当業者に公知の手段によって検出することができる。例えば実施例にあるように、被験者の精液から洗浄精子を調製して検体とし、該検体に抗SPMI抗体および標識した二次抗体を添加し、一方、核染色剤等で精子を標識し、それぞれの標識物質から発せられたシグナルをフローサイトメトリーによって検出すれば、測定した精子数、SPMIと結合した精子数、および精子に結合したSPMI量を知ることができる。【００１３】
本発明の方法で使用する抗SPMI抗体は、SPMIを特異的に認識する抗体であれば、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。上記「特異的に認識する」とは非特異的にSPMIに結合する抗体を排除する趣旨であり、本願の抗SPMI抗体は、非特異的にではなくSPMIを認識して結合する限り、SPMIに含まれるセミノジェリンIまたはIIの一部分を認識して、セミノジェリンIまたはIIに結合することを妨げない。本発明の方法で使用する抗SPMI抗体は、好ましくはセミノジェリンI分解産物であるSPMIとセミノジェリンII分解産物であるSPMIの双方を認識する抗体であり、すなわち、セミノジェリンIとセミノジェリンIIに共通する配列を認識する抗体である。セミノジェリンIとIIに共通する配列は、当業者であれば、公知であるセミノジェリンIとセミノジェリンIIのアミノ酸配列を比較することにより、容易に知ることができる。このような共通配列の一例として、GTQNPSQDQGNSPSGKG（配列番号：１）を挙げることができる。【００１４】
本発明の方法で使用する抗SPMI抗体は、当業者に周知の方法で製造することができる。すなわち抗SPMIポリクローナル抗体であれば、免疫原を必要に応じて免疫補助剤とともに動物に注射して免疫し、該免疫された動物から採血して抗体価の上昇を確認した後、該免疫された動物を放血させて抗血清を調製すればよい。また、抗モノクローナル抗体であれば、動物を免疫し、抗体価が上昇した該動物から脾臓を摘出し、該脾臓から得たB細胞とミエローマ細胞を細胞融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマの中から抗体産生細胞をスクリーニングし、該抗体産生細胞の培養上清から抗SPMI抗体を調整することができる。免疫原は、液化した精液から調製した天然のSPMI、またはその一部であるポリペプチドでもよい。SPMIの全長または一部を、人工的に合成したものでもよい。例えば、配列番号：１記載のアミノ酸配列を含むSPMI断片を免疫原として使用することができる。さらに、セミノジェリンIまたはIIの全体あるいはSPMIに共通する配列を含むセミノジェリン断片を免疫原とし、SPMIを認識する抗体を作ることも可能である。免疫する動物の種類は特に問わない。例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ロバ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル等の動物を挙げることができる。あるいは本発明の方法にヒト抗体を使用してもよい。抗SPMI抗体の調製例は、特開2000-283982、特開2004-2279、またはJ Androl. 2003 Nov-Dec;24(6):878-84.に記載されている。【００１５】
精子の標識は、例えば、Propidium iodide等の公知の核染色剤によって行うことができる。または、抗精子抗体と呼ばれる抗体や精子に特異的な表面抗原に対する抗体を標識し、二次的に精子を標識することも可能である。
上記方法によって得た、検体中の総精子量、SPMIと結合した精子量、および精子に結合したSPMI量の数値から、本願の「SPMI結合量」および「SPMI結合率」を求めることができる。本発明において「SPMI結合量」とは精子に結合したSPMIの量を意味する。SPMI結合量は、SPMIの質量やモル数として直接表示してもよいし、SPMI量を反映するパラメーター量として間接的に表示することもできる。例えば、SPMI量を反映する標識化合物のシグナル量として表示してもよい。また本発明において「SPMI結合率」とは測定した精子中の、SPMIが結合した精子の割合を意味する。【００１６】
上記のように算出した被験者のSPMI結合量およびSPMI結合率が、健常人男性におけるSPMI結合量およびSPMI結合率よりも多い場合は、該被験者の精子の質が低下していると判定する。本発明において「精子の質」とは、受精にかかわる精子の機能における良否を意味する。【００１７】
本実施例では精子運動率が50％以上の健常人は一定以下のSPMI結合量かつ一定以下のSPMI結合率に限局することが示された。WHOの基準では精子運動率が50％未満の症例を精子無力症と定義している。したがって本発明の方法において、一定以上のSPMI結合量もしくは一定以上のSPMI結合率を示した症例は、精子無力症であると疑うことが妥当である。【００１８】
ここで、一定以上のSPMI結合量とは、例えば、120以上、好ましくは450以上を意味する。【００１９】
一定以上のSPMI結合率とは、例えば、42%以上、好ましくは55%以上を意味する。【００２０】
本発明の抗SPMI抗体は、精子標識用の試薬を組み合わせ、精子無力症の診断用のキットとすることができる。本発明の精子無力症診断用キットは、必要に応じて、他の試薬を含んでいてもよい。例えば、洗浄精子調製用の溶液等を組み合わせてもよい。また本発明の診断用キットは使用者に合わせて適宜構成を変えることができ、例えば、医師や検査技師等の専門家用試薬のほか、操作を簡便にする器具を組み合わせて家庭用試薬とすることもできる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例］  精子へのSPMI結合性が精子無力症の診断パラメーターとなりうるかどうかを調べるため、抗ヒトSPMI抗体を用いたフローサイトメトリーによって、精液中の精子‐SPMI結合を解析した。本実施例は、聖マリアンナ大学生命倫理委員会の承認のもと実施した。
（方法）  2006年６月〜８月に不妊を主訴として来院した精子運動率50％未満の患者16例から18検体、および健常男性5例から11検体の精液を得た。十分に液化した上記精液検体を65％Percollにて遠心し、洗浄精子を調製した。洗浄前後に各検体の液量、精子濃度、運動率、生存率を測定した。【００２２】
精子とSPMIとの結合は、下記のように解析した。上記洗浄精子を2％PFAで固定し、抗ヒトSPMIモノクローナル抗体（F11）と反応させた後、Alexa488で標識した抗マウスIgGと反応させた。さらにPropidium iodide (PI)で核染色を行った後、フローサイトメトリーによってSPMIと精子との結合を検出し、
SPMI結合率（％）＝（SPMIと結合した検体中の精子数／測定した精子数）×100
および
SPMI結合量（SPMIと結合した精子のAlexa488平均蛍光強度）を求めた。
（結果）  SPMI結合率（平均値±標準偏差）は、患者：63±17（％）および健常男性：29±14（％）であり、患者におけるSPMI結合率は健常男性よりも有意に高いことが確認された（p<0.0001）。SPMI結合率と精子運動率との間に負の相関関係が認められ（図１、r＝-0.64, p<0.0001）、SPMI結合率と精子生存率との間にも負の相関関係（図２、r＝-0.68, p<0.0001）が認められた。【００２３】
またSPMI結合量（平均値±標準偏差）においても、上記SPMI結合率の場合と同様に、患者（579±456）は健常男性（184±143）よりも有意に高かった。SPMI結合量と精子運動率との間に負の相関関係が認められ（ｒ＝-0.37, ｐ＝0.046）、SPMI結合量と精子運動率との間にも負の相関関係が認められた（ｒ＝-0.45, ｐ＝0.013）。
SPMIの結合率とSPMI結合量には正の相関関係が認められた（ｒ＝0.538, ｐ＝0.002）。【００２４】
上記のとおり、SPMI結合率が高い検体ではSPMI結合量も多く、その傾向は患者群においてのみ有意に認められた。図３に示すように、SPMI結合率55％以上もしくは結合量450以上には患者のみが分布しており、今回の対象集団においてはこの数値が健常者のカットオフ値と考えられた。カットオフ値以上を示した検体の患者では、精子にSPMIが結合して精子の運動性が抑制され、不妊症状を呈しているものと推察される。上記結果から、精子へのSPMI結合性の検出は、精子無力症の診断パラメータの一つとして有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によって、精子無力症の新規診断方法が提供された。本発明の方法は、精子およびSPMI間の結合の検出にもとづいて精子の運動性のみならず、受精能を含む質を判断する。したがって本発明の方法は、従来法のように観察者の主観の影響を受けることなく、客観的診断を可能にする。また、もう1つの利点として検体採取から測定までの時間に影響を受けない、すなわち測定設備がない個人クリニック等でも検査委託会社への外注による検査が可能となる。延いては、不妊症の患者に対し適切な治療をいち早く提供可能にするものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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