(57)【要約】以下の工程により、被検試料中の微生物の生菌を検出する。ａ）前記被検試料に、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、ｂ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、ｃ）光照射処理した被検試料に含まれる架橋剤を除去する工程、ｄ）架橋剤を除去した被検試料に培地を添加して保温する工程、ｅ）保温した被検試料に再び３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、ｆ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、ｇ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及びｈ）増幅産物を解析する工程
2009022558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料に、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｂ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｃ）光照射処理した被検試料に含まれる架橋剤を除去する工程、
ｄ）架橋剤を除去した被検試料に培地を添加して保温する工程、
ｅ）保温した被検試料に再び３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｆ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｇ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｈ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法をリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被検試料が、食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、工業用水、市水、地下水、河川水又は雨水のいずれかである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲット領域が５０〜５０００塩基の領域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が病原性細菌である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット領域が病原遺伝子である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被検試料中の微生物の生菌を核酸増幅法により検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤、培地、及び
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【請求項１１】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法である請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択される請求項１０又は１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や生体試料中に含まれる微生物、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の検出法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、食品や生体試料、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の生菌の選択的な検出が可能な検出法及び微生物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品や生体試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間程度の時間を要する。【０００３】
食品の殺菌技術や加工技術が向上したことにより、微量であっても被検試料中に存在する微生物の生死の状態を識別するニーズが高まっている。特に、食品衛生検査や臨床検査領域においては、細菌の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各細菌の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各細菌の存在の有無を判別及び定量する試みがなされている。しかし、細菌のＤＮＡにターゲットを当てた場合、被検試料に元来含まれている死菌のバックグラウンドまで検出されるため、ＰＣＲで陽性判定がでた場合、必ずしも生きた細菌の存在を示唆しているとは限らなかった。そのために、食品衛生や臨床検査の分野では、ＰＣＲは高感度・迅速でありながら普及していないのが現状であった。【０００４】
最近では、ｍＲＮＡをターゲットにして、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製後、各細菌の特異プライマーを用いてＰＣＲを行い、被検試料中の生菌のみを検出・定量する試みがなされている。しかし、この方法では死菌のｍＲＮＡの逆転写そのものが阻害されるわけではなく、１０4ｃｆｕ／ｍｌ又は１０4ｃｆｕ／ｇ以上の死菌が被検試料に含まれている場合、死菌のバックグラウンドを検出してしまうため、生死の判別法としては十分なものとは言えなかった。【０００５】
具体的には、ＰＣＲ法を利用した細菌等の微生物の生死を判別する方法としては、特許文献１又は特許文献２に記載の方法が開示されている。しかしながら、これらのＰＣＲ法を利用した細菌等の微生物の生死を判別する方法には以下に示すような問題が残されていた。【０００６】
前記特許文献１の技術は、１００℃、１０〜３０分の高温長時間加熱殺菌が施された一部のボイル（煮沸）食品中における死菌や、エタノール殺菌やホルムアルデヒト殺菌を施した食品中の微生物の識別を例示しているが、特に後者については実際そのような殺菌処理を施されている食品は存在しない。また、現在食品業界で主流な殺菌方法である低温保持殺菌（ＬＴＬＴ殺菌）、高温短時間（ＨＴＳＴ殺菌）または超高温瞬間加熱殺菌（ＵＨＴ殺菌）を施された食品中の生きた微生物のみの検出や、抗生物質投与を受けた感染症患者における臨床検体中の生きた特定病原菌等の検出は想定されていない。また、特許文献１の技術では、被検試料中に死菌バックグラウンドが１０4ｃｆｕ／ｍｌ以上の濃度で存在する食品や臨床検体の場合、死菌由来のＰＣＲ最終増幅産物量が検出限界以上になり、被検試料のＰＣＲ陽性反応が生菌由来か死菌由来かの識別が不可能である。【０００７】
また、前記特許文献２の技術は、死細胞のＲＮＡ／ＤＮＡモル比が生細胞のそれと比較して相対的に低下することを利用した生菌と死菌を識別する方法を開示したものである。この方法は、トータルＲＮＡを抽出し逆転写反応を利用してコンプリメンタリーＤＮＡを作製し、その後ＰＣＲを行ってそのＣｔ値を算出し、別途作製した検量線によりＲＮＡのモル濃度を求め、一方で、このＲＮＡに相当する染色体ＤＮＡの領域をＰＣＲにより増幅してＣｔ値を求め、前記検量線より染色体ＤＮＡのモル濃度を算出することにより、ＲＮＡ／ＤＮＡのモル比を求めるものである。すなわち、上記操作は、煩雑なトータルＲＮＡ抽出を行う必要があり、逆転写反応−ＰＣＲという２ステップを伴うために、定量性や迅速性で通常のＤＮＡをターゲットにしたＰＣＲより劣る。更に、生菌ではＲＮＡが連続的に産生される一方、死菌由来のＲＮＡは早期に分解されるため安定性に欠ける。また、高濃度の死菌を含む食品や臨床検体においてはその１／１０濃度の生菌しか検出できない。したがって、迅速、高感度、且つ精確性を要求される食品衛生検査や臨床検査においては適用が困難であった。
【特許文献１】特表２００３−５３０１１８号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／０５２０３４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、食品や生体試料中に含まれる微生物の生菌（Live cell）（Viable-and-Culturable cell）を死菌（Dead cell）や損傷菌（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell；「VNC cell」）に比べて選択的に検出する方法、すなわち、培養法の特性をそのまま引き継いだ迅速代替検出法、及び同方法を実施するためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、種々の殺菌方法に適用可能な、検出感度が高い食品衛生検査に適した微生物の生死の判別法、及び病院や臨床現場において感染症患者における特定病原菌の検出も可能な方法について鋭意検討したところ、被検試料中の微生物の生菌及び損傷菌を判別する方法において、被検試料を３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理して３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光照射を行い、一旦、前記架橋剤を除去した後、被験試料中に含まれる微生物の培養に適した培地を添加して一定時間保温し、再度、前記架橋剤で処理して３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する光照射を行い、次いで、微生物中の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、前記判別を迅速に行うことかできることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
ａ）前記被検試料に、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｂ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｃ）光照射処理した被検試料に含まれる架橋剤を除去する工程、
ｄ）架橋剤を除去した被検試料に培地を添加して保温する工程、
ｅ）保温した被検試料に再び３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｆ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｇ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｈ）増幅産物を解析する工程。【００１１】
前記方法は、前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。【００１２】
また前記方法は、前記ＰＣＲ法をリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを好ましい態様としている。【００１３】
また前記方法は、前記被検試料が、食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、工業用水、市水、地下水、河川水又は雨水のいずれかであることを好ましい態様としている。【００１４】
また前記方法は、前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択されることを好ましい態様としている。【００１５】
また前記方法は、前記ターゲット領域が５０〜５０００塩基の領域であることを好ましい態様としている。【００１６】
また前記方法は、前記微生物が病原性細菌であることを好ましい態様としている。この態様においては、前記ターゲット領域が病原遺伝子であることが好ましい。【００１７】
また本発明は、被検試料中の微生物の生菌を核酸増幅法により検出するためのキットであって、下記の要素を含むキットを提供する：
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤、培地、及び
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
前記キットは、前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。【００１８】
また前記キットは、前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択されることを好ましい態様としている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】架橋剤（EMA）の単回処理及び多段階処理によるリステリア菌（生菌及び損傷菌）のhlyA-PCRの最終増幅産物バンド強度を示す電気泳動写真。生：リステリア生菌損：リステリア損傷菌
【図２】架橋剤（EMA）の単回処理及び多段階処理によるエンテロバクター・サカザキ菌（生菌及び損傷菌）のompA-PCRの最終増幅産物バンド強度を示す電気泳動写真。生：エンテロバクター・サカザキ菌生菌損：エンテロバクター・サカザキ菌損傷菌
【図３】架橋剤（EMA）の単回処理及び多段階処理によるエンテロバクター・サカザキ菌（生菌及び損傷菌）のMMS-PCRの最終増幅産物バンド強度を示す電気泳動写真。生：エンテロバクター・サカザキ菌生菌損：エンテロバクター・サカザキ菌損傷菌
【図４】架橋剤（EMA）の単回処理及び多段階処理によるサルモネラ菌（生菌及び損傷菌）のinvA-PCRの最終増幅産物バンド強度を示す電気泳動写真。生：サルモネラ菌生菌損：サルモネラ菌損傷菌
【図５】架橋剤（EMA）の単回処理及び多段階処理によるサルモネラ菌（生菌及び損傷菌）のenterotoxin-PCRの最終増幅産物バンド強度を示す電気泳動写真。生：サルモネラ菌生菌損：サルモネラ菌損傷菌
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明の方法においては、その検出の対象として、結果的に増幅することが可能であれば、核酸全般、具体的には１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、及び２本鎖ＲＮＡを例示することができ、中でもＤＮＡを検出対象とすることが好ましく、２本鎖ＤＮＡが特に好ましい。【００２１】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）前記被検試料に、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｂ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｃ）光照射処理した被検試料に含まれる架橋剤を除去する工程、
ｄ）架橋剤を除去した被検試料に培地を添加して保温する工程、
ｅ）保温した被検試料に再び３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｆ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｇ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｈ）増幅産物を解析する工程。【００２２】
本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在する微生物の生菌を検出する対象であり、核酸増幅法による染色体ＤＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されないが、食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、工業用水、市水、地下水、河川水、又は雨水等が挙げられる。特に、食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品等が好ましい。本発明においては、被検試料は、前記のような製品又は生体試料そのものであってもよく、これを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。
また、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、及び脂肪等の夾雑物は、酵素処理等によって除去又は低減させてもよい。前記被検試料中に存在する微生物以外の細胞としては、被検試料が乳、乳製品、乳又は乳製品を原料とする食品である場合には、ウシ白血球及び乳腺上皮細胞等が挙げられる。また、被検試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等の生体試料の場合には、赤血球、白血球（顆粒球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球等）、及び血小板等が挙げられる。
前記酵素としては、前記夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生菌を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方を用いることが好ましい。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはプロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が挙げられる。【００２３】
「微生物」は、本発明の方法により検出される対象であり、核酸増幅法により検出することが可能であって、かつ、架橋剤の微生物に対する作用が生菌と死菌や損傷菌とで異なるものであれば、特に制限されないが、好ましくは細菌、糸状菌、酵母等が挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis））等のスタフィロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）等のバチラス属細菌、マイコバクテリウム属細菌、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリヌム）、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス）等のクロストリジウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等が挙げられる。【００２４】
本発明において「生菌」（Live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）であり、細胞壁の損傷はほとんど無い微生物をいう。なお、ここでいう代謝活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。【００２５】
「死菌」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。【００２６】
「損傷菌」（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、一般に好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生菌と比較すると低下しているものの死菌と比較すると有意に活性を有する状態の微生物である。【００２７】
特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷菌の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明においては、生菌の検出のみならず、生菌と死菌又は損傷菌との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。【００２８】
尚、生菌、損傷菌及び死菌の菌数単位は、通常、いずれも細胞数（cells）／ｍｌで表される。生菌の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ（colony forming units / ml））で近似させることができる。また、損傷菌の標準試料は、例えば、生菌懸濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、加熱処理する前の生菌懸濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。尚、損傷菌を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、５０秒程度で損傷菌を調製することができる。さらに、損傷菌の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、生菌懸濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長６００ｎｍ）の透過度、すなわち濁度を測定し、生菌数濃度が予め判っている生菌懸濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ）で近似させることができる。【００２９】
尚、本発明の方法は、生菌の検出が目的であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であっても死菌であってもよい。【００３０】
本発明において、「生菌の検出」とは、被検試料中の生菌の有無の判別及び生菌の量の決定のいずれをも含む。また、生菌の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。【００３１】
（１）ステップａ）
被検試料を３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤で処理する。
本発明に用いる架橋剤とは、染色体ＤＮＡにインターカレートし、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射により染色体ＤＮＡに共有結合してＤＮＡの分子間を架橋するものである。【００３２】
前記架橋剤は、生菌と、損傷菌又は死菌及びウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等に対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生菌の細胞壁よりも損傷菌もしくは死菌の細胞壁、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。【００３３】
前記架橋剤としては、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren：ＰＭＡ）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）等が挙げられる。架橋剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。【００３４】
架橋剤による処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌及び死菌もしくは損傷菌の懸濁液に、種々の濃度の架橋剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生菌と死菌もしくは損傷菌を区別しやすい条件を決定することができる。さらに、検出対象の微生物の生菌、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板等の懸濁液に、種々の濃度の架橋剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生菌と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。このような条件として、具体的には、エチジウムモノアザイドでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５分〜４８時間、エチジウムジアジドでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５分〜４８時間、プソラーレンでは終濃度１×１０-5〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、４，５'，８−トリメチルプソラーレンでは終濃度１×１０-5〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、８−メトキシプソラーレンでは終濃度１×１０-5〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間が挙げられる。【００３５】
（２）ステップｂ）
次に、架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う。
上記架橋剤は、生菌の細胞壁よりも死菌及び損傷菌の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌もしくは死菌または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。また、生きた体細胞でも細胞膜のみを有し、細胞壁を有さないことから前記架橋剤は透過すると考えられる。その結果、架橋剤は、体細胞の死細胞及び死菌並びに損傷菌の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡと無秩序に共有結合し、もしくはインターカレートし、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を行うことによりＤＮＡの分子間を架橋し、染色体ＤＮＡ内に歪みが生じる結果、染色体ＤＮＡが破壊（断片化・切断）されると推定される。
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光とは、少なくとも３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光を含んでいればよく、単波長光であってもよく、複合光であってもよい。また、すべての成分が３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内にあってもよく、３５０ｎｍよりも短波長の光、及び／又は７００ｎｍ以上の長波長の光を含んでいてもよいが、強度分布におけるピークが３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。尚、光照射のみによって微生物の染色体ＤＮＡを切断する程の短波長の成分は含まないことが好ましい。【００３６】
生菌よりも損傷菌や死菌の染色体ＤＮＡが優先的に破壊されると、生菌では染色体ＤＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、損傷菌や死菌ではターゲット領域が破壊（切断）される結果、核酸増幅反応が阻害され、生菌を損傷菌や死菌に比べて選択的に検出することができる。【００３７】
本発明の好ましい態様は、前記架橋剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光線を照射する工程を含む。エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ）は、微生物の生菌の細胞壁よりも損傷菌や死菌の細胞壁を透過しやすい。したがって、ＥＭＡは生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌や死菌の細胞壁や死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。尚、血液中の白血球、血小板が生細胞の場合、ＥＭＡは滅菌水や低張な塩溶液下で前記細胞の細胞膜をより透過する。ＥＭＡは、体細胞の死細胞及び損傷菌並びに死菌の細胞内に進入して核内ＤＮＡに無秩序にインターカレートした後、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりインターカレートしたＥＭＡのみがナイトレンに変換され、核内ＤＮＡに共有結合し、ＤＮＡの分子間を架橋する。そして、染色体ＤＮＡの各塩基およびデオキシリボースに対して至るところで共有結合したＥＭＡにより、染色体ＤＮＡ内に大きな歪みが生じ、その結果、染色体ＤＮＡが破壊（断片化）されると推定される。【００３８】
エチジウムモノアザイド以外の架橋剤であっても、微生物の生菌の細胞壁よりも損傷菌や死菌の細胞壁を透過しやすく、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光線（長波長紫外線、又は可視光線）を照射することによりＤＮＡを架橋し、染色体ＤＮＡを破壊するものであれば、本発明に使用することができる。【００３９】
ＥＭＡによる処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌、及び損傷菌や死菌の懸濁液に、種々の濃度のＥＭＡを加えて、種々の時間置いた後、可視光を照射して、必要に応じて遠心分離等によって菌体を分離し、核酸増幅法により分析することによって、生菌と死菌及び損傷菌とを区別しやすい条件を決定することができる。また、光照射の条件も、照射時間を変えて上記の実験を行うことにより、好ましい条件を決定することができる。光照射の条件として具体的には、被検試料から１０〜５０ｃｍの距離から１００〜７５０Ｗの前記波長の光を５分〜２時間照射する条件が挙げられる。光照射は、低温下で、例えば試料を氷冷して行うことが好ましい。【００４０】
（３）ステップｃ）
光照射処理した被検試料から、被験試料中に含まれる未反応の架橋剤を除去する。
この工程は、ステップｂ）の後に速やかに行うことが好ましい。架橋剤を除去する方法としては、被検試料を遠心分離して、微生物を含む沈殿と架橋剤を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、架橋剤を除去した後、適宜、洗浄剤で微生物を洗浄する工程を追加することも可能である。【００４１】
（４）ステップｄ）
続いて、架橋剤を除去した被検試料に培地を添加して保温する。
培地は、被験試料中に含まれる微生物の培養に適した培地であることが好ましく、液体培地を使用することが特に好ましい。具体的には、ブイヨン培地、ペプトン培地、ブレインハート インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス等を例示することができる。保温は、対象の微生物の増殖に適した温度、例えば当該微生物の至適培養温度またはそれに準ずる温度であることが好ましい。対象微生物の至適培養温度は、例えば、対象微生物を種々の温度で培養し、微生物が最も増殖する温度を選択することによって、決定することができる。例えば、上記で例示した細菌では、通常20℃〜43℃、好ましくは25℃〜37℃、より好ましくは30℃〜37℃である。また、被検試料中の微生物が増殖する限り、保温時間は特に制限されないが、具体的には例えば、0.5〜48時間、好ましくは1〜24時間、より好ましくは2〜3時間である。微生物を含む被検試料を培地中で保温することにより、架橋剤が取り込まれず、染色体ＤＮＡが破壊されなかった生菌は、培地中での保温により培養されて増殖し、被検試料中の生菌の有無の判別及び生菌の量の決定における検出感度の向上が期待される。【００４２】
（５）ステップｅ），ｆ）
ステップｅ），ｆ）は、それぞれ前記ステップａ），ｂ）と同様である。
前記ステップｄ）を行うことによって、被験試料中の生菌については、増殖することが期待されることから、ステップｄ）の後に、さらに、ステップｅ），ｆ）を実施することによって、生菌とそれ以外の菌との検出感度の差を高めることが可能である。これによって、被検試料中の生菌、損傷菌または死菌の有無の判別及び生菌の量の決定において飛躍的な検出感度の向上が可能となる。ステップｅ）で添加する架橋剤は、ステップａ）で添加した架橋剤と同じであってもよいし、異なるものであってもよい。【００４３】
本発明の特に好ましい態様は、被検試料に対し、架橋剤添加及び光照射処理と遠心分離等による架橋剤除去、並びに培地の添加、及び保温、さらに再び架橋剤添加及び光照射処理、を連続的に行うことであるが、前記一連の処理を行った後、さらに複数回、架橋剤除去、培地の添加、及び保温、さらに再び架橋剤添加及び光照射処理、を行うことによって、さらなる検出感度の向上も可能である。具体的には、ステップａ）及びｂ）の後、ステップｃ）、ｄ）、ｅ）及びｆ）を２回、又はそれ以上繰返せばよい。
後記実施例及び比較例において、ステップａ），ｂ）のみを行い、ステップｅ），ｆ）を行わないことを「単回処理」、ステップａ），ｂ）に加えて、ステップｅ），ｆ）を行うことを「多段階処理」ということがある。【００４４】
（６）ステップｇ）
ステップａ〜ｆ）で処理された被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification：新規遺伝子増幅法（LAMP法）の原理と応用 、納富継宣、長谷哲、BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification：Edward L. Chan, Ken Brandt, Karen Olienus, Nick Antonishyn, Greg B. Horsman., Performance characteristics of the Becton Dickinson ProbeTec System for direct detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in male and female urine specimens in comparison with the Roche Cobas system. Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）、ＤＮＡマイクロアレイ法（Validation of Virulence and Epidemiology DNA Microarray for Identification and Characterization of Staphylococcus aureus Isolates: Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, p.1620-1627, 2008）等がそれぞれ例示される。なお、本発明においては、ＰＣＲ法を利用することが特に好ましいが、これに制限されない。【００４５】
被検試料からのＤＮＡの抽出は、抽出されたＤＮＡが核酸増幅反応における鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物のＤＮＡの抽出法にしたがって行うことができる。【００４６】
ＤＮＡの抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載されている。【００４７】
本発明において「ターゲット領域」とは、染色体ＤＮＡのうち、本発明に用いるプライマーを用いた核酸増幅法により増幅され得る領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。検出対象の微生物に特異的なターゲット領域に対応するプライマーセットと、広汎な微生物の染色体ＤＮＡに対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生菌量と、多数種の微生物の生菌量を、同時に測定することができる。ターゲット領域の長さとしては、通常５０〜５０００塩基、好ましくは５０〜２０００塩基、特に好ましくは５０〜５００塩基が挙げられる。【００４８】
核酸の増幅に用いるプライマーは、各種核酸増幅法の原理に基づいて、適宜設定することが可能であって、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。【００４９】
また、検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、ターゲット領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のenterotoxin（エンテロトキシン）遺伝子やinvasion（ｉｎｖＡ）遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属細菌のouter-membrane-proteinA（ｏｍｐＡ）遺伝子（エンテロバクター・サカザキ菌）及びmacromolecular synthesis（ＭＭＳ）オペロン（エンテロバクター・サカザキ菌）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。また、病原遺伝子に対応するプライマーとしては、例えば、リステリア菌のｈｌｙＡ遺伝子に対応する配列番号１及び２に示すプライマーセット、エンテロバクター・サカザキ菌のｏｍｐＡ遺伝子に対応する配列番号３及び４に対するプライマーセット、及びエンテロバクター・サカザキ菌のＭＭＳオペロンに対応する配列番号５及び６に対するプライマーセットが挙げられる。【００５０】
複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生菌を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生菌を検出することができる。【００５１】
核酸増幅反応の条件は、各核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法等）の原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。【００５２】
（７）ステップｈ）
続いて、核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。尚、核酸増幅法にＰＣＲ法を用いた場合は、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al./ Application of 5'-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al./ Application of the 5'-nuclease PCR assay in evaluation and development of methods for quantitative detection of campylobacter jejuni. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）を利用することが可能である。
電気泳動法によれば、核酸増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出し、そのＳＤ値に１０を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。【００５３】
また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。【００５４】
本発明の方法によって生菌を検出する場合、核酸増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生菌の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各ステップを行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＤＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡを標準試料として用いることもできる。【００５５】
尚、本発明による生菌の検出が生菌の量の決定を含む場合、ステップｄ）で生菌が増殖するため、被検試料中の生菌の量を決定するには、この増殖の程度を考慮する必要がある。そのためには、例えば、上記のように微生物の標準試料を用いて微生物量と増幅産物との関連を示す標準曲線を作成しておけばよい。【００５６】
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、被検試料中の微生物の生菌を核酸増幅法により検出するためのキットであって、架橋剤、培地、及び検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマーを含む。【００５７】
前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、又はＬＣＲ法であることが好ましい。なお、上記キットにおいて、架橋剤や培地は、本発明の方法で説明したものと同様である。【００５８】
本発明のキットの好ましい態様は、架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択されることが好ましく、特にエチジウムモノアザイドを使用することが好ましい。【００５９】
本発明のキットは、さらに、希釈液、架橋剤反応用の反応液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【００６０】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６１】
〔実施例１〕
１．試料の調製−リステリア・モノサイトゲネス（生菌及び損傷菌）懸濁液の調製
グラム陽性細菌であるリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes JCM 2873；以下、「リステリア」と略記することがある）を、ブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロスを用いて３０℃で培養し、対数増殖期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に生理食塩水４０ｍｌを加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数を標準寒天平板培地により測定したところ、１．３×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。【００６２】
また、上記生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。尚、この懸濁液中の細胞には少数の生菌及び死菌も一部含まれると考えられるが、主に損傷菌であるため、単に「損傷菌」と記載する。尚、本発明の方法は本来生菌を検出する方法であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であるか死菌であるかは問わない。【００６３】
２．試験方法
２−１）多段階処理（本発明の方法）
前記で調製したリステリアの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、エチジウムモノアザイド（EMA）を終濃度0、又は100μg/mlで添加し、遮光下4 ℃、5分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線（FLOOD PRF: 100V、500 W、岩崎電気社製、波長：５００〜７００ｎｍ）を5分間照射した。その後、4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離し、上清を除去し、同容量の生理食塩水を加え撹拌後、4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離を行い上清を除去後、同容量のブレイン・ハート・インフュージョン(BHI)ブロスを加え、30 ℃により2時間インキュベーションした。【００６４】
1回目のEMA処理時、EMA濃度 0の生菌及び損傷菌懸濁液にはEMAを再度加えず、EMA濃度100 μg/mlの生菌及び損傷菌懸濁液にはEMAを終濃度10 μg/ml、又は、25 μg/mlで再度添加し、遮光下4 ℃、5分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線を5分間照射した。【００６５】
２−２）単回処理（比較例１）
１．で調製したリステリアの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、エチジウムモノアザイド（EMA）を終濃度 0、10、又は25 μg/mlで添加し、遮光下4 ℃、5分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線(FLOOD PRF: 100V、500 W、岩崎電気社製、波長：５００〜７００ｎｍ)を5分間照射した。【００６６】
２−３）PCR試験に供する各細菌懸濁液の調製
前記２−１）及び２−２）で処理されたリステリアの生菌及び損傷菌の各懸濁液の入ったマイクロチューブを4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離した。上清を除去後、1 mlの生理食塩水を加えよく撹拌し、同様の冷却遠心処理を行った（洗浄処理）。更に1回同様の洗浄処理を行った後、ペレットに10 μlのTEバッファー(10 mMトリス塩酸緩衝液、1 mM EDTA・2Na)を加えよく撹拌した。【００６７】
３．リステリア菌の病原遺伝子(short DNA)をターゲットにしたPCR
３−１）病原遺伝子リステリア・リステリオリシンO（hlyA）遺伝子増幅
細菌からの染色体DNAの溶出及びPCR反応を連続して自動的に行えるＧ&ｇサイエンス社（神奈川県横浜市）製ダイレクトバッファーＭＩＸを使用し、PCRマスターミックス（全量50.5 μl）を調製した。本バッファーＭＩＸにはPCR反応に利用する細菌由来の鋳型DNAに細菌由来のタンパク質が吸着することを阻止する成分（界面活性剤）、及び、DNAポリメラーゼに細菌由来の多糖類が吸着することを阻止する成分（界面活性剤）を含んでおり、それ以外にリアルタイムPCR反応に必要な組成を含んでいる。PCRマスターミックスの詳細は下記の通りである。【００６８】
・Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーMIX: 42 μl
・(5U/μl) Ex-Taq (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.5 μl
・(10 pmol/μl) 配列番号1 (hlyA-F) DNA: 4 μl
・(10 pmol/μl) 配列番号2 (hlyA-R) DNA: 4 μl【００６９】
尚、前記試薬の全てを足し合わせると全量50.5 μlになるが、Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーＭＩＸには、全量50.5 μlのPCRマスターミックスにおいて必要成分が下記の終濃度になるように予め調製されている。【００７０】
・Ex-Taq Buffer (宝酒造社製、カタログ番号: RR001B): 1 ×
・dNTP mixture (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.2 mM each
・SYBA Green (BMA社製、カタログ番号：50513): 0.4 ×【００７１】
３−２）hlyA遺伝子増幅用PCRサーマルサイクルプロファイル【００７２】
【表１】
2009022558.tif 000003
【００７３】
３−３）PCR反応
前記２−３）で調製した各試験懸濁液の5μlを前記３−１）で調製したPCRマスターミックス(50.5 μl)に添加した。ネガテイブコントロールとしてはTEバッファー５μlを用いた。【００７４】
３−２）で示したPCRサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムPCR装置i Cycler(バイオラッド社製、機種番号：iQ)を用いてPCR反応を行った。【００７５】
４．PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動
前記３−３）のPCR増幅産物を3 %アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動終了後、アガロースゲルを１μg/mlエチジウムブロマイド水溶液に20分間浸漬し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長254 nm）によりhlyA遺伝子増幅産物の増幅度合いを観察した。【００７６】
５．試験結果
リステリアの生菌及び損傷菌に対して、多段階処理を行った後hlyA遺伝子をターゲットにしたPCRを行いアガロースゲル電気泳動した結果を図１（多段階処理レーン）に示し、そのPCR最終増幅産物のバンド強度を数値化したものを表２に示す。また、リステリアの生菌及び損傷菌に対して、単回処理を行った後hlyA遺伝子をターゲットにしたPCRを行いアガロースゲル電気泳動した結果を図１（単回処理レーン）に示し、そのPCR最終増幅産物のバンド強度を数値化したものを表３に示す。表中におけるバンド強度は、バンドの濃淡をバイオラッド社製GS-700 Imaging Densitometer（デンシトメーター：測定波長６００ｎｍ）を用いて、電気泳動方向にバンドをスキャンした際の測定値である。【００７７】
【表２】
2009022558.tif 000004
【００７８】
【表３】
2009022558.tif 000005
【００７９】
多段階処理においてEMA未添加の場合、リステリアの生菌と損傷菌ともにhlyA遺伝子増幅産物と推察されるバンドが検出され、生菌のみを特異的に検出することができなかった。しかし、多段階処理でEMAを添加した場合（EMA 100 μg/ml-インキュベーション-EMA 25、又は10 μg/ml）、生菌ではバンドは明瞭に検出されたが、損傷菌ではバンドは殆ど、もしくは全く検出されなくなった。従って、多段階処理により生菌のみ選択的に検出することがPCRにより可能となった。同様に表２に示すように、バンド強度を数値化したデータからも多段階処理により113 bpという短い遺伝子をターゲットにしたPCRにおいても、明瞭に生菌と損傷菌の識別が可能となった。【００８０】
一方、単回処理においてEMA未添加の場合、PCRによりhlyA遺伝子増幅産物と推察されるバンドがリステリアの生菌と損傷菌共に検出され、生菌のみを選択的に検出することができなかった。また、単回処理でEMAを10 μg/ml添加した場合、生菌と損傷菌ともにhlyA遺伝子増幅産物と推察されるバンドが検出され、生菌のみを特異的に検出することができなかった。単回処理でEMAを25 μg/ml添加した場合、生菌及び損傷菌ともにhlyA遺伝子増幅産物と推察されるバンドが殆ど消失に近い形まで減少し、生菌のみを特異的に検出することは不可能であった。表３においても、単回処理により113 bpという短い遺伝子（hlyA）をターゲットにしたPCRでは生菌と損傷菌の明瞭な識別は不可能であった。【００８１】
６．考察
特定病原細菌に焦点を当て生菌と損傷菌（死菌も含めて）との識別を迅速に行う場合、病原細菌のみ特異的に検出するため、及び、更に定量的リアルタイムPCRにより試験液中の細菌数を定量するため、80〜200塩基という短い遺伝子領域をターゲットとする傾向がある。比較例１に示される単回処理の場合、10 μg/mlより高濃度のEMAを用いて処理すると、損傷菌だけでなく生菌の細胞壁も透過し、生菌及び損傷菌の染色体DNAを至る所で細菌内酵素に依存せず直接的に２本鎖を切断するので、生菌のみを特異的に検出することができないと考えられる。又、単回処理でEMAを10 μg/ml又はそれ以下の濃度で作用させた場合、EMAは損傷菌の細胞壁を透過しにくく、高頻度で染色体ＤＮＡが切断を受けている可能性は低い。したがって、PCRターゲット領域が短い場合、全ての損傷菌細胞の染色体DNAのターゲット領域が切断されるとは限らず、その結果、PCRは完全に抑制されないと考えられる。【００８２】
一方、多段階処理においては、EMAを１回作用させた後、EMAが多少生菌を透過し生菌数が減少したとしても、培養に適した培地中でインキュベーションすることにより、生菌数を元の数値に戻したり、生菌の拡散ポンプを回復させたり、未反応EMAを菌体外に排出させることが可能であるため、作用させるEMAの１回目の濃度は100 μg/ml等の高濃度が可能であり、損傷菌の染色体DNAは高濃度EMAにより極めて激しく切断を至る所で受けることになり、その後の培地中でのインキュベーションを行っても生菌とは異なり細胞数を増やすことは不可能である。そのような状況下、５分等の短時間では生菌の細胞壁には殆ど透過しない濃度、例えば10 μg/mlで再度EMAを作用させれば、損傷菌の細胞壁のみにEMAが透過し、染色体DNAの更なる切断を促し、損傷菌のみPCR最終増幅産物のバンドが検出されないものと考えられる。【００８３】
〔実施例２〕
１．試料の調製−エンテロバクター・サカザキ（生菌及び損傷菌）懸濁液の調製
グラム陰性細菌であるエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ATCC 6538P；以下、「サカザキ」と略記することがある）を、ブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロスを用いて３7℃で培養し、対数増殖期の培養液5ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に生理食塩水5ｍｌを加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に5ｍｌの生理食塩水を加え更に10倍希釈し生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数を標準寒天平板培地により測定したところ、8.38 ± 0.25 log10ｃｆｕ／ｍｌであった。【００８４】
また、上記生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に2分浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。尚、この懸濁液中の細胞には少数の生菌及び死菌も一部含まれると考えられるが、主に損傷菌であるため、単に「損傷菌」と記載する。尚、本発明の方法は本来生菌を検出する方法であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であるか死菌であるかは問わない。【００８５】
２．試験方法
２−１）多段階処理（本発明の方法）
前記で調製したサカザキの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、エチジウムモノアザイド（EMA）を終濃度0、10、25又は100μg/mlで添加し、遮光下4 ℃、10分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線（FLOOD PRF: 100V、500 W、岩崎電気社製、波長：５００〜７００ｎｍ）を5分間照射した。その後、4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離し、上清を除去し、同容量の生理食塩水を加え撹拌後、4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離を行い上清を除去後、同容量のブレイン・ハート・インフュージョン(BHI)ブロスを加え、37 ℃により2時間インキュベーションした。【００８６】
1回目のEMA処理時、EMA濃度 0の生菌及び損傷菌懸濁液にはEMAを再度加えず、EMA濃度10、25、又は100 μg/mlの生菌及び損傷菌懸濁液にはEMAを終濃度10 μg/mlで再度添加し、遮光下4 ℃、10分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線を5分間照射した。【００８７】
２−２）単回処理（比較例２）
１．で調製したサカザキの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、エチジウムモノアザイド（EMA）を終濃度 0、10、25又は100 μg/mlで添加し、遮光下4 ℃、10分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線(FLOOD PRF: 100V、500 W、岩崎電気社製、波長：５００〜７００ｎｍ)を5分間照射した。【００８８】
２−３）PCR試験に供する各細菌懸濁液の調製
前記２−１）及び２−２）で処理されたサカザキの生菌及び損傷菌の各懸濁液の入ったマイクロチューブを4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離した。上清を除去後、1 mlの生理食塩水を加えよく撹拌し、同様の冷却遠心処理を行った（洗浄処理）。更に1回同様の洗浄処理を行った後、ペレットに初期容量と同容量の滅菌水を加えよく撹拌した。【００８９】
３．サカザキのouter-membrane-proteinA（ompA）遺伝子及びmacromolecular synthesis (MMS)オペロン(short DNA)をターゲットにしたPCR
３−１）ompA遺伝子及びMMS遺伝子増幅
細菌からの染色体DNAの溶出及びPCR反応を連続して自動的に行えるＧ&ｇサイエンス社（神奈川県横浜市）製ダイレクトバッファーＭＩＸを使用し、PCRマスターミックス（全量25.25 μl）を調製した。本バッファーＭＩＸにはPCR反応に利用する細菌由来の鋳型DNAに細菌由来のタンパク質が吸着することを阻止する成分（界面活性剤）、及び、DNAポリメラーゼに細菌由来の多糖類が吸着することを阻止する成分（界面活性剤）を含んでおり、それ以外にリアルタイムPCR反応に必要な組成を含んでいる。PCRマスターミックスの詳細は下記の通りである。【００９０】
ompA遺伝子検出用PCRマスターミックスの各成分を下記に示す。
・Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーMIX: 21 μl
・(5U/μl) Ex-Taq (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.25 μl
・(10 pmol/μl) 配列番号3 (ompA-F) DNA: 2 μl
・(10 pmol/μl) 配列番号4 (ompA-R) DNA: 2 μl【００９１】
MMS遺伝子検出用PCRマスターミックスの各成分を下記に示す。
・Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーMIX: 21 μl
・(5U/μl) Ex-Taq (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.25 μl
・(10 pmol/μl) 配列番号5 (MMS-F) DNA: 2 μl
・(10 pmol/μl) 配列番号6 (MMS-R) DNA: 2 μl【００９２】
尚、前記試薬の全てを足し合わせると全量25.25 μlになるが、Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーＭＩＸには、全量25.25 μlのPCRマスターミックスにおいて必要成分が下記の終濃度になるように予め調製されている。【００９３】
・Ex-Taq Buffer (宝酒造社製、カタログ番号: RR001B): 1 ×
・dNTP mixture (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.2 mM each
・SYBA Green (BMA社製、カタログ番号：50513): 0.4 ×【００９４】
３−２）ompA遺伝子及びMMS遺伝子増幅用PCRサーマルサイクルプロファイル【００９５】
【表４】
2009022558.tif 000006
【００９６】
３−３）PCR反応
前記２−３）で調製した各試験懸濁液の2μlを前記３−１）で調製したPCRマスターミックス(25.25 μl)に添加した。ネガテイブコントロールとしては滅菌水2.5 μlを用いた。【００９７】
３−２）で示したPCRサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムPCR装置i Cycler(バイオラッド社製、機種番号：iQ)を用いてPCR反応を行った。【００９８】
４．PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動
前記３−３）のPCR増幅産物を2 %アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動終了後、アガロースゲルを１μg/mlエチジウムブロマイド水溶液に20分間浸漬し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長254 nm）によりhlyA遺伝子増幅産物の増幅度合いを観察した。【００９９】
５．試験結果
サカザキの生菌及び損傷菌に対して、多段階処理を行った後ompA遺伝子をターゲットにしたPCRを行いアガロースゲル電気泳動した結果を図２（多段階処理レーン）に示し、そのPCR最終増幅産物のバンド強度を数値化したものを表５に示す。また、サカザキの生菌及び損傷菌に対して、単回処理を行った後ompA遺伝子をターゲットにしたPCRを行いアガロースゲル電気泳動した結果を図２（単回処理レーン）に示し、そのPCR最終増幅産物のバンド強度を数値化したものを表６に示す。表中におけるバンド強度は、バンドの濃淡をバイオラッド社製GS-700 Imaging Densitometer（デンシトメーター：測定波長６００ｎｍ）を用いて、電気泳動方向にバンドをスキャンした際の測定値である。更に、多段階処理及び単回処理の各リアルタイムPCRカーブの立ち上がりのサイクル数（Ct値）を表７に示す。
同様にMMS遺伝子に関して、多段階処理後のPCR最終増幅産物をアガロース電気泳動した結果を図３（多段階処理レーン）、そのPCRバンドを数値化したものを表８に、単回処理の電気泳動結果を図３（単回処理レーン）に示し、そのPCRバンドを数値化したものを表９に示す。更に、多段階処理及び単回処理の各リアルタイムPCRカーブの立ち上がりのサイクル数（Ct値）を表１０に示す。【０１００】
【表５】
2009022558.tif 000007
【０１０１】
【表６】
2009022558.tif 000008
【０１０２】
【表７】
2009022558.tif 000009
【０１０３】
【表８】
2009022558.tif 000010
【０１０４】
【表９】
2009022558.tif 000011
【０１０５】
【表１０】
2009022558.tif 000012
【０１０６】
多段階処理においてEMA未添加の場合、サカザキの生菌と損傷菌ともにompA遺伝子及びMMS遺伝子増幅産物と推察されるバンドが検出され、生菌のみを特異的に検出することができなかった。一方、多段階処理でEMAを添加した場合（EMA 10 μg/ml-インキュベーション-EMA 10 μg/ml）、生菌ではバンドは明瞭に検出されたが、損傷菌ではバンドは全く検出されなくなった（損傷菌の場合、ターゲット遺伝子より短いバンドが存在するが、これはプライマーダイマーである）。従って、多段階処理により生菌のみ選択的に検出することがPCRにより可能となった。同様に表５及び表８に示すように、バンド強度を数値化したデータからも多段階処理により469 bp及び78 bpという比較的短い、又は極めて短い遺伝子をターゲットにしたPCRにおいても、明瞭に生菌と損傷菌の識別が可能となった。【０１０７】
尚、表７の各Ct値も考慮すると、単回処理EMA 25 μg/mlにおいても生菌と損傷菌の識別が可能となっているが、生菌のCt値が20.9 ± 0.6となっており、多段階処理（EMA 10/10 μg/ml）の生菌のCt値15.9 ± 0.4と比較して5.0程度大きくなっており、すなわち、単回処理の場合、生死の識別が可能となっても、生菌の検出限界が多段階処理より、およそ2 log10 cells/ml程度劣るため、低濃度のサカザキを検出することができなかった。【０１０８】
６．考察
MMS遺伝子（78 bp）という極めて短い遺伝子をターゲットにしたPCRの場合、比較例２に示される単回処理では、10 μg/mlのEMAを用いて処理したときは、EMAが損傷菌にのみ選択的に透過し、損傷菌の染色体DNAを至る所で細菌内酵素に依存せず直接的にEMAが２本鎖を切断する。しかし、損傷菌数が108 cfu/mlレベルの高濃度であると、全ての損傷菌のターゲットMMS遺伝子領域に切断が入っているとは言えず、その結果、EMAの濃度が高くても単回処理においては損傷菌のPCR最終増幅産物は陰性とならなかったと解釈される。又、単回処理でEMAを10 μg/ml又はそれ以下の濃度で作用させた場合、EMAは損傷菌の細胞壁を透過しにくく、高頻度で染色体ＤＮＡが切断を受けている可能性は低い。したがって、PCRターゲット領域が短い場合、全ての損傷菌細胞の染色体DNAのターゲット領域が切断されるとは限らず、その結果、PCRは完全に抑制されないと考えられる。【０１０９】
一方、多段階処理においては、EMAを１回作用させた後、EMAが多少生菌を透過し生菌数が減少したとしても、培養に適した培地中でインキュベーションすることにより、生菌数を元の数値に戻したり、生菌の拡散ポンプを回復させたり、未反応EMAを菌体外に排出させることが可能である。一方、損傷菌の染色体DNAはEMAにより激しく切断を至る所で受けてはいるが、PCR増幅対象遺伝子が短い場合、全ての染色体DNAの本領域に切断が入っているとは限らないが、更に、その後の培地中でのインキュベーションを行っても生菌とは異なり細胞数を増やすことは不可能である。そのような状況下、例えば10 μg/mlで再度EMAを作用させれば、損傷菌の細胞壁のみにEMAが透過し、染色体DNAの更なる切断を促し、損傷菌のみPCR最終増幅産物のバンドが検出されないものと考えられる。【０１１０】
〔実施例３〕
１．試料の調製−サルモネラ・エンテリテイデイス（生菌及び損傷菌）懸濁液の調製
グラム陰性細菌であるサルモネラ・エンテリテイデイス（Salmonella enteritidis IIP 604 ；以下、「サルモネラ」と略記することがある）を、ブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロスを用いて３7℃で培養し、対数増殖期の培養液5ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に生理食塩水5ｍｌを加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に5ｍｌの生理食塩水を加え更に10倍希釈し生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数を標準寒天平板培地により測定したところ、8.06 ± 0.02 log10ｃｆｕ／ｍｌであった。【０１１１】
また、上記生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に2分浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。尚、この懸濁液中の細胞には少数の生菌及び死菌も一部含まれると考えられるが、主に損傷菌であるため、単に「損傷菌」と記載する。尚、本発明の方法は本来生菌を検出する方法であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であるか死菌であるかは問わない。【０１１２】
２．試験方法
２−１）多段階処理（本発明の方法）
前記で調製したサルモネラの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、エチジウムモノアザイド（EMA）を終濃度0、10、25又は100μg/mlで添加し、遮光下4 ℃、10分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線（FLOOD PRF: 100V、500 W、岩崎電気社製、波長：５００〜７００ｎｍ）を5分間照射した。その後、4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離し、上清を除去し、同容量の生理食塩水を加え撹拌後、4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離を行い上清を除去後、同容量のブレイン・ハート・インフュージョン(BHI)ブロスを加え、37 ℃により2時間インキュベーションした。【０１１３】
1回目のEMA処理時、EMA濃度 0の生菌及び損傷菌懸濁液にはEMAを再度加えず、EMA濃度10、25、又は100 μg/mlの生菌及び損傷菌懸濁液にはEMAを終濃度10 μg/mlで再度添加し、遮光下4 ℃、10分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線を5分間照射した。【０１１４】
２−２）単回処理（比較例３）
１．で調製したサルモネラの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、エチジウムモノアザイド（EMA）を終濃度 0、10、25又は100 μg/mlで添加し、遮光下4 ℃、10分放置後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から20 cmの距離に設置した500 Wの可視光線(FLOOD PRF: 100V、500 W、岩崎電気社製、波長：５００〜７００ｎｍ)を5分間照射した。【０１１５】
２−３）PCR試験に供する各細菌懸濁液の調製
前記２−１）及び２−２）で処理されたサルモネラの生菌及び損傷菌の各懸濁液の入ったマイクロチューブを4 ℃で15,000 × g、10分間冷却遠心分離した。上清を除去後、1 mlの生理食塩水を加えよく撹拌し、同様の冷却遠心処理を行った（洗浄処理）。更に1回同様の洗浄処理を行った後、ペレットに初期容量と同容量の滅菌水を加えよく撹拌した。【０１１６】
３．サルモネラのinvasion gene（invA）遺伝子及びenterotoxin遺伝子(共にshort DNA)をターゲットにしたPCR
３−１）invA遺伝子及びenterotoxin遺伝子増幅
細菌からの染色体DNAの溶出及びPCR反応を連続して自動的に行えるＧ&ｇサイエンス社（神奈川県横浜市）製ダイレクトバッファーＭＩＸを使用し、PCRマスターミックス（全量25.25 μl）を調製した。本バッファーＭＩＸにはPCR反応に利用する細菌由来の鋳型DNAに細菌由来のタンパク質が吸着することを阻止する成分（界面活性剤）、及び、DNAポリメラーゼに細菌由来の多糖類が吸着することを阻止する成分（界面活性剤）を含んでおり、それ以外にリアルタイムPCR反応に必要な組成を含んでいる。PCRマスターミックスの詳細は下記の通りである。【０１１７】
invA遺伝子検出用PCRマスターミックスの各成分を下記に示す。
・Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーMIX: 21 μl
・(5U/μl) Ex-Taq (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.25 μl
・(10 pmol/μl) invA-F DNA: 2 μl
・(10 pmol/μl) invA-R DNA: 2 μl
invA-F: サルモネラ菌invA遺伝子検出用Primer Set SIN-1 (製品コード：S018; TakaraBio)
invA-R：サルモネラ菌invA遺伝子検出用Primer Set SIN-2 (製品コード：S018; TakaraBio)【０１１８】
MMS遺伝子検出用PCRマスターミックスの各成分を下記に示す。
・Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーMIX: 21 μl
・(5U/μl) Ex-Taq (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.25 μl
・(10 pmol/μl) enterotoxin-F DNA: 2 μl
・(10 pmol/μl) enterotoxin-R DNA: 2 μl
enterotoxin-F: サルモネラ菌エンテロトキシン遺伝子検出用Primer Set STN-1 (製品コード：S019; TakaraBio)
enterotoxin-R: サルモネラ菌エンテロトキシン遺伝子検出用Primer Set STN-2 (製品コード：S019; TakaraBio)【０１１９】
尚、前記試薬の全てを足し合わせると全量25.25 μlになるが、Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーＭＩＸには、全量25.25 μlのPCRマスターミックスにおいて必要成分が下記の終濃度になるように予め調製されている。【０１２０】
・Ex-Taq Buffer (宝酒造社製、カタログ番号: RR001B): 1 ×
・dNTP mixture (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.2 mM each
・SYBA Green (BMA社製、カタログ番号：50513): 0.4 ×【０１２１】
３−２）invA遺伝子及びenterotoxin遺伝子増幅用PCRサーマルサイクルプロファイル【０１２２】
【表１１】
2009022558.tif 000013
【０１２３】
３−３）PCR反応
前記２−３）で調製した各試験懸濁液の2μlを前記３−１）で調製したPCRマスターミックス(25.25 μl)に添加した。ネガテイブコントロールとしては滅菌水2.5 μlを用いた。【０１２４】
３−２）で示したPCRサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムPCR装置i Cycler(バイオラッド社製、機種番号：iQ)を用いてPCR反応を行った。【０１２５】
４．PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動
前記３−３）のPCR増幅産物を2 %アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動終了後、アガロースゲルを１μg/mlエチジウムブロマイド水溶液に20分間浸漬し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長254 nm）によりhlyA遺伝子増幅産物の増幅度合いを観察した。【０１２６】
５．試験結果
サルモネラの生菌及び損傷菌に対して、多段階処理を行った後invA遺伝子をターゲットにしたPCRを行いアガロースゲル電気泳動した結果を図４（多段階処理レーン）に示し、そのPCR最終増幅産物のバンド強度を数値化したものを表１２に示す。また、サルモネラの生菌及び損傷菌に対して、単回処理を行った後invA遺伝子をターゲットにしたPCRを行いアガロースゲル電気泳動した結果を図４（単回処理レーン）に示し、そのPCR最終増幅産物のバンド強度を数値化したものを表１３に示す。表中におけるバンド強度は、バンドの濃淡をバイオラッド社製GS-700 Imaging Densitometer（デンシトメーター：測定波長６００ｎｍ）を用いて、電気泳動方向にバンドをスキャンした際の測定値である。更に、多段階処理及び単回処理の各リアルタイムPCRカーブの立ち上がりのサイクル数（Ct値）を表１４に示す。
同様にenterotoxin遺伝子に関して、多段階処理後のPCR最終増幅産物をアガロース電気泳動した結果を図５（多段階処理レーン）、そのPCRバンドを数値化したものを表１５に、単回処理の電気泳動結果を図５（単回処理レーン）に示し、そのPCRバンドを数値化したものを表１６に示す。更に、多段階処理及び単回処理の各リアルタイムPCRカーブの立ち上がりのサイクル数（Ct値）を表１７に示す。【０１２７】
【表１２】
2009022558.tif 000014
【０１２８】
【表１３】
2009022558.tif 000015
【０１２９】
【表１４】
2009022558.tif 000016
【０１３０】
【表１５】
2009022558.tif 000017
【０１３１】
【表１６】
2009022558.tif 000018
【０１３２】
【表１７】
2009022558.tif 000019
【０１３３】
多段階処理においてEMA未添加の場合、サルモネラの生菌と損傷菌ともにinvA遺伝子及びenterotoxin遺伝子増幅産物と推察されるバンドが検出され、生菌のみを特異的に検出することができなかった。しかし、多段階処理でEMAを添加した場合（EMA 10 μg/ml-インキュベーション-EMA 10 μg/ml）、生菌ではバンドは明瞭に検出されたが、損傷菌ではバンドは全く検出されなくなった。従って、多段階処理により生菌のみ選択的に検出することがPCRにより可能となった。同様に表１２及び表１５に示すように、バンド強度を数値化したデータからも、多段階処理により378 bp及び264 bpという比較的短い遺伝子をターゲットにしたPCRにおいて明瞭に生菌と損傷菌の識別が可能となった。【０１３４】
又、表１４の各Ct値も考慮すると、単回処理EMA 25 μg/ml及び100 μg/mlにおいても生菌と損傷菌の識別が可能となっているが、生菌のCt値がそれぞれ18.2 ± 0.3、27.7 ± 3.8となっており、多段階処理（EMA 10/10 μg/ml）の生菌のCt値16.0 ± 3.5と比較して2.2及び11.7程度大きくなっており、すなわち、単回処理の場合、生死の識別が可能となっても、生菌の検出限界が多段階処理より、およそ1 log10 cells/ml又は4 log10 cells/ml程度劣るため、低濃度のサカザキを検出することができなかった。【０１３５】
６．考察
invA及びenterotoxin遺伝子（378 bp及び284 bp）という短い遺伝子をターゲットにしたPCRの場合、比較例３に示される単回処理では、10 μg/mlのEMAを用いて処理したときは、EMAが損傷菌の染色体DNAを至る所で細菌内酵素に依存せず直接的にEMAが２本鎖を切断してPCRを抑制している。しかし、生菌においては、EMA濃度が高くなるとCt値が上昇し、生菌の検出限界の低下を招いている。【０１３６】
一方、多段階処理においては、EMAを１回作用させた後、EMAが多少生菌を透過し生菌数が減少したとしても、培養に適した培地中でインキュベーションすることにより、生菌数を元の数値に戻したり、生菌の拡散ポンプを回復させたり、未反応EMAを菌体外に排出させることが可能である。一方、損傷菌の染色体DNAはEMAにより激しく切断を至る所で受けてはいるがPCR増幅対象遺伝子が短い場合、全ての染色体DNAの本領域に切断が入っているとは限らないが、更に、その後の培地中でのインキュベーションを行っても生菌とは異なり細胞数を増やすことは不可能である。そのような状況下、例えば10 μg/mlで再度EMAを作用させれば、損傷菌の細胞壁のみにEMAが更に透過し、染色体DNAの更なる切断を促し、損傷菌のみPCR最終増幅産物のバンドが検出されないものと考えられる。更に、表１４及び１７のCt値により評価しても、多段階処理の方が、途中に培地中でのインキュベーションを導入しているため、結果的に生菌の検出限界も向上させ、これにより低濃度の生菌のみの検出を可能とすることが結論付けられる。【０１３７】
以上により、本発明の方法（多段階処理）において、グラム陰性細菌としてエンテロバクター・サカザキ、サルモネラ、更にグラム陽性細菌としてリステリアの80〜500塩基程度の合計5つの短い遺伝子をターゲットとしてPCRを行った場合、いずれのケースにおいても108 cellsの損傷菌（死菌も含む）のPCR最終増幅産物が検出されず、生菌のPCR最終増幅産物が検出されたことから、最大105〜107 cells/mlの各種病原細菌・損傷菌や死菌を含む牛乳においても、生菌を特異的に検出することが可能である。更に、本実施例２に示すようにサカザキに特異的に存在するが必ずしも病原性とは直接には関与していないMMS遺伝子を用いても、多段階処理により短い遺伝子をターゲットにしたPCRにおいて、生菌と損傷菌の識別を可能としており、本願が病原細菌のみをターゲットしたものではなく病原細菌を含め腐敗菌などの一般細菌にも適用可能なことを示唆している。したがって、食品衛生検査のO-157、サルモネラ、リステリア、エンテロバクター・サカザキ、カンピロバクター・ジェジュニ、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌等のグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌の検査として広く適用することが可能と考える。【０１３８】
また、菌血症で肝機能障害を有する患者の場合、血液中に病原細菌の生菌及び抗生物質損傷菌が104 cells/ml以上の高濃度で存在する可能性もあり、そのようなケースにおいても本発明により病原細菌の生菌のみを検出できることが期待される。又、結核患者の抗結核剤による治癒経過観察に適用する場合、主として喀痰が検査材料になるが、結核患者の治療前における結核菌の生菌数は108〜109 cells/gの場合が相当数を占め、それら患者の治療後期には抗結核剤による損傷結核菌が107〜108 cells/gの濃度で存在する。そのような状況下、培養可能な生きた結核菌を定量することが培養法の迅速代替法として期待されるが、本発明によりPCRを結核患者の治療経過診断に応用することが可能となると考える。【０１３９】
［参考例１］食品からの被検試料の調製
本発明の被検試料の１つである食品として、牛乳中に微生物が混入していた場合を想定した被検試料の調製法を以下に例示する。【０１４０】
牛乳に、終濃度が１〜５ｍＭ、特に２ｍＭとなるようにＥＤＴＡ溶液、及び終濃度が０．１〜０．５％、特に０．１％となるようにＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ添加し、１０，０００×ｇにて、１０分間、４℃により冷却遠心分離した。なお、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌのリパーゼ（シグマ社製E.C.3.1.1.3）を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理した後、終濃度が２０Ｕ／ｍｌとなるようにプロテイナーゼＫを（シグマ社製E.C.3.4.21.64）添加して３０分〜１時間放置することが好ましい。液表面の脂肪層及び中間部の水層を除去し、沈渣を回収した。この沈渣には、細菌、乳腺上皮細胞、ウシ白血球等の体細胞が含まれており、１０，０００×ｇ以上で遠心分離した場合は、プロテイナーゼＫにより不完全に分解したミセルタンパク質分解物（カゼインミセル不完全分解物）も含まれる。ここで、カゼインミセル不完全分解物は疎水性の高いα、β−カゼインのサブミセルと考えられる。【０１４１】
前記沈渣に当初と同容量の生理食塩水を添加して懸濁した後、１００×ｇにて、５分間、４℃で冷却遠心分離し、微生物等が存在する上清を回収した。【０１４２】
［参考例２］血液からの被検試料の調製（１）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加え、１０，０００×ｇにて、５分間、４℃で遠心分離し、上清は除去し、沈渣を回収した。この沈渣には、細菌、血小板、単球やリンパ球等の単核球、顆粒球、及び赤血球が含まれていた。【０１４３】
［参考例３］血液からの被検試料の調製（２）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加え、１００×ｇにて、５分、４℃で冷却遠心分離し、血漿と血球成分（単球やリンパ球等の単核球、並びに顆粒球及び赤血球）に分離し、微生物が存在する血漿を回収した。【０１４４】
［参考例４］血液からの被検試料の調製（３）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加えた。滅菌試験管に、まず２倍希釈されたヘパリン加血液と同容量のFicoll-Paque［アマシャムバイオサイエンス社製；Ficoll 400 （フィコール４００）は５．７ｇ／１００ｍｌ、ジアトリゾエートナトリウムは９ｇ／１００ｍｌである。比重１．０７７ｇ／ｍｌ］を充填し、その後、前記の２倍希釈されたヘパリン加血液を、試験管を斜めに傾けながらゆっくりと重層した。続いて、１００×ｇ、５分間、４℃で冷却遠心分離し、微生物が存在する上清を回収した。なお、Ficoll-Paqueに２倍希釈されたヘパリン加血液を重層するする前に、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌのリパーゼ（シグマ社製E.C.3.1.1.3）溶液を添加した後、１０〜５０Ｕ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼI（シグマ社製、EC 3.1.21.1）溶液を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理後、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌとなるようにプロテイナーゼＫ（シグマ社製E.C.3.4.21.64）を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理することが好ましい。【０１４５】
［参考例５］血液からの被検試料の調製（４）
滅菌試験管に、予めヘパリン加血液の１／２容量となるようにMonopolyTM［アマシャムバイオサイエンス社製； Ficoll（フィコール）とMetrizoate（メトリゾエート）の混合液、比重１．１１５ｇ／ｍｌ］添加しておき、試験管を傾けながらゆっくりとヘパリン加血液を重層した。その後、１００×ｇ、５分、４℃で冷却遠心分離し、細菌が存在する上清を回収した。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明により、核酸増幅法による簡易かつ迅速な食品及び生体試料、工業用水や市水等の環境中の生菌・損傷菌・死菌の判別が可能となる。本発明の方法及びキットは、自主検査に応用可能であり、経済性にも優れている。
【図１】
2009022558.tif 000020
【図２】
2009022558.tif 000021
【図３】
2009022558.tif 000022
【図４】
2009022558.tif 000023
【図５】
2009022558.tif 000024
【配列表】
2009022558000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月9日(2009.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料に、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｂ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｃ）光照射処理した被検試料に含まれる架橋剤を除去する工程、
ｄ）架橋剤を除去した被検試料に培地を添加して保温する工程、
ｅ）保温した被検試料に再び３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｆ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｇ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｈ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法をリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被検試料が、食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、工業用水、市水、地下水、河川水又は雨水のいずれかである請求項１〜４のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項６】
前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲット領域が５０〜５０００塩基の領域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が病原性細菌である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット領域が病原遺伝子である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被検試料中の微生物の生菌と死菌又は損傷菌との識別を核酸増幅法により検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤、培地、及び
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【請求項１１】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法である請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択される請求項１０又は１１に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
また本発明は、被検試料中の微生物の生菌と死菌又は損傷菌との識別を核酸増幅法により検出するためのキットであって、下記の要素を含むキットを提供する：
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤、培地、及び
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
前記キットは、前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
４．PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動
前記３−３）のPCR増幅産物を2 %アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動終了後、アガロースゲルを１μg/mlエチジウムブロマイド水溶液に20分間浸漬し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長254 nm）によりompA遺伝
子増幅産物及びMMS遺伝子増幅産物の増幅度合いを観察した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
【表７】
2009022558.tif 000025
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
【表１０】
2009022558.tif 000026
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
enterotoxin遺伝子検出用PCRマスターミックスの各成分を下記に示す。
・Ｇ&ｇサイエンス社ダイレクトバッファーMIX: 21 μl
・(5U/μl) Ex-Taq (宝酒造社製、カタログ番号：RR001B): 0.25 μl
・(10 pmol/μl) enterotoxin-F DNA: 2 μl
・(10 pmol/μl) enterotoxin-R DNA: 2 μl
enterotoxin-F: サルモネラ菌エンテロトキシン遺伝子検出用Primer Set STN-1 (製品コード：S019; TakaraBio)
enterotoxin-R: サルモネラ菌エンテロトキシン遺伝子検出用Primer Set STN-2 (製品コード：S019; TakaraBio)
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
４．PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動
前記３−３）のPCR増幅産物を2 %アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動終了後、アガロースゲルを１μg/mlエチジウムブロマイド水溶液に20分間浸漬し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長254 nm）によりinvA遺伝子増幅産物及びenterotoxin遺伝子増幅産物の増幅度合いを観察した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
【表１４】
2009022558.tif 000027
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【表１７】
2009022558.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月26日(2009.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料に、３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｂ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｃ）光照射処理した被検試料に含まれる架橋剤を除去する工程、
ｄ）架橋剤を除去した被検試料に培地を添加して保温する工程、
ｅ）保温した被検試料に再び３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤を添加する工程、
ｆ）架橋剤を添加した被検試料に３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射処理を行う工程、
ｇ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｈ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、又はＤＮＡマイクロアレイ法である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法をリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被検試料が、食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、工業用水、市水、地下水、河川水又は雨水のいずれかである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤が、エチジウムモノアザイド（ethidium monoazide）、エチジウムジアジド（ethidium diazide）、プソラーレン（psolaren）、４，５'，８−トリメチルプソラーレン（4,5',8-trimethyl psolaren）、及び８−メトキシプソラーレン（8-methoxy psolaren）から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲット領域が５０〜５０００塩基の領域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が病原性細菌である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット領域が病原遺伝子である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射によりＤＮＡを架橋する架橋剤、
培地、及び
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【国際調査報告】
2009022558.tif 000029
2009022558.tif 000030
2009022558.tif 000031
2009022558.tif 000032