【手続補正書】
【提出日】平成15年12月4日(2003.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】抹消カンナビノイド受容体に特異的なアゴニスト
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式で表される化合物：
一般式
【化１】
2004505006.tif 000001
上式中、Ｒ1は-ＣＨ2ＯＨであり、Ｇは−ＯＣＨ3であり、Ｒ3は１，１−ジメチル−ヘプチルである。）で表され、かつ、（３Ｒ，４Ｓ）配置を示し、（３Ｓ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的には含まない化合物。
【請求項２】
下記の一般式で表され、かつ、（３Ｓ，４Ｓ）立体配置をもち、（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的には含まない化合物：
一般式
【化２】
2004505006.tif 000002
上式中、
ＡとＢとの間は単結合または二重結合を表し、
Ｒ1は（ａ）−Ｒ'Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｂ）−Ｑ（ここでＱは、カルボン酸類似体として働くような、活性な水素原子をもつ複素環部分である。）、（ｃ）−Ｒ'Ｘ（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｘはハロゲンである。）、（ｄ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては、末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｅ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）ＯＲ"（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"は、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｆ）−Ｒ'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、あるいは（ｇ）−Ｒ'ＯＲ"'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"'は水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）であり、
Ｇは水素であり、そして
Ｒ3は（ａ）Ｃ1−Ｃ12直鎖もしくは分枝鎖アルキル、（ｂ）−ＯＲ""（ここでＲ""はフェニル基により末端の炭素原子で置換されることができる直鎖もしくは分枝鎖Ｃ2−Ｃ9アルキルである。）、または（ｃ）−（ＣＨ2）nＯＲ"'（ここでｎは１〜７の整数であり、Ｒ"'は水素または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ1−Ｃ5アルキルである。）である。
【請求項３】
Ｒ3が直鎖もしくは分枝鎖Ｃ5−Ｃ12アルキル、１,１−ジメチルーヘプチルまたは１，２−ジメチルーヘプチルである、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
ＱがＮ、Ｓ及びＯのうちの少なくとも１個とＣから成る４〜８員の飽和もしくは不飽和環であり、前記環が、場合によっては、−ＣＯＲ"'もしくは−ＣＯＯＲ"'（ここでＲ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）で置換されていてもよい、請求項２記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1が−ＣＨ2ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）2、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"、−ＣＯＯＨ、アミノ酸もしくはカルボキサミドであり、Ｒ"は請求項２に定義したとおりである、請求項２記載の化合物。
【請求項６】
下記の一般式で表され、かつ、（３Ｓ，４Ｓ）立体配置をもち、（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的には含まない、ＣＢ２特異的アゴニスト：
一般式
【化３】
2004505006.tif 000003
上式中、Ｒ1は−ＣＨ2ＯＨであり、Ｇは−ＯＣＨ3であり、そしてＲ3は１，１−ジメチルーヘプチルである。
【請求項７】
有効成分としての請求項２〜５のいずれかに記載の化合物、および製薬学的に許容される希釈剤、賦形剤もしくは担体を含んでなる神経保護活性剤。
【請求項８】
有効成分として下記の一般式で表され、かつ、（３Ｓ，４Ｓ）立体配置をもち、（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的には含まない化合物、および製薬学的に許容される希釈剤、賦形剤もしくは担体を含んでなるＣＢ２特異的アゴニスト活性剤：
一般式
【化４】
2004505006.tif 000004
上式中、  ＡとＢとの間は単結合または二重結合を表し、
Ｒ1は（ａ）−Ｒ'Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｂ）−Ｑ（ここでＱは、カルボン酸類似体として働くような、活性な水素原子をもつ複素環部分である。）、（ｃ）−Ｒ'Ｘ（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｘはハロゲンである。）、（ｄ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては、末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｅ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）ＯＲ"（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"は、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｆ）−Ｒ'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、あるいは（ｇ）−Ｒ'ＯＲ"'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"'は水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）であり、
Ｇは水素、ハロゲンもしくは−ＯＲ2であり、ここでＲ2は水素、場合によっては、末端の−ＯＲ"'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'、 −Ｃ（Ｏ）ＯＲ"'もしくは−Ｃ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、そして
Ｒ3は（ａ）Ｃ1−Ｃ12直鎖もしくは分枝鎖アルキル、（ｂ）−ＯＲ""（ここでＲ""はフェニル基により末端の炭素原子で置換されることができる直鎖もしくは分枝鎖Ｃ2−Ｃ9アルキルである。）、または（ｃ）−（ＣＨ2）nＯＲ"'（ここでｎは１〜７の整数であり、Ｒ"'は水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）である。
【請求項９】
Ｒ1が−ＣＨ2ＯＨであり、Ｇが水素、ＯＲ2（ここでＲ2は低級アルキル基である。）または−ＯＣＨ3であり、そしてＲ3が直鎖もしくは分枝鎖Ｃ1−Ｃ5アルキルまたは１，１−ジメチルーヘプチルである、請求項８記載のＣＢ２特異的アゴニスト活性剤。
【請求項１０】
Ｒ1が−ＣＨ2ＯＨであり、Ｇが−ＯＣＨ3であり、Ｒ3が１，１−ジメチルーヘプチルであり、そしてＡとＢとの間が二重結合である、請求項９記載のＣＢ２特異的アゴニスト活性剤。
【請求項１１】
有効成分として下記の一般式で表され、かつ、（３Ｓ，４Ｓ）立体配置をもち、（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的には含まない化合物、および製薬学的に許容される希釈剤、賦形剤もしくは担体を含んでなる、高血圧、炎症、末梢痛、胃腸障害、もしくは自己免疫疾患を治療、予防もしくは管理するための製薬学的組成物：
一般式
【化５】
2004505006.tif 000005
上式中、  ＡとＢとの間は単結合または二重結合を表し、
Ｒ1は（ａ）−Ｒ'Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｂ）−Ｑ（ここでＱは、カルボン酸類似体として働くような、活性な水素原子をもつ複素環部分である。）、（ｃ）−Ｒ'Ｘ（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｘはハロゲンである。）、（ｄ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては、末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｅ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）ＯＲ"（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"は、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｆ）−Ｒ'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、あるいは（ｇ）−Ｒ'ＯＲ"'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"'は水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）であり、
Ｇは水素、ハロゲンもしくは−ＯＲ2であり、ここでＲ2は水素、場合によっては、末端の−ＯＲ"'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'、 −Ｃ（Ｏ）ＯＲ"'もしくは−Ｃ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、そして
Ｒ3は（ａ）Ｃ1−Ｃ12直鎖もしくは分枝鎖アルキル、（ｂ）−ＯＲ""（ここでＲ""はフェニル基により末端の炭素原子で置換されることができる直鎖もしくは分枝鎖Ｃ2−Ｃ9アルキルである。）、または（ｃ）−（ＣＨ2）nＯＲ"'（ここでｎは１〜７の整数であり、Ｒ"'は水素または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ1−Ｃ5アルキルである。）である。
【請求項１２】
Ｒ1が−ＣＨ2ＯＨであり、Ｇが水素、ＯＲ2（ここでＲ2は低級アルキル基である。）または−ＯＣＨ3であり、そしてＲ3が直鎖もしくは分枝鎖Ｃ1−Ｃ5アルキルまたは１，１−ジメチルーヘプチルである、請求項１１記載の製薬学的組成物。
【請求項１３】
Ｒ1が−ＣＨ2ＯＨであり、Ｇが−ＯＣＨ3であり、Ｒ3が１，１−ジメチルーヘプチルであり、そしてＡとＢとの間が二重結合である、請求項１２記載の製薬学的組成物。
【請求項１４】
有効成分として下記の一般式で表され、かつ、（３Ｓ，４Ｓ）立体配置をもち、（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的には含まない化合物、および製薬学的に許容される希釈剤、賦形剤もしくは担体を含んでなる、ＣＢ２受容体を発現する腫瘍を治療、予防もしくは管理するための製薬学的組成物：
一般式
【化６】
2004505006.tif 000006
上式中、  ＡとＢとの間は単結合または二重結合を表し、
Ｒ1は（ａ）−Ｒ'Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｂ）−Ｑ（ここでＱは、カルボン酸類似体として働くような、活性な水素原子をもつ複素環部分である。）、（ｃ）−Ｒ'Ｘ（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｘはハロゲンである。）、（ｄ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては、末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｅ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）ＯＲ"（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"は、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、（ｆ）−Ｒ'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）、あるいは（ｇ）−Ｒ'ＯＲ"'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"'は水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである。）であり、
Ｇは水素、ハロゲンもしくは−ＯＲ2であり、ここでＲ2は水素、場合によっては、末端の−ＯＲ"'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'、 −Ｃ（Ｏ）ＯＲ"'もしくは−Ｃ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、そして
Ｒ3は（ａ）Ｃ1−Ｃ12直鎖もしくは分枝鎖アルキル、（ｂ）−ＯＲ""（ここでＲ""はフェニル基により末端の炭素原子で置換されることができる直鎖もしくは分枝鎖Ｃ2−Ｃ9アルキルである。）、または（ｃ）−（ＣＨ2）nＯＲ"'（ここでｎは１〜７の整数であり、Ｒ"'は水素または直鎖もしくは分枝鎖Ｃ1−Ｃ5アルキルである。）である。
【請求項１５】
Ｒ1が−ＣＨ2ＯＨであり、Ｇが水素、ＯＲ2（ここでＲ2は低級アルキル基である。）または−ＯＣＨ3であり、そしてＲ3が直鎖もしくは分枝鎖Ｃ1−Ｃ5アルキルまたは１，１−ジメチルーヘプチルである、請求項１４記載の製薬学的組成物。
【請求項１６】
Ｒ1が−ＣＨ2ＯＨであり、Ｇが−ＯＣＨ3であり、Ｒ3が１，１−ジメチルーヘプチルであり、そしてＡとＢとの間が二重結合である、請求項１５記載の製薬学的組成物。
【請求項１７】
希釈剤が製薬学的に許容される補助溶媒を含んでなる水性補助溶液、天然もしくは合成のイオン性もしくは非イオン性界面活性剤で調製されたミセル溶液もしくはエマルションまたはかような補助溶液とミセル溶液もしくはエマルションとの組み合わせ物である請求項７〜１６のいずれかに記載の製剤または製薬学的組成物。
【請求項１８】
ＣＢ２受容体のモジュレーションに伴う疾患もしくは障害の治療、予防もしくは管理用の医薬の調製のための請求項８〜１０のいずれかに記載の製剤の使用方法。
【請求項１９】
高血圧、炎症、末梢痛、胃腸障害、もしくは自己免疫疾患の治療、予防もしくは管理用の医薬の調製のための請求項１１〜１３のいずれかに記載の製薬学的組成物の使用方法。
【請求項２０】
ＣＢ２受容体を発現する腫瘍の治療、予防もしくは管理用の医薬の調製のための請求項１４〜１６のいずれかに記載の製薬学的組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は末梢カンナビノイド受容体ＣＢ２の特異的アゴニストである非向精神性カンナビノイドに関する。より具体的には、本発明は、高血圧、炎症、疼痛、胃腸障害、自己免疫疾患及び腫瘍の予防、治療及び管理に有用な特異的ＣＢ２アゴニストである４−フェニルピネン誘導体を含んで成る製薬学的組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Mechoulam等は２種のカンナビノイド受容体、すなわち、中枢神経系（ＣＮＳ）及び比較的少量はその他の組織に存在するＣＢ１並びに、末梢終末神経を含む末端器官に、ＣＮＳの外側に存在するＣＢ２が同定されたことを報告した（Mechoulam et al.,Proc. Nat. Acad. Sci.,U.S.,96, 14228-14233）。大麻（cannabis sativa）調製物は数千年にわたり、様々な疾患に対する治療薬として知られてきた。天然の有効成分のデルタ９−テトラヒドロカンナビノール（デルタ−９−ＲＨＣ）は今日、主としてＡＩＤＳ患者に嘔吐の治療及び食欲増進のために一般名Dronabinolとして処方されている。
【０００３】
しかし、カンナビノイド受容体に結合するアゴニストに関して、治療的に望ましくない向精神性効果の臨床的に望ましいものからの分離は報告されていない。ＴＨＣ、並びにカンナビノイド受容体に結合する今日までに同定された２種の主要な内因性の化合物、アナンダミド及び２−アラキドニルグリセロール（２−ＡＧ）は、ＣＢ１及びＣＢ２カンナビノイド受容体双方に結合することによりそれらの大部分の効果をもたらす。ＣＢ１受容体はＣＮＳ中に、そして比較的僅かにその他の組織中に存在する。ＣＢ２受容体はＣＮＳ中には存在しないで、大部分は、マクロファージ及びＢ細胞を含む免疫機能と関連する末梢組織並びに末梢終神経に存在する。主としてＣＮＳにおいてＣＢ１により媒介される効果は完全に研究されたが、ＣＢ２により媒介される効果は十分に規定されていない。
【０００４】
胃腸活動の抑制がデルタ９−ＴＨＣもしくはアナンダミドの投与後に認められた。この効果は、特異的なＣＢ１アンタゴニストのＳＲ  １４１７１６Ａがこの効果をブロックするので、ＣＢ１媒介であると推定された。しかし、もう１つの報告は、腸運動の予防はまたＣＢ２媒介要素をもつことができることを示唆している。
【０００５】
カンナビノイドはそれらの心血管作用について周知である。末梢ＣＢ１受容体の活性化は出血性及びエンドトキシン誘発低血圧をもたらす。マクロファージ及び血小板により生産されるアナンダミド及び２−ＡＧはそれぞれ、この効果を媒介することができる。
【０００６】
出血ラットにおける低血圧はＣＢ１アンタゴニストのＳＲ  １４１７１６Ａにより予防された。最近、同一グループが、アナンダミド誘発腸間膜血管拡張が、ＣＢ１カンナビノイド受容体と異なる、内皮内に位置するＳＲ  １４１７１６Ａ−感受性「アナンダミド受容体」により媒介されること、及び、エンドカンナビノイド、恐らくアナンダミドによるこれらの受容体の活性化がインビボにおけるエンドトキシン誘発腸間膜血管拡張に寄与すること、を発見した。著しく強力な合成カンナビノイドのＨＵ−２１０、並びに２−ＡＧは腸間膜血管拡張作用をもたなかった。更に、アナンダミドによる腸間膜血管拡張は明らかに２要素、１つはＳＲ  １４１７１６−感受性の非−ＣＢ１受容体（内皮上に位置する）により媒介されるもの、及び他方は血管の平滑筋に対するＳＲ  １４１７１６Ａ−抵抗性の直接作用により媒介されるものをもつことが示された。
【０００７】
２−ＡＧの生産は、アセチルコリン受容体アゴニストのカルバコールによる刺激時に、正常時には増加するが、内皮露出ラット大動脈においては増加しない。２−ＡＧはラットの血圧を著しく低下させ、内皮誘発の血圧低下因子を表すかも知れない。
【０００８】
アナンダミドはホルマリン誘発の化学的損傷により誘起される疼痛行動の早期相もしくは後期相を緩和する。この効果は疼痛伝達に関与する感覚ニューロンの末端物上に位置するＣＢ１（もしくはＣＢ１−様）受容体との相互作用により誘起される。アナンダミドのように皮膚内に存在するパルミチルエタノールアミドもまた、疼痛行動の後期相中に末梢抗侵害受容作用を示す。しかし、パルミチルエタノールアミドはＣＢ１にもＣＢ２にも結合しない。その鎮痛作用は、特異的なＣＢ１アンタゴニストのＳＲ  １４１７１６Ａによってではないが、特異的なＣＢ２アンタゴニストのＳＲ  １４４５２８によりブロックされる。従ってＣＢ２−様受容体が仮定された。
【０００９】
米国特許第５，４３４，２９５号明細書は、１群の新規の４−フェニルピネン誘導体を開示し、中枢神経系に対する損傷を伴う様々な病理学的症状を治療するために有用な製薬学的組成物中にいかにこれらの化合物を使用するべきかを教示している。米国特許第４，２８２，２４８号明細書は更なるピネン誘導体を開示している。これらの特許はそれらに開示された化合物のどれも、末梢のカンナビノイド受容体に選択的であることを述べていない。
【００１０】
幾つかの合成カンナビノイドはＣＢ１受容体に対するよりも高い親和性を伴ってＣＢ２受容体に結合することが示された。これらの化合物は大部分、ごく穏やかな選択性を示す。そのフェノール基がメチルエーテルとしてブロックされている、記載化合物のうちの１つの、古典的ＴＨＣ−型カンナビノイドのＬ−７５９，６５６は＞１０００のＣＢ１／ＣＢ２結合比をもつ。これらの既知のアゴニストの薬理学はまだ説明されなければならない。
【００１１】
ある種の腫瘍、特に神経膠腫はＣＢ２受容体を発現する。Guzman及び共同研究者は２種の非選択的カンナビノイドアゴニストのデルタ９−テトラヒドロカンナビノール及びＷＩＮ−５５，２１２−２は、ラット及びマウスの悪性脳腫瘍の後退もしくは根絶を誘起することを示した（Guzman et al., Nature Medicine 6,313-319,(2000)）。ラットの神経膠腫Ｃ６はＣＢ２受容体を発現し、ＣＢ１及びＣＢ２の選択的アンタゴニストによる研究に基づいて、２種の受容体のどちらかの活性化がアポトーシスの引金を引く可能性があると仮定された。
【００１２】
従って、選択的末梢カンナビノイド受容体及び、特に末梢カンナビノイド受容体ＣＢ２の特異的アゴニストについてのニーズが存在する。今や、本発明がそのニーズを満たす。
【００１３】
（発明の要約）
本発明は特異的ＣＢ２アゴニストを提供することにより末梢のカンナビノイド受容体ＣＢ２により媒介される効果をいかに分離するかを教示する。本発明はまた、インビボにおいてそのＣＢ２特異性の効果を与えることができるある種のＣＢ２特異的アゴニストを開示する。従って、本発明はまた、これらの特異的ＣＢ２アゴニストを含む新規の治療製品を調製させることができる。本発明は更に、治療的に有効量のＣＢ２特異的アゴニストを有効成分として含む製薬学的組成物を、それを必要とする動物に投与することにより疾患を予防、治療もしくは管理する方法を提供する。
【００１４】
本発明に従う製薬学的組成物の有効成分は、一般式１、
【００１５】
【化７】
2004505006.tif 000007
【００１６】
［式中、Ａ---Ｂは場合による二重結合を表し（すなわち、ＡとＢとの間には、単結合もしくは二重結合が存在する。）、Ｒ1は様々な有機部分を表し、Ｇは水素、ハロゲンもしくは様々なエーテル基を表し、そしてＲ3は様々なアルキル基、エーテル基、もしくはそれらの組み合わせ物を表す］
の化合物である。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、引用により記述事項の全体が
明白に本明細書に取り込まれている、米国特許第５，４３４，２９５号明細書に開示されるような式１の化合物を使用する。本発明のすべての化合物は（３Ｓ，４Ｓ）立体配置をもち、（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的に含まない。
【００１８】
更に、本明細書に開示されたある化合物は新規で、それら自体で本発明の１態様を構成する。これらの化合物はＧが水素であるものを含む。他の好ましい態様は、Ｇが水素もしくはＯＲ2であり、そこでＲ2が１〜５炭素原子の低級アルキル基である、式１の化合物を含む。
【００１９】
より好ましい態様に従うと、本明細書においてＨＵ−３０８と名付けられた特異的リガンドの合成及び使用がＣＢ−１及びＣＢ−２へのその異なる結合、並びにカンナビノイドにより影響を受けることが知られている幾つかのインビボのアッセイにおけるその作用を伴って開示されている。ＨＵ−３０８は、そこでＲ1がＣＨ2ＯＨであり、Ｇがメトキシであり、そして3が１，１ジメチルヘプチルである一般式１の化合物である。しかし、ＨＵ−３０８は血圧を減少し、排便を妨げ、そして、抗炎症及び末梢鎮痛作用を引き出す。ＨＵ−３０８により誘起される血圧降下、抗炎症、末梢鎮痛作用及び胃腸効果はＣＢ２アンタゴニストのＳＲ  １４４５２８によりブロックされるが、ＣＢ１アンタゴニストのＳＲ  １４１７１６Ａによりブロックされない。
【００２０】
従って、本発明は新規の非向精神性カンナビノイドを提供し、高血圧、炎症、疼痛、胃腸疾患、自己免疫疾患、及び腫瘍の新規の治療を提供する。
【００２１】
本発明の好ましい構成要件は以下の詳細な記述及び図面をレビユーすることによって理解することができる。
【００２２】
（好ましい態様の詳細な記述）
個々の受容体の生化学的及び薬理学的研究が新規の薬剤もしくはリード薬剤の開発に導く可能性があるので、特定の受容体に対して選択的なアゴニストは興味深く、重要である。本発明は一般式１のピネン誘導体の新規な医薬用途を提供する。これらの化合物はＣＢ２特異性アゴニストであることが予期せずに示された。具体的にはその方法は、式１、
【００２３】
【化８】
2004505006.tif 000008
【００２４】
［式中、点線Ａ-----Ｂは場合による結合であり、置換体Ｒ1、Ｇ及びＲ3は下記のように定義される、
Ｒ1は（ａ）−Ｒ'Ｎ（Ｒ"）2（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである）、（ｂ）−Ｑ（ここでＱは、カルボン酸類似体として働くような、活性な水素原子をもつ複素環部分である）、（ｃ）−Ｒ'Ｘ（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｘはハロゲンである），（ｄ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ"） 2（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"はそれぞれ、同一であるかもしくは異なることができ、水素または、場合によっては、末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分を含むＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、そこでＲ"'は水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである）、（ｅ）−Ｒ'Ｃ（Ｏ）ＯＲ"（ここでＲ'は直接結合またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"は、水素または、場合によっては末端の−ＯＲ"'もしくは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素またはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである）、（ｆ）−Ｒ'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである）、あるいは（ｇ）−Ｒ'ＯＲ"'（ここでＲ'はＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルであり、Ｒ"'は水素もしくはＣ1−Ｃ5直鎖もしくは分枝鎖アルキルである）、であり、
Ｇは水素、ハロゲン、もしくはＯＲ2（ここでＲ2は水素または、場合によっては末端−ＯＲ"'、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ"'、Ｃ（Ｏ）ＯＲ"'、もしくは−Ｃ（Ｏ）Ｒ"'部分であって、Ｒ"'が水素もしくはＣ1−Ｃ5アルキルである、部分を含んでいてもよいＣ1−Ｃ5アルキルである）であり、そして
Ｒ3は（ａ）Ｃ1−Ｃ12直鎖もしくは分枝鎖アルキル、（ｂ）−ＯＲ""（ここでＲ""はフェニル基により末端の炭素原子で置換されることができる直鎖もしくは分枝鎖Ｃ2−Ｃ9アルキルである）、または（ｃ）−（ＣＨ2）nＯＲ"'（ここでｎは１〜７の整数であり、Ｒ"'は水素もしくはＣ1−Ｃ5アルキルである）
である］
の化合物をそれらの有効成分として含むＣＢ２アゴニスト作用をもつ適切に調製された製薬学的組成物の使用に関与する。
【００２５】
式２に従う化合物は（３Ｓ，４Ｓ）立体配置をもち、（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを本質的に含まない。
【００２６】
前記のように、前記の式のある化合物、すなわち、Ｇが水素である化合物は新規であり、それ自体、本発明の好ましい態様を構成する。
【００２７】
前記に定義されたとおりの一般式１をもつ新型のＣＢ２特異性アゴニストの合成及び使用を、ここに説明する。本発明の原理は式１の目下好ましい化合物であるＨＵ−３０８により本明細書により例示されており、該化合物は図１に記載のように合成することができる。
【００２８】
図２はＨＵ−３０８がＣＢ２カンナビノイド受容体に結合することを示Mechoulam,R.,Ben-Shabat,S.,Hanus,L.,Ligumsky,M.,Kaminski,N.E.,Schatz,A.R.,Gopher,A.,Almog,S.,Martin,B.R.,Compton,D.R.,Pertwee,R.G.,Griffin,G.,Bayewitch,M.,Barg,J.&Vogel,Z.(1995)Biochem.Pharmacol.50,83-90に記載されるように、ＨＵ−３０８は、ＣＢ２受容体遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクションさせたＣＯＳ−７細胞中の［3Ｈ］ＨＵ−２４３の競合的阻害により測定されたＫｉ＝２２．７±３．９ｎＭを伴って、ＣＢ２カンナビノイド受容体に結合する。しかし、ＨＵ−３０８はＣＢ１には結合しない（Ｋｉ＞１０ｍＭ）。結合のこの相異は薬理学的アッセイの結果に反映される。図３は、雌のＣ５７／ＢＬ６マウスに大量のＨＵ−３０８（４０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射すると、ｉ．ｐ．投与の１０分後（データは示されない）、３０分後（データは示されない）、もしくは１５０分後にテストした時に、開放フィールド試験における彼らの活動減少はなく、脱力発作なし、体温低下なし、そしてホットプレート上で痛覚脱失なし（以後本明細書中では４組のアッセイと呼ぶ）であったことを示している。
【００２９】
ＨＵ−３０８はまた２０ｍｇ／ｋｇの投与量で、マウスに腸運動の完全な抑制を誘起した。図４は雌のSabraマウスにＨＵ−３０８（２０、５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与後２時間にわたり排出された便粒数の効果を示す。腸運動は個別のケージ中にマウスを隔離後に、２時間以内に排出された便粒の蓄積総数により１５分毎（２時間にわたり）に算定した。７５分後に、１００ｍｇ／ｋｇ投与されたマウスは対照より有意に少ないボーラスを排出した。９０分までにすべての治療群が対照と異なった。従って、この胃腸効果は少なくとも一部は末梢ＣＢ２受容体により媒介されることができる。実際、ＣＢ２アンタゴニストのＳＲ１４４５２８の投与はこの効果を一部はブロックした。
【００３０】
ＨＵ−３０８はラットに投与されると、血圧減少させることが発見された。図５はＨＵ−３０８が麻酔挿管ラットの血圧を降下させることを示している。基礎ラインの血圧をＨＵ−３０８投与前に記録した。ＨＵ−３０８を３０ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．投与した（それより下の投与量では有意な効果をもたなかった）。この心血管効果はＣＢ２アンタゴニストのＳＲ  １４４５２８によりブロックされるが、ＣＢ１アンタゴニストのＳＲ１４１７１６Ａによりブロックされない。アンタゴニストのＳＲ１４１７１６Ａ（３ｍｇ／ｋｇ）もしくはＳＲ１４４５２８（１ｍｇ／ｋｇ）はＨＵ−３０８の５分前に注射した。図５の（＊）は対照の基礎
ラインの値と有意に異なる値を意味する（ｐ＜０．０５）。
【００３１】
明らかにＨＵ−３０８により誘起された血圧低下効果はエンドカンナビノイドにより誘起された前記のＣＢ１媒介（もしくは「アナンダミド受容体」−媒介）の血圧降下と異なる機序により誘起される。この予期されなかった観察は、ＨＵ−３０８が前記の４組のアッセイにおける効果の欠乏により確定される、向精神性効果を誘起せず、従って、大部分のカンナビノイドが向精神性効果以外の有意な副作用を誘起しないために、ヒトにおける主要な望ましくない効果を誘起しないにちがいないために、新規の血圧降下剤の開発の出発点として役立つ。
【００３２】
アラキドン酸の投与前３０分及び９０分の間に注射されたＨＵ−３０８及びインドメタシンは、５０及び２０ｍｇ／ｋｇそれぞれの投与量において、アラキドン酸誘起の耳の腫張を有意に減少させた。図６は、片方の耳の内側内面に分散された４．５ｍｇのＡ'Ａ（５ｍｌのＥｔＯＨ中）で治療された雌のSabraマウスの耳のアラキドン酸（Ａ'Ａ）−誘起腫張に対するＨＵ−３０８及びインドメタシンの効果を示す。他方の耳はＥｔＯＨ５ｍｌで治療して、対照とした。耳の腫張は、治療の直前及び、Ａ'Ａ投与後９０分間、１５分毎にダイヤル厚さゲー（Mitutoyo， Japan）で耳の厚さを測定することにより算定した。ビヒクル、ＨＵ−３０８（５０ｍｇ／ｋｇ）もしくはインドメタシン（２０ｍｇ／ｋｇ）をＡ'Ａ投与の６０分前にｉ．ｐ．投与した（Ａ'Ａの３０もしくは９０分前のＨＵ−３０８の注射も同様な効果を誘起した）。曲線「ａ」は時間曲線であり、耳の最大腫張はＡ'Ａ投与の約３０分後に達せられることを示している。曲線「ｂ」はＨＵ−３０８の抗炎症効果に対するＣＢ１及びＣＢ２受容体アンタゴニストの効果を示している。ＣＢ１アンタゴニスト（ＳＲ１４１７１６Ａ、５ｍｇ／ｋｇ）もしくはＣＢ２受容体アンタゴニスト（ＳＲ１４４５２８、１ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射した。次に、ＨＵ−３０８を６０分後に投与（５０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ
．）し、Ａ'ＡをＨＵ−３０８の５０分後に投与した。結果はＡ'Ａ治療の耳とＥｔＯＨ治療の耳の間の差として示されている。各治療群に対してＮ＝５であった。（＊）はビヒクル治療マウスと有意差（ｐ＜０．０５）をもつ値を示し、（＊＊）はビヒクル治療マウスと有意差（ｐ＜０．０１）をもつ値を意味し、そして（＊＊＊）はビヒクル治療マウスと有意差（ｐ＜０．００１）の値を表す。
【００３３】
図６における結果は、インドメタシンにより誘発された抗炎症効果はＨＵ−３０８により誘発されたものより大きかったことを示す。ＨＵ−３０８の１５分前に投与されたＣＢ１アンタゴニストのＳＲ  １４１７１６Ａ（５ｍｇ／ｋｇ）はＨＵ−３０８の抗炎症効果を予防しなかった。ＳＲ  １４１７１６Ａはむしろそれ自体でアラキドン酸誘発の耳の腫張を減少させた。図６はまた、ＣＢ２受容体アンタゴニストのＳＲ  １４４５２８（０．５ｍｇ／ｋｇ）がそれ自体で抗炎症効果を誘発せず、ＨＵ−３０８の抗炎症効果を減少させたことを示している。
【００３４】
ＨＵ−３０８はまた疼痛行動の後期相中の末梢痛を減少させた。図７はホルマリン−誘発末梢痛に対するＳＲ  １４４５２８を伴わないＨＵ−３０８の効果を示している。ビヒクルもしくはＳＲ  １４４５２８をビヒクルもしくはＨＵ−３０８（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）注射の１５分間前に注射した。ＨＵ−３０８注射の９０分後にホルマリンを肢に皮下注射した。疼痛は１時間中に記録された注射された後肢を嘗めた総回数として算定した。初期（５分）及び後期（２５〜６０分）相の疼痛をCalignano,A.,La Rana,G.,Giuffrida,A. & Piomelli,D.(1998) Nature (London)394,277-280に記載のように観察した。ＨＵ−３０８−誘発の効果は後期相にのみ認めた。従って、提示された唯一のデータはホルマリン注射の３０分後に収集されたデータである。結果は、ＨＵ−３０８が疼痛行動の後期相中の末梢痛を減少し、そしてこの効果がＣＢ２アンタゴニストのＳＲ  １４４５２８により予防されたが、ＣＢ１アンタゴニストのＳＲ  １４１７１６Ａにより予防されなかったことを示す。ＨＵ−３０８は明らかに、それがＣＢ２に結合し、ＣＢ１に結合しないので、ＣＢ２受容体を介して作用する。この観察は末梢終末神経に対するＣＢ２受容体のGriffin等による最近の発見と一致している（Griffin,G.,Fernando,S.R.,Ross,R.A.,McKay,,N.G.,Ashford,M.L.J.,Shire,D.,Huffman,J.W.,Yu,S.,Lainton,J.A.H.&Pertwee,R.G.(1997)Eur.J.Pharmacol.339, 53-61）。疼痛伝達に対するＨＵ−３０８の正確な作用機序が何であれ、我々の結果はカンナビノイドが中枢効果をもたない末梢鎮痛剤として役立つことができることを示している。
【００３５】
要約すると、ＨＵ−３０８はＣＢ１に結合せず（Ｋｉ＞１０ｍＭ）、ＣＢ２に有効に結合する（Ｋｉ＝２２．７±３．９ｎＭ）。それはＣＮＳのＴＨＣ−型作用に特異的であることが一緒に示されたマウスの４組の行動試験においては作用を示さない。ＨＵ−３０８は血圧を降下させ、排便を予防し、そして抗炎症及び末梢鎮痛作用をもたらす。ＨＵ−３０８によりもたらされた血圧降下、抗炎症、末梢鎮痛作用、及び胃腸運動の予防はＣＢ２アンタゴニストのＳＲ  １４４５２８によりブロックされるが、ＣＢ１アンタゴニストのＳＲ  １４１７１６Ａによ
ってはブロックされない。
【００３６】
これらの例示的結果は、制約しない方法で解釈することができ、高血圧、炎症、疼痛、及び胃腸障害を治療するために使用することができる新規の非向精神性カンナビノイドの可能性を示している。実際、本発明の組成物は高血圧、炎症末梢痛及び胃腸障害を予防、治療及び管理するのに特別の価値をもつ。本発明の組成物はまた、それらに限定はされないが、多発性硬化症及び関節炎を含む自己免疫疾患の治療、及びＣＢ２受容体を発現する腫瘍、とりわけ、ＣＢ２受容体を発現する神経膠腫の治療に適用をもつ。ＣＢ２選択性アゴニストで脳腫瘍細胞を殺すことは、望ましくない向精神性副作用を誘発せずに腫瘍管理を可能にすることができるであろう。従って、本発明は高血圧、炎症、末梢痛、胃腸障害、自己免疫疾患、及び腫瘍を含む様々な病理学的症状を治療、予防及び管理する方法を提供する。
【００３７】
化合物は生理学的に許容できる調製物を製造するために必要な溶媒、希釈剤、賦形剤、等とともに、通常の製薬学的形態で前記の目的のために投与される。それらは、通常のあらゆる投与経路によって投与することができる。
【００３８】
上記式の化合物が有効成分である製薬学的組成物は様々な形態及び投与量に調製することができる。これらの組成物の調製法は通常の当業者には容易に知られる。従って、化合物は標準的方法に従い、製薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を用いて調製することができる。例えば、製薬学的に許容できる補助溶媒、天然もしくは合成の、イオン性もしくは非イオン性界面活性剤を用いて調製されたミセルもしくはエマルション溶液、またはこれらの補助溶媒及びミセルもしくはエマルション溶液の組み合わせ物を含んで成る補助溶媒水溶液である、希釈剤を選択することができる。本質的にエタノール、界面活性剤及び水、の溶液から成る担体を使用することができるかまたは、本質的にトリグリセリド、レシチン、グリセロール、乳化剤、抗酸化剤、及び水を含んで成るエマルションから成る担体を選択することができる。製薬学的組成物は一般に、医薬品としてそれらを使用する前に、単位投与量の形態に調製されるであろう。ヒトに対する化合物の１日投与量は具体的には、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、そして好ましくは約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。
【００３９】
本発明の製薬学的組成物の最も適した投与は治療される傷害もしくは疾患の種類に応じるであろう。
【００４０】
【実施例】
本発明の原則は、限定しない方法で解釈することができる、以下の実施例において、より完全に理解されるであろう。
（実施例１）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジヒドロキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルビノールピバレート (III）の合成
【００４１】
【化９】
2004505006.tif 000009
【００４２】
ピバル酸４−ヒドロキシミルテニル（１４．７５ｇ、４０ミリモル）及びジメチルヘプチルレソルシノール（９．５２ｇ、４０．３ミリモル）の十分に撹拌した溶液（２００ｍｌの無水ジクロロメタン中）に、無水ｐ−トルエンスルホン酸（１．５ｇ）を一度に添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ分析が出発物質の完全な消失を示した。反応混合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）、次いで飽和ＮａＨＣＯ3水溶液２００ｍＬで希釈した。水層を分離し、ジクロロメタン（２×２００ｍＬ）で抽出し、有機溶液を合わせた。合わせた有機溶液をＮａＨＣＯ3水溶液１５０ｍＬで２回、そして生理食塩水２００ｍＬで２回洗浄した。有機層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、蒸発させると、粗製物質２３．５４ｇを与えた。粗製物質を、溶出剤として３％の酢酸エチル／石油エーテルを使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、純粋物質（III）１１．２ｇを与えた。
（実施例２）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジメトキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルビノールピバレート(IＶ）の合成
【００４３】
【化１０】
2004505006.tif 000010
【００４４】
（III）（１０．８１ｇ、２３ミリモル）及び炭酸カリウム（１２．８４ｇ、９２ミリモル）の十分に撹拌した懸濁液（８０ｍｌの無水ＤＭＦ中）に、ヨウ化メチル（３０ｍＬ、０．４６モル）を一度に添加した。反応混合物を室温で窒素雰囲気下で３日間撹拌した。ＨＰＬＣ分析（８０％アセトニトリル、２０％水）が１７％出発物質、３９％の生成物及び２７％のモノメチル化生成物（IＶ、下記に示す）の存在を示した。
【００４５】
【化１１】
2004505006.tif 000011
【００４６】
反応混合物に更なる量の炭酸カリウム（１２．９３ｇ）及びヨウ化メチル（２０ｍＬ）を添加した。反応は２時間後に停止し、エーテル２５０ｍＬ、次いで水２００ｍＬで希釈した。水層をエーテル（３×２００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水（４×２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、減圧下蒸発させると、粗製物質１１．１５ｇを与えた。粗製物質を、溶出剤として３％のエーテル／石油エーテルを使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、純粋物質（Ｖ）５．２７ｇ及び純粋物質（ＶＩ）１．７ｇを与えた。
（実施例３）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジメトキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルビノール(ＨＵ−３０８）（Ｖ）の合成
【００４７】
【化１２】
2004505006.tif 000012
【００４８】
ＨＵ−３０８の合成のための出発物質、ピバル酸４−ヒドロキシ−ミルテニル（Ｉ）及び５−（１，１−ジメチルヘプチル）−レソルシノール（II）、並びにＨＵ−３０８の合成中間体は公知であり（Mechoulam,R.,Lander,N.,Breuer,A.&Zahalka,I.(1990)Tetrahedron:Asymmetry １，３１５−３１９）、そして前記のように調製した。ＨＵ−３０８の合成は図１に説明されている。図１において、「ａ」は塩化メチレン中の無水ｐ−トルエンスルホン酸であり、「ｂ」は炭酸カリウム、メタノールであり、そして「ｃ」は水素化アルミニウムリチウムである。
【００４９】
化合物ＩＶ（５．０７６ｇ、１０．２ミリモル）の溶液（２５ｍＬの蒸留したての無水テトラヒドロフラン中）を−４０℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム（ＴＨＦ中１Ｎ、１２ｍＬ）を冷却溶液に滴下した。反応混合物を−４０℃で１０分間、次いで室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣ分析が化合物（ＩＶ）の完全な消失を示した。反応混合物を−４０℃に冷却し、酢酸エチル２０ｍＬ、次いで飽和ＭｇＳＯ4水溶液４０ｍＬを添加した。層を分離し、水層を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を生理食塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、溶媒を蒸発除去すると、油を与え、それを凍結乾燥すると、純粋物質（Ｖ）４．２２ｇを与えた。
【００５０】
ＨＵ−３０８は５０℃の融点及び［α］D＝＋１２７℃（ｃ＝２．８７ｍｇ／ｃｃＣＨＣｌ3）を有する。ＨＵ−３０８の構造は1Ｈ  ＮＭＲ，ＧＣ−ＭＳ及び高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）により確証された。ＮＭＲ，３００ＭＨｚ，（ＣＤＣｌ3）：６．４５（２Ｈ，ｓ，芳香族），５．７（１Ｈ，オレフィン），４．１２（２Ｈ，ＣＨ3Ｏ−），４．０１（１Ｈ，ベンジル），３．７（６Ｈ，ＯＣＨ3）。Ｃ27Ｈ42Ｏ3に対する計算ＨＲＭＳは４１４．６２８７、実測値４１４．３１１４。
（実施例４）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−メトキシ−ヒドロキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルビノール(ＶII）の合成
【００５１】
【化１３】
2004505006.tif 000013
【００５２】
化合物ＶＩ（５．０７６ｇ、１０．２ミリモル）の溶液（２５ｍＬの蒸留したての無水テトラヒドロフラン中）を−４０℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム（ＴＨＦ中１Ｎ、１２ｍＬ）を冷却溶液に滴下した。反応混合物を−４０℃で１０分間、次いで室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣ分析が出発物質の完全な消失を示した。反応混合物を−４０℃に冷却し、酢酸エチル２０ｍＬ、次いで飽和ＭｇＳＯ4水溶液４０ｍＬを添加した。層を分離し、水層を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を生理食塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、溶媒を蒸発除去すると、油を与え、それを凍結乾燥すると、純粋物質（ＶII）４．２２ｇを与えた。
（実施例５）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジ（ジ−ｔｅｒブチルメチルシリルオキシ）−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルビノールピバレート(ＶIII）の合成
【００５３】
【化１４】
2004505006.tif 000014
【００５４】
反応は窒素雰囲気下で実施した。化合物III（５．２３ｇ、１１．１ミリモル）及びｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（９．１０８８ｇ、１３３．３ミリモル）の十分な撹拌溶液（６０ｍＬの無水ＴＨＦ中）にイミダゾール（１０．２０ｇ、６６．７６ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で１晩撹拌した。水（１００ｍｌ）の添加により反応を停止し、水溶液をエーテル（３×１５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、水（４×１５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、減圧下蒸発すると、純粋物質（ＶIII）７．８９ｇを与えた。
（実施例６）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジ（ジ−ｔｅｒブチルメチルシリルオキシ）−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルビノール(ＩＸ）の合成
【００５５】
【化１５】
2004505006.tif 000015
【００５６】
化合物ＶII（６．９４ｇ、１０ミリモル）を蒸留したての無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、溶液を−４０℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム（ＴＨＦ中１Ｎ、１２ｍＬ）を冷却溶液に滴下した。冷却浴を外し、反応物を室温で３０分間撹拌させた。ＴＬＣ分析が出発物質の完全な消失を示した。反応混合物を−４０℃に冷却し、酢酸エチル１００ｍＬ、次いで飽和ＭｇＳＯ4水溶液４０ｍＬを添加した。層を分離し、水層を酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を生理食塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、溶媒を蒸発により除去すると油を与え、それを凍結乾燥すると、純粋物質（ＩＸ）４．５４ｇを与えた。
（実施例７）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジ（ジ−ｔｅｒブチルメチルシリルオキシ）−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルボキシアルデヒド(Ｘ）の合成
【００５７】
【化１６】
2004505006.tif 000016
【００５８】
化合物ＩＸ（２．５９ｇ、４．２３ミリモル）の十分な撹拌溶液（３０ｍＬの無水ジクロロメタン中）に、二クロム酸ピリジニウム（３．２２ｇ、８．４６ミリモル）を添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣ分析が出発物質の完全な消失を示した。反応混合物を水（３００ｍＬ）で希釈し、水層をジクロロメタン（３×２００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、水（４×２５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、セライトで濾過し、溶媒を蒸発により除去すると粗製物質２．５ｇを与えた。粗製物質を、３％エーテル／石油エーテルを溶離剤として使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、純粋物質（Ｘ）１．８１ｇを与えた。
（実施例８）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジ（ジ−ｔｅｒブチルメチルシリルオキシ）−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルボン酸(ＸＩ）の合成
【００５９】
【化１７】
2004505006.tif 000017
【００６０】
化合物Ｘ（１３．６ｇ、２２．２８ミリモル）の十分な撹拌溶液（１２０ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ中）に、２−メチル−２−ブテン（６０ｍｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4の飽和水溶液（３０ｍｌ）、及び塩化ナトリウム（１１．１０ｇ、１２２．２ミリモル）を少量ずつ添加した。反応混合物を室温で１晩間撹拌し、水１００ｍＬの添加により反応を停止した。水層を酢酸エチル（３×２５０ｍｌ）で抽出し、有機層を水（３×３００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、減圧下蒸発させた。生成された残留物（１５ｇ）を５％酢酸エチル／石油エーテルから２０％酢酸エチル／石油エーテルまでの勾配を使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、（ＸＩ）１３．４９ｇを与えた（収率９６％）。
（実施例９）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジヒドロキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルボン酸(ＸII）の合成
【００６１】
【化１８】
2004505006.tif 000018
【００６２】
化合物ＸＩ（３．１３ｇ、５ミリモル）の十分な撹拌溶液（５０ｍＬのＴＨＦ中）に、テトラ−ブチルアンモニウムフロリド（５．２４ｇ、２０ミリモル）を一度に添加した。反応混合物を室温で３０分間間撹拌し、エーテル１００ｍＬで希釈し、水（５×１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、減圧下蒸発すると、（ＸII）２．７４ｇを与えた。
（実施例１０）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジアセチルメチルオキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルボン酸 (ＸIII）の合成
【００６３】
【化１９】
2004505006.tif 000019
【００６４】
化合物ＸII（０．１０９ｇ、０．２５ミリモル）及び炭酸カリウム（０．１３８ｇ、１ミリモル）の懸濁液（４ｍＬの無水アセトン中）に、クロロアセトン（６０ミクロリッター、０．７５ミリモル）を添加した。反応混合物を還流下で撹拌し、触媒量のヨウ化カリウムを添加した。３時間後、固体を濾取し、ジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタン溶媒をアセトン濾液と合わせ、合わせた溶媒を蒸発除去した。生成された残留物を７０％アセトニトリル（３０％水、０．１％酢酸）を使用する逆相Ｃ−１８カラムで精製すると、純粋物質（ＸIII）８６ｍｇを与えた（６７％収率）。
（実施例１１）  （＋）−（１−α−Ｈ，４−β−Ｈ，５−α−Ｈ）−４−［２，６−ジ（メチルアセテートオキシ−４−（１，１−ジメチルヘプチル）フェニル］−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−２−エン−２−カルボン酸(ＸIＶ）の合成
【００６５】
【化２０】
2004505006.tif 000020
【００６６】
化合物ＸIII（０．１２ｇ、０．３ミリモル）及び無水炭酸カリウム（０．１８ｇ、１．３ミリモル）の十分な撹拌懸濁液（１０ｍＬの無水アセトン中）に、ブロモ酢酸メチル（９５ミクロリッター、１ミリモル）を添加した。反応混合物を還流下で４時間撹拌し、次いで室温で１晩撹拌した。ＨＰＬＣ分析が２生成物、モノ及びジアルキル化生成物を示した。更なる量のブロモ酢酸メチル（９５ミクロリッター、１ミリモル）を添加し、更に３時間還流を継続した。ＨＰＬＣ分析がジアルキル化生成物に対応する１個のピークを示した。固体を濾取し、ジクロロメタンで洗浄した。ジクロロメタン溶媒をアセトン濾液と合わせ、合わせた溶媒を除去した。生成された残留物を酢酸エチル（１０ｍｌ）に溶解し、有機溶液を水で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、蒸発させると、純粋物質（ＸIＶ）０．１２ｇを与えた（７８％収率）。
（実施例１２）  動物に対するＨＵ−３０８の効果
動物及び薬剤投与
雌のSabraマウス（生後２カ月、Harlan-Sprague Dawley, Jerusalem）を、向精神性効果に対する一連のテスト（「４組」）、腸運動予防（「排便」）測定、そして炎症及び末梢痛に対するアッセイに使用した。血圧は雄のSabraラットで測定した。ＨＵ−３０８、ＳＲ  １４１７１６Ａ及びＳＲ  １４４５２８（後者２種はSanofi Reserche, Franceから贈呈された）をエタノール：エマルフォア（emulphor）:生理食塩水（１：１：１８）（Martin,B.R.,Compton,D.R.,Thomas,B.F.,Prescott,W.R.,Little,P.J.,Ranzdan,R.K.,Johnson,M.R.,Melvin,L.S.,Mechoulam,R & Ward,S.J.(1991)Pharmacol.Biochem.Behavior,40,471-478及びFride,E. & Mechoulam,R.(1993)Eur.J.Pharmacol.231,313-314）のビヒクルに溶解し、マウスには０．１ｍｌ／１０ｇもしくはラットに０．１ｍｌ／１００ｇの容量を注射した。ＨＵ−３０８は行動、抗炎症及び抗侵害受容アッセイにおいて、マウスに腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。血圧をモニターする実験において、それをラットにｉ．ｖ．投与した。
受容体結合アッセイ
ＣＢ１結合アッセイをラットの脳から作製したシナプトソームの膜で実施した（Devane,W.A.,Hanus,L.,Breuer,A.,Pertwee,R.G.,Stevenson,L.A.,Griffin,G., Gibson,D.,Mandelbaum,A.,Etinger,A.,& Mechoulam,R.(1992)Science 258,1946-1949）。ＣＢ２アッセイはトランスフェクション細胞で実施した（Mechoulam,R.,Ben-Shabat,S.,Hanus,L.,Ligumsky,M,Kaminski,N.E.Schatz,A.R.,Gopher,A.,Almog,S.,Martin,B.R.,Compton,D.R.,Pertwee,R.G.,Griffin,G.,Bayewitch,M.,Barg,J.& Vogel,Z.(1995) Biochem.Pharmacol.50,83-90）。遠心分離に基づいたリガンド結合アッセイにおいて、前記のプローブ［3Ｈ］ＨＵ−２４３を使用した（Devane,W.A.,Hanus,L.,Breuer,A.,Pertwee,R.G.,Stevenson,L.A.,Griffin,G., Gibson,D.,Mandelbaum,A.,Etinger,A.,& Mechoulam,R.(1992)Science 258,1946-1949及びDevane,W.A.,Breuer,A.,Sheskin,T.,Jarbe,T.U.C.,Eisen,M.,& Mechoulam,R.(1992)J.Med.Chem.35,2065-2069）。
マウスにおける薬理学的アッセイ
前記（Fride,E.& Mechoulam,R.(1993)Eur.J.Pharmacol.231,313-314）と同様な時間の間隔を使用して、マウスにおける精神活性カンナビノイド誘発効果を評価するために使用された標準法に従い、各マウスにつき、一連の４種の継続的観察を実施する（Martin,B.R.,Compton,D.R.,Thomas,B.F.,Prescott,W.R.,Little, P.J.,Razdan,R.K.,Johnson,M.R.,Melvin,L.S.,Mechoulam,R.& Ward,S.J.,(1991) Pharmacol.Biochem.Behavior,40,471-478）。注射後の様々な時間に４種のアッセイでマウスを連続的にテストした。４種のアッセイは（１）８分間の開放フィールド（２０×３０ｃｍ、１２個の等サイズの正方形に分割されている）中での運動活動（歩行及び後退）（２）４分間の直径５．５ｃｍのリング上での不動性（「脱力発作」）、（３）遠隔温度計（Yellow Springs Instruments Co.）による体温、（４）最長４５秒を伴う最初の後肢の嘗めもしくはプレートからの飛び上がり（後者の反応はめったに見られなかった）までを潜伏時間（秒）として測定された、５５℃に維持されたホットプレート上における鎮覚脱失、であった。この研究の結果はグラフ形式で図３に提供されている。
腸運動性の抑制
腸運動性はＨＵ−３０８（２０、５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ）をマウスに注射し、注射直後に個々のケージ中にマウスを分離し、２時間にわたり１５分毎に便粒数を記録することにより測定した。中枢活性の指標として、直腸温度も記録した。この研究の結果はグラフ形式で図４に提供されている。
マウスにおけるアラキドン酸−誘発の耳の炎症
耳の炎症をアラキドン酸の局所投与後の耳組織の腫張を算定することにより測定した。非ステロイド抗炎症剤はこのモデルの腫張を減少させることが示された（Young,J.M.,Spires,D.A.,Bedord,C.J.,Wagner,B.,Ballaron,S.& De Young,L.M.(1981)J.Invest,Dermatol.82,367-371）。ＨＵ−３０８（５０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射後の様々な時間に、アラキドン酸（５ｍｌエタノール中４．５ｍｇ）を片方の耳の内側面に投与した。他方の耳は対照（５ｍｌのエタノール）として働いた。ダイアル厚さゲージ（Mitutoyo,Japan)を使用して、アラキドン酸投与直後から開始して、耳の厚さを１５分毎に９０分間決定した（０．０１ｍｍ単位で）。この研究の結果はグラフ形式で図６に提供される。
末梢痛
末梢神経系により媒介される疼痛を、皮膚（末梢）痛に対する「ホルマリンテスト」で試験した（Tjolson,A.,Berge,O-G.,Hunskaar,S.,Rosland,J.H.and Hole,K.(1992)Pain,51,5-17、Calignano,A.,La Rana,G.,Giuffrida,A.& Piomelli,D. (1998)Nature(London)394,277-280及び Jagger,S.I.,Hasnie,F.S.,Sellaturay,S and Rice,A.S.C.(1998)Pain 76,189-199）。ＨＵ−３０８（もしくはビヒクル）はｉ．ｐ．注射された。アンタゴニストを伴う実験においては、アンタゴニストはＨＵ−３０８の１５分前にｉ．ｐ．投与した。ホルマリンは、ＨＵ−３０８注射の９０分後にマウスの後肢にｓ．ｃ．注射した。ホルマリン投与の直後に疼痛は、動物がホルマリン注射肢を嘗める回数により１時間中、５分毎に算定した。この研究の結果はグラフ形式で図７に提供される。
血圧のアッセイ
全身血圧を雄ラット（Sabra 種、２７０〜３５０ｇ）でモニターした。持続的カニューレ（Ｐ５０、Clay Adams)をペントバルビタール麻酔（６０ｍｇ／ｋｇ）下で大腿動脈中に移植した。頸静脈を薬剤投与のために挿管した。動脈カニューレを圧力トランスジューサー（Db23, Statham City)につなぎ、トランスジューサーをデータ獲得システム（CODAS software and scroller card, Dataq,Ohio）に接続した。圧力は１／秒の速度で採取した。
【００６７】
記録は治療前の３０〜６０分間採取した。準備的観察は、血圧に対するＨＵ−３０８の効果は投与後の３０分以内に十分正常に復帰したことを示した。従って、ＨＵ−３０８のｉ．ｖ．ボーラス注射後の３０分間に測定を実施した。各ラットに、アンタゴニスト（ＣＢ１受容体をブロックするためのＳＲ  １４１７１６Ａ、ＣＢ２受容体をブロックするためのＳＲ  １４４５２８）を伴って、もしくは伴わずに、ＨＵ−３０８（５〜４０ｍｇ／ｋｇ）の１回量のみを投与した。本研究の結果はグラフ形式で図５に提供される。
統計的分析
時間曲線を２方向分散分析（ＡＮＯＶＡ、時間対用量）により比較した。ビヒクル治療との差異を１方向ＡＮＯＶＡ、次いでpost-hoc Newman-Keulsテスト（Graphpad, San Diegoからのプリズムソフトウェア）により比較した。
（実施例１３）  酢酸誘起した炎症性腸疾患におけるＨＵ−３０８の作用
酢酸誘起した炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を緩和させるＨＵ−３０８の効果を評価した。雄のSorague Dawleyラット（生後１０週、２００〜２５０ｇ）をケタミンロンプン（rompun）組み合わせ物で軽く麻酔した。ポリエチレンカテーテル（外径１．７ｍｍ）を結腸内に直腸５ｃｍを通って挿入し、５％酢酸溶液２ｍＬを結腸中に緩徐に投与した。１５秒後に、生理食塩水３ｍＬ、次いで更に１５秒後に更なる生理食塩水３ｍＬで結腸を洗浄した。その直後に動物をＨＵ−３０８（１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇ）もしくはそのビヒクル（２ｍＬ／ｋｇ）のいずれかで治療した。ＨＵ−３０８もしくはそのビヒクルはＨＵ−３０８もしくはそのビヒクル０．３ｍＬを生理食塩水２．７ｍＬで希釈することにより調製した。ＨＵ−３０８もしくはそのビヒクルをｉ．ｐ．投与し、７日間毎日投与した。動物を１週間臨床的に追跡し、体重、便中の血液の存在、及び便のコンシステンシーを毎日モニターし、記録し、表１に提供した目盛りに従って０〜４の評価を採点した（Murthy et al．，Dig.Dis.Sci.38(9),1722-1734(1993)）。
表１  炎症性腸疾患（ＤＡＩ）1の疾患活性インデックス評価の基準
評価    体重減少率      便コンシステンシー2      潜血もしくは肉眼出血
０        なし            正常                      陰性
１      １〜５            緩い便                    陰性
２      ５〜１０          緩い便                  潜血陽性
３      １０〜１５        下痢                    潜血陽性
４      ０．１５          下痢                    肉眼出血
1  疾患活性インデックス＝（体重減少、便のコンシステンシー及び出血の合わせた評価）／３
2  正常な便＝形態を十分に保った粒、緩い便＝肛門に付着しないペースト状の便、そして下痢＝肛門に付着する液体便、  疾患誘発の７日後に、動物をフェノバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で安楽死させ、結腸全体を切除し、縦に切開し、拡大鏡下で検査した。結腸に対するあらゆる可視的損傷を記録し、評価した。結腸損傷に対する評価目盛りは表２に示される。
【００６８】
表２  炎症性腸疾患の重症度を評価するための肉眼的病理学評価法
評価          病理学                        
０      損傷なし
１      局所的充血及び／もしくは浮腫
２      ２カ所以上の充血及び／もしくは浮腫
３      局所的びらん
４      局所的潰瘍
５      ２カ所以上のびらんもしくは潰瘍、または結腸の長さに沿って、
＞２ｃｍ延伸している１カ所の潰瘍
臨床的結果は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次いでDuncan's post hoc testを使用して分析した。肉眼的病理所見を評価するために、非パラメーターテスト（Wilcox Rank Sum Test)を使用した。
【００６９】
図８は疾患活性インデックス（ＤＡＩ）により示した疾患の進行が３〜４日目に最大になり、ＨＵ−３０８（１０ｍｇ／ｋｇ）が疾患の重症度を軽減し、そのビヒクル及びＨＵ−３０８（２０ｍｇ／ｋｇ）に比較して治癒を増加したことを表し（ｐ＜０．０５）、線「ｂ」はＨＵ−３０８（１０ｍｇ／ｋｇ）対ＨＵ−３０８（２０ｍｇ／ｋｇ）を表し（ｐ＜０．０５）、そして線「ｃ」はＨＵ−３０８（２０ｍｇ／ｋｇ）対ビヒクルを表す（ｐ＜０．０５）。その差は２、３、及び４日目において統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【００７０】
図９は未治療マウス、ビヒクル治療マウス、ＨＵ−３０８の１０ｍｇ／ｋｇ治療マウス、及びＨＵ−３０８の２０ｍｇ／ｋｇ治療マウスに対する肉眼的病理学的評価（表２）の棒グラフである。図９はＨＵ−３０８がそのビヒクルに比較して３５パーセントだけ胃腸管における病理学的病巣の重症度を減少した（１０ｍｇ／ｋｇに対してｐ＜０．０５、２０ｍｇ／ｋｇに対してｐ＝０．０５２）ことを示している。本研究の結果は、７日間毎日、マウスに１０及び２０ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８のｉ．ｐ．投与が酸誘発炎症性腸疾患の重症度を軽減させることができることを示す。
（実施例１４）  自己免疫疾患のモデルにおけるＨＵ−３０８の抗炎症性効果
自己免疫疾患は炎症性サイトカインの上昇したレベルと関連付けられる。自己免疫疾患を研究するための最も好都合なモデルは囓歯類の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）及び実験的自己免疫性関節炎である。ＥＡＥは、塩基性脳炎誘発タンパク質としても知られている、中枢神経系からのミエリンの塩基性タンパク質への動物の免疫により誘導される自己免疫性神経学的疾患である。ＥＡＥはヒトの疾患の多発性硬化症のモデルを表すと考えられる。実験的自己免疫性関節炎はフロイント完全アジュバント中のコラーゲンによる免疫感作により動物に誘発される。自己免疫関節炎及びＥＡＥの臨床症状を予防もしくは緩和するための一般式ＩのＣＢ２特異的化合物の能力が評価される。
自己免疫性関節炎
研究の目的は自己免疫性関節炎の予防におけるＨＵ−３０８の活性を試験することである。実験的自己性免疫関節炎は完全フロイントアジュバント中の２型コラーゲンによる免疫感作により動物に誘発させる。
【００７１】
治療群当たり少なくとも５匹の、成長ＣＤ−１雄マウス（２７〜３３ｇｒ）を研究に使用する。各動物に完全フロイントアジュバント０．１ｍＬ中の１００μｇ／ｍｌの２型コラーゲンを投与する。コラーゲンは尾の付け根に皮下投与される。各後肢の体積を、コラーゲンの投与前及び治療の１、４、７、１０、１３、及び１６日目（薬剤投与の３０分後）に体積測定器（Hugo Basill of Italyから市販）を使用して測定する（薬剤投与の３０分後）。以下の治療群、ビヒクル（１０ｍｌ／ｋｇの標準容量を使用する空の補助溶媒）のみ、３日毎に、２〜１５ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８投与、１日１回、２〜１５ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８の投与、及び正の対照として、３日毎に、１０ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｌ／ｋｇ）のジクロフェナック（diclofenac）、を試験する。すべての治療を腹腔内投与する。ＨＵ−３０８は生理食塩水で希釈することにより１：２５、補助溶媒中５％のストック調製物から使用される。空の補助溶媒で、同様な手順を実施する。ジクロフェナックは１ｍｇ／ｍｌの溶液としてPharmosで調製される。後肢を測定する時に同時に、R.O.Williams,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:89:9784-9788の方法に従ってそれらを臨床的に評価し、そこでは０＝正常、１＝僅かな腫張及び紅斑、２＝著しい紅斑性腫張，そして３＝関節硬化である。治療の１５日目に、動物をペントバルビタール１００ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．で安楽死させる。血液試料を採取して（ヘパリン中）、ヘマトクリットレベル及びＨＵ−３０８の血中レベルを決定する。
【００７２】
実験的自己免疫関節炎に明白な、主要な関節炎関連症状は四肢の腫張である。ＨＵ−３０８治療動物は他の治療群に比較して、四肢の腫張の発生率及び重症度の減少を示す。非パラメーター分析（Wilcoxon Rank Sum Test）を使用して差を比較する。ジクロフェナック治療動物はビヒクル治療ラットに比較して小さい四肢体積を示すが、この差は統計的に有意ではない。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の緩和
疾患誘発に使用された動物の種及び抗原に応じて、自己免疫性脳脊髄炎の誘発のための様々なシステムが、当該技術分野で知られている。ＥＡＥはルイスラットを使用して試験され、そこでは疾患が、疾患の誘発のほぼ１０日後に症状の開始を示し、疾患の誘発のほぼ１８日後に自然の回復を示す。動物（１試験群当たり少なくとも５匹）は、飼料及び水を自由に与えられ、２２℃の恒室温で、１２時間照明／１２時間暗室の管理下で維持される。ＥＡＥは、完全フロイントアジュバント中に乳化された精製モルモットミエリン塩基性タンパク質による免疫感作により動物に誘発する。モルモットのミエリン塩基性タンパク質（ｍｂｐ）はクロロホルム／エタノールで脱脂された脊髄ホモジネートから作製され、単離されたタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製する。各動物は精製タンパク質５０マイクログラムを受ける。ｍｂｐ（０．５ｍｇ／ｍｌ）の溶液をヒト型結核菌４ｍｇ／ｍｌを含む等量の完全フロイントアジュバントで乳化させ、各動物は１００マイクロリッター（各後肢のフットパッドに５０μｌ）を受ける。
【００７３】
動物は２ｍｌの容量を静脈内投与されて、ＨＵ−３０８もしくはビヒクルの対照で処理される。治療時間は各群当たり少なくとも５匹の動物を伴って疾患誘発の１０日後から１８日後まで変動する。結果は次の目盛りに従い、ＨＵ−３０８治療動物において平均臨床評価の減少を示し、１は尾の麻痺を示し、２は片麻痺を示し、３は四肢麻痺を示し、４は完全な身体麻痺を示し、そして５は死亡を示す。
【００７４】
これらの態様は本発明の幾つかのアスペクトの例示として意図されているので、本明細書に記載され、請求された本発明は、本明細書に開示された具体的な態様により範囲を限定されない。あらゆる同様な態様は本発明の範囲内に入ることが意図される。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾物が、前記の説明から当業者に明白になるであろう。これらの修飾物もまた、付記の請求項の範囲内に入ることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＵ−３０８を合成するための反応スキームを表す。
【図２】
ＣＢ２受容体遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞中の［3Ｈ］ＨＵ−２４３の競合的阻害により測定されたＣＢ２カンナビノイド受容体へのＨＵ−３０８の結合を表す。
【図３】
（ａ）歩行、（ｂ）開放フィールド内での後退、（ｃ）運動不能、（ｄ）体温低下、及び（ｅ）ホットプレート上での痛覚脱失、に対するＨＵ−３０８（４０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射の２．５時間後の、試験した雌のＣ５７／ＢＬ６マウスに対するＨＵ−３０８の効果を表す。開放棒はビヒクル治療されたマウスを表し、閉鎖棒はＨＵ−３０８（５０ｍｇ／ｋｇ）治療されたマウスを表す。
【図４】
ビヒクルまたは２０、５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８のｉ．ｐ．注射後の、ＨＵ−３０８投与後２時間以内に排出された便粒数により測定された雌Sabraマウスの腸の運動低下を表す。
【図５】
麻酔ラットにおけるＨＵ−３０８、ＨＵ−３０８とＳＲ１４１７１６（３ｍｇ／ｋｇ）及びＨＵ−３０８とＳＲ１４４５２８（１ｍｇ／ｋｇ）の血圧低下効果を表す。
【図６ａ】
Ａ'Ａ投与後９０分間にわたり、１５分毎のＡ'Ａ治療耳及びＥｔＯＨ治療耳との間の差により測定した、片方の耳の内側面上に分散された４．５ｍｇのＡ'Ａ（５ｍｌのＥｔＯＨ中）で治療した雌Sabraマウスの耳のアラキドン酸（ＡＡ）誘発腫張に対するＨＵ−３０８（５０ｍｇ／ｋｇ）及びインドメタシン（２０ｍｇ／ｋｇ）の効果を表す時間グラフである。
【図６ｂ】
Ａ'Ａ治療耳及びＥｔＯＨ治療耳との間の差により測定した、片方の耳の内側面上に分散された４．５ｍｇのＡ'Ａ（５ｍｌのＥｔＯＨ中）で治療した雌Sabraマウスの耳のアラキドン酸（Ａ'Ａ）誘発腫張に対するＨＵ−３０８の抗炎症効果に対する、ＣＢ１受容体アンタゴニスト（ＳＲ１４１７１６Ａ、５ｍｇ／ｋｇ）及びＣＢ２受容体アンタゴニスト（ＳＳＲ１４４５２８Ａ、１ｍｇ／ｋｇ）の効果を表す棒グラフである。
【図７】
１時間にわたり記録された注射された後肢を嘗める総回数により測定された、後肢中へのホルマリン注射３０分後のマウスのホルマリン誘発末梢痛に対するＨＵ−３０８及びＨＵ−３０８プラスＳＳＲ１４４５２８の効果を表す棒グラフである。
【図８】
１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８またはビヒクルで治療した酸誘発の炎症性腸疾患をもつマウスに対する疾患活性インデックス評価対、治療日数のグラフである。
【図９】
酸誘発の炎症性腸疾患誘発後の、未治療マウス、ビヒクル治療マウス、１０ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８治療マウス及び２０ｍｇ／ｋｇのＨＵ−３０８治療マウスに対する肉眼病理学評価の棒グラフである。