【手続補正書】
【提出日】平成16年3月26日(2004.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2004537565.tif 000001
［ここで、Ｒ１はＨ、ｇｌｃ又はｇｌｃ１−２ｇｌｃであり、Ｒ２は、Ｈ又はＯＨであり、Ｒ３は、Ｈ又はＯＨであり；かつ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３がＨの場合、２０（２１）及び２４（２５）位に二重結合が存在し；Ｒ１がＨ、Ｒ２がＯＨ、かつＲ３がＯＨの場合、２０（２２）及び２５（２６）位に二重結合が存在し；Ｒ１がＨ、Ｒ２がＯＨ、かつＲ３がＨの場合、２０（２２）及び２４（２５）位に二重結合が存在し；Ｒ１がｇｌｃ、Ｒ２がＨ、かつＲ３がＨの場合、２０（２１）及び２４（２５）位に二重結合が存在し；かつＲ１がｇｌｃ１−２ｇｌｃ、Ｒ２がＨ、かつＲ３がＨの場合、２０（２２）及び２４（２５）位に二重結合が存在する］
に従うサポゲニン及び前記サポゲニンを含む製薬的に許容可能な組成物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３がＨであり、かつ２０（２１）及び２４（２５）位に二重結合が存在する請求項１に記載のサポゲニン。
【請求項３】
Ｒ１がＨ、Ｒ２及びＲ３がＯＨであり、かつ２０（２２）及び２５（２６）位に二重結合が存在する請求項１に記載のサポゲニン。
【請求項４】
Ｒ１がＨ、Ｒ２がＯＨ及びＲ３がＨであり、かつ２０（２２）及び２４（２５）位に二重結合が存在する請求項１に記載のサポゲニン。
【請求項５】
Ｒ１がｇｌｃ、Ｒ２及びＲ３がＨであり、かつ２０（２１）及び２４（２５）位に二重結合が存在する請求項１に記載のサポゲニン。
【請求項６】
Ｒ１がｇｌｃ１−２ｇｌｃ、Ｒ２及びＲ３がＨ、かつ２０（２２）及び２４（２５）位に二重結合が存在する請求項１に記載のサポゲニン。
【請求項７】
癌細胞を死滅させる工程、癌細胞にアポトーシスを誘導する工程、癌細胞の増殖を抑制する工程又はそれらの任意の組み合わせからなる、癌細胞を治療するために請求項１のサポゲニンを使用する方法。
【請求項８】
サポゲニンを単独にて使用すること、一つ又はそれ以外のサポゲニンとの組み合わせにて使用すること、他の化学療法剤との組み合わせにて使用すること、又は他のサポゲニン及び他の化学療法剤と組み合わせにて使用することからなる多剤耐性癌細胞（ＭＤＲ）を治療するために請求項１に記載のサポゲニンを使用する方法。
【請求項９】
以下の式：
【化２】
2004537565.tif 000002
に従うサポゲニン。
【請求項１０】
以下の式：
【化３】
2004537565.tif 000003
に従うサポゲニン。
【請求項１１】
以下の式：
【化４】
2004537565.tif 000004
に従うサポゲニン。
【請求項１２】
以下の式：
【化５】
2004537565.tif 000005
に従うサポゲニン。
【請求項１３】
以下の式：
【化６】
2004537565.tif 000006
に従うサポゲニン。
【請求項１４】
癌を治療するためにＰＡＭ−１２０、ＰＢＭ−１００及びＰＢＭ−１１０の一つ以上からなる組成物を使用する方法。
【請求項１５】
癌を治療するためにＰＡＮ−２０及びＰＡＮ−３０の一つ以上からなる組成物を使用する方法。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の組成物において、一つ又はそれ以上の製薬的に許容可能な担体を備えるか又は備えていない製薬的に有効な量の組成物と、一つ又はそれ以上の化学療法剤とからなる組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、一日当たり、体重１ｋｇに対して５マイクログラム乃至５０グラムの用量にて投与される請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、一日当たり、体重１ｋｇに対して５０マイクログラム乃至５グラムの用量にて投与される請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物の剤型は、経口投与可能な剤型、注射可能な剤型、及び局所に適用可能な剤型からなる群より選択される請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記経口投与可能な剤型は、錠剤、散剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ剤、丸剤、液剤、酒精剤、シロップ剤及びリモナーデ剤からなる群より選択される請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記注射可能な剤型は、液剤、懸濁剤及び溶液からなる群より選択される請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記局所に適用可能な剤型は、滴下剤、パスタ剤、軟膏剤、液剤、散剤、プラスター剤、坐剤、エアロゾル剤、リニメント剤、ローション剤、浣腸剤及び乳剤からなる群より選択される請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、一つ又はそれ以上の抗癌治療剤とともに投与される請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、多剤耐性癌又はその他任意の種類の癌に対して、相加又は相乗の治療効果を得るために一つ又はそれ以上のその他の抗癌剤とともに処方化されている請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１に記載のサポゲニンを調製するための方法において、前記方法は、
オタネニンジン、アメリカニンジン及びサンシチニンジンからなる群より選択される植物からのジンセノサイド抽出物又はその他の植物からのサポゲニン源を生成する工程と、それに続く以下の工程：
（ａ）前記ジンセノサイド抽出物を水と混合する工程と、
（ｂ）（ｉ）前記ジンセノサイド抽出物及び水を短鎖（炭素数１乃至５）アルカリ金属アルコラート溶液又は水酸化物−エタノール溶液と混合して混合物を生成し、かつ
（ｉｉ）得られた混合物を反応タンクに入れ、該得られた混合物が必要とされる高温及び高圧下にて化学反応を受ける工程、又は
（ｃ）（ｉ）これに代えて、前記ジンセノサイド抽出物をエタノールと混合し、
（ｉｉ）前記抽出物及びエタノールをアルカリ金属アルコラート溶液と混合して混合物を生成し、かつ
（ｉｉｉ）得られた混合物を反応タンクに入れ、該得られた混合物が必要とされる高温及び高圧下にて化学反応を受ける工程と、
（ｄ）前記反応が完了した後に、前記エタノール混合物からジンセノサイド及びサポゲニンの混合物である中間産物を回収する工程と、
（ｅ）前記中間産物であるサポニン−サポゲニン混合物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより所望のサポゲニンを分離する工程、
とからなる方法。
【請求項２６】
前記アルカリ金属はカリウム又はナトリウムである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記水酸化物は水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルカリ金属アルコレート溶液、又は水酸化物−エタノール溶液の濃度は５乃至５０（Ｗ／Ｖ）％である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記エタノールは、１乃至５個の炭素原子を有する請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記反応タンクの温度は１５０乃至３００℃の範囲であり、かつ反応圧は２．５乃至８．４ＭＰａの範囲である請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載のサポゲニンを調製するための方法において、前記方法は、
オタネニンジン、アメリカニンジン及びサンシチニンジンからなる群より選択される植物からのジンセノサイド抽出物を生成する工程と、それに続く以下の工程：
（ａ）前記ジンセノサイド抽出物を水と混合する工程と；
（ｂ）（ｉ）前記ジンセノサイド抽出物及び水を短鎖（炭素数１乃至５）アルカリ金属アルコラート溶液又は水酸化物−エタノール溶液と混合して混合物を生成する工程；及び
（ｃ）得られた混合物を反応タンクに入れ、該得られた混合物が必要とされる高温及び高圧下にて化学反応を受ける工程と；又は
（ｄ）前記反応が完了した後に、前記エタノール混合物からジンセノサイド及びサポゲニンの混合物である中間産物を回収する工程と；
（ｅ）前記中間産物であるサポニン−サポゲニン混合物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより所望のサポゲニンを分離する工程；
とからなる方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のサポゲニンを調製するための方法において、前記方法は、
オタネニンジン、アメリカニンジン及びサンシチニンジンからなる群より選択される植物からのジンセノサイド抽出物を生成する工程と、それに続く以下の工程：
（ａ）前記ジンセノサイド抽出物を水と混合する工程と；
（ｂ）これに代えて、前記ジンセノサイド抽出物をエタノールと混合する工程と、
（ｃ）前記抽出物及びエタノールをアルカリ金属アルコラート溶液と混合して混合物を生成する工程、及び
（ｄ）得られた混合物を反応タンクに入れ、該得られた混合物が必要とされる高温及び高圧下にて化学反応を受ける工程と；
（ｅ）前記反応が完了した後に、前記エタノール混合物からジンセノサイド及びサポゲニンの混合物である中間産物を回収する工程と；
（ｆ）前記中間産物であるサポニン−サポゲニン混合物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより所望のサポゲニンを分離する工程；
とからなる方法。
【請求項３３】
請求項１乃至６又は９乃至１３のいずれか一項に記載のサポゲニンを含む食品。
【請求項３４】
請求項１乃至６又は９乃至１３のいずれか一項に記載のサポゲニンを含む健康食品。
【請求項３５】
請求項１乃至６又は９乃至１３のいずれか一項に記載のサポゲニンを含む栄養製品。
【請求項３６】
請求項１乃至６又は９乃至１３のいずれか一項に記載のサポゲニンを含む自然製品。
【請求項３７】
請求項１乃至６又は９乃至１３のいずれか一項に記載のサポゲニンを含む代替医薬品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
該方法は、一つ又はそれ以上の製薬的に許容可能な担体を備えているか、又は備えていないＰＡＭ−１２０、ＰＢＭ−１００、ＰＢＭ−１１０、ＰＡＮ−２０及びＰＡＮ−３０の製薬的に有効な量を含み得る。活性成分は、体重１ｋｇ当たり、一日５μｇ乃至５０ｇの投与量にて投与され得る。好ましい範囲は、体重１ｋｇ当たり、一日５０μｇ乃至５ｇである。組成物の剤型は、経口投与可能な剤型、注射可能な剤型及び局所に適用可能な剤型からなる群より選択され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明はまた、本発明に従うサポゲニンを食品、健康食品、栄養製品、自然製品及び代替医薬品（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）に組み込むことを含む。
本発明はまた、サポゲニンを調製するための方法に関し、該方法はオタネニンジン、アメリカニンジン及びサンシチニンジンからなる群より選択される植物からジンセノサイド抽出物を生成する工程と、以下の工程、即ち、（ａ）該ジンセノサイド抽出物を水と混合すること；（ｂ）（ｉ）ジンセノサイド抽出物及び水を短鎖（炭素数が１−５）アルカリ金属アルコラート溶液又は水酸化物−エタノール溶液と混合して混合物を生成し、かつ（ｉｉ）得られた混合物を反応タンクに入れ、該混合物が必要とされる高温及び高圧下にて化学反応を受けること；又は（ｃ）（ｉ）これに代えて、ジンセノサイド抽出物をエタノールと混合し；（ｉｉ）該抽出物及びエタノールをアルカリ金属アルコラート溶液と混合して混合物を生成し、かつ（ｉｉｉ）得られた混合物を反応タンクに入れ、該混合物が必要とされる高温及び高圧下にて化学反応を受けること；（ｄ）反応が完了した後にジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ）とサポゲニンの混合物である中間産物をエタノール混合物から回収すること、及び（ｅ）サポニン−サポゲニン中間混合物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより所望のサポゲニンを分離することに従い進められることからなる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
アルカリ金属はカリウム又はナトリウムであり得る。水酸化物は水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムであり得る。アルカリ金属アルコラート溶液又は水酸化物−エタノール溶液の濃度は５乃至５０（Ｗ／Ｖ）％であり得る。アルコールは１乃至５の炭素原子を有する。反応タンクの温度は、１５０乃至３００℃の間であり得、反応圧力は２．５乃至８．４ＭＰａの間であり得る。好ましくは、温度は２４０乃至３００℃の間であり、圧力は３．５乃至８．４ＭＰａの間である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明は、以下に示す新規な化合物の物理的に得られた群に関する：
ダンマラ（Ｄａｍｍａｒａ）−２０（２１）−ジエン−３，１２−ジオール（ＰＡＭ−１２０と称される）；
ダンマラ−２０（２２Ｅ）−ジエン−３，１２，２４−トリオール（ＰＢＭ−１００と称される）；
ダンマラ−２０（２２Ｅ）−ジエン−３，１６，１２−トリオール（ＰＢＭ−１１０と称される）；
３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−ダンマラ−２０（２１）−ジエン−３，１２−ジオール（ＰＡＮ−２０と称される）；及び
３−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→２）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−ダンマラ−２０（２２Ｅ）−ジエン−３，１２−ジオール（ＰＡＮ−３０と称される）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
調製方法の実施例：
実施例１：ＰＡＭ−１２０、ＰＢＭ−１００及びＰＡＮ−２０を製造するための調製方法
［１］ニンジンの粗抽出物１０ｇを４０ｍＬの９５％エタノール溶液に溶解する。
［２］５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を４０ｍＬ加える。
［３］反応タンク中に注入し、１．５時間の間、２４０℃の温度と３．５Ｍｐａの圧力に設定する。
［４］温度を室温まで下げて、該製品をタンクから取り出す。
［５］ＨＣｌを加えてｐＨを約７に中和し、水を用いて体積を８００ｍＬまでにする。
［６］各回１００ｍＬの酢酸エステルで、３回抽出する。
［７］全ての抽出物を合わせて、減圧して乾燥させる。それにより、３．８ｇの乾燥した抽出物が得られる。
［８］該抽出物を粉砕し、２０ｍＬのメタノールに溶解し、該メタノール溶液にシリカゲルを混合する。
［９］該混合物を乾燥し、微粉末に粉砕する。
［１０］シリカゲルカラムに装填する。
［１１］エーテル：石油ベンジン（１：３）の混液６０ｍＬにてカラムを洗浄することにより、２５０ｍｇのＰＡＭ−１２０と４５ｍｇのＰＢＭ−１００が得られた。
［１２］カラムをクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）：メタノール（９５：５）混液９０ｍＬにて洗浄することにより、５０ｍｇのＰＡＮ−２０が得られた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
実施例３：ジンセノサイド２０（Ｓ）−Ｒｈ２と新規なダンマランサポゲニンＰＡＭ−１２０、ＰＢＭ−１００、ＰＡＮ−３０及びそれらの組成物におけるインビトロでの癌細胞抑制効果の比較
Ａ.方法
組成物：２０（Ｓ）−Ｒｈ２は、中華人民共和国に所在のシェンヤン・ペガサス・ファーマシューティカルＲ＆Ｄ社（Ｓｈｅｎｙａｎｇ  Ｐｅｇａｓｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｏ．）から純度が９８％以上のものが供給された。Ｒｈ２の分子量は６２２．３であった。サポゲニンＰＡＭ−１２０、ＰＢＭ−１００及びＰＡＮ−３０は実施例１に記載された方法により得られた。ＰＡＭ−１２０、ＰＢＭ−１００及びＰＡＮ−３０の分子量はそれぞれ、４４２．７、４７４．７及び７６６．６であり、これら３つの成分の各々の純度は９９％を超えていた。Ｒｈ２、ＰＡＭ−１２０、ＰＢＭ−１００及びＰＡＮ−３０はいずれもその１グラムが、１００ｍＬの無水エタノールに個々に溶解され、４℃にて保存された。該化合物は、表１に示されるように、ＰＲＭＩ−１６４０媒体を用いて所望の濃度に希釈された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
図２は、薬剤耐性ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７ｒに対する種々のジンセノサイドの腫瘍抑制効果のグラフを示す。薬剤耐性ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７ｒ）は９６ウェルのディッシュ中にてＤＭＥＭ及び５％血清補助剤で培養した。次いで、細胞を種々の濃度のＰＡＮ−２０、ＰＡＮ−３０、ＰＢＭ−１００、ＰＭＢ−１１０、ＰＡＭ−１２０及びＲｈ２にてそれぞれ処理した。処理後２４時間の生存細胞の数をＭＴＴ法を用いて測定し、対照サンプルと比較した。新たな化合物の全てがＲｈ２よりも顕著に高い腫瘍抑制効果を示し、特に低濃度にて示した（ｐ＜０．０１，スチューデントｔ検定）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004537565.tif 000007
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2004537565.tif 000008
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2004537565.tif 000009