(57)【要約】  酸素によってセンサが劣化することなく、特異的、かつ、高感度に亜酸化窒素の濃度を測定できる酵素センサを提供すること。本発明は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの亜酸化窒素還元酵素を有する酵素電極を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素を有する酵素電極。
【請求項２】
前記亜酸化窒素還元酵素は、亜酸化窒素を還元する活性を有し、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約８８±２．０ｋＤａである、請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
作用極として、請求項１又は２記載の酵素電極を備える酵素センサ。
【請求項４】
絶縁性基板と、
前記絶縁性基板上に形成された、作用極及び対極を含む電極系と、
前記電極系の上層又は近傍に形成された反応層を備える、酵素センサであって、
前記作用極として、請求項１又は２記載の酵素電極を備え、
前記電極系に流れる電流値に基づいて亜酸化窒素の濃度を測定する、酵素センサ。
【請求項５】
電子メディエータをさらに含む、請求項３又は４記載の酵素センサ。
【請求項６】
電子メディエータがベンジルビオロゲン又は１−メトキシフェナジンメトサルフェートである、請求項５記載の酵素センサ。
【請求項７】
請求項３〜６いずれか一項記載の酵素センサを含む、亜酸化窒素測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極及び酵素センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）は、一酸化窒素（ＮＯ）や二酸化窒素（ＮＯ２）と同様に窒素酸化物の一種であるが、麻酔作用を有するため、吸入麻酔剤として医療現場で使用され、人体に対してはほとんど無害の気体である。【０００３】
しかしながら、亜酸化窒素は、二酸化炭素の約３００倍の温室効果があり、京都議定書においては排出規制の対象となっている。このため、地球温暖化防止の観点から、大気中の亜酸化窒素の濃度を測定し、工場等から排出される亜酸化窒素の量を監視していくことが急務である。【０００４】
亜酸化窒素の濃度は、ガスクロマトグラフで測定するのが一般的であり、他に簡易な方法がないのが現状である。しかしながら、最近になって、デンマークの研究グループが、亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサを開発し、亜酸化窒素の濃度を測定できることを報告している（非特許文献１）。このセンサは、金電極を用いて、−１Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの還元電位で亜酸化窒素を計測するものである。【０００５】
また、窒素酸化物を検出するためのバイオセンサとしては、硝酸を還元して亜酸化窒素を発生する微生物を電極に固定化した硝酸微生物センサや（非特許文献２）、硝酸還元酵素を還元型の電子メディエータとともに電極に固定した酵素センサ（非特許文献３）が報告され、いずれも硝酸還元反応を電気化学的に検出することによって硝酸の濃度を測定している。【０００６】
【非特許文献１】Ｎｉｅｌｓら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８８年、５４巻、ｐ．２２４５−２２４９
【非特許文献２】Ｌａｒｓｅｎら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９６年、６２巻、ｐ．１２４８−１２５１
【非特許文献３】Ｆｅｒｒｅｙｒａら、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、６４巻、１号、ｐ．６１−７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記の非特許文献１に記載された亜酸化窒素を電気化学的に検出するセンサは、電極反応に選択性がなく、測定時に酸素が存在すると酸素に対しても同時に反応してしまうという問題点を有していた。また、これまでに亜酸化窒素のバイオセンサに関する報告はなかったため、亜酸化窒素の濃度を正確に測定するには、測定試料をサンプリングし、ガスクロマトグラフが設置してある測定室まで測定試料を持ち帰る必要があった。【０００８】
さらに、現在までに報告されているバイオセンサは、人工電子メディエータが無ければ目的とする感度が得られないという問題点を有していたため、人工電子メディエータを用いなくとも高い感度を得ることができる直接電子移動型の酵素センサの開発が求められていた。【０００９】
そこで本発明の目的は、酸素によってセンサが劣化することなく、特異的、かつ、高感度に亜酸化窒素の濃度を測定できる電子メディエータ型の酵素センサを提供することにある。また、亜酸化窒素の濃度を測定できる直接電子移動型の酵素センサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素を有する酵素電極を提供する。【００１１】
Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、酸素感受性が非常に低く、空気中に放置しても酵素活性が消失しないため、上記酵素電極は、酸素が存在している状況下でも、亜酸化窒素に対して安定でかつ高感度な応答を得ることができる。【００１２】
上記Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓから単離された亜酸化窒素還元酵素は、亜酸化窒素を還元する活性を有し、ＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した分子量が約８８±２．０ｋＤａであることが好ましい。上記Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓから単離された亜酸化窒素還元酵素は、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列有していてもよく、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において数個のアミノ酸配列が欠質、置換又は付加されたアミノ酸配列有していてもよい。【００１３】
上記Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素を有する酵素電極は、人工電子メディエータを用いることなく、亜酸化窒素に反応して直接的に電子の移動を行うことができる。すなわち、上記電極は、直接電子移動型の酵素電極となり、電極反応の高い選択性を実現できる。また、人工電子メディエータを用いることにより、より高感度な亜酸化窒素の測定が可能となる。【００１４】
また本発明は、作用極として上記酵素電極を備える酵素センサを提供する。【００１５】
これまでに、亜酸化窒素還元酵素を用いた酵素センサの報告はないが、作用極として上記酵素電極を備える酵素センサは、人工電子メディエータを用いない直接電子移動型の酵素センサとなり、野外においてもリアルタイムで亜酸化窒素の濃度を測定できる。【００１６】
上記酵素センサは、絶縁性基板と、絶縁性基板上に形成された、対極及び上記酵素電極を含む電極系と、電極系の上層又は近傍に形成された反応層を備える、酵素センサであって、作用極として上記酵素電極を備え、電極系に流れる電流値に基づいて亜酸化窒素の濃度を測定する酵素センサであることが好ましい。【００１７】
酵素センサが上記のような簡単な構造及び構成となることにより、酵素センサ自体の作製が容易となり、安定性かつ耐久性を備えた小型の酵素センサを構築できる。【００１８】
上記酵素センサは、電子メディエータをさらに含むことが好ましい。電子メディエータは、ベンジルビオロゲン、メチルビオロゲン、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）、フェロセン誘導体、オスミウム誘導体等であることが好ましく、ベンジルビオロゲン又は１−メトキシフェナジンメトサルフェートであることがより好ましい。この構成により、より高感度な亜酸化窒素の測定が可能となる。【００１９】
なお、上記酵素センサは、電極反応の高い選択性を実現し、酸素が存在しても安定した応答性を保った状態で亜酸化窒素の濃度を測定できるため、アッセイに必要な緩衝液、亜酸化窒素の標準溶液及び測定マニュアル等をセットにした亜酸化窒素測定キットとしても利用できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の酵素電極を用いれば、電子メディエータ型の酵素センサに加え、直接電子移動型の酵素センサを構築でき、野外においてもリアルタイムで亜酸化窒素の濃度の測定が可能な、安定性と耐久性とを備えた小型の酵素センサの構築を実現できる。【００２１】
また本発明の酵素電極及び酵素センサによれば、人工電子メディエータを用いなくても亜酸化窒素に対して高感度な応答を得ることができ、酸素が存在している状況下でも電極反応の高い選択性を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施形態の酵素センサ１０の各構成要素の形成パターンを示す平面図。
【図２】図１の各図に示す各構成要素の積層順序を示す分解斜視図。
【図３】図１及び２の各図に示す各構成要素が形成されてなる酵素センサ１０を示す平面図。
【図４】水溶性画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図５】陽イオン交換カラムに吸着した成分の溶出プロファイルを示すクロマトグラム。図中、ＵＶは溶出溶液の２８０ｎｍ吸光度、Ｃｏｎｃは溶出溶媒中のＢ液の割合（％、計算値）、ＣｏｎｄはＢ液の電気伝導度を１００％としたときの相対電気伝導度（％）、数字１〜３７は各溶出画分の番号をそれぞれ示す。
【図６】溶出画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図７】亜酸化窒素還元酵素を固定化した電子メディエータ型ＧＣ電極を用いたＮ２Ｏガス存在下におけるサイクリックボルタンメトリーの測定結果を示すグラフ。
【図８】亜酸化窒素還元酵素を固定化した直接電子移動型ＧＣ電極を用いたＮ２Ｏガス存在下におけるサイクリックボルタンメトリーの測定結果を示すグラフ。
【図９】亜酸化窒素還元酵素を固定化した直接電子移動型ＧＣ電極を用いた電流測定の結果を示すグラフ。
【図１０】亜酸化窒素還元酵素を固定化した電子メディエータ型ＧＣ電極を用いた電流測定の結果を示すグラフ。
【図１１】電子メディエータ型酵素電極を用いた電流測定の結果を示すグラフ。反応セルの気層部分をＡｒガスで充填した時の、Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値のタイムコース（Ａ）、及び、キャリブレーションカーブ（Ｂ）。
【図１２】電子メディエータ型酵素電極を用いた電流測定の結果を示すグラフ。反応セルの気層部分を空気で充填した時の、Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値のタイムコース（Ａ）、及び、キャリブレーションカーブ（Ｂ）。
【図１３】直接電子移動型酵素電極を用いた電流測定の結果を示すグラフ。反応セルの気層部分をＡｒガスで充填した時の、Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値のキャリブレーションカーブ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２４】
（酵素電極）
本発明の酵素電極は、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素を有することを特徴としている。【００２５】
「酵素電極」とは、酵素触媒機能を備えた電極であって、その電気化学特性が酵素反応の特性に大きく依存する電極のことをいう。すなわち、酵素電極で得られる電流は、そこで起こる酵素反応の速度で規定され、酵素の基質に対して特有の濃度依存性を示すこととなる。【００２６】
上記の酵素電極は、Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの亜酸化窒素還元酵素を電極上に固定化することにより製造できる。【００２７】
酵素電極に用いる電極材料としては、例えば、カーボン、金、白金を用いることができるが、カーボンがより好ましい。【００２８】
具体的には、上記の酵素電極は、Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの亜酸化窒素還元酵素をカーボン（カーボンペースト）などの電極材料と混合して電極に装着すればよいが、以下の一般的な酵素固定化方法を用いて電極上に装着してもよい。【００２９】
酵素固定化方法としては、例えば、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被膜する方法、光架橋ポリマーや酸化還元ポリマーを用いて固定する方法が例示でき、これらを組み合わせて用いてもよい。より詳細には、グルタルアルデヒドを用いて上記の亜酸化窒素還元酵素をカーボン電極上に固定化し、その後、アミン基を有する試薬で処理することにより、グルタルアルデヒドをブロッキングする方法が挙げられる。【００３０】
Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓは、ルーメン細菌の一種であり、複数の公的機関から入手可能である。例えば、ドイツのＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）や米国のＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から容易に入手できる。【００３１】
上記の亜酸化窒素還元酵素は、Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓが産生する亜酸化窒素還元酵素であればよいが、亜酸化窒素を還元する活性を有し、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約８８±２．０ｋＤａであることが好ましい。例えば、Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭＺ１７４０株が保有する配列番号１記載のアミノ酸配列を有する亜酸化窒素還元酵素を例示できる。【００３２】
上記の酵素電極に用いられる亜酸化窒素還元酵素は、Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを培養し、増殖したＷ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ菌体又は培養中から、酵素活性を指標に精製できる。【００３３】
具体的には、液体培地にＷ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを植菌し、培養中は常に亜酸化窒素を通気しながら、嫌気的条件下、３７℃で培養すればよい。Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養に用いる液体培地としては、例えば、酵母抽出物、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸銅、チオグリコール酸を含み、ｐＨを中性付近に調整した培地が挙げられる。また、上記液体培地に、ニュートリエント培地成分、トリプチカーゼペプトン、ビタミンＫ１、ヘミンなどを加えた栄養培地にＷ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを植菌し、嫌気的条件下、３７℃で培養してもよい。【００３４】
亜酸化窒素還元酵素の精製は、培養したＷ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの菌体から、当業者であれば公知である常法のタンパク質の精製方法に従って行うことができる。例えば、培養したＷ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの菌体をフレンチプレス又は超音波破砕器などで破砕し、遠心分離して得られた上清（亜酸化窒素還元酵素を含む粗酵素溶液）を、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの精製手段で分画することにより、単一酵素として精製できる。【００３５】
こうして調製されたＷ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素は、同酵素の亜酸化窒素還元活性に基づき、電子供与体として還元型人工電子メディエータを用いて同酵素の基質である亜酸化窒素を還元させ、還元型人工電子メディエータの減少あるいは酸化型電子メディエータの増加量を指標として亜酸化窒素の濃度を計測することを可能にするものである。また、Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの亜酸化窒素還元酵素は、同酵素亜酸化窒素還元活性に基づき、電子供与体として電極から供給される電子を用いて同酵素の基質である亜酸化窒素を還元させ、電極に流れる還元電流を指標として亜酸化窒素の濃度を計測することも可能にするものである。【００３６】
（酵素センサ）
以下に、本発明の酵素センサについて詳細に説明する。【００３７】
本発明の酵素センサの第一の態様は、亜酸化窒素の濃度を測定するための酵素センサであって、作用極として上記の酵素電極を備えることを特徴としている。【００３８】
「酵素センサ」とは、酵素の基質認識能と触媒能とを利用して、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系のことをいう。通常は、作用極、対極及び参照極の３電極を備えているが、作用極と対極とから構成される２電極系であってもよい。また、酵素センサは、緩衝液及び被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を備えており、バッチ型であってもフロー型であってもよい。このような酵素センサの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｐ．Ｆ．Ｔｕｎｅｒ，Ｉｓａｏ  Ｋａｒｕｂｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒｏｇｅ  Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ、  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年）に記載されている。【００３９】
第一の態様における酵素センサは、作用極に上記の酵素電極を用いることを特徴としているが、例えば、対極には白金電極を、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる構成を例示できる。【００４０】
被検試料中に含まれる亜酸化窒素の濃度の測定については、例えば、恒温セルに緩衝液を入れ、作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルに被検試料を加えて電流の増加を測定することになる。標準濃度の亜酸化窒素を含有する溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中の亜酸化窒素の濃度を計算できる。【００４１】
本発明の酵素センサの第二の態様は、絶縁性基板と、絶縁性基板上に形成された作用極及び対極を含む電極系と、電極系の上層又は近傍に形成された反応層とを備える、酵素センサであって、作用極として上記の酵素電極を備え、上記電極系に流れる電流値に基づいて亜酸化窒素の濃度を測定することを特徴としている。【００４２】
図１は、本実施形態の酵素センサ１０の各構成要素の形成パターンを示す平面図である。なお、図１の各図においては、各図により説明するための構成要素に加えて、絶縁性基板２０の外形を示す仮想線が図示されている。図１（ａ）は、絶縁体基板２０上でのリード部３０及びコネクタ部３２の形成パターンを示す平面図である。図１（ｂ）は、電極系４０を構成する参照極４２の形成パターンを示す平面図である。図１（ｃ）は、電極系４０を形成する作用極４４及び対極４６の形成パターンを示す平面図である。図１（ｄ）は、絶縁層５０の形成パターンを示す平面図である。図１（ｅ）は、スペーサー６０及び反応層７０の形成パターンを示す平面図である。【００４３】
図２は、図１の各図に示す各構成要素の積層順序を示す分解斜視図である。図３は、図１及び２の各図に示す各構成要素が形成されてなる酵素センサ１０を示す平面図である。図２及び３に示すように、酵素センサ１０においては、絶縁性基板２０上に、一体化されたリード部３０及びコネクタ部３２、電極系４０、絶縁層５０、スペーサー６０及び反応層７０が、絶縁層基板２０の側からこの順に積層されている。なお、酵素センサ１０は、カバーによりさらに覆われた状態で使用及び保存される場合があるが、図１〜３においては、そのようなカバーは省略されている。【００４４】
酵素センサ１０は、被検試料（例えば、試料溶液）中の亜酸化窒素を測定するための装置である。以下、酵素センサ１０を構成する各部材について詳細に説明する。【００４５】
酵素センサ１０は、その基体として絶縁性基板２０を備える。絶縁性基板２０は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）やポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙等の従来公知の絶縁性材料により構成される。絶縁性基板２０の形状やサイズについては、特に制限はない。【００４６】
絶縁性基板２０上には、図２及び３に示すように、リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）及びコネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）が形成されている。コネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）は、後述する電極系４０と酵素センサ１０外部とを電気的に接続するための手段として機能し、リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）を介して電極系４０と電気的に接続されている。【００４７】
リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）は、図１〜３に示すように、コネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）から、電極系４０の位置まで延長されており、電極系４０の各電極（４２、４４、４６）の下地層を構成する。リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）及びコネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）を構成する材料は、例えば、銀、金、白金、パラジウム、カーボンなどにより構成される。リード部及びコネクタ部の形成方法は特に制限されず、スクリーン印刷法やスパッタリング法などの従来公知の手法により形成される。【００４８】
絶縁性基板２０上に形成されたリード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）及びコネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）、並びに電極系４０の上層には、図１〜３に示すように、電極系４０が露出するように、絶縁層５０が形成されている。絶縁層５０の存在により、電極系４０を構成する各電極間の短絡が防止される。絶縁層５０を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス等により構成される。絶縁層５０の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン法や接着法等の従来公知の手法により形成される。【００４９】
電極系４０及び絶縁層５０の上層には、図１〜３に示すように、スペーサー６０及び反応層７０が形成されている。酵素センサ１０の使用時には、反応層７０において、後述する酵素反応が進行する。また、スペーサー６０を設けることで、酵素センサ１０の使用時における被検試料の漏出が防止される。図示する形態において、スペーサー６０は、電極系４０に対応する部位に矩形の開口部を有しており、この開口部に反応層７０が設けられている。但し、スペーサー６０の有する開口部の形状は矩形のみに制限されず、任意の形状が用いられる。スペーサー６０を構成する材料は特に制限されないが、例えば、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙等により構成される。スペーサー６０及び反応層７０の形成方法は特に制限されず、例えば、所定の部位に開口部を有するスペーサー６０を載置し、この開口部に反応層７０を形成するための溶液を滴下して、乾燥させるという手法が用いられる。なお、反応層７０は１層のみからなる層であってもよいし、２層以上からなる層であってもよい。【００５０】
また、図示する形態において、反応層７０は電極系４０の上層に形成されているが、場合によっては、図示する形態とは異なり、電極系４０の近傍に反応層７０を形成し、電極系４０と反応層７０との直接接触しない形態としてもよい。なお、反応層７０が電極系４０の「近傍」に形成される形態としては、電極系４０と反応層７０との間に空間やフィルタが介在する形態や、試料供給口と電極系４０との間に反応層７０が形成される形態などが例示される。【００５１】
作用極４４は、上記の亜酸化窒素還元酵素を有する酵素電極である。作用極４４における上記の亜酸化窒素還元酵素は、酵素センサ１０の使用時において、被検試料中の亜酸化窒素を還元する機能を有する。作用極４４における亜酸化窒素還元酵素の含有量は特に制限はなく、測定を希望する成分の種類や被検試料の添加量等に応じて適宜調節すればよい。【００５２】
第三の態様における酵素センサは、電子メディエータをさらに含むことを特徴としている。電子メディエータは、反応層７０に含まれていてもよく、また、酵素電極に含まれていてもよい。電子メディエータは、酵素センサ１０の使用時において、酸化還元酵素反応と電極との間の電子の遣り取りを仲介する。作用極４４における亜酸化窒素還元酵素の含有量は特に制限はなく、測定を希望する成分の種類や被検試料の添加量等に応じて適宜調節すればよい。電子メディエータとしては、ベンジルビオロゲン、メチルビオロゲン。フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）、フェロセン誘導体、オスミウム誘導体等を用いることができる。【００５３】
次に、本発明の酵素センサ１０の動作について説明する。【００５４】
まず、亜酸化窒素の濃度を測定する被検試料の所定量を、酵素センサ１０に供給する。被検試料の具体的な形態は特に制限されず、亜酸化窒素を含む溶液が適宜用いられる。【００５５】
被検試料を酵素電極に供給する形態は特に制限されないが、試料溶液の場合は、所定量を酵素電極表面に対して直接滴下することにより供給してもよい。【００５６】
酵素電極に被検試料が供給されると、酵素電極に含まれる亜酸化窒素還元酵素の作用によって亜酸化窒素は還元される。この時、亜酸化窒素還元酵素内の還元型チトクロムＣから亜酸化窒素の還元に必用な電子が供給され、これに伴ってチトクロムＣは還元型から酸化型へと変化する。その後、電極に一定の電位を印加し、酸化型チトクロムＣを還元する。この時に流れる還元電流によって電圧印加前の酸化型チトクロムＣの量が算出され、さらに、亜酸化窒素還元酵素によって還元された亜酸化窒素の量が定量されることとなる。【００５７】
電流値の測定及び当該電流値から亜酸化窒素濃度への換算の手法としては、所定の電圧を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点では、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられる。【００５８】
以上、酸化型のチトクロムＣを還元する際の電流（還元電流）を測定することにより亜酸化窒素の濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、酸化されずに残存している還元型のチトクロムＣを酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより亜酸化窒素の濃度を算出する形態が採用されてもよい。【００５９】
（亜酸化窒素測定キット）
本発明の亜酸化窒素測定キットは、上記の酵素センサを含むことを特徴としている。【００６０】
上記の亜酸化窒素測定キットは、亜酸化窒素の濃度の測定に必要な上記の酵素センサに加えて、緩衝液、亜酸化窒素の標準溶液及び測定マニュアル等をセットにしたものが挙げられ、亜酸化窒素の濃度の測定に必要なその他の試薬や器具等を含むものであってもよい。【００６１】
また、亜酸化窒素測定キットとしては、Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素と、人工電子メディエータとを含むキットであってもよい。この場合、同酵素の亜酸化窒素還元活性に基づき、電子供与体として還元型人工電子メディエータを用いて同酵素の基質である亜酸化窒素を還元させ、還元型人工電子メディエータの減少あるいは酸化型電子メディエータの増加量を指標として亜酸化窒素の濃度を計測する原理に基づいて亜酸化窒素を計測することが例示できる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６３】
（実施例１）  亜酸化窒素還元酵素（Ｎｏｓ）の生産・精製
（１−１）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養
Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの培養には、以下の組成からなる培地を用いた。なお、この培地を嫌気条件下で保存及び使用した。
０．８％  ニュートリエント培地
０．５％  酵母抽出物
３％  トリプチカーゼペプトン
１０ｍＭ  コハク酸二ナトリウム
０．５％  リン酸水素二カリウム
０．０３５％  Ｌ−システイン
０．０００１％  レサズリン
０．０５％  チオグリコール酸ナトリウム
１μＭ  硫酸銅（ＩＩ）
０．０００５％  ヘミン
０．０００１％  ビタミンＫ１
１００ｍＭ  ギ酸ナトリウム
１００ｍＭ  硝酸カリウム【００６４】
Ｗ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２９５４３株を、上記培地２０ｍｌが入った密封バイアルに植菌し、嫌気条件下、３７℃で２５時間前培養した。増殖がＯＤ６６０＝０．４０程度のところで、この前培養液を０．８ｍｌずつ、嫌気条件下の栄養培地８０ｍｌが入った密封バイアル２５本に植菌し、３７℃で２６時間培養した。増殖がＯＤ６６０＝０．３以上において好気的に集菌し、菌体を洗浄した。２Ｌの培養液からＷ．  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ湿菌体２．１ｇが得られた。【００６５】
（１−２）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素の精製
得られた湿菌体２．１ｇを５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）７ｍｌで懸濁し、超音波破機を用いて破砕した。菌体破砕液を４℃、１００００×ｇ、３０分間の遠心分離を２回行い、さらに４℃、４００００×ｇで６０分間、超遠心分離して上清を回収した。この上清を５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で一晩透析し、得られた透析溶液を水溶性画分とした。【００６６】
水溶性画分を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、８８ｋＤａ付近にＮｏｓと考えられるバンドが観察された（図４）。そこで次に、陽イオン交換クロマトグラフィーによりＮｏｓの精製を試みた。【００６７】
陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、１ｍＬ）を５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した後、水溶性画分をカラムに吸着させ、５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）でカラム未吸着成分を洗浄除去した。次に、以下の条件で、カラム容量の２０倍量で溶出溶媒がＡ液１００％からＢ液１００％となるようなリニアグラジエントをかけてカラム吸着成分を溶出させ、０．５ｍLずつ分取し、溶出画分とした。
Ａ液：５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．４Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
移動相の流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２８０ｎｍ【００６８】
陽イオン交換カラムに吸着した成分の溶出プロファイルを示すクロマトグラムを図５に示す。およそ２５％の０．４Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を流したところで、２８０ｎｍの吸光度の大きなピークが得られた（溶出画分２４及び２５）。これらの画分を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ったところ、８８ｋＤａ付近にＮｏｓと考えられるメインバンドが観察された（図６）。【００６９】
（１−３）活性測定
水溶性画分及び溶出画分について、以下の方法により亜酸化窒素還元活性を測定した。密封しＡｒガスで置換した分光光度計用セルに、１０ｍＭ  ベンジルビオロゲン１５μｌ、５ｍＭ  亜ジチオン酸ナトリウム１５μｌ、標準酵素溶液又は各画分３０μｌ、５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、及び、飽和Ｎ２Ｏ溶液（２５ｍＭ）２００μｌをガスタイトシリンジを用いてこの順に添加し、６００nmにおけるベンジルビオロゲンの吸光度変化（△ＡＢＳ６００  ｎｍ／ｍｉｎ）を測定した。ブランクとして、１０ｍＭ  ベンジルビオロゲン１５μｌの代わりに等量の５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を添加した試料を用い、この試料により得られた吸光度変化をベースラインとした。【００７０】
活性測定の結果を表１に示す。水溶性画分の比活性は０．３３Ｕ／mｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、溶出画分２４及び２５を合わせた画分（粗精製画分）の比活性は４．９Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。以上より、溶出画分２４及び２５においてメインバンドとして検出される約８８ｋＤａのタンパク質が亜酸化窒素還元酵素であることが分かった。また、この亜酸化窒素還元酵素は酸素存在下においても安定であることが分かった。【００７１】
【表１】
2009031652.tif 000002
【００７２】
（実施例２）Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来の亜酸化窒素還元酵素を固定化した電極の作製
陽イオン交換クロマトグラフィーにより得られた溶出画分２５（１ｍＬ）を限外ろ過により濃縮し、亜酸化窒素還元酵素溶液を調製した。ライオンペーストＷ−３１１Ｎ（ライオン株式会社）：５％  ナフィオン（デュポン株式会社）：５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）：４６ｍＵ／μｌ亜酸化窒素還元酵素溶液を１：１：２：６の体積比で混合したものをライオンペースト酵素インクとした。研磨したグラッシーカーボン（ＧＣ）電極（φ３ｍｍ）にライオンペーストインク５μｌを滴下し、４℃で２時間乾燥させた。この電極を２５％  グルタルアルデヒド溶液の蒸気を用いて３０分間架橋処理した後、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に２０分間、さらに１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に３０分間浸漬した。得られた酵素電極を以下の実施例３及び４にて用いた。【００７３】
また、ライオンペーストＷ−３１１Ｎ（ライオン株式会社）：５％  ナフィオン（デュポン株式会社）：５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）：１８ｍＵ／μｌ亜酸化窒素還元酵素溶液を１：１：４：４の体積比で混合したものをライオンペースト酵素インクとして用いた以外は上記と同様の手順で酵素電極を作製し、以下の実施例５〜７にて使用した。【００７４】
（実施例３）サイクリックボルタンメトリーによるＮ２Ｏの電気化学的測定
（３−１）電子メディエータ型酵素電極
実施例２で作製した酵素電極を作用極、Ｐｔ電極を対極、Ａｇ／ＡｇＣｌを参照極とした３電極方式の電極反応系を密閉可能な反応セル内に構築し、掃引速度３０ｍＶ／ｓｅｃでサイクリックボルタンメトリーを行った。反応溶液として、電子メディエータである１−メトキシＰＭＳ（以下、ｍＰＭＳ）を最終濃度２ｍＭで含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌを用いた。また、予め反応溶液をＡｒガス又はＮ２Ｏガスでバブリングし、反応溶液中に溶解しているガス及び反応セル内の気相をＡｒガス又はＮ２Ｏガスで置換した。サイクリックボルタンメトリーの測定結果を図７に示す。【００７５】
（３−２）直接電子移動型酵素電極
また、電子メディエータを含まない１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌを反応溶液とし、掃引速度５０ｍＶ／ｓｅｃとした以外は、実施例３−１と同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。測定結果を図８に示す。【００７６】
反応溶液に電子メディエータを含まない場合（図８）、Ｎ２Ｏの有無によるボルタモグラムの変化は見られなかった。一方、反応溶液に電子メディエータであるｍＰＭＳを含む場合（図７）、Ａｒ存在下と比較してＮ２Ｏ存在下で還元電流の増加が見られた。【００７７】
（実施例４）一定電位におけるＮ２Ｏの電気化学的測定
次に、この電極反応系に−６００ｍＶ  ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌを印加し、反応溶液１０ｍｌにＡｒガス及びＮ２Ｏガスを交互にバブリングした時に得られる応答電流値を測定した（攪拌速度１５０ｒｐｍ）。測定はすべて室温で行った。反応溶液として、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び２ｍＭ  ｍＰＭＳ／１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合の測定結果を、それぞれ図９及び１０に示す。【００７８】
Ｎ２Ｏガスをバブリングすることにより、電子メディエータを含む場合（図９）には数十μA、電子メディエータを含まない場合（図１０）でも数μAの還元電流が得られた。これらのことから、Ｎｏｓ固定電極を用いることにより、Ｎｏｓ−電極間の直接電子移動が可能であることが明らかとなった。また、電子メディエータ型、直接電子移動型のいずれにおいても、Ｎ２Ｏ計測が可能であることが示された。【００７９】
（実施例５）亜酸化窒素還元酵素（Ｎｏｓ）を固定した電子メディエータ型酵素電極でのＮ２Ｏ定量の検討
（５−１）Ａｒ存在下の電子メディエータ型酵素電極
実施例３で作製した酵素電極を作用極、Ｐｔ電極を対極、Ａｇ／ＡｇＣｌを参照極とした３電極方式で、２ｍＭ  ｍＰＭＳ／１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を反応溶液とし、−６００ｍＶ  ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌを印加した時の、２５ｍＭ  Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値を測定した（図１１）。反応セルの気層部分をＡｒガスで充填し、室温で測定を行った。反応溶液を１５０ｒｐｍで撹拌しながら、所定量の２５ｍＭ  Ｎ２Ｏ溶液を逐次添加することによって反応溶液中のＮ２Ｏ濃度を変化させた。２５ｍＭ  Ｎ２Ｏ溶液は、２ｍＭ  ｍＰＭＳ／１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）が入ったバイアルを密封し、このバイアルの気層部分にＮ２Ｏガスを１ａｔｍとなるように充填することにより調製した。【００８０】
（５−２）空気存在下の電子メディエータ型酵素電極
反応セルの気層部分を空気で充填した以外は、実施例５−１と同様の手順で測定を行った（図１２）。【００８１】
反応セルの気層部分をＡｒガスで充填した時の、Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値のタイムコースを図１１Ａに、キャリブレーションカーブを図１１Ｂに示す。応答時間はおよそ２分であり、Ｎ２Ｏ濃度が２５ｍＭまでほぼ直線的な還元電流の増加が見られた。一方、反応セルの気層部分を空気で充填した時の、Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値のタイムコースを図１２Ａに、キャリブレーションカーブを図１２Ｂに示す。応答時間は、気層部分をＡｒガスで充填した場合と同様におよそ２分であったが、Ｎ２Ｏ濃度が３ｍＭ程度で還元電流が飽和した。また、気層部分にＡｒガスを充填した場合の初期電流値（Ｎ２Ｏ  ０ｍＭ）は−１．３μＡ、空気を充填した場合は−３．０μＡであった。これは、気層部分が空気で充填されている場合、ｍＰＭＳが空気酸化され、気層部分がＡｒガスで充填されている場合と比べ、酸化型のｍＰＭＳ濃度が高くなっているためと考えられる。【００８２】
実施例５の結果より、亜酸化窒素還元酵素（Ｎｏｓ）を固定した電子メディエータ型酵素電極を用いることにより、Ａｒガス存在下（酸素非存在下）においてＮ２Ｏ濃度２５ｍＭまでの溶液のＮ２Ｏ濃度を定量できることがわかった。また、空気存在下（酸素存在下）においても、Ｎ２Ｏ濃度３ｍＭまでの溶液のＮ２Ｏ濃度を定量できることがわかった。【００８３】
また、実施例５−２の測定終了後、反応溶液を新しい２ｍＭ  ｍＰＭＳ／１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置換して実施例４と同様の手法で応答電流値を測定したところ、実施例４と同様の応答電流値が得られた。このことから、亜酸化窒素還元酵素を固定した酵素電極が、空気存在下での電極反応後においても劣化せず、安定であることが確認できた。【００８４】
（実施例６）応答電流値の印加電位依存性
実施例５において作製した電極反応系に、−６００ｍＶ、−４００ｍＶ、−２００ｍＶ、又は、−１００ｍＶ  ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌを印加した条件において、反応溶液（２ｍＭ  ｍＰＭＳ／１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））にＮ２Ｏガス又はＡｒガスをバブリングして得られる応答電流値をそれぞれ測定し、応答電流値の印加電位依存性を検討した。【００８５】
Ｎ２Ｏガスをバブリングした時に得られる応答電流値からＡｒガスをバブリングしたときに得られる応答電流値を差し引いた値は、印加電位を−６００ｍＶ、−４００ｍＶ、−２００ｍＶ、又は、−１００ｍＶ  ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌとしたときそれぞれ、−３．１μＡ、−２．４μＡ、−２．７μＡ、−０．９９μＡであった。したがって、印加電位を−２００ｍＶ  ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌまで高くしても、−６００ｍＶ  ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌを印加したときとほぼ同等な応答電流値が得られることがわかった。【００８６】
（実施例７）亜酸化窒素還元酵素（Ｎｏｓ）を固定した直接電子移動型酵素電極でのＮ２Ｏ定量の検討
反応溶液として、電子メディエータを含まない１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は、実施例５−１と同様の手順で、２５ｍＭ  Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値を測定した。
反応セルの気層部分をＡｒガスで充填した時の、Ｎ２Ｏ溶液添加に伴う応答電流値のキャリブレーションカーブを図１３に示す。応答時間はおよそ３分であり、４ｍＭまでのＮ２Ｏ濃度の範囲において、Ｎ２Ｏ濃度依存的な還元電流の増加が見られた。【００８７】
実施例７の結果より、亜酸化窒素還元酵素（Ｎｏｓ）を固定した直接電子移動型酵素電極を用いた場合においても、Ａｒガス存在下においてＮ２Ｏ濃度４ｍＭまでの溶液のＮ２Ｏ濃度を定量できることがわかった。【００８８】
以上の結果より、作用極に亜酸化窒素還元酵素を備える酵素センサによって、亜酸化窒素の検出ができることが確認された。
【図１】
2009031652.tif 000003
【図２】
2009031652.tif 000004
【図３】
2009031652.tif 000005
【図５】
2009031652.tif 000006
【図７】
2009031652.tif 000007
【図８】
2009031652.tif 000008
【図９】
2009031652.tif 000009
【図１０】
2009031652.tif 000010
【図１１】
2009031652.tif 000011
【図１２】
2009031652.tif 000012
【図１３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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