【手続補正書】
【提出日】平成17年1月24日(2005.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  抗脈管形成因子としてのＴＷＥＡＫレセプターアゴニスト
【特許請求の範囲】
【請求項１】  脈管形成を調節する方法であって、治療有効量のＴＷＥＡＫレセプターアゴニストを被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】  前記ＴＷＥＡＫレセプターがＦｎ１４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記ＴＷＥＡＫレセプターアゴニストがＦｎ１４アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  前記Ｆｎ１４アゴニストが抗Ｆｎ１４抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】  前記抗Ｆｎ１４抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】  前記Ｆｎ１４アゴニストが、治療有効量の少なくとも１つの内皮細胞モジュレーターの存在下で投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】  脈管形成を調節する方法であって、治療有効量の少なくとも２つのＦｎ１４アゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】  前記Ｆｎ１４アゴニストの少なくとも１つが抗Ｆｎ１４抗体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】  前記抗Ｆｎ１４抗体がモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  前記Ｆｎ１４アゴニストが、少なくとも２つの抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体を含み、該抗体が、Ｆｎ１４の重複しないエピトープに対するものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】  脈管形成を調節する方法であって、治療有効量のＦｎ１４−Ｆｃ融合タンパク質を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】  脈管形成を阻害する方法であって、治療有効量のＴＷＥＡＫレセプターアゴニストを被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】  前記ＴＷＥＡＫレセプターがＦｎ１４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】  前記ＴＷＥＡＫレセプターアゴニストがＦｎ１４アゴニストである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】  前記Ｆｎ１４アゴニストが抗Ｆｎ１４抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】  前記抗Ｆｎ１４抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】  前記Ｆｎ１４アゴニストが、治療有効量の少なくとも１つの内皮細胞モジュレーターの存在下で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】  脈管形成を阻害する方法であって、治療有効量の少なくとも２つのＦｎ１４アゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】  前記Ｆｎ１４アゴニストの少なくとも１つが抗Ｆｎ１４抗体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】  前記抗Ｆｎ１４抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】  前記Ｆｎ１４アゴニストが、少なくとも２つの抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体を含み、該抗体が、Ｆｎ１４の重複しないエピトープに対するものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】  腫瘍進行を阻害する方法であって、治療有効量のＴＷＥＡＫレセプターアゴニストを被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２３】  前記ＴＷＥＡＫレセプターがＦｎ１４である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】  前記ＴＷＥＡＫレセプターアゴニストがＦｎ１４アゴニストである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】  前記Ｆｎ１４アゴニストが抗Ｆｎ１４抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】  前記抗Ｆｎ１４抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】  前記Ｆｎ１４アゴニストが、治療有効量の少なくとも１つの内皮細胞モジュレーターの存在下で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】  腫瘍進行を阻害する方法であって、治療有効量のＦｎ１４−Ｆｃ融合タンパク質を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】  ＴＷＥＡＫレセプターに対するアゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３０】  前記アゴニストが抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体である、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
脈管形成は、種々の正常な事象および病理学的事象（例えば、女性の生殖周期、胎児の発達、創傷治癒、炎症および腫瘍進行）の間の組織再構築の必須の要素である（Ｈａｎ，Ｚ．Ｃ．およびＹ．Ｌｉｕ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ、７０（２）：６８（１９９９）；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１（１）：２７（１９９５））。微小血管の成長は、内皮細胞の同調的な移動、増殖、分化および毛細血管構造への形態発生的組織化に関与する。新生血管のさらなる安定化および成熟は、その血管壁への隣接する間葉細胞の動員を介して生じる（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｆ．Ａ．、Ｔｒａｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．、２２（７）：２５１（１９９７））。発生中の血管および休止中の血管の維持は、適切な生存シグナルの利用能に依存する。これらの脈管形成事象は、細胞外因子（いくつかのクラスのサイトカイン、細胞外マトリクスおよびインテグリンを含む）のネットワークによって、そしてそれらの同族のレセプターによって、調整される。
【０００２】
多くの公知の脈管形成調節因子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属する。このファミリーのリガンドは、ＩＩ型膜タンパク質として発現され、これは、タンパク質分解的に切断され、可溶性のサイトカインを生成し得る（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、７６：９５９（１９９４））。これらのリガンドは、ＴＮＦレセプターファミリーにおけるそれらの対応するレセプターを介して結合しそしてシグナル伝達することによって、生物学的活性を誘発する。ＴＮＦファミリーメンバーの大半は、宿主防御、炎症および免疫学的調節を媒介する（Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｐ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０：４１１（１９９２）；Ｄｅ  Ｔｏｇｎｉ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４（５１５９）：７０３（１９９４）；Ｎａｇａｔａ，Ｓ．およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｐ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７：１４４９（１９９５）；Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．ら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４：５９１（１９９６）；Ｍａｃｋａｙ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９０（１１）１６９７（１９９９））。さらに、これらのリガンドのいくつか（ＴＮＦ−β、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、血管内皮増殖インヒビター（ＶＥＧＩ）またはＴＬＩを含む）、およびＴＷＥＡＫは、ＥＣ機能を調節することが示されている（Ｆｒａｔｅｒ−Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：５２７７（１９８７）；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１７（７）：４０１５（１９９７）；Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、４（４）：４０８（１９９８）；Ｆａｊａｒｄｏ，Ｌ．Ｆ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１４０（３）：５３９（１９９２）；Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ，Ｓ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２９（６１４０）：６３０（１９８７）；Ｂｉａｎｃｏｎｅ，Ｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１８６（１）：１４７（１９９７）；Ｙｕｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７４：１４７９（１９９９）；Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ、１３（１）：１８１（１９９９））。ＥＣの挙動に対するＴＮＦ−αの効果は、複雑である。ＴＮＦ−αは、インビトロでＥＣ増殖を阻害するが、毛細管形成を誘導する（Ｆｒａｔｅｒ−Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：５２７７（１９８７）；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１７（７）：４０１５（１９９７））。これはまた、固形腫瘍の環境下で抗脈管形成性であり得るか（Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．Ａ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ、４（４）：４０８（１９９８））、またはインビボでの角膜設定下で脈管形成性である（Ｆｒａｔｅｒ−Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：５２７７（１９８７）；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１７（７）：４０１５（１９９７）；Ｆａｊａｒｄｏ，Ｌ．Ｆ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１４０（３）：５３９（１９９２）；Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ，Ｓ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２９（６１４０）：６３０（１９８７））。Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用は、インビボで内皮毛細管形成を誘導し得、これはおそらく、ヘパリン結合増殖因子の産生を誘発することによる（Ｂｉａｎｃｏｎｅ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１８６（１）：１４７（１９９７））。一方、ＶＥＧＩは、ＥＣの生存および増殖を阻害する（Ｚｈａｉ，Ｙ．ら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ、１３（１）：１８１（１９９９）；Ｙｕｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１４７９（１９９９））。ＴＮＦリガンドファミリーの新規メンバーであるＴＷＥＡＫ（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ，Ｙ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７２（５１）：３２４０１（１９９７））は、いくつかの上皮腫瘍細胞株において脈管形成性ケモカインであるインターロイキン−８（ＩＬ−８）の発現を誘導する。最近、ＴＷＥＡＫは、減少した増殖因子条件下での、培養ヒトＥＣの増殖および角膜新生血管形成の両方を誘導することが報告された（Ｌｙｎｃｈ，Ｃ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（１３）：８４５５（１９９９））。
【０００３】
発現クローニングの使用によって、ＴＷＥＡＫに対するレセプタータンパク質が、「Ｆｎ１４」であることが最近同定された。このタンパク質は、元来、ＦＧＦ−１誘導最初期応答遺伝子として特徴付けられた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３１６６−３３１７６（１９９９）およびＷＯ９８／５５５０８）。Ｆｎ１４は、（ＴＷＥＡＫと比較した場合）成体組織においてより限定された発現パターンを有し、今日までに記載される中で最も小さいＴＮＦレセプターであり、たった１つのシステインリッチ反復しか有さない。
【０００４】
（発明の要旨）
脈管形成の誘導においてＴＷＥＡＫおよびＦｎ１４によって果される役割（ＷＯ０１／４５７３０を参照のこと）に加えて、本発明者らは、Ｆｎ１４アゴニストまたは活性化因子（例えば、ＴＷＥＡＫおよびアゴニスト抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体）が、脈管形成の阻害を介して間接的にか、または直接的な抗腫瘍活性によって、実際に（１）脈管形成を阻害し、そして（２）腫瘍の進行を遅くさせることを発見した。
【０００５】
従って、本発明は、治療有効量の、ＴＷＥＡＫレセプターに対するアゴニストを投与することによって脈管形成を調節する方法を提供する。好ましい実施形態において、ＴＷＥＡＫレセプターは、Ｆｎ１４である。他の好ましい実施形態において、Ｆｎ１４レセプターアゴニストは、ＴＷＥＡＫであるかまたは抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体である。本発明は、好ましくは、治療有効量の、ＴＷＥＡＫレセプターに対するアゴニストを投与することによって脈管形成を阻害する方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、治療有効量のＴＷＥＡＫレセプターに対するアゴニストを投与することによって腫瘍進行を阻害する方法を提供する。好ましい実施形態において、ＴＷＥＡＫレセプターは、Ｆｎ１４である。他の好ましい実施形態において、Ｆｎ１４アゴニストは、ＴＷＥＡＫであるかまたは抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体である。  本発明はまた、治療有効量の、ＴＷＥＡＫレセプターに対するアゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を意図する。
【０００７】
本発明の方法が脈管形成を調節することを意図する程度に、これらは、新生血管形成を促進するために増強した脈管形成活性が所望される疾患において、処置として有用である。このような疾患および状態としては、以下が挙げられる：心筋虚血状態（例えば、心筋梗塞、心筋虚血または心臓以外の領域への不十分な血流（末梢血管疾患におけるような）に罹患している冠状動脈疾患を有する患者における血流（ここでは、血流の減少が問題である）の改善、壊死組織（例えば、梗塞または血管形成術後の心筋層）の血管再生、アンギナ、心臓移植片、血管移植片、ならびにこれらの病変の血管形成、灌流、膠原化および組織化を改善するための血管の再開）、創傷治癒、ならびに組織移植および器官移植（例えば、自己微小血管移植または異種微小血管移植の増強）。創傷治癒の促進としては、切開部の治癒、骨修復、痛みの治癒、心筋損傷の梗塞後修復、胃潰瘍および胃腸管の他の潰瘍の治癒、ならびに一般的な、組織の形成、維持および修復の促進が挙げられる。移植（ｇｒａｆｔｅｄ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）された組織の新生血管形成もまた、特に、血管不全に罹患している被験体（例えば、糖尿病患者）において、意図される。
【０００８】
本発明の方法が脈管形成を阻害することを意図する程度に、これらは、新生血管形成を阻害するために減少した脈管形成活性が所望される疾患において、処置として有用である。このような状態としては、癌、炎症性黄斑変性、および糖尿病性網膜症が挙げられる。
【０００９】
本発明の方法が腫瘍進行を阻害することを意図する程度に、これらは、所望されない細胞増殖に関連する状態（例えば、癌（前立腺癌、リンパ腫、腺癌、神経新生物、結腸癌、膵臓癌、パラガングリオーマ、乳癌、腎細胞癌、肺癌、卵巣癌、平滑筋腫、肺癌、髄膜腫、褐色細胞腫、骨肉腫および甲状腺癌を含むが、これらに限定されない））を処置するために有用である。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。
【００１１】
用語「抗腫瘍活性」とは、物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する腫瘍細胞の増殖をブロックするか、またはその腫瘍細胞の死を誘導する、能力をいう。
【００１２】
用語「腫瘍進行の阻害」とは、物質または化合物が、その物質または化合物と相互作用する腫瘍細胞の増殖をブロックするか、またはその腫瘍細胞の増殖および発達を減少する、能力をいう。
【００１３】
用語「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死のプロセスをいう。
【００１４】
用語「細胞傷害活性」は、物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する細胞の死を誘導する能力をいう。
【００１５】
用語「エピトープ」（または抗原決定基）は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と結合する分子の一部と規定される。単一のエピトープは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって認識される。複数のエピトープが、通常ポリクローナル抗体によって認識される。
【００１６】
用語「脈管形成因子」は、このプロセスの以下の段階を含むが、これらに限定されない、脈管形成プロセスを促進する因子をいう：すなわち、細胞外マトリクスの分解、細胞増殖、細胞移動および構造的組織化（Ｋｕｍａｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２：７４９−７５７（１９９８）；Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２：２５１−２５６（１９９７））。脈管形成因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、血管内皮増殖因子アイソフォーム（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１）およびアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、肝細胞増殖因子、プロリファリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）、Ｂ６１、可溶性血管細胞接着分子−１、可溶性Ｅ−セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、１２−ヒドロジエイコサテトラエノン酸（ｈｙｄｒｏｚｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質、アンギオゲニン、ＴＮＦα、ＦａｓＬ、トランスフォーミング増殖因子−β。
【００１７】
抗体の「Ｆｃドメイン」は、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域およびヒンジ領域を含むが抗原結合部位を欠く分子の一部をいう。
【００１８】
用語「Ｆｎ１４」は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３３１６６−３３１７６（１９９９）（この全体が本明細書中に参考として援用される）において特徴付けられたＴＷＥＡＫレセプタータンパク質をいう。このＩ型膜貫通タンパク質についてのヒトおよびマウスのアミノ酸配列は、図１０Ａおよび１０Ｂに提供される。
【００１９】
用語「Ｆｎ１４アゴニスト」または「Ｆｎ１４活性化因子」は、Ｆｎ１４に対するリガンド、Ｆｎ１４シグナル伝達を増強し得る任意の因子、またはＦｎ１４シグナルが細胞内で解釈される態様に影響を与え得る任意の因子をいう。Ｆｎ１４アゴニストの例としては、ＴＷＥＡＫ、可溶性抗Ｆｎ１４Ａｂ、架橋抗Ｆｎ１４Ａｂおよび多価抗Ｆｎ１４Ａｂが挙げられる。
【００２０】
用語「Ｆｎ１４シグナル伝達」は、Ｆｎ１４経路に関連する分子反応の全て、およびＦｎ１４経路から生じるその後の分子反応をいう。
【００２１】
用語「抗Ｆｎ１４抗体」（「抗Ｆｎ１４Ａｂ」）は、Ｆｎ１４レセプターの少なくとも１つのエピトープを認識しかつこれに結合する任意の抗体をいう。
【００２２】
用語「抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体」（「抗Ｆｎ１４ｍＡｂ」）は、Ｆｎ１４の単一のエピトープを認識しかつこれに結合する任意のモノクローナル抗体をいう。
【００２３】
用語「架橋抗Ｆｎ１４（ｍ）Ａｂ」は、抗Ｆｎ１４抗体（ＡｂもしくはｍＡｂ）架橋剤を使用して互いに架橋されて溶液中で抗体塊を形成したか、または表面またはマトリクス上で互いに近接して固定化されているかのいずれかである、Ｆｎ１４に対する抗体をいう。
【００２４】
用語「抗Ｆｎ１４Ａｂ（またはｍＡｂ）架橋剤」は、Ａｂが標的細胞表面Ｆｎ１４クラスタリングに結合しかつこれを増強するように、溶液中で抗Ｆｎ１４Ａｂを共有結合的にかまたは非共有結合的に凝集させ得る任意の薬剤をいう。このような架橋剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：化学的架橋剤、抗Ｆｎ１４ＡｂもしくはｍＡｂの一部と反応する二次抗体、および抗Ｆｎ１４Ａｂに結合し得る可溶性Ｆｃレセプターもしくは表面結合Ｆｃレセプター（内因性であるかまたは外因的に加えられたかのいずれか）。
【００２５】
用語「多価リガンド」は、１より多いレセプター結合部位を有し、そして少なくとも２つのレセプター分子を同時に結合し得かつ近傍に導き得る分子または複合体をいう。
【００２６】
「Ｉ型リーダー配列」は、真核生物タンパク質のアミノ末端部分であり、これは、小胞体（ＥＲ）膜にこのタンパク質を指向させるシグナルとして作用し、しばしば分泌経路全体を通じて作用する。リーダー配列は、通常ＥＲ膜においてシグナルペプチダーゼによって切り出される。
【００２７】
「シグナル配列」は、原核生物宿主における真核生物Ｉ型リーダー配列の機能的等価物であり、細菌の脂質二重膜内部へのタンパク質の移動または細菌の脂質二重膜を横切るタンパク質の移動を指向する。
【００２８】
（抗Ｆｎ１４抗体の供給源）
抗タンパク質（抗ペプチド）抗血清またはモノクローナル抗体を、標準的プロトコル（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ：１９８８を参照のこと）によって作製し得る。
【００２９】
ヒトＦｎ１４に対するポリクローナル抗体血清を、動物（例えば、ヤギ、ウサギまたはマウス）に、フロイント完全アジュバント中のヒトＦｎ１４  Ｆｃ融合タンパク質を皮下注射し、ブースターをフロイント完全アジュバントで腹腔内注射または皮下注射することによる慣用的技術を使用して調製する。Ｆｎ１４に対する所望の抗体を含むポリクローナル抗血清を、慣用的手順によってスクリーニングする。
【００３０】
ヒトＦｎ１４融合タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、アジュバント非存在下でプロテインＡセファロースビーズに付着させたＣＨＯ細胞由来組換えＦｎ１４融合タンパク質（Ｆｎ１４  Ｆｃ）を用いて、ＲＢＦマウスの反復性腹腔内免疫によって調製する。動物を、最終的に可溶性Ｆｎ１４  Ｆｃ（ｉ．ｐ．およびｉ．ｖ．の両方）でブーストし、脾臓細胞を、古典的なプロトコルを使用して融合させ、そしてハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした（Ｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．５３−５９（１９９５））。純粋なｍＡｂを、ハイブリドーマ培養上清よりＩｇＧのプロテインＡセファロース精製によって調製する。
【００３１】
抗Ｆｎ１４抗体の種々の形態をまた、標準的組換えＤＮＡ技術（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ２９３−９９（１９９１））を使用して作製し得る。例えば、「キメラ」抗体を構築し得、この抗体において、動物抗体由来の抗原結合ドメインをヒト定常ドメインに連結させている（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４））。キメラ抗体は、ヒト臨床処置において使用する場合、動物抗体によって惹起された、観察された免疫原性応答を減少させる。
【００３２】
さらに、Ｆｎ１４を認識する組換え「ヒト化抗体」を合成し得る。ヒト化抗体は、特異的抗原結合を担う領域が挿入されている、大部分ヒトＩｇＧ配列を含むキメラである（例えば、ＷＯ  ９４／０４６７９）。動物を、所望の抗原で免疫し、対応する抗体を単離し、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の部分を除去する。次いで、動物由来の抗原結合領域を、抗原結合領域が除かれているヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングする。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異種（種間）配列の使用を最小限にし、処置した被験体において免疫応答をほとんど惹起しないようである。また、霊長類化した（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）ｍＡｂおよび／または完全なヒトｍＡｂを、当該分野において周知の技術を使用して生成し得、本発明において利用し得る。
【００３３】
異なるクラスの組換え抗Ｆｎ１４抗体の構築をまた、抗Ｆｎ１４可変ドメイン、および異なるクラスの免疫グロブリンから単離されたヒト定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含むキメラ抗体またはヒト化抗体を作製することによって達成し得る。例えば、抗原結合部位の結合価を増加させた抗Ｆｎ１４  ＩｇＭ抗体を、ヒト：鎖定常領域を保有するベクターに抗原結合部位をクローニングすることによって組換え生成し得る（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，ｐｐ．１４３９−５０（１９９３）；Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，ｐｐ．２５７３−７８（１９９３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９，ｐｐ．６８−７０（１９８９））。
【００３４】
さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、抗原結合部位に近接するアミノ酸残基を変更することによって、組換え抗体のその抗原に対する結合親和性を変更し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性を、分子モデルに基づく変異誘発によって増加させ得る（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，ｐｐ．１００２９−３３（１９８９）；ＷＯ  ９４／０４６７９）。
【００３５】
標的化される組織型または想定された特定の処置スケジュールに依存して、Ｆｎ１４に対する抗Ｆｎ１４Ａｂの親和性を増加または減少させることが、所望され得る。例えば、半予防的処置について、Ｆｎ１４経路を介してシグナル伝達する能力が低下した定常レベルの抗Ｆｎ１４で、患者を処置することが有利かもしれない。同様に、Ｆｎ１４に対する親和性が増加した抗Ｆｎ１４Ａｂは、短期間の腫瘍標的化処置に有利かもしれない。
【００３６】
（溶液中の複数の抗Ｆｎ１４  Ａｂは、Ｆｎ１４アゴニストとして作用する）
Ｆｎ１４アゴニストとして作用する、複数の抗Ｆｎ１４  Ａｂを溶液中に含む組成物が、本発明において提供される。Ｆｎ１４の異なるエピトープに対するポリクローナル抗Ｆｎ１４Ａｂが、使用され得る。好ましくは、抗Ｆｎ１４  Ａｂは、Ｆｎ１４の異なるエピトープおよび非重複エピトープに対するモノクローナル抗体である。
【００３７】
Ｆｎ１４活性化に対する複合抗Ｆｎ１４  ｍＡｂアプローチは、２つの非重複エピトープを合わせることを必要とする。免疫化マウス脾臓細胞を融合し続けることによって、異なる種の動物を免疫することによって、そして異なる経路の免疫化を使用することによって、さらなるエピトープ（新たなｍＡｂによって規定されるような）を同定し得る。
【００３８】
ＢＩＡｃｏｒｅクロマトグラフィー技術（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ」，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３．２，（Ｍａｙ  １９９４）；Ｊｏｈｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６０，ｐｐ．２０１９１−８（１９９３）をまた参照のこと）を使用してＦｎ１４への結合について互いに競合する異なるｍＡｂの能力を評価することによって、エピトープをまた、マッピングし得る。
（Ｆｎ１４アゴニストとしての抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体の機能）
通常の２つより多いＩｇＧ抗原結合部位を含む抗Ｆｎ１４  ｍＡｂもまた、細胞表面Ｆｎ１４架橋剤として溶液中で機能し、従って、本発明に従うＦｎ１４アゴニストの定義内に入る。標準的組換えＤＮＡ技術およびハイブリドーマ技術を使用して、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂの抗原結合部位を、１０個の抗原結合部位を有するＩｇＭ分子内に組み込み得る。
【００３９】
あるいは、抗原を用いた単回の免疫後にハイブリドーマ融合技術によって単離された完全なマウス（または他の動物）のＩｇＭ分子を回収および富化し得る。ＩｇＭ分子を富化する方法の１つは、ＣＤ４０シグナル伝達欠損マウス（Ｋａｗａｂｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１，ｐｐ．１６７−７８（１９９４）；Ｘｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１，ｐｐ．４２３−３１（１９９４））を免疫することである。これらのマウスは、ＩｇＧを効果的には生成し得ず、従って、抗原によるチャレンジに対するこれらのマウスの応答は、ＩｇＭアイソタイプを富化させる。
【００４０】
抗Ｆｎ１４  ＩｇＭ抗体は、その増加した結合価によって、膜面内にＦｎ１４分子を効率的に凝集し得、これにより、抗原結合部位を２つ有するＩｇＧ対照物と比較してＦｎ１４シグナル伝達を増強し得る。レセプタークラスタリングにおける多価抗体の増加した効果の劇的な例示は、Ｆａｓレセプターに対する抗体に関して見られる。ここで、ＩｇＭ形態は非常に強力であり、そして正常な二価ＩｇＧは溶液中で効果的ではない（Ｙｏｎｉｈａｒａ  ａｎｄ  Ｙｏｎｉｈａｒａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，ｐｐ．１７４７−５６（１９８９）；Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，ｐｐ．１７９９−１８０６（１９９４））。
【００４１】
同様に、Ｆａｓレセプターに対するａｐｏ−１  ｍＡｂは、ＩｇＧ３  ｍＡｂである。このｍＡｂは、ＩｇＧ３サブタイプに特有なＦｃ相互作用に依存してより大きな多価形態へと凝集する、強力な細胞傷害性因子である。Ｆｃ領域の除去は、より大きな凝集体に会合し得ずそして不活性であるＦ（ａｂ）２形態を生成する（Ｄｈｅｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９，ｐｐ．３１６６−７３（１９９２））。よって、類推によって、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂのＩｇＭバージョンが強力な抗腫瘍因子であると予測する。
【００４２】
（Ｆｎ１４アゴニストを使用する処置）
本発明の組成物は、扱われる特定の臨床状態を処置するために効果的な用量で投与される。所定の適用について好ましい薬学的処方物および治療的有効量のレジメンの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度、およびその処置に対する患者の寛容を十分に考慮している当業者の範囲内にある。
【００４３】
本発明の治療剤は、その選択された薬剤と適合性である任意の経路によって投与され得、そして投与経路に適切な薬学的に受容可能な任意のキャリアとともに処方され得る。好ましい投与経路は非経口であり、特に、静脈内投与、腹腔内投与および嚢内投与である。処置はまた、好ましくは、外来患者ベースで長期間にわたって行われる。治療剤の日々の投薬量は、約０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１０〜３００μｇ／ｋｇ体重の範囲内であることが予想されるが、正確な投薬量は、使用される特定の治療剤ならびに特定の被験体の健康状態および病歴に依存して変動する。
【００４４】
単離および精製された形態の抗体および複合体、その塩またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む、本発明の抗Ｆｎ１４  Ａｂの投与は、抗腫瘍活性を示す薬剤の慣用的に受容された投与様式のいずれかを使用して達成され得る。
【００４５】
これらの治療において使用される薬学的組成物はまた、種々の形態にあり得る。これらとしては、例えば、固体、半固体および液体の投薬形態（例えば、錠剤、丸剤、粉末、液体の溶液または懸濁物、坐剤、ならびに注射可能な溶液および注入可能な溶液）が挙げられる。好ましい形態は、投与および治療適用の意図された様式に依存する。投与の様式としては、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与または局所投与が挙げられ得る。
【００４６】
抗Ｆｎ１４Ａｂは、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を伴うかまたは伴わないで、滅菌された等張性の処方物中に置かれ得る。処方物は、好ましくは液体であるか、または凍結乾燥された粉末であり得る。例えば、抗Ｆｎ１４Ａｂは、５．０ｍｇ／ｍｌ  クエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌ  クエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌ  マンニトール、１ｍｇ／ｍｌ  グリシンおよび１ｍｇ／ｍｌ  ポリソルベート２０を含む処方緩衝液で希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され得、冷凍庫内で貯蔵され得、滅菌したＷａｔｅｒ−Ｆｏｒ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＳＰ）で投与される前に再構成され得る。
【００４７】
組成物はまた、好ましくは、当該分野において周知の従来の薬学的に受容可能なキャリアを含み得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｎ，１９８０，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャリアとしては、他の医療用薬剤、キャリア、遺伝的キャリア、アジュバント、賦形剤など（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）が挙げられ得る。組成物は、好ましくは単位用量の形態であり、通常１日に１回以上投与される。
本発明の薬学的組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他の微小粒子送達系、あるいは患部組織中、患部組織のそば、もしくは患部組織と連絡してか、または血流に置かれる徐放性処方物を使用して投与され得る。徐放性キャリアの適切な例としては、坐剤または微小カプセルのような形状の物品の形態での半透過性のポリマーマトリクスが挙げられる。移植可能な徐放性マトリクスまたは微小カプセルの徐放性マトリクスとしては、以下が挙げられる：ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，ｐｐ．５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ，Ｔｅｃｈ．，１２，ｐｐ．９８−１０５（１９８２））。
【００４８】
抗Ｆｎ１４Ａｂを含むリポソームは、周知の方法によって調製され得る（例えば、ＤＥ  ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，ｐｐ．３６８８−９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，ｐｐ．４０３０−３４（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型であり、ここで、脂質含量は、約３０モル％コレステロールより多い。コレステロールの割合は、抗Ｆｎ１４  Ａｂ放出の最適な速度を制御するように選択される。
【００４９】
本発明の抗Ｆｎ１４Ａｂはまた、他のＦｎ１４活性化因子、ＩＦＮ−（代表的に、腫瘍領域に見出される）を補充した化学療法剤を含む、リポソームに結合され得る。リポソームのＴＷＥＡＫ複合体および抗Ｆｎ１４Ａｂの結合は、標的化された送達について、毒素または化学療法剤を抗体に結合するために広範に使用されているヘテロ二官能性架橋剤のような、公知の任意の架橋剤によって達成され得る。リポソームの結合体化はまた、炭化水素指向型架橋剤である４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）（Ｄｕｚｇｕｎｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ  ７７（１９９２））を使用して達成され得る。
【００５０】
腫瘍を保有するヒトに慣用的な抗腫瘍治療（すなわち、放射線療法および化学療法）と組み合わせてｍＡｂが投与されることが、想定される。Ｆｎ１４活性化の慣用的化学療法との併用処置は、慣用的な抗腫瘍治療が単独で使用される場合よりも患者の腫瘍形成細胞をより清澄化するようである腫瘍殺傷活性の外因子を提供し得る。
【００５１】
このアプローチは比較的副作用を有し得ず、従って、転移し得なかった癌腫の場合に半予防的意味で与えられ得るか、または特定の型の癌について遺伝的な素因を示す家系由来の患者において与えられ得ることが、さらに可能である。
【００５２】
以下は、本発明の方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定として解釈されるべきではなく：これらの実施例は、例示の目的で含まれ、そして本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００５３】
（実施例）
（実施例１：ＴＷＥＡＫは、塩基性線維芽細胞増殖因子と血管内皮増殖因子に対する内皮細胞応答を調節する）
（細胞および培養条件）−ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）を、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＳ−Ｃ）（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）またはＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。大動脈ＥＣ、大動脈平滑筋細胞、肺線維芽細胞、胚筋芽細胞およびヒト末梢血樹状細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから購入した。ＨＵＶＥＣおよびＨＤＭＥＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と供給増殖補充物とを含むＣＳ−Ｃ完全培地中で慣用的に継代し、そして７回継代まで実験において使用した。生存研究を、特定したようなＣＳ−Ｃ完全培地およびＣＳ−Ｃ培地（ＦＢＳを含まない、および増殖補充物を含まない）中で実施した。増殖実験、移動実験および免疫蛍光染色実験のために、２％  ＦＢＳと供給増殖補充物とを含むＥＣ基底培地（ＥＢＭ）（本明細書中で「完全培地」と規定する）、および２％  ＦＢＳを含むＥＢＭ（本明細書中で「基底培地」と規定する）を、使用した（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）。毛細管形成アッセイのために、５％  ＦＢＳと供給増殖補充物とを含むＥＣ基底培地２（ＥＢＭ−２）を、使用した（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）。ＭＳ−１細胞株およびＭ２１０Ｂ４細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。２００  ｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（クローン２Ｃ１１）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてインビボで活性化した２４〜４８時間後に、マウスリンパ系細胞を得た。チオグリコレート誘導性末梢マクロファージを、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）（１００単位／ｍｌ）、ＴＮＦ−β（１０μｇ／ｍｌ）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）（１μｇ／ｍｌ）を用いてインビトロで４８時間刺激した。
【００５４】
（試薬および抗体）−組換えヒトｂＦＧＦを、増殖供給補充物（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）として入手し、そしてｂＦＧＦおよびＶＥＧＦをまた、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣおよびプロピジウムヨーダイト（ＰＩ）を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した。Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した、マウス抗ヒトＴＮＦ−β  ｍＡｂ、およびマウス抗ヒトＩＬ−８  ｍＡｂ、ならびにアイソタイプ適合コントロールＩｇ  ＭＯＰＣ２１（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を、ブロッキング研究のために使用した。ビオチン結合化抗ＦＬＡＧを、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から入手し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）−ストレプトアビジンを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手した。
【００５５】
（ＴＷＥＡＫ特異的ｍＡｂ）−可溶性ヒトＴＷＥＡＫタンパク質による免疫および標準的ハイブリドーマ生成手順によって、アルメニアハムスターにおいて、ＢＥ．Ｂ３、ＡＢ．Ｇ１１およびＡＢ．Ｄ３を生成した。ＡＢ．Ｄ３およびＡＢ．Ｇ１１がヒトおよびマウスのＴＷＥＡＫに結合し、ＢＥ．Ｂ３がヒトＴＷＥＡＫに結合する能力を、９６ウェルマイクロタイタープレート上に固定した組換え可溶性ＴＷＥＡＫタンパク質を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて示した。ＡＢ．Ｄ３およびＡＢ．Ｇ１１のブロッキング活性が、ＦＡＣＳ分析においてＨＴ２９細胞に可溶性フラッグ（ｆｌａｇ）タグ化ヒトＴＷＥＡＫが結合することを阻害することが、これらのｍＡｂによって示されたが、ＢＥ．Ｂ３によっては示されなかった。ＢＥ．Ｂ３を、製造業者のプロトコルに従ってＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ビオチン化した。ハムスターコントロールＩｇ（クローンＨａ４／８−３．１）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、そしてｍＡｂを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により、培養物上清から精製した。
【００５６】
（組換え可溶性ヒトＴＷＥＡＫタンパク質）−アミノ酸残基Ａ１０６〜Ｈ２４９を含む組換え可溶性ヒトＴＷＥＡＫ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３００９９）を、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｌｏｃａｔｉｏｎ）において、Ｎ末端フラッグ（ｆｌａｇ）エピトープとともにかまたはＮ末端フラッグエピトープを含まないかのいずれかで、発現させた。可溶性ヒトＴＷＥＡＫを発現するｐｉｃｈｉａからの発酵培地を濃縮し、そして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）においてダイアフィルトレーションし、そしてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でイオン交換し、その後、Ｚｎキレートカラムにローディングした。可溶性ＴＷＥＡＫを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）中でのイミダゾール勾配によって溶出した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００カラムを使用するサイズ排除によって最終的に分画した。
【００５７】
（アポトーシスの分析）−血清枯渇実験のために、ＨＵＶＥＣまたはＨＤＭＥＣを、１．２×１０５細胞／ウェルの密度にて６ウェルプレートに播種し、そしてＣＳ−Ｃ完全培地にて一晩インキュベートした。各実験の直前に、細胞をリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）を補充し、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＴＷＥＡＫ（２００ｎｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まない、ＣＳ−Ｃ完全培地またはＣＳ−Ｃ培地において、４８時間培養した。示される場合、２μｇ／ｍｌの抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｇ１１またはコントロールＩｇもまた、添加した。４８時間後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そしてジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）（ＣＳ−Ｃ）とともに３７℃で１５分間インキュベートすることにより剥離させ、その後、５ｍＭ  ＥＤＴＡと０．１％  ＢＳＡとを含むＰＢＳで３７℃にて１５分間置換した。ＰＢＳ中でさらに１回洗浄した後、供給業者に従って、細胞を、ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖおよび５μｇ／ｍｌ  ＰＩで染色した。ＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、１時間以内に蛍光を分析した。
【００５８】
（増殖アッセイ）−ＨＵＶＥＣを、９６ウェルマイクロタイタープレート中にサブコンフルエント（４０００細胞／ウェル）で配置し、そして供給増殖補充物を添加しないＣＳ−Ｃ培地において一晩培養した。培地を、上記に規定したような完全培地または基底培地で置換した。ＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むかもしくは含まないか、ｂＦＧＦ補充物（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）の１／５００〜１／１０００希釈物もしくは１ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するｂＦＧＦを含むかもしくは含まないか、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むかもしくは含まないか、またはこれらの因子の組み合わせを含むかもしくは含まない、基底培地において、細胞を培養した。示される場合、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂであるＡＢ．Ｄ３、ＢＥ．Ｂ３またはハムスターコントロールＩｇ  Ｈａ４／８  １０μｇ／ｍｌもまた、添加した。細胞を、５％  ＣＯ２ととともに３７℃にて３日間インキュベートし、そして培養の最後の１０時間の間３Ｈ−チミジンでパルスすることによって、増殖を測定した。細胞結合性放射能を、ＢｅｔａｐｌａｔｅＴＭ（ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて測定した。
【００５９】
（内皮創傷修復アッセイ）−標準的創傷修復アッセイを、以前に記載された（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１（３）：７５５（１９９５））のように使用した。簡単に述べると、ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層を、２ｍｍグリッドを備えた３５×１０ｍｍ細胞培養皿（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｅ，ＩＬ）において、ＣＳ−Ｃ完全培地中で増殖させた。１ｍｍのチップを用いた、その皿の直径を通る２本の垂直な線によって、その単層を傷つけた。取り外された細胞を吸引し、そしてプレートをＰＢＳでリンスした。ＴＷＥＡＫ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１／１０００または１ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはこれらの組み合わせを含むかまたは含まない、上記で規定したような完全培地または基底培地において、細胞を１８時間培養し、その後、１％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、Ｈａｒｒｉｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で染色した。間隔が移動細胞により見えないグリッドの数を眼で計数することによって、創傷修復を定量した。この数を、創傷を並べたグリッドの総数で除算し、そして結果を、平均創傷修復パーセンテージ±ＳＥＭとして表した。
【００６０】
（免疫蛍光染色）−細胞を、ｆｌａｇ−ＴＷＥＡＫと共にインキュベートすることによってＴＷＥＡＫ結合について分析し、そして結合を、ビオチン化マウス抗ｆｌａｇ  ｍＡｂまたはビオチン化ＢＥ．Ｂ３のいずれか、およびストレプトアビジン−ＰＥを用いて検出した。非標識競合を、１００ｎｇ／ｍｌのｆｌａｇ−ＴＷＥＡＫおよび漸増濃度の非タグ化ＴＷＥＡＫを用いて行い、結合を、ビオチン化マウス抗ｆｌａｇ  ｍＡｂを用いて検出した。ＡＢ．Ｄ３  ＡｂによるＴＷＥＡＫ結合のブロックを、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂとのｆｌａｇ−ＴＷＥＡＫのプレインキュベーションによって行った。
【００６１】
（毛細血管形成アッセイ）−ＥＣによる毛細血管形成を、以前に記載された方法（Ｍａｃｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５４、（１）：２２９（１９９９））に基づく、フィブリンマトリクスゲルアッセイを使用して分析した。手短に言うと、４ｍｇ／ｍｌの無プラスミノーゲンヒトフィブリノーゲン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ヘパリンおよびポリミキシンＢ（両方とも、１μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、ならびにＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを除く全ての供給補充物を含む、無血清ＥＢＭ−２培地中に溶解した。フィブリン溶液を濾過滅菌し、そしてフィブリンマトリクスを、トロンビン（２０〜５０ミリユニット／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして２４ウェルプレート中の１ウェル当たり３００μｌで分配することによって、調製した。ＨＵＶＥＣ（４×１０４細胞／ｃｍ２）をゲル表面に播種し、そしてＴＷＥＡＫ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦまたはこれらの因子の組み合わせの存在下または非存在下で、上記のＥＢＭ−２培地および５％  ＦＢＳを重層した。ＴＷＥＡＫを１μｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌで、ｂＦＧＦを１００ｎｇ／ｍｌで、そしてＶＥＧＦを５０ｎｇ／ｍｌで用いて、類似の結果が得られた。いくつかの実験において、ＴＮＦに特異的な中和ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−８に特異的な中和ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプコントロールＩｇを、使用した。４８〜７２時間の培養後、ゲル表面の位相差顕微鏡写真を撮影した。ゲルを、１０％エタノールで１０分間固定し、元のウェルから新しいウェルに移し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包理視、切片化（５ミクロン）し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００６２】
（ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ））−ＲＰＡを、ｈＡｎｇｉｏ  ｍｕｌｔｉｐｒｏｂｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｅｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して行った。ＨＵＶＥＣを、５％  ＦＢＳならびにｂＦＧＦおよびＶＥＧＦを除く供給補充物を含むＥＢＭ−２培地中で、接着単層として培養した。ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ＋ＴＷＥＡＫを添加し、そしてＲＮＡを１６時間の培養後に単離した。
【００６３】
（結果）
（ＴＷＥＡＫ結合は細胞型限定性である）−どの細胞型がＴＷＥＡＫ活性の標的であり得るかを決定するために、本発明者らは、免疫蛍光染色によって、組換え可溶性ヒトＴＷＥＡＫに結合する能力について、種々の初代細胞を調査した。表Ｉに示されるように、ＴＷＥＡＫは、ヒトの静脈および動脈のＥＣ、動脈平滑筋細胞、胚性筋芽細胞、およびより低い程度で、肺線維芽細胞に結合した。ｆｌａｇ−ＴＷＥＡＫ結合は、ＡＢ．Ｄ３  ｍＡｂでのブロッキングおよび独立したＴＷＥＡＫ調製物での非標識競合によって明らかにされるように、用量依存性かつ特異的であった（図１およびデータは示さず）。同様に、ＴＷＥＡＫは、マウスのＥＣおよび線維芽細胞株に結合した。しかし、ＴＷＥＡＫは、いかなるヒト白血球（新鮮に単離されたか、または種々の条件下で活性化されたかのいずれか）にも検出可能に結合しなかった。
【００６４】
（ＴＷＥＡＫはＥＣ生存を促進する）−ＴＷＥＡＫがＥＣ生存を促進する能力を、ＴＷＥＡＫの非存在下または存在下の無血清培地中でＨＵＶＥＣを培養することによって試験した。これらの条件下でのＨＵＶＥＣの生存性を、ＶＥＧＦを補充した無血清培地中での生存性（Ｎｏｒ，Ｊ．Ｅ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５４（２）：３７５（１９９９））またはＣＳ−Ｃ完全培地中での生存性と比較した。細胞生存性を、アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）（アポトーシスについての初期マーカー）での標準的な二重染色およびＰＩ色素排除によって測定した。図２Ａに示されるように、ＣＳ−Ｃ完全培地中で培養した細胞は、４８時間で生存可能なままであったが（９７％）、さらなる因子を含まない無血清培養物中では、生存細胞は、２５％に減少し、有意な割合のアポトーシス細胞（４８％）および死細胞（２６％）が現れた。しかし、ＴＷＥＡＫの存在下で、ＨＵＶＥＣは、アポトーシスからほとんど保護されたままであった（７３％  生存性）。ＴＷＥＡＫで達成されたこのＥＣ生存の程度は、ＶＥＧＦで達成されたＥＣ生存の程度に匹敵した。無血清培地中でのＨＤＭＥＣの生存もまた、ＴＷＥＡＫによって増強されたが、ＨＵＶＥＣよりも低い程度であり、そしてこの活性は、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｇ１１によって特異的に阻害された（図２Ｂ）。
【００６５】
（ＴＷＥＡＫは、ｂＦＧＦと協同してＥＣ増殖を増加させる）−本発明者らは、ＴＷＥＡＫを単独で含むか、または２つの重要な脈管形成因子と組み合わせて含む、基底培地中で培養したＨＵＶＥＣの３Ｈチミジンの取り込みを測定することによって、増殖に対するＴＷＥＡＫの効果をさらに試験した。ＴＷＥＡＫは、ＨＵＶＥＣ増殖に対する、小さい有意でない増加（基底培地と比較して平均１．６倍の増加）（ｎ＝７回の独立した実験）を誘導した。対照的に、ＴＷＥＡＫおよびｂＦＧＦと共に培養した細胞は、ｂＦＧＦのみの存在下で培養した細胞と比較して、有意に増強された増殖応答を示した（図３Ａ）。達成された３Ｈチミジンの取り込みのレベルは、完全培地中で培養したＥＣの取り込みと匹敵するかまたはそれより高かった。同様の結果が、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを使用して得られた。ｂＦＧＦとのＴＷＥＡＫの相乗活性は、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３によって完全に阻害され、これは、ＴＷＥＡＫの効果が特異的であることを示すが、抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＢＥ．Ｂ３によってもコントロールＩｇによっても阻害は見られなかった。対照的に、ＴＷＥＡＫは、ＶＥＧＦに対する増殖応答に影響しなかった（図３Ｂ）。
【００６６】
（ＴＷＥＡＫは、ｂＦＧＦ依存性ＥＣ移動を増強し、そしてＶＥＧＦ依存性ＥＣ移動を阻害する）−ＴＷＥＡＫがＥＣ移動をもたらす能力もまた、他の脈管形成因子の存在下および非存在下で評価した。コンフルエントなＨＵＶＥＣ単層に傷をつけ、そして創傷修復の程度を測定することによって、ＥＣ移動を最初の１８時間モニターした。基底培地へのＴＷＥＡＫまたはｂＦＧＦの添加は、低レベルの創傷修復を誘導する。対照的に、ＴＷＥＡＫおよびｂＦＧＦの両方で処理した培養物は、基底培地中で維持した培養物またはいずれかの因子のみで刺激した培養物よりも効率的に修復された（図４）。対照的に、創傷修復は、ＶＥＧＦのみで処理した培養物と比較して、ＴＷＥＡＫ＋ＶＥＧＦで処理した培養物において減少された。このように、ＴＷＥＡＫは、ｂＦＧＦと協同し、創傷修復に対するＶＥＧＦの効果をアンタゴナイズする。
【００６７】
（ＴＷＥＡＫは、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦによって誘導されるＥＣ形態発生を差示的に調節する）−微小血管の成長は、ＥＣの同調的な増殖、移動、および毛細血管構造への形態発生的組織化に関与する。形態発生活性に対するＴＷＥＡＫの効果を、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在下または非存在下でフィブリンゲルの表面上に播種したＥＣの培養物を使用して評価した。本発明者らは、位相差顕微鏡によって示されるように、ｂＦＧＦが、フィブリンゲル表面上のＥＣ単層における形態学的変化を誘導するが、ＴＷＥＡＫは誘導しないこと（図５Ａ）、およびｂＦＧＦへのＴＷＥＡＫの添加が、これらの形態学的変化を顕著に増強し、毛細血管出芽数の２倍の増加を誘導すること（図６）を、見出した。さらに、マトリクス表面に対して垂直の断面の組織学的分析は、ｂＦＧＦが、フィブリンマトリクスへのＥＣ浸潤を促進するが、ＴＷＥＡＫが促進しないこと、および、ｂＦＧＦへのｐＴＷＥＡＫの添加が、内腔含有構造の形成を誘導すること（図５Ｂ）を明らかにした。同様の結果は、いくつかの異なるＥＣ型（ＨＵＶＥＣ、ＨＤＭＥＣ、ヒト肺動脈ＥＣ、およびヒト肺微小血管ＥＣを含む）で得られたが、内腔形態発生の刺激は、ＴＷＥＡＫを別のＴＮＦファミリーメンバーであるＣＤ４０Ｌによって置換した場合に観察されなかった（データは示さず）。ＴＷＥＡＫとｂＦＧＦとの間の協同は、ＴＷＥＡＫがＩＬ−８（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ，Ｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７２（５１）：３２４０１（１９９７））および／またはＴＮＦ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２９（６）：１７８５（１９９９））（インビトロでＥＣの形態発生を協同的に促進することが以前に示されたサイトカイン（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１７（７）：４０１５（１９９７）；Ｋｏｏｌｗｉｊｋ，Ｐ．ら、Ｔｈｅ  Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１３２：１１７７（１９９６））を誘導する能力に起因し得る。しかし、図６に示されるように、ＴＷＥＡＫ＋ｂＦＧＦによって形成される毛細血管出芽の数は、これらの因子に対する中和ｍＡｂの存在下で減少されなかった。これらのｍＡｂの阻害活性は、独立して確かめられ、抗ＴＮＦ  ｍＡｂは、腫瘍殺傷を阻害し、そして抗ＩＬ−８は、ＩＬ−８誘導性ＥＣ増殖を阻害する（データは示さず）。
【００６８】
ＶＥＧＦはまた、フィブリンゲル表面上のＨＵＶＥＣ単層の再構成により証明されるように、ＥＣ形態形成を誘導した（図７）。ＶＥＧＦにより誘導された構造の外観は、ｂＦＧＦにより誘導された構造の外観とは、質的に異なり、そしてフィブリンマトリクスへのＥＣ浸潤はなかった。興味深いことに、ＴＷＥＡＫ＋ＶＥＧＦを用いて処理したコンフルエントなＥＣ単層は、再構成されず、そして未処理の培養物およびＴＷＥＡＫのみで処理した培養物に外観が類似していた。従って、ＴＷＥＡＫは、ｂＦＧＦと協同して毛細管様構造の形成を誘導するが、ＶＥＧＦに対するＨＵＶＥＣの形態学的応答をアンタゴナイズする。
【００６９】
（ＴＷＥＡＫは、ＶＥＧＦレセプターＦＬＴ１の発現を阻害する）−ＴＷＥＡＫは、ＶＥＧＦのレセプターを通じるＶＥＧＦシグナル伝達を調節することによって、ＶＥＧＦに対するＥＣ応答を制御し得る。脈管形成サイトカインおよびレセプターのパネルにおけるＲＰＡ発現分析を、この可能性を扱う手段として行った。本発明者らの結果（図８）は、コントロール培養物と比較した、ＶＥＧＦを用いて処理した培養物におけるＦＬＴ１の発現の増加を示す。ＴＷＥＡＫのみで処理した培養物は、コントロールと類似していた（データ示さず）。興味深いことに、この応答は、ＴＷＥＡＫ＋ＶＥＧＦで処理した培養物中で阻害された。従って、ＴＷＥＡＫは、ＶＥＧＦの存在下でのＦＬＴ１のｍＲＮＡレベルを低下させた。本発明者らのＲＰＡ分析はまた、ＴＩＥ（新脈管形成に必要とされる別のＥＣレセプター）の発現のＴＷＥＡＫによる阻害を示す（Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６（６５３５）：７０−７４（１９９５））。これらのデータは、ＴＷＥＡＫが、脈管形成因子によりシグナル伝達を調節し得る機構を示唆する。
【００７０】
従って、これらの結果は、ＴＷＥＡＫが、ＶＥＧＦに対するＥＣの形態学的応答をアンタゴナイズし、そしてＶＥＧＦ誘導性ＥＣ移動を阻害するが、ＶＥＧＦの存在下でのＥＣ増殖に対する測定可能な効果はなく、そしてＴＷＥＡＫの作用は、特定の脈管形成状況に依存して、前脈管形成的かまたは抗脈管形成的であり得る。
【００７１】
ｂＦＧＦの状況におけるＴＷＥＡＫの前脈管形成活性と対照的に、これらの結果は、ＴＷＥＡＫが他の設定におけるＥＣの脈管形成行動を阻害し得ることを示す。ＴＷＥＡＫは、両方の因子の存在下でのフィブリンゲル表面上にプレートしたコンフルエントなＥＣ単層の外観における、もしあったとしてもわずかな変化により証明されるように、ＶＥＧＦにより誘導されるＥＣ形態形成を阻害する。ＴＷＥＡＫのこの抗脈管形成効果は、創傷修復アッセイにおいて独立して観察されたＶＥＧＦ依存ＥＣ移動のＴＷＥＡＫ阻害を反映し得る。ＶＥＧＦのみと比較した場合、ＴＷＥＡＫおよびＶＥＧＦを用いて処理した培養物中のインテグリンαｖ、α１、α２、α５、β３、およびβ１の発現に変化はなかった（Ａ．Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ，未公開の観察）。しかし、本発明者らは、ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ−１の誘導性発現が、ＴＷＥＡＫの添加により阻害されたことを見出した。従って、ＴＷＥＡＫは、ＶＥＧＦのレセプターを介してＶＥＧＦシグナル伝達を調節することにより、ＶＥＧＦに対するＥＣ応答を制限し得る。このことは、腫瘍生物学を理解および有効にするのに特に重要であり、ここでの内因性ＶＥＧＦの役割は、腫瘍の進行に重要である（Ｆｅｒｒａｒｓ，Ｎ．およびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，Ｔ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１８：４−２５（１９９７））。
【００７２】
このデータは、ＴＮＦパラダイムと合わせて、ＴＷＥＡＫが特定の脈管形成設定に依存して新脈管形成を差次的に調節し得るという仮説を支持する。これらの結果は、それが微小血管成長のインビボでの調節、再構築、および／または維持において役割を果たし、脈管形成の状況に依存して前脈管形成的であるかまたは抗脈管形成的であることを示す。ＴＷＥＡＫ経路のアゴニスト（またはアンタゴニスト）は、虚血性損傷、癌、脈管増殖性障害および炎症性障害の設定における処置に対して有用な治療アプローチを提供し得る。
【００７３】
（実施例２：ルイス肺癌の増殖は、ＴＷＥＡＫトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおいて阻害される）
インビトロ細胞株におけるルイス肺癌を、Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した。この細胞株を、インビトロでＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中で抗生物質なしで４継代まで継代した後、動物に移植した。（Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統起源の）腫瘍細胞を、１匹のマウスあたり１×１０６細胞の接種量で、ＴＷＥＡＫ−Ｔｇマウスおよび非Ｔｇ同腹仔（これはＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドで連続して繁殖されている）の右脇腹領域に皮下注射した。各々の実験において、腫瘍細胞を、８匹のＴＷＥＡＫ−Ｔｇマウスおよび８匹の非Ｔｇ同腹仔に注射した。腫瘍の測定を、２週ごとに記録し、そして各時点での平均腫瘍重量を、各実験群について計算した。２つの別個の実験の各々についての腫瘍重量対時間のプロットを図９に示す。これは、腫瘍成長が、正常な同腹仔と比較して、ＴＷＥＡＫを発現するマウスにおいてより遅かったことを示す。
【００７４】
（表Ｉ：主な細胞型に対するＴＷＥＡＫ結合）
【００７５】
【表１】
2004508415.tif 000001
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）  対  ＴＷＥＡＫ濃度を示す２つのプロットを示し（左）、点線は、間接的な検出工程のみでのバックグラウンドのＭＦＩを示す。ヒストグラム（右）は、（１）間接的な検出工程のみでのバックグラウンド蛍光、（２）ＴＷＥＡＫ結合、および（３）ＡＢ．Ｄ３  ｍＡｂによるＴＷＥＡＫ結合の阻害に対応する。
【図２】
図２は、ＴＷＥＡＫでの処理後に生存しているか、アポトーシス状態であるか、または死んでいる、（Ａ）ＨＵＶＥＣ細胞および（Ｂ）ＨＤＭＥＣ細胞のパーセンテージを示す、２つの棒グラフを示す。ＥＣを、ＣＭ（１０％ＦＢＳおよび増殖補充物を含む、ＣＳ−Ｃ完全培地）、０％  ＦＢＳ（ＦＢＳおよび増殖補充物を含まず、かつ０．１％  ＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌヘパリンを補充した、ＣＳ−Ｃ培地）、およびＴＷＥＡＫもＶＥＧＦも含まない０％  ＦＢＳ中で、４８時間培養した。抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｇ１１およびコントロールＩｇを、示されるように添加した。細胞を、ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−ＶおよびＰＩで染色し、そして生存細胞、アポトーシス細胞および死細胞のパーセンテージを示した。これらの結果の各々は、２回の独立した実験を表す。
【図３】
図３は、ｂＦＧＦ依存性の増殖を示す、２つの棒グラフを示す。ＨＵＶＥＣを、完全培地中または基底培地中で３日間培養した。ＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１／５００希釈）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはこれらの因子の組み合わせを、示されるように基底培地に添加し、そして増殖を、３Ｈチミジンの取り込みによって測定した。（Ａ）示されるデータは、３連のウェルの平均値＋／−ＳＤである。これらの結果は、４回の独立した実験を示す。増殖因子に加えて、ブロッキング抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＡＢ．Ｄ３、非ブロッキング抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ  ＢＥ．Ｂ３、および無関係のハムスターコントロールＩｇ  Ｈａ４／８（１０μｇ／ｍｌ）を、示されるように添加した。結果は、２回の独立した実験を示す。（Ｂ）示される結果は、３連のウェルの平均値＋／−ＳＤであり、そして４回の独立した実験を示す。
【図４】
図４は、ｂＦＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ移動に対するＴＷＥＡＫの効果を示す、棒グラフを示す。ＴＷＥＡＫ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびこれらの因子の組み合わせで処理したコンフルエントなＨＵＶＥＣ単層に傷をつけ、そして１８時間の培養後に修復を測定した。示される結果は、４回の実験の平均＋／−ＳＥＭである。
【図５Ａ】
図５Ａは、未処理、あるいはｂＦＧＦ、ＴＷＥＡＫまたはｂＦＧＦ＋ＴＷＥＡＫで処理した、３日間の培養後のフィブリンゲルマトリクスの表面上のＨＵＶＥＣの位相差画像を示す。全ての画像は、４×の倍率である。これらの結果は、８回の独立した実験を示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、フィブリンゲル培養物のヘマトキシリン染色切片およびエオシン染色切片を示す。未処理およびＴＷＥＡＫ処理した培養物中のＥＣ細胞は、フィブリンゲル表面上に残存する。浸潤しているＥＣの紐様構造が、ｂＦＧＦ処理培養物中に示され、そしてＴＷＥＡＫ＋ｂＦＧＦ処理培養物中に、内皮内腔の構造組織化が示される。同様の結果が、４つの独立したＥＣ型から得られた。
【図６】
図６は、ＴＷＥＡＫおよびｂＦＧＦでの処理後の毛細血管出芽の数を示す、棒グラフを示す。ＨＵＶＥＣをフィブリンゲルマトリクス上にプレートし、そして処理なしでか、または示されるような因子および抗ＴＮＦ  ｍＡｂおよび抗ＩＬ−８  ｍＡｂと共に４８時間で培養した。毛細血管出芽を、１ウェル当たり５つの領域を使用して、可視的に計数した。これらの結果は、４回の独立した実験を示す。
【図７】
図７は、未処理、あるいはＶＥＧＦ、ＴＷＥＡＫまたはＴＷＥＡＫ＋ＶＥＧＦで処理した、３日間の培養後のフィブリンゲルマトリクスの表面上のＨＵＶＥＣの位相差画像を示す。全ての画像は、４×の倍率である。
【図８】
図８は、ＶＥＧＦレセプターＦＬＴ１のｍＲＮＡレベルが、ＶＥＧＦのみで処理した培養物と比較して、ＴＷＥＡＫ＋ＶＥＧＦで処理した培養物において減少されることを示す、ゲル電気泳動画像である。
【図９Ａ】
図９Ａは、移植後の日数での腫瘍重量（ｍｇ）としてプロットしたＴＷＥＡＫトランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌の増殖を示す。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、移植後の日数での腫瘍重量（ｍｇ）としてプロットしたＴＷＥＡＫトランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌の増殖を示す。
【図１０】
図１０Ａは、Ｉ型膜貫通タンパク質Ｆｎ１４［Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ］のアミノ酸配列である。図１０Ｂは、Ｉ型膜貫通タンパク質Ｆｎ１４［Ｍｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓ］のアミノ酸配列である。
【００７６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Biogen Idec MA, INC.
<120> TWEAK RECEPTOR AGONISTS AS ANTI-ANGIOGENIC AGENTS BACKGROUND
<130> F103C48573
<140> JP 2002-526415
<141> 2001-09-12
<150> US 60/232,355
<151> 2000-09-14
<160> 2     
<170> PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  129
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  TRANSMEM
<222>  (1)..(129)
<223>  Type I Transmembrane Protein Fn14 (Homo sapiens)
<400>  1
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly 
1              5                  10                 15      
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly 
20                 25                 30          
Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys 
35                 40                 45             
Cys Met Asp CysAla Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys 
50                 55                 60                 
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro 
65                 70                 75                 80  
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser 
85                 90                 95      
Gly Phe Leu ValTrp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr 
100                105                110         
Pro Ile Glu GluThr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile 
115                120                125            
Gln 
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> TRANSMEM
<222> (1)..(129)
<223> Type I Transmembrane Protein Fn14 (Mus musculus)
<400> 2
Met Ala Pro GlyTrp Pro Arg Ser Leu Pro Gln Ile Leu Val Leu Gly 
1              5                  10                 15      
Phe Gly Leu Val Leu Met Arg Ala Ala Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly 
20                 25                 30          
Thr Ser Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys 
35                 40                 45             
Cys Met Asp CysAla Ser Cys Pro Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys 
50                 55                 60                 
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Phe Arg Leu Leu Trp Pro 
65                 70                 75                 80  
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Val Leu Val Leu Ala Leu Val Ser 
85                 90                 95      
Ser Phe Leu ValTrp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr 
100                105                110         
Pro Ile Glu GluThr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Gly Val Ala Leu Ile 
115                120                125             
Gln