(57)【要約】  １，５−アンヒドログルシトールの測定に干渉するグルコース及び／又はその誘導体をあらかじめ消去又は変換する工程と、その後行われる１，５−アンヒドログルシトールを測定する工程からなり、血球分離をせずに全血のままグルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換し、更に血球を分離することなく１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素を作用させ、１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定する１，５−アンヒドログルシトールの測定方法により、遠心分離機等を使用せずに微量な全血を用いた１，５−アンヒドログルシトールの測定が可能となり、従って、この測定方法はベッドサイドあるいは診察室での１，５−アンヒドログルシトールの迅速測定や患者自身による家庭での測定に適用できる。
2008072702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血中の１，５−アンヒドログルシトールを測定する方法であって、該測定に干渉するグルコース及び／又はその誘導体をあらかじめ消去又は変換する工程と、その後行われる１，５−アンヒドログルシトールを測定する工程からなり、血球分離をせずに全血のままグルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換し、更に血球を分離することなく１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素を作用させ、１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定する、１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項２】
１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素が酸化還元酵素である請求項１に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項３】
酸化還元酵素がピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ又は１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼである請求項２に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項４】
酸化還元酵素がシュードモナス属由来又はアグロバクテリウム属由来の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼである請求項３に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項５】
レドックスメディエータの存在下、電気化学的に測定する請求項１〜４のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項６】
レドックスメディエータがオスミウム錯体、キノン系化合物、フェロセン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、フェナジン系化合物、インドフェノール系化合物、ジフェニルアミン系化合物又はフェノール系化合物である請求項５に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項７】
血球分離をせずに全血のままグルコース及び／又はその誘導体を酵素を用いて消去又は変換する請求項１〜６のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項８】
安定化剤の存在下、電気化学的に測定する請求項１〜７のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項９】
安定化剤が２−スルホ安息香酸又は３−スルホ安息香酸である請求項８に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項１０】
アンペロメトリー法、クーロメトリー法又はサイクリックボルタンメトリー法により電気化学的に測定する請求項１〜９のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項１１】
１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、対極を有する電極を用いて電気化学的に測定する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項１２】
差動型電極を用いて電気化学的に測定する請求項１１に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項１３】
差動型電極が、１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、レドックスメディエータが含まれており１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素が含まれていないブランク測定用作用極と、対極を有する電極である請求項１２に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項１４】
１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、対極を有する電極を含む、全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップ。
【請求項１５】
更に、グルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換するための試薬を含む、請求項１４に記載の全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップ。
【請求項１６】
１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、レドックスメディエータが含まれており１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素が含まれていないブランク測定用作用極と、対極を有する電極からなる差動型電極を含む、請求項１４又は１５に記載の全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップ。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のセンサーチップと血液採取に使用する穿刺器具と１，５−アンヒドログルシトール用測定器を含む全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用キット。
【請求項１８】
更に、グルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換するための試薬を含む、請求項１７に記載の全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース及び／又はその誘導体の干渉を受ける、血中の１，５−アンヒドログルシトール測定方法において、検体として全血を使用し、血球分離を必要としないことを特徴とする血中１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定方法、該測定方法に使用するセンサーチップ及び該センサーチップを有する１，５−アンヒドログルシトールの測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活が豊かになるのに伴い糖尿病患者が増大している。糖尿病患者の合併症発症を予防するためには血糖値を健常者に近いレベルに保つ必要があり、患者自身が自宅で測定する自己血糖測定装置が普及している。しかし、血糖は食事により変動するため、頻回に測定する必要があり患者の負担が大きく、知識の乏しい患者自身では測定値の的確な解釈は難しく、血糖値を厳密にコントロールすることは容易ではない。
一方、１，５−アンヒドログルシトールは食事の影響を受けず、糖尿病患者の過去１週間の血糖コントロール状態を反映するので、自宅で「１週間に１回」測定するだけで、糖尿病患者は自分の血糖コントロール状態を正確に把握できる。１，５−アンヒドログルシトール自己測定キットができれば患者にとって大きなメリットがあるが、従来の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法は血球分離が必要な血清又は血漿を検体とする方法であり、測定に必要な検体量も多いため自己測定には適さない。従って、微量の全血をそのまま検体として用いるものも含めて１，５−アンヒドログルシトールの自己測定キットは実現していない。【０００３】
特許文献１〜９に記載されている１，５−アンヒドログルシトールの測定方法は、使用される検体が全血ではなく血清や血漿であり、又、電気化学的な測定方法ではない。
又、和光純薬工業（株）より販売されていた動物用１，５ＡＧキット（日本化薬（株）製）では、全血検体を使用する場合には精製水又は１０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）水溶液を加えて溶血し、更に遠心分離後に、その上清液をカラム処理して１，５−アンヒドログルシトールを色素を用いた比色法で測定している。即ち、血球分離をせずに全血をそのまま検体とする１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定方法ではない。【０００４】
従来、検体として全血ではなく血清又は血漿を用いる理由は、血球中にもグルコースが含まれており、全血にグルコースを消去又は変換する試薬を添加しても血球中のグルコースが消去又は変換されずに残り、血中１，５−アンヒドログルシトール測定工程においてグルコースが細胞膜を通ってもれ出てくるためグルコースによる干渉が完全に除去しきれず、又、血中１，５−アンヒドログルシトール検出反応で、酸化還元能のある赤血球中のヘモグロビンによる妨害が予想されたためである。今までに、全血を用いて酵素的にグルコースをあらかじめ消去又は変換し、そのまま血球分離することなく血中１，５−アンヒドログルシトールを測定する方法は知られていない。【０００５】
更に、１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定する方法は、非特許文献１、特許文献１０及び特許文献１１に記載されている。しかしながら、非特許文献１には、過酸化水素電極と酵素固定化した膜から構成される酵素センサーを用いた尿中の１，５−アンヒドログルシトールの測定が記載されているが、グルコース等が共存する全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定については記載されていない。特許文献１０では脱水素酵素と電子受容体のフェナジンメトサルフェートを用いてアンペロメトリー法で１，５−アンヒドログルシトールを測定しているが、１，５−アンヒドログルシトールの標準品についての実施例のみであり、全血中の測定については一切記載がない。又、特許文献１１には、１，５−アンヒドログルシトール酸化能を有する酵素を作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素電極で電気化学的に測定している。しかし、この測定においても血清を使用しており、全血を使用する測定方法ではない。【０００６】
ところで、１，５−アンヒドログルシトールはグルコースの１位の位置が還元された化合物であり、グルコースと極めて似た化学構造をしているため、１，５−アンヒドログルシトールの測定に使用する多くの酵素はグルコースとも反応する。血中には１，５−アンヒドログルシトールに比べて２０倍以上と遥かに多量のグルコースが含まれており、１，５−アンヒドログルシトールを測定するためにはグルコースを何らかの方法で１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素と反応しないように消去又は変換しなければならない。又、この変換により生成したグルコース誘導体が、更に１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素と反応する場合には、その誘導体も消去又は変換しなければならない。【０００７】
特許文献１ではグルコースをグルコースオキシダーゼによる酸化又はヘキソキナーゼによるリン酸化をすることにより、特許文献２ではグルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼ、又は、グルコースデヒドロゲナーゼとグルコノラクトナーゼによる酸化をすることにより、特許文献３又は４では、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼ、又は、グルコースイソメラーゼ、フルクトキナーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼによるフルクトース−１，６−二リン酸への変換により、特許文献５ではグルコキナーゼ又はヘキソキナーゼによるリン酸化をすることにより、特許文献６ではグルコース−６−リン酸化酵素によるリン酸化をすることによりグルコースの消去又は変換を行っており、その後で１，５−アンヒドログルシトールの測定を行っている。因みに、これらの文献中でグルコースは、グルコノ−１，５−ラクトン、グルコース−６−リン酸、グルコン酸、フルクトース−６−リン酸やフルクトース−１，６−二リン酸等に変換されている。しかしながら、現在まで全血を用い酵素によるグルコースの消去又は変換後、全血を用いた１，５−アンヒドログルシトールの定量を酵素を用い電気化学的に測定することについては知られていない。【０００８】
【特許文献１】特許第２９８３０１５号公報
【特許文献２】特開２００１−７８７９７号公報
【特許文献３】特許第３１７０３２０号公報
【特許文献４】特許第３２１７１８０号公報
【特許文献５】特開２００１−１１６７５６号公報
【特許文献６】特許第２８７２９８３号公報
【特許文献７】特開昭６３−１８５３９７号公報
【特許文献８】特開平１０−１９１９９８号公報
【特許文献９】特開平８−７０８９３号公報
【特許文献１０】特開平７−６７６９７号公報
【特許文献１１】特開昭６２−７９７８０号公報
【特許文献１２】特開平５−３０４９９７号公報
【特許文献１３】特開昭６３−２２１８５号公報
【特許文献１４】特開平２−２６８６７９号公報
【特許文献１５】特開２０００−１３５０７９号公報
【特許文献１６】特開平１１−１８７６０号公報
【特許文献１７】特開２０００−１７５６９８号公報
【特許文献１８】特開平１０−１７９１４０号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，ｖｏｌ．７，ｐ４１（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
最近、臨床検査において、Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇと言われるベッドサイドあるいは診察室で種々の検査項目の迅速測定が行われるようになり、又、血糖については患者自身による家庭での測定も行われるようになってきた。その際には血清や血漿を得るための遠心分離機等の使用は煩雑で時間を要するため実際の臨床現場での使用は難しく、特に患者自身による家庭での測定においては、穿刺器具とサンプル採取用器具を用いて採取される数十マイクロリットル以下の微量な血液が検体であり、遠心分離機を使用して血清を得て測定することはできない。従って、全血をそのまま検体として用いることのできる１，５−アンヒドログルシトールの測定方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、全血をそのまま検体として用いる血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定方法を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
即ち、本発明は、
（１）  全血中の１，５−アンヒドログルシトールを測定する方法であって、該測定に干渉するグルコース及び／又はその誘導体をあらかじめ消去又は変換する工程と、その後行われる１，５−アンヒドログルシトールを測定する工程からなり、血球分離をせずに全血のままグルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換し、更に血球を分離することなく１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素を作用させ、１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定する、１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（２）  １，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素が酸化還元酵素である上記（１）に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（３）  酸化還元酵素がピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ又は１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼである上記（２）に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（４）  酸化還元酵素がシュードモナス属由来又はアグロバクテリウム属由来の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼである上記（３）に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（５）  レドックスメディエータの存在下、電気化学的に測定する上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（６）  レドックスメディエータがオスミウム錯体、キノン系化合物、フェロセン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、フェナジン系化合物、インドフェノール系化合物、ジフェニルアミン系化合物又はフェノール系化合物である上記（５）に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（７）  血球分離をせずに全血のままグルコース及び／又はその誘導体を酵素を用いて消去又は変換する上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（８）  安定化剤の存在下、電気化学的に測定する上記（１）〜（７）のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（９）  安定化剤が２−スルホ安息香酸又は３−スルホ安息香酸である上記（８）に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（１０）  アンペロメトリー法、クーロメトリー法又はサイクリックボルタンメトリー法により電気化学的に測定する上記（１）〜（９）のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（１１）  １，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、対極を有する電極を用いて電気化学的に測定する上記（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（１２）  差動型電極を用いて電気化学的に測定する上記（１１）に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；
（１３）  差動型電極が、１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、レドックスメディエータが含まれており１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素が含まれていないブランク測定用作用極と、対極を有する電極である上記（１２）に記載の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法；【００１２】
（１４）  １，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、対極を有する電極を含む、全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップ；
（１５）  更に、グルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換するための試薬を含む、上記（１４）に記載の全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップ；
（１６）  １，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、レドックスメディエータが含まれており１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素が含まれていないブランク測定用作用極と、対極を有する電極からなる差動型電極を含む、上記（１４）又は（１５）に記載の全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップ；【００１３】
（１７）  上記（１４）〜（１６）のいずれか一項に記載のセンサーチップと血液採取に使用する穿刺器具と１，５−アンヒドログルシトール用測定器を含む全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用キット；
（１８）  更に、グルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換するための試薬を含む、請求項１７に記載の全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用キット
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、検体として全血を用いる１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定が可能となり、血球分離を必要としないので遠心分離機等を使うことがなく、測定が簡便となり、患者自身による家庭での測定も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、グルコースの干渉を受ける血中の１，５−アンヒドログルシトール測定において、全血を検体として用い血球分離を必要としないことを特徴とする血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定方法である。即ち、本発明の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法は、血球分離をせずに全血のままグルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換処理し、更に血球を分離することなく１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素を作用させ、１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定することを特徴とする。前述のように１，５−アンヒドログルシトールを測定するための酵素はグルコースも基質とするため、グルコースの干渉を受けないようにグルコース及び／又はその誘導体を消去又は変換処理する必要がある。
本発明の測定方法におけるグルコース及び／又はその誘導体をあらかじめ消去又は変換する工程と１，５−アンヒドログルシトールを測定する工程は連続して行っても、他の工程をはさんで順次行ってもよい。【００１６】
本発明が適用される全血とは、血球を分離していない採血した状態のままの血液であり、採血用の採血管等に含まれるヘパリン、フッ化ナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤等を含んでいてもよい。なお、保存した血液の場合には、フッ化ナトリウムとヘパリンを含有する採血管で採血したものが好ましい。又、本発明の全血には採血管等を使用せずに、自己血糖測定に用いられる穿刺器具等により採血した血液等も含まれる。採血部位も指先のほか、前腕外側や腹壁又は上腕外側等特に制限はない。採血量は、例えば、５０μＬ以下、好ましくは０．１μＬ〜３０μＬ、より好ましくは３μＬ〜２０μＬあればよい。【００１７】
本発明におけるグルコース及び／又はその誘導体を該測定に干渉しない物質へ消去又は変換する工程は、目的とする血中１，５−アンヒドログルシトールの測定に影響を与えなければ特に限定されず、例えば、特許文献１〜９等に記載のグルコース及び／又はその誘導体を測定に干渉しない物質へ消去又は変換する方法が挙げられるが、好ましくは酵素を使用する方法が挙げられ、例えば、グルコースを酵素的酸化又は酵素的リン酸化する方法が挙げられる。
全血を用いた酵素によるグルコースの消去又は変換は前記の予想に反して問題なく進行し、後記の実施例にも示すように全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定が可能となった。【００１８】
グルコースの酵素的酸化方法としては、例えば、グルコースオキシダーゼによりグルコースを酸化する方法、グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコース脱水素酵素）により補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）若しくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の存在下にグルコースを酸化する方法等が挙げられ、又、グルコースの酵素的リン酸化する方法としては、例えば、ヘキソキナーゼ若しくはグルコキナーゼによりグルコースをリン酸化してグルコース−６−リン酸とする方法等が挙げられる。１，５−アンヒドログルシトールの測定に用いる酵素の種類によっては、グルコースをリン酸化して生成したグルコース−６−リン酸を更に変換する必要がある。この場合、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、補酵素ＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋の存在下にグルコースをグルコノラクトン−６−リン酸に酸化する方法、アデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）やアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）の存在下、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼを作用させてグルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換する方法やヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）やヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の存在下、グルコースイソメラーゼ、フルクトキナーゼ及び６−ホスホフルクトキナーゼを作用させてグルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に変換する方法等が挙げられる。【００１９】
中でも好ましくは、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼによるグルコースをリン酸化する方法であり、特に好ましくは、例えば、マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の存在下でヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼによって行われる酵素サイクリング法によるグルコースをリン酸化する方法である。【００２０】
上記変換に使用する酵素としては、１，５−アンヒドログルシトールを基質としない酵素であれば特に制限は無く、例えば、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でグルコースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．４、グルコースデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．１．４７、ＥＣ１．１．１．１１８、ＥＣ１．１．１．１１９、ＥＣ１．１．９９．１０、ヘキソキナーゼ：ＥＣ２．７．１．１、グルコキナーゼ：ＥＣ２．７．１．２、ホスホヘキソースイソメラーゼとして、グルコース−６−ホスフェートケトールイソメラーゼ：ＥＣ５．３．１．９、グルコースイソメラーゼ：ＥＣ５．３．１．１８、フルクトキナーゼ：ＥＣ２．７．１．４、６−ホスホフルクトキナーゼとして、ホスホヘキソキナーゼ：ＥＣ２．７．１．１１に分類されるものが使用でき、市販の酵素も使用し得る。ヘキソキナーゼは、ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、特にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等であっても何ら問題ない。【００２１】
又、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼによりグルコースを酸化する方法においては、生成するグルコノ−１，５−ラクトンを完全にグルコン酸に変換するためグルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．１７）を使用することも可能であり、必要に応じてムタロターゼ（ＥＣ５．１．３．３）と組み合わせてもよい。【００２２】
１，５−アンヒドログルシトールを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換し、１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に作用する酵素を用いて測定する方法においては、グルコースと１，５−アンヒドログルシトールを共にリン酸化するヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼも本発明の測定方法に使用可能である。【００２３】
本発明におけるグルコース及び／又はその誘導体を該測定に干渉しない物質への変換は、例えば、変換試薬と全血を接触させることにより行われる。具体的には、両者をあらかじめ容器中で混合することによって行っても、該変換試薬を後記のセンサーチップ上に担持させて行ってもよい。該変換試薬としては、例えば、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）及び／又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウム、及び塩化カリウムからなる溶液、又はその溶液を乾燥した剤が挙げられる。
ヘキソキナーゼは酵母由来のものが好ましく、グルコキナーゼはバチルスステアロサーモフィラス由来のものが好ましい。変換試薬にはヘキソキナーゼとグルコキナーゼを両方含有しても、どちらか片方でもよく、ヘキソキナーゼ及び／又はグルコキナーゼの変換試薬溶液中の濃度は１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬである。
変換試薬溶液中のピルビン酸キナーゼの濃度は１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬであり、ＡＴＰの濃度は１ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜８０ｍＭであり、ホスホエノールピルビン酸の濃度は１０ｍＭ〜１５００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭであり、塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウムの濃度は１ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭであり、塩化カリウムの濃度は１ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは、５ｍＭ〜５０ｍＭである。【００２４】
更に、変換試薬にアスコルビン酸酸化酵素、尿酸酸化酵素、ビリルビン酸化酵素等の各干渉物質に作用する酵素を加えることは、グルコース以外の干渉物質の測定への妨害を除去するために効果的である。例えば、アスコルビン酸酸化酵素の変換試薬溶液中の濃度は１Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬである。【００２５】
次に、全血中の１，５−アンヒドログルシトールを酵素を用いて電気化学的に測定する工程について説明する。該測定としては、例えば、酵素による酸化還元反応に伴う過酸化水素を直接測定する方法あるいは酸化還元反応に関与する電子の授受の仲立ちを担うレドックスメディエータを使用して測定する方法等が挙げられる。
該酵素としては、１，５−アンヒドログルシトールを酸化する酵素が挙げられ、酸化還元酵素が好ましく、例えば、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法で、ピラノースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．１０、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．１１、Ｌ−ソルボースデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．９９．１２、１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．９９．１３に分類される酵素等が挙げられる。【００２６】
該酸化還元酵素としては、例えば、特許文献１２に記載のバシジオマイセタウス  フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）Ｎｏ．５２（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１０６）や特許文献７に記載のポリポラス  オブツサス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２６７３３等の産生するピラノースオキシダーゼ、トラメテス  サングイネア（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅａ）ＩＦＯ４９２３の産生するＬ−ソルボースオキシダーゼ、特許文献１３に記載のグルコノバクター  オキシダンス  ＵＶ−１０（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−８４２２）等の産生するＬ−ソルボースデヒドロゲナーゼ、特許文献１１に記載のシュードモナス属ｓｐ．ＮＫ−８５００１（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７）等の産生する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素）、特許文献１４に記載のオイペニシリウム  クルスタセウム  ＩＦＯ−８９３８等の真菌類の産生する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ、特許文献１５に記載のトリコデルマ  ロンギブラキアツムＫＤＫ３００３（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４５８）等の産生する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ、特許文献１６に記載のラフネラ  アクアティリス４７４（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６１５８）、エンテロバクター  クロアカエ３４０（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６１５７）及びセラチア  マルセッセンス８２５（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６１５９）等の産生する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ、特許文献６に記載の電子受容体を介さずに１，５−アンヒドログルシトールを脱水素化できるアグロバクテリウム  ツメファシエンスＮＴ１１３０株（（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター；受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９９７）の産生する１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ、特許文献１０に記載のサイトファーガ  マリフラバＡＴＣＣ１９３２６等の産生するＤ−グルコシド−３−デヒドロゲナーゼや特許文献１７、特許文献１８、特許文献１２に記載の酵素等が挙げられ、又、その他の市販の１，５−アンヒドログルシトールを酸化する酸化還元酵素等も使用できる。
中でもピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ又は１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼが好ましい。
更に、これらの酵素の遺伝子を特定し、通常の遺伝子操作技術により改良・改変した後に、組換え大腸菌等を用いて製造した酵素も１，５−アンヒドログルシトールを基質とする酸化還元酵素であれば本発明の測定方法に使用可能である。【００２７】
電気化学的測定方法としては、例えば、アンペロメトリー法（電流測定方法）、クーロメトリー法（電量測定方法）、電位スイープ法やサイクリックボルタンメトリー法等が挙げられ、中でもアンペロメトリー法あるいはクーロメトリー法が好ましい。【００２８】
電気化学的測定方法に使用する電極としては、絶縁性の基板上に、例えば、金、白金、カーボン、パラジウム又は銀、銀塩化銀で形成することができる。絶縁性の基板の材料は、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート若しくはポリビニルカーボネート等のプラスチック又はガラス等であり、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。これらの基板上に、スクリーン印刷法、真空蒸着法、スパッタ法等により電極を形成することができ、中でもスクリーン印刷法が好ましい。即ち、ポリエチレンテレフタレートの基板に導電性カーボンインク又は銀塩化銀を用いてスクリーン印刷し、１００℃〜１５０℃で焼入れすることにより電極を形成するのが好ましい。【００２９】
本発明の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定に使用する電極としては、作用極、対極、参照極を形成する３電極であっても、作用極、対極を形成する２電極であっても、そのどちらも使用可能である。一般的に、３電極を使用する測定では、参照極を基準にして作用極に電位を印加して、作用極と対極間を流れる電流を測定する。２電極を使用する測定では、対極を参照極として併用して対極を基準に作用極に一定の電位を印加して作用極と対極間を流れる電流を測定する。【００３０】
電気化学的測定には種々の方法が考えられるが、本発明においては、発生する過酸化水素を直接過酸化水素電極を用いて測定する方法あるいは酸化還元反応に関与する電子の授受の仲立ちを担うレドックスメディエータを使用して測定する方法等が挙げられる。
該レドックスメディエータとしては、酸化型メディエータ又は還元型メディエータが挙げられ、酸化型メディエータが好ましく、中でもオスミウム錯体、キノン系化合物、フェロセン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、フェナジン系化合物、インドフェノール系化合物、ジフェニルアミン系化合物、フェノール系化合物等が、より好ましい。オスミウム錯体としては、例えば、［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２やそのポリマー体；キノン系化合物としては、例えば、ベンゾキノン、２−メチルベンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン、２，６−ジクロロベンゾキノン、２，５−ジヒドロキシベンゾキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−メチル−１，４−ナフトキノン、２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）又はユビキノン；フェロセン系化合物としては、例えば、フェロセニルＰＥＧ、フェロセニルＴＭＡ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルフェロセン又はフェロセンメタノール；フェノチアジン系化合物としては、例えば、チオニン、メチレンブルー、メチレングリーン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７’−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩、トルイジンブルーＯ、アズールＩ、アズールＣ、アズールＡ、ニューメチレンブルー又はベンゾイルロイコメチレンブルー；フェノキサジン系化合物としては、例えば、メルドラブルー；フェナジン系化合物としては、例えば、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシフェナジンメトサルフェート、サフラニン又はフェノサフラニン；インドフェノール系化合物としては、例えば、２−ジクロロフェノール−インドフェノール（ＤＣＩＰ）；ジフェニルアミン系化合物としては、例えば、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル−１，４−フェニレンジアミン塩酸塩、又はＮ−メチル−Ｎ−（３−メトキシフェニル）−１，４−フェニレンジアミン塩酸塩；フェノール系化合物としては、例えば、ｐ−アミノフェノール等が挙げられる。【００３１】
その他、本発明に使用可能なメディエータとしては、フェリシアン系化合物（フェリシアン化カリウム等）、ルテニウム錯体若しくはそのポリマー体、ビピリジン系化合物（メチルビオローゲン等）、トリフェニルメタン系化合物（マラカイトグリーンやＴＰＭ−ＰＳ等）、ベンゾチアゾリン系化合物（２−ヒドラゾノ−２，３−ジヒドロ−３−メチル−６−ベンゾチアゾールやそのスルホン酸塩等）、シアニン系化合物（ガロシアニン、フタロシアニンやフィコシアニン等）、アゾ系化合物（マゼンタＪ−３ＧＬ、イエローＣ−Ｙ９やブラックＣ−ＢＫ４等）、ビピリジルアゾ系化合物（５−Ｂｒ−ＰＳＡＡ、５−Ｂｒ−ＰＡＰＳやＴＡＭＳＭＢ等）、アニリン若しくはその誘導体（ＤＡＰＳ、ＨＡＬＰＳ、ＡＤＰＳ、ＡＬＰＳ、ＴＯＯＳやＡＬＯＳ等）、ポリアニリン若しくはその誘導体、フェノール系化合物（ｐ−アミノフェノール等）、フェニレンジアミン系化合物（バリアミンブルーＢや２，３，５，６−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン等）、ローダミン系化合物（ローダミンＢ等）、キサンテン系化合物（ピロニンＹ、ピロニンＢやフルオレセインナトリウム等）、イソアロキサジン系化合物（リボフラビンやＦＡＤ等）、インジゴ系化合物（インジゴトリスルホン酸やインジゴカーミン等）、フェナントロリン系化合物（バソクブロインスルホン酸ナトリウムやバソフェナントロリンスルホン酸ナトリウム等）、スルホフタレイン系化合物（メチルチモルブルー等）、ベンチジン系化合物（ＴＭＢＺ、ＴＭＢＺ・ＰＳ、ＤＡＢやアニシジンブルー等）、テトラゾリウム系化合物（ＷＳＴ−１、ＭＴＴ、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢやＸＴＴ等）、チトクロムＣやルミクロム、フェレドキシン類、ＥＤＴＡ類、ＮＡＤやＮＡＤＰ等が挙げられる。【００３２】
本発明の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定において電極に担持させる、前記酵素やレドックスメディエータなどの化合物は、電極試薬として、精製水又は適当な緩衝液に溶解して、電極試薬溶液として、電極に塗布して適用する。
該電極試薬に含有される前記のレドックスメディエータの濃度は、例えば、電極塗布時の精製水又は適当な緩衝液に溶解した電極試薬溶液中の濃度として０．０１μＭ〜１Ｍ程度、好ましくは０．１μＭ〜２００ｍＭであり、前記の酵素の濃度は、例えば、電極塗布時の精製水又は適当な緩衝液に溶解した電極試薬溶液中の濃度として０．１Ｕ／ｍＬ〜５０００Ｕ／ｍＬ程度、好ましくは１Ｕ／ｍＬ〜２０００Ｕ／ｍＬである。該緩衝液としては、通常の生化学反応で用いられる緩衝液が使用可能であり、例えば、２−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液、トリス緩衝液、燐酸緩衝液等が挙げられる。そのｐＨは３〜１０、好ましくは５〜９である。緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５ｍＭ〜５００ｍＭである。【００３３】
電極試薬溶液には、酵素やレドックスメディエータの安定性を高め、長期間にわたる安定した１，５−アンヒドログルシトールの測定を可能にせしめ、血液の測定において精度よい１，５−アンヒドログルシトールの測定を可能とする安定剤として、スルホ安息香酸、糖、糖アルコール等の低分子化合物や、アルブミン等のタンパク質、カルボキシルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の親水性高分子化合物等を含むことが好ましい。スルホ安息香酸として好ましくは２−スルホ安息香酸又は３−スルホ安息香酸が挙げられる。スルホ安息香酸などの低分子を該安定化剤として使用する場合、その濃度は、例えば、電極塗布時の電極試薬溶液中の濃度として０．１ｍＭ〜５００ｍＭ程度、好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ程度である。アルブミンなどの親水性高分子を該安定化剤として使用する場合、その濃度は、例えば、電極塗布時の電極試薬溶液中の濃度として０．０１％〜２０％程度、好ましくは０．０２％〜１０％程度である。【００３４】
前記電極には前記電極試薬を担持させることが好ましい。その作成は公知の方法が使用可能であり、例えば、前記電極試薬の一定量をスポッティング、ディッピングやスピンコートにより電極に塗布し、乾燥して作成する。又、このような物理的な吸着法以外に、前記電極試薬を電極上に化学的に結合させて作成してもよい。
前記安定化剤は、前記電極試薬溶液に添加した後、塗布・乾燥して電極上に担持させても、前記酵素等が担持されている層の上に積層して担持させてもよい。【００３５】
次に、差動型電極について説明する。
差動型電極とは、例えば、酸化還元型酵素とレドックスメディエータ試薬を担持した作用極（例えば、１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極）と、酸化還元型酵素を含まずレドックスメディエータ試薬を担持した作用極（例えば、ブランク測定用作用極）と、対極を有し、レドックスメディエータ等に関係する干渉物質を含む検体を酸化還元型酵素とレドックスメディエータ試薬を担持した作用極と酸化還元型酵素を含まずレドックスメディエータ試薬を担持した作用極を用いて同時測定し、干渉によるシグナル部分を差し引くことにより干渉物質の影響を除く電極であり、そのような働きをするものであればどのような構造であっても構わない。例えば、後述の実施例に記載した１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極、レドックスメディエータが含まれているブランク測定用作用極と、対極を有する差動型電極が挙げられる。【００３６】
この差動型電極を使用した電気化学的測定方法は差動法と呼ばれ、グルコースを測定対象とする例が知られている。その場合の干渉物質は尿酸とアスコルビン酸であるが、これらの血中濃度は、グルコース；５５００μｍｏｌ／Ｌ〜３３０００μｍｏｌ／Ｌに対して尿酸；１２０μｍｏｌ／Ｌ〜７７０μｍｏｌ／Ｌ、アスコルビン酸；１１μｍｏｌ／Ｌ〜２１０μｍｏｌ／Ｌであり、測定対象物であるグルコースの濃度に比べて非常に低い濃度である。
一方、１，５−アンヒドログルシトールの血中濃度は６μｍｏｌ／Ｌ〜３００μｍｏｌ／Ｌであり、グルコースに比べて極めて低い。血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定においても、同様に尿酸とアスコルビン酸は干渉物質となるが、その濃度は１，５−アンヒドログルシトールとほぼ同等若しくはそれ以上である。
即ち、測定対象物の濃度より干渉物質の濃度が有意に低い場合の差動法による測定は知られているが、測定対象物の濃度より干渉物質の濃度が同等又は高い場合での差動法による測定についてはこれまで報告がない。従って、１，５−アンヒドログルシトール（測定対象物）の濃度に対して、同等又はそれ以上の濃度で干渉物質（尿酸、アスコルビン酸）が存在する場合にも差動法が有効で、正確な測定結果が得られるかどうかは知られていなかった。【００３７】
本発明の１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップは、絶縁性の支持体上に形成された前記電極、測定器に接続するための接続部、電極と接続部を繋ぐリード部、更に電極の面積を一定にしてリード部を絶縁するためのレジスト（絶縁部）等を含み、更に検体である血液の採取口、血液が入る空間や流路等から形成される。これらの構造はポリエチレンフィルムやポリイミドフィルム等のフィルム剤、ホットメルト等の接着剤、両面テープ等のテーピング剤等により形成される。【００３８】
電極に電極試薬を担持せず、あらかじめ検体と該試薬を混合して添加するセンサーチップによっても１，５−アンヒドログルシトールを測定することはできるが、１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極と、対極を有する電極を含むセンサーチップが好ましく、又、１，５−アンヒドログルシトール測定用の酸化還元酵素及びレドックスメディエータが含まれている１，５−アンヒドログルシトール測定用作用極、酸化還元酵素を含まずレドックスメディエータが含まれているブランク測定用作用極と、対極を有する差動型電極を含むセンサーチップが、より好ましい。対極には必要に応じて前記電極試薬を担持させてもよい。
更に、グルコース及び／又はその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換するための工程を行う試薬を含む前処理部を有するセンサーチップであってもよい。【００３９】
本発明で使用するセンサーチップの一例の簡略図を図１〜図３に示す。【００４０】
本発明には、少なくとも前記センサーチップと血液採取に使用する穿刺器具と１，５−アンヒドログルシトール用測定器を含む全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用キットも含まれる。穿刺器具は、自己血糖測定装置に付けられている穿刺器具と同様なものでもよい。このキットには、更に、グルコース及び／又はその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換するための工程に使用する試薬が含まれていてもよい。【００４１】
更に、この１，５−アンヒドログルシトール用測定キットにはサンプル採取用器具、前処理用試薬、キャリブレータ等を有していてもよい。サンプル採取用器具としては数十μＬ以下程度の全血を採取できれば特に限定されず、ヘマトクリット測定時に使用するキャピラリーと同様なものでもよい。【００４２】
以下、実施例、参考例により本発明を更に詳細に説明するが、これらは本発明の一態様を示すものであり、本発明を限定するものではない。実施例中の各酵素は文献公知の方法で得たもの又は市販のものを使用した。
すべての実施例と参考例９、１０、１１における電気化学検出器は、（株）東方技研製ＧＰＩＢ  ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８を使用し、参考例７，８における電気化学検出器は、（株）東方技研製ファンクションジェネレーターＦＧ−０２付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８を使用した。
なお、図中の１，５ＡＧは１，５−アンヒドログルシトールを意味する。【００４３】
実施例１
１）グルコース変換試薬
１）グルコース変換試薬
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．０に調整した後の組成が、１７．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１７．６ｍＭのＫＣｌ、１７５．７ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１７．６ｍＭのＡＴＰ、１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、７５Ｕ／ｍＬのグルコキナーゼ、２００Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸酸化酵素、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のＮａＮ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０６％のＢＳＡ（牛血清アルブミン）となるように１０．０ｍＭのＭＥＳ緩衝液に各成分を加え、グルコース変換試薬とした。【００４４】
２）電極試薬溶液
特許第３７１３０４９号公報に記載のオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）を２３．６ｍＭ、ピラノースオキシダーゼ（バシジオマイセタウス・フンギＮｏ．５２由来）を９３０Ｕ／ｍＬ、３−スルホ安息香酸を５０ｍＭの組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【００４５】
３）センサーチップ
ポリエチレンテレフタレートの基盤に作用極とリード部、対極とリード部をカーボンインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名カーボンペーストＴＵ１５ＳＴ）で、厚さ１０μｍでスクリーン印刷し、１５０℃で４０分焼入れし、次いで電極部と、測定装置との接続部とを除く部分にレジストインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名ＣＲ１８Ｇ−ＫＦ）を厚さ２０μｍでスクリーン印刷し、１３０℃で１５分焼入れをして、図１に示す電極１１を製造した。
上記の２）電極試薬溶液４μＬを電極１１の検体添加位置１に塗布して、５０℃で１３分乾燥してセンサーチップを作製した。【００４６】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、血漿に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた５検体（血球分離操作を除いて後記参考例１の操作で求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は３．８、７．８、１５．８、３１．４、６３．９μｇ／ｍＬであった）各２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１１の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器（ＧＰＩＢ  ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８；（株）東方技研）で測定した。電流値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。【００４７】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
上記４）の検体と尿酸値のほぼ等しい若しくは測定検体の尿酸値の低い健常人３名の全血各２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１１の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。上記４）の検量線を用い、３検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた結果を表１に示す。なお、検量線作成用検体は４回測定したその平均値、検体は１回測定した値である。【００４８】
参考例１
実施例１の５）で測定したのと同じ健常人３名の全血検体を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、その上清（血漿）を１，５−アンヒドログルシトール測定用試薬（ラナ１，５ＡＧオートリキッド；日本化薬（株）製）と自動分析装置７１５０形（（株）日立製作所製）にて、以下のパラメータで１，５−アンヒドログルシトールを定量測定し、結果を表１に示す。【００４９】
分析法                                                ２ポイント
測定ポイント                                          ２４−５０
検体量                                                    ８μＬ
ラナ１，５ＡＧオートリキッドの前処理液（Ｒ１）        ２４０μＬ
ラナ１，５ＡＧオートリキッドの発色液（Ｒ２）          １２０μＬ
温度                                                      ３７℃
測定波長（副／正）                            ７００／５４６ｎｍ【００５０】
【表１】
2008072702.tif 000003
【００５１】
全血を用い、これにグルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、電極試薬と反応させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例１）は、公知の測定方法による参考例１の測定値とよい一致（相関係数；０．９８８１）を示し、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定が可能であることを示している。【００５２】
実施例２
１）グルコース変換試薬
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．０に調整した後の組成が、１７．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１７．６ｍＭのＫＣｌ、１７５．７ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１７．６ｍＭのＡＴＰ、１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、９７Ｕ／ｍＬのヘキソキナーゼ及び２０Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸酸化酵素となるように１０．０ｍＭのＭＥＳ緩衝液に各成分を加え、グルコース変換試薬とした。【００５３】
２）電極試薬溶液
（ｉ）１，５−アンヒドログルシトール測定用
２３．６ｍＭのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）、４６５．２Ｕ／ｍＬのピラノースオキシダーゼ（バシジオマイセタウス・フンギＮｏ．５２由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。
（ｉｉ）ブランク測定用
２３．６ｍＭのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）の組成となるように精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【００５４】
３）センサーチップ
実施例１の３）と同様に製造した電極１１を２個用意し、上記の２）の１，５−アンヒドログルシトール測定用又はブランク測定用の各電極試薬溶液４μＬをそれぞれの電極の検体添加位置１に塗布して、５０℃で１３分乾燥して１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用のセンサーチップを作製した。【００５５】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、血漿に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた５検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は９．４、１８．８、３７．５、７５．０、１５０．０μｇ／ｍＬであった）各２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用の電極１１の検体添加位置１に、それぞれ反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップから得られた電流値とブランク測定用センサーチップから得られた電流値との差の値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。【００５６】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
１，５−アンヒドログルシトールを測定する健常人６名の全血２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用の電極１１の検体添加位置１に、それぞれ反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップから得られた電流値とブランク測定用センサーチップから得られた電流値との差の値を検量線と対比して、６検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた。結果を表２に示す。なお、検量線作成用検体は４回測定したその平均値、検体は１回測定した値である。【００５７】
参考例２
実施例２の５）で測定したのと同じ全血検体を参考例１の操作方法で１，５−アンヒドログルシトールを定量測定した。結果を表２に示す。【００５８】
【表２】
2008072702.tif 000004
【００５９】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで電極試薬と反応させて差動法により測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値は、参考例２の測定値と相関がよく（相関係数；０．８９４３）、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定が可能であることを示している。【００６０】
実施例３
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。【００６１】
２）電極試薬溶液
（ｉ）１，５−アンヒドログルシトール測定用
２３．６ｍＭのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）、９３０Ｕ／ｍＬのピラノースオキシダーゼ（バシジオマイセタウス・フンギＮｏ．５２由来）、５０ｍＭの３−スルホ安息香酸の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。
（ｉｉ）ブランク測定用
２３．６ｍＭのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）、５０ｍＭの３−スルホ安息香酸の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【００６２】
３）センサーチップ
上記の実施例２の３）と同様にして１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップとブランク測定用センサーチップを作製した。【００６３】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、血漿に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた５検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は９．５、１９．６、３９．６、７８．５、１５９．８μｇ／ｍＬであった）各２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用の電極１１の検体添加位置１に、それぞれ反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップから得られた電流値とブランク測定用センサーチップから得られた電流値との差の値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。【００６４】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
１，５−アンヒドログルシトールを測定する健常人６名の全血２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用の電極１１の検体添加位置１に、それぞれ反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップから得られた電流値とブランク測定用センサーチップから得られた電流値との差の値を検量線と対比して、６検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた。結果を表３に示す。なお、検量線作成用検体は４回測定したその平均値、検体は１回測定した値である。【００６５】
参考例３
実施例３の５）で測定したのと同じ全血検体を参考例１と同様の操作方法で１，５−アンヒドログルシトールを定量測定した。結果を表３に示す。【００６６】
【表３】
2008072702.tif 000005
【００６７】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで電極試薬と反応させて差動法により測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例３）は、公知の測定方法による参考例３の測定値とよい一致（相関係数；０．９９８２）を示し、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定が可能であることを示している。又、先の実施例２（相関係数；０．８９４３）と比べると更に相関がよいことが明らかである。即ち、安定化剤と差動法を組み合わせることで、全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定において、より精度がよくなることを示している。【００６８】
実施例４
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。【００６９】
２）電極試薬溶液
（ｉ）１，５−アンヒドログルシトール測定用
１１．８ｍＭのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）、１１１．０Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。
（ｉｉ）ブランク測定用
１１．８ｍＭのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）の組成となるように精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【００７０】
３）センサーチップ
実施例１の３）と同様に製造した電極１１を２個用意し、上記の２）の１，５−アンヒドログルシトール測定用又はブランク測定用の各電極試薬溶液４μＬをそれぞれの電極の検体添加位置１に塗布して、５０℃で８分乾燥して１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用のセンサーチップを作製した。【００７１】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、血漿に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた３検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は２４．２、４９．３、９８．８μｇ／ｍＬであった）各２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用の電極１１の検体添加位置１に、それぞれ反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップから得られた電流値とブランク測定用センサーチップから得られた電流値との差の値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。【００７２】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
１，５−アンヒドログルシトールを測定する健常人４名の全血２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用の電極１１の検体添加位置１に、それぞれ反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップから得られた電流値とブランク測定用センサーチップから得られた電流値との差の値を、検量線と対比して、４検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた。結果を表４に示す。なお、検量線作成用検体は４回測定したその平均値、検体は１回測定した値である。【００７３】
参考例４
実施例４で測定したのと同じ全血検体を参考例１の操作方法で１，５−アンヒドログルシトールを定量測定した。結果を表４に示す。【００７４】
【表４】
2008072702.tif 000006
【００７５】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを含む電極試薬と反応させて差動法により測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例４）は、参考例４の測定値と相関よく（相関係数；０．９９７４）、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定が可能であることを示している。【００７６】
参考例５
１）グルコース変換試薬
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．０に調整した後の組成が、１７．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１７．６ｍＭのＫＣｌ、１７５．７ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１７．６ｍＭのＡＴＰ、１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）及び９７Ｕ／ｍＬのヘキソキナーゼとなるように１０．０ｍＭのＭＥＳ緩衝液に各成分を加え、グルコース変換試薬とした。【００７７】
２）電極試薬溶液
１１．８ｍＭのオスミウム（ＩＩＩ）錯体（［Ｏｓ（ＩＩＩ）（ビピリジル）２（イミダゾイル）Ｃｌ］Ｃｌ２）、９３０Ｕ／ｍＬのピラノースオキシダーゼ（バシジオマイセタウス・フンギＮｏ．５２由来）及び５０ｍＭの２−スルホ安息香酸（参考例５−１）又は５０ｍＭの３−スルホ安息香酸（参考例５−２）の組成となるように各成分を精製水に溶解して、２種類の組成の電極試薬溶液を調製した。スルホ安息香酸を添加しない場合を参考例５−３とする。【００７８】
３）センサーチップ
上記の実施例１の３）と同様にして１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップを作製した。【００７９】
４）測定操作
上記の３）で作成したセンサーチップを、０日目（作成直後）と室温で湿度約２０％にて５日間保存後に、１，５−アンヒドログルシトール０μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬの試料２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１１の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、８０秒後に対極を基準に０．１５Ｖで１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。４回測定しその平均値、標準偏差及び変動比の結果を表５−１及び表５−２に示す。【００８０】
【表５−１】
2008072702.tif 000007
【００８１】
【表５−２】
2008072702.tif 000008
【００８２】
参考例５−１及び参考例５−２は、参考例５−３に比べて、変動比（５日目の平均電流値／１日目の平均電流値）が小さく、電流値の経時的上昇変動を抑制している。更に、標準偏差も小さく、測定の信頼性、即ち測定精度が向上していることを示している。この結果は電極試薬への安定化剤の添加による効果を示しており、全血を使用した１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定にも適用できる。【００８３】
実施例５
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。【００８４】
２）前処理操作（１，５−アンヒドログルシトール測定及びブランク測定共通）
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として血漿に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた４検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は３．８、７．８、１５．８、３１．４μｇ／ｍＬであった）又はヒトの全血４検体の各１０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。【００８５】
３）電極測定の前操作
（ｉ）１，５−アンヒドログルシトール測定用操作
前記の前処理操作後の溶液に、２２．０ｍＭの２，６−ジメチルベンゾキノンを溶解した１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μＬと、２００Ｕ／ｍＬのピラノースオキシダーゼ（バシジオマイセタウス・フンギＮｏ．５２由来）を溶解した１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μＬを順次加え、混合して５分間放置した。
（ｉｉ）ブランク測定用操作
前記の前処理操作後の溶液に、２２．０ｍＭの２，６−ジメチルベンゾキノンを溶解した１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μＬ、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５μＬを順次加え、混合して５分間放置した。【００８６】
４）センサーチップでの測定操作
ポリエチレンテレフタレートの基盤に作用極とリード部、対極とリード部、参照極とリード部をカーボンインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名カーボンペーストＴＵ１５ＳＴ）で、厚さ１０μｍでスクリーン印刷し、１５０℃で４０分焼入れし、次いで電極部と、測定装置との接続部とを除く部分にレジストインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名ＣＲ１８Ｇ−ＫＦ）を厚さ２０μｍでスクリーン印刷し、１３０℃で１５分焼入れして、図２に示す電極１２を作成した。
電極１２の検体添加位置１に上記３）の各反応液１５μＬを滴下し、参照極を基準に０．５Ｖを１０秒間印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器で１，５−アンヒドログルシトール測定用とブランク測定用についてそれぞれ測定した。【００８７】
５）１，５−アンヒドログルシトール量の算出
上記１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用検体を用いた操作で得られた１，５−アンヒドログルシトール測定用から得られた電流値から、ブランク測定から得られた電流値を差し引いた電流値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。
ヒトの全血４検体について同様に１，５−アンヒドログルシトール測定用から得られた電流値からブランク測定用から得られた電流値を差し引いた電流値と検量線とを対比して、全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた。結果を表６に示す。なお、検量線作成用検体は４回測定したその平均値、検体も４回測定したその平均値である。【００８８】
参考例６
実施例５で測定したのと同じ全血検体を参考例１と同様の操作方法で１，５−アンヒドログルシトールを定量測定し、結果を表６に示す。【００８９】
【表６】
2008072702.tif 000009
【００９０】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、電極に担持していない電極試薬と反応させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例５）は、公知の測定方法による参考例６の測定値とよい一致（相関係数；０．９９４１）を示し、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定が可能であることを示している。【００９１】
参考例７
Ｄｅｎｋｉ  Ｋａｇａｋｕ  Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１０，ｐ９０６−９１３（１９９５）に記載されている酵素とメディエータの反応速度の評価方法に従い、前記バシジオマイセタウス・フンギＮｏ．５２由来のピラノースオキシダーゼと表７に示した各レドックスメディエータと１，５−アンヒドログルシトールとの反応を調べた。【００９２】
ポリエチレンテレフタレートの基盤に作用極とリード部、対極とリード部をカーボンインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名カーボンペーストＴＵ１５ＳＴ）で、参照極とリード部を銀塩化銀インク（アチソン（株）製、製品ＥｌｅｃｔｒｏｄａｇＰＥ−４０９）で、厚さ１０μｍでスクリーン印刷し、１５０℃で４０分焼入れし、次いで電極部と、測定装置との接続部とをのぞく部分にレジストインク（（株）アサヒ化学研究所製、製品名ＣＲ１８Ｇ−ＫＦ）を厚さ２０μｍでスクリーン印刷し、１３０℃で１５分焼入れして図３に示す電極１３を作成した。
電気化学的な測定は、電気化学検出器（ファンクションジェネレーターＦＧ−０２付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８；（株）東方技研）を使用した。【００９３】
ピラノースオキシダーゼ２０Ｕ／ｍＬと、表７に示したそれぞれのレドックスメディエータ６０μＭとを含む水溶液１０μＬを、電気化学検出器に接続した電極１３の検体添加位置１に載せ、電極１３の参照極を基準に−０．５Ｖから＋１Ｖまで、１ｍＶ／秒で電位を掃引し、サイクリックボルタンメトリー法を行い、酸化電流値Ｉｄを測定した。次に、ピラノースオキシダーゼ２０Ｕ／ｍＬ、基質（１，５−アンヒドログルシトール５００μｇ／ｍＬ）と、表７に示したそれぞれのレドックスメディエータ６０μＭを含む水溶液１０μＬを電極１３の検体添加位置１に載せ、電極１３の参照極を基準に−０．５Ｖから＋１Ｖまで、１ｍＶ／秒で電位を掃引し、サイクリックボルタンメトリー法を行い、キャタリティック電流値Ｉｋを測定した。キャタリティック電流値Ｉｋをレドックスメディエータのみの酸化電流値Ｉｄで割った値Ｉｋ／Ｉｄにより、レドックスメディエータと酵素との反応速度を比較した。
それぞれのレドックスメディエータについて求めたＩｋ／Ｉｄの結果を表７に示した。【００９４】
【表７】
2008072702.tif 000010
（注）ニトロ−ＴＢ：３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩化物］【００９５】
表７からピラノースオキシダーゼが、オスミウム錯体、フェロセン系化合物、キノン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、フェナジン系化合物、ジフェニルアミン系化合物、インドフェノール系化合物、フェノール系化合物等の種々のレドックスメディエータと速い速度で反応することが明らかとなり、この結果は、これらのレドックスメディエータとピラノースオキシダーゼを使用する、例えば、実施例１〜３の方法による全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定が可能となるであろうことを示している。【００９６】
参考例８
参考例７と同様に、前記１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼと表８に示したレドックスメディエータとの反応を調べた。
参考例７と同様にして電極１３を作成した。【００９７】
１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）２０Ｕ／ｍＬと、表８に示したそれぞれのレドックスメディエータ６０μＭを含む水溶液１０μＬを、電気化学検出器に接続した電極１３の検体添加位置１に載せ、電極１３の参照極を基準に−０．５Ｖから＋１Ｖまで、１ｍＶ／秒で電位を掃引し、サイクリックボルタンメトリー法を行い、酸化電流値Ｉｄを測定した。次に、１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ２０Ｕ／ｍＬ、基質（１，５−アンヒドログルシトール５００μｇ／ｍＬ）と、表８に示したそれぞれのレドックスメディエータ６０μＭを含む水溶液１０μＬを電極１３の検体添加位置１に載せ、電極１３の参照極を基準に−０．５Ｖから＋１Ｖまで、１ｍＶ／秒で電位を掃引し、サイクリックボルタンメトリー法を行い、キャタリティック電流値Ｉｋを測定した。キャタリティック電流値Ｉｋを基質なしでレドックスメディエータのみの酸化電流値Ｉｄで割った値Ｉｋ／Ｉｄにより、レドックスメディエータと酵素との反応速度を比較した。
それぞれのレドックスメディエータについて求めたＩｋ／Ｉｄ結果を表８に示した。【００９８】
【表８】
2008072702.tif 000011
【００９９】
表８から、１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼが、オスミウム錯体、フェロセン系化合物、キノン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、フェナジン系化合物、ジフェニルアミン系化合物、インドフェノール系化合物、フェノール系化合物素等の種々のレドックスメディエータと速い速度で反応することが明らかとなり、この結果は、これらのレドックスメディエータと１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを使用する、例えば、実施例４の方法による全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定が可能となるであろうことを示している。【０１００】
参考例９
１）グルコース変換試薬
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．０に調整した後の組成が、１４．８ｍＭのＭｇＣｌ２、９９．２ｍＭのＫＣｌ、４８ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、２ｍＭのＡＴＰ、２０Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、１６Ｕ／ｍＬのグルコキナーゼ、１０Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸酸化酵素、２００ｍＭの塩化ナトリウム、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１．２ｇ／ＬのＢＳＡとなるように５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液に各成分を加え、グルコース変換試薬とした。【０１０１】
２）電極試薬溶液
（ａ）０．５４ｍＭフェロセニルＰＥＧ（（株）同仁化学研究所製）
（ｂ）６．２５Ｕ／ｍＬ西洋わさびペルオキシダーゼ（東洋紡績（株）製）
（ｃ）５０Ｕ／ｍＬピラノースオキシダーゼ（バシジオマイセタウス・フンギＮｏ．５２由来）
の組成となるように各成分を１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して電極試薬溶（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を調製した。【０１０２】
３）センサーチップ
まず、参考例７で作成した電極１３の作用極部位に０．５％カルボキシメチルセルロース水溶液１０μＬを塗布し、５０℃で１０分間乾燥して電極表面を親水化した。次に、上記の２）の電極試薬溶液（ａ）３μＬを親水化した部分に滴下・乾燥し、その上に電極試薬溶液（ｂ）３μＬを適下・乾燥し、その後、更に電極試薬溶液（ｃ）３μＬを滴下・乾燥してセンサーチップを作製した。【０１０３】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、生理食塩液に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた３検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０、１０、５０μｇ／ｍＬであった）各２０μＬをそれぞれグルコース変換試薬１０μＬとエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、３）のセンサチップの電極１３の検体添加位置１に反応液１５μＬを滴下し、５分間反応した後に参照極（銀塩化銀）を基準に０Ｖを印加して、５秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。電流値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成し、図４に示した。図中の１，５ＡＧは１，５−アンヒドログルシトールを表す。【０１０４】
得られた検量線は濃度依存性が良好な検量線を示し、この結果は、フェロセニルＰＥＧとピラノースオキシダーゼを使用する、例えば、実施例１〜３の方法に準じる全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定が可能となるであろうことを示している。【０１０５】
参考例１０
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。
２）電極試薬溶液
表９の各濃度の各レドックスメディエータ及び表９の各濃度の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【０１０６】
３）センサーチップ
参考例７で作成した電極１３に、上記の２）の電極試薬溶液２μＬを電極の作用極に塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサーチップを作製した。【０１０７】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、０．３８％クエン酸ナトリウム溶液に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた５検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０、２．５、１１．９、２４．２、４９．３μｇ／ｍＬであった）各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、表９記載のそれぞれの電位を参照極（銀塩化銀）を基準にして印加し、５秒後の電流値を電気化学検出器で測定して、電流値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。それぞれの検量線を図５〜１３に示した。【０１０８】
【表９】
2008072702.tif 000012
【０１０９】
得られた検量線はいずれも濃度依存性のあるスムーズな検量線であり、この結果は、各メディエータと１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを使用する全血中の１,５-アンヒドログルシトールのアンペロメトリー法による電気化学的な測定が可能となるであろうことを示している。【０１１０】
参考例１１
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。
２）電極試薬溶液
表１０の各濃度の各レドックスメディエータ及び表１０の各濃度の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【０１１１】
３）センサーチップ
参考例７で作成した電極１３に、上記の２）の電極試薬溶液２μＬを電極の作用極に塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサーチップを作製した。【０１１２】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、０．３８％クエン酸ナトリウム溶液に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた６検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０、２．５、５．０、１１．９、２４．２、４９．３μｇ／ｍＬであった）各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、表１０記載のそれぞれの第一電位を参照極を（銀塩化銀）基準にして１０秒印加し、次いで第２電位を参照極（銀塩化銀）を基準に１１０秒印加して、第２電位の印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定して、クーロメトリー法を行い、クーロン量と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。それぞれの検量線を図１４〜２７に示した。【０１１３】
【表１０】
2008072702.tif 000013
【０１１４】
得られた検量線はいずれも濃度依存性のあるスムーズな検量線であり、この結果は、各メディエータと１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを使用する全血中の１,５-アンヒドログルシトールのクーロメトリー法による電気化学的な測定が可能となるであろうことを示している。【０１１５】
実施例６
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。
２）電極試薬溶液
１２０μＭのチオニンアセテート（シグマーアルドリッチ（株）製）、４０Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【０１１６】
３）センサーチップ
参考例７で作成した電極１３に、上記の２）の電極試薬溶液２μＬを電極の作用極に塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサーチップを作製した。【０１１７】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、０．３８％クエン酸ナトリウム溶液に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた７検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０、２．５、５．０、１１．９、２４．２、４９．３、９８．８μｇ／ｍＬであった）各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準にして−０．１Ｖを１０秒、次いで０Ｖを１１０秒印加し、０Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定して、クーロン量と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。良好な直線性を示した検量線を図２８に示した。【０１１８】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
１，５−アンヒドログルシトールを測定する７名のヒトの全血検体各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準にして−０．１Ｖを１０秒、次いで０Ｖを１１０秒印加し、０Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定して、検量線と対比して７検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた。結果を表１１に示す。なお、結果は４回測定したその平均値である。【０１１９】
参考例１２
比較のために、実施例６の５）で測定したのと同じ全血検体を参考例１の操作方法で１，５−アンヒドログルシトールを定量測定した。結果を表１１に示す。【０１２０】
【表１１】
2008072702.tif 000014
【０１２１】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、チオニンアセテートを含む電極試薬と反応させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例６）は、公知の測定方法による参考例１２の測定値とよい一致（相関係数；０．９７１１）を示し、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定が可能であることを示している。【０１２２】
実施例７
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。
２）電極試薬溶液
（ｉ）１，５−アンヒドログルシトール測定用
５０μＭメチレンブルー（米山薬品工業（株）製）、１００Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。
（ｉｉ）ブランク測定用
５０μＭメチレンブルー（米山薬品工業（株）製）の組成となるように精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【０１２３】
３）センサーチップ
参考例７で作成した図３で示される電極１３を２個用意し、上記の２）の１，５−アンヒドログルシトール測定用又はブランク測定用の電極試薬溶液２μＬをそれぞれの電極の作用極に塗布して、５０℃で５分乾燥して１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップとブランク測定用センサーチップを作製した。【０１２４】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、１，５−アンヒドログルシトールがほとんど存在しないことが知られている羊血清（日本バイオテスト（株）製）に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた６検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０．６、２．８、５．０、１０．０、２４．７、５０．２μｇ／ｍＬであった）各２０μＬとグルコース変換試薬１０μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップとブランク測定用センサーチップの電極１３の検体添加位置１にそれぞれ反応液１０μＬを滴下し、それぞれのセンサーチップの参照極（銀塩化銀）を基準に−０．２Ｖを１０秒、−０．１Ｖを１１０秒印加し、−０．１Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップのクーロン量からブランク測定用センサーチップのクーロン量を差し引いたクーロン量と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。良好な直線性を示した検量線を図２９に示した。【０１２５】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
実施例６の７名の全血各２０μＬとグルコース変換試薬１０μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップとブランク測定用センサーチップの電極１３の検体添加位置１にそれぞれ反応液１０μＬを滴下し、それぞれのセンサーチップの参照極（銀塩化銀）を基準に−０．２Ｖを１０秒、−０．１Ｖを１１０秒印加し、−０．１Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器（ＧＰＩＢ  ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ  マルチポテンショスタット  ＭＯＤＥＬ  ＰＳ−０８；（株）東方技研）で測定して、１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップのクーロン量からブランク測定用センサーチップのクーロン量を差し引いたクーロン量を求め、検量線と対比して７検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトールの量を求めた。結果を表１２に示す。なお、結果は４回測定したその平均値である。【０１２６】
参考例１２
実施例７で用いた検体は、実施例６と同じ全血検体であるので、実施例６の参考例１２の測定結果を表１２に示す。【０１２７】
【表１２】
2008072702.tif 000015
【０１２８】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、メチレンブルーを含む電極試薬と反応させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例７）は、公知の測定方法による参考例１２の測定値と良い一致（相関係数；０．９６５８）を示し、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定が可能であることを示している。【０１２９】
実施例８
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。
２）電極試薬溶液
１２０μＭチオニンアセテート（シグマーアルドリッチ（株）製）、４０Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【０１３０】
３）センサーチップ
参考例７で作成した電極１３に、上記の２）の電極試薬溶液２μＬを電極の作用極に塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサーチップを作製した。【０１３１】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、羊血清（日本バイオテスト（株）製）に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた７検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０．６、２．８、５．０、１０．０、２４．７、５０．２、１０３．９μｇ／ｍＬであった）各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準に−０．１Ｖを印加して５秒後の電流値を電気化学検出器で測定し、電流値と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。良好な直線性を示した検量線を図３０に示した。【０１３２】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
実施例６の７名の全血各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準に−０．１Ｖを印加して５秒後の電流値を電気化学検出器で測定し、電流値を求めて検量線と対比することにより７検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトールの量を求めた。結果を表１３に示す。なお、結果は４回測定したその平均値である。【０１３３】
参考例１２
実施例８で用いた検体は、実施例６と同じ全血検体であるので、実施例６の参考例１２の測定結果を表１３に示す。【０１３４】
【表１３】
2008072702.tif 000016
【０１３５】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、チオニンアセテートを含む電極試薬と反応させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例８）は、公知の測定方法による参考例１２の測定値と良い一致（相関係数；０．９７００）を示し、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定が可能であることを示している。【０１３６】
実施例９
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。
２）電極試薬溶液
１２０μＭチオニンアセテート（シグマーアルドリッチ（株）製）、４０Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【０１３７】
３）センサーチップ
参考例７で作成し、参考例９の処理をした電極１３に、上記の２）の電極試薬溶液２μＬを電極の作用極に塗布して、５０℃で５分乾燥してセンサーチップを作製した。【０１３８】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、０．３８％クエン酸ナトリウム溶液に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた４検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０、５．０、１１．９、２４．２μｇ／ｍＬであった）各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準に０Ｖを１１０秒印加して、印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定し、センサーチップのクーロン量と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。良好な直線性を示した検量線を図３１に示した。【０１３９】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
１，５−アンヒドログルシトールを測定する６名のヒトの全血各１０μＬとグルコース変換試薬５μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、電極１３の検体添加位置１に反応液１０μＬを滴下し、参照極（銀塩化銀）を基準に０Ｖを１１０秒印加して、印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定し、クーロン量を求め、検量線と対比して６検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた。結果を表１４に示す。なお、結果は４回測定したその平均値である。【０１４０】
参考例１３
比較のために、実施例９の５）で測定したのと同じ全血検体を参考例１の操作方法で１，５−アンヒドログルシトールを定量測定した。結果を表１４に示す。【０１４１】
【表１４】
2008072702.tif 000017
【０１４２】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、チオニンアセテートを含む電極試薬と反応させて測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例９）は、公知の測定方法による参考例１３の測定値と良い一致（相関係数；０．９８５５）を示し、本発明による全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定が可能であることを示している。【０１４３】
実施例１０
１）グルコース変換試薬
実施例１の１）のグルコース変換試薬を使用した。
２）電極試薬溶液
（ｉ）１，５−アンヒドログルシトール測定用
１００μＭメチレンブルー（東京化成工業（株）製）、５０Ｕ／ｍＬの１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（シュードモナスｓｐ．ＮＫ−８５００１由来）の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。
（ｉｉ）ブランク測定用
１００μＭメチレンブルー（東京化成工業（株）製）の組成となるように精製水に溶解して電極試薬溶液を調製した。【０１４４】
３）センサーチップ
参考例７で作成した図３で示される電極１３を２個用意し、上記の２）の１，５−アンヒドログルシトール測定用又はブランク測定用の電極試薬溶液２μＬをそれぞれの電極の作用極に塗布して、５０℃で５分乾燥して１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップとブランク測定用センサーチップを作製した。【０１４５】
４）検量線作成
１，５−アンヒドログルシトール検量線作成用として、羊血清（日本バイオテスト（株）製）に濃度既知の１，５−アンヒドログルシトール標品を加えた４検体（血球分離操作を除いて参考例１の操作により求めた各検体の１，５−アンヒドログルシトール濃度は、０．６、１０．０、５０．２、１０３．９μｇ／ｍＬであった）各２０μＬとグルコース変換試薬１０μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップとブランク測定用センサーチップの電極１３の検体添加位置１にそれぞれ反応液１０μＬを滴下し、それぞれのセンサーチップの参照極（銀塩化銀）を基準に−０．１Ｖを１１０秒印加し、−０．１Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定した。１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップのクーロン量からブランク測定用センサーチップのクーロン量を差し引いたクーロン量と１，５−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。良好な直線性を示した検量線を図３２に示した。【０１４６】
５）１，５−アンヒドログルシトール測定操作
実施例９の６名の全血各２０μＬとグルコース変換試薬１０μＬとをエッペンドルフチューブ内で混合して５分間放置した。その後、１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップとブランク測定用センサーチップの電極１３の検体添加位置１にそれぞれ反応液１０μＬを滴下し、それぞれのセンサーチップの参照極（銀塩化銀）を基準に−０．１Ｖを１１０秒印加し、−０．１Ｖの印加開始から１００秒間のクーロン量を電気化学検出器で測定し、１，５−アンヒドログルシトール測定用センサーチップのクーロン量からブランク測定用センサーチップのクーロン量を差し引いたクーロン量を求め、検量線と対比して６検体について全血中の１，５−アンヒドログルシトール量を求めた。結果を表１５に示す。なお、結果は４回測定したその平均値である。【０１４７】
参考例１３
実施例１０で用いた検体は、実施例９と同じ全血検体であるので、実施例９の参考例１３の測定結果を表１５に示す。【０１４８】
【表１５】
2008072702.tif 000018
【０１４９】
全血を用い、グルコース変換試薬を作用させてグルコースを測定に干渉しない物質に変換し、血球を分離しないで、メチレンブルーを含む電極試薬と反応させて差動法により測定した全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定値（実施例１０）は、公知の測定方法による参考例１３の測定値と良い一致（相関係数；０．９９６４）を示し、本発明によって全血中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的な測定が可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明の１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定する１，５−アンヒドログルシトールの測定方法により、遠心分離機等を使用せずに微量な全血を用いた１，５−アンヒドログルシトールの測定が可能となる。従って、本発明の測定方法はベッドサイドあるいは診察室での１，５−アンヒドログルシトールの迅速測定や患者自身による家庭での測定に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】本発明で用いる電極１１を簡略化して示した図である。
【図２】本発明で用いる電極１２を簡略化して示した図である。
【図３】本発明で用いる電極１３を簡略化して示した図である。
【図４】参考例９で作成した検量線である。
【図５】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．１についての検量線である。
【図６】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．２についての検量線である。
【図７】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．３についての検量線である。
【図８】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．４についての検量線である。
【図９】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．５についての検量線である。
【図１０】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．６についての検量線である。
【図１１】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．７についての検量線である。
【図１２】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．８についての検量線である。
【図１３】参考例１０の表９の試験Ｎｏ．９についての検量線である。
【図１４】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．１についての検量線である。
【図１５】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．２についての検量線である。
【図１６】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．３についての検量線である。
【図１７】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．４についての検量線である。
【図１８】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．５についての検量線である。
【図１９】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．６についての検量線である。
【図２０】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．７についての検量線である。
【図２１】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．８についての検量線である。
【図２２】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．９についての検量線である。
【図２３】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．１０についての検量線である。
【図２４】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．１１についての検量線である。
【図２５】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．１２についての検量線である。
【図２６】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．１３についての検量線である。
【図２７】参考例１１の表１０の試験Ｎｏ．１４についての検量線である。
【図２８】実施例６で作成した検量線である。
【図２９】実施例７で作成した検量線である。
【図３０】実施例８で作成した検量線である。
【図３１】実施例９で作成した検量線である。
【図３２】実施例１０で作成した検量線である。
【符号の説明】
【０１５２】
１  検体添加位置
２  支持体
３  作用極
４  対極
５  レジスト
６  参照極（カーボンインク）
６ａ  参照極（銀塩化銀インク）
１１  電極
１２  電極
１３  電極
【図１】
2008072702.tif 000019
【図２】
2008072702.tif 000020
【図３】
2008072702.tif 000021
【図４】
2008072702.tif 000022
【図５】
2008072702.tif 000023
【図６】
2008072702.tif 000024
【図７】
2008072702.tif 000025
【図８】
2008072702.tif 000026
【図９】
2008072702.tif 000027
【図１０】
2008072702.tif 000028
【図１１】
2008072702.tif 000029
【図１２】
2008072702.tif 000030
【図１３】
2008072702.tif 000031
【図１４】
2008072702.tif 000032
【図１５】
2008072702.tif 000033
【図１６】
2008072702.tif 000034
【図１７】
2008072702.tif 000035
【図１８】
2008072702.tif 000036
【図１９】
2008072702.tif 000037
【図２０】
2008072702.tif 000038
【図２１】
2008072702.tif 000039
【図２２】
2008072702.tif 000040
【図２３】
2008072702.tif 000041
【図２４】
2008072702.tif 000042
【図２５】
2008072702.tif 000043
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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