【手続補正書】
【提出日】平成16年2月9日(2004.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
【図１】切断型TYLCV Rep遺伝子を有するバイナリー形質転換ベクターを図示する。
【図２】pKYLX71:35S2の発現カセットを示す。TL、TR＝左側および右側T-DNA境界配列（その起源の詳細な説明については、Anらを参照のこと）。pKYLX71およびpKYLX71:35S2（使用したプラスミド）のマルチクローニング部位は、HindIII*-BamHI-XhoI*-PstI-SacI*-XbaI*である（*はユニーク部位を示す）。pKYLX71:35S2のプロモーターは、35Sプロモーターを「エンハンサー」領域の重複により改変したものである。矢印は、発現カセットおよびNPTII遺伝子の転写方向を示す。このプラスミドは、大腸菌とAgrobacterium tumefaciensにテトラサイクリンおよびカナマイシン耐性を付与する。
【図３Ａ−Ｂ】pKYLX71:35S2の発現カセットの配列を示す。35S2プロモーターを作製するために重複させた領域は、かっこで囲みイタリック体で示し（これは2回反復のうちの1つめである）、転写開始部位、マルチクローニング部位、およびrbcS-E9 3’領域の主要な3’末端は太字で強調してある。発現カセットは、EcoRIおよびClaI部位で結合している。
【図４】切断型Rep遺伝子で形質転換しTYLCV抵抗性を示すトマト植物体（後方）を示す。非形質転換トマト（前方）は、TYLCV病徴を示す。試験は、フロリダ州ブラデントンの野外において2000年の秋に実施した。植物はすべて、野外に移植する前に病原体を有するコナジラミに曝した。配列番号：8は、pKYLX71:35S2の発現カセットの配列を示す。
【図５Ａ−Ｂ】トランスジェニック2/5 Repタバコ植物体および非形質転換対照から抽出した全RNAのノーザンブロット解析を示す。図5A、レーン1は非形質転換植物体を示し、レーン2は非接種2/5 Rep植物体を示し、レーン3および4はTYLCV接種したC1T1植物体を示す。図5Bは、レーンに同量のRNAを泳動したことを確認するために18S rRNA遺伝子でプローブした同じブロットを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i) Rep遺伝子の5’遺伝子間領域およびRep遺伝子の5’コード配列の約400〜500に至るヌクレオチドのすべてまたは一部からなるTYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチド、またはTYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ポリヌクレオチドの断片と、
ii) 該TYLCV Rep遺伝子の該断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチド、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該アンチセンスポリヌクレオチドの断片と、
iii) 該TYLCV Rep遺伝子の該断片もしくは該TYLCV Rep遺伝子の該断片に対してアンチセンスである該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド、または該TYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のあるハイブリダイズする該ポリヌクレオチドの断片と
からなる群より選択されるポリヌクレオチドで植物または植物組織を形質転換することを含む、植物または植物組織においてトマト黄化葉巻ウイルス（TYLCV）による感染に対する抵抗性を提供する方法。
【請求項２】
TYLCV Rep遺伝子の断片がTYLCV-Is由来である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
TYLCV Rep遺伝子の断片がTYLCV-Isのフロリダ州単離体由来である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
TYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチドが、配列番号：4に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
TYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチドが、配列番号：6に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
TYLCV Rep遺伝子の断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチドが、配列番号：5に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
TYLCV Rep遺伝子の断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチドが、配列番号：7に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
トマト黄化葉巻ウイルスが、TYLCV-中国、TYLCV-イスラエル、TYLCV-ナイジェリア、TYLCV-サルデーニャ、TYLCV-南サウジアラビア、TYLCV-タンザニア、TYLCV-タイ、およびTYLCV-イエメンからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
トマト黄化葉巻ウイルスがTYLCV-イスラエルである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
植物または植物組織が、トマト、タバコ、スターチス、ペチュニア、リシアンサス、およびトマティロからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
植物または植物組織がトマトである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
植物または植物組織がタバコである、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
アグロ感染法、遺伝子銃ターゲティング法、電気穿孔法、もしくは遺伝子直接注入法により、ポリヌクレオチドで植物または植物組織を形質転換する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドがRep遺伝子配列に機能的に結合した制御配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
制御配列がプロモーターを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
プロモーターが、CaMV 35Sプロモーター、CaMV 35S2プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、Ap3プロモーター、熱ショック80プロモーター、アルファルファヒストンH3.2遺伝子プロモーター、およびE8プロモーターからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが選択マーカー遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
選択マーカー遺伝子が発現された場合に抗生物質耐性を提供する、請求項10記載の方法。
【請求項２０】
抗生物質耐性が、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドが3’非翻訳終結配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
i) Rep遺伝子の5’遺伝子間領域およびRep遺伝子の5’コード配列の約400〜500に至るヌクレオチドのすべてまたは一部からなるTYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチド、またはTYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ポリヌクレオチドの断片と、
ii) 該TYLCV Rep遺伝子の該断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチド、または該TYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のある該アンチセンスポリヌクレオチドの断片と、
iii) 該TYLCV Rep遺伝子の該断片もしくは該TYLCV Rep遺伝子の該断片に対してアンチセンスである該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド、または該TYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のあるハイブリダイズする該ポリヌクレオチドの断片と
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、トマト黄化葉巻ウイルス（TYLCV）による感染に対して増強した抵抗性を有するトランスジェニックもしくは形質転換植物または植物組織。
【請求項２３】
TYLCV Rep遺伝子の断片がTYLCV-Is由来である、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項２４】
TYLCV Rep遺伝子の断片がTYLCV-Isのフロリダ州単離体由来である、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項２５】
TYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチドが、配列番号：4に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項２６】
TYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチドが、配列番号：6に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項２７】
TYLCV Rep遺伝子の断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチドが、配列番号：5に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項２８】
TYLCV Rep遺伝子の断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチドが、配列番号：7に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項２９】
トマト黄化葉巻ウイルスが、TYLCV-中国、TYLCV-イスラエル、TYLCV-ナイジェリア、TYLCV-サルデーニャ、TYLCV-南サウジアラビア、TYLCV-タンザニア、TYLCV-タイ、およびTYLCV-イエメンからなる群より選択される、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項３０】
トマト黄化葉巻ウイルスがTYLCV-イスラエルである、請求項29記載の植物または植物組織。
【請求項３１】
植物または植物組織が、トマト、タバコ、スターチス、ペチュニア、リシアンサス、およびトマティロからなる群より選択される、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項３２】
植物または植物組織がトマトである、請求項31記載の植物または植物組織。
【請求項３３】
植物または植物組織がタバコである、請求項31記載の植物または植物組織。
【請求項３４】
アグロ感染法、遺伝子銃ターゲティング法、電気穿孔法、もしくは遺伝子直接注入法により、ポリヌクレオチドで植物または植物組織を形質転換する、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項３５】
ポリヌクレオチドがRep遺伝子配列に機能的に結合した制御配列を含む、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項３６】
制御配列がプロモーターを含む、請求項35記載の植物または植物組織。
【請求項３７】
プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項36記載の植物または植物組織。
【請求項３８】
プロモーターが、CaMV 35Sプロモーター、CaMV 35S2プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、Ap3プロモーター、熱ショック80プロモーター、アルファルファヒストンH3.2遺伝子プロモーター、およびE8プロモーターからなる群より選択される、請求項36記載の植物または植物組織。
【請求項３９】
ポリヌクレオチドが選択マーカー遺伝子を含む、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項４０】
選択マーカー遺伝子が発現された場合に抗生物質耐性を提供する、請求項39記載の植物または植物組織。
【請求項４１】
抗生物質耐性が、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性からなる群より選択される、請求項40記載の植物または植物組織。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドが3’非翻訳終結配列を含む、請求項22記載の植物または植物組織。
【請求項４３】
請求項22記載の植物または植物組織の子孫。
【請求項４４】
i) Rep遺伝子の5’遺伝子間領域およびRep遺伝子の5’コード配列の約400〜500に至るヌクレオチドのすべてまたは一部からなるTYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチド、またはTYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ポリヌクレオチドの断片と、
ii) 該TYLCV Rep遺伝子の該断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチド、または該TYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のある該アンチセンスポリヌクレオチドの断片と、
iii) 該TYLCV Rep遺伝子の該断片もしくは該TYLCV Rep遺伝子の該断片に対してアンチセンスである該配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド、または該TYLCVによる感染に対する抵抗性を提供する能力のあるハイブリダイズする該ポリヌクレオチドの断片と
からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項４５】
TYLCV Rep遺伝子の断片がTYLCV-Is由来である、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
TYLCV Rep遺伝子の断片がTYLCV-Isのフロリダ州単離体由来である、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
TYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチドが、配列番号：4に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
TYLCV Rep遺伝子の断片を含むポリヌクレオチドが、配列番号：6に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
TYLCV Rep遺伝子の断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチドが、配列番号：5に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
TYLCV Rep遺伝子の断片に対してアンチセンスである配列を含むポリヌクレオチドが、配列番号：7に示すヌクレオチド配列、または感染に対する抵抗性を提供する能力のある該ヌクレオチド配列の断片を有する、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
トマト黄化葉巻ウイルスが、TYLCV-中国、TYLCV-イスラエル、TYLCV-ナイジェリア、TYLCV-サルデーニャ、TYLCV-南サウジアラビア、TYLCV-タンザニア、TYLCV-タイ、およびTYLCV-イエメンからなる群より選択される、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
トマト黄化葉巻ウイルスがTYLCV-イスラエルである、請求項51記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
植物または植物組織が、トマト、タバコ、スターチス、ペチュニア、リシアンサス、およびトマティロからなる群より選択される、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項５４】
植物または植物組織がトマトである、請求項53記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
植物または植物組織がタバコである、請求項53記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
アグロ感染法、遺伝子銃ターゲティング法、電気穿孔法、もしくは遺伝子直接注入法により、ポリヌクレオチドで植物または植物組織を形質転換する、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項５７】
ポリヌクレオチドがRep遺伝子配列に機能的に結合した制御配列を含む、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項５８】
制御配列がプロモーターを含む、請求項57記載のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項58記載のポリヌクレオチド。
【請求項６０】
プロモーターが、CaMV 35Sプロモーター、CaMV 35S2プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、Ap3プロモーター、熱ショック80プロモーター、アルファルファヒストンH3.2遺伝子プロモーター、およびE8プロモーターからなる群より選択される、請求項58記載のポリヌクレオチド。
【請求項６１】
ポリヌクレオチドが選択マーカー遺伝子を含む、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項６２】
選択マーカー遺伝子が発現された場合に抗生物質耐性を提供する、請求項61記載のポリヌクレオチド。
【請求項６３】
抗生物質耐性が、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性からなる群より選択される、請求項62記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
ポリヌクレオチドが3’非翻訳終結配列を含む、請求項44記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
請求項44記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６６】
植物においてポリヌクレオチドを発現するのに適した、請求項65記載の発現ベクター。
【請求項６７】
請求項44記載のポリヌクレオチドをゲノムに含む植物細胞。
【請求項６８】
請求項44記載のポリヌクレオチドをゲノムに含む植物種子。