(57)【要約】  本発明は、哺乳動物の癌の診断方法を提供することを課題とする。  使用する抗体の組み合わせを最適化することにより、悪性腫瘍を有する哺乳動物の血中特に血漿中のミッドカイン濃度の測定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程及び抗体の組み合わせを含む哺乳動物の癌の診断方法：
（１）哺乳動物由来の生体試料を、固相に結合させた１次抗体と反応させる工程；
（２）さらに標識化２次抗体を該生体試料と反応させる工程；
（３）該固相に捕捉された標識量を測定する工程；
および、上記１次抗体と上記２次抗体の組み合わせが以下である、
（a）１次抗体がIP9又はその断片、２次抗体がIP10又はその断片；
（b）１次抗体がIP10又はその断片、２次抗体がIP9又はその断片；
（c）１次抗体がSC2又はその断片、２次抗体がSC4又はその断片；
（d）１次抗体がSC4又はその断片、２次抗体がSC2又はその断片；
ことを特徴とする哺乳動物の癌の診断方法。
【請求項２】
上記標識量と予め設定しておいたcut off値と比較して、該標識量が該cut off値を超えた場合には、画像診断により癌の病巣部位を検査することを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
【請求項３】
上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌の進行度合いを判定することを特徴とする請求項２に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
【請求項４】
上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌治療による回復度合いを判定することを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
【請求項５】
上記生体試料が、血漿であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
【請求項６】
上記癌が、脾腫、乳腺腫瘍、前立腺癌、乳腺癌、骨肉腫又は繊維肉腫であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
【請求項７】
上記癌が、扁平上皮癌、メラノーマ、脳腫瘍、肥満細胞腫、肺腫瘍、肝癌、滑膜肉腫、平滑筋腫であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
【請求項８】
IP9及びIP10の抗体の組み合わせ又はSC2及びSC4の抗体の組み合わせと、標準試料として用いられるミッドカインを含む哺乳動物の癌の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物特にイヌ、ネコの癌の診断方法に関する。
また、本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号2007-213271からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
社会構造の発達と変化は、人間社会の構成員としての愛玩動物の重要性が高まっている。近年、愛玩動物の代表例であるイヌ、ネコは、単にペットという存在ではなく、人間の生活の伴侶、すなわち家族の一員として位置付けられるようになっている。【０００３】
また、飼い主とイヌ、ネコの関係は極めて親密であり、飼い主はイヌ、ネコの日々の体調を注意深く観察している。しかし、飼い主が、イヌ、ネコの日々の行動から悪性腫瘍の罹患状態を早期に感知、発見に至る場合はほとんどない。特に、イヌ癌の進行は、ヒトの癌と比較して、5〜8倍の早さで進行する。
飼い主が、イヌ、ネコの症状より獣医師に診察させる事例は、殆ど進行癌の場合である。このような場合でも、現在の診断方法は、エックス線等の画像診断による方法以外の有効な方法がない。
よって、イヌ、ネコの悪性腫瘍による死亡例は多い、ネコの全死亡例の32％は悪性腫瘍が原因であり、イヌの全死亡例の47％は悪性腫瘍が原因である。【０００４】
上記状況が愛玩動物の悪性腫瘍の発見を遅らせ、愛玩動物に有効な治療を施すことができず愛玩動物が死に至るので、飼い主は大きな悲しみを有する。【０００５】
癌の進展ないし拡大の程度は、一般に早期癌、進行癌、末期癌と表現される。このうち早期癌は、基本的には無症状である。特に哺乳動物の日々の行動から早期癌を検出するのは不可能である。したがって、哺乳動物の早期癌を検出するには、好ましくは定期的に癌の診断を行うことが必要である。
このように定期的に癌の診断の行うには、先ずは簡便な操作で、かつ高感度に検出できる系が必要である。【０００６】
ミッドカイン（以後、"ＭＫ"と称す場合がある）は、1989年に村松喬氏と門松健治氏により発見され、胎生中期（Midgestation Period）に最も強い発現、そしてヘパリン結合性の成長因子であるサイトカイン（Cytokine）である。ミッドカインは、塩基性の低分子量（分子量：13,240）のタンパク質であり、細胞保護作用・成長作用、炎症性細胞の遊走を促進し炎症を促進する作用、アポトーシス（細胞死）を抑制する作用などを持つサイトカインに分類される。成体での発現は限局されるが、発癌、そして炎症、修復の過程で強く発現するという特徴を有している。該特徴により、癌の診断マーカーとして有用であり、ポリクローナル抗ミッドカイン抗体を使用したELISAキットがすでに販売されている（Elegance MIDKINE ELISA, 販売元：Bioclone Lim. Sydney, Australia）。【０００７】
また、ＭＫ遺伝子をプローブとしたノーザンブロットによる癌の診断法（特許文献１）、抗ＭＫタンパク質抗体を含む癌の診断薬（特許文献２）、早期癌腫瘍マーカー（特許文献３）が提案されている。しかしながら、これらの公開特許には、哺乳動物の癌の診断方法を対象としていない。
したがって、哺乳動物の癌特に早期癌の診断方法の開発が望まれている。
【特許文献１】特開平6−113898
【特許文献２】特開平6-172218
【特許文献３】再公表特許WO01/020333
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明らは、上記記載の従来技術の問題を解決すべく、市販のヒト用ポリクローナル抗ミッドカイン抗体を使用したELISAキットを使用して哺乳動物の癌の診断を行った。しかしながら、担癌哺乳動物の検出結果は、正常哺乳動物の検出結果と比較して、有意な差を得ることができなかった。すなわち、癌の診断を行なうことができなかった。
そこで、本発明者らは、新たに哺乳動物の癌の診断方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、使用する抗体の組み合わせを最適化することにより、悪性腫瘍を有する哺乳動物の血中特に血漿中のミッドカイン濃度の測定方法を提供する。【００１０】
つまり、本発明は、以下の通りである。
「１．以下の工程及び抗体の組み合わせを含む哺乳動物の癌の診断方法：
（１）哺乳動物由来の生体試料を、固相に結合させた１次抗体と反応させる工程；
（２）さらに標識化２次抗体を該生体試料と反応させる工程；
（３）該固相に捕捉された標識量を測定する工程；
および、上記１次抗体と上記２次抗体の組み合わせが以下である、
（a）１次抗体がIP9又はその断片、２次抗体がIP10又はその断片；
（b）１次抗体がIP10又はその断片、２次抗体がIP9又はその断片；
（c）１次抗体がSC2又はその断片、２次抗体がSC4又はその断片；
（d）１次抗体がSC4又はその断片、２次抗体がSC2又はその断片；
ことを特徴とする哺乳動物の癌の診断方法。
２．上記標識量と予め設定しておいたcut off値と比較して、該標識量が該cut off値を超えた場合には、画像診断により癌の病巣部位を検査することを特徴とする前項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
３．上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌の進行度合いを判定することを特徴とする前項２に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
４．上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌治療による回復度合いを判定することを特徴とする前項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
５．上記生体試料が、血漿であることを特徴とする前項１〜４のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
６．上記癌が、脾腫、乳腺腫瘍、前立腺癌、乳腺癌、骨肉腫又は繊維肉腫であることを特徴とする前項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
７．上記癌が、扁平上皮癌、メラノーマ、脳腫瘍、肥満細胞腫、肺腫瘍であることを特徴とする前項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
８．IP9及びIP10の抗体の組み合わせ又はSC2及びSC4の抗体の組み合わせと、標準試料として用いられるミッドカインを含む哺乳動物の癌の診断キット。」
【発明の効果】
【００１１】
本発明では、悪性腫瘍を有する哺乳動物の血中特に血漿中のミッドカイン濃度の測定方法を完成し、哺乳動物の癌の診断方法を確立した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（哺乳動物）
本発明の哺乳動物とは、ヒトを除く哺乳動物一般を意味する。特に、いわゆる愛玩動物である、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ウサギ、ウマ特に競馬ウマ等を意味する。【００１３】
（癌）
本発明の哺乳動物の癌の診断方法における癌種は特に限定されないが、前立腺癌、乳腺癌、骨肉腫、繊維肉腫、胃癌、肝細胞癌、食道癌、大腸癌、胆管癌、転移性肝癌、乳癌、肺癌、膵癌、脾腫、乳腺腫瘍、扁平上皮癌、メラノーマ、脳腫瘍、肥満細胞腫、肺腫瘍、肝癌、滑膜肉腫、平滑筋腫等が挙げられる。
特に、「早期癌」とは、腫瘍が発生した局所（粘膜内）に限局していて、周囲組織への浸潤のないもの、あるいは浸潤があってもその範囲が局所に限局しているものを言う。哺乳動物特にイヌの癌の進行度合いが早く、早期癌を検出することは重要である。【００１４】
（ミッドカイン）
本発明のミッドカイン（「ＭＫ」）とは、全長ＭＫタンパク質、又はＭＫの生物活性を有する任意の長さのアミノ酸配列を有するフラグメントを含む。Ｎドメインを欠く変異型ＭＫが癌特異的に発現しており（Ｋａｎａｍｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１９：２５６−２６０，１９９６）、このような変異型ＭＫも含む。遺伝子組み換え技術によって生成されたＭＫ、および化学合成されたＭＫは、本明細書では交換可能に用いられる。ヒト全長ＭＫをコードするＤＮＡ配列は公知（米国特許：５，４６１，０２９）である。ＭＫの生物活性とは、ＭＫが細胞に与える生理的な作用のみならず、抗ＭＫ抗体との免疫学的な反応性も含む。
特に、ミッドカインは、さまざまなタイプの不特定癌において、早期に血中や尿中のレベルが健常人の基準値に比較して上昇することが知られている。すなわち、不特定癌に対する広いスペクトルを有し、感度が高いといってよい。臓器を問わず幅広く早期癌のスクリーニングを行うには、特定癌に対する高い検出感度、特異性とともに、不特定癌検出に対する広いスペクトルが求められる。ミッドカインは、このようなスクリーニングに必要な感度と特異性を備えていると言える。【００１５】
（１次抗体、２次抗体）
本発明の１次抗体及び２次抗体は、いずれもミッドカインに対するモノクローナル抗体であり、以下を使用する。なお、以下の抗体は、いずれもabcam登録商標（アブカム株式会社：日本オフィス）より入手可能である。
IP9：コード番号ab52317
IP10：コード番号ab52318
SC2：コード番号ab52319
SC4：コード番号ab52320
さらに、上記抗体の断片も抗体として使用することができる。なお、「断片」とは、ミッドカインに対する特異的認識能力を保持しながら、抗体の一部のアミノ酸配列が欠如しているタンパク質を意味する。【００１６】
（生体試料）
本発明の「生体試料」とは、哺乳動物より得ることができる試料を意味する。より具体的には、例えば、血液、血漿、尿、及びその他の分泌物等を挙げることができる。なお、生体試料にヘパリンを添加しても良い。
なお、血漿は自体公知の方法より得られるが、例えば、血液（全血）から抗凝固作用のあるヘパリン、EDTA、クエン酸等を添加して得る。【００１７】
（癌の診断）
本発明の「癌の診断」とは、哺乳動物（被検体）の生体内に癌が存在する可能性が高いことを判定することを意味する。
本発明の哺乳動物の癌の診断方法に対しては、任意の集団を対象として癌が存在する可能性が高い被検体を絞り込むことを目的とする。
さらに、本発明の癌の診断方法では、標識量と予め設定しておいたcut off値と比較して、該標識量が該cut off値を超えた場合には、さらにエックス線画像診断等の画像診断により癌の病巣部位を検査することも含む。
なお、cut off値の設定方法としては、癌の存在しない哺乳動物の生体試料から得られる標識量の平均値から算出する。通常、予め決定したcut off値の標準偏差の1.5倍、好ましくは2倍、より好ましくは3倍の標識量を生じる生体試料は、癌に対して陽性であると考えられる。【００１８】
さらに、本発明の癌の診断方法では、標識量と予め設定しておいた基準値とを比較して、癌の進行度合いを判定する又は癌治療による回復度合いを判定することも含む。
なお、基準値とは各癌種における進行度を示す標準値を示す。一般的に、生体試料中のミッドカイン濃度は、早期癌、進行癌、末期癌になるにつれて上昇すると考えられる。基準値の設定方法としては、予め各癌の進行度合いを確認している担癌哺乳動物の生体試料から得られる標識量の平均値から算出する。【００１９】
本発明の癌の診断方法では、ある哺乳動物の生体試料中のミッドカイン濃度を測定する。そして、該ミッドカイン濃度が、予め設定しておいたcut off値を超える場合には、該哺乳動物がある悪性腫瘍の罹患状態にある可能性が非常に高い。これにより、獣医師が該哺乳動物の病巣を画像診断より検査する。そして、獣医師が該哺乳動物の病巣位置及び癌種を特定する。
さらに、生体試料中のミッドカイン濃度と基準値を比較することにより、癌の進行度合い（早期癌、進行癌、末期癌）を判定することができる。
また、癌治療中の哺乳動物の生体試料中のミッドカインを定期的に測定することにより、癌治療効果である回復度合いの確認をすることができる。これにより、獣医師は、現在適用している癌治療方法の効果を確認することができる。さらに、獣医師は、測定したミッドカイン濃度と基準値を比較することを基にして、望むような治療効果が得られないような場合には、適宜癌治療方法を変更することができる。【００２０】
（生体試料中のミッドカイン濃度の測定方法）
本発明の生体試料中のミッドカイン濃度の測定方法は、ミッドカインに対するモノクローナル抗体を用いたＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）法、ＲＩＡ法、ＦＩＡ、化学発光イムノアッセイ、あるいはＥＣＬＩＡ法などを用いて測定することができる。特に、ＥＩＡ法が好ましい。
ミッドカイン濃度測定の一例では、１次抗体を固相に自体公知のブロッキング剤を使用して固定化する。次に、生体試料、続いて酵素標識化２次抗体を該固相に添加する。ここで、該固相を洗浄することにより、生体試料中のミッドカインと結合していない標識化２次抗体が固相から除去される。さらに、反応基質を該固相に添加することで、該酵素と該反応基質が反応して、該固相中の標識量である溶液の吸光度が上昇する。
固相としては、試験管、９６穴の反応プレート、ビーズ等が使用できるが、特に限定されない。
また、標識量とは、ミッドカインに特異的に結合した２次抗体量の指標であり、該２次抗体量は生体試料中のミッドカイン濃度に比例する。すなわち、標識量の増減が生体試料中のミッドカイン濃度の増減を意味する。【００２１】
本発明の癌の診断方法の測定装置は、１次抗体をニトロセルロースのようなメンブレン上に固相化したフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）テスト型又はストリップテスト型を用いて実施できる。
フロースルーテスト型においては、生体試料がメンブレンを通り抜けるとき、生体試料中のミッドカインは１次抗体に結合する。次に、標識化２次抗体を含む溶液がメンブレンを通り抜けるとき、該２次抗体は、１次抗体−ミッドカイン複合体に結合する。次に、結合した２次抗体は上記示した方法で検出する。
ストリップテスト型においては、１次抗体が結合したメンブレンの一端を生体試料を含む溶液中に浸す。生体試料は、２次抗体を含む領域を通過するようにメンブレンを移動し１次抗体のエリアに向かって移動する。１次抗体のエリアにおける２次抗体の濃度がミッドカイン濃度を示す。
また、標識量を公知のplate reader等で機械的に読み取ることにより、生体試料中のミッドカインの定量的な測定が可能である。【００２２】
（哺乳動物の癌の診断キット）
本発明の哺乳動物の癌の診断キットは、少なくともIP9及びIP10の抗体の組み合わせ又はSC2及びSC4の抗体の組み合わせと、標準試料として用いられるミッドカインを含む。
さらに、本発明の哺乳動物の癌の診断キットには、２次抗体を標識するための標識成分、標識成分の検出に必要な酵素基質、及び取り扱い指示書等を組み合わせることができる。【００２３】
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
（抗体の組合せの検討）
IP9、IP10、SC2及びSC4の４種類のモノクローナル抗体（すべてIgG1 subclass）の組み合わせを検討した。詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg /ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl｛PBS-1%BSA(RIA grade) 又はPBS-1% Block Ace｝により室温で２時間ブッキングをした。次に、各サンプル20μl｛緩衝液、ミッドカイン（株式会社ペプチド研究所）、前立腺癌細胞の上澄液｝及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System,販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、２次抗体のペロキシダーゼ標識には、Peroxidase Labeling Kit-NH2（販売元：Dojinndo Lab. Kumamoto, Japan）を用いた【００２５】
上記測定結果を下記表１，２に示す。
１次抗体がIP9の場合には、２次抗体がIP10抗体のみELISA測定反応が得られた。また、１次抗体がIP10の場合には、２次抗体がIP9抗体のみELISA測定反応が得られた。また、１次抗体がSC2の場合には、２次抗体がSC4抗体のみELISA測定反応が得られた。また、１次抗体がSC4の場合には、２次抗体がSC2抗体のみELISA測定反応が得られた。
以上の結果より、本発明の哺乳動物の癌の診断方法に使用する抗体の最適な組み合わせを決定した。
加えて、上記測定では、２種類（BSA、Block Ace）のブロッキング剤を使用した結果、BSAではバックグランド値が高くなる傾向があることを確認した。よって、ブッロキング剤として、Block Aceが優れていることを確認した。しかしながら、BSAをブロッキング剤として使用してELISA測定することもできる。
なお、Block Aceとは、乳タンパク質と有機酸緩衝塩を主成分としてブロッキング剤であり、大日本住友製薬株式会社から購入可能である。【００２６】
【表１】
2009025094.tif 000002
【００２７】
【表２】
2009025094.tif 000003
【実施例２】
【００２８】
（定量検出の確認）
上記実施例１で最適な抗体の組合で測定した場合には、ミッドカインを定量的に検出することができるかを確認した。また、コントロールとして市販のポリクローナル抗体のELISA kit（Elegance MIDKINE ELISA, 販売元：Bioclone Lim. Sydney, Australia）を使用した。詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg /ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。各濃度のミッドカイン｛0、0.00625、0.0125、0.025、0.05、1（μl）：株式会社ペプチド研究所｝及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、市販のポリクローナル抗体のELISA kitを使用した測定方法は、キット添付の説明書に従った。【００２９】
上記測定結果を下記表３及び図１〜５に示す。
１次抗体がIP9、２次抗体がIP10抗体を用いての測定では、直線性を示し、十分にミッドカインの定量が可能である（図１）。また、１次抗体がIP10、２次抗体がIP9抗体でも同様な結果であった（図２）。１次抗体がSC2、２次抗体がSC4抗体でも同様な結果であった（図３）。１次抗体がSC4、２次抗体がSC2でも同様な結果であった（図４）。
以上の結果より、本発明の抗体の組み合わせを用いた測定方法は、ミッドカインを定量的に測定することができ、かつ定量線を設定することができる。これにより、cut off値及び基準値を設定することができる。【００３０】
【表３】
2009025094.tif 000004
【実施例３】
【００３１】
（原発腫瘍細胞の培養上清中のミッドカイン測定）
哺乳動物（イヌ）の原発腫瘍細胞の培養上清中のミッドカイン量を測定できるかを確認した。詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg/ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。各サンプル20μl（緩衝液、イヌの前立腺癌細胞の培養上清液、乳腺癌細胞の培養上清液及び骨肉腫細胞の培養上清液）及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。【００３２】
上記測定結果を下記表４に示す。
いずれの抗体の組み合わせを用いた測定でも各癌種の培養上清液中のミッドカインを定量的に測定することができた。特に、前立腺癌細胞の培養上清液中のミッドカイン値が他の癌種よりも産出されていることがわかった。
以上の結果より、哺乳動物特にイヌの癌細胞の培養上清液でもミッドカインが産出されていることを確認した。さらに、細胞の培養上清中のミッドカイン量を測定することにより、哺乳動物の癌の診断を行なうことができることを確認した。【００３３】
【表４】
2009025094.tif 000005
【実施例４】
【００３４】
（血漿中のミッドカイン測定による哺乳動物の癌の診断）
正常犬及び担癌犬の血漿中のミッドカインを測定することにより、哺乳動物の癌の診断を行なうことができるかを確認した。なお、EDTAとヘパリンで同時採血した血漿で測定を行なった。
詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg /ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。各サンプル20μl（緩衝液、クエン酸採血、EDTA採血、ヘパリン採血）及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、担癌犬では、IP9及びIP10のみを使用して測定した。【００３５】
上記測定結果を下記表５、６及び図６に示す。
担癌犬の血漿は、正常犬の血漿よりもミッドカイン濃度が高い傾向を示した。特に、骨肉腫の担癌犬では、血漿中のミッドカイン濃度が高い値を示した。
また、EDTA採血とヘパリン採血した血漿のミッドカイン濃度を比較すると、EDTA採血した画分がミッドカイン濃度が高いが、ヘパリン採血でも十分にミッドカイン濃度を検出することができることを確認した。【００３６】
【表５】
2009025094.tif 000006
【００３７】
【表６】
2009025094.tif 000007
【実施例５】
【００３８】
（ヘパリン添加効果の確認）
ヘパリン添加によるミッドカイン濃度の影響を確認にした。詳しくは、以下の通りである。
最初に、各濃度ミッドカイン｛0.025、0.05、0.1（μM）：株式会社ペプチド研究所｝にヘパリン（100Ｕ/ml）を添加した後、室温1時間で静置して、サンプルを作成した。
次に、各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg/ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。上記作成した各サンプル20μl及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。【００３９】
上記測定結果を下記表７に示す。
１次抗体がIP9、２次抗体がIP10の場合及び１次抗体がIP10、２次抗体がIP9を用いた測定は、ヘパリンを添加してない場合と比較して、ミッドカイン値が上昇することを確認した。
しかしながら、１次抗体がSC2、２次抗体がSC4の場合及び１次抗体がSC4、２次抗体がSC2を用いた測定の場合は、ヘパリンを添加してない場合と比較して、ミッドカイン値が減少することを確認した。
以上の結果より、１次抗体がIP9、２次抗体がIP10の場合及び１次抗体がIP10、２次抗体がIP9を用いた測定では、生体試料にヘパリンを添加することでミッドカインを高感度で検出することができる。【００４０】
【表７】
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【実施例６】
【００４１】
（市販のポリクローナル抗体のELISAキットを使用しての哺乳動物の癌の診断）
市販されているヒトミッドカインELISA kit（Elegance MIDKINE ELISA, 販売元：Bioclone Lim. Sydney, Australia）が哺乳動物の癌の診断に使用できるかを確認した。また、該キットの測定結果を本発明の測定方法により得られる結果と比較した。
詳細は、以下の通りである。
ヒトミッドカインELISA kitの添付説明書に従い、キット中のポリクローナル抗体を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。正常犬又は担癌犬（骨肉腫、繊維肉腫）の血漿サンプル20μl及びキット中の予めペロキシダーゼ標識したポリクローナル抗体を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、本発明の測定方法は、実施例４に記載の測定方法と同様に行った。サンプルは、正常犬及び担癌犬（骨肉腫、繊維肉腫）の血漿20μlとした。担癌犬のサンプルでは、１次抗体をIP9とし、２次抗体をIP10とした。【００４２】
上記測定結果を下記表８〜１０及び図７に示す。
市販されているヒトミッドカインELISA kitを用いた測定方法では、正常犬の測定値と担癌犬の測定値間には十分な差異が検出されなかった。より詳しくは、正常犬の測定値が、担癌犬の測定値と比較して、高い場合があった。
一方、本発明の測定方法では、正常犬の測定値と担癌犬との測定値間は十分な差異を検出することができた。
これにより、市販されているヒトミッドカインELISA kitでは、哺乳動物の癌の診断に使用できないことを確認した。【００４３】
【表８】
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【００４４】
【表９】
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【００４５】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】１次抗体IP9、２次抗体IP10を用いてのミッドカインの定量測定。なお、図中の"Capture ab"は、１次抗体、"Detection ab"は２次抗体を意味する。
【図２】１次抗体IP10、２次抗体IP9を用いてのミッドカインの定量測定。
【図３】１次抗体SC2、２次抗体SC4を用いてのミッドカインの定量測定。
【図４】１次抗体SC4、２次抗体SC2を用いてのミッドカインの定量測定。
【図５】ポリクローナル抗体を用いてのミッドカインの定量測定。
【図６】正常犬及び担癌犬の血漿中のミッドカイン濃度測定。（a）正常犬と担癌犬の比較、（ｂ）担癌犬の癌種の比較。
【図７】市販のポリクローナル抗体のELISAキットを使用しての哺乳動物の血漿中のミッドカイン濃度測定。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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