【手続補正書】
【提出日】平成17年2月17日(2005.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）反応混合物を形成するために閉環状南京錠プローブ分子；標的核酸分子；フォワードプライマー；リバースプライマー；ｄＮＴＰｓ；および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）多数の尾部の付いた（ｍｕｌｔｉ−ｔａｉｌｅｄ）複合体を生成せしめること；
（ｃ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、ここで、該第二のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である；ならびに
（ｄ）該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）、
を含んでなる核酸増幅方法。
【請求項２】
該第一のＤＮＡポリメラーゼがＢｓｔＬＦである請求項１の方法。
【請求項３】
該第二のＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、パイロコッカス種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）もしくはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から得られるポリメラーゼ酵素である請求項１の方法。
【請求項４】
該第二のＤＮＡポリメラーゼが組換え熱安定性ポリメラーゼである請求項１の方法。
【請求項５】
組換え熱安定性ポリメラーゼが抗体不活性化ポリメラーゼもしくは化学的不活性化ポリメラーゼである請求項４の方法。
【請求項６】
反応混合物がさらに鎖置換因子を含有する請求項１の方法。
【請求項７】
熱循環させる前に反応混合物を約５０〜約７０℃で約１〜約３０分間インキュベーションする請求項１の方法。
【請求項８】
熱循環させる前に反応混合物を約５０〜約７０℃で約３〜約２０分間インキュベーションする請求項１の方法。
【請求項９】
方法が：
（ｅ）該第一のＤＮＡポリメラーゼを変性させること、
をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項１０】
該標的核酸分子が一本鎖ＤＮＡ分子もしくは二本鎖ＤＮＡ分子である請求項１の方法。
【請求項１１】
該標的核酸分子が一本鎖ＲＮＡ分子もしくは二本鎖ＲＮＡ分子である請求項１の方法。
【請求項１２】
該標的核酸がプラスミドもしくはそのフラグメント、ゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＲＮＡもしくはそのフラグメント、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはそのフラグメント、または染色体ＤＮＡもしくはそのフラグメントである請求項１の方法。
【請求項１３】
該フォワードもしくはリバースプライマーの５’末端領域が、尾部の付いた（ｔａｉｌｅｄ）プライマー分子である請求項１の方法。
【請求項１４】
フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つがヘアピンプライマーである請求項１の方法。
【請求項１５】
ヘアピンプライマーが、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するループ領域を有する請求項１４の方法。
【請求項１６】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つを検出可能に標識する請求項１の方法。
【請求項１７】
検出可能に標識するプライマーが分子エネルギー転移機構を含有する請求項１６の方法。
【請求項１８】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの非情報的（ｎｏｎ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）塩基類似体を含有する請求項１の方法。
【請求項１９】
該非情報的塩基類似体がニトロピロールもしくはニトロインドールである請求項１８の方法。
【請求項２０】
該フォワードプライマーもしくはリバースプライマーの少なくとも一つが少なくとも一つの極性スイッチを含有する請求項１の方法。
【請求項２１】
（ａ）フォワードプライマーおよびリバースプライマー；
（ｂ）リガーゼ酵素；
（ｃ）第一のポリメラーゼ酵素；
（ｄ）線状南京錠プローブ分子、ここで、南京錠プローブは３’末端領域、５’末端領域、およびスペーサー領域を含んでなり、ここで、スペーサー領域はフォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合部位を含有する；ならびに
（ｅ）第二のポリメラーゼ酵素、ここで、第二のポリメラーゼ酵素は熱安定性酵素であり、そしてここで、第二のポリメラーゼ酵素は第一のポリメラーゼ酵素と同じ酵素ではない、
を含んでなる核酸分子増幅キット。
【請求項２２】
（ａ）標的核酸分子、線状南京錠プローブ分子、リガーゼ酵素、フォワードプライマー、リバースプライマー、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）閉環状南京錠プローブ分子を生成せしめること；
（ｃ）該閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｄ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；
（ｅ）該第二のＤＮＡポリメラーゼと共に該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに
（ｆ）該多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出すること、
を含んでなるサンプルにおける標的核酸分子を検出する方法。
【請求項２３】
（ａ）標的核酸分子、該標的核酸分子にトポロジカルに連結される閉環状南京錠プローブ分子、フォワードプライマー、リバースプライマー、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）該閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｃ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；
（ｄ）該第二のＤＮＡポリメラーゼと共に該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに
（ｅ）該多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出すること、
を含んでなるサンプルにおける標的核酸分子を検出する方法。
【請求項２４】
（ａ）複数の標的核酸分子、複数の別個の標的核酸分子にアニールすることができる複数の線状南京錠プローブ分子、リガーゼ酵素、ｄＮＴＰｓ、および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）少なくとも二つの閉環状核酸分子を生成せしめること、ここで、該閉環状核酸分子の各々は別個の標的核酸分子にトポロジカルに連結される；
（ｃ）該少なくとも二つの閉環状核酸分子の各メンバーに、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを与えること；
（ｄ）該別個の標的核酸分子の各々の多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｅ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること；
（ｆ）該第二のＤＮＡポリメラーゼと共に該少なくとも二つの別個の多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること；ならびに
（ｇ）該少なくとも二つの別個の多数の尾部の付いた複合体の増幅生成物を検出すること、
を含んでなるサンプルにおける複数の標的核酸分子を検出する方法。
【請求項２５】
（ａ）反応チューブに標的核酸分子、リガーゼ酵素；フォワードプライマー；リバースプライマー；ｄＮＴＰｓ；および第一のＤＮＡポリメラーゼを与えること；
（ｂ）該反応チューブを密閉すること；
（ｃ）閉環状南京錠プローブ分子を生成せしめること；
（ｄ）該閉環状南京錠プローブ分子から多数の尾部の付いた複合体を生成せしめること；
（ｅ）第二のＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、ここで、該第二のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである；ならびに
（ｆ）該多数の尾部の付いた複合体を熱循環させること、
を含んでなる閉管核酸分子増幅方法。
【請求項２６】
プライマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチド塩基が非情報的塩基類似体である、以下の配列：
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ−３’；
５’−ａｃｔａｇａｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃｇｃａ−３’；もしくは
５’−ａｃｔａｇａｇｔｔｃａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃｇｃａ−３’
のいずれかを含んでなる南京錠プローブ増幅プライマー。