【手続補正書】
【提出日】平成16年12月10日(2004.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
（材料および方法）
細菌株および成長条件。本研究に用いられる細菌株およびプラスミドは、表５に記載される。Ｓ．スイス菌株を、トッド・ヒューイット培地（コードＣＭ１８９、オキソイド社製）において成長させ、６％（ｖ／ｖ）のウマ血液を含有するコロンビア血液基礎寒天プレート（コードＣＭ３３１、オキソイド社製、ロンドン、英国）において培養した。大腸菌株を、ルリア培地において成長させ（１７）、１．５％（ｗｔ／ｖ）の寒天を含有するルリア培地において培養した。必要に応じて、抗生物質を、５０μｇ／ｍＬの大腸菌用スペクチノマイシン（シグマ社製、セントルイス、ミズーリ州）および１００μｇ／ｍＬのＳ．スイス用スペクチノマイシン、１００μｇ／ｍＬの大腸菌用アンピシリン（ベーリンガーマンハイム社製、独国）、ならびに２５μｇ／ｍＬの大腸菌用カナマイシン（ベーリンガー社製）の濃度で加えた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ｆｂｐｓノックアウト突然変異体の構築。突然変異株１０）ＦＢＰＳを構築するために、Ｓ．スイス血清型２型の病原菌株１０（２７，２９）を、プラスミドｐＦＢＰＳ７−４７で電気形質転換した（２４）。このプラスミドにおいて、ｆｂｐ遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入によって不活性にした。ｐＥＢＰＳ７−４７を産生するために（図１）、ｐＦＢＰＳ７−４６の３８２ｂｐＳａｌＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ベクターのＳａｌＩ部位を平滑にした後、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含有するｐＩＣ−Ｓｐｃの１．２ｋｂＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩフラグメントによって置換した。ｐＦＢＰＳ７−４７による菌株１０の電気形質転換の後、スペクチノマイシン耐性コロニーを１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有するコロンビア寒天プレートにおいて選択した。サザンブロッティングおよびハイブリッド形成実験を、２回交差統合(double crossover
integration events)に関する選択のために用いた（データは示していない）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
ＦＢＰＳの精製。Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］［ｐＱＥ−３０−ＦＢＰＳ］を、ＱＩＡエクスプレッショニスト（登録商標）（キアゲン社製)を用いてＦＢＰＳを発現かつ精製するために用いた。要するに、Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］［ｐＱＥ−３０−ＦＢＰＳ］細胞を飛躍的に成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、これらの細胞を３７℃でもう４時間成長可能にした。その後、細胞を収集し、かつ溶解した。透明な上清をＮｉ2+−ＮＴＡアガロースカラムに取込んだ。６×ＨＩＳタグを含有するＦＢＰＳをＮｉ2+−カラムに結合させた。カラムを洗浄し、タンパク質を溶出した。異なる緩衝液を、未変性の精製に、および変性の精製に用いた。変性条件下で精製されたＦＢＰＳを、プロテアーゼインヒビター（２５μｇ／ｍＬのペファブロック(pefabloc)、０．７μｇ／ｍＬのペプスタチン、１μｇ／ｍＬのアプロチニン、および０．５μｇ／ｍＬのロイペプチン）を含有する、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロールおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］中の直線的な６Ｍ〜１Ｍの尿素濃度勾配を用いることによって、Ｎｉ2+−ＮＴＡカラムにおいて復元した。すべての手順は、製造者の提案に従って行われた。６×ＨＩＳタグを、ＲＴで１６時間、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2および０．５Ｕの軽鎖エンテロキナーゼ（ニューイングランドバイオラブス(New
England Biolabs)社製、べバリー、マサチューセッツ州）中で、精製したＦＢＰＳをインキュベーションすることによって、タンパク質から除去した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
ＦＢＰＳによるウサギの免疫。精製され、かつ復元されたＦＢＰＳを、２匹のウサギに免疫性を与えるために用いた。尿素を除去するために、タンパク質を４℃で一晩中、リン酸緩衝溶液（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、および２．７９ｍＭのＫＨ2ＰＯ4［ｐＨ７．２］）に対して透析した。免疫７日前、ＦＢＰＳに対する自然力価を決定するために、血液をウサギから採集した。１日目に、陰性の抗ＦＢＰＳ力価を有するこれらのウサギに、油中水エマルション（Ｓｐｅｃｏｌ、ＩＤ−レリスタッド(ID-lelystad)）中の１００μｇ／ｍＬのＦＢＰＳ０．５ｍＬを２回、筋肉注射で免疫した。２８日目に、ウサギに同量のタンパク質および同経路の免疫法を用いて２回免疫した。２回目の免疫から４週間後、ウサギを犠牲にし、血液を採集した。血液を凝固させ、血清を採集し、ＦＢＰＳの免疫検出に用いた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
フィブロネクチン結合およびフィブリノーゲン結合。結合研究を間接ウエスタンブロッティングによって行った。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離するとともに、前述のようにニトロセルロース膜に転移した。膜をＭＰＢＳ、すなわち４％のスキムミルクおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中でブロックした。その後、膜を、１時間ＲＴで５％のウシ胎仔血清、２％のＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳ中で５μｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン（ｆｎ）（シグマ社製）またはヒトフィブリノーゲン（ｆｇｎ）（シグマ社製）とインキュベーションした。結合されたフィブロネクチンおよびフィブリノーゲンを検出するために、膜を、１時間ＲＴで５％のウシ胎仔血清、２％のＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳの１：１，０００希釈液中でホースラディッシュペルオキシダーゼ複合抗フィブロネクチン（ＤＡＫＯ）または抗フィブリノーゲン（ＤＡＫＯ）抗体とインキュベーションした。この信号を製造者の提案に従って、ＥＣＬ+（アメルシャムファーマシアバイオテック(
Amersham Pharmacia Biotech)社製、Ｎ．Ｊ．）を用いて視覚化した。信号をホスフォイメージャー（Ｓｔｏｒｍ、モレキュラーダイナミックス社製）において検出した。すべての洗浄ステップをＭＰＢＳ−ＰＢＳ（１：１）中で行った。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実験感染。無菌の子ブタ、グレートヨークシャーおよびダッチランドレースの雑種を帝王切開によってメスブタから得た。この手術は、消毒したフレキシブルフィルムアイソレーターにおいて行った。子ブタを４匹の群に割り当て、消毒したステンレス鋼インキュベーター中で収容した。収容条件および給餌管理は前述のとおりであった（２７，２９）。６日齢の子ブタに、Ｓ．スイスによる感染症がこれらの子ブタにかかり易くするために、約１０７ｃｆｕの気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)９２９３２を鼻内で接種した。２日後、１０６ｃｆｕのＳ．スイス菌株１０と１０６ｃｆｕのＳ．スイス菌株１０）ＦＢＰＳとを鼻内に接種した。野生型菌株および突然変異体菌株の間のビルレンスの相違を決定するために、ＬＤ５０値を決定しなければならない。このために、多数の子ブタが必要とされる。倫理的理由のために、これは許されない。この問題を回避するために、共通コロニー形成研究を行うことにした。Ｓ．スイスおよび気管支敗血症菌の存在を監視するために、および汚染物質の不存在を検査するために、鼻咽頭および糞から採取されたスワブを１週間に３回培養した。これらのスワブを、６％のウマ血液を含有するコロンビア寒天に直接培養し、またはトッドヒューイット培地において４８時間成長させた後、６％のウマ血液を含有するコロンビア寒天に培養した。ブタを、発熱、神経性症状および跛行などの臨床的症状について１日２回監視した。各ブタからの血液サンプルを１週間に３回採集した。白血球を細胞カウンタで計数した。子ブタは、関節炎または脳膜炎などのＳ．スイス感染症の特異的な症状が観察されたとき、またはブタが致命的な病気になったときに殺された。その他のブタは、Ｓ．スイスによる接種から２週間後に殺され、臨床的症状に基づいて殺されたブタと同じ方法で検査された。すべてのブタを病理変化について検査した。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および扁桃腺、ならびにＳ．スイス感染症に特異的に関係する器官（中枢神経系（ＣＮＳ）、漿膜および関節）からの組織標本を外科用メスでスライスした。各器官または部位からの組織スライスを、１５％のグリセロールを含有する、前記組織スライスの寸法に応じて２〜２５ｍＬのトッドヒューイット中で再浮遊させた。この浮遊物を５分間３，０００ｒｐｍで分離した。上清を採集し、連続希釈液を、６％のウマ血液を含有するコロンビア寒天において培養するとともに、野生型および突然変異体細菌の存在数を定量化するために６％のウマ血液および１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有するコロンビア寒天プレートにおいて培養した。突然変異菌株１０）ＦＢＰＳ細胞の数を、選択的プレートにおいて適当な連続希釈液におけるＣＦＵ数を計数することによって決定した。野生型菌株１０細胞の数を、コロンビア寒天血液プレートにおいて適当な連続希釈液のＣＦＵ数であって、前記選択的プレートにおいて計数されたＣＦＵ数を控除した数を計数することによって決定した。野生型および突然変異細菌が組織中に発見される場合、野生型菌株と突然変異菌株との割合は、両コロンビア寒天プレートに、および１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有するコロンビア寒天プレートに約１００の個別のコロニ��をトゥースピックすることによって再度決定した。すべての動物実験は、動物実験におけるオランダ法に従って動物科学健康研究所の倫理委員会によって承認された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンに対するＦＢＰＳの結合。フィブロネクチン（ｆｎ）およびフィブリノーゲン（ｆｇｎ）に対するＳ．スイスのＦＢＰＳの結合を確認するために、ＦＢＰＳを自然条件下で精製した。この精製のために、Ｎ末端と融合した６×ＨＩＳタグによってＦＢＰＳを発現するタンパク質発現構築物を用いた。４００μｇのＦＢＰＳを、ＩＰＴＧによる誘導後に５０ｍＬの指数的成長相大腸菌細胞から精製した。このＦＰＢＳの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティグによって決定した（図２）。誘導された大腸菌溶解物は広範囲のタンパク質を含有し、このうち６４ｋＤａタンパク質ＦＢＰＳは非常に明瞭に存在した（パネルＡ，レーン１）。精製後、６×ＨＩＳタグによって高度に精製されたＦＢＰＳが得られた（パネルＡ，レーン２）。サンプルを６×ＨＩＳタグに対するモノクローナル抗体とインキュベーションすると、ＦＢＰＳは検出された唯一のタンパク質であった（パネルＢ）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
【図１】Ｓ．スイス血清型２型のｆｂｐｓ遺伝子をクローン化するために用いられる手順と、Ｓ．スイス血清型２型の挿入ノックアウト突然変異体の構築との概略図である。Ａ５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中でクローン化して、ｐＦＢＰＳ７−４６を産生し、ｆｂｐｓの挿入ノックアウトを得るようにベクターを平滑化した後、ｐＦＢＰＳ７−４６の３８２ｂｐＳａｌＩ−ＳａｌＩフラグメントを、１．２ｋｂのスペクチノマイシン耐性遺伝子によって置換した。ｉｖｓ−３１：ｉｎ  ｖｉｖｏで選択された遺伝子３１。
【図２】自然条件下で精製されたＦＢＰＳの純度および免疫原性。４μＬの大腸菌Ｍ１５［ｐＱＥ−３０−ｐＲＥＰ４−ＦＦＢＰＳ］溶解物（レーン１）および１６５ｎｇの精製されたＦＢＰＳ（レーン２）の、ＳＹＰＲＯオレンジ非特異的タンパク質染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（パネルＡ）、ならびに６ｘＨＩＳタグに対するモノクローナル抗体によるウエスタンブロット分析（パネルＢ）。４μＬの大腸菌Ｍ１５［ｐＱＥ−３０−ｐＲＥＰ４−ＦＢＰＳ］溶解物および０．５μｇの精製されたＦＢＰＳに存在するＦＰＢＳの免疫原性を検査するために、Ｓ．スイス菌株１０に対する回復期血清を用いた（パネルＣ，レーン１および２）。矢印：６４ｋＤａのＦＰＢＳ、Ｍｗ：分子量標識。
【図３】精製されたＦＢＰＳとの結合研究。パネルＡおよびＢを、ｆｎ（Ａ）またはｆｇｎ（Ｂ）の５μｇ／ｍＬで精査した。レーン１は５００ｎｇの精製されたＦＢＰＳを含有し、レーン２は５００ｎｇのＢＳＡを含有する。パネルＣならびにＤのレーン３および４は、５００ｎｇの精製されたＦＢＰＳを含有する。レーン３を２０μｇ／ｍＬのｆｎ（Ｃ）またはｆｇｎ（Ｄ）で精査し、レーン４をｆｎまたはｆｇｎのない複合体とインキュベーションするのみであった。パネルＥおよびＦを、２０μｇ／ｍＬのｆｎ（Ｅ）またはｆｇｎ（Ｆ）で精査した。レーン５は、エンタロキナーゼで消化された１．８μｇの精製されたＦＢＰＳを含有し、レーン６は、５００ｎｇの精製されたＦＢＰＳを含有する。黒矢印は、６４ｋＤａのＦＢＰＳを示し、白抜き矢印は、６×ＨＩＳなしの約５５ｋＤａのＦＢＰＳを示す。
【図４】様々なＳ．スイス血清型中のｆｂｐｓの分布。１μｇの染色体ＤＮＡをニトロセルロース膜上にスポットし、32Ｐ標識ｆｂｐｓプローブでハイブリッド形成した。血清型を示すようにスポットした。Ｓ１０：Ｓ．スイス血清型２型、ＭＲＰ+ＥＦ+、Ｔ１５：Ｓ．スイス血清型２型、ＭＲＰ-ＥＦ-、Ｓ１７：Ｓ．スイス血清型２型、ＭＲＰ+ＥＦ+。
【図５】感染したブタの様々な器官における野生型および突然変異体細菌のコロニー形成の効率。パネルＡは、扁桃腺の野生型菌株１０および突然変異体菌株１０）ＦＢＰＳのコロニー形成を表す。υ：扁桃腺ブタｎｏ．４６６４、ν：扁桃腺ブタｎｏ．４６６５、σ：扁桃腺ブタｎｏ．４６６６、λ：扁桃腺ブタｎｏ．４６６８。パネルＢは、特異的な器官のコロニー形成を表す。白抜きおよび黒υ：関節からの膿ブタｎｏ．４６６４、σ：関節からの膿ブタｎｏ．４６６６、λ：ＣＮＳブタｎｏ．４６６８。各点は、１匹のブタからの１つの特異的な器官から単離された野生型または突然変異体細菌の数を表す。
【図６Ａ】ここに同定されるｉｒｉ１，６，２２のヌクレオチド配列。
【図６Ｂ】ここに同定されるｉｒｉ１０，２０のヌクレオチド配列。
【図６Ｃ】ここに同定されるｉｒｉ１１のヌクレオチド配列。
【図６Ｄ】ここに同定されるｉｒｉ１３，１５，２７のヌクレオチド配列。
【図６Ｅ】ここに同定されるｉｒｉ１４のヌクレオチド配列。
【図６Ｆ】ここに同定されるｉｒｉ１６のヌクレオチド配列。
【図６Ｇ】ここに同定されるｉｒｉ１８のヌクレオチド配列。
【図６Ｈ】ここに同定されるｉｒｉ２のヌクレオチド配列。
【図６Ｉ】ここに同定されるｉｒｉ２３のヌクレオチド配列。
【図６Ｊ】ここに同定されるｉｒｉ２４のヌクレオチド配列。
【図６Ｋ】ここに同定されるｉｒｉ２９のヌクレオチド配列。
【図６Ｌ】ここに同定されるｉｒｉ３のヌクレオチド配列。
【図６Ｍ】ここに同定されるｉｒｉ３２のヌクレオチド配列。
【図６Ｎ】ここに同定されるｉｒｉ３４のヌクレオチド配列。
【図６Ｏ】ここに同定されるｉｒｉ４のヌクレオチド配列。
【図６Ｐ】ここに同定されるｉｒｉ７のヌクレオチド配列。
【図６Ｑ】ここに同定されるｉｒｉ８，２６のヌクレオチド配列。
【図６Ｒ】ここに同定されるｉｖｓ１のヌクレオチド配列。
【図６Ｓ】ここに同定されるｉｖｓ１１のヌクレオチド配列。
【図６Ｔ】ここに同定されるｉｖｓ１５のヌクレオチド配列。
【図６Ｕ】ここに同定されるｉｖｓ１６のヌクレオチド配列。
【図６Ｖ】ここに同定されるｉｖｓ１８のヌクレオチド配列。
【図６Ｗ】ここに同定されるｉｖｓ１９のヌクレオチド配列。
【図６Ｘ】ここに同定されるｉｖｓ２，４，２８のヌクレオチド配列。
【図６Ｙ】ここに同定されるｉｖｓ２０のヌクレオチド配列。
【図６Ｚ】ここに同定されるｉｖｓ２３，２４のヌクレオチド配列。
【図６Ａ１】ここに同定されるｉｖｓ２５のヌクレオチド配列。
【図６Ｂ１】ここに同定されるｉｖｓ２９のヌクレオチド配列。
【図６Ｃ１】ここに同定されるｉｖｓ３のヌクレオチド配列。
【図６Ｄ１】ここに同定されるｉｖｓ３１のヌクレオチド配列。
【図６Ｅ１】ここに同定されるｉｖｓ３２，３５のヌクレオチド配列。
【図６Ｆ１】ここに同定されるｉｖｓ３３のヌクレオチド配列。
【図６Ｇ１】ここに同定されるｉｖｓ３４のヌクレオチド配列。
【図６Ｈ１】ここに同定されるｉｖｓ３６のヌクレオチド配列。
【図６Ｉ１】ここに同定されるｉｖｓ５，１０，１２，２２のヌクレオチド配列。
【図６Ｊ１】ここに同定されるｉｖｓ６，７，１３，１４のヌクレオチド配列。
【図６Ｋ１】ここに同定されるｉｖｓ８のヌクレオチド配列。
【図６Ｌ１】ここに同定されるｉｖｓ９，１７のヌクレオチド配列。