【手続補正書】
【提出日】平成17年3月16日(2005.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハマメリスの植物体をメタノール抽出し、減圧乾固し、塩化メチレンと水で液液抽出することにより得られた塩化メチレン層を減圧乾固して得られた精製物を含む、Ｐ関連遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
ハマメリスの植物体をメタノール抽出し、減圧乾固し、塩化メチレンと水で液液抽出し、得られた塩化メチレン層を減圧乾固し、精製物を得ることを特徴とする、Ｐ関連遺伝子発現抑制剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＰ関連遺伝子発現抑制剤を配合することを特徴とする化粧料の製造方法。
【請求項４】
ハマメリスの植物体をアルコール抽出し、抽出物を精製して得られた精製物について、マウスメラノーマ細胞の培養系にて共存培養して、ピンクアイド・ダイリューション遺伝子の発現を確認した後、前記精製物を化粧料に含有せしめることを特徴とする、前記ピンクアイド・ダイリューション遺伝子が係わる老人性のシミを改善するための化粧料の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【発明の実施の形態】（１）本発明のＰ関連遺伝子発現抑制剤
本発明のＰ関連遺伝子発現抑制剤は、ハマメリスのエッセンスからなる。本発明で言うエッセンスとは、植物体それ自身、植物体を乾燥・細切・粉砕などした加工物、植物体の一部又は全部或いは加工物に溶媒を加え、抽出した抽出物とその溶媒除去物、抽出物やその溶媒除去物をカラムクロマトグラフィーや液液抽出等で精製した精製物等が例示できる。この中で特に好ましいものは抽出物、抽出物の溶媒除去物、精製物である。この場合、溶媒抽出は、水、メタノールや１，３−ブタンジオール等のアルコール、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、酢酸エチルや蟻酸メチル等のエステル類、クロロホルムや塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、アセトニトリル等のニトリル類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類から選ばれる１種乃至は２種以上を植物体或いはその加工物に対して１〜２０倍量を加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬すればよい。浸漬後は、濾過などにより不溶物を取り除き、必要に応じて減圧濃縮や凍結乾燥をして溶媒を除去すればよい。かかる抽出の好ましい溶媒は、極性溶
媒であり、特にアルコール類を含むものが好ましい。これは、有効成分がこの様な溶媒に抽出されやすいからである。又、植物体の使用部位としては特段の限定は受けないが、地上部が特に好ましい。これはこれらの部分にＰ関連遺伝子の発現を抑制する物質が特に多く含まれているからである。かくして得られたハマメリスのエッセンスは、Ｐ関連遺伝子の発現の抑制効果に優れるため、Ｐ関連遺伝子発現抑制剤としてＰ関連遺伝子に起因するメラニン生成の異常の改善・予防に大変有用である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
（２）本発明の化粧料
本発明の化粧料は、上記Ｐ関連遺伝子発現抑制剤を含有し、Ｐ関連遺伝子に起因するメラニン生成異常の改善・予防に好適であることを特徴とする。本発明の化粧料に於ける、Ｐ関連遺伝子発現抑制剤の好ましい含有量は、０．０１〜１０重量％であり、更に好ましくは、０．０５〜５重量％である。これは少なすぎると、効果が期待できない場合があり、多すぎても効果が頭打ちになるからである。本発明の化粧料に於いて、上記Ｐ関連遺伝子発現抑制剤以外に、通常化粧料に使用される任意成分を含有することができる。かかる任意成分としては、例えば、ワセリンやマイクロクリスタリンワックス等のような炭化水素類、ホホバ油やゲイロウ等のエステル類、牛脂、オリーブ油等のトリグリセライド類、セタノール、オレイルアルコール等の高級アルコール類、ステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸、グリセリンや１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、非イオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、エタノール、カーボポール等の増粘剤、防腐剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、粉体類、ビタミンＣとその誘導体やアルブチン等の美白物質やメラニン産生阻害剤等が例示できる。これらの任意成分の内、特に好ましいものは、従来から知られている、ビタミンＣとその誘導体やアルブチン等の美白物質やメラニン産生阻害剤である。これは、本発明のＰ関連遺伝子発現抑制剤とともにこの様な物質を使用することにより相乗効果を得ることができるからである。本発明の化粧料は、例えば、老人性シミのように、Ｐ関連遺伝子が関連するメラニン産生異常に対して、Ｐ関連遺伝子の発現を抑制し、メラニン産生を抑え、かかるメラニン産生異常を改善し、或いは症状が更に悪化するのを予防する作用を有する。本発明の化粧料の適用方法は、従来の美白化粧料に準じて適用することができ、例えば、０．１〜０．５ｇを一日数回塗布すればよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
＜実施例２＞プラスチック培養フラスコ（２５ｃｍ2）に１０％ＦＢＳ添加イーグルの最少培地に９×１０4個のマウスメラノーマＢ−１６細胞を播種し５％炭酸ガス下、３７℃の条件で２４時間培養し、Ｐ関連遺伝子発現抑制剤１をＤＭＳＯにとかし、終濃度１×１０-3（Ｗ／Ｖ）％になるように加え更に２日間培養した。この時、ＤＭＳＯの濃度は０．２％を越えないように留意した。対照例はＤＭＳＯとした。培養終了後、燐酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、トリプシン処理をして細胞を剥離させ、遠心分離で集め、燐酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴを加え細胞を溶解した。この細胞溶解液１ｍｌあたり１００μｌのクロロホルムを加え、遠心分離し、水層を取り５００μｌのイソプロパノールを加え、攪拌し、遠心分離してＲＮＡを沈殿させた。上澄みを捨て、７５％のエタノールでペレットを洗浄し、３００μｌのフォルマゾール（ＦＯＲＭＡＺＯＬ、モレキュラー・リサーチ・センター製）にペレットを溶かし、分光光度によりＲＮＡの濃度を測定し、調整した。この液を用いてノーザンブロッティングを行い、Ｐ
関連遺伝子を検出した。即ち、この溶解液を用い、１レーンあたり８μｇのＲＮＡをホルムアルデヒド法にて、アガロースゲル電気泳動を行いキャピラリー法によりナイロンメンブランに転写した。紫外線照射によりＲＮＡをメンブランに固定した後、ホルムアミド５０％を含有するプレハイブリダイゼーション液（シグマ社製）にて数時間４２℃にてプレハイブリダイゼーションを行った。プローブにはピンクアイド・ダイリュート遺伝子を用いた。プレハイブリダイゼーション液を交換した後、ランダムプライマー法にてラベルしたプローブを加え、１晩４２℃でハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＰＥ０．１％ＳＤＳ、４２℃で一回洗浄した後、メンブランに残った放射活性を測定しながら、ＳＳＰＥの濃度を下げ、放射活性が適当なところで洗浄をやめ、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーによりバンドを検出した。このノーザンブロッティングの結果を図１に示す。この図より、本発明のＰ関連遺伝子発現抑制剤１は、対照に比し著しくＰ関連遺伝子の発現を抑制していることがわかる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
＜実施例３＞以下に示す処方に従って、本発明の化粧料を作製した。即ち、処方成分を室温で攪拌溶解し、本発明の化粧料である化粧水を得た。
Ｐ関連遺伝子発現抑制剤１                      １     重量部
ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油        ０．５ 重量部
エタノール                                  １０     重量部
グリセリン                                    ５     重量部
水                                          ８３．５ 重量部
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
＜実施例４＞以下に示す処方に従って、本発明の化粧料を作製した。即ち、処方成分を室温で攪拌溶解し、本発明の化粧料である化粧水を得た。
Ｐ関連遺伝子発現抑制剤１                      ０．１ 重量部
ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油        ０．５ 重量部
エタノール                                  １０     重量部
グリセリン                                    ５     重量部
水                                          ８４．４ 重量部
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
＜実施例５＞以下に示す処方に従って、本発明のクリームを作製した。即ち、イの成分を良く混練りした後、８０℃に加熱し、ロ、ハを予め８０℃に予熱しておき、イにロを加え希釈し、これにハを徐々に加え乳化し、攪拌冷却しクリームを得た。
イ
トリグリセリンジイソステアレート              ５     重量部
マルチトール７０％水溶液                      ５     重量部
グリセリン                                    ３     重量部
１，３−ブタンジオール                        ５     重量部
Ｐ関連遺伝子発現抑制剤１                      ０．７ 重量部
メチルパラベン                                ０．２ 重量部
ブチルパラベン                                ０．１ 重量部
ロ
流動パラフィン                              １５     重量部
マイクロクリスタリンワックス                  ３     重量部
ネオペンチルグリコールジイソオクタネート      ５     重量部
カルナウバワックス                            ２     重量部
ハ
水                                          ５６     重量部