(57)【要約】シスプラチン投与による治療効果の有無を優れた確度及び特異度で判定する。  診断対象者から採取した生体由来試料における、ＰＤＥ３Ｂ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３Ｂ）遺伝子、ＰＤＧＦＣ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）遺伝子、ＰＫＤ２（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ−２  ｇｅｎｅ）遺伝子、ＮＲＧ１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  １）遺伝子及びＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するステップａと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップｂとを含むシスプラチン投与効果判定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
診断対象者から採取した生体由来試料における、ＰＤＥ３Ｂ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３Ｂ）遺伝子、ＰＤＧＦＣ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）遺伝子、ＰＫＤ２（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ−２  ｇｅｎｅ）遺伝子、ＮＲＧ１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  １）遺伝子及びＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するステップａと、
測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップｂと、
を含むシスプラチン投与効果判定方法。
【請求項２】
前記ステップａでは、上記遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することを特徴とする請求項１記載のシスプラチン投与効果判定方法。
【請求項３】
前記ステップａでは、上記遺伝子の産物であるタンパク質量を測定することを特徴とする請求項１記載のシスプラチン投与効果判定方法。
【請求項４】
上記ステップａでは、表１に示す遺伝子群のうち上記ＰＤＥ３Ｂ遺伝子、上記ＰＤＧＦＣ遺伝子、上記ＰＫＤ２遺伝子、上記ＮＲＧ１遺伝子及び上記ＬＵＭ遺伝子以外の少なくとも１以上の遺伝子の発現量を更に測定することを特徴とする請求項１記載のシスプラチン投与効果判定方法。
【表１】
2008047947.tif 000068
2008047947.tif 000069
2008047947.tif 000070
2008047947.tif 000071
2008047947.tif 000072
2008047947.tif 000073
2008047947.tif 000074
2008047947.tif 000075
2008047947.tif 000076
2008047947.tif 000077
2008047947.tif 000078
2008047947.tif 000079
2008047947.tif 000080
2008047947.tif 000081
2008047947.tif 000082
2008047947.tif 000083
【請求項５】
ＰＤＥ３Ｂ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３Ｂ）遺伝子、ＰＤＧＦＣ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）遺伝子、ＰＫＤ２（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ−２  ｇｅｎｅ）遺伝子、ＮＲＧ１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  １）遺伝子及びＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するための手段を含む、シスプラチン投与効果判定キット。
【請求項６】
上記手段は、上記遺伝子のｍＲＮＡ又は当該ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項５記載のシスプラチン投与効果判定キット。
【請求項７】
上記ポリヌクレオチドは、支持体に固定されたものであることを特徴とする請求項６記載のシスプラチン投与効果判定キット。
【請求項８】
上記手段は、上記遺伝子の産物であるタンパク質に対して特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項５記載のシスプラチン投与効果判定キット。
【請求項９】
表２に示す遺伝子群のうち上記ＰＤＥ３Ｂ遺伝子、上記ＰＤＧＦＣ遺伝子、上記ＰＫＤ２遺伝子、上記ＮＲＧ１遺伝子及び上記ＬＵＭ遺伝子以外の少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するための手段を更に含むことを特徴とする請求項５記載のシスプラチン投与効果判定キット。
【表２】
2008047947.tif 000084
2008047947.tif 000085
2008047947.tif 000086
2008047947.tif 000087
2008047947.tif 000088
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤として使用されているシスプラチンの投与効果を判断する方法及びシスプラチン投与効果判定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、“ＣＤＤＰ”と略称される）は、全ての種類の癌において抗癌剤・化学療法の中心的な薬剤である。シスプラチン投与に起因する副作用は、ほぼ１００％近くの患者に出現するが、臨床的効果は必ずしも良好とは言えない。シスプラチンの投与効果は、症例によってばらつきがあり、一部の患者に対しては全く奏効しないことが知られている。このため、多くの患者が非常に重篤な副作用に苦しんだにも拘わらず、治療効果が得られないまま癌が進行して予後不良となることがしばしばある。
したがって、シスプラチンによる治療効果が投与前に判定できるとすれば、患者にとって非常に大きな福音となる。また、シスプラチン投与に耐性を示す患者群に特異的に発現亢進する遺伝子（薬剤耐性遺伝子）及びシスプラチン投与に感受性を示す患者群に特異的に発現亢進する遺伝子（薬剤感受性遺伝子）を同定することにより、薬剤耐性を克服した新たな効果的な抗癌剤治療法を開発することができる。
しかしながら、現在までシスプラチン耐性に関連する遺伝子が幾つか発表（Ｂｏｒｄｏｗら、１９９４（非特許文献１）；Ｇｏｔｔｅｓｍａｎら、１９９６（非特許文献２）；Ｌｏｅら、１９９６（非特許文献３）；Ｊｉｎら、１９９８（非特許文献４）；Ｐｅｒｅｚら、１９９８（非特許文献５）；Ｈｉｎｏｓｈｉｔａら、２０００（非特許文献６））されているものの、実際の臨床でシスプラチン投与効果を判定できるような遺伝子は無いのが現状である。
【非特許文献１】Ｂｏｒｄｏｗ  ＳＢ，Ｈａｂｅｒ  Ｍ，Ｍａｄａｆｉｇｌｉｏ  Ｊ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｂ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＧＭ，Ｎｏｒｒｉｓ  ＭＤ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｏｃｔ  １；５４（１９）：５０３６−５０４０．１９９４
【非特許文献２】Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＭＭ，Ｐａｓｔａｎ  Ｉ，Ａｍｂｕｄｋａｒ  ＳＶ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ．Ｏｃｔ；６（５）：６１０−６１７．１９９６
【非特許文献３】Ｌｏｅ  Ｄ．Ｗ．，Ｄｅｅｌｅｙ  Ｒ．Ｇ．，Ｃｏｌｅ  Ｓ．Ｐ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３２Ａ：９４５−９５７，１９９６．
【非特許文献４】Ｊｉｎ  Ｓ，Ｓｃｏｔｔｏ  ＫＷ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｊｕｌ；１８（７）：４３７７−４３８４．１９９８
【非特許文献５】Ｐｅｒｅｚ  ＲＰ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｓｅｐ；３４（１０）：１５３５−１５４２．１９９８
【非特許文献６】Ｈｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｅ，Ｕｃｈｉｕｍｉ  Ｔ，Ｔａｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｋｉｎｕｋａｗａ  Ｎ，Ｔｓｕｎｅｙｏｓｈｉ  Ｍ，Ｍａｅｈａｒａ  Ｙ，Ｓｕｇｉｍａｃｈｉ  Ｋ，Ｋｕｗａｎｏ  Ｍ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｊｕｎ；６（６）：２４０１−２４０７．２０００
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明者らは、上述した実情に鑑み、シスプラチン投与による治療効果の有無を判定することができるシスプラチン投与効果判定方法及びシスプラチン投与効果判定キット提供することを目的としている。
上述した目的を達成するため、本発明者は、シスプラチンに対する非常に優れた耐性を示す細胞株を使用することでシスプラチン耐性或いは感受性を示す遺伝子群を特定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）  診断対象者から採取した生体由来試料における、ＰＤＥ３Ｂ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３Ｂ）遺伝子、ＰＤＧＦＣ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）遺伝子、ＰＫＤ２（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ−２  ｇｅｎｅ）遺伝子、ＮＲＧ１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  １）遺伝子及びＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するステップａと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップｂとを含むシスプラチン投与効果判定方法。
（２）  前記ステップａでは、上記遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することを特徴とする（１）記載のシスプラチン投与効果判定方法。
（３）  前記ステップａでは、上記遺伝子の産物であるタンパク質量を測定することを特徴とする（１）記載のシスプラチン投与効果判定方法。
（４）  上記ステップａでは、後述する表１に示す遺伝子群のうち上記ＰＤＥ３Ｂ遺伝子、上記遺伝子、上記ＰＫＤ２遺伝子、上記ＮＲＧ１遺伝子及び上記ＬＵＭ遺伝子以外の少なくとも１以上の遺伝子の発現量を更に測定することを特徴とする（１）記載のシスプラチン投与効果判定方法。
（５）  ＰＤＥ３Ｂ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３Ｂ）遺伝子、ＰＤＧＦＣ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）遺伝子、ＰＫＤ２（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ−２  ｇｅｎｅ）遺伝子、ＮＲＧ１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  １）遺伝子及びＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するための手段を含む、シスプラチン投与効果判定キット。
（６）  上記手段は、上記遺伝子のｍＲＮＡ又は当該ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする（５）記載のシスプラチン投与効果判定キット。
（７）  上記ポリヌクレオチドは、支持体に固定されたものであることを特徴とする（６）記載のシスプラチン投与効果判定キット。
（８）  上記手段は、上記遺伝子の産物であるタンパク質に対して特異的に結合する抗体であることを特徴とする（５）記載のシスプラチン投与効果判定キット。
（９）  後述する表１に示す遺伝子群のうち上記ＰＤＥ３Ｂ遺伝子、上記遺伝子、上記ＰＫＤ２遺伝子、上記ＮＲＧ１遺伝子及び上記ＬＵＭ遺伝子以外の少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するための手段を更に含むことを特徴とする（５）記載のシスプラチン投与効果判定キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２８６２８５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例で樹立した耐性株の代表例として、Ｓａ−３株及びＳａ−３Ｒ株におけるＭＴＴアッセイの結果を示す特性図である。
図２は、実施例で樹立した耐性株の代表例として、Ｓａ−３株及びＳａ−３Ｒ株におけるＡＢＣトランスポーター（ＭＤＲ１、ＭＲＰ１及びＭＲＰ２）について発現をＲＴ−ＰＣＲで測定した結果を示す特性図である。
図３は、実施例で樹立した耐性株及びその親株を用いたマイクロアレイ解析の結果として同定された耐性株において特異的に発現増強する遺伝子及び発現減弱する遺伝子の個数を示すベン図である。
図４は、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定された１９９個の遺伝子についてパスウェイ解析を行った結果として得られた４つのネットワークを示す特性図である。
図５は、実施例で特定した５つの遺伝子の代表例としてｌｕｍｉｃａｎ遺伝子について行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示す特性図（Ａ）及びウエスタンブロッティングの結果を示す写真（Ｂ）である。
図６は、実施例で特定した５つの遺伝子の代表例としてｌｕｍｉｃａｎ遺伝子について臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果を示す写真である。
図７は、ＰＤＥ３Ｅ遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図８は、ｌｕｍｉｃａｎ遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図９は、ＰＤＧＦＣ遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図１０は、ＰＫＤ２遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図１１は、ＮＲＧ１遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法及び／又はシスプラチン投与効果判定キットを詳細に説明する。
本シスプラチン投与効果判定方法は、診断対象者から採取した生体由来試料における、以下の５個の遺伝子から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現を測定するステップａと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップｂとを含んでいる。
ＰＤＥ３Ｂ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３Ｂ）遺伝子（配列番号１）
ＰＤＧＦＣ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）遺伝子（配列番号３）
ＰＫＤ２（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ−２  ｇｅｎｅ）遺伝子（配列番号５）
ＮＲＧ１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  １）遺伝子（配列番号７）
ＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子（配列番号９）
ＰＤＥ３Ｂ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＰＤＧＦＣ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。ＰＫＤ２遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。ＮＲＧ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。ＬＵＭ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
なお、これらＰＤＥ３Ｂ遺伝子、ＰＤＧＦＣ遺伝子、ＰＫＤ２遺伝子、ＮＲＧ１遺伝子及びＬＵＭ遺伝子は、詳細を後述する、シスプラチン耐性株及びシスプラチン感受性株を用いてマイクロアレイ解析や、臨床検体を用いた後ろ向き試験を行った結果として同定された遺伝子である。また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においては、これらの遺伝子の発現量に加えて表１に挙げた遺伝子群から得らばれる少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、上記５つの遺伝子の発現量に加えてこの遺伝子の発現量を判定に使用しても良い。
【表１】
2008047947.tif 000002
2008047947.tif 000003
2008047947.tif 000004
2008047947.tif 000005
2008047947.tif 000006
2008047947.tif 000007
2008047947.tif 000008
2008047947.tif 000009
2008047947.tif 000010
2008047947.tif 000011
2008047947.tif 000012
2008047947.tif 000013
2008047947.tif 000014
2008047947.tif 000015
2008047947.tif 000016
2008047947.tif 000017
表１において「Ｎｏ．」の欄は各遺伝子に割り振った番号を示し、「Ｃｏｍｍｏｎ」の欄は一般的な遺伝子の名称を示している。また、「Ｇｅｎｂａｎｋ」の欄はＧｅｎｂａｎｋの提供するデータベースにおける当該遺伝子の登録番号であり、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ」の欄は当該遺伝子の系統名を示し、「Ｍａｐ」の欄は当該遺伝子の染色体上の位置を示している。さらに、「Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」の欄は遺伝子に関する説明又は当該遺伝子の産物であるタンパク質に関する説明である。
なお、表１に挙げた遺伝子群は、詳細を後述する、シスプラチン耐性株及びシスプラチン感受性株を用いてマイクロアレイ解析を行った結果として同定された遺伝子から構成される。ここで、シスプラチン耐性株は、口腔扁平上皮癌由来細胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株からシスプラチン耐性を指標として樹立された細胞株であって、シスプラチン投与により奏効しない患者の細胞株モデルとしての意味を有する。また、シスプラチン感受性株とは、シスプラチン耐性株の親株である口腔扁平上皮癌由来細胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株それ自身を意味する。
すなわち、表１に挙げた遺伝子群は、シスプラチン耐性株において、特異的に発現増強した遺伝子と特異的に発現減弱した遺伝子とから構成されている。表１において、シスプラチン耐性株において特異的に発現増強した遺伝子はＮｏ．１〜１６４であり、シスプラチン耐性株において特異的に発現減弱した遺伝子はＮｏ．１６５〜１９９である。
また、表１に挙げた遺伝子群について、上記マイクロアレイ解析の結果を用いてＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓを行うことで統計的に意義あるネットワークを構築した結果として、表２に示す遺伝子群が特定される。
具体的に、表１に挙げた遺伝子群のうち５１個の遺伝子群が４つのネットワークを形成するとともに、これら４つのネットワークが大きな一大ネットワークを形成している。
【表２】
2008047947.tif 000018
2008047947.tif 000019
2008047947.tif 000020
2008047947.tif 000021
2008047947.tif 000022
ここで、判定対象者としては、特に限定されず、各種癌に罹患した患者、各種癌を疑われた者及び健常者のいずれであっても良い。また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法は、判定対象者の対して直接何らかの処置を施すものではなく、診断対象者から採取した生体由来試料を用いて実施する。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において生体由来試料とは、判定対象者における遺伝子発現解析が可能であれば特に限定されないが、例えば、組織、細胞、体液、尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液を挙げることができる。ここで体液とは、血液、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）、消化液、膵液、腸液、精液及び羊水を含む意味である。また、生体由来試料は、組織、細胞、体液、尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液のいずれか一種でも複数種でもよい。
組織としては、癌罹患患者の治療目的で行われた手術の際に得られた組織の一部、癌を疑われた診断対象者から生検等によって採取された組織の一部、癌罹患患者で原発性か転移性かを鑑別する目的で生検等によって採取された組織の一部を含む意味である。
また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において細胞としては、上記各組織から単離した細胞を使用することができる。また、体液としては、上記血液から分離した血漿又は血清、尿、リンパ液、脳脊髄液或いは腹水を使用することができる。本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においてその他の生体由来試料としては、喀痰などから単離した細胞又は蛋白質抽出液を用いることができる。
具体的に、判定対象者から採取した生体由来試料における、上述した遺伝子の発現を測定するには、例えば、測定対象の遺伝子に対するｍＲＮＡ量を測定する又は測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定すればよい。
測定対象の遺伝子に対するｍＲＮＡ量を測定する方法としては、公知の遺伝子の発現の検出方法を用いることができる。例えば、測定対象の遺伝子のｍＲＮＡ量を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、測定対象の遺伝子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いることができる。当該プローブを用いて測定対象の遺伝子のｍＲＮＡ量を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、プローブを作製する際に当該プローブに適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを判定対象者から採取した生体由来試料から単離したｍＲＮＡ（又はｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ）とハイブリダイズする。その後、ハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光強度を測定することにより、測定対象の遺伝子のｍＲＮＡ量を検出することができる。なお、プローブとしては、ガラスビーズやガラス基板等の支持体に固定化して使用することもできる。すなわち、測定対象の遺伝子（複数でもよい）について作製したプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ又はＤＮＡチップの形で用いることもできる。
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、４２℃で、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理によってもハイブリダイズを維持することを意味する。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
一方、測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定する方法としては、公知のタンパク質検出方法を用いることができる。具体的には、測定対象のタンパク質に対する抗体を使用した各種の方法を適用することができる。
なお、測定対象のタンパク質を抗原とし、当該抗原に結合する限り、前記抗体としては特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。
ここで、モノクローナル抗体を作製する際には、上述した遺伝子の産物を抗原として使用することができ、また、上述した遺伝子の産物の断片を発現する細胞を抗原として使用することができる。なお、これらタンパク質若しくは当該タンパク質の断片は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版第１−３巻  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。また、これらタンパク質若しくは当該タンパク質の断片を発現する細胞も、Ｍｏｌｅｃｕａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版第１−３巻  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。
得られたモノクローナル抗体は、測定対象のタンパク質の定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイ法で検査試薬として用いることができる。また、モノクローナル抗体は標識化されることが好ましい。標識化を行う際、標識化合物としては例えば当分野で公知の酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、染色物質などを使用することができる。
ところで、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においては、測定対象の遺伝子として上述したＰＤＥ３Ｂ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３Ｂ）遺伝子、ＰＤＧＦＣ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）遺伝子、ＰＫＤ２（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ−２  ｇｅｎｅ）遺伝子、ＮＲＧ１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  １）遺伝子及びＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子から選択するが、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法は、測定対象の遺伝子をこれら５つの遺伝子に限定するものではなく、表１に挙げる遺伝子群から選ばれる他の遺伝子を測定対象として追加してもよい。特に、測定対象の遺伝子としては、上述した５つの遺伝子に加えて、表２に挙げた遺伝子群から選ばれる他の遺伝子を測定対象とすることがより好ましい。
以上のようにして、診断対象者から採取した生体由来試料における、上述した遺伝子群から選ばれる測定対象の遺伝子の発現量を測定した後、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法では、当該発現量に基づいてシスプラチン投与による効果の有無又は効果の程度を判定する。
具体的には、上述したいずれかの方法により測定対象の遺伝子の発現量を測定した後、当該遺伝子の発現量を評価する。発現量の評価は、測定対象の遺伝子毎に基準値を設定し、この基準値との比較によって行っても良い。基準値としては、構成的に発現する遺伝子の発現量に対する相対値を設定することができる。また、測定対象の遺伝子の発現量は、今回行ったように免疫組織化学染色（ＩＨＣ）スコアにて評価し、擬陽性と擬陰性を評価できる値を基準値として評価しても良い。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法及び判定キットによれば、非常に優れた確度及び／又は優れた特異度で判定対象者について、シスプラチン投与による効果の有無又は効果の程度を判断することができる。ここで、感度とは、シスプラチン投与に奏功する患者群における陽性率を意味する。特異度とは、シスプラチン投与に奏功しない患者群における陰性率を意味する。
特に、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において、測定対象の遺伝子の種類を増やすこと（例えば、６種類以上の遺伝子）によって、より優れた感度及び／又はより優れた特異度で診断することができる。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法によれば、抗癌剤・化学療法開始前の癌患者から採取した生体由来試料を用いた遺伝子発現解析（ｍＲＮＡレベル或いはタンパク質レベル）により、シスプラチン投与による効果をより客観的、特異的に判定することができることから、投与効果を期待できない患者に対する過度の負担となるようなシスプラチンの投与を防止することができ、当該患者にとって有効な治療方針にとって有用な知見を提供することができる。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明に係る技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
＜耐性株の樹立＞
先ず、本実施例ではシスプラチン耐性株を樹立した。具体的には、和歌山医科大学医学部歯科口腔外科講座から提供された口腔扁平上皮癌由来細胞株（Ｈ−１株及びＳａ−３株）に対して、シスプラチン（以下、ＣＤＤＰと称する場合もある）濃度を０．１μｇ／ｍｌの低濃度から段階的にＣＤＤＰを持続的に接触させることによって、シスプラチンに対して耐性を有する細胞株を樹立した。Ｈ−１株から樹立したシスプラチン耐性株をＨ−１Ｒ株と命名し、Ｓａ−３株から樹立したシスプラチン耐性株をＳａ−３Ｒ株と命名した。
また、中咽頭扁平上皮癌由来細胞株（ＫＢ株）に対しても同様にＣＤＤＰ処理を行い、シスプラチン耐性株を樹立した。ＫＢ株から樹立したシスプラチン耐性株をＫＢＲ株と命名した。
これらシスプラチン耐性株（Ｈ−１Ｒ株、Ｓａ−３株及びＫＢＲ株）について、シスプラチンに対して感受性を示す各親株に対する相対的な耐性度を検討した。具体的には、各耐性株及び各親株をそれぞれ、ＣＤＤＰで処理し（ＣＤＤＰの濃度を０．０５〜１０μｇ／ｍｌとした）、その後、ＭＴＴアッセイを行った。そして、各耐性株及び各親株について５０％生存（死滅）濃度（ＩＣ５０）を求めた。Ｈ−１株とＨ−１Ｒ株の相対的な耐性度は約１０倍、Ｓａ−３株とＳａ−３Ｒ株の相対的な耐性度は約７．５倍、ＫＢ株とＫＢＲ株の相対的な耐性度は８．６倍であった。これらの３種類の細胞株は凍結解凍を行っても、さらに、１月間ＣＤＤＰ無添加培養を行っても耐性は変わらなかった。
図１に代表例としてＳａ−３株及びＳａ−３Ｒ株におけるＭＴＴアッセイの結果を示す。なお、他の耐性株とその親株においても、図１に示したプロファイルと同様なプロファイルを示した。
なお、耐性株のサイズは親株と比較して若干大きくなっているが、基本的な形態、増殖速度、およびコロニー形成能については、耐性株及び親株において大きな変化は認められず、ほぼ同様の性状を保っていた。
また、樹立した耐性株が遺伝子学的にもＣＤＤＰ耐性を示すことを証明するため、薬剤耐性機構のうちＡＢＣトランスポーター遺伝子の発現状況をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。ＡＢＣトランスポーター（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）は、細胞膜に存在し、薬物の輸送に関わっており、特に薬剤耐性との関連について多く報告されている。ＣＤＤＰ耐性と関連があるといわれるＡＢＣトランスポーター（ＭＤＲ１、ＭＲＰ１及びＭＲＰ２）について発現を検討した。具体的に、ＭＤＲ１、ＭＲＰ１及びＭＲＰ２の各ＲＴ−ＰＣＲに際しては、以下の表３に示すプライマーを用いた。なお、比較の対象としてＧＡＰＤＨをＲＴ−ＰＣＲによって検出した。
【表３】
2008047947.tif 000023
2008047947.tif 000024
ＲＴ−ＰＣＲの結果、本例で樹立した各耐性株においては、３種類のＡＢＣトランスポーターで強発現が認められた。図２に代表例としてＳａ−３株及びＳａ−３Ｒ株におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。この結果から、本例で樹立した各耐性株は遺伝子学的もＣＤＤＰに対する耐性を有する細胞株であることが明かとなった。なお、従前のＣＤＤＰ耐性に関連する報告では、耐性株の耐性度は２倍程度であり、実験誤差範囲ともいえる程度の低耐性しか保有していない細胞株であった。本実施例で樹立した耐性株は、従前の細胞株と比較して高い薬剤耐性を有し、解析に非常に有用であると考えられた。
＜マイクロアレイ解析＞
次に、本実施例では、耐性株及びその親株を用いたマイクロアレイ解析によって、耐性株において特異的に発現増強している遺伝子及び耐性株において特異的に発現減弱している遺伝子を同定した。具体的にマイクロアレイ解析では、マイクロアレイとして５４６７５種類のプローブが固定化されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０を使用した。また、マイクロアレイ解析には、解析ソフトウェアとしてＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）及びＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ６．１（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を使用した。
マイクロアレイ解析としては、先ず、耐性株Ｓａ−３Ｒ株についてその親株Ｓａ−３株と比較して１．５倍以上の発現が観察された遺伝子群、耐性株Ｈ−１Ｒ株についてその親株Ｈ−１株と比較して１．５倍以上の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株ＫＢＲ株についてその親株ＫＢ株比較して１．５倍以上の発現が観察された遺伝子群を特定した。そして、これら３つの群に共通する遺伝子群を、シスプラチン耐性株において特異的に発現増強している遺伝子群（１６４遺伝子）として同定した（図３参照）。
一方、耐性株Ｓａ−３Ｒ株についてその親株Ｓａ−３株と比較して１．５倍以下の発現が観察された遺伝子群、耐性株Ｈ−１Ｒ株についてその親株Ｈ−１株と比較して１．５倍以下の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株ＫＢＲ株についてその親株ＫＢ株比較して１．５倍以下の発現が観察された遺伝子群を特定した。そして、これら３つの群に共通する遺伝子群を、シスプラチン耐性株において特異的に発現減弱している遺伝子群（３５遺伝子）として同定した（図３参照）。
これら合計１９９遺伝子は、癌細胞においてシスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定できたこととなる。
＜パスウェイ解析＞
次に、本実施例では、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定された１９９個の遺伝子についてパスウェイ解析を行い、１９９個の遺伝子で如何なるネットワークが形成されるかを検討した。具体的に、パスウェイ解析には、ソフトウェアとしてＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。その結果、１９９個の遺伝子のうち５０個の遺伝子が４つのネットワークを形成しており、これら４つのネットワークが更に大きな１つのネットワークを形成していることが判明した。これら４つのネットワークを構成する遺伝子群を表４にまとめた。
【表４】
2008047947.tif 000025
2008047947.tif 000026
また、パスウェイ解析の結果として得られた４つのネットワークを図４に示す。表４及び図４に示したネットワークを構成する５０個の遺伝子は、耐性株におけるＣＤＤＰ耐性という表現型に強く関連する遺伝子であると結論づけた。
＜後ろ向き試験＞
次に、本実施例では、後ろ向き試験として臨床検体によって抗癌剤の奏功率を予測しえる候補遺伝子を、この５０個の遺伝子から検索した。まず、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡの発現を確認することで、５０遺伝子中で耐性株において発現している遺伝子のなかから５個の遺伝子（ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＧＦＣ、ＰＫＤ２、ＮＲＧ１及びＬｕｍｉｃａｎ）を選出した。
ＰＤＥ３Ｂに対する抗体として抗ヒトＰＤＥ３Ｂヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、ＰＤＧＦＣに対する抗体として抗ヒトＰＤＧＦＣヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、ＰＫＤ２に対する抗体として抗ヒトＰＫＤ２ウサギポリクローナル抗体（ＡＢＧＥＮＴ社製）、ＮＲＧ１に対する抗体として抗ヒトＰＫＤ２ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）及びＬｕｍｉｃａｎに対する抗体として抗ヒトＬｕｍｉｃａｎヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を準備した。これらの遺伝子がタンパク・レベル質レベルで耐性株において発現増強していることを、準備した抗体を用いたウエスタンブロッティングにて確認した。
なお、上述した５個の遺伝子のうちｌｕｍｉｃａｎ遺伝子について行ったＲＴ−ＰＣＲの結果及びウエスタンブロッティングの結果を代表例として図５（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ｌｕｍｉｃａｎ遺伝子は、親株と比較して耐性株において特異的に発現していることが判る。Ｌｕｍｉｃａｎ遺伝子を除く他の遺伝子についても同様な結果が得られた。
また、シスプラチン投与に結果、完全寛解した症例（ＣＲ症例：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ症例）、部分寛解した症例（ＰＲ症例：Ｐａｒｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ症例）及び不変の症例（ＮＣ症例：Ｎｏ  Ｃｈａｎｇｅ症例）由来の臨床検体を用いて、免疫組織学的染色法により発現状態を調べた。免疫組織学的染色法は、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋組織を厚さ４μｍの切片にし、脱パラフィン処理と脱水処理した後、０．３％Ｈ２Ｏ２と３０分間反応させて内因性ペルオキシダーゼを除去し、１．５％ブロッキング血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で非特異的なタンパクとの反応を阻害した。その後、１：１００倍希釈抗体Ｌｉｎ７Ｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を室温・湿潤状態で３０分間反応させた。リン酸緩衝液で３回洗浄し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄａｋｏ社製）と反応させた後、３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｄａｋｏ社製）によって発色させ検出した。最終に、対比のためにヘマトキシリン染色を施した。
免疫組織学的染色法における染色性の評価にはＩＨＣスコアを用いた。ＩＨＣスコアは、対物レンズ４０倍で観察し、１視野の中の全細胞数のうち陽性細胞の百分率と染色性の強度（例えば３段階（弱、中及び強）に評価して、それぞれに１〜３の整数を割り当てる）とを掛け合わせた数の総和である。これを無作為に抽出した１０視野で行い、その平均値としてＩＨＣスコアを算出する。ＩＨＣスコアは、染色強度と染色範囲を示す優れたスコアとして、現在、一般的に用いられている染色度判定方法である。
ｌｕｍｉｃａｎ遺伝子について臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果の代表例を図６に示した。シスプラチンに耐性である臨床検体症例において、ｌｕｍｉｃａｎタンパクの発現亢進が確認できた。
また、シスプラチン投与に対するＮＣ症例を１０症例、ＰＲ症例を２２症例及びＣＲ症例を１６症例を用いてＩＨＣスコアを求め、ＩＨＣスコアの分布を上述した５つの遺伝子毎に求めた。ＰＤＥ３Ｅ遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果を図７に示し、ｌｕｍｉｃａｎ遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果を図８に示し、ＰＤＧＦＣ遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果を図９に示し、ＰＫＤ２遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果を図１０に示し、ＮＲＧ１遺伝子についてＩＨＣスコアの分布を求めた結果を図１１に示した。
図７〜１１に示すように、上記の５つの遺伝子全てについて、ＩＨＣスコアとシスプラチン投与の奏功評価とが相関していることが明かとなった。
さらに、上記の５個の遺伝子について、その発現の有無と治療効果判定を表５に纏めた。なお、表５において「＋」は各遺伝子についてタンパク質レベルの発現が陽性であったことを示し、「−」は各遺伝子についてタンパク質レベルの発現が陰性であったことを示している。
【表５】
2008047947.tif 000027
2008047947.tif 000028
表５からも判るように、シスプラチン投与の奏功結果と上述した５つの遺伝子の発現とが相関していることが明かとなった。
＜結果のまとめ＞
以上のように、先ず＜マイクロアレイ解析＞の結果から、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として信頼性の高い１９９個の遺伝子を同定することができたに絞り込めた。また、＜パスウェイ解析＞の結果から、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として更に信頼性の高い５１個の遺伝子を絞り込めた。さらに、＜後ろ向き試験＞の結果から、５１個の遺伝子に含まれる５個の遺伝子については、その発現量からシスプラチン投与の効果を判定できることが実証された。これらの結果から、各種癌に対するシスプラチンの投与効果を患者毎に高精度に判定することができる有用な手法を開発できたものと評価できる。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明によれば、シスプラチンの投与による奏効の有無を非常に優れた確度で判定することができる。したがって、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法及びシスプラチン投与効果判定キットは、対象となる患者に対してシスプラチン投与を含む治療を適用するか否かの判定を行うことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
2008047947.tif 000029
2008047947.tif 000030
2008047947.tif 000031
2008047947.tif 000032
2008047947.tif 000033
2008047947.tif 000034
2008047947.tif 000035
2008047947.tif 000036
2008047947.tif 000037
2008047947.tif 000038
2008047947.tif 000039
2008047947.tif 000040
2008047947.tif 000041
2008047947.tif 000042
2008047947.tif 000043
2008047947.tif 000044
2008047947.tif 000045
2008047947.tif 000046
2008047947.tif 000047
2008047947.tif 000048
2008047947.tif 000049
2008047947.tif 000050
2008047947.tif 000051
2008047947.tif 000052
2008047947.tif 000053
2008047947.tif 000054
2008047947.tif 000055
2008047947.tif 000056
2008047947.tif 000057
2008047947.tif 000058
2008047947.tif 000059
2008047947.tif 000060
2008047947.tif 000061
2008047947.tif 000062
2008047947.tif 000063
2008047947.tif 000064
2008047947.tif 000065
2008047947.tif 000066
2008047947.tif 000067
【図１】
2008047947.tif 000089
【図２】
2008047947.tif 000090
【図３】
2008047947.tif 000091
【図４】
2008047947.tif 000092
【図７】
2008047947.tif 000093
【図８】
2008047947.tif 000094
【図９】
2008047947.tif 000095
【図１０】
2008047947.tif 000096
【図１１】
2008047947.tif 000097
【図５】
2008047947.tif 000098
【図６】
2008047947.tif 000099
【国際調査報告】
2008047947.tif 000100
2008047947.tif 000101
2008047947.tif 000102
2008047947.tif 000103