【手続補正書】
【提出日】平成14年6月3日(2002.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス由来重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなる群から選択されたアミノ酸配列の一部または全体がヒト由来重鎖ＨＣＤＲのアミノ酸配列の一部または全体と置換されていることを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原Ｓに選択的に結合するヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項２】
ＨＣＤＲ１のアミノ酸残基３４番イソロイシンがバリンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項３】
ＨＣＤＲ２のアミノ酸残基５４番スレオニンがセリンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項４】
ＨＣＤＲ２のアミノ酸残基６５番セリンがグリシンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項５】
ＨＣＤＲ３のアミノ酸残基１００番グルタミン酸がセリンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項６】
請求項２ないし請求項５の遺伝子変異を全て含むことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項７】
請求項６のヒト化重鎖遺伝子変異体を含むｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ発現ベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８３ＢＰ）。
【請求項８】
マウス由来重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなる群から選択されたアミノ酸配列の一部または全体がヒト由来重鎖ＨＣＤＲ部位のアミノ酸配列の一部または全体と置換され、かつ、ヒトＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに結合するペプチド配列が除去された、配列番号５２で表されるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原Ｓに選択的に結合するヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項９】
ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに結合するペプチド配列は、配列番号５０または配列番号５１で表わされることを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１０】
配列番号４４で表わされる配列のＰ９位置セリンがスレオニンに置換された配列番号５０で表されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１１】
配列番号４５で表わされる配列のＰ６位置スレオニンがアスパラギン酸に置換された配列番号５１で表されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１２】
請求項１０ないし請求項１１の遺伝子変異を全て含むことを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１３】
請求項１２のヒト化重鎖遺伝子変異体を含むｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈ発現ベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８０ＢＰ）。
【請求項１４】
マウス由来軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で構成された群から選択されたアミノ酸配列の一部または全体が、ヒト由来軽鎖ＬＣＤＲ部位アミノ酸配列の一部または全体と置換されたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原Ｓに選択的に結合するヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１５】
ＬＣＤＲ１のアミノ酸残基２７ｃ番アスパラギン酸がセリンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１６】
ＬＣＤＲ１のアミノ酸残基３１番セリンがアスパラギンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１７】
ＬＣＤＲ１のアミノ酸残基３３番メチオニンがイソロイシンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１８】
ＬＣＤＲ２のアミノ酸残基５４番グルタミンがリジンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１９】
ＬＣＤＲ２のアミノ酸残基５６番セリンがスレオニンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項２０】
マウス由来軽鎖ＬＣＤＲ３アミノ酸残基９１番スレオニンがセリンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項２１】
請求項１５ないし請求項２０の遺伝子変異を全て含むことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項２２】
請求項２１のヒト化軽鎖遺伝子変異体を含むｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ発現ベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８４ＢＰ）。
【請求項２３】
請求項７または請求項１３のヒト化重鎖発現ベクター及び請求項２２のヒト化軽鎖発現ベクターが同時に形質転換された形質転換体。
【請求項２４】
請求項２３の形質転換体から発現される、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原Ｓに対するヒト化抗体。
【請求項２５】
マウスとヒトの抗体のＣＤＲ配列を比較し、マウスＣＤＲと最も類似なヒトＣＤＲ配列を選択し、抗原結合に直接的に関与しないマウス抗体のＣＤＲ中のアミノ酸残基をヒト抗体のＣＤＲ中のヒト由来アミノ酸残基に置換してヒト化抗体を製造する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明のヒト化抗体は、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖可変領域に存在するマウス抗体由来のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３部分のアミノ酸残基を各々ヒト抗体由来の重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と比較して最も類似のＣＤＲ配列を選定して各ＣＤＲ内で抗原結合に影響を及ぼさないアミノ酸残基をヒト抗体由来のアミノ酸配列に置換させて製造する。本明細書において、アミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔ計数法に従って指定した（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９９１）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
また、本発明では、上記のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖配列内でＭＨＣｃｌａｓｓ  ＩＩに結合するペプチド配列が存在するかどうかをスタニオロ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ）等の方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，５５５−５６１，１９９９）でスクリーニングし、ＭＨＣＩＩに結合しないと推定される残基を置換したヒト化重鎖を製造し、その抗原結合能を測定した。上記のようなヒト化重鎖を製造する為に、アミノ酸残基４４番セリンがスレオニンに置換された遺伝子変異Ｓ４４Ｔ（配列番号４６及び配列番号４７のプライマーの組を利用）とアミノ酸残基６８番スレオニンがアスパラギン酸に置換された遺伝子変異Ｔ６８Ｄ（配列番号４８及び配列番号４９のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈを製造し、これを２００１年９月２６日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＲＩＢＢ）に寄託した（寄託番号；ＫＣＴＣ１００８０ＢＰ）。上記発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈから発現されるヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列を分析した結果、配列番号５２で記載されるヒト化重鎖ＨｚＳ−ＩＶ−ＶＨからなることを確認した。上記ヒト化重鎖発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈとヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋを動物セルラインに形質転換させた後、４８時間培養して形質転換体からヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶを発現させた。これから得た培養上澄み液内に存在するヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶの抗原結合能を測定した結果、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶは、ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩとほとんど類似した抗原結合親和度を示した（図１２参照）。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
【表１】
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上記ペプチドのＭＨＣＩＩに対する結合力を弱化させる為に、本発明者らは、配列番号４４で表わされるアミノ酸配列のＰ９位置にあるセリンをスレオニンに置換した配列番号５０で表されるアミノ酸配列に対して分析した結果、結合可能なＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ分子が８個（２８％）に減少し、配列番号４５で表わされるアミノ酸配列のＰ６に存在するスレオニン残基をアスパラギン酸に置換した配列番号５１で表されるアミノ酸配列に対して分析した時には、５１種類のＭＨＣＩＩ分子中でただ１種類にだけ結合可能であると分析された。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
したがって、本発明者らは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに対する結合程度が弱化されたヒト化重鎖を製造する為に、ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖配列４４番セリンがスレオニンに置換された遺伝子変異Ｓ４４Ｔ（配列番号４６及び配列番号４７のプライマーの組を利用）とアミノ酸残基６８番スレオニンがアスパラギン酸に置換された遺伝子変異Ｔ６８Ｄ（配列番号４８及び配列番号４９のプライマーの組を利用）を含む遺伝子変異体Ｓ４４Ｔ／Ｔ６８Ｄを得た。上記遺伝子変異体Ｓ４４Ｔ／Ｔ６８Ｄの可変領域の両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造して、ｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈと命名し、これを２００１年９月２６日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（寄託番号；ＫＣＴＣ  １００８０ＢＰ）。
上記発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈから発現されるヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶの重鎖アミノ酸配列を分析した結果、配列番号５２で表されるアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化重鎖ＨｚＳ−ＩＶ−ＶＨからなることを確認した。