(57)【要約】本発明は、遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含むことを特徴とするバラを提供する。当該フラボン及びデルフィニジンは、典型的には、それぞれ、導入されたフラボン合成酵素遺伝子及びフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子の発現によって生成される。前記フラボン合成酵素遺伝子は、例えば、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子であり、具体例として、ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子、及びゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子である。また、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子は、例えば、パンジー（Ｖｉｏｌａ  ｘ  ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ）由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含むことを特徴とするバラ（ａ  ｒｏｓｅ）。
【請求項２】
前記フラボンが、導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現によって生成したものである、請求項１に記載のバラ。
【請求項３】
前記フラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子である、請求項２に記載のバラ。
【請求項４】
前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科キンギョソウ（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）由来のフラボン合成酵素遺伝子である、請求項３に記載のバラ。
【請求項５】
前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科トレニア（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ，Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のフラボン合成酵素遺伝子である、請求項３に記載のバラ。
【請求項６】
前記ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子が、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号１に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、請求項４に記載のバラ。
【請求項７】
前記ゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子が、
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号３に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、請求項５に記載のバラ。
【請求項８】
前記デルフィニジンが、導入されたパンジー（Ｖｉｏｌａ  ｘ  ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ）由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子の発現によって生成したものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバラ。
【請求項９】
前記パンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子が、
（１）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、
（２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、又は
（４）配列番号７に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、請求項８に記載のバラ。
【請求項１０】
フラボン合成酵素遺伝子及びフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化している、請求項２〜９のいずれか１項に記載のバラ。
【請求項１１】
前記花色の変化が、青に向けての変化である、請求項１０に記載のバラ。
【請求項１２】
前記花色の変化が、Ｌ＊ａ＊ｂ表色系色度図における色相角度（θ）が青方向軸である２７０°に近づく変化である、請求項１０又は１１に記載のバラ。
【請求項１３】
前記花色の変化が、花弁の反射スペクトルの極小値が長波長側にシフトする変化である、請求項１０に記載のバラ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバラと同じ性質を有する、その部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞。
【請求項１５】
遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含めることにより生ずるコピグメンテーション効果によりバラの花色を改変する方法。
【請求項１６】
前記コピグメンテーション効果が、花色を青色方向に変化させる効果である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラボン（ｆｌａｖｏｎｅ）及びデルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）を人為的に含有させたバラ（ａ  ｒｏｓｅ）に関する。本発明は、遺伝子操作によりフラボン及びデルフィニジンを含めることにより生ずるコピグメンテーション効果（ｃｏ−ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）によりバラの花色を改変する方法、特に花色を青色方向に変化させる方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
花は植物の生殖器官であり次の世代となる種子を生産するために必要である。種子を形成するためには花粉がめしべに付着し、受精することが必要である。通常花粉の運搬は、蜂や蝶などの昆虫や、ハチドリ、まれにはコウモリにより行われる。花弁の役割は花粉を運ぶこれらの生物を魅了することにあり、植物はそのために、花の色や形、模様に工夫を凝らしている。
花の色は鑑賞の際にも花卉の最も重要な形質であることから、古くから様々な色の花が交配によって育種されてきた。しかしながら、ひとつの植物種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、たとえば、交配により作製されたバラ（ｒｏｓｅ（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａ））、カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、キク（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ））、ユリ（ｌｉｌｙ（Ｌｉｌｉｕｍ  ｓｐｐ．））などには紫から青の品種がなく、ハナショウブ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｇａｒｄｅｎ  ｉｒｉｓ（Ｉｒｉｓ  ｅｎｓａｔａ  ｔｈｕｍｂ．））やリンドウ（ｇｅｎｔｉａｎ（Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｔｒｉｆｌｏｒａ））には鮮やかな赤い品種はない。
花色のうち、淡い黄色から赤色、青色はフラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）及びアントシアニン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ）（フラボノイドに属する有色配糖体）に由来することが多い。フラボノイドは植物の代表的な二次代謝物で、以下に示すように、Ｃ６Ｃ３Ｃ６の基本骨格をもち、フェニルアラニンとマロニルＣｏＡから合成される。Ｃ環の酸化状態により、フラボン、フラボノール（ｆｌａｖｏｎｏｌ）などに分類される。
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フラボノイドは、紫外線を吸収したり、ラジカルを除去したりするので、もともとは植物体を様々なストレスから保護する機能を担っていたと考えられる。また健康によい成分としても近年注目されている（Ｈａｒｂｏｒｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ２０００  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，４８１−５０４参照）。
有色のアントシアニンには、数百分子種が知られているが、以下に示すように、その発色団であるアントシアニジン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）には、（１）オレンジ色から赤色の花に多いペラルゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、（２）赤色から紅色の花に多いシアニジン（ｃｙａｎｉｄｉｎ）及びペオニジン（ｐｅｏｎｉｄｉｎ）、並びに（３）紫から青色の花に多いデルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、ペチュニジン（ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）及びマルビジン（ｍａｌｖｉｄｉｎ）の６種が一般的である。
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アントシアニンの構造はその色に大きな影響を与える。アントシアニンのＢ環の水酸基数が増えると青みが増す。従って、デルフィニジン型アントシアニンは、ペラルゴニジン型アントシアニン、シアニジン型アントシアニンに比べ青い。アントシアニンを含むフラボノイドの生合成は、植物種を超えてよく保存されている。フラボノイドは細胞質で生合成され、糖やアシル基が付加した後に、液胞へと輸送され蓄積される（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ８０，１−２４、及びＴａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ  ２００６  Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ編、Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、ｐｐ．２０１−２３９，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ．参照）。
生合成に関わる酵素の構造遺伝子はすべてクローニングされている。組換え植物を作製できれば、これらの遺伝子の発現を人為的に調整することにより花で蓄積するフラボノイドの構造と量を改変し、花色を変えることができる（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ８０，１−２４、及びＴａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ  ２００６  Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ編、Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、ｐｐ．２０１−２３９，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ．参照）。たとえば、花弁でデルフィニジンを生産できないカーネーションやバラにおいて、デルフィニジンを合成するために必要なフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（以下、「Ｆ３’５’Ｈ」と略す。）遺伝子を発現させることにより、デルフィニジンを生産させ、自然にはない青い花を作製した例がある（Ｔａｎａｋａ  ２００６  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５，２８３−２９１参照）。
このように植物の代謝を人為的に改変する方法は代謝工学と呼ばれることがある。代謝を改変し、目的の物質を蓄積させるためには、目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させればよいが、しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、目的の物質の蓄積がまったく、あるいはほとんど起こらず、産業上有用な形質を持つに至らないことも多い。
たとえば、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）はそのジヒドロフラボノール還元酵素（以下、「ＤＦＲ」と略す。）の特異性のためにペラルゴンジンを蓄積できず、したがってオレンジ色の花色の品種は天然には存在しない。
バラなどのＤＦＲ遺伝子を導入することによりペラルゴニジンを蓄積させたオレンジ色のペチュニアが報告されているが、ペラルゴニジンを蓄積させるためには、ＤＦＲと競合するフラボノイド３’−水酸化酵素（以下、「Ｆ３’Ｈ」と略す。）、Ｆ３’５’Ｈ、フラボノール合成酵素（以下、「ＦＬＳ」と略す。）の遺伝子が欠損しているペチュニア品種を用いる必要があり、これらが欠損していないペチュニアにバラのＤＦＲ遺伝子を導入しても表現型の変化は認められない（Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ  ２００６  Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ編、Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、ｐｐ．２０１−２３９，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ．参照）。したがって目的の遺伝子を単に導入するだけで目的の化合物が蓄積し表現型があらわれるかどうかは予想できない。
さらに、代謝工学においては予想外の結果が出ることも多い。たとえば、トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）においてフラボン合成酵素遺伝子の発現を抑制したところ、フラボン量が減少し、フラバノン（ｆｌａｖａｎｏｎｅ）の蓄積が見られた。フラバノンが蓄積すればアントシアニン量は増加するはずであるが、実際にはアントシアニン量も減少した（Ｕｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６３，２５３−２６３，２００２）。このように代謝物の増減を予想することは困難で目的の表現型を得るためには鋭意工夫が必要である。
また、アントシアニンは結合する芳香族アシル基の数が増えると分子内コピグメント作用により青くなる。２つ以上の芳香族アシル基をもつアントシアンはポリアシル化アントシアニンと呼ばれ、安定な青い色を呈する（Ｈａｒｂｏｒｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ２０００  ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，４８１−５０４参照）。
必須色素であるアントシアニン色素自体の構造によるほか、共存するフラボノイド（コピグメントともいう）や金属イオン、液胞のｐＨなどによっても花の色は変化する。たとえば、フラボンやフラボノールは、代表的なコピグメントで、アントシアニンとサンドイッチ状に積み重なることにより、アントシアニンを青くし、濃く見えるようにする効果がある（Ｇｏｔｏ（１９８７）Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔｌ．Ｐｒｏｄ．５２参照）。この点で、フラボンは無色の補助色素成分であるといえる。たとえばフラボンの一種であるイソビテキシン（ｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎ）はハナショウブ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｇａｒｄｅｎｉｒｉｓ（Ｉｒｉｓ  ｅｎｓａｔａ  Ｔｈｕｎｂ．））においてアントシアニンに対しコピグメント効果を発揮し、色を青くする。また、イソビテキシンはアントシアニンを安定化することによりハナショウブの花の色を安定化することも示されている（Ｙａｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ２０００  １１５，１−５参照）。
また、フラボンはフラボノールよりも強いコピグメント効果を示すことが多い。たとえば遺伝子組換えカーネーションの解析ではフラボンがフラボノールよりもコピグメント効果が強いことが示されている（Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６３，１５−２３，２００３参照）。したがって、フラボンの蓄積は花の色を青くするために重要である。しかしながら、すべての植物がフラボンを生産できるわけではなく、バラやペチュニアなどはフラボンを蓄積しないことが知られている。また、フラボンは、花色以外に、紫外線の吸収、さまざまなストレス、他の微生物との相互作用などにも関与しており、フラボンを合成させることにより新しい形質を持った植物を得ることができることも知られている（フラボン合成酵素をコードする遺伝子に関する特許文献として、特開２０００−２７９１８２を参照のこと）。しかしながら、バラにおいてフラボンを発現させた例は未だ知られていない。
フラボンはフラボン合成酵素が触媒する反応によりフラバノンから合成される。すなわち、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）はナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）から、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）はエリオジクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）から、トリセチン（ｔｒｉｃｅｔｉｎ）はペンタヒドロキシフラバノンから合成される。フラボン合成酵素には、フラボン合成酵素Ｉとフラボン合成酵素ＩＩの２種類がある。両者は同じ反応を触媒するが、異なるタイプの酵素である。フラボン合成酵素Ｉは２−オキソグルタル酸依存的なジオキシゲナーゼ（Ｂｒｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３６ｃ  ｐｐ．７４２−７５０、及びＢｒｉｔｓｃｈ（１９９０）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８２  ｐｐ．１５２−１６０参照）の１種であり、フラボン合成酵素ＩＩはチトクロームＰ４５０型のモノオキシゲナーゼである。フラボン合成酵素ＩＩの構造遺伝子は、トレニア、キンギョソウ、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、ガーベラ（ｇｅｒｂｅｒａ（Ｇｅｒｂｅｒａ  ｈｙｂｒｉｄａ））、リンドウなどから得られている（Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ  ２００６  Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ編、Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、ｐｐ．２０１−２３９，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ．参照）。
フラボン合成酵素遺伝子を、フラボンを生産しない遺伝子組換え植物において発現させると、フラボンが合成されることが予想される。しかしながら、ペチュニアにおいてトレニアのフラボン合成酵素遺伝子を発現させたところ、濃い青紫色の花の色が薄くなったとの報告もある（Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１，３７７−３８６，２００４）。また、リンドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで発現させたところ、フラボンが合成されたが、やはり花の色は薄くなったとの報告もある（Ｎａｋａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  １７：９１−９９）。このように、フラボンが合成されても必ずしも花色は青くならない。言い換えれば、コピグメント効果を示さない原因として、アントシアニンとフラボンの量や比が適切でないことや、アントシアニンとフラボンの糖やアシル基による修飾が適切ではないことなどが挙げられる。これらの結果から、単にフラボン合成酵素遺伝子を発現させフラボンを蓄積させるだけでは花の色をより青くすることはできないということが示唆される。
バラは最も人気のある花卉植物であり、紀元前から栽培されていた記録がある。また、数百年にわたり人為的な品種改良がされてきた。その結果、ペラルゴニジン、シアニジン、フラボノールといったフラボノイドを含むバラが得られている。また、近年では遺伝子組換えの手法を用いて、自然のバラにはないデルフィニジンを生産するバラも作られている。しかしながら、フラボンを蓄積するバラは、交配によっても遺伝子組換えによっても未だ得られていない。
【発明の開示】
【０００３】
植物の品種改良に遺伝子組換えの手法を用いることの最大の利点は、交配による品種改良と異なり、交配することができない植物や他の生物の遺伝子を利用して植物を改良できることである。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いると他種の生物の任意の遺伝子を任意の植物、たとえばバラに導入し、その植物に新しい能力を付与することができるとされている。しかしながら、バラはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）やタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．））などのモデル植物とは異なり、導入した遺伝子が機能するかどうかはその遺伝子の起源や使用するプロモーターなどに大きく依存することが知られている。
ＷＯ２００５／０１７１４７によれば、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子（Ｆ３’５’Ｈ）をバラに導入した場合、遺伝子組換えバラにおいて、ペチュニアやリンドウに由来する同遺伝子は発現せず、デルフィニジンも検出されなかったが、興味深いことにパンジー由来の同遺伝子は発現し、デルフィニジンを生産するという新しい能力をバラに付与することができた。この結果はバラにおいては、どの植物種由来の遺伝子を導入すれば機能するかは容易に類推できないことを示している。
また、キクにおいてはある遺伝子を導入することができてもその遺伝子がキクで機能するかどうかは予想することは困難であり、また組換えキクの加齢にしたがって導入した遺伝子が機能しなくなることが知られている。組換え植物において異種の遺伝子の転写によく使用されるカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーターは、リンドウにおいては機能しないことも報告されている（Ｍｉｓｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００５，４４：５４１−５５６参照）。
フラボンをバラで合成させるためには、フラボン合成酵素遺伝子を発現させればよいことは容易に類推できるが、ジオキシゲナーゼ型又はチトクロームＰ４５０型のいずれのフラボン合成酵素を発現させればよいのか、どの植物起源のフラボン合成酵素遺伝子を発現させればよいのかなどについては、容易に類推することはできないので、試行錯誤が要求される。また、コピグメント効果は液胞中にアントシアニンとフラボンやフラボノールが一定の濃度で共存すれば生じる現象であるが、発色源であるアントシアニンの配糖化等の修飾状態に対し、コピグメントとなるフラボンやフラボノールがより適合した配糖化等の修飾を受けていることが必要であることも明らかにされている（Ｎａｔｕｒｅ．２００５  Ａｕｇ  １１；４３６（７０５２）：７９１、及びＮａｔｕｒｅ，３５８，５１５−５１８（１９９２）参照）。
つまり、必要な色調発現のためには、アントシアニンとフラボン・フラボノールが、最適な構造上の組み合わせをとることが必要であり、また、どのように修飾されたアントシアニンとフラボン・フラボノールを共存させればよいのかという点についても試行錯誤を要するであろう。さらに、フラボン合成酵素がバラで機能したとしても、天然のバラではナリンゲニンなどのフラバノンはフラバノン３−水酸化酵素（以下、「Ｆ３Ｈ」と略す。）により速やかに水酸化されるため、フラバノンからフラボンが合成されるとは限らない。
従って、本発明は、バラにおける目的とする色調発現のために適切な色素を含むバラを提供しようとするものである。
上記の課題を解決するため、本発明者は、種々検討の結果、バラに人為的にフラボン及びデルフィニジンを含有せしめることにより目的とする色調発現が達成されることを見出し、本発明を完成した。
具体的には、本発明は以下の通りのものである：
１．遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含むことを特徴とするバラ（ａ  ｒｏｓｅ）。
２．前記フラボンが、導入されたフラボン合成酵素遺伝子の発現によって生成したものである、前記１に記載のバラ。
３．前記フラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記２に記載のバラ。
４．前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科キンギョソウ（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記３に記載のバラ。
５．前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、ゴマノハグサ科トレニア（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ，Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のフラボン合成酵素遺伝子である、前記３に記載のバラ。
６．前記ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子が、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号１に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、前記４に記載のバラ。
７．前記ゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子が、
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号３に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、前記４に記載のバラ。
８．前記デルフィニジンが、導入されたパンジー（Ｖｉｏｌａ  ｘ  ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ）由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子の発現によって生成したものである、前記１〜７のいずれかに記載のバラ。
９．前記パンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子が、
（１）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、
（２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、又は
（４）配列番号７に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボノイド３’，５’−水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子である、前記８に記載のバラ。
１０．フラボン合成酵素遺伝子及びフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子の導入前の宿主と比べて花色が変化している、前記２〜９のいずれかに記載のバラ。
１１．前記花色の変化が、青に向けての変化である、前記１０に記載のバラ。
１２．前記花色の変化が、Ｌ＊ａ＊ｂ表色系色度図における色相角度（θ）が青方向軸である２７０°に近づく変化である、前記１０又は１１に記載のバラ。
１３．前記花色の変化が、花弁の反射スペクトルの極小値が長波長側にシフトする変化である、前記１０に記載のバラ。
１４．前記１〜１３のいずれかに記載のバラと同じ性質を有する、その部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞。
１５．遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含めることにより生ずるコピグメンテーション効果によりバラの花色を改変する方法。
１６．前記コピグメンテーション効果が、花色を青色方向に変化させる効果である、前記１５に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
用語の定義
用語「バラ（ａ  ｒｏｓｅ）」とは、本明細書中で使用するとき、バラ目バラ科バラ属（Ｏｒｄｅｒ，Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｆａｍｉｌｙ，Ｒｏｓａｃｅａｅ，Ｇｅｎｕｓ  Ｒｏｓａ）の落葉低木である鑑賞用植物の総称をいい、特定の品種に限定されることを意図されず、また、植物の全体又は通常花を含む部分を意味する。
用語「バラ」の「部分、子孫、組織、栄養増殖体又は細胞」とは、本明細書中に使用するとき、本願発明に係る「バラ」の所望の遺伝的形質が保持されている限り、当該「バラ」に由来するすべての物を意味し、特定のものに限定されることを意図されない。
用語「高ストリンジェント条件」とは、本明細書中で使用するとき、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ホルムアミドを含む溶液中、アンチセンス鎖と、対象の核酸とを５５℃で一晩保温し、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又は６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、特に、バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる条件をいう。
用語「Ｌ＊ａ＊ｂ表色系色度図における色相角度（θ）」とは、本明細書中で使用するとき、１９７６年国際証明委員会（ＣＩＥ）で規格化され、日本国においてもＪＩＳ８７２９として採用された色相角度（θ）をいい、０°は赤方向、９０°は黄方向、１８０°は緑方向、そして２７０°は青方向である。尚、花の色は、かかる色相角度と、ＲＨＳ（英国王立園芸協会）のカラーチャートのデータを併用して、表すことができる。
フラボン合成遺伝子及びフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子の導入
バラに公知の方法で、シソ由来のフラボン合成酵素ＩＩの遺伝子を、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子などとともに導入した。その結果、シソ由来のフラボン合成酵素ＩＩの遺伝子を導入したバラではフラボンは検出されず、この遺伝子はバラの中では機能しないことが示された。一方、トレニア又はキンギョソウ由来のフラボン合成酵素ＩＩの遺伝子を導入したバラではフラボンが検出され、フラボン合成遺伝子はバラの中で機能することがわかった。
このようにして、従来は存在しなかったフラボンを蓄積するバラを作出することができた。フラボンの総フラボノイド中の含量（％）は、１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、そして最も好ましくは３０％以上であればよい。アントシアニンとフラボンの両方を蓄積するバラは、同じアントシアニンのみを含むバラよりも、相対的に青い色をしており、フラボンの蓄積が青色化という新しい形質の付与に貢献していることがわかった。
また、交雑試験により、デルフィニジン型アントシアニンとフラボンの両者を蓄積する形質は子孫にも伝達されることがわかった。
本発明に関連する酵素類は、典型的には、配列表に記載されている特定のアミノ酸配列を有する酵素である。しかしながら、酵素においては、特定の、例えば生来の、アミノ酸配列のみならず、酵素活性に関与する領域以外の領域においてアミノ酸配列が修飾されていても、所望の酵素活性が維持されることはよく知られている。従って、本発明の酵素類は、配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対して、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、本来の酵素活性を維持しているタンパク質、及び配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、本来の酵素活性を維持しているタンパク質も、本発明の酵素に含まれる。
また、ある酵素をコードする遺伝子を手にすれば、当該遺伝子に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸は、当該酵素と同様の活性を有する酵素をコードしている蓋然性が高いことが知られている。従って、特定の配列番号で示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、且つ目的の酵素活性を有する酵素も、本発明の酵素に含まれる。
従って、本発明に関与する酵素遺伝子として下記のものが挙げられる。
（Ａ）キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）由来のフラボン合成酵素遺伝子
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号１に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
（Ｂ）トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のフラボン合成酵素遺伝子
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号３に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
（Ｃ）シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）由来のフラボン合成酵素遺伝子
（１）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（２）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
（３）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、又は
（４）配列番号５に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたフラボン合成酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
（Ｄ）パンジー（ｐａｎｓｙ（Ｖｉｏｌａ  ｘ  ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ））由来の３’，５’−水酸化酵素遺伝子
（１）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する３’，５’−水酸化酵素、
（２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する３’，５’−水酸化酵素、
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する３’，５’−水酸化酵素、又は
（４）配列番号７に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされた３’，５’−水酸化酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
（Ｅ）トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のメチル基転移酵素遺伝子
（１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（２）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
（３）配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、又は
（４）配列番号９示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたメチル基転移酵素、
のいずれかをコードする遺伝子。
【実施例】
【０００５】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。本実施例は、本発明を例示することのみを目的とし、本発明の範囲を限定するものと解されることを意図されない。
実施例１：アントシアニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミュレーション
アントシアニンに対するフラボンのコピグメント効果のシミュレーションを行うため、まずアントシアニン類を調製した。Ｃｙａｎｉｎはバラ品種“Ｒｏｔｅ  Ｒｏｓｅ”（ｒｏｓｅ  ｃｖ．“Ｒｏｔｅ  Ｒｏｓｅ”）の花弁より抽出、精製した。Ｄｅｌｐｈｉｎはバーベナ品種“タピアンバイオレット”（ｖｂｅｒｂｅｎａ  ｃｖ．“Ｔａｐｉｅｎ  Ｖｉｏｌｅｔ”ｏｒ  ｖｂｅｒｂｅｎａ  ｖａｒｉｅｔｙ  Ｓｕｎｍａｒｅｆ  ＴＰ−Ｖ（“Ｔａｐｉｅｎ  Ｖｉｏｌｅｔ”）（“Ｔａｐｉｅｎ”ｉｓ  ａ  Ｔｒａｄｅ  Ｍａｒｋ  ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ））の花弁より抽出した色素を、アルカリ加水分解した後精製した。Ｍａｌｖｉｎ、及びＬｕｔｅｏｌｉｎ７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅはフナコシ株式会社より購入した。
このようにして調製した種々のアントシアニンに対してフラボン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ  ７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）を、ｐＨ５．０の緩衝液中、０、１、２、４当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。アントシアニンとしては、Ｃｙａｎｉｎ（Ｃｙａｎｉｄｉｎ  ３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、Ｄｅｌｐｈｉｎ（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ  ３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、Ｍａｌｖｉｎ（Ｍａｌｖｉｄｉｎ  ３，５−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）を用いた。アントシアニンの濃度はＣｙａｎｉｎ、ＤｅｌｐｈｉｎおよびＭａｌｖｉｎは１ｍＭとした。
以下の表１と２に示すように、フラボンの添加により、アントシアニン水溶液の吸光度は増大し、その変化の割合（吸光度比）は、Ｍａｌｖｉｎで最大であった。また、吸収極大（λｍａｘ）もフラボンの添加とともに長波長側へシフトした。その変化の割合はＭａｌｖｉｎで最大、次いでＤｅｌｐｈｉｎであった。さらに、Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系により色彩値の評価を行ったところ、フラボンの添加により、色彩の青色化が観察され、彩度も上昇した。その効果は、Ｍａｌｖｉｎで最も顕著であった。すなわち、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ  ７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅのコピグメント効果を最も受けるのはＭａｌｖｉｎであることが判明した。
【表１】
2008156214.tif 000005
【表２】
2008156214.tif 000006
実施例２（参考例）：バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とシソ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
特開２０００−２７９１８２に記載のシソ由来フラボン合成酵素遺伝子を含むプラスミド、ｐＹＦＳ３をＸｂａＩで消化した後、平滑末端化し、さらにＢａｍＨＩで消化して、約１．８ｋｂのシソ  フラボン合成酵素遺伝子断片を得た。一方、ＷＯ２００５／０１７１４７に記載のｐＳＰＢ９０６をＸｈｏＩで消化後、平滑末端化し、さらにＢａｍＨＩで消化した。この平滑末端とＢａｍＨＩ切断部位の間に、前述のシソのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し９０６−ｐＹＦＳ３を得た。９０６−ｐＹＥＳ３はＥｌ２３５ＳプロモーターとＤ８ターミネーター（いずれもＷＯ２００５／０１７１４７に記載）の間にシソ由来のフラボン合成酵素遺伝子を有するものである。
Ｕｅｙａｍａらの報告（Ｕｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６３，２５３−２６３，２００２）に記載されたｐＳＰＢ１７６のＢａｍＨＩとＳａｌＩ部位に、ＷＯ２００５／０１７１４７に記載のｐＣＧＰ１９６１からＢａｍＨＩとＸｈｏＩの部分消化で切り出したパンジーＦ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子の断片を挿入したプラスミドをｐＳＰＢ５７５とした。このＡｓｃＩ部位に、上述の９０６−ｐＹＦＳ３をＡｓｃＩで消化して得られる約３．４ｋｂのシソのフラボン合成酵素遺伝子発現カセットを挿入した。得られたプラスミドのうち、Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子の発現カセットとシソのフラボン合成酵素の発現カセットが同じ方向に連結されたベクターをｐＳＰＢ１３１０とした。本プラスミドは植物においてはパンジーのＦ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とシソのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ１３１０を藤色系バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”（ｍａｕｖｅ  ｒｏｓｅ  ｖａｒｉｅｔｙ“Ｌａｖａｎｄｅ”）へ導入し、５５個体の形質転換体を得た。色素分析を行った５０個体のうち４９個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高７０％（平均２６％）であった。しかしながら、フラボンは全く検出されず、シソ由来のフラボン合成酵素遺伝子がバラの細胞では機能していないことが推察された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表３に示す。
【表３】
2008156214.tif 000007
実施例３：バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
Ａｋａｓｈｉらの報告（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４０，１１８２−１１８６，１９９９）に記載のトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子が、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位に挿入されたプラスミドをｐＳＰＢ４２６とした。これをＫｐｎＩで消化した後、平滑末端化し、さらにＢａｍＨＩで消化し、約１．７ｋｂのトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子断片を得た。一方、ＷＯ２００５／０１７１４７に記載のｐＳＰＢ９０６をＸｈｏＩで消化後、平滑末端化し、さらにＢａｍＨＩで消化した。この平滑末端とＢａｍＨＩ切断部位の間に、前述のトレニアのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し９０６−４２６を得た。
Ｕｅｙａｍａらの報告（Ｕｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６３，２５３−２６３，２００２）に記載されたｐＳＰＢ１７６のＢａｍＨＩとＳａｌＩ部位に、ＷＯ２００５／０１７１４７に記載のｐＣＧＰ１９６１からＢａｍＨＩとＸｈｏＩの部分消化で切り出したパンジーＦ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子の断片を挿入したプラスミドをｐＳＰＢ５７５とした。このＡｓｃＩ部位に、上述の９０６−４２６をＡｓｃＩで消化して得られる約３．３ｋｂのトレニアのフラボン合成酵素遺伝子発現カセットを挿入した。得られたプラスミドのうち、Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子の発現カセットとトレニアのフラボン合成酵素の発現カセットが同じ方向に連結されたベクターをｐＳＰＢ１３０９とした。本プラスミドは植物においてはパンジーＦ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニアのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ１３０９を藤色系バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”へ導入し、５０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った３８個体のうち３６個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高４５％（平均１２％）であった。一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、３５個体で新たにフラボン（ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり１．６８ｍｇという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表４に示す。
【表４】
2008156214.tif 000008
実施例４：バラ品種“ＷＫＳ１２４”へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
サーモンピンク系のバラ品種“ＷＫＳ１２４”（ｓａｌｍｏｎ−ｐｉｎｋ  ｒｏｓｅ  ｖａｒｉｅｔｙ“ＷＫＳ１２４”）へ実施例３に記載のｐＳＰＢ１３０９を導入し、４０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２７個体のうち２６個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高９６％（平均８１％）であった。一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、２６個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり４．４１ｍｇという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表５に示す。
【表５】
2008156214.tif 000009
実施例５：バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”でのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とキンギョソウ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在性フラボノール合成酵素遺伝子の抑制
Ｔａｎａｋａらの報告（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｒｏｓｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．１，ｐｐ．３４１−３５０，ＩＳＢＮ  ０−１２−２２７６２１−３）に記載のバラのフラボノール合成酵素をコードするｃＤＮＡが、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−にクローニングされたものをｐＲＦＬＳとする。ベクターのマルチクローニングサイト上流の配列に由来するＲｅｖｅｒｓｅプライマー（ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）（配列番号１１）と、バラのフラボノール合成酵素ｃＤＮＡの配列の５’末端から約０．８ｋｂ下流の配列に加えてＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加したＲＦＬＳ−ＨｉｎｄＩＩＩプライマー（ＧＡＴＣＴＴＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧＡＣＡＴＡＣ）（配列番号１２）を用い、ｐＲＦＬＳを鋳型として常法に従いＰＣＲを行った。
得られた断片をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し、続いてＳａｃＩで消化することにより、バラフラボノール合成酵素ｃＤＮＡの上流約０．８５ｋｂに由来する断片を得た。一方、ｐＲＦＬＳをベクターのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩとフラボノール合成酵素ｃＤＮＡ内に存在するＨｉｎｄＩＩＩで切断し、バラフラボノール合成酵素ｃＤＮＡの上流約０．６ｋｂに由来する断片を得た。フラボノール合成酵素ｃＤＮＡに由来するこれら約０．６ｋｂの断片並びに約０．８５ｋｂの断片を、ＷＯ２００５／０５９１４１に記載のｐＳＰＢ１８４を、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにて消化し得られるＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ部位に挿入し、ｐＳＰＢ１４０２を得た。
次に、特開２０００−２７９１８２に記載のキンギョソウ由来フラボン合成酵素遺伝子ＡＮＦＮＳ２をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩからＢａｍＨＩとＸｈｏＩから切り出し、これをＷＯ２００５／０１７１４７に記載のｐＳＰＢ９０６をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られるプロモーターとターミネーターに連結した。これをｐＳＰＢ５７７とする。ｐＳＰＢ５７７をＡｓｃＩで切断して得られるキンギョソウのフラボン合成酵素発現カセット断片を実施例２に記載のｐＳＰＢ５７５のＡｓｃＩ部位に挿入したものをｐＳＰＢ９０８とする。
このようにして得られたｐＳＰＢ９０８をＡｓｃＩで部分消化し、ここに、ｐＳＰＢ１４０２をＡｓｃＩで消化して得られる約３．５ｋｂのバラフラボノール合成酵素ｃＤＮＡに由来する二本鎖ＲＮＡ発現カセットを挿入した。得られたプラスミドｐＳＰＢ１４０３は、パンジーＦ３’５’Ｈ  ＃４０、キンギョソウＦＮＳ遺伝子、バラＦＬＳ遺伝子の二本鎖ＲＮＡ発現カセットが同方向に連結されたバイナリ−ベクターである。本プラスミドは植物においてはＦ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子遺伝子とキンギョソウフラボン合成酵素遺伝子を構成的に発現し、さらにＲＮＡｉ法により内在性のフラボノール合成酵素遺伝子の発現を抑制するようデザインされている。
藤色系バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”へｐＳＰＢ１４０３を導入し、８２個体の形質転換体を得た。色素分析を行った８２個体のうち６４個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高７２％（平均１９％）であった。一方、キンギョソウ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、７０個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり２．５０ｍｇという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表６に示す。
【表６】
2008156214.tif 000010
実施例６：バラ品種“ＷＫＳ１２４”でのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とキンギョソウ由来フラボン合成酵素遺伝子の発現とバラ内在性フラボノール合成酵素遺伝子の抑制
実施例５に記載のｐＳＰＢ１４０３をサーモンピンク系バラ品種“ＷＫＳ１２４”へ導入し、２０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２０個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高８９％（平均５５％）であった。一方、キンギョソウ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、２０個体全てで新たにフラボン（ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり１．２６ｍｇという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表７に示す。
【表７】
2008156214.tif 000011
実施例７：バラ品種“ＷＫＳ１２４”へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例３に記載のｐＳＰＢ１３０９をＰａｃＩ処理し、トレニア由来のフラボン合成酵素発現カセットとパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子発現カセットの連結部位付近に存在する（より厳密には、フラボン合成酵素発現カセットのＤ８ターミネーター３’末端付近に存在する）ＰａｃＩ部位とベクターのマルチクローニングサイト内のＰａｃＩ部位を切断することにより、パンジーＦ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子発現カセットを切り出した。
一方、ＷＯ２００３−０６２４２８に記載トレニアのメチル基転移酵素遺伝子発現カセットを有するバイナリーベクターｐＳＰＢ１５３０をＰａｃＩで切断し、そこに上記のパンジーＦ３’５’Ｈ  ＃４０発現カセットを、メチル基転移酵素遺伝子発現カセットと同じ方向に挿入した。本プラスミドをＴＭＴ−ＢＰ４０とする。
一方、ｐＳＰＢ１３０９をＡｓｃＩで切断し、トレニアのフラボン合成酵素発現カセットを切り出した。これをＴＭＴ−ＢＰ４０のＡｓｃＩ部位に、これらの発現カセットと同じ方向に挿入し、得られたプラスミドをｐＳＦＬ５３５とした。本プラスミドは植物において、パンジーＦ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニアのメチル基転移酵素遺伝子、及びトレニアのフラボン合成酵素遺伝子を構成的に発現する。
このようにして得られたｐＳＦＬ５３５をサーモンピンク系バラ品種“ＷＫＳ１２４”へ導入し、１７３個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った９８個体の形質転換体のうち８８個体でマルビジン（デルフィニジンの３’位と５’位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高８４％（平均５０％）であった。
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、７７個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり４．５８ｍｇという高い含有量であった。また、５１個体でメチル化されたトリセチンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表８に示す。
【表８】
2008156214.tif 000012
実施例８：バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例７に記載のｐＳＦＬ５３５を藤色系バラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”へ導入し、１３０個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った１１８個体の形質転換体のうち３７個体でマルビジン（デルフィニジンの３’位と５’位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高５５．６％（平均２０．５％）であった。
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、７８個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり５．１１ｍｇという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち２０個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表９に示す。
【表９】
2008156214.tif 000013
実施例９：バラ品種“ＷＫＳ８２”へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例７に記載のｐＳＦＬ５３５を藤色系バラ品種“ＷＫＳ８２”（ｍａｕｖｅ  ｒｏｓｅ  ｖａｒｉｅｔｙ“ＷＫＳ８２”）へ導入し、２５０個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った２３２個体の形質転換体のうち１１０個体でマルビジン（デルフィニジンの３’位と５’位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高６５．２％（平均１９．７％）であった。
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、１２５個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり４．７１ｍｇという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち８０個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表１０に示す。
【表１０】
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実施例１０：バラ品種“ＷＫＳ１４０”へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例７に記載のｐＳＦＬ５３５を藤色系バラ品種“ＷＫＳ１４０”（ｍａｕｖｅ  ｒｏｓｅ  ｖａｒｉｅｔｙ“ＷＫＳ１４０”）へ導入し、７４個体の形質転換体を得た。アントシアニジン分析を行った７４個体の形質転換体のうち２０個体でマルビジン（デルフィニジンの３’位と５’位がメチル化されたアントシアニジン）の蓄積を確認でき、バラの花弁においてパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高５１．３％（平均３３．５％）であった。
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、２９個体で新たにフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり３．０４ｍｇという高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体のうち２０個体でメチル化されたトリセチン又はルテオリンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表１１に示す。
【表１１】
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実施例１１：フラボン及びマルビジン合成能の後代への伝播−パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子を導入した遺伝子組換えバラと栽培バラとの交雑
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するため、実施例７で作出したマルビジン及びフラボンを生産するバラ（表８中、植物Ｎｏ．６）を花粉親として用いた交配を行った。種子親には、中輪系栽培バラ“Ｍｅｄｅｏ（メデオ）”（ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  ｒｏｓｅ  ｖａｒｉｅｔｙ“Ｍｅｄｅｏ”）を用いた。
取得した形質転換体Ｆ１雑種後代のうち１０個体の色素分析を行ったところ、７個体でマルビジンの蓄積が確認され、バラの花弁においてパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示された。なお、マルビジン含有率は最高６８．２％（平均４６．６％）であった。
一方、トレニア由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、８個体の形質転換体後代でフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積も確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり７．３５ｍｇという極めて高い含有量であった。また、フラボンを生産していた形質転換体後代のうち６個体でメチル化されたトリセチンが検出された。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表１２に示す。
【表１２】
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実施例１２：フラボン合成能の後代への伝播
パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子及びトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子を導入したバラ品種“ＷＫＳ１２４”と、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子とトレニア由来フラボン合成酵素遺伝子を導入したバラ品種“Ｌａｖａｎｄｅ”の交配
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するため、実施例３で作出したフラボン生産株（表４中、植物Ｎｏ．４）を花粉親として用いた交配を行った。種子親には、バラ品種ＷＫＳ１２４へｐＳＰＢ１５３２を導入し、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ  ＃４０遺伝子およびトレニア由来アントシアニンメチル基転移酵素遺伝子の働きにより花弁でマルビジンを高蓄積した形質転換体ＷＫＳ１２４／１５３２−１２−１（ＷＯ２００３／０６２４２８に記載）を用いた。
取得した形質転換体後代のうち１４９個体の色素分析を行ったところ、８８個体でフラボン（トリセチン、ルテオリン、アピゲニン）の蓄積が確認できた。フラボン総量は最高で新鮮花弁重量１ｇあたり４．０９ｍｇという高い含有量であった。また、４２個体でメチル化されたトリセチンが検出され、１１個体でメチル化されたルテオリン（Ｃｈｒｙｓｏｅｒｉｏｌ（３’Ｍｅｔ−Ｌｕｔ））が検出された。なお、色素分析を行った１４９個体のうち、１２９個体でマルビジンの蓄積が確認できた。マルビジン含有率は最高７９％（平均３６％）であった。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表１３に示す。
【表１３】
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実施例１３：フラボンを含むバラの花色の評価
実施例４及び７において作出された形質転換体（バラ品種“ＷＫＳ１２４”を宿主とする）について、（１）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラボンを含まないもの、（２）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラボンを含むもの、及び（３）宿主（主な色素としてペラハゴニジンを蓄積）というグループに分類し、それぞれの花弁の色彩について分光測色計を用いて評価を行った（ｎ＝１０）。
主色素がデルフィニジンタイプのバラ、マルビジンタイプのバラいずれにおいても、フラボンが共存する場合に花弁の色相角度は青色方向へシフトしていた。また、主色素がマルビジンタイプのバラにおいては、その傾向がより顕著であり、反射スペクトルの極小（λＭｉｎ）も長波長側へ大きくシフトしていた。以上の結果から、フラボンの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。結果を以下の表１４に示す。
【表１４】
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【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明により、鑑賞用植物として人気のある花卉植物であるバラにおいて、遺伝子組換え手法によりフラボン及びデルフィニジンを含ませることで、コピグメンテーション効果によりバラの花色を青色方向に変化させることができる。青色の花色をもつバラは観賞用植物としての商品需要が見込まれる。
ここで、本明細書中に引用した特許文献、非特許技術文献の全てを、個別に又はそれらを全体として、本明細書中に援用する。
これまで、本発明を説明してきたが、本発明は、その本質から逸脱せずに、修正又は変更されうると解されるべきであり、本発明の範囲は、実施例の記載に基づくのではなく、添付の請求の範囲により画されるべきことはいうまでもない。
［配列表］
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【国際調査報告】
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