【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のアトピー性皮膚炎動物モデルの背部のドライスキン部位に、検体を連続的に投与した群（投与群）と、ベヒクルを連続的に投与した群（ベヒクル群）および無塗布群とを作成し、前記ベヒクル群の炎症の度合いおよび皮膚表面性状の度合いと前記投与群および無塗布群の炎症の度合い、皮膚表面性状の度合いとを比較して、投与群の炎症の度合いおよび皮膚表面性状の回復度合いを指標とすることを特徴とする、アトピー性皮膚炎処置剤の評価法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【従来の技術】
近年、アトピー性皮膚炎の患者は急増していると言われている。これらの原因としては、食生活の変化、ストレス、生活環境の悪化等が推定されているが、確証はなく、その原因は不明と思われる。又、炎症の種類としても不明のことが多い。又、この様なアトピー性皮膚炎の確固たる治療薬も開発されていない。これはひとえに、アトピー性皮膚炎の適切な動物モデルが存在せず、これによって治療薬が開発されにくい為と言われている。アトピー性皮膚炎においては、その皮膚免疫学的性質の変化のみならず、皮膚表面においてはＴＥＷＬの上昇、角層細胞面積の縮小、皮膚の乾燥、皮膚厚さの増加などの症状が認められる。この様な変化が全て確認されている、確立した動物モデルは現在の所未だ得られていないのが現状である。現在知られている、動物モデルとしては、過密状態での飼育のストレス負荷により肌荒れを起こさせた、過密ストレスモデル（特開２００２−２６５３４６）、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの耳に、感作性物質である２，４，６−トリニトロ−１−クロロベンゼン（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏ−１−ｃｈｒｏｌｏｂｅｎｚｅｎｅ ；ＴＮＣＢ）あるいはオキサゾリン（Ｏｘａｚｏｌｉｎ）を２日間 インターバルで２４−４８日間、連続塗布するモデル（Ｋｉｔａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｔｙｐｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｌａｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ．Ｉ．Ｄ． １０５： ７４９−７５５， １９９５）等が知られている。しかしながら、前者に於いては、その手技に技能的な熟度が要求され、
誰もが再現性良く動物モデルを作成できるわけではなく、又、動物の飼育環境もその肌荒れの度合いに大きく影響を与える。後者の場合に於いては、炎症部位が耳であるため、種々の病理的な検討、非侵襲的測定が行えない欠点があり、果たしてアトピー性皮膚炎特有の病理変化を全て充足しているか否かは不明としか言いようが無かった。言い換えれば、今まで得られているアトピー性皮膚炎動物モデルにおいては、その作成の再現性と容易性、アトピー性皮膚炎の病理的特徴を全て兼ね備えた動物モデルは存在しておらず、この様な動物モデルの開発が望まれていた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
【課題の解決手段】
本発明者らは、この様な状況に鑑みて、その作成の再現性と容易性、アトピー性皮膚炎の病理的特徴を全て兼ね備えた動物モデルを求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、ヘアレスマウスの背部に、起アレルギー物質を連続的に投与し、ドライスキンを起こさせた動物の皮膚性状が、アトピー性皮膚炎の病理学的特徴に酷似して居ることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下に示す技術に関するものである。
（１）ヘアレスマウスの背部に、起アレルギー物質を連続的に投与し、ドライスキンを起こさせたことを特徴とする、アトピー性皮膚炎動物モデル。
（２）前記起アレルギー性物質が、２，４，６−トリニトロ−１−クロロベンゼンであることを特徴とする、（１）に記載のアトピー性皮膚炎動物モデル。
（３）前記アレルギー性物質の投与回数が少なくとも１２回以上であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載のアトピー性皮膚炎動物モデル。
（４）（１）〜（３）何れか１に記載のアトピー性皮膚炎動物モデルの背部のドライスキン部位に、検体を連続的に投与した群（投与群）と、ベヒクルを連続的に投与した群（ベヒクル群）および無塗布群とを作成し、前記ベヒクル群および無塗布群の炎症の度合い、皮膚表面性状の度合いと前記投与群の炎症の度合い、皮膚表面性状の度合いとを比較して、投与群の炎症の度合いおよび皮膚表面性状の回復度合いを指標とすることを特徴とする、アトピー性皮膚炎処置剤の評価法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【発明の実施の形態】
（１）本発明のアトピー性皮膚炎動物モデル
本発明のアトピー性皮膚炎動物モデルは、ヘアレスマウスの背部に、起アレルギー物質を連続的に投与し、ドライスキンを起こさせたことを特徴とする。前記連続的投与としては、少なくとも感作が成立する程度は必要であり、より好ましくは、感作が成立した後、尚、数回は投与されることが好ましい。具体的には２日毎の投与であれば１２回以上の投与回数が好ましく、連日の投与では１０回以上が好ましい。かかる起アレルギー物質としては、アレルギーを起こさせる作用を有することが知られているものであれば、特段の限定なく使用することが出来るが、特に好ましいものとしては、２，４，６−トリニトロ−１−クロロベンゼンが例示できる。かかる起アレルギー物質は溶剤などを用いて希釈して、１％程度の濃度に調整して投与するのが好ましく、投与量は背部前面に１０〜２００μｌ投与することが好ましい。アトピー性皮膚炎の成立の有無については、肉眼でスケーリングが観察されるか否かによって判断することが出来るし、非侵襲的測定法で皮膚水分量を
測定するなどにより判断することができる。勿論、角層細胞や皮膚の一部をサンプリングして病理学的な確認を行うことも可能である。かくして得られたアトピー性皮膚炎動物モデルは、後記実施例に示す如く、その皮膚反応の特徴が極めてアトピー性皮膚炎のそれに一致しており、皮膚外用剤に対する反応特性も一致している。この為、アトピー性皮膚炎のモデルとして、アトピー性皮膚炎治療薬のスクリーニング等に好適である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
（２）本発明のアトピー性皮膚炎処置剤の評価法
本発明のアトピー性皮膚炎処置剤の評価法は、上記アトピー性皮膚炎動物モデルを使用することを特徴とする。即ち、前記の如く作成したアトピー性皮膚炎動物モデルに被験検体を投与し、該投与により、動物の皮膚の状態がどの様に変化するかを指標にして、その効能を評価するものである。投与はスケーリングが起こっている部位に、被験検体を１日１回、連日１２〜３６回程度投与すれば良く、かかる処置を行った後に、皮膚の肉眼観察、ＴＥＷＬ（経皮的散逸水分量）の測定、病理組織の観察、角層細胞分析などを行い、被験検体を投与しなかった対照群、全く塗布処置を行わなかった無塗布群のものと比較し、対照群および無塗布群の状態からどの程度無処置群（同週齢対照群）の状態にまで近づいたかを指標に評価する。この様な評価に於いては、例えば、ＴＥＷＬの様な指標であれば、数値として知ることが出来、かかる数値をそのまま使用することが出来るし、数値にならないものは、無処置群と無塗布群とを両極端に置くスケールで、スコア化することが出来る。この変化を見ることにより、被験検体のアトピー性皮膚炎への効果を知ることが出来る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（１）ヘアレスマウス皮膚表面状態の変化およびＴＥＷＬ変化測定、角層水分量変化測定皮膚表面の状態については肉眼観察を行った。ＴＥＷＬ測定はＴＥＷＡメーター（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）で測定し、角層水分量の測定はコロネオメーター（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）で測定を行った。
（２）皮膚接触過敏反応の測定（皮膚厚さ測定）
耳および背中皮膚の厚さ測定にはピーコック社製のマイクロメーターを用いた。またヘアレスマウス皮膚厚さの測定ではマウスの背中皮膚を正中線に沿ってつまんで引上げて測定した。
（３）角層面積変化測定
橿渕らの方法に従い、テープストリップ等にて得られた角質細胞を染色し、顕微鏡下で角層細胞の面積を測定した。（橿渕暢夫， 皮膚の形態学的評価のための改良された剥離角層細胞診断法；日皮協ジャーナル、２７，１２２−１３２、１９９１）
（４）電子顕微鏡による角層細胞裏面絨毛様突起の観察
大畑らの報告に従い、テープストリップにて得られた角層細胞の裏面を走査型電子顕微鏡にて観察した。なお、評価はスコア判定で行い、０点：全く絨毛様突起が認められない、１点：観察視野の一部に弱い絨毛用突起が観察される、２点：観察視野の半分以上に絨毛様突起が観察される、 ３点：観察視野全体に絨毛様突起が夥しく観察される、という基準を用いた。（大畑智他、成人アトピー性皮膚炎患者より得た剥離角質細胞の走査型電子顕微鏡所見； 日本皮膚科学会誌、１０３（１０）： １３０７−１３１４，１９９３）
（５）皮膚組織の組織学的観察
採取した皮膚組織を中性ホルマリンで固定、パラフィン包埋後、薄切し、Ｈ＆Ｅ染色、トルイジンブルー染色、ＬＵＮＡ染色を行い、真皮に存在するマスト細胞、好酸球を顕微鏡下で計測した。
（６）角層内セラミドの定量
ディスパーゼ、トリプシン処理し、真皮と生細胞を除去した角層サンプル（３ｃｍφ） を乾燥後、クロロホルム：エタノール＝２：１、１：１、１：２で順次抽出し、薄層クロマトグラムで展開し（クロロホルム：メタノール：酢酸（１９０ ： ９ ： １））、硫酸噴霧後の焼きつけで可視化したセラミドをフォトデンシトメーターで定量した。
（７）血清中ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ濃度測定
マウスより眼底採取した血清中に存在するＩｇＥ、ＩＦＮ−γをサンドイッチＥｌｉｓａ（Ｍｏｒｉｎａｇａ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により定量した。
（８）表皮内Ｔ細胞サブセットの染色および計測と表皮ランゲルハンス細胞の染色
表皮シート内に存在するＴ細胞サブセット（ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８）を塩原の方法により染色し、蛍光顕微鏡下で可視化してサブセットの計測（単位面積あたり）を行った。また表皮シート内に存在するランゲルハンス細胞はＩ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ抗原に対する抗体を用いて染色し、蛍光顕微鏡下で観察を行った。（Ｓｈｉｏｈａｒａ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．，
Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−αβ／ＣＤ３ ａｎｄ ＣＤ８ Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５０（１０）， ４３２３−４３３０，１９９３）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】ＴＮＣＢ塗布による表皮Ｔ細胞サブセットの変化（ＣＤ８）を示
す図である。