(57)【要約】本発明は、新規な発光波長ピークを有するＧＦＰの人為的変異体を提供する。配列番号１に示されるアミノ酸配列において、６６位のアミノ酸残基と１７５位のアミノ酸残基がそれぞれ置換され、さらに７２位のアミノ酸残基又は２０６位のアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質、又はさらに６５位、１４５位、１４８位、４６位、及び／又は２０３位の各アミノ酸残基が置換されている、発光波長ピークが４２４ｎｍであり、ｐＨ非依存性蛍光強度を有する蛍光タンパク質。本発明の蛍光タンパク質は４２４ｎｍという発光波長ピークの蛍光を発し、群青色として他の蛍光タンパク質と肉眼で識別することができる。また、ｐＨの変化に蛍光強度が左右されない、ｐＨ非依存性の蛍光強度を有する。
2009020197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、６６位のアミノ酸残基と１７５位のアミノ酸残基がそれぞれ置換され、さらに７２位のアミノ酸残基又は２０６位のアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質。
【請求項２】
７２位のアミノ酸残基及び２０６位のアミノ酸残基がいずれも置換されている、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
６６位のアミノ酸残基がフェニルアラニンに、７２位のアミノ酸残基がアラニンに、１７５位のアミノ酸残基がグリシンに、及び２０６位のアミノ酸残基がリジンにそれぞれ置換されている、請求項２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
さらに６５位のアミノ酸残基、１４５位のアミノ酸残基又は１４８位のアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されている、請求項１〜３の何れかに記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
６５位のアミノ酸残基、１４５位のアミノ酸残基及び１４８位のアミノ酸残基が何れも置換されている、請求項４に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
６５位のアミノ酸残基がグルタミンに、１４５位のアミノ酸残基がグリシンに、及び１４８位のアミノ酸残基がセリンに置換されている、請求項５に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
さらに４６位のアミノ酸残基が置換されている、請求項４〜６の何れかに記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
４６位のアミノ酸残基がロイシンに置換されている、請求項７に記載の蛍光タンパク質。
【請求項９】
さらに２０３位のアミノ酸残基が置換されている、請求項１〜８の何れかに記載の蛍光タンパク質。
【請求項１０】
２０３位のアミノ酸残基がバリンに置換されている、請求項９に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１１】
６６位のアミノ酸残基がフェニルアラニンに、１７５位のアミノ酸残基がグリシンに、７２位のアミノ酸残基がアラニンに、２０６位のアミノ酸残基がリジンに、６５位のアミノ酸残基がグルタミンに、１４５位のアミノ酸残基がグリシンに、１４８位のアミノ酸残基がセリンに、４６位のアミノ酸残基がロイシンに、及び２０３位のアミノ酸残基がバリンに置換されている、請求項１０に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１に記載の蛍光タンパク質において、さらに１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れかに記載の蛍光タンパク質と任意のタンパク質又はポリペプチドとからなる融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れかに記載の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸によってコードされる蛍光タンパク質又は融合タンパク質を発現するベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された蛍光特性を有する蛍光タンパク質、特に群青色に発光する蛍光タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
発光クラゲの一種であるイクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する蛍光タンパク質、いわゆるＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、３９５ｎｍの励起スペクトルピークと５０９ｎｍの発光スペクトルピークを有し、緑色に発光するタンパク質である（Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、第２６３巻、第８０２−８０５頁）。このタンパク質は、高温で安定（Ｔｍ＝７８℃）である、カオトロピック試薬（例えば８Ｍ尿素）中で安定である、他のタンパク質との融合タンパク質の形態で比較的安定に発現され、その蛍光発色により当該融合タンパク質の存在が視認できる、などの利点を有しており、無傷の生体あるいは細胞を用いた、生体或いは細胞内における特定の物質の局在性の観察ないし確認、さらには特定の遺伝子発現の確認を行うことを可能とし、分子生物学における研究に大きな変革をもたらした。【０００３】
この蛍光タンパク質の有用性をさらに高める研究が盛んに行われており、ＧＦＰの特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換させた人為的変異体が多数報告されている。ＧＦＰの人為的変異体の構築の目的は、蛍光強度の増加と発光スペクトルの偏移に大別される。特に、発光スペクトルが偏移した蛍光タンパク質を複数用いることで、複数の異なる物質の局在性や複数の遺伝子発現を同時に確認することが可能となることから、様々な蛍光色に発光する変異体が報告されるに至っている。【０００４】
これまでに報告されているＧＦＰの人為的変異体の変異部位と特徴は、例えば下記の例を挙げることができる。なお、ＧＦＰの人為的変異体変異体の表記は、例えば野生型ＧＦＰのアミノ酸配列のＮ末端から６６番目のアミノ酸残基であるチロシン（Ｙ、以下特に断らない限り、アミノ酸は１文字表記で表す）がＨに置換された変異体をＹ６６Ｈと表し、複数のアミノ酸残基が同時に置換された変異体は、それぞれの置換をハイフン（−）で結ぶこととする。【０００５】
Ｙ６６Ｈ：青色に発色する蛍光タンパク質であり、蛍光強度は低く、発光は急速に消失する（非特許文献１）
Ｖ１６３Ａ：青色に発光する蛍光タンパク質であり、さらにＶ１６３Ａ−Ｓ１７５Ｇは耐熱性を獲得し、高められた蛍光強度を有する（特許文献１）
Ｆ６４Ｉ、Ｆ６４Ｖ、Ｆ６４Ａ、Ｆ６４Ｇ、Ｆ６４Ｌ：発光波長の変化はないが、蛍光強度が高められた蛍光タンパク質（特許文献２）
Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｙ６６Ｈ−Ｙ１４５Ｆ：青色に発光するが、蛍光強度は低く、発光が急速に消失する蛍光タンパク質（特許文献３）
Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−Ｙ１４５Ｆ−Ｌ２３６Ｒ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−Ｙ１４５Ｆ−Ｖ１６３Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ｌ２３６Ｒ、Ｙ６６Ｈ−Ｙ１４５Ｆ−Ｖ１６３Ａ−Ｓ１７５Ｇ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−Ｙ１４５Ｆ：光安定性を有する蛍光タンパク質（特許文献４）
Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−Ｓ１７５Ｇ：安定した蛍光特性を呈し、異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する、青色蛍光タンパク質（特許文献５）
Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−Ｖ１６３Ａ：より高められた蛍光強度を有する青色蛍光タンパク質（特許文献６）。
【非特許文献１】Ｈｅｉｍら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、第１２５０１−１２５０４頁
【特許文献１】国際公開第９６／２７６７５号
【特許文献２】米国特許第６１７２１８８号
【特許文献３】米国特許第５７７７０７９号
【特許文献４】米国特許第６１９４５４８号
【特許文献５】特表２００５−５１１０２７
【特許文献６】特表２０００−５０９９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、これまでに報告されていない、新たな最大発光波長ピークを有する新規な蛍光タンパク質の提供を第一の目的とする。また本発明は、野生型のＧＦＰを含め、従来の変異蛍光タンパク質の蛍光強度がｐＨの変化に大きく依存し、酸性下では蛍光が殆ど失われることから、これまでに報告のない新たな発光スペクトルを有し、かつｐＨの変化に蛍光強度が左右されない、ｐＨ非依存性の蛍光強度を有する新規な蛍光タンパク質を提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これまでに報告のない新たな発光波長ピークを有し、特に蛍光強度が幅広いｐＨで安定に保持されたＧＦＰの人為的変異体を創成することを目的として研究を行い、ＧＦＰの特定のアミノ酸を置換した変異体がかかる特性を発揮することを見いだし、下記の各発明を完成した。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、６６位のアミノ酸残基と１７５位のアミノ酸残基がそれぞれ置換され、さらに７２位のアミノ酸残基又は２０６位のアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質。
（２）７２位のアミノ酸残基及び２０６位のアミノ酸残基がいずれも置換されている、（１）に記載の蛍光タンパク質。
（３）６６位のアミノ酸残基がフェニルアラニンに、７２位のアミノ酸残基がアラニンに、１７５位のアミノ酸残基がグリシンに、及び２０６位のアミノ酸残基がリジンにそれぞれ置換されている、（２）に記載の蛍光タンパク質。
（４）さらに６５位のアミノ酸残基、１４５位のアミノ酸残基又は１４８位のアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が置換されている（１）〜（３）の何れかに記載の蛍光タンパク質。
（５）６５位のアミノ酸残基、１４５位のアミノ酸残基及び１４８位のアミノ酸残基が何れも置換されている、（４）に記載の蛍光タンパク質。
（６）６５位のアミノ酸残基がグルタミンに、１４５位のアミノ酸残基がグリシンに、及び１４８位のアミノ酸残基がセリンに置換されている、（５）に記載の蛍光タンパク質。
（７）さらに４６位のアミノ酸残基が置換されている、（４）〜（６）の何れかに記載の蛍光タンパク質。
（８）４６位のアミノ酸残基がロイシンに置換されている、（７）に記載の蛍光タンパク質。
（９）さらに２０３位のアミノ酸残基が置換されている、（１）〜（８）の何れかに記載の蛍光タンパク質。
（１０）２０３位のアミノ酸残基がバリンに置換されている、（９）に記載の蛍光タンパク質。
（１１）６６位のアミノ酸残基がフェニルアラニンに、１７５位のアミノ酸残基がグリシンに、７２位のアミノ酸残基がアラニンに、２０６位のアミノ酸残基がリジンに、６５位のアミノ酸残基がグルタミンに、１４５位のアミノ酸残基がグリシンに、１４８位のアミノ酸残基がセリンに、４６位のアミノ酸残基がロイシンに、及び２０３位のアミノ酸残基がバリンに置換されている、（１０）に記載の蛍光タンパク質。
（１２）（１）〜（１１）に記載の蛍光タンパク質において、さらに１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質。
（１３）（１）〜（１２）の何れかに記載の蛍光タンパク質と任意のタンパク質又はポリペプチドとからなる融合タンパク質。
（１４）（１）〜（１３）の何れかに記載の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸。
（１５）（１４）に記載の核酸によってコードされる蛍光タンパク質又は融合タンパク質を発現するベクター。
（１６）（１５）に記載の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の蛍光タンパク質は、第一にこれまでにない４２４ｎｍという発光波長ピークの蛍光を発し、群青色として他の蛍光タンパク質と肉眼で識別することができる。また、ｐＨの変化に蛍光強度が左右されない、ｐＨ非依存性の蛍光強度を有する本発明の蛍光タンパク質は、従来困難であった酸性環境下における蛍光タンパク質の利用を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＧＦＰ、ＧＦＰの既知のアミノ酸置換変異体及び本発明のＵＭＦＰ−１の蛍光の呈色を示す。
【図２】本発明の蛍光タンパク質と既知の蛍光タンパク質の吸収スペクトル及び発光スペクトルを表す。図左が吸収スペクトル、図右が発光スペクトルである。
【図３】本発明の蛍光タンパク質と既知の蛍光タンパク質変異体（ＧＦＰとＢＦＰ）の発光強度に関するｐＨ滴定曲線を示す。
【図４】ＵＭＦＰ−３（赤色）、ＥＢＦＰ（青色）を３５５ｎｍの励起光で励起した際の蛍光褪色曲線を示す。
【図５】ＣΔ１１ＵＭＦＰ−ＬＥ−ＮΔ４ＥＣＦＰ（青色）、ＵＭＦＰ−３（赤色）、ＥＣＦＰ（シアン色）を３５５ｎｍの励起光で励起した際の蛍光スペクトルを示す。
【図６】ＵＣ−ＳＣＡＴ３による生きた細胞内におけるカスパーゼ３活性化のモニターリング。縦軸が大きいほど、カスパーゼ３が活性化していることを表す。横軸はＴＮＦα処理後の時間を示す。
【図７】Ｓｉｒｉｕｓ（水色）またはＥＧＦＰ（緑色）を発現する大腸菌がファゴサイトーシスによって細胞性粘菌（微分干渉像）に取り込まれ、消化されていく画像を示す。パネルの上の数字は大腸菌が細胞性粘菌に取り込まれてからの時間（秒）を表す。
【図８】ＳＣ−ＳＣＡＴ３とＳａｐＲＣ２による生きた細胞内におけるカスパーゼ３活性化とＣａ２＋動態のの同時画像化。暖かい色彩ほどカスパーゼ３の活性が高く、Ｃａ２＋の濃度が高いことを表す。また、パネル上段の数字はＴＮＦαの添加からの時間を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、一般にＧＦＰと称される蛍光タンパク質の変異体に関する。本発明の変異体は、オワンクラゲ（イクオレア属、Ａｅｑｕｏｒｅａ属）生物、例えばイクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のＧＦＰの特定のアミノ酸残基が置換された、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質、またこの蛍光タンパク質においてさらに１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、発光波長ピークが４２４ｎｍである蛍光タンパク質である。この発光波長は群青色（Ｕｌｔｒａ  Ｍａｒｉｎｅ）として肉眼で視認され、従来知られている青色蛍光タンパク質の発光色とは肉眼によって明確に区別することが出来る（図１）。以下、群青色の蛍光を発する本発明のタンパク質を、ＵＭＦＰ（Ｕｌｔｒａ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）と表すこととする。【００１１】
本発明のＵＭＦＰは、配列番号１に示されるアミノ酸配列における特定の位置のアミノ酸が置換されてなる蛍光タンパク質である。この配列番号１に示されるアミノ酸配列は、イクオレア・ビクトリア由来の野生型ＧＦＰのアミノ酸配列において、６４位のＦがＬに、６５位のＳがＴに、６６位のＹがＷに、１４６位のＮがＩに、１５３位のＭがＴに、１６３位のＶがＡに、２３１位のＨがＬに、それぞれ置換されてなるアミノ酸配列である。従って本発明は、野生型ＧＦＰのアミノ酸配列において前記７つの位置に置換変異を有するアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質に対して、さらに特定の部位のアミノ酸を置換してなる、多重置換変異を有する蛍光タンパク質である。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、以前Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社からｐＥＣＦＰ  Ｖｅｃｔｏｒの名称（カタログ番号６３２３０９）で市販されていた。【００１２】
本発明のＵＭＦＰは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、６６位（Ｗ）及び１７５位（Ｓ）のアミノ酸残基の置換と、さらに７２位（Ｓ）又は２０６位（Ａ）のアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基の置換とを含むタンパク質である。このＵＭＦＰを、以下、ＵＭＦＰ−１と表す。ＵＭＦＰ−１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において６６位、１７５位、７２位及び２０６位の４アミノ酸残基の置換を含むタンパク質であることが好ましい。また、ＵＭＦＰ−１は、６６位のアミノ酸残基がＦ、７２位のアミノ酸残基がＡ、１７５位のアミノ酸残基がＧに、及び２０６位のアミノ酸残基がＫにそれぞれ置換された蛍光タンパク質であることが好ましい。以下、本発明の蛍光タンパク質を置換位置と置換後のアミノ酸の種類で表すときは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を基にしたことを表すために、ハイフンで結ばれる置換位置と置換後のアミノ酸の先頭にＥＣＦＰを付けて表すこととする。例えば、上記のＵＭＦＰ−１の好ましい例は、ＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋと表される。【００１３】
また本発明は、上記ＵＭＦＰ−１において、６５位（Ｔ）、１４５位（Ｙ）、又は１４８位（Ｈ）の何れかのアミノ酸残基のいずれかが、好ましくはこれら３アミノ酸残基の全てがさらに同時に置換された蛍光タンパク質を含む。このさらなる置換を含むＵＭＦＰを、以下、ＵＭＦＰ−２と表す。ＵＭＦＰ−２は、６５位、１４５位、及び１４８位の３アミノ酸残基がさらに置換された蛍光タンパク質であることが好ましい。特に、ＵＭＦＰ−２は、６５位のアミノ酸残基がＱ、１４５位のアミノ酸残基がＧ、及び１４８位のアミノ酸残基がＳにそれぞれ置換された蛍光タンパク質であることが好ましい。前記３アミノ酸残基がそれぞれ好適なアミノ酸残基に置換された本発明のＵＭＦＰ−２の特に好ましい例は、ＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓと表される。ＵＭＦＰ−２は、発光波長ピークが４２４ｎｍであることに加え、ＵＭＦＰ−１よりも高められた蛍光強度を有する。この蛍光強度は、４６位（Ｆ）に、好ましくはＦ４６Ｌという置換をさらに導入することで、より蛍光強度を高めることが出来る。この４６位の置換を含むＵＭＦＰ、すなわちＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓも、ＵＭＦＰ−２の一つである。【００１４】
さらに本発明は、前記ＵＭＦＰ−１又はＵＭＦＰ−２において、２０３位（Ｔ）が更に置換された蛍光タンパク質を含む。この更なる２０３位の置換を含むＵＭＦＰを、以下、ＵＭＦＰ−３と表す。ＵＭＦＰ−３における好ましい置換はＴ２０３Ｖである。【００１５】
本発明のタンパク質の蛍光波長は、好適には光学的手段、例えば分光光度計、蛍光計ＣＣＤ撮像素子などにより測定することができる。スペクトル特性は、本発明のタンパク質による発光の励起波長特性および発光波長特性として測定され得、これらのスペクトル特性から、励起波長および発光波長それぞれのピークとなる波長を確認することができる。特に明記しない限り、例えば本発明において「４２４ｎｍ」との記載は、好ましくは４２４±３ｎｍ（より好ましくは４２４±２ｎｍ）を含む意味で用いられる。【００１６】
上記のアミノ酸置換によって、本発明の蛍光タンパク質は、公知の蛍光タンパク質とは明確に異なる、約４２４ｎｍ以下に発光波長のピークを有する。例えば、公知の蛍光タンパク質は、発光波長ピークが約４５０ｎｍ（例えば、ＢＦＰ）、約４７０ｎｍ（例えば、ＣＦＰ）、約５１０ｎｍ（例えば、ｅＧＦＰ）、約５３０ｎｍ（例えば、ＹＦＰ）、約６００ｎｍ（例えば、ＤｓＲｅｄ）などのピークを有する。これら公知の波長ピークとは明確に異なる発光波長ピークは、異なる色彩を有する発光（例えば、本発明の群青色）を提供し、これによって肉眼によって視認することが可能である（図１）。【００１７】
本発明の蛍光タンパク質はまた、公知の蛍光タンパク質とは明確に異なる、約３５５ｎｍに励起波長のピークを有する。例えば、公知の蛍光タンパク質は、励起波長ピークが約３８０ｎｍ（例えば、ＢＦＰ）、約４３０ｎｍ（例えば、ＣＦＰ）、約４８０ｎｍ（例えば、ｅＧＦＰ）、約５１０ｎｍ（例えば、ＹＦＰ）、約５５０ｎｍ（例えば、ＤｓＲｅｄ）などのピークを有する。したがって、公知の蛍光タンパク質がほとんど反応できない波長の励起光を照射することが可能である。【００１８】
また、本発明の蛍光タンパク質、例えばＵＭＦＰ−３は、発光波長のピークが４２４ｎｍであることに加え、その蛍光強度が酸性条件下でも高く維持されるという特徴を有する。ｗｔＧＦＰその他の従来のＧＦＰの酸性条件下、例えばｐＨ５以下の蛍光強度は、中性から弱アルカリ性条件下、例えばｐＨ７〜ｐＨ９で示す蛍光強度に対して著しく低下する（通常、７０％〜１００％低下する）のに対して、例えば本願のＵＭＦＰ−３の酸性条件下の蛍光強度は、中性から弱アルカリ性条件下における蛍光強度の少なくとも５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上が維持される。さらに、本発明の蛍光タンパク質の酸性条件下（好ましくはｐＨ５以下、より好ましくはｐＨ３〜ｐＨ５）における蛍光強度は、アルカリ性条件下（好ましくはｐＨ７以上、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９）における蛍光強度より強くてもよい。すなわち、本発明の蛍光タンパク質において、ｐＨ９における蛍光強度に対して正規化した相対蛍光強度は、例えばｐＨ３〜９の範囲内において、好ましくは５０％以内、好ましくは２５％以内、より好ましくは１０％以内で変化し得る。上記のような、ｐＨの変化に対して好ましくは５０％以内、好ましくは２５％以内、より好ましくは１０％以内で変化する蛍光強度を、本明細書中ではｐＨ非依存性蛍光強度と表す。【００１９】
本明細書において、「高められた蛍光強度」とは、従来の蛍光タンパク質よりも、ある波長を有する一定の光量の励起光に対して、本発明の蛍光タンパク質はモル当たりの発光量が高いことを意味する。蛍光タンパク質のアミノ酸配列中に変異を導入することによって蛍光強度が上昇する例としては、本発明のＵＭＦＰ−１とＵＭＦＰ−３との比較が挙げられ、この例の場合は、３５５ｎｍの励起光をそれぞれの蛍光タンパク質に照射した場合、ＵＭＦＰ−３は元のＵＭＦＰ−１よりも少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％の上昇を示す。また、本発明の蛍光タンパク質は、公知の蛍光タンパク質と比較して励起光が低波長側にあるため、より低波長の励起光に対して比較的高い蛍光強度を提供できる。【００２０】
例えば、ＵＭＦＰ−２の一つであるＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８ＳにさらにＴ２０３Ｖの置換を導入したＵＭＦＰ−３、すなわちＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｖ−Ｈ１４８Ｓ−Ｔ２０３Ｖは、４２４ｎｍの発光波長ピークを有し、ＵＭＦＰ−１よりも少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％だけ高められた蛍光強度を有し、かつ酸性条件下でもその蛍光強度が大きく変化しない（例えば、蛍光強度の変化が５０％以内、好ましくは２５％以内、より好ましくは１０％以内である）という特徴を有している。【００２１】
本発明は、ＵＭＦＰの前記特徴、例えば、約４２４ｎｍの発光波長ピークを有する、好ましくは約４２４ｎｍの発光波長ピークと高められた蛍光強度とを有する、さらに好ましくは４２４ｎｍの発光波長ピーク、および高められた蛍光強度とｐＨ非依存性蛍光強度とを有する特徴を示す、本発明のＵＭＦＰを特徴付ける変異部位、すなわち４６位、６６位、７２位、１７５位、２０６位、６５位、１４５位、１４８位及び２０３位以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質も含む。本発明におけるアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加に関する「１若しくは数個」とは、１〜数十アミノ酸以内、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、更に好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸残基の変化を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）で表せば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として表すことができる。【００２２】
タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。従って、ＵＭＦＰにおける置換部位として特定される４６位、６６位、７２位、１７５位、２０６位、６５位、１４５位、１４８位及び２０３位以外の部位において、配列番号１に記載されたアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、ＵＭＦＰとしても前記特徴を有する場合もあり、これらは本発明の一態様として理解される。例えば、前記４６位、６６位、７２位、１７５位、２０６位、６５位、１４５位、１４８位及び２０３位以外の部位におけるアミノ酸以外はすべてｗｔＧＦＰのアミノ酸配列と同一のアミノ酸からなる蛍光タンパク質も含まれる。また、前記４６位、６６位、７２位、１７５位、２０６位、６５位、１４５位、１４８位及び２０３位以外の部位におけるアミノ酸の置換が、本発明のＵＭＦＰが特徴とする上記の機能を損なうことなく、さらに酵素の安定性向上や蛍光強度の増加等の有益な特性変化をもたらすこともあり、その様な蛍光タンパク質も本発明に含まれる。【００２３】
さらにまた本発明のタンパク質は、時間の経過に伴う発光の褪色に対しても利点を有する。すなわち、公知の蛍光タンパク質と比較して、本発明の蛍光タンパク質は、褪色が長期化される。例えば本明細書中の実施例６および図４に示されるように、１０秒間のパルス照射した直後の発光強度の対する１０００秒後の発光強度を測定すると、本発明の蛍光タンパク質はその約８０％を維持しているが、公知のＥＢＦＰの場合は約１０％しか維持できない。また、本発明の蛍光タンパク質は、少なくとも照射後１０００秒の範囲で線形型の褪色を提供できることも特徴とする。【００２４】
本発明のタンパク質は、単独で製造し、使用してもよいが、本発明のタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に、本発明のタンパク質以外のタンパク質又はポリペプチドを付加させた、いわゆる融合タンパク質として製造し、又利用してもよい。この様な本発明のタンパク質を含む融合タンパク質も、本発明の一態様である。特に本発明のＵＭＦＰは、従来のＧＦＰやその変異体と同じ使用目的において、それらに換えて利用することが出来る。例えば、あるタンパク質と本発明のＵＭＦＰとの融合タンパク質を生体或いは細胞内で発現させることで、当該タンパク質の生体あるいは細胞内での局在性を調べることができる。また、本発明のＵＭＦＰの発現を指標として、生体あるいは細胞内での遺伝子発現制御機構を調べることも出来る。特に、本発明のＵＭＦＰ−３はｐＨ非依存性蛍光強度を有していることから、エンドソームやリソソームなどの、従来知られているＧＦＰあるいはその変異体を利用することができないか、またはその利用が非常に困難であった酸性オルガネラにおけるタンパク質の局在性の確認、細胞内膜挙動の観察、その他の目的に利用することができる。【００２５】
本発明の蛍光タンパク質はまた、発光波長ピークおよび励起波長ピークの各々が、公知の蛍光タンパク質が有する各々のピークとは異なるため、同時に複数の蛍光タンパク質を用いる用途に利用することが可能である。例えば、本発明の蛍光タンパク質は発光波長ピークが公知の蛍光タンパク質とは異なるため、本発明の蛍光タンパク質（またはその融合タンパク質）による発光と、公知の蛍光タンパク質（またはその融合タンパク質）による発光とを肉眼によって識別可能である（図１）。また、本発明の蛍光タンパク質の励起波長ピークが公知の蛍光タンパク質とは異なるため、公知の蛍光タンパク質を励起できない波長利用する測定システムも可能である。さらにまたこれら上記の利点によって、本発明の蛍光タンパク質および公知の蛍光タンパク質を同時に利用すると、従来よりも複雑であり、かつ／またはより示差性に優れた、同時多重解析が可能となり得る。【００２６】
さらに本発明の蛍光タンパク質は、上記のように公知の蛍光タンパク質とは励起波長ピークおよび発光波長ピークが共に異なるため、本発明のタンパク質またはその融合タンパク質と、公知の蛍光タンパク質またはその融合タンパク質とを適切に組合わせることによって、従来とは異なる波長において蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用するシステムの構築が可能である。ＦＲＥＴおよびその利用例については当業者に公知であり、例えば、Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｎａｇａｉ，Ｔ．，Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．＆  Ｍｉｕｒａ，Ｍ．Ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６０，２３５−２４３（２００３）；Ｍｉｚｕｎｏ，Ｈ．，Ｓａｗａｎｏ，Ａ．，Ｅｌｉ，Ｐ．，Ｈａｍａ，Ｈ．＆  Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．Ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ａｓ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔａｇ  ａｎｄ  ａ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４０，２５０２−２５１０（２００１）．などに記載される。【００２７】
また、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質は、当該機能性タンパク質が示す機能が付加される点で、本発明のタンパク質を単独で製造し、あるいは使用する場合に比べて、高められた有用性を有する。その様な機能性タンパク質の例としては、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、その他の、融合蛋白質の製造に汎用されるタンパク質を挙げることができる。また、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ又はキチン結合配列のように、組み換えタンパク質の製造、特に組み換えタンパク質の精製を容易にする機能性ポリペプチドを利用すれば、本発明のタンパク質の製造をより有利に行うことができる。【００２８】
さらに、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質には、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付加したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子を結合させたりすることが可能であり、あるいは本発明で使用されるタンパク質を不溶性担体へ結合させたりすることも可能である。こうしたタンパク質を対象とした化学的修飾法は当業者に広く知られており、本発明のタンパク質の機能を損なわない限り、どの様に修飾し、利用してもよい。【００２９】
特に、融合タンパク質の製造における抽出操作又は精製操作など、または標識化タンパク質の製造における標識化合物の付加反応等において、タンパク質は様々な反応条件に晒され得る。本発明の蛍光タンパク質はｐＨ非依存性に活性を維持できるため、公知の蛍光タンパク質よりも様々な反応条件において寛容であり、この特性によって、本発明のタンパク質の利用が促進されると考えられる。【００３０】
本発明は、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡを含み、その形態としてはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。本発明の好ましい核酸はＤＮＡである。また本発明の核酸は１本鎖であっても、それに相補的な配列を有する核酸やＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該核酸は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。【００３１】
本発明の核酸、好ましくは本発明のタンパク質であるＵＭＦＰをコードするＤＮＡは、配列番号２に示されるＧＦＰをコードする塩基配列において、前記ＵＭＦＰ１〜３を特徴付ける置換部位、すなわち４６位、６６位、７２位、１７５位、２０６位、６５位、１４５位、１４８位及び２０３位以外のコドンが、それぞれのアミノ酸置換に応じたコドンに置き換えられた塩基配列からなる。また、係る塩基配列と相補する塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明のＵＭＦＰをコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。本発明におけるストリンジェントな条件とは、塩濃度１．５Ｍを含む６５℃の緩衝液中で配列番号２に相補的な塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、５０℃の２×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）でＤＮＡを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でハイブリダイズが維持される条件を言う。また、塩基配列の同一性（％）で示せば、配列番号２の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸であればよい。これらの手法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７などに記載されている方法を利用することができる。【００３２】
本発明の核酸は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、具体的には配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡを基に、ＰＣＲ、部位特異的変異法その他の一般的な遺伝子工学的手法によって調製することができる。配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、これを含むベクターが種々市販されており、これらをそのまま利用すればよい。また部位特異的変異等の遺伝子工学的手法は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）その他の、当業者に広く利用されている実験操作マニュアル書に記載されている。なお、本発明の核酸は、配列番号２に示される塩基配列情報を基にして、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により、あるいは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて直接製造することもできる。【００３３】
本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸であるＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み込むことができ、かかる発現ベクターは本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の組換え的生産に利用される。この様なタンパク質の生産用の組み換えベクターも本発明に含まれる。本発明のベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよく、また本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。【００３４】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸に付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者は本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を基に任意かつ容易に加工することができる。【００３５】
また本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能である。【００３６】
利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＢＴ−９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、等を例示することができる。本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の発現は、該タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。その様な発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに組み込む等の操作も、前記Ｍａｎｉａｔｉｓらその他の実験操作マニュアル書の記載に基づいて行うことができる。【００３７】
本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質は、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできるが、遺伝子組換え技術によって、前記の核酸、特に発現ベクターに組み込まれたＤＮＡを原核生物もしくは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた好適な発現系に導入することによって製造することが好ましい。【００３８】
宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エルウニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等の微生物、カイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等の動物細胞を挙げることができる。【００３９】
宿主細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記のＭａｎｉａｔｉｓらを初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞の利用については、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）やＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８年、第６巻、第４７頁等に記載されている。【００４０】
本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質は、前記の発現ベクターを上記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。【００４１】
また、本発明のタンパク質をヒスチジンタグやＦＬＡＧタグ等との融合タンパク質として発現させた場合には、そのタグ等に特徴的な精製法を採用することが好ましい。融合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて切断し、本発明のタンパク質を回収することができる。また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。【００４２】
この様に本発明のタンパク質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本発明のタンパク質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。【００４３】
また、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を挙げることができるが、特にモノクローナル抗体が好ましい。かかる抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用いた通常の操作により、非ヒト動物を免疫し、血清を回収して、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を誘導して製造することができる。また、定法に従って、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）やテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、放射性同位元素、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素タンパク質で標識してもよい。【００４４】
本発明のタンパク質は、従来知られているＧＦＰあるいはその変異体をマーカーとして利用した各種分子生物学的な方法において、当該ＧＦＰあるいはその変異体に換わるマーカータンパク質として利用することができる。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のｐＲＳＥＴ／ＥｍＧＦＰベクター等のように、ＧＦＰとの融合タンパク質を簡便に発現させることのできるベクターとして当業者に利用され、あるいは市販されている各種ベクターにおけるＧＦＰをコードするＯＲＦを、本発明の蛋白質をコードするＯＲＦに置き換えたベクターを用意すれば、任意のタンパク質と本発明のタンパク質との融合タンパク質を簡便に製造し、或いは利用することができる。この様なベクターを用いることで、当該任意のタンパク質の生体内あるいは細胞内での発現、細胞および／または細胞外局在性の測定ないし確認、方法を測定することもできる。測定ないし確認は、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の蛍光発光を検出ないし測定することで行う事ができる。【００４５】
また、任意の機能性核酸の制御下に本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を連結し、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の蛍光発光を検出ないし測定することで、当該機能性核酸の制御機構を調べたり、当該機能性核酸の機能を促進あるいは抑制することの物質を探索したりすることもできる。
【実施例】
【００４６】
＜実施例１＞ＵＭＦＰ−１（ＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ）の作製
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のｐｃＤＮＡ３に保持されているＥＣＦＰ（配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる変異蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡ（ＥＣＦＰ遺伝子）を、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切り出し、同制限酵素で開環させたプラスミドベクターｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み換えて、ｐＲＳＥＴＢ／ＥＣＦＰを作製した。このプラスミドベクターを鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡを用いて、Ａｓａｎｏらの方法（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２０００年、第２８巻、第１６号、ｅ７８）に従って、Ｓ７２Ａ、Ｓ１７５Ｇ及びＡ２０６Ｋの３箇所のアミノ酸変異を導入した。
2009020197.tif 000003
すなわち、５００ｎｇのｐＲＳＥＴＢ／ＥＣＦＰ、各１０ｐｍｏｌのプライマー１〜３、３．７５ｎｍｏｌのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を含む２０μＬを準備し、６５℃、５分のプレインキュベーションを行ってＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後、９５℃、１分のＤＮＡ変性の後、９５℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、３０秒のアニーリング反応及び６５℃、１０分の伸長・連結反応を１サイクルとした２０サイクルのサーマルサイクル反応を行った。サーマルサイクル反応後の反応溶液２０μＬに、０．４μＬ（８Ｕ）のＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、さらにフェノールクロロホルム抽出を行ってＤＮＡを精製した後、塩化カルシウム法により、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を形質転換し、ＥＣＦＰ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ（配列番号：１５）をコードするＤＮＡ（配列番号：１４）を有するプラスミドベクターｐＲＳＥＴＢ／ｍＳＥＣＦＰを得た。【００４７】
このベクターを鋳型とし、下記のプライマーを用いてサーマルサイクル反応を行った。
2009020197.tif 000004
サーマルサイクルの反応条件は、用いるプライマーを除き、先に示したサーマルサイクル反応と同じ条件である。この反応により、ヒスチジンタグが付加されたＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ（ＵＭＦＰ−１）をコードするベクターｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−１を作製した。ＵＭＦＰ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１６および１７に記載される。【００４８】
このベクターを用いて、塩化カルシウム法により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地２ｍＬで、２３℃で４日間培養し、得られた細胞をフレンチプレスにより破砕した。破砕後の残渣を遠心分離で除去した上清液から、ニッケルキレートカラム（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてヒスチジンタグが付加されたＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋを１００ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４により溶出して回収し、さらにＰＤ−１０脱塩・バッファー交換用カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４に緩衝液を交換して、ヒスチジンタグが付加されたＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ（ＵＭＦＰ−１）（約７．５ｍｇ／ｍＬ）を得た。【００４９】
＜実施例２＞  ＵＭＦＰ−２（ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ―Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ）の作製
実施例１で作製したｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−１を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡを用いてサーマルサイクル反応を行った。
2009020197.tif 000005
すなわち、５００ｎｇのｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−１、各１０ｐｍｏｌのプライマー５〜７、３．７５ｎｍｏｌのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を含む２０μＬを準備し、６５℃、５分のプレインキュベーションを行ってＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後、９５℃、１分のＤＮＡ変性の後、９５℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、３０秒のアニーリング反応及び６５℃、１０分の伸長・連結反応を１サイクルとした２０サイクルのサーマルサイクル反応を行った。サーマルサイクル反応後の反応溶液２０μＬに、０．４μＬ（８Ｕ）のＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、さらにフェノールクロロホルム抽出を行ってＤＮＡを精製した後、塩化カルシウム法により、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を形質転換し、ＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｖ−Ｈ１４８Ｓ（配列番号：１９）をコードするＤＮＡ（配列番号：１８）を有するプラスミドベクターｐＲＳＥＴＢ／ＥＣＦＰ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓを得た。【００５０】
このベクターを鋳型とし、下記のプライマーを用いてサーマルサイクル反応を行い、ｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−２を得た。
2009020197.tif 000006
サーマルサイクルの反応条件は、用いるプライマーを除き、先に示したサーマルサイクル反応と同じ条件である。ｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−２を用いて実施例１と同様の操作を行い、ヒスチジンタグが付加されたＵＭＦＰ−２（約９．３ｍｇ／ｍＬ）を得た。ＵＭＦＰ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２０および２１に記載される。【００５１】
＜実施例３＞ＵＭＦＰ−３（ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ６５Ｑ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｔ２０３Ｖ）の作製
実施例２で作製したｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−２を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡを用いてサーマルサイクル反応を行い、ｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−３を得た。
2009020197.tif 000007
サーマルサイクルの反応条件は、用いるプライマーを除き、先に示したサーマルサイクル反応と同じ条件である。このｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−３を用いて実施例１と同様の操作を行い、ヒスチジンタグが付加されたＵＭＦＰ−３（約９．３ｍｇ／ｍＬ）を得た。ＵＭＦＰ−３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２２および２３に記載される。【００５２】
＜実施例４＞ＵＭＦＰの励起波長ピーク及び発光波長ピークの測定
実施例１〜３で調製したＵＭＦＰ−１〜３／５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４の水溶液を５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いて１００倍希釈し、蛍光分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｆ−２５００）を使用して、励起スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。また、同時にｗｔＧＦＰ、既知のＧＦＰの人為的変異体であるＢＦＰ（Ｈｅｉｍら、前記非特許文献１）、ＣＦＰ（Ｈｅｉｍら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年、第６巻、第１７８−１８２頁）、ＹＦＰ（Ｏｒｍｏｅら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７３巻、第１３９２−１３９５）及びＤｓＲｅｄ（Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９０巻、第１５８５−１５８８頁）の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを、ＵＭＦＰと同一条件で測定した。各蛍光タンパク質の最大輝度を１に規格化した蛍光スペク卜ルを図２に示す。ＵＭＦＰ１〜３は、いずれも励起波長のピークが約３５５ｎｍであり、発光波長のピークが約４２４ｎｍであった。【００５３】
＜実施例５＞ＵＭＦＰ−３のｐＨ非依存性蛍光強度
５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０〜３．４）、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ３．８〜５．４）、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．８〜６．２）、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．６〜７．０）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４〜７．８）、５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ８．６〜９．０）を用いてｐＨ３．０〜９．０の範囲の緩衝液を調製し、２μＭのＵＭＦＰ−３／各緩衝液２０ｍＭの蛍光を測定し、各ｐＨにおける蛍光強度を計算した。また、ＧＦＰとＢＦＰについても同様の測定を行った。この結果を図３に示す。【００５４】
ＧＦＰとＢＦＰいずれも、酸性環境下で蛍光強度が１／２以下に減少した。一方、ＵＭＦＰ−３の蛍光強度は、広いｐＨ範囲（ｐＨ３．０〜９．０）において一定であった。【００５５】
＜実施例６＞ＵＭＦＰ−３の光安定性
ＵＭＦＰ−３及び、比較のためのＥＢＦＰをＨｅＬａ細胞に一過性発現させることにより、光安定性の測定を行った。３５ｍｍのガラスボトムディッシュに培養したＨｅＬａ細胞に、ｐｃＤＮＡ３／ＵＭＦＰ−３、ｐｃＤＮＡ３／ＥＢＦＰそれぞれを、Ｓｕｒｐｅｒｆｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション１日後、それぞれの組み換えタンパク質が細胞質に正常に発現していることを確認し、光安定性の測定を行った。顕微鏡はＮｉｋｏｎ  ＴＥ−２０００Ｅ倒立顕微鏡を用い、対物レンズはＦｌｏｕｒ、４０倍、開口数１．３０の油浸対物レンズを用いた。ＵＭＦＰ−３、ＥＢＦＰの蛍光は、３４０−３８０ｎｍの波長域で励起し、４３５−４８５ｎｍの波長域のバンドパスフィルターを用いて検出した。図４は、ＵＭＦＰ−３、ＥＢＦＰそれぞれの蛍光タンパク質を発現したＨｅＬａ細胞に１０秒間励起光を当てて撮影をする作業を繰り返して得た、蛍光強度の褪色曲線を示したものである。図４に示されるように、１０秒間のパルス照射した直後の発光強度の対する１０００秒後の発光強度を測定すると、本発明の蛍光タンパク質はその約８０％を維持しているが、公知のＥＢＦＰの場合は約１０％しか維持できない。またこの図は、本発明の蛍光タンパク質が少なくとも照射後１０００秒の範囲で線形型の褪色を提供できることも示している。【００５６】
＜実施例７＞ＵＭＦＰ−３をドナー、ＥＣＦＰをアクセプターとしたＦＲＥＴペアの作製とＦＲＥＴ効率の検討
ＵＭＦＰ−３とＥＣＦＰの蛍光スペクトル及びＦＲＥＴ効率を測定するにあたり、Ｃ末端１１アミノ酸を削ったＵＭＦＰ−３と、Ｎ末端４アミノ酸を削ったｍＳＥＣＦＰを制限酵素ＸｈｏＩの認識配列であるロイシン、グルタミン酸の２つのリンカーアミノ酸でつなげたキメラタンパクを作製した（以下ＣΔ１１ＵＭＦＰ−ＬＥ−ＮΔ４ＥＣＦＰ：ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２４および２５に記載される）。ＣΔ１１ＵＭＦＰのｃＤＮＡは制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行うことで増幅させた。また、ＮΔ４ＥＣＦＰのｃＤＮＡは制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むセンスプライマーと、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を含むアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行うことで増幅させた。制限酵素処理をした産物をｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、大腸菌発現プラスミドのｐＲＳＥＴＢ／ＣΔ１１ＵＭＦＰ−ＬＥ−ＮΔ４ＥＣＦＰを作製した。ｐＲＳＥＴＢ／ＣΔ１１ＵＭＦＰ−ＬＥ−ＮΔ４ＥＣＦＰ、ｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−３、ｐＲＳＥＴＢ／ＥＣＦＰを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）に導入し、それぞれの組み換えタンパク質を室温で発現させ、ポリヒスチジンタグを用いた精製を行った。精製したサンプルの蛍光スペクトルの測定は、Ｆ−２５００蛍光分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用した。測定は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に濃度２μＭのサンプルを溶解させたものを用いた。図５はＣΔ１１ＵＭＦＰ−ＬＥ−ＮΔ４ＥＣＦＰ（青色）、ＵＭＦＰ−３（赤色）、ＥＣＦＰ（シアン色）を３５５ｎｍの励起光で励起した際の蛍光スペクトルを表している。この実験より、ＣΔ１１ＵＭＦＰ−ＬＥ−ＮΔ４ＥＣＦＰのＦＲＥＴ効率は約６６％と計算される。ＦＲＥＴ効率に関して、例えば、ＦＲＥＴ効率の良さから一般的に使われるＣＦＰ−ＹＦＰのＦＲＥＴペアを用いたｃＡＭＰ指示薬（文献：Ｐｏｎｓｉｏｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｃＡＭＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｐａｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｅｐａｃ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃＡＭＰ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．５，１１７６−１１８０（２００４）．）は、蛍光スペクトルから判断して、ＦＲＥＴ効率が数％程度であることが記載されている。したがって、本蛍光タンパク質ペアは従来よりも低い波長の励起光によって、非常に高い効率でＦＲＥＴを起こすことが可能であった。【００５７】
＜実施例８＞ＵＭＦＰ−３とｍＳＥＣＦＰのＦＲＥＴペアを用いたＳＣＡＴ  ｔｙｐｅ指示薬によるＣａｓｐａｓｅ−３活性化のリアルタイムイメージング
ＵＭＦＰ−３からｍＳＥＣＦＰへのＦＲＥＴを用いてシステインプロテアーゼであるカスパーゼ３の活性化指示薬ＵＣ−ＳＣＡＴ３（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２６および２７に記載される）を作成した。本指示薬遺伝子を発現するプラスミドＵＣ−ＳＣＡＴ３−ｐｃＤＮＡ３．１（−）は竹本らが開発したＥＣＦＰとＶｅｎｕｓをＦＲＥＴペアとして利用したカスパーゼ３活性化指示薬であるＳＣＡＴ３（Ｔａｋｅｍｏｔｏ  Ｋ，Ｎａｇａｉ  Ｔ，Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６０：２３５−２４３，２００３．）のＶｅｎｕｓ遺伝子を制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そこにＵＭＦＰ−３を導入し、さらにＥＣＦＰ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断し、そこにｍＳＥＣＦＰを導入することによって作製した。ＵＣ−ＳＣＡＴ３−ｐｃＤＮＡ３．１（−）を３５ｍｍのガラスボトムディッシュに培養したＨｅＬａ細胞に、Ｓｕｒｐｅｒｆｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションし、細胞質に発現させた。トランスフェクションして１日後にイメージングを行った。なお、アポトーシスを誘導するために、イメージングを行う９０分前に５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαと１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで細胞を処理した。観察は、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ−２０００Ｅ倒立顕微鏡を用い、対物レンズはＡｐｏ−ＶＣ、６０倍、開口数１．３５、の油浸対物レンズを用いた。ＨｅＬａ細胞の細胞質に発現したＵＣ−ＳＣＡＴ３を３５２−３８８ｎｍの波長域で励起した。蛍光の検出は、ＵＭＦＰ−３については４１５−４５５ｎｍの波長域のバンドパスフィルターを用いて検出し、ＥＣＦＰについては４５９−４９９ｎｍの波長域のバンドパスフィルターを用いて検出した。図６の左図は、右図の各円枠内（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔ）におけるＣａｓｐａｓｅ−３の活性化に伴うＵＭＦＰ−３／ｍＳＥＣＦＰのレシオの変化を示したものである。横軸は、観察開始時からの経過時間を示している。この図から、ＵＭＦＰ−３／ｍＳＥＣＦＰの蛍光強度比の変化に伴う、Ｃａｓｐａｓｅ−３の活性化を検出することが可能であることが分かる。【００５８】
＜実施例９＞ＵＭＦＰ−４（ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ）の作製
実施例３で作製したＵＭＦＰ−３（ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ）をコードするプラスミドベクター、ｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−３を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡを用いてサーマルサイクル反応を行った。
2009020197.tif 000008
すなわち、５０ｎｇのｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−３、１０ｐｍｏｌのプライマー１０、３．７５ｎｍｏｌのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を含む２０μＬを準備し、６５℃、５分のプレインキュベーションを行ってＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後、９５℃、１分のＤＮＡ変性の後、９５℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、３０秒のアニーリング反応及び６５℃、１０分の伸長・連結反応を１サイクルとした２０サイクルのサーマルサイクル反応を行った。サーマルサイクル反応後の溶液２０μＬに、０．４μＬ（８Ｕ）のＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、さらにフェノールクロロホルム抽出を行ってＤＮＡを精製した後、塩化カルシウム法により、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を形質転換し、ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ（ＵＭＦＰ−４）をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクターｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−４を得た。ＵＭＦＰ−４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２８および２９に記載される。【００５９】
このベクターｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−４を用いて、塩化カルシウム法により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地２００ｍＬで、２３℃で４日間培養し、得られた細胞をフレンチプレスにより破砕した。破砕後の残渣を遠心分離で除去した上清液から、ニッケルキレートカラム（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ヒスチジンタグが付加されたＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖを１００ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４によって回収した。さらにＰＤ−１０脱塩・バッファー交換用カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４に緩衝液を交換して、ヒスチジンタグが付加された、ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ（ＵＭＦＰ−４）を約５００μｇ／ｍＬ得た。【００６０】
＜実施例１０＞Ｓｉｒｉｕｓ（ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ−Ｆ２２３Ｓ）の作製
＜実施例９＞で作製したＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖをコードするプラスミドベクター、ｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−４を鋳型とし、下記のプライマーＤＮＡを用いてサーマルサイクル反応を行った。
2009020197.tif 000009
すなわち、５０ｎｇのｐＲＳＥＴＢ／ＵＭＦＰ−４、１０ｐｍｏｌのプライマー１１、３．７５ｎｍｏｌのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を含む２０μＬを準備し、６５℃、５分のプレインキュベーションを行ってＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼによる鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後、９５℃、１分のＤＮＡ変性の後、９５℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、３０秒のアニーリング反応及び６５℃、１０分の伸長・連結反応を１サイクルとした２０サイクルのサーマルサイクル反応を行った。サーマルサイクル反応後の溶液２０μＬに、０．４μＬ（８Ｕ）のＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、さらにフェノールクロロホルム抽出を行ってＤＮＡを精製した後、塩化カルシウム法により、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を形質転換し、ＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ−Ｆ２２３Ｓ（Ｓｉｒｉｕｓ）をコードするＤＮＡを有するプラスミドベクターｐＲＳＥＴＢ／Ｓｉｒｉｕｓを得た。Ｓｉｒｉｕｓのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３０および３１に記載される。【００６１】
このベクターｐＲＳＥＴＢ／Ｓｉｒｉｕｓを用いて、塩化カルシウム法により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地２００ｍＬで、２３℃で４日間培養し、得られた細胞をフレンチプレスにより破砕した。破砕後の残渣を遠心分離で除去した上清液から、ニッケルキレートカラム（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、ヒスチジンタグが付加されたＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ−Ｆ２２３Ｓ（Ｓｉｒｉｕｓ）を１００ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４によって回収した。さらにＰＤ−１０脱塩・バッファー交換用カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４に緩衝液を交換して、ヒスチジンタグが付加されたＥＣＦＰ−Ｆ４６Ｌ−Ｔ６５Ｑ−Ｗ６６Ｆ−Ｑ６９Ｌ−Ｓ７２Ａ−Ｙ１４５Ｇ−Ｈ１４８Ｓ−Ｓ１７５Ｇ−Ａ２０６Ｋ−Ｔ２０３Ｖ−Ｆ２２３Ｓ（Ｓｉｒｉｕｓ）を約５００μｇ／ｍＬ得た。【００６２】
＜実施例１１＞二光子励起顕微鏡を用いた細胞性粘菌Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ＤｉｓｃｏｉｄｅｕｍによるＳｉｒｉｕｓを発現する大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉのファゴサイトーシスの観察
細胞性粘菌ＡＸ２は予め２３．３℃、１０ｍＬのＨＬ５培地で培養し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）は＜実施例１０＞で作製したプラスミドベクターｐＲＳＥＴＢ／Ｓｉｒｉｕｓを用いて、塩化カルシウム法により形質転換させた後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地２ｍＬで、３７℃、１２時間培養した。細胞性粘菌ＡＸ２は、遠心により沈殿させた後、ＢＳＳバッファーで再び懸濁し、Ｓｉｒｉｕｓを発現する大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）は、遠心により沈殿させた後、ＰＢＳバッファーで再び懸濁した。３５ｍｍペトリディッシュ上の１％アガロースゲルの上で、バッファーで懸濁した細胞性粘菌ＡＸ２とＳｉｒｉｕｓを発現する大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を混合した。その後室温で１時間インキュベートし、３５ｍｍペトリディッシュ上のアガロースゲルを裏返しにして、混合した細胞性粘菌ＡＸ２とＳｉｒｉｕｓを発現する大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を顕微鏡観察した。顕微鏡は、多光子励起顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ３００を用い、対物レンズはＵＰｌａｎ  ＦＬＮ、４０倍、開口数１．３０（Ｏｌｙｍｐｕｓ）の油浸レンズを用いた。レーザーはＴｉ：ｓａｐｐｈｉｒｅ（ＭＡＩＴＡＩ，Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ社）を用い７８０ｎｍの励起光によってＳｉｒｉｕｓを２光子励起して蛍光観察した。図７は、Ｓｉｒｉｕｓを発現する大腸菌がファゴサイトーシスによって細胞性粘菌に取り込まれ、消化されていく模様をを示している。この図は、蛍光強度がｐＨ非依存性であるＳｉｒｉｕｓが、蛍光強度がｐＨに依存するＥＧＦＰよりも、酸性条件下にある粘菌のファゴソームの中に取り込まれた大腸菌の様子を明確に確認することが可能であることを示している。【００６３】
＜実施例１２＞Ｓｉｒｉｕｓをドナー、ｍＳＥＣＦＰをアクセプターとするＦＲＥＴペア及びＳａｐｐｈｉｒｅをドナー、ＤｓＲｅｄをアクセプターとするＦＲＥＴペアを同時に用いた、１波長励起４波長測光Ｄｕａｌ  ＦＲＥＴ観察
始めに、ＳｉｒｉｕｓからｍＳＥＣＦＰへのＦＲＥＴを用いてシステインプロテアーゼであるカスパーゼ３の活性化指示薬ＳＣ−ＳＣＡＴ３（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３２および３３に記載される。）を作成した。本指示薬遺伝子を発現するプラスミドＳＣ−ＳＣＡＴ３−ｐｃＤＮＡ３．１（−）は＜実施例８＞で作成したＵＣ−ＳＣＡＴ３のＵＭＦＰ−３遺伝子を制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そこにＳｉｒｉｕｓを導入することによって作製した。【００６４】
このカスパーゼ３の指示薬であるＳＣ−ＳＣＡＴ３と、カルシウムイオン指示薬であるＳａｐＲＣ２（Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ，Ｓａｗａｎｏ  Ａ，Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．：Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ａｓ  ａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔａｇ  ａｎｄ  ａ  Ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４０：２５０２−２５１０，２００１．）の二組のＦＲＥＴペアを、ＨｅＬａ細胞内で発現させた。すなわち、４μｌのＳｕｒｐｅｒｆｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１μｇ／ｄｉｓｈのｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＳＣ−ＳＣＡＴ３とｐｃＤＮＡ３／ＳａｐＲＣ２を３５ｍｍガラスボトムディッシュ上で培養したＨｅＬａ細胞に導入し、共発現させることにより、行った。【００６５】
観察は、プラスミドベクターを導入してから２日後に行った。なお、ＨｅＬａ細胞にアポトーシスを誘導するために、イメージングを行う直前に、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαと１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドで細胞を処理した。Ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ蛍光観察は、ＴＥ−２０００Ｅ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で行い、対物レンズは、Ａｐｏ−ＶＣ、６０倍、開口数１．３５の油浸レンズ（Ｎｉｋｏｎ）を用いた。また、干渉フィルターは、すべてＳｅｍｒｏｃｋ社のものを使用した。【００６６】
ＳＣ−ＳＣＡＴ３、ＳａｐＲＣ２の発光観察はともに、水銀アークランプを光源とし、ＦＦ０１−３７０／３６の励起フィルター及び、ＣＦＷ−Ｄｉ０ｉ−Ｃｌｉｎのダイクロイックミラーを用いて励起した。Ｓｉｒｉｕｓ、ｍＳＥＥＣＦＰ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＤｓＲｅｄの蛍光の検出は、それぞれＦＦ０１−４３５／４０、ＦＦ０１／４７９／４０、ＦＦ０１−５２５／３９、ＦＦ０１−５８５／４０のフィルターを通して行った。図８はアポトーシス過程のＨｅＬａ細胞内におけるカスパーゼ３の活性化とＣａ２＋の動態を同時にタイムラプス観察した画像を示す。この図より、細胞に共発現させたカスパーゼ３指示薬のＳＣ−ＳＣＡＴ３とカルシウムイオン指示薬のＳａｐＲＣ２により、誘導された細胞死に伴うカスパーゼ３の活性化及び、カルシウムイオン濃度の時間変化を同時に観察することが可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の蛍光タンパク質は、第一にこれまでにない４２４ｎｍという発光波長ピークの蛍光を発し、群青色として他の蛍光タンパク質と肉眼で識別することができる。また、ｐＨの変化に蛍光強度が左右されない、ｐＨ非依存性の蛍光強度を有する本発明の蛍光タンパク質は、従来困難であった酸性環境下における蛍光タンパク質の利用を可能にする。したがって、本発明の蛍光タンパク質によって、無傷の生体あるいは細胞を用いた、生体或いは細胞内における特定の物質の局在性の目視による観察ないし確認、さらには特定の遺伝子発現の確認などを行うための、より多様な条件に適合可能な蛍光タンパク質を提供することが可能になり、分子生物学における研究などに大きく貢献し得る。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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