(57)【要約】  毛髪成長阻害活性を有する内在性因子を決定し、当該内在性因子と類似の活性を有する物質又は当該内在性因子の活性もしくは発現を促進する物質をスクリーニングし、これらの生理活性を利用して、脱毛剤、発毛抑制剤を提供する。  FGF18が毛髪成長を阻害することが見出され、FGF18様活性物質又はFGF18活性促進物質又はFGF18遺伝子発現促進物質をスクリーニングして、披検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法が開示される。また、FGF18及び／又はFGF18の部分ペプチドもしくは海人草抽出物などのFGF18様活性物質及び／又はFGF18の活性もしくは発現を促進する物質を有効成分として含有する毛髪成長阻害剤、脱毛剤が開示される。
2008102782.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
FGF18及び／又はFGF18様活性物質及び／又はFGF18の活性もしくは発現を促進する物質を有効成分として含有する毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
【請求項２】
前記FGF18及び／又はFGF18様活性物質及び／又はFGF18の活性もしくは発現を促進する物質を毛包部に持続的に存在させるように投与することを特徴とする請求項1に記載の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
【請求項３】
FGF18をコードするDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する毛髪成長阻害剤及び脱毛剤であって、FGF18を毛包部で持続的に発現させるように投与することを特徴とする毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
【請求項４】
前記FGF18が、配列番号２のアミノ酸配列の全長もしくはFGF18様活性を有する部分ペプチドである請求項1ないし３のいずれか１項に記載の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
【請求項５】
前記FGF18様活性物質が海人草の抽出物である請求項１又は２に記載の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
【請求項６】
他の毛髪成長阻害剤及び脱毛剤をさらに含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のFGF18様活性物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4から選ばれた少なくとも１つのFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作により細胞表面に強制的に発現させ、当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する細胞系に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18と同様の細胞増殖促進活性を観察した披検物質を選択する工程。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のFGF18様活性物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4の４種のFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作によりそれぞれを細胞表面に強制的に発現させ、４種の当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する４種の細胞系に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18と同様に、同濃度においてFGFR3c発現細胞と FGFR4発現細胞に対する細胞増殖促進活性がFGFR1c発現細胞とFGFR2c発現細胞に対する細胞増殖促進活性よりも格段に強い細胞増殖促進活性を観察した披検物質を選択する工程。
【請求項９】
前記FGF受容体を細胞表面に強制的に発現させるための細胞がマウスIL-3依存性Ba/F3細胞株である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のFGF18の活性を促進する物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4から選ばれた少なくとも１つのFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作により細胞表面に強制的に発現させ、当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する細胞系にFGF18と共に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18を単独で作用させた場合と比較して高い細胞増殖促進活性を観察した系を選択する工程。
【請求項１１】
前記FGF受容体がFGFR3cである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記FGF受容体がFGFR4である請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記FGF受容体を細胞表面に強制的に発現させるための細胞がマウスIL-3依存性Ba/F3細胞株である請求項１０ないし１２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載のFGF18の発現を促進する物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）FGF18遺伝子を観察可能な程度に発現しうる実験動物又は動物培養細胞を用意する工程、
（ｂ）実験動物に披検物質を接触もしくは投与するか、又は動物培養細胞に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程後の実験動物又は動物培養細胞におけるFGF18遺伝子の発現をモニターする工程、
（ｄ）FGF18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を選択する工程。
【請求項１５】
前記（ｃ）工程において、前記（ｂ）工程後の実験動物又は動物培養細胞から、mRNAを抽出し、発現されたFGF18のmRNA量を解析することによりFGF18遺伝子の発現をモニターし、前記（ｄ）工程において、披検物質を作用させない場合と比較して高いレベルのFGF18のmRNA量を観察した系を選択することにより、FGF18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を選択することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛包（毛根と同義）の成長を阻害する物質を含有する毛髪成長阻害剤及び脱毛剤及びそれらのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維芽細胞増殖因子（以下FGFと称する）といった様々なポリペプチド増殖因子が皮膚組織において発現していることが知られている。マウス及びヒトにおいては、FGFは22種類の異なる遺伝子によってコードされる（非特許文献１）。特に、FGF1、FGF2、FGF5、FGF7、FGF10、FGF13及びFGF22は、皮膚細胞及び毛包細胞において発現し、毛髪成長及び皮膚再生を制御していることが報告されている（非特許文献２〜１７、特許文献１参照）。
上掲した非特許文献２〜１７を含む他の文献から、FGFが皮膚細胞の増殖及び分化に重要な役割を担っていることが示唆される。しかしながら、毛包の成長を促進もしくは抑制する作用、それに伴う毛髪成長促進作用もしくは毛髪成長阻害作用に対して、FGF群がどのように関与するのかといった知見は依然として不明のままである。
上記の背景にあって発明者らは以前、FGF18をマウス休止期皮膚に単回投与することにより、発毛を誘導することを見いだし、FGF18を毛包の成長期を誘導して毛髪の成長を促進する物質として報告した（非特許文献１９、特許文献２）。
【非特許文献１】Ornitz DM, Itoh N: Fibroblast growth factors. Genome Biol2:REVIEWS3005, 2001
【非特許文献２】du Cros DL: Fibroblast growth factor and epidermal growth factor inhair development. J Invest Dermatol 101:106S-113S. 1993
【非特許文献３】du Cros DL, Isaacs K, Moore GP: Distribution of acidic and basicfibroblast growth factorsin ovine skin during follicle morphogenesis.  J Cell Sci 105:667-674, 1993
【非特許文献４】Hebert JM, Rosenquist T, Gotz J, Martin GR: FGF5 as a regulator ofthe hair growth cycle: Evidence from targeted and spontaneous mutations. Cell78:1017-1025, 1994
【非特許文献５】Danilenko DM, Ring BD, Yanagihara D, Benson W, Wiemann B, StarnesCO, Pierce GF: Keratinocyte growth factor is an important endogenous mediatorof hair follicle growth, development, and differentiation. American J Pathol147:145-154, 1995
【非特許文献６】Marchese C, Chedid M, Dirsch OR, et al: Modulation of keratinocytegrowth factor and its receptor in reepithelializing human skin. J Exp Med182:1369-1376, 1995
【非特許文献７】Guo L, Degenstein L, Fuchs E: Keratinocyte growth factor is requiredfor hair development but not for wound healing. Genes Dev 10:165-175, 1996
【非特許文献８】Rosenquist TA, Martin GR: Fibroblast growth factor signalling in thehair growth cycle: Expression of the fibroblast growth factor receptor andligand genes in the murine hair follicle. Developmental Dynamics 205:379-386,1996
【非特許文献９】Petho-Schramm A, Muller HJ, Paus R: FGF5 and the murine hair cycle.Arch Dermatol Res 288:264-266, 1996
【非特許文献１０】Mitsui S, Ohuchi A, Hotta M, Tsuboi R, Ogawa H: Genes for a range ofgrowth factors and cyclin-dependent kinase inhibitors are expressed by isolatedhuman hair follicles. Br J Dermatol 137:693-698, 1997
【非特許文献１１】Ortega S, Ittmann M, Tsang SH, Ehrlich M, Basilico C: Neuronaldefects and delayed wound healing in mice lacking fibroblast growth factor-2.Proc  Natl  Acad  Sci USA  95:5672-5677, 1998
【非特許文献１２】Suzuki S, Kato T, Takimoto H, et al: Localization of rat FGF-5protein in skin macrophage-like cells and FGF-5S protein in hair follicle:Possible involvement of two Fgf-5 gene products in hair growth cycleregulation. J Invest Dermatol 111:963-972, 1998
【非特許文献１３】Suzuki S, Ota Y, Ozawa K, Imamura T: Dual-mode regulation of hairgrowth cycle by two Fgf-5 gene products. J Invest Dermatol 114:456-463, 2000
【非特許文献１４】Nakatake Y, Hoshikawa M, Asaki T, Kassai Y, Itoh N: Identificationof a novel fibroblast growth factor, FGF-22, preferentially expressed in theinner root sheath of the hair follicle. Biochem Biophys Acta 1517:460-463, 2001
【非特許文献１５】Stenn KS, Paus R: Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev81:449-494, 2001
【非特許文献１６】Beyer TA, Werner S, Dickson C, Grose R: Fibroblast growth factor 22and its potential role during skin development and repair. Exp Cell Res287:228-236, 2003
【非特許文献１７】Kawano M, Suzuki S, Suzuki M, Oki J, Imamura T: Bulge- and basallayer-specific expression of fibroblast growth factor 13 (FHF-2) in mouse skin.J Invest Dermatol 122:1084-1090, 2004
【非特許文献１８】Suzuki S, Ota Y, Ozawa K, Imamura T: Dual-mode regulation of hairgrowth cycle by two Fgf-5 gene products. J Invest Dermatol 114:456-463, 2000
【非特許文献１９】Kawano M, Komi-Kuramochi A, Asada M, Suzuki M, Oki J, Jiang J,Imamura T. Comprehensive analysis of FGF and FGFR expression in skin: FGF18 ishighly expressed in hair follicles and capable of inducing anagen from telogenstage hair follicles. J Invest Dermatol. 2005, 124(5):877-885
【非特許文献２０】ZhangX, Ibrahimi OA, Olsen SK, Umemori H, Mohammadi M, Ornitz DM. ReceptorSpecificity of the Fibroblast Growth Factor Family: THE COMPLETE MAMMALIAN FGFFAMILY. J Biol Chem 2006, 281(23):15694-15700
【特許文献１】特開平4-224522号公報
【特許文献２】特開2006-83082号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
むだ毛に悩む人は多い。その処置として化学物質利用や物理的方法による毛軸の除去などが盛んに行われているが、その効果は、自然の毛包成長によってすぐに失われてしまう。そこで本発明は、毛髪成長を制御する内在性因子の作用機構を解明して、毛髪の成長を阻害する内在性因子を決定し、当該内在性因子を用いた毛髪成長阻害剤及び脱毛剤を提供することを目的とする。さらにその内在性因子の活性もしくは発現を促進する物質、及びその内在性因子と類似作用を有する物質をスクリーニングし、内在性因子と同様の毛髪成長阻害作用を呈する物質を提供することを目的としている。
また、そのためのスクリーニング方法も本発明の他の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記したように、FGF18は、休止期毛包を有する皮膚に単回投与すると数週間の反応期間を経てから毛成長が促進されることが確認されていたことから、毛髪の成長促進作用を有する物質であると考えられていた。
しかしながら、今回、休止期にあるマウス背部毛包において、抜毛によって強制的に毛包の成長期を誘導した後に、FGF18を1日1回、８日間、背部皮下に投与し、毛包部に持続的に存在させた状態での毛髪の成長状態を観察したところ、予想もしなかった驚くべき知見が得られた。
すなわち、対照群として同様な条件下で投与したリン酸緩衝生理食塩水の場合は、９日目に毛の成長が順調に進んで毛包の肥大化が起きたのに対して、FGF18投与群では毛の成長は著しく阻害された。
さらに、本発明者等は、FGF18に関する詳細な機能解析を行ったところ、毛包成長の司令塔と考えられる毛乳頭細胞において、FGF18の存在する環境下で培養することにより、毛包成長にとって重要であるとされる増殖因子VEGFの発現レベルが減少することを見出した。
本発明者らは、従来毛髪の成長を促進する物質であると考えられていた「FGF18」が持続的に投与された場合には「毛髪成長に抑制的に働く」という予想外の新規な知見に基づいて、本発明を完成するに至った。【０００５】
FGF18が毛包内にもともと存在している内在因子であることを考慮すれば、毛包に対してFGF18と類似の活性を有する物質、FGF18自身の活性を促進する物質、もしくはFGF18遺伝子の発現を活性化する物質もまた明らかに毛髪成長阻害剤及び脱毛剤として用いることができる。
FGF18遺伝子の発現を活性化する物質は、動物培養細胞又は実験動物を用いてFGF18遺伝子の発現を促進するか否かをモニターすることでスクリーニングすることができる。
FGF18自身の活性を促進する物質は、披検物質をFGF18と共に細胞表面のFGFレセプターに接触させ、FGFレセプターに対するFGF18自身の活性を促進するか否かをモニターすることでスクリーニングできる。
具体的には、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含むスクリーニング方法により得ることができる。
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4から選ばれた少なくとも１つのFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作により細胞表面に強制的に発現させ、当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する細胞系にFGF18と共に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18を単独で作用させた場合と比較して高い細胞増殖促進活性を観察した系を選択する工程。
また、FGF18と類似の活性を有する物質であれば、同様の毛髪成長阻害効果があるとの推定をもとに、毛包細胞に存在するFGF受容体に対するFGF18の反応性に着目した。すなわち、FGF18はFGF受容体サブクラスのうちFGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4と反応するので、当該反応性に基づくFGF18様活性物質のスクリーニング系を開発した（非特許文献２０）。
そして、当該スクリーニング系としてFGF4受容体を用い、自然界に存在する植物その他の天然物由来物質を広く探索した結果、FGF4受容体を活性化するいくつかの天然物由来物質を見出し、FGF18様活性物質に係る本発明も完成させた。【０００６】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）  FGF18及び／又はFGF18様活性物質及び／又はFGF18の活性もしくは発現を促進する物質を有効成分として含有する毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
（２）  前記FGF18及び／又はFGF18様活性物質及び／又はFGF18の活性もしくは発現を促進する物質を毛包部に持続的に存在させるように投与することを特徴とする（１）の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
（３）  FGF18をコードするDNAを組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有する毛髪成長阻害剤及び脱毛剤であって、FGF18を毛包部で持続的に発現させるように投与することを特徴とする毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
（４）  前記FGF18が、配列番号２のアミノ酸配列の全長もしくはFGF18様活性を有する部分ペプチドである前記（1）ないし（３）のいずれかに記載の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
（５）  前記FGF18様活性物質が海人草の抽出物である前記（１）又は（２）に記載の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
（６）  他の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤をさらに含むことを特徴とする前記（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤。
（７）  前記（１）又は（２）に記載のFGF18様活性物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4から選ばれた少なくとも１つのFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作により細胞表面に強制的に発現させ、当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する細胞系に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18と同様の細胞増殖促進活性を観察した披検物質を選択する工程。
（８）  前記（１）又は（２）に記載のFGF18様活性物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4の４種のFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作によりそれぞれを細胞表面に強制的に発現させ、４種の当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する４種の細胞系に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18と同様に、同濃度においてFGFR3c発現細胞と FGFR4発現細胞に対する細胞増殖促進活性がFGFR1c発現細胞とFGFR2c発現細胞に対する細胞増殖促進活性よりも格段に強い細胞増殖促進活性を観察した披検物質を選択する工程。
（９）  前記FGF受容体を細胞表面に強制的に発現させるための細胞がマウスIL-3依存性Ba/F3細胞株である前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）  前記（１）又は（２）に記載のFGF18の活性を促進する物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4から選ばれた少なくとも１つのFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作により細胞表面に強制的に発現させ、当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する細胞系にFGF18と共に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18を単独で作用させた場合と比較して高い細胞増殖促進活性を観察した系を選択する工程。
（１１）  前記FGF受容体がFGFR3cである前記（１０）に記載の方法。
（１２）  前記FGF受容体がFGFR4である前記（１０）に記載の方法。
（１３）  前記FGF受容体を細胞表面に強制的に発現させるための細胞がマウスIL-3依存性Ba/F3細胞株である前記（１０）ないし（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）  前記（１）又は（２）に記載のFGF18の発現を促進する物質をスクリーニングし、被検物質を毛髪成長阻害剤又は脱毛剤の候補とするための方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）FGF18遺伝子を観察可能な程度に発現しうる実験動物又は動物培養細胞を用意する工程、
（ｂ）実験動物に披検物質を接触もしくは投与するか、又は動物培養細胞に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程後の実験動物又は動物培養細胞におけるFGF18遺伝子の発現をモニターする工程、
（ｄ）FGF18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を選択する工程。
（１５）  前記（ｃ）工程において、前記（ｂ）工程後の実験動物又は動物培養細胞から、mRNAを抽出し、発現されたFGF18のmRNA量を解析することによりFGF18遺伝子の発現をモニターし、前記（ｄ）工程において、FGF18を作用させない場合と比較して高いレベルのFGF18のmRNA量を観察した系を選択することにより、FGF18遺伝子の発現を促進する機能を有する被検物質を選択することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、毛包の成長を阻害している内在性の因子を利用または模倣することによる毛髪成長阻害剤及び脱毛剤を提供することができる。
また、本発明に係るスクリーニング方法によれば、毛髪成長阻害剤及び脱毛剤として有効な物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】毛乳頭細胞の放出する毛包成長促進因子のmRNA数が、FGF18が存在し続けると、低く抑えられていることを示す図である。
【図２】FGF18を連続投与することによって、毛包の成長を抑制できることをin vivoにおいて実証する図である。図中、Ａは対照液PBSを投与したマウスの皮膚切片、ＢはFGF18を投与したマウスの皮膚切片の顕微鏡写真である。
【図３】FGF18のN末側を欠失させた部分ペプチドがFGF受容体刺激作用を有することを示す図である。（FGF受容体発現細胞を約100ng/mlの試料で刺激した場合のDNA合成量）図中、R1c、R2c、R3c、R4はそれぞれFGFR1c発現細胞、FGFR2c発現細胞、FGFR3c発現細胞、FGFR4発現細胞であり、カラム1,9,16,26は試料添加なし（対照）、カラム2,10,17,27は(d4)、カラム3,18,28は(d12)、カラム19,29は(d16)、カラム4,20,30は(d18)、カラム5,11,21,31は(d22)、カラム6,22,32は(d37)、カラム12は(d48)、カラム13,23,33は(d67)、カラム7,14,24,34は(d77)、カラム8,15,95は(d95)である。
【図４】FGF18のC末側を欠失させた部分ペプチドがFGF受容体刺激作用を有することを示す図である。（FGF受容体発現細胞を種々の濃度の試料で刺激した場合のDNA合成量）
【図５】海人草抽出液のR4/Ba/F3 細胞増殖促進作用：FGF18存在下、非存在下での海人草抽出液0.083％、0.83％及び8.3％の添加によるR4/Ba/F3 細胞の増殖率を示す。
【図６】海人草抽出液のin vivo 解析：海人草抽出液を毛周期の休止期にあるC3H/HeN マウス背部に２回皮下投与後のマウス背部の発毛状態の変化を示す。
【発明の実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を適用することによって、新規な毛髪成長阻害剤及び脱毛剤を提供することができる。これら毛髪成長阻害剤及び脱毛剤は、持続的高濃度のFGF18が毛包（毛根と呼ばれる場合もある）の成長を抑制する作用を利用する点で共通する。
【００１０】
毛包とは、毛を作る器官である。毛包の成長周期は、成長期（anagen）、退行期（catagen）、退行期に続く休止期（telogen）からなり、休止期の後に成長期に入るというサイクルである。一般に、マウスの実験系では、成長期は脱毛後1〜19日目の期間であり、退行期は20〜21日目の期間である。また、脱毛後、21〜22日目に休止期に入ることが知られている。成長期においては、新しい毛の成長（伸長）が活発化するとともに、皮膚内では毛包の成長が活発化して、その底部が皮膚の下部近傍に到達する。一方、休止期においては、毛包は皮膚の浅いところに小さい状態で存在する。また、成長期と休止期とでは皮膚の厚さも全く異なる。さらに有色体毛を持つマウスでは、成長期の初期にはメラニン色素が合成され、皮膚が青くなっているのを視認することができる。したがって、皮膚の外側から青い色を見て毛包の成長周期の進行を評価することもできる。また、成長期に皮膚を切開して裏側から見ると、メラニン色素を多量に含んだ毛包が高い密度で並ぶこととなるため、皮膚の裏側が黒なっているのを視認することができる。これに対して休止期においては、皮膚の裏側は白いままであることを視認することができる。例えば、マウスの実験系では、生後7〜8週齢のマウスの背中の毛は全て休止期にあり、また、生えている毛を抜くことにより、同調して成長期が開始する。
【００１１】
1.  FGF18
FGF18は、ヒトとマウスでは産生細胞の細胞質で207アミノ酸のポリペプチドとして合成され、それが細胞外に分泌される際にN末端のシグナルペプチドが切断され、181アミノ酸より成る分泌体として生理作用を発揮する。そして、７種類あるFGF受容体サブクラス（FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3b、FGFR4）のうち少なくとも４つ、すなわちFGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4と反応することが確認されている（非特許文献２０）。
本発明に係る新規な毛髪成長促進剤、発毛促進剤及び脱毛症治療剤に含まれるFGF18としては、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒト由来のFGF18を使用することができる。他の使用可能なFGF18としては、ヒト由来に限定されず、例えば、他の哺乳動物由来のFGF18を使用することができる。他の哺乳動物としては、マウス、ラット、ニワトリ、七面鳥、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギ等を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、配列番号１に示すヒト由来FGF18の塩基配列に基づいて作製したプローブを定法に従って用いれば、ヒトを除く他の哺乳動物からFGF18をコードする遺伝子を単離することができる。
分泌シグナル配列を除去したヒト由来FGF18の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。分泌シグナル配列を除去したマウス由来FGF18の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び１４に示す。これら配列番号２及び１４に示すアミノ酸配列を比較すると判るように、哺乳動物においてFGF18は非常に高い相同性を有しており、哺乳動物におけるFGF18の機能はほぼ同様であると理解することができる。
【００１２】
本願発明において、N末端の欠失アミノ酸の数をいうときは、組み換えタンパク質生産における翻訳開始のために導入されたメチオニン残基を除いた欠失アミノ酸の数を意味する。配列番号２及び１４に示すアミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加されたアミノ酸配列からなり、毛包の成長抑制作用があるタンパク質であれば、本願におけるFGF18に含まれる。ここで、数個のアミノ酸とは、例えば2〜37個、好ましくは2〜22個、より好ましくは2〜18個、さらに好ましくは2〜12個、最も好ましくは2〜4個を意味する。
そして、配列番号１４に示すアミノ酸配列における32〜151番目の領域は、様々なFGFに共通するコア部分であると考えられており、受容体とヘパリンに結合することが観察されている（非特許文献１）。したがって、配列番号１４に示すアミノ酸配列における32〜151番目を含む部分ペプチド、もしくは、当該32〜151番目の領域以外の領域に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加された変異ペプチドであっても、FGF18の有する毛包の成長抑制作用を発揮する限りにおいて、本願におけるFGF18として使用することができる。
実際に、配列番号１４に示すN末端からメチオニン残基を除いた4〜95個のアミノ酸を除去した場合（d4〜d95）のFGF18活性への影響を測定した実験結果によれば（図３）、d95の場合でもFGF18様のFGFR3c刺激活性を弱いながらも有している。
したがって、配列番号１４に示すN末側からメチオニン残基を除いた1〜95番目のアミノ酸については、すべて欠失しても本発明におけるFGF18として用いることができる。好ましくはN末側から1〜77番目のアミノ酸を欠失した部分ペプチドが用いられ、好ましくは1〜37番目、より好ましくは1〜22番目、さらに好ましくは1〜12番目、最も好ましくは1〜4番目のアミノ酸を欠失した部分ペプチドが用いられる。また、N末側アミノ酸配列の１〜95番目のアミノ酸の1部を置換してもよく、好ましくは、24〜182番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであり、より好ましくは、6〜182番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチドが用いられる。
また、C末側に関しては、実際に、配列番号１４に示すC末端から8〜25番目のアミノ酸を除去した場合（dc8〜dc25）のFGF18活性への影響を測定した実験結果によれば、dc25の場合でもFGF18様のFGFR2c, FGFR3c, FGFR4刺激活性を強く有している（図４）。したがって、配列番号１４に示すC末側から1〜25番目のアミノ酸については、すべて欠失しても本発明におけるFGF18として用いることができる。
以上のとおり、本願発明においてFGF18というときは、ヒト、マウスをはじめとする哺乳動物由来FGF18の全長ポリペプチドのみならず、FGF18様活性を有するFGF18部分ペプチド及びFGF18変異ペプチドも包含する。
【００１３】
2.  FGF18様活性物質、FGF18活性化物質及びそのスクリーニング方法について
〔１〕FGF18様活性物質
FGF18様活性物質という表現は、FGF18と同様の受容体に結合して同様の細胞内情報伝達系を作動させる物質を意味するが、FGF18は、上述のように、７種類あるFGF受容体サブクラスのうちの少なくともFGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4と反応するので、本発明における「FGF18様活性物質」とは、細胞表面のFGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4のいずれかの受容体に結合して、その細胞にFGF18と同様に細胞内情報伝達系を作動させる物質をいう。（ただし、FGF18様活性物質のうち、FGF18の部分ペプチド及び変異ペプチドの場合は、本発明においては「FGF18」に含める。）FGF受容体を表面に有する細胞での細胞内情報伝達系を作動させるか否かを具体的に確認するためには、細胞内のセカンドメッセンジャー（Caイオン，cAMPなど）の量を測定してもよいが、典型的にはこれらFGF受容体発現細胞に投与した場合、又は遺伝子導入して発現させた場合に、当該細胞の増殖性が観察されることをいう。
特に、FGF18はこれら受容体の中でもとりわけFGFR3c発現細胞と FGFR4発現細胞に細胞内情報伝達系を作動させる活性が強いので、FGF18様活性物質とは、FGFR3c発現細胞またはFGFR4発現細胞に対する活性が強い物質として選択することもできる。さらにFGF18様活性物質とは、同濃度においてFGFR3c発現細胞と FGFR4発現細胞に対する細胞増殖促進活性がFGFR1c発現細胞とFGFR2c発現細胞に対する細胞増殖促進活性よりも格段に（２倍以上、好ましくは３倍以上）強い細胞増殖促進活性を有するものとして選択することもできる。
【００１４】
〔２〕FGF18様活性物質のスクリーニング方法
被検物質が、このようなFGF18類似の活性がある物質かどうかを検索することにより、毛髪成長抑制或いは脱毛といった機能を有する可能性のある物質をスクリーニングすることができる。
具体的には、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4から選ばれた少なくとも１つのFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作により細胞表面に強制的に発現させ、当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する細胞系に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18と同様の細胞増殖促進活性を観察した披検物質を選択する工程。
又は下記の（ａ’）〜（ｃ’）の工程を含む方法である。
（ａ’）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4の４種のFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作によりそれぞれを細胞表面に強制的に発現させ、４種の当該細胞を培養する工程、
（ｂ’）（ａ’）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する４種の細胞系に披検物質を接触させる工程、
（ｃ’）（ｂ’）工程において、FGF18と同様に、同濃度においてFGFR3c発現細胞と FGFR4発現細胞に対する細胞増殖促進活性がFGFR1c発現細胞とFGFR2c発現細胞に対する細胞増殖促進活性よりも格段に強い細胞増殖促進活性を観察した披検物質を選択する工程。
ここで、FGF受容体遺伝子としては、FGF18が結合し、かつ細胞表面に受容体を有する細胞に対するFGF18の細胞増殖作用が確認されているFGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4の受容体遺伝子の少なくとも１つを用いる。好ましくは、FGFR3cまたはFGFR4遺伝子を用いる。被検物質を細胞に接触させる場合に、典型的には、細胞培養液に被検物質を直接投与するが、特に被検物質がタンパク質の場合などは、当該被検物質をコードする遺伝子をFGF受容体発現細胞中に導入することも可能である。
また、FGF受容体を細胞表面に強制的に発現させるための細胞は、培養可能な細胞であればどのような細胞でもよいが、好ましくはマウスIL-3依存性Ba/F3細胞株である。
そして、FGF受容体遺伝子を導入していない親細胞は対照試験に用いることができ、披検物質を用いて（ｂ）工程と同様の操作を行い、披検物質がこれら親細胞に対しては細胞増殖促進活性を起こさないことを確認する工程を設けることが好ましい。
【００１５】
〔３〕FGF18の活性を促進する物質
上記（１）のFGF18様活性物質とまではいえなくても、FGF18の受容体結合を促進もしくは増強することなどにより、FGF18による毛包の成長抑制作用を助長する物質であれば、毛髪の成長阻害作用又は脱毛作用を有するので、これらの物質を本発明では「FGF18の活性を促進する物質」という。これらのFGF18の活性を促進する物質は、単独で、もしくはFGF18などと共に、毛髪成長阻害剤又は脱毛剤として用いることができる。
【００１６】
〔４〕FGF18の活性を促進する物質のスクリーニング方法
FGF18の活性を促進する物質は、披検物質をFGF18と共に細胞表面のFGF受容体に接触させ、FGF受容体に対するFGF18自身の活性を促進するか否かをモニターすることでスクリーニングできる。
具体的には、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含むスクリーニング方法により得ることができる。
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含むスクリーニング方法により得ることができる。
（ａ）FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c及びFGFR4から選ばれた少なくとも１つのFGF受容体遺伝子を用いて遺伝子操作により細胞表面に強制的に発現させ、当該細胞を培養する工程、
（ｂ）（ａ）工程で得られた、細胞表面にFGF受容体を有する細胞系にFGF18と共に披検物質を接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程において、FGF18を単独で作用させた場合と比較して高い細胞増殖促進活性を観察した系を選択する工程。
当該スクリーニング方法において、FGFR3c又はFGFR4などのFGF受容体発現細胞に対するFGF18の細胞増殖促進活性を増大させた被検物質は、毛包細胞におけるFGF18の活性を促進する物質であると考えられるから、毛髪成長抑制或いは脱毛といった機能を有する可能性があると判断できる。
したがって、このような工程を経てスクリーニングされたFGF18の活性促進物質は毛髪成長阻害剤及び脱毛剤の有力な候補となる。その際の目安として、FGF18を単独で作用させた場合に比べて、FGF受容体発現細胞の増殖能を5％以上、好ましくは10％以上、より好ましくは20％以上増大させる物質を選択すればよい。
【００１７】
3.  FGF18の発現促進物質及びそのスクリーニング方法
FGF18は毛包内に存在する内在因子であるので、毛包細胞内でのFGF18遺伝子の転写及び翻訳を促進する物質、すなわちFGF18遺伝子の発現を活性化する物質も毛包細胞中のFGF18濃度を増加させて、FGF18による毛髪成長の阻害活性を引き起こすことができるから、毛髪成長阻害又は脱毛作用を有する。
このようなFGF18遺伝子の発現を活性化する物質は、皮膚由来細胞などの動物培養細胞又は実験動物を用いてFGF18遺伝子の発現を促進するか否かをモニターすることでスクリーニングすることができる。
具体的には、先ず、実験動物に被検物質を接触もしくは投与するか、動物培養細胞に被検物質を接触させる。なお、実験動物とは、ヒトを除く、例えば、マウス、ラット、ニワトリ、七面鳥、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギ等を意味する。被検物質としては、何ら限定されないが、例えば、植物抽出液、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質を細胞もしくは動物に接触させる場合に、典型的には、被検物質を細胞培養液に添加するか又は実験動物に投与するが、特に被検物質がタンパク質の場合などは、当該被検物質をコードする遺伝子をFGF受容体発現細胞中に導入することも可能である。
次に、当該動物培養細胞又は実験動物におけるFGF18遺伝子の発現をモニターする。動物培養細胞又は実験動物におけるFGF18遺伝子の発現は、例えば、FGF18抗体を用いたELISA等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内又は実験動物内におけるFGF18遺伝子のmRNA量を定量的逆転写PCR法やノーザンブロット法等により解析するといった方法によりモニターすることができる。
これらいずれかの解析により、被検物質の非存在下で培養された動物培養細胞内におけるFGF18遺伝子の発現量と比べて、被検物質の存在下で培養された動物培養細胞内又は実験動物内におけるFGF18遺伝子の発現量が増加すれば、当該被検物質は毛髪成長抑制或いは脱毛といった機能を有する可能性があると判断できる。具体的には、被検物質を作用させない場合と比較して、mRNA量が20％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは100％以上増加すれば、確実にFGF18の発現促進物質であるといえる。培養角化細胞や培養真皮細胞、培養毛乳頭細胞でのFGF18のmRNA発現量は、培養条件や細胞の種類により様々であるので、上記の方法などにより個別に測定し、その数値が1.2倍以上に上昇することを目安にスクリーニングすればよい。
このような工程を経てスクリーニングされたFGF18の発現促進物質は、単独で、もしくはFGF18などと共に、毛髪成長阻害剤又は脱毛剤として用いることができる。
【００１８】
4.  毛髪成長阻害剤及び脱毛剤
本発明において、上記したFGF18、FGF18様活性物質、FGF18活性化物質及びFGF18発現促進物質(以下、「FGF18など」という。)は、毛包部に持続的に存在させるように投与させる必要がある。ここで、「持続的に存在させる」とは、初期濃度の1％以上、好ましくは5%以上、より好ましくは10％以上のFGF18などが、少なくとも1日間、好ましくは4日間、より好ましくは8日間毛包部にとどまっている状態を意味する。そのためには、インプラント剤又は貼付剤などで皮膚から徐々に吸収させる方法も採用できるが、１〜3日ごとに、もしくは1日に２回以上、必要に応じて繰り返し投与すればよい。
具体的な投与形態としては、単独もしくは併用して、例えば、皮膚適用向けに適合化された溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローシヨン、シャンプー、エアゾール又は貼付剤といった形態で製剤化され、毛髪成長阻害剤又は脱毛剤として提供される。
特に、毛髪成長阻害剤又は脱毛剤は、局所投与用に適合化された薬理学上許容されるキャリアと共にFGF18などを含んだ医薬組成物の形で投与される。FGF18などを含有する毛髪成長阻害剤又は脱毛剤は、薬学上許容されるキャリア中に通常約0.01〜約100μg/日/cm2、好ましくは約0.1〜約10μg/日/cm2の活性化合物を含有している。言い換えると、FGF18などの濃度は薬学上許容されるキャリア中で通常約0.01〜約100μg/日/cm2、好ましくは約0.1〜約10μg/日/cm2の活性化合物である。
【００１９】
また、毛髪成長阻害剤又は脱毛剤は、当業界で周知の他の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤を含有していても良い、FGF18などによる毛髪成長阻害又は脱毛効果を増加もしくは増強させる物質としては特に限定されない。
さらに、毛髪成長阻害剤又は脱毛剤は、当業界で周知の毛髪成長阻害活性又は脱毛活性を示す化合物もしくは薬剤を含んでいても良い。他の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤としては、特に限定されない。
さらにまた、局所投与用に適合化された薬理学上許容されるキャリアとしては、特に限定されないが、親水ワセリン又はポリエチレングリコール軟膏のような軟膏、キサンゴムのようなゴム等のペースト、アルコール、水性又は緩衝液のような溶液、水酸化アルミニウム又はアルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル、ヒト又は動物アルブミンのようなアルブミン、ヒト又は動物コラーゲンのようなコラーゲン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースのようなセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース、プルロニックＦ−１２７で例示されるプルロニック（Pluronic（商標））ポリオ−ルのようなポリマ−；テトロニック１５０８のようなテトロニック（tetronic）、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸塩を挙げることができる。
【００２０】
また、本発明に係る毛髪成長阻害剤又は脱毛剤は、上記「１．FGF18」で説明したFGF18をコードするDNA（すなわち、ヒトなどの哺乳動物由来FGF18の全長ポリペプチド又はFGF18様活性を有するその部分ペプチドもしくはその変異ペプチドをコードするDNA）を有する発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよい。すなわち、本発明に係る毛髪成長阻害剤又は脱毛剤は、上記発現ベクターを用いた遺伝子治療に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞において発現を実現するためのプロモーターなどの配列を備えるが、特に限定されるものではない。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが利用可能であるが、これらに限定されない。
より具体的には、遺伝子治療においては、上記「１．FGF18」で説明したFGF18をコードするDNAを、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内ではFGF18が産生され、毛包の成長を阻害することができる。
遺伝子治療用の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス，1994年4月号，20-45頁、実験医学増刊，12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療 の基礎技術」，羊土社(1996)）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス又はRNAウイルスに、TR4あるいは変異TR4をコードするDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNAワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。
また遺伝子治療用の毛髪成長阻害剤又は脱毛剤を実際に医薬として作用させるには、DNAを直接体内に導入するインビボ法及びヒトからある種の細胞を取り出し体外でDNAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボがある（日経サイエンス，1994年4月号，20-45頁、月刊薬事，36(1)，23-48(1994)、実験医学増刊，12(15)(1994)）。
例えば、該遺伝子治療 剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【００２１】
5.  海人草抽出物
本発明の前記２．〔２〕のスクリーニング方法により得られたFGF18様活性物質の１つは海人草抽出物であり、その発毛抑制効果も確認された。
原料となる海人草は、紅藻類のイギス目フジマツモ科に属し、学名はDigenea simplexであり、マクリとも呼ばれている。
海人草からその抽出物を得るに当たっては、植物体の全部位が使用可能であり、各部位を単独に、或いは適宜混合して抽出原料に用いることができる。また、原料となる植物体の性状は、乾燥状態のもの、非乾燥状態のもの、いずれも用いることができる。
【００２２】
海人草から、本発明に用いる抽出物を得るには、これらの原料を必要により細切ないし粉砕し、適当な溶媒を用いて、一般に用いられる抽出法で抽出すれば良い。抽出に用いられる溶媒は、特に限定されないが、例えば水、無水或いは含水有機溶媒を例示することができる。無水或いは含水有機溶媒としては、1価アルコール、多価アルコールまたはその誘導体、ケトン、エステル、エーテル、石油エーテル、脂肪族炭化水素、またはハロゲン化合物、芳香族炭化水素より選択された一種または二種以上を例示することができる。具体的な溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチルエステルが例示され、これらは一種または二種以上を組み合わせて用いることができる。このうち、特に水、或いはメタノールやエタノール等の１価アルコールを用いることが好ましい。抽出に当たって、上記溶媒の使用量は特に限定されないが、抽出原料である海人草に対して、0.1-1000重量倍、好ましくは1-100重量倍、更に好ましくは2-50重量倍である。
【００２３】
上記溶媒による抽出法は、常法に従って行なうことができる。例えば抽出温度については、室温程度の温度で抽出しても良く、また用いられる溶媒の沸点付近の温度で抽出しても良い。また、抽出操作についても、海人草の乾燥粉砕物もしくは粉砕物を室温下で１-３０日間浸漬することにより抽出する方法や、抽出溶媒の沸点程度の温度において還流抽出する方法等を用いることができる。
【００２４】
当該海人草抽出物は、下記の実施例４において示されるように、本発明のFGF18様活性物質のスクリーニング方法である、FGFレセプターの１つであるFGFR4を遺伝子発現操作により細胞表面に強制的に発現させた細胞を用いて、FGF18様の細胞増殖促進活性を有する物質の１つとして検索された。この海人草抽出物は、FGFR4発現細胞に対してはFGF18と同様の細胞増殖促進活性を示し、FGFR4を発現していない親株に対する細胞増殖促進活性は無いことから、FGF18様活性物質であるということができる。
そして、当該FGF18様活性物質は、推定どおり発毛抑制作用があることが、実施例6により実証された。
また、FGFR4発現細胞に対する細胞増殖促進作用について、FGF18単独で作用させた場合との比較実験を行った結果、低濃度の海人草抽出物には、FGF18活性を促進する作用が確認され、海人草抽出物はFGF18活性の促進物質であるということもできる。このことから、当該比較実験の手法は、FGF18活性の促進物質をスクリーニング法として用いることができることを示すものであり、この手法が発毛抑制剤の候補を選択するための有力な手段であることは明らかである。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
毛乳頭細胞遺伝子発現に対するFGF18の影響
本実施例では、FGF18の毛成長に対する機能を評価するため、毛包成長の司令塔と考えられている毛乳頭細胞による遺伝子発現について、FGF18の影響を調べた。
＜材料と方法＞
培養したヒト毛乳頭細胞（HFDP：成人頭皮由来；東洋紡績株式会社製）はHFDP生育培地（20%ウシ胎児血清を含む乳頭細胞基礎培地；東洋紡績株式会社製）で継代培養して2継代以内に実験に使用した。細胞はトリプシン処理してコラーゲンコートプレート（Sumilon社製）に、密度が1×104細胞/ウェルで24ウェルに分注してHFDP培地で37℃に維持した。次の日に培地にFGF18を添加し、細胞を24時間培養してからFGF18を含まない培地に交換した。対照群に対しては、FGF18を含まない培地で培養した。そして細胞を採取して、そのmRNAを抽出し、精製した。その中に含まれる、毛包成長促進因子として知られるVEGFのmRNAの発現レベルを解析した。
＜結果＞
結果を図１に示す。毛乳頭細胞は様々な因子を放出して毛成長を支えていると考えられている。それらの因子の一つとしてVEGFがある。本実験で、毛乳頭細胞によるVEGFのmRNAの発現レベルが、培地にFGF18を添加することにより減少したことから、毛乳頭細胞による毛成長のための一つの因子の産生をFGF18が抑制することを確認した。【００２６】
〔実施例２〕
FGF18の毛髪成長に対する抑制作用
本実施例では、毛包成長に対するFGF18のin vivoでの影響の特徴を調べるため、FGF18の投与による影響を毛包成長期に誘導したC3H/HeNマウスで試験した。
＜材料と方法＞
FGF18の毛包成長に対するin vivoでの影響の特徴を調べるため、毛包成長期に誘導したマウスに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したFGF18タンパク質を投与した。
すなわち、50日齢のC3H/HeN雄マウスの休止期にある背部毛を手指によって優しく抜き去り、毛包成長期開始を誘導した。そしてFGF18溶液を尾部近くより背部皮膚に皮下注射した（マウス1匹あたり1μgのFGF18）。マウスは飼料および水を任意に摂取できるようにして飼育した。この日から８日間、毎日ほぼ同時刻に８日間、FGF18溶液を背部皮膚に皮下注射した。対照群としては、FGF18の代わりにPBSを注射した。９日後にマウスに麻酔をかけて安楽死させた。背部皮膚を全層で切除し、パラフィンで包理した。包理した皮膚サンプルはミクロトームで4μm厚の切片にしてヘマトキシリンで染色して顕微鏡で観察した。
＜結果＞
結果を図２に示す。図中、Aは対照液PBSを投与したマウスの皮膚切片の顕微鏡写真であり、BはFGF18を投与したマウスの皮膚切片の顕微鏡写真である。なお、A,Bで写真の拡大倍率は一定である。
写真Aから分かるように、PBS液を皮下投与したマウスでは、９日後に毛包の自然な成長が認められ、毛包が長く成長し、皮膚の下層まで達している。
これに対して、写真BのFGF18液を投与したマウスでは毛包が短く、毛成長が強く抑制されていることが示される。
この結果から、FGF18を連続投与することによって、毛包の成長を抑制できることがin vivoにおいて実証された。【００２７】
〔実施例３〕
FGF18部分ペプチドのFGF受容体刺激作用
FGF18の部分ペプチドとして、マウスFGF18のアミノ酸配列に対応する配列番号１４のメチオニンを除くN末端から４番目から95番目のアミノ酸を除去した部分ポリペプチド（d4〜d95：メチオニンを除くN末端から除去したアミノ酸数で表す。）を作製した。さらに、FGF18の部分ペプチドとして、マウスFGF18のアミノ酸配列に対応する配列番号１４のC末端から8番目から25番目のアミノ酸を除去した部分ポリペプチド（dc8〜dc25：C末端から除去したアミノ酸数で表す。）を作製した。
なお、それぞれの部分ポリペプチドのアミノ酸配列（塩基配列）は、以下の配列番号に対応する。
d4：配列番号１５（配列番号４）
d12：配列番号１６（配列番号５）
d16：配列番号１７（配列番号６）
d18：配列番号１８（配列番号７）
d22：配列番号１９（配列番号８）
d37：配列番号２０（配列番号９）
d48：配列番号２１（配列番号１０）
d67：配列番号２２（配列番号１１）
d77：配列番号２３（配列番号１２）
d95：配列番号２４（配列番号１３）
dc8：配列番号２８（配列番号２５）
dc15：配列番号２９（配列番号２６）
dc25：配列番号３０（配列番号２７）
FGF18は４種類のFGFレセプターFGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 を刺激するが、それらを刺激する強さは異なり、また、これらの受容体への刺激の総和としての結果として、毛成長抑制をすると考えられる。
文献の教示にしたがって、マウスIL-3依存性proB細胞であるBa/F3細胞株（理研BRCより入手）に、遺伝子発現操作によりFGFレセプターであるFGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4のいずれかを導入して、FGFRが細胞表面に強制的に発現されている細胞を作成した（Ornitz, DM., Xu, J., Colvin, JS., McEwen, DG., MacArthur, CA., Coulier, F., Gao, G. and Goldfarb, M., 1996. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. J. Biol. Chem. 271(25):15292-15297；Yoneda, A., Asada, M., Oda, Y., Suzuki, M. and Imamura, T., 2000. Engineering of an FGF-proteoglycan fusion protein with  heparin-independent, mitogenic activity. Nat. Biotec. 18(6):641-644）。
これらの細胞を用い、それぞれのレセプターの刺激活性を調べた。その結果を図３に示す。
図３の左から、それぞれ、FGFR1c発現細胞(R1c)、FGFR2c発現細胞（R2c）、FGFR3c発現細胞(R3c)、FGFR4発現細胞（R4）を用いた試験の結果を示す。
縦軸はそれぞれにおいて、細胞を何ら刺激しない場合の基底レベルのDNA合成量を100%として、細胞を約100ng/mlの試料で刺激した場合のDNA合成量を表す。
＜R1c＞
カラム1：試料添加なし（対照）。 カラム2：(d4)。カラム3 ：(d12) 。カラム4：(d18)。カラム5：(d22)。カラム6：(d37)。カラム7：(d77) 。カラム8 ：(d95)。
＜R2c＞
カラム9：試料添加なし（対照）。カラム10：(d4) 。カラム11：(d22) 。カラム12：(d48)。カラム13：(d67)。カラム14：(d77)。カラム15：(d95)。
＜R3c＞
カラム16：試料添加なし（対照）。カラム17：(d4)。カラム18：(d12)。カラム19：(d16)。カラム20：(d18)。カラム21：(d22)。カラム22：(d37)。カラム23：(d67)。カラム24：(d77)。カラム25：(d95)。
＜R4＞
カラム26：試料添加なし（対照）。カラム27：(d4)。カラム28：(d12)。カラム29：(d16)。カラム30：(d18)。カラム31：(d22)。カラム32：(d37)。カラム33：(d67)。カラム34：(d77)。
図４の左から、それぞれ、FGFR2c発現細胞（R2c）、FGFR3c発現細胞(R3c)、FGFR4発現細胞（R4）を用いた試験の結果を示す。
縦軸はそれぞれにおいて、細胞を何ら刺激しない場合の基底レベルのDNA合成量を0 CPMとして、細胞を様々な濃度の試料で刺激した場合のDNA合成量をCPMで表す。横軸はそれぞれにおいて、細胞を刺激するのに用いた試料の濃度を示す。
＜R2c＞
上図：全長（対照）。中図：(dc8) 。下図：(dc25) 。
＜R3c＞
上図：全長（対照）。中図：(dc8) 。下図：(dc25) 。
＜R4＞
上図：全長（対照）。中図：(dc8) 。下図：(dc25) 。
図３及び図４から、FGF18部分ペプチド（d4〜d95, dc8〜dc25）でも、様々な強さでFGF受容体を刺激して、細胞によるDNA合成を刺激する活性が認められた。特に、FGFR3c発現細胞とFGFR4発現細胞を強く刺激する活性を有していることが示された。このようなFGF18が有するFGF受容体刺激活性と類似した活性を有している実験結果は、毛成長制御においてもFGF18類似活性を有していることを示している。
FGF18部分ペプチド中でもd4〜d37及び dc8〜dc25、特にd4〜d22及び dc8〜dc25はFGFR3c及びFGFR4dいずれの受容体刺激活性も強いことから、N末側からメチオニンを除く37個以下、特に22個以下のアミノ酸を除いた部分ペプチド、及びC末側からの25個以下のアミノ酸を除いた部分ペプチド、が本発明のFGF18として好ましく用いられる。【００２８】
〔実施例４〕
FGFR4発現細胞を用いたFGF18様活性物質のスクリーニング
作製したFGFR4が細胞表面に強制的に発現されている細胞（R4/Ba/F3細胞）を、被験液として種々の植物抽出液と共に培養した。陽性対照としては市販のFGF18蛋白質を用いた。一定時間培養した後の細胞数を、Cell Counting Kit-8（(株)同仁化学研究所製造、和光純薬工業株式会社販売）を用いて、WST-8ホルマザンの産生量に伴う450 nmの発色を測定して求めた。【００２９】
その結果、海人草の抽出物が、FGF18様活性物質として作用し、R4/BaF3細胞の増殖を促進しうることが見いだされた。【００３０】
〔実施例５〕
本発明のFGF18様活性物質の細胞増殖促進活性
乾燥した海人草（琉球海産物加工場、または、名護海苔商会）2.0ｇに、70％エタノール水溶液40mlを加え、室温で7日間浸漬抽出した。乾燥した海人草（琉球海産物加工場、または、名護海苔商会）2.0ｇに、蒸留水40mlを加え、20分間煮沸した。以上の様にして得られた抽出液をろ過してろ液を取り、抽出液を得た。【００３１】
実施例３と同様にして、R4/Ba/F3細胞を用いて本発明のFGF18様活性物質の細胞増殖活性の測定を行った。具体的には、測定は次の様にして行った。96穴の細胞培養用プレートの各ウエルに、1ウエル当たり50μlの10% FBS、1% Antibiotic G-418 Sulfate（プロメガ株式会社、V7983）を含むRPMI1640培地を加えた。次いで、各試料を水で希釈して調製した種々の濃度の被験液 10μl を添加した後、10% FBS、1% Antibiotic G-418 Sulfateを含むRPMI1640培地中に5 x 104個のR4/Ba/F3細胞が懸濁した細胞懸濁液50μlを添加し、軽く撹拌した。最後に、heparin / 10% FBS / 1% Antibiotic G-418 Sulfate / RPMI1640培地、10μl（heparin終濃度5μg/ml） を加え、5%CO2存在下、37℃の炭酸ガスインキュベーターで72時間培養した。R4/Ba/F3細胞の増殖は、72時間培養後の各ウエルに、Cell Counting Kit-8（(株)同仁化学研究所製造、和光純薬工業株式会社販売）/PBS溶液10μlを加えた後、更に3時間培養し、WST-8ホルマザンの産生量に伴う450 nmの発色を測定して求めた。
測定に際しては、陽性対照としては、FGF18（ぺプロテック株式会社、100-28）溶液 10μl（FGF18終濃度3ng/ml）を、また陰性対照としては、被験液作製時に使用した水またはエタノール溶液（エタノール溶液の終濃度は1%以下になるように調製）10μl を用いて測定した。細胞増殖率（％）の算定は、被験液添加時に得られる吸光度について、陽性対照として用いたFGF18(終濃度3ng/ml)添加時の吸光度を100%、陰性対照として用いた水またはエタノール溶液添加時の吸光度を0%として算出した。
海人草抽出液についての結果を図５に示す。終濃度8.3%の海人草抽出液を被験液とした場合、発色量が増加し、FGF18様の細胞増殖促進活性を有することが確認された。
図５において、海人草抽出物は、添加濃度０．０８３％、及び、０．８３％においてＦＧＦ１８単独でFGFR4/BaF3株を培養した場合と比較して、より強い細胞増殖促進作用を示し、低濃度の海人草抽出物はFGF18活性促進作用を有している。
すなわち、海人草抽出物はFGF18様活性物質であり、かつFGF18活性の促進物質でもある。【００３２】
〔実施例６〕
FGF18様活性物質の in vivo での作用を見るために、毛周期の休止期にあるC3H/HeN マウスで試験した。
本発明のFGF18様活性物質の in vivo 解析
実施例５に準じて、乾燥した海人草（琉球海産物加工場、または、名護海苔商会）2.0ｇに、蒸留水30mlを加え、20分間煮沸した。抽出液が室温に戻った後、12,000回転、10分間遠心し、上清を得た。遠心上清は、更に0.45 mmのマイレクスHV滅菌フィルターを通過させ、被験液とした。この様にして得られた海人草抽出液について、毛周期の休止期にあるC3H/HeN マウス背部に皮下投与した。７週齢のC3H/HeN 雄マウスに麻酔をし、背部毛をバリカンにより優しく剃毛した。剃毛後、被験液として海人草抽出液、又はPBS(-)（生理的リン酸緩衝液）100ml をそれぞれ１群５匹に皮下注射した（第０日）。同様にして、第４日目に、再度皮下注射し、第２１日、２８日、３５日目のマウス背部の発毛状態を目視により観察し、発毛スコアーを得た。発毛スコアーは、１）色素沈着：１点、２）短かな毛並み：２点、３）通常の毛並み：３点とし、それぞれの発毛状態の面積が全剃毛面積に対して占める割合を％で示し、以下の式で求めた。本算出法によると、全剃毛面積が通常の毛並みに回復した場合、１００点となる。
発毛スコアー＝(色素沈着面積の割合（％）×１＋短かな毛並み面積の割合（％）×２＋通常毛並み面積の割合（％）×３)／３
第一回の皮下注射後、第２１日（３W）、２８日（４W）、３５日（５W）目におけるマウス背部の発毛状態を観察した結果、図６に示す通り、海人草抽出液投与群は、PBS(-)投与群に比較して発毛スコアーが低く、毛包の成長を抑制できることをin vivoにおいて実証した。
以上の様に、海人草抽出液は発毛抑制剤としての作用が実証された。【００３３】
〔実施例７〕
本発明である海人草抽出物を用いたヘアシャンプーの処方及び製造法を示す。
以下の処方、及び製法に従ってヘアシャンプーを製造した。
（処方）
成  分                          重量％
１.実施例５で得られた希釈液      0.1
２.ラウリルエーテル硫酸ナトリウムエタノール  20
３.ラウリル硫酸ナトリウム        10
４.1,3ブチレングリコール          1
５.香料                          適量
６.精製水                        残量（全量で100とする）
（製法）
処方成分を80℃に加熱し、攪拌混合した後、攪拌冷却し本発明のヘアシャンプーを製造した。【００３４】
〔実施例８〕
本発明である海人草抽出物を用いたヘアリキッドの処方及び製造法を示す。
以下の処方、及び製法に従ってヘアリキッドを製造した。
（処方）
成  分                                重量％
１.実施例５で得られた希釈液      0.1
２.エタノール                          40
３.グリセリン                           1
４.香料                                適量
５.精製水                              残量（全量で100とする）
（製法）  処方成分を加えて攪拌溶解した後、精製水を加えてヘアリキッドを製造した。【００３５】
〔実施例９〕
実施例９は、本発明である海人草抽出物を用いたヘアクリームの処方及び製造法を示すものである。
以下の処方、及び製法に従ってヘアクリームを製造した。
（処方）
成  分                                重量％
１.実施例５で得られた希釈液      0.1
２.流動パラフィン                      40
３.ワセリン                              1
４.セトステアリルアルコール          1
５.メチルポリシロキサン                1
６.パラオキシ安息香酸メチル      0.2
７.プロピレングリコール              5
８.香料                              適量
９.精製水                            残量（全量で100とする）
（製法）
処方成分を攪拌混合し、本発明のヘアクリームを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、効果的な毛髪成長阻害剤及び脱毛剤が提供でき、これらを配合することにより、毛髪成長阻害活性を有するシャンプー、ヘアリキッドの他、皮膚のむだ毛を除去するための脱毛クリームなどが提供できる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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