(57)【要約】本発明は、乳癌関連細胞の高転移能・高浸潤能獲得モデルを作製することを目的とする。本発明は、ＭＣＦ７細胞に由来する細胞であって、ＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い浸潤能または転移能を有するＭＣＦ７由来細胞を提供する。本発明のＭＣＦ７由来細胞は、マトリゲル等の基底膜調製物又はその類似物通過能を獲得したＭＣＦ７細胞を回収することによって得ることができる。
2008093886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＦ７細胞に由来する細胞であって、ＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い浸潤能を有するＭＣＦ７由来細胞。
【請求項２】
ＭＣＦ７細胞に由来する細胞であって、ＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い転移能を有するＭＣＦ７由来細胞。
【請求項３】
ＨＥＲ２陰性である、請求項１又は２に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項４】
ＥＳＴＲ陽性である、請求項１から３のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項５】
ＣＤ４４遺伝子、ＣＸＣＬ１２遺伝子、ＰＬＡＵ遺伝子、及びＶＥＧＦ遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量が、ＭＣＦ７細胞の１．５倍以上である、請求項１から４のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項６】
スフェロイドを形成することを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項７】
実験用動物に移植した場合、移植部位に原発腫瘍巣を形成する能力を有する、請求項１から６のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項８】
実験用動物に移植した場合、近位リンパ節、遠隔リンパ節、又は脳に転移巣を形成する能力を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項９】
ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種し、該基底膜調製物又はその類似物を通過するように変異した細胞を回収することによって得られる、請求項１から８のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項１０】
ＭＣＦ７−１４細胞（受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４）である、ＭＣＦ７由来細胞。
【請求項１１】
ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子が導入されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞が移植された実験用動物。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系。
【請求項１４】
請求項１２に記載の実験用動物を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系。
【請求項１５】
ＭＣＦ７細胞から、高浸潤能または高転移能を獲得した変異細胞株を樹立する方法であって、ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種した後、該基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収しては再び基底膜調製物又はその類似物上に播種する工程を少なくとも７回繰り返すことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低転移性のヒト乳癌由来樹立細胞株であるＭＣＦ７細胞を所定の条件で継代培養することによって得られる、高浸潤性または高転移性ＭＣＦ７由来細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療機器の進歩により極めて早期の癌診断が可能になり、癌の治癒率、特に術後５年生存率は徐々に上昇し、癌の死亡率は１９７５年以降緩やかに減少してきている。しかし乳癌をはじめとする転移性の高い上皮性癌はその範疇ではない。現在国内の乳癌罹患者数は４万人を超えており、その数は未だに増加傾向にある。しかも初発乳癌の切除手術後の５年生存率が９０％以上であるにも関わらず、乳癌罹患者の約４０％は死に至るという統計がある。
このような乳癌を含めた上皮性癌患者の主な死因は癌の遠隔転移や再発によるが、転移や再発を正確に予測できないために、本来ならば不要な抗癌剤治療を長期にわたって行われ、副作用で苦しんでいる患者も多く存在する。例えば乳癌の場合、腫瘍の大きさや腋窩リンパ節転移の有無等の予後マーカーはあるが、判定精度が低く患者の約３０％しか転移再発リスクを予測できない。また癌の早期発見が可能になったため原発巣は小さく、その時点で転移巣が存在しても極微小であるか、小さな播種性癌細胞として血中を漂っている可能性が高く、視覚的に転移を捕らえることが非常に困難であり、上記のような予後マーカーは有効ではなくなってきている。したがって癌細胞が転移能を獲得する極めて初期に生じる変化を捕らえることが重要である。
バイオマーカーの探索は数１０億ドル市場として世界中の注目を浴びており、多くの研究者と資金を投じて研究が行われているが、疾患特異的マーカーの発見に至るには困難を極めている。もちろん癌転移マーカーや予後予測マーカーもその例外ではない。最近ＤＮＡマイクロアレイの解析により原発巣と転移巣では遺伝子の発現プロファイルが異なるだけでなく、予後不良な癌は早い時期に遺伝子変異が入って転移形成能を獲得することが報告された。また、創傷と腫瘍の生理現象（マトリックスリモデリング、細胞運動、血管形成の活性化）の類似を根拠に、乳癌患者の創傷応答遺伝子の発現パターンを調べたところ、これらの遺伝子が予後不良を予測できるマーカーとしての可能性が示された。このようなＤＮＡマイクロアレイによる解析結果から、約７０個の遺伝子の発現プロファイルが癌転移とリンクすることが判明してきた（例えば、非特許文献１を参照）。しかし疾患の不均一さや個人差による遺伝子発現への影響や解析方法の複雑さから判定精度が安定しておらず、臨床応用はされていない。
薬物誘導性遺伝子の同定により発見されたＨＥＲ２は乳癌の予後マーカーとして有効であることが示されてきている。特にこのレセプターに対するモノクローナル抗体ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、ＨＥＲ２陽性早期乳癌患者への投与により再発リスクの軽減及び延命効果があることが報告された。また癌浸潤時に発現量が増大するプラスミノーゲンアクチベーターとその阻害因子なども予後マーカーとして有効であり、特に化学療法への感受性を規定する因子として臨床応用されるようになってきた。
しかしながら、これらのマーカーを発現していない乳癌患者においても遠隔転移や再発が生ずることや、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂや化学療法に対する感受性が低い乳癌患者においても遠隔転移や再発が生ずることから、転移の発生メカニズムを調べ、転移能を獲得する初期ステージでの変化を捉え、癌転移、再発等の予後予測マーカーを探索するために、乳癌関連細胞の高転移能獲得モデルが必要とされていた。
【非特許文献１】Ｌａｕｒａ  Ｊ．ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ，Ｈｏｎｇｙｕｅ  Ｄａｉ，Ｍａｒｋ  Ｊ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  ４１５，５３０−５３６
【発明の開示】
【０００３】
癌の転移においては、癌細胞の接着、浸潤、移動のステップが繰り返される。転移能の高い癌細胞は接着性、浸潤性、移動性が高い。特に、癌転移の最初のステップは、基底膜から周辺組織への浸潤であるため、転移の発生のメカニズムや、転移能を獲得する初期のステージには細胞の浸潤性が深く関与していると考えられる。
そこで、本発明は、乳癌関連細胞の高転移能獲得または高浸潤能獲得モデルを作製することを目的とする。
本発明者らは、上記課題に鑑みて研究を重ねた結果、低転移性のヒト乳癌由来樹立細胞株ＭＣＦ７細胞をマトリゲル（商標。以下同様）上に播種し、マトリゲル通過能を有する細胞を回収しては再びマトリゲル上に播種する工程を繰り返すことにより、浸潤性、転移能が高く、ＭＣＦ７細胞とは形態も異なる新規な細胞株を得ることに成功し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
〔１〕ＭＣＦ７細胞に由来する細胞であって、ＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い浸潤能を有するＭＣＦ７由来細胞；
〔２〕ＭＣＦ７細胞に由来する細胞であって、ＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い転移能を有するＭＣＦ７由来細胞；
〔３〕ＨＥＲ２陰性である、上記〔１〕又は〔２〕に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔４〕ＥＳＴＲ陽性である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔５〕ＣＤ４４遺伝子、ＣＸＣＬ１２遺伝子、ＰＬＡＵ遺伝子、及びＶＥＧＦ遺伝子から
なる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量が、ＭＣＦ７細胞の１．５倍以上
である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔６〕スフェロイドを形成することを特徴とする、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項
に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔７〕実験用動物に移植した場合、移植部位に原発腫瘍巣を形成する能力を有する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔８〕実験用動物に移植した場合、近位リンパ節、遠隔リンパ節、又は脳に転移巣を形成する能力を有する、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔９〕ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種し、該基底膜調製物又はその類似物を通過するように変異した細胞を回収することによって得られる、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔１０〕ＭＣＦ７−１４細胞（受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４）である、ＭＣＦ７由来細胞；
〔１１〕ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子が導入されている、上記〔１〕から〔１０〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞；
〔１２〕上記〔１〕から〔１１〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞が移植された実験用動物；
〔１３〕上記〔１〕から〔１１〕のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系；
〔１４〕上記〔１２〕に記載の実験用動物を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系；及び
〔１５〕ＭＣＦ７細胞から、高浸潤能または高転移能を獲得した変異細胞株を樹立する方法であって、ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種した後、該基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収しては再び基底膜調製物又はその類似物上に播種する工程を少なくとも７回繰り返すことを特徴とする方法、に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、マトリゲルインベンジョンチャンバーを用いた高浸潤性細胞株樹立方法の概要を示す。
図２は、マトリゲルインベージョンチャンバーを通過した細胞を固定しクリスタルバイオレット染色した像を示す。
図３は、マトリゲルを通過し下側に移動した細胞を１００倍の倍率で顕微鏡観察した像を示す。
図４は、マトリゲルを通過し下側に移動した細胞数の平均を示す。
図５は、ＭＣＦ７細胞（Ａ）とＭＣＦ７−１４細胞（Ｂ）の位相差像を示す。
図６は、ＭＣＦ７細胞及びＭＣＦ７−１４細胞の増殖曲線を示す。
図７は、ＭＣＦ７細胞及びＭＣＦ７−１４細胞のＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  アッセイの結果を示す。
図８は、マトリゲルを含まない細胞培養用ディッシュで培養したときのＭＭＰ活性をザイモグラム法で検出した結果を示す。
図９は、マトリゲルインベージョンチャンバーで培養したときのＭＭＰ活性をザイモグラム法で検出した結果を示す。
図１０は、ＨＥＲ２遺伝子及びＥＳＴＲ遺伝子の発現量をウエスタンブロット解析により調べた結果を示す。
図１１は、細胞の移植方法の概要を示す。
図１２は、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞（Ａ、Ｃ）とＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞（Ｂ、Ｄ）を移植して４週間後のマウスの解剖結果を示す。ＡとＢは解剖像、ＣとＤはＧＦＰ発現細胞の挙動を蛍光観察した結果である。
図１３は、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞（Ａ、Ｃ、Ｅ）とＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を移植したマウスから４週間後に摘出した肺を観察した結果を示す。ＡとＢは肺の解剖像、ＣとＤは蛍光観察像、ＥとＦは摘出した肺から凍結切片を作製し抗ＧＦＰ抗体により免疫染色した結果を示す。
図１４は、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞を移植したマウスから４週間後に摘出した乳腺の移植部位（Ａ、Ｃ）と近位リンパ節（Ｂ、Ｄ）を観察した結果を示す。
図１５は、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞を移植したマウスから４週間後に摘出した乳腺の移植部位（Ａ、Ｃ）と近位リンパ節（Ｂ、Ｄ）を観察した結果を示す。
図１６は、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植マウスから移植４週間後にすい臓周辺部位を摘出して観察した結果を示す。
図１７は、移植４週間後のＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植マウスからすい臓部分の腫瘤を摘出、凍結組織切片を作成し、明視野および蛍光観察した結果を示す。
図１８は、移植４週間後のマウスから、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞移植部、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞の移植部およびすい臓部分の腫瘤の凍結切片を作成し、上皮マーカーの免疫染色を行った結果を示す。
図１９は、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞をマウスに移植してから１２週間後のマウス腹部（Ａ、Ｂ）、摘出したすい臓周辺部位（Ｃ、Ｄ）と脳（Ｅ、Ｆ）を観察した結果を示す。ＡとＢにおいて、矢印は移植部位、丸で囲んだ部分はすい臓の周辺を示す。
【符号の説明】
【０００５】
符号は、それぞれ１…マトリゲルインベージョンチャンバー、１０…セルカルチャーインサート、１２…メンブレン、１３…マトリゲル、１４…細胞、２…ディッシュを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について、その好ましい態様を具体的に説明する。
本発明に係るＭＣＦ７由来細胞は、高い浸潤性を獲得したＭＣＦ７細胞の変異株である。ヒト乳癌に由来するＭＣＦ７細胞は本来浸潤性が低く、従って低転移性であり、ヌードマウス等に移植しても原発巣は形成するが転移しない。これに対し、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、もとのＭＣＦ７細胞に比較して、有意に高い浸潤性を獲得した変異株である。
本発明において、「有意に高い浸潤能を有する」とは、細胞の浸潤性を測定する種々の方法のうちいずれかの方法で測定された浸潤能が、ＭＣＦ７細胞の浸潤能より統計的に有意に高いことを意味する。また、細胞の浸潤性は、例えば、生体内の基底膜と類似した環境を提供するマトリゲル通過能で評価することができる。マトリゲル上に、ＭＣＦ７由来細胞を播種し、播種した細胞数に対するマトリゲルを通過した細胞数の割合が、ＭＣＦ７細胞で同様の試験を行った場合に比較して５０倍以上、好ましくは１００倍以上、さらに好ましくは５００倍以上高いことを、浸潤性が高いということができる。
本発明のＭＣＦ７由来細胞は、もとのＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い転移能を有する。ＭＣＦ７細胞は低転移性であり、ヌードマウス等に移植しても原発巣は形成するが転移はしない。しかし、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、高い転移能を獲得する変異を有している。本発明において「有意に高い転移能を有する」とは、細胞の転移能を評価する種々の方法のうちいずれかの方法によって求めた転移能が、ＭＣＦ７細胞の転移能よりも統計的に有意に高いことを意味する。また、例えば、細胞を実験用動物に移植した場合に、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上の個体において近接するリンパ節への転移が見られることを、転移能が高いということができる。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、ＨＥＲ２陰性であることを特徴とする。ここで、「ＨＥＲ２陰性」とはＨＥＲ２タンパク質が標準的なウエスタンブロッティング法での検出限界以下であることを言う。ＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質は高い転移能力を持つ乳癌由来の悪性腫瘍では高い発現が認められることが多く、診断及び治療法の決定にしばしば用いられている腫瘍マーカーである。本発明のＭＣＦ７由来細胞は高浸潤能・高転移能を有するにも関わらず、転移能に関連するＨＥＲ２陰性であることから、ｔｒａｓｔｕｚｍａｂに対する感受性の低い乳癌患モデルとして、転移や再発の研究に利用できる可能性が高いことが示唆される。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、高浸潤能または高転移能を有するにも関わらず、ＥＳＴＲ陽性である。ここで、ＥＳＴＲはエストロゲン受容体のことであり、「ＥＳＴＲ陽性」とは標準的なウエスタンブロッティング法で明確なバンドが検出可能であることを言う。このように、ＥＳＴＲ陽性であることから、ホルモン治療に対しても高い抵抗性を示すものと考えられ、本発明のＭＣＦ７由来細胞が、ホルモン治療に対する感受性の低い乳癌モデルとして、転移や再発の研究に利用できる可能性が高いことが示唆される。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、ＣＤ４４遺伝子、ＣＸＣＬ１２遺伝子、ＰＬＡＵ遺伝子、及びＶＥＧＦ遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量が、ＭＣＦ７細胞の１．５倍以上である。遺伝子の発現量を測定する方法には種々のものがあるが、いずれかの方法で測定した場合に、ＭＣＦ７細胞の１．５倍以上であればよい。ＣＤ４４遺伝子については好ましくは２倍以上、ＣＸＣＬ１２遺伝子については好ましくは５倍以上、ＰＬＡＵ遺伝子については好ましくは１０倍以上、ＶＥＧＦ遺伝子については好ましくは１．８倍以上である。これらの遺伝子は、いずれも転移能を有する細胞で発現量が多いことが知られている。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、ＭＣＦ７細胞と異なり、スフェロイドを形成する。ＭＣＦ７細胞を培養すると、通常４〜５日でコンフルエントになり、容器から剥がれて死亡するところ、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、スフェロイドを形成し、１０日以上培養可能であったことから、長期培養・高密度培養が可能であるものと推測される。このような性質は、本発明のＭＣＦ７由来細胞から、タンパク質や核酸等、特定の物質を抽出して研究する場合に有用である。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、実験用動物に移植した場合、移植部位に原発腫瘍巣を形成する能力を有する。一般に、ＭＣＦ７細胞等の癌細胞は、癌特異的抗原の発現の上昇等により、移植しても数日で剥離することが多いことが知られているところ、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、移植された個体で安定に定着する。ここで、安定に定着するとは、例えば、移植した個体のうち少なくとも５０％、好ましくは６０％、さらに好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％の個体において、２８日以上剥離しない場合をいう。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、実験用動物に移植した場合、近位リンパ節、遠隔リンパ節、又は脳に転移巣を形成する能力を有する。
このようなＭＣＦ７由来細胞は、例えば、ＭＣＦ７細胞を基底膜と同等の性質を有する基底膜調製物又はその類似物上に播種し、該基底膜調製物又はその類似物を通過できるような変異が自然発生的に生じた細胞を回収することによって得ることができる。さらに、基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を、再び基底膜調製物又はその類似物上に播種し、基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収する工程を繰り返すことにより、より高い浸潤能または転移能を有するＭＣＦ７由来細胞株を作製することができる。基底膜調製物又はその類似物の例としては、例えば、マトリゲルを挙げることができるが、ここでマトリゲルとは細胞外基質タンパク質（ＥＣＭ）が豊富なＥＨＳマウス腫瘍細胞から抽出された可溶化基底膜調製品であり、生体内の基底膜と類似した環境を提供するものである。マトリゲルを使用する場合には、ＭＣＦ７細胞をマトリゲルに播種した後、マトリゲルを通過する細胞を回収して再びマトリゲル上に播種する工程を少なくとも７回、好ましくは８回、さらに好ましくは９回、最も好ましくは１０回繰り返すことにより、十分に高い浸潤能または転移能を獲得したＭＣＦ７由来細胞を得ることができる。また、基底膜調製物の類似物の例としては、アガロース又はコラーゲンゲルが挙げられる。ＭＣＦ７由来細胞株は培養中に培地中の線維成分により移動能が制限され、浸潤能や転移能が低くなると考えられるが、このような線維成分を基底膜調製物の類似物としてＭＣＦ７由来細胞を得ることも可能である。
このような本発明のＭＣＦ７由来細胞としては、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託したＭＣＦ７−１４細胞株が挙げられる。
［寄託された生物材料への言及］
１）寄託機関の名称及びあて名
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
２）寄託日
平成１９年１月１０日（原寄託日）
３）受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４
この細胞は癌転移研究及び予後マーカー、創薬ターゲット探索等を行ううえで有用な情報を与える可能性が高い。たとえばＤＮＡマイクロアレイやサブトラクション法などの遺伝子レベルでの解析に加えて、二次元電気泳動−質量分析といったタンパク質レベルでの詳細な解析を駆使することにより、高転移能や高浸潤能の獲得に特異的だと考えられる因子が同定される可能性が高い。また転移初期に変異する因子を捕らえることで、初発癌の発見と同時にその癌が転移性なのか予後予測ができるようになり、抗癌剤投与方法等の治療方針を立てる上で役立つ診断基準になる可能性が高い。新規予後マーカーとしての可能性だけではなく、同定された因子そのものが癌治療の標的分子になる可能性がある。転移細胞特異的に発現する因子が発見できれば、転移巣を形成する前の血中を漂っている播種性癌細胞をターゲッティングし、細胞死を誘導するドラッグデリバリーシステムの開発など創薬への貢献も大きい。さらに遺伝子レベル、タンパク質レベルなど様々な角度から転移現象を網羅的に解析することにより得た多くの情報は、転移のメカニズムを解明する糸口をいくつも提供すると考えられる。転移巣形成の分子メカニズムへの理解が深まれば、新しい癌治療戦略の発展にもつながる。
さらに、本発明は、ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子が導入されているＭＣＦ７由来細胞も提供する。このような細胞は、公知の遺伝子導入法又はそれに順ずる方法によって作製することができ、それぞれの遺伝子の表現型を種々の研究に利用することができて有用である。
また、本発明は、上述のＭＣＦ７由来細胞が移植された実験用動物をも提供する。このような実験用動物は、公知の方法又はそれに順ずる方法によって作製することができる。上述のように本発明に係るＭＣＦ７由来細胞は、高い浸潤能、転移能を有する上に移植能が高いことから、当該実験用動物は、乳癌モデルとして、転移や再発の研究等に有用である。尚、実験用動物としては、マウス、ラット、ハムスター類、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サル類、トリ類、魚類、両生類等を用いることができる。
また、本発明は、上述のＭＣＦ７由来細胞を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系を提供する。細胞を含むスクリーニング系は、公知の方法又はそれに順ずる方法で作製することができる。このスクリーニング系は、従来の乳癌の治療方法に感受性の低いＭＣＦ７由来細胞を含むので、浸潤阻害物質をスクリーニングすることができ、新規な乳癌の転移若しくは再発関連因子の発見や、新規な乳癌治療・予防薬の発見に寄与する有用なものである。
また、本発明は、上述のＭＣＦ７由来細胞を移植した実験用動物を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系を提供する。このような実験用動物を含むスクリーニング系は、公知の方法又はそれに順ずる方法で作製することができる。このスクリーニング系は、転移阻害物質をスクリーニングすることができる有用なものである。
また、本発明は、ＭＣＦ７細胞から高浸潤性または高転移能を獲得した変異細胞株を樹立するスクリーニング方法も提供する。当該方法は、ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種した後、該基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収しては再び基底膜調製物又はその類似物上に播種する工程を少なくとも７回繰り返すことを特徴とする。ＭＣＦ７由来細胞の浸潤性・転移性を向上させる方法としては、点突然変異を誘発するなど人工変異誘発剤を用いる方法もあるが、導入できる変異のパターンが有限であることから浸潤性が十分に高くすることができない。また、生体内では生じない変異が生じる可能性があることから、乳癌モデルとしては適さない場合もある。しかしながら、本発明のスクリーニング方法によれば、薬剤等によって変異を誘発しないで極めて高い浸潤性を有するＭＣＦ７由来細胞を得ることができ、乳癌モデルとして転移の発生のメカニズムや、転移能を獲得する初期ステージでの変化を捉える研究に有用に用いられる。基底膜調製物又はその類似物としては、例えば、マトリゲルを使用することができる。
【実施例】
【０００７】
以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
１．細胞培養
ＭＣＦ７細胞（Ｂｒｅａｓｔ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｈｕｍａｎ）は１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  ＢＩＯ社製）含有ＲＰＭＩ  １６４０（ＳＩＧＭＡ社製）培地で培養した。細胞は３日毎に公知の方法に従って継代した。
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ及び低浸潤能細胞から高浸潤細胞の樹立
図１に示すように、ＭＣＦ７細胞１４をマトリゲルインベージョンチャンバー１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）のセルカルチャーインサート１０に公知の方法に従って播種した。セルカルチャーインサート１０の底部は、メンブレン１２上にマトリゲル１３がコーティングされており、マトリゲル通過能を有する細胞１４のみがメンブレン１２の下側に移動する。６０時間後にメンブレン１２の下側に移動した細胞（浸潤細胞）をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収した。回収した細胞１４はディッシュ２でサブコンフルエントになるまで培養し、再びマトリゲルインベージョンチャンバー１に播種した。以上の操作を１４回繰り返し行った。またメンブレン１２の下側に移動した細胞はクリスタルバイオレット染色し、全体像を観察するとともに、顕微鏡下で５視野選択して、移動した細胞数を数えた。
結果を図２〜４に示す。図２はクリスタルバイオレット染色像、図３は１００倍の倍率で観察した顕微鏡像、図４は移動した細胞数を示している。ｃｏｎｔｒｏｌはＭＣＦ７細胞を、数字はマトリゲルを通過させた回数を示す。マトリゲル１３を通過した細胞を再びマトリゲル上に播種して通過させるというサイクルを１４回繰り返した結果、浸潤能の高い細胞群（ＭＣＦ７−１４細胞）を得られた。
図５にＭＣＦ７細胞とＭＣＦ７−１４細胞の位相差像を示す。ＭＣＦ７細胞（図５Ａ）とＭＣＦ７−１４細胞（図５Ｂ）を比較すると、ＭＣＦ７−１４細胞の方が丸みを帯びていた。また、ＭＣＦ７細胞はコンフルエントにすると剥離してしまうが、ＭＣＦ７−１４細胞はスフェロイドを形成し増殖し続けた。
３．細胞増殖曲線
ＭＣＦ７細胞とＭＣＦ７−１４細胞を９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで播種し１、２、３、４日後の細胞数をＭＴＴ法により計測した。
結果を図６に示す。縦軸は細胞数、横軸は培養日数を示す。ＭＣＦ７細胞とＭＣＦ７−１４細胞では、細胞増殖率には有意差はなかった。
４．Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  アッセイ
細胞の移動能を比較するために、Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  アッセイを行った。ＭＣＦ７細胞とＭＣＦ７−１４細胞を１０ｃｍディッシュでコンフルエントの状態まで培養し、マイクロピペットのチップで溝を作った。１、２、３、４日後の細胞の移動した様子（それぞれ３箇所の同一視野）を位相差顕微鏡で観察し、カメラで撮影した。細胞の移動度を調べるために、画像解析ソフトを用いて解析し、溝の幅を測定した。
結果を図７に示す。溝をつけてから０、１、２、３、４日後のＭＣＦ７細胞（図７Ａ）とＭＣＦ７−１４細胞（図７Ｂ）を比較すると、ＭＣＦ７−１４細胞の方が早く溝が埋まった。図７Ｃは、細胞が移動した距離の３視野の平均（％）を示す。図７Ｄ及び図７Ｅは、それぞれ、３日後のＭＣＦ７細胞及びＭＣＦ７−１４細胞の拡大像である。ＭＣＦ７−１４細胞（図７Ｅ）では、アクチンストレスファイバーが活発に伸びていた。
５．ザイモグラムによるＭＭＰ活性の検証
次に、ＭＣＦ７細胞及びＭＣＦ７−１４細胞における、マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性を測定した。ＭＭＰは、細胞外マトリックスを基質として分解する酵素であり、癌細胞の浸潤・転移形成に大きな役割を果たす。
１２ウェルプレートに、ＭＣＦ７細胞とＭＣＦ７−１４細胞を２．５×１０５細胞／ウェルの濃度で、マトリゲルを含まない通常の培地と、マトリゲルを含む培地に播種した。翌日、培地を５００μｌの無血清培地に交換し、１、２、３時間後に培地を回収した。回収した培地はＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）  ＹＭ３０（ミリポア社製）を用いて遠心濃縮した。濃縮した培地とサンプルバッファーを混合し、１０％ポリアクリルアミドゲルを用い、４□にて２５ｍＡで２時間電気泳動した。２．５％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００含有緩衝液を満たしたバットにゲルを入れ、室温で３０分間、ゆっくりと浸透しながらＳＤＳを取り除く作業を２回行なった。さらにゼラチナーゼ活性化溶液で３７□、２４時間インキュベーションした。その後ＣＢＢ染色液で３０分間染色し、さらに３０分間脱色液で脱色した。
図８にマトリゲルを含まない細胞培養用ディッシュで培養した場合の結果を、図９にマトリゲルインベージョンチャンバーで培養したときの結果を示す。各図Ａは、ザイモグラム法で用いたゲルの染色像であり、各図Ｂ及びＣは、それぞれ、画像解析ソフトにより解析してＭＭＰ９とＭＭＰ２の活性を測定した結果である。図示されるとおり、培地にマトリゲルを含まずに培養した状態でも、培地にマトリゲルを含み浸潤させながら培養した場合であっても、ＭＣＦ７−１４細胞の方が、活性型ＭＭＰの発現量が高かった。
６．オリゴマイクロアレイ
ＭＣＦ７細胞とＭＣＦ７−１４細胞から公知の方法に従ってＲＮＡを抽出し、公知の方法に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ  １３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）よる解析を行なった。その後、２倍以上変動した遺伝子と２倍以下の変動した遺伝子について“ｃａｎｃｅｒ”と“転移”に関与している遺伝子をＧｅｎｅ  ｓｐｒｉｎｇにより検索した。
結果を表１〜４に示す。２倍以上変動した１４９５遺伝子中、ｃａｎｃｅｒに関与している遺伝子は１３遺伝子（表１）、転移に関与している遺伝子は１３遺伝子（表２）であった。また、０．５倍以下に変動した１３６３遺伝子中、ｃａｎｃｅｒに関与している遺伝子は７遺伝子（表３）、転移に関与している遺伝子は０遺伝子であった。さらに乳癌に関与することが示唆された２３１遺伝子（非特許文献１を参照）のうち１４遺伝子の変動が確認された（表４）。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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７．ＧＦＰ発現安定株の作製
ＭＣＦ７細胞と樹立したＭＣＦ７−１４細胞に、公知の方法に従ってＧＦＰ発現プラスミドベクターを遺伝子導入し、約１週間ＧＦＰ発現細胞をスクリーニングした。クローニングリングを用いて３０クローンをクローニングし、約３週間、選択培地（４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＳＩＧＭＡ社製）添加培地）と維持培地（５０μｇ／ｍｌのＧ４１８添加培地）で繰り返し培養することでＧＦＰ発現安定株を樹立した。以下、それぞれ、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞と称する。
８．ウエスタンブロット解析
ＭＣＦ７細胞、ＭＣＦ７−１４細胞、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞から蛋白質を抽出し、２〜１５％の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲルを用いて公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。分離した蛋白質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、５％スキムミルクでブロッキング後に、抗ＨＥＲ２抗体、あるいは抗エストロゲンレセプター抗体と反応させた。さらにＨＲＰ架橋２次抗体と反応させ、ＥＣＬで検出した。
結果を図１０に示す。ＭＣＦ７細胞（レーン１）、ＭＣＦ７−１４細胞（レーン２）、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞（レーン３）、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞（レーン４）から抽出した蛋白質を用い、抗ＨＥＲ２抗体（上段）と抗ＥＳＴＲ抗体（下段）によるウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す。一般にＨＥＲ２の発現量が増大すると転移性が高く、ＥＳＴＲ発現量が増大すると悪性度が増す（転移性が高い）ことが知られているが、ＭＣＦ７−１４は逆の性質（ＨＥＲ２陰性、ＥＳＴＲ陽性）を示した。
９．細胞移植
ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）と樹立したＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞を最終濃度が８．６×１０７細胞／ｍｌになるようにグロースファクターリデューストマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）と１：１で混合し、移植細胞液を調製した。この移植細胞液  １００μｌを、図１１に示すように、ＢＡＬＢ／ｃＡＬｃｌ−ｎｕ／ｎｕ系統マウスのメスの第４乳腺に移植した。移植後、解剖時にＧＦＰ発現細胞の挙動を解析した。
移植４週間後のマウスを観察した結果を図１２に示す。図１２Ａ及びＣはＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞、Ｂ及びＤはＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞を移植したマウスであり、Ａ及びＢはマウス全体像、Ｃ及びＤはそれぞれＡ及びＢの蛍光観察像である。ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞では、移植部位に腫瘍を形成しているものの転移巣は観察されなかった。一方、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞は移植部位の原発腫瘍巣の形成に加えて、腹膜内へ播種しているＧＦＰ発現細胞の局在、及び腹部に比較的大きなＧＦＰ発現細胞の細胞塊が観察された。
１０．染色による転移の確認
移植４週間後の乳腺を摘出し、公知の方法に従って凍結切片を作製した。この切片を公知の方法に従って、ＨＥ染色及び抗ＧＦＰポリクローナル抗体、抗ＢＲＣＡ２モノクローナル抗体による免疫染色を行なった。
ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞及びＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植マウスの肺部位の全体像及び抗ＧＦＰ抗体で免疫染色した組織切片を観察した結果を図１３に示す。図１３中、Ａ、Ｃ及びＥはＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞、Ｂ、Ｄ、ＦはＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞に関するものであり、図１３中、Ａ、Ｂは肺の解剖像、Ｃ、Ｄは蛍光観察像、Ｅ、Ｆは凍結切片を抗ＧＦＰ抗体により免疫染色した結果である。図示されるように、マウス肺部位に腫瘍及びＧＦＰ発現細胞は観察されなかった。
図１４は、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞移植４週間後のマウスから摘出した乳腺の移植部位（Ａ、Ｃ）と近位リンパ節（Ｂ、Ｄ）を観察した結果を示す。ＡとＢはＨＥ染色、ＣとＤは抗ＧＦＰ抗体により免疫染色した結果を示す。ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞を移植したマウスの移植部位ではＧＦＰ発現細胞が多数観察されたが、乳腺リンパ節にはなく転移が起きていないことが観察された。
図１５は、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植４週間後のマウスから摘出した乳腺の移植部位（Ａ、Ｃ）と近位リンパ節（Ｂ、Ｄ）を観察した結果を示す。ＡとＢはＨＥ染色、ＣとＤは抗ＧＦＰ抗体により免疫染色した結果を示す。ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植マウスは移植部位、乳腺リンパ節の両方にＧＦＰ発現細胞が観察され、転移の予後予測マーカーでもある近位リンパ節転移が生じていることが観察された。
図１２で示されたＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植マウスの転移巣に関して、さらに詳しく調べるため、すい臓周辺部位を摘出して観察した結果を図１６に示す。図１６中、Ａはマウス全体像、Ｂは摘出したすい臓周辺の解剖像、ＣとＤはそれぞれＡとＢに相当する部位を蛍光観察した結果である。すい臓のリンパ節が肥大しており、ＧＦＰ発現細胞が多数局在していることが観察された。
さらに詳しく解析するために、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植マウスからすい臓部分の腫瘤（図１７Ａ，Ｂ）を摘出、凍結組織切片（厚さ６μｍ）を作製し、ＨＥ染色（図１７Ｃ）、メチルグリーンピロニン染色（図１７Ｄ）による明視野観察、およびＧＦＰの蛍光観察（図１７Ｅ）を行った。すい臓部分の腫瘤にＧＦＰの発光が観察されたことから、移植したＭＣＦ７−１４細胞の転移巣であると考えられた。
図１８に示したように、移植４週間後のＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞移植マウスから移植部（Ａ−Ｃ）を、移植４週間後のＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植マウスから移植部（Ｄ−Ｆ）およびすい臓部分の腫瘤（Ｇ−Ｉ）を摘出、凍結切片を作成し、上皮マーカーであるサイトケラチン７（ＫＲＴ７；Ａ，Ｄ，Ｇ）、ＫＲＴ１９（Ｂ，Ｅ，Ｈ）、ＫＲＴ２０（Ｃ，Ｆ，Ｉ）の免疫染色を行った。一次抗体として、マウス抗ＫＲＴ７モノクローナル抗体（ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１８−０２３４；希釈倍率５０倍）、マウス抗ＫＲＴ１９モノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ，ｓｃ−６２７８；５０倍）およびマウス抗ＫＲＴ２０モノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ，ｓｃ−５２３２０；５０倍）を用い、ブロッキングおよび増感試薬としてヒストファインマウスステインキット（ニチレイ）を、発色基質には３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＫＯ）を使用した。すい臓に認められた腫瘤に含まれる細胞の多くは、由来となるＭＣＦ７細胞のＧＦＰ導入株（ＭＣＦ７−ＧＦＰ）および移植したＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞と、同様の上皮マーカーの発現パターンを示したことから、乳腺に移植したＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞が転移し、転移巣を形成していることが確認された。
図１９は、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞移植１２週間後のマウスを観察した結果を示す。マウス腹部（Ａ、Ｂ）からすい臓周辺部位（Ｃ、Ｄ）を摘出し、さらには脳（Ｅ、Ｆ）を摘出した。Ａ、Ｃ、Ｅは解剖像、Ｂ、Ｄ、Ｆは蛍光観察像である。この結果からもすい臓付近リンパ節に直径１ｃｍ以上の転移腫瘍巣が観察され、脳においてもＧＦＰ発現細胞の局在が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明に係るＭＣＦ７由来細胞は、ＭＣＦ７細胞由来であるにもかかわらず、高い浸潤能を有し、または、高い転移能を有する。このような変異は、薬剤等を使用せず、自然に近い環境で誘発されたものであるため、転移の発生のメカニズムや、本発明に係るＭＣＦ７由来細胞は、転移能を獲得する初期ステージでの変化を捉え、転移や再発等の予後予測マーカーを探索する研究に好適に利用されるものであり、浸潤・転移特異的因子の探索や、癌転移性及び予後予測用診断キット開発にも利用されうるものである。
また、従来の癌転移研究においては、様々な人種や多様な疾患症状由来の組織、あるいはそれらの組織から派生した細胞株を対象としているため、非常に多くの原因因子を発見することはできたものの、共通に存在しマーカーとなりうる因子を同定することは困難であった。しかしながら、本発明のＭＣＦ７由来細胞を用いれば、同一の遺伝的背景をもつ細胞株から派生した亜細胞株を比較することで、精度の高いマーカーのスクリーニングができる可能性が高く、マーカーだけではなく同定因子そのものが創薬ターゲットになる可能性も高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月1日(2008.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＦ７細胞に由来する細胞であって、ＭＣＦ７細胞に比較して有意に高い浸潤能および転移能を有し、かつ下記の性質を有する、ＭＣＦ７由来細胞。
（１）ＨＥＲ２陰性である。
（２）ＥＳＴＲ陽性である。
（３）ＣＤ４４遺伝子の発現量が、ＭＣＦ７細胞の１．５倍以上である。
（４）スフェロイドを形成する。
（５）実験用動物に移植した場合、移植部位に原発腫瘍巣を形成する能力を有する。
（６）実験用動物に移植した場合、近位リンパ節、遠隔リンパ節、又は脳に転移巣を形成する能力を有する。
（７）ＭＣＦ７細胞に比較して活性型ＭＭＰの発現量が高い。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種し、該基底膜調製物又はその類似物を通過するように変異した細胞を回収することによって得られる、請求項１に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項１０】
ＭＣＦ７−１４細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４）である、ＭＣＦ７由来細胞。
【請求項１１】
ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子が導入されている、請求項１、９および１０のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞。
【請求項１２】
請求項１、および９から１１のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞が移植された実験用動物。
【請求項１３】
請求項１、および９から１１のいずれか１項に記載のＭＣＦ７由来細胞を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系。
【請求項１４】
請求項１２に記載の実験用動物を含む、癌転移若しくは再発関連因子又は抗癌剤のスクリーニング系。
【請求項１５】
ＭＣＦ７細胞から、高浸潤能および高転移能を獲得した変異細胞株を樹立する方法であって、ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種した後、該基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収しては再び基底膜調製物又はその類似物上に播種する工程を少なくとも７回繰り返すことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
ＭＣＦ７細胞を基底膜調製物又はその類似物上に播種した後、該基底膜調製物又はその類似物通過能を有する細胞を回収しては再び基底膜調製物又はその類似物上に播種する工程を少なくとも７回繰り返すことにより得られる、ＭＣＦ７由来細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
は、高い転移能を獲得する変異を有している。本発明において「有意に高い転移能を有する」とは、細胞の転移能を評価する種々の方法のうちいずれかの方法によって求めた転移能が、ＭＣＦ７細胞の転移能よりも統計的に有意に高いことを意味する。また、例えば、細胞を実験用動物に移植した場合に、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上の個体において近接するリンパ節への転移が見られることを、転移能が高いということができる。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、ＨＥＲ２陰性であることを特徴とする。ここで、「ＨＥＲ２陰性」とはＨＥＲ２タンパク質が標準的なウエスタンブロッティング法での検出限界以下であることを言う。ＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質は高い転移能力を持つ乳癌由来の悪性腫瘍では高い発現が認められることが多く、診断及び治療法の決定にしばしば用いられている腫瘍マーカーである。本発明のＭＣＦ７由来細胞は高浸潤能・高転移能を有するにも関わらず、転移能に関連するＨＥＲ２陰性であることから、ｔｒａｓｔｕｚｍａｂに対する感受性の低い乳癌患モデルとして、転移や再発の研究に利用できる可能性が高いことが示唆される。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、高浸潤能または高転移能を有するにも関わらず、ＥＳＴＲ陽性である。ここで、ＥＳＴＲはエストロゲン受容体のことであり、「ＥＳＴＲ陽性」とは標準的なウエスタンブロッティング法で明確なバンドが検出可能であることを言う。このように、ＥＳＴＲ陽性であることから、ホルモン治療に対しても高い感受性を示すものと考えられ、本発明のＭＣＦ７由来細胞が、ホルモン治療に対する感受性の高い乳癌モデルとして、転移や再発の研究に利用できる可能性が高いことが示唆される。
また、本発明のＭＣＦ７由来細胞は、ＣＤ４４遺伝子、ＣＸＣＬ１２遺伝子、ＰＬＡＵ遺伝子、及びＶＥＧＦ遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量が、ＭＣＦ７細胞の１．５倍以上である。遺伝子
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
７．ＧＦＰ発現安定株の作製
ＭＣＦ７細胞と樹立したＭＣＦ７−１４細胞に、公知の方法に従ってＧＦＰ発現プラスミドベクターを遺伝子導入し、約１週間ＧＦＰ発現細胞をスクリーニングした。クローニングリングを用いて３０クローンをクローニングし、約３週間、選択培地（４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＳＩＧＭＡ社製）添加培地）と維持培地（５０μｇ／ｍｌのＧ４１８添加培地）で繰り返し培養することでＧＦＰ発現安定株を樹立した。以下、それぞれ、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞と称する。
８．ウエスタンブロット解析
ＭＣＦ７細胞、ＭＣＦ７−１４細胞、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞から蛋白質を抽出し、２〜１５％の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲルを用いて公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。分離した蛋白質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、５％スキムミルクでブロッキング後に、抗ＨＥＲ２抗体、あるいは抗エストロゲンレセプター抗体と反応させた。さらにＨＲＰ架橋２次抗体と反応させ、ＥＣＬで検出した。
結果を図１０に示す。ＭＣＦ７細胞（レーン１）、ＭＣＦ７−１４細胞（レーン２）、ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞（レーン３）、ＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞（レーン４）から抽出した蛋白質を用い、抗ＨＥＲ２抗体（上段）と抗ＥＳＴＲ抗体（下段）によるウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す。一般にＨＥＲ２の発現量が増大すると転移性が高く、ＥＳＴＲ発現量が減少すると悪性度が増す（転移性が高い）ことが知られているが、ＭＣＦ７−１４は逆の性質（ＨＥＲ２陰性、ＥＳＴＲ陽性）を示した。
９．細胞移植
ＭＣＦ７−ＧＦＰ細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）と樹立したＭＣＦ７−１４−ＧＦＰ細胞を最終濃度が８．６×１０７細胞／ｍｌになるようにグロースファク
【国際調査報告】
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