(57)【要約】  生体内での肝機能を再現することができる肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法を提供すること。本発明に係る肝細胞培養容器１０は、表面に複数のマイクロ容器１１を有する肝細胞培養容器１０であって、マイクロ容器１１の底部面積が０．０１〜０．１ｍｍ２であり、マイクロ容器１１を構成する側壁１３の高さが２５〜１５０μｍあるものである。また、マイクロ容器１１の底部形状が等方的であって、長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に複数のマイクロ容器を有する肝細胞培養容器であって、前記マイクロ容器底部面積が０．０１〜０．１ｍｍ２であり、前記マイクロ容器の深さが２５〜１５０μｍであり、肝細胞を培養することを特徴とする肝細胞培養容器。
【請求項２】
前記マイクロ容器底部の長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の肝細胞培養容器。
【請求項３】
前記マイクロ容器水平面を基準面とした前記マイクロ容器を構成する側壁の高さ方向の上部５０％以上において、水平面と該側壁の各側面がなす角度が８０°〜９０°であることを特徴とする請求項１または２に記載の肝細胞培養容器。
【請求項４】
前記マイクロ容器が隣接するマイクロ容器の少なくとも１つと連通していることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項に記載の肝細胞培養容器。
【請求項５】
前記マイクロ容器が隣接するマイクロ容器の少なくとも１つと連通するための開口部の幅が１〜２５μｍであることを特徴とする請求項４記載の肝細胞培養容器。
【請求項６】
前記マイクロ容器が設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項に記載の肝細胞培養容器。
【請求項７】
前記表面処理により形成される積層膜が２層以上であり、少なくとも１層が無機膜であり、少なくとも１層が有機膜であることを特徴とする請求項６に記載の肝細胞培養容器。
【請求項８】
前記マイクロ容器が設けられた領域が透明であることを特徴とする請求項１〜７いずれか１項に記載の肝細胞培養容器。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の肝細胞培養容器に設けられた前記マイクロ容器に肝細胞を注入して、前記肝細胞を培養する肝細胞培養方法。
【請求項１０】
前記マイクロ容器で培養する肝細胞が集積し、肝細胞塊を形成することを特徴とする請求項９に記載の肝細胞培養方法。
【請求項１１】
前記肝細胞塊の直径が３０〜２００μｍであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の肝細胞培養方法。
【請求項１２】
前記肝細胞の播種密度が１．０×１０４〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の肝細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。【０００３】
単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿や試験管のなかで細胞培養が行われる。この培養細胞を用いて、種々の検査が行われる。細胞培養試験に用いられる細胞培養株には、生体内での試験いわゆるin vivo試験と同様の薬剤感受性、毒性反応を示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器の表面で規則性を有して配列された細胞間のネットワークを構築できることが必要とされる。また、細胞培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、細胞の生存率及び増殖速度の向上が望まれている。【０００４】
上記細胞培養試験は、同一条件下、評価する薬物等の量、濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、細胞培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。この細胞培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられる。ウェルプレートには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレート又はシャーレがある。これらは、一般に、プレート全体の大きさはほぼ同じであり、ウェル数が大きくなるほど、１ウェルのサイズが小さくなる。この１ウェルが１培養皿に相当する。また、最近の微量化への流れから、さらに小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。これらの培養皿の底部は平坦な平板状であり、この底面を培養面として用いている。【０００５】
しかしながら、組織細胞の培養に、従来の細胞培養容器を用いると、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となる。また、細胞培養容器の表面にランダムに配置されるため、細胞間のネットワークは、複雑に交錯して形成される。そのため、生体内での細胞機能を再現できないという問題があった。例えば、肝細胞では肝機能を維持することで知られるスフェロイド状の肝細胞塊を形成しない。【０００６】
上記問題を解決するため、平板状の培養面に特殊な高分子を固定化する方法（特許文献１参照）、特殊な装置を使用する方法（特許文献２参照）などが開示されている。
【特許文献１】特許第３１７７６１０号公報
【特許文献２】特開平７−７９７７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、固定化方法が煩雑で安定的に製造できず、高コストとなる問題があった。他方、特許文献２に記載の方法では、培養方法が複雑であるのに関わらず、スフェロイドの形成効率が悪く、高コストになる等の問題があった。【０００８】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、生体内での肝機能を再現することができる肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
係る目的を達成するために、本発明に係る肝細胞培養容器は、表面に複数のマイクロ容器を有する肝細胞培養容器であって、前記マイクロ容器底部の面積が０．０１〜０．１ｍｍ２であり、前記マイクロ容器の深さが２５〜１５０μｍであるものである。前記マイクロ容器底部の、長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることが好ましい。前記マイクロ容器底部の形状が円又は正多角形等の等方的であることがより好ましい。【００１０】
また、前記マイクロ容器水平面を基準面とした前記側壁の高さ方向の上部５０％以上において、水平面と該側壁の各側面がなす角度が８０°〜９０°であることが好ましい。【００１１】
さらに、前記マイクロ容器が隣接するマイクロ容器の少なくとも１つと連通しており、そのための開口部の底面幅が１μｍ〜２５μｍであることが好ましい。【００１２】
また、前記マイクロ容器が設けられた領域に表面処理が行われており、前記表面処理により形成される積層膜が２層以上であり、少なくとも１層が無機膜、少なくとも１層が有機膜であることが好ましい。さらに、その領域が透明であることが好ましい。【００１３】
本発明に係る肝細胞培養方法は、上記の肝細胞培養容器において、肝細胞培養容器に設けられた前記マイクロ容に細胞を注入して、前記細胞を培養するものである。また、前記肝細胞培養方法によれば、前記マイクロ容に培養する細胞が集積し、細胞塊を形成する。この細胞塊の直径が３０〜２００μｍとなることを特徴とするものである。【００１４】
前記細胞の播種密度が１．０×１０４〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体内での肝機能を再現することができる肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１に係る肝細胞培養容器の構成を示す平面図である。
【図２】実施例１に係る肝細胞培養容器の構成を示す断面図である。
【図３】実施例２に係る肝細胞培養容器の構成を示す平面図である。
【図４】実施例２に係る肝細胞培養容器の構成を示す断面図である。
【図５】実施例２に係る肝細胞培養容器での肝細胞培養塊の光学顕微鏡像である。
【図６】比較例１に係る肝細胞の光学顕微鏡像である。
【符号の説明】
【００１７】
１０  肝細胞培養容器
１１  マイクロ容器
１２  側壁
１３  開口部
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に係る肝細胞培養容器には凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器が形成されている。これにより、生体内と同様な立体的な細胞生育が可能であることに加え、各マイクロ容器内において、ばらつき無く細胞が凝集した形態で培養できる。また、マイクロ容器は、例えば、マイクロ容器を仕切る側壁（凸部）の高さを最適化することで、凝集した肝細胞塊をマイクロ容器内のみで培養することができる。【００１９】
側壁により囲まれたマイクロ容器の寸法は、細胞を培養するために最適な範囲とする必要である。マイクロ容器の底部面積が大きすぎると、平板上での培養と同様、細胞は薄く伸び、立体構造とならない。一方、マイクロ容器の底部面積が小さすぎると、細胞を収容できなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、一又は複数個が収容できる範囲とすることが好ましい。細胞が複数個集積した肝細胞塊を形成させる場合、その肝細胞塊が収納できる範囲とすることが好ましい。【００２０】
側壁の高さは、マイクロ容器で培養する細胞を隣接するマイクロ容器へ移動させないために最適な範囲とする必要である。側壁の高さが低すぎると、細胞が側壁を乗り越えてしまい、培養に適さない。側壁の高さが高すぎると、作製が困難な上、物質拡散がしにくくなり培養環境が悪化してしまう。従って、側壁の高さは、細胞種に応じて、マイクロ容器内に配置された培養細胞を、そのマイクロ容器内において安定的に培養し続けられる範囲とすることが好ましい。【００２１】
また、側壁に開口部を設け、複数のマイクロ容器を連通した構造とするにより、細胞への酸素や栄養分の供給及び細胞からの老廃物の除去を効率良く行うことができる。なお、培養する細胞種に応じ、側壁の高さ、マイクロ容器寸法、開口部の幅を適宜設定することにより、多様な培養系に適用することもできる。【００２２】
実施の形態
以下に、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。【００２３】
実施の形態に係る肝細胞培養容器の構成について図１、２を用いて説明する。図１は、本実施の形態に係る肝細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図２は図１のＸ−Ｘ'断面図である。図１に示すように、肝細胞培養容器１０はマイクロ容器１１、側壁１２、開口部１３を備える。肝細胞培養容器１０の培養面には、複数の側壁１２が網目状に形成されており、この側壁１２に四方を囲われた空間がマイクロ容器１１となる。また、各マイクロ容器１１の四辺に形成された側壁１２の各辺の中央部に、開口部１３が形成されている。【００２４】
図１において、マイクロ容器１１の底部の幅ａ、マイクロ容器１１を区画するための側壁１２の幅ｂ、高さｃ、隣接するマイクロ容器１１が互いに連通するための開口部１３の幅ｄを示した。本発明における底部面積とは、マイクロ容器開口水平面（側壁１２上面と同一面）に垂直方向に上方から容器底へ平行光を照射した際の投影面積のことをいう。例えば、マイクロ容器の底がＵ字形状である場合、その開口面に垂直方向な上方より底に入射した平行光が投影する形状が底部面積となる。投影底部の長径及び短径とは、円及び楕円の場合、その重心を通る長軸及び短軸と円周との交点の各軸上の距離を長径及び短径といい、多角形の場合、その多角形の面積との差が最小となり各頂点を通る外挿円又は外挿楕円の長径および短径をいい、各頂点を通る外挿円又は外挿楕円を描けない場合は、最も多くの頂点を通る近似円又は楕円の長径および短径をいう。【００２５】
マイクロ容器１１の底部形状は特に制限されるものではなく、正方形、円、多角形以外にも種々の形状を採用することができる。生体内での肝機能を再現する細胞培養には、この底部面積は０．０１ｍｍ２〜０．１ｍｍ２が好ましい。また、底部の長径が短径の１〜１．５倍であることが好ましい。さらに、等方的形状が好ましく、正方形であれば、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、一辺の長さが１００μｍ〜３００μｍが好ましい。【００２６】
マイクロ容器１１の水平面と側壁１２とがなす角度は、細胞が乗り上げない角度でなければならないため、側面の上部から５０％以上の部分は８０〜９０°が好ましく、特に、８５°〜９０°であることが好ましい。【００２７】
側壁１２の高さｃは、マイクロ容器１１で培養する細胞が乗り上げ隣接するマイクロ容器１１へ移動しなければよく、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、５０μｍ〜１５０μｍが好ましい。【００２８】
隣接するマイクロ容器１１を互いに連通するための開口部１３の幅ｄは、培養細胞が最初に播種されたマイクロ容器１１から隣接するマイクロ容器１１に移動できない程度であればよい。例えば、培養細胞の相当直径が２０μｍであれば、５〜１５μｍであることが好ましい。なお、開口部１３は必須ではなく、図３及び図４に示すように、マイクロ容器１１の四辺が側壁１２により完全に囲まれていてもよい。ここで、図３は、本実施の形態に係る他の肝細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図４は図３のＹ−Ｙ'断面図である。【００２９】
本発明の肝細胞培養容器上の凹凸パターンを作製する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等の方法が挙げられる。肝細胞培養容器の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。【００３０】
モールドを用いて転写成形方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で凹凸パターンを形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で樹脂へ凹凸パターンに再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。【００３１】
上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択すればよい。【００３２】
上記で得られた金属構造体を型として用いて樹脂へ凹凸パターンを成形する方法としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができる。生産性及び型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。【００３３】
本発明の肝細胞培養容器を構成する材料としては、自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞視認性の観点から、透明な合成樹脂を材料とすることが好ましい。透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体等のアクリル系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸等のエステル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。【００３４】
本発明の肝細胞培養容器は、容器表面の親水性、生体適合性、細胞親和性等を向上させることを目的として、凹凸パターン表面側に表面処理を行い、改質層及び／又はコーティング層が配されていてもよい。上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。またコーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティング等の方法が挙げられる。凹凸パターン上には、気泡の混入することなく培養液を注入するために親水性を付与することが望ましく、均一な親水性膜を形成させる方法として、無機蒸着が好ましい。【００３５】
また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。コラーゲン水溶液等を均一にコートするために、上述の親水性膜を形成させた後、コートすることが好ましい。通常、肝細胞培養においては、生体内環境を模倣して細胞外マトリックス表面での培養が望ましいため、上記のように均一な親水性無機膜を配した後に、培養細胞に適した細胞外マトリックスからなる有機膜を配することが特に好ましい。【００３６】
本発明の肝細胞培養方法は、細胞を培養するマイクロ容器のみに細胞を配置させ、その空間内で生体内に類似した形態や機能を発現させるため、適切な細胞数を播種する必要があり、細胞播種密度１．０×１０４〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２が好ましい。例えば、マイクロ容器が正方形で、１辺が２００μｍの場合、５．０×１０４〜５．０×１０５細胞／ｃｍ２が好ましい。このような条件のもと、直径が３０〜２００μｍに及ぶ肝細胞塊を得ることができる。
【実施例】
【００３７】
次に本発明に係る肝細胞培養容器の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００３８】
＜肝細胞の調製＞
培養に用いる初代ラット肝細胞は以下のように調製した。６週齢のウィスター系マウスの門脈にサーフロー留置針を挿入し、ＥＤＴＡ含有溶液を流して脱血液を行った後、コラゲナーゼ溶液を還流した。その後、コラゲナーゼ溶液で処理された肝臓を培養液へ入れ、メスピペットによるピペッティングで肝細胞を分散させた。肝細胞懸濁液を３回洗浄し、肝細胞以外の細胞を除去し、単離した肝細胞を培養に用いた。【００３９】
＜培養方法＞
培養に用いる培養液は以下のように調製した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％  ウシ胎児血清、１ｕｇ／ｍｌ  インシュリン、１×１０−７Ｍ  デキサメタゾン、１０ｍＭ  ニコチンアミド、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μｍ  β−メルカプトエタノール、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５９ｕｇ／ｍｌ  ペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、２５ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを添加した。凹凸パターン基材上に、１．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で肝細胞を播種し、５％ＣＯ２、３７℃で所定時間培養した。また、同組成の新鮮培地０．５ｍＬを用い、１日から２日毎に培地交換を行った。【００４０】
側壁上面の接着細胞数は、所定時間経過後の写真にて評価した。なお、アンモニア代謝能等の評価で用いた細胞数は、トリパンブルーにて染色を行い、染色されていない生細胞数をカウントした。【００４１】
アンモニア代謝能は、０．４％塩化アンモニウム水溶液を培養液へ添加し、２４時間後の液中のアンモニウムイオン濃度を測定することで評価した。【００４２】
［実施例１］
図１に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍ、ｄ＝１０μｍのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターン基材を得た。その凹凸基材上で肝細胞を培養した。【００４３】
［実施例２］
図３に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターン基材を得た。その凹凸基材上で肝細胞を培養した。【００４４】
［比較例１］
市販（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標））のγ線滅菌済み平面状２４ウェル培養プレートを用い、肝細胞を培養した。【００４５】
表１に、細胞播種後３日目の実施例１、実施例２及び比較例１における接着細胞数及び５日目の肝細胞塊の直径、３日目のアンモニア代謝能の測定結果を示す。比較例１に係る肝細胞培養容器の底部は平板状であり、側壁１２が形成されていないため、底部細胞数は最も多かった。しかしながら、図５に示すように、実施例１及び２では、各マイクロ容器の中央部に、肝細胞塊を形成したのに対し、図６に示すように、比較例１では、肝細胞塊を形成しなかった。細胞播種後３日目のアンモニア代謝能では、比較例１に比較して、実施例１及び実施例２は高い代謝能を示した。中でも、隣接するマイクロ容器１１を連通する開口部１３を有する実施例１に係る肝細胞培養容器が最も高い代謝能を示した。
【表１】
2008130025.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、肝細胞を培養する肝細胞培養容器に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2008130025.tif 000011
2008130025.tif 000012
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