【手続補正書】
【提出日】平成16年11月15日(2004.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象牛における牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）を検出する方法であって、多形性マイクロサテライトマーカーＢＭ４１２９およびＢＭＳ１２６６によって挟まれ、これらを包む領域中の牛染色体ＢＴＡ３上に位置する、牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を同定するものであり、下記：
ａ）牛遺伝子材料を準備すること、
ｂ）該遺伝子材料において、牛複合脊椎奇形病特性に連鎖する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在または不存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、約５９.５ｃＭ〜約６７.９ｃＭの領域に位置する、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＢＭＳ９３７に挟まれ、これらを含む領域中に位置する、請求項２の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、多形性マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３とＩＬＳＴＳ０２９に挟まれ、これらを含む領域中に位置する、請求項３の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３である、請求項１の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ２７９０である、請求項１の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９である、請求項１の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡ１２３である、請求項１の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭ２２０である、請求項１の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＨＵＪ２４６である、請求項１の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ８６２である、請求項１の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、マイクロサテライトマーカーＢＭＳ９３７である、請求項１の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子に連鎖している、請求項１の方法。
【請求項１４】
牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子が、牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
牛ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む牛ＳＬＣ３５Ａ３タンパク質をコードする、請求項１４の方法。
【請求項１６】
牛ＳＬＣ３５Ａ３タンパク質が、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ配列によりコードされる、請求項１５の方法
【請求項１７】
遺伝子マーカーが、配列番号１８のヌクレオチド５５９に等価の位置での単一ヌクレオチド多形性である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
単一ヌクレオチド多形性が、Ｇ／Ｔ多形性である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
Ｇ／Ｔ多形性の検出が、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ミニシークエンス、プライマー伸長法、ピロシークエンス、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、遺伝子特異的ローリングサイクル増幅法およびプライマー伸長法に続くＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析よりなる群から選ばれる技法により行われる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの遺伝子マーカーが、牛複合脊椎奇形病を起こす遺伝子または疾患特性に、少なくとも５.０、少なくとも６.０、少なくとも７.０、少なくとも８.０、少なくとも９.０、少なくとも１０.０、少なくとも１１.０、少なくとも１２.０を含む少なくとも４.０などの少なくとも３.０のロッドスコアーで遺伝的に連鎖している、請求項１の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのマーカーが、遺伝子マーカーの組合せである、請求項１の方法。
【請求項２２】
マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡＡ００３を増幅するためのプライマー対が、配列番号１および配列番号２である、請求項５の方法。
【請求項２３】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ２７９０を増幅するためのプライマー対が、配列番号３および配列番号４である、請求項６の方法。
【請求項２４】
マイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９を増幅するためのプライマー対が、配列番号５および配列番号６である、請求項７の方法。
【請求項２５】
マイクロサテライトマーカーＩＮＲＡ１２３を増幅するためのプライマー対が、配列番号７および配列番号８である、請求項８の方法。
【請求項２６】
マイクロサテライトマーカーＢＭ２２０を増幅するためのプライマー対が、配列番号９および配列番号１０である、請求項９の方法。
【請求項２７】
マイクロサテライトマーカーＨＵＪ２４６を増幅するためのプライマー対が、配列番号１１および配列番号１２である、請求項１０の方法。
【請求項２８】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ８６２を増幅するためのプライマー対が、配列番号１３および配列番号１４である、請求項１１の方法。
【請求項２９】
マイクロサテライトマーカーＢＭＳ９３７を増幅するためのプライマー対が、配列番号１５および配列番号１６である、請求項１２の方法。
【請求項３０】
牛複合脊椎奇形（ＣＶＭ）に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの対象牛における存在を検出するために使用する診断キットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８およびこれらの組合せよりなる群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
実施例
実施例１
複合脊椎奇形のゲノムマッピング(ＣＶＭ)
この実施例は、牛染色体 ＢＴＡ３に対するＣＶＭ遺伝子座の局在化を示す。さらに、この実施態様は、ＣＶＭ遺伝子座に連鎖したマーカーの同定、すなわち、牛染色体ＢＴＡ３のＣＶＭ領域に関する特徴付与を説明するものである。
【００５３】
ＣＶＭに関与する座をマッピングするために、サンプルを育種研究に関係のある動物から得た。要約すると、雄牛Ｔ Ｂｕｒｍａの系統であり、雄牛ＫＯＬ Ｎｉｘｏｎ由来の精液で人工受精した約３００の乳牛および若い雌牛を、育種研究に選択した。１３頭の罹患子牛を、Agerholm et al., 2000に記載のような剖検を基に選択した。これら１３頭の子牛と両親、全２８頭の動物を最初のゲノムスキャンに用いた。子牛を、共通の祖先、純系雄牛のエリートＵＳホルスタイン(Carlin-M Ivanhoe Bell)に対する４世代に分けた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
表３
ＣＶＭ座および牛染色体３のマーカーの連鎖解析からの２点ロッドスコアー(Ｚ)および組換え画分(θ)
【表３】
2004519219.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
上記の結果は、ＣＶＭ座をＵＳＤＡゲノムマップ(Kappes et al., 1997)によるＢＴＡ３(図２)に対して位置づける。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
●１１頭の子牛は、ＩＮＲＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭＳ８６２およびＨＵＪ２４６によって明確にされるインターバルについてホモ接合体であり、一方、ＢＭＳ２７９０およびＩＬＳＴＳ０２９のみが、図１に示した全１３頭の子牛においてホモ接合体であった。これらのマーカーのハプロタイプを構築することが可能となり、殆ど同じようなＣＶＭハプロタイプであると推定した(図１)。ハプロタイプを１からＮの数字をつけたマーカーの対立遺伝子のサイズによって定義した。ここで、１は増幅マーカーの最も短い対立遺伝子を定義し、Ｎは最も長い対立遺伝子と定義する。ＢellにおけるＣＶＭ関連対立遺伝子の実際の長さは下記の通りである： 
ＩＮＲＡ００３ (対立遺伝子番号３): １７６塩基対
ＢＭＳ２７９０ (対立遺伝子番号３): １１８塩基対
ＩＬＳＴＳ０２９ (対立遺伝子番号２): １６４塩基対
ＢＭＳ８６２ (対立遺伝子番号１): １３０塩基対
ＨＵＪ２４６ (対立遺伝子番号３): ２６２塩基対
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
１７頭の子牛およびその母牛を、８つのマーカー：ＩＮＲＡ００３、ＢＭＳ２７９０、ＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭ２２０、ＩＮＲＡ１２３、ＢＭＳ８６２、ＢＭＳ９３７、ＨＵＪ２４６を用いて遺伝子型を決定した。これらは、ＢＴＡ３上の約５９.５ｃＭ〜６７.９ｃＭの領域にある。そして最初の育種研究と同じように別の１７頭の子牛のＣＶＭ遺伝子が共通の祖先雄牛Ｂellから生じると想定できるので、系統(ＩＢＤ)による同一性に関する類似領域を、全ての罹患子牛中に存在すると考えた。また、これは、次ぎの事象でもわかる。１７頭の子牛中の１７頭でＩＮＲＡ００３およびＢＭＳ２７９０で明確にされる染色体分節が同型ホモ接合体であり、育種研究由来の動物と同一対立遺伝子を共有している。１９頭の動物のうち２頭において、ヘテロ接合体は、ＢＭＳ２７９０およびＩＬＳＴＳ０２９間の１つの組換え事象によって説明されるＩＬＳＴＳ０２９およびＢＭＳ８６２座で観察された。即ち、組み合わせた遺伝子型決定の結果を基に、ＣＶＭ遺伝子欠損が、図２に示したようなマーカーＩＮＲＡ００３およびＩＬＳＴＳ０２９に挟まれ、そして「ＣＶＭ領域」と表示した６ｃＭ以下のインターバル中に位置する可能性が最も高いことを見出した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
実施例２
ＣＶＭキャリアーを同定するための診断試験:
ＣＶＭの牛キャリアーを決定するための診断試験を、Ｂellからの子孫が疾患関連ハプロタイプのキャリアーであるかどうかを決定することによって確立した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
連鎖ＤＮＡマーカーを基にした全ての診断用遺伝子試験のように、このＣＶＭ試験は、二重組換え事象 (遺伝子とフランキングマーカーとの原因遺伝子の各サイドで１つの事象)が検出できないという欠点がある。本ケースでは、この事象は、マーカーとＣＶＭ遺伝子との堅い連鎖のために非常に稀であるので、該試験の信頼性を９９％以上であると推定
する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
タッチダウンＰＣＲ反応は、９５℃で２分間の初期熱活性化ステップに続いて、９５℃３０秒間の変性、７０℃、３０秒間(０.５℃減少率) のアニーリングおよび７２℃で２０秒間の伸長を１０サイクル、さらに９５℃で３０秒間の変性ステップ、５７℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長ステップを含む３０サイクル、からなる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
実施例６
配列決定によるＣＶＭの決定:
ＰＣＲ反応(２μlの精製鋳型/サンプルゲノムＤＮＡ、１０ｘＰＣＲ緩衝液（２μｌ）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２(２μｌ)、３.３μｌの０.２ｍＭの各ｄＮＴＰ(Ultrapure dNTP, 27-2033-01; Amersham Pharma-cia Biotech)、６pmolのプライマー (フォワード: ＣＢ
ＦＥＸ１, ５'-ＧＧＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＴＴ ＣＴＣ-３' (配列番号３１); リバース: ＣＢＴＥＸＲ, ５'-ＧＴＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ＴＴＣ ＴＴＡ-３') (配列番号３２)、０.１６５ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ (Biotaq, M95801B; Bioline)、ｄＨ2Ｏ の添加で全容積)を、Primus HT (MWG Biotech AG)を用いて、９６ウェルプレートにおいて油不含で行った。サイクル条件: ９５℃で１２０秒、３５ｘ[９５℃６０秒、６０℃３０秒、７２℃１１０秒]。反応後の清浄化を、最終のサンプル溶出のためにｄＨ2Ｏ(５０μｌ)を用いて、製造者推奨の説明に従って、Sephadex G-50 Superfine (17-0041-01, Amersham Pharmacia Biotech)を用いてゲルろ過(Millipore Filtration System)を行った。フォワードおよびリバース配列決定反応を、ＰＣＲ産物［２μｌのＰＣＲ産物、８μｌのSequencing Mix、０.６μｌの６pmol プライマー(上記参照)］、ｄＨ２Ｏを２０μｌ添加; DYEnamic ET Dye Terminator Sequencing Kit (US81095)の生成に使用したものと同じプライマーで行った。熱サイクル(３０ｘ [９５℃２０秒、５５℃１５秒、６０℃７０秒])後、サンプルを、上記記載のように主にゲルろ過によって清浄にし、LPA long-read matrixと下記シークエンス条件：３ｋＶで９０秒の注入、９ｋＶで３５分間の実施時間を用いて、MegaBACE1000 (Amersham Pharmacia Biotech)で分析した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
（図面の簡単な説明）
図１は、牛複合脊椎奇形(ＣＶＭ)座および牛染色体３上で５つのマイクロサテライトマーカーのハプロタイプを位置付けるのに使用した系統を示す。ほぼ確実なＣＶＭハプロタイプは太字である。黒四角は罹患子牛を示す。父系と母系の間の二重線は同系交配ループを示す。Ｎは動物の数を示す。１３頭の異なる母系の遺伝子型は簡素化のために示していない。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
図２は、牛染色体３の遺伝子マップを示す。側面の数は、染色体と共にセンチモルガン(centiMorgan)(ｃＭ)で与えられる遺伝子距離を示す。牛複合脊椎奇形(ＣＶＭ) 座のほぼ確実な位置を示した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
図６は、配列決定によってＣＶＭ状態の決定において５５９位でＧ/Ｔ多形性を示す領域(ＳＬＣ３５Ａ３のヌクレオチド５４４から５７２)（図４を参照）の配列決定から得た結果を示す。左および右パネルは、フォワードおよびリバース配列を各々示す。上欄（−／−)は、野生型動物の配列を示し、中欄は、キャリアー(ヘテロ接合体)の配列を示し、下欄は、罹患動物の配列を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
【図１】図１は、牛複合脊椎奇形(ＣＶＭ)座および牛染色体３上で５つのマイクロサテライトマーカーのハプロタイプを位置付けるのに使用した系統を示す。ほぼ確実なＣＶＭハプロタイプは太字である。
【図２】図２は、牛染色体３の遺伝子マップを示す。側面の数は、染色体と共にセンチモルガン(centiMorgan)(ｃＭ)で与えられる遺伝子距離を示す。牛複合脊椎奇形(ＣＶＭ)座のほぼ確実な位置を示した。
【図３】図３は、U.S. Meat Animal Research Center (Kappes et al. 1997)によって説明されたように、牛染色体３上にの３つのマイクロサテライトマーカーＩＬＳＴＳ０２９、ＢＭＳ２７９０およびＩＮＲＡ００３(牛染色体３上のContigマーカーに記した直線で示した)間のｃＭの相対距離を示す。
【図４】図４は、ＳＬＣ３５Ａ３遺伝子のｃＤＮＡ配列(配列番号１８)および翻訳部分、およびコードしたアミノ酸配列(配列番号１７)を示す。
【図５】図５は、乳牛ＬＣ３５Ａ３と、ヒト(ＡＢ０２１９８１) (Ishida et al. 1999)およびイヌ(AF057365)(Guillen et al. 1998)の配列の推定アミノ酸配列の比較を示す。
【図６】図６は、配列決定によるＣＶＭ状態の決定において５５９位置でＧ/Ｔ多型性を示す領域(ＳＬＣ３５Ａ３のヌクレオチド５４４から５７２）（図４を参照)の配列決定から得た結果を示す。
【図７】図７は、２つの野生型、２つのキャリアーおよび２つの罹患動物からのアレイ特異的ＰＣＲ産物を示す図である。