【手続補正書】
【提出日】平成16年11月8日(2004.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  （ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ固相を含む第一シラン処理シリカ基質を提供するステップであって、前記複数のリガンドの各々が、第一溶液中に中性電荷を有するステップと；および
（ｂ）破壊された生体物質、標的核酸物質、および前記基質への前記破壊された生体物質の選択的吸着を促進するのに十分な濃度のカオトロピック塩を含む、前記第一溶液と、前記第一シラン処理シリカ基質とを混合し、それによって第一複合体を形成するステップと
を含む、破壊された生体物質を溶液から除去する方法。
【請求項２】  前記破壊された生体物質が、バクテリア細胞溶解物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記破壊された生体物質が、破壊された植物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】  ステップ（ｂ）における前記カオトロピック塩濃度が、少なくとも約０．５Ｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】  前記複数のシランリガンドにおける各リガンドが、下記一般式で表され：
【化１】
2004513634.tif 000001
式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、ヒドロキシル基ならびに別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；および
Ｒ3は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、およびエポキシ基からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】  前記複数のシランリガンドにおける各リガンドが下記一般式で表され：
【化２】
2004513634.tif 000002
式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して−ＯＨ，−ＣＨ3，−ＯＣＨ3，または
−ＯＣＨ2ＣＨ3であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】  前記シリカ固相が、第一シリカ磁気粒子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】  前記第一溶液から前記第一複合体を分離し、それによって除去された溶液を作るステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】  前記除去された溶液を第二溶液の中で第二シリカ基質と混合させるステップであって、前記標的核酸が特異的に前記第二シリカ基質に吸着し、それによって第二複合体を形成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  前記第二シリカ基質が、複数の第二のシリカ磁気粒子を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】  前記第二シリカ基質が、複数の第二シラン処理シリカ磁気粒子であり、かつ前記第二溶液が、約８．０までのｐＨを有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】  前記第一シリカ基質および前記第二シリカ基質が同じであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】  （ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ磁気粒子を含む第一シラン処理シリカ磁気粒子を提供するステップと；
（ｂ）破壊された生体物質、標的核酸、および前記破壊された生体物質の前記シラン処理シリカ磁気粒子への選択的吸着を促進するのに十分に高いカオトロピック塩濃度を含む第一溶液と、前記第一シラン処理シリカ磁気粒子とを混合させ、それによって第一複合体を形成するステップと；
（ｃ）前記第一溶液から前記第一複合体を分離し、それによって除去された溶液を形成するステップ
を含む、破壊された生体物質を溶液から除去する方法。
【請求項１４】  前記破壊された生体物質が、バクテリア細胞溶解物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】  前記破壊された生体物質が、破壊された植物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】  前記第一溶液が、約３．５Ｍまでの濃度でカオトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】  前記複数のシランリガンドの各々が下記一般式で表され：
【化３】
2004513634.tif 000003
式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、およびヒドロキシル基からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；Ｒ3は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ基および別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】  前記第一複合体が、磁場の存在において前記第一溶液から分離されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】  前記第一複合体が、遠心分離法によって前記第一溶液から分離されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】  前記除去された溶液を第二シリカ基質と第二溶液の中で混合させるステップであって、前記標的核酸が特異的に前記第二シリカ基質に吸着し、それによって第二複合体を形成するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】  前記第二シリカ基質が、共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ磁気粒子固相を含む第二シラン処理シリカ磁気粒子であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】  前記第一シラン処理シリカ磁気粒子および前記第二シラン処理シリカ磁気粒子が同じであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】  前記第二シリカ基質が、シリカ磁気粒子であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】  （ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ固相を含むシラン処理シリカ基質を提供するステップであって、前記複数のシランリガンドの各々が下記一般式で表され：
【化４】
2004513634.tif 000004
式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、およびヒドロキシル基からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；Ｒ3は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ基および別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴したステップと；
（ｂ）前記シラン処理シリカ基質を、約ｐＨ８．０までのｐＨを有する核酸吸着溶液と混合させるステップであって、前記核酸吸着溶液が前記標的核酸および少なくとも１の非標的物質を含み、前記標的核酸が選択的に、前記シラン処理シリカ基質に吸着し、それによって複合体を形成するステップと；および
（ｃ）前記複合体を、前記核酸吸着溶液から分離するステップと
を含む、核酸吸着溶液から標的核酸を単離する方法。
【請求項２５】  前記核酸吸着溶液が、植物油を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】  前記核酸吸着溶液が、前記標的核酸の、前記第二シラン処理シリカ基質への吸着を促進するのに十分な低分子量アルコールの濃度をさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】  前記吸着溶液が、０．２Ｍ乃至１．２Ｍのカオトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】  前記カオトロピック塩が、塩酸グアニジンおよびグアニジンチオシアネートからなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】  前記シリカ基質の前記シリカ固相が、シリカ磁気粒子であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】  前記複合体が、磁場の存在において前記核酸吸着溶液から分離されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】  約８．０までのｐＨを有する洗浄溶液で前記複合体を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】  前記洗浄溶液が、少なくとも約３０％の低分子量アルコールの濃度を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】  少なくとも約８．０のｐＨを有する溶出溶液と前記複合体を混合させ、それによって前記標的核酸を前記複合体から脱着するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】  前記溶出溶液が、少なくとも約９．０のｐＨを有するバッファであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】  前記標的核酸が、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびトータルＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】  前記標的核酸が、少なくとも約２５塩基対かつ約６０キロ塩基対までの分子量を有する二本鎖線状ＤＮＡであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】  （ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ磁気粒子を含む、シラン処理シリカ磁気粒子を提供するステップであって、前記複数のシランリガンドの各々が下記一般式で表され：
【化５】
2004513634.tif 000005
各式において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立した−ＯＨ，−ＣＨ3，−ＯＣＨ3，または−ＯＣＨ2ＣＨ3であるステップと；
（ｂ）前記シラン処理シリカ磁気粒子を約ｐＨ８．０までのｐＨを有する核酸吸着溶液と混合させるステップであって、前記核酸吸着溶液が前記標的核酸および少なくとも１の非標的物質を含み、前記標的核酸が、前記シラン処理シリカ磁気粒子に選択的に吸着し、それによって複合体を形成するステップと；および
（ｃ）前記複合体を前記吸着溶液から分離するステップと
を含むことを特徴とする、シラン処理シリカ磁気粒子を用いて核酸吸着溶液から標的核酸を単離する方法。
【請求項３８】  前記吸着溶液が、約８．０までのｐＨを有することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】  前記吸着溶液が、植物油を含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】  前記吸着溶液が、アガロースゲルスライスからの前記標的核酸と、前記アガロースゲルとを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】  前記吸着溶液が、前記シラン処理シリカ磁気粒子への前記標的核酸の吸着を促進するのに十分な低分子量アルコールの濃度をさらに含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】  前記吸着溶液がカオトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】  前記カオトロピック塩が、塩酸グアニジンおよびグアニジンチオシアネートからなる群から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】  約８．０までのｐＨを有する洗浄溶液で前記複合体を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】  前記洗浄溶液が、少なくとも約３０％の低分子量アルコールの濃度を含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】  少なくとも約８．０のｐＨを有する溶出溶液と前記複合体を混合させ、それによって前記複合体から前記標的核酸を溶出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】  前記標的核酸が、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびトータルＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】  前記標的核酸が、少なくとも２５塩基対および約６０キロ塩基対までの分子量を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】  単一の容器に：
各粒子の表面に共有結合した少なくとも１のシランリガンドを伴うシリカ固相を含む複数のシラン処理シリカ磁気粒子であって、前記シランリガンドが次の式の構造を有し：
【化６】
2004513634.tif 000006
式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、およびヒドロキシル基からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；およびＲ3は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ基および別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴する複数のシラン処理シリカ磁気粒子を含むキット。