【手続補正書】
【提出日】平成14年10月9日(2002.10.9)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】プロテアーゼ低下活性を備える創傷包帯材
【特許請求の範囲】
【請求項１】創傷部位においてエラスターゼを分離する方法において、
前記創傷部位に、カルボキシメチルセルローズ、ジアルデヒドガーゼ、スルホン酸処理ガーゼ、およびリン酸エステル化ガーゼから成る群から選んだ創傷包帯材を接触させる過程
を含む方法。
【請求項２】前記創傷包帯材がカルボキシメチルセルローズである請求項１記載の方法。
【請求項３】前記創傷包帯材がジアルデヒドガーゼである請求項１記載の方法。
【請求項４】前記創傷包帯材がスルホン酸処理ガーゼである請求項１記載の方法。
【請求項５】前記創傷包帯材がリン酸エステル化ガーゼである請求項１記載の方法。
【請求項６】創傷治療用の創傷包帯材において、
支持基剤と、
前記支持基剤に伴う活性剤であって、好中球誘導プロテアーゼの抑制体およびプロテアーゼ分離剤から成る群から選んだ活性剤と
を含む創傷包帯材。
【請求項７】前記支持基剤をセルローズおよびカルボキシメチルセルローズから成る群から選んだ請求項６記載の創傷包帯材。
【請求項８】前記好中球誘導プロテアーゼがエラスターゼである請求項６記載の創傷包帯材。
【請求項９】前記抑制体をＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｏメチルエステル、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ペンタフルオロエチルケトン、プロピル−３−ケトン、グルコーズ−６−クエン酸塩およびレブリン酸塩から成る群から選んだ請求項６記載の創傷包帯材。
【請求項１０】前記プロテアーゼ分離剤をアルデヒド、硫酸塩およびリン酸塩から成る群から選んだ請求項６記載の創傷包帯材。
【請求項１１】前記活性剤が共有結合、非共有結合およびイオン結合から成る群から選んだ手段により前記支持基剤に伴っている請求項６記載の創傷包帯材。
【請求項１２】請求項６記載の創傷包帯材を前記創傷に接触させることを含む創傷治癒促進の方法。
【請求項１３】前記創傷が慢性である請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
【０００２】
この発明は概括的には創傷包帯材に関する。より詳細にいうと、この発明は創傷、とくに慢性の創傷の治癒を向上させるプロテアーゼ抑制体や分離剤などの関連活性剤付きの創傷包帯材に関する。
【０００３】
（背景技術）
【０００４】
組織の損傷に対する正常な応答は、解剖学的機能完全性の持続的回復に至る適時的で秩序ある回復過程である（Ｌａｚａｒｕｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）。これと対照的に慢性の潰瘍では治癒過程が長引き、不完全になり、非整合な状態で進行し、解剖学的にも機能的にも思わしくない結果に至る。臨床的には、創傷は治癒の適時性によって急性と慢性とに分けられる。
【０００５】
慢性潰瘍の多くは少数の画定された臨床上の実在、とくに慢性の静脈鬱血、糖尿病、圧迫潰瘍を伴う。これらの症状全体で慢性潰瘍の全症例の約７０％を占める（Ｎｗｏｍｅｈ ｅｔ ａｌ． １９９８）。慢性潰瘍の発生率と有病率はばらつきが大きいが、脊髄損傷患者および高齢者についてはとくに高い数値を示す。社会の老齢化が続くと、慢性潰瘍の発生率も著しい増勢を保つものと予測される。圧迫潰瘍の患者が社会全体に及ぼす経済的負担も大きい。例えば、圧迫潰瘍に対する医療費だけでも年額３０億ドルを超えるものと推算されている（Ｎｗｏｍｅｈ ｅｔａｌ． １９９８）。
【０００６】
正常な治癒は多数の種類の細胞、可溶性因子および基質成分の間の相互作用を伴う複雑な一連の事象を包含する。治癒は時期的に互いに重なった凝固段階、炎症線維増殖段階および再造形段階に分けられる。事象の多くはサイトカイン調節を受けている。炎症段階では、通常は多形核白血球（ＤＮＭ）が白血球の中で初めに現れる。それら多形核白血球はＭＭＰ−８（コラゲナーゼ）やエラスターゼなどの種々のプロテアーゼを生成し、それによって損傷基質を除去し治癒を助長する。開放性の急性および慢性創傷においては、収縮並びに創傷の自然閉鎖および脈管形成に種々のサイトカインが重要である。正常状態では、開放創傷の閉鎖は、表面細胞が最終的閉鎖を密封する際に上皮形成でさらに支援される。
【０００７】
慢性創傷は著しく異なる。例えば、圧迫潰瘍は、表皮の喪失よりも大幅に大きい筋肉および脂肪の喪失を伴う深部組織壊死を特徴とする（Ｆａｌａｎｇａ ｅｔ ａｌ． １９９８）。これらの欠損は不動化された患者および衰弱した患者に普通にみられる。合衆国における脊髄損傷患者数は約２２５，０００であり、毎年約９０００の新たな症例がある。これらの患者の約６０％が圧迫潰瘍を発症し、これら患者１人あたりの医療関連費用は年額２５，０００ドル以上である（Ａｌｌｍａｎ １９９８）。圧迫潰瘍を患っている老人ホーム在住の高齢者数を脊髄損傷患者数に加算すると、圧迫潰瘍治療のための医療費は莫大な額になる。
【０００８】
慢性創傷治癒率を改善するための努力の大部分は、これまで外因性ペプチド成長因子の利用およびサイトカインなどの細胞ベースの製品の利用に集中していた。これらの試みの大部分はほとんど成果を挙げていない。代わりの手法として、Ａｇｌｉｇｒａｆ（基質＋細胞）およびＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（基質＋細胞）などの「代用皮膚」の利用がある。この２番目の手法はある程度有望であるが、コストが高いためにその利用は裕福な先進国に限られている。創傷包帯材の多様な変形が治癒促進の手段として提案されてきている。
【０００９】
上述のもの以外に次の例がある。
【００１０】
Ｙａｍａｚａｋｉほか名義の米国特許第５，０９８，４１７号はセルローズ性創傷包帯材に生理的活性剤をイオン結合する手法を開示している。
【００１１】
Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎほか名義の米国特許第４，４５３，９３９号は創傷の「封止および治癒」のための組成物にアプロトニンを添加する手法を開示している。
【００１２】
Ｂｏｎｔｅほか名義の米国特許第５，８０７，５５５号はコラーゲン合成促進のための薬剤にアルファ−１−プロテアーゼ、コラゲナーゼおよびエラスターゼを添加する手法を開示している。
【００１３】
Ｗｕほか名義の米国特許第５，６９６，１０１号は創傷治療における酸化セルローズ（例えばＯｘｙｃｅｌ）の殺菌物質および止血物質としての利用を開示している。
【００１４】
Ｗａｔｔほか名義の国際出願公開公報第ＷＯ９８／００１８０号は、慢性創傷治癒のために酸化セルローズを構造タンパク（例えばコラーゲン）で錯体化する手法を開示し、創傷治癒の促進において酸化セルローズの生体内分解で生ずるオリゴ糖が有用であることに参照事項を付けている。
【００１５】
好中球は急性炎症応答でみられる主な浸潤炎症細胞である。好中球は侵入病原体を破壊し創傷部位における失活組織を切除するように機能する。正常な大人は１日あたり約１０１１個の好中球を生ずる。宿主防衛に有効に機能するには、好中球は炎症部位に移動し、細胞質粒子から種々の細胞溶解酵素、抗微生物ペプチドおよび有効酸化剤を選択的に放出しなければならない。上記以外の条件の下では、好中球は正常な宿主細胞に損傷を与えて疾病を誘発することに関わっている。そのような炎症性の組織損傷は関節炎、虚血−再充満組織損傷、全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、および急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）などの多様な臨床上の障害の病因論に重要である（Ｗｅｉｓｓ １９８９）。好中球が圧迫潰瘍の病理生理学にも重要な役割を果たし得ることについては強力な証拠がある。
【００１６】
好中球は圧迫潰瘍の中で優勢な細胞の種類である（Ｐａｌｏａｈｔｉ ｅｔ ａｌ． １９９３， Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ． １９９５）、また、好中球の生成物と慢性圧迫潰瘍とを関連づける直接の証拠がある（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７）。すなわち、好中球のエラスターゼ、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）などがそれに含まれる（Ｗｙｓｏｃｋｉ １９９６， Ｗｙｓｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ． １９９３， Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｙａｇｅｒｅｔ ａｌ． １９９６）。したがって、上記以外の炎症過程における組織破壊に関わりがある旨のこれら考察および証拠は、好中球生成物が圧迫潰瘍およびその後の治癒不達の病因に関係しているとの仮説に強力な信憑性を与えるものである。好中球誘導のＭＭＰ−８は急性創傷および慢性創傷の両方で優勢なコラゲナーゼであることが判明している（Ｎｗｏｍｅｈ ｅｔ ａｌ． １９９９）。
【００１７】
好中球は多量のエラスターゼ（細胞１個あたり１ｐｇ）を含有する。このセリンプロテアーゼは広い基質スペクトラムを有する。好中球誘導のＭＭＰ−８の場合と同様に、エラスターゼレベルは圧迫潰瘍から抽出した液体では著しく高いことが見出されている（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７）。 創傷部位において活性エラスターゼのレベルが高くなることは、ペプチド成長因子利用の創傷治癒療法に重大な関連をもち得る。慢性創傷にみられるエラスターゼはＰＤＧＦやＴＧＦ−ｂなどのペプチド成長因子を減成する（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７）。また、ペプチド成長因子に対する細胞表面受容体がエラスターゼの作用で不活性化され得る。さらに、エラスターゼは慢性創傷の全般的な蛋白分解環境に寄与し得る。特定の抑制因子、すなわちＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓの組織抑制因子（ＴＩＭＰ）を蛋白分解で不活性化することは周知である。また、エラスターゼ自体がコラゲナーゼおよびゼラチナーゼチモーゲンを蛋白分解で活性化することに参画し得る。調節なしの蛋白分解環境が慢性創傷の病理生理学の重要な側面であり得ることは明らかである。
【００１８】
創傷治癒を促す新たな方法が得られれば非常に有益であろう。とくに、創傷の治癒を促進するために創傷の蛋白分解環境を制御することを対象とする方法が望まれる。そのような方法は創傷全般の治療、とくに慢性創傷の治療に有用である。また、これらの方法が低廉で広く受け入れ可能なものであればいっそう有益である。
【発明の概要】
【００１９】
この発明の目的は創傷の治療用、とくに慢性難治創傷の治療用の新規な創傷包帯材を提供することである。この発明の創傷包帯材は支持基質およびその支持基質に伴う活性剤から成る。この発明の好ましい実施例では、支持基質はセルローズまたはカルボキシメチルセルローズで構成する。
【００２０】
上記活性剤はプロテアーゼ抑制体で構成できる。この発明の実施にとくに適したプロテアーゼ抑制体は、慢性創傷に過剰に見出される好中球誘導のプロテアーゼを抑制するプロテアーゼ抑制体を含む。より詳しくいうと、それら抑制体はエラスターゼなどの陽イオンプロテアーゼである。例としては、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌもしくはＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａなどのジペプチド配列もしくはトリペプチド配列またはＡｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌもしくはＶａｌ−Ｐｒｏを含むテトラペプチド系列などがある。これらの抑制体を共有結合、非共有結合またはイオン結合により支持基質と関連づけることができる。また、これら抑制体は基質から解離可能にすることもできる。創傷の液体に接触するとこれら抑制体が基質から放出されて創傷環境に移動する。
【００２１】
活性剤はまた分離剤でもあり得る。分離剤に適した物質はプロテアーゼ抑制体でもある（上に挙げたとおり）。代替的に、分離剤を、例えば支持基質と関連づけたスルホニル族、リン酸塩、アルデヒド族などにより一般的な物質で構成することもできる。分離剤は創傷液体に見出されるプロテアーゼを結合し、それらを創傷環境から除去する。
【００２２】
この発明は創傷部位においてエラスターゼを分離する方法など創傷包帯材使用の方法も提供する。この方法は、創傷部位に、カルボキシメチルセルローズ、ジアルデヒドガーゼ、スルホン酸処理ガーゼおよびリン酸塩処理ガーゼから成る群から選んだ創傷包帯材で接触する過程を含む。
【００２３】
この包帯材は創傷の治癒、とくに慢性創傷の治癒を促進するために創傷に適用できる。
【好ましい実施の形態の説明】
【００２４】
この発明は、プロテアーゼの抑制体および分離剤などの活性剤が創傷の治癒促進剤、とくに慢性創傷の治癒促進剤として使えることを発見したことに基づいている。これらの抑制体および分離剤は創傷包帯材に物理的に塗布可能であり、また代替的には、活性剤の持続的放出または創傷環境からの生体内構成物の分離の目的で創傷包帯材にイオン結合または共有結合できる。この発明の好ましい実施例では、活性剤が好中球エラスターゼなどの陽イオン好中球誘導プロテアーゼを抑制または結合する。
【００２５】
活性剤という用語はプロテアーゼ抑制体およびプロテアーゼ分離剤の意味を含んでいる（しかし、それに限られない）。これら二つのカテゴリーが互いに排他的でないことを当業者は認識するであろう。プロテアーゼ抑制体は分離剤としても作用し、分離剤はプロテアーゼを抑制する場合もあるので、これら二つのカテゴリーは重複する場合もある。また、用語「活性剤」の意味は、（１）創傷包帯材に加えられ（化学的に付着させるかまたは物理的に包帯材の組成物にする）た結果包帯材に伴っている物質、および（２）包帯材そのものの中につきものの機能群およびそれら機能群の誘導体および化学的改変物に及ぶ。後者の例はセルローズのヒドロキシル基である。
【００２６】
プロテアーゼ抑制体という用語はプロテアーゼ活動の縮小をもたらす材料を含む意味で用いる。その種の抑制体の例としては、プロテアーゼの活性部位の抑制体、アロステリック抑制体、可逆的および非可逆的抑制体、種々の基質類似体、ペプチド、擬態ペプチド、抗生物質などがある。この発明の好ましい実施例では、プロテアーゼ抑制体が好中球誘導のプロテアーゼを抑制する。この発明のもう一つの好ましい実施例では、この好中球誘導のプロテアーゼは好中球エラスターゼである。
【００２７】
この発明の実施に利用できるプロテアーゼ抑制体の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｖ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｎｌｅなどのアルキルアミノ酸、Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌまたはＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａなどのジペプチド配列またはトリペプチド配列、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌまたはＶａｌ−Ｐｒｏを含み終端残留物としてＡｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒなどのアミノ酸を有するテトラペプチドなどがあるが、これらに限られるわけではない。これらの抑制体はアミノ終端またはカルボキシ終端を通じ例えば塩の橋かけ経由で創傷包帯材に結合できる。また、これら抑制を創傷包帯材に埋め込んだりその他の方法で組み合わせることもできる。抑制体がアミノ酸またはペプチドである場合は、アミノ終端またはＣＯＯＨ終端で、例えば酸、カルボキシアミド、アルコール、エステル、ケトン、アルデヒド、ケトメチルエステル、α−ケトエステル、クロロホルムメチル、ペンタフルオロエチルケトン、トリフルオロメチルケトン、ホウ酸、オレイン酸などの誘導体にすることもできる。また、この抑制体はアルファ抗トリプシン、または任意のタンパクセリンプロテアーゼ抑制体でも構成できる。
【００２８】
プロテアーゼ抑制体の場合は、それら抑制体を基質上に固定化することもでき、創傷液体に放出可能にすることもできる。例えば、共有結合した抑制体は加水分解で放出できる。基質に組成物の一部として含めた抑制体を加水分解および溶解で創傷液体中に放出することもできる。放出された抑制体は創傷液体に自由に移動して創傷環境全体に薬効（有害なプロテアーゼを抑制する）を発揮する。
【００２９】
分離剤という用語はプロテアーゼを創傷床から除去するようにプロテアーゼを拘束して保持することができる活性剤を含む意味で用いる。創傷環境におけるプロテアーゼ濃度はしたがって減少する。分離剤はプロテアーゼに特異的にし、例えばプロテアーゼ活性部位を拘束する（可逆的または非可逆的に）ようにすることも、プロテアーゼの上記以外の特性に結びつけるようにすることもできる。例えば、この分離剤をプロテアーゼまたは一群のプロテアーゼのエピトープを対象とする抗体で構成することもできる。また、拘束は一般的な性質のもので差し支えない。例えば、この拘束は陽イオンプロテアーゼなど一般的な一群のプロテアーゼを対象とするものでもよい。その場合は、活性剤はリン酸塩、硫酸塩、カルボン酸塩などの陰イオン群で構成できる。これら陰イオン群は創傷包帯材に直接に付着させることができ（例えばセルローズ綿のヒドロキシル機能）、またアルキル鎖などの結合基により間接的に創傷包帯材に付着させることができる。さらに、この陰イオン群を創傷包帯材と関連するもう一つの下位構成部分の一部として構成することもできる。例えば、上記陰イオンはアミノ酸またはペプチドのカルボキシル官能、またはアミノ酸もしくはペプチド付着のリン酸塩であり得る。支持基質に直接に結合できプロテアーゼへの親和性を備える任意の抑制体または分離剤をこの発明の実施に用いることができる。
【００３０】
創傷包帯材に伴う抑制体および配列の特異的薬効には、創傷の潰瘍部位への細胞の移動を刺激する成長因子の分裂を阻止して、開放創傷治癒をもたらす新しい組織の成長を導くことが含まれる。この技術は、糖尿病性潰瘍および褥瘡潰瘍を含むあらゆる種類の慢性潰瘍に広く適用できる。創傷包帯材製剤の組成物を末梢投与しても中枢投与しても慢性潰瘍の治癒が得られる。この発明の組成物は創傷に放出され得る薬剤として包帯材に塗布し、ヒトエラスターゼなどのプロテアーゼを抑制し、成長因子および組織分解を防止するようにすることができる。また、この発明の抑制体を包帯材に共有結合させることもできる。この種の基質の成分として、これら抑制体は創傷の微小環境から破壊的なプロテアーゼを分離し、処理不適用の場合に生じ得る成長因子の分解およびフィブロネクチンを防止する。
【００３１】
抑制体含有のこの包帯材の治療用投与は、治療を要する患者の治療の際に抑制体または分離剤の薬効発揮投与量を投与することを含む。患者における加速治癒を促進するために包帯材に必要とされる抑制体または分離剤の投与量は１日あたり約０．２ｍｇ／グラム線維乃至約２００ｍｇ／グラム線維の範囲であるが、この数値は患者の健康状態、創傷の種類、使用した特異的プロテアーゼ抑制体／分離剤などの特異的要因に左右される。活性剤の所要量は当業者に容易に決められる。
【００３２】
この明細書に用いた用語「患者」は、羊、馬、牛、豚、犬、猫、鼠、二十日鼠、ヒトを含む霊長類を意味する。
【００３３】
また、この明細書における用語「包帯材」は医薬品として受け入れ可能な次に例示する創傷被覆材または支持基質を含む意味で用いてある：
ａ）ポリウレタン共重合体、アクリルアミド、アクリル酸塩、パラフィン、多糖類およびラノリンなどの半透性または半閉塞性の膜などの膜。
ｂ）ゼラチン、ペクチン、Ａｃａｃｉａガム、Ｇｕａｒガム、Ｋａｒａｙａなどの錯多糖類のカルボキシメチルセルローズ蛋白成分を含む親水コロイド。これらの材料を可撓泡体の形で、ポリウレタン製剤として、ポリイソプレンなどの粘着製剤として利用できる。
ｃ）寒天、澱粉、プロピレングリコールなどの親水ゲル。これらの材料は約８０％乃至９０％の水分を含み、酸化ポリエチレン、ポリビニルピロリトン、アクリルアミド、プロピレングリコールなどの橋かけ結合重合体と組み合わせたシート、粉、糊、ゲルの形に慣用的に製剤される。
ｄ）親水性の開放細胞接触表面および疎水性の閉鎖細胞ポリウレタンから成る多糖類の泡体。
ｅ）松巣網目ガーゼ、パラフィン被覆またはラノリン被覆ガーゼ、ポリウレタングリコール被覆ガーゼ、編組ビスコース、レイヨン、ポリエステルなどの含浸材。
ｆ）不織線維複合体または織物複合体として製剤可能なアルギン酸カルシウムを含むアルギン酸塩などのセルローズ様の多糖類。
【００３４】
好ましい創傷包帯材は活性剤とイオン結合または共有結合により結合できる支持基質、または活性剤を組成成分として含有できる支持基質であって、キトサン、アルギン酸、綿またはガーゼ、膜、親水コロイド、親水ゲル、親水活性剤、泡体、含浸材、吸収性固体、糊など、ＵＳＰ２４、ＮＰ１９、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ： Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， ＵＳ２４、ＮＦ１９、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌ， ＭＤ， Ｊａｎ．１， ２０００に記載され周知のものを含む。上記刊行物をここに参照してその内容をこの明細書に組み入れる。
【００３５】
とくに好ましい創傷包帯材は織りガーゼまたは不織ガーゼの形状にした綿セルローズを含む。この種の創傷包帯材は容易に入手でき比較的低価格である利点を有する。この場合、プロテアーゼ分離剤または抑制体を、アミノ基、カルボン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、塩酸塩、ホウ酸塩、モノカルボキシル酸、ジカルボキシル酸、トリカルボキシル酸または医薬として受容可能なこれらの酸の塩などの置換基を通じてセルローズ多糖類連鎖に結合させる。それら塩の例としては、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、シナモン酸、サリチル酸および２−フェノキシ安息香酸などの酸、並びにメタンスルホン酸およびヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸の塩が挙げられる。カルボキシル終端アミノ酸ｍｏｉｅｔｙの塩は、任意のｓｉｌｉｔａｂｌｅな無機または有機の基剤で賦形した無毒のカルボン酸塩を含む。これらの塩の例としては、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムなどの２Ａ族の軽金属の塩、トリエチルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ−アルキルピベリジンほか任意の適当なアミンなどの有機一次、二次および三次アミンが挙げられる。
【００３６】
活性剤は、創傷包帯材の化学結合成分として、または組成物構成成分として、包帯材中の加湿線維を通じて治療部位に当たるように加える。包帯材システムは単一段階または多段階に構成できる。一段階システムの場合は活性剤付きの創傷包帯材で構成される。多段階システムでは、例えば創傷包帯材および生理的に受け入れ可能な溶媒の懸濁液を用いる。溶媒として機能し得る医薬担体の例は水、油または表面活性剤含有の殺菌ずみの生理的に受容可能な液体である。
【００３７】
これらの製剤で使用可能な油の例は石油、動物油、植物油、合成油であり、例えば落花生油、大豆油、鉱油などである。概括的に言って、水、食塩水、ポリエチレングリコールなどのグリコール類は好ましい担体である。
【００３８】
この発明の創傷包帯材は単独で、あるいは他の治療処理に付加して用いることができる。例えば、この創傷包帯材は外因性成長因子の投与と組み合わせて用いることができる。外因性ペプチド成長因子またはその受容体の安度性を高める条件はその薬効を高める。また、この発明の創傷包帯材は皮膚移植に関連して用いることもできる。その場合は、制御ずみの蛋白分解環境が拒絶反応または代用皮膚溶融を引き起こす可能性が低下する。
【００３９】
さらに、この発明の創傷包帯材は単一の活性剤で構成でき、また共通の包帯材に複数の活性剤を含ませた形でも構成できる。例えば、分離剤および抑制剤の両方を包帯材に伴わせることができる。また、放出可能な抑制体および分離剤の両方を包帯材に伴わせることもできる。この包帯材に抗生物質、ビタミンなどの治療に有益な他の物質を含ませることもできる。この発明の包帯材および方法はいかなる種類の創傷の治療にも利用できる。好ましい実施例では、慢性難治の創傷の治療を行う。
【００４０】
この発明を実施例により次に説明するが、これら実施例は説明のためのものであって、限定を意図するものではない。
【実施例】
略語：
ＣＭＣ：カルボキシメチルセルローズ
ＤＩＣ：ジイソプピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノプロピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＳ：置換度
ＥＤＣＩ：Ｎ’−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩ＦＡＢＭＳ：高速原子衝撃質量分光分析
Ｆｍｏｃ：４−フルオロニルメチルオキシカルボニル
ＨＬＥ：ヒト好中球エラスターゼ
ＨＯＢＴ：ヒドロキシベンゾトリアゾル
ＮＭＩ：Ｎ−メチルモルフォリン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
（実施例１）分離剤としてのエラスターゼ配列の評価
方法
綿セルローズ複合体および抑制体配列の一般的合成および製剤
【００４１】
サイズを整え洗浄し漂白したマーセル法加工ずみの綿ガーゼをこの合成に用いた。この綿線維織物を合成用に円板状（直径８．５ｃｍ）に切った。１００％綿織物（２９０グラム）をメタノール：イソプロパノール（１３：８７，ｖ：ｖ）および０．５％ＴＸ−１００の水酸化ナトリウム溶液中で２５％モノクロロ酢酸で１時間にわたり環流してカルボキシメチル綿セルローズを作成した。カルボキシメチル化成分またはカルボキシル成分の置換度を酸ベースの滴定によりカルボキシル成分を測定することにより測定した。カルボキシル含有量を次の式から算出した。
【００４２】
ＤＳ＝［（１６２）（％ＣＯＯＨ）］４５００−（Ｒ）（％ＣＯＯＨ）
ここで、Ｒはエーテル置換基の分子量マイナス１、すなわちカルボキシメチルセルローズについては５８である。
【００４３】
綿セルローズのエステル化は塩酸触媒を用いたカルボジイミド／ＨＯＢＴアセチル化により行った。この合成で用いた綿試料を２０ｍｌの２５％ＴＦＡ／ＤＣＭ（１０分）で前処理し、５×２０ｍｌ、ＤＣＭ、２×２０ｍｌ １０％ＤＩＰＥＡ、５×２０ｍｌ（５分）および２×２０ｍｌＤＣＭで洗滌した。綿円板をＢｕｃｈｎｅｒ炉で真空乾燥させ、超音波浴の中のビーカーでエステル化した。Ｆｍｏｃ−グリシンエステル化を、上記円板を０．３ＭＦｍｏｃ−グリシン／ＤＩＣ／ＨＯＢＴおよび０．０３ＤＭＡＰ含有のＤＭＦ溶液２０ｍｌ中で反応させることによって行った。この綿円板をＤＭＦおよび水で洗滌し、アミノ酸分析からグリシン値を２００マイクロモル／綿１グラムと推算した。グリシン結合子で作成したこの種の綿試料はペプチド配列の組立に用いることができ、ペプチドのカウンタイオンまたはアミノ酸カルボキシ塩の形成に用いることができる。すなわち、グリシン綿セルローズ複合体のアミノ酸塩を請求項に表示したエラスターゼペプチド抑制体で形成できる。
綿セルローズ上でのＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙペプチド合成
【００４４】
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ認識配列を、綿織物８．５ｃｍ円板上のＣＯＯＨ終端結合子としてグリシンを用いて合成した。綿にＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを合成するための合成プロトコルは、Ｅｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ １９９１記載のとおり次の過程から成る。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−結合のセルローズ綿のアセチル化は酸無水物／ＮＭＩ／ＭＤＦ １：２：３（ｖ／ｖ／ｖ）６０分により行った。この綿円板をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）およびＤＣＭ（２×１０ｍｌ）で洗滌した。
【００４５】
Ｆｍｏｃの保護除去を２０％ピペリジン／ＤＭＦ１５分、洗滌（３×ＤＭＦ、２×ＤＣＭ）、カップリング（ＤＭＦ中の０．３ＭＦｍｏｃ−アミノ酸／ＨＯＢＴ／ＤＩＣ、９０分）、洗滌（３×ＤＭＦ、２×ＤＣＭ）で行った。カップリング過程でプロモフェニルブルー／ＤＭＦ溶液１０マイクロリットルを添加した。２００ミリグラムの試料をアミノ酸分析にかけた。その分析から得られたアミノ酸比率は１：２（Ｐｒｏ：Ｖａｌ）、収率は１．１マイクロモル／綿１グラムであった。
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｏ−メチルエステルの合成
【００４６】
カルボベンゾキシ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（１ｇ、２．８ｍｍｏｌ）の乾燥テトラヒドロフラン３０ｍｌ溶液を−５℃に冷却し、Ｎ−メチルメルフォリン（０．２９ｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（０．３９１ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を添加して１時間攪拌した。Ｖａｌ−ＯＭｅ（０．４９ｇ、２．８ｍｍｏｌ）のジオキサン／水溶液（７：３）をジイソプロピルエチルアミンでｐＨ７に調節した。これら溶液を混合し、その混合物を３時間攪拌し、１ＮＨＣｌ、飽和食塩水によるｗｏｒｋ−ｕｐおよび硫酸ナトリウムにより乾燥にかけ、透明な油を得た。この生成物はＦＡＢＭＳ（［ｍ＋１］＝４６３）で確認され、Ｎ保護基をギ酸アンモニウムを用いた水素化分解で除去した（Ａｎｗｅｒ， Ｍ．Ｋ．＆Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ．（１９８０）， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １１， ９２９−９３２）。この生成物Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＯＭｅはカルボキシメチルセルローズ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＯＭｅ複合体の形成に用いることができる。
カルボキシメチルセルローズ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＯＭｅ複合体の合成
【００４７】
カルボキシメチル綿円板（直径８．５ｃｍ、重さ２．６ｇ、置換率２５％以下）２枚をビーカー中で１０ｍｌのＤＭＦと混合した０．１５Ｍ Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＯＭｅ／ＨＯＢＴ／ＤＩＣと反応させ、超音波浴の中に置いた。ブロモフェノールブルー（２０μｌ、０．０１Ｍ）でモニタし、その反応を一晩継続させた。青色から黄色への変化で反応の完結を検知した。綿セルローズ複合体の３００ミリグラムの試料をアミノ酸分析にかけた。この分析から得られたアミノ酸比率は１：２（Ｐｒｏ：Ｖａｌ）、収率は８．５マイクロモル／綿１グラムであった。
カルボキシメチルセルローズ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌｉｎｅ−クロロメチルケトンおよびその綿複合体の作成
【００４８】
無水エーテル中のＮ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｖａｌｉｎｅ酸塩酸塩（０．９５ｇ、３ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液を無水エーテル中でエーテル状ジアゾメタン（６ｍｍｏｌ）で氷浴させた。この反応混合物を一晩放置して塩化水素により２時間処理した。溶媒からの除去時にクロロケトンが得られた。乾燥テトラヒドロフラン３０ｍｌ中のカルボベンゾキシ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２．８ｍｍｏｌ）を−５℃に冷却し、Ｎメチルモルフォリン（０．２９ｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（０．３９１ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を添加して１時間攪拌した。Ｎ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｖａｌｉｎｅクロロメチルケトン（２．８ｍｍｏｌ）のシオキサン／水（７：３）溶液をジイソプロピルエチルアミンでｐＨ７に調節した。これら溶液を混合してその混合物を３時間攪拌し、水を加えテトラヒドロフランを蒸発させた。得られた油を酢酸エチルで抽出しＩＮ ＨＣｌ、飽和食塩水によるｗｏｒｋ−ｕｐおよび硫酸ナトリウムにより乾燥にかけ、透明な油を得た。Ｎ保護基をギ酸を用いた水素化分解で除去した。この生成物を濾過し凍結乾燥させてペプチドＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌクロロメチルケトンを得た。カルボキシメチル円板（直径８．５ｃｍ、重さ２．６ｇ、置換率２５％）２枚をビーカー中で１０ｍｌ ＤＭＦと混合したＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ペンタフルオロエチルケトン／ＨＯＢＴ／ＤＩＣと反応させ、超音波浴の中に置いた。ブロモフェノールブルー（２０μｌ、０．０１Ｍ）でモニタし、その反応を一晩継続させた。青色から黄色への変化で反応の完結を検知した。綿セルローズ複合体の３００ミリグラムの試料をアミノ酸分析にかけた。この分析から得られたアミノ酸比率は２：１：１（Ａｌａ：Ｐｒｏ：Ｖａｌ）、収率は０．４８４マイクロモル／綿１グラムであった。
カルボキシメチルセルローズ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ペンタフルオロエチルケトンおよびその綿の段階的作成
ステップ１：Ｂｏｃ−Ｖａｌｙｌ−Ｎ−メチル−Ｏ−メチルカルボキシアミドの生成
【００４９】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ｖａｌｉｎｅの塩化エチレン溶液にジメチルアミナノピリジン，Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩、ＮＭＭおよびＥＤＣＩを添加して、その溶液を室温で２０時間攪拌した。この溶液を１０％ＨＣｌ溶液、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗滌し、溶媒を真空中で除去して無色の油を得た。
ステップ２：Ｂｏｃ−Ｖａｌｙｌ−ペンタフルオロケトンの生成
【００５０】
Ｂｏｃ−Ｖａｌｙｌ−Ｎ−メチルカルボキシアミドの−７８℃の溶液に濃縮ペンタフルオロエチリオジドを添加した。この混合物にメチルリチウム−ホウ酸リチウム錯体を添加し、内部反応温度−６５℃乃至−７８℃で１．５時間攪拌した。この混合物を水に注ぎ、この水相の混合物を硫酸水素カリウムで酸性化した。この水相から追加のＥｔ２Ｏ（５００ｍｌ）を抽出し、結合ずみの有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３で洗滌しＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。
ステップ３：Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ペンタフルオロエチルケトンの生成
【００５１】
Ｂｏｃ−Ｖａｌｙｌ−ペンタフルオロエチルケトンのトリフルオロ酢酸、塩化エチレン（１：１ ｖ／ｖ）溶液を作り、反応を３０分継続させた。溶媒を真空中で除去して、その結果の保護解除ペプチドがＢｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨにジイソプロピカルボジイミド／ＨＯＢＴ結合を通じて反応するようにした。
【００５２】
上記以外のカルボキシメチルセルローズ−Ｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ペンタフルオロエチルケトンの生成は次のとおりである。
【００５３】
カルボキシメチル綿円板（直径８．５ｃｍ、重さ２．６ｇ、置換率２５％以下）２枚をビーカー中で１０ｍｌのＤＭＦと混合した０．１５Ｍ Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ペンタフルオロエチルケトンと反応させ、超音波浴の中に置いた。ブロモフェノールブルー（２０μｌ、０．０１Ｍ）でモニタし、その反応を一晩継続させた。青色から黄色への変化で反応の完結を検知した。次にこの綿をＤＭＦ２０ｍｌで３回洗滌し、塩化メチレンで３回洗滌した。これで得られたペプチド−セルローズ複合体をアミノ酸分析にかけ、ペプチド３０マイクロモル／綿１グラムを含むことが見出された。
プロピル−３−ケト−（２．３．６）−Ｏ−セルローズエーテルの生成
【００５４】
綿セルローズ４グラムをジオキサンおよび水の溶液（２：１）中に懸濁させ、それにＤａｂｃｏ（１，４−ジアザバイチクロ［２，２，２］オクタン）を添加してｐＨ８とし、ビニルプロピルケトン０．０２４６モルを添加した。この懸濁液を一晩中継続して攪拌した。基剤およびビニルプロピルケトンに含浸した処理ずみガーゼを１００℃で１時間硬化させ、その生成物を冷水で３０分洗滌し、８５℃で乾燥させることもできる。
レブリン酸塩−（２，３，６）−Ｏ−セルローズエステルの生成
【００５５】
レブリン酸による綿セルローズガーゼのエステル化は、ＤＭＦ溶液２０ｍｌ中で上記綿円板を０．３Ｍレブリン酸／ＤＩＣ／１−ＨＯＢＴおよび０．０３Ｍ ＤＭＡＰと反応させることによって行った。このエステル化は、水溶性カルボジイミドと同一分子濃度で、慣用のパッドおよび硬化手法により、クエン酸およびレブリン酸の次亜リン酸エステル橋かけ結合を用いて水性条件の下で行うこともできる。
グルコーズ−６−クエン酸塩−（２，３，６）−Ｏ−セルローズエステルの生成
【００５６】
綿ガーゼの２グラムの試料を、次亜リン酸ナトリウムの４％溶液、０．０２Ｍクエン酸および０．１２Ｍグルコーズ溶液に研究室用マングルで２回ディップ２ニップでパッドした。パッド処理ずみのガーゼを乾燥させ、炉中の循環空気中で硬化させた。硬化温度は１８０℃、乾燥温度は８５℃に設定した。その結果得られた生成物のアドオン重量は１１％であった。
【００５７】
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン酢酸塩１０ｍｇを０．０５Ｍ食塩水に溶解し、カルボキシメチル綿ガーゼ２グラムに飽和に達するまで加えた。次にこのガーゼを親液性化し、一つの綿セルローズ試料をアミノ酸分析用に取り出した。その結果、綿ガーゼ１グラムあたり１０マイクロモルのペプチドが見出された。
結果
【００５８】
綿セルローズ結合認識配列のエラスターゼに対する親和性および綿線維複合体が水性環境からエラスターゼを分離する能力の測定にクロマトグラフィを行った。合成はマーセリゼーション処理した綿について行われるので、マーセリゼーション処理ずみの綿をエラスターゼ溶離についてクロマトグラフィ安定相としての未処理綿と比較した。未処理でマーセリゼーション処理なしの綿に比べて（１２％）マーセリゼーション処理ずみの綿に保持されたエラスターゼの量は少なかった（４％）。綿線維の結晶化度がマーセリゼーションにより変化するので、これは予期された結果であった。表１は保持されたエラスターゼの比較レベルを綿カラム上の保持エラスターゼの百分率で表したものである。生理食塩水条件の下でのカラム保持エラスターゼの比較レベルは、創傷液体からのエラスターゼを分離する能力を示唆している。二つのシリーズのエラスターゼ保持能力測定を行った。すなわち、第１のシリーズはエラスターゼを新たに作成したコラムに注入して測定し、それに伴うエラスターゼ保持率を測定した。第１の注入のあとの保持エラスターゼの百分率のほうが反復注入の場合に比べて全試料について大きい値を示した。
【００５９】
複合体１はエラスターゼ保持最大値を示した。ＣＭＣ対象が３０％であったのに対して複合体１に保持されたエラスターゼは５０％であった。複合体１はカルボキシメチルセルローズにアミノ終端Ｖａｌｉｎｅで結合させたＶａｌ−Ｐｒｏ−ＶａｌのＣＯＯＨ終端メチルエステルである。これによって、ＣＯＯＨ終端が酵素結合により受け入れ容易になる。ＣＯＯＨ終端グリシンを通じて綿セルローズに結合した綿セルローズ複合体Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ配列は初めの注入からより少量のエラスターゼ（２６％）を保持した。反復注入で保持されたエラスターゼ百分率も初注入試料と同様の傾向を示す。複合体１はエラスターゼ保持最大平均値（３７％）を示した。
表１    ペプチドセルローズカラムのエラスターゼ保持
2004508069.tif 000001
注１  エラスターゼを上述のとおり綿複合体カラムに注入した。
注２  保持エラスターゼ百分率は同じコラムへの３回の注入についての平均値を示す。
【００６０】
これらの結果はセルローズ支持体に共有結合させたペプチド配列がそれら配列が抑制要素となるプロテアーゼの分離を生じさせることを示す。
（実施例２）綿結合体合成プロテアーゼ抑制体によるエラスターゼの抑制
材料および方法
【００６１】
ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐニトロアナリドおよびＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌクロロメチルケトンをそれぞれ含むペプチド基剤および抑制体をＳｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）から入手し、それら物質の純度を実験用に用いる前に反転位相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰＨＰＬＣ）で確認した。ヒト白血球から得られた白血球エラスターゼ（上記Ｓｉｇｍａ社）を１単位のｖｉａｌ（ＨＬＥ１単位はＮ−ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａｎｉｎｅ ｐ−ニトロフェニルエステルからｐＨ６．５で毎秒１ナノモルのｐ−ニトロフェノールを放出する）、反応あたり０．２単位の使用ａｌｉｑｕｏｔｓから可溶化した。綿線維を綿織物から抽出し、練り、漂白して洗滌した。この綿織物をセルラーゼ酵素Ｃｅｌｌｓｏｆｔとトリフルオロ酢酸の１０％塩化メチレン溶液で前処理し、塩化メチレンで３回洗滌した。この綿線維を、セルローズ綿の一次細胞壁の非セルローズ成分を除去しペプチドＣＭＫの結合を改善するようにセルラーゼで前処理した。
線維−抑制体製剤の作成
【００６２】
製剤および試験管内放出のための最適条件を示すモデルとして、低分子量ＣＯＯＨ終端修飾テトラペプチドケトンを綿線維に含浸させた。ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌクロロメチルケトン（１．２ｍｇ／ｍｌ）のアセトニトリル溶液（０．５ｍｌ）を綿織物線維の３００ｍｇの試料を分離するために加えた。この場合にアセトニトリルを用いることによって、抑制体溶液の線維中への高速拡散を達成する。この抑制剤はセルローズ線維の多糖類連鎖に水素結合で非共有結合するものと考えられる。この線維をトリフルオロ酢酸により前処理で弱酸性にし、ペプチドケトンとセルローズ中のグルコーズ環の中の空きのヒドロキシルとの間のヘミケタルの酸触媒形成を促す。これによって綿セルローズ、すなわち水性条件の下で加水分解される綿セルローズに対する抑制体のより持続性の高い親和性を構成する。ヘミケタルは親和時に対応のケトンに放出される。試料を空気中で乾燥させ、８０メッシュ膜（太さ１５０ミクロンの線維）のＷｉｌｅｙ Ｍｉｌｌで微粉砕する。それら微粉砕した試料を親液化してアセトニトリルの微小残量を除去する。
酵素評価分析
【００６３】
ＨＬＥの酵素評価分析を０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、３．３％ＤＭＳＯから成るｐＨ７．６の緩衝液で行い、ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡの酵素により加水分解からのｐ−ニトロアニリンの放出の４１０ｎｍにおける分光分析にかけた。通常の実験では、エラスターゼの酵素溶液（０．５２単位、２．０８ユニットｍｌ）２５０μｌを６０μＭ基剤を含む全体積１．５ｍｌの緩衝液で結合した。通常の実験では、線維−抑制体製剤の評価を、微粉砕綿試料数ミリグラムをＲｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）５ｍｌ中で酵素溶液と混合することによって行った。綿線維懸濁を５ｍｌ注射器につけた０．４５ミクロン濾過器で濾過した。炉液を基剤と混合し、その基剤の酵素により加水分解を分光分析で測定した。
【００６４】
反応過程曲線を記録器つきのＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−２６５で記録した。時点はＵｎ−Ｓｃａｎ Ｉｔプログラム（ユタ州オクデン所在のＳｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を記録曲線に適用して特定した。ディジタル化走査により、吸収時間データ点２８０対乃至４５０対を得た。速度は上述のとおり進歩曲線沿いの１０点乃至４０点で算定した（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ）。
【００６５】
アミノ酸分析をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社アミノ酸分析装置で行った。この分析装置は４２０Ａ型Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｒ／Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｒから成り、これによってペプチド試料を６Ｎ ＨＣｌで加水分解し、ＰＴＣ誘導体に変換し、１３０Ａ型および９２０型データモジュールでクロマトグラフィ分析した。
【００６６】
高性能液体クロマトグラフィ研究をＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｇｏｌｄ ５０８自動サンプラ、プログラマブル溶媒モジュール１２６およびダイオードアレー検出器モジュールで行った。データはＧｏｌｄ Ｎｏｖｅａｕソフトウェアを用いたコンピュータで捕捉し分析した。エラスターゼ抑制体のクロマトグラフィ分析および分離を、Ｖｙｄａｃ５ミクロンＣ１８ペプチド逆相カラムで行った。
患者および創傷液体
【００６７】
脊髄損傷患者５名の七等級３の仙骨、坐骨、転子圧迫潰瘍から液体を採取した。３名の患者は二つの明確な創傷を患っており、それら創傷は試料化し個別のデータ点とした。患者の年齢は５０歳乃至６５歳の範囲にあり、目立った共存症はなかった。外傷は発現から最低２ヶ月を経たものであった。この研究に用いたどの創傷にも重篤な感染の証拠はなかった。一例以外の全創傷の治療は通常の食塩水含浸の加湿包帯材、乾燥包帯材によるものであって。一つの創傷の小さい外縁部には局所コラゲナーゼを壊死組織切除のために施してあった。この創傷は潰瘍液体採取前に普通の食塩水で十分に洗滌してあった。閉塞性包帯材（Ｔａｇｅｄｅｒｍ：ミネソタ州セントポール所在の３Ｍ社）で潰瘍を２〜４時間覆い、殺菌ツベルクリン注射器により吸引で採取した。この液体を１４，０００ｇで１５分にわたり４℃で清澄化した。蛋白濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ評価分析（カリフォルニア州リッチモンド）によりウシ血清アルブミンを定量標準として算定した。
創傷液体におけるエラスターゼ活性の測定
【００６８】
上述の方法によりエラスターゼ活性を算定した（Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ）。蛋白質１００マイクログラムを、綿結合線維抑制体０乃至５ｍｇ含有のＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液１．０ｍｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ５００ｍｍｏｌ／ｌ、１０％ＤＭＳＯで培養した。外因性反応を激しく攪拌しながら常温で培養した。次に、この抑制体−蛋白質混合物を０．２２ミクロン濾過器で細管に濾過した。反応基剤を濾過ずみ試料の各々に最終濃度１００μｍｏｌ／ｌになるまで加えた。基剤加水分解を基剤添加から５分後、１５分後および６０分後にＡ４１０を測定することによって評価した。生成した好中球エラスターゼを標準曲線発生のために用いた。
結果
エラスターゼ抑制動態
【００６９】
線維−抑制体試料の存在下でのヒト好中球エラスターゼ（ＨＬＥ）の抑制についての反応進捗曲線を形成し（図１Ａ）、周知の抑制体ＭｅＯＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンによる抑制についての反応進捗曲線と比較した（図１Ｂ）。この反応混合物におけるＨＬＥ濃度はこの線維抑制体およびＭｅＯＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンについて、それぞれ０．５単位／ｍｌおよび０．２単位／ｍｌであった。この抑制の検討に用いた綿結合抑制体試料の重さは数ミリグラムの範囲（０．５乃至３．０ｍｇ）にあった。これらの結果は、ＭｅＯＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンによる抑制との比較から判断されるとおり、この綿試料が０．０１乃至０．７μＭ抑制体濃度をもたらしていることを示す。また、酵素抑制と投与量応答との関係は、この綿線維−抑制体試料についての反応進捗曲線に示された。
【００７０】
ＨＬＥについての抑制の投与量応答は線維抑制体の重さに対する可逆的初期速度（ｌ／ｖ０）の値の直線的な関係から明らかである。同様に、無拘束に溶解した抑制体を用いたＨＬＥについての抑制の投与量応答が、線維から溶液への抑制体の放出について予想される値と同じ濃度範囲にあることも明らかである。このように、重量測定した線維抑制体試料についての初期速度（ｖ０）は、別に評価分析した無拘束溶解抑制体についての値と同等であった。
【００７１】
ＨＬＥについての二相反応進歩は、遊離ペプチドクロロメチルケトン（ＣＭＫ）および線維結合ペプチドにより観測された。この点は低速結合抑制体についても示される。低速結合抑制体についての反応進歩曲線は次式、すなわち
Ｐ＝ｖｓｔ＋（ｖ０−ｖｓ）［１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ）／ｋｏｂｓ＋ｄ
で説明できる。ｋｏｂｓの値はこの式においてｋｏｂｓをＨＬＥの反応進歩曲線に適用することによってこの式から誘導した。線維結合の抑制体および無拘束に溶解した抑制体の酵素による培養前実験についてのｋｏｂｓの値を導き出した。ＨＬＥの線維結合抑制についてのｋｏｂｓの値（表２）は、無拘束抑制体の場合と同じ範囲にあり、同じ割合で減少することを示している。
表２    無拘束ＨＬＥ抑制体および結合ＨＬＥ抑制体についてのｋｏｂｓ値の比較
2004508069.tif 000002
酵素抑制および創傷液体活性の測定
【００７２】
抑制活性の測定を、結合抑制帯および無拘束溶解ＣＭＫ抑制体についてのＩ１０値の比較によって反応進捗曲線の各々から行った。Ｉ５０値は懸濁液における抑制５０％時の抑制体濃度または線維抑制重量を、対照の無拘束反応を１００％活性のベンチマークとして用いることによって反映する。初期の割合対無拘束溶解抑制体の測定結果に基づきＨＬＥの抑制にＩ５０値を割り当てた。ＨＬＥについては、初期割合対無拘束溶解抑制体濃度の測定値は約１１ｎＭの無拘束抑制体および０．６ｍｇの線維抑制体のＩ５０値を明らかにした。
【００７３】
創傷液体におけるエラスターゼ活性の線維抑制体の評価をＨＬＥ含有創傷液体による線維抑制体の培養のあとの一定の時点で基剤加水分解を測定することによって行った。抑制の投与量応答は、線維抑制体試料１ｍｇ乃至５ｍｇを創傷液体の存在下で培養した場合に明白であった。エラスターゼ活性レベルは線維抑制体１乃至５ｍｇの存在下で抑制体なしまたは０乃至１９ｍＵの場合には４０乃至６０ｍＵから低下する（図２Ａ−２Ｃ）。
【００７４】
線維重量の増加に伴うエラスターゼ活性のこの低下は、創傷液体への放出時のセリンプロテアーゼ抑制体の抑制活性を示している。
【００７５】
この実施例に示した結果は、セルローズ支持体に加水分解可能な結合で付けたプロテアーゼ抑制体が創傷液体におけるプロテアーゼの抑制をもたらす能力を備えることを示している。
（実施例３）  カルボキシメチル綿ガーゼおよびジアルデヒド綿ガーゼ
方法
ジアルデヒド綿ガーゼの作成
【００７６】
ジアルデヒド綿ガーゼ（２，３ジアルデヒド−無水グルコーズ−セルローズ、酸化セルローズ、オキシセルローズまたはペルイオデート酸化セルローズともいう）を次のようにして作成した。綿ガーゼ（１２重４ｉｎ．×４ｉｎ．）、ＵＳＰ７型をガーゼスポンジ５０個ロットで三つの互いに異なる条件で処理した。すなわち処理１：ナトリウムペルイオデート０．０７Ｍ溶液をｐＨ４．２、４５℃で１時間にわたり処理する。処理２：ナトリウムペルイオデートの０．２Ｍ溶液をｐＨ４．５、４５℃で３時間にわたり処理する。これらの処理のあと過剰のペルイオデートを水洗で除去した。洗滌のあとガーゼ試料を除湿した。次に、これら試料を分離し一晩自然乾燥させた。乾燥後のガーゼをＣｈｅｘ ａｌｌ ２即時密封パウチ（５ｉｎ．×１０ｉｎ．）に入れマサチューセッツ州アゴーアム所在のＭｉｃｒｏ Ｔｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の装置で酸化エチレンガスにより殺菌した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、線維抑制体によりＨＬＥの抑制の反応進捗曲線（図１Ａ）、および周知の抑制体ＭｅＯＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンにより抑制の進捗曲線（図１Ｂ）を示す。
【図２】エラスターゼ含有創傷液体における線維抑制体についての投与量応答関係を示す。線維抑制体を増量しながら創傷液体中の残留エラスターゼ活性を測定した線維抑制体の表示した量で創傷液体を培養して５分後（図２Ａ）、１５分後（図２Ｂ）、および６０分後（図２Ｃ）に測定を行った。データは、試料中の残留ＨＬＥにより基質Ｎ−メトキシサクシニル−Ａｌａ−Ａｋａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドの触媒作用に起因する４１０ｎｍにおける吸光度である。
【図３】ジアルデヒド綿ガーゼ（ＤＡＧ１および２）中のジカルボニルの百分率レベルおよびカルボキシメチルセルローズ（ＣＭＣ３および４）のカルボン酸塩の百分率レベルを変性綿線維の滴定により測定した。データは３回測定値の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは変性綿ガーゼに曝したのちのＨＬＥ試料におけるヒト好中球エラスターゼ活性の低下の評価である。４Ａ：ＨＬＥ試料を治療方法１、２および３のガーゼ対応の三つの互いに異なる酸化綿ガーゼ試料に曝した（方法、ジアルデヒド綿ガーゼの作成参照）。４Ｂ：ＨＬＥ試料を互いに異なる二つのカルボキシメチル綿ガーゼ試料３および４２５ｍｇおよび５０ｍｇに曝した（方法、カルボキシメチル綿ガーゼ参照）。未処理ガーゼを対象として用いた。
【図５】図５Ａ乃至図５Ｃはエラスターゼのガーゼ処理した溶液についての反応進捗曲線を示す。ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡの６０μＭ溶液で基質の加水分解を行い、反応速度を４０５ｎｍにおけるｐ−ニトロアニリンの放出の分光計計測でモニタした。２５、５０および７５ｍｇのリン酸エステル化綿ガーゼ試料（ＰＳＣ、図５Ａ）、スルホン酸処理ガーゼ（ＳＯＣ、図５Ｂ）、およびジアルデヒド綿ガーゼ（ＤＡＧ、図５Ｃ）を未処理綿ガーゼ（ＵＴ）７５ｍｇと比較した。
【図６】未処理ガーゼ（ＵＴ）、ジアルデヒドガーゼ（ＤＡＧ）、スルホン酸ガーゼ（ＳＯＣ）、カルボキシメチルガーゼ（ＣＭＣ）、リン酸エステルガーゼ（ＰＳＣ）に曝した試料における残留エラスターゼ活性の初期速度（ｖ０）をガーゼ処理を施してない試料の場合と比較した。ガーゼ試料の重みは７５ｍｇ（Ａ）、５０ｍｇ（Ｂ）および２５ｍｇ（Ｃ）であった。データは３回測定値の平均Ｓ．Ｄ．である。分散の分析から算定されるとおり、試料はすべて対象ｐ＜０．０５と著しく異なっている。
【図７】参照文献リスト。