(57)【要約】  異常行動を示し、かつ、ゲノム中のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常行動を示し、かつ、ゲノム中のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
異常行動が、（ａ）正常非ヒト哺乳動物に比べて活動期の自発行動量の増大が認められる一方、明暗周期で見られる自発行動の日内リズムには差異は認められない行動である請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
異常行動が、（ｂ）歩行時に不規則な右又は左回転を示す行動である請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
異常行動が、（ｃ）活動モードに入るとケージ内を落ち着きなく移動する行動である請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
更に、（ｄ）不安症状の減少と認知機能の低下が認められる請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物である請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物が、マウス又はラットである請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物が、マウスである請求項７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
ヒト注意欠陥・多動性障害のモデル動物である請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
ヒト統合失調症のモデル動物である請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
ターゲティングベクターを用いて、胚性幹細胞に遺伝子を導入してＳｐｓｂ４遺伝子を改変する工程、該胚性幹細胞由来のヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する工程、及び、該ヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を１世代以上交配することにより、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物を得る工程を含むことを特徴とする異常行動を示す非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項１２】
（Ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の異常行動を示す非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、（ＩＩ）該非ヒト哺乳動物の多動性の変化を検定する工程、及び、（ＩＩＩ）候補物質を投与しない場合に比べて、多動性が低下する候補物質を選択する工程を含むことを特徴とする抗ＡＤＨＤ薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
（Ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の異常行動を示す非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、（ＩＩ）該非ヒト哺乳動物の多動性の変化を検定する工程、及び、（ＩＩＩ）候補物質を投与しない場合に比べて、多動性が低下する候補物質を選択する工程を含むことを特徴とする統合失調症治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常行動を示す遺伝子改変非ヒト哺乳動物及びその作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトの注意欠陥・多動性障害（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔ／Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ＡＤＨＤ）及び統合失調症の原因解明と予防及び治療法の確立に有用な、異常行動を示す遺伝子改変非ヒト哺乳動物、その作製方法、並びに抗ＡＤＨＤ薬及び統合失調症治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）は、主に幼児期から学齢期の児童に認められる、不注意、多動性及び衝動性を中核症状とした精神疾患である。ＡＤＨＤ児童の増加が欧米でも大きな社会問題となっているが、近年、子供時代の障害だけでなく、成人になってもＡＤＨＤが継続することが明らかにされている。【０００３】
ＡＤＨＤの発症原因は不明であり、そのため有効な予防法や治療法が確立されていない。ＡＤＨＤの原因の解明とその予防法、そして治療法及び治療薬の確立のためには、この疾患の動物モデルが不可欠であるが、有用なモデル動物が現在十分に開発されていない。【０００４】
ヒトＡＤＨＤに類似した多動性障害を発現するモデル動物として、肝炎・肝癌・ヒトＷｉｌｓｏｎ病モデルＬＥＣラットのうち、（ａ）歩行中の連続的な頭部振動、（ｂ）突然の旋回運動、および（ｃ）後方への頭部伸長運動を示す多動性障害モデルラットが開示されている（特許文献１を参照）。この多動性モデルラットは、肝炎・肝癌・ヒトＷｉｌｓｏｎ病モデルＬＥＣラットのオリジナル系統の維持過程で、通常のラットとは異なる行動上の特徴をもつ個体が見出されたものであり、この異常行動形質が常染色体単一性劣性遺伝様式をとることが示唆されている。【０００５】
一方、遺伝子機能の解明のために種々の遺伝子改変動物が作製され、利用されている。例えば、ＡＤＨＤの発症にかかわる遺伝子を同定し、ＡＤＨＤの原因遺伝子改変によるモデル動物を得ることができれば、ＡＤＨＤの発症機構の新たな側面を知ることにつながり、ＡＤＨＤの治療法、具体的には新規な薬剤等を開発する上で極めて有用である。従って、このようなモデル動物の開発が望まれている。
【特許文献１】特開２００１−１８６８２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＡＤＨＤ及び統合失調症の治療法及び治療薬の開発に有用なモデル動物である、異常行動を示す遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供することを目的とする。本発明はまた、このような異常行動を示す遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法、及び、該非ヒト哺乳動物を用いてＡＤＨＤ及び統合失調症の予防及び／又は治療に有用な物質を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞を利用しなくても、マウスの交配だけで遺伝子改変マウスを作製することができる技術を開発し、以前に報告した（例えば、特表２００２−０１３６０２号公報、及びHorie et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 23, No 24, p. 9189-9207(2003)を参照）。これは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（以下、ＳＢともいう）トランスポゾンのトランスポジションを利用することによって、染色体に効率よく遺伝子を導入することができる技術である。このマウストランスポゾンシステムを用いて、網羅的に遺伝子改変マウスを作製したところ、作製した遺伝子改変マウスの中に以下の（１）〜（３）の異常行動を示すマウスを発見した。
（１）正常（野生型）マウスと比較して、出生後〜授乳中における異常性は認められないが、離乳期頃（３週齢）より歩行時に不規則な右又は左回転を示すようになる（回転運動）、
（２）正常マウスと同様に静穏時はケージ隅で群をなしているが、活動モードに入るとケージ内を落ち着きなく移動する（多動性）、及び、
（３）赤外線センサー式測定機器を用いた長期的（半日以上）な自発行動量の測定において、正常マウスに比べて暗期（活動期）の自発行動量の増大（多動性）が認められ、一方、明暗周期で見られる自発行動の日内リズムには差異は認められない。
また、（１）〜（３）の異常行動を示す遺伝子改変マウスについて更に詳細な行動解析を行ったところ、これらのマウスには不安症状の減少と認知機能の低下が認められ、このようなマウスの行動が、発達障害の一つと言われている注意欠陥・多動性障害（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｔ  Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ＡＤＨＤ）の症状に非常に類似することを見出した。また、（２）及び（３）の多動性については、ヒトの統合失調症に対する治療薬に対して感受性を示すことを見出した。【０００８】
更に、遺伝子解析により遺伝子改変部位を調べたところ、このマウスではトランスポゾンがＳｐｓｂ４（ｓｐｌＡ／ｒｙａｎｏｄｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ＳＯＣＳ  ｂｏｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４）遺伝子配列中に挿入されていることを見出した。すなわち、トランスポゾンによってＳｐｓｂ４遺伝子のみが破壊されていた。この結果は、Ｓｐｓｂ４遺伝子の異常とＡＤＨＤ及び統合失調症とが関連していることを強く示唆するものである。これまで、Ｓｐｓｂ４遺伝子配列やアミノ酸配列から動物の異常行動を予測した研究については報告されておらず、Ｓｐｓｂ４遺伝子とＡＤＨＤ及び統合失調症とを関連付けた報告もなされていない。従って、このような単一遺伝子の異常により異常行動を呈する本発明の非ヒト哺乳動物は、ヒトＡＤＨＤ及びヒト統合失調症のモデル動物として、基礎的事項の解析と臨床応用との両方において有用なものである。更に、Ｓｐｓｂ４遺伝子改変マウスにヒトのＡＤＨＤ治療薬や総合失調症治療薬を投与したところ、異常行動が改善されることを見出し、このような動物の異常行動が、これらの疾患に関連する病態を反映するものであること、このような遺伝子改変非ヒト哺乳動物がＡＤＨＤ及び統合失調症の治療法及び治療薬の開発に非常に有用であることに想到し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
即ち、本発明は
（１）異常行動を示し、かつ、ゲノム中のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物、
（２）異常行動が、（ａ）正常非ヒト哺乳動物に比べて活動期の自発行動量の増大が認められる一方、明暗周期で見られる自発行動の日内リズムには差異は認められない行動である上記（１）に記載の非ヒト哺乳動物、
（３）異常行動が、（ｂ）歩行時に不規則な右又は左回転を示す行動である上記（１）に記載の非ヒト哺乳動物、
（４）異常行動が、（ｃ）活動モードに入るとケージ内を落ち着きなく移動する行動である上記（１）に記載の非ヒト哺乳動物、
（５）更に、（ｄ）不安症状の減少と認知機能の低下が認められる上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、
（６）一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物である上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、
（７）非ヒト哺乳動物が、マウス又はラットである上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物が、マウスである上記（７）に記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ヒト注意欠陥・多動性障害のモデル動物である上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、及び、
（１０）ヒト統合失調症のモデル動物である上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物、
に関する。【００１０】
本発明はまた、
（１１）ターゲティングベクターを用いて、胚性幹（ＥＳ）細胞に遺伝子を導入してＳｐｓｂ４遺伝子を改変する工程、該胚性幹細胞由来のヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する工程、及び、該ヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を１世代以上交配することにより、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物を得る工程を含むことを特徴とする異常行動を示す非ヒト哺乳動物の作製方法、
に関する。【００１１】
本発明はまた、
（１２）（Ｉ）上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の異常行動を示す非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、（ＩＩ）該非ヒト哺乳動物の多動性の変化を検定する工程、及び、（ＩＩＩ）候補物質を投与しない場合に比べて、多動性が低下する候補物質を選択する工程を含むことを特徴とする抗ＡＤＨＤ薬のスクリーニング方法、
に関する。【００１２】
本発明はまた、
（１３）（Ｉ）上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の異常行動を示す非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、（ＩＩ）該非ヒト哺乳動物の多動性の変化を検定する工程、及び、（ＩＩＩ）候補物質を投与しない場合に比べて、多動性が低下する候補物質を選択する工程を含むことを特徴とする統合失調症治療薬のスクリーニング方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の異常行動を示す遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、ヒトＡＤＨＤ及びヒト統合失調症のモデル動物として、ＡＤＨＤ及び統合失調症の原因の解明とその予防法、治療法及び治療薬の開発に非常に有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】正常マウスと実施例１で作製した異常行動を示すホモ型遺伝子改変マウスの自発行動及び日内リズムを測定した結果を示す図である。白丸（ｗｔ／ｗｔ）及び黒丸（Ｔｐ／Ｔｐ）は、それぞれ正常マウス及びホモ型遺伝子改変マウスを表す。
【図２】Ｓｐｓｂ４遺伝子へのトランスポゾンの挿入部位を示す図である。
【図３】ＰＣＲ法によるＳｐｓｂ４変異マウスの同定方法を示す図である。ｐ１、ｐ２及びｐ３は、ＰＣＲに用いたプライマーを表す。
【図４】不安の検定の試験結果を示す図である。Ａは、オープンアームでの滞在時間を示す。Ｂは、クローズドアームでの滞在時間を示す。Ｃは、ヘッドディップス（オープンアームへの覗き込み回数）を示す。＊は、正常マウスに対してＰ＜０．０５であることを意味し、＊＊は、正常マウスに対してＰ＜０．０１であることを意味する。ｗｔ／ｗｔは、正常マウスを、Ｔｐ／Ｔｐはホモ型遺伝子改変マウスをそれぞれ表す。
【図５】オープンフィールドテストの試験結果を示す図である。Ａは、内円歩行量の測定結果を示す。Ｂは、外円歩行量の測定結果を示す。ｗｔ／ｗｔ、Ｔｐ／ｗｔ及びＴｐ／Ｔｐは、正常マウス、ヘテロ型遺伝子改変マウス及びホモ型遺伝子改変マウスをそれぞれ表す。
【図６】認知機能の試験における、探索嗜好性の算定結果を示す図である。左図は訓練試行における探索嗜好性を示し、右図は保持試行における探索嗜好性を示す。ｗｔ／ｗｔ、Ｔｐ／ｗｔ及びＴｐ／Ｔｐは、正常マウス、ヘテロ型遺伝子改変マウス及びホモ型遺伝子改変マウスをそれぞれ表わす。
【図７】攻撃性試験の試験結果を示す図である。Ａは、にじり寄り行動の測定結果を示し、Ｂは、総接触時間の測定結果を示す。ｗｔ／ｗｔは、正常マウスを、Ｔｐ／Ｔｐはホモ型遺伝子改変マウスをそれぞれ表わす。
【図８】マウスへの薬投与試験の結果を示す図である。Ａは、正常マウスへの薬投与試験の結果を示す。Ｂは、ホモ型遺伝子改変マウスへの薬投与試験の結果を示す。図中、Ｎｏｎｅ（丸）は、薬を投与しなかったマウス、ＭＰＤ（三角）は、塩酸メチルフェニデートを投与したマウス、ＣＬＺ（四角）は、クロザピンを投与したマウスである。
【図９】薬投与群及び非投与群の自発行動量の積算値を示す図である。図中、Ｎｏｎｅは、薬を投与しなかったマウス、ＭＰＤは、塩酸メチルフェニデートを投与したマウス、ＣＬＺは、クロザピンを投与したマウスである。ｗｔ／ｗｔは、正常マウスを、Ｔｐ／Ｔｐはホモ型遺伝子改変マウスをそれぞれ表わす。＊＊は、正常マウスに対してＰ＜０．０１であることを意味し、++は、薬物非投与群に対してＰ＜０．０１であることを示す。
【図１０】ジーンターゲティング法によるＳｐｓｂ４遺伝子への変異導入の手順を示す図である。
【図１１】サザンブロット法によりＳｐｓｂ４遺伝子の変異を確認した結果を示す図である。Ａは、ＢｓｔＺＩ及びＫｐｎＩで切断したＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを図１０のｐｒｏｂｅＡ及びＢで解析した結果であり、Ｂは、Ａと同様にＢｓｔＺＩ及びＫｐｎＩで切断したＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを図１０のｐｒｏｂｅ  ｎｅｏで解析した結果である。
【図１２】Ｓｐｓｂ４変異マウスの作製フローを示す概略図である。
【図１３】オープンフィールドテストにおいて移動距離を調べた結果を示す図である。Ａ及びＣは、オープンフィールドにおけるマウスの１０分毎の移動距離の推移を示す。Ｂ及びＤは、オープンフィールドにおけるマウスの６０分間の総移動距離を示す。ｗｔ／ｗｔは、正常マウスを表す。Ｔｐ／Ｔｐ及びＴｐ／ｗｔは、実施例１で作製したホモ型遺伝子改変マウス及びヘテロ型遺伝子改変マウスを、それぞれ表わす。Ｔｐ／Ｄｅｌは、一対の染色体の一方のＳｐｓｂ４遺伝子がトランスポゾンの転移によって改変され、他方のＳｐｓb４遺伝子がジーンターゲティング法により欠損した遺伝子改変マウスを表わす。＊は、正常マウスに対してＰ＜０．０５であることを意味し、＊＊は、正常マウスに対してＰ＜０．０１であることを意味し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１であることを意味する。
【図１４】オープンフィールドテストにおいて移動軌跡を調べた結果を示す図である。Ａ及びＣは、オープンフィールドにおける正常マウス（ｗｔ／ｗｔ）の移動軌跡を、Ｂ、Ｄ及びＥは、遺伝子改変マウスの移動軌跡をそれぞれ示す。Ｔｐ／Ｔｐ及びＴｐ／ｗｔは、実施例１で作製したホモ型遺伝子改変マウス及びヘテロ型遺伝子改変マウスを、それぞれ表わす。Ｔｐ／Ｄｅｌは、一対の染色体の一方のＳｐｓｂ４遺伝子がトランスポゾンの転移によって改変され、他方のＳｐｓb４遺伝子がジーンターゲティング法により欠損した遺伝子改変マウスを表わす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書中、「異常行動」とは、行動学的解析の後、対照群である正常（野生型）動物と比較して統計学的に差異が認められるものと定義する。すなわち、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物には、目視での観察下において歩行時の回転運動及び／又は多動性の異常行動が認められるが、これらの行動を薬効評価等の解析における客観的指標にするには困難であると考えられるため、非ヒト哺乳動物の行動（自発行動、不安行動、環境馴化、探索行動、社会行動等）を実験科学的に計測したうえ、野生型動物群の測定値との群間比較において有意水準５％以下（Ｐ＜０．０５）のものを異常行動動物とする。好ましくは、非ヒト哺乳動物の異常行動の実験計測値が、野生型動物群の測定値との群間比較において有意水準１％以下（Ｐ＜０．０１）の動物である。【００１６】
（Ｉ）異常行動について
本発明の非ヒト哺乳動物は、異常行動を示すものであるが、異常行動としては、（ａ）正常非ヒト哺乳動物に比べて活動期の自発行動量の増大が認められる一方、明暗周期で見られる自発行動の日内リズムには差異は認められない行動、（ｂ）歩行時に不規則な右又は左回転を示す行動、（ｃ）外的刺激によって一度活動モードに入るとケージ内を落ち着きなく移動する行動が挙げられる。好ましくは、（ａ）又は（ｃ）の多動性と、（ｂ）の回転運動とを示す非ヒト哺乳動物である。より好ましくは、（ａ）及び（ｃ）の多動性並びに（ｂ）の回転運動を示す非ヒト哺乳動物である。【００１７】
具体的には、本発明の非ヒト哺乳動物は、長期的（半日以上）な自発行動量の測定において、（ａ）の行動を示す。例えば、非ヒト哺乳動物がマウスであれば、マウスは夜行性であるので、正常（野生型）マウスでは活動期（夜間：暗期）には自発行動量が増大し、静穏期（昼間：明期）には自発行動量が減少する。本発明の非ヒト哺乳動物は、図１に示すように、正常マウスと同様に活動期（暗期）に自発行動量が増加し、静穏期（明期）に自発行動量が減少するため、自発行動の日内リズムは保たれている。しかしながら、活動期の自発行動量は、正常マウスと比べて顕著に増大している。【００１８】
本発明の非ヒト哺乳動物においては、正常非ヒト哺乳動物と比較して、出生後〜授乳中には異常性は認められない。しかしながら、本発明の非ヒト哺乳動物は、離乳期（マウスであれば、３週齢）頃より（ｂ）の歩行時に不規則な右又は左回転を示すようになる。すなわち、歩行時に不規則に右又は左に旋回する行動を頻繁に示す。【００１９】
（ｃ）の行動については、本発明の非ヒト哺乳動物は、静穏期には正常非ヒト哺乳動物と同様に行動量が少なくケージ隅で群をなしているが、例えば、外的刺激によって一度活動モードに入ると正常動物と比べてケージ内を落ち着きなく移動する。【００２０】
（a）及び（ｃ）の多動性については、例えば、ケージに非ヒト哺乳動物を入れ、上部に設置した赤外線センサー式測定機器（ＮＳ−ＡＳ０１；ニューロサイエンス、東京）によって自発行動量を検出し、検出シグナルを短期データ集録解析システム（ＤＡＳ−００８；ニューロサイエンス、東京）を用いて数値化することによって評価することができる。また、Ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔによっても評価することができる。
（ｂ）の行動については、正常非ヒト哺乳動物はこのような回転行動を示さないので、目視によって正常非ヒト哺乳動物との差異を確認することができる。【００２１】
本発明の非ヒト哺乳動物は、更に、（ｄ）不安症状の減少と認知機能の低下が認められるものであることが好ましい。（ａ）〜（ｃ）の異常行動を示し、かつ（ｄ）が認められる非ヒト哺乳動物の行動は、ＡＤＨＤの患者の症状と非常に似ているため、このような動物はＡＤＨＤのモデル動物として非常に有用である。【００２２】
（ｄ）の不安症状については、例えば、非ヒト哺乳動物がマウスの場合には、実施例に記載する高架式十字迷路試験やＯｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔによって評価することができる。認知機能については、例えば、実施例に記載する新奇対象物探索試験により評価することができる。【００２３】
（ＩＩ）Ｓｐｓｂ４遺伝子の改変
本発明の異常行動を示す非ヒト哺乳動物においては、ゲノム中のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されている。Ｓｐｓｂ４遺伝子は、ヒト、イヌ、ラット、マウス等の哺乳類に広く存在する遺伝子であり、Ｃｕｌｌｉｎ型Ｅ３ユビキチンリガーゼのＥＣＳ複合体をコードしていることが知られている。例えば、マウスのＳｐｓｂ４遺伝子については、マウスゲノムインフォマティックス（Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）に、ＩＤ番号  ＭＧＩ：２１８３４４５で登録されている。また、以下のｗｅｂ  ｓｉｔｅに、その詳細な情報が記載されている。
http://www.informatics.jax.org/javawi2/servlet/WIFetch?
page=markerDetail&key=82615【００２４】
「遺伝子が改変されている」とは、Ｓｐｓｂ４遺伝子のＤＮＡ領域の一部又は全部が改変されていることを意味する。Ｓｐｓｂ４遺伝子のＤＮＡ領域の一部又は全部が改変されているとは、Ｓｐｓｂ４遺伝子のゲノムＤＮＡの一部が変更、付加、削除又は置換されていること、又は、特定の範囲の領域に逆位を生じさせていること等をいう。Ｓｐｓｂ４遺伝子の改変は、Ｓｐｓｂ４遺伝子が不活性化されていればよい。Ｓｐｓｂ４遺伝子を不活性化するために、Ｓｐｓｂ４遺伝子に対して変更、付加、削除又は置換のうち２つ以上の方法を用いてもよい。「不活性化」とは、変更したＳｐｓｂ４遺伝子の発現産物が機能しないか又は存在しないようにすることをいう。【００２５】
本発明において、ゲノムＤＮＡの「変更」とは、Ｓｐｓｂ４遺伝子のゲノムＤＮＡ配列中に１又はそれ以上の塩基置換を導入し、当該変更したＳｐｓｂ４遺伝子の発現産物が機能しないか又は存在しないようにすることをいう。本発明においてゲノムＤＮＡの「削除」とは、Ｓｐｓｂ４遺伝子のゲノムの一部又は全部を欠失させることにより、Ｓｐｓｂ４遺伝子の発現産物が機能しないか又は存在しないようにすることをいう。本発明において、ゲノムＤＮＡに対して「挿入」とは、Ｓｐｓｂ４遺伝子中に、Ｓｐｓｂ４遺伝子以外の配列を有するＤＮＡを挿入することにより、当該Ｓｐｓｂ４遺伝子以外のＤＮＡを挿入したＳｐｓｂ４遺伝子の発現産物が機能しないか又は存在しないようにすることをいう。本発明において、ゲノムＤＮＡの「置換」とは、Ｓｐｓｂ４遺伝子のゲノムの一部又は全部をＳｐｓｂ４遺伝子とは関連しない別個の配列により置換し、Ｓｐｓｂ４遺伝子の発現産物が機能しないか又は存在しないようにすることをいう。【００２６】
また、改変位置、すなわち変異が導入される部分がエクソンの３’側であると、エクソンの５’側が正常に転写及び翻訳される場合、Ｓｐｓｂ４遺伝子にコードされるタンパク質のＮ末端側は発現する可能性がある。従って、Ｓｐｓｂ４遺伝子の改変位置としては、イントロンの場合には、遺伝子の上流のエクソン１とエクソン２との間が好ましい。Ｓｐｓｂ４遺伝子の改変位置がエクソンの場合には、タンパク質の大部分がコードされているエクソン２を削除することが好ましい。【００２７】
本発明の非ヒト哺乳動物は、一対の染色体の片側のＳｐｓｂ４遺伝子のみが改変された、ヘテロ型Ｓｐｓｂ４遺伝子改変動物であってもよく、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物であってもよい。好ましくは、ホモ型遺伝子改変動物である。後述するように、ヘテロ型Ｓｐｓｂ４遺伝子改変動物を１又は２世代以上交配することにより、ホモ型遺伝子改変動物を得ることができる。【００２８】
本発明の非ヒト哺乳動物の種類としては特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。これらの中でも、取扱いが容易で繁殖しやすいことかららマウス又はラットが好ましく、マウスが最も好ましい。【００２９】
本発明の非ヒト哺乳動物を作製する方法としては、例えば、実施例に記載するように（Ｉ）トランスポゾン配列を有し、且つ、全身の細胞に少なくとも１つの転位部位を有するヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する工程（Ａ）、作製したヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物の中からＳｐｓｂ４遺伝子が改変された動物を選択する工程（Ｂ）、及び、Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変されたヘテロ型遺伝子改変動物を２世代以上交配することにより、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物を得る工程（Ｃ）を含む方法、又は、（ＩＩ）ターゲティングベクターを用いて、胚性幹（ＥＳ）細胞に遺伝子を導入してＳｐｓｂ４遺伝子を改変する工程（Ｄ）、該ＥＳ細胞由来のヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する工程（Ｅ）、及び、該ヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を１世代以上交配することにより、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物を得る工程（Ｆ）を含む方法が挙げられる。本発明の異常行動を示す非ヒト哺乳動物を再現性よく作製するためには、（ＩＩ）の方法が好適である。なお、これらの方法は、本発明の非ヒト哺乳動物の作製方法の一例であり、本発明の非ヒト哺乳動物の作製方法は以下の方法に限定されるものではない。また、必要に応じて以下に示す方法に適宜修飾及び／又は変更を加えることもできる。【００３０】
（Ｉ）の方法において、トランスポゾン配列を有し、且つ、全身の細胞に少なくとも１つの転位部位を有するヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、トランスポゾンの転位に由来する遺伝子変異が非ヒト哺乳動物の細胞全体の大部分で共通しているものである。このような非ヒト哺乳動物は、例えば、トランスポゾン配列及びトランスポゼース遺伝子を両方有する非ヒト哺乳動物（ダブルトランスジェニック非ヒト哺乳動物）と野生型非ヒト哺乳動物とを交配することにより得ることができる。【００３１】
本発明におけるトランスポゾン配列とは、トランスポゼースの作用によりゲノム中の多様な位置に挿入し得る、自身では非転位性のＤＮＡセグメントであり、通常両末端に反復配列（逆向きの繰返し構造）を有するものである。ただし、該繰返し構造は、トランスポゼースの作用により転位（ゲノム中の他の位置に挿入）可能であれば、不完全な繰り返し部分を含んでいてもよい。トランスポゾン配列の両末端に逆向きの繰返し構造に挟まれる部分には、様々なＤＮＡ配列、例えば、マーカー遺伝子、遺伝子発現調節配列、所望の遺伝子等を挿入することができる。トランスポゾンが挿入されるＤＮＡ中の、トランスポゾンの転位において機能する短いヌクレオチド配列は標的配列と呼ばれ、トランスポゾン挿入の際には標的配列の重複が生じ、トランスポゾンは標的配列の２つの同一コピー間に挟まれた状態になる。例えば、後述するＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンでは、標的配列はＴＡであり、トランスポゾンの転位部位の配列は、ＴＡ−トランスポゾン−ＴＡとなる。【００３２】
上記（Ｉ）の方法における工程（Ａ）の好ましい実施形態の一例を、以下に示す。
まず、トランスポゼース遺伝子含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物及びトランスポゾン配列含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する（工程ａ１）。工程ａ１では、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞又は受精卵の中にトランスポゼース遺伝子又はトランスポゾン配列を導入することによって、トランスポゼース遺伝子含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物又はトランスポゾン配列含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することができる。ＥＳ細胞及び受精卵へのトランスポゾン配列又はトランスポゼース遺伝子導入のために用いる方法としては、公知の方法が使用できる。好ましくは、例えば、ＥＳ細胞への導入法としてレトロウィルスベクターを用いる方法又はエレクトロポレーション法が挙げられる。受精卵への導入法として、マイクロインジェクション法等が挙げられる。【００３３】
トランスポゼース遺伝子としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゼース遺伝子が好ましい。また、トランスポゾン配列としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（ＳＢ）配列が好ましい。例えば、遺伝子改変マウスを作製する場合には、Horie et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 23, No 24, p. 9189-9207(2003)に記載されている方法に従って、ＳＢトランスポゼース遺伝子含有トランスジェニックマウス及びトランスポゾン配列含有トランスジェニックマウスを作製することができる。なお、本明細書中、「ＳＢトランスポゾン」又は「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン」とは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンであって、哺乳動物又はその細胞においてトランスポゾン活性を有するものをいう（Z.Ivics et al.;Cell,91:501-510(1997)）。【００３４】
このトランスポゼース遺伝子含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物とトランスポゾン配列含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物とを交配することにより、ダブルトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する（工程ａ２）。得られたダブルトランスジェニック非ヒト哺乳動物の遺伝子型をＰＣＲ等により同定してトランスポゾン配列及びトランスポゼース遺伝子両方を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物（シード非ヒト哺乳動物ともいう）を選別する（工程ａ３）。このシード非ヒト哺乳動物と正常（野生型）非ヒト哺乳動物とを交配することにより、子孫の中から、一対の染色体の片方の遺伝子が改変されたヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を得ることができる（工程ａ４）。次いで、このヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物の中からＳｐｓｂ４遺伝子が改変された動物を選択する（工程Ｂ）。作製したヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物の中からＳｐｓｂ４遺伝子が改変された動物を選択する方法としては特に限定されない。例えば、得られた非ヒト哺乳動物の尾等を切断して遺伝子を採取し、特異的なプライマーを用いるＰＣＲ法により、Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変された動物を選択することができる。【００３５】
Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変されたヘテロ型遺伝子改変動物を２世代以上交配することにより、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物を得ることができる（工程Ｃ）。【００３６】
ＥＳ細胞を用いる（ＩＩ）の方法は、工程（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）を含むが、工程（Ｄ）は、例えば、遺伝子組換え技術を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでターゲティングベクターを作製する工程（ｄ１）を含んでもよい。また工程（Ｄ）においては、ターゲティングベクターを用いて、胚性幹（ＥＳ）細胞に遺伝子を導入してＳｐｓｂ４遺伝子を改変する工程（ｄ２）を行なった後、遺伝子導入されたＥＳ細胞のうち、Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変されたものを選択する工程（ｄ３）を行なうことが好ましい。また工程（Ｅ）は、Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変されたＥＳ細胞を正常非ヒト哺乳動物由来の胚盤胞に移入してキメラ非ヒト哺乳動物を得る工程（ｅ１）、及び得られたキメラ非ヒト哺乳動物を正常非ヒト哺乳動物と交配する工程（ｅ３）を含むことが好ましい。なお工程（Ｅ）においては、必要に応じて、工程ｅ１を行なった後、キメラ非ヒト哺乳動物を選択する工程（ｅ２）を行なってもよく、さらに、工程ｅ３を行なった後、変異の導入された非ヒト哺乳動物を選択する工程（ｅ４）を行なってもよい。【００３７】
ＥＳ細胞を用いる（ＩＩ）の方法の好ましい実施形態の１つにおいては、例えば、まず遺伝子組換え技術を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでターゲティングベクターを作製し（工程ｄ１）、そのベクターをＥＳ細胞に遺伝子導入することによりＳｐｓｂ４遺伝子を改変（例えば、破壊）する（工程ｄ２）。遺伝子導入されたＥＳ細胞のうち、Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変されたものをサザンブロット等の方法により選択する（工程ｄ３）。次にＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたＥＳ細胞を正常非ヒト哺乳動物由来の胚盤胞に移入してキメラ非ヒト哺乳動物を作製し（工程ｅ１）、得られたキメラ非ヒト哺乳動物を正常非ヒト哺乳動物と交配する（工程ｅ３）ことにより、ＥＳ細胞由来の非ヒト哺乳動物を作製することができる。このＥＳ細胞由来の非ヒト哺乳動物は、一対の染色体の片方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物である。次いで、このヘテロ型遺伝子改変非ヒト哺乳動物を１世代以上交配することにより、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物を得ることができる（工程Ｆ）。【００３８】
上記（ＩＩ）の方法により異常行動遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製する方法について、以下に具体的に示す。
（１）ターゲッティングベクターの作製（工程ｄ１）
まず、ＤＮＡライブラリーから、作製しようとする変異動物のＳｐｓｂ４遺伝子中の変異させる部位を含むＤＮＡ断片を得る。ＤＮＡ断片は、ＥＳ細胞の相同組換えを行うためのターゲッティングベクターを構築するために使用する。このＤＮＡ断片は、相同組換えを行うときにより効率よく組換えが生じるよう、作製しようとするＥＳ細胞と同一の配列を有するＤＮＡを単離して使用することが好ましい。例えば、変異を導入する動物としてマウスを用いる場合には、ＥＳ細胞由来のジェノミックＤＮＡライブラリーから、Ｓｐｓｂ４遺伝子のエクソン２を削除又は他の遺伝子で置換し得るようなマウスのＤＮＡ断片を調製する。【００３９】
Ｓｐｓｂ４遺伝子を改変する方法としては、通常の部位特異的遺伝子変異導入法を利用することができる。例えば、BAC recombineering（Lee, E.C. et al. Genomics, vol. 73, p. 56-65 (2001)を参照）等の方法を用いて目的の変異を導入することができる。【００４０】
改変したＳｐｓｂ４遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクター中に挿入することにより、ターゲティングベクターを作製する。ターゲッティングベクターは、変異を導入した染色体ＤＮＡ断片、選択マーカーをコードするＤＮＡ断片、これの転写を制御するためのプロモーター、及びターミネーターを含む選択マーカー発現ユニットを必須要素として含んでいることが好ましい。変異を導入した染色体ＤＮＡ断片は、ＥＳ細胞内で相同組換えを起こすために必要な部分であり、変異を導入した箇所を挟んで前後の染色体ＤＮＡ断片が必要である。すなわち、ターゲッティングベクターは、変異させた塩基のみが本来の染色体ＤＮＡとは異なるＤＮＡ断片を持っている。変異を導入した箇所を挟む前後の染色体ＤＮＡ断片の長さはそれぞれ１０ｋｂｐ程度が好ましいが、一般的には多少の長さの増減は許容される。もっとも、あまりに短い場合には、ＥＳ細胞内での相同組換えの頻度が低下する場合がある。【００４１】
選択マーカーをコードするＤＮＡ断片としては、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等が好適である。薬剤耐性遺伝子としては、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子等が挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子等が挙げられる。プロモーターとしては、ＣＡＧプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ−１）プロモーター、伸長因子２（ＥＦ−２）プロモーター、ＭＣ−１プロモーター等を使用することができる。【００４２】
改変したＳｐｓｂ４遺伝子を含むＤＮＡ断片が導入されるターゲティングベクターの基本骨格となるベクターとしては特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＺＥｒＯ １．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等を使用することができる。【００４３】
（２）ＥＳ細胞へのベクターの導入（工程ｄ２）と遺伝子導入されたＥＳ細胞の選択（工程ｄ３）
作製したターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した後、ＥＳ細胞を培養し、出現してくるコロニーを採取する。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株及び新しく樹立した細胞株のいずれをも使用することができる。ＥＳ細胞への遺伝子導入は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の方法を採用することができるが、簡便に多数の細胞を処理できる点でエレクトロポレーション法が好ましい。【００４４】
導入遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法によりスクリーニングすることによって、Ｓｐｓｂ４遺伝子が破壊されたものを選択することができる。あるいは、上述したような薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子を含むベクターを用いることによってセレクションを行ってもよい。ターゲッティングベクター導入後のＥＳ細胞を選択マーカー存在下で培養すると、生き残ってコロニーを形成するＥＳ細胞は相同組換えを起こしている可能性がある。これらのコロニーを形成したＥＳ細胞の中から相同組換えを起こしている細胞を調べる方法として一般的にはＰＣＲ法が用いられるが、プローブとして使用できるＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、合成オリゴデオキシヌクレオチド、又は抗体等を使用することも可能である。【００４５】
（３）トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製（工程Ｅ）
Ｓｐｓｂ４遺伝子の破壊が確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚盤胞に移入することにより、該ＥＳ細胞が宿主胚の細胞塊に組み込まれてキメラ胚が形成される。このキメラ胚を仮親に移植して発生及び生育させることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる（工程ｅ１）。例えば、マウスを用いる場合には、別途、妊娠マウスから胚盤胞を取り出し、選択されたＥＳ細胞を移入した後、偽妊娠させたメスマウスの子宮に導入する。そして、仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ（工程ｅ２）。キメラ動物は、例えば、ＥＳ細胞が１２９マウスから由来している場合、毛色で選択することができる。キメラ動物を正常な動物と交配し（工程ｅ３）、生まれてきた仔の尾等からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって変異の導入されたものを選択する（工程ｅ４）ことにより、Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変されたヘテロ型動物を得ることができる。【００４６】
具体的な選択方法としては、得られる仔の尾の一部を採取し、染色体ＤＮＡを抽出する。抽出した染色体ＤＮＡを基質として、Ｓｐｓｂ４遺伝子の突然変異部位を挟むように設計した塩基配列を持つ二本のオリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行い、バンドの有無、バンドのゲル上での移動度、変異部位を含む塩基配列を持つオリゴデオキシヌクレオチドを用いたハイブリダーゼーションによる変異を含むバンドの確認等により、抽出した染色体ＤＮＡに、改変されたＳｐｓｂ４遺伝子が含まれているかどうかを調べることができる。ＰＣＲのプライマーに使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、改変Ｓｐｓｂ４遺伝子を検出できるものであればいかなるものでもよい。ＰＣＲの結果に基づいて、改変Ｓｐｓｂ４遺伝子を持つ動物を選抜することにより、改変Ｓｐｓｂ４遺伝子をヘテロで持つ動物を得ることができる。
改変Ｓｐｓｂ４遺伝子をヘテロで持つ動物を１世代以上交配することにより、一対の染色体の両方のＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたホモ型遺伝子改変動物を得ることができる（工程Ｆ）。【００４７】
本発明の非ヒト哺乳動物の異常行動は、ヒトのＡＤＨＤ治療薬及び総合失調症治療薬に感受性を示す。すなわち本発明の非ヒト哺乳動物にＡＤＨＤ治療薬又は総合失調症治療薬を投与すると、多動性が改善される。従って、本発明の非ヒト哺乳動物の異常行動は、これらの疾患に関連する病態を反映するものであると考えられる。ＡＤＨＤ治療薬及び総合失調症治療薬としては特に限定されないが、例えば、塩酸メチルフェニデート（化学名：メチルα−フェニル−２−ピペリジンアセテート塩酸塩）、クロザピン（化学名：８−クロロ−１１−（４−メチルピペラジン−１−イル）−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン）が挙げられる。【００４８】
本発明の非ヒト哺乳動物は、（１）動物の行動が、ＡＤＨＤの患者の症状と似ていること（表面妥当性）、（２）ＡＤＨＤに効く薬が動物の異常行動、例えば、多動性を改善すること（予測妥当性）を満たすものであり、ヒトＡＤＨＤのモデル動物として非常に有用なものである。従って、本発明の非ヒト哺乳動物に種々の被検物質を投与し、非投与群の動物又は対照物質投与動物における多動性等の異常行動の変化を比較することにより、ＡＤＨＤの予防及び／又は治療に有用な物質を評価することができる。評価の代表例として候補物質のスクリーニングを挙げることができ、試験項目としては、症状、病理所見、薬理試験等が挙げられる。このような、本発明の異常行動を示す非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、（ＩＩ）該非ヒト哺乳動物の異常行動の変化を検定する工程、及び、（ＩＩＩ）候補物質を投与しない場合に比べて、異常行動が低下する候補物質を選択する工程を含む抗ＡＤＨＤ薬のスクリーニング方法も、本発明の１つである。例えば、ある候補物質を投与した場合に、多動性等の異常行動が改善されたことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を抗ＡＤＨＤ薬として選択することが可能である。スクリーニング方法において検定する異常行動としては、多動性が好適である。【００４９】
本発明の非ヒト哺乳動物はまた、（１）動物が示す多動性が統合失調症の患者の症状と似ていること（表面妥当性）、（２）統合失調症に効く薬が動物の多動性を改善すること（予測妥当性）を満たすものであり、ヒト統合失調症のモデル動物としても非常に有用なものである。従って、本発明の非ヒト哺乳動物に種々の被検物質を投与し、非投与群の動物又は対照物質投与動物における多動性の変化を比較することにより、統合失調症の予防及び／又は治療に有用な物質を評価することができる。評価の代表例として候補物質のスクリーニングを挙げることができ、試験項目としては、上記と同様に症状、病理所見、薬理試験等が挙げられる。このような、本発明の異常行動を示す非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、（ＩＩ）該非ヒト哺乳動物の多動性の変化を検定する工程、及び、（ＩＩＩ）候補物質を投与しない場合に比べて、多動性が低下する候補物質を選択する工程を含む統合失調症治療薬のスクリーニング方法も、本発明の１つである。例えば、ある候補物質を投与した場合に、多動性が改善されたことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を統合失調症治療薬として選択することが可能である。【００５０】
本発明のスクリーニング方法において、多動性等の異常行動の変化を検定する方法としては特に限定されない。例えば、上記（ａ）〜（ｃ）の異常行動及び（ｄ）の症状の１又は２以上について、上述した評価方法又は以下の実施例に記載する試験及び方法を行なうことによって、候補物質投与前後における行動の変化を評価することができる。具体的には、多動性の変化は、例えば、赤外線センサー式測定機器（ＮＳ−ＡＳ０１；ニューロサイエンス、東京）によって自発行動量を検出し、検出シグナルを短期データ集録解析システム（ＤＡＳ−００８；ニューロサイエンス、東京）を用いて数値化する方法、Ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔ等によって評価することができる。【００５１】
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等）の組織抽出液、血漿等が挙げられる。候補物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。この様な塩としては、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩；酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩等が好適である。【００５２】
試験動物を候補物質で接触させる方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与等が用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質等にあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質等にあわせて適宜選択することができる。
【実施例】
【００５３】
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５４】
実施例１
１．トランスポゾンを用いる遺伝子改変マウスの作製
（Ｉ）Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゼース遺伝子含有トランスジェニックマウス（ＳＢトランスジェニックマウス）の作製
特公表２００２−０１３６０２号公報及びHorie et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 : 9191-9196 (2001)（以下、引例Ａともいう）に記載されている方法で、ＳＢトランスジェニックマウスを作製した。具体的な方法を、以下に示す。【００５５】
（ｉ）ＳＢトランスジェニックマウスの作製のためのｐＣＸ−ＳＢコンストラクトの作製
ｐＳＢ１０プラスミド（Z.Ivics et al.;Cell,91:501-510(1997)）からＳＢトランスポゼース遺伝子を制限酵素ＳａｃＩＩで切断後、平滑化した。そのＳＢ−ＤＮＡ断片をｐＣＸ−ＥＧＦＰプラスミド（M.Okabe et al.;FEBS Letter,407:313-319(1997)）の平滑化されたＥｃｏＲＩサイトにＥＧＦＰ断片と入れ換える状態で挿入してＰＣＸ−ＳＢコンストラクトを得た後、コンストラクト中のＳＢトランスポゼース遺伝子の向きを確認した。
（ｉｉ）ｐＣＸ−ＳＢコンストラクトからＳＢトランスジェニックマウスの作製
プロモーター・ＳＢ・ＰｏｌｙＡ付加シグナルを含むユニットＤＮＡ断片をｐＣＸ−ＳＢコンストラクトから制限酵素ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩで切断し、その後電気泳動して精製した。このＤＮＡ断片約５ｆｇをＢ６Ｃ３Ｆ２マウス受精卵（Ｃ５７ＢＬ／６の雌とＣ３Ｈの雄から生まれたものどうしを掛け合わせたものから得られた受精卵）に移入したのち偽妊娠マウスの卵管に移植することにより、その後２０日前後でＳＢトランスジェニックマウスを作製した。【００５６】
（ＩＩ）トランスポゾン配列含有トランスジェニックマウスの作製
ａ）トラップベクターの構築
Horie et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 23, No 24, p. 9189-9207(2003)に記載されている方法で、トラップベクターを作製した。具体的な方法を以下に示す。【００５７】
（ｉ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のクローニングサイトを、プライマー
5’-GCCG CTCG AGGG CGCG CCAG ATTT AAAT CAGC TTTT GTTC CCTT TAGT GAG-3’  （配列番号１）
及び
5’-CGCA GCGG CCGC ATTT AAAT GAGG CGCG CCGC TCCA ATTC GCCC TATA GTG-3’  （配列番号２）
を用いたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩのＰＣＲ増幅によってＡｓｃＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ及びＳｗａＩサイトに置換した。ＰＣＲ生成物である２．９ｋｂのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＢＳ−ＩＲ／ＤＲ（Ｒ，Ｌ）（引例Ａ参照）由来のＩＲ／ＤＲ（Ｒ，Ｌ）の０．８ｋｂのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとライゲーションし、逆方向反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）と直接反復配列（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）に隣接するＡｓｃＩ及びＳｗａＩサイトを含むｐＢＳ−ＩＲ／ＤＲ−ＡＳを得た。【００５８】
（ｉｉ）オリゴヌクレオチド
5’-GTAC GGCG CGCC GGTA CCAT TTAA AT-3’ （配列番号３）
及び
5’-GTAC ATTT AAAT GGTA CCGG CGCG CC-3’ （配列番号４）
と、オリゴヌクレオチド
5’-CGTT TAAA CTTA ATTA AGAG CT-3’ （配列番号５）
及び
5’-CTTA ATTA AGTT TAAA CGAG CT-3’ （配列番号６）
をそれぞれアニールすることによって、ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩ−ＳｗａＩサイト及びＰｍｅ  Ｉ−ＰａｃＩサイトを含むリンカーＤＮＡを作製した。ＴｒａｎｓＣＸ−ＧＦＰフラグメントを取り除いた後、ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＧＦＰ：Ｎｅｏ（引例Ａ参照）の特有のＫｐｎＩ及びＳａｃＩサイトそれぞれに各リンカーを挿入し、ｐＡＫＳ：Ｎｅｏ：ＰＰを得た。【００５９】
（ｉｉｉ）ＣＡＧ−ＥＧＦＰを含むｐＣＸ−ＥＧＦＰ−ＰｉｇＡ（引例Ａ参照）のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメント、及び、ＢａｍＨＩで平滑化したＮｅｏカセット（Ishida and Leder, Nucleic Acids Res., Vol. 27:e35 (1999)）の２５６ｂｐのＸｈｏＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩのＳａｌＩで平滑化したＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤを得た。Ｎｅｏカセットは、マウスｈｐｒｔ遺伝子エクソン８／イントロン８領域由来のスプライスドナー（ＳＤ）配列、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のｃＤＮＡの３’非翻訳領域由来のｍＲＮＡ不安定化シグナルから構成される。【００６０】
（ｉｖ）ウサギβ−グロビンｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルのＸｂａＩで平滑化したＨｉｎｄＩＩＩフラグメント及び核局在化シグナルを含むｌａｃＺ遺伝子のＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＲＴｏｎＺから単離し（堀江恭二ら、未発表データ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩのＸｂａＩ及びＳｍａＩサイト、並びに、ＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩサイトにそれぞれ挿入し、ｐＬａｃＺ−ＢＳを得た。ＬａｃＺ−ｐｏｌｙ（Ａ）の挿入後、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを平滑化によって削除し、セルフライゲーションさせた。ｐＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ由来のＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤのＳａｌＩ−ＸｈｏＩフラグメントをｐＬａｃＺ−ＢＳのＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤを得た。ヒトｂｃｌ−２イントロン２／エクソン３スプライスアクセプター（ＳＡ）配列を、ＲＥＴベクター（Ishida et al. : Nucleic Acids Res. 27:e35 (1999)）をテンプレートとし、以下のプライマーを用いて増幅した。
5’-CGGC AAGC TTCT CGAG CTGT ATCT CTAA GATG GCTG G-3’ （配列番号７）
5’-GCCA CGGT CGAC GCCT GCAT ATTA TTTC TACT GC-3’ （配列番号８）
配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を、再度ＲＥＴベクターをテンプレートとし、以下のプライマーを用いて増幅した。
5’-GGAG CGTC GACT ACGT AAAT TCCG CCCC TCTC CCTC-3’ （配列番号９）
5’-GGAG CGTC GACT ACGT AAAT TCTC CCTC CCC-3’ （配列番号１０）
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ  ＳＡ含有フラグメント及びＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ  ＩＲＥＳ含有フラグメントをｐＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩサイトに同時にクローン化し、ｐＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤを得た。【００６１】
（ｖ）ＳＡ、ＩＲＥＳ、ｌａｃＺ、ｐｏｌｙ（Ａ）及びＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤを含むｐＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤのＸｈｏＩフラグメントを平滑化し、ｐＢＳ−ＩＲ／ＤＲ−ＡＳのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイト両方を平滑化した後これらのサイトに挿入し、ｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤを得た。ｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤのＡｓｃＩ−ＳｗａＩフラグメントをｐＡＫＳ：Ｎｅｏ：ＰＰのＡｓｃＩ及びＳｗａＩサイトに挿入し、ｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ：Ｎｅｏを得た。【００６２】
ｂ）ｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ：Ｎｅｏからのトランスポゾントランスジェニックマウスの作製
得られたｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ：ＮｅｏをＰａｃ  Ｉを用いて直線化し、このＤＮＡ断片を受精卵（ＢＤＦ１マウス×ＢＤＦ１マウス）に注入した。この受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植することにより、その後２０日前後でトランスポゾン配列含有トランスジェニックマウスを作製した。【００６３】
（ＩＩＩ）ダブルトランスジェニックマウスの作製
（Ｉ）で作製したＳＢトランスジェニックマウスと、（ＩＩ）で作製したトランスポゾン配列含有トランスジェニックマウスとを交配し、ダブルトランスジェニックマウス（シードマウスと呼ぶ）を作製した。遺伝子型の同定は、上述したＧＦＰ及びＳＢ遺伝子に特異的なプライマー（引例Ａ参照）を用いて行った。全ての動物実験は、大阪大学ガイドラインに従って行った。【００６４】
（ＩＶ）トランスジェニックマウスのスクリーニング
（ｉ）トランスジェニックマウスの選抜
得られた出生直後のシードマウスの尾から採取したＤＮＡをＰＣＲ法により分析し、ｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ：Ｎｅｏ及びｐＣＸ−ＳＢを両方有するトランスジェニックマウスを選抜した。ｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ：Ｎｅｏ及びｐＣＸ−ＳＢを両方有するトランスジェニックマウスは、グリーンの蛍光を発しなかった。
（ｉｉ）トランスポゼースによりトランスポゾン配列が転位しグリーンの蛍光を発するマウス
上記（ＩＩ）のａ）のｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ：Ｎｅｏ及びｐＣＸ−ＳＢを両方有するトランスジェニックマウスと、雌の野生型ＩＣＲマウスとを交配し、子孫の中から遺伝子改変マウスを得た。得られた出生直後のマウスの尾を切除し、ＧＦＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｆｉｌｔｅｒを有する蛍光立体顕微鏡（ＷＩＬＤ  Ｍ１０、ライカ社製）を用いて蛍光を測定した。検出感度が減少するのを避けるため、毛色の出現以前にスクリーニングを行った。ＧＦＰが発現しグリーン蛍光に光る個体を、ＳＢトランスポゼースによりトランスポゾン配列が転位したマウス（遺伝子改変マウス）として選抜した。この遺伝子改変マウスのうち、異常行動を示すマウスを分離し、後述する遺伝子解析を行った。遺伝子解析によりＳｐｓｂ４遺伝子が改変されていることがわかったマウス（ヘテロ型遺伝子改変マウス：遺伝子型Ｔｐ／ｗｔ）を二世代以上交配することにより、一対の染色体の両遺伝子においてＳｐｓｂ４遺伝子が改変されたマウス（ホモ型遺伝子改変マウス：遺伝子型Ｔｐ／Ｔｐ）を得た。【００６５】
２．遺伝子解析
次に、ヘテロ型遺伝子改変マウスの尾のＤＮＡを用いて、トランスポゾン挿入部位をｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）により決定した（Horie et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 23, No 24, p. 9189-9207(2003)を参照）。
図２にＳｐｓｂ４遺伝子へのトランスポゾンの挿入部位を模式的に示す。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポゾンはＴＡ配列へ挿入される。図２の上図は、正常（野生型）のＳｐｓｂ４遺伝子の部分配列を示し、下図は、ＳＢトランスポゾンが挿入されたＳｐｓｂ４遺伝子の部分配列を示す。挿入後は、ＳＢトランスポゾンの両側にＴＡ配列が重複する。遺伝子解析の結果、ＳＢトランスポゾンはＳｐｓｂ４遺伝子のエクソン１とエクソン２との間のイントロン部分の図２に示す部位に挿入されていた。他の部位の変異は確認されなかったため、このＳｐｓｂ４遺伝子の改変が、マウスの異常行動の原因であると考えられる。【００６６】
その挿入部位の配列を基に、以下のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、遺伝子型を同定するシステムを確立した。
図３に、ＰＣＲ法によるＳｐｓｂ４変異マウスの同定方法について、模式図を示す。図３の上図は、正常（野生型）マウスのＳｐｓｂ４遺伝子を示し、下図は、ＳＢトランスポゾンが挿入された変異型遺伝子を示す。図３中、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は、以下に示すプライマーを表す。
Ｐ１：  5’-AACAAATCAGACAGACAGCATCTGAGGAAC-3’ （配列番号１１）
Ｐ２：  5’-TAGTCTGTGTTGTCTTATCTTCGAGGCATG-3’ （配列番号１２）
Ｐ３：  5’-CTTGTGTCATGCACAAAGTAGATGTCC-3’ （配列番号１３）
プライマーＰ１及びＰ２は、それぞれｐＴｒａｎｓ−ＳＡ−ＩＲＥＳＬａｃＺ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＳＤ：Ｎｅｏの外側に位置する。ＰＣＲは、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、以下の条件下に行った：９５℃１５分、３５サイクル（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒）、次いで最終工程で７２℃７分の１サイクル。【００６７】
得られたＰＣＲ産物は、Ｐ１及びＰ２を用いた場合３３４ｂｐであり、Ｐ３及びＰ２を用いた場合４３９ｂｐであった。【００６８】
３．異常行動マウスの行動解析
得られたホモ型遺伝子改変マウス、ヘテロ型遺伝子改変マウス及び正常マウスを用いて、後述する試験を行った。なお、マウスの飼育は、以下のように行った。
マウスの飼育条件
遺伝子改変マウス及び正常マウス共に、実験動物の飼育条件として標準的な環境下にて全く同様に飼育した。すなわち、温度２３±１℃、湿度５０±１０％、１２時間（明期：８：４５〜２０：４５）の明暗サイクル下において、離乳後は同性のみでの５〜６匹／ケージとし、餌と水を自由に摂取させた。なお、実験には雄性のみを使用した。ホモ型遺伝子改変マウスは、飼育中、正常マウスと比較して、歩行時に不規則に右又は左に旋回する回転運動を頻繁に示した。【００６９】
（Ｉ）日内リズム  （Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ）
（ｉ）試験方法
ポリカーボネート製ケージ（３５×３０×１７ｃｍ）にマウスを入れ、上部に設置した赤外線検出型自発行動量センサー（ＮＳ−ＡＳ０１；ニューロサイエンス、東京）によって検出したシグナルを短期データ集録解析システム（ＤＡＳ−００８；ニューロサイエンス、東京）を用いて数値化した。測定は各動物７日間継続して実施し、１時間毎のカウント数を算出した。
（ｉｉ）評価方法
マウスは通常、暗期に行動量が増加し、明期に行動量が減少する。ホモ型遺伝子改変マウスと野生型マウスの１時間あたりの自発行動量の推移（最大自発運動を示す時間帯）の比較より、日内リズムの差異を判断した。２群間の自発行動量の差異については、反復測定分散分析により算出されるｐ値を指標として判定した。
（ｉｉｉ）結果
ホモ型遺伝子改変マウスについて、正常マウスと同様に消灯後速やかに自発行動量の増加が認められ、５〜６時間持続した。この結果を図１に示す。７日間の連続測定で見られた自発行動量の日内リズムにおいては、ホモ型遺伝子改変マウスと正常マウスの間に差異は認められなかった。しかしながら、ホモ型遺伝子改変マウスの自発行動量は、正常マウスと比べて著明に増加していた［Ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ：ｇｅｎｏｔｙｐｅ，  Ｆ（１，７）＝７．９０８，  ｐ＝０．０２６１  （ｐ＜０．０５）；  ｔｉｍｅ，  Ｆ（１６７，１１６９）＝１１．１７２，  ｐ＜０．０００１；  ｔｉｍｅ×ｇｅｎｏｔｙｐｅ，  Ｆ（１６７，１１６９）＝３．６６４，  ｐ＜０．０００１］．
（ｉｖ）評価
ホモ型遺伝子改変マウスは、活動期の日内リズムは保たれているが、正常動物に比べて著明な自発行動の増大を示すと評価した。【００７０】
（ＩＩ）不安の検定
（ｉ）試験方法
不安行動は、高架式十字迷路試験により評価した。壁のない２本のアーム（オープンアーム）と側壁のある２本のアーム（クローズドアーム）が交差する構造を有する高架式十字迷路（高さ５０ｃｍ、アーム幅１０ｃｍ、壁高３０ｃｍ）の中央にマウスの頭がオープンアームの方向となるように置き、５分間のオープンアームでの滞在時間、オープンアームへの進入回数、クローズドアームでの滞在時間、クローズドアームへの進入回数及びヘッドディップス（オープンアームの覗き込み回数）を記録した。
（ｉｉ）評価方法
マウスは通常、閉鎖的で暗い場所を好む性質を有する。したがって、本試験で正常マウスは、開放的なオープンアームより閉鎖的なクローズドアームに長く滞在することが観察される。また、マウスの不安感の増加に伴い、オープンアームへの進入及び滞在が減少することが知られている。そこで、各測定項目について正常マウスの測定値を基準として群間検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を行い、その中で特にオープンアームへの滞在時間及び進入回数に有意差が認められた場合、マウスの不安行動が変化しているものとして評価した。
（ｉｉｉ）結果
正常マウスに比べて、ホモ型遺伝子改変マウスではオープンアームでの滞在時間の増加（図４Ａ）とそれに対応するクローズドアームでの滞在時間の減少（図４Ｂ）が観察された。また、ホモ型遺伝子改変マウスではヘッドディップスの回数（図４Ｃ）が増加していた（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、正常マウスに対して）。一方、オープンアームへの進入回数（正常マウス：４．００±０．８０、ホモ型遺伝子改変マウス：７．１３±１．３７、ｐ＝０．０６８９）及びクローズドアームへの進入回数（正常マウス：１１．９±１．６０、ホモ型遺伝子改変マウス：１２．９±１．４９、ｐ＝０．６５４４）については、両群間で差異は認められなかった。
（ｉｖ）評価
ホモ型遺伝子改変マウスでは、正常マウスに比べて不安感情が低下している、あるいは衝動性が増大していると評価した。【００７１】
（ＩＩＩ）オープンフィールドテスト（Ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔ）
（ｉ）試験方法
灰色のアクリル製円形オープンフィールド（直径６０ｃｍ、高さ３５ｃｍ）の中央にマウスをおき、その後５分、１０分における外円歩行量、内円歩行量、内円への進入回数、内円での滞在時間、ｒｅａｒｉｎｇ回数、ｃｌｉｍｂｉｎｇ回数、ｇｒｏｏｍｉｎｇ時間、及び移動潜時（歩行を開始するまでの時間）を測定した。
（ｉｉ）評価方法
上述のようにマウスは通常、閉鎖的で暗い場所を好む性質を有する。したがって、本試験で正常マウスは、開放的な中心部より周辺部に長く滞在することが観察される。また本試験では、装置への馴化も含むマウスの不安感の低下に伴い、中心部への進入及び滞在が増加することが知られている。更に、本フィールド内に記された区画間の移動（内円歩行量及び外円歩行量）は、マウスの自発行動量の指標と考えられている。そこで各測定項目について、一元配置分散分析及び事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ  ｔｅｓｔ）を実施し、有意差が認められた項目に応じて、マウスの不安又は自発行動の変化として評価した。
（ｉｉｉ）結果
正常マウス及びヘテロ型遺伝子改変マウスに比べて、ホモ型遺伝子改変マウスでは内円歩行量（図５Ａ）［ＡＮＯＶＡ：Ｆ（２、１１）＝７．２３４、ｐ＝０．００９９］及び外円歩行量（図５Ｂ）［ＡＮＯＶＡ：Ｆ（２、１１）＝１０．５９３、ｐ＝０．００２７］共に増加していた（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ  ｔｅｓｔ：＊Ｐ＜０．０５、  ＊＊Ｐ＜０．０１、正常マウスに対して）。一方、その他の測定項目においては、群間で差異は認められなかった。結果を表１に示す。【００７２】
【表１】
2009017082.tif 000002
【００７３】
（ｉｖ）評価
正常マウスに比べて、ホモ型遺伝子改変マウスの内円区画での行動量が増加している点について、不安感情の低下又は行動量の増加を反映しているものと評価した。【００７４】
（ＩＶ）認知機能
（ｉ）試験方法
認知機能は新奇対象物探索試験により評価した。アクリル製のオープンフィールド（３０×３０×３５ｃｍ）に設置した２つの物質（円柱の積木、ゴルフボール及びコンセントのアダプターから選択される２つの物質）に対する探索嗜好性を基に算出した。まず対象物を設置しない実験装置に３日間（１０分間／日）動物を慣らした後、異なる２つの物質を置いた装置内で１０分間自由に探索させた（訓練試行）。２４時間後、２つのうち１つを新奇対象物と置換した装置内で５分間自由に探索させた（保持試行）。訓練試行、及び保持試行において、２つの対象物に対するそれぞれの探索時間を測定した。訓練試行時においては、総探索時間に対するいずれかの対象物への探索時間の割合（％）を、保持試行においては総探索時間に対する新奇対象物への探索時間の割合（％）を探索嗜好性（ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＥＰ）として示した。新奇物質を探索した時間をＡ、訓練試行時と同じ物質を探索した時間をＢとした場合、探索嗜好性（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００として算出される。
（ｉｉ）評価方法
マウスは通常、新奇物質に対して好奇心を示す。従って、正常マウスは、訓練試行では２つの物質に対して同程度の探索行動を示すのに対して、保持試行においては新奇物質に対してより強い探索嗜好性を示す。すなわち、ＥＰは、訓練試行では約５０％、保持試行では５０％を大きく上回ることになる。一方、認知機能の低下した動物では、訓練試行時の物質を覚えていないため、保持試行における新奇物質への探索行動が減少する。本試験では、一元配置分散分析及び事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ  ｔｅｓｔ）において、保持試行でのＥＰに有意な減少が認められた場合、マウスの視覚的認知機能が低下していると評価した。
（ｉｉｉ）結果
訓練試行において、正常マウス、ヘテロ型遺伝子改変マウス及びホモ型遺伝子改変マウスの群間にＥＰ、探索行動時間及び行動量の差異は認められなかった［ＥＰ、ＡＮＯＶＡ：  Ｆ（２、１１）＝０．６３９、ｐ＝０．５４６３］が、保持試行において、ホモ型遺伝子改変マウスのＥＰは正常マウスに比べて低値であった（図６）［ＡＮＯＶＡ：Ｆ（２、１１）＝５．１２４、ｐ＝０．０２６８；ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ  ｔｅｓｔ：＊＊Ｐ＜０．０１、正常マウスに対して］。なお、保持試行時の探索行動時間及び行動量については、３群間に差異は観察できなかった。表２に結果を示す。【００７５】
【表２】
2009017082.tif 000003
【００７６】
（ｉｖ）評価
ホモ型遺伝子改変マウスでは、正常マウスに比べて、認知機能ならびに注意力が低下していると評価した。【００７７】
（Ｖ）攻撃性（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ）
（ｉ）試験方法
各マウスを飼育環境より小さなポリカーボネート製ケージ（２０×１２×１０ｃｍ）に移し、１０分間馴らした後、別ケージにて飼育した同性同週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス（日本ＳＬＣより購入）を新奇侵入マウスとして導入し、その後の行動を解析した。解析は１０分間行い、侵入マウスに対する社会行動（にじり寄り、潜り込み）と攻撃及び敵対行動（噛みつき、尾の振戦、毛繕い）を攻撃行動として、その回数及びその時間を測定した。
（ｉｉ）評価方法
マウスは通常、新奇侵入動物に対して警戒心及び敵対心を示す。しかしながら、正常マウスでは、同系統の動物に対して攻撃行動を示すことは極めて少ない。本試験では、各測定項目について正常マウスの測定値を基準として群間検定（ｔ−検定）を行い、有意差が認められた項目に応じて、マウスの攻撃性又は社会的行動の変化として評価した。
（ｉｉｉ）結果
正常マウスに比べて、ホモ型遺伝子改変マウスでは侵入マウスに対するにじり寄り行動（図７Ａ）及び総接触時間（図７Ｂ）の減少が認められた（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ：  ＊Ｐ＜０．０５、正常マウスに対して）。一方、その他の測定項目においては、両群間で差異は認められなかった。結果を表３に示す。【００７８】
【表３】
2009017082.tif 000004
【００７９】
（ｉｖ）評価
ホモ型遺伝子改変マウスでは、正常マウスに比べて、社会行動（接触）の低下が見られるものの、攻撃性は発現していないと評価した。【００８０】
４．マウスへの薬投与試験試験
（ｉ）試験方法
塩酸メチルフェニデート（化学名：メチルα−フェニル−２−ピペリジンアセテート塩酸塩）は生理食塩水に溶解し、クロザピン（化学名：８−クロロ−１１−（４−メチルピペラジン−１−イル）−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン）は０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁し、それぞれ行動解析開始の３０分前に体重あたり０．５ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。日内リズムの試験と同様、マウスをポリカーボネート製ケージ（３５×３０×１７ｃｍ）に入れ、２０：００〜翌日８：００までの自発運動量を計測した。なお、メチルフェニデートの投与試験においては、ホモ型遺伝子改変マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと３回交配したマウスを用いた。
（ｉｉ）評価方法
薬物投与群及び非投与群の各マウスの２１：００〜３：００までの自発運動量の積算値を産出し、一元配置分散分析及び事後検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔ）において算出されるｐ値を指標として判定した。
（ｉｉｉ）結果
正常マウスの暗期での自発行動に影響を与えない用量の塩酸メチルフェニデート及びクロザピン（図８Ａ及び図９）は、ホモ型遺伝子改変マウスの自発行動量の増大に対して抑制効果を示し、正常マウスレベルまで改善した（図８Ｂ及び図９）［図９、ＡＮＯＶＡ：Ｆ（５、２１）＝８．６７４、ｐ＝０．０００１；ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔ：＊＊Ｐ＜０．０１、正常マウスに対して；++Ｐ＜０．０１、薬物非投与群に対して］。
（ｉｖ）評価
ホモ型遺伝子改変マウスの多動性は、ＡＤＨＤ治療薬及び統合失調症治療薬に感受性を示し、本行動がこれら疾患に関連する病態を反映するものと評価した。【００８１】
実施例２
ジーンターゲティング法によるＳｐｓｂ４遺伝子への変異導入と表現型解析
トランスポゾンを用いて作製した変異マウスの表現型の原因遺伝子がＳｐｓｂ４遺伝子であることを確認するために、ＥＳ細胞でのジーンターゲティング法を用いてＳｐｓｂ４遺伝子へ変異を導入したマウスを作製し、表現型解析を行なった。以下、その具体的な手順を示す。【００８２】
１．  ＥＳ細胞への変異導入
Ｓｐｓｂ４遺伝子断片（配列番号１４）を含むbacterial artificial chromosome（ＢＡＣ）は、BACPAC Resources Center at Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, California, USAから入手した。このＳｐｓｂ４遺伝子断片（配列番号１４）を含むＢＡＣ内へ、Liu et al.によるBAC recombineering法（Genome Research, vol. 13, no. 3, p. 476-484, 2003）を用いて、図１０最上段に示す２つのｌｏｘＰ配列及びｎｅｏ遺伝子を挿入した。さらに、第１イントロンから第２イントロンにかけての領域をプラスミドベクターへクローニングし、ターゲティングベクターとした。このベクターを、マウス由来のＥＳ細胞へエレクトロポレーション法により導入し、ｎｅｏ耐性コロニーの中から、図１０のＳｔｅｐＩに示す相同組換えによってＥＳ細胞のゲノムへ変異の導入された細胞株を得た。ＥＳ細胞ゲノムに導入された変異の確認は、図１０並びに図１１Ａ及びＢに示すように、ゲノムＤＮＡをＢｓｔＺ１７Ｉ又はＫｐｎＩで切断後、Ｓｐｓｂ４遺伝子領域のプローブ及びｎｅｏ遺伝子内のプローブを用いたサザンブロット法により行なった。図１１Ａは、サザンブロット法において図１０のｐｒｏｂｅ  Ａ及びＢを用いた解析結果であり、図１１Ｂは、図１０のｐｒｏｂｅ  ｎｅｏを用いた解析結果である。図１１Ａ及びＢに示すように、野生型（ｗｔ／ｗｔ）では検出されないＤＮＡのバンドが検出されたことから、Ｓｐｓｂ４遺伝子にｌｏｘＰ配列及びｎｅｏ遺伝子が挿入されたことが分かった。【００８３】
２．  遺伝子改変マウスの作製
上記で作製したＳｐｓｂ４遺伝子を改変したＥＳ細胞を、マウスの胚盤胞へ注入し、さらに偽妊娠マウスの子宮へ移植して、雄のキメラマウス（Ｎｅｏ／ｗｔ）を得た。一方、実施例１において作製したヘテロ型Ｓｐｓｂ４変異マウス（Ｔｐ／ｗｔ）をＣＡＧ−Ｃｒｅマウス（Sakai K. and Miyazaki J, Biochemical and Biophysical Research Communications, vol 237, no. 2, p. 318-324, 1997）と交配し、Ｓｐｓｂ４遺伝子がヘテロ変異型（Ｔｐ／ｗｔ）で、かつ、ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジーンを有す雌マウスを作製した（Ｔｐ／ｗｔ、ＣＡＧ−Ｃｒｅ）。一般に、ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジーンを有す雌マウスでは、Ｃｒｅタンパクが卵に蓄積しているために、ｌｏｘＰ配列を有す雄マウスに交配すると、受精直後にｌｏｘＰ間の組換えが高頻度に生じることが知られている。そこで、図１２に示すように、雌のＴｐ／ｗｔ、ＣＡＧ−Ｃｒｅマウスを、雄のＮｅｏ／ｗｔマウスと交配すると、図１０のＳｔｅｐＩＩに示す組換えによって、第２エクソンが欠失したアレル（Ｄｅｌアレル）が得られた。Ｓｐｓｂ４遺伝子の翻訳領域の大部分はエクソン２に存在するので、このエクソンの欠失は、遺伝子機能を完全に不活化すると考えられる。図１２の交配で得られた産仔の中で、Ｓｐｓｂ４遺伝子がＴｐ／Ｄｅｌの遺伝型の個体がＴｐ／Ｔｐと同一の表現型を示すか否かを、次項に示す方法で解析した。【００８４】
ｌｏｘＰ間の組換えを調べるために用いたＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ（図１０）の配列を、以下に示す。
Ｐｒｉｍｅｒ１  5'-TAATGAGGGGTTTGGAACAGTGCTGTCTGG-3'  （配列番号１５）
Ｐｒｉｍｅｒ２  5'-GTCTTAAAATGTAACCAGGCTTGGGAAACA-3'  （配列番号１６）
Ｐｒｉｍｅｒ３  3  5'-TTAGCAACTGCTGGGACAGTTCACACAATC-3'  （配列番号１７）
ＰＣＲにはＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、以下の条件下にて反応を行なった：９５℃１５分を１サイクル、（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒）を３５サイクル、７２℃７分を１サイクル。【００８５】
３．  表現型解析
オープンフィールドテストにおける移動距離と移動軌跡とを指標として、Ｔｐ／Ｄｅｌマウス及びＴｐ／Ｔｐマウスの表現型を解析した。【００８６】
（ｉ）マウスの飼育条件
野生型マウス（ｗｔ／ｗｔマウス）及び遺伝子改変マウス（Ｔｐ／Ｄｅｌマウス及びＴｐ／Ｔｐマウス）をそれぞれ、実験動物の飼育条件として標準的な環境下にて全く同様に飼育した。すなわち、温度２３±１℃、湿度５０±１０％、１２時間（明期：８：４５〜２０：４５）の明暗サイクル下において、離乳後は同性のみで飼育し、餌と水を自由に摂取させた。【００８７】
（ｉｉ）試験方法
灰色のアクリル製円形オープンフィールド（直径６０ｃｍ、高さ３５ｃｍ）の中央にマウスを置き、Ｅｔｈｏ  Ｖｉｓｉｏｎトラッキングシステム（ブレインサイエンス、大阪）を用いて１０分毎の移動距離を解析するとともに、合計６０分間の総移動距離を算出した。また、オープンフィールドにマウスを置いてから最初の１５０秒間の行動軌跡を比較した。１０分毎の移動距離の推移の比較には反復測定分散分析を、６０分間の総移動距離の比較には一元配置分散分析及び事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｔｅｓｔ）をそれぞれ実施し、算出されるｐ値を指標として判定した。【００８８】
（ｉｉｉ）結果
図１３Ａ及びＢに示すように、ｗｔ／ｗｔマウスと比較してＴｐ／Ｔｐマウスにおいて１０分毎の移動距離の推移（図１３Ａ）及び６０分間の総移動距離（図１３Ｂ）が有意に増加することが認められた［Ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ：  ｇｅｎｏｔｙｐｅ，  Ｆ（１，１８）＝１７．８６５，  ｐ＝０．０００５  （ｐ＜０．００１）；  ｔｉｍｅ，  Ｆ（５，９０）＝０．８６８，  ｐ＝０．５０６２；  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ×  ｔｉｍｅ；  Ｆ（５，９０）＝２．３５９，  ｐ＝０．０４６３  （ｐ＜０．０５）：  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ；  ＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ｗｔ／ｗｔ］。【００８９】
同様に、ｗｔ／ｗｔと比較してＴｐ／Ｄｅｌでは１０分毎の移動距離の推移（図１３Ｃ）及び６０分間の総移動距離（図１３Ｄ）が有意に増加することが認められた［Ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ：  ｇｅｎｏｔｙｐｅ，  Ｆ（２，２７）＝４．９８１，  ｐ＝０．０１４４  （ｐ＜０．０５）；  ｔｉｍｅ，  Ｆ（５，１３５）＝１１．８３８，  ｐ＜０．０００１；  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ×  ｔｉｍｅ，  Ｆ（５，１３５）＝１．５４，  ｐ＝０．１３１９：  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｔｅｓｔ；  ＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｗｔ／ｗｔ：  ＡＮＯＶＡ：  Ｆ（２，２７）＝４．９８１，  ｐ＝０．０１４４：  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｔｅｓｔ；  ＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ｗｔ／ｗｔ．］。
さらに図１４に示すように、オープンフィールド試験の開始初期（試験開始から最初の１５０秒間）においては、ｗｔ／ｗｔマウス（図１４Ａ及びＣ）は、主にオープンフィールドの周囲の壁沿いを探索歩行するのに比較して、Ｔｐ／Ｔｐマウス（図１４Ｂ）及びＴｐ／Ｄｅｌマウス（図１４Ｅ）はオープンフィールドの中央部に出て探索行動を示した。【００９０】
（ｉｖ）評価
Ｔｐ／Ｄｅｌマウスは、実施例１で作製したＴｐ／Ｔｐマウス（ホモ型遺伝子マウス）と類似した表現型（多動及び不安感情の低下）を示すと評価した。【００９１】
実施例１及び２より、Ｓｐｓｂ４遺伝子の異常が、ＡＤＨＤ及び統合失調症と関連していることが分かった。従って、Ｓｐｓｂ４遺伝子が改変された本発明の非ヒト哺乳動物は、ヒトＡＤＨＤ及びヒト統合失調症のモデル動物として有用であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、ヒトＡＤＨＤ及び統合失調症のモデル動物として、ＡＤＨＤ及び統合失調症の原因の解明とその予防法、治療法及び治療薬の開発に非常に有用なものである。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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