(57)【要約】【課題】  充分な発酵性をもち、かつ、得られた酒母で発酵飲料を製造した場合に、香気成分のバランスの優れた発酵飲料を提供することのできる酒母を提供すること【解決手段】  本発明は、酵母の培養方法に関し、特に、短期間に効率的に酵母を増殖させ、香味特性の優れた発酵飲料を製造し得る酒母を得る方法に関する。より具体的には、本発明は、細胞の短径：直径の比が１：３以上である異常酵母の発生率が培養終了時に酵母全体の２０％以下となる培養条件下で酵母を培養する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の短径：直径の比が１：３以上である異常酵母の発生率が培養終了時に酵母全体の２０％以下となる培養条件下で酵母を培養する方法。
【請求項２】
エルゴステロール生合成系に関わる成分を培養液中で増量させた条件で培養を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成分が、エルゴステロールおよび／またはエルゴステロールの前駆体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記成分が、エルゴステロール生合成における中間反応を触媒する酵素および／または補酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記成分がメバロン酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記成分がパントテン酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記酵母が発酵飲料製造のための酒母である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記発酵飲料がビールまたはビールテイスト発酵飲料である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記請求項１〜８のいずれかに記載の方法で得られた酒母。
【請求項１０】
請求項９に記載の酒母を用いて製造した酒類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の培養方法に関する。本発明は、特に、短期間に効率的に酵母を増殖させ、香味特性の優れた発酵飲料を製造し得る酒母を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類、例えば麦芽発酵飲料の製造においては、製造に伴って生じた酵母を発酵終了時に回収し、次回の発酵の酒母として再利用する、いわゆる「連醸」を行うことがある。しかし、酵母の再利用の回数には限度があり、数回の連醸後は新たに試験管などの小スケールから数段階の拡大培養を経て、数キロリットル規模の酒類生産を行えるだけの酵母を確保する必要がある。また近年では、消費者の幅広い嗜好に応じるため少量多品種生産の必要性が高まっているが、こういった場合にも、それぞれの品種に適した酵母を順次培養し、発酵に備えなくてはならない。
このような背景の中で、生産リードタイムを短縮させ、生産現場の自由度を向上させることは非常に重要であり、培養工程では酸素あるいは空気を供給しながら培養することで単位時間当たりの酵母増殖量（増殖効率）を上げるのが一般的である。【０００３】
しかしながら、このように通気条件で迅速に培養された酵母にみられる現象のひとつとして、通常はほぼ球形の細胞が、より極方向に伸長した細長い楕円形に変化してしまうことがある。このような異常酵母では増殖速度や発酵速度が低下する場合が多く、また、そういった酵母を用いた発酵で得られる発酵飲料では香気成分バランスが悪化しているなど、酒母品質として必ずしも良好ではないことが知られている。このため、異常酵母の割合が充分低下するまで数回の順応発酵を繰り返す必要があり、結局のところ、本発酵までには多くの時間を要しているのが現状である。【０００４】
一方、酵母の改質法としては、例えば日本国特許第2537361号（特許文献1）では、高濃度の亜鉛を添加した処理液に酵母を浸漬して亜鉛を吸収させることにより、酵母の発酵性や耐久性を高めることができるとされている。また、特公平5-442268号公報（特許文献2）では、醤油や味噌などの醸造食品の製造に用いる酵母を培養するにあたり、培養中の溶存酸素量を制限することにより、得られる酵母の発酵性を高めることができるとされている。しかし、これらの文献には発酵飲料を製造するための大量の酵母を、小規模培養から、順応発酵を経ずに製造する方法は開示されていない。また特開2006-212024号公報（特許文献3）では、発酵原液に少量のミネラルを添加すること、酸素あるいは空気の供給を制限すること、培養液の溶存炭酸ガス濃度を低減すること、あるいはこれらの組み合わせによって、実用可能な酒母を短期間に効率よく得ることができるとされている。
【特許文献１】日本国特許第2537361号公報
【特許文献２】特公平5-442268号公報
【特許文献３】特開2006-212024号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の現状に鑑み、充分な発酵性をもち、かつ、得られた酒母で発酵飲料を製造した場合に、香気成分のバランスの優れた発酵飲料を提供することのできる酒母を、通気条件を制限することなく迅速に得る培養法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、正常な酵母形態が保たれることが重要であろうという着想のもとに、所望の酒母が得られる培養条件を種々検討した結果、本発明を完成させた。すなわち、本発明は次のような、酵母の培養方法、そのような培養方法で得られる酒母、その酒母を用いて得られる発酵飲料などを提供する。
（１）細胞の短径：直径の比が１：３以上である異常酵母の発生率が培養終了時に酵母全体の２０％以下、好ましくは１０％以下となる培養条件下で酵母を培養する方法。
（２）エルゴステロール生合成系に関わる成分を培養液中で増量させた条件で培養を行う、上記（１）に記載の方法。
（２a）エルゴステロール生合成系に関わる成分を培養液中で増量させた条件で培養を行う、酒質を向上（例えば、香味を改善）させる酵母の培養方法。
（３）前記成分が、エルゴステロールおよび／またはエルゴステロールの前駆体である、上記（２）又は（２a）に記載の方法。
（４）前記成分が、エルゴステロール生合成における中間反応を触媒する酵素および／または補酵素である、上記（２）又は（２a）に記載の方法。【０００７】
（５）前記成分がメバロン酸である、上記（２）又は（２a）に記載の方法。
（６）前記成分がパントテン酸である、上記（２）又は（２a）に記載の方法。
（７）前記酵母が発酵飲料製造のための酒母である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記発酵飲料がビールまたはビールテイスト発酵飲料である、上記（７）に記載の方法。
（９）前記上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法で得られた酒母。
（１０）上記（９）に記載の酒母を用いて製造した酒類。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、1）通気条件を保つ（制限しない）ことで酵母の増殖効率が高まり、培養期間が短縮できる、2）得られる酵母の酒母品質が良好であることで順応発酵に要する時間が短縮できるなどという効果が得られる。この結果、小スケールの培養酵母から醸造特性に優れた充分量の酒母を迅速に得ることができる。また、少量多品種生産で製品ごとに異なる酵母が必要な場合などにおいても、酒母立てに要する時間が大幅に短縮できる。
本発明の方法で製造した酒母は、通常、発酵性に優れ、香味バランスに優れた発酵飲料を製造できるなどという特性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．発明の概要
本発明者らは、正常な酵母形態が保たれることが重要であり、異常形態酵母の発生を抑制することによって、発酵性に優れ、香気成分バランスの優れた発酵飲料を提供することのできる酒母を高効率に製造可能であると着想した。この着想に基づき、培養条件および培地成分が酵母に与える影響を鋭意検討した結果、麦芽などの穀物原料を用いる発酵原液に、酵母のエルゴステロール生合成系に関わる成分、具体的には例えばメバロン酸あるいはパントテン酸などを添加することによって、通気条件下においても、異常形態酵母の発生を抑制することができることを見出した。その結果、発酵性に優れ、香気成分バランスの優れた発酵飲料を提供することのできる酒母を高効率に充分量製造できることを見出した。【００１０】
２．本発明の酵母の培養方法
まず、本発明は、細胞の短径：直径の比が１：３以上である異常酵母の発生率が培養終了時に酵母全体の２０％以下（好ましくは１０％以下、さらに好ましくは６％以下）となる培養条件下で酵母を培養する方法に関する。異常酵母の発生率の測定は、顕微鏡および血球計算盤を用いることによって行うことができる。より具体的には、本発明は、エルゴステロール生合成系に関わる成分を培養液中で増量させた条件で培養を行う、酵母の培養方法に関する。
（酵母）
本発明で使用する酵母は、醸造用に使用可能な任意の酵母であれば特に限定されない。例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。【００１１】
（酒母）
本発明においては、上記酵母の培養方法を用いて、酒母を製造する。
本明細書中で、「酒母」とは、発酵飲料生産の発酵に使用される状態にある酵母および同使用の目的で増殖させた酵母を包含する。酒母は、試験管規模の小培養液から何段階かのスケールアップを経て増殖させたものでもよく、また発酵飲料の製造後に回収した酵母であってもよい。小培養液からスケールアップして酒母を得る場合には、本発明の方法は、最終の培養過程で実施すれば、発酵性の良好な酒母を得ることができる。発酵飲料の製造後に回収した酵母は、通常はそのまま酒母として使用できるが、酒母としての発酵性を高めるために本発明の方法を少なくとも一回実施することが好ましい。従って、本明細書中で、「酒母の原料とする酵母」とは、本発明の方法で少なくとも1回培養させて発酵性の良好な酒母を製造するための出発酵母を全て包含する。【００１２】
（培地）
本発明の方法においては、酒母製造のための培地としては、発酵飲料の製造のための発酵原液と同じもの、例えばビール製造と同様の麦汁を使用することができる。発泡酒やビールテイスト飲料では、麦芽の使用比率が低いか麦芽以外の原料を用いているが、これらによる発酵原液もまた酒母の製造に用いることが可能である。しかしながら、例えば、麦芽使用比率の低い発泡酒麦汁においてアミノ酸含量が低いように、酵母の増殖に必要な栄養源が不足している場合は適宜それを補ってもよい。これらの一般的な製造条件については、例えばW. Kunze, Technology Brewing and Malting, 3rd completely updated Ed.（2004）、宮地、ビール醸造技術、食品産業新聞社（1999）などを参照することができる。【００１３】
（エルゴステロール生合成系に関わる成分）
本発明の方法においては、酵母のエルゴステロール生合成系に関わる成分の培養液中の濃度を高めることを特徴とする。エルゴステロールは酵母細胞膜の構成成分の1つであり、その機能は多様であることが知られている。例えば、細胞膜上にはエルゴステロールに富むラフトと呼ばれるドメインがあり、培地中の栄養成分を取り込むためのトランスポーター類に代表される膜タンパク質の機能に大きな役割を果たしている。
酵母のエルゴステロール生合成は、アセチルCoAを出発物質として、メバロン酸、スクアレン、ラノステロールなどを経る20段階以上の反応から成る。この生合成系に関わる主な成分としては、エルゴステロール自体、エルゴステロール生合成系のそれぞれの反応を触媒する酵素、例えばヒドロキシメチルグルタリルCoAシンターゼ、ヒドロキシメチルCoAレダクターゼやスクアレンシンターゼなどがある。これ以外にも、エルゴステロールの前駆体（中間代謝物）であるメバロン酸やスクアレンなど、補酵素であるパントテン酸などがあるが、添加する場合、添加物としての使用実績やコスト、培養液への溶解性などを考慮するとメバロン酸、パントテン酸あるいはこれらの混合物が好適である。本発明においては、特にパントテン酸を用いることが好ましい。なお、使用する酵母の種類によって好ましい添加成分が異なることもある。したがって、好ましい添加成分は、使用する酵母毎に培養試験および醸造試験を実施して適宜選択することができる。
これらの物質の発酵原液中の濃度を高める方法は、発酵原液の作製方法、例えば麦芽製造方法や麦汁製造方法を選択することによって行ってもよいし、あるいはフリー体や塩などの形で添加することによって行ってもよい。培養液中の上記成分の濃度は特に限定されるものではなく、例えば、得られる酵母の酒質改善能を向上させる程度の濃度に調整する。例えば、麦汁などの発酵原液中に溶解した状態で、中間代謝物の場合1〜1000ppm、好ましくは1〜100ppm程度、補酵素類の場合0.01〜100ppm、好ましくは0.01〜10ppm程度となるように添加すればよい。また、このような添加物を培養原液に添加するのは培養開始から酵母が対数増殖期に入るまでの間が好ましい。【００１４】
（通気条件）
酸素の供給は、酵母の増殖を迅速にする。酵母の増殖に必要な酸素の供給は、培養液へ酸素を含む気体（例えば、酸素または空気）を供給することによって行うことができる（たとえば、特開2006-212024号公報など参照）。酸素供給量は、各種培養条件や目標の酵母濃度、あるいは菌株によって、適宜設定すればよい。例えばW h e ih e n s t e p h a n - 3 4株を用いて酵母濃度が20×106 cells/mLで培養を開始し、24時間で6〜8倍程度に増殖させる場合、目安として培養開始時に酸素を含む気体の供給を培養液1Lあたり酸素として毎分0.2〜2.0mL程度、好ましくは培養液1Lあたり酸素として毎分約1.2mLの通気量で培養を開始する。例えば、空気の場合毎分1〜10mL、好ましくは約6mLの通気量で培養を開始する。
酸素ないし空気の供給は連続的でも断続的でもよい。供給方法は特に限定されず、培養タンクへの配管を設置するなど適宜選択することができる。酸素の供給量の調整は、一定流量の酸素を供給する時間の長さを変えることによって行うことができるし、あるいは、供給時間を一定にして流量を調整することによっても制御することができる。【００１５】
（酵母濃度）
本発明の方法において、培養開始時の酵母濃度は、特に限定されないが、通常、1×106 〜5×108 cells/mL、より好ましくは1×107〜1×108 cells/mLである。培養最終時の酵母濃度は、好ましくは、5×107〜1×109 cells/mLである。【００１６】
３．本発明の酒母を用いて得られる酒類
本発明においては、上記のようにして得られる酒母を用いて発酵飲料を製造する。発酵飲料としては、例えば、ビール、発泡酒、雑酒、リキュール類、スピリッツ類、低アルコール麦芽発酵飲料（例えばアルコール分１％ 未満の麦芽発酵飲料）等をあげることができる。本発明の好ましい態様によれば、ビールやビールテイスト飲料を製造する。ここでビールテイスト飲料とは、麦芽や糖液などの糖質原料、ホップ類などを原料とし、酵母で発酵させた飲料であって、ビールのような風味を有するものをいう。
本発明の方法によって得られる酒母を培養して得られる発酵飲料（特に、ビールまたはビールテイスト飲料）は、香味バランスに優れているという特徴を有する。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（評価項目および評価方法）
増殖量：培養あるいは発酵工程で経時的にサンプリングを行い、顕微鏡および血球計算盤を用いた直接計数法によって酵母菌体濃度を測定した。
異常形態酵母の割合：細胞の短径：長径の比が1：3以上のものを異常形態酵母として計数し、全体に占める割合を算出した。
香り：培養酵母を用いて試醸した発泡酒について、訓練されたパネラー5 名によるブラインド方式の官能評価を行い、目的とする香りの厚み（良好な香りの質・量）を評価した。また、オフフレーバーや味も含めた総合評価も併せて実施した。【００１８】
実施例1：添加物の効果検証
下面ビール醸造用酵母（BH６０４）を、5%酵母エキスおよび2%グルコースを含む培地で好気的条件下で前培養し、続いて麦芽使用比率24%の発泡酒麦汁を培地とした本培養に供した。添加物については設定濃度の1000倍濃度のストック液を調製し、培養液量の1/1000量を添加した。表1に実験水準を示す。
【表１】
2009020008.tif 000002
（その他の培養条件）
培養温度：         20℃
運転容量：         4L
通気量（無菌空気）：24mL/min
撹拌速度：         30rpm
初期酵母濃度：     60×106cells/mL
培養期間：         29h【００１９】
培養終了時における酵母菌体濃度を図1に、異常形態酵母の割合を図2に示す。各添加物の使用により増殖量が増加し、最終酵母濃度はコントロールに対してそれぞれ28%、22%増加した。また、各添加物を使用した水準では培養期間を通じて異常酵母の出現頻度が非常に低く、培養終了時における異常形態酵母の割合はそれぞれコントロールの20%、12%と著しく低下した。このように、極低濃度の添加物を使用することにより、通気条件下で酵母の増殖効率を高めつつも異常形態酵母の発生を抑制することが可能であることが分かった。【００２０】
実施例2：発泡酒試験醸造
添加物を使用した培養により得られた酵母を酒母として、順応発酵を行うことなく、そのまま発泡酒（麦芽使用比率24%）試醸を行った。培養条件（添加物の有無）以外は同一の醸造条件とし、酒質に対する酒母品質の影響を検証した。
発酵温度：    15℃
発酵容量：    4L
初期酵母濃度：20×106cells/mL
発酵期間：    7日間【００２１】
図3に示す通り、メバロン酸添加あるいはパントテン酸添加培養による酵母を用いて発酵させた試醸品は、コントロール（無添加）培養酵母による試醸品に対して、香りの厚みにおいて高いスコアが得られた。一般的に通気培養酵母を用いると香りの質・量ともに低下すると言われているが、これらの添加物の使用によって、おそらくは酵母の質の向上を通じて、香味が改善されたと考えられる。また、図４に示すとおり、メバロン酸あるいはパントテン酸添加培養酵母を用いることによって香りの厚みが改善された試醸品は、総合評価においても高いスコアを示した。【００２２】
実施例３：添加物の効果検証
下面ビール醸造用酵母としてS. pastorianusWeihenstephan Nr.34（Nr.34）を用いた以外は、実施例１と同様に培養試験を実施した。すなわち、Nr.34を用いて、5%酵母エキスおよび2%グルコースを含む培地で好気的条件下で前培養し、続いて麦芽使用比率24%の発泡酒麦汁を培地とした本培養に供した。添加物については設定濃度の1000倍濃度のストック液を調製し、培養液量の1/1000量を添加した。メバロン酸及びパントテン酸の添加濃度、その他の培養条件なども実施例１と同様である。【００２３】
培養終了時における酵母菌体濃度を図５に、異常形態酵母の割合を図６に示す。各添加物を使用した水準では培養期間を通じて異常酵母の出現頻度が非常に低く、培養終了時における異常形態酵母の割合はそれぞれコントロールに対して著しく低下した。このように、極低濃度の添加物を使用することにより、通気条件下で酵母の増殖効率を高めつつも異常形態酵母の発生を抑制することが可能であることが分かった。【００２４】
実施例４：発泡酒試験醸造
下面ビール醸造用酵母としてNr.34を用い、パネラーを９名とした以外は、実施例２と同様にして酒母品質の試験を実施した。すなわち、添加物を使用した培養により得られた酵母を酒母として、順応発酵を行うことなく、そのまま発泡酒（麦芽使用比率24%）試醸を行った。培養条件（添加物の有無）以外は同一の醸造条件とし、酒質に対する酒母品質の影響を検証した。【００２５】
図７に示す通り、パントテン酸添加培養による酵母を用いて発酵させた試醸品は、コントロール（無添加）培養酵母による試醸品に対して、香りの厚みにおいて高いスコアが得られた。一般的に通気培養酵母を用いると香りの質・量ともに低下すると言われているが、これらの添加物の使用によって、おそらくは酵母の質の向上を通じて、香味が改善されたと考えられる。また、図８に示すとおり、パントテン酸添加培養酵母を用いることによって香りの厚みが改善された試醸品は、総合評価においても高いスコアを示した。
なお、Nr.34の場合は、メバロン酸の官能評価の結果は良好ではなかったので、Nr.34とメバロン酸の相性は必ずしも良好ではない可能性が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上のように、本発明により、少量の種酵母から醸造特性に優れた酒母を迅速に十分量得ることができる。これにより、発酵飲料の製造までのリードタイムを大幅に短縮することができ、その産業上の利用価値は極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１における培養終了時の酵母菌体濃度を示した図である。メバロン酸あるいはパントテン酸の添加により酵母増殖効率が向上したことを示している。
【図２】実施例１における培養終了時の異常形態酵母の割合を示した図である。メバロン酸あるいはパントテン酸の添加によって割合が有意に低下したことを示している。
【図３】実施例２における試醸した発泡酒の官能評価結果を示した図である。培養工程で通気を保った場合にも、メバロン酸あるいはパントテン酸を添加することによって香りの厚みを向上させることが可能なことを示している。
【図４】実施例２における試醸した発泡酒の官能評価結果を示した図である。メバロン酸あるいはパントテン酸添加培養酵母を用いることによって香りの厚みを向上させた試醸品は、総合評価においても高いスコアを示している。
【図５】実施例3における培養終了時の酵母菌体濃度を示した図である。各添加物の添加により酵母増殖効率が向上したことを示している。
【図６】実施例3における培養終了時の異常形態酵母の割合を示した図である。各添加物の添加によって割合が有意に低下したことを示している。
【図７】実施例4における試醸した発泡酒の官能評価結果を示した図である。培養工程で通気を保った場合にも、パントテン酸を添加することによって香りの厚みを向上させることが可能なことを示している。
【図８】実施例4における試醸した発泡酒の官能評価結果を示した図である。パントテン酸添加培養酵母を用いることによって香りの厚みを向上させた試醸品は、総合評価においても高いスコアを示している。
【図１】
2009020008.tif 000003
【図２】
2009020008.tif 000004
【図３】
2009020008.tif 000005
【図４】
2009020008.tif 000006
【図５】
2009020008.tif 000007
【図６】
2009020008.tif 000008
【図７】
2009020008.tif 000009
【図８】
2009020008.tif 000010
【国際調査報告】
2009020008.tif 000011
2009020008.tif 000012
2009020008.tif 000013
2009020008.tif 000014