【手続補正書】
【提出日】平成17年3月24日(2005.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、複数のエピトープを含むマルチエピトープ構築物を設計するための方法およびシステムを提供する。本方法は、（ｉ）複数のエピトープを分類して接合エピトープの数を最小限に抑えること、（ｉｉ）エピトープのＣ＋１位にフランキングアミノ酸残基を導入してマルチエピトープ構築物中に含ませること、（ｉｉｉ）マルチエピトープ構築物の２つのエピトープ間に接合エピトープの生成を防止する１つまたは複数のアミノ酸スペーサー残基を導入すること、および（ｉｖ）各エピトープに対してＣ＋１位に最小数の接合エピトープ、最小数のアミノ酸スペーサー残基および最大数のフランキングアミノ酸残基を有する１つまたは複数のマルチエピトープ構築物を選択することの各ステップを含む。いくつかの実施形態において、スペーサー残基は、ＨＬＡクラスＩＩの一次アンカー残基であることが知られていない残基から、独立に選択される。特定の実施形態では、スペーサー残基を導入することによって、ＨＴＬエピトープの生成が防止される。このようなスペーサーは、Ｇ、ＰおよびＮからなる群から独立に選択される少なくとも５つのアミノ酸残基を含むことが多い。いくつかの実施形態では、スペーサーはＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
構築物中のスペーサー数、スペーサー中のアミノ酸数およびスペーサーのアミノ酸組成は、エピトーププロセシングを最適化するようにおよび／または接合エピトープを最少化するように選択することができる。スペーサーは、エピトーププロセシングと接合モチーフを同時に最適化することによって選択することが好ましい。エピトーププロセシングを最適化するために適切なアミノ酸を本明細書に記載する。また、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＬＡに対して、構築物中の接合エピトープ数を最少化するのに適切なアミノ酸スペーシングを本明細書に記載する。たとえば、クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープの側面に位置するスペーサーは、一次アンカー残基として一般には知られていないＧ、Ｐおよび／またはＮ残基を含むことが好ましい（たとえば、特許文献４参照）。クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープの側面に位置する特に好ましいスペーサーには、ＧとＰが交互になった残基、たとえば、（ＧＰ）n、（ＰＧ）n、（ＧＰ）nＧ、（ＰＧ）nＰなど（ｎは１から１０の整数、好ましくは２または約２であり、そのようなスペーサーの具体的な例はＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）である）が含まれる。好ましいスペーサー、特にクラスＩ  ＨＬＡエピトープに対する好ましいスペーサーは、１、２、３個以上の連続したアラニン（Ａ）残基を含む（たとえば、３個の連続したアラニン残基を含むスペーサーを示した図２３Ａを参照されたい）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
第１の構築物は、直線状に配列された４個の異なるエピトープを取り込み、一方、第２の構築物はＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）スペーサーを取り込む。３個の潜在的な接合エピトープに相当する合成ペプチドも合成した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
ＩＡb陽性マウス中の様々なエピトープに対して増殖性反応を示すかどうかこれらの異なる構築物２ｎＭの初回抗原刺激能力を試験し、等モル量の同じペプチドのプール（各ペプチド３μｇ）によって誘発される応答と比較した。具体的には、３匹のマウスのグループにＣＦＡエマルジョンで希釈したペプチドを注射し、注射から１１日後にそれらのリンパ節細胞をその後３日間インビトロで培養し、培養の最後の２４時間にチミジン取り込みを測定した。それらの高い親和性ＩＡb結合能力に基づいて予想されるように、４個のエピトープすべてが良好な増殖性反応を誘発することが判明した（図２ｂ）。これらのペプチドをプールして注射すると、刺激指数（ＳＩ）値は４．９から１７．９の範囲に認められた。しかし、同じエピトープを組み込んだ線形ポリペプチドを試験すると、Ｐｏｌ  ３３５に対する応答が消失した。これは、Ｇａｇ  １７１とＰｏ１  ３３５にまたがる接合エピトープに対する応答の出現を伴った。ＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）スペーサーを使用すると、おそらくは接合エピトープが破壊されＰｏｌ  ３３５応答が回復することにより、この問題は解消した。認められた応答は、単離したペプチドのプールで認められた応答と同様の大きさであった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
【図１】２０から２５個のそれぞれ異なるＣＴＬエピトープが組み込まれた３つの異なるマルチエピトープ構築物に関するデータを示す図である。
【図２】図２ａは、２つの異なる合成ポリペプチドを示す図であり、第１の構築物は直線上に同時に合成された（ｃｏｓｙｎｔｈｅｔｉｚｅｄ）４つの異なるエピトープが組み込まれ、第２の構築物はＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）スペーサーが組み込まれている。図２ｂは、これらの異なる構築物２ｎＭのＩＡbポジティブマウス中の様々なエピトープへの増殖性反応に対する初回抗原刺激能力を示すグラフであり、同量の同じペプチドのプール（各ペプチド３μｇ）によって誘導される応答と比較したものである。
【図３】マルチエピトープＤＮＡ構築物の構造を示す図である。ＨＬＡの限定を各エピトープ上に示す。Ａ*０２０１エピトープは太字で書かれている。ＨＬＡ結合親和性（ＩＣ50ｎＭ）を各エピトープの下に示す。（ａ）コードされたエピトープの順番を示すＨＩＶ−ＦＴの概略図。（ｂ）ＨＢＶ特異的構築物の概略図。Ｃｏｒｅ  １８に対するＣ＋１アミノ酸を矢印で示す。Ｃｏｒｅ  １８のＣ1位に単一のアミノ酸挿入物を含むＨＢＶ特異的構築物をＨＢＶ．１Ｘとして示す。
【図４】ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−ＦＴ中のＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの免疫原性を示すグラフである。（ａ）エピトープＰｏｌ  ４９８（丸）、Ｖｐｒ  ６２（三角）、Ｇａｇ  ３８６（正方形）に対する代表的ＣＴＬ応答。各ペプチドの存在下（塗りつぶした記号）または非存在下（白抜きの記号）でのジャーカット−ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb標的細胞に対する51Ｃｒ放出アッセイで細胞障害性を分析した。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−ＦＴの免疫原性のＣＴＬ応答の概要。横棒は陽性培養物の幾何平均ＣＴＬ応答を示す。陽性ＣＴＬ培養物の頻度も示す。
【図５】エピトープ免疫原性に対するＣ＋１アミノ酸の影響を示すグラフである。９４通りのエピトープ／Ｃ＋１アミノ酸の組合せを表す多様なマルチエピトープ構築物からのＣＴＬ応答を取り入れたデータベースを分析して、特定の組合せが最適なＣＴＬ応答を伴う例の頻度（％）を決定した。測定した培養物の少なくとも３０％において１００ＳＵまたは２０ＬＵよりも大きい場合にＣＴＬ応答を最適と見なした。所与のエピトープ／Ｃ＋１アミノ酸の組合せが観測された回数も示す。
【図６】ＨＢＶ特異的構築物に対するＣＴＬ応答を示すグラフである。（ａ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスのＤＮＡ免疫化後のＣｏｒｅ  １８エピトープに対するＣＴＬ応答。（ｂ）Ｃｏｒｅ  １８のＣ＋１位の単一アミノ酸挿入物で変わる構築物によるＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスのＤＮＡ免疫化後のＨＢＶ  Ｃｏｒｅ  １８に対するＣＴＬ応答。
【図７】ＨＢＶ．１（陰影の付いた棒）およびＨＢＶ．１Ｋ（斜線の入った棒）の各トランスフェクション細胞系におけるＨＢＶ  Ｃｏｒｅ  １８提示レベルを示すグラフである。エピトープの提示を、ペプチド特異的ＣＴＬ系を用いて定量化した。ＨＢＶ  Ｐｏｌ  ４５５の提示を比較のために示す。
【図８】ＨＩＶ−ＦＴ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）をトランスフェクションした２２１Ａ２Ｋb標的細胞のデータを示すグラフである。ＨＬＡトランスジェニックマウス由来のＣＴＬ系に対して、これらのトランスフェクション細胞のエピトープ提示能力を評価した。これらのトランスフェクション細胞は、様々なＨＩＶ誘導ＣＴＬエピトープに特異的である。異なるＣＴＬ系の抗原感受性の相違を補正するために、トランスフェクションしなかった細胞をＡＰＣとして用いて、ペプチド投与量の滴定を並行して行った。
【図９】本発明の方法を用いて最適化されたＨＩＶマルチエピトープ構築物を示す図である。ＧＡＡＡスペーサー（配列番号：４１７）；ＮＡＡＡ（配列番号：４１８）；ＫＡＡＡ（配列番号：４１９）。
【図１０】本発明の一実施形態によるマルチエピトープ構築物の自動最適化を実施するためのコンピュータシステムを示す図である。
【図１１Ａ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの実行に用いるユーザー入力パラメータを含む例示的な入力テキストファイルを示す表である。
【図１１Ｂ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの実行に用いるユーザー入力パラメータを含む例示的な入力テキストファイルを示す表である。
【図１２】本発明の一実施形態による最適マルチエピトープ構築物を同定するためのソフトウエアプログラムのフローチャートを示す図である。
【図１３Ａ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１３Ｂ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１３Ｃ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１３Ｄ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１４Ａ】ＥＰ−ＨＩＶ−９０によって誘導される、ＩＦＡ中の個々のペプチドに対するＣＴＬ応答を示すグラフである。
【図１４Ｂ】個々のペプチドに対するＰｆＣＴＬ．１．、ＰｆＣＴＬ．２およびＰｆＣＴＬ．３によって誘導されるＣＴＬ応答を示すグラフである。
【図１５】個々のエピトープへのＨＴＬ応答に対するクラスＩＩエピトープ構築物ＨＩＶ７５量体およびＨＩＶ６０量体中のＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）スペーサーの効果を示すグラフである。
【図１６】ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築物中に存在する個々のエピトープに対するＨＴＬ応答を示すグラフである。
【図１７】ＨＩＶ７５量体、ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３およびＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）中に存在するエピトープを示す概略図である。ＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）。
【図１８Ａ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｂ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｃ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｄ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｅ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｆ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｇ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｈ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｉ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｊ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｋ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｌ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｍ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｎ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１９Ａ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｂ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｃ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｄ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｅ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図２０Ａ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂを構築するのに使用したＨＢＶ  ＣＴＬエピトープを示す。
【図２０Ｂ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのエピトープの順番を示す。図２０Ｂでは、ＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂ中のシグナル配列は、Ｉｇκコンセンサスシグナル配列である。ただし、他のシグナル配列も利用できる。
【図２０Ｃ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂの、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスで誘導される免疫応答を示す。
【図２０Ｄ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのうち、ＨＢＶ−２のアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２０Ｅ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのうち、ＨＢＶ−２Ａのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２０Ｆ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのうち、ＨＢＶ−２Ｂのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２１Ａ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂを構築するのに使用したＨＢＶ  ＣＴＬエピトープを示す。
【図２１Ｂ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂのエピトープの順番を示す図である。
【図２１Ｃ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂの、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスにおいて誘導された免疫応答を示すグラフである。
【図２１Ｄ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂのうち、ＨＢＶ−２１Ａのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２１Ｅ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂのうち、ＨＢＶ−２１Ｂのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２２Ａ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃを構築するのに使用したＨＢＶ  ＣＴＬエピトープを示す。
【図２２Ｂ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃのエピトープの順番を示す図である。
【図２２Ｃ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃの、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスにおいて誘導された免疫応答を示すグラフである。
【図２２Ｄ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃのうち、ＨＢＶ−３０Ｂのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２２Ｅ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃのうち、ＨＢＶ−３０Ｃのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２３Ａ】ＨＢＶ−３０Ｃ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）において２つのＨＬＡ  Ａ２限定ＣＴＬエピトープに隣接するスペーサーになされた修飾を示す図である。プロセシングおよびその後の提示の効率が増加するように、したがって、エピトープの免疫原性が増加するように修飾を設計した。ＨＢＶ−３０ＣのＣｏｒｅ  １８エピトープの側面に位置するリシン（Ｋ）スペーサーを修飾して３個のアラニン残基（ＡＡＡ）を入れたＨＢＶ−３０ＣＬとした。また、ＨＢＶ−３０Ｃのｅｎｖ  １８３エピトープの側面に位置する１個のアスパラギン（Ｎ）スペーサーを修飾して３個のアラニン残基（ＡＡＡ）を入れたＨＢＶ−３０ＣＬとした。ＫＡＡＡ（配列番号：４１９）；ＮＡＡＡ（配列番号：４１８）。
【図２３Ｂ】２つのＨＬＡ  Ａ２限定ＣＴＬエピトープの側面に位置するスペーサーが修飾されたＨＢＶ−３０Ｃ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）の、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスを用いて測定した免疫原性を示すグラフである。
【図２３Ｃ】２つのＨＬＡ  Ａ２限定ＣＴＬエピトープの側面に位置するスペーサーが修飾されたＨＢＶ−３０Ｃ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）のアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２４Ａ】ＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）アミノ酸スペーサーによって分離されたＨＴＬエピトープを含むマルチエピトープワクチンを構築するのに使用したＨＴＬエピトープおよび選択されたＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に対するそれらの結合親和性を示す
【図２４Ｂ】ＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）アミノ酸スペーサーによって分離されたＨＴＬエピトープを含むマルチエピトープワクチンを構築するのに使用したＨＴＬエピトープの図である。
【図２４Ｃ】ＧＰＧＰＧ（配列番号：４１６）アミノ酸スペーサーによって分離されたＨＴＬエピトープを含むマルチエピトープワクチンの核酸配列およびその核酸によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０Ｆ】
2005502320.tif 000001