(57)【要約】本発明の目的は、皮膚又は粘膜細胞に対する細胞毒性が低減されており、より高い安全性を備える、アルギン酸及び／又はその塩を含む皮膚又は粘膜適用組成物を提供することである。分子量3500以下の低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩を配合して、皮膚又は粘膜適用組成物を調製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩を含有することを特徴とする、皮膚又は粘膜適用組成物。
【請求項２】
前記アルギン酸及び／又はその塩において、分子量380以上3500以下である画分が、分子量380以上である画分の総量の2.5％以下である、請求項１に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
【請求項３】
前記アルギン酸及び／又はその塩が、組成物の総量の0.001〜20重量％含まれる、請求項１に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
【請求項４】
液剤である、請求項１に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
【請求項５】
眼科用組成物、耳鼻科用組成物、口腔用組成物、直腸用組成物、膣用組成物、又は尿道用組成物である、請求項１に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
【請求項６】
点眼剤又は洗眼剤である、請求項１に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
【請求項７】
アルギン酸及び／又はその塩から、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に除去する工程を含む、アルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性の低減方法。
【請求項８】
分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜適用組成物の製造のための使用。
【請求項９】
分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜適用組成物において細胞毒性が惹起されるのを回避するための使用。
【請求項１０】
分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避し、且つ皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜における滞留性を高めるための使用。
【請求項１１】
皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避するための、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩。
【請求項１２】
皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避し、且つ皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜における滞留性を高めるための、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚又は粘膜細胞に対する細胞毒性が低減されている、アルギン酸及び／又はその塩を含有する皮膚又は粘膜適用組成物に関する。更に、本発明は、アルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性を低減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸は、Ca2+イオン等の二価以上の陽イオンによって部分的に架橋されてゲル化（高粘度化）する作用を有しており、眼粘膜、鼻粘膜、口腔内粘膜等の粘膜に適用可能な成分であることが既に知られている（特許文献１参照）。アルギン酸を含む製剤を皮膚や粘膜に適用すると、皮膚や粘膜に存在する微量のCa2+イオンとアルギン酸が接触することにより、皮膚や粘膜上で製剤がゲル化（高粘度化）し、適用部位での該製剤の滞留性を高めたり、有効成分の効果を持続させたりすることも分かっている。【０００３】
一方、皮膚や粘膜、特に粘膜は、刺激や毒性に対する感受性が極めて高いために、適用される成分には、低刺激であり且つ低毒性であることが求められる。刺激性に関しては、アルギン酸は、皮膚や粘膜において低刺激であるだけでなく、他の物質の刺激性を低減させる作用をも有していることが報告されている（特許文献２参照）。これに対して、細胞毒性に関しては、アルギン酸のカルシウム塩については細胞毒性を示すことが報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、他のアルギン酸の塩やアルギン酸自体についての細胞毒性については、十分に検討されているとはいえないのが現状である。【０００４】
近年、安全性に対する意識が高まっており、細胞毒性が極力低減されている皮膚又は粘膜適用組成物を提供することが望まれている。
【特許文献１】特開２００２−３３２２４８号公報
【特許文献２】特開２００６−５１７２００号公報
【特許文献３】特開２００１−２１２２２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、皮膚又は粘膜に対する毒性が低減されており、より高い安全性を備える、アルギン酸及び／又はその塩を含む皮膚又は粘膜適用組成物を提供することである。更に、本発明の他の目的は、アルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性を低減する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、以下の新たな知見を見出した。
(i)従来、コンブ等から精製され、生体への適用が許容されていたアルギン酸及び／又はその塩では、分子量が380〜1000000程度の範囲のものが混在している。中でも、分子量が3500以下である低分子量画分のアルギン酸及び／又はその塩は、全体の7〜20％程度（GPC法によるピーク面積比）存在している。
(ii)分子量が3500以下である低分子量画分は、粘膜細胞に対して細胞毒性を示すが、これより大きい分子量画分は、粘膜細胞に対して細胞毒性を示さない。
(iii)分子量が3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩を採用し、これを皮膚又は粘膜適用組成物に配合することによって、皮膚又は粘膜適用組成物の細胞毒性を顕著に低減でき、その安全性をより一層高めることができる。【０００７】
本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。【０００８】
即ち、本発明は、下記に掲げる皮膚又は粘膜適用組成物である。
項1-1.  分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩を含有することを特徴とする、皮膚又は粘膜適用組成物。
項1-2.  前記アルギン酸及び／又はその塩において、分子量380以上3500以下である画分が、分子量380以上である画分の総量の2.5％以下である、項1-1に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
項1-3.  前記アルギン酸及び／又はその塩が、組成物の総量の0.001〜20重量％含まれる、項1-1に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
項1-4.  液剤である、項1-1に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
項1-5.  眼科用組成物、耳鼻科用組成物、口腔用組成物、直腸用組成物、膣用組成物、又は尿道用組成物である、項1-1に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。
項1-6.  点眼剤又は洗眼剤である、項1-1に記載の皮膚又は粘膜適用組成物。【０００９】
また、本発明は、下記に掲げるアルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性の低減方法である。
項2-1.  アルギン酸及び／又はその塩から、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に除去する工程を含む、アルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性の低減方法。
項2-2.  前記工程が、アルギン酸及び／又はその塩から、分子量380以上3500以下である画分が分子量380以上である画分の総量の2.5％以下になるように該低分子量画分を除去する工程である、項2-1に記載の低減方法。【００１０】
また、本発明は、下記に掲げる使用である。
項3-1.  分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜適用組成物の製造のための使用。
項3-2.  細胞毒性が低減された皮膚又は粘膜適用組成物の製造のための使用である、項3-1に記載の使用。
項3-3.   前記アルギン酸及び／又はその塩において、分子量380以上3500以下である画分が、分子量380以上である画分の総量の2.5％以下である、項3-1に記載の使用。
項3-4.  前記アルギン酸及び／又はその塩が、皮膚又は粘膜適用組成物の総量の0.001〜20重量％含まれる、項3-1に記載の使用。
項3-5.  皮膚又は粘膜適用組成物が、液剤である、項3-1に記載の使用。
項3-6.  皮膚又は粘膜適用組成物が、眼科用組成物、耳鼻科用組成物、口腔用組成物、直腸用組成物、膣用組成物、又は尿道用組成物である、項3-1に記載の使用。
項3-7.  皮膚又は粘膜適用組成物が、点眼剤又は洗眼剤である、項3-1に記載の使用。【００１１】
また、本発明は、下記に掲げる使用である。
項4-1.  分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜適用組成物において細胞毒性が惹起されるのを回避するための使用。
項4-2.  前記アルギン酸及び／又はその塩において、分子量380以上3500以下である画分が、分子量380以上である画分の総量の2.5％以下である、項4-1に記載の使用。
項4-3.  細胞毒性が低減された皮膚又は粘膜適用組成物の製造のための使用である、項4-1に記載の使用。
項4-4.  皮膚又は粘膜適用組成物が、液剤である、項4-1に記載の使用。
項4-5.  皮膚又は粘膜適用組成物が、眼科用組成物、耳鼻科用組成物、口腔用組成物、直腸用組成物、膣用組成物、又は尿道用組成物である、項4-1に記載の使用。
項4-6.  皮膚又は粘膜適用組成物が、点眼剤又は洗眼剤である、項4-1に記載の使用。【００１２】
また、本発明は、下記に掲げる使用である。
項5-1.  分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避し、且つ皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜における滞留性を高めるための使用。
項5-2.  前記アルギン酸及び／又はその塩において、分子量380以上3500以下である画分が、分子量380以上である画分の総量の2.5％以下である、項5-1に記載の使用。
項5-3.  細胞毒性が低減された皮膚又は粘膜適用組成物の製造のための使用である、項5-1に記載の使用。
項5-4.  皮膚又は粘膜適用組成物が、液剤である、項5-1に記載の使用。
項5-5.  皮膚又は粘膜適用組成物が、眼科用組成物、耳鼻科用組成物、口腔用組成物、直腸用組成物、膣用組成物、又は尿道用組成物である、項5-1に記載の使用。
項5-6.  皮膚又は粘膜適用組成物が、点眼剤又は洗眼剤である、項5-1に記載の使用。【００１３】
また、本発明は、下記に掲げるアルギン酸及び／又はその塩の用途である。
項6-1.  皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避するための、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩。
項6-2.  分子量380以上3500以下である画分が、分子量380以上である画分の総量の2.5％以下である、項6-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
項6-3.  皮膚又は粘膜適用組成物が、液剤である、項6-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
項6-4.  皮膚又は粘膜適用組成物が、眼科用組成物、耳鼻科用組成物、口腔用組成物、直腸用組成物、膣用組成物、又は尿道用組成物である、項6-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
項6-5.  皮膚又は粘膜適用組成物が、点眼剤又は洗眼剤である、項6-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
【００１４】
また、本発明は、下記に掲げるアルギン酸及び／又はその塩の用途である。
項7-1.  皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避し、且つ皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜における滞留性を高めるための、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩。
項7-2.  分子量380以上3500以下である画分が、分子量380以上である画分の総量の2.5％以下である、項7-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
項7-3.  皮膚又は粘膜適用組成物が、液剤である、項7-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
項7-4.  皮膚又は粘膜適用組成物が、眼科用組成物、耳鼻科用組成物、口腔用組成物、直腸用組成物、膣用組成物、又は尿道用組成物である、項7-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
項7-5.  皮膚又は粘膜適用組成物が、点眼剤又は洗眼剤である、項7-1に記載のアルギン酸及び／又はその塩。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物によれば、アルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性が著しく低減されているため、毒性に対して過敏な粘膜に対しても、高い安全性をもって使用できる。【００１６】
また、従来使用されているアルギン酸及び／又はその塩は、溶液中で沈殿を生じ易い性質があり、製剤化が困難であったが、本発明で使用されるアルギン酸及び／又はその塩によれば、沈殿の生成を抑制することができる。従って、本発明の皮膚又は粘膜適用組成物は、従来使用されているアルギン酸及び／又はその塩を使用する場合に比して、製剤化が容易である点でも利点がある。【００１７】
更に、本発明の皮膚又は粘膜適用組成物は、配合されているアルギン酸及び／又はその塩の作用により、皮膚又は粘膜上で汗や涙液等の体液と接触すると、優れた増粘効果及びゲル強度の増強効果を示す。そのため、本発明の皮膚又は粘膜適用組成物は、皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避し且つ、該皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜上での滞留性を高めたり、該有効成分の効果を持続させるのに有用である。【００１８】
また、本発明のアルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性の低減方法は、粘膜細胞又は皮膚細胞に対して細胞毒性が低減されたアルギン酸及び／又はその塩を提供できるので、細胞毒性が低減され安全性の高い皮膚又は粘膜適用組成物に配合される原料素材の供給に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
I．皮膚又は粘膜適用組成物
アルギン酸とは、マンヌロン酸（以下、単に「Ｍ」と表示することもある）とグルロン酸（以下、単に「Ｇ」と表示することもある）から構成される多糖類であり、マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、及びマンヌロン酸とグルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。【００２０】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物では、分子量が3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸又はその塩が使用される。ここで、「分子量が3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸」とは、分子量が3500以下である低分子量画分の除去処理がなされ、分子量が3500以下である画分が不可避的に残存するものを除いては含まれていないアルギン酸のことである。より具体的には、「分子量が3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸」として、GPC法を行った時に、分子量380以上である画分の総量（分子量380以上に相当するピーク面積の総和）に対する分子量380以上3500以下である画分（分子量380以上3500以下に相当するピーク面積の総和）の割合（以下、単に、「分子量3500以下の割合」と表記することもある）が2.5％以下であるアルギン酸が例示される。【００２１】
皮膚又は粘膜細胞に対する毒性をより低減させるという観点から、本発明の皮膚又は粘膜適用組成物で使用されるアルギン酸としては、分子量3500以下の割合が、好ましくは0〜2.0％未満、更に好ましくは0〜1.5％未満、特に好ましくは0〜1.0％未満のものが挙げられる。換言すれば、本発明に使用されるアルギン酸としては、分子量3500より大きい分子量画分（高分子量画分）が、分子量380以上である画分の総量に対して、97.5％より多く、好ましくは98.0〜100％、更に好ましくは98.5〜100％、特に好ましくは99.0〜100％を占めているものが例示される。【００２２】
本発明において、アルギン酸の分子量、及び分子量3500以下の割合は、ゲル浸透クロマトグラフィー法（GPC法）により求められる。具体的条件については、参考例に記載する。【００２３】
また、本発明に使用されるアルギン酸及び／又はその塩において、そのグルロン酸に対するマンヌロン酸の構成比率（M/G比；モル比）については、特に制限されず、例えばM/G比が０．４〜４．０の範囲に含まれるものが広く使用される。M/G比が小さい程、組成物のゲル化が開始し易い傾向があり、薬理活性成分の適用部位における滞留性を向上させるという観点からは、M/G比が２．５以下、好ましくは２．０以下、より好ましくは１．６以下、特に好ましくは１．０以下であることが望ましい。なお、本発明において、M/G比は、アルギン酸をブロック単位で分解したものを分画し、それぞれを定量することにより算出される値であり、具体的には、A. Haug et al., Carbohyd. Res. 32(1974), p.217-225に記載の方法に従って測定される。【００２４】
また、本発明に使用されるアルギン酸及び／又はその塩において、ＭＭ画分、ＧＧ画分及びＭＧ画分の比率についても、特に制限されず、皮膚又は粘膜適用組成物の用途や形状に応じて適宜選択することができる。【００２５】
また、本発明に使用されるアルギン酸の塩としては、分子量が3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸の塩の形態であり、且つ薬理学的に又は生理学的に許容されることを限度として、特に制限されるものではない。当該アルギン酸の塩として、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらのアルギン酸の塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。【００２６】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物には、分子量が3500以下である低分子量画分を実質的に含まないことを限度として、アルギン酸及びその塩の中から、一種のものを選択して単独で使用してもよく、二種以上のものを任意に組み合わせて使用してもよい。特に、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムは水溶性であり、本発明において好適に使用される。尚、本発明の効果をより有利に得られる、また製造が簡易である等の観点から、特にアルギン酸が好ましい。【００２７】
上記の分子量範囲を満たすアルギン酸及び／又はその塩は、市販されているアルギン酸及び／又はその塩、或いは常法に従ってコンブから精製したアルギン酸及び／又はその塩を、ゲル濾過等に供して、分子量3500以下の画分を除去することにより調製することができる。また、市販されているアルギン酸及び／又はその塩、或いは常法に従ってコンブから精製したアルギン酸及び／又はその塩を、水より低い極性の溶液に添加して、生成した析出物を回収することによっても、上記の分子量範囲を満たすアルギン酸及び／又はその塩を調製することもできる。ここで、水より低い極性の溶液としては、具体的には、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトン等の有機溶媒、又はこれらと水の混合液が例示される。【００２８】
本発明で用いるアルギン酸及び／又はその塩をコンブから精製する場合、原料として使用されるコンブとしては、例えば、チリ産のLessonia nigrescens、チリ産のLessonia flavicans、米国西海岸産のMacrocystis pyrifera、南アフリカ産のEcklonia maxima、タスマニア産のDurvillaea potatorum、北欧産のAscophyllum nodosum、北欧産のLaminaria hyperborea、北欧産のLaminaria digitata等が例示される。【００２９】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物において、上記のアルギン酸画分の配合割合については、特に制限されるものではなく、適用される粘膜の種類、該皮膚又は粘膜適用組成物の形態等に応じて適宜設定すればよい。具体的には、上記のアルギン酸画分の配合割合（アルギン酸重量換算）として、皮膚又は粘膜適用組成物の総量に対して、通常0.001〜20重量％、好ましくは0.005〜10重量％が挙げられる。上記のアルギン酸画分の配合割合（アルギン酸重量換算）について、皮膚又は粘膜適用組成物の用途毎の具体例は、以下の通りである：
眼科用組成物の場合、通常0.001〜1重量％、好ましくは0.005〜1重量％、更に好ましくは0.01〜0.5重量％、特に好ましくは0.01〜0.2重量％；
鼻腔用組成物の場合、通常0.001〜10重量％、好ましくは0.01〜5重量％、更に好ましくは0.05〜1重量％；
口腔用組成物の場合、通常0.001〜20重量％、好ましくは0.01〜10重量％、更に好ましくは0.01〜5重量％；
直腸用、膣用又は尿道用組成物の場合、通常0.001〜10重量％、好ましくは0.005〜5重量％、更に好ましくは0.01〜2重量％；
経皮用組成物の場合、通常0.001〜20重量％、好ましくは0.01〜10重量％、更に好ましくは0.01〜5重量％。【００３０】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物には、上記のアルギン酸及び／又はその塩に加えて、有効成分（薬理活性成分や生理活性成分等）を配合することができる。このような成分の種類は特に制限されず、例えば、充血除去成分、眼筋調節薬成分、抗炎症薬成分又は収斂薬成分、抗アレルギー薬成分、ビタミン類、アミノ酸類、抗菌薬成分又は殺菌薬成分、糖類、高分子化合物又はその誘導体、セルロース又はその誘導体、局所麻酔薬成分、緑内障治療成分、白内障治療成分等が例示できる。本発明において好適な薬理活性成分及び生理活性成分としては、例えば、次のような成分が挙げられる。【００３１】
充血除去成分：例えば、α−アドレナリン作動薬、具体的にはエピネフリン、塩酸エピネフリン、塩酸エフェドリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸ナファゾリン、塩酸フェニレフリン、塩酸メチルエフェドリン、酒石酸水素エピネフリン、硝酸ナファゾリンなど。これらはｄ体、ｌ体又はｄｌ体のいずれでもよい。【００３２】
眼筋調節薬成分：例えば、アセチルコリンと類似した活性中心を有するコリンエステラーゼ阻害剤、具体的にはメチル硫酸ネオスチグミン、トロピカミド、ヘレニエン硫酸アトロピンなど。【００３３】
抗炎症薬成分又は収斂薬成分：例えば、硫酸亜鉛、乳酸亜鉛、アラントイン、イプシロン−アミノカプロン酸、インドメタシン、塩化リゾチーム、硝酸銀、プラノプロフェン、アズレンスルホン酸ナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、グリチルリチン酸二アンモニウム、ジクロフェナクナトリウム、ブロムフェナクナトリウム、塩化ベルベリン、硫酸ベルベリンなど。【００３４】
抗アレルギー薬成分：例えば、レボカバスチン、アンレキサノクス、イブジラスト、タザノラスト、トラニラスト、イソチペンジル、ジフェテロール、トリプロリジン、トリペレナミン、トンジルアミン、メブヒドロリン、フェネタジン、オキサトミド、スプラタスト、クロモグリク酸ナトリウム、ペミロラストカリウムなど。【００３５】
ビタミン類：例えば、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、塩酸ピリドキシン、フラビンアデニンジヌクレオチドナトリウム、リン酸ピリドキサール、シアノコバラミン、パンテノール、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、アスコルビン酸、酢酸トコフェロール、ニコチン酸トコフェロール、コハク酸トコフェロール、コハク酸トコフェロールカルシウム、ユビキノン誘導体など。【００３６】
アミノ酸類：例えば、アミノエチルスルホン酸（タウリン）、グルタミン酸、クレアチニン、アスパラギン酸ナトリウム、アスパラギン酸カリウム、アスパラギン酸マグネシウム、アスパラギン酸マグネシウム・カリウム混合物、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸マグネシウム、イプシロン−アミノカプロン酸、グリシン、アラニン、アルギニン、リジン、γ−アミノ酪酸、γ−アミノ吉草酸、コンドロイチン硫酸ナトリウムなど。これらはｄ体、ｌ体又はｄｌ体のいずれでもよい。【００３７】
抗菌薬成分又は殺菌薬成分：例えば、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロラムフェニコール、スルファメトキサゾール、スルフイソキサゾール、スルファメトキサゾールナトリウム、スルフイソキサゾールジエタノールアミン、スルフイソキサゾールモノエタノールアミン、スルフイソメゾールナトリウム、スルフイソミジンナトリウム、オフロキサシン、ノルフロキサシン、レボフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、アシクロビルなど。【００３８】
糖類：例えば単糖類、二糖類、具体的にはグルコース、マルトース、トレハロース、スクロース、シクロデキストリン、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなど。【００３９】
高分子化合物又はその誘導体：例えば、アラビアゴム、カラヤガム、キサンタンガム、キャロブガム、グアーガム、グアヤク脂、クインスシード、ダルマンガム、トラガント、ベンゾインゴム、ローカストビーンガム、カゼイン、寒天、デキストリン、デキストラン、カラギーナン、ゼラチン、コラーゲン、ペクチン、デンプン、ポリガラクツロン酸、キチンおよびその誘導体、キトサンおよびその誘導体、エラスチン、ヘパリン、ヘパリノイド、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、セラミド、ポリビニルアルコール(完全、または部分ケン化物)、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン、リボ核酸、デオキシリボ核酸、マクロゴールおよびその薬学上許容される塩類など。【００４０】
セルロース又はその誘導体：例えば、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシエチルセルロース、ニトロセルロースなど。【００４１】
局所麻酔薬成分：例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなど。【００４２】
緑内障治療成分：例えば、イソプロピルウノプロストン、エピネフリン、塩酸アプラクロニジン、塩酸カルテオロール、塩酸ジピベフリン、塩酸ドルゾラミド、塩酸ピロカルピン、塩酸ブナゾシン、塩酸ブプラノロール、塩酸ベタキソロール、塩酸ベフノロール、カルバコール、塩酸レボブノロール、ジピバル酸エピネフリン、臭化ジスチグミン、ニプラジロール、マレイン酸チモロール、ラタノプロストなど。【００４３】
白内障治療成分：例えば、グルタチオン、ピレノキシン、5,12−ジヒドロアザペンタセンジスルホン酸ナトリウム（Sodium 5,12-dihydro azapentacene disulfonate）など。【００４４】
皮膚適用製剤や粘膜適用製剤等の分野において各種成分の配合割合は既知であり、本発明の該皮膚又は粘膜適用組成物中の上記成分の配合割合は、該皮膚又は粘膜適用組成物の剤型、薬理活性成分又は生理活性成成分の種類等に応じて適宜設定される。例えば、薬理活性成分又は生理活性成成分の配合割合は、皮膚又は粘膜適用組成物の総量に対して0.0001〜30重量％、好ましくは0.001〜10重量％程度の範囲から選択できる。【００４５】
また、本発明の皮膚又は粘膜適用組成物には、発明の効果を損なわない範囲であれば、その用途や形態に応じて、常法に従い、様々な成分や添加物を適宜選択し、一種またはそれ以上を併用して含有させることができる。それらの成分または添加物として、例えば、半固形剤や液剤などの調製に一般的に使用される担体（水性溶媒、水性又は油性基剤など）、界面活性剤、防腐剤、殺菌剤又は抗菌剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、キレート剤、緩衝剤、安定化剤等の各種添加剤を挙げることができる。【００４６】
以下に本発明の皮膚又は粘膜適用組成物に使用される代表的な成分を例示するが、これらに限定されない。【００４７】
担体：水、含水エタノール等の水性溶媒。【００４８】
界面活性剤：例えば、ポリオキシエチレン（以下、ＰＯＥと略す）−ポリオキシプロピレン（以下、ＰＯＰと略す）ブロックコポリマー (具体的には、ポロクサマー407など)、エチレンジアミンのＰＯＥ-ＰＯＰブロックコポリマー付加物（具体的には、ポロキサミンなど）、モノオレイン酸ＰＯＥソルビタン、ＰＯＥ硬化ヒマシ油（具体的には、ＰＯＥ(60)硬化ヒマシ油など）、ステアリン酸ポリオキシルなどの非イオン性界面活性剤；アルキルジアミノエチルグリシンなどのグリシン型両性界面活性剤；アルキル４級アンモニウム塩（具体的には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどの陽イオン界面活性剤など。なお、括弧内の数字は付加モル数を示す。【００４９】
防腐剤、殺菌剤又は抗菌剤：例えば、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、安息香酸ナトリウム、エタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、硫酸オキシキノリン、フェネチルアルコール、ベンジルアルコール、ビグアニド化合物（具体的には、ポリヘキサメチレンビグアニドなど）、グローキル（ローディア社製  商品名）など。【００５０】
ｐＨ調節剤：例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、トリエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、硫酸、ポリリン酸、プロピオン酸、シュウ酸、グルコン酸、フマル酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、グルコノラクトン、酢酸アンモニウムなど。【００５１】
等張化剤：例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、グリセリン、プロピレングリコールなど。【００５２】
キレート剤：例えば、アスコルビン酸、エデト酸四ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸など。【００５３】
緩衝剤：クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤など。具体的には、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂 、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムなど。【００５４】
安定化剤：ジブチルヒドロキシトルエン、トロメタモール、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート（ロンガリット）、トコフェロール、ピロ亜硫酸ナトリウム、モノエタノールアミン、モノステアリン酸アルミニウム、モノステアリン酸グリセリンなど。【００５５】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物は、その剤型については特に制限されず、液剤、懸濁剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、貼付剤、スプレー剤、エアゾール剤等の剤型が広く挙げられる。これらの中で、好ましくは液剤である。【００５６】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物は、その剤型等に応じて、適当な基剤や添加剤を適宜使用して、通常の方法に従って製造することができる。【００５７】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物の適用対象は、皮膚又は粘膜のいずれであってもよいが、好ましくは粘膜である。適用対象とする粘膜については、特に制限されず、生体を構成する様々な粘膜に対して適用することができる。具体的には、粘膜適用組成物にする場合には、角膜及び結膜等の眼粘膜に適用される眼科用組成物；鼻腔、耳腔等に適用される耳鼻科用組成物；歯茎、舌、口唇、口腔粘膜等の口腔用組成物；直腸に適用される直腸用組成物；膣に適用される膣用組成物；尿道に適用される尿道用組成物等として使用することができる。【００５８】
上記眼科用組成物として、具体的には、点眼剤（点眼薬、点眼液を含む）、洗眼剤（洗眼薬、洗眼液を含む）、眼軟膏薬、コンタクトレンズ装着液、コンタクトレンズ用ケア用剤（洗浄液、保存液、消毒液、マルチパーパスソリューションなど）等が例示される。なお、上記の点眼剤及び洗眼剤には、コンタクトレンズを装用したまま使用可能な点眼剤及び洗眼剤を含む。また、本明細書において、コンタクトレンズとは、ハードコンタクトレンズ（酸素透過性ハードコンタクトレンズも含む）、ソフトコンタクトレンズ等のあらゆるタイプのコンタクトレンズを包含する。また、上記耳鼻科用組成物としては、具体的には、点鼻剤（点鼻薬、点鼻液を含む）、洗鼻剤（洗鼻薬、洗鼻液を含む）、点耳剤（点耳薬、点耳液を含む）が例示される。また、上記口腔用組成物としては、具体的には、口腔咽頭薬、含嗽薬等が例示される。上記直腸用組成物としては、具体的には、痔疾用剤、坐剤等が例示される。また、上記膣用組成物としては、具体的には、膣坐剤、膣用クリーム剤が例示される。また、尿道用組成物としては、具体的には、粘滑・表面麻酔剤が例示される。【００５９】
本発明の皮膚又は粘膜適用組成物は、上記用途の中でも、好ましくは眼科用組成物、更に好ましくは点眼剤又は洗眼剤として使用される。生体を構成する粘膜の中でも、眼粘膜は、細胞毒性による悪影響を受け易い粘膜の１つであることが知られているが、本発明の皮膚又は粘膜適用組成物によれば、このような細胞毒性による悪影響に対して過敏な眼粘膜に対しても、細胞毒性を示すことなく高い安全性をもって使用することができる。また、洗眼剤は、眼粘膜を多量の液で洗浄するため好ましい。【００６０】
II.  アルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性の低減方法
前述するように、アルギン酸及び／又はその塩から、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に除去することによって、粘膜細胞又は皮膚細胞に対して細胞毒性を示さないアルギン酸及び／又はその塩を提供することができる。そこで、本発明は、更に、他の観点から、アルギン酸及び／又はその塩から、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に除去する工程を含む、アルギン酸及び／又はその塩の細胞毒性の低減方法を提供する。当該低減方法において、アルギン酸及び／又はその塩から分子量3500以下である低分子量画分を実質的に除去する手段については、前記「I. 皮膚又は粘膜適用組成物」の欄に記載の通りである。【００６１】
III.  分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の使用
前述するように、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩は、皮膚又は粘膜適用組成物、特に細胞毒性が低減された皮膚又は粘膜適用組成物の製造に有用である。そこで、本発明は、更に、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜適用組成物の製造のための使用を提供する。【００６２】
更に、当該アルギン酸及び／又はその塩を使用することによって、分子量3500以下である低分子量画分を含むアルギン酸及び／又はその塩を配合した皮膚又は粘膜適用組成物において細胞毒性が惹起されるのを回避することができる。そこで、本発明は、更に、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜適用組成物において細胞毒性が惹起されるのを回避するための使用を提供する。また、本発明は、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の、皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避し、且つ皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜における滞留性を高めるための使用を提供する。【００６３】
IV.  分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩の用途
前述するように、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩を使用することによって、分子量3500以下である低分子量画分を含むアルギン酸及び／又はその塩により皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避することができる。そこで、本発明は、更に、皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避するための、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩を提供する。【００６４】
また、当該アルギン酸及び／又はその塩を使用することによって、皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避しつつ、皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜上での滞留性を高めることができる。そこで、本発明は、更に、皮膚又は粘膜において細胞毒性が惹起されるのを回避し、且つ皮膚又は粘膜適用組成物に配合されている有効成分の皮膚又は粘膜における滞留性を高めるための、分子量3500以下である低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸及び／又はその塩を提供する。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例及び試験例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００６６】
参考例  アルギン酸の分子量の測定方法
以下の方法に従って、アルギン酸の分子量、及び分子量3500以下の割合を求めた。まず、分子量マーカーとして分子量既知のプルラン標準品８種を用い、プルランの分子量とGPC法による保持時間との検量線を求めた。次に、アルギン酸（補正用アルギン酸試料）をGPC法に供し、先に求めた検量線からアルギン酸（補正用アルギン酸試料）の仮の重量平均分子量を求めた。更に、GPC法の検出器として多角度光散乱検出器（MALS）を用いて、アルギン酸（補正用アルギン酸試料）をGPC法に供し、重量平均分子量を求め、先にプルランから求めた関係式を補正する。以後、この補正した関係式を用いて、アルギン酸の分子量、及び分子量3500以下の割合を求める。詳細は、以下に示す通りである。【００６７】
(1)GPC測定条件
ゲル浸透クロマトグラフィー法（GPC法）は液体クロマトグラフを用い、以下の測定条件にて測定する。
(1-1)検出器：示差屈折率検出器又は多角度光散乱検出器（MALS）
(1-1-1)多角度光散乱検出器（MALS）：DAWN-EOS型多角度光散乱検出器を用いる。
(1-1-2)波長：690nm（半導体レーザー）に設定する。
(1-1-3)第2ビリアル係数(A2)×濃度(c)：0 mol/gに設定する。
(1-1-4)屈折率増分(dn/dc)：0.114mL/gに設定する。
(1-1-5)温度：23±2℃に設定する。
(1-2)カラム：ポリエチレンオキサイド又はポリエチレングリコールの水溶液におけるに対する排除限界分子量が1000万、40万、及び5000である親水性ビニルポリマー（粒径は順に13μm、10μｍ、7μｍ）がそれぞれ充填された３本のステンレス製カラムを連結させて使用する。ステンレス製カラムは何れも1本につき、内径7.8mm、長さ30cmのものを用いる。
(1-3)カラム温度：35℃に設定する。
(1-4)移動相：リン酸二水素アンモニウム11.5g及び塩化ナトリウム17.5gを蒸留水に溶解して全量を1000mLとし、リン酸を用いてpH 4.0に調整した液を用いる。
(1-5)移動相の流量：0.75mL/分に設定する。なお、本試験においては、ベースラインを安定化させることが重要であるので、ベースラインを安定させるために，機器の温度管理と平衡化を十分に行う。対照路を開放した状態で終夜以上移動相を流した後に、対照路を閉じてさらに終夜以上移動相を流す。また、分析中は部屋の温度変化がないようにして，更にカラム、配管、検出器など機器内の温度も一定になるようにする。【００６８】
(2)分子量マーカーによる検量線の作成
分子量マーカーとして入手可能なプルラン標準品（分子量5900〜788000の範囲内で分子量既知のプルランが8種類以上）及びブドウ糖をそれぞれ0.1w/v%となるように上記GPC測定条件に記載の移動層に溶解し、それぞれ100μLを下記記載のGPC法に供して、それぞれの溶出時間を求める。各プルラン標準品の分子量Mの対数値log10Mをｙ軸、及びそれぞれの溶出時間をｘ軸として、プルラン標準品の検量線を作成し、この検量線の直線式（下式１）を求める。【００６９】
【数１】
2008056786.tif 000002
【００７０】
(3)検量線直線式の補正
(3-1)補正用アルギン酸試料の作成
乾燥したコンブ（Lessonia nigrescens）100ｇを切断し、水洗した後、0.2重量％硫酸3Ｌに2時間浸漬する。浸出液を除去し、残渣を次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素10.5重量％）水溶液1Ｌに10分間浸漬し、この残渣を取り出し、精製水を加えて3Ｌとし、10時間放置する。この液に硫酸酸性メタノール水溶液（硫酸濃度2重量％、メタノール濃度90重量％、残部水）を同量加え、析出する沈殿物をろ過回収し、乾燥する。この乾燥沈殿物3ｇを取り，250 mLの水に少しずつ加え，10分間撹拌して，水中で均一に分散していることを確認した後，炭酸ナトリウム0.825 gを加えてさらに20分間撹拌、沈殿物を溶解せしめる。沈殿物が完全に溶解していることを確認した後，水を加えて300 gとした液を粗アルギン酸溶液とする。次に、粗アルギン酸溶液200 gにアセトン1800 mLを少しずつ加えて、30分間撹拌した後、ろ紙（φ110mm）でろ過する。ろ紙上に得られた残留物を回収し、室温で乾燥させてアセトンを留去したものを補正用アルギン酸試料とする。【００７１】
(3-2)補正用アルギン酸試料のプルラン標準品による仮の重量平均分子量測定
上記で調製した補正用アルギン酸試料を量り0.1w/v%となるように、上記GPC測定条件に記載の移動層に溶解し、試料溶液とする。この試料溶液をGPC法に供して分析する。この補正用アルギン酸試料の分析において、分析後の解析時に自動積分法によりアルギン酸のピークを溶出時間を0.1分ごとにｉ個に区切り、その区間毎に面積値（An）を算出する。また、各区間の溶出時間を式1に代入することにより、各々のMの値を算出し、これを各区間のアルギン酸の仮の分子量（Mn assumption）とする。また、各区間の面積値（An）を各区間のアルギン酸の仮の分子量（Mn assumption）で除することにより、各区間のアルギン酸の仮の分子数（Nn assumption）を算出する。斯くして算出された仮の分子量（Mn assumption）と仮の分子数（Nn assumption）を用いて、下式２にから補正用アルギン酸試料の仮の重量平均分子量（Mw assumption）を算出する。【００７２】
【数２】
2008056786.tif 000003
【００７３】
(3-3)補正用アルギン酸試料の真の重量平均分子量測定
補正用アルギン酸試料を量り、0.5w/v％になるように上記GPC測定条件に記載の移動層に溶解し、試料溶液とする。この試料溶液100μLを多角度光散乱検出器（MALS）を検出器に接続したGPC法に供し、GPC-MALS法により、真の重量平均分子量（Mw real）を測定する。重量平均分子量の算出は、検出された単一ピークについて、Berryプロットを行い、その切片の値を読みとることにより行う。【００７４】
(3-4)直線式の補正
式２によって算出される仮のアルギン酸の重量平均分子量（Mw assumption）の値が、上記(3-3)のGPC-MALS法で求めた真の重量平均分子量（Mw real）と同じ値となるように、アルギン酸の仮の分子量（Mn assumption）の値を補正計算することにより、各区間のアルギン酸の真の分子量（Mn real）を求める。具体的には、上記式２にMn assumption及びNn assumptionの値として以下の数値を代入して算出される値がMw realと一致するように、b'の値を算出する。【００７５】
【数３】
2008056786.tif 000004
【００７６】
上記で得られたａ及びb'の値を用いた下記の式３を真のアルギン酸検量線とする。【００７７】
【数４】
2008056786.tif 000005
【００７８】
(4)  分子量の算出と分子量3500以下のピーク面積の算出
測定対象のアルギン酸及び／又はその塩について、GPC法により得られたクロマトグラフの各ピークの溶出時間を上記式3で得られた検量線に照合することにより、各ピークの分子量を算出する。【００７９】
なお、本発明において、GPC法により得られたクロマトグラフのピーク面積は、AgilentTechnology社製のAgilent 1100シリーズ AgilentChemstationを用いた以下の設定条件の自動積分法、或いはこれに準ずる方法の下に算出されるものである。
・初期設定
Slope Sensivity  5
Peak Width  10
Area Reject  100
High Reject  10
Soulder  Drop
・プログラム
0.1秒  Integration  OFF
アルギン酸の分子量1100000に相当する溶出時間  Baseline at Valleys ON  
アルギン酸の分子量1000000に相当する溶出時間  Integration  ON
アルギン酸の分子量3500に相当する溶出時間  Split peak ON
アルギン酸の分子量3000に相当する溶出時間  Slope Sensivity  2.5。【００８０】
分子量3500以下のアルギン酸のピーク面積は、分子量380以上3500以下のアルギン酸のピークの面積として算出する。【００８１】
試験例１
１．アルギン酸の調製
＜低分子量画分が除かれていないアルギン酸の調製＞
チリ産の乾燥コンブ（Lessonia nigrescens）片5 gに水100 mLを加えて，室温で60分間静置した後、90〜100℃の温浴中でガラス棒で時々かき混ぜながら30分間加温した。その後、4℃で約3時間冷却し、ろ紙（ADVANTEC社製，No.2，φ110mm）でろ過したろ液を回収した。この液50mLにアセトン450ｍLを加えて攪拌して、同様にろ紙でろ過することによって、沈殿物を回収した。この沈殿物を乾燥することにより、アルギン酸（比較例１）を得た。
＜低分子量画分が除かれているアルギン酸、及びアルギン酸の低分子量画分の調製＞
チリ産の乾燥したコンブ（Lessonia nigrescens）100ｇを切断し、水洗した後、0.2重量％硫酸3Ｌに2時間浸漬した。浸出液を除去し、残渣を次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素10.5重量％）水溶液1Ｌに10分間浸漬し、この残渣を取り出し、精製水を加えて3Ｌとし、10時間放置した。この液に硫酸酸性メタノール水溶液（硫酸濃度2重量％、メタノール濃度90重量％、残部水）を同量加え、析出する沈殿物をろ過回収し、乾燥した。この乾燥沈殿物3ｇを取り、250 mLの水に少しずつ加え、10分間撹拌して、水中で均一に分散していることを確認した後、炭酸ナトリウム0.825 gを加えてさらに20分間撹拌、沈殿物を溶解せしめた。沈殿物が完全に溶解していることを確認した後、水を加えて300 gとした液を粗アルギン酸溶液とした。斯くして得られた粗アルギン酸溶液200 gにアセトン1800 mLを少しずつ加えて、30分間撹拌した後、ろ紙（ADVANTEC社製，No.2，φ110mm）でろ過する。ろ紙上に得られた残留物を回収し、室温で乾燥させてアセトンを留去させることにより、アセトン不溶画分のアルギン酸（即ち、低分子量画分が除かれているアルギン酸；実施例1）を得た。また、ろ過後のろ液を回収して、減圧下（100〜150 mmHg，25℃）でアセトン及び水を留去することにより、アセトン溶解画分のアルギン酸（即ち、アルギン酸の低分子量画分；比較例2）を得た。【００８２】
２．調製されたアルギン酸の分子量分布の測定
液体クロマトグラフ［Agilent 1100システム（Agilent Technologies製）、コントローラ／データ処理装置：G2170AJ   Chemstation、ポンプ：G1311A、注入装置：G1329A、検出器：示差屈折率検出器G1362A（設定温度35℃）、恒温槽：G1316A］を使用して、上記参考例の欄に記載の条件及び方法に従って、上記で得られたアルギン酸（実施例１及び比較例１−２）の分子量3500以下の割合を測定した。【００８３】
尚、分子量3500以下の割合は、上記参考例の欄に記載の方法に従って、補正用アルギン酸試料の作成、補正用アルギン酸試料の重量平均分子量の測定、プルラン標準品（Shodex P−82，昭和電工製を使用）を用いた検量線の作成、アルギン酸（実施例１及び比較例１−２）のGPC法により検出された各ピークの分子量の算出、及び当該ピークの面積の算出を行うことにより求めた。【００８４】
その結果、各アルギン酸（実施例１及び比較例１−２）の分子量3500以下の割合は以下の通りであった。【００８５】
【表１】
2008056786.tif 000006
【００８６】
３．調製されたアルギン酸の細胞毒性の評価
上記で調製したアルギン酸（実施例１及び比較例１−２）の細胞に対する毒性試験を行った。まず、medium199(GIBCO社製)にウシ胎児血清（第一化学薬品社製）を10%(v/v)添加した細胞培養培地に、各アルギン酸を0.2又は2.0%(w/v)の濃度に溶解したアルギン酸溶液を作製した。次にウサギ角膜上皮細胞株SIRC（ATCC number:CCL-60）を1ウェル当たり2.0x105個を播種した48ウェルマイクロタイタープレート（コーニング社製）を用意し、先の調製済みアルギン酸溶液をアルギン酸終濃度0.1或いは1.0%(w/v)になるように添加後、37℃、5%CO2、相対湿度90%の条件で培養した。対照として用意したアルギン酸溶液無添加のウェルには、等量の細胞培養培地を添加した。培養開始から48時間後に、上清を回収し、生細胞検出試薬Cell Counting Kit-8 (同仁化学社製)を10%(v/v)を添加し37℃、5%CO2、相対湿度90%の条件で1時間インキュベートした。1時間後、分光光度計(サーモエレクトロン)にて生細胞に反応して発色した色素の吸光度（450 nm）を測定した。吸光度の実測値を基に、下記式を用いて細胞生存率を算出し、各アルギン酸の細胞毒性を評価した。【００８７】
【数５】
2008056786.tif 000007
【００８８】
結果を図１に示す。比較例2の1.0%(w/v)アルギン酸溶液を添加した際、細胞生存率が約5%と毒性発現が顕著であった。加えて、顕微鏡による肉眼観察でも比較例2のアルギン酸を加えた細胞は、接着能を失い浮遊していることが確認できた。これに対して、実施例1では比較例1及び２に比べて明らかに毒性傾向の減弱が認められた。これらの結果から、アルギン酸の細胞毒性は低分子量画分に含有される成分に起因することが判明した。また、低分子量画分を実質的に含まないアルギン酸を選択的に皮膚又は粘膜適用組成物に配合することで、粘膜細胞に対する毒性を低下させることが可能であることも確認された。【００８９】
試験例２  アルギン酸の刺激性の評価
実施例１のアルギン酸を用いて下記処方例１の点眼剤を調製した。当該点眼剤は、ポアサイズ0.22μｍのメンブランフィルターでろ過した後に、プラスチック容器に無菌充填した。
処方例１
実施例１のアルギン酸    0.1ｇ
塩化ナトリウム          0.44g
塩化カリウム            0.08g
ホウ酸                  0.3g
ホウ砂                  0.035g
塩酸                    適量
水酸化ナトリウム        適量
精製水                  適量            
全量100mL（pH7）【００９０】
この点眼剤を健常な成人5名（男性3名、女性2名）が点眼し、下記の判定基準に従って刺激感の評価を実施した。
＜評価方法＞
＋：  刺激を感じる。
±：  僅かに刺激を感じる。
−：  刺激を感じない。【００９１】
得られた結果を表２に示す。この結果、処方例１の点眼剤の使用感は良好であり、点眼直後、点眼５分後及び点眼10分後の何れも刺激感を訴える者はいなかった。【００９２】
【表２】
2008056786.tif 000008
【００９３】
また、実施例１のアルギン酸の代わりに比較例1のアルギン酸を用いたこと以外は、処方例1と同様にして調製した点眼剤（比較処方例1）を用いて、上記と同様に点眼後の刺激感を評価した。この結果、比較処方例1の点眼剤の点眼直後に刺激を感じると評価した被験者が認められた。【００９４】
以上の結果から、分子量3500以下の低分子量画分を含むアルギン酸は、粘膜細胞に対して細胞毒性を示し、更には点眼時の刺激感をも生じさせ得ることが確認された。これに対して、分子量3500以下の低分子量画分を実質的に除去したアルギン酸では、粘膜細胞に対する細胞毒性が顕著に低く、更には点眼時の刺激感を生じさせないため、安全性及び使用感の点で優れていることが明らかとなった。【００９５】
試験例３  アルギン酸の刺激性の評価
実施例１のアルギン酸の濃度が0.01g/100mLである点眼剤（処方例2）及び実施例１のアルギン酸の濃度が0.2g/100mLである点眼剤（処方例3）を調製した。処方例2及び3の点眼剤において、アルギン酸以外の配合成分及び濃度については、処方例１と同様とした。【００９６】
処方例2及び3の点眼剤を用いて、上記試験例２と同様に点眼後の刺激感を評価した。この結果、処方例2及び3の点眼剤の何れにおいても、点眼直後、点眼５分後及び点眼10分後に刺激感を訴える者はいなかった。【００９７】
処方例
実施例１のアルギン酸を用いて、表３−５に示す組成の製剤（処方例4−11）を調製した。【００９８】
【表３】
2008056786.tif 000009
【００９９】
【表４】
2008056786.tif 000010
【０１００】
【表５】
2008056786.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】試験例１において、アルギン酸（実施例１及び比較例１−２）の細胞に対する毒性試験を実施した結果を示す図である。
【図１】
2008056786.tif 000012
【国際調査報告】
2008056786.tif 000013
2008056786.tif 000014
2008056786.tif 000015
2008056786.tif 000016