(57)【要約】  神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法を開示する。（ａ）一定量の神経毒素を含む標準試料と当該神経毒素に対する中和抗体を含有する被験試料を混合し、（ｂ）（ａ）の混合物を非ヒト哺乳動物の筋肉に投与し、（ｃ）当該非ヒト哺乳動物に電気刺激をかけ、（ｄ）電気刺激による当該哺乳動物の筋肉収縮に伴う複合筋活動電位（CMAP）を筋電計で測定し、ついで（ｅ）操作ステップ（ｄ）で測定して得られたCMAP振幅データから、未中和の神経毒素による振幅の低下の程度を解析することにより被験試料中に含有される中和抗体の力価を定量化することから構成されることを特徴とする神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の操作ステップ：
（ａ）一定量の神経毒素を含む標準試料と当該神経毒素に対する中和抗体を含有する被験試料を混合し、
（ｂ）（ａ）の混合物を非ヒト哺乳動物の筋肉に投与し、
（ｃ）当該非ヒト哺乳動物に電気刺激をかけ、
（ｄ）電気刺激による当該哺乳動物の筋肉収縮に伴う複合筋活動電位（CMAP）を筋電計で測定し、ついで
（ｅ）操作ステップ（ｄ）で測定して得られたCMAP振幅データから、未中和の神経毒素による振幅の低下の程度を解析することにより被験試料中に含有される中和抗体の力価を定量化すること
から構成されることを特徴とする神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法。
【請求項２】
当該神経毒素がクロストリジウム属に属する細菌が産生する神経毒素、魚貝類が産生する神経毒素、または蛇毒から選択される請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
当該クロストリジウム属に属する細菌が、クロストリジウム・ボツリナムである請求項２に記載の定量方法。
【請求項４】
当該クロストリジウム・ボツリナムが、血清型A、B、C、D、E、FおよびGより選択されるクロストリジウム・ボツリナムである請求項３に記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法に関する。詳細には、哺乳動物に対して筋弛緩作用を有するクロストリジウム属が産生する神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法に関する。さらに詳細には、神経毒素と中和抗体を混合して哺乳動物へ投与し、未中和の神経毒素による哺乳動物の筋弛緩の程度を筋電計を用いて定量することを特徴とする神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経毒素は、クロストリジウム属に属する細菌が産生する神経毒素、フグ毒のテトロドトキシンに代表される一部の魚貝類が産生する神経毒素、アルファー・ブンガロトキシンなどの蛇毒などが知られている。これらは、その作用点は異なるものの、神経終末において神経伝達を遮断し、接種された哺乳動物に筋弛緩作用を示すという点が共通している。中でも、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム属に属する細菌が産生する神経毒素であり、クロストリジウム属はそれらの形態と機能により百を超える分類がされている。クロストリジウム属に属する細菌としては、クロストリジウム・バラティ（Clostridium baratii）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、およびクロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）などが知られている。嫌気性のグラム陽性菌であるクロストリジウム・ボツリナムが産生するボツリヌス毒素は地球上で最も致死性の高い神経毒であり、これまでに血清型A、B、C、D、E、FおよびGの７種のボツリヌス菌由来の神経毒とその特性が明らかにされている。これらはそれぞれ血清型特異的中和抗体で識別される。ボツリヌス毒素の血清型の違いにより、それらが影響しうる動物種、誘発される麻痺の重症度および持続期間等が異なる（非特許文献１）。【０００３】
ボツリヌス菌またはその毒素がヒトに侵入した場合には、「ボツリヌス中毒」が生じる。ボツリヌス中毒の大半は、食品がボツリヌス毒素によって汚染され、産生された毒素を食品とともに摂取することで生じる（食餌性ボツリヌス症）。ボツリヌス菌を経口摂取しても、胃酸や腸内細菌により死滅するが、例外的な状況では生存して腸管に至り、腸管内で増殖して中毒症を起こす（乳児ボツリヌス症）。また、汚染された創傷部位で菌が増殖して生じるボツリヌス中毒もある（創傷ボツリヌス症）。さらに、この３病態に分類できないものとして、「分類不能ボツリヌス症」がある（非特許文献１）。このようなボツリヌス中毒に陥った際の治療方法として、十分な呼吸管理と抗血清投与がなされる。ボツリヌス抗血清は、乾燥ボツリヌスウマ血清（A、B、E、F型）として財団法人化学及血清療法研究所などから販売されている。【０００４】
一方で、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス中毒においては全身の神経伝達を遮断してヒトを死に至らしめる毒素ではあるが、逆にその活性を積極的に利用して、異常な筋緊張性亢進を来たす疾患、例えばジストニアの患者の筋肉内に直接投与することによって、局所の筋緊張を緩和する治療薬として用いられている。例えば、A型ボツリヌス毒素複合体（BOTOX(登録商標)）は、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣、頚部ジストニアの治療用、並びに眉間のしわの治療用としてアメリカ食品薬品局（FDA）によって承認されている。また、B型ボツリヌス毒素（MYOBLOC(登録商標))も頚部ジストニア治療用としてFDAによって承認されている。非A型ボツリヌス毒素血清型は、A型ボツリヌス毒素と比較して、より低い効力およびより短い作用持続期間を有するといわれている。末梢筋肉内のA型ボツリヌス毒素は、通常、注入後24時間以内に薬理作用が発現するが、臨床効果は2〜3日後に見られることが多い。A型ボツリヌス毒素の単一の筋肉内注射から症状改善の典型的な作用持続期間は平均して約3〜4ヶ月である（非特許文献１）。【０００５】
しかし、治療薬としてボツリヌス毒素を使用する場合、ボツリヌス毒素が人体にとって異種蛋白であることから、抗体産生の問題が起こりうる。ここで問題になるのは中和抗体である。中和抗体が産生されると、低力価のうちは用量を増やすことである程度の効果が期待できるが、中和抗体の力価が上昇するとボツリヌス毒素の効果は消失する（非特許文献２および３）。このように、治療薬としてボツリヌス毒素を使用する場合、抗体産生は大きな問題である。中和抗体の力価が上昇するとボツリヌス毒素投与による治療効果は消失するためである。この中和抗体の発生を早期に発見し、ボツリヌス毒素治療における投与量や投与スケジュールでのコントロールを行うことは非常に重要である。【０００６】
抗毒素抗体の力価を測定する方法にはいくつかあり、測定方法により感度が異なる（非特許文献４）。代表的な抗毒素抗体の測定方法は以下の通りである。
（1）マウス中和法（Mouse Lethality Assay：MLA）
この方法は、神経毒素と中和抗体を混合し、マウスへ投与し、未中和の神経毒素によるマウスの死亡数より、抗体の力価を測定するものである。おおよその感度は10mIU/mLである（非特許文献５）。この方法は、中和抗体の力価を測定する方法として最も古くから行われている。【０００７】
（2）マウス横隔膜アッセイ法（Mouse Diaphragm Assay：MDA）
この方法は、マウスの横隔神経−横隔膜標本を作成し、これに対する毒素の効果を観察することで、中和抗体の力価を推定するものである。中和抗体検出の感度はMLAよりも高く、0.3mIU/mL程度と考えられる（非特許文献６）。【０００８】
（3）in vitroでの定量方法
in vitro系での定量方法として、ウエスタンブロット法があるが、本方法は感度、特異性ともに低い（非特許文献７）。その他、ハプテン標識抽出法（hapten-labeled elution）法、免疫沈降法（immunoprecipitation assay：IPA）、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）法などがある（非特許文献４）。これら方法の感度は0.3〜1.0mIU/mLと高いが、中和抗体と非中和抗体を区別することができない。また、中和抗体のin vitroでの定量法として、エンドペプチダーゼアッセイ法（SNAP-25の分解産物を抗SNAP-25抗体を用いて検出する方法）は、MLAよりも高感度であることが示されている（非特許文献８）。現在、in vitroでの定量方法としてはIPAが最も高く評価されている。MLA、MDA、IPA間の比較では、感度はIPAまたはMDAが最も高い。特異性はMLAが最も優れており、IPAは100％ではないが、動物を殺さず、簡便、迅速、安価である点も長所である。【０００９】
ボツリヌス毒素のような神経毒素に対する中和抗体の力価の測定は現在でもMLAが用いられる。この方法は中和されなかった残存毒素によるマウス致死活性を指標として測定しているが、この方法は感度も低く、研究所間で著しくバラつくことが報告されている（非特許文献９）。さらに、この方法は多くのマウスを使用することから、倫理面、動物愛護の面からも問題視されている。一方、ボツリヌス毒素治療を受けている患者の中には稀なケースではあるが、治療効果が認められなくなる患者があり、その血清中には微量抗体が含まれる。しかしマウス法の検出感度ではその抗体を測定できないため、測定感度を上げた測定系が必要とされている（非特許文献１）。【００１０】
神経毒素に対する中和抗体の有無を検出する方法として、筋電計を用いた方法が報告されている。すなわち、患者の麻痺を生じても生活に支障のない筋、代表的な筋、短趾伸筋（extensor digitorum brevis：EDB）に少量のボツリヌス毒素を筋肉内注射し、注射前と1〜2週間後に同じ筋のCMAPを記録し、比較するEDB試験である。感度は約1mIU/mL程度と推測されている。しかしながら、本方法では患者の不必要な筋へ神経毒素の投与を行う必要があり、さらに結果を得るまでに時間がかかり過ぎる（非特許文献４）。
【非特許文献１】梶龍兒ら、「ジストニアとボツリヌス治療」、診断と治療社、2005年
【非特許文献２】Dresslerら、Eur. Neurol., 2002, 47, p.118-121
【非特許文献３】Dresslerら、Eur. Neurol., 2002, 48, p.26-29
【非特許文献４】Sesaardicら、Mov. Disord., 2004, 19(Suppl 8), p.S85-S91
【非特許文献５】Hathewayら、J. Infect. Dis., 1984, 150, p.407-412
【非特許文献６】Goschelら、Exp. Neurol., 1997, 147, p.96-102
【非特許文献７】Duaneら、Neurology, 1997, 48(Suppl2), A399
【非特許文献８】Hallisら、J. Clin. Microbiol., 1996, 34, p.1934-1938
【非特許文献９】Sheridanら、J. Appl. Toxicol., 1999,19(Suppl1),p.S29-S33
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、クロストリジウム毒素に対する中和抗体の力価を、特異的にかつ高感度で定量的に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、神経毒素に対する中和抗体の力価を定量する方法を確立した。本発明は、筋電計を用いた中和抗体の測定方法は中和抗体と毒素とを反応させ、未中和の残存毒素量による筋電位の低下から中和抗体の力価を測定するものである。以下、本方法を中和CMAP法という。この方法はMLAよりも高感度であり、約1mIU/mLの中和抗体を検出することが出来る。MLAでは投与後4日間の観察が必要であるが、この方法では投与1日目で定量が可能であり、迅速に結果を得ることができる。さらに、測定方法は通常の筋電図測定と変わらないため簡便であり、再現性にも優れている。また、MLAのように致死による測定でないため動物を殺さないということが最大の長所である。【００１３】
本発明は、下記（１）〜（４）の発明を含むものである。
（１）以下の操作ステップ：
（ａ）一定量の神経毒素を含む標準試料と当該神経毒素に対する中和抗体を含有する被験試料を混合し、
（ｂ）（ａ）の混合物を非ヒト哺乳動物の筋肉に投与し、
（ｃ）当該非ヒト哺乳動物に電気刺激をかけ、
（ｄ）電気刺激による当該哺乳動物の筋肉収縮に伴う複合筋活動電位（CMAP）を筋電計で測定し、ついで
（ｅ）操作ステップ（ｄ）で測定して得られたCMAP振幅データから、未中和の神経毒素による振幅の低下の程度を解析することにより被験試料中に含有される中和抗体の力価を定量化すること
から構成されることを特徴とする神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法。
（２）当該神経毒素がクロストリジウム属に属する細菌が産生する神経毒素、魚貝類が産生する神経毒素、または蛇毒から選択される上記（１）に記載の定量方法。
（３）当該クロストリジウム属に属する細菌が、クロストリジウム・ボツリナムである請求項２に記載の定量方法。当該クロストリジウム毒素が、ボツリヌス菌由来の毒素である上記（２）に記載の定量方法。
（４）当該クロストリジウム・ボツリナムが、血清型A、B、C、D、E、FおよびGより選択されるクロストリジウム・ボツリナムである上記（３）に記載の定量方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法を利用することで、（１）神経毒素に対する中和抗体の定量化、（２）各種血清型ボツリヌス毒素抗血清の定量化、（３）ボツリヌス毒素治療の不応患者血清中の中和抗体の力価測定を行うことができる。【００１５】
本発明では、ボツリヌス毒素を投与した哺乳動物（ラット等）について外科的切開も殺傷も行わない。連続的に飼育した同一の哺乳動物を経時的に測定することで、長期的な評価が可能であり、日間差や個体差の影響も少なく、精度のよい定量系である。さらに、使用する哺乳動物も少ないため、倫理面からも、動物愛護の面からも好ましい方法である。また、従来のMLA法と比較して、高感度に測定できるため、ボツリヌス毒素治療の不応患者の中和抗体の力価を測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】神経毒素の投与部位とCMAP測定部位を表した図。
【００１７】
【図２】中和CMAP法を用いた標準ボツリヌスＡ型抗毒素とウサギ抗血清の力価の比較結果を示す図。
【００１８】
【図３】中和CMAP法による標準ボツリヌスＢ型抗毒素の容量反応直線を示す図。
【００１９】
【図４】中和CMAP法による標準ボツリヌスＥ型抗毒素の容量反応直線を示す図。
【００２０】
【図５】中和CMAP法による標準ボツリヌスＦ型抗毒素の容量反応直線を示す図。
【００２１】
【図６】中和CMAP法による標準ボツリヌスＡ型抗毒素の検量線を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の神経毒素の中和抗体の力価を定量的に測定する方法は、電気刺激による後肢筋、望ましくは腓腹筋の複合筋活動電位を筋電計でモニターすることによって行うことができる。ここで、筋電計でモニターされた筋電図パラメータの中でも、特に振幅データに着目し、未中和の神経毒素による振幅の低下を解析することで中和抗体の力価を精度よく定量化できるという発見に基づくものである。【００２３】
広い実施形態では、本発明は、神経毒素に対する中和抗体の力価を定量するために、神経毒素と中和抗体を混合し、非ヒト哺乳動物の筋肉へ投与し、未中和の神経毒素による非ヒト哺乳動物の筋弛緩の程度を測定するために、投与部位における神経伝達の複合筋活動電位を筋電計でモニターする。ここで特に振幅データに着目し、未中和の神経毒素による振幅の低下を解析することで、神経毒素に対する中和抗体の力価を精度よく定量化することができる。【００２４】
一つの実施形態では、本発明は、神経毒素に対する中和抗体の力価を決定する方法を提供する。【００２５】
本発明で用いられるような「非ヒト哺乳動物」には例えば、サル、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、マウスおよびイヌ等が含まれる。【００２６】
神経毒素は、クロストリジウム・バラティ、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・テタニおよびクロストリジウム・ボツリナムなどのクロストリジウム毒や破傷風毒などから選ばれてよい。ボツリヌス毒素は、A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型、並びにそれらの混合物よりなる群から選ばれてよく、代表的なものはA型ボツリヌス毒素である。【００２７】
筋電気刺激による筋電計から得られる最大電位と最低電位の差異がCMAP振幅である。このCMAP振幅は、WO2007/125604（PCT/JP2006/309040）に記載されているように、神経毒素により用量依存的に振幅が低下する。中和CMAP法はこの方法を応用し、中和抗体の力価測定に使用したものである。用いられる筋電計は、ニコレー・バイオメディカル社（ニコレー バイキングクエストシリーズ）などから医療診断用機器として市販されている。【００２８】
本方法では、毒素量を一定にして中和抗体の力価を変動させることで残存毒素量が変化し、残存毒素量が多いほどCMAP振幅値は低下し、中和抗体の力価が高いほど毒素は中和されて残存毒素量が減少してCMAP振幅値が上昇する。中和抗体の力価とCMAP振幅値とは用量依存性の関係が存在し、グラフに書くことにより検量線が作成できる。【００２９】
中和CMAP法の投与部位、測定部位は特に限定されるものではないが、測定の簡便性の観点から、四肢、特に下腿部等が好ましい。【００３０】
中和CMAP法の概要は次のように実施する。中和抗体と神経毒素の反応液を筋肉内に投与し、数時間から数日後に投与筋肉を支配する神経に対し電気刺激を行い、投与筋について記録電極を用いてCMAP電位を記録する。得られたCMAP電位からCMAP振幅値を算出し、同じ力価投与群を1群とし、数群のデータを統計解析して検量線を得る。中和抗体の力価が未知のサンプルについても同様に実施し、振幅値を検量式に当てはめることで中和抗体の力価を得る。【００３１】
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
《調製例：ボツリヌス神経毒素の精製》
「Sakaguchi, G., Ohishi, I., and Kozaki, S. 1981. BIOCHEMICAL ASPECTS of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins, pp.21-34, Lewis, G.E. (ed.), Academic Press, New York」に記載された方法に従って、ボツリヌスA、B、E及びF型神経毒素（NTX）を精製した。【００３２】
ボツリヌスM毒素を10mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAEセファロースカラムに吸着させ、同緩衝液の0〜0.3M NaCl濃度勾配で溶出し、神経毒素と無毒蛋白質に分離した。得られた神経毒素（NTX）はYM-10メンブラン（ミリポア社製）で1mg/mLまで濃縮し、50mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して透析した後、使用時まで-80℃に保存した。【００３３】
《比較例：MLA法によるボツリヌス神経毒素に対する中和抗体の定量化》
標準A型ボツリヌス抗毒素（国立感染症研究所より分与）を0.5w/v%ゼラチンを含む50mMリン酸緩衝液（pH6.0）で0.078、0.063、0.05、0.04、0.032IU/0.25mLに段階希釈し、サンプルも予想力価から標準A型ボツリヌス抗毒素と同じ力価となるように段階希釈を作製した。試験毒素は調製例により作製されたA型NTXを使用し、0.25mL中に1試験毒素量（0.05IU/0.25mLと反応させ、マウスに投与して半数死亡する毒素量）を含む液を作製した。抗毒素と試験毒素を等量混合し1時間反応させ、反応液をマウス1匹あたり0.5mLずつ腹腔内投与し投与後4日間観察した。【００３４】
ボツリヌスA型毒素で免疫して得られたウサギ抗血清をMLA法により2回試験を行ったところ、1回目の力価は479.6IU/mLであったのに対し、2回目の測定では405.2 IU/mLとなった。このようにMLA法はバラツキが大きい試験系であることが明らかである。【００３５】
《実施例１：中和CMAP法によるA型ボツリヌス毒素抗血清の定量化》
標準A型ボツリヌス抗毒素と、比較例１においてMLAで測定を行い値付けされたウサギ抗血清を25、12.5、6.3、3.1mIU/mLとなるように0.5w/v%ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液で希釈を行った。試験毒素はA型NTXを用い、試験毒素量として毒素単独の投与で振幅が投与1日目に投与前の1/3まで低下する量（10LD50/mL）に設定した。標準A型ボツリヌス抗毒素またはウサギ抗血清と試験毒素を等量混合し1時間反応させた後にラットの左側腓腹筋に0.1mL筋肉内投与した。【００３６】
CMAP測定はラットに麻酔を行い眼瞼反射の消失を確認後、ラットを伏臥位におき測定を行った。電極の配置は、刺激電極を脊髄根上に、記録電極（＋）を後肢腓腹筋筋腹に、記録電極（−）を後肢腓腹筋腱に、アース電極を尾根部に各々々設置した。25mA、0.2msec電気刺激し、投与側CMAP振幅を2回ずつ測定し、得られるCMAP振幅の平均をデータに使用した。CMAP測定は投与前及び投与後1日に行った。投与部位とCMAP測定部位を図１に示した。【００３７】
標準抗毒素投与群、ウサギ抗血清投与群の振幅値を用いて回帰分析し、得られた各回帰直線を平行線検定し抗毒素量を決定した。その結果、図２に示したように、両直線は平行性、直線性が認められ、ほぼ同一であることが明らかとなった。この結果、中和CMAP法で得られる力価とMLAによるマウス中和法で得られる力価が一致することを確認した。【００３８】
《実施例２：中和CMAP法による各種血清型ボツリヌス毒素抗毒素の定量化》
標準B、E、F型ボツリヌス抗毒素（国立感染症研究所から分与）をそれぞれ200、100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.5mIU/mLとなるように希釈を行った。試験毒素は調製例で作製した各血清型のNTXを用い、試験毒素量として毒素単独の投与で振幅が投与前の1/3程度まで低下する量（B型120,000LD50/mL、E型60LD50/mL、F型600LD50/mL）に設定した。標準ボツリヌス抗毒素と試験毒素を等量混合し1時間反応させた後にラットの左側腓腹筋に0.1mL筋肉内投与した。投与1日目にCMAP測定を行い、それぞれの振幅値を用いて回帰分析を行ったところ、B型では25〜200mIU/mL（図３）、E型では1.5〜50mIU/mL（図４）、F型では3.1〜50mIU/mLで用量反応直線が得られた（図５）。【００３９】
《実施例３：中和CMAP法によるボツリヌス毒素治療の不応患者血清中の中和抗体力価測定》
標準A型ボツリヌス抗毒素を25、12.5、6.25、3.1mIU/mLとなるように希釈を行い、患者血清は原液をそのまま使用した。試験毒素はA型NTXを用い、試験毒素量は10LD50/mLに設定した。標準A型ボツリヌス抗毒素と試験毒素を等量混合し、1時間反応させた後にラットの左側腓腹筋に0.1mL筋肉内投与した。投与後1日にCMAP測定を行い、標準A型ボツリヌス抗毒素投与群の振幅値を用いて回帰分析し、得られた回帰直線を検量線とした（図６）。検量線から患者血清投与群の振幅値を当てはめて抗毒素量を決定した。その結果、今回の患者血清の力価は5.1mIU/mLであることが明らかとなった（表１）。【００４０】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明による神経毒素に対する中和抗体の力価の定量方法は、（１）神経毒素に対する中和抗体の定量化、（２）各種血清型ボツリヌス毒素抗血清の定量化、（３）ボツリヌス毒素治療の不応患者血清中の中和抗体の力価測定に利用することができ、とりわけ、クロストリジウム毒素に対する中和抗体の力価を特異的かつ高感度で定量的に測定する手段を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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