(57)【要約】  本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物は、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を含む。これにより、被験物質と核酸との結合親和性を測定するに際して、高精度かつ簡便に測定することができ、さらに、被験物質として様々な物質を利用可能とする。
2008153223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を含むことを特徴とする核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項２】
下記一般式（１）
【化１】
2008153223.tif 000042
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項３】
上記化合物が、下記一般式（２）
【化２】
2008153223.tif 000043
（Ｒ５は、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数２〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項４】
上記化合物が、下記構造式（３）
【化３】
2008153223.tif 000044
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項５】
上記化合物が、下記一般式（１２）
【化４】
2008153223.tif 000045
（ｎは３、４、または５を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項６】
上記化合物が、下記構造式（１３）
【化５】
2008153223.tif 000046
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項７】
上記化合物が、下記一般式（１４）
【化６】
2008153223.tif 000047
（ｎは１または２を表し、Ｒ１０、Ｒ１１はそれぞれ独立してアルキル基またはカルボキシル基を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項８】
上記化合物が、下記一般式（１６）
【化７】
2008153223.tif 000048
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項９】
上記化合物が、下記一般式（１７）
【化８】
2008153223.tif 000049
（Ｒ１６、Ｒ１８はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または炭素数１〜５のアルコキシル基であり、上記アルコキシル基は１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子および／または窒素原子に置換されていてもよく、Ｘ１は酸素原子、窒素原子または硫黄原子であり、Ｒ１７は炭素数１〜５のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個またはそれ以上の水素原子が水酸基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる１以上の官能基で置換されていてもよい）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項１０】
上記化合物が、下記一般式（１８）
【化９】
2008153223.tif 000050
（Ｒ１９、Ｒ２１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または炭素数１〜５のアルコキシル基であり、上記アルコキシル基は１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子および／または窒素原子に置換されていてもよく、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立して酸素原子、窒素原子または硫黄原子であり、Ｒ２０、Ｒ２２はそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個またはそれ以上の水素原子が水酸基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる１以上の官能基で置換されていてもよい）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項１１】
ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を備えていることを特徴とする核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキット。
【請求項１２】
下記一般式（１）
【化１０】
2008153223.tif 000051
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物および／または下記一般式（１６）
【化１１】
2008153223.tif 000052
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物を備えていることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキット。
【請求項１３】
核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法であって、
ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体および核酸を混合して第一の溶液を得て、上記第一の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第一の測定工程と、
上記第一の溶液に被験物質をさらに混合して第二の溶液を得て、上記第二の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第二の測定工程と、
上記第一の測定工程で測定した蛍光及び上記第二の測定工程で測定した蛍光を比較する比較工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法であって、
核酸と、下記一般式（１）
【化１２】
2008153223.tif 000053
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物および／または下記一般式（１６）
【化１３】
2008153223.tif 000054
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物とを混合して第一の溶液を得て、上記第一の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第一の測定工程と、
上記第一の溶液に被験物質をさらに混合して第二の溶液を得て、上記第二の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第二の測定工程と、
上記第一の測定工程で測定した蛍光及び上記第二の測定工程で測定した蛍光を比較する比較工程と、を含むことを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物及びその利用に関するものである。より具体的には、ディスプレイスメントアッセイにより核酸と被験物質との結合親和性を測定するための、核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物、核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキット及び当該化合物を用いる、核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体内での核酸の機能が注目されている。特にＲＮＡが遺伝子発現を制御する例も少なくない。そのため、今後、ＲＮＡを標的とした薬剤の開発が加速すると考えられる。【０００３】
一般に、薬剤の開発では、薬剤の候補となる候補物質のライブラリーから、薬剤の標的となる物質に結合する物質をスクリーニングする一次スクリーニングから行なう。この一次スクリーニングの速度が、薬剤開発の速度を決定する重要な要因となる。例えば、ＲＮＡを薬剤の標的とする場合、ＲＮＡに結合する候補物質を迅速にスクリーニングするために、ＲＮＡと候補物質との結合親和性を簡便かつ迅速に調べる方法が必要となる。【０００４】
従来、ＲＮＡ等の核酸と候補物質との結合親和性は、核酸を、ビーズ等の検出デバイスに固定したり蛍光色素に結合させたりして、その相互作用により変化するシグナルを検出する方法が用いられてきた。例えば、非特許文献１では、エイズウイルスＨＩＶ‐１のｍＲＮＡ中のＲＲＥ（Ｒｅｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合したエチジウムブロマイドに対して、Ｒｅｖタンパク質が置換されるか否かを指標に、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定するディスプレイスメントアッセイが開示されている。エチジウムブロマイドは二本鎖核酸に結合することで、励起光を照射すると蛍光を発する性質を有している。そして、ＲＲＥに結合していたエチヂウムブロマイドの代わりに、Ｒｅｖタンパク質が結合すると、エチジウムブロマイドは遊離するので、検出される蛍光は減少する。この蛍光の減少から、ＲＲＥとＲｅｖタンパク質との結合親和性を測定する。なお、ＲＲＥに結合する物質については、非特許文献２にも開示されている。【０００５】
なお、ＤＮＡ同士の結合に関しては、特許文献１〜３に、キサンタン蛍光染料で標識したＤＮＡをプライマーとして用いて、当該プライマーを標的のＤＮＡ断片にアニールさせる方法が開示されている。キサンタンについては、特許文献４〜６、非特許文献３に開示されている。
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開平９−１２４６３６号公報（公開日：１９９７年５月１３日）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００４−２２５０４９号公報（公開日：２００４年８月１２日）」
【特許文献３】日本国公表特許公報「特表２００４−５３２８０５号公報（公表日：２００４年１０月２８日公開）」
【特許文献４】日本国公開特許公報「特開平１０−１０１５９１号公報（公開日：１９９８年４月２１日）」
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０１７１０７９号明細書（２００５年８月４日公開）
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／０２３４０３１号明細書（２００５年１０月２０日公開）
【非特許文献１】Nathan W. Luedtke, Yitzhak Tor, Fluorescence-based methods for evaluating the RNA affinity and specificity of HIV-1 Rev-RRE inhibitors, Biopolymers, Vol. 70, Issue 1 , p.103-119.
【非特許文献２】日本化学会第８３回春季大会講演要旨集、２００３年３月３日、１１０２頁、１Ｇ８−３７
【非特許文献３】IUPAC Name: 2,7-bis(2-aminoethoxy)xanthen-9-one, [online], NCBI PubChem, CID:11659655, Create Date:2006-10-27, ［２００７年７月１３日検索］インターネット＜ＵＲＬ：http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=11659655＞
【発明の開示】
【０００６】
しかしながら、上記従来の技術では、核酸と被験物質との結合親和性を、高精度かつ簡便に測定することができないという問題や、利用可能な被験物質が限られるという問題を生じる。
【０００７】
非特許文献１に開示のエチジウムブロマイドを用いる方法では、蛍光の減少を測定する必要がある。これでは、バックグラウンドの蛍光による影響を受けやすい。例えば、少量の被験物質がエチジウムブロマイドに置換して核酸に結合した場合、置換が起こらなかった全てのエチジウムブロマイドから蛍光が発せられる。このようにバックグラウンドで蛍光が発せられている中で、蛍光強度の微細な減少量を測定することは困難であり、測定精度を高めるには高度な装置が必要になるため、簡便でない。また、エチジウムブロマイドは強い発癌性を有する物質であるため、慎重な作業が要求され、簡便に作業を行なうことができない。
【０００８】
特許文献１〜３に開示の技術では、ＤＮＡ同士のアニールを検出することしかできず、例えば薬剤としてよく用いられる低分子化合物等のＤＮＡ以外の物質と核酸との結合親和性を測定することができない。また、ＤＮＡ同士のアニールを検出する場合にも、一方のＤＮＡを蛍光染料で標識する必要があり、煩雑な作業を要求される。
【０００９】
特許文献４〜６及び非特許文献２及び３は、そもそも被験物質と核酸との結合親和性を測定することに関する文献ではなく、上記の問題の解決に資する技術は開示されていない。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、被験物質と核酸との結合親和性を測定するに際して、高精度かつ簡便に測定することができ、さらに、被験物質として様々な物質を利用することを可能にする、核酸と被験物質との結合親和性の測定用組成物及びこれを利用した技術を提供することにある。
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物は、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を含むことを特徴としている。
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物は、下記一般式（１）
【００１３】
【化１】
2008153223.tif 000003
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物を含むことを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記一般式（２）
【００１５】
【化２】
2008153223.tif 000004
（Ｒ５は、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数２〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物であることがより好ましい。
【００１６】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記構造式（３）
【００１７】
【化３】
2008153223.tif 000005
で示される化合物であることがより好ましい。
【００１８】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記一般式（１２）
【００１９】
【化４】
2008153223.tif 000006
（ｎは３、４、または５を表す。）
で示される化合物であることがより好ましい。
【００２０】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記構造式（１３）
【００２１】
【化５】
2008153223.tif 000007
で示される化合物であることがより好ましい。
【００２２】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記一般式（１４）
【００２３】
【化６】
2008153223.tif 000008
（ｎは１または２を表し、Ｒ１０、Ｒ１１はそれぞれ独立してアルキル基またはカルボキシル基を表す。）
で示される化合物であることがより好ましい。
【００２４】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記一般式（１６）
【００２５】
【化７】
2008153223.tif 000009
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物であることがより好ましい。
【００２６】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記一般式（１７）
【００２７】
【化８】
2008153223.tif 000010
（Ｒ１６、Ｒ１８はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または炭素数１〜５のアルコキシル基であり、上記アルコキシル基は１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子および／または窒素原子に置換されていてもよく、Ｘ１は酸素原子、窒素原子または硫黄原子であり、Ｒ１７は炭素数１〜５のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個またはそれ以上の水素原子が水酸基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる１以上の官能基で置換されていてもよい）
で示される化合物であることがより好ましい。
【００２８】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物では、上記化合物が、下記一般式（１８）
【００２９】
【化９】
2008153223.tif 000011
（Ｒ１９、Ｒ２１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または炭素数１〜５のアルコキシル基であり、上記アルコキシル基は１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子および／または窒素原子に置換されていてもよく、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立して酸素原子、窒素原子または硫黄原子であり、Ｒ２０、Ｒ２２はそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個またはそれ以上の水素原子が水酸基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる１以上の官能基で置換されていてもよい）
で示される化合物であることがより好ましい。
【００３０】
また、本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキットでは、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を備えていることを特徴としている。
【００３１】
また、本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキットでは、下記一般式（１）
【００３２】
【化１０】
2008153223.tif 000012
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物および／または下記一般式（１６）
【００３３】
【化１１】
2008153223.tif 000013
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物を備えていることがより好ましい。
【００３４】
また、本発明に係る方法は、核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法であって、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体および核酸を混合して第一の溶液を得て、上記第一の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第一の測定工程と、上記第一の溶液に被験物質をさらに混合して第二の溶液を得て、上記第二の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第二の測定工程と、上記第一の測定工程で測定した蛍光及び上記第二の測定工程で測定した蛍光を比較する比較工程と、を含むことを特徴としている。
【００３５】
また、本発明に係る方法は、核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法であって、核酸と、下記一般式（１）
【００３６】
【化１２】
2008153223.tif 000014
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物および／または下記一般式（１６）
【００３７】
【化１３】
2008153223.tif 000015
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物とを混合して第一の溶液を得て、上記第一の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第一の測定工程と、上記第一の溶液に被験物質をさらに混合して第二の溶液を得て、上記第二の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第二の測定工程と、上記第一の測定工程で測定した蛍光及び上記第二の測定工程で測定した蛍光を比較する比較工程と、と含むことがより好ましい。
【００３８】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明に係る方法の原理を模式的に示した図であり、（ａ）は上記第一の溶液を模式的に示し、（ｂ）は上記第二の溶液を模式的に示す。
【図２】本実施例で用いたＲＮＡの構造を模式的に示す図である。
【図３】Ｘ２ＳとＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図である。
【図４】Ｘ２ＳとＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図である。
【図５】Ｘ１ＳとＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図である。
【図６】本実施例で用いたＲＲＥの構造を模式的に示した図である。
【図７】Ｘ２ＳとＲＲＥとの結合を確認した結果を示す図である。
【図８】図７に示した結果の測定波長４５３ｎｍにおける蛍光強度をプロットした図である。
【図９】本実施例で用いたＲｅｖタンパク質の構造を模式的に示す図である。
【図１０】本実施例で用いたトロンビンの構造を模式的に示す図である。
【図１１】Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図１２】ネオマイシンとＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図１３】トロンビンとＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図１４】図１１〜１３に示した結果のうち、蛍光波長４５３ｎｍにおける蛍光強度をプロットした図である。
【図１５】ＲＲＥとエチジウムブロマイドとの結合を確認した結果を示す図である。
【図１６】Ｘ２Ｓを用いたディスプレイスメントアッセイの結果を示す図である。
【図１７】エチジウムブロマイドを用いたディスプレイスメントアッセイの結果を示す図である。
【図１８】Ｘ２ＳとｓｓＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図である。
【図１９】Ｘ２Ｓに励起波長３７０ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。
【図２０】Ｘ２Ｓ（３）に励起波長３７２ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。
【図２１】Ｘ２Ｓ（４）に励起波長３７５ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。
【図２２】Ｘ２Ｓ（５）に励起波長３７６ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。
【図２３】Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）に励起波長３７０ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。
【図２４】３，６−Ｘ２Ｓ（２）に励起波長３２２ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。
【図２５】Ｘ２Ｓに励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓの蛍光強度との関係を示す図である。
【図２６】Ｘ２Ｓ（３）に励起波長３７２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（３）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図２７】Ｘ２Ｓ（４）に励起波長３７５ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（４）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図２８】Ｘ２Ｓ（５）に励起波長３７６ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（５）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図２９】Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）に励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合のＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３０】３，６−Ｘ２Ｓ（２）に励起波長３２２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度と３，６−Ｘ２Ｓ（２）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３１】二本鎖ＲＮＡの添加濃度と各化合物の蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図３２】二本鎖ＲＮＡの濃度が０．０μＭであるときの蛍光ピークの蛍光強度を１００％とした場合の、残存蛍光強度（％）をプロットした図である。
【図３３】Ｘ２Ｓに励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓの蛍光強度との関係を示す図である。
【図３４】Ｘ２Ｓ（３）に励起波長３７２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（３）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３５】Ｘ２Ｓ（４）に励起波長３７５ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（４）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３６】Ｘ２Ｓ（５）に励起波長３７６ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（５）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３７】Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）に励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合のＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３８】３，６−Ｘ２Ｓ（２）に励起波長３２２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度と３，６−Ｘ２Ｓ（２）の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３９】ＲＲＥの添加濃度と各化合物の蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図４０】ＲＲＥの濃度が０．０μＭであるときの蛍光ピークの蛍光強度を１００％とした場合の、残存蛍光強度（％）をプロットした図である。
【図４１】二本鎖ＲＮＡを用いたときの残存蛍光強度（％）を、ＲＲＥを用いたときの残存蛍光強度（％）で割った値をプロットした図である。
【図４２】二本鎖ＲＮＡを用いたときの残存蛍光強度（％）からＲＲＥを用いたときの残存蛍光強度（％）を減じた値をプロットした図である。
【図４３】Ｘ２Ｓを用い、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図４４】Ｘ２Ｓ（３）を用い、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図４５】Ｘ２Ｓ（４）を用い、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図４６】Ｘ２Ｓ（５）を用い、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図４７】Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）を用い、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図４８】３，６−Ｘ２Ｓ（２）を用い、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図４９】Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）、３，６−Ｘ２Ｓ（２）について、Ｒｅｖの添加量と蛍光強度との関係を示す図である。
【図５０】Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）、３，６−Ｘ２Ｓ（２）について、Ｒｅｖの添加量と、蛍光強度の回復率との関係を示すグラフである。
【図５１】1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。
【図５２】1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideと二本鎖ＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図である。
【図５３】1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideとＲＲＥとの結合を確認した結果を示す図である。
【図５４】ＲＮＡの濃度を変化させたときの蛍光波長３７５ｎｍにおける1-Pyrenemethanamideの残存蛍光強度（％）をプロットした図である。
【図５５】1-Pyrenemethanamideを用いた場合において、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。
【図５６】1-Pyrenemethanamideについて、Ｒｅｖの添加量と、蛍光強度の回復率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明者らは、高精度かつ簡便に、被験物質と核酸との結合親和性を測定する方法について鋭意検討を行なった。その結果、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体、例えば上記一般式（１）で示される化合物や上記一般式（１６）で示される化合物は、光を照射すると励起して蛍光を発する蛍光物質でありながら、当該化合物を単独で核酸に結合させると、光を照射しても蛍光を発光しなかったり、発する蛍光が弱くなったりするという現象が起きることを見出した。【００４１】
従来、上記一般式（１）で示される化合物のうち、一部の化合物は、特許文献１〜３に開示のようにＤＮＡ等を標識するために用いられていた。このように、当該一部の化合物は、標的の物質同士が結合したときに、蛍光を発光させるための標識物質として用いられてきたにも関わらず、本発明者らは上記有機蛍光体、例えば上記一般式（１）で示される化合物や上記一般式（１６）で示される化合物で何らかの物質を標識するのではなく、単独で核酸に結合させるという誰も想到しなかった試みを行なった結果、上記現象が生じるということを見出したのである。【００４２】
そして、上記有機蛍光体、例えば上記一般式（１）で示される化合物や上記一般式（１６）で示される化合物を用いてディスプレイスメントアッセイを行なえば、被験物質が当該化合物に置換して核酸に結合するに伴い、検出される蛍光強度が向上するため、バックグラウンドの蛍光の影響を全く受けることないため高精度に測定を行なえる点、核酸や被験物質を標識する必要がなく、また、核酸及び当該化合物を混合して、被験物質をさらに混合すればよいので、極めて簡便に測定を行なうことができる点を見出して、本発明の完成に至ったのである。【００４３】
なお、上記特許文献１〜３のように、核酸や被験物質を標識すれば、当該核酸や被験物質の構造が変化する恐れがある。核酸や被験物質の構造が変化すれば、標識しないときとは異なる結果になるという恐れも生じる。しかし、本発明によれば、核酸や被験物質の構造を変化させることがないので、このような恐れを解消することもできる。【００４４】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。
＜１．核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物＞
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物（以下、「本発明に係る組成物」と表記する）は、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を含む。【００４５】
上記有機蛍光体としては、特に限定されるものではないが、下記一般式（１）で示される化合物、一般式（１６）で示される化合物等を挙げることができる。【００４６】
これらの化合物は、ＲＮＡに結合することができ、しかも光を照射した場合、ＲＮＡに結合した状態よりも、ＲＮＡから遊離している状態の方が発する蛍光が強い。よって、エチジウムブロマイドを用いる場合のように、バックグラウンドの蛍光の影響を受けない。それゆえ、ディスプレイスメントアッセイに好適に用いることができ、薬剤の標的物質の一次スクリーニングの効率化に寄与することができる。【００４７】
本発明に係る組成物は、下記一般式（１）【００４８】
【化１４】
2008153223.tif 000016
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物を含むことが好ましい。【００４９】
上記一般式（１）で示される化合物（以下、「キサンタン蛍光分子」とも表記する）としては、特に限定されるものではないが、例えば、下記一般式（４）【００５０】
【化１５】
2008153223.tif 000017
（Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物、下記構造式（５）【００５１】
【化１６】
2008153223.tif 000018
で示される化合物、下記構造式（６）【００５２】
【化１７】
2008153223.tif 000019
で示される化合物、下記一般式（７）【００５３】
【化１８】
2008153223.tif 000020
（Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はアルキル基であり、上記アルキル基は、２−アミノエトキシ基に対してオルト位であることが好ましい）
で示される化合物、下記構造式（８）【００５４】
【化１９】
2008153223.tif 000021
で示される化合物、下記構造式（９）【００５５】
【化２０】
2008153223.tif 000022
で示される化合物、下記構造式（１３）【００５６】
【化２１】
2008153223.tif 000023
で示される化合物を例示できる。上記一般式（４）で示される化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば下記一般式（１０）【００５７】
【化２２】
2008153223.tif 000024
（Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物が好ましい。また、上記一般式（１０）で示される化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、下記一般式（２）【００５８】
【化２３】
2008153223.tif 000025
（Ｒ５は、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数２〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）で示される化合物が好ましい。上記一般式（２）で示される化合物としては、特に限定されるものではないが、下記構造式（３）【００５９】
【化２４】
2008153223.tif 000026
で示される化合物、即ち、２，７‐ビス（２‐アミノエトキシ）キサンタン‐９‐オン（以下、「Ｘ２Ｓ」と表記する）、２‐（２‐アミノエトキシ）キサンタン‐９‐オン（以下、「Ｘ１Ｓ」と表記する）、下記構造式（１１）【００６０】
【化２５】
2008153223.tif 000027
で示される化合物を例示でき、中でもＸ２Ｓが特に好ましい。【００６１】
また、一般式（４）で示される化合物としては、下記一般式（１２）【００６２】
【化２６】
2008153223.tif 000028
（ｎは３、４、または５を表す。）で示される化合物、
下記一般式（１４）【００６３】
【化２７】
2008153223.tif 000029
（ｎは１または２を表し、Ｒ１０、Ｒ１１はそれぞれ独立してアルキル基またはカルボキシル基を表す。）で示される化合物、
下記構造式（１５）【００６４】
【化２８】
2008153223.tif 000030
（ｎは１または２を表す。）で示される化合物、を例示することもできる。【００６５】
本発明にかかる組成物は、下記一般式（１６）【００６６】
【化２９】
2008153223.tif 000031
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）で示される化合物であってもよい。【００６７】
上記一般式（１６）で表される化合物（以下、「ピレン蛍光分子」とも表記する）としては、特に限定されるものではないが、例えば下記一般式（１７）【００６８】
【化３０】
2008153223.tif 000032
（Ｒ１６、Ｒ１８はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または炭素数１〜５のアルコキシル基であり、上記アルコキシル基は１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子および／または窒素原子に置換されていてもよく、Ｘ１は酸素原子、窒素原子または硫黄原子であり、Ｒ１７は炭素数１〜５のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個またはそれ以上の水素原子が水酸基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる１以上の官能基で置換されていてもよい）
で示される化合物、下記一般式（１８）【００６９】
【化３１】
2008153223.tif 000033
（Ｒ１９、Ｒ２１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または炭素数１〜５のアルコキシル基であり、上記アルコキシル基は１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子および／または窒素原子に置換されていてもよく、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立して酸素原子、窒素原子または硫黄原子であり、Ｒ２０、Ｒ２２はそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個またはそれ以上の水素原子が水酸基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる１以上の官能基で置換されていてもよい）
で示される化合物を例示できる。【００７０】
上記一般式（１７）で表される化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば下記構造式（１９）【００７１】
【化３２】
2008153223.tif 000034
で示される化合物を例示することができる。【００７２】
キサンタン蛍光分子に励起光を照射したときに発する蛍光強度は、当該キサンタン蛍光分子が核酸に結合することで減少する。よって、キサンタン蛍光分子と、核酸と、被験物質とを用いれば、ディスプレイスメントアッセイが可能となる。つまり、核酸にキサンタン蛍光分子を結合させておき、核酸に結合したキサンタン蛍光分子に対して、被験物質が置換されるか否かを指標に、被験物質と核酸との結合親和性を測定することができる。同様のことは、例えば構造式（１９）に示すような、励起光を照射したときに蛍光を発するピレン蛍光分子に対してもいえる。【００７３】
また、キサンタン蛍光分子を用いたディスプレイスメントアッセイでは、バックグラウンドの蛍光の影響を受けることがないので、高精度に被験物質と核酸との結合親和性を測定することができる。つまり、核酸とキサンタン蛍光分子とが結合した状態では、蛍光が検出されないか、検出されたとしてもわずかである。そして、被験物質がキサンタン蛍光分子に置換して核酸と結合することで、キサンタン蛍光分子が遊離すると、検出される蛍光の強度が増大する。よって、バックグラウンドの蛍光の影響を抑えることができるため、高精度な測定が可能となる。同様のことは、例えば構造式（１９）に示すような、励起光を照射したときに蛍光を発するピレン蛍光分子に対してもいえる。【００７４】
なお、例示した各キサンタン蛍光分子を得る方法は、特に限定されるものではない。例えば、市販のものを用いてもよく、市販されていないものは、キサントンや２，７‐ジヒドロキシキサントンを原料に、Szajnman, S. H.; , Yan, W.;  Bailey, B. N.; Docampo, R.; Elhalem, E.; Rodriguez, J. B. J. Med. Chem. 2000,43,1826-1840.、Pace, T. C. S.; Monahan, S. L.; MacRae, A. I.; Kaila, M.; Bohne, C. Photochem. Photobiol. 2006, 82, 78-87.に記載の方法によれば合成することができる。例えば、本発明者らは、これらの文献を参考にＸ２Ｓを合成した。【００７５】
なお、例示した各ピレン蛍光分子を得る方法は、特に限定されるものではない。例えば、市販のものを用いてもよく、市販されていないものは、例えば以下の合成経路で合成することができる。【００７６】
【化３３】
2008153223.tif 000035
上記合成経路において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して炭素数１〜１８のアルキル基、炭素数１〜１８のアルケニル基、炭素数１〜１８のアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基またはアラルキル基を示す。当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基およびアラルキル基中の１個またはそれ以上の水素原子は、アルキル基、ハロアルキル基、アルコキシル基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、シロキシ基、ジアルキルアミノ基、エステル基、シアノ基、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子およびニトロ基からなる群より選ばれる１以上の官能基で置換されていても良い。【００７７】
上記合成経路に示すように、ピレンアルデヒドを、ＮａＢＨ４を還元剤として用い、一級アミンと反応させることによって化合物（Ｉ）を合成することができる。また、ピレンアルデヒドをＮａＢＨ４を還元剤として用い、四臭化炭素およびトリフェニルホスフィンと反応させ、さらに、水素化ナトリウムの存在下でアルコールと反応させることによって、化合物（ＩＩ）を合成することができる。【００７８】
本発明に係る組成物では、キサンタン蛍光分子またはピレン蛍光分子などの有機蛍光体を安定的に保持するために、当該化合物を緩衝液に溶解したものであることが好ましい。この緩衝液としては、キサンタン蛍光分子またはピレン蛍光分子などの有機蛍光体の機能を損なわない限り限定されるものではないが、例えば、カコジル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等を好ましく例示できる。これらの中でもカコジル酸緩衝液は、キサンタン蛍光分子またはピレン蛍光分子などの有機蛍光体をより安定的に保持できるため好ましい。また、これらの緩衝液には、ＮａＣｌを予め５０〜２００ｍＭ溶解しておくことが好ましい。塩濃度を上げることで、非特異的な静電的結合を避けることができるからである。【００７９】
本発明に係る組成物において、核酸に対する結合親和性を測定する対象となる被験物質は限定されるものではない。本発明に係る組成物を用いれば、どのような物質であっても、被験物質として測定可能である。例えば、低分子化学物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質等の高分子化学物質等を例示できる。一般に薬剤の候補として、低分子化学物質が挙げられることが多いが、このような低分子化学物質と核酸との結合親和性も、本発明に係る組成物を用いれば、高精度かつ簡便に測定することができる。【００８０】
＜２．核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキット＞
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキット（以下、「本発明に係るキット」と表記する）は、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を備えればよい。【００８１】
また、本発明に係るキットは、上記一般式（１）で示される化合物および／または上記一般式（１６）で示される化合物を備えることが好ましい。また、上述の緩衝液を備えることが好ましい。【００８２】
また、キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、蛍光を測定するためのマイクロプレートやカラム等の器具を含んでもよいし、測定する対象となる核酸を備えていてもよい。【００８３】
また、本発明に係るキットの提供形態は、キサンタン蛍光分子および／またはピレン蛍光分子、緩衝液、その他の試薬全てを、適切な容量及び／又は形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係るキットには、後述する本発明に係る方法を行なうための手順等を記載した説明書を備えてもよい。【００８４】
＜３．核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法＞
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法（以下、「本発明に係る方法」と表記する）は、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体および核酸を混合して第一の溶液を得て、上記第一の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第一の測定工程と、上記第一の溶液に被験物質をさらに混合して第二の溶液を得て、上記第二の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第二の測定工程と、上記第一の測定工程で測定した蛍光及び上記第二の測定工程で測定した蛍光を比較する比較工程と、を含めばよい。【００８５】
上記有機蛍光体は、下記一般式（１）【００８６】
【化３４】
2008153223.tif 000036
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）で示される化合物および／または下記一般式（１６）【００８７】
【化３５】
2008153223.tif 000037
（Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、または炭素数１〜５の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群より選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）で示される化合物であることが好ましい。【００８８】
上記第一の工程で作製する上記第一の溶液は、上記有機蛍光体、例えばキサンタン蛍光分子および／またはピレン蛍光分子と核酸とを溶解した溶液であればよい。上記第一の溶液を作製するときに用いる溶媒は、上記有機蛍光体、例えばキサンタン蛍光分子および／またはピレン蛍光分子、核酸並びに被験物質を溶解可能である限り、限定されるものではない。例えば、本発明に係る組成物の説明において述べた緩衝液等を用いればよい。【００８９】
上記第一の測定工程において蛍光を測定する方法は特に限定されない。例えば遊離しているキサンタン蛍光分子および／またはピレン蛍光分子であれば、蛍光を発せさせることが可能な波長の光を照射した上で、第一の溶液から発せられる蛍光を測定すればよい。このような光としては、キサンタン蛍光分子および／またはピレン蛍光分子の種類に応じて適宜設定すればよく、特に限定されるものではないが、例えば、３００〜４５０ｎｍの波長の光が好ましく、３５０〜４００ｎｍの波長の光が好ましい。このように蛍光を測定する方法としては、光を照射して蛍光の検出が可能である限り限定されるものではない。例えば、第一の溶液をマイクロプレートの各ウェル内に作製して、光の照射及び蛍光の測定が可能な、従来公知のマイクロプレートリーダによって当該第一の溶液の蛍光を測定すればよい。【００９０】
上記第二の測定工程で作製する上記第二の溶液は、上記第一の溶液に被験物質をさらに溶解させたものである限り限定されるものではない。上記第二の測定工程における蛍光の測定は、上記第一の測定工程と同様にして行なえばよい。【００９１】
上記比較工程では、上記第一の工程で測定した蛍光と上記第二の工程で測定した蛍光とを比較すればよい。例えば、上記第一の溶液から発せられる蛍光強度に対する、上記第二の溶液から発せられる蛍光強度の増加量を算出すれば、核酸と被験物質との結合親和性を定量的に測定することができる。【００９２】
ここで、本発明に係る方法の原理について、図１を用いて説明する。図１は本発明に係る方法の原理を模式的に示した図であり、図１の（ａ）は上記第一の溶液を模式的に示しており、図１の（ｂ）は上記第二の溶液を模式的に示している。なお、図１では、キサンタン蛍光分子を単に「蛍光分子」として表している。【００９３】
図１の（ａ）に示すように、上記第一の溶液は、キサンタン蛍光分子と核酸とが混合されており、キサンタン蛍光分子と核酸とは結合している。このとき、上記第一の溶液に光を照射しても、キサンタン蛍光分子は蛍光を発しないか、発する蛍光が少ない。つまり、上記第一の測定工程の測定では、蛍光強度が検出されなかったり、低い値の蛍光強度を得たりすることとなる。なお、このとき得られる蛍光強度は、キサンタン蛍光分子の種類、核酸の配列、キサンタン蛍光分子及び核酸の混合量の影響も受ける。【００９４】
次に、本発明に係る方法では、図１の（ｂ）に示すように、上記第一の溶液にさらに被験物質を混合して、上記第二の溶液を作製する。このとき、被験物質と核酸との結合親和性が、キサンタン蛍光分子と核酸との結合親和性より高ければ、キサンタン蛍光分子と被験物質とが置換して、キサンタン蛍光分子が遊離する。遊離したキサンタン蛍光分子に、光を照射すると、当該キサンタン蛍光分子は蛍光を発光する。よって、上記第二の測定工程では、遊離したキサンタン蛍光分子に由来する蛍光を測定することとなる。【００９５】
本発明に係る方法では、上記比較工程において、上記第一の測定工程で測定した蛍光と上記第二の測定工程で測定した蛍光とを比較する。比較の結果、上記第一の測定工程で測定した蛍光に対する、上記第二の測定工程で測定した蛍光の増加量から、被験物質と核酸との結合親和性を測定することができる。例えば、増加量が大きければ被験物質と核酸との結合親和性は高いといえる。また、蛍光強度の増加が認められなければ、被験物質と核酸との結合親和性は、キサンタン蛍光分子と核酸との結合親和性より低いといえる。【００９６】
以上、キサンタン蛍光分子を例にとって説明したが、ピレン蛍光分子などの他の有機蛍光体を用いた場合についても同様のことが言える。【００９７】
このように、本発明によれば、核酸と被験物質との結合親和性を高精度かつ簡便に測定することができる。よって、薬剤のスクリーニングを安価で、迅速かつ簡便に行なうことができる。上述のように、本発明に係る方法は、従来公知の、マイクロプレート及びこれに励起光を照射して蛍光を検出できるマイクロプレートリーダ等を用いて実施することができるので、候補物質のライブラリーの各物質に対して、本発明に係る方法を繰り返したり、複数の候補物質に対して同時に行なったりすることができる。よって、薬剤の一次スクリーニングをハイスループットで行なうことができる。【００９８】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００９９】
〔実施例１：Ｘ２Ｓの合成〕
Ｘ２Ｓの合成については、以下の合成経路で行なった。【０１００】
【化３６】
2008153223.tif 000038
具体的には、まず、キサントンから２，７‐ジヒドロキシキサントンの合成は、Sergio H. Szajnman, Wen Yan, Brian N. Bailey, Roberto Docampo, Eleonora Elhalem, Juan B.Rodriguez., J. Med. Chem. 2000,43,1826-1840.、Tamara C.S.Pace, Sarah L.Monahan, Andrew I. MacRae, Monica Kaila, Cornelia Bohne., Photochemistry and Photobiology, 2006,82:78-87.の記載に従った。【０１０１】
次に、２，７‐ジヒドロキシキサントン（０．１３ｍｍｏｌ、３０．０ｍｇ）をｄｒｙ  ＴＨＦ（tetrahydrofuran）７ｍｌに溶解した後、トリフェニルフォスフィン（８６．３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ.）及びジエチルアゾジカルボン酸（４０％トルエン溶液、１４３ｍｇ、１５０μｌ、０．３３ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ.）を添加した。これにより得た溶液を室温で１５分間攪拌した後、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護した２‐アミノ‐１‐エタノール（５３ｍｇ、５０μｌ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加して、室温で２４時間攪拌した。【０１０２】
次に、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１の後、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ＝１００：１〜２）で精製して、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護されたＸ２Ｓ（以下、「Ｎ‐Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ」と表記する）（２１．５ｍｇ、３１％）を得た。このＮ−Ｂｏｃ‐Ｘ２ＳをＮＭＲで確認した結果は次の通りである。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） １．３５‐１．４５ （９Ｈ）； ３．５２‐３．５４ （２Ｈ）；４．０３‐４．０９, （２Ｈ）；４．９０‐４．９６ （ｂｒｏａｄ １Ｈ）；７．２５‐７．２８, １Ｈ； ７．３７‐７．３９,（ｄ,１Ｈ, Ｊ＝９．０４Ｈｚ）;７．６１‐７．６２（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝２．９２Ｈｚ）.１３ＣＮＭＲ：２８．８８６, ２９．６８６, ４０.００３，６７.８８４, １０６．８４０, １１９．４８５, １２１．４６８, １２４．８２４, １５１．１０２, １５４．７９６, １５５．８２４, １７６.７２１;ＨＲ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ. ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ３４Ｎ２ＮａＯ８[Ｍ＋Ｎａ]＋, ５３７.２２１３；ｆｏｕｎｄ, ５３７．２１８９．。【０１０３】
Ｎ‐Ｂｏｃ基は次のようにして除去した。まず、酢酸エチル１５ｍｌ中にＮ−Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓを混合して、さらに４Ｎ ＨＣｌを加えて、室温で１５分間攪拌した。次に、攪拌後の溶液を濃縮して、得られた生成物を純水に溶解した後、これを濾過して、凍結乾燥した。これにより、Ｘ２Ｓの白色固体を得た。これを純水に溶解して１ｍＭのＸ２Ｓ溶液として保存して、以下の実施例に用いた。なお、得られたＸ２ＳをＨＲ‐ＭＳで分析した結果は次の通りである。ＨＲ‐ＭＳ: ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３１５．１３３４， ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ Ｃ１７Ｈ１９Ｎ２Ｏ４， ３１５．１３４５．。【０１０４】
なお、上述の合成では、Szajnman, S. H.;, Yan, W.;  Bailey, B. N.; Docampo, R.; Elhalem, E.; Rodriguez, J. B. J. Med. Chem. 2000,43,1826-1840.及びPace, T. C. S.; Monahan, S. L.; MacRae, A. I.; Kaila, M.; Bohne, C. Photochem. Photobiol. 2006, 82, 78-87を参照した。【０１０５】
〔実施例２：Ｘ２ＳとＲＮＡとの結合の確認〕
次に、Ｘ２ＳとＲＮＡとの結合を確認した。本実施例で用いたＲＮＡの構造を図２に示す。図２は本実施例で用いたＲＮＡの構造を模式的に示す図である。また、本実施例で用いたＲＮＡの配列を配列番号１〜３に示す。【０１０６】
図２中のＮは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇのいずれかの塩基か、塩基が存在しないことを示している。つまり、図２において、ＮがＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇのいずれかの塩基であるＲＮＡは、配列番号１に示す塩基配列からなるＲＮＡと配列番号２に示す塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡとがハイブリダイズしてなるＲＮＡに相当する。また、図２において、Ｎの位置に塩基が存在しないときのＲＮＡは、配列番号１に示す塩基配列からなるＲＮＡと配列番号３に示す塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズしてなるＲＮＡに相当する。【０１０７】
また、本実施例で用いたＲＮＡは、ＮがＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇのいずれかの塩基であるとき、これらの塩基は相補的な塩基と結合しないため、バルジ構造を形成する。Ｎに塩基が存在しないとき、このＲＮＡはバルジ構造を有していない。なお、Ａが相補的な塩基と結合しないことでバルジ構造を形成したＲＮＡを、以下、「Ａバルジ」と表記することもある。他の塩基についても同様である。本実施例で用いたＲＮＡは、北海道システムサイエンス社から購入した。【０１０８】
まず、Ｘ２Ｓを１０μＭとなるように、カコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム １０ｍＭ ｐＨ ７．０、ＮａＣl １００ｍＭ）に混合してＸ２Ｓ溶液を得た。当該Ｘ２Ｓ溶液に、吸収極大３７１±３ｎｍの光を照射して、蛍光強度を測定した。この蛍光強度の測定は、島津社製(品番ＲＦ-５３００ＰＣ)の装置を用いた。なお、当該Ｘ２Ｓ溶液に、それぞれのＲＮＡが３０μＭとなるように混合した後に、蛍光強度を測定した。【０１０９】
ＲＮＡを混合する前後の蛍光強度を比較した結果を図３及び４に示す。図３及び４は、いずれも、Ｘ２ＳとＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図であり、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。また、図４は図３の蛍光強度５Ａ．Ｕ．近傍を拡大した図である。【０１１０】
図３及び４に示すように、バルジ構造の有無及びバルジ構造を形成する要因となる塩基の種類によって、蛍光強度に若干の差はあるものの、Ｘ２Ｓが、ＲＮＡの構造によらず、様々な構造のＲＮＡに結合可能であることが確認できた。【０１１１】
〔実施例３：Ｘ１ＳとＲＮＡとの結合の確認〕
Ｘ２Ｓの代わりにＸ１Ｓを用いた以外は、実施例２に記載の方法と同様にして、Ｘ１ＳとＲＮＡとの結合を確認した。結果を図５に示す。図５は、Ｘ１ＳとＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図であり、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。【０１１２】
図５に示すように、Ｘ１Ｓも、Ｘ２Ｓと同様に、バルジ構造の有無に関わらずＲＮＡに結合することが示された。なお、Ｘ２Ｓを用いた場合ほど蛍光強度の減少は確認されなかった。【０１１３】
なお、以下に、本実施例で用いたＸ１Ｓの合成方法を説明する。Ｘ１Ｓの合成については以下の合成経路で行なった。【０１１４】
【化３７】
2008153223.tif 000039
このＸ１Ｓの合成経路のうち、１及び２の化合物から３の化合物の合成（ｉの反応）は、Org. Lett. 2005,Vol 7, No.19,4273-4275に記載の方法に従った。【０１１５】
次に、iiの反応では、最初に３の化合物（２−メトキシキサントン）１５０ｍｇ(０．６４４ｍｍｏｌ)及び１．８ｇのピリジン・ＨＣｌ塩の混合物を、１８０℃で１０時間加熱した。その後、室温まで冷却して５０ｍｌの水に混合した。次に、ろ過して白色固形物を得た。当該白色固形物を水で洗浄した後、高真空ポンプを用いて乾燥させた。９６．１ｍｇの白色物質を得た。これにより収率６７．０％で、４の化合物（２−ヒドロキシキサントン）を得た。この２−ヒドロキシキサントンをＮＭＲで確認した結果は次の通りである。1ＨＮＭＲ(ｄ-ＤＭＳＯ， ４００ＭＨｚ): ７．３０‐７．３３， ｍ， １Ｈ; ７．４３‐７．４７， ｍ， ２Ｈ; ７．５４‐７．５６， ｄ， １Ｈ; ７．６２‐７．６４，ｄ，１Ｈ; ７．８２‐７．８６，ｍ，１Ｈ; ８．１６‐８．１８， ｄ，１Ｈ; ９．９７， ｓ， １Ｈ． ＨＲ‐ＭＳ: [Ｍ＋Ｈ]＋２１３．０５５０６， ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ Ｃ１８Ｈ９Ｏ３:２１３．０５５１７．。【０１１６】
次に、iiiの反応では、最初に４の化合物（２−ヒドロキシキサントン）７２ｍｇ(０．３４０ｍｍｏｌ)、ＢｏｃＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ５４．８ｍｇ（５２μｌ）（０．３４０ｍｍｏｌ）及びのＰｈ３Ｐ９１．８ｍｇ(０．３４ｍｍｏｌ)を５ｍｌのＴＨＦに溶解した。これに、ＤＥＡＤ１４８．５ｍｇ（１５５μｌ）（０．３４１ｍｍｏｌ）の４０％トルエン溶液を２ｍｌのＴＨＦに溶解したものを徐々に加えて、得られた溶液を２４時間攪拌した。ＴＨＦが蒸発した後、当該溶液をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１の後、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１００：１〜３）で精製した。これにより得られた溶液から溶媒を蒸散させて、生成物を高真空ポンプで乾燥した。６８．９ｇ（収率５７．１％）の５の化合物を得た。これをＮＭＲで確認した結果は次の通りである。１ＨＮＭＲ （ｄ‐ＣＤＣｌ３， ４００ＭＨｚ）: １．３９ （ｓ， ９Ｈ）; ３．５２， ｍ， ２Ｈ; ４．０３‐４．０８， ｍ， ２Ｈ; ４．９２，ｂｒｏａｄ， ＮＨ; ７．３１‐７．３８， ｍ， ２Ｈ; ７．４１‐７．４９， ｍ， ２Ｈ; ７．６８‐７．７７， ｍ， ２Ｈ; ８．３１‐８．３４， ｍ， １Ｈ． １３ＣＮＭＲ， ３９．９８４， ６７．８５１， １０７．０３７， １０９．８７３， １１７．９６２， １１９．４９１， １２１．１９２， １２２．０９６， １２３．６５８， １２３．７８２， １２４．８２６， １２６．６１８， １２６．６８３， １３４．６７４， １５１．１１４， １５４．８７９， １５６．１１２，１７７．０４１．。【０１１７】
最後に、次に、iｖの反応では、最初に、iiiの反応で得られた５の化合物を１５ｍｌの４Ｎ ＨＣｌ酢酸エチルの４Ｎ ＨＣｌ溶液に混合して、室温で１５分間攪拌した。次に、酢酸エチルを蒸散させて、最終生成物を水と混合した。そして、ろ過した後、凍結乾燥を行ない、Ｘ１Ｓの白色固形物を得た。これを純水に溶解して１ｍＭのＸ１Ｓ溶液として保存して、上述の実施例に用いた。なお、得られたＸ２ＳをＨＲ‐ＭＳで分析した結果は次の通りである。ＨＲ‐ＭＳ: ２５６．０９８７４， ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ: Ｃ１５Ｈ１４ＮＯ３， ２５６．０９７３７．。【０１１８】
〔実施例４：Ｘ２ＳとＲＲＥとの結合の確認〕
本実施例では、実施例２と同様の方法で、ＲＲＥとＸ２Ｓとの結合を確認した。【０１１９】
ＲＲＥのアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、ＲＲＥの構造を図６に示す。図６はＲＲＥの構造を模式的に示した図である。図６に示すように、ＲＲＥはＵバルジ構造を備えている。なお、ＲＲＥは北海道システムサイエンス社から購入した。【０１２０】
まず、実施例１で得たＸ２Ｓ溶液を、カコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム １０ｍＭ ｐＨ ７．０、ＮａＣl １００ｍＭ）で希釈して、Ｘ２Ｓの濃度を２μＭとした。この２μＭのＸ２Ｓ溶液に、ＲＲＥを、０、１、２、３、４、５、６、及び８μＭとなるように、段階的に添加した。各濃度におけるＸ２Ｓの２μＭ溶液の蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定については、実施例２に記載の方法と同様にして行なった。【０１２１】
結果を図７及び８に示す。図７は、Ｘ２ＳとＲＲＥとの結合を確認した結果を示す図であり、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。なお、図７中の矢印は、各曲線を得たときのＲＲＥの濃度が、この矢印の方向の順に多いことを示している。つまり、最も上の曲線はＲＲＥの濃度が０μＭのときの結果を示し、最も下の曲線はＲＲＥの濃度が８μＭのときの結果を示している。他の図面においても、蛍光強度の測定結果中の矢印は、段階的に添加した物質の量が、当該矢印の方向の順に多いことを示している。【０１２２】
図８は、図７に示した結果の測定波長４５３ｎｍにおける蛍光強度をプロットした図であり、横軸はＲＲＥの濃度を示し、縦軸は蛍光強度を示す。【０１２３】
図７及び８に示すように、ＲＮＡの濃度が増加するに伴って蛍光強度は低下した。また、図８に示すように、ＲＮＡの濃度と蛍光強度とは相関しており（相関係数Ｒ＝０．９８）、相関曲線を形成している。これらのことから、Ｘ２ＳはＲＮＡに結合すると、蛍光が消光することが確認できた。【０１２４】
〔実施例５：Ｘ２Ｓを用いたディスプレイスメントアッセイ〕
本実施例では、Ｘ２Ｓを用いて、被験物質とＲＲＥとの結合親和性を測定した。被験物質としては、Ｒｅｖタンパク質（京都大学エネルギー科学研究所森井孝教授から供与された）、アミノグリコシド系抗生物質ネオマイシン（Ｓｉｇｍａ社製 品番；Ｎ‐１８７６）（以下、単に「ネオマイシン」と表記する）、トロンビン（Ｂａｃｈｅｍ社製 品番；ＡＧ Ｈ‐８５５０）を用いた。なお、Ｒｅｖタンパク質及びネオマイシンはＲＲＥに結合することが知られており、トロンビンはＲＲＥに結合しないことが知られている。なお、Ｒｅｖタンパク質の構造を図９に示し、アミノ酸配列を配列番号５に示す。図９はＲｅｖタンパク質の構造を模式的に示す図である。また、トロンビンの構造を図１０に示し、アミノ酸配列を配列番号６に示す。図１０はトロンビンの構造を模式的に示す図である。【０１２５】
まず、実施例３と同様にしてカコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム １０ｍＭ ｐＨ ７．０、ＮａＣl １００ｍＭ）に、Ｘ２Ｓを２μＭ、ＲＲＥを２μＭとなるように溶解して、Ｘ２Ｓ‐ＲＲＥ溶液を調製した。【０１２６】
このＸ２Ｓ‐ＲＲＥ溶液に、Ｒｅｖタンパク質を、濃度が０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、２．８、３．２、３．６、及び４．０μＭとなるように段階的に添加した。また、各濃度で蛍光強度を測定した。同様に、Ｘ２Ｓ‐ＲＲＥ溶液に、ネオマイシンを、濃度が０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、２．８、３．２、３．６、及び４．０μＭとなるように段階的に添加し、各濃度で蛍光強度を測定した。同様に、Ｘ２Ｓ‐ＲＲＥ溶液に、トロンビンを、濃度が０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、２．８、３．２、３．６、及び４．０μＭとなるように段階的に添加し、各濃度で蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定については、実施例２に記載の方法と同様にして行なった。【０１２７】
結果を図１１〜１４に示す。図１１はＲｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示し、図１２はネオマイシンとＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示し、図１３はトロンビンとＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す。図１１〜１３において横軸は蛍光波長を示し縦軸は蛍光強度を示す。また、最も上の曲線は、ＲＲＥ非存在下での蛍光強度を示しており、最も下の曲線は、ＲＲＥ及びＸ２Ｓが存在し、被験物質が存在しない状態で検出した蛍光強度を示している。また、最も下の曲線から矢印の方向の順に、添加した被験物質の量が多い場合の結果を示している。【０１２８】
図１４は、図１１〜１３に示した結果のうち、蛍光波長４５３ｎｍにおける蛍光強度をプロットした図であり、横軸は各被験物質の濃度を示し、縦軸は蛍光強度を示す。なお、図１４において、丸印はＲｅｖタンパク質、四角印はネオマイシン、三角印はトロンビンを用いたときの結果を示している。【０１２９】
図１１及び１４に示すように、Ｒｅｖタンパク質を添加すると、蛍光強度が増加することが確認できた。これは、Ｒｅｖタンパク質が増加したことにより、ＲＲＥに結合していたＸ２Ｓの代わりに、Ｒｅｖタンパク質がＲＲＥに結合してＸ２Ｓが遊離したことを示している。このことから、Ｒｅｖタンパク質はＲＲＥに対する結合親和性が極めて高いことが示された。【０１３０】
図１２及び１４に示すように、ネオマイシンを添加すること、蛍光強度が若干増加するが、Ｒｅｖタンパク質を添加したときほど、蛍光強度が増加しないことが示された。これにより、ネオマイシンはＲＲＥに対して結合するが、この結合親和性は、Ｒｅｖタンパク質のＲＲＥに対する結合親和性より低いことが示された。【０１３１】
図１３及び１４に示すように、トロンビンを添加しても、蛍光強度はほとんど増加しなかった。これにより、トロンビンはＲＲＥに対して結合しないことが確認できた。【０１３２】
以上のように、本発明によれば、様々な被験物質の核酸に対する結合親和性を測定できることが示された。【０１３３】
また、図１４に示すように、蛍光強度は約８０％程度まで回復した。Ｒｅｖタンパク質はＲＲＥのＵバルジ構造に結合することが知られていることを考慮すると、Ｘ２ＳはＲＲＥのバルジ構造に優位に結合していることが示されたといえる。【０１３４】
〔実施例６：Ｘ２Ｓとエチジウムブロマイドとの比較〕
本実施例では、比較例として、エチジウムブロマイドとＲＲＥとの結合の確認及びエチジウムブロマイドを用いてディスプレイスメントアッセイを行ない、Ｘ２Ｓを用いた場合の結果と比較した。【０１３５】
（エチジウムブロマイドとＲＲＥとの結合の確認）
２μＭ エチジウムブロマイド溶液に、ＲＲＥを０、１、２、３、４、５、６、７μＭとなるように段階的に混合した。ＲＲＥが各濃度のときに、２８４ｎｍの励起波長により得られる蛍光を検出した。なお、蛍光強度の測定については、励起波長が異なる以外は実施例２に記載の方法と同様にして行なった。【０１３６】
この結果を図１５に示す。図１５は、ＲＲＥとエチジウムブロマイドとの結合を確認した結果を示す図であり、横軸は蛍光波長、縦軸は蛍光強度を示す。【０１３７】
図１５に示すように、ＲＲＥの濃度が増えると蛍光は増大した。また、エチジウムブロマイドとＲＲＥとの量が等しいとき（共に２μＭのとき）に、蛍光強度の増加量は減少して飽和した。この結果を、上記図１１に示した結果と比較すると分かるように、Ｘ２Ｓを用いた方が、蛍光強度の変化が大きいことが確認できた。【０１３８】
（Ｘ２Ｓを用いたディスプレイスメントアッセイとエチジウムブロマイドを用いたディスプレイスメントアッセイとの比較）
Ｘ２Ｓを用いたディスプレイスメントアッセイは、添加したＲｅｖタンパク質の濃度が、４．４μＭ、４．８μＭのときにも蛍光を測定した以外は、実施例５に記載した方法と同様にして行なった。【０１３９】
この結果を図１６に示す。図１６は、Ｘ２Ｓを用いたディスプレイスメントアッセイの結果を示す図であり、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。【０１４０】
また、エチジウムブロマイドを用いたディスプレイスメントアッセイは、実施例５に記載した方法と同様にして行なった。ただし次の点で異なる。Ｘ２Ｓの代わりにエチジウムブロマイドを用いた。添加したＲｅｖタンパク質の濃度が、４．４μＭ、４．８μＭのときにも蛍光を測定した。蛍光の測定のための励起波長を２８４ｎｍとした。【０１４１】
結果を図１７に示す。図１７は、エチジウムブロマイドを用いたディスプレイスメントアッセイの結果を示す図であり、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。【０１４２】
図１６及び１７に示すように、エチジウムブロマイドを増やすと蛍光は減少していくが、ＲＲＥを２．４μＭとしたときに、最初の値に比べて約３０％低下した蛍光強度となり、それ以降は蛍光強度の増加が緩やかになり、最終的に蛍光強度は約６０％低下した。一方、Ｘ２Ｓを用いた場合、ＲＲＥを３．２μＭとしてもなお蛍光強度の減少は明確に確認でき、蛍光強度は最終的に約８０％上昇した。【０１４３】
以上の結果から、Ｘ２Ｓを用いると極めて高い測定精度で、ＲＮＡと被験物質との結合親和性を測定できることが示された。【０１４４】
〔実施例７：Ｘ２Ｓと一本鎖ＲＮＡとの結合〕
本実施例では、Ｘ２Ｓと一本鎖ＲＮＡ（以下、「ｓｓＲＮＡ」と表記する）との結合を確認した。具体的には、次の点以外は、実施例２に記載の方法と同様に行なった。二本鎖ＲＮＡの代わりにｓｓＲＮＡを用いた。ｓｓＲＮＡの濃度が０、１、２、３、４、５、６、７、８μＭとなるように段階的に添加した。ｓｓＲＮＡは、北海道システムサイエンス社から購入した。なお、ｓｓＲＮＡの配列を配列番号７に示す。【０１４５】
この結果を図１８に示す。図１８は、Ｘ２ＳとｓｓＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図であり、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。【０１４６】
図１８に示すように、Ｘ２ＳはｓｓＲＮＡにも結合することが確認できた。なお、蛍光強度の変化量は、ｓｓＲＮＡが０μＭのときと８μＭのときとを比較すると約５０％程度であった。【０１４７】
〔実施例８：Ｘ２Ｓ（３）の合成〕
上記一般式（１２）においてｎ＝３である化合物、すなわち２，７−ビス（２−アミノプロポキシ）キサンタン−９−オン（以下、「Ｘ２Ｓ（３）」と表記する）を合成した。まず、実施例１と同様の方法によって２，７−ジヒドロキシキサントンを合成した。次に、２，７−ジヒドロキシキサントン（２．８５ｍｍｏｌ、６５０ｍｇ）をｄｒｙ  ＴＨＦ（tetrahydrofuran）３０ｍｌに溶解した後、トリフェニルホスフィン（１６００ｍｇ、６．１０ｍｍｏｌ、２．１ｅｑ.）及びジエチルアゾジカルボン酸（４０％トルエン溶液、２８００ｍｇ、２９００μｌ、６．３５ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ.）を添加した。これにより得た溶液を室温で１５分間攪拌した後、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護した３-アミノ‐１‐エタノール（１１００ｍｇ、６．２８ｍｍｏｌ）を添加して、室温で２４時間攪拌した。【０１４８】
次に、実施例１と同様のカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護されたＸ２Ｓ（３）（以下、「Ｎ‐Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（３）」と表記する）（２７８ｍｇ、収率１８％）を得た。このＮ−Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（３）をＮＭＲで確認した結果は表１に示す。【０１４９】
Ｎ‐Ｂｏｃ基は実施例１に記載の方法と同じ方法で除去した。これにより、Ｘ２Ｓ（３）の白色固体を得た。これを純水に溶解して１ｍＭのＸ２Ｓ（３）溶液として保存して、以下の実施例に用いた。なお、得られたＸ２Ｓ（３）をＭＳ分析した結果は表１に示した。【０１５０】
【表１】
2008153223.tif 000040
〔実施例９：Ｘ２Ｓ（４）の合成〕
上記一般式（１２）においてｎ＝４である化合物、すなわち２，７−ビス（２−アミノブトキシ）キサンタン−９−オン（以下、「Ｘ２Ｓ（４）」と表記する）を合成した。まず、実施例１と同様の方法によって２，７−ジヒドロキシキサントンを合成した。次に、２，７−ジヒドロキシキサントン（３．９４ｍｍｏｌ、９００ｍｇ）をｄｒｙ  ＴＨＦ（tetrahydrofuran）６０ｍｌに溶解した後、トリフェニルホスフィン（２２３０ｍｇ、８．５０ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ.）及びジエチルアゾジカルボン酸（４０％トルエン溶液、３７００ｍｇ、３９００μｌ、８．５８ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ.）を添加した。これにより得た溶液を室温で１５分間攪拌した後、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護した４-アミノ-１-エタノール（１６５０ｍｇ、８．７２ｍｍｏｌ）を添加して、室温で２４時間攪拌した。【０１５１】
次に、実施例１と同様のカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護されたＸ２Ｓ（４）（以下、「Ｎ‐Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（４）」と表記する）（６３０ｍｇ、収率２８％）を得た。このＮ−Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（４）をＮＭＲで確認した結果は表１に示す。【０１５２】
Ｎ‐Ｂｏｃ基は実施例１に記載の方法と同じ方法で除去した。これにより、Ｘ２Ｓ（４）の白色固体を得た。これを純水に溶解して１ｍＭのＸ２Ｓ（４）溶液として保存して、以下の実施例に用いた。なお、得られたＸ２Ｓ（４）をＭＳ分析した結果を表１に示した。【０１５３】
〔実施例１０：Ｘ２Ｓ（５）の合成〕
上記一般式（１２）においてｎ＝５である化合物、すなわち２，７−ビス（２−アミノペントキシ）キサンタン−９−オン（以下、「Ｘ２Ｓ（５）」と表記する）を合成した。まず、実施例１と同様の方法によって２，７−ジヒドロキシキサントンを合成した。次に、２，７−ジヒドロキシキサントン（３．５１ｍｍｏｌ、８００ｍｇ）をｄｒｙ  ＴＨＦ（tetrahydrofuran）６０ｍｌに溶解した後、トリフェニルホスフィン（２０００ｍｇ、７．６３ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ.）及びジエチルアゾジカルボン酸（４０％トルエン溶液、３３００ｍｇ、３５００μｌ、７．６６ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ.）を添加した。これにより得た溶液を室温で１５分間攪拌した後、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護した５-アミノ-１-エタノール（１５００ｍｇ、７．３８ｍｍｏｌ）を添加して、室温で２４時間攪拌した。【０１５４】
次に、実施例１と同様のカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護されたＸ２Ｓ（５）（以下、「Ｎ‐Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（５）」と表記する）（９２４ｍｇ、収率４４％）を得た。このＮ−Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（５）をＮＭＲで確認した結果を表１に示す。【０１５５】
Ｎ‐Ｂｏｃ基は実施例１に記載の方法と同じ方法で除去した。これにより、Ｘ２Ｓ（５）の白色固体を得た。これを純水に溶解して１ｍＭのＸ２Ｓ（５）溶液として保存して、以下の実施例に用いた。なお、得られたＸ２Ｓ（５）をＭＳ分析した結果を表１に示した。【０１５６】
〔実施例１１：３，６−Ｘ２Ｓ（２）の合成〕
構造式（１３）で示される化合物、すなわち３，６−ビス（２−アミノエトキシ）キサンタン−９−オン（以下、「３，６−Ｘ２Ｓ（２）」と表記する）を合成した。【０１５７】
2,2’,4,4’-テトラヒドロキシベンゾフェノン（０．０１０ｍｍｏｌ，２．５ｇ）を水２０ｍｌに懸濁し密閉容器を用いてオートクレーブで２００℃で４時間加熱した。吸引濾過により濾取した固体を、メタノール、酢酸エチルで洗浄して３，６−Ｘ２Ｓ（２）（１．７ｇ，収率７３％）を得た。【０１５８】
次に、３，６−ジヒドロキシキサントン（０．３２ｍｍｏｌ、７２ｍｇ）をｄｒｙ  ＴＨＦ（tetrahydrofuran）３．５ｍｌに溶解した後、トリフェニルホスフィン（２１０ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ.）及びDEAD（２．２Ｍ  ４０％トルエン溶液、３６４μｌ、０．８０ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ.）を添加した。これにより得た溶液を室温で４５分間攪拌した後、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護したエタノールアミン（１２９ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加して、室温で２４時間攪拌した。さらに、トリフェニルホスフィン（８４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、1.0ｅｑ.）及びDEAD（２．２Ｍ  ４０％トルエン溶液、１４５μｌ、０．３２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ.）を添加し、２４時間撹拌した。【０１５９】
次に、実施例１と同様のカラムクロマトグラフィーとＧＰＣで精製して、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護された３,６-Ｘ２Ｓ（２）（以下、「Ｎ‐Ｂｏｃ‐３，６−Ｘ２Ｓ（２）」と表記する）（３２．３ｍｇ、収率２０％）を得た。Ｎ‐Ｂｏｃ‐３，６−Ｘ２Ｓ（２）をＮＭＲで確認した結果を表１に示す。【０１６０】
Ｎ‐Ｂｏｃ基は実施例１に記載の方法と同じ方法で除去した。これにより、３，６−Ｘ２Ｓ（２）の白色固体を得た。これを純水に溶解して１ｍＭの３，６−Ｘ２Ｓ（２）溶液として保存して、以下の実施例に用いた。なお、得られた３，６−Ｘ２Ｓ（２）をＭＳ分析した結果を表１に示した。【０１６１】
〔実施例１２：Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）の合成〕
一般式（１５）においてｎ＝１である化合物、すなわち、２，７−ビス（２−メチル−２−アミノエトキシ）キサンタン−９−オン（以下、「Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）」と表記する）を合成した。まず、実施例１と同様の方法によって２，７−ジヒドロキシキサントンを合成した。次に、２，７−ジヒドロキシキサントン（３．５１ｍｍｏｌ、８００ｍｇ）をｄｒｙ  ＴＨＦ（tetrahydrofuran）５０ｍｌに溶解した後、トリフェニルホスフィン（２０００ｍｇ、７．６３ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ.）及びジエチルアゾジカルボン酸（４０％トルエン溶液、３３００ｍｇ、３５００μｌ、７．６６ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ.）を添加した。これにより得た溶液を室温で１５分間攪拌した後、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護した２-アミノ-１-プロパノール（１３４０ｍｇ、７．６５ｍｍｏｌ）を添加して、室温で２４時間攪拌した。【０１６２】
次に、実施例１と同様のカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ−Ｂｏｃ基で保護されたＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）（以下、「Ｎ‐Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）」と表記する）（３９９ｍｇ、収率２１％）を得た。このＮ−Ｂｏｃ‐Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）をＮＭＲで確認した結果を表１に示す。【０１６３】
Ｎ‐Ｂｏｃ基は実施例１に記載の方法と同じ方法で除去した。これにより、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）の白色固体を得た。これを純水に溶解して１ｍＭのＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）溶液として保存して、以下の実施例に用いた。なお、得られたＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）をＭＳ分析した結果を表１に示した。【０１６４】
〔実施例１３：キサンタン蛍光分子の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルの確認〕
カコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム  １０ｍＭ  ｐＨ７．０、ＮａＣｌ１００ｍＭ）に、Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）、３，６−Ｘ２Ｓ（２）またはＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）をそれぞれ１０μＭとなるように混合し、各化合物の溶液を得た。【０１６５】
上記溶液に光を照射して、蛍光強度を測定した。この蛍光強度の測定は、島津社製(品番ＲＦ-５３００ＰＣ)の装置を用いた。スリット幅の増減は励起時が±１．５ｎｍ、蛍光測定時が±１．５ｎｍである。図１９は、Ｘ２Ｓに励起波長３７０ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。なお、図１９〜２４において、横軸は蛍光波長、縦軸は蛍光強度を示す。図１９に示すように、Ｘ２Ｓの蛍光ピークは４５０ｎｍであった。【０１６６】
図２０は、Ｘ２Ｓ（３）に励起波長３７２ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。図２０に示すように、Ｘ２Ｓ（３）の蛍光ピークは４５６ｎｍであった。【０１６７】
図２１は、Ｘ２Ｓ（４）に励起波長３７５ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。図２１に示すように、Ｘ２Ｓ（４）の蛍光ピークは４６０ｎｍであった。【０１６８】
図２２は、Ｘ２Ｓ（５）に励起波長３７６ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。図２２に示すように、Ｘ２Ｓ（５）の蛍光ピークは４６２ｎｍであった。【０１６９】
図２３は、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）に励起波長３７０ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。図２３に示すように、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）の蛍光ピークは４５０ｎｍであった。【０１７０】
図２４は、３，６−Ｘ２Ｓ（２）に励起波長３２２ｎｍの光を照射したときの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。図２３に示すように、３，６−Ｘ２Ｓ（２）の蛍光ピークは３７３ｎｍであった。【０１７１】
〔実施例１４：二本鎖ＲＮＡを用いた蛍光滴定実験〕
本実施例では、Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）または３，６−Ｘ２Ｓ（２）の各化合物と二本鎖ＲＮＡとを結合させ、蛍光強度の変化を観察した。【０１７２】
まず、Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）または３，６−Ｘ２Ｓ（２）を１．０μＭとなるように、カコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム １０ｍＭ ｐＨ ７．０、ＮａＣl １００ｍＭ）に混合して各化合物の溶液を得た。【０１７３】
二本鎖ＲＮＡとしては、図２においてＮの位置に塩基が存在しないときのＲＮＡ、すなわち配列番号１に示す塩基配列からなるＲＮＡと配列番号３に示す塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズしてなるＲＮＡを用いた。当該ＲＮＡを、上記各化合物の溶液に、０．０、０．２、０．４、０．８、１．０μＭとなるように段階的に添加した。【０１７４】
上記ＲＮＡを添加した溶液に光を照射して、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定装置は実施例１３と同じである。スリット幅の増減は励起時が±３．０ｎｍ、蛍光測定時が±３．０ｎｍである。結果を図２５〜３２に示す。【０１７５】
図２５は、Ｘ２Ｓに励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓの蛍光強度との関係を示す図である。【０１７６】
図２６は、Ｘ２Ｓ（３）に励起波長３７２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（３）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１７７】
図２７は、Ｘ２Ｓ（４）に励起波長３７５ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（４）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１７８】
図２８は、Ｘ２Ｓ（５）に励起波長３７６ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（５）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１７９】
図２９は、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）に励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合のＲＮＡの濃度とＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１８０】
図３０は３，６−Ｘ２Ｓ（２）に励起波長３２２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＮＡの濃度と３，６−Ｘ２Ｓ（２）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１８１】
なお、図２５〜３０において、横軸は蛍光波長、縦軸は蛍光強度を示す。図２５〜３０中の矢印は、各曲線を得たときのＲＮＡの濃度がこの矢印の方向の順に多いことを示している。つまり、最も上の曲線はＲＮＡの濃度が０．０μＭのときの結果を示し、最も下の曲線はＲＮＡの濃度が１．０μＭのときの結果を示している。【０１８２】
図３１は、二本鎖ＲＮＡの添加濃度と各化合物の蛍光強度との関係を示すグラフであり、図２５〜３０に示した結果の蛍光ピークにおける蛍光強度をプロットした図である。図３２は、図２５〜３０に示した結果について、各濃度の二本鎖ＲＮＡを添加した場合に観察された残存蛍光強度（％）をプロットした図である。【０１８３】
なお、本明細書において「残存蛍光強度（％）」とは、添加ＲＮＡの濃度が０．０μＭであるときの蛍光ピークの蛍光強度（Ａ）を基準とし、各濃度の二本鎖ＲＮＡを添加した場合に観察された蛍光強度（Ｂ）の（Ａ）に対する割合を百分率で表したものである。【０１８４】
図３１，３２において、横軸はＲＮＡの濃度を示し、図３１の縦軸は蛍光強度を示し、図３２の縦軸は残存蛍光強度（％）を示す。【０１８５】
図２５〜３２に示すように、ＲＮＡの濃度が増加するのに伴って蛍光強度は低下した。よって、本実施例で用いた各化合物はＲＮＡに結合すると蛍光強度が低下することが確認できた。低下の程度は化合物によって異なっており、図３２に示すように、Ｘ２Ｓ（３）およびＸ２Ｓ（４）で特に低下率が高かった。【０１８６】
〔実施例１５：ＲＲＥを用いた蛍光滴定実験〕
本実施例では、Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）または３，６−Ｘ２Ｓ（２）の各化合物とＲＲＥとを結合させ、蛍光強度の変化を観察した。【０１８７】
まず、Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）または３，６−Ｘ２Ｓ（２）を１．０μＭとなるようにカコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム １０ｍＭ ｐＨ ７．０、ＮａＣl １００ｍＭ）に混合して各化合物の溶液を得た。ＲＲＥは、実施例４で用いたものと同じである。ＲＲＥは、上記各化合物の溶液に、０．０、０．２、０．４、０．８または１．０μＭとなるように段階的に添加した。【０１８８】
ＲＲＥを添加した溶液に光を照射して、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定装置は実施例１３と、スリット幅の増減は実施例１４と同じである。結果を図３３〜４２に示す。【０１８９】
図３３は、Ｘ２Ｓに励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓの蛍光強度との関係を示す図である。【０１９０】
図３４は、Ｘ２Ｓ（３）に励起波長３７２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（３）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１９１】
図３５は、Ｘ２Ｓ（４）に励起波長３７５ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（４）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１９２】
図３６は、Ｘ２Ｓ（５）に励起波長３７６ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（５）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１９３】
図３７は、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）に励起波長３７０ｎｍの光を照射した場合のＲＲＥの濃度とＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１９４】
図３８は、３，６−Ｘ２Ｓ（２）に励起波長３２２ｎｍの光を照射した場合の、ＲＲＥの濃度と３，６−Ｘ２Ｓ（２）の蛍光強度との関係を示す図である。【０１９５】
なお、図３３〜３８において、横軸は蛍光波長、縦軸は蛍光強度を示す。図３３〜３８中の矢印は、各曲線を得たときのＲＲＥの濃度がこの矢印の方向の順に多いことを示している。つまり、最も上の曲線はＲＲＥの濃度が０．０μＭのときの結果を示し、最も下の曲線はＲＲＥの濃度が１．０μＭのときの結果を示している。【０１９６】
図３９は、ＲＲＥの添加濃度と各化合物の蛍光強度との関係を示すグラフであり、図３３〜３８に示した結果の蛍光ピークにおける蛍光強度をプロットした図である。図４０は、図３３〜３８に示した結果について、ＲＲＥの濃度が０．０μＭであるときの蛍光ピークの蛍光強度を１００％とした場合の、残存蛍光強度（％）をプロットした図である。横軸はＲＮＡの濃度を示し、図３９の縦軸は蛍光強度を示し、図４０の縦軸は残存蛍光強度（％）を示す。【０１９７】
図４１，４２は、ＲＲＥを用いたときと、実施例１４で用いた二本鎖ＲＮＡを用いたときとの蛍光強度の差異を評価した結果を示すものである。図４１は、二本鎖ＲＮＡを用いたときの残存蛍光強度（％）を、ＲＲＥを用いたときの残存蛍光強度（％）で割った値をプロットした図である。つまり、図３２に示される残存蛍光強度（％）を、図４０に示される残存蛍光強度（％）で割った値をプロットした図である。図４２は、二本鎖ＲＮＡを用いたときの残存蛍光強度（％）からＲＲＥを用いたときの残存蛍光強度（％）を減じた値をプロットした図である。つまり、図３２に示される残存蛍光強度（％）から図４０に示される残存蛍光強度（％）を減じた値をプロットした図である。【０１９８】
図３３〜４０に示すように、ＲＲＥを用いた場合も、ＲＲＥの濃度が増加するのに伴って蛍光強度は低下した。よって、本実施例で用いた各化合物はＲＲＥに結合すると蛍光強度が低下することが確認できた。低下の程度は化合物によって異なっており、図４０に示すように、Ｘ２Ｓ、Ｘ２Ｓ（３）およびＸ２Ｓ（４）で特に低下率が高くなる傾向が見られた。また、図４１，４２に示すように、蛍光強度の低下は、二本鎖ＲＮＡを用いたときの方が小さく、Ｘ２Ｓ、Ｘ２Ｓ（３）およびＸ２Ｓ（４）を用いた場合に、ＲＲＥと二本鎖ＲＮＡの消光効率に最も大きな差が見られた。消光効率の差は、ＲＲＥまたは二本鎖ＲＮＡを約０．４μＭ加えたところで飽和した。【０１９９】
〔実施例１６：ＲＲＥとの複合体形成後のＲｅｖペプチドによるディスプレイスメントアッセイ〕
本実施例では、Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）または３，６−Ｘ２Ｓ（２）の各化合物を用いて、被験物質とＲＲＥとの結合親和性を測定した。被験物質としては、実施例５で用いたＲｅｖタンパク質を用いた。【０２００】
まず、実施例３と同様にしてカコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム １０ｍＭ  ｐＨ ７．０、ＮａＣl １００ｍＭ）に、上記各化合物を２μＭ、ＲＲＥを２μＭとなるように溶解して、Ｘ２Ｓ‐ＲＲＥ溶液、Ｘ２Ｓ（３）‐ＲＲＥ溶液、Ｘ２Ｓ（４）‐ＲＲＥ溶液、Ｘ２Ｓ（５）‐ＲＲＥ溶液、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）‐ＲＲＥ溶液、３，６−Ｘ２Ｓ（２）‐ＲＲＥ溶液を調製した。【０２０１】
これらの各溶液に、Ｒｅｖタンパク質を、濃度が０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、２．８、３．２、３．６、及び４．０μＭとなるように段階的に添加した。また、各濃度で蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定については、実施例１４に記載の方法と同様にして行なった。【０２０２】
結果を図４３〜５０に示した。図４３〜４８は、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。図４３はＸ２Ｓ，図４４はＸ２Ｓ（３）、図４５はＸ２Ｓ（４）、図４６はＸ２Ｓ（５）、図４７はＸ２Ｓ（２−Ｍｅ）図４８は３，６−Ｘ２Ｓ（２）を用いた場合の結果である。図４３〜４８において横軸は蛍光波長を示し縦軸は蛍光強度を示す。また、最も上の曲線は、ＲＲＥ非存在下での蛍光強度を示しており、最も下の曲線は、ＲＲＥ及び各化合物が存在し、被験物質が存在しない状態で検出した蛍光強度を示している。また、最も下の曲線から矢印の方向の順に、添加した被験物質の量が多い場合の結果を示している。【０２０３】
図４９は、Ｘ２Ｓ，Ｘ２Ｓ（３）、Ｘ２Ｓ（４）、Ｘ２Ｓ（５）、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）、３，６−Ｘ２Ｓ（２）について、Ｒｅｖの添加量と蛍光強度との関係を示す図であり、図４３〜４８に示した結果のうち、蛍光ピークを示す蛍光波長における蛍光強度をプロットした図である。図５０は、Ｒｅｖの添加量と、蛍光強度の回復率との関係を示すグラフである。図４９の縦軸は蛍光強度、図５０の縦軸は蛍光強度の回復率、図４９，５０の横軸はＲｅｖの添加量を表している。つまり、図４９、図５０は、Ｒｅｖを添加することによってＲＲＥから遊離した上記各化合物の量を反映している。【０２０４】
蛍光強度の回復率は、図４３〜４８において、Ｒｅｖの濃度を０〜４．０μＭとしたときの各蛍光強度の極大値を、図４３〜４８における最も上の曲線の蛍光強度の極大値で除することによって求めた。【０２０５】
図４３〜５０に示すように、Ｒｅｖタンパク質を添加すると、蛍光強度が増加することが確認できた。これは、Ｒｅｖタンパク質が増加したことにより、ＲＲＥに結合していた上記各化合物の代わりに、Ｒｅｖタンパク質がＲＲＥに結合して上記各化合物が遊離したことを示している。このことから、Ｒｅｖタンパク質はＲＲＥに対する結合親和性が極めて高いことが示され、上記各化合物によってＲｅｖタンパク質のＲＲＥに対する結合親和性を測定できることが示された。【０２０６】
Ｘ２Ｓは蛍光強度が高く、蛍光強度の回復率も良好であった。また、Ｘ２Ｓ（２−Ｍｅ）は、蛍光強度はＸ２Ｓより低かったが、蛍光強度の回復率は最も高かった。３，６−Ｘ２Ｓ（２）は、蛍光強度は低かったが、蛍光強度の回復率はＸ２Ｓと同程度であり良好であった。【０２０７】
〔実施例１７：ピレン蛍光分子の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルの確認〕
カコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム  １０ｍＭ  ｐＨ７．０、ＮａＣｌ１００ｍＭ）に、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideを１０μＭとなるように混合し溶液を得た。当該溶液に励起波長３４０ｎｍの光を照射し、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定装置、スリット幅は実施例１３と同じである。【０２０８】
図５１は、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideの励起スペクトルと蛍光スペクトルの関係を示す図である。横軸は蛍光波長、縦軸は蛍光強度を示す。図５１に示すように、蛍光ピークは３７５ｎｍであった。【０２０９】
〔実施例１８：二本鎖ＲＮＡおよびＲＲＥを用いた蛍光滴定実験〕
本実施例では、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideと二本鎖ＲＮＡまたはＲＲＥとを結合させ、蛍光強度の変化を観察した。【０２１０】
二本鎖ＲＮＡとしては、実施例１４と同様に、配列番号１に示す塩基配列からなるＲＮＡと配列番号３に示す塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズしてなるＲＮＡを用いた。また、ＲＲＥは実施例４で用いたのと同じものを用いた。【０２１１】
上記二本鎖ＲＮＡまたはＲＲＥを、実施例１７で調製した溶液に０．０、０．２、０．４、０．８、１．０μＭとなるように段階的に添加した。【０２１２】
上記ＲＮＡを添加した溶液に励起波長３４０ｎｍの光を照射して、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定装置およびスリット幅の増減は実施例１３と同じである。結果を図５２〜５４に示す。図５２、５３の横軸は蛍光波長、縦軸は蛍光強度を示す。【０２１３】
図５２は、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideと二本鎖ＲＮＡとの結合を確認した結果を示す図である。図５３は、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideとＲＲＥとの結合を確認した結果を示す図である。図５２，５３において、最も上の曲線はＲＮＡの濃度が０μＭのときの結果を示し、下の曲線ほどＲＮＡの濃度が大きく、最も下の曲線はＲＮＡの濃度が１．０μＭのときの結果を示している。図５４は、ＲＮＡの濃度を変化させたときの蛍光波長３７５ｎｍにおける1-Pyrenemethanamideの残存蛍光強度（％）をプロットした図であり、横軸はＲＮＡの濃度、縦軸は残存蛍光強度（％）を示す。【０２１４】
図５２〜５４に示すように、ＲＮＡの濃度が増加するに伴って蛍光強度は低下し、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideはＲＮＡに結合すると蛍光強度が低下することが確認できた。蛍光強度の低下はＲＲＥを用いた場合の方がより顕著であった。【０２１５】
〔実施例１９：ＲＲＥとの複合体形成後のＲｅｖペプチドによるディスプレイスメントアッセイ〕
本実施例では、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideを用いて、被験物質とＲＲＥとの結合親和性を測定した。被験物質としては、実施例５で用いたＲｅｖタンパク質を用いた。【０２１６】
まず、実施例３と同様にしてカコジル酸緩衝液（カコジル酸ナトリウム １０ｍＭ  ｐＨ ７．０、ＮａＣl １００ｍＭ）に、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideを２μＭ、ＲＲＥを２μＭとなるように溶解して、1-Pyrenemethanamide, hydrochloride−ＲＲＥ溶液を調製した。【０２１７】
上記溶液に、Ｒｅｖタンパク質を、濃度が０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、２．８、３．２、３．６、及び４．０μＭとなるように段階的に添加した。また、各濃度の上記溶液に励起波長３４０ｎｍの光を照射して、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定装置およびスリット幅の増減は実施例１３と同じである。【０２１８】
結果を図５５、５６に示した。図５５は、Ｒｅｖタンパク質とＲＲＥとの結合親和性を測定した結果を示す図である。横軸は蛍光波長を示し縦軸は蛍光強度を示す。最も上の曲線は、ＲＲＥ非存在下での蛍光強度を示しており、最も下の曲線は、ＲＲＥ及び各化合物が存在し、被験物質が存在しない状態で検出した蛍光強度を示している。また、最も下の曲線から順に上の曲線になるほど、添加した被験物質の量が多い場合の結果を示している。【０２１９】
図５６は、Ｒｅｖの添加量と、蛍光強度の回復率との関係を示すグラフである。縦軸は蛍光強度の回復率、横軸はＲｅｖの添加量を表している。蛍光強度の回復率は、図５５における蛍光波長３４０ｎｍのときの蛍光強度を、図５５における最も上の曲線の蛍光波長３４０ｎｍのときの蛍光強度で除した値を１００倍することによって求めた。【０２２０】
図５５，５６に示すように、Ｒｅｖタンパク質を添加すると、蛍光強度が増加することが確認できた。これは、Ｒｅｖタンパク質が増加したことにより、ＲＲＥに結合していた1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideの代わりに、Ｒｅｖタンパク質がＲＲＥに結合して上記各化合物が遊離したことを示している。また、蛍光強度の回復率はＸ２Ｓと同程度であった。このことから、1-Pyrenemethanamide, hydrochlorideによってＲｅｖタンパク質のＲＲＥに対する結合親和性を測定できることが示された。【０２２１】
本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物は、以上のように、ＲＮＡに結合可能であって、かつ、ＲＮＡから遊離しているときの蛍光強度が、ＲＮＡに結合しているときの蛍光強度よりも強い有機蛍光体を含むので、被験物質として様々な物質を利用することができ、当該被験物質と核酸との結合親和性を高精度かつ簡便に測定することができるという効果を奏する。【０２２２】
また、本発明に係る核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物は、以上のように、下記一般式（１）【０２２３】
【化３８】
2008153223.tif 000041
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）で示される化合物を含むので、被験物質として様々な物質を利用することができ、当該被験物質と核酸との結合親和性を高精度かつ簡便に測定することができるという効果を奏する。【０２２４】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２２５】
本発明に係る組成物によれば、核酸を標的とした薬剤（医薬品、農薬等）を、高精度かつ簡便にスクリーニングできるので、医薬産業等において利用可能である。
【図１】
2008153223.tif 000055
【図２】
2008153223.tif 000056
【図３】
2008153223.tif 000057
【図４】
2008153223.tif 000058
【図５】
2008153223.tif 000059
【図６】
2008153223.tif 000060
【図７】
2008153223.tif 000061
【図８】
2008153223.tif 000062
【図９】
2008153223.tif 000063
【図１０】
2008153223.tif 000064
【図１１】
2008153223.tif 000065
【図１２】
2008153223.tif 000066
【図１３】
2008153223.tif 000067
【図１４】
2008153223.tif 000068
【図１５】
2008153223.tif 000069
【図１６】
2008153223.tif 000070
【図１７】
2008153223.tif 000071
【図１８】
2008153223.tif 000072
【図１９】
2008153223.tif 000073
【図２０】
2008153223.tif 000074
【図２１】
2008153223.tif 000075
【図２２】
2008153223.tif 000076
【図２３】
2008153223.tif 000077
【図２４】
2008153223.tif 000078
【図２５】
2008153223.tif 000079
【図２６】
2008153223.tif 000080
【図２７】
2008153223.tif 000081
【図２８】
2008153223.tif 000082
【図２９】
2008153223.tif 000083
【図３０】
2008153223.tif 000084
【図３１】
2008153223.tif 000085
【図３２】
2008153223.tif 000086
【図３３】
2008153223.tif 000087
【図３４】
2008153223.tif 000088
【図３５】
2008153223.tif 000089
【図３６】
2008153223.tif 000090
【図３７】
2008153223.tif 000091
【図３８】
2008153223.tif 000092
【図３９】
2008153223.tif 000093
【図４０】
2008153223.tif 000094
【図４１】
2008153223.tif 000095
【図４２】
2008153223.tif 000096
【図４３】
2008153223.tif 000097
【図４４】
2008153223.tif 000098
【図４５】
2008153223.tif 000099
【図４６】
2008153223.tif 000100
【図４７】
2008153223.tif 000101
【図４８】
2008153223.tif 000102
【図４９】
2008153223.tif 000103
【図５０】
2008153223.tif 000104
【図５１】
2008153223.tif 000105
【図５２】
2008153223.tif 000106
【図５３】
2008153223.tif 000107
【図５４】
2008153223.tif 000108
【図５５】
2008153223.tif 000109
【図５６】
2008153223.tif 000110
【配列表】
2008153223000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月18日(2010.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2008153223.tif 000111
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物を含むことを特徴とする核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項２】
上記化合物が、下記一般式（２）
【化２】
2008153223.tif 000112
（Ｒ５は、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数２〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項３】
上記化合物が、下記構造式（３）
【化３】
2008153223.tif 000113
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項４】
上記化合物が、下記一般式（１２）
【化４】
2008153223.tif 000114
（ｎは３、４、または５を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項５】
上記化合物が、下記構造式（１３）
【化５】
2008153223.tif 000115
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項６】
上記化合物が、下記一般式（１４）
【化６】
2008153223.tif 000116
（ｎは１または２を表し、Ｒ１０、Ｒ１１はそれぞれ独立してアルキル基またはカルボキシル基を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物。
【請求項７】
下記一般式（１）
【化７】
2008153223.tif 000117
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物を備えていることを特徴とする、核酸と被験物質との結合親和性を測定するためのキット。
【請求項８】
核酸と被験物質との結合親和性を測定する方法であって、
核酸と、下記一般式（１）
【化８】
2008153223.tif 000118
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子又は炭素数１〜８の有機基であり、上記有機基は水素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びハロゲン原子よりなる群から選ばれる１つ以上の原子を含んでもよい）
で示される化合物とを混合して第一の溶液を得て、上記第一の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第一の測定工程と、
上記第一の溶液に被験物質をさらに混合して第二の溶液を得て、上記第二の溶液に光を照射することで発せられる蛍光を測定する第二の測定工程と、
上記第一の測定工程で測定した蛍光及び上記第二の測定工程で測定した蛍光を比較する比較工程と、を含むことを特徴とする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【化６】
2008153223.tif 000119
（ｎは１または２を表し、Ｒ１０、Ｒ１１はそれぞれ独立してアルキル基またはカルボキシル基を表す。）
で示される化合物であることがより好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【化２７】
2008153223.tif 000120
（ｎは１または２を表し、Ｒ１０、Ｒ１１はそれぞれ独立してアルキル基またはカルボキシル基を表す。）で示される化合物、
下記構造式（１５）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
【化２８】
2008153223.tif 000121
（ｎは１または２を表す。）で示される化合物、を例示することもできる。
【国際調査報告】
2008153223.tif 000122
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