【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＤＯＰＡクロムトートメラーゼ、ＤＨＩＣＡポリメラーゼ、またはその両方を阻害する有効量の局所性ライトニング剤、およびｂ）賦形剤を含む組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤がメラニン合成調整剤を含んでいる組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、メラニン合成調整剤がココナッツ水、ヤシ水、これらの濃縮物、およびこれらの任意の組合せから成る群から選択される組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物であって、メラニン合成調整剤がココナッツ水の濃縮物である組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の組成物であって、メラニン合成調整剤がココナッツミルク、ヤシナッツミルク、ペカンナッツミルク、アーモンドナッツミルク、カシューナッツミルク、クルミナッツミルク、これらの濃縮物、およびこれらの任意の組合せから成る群から選択される組成物。
【請求項６】
請求項２に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤がメラノサイトからケラチノサイトへのメラニンの移行を阻害するのに有効量のメラニン取込み阻害剤をさらに含む組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、メラニン取込み阻害剤がシソエキスである組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物であって、メラニン取込み阻害剤がシソ葉、シソ種子、シソ茎、およびシソ根から成る群から選択されたエキスである組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の組成物であって、メラニン合成調整剤がココナッツ水の濃縮物であり、メラニン取込み阻害剤がシソ葉エキスである組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤が組成物の総重量に対しておよそ０．００１ｗｔ％からおよそ２０ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤が組成物の総重量に対しておよそ０．０１ｗｔ％からおよそ５ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤が組成物の総重量に対しておよそ０．１ｗｔ％からおよそ２．５ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、組成物がクリーム、ローション、軟膏、ゲル、フォーム、ポマード、エーロゾルスプレー、ポンプスプレー、スティック、ぬれナプキン、およびパッチから成る群から選択された製品形態中にある組成物。
【請求項１４】
肌、頭皮、髪、唇、及び／又は爪に請求項１に記載の組成物を局所的に適用することを含む、肌、髪、唇、及び／又は爪をライトニングする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記組成物を局所的に適用してそばかす、加齢斑、暗色斑、色素沈着過剰、炎症後色素沈着過剰、変色、黒皮症、黄色症、目下の暗色環、およびこれらの任意の組合せから成る群から選択された肌の状態を治療する方法。
【請求項１６】
ａ）シソ葉エキス、およびｂ）賦形剤を含む局所性組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、シソ葉エキスが肌のケラチノサイトによるメラニンの取込みを阻害するのに有効な量で存在する組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の組成物であって、シソ葉エキスが組成物の総重量に対しておよそ０．００１ｗｔ％からおよそ２０ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項１９】
請求項１６に記載の組成物であって、シソ葉エキスが組成物の総重量に対しておよそ０．０１ｗｔ％からおよそ５ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項２０】
請求項１６に記載の組成物であって、シソ葉エキスが組成物の総重量に対しておよそ０．１ｗｔ％からおよそ２．５ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項２１】
請求項１６に記載の組成物であって、組成物がクリーム、ローション、軟膏、ゲル、フォーム、ポマード、エーロゾルスプレー、ポンプスプレー、スティック、ぬれナプキン、およびパッチから成る群から選択された製品形態中にある組成物。
【請求項２２】
肌、頭皮、髪及び／又は爪に請求項１７に記載の組成物を局所的に適用することを含む、肌、髪、唇、及び／又は爪をライトニングする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記組成物を局所的に適用してそばかす、加齢斑、暗色斑、色素沈着過剰、炎症後色素沈着、変色、黄色症、黒皮症、目下の暗色環、およびこれらの任意の組合せから成る群から選択された肌の状態を治療する方法。
【請求項２４】
ａ）ココナッツ水、ヤシ水、ヤシナッツミルク、ペカンナッツミルク、アーモンドナッツミルク、カシューナッツミルク、クルミナッツミルク、これらの濃縮物、およびこれらの任意の組合せから成る群から選択された局所性ライトニング剤、ならびにｂ）賦形剤を含む組成物であって、局所性ライトニング剤がＤＯＰＡクロムトートメラーゼ、ＤＨＩＣＡポリメラーゼ、またはその両方を阻害するのに有効な量で存在する組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤がココナッツ水またはその濃縮物である組成物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤が組成物の総重量に対しておよそ０．００１ｗｔ％からおよそ２０ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項２７】
請求項２４に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤が組成物の総重量に対しておよそ０．０１ｗｔ％からおよそ５ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項２８】
請求項２４に記載の組成物であって、局所性ライトニング剤が組成物の総重量に対しておよそ０．１ｗｔ％からおよそ２．５ｗｔ％までの量で存在する組成物。
【請求項２９】
肌、頭皮、唇、髪、及び／又は爪に請求項２４に記載の組成物を局所的に適用することを含む、肌、髪、唇、及び／又は爪をライトニングする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記組成物を局所的に適用してそばかす、加齢斑、暗色斑、色素沈着過剰、炎症後色素沈着、変色、黄色症、黒皮症、目下の暗色環、およびこれらの任意の組合せから成る群から選択された肌の状態を治療する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
実施例１  ＤＯＰＡクロムトートメラーゼアッセイ(ココナッツ水)
ＤＯＰＡクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）活性を特定方法でアッセイした。こ
の特定方法は、文献「Chakraborty et al.,1998,ヒトメラノサイト中のメラニン
形成タンパク質上のアルブチン効果(Effect of arbutin on melanogenic 
proteins in human melanocytes) Pigment Cell Res.11:206-212」で開示されて
いる。具体的に言うと、氷のように冷たいＤＯＰＡ(０.５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８)をＡｇ２Ｏと混合した(３０ｍｇ  Ａｇ２Ｏ：１ｍｇ  ＤＯＰＡ)。およそ１分間混合した後、ミリポア社の０．２２μｍフィルター(0.22μm Millipore filter)を通してろ過した。新たに調製したＤＯＰＡクロム(〜０．５ｍｇ／ｍｌ)の０．５ｍｌの溶液に０．１ｍｌまで細胞エキスを加えることによって、ＤＣＴを分光光学的にアッセイした。室温、プラスチックキュベット中で反応させ、４７５ｎｍ光の吸収による消失が起こった。細胞エキス中のチロシナーゼの存在がアッセイを阻害するおそれがあるので、フェニルチオ尿素(１ｍＭ)を反応混合液に添加した。タンパク質エキスのｍｇ当りでＤＯＰＡクロムの転換％を計算し、コントロールに対して基準化した。０．０２％ｗｔ.／ｖｏｌ.ココナッツ水(凍結乾燥)によって、コントロールと比較してＤＯＰＡクロムの転換が平均５０％(４２／５８)減少することを実証した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
具体的には、細胞エキス(０．５ｍｌ,１５０μｇから２００μｇまでのタンパク質)を溶解緩衝液(lysis buffer)で平衡化した小麦麦芽アグルチニンカラム(１ｍｌ総容積)に通した。カラムに取り込まれた物質を０．５ｍｌの１Ｍ  Ｎ−アセチルグルコサミンで溶出した。この物質は未精製ＤＨＩＣＡ重合因子と他のメラニン形成タンパク質を含む。０．５ｍｌの反応混合液は、測定される酵素剤(小麦麦芽アグルチニン抽出液から得たタンパク質２０μｇ)または適切な緩衝液ブランク、ＤＨＩＣＡ(０．５ｍＭ)、および１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を含んでいる。また、その製剤中の内因性チロシナーゼ活性を阻害するためにフェニルチオ尿素が含まれる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
例３  メラノソーム取込みアッセイ(シソ葉エキス)
メラノソームの分離
Ｂ１６メラノサイトのコンフルエント培養液は適度にメラノソームを産生する。一方、この細胞系統中の上昇したメラノソーム産生を導入するために、Ｂ１６細胞の半コンフルエント(６０％)培養液をおよそ３６時間の間、１０ｍＭアンモニウムクロライド(最終濃度)を添加した通常成長培養液で処理した。その後、培養液を吸引し、過剰なメラニン細胞を蒸留水で洗浄し(２×２ｍｌ)、低張性ストレスを細胞に与える。一定分量(２ｍｌ)の低張性溶解液(０．０２％水ＮＰ−４０)を各プレートに添加し、各プレートをおおよそ５分間室温でインキュベートした。光学顕微鏡を使用した細胞溶液の以下の検証において、３つの(３)培養プレートからの細胞物質を１５ｍｌコニカルチューブ中にプールし、およそ(２００×ｇ)で５分間細胞細片を取り除くために遠心分離した。生じた上澄みはメラノソームを含んでいるので、新しい１５ｍｌコニカルチューブに移し、（８５０×ｇ）で２０分間遠心分離した。生じたペレットには分離されたメラノソームが含まれており、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で再懸濁し、使用時まで４℃で保管した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
メラノソームによるケラチノサイトの処理
正常ヒト表皮ケラチノサイト(ＮＨＥＫｓ)(Clonetics, Inc.から入手)を２４穴ウェル中で１ウェルあたり２００，０００個数の細胞密度で播種した。およそ２４時間後、成長培養液を１ｍｌの適切な成長培養液(すなわち、ＤＭＥＭ／ＫＧＭ−２)と交換した。この成長培養液は更なる処理状態をほどこした又はほどこしていない状態でメラノソーム剤を含む。細胞を異なる濃度のシソ葉エキス(パウダー状または水状)で処理した。その後細胞をインキュベーターに戻しておよそ１．５時間の間インキュベートした。これらの研究のために、各ウェルのケラチノサイトを単一プレートにあるＢ１６細胞から分離したメラノソーム量で処理した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
メラノソーム取込みの分析
分析のために、各ウェルにおけるケラチノサイトの細胞をＰＢＳで洗浄し(３×１ｍｌ)、トリプシン／ＥＤＴＡを使用してＰＢＳで洗浄したプレートから取り除いた。ケラチノサイトによるメラノソームの取込みを分析するために、内部移行したメラニンをBessou‐Touya, S.等の改良方法(色素沈着および光防護中のメラノサイトおよびケラチノサイトの役割を研究するためのキメラヒト上皮再構成  J.Invest.Dermatol.,111:1103-1108,1998)によって細胞から抽出し、４０５ｎｍでメラニン特定吸光度を決定することによって分光光学的に定量化した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
メラノソームはケラチノサイトによって取り入れられ、摂取率、ケラチノサイト中へのメラノソームの貯留(retention)および進行(processing)が肌の色の決定の鍵となる。従って内部移行したメラニン量はケラチノサイトによるメラニン／メラノソーム取込み量および貯留量を示す。従って、より少ない内部移行メラニン量、特にメラニンを伴うコントロールよりも少ない内部移行メラニン量は、ケラチノサイトによるメラニンの取込みが阻害されていることを示す。図１に示したように、シソ葉エキスによる内部移行メラニン量は、メラニンを伴うコントロールの内部移行メラニン量より低かった。