【手続補正書】
【提出日】平成17年2月1日(2005.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  アデノウイルス死滅蛋白質を過剰発現し、且つ新形成細胞において複製可能である組換えアデノウィルスであって、前記アデノウィルス死滅蛋白質が配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１もしくは配列番号：１２に示される配列から選択される配列を有する組換えアデノウィルス、またはその共保存的に置換された変異体。
【請求項２】  ｇｐ１９Ｋ；ＲＩＤα；ＲＩＤβおよび１４．７Ｋよりなる群から選択される少なくとも１つのＥ３蛋白質の発現を欠損することを特徴とする、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】  配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：１３のいずれか１つから選択される、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】  さらにＥ４プロモーターに代えて置き換えられる組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、または誘導性プロモーターをさらに含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】  組織特異的プロモーターがサーファクタント蛋白質Ｂプロモーターである、請求項４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】  配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：１６に示される配列を含む、請求項５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】  該ベクターが、さらに、抗癌産物をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】  抗癌産物をコードする該遺伝子が当該ベクターのＥ３領域にある請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】  患者における腫瘍の治療方法に用いられる、請求項１〜８の何れかに記載の組換えアデノウィルス。
【請求項１０】  該組換えアデノウィルスが、患者における腫瘍に治療方法に抗癌産物を発現する１つ以上の複製欠損アデノウィルスと一緒に用いられ、複製欠損型アデノウィルスの複製を補う、請求項１〜９の何れかに記載の組換えアデノウィルス。
【請求項１１】  患者において腫瘍を治療する医薬の製造のための請求項１〜９の何れかに記載の組換えアデノウィルスを使用する方法。
【請求項１２】  さらに、腫瘍を放射線照射で処理する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】  さらに、腫瘍を化学療法で処理する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】  請求項１〜９の何れかに記載の組換えアデノウィルス、および複製欠損型であり、抗癌遺伝子産物を発現する第２の組換えウィルスを含む組成物であって、組換えアデノウィルスが第２の組換えウィルスの複製を補うことを特徴とする組成物。
【請求項１５】  請求項１〜９の何れかに記載の組換えアデノウィルス、および新形成細胞において複製可能である第２の組換えウィルスを含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
また、本発明は、その複製が分裂細胞に制限されるＡＤＰ−発現ベクターを提供する。そのような複製−制限表現型を供することが知られているいずれの手段も用いることができる。例えば、ＷＯ９６／４０２３８は腫瘍細胞に選択的に侵入する微生物ならびに腫瘍において選択的に活性化される細菌プロモーターを同定し単離するための方法を記載する。また、複製に必須の１以上のベクター蛋白質の発現は、その発現が新形成細胞で上昇調節されることが知られている細胞遺伝子のためのプロモーターの制御下に置くことができると考えられる。そのような遺伝子の例は、限定されるものではないが、乳癌マーカーママグロビン（Ｗａｔｓｏｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：８１７−８２４，１９９８）；ＢＲＣＡ１（Ｎｏｒｒｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２７７７−２２７８２，１９９５）ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｓｃｏｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９８４８−１９８５８，１９９４）；前立腺特異的抗原（米国特許第５，６９８，４４３号）；肺胞についてのサーファクタント蛋白質（surfactant protein）Ｂ（Ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８５２−２４８５７，１９９５）；肺についての第ＶＩＩ因子（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１２３４７−１２３５１，１９９５）；および一般に癌についてのスルビビン（Ｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：５８０−５８４）を含む。ベクターがアデノウイルスである場合、そのような腫瘍−特異的プロモーターをＥ４プロモーターに代えて置き換えることができると考えられるＥ４遺伝子産物はＡｄ複製に必須であるので、それらの発現を腫瘍−特異的プロモーターの制御下に置くことは、プロモーターが活性化される腫瘍細胞へのベクターの複製を制限するはずである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
また本発明は、複製に必須の１以上の蛋白質の発現を、組織特異的プロモーターおよび／または腫瘍特異的プロモーターの制御下に置くことによって、その複製が特異的組織に制限されるＡＤＰを過剰発現するベクターを含む。多数の組織特異的および／または腫瘍特異的プロモーターが当該分野で記載されている。非限定的例は、内皮系の細胞において特異的に遺伝子発現を指令する、Ｂｒｅｉｔｍａｎらに対する米国特許第５，４６６，５９６号に記載されたＴＴＦＩ転写因子を含有する細胞（すなわち、ＩＩ型歯槽細胞（Ｙａｎら，前掲））においてのみ活性であるサーファクタント蛋白質Ｂプロモーター；前立腺細胞で発現される前立腺特異的抗原（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，前掲）；ヒト・テロメラーゼ蛋白質（ｈＴＥＲＴ）プロモーター（例えば、米国特許第６，０５４，５７５号参照）；乳癌細胞で発現されるヒトα−ラクトアルブミン遺伝子（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：８５４−８６４，１９９９）を含む。多くの他の組織−特異的、腫瘍特異的または組織−好ましいエンハンサー／プロモーターが報告されている（ＭｉｌｌｅｒおよびＷｈｅｌａｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８０３−８１５，１９９７）。実施例６および１０においてサーファクタント蛋白質Ｂプロモーターで例示されているごとく、組織−特異的プロモーターを発現するベクターは、ウイルス複製、ウイルス拡大、細胞溶解および腫瘍抑制において組織特異性を示すと予測される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
前記で示したごとく、ＫＤ１およびＫＤ３におけるｄｌ０１／０７突然変異がこれらのベクターの増殖を癌細胞に制限する。その複製表現型をさらに制限するために、各ウイルスにおけるＥ４プロモーターを欠失し、サーファクタント蛋白質Ｂ（ＳＰＢ）プロモーターによって置き換えて、ＫＤ１−ＳＰＢ（配列番号：１４）、ＫＤ３−ＳＰＢ（配列番号：１５）およびｄｌ０１／０７−ＳＰＢ（配列番号：１６）と命名されたベクターを得た。これらのＳＰＢプロモーターは、かくしてヒト肺のＩＩ型肺胞細胞で主として見い出されているＴＴＦ１転写因子を含有する細胞でのみ活性である（Ｌａｚｚａｒｏら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１０９３−１１０４，１９９１）。かくして、ＫＤ１−ＳＰＢ、ＫＤ３−ＳＰＢおよびｄｌ０１／０７−ＳＰＢは、ヒト肺の癌性ＩＩ型肺胞細胞にひどく制限されるべきである。多くの肺癌はこのタイプのものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
Ａ５４９−ＴＴＦ１細胞系を発生させて、ｄｌ０１／０７−ＳＰＢ、ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ３−ＳＰＢの複製がＴＴＦ１転写因子を発現する癌性細胞に制限されるであろうという予測をテストした。これらの細胞を２つのプラスミドで共トランスフェクトした（１つは、ＴＴＦ１がＣＭＶプロモーターから発現されるものであり、ネオマイシン耐性クローンに対する抵抗性につきコードするもう１つは単離され、サーファクタント蛋白質Ｃプロモーターを要求するＴＴＦ１からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するプラスミドでの一過性トランスフェクションによって判断してＴＴＦ１活性を発現することが示されている）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
実施例１０
本実施例は、実施例６に記載された組織特異的Ａｄベクターをさらに特徴づける。そこで議論したごとく、Ａｄ  Ｅ４プロモーターは欠失され、これらのベクターにおいてサーファクタント蛋白質Ｂ（ＳＰＢ）に代えて該プロモーターで置き換えられる（図２４）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はＡｄ５（図１Ａ）および本発明の好ましい具体例（図１Ｂ）であるＫＤ３における遺伝子発現の模式図であり、ここに、各ゲノムは斑点をつけた棒線によって表され、転写単位は棒線の上方および下方の矢印によって表され、Ｅ３蛋白質は、Ｅ３転写単位、および示された後期ｍＲＮＡのＬ１ないしＬ５ファミリーについての矢印の上方にリストされる。
【図２】  図２は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１およびＧＺ３によるＡＤＰの過剰発現を説明し、示されたウイルスで感染させ、抗ＡＤＰ抗体でプローブされたヒトＡ５４９細胞から単離された蛋白質の免疫ブロットを示し、ＡＤＰは、異なってグリコシル化され、蛋白質分解的に処理されたＡＤＰの形態を示す。
【図３】  図３は、図面中および以後ｄｌ０１／０７というＥ１Ａ  ｄｌ１１０１／１１０７突然変異体が後期蛋白質の発現を遅らせることを説明し、野生型Ｅ１Ａ領域を有し、および１２．５Ｋ蛋白質をコードする遺伝子を除いて全てのＥ３遺伝子の欠失を有する、ｄｌ３２７の不存在下（図３Ａおよび３Ｂ）または存在下（図３Ｃおよび３Ｄ）で示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞におけるＥ１Ａ蛋白質および後期蛋白質の免疫ブロットを示す（図３Ｃおよび３Ｄ）。Ｅ１Ａ蛋白質に特異的な抗血清を図３Ａおよび３Ｃで用いた。Ａｄ５ビリオンに対して生起した抗血清を図３Ｂおよび３Ｄで用いた。
【図４】  図４はＡＤＰを少量しかまたは全く発現しない対照ウイルスよりも効果的にＫＤ１およびＫＤ３が細胞を殺すことを説明し、トリパンブルー排除によって測定して、感染後示された日において生存した示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞のパーセントのグラフを示す。
【図５】  図５は、ＡＤＰの過剰発現がウイルスの細胞間広がりを増強することを説明する細胞広がりアッセイであり、生きた細胞を染色するが死滅した細胞を染色しないクリスタルバイオレットで感染後７日において処理した示されたＰＦＵ／細胞での示された細胞で感染させた単層を示す。
【図６】  図６は、増殖する細胞においてＫＤ１およびＫＤ３がよく複製するが、増殖阻止細胞においてはそうではないことを説明し、１００ＰＦＵ／ｍｌの以下のウイルス：ｄｌ３０９（図６Ａ）、ｄｌ０１／０７（図６Ｂ）、ＫＤ１（図６Ｃ）およびＫＤ３（図６Ｄ）での感染に続いて種々の回数、増殖するまたは増殖阻止ＨＥＬ−２２９細胞から抽出されたウイルス力価を示す。
【図７】  図７は初代ヒト気管支上皮細胞を殺すにおいてＫＤ１およびＫＤ３が効果的であることを説明し、１０ＰＦＵ／ｍｌの示されたウイルスで３０％密集において感染させ、ニュートラルレッドで感染後５日において染色したこれらの細胞単層を示す。
【図８】  図８は、ＫＤ１およびＫＤ３がヌードマウスにおいて増殖するヒトＡ５４９細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、図８Ｂにおいては、週間隔にて緩衝液または示されたウイルスの５×１０７ＰＦＵでの腫瘍の感染に続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増加のグラフを示し、図８Ｂにおいては、５×１０８ＰＦＵのＫＤ３またはＧＺ３で一回注射した腫瘍の同様のグラフを示す。
【図９】  図９は、ＫＤ１およびＫＤ３がヌードマウスで増殖するヒトＨｅｐ  ３Ｂ細胞腫瘍の増殖速度を低下させることを説明し、毎週２回の間隔での緩衝液または示されたウイルス（ｄｌ３０９、ＫＤ１またはＫＤ３）の５×１０７ＰＦＵでの腫瘍の注射に続く週の数に対してプロットした腫瘍サイズの平均倍増加のグラフを示す。
【図１０】  図１０は、感染性中心アッセイを用い、β−ガラクトシダーゼを発現するＡｄ−β−ｇａｌ、複製−欠陥ベクターの複製および広がりをＫＤ１およびＫＤ３が補充することを説明し、図１０Ａでは、Ａｄ−β−ｇａｌ単独または示されたウイルスで感染させたＡ５４９細胞を接種したＡ５４９細胞単層の図を示し、図１０Ｂおよび１０Ｃでは、図１０Ａの単層の２つのクローズアップ図を示す。
【図１１】  図１１は、腫瘍に示された組合せのウイルスが注入され、次いで、感染後２週間において抽出し、ルシフェラーゼ活性につきアッセイするアッセイを用い、ヌードマウスで増殖するヒトＨｅｐ  ３Ｂ細胞腫瘍においてＫＤ１およびＫＤ３がルシフェラーゼの発現を増加させることを示す棒グラフである。括弧に入れた数は、Ａｄｌｕｃベクター＋緩衝液のそれと比較したルシフェラーゼ活性の倍増加を示した。
【図１２】  図１２は、ＴＴＦ１転写因子を発現するように作成されたＡ５４９細胞（Ａ５４９／ＴＴＦ１）および親５４９細胞に対するＫＤ１およびＫＤ１−ＳＰＢについての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフであり、ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの数をそのウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、１００を掛けたものとしてプロットする。
【図１３】  図１３はＨ４４１およびＨｅｐ  ３Ｂ細胞についてのＫＤ１およびＫＤ１−ＳＰＢについての細胞広がりアッセイであり、ここに、細胞はＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢの示された量で感染させ、Ｈ４４１およびＨｅｐ  ３Ｂ細胞は、各々、感染後５日においておよび感染後８日においてクリスタルバイオレットで染色した。
【図１４】  図１４は、ｂｌ３０９および本発明の２つの好ましい実施例、ＧＺ１およびＧＺ３についての標準的プラーク発生アッセイの結果を示すグラフであり、ここに、データは、アッセイにおける特定の日に観察されたプラークの数をそのウイルスで観察されたプラークの最終数で割り、１００を掛けたものとしてプロットする。
【図１５】  図１５は、ＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３とＸ線照射の組合せが、ウイルスベクター単独または照射単独よりもＡ５４９細胞単層を破壊するにおいてより効果的であることを示す細胞広がりアッセイであり、ここに、細胞は示された量の示されたウイルスで感染させ、６００センチグレイ（ｃＧｙ）のｘ−照射で照射し（底部パネル）、またはモック照射し（頂部パネル）、次いで感染後６日においてクリスタルバイオレットで染色した。
【図１６】  図１６は、１５０、３００または６００センチグレイの照射と組み合わせて用いた１０−３ＰＦＵのＫＤ１、ＫＤ３、ＧＺ１またはＧＺ３が、ウイルスベクター単独または照射単独よりもＡ５４９細胞単層を破壊するにおいてより効果的であることを説明する細胞広がりアッセイのグラフである。細胞生存率は、モック感染非照射ウェルを１００％生存率として用い、培養ウェルから抽出したクリスタルバイオレットの量に基づく。
【図１７】  図１７は、ＫＤ３またはＧＺ３＋ｘ線照射の組み合わせが、ＫＤ３単独またはＧＺ３単独よりもヌードマウスで増殖するＡ５４９細胞腫瘍の増殖を低下させるにおいて効果的であることを説明する。
【図１８】  図１８はＡＤＰの構造−機能分析を説明し、図１８Ａにおいて、種々の推定ドメインおよび標識されたグリコシル化部位を持つ、Ａｄ２によってコードされたアデノウイルス死滅蛋白質のアミノ酸配列を示し、図１８Ｂにおいて、ｒｅｃ７００および示された欠失突然変異体におけるＡＤＰ遺伝子の模式図を示し、右欄は野生型表現型のパーセンテージとしての種々の突然変異体の死滅促進表現型をまとめる。
【図１９】  図１９Ａおよび１９Ｂは示されたＡＤＰ突然変異体の細胞生存率アッセイを説明し、感染後の時間（図１９Ａ）または日数（図１９Ｂ）に対してプロットしたトリパンブルー排除によって測定された生存率のグラフを示す。
【図２０】  図２０は、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ６（配列番号：５−８）のＡＤＰ蛋白質についての、Ａｄ２  ＡＤＰ突然変異体ｄｌ７１６、ｄｌ７１５、ｄｌ７１４およびｄｌ７３７（配列番号：９−１２）についての、および推定ルーメンドメイン（配列番号：１７）、膜貫通ドメイン（配列番号：１８）、サイトゾル塩基性−プロリンドメイン（配列番号：１９）、およびＡｄ２のＡＤＰ蛋白質のサイトゾルドメインの残り（配列番号：２０）についての、単一文字暗号で示したアミノ酸配列を示す。
【図２１】  図２１はＡｄ５のゲノムの完全なヌクレオチド配列を表す。
【図２２】  図２２はＫＤ１のゲノムの完全なヌクレオチド配列（配列番号：１）を表す。
【図２３】  図２３はＫＤ３のゲノムの完全なヌクレオチド配列（配列番号：２）を表す。
【図２４】  図２４は以下のベクターの模式図である：Ａ．Ａｄ５。斑点を入れた棒線は３６ｋｂｐのＤＮＡゲノムを示す。塗り潰ぶしていない矢印は即時型Ｅ１Ａ転写ユニットを示し、黒色矢印は遅延した初期Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４転写ユニットである。ハッチングを施した矢印は主な後期ｍＲＮＡの５つのファミリー、および主な後期転写ユニットの一部として合成されるＡＤＰ  ｍＲＮＡを示す。各主要後期ｍＲＮＡはその５’末端にスプライスされた三部リーダー（リーダー１、２および３）を有する。Ｂ．ｄｌ３０９。ｄｌ３０９はそれが欠失されたＥ３−ＲＩＤおよびＥ３−１４．７Ｋ遺伝子を有する以外はＡｄ５と同一である。ｄｌ３０９はＡｄ５と同様なレベルでＡＤＰを発現する。Ｃ．ＫＤ１。ＫＤ１は、Ｅ１Ａ蛋白質のｐＲＢまたはｐ３００／ＣＢＰへの結合をなくするＥ１Ａ遺伝子中の２つの小さな欠失（「Ｘ」マークで示す）を有する。それはａｄｐ以外の全てのＥ３遺伝子を欠く。ＡＤＰは、Ａｄ５またはｄｌ３０９からのＡＤＰよりも感染において初期に、かつより豊富に発現される。Ｄｏｒｏｎｉｎら，Ｊ．ｖｉｒｏｌ．７４：６１４７−６１５５。Ｄ．ＫＤ１−ＳＰＢ。ＫＤ１−ＳＰＢは、それがサーファクタント蛋白質Ｂ（ＳＰＢ−Ｐ）に代えてプロモーターによって置き換えられたＥ４プロモーターを有する以外はＫＤ１と同一である。
【図２５】  図２５は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１肺癌腫細胞においてＫＤ１と同程度よく増殖するが、Ｈｅｐ  ３Ｂ肝臓腫瘍細胞においてはＫＤ１よりもかなり貧弱にしか増殖しないことを示すグラフを表す。ＫＤ１−ＳＰＢおよびＫＤ１のＣｓＣｌ−バンデッドストックは標準的な方法を用い（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｐ．１−９  Ｉｎ  Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ（編）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  およびＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）、２９３Ｅ４または２９３−細胞（Ａ）につき、またはＡ５４９細胞（Ｂ）につき力価測定した。データは、アッセイの最終日に観察されたプラークの数のパーセンテージとしてのプラークアッセイのいずれかの日に観察されたプラークの数としてプロットする（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２０：１５２−１６２，１９９６）。
【図２６】  図２６は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１細胞においてＣＰＥを誘導するが、Ｈｅｐ  ３Ｂ細胞では誘導しないことを示す顕微鏡写真を表す。Ｈ４４１およびＨｅｐ  ３Ｂ単層をモック感染させ、または１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させ、次いで、感染後４または７日において位相差下で写真を取った。
【図２７】  図２７は、ＫＤ１−ＳＰＢ  ＤＮＡがＨ４４１細胞では効果的に合成されるが、Ｈｅｐ  ３Ｂ細胞ではそうではないことを説明するサザーンハイブリダイゼーションおよびグラフを示す。Ｈ４４１またはＨｅｐ  ３Ｂ細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。全ゲノムＤＮＡを感染後０、５、２４、４８、７２および９６時間において単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分解し、ブロットし、３２Ｐ−標識Ａｄ  ＤＮＡとハイブリダイズさせた。Ａ．オートラジオグラム。Ｂ．パネルＡにおけるＤＮＡバンドのＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ定量。
【図２８】  図２８は単一工程増殖曲線を示すグラフを表し、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１でよく増殖するが、Ｈｅｐ  ３Ｂ細胞では増殖しないことを示す。細胞は１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。ベクターは感染後示された日に抽出し、力価はプラークアッセイによって測定した。
【図２９】  図２９は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１においてＥ４ＯＲＦ３およびＡＤＰを発現するが、Ｈｅｐ  ３Ｂ細胞では発現しないことを示す免疫ブロットを表す。細胞は１０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。感染後２４時間において、蛋白質抽出物を、特異的抗血清を用いてＥ１Ａ、Ｅ４ＯＲＦ３およびＡＤＰにつき分析した。Ｅ１Ａ蛋白質は複数バンドとして出現する。ＡＤＰは２つのバンドとして出現する；上方バンドはグリコシル化されており、下方バンドは蛋白質分解により切断された種である（Ｓｃａｒｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１：７４３−７５３，１９９２；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３６３３−３６４２）。
【図３０】  図３０は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨ４４１ではＥ４ＯＲＦ３を発現するが、Ｈｅｐ  ３Ｂ細胞では発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を示す。カバーグラス上で増殖する細胞を２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１、ＫＤ１−ＳＰＢまたはｄｌ３０９（野生型）で感染させた。４８時間（パネルＡ）または６日（パネルＢ）において、細胞を固定し、Ｅ４ＯＲＦ３に対するウサギ・ポリクローナル抗ペプチド抗血清で染色した。写真は１００×Ｐｌａｎａｐｏレンズを用いて取った。各パネルは約８つの核を示す。この図面は図３１に示した同一実験の一部である。
【図３１】  図３１は、ＫＤ１−ＳＰＢがＨｅｐ  ３Ｂ細胞においてＥ２−ＤＢＰまたは繊維を効果的に発現しないことを示す免疫蛍光顕微鏡写真を表す。Ｈｅｐ  ３Ｂ細胞は２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１−ＳＰＢまたはＫＤ１で感染させた。感染後４８時間（Ａ）または６日（Ｂ）において、細胞を固定し、ＤＢＰに対するウサギ・ポリクローナル抗血清および繊維に対するマウス・モノクローナル抗体を用いて二重染色した。同一視野をＤＢＰおよび繊維につき示す。この図面は図３０に示した同一実験の一部である。
【図３２】  図３２は、ＫＤ１−ＳＰＢがＫＤ１と同程度に効果的にＨ４４１を溶解するが、Ｈｅｐ  ３Ｂを溶解しないことを説明するグラフを表す。Ｈ４４１またはＨｅｐ  ３Ｂ細胞をモック感染し、あるいは２０ＰＦＵ／細胞のＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢで感染させた。細胞溶解は、細胞から培地への乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって測定した。
【図３３】  図３３はＫＤ１−ＳＰＢがＫＤ１と同程度よくヌードマウスにおいてＨ４４１腫瘍の増殖を抑制することを説明するグラフを表す。腫瘍細胞はヌードマウスの側腹部に注射し、約１００μｌ（Ｈ４４１）または１５０μｌ（Ｈｅｐ  ３Ｂ）容量まで増殖させた。腫瘍（ｎ＝１０）はＤＭＥＭ（モック）を、または５×１０７ＰＦＵのＫＤ１またはＫＤ１−ＳＰＢを注入した。ウイルスの注射は、腫瘍当たり３．０×１０８ＰＦＵの合計用量まで３週間の間毎週２回反復した。腫瘍を測定し、腫瘍サイズの平均倍増加を計算した。