【手続補正書】
【提出日】平成16年1月27日(2004.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩ型膜型セリンプロテアーゼ９(ＭＴＳＰ９)のプロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分を含む、実質的に精製された単鎖もしくは２本鎖ポリペプチド。
【請求項２】
活性化された２本鎖タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９として示されるヌクレオチド配列によりコード化されるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８5％のアミノ酸配列同一性を含む、ポリペプチド；
配列番号１７に示されるヌクレオチド配列によりによりコード化されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチド配列に高度のストリンジェンシーの条件下にその全長の少なくとも70％に沿ってハイブリダイズするヌクレオチド配列によりによりコード化されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
配列番号６もしくは配列番号１８でアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
配列番号６もしくは１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
配列番号１７に示される配列のスプライス変異体であるヌクレオチド配列によりコード化される、ポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドであって；
ポリペプチドのＭＴＳＰ９部分がＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分から本質的に成る、ポリペプチド。
【請求項５】
ＭＴＳＰ９がヒトのポリペプチドである、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項６】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインもしくはＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインの触媒的に活性な部分から本質的に成る、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項７】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインもしくはＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインの触媒的に活性な部分から本質的に成る、請求項３に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号６にアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチドであって、プロテアーゼドメインが配列番号６のアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチドであって、配列番号６として示されるアミノ酸配列もしくは配列番号１８として示されるアミノ酸配列を含むところのポリペプチドと約８０％以上の配列同一性を有し、そこでは実質的に精製されたポリペプチドがプロテアーゼである、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、プロテアーゼドメイン部分が核酸分子であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチド配列または少なくとも一つのそのドメインもしくはドメインの触媒的に活性な部分を含む核酸分子に高度のストリンジェンシーの条件下にその全長の少なくとも70％に沿ってハイブリダイズする核酸分子によりコード化される、ポリペプチド。
【請求項１３】
ドメインがプロテアーゼドメインである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドが配列番号１８に示される完全な配列を含まないでそして配列番号１８の少なくともアミノ酸８５〜８７および／もしくは１６０〜１６５を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
突然変異タンパク質である請求項３に記載のポリペプチドであって、
約５０％までのアミノ酸がさらに別のアミノ酸により置換され；
そして得られたポリペプチドが突然変異していないポリペプチドの少なくとも１０％の触媒活性を有する単鎖もしくは２本鎖のポリペプチドである：
ポリペプチド。
【請求項１６】
約１０％までのアミノ酸がさらに別のアミノ酸により置換される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリペプチドであって、得られたポリペプチドが単鎖もしくは２本鎖のポリペプチドでありそして突然変異していないタンパク質の少なくとも５０％の触媒活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１８】
プロテアーゼドメイン中の遊離システインがさらに別のアミノ酸により置換される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
置換するアミノ酸がセリンである、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインから本質的に成る、単離された実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸分子であって、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列：
からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、核酸分子。
【請求項２３】
請求項1５に記載の突然変異タンパク質をコード化する、単離された核酸分子。
【請求項２４】
請求項２１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２５】
発現ベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
真核性のベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項２４に記載のベクターであって、それに機能するように結合されたヌクレオチド配列によりコード化される任意のポリペプチドの分泌を指示するヌクレオチドの配列を含む、ベクター。
【請求項２８】
PichiaベクターもしくはＥ．coliベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３０】
原核性の細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
真核性の細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３２】
細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞の中から選択される、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３３】
哺乳動物の細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３４】
請求項６に記載のポリペプチドをコード化する、核酸分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３７】
組み替え非ヒト動物であって、請求項１に記載のポリペプチドをコード化する内因性遺伝子が動物もしくはその祖先の相同性組み替えもしくは挿入突然変異誘発によリ欠失されるかもしくは不活性化されている、動物。
【請求項３８】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインを含む、ポリペプチドを製造する方法であって、
請求項２９に記載の細胞をそれによりコード化されたポリペプチドが細胞により発現される条件下で培養すること；および
発現されたポリペプチドを回収すること：
を含む、方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが培養培地の中に分泌される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞がPichia細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドが宿主細胞の細胞質の中に発現される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ポリペプチドのプロテアーゼドメインを含むポリペプチドを製造する方法であって、
請求項３６に記載の細胞をそれによりコード化されたポリペプチドが細胞により発現される条件下で培養すること；および
発現されたポリペプチドを回収すること：
を含む、方法。
【請求項４３】
アンチセンス核酸分子であって、
請求項１に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に相補的である少なくとも１４個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか；または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に相補的である少なくとも１６個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか：または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に相補的である少なくとも３０個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含み、そこではアンチセンス分子は配列番号１７のヌクレオチド１１６２〜１２６２を含まない、
アンチセンス核酸分子。
【請求項４４】
請求項４３に記載のアンチセンス分子であって、
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列の相補体であるヌクレオチドの連続的配列を含む、アンチセンス分子。
【請求項４５】
二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)分子であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９をコード化するヌクレオチドの配列から少なくとも約２１個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含む、二重鎖ＲＮＡ分子。
【請求項４６】
抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であってよい、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドのプロテアーゼドメイン、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体の単鎖型および／もしくは２本鎖型に特異的に結合する抗体。
【請求項４７】
ポリペプチドの酵素的活性を阻害する、請求項４６に記載の抗体。
【請求項４８】
抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であってよくそして該抗体がポリペプチドの酵素的活性を阻害する、請求項３に記載のポリペプチドのプロテアーゼドメイン、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体の単鎖型および／もしくは２本鎖型に特異的に結合する抗体。
【請求項４９】
抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であってよくそして該抗体がポリペプチドの酵素的活性を阻害する、請求項６に記載のポリペプチドのプロテアーゼドメインの単鎖型および／もしくは２本鎖型、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体に特異的に結合する抗体。
【請求項５０】
結合体であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド、および
ポリペプチドに直接的にもしくはリンカーを介して結合したターゲティング剤：
を含む、結合体。
【請求項５１】
請求項５０に記載の結合体であって、
ターゲティング剤が、
結合体の親和性単離および精製；
結合体の表面への付着；
結合体の検出；もしくは
選択された組織もしくは細胞への目標を定めた送達、
を許容する、結合体。
【請求項５２】
結合体であって、
請求項３に記載のポリペプチド、および
ポリペプチドに直接的にもしくはリンカーを介して結合したターゲティング剤：
を含む、結合体。
【請求項５３】
請求項５２に記載の結合体であって、
ターゲティング剤が、
結合体の親和性単離および精製；
結合体の表面への付着；
結合体の検出；もしくは
選択された組織もしくは細胞へターゲティングされた送達、
を可能とする、結合体。
【請求項５４】
結合体であって、
請求項６に記載のポリペプチド、および
ポリペプチドに直接的にもしくはリンカーを介して結合したターゲティング剤：
を含む、結合体。
【請求項５５】
請求項５４に記載の結合体であって、
ターゲティング剤が、
結合体の親和性単離および精製；
結合体の表面への付着；
結合体の検出；もしくは
選択された組織もしくは細胞へターゲティングされた送達、
を可能とする、結合体。
【請求項５６】
組合せであって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの触媒活性を阻害する剤もしくは処置；および
抗腫瘍性のもしくは抗血管新生性の処置または剤から選択されるさらに別な処置または剤：
を含む、組合せ。
【請求項５７】
請求項５６に記載の組合せであって、
阻害剤および抗腫瘍性のおよび／もしくは抗血管新生性の剤が単一の医薬組成物中に処方されるか、もしくはそれぞれが別々の医薬組成物に処方される、組合せ。
【請求項５８】
請求項５６に記載の組合せであって、
阻害剤が抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)から選択される、組合せ。
【請求項５９】
固体支持体であってそれに直接的にもしくはリンカーを介してのどちらかで結合した請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二つもしくはそれ以上のポリペプチドを含む、固体支持体。
【請求項６０】
ポリペプチドがアレイを含む、請求項５９に記載の支持体。
【請求項６１】
ポリペプチドが複数の異なるプロテアーゼドメインを含む、請求項５９に記載の支持体。
【請求項６２】
オリゴヌクレオチドが少なくとも１６個のヌクレオチドを含有する、請求項２１に記載の二つもしくはそれ以上の核酸分子またはそれに直接的にもしくはリンカーを介してのどちらかで結合したそのオリゴヌクレオチド部分を含む、固体支持体。
【請求項６３】
核酸分子がアレイを含む、請求項６２に記載の支持体。
【請求項６４】
核酸分子が異なるプロテアーゼドメインをコード化する複数の分子含む、請求項６２に記載の支持体。
【請求項６５】
ポリペプチドのプロテアーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをポリペプチドによりタンパク質分解的に切断される基質と接触させること、および、同時に、前にもしくは後でのどちらかで、一つの試験化合物またはその複数を添加すること；
試験化合物の存在下で切断された基質の量を測定すること；ならびに
対照に比較して切断された基質の量を変化させる化合物を選択すること：
を含み、それによりポリペプチドの活性を調整する化合物を同定する、
方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法あって、
試験化合物がポリペプチドの活性を調整するところの小分子、ペプチド、ペプチドミメティック、天然産物、抗体もしくはそれらのフラグメントである、方法。
【請求項６７】
複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
請求項６５に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；または
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列
を含む：
ヌクレオチドの配列からなる群から選択されるヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項６９】
請求項６５に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９として示されるヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号１７で示されるヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列に高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズするところのヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号６のアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号１６のアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸の配列もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
配列番号１７に示される配列のスプライス変異体であるヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチド：
からなる群から選択されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項７０】
請求項６５に記載の方法あって、
切断された基質の量の変化が試験化合物の存在下で切断された基質の量を試験化合物の不在下で切断された基質の量と比較することにより評価される、方法。
【請求項７１】
複数のポリペプチドが直接的にもしくはリンカーを介してのどちらかで固体支持体に結合する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
ポリペプチドがアレイを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖のプロテアーゼドメインにならびに／または単鎖および／もしくは２本鎖のポリペプチドにならびに／またはその単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのタンパク質分解的に活性な部分を一つの試験化合物またはその複数とその結合に伝導性(conductive)の条件下で接触させること；および
ａ)単鎖および／もしくは２本鎖型のポリペプチドにまたはその単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に特異的に結合する試験化合物を同定することか、または
ｂ)単鎖および／もしくは２本鎖型のポリペプチドにまたはその単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に結合すると知られている化合物の結合を阻害するところの試験化合物を同定することか：
のどちらか：
を含み、そこでは既知の化合物をポリペプチドと試験化合物の以前に、と共に同時にまたは後に接触させる、方法。
【請求項７４】
ポリペプチドが直接的にもしくはリンカーを介して間接的にのどちらかで固体支持体に結合する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法あって、
試験化合物がその小分子、ペプチド、ペプチドミメティック、天然産物、抗体もしくはそのフラグメントである、方法。
【請求項７６】
複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
複数のポリペプチドが固体支持体に結合する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
請求項７３に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；または
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列：
によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項７９】
チモーゲン型のＭＴＳＰ９のアクチベーターを同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のチモーゲン型のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはその潜在的にタンパク質分解的に活性な部分をポリペプチドの活性化型の基質と接触させること；
試験化合物が基質の添加の前に、後でもしくは同時に、添加されるところで、試験化合物を添加すること；および
基質の切断を検出すること：
を含み、それによりチモーゲンを活性化する化合物を同定する、方法。
【請求項８０】
基質が色素産生性の基質である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
基質がＬ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン塩酸塩である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
試験化合物が小分子、核酸もしくはポリペプチドである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
哺乳動物において、新生物形成性疾患を処置するか予防する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の方法あって、
阻害剤がポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントもしくは誘導体であり、そこでは抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体である、方法。
【請求項８５】
請求項８３に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；または
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列
を含む：
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項８６】
請求項８３に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列； 
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；または
(ｅ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)もしくは(ｄ)の縮重コドン：
によりコード化されるポリペプチドを含む、方法。
【請求項８７】
腫瘍発生、成長もしくは進行を阻害するかまたは悪性腫瘍もしくは前がん性異常を処置する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のチモーゲン型のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはその潜在的にタンパク質分解的に活性部分の活性化切断を阻害するかまたは活性化型のＭＴＳＰ９もしくはそのタンパク質分解的に活性な部分の活性を阻害するところの剤を投与することを含む、方法。
【請求項８８】
異常が乳房、子宮頚、前立腺、肺、卵巣もしくは結腸の異常である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)もしくは抗体である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
、抗腫瘍性および抗血管新生性の処置または剤から選択されるもう一つの処置または剤を投与することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
請求項８７に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；または
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列：
によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項９２】
請求項８７に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；または
(ｅ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)もしくは(ｄ)の縮重コドン：を含む
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドを含む、方法。
【請求項９３】
請求項に記載のＭＴＳＰ９ポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖型にならびに／または請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９ポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に結合する化合物を同定する方法であって、
試験化合物を両方の型に接触させること；
化合物がどちらの型に結合するかを決定すること；ならびに
もしそれがポリペプチドの一つの型に結合するならば、化合物が以下の性質の少なくとも一つを有しているか否かをさらに決定すること：
(i)単鎖チモーゲン型のポリペプチドの活性化切断を阻害する；
(ii)二本鎖もしくは単鎖の型の活性を阻害する；および
(iii)タンパク質の二量体化を阻害する：
を含む、方法。
【請求項９４】
新生物形成性疾患を検出する方法であって、
生物学的試料の中で請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むポリペプチドを検出すること：を含み、そこでは検出される量、型および／もしくは活性が新生物形成性疾患を有しない対象から検出されるポリペプチドの量、型および／もしくは活性とは異なる、方法。
【請求項９５】
請求項９４に記載の方法あって、
生物学的試料が血液、尿、唾液、涙、滑液、汗、間質液、精液、脳脊髄液、腹水、腫瘍細胞生検材料、および循環腫瘍細胞からなる群から選択される、方法。
【請求項９６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖型に結合する化合物を同定する方法であって、
試験化合物を両方の型に接触させること；
化合物がどちらの型に結合するかを決定すること；ならびに
もしそれがポリペプチドの一つの型に結合するならば、化合物が以下の性質の少なくとも一つを有しているか否かをさらに決定すること：
(i)単鎖チモーゲン型のポリペプチドの活性化切断を阻害する；
(ii)二本鎖もしくは単鎖の型の活性を阻害する；および
(iii)タンパク質の二量体化を阻害する：
を含む、方法。
【請求項９７】
請求項９６に記載の方法あって、
生物学的試料が血液、尿、唾液、涙、滑液、汗、間質液、精液、脳脊髄液、腹水、腫瘍細胞生検材料、および循環腫瘍細胞からなる群から選択される、方法。
【請求項９８】
両方の型がプロテアーゼドメインから本質的に成る、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
対象における前がん病変、悪性病変、もしくは他の病態の存在を診断する方法であって、
対象から生物学的試料を採取すること；および
該生物学的試料を２本鎖および／もしくは単鎖型のＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合する検出可能な剤に曝露させること：
を含み、そこでは病態は２本鎖および／もしくは単鎖型の存在もしくは不在を特徴とする、方法。
【請求項１００】
腫瘍進行および／もしくは治療的有効性をモニターする方法であって、
身体の組織または液体試料中のＭＴＳＰ９ポリペプチドのレベル、型および／もしくは活性を検出することならびに／または定量化することを含む、方法。
【請求項１０１】
腫瘍が乳房、子宮頚、前立腺、肺、卵巣もしくは結腸の腫瘍である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
体液が血液、尿、汗、唾液、脳脊髄液および滑液である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドが配列番号１８の少なくともアミノ酸８５〜８７および／もしくは１６０〜１６５を含む、ポリペプチド。
【請求項１０４】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくはそのタンパク質分解的に活性な部分をポリペプチドによりタンパク質分解的に切断された基質と接触させることおよび、一つの試験化合物もしくはその複数を添加すると同時に、前にまたは後でのどちらかで； 
試験化合物の存在下に切断された基質の量を測定すること；および
対照と比較して切断された基質の量を変化させる化合物を選択すること：
を含み、それによりポリペプチドの活性を調整する化合物が同定される、方法。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；または
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列
を含む：
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドを含む、方法。
【請求項１０６】
請求項１０４に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；または
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドを含む：
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項１０７】
プロテアーゼドメインが配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１０８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード化する異種の核酸を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０９】
プローブもしくはプライマーであって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に同一である少なくとも１４個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか：または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に同一である少なくとも１６個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか：または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に同一である少なくとも３０個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含み、そこではプローブまたはプライマーは配列番号１７のヌクレオチド１１６２〜１２６２を含まない、プローブもしくはプライマー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
薬学的に許容される担体もしくは賦形剤中で、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインおよび／もしくは完全長または他のドメインを含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。
また、ＭＴＳＰ９ポリペプチドおよび単鎖型もしくは活性型にあるＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインを含有する、製造品目が、提供される。製造品目はａ)包装材；ｂ)ポリペプチド(もしくはコード化する核酸)、特にその単鎖プロテアーゼドメイン；およびｃ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性のモジュレーターを同定するためのアッセイにおける用途のためのものである品目がそこにおいて提供されることを示すラベルを含有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本明細書において使用されるように、セリンプロテアーゼとは、タンパク質もしくはペプチドの加水分解にセリン残基が関与する、プロテアーゼの種々のファミリーを指す。セリン残基は、触媒作用においてセリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸を含む触媒三つ組機構の一部、または触媒作用においてセリンおよびリジンを伴うヒドロキシル／ε−アミノもしくはヒドロキシル／α−アミンの触媒二つ組機構の一部であり得る。ヒトを含む哺乳動物起源のＳＰが特に興味深い。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させないことを当業者は認識している(例えばWatson et al. (1987)、「遺伝子の分子生物学、第４版」、The Bejamin/Cummings Pub. co., p.224を参照)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本明細書において使用されるように、ＭＴＳＰ９は、本明細書において参照される場合は常に、
配列番号１７に示されるヌクレオチド配列により、もしくは配列番号６のアミノ酸１１〜２３２をコード化するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によりによりコード化されるポリペプチド；
配列番号５のヌクレオチドとしてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチド配列に低度、中度、もしくは高度のストリンジェンシーの条件下にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチド；
配列番号６のアミノ酸１１〜２３２として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号１６もしくは１８に示されるアミノ酸、または配列番号６のアミノ酸１１〜２３２として示されるアミノ酸の配列と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／もしくは
配列番号１７に示されるＭＴＳＰ９のスプライス変異体によりコード化されるポリペプチド：
の少なくとも一つもしくは全てまたは任意の組合せを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインは、本明細書において参照される場合は常に、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列５もしくは１７に示されるヌクレオチド配列に低度、中度、もしくは高度にストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチド；
配列番号６、１６もしくは１８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号６、１６もしくは１８に示されるアミノ酸配列に少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または
ＭＴＳＰ９のスプライス変異体によりコード化されるポリペプチドのプロテアーゼドメイン：
の触媒的に活性な部分の少なくとも一つもしくは全てまたは任意の組合せを含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
本明細書において使用されるように、活性化切断とは、切断に際してプロテアーゼドメインのＮ末端(この場合には、Ｒ１８５とＩ１８６の間；配列番号１２および１５を参照して)におけるプロテアーゼの切断を指す。切断に際して、プロテアーゼドメイン外のＣｙｓ(この場合、例えばＣ１７５)およびプロテアーゼドメイン内のＣｙｓ(この場合には、Ｃｙｓ２９２)との間のＣｙｓ−Ｃｙｓ対のお陰で、得られたポリペプチドは二本鎖(''Ａ''鎖およびプロテアーゼドメインである''Ｂ''鎖)を有する。切断は、さらに別のプロテアーゼにより、もしくは自己触媒的に行われることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
興味のあるＭＴＳＰは、非腫瘍細胞とは、典型的にはより高度に、異なる腫瘍細胞において活性化および／もしくは発現されているもの；およびそのための基質が腫瘍細胞において非腫瘍細胞と異なるか、または基質、補因子もしくは受容体に関して異なっている、またはそうでなければＭＴＳＰの活性もしくは特異性を変えているところの細胞由来のものを含む。
本明細書において使用されるように、ヒトタンパク質は、ヒトのゲノム中に存在するＤＮＡのような核酸によりコード化されるものであり、全ての対立遺伝子変異体および保存的変異体を、それらが他の哺乳動物に見出される変異体でない限りに、含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【表１】
2005506047.tif 000001
他の置換はまた、許容可能であって、経験によりもしくは既知の保存的置換にしたがって決定されることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
ポリペプチドおよび突然変異タンパク質
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインを含有する、単離された、実質的に純粋な単鎖および２本鎖ポリペプチドが、本明細書において提供される。ポリペプチドはまた、アミノ酸の他の非ＭＴＳＰ配列を含有することができるが、本明細書において提供される任意のような、そのようなプロテアーゼ活性を評価する任意のインビトロアッセイにおいて触媒活性を示すために、プロテアーゼドメインもしくはその充分な部分を含む。
本明細書において提供されるＭＴＳＰ９は、典型的にはそれらが同じタイプの非腫瘍細胞において発現もしくは活性化されるレベルとは異なったレベルで、腫瘍細胞によりもしくはその中で発現または活性化される。したがって、例えば、もしＭＴＳＰが子宮頚部腫瘍において発現しているならば、それは非腫瘍子宮頚部細胞におけるレベルとは異なるレベルで発現しているかもしくは活性である。ＭＴＳＰ９の発現もしくは活性化は子宮頚部、肺、食道、結腸、前立腺、子宮、膵臓、乳房および他の腫瘍を示し得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
また、実質的に精製されたＭＴＳＰ９チモーゲン、活性化された２本鎖型、単鎖プロテアーゼドメインおよび２本鎖プロテアーゼドメインが含まれる。これらのポリペプチドは、タンパク質分解酵素活性を示すプロテアーゼドメインをコード化する配列を含むところの、そして配列番号５もしくは１７に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と、典型的には中等度の、一般的には高度のストリンジェンシー下で、そして一般的には完全長に沿って、もしくはプロテアーゼドメインの完全長の少なくとも約７０％、８０％もしくは９０％(もしくは実質的に完全長)に沿ってハイブリダイズするところの、核酸によりコード化される。スプライスバリアントもまた、本明細書において意図される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
かくして、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をＳＰの単鎖型として含む、単離された、実質的に純粋なプロテアーゼが、提供される。プロテアーゼドメインは、さらに長いタンパク質中に含まれることもできて、そのようなさらに長いタンパク質は、任意にＭＴＳＰ９チモーゲンである。
特に、例示的なプロテアーゼドメインは、配列番号１６中のアミノ酸２０６〜４３８に示されるアミノ酸配列(配列番号５および１７によりコード化される)の少なくとも充分な部分を含有する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
記述のように、ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインは、チモーゲンが活性化されるとき切断部位(一般的には、矢印は切断部位を表す、コンセンサス配列Ｒ（下矢）ＶＶＧＧ、Ｒ（下矢）ＩＶＧＧ、Ｒ（下矢）ＩＶＱ、Ｒ（下矢）ＩＶＮＧ、Ｒ（下矢）ＩＬＧＧ、Ｒ（下矢）ＶＧＬＬ、Ｒ（下矢）ＩＬＧＧもしくはそのバリエーション；Ｎ末端Ｒ（下矢）ＶまたはＲ（下矢）Ｉ)において生成したＮ末端(ＩＶ、ＶＶ、ＩＬおよびＩＩのような)を持つ、単鎖ポリペプチドまたは２本鎖ポリペプチドである。Ｒ１８５およびＩ１８６の間の活性化切断(Ｒ（下矢）Ｉ)により生成された例示的ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインは、配列番号６および１８に示すように、配列Ｒ（下矢）ＩＡＳＧを含む。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
また、ＭＴＳＰ９をコード化する上述のヌクレオチド配列と、少なくとも低度のストリンジェンシー、中等度のストリンジェンシー、および典型的には高度のストリンジェンシーでハイブリダイズし、そしてプロテアーゼドメインおよび／もしくは完全長または完全長プロテアーゼドメイン、もしくはＭＴＳＰ９の他のドメインまたはそのスプライスバリアントもしくは対立遺伝子突然変異体の少なくとも７０％、８０％もしくは９０％をコード化するところの核酸分子が、提供される。一般的には、分子は、そのような条件下で少なくとも一つのドメインに対する完全長に沿って、または完全長の少なくとも７０％、８０％もしくは９０％に沿ってハイブリダイズし、そしてポリペプチドのプロテアーゼもしくは細胞外ドメインのような少なくとも一つのドメインをコード化する。特に、そのような核酸分子は、膜セリンプロテアーゼドメインの少なくとも一つのドメインをコード化する任意の単離核酸フラグメントを含み、それは、(１)プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するヌクレオチド配列を含有し、そして(２)、
(ａ)配列５もしくは１７に示されるヌクレオチド配列を含む、プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するヌクレオチドの配列；
(ｂ)そのような部分もしくは完全長のプロテアーゼをコード化し、そしてそのようなタンパク質またはそのフラグメントをコード化する、哺乳動物中に存在するｍＲＮＡ転写物に相補的である核酸に一般的には、高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズするところのヌクレオチドの配列；
(ｃ)そのような部分もしくは完全長のオープンリーディングフレームによりコード化されるアミノ酸の配列を含む、膜貫通プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するところのヌクレオチドの配列；
(ｄ)配列番号５、もしくは１７に示される配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するところのヌクレオチドの配列；および
(ｅ)そのようなサブユニットをコード化するヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む膜貫通プロテアーゼをコード化し、そしてｍＲＮＡ転写物に相補的であるＤＮＡに低度、中等度、もしくは高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするところのヌクレオチドの配列：
の中から選択される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
核酸分子から由来したプローブおよびプライマーが、提供される。そのようなプローブおよびプライマーは、一般的には配列番号５のヌクレオチド６３４〜７１もしくは配列番号１７のヌクレオチド１１６２〜１２７９を除くＭＴＳＰ９の連続したヌクレオチドと同一性を持つ少なくとも８、１４、１６、３０、１００個もしくはそれより多い連続したヌクレオチド、および配列番号５のヌクレオチド６３４〜７３４を除く(配列番号１７のヌクレオチド１１６２〜１２６２を除く)、配列番号５のヌクレオチドの少なくとも３０、５０もしくは１００個の連続した配列をを持つプローブを含有する。プローブおよびプライマーは、放射標識もしくは蛍光タグのような検出可能な標識で任意に標識され、または質量分析もしくは他の方法による検出用に質量を異にすることができる。
ＤＮＡフラグメントは、ハイブリダイズするであろう。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
制限酵素消化(複数を含む)、そして、それが利用可能ならば、既知の制限マップにしたがって予想されるサイズとのフラグメントのサイズを比較することにより、もしくはＤＮＡ配列分析およびＭＴＳＰポリペプチドの既知のヌクレオチド配列との比較により、適切なフラグメントを同定することがまた、可能である。さらなる選択を、遺伝子の性質に基づいて行うことができる。これに代えて、遺伝子の存在を、その発現された産物の物理的、化学的、もしくは免疫学的性質に基づくアッセイにより検出することができる。例えば、例えば類似のもしくは同一の電気泳動移動度、等電点電気泳動の挙動、タンパク質分解酵素による消化マップ、抗原的性質、セリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生産するところの、適切なｍＲＮＡとハイブリッドを形成して選択するｃＤＮＡクローンもしくはＤＮＡクローンを選択することができる。もし抗ＭＴＳＰポリペプチド抗体が利用可能ならば、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検査法)タイプの手順により、推定的にＭＴＳＰポリペプチドを合成するクローンへの標識抗体の結合によって同定されることができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
２．ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティック
ＳＰタンパク質に結合して、活性を調整するところの分子を同定する方法が、本明細書において提供される。ＳＰ、特にそれらの単鎖プロテアーゼドメインもしくは触媒的に活性なフラグメント、に結合する分子の中には、環状ペプチドを含む、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックが含まれる。ペプチドミメティックとは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのような標的分子に特異的に結合するために必要な、リガンドもしくはポリペプチドの分子配座を模倣する分子もしくは化合物である。例示的な実施態様では、ペプチド、ポリペプチドもしくはペプチドミメティックは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインに結合する。そのようなペプチドおよびペプチドミメティックとしては、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに特異的に結合し、典型的には、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインに結合するところの抗体のそれらが、挙げられる。本明細書において提供される方法によって同定されるペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストであり得る。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２４】
リンカーは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインおよびターゲッティング剤を会合させるために適当な任意の部分であり得る。そのようなリンカーおよび結合としては、ペプチド結合、典型的には１〜約６０個のアミノ酸、より一般的には約１０〜３０個のアミノ酸、を含むアミノ酸およびペプチド結合、ヘテロ二官能性の切断可能な交差−リンカーのような化学的リンカーが挙げられるが、それに限定されないで、そこでは、化学的リンカーとしては、 (４−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸Ｎ−スクシンイミジル、(４−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸、スルホスクシンイミジルエステル、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−(２−ピリジルジチオ)トルエン、６−[α−メチル−α−(ピリジルジチオ)−トルアミド] ヘキサン酸スルホスクシンイミジル、Ｎ−スクシンイミジル−３−(−２−ピリジルジチオ)−プロピオネート、６[３(−(−２−ピリジルジチオ)−プロピオアミド)ヘキサン酸スクシンイミジルエステル、６[３(−(−２−ピリジルジチオ)−プロプリオンアミド)ヘキサン酸スルホスクシンイミジルエステル、３−(２−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド、Ellman試薬、ジクロロトリアジン酸、およびＳ−(２−チオピリジル)−Ｌ−システイン、を含むものが、挙げられるが、これらに限定されない。他のリンカーとしては、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインとターゲッティング剤との間の立体障害を減少するペプチドおよび他の部分、細胞内酵素基質、結合体の柔軟性を増加するリンカー、結合体の溶解度を増加するリンカー、結合体の血清安定性を増加するリンカー、光切断性リンカーならびに酸切断性リンカーが、挙げられるが、これらに限定されない。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７４】
組成物は、以下の活性成分と一緒に含有し得る：ラクトース、蔗糖、リン酸二カルシウムもしくはカルボキシメチルセルロースのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはタルクのような滑沢剤；並びに結合剤例えばデンプン、天然ガム例えばガムアカシア、ゼラチン、ブドウ糖、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンのような結合剤ならびに当業者に公知の他のそのような結合剤である。液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、それによって溶液もしくは懸濁液を形成するように、上で定義される活性化合物および、任意の薬学的補助剤を、例えば、水、生理食塩液、水性デキストロース、グリセリン、グリコール、エタノール等のような担体中で、溶解し、分散し、もしくはそうでなければ混合することによって調製されることができる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３０】
ＭＴＳＰ９の完全長プロテアーゼドメインをコード化するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するｃＤＮＡフラグメントを得るために、遺伝子特異的プライマーおよびヒト食道由来のｃＤＮＡを用いる終端間ＰＣＲ増幅を使用した。使用した二つのプライマーは：５’末端用は、５’ＣＧＡＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＡＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣ３’  (配列番号９)、そして３’末端用は、５’ＧＣＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＴＣＧＴＧ  ３’(配列番号１０)である。両プライマーのための配列は、ＭＴＳＰ９のゲノム配列から得られた。５’プライマーは、ＭＴＳＰ９プロテアーゼドメインの開始のすぐ上流の領域をコード化する配列(ＲＶＶＰＬＮＶＮＲＩＡ；配列番号１２)を含んでいた。３’プライマーは、推定停止コドンの直後の配列に対応する。約７５０ｂｐのフラグメントが、ヒト食道ｃＤＮＡライブラリーから増幅された。ＰＣＲ産物を単離して、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA; カタログ番号２８７０４)を用いることにより精製した。ＭＴＳＰ９産物を用いて、PichiaベクターのｐＰＩＣ９Ｋ中にサブクローン化するための適切な制限部位を含有するｃＤＮＡフラグメントを増幅した。使用した遺伝子特異的プライマーは
５’末端で、５’ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＡＡＧ３’(配列番号１３)、および
３’末端で、５’ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣ３’(配列番号２３)である。５’末端のプライマーは、Pichiaプロテアーゼ切断部位のすぐ上流にＸｈｏｌ部位(下線部)、およびＭＴＳＰ９プロテアーゼドメインの一部(ＫＲＩＡＳＧＶＩＡＰＫ；配列番号１５)を含有している一方で、３’末端は、停止コドン(太字)のすぐ下流にＮｏｔＩ部位(下線部)を含有していた。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４８】
もし上記の基質のどれも切断されなければ、上述の結合アッセイを使用することができる。略述すれば、結合アッセイは、プロテアーゼが、プラスミノーゲンおよびトリプシノーゲンのような、酵素を活性化する能力を試験する。これらのアッセイを行うために、単鎖プロテアーゼを、リス−プラスミノーゲンのような、チモーゲンに対する既知の基質の存在下にプラスミノーゲンもしくはトリプシノーゲンのような、チモーゲンと共にインキュベートする。もし単鎖がチモーゲンを活性化すれば、プラスミンおよびトリプシンのような、活性化された酵素が、それに対する基質を分解するであろう。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５３】
色素生産性基質の加水分解の初速度を、両アッセイにおいて、Thermo Max[登録商標]キネティックマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４０５ｎｍの吸収の変化で５分間測定したが、そこでは添加した基質の５％未満が使用された。加水分解の初速度の５０％減少をもたらすところの添加された阻害剤の濃度を、二つのアッセイ(３０もしくは６０分および０分時)のそれぞれにおけるそれぞれのＩＣ５０値として定義した。