(57)【要約】  オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体を用いて、オスモチン組換えタンパク質を製造する。これにより、本発明は、簡便に、しかも安価かつ大量に取得可能で、生理活性を有するオスモチン組換えタンパク質およびその製造方法、並びにその利用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体を用いて、オスモチン組換えタンパク質を製造することを特徴とするオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項２】
上記オスモチン組換えタンパク質の、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼのリン酸化活性を検出する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項３】
上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌、酵母、真菌類、昆虫、または哺乳類であることを特徴とする請求項１または２に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項４】
上記非植物形質転換体において、オスモチン組換えタンパク質を含む封入体を形成させ、
該封入体を抽出し、該封入体を可溶化溶液に溶解させることにより、上記封入体に含まれるオスモチン組換えタンパク質を可溶化し、
該可溶化されたオスモチン組換えタンパク質をリフォールディングさせることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項６】
上記ポリヌクレオチドは、ジャガイモ、トマト、ピーマン、トウガラシ、およびタバコからなる群より選択されるいずれか１つの植物に由来するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項７】
上記可溶化されたオスモチン組換えタンパク質は、還元型グルタチオンと、酸化型グルタチオンとを含む溶液中、２℃〜４０℃でリフォールディングされることを特徴とする請求項４に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項８】
上記可溶化溶液は、Ｎ‐ラウロイルサルコシンを含有することを特徴とする請求項４または７に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項９】
上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌であり、
上記ポリヌクレオチドの発現を、２０℃〜３０℃で誘導することにより、オスモチン組換えタンパク質を産生させることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法で製造されたオスモチン組換えタンパク質。
【請求項１１】
５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有することを特徴とする請求項１０に記載のオスモチン組換えタンパク質。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のオスモチン組換えタンパク質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
生活習慣病の予防または治療に用いられることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
上記生活習慣病は、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧症、動脈硬化、および心臓病からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
酸化ストレスに起因する疾患の予防または治療に用いられることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
上記酸化ストレスに起因する疾患が、癌、炎症、アレルギー性疾患、アルツハイマー病、加齢黄斑変性や皮膚のエイジングからなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１７】
５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法であって、
オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体から、オスモチン組換えタンパク質を抽出し、
該オスモチン組換えタンパク質の、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を検出することを特徴とするオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌、酵母、真菌類、昆虫、または哺乳類であることを特徴とする請求項１７に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
上記オスモチン組換えタンパク質は、
上記非植物形質転換体において、オスモチン組換えタンパク質を含む封入体を形成させ、
該封入体を抽出し、該封入体を可溶化溶液に溶解させることにより、上記封入体に含まれるオスモチン組換えタンパク質を可溶化し、
該可溶化されたオスモチン組換えタンパク質をリフォールディングさせて得られることを特徴とする請求項１７または１８に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
上記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項２１】
上記ポリヌクレオチドは、ジャガイモ、トマト、ピーマン、トウガラシ、およびタバコからなる群より選択されるいずれか１つの植物に由来するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
上記可溶化されたオスモチン組換えタンパク質は、還元型グルタチオンと、酸化型グルタチオンとを含む溶液中、２℃〜４０℃でリフォールディングされることを特徴とする請求項１９に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
上記可溶化溶液は、Ｎ‐ラウロイルサルコシンを含有することを特徴とする請求項１９または２２に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２４】
上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌であり、
上記ポリヌクレオチドの発現を、２０℃〜３０℃で誘導することにより、オスモチン組換えタンパク質を産生させることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オスモチン組換えタンパク質およびその製造方法、並びにその利用に関するものであり、特に、簡便に、しかも安価かつ大量に取得可能で、生理活性を有するオスモチン組換えタンパク質およびその製造方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本人の死因の第一位は、心筋梗塞、脳梗塞などの心血管疾患である。心血管疾患の主要な原因は、肥満、糖尿病、高脂血症、および高血圧を重複するメタボリックシンドロームであると考えられる。したがって、メタボリックシンドロームの予防方法および治療方法の確立は極めて重要な課題である。【０００３】
メタボリックシンドロームは、心血管疾患予防を第一義の目的としてハイリスクグループを絞り込むために定義された疾患概念である。具体的には、内臓脂肪の蓄積によりインスリン抵抗性（耐糖能異常）、動脈硬化惹起性リポ蛋白異常、血圧高値を合併する病態である。【０００４】
ＷＨＯおよびＮＥＣＰ（米国）は、２００２年、健康対策としてメタボリックシンドロームを重視する方針を打ち出し、メタボリックシンドロームの診断基準を発表している。その診断基準には、複数のリスクファクターが含まれている。日本人においても、これらのリスクファクターを３個以上合併した群では、対象群と比較して、心血管疾患危険率が３０倍以上に達することが報告されている。【０００５】
メタボリックシンドロームは、従来、シンドロームＸ、死の四重奏、インスリン抵抗性症候群、内臓脂肪症候群などといわれてきた。しかし、２００５年、日本内科学会および関連７学会により、『内臓脂肪の蓄積と、それを基盤にしたインスリン抵抗性および糖代謝異常、脂質代謝異常、高血圧を複数合併するマルチプルリスクファクター症候群で、動脈硬化になりやすい病態』と定義された。【０００６】
メタボリックシンドロームの発症原因については未解明の部分が多いが、体内で生じるストレスがその一部であると考えられている。例えば、糖尿病合併症の発症機構には「酸化ストレス」および「カルボニルストレス」が関わっていると推定されている。酸化ストレスとは、反応性の高い活性酸素種によりタンパク質、ＤＮＡなどの生体部分が傷害を受けるものである。また、カルボニルストレスとは、グルコースなどのカルボニル化合物が、タンパク質などの生体分子を攻撃するものである。この反応はメイラード反応と呼ばれる。そして、これら生体部分が受けた「傷」が発症へ結びつくとの推定がなされているが、その詳細な機構は依然として不明である。【０００７】
慢性的な高血糖状態は、グリケーション反応、ミトコンドリア電子伝達系、およびヘキソサミン経路を介して、活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰発生を引き起こし、強力な酸化ストレスとして作用する。しかしながら、現在の糖尿病有病者の半数以上が全く治療行為を行っていないのが現状であるため、これらの有病者は元より過食、肥満、運動不足等の生活習慣を持つ人が、日常生活の中で酸化ストレスを低減し、生体を保護するための対策を講じることは必要不可欠である。【０００８】
例として糖尿病について述べたが、酸化ストレスは、メタボリックシンドロームのみならず、癌、炎症、アレルギー性疾患、アルツハイマー病、加齢黄斑変性、皮膚のエイジングなどとの関連が報告されている。したがって、酸化ストレスの低減は酸化ストレスに起因する様々な疾患の予防および改善、ならびにアンチエイジングといった効果が期待できる。【０００９】
飽食と運動不足による過栄養とを原因として内臓脂肪（腹腔内脂肪）が蓄積すると、脂肪細胞は、様々な生理活性物質、特にアディポサイトカインの分泌異常をきたす。その結果、糖代謝異常、脂質代謝異常、高血圧、さらには心血管疾患を惹起する。【００１０】
アディポサイトカインとは、脂肪細胞において産生および分泌される生理活性物質の総称である。脂肪細胞からは種々のアディポサイトカインが産生および分泌される。それらアディポサイトカインは、病態を改善させる善玉アディポサイトカインと、反対に病態を悪化させる悪玉アディポサイトカインとに大別される。【００１１】
アディポネクチン（別名Ａｃｒｐ３０）は、抗糖尿病および抗動脈硬化作用を有する善玉アディポサイトカインである。アディポネクチンは、脂肪組織特異的に発現する遺伝子ａｐＭ１（adipose most abundant gene transcript 1）の産物で、２２４アミノ酸からなる分泌タンパク質である。【００１２】
アディポネクチンは分泌タンパク質に共通して見られるシグナル配列に続き、Ｎ末端部はコラーゲン様線維状ドメイン、Ｃ末端部は補体Ｃ１ｑ様球状ドメインからなる。血漿中でアディポネクチンはコラーゲン様ドメインを中心に多量体を形成する。また、全長アディポネクチンからは、Ｃ末端部の補体Ｃ１ｑ様球状ドメインのみの球状アディポネクチンが生成され、微量でも全長アディポネクチンよりも高い活性を示すことが報告されている。また、非特許文献１には、血中アディポネクチン量は、肥満、インスリン抵抗性、およびＩＩ型糖尿病によって低下するが、マウスを用いた実験において、アディポネクチンの投与によって血糖値が低下し、インスリン抵抗性が改善されることが記載されている。また、アディポネクチンが体重制御のための薬剤となりうることが示唆されている。【００１３】
非特許文献２には、アディポネチンが結合するアディポネクチン受容体（ＡｄｉｐｏＲ）が存在し、該ＡｄｉｐｏＲが、アディポネチンによる生物のエネルギー状態、脂肪酸酸化、およびグルコース輸送の調節を媒介していることが記載されている。また、ＡｄｉｐｏＲアゴニストは、抗糖尿病薬、または抗アテローム効果症薬となりうることが示唆されている。【００１４】
また、非特許文献３には、骨格筋モデル細胞であるＣ２Ｃ１２を用いた検討により、アディポネクチンはＡｄｉｐｏＲを介し、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（以下、「ＡＭＰＫ」ともいう）をリン酸化させることで種々の生理作用を示すことが記載されている。【００１５】
ところで、非特許文献４には、タバコオスモチンは、ＰＲ−５ファミリーに属するタバコの抗菌タンパク質であり、ＲＡＳ２／ｃＡＭＰ経路を介した細胞のストレス応答を抑制することにより、酵母におけるアポトーシスを誘導することが記載されている。また、タバコオスモチンは、球状アディポネクチンと立体構造上の相同性を示すことが記載されている。さらに、タバコオスモチンの受容体ＰＨＯ３６は酵母のＡｄｉｐｏＲホモログであることが記載されている。【００１６】
加えて、非特許文献４には、骨格筋モデル細胞であるＣ２Ｃ１２を用いた検討により、オスモチンは、アディポネクチンと同様に、ＡＭＰＫをリン酸化させうることが記載されている。また、オスモチンによるＡＭＰＫのリン酸化活性はＡｄｉｐｏＲの発現低下に伴って減弱することが示されている。そのため、オスモチンはＡｄｉｐｏＲを介してＡＭＰＫをリン酸化している可能性が示唆されている。【００１７】
このように、オスモチンの生理活性についての研究が様々なされているが、従来、例えば、タバコオスモチンは、植物体であるタバコから抽出、精製される。しかし、タバコにおいて、タバコオスモチンの発現量は低く、その収量が非常に少ない。【００１８】
そこで、より多くタバコオスモチンを取得するため、様々な試みがなされている。例えば、タバコオスモチンは浸透圧ストレスにより液胞に蓄積されることが知られている。そのため、塩ストレス処理によりタバコオスモチンを発現誘導したタバコ培養細胞から抽出および精製する方法、ならびに組換えＤＮＡ技術を用いて作製した形質転換体タバコより、タバコオスモチン組換えタンパク質を抽出および精製する方法が報告されている。さらに、非特許文献５および６には、発現したタバコオスモチンを細胞外マトリクスに分泌する形質転換体タバコより、タバコオスモチン組換えタンパク質を抽出および精製する方法が開示されている。
【非特許文献１】Lodish et al ,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 2005-2010, 2001.
【非特許文献２】Yamauchi et al ,Nature 423, 762-769, 2003.
【非特許文献３】Yamauchi et al ,Nature Medicine 8, 1288-1295, 2002.
【非特許文献４】Narasimhan et al ,Mol. Cell 17, 171-180, 2005.
【非特許文献５】Maggio et al ,Plant Mol. Biol. Rep. 14, 249-260, 1996.
【非特許文献６】Liu et al ,Plant Sci. 121, 123-131, 1996.
【非特許文献７】Xu Hu and A.S.N. Reddy, Plant Mol. Biol. 34; 949-959, 1997
【発明の開示】
【００１９】
上述したように、ＡｄｉｐｏＲを活性する物質、すなわちＡｄｉｐｏＲアゴニストはメタボリックシンドロームの予防および治療に有効であると考えられる。オスモチンは、ＡｄｉｐｏＲアゴニストの１つと考えられ、メタボリックシンドロームの予防および治療への利用が考えられる。
【００２０】
オスモチンをメタボリックシンドロームの予防および治療に用いる場合、オスモチンを大量生産することが望まれる。しかしながら、上述したように、野生型のタバコ植物体からはごく微量のオスモチンしか取得できない。また、非特許文献５に開示されるような従来のタバコオスモチン組換えタンパク質の大量発現系を用いたとしても、該形質転換体タバコの葉１ｋｇから取得できるタバコオスモチン組換えタンパク質は数ｍｇに過ぎない。このように、従来の技術では、いずれの方法を用いてもタバコオスモチンの収率が非常に低い。そのため、大量のタバコオスモチンまたはその組換えタンパク質を得ようとすると、タバコもしくは形質転換体タバコを広大な面積で栽培する必要が生じる。つまり、栽培場所、栽培設備の点で生産性よくタバコオスモチンを製造することができないという問題が生じる。また、タバコオスモチンまたはその組換えタンパク質を抽出および精製するにも、大量のタバコまたは形質転換体タバコから抽出および精製する必要があるため、多大な労力を要するという問題がある。
【００２１】
また、オスモチンが属するＰＲ−５ファミリーの他のタンパク質では、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現系が報告されている（非特許文献７を参照）。しかしながら、オスモチンについては、ＤＮＡ組換え技術を用いて、細菌や酵母といった異種生物で発現させることが試みられているものの、オスモチン組換えタンパク質を取得するには至っていない（非特許文献５を参照）。
【００２２】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、簡便に、しかも安価かつ大量に取得可能で、生理活性を有するオスモチン組換えタンパク質およびその製造方法、並びにその利用を提供することにある。
【００２３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体において、オスモチン組換えタンパク質を含む封入体を形成させ、該封入体からオスモチン組換えタンパク質を抽出し、該オスモチン組換えタンパク質をリフォールディングさせることにより、生理活性を有するオスモチン組換えタンパク質を、簡便に、しかも安価かつ大量に取得することができることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００２４】
（１）オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体を用いて、オスモチン組換えタンパク質を製造することを特徴とするオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００２５】
（２）上記オスモチン組換えタンパク質の、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼのリン酸化活性を検出する工程を含むことを特徴とする（１）に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００２６】
（３）上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌、酵母、真菌類、昆虫、または哺乳類であることを特徴とする（１）または（２）に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００２７】
（４）上記非植物形質転換体において、オスモチン組換えタンパク質を含む封入体を形成させ、該封入体を抽出し、該封入体を可溶化溶液に溶解させることにより、上記封入体に含まれるオスモチン組換えタンパク質を可溶化し、該可溶化されたオスモチン組換えタンパク質をリフォールディングさせることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００２８】
（５）上記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドであることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（６）上記ポリヌクレオチドは、ジャガイモ、トマト、ピーマン、トウガラシ、およびタバコからなる群より選択されるいずれか１つの植物に由来するポリヌクレオチドであることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００２９】
（７）上記可溶化されたオスモチン組換えタンパク質は、還元型グルタチオンと、酸化型グルタチオンとを含む溶液中、２℃〜４０℃でリフォールディングされることを特徴とする（４）に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００３０】
（８）上記可溶化溶液は、Ｎ‐ラウロイルサルコシンを含有することを特徴とする（４）または（７）に記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００３１】
（９）上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌であり、上記ポリヌクレオチドの発現を、２０℃〜３０℃で誘導することにより、オスモチン組換えタンパク質を産生させることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法。
【００３２】
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載のオスモチン組換えタンパク質の製造方法で製造されたオスモチン組換えタンパク質。
【００３３】
（１１）５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有することを特徴とする（１０）に記載のオスモチン組換えタンパク質。
【００３４】
（１２）（１０）または（１１）に記載のオスモチン組換えタンパク質を含むことを特徴とする組成物。
【００３５】
（１３）生活習慣病の予防または治療に用いられることを特徴とする（１２）に記載の組成物。
【００３６】
（１４）上記生活習慣病は、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧症、動脈硬化、および心臓病からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする（１３）に記載の組成物。
【００３７】
（１５）酸化ストレスに起因する疾患の予防または治療に用いられることを特徴とする（１２）に記載の組成物。
【００３８】
（１６）上記酸化ストレスに起因する疾患が、癌、アルツハイマー病、加齢黄斑変性、皮膚のエイジングからなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする（１５）に記載の組成物。
【００３９】
（１７）５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法であって、
オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体から、オスモチン組換えタンパク質を抽出し、
該オスモチン組換えタンパク質の、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を検出することを特徴とするオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【００４０】
（１８）上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌、酵母、真菌類、昆虫、または哺乳類であることを特徴とする（１７）に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【００４１】
（１９）上記オスモチン組換えタンパク質は、
上記非植物形質転換体において、オスモチン組換えタンパク質を含む封入体を形成させ、
該封入体を抽出し、該封入体を可溶化溶液に溶解させることにより、上記封入体に含まれるオスモチン組換えタンパク質を可溶化し、
該可溶化されたオスモチン組換えタンパク質をリフォールディングさせて得られることを特徴とする（１７）または（１８）に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【００４２】
（２０）上記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドであることを特徴とする（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｋ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｌ）配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２１）上記ポリヌクレオチドは、ジャガイモ、トマト、ピーマン、トウガラシ、およびタバコからなる群より選択されるいずれか１つの植物に由来するポリヌクレオチドであることを特徴とする（１７）〜（１９）のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【００４３】
（２２）上記可溶化されたオスモチン組換えタンパク質は、還元型グルタチオンと、酸化型グルタチオンとを含む溶液中、２℃〜４０℃でリフォールディングされることを特徴とする（１９）に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【００４４】
（２３）上記可溶化溶液は、Ｎ‐ラウロイルサルコシンを含有することを特徴とする（１９）または（２２）に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【００４５】
（２４）上記非植物形質転換体の宿主は、大腸菌であり、
上記ポリヌクレオチドの発現を、２０℃〜３０℃で誘導することにより、オスモチン組換えタンパク質を産生させることを特徴とする（１７）〜（２３）のいずれか１項に記載のオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法。
【００４６】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例におけるタバコオスモチン組換えタンパク質の発現ベクターの構築方法を示す図である。
【図２】図２は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質を添加したＣ２Ｃ１２細胞のライセートを用いたウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質によるＣ２Ｃ１２細胞のＡＭＰＫリン酸化活性測定の結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質を添加したＣ２Ｃ１２細胞のライセートを用いたウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質によるＣ２Ｃ１２細胞のＡＭＰＫリン酸化活性測定の結果を示す図である。
【図８】図８は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質の脂質代謝異常改善効果の評価結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質の糖代謝異常改善効果の評価結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例にかかるタバコオスモチン組換えタンパク質の酸化ストレス低減効果の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の一実施形態について説明すると、以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。【００４９】
＜Ｉ．オスモチン組換えタンパク質＞
本発明にかかるオスモチン組換えタンパク質（以下、単に「本発明にかかる組換えタンパク質」ともいう）は、天然では浸透圧ストレスによって誘導されるオスモチン（以下、「オスモチン」または「Ｏｓｍ」ともいう）の組換えタンパク質であって、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（以下、「ＡＭＰＫ」ともいう）をリン酸化する活性（以下、「ＡＭＰＫリン酸化活性」ともいう）を有するものである。本明細書において、「タンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性」とは、該タンパク質をＡＭＰＫに作用させた時の全ＡＭＰＫ（以下、「ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫ」または「ｔ−ＡＭＰＫ」ともいう）中、リン酸化を受けたＡＭＰＫ（以下、「ｐ−ＡＭＰＫ」ともいう）の割合が意図される。つまり、ｔ−ＡＭＰＫ中、ｐ−ＡＭＰＫの割合が高いほど、該タンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性が高いことを示す。なお、ＡＭＰＫリン酸化活性は、本明細書に記載されている方法により測定することができる。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」または「ペプチド」と交換可能に使用される。【００５０】
なお、ＡＭＰＫリン酸化活性は、Ｏｓｍが有する生理活性の１つである。したがって、本発明にかかる組換えタンパク質は、ＡＭＰＫリン酸化活性以外の生理活性を有していてもよい。ＡＭＰＫリン酸化活性以外の生理活性としては、例えば、酸化ストレス低減活性が挙げられる。【００５１】
酸化ストレス低減活性は、具体的にはSuperoxide disumutase（以下、「ＳＯＤ」ともいう）発現亢進活性を指す。Superoxide(O2-)は、白血球のひとつである顆粒球や単球が外来性の感染に対して示す貪食作用や殺菌作用に不可欠なフリーラジカルの一種であるが、一方でさまざまな生物反応や外的ストレスにより、過剰に産生されると、ＤＮＡに障害を与えることから酸化ストレスの原因物質とされている。ＳＯＤは、Superoxideと水素イオンから過酸化水素と酸素をつくる反応を触媒する酵素で、生体に備わった唯一のSuperoxideを消去する機構として考えられている。したがって、ＳＯＤ発現亢進活性を有する物質は、生体内の酸化ストレスを消去し、酸化ストレスに起因する種々の疾患の予防および改善に有効である。【００５２】
本発明にかかる組換えタンパク質は、植物以外の宿主によって製造されることが好ましい。具体的には、例えば、大腸菌、酵母、真菌類、昆虫、および哺乳類等を宿主として製造されることが好ましく、中でも、大腸菌を宿主として製造されることがより好ましい。より具体的には、後述の本発明にかかるオスモチン組換えタンパク質の製造方法により製造されることが好ましい。【００５３】
本発明にかかる組換えタンパク質は、上述したように、ＡＭＰＫリン酸化活性を有する。上記ＡＭＰＫリン酸化活性は、後述する実施例に記載の方法により測定することができる。本発明にかかる組換えタンパク質は、天然に発現するオスモチンと、同等もしくはそれ以上のＡＭＰＫリン酸化活性を有することが好ましい。【００５４】
ここで、本発明にかかる組換えタンパク質の構造について具体的に説明する。本発明にかかる組換えタンパク質としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４（タバコ由来）、ＡＡＵ９５２４１（ジャガイモ由来）、ＡＡＣ６４１７１（トマト由来）、ＣＡＣ３４０５５（ピーマン由来）、あるいはＡＡＰ８６７８１（トウガラシ由来）として登録されているアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。また、本発明にかかる組換えタンパク質は、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。さらに、本発明にかかる組換えタンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端に付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドや、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグが挙げられる。必要に応じて、これらの付加的なポリペプチドを利用して、本発明にかかる組換えタンパク質のアフィニティー精製を行ってもよい。【００５５】
また、一実施形態において、本発明にかかる組換えタンパク質は、Ｏｓｍの変異体でありうる。つまり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４、ＡＡＵ９５２４１、ＡＡＣ６４１７１、ＣＡＣ３４０５５、あるいはＡＡＰ８６７８１として登録されているアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありうる。具体的には、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４として登録されているアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。なお、本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドが意図される。【００５６】
また、上記変異体には、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が含まれる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。【００５７】
また、好ましい変異体として、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する変異体が挙げられる。このような変異体もまた、本発明にかかる組換えタンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性を変化させない。代表的な保存性置換としては、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換を挙げることができる。【００５８】
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。【００５９】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＡＭＰＫリン酸化活性を有するか否かを容易に決定することができる。【００６０】
また、本発明にかかる組換えタンパク質は、一実施形態として、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４として登録されているアミノ酸配列の第１位〜第２２５位からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。ＯｓｍにおいてＣ末端側の２０アミノ酸残基からなるポリペプチドは、タンパク合成後、液胞へ輸送されるためのシグナル配列であり、削除してもＯｓｍの活性には影響しないことが報告されている（非特許文献６を参照）。したがって、上記ポリペプチドもまた、ＡＭＰＫリン酸化活性を有するため、本発明にかかる組換えタンパク質に含まれる。【００６１】
さらに、本発明にかかる組換えタンパク質は、別の実施形態として、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４として登録されているアミノ酸配列の第２位〜第２４５位からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４として登録されているアミノ酸配列の第２位〜第２２５位からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。【００６２】
本発明にかかる組換えタンパク質は、上記の物性および構造を有するため、ＡＭＰＫを介する経路の活性化または阻害に起因する疾患の治療および改善に利用可能である。また、本発明にかかる組換えタンパク質は、上記の物性および構造を有するため、酸化ストレスの発生に起因する疾患の治療および改善に利用可能である。【００６３】
＜ＩＩ．オスモチン組換えタンパク質の製造方法＞
本発明にかかるオスモチン組換えタンパク質の製造方法（以下、単に「本発明にかかる製造方法」ともいう）は、Ｏｓｍまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体を用いて、ＡＭＰＫリン酸化活性を有するオスモチン組換えタンパク質（以下、「Ｏｓｍ組換えタンパク質」ともいう）を製造する方法である。本発明にかかる製造方法によれば、上述した本発明にかかる組換えタンパク質を効率よく製造することができる。【００６４】
本発明にかかる製造方法は、一実施形態として、具体的には、上記非植物形質転換体から、従来公知の方法を用いて、Ｏｓｍ組換えタンパク質を抽出する実施形態でありうる。この実施形態では、より具体的には、上記非植物形質転換体から、従来公知のタンパク質抽出液中で、従来公知の細胞もしくは組織の破砕方法により、上記非植物形質転換体の細胞または組織を破壊し、遠心分離等により可溶性画分を取得することにより、Ｏｓｍ組換えタンパク質を取得することができる。また、上記可溶性画分から、従来公知の方法を用いて、Ｏｓｍ組換えタンパク質を精製してもよい。【００６５】
また、本発明にかかる製造方法は、別の実施形態として、上記非植物形質転換体において、Ｏｓｍ組換えタンパク質を含む封入体を形成させる工程（以下、「封入体形成工程」ともいう）、該封入体を抽出し、該封入体を可溶化溶液に溶解させることにより、上記Ｏｓｍ組換えタンパク質を可溶化する工程（以下、「可溶化工程」ともいう）、および上記可溶化されたＯｓｍ組換えタンパク質をリフォールディングさせる工程（以下、「リフォールディング工程」ともいう）を含む構成でありうる。【００６６】
本発明にかかる製造方法は、上記いずれの実施形態であっても、さらに、上記非植物形質転換体を作製する工程（以下、「形質転換体作製工程」ともいう）、および上記リフォールディング工程後、得られたＯｓｍ組換えタンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性を検出する工程（以下、「活性検出工程」ともいう）を含んでいてもよい。上記形質転換体作製工程および活性検出工程は、一方のみを含んでいてもよいし、両方を含んでいてもよい。なお、本明細書において、「非植物形質転換体」とは、植物を除く生物を宿主とする形質転換体が意図される。【００６７】
以下、上記の形質転換体作製工程、封入体形成工程、可溶化工程、リフォールディング工程、および活性検出工程を含む実施形態について、詳細に説明する。【００６８】
（Ｉ−１）形質転換体作製工程
上記形質転換体作製工程では、Ｏｓｍまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体を作製する。具体的には、植物を除く宿主に対して、Ｏｓｍまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを発現可能に導入する。本明細書において、「ポリヌクレオチドが発現可能に導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象（宿主）内に発現可能に導入されることを意味する。また、用語「形質転換体」とは、細胞、組織、器官のみならず、生物個体を含むことが意図される。【００６９】
上記植物を除く宿主は、特に限定されるものではなく、植物を除く生物であればよい。具体的には、例えば、大腸菌、酵母、真菌類、昆虫、および哺乳類等を挙げることができるが、本発明はこれらに限定されるものではない。上記例示した宿主のうち、上記植物を除く宿主として、大腸菌を用いることが好ましく、中でも、Ｔ７プロモーターやｌａｃプロモーター等の高発現プロモーターを活性化する転写因子を発現する遺伝型を有する株を用いることがより好ましい。このような株としては、ＢＬ２１株、Origami株、Rosetta株、Rosetta-gami株などを挙げることができる。また、上記宿主として用いる大腸菌は、プロテアーゼ欠損株であることがさらに好ましい。したがって、特に好ましい大腸菌として、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）株を挙げることができる。このような宿主によれば、Ｏｓｍ組換えタンパク質をより効率よく製造することができる。【００７０】
上記ポリヌクレオチドは、一実施形態として、Ｏｓｍをコードするポリヌクレオチドである。具体的には、例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。該ポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号Ｘ６１６７９として登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、タバコ（Nicotiana tabacum）由来のオスモチンをコードする。また、上記ポリヌクレオチドとしては、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＡＹ７３７３１２（ジャガイモ由来のオスモチンをコードするポリヌクレオチド）、ＡＦ０９３７４３（トマト由来のオスモチンをコードするポリヌクレオチド）、ＡＪ２９７４１０（ピーマン由来のオスモチンをコードするポリヌクレオチド）、およびＡＹ２６２０５９（トウガラシ由来のオスモチンをコードするポリヌクレオチド）として登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。さらに、これらポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ＡＭＰＫリン酸化活性を有する。なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。【００７１】
また、一実施形態として、上記ポリヌクレオチドは、Ｏｓｍの変異体をコードするポリヌクレオチドでありうる。このようなポリヌクレオチドは、Ｏｓｍをコードするポリヌクレオチドの変異体と称することもできる。なお、本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。【００７２】
具体的には、上記Ｏｓｍをコードするポリヌクレオチドの変異体は、一実施形態として、配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでありうる。【００７３】
当業者は、周知技術を使用してポリヌクレオチドの塩基配列において１個または数個の塩基を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。【００７４】
また、上記変異体の一実施形態として、配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでありうる。【００７５】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、実施例において用いられているように、ポリヌクレオチドを単離するために用いるプライマーとしても有用である。【００７７】
また、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドが意図される。【００７８】
上記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。【００７９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。【００８０】
また、上記ポリヌクレオチドは、別の実施形態として、配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号１に示される塩基配列の第１位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでありうる。このようなポリヌクレオチドによれば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４として登録されているアミノ酸配列のＣ末端から２０アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドを製造することができる。【００８１】
さらに、上記ポリヌクレオチドは、別の実施形態として、配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第７３８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでありうる。このようなポリヌクレオチドによれば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４として登録されているアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン残基が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドを製造することができる。【００８２】
加えて、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号１に示される塩基配列の第４位〜第６７８位からなる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでありうる。このようなポリヌクレオチドによれば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号ＣＡＡ４３８５４として登録されているアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン残基と、Ｃ末端から２０アミノ酸残基とが欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドを製造することができる。このように、配列番号１に示される塩基配列において、開始コドンである第１位〜第３位が欠失したポリヌクレオチドを用いることにより、翻訳および発現効率が向上する場合がある。したがって、上記構成によれば、Ｏｓｍ組換えタンパク質の生産効率を向上させることができる。【００８３】
上記ポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。具体的には、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが融合されうる。【００８４】
また、上記ポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。【００８５】
上記ポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。また、上記ポリヌクレオチドは、化学合成により取得することもできる。【００８６】
さらに、上記ポリヌクレオチドが変異体である場合、上述したように、人為的に変異を導入して取得する以外に、天然から、所望の変異体を取得できることは周知である。【００８７】
上記形質転換体作製工程において、上記ポリヌクレオチドを、上記植物を除く宿主に、発現可能に導入する方法は特に限定されるものではなく、宿主に応じて、従来公知の方法を用いて導入すればよい。例えば、上記ポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入することができる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等の従来公知の方法を好適に用いることができる。【００８８】
上記組換え発現ベクターは、プラスミドであることが好ましいが、本発明はこれに限定されず、宿主に目的ポリヌクレオチドを発現可能に導入することができるものであればその他の発現ベクターであっても用いることができる。また、上記組換え発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターが組み込まれていることが好ましい。また、上記プロモーターは、Ｏｓｍ組換えタンパク質の発現量を向上させるものであることが好ましい。さらに、上記組換え発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドの翻訳産物であるポリペプチドにタグを付与するためのタグ配列を含んでいてもよい。このようなタグ配列を有することで、上記ポリペプチドを比較的容易に精製することが可能である。【００８９】
細菌における使用に好ましい組換え発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴベクター、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５等を挙げることができる。中でも、Ｔ７プロモーターやｌａｃプロモーターを有するプラスミドベクターであることが好ましい。【００９０】
また、好ましい真核生物ベクターとしては、例えば、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ等を挙げることができる。【００９１】
また、上記ポリヌクレオチドを上記組換えベクターに組み込む方法もまた、特に限定されるものではなく、従来公知の方法で組み込めばよい。このような技術は、当業者には周知である。【００９２】
（Ｉ−２）封入体形成工程
上記封入体形成工程では、Ｏｓｍまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体において、Ｏｓｍ組換えタンパク質を含む封入体を形成させる。なお、本明細書において、「封入体」は、「インクルージョンボディー（inclusion body）」と交換可能に用いられる。【００９３】
上記封入体を形成させる方法は、特に限定されるものではなく、上記ポリヌクレオチドが発現する条件で、上記非植物形質転換体を培養すればよい。本発明では、上記ポリヌクレオチドの発現を、従来公知の遺伝子発現誘導系を用いて誘導することにより、Ｏｓｍ組換えタンパク質を産生させ、上記封入体を形成させることが好ましい。上記遺伝子発現誘導系としては、例えば、温度シフトによる発現誘導系、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）発現誘導系、オーキシン（ＩＡＡ）発現誘導系などが挙げられる。これら遺伝子発現誘導系は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。【００９４】
上記非植物形質転換体の一実施形態として、オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された大腸菌形質転換体を用いる場合、例えば、ＩＰＴＧによる遺伝子誘導系を用いて、２０℃〜３０℃で上記ポリヌクレオチドの発現を誘導することが好ましい。上記温度範囲で上記ポリヌクレオチドの発現を誘導することにより、上記大腸菌形質転換体において、Ｏｓｍ組換えタンパク質を効率よく産生させ、上記封入体を形成させることができる。【００９５】
（Ｉ−３）可溶化工程
上記可溶化工程では、まず、上記封入体形成工程で形成させた封入体を、上記非植物形質転換体から抽出する。該封入体を抽出する方法は特に限定されるものではない。例えば、上記封入体は水に対して不溶であるため、上記非植物形質転換体の細胞または組織を、適当な水性の緩衝液中で破壊し、抽出液を得た後、該抽出液を遠心分離して不溶性画分を回収することにより取得することができる。上記非植物形質転換体の細胞または組織を破壊する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、超音波処理やフレンチプレスなどの物理的溶菌、あるいは界面活性剤やリゾリームなどによる溶菌によって破壊することができる。より具体的には、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤を含有する緩衝液に懸濁し、超音波やフレンチプレスで物理的に破砕した後に、リゾチームとヌクレアーゼを添加し、３０℃〜３７℃で酵素反応させることによって、上記封入体を抽出することができる。【００９６】
また、上記緩衝液は、特に限定されるものではないが、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーやリン酸バッファー（１０ｍＭ〜５０ｍＭ／中性ｐＨ）等を挙げることができる。また、上記緩衝液には、１％〜２％程度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有させてもよい。これにより、上記非植物形質転換体の膜画分由来の不純物であるタンパク質を除去することができる。【００９７】
さらに、上記非植物形質転換体の細胞または組織の破壊には、BugBuster MasterMix (Novagen)等の市販の試薬を用いてもよい。例えば、BugBuster MasterMix (Novagen)によれば、菌体を溶かすリゾチームや大腸菌由来のゲノムＤＮＡを除去するためのヌクレアーゼが含まれているため、上記非植物形質転換体の宿主が大腸菌である場合、機械的破砕なしに菌体を壊して、上記封入体を回収することができる。【００９８】
次に、上記可溶化工程では、上記抽出した封入体を可溶化溶液に溶解する。これにより、上記封入体に含まれるＯｓｍ組換えタンパク質が可溶化される。【００９９】
上記可溶化溶液は、特に限定されるものではなく、上記封入体を可溶化できる可溶化溶液であればよい。上記可溶化溶液としては、具体的には、例えば、界面活性剤および／または変性剤を含む緩衝液を挙げることができる。上記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの非イオン界面活性剤；臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、および臭化セチルトリメチルアンモニウムなどの陽イオン界面活性剤；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ‐ラウロイルサルコシン、デオキシコール酸、コール酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤；ホスファチジルエタノールアミンなどの両性界面活性剤を挙げることができるが、本発明はこれらに限定されるものではない。中でも、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウムを用いることが好ましい。上記変性剤としては、例えば、尿素、チオ尿素、グアニジン塩酸塩等を挙げることができる。これら界面活性剤および変性剤は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。【０１００】
上記界面活性剤およびタンパク質変性剤の可溶化溶液における濃度は、特に限定されるものではなく、用いる界面活性剤およびタンパク質変性剤の種類に応じて、適宜設定されるものである。具体的には、例えば、上記可溶化溶液にＮ‐ラウロイルサルコシンを含有させる場合、その濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）とすることが好ましく、２％（ｗ／ｖ）とすることがより好ましい。上記範囲であれば、上記封入体を効果的に溶解させることができる。【０１０１】
上記可溶化溶液には、還元剤が含まれていてもよい。上記還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、グルタチオン、システイン、シスタミン、２−メルカプトエタノールなどが挙げられるが、特に限定されない。また、これら還元剤は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。【０１０２】
上記可溶化溶液に含まれる緩衝液もまた、特に限定されるものではないが、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液等を挙げることができる。また、上記可溶化溶液のｐＨは、５．５〜１２．５であることが好ましい。中でも、アルカリ性の緩衝液、より具体的にはｐＨが８．０〜１２．５の緩衝液を用いることが好ましい。このような緩衝液に、上記例示した界面活性剤を含有させた可溶化溶液によれば、上記封入体をより効率よく可溶化することができる。【０１０３】
さらに、上記可溶化溶液には、０．１Ｍ〜０．５Ｍの塩が含まれていてもよい。該塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。【０１０４】
また、上記封入体を上記可溶化溶液で処理する条件は特に限定されるものではなく、上記封入体を可溶化できる条件で処理すればよい。つまり、処理温度および処理時間等は、上記可溶化溶液の組成やｐＨに応じて、該可溶化溶液により上記封入体が可溶化されるように適宜設定すればよい。具体的には、上記可溶化溶液のｐＨが中性付近、換言すれば、ｐＨが７〜８である場合、上記処理温度は、４℃〜３７℃であることが好ましく、４℃であることがより好ましい。また、上記処理時間は、３０分〜２４時間とすることが好ましく、１８時間とすることがより好ましい。一方、上記可溶化溶液のｐＨがアルカリ性、換言すれば、ｐＨが９〜１２である場合、上記処理温度は、４℃〜３７℃であることが好ましく、室温（１５℃〜３０℃）であることがより好ましい。また、上記処理時間は、１５分〜２時間とすることが好ましい。上記の処理条件によれば、上記封入体を効率よく溶解させることができる。【０１０５】
上記可溶化工程では、可溶化された封入体を含む溶液、換言すれば、可溶化されたＯｓｍ組換えタンパク質を含む溶液から、該可溶化されたＯｓｍ組換えタンパク質を精製してもよい。該可溶化されたＯｓｍ組換えタンパク質を精製する方法は、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上記可溶化された封入体を含む溶液から、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製することができる。なお、上記可溶化された封入体を含む溶液は、界面活性剤および／または変性剤を含むため、該界面活性剤および／または変性剤存在下でも、使用可能な方法、条件を選択することが好ましい。【０１０６】
（Ｉ−４）リフォールディング工程
上記リフォールディング工程では、上記可溶化工程で可溶化されたＯｓｍ組換えタンパク質をリフォールディングさせる。具体的には、上記可溶化工程後、Ｏｓｍ組換えタンパク質は上記可溶化溶液に溶解した状態にある。上記リフォールディング工程では、この可溶化されたＯｓｍ組換えタンパク質を含む溶液を用いて、該Ｏｓｍ組換えタンパク質を、ＡＭＰＫリン酸化活性を有するＯｓｍ組換えタンパク質にリフォールディングさせる。リフォールディングさせる方法は特に限定されるものではないが、従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、例えば、透析法や、希釈法により行うことができる。【０１０７】
リフォールディングに用いる反応液（以下、「リフォールディング溶液」ともいう）は、特に限定されるものではないが、立体構造の形成、すなわち分子間あるいは分子内のジスルフィド結合の形成を促進、もしくは補助するＳ−Ｓ結合形成促進／補助剤を含有することが好ましい。上記Ｓ−Ｓ結合形成促進／補助剤としては、具体的には、例えば、還元型グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」ともいう）、酸化型グルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」ともいう）、ジチオスレイトール（以下、「ＤＴＴ」ともいう）等を用いることができる。これらは、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。上記リフォールディング溶液におけるＳ−Ｓ結合形成促進／補助剤の濃度は特に限定されるものではなく、用いるＳ−Ｓ結合形成促進／補助剤の種類に応じて、設定すればよい。例えば、上記Ｓ−Ｓ結合形成促進／補助剤として、ＧＳＨとＧＳＳＧとを用いる場合、ＧＳＨ濃度は、１ｍＭ〜５ｍＭとすることが好ましく、ＧＳＳＧ濃度は０．１ｍＭ〜０．５ｍＭとすることが好ましい。また、ＤＴＴを用いる場合、ＤＴＴ濃度は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭとすることが好ましい。【０１０８】
また、上記リフォールディング溶液のｐＨは、５〜８であることが好ましい。さらに、上記リフォールディング溶液には、０．１Ｍ〜０．５Ｍの塩を含んでいてもよい。該塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等を挙げることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。【０１０９】
また、リフォールディング時の温度は、Ｏｓｍ組換えタンパク質がＡＭＰＫリン酸化活性を有するポリペプチドにリフォールディングできる温度であればよい。具体的には、２℃〜４０℃であることが好ましく、４℃〜３７℃で行うことがより好ましく、２０℃〜３０℃で行うことがさらに好ましい。上記温度範囲でリフォールディングを行うことにより、高いＡＭＰＫリン酸化活性を有するＯｓｍ組換えタンパク質となるようにリフォールディングすることができる。【０１１０】
上記リフォールディング工程では、Ｏｓｍ組換えタンパク質のリフォールディング後、該Ｏｓｍ組換えタンパク質を精製してもよい。該Ｏｓｍ組換えタンパク質を精製する方法は、特に限定されるものではない。例えば、リフォールディングされたＯｓｍ組換えタンパク質を含むリフォールディング溶液から、周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製することができる。【０１１１】
（Ｉ−５）活性検出工程
上記活性検出工程では、上記リフォールディング工程でリフォールディングされたＯｓｍ組換えタンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性を検出する。ＡＭＰＫリン酸化活性の検出方法は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、上記Ｏｓｍ組換えタンパク質を細胞（培養細胞）または動物個体に添加／投与して刺激した後、細胞または臓器におけるｔ−ＡＭＰＫに対するｐ−ＡＭＰＫの割合を検出することにより、ＡＭＰＫリン酸化活性を検出することができる。より具体的には、例えば、ｔ−ＡＭＰＫは、抗αＡＭＰＫ抗体を用いることにより検出し、ｐ−ＡＭＰＫは、抗ｐ−ＡＭＰＫ抗体を用いることにより検出し、両者の比をとることで、ＡＭＰＫリン酸化活性を検出することができる。【０１１２】
上記抗αＡＭＰＫ抗体および抗ｐ−ＡＭＰＫ抗体を用いて、ｔ−ＡＭＰＫおよびｐ−ＡＭＰＫを検出する方法は、特に限定されないが、例えば、これら抗体を用いて、細胞または組織サンプルのウェスタンブロッティングを行う方法や、抗αＡＭＰＫ抗体および／またはｐ−ＡＭＰＫ抗体を固定化したＥＬＩＳＡ法により検出することができる。【０１１３】
上述したように、上記ＡＭＰＫリン酸化活性の検出には、細胞または動物個体を用いることができるが、培養細胞を用いることが好ましい。培養細胞によれば、Ｏｓｍ組換えタンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性を、簡便かつ迅速に検出することができる。【０１１４】
また、上記細胞および動物個体は、アディポネクチン受容体（以下、「ＡｄｉｐｏＲ」ともいう）を発現している細胞および動物個体であればよい。ＡｄｉｐｏＲを発現している細胞としては、具体的には、例えば、マウス骨格筋モデルであるＣ２Ｃ１２細胞やマウス肝臓由来細胞であるＦａｏ細胞を挙げることができる。これら細胞は、ＡｄｉｐｏＲを発現しているため、本発明に好適に用いることができる。また、ＡｄｉｐｏＲを発現している細胞として、ＡｄｉｐｏＲを強制発現させた細胞株を用いることもできる。【０１１５】
以上のように、本発明にかかる製造方法によれば、特殊な機器や、設備を必要とすることなく、生理活性を有するＯｓｍ組換えタンパク質を製造することができる。つまり、本発明にかかる製造方法によれば、安価で簡便に、しかも大量に生理活性を有するＯｓｍ組換えタンパク質を製造することが可能である。具体的には、例えば、上記非植物形質転換体として、大腸菌の形質転換体を用いる場合、培養液１Ｌから約１０ｍｇの収量で、生理活性を有するＯｓｍ組換えタンパク質を製造することができる。一方、非特許文献５に開示されるようなタバコ形質転換体からのＯｓｍ組換えタンパク質の収量は、タバコ形質転換体の葉１ｋｇから２ｍｇ〜３ｍｇである。したがって、本発明にかかる製造方法によれば、従来技術よりも格段に高い収量のＯｓｍ組換えタンパク質を得ることができる。さらに、本発明にかかる製造方法によれば、用いる宿主に制約ないため、用途、製造スケール、設備、コストなど様々な条件に対応することができる。【０１１６】
また、上記活性検出工程を含む構成とすれば、オスモチンの変異体から、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有する変異体を容易にスクリーニングし、該Ｏｓｍ組換えタンパク質を取得することができる。すなわち、本発明には、上記封入体形成工程、可溶化工程、リフォールディング工程、および活性検出工程を少なくとも含む、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法が含まれる。本発明にかかるスクリーニング方法によれば、特別の設備や技術を要することなく、簡便に、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するオスモチン組換えタンパク質をスクリーニングすることができる。【０１１７】
＜ＩＩＩ．オスモチン組換えタンパク質を含む組成物＞
本発明にかかる組成物は、上述した本発明にかかる組換えタンパク質を含有する。本発明にかかる組換えタンパク質はＡＭＰＫリン酸化活性を有する。それゆえ、本発明にかかる組成物は、ＡＭＰＫを介する経路の活性化または阻害に起因する疾患を予防または治療するための組成物として用いることができる。【０１１８】
前記疾患としては、生活習慣病を挙げることができる。より具体的には、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧症、動脈硬化、および心臓病を挙げることができる。本発明にかかる組成物は、上記疾患を単独で発症している患者に対して適用してもよいし、複数の疾患を併発している患者に対して適用してもよい。【０１１９】
なお、さらに付言すれば、後述の実施例において実証したように、一局面において、本発明にかかる組換えタンパク質は、糖代謝異常改善効果および脂質代謝異常改善効果を有している。当業者は、糖代謝異常または脂質代謝異常の改善が、生活習慣病、例えば、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化、および心臓病の症状の改善または予防につながることを容易に理解する。【０１２０】
本発明にかかる組成物は、換言すれば、「生活習慣病改善剤」として用いることができる。本明細書において、用語「生活習慣病改善剤」とは、摂取により前記疾患の症状を緩和あるいは解消する効果を有する医薬品、食品、化粧品組成物が意図される。【０１２１】
また、本発明にかかる組換えタンパク質は酸化ストレス低減活性を有する。それゆえ、本発明にかかる組成物は、酸化ストレスに起因する疾患の予防または治療に用いることができる。【０１２２】
前記疾患としては、癌、炎症、アレルギー性疾患、アルツハイマー病、加齢黄斑変性や皮膚のエイジングを挙げることができる。本発明にかかる組成物は、上記疾患を単独で発症している患者に対して適用してもよいし、複数の疾患を併発している患者に対して適用してもよい。【０１２３】
本発明にかかる組成物は、換言すれば、「酸化ストレス低減剤」として用いることができる。本明細書において、用語「酸化ストレス低減剤」とは、摂取により前記疾患の症状を緩和あるいは解消する効果を有する医薬品、食品、化粧品組成物が意図される。【０１２４】
本発明にかかる組成物を、臨床適用のための治療薬剤として用いる場合、その投与条件は、治療対象となる疾患を発症するモデル動物系を用いて決定することができる。すなわち、上記モデル動物を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防または治療効果を得られる条件を決定することができる。【０１２５】
また、本発明にかかる組成物は、薬学的に許容できる所望の担体と組み合わせることができる。上記担体としては、例えば滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、使用可能な担体としては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ばれいしょデンプン、尿素などが挙げられる。また、本発明にかかる組成物には、上記例示した担体以外にも、薬学的に許容される範囲であれば、いかなる物質を含んでいてもよい。【０１２６】
において、本発明にかかる組換えタンパク質の含有量や、該組換えタンパク質以外の成分については特に限定されるものではない。使用用途、投与方法等に応じて設定されればよい。また、
本発明にかかる組成物を製剤化する場合、その剤型は特に限定されない。例えば、溶液（注射剤）、粉体、マイクロカプセル、錠剤などであってよい。また、本発明にかかる組成物を投与対象に投与する方法は、特に限定されるものではなく、全身または局所的に投与することができる。具体的には、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、または経口的に投与することができる。中でも、静脈内投与または経口投与することが好ましく、経口投与がより好ましい。また、全身投与による副作用や、効果の低下がある場合には、局所投与することが好ましい。例えば本発明にかかる組成物を徐放剤と組み合わせ、疾患部位を標的とするドラッグデリバリーにより効果的に治療を行うことが可能と考えられる。投与量、投与方法は、治療薬剤の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。【０１２７】
また、本発明にかかる組成物において、本発明にかかる組換えタンパク質の含有量は特に限定されるものではく、使用用途、投与方法等に応じて設定されればよい。一般的に、本発明にかかる組換えタンパク質の含有量は、総組成物の０．１〜９０重量％であることが好ましい。また、本発明にかかる組成物の投与対象への投与量も特に限定されるものではないが、一般的に、非経口投与では、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。しかし、疾患状態、体重、及び治療に対する患者の個々の反応、投与される組成物の種類、および投与形態、病気の経過の段階または投与の間隔に依存して、これら投与量は適宜調整することが好ましい。つまり、上述した最小投与量より少ない投与量としてもよいし、治療効果を得るために上述した最大投与量を越えて投与してもよい。投与は１回〜数回に分けて行うことができ、１日あたり１〜５回投与することができる。【０１２８】
また、本発明にかかる組成物を投与する対象は、特に限定されるものではない。例えば、ヒト、およびマウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物等が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ＡＭＰＫを介する経路の活性化または阻害に起因する疾患に対する予防法または治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、例えば生活習慣病を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。【０１２９】
また、本発明にかかる組成物は、医薬品として用いることができるだけではなく、食品、化粧品組成物として用いることもできる。このような食品あるいは化粧品組成物としての利用は、ＡＭＰＫを介する経路の活性化または阻害に起因する疾患、例えば、生活習慣病の予防および改善に効果を奏する。【０１３０】
なお、本明細書に接した当業者は、ＡＭＰＫを介する経路の活性化または阻害に起因する疾患、例えば、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化、および心臓病のような生活習慣病、または糖代謝異常、脂質代謝異常の予防または治療のために本発明にかかるタンパク質を投与すること、および上記予防または上記治療のための薬剤の製造において本発明にかかるタンパク質を使用することも本発明の範囲内であることを容易に理解する。【０１３１】
さらに、本発明にかかる組成物は、酸化ストレス低減効果を有することから、医薬品として用いることができるだけではなく、食品、化粧品組成物として用いることもできる。このような食品あるいは化粧品組成物としての利用は、酸化ストレスに起因する疾患の予防・改善に効果を奏する。【０１３２】
なお、本明細書に接した当業者は、酸化ストレスに起因する疾患、例えば、癌、炎症、アレルギー性疾患、アルツハイマー病、加齢黄斑変性や皮膚のエイジングの予防または治療のために本発明にかかるタンパク質を投与すること、および上記予防または上記治療のための薬剤の製造において本発明にかかるタンパク質を使用することも本発明の範囲内であることを容易に理解する。【０１３３】
＜ＩＩＩ−Ａ．食品組成物＞
本発明にかかる組成物を含有する食品組成物の形態は特に制限されない。したがって、本発明の食品は、前述の組成物のまま、又はこれに食品に通常用いられている賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、またはエリキシル剤等の剤型に、公知の手法にて製剤化することもできる。好ましい剤型は錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤およびカプセル剤などの固形投与形態であり、より好ましくは顆粒剤、または錠剤や丸剤等の圧縮成型された剤型である。【０１３４】
食品に通常用いられる賦形剤としては、例えば、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンなど）、滑沢剤（例えば、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコール）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、固結防止剤（例えばシリカ）等を挙げることができる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などを例示することができる。【０１３５】
なお、本発明が対象とする食品には、上記製剤形態を有するサプリメント（保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）および栄養補助食品などのいわゆる健康食品も含まれる）に加えて、前記抗酸化剤を、飲食物の製造原料の一つとして用いて調製される食品（一般食品（健康食品を含む）のほか、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）も含まれる）も含まれる。【０１３６】
ここで食品の種類は特に制限されず、飲料（乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜および果実の飲料、アルコール飲料、コーヒー飲料、粉末飲料、スポーツ飲料、サプリメント飲料、紅茶飲料、緑茶、ゼリー入り飲料、ブレンド茶等の茶飲料等）、菓子類（カスタードプリン、ミルクプリン、果汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、ババロア及びヨーグルト等のデザート類；ミルクアイスクリーム、果汁入りアイスクリーム及びソフトクリーム、アイスキャンディー等の冷菓類；チューインガムや風船ガム等のガム類（板ガム、糖衣状粒ガム）；マーブルチョコレート等のコーティングチョコレートの他、イチゴチョコレート、ブルーベリーチョコレート及びメロンチョコレート等の風味を付加したチョコレート等のチョコレート類；ハードキャンディー（ボンボン、バターボール、マーブル等を含む）、ソフトキャンディー（キャラメル、ヌガー、グミキャンディー、マシュマロ等を含む）、ドロップ、タフィ等のキャラメル類；ハードビスケット、クッキー、おかき、煎餅等の焼き菓子類）、パン類、スープ類（コンソメスープ、ポタージュスープ等）、魚肉加工品（魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉すり身、蒲鉾、竹輪、はんぺん、薩摩揚げ、伊達巻き、鯨ベーコンなど）、畜肉加工品（ハム、ソーセージ、焼き豚等）、麺類（うどん、冷麦、そうめん、ソバ、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、ビーフン、はるさめ及びワンタン等）、ソース類（セパレートドレッシング、ノンオイルドレッシング、ケチャップ、たれ、ソース）、総菜などを例示することができる。中でも継続的に摂取するという観点から、より好ましくは飲料である。【０１３７】
本発明の食品組成物は、その有効成分であるオスモチン組換えタンパク質の酸化ストレス低減作用により、紫外線、生体内食細胞、放射線、化学物質、タバコ、ストレス等により必要以上に生じた活性酸素が関わるとされている各種疾患、例えば、癌、炎症、アレルギー性疾患、アルツハイマー病、加齢黄斑変性や皮膚のエイジングなどとの予防または改善に有効に使用することができる。【０１３８】
このため本発明の食品には、一般食品のほか、ＡＭＰＫ活性化作用または酸化ストレス低減作用を効能とし、その特定の保健用途で使用される食品が含まれる。かかる食品として特定保健用食品またはこれに準じる健康食品を挙げることができる。なお、特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）は、その包装容器などに、日本国厚生労働省が承認または認可した機能表示または保健用途の表示をすることが可能な食品である。本発明において特定の保健の目的は、ＡＭＰＫ活性化、具体的にはＡＭＰＫを介する経路の活性化または阻害に起因する疾患の治療および改善、または、酸化ストレス低減、具体的には酸化ストレスに起因する各種疾患の予防または改善であり、表示の一例として、「抗メタボリックシンドローム作用」、「抗酸化作用」、「ラジカル消去」、「活性酸素消去」、「酸化を予防する」、「老化を抑制または予防する」などを挙げることができる。特定保健用食品は、こうした機能表示ができる点で、機能表示ができない一般食品と差別化を図ることができるため、本発明でいう食品の好適な一態様である。【０１３９】
＜ＩＩＩ−Ｂ．化粧品組成物＞
本発明にかかる組成物を含有する化粧品組成物の形態は特に制限されない。したがって、固体、液体、ペースト、ゼリー、粉末などのいずれの状態をとるものであってもよい。このような状態を形成するために、例えばゲル化剤を用いて固化したり、液体を用いて分散状態にしたりすることができる。また、溶媒を添加して溶液にしたり、噴霧乾燥して粉末状にしたりすることもできる。【０１４０】
また、本発明に係る本発明にかかる組成物を含有する化粧品組成物の剤形は限定されず、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、丸剤、錠剤、固形剤、液剤、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート、ムース、浴用剤など多様なものとすることができる。【０１４１】
本発明に係る本発明にかかる組成物を含有する化粧品組成物はヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が期待できる限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。【０１４２】
本発明の本発明にかかる組成物を含有する化粧品組成物には、使用目的に応じて美白剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗菌剤、及びそれら以外のさまざまな成分をさらに添加させておくことができる。以下に、添加剤の例を示す。【０１４３】
（美白剤）
美白剤が、メラニン生成抑制剤および／またはチロシナーゼ活性阻害剤であってもよい。【０１４４】
例えば、美白剤として、Ｌ−アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン及びその誘導体、ルシノール、エデト酸及びその誘導体、並びに胎盤抽出物、t-AMCHA、アセロラエキス、エイジツエキス、エラグ酸またはその誘導体、火辣エキス、カミツレエキス、カミツレ花エキス、キウイエキス、グルタチオン、トコトリエノール、フェルラ酸、ラズベリーケトン、ルシノール、ウワウルシエキス、ジパルミチン酸ピリドキシン、イオウ、コウジ酸またはその誘導体、グルコサミンまたはその誘導体、ヒドロキシケイヒ酸またはその誘導体、グルタチオン、アルニカエキス、オウゴンエキス、ソウハクヒエキス、サイコエキス、ボウフウエキス、マンネンタケ菌糸体培養物またはその抽出物、シナノキエキス、モモ葉エキス、エイジツエキス、クジンエキス、ジユエキス、トウキエキス、ヨクイニンエキス、カキ葉エキス、ダイオウエキス、ボタンピエキス、ハマメリスエキス、マロニエエキス、オトギリソウエキス、油溶性カンゾウエキス等が例示される。【０１４５】
これらの美白剤は、１種を単独で、若しくは２種以上を組み合わせて用いることができる。【０１４６】
（抗老化剤）
抗老化剤が、抗炎症剤および／または抗酸化剤であってもよい。【０１４７】
例えば、抗老化剤として抗炎症剤と抗酸化剤が用いられ、抗炎症剤としては、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸及びその塩、イソプロピルアミノカプロン酸及びその塩、アラントイン、塩化リゾチーム、グアイアズレン、サリチル酸メチル、γ−オリザノール、抗酸化剤としては、αカロチン、βカロチン、γカロチン、リコピン、クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、イソゼアキサンチン、ロドキサンチン、カプサンチン、クロセチン等のカロチノイド；１，４−ジアザシクロオクタン、２，５−ジメチルフラン、２−メチルフラン、２，５−ジフェニルフラン、１，３−ジフェニルイソベンゾフラン、αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、ｄトコフェロール、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、アラニン又はそのアルキルエステル；ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、アスコルビン酸、タンニン酸、エピカテキン、エピカロカテキン、エピカテキンガレート、エピカロカテキンガレート等のタンニン類、ルチン等のフラボノイド、その他没食子酸プロピル、アスタキサンチン、カロチン、トコフエロール、アスコルビン酸、エデト酸四ナトリウム、エリソルビン酸、酢酸トコフェロール、酢酸レチノール、ジビチルヒドロキシトルエン、ステアリン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、メチルシラノールジオレイルトコフェロール無水ケイ酸混合物、ニコチン酸ベンジル、感光素４０１号、アスパラギン酸、アデノシン三リン酸２Ｎａ、アミノ酪酸、ウイキョウエキス、オランダカラシエキス、カフェイン、クロレラエキス、サフランエキス、ショウキョウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、葉酸、レチノール、パルミチン酸レチノール、イノシトール、ウコンエキス、オリザノール、カロチン、カロットエキス、コムギ胚牙エキス、センキュウエキス、チンピエキス、トウキエキス、トウキ根エキス、ドクダミエキス、トコフフェロール、ニコチン酸トコフェロール、ボタンエキス、エルゴカルシフェロール、ジカプリル酸ピリドキシン、バチルアルコール、ステアリン酸グリチルレチニル、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、塩酸ジフェンヒドラミン、塩化リゾチーム、アミノカプロン酸、レイシエキス、ヨクイニン、メリロートエキス、ボタンエキス、トウキエキス、トウキ根エキス、センキュウエキス、ゲンノショウコエキス、アラントイン、アルニカエキス、アルニカ花エキス、オウゴンエキス、オウレンエキス、オドリコソウエキス、ガマ穂エキス、カミツレエキス、カラミン、カワラヨモギエキス、甘草エキス、グアイアズレン、クチナシエキス、クマザサエキス、グリチルリチン酸２Ｋ、グリチルレチン酸ステアリル、ゲンチアナエキス、紅茶エキス、コンフリーエキス、コンフリー葉エキス、酢酸トコフェロール、サリチル酸メチル、酸化亜鉛、シコンエキス、ムラサキ根エキス、シソエキス、シソ葉エキス、シモツケソウエキス、シャクヤクエキス、スイカズラエキス、セージエキス、セイヨウキズタエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、トウキンセンカエキス、ピリドキシンＨＣｌ、ビワ葉エキス、フユボダイジュエキス、モモ葉または���実エキス、ヤグルマギクエキス、ユキノシタエキス、ヨモギエキス、レタスエキス、ローマカミツレエキス、ワレモコウエキス及びカカロール、ポリアミン等が例示される。【０１４８】
これらの抗老化剤は、１種を単独で、若しくは２種以上を組み合わせて用いることができる。【０１４９】
（保湿剤）
保湿剤としては、親水性保湿剤および／または親油性保湿剤であればよく、親水性保湿剤として、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、高級アルコール及びこれらの誘導体、親油性保湿剤として、リン脂質、糖脂質、ステロイド類等を用いてもよい。【０１５０】
保湿剤として、ピリドンカルボン酸ナトリウム、グリコール、グリセリン、グルコース、マルトース、マルチトール、ショ糖、フラクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、スレイトール、エリスリトール、デンプン分解糖還元アルコール、ソルビトール、多価アルコール類としては、エチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３−プロパンジオール、その他セリン、グリシン、スレオニン、アラニン、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ヒドロネクチン、フィブロネクチン、ケラチン、エラスチン、ローヤルゼリー、コンドロイチン硫酸ヘパリン、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、リノール酸またはそのエステル類、エイコサペンタエン酸またはそのエステル類、ペクチン、ビフィズス菌発酵物、乳酸発酵物、酵母抽出物、レイシ菌糸体培養物またはその抽出物、小麦胚芽油、アボガド油、米胚芽油、ホホバ油、ダイズリン脂質、γ−オリザノール、ビロウドアオイエキス、ヨクイニンエキス、ジオウエキス、タイソウエキス、カイソウエキス、キダチアロエエキス、ゴボウエキス、マンネンロウエキス、アルニカエキス、小麦フスマ、ピロリドンカルボン酸、トマトエキス、ツバキ油、大豆リン脂質、ヒアルロン酸、トレオニン、グリコール酸アンモニウム、アルギン酸メチルシラノール、ヨクイニン、トウキエキス、トウキ根エキス、ダイズエキス、アスパラガスエキス、ＤＮＡ−Ｎａ、ＰＣＡ−Ｎａ、ＲＮＡ−Ｎａ、アシタバエキス、アスパラギン酸、アマチヤエキス、アラニン、アルギニン、アルギン酸Ｎａ、アルテアエキス、アロエベラエキス、オイスタエキス、オオムギバクガエキス、カキ葉、加水分解ケラチン、加水分解コラーゲン、加水分解コンキオリン、加水分解卵殻膜、加水分解卵白、加水分解シルク、加水分解ダイズタンパク、褐藻エキス、カリンエキス、キイチゴエキス、キシリトール、キトサン、キュウリエキス、キュウリ果実エキス、グアバ菓エキス、クインスシードエキス、グリシン、グリセリン、グルコース、グレープフルーツエキス、グレープフルーツ果実エキス、クレマティスエキス、ゴボウエキス、コメ発酵液、コンドロイチン硫酸Ｎａ、魚コラ一ゲノ、サンザシエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、グリセリン、シスチン、システイン、スギナエキス、ゼニアオイエキス、セリン、ソルビトール、ダイズタンパク、トマトエキス、乳酸Ｎａ、乳酸桿菌、ダイズ醗酵エキス、ノバラエキス、コーン油、ハチミツ、ヒアルロン酸Ｎａ、フクノエキス、ベタイン、ヘチマエキス、マルチトール、マルトース、マンニトール、ユリエキス、ラクトフェリン、リシン、リンゴエキス、レンゲソウエキス、ローヤルゼリー、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール１０００、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソブチル、ヘキシルデカノール、乳酸ミリスチル、ラノリン脂肪酸、トリカプリルグリセリル、オレイルアルコール、オレイン酸オクチルドデシル、オレイン酸デシル、還元ラノリン、オクチルドデカノ���ル、アーモンド油、アボカド油、オリーブ油、オレイン酸、オレンジラフイー油、カカオ脂、カロットエキス、ゴマ油、サザンカ油、サフラワー油、ジヒドロコレステロール、スクワラン、ステアリン酸コレステリル、セラミド２、月見草油、ヒマシ油、ヒマワリ油、セフニド３、ヒマワリ種子油ハイブリッドヒマワリ油、フィトスフィンゴシン、ブドウ種子油、ホホバ油、ホホバ種子油、ミネラルオイル、ミンク油、マカデミアナッツ油、メドウフォーム油、ユーリ油、ユーカリ葉油、ラノリン、リノール酸、ローズヒップ油、ワセリン及びポリグルタミン酸等が例示される。【０１５１】
これらの保湿剤は、１種を単独で、若しくは２種以上を組み合わせて用いることができる。【０１５２】
（紫外線吸収剤）
紫外線吸収剤としては、安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、ケイ皮酸系紫外線吸収剤、トリアジン系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤などを使用しても良い。【０１５３】
例えば紫外線吸収剤 として、紫外線吸収剤が安息香酸アミル、パラアミノ安息香酸オクチル、サリチル酸エチレングリコール、サリチル酸フェニル、サリチル酸オクチル、サリチル酸ベンジル、サリチル酸ブチルフェニル、サリチル酸ホモメンチル、ケイ皮酸ベンジル、パラメトキシケイ皮酸２−エトキシエチル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、ジパラメトキシケイ皮酸モノ２−エチルヘキサン酸グリセリル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、ジイソプロピル−ジイソプロピルケイ皮酸エステル混合物、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、ヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸およびその塩、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノンジスルフォン酸ナトリウム、ジヒドロキシベンゾフェノン、テトラヒドロキシベンゾフェノン、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシ−ジベンゾイルメタン、２，４，６−トリアニリノ−ｐ−（カルボ−２’−エチルヘキシル−１’−オキシ）−１，３，５−トリアジン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、パラジメチルアミノ安息香酸２−エチルヘキシル、パラアミノ安息香酸エチル、トプチルメトキシジペンゾイルメタン、オキシベンゾン−１、グアイアズレンスルホン酸エチル、酸化亜鉛、シノキサート、アントラニル酸系紫外線吸収剤としては、例えば、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレートなどが例示される。【０１５４】
これらの紫外線吸収剤は、１種を単独で、若しくは２種以上を組み合わせて用いることができる。【０１５５】
（抗菌剤）
抗菌剤が、有機系抗菌剤および／または無機系抗菌剤であってもよい。【０１５６】
例えば、抗菌剤として、オウバク抽出液、ハロカルバン、クロロフェネシン、塩化リゾチーム、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、イソプロピルメチルフェノール、チモール、ヘキサクロロフェン、ベルベリン、チオキソロン、サリチル酸およびそれらの誘導体、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、パラクロルメタクレゾール、塩化ベンザルコニウム、フェノキシエタノール、イソプロピルメチルフェノール、石炭酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ヘキサクロロフェン、塩化クロルヘキシジン、トリクロロカルバニリド、感光素、ビス（２−ピリジルチオ−１−オキシド）亜鉛、チアントール、ヒノキチオール、トリクロサン、トリクロロヒドロキシジフェニルエーテル、クロルヘキシジングルコン酸塩、フェノキシエタノール、レゾルシン、アズレン、サリチル酸、ジンクピリチオン、モノニトログアヤコールナトリウム、ウイキョウエキス、サンショウエキス、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンゼトニウム及びウンデシレン酸誘導体などが例示される。【０１５７】
これらの抗菌剤は、１種を単独で、若しくは２種以上を組み合わせて用いることができる。【０１５８】
本発明にかかる組成物を含有する化粧品組成物において、界面活性剤を含有していても良い。例えば、界面活性剤としては、アニオン界面活性剤（カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩）、カチオン界面活性剤（アミン塩、四級アンモニウム塩）、両性界面活性剤（カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤）、非イオン界面活性剤（エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤）、その他の界面活性剤（天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタンまたはケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤などが挙げられる。【０１５９】
本発明にかかる組成物を含有する化粧品組成物において、非イオン性の界面活性剤や低級アルコール、多価アルコール、あるいはオリーブ油、スクワラン、脂肪酸などの天然油脂に溶解して用いてもよい。【０１６０】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン等）；グリセリンポリグリセリン脂肪酸類（例えば、モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリン、セスキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、α，α’−オレイン酸ピログルタミン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸等）；プロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、モノステアリン酸プロピレングリコール等）；硬化ヒマシ油誘導体；グリセリンアルキルエーテル等が挙げられる。【０１６１】
ＰＯＥ系の親水性非イオン界面活性剤としては、例えば、ＰＯＥ−ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンモノステアレート、ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンテトラオレエート等）；ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート、ＰＯＥ−ソルビットモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビットペンタオレエート、ＰＯＥ−ソルビットモノステアレート等）；ＰＯＥ−グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥ−グリセリンモノステアレート、ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート、ＰＯＥ−グリセリントリイソステアレート等のＰＯＥ−モノオレエート等）；ＰＯＥ−脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥ−ジステアレート、ＰＯＥ−モノジオレエート、ジステアリン酸エチレングリコール等）；ＰＯＥ−アルキルエーテル類（例えば、ＰＯＥ−ラウリルエーテル、ＰＯＥ−オレイルエーテル、ＰＯＥ−ステアリルエーテル、ＰＯＥ−ベヘニルエーテル、ＰＯＥ−２−オクチルドデシルエーテル、ＰＯＥ−コレスタノールエーテル等）；プルロニック型類（例えば、プルロニック等）；ＰＯＥ・ＰＯＰ−アルキルエーテル類（例えば、ＰＯＥ・ＰＯＰ−セチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ−２−デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ−モノブチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ−水添ラノリン、ＰＯＥ・ＰＯＰ−グリセリンエーテル等）；テトラＰＯＥ・テトラＰＯＰ−エチレンジアミン縮合物類（例えば、テトロニック等）；ＰＯＥ−ヒマシ油硬化ヒマシ油誘導体（例えば、ＰＯＥ−ヒマシ油、ＰＯＥ−硬化ヒマシ油、ＰＯＥ−硬化ヒマシ油モノイソステアレート、ＰＯＥ−硬化ヒマシ油トリイソステアレート、ＰＯＥ−硬化ヒマシ油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、ＰＯＥ−硬化ヒマシ油マレイン酸等）；ＰＯＥ−ミツロウ・ラノリン誘導体（例えば、ＰＯＥ−ソルビットミツロウ等）；アルカノールアミド（例えば、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等）；ＰＯＥ−プロピレングリコール脂肪酸エステル；ＰＯＥ−アルキルアミン；ＰＯＥ−脂肪酸アミド；ショ糖脂肪酸エステル；アルキルエトキシジメチルアミンオキシド；トリオレイルリン酸等が挙げられる。【０１６２】
低級アルコールとしては、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等が挙げられる。【０１６３】
多価アルコールとしては、例えば、２価のアルコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、テトラメチレングリコール、２，３−ブチレングリコール、ペンタメチレングリコール、２−ブテン−１，４−ジオール、ヘキシレングリコール、オクチレングリコール等）；３価のアルコール（例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等）；４価アルコール（例えば、１，２，６−ヘキサントリオール等のペンタエリスリトール等）；５価アルコール（例えば、キシリトール等）；６価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール等）；多価アルコール重合体（例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、ジグリセリン、ポリエチレングリコール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ポリグリセリン等）；２価のアルコールアルキルエーテル類（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、エチレングリコールモノ２−メチルヘキシルエーテル、エチレングリコールイソアミルエーテル、エチレングリコールベンジルエーテル、エチレングリコールイソプロピルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル等）；２価アルコールアルキルエーテル類（例えば、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエチルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールイソプロピルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールエチルエーテル、ジプロピレングリコールブチルエーテル等）；２価アルコールエーテルエステル（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノフェニルエーテルアセテート、エチレングリコールジアジベート、エチレングリコールジサクシネート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノエチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノプロピルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノフェニルエーテルアセテート等）；グリセリンモノアルキルエーテル（例えば、キミルアルコール、セラキルアルコール、バチルアルコール等）；糖アルコール（例えば、ソルビトール、マルチトール、マルトトリオース、マンニトール、ショ糖、エリトリトール、グルコース、フルクトース、デンプン分解糖、マルトース、キシリトース、デンプン分解糖還元アルコール等）；グリソリッド；テトラハイドロフルフリルアルコール；ＰＯＥ−テトラハイドロフルフリルアルコール；ＰＯＰ−ブチルエーテル；ＰＯＰ・ＰＯＥ−ブチルエーテル；トリポリオキシプロピレングリセリンエーテル；ＰＯＰ−グリセリンエーテル；ＰＯＰ−グリセリンエーテルリン酸；ＰＯＰ・ＰＯＥ−ペンタンエリスリトールエーテル、ポリグリセリン等が挙げられる。【０１６４】
油類としては、アボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油およびその硬化油。流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンがある。【０１６５】
高級脂肪酸としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などがある。高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコール、ホホバアルコール、ラノリンアルコール、バチルアルコール、２−デシルテトラテセシノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール等がある。合成エステルとしては、例えば、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等がある。シリコーンとしては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、デカメチルシクロポリシロキサン等の環状ポリシロキサン、シリコーン樹脂等の三次元網目構造のもの等がある。【０１６６】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【０１６７】
本発明について、実施例および比較例、並びに図１〜図９に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。【０１６８】
〔調製例１：タバコＢＹ−２培養細胞からのタバコオスモチン遺伝子の単離〕
タバコＢＹ−２培養細胞から、図１に示すフローで、タバコオスモチン遺伝子を単離した。以下、タバコオスモチン遺伝子の単離方法について詳細に説明する。【０１６９】
（１）鋳型ＤＮＡサンプルの調製
タバコＢＹ−２培養細胞より、RNeasy Plant RNA Kit(QIAGEN)を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡ ３μｇをRQ1 RNase-Free DNase（Promega）を用いてＤＮａｓｅ除去処理を行い、TaqMan Reverse Transcription Reagent(Applied Biosystems)を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ（以下、「試料１」ともいう）を含む溶液を合成した。【０１７０】
（２）タバコオスモチン遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号２および３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、それぞれ、「オリゴ１」および「オリゴ２」ともいう）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。なお、オリゴ１はＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号Ｘ６１６７９として登録されている塩基配列（配列番号１に示される塩基配列）の第１位〜第２０位の塩基と相同な配列からなるフォワードプライマーであり、オリゴ２はＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号Ｘ６１６７９として登録されている塩基配列（配列番号１に示される塩基配列）の第７１８位〜第７３８位の塩基に相補的な配列からなるリバースプライマーである。【０１７１】
（３）ＰＣＲ法によるタバコオスモチン遺伝子の増幅
上記試料１を含む溶液２μｌ、オリゴ１およびオリゴ２を各２５ｐｍｏｌｅｓ、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、KOD-plus DNAポリメラーゼにミリＱを加えて全量を５０μｌとした。ＰＣＲ反応は最初に９４℃で１分間の熱処理後、次いで９４℃−１５秒間のデナチュレーション工程、及び５５℃−３０秒間のアニーリング及び６８℃−１分間のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３０サイクル行うことにより実施した。【０１７２】
（４）タバコオスモチン遺伝子のクローニング
上記で増幅したタバコオスモチン遺伝子を含むＰＣＲ反応液を２％アガロースゲル電気泳動にて単離し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)にて精製し、タバコオスモチン遺伝子のみを含むＤＮＡ（ＰＣＲ産物；以下、「試料２」ともいう）を含有する溶液を調製した。試料２はTArget Clone-plus（東洋紡績）を用いてプラスミドベクターへ挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株に形質転換し、全長タバコオスモチン遺伝子を挿入したプラスミドＤＮＡ（以下、「試料３」ともいう）を含む溶液を調製した。【０１７３】
〔調製例２：タバコオスモチン遺伝子を含む組換え発現ベクターの作製〕
調製例１で単離したタバコオスモチン遺伝子を用いて、図１に示すフローで、組換え発現ベクターを構築した。以下、組換えベクターの構築方法について詳細に説明する。【０１７４】
（１）タバコオスモチン遺伝子へ制限酵素サイトを付加するためのオリゴの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号３および４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、それぞれ「オリゴ３」および「オリゴ４」ともいう）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。なお、オリゴ３はＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号Ｘ６１６７９として登録されている塩基配列（配列番号１に示される塩基配列）の第４位〜第１９位の塩基と相同な配列の５’末端側にＥｃｏＲＩサイトが付加された塩基配列からなるフォワードプライマーであり、オリゴ４はＧｅｎＢａｎｋにアクセション番号Ｘ６１６７９として登録されている塩基配列（配列番号１に示される塩基配列）の第６６２位〜第６７５位の塩基に相補的な配列の５’末端側にＳａｃＩサイトが付加された塩基配列からなるリバースプライマーである。【０１７５】
（２）タバコオスモチン遺伝子への制限酵素サイトの付加
上記試料３を含む溶液を２μｌ、オリゴ３およびオリゴ４を各２５ｐｍｏｌｅｓ、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、KOD-plus DNAポリメラーゼにミリＱを加えて全量を５０μｌとした。【０１７６】
ＰＣＲ反応は最初に９４℃で１分間の熱処理後、次いで９４℃−１５秒間のデナチュレーション工程、及び５５℃−３０秒間のアニーリング及び６８℃−１分間のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３０サイクル行うことにより実施した。上記で増幅したＰＣＲ反応液を２％アガロースゲル電気泳動にて単離し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)にて精製し、制限酵素サイトを付加されたタバコオスモチン遺伝子のみを含むＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩサイトを付加したタバコオスモチン遺伝子；以下、「試料４」ともいう）を含有する溶液を調製した。【０１７７】
（３）タバコオスモチン遺伝子タンパク発現ベクターの構築
上記試料４を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）およびＳａｃＩ（宝酒造）にて制限酵素処理し、制限酵素処理した試料４を含むＤＮＡ溶液を１％アガロースゲル電気泳動にて単離し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)にて精製し、制限酵素により切断されたタバコオスモチン遺伝子を含むＤＮＡ（osmotin-EcoRI/SacI；以下、「試料５」ともいう）を含有する溶液を調製した。なお、制限酵素処理の試薬組成および反応条件は試薬の推奨条件に従った。同様にｐＥＴ２８ａベクターも制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩにて制限酵素処理し、ｐＥＴ２８ａベクターを含むＤＮＡ溶液より、制限酵素により切断されたｐＥＴ２８ａベクターを含むＤＮＡ（pET28-EcoRI/SacI；以下、「試料６」ともいう）を含有する溶液を調製した。【０１７８】
試料５と試料６とをモル比で５：１の割合で混合し、DNA Ligation Kit Ver.1(宝酒造)を加え、１６℃にて１８時間のライゲーション反応を行った。得られた反応液１μｌを大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造）５０μｌと混合し、定法に従い形質転換した。出現したコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出し、ｐＥＴ２８ａに組込まれたタバコオスモチン遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（osmotin-pET28；以下、「試料７」ともいう）を含む溶液を調製した。【０１７９】
〔実施例１：大腸菌を用いたタバコオスモチン組換えタンパク質の大量発現〕
（１）形質転換体大腸菌の作製およびタバコオスモチン組換えタンパク質の発現誘導
調製例２で調製した試料７を含む溶液を１μｌと、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)株 ２０μｌとを混合し、定法に従い形質転換した。出現したコロニーより釣菌し、ＬＢ−Ｋａｍ(カナマイシン)液体培地５ｍｌに植菌し、３７℃にて１６時間培養した。翌日、培養液５ｍｌをＴＢ−Ｋａｍ液体培地５００ｍｌに添加し、３７℃にて３時間培養後、ＩＰＴＧ １ｍＭを添加し、さらに２５℃にて６時間培養した。【０１８０】
（２）封入体の調製および可溶化
上記で培養したＴＢ−Ｋａｍ液体培地より集菌し、得られた大腸菌ペレットをBugBuster MasterMix(Novagen) ２０ｍｌに懸濁した。室温にて２０分間インキュベートした後、５８００×ｇにて２０分間遠心し、上清を除去して封入体を調製した。調製した封入体は可溶化バッファー１（２％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）に懸濁し、４℃で１８時間インキュベートすることで可溶化させ、タバコオスモチン組換えタンパク質を含むライセートを調製した。【０１８１】
（３）リフォールディング
上記で調製したライセートを再生バッファー（０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、５ｍＭ還元型グルタチオン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）にて２５℃または４℃で６時間透析した。透析終了後、ライセートを回収し、PD-10 Column(GEヘルスケア)にて脱塩およびＰＢＳ（ｐＨ７．４）への置換を行った。脱塩し、ＰＢＳ置換したライセートを還元レムリ処理し、２−１５％グラジエントゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルをクマシー染色したところ、図２に示すように、約２６ｋＤの位置に単一のバンドが検出された。【０１８２】
〔実施例２：タバコオスモチン組換えタンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性測定〕
（１）Ｃ２Ｃ１２細胞の分化誘導
マウス骨格筋細胞であるＣ２Ｃ１２細胞を１２穴プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地にて１００％コンフルエントになるまで培養した後、２．５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地に交換して７日間培養し、分化誘導した。【０１８３】
（２）タバコオスモチン組換えタンパク質の添加
上記の分化誘導させたＣ２Ｃ１２細胞を無血清培地に交換して、３７℃で７時間培養した後、培地中に０．５ｍＭ／ｗｅｌｌとなるように、ＡＩＣＡＲ(1-b-D-ribofuranoside:TRC)を加え、さらに３７℃で１時間培養した。ＡＩＣＡＲ添加の１時間後に２５℃または４℃でリフォールディングさせたタバコオスモチン組換えタンパク質をＡＩＣＡＲ同様に培地中に添加して、３７℃で７分間培養した後、Ｃ２Ｃ１２細胞を回収した。回収した細胞は液体窒素で凍結し、測定まで−８０℃にて保存した。【０１８４】
（３）ウェスタンブロッティング
上記にて回収したＣ２Ｃ１２細胞に細胞溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸、１０ｍＭフッ化ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）を各ウェル１００μｌ添加して細胞を回収し、超音波処理後、１０，０００×ｇにて１５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は還元レムリ処理を行い、１サンプルあたり１０μｇずつ用いて７．５％アクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、定法に従ってＰＶＤＦ膜に転写した。【０１８５】
上記にてタンパクが転写されたＰＶＤＦ膜は５％スキムミルク溶液を用いて、室温にて１時間のブロッキング反応を行った。ブロッキング終了後、抗αＡＭＰＫポリクローナル抗体（１／１０００ Ｔｏｔａｌ  ＡＭＰＫ:Cell Signalling）およびリン酸化ＡＭＰＫモノクローナル抗体（１／１０００ ｐ−ＡＭＰＫ:Cell Signalling）を用いて、室温にて１時間の一次抗体反応を行った。一次抗体反応終了後、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（ZYMED）を用いて室温にて４５分間の二次抗体反応を行った。二次抗体反応終了後、ECL Detection Reagent（GEヘルスケア）にて検出した。その結果を図３に示す。【０１８６】
（４）活性評価
上記のウェスタンブロッティングにて検出されたバンド（図３を参照）をScion Imagesにて画像解析し、Ｔｏｔａｌ  ＡＭＰＫに対するｐ−ＡＭＰＫの割合を算出した。その結果、図４に示すように、無血清培地のみを添加したブランクと比較して、タバコオスモチン組換えタンパク質の濃度に依存して、ＡＭＰＫがリン酸化されている割合が増加することが確認できた。また、図４に示すように、４℃よりも２５℃にてリフォールディングさせたタバコオスモチン組換えタンパク質のほうがより強いＡＭＰＫリン酸化活性を示すことが確認できた。【０１８７】
〔実施例３：タバコオスモチン組換えタンパク質の発現誘導条件の検討〕
調製例１で単離したタバコオスモチン遺伝子を、ｐＥＴ３２発現ベクターに、発現可能に導入し、該タバコオスモチン遺伝子を含むｐＥＴ３２を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に定法にて形質転換した。こうして得られた形質転換体を、１ｍＭのＩＰＴＧの添加後、３７℃で培養したところ、タバコオスモチン組換えタンパク質の発現はほとんど見られなかった。一方、ＩＰＴＧ添加後の培養温度を、３０℃、２５℃と下げたところ、培養温度の低下に伴って、タバコオスモチン組換えタンパク質の発現量の増加が見られた。【０１８８】
また、ＩＰＴＧ濃度（換言すれば、発現誘導の強さ）および培養時間が同じ条件で培養温度を変えると、培養温度が低い方が菌体の生育が良くなるという傾向が見られた。このことから、ＩＰＴＧ添加後、低温で培養することにより、タバコオスモチンの抗菌活性が一部抑制され、大腸菌が増殖可能になり、発現量も増加するのではないかと推測された。【０１８９】
〔比較例１〕
調製例２で調製した試料７と、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株とを混合し、定法により形質転換した。こうして得られた形質転換体を用いて、実施例１と同様の方法で、タバコオスモチン組換えタンパク質の発現を誘導したが、タバコオスモチン組換えタンパク質は全く発現しなかった。【０１９０】
〔比較例２〕
実施例１の封入体を、可溶化バッファー１に代えて、可溶化バッファー２（２Ｍ 尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）または可溶化バッファー３（４Ｍ 尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）に懸濁し、３７℃で１時間インキュベートしたところ、該封入体を十分に可溶化することはできなかった。【０１９１】
〔実施例４：大腸菌を用いたタバコオスモチン組換えタンパク質の大量発現〕
（１）形質転換体大腸菌の作製およびタバコオスモチン組換えタンパク質の発現誘導
調製例２で調製した試料７を含む溶液を１μｌと、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ (ＤＥ３)株 ２０μｌとを混合し、定法に従い形質転換した。出現したコロニーより釣菌し、ＬＢ−Ｋａｍ(カナマイシン)液体培地５ｍｌに植菌し、３７℃にて１６時間培養した。翌日、培養液５ｍｌをＴＢ−Ｋａｍ液体培地５００ｍｌに添加し、３７℃にて４時間培養後、ＩＰＴＧ ０．１ｍＭを添加し、さらに２５℃にて４時間培養した。【０１９２】
（２）可溶性画分からのタバコオスモチン組換えタンパク質の回収
上記で培養したＴＢ−Ｋａｍ液体培地より集菌し、得られた大腸菌ペレットをBugBuster MasterMix(Novagen) ２０ｍｌに懸濁した。室温にて２０分間インキュベートした後、５８００×ｇにて２０分間遠心し、上清を回収することによって、ライセート（可溶性画分）を調製した。調製したライセートを、精製バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース・ビーズと混合した後、４℃で１時間インキュベートして、当該ライセートに含まれるタバコオスモチン組換えタンパク質をビーズに吸着させた。インキュベート終了後、１５００×ｇにて５分間遠心し、上清を除去してビーズを回収した。ビーズは洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール、２０％グリセロール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）で洗浄し、溶出バッファー（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）にて溶出を行い、精製されたタバコオスモチン組換えタンパク質を回収した。【０１９３】
（３）大腸菌由来シャペロニンの除去
上記で回収したタバコオスモチン組換えタンパク質について、PD-10 Column(GEヘルスケア)を用いて、脱塩および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）への置換を行った。脱塩し、バッファー置換したタバコオスモチン組換えタンパク質を、反応バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍｇ／ｍｌ カゼイン：ｐＨ８．０）を用いて、最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように調整した後、３７℃で３０分間インキュベートし、タバコオスモチン組換えタンパク質に結合した大腸菌由来シャペロニンを除去した。【０１９４】
シャペロニンを除去したタバコオスモチン組換えタンパク質溶液に、ＮａＣｌを最終濃度が３００ｍＭになるように添加した後、５８００×ｇで２０分間遠心し、上清を回収した。【０１９５】
回収した上清を、精製バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース・ビーズと混合した後、４℃で１時間インキュベートして、上清に含まれるタバコオスモチン組換えタンパク質をビーズに吸着させた。インキュベート終了後、１５００×ｇにて５分間遠心し、上清を除去してビーズを回収した。回収したビーズを、洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール、２０％グリセロール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）、およびＬＰＳ除去バッファー（１．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）で洗浄した後、溶出バッファー（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ：ｐＨ８．０）にて溶出して、タバコオスモチン組換えタンパク質を回収した。【０１９６】
回収したタバコオスモチン組換えタンパク質はＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて４℃で１６時間透析し、脱塩およびＰＢＳへの置換を行った。ＰＢＳ置換したタバコオスモチン組換えタンパク質を還元レムリ処理し、２−１５％グラジエントゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルをクマシー染色したところ、図５に示すように、約２６ｋＤの位置にバンドが検出された。【０１９７】
〔実施例５：タバコオスモチン組換えタンパク質のＡＭＰＫリン酸化活性測定〕
（１）Ｃ２Ｃ１２細胞の分化誘導
マウス骨格筋細胞であるＣ２Ｃ１２細胞を１２穴プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地にて１００％コンフルエントになるまで培養した後、培地を２．５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地に交換して７日間培養し、分化誘導した。【０１９８】
（２）タバコオスモチン組換えタンパク質の添加
上記の分化誘導させたＣ２Ｃ１２細胞について、培地を無血清培地に交換して、３７℃で７時間培養した後、培地中に２ｍＭ／ｗｅｌｌとなるように、ＡＩＣＡＲ(1-b-D-ribofuranoside:TRC)を加え、さらに３７℃で３０分間培養した。ＡＩＣＡＲ添加の１時間後に、可溶性画分より精製してシャペロニンを除去したタバコオスモチン組換えタンパク質を、ＡＩＣＡＲ同様に培地中に添加して、３７℃で７分間培養した後、Ｃ２Ｃ１２細胞を回収した。回収した細胞は液体窒素で凍結し、後述する測定まで−８０℃にて保存した。【０１９９】
（３）ウェスタンブロッティング
上記にて回収したＣ２Ｃ１２細胞に、細胞溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸、１０ｍＭフッ化ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）を各ウェル１００μｌ添加して細胞を回収し、超音波処理後、１０，０００×ｇにて１５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は還元レムリ処理を行い、１サンプルあたり１０μｇずつ用いて７．５％アクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、定法に従ってＰＶＤＦ膜に転写した。【０２００】
上記にてタンパクが転写されたＰＶＤＦ膜は５％スキムミルク溶液を用いて、室温にて１時間のブロッキング反応を行った。ブロッキング終了後、抗αＡＭＰＫポリクローナル抗体（１／１０００ Ｔｏｔａｌ  ＡＭＰＫ:Cell Signalling）およびリン酸化ＡＭＰＫモノクローナル抗体（１／１０００ ｐ−ＡＭＰＫ:Cell Signalling）を用いて、室温にて１時間の一次抗体反応を行った。一次抗体反応終了後、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（ZYMED）を用いて室温にて４５分間の二次抗体反応を行った。二次抗体反応終了後、ECL Detection Reagent（GEヘルスケア）にて検出した。その結果を図６に示す。【０２０１】
（４）活性評価
上記のウェスタンブロッティングにて検出されたバンド（図６を参照）をScion Imagesにて画像解析し、Ｔｏｔａｌ  ＡＭＰＫに対するｐ−ＡＭＰＫの割合を算出した。その結果、図７に示すように、無血清培地のみを添加したブランクと比較して、タバコオスモチン組換えタンパク質の添加により、ＡＭＰＫがリン酸化されている割合が増加したことが確認できた。【０２０２】
〔実施例６：タバコオスモチン組換えタンパク質の脂質代謝異常改善効果〕
（１）動物
オス＋Ｌｅｐｒｄｂ  ／  ＋Ｌｅｐｒｄｂ  マウス（ｄｂマウス）（週齢７−１０）を、日本チャールズリバーより購入した。【０２０３】
（２）腹腔内投与による脂質代謝異常改善効果の測定
ＰＢＳで懸濁したタバコオスモチン組換えタンパク質（Ｏｓｍ）を、一群のｄｂマウス（Ｏｓｍ投与群）に対して体重当たり０．０５ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内投与した。対照として、等量のＰＢＳを他群のｄｂマウス（ＰＢＳ投与群）に腹腔内投与した。投与前（０ｈ）および投与９時間後（９ｈ）に採血を行い、得られた血漿中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）濃度を測定した。その結果を図８に示す。Ｏｓｍ投与群ではＰＢＳ投与群と比較して、有意にＦＦＡ濃度が低下しており、タバコオスモチン組換えタンパク質に、脂質代謝異常改善効果が認められた。【０２０４】
〔実施例７：タバコオスモチン組換えタンパク質の糖代謝異常改善効果〕
（１）動物
オス＋Ｌｅｐｒｄｂ  ／  ＋Ｌｅｐｒｄｂ  マウス（ｄｂマウス）（週齢７−１０）は日本チャールズリバーより購入した。【０２０５】
（２）経口糖負荷試験による糖代謝異常改善効果の測定
浸透圧ポンプ（Alzet）をｄｂマウスの背部の皮下に外科手術により挿入した。上記浸透圧ポンプにより、一群のｄｂマウス（Ｏｓｍ投与群）に対して、ＰＢＳで懸濁したタバコオスモチン組換えタンパク質（Ｏｓｍ）が１日につき体重当たり０．０５ｍｇ／ｋｇ持続投与されるように設定した。対照として、他群のｄｂマウス（ＰＢＳ投与群）に対して、等量のＰＢＳが持続投与されるように設定した。投与開始より１０日目に経口糖負荷試験を行い、Ｏｓｍ投与群およびＰＢＳ投与群の糖代謝能を測定した。【０２０６】
（３）糖代謝異常改善効果の評価
経口糖負荷試験において、糖負荷後０分、１５分、３０分、６０分、および１２０分における血糖値を測定し、糖代謝異常改善効果を評価した。その結果を図９に示す。血糖値の変動を表わすグラフにおいて、Ｏｓｍ投与群では１５分、３０分、６０分のポイントでＰＢＳ投与群よりも有意に血糖値が低く、タバコオスモチン組換えタンパク質に、糖代謝異常改善効果が認められた。【０２０７】
〔実施例８：タバコオスモチン組換えタンパク質の酸化ストレス低減効果〕
（１）動物
オス＋Ｌｅｐｒｄｂ  ／  ＋Ｌｅｐｒｄｂ  マウス（ｄｂマウス）（週齢７−１０）は日本チャールズリバーより購入した。【０２０８】
（２）タバコオスモチン組換えタンパク質の連続投与および脂肪組織の採取
ｄｂマウスの血糖値および体重が均等になるように、４匹ずつ２つの群に分けた。浸透圧ポンプ（Alzet）をｄｂマウスの背部の皮下に外科手術により挿入した。上記浸透圧ポンプにより、一群のｄｂマウス（Ｏｓｍ投与群）に対して、ＰＢＳで懸濁したタバコオスモチン組換えタンパク質（Ｏｓｍ）が１日につき体重当たり０．０５ｍｇ／ｋｇ持続投与されるように設定した。対照として、他群のｄｂマウス（ＰＢＳ投与群）に対して、等量のＰＢＳが持続投与されるように設定した。投与開始より１２日目に解剖を行い、精巣周囲脂肪組織を採取した。【０２０９】
（３）精巣周囲脂肪組織からの全ＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製
採取したマウスの精巣周囲脂肪組織から全ＲＮＡを調製した。具体的には、浸透圧ポンプにてタバコオスモチン組換えタンパク質を１２日間投与した後の精巣周囲脂肪組織を摘出し、ＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を添加し、ホモゲナイザーでつぶしてからそれぞれ全ＲＮＡを調製した。なお、全ＲＮＡの調製は、ＴＲＩＺＯＬを用いて付属のプロトコールに従って行った。得られた全ＲＮＡはＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製）に溶解した。調製した全ＲＮＡ ３μｇをRQ1 RNase-Free DNase（Promega）を用いてＤＮａｓｅ除去処理を行い、TaqMan Reverse Transcription Reagent(Applied Biosystems)を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ（以下、「試料８」ともいう）を含む溶液を合成した。【０２１０】
（４）リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の変動解析
試料８を各サンプル等量ずつ採取し、混合したｃＤＮＡを１倍、３倍、９倍、２７倍にＤＥＰＣ水で段階希釈し、検量線作成用の標準サンプルとした。残りの試料８をＤＥＰＣ水で３倍希釈し、測定サンプルとした。標準サンプルおよび測定サンプルを、TaqMan Gene Expression Master Mix(ABI)およびTaqMan Gene Expression Assays(ABI)を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。なお。操作はキットに付属のプロトコールにしたがって行った。【０２１１】
（５）遺伝子解析
上記のリアルタイムＰＣＲの結果を、SDS2.2(ABI)を用い、各測定サンプルにおける遺伝子発現変動を標準サンプルで作成した検量線にて表した相対的遺伝子発現変動の結果を図１０に示す。酸化ストレスを消去する作用を有する酵素Super oxidedismutase（ＳＯＤ）の遺伝子発現を、内部標準として用いた36B4遺伝子の発現量にて補正すると、Ｏｓｍ投与群において有意なＳＯＤ遺伝子発現の上昇が認められた。すなわち、Ｏｓｍ投与によって脂肪組織による酸化ストレスが低減されることが判明した。【０２１２】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。【０２１３】
本発明にかかるオスモチン組換えタンパク質の製造方法は、オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体を用いて、オスモチン組換えタンパク質を製造する。それゆえ、オスモチン組換えタンパク質を、簡便に、しかも安価かつ大量に取得することができるという効果を奏する。【０２１４】
また、本発明にかかるオスモチン組換えタンパク質のスクリーニング方法は、オスモチンまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入された非植物形質転換体から、オスモチン組換えタンパク質を抽出し、該オスモチン組換えタンパク質の、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を検出する。それゆえ、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼをリン酸化する活性を有するオスモチン組換えタンパク質を容易にスクリーニングするという効果を奏する。【０２１５】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２１６】
以上のように、本発明は、生理活性を有するＯｓｍ組換えタンパク質を提供するとともに、該Ｏｓｍ組換えタンパク質を簡便に、しかも安価かつ大量に製造する方法を提供する。したがって、オスモチンの生理活性を利用する分野、具体的には、医薬品分野や、医療分野、食品分野、化粧品分野等に広く用いることができる。
【図１】
2008133141.tif 000002
【図４】
2008133141.tif 000003
【図７】
2008133141.tif 000004
【図８】
2008133141.tif 000005
【図９】
2008133141.tif 000006
【図１０】
2008133141.tif 000007
【図２】
2008133141.tif 000008
【図３】
2008133141.tif 000009
【図５】
2008133141.tif 000010
【図６】
2008133141.tif 000011
【配列表】
2008133141000001.app
【国際調査報告】
2008133141.tif 000012
2008133141.tif 000013
2008133141.tif 000014
2008133141.tif 000015