(57)【要約】【課題】低投与量で治療効果の高い核酸系代謝拮抗剤の誘導体が望まれている。【解決手段】ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤であるヌクレオシド誘導体の水酸基とがエステル結合していることを特徴とする核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体及びその製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤の水酸基とがエステル結合していることを特徴とする核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項２】
側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がポリグルタミン酸誘導体である請求項１に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項３】
核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体が下記一般式（１）：
【化７】
2008056596.tif 000014
［式中、Ｒは水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を示し、Ａは水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アシル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基を示し、ｍは平均値で３〜２００、ｎは平均値で５〜２０００を示し、Ｘは核酸系代謝拮抗剤残基、水酸基、疎水性置換基、及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）（Ｒ１、Ｒ２は同一でも異なっていてもよく３級アミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基）からなる群から選ばれ、核酸系代謝拮抗剤残基及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）を含む基である請求項１又は２に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項４】
ｍのうち５〜９５％はＸが核酸系代謝拮抗剤残基、０〜９５％はＸが水酸基、０〜８０％はＸが疎水性置換基、５〜８０％はＸが−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）である請求項３に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項５】
ｍのうち５〜７０％はＸが核酸系代謝拮抗剤残基、５〜７０％はＸが水酸基、２０〜７０％はＸが疎水性置換基、５〜７０％はＸが−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）である請求項３に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項６】
ＲがＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、ＡがＣ２〜Ｃ４アシル基であり、ｍが平均値で５〜１００、ｎが平均値で５０〜１０００であり、核酸系代謝拮抗剤残基が式（２）：
【化８】
2008056596.tif 000015
［式中、−Ｒｆは、式（３）：
【化９】
2008056596.tif 000016
の置換基群より選ばれる基を示す］
で表されるいずれかの核酸系代謝拮抗剤の残基である請求項３〜５のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項７】
Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、核酸系代謝拮抗剤残基がゲムシタビン又はドキシフルリジン残基である請求項６に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項８】
疎水性置換基が一般式（４）：
【化１０】
2008056596.tif 000017
［式中、Ｑは中性アミノ酸の側鎖を示し、ＷはＣ１〜Ｃ６アルキル基又はベンジル基を示す］
で表されるα−アミノ酸誘導体である請求項３〜７のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項９】
Ｑがイソプロピル基又はベンジル基であり、Ｗがベンジル基である請求項８に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項１０】
疎水性置換基が一般式（５）：
【化１１】
2008056596.tif 000018
［式中、Ｔはフェニル基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す］
で表される基である請求項３〜７のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項１１】
Ｔがベンジル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基又は５−フェニルペンチル基である請求項１０に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項１２】
Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、核酸系代謝拮抗剤残基がゲムシタビン残基であり、疎水性置換基が４−フェニルブトキシ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基であり、−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である請求項３に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項１３】
ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸代謝拮抗剤とを有機溶媒中カルボジイミド系の縮合剤を用いてエステル結合させることで得られる、核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分として含む抗腫瘍剤。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分として含む抗ウイルス剤。
【請求項１６】
ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸代謝拮抗剤のヌクレオシド誘導体とを、有機溶媒中カルボジイミド系の縮合剤を用いてエステル結合させることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体、その用途及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍あるいはウイルス性疾患の治療を目的として種々の核酸系代謝拮抗剤の開発が行なわれ、抗腫瘍剤（抗癌剤）としてはシタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ネララビン（ｎｅｌａｒａｂｉｎｅ）等が、抗ウイルス剤としてはザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）等が臨床で使用されている。【０００３】
しかし、これら核酸系代謝拮抗剤は強いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示すにもかかわらず、生体内での代謝・排泄を受けやすいために本来の薬剤が持つ薬効を十分に発揮できなかったり、あるいは高投与量を必要とするものが多い。例えば、ゲムシタビンはｉｎ  ｖｉｔｒｏではパクリタキセルやドキソルビシン等の抗癌剤に匹敵する強い細胞増殖抑制活性を有するのに対し、臨床においては体表面積あたり１回１０００ｍｇ／ｍ2の高投与が必要である。これは、２’−デオキシシチジンの代謝酵素であるシチジン脱アミノ化酵素によって塩基の４位アミノ基が代謝・失活されることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ利用率が低くなるためと考えられている（非特許文献１参照）。【０００４】
ポリマーに薬剤を結合させることにより、生体内における薬物動態が改善し治療効果の向上がみられることがある。非特許文献２には、平均分子量約３００００のポリグルタミン酸類とシタラビンとを結合させた高分子誘導体が記載されている。しかしながら、薬剤の高分子誘導体には免疫反応により過敏反応を示す場合があり、その様な場合には薬剤として繰返し投与ができない。【０００５】
特許文献１にはポリエチレングリコール類にシチジン系誘導体を結合させた高分子誘導体が，非特許文献３にはポリエチレングリコール類の両末端にアスパラギン酸を分枝状に置換させそれにシタラビンを結合させた高分子誘導体が記載されている。さらに，特許文献５にはポリエチレングリコール鎖の末端にアミノ酸を用い分岐させ，その各分岐がベンジル脱離反応を受けた後に薬剤を放出する構造を持つ高分子誘導体が記載されている。しかし，これらすべての高分子誘導体は，血漿中での加水分解速度が、長くても数１０時間でそれほど遅くなっておらず，高分子誘導体そのものが，生体内に長時間滞留し，長時間にわたって内包化合物を放出しない。さらに，これら高分子誘導体は，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の加水分解速度と血漿中の加水分解速度の差が大きく，加水分解反応が生体内の酵素に大きく依存するため，臨床上における治療効果が患者の個体差に大きく影響される可能性がある。【０００６】
特許文献２にはポリエチレングリコール類とポリアスパラギン酸が縮合したブロック型ポリマーに薬剤を結合した分子がミセルを形成し医薬となることが記載されている。又、特許文献３にはポリエチレングリコール類とポリグルタミン酸が縮合したブロック型ポリマーのグルタミン酸側鎖カルボキシル基に抗癌性物質を結合させた高分子が記載されている。しかしながら、これらには結合する薬剤として核酸系代謝拮抗剤に関する記載はない。【０００７】
さらに、特許文献４にはポリエチレングリコールとポリカルボン酸との重合体のカルボキシル基と、フェノール性カンプトテシン類のフェノール性水酸基とを、エステル縮合した水溶性高分子誘導体が癌化学療法に適していることが記載されているが、これらは薬剤の結合様式がフェノールとカルボキシル基が結合したエステルであり、１級アルコールや２級アルコールとカルボキシル基が結合したエステルではない。また、これらにも結合する薬剤として核酸系代謝拮抗剤に関する記載はない。【０００８】
【特許文献１】特表２００３−５２４０２８号公報
【特許文献２】特許第２６９４９２３号公報
【特許文献３】特開平５−９５５号公報
【特許文献４】国際公開番号ＷＯ２００４／０３９８６９号パンフレット
【特許文献５】特表２００４−５３２２８９号公報
【０００９】
【非特許文献１】「キャンサー・サイエンス」、日本癌学会発行、２００４年、第９５巻、１０５−１１１頁（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．９５、ｐ．１０５−１１１（２００４））
【非特許文献２】「キャンサー・リサーチ」（米国）、米国癌学会発行、１９８４年、第４４巻、２５−３０頁（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．４４、ｐ．２５−３０（１９８４））
【非特許文献３】「ジャーナル  オブ  コントロールド  リリース」（英国）、エルゼヴィア発行、２００２年、第７９巻、５５−７０頁（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｖｏｌ．７９、ｐ．５５−７０（２００２））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、低投与量でより高い効果を有し新規な抗癌剤又は抗ウイルス剤となる核酸系代謝拮抗剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体、特にポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤の水酸基とがエステル結合していることを特徴とする核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を見出した。【００１２】
即ち、本発明は次の（１）〜（１６）に関する。
（１）ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤の水酸基とがエステル結合していることを特徴とする核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（２）側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がポリグルタミン酸誘導体である上記（１）記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（３）核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体が下記一般式（１）【００１３】
【化１】
2008056596.tif 000003
［式中、Ｒは水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を示し、Ａは水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アシル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基を示し、ｍは平均値で３〜２００、ｎは平均値で５〜２０００を示し、Ｘは核酸系代謝拮抗剤残基、水酸基、疎水性置換基、及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）（Ｒ１、Ｒ２は同一でも異なっていてもよく３級アミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基）からなる群から選ばれ、核酸系代謝拮抗剤残基及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）を含む基である上記（１）又は（２）に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（４）ｍのうち５〜９５％はＸが核酸系代謝拮抗剤残基、０〜９５％はＸが水酸基、０〜８０％はＸが疎水性置換基、５〜８０％はＸが−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）である上記（３）に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（５）ｍのうち５〜７０％はＸが核酸系代謝拮抗剤残基、５〜７０％はＸが水酸基、２０〜７０％はＸが疎水性置換基、５〜７０％はＸが−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）である上記（３）に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（６）ＲがＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、ＡがＣ２〜Ｃ４アシル基であり、ｍが平均値で５〜１００、ｎが平均値で５０〜１０００であり、核酸系代謝拮抗剤残基が式（２）：【００１４】
【化２】
2008056596.tif 000004
［式中、−Ｒｆは、式（３）：【００１５】
【化３】
2008056596.tif 000005
の置換基群より選ばれる基を示す］
で表されるいずれかの核酸系代謝拮抗剤の残基である上記（３）〜（５）のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（７）Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、核酸系代謝拮抗剤残基がゲムシタビン又はドキシフルリジン残基である上記（６）に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（８）疎水性置換基が一般式（４）【００１６】
【化４】
2008056596.tif 000006
［式中、Ｑは中性アミノ酸の側鎖を表し、ＷはＣ１〜Ｃ６アルキル基又はベンジル基を示す］
で表されるα−アミノ酸誘導体である上記（３）〜（７）のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（９）Ｑがイソプロピル基又はベンジル基であり、Ｗがベンジル基である上記（８）に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（１０）疎水性置換基が一般式（５）：【００１７】
【化５】
2008056596.tif 000007
［式中、Ｔはフェニル基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す］
で表される基である、上記（３）〜（７）のいずれか一項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（１１）Ｔがベンジル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基又は５−フェニルペンチル基である、上記（１０）に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（１２）Ｒがメチル基、Ａがアセチル基であり、ｍが平均値で１０〜６０、ｎが平均値で１００〜３００であり、核酸系代謝拮抗剤残基がゲムシタビン残基であり、疎水性置換基が４−フェニルブトキシ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基、−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である、上記（３）に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（１３）ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤とを有機溶媒中カルボジイミド系の縮合剤を用いてエステル結合させることで得られる、核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体。
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分として含む抗腫瘍剤。
（１５）前記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分として含む抗ウイルス剤。
（１６）ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸代謝拮抗剤のヌクレオシド誘導体とを、有機溶媒中カルボジイミド系の縮合剤を用いてエステル結合させることを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の製造法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤の水酸基とがエステル結合し、且つ何らかの疎水性残基が結合した構造を有することを特徴とし、生体内において血中に長時間滞留し、核酸系代謝拮抗剤を長時間徐放することができ、低投与量で治療効果に優れる抗癌剤又は抗ウイルス剤として有用である。本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、その構造上、水中で水と親和性の高いポリエチレングリコール類部位を外殻、疎水性残基や核酸系代謝拮抗剤を有する側鎖を内殻とした凝集体を形成すると考えられる。したがって、酵素非依存的に薬剤を徐放する性質を有し、このため治療効果に対する患者の個体差の影響が少ない誘導体となり得る。又、本発明の高分子誘導体は選択的に患部に集積し、より高い効果で副作用が少ない薬剤となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤の水酸基とを有機溶媒中カルボジイミド系の縮合剤を用いて脱水縮合して得られることを特徴とする。【００２０】
本発明における「核酸系代謝拮抗剤」とは、抗腫瘍活性又は抗ウイルス活性を有し、ヌクレオシド誘導体の構造を有する化合物である。より具体的には、「核酸系代謝拮抗剤」とは、核酸塩基部分が上記式（２）から選択されるいずれかであり、それに結合している基（Ｒｆ）が上記式（３）から選択されるいずれかである化合物である。【００２１】
更に具体的には、例えば、本発明の核酸系代謝拮抗剤として、下記式（６）に構造を示すシタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ネララビン（ｎｅｌａｒａｂｉｎｅ）、２’−メチリデン−２’−デオキシシチジン（ＤＭＤＣ）、テザシタビン（ｔｅｚａｃｉｔａｂｉｎｅ）、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５’−ＤＦＣＲ）、トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）、３’−エチニルシチジン（Ｅｔｈｙｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）又は２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。【００２２】
【化６】
2008056596.tif 000008
【００２３】
本発明において「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」における側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分としては、カルボキシル基を有する側鎖がポリマー主鎖から枝分かれしたグラフト型ポリマーやポリカルボン酸ポリマーが縮合したブロック型ポリマー等が挙げられる。【００２４】
側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がグラフト型ポリマーである前記の高分子化合物としては、例えば、特開平１１−２７９０８３号公報に記載のポリエチレングリコールとアクリル酸類の縮合物とアクリル酸類あるいは無水マレイン酸等とを共重合反応に供し、必要に応じて加水分解反応に付すこと等によって得られるポリマー等が挙げられる。【００２５】
側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がブロック型ポリマーである前記の高分子化合物としては、末端官能基を有するポリエチレングリコール類と末端に官能基を有するポリカルボン酸を結合した化合物や、特許文献３に記載されている、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール類で重合を開始するアミノ酸活性化物の重合反応によって得られる化合物等が挙げられる。【００２６】
側鎖にカルボキシル基を有するポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリンゴ酸又はポリグルタミン酸等が挙げられ、好ましくはポリグルタミン酸である。【００２７】
本発明における「ポリエチレングリコール類」としては、両末端又は片末端が修飾されたポリエチレングリコール誘導体でもよく、その場合、両末端の修飾基は同一でも異なっていてもよい。末端の修飾基としては、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基が挙げられ、好ましくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基である。【００２８】
置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基におけるＣ１〜Ｃ６アルキル基としては直鎖、分岐鎖又は環状のＣ１〜Ｃ６アルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基又はｔ−ブチル基等であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基である。【００２９】
置換基を有してもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基の置換基としては特に限定されない。例えば、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基等が挙げられ、好ましくはアミノ基である。【００３０】
本発明においては両末端が修飾されたポリエチレングリコール誘導体が好ましく、具体的には、一方の末端がＣ１〜Ｃ６アルキル基で他方の末端がアミノＣ１〜Ｃ６アルキル基であるポリエチレングリコール誘導体が挙げられ、一方の末端がＣ１〜Ｃ４アルキル基で他方の末端がアミノＣ１〜Ｃ４アルキル基であるポリエチレングリコール誘導体が好ましく、特に一方の末端がメチル基で他方の末端がアミノプロピル基であるポリエチレングリコール誘導体が好ましい。【００３１】
本発明における「ポリエチレングリコール類」の重量平均分子量としては２００〜５０００００程度であり、好ましくは５００〜１０００００程度、より好ましくは２０００〜５００００程度である。【００３２】
本発明における「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」として好ましくはブロック型ポリマーであり、より好ましくはポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシル基を有するポリマーのブロック共重合体である。【００３３】
ポリエチレングリコール類と側鎖にカルボキシル基を有するポリマーのブロック共重合体としては、例えば、アルコキシポリエチレングリコール−ポリアクリル酸、アルコキシポリエチレングリコール−ポリメタクリル酸又はアルコキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸等が挙げられ、好ましくはメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸である。【００３４】
本発明における「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」の１分子あたりの平均カルボキシル基数としては、３〜２００個程度であり、好ましくは５〜１００個程度、より好ましくは１０〜６０個程度である。【００３５】
本発明における「ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物」の重量平均分子量としては５００〜５０００００程度であり、好ましくは２０００〜１０００００程度であり、より好ましくは３０００〜５００００程度である。【００３６】
本発明において、ポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物にエステル結合している核酸系代謝拮抗剤の結合量は、１個〜カルボキシル基の総数の範囲内であれば特に限定されず、生体内に投与した際に薬効を示す量であればよい。好ましくはポリマー部分の総カルボキシル基数の５〜１００％、より好ましくは５〜７０％である。【００３７】
上記結合量は、本発明化合物の紫外線吸収スペクトルの強度から求めることができる。又、本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体をアルカリ加水分解することにより遊離する核酸系代謝拮抗剤を、例えば、高速液体クロマトグラフィー等で定量することによっても求めることができる。【００３８】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の代表的な化合物として、前記一般式（１）［式中、Ｒは水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルキル基を示し、Ａは水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アシル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基を示し、ｍは平均値で３〜２００、ｎは平均値で５〜２０００を示し、Ｘは核酸系代謝拮抗剤残基、水酸基、疎水性置換基、及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）（Ｒ１、Ｒ２は同一でも異なっていてもよく３級アミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基）からなる群から選ばれる基であって、核酸系代謝拮抗剤残基及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）を含む基（すなわち核酸系代謝拮抗剤残基、水酸基、疎水性置換基、及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）からなる群から２種以上選ばれる基であって、核酸系代謝拮抗剤残基及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）が必須であり、その他が任意である基）を示し、好ましくは、ｍのうち５〜９５％はＸが核酸系代謝拮抗剤残基、０〜９５％はＸが水酸基、０〜８０％はＸが疎水性置換基、５〜８０％はＸが−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）である］で表される化合物が挙げられる。【００３９】
一般式（１）中、ＲにおけるＣ１〜Ｃ６アルキル基は上記のアルキル基と同じ意味であり、好ましい基も同様である。【００４０】
一般式（１）中、ＡにおけるＣ１〜Ｃ６アシル基は、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基又はヘキサノイル基が挙げられ、好ましくはＣ２〜Ｃ４アシル基、例えば、アセチル基又はプロピオニル基であり、より好ましくはアセチル基である。【００４１】
一般式（１）中、ＡにおけるＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基は、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペントキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、シクロプロポキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基又はシクロヘキシルオキシカルボニル基が挙げられ、好ましくはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であり、より好ましくはエトキシカルボニル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である。【００４２】
一般式（１）中、ｍは平均値で３〜２００であり、好ましくは５〜１００程度であり、より好ましくは１０〜６０程度である。【００４３】
一般式（１）中、ｎは平均値で５〜２０００であり、好ましくは５０〜１０００程度であり、より好ましくは１００〜３００程度である。【００４４】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の一般式（１）において、Ｘが核酸系代謝拮抗剤残基であるグルタミン酸誘導体、Ｘが水酸基であるグルタミン酸誘導体、Ｘが疎水性置換基であるグルタミン酸誘導体、及びＸが−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）であるグルタミン酸誘導体がランダムに結合していても、Ｘの種類ごとにブロックを形成して結合していてもよい。一般式（１）中、Ｘにおける核酸系代謝拮抗剤として特に好ましくは、ゲムシタビンが挙げられる。【００４５】
一般式（１）のＸにおける疎水性置換基としては種々の置換基が挙げられ、核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の薬効発現に支障をきたさない限り特に限定されない。好ましくは上記一般式（４）［式中、Ｑは中性アミノ酸の側鎖を表し、ＷはＣ１〜Ｃ６アルキル基又はベンジル基を示す］で表されるα−アミノ酸誘導体又は上記一般式（５）［式中、Ｔはフェニル基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す］で表される基が挙げられる。【００４６】
一般式（４）のＱにおいて中性アミノ酸の側鎖としては、例えば、水素原子、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ベンジル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基等の天然型アミノ酸残基又はｔｅｒｔ−ブトキシメチル基、ベンジルオキシメチル基、ベンジルオキシカルボニルメチル基、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基等のアミノ酸残基誘導体等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基、ベンジルオキシカルボニルメチル基、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基等であり、より好ましくはイソプロピル基、ベンジル基、ベンジルオキシメチル基又は２−ベンジルオキシカルボニルエチル基であり、特に好ましくはイソプロピル基又はベンジル基である。【００４７】
一般式（４）のＷにおけるＣ１〜Ｃ６アルキル基としては前記のアルキル基と同じ基が挙げられ、好ましい基も同様である。【００４８】
一般式（５）のＴにおけるＣ１〜Ｃ６アルキル基は、前記のアルキル基と同じ意味であり、好ましい基も同様である。一般式（５）で表される基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘキシルメトキシ基、ベンジルオキシ基、２−フェネチルオキシ基、３−フェニルプロポキシ基、４−フェニルブトキシ基、５−フェニルペンチルオキシ基又はジフェニルメトキシ基等が挙げられる。【００４９】
上記疎水性置換基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｎ−ペンチルアミノ基、ｎ−ヘキシルアミノ基、シクロプロピルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、シクロヘキシルメチルアミノ基、ジシクロヘキシルメチルアミノ基、アニリノ基、ベンジルアミノ基、２−フェネチルアミノ基、３−フェニルプロピルアミノ基、４−フェニルブチルアミノ基又はジフェニルメチルアミノ基等のアミノ基も挙げられる。【００５０】
一般式（１）のＸにおける疎水性置換基として特に好ましいのは、ベンジルオキシ基、３−フェニルプロポキシ基、４−フェニルブトキシ基、（１−ベンジルオキシカルボニル−２−メチル）プロピルアミノ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基であり、殊更好ましいのは、４−フェニルブトキシ基又は（１−ベンジルオキシカルボニル−２−フェニル）エチルアミノ基である。【００５１】
一般式（１）のＸにおける−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）は、核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の薬効発現に支障をきたさない限り特に限定されない。好ましくは、−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）のＲ１、Ｒ２は同一でも異なっていてもよく３級アミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基で表される基である。より好ましくは、シクロヘキシルアミノカルボニルシクロヘキシルアミノ基、イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である。【００５２】
なお、−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）のＲ１、Ｒ２において、３級アミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基のＣ１〜Ｃ６アルキル基は、前記のアルキル基と同じ意味であり、好ましい基も同様である。【００５３】
一般式（１）中、ポリマー部分の総カルボキシル基数（ｍに等しい数）に対して、Ｘが核酸系代謝拮抗剤残基である割合は５〜９５％、好ましくは５〜７０％であり、Ｘが水酸基である割合は０〜９５％、好ましくは５〜７０％であり、Ｘが疎水性置換基である割合は０〜８０％、好ましくは２０〜７０％、Ｘが−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）である割合は５〜８０％、好ましくは５〜７０％である。【００５４】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体において、核酸系代謝拮抗剤等が結合していない側鎖カルボキシル基が存在する場合、当該カルボキシル基は遊離型又はアルカリ類の塩型でもよい。遊離型で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法によって目的とする塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準ずる方法により遊離型又は目的とする他の塩に変換することができる。【００５５】
アルカリ類の塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩又はトリエチルアンモニウム塩等が挙げられる。【００５６】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体における側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分を構成する構造単位は、光学異性体が存在する場合は光学活性体でもラセミ体でも任意の割合の混合体でもよい。例えば、側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分がポリグルタミン酸誘導体の場合、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｄ−グルタミン酸、側鎖が置換されたＬ−グルタミン酸及び側鎖が置換されたＤ−グルタミン酸が任意の割合で任意の結合順で結合したポリマーでよい。【００５７】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体として特に好ましい化合物としては、例えば、以下の表１に示す化合物が挙げられる。【００５８】
表１において、各Ｘの下に示す「割合」とは、ポリマー部分の総カルボキシル基数（ｍに等しい）に対してＸの各置換基が結合している割合（％）であり、おおよその値を示す。表に示した以外の残余は水酸基である。Ｂｚｌはベンジル基、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｃ4Ｈ8Ｐｈは４‐フェニルブチル基を表す。Ｘの核酸系代謝拮抗剤残基としては、シタラビン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、アザシチジン、デシタビン、ネララビン、テザシタビン、５’−デオキシ−５−フルオロシチジン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、３’−エチニルシチジン、２’−Ｃ−シアノ−２’−デオキシ−１−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）、トロキサシタビン及び（−）−ベータ−Ｌ−ジオキソランシチジンの各残基が挙げられる。【００５９】
【表１】
2008056596.tif 000009
【表】
2008056596.tif 000010
【００６０】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、例えば、特許文献３記載の方法に準じて製造されたメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体と、核酸系代謝拮抗剤とを、溶媒中で脱水縮合剤により縮合することにより製造することができるが、特にこの製造法に限定されない。【００６１】
上記反応における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されない。例えば、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル等のエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類、１，３−ジメチルイミダゾリジノン等のウレア類又は前記溶媒の混合溶媒等が挙げられ、好ましくはアミド類又はウレア類であり、より好ましくはジメチルホルムアミド又は１，３−ジメチルイミダゾリジノンである。【００６２】
上記反応における脱水縮合剤としては、核酸系代謝拮抗剤であるヌクレオシド誘導体の水酸基とカルボキシル基との縮合反応が進行する限り特に限定されない。好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド等のカルボジイミド系縮合剤が挙げられる。【００６３】
脱水縮合反応の際、反応補助剤を用いてもよく、該反応補助剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は４−ジメチルアミノピリジン、又は２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン等が挙げられる。【００６４】
脱水縮合反応の反応温度は通常４〜６０℃であり、好ましくは１５〜５０℃である。反応時間は２時間〜数日であり、好ましくは４〜４８時間である。【００６５】
上記反応後、必要に応じて自体公知の分離手段、例えば、減圧濃縮、溶媒抽出、結晶化、透析、クロマトグラフィー等を適宜適用して目的化合物を単離、精製することができる。【００６６】
上記の脱水縮合反応により、Ｘが、核酸系代謝拮抗剤残基、水酸基、−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）（Ｒ１、Ｒ２は同一でも異なっていてもよく３級アミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基）からなる群から選ばれる基からなる高分子誘導体が得られる。また、この脱水縮合反応で得られる高分子誘導体の高分子担体と核酸系代謝拮抗剤との結合様式は、カルボジイミド系縮合剤を使用することで、ほぼエステル結合となる。核酸系代謝拮抗剤によりエステル結合以外の様式の結合ができる場合があるが、核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の薬効発現に支障をきたさない限り、結合様式は混合でも単独でもよい。【００６７】
Ｘとして−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）（Ｒ１、Ｒ２は同一でも異なっていてもよく３級アミノ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基）のみを高分子化合物担体へ導入する場合、上記の核酸系代謝拮抗剤と高分子化合物との脱水縮合反応を核酸系代謝拮抗剤非存在下で行うことによりなし得る。【００６８】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体が疎水性置換基を有する場合、例えば、特許文献３に記載の方法に準じて製造されたメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体のカルボキシル基の一部に疎水性置換基を導入して得られるポリエチレングリコール類部分及び側鎖にカルボキシル基を有するポリマー部分からなる高分子化合物の側鎖の未置換のカルボキシル基と、核酸系代謝拮抗剤であるヌクレオシド誘導体とを前記のように有機溶媒中で脱水縮合剤を用いて縮合して製造することができる。【００６９】
疎水性置換基の導入は、例えば、疎水性置換基がアルコキシ基の場合には対応するアルコールと該カルボキシル基とを溶媒中脱水縮合剤により縮合（エステル化）すること、又は対応するハロゲン化アルキル等と該カルボキシル基とを溶媒中、塩基存在下で求核置換反応に供することによって為され、例えば、疎水性置換基が置換アミノ基の場合には対応するアミン類と該カルボキシル基とを溶媒中、脱水縮合剤により縮合（アミド化）させることにより製造可能である。【００７０】
上記脱水縮合反応（エステル化反応）における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、前記のメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体と核酸系代謝拮抗剤とを脱水縮合させる際に使用できる溶媒と同様な溶媒が使用でき、好ましい溶媒も同様である。脱水縮合剤としてはアルコールとカルボキシル基との脱水縮合反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル又はピバリン酸クロリドである。【００７１】
脱水縮合反応の際、反応補助剤を用いてもよく、該反応補助剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は４−ジメチルアミノピリジン、又は２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン等が挙げられる。【００７２】
脱水縮合反応の反応温度は通常４〜６０℃であり、好ましくは１５〜５０℃である。反応時間は２時間〜数日であり、好ましくは４〜４８時間である。【００７３】
上記求核置換反応における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、前記のメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体と核酸系代謝拮抗剤とを脱水縮合させる際に使用できる溶媒と同様な溶媒が使用でき、好ましい溶媒も同様である。塩基としては、例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩類；水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物類；リチウムメトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類；トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）等の有機アミン類等が挙げられ、好ましくはアルカリ金属炭酸塩類、アルカリ金属水素化物類又は有機アミン類である。【００７４】
上記求核置換反応の反応温度は通常４〜６０℃であり、好ましくは室温〜５０℃である。反応時間は１時間〜数日であり、好ましくは４〜４８時間である。【００７５】
上記脱水縮合反応（アミド化反応）における溶媒としては反応が進行する限り特に限定されないが、上記のメトキシポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体と核酸系代謝拮抗剤との脱水縮合に使用できる溶媒と同様な溶媒が使用でき、好ましい溶媒も同様である。脱水縮合剤としてはアミン類とカルボキシル基との縮合反応が進行する限り特に限定されないが、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸イソブチル、ピバリン酸クロリド、ＤＭＴ−ＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド）、ＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリノン（ＥＥＤＱ）又はＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。【００７６】
上記脱水縮合反応の際、反応補助剤を用いてもよく、該反応補助剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は４−ジメチルアミノピリジン、又は２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピリジン等が挙げられる。【００７７】
脱水縮合反応の反応温度は通常４〜６０℃であり、好ましくは室温〜５０℃である。反応時間は１時間〜数日であり、好ましくは４〜４８時間である。【００７８】
なお、高分子化合物への疎水性置換基、核酸系代謝拮抗剤及び−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）からなる群から選ばれる基の結合順は問わないので、混合して反応させてもよいが、多官能基を有する活性本体である核酸系代謝拮抗剤の反応及び分解を回避するため、高分子化合物へ疎水性置換基を導入した後、核酸系代謝拮抗剤と−Ｎ（Ｒ１）ＣＯＮＨ（Ｒ２）を結合させるのが好ましい。【００７９】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、水溶液中でポリエチレングリコール類部分を外殻とするミセルを形成していてもよい。ミセルの形成については、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法又は動的光散乱法等により確認することができる。【００８０】
本発明において、核酸系代謝拮抗剤が結合していないカルボキシル基を疎水性置換基と結合させることによりミセルを形成しやすくなる。【００８１】
本発明には上記の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分として含む抗腫瘍剤又は抗ウイルス剤も含まれる。該核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体は、そのまま投与することも、又、医薬上許容できる物質と混合した薬学的組成物として投与することもできる。薬学的組成物の剤型は注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよい。又、これらの製剤は医薬用に用いられる種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。【００８２】
製剤中における核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の含量は製剤により種々異なるが、通常０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９８重量％である。【００８３】
核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする本発明の抗腫瘍剤の適用は特に限定されないが、例えば、非小細胞肺癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫等に使用され得る。【００８４】
核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体を薬効成分とする本発明の抗ウイルス剤の適用は特に限定されないが、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、帯状疱疹、単純ヘルペスウイルス感染症等に使用され、感染予防目的にも使用され得る。【００８５】
本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の投与方法として、経口、注射、直腸内投与、門脈内投与、臓器の灌流液に混合、患部臓器への局所投与等いずれの投与方法でも可能であるが、好ましくは非経口的投与であり、より好ましくは注射による静脈内投与、動脈内投与又は患部臓器への局所投与である。本発明の核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体の投与量は、病状、投与方法、患者の状態、年齢、体重等により異なるが、通常、核酸系代謝拮抗剤換算で体表面積１ｍ２あたり１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜２０００ｍｇであり、これを１日１回又は数回に分けて投与してもよい。又、この投与は連日行なうこともできるが、数日から数ヶ月の間をおいて反復投与を行なってもよい。必要に応じて前記以外の投与方法、投与量、投与スケジュールを用いることができる。【００８６】
本発明の高分子誘導体がプロドラッグとして作用する場合も本発明に含まれる。ここで、プロドラッグとは生物学的に活性な親化合物の化学的誘導体であって、投与すると生体内で該親化合物を遊離するものである。
【実施例】
【００８７】
以下に、実施例、参考例及び試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【００８８】
参考例１  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
片末端メトキシ基片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日本油脂株式会社製、平均分子量１２０００、７．７４ｇ）をジメチルスルホキシド（１６０ｍＬ）に溶解し、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＧ−ＮＣＡ、５．１ｇ；ポリエチレングリコールに対して３０当量）を加え、３０℃にて一晩撹拌した。イソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、２．４Ｌ）撹拌下に反応液を滴下し、更に１時間撹拌した。析出した沈殿物をろ取し、イソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、４００ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物（１１．５０ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１８０ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（３．４５ｍＬ）を加えて、３０℃にて一晩撹拌した。イソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、１．６Ｌ）撹拌下に滴下し、更に１時間撹拌した。析出した沈殿物をろ取し、イソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、４００ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物（１１．２４ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶解し、５％パラジウム炭素（５５％含水、１．００ｇ）を加えて、水素雰囲気下室温にて一晩撹拌した。パラジウム炭素をろ別した後、ろ液をイソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、２．５Ｌ）撹拌下に滴下し、更に１時間撹拌した。析出した沈殿物をろ取し、イソプロピルエーテル−酢酸エチル混合溶媒（４：１、３００ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物を蒸留水（５００ｍＬ）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて液性をｐＨ１１に調整した。蒸留水を加えて最終液量を１０００ｍＬとし、塩化ナトリウム（５０ｇ）を加えた。この溶液を吸着樹脂ＨＰ−２０ｓｓ（三菱化学製、２５０ｍＬ）のカラムに通塔し、５％塩化ナトリウム水溶液（１０００ｍＬ）及び蒸留水（１０００ｍＬ）にて洗浄後、５０％アセトニトリル水溶液（１２５０ｍＬ）にて溶出した。目的物を含む溶出画分を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、１００ｍＬ）のカラムに通塔、溶出し、更に５０％アセトニトリル水（１５０ｍＬ）にて溶出した。目的物を含む溶出画分を液量が約１５０ｍＬになるまで減圧下濃縮した後、凍結乾燥して、標記化合物（６．６７ｇ）を得た。
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボキシル基数）は、２５．８１であった。【００８９】
参考例２  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１に記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを２９．１当量用いることにより、標記化合物を得た。
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボキシル基数）は、２６．７２であった。【００９０】
参考例３  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１に記載の方法に従い、ポリエチレングリコールに対してＢＬＧ−ＮＣＡを３０当量用いることにより、標記化合物を得た。
水酸化ナトリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボキシル基数）は、２６．７０であった。【００９１】
参考例４  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約４５％）の合成
参考例１に記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（５９６ｍｇ）、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの塩酸塩（１２８ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７７μＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（１４６ｍｇ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、２ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（５８０ｍｇ）を得た。
本化合物を加水分解した後、遊離したベンジルアルコールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して４５．９４％であった。
加水分解の方法
標記化合物（１２．８０ｍｇ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍＬ）を加えて４０度にて１時間撹拌した。酢酸にて中和後、蒸留水にて希釈して正確に１０ｍＬ溶液とした。
ＨＰＬＣの分析条件（ベンジルアルコールの分析）
カラム：ＹＭＣ  Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ、４．６φ×２５０ｍｍ；
カラム温度：４０℃；
溶離液  Ａ液：１％リン酸水溶液、Ｂ液：アセトニトリル；
グラジエント：Ｂ液％（時間、分）０（０）、０（５）、８０（２５）、８０（３５）、ｓｔｏｐ（３５．０１）；
流速：１ｍＬ／分；
検出器（検出波長）：ＵＶ（２１０ｎｍ）【００９２】
参考例５  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約７０％）の合成
参考例１に記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（５９６ｍｇ）、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの塩酸塩（１９３ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５μＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（２１９ｍｇ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、２ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（６６７ｍｇ）を得た。
本化合物を参考例４と同様の方法で加水分解した後、遊離したベンジルアルコールを参考例４と同様な条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して６９．９％であった。【００９３】
参考例６  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と、４−フェニルブチルブロミドとのエステル結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約４０％）の合成
参考例１に記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（１．００ｇ）及び４−フェニルブチルブロミド（１６１ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ、２５１μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、２５０ｍＬ）に滴下した。３０分撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を６０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、４ｍＬ）を加え、２時間振とう、樹脂をろ去後、ろ液を凍結乾燥して、標記化合物（１．０２７ｇ）を得た。
本化合物を参考例４と同様な条件で加水分解した後、遊離した４‐フェニルブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物の４‐フェニルブトキシ基の結合率を求めたところ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して４２．１％であった。【００９４】
参考例７  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と４−フェニルブチルブロミドとのエステル結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約６０％）の合成
参考例２記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（３．７３ｇ）及び４−フェニルブチルブロミド（１．０５ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９１ｍＬ）に溶解し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ、８９７μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１．５Ｌ）に滴下した。３０分撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、１５ｍＬ）を加え、２時間振とう、樹脂をろ去した後、ろ液を凍結乾燥して、標記化合物（３．８０ｇ）を得た。
本化合物を参考例４と同様な条件で加水分解した後、遊離した４‐フェニルブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物の４‐フェニルブトキシ基の結合率を求めたところ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して６２．３％であった。【００９５】
参考例８  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約３０％）の合成
参考例１記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（１０００ｍｇ）、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの塩酸塩（１４７ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８８μＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（１６７ｍｇ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、２５０ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、４ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（１０７０ｍｇ）を得た。
本化合物を参考例４と同様の方法で加水分解した後、遊離したベンジルアルコールを参考例４と同様な条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して３０．８％であった。【００９６】
参考例９  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約５５％）の合成
参考例１に記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（５９６ｍｇ）、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの塩酸塩（１６１ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９６μＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（１８３ｍｇ）を加え４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌した後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、２ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（６３０ｍｇ）を得た。
本化合物を参考例４と同様の方法で加水分解した後、遊離したベンジルアルコールを参考例４と同様な条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して５６．８％であった。【００９７】
参考例１０  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルとのアミド結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約６０％）の合成
参考例３記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（２．３２ｇ）、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルの塩酸塩（７７０ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６０μＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（８７７ｍｇ）を加え４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、４５０ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌した後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、１０ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（２．６９ｇ）を得た。
本化合物を参考例４と同様の方法で加水分解した後、遊離したベンジルアルコールを参考例４と同様な条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のアミド結合しているＰｈｅ−ＯＢｚｌ基の結合率を求めたところポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して６０．４％であった。【００９８】
参考例１１  分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と、４−フェニルブチルブロミドとのエステル結合体（ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して約５０％）の合成
参考例２記載の分子量約１２０００のモノメトキシポリエチレングリコールと重合数約２６のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物（２９０ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．５ｍＬ）に溶解し、４−フェニルブチルブロミド（６４ｍｇ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ、７５μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１００ｍＬ）に滴下した。３０分撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、２ｍＬ）を加え、２時間振とう、樹脂をろ去した後、ろ液を凍結乾燥して、標記化合物（３０５ｍｇ）を得た。
本化合物を参考例４と同様な条件で加水分解した後、遊離した４‐フェニルブタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物の４‐フェニルブトキシ基の結合率を求めたところ、ポリグルタミン酸のカルボキシル基に対して５０．４％であった。【００９９】
実施例１  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがゲムシタビン残基、水酸基、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物１）
参考例４で合成した化合物（４８０ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（１２５ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７３μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（１０．２ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（１３１μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、２ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（４５３ｍｇ）を得た。
本化合物を加水分解した後、遊離したゲムシタビンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で８．４％（ｗ／ｗ）であった。又、本発明化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。
加水分解の方法
標記化合物（１１．３６ｍｇ）をメタノール（１．０ｍＬ）に溶解し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍＬ）を加えて４０℃にて１時間撹拌した。酢酸にて中和後、蒸留水にて希釈して正確に１０ｍＬ溶液とした。
ＨＰＬＣの分析条件（ゲムシタビンの分析）
カラム：ＹＭＣ  Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ、４．６φ×２５０ｍｍ；
カラム温度：４０℃；
溶離液  Ａ液：１％リン酸水溶液、Ｂ液：アセトニトリル；
グラジエント：Ｂ液％（時間、分）０（０）、０（５）、８０（２５）、８０（３５）、ｓｔｏｐ（３５．０１）；
流速：１ｍＬ／分；
検出器（検出波長）：ＵＶ（２１０ｎｍ）
また、本化合物におけるゲムシタビンに対するイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基のモル比は重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められ、０．４７であった。【０１００】
実施例２  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがゲムシタビン残基、水酸基、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物２）
参考例５で合成した化合物（５６７ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（９２ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５４μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（７．５ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（９６μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、２００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、２ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（５３９ｍｇ）を得た。
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解した後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で４．０％（ｗ／ｗ）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。【０１０１】
実施例３  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがゲムシタビン残基、水酸基、４−フェニルブチルアルコール残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物３）
参考例６で合成した化合物（１０２７ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（２８５ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６５μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（２３．２ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（２９７μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、２００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌した後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、４ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（１０７０ｍｇ）を得た。
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解した後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で９．１％（ｗ／ｗ）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。
また、本化合物におけるゲムシタビンに対するイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基のモル比は重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められ、０．５５であった。【０１０２】
実施例４  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがゲムシタビン残基、水酸基、４−フェニルブチルアルコール残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物４）
参考例７で合成した化合物（１６５０ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（３００ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（２４．４ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（３１３μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、３００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、６ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（１６７８ｍｇ）を得た。
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解した後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で４．９％（ｗ／ｗ）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。
また、本化合物におけるゲムシタビンに対するイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基のモル比は重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの1Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められ、０．７２であった。【０１０３】
実施例５  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがドキシフルリジン残基、水酸基、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物５）
参考例８で合成した化合物（４７６ｍｇ）及びドキシフルリジン（１２３ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（１２．２ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（１５７μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１５０ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、３ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（４８５ｍｇ）を得た。
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解した後、遊離したドキシフルリジンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のドキシフルリジン含量を求めたところ、ドキシフルリジン換算で９．０％（ｗ／ｗ）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のドキシフルリジン含量は０．２％以下であった。
また、本化合物におけるドキシフルリジンに対するイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基のモル比は重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの1Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められ、０．７６であった。【０１０４】
実施例６  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがゲムシタビン残基、水酸基、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物６）
参考例９で合成した化合物（１００ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（２１ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．２μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（１．７ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（２１．９μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、５０ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、１ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（６３ｍｇ）を得た。
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解した後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で６．６％（ｗ／ｗ）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。【０１０５】
実施例７  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがゲムシタビン残基、水酸基、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物７）
参考例１０で合成した化合物（２．５０ｇ）及び塩酸ゲムシタビン（４１５ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２４１μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（３３．８ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（４３３μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、５００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を７０％アセトニトリル水に溶解し、透析膜（分画分子量：１２０００〜１４０００）を用いて、蒸留水（２Ｌ×３）にて透析した．透析した溶液を凍結乾燥して、標記化合物（２．４５ｇ）を得た。
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解した後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で６．１２％（ｗ／ｗ）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。
また、本化合物におけるゲムシタビンに対するイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基のモル比は重水酸化ナトリウム／重水／重アセトニトリルに溶解したものの1Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル）から求められ、０．６５であった。【０１０６】
実施例８  一般式（１）でＲがメチル基、Ａがアセチル基、ｍの平均値が２６、ｎの平均値が２７２、Ｘがゲムシタビン残基、水酸基、４−フェニルブチルアルコール残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である核酸系代謝拮抗剤の高分子誘導体（表１の化合物８）
参考例１１で合成した化合物（３０５ｍｇ）及び塩酸ゲムシタビン（７１ｍｇ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４１μＬ）を加えて４０℃にて撹拌した。溶解後、４−ジメチルアミノピリジン（５．８ｍｇ）及びジイソプロピルカルボジイミド（７４μＬ）を加えて４０℃にて一晩撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１、１００ｍＬ）に滴下した。３０分間撹拌後、析出した沈殿物をろ取し、ジイソプロピルエーテル−エタノール混合溶媒（４：１）にて洗浄した。得られた生成物を５０％アセトニトリル水に溶解し、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（プロトン型、２．５ｍＬ）を加え、２時間室温で振とうした後、樹脂をろ去し、樹脂を５０％アセトニトリル水にて洗浄した。得られたろ液を、減圧下１／２容量まで濃縮した後、凍結乾燥して標記化合物（２９２ｍｇ）を得た。
本化合物を実施例１と同様の方法で加水分解した後、遊離したゲムシタビンを実施例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより、本発明化合物のゲムシタビン含量を求めたところ、塩酸ゲムシタビン換算で７．９％（ｗ／ｗ）であった。又、本化合物についてＨＰＬＣで分析したところ、遊離のゲムシタビン含量は０．２％以下であった。【０１０７】
試験例１  酵素非存在下における薬剤放出性試験
実施例１の化合物（図１中では化合物１と表記）、実施例２の化合物（図１中では化合物２と表記）、実施例４の化合物（図１中では化合物４と表記）又は実施例５の化合物（図１中では化合物５と表記）をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、３７℃にて定温放置した。放出されたゲムシタビン及びドキシフルリジン量をＨＰＬＣにて経時的に測定し、使用した化合物中の全ゲムシタビン及びドキシフルリジン量に対する放出されたゲムシタビン及びドキシフルリジン量の割合を求めた。結果を図１に示す。本発明の化合物は酵素に依存せずに薬剤が徐放されることが示された。【０１０８】
試験例２  マウス血漿中における薬剤放出性
実施例４の化合物（図１中では化合物４と表記）又は実施例５の化合物（図１中では化合物５と表記）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解した後、マウスより採血・調製した血漿を４倍量（ｖ／ｖ）加えて、３７℃にて定温放置した。５０μＬずつを経時的に取り，５０％メタノール水（４５０μＬ）にて希釈した。メンブランフィルター（孔径０．４５μｍ）にて除タンパク処理した後、本発明化合物より放出されたゲムシタビン量をＨＰＬＣにて経時的に測定し、本発明化合物中の全ゲムシタビン量に対する、放出されたゲムシタビン量の割合を求めた。結果を図２に示す。【０１０９】
試験例１及び試験例２の結果を比較すると、本発明の化合物が、マウス血漿中においては、酵素非存在下の場合よりも、薬剤放出率が高いものの、マウス血漿中においても高分子誘導体として、長時間滞留し、薬剤を放出していることが伺える。【０１１０】
試験例３  担癌マウスに対する抗腫瘍効果（１）
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍塊を約２ミリメートル角のブロックにし、套管針を用いてマウス皮下に移植した。腫瘍移植後７日目に実施例１の化合物（表２中では化合物１と表記）、及び実施例２の化合物（表２中では化合物２と表記）を生理食塩水で、対照薬としての塩酸ゲムシタビンを５％ブドウ糖注射液にて溶解し、表２に示す投与量で静脈内に単回投与した。投与開始日及び投与開始後７日目の腫瘍体積を下記式により算出し、投与開始日に対する投与開始後７日目の相対腫瘍体積を求めた。結果を表２に示す。【０１１１】
【数１】
2008056596.tif 000011
【０１１２】
【表２】
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この結果、本発明の化合物は、対照薬である塩酸ゲムシタビンと比較して低投与量で同等以上の抗腫瘍効果を有することが明らかである。【０１１３】
試験例４  担癌マウスに対する抗腫瘍効果（２）
マウス皮下で継代しているマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍塊を約２ミリメートル角のブロックにし、套管針を用いてマウス皮下に移植した。腫瘍移植後７日目に実施例３の化合物（表３中では化合物３と表記）、及び実施例４の化合物（表３中では化合物４と表記）を生理食塩水で、対照薬としての塩酸ゲムシタビンを５％ブドウ糖注射液にて溶解し、表３に示す投与量で静脈内に単回投与した。投与開始日及び投与開始後８日目の腫瘍体積を試験例３と同様に算出し、投与開始日に対する投与開始後８日目の相対腫瘍体積を求めた。結果を表３に示す。【０１１４】
【表３】
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この結果、本発明の化合物は、対照薬である塩酸ゲムシタビンと比較して低投与量で同等以上の抗腫瘍効果を有することが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】酵素非存在下における薬剤放出の経時変化を示す。  ◆は化合物１、■は化合物２、△は化合物４、×は化合物５をそれぞれ表す。
【図２】マウス血漿中における薬剤放出の経時変化を示す。  △は化合物４、×は化合物５をそれぞれ表す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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