【手続補正書】
【提出日】平成16年11月17日(2004.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
また、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の任意の位置へ変異を導入することにより、ノックアウト非ヒト動物を作製することも可能である。例えば、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳領域中へ、塩基を置換、欠失、及び／又は挿入等させて変異を導入することにより、その遺伝子産物の活性を改変させることも可能である。
また、その発現制御領域への同様な変異を導入することにより、例えば、発現の程度、時期、及び／又は組織特異性等を改変させることも可能である。更に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、及び／又は発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモーターを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例［Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７  １９９６）］や、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５，（１９９７）］が知られている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
【実施例５】
《各種動物細胞又は各種動物組織におけるＳＭＧ−１タンパク質の検出》
（１）各種動物細胞溶解物におけるウエスタンブロット法によるＳＭＧ−１タンパク質の検出
ＨｅＬａ細胞を７％仔ウシ血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）により培養し、細胞を溶解用緩衝液Ｆ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌショ糖、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール、１ｍｍｏｌ／Ｌオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化ナトリウム、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、０．５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、及び２μｇ／ｍＬアプロチニン］中で超音波破砕し、細胞溶解物を調製した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
（２）各種動物組織由来の細胞溶解物におけるウエスタンブロット法によるＳＭＧ−１タンパク質の検出
ラット及びマウス由来の種々の組織において、抗血清Ｃ３を用いてウエスタンブロット法を行なった。各動物から手術によって組織を摘出し、それらを液体窒素中で急速に凍結した後、押しつぶすことにより粉末化した。１×ＳＤＳサンプルバッファー中で可溶化した後に、各組織からのタンパク質２０μｇを用いてウエスタンブロット法を実施した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
【実施例６】
《ヒトＳＭＧ−１（ヒトＨｅＬａ細胞溶解物の抗ヒトＳＭＧ−１抗血清による免疫沈降物）のプロテインキナーゼ活性の確認》
（１）ヒトＨｅＬａ細胞溶解物の各種ヒトＳＭＧ−１抗血清による免疫沈降物における、ウエスタンブロット法によるＳＭＧ−１タンパク質の検出
前記実施例５（１）と同様にして得られたＨｅＬａ細胞溶解物について、抗血清Ｎ１、抗血清Ｌ２、及び抗血清Ｃ３並びにコントロール用の免疫前抗血清を用いて、それぞれ免疫沈降を行なった。免疫沈降は、細胞溶解物に各抗血清を添加し、４℃で２時間放置して免疫複合体を形成させた後、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を添加して更に２時間放置して免疫複合体を結合させ、遠心分離によりプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂを回収する方法で行なった。各免疫沈降物について、５．５％の各ゲル濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、抗血清Ｃ３を用いたウエスタンブロット法を行なった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
（２）ヒトＨｅＬａ細胞溶解物の各種ヒトＳＭＧ−１抗血清による免疫沈降物のプロテインキナーゼ活性の確認
前記実施例６（１）で得られた各免疫沈降物を、０．２５ｍｏｌ／Ｌ−ＬｉＣｌを含む溶解用緩衝液Ｆで５回洗浄した後、１×キナーゼ反応用緩衝液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−グリセロリン酸、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｎＣｌ２］で２回洗浄した。
洗浄後の免疫沈降物に、２×キナーゼ反応用緩衝液（すなわち、前記組成の２倍濃度のキナーゼ反応用緩衝液）２５μＬを加えた。リン酸化反応は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＡＴＰ及び３７０ｋＢｑ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を等量（２５μＬ）加えることで開始し、時々攪拌しながら、３０℃で３０分間反応させた。最終反応量を５０μＬに維持し、４×ＳＤＳサンプルバッファー２５μＬを加えて反応を終了させた。５．５％及び１２．５％の各ゲル濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、オートラジオグラフィーによりリン酸化されたタンパク質を検出した。タンパク質のリン酸化強度は、イメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）で測定した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
結果を図２５に示す。図２５において、記号「ｖｅｃｔｏｒ」は、ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＷＴ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１を用いた場合の結果を意味し、記号「ｈＳＭＧ−１  ＤＡ」は、ベクターＳＲ６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を用いた場合の結果を意味する。また、記号「ａｎｔｉ−ＨＡ」は、抗ＨＡ抗体によるウエスタンブロット法の結果であることを意味する。更に、記号「ＨＡ  ｈＵＰＦ１−Ｐ」は、リン酸化されたＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味し、記号「ＨＡ  ｈＵＰＦ１」は、リン酸化されていないＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２を意味する。図２５において、シフトしたＨＡ−ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２の位置に記号「＊」を付した。
ベクターＳＲ６Ｈ（コントロール）のみの場合と同様に、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１（ＤＡ）を過剰に発現させた場合には、外因性のＨＡタグ付加ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＯＡ誘発上方シフトは、観察されなかった。しかし、６Ｈ−ｈＳＭＧ−１が過剰に発現すると、ＨＡタグ付加ｈＵｐｆ１／ＳＭＧ−２のＯＡ誘発上方シフトが大きく増幅された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号８の配列で表される塩基配列は、６個のヒスチジン残基を含有するＨｉｓタグ配列である。