【手続補正書】
【提出日】平成15年7月29日(2003.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質アレイを製造する方法であって、
(a)無細胞系によって転写及び翻訳できる配列と、コードされたタンパク質、ドメイン又はペプチドを表面又はビーズに共有又は非共有結合で付着できる配列とを含むDNA構造物を調製し、
(b)前記DNA構造物を、前記タンパク質を固定化するためのリガンド又は試薬を担持するウエル中に、表面上に、又はビーズの存在下で、グリッドの形に分布させ、
(c)前記DNAを、無細胞系を使用して、グリッドの形で転写及び翻訳し、及び
(d)前記タンパク質、ドメイン又はペプチドが生成するに従って、生成されたタンパク質、ドメイン又はペプチドが、前記ウエル、表面又はビーズに付着して、タンパク質アレイを作る、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
タンパク質アレイを製造する方法であって、
(a)無細胞系によって転写及び翻訳できる配列と、コードされたタンパク質、ドメイン又はペプチドを、表面又はビーズに共有又は非共有結合で付着できる配列とを含むDNA構造物を調製し、
(b)前記DNAを、グリッドの形に配置し、かつタンパク質を固定化するためのリガンド又は試薬を担持するウエル中に、表面又はビーズ上に共有又は非共有結合のいずれかで固定化し、
(c)前記DNAを、無細胞系を使用して、グリッドの形で転写又は翻訳し、及び
(d)前記タンパク質、ドメイン又はペプチドが生成するに従って、生成されたタンパク質、ドメイン又はペプチドが、前記ウエル、表面又はビーズに付着して、タンパク質アレイを作る、
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
前記DNAを、まず、mRNAに転写し、次に、該mRNAを、別の反応で翻訳する、請求項１又は２記載のタンパク質アレイを製造する方法。
【請求項４】
前記無細胞系が、DNAの連結した転写及び翻訳を実施でき、又は別々のDNAの転写及びmRNAの翻訳ができ、かつ、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、酵母、細菌又は他の真核若しくは原核細胞起源である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
DNA分子の転写及び翻訳、又はmRNA分子の翻訳のための無細胞インビトロ系を使用して作られるタンパク質アレイであって、前記DNA又はmRNA分子が、グリッドの形に配置されて、表面又はビーズに共有又は非共有的に付着できるアミノ酸配列を含む、個々のタンパク質、ドメイン又はペプチドを生成し、個々のタンパク質が生成するに従って表面又はビーズに付着するように、タンパク質の固定化するための適切なリガンド又は試薬を担持する表面上又はビーズの存在下で、翻訳が行われ、前記タンパク質、ドメイン又はペプチドが、金属イオンとの相互作用によって固定化されるための一対のヘキサヒスチジンを含み、かつ該一対のヘキサヒスチジンの２つのヘキサヒスチジン配列が、アミノ酸スペーサー配列によって分けられていることを特徴とする、タンパク質アレイ。
【請求項６】
前記アミノ酸スペーサー配列が、約１１アミノ酸の長さである、請求項５記載のタンパク質アレイ。
【請求項７】
前記アミノ酸スペーサー配列によって分けられた一対のヘキサヒスチジン配列が、アミノ酸配列(his)6-SRAWRHPQFGG-(his)6［配列ID番号２］を有する、請求項６又は７記載のタンパク質アレイ。
【請求項８】
前記DNA又はmRNA分子が、表面又はビーズに共有又は非共有結合され、前記個々のタンパク質が生成されるに従って前記表面又はビーズに付着するように、前記表面又はビーズが、前記タンパク質の固定化のためのリガンド又は試薬を担持する、請求項５〜７のいずれか１項記載のタンパク質アレイ。
【請求項９】
適切なプライマー配列を含有する結果、原核及び真核無細胞系のいずれか又は両方で発現され得るDNA構造物から作られた、請求項５〜８のいずれか１項記載のタンパク質アレイ。
【請求項１０】
DNAの連結した転写及び翻訳を実施でき、又は別々のDNAの転写及びmRNAの翻訳ができる、無細胞系を使用し、前記無細胞系が、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、酵母、細菌又は他の真核若しくは原核細胞起源である、請求項５〜９のいずれか１項記載のタンパク質アレイ。
【請求項１１】
DNAの連結された転写／翻訳、又は別個のmRNAの翻訳が、マイクロウエル内で、又はガラス、ニトロセルロース若しくは他の膜の表面上で、又は他の支持媒体で、又はビーズ存在下で行われる、請求項５〜１０のいずれか１項記載のタンパク質アレイ。
【請求項１２】
前記配列されたタンパク質が、一本鎖抗体フラグメントである、請求項５〜１１のいずれか１項記載のタンパク質アレイ。
【請求項１３】
前記配列されたタンパク質が、タンパク質の天然の機能を保持し、かつ示す、請求項５〜１２のいずれか１項記載のタンパク質アレイ。
【請求項１４】
請求項５〜１３のいずれか１項記載のタンパク質アレイの使用であって、前記配列されたタンパク質と他の分子との相互作用を同定するための、使用。
【請求項１５】
前記配列されたタンパク質と、ライブラリーにディスプレイされた他の分子との相互作用を同定するための、請求項５〜１３のいずれか１項記載のタンパク質アレイの使用。
【請求項１６】
細胞タンパク質の発現プロフィールを研究するための、請求項５〜１３のいずれか１項記載のタンパク質アレイの使用。
【請求項１７】
細胞タンパク質の翻訳後修飾を研究するための、請求項５〜１３のいずれか１項記載のタンパク質アレイの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
タグを付けた一本鎖抗体のインビトロでの発現のためのPCR構造物の設計
図１０は、例として一本鎖抗体VH/Kフラグメントを使用する、PISA用のインビトロタンパク質合成に好適なDNAの構造物のための一般的なPCR方法の概略を説明する。構造物には、T7  RNAポリメラーゼによる転写のためのT7プロモーター及び無細胞の真核細胞系で翻訳を開始するためのKozak配列が含まれる。Ni-NTAコート表面にタンパク質を固定化する効率を上げ、かつタンパク質アレイの再使用を可能にするため、一対の(His)6−タグドメインを設計した。付着タンパク質の折りたたみでタグ配列の起こりうる障害を減少させるため、フレキシブルな１９残基のリンカー（Robinson及びSauer, 1998, Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:5929-5934)を、配列されるタンパク質とHis-タグドメインとの間に配置する。ポリ（A)28テイル及び転写ターミネーターをDNAの３’末端に組み込んで、転写効率を上げる。翻訳終止及びリボソーム複合体からの新生ポリペプチドの放出を確実にするため、２つの停止コドン（TAATAA［配列ID番号３］）を、一対の（His)6-タグ配列に続いて含める。
VH/Kフラグメントが一対の（His)6-タグドメイン（VH/K-His）に結合する構造物を、以下のプライマーでPCRによって生成した。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
このプライマーは、T7プロモーター及びKozakシグナル（下線部）及び抗体重鎖の５’領域に相補的な変性配列（イタリック体）を提供する。開始コドンを太字で示す。
Ab-リンカー/フォア:  5'-GCC ACC GCC TCT AGA GCG GCT CAG CGT CAG GGT GCT GCT-3' [配列ID番号５]。これは、ヒトκ定常ドメイン（Cκ）の３’領域に相補的な配列及び一対の(His)6−タグドメインの生成のために使用されるリンカー−タグ／バックプライマー（以下を参照）と部分的に一致する配列（下線部）を提供する。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
His-タグドメインのPCR生成のためのプライマー
リンカー-タグ/バック: 5'-GC TCT AGA GGC GGT GGC TCT GGT GGC GGT TCT GGC GGT GGC ACC GGT GGC GGT TCT GGC GGT GGC AAA CGG GCT GAT GCT GCA [配列ID番号６]。これは、VH/K-リンカー構成に使用されるAb−リンカー／フォアプライマー （前述）と一対の(His)6−タグドメインのPCR生成のためのリンカー配列（後述）と部分的に一致する配列（下線）を提供する。
His-タグ/フォア : 5'-TCC GGA TAT AGT TCC TCC-3' [配列ID 番号７]。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
一対の（His)6−タグドメインをコードするプラスミドPTA−His
プラスミドPTA-Hisは、フレキシブルリンカーと一対の(His)6−タグを（順
番に）コードするフラグメントを含み、２つの停止コドンに続いて、ポリAテイル及び転写終結領域を含む。このフラグメントの配列は、以下のとおりである。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
小文字配列は、１９アミノ酸配列をコードするリンカー、下線配列は、一対の(His)6タグ、太字は、停止コドン、（A)28は、２８×Ａを含むポリＡ領域である。イタリック体、下線配列は、転写ターミネーターである。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ＰＣＲフラグメントの構造物
一般的に、製造メーカーの指示に従って、VH/K-リンカーフラグメント及び一対の(His)6−タグドメインを得るため、Taqポリメラーゼ（キアゲン社、イギリス)を使用する別々の反応で、標準ＰＣＲを３０サイクル行った。生成したフラグメントを分析して、ゲル抽出キット（キアゲン社、イギリス）を使用して１％アガロースゲルから溶出した。アセンブリ用に、同量のVH/K−リンカー及び一対の(His)6−タグドメイン（全部で１０〜５０ng）を混合して、２．５μｌの10×PCRバッファー（TaqDNAポリメラーゼと一緒に供給）、１μｌの２．５ｍＭ  dNTP、１U  TaqDNAポリメラーゼ及び最終量で２５μｌにするH2Oを含むPCR混合物に添加した。８回の熱サイクル（９４℃で３０秒、５４℃で１分及び７２℃で１分）後、２μｌの混合物を、プライマーT7Ab／バック及びHis-タグ/フォアを使用して、５０μｌで３０サイクルの第二PCRにかけ、VH/K-Hisを生成した(図１０参照）。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
一つの態様において、転写及び翻訳のためのグリッドの形には、好適なプレート（例えば、９６、３８４又は１５３６ウエルポリスチレンプレート）のマイクロウエルが含まれる。個々のDNA構造物（１μｇ）をウエルに分注し、それぞれには、PCR  DNA系用ウサギ網状赤血球TNT  T7  Quick（プロメガ社)、TNT連結コムギ胚芽抽出系（プロメガ社)又は大腸菌（E.coli）S30抽出系等の無細胞の連結転写／翻訳系の少量（例えば１〜５０μｌ）が、メチオニン（０．０２ｍＭ)と一緒に含まれる。タンパク質を標識するため、35Ｓメチオニン又は他の標識アミノ酸を含めてもよい。プレートを３０℃で１時間インキュベートする。タンパク質が、単一又は一対のヘキサヒスチジンタグ又は特定のペプチドタグ配列等の固定化配列を含む場合、タンパク質を、ニッケルでコートした表面又はビーズに金属アフィニティーで、又はタグ配列に対する抗体のいずれかによって結合できる。従って、翻訳反応が起きるウエルを、HisSorbプレート及びストリップ（キアゲン社）等のＮｉ−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）又は抗タグ抗体でプレコートすると、タンパク質は生成後直ちに表面に結合して、インサイツでアレイを生成するであろう。同様に、Ni-NTAでコートしたビーズの存在下では、タンパク質がビーズの表面に結合するようになるであろう。また、コートされていないウエルでTNT反応を行ってもよく、手動又は自動化手順で、翻訳混合物を、Ni-NTAでコートしたガラス、Ni-NTAでコートしたビーズ、ニトロセルロースやPVDFフィルター膜等の、別の固定化表面に移すことができる。非結合材料は、結合タンパク質を残したまま、洗い流される。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【実施例】
例１  インサイツでの抗体フラグメントの同時発現及び固定化による、機能的タンパク質アレイ成分の製造
インサイツでの機能的タンパク質アレイ成分の製造を証明するため、一本鎖ヒト抗プロゲステロン抗体VH/Kフラグメント（P5-17)をコードする構造物を使用した（Heら、1999、J.  Immunol.  Methods,  231：105）。タンパク質アレイの構造物を調製するため、T7プロモーター、発現シグナル及び一対のヘキサヒスチジンタグをPCRアセンブリによってこのフラグメントに組み込んだ。PCRフラグメント（0.5μｇ）を、２０μｌの連結した転写／翻訳「PCR  DNAシステム用TNT」（プロメガ（Promega）社)と混合して全体量を２５μｌにし、混合物を、８ウエルHisSorbストリップ（キアゲン（Qiagen）社)のNi-NTAコートウエルで３０℃で１時間インキュベートした。コントロールとして、非抗体PCRフラグメントを、同じ転写／翻訳及びインキュベーション条件で使用した。インキュベーション後、ストリップをPBS（リン酸緩衝食塩水）、0.05％ツイーンで３回洗浄した。抗体フラグメントが発現してウエルの表面に固定化されたのを証明するため、HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）−抗−ヒトκ抗体を使用した。固定化されたP5-17の結合活性をテストするため、ウエルをビオチン標識プロゲステロン−BSA（P-BSA)で１時間インキュベートし、続いてHRP-ストレプトアビジンで、さらに１時間で検出した。HRP活性を発色させ、その色をELISAリーダーで450nmで測定した。
この２つの成分アレイの実験の結果、抗体フラグメントは、インビトロでうまく発現し、ウエルの表面にインサイツで結合し（抗体κ結合陽性）、特定の抗原結合の判定基準によって機能的であったことが示された（図５）。この結果は、PCR  DNAのインビトロの転写及び翻訳と、ウエル表面に生成物が同時に固定化されることによって、タンパク質の機能を保持しつつ、個々のタンパク質アレイ位置をマイクロウエルに作成できることを示す。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
例３  固定化がヘキサヒスチジンタグを要求する証明
非特異的タンパク質の局在を不可能にするため、抗プロゲステロンDB3のマウス抗体VH/Kフラグメントを、前述の２つの異なる構造物を使用して生成した。一つは、単一のヘキサヒスチジンタグ配列を含めたのに対し、もう一つは、その配列を除いた。タンパク質合成をHisSorbウエルで行った。 (His)6-含有構造物だけが、HRP-結合抗マウスκによって翻訳後に検出され、インサイツでの固定化はヘキサヒスチジン配列を要求することを示した。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
例４  インサイツでのタンパク質アレイによるヒト一本鎖抗プロゲステロンVH/K（P5-17)の機能分析
フラグメントP5-17をコードするDNA構造物をPCRで生成した。構造物は、インビトロでのタンパク質合成のためのT7プロモーターとKozak配列、タンパク質固定化のための一対のHis-タグ、及び有効なタンパク質生成のためのポリA及び転写終結領域を含む。タンパク質発現を、プロメガ社「PCR’キット用TNT  Quick」にPCR構造物を添加することにより行った。混合物を、Ni+-NTAコートプレート（キアゲン社)のそれぞれのウエルでインキュベートし、その結果タンパク質生成及びインサイツでの固定化が同時に行われた。各ウエルは２５μｌのTNT翻訳混合物を含み、この混合物を、３０℃で２〜３時間シェーキングしながらインキュベートした。PBS-ツイーンで洗浄（３回）後、ウエルをビオチン標識プロゲステロン−BSA(P-BSA)又はHRP-結合ヒツジ抗ヒトκのいずれかで処理した。ビオチン標識された抗原の検出には、HRP結合ストレプトアビジンを使用した。コントロールとして、ビオチン標識BSA（BSA)及び抗マウスκ（マウス）を使用した。図６は、ビオチン標識BSAが結合しなかったのに対し、ビオチン標識プロゲステロンBSAを強く結合した（黄色）ことを示す。同様に、P5-17の存在は、抗マウスκではなく抗ヒトκ（青）によってのみ検出された。従って、この実験は、「タンパク質インサイツアレイ」の形（PISA)で、P5-17フラグメントの機能的発現及び固定化を証明する。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
例７  連結した発現及びマグネチックビーズでのルシフェラーゼの固定化
PISA手順を使用してマグネチックビーズの固体表面に固定化した機能的酵素を生成するのに、ルシフェラーゼを選択した。C末端一対His-タグ（Luci-His)を有するルシフェラーゼをコードする構造物を、VH/Kで述べたPCRで生成した。また、コントロールとして、His-タグドメインを欠くルシフェラーゼDNA（Luci)をPCR生成した。ルシフェラーゼDNAのPCR生成用プライマーは、以下の通りであった。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
T7プロモーター及びKozakシグナルは、下線部である。イタリック体は、ルシフェラーゼの５’領域に相補的な配列を示す。ATGは、開始コドンである。Luci-リンカー/フォア: GCC ACC GCC TCT AGA GCG CAA TTT GGA CTT TCC GCC [配列ID番号１０]。下線部の配列は、一対の（His)6-タグドメインの生成に使用されるリンカー−タグ/バックプライマー（前記参照）と部分的に一致する。
Ni-NTAコートマグネチックビーズの存在下で無細胞発現後、後者を翻訳混合物から分離し、洗浄した。翻訳混合物上清中のフリーのルシフェラーゼ活性、ビーズに固定化されたルシフェラーゼ活性を、照度計を使用して測定した（図１１）。His-タグドメインを欠くルシフェラーゼ構造物は、翻訳混合物中でのみ活性を生じたが、Luci-Hisは混合物又はビーズの両方で活性を起こし、一対のHisタグドメインを通して機能的ルシフェラーゼの成功した固定化が示された。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
例１４  リボソームディスプレイ及びPISAの組み合わせによるタンパク質―タンパク質相互反応の証明：Grb2のVav/N-SH3との相互作用
シグナル伝達タンパク質Vav及びGrb2の相互作用（Ye及びBaltimore（1994）PNAS  91：12629-12633）をモデルとして選択し、リボゾームディスプレイ及びPISAタンパク質アレイの組み合わせを通してタンパク質−タンパク質相互作用を証明した。未処理の哺乳類の造血細胞において、Vavはアダプター分子Grb2に結合し、Rasアクチベーションを経由してシグナル伝達を開始する。Vavは、Src相同性２及び３ドメイン（SH2、SH3）を(N-SH3)-SH2-(C-SH3)の順で含む。まず、Grb2との相互作用を酵母two-hybridスクリーニングによって同定し、引き続いてフィルター結合アッセイによってVavのN-SH3ドメインとGrb2のC-SH3ドメインの間に高い特異性結合を伴うことが示された（Ye及びBaltimore、1994）。Grb2  C-SH3ドメインは、VavのN-SH3のドメインと結合するが、Vav/SH2-(C-SH3)ドメインとは結合しない。また、Ye及びBaltimoreは、Vavとの相互作用を検出するため、グルタチオン複合アガロースビーズに連結したGST-Grb2を調製し、ビーズの完全長Grb2が細胞ライセートから完全長Vavを沈澱させたことを示した。
我々は、Martin  Turner博士（Babraham  Institute)によって提供されたプラスミドから、Vav/N-SH3フラグメント（N末端SH3ドメインを含む）、Vav/SH2-C-SH3（SH2ドメイン及び結合C末端SH3ドメインを含む）及びPCRによる完全長Grb2に対するDNAを、これらに対応するDNA配列に基づくプライマーを用いて生成した。リボソームディスプレイのための構造物に、ヒトCκドメインを、タンパク質のC末端で組み入れ、一方タンパク質アレイ（PISA)フォーマットのための構造物に、一対の（His)6ドメインをC末端（Cκドメインなし）に加えた。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
インビトロでのDNAの転写及び翻訳後のインサイツでの機能的タンパク質アレイ成分の構造物である。
P5-17タンパク質又はコントロールタンパク質を、インビトロでそれぞれ３デュプリケートウエルでPCR  DNAから合成し、一対のヘキサヒスチジンタグを介してHisSorbウエルのNi-NTA表面にインサイツで固定化した。
１：ビオチン標識プロゲステロンBSAの結合、その後HPRストレプトアビジン検出。
２：HRP抗ヒトκ抗体の結合。
３：HRPストレプトアビジンの結合。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
インビトロでのDNAの転写および翻訳後、第二表面へのタンパク質の移転による機能的タンパク質アレイ成分の構築
一対のヘキサヒスチジンタグを有するP5-17タンパク質又はコントロールタンパク質を、コートしていないポリスチレンウエルで、インビトロでPCR  DNAから合成して、Ni-NTAでコートしたHisSorbウエルに移した。特異的結合を、ビオチン標識プロゲステロンウシ血清アルブミン（*P-BSA)、ビオチン標識BSA（*BSA)、又はビオチン標識癌胎児性抗原（*CEA)で、続いてHRPストレプトアビジン検出で、検出した。タンパク質の発現を、HRP抗ヒトκ抗体で検出した。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
照度計によるフリー及びPISA固定化されたルシフェラーゼの機能的アッセイである。上清：NiNTAマグネチックアガロースビーズとのインキュベーション後のTNT混合物である。NC:PCR  DNAを欠くTNT混合物コントロールである。Luci：一対のHisタグドメインなしのルシフェラーゼをコードするPCR構造物を含むTNT混合物である。Luci-His：一対のHisタグドメインと融着したルシフェラーゼをコードするPCR構造物を含むTNT混合物である。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2004506898.tif 000001