(57)【要約】  薬物感受性が著しく向上した酵母遺伝子破壊株セットを提供する。  本発明の酵母細胞セットは、２種以上の酵母細胞からなる酵母細胞セットであって、前記２種以上の酵母細胞の各々が相互に異なる遺伝子の少なくとも１種を欠損又は変異し、かつ、前記２種以上の酵母細胞のすべてが薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種を発現制御された薬物高感受性酵母細胞からなる酵母細胞セットである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の酵母細胞からなる酵母細胞セットであって、前記２種以上の酵母細胞の各々が相互に異なる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を欠損又は変異し、かつ、前記２種以上の酵母細胞のすべてが薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種を発現制御された薬物高感受性酵母細胞である酵母細胞セット。
【請求項２】
前記薬物感受性関連遺伝子が、トランスポーター関連遺伝子及びエルゴステロール合成関連遺伝子から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の酵母細胞セット。
【請求項３】
前記トランスポーター関連遺伝子が、ＰＤＲ１及びＰＤＲ３であることを特徴とする請求項２に記載の酵母細胞セット。
【請求項４】
前記エルゴステロール合成関連遺伝子が、ＥＲＧ６又はＥＲＧ３であることを特徴とする請求項２に記載の酵母細胞セット。
【請求項５】
前記トランスポーター関連遺伝子は、前記トランスポーター関連遺伝子の欠損によって発現制御され、かつ、前記エルゴステロール合成関連遺伝子は、前記エルゴステロール合成関連遺伝子の転写調節によって発現制御されることを特徴とする請求項２に記載の酵母細胞セット。
【請求項６】
前記酵母細胞は、二倍体であることを特徴とする請求項１に記載の酵母細胞セット。
【請求項７】
被検物質の標的候補分子を同定する方法であって、
請求項１に記載の酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、前記被検物質とを接触させる工程と、
前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
前記選択された酵母細胞において変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、
前記第１の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程と、
を含む標的候補分子同定方法。
【請求項８】
被検物質の標的候補分子を同定する方法であって、
請求項１に記載の酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、前記被検物質とを接触させる工程と、
前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、
前記第１の遺伝子と対立遺伝子の関係にある遺伝子を、第２の遺伝子として同定する工程と、
前記第２の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程と、
を含む標的候補分子同定方法。
【請求項９】
被検物質の標的候補分子を同定する方法であって、
請求項１に記載の酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、前記被検物質とを接触させる工程と、
前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、
前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を、第２の遺伝子として同定する工程と、
前記第２の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程と、
を含む標的候補分子同定方法。
【請求項１０】
前記表現型の変化は、致死又は増殖抑制であることを特徴とする請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の標的候補分子同定方法。
【請求項１１】
前記酵母細胞を選択する工程が、
（１）前記被検物質非存在下における細胞数に関する指標の時間に対するコントロール曲線の関数Ｆ（ｔ）と、前記被検物質存在下における細胞数に関する指標の時間に対するテスト曲線の関数Ｇ（ｔ）と、を入手する工程と、
（２）式（Ｆ（ｔ）−Ｇ（ｔ））の積分値を算出して、エリア値を得る工程と、
（３）前記エリア値をもとに、表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の標的候補分子同定方法。
【請求項１２】
被検物質の酵母細胞に対する作用機序を解析する方法であって、
請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の標的候補分子同定方法により、被検物質の標的候補分子を同定する工程と、
前記標的候補分子の機能を同定する工程と、
前記標的候補分子の機能に基づいて、被検物質の酵母細胞に対する作用機序を解析する工程と、
を含む被検物質の作用機序解析方法。
【請求項１３】
目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
請求項１に記載の酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、
前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
前記選択された酵母細胞において変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、
前記第１の遺伝子と、前記目的とする分子を転写産物あるいは翻訳産物とする遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１４】
目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
請求項１に記載の酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、
前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、
前記第１の遺伝子と対立遺伝子の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程と、
前記第２の遺伝子と、前記目的とする分子を転写産物あるいは翻訳産物とする遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１５】
目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
請求項１に記載の酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、
前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、
前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程と、
前記第２の遺伝子と、前記目的とする分子を転写産物あるいは翻訳産物とする遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記表現型の変化は、致死又は増殖抑制である請求項１３〜請求項１５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記酵母細胞を選択する工程が、
（１）前記被検物質非存在下における細胞数に関する指標の時間に対するコントロール曲線の関数Ｆ（ｔ）と、前記被検物質存在下における細胞数に関する指標の時間に対するテスト曲線の関数Ｇ（ｔ）と、を入手する工程と、
（２）式（Ｆ（ｔ）−Ｇ（ｔ））の積分値を算出して、エリア値を得る工程と、
（３）前記エリア値をもとに、表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、
を含むことを特徴とする請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Technical Field
本発明は、酵母細胞セット、並びに、標的候補分子同定方法、作用機序解析方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Background Art
被検物質が細胞に作用するメカニズムおよびその標的分子の同定は、ゲノム構造が明らかになった現在でも困難な課題の一つである。最近、ＤＮＡマイクロアレイ等のポストゲノム技術の進展により、被検物質の作用をゲノムワイドに解析する試みがなされてきている（例えば、非特許文献１参照）。この中で、多くのヒト相同遺伝子を持ち遺伝学的手法が使える出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ（S.cerevisiae、以下、「酵母」と称する場合がある）は、被検物質の作用メカニズム解明に有用な道具と考えられてきた（例えば、非特許文献２参照）。【０００３】
最近、酵母の全遺伝子約６０００種を一種ずつ破壊するプロジェクトが完了し（例えば、非特許文献３参照）、これらの酵母を用いたシステムが注目されている。前記プロジェクトの結果、酵母ゲノム上に存在する約６０００種の遺伝子のうち、約１２００遺伝子は、生存に必須の遺伝子、即ち、これらの遺伝子を一つでも破壊すると、当該酵母が致死となる遺伝子（必須遺伝子）であることが明らかになった。一方、残りの約４８００遺伝子は、その遺伝子の一つを破壊しても、当該酵母が通常の培地中での増殖が可能であり、当該酵母が致死とならない遺伝子（非必須遺伝子）であることが明らかになった。【０００４】
例えば、ある被検物質を、約４８００種の非必須遺伝子を破壊した株それぞれに作用させたとき、特異的にその被検物質の影響を受ける非必須遺伝子破壊株があれば、その遺伝子がその被検物質の作用に関連していることがわかる。ここで、非必須遺伝子とは、遺伝子を破壊（二倍体細胞の場合には２本の対立遺伝子の双方を破壊、一倍体細胞の場合には１本の遺伝子を破壊）しても細胞が増殖できる遺伝子をいう。実際に、この原理を用いた被検物質の作用機序解析法が次々と報告されてきている（例えば、非特許文献４〜７参照）。また、様々な被検物質について被検物質の感受性株プロファイリングを行い、これらを比較することで、ターゲット未知の被検物質の作用点が見えてくる可能性が報告されている（例えば、非特許文献７参照）。
上記のような目的に用いられる酵母株は一般にノックアウト酵母（Yeast knockout strain；ＹＫＯ）と呼ばれ、ＹＫＯコレクションとして市販されている。【０００５】
酵母細胞は自然界で様々な低分子化合物に晒されながら生存するために、酵母細胞にとっての毒物となる低分子化合物から身を守る仕組みを備えている。例えば細胞内に低分子化合物が進入してきた場合、これを細胞外へ排出するポンプ（以下、「トランスポーター」ということがある）を機能させて、低分子化合物から身を守っている。また酵母細胞においては、細胞膜の組成が哺乳類細胞と異なっている。具体的にはコレステロールの代わりにエルゴステロールが含まれているため、酵母細胞における低分子化合物の細胞膜透過性は、哺乳類細胞に比べて著しく低下している。これらの発達した仕組みにより、酵母細胞は哺乳類細胞に比べて一般に薬物（低分子化合物）の影響を受け難いことが知られている。例えば、薬物によってはその作用濃度の差が１００倍程度の場合もある。
このような酵母細胞における薬物感受性の低さは、ＹＫＯを用いた評価方法を多くの薬物に適用する際に大きな壁となっていた。【０００６】
酵母細胞の薬物感受性を向上させる方法として、ＡＢＣ（ATP Binding Cassette）トランスポーターであるＰｄｒ５ｐの発現を誘導する転写因子Ｐｄｒ１ｐ及びＰｄｒ３ｐの発現を抑制する方法が報告されている（例えば、非特許文献８参照）。また、酵母細胞膜の構成成分であるエルゴステロールを合成する経路の酵素Ｅｒｇ６ｐの発現を抑制することで薬物透過性が上がり、酵母の薬物感受性が高くなることが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】国際公開第２００６／０４６６９４号パンフレット
【非特許文献１】Huels et al, 2002, Drug Discovery Today, 7(suppl.):119-124.
【非特許文献２】Simon and Bedalov, Nat Rev Cancer, 2004, 4:481-92.
【非特許文献３】Giaever et al, Nature 2002 418:387-91.
【非特許文献４】Giaever et al, Nat Genet, 1999, 21:278-83.
【非特許文献５】Giaever et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101:793-798.
【非特許文献６】Lum et al, Cell, 2004, 116:121-37.
【非特許文献７】Parsons et al, Nat BioTechnol, 2004, 22:62-9.
【非特許文献８】Delaveau et al, Mol Gen Genet., 1994, 244(5), 501-11.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Disclosure of Invention
本発明の課題は、薬物感受性が著しく向上した酵母遺伝子破壊株セットを提供することである。また、本発明の別の課題は、薬物感受性が著しく向上した酵母遺伝子破壊株セットを用いた高感度な被検物質の標的候補分子同定方法、作用機序解析方法及び目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、従来の酵母遺伝子破壊株セットに含まれる各々の酵母細胞に対して、薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種を更に発現制御することで、本発明の課題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の具体的手段は以下の通りである。【０００９】
本発明の第1の態様は、２種以上の酵母細胞からなる酵母細胞セットであって、前記２種以上の酵母細胞の各々が相互に異なる遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を欠損又は変異し、かつ、前記２種以上の酵母細胞のすべてが薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種を発現制御された薬物高感受性酵母細胞である酵母細胞セットである。
前記薬物感受性関連遺伝子は、トランスポーター関連遺伝子及びエルゴステロール合成関連遺伝子から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい
また、前記トランスポーター関連遺伝子が、ＰＤＲ１及びＰＤＲ３であることが好ましく、前記エルゴステロール合成関連遺伝子が、ＥＲＧ６又はＥＲＧ３であることもまた好ましい。
また、前記トランスポーター関連遺伝子は、前記トランスポーター関連遺伝子の欠損によって発現制御され、かつ、前記エルゴステロール合成関連遺伝子は、前記エルゴステロール合成関連遺伝子の転写調節によって発現制御されることが好ましい。
更に前記酵母細胞は、二倍体であってもよい。【００１０】
本発明の第２の態様は、被検物質の標的候補分子を同定する方法であって、前記酵母細胞セットに含まれる少なくとも１種の酵母細胞と、前記被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程と、を含む被検物質の標的候補分子同定方法である。【００１１】
本発明の第３の態様は、被検物質の標的候補分子を同定する方法であって、前記酵母細胞セットに含まれる少なくとも１種の酵母細胞と、前記被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子と対立遺伝子の関係にある遺伝子を、第２の遺伝子として同定する工程と、前記第２の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程と、を含む被検物質の標的候補分子同定方法である。【００１２】
本発明の第４の態様は、被検物質の標的候補分子を同定する方法であって、前記酵母細胞セットに含まれる少なくとも１種の酵母細胞と、前記被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を、第２の遺伝子として同定する工程と、前記第２の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程と、を含む被検物質の標的候補分子同定方法である。【００１３】
本発明の第５の態様は、被検物質の酵母細胞に対する作用機序を解析する方法であって、前記標的候補分子同定方法により、被検物質の標的候補分子を同定する工程と、前記標的候補分子の機能を同定する工程と、前記標的候補分子の機能に基づいて、被検物質の酵母細胞に対する作用機序を解析する工程と、を含む被検物質の作用機序解析方法である。【００１４】
本発明の第６の態様は、目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、前記酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子と、前記目的とする分子を転写産物あるいは翻訳産物とする遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、を含むスクリーニング方法である。【００１５】
本発明の第７の態様は、目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、前記酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子と対立遺伝子の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程と、前記第２の遺伝子と、前記目的とする分子を転写産物あるいは翻訳産物とする遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、を含むスクリーニング方法である。【００１６】
本発明の第８の態様は、目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、前記酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程と、前記第２の遺伝子と、前記目的とする分子を転写産物あるいは翻訳産物とする遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、を含むスクリーニング方法である。【００１７】
また、本発明の第２〜第８の態様における前記表現型の変化は、致死又は増殖抑制であることが好ましい。
更に、前記酵母細胞を選択する工程が、（１）前記被検物質非存在下における細胞数に関する指標の時間に対するコントロール曲線の関数Ｆ（ｔ）と、前記被検物質存在下における細胞数に関する指標の時間に対するテスト曲線の関数Ｇ（ｔ）と、を入手する工程と、（２）式（Ｆ（ｔ）−Ｇ（ｔ））の積分値を算出して、エリア値を得る工程と、（３）前記エリア値をもとに、表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、薬物感受性が著しく向上した酵母遺伝子破壊株セットを提供することができる。また、本発明によれば、薬物感受性が著しく向上した酵母遺伝子破壊株セットを用いた高感度な被検物質の標的候補分子同定方法、作用機序解析方法及び目的とする分子の機能に影響を与える物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
Brief Description of Drawings
【図１】ＭＡＴa型バリアフリーＹＤＳの作製手順を示す概略図である。
【図２】ＭＡＴα型バリアフリーＹＤＳの作製手順を示す概略図である。
【図３】ＭＡＴa型スーパーバリアフリーＹＤＳの作製手順を示す概略図である。
【図４】薬物感受性関連遺伝子破壊株のロバスタチンに対する感受性を示すグラフである。
【図５】薬物感受性関連遺伝子破壊株のラパマイシンに対する感受性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
Best Mode of Carrying Out the Invention
本発明の酵母細胞セットは、２種以上の酵母細胞からなり、前記２種以上の酵母細胞の各々が相互に異なる遺伝子の少なくとも１種を欠損又は変異し、かつ、前記２種以上の酵母細胞のすべてが薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種を発現制御された薬物高感受性酵母細胞であることを特徴とする。
かかる構成の酵母細胞セットは、薬物感受性が著しく向上した酵母遺伝子破壊株セットである。【００２１】
本発明の酵母細胞セットは２種以上の酵母細胞からなるが、後述する被検物質の標的候補分子同定方法において、より効率的、より高精度に標的候補分子が同定可能であるという点から、１０００種以上の酵母細胞からなることが好ましく、２０００種以上の酵母細胞からなることがより好ましく、３０００種以上の酵母細胞からなることが更に好ましい。【００２２】
本発明における２種以上の酵母細胞においては、各々の酵母細胞が相互に異なる遺伝子の少なくとも１種を欠損又は変異している。このような酵母細胞からなる酵母細胞セットを用いることで、後述のようにして被検物質の標的候補分子を同定することができる。
本発明における酵母細胞は一倍体であっても二倍体であってもよく、二倍体である場合、必須遺伝子においては対立遺伝子の片方を欠損又は変異していることが好ましい。この場合には、必須遺伝子についても転写産物あるいは翻訳産物を標的候補分子として同定することができる。また、非必須遺伝子においては対立遺伝子の両方を欠損又は変異していることもまた好ましい。【００２３】
本発明における、２種以上の酵母細胞からなり、前記２種以上の酵母細胞の各々の酵母細胞が相互に異なる遺伝子の少なくとも１種を欠損又は変異している酵母細胞セットは、例えば、Science 2001, 294, 2364-2368に記載方法で作製することができる。また、インビトロジェン社製＃９５４０１．Ｈ２およびオープンバイオシステム社製＃ＹＳＣ１０６６として入手することができる。【００２４】
本発明の酵母細胞セットに含まれるすべての酵母細胞は、薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種が発現制御された高薬物感受性酵母細胞となっている。
本発明における薬物感受性関連遺伝子とは、酵母細胞の薬物感受性を直接的又は間接的に制御可能な遺伝子であって、発現抑制又は発現過剰によって致死とならない限りいかなる遺伝子であってもよい。例えば、細胞内からの薬物排出に関与する遺伝子、細胞膜の薬物透過性に関与する遺伝子、ストレス応答に関与する遺伝子等を挙げることができる。より具体的には、トランスポーター関連遺伝子、エルゴステロール合成関連遺伝子、ストレス応答関連遺伝子等を挙げることができる。【００２５】
本発明における薬物感受性関連遺伝子としては、薬物感受性のより効果的な向上の点から、トランスポーター関連遺伝子及びエルゴステロール合成関連遺伝子から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、トランスポーター関連遺伝子及びエルゴステロール合成関連遺伝子の両方であることがより好ましい。
また、本発明における薬物感受性関連遺伝子としては、同種の遺伝子を２種以上用いることもできる。【００２６】
本発明におけるトランスポーターとは、細胞膜に存在する膜タンパク質であって輸送基質の細胞膜通過に関与するタンパク質をいう。トランスポーターには、ＡＴＰの加水分解エネルギーを利用して輸送を行うＡＢＣトランスポーターと、ＡＴＰの加水分解エネルギーを利用しないで輸送を行うＳＬＣトランスポーターがあるが、本発明においては、ＡＢＣトランスポーターであることが好ましい。
本発明におけるトランスポーター関連遺伝子としては、例えば、トランスポーターを構成するタンパク質をコードする遺伝子、トランスポーター遺伝子の転写因子をコードする遺伝子、トランスポーターの活性を制御するタンパク質をコードする遺伝子、トランスポーターの細胞膜表面への発現を制御する遺伝子等を挙げることができる。
本発明においては、トランスポーター関連遺伝子がＡＢＣトランスポーターの１種であるｐｄｒ５ｐをコードするＰＤＲ５遺伝子に関連する遺伝子であることが好ましい。ＰＤＲ５関連遺伝子の中でも、ＰＤＲ１及びＰＤＲ３であることがより好ましい。【００２７】
ここでＰＤＲ１及びＰＤＲ３は、ＰＤＲ５遺伝子のマスター転写因子であるｐｄｒ１ｐとｐｒｄ３ｐとをそれぞれコードする遺伝子を意味する。
酵母細胞におけるｐｄｒ１ｐ及びｐｒｄ３ｐとしては、例えば、酵母がサッカロミセス・セレビジエの場合、GenBank Accession No.CAA96713及びGenBank Accession No. CAA84822として公知のアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。【００２８】
またエルゴステロール合成関連遺伝子としては、例えば、エルゴステロール合成酵素タンパク質をコードする遺伝子、エルゴステロール合成酵素の転写因子をコードする遺伝子、エルゴステロール合成酵素の活性を制御する遺伝子等を挙げることができる
本発明においては、エルゴステロール合成関連遺伝子がエルゴステロール合成酵素タンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。エルゴステロール合成酵素タンパク質をコードする遺伝子としては、酵母がサッカロミセス・セレビジエの場合、ＥＲＧ６又はＥＲＧ３であることが好ましく、ＥＲＧ６であることがより好ましい。ここでＥＲＧ６及びＥＲＧ３は、それぞれエルゴステロール合成酵素の一つであるｅｒｇ６ｐ及びｅｒｇ３ｐをコードする遺伝子である。本発明におけるｅｒｇ６ｐ及びｅｒｇ３ｐとしては、例えば、GenBank Accession No.CAA89944、CAA97586として公知のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。【００２９】
また、ストレス応答関連遺伝子としては、例えば、ＹＡＰ１（GenBank Accession No.CAA89945）等を挙げることができる。【００３０】
本発明において前記薬物感受性関連遺伝子が発現制御されているとは、前記薬物感受性関連遺伝子の一部もしくはすべてが欠損していること、又は、前記薬物感受性関連遺伝子が転写調節によって発現制御されていることを意味する。
薬物感受性関連遺伝子の一部が欠損しているとは、薬物感受性関連遺伝子がコードするタンパク質がその機能を発揮できない状態となる程度に、その遺伝子配列の一部を欠損していることを意味する。また、機能を発揮できない状態とは、薬物に対する感受性が上昇する程度に機能が抑制された状態にあればよい。【００３１】
また本発明において、前記薬物感受性関連遺伝子の転写制御による発現制御は、薬物感受性関連遺伝子が誘導可能に発現抑制されていることが好ましい。薬物感受性関連遺伝子が誘導可能に発現抑制されているとは、発現が抑制された状態と、発現が誘導された状態とが、外部因子により調節可能であることをいう。「発現が抑制された状態」とは、薬物感受性が上昇する程度に薬物感受性関連遺伝子の発現が抑制されていればよく、例えば、薬物感受性関連遺伝子の発現量が、野生株または非改変株の１０％以下に低下した状態が好ましい。また、「発現が誘導された状態」とは、例えば、薬物感受性関連遺伝子の発現量が、野生株または非改変株と同程度まで誘導された状態が好ましく、野生株または非改変株における発現量の８０％以上に誘導された状態がより好ましい。薬物感受性関連遺伝子の発現量は、例えば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ等公知の技術を用いて確認することができる。【００３２】
薬物感受性関連遺伝子の発現量を調節する方法としては、薬物感受性関連遺伝子の転写を調節する方法が挙げられる。薬物感受性関連遺伝子の転写を調節する方法としては、公知の方法を特に制限なく用いることができる。具体的には例えば、テトラサイクリン遺伝子発現誘導系を用いる方法及び誘導可能なプロモーターを用いる方法等を挙げることができる。
本発明において用いることができる、誘導可能なプロモーターを用いた薬物感受性関連遺伝子の転写調節方法としては、例えば、国際公開第２００６／０４６６９４号に記載の方法を挙げることができる。【００３３】
本発明においては、薬物感受性と作製可能な薬物高感受性酵母株の種類の点とから、前記薬物感受性関連遺伝子の発現制御が、前記トランスポーター関連遺伝子の欠損による発現制御であって、かつ、前記エルゴステロール合成関連遺伝子の転写調節によって発現制御であることが好ましい。【００３４】
本発明において、薬物感受性関連遺伝子が誘導可能なプロモーターによって転写調節される場合、薬物感受性関連遺伝子に加えて、形質転換された酵母細胞株を選択するためのマーカー遺伝子も前記プロモーターによって転写調節されることが好ましい。これにより、本発明の酵母細胞セットを用いたバイオアッセイにおいて、マーカー遺伝子の影響を効果的に排除することができる。
前記マーカー遺伝子としては、ＫａｎＭＸ６、ＭＰＲ１、ＰＰＲ１＋等公知のマーカー遺伝子を特に制限なく用いることができる。本発明においては、選択効率の点から、ＰＰＲ１＋であることが好ましい。【００３５】
特に、本発明における薬物高感受性酵母細胞としては、前記ＰＤＲ１遺伝子及びＰＤＲ３遺伝子の両方が欠損している状態にあり、かつ前記ＥＲＧ６遺伝子が誘導可能に発現抑制されている状態にある酵母細胞であることがより好ましい。これにより、より高い薬物感受性を有する酵母細胞とすることができる。また、良好な接合効率によって、より多くの薬物高感受性酵母細胞株が作製可能になる。【００３６】
本発明の酵母細胞セットが一倍体酵母細胞からなる場合、酵母細胞の性（接合型）はａ型又はα型となる。性がａ型の酵母細胞からなる酵母細胞セットは、例えば、Science, 2001, 294, 2364-2368.に記載の方法によって作製することができる。一方、性がα型の酵母細胞からなる酵母細胞セットは、例えば、前記ＭＡＴａ遺伝子を有する酵母細胞からなる酵母細胞セットの作製において、マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を用い、５−ＦＯＡ（5-Fluoroorotic acid）を用いた対抗選択を行うことによって作製することができる。すなわち５−ＦＯＡはＵＲＡ３遺伝子の遺伝子産物により毒性化合物に変換されるため、培地に５−ＦＯＡを添加することで、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞のみを選択的に除外することができる。
本発明における一倍体の酵母細胞の選択においては、選択培地による選択を少なくとも２回行うことが好ましく、中でも、シングルコロニーを選択する操作を少なくとも１回行うことがより好ましい。これにより、野生型遺伝子を有する二倍体酵母細胞の混入をより効果的に防ぐことができる。【００３７】
本発明においては、二倍体酵母細胞の作製効率の観点から、マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を用いることが好ましい。例えば、ＭＦＡ１プロモーターによって転写制御されるＵＲＡ３遺伝子を導入することにより、ａ型の酵母細胞特異的にＵＲＡ３遺伝子が発現し、ウラシルを含まない（Ｕｒａ−）の培地によりａ型の酵母細胞が、また、５−ＦＯＡを含む培地によりα型の酵母細胞を選択できる。すなわち、ａ型の酵母細胞セットを作製する工程において、α型の酵母細胞セットを同時に作製することができる。
また、プロモーターとしてＭＦＡ１の代わりにＭＦα１プロモーターを使用することで、同様にしてα型の酵母細胞セットを作る過程においてａ型の酵母細胞セットを作ることができる。【００３８】
本発明の酵母細胞セットは、例えば、薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種が発現制御されたパートナー株を作製し、これを既存の酵母遺伝子破壊株（ＹＫＯ）セットに含まれる各々の酵母細胞株と掛け合わせることで作製することができる。本発明においては、前記ＥＲＧ６が誘導可能に発現制御されていることにより、より効率的に薬剤高感受性酵母細胞を作製することができる。
上記薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種が、発現制御されたパートナー株は、例えば、ＰＣＲによる効率的遺伝子破壊アレルの作製法（Baudin A et.al., Nucl.Acid Res., 1993, 21, 3329-3330.）に記載の方法を用いることで、薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種が破壊されたパートナー株として作製することができる。【００３９】
また、薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種が誘導可能に発現抑制されたパートナー株は、例えば、国際公開第２００６／０４６６９４号に記載の方法で作製することができる。
また、薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種が発現制御され、更に別の遺伝子変異を有する酵母細胞株は、例えば、Science. 2001 Dec 14;294(5550):2364-2368（トロント大学のBooneらによるSynthetic Genetic Array (SGA)法の論文）に記載された方法に準じて行うことができる。【００４０】
二倍体の酵母細胞は、一倍体の酵母細胞を掛け合わせる（接合する）ことにより作製できる。例えば、非必須遺伝子の対立遺伝子の両方を欠損又は変異しているホモ欠損二倍体からなる薬物高感受性酵母細胞は、マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を用いて非必須遺伝子を欠失したａ型の酵母細胞とα型の酵母細胞を上記のようにして同時に作製し、これらを接合することにより作製できる。
また、必須遺伝子における対立遺伝子の片方を欠損又は変異しているヘテロ欠損二倍体からなる薬物高感受性酵母細胞は、例えば以下のようにして作製することができる。欠損又は変異している前記必須遺伝子をプラスミドとして薬物高感受性ではないヘテロ欠損二倍体酵母細胞株に導入した後、胞子形成させる。形成された胞子から、前記必須遺伝子を欠損し且つ前記プラスミドを有する一倍体酵母細胞株を選択する。選択した一倍体酵母細胞株を上記薬物感受性関連遺伝子の少なくとも１種が破壊されたパートナー株と接合、胞子形成した後、例えばａ型酵母細胞株を選択する。選択した酵母細胞株を再び上記パートナー株と接合して二倍体細胞株とした後、導入したプラスミドを除去することで作製することができる。【００４１】
上記の作製方法における具体的な操作方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY、Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harber Laboratory Course Manual, 2000 Edition等に記載の方法に従って行うことができる。【００４２】
本発明の第１の被検物質の標的候補分子同定方法は、上記酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と被検物質とを接触させる工程と、被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を被検物質の標的候補分子として同定する工程とを含むことを特徴とする。
本発明の第１の標的候補分子同定方法が上記構成であることにより、従来は同定不可能であった低濃度の薬物を用いた場合であっても、より高い精度で被検物質の標的候補分子を同定することができる。【００４３】
本発明においては、上述の酵母細胞セットから選ばれる少なくとも１種の酵母細胞と被検物質と接触させる。前記酵母細胞の種類数に特に制限はないが、被検物質の標的候補分子を同定する精度と効率の点から、可能な限り多いほうが好ましい。例えば、好ましくは１０００種以上、より好ましくは３０００種以上とすることで、より高精度かつより効率的に被検物質の標的候補分子を同定することができる。【００４４】
前記被検物質としては酵母細胞と接触させることができる限り、いかなる物質を用いることもできる。被検物質としては、例えば、天然由来の低分子化合物、天然由来の高分子化合物、合成低分子化合物、合成高分子化合物、ペプチド、タンパク質、多糖類、核酸等を挙げることができる。
前記酵母細胞と被検物質とを接触させる方法には、特に制限はなく、例えば、酵母細胞の培養液に被検物質の溶液を添加することで行うことができる。【００４５】
前記表現型の変化としては、細胞数、コロニーの大きさ、形、色等、識別可能であればいかなる表現型の変化であってもよいが、検出効率の点から、致死又は増殖抑制であることが好ましい。
表現型が致死又は増殖抑制に変化した酵母細胞を選択する方法としては、例えば、酵母細胞の培養液中における、被検物質非存在下の細胞数に対する被検物質存在下の細胞数の割合を評価することで選択する方法を挙げることができる。このような評価は、培養液中の細胞数を実測することによって行ってもよく、細胞数を代替する指標を設定し、これを定量化することで行ってもよい。細胞数を代替する指標としては、例えば、グルコース消費量、培養液の濁度、細胞面積、蛍光強度等を挙げることができる。本発明においては、精度と簡便性の点から、培養液の濁度であることが好ましい。培養液の濁度は、例えば、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの吸光度を測定することで求めることができる。【００４６】
細胞数を代替する指標を定量化する方法としては、例えば、所定の培養時間経過後の前記指標を測定する方法や、前記指標を経時的に測定して指標の変化速度を評価する方法等を挙げることができる。【００４７】
本発明においては、前記酵母細胞を選択する工程が、（１）被検物質非存在下における細胞数に関する指標の時間に対するコントロール曲線の関数Ｆ（ｔ）と、被検物質存在下における細胞数に関する指標の時間に対するテスト曲線の関数Ｇ（ｔ）と、を入手する工程と、（２）式（Ｆ（ｔ）−Ｇ（ｔ））の積分値を算出して、エリア値を得る工程と、（３）前記エリア値をもとに、表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、を含むことが好ましい。これにより、より高い精度とより良好な再現性とで、表現型の変化した酵母細胞を選択することができる。【００４８】
また本発明においては、精度と再現性の点から、前記（２）のエリア値を得る工程が、所定の時間内における式（Ｆ（ｔ）−Ｇ（ｔ））の積分値を算出してエリア値を得る工程であることが好ましく、所定の時間内における式（Ｆ（ｔ）−Ｇ（ｔ））の積分値をさらに所定の時間により除算してエリア値を得る工程であることがより好ましい。【００４９】
本発明において、前記関数Ｆ（ｔ）は、例えば、細胞数の指標を経時的に測定し、細胞数の指標の経時的変化を直線で近似することで求めることができる。また、同様にして前記関数Ｇ（ｔ）を求めることができる。
前記エリア値を得る工程については、例えば、特開２００６−１４１２９８号公報に記載の事項を、本発明においても好適に適用することができる。【００５０】
前記選択された酵母細胞が欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程においては、選択された酵母細胞が有する遺伝子を、ＰＣＲ等を用いた公知の方法で、欠損又は変異している遺伝子を同定することができる。また、本発明における酵母細胞として、欠損又は変異している遺伝子があらかじめ同定されている酵母細胞株を用いることで、選択された酵母細胞から該遺伝子を容易に同定することができる。【００５１】
前記第１の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程においては、例えば、第１の遺伝子の変異が、転写産物又は翻訳産物の機能を減弱するような変異である場合に、第１の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定することができる。【００５２】
第１の遺伝子の変異として転写産物又は翻訳産物の機能を減弱するような変異を有する酵母細胞株としては、例えば、第１の遺伝子の変異によって温度感受性となった酵母細胞株や、第１の遺伝子の発現が不完全に抑制された酵母細胞株を挙げることができる。【００５３】
また、本発明の第２及び第３の被検物質の標的候補分子同定方法は、上記酵母細胞セットに含まれる酵母細胞と被検物質とを接触させる工程と、被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子と対立遺伝子の関係にある遺伝子、又は、前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程と、前記第２の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を被検物質の標的候補分子として同定する工程と、を含むことを特徴とする。【００５４】
本発明の第２及び第３の標的候補分子同定方法が上記構成であることにより、従来は同定不可能であった低濃度の薬物を用いた場合であっても、より高い精度で被検物質の標的候補分子を同定することができる。【００５５】
本発明の、第２及び第３の標的候補分子同定方法において、前記第１の標的分子同定方法と共通する工程については、第１の標的分子同定方法において説明した事項をそのまま適用することができる。【００５６】
前記第１の遺伝子と対立関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程においては、例えば、前記第１の遺伝子が必須遺伝子であって、酵母細胞株が二倍体の場合、前記第１の遺伝子と対立関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定することができる。【００５７】
また、前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程においては、例えば、前記第１の遺伝子が非必須遺伝子であって、酵母細胞株が一倍体又は二倍体の場合、前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定することができる。【００５８】
ここで、合成致死とは、細胞中の複数種の遺伝子を同時に破壊すると致死に至る性質をいう。また、合成致死に至る遺伝子の組合せを合成致死の関係にあるという。また、対立関係にある遺伝子とは、二倍体細胞において、それぞれの遺伝子が相同の遺伝子座に属する遺伝子であって異なる遺伝子変異を有する関係にあることをいう。【００５９】
また、前記第２の遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を、前記被検物質の標的候補分子と同定する工程においては、例えば、前記第１の遺伝子が欠損している場合には、前記第２の遺伝子の、転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方を前記被検物質の標的候補分子と同定することができる。【００６０】
本発明においては、例えば、非必須遺伝子破壊株を用い、合成致死（synthetic lethal）を利用して、被検物質に影響を受ける遺伝子及びタンパク質の少なくとも一方を同定することができる。【００６１】
例えば、それぞれ非必須遺伝子である遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂの破壊株は、生育可能であるが、遺伝子Ａおよび遺伝子Ｂを同時に破壊された株は、致死となる場合がある。このとき、遺伝子Ａと遺伝子Ｂは、合成致死の関係にあるということができる。そして、例えば、遺伝子Ｂの破壊株に対して、遺伝子Ａの転写産物および翻訳産物の少なくとも一方を阻害する被検物質を作用させると、その被検物質の濃度が、遺伝子Ｂを破壊していない株の生育を完全には阻害しない濃度であっても、遺伝子Ｂの破壊株においては生育阻害又は致死となる濃度であることが期待される。この原理を応用して、被検物質を非必須遺伝子破壊株に作用させたときに生育阻害又は致死となる株を同定すると、その株で破壊されている遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子が明らかになる。すなわち被検物質の標的遺伝子が同定される。そして、当該合成致死の関係にある遺伝子の転写産物及び翻訳産物のすくなくとも一方が、その被検物質の標的候補分子となると考えられる（Hartwell et al, Science, 1997, 278:1064-8, Parsons et al, Nat Biotechnol, 2004,22:62-9）。【００６２】
また、ある遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子が知られていない場合であっても、公知である多数の非必須遺伝子破壊株に対する作用を網羅的に解析することによって、被検物質の標的遺伝子及び標的分子の少なくとも一方を推定することも可能である。例えば、すでに標的分子が明らかになっている物質を多数の非必須遺伝子破壊株に作用させ、網羅的に感受性パターンを取得しておく。この作業を標的分子が明らかになっている複数の物質について行い感受性パターンのセットを取得する。次に、標的候補分子の知られていない被検物質を多数の非必須遺伝子破壊株に作用させて網羅的に感受性パターンを取得し、先に取得した複数の物質の感受性パターンと比較する。その結果、被検物質により得られた感受性パターンと一致または類似した感受性パターンを示す物質が存在すれば、被検物質の標的候補分子が、当該物質の標的候補分子と同一であると考えられる。【００６３】
さらには、例えば、ある特定の代謝経路に存在する遺伝子群の破壊株が特異的に感受性を示した場合、その代謝経路そのものか、もしくは代謝的に密接な関係のある経路に存在する遺伝子の転写産物及び翻訳産物の少なくとも一方が標的候補分子となる。【００６４】
また、必須遺伝子について、２本ある対立遺伝子のうちの１本が破壊された株（以下、「ヘテロ欠損株」と称する場合がある）を用いて、被検物質に影響を受ける遺伝子及びタンパク質の少なくとも一方を検出することができる。ここで、必須遺伝子とは、２本の対立遺伝子の双方を破壊すると細胞が増殖できず死んでしまう遺伝子をいう。また、酵母の全遺伝子約６０００種のうち約１２００種の遺伝子は、必須遺伝子である。【００６５】
例えば、必須遺伝子である遺伝子Ｃのヘテロ欠損株に対して、遺伝子Ｃの転写産物および翻訳産物の少なくとも一方を阻害する被検物質を作用させると、遺伝子Ｃの転写産物および翻訳産物の少なくとも一方の機能が低下する結果、被検物質に対して特異的な感受性を示す（Drug-induced haploinsufficiency；Giaever et al, Nature genetics, 1999,21:278-283）。この原理を応用して、被検物質をヘテロ欠損株に作用させたときに致死となる株を同定すると、その株で破壊されている遺伝子が明らかになる。そして、当該へテロ欠損株において破壊されている遺伝子の転写産物および翻訳産物の少なくとも一方が、その被検物質の標的候補分子となると考えられる。【００６６】
さらに、非必須遺伝子破壊株を用いて、被検物質による増殖抑制に対する特異的な耐性化を利用して、被検物質に影響を受ける遺伝子およびタンパク質の少なくとも一方を検出することができる。例えば、被検物質が、あるタンパク質により修飾を受けた時のみ毒性を発揮するような場合、その修飾を行うタンパク質をコードする遺伝子を欠損した株では毒性は発揮されない。この場合、この遺伝子破壊株は被検物質に対して特異的な耐性を示すことになる。
ここで修飾とは、例えば、被検物質の酵素的な化学修飾、被検物質とタンパク質との結合による毒性複合体の生成などが挙げられる。前者の例としては、ＵＲＡ３遺伝子産物による５−ＦＯＡの５−ＦＵへの変換を挙げることができ、ＵＲＡ３遺伝子欠損により５−ＦＯＡ耐性が付与される。また、後者の例としてはラパマイシンのＦＰＲ１タンパク質への結合などが挙げられ、ＦＰＲ１遺伝子欠損によりラパマイシン耐性が付与される（Heitman J, et al. (1991) FK 506-binding protein proline rotamase is a target for the immunosuppressive agent FK 506 in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A 88(5):1948-52)。【００６７】
例えば、非必須遺伝子である遺伝子Ｄの破壊株に対して、遺伝子Ｄの転写産物および翻訳産物の少なくとも一方を阻害する被検物質を作用させると、その被検物質の濃度が野生株の生育が阻害される濃度であっても、当該破壊株の生育が阻害されないことがある。この原理を応用して、被検物質を非必須遺伝子破壊株に作用させたときに生育が阻害されない株を同定すると、その株で破壊されている遺伝子が明らかになる。そして、当該非必須遺伝子破壊株において破壊されている遺伝子の転写産物および翻訳産物の少なくとも一方が、その被検物質の標的候補分子または標的候補分子と同一の情報伝達経路に存在する分子となると考えられる（Heitman et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991, 88:1948-52）。【００６８】
本発明の被検物質の酵母細胞に対する作用機序を解析する方法は、上記標的候補分子同定方法により被検物質の標的候補分子を同定する工程と、前記標的候補分子の機能を同定する工程と、前記標的候補分子の機能から被検物質の酵母細胞に対する作用機序を解析する工程と、を含んで構成される。これにより、被検物質の酵母細胞に対する作用機序の解析を、効率的かつ高精度に行うことができる。【００６９】
前記被検物質の標的候補分子を同定する工程については、上記被検物質の標的候補分子同定方法において説明した事項をそのまま適用することができる。
また、前記標的候補分子の機能を同定する方法は、例えば、標的候補分子をコードする遺伝子の遺伝子配列を、その機能が既知の遺伝子配列とその相同性を比較することで行うことができる。【００７０】
更に、同定された標的分子の機能に基づいて、被検物質の酵母細胞に対する作用機序を解析することができる。例えば、標的分子の機能が特定の酵素の阻害作用である場合には、被検物質の酵母細胞に対する作用機序は、該酵素の阻害であることが推定できる。【００７１】
本発明の第１のスクリーニング方法は、目的とする分子の機能に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、上記酵母細胞セットに含まれる少なくとも１種の酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、前記第１の遺伝子と前記標的候補分子の遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、を含むことを特徴とする。これにより、より効率的に、より高精度で遺伝子産物である標的候補分子と特異的に作用する物質をスクリーニングすることができる。【００７２】
また本発明の第２及び第３のスクリーニング方法は、目的とする分子の機能に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、上記酵母細胞セットに含まれる少なくとも１種の酵母細胞と、被検物質とを接触させる工程と、前記被検物質との接触により表現型が変化した酵母細胞を選択する工程と、前記選択された酵母細胞において欠損又は変異している遺伝子を、第１の遺伝子と同定する工程と、第１の遺伝子と対立遺伝子の関係にある遺伝子、又は、前記第１の遺伝子と合成致死の関係にある遺伝子を第２の遺伝子として同定する工程と、前記第２の遺伝子と前記標的候補分子の遺伝子とが一致する被検物質を選択する工程と、を含むことを特徴とする。これにより、より効率的に、より高精度で遺伝子産物である標的候補分子と特異的に作用する物質をスクリーニングすることができる【００７３】
ここで、目的とする分子の機能に影響を与える物質としては、天然由来の低分子化合物、天然由来の高分子化合物、合成低分子化合物、合成高分子化合物、ペプチド、タンパク質、多糖類、核酸等を挙げることができる。【００７４】
本発明のスクリーニング方法においては、既述の標的候補分子同定方法と同様にして被検物質がその機能に影響を与える分子の遺伝子を同定することができる。また、同定された遺伝子とスクリーニングの標的候補分子の遺伝子とが一致する被検物質を選択することで、目的とする分子の機能に影響を与える物質を、被検物質の中からスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７６】
（実施例１）
＜パートナー株の作製＞
（１）ＰＤＲ１遺伝子とＰＤＲ３遺伝子とが破壊されたパートナー株の作製
ＰＣＲによる効率的遺伝子破壊アレルの作製法（Baudin A. et al. (1993) Nucl. Acid Res. 21:3329-3330）に記載の方法を用いて、以下のようにしてＰＤＲ１遺伝子とＰＤＲ３遺伝子とが破壊されたパートナー株を作製した。
ＢＹ４７４１株(ＭＡＴａ)のＰＤＲ３遺伝子座位をＬＥＵ２遺伝子にて置換することによりＰＤＲ３遺伝子を破壊した(以下、ＫＥ３８３という)。またＢＹ４７４２株(ＭＡＴα)のＰＤＲ１遺伝子座位をＨＩＳ３遺伝子にて置換することによりＰＤＲ１遺伝子を破壊した(以下、ＫＥ３８４という)。ＫＥ３８３株とＫＥ３８４株を掛け合わせ胞子形成させてＰＤＲ１とＰＤＲ３とがともに破壊され、かつ、Δｍｅｔ１５であり、ＭＡＴａ型である株を作製した(以下、ＫＥ４４５という)。【００７７】
（２）ＭＦＡ１プロモーターにより発現誘導されるＵＲＡ３遺伝子のＣＡＮ１領域への導入
まず、出芽酵母S. cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（野生株）のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、(Ａ)ＣＡＮ１遺伝子に隣接した５'非翻訳領域約４５０塩基対を含む遺伝子断片、(Ｂ)ＭＦＡ１遺伝子のプロモーター領域約４００塩基対を含む遺伝子断片、(Ｃ)ＵＲＡ３遺伝子の翻訳領域全長を含む約８００塩基対の遺伝子断片、(Ｄ)ＣＡＮ１遺伝子に隣接した３'非翻訳領域約３００塩基対を含む遺伝子断片をそれぞれＰＣＲ法にて増幅した。次に（Ａ）断片と（Ｂ）断片、および（Ｃ）断片と（Ｄ）断片をそれぞれＰＣＲ法にて連結増幅し、（Ｅ）断片および（Ｆ）断片を得た。最後に（Ｅ）断片と（Ｆ）断片をＰＣＲ法にて連結増幅し、ＭＦＡ１-ＵＲＡ３マーカーを含む約２０００塩基対の（Ｇ）断片を得た。この（Ｇ）断片を用いてプラスミドを構築した。このプラスミドを上記ＫＥ４４５株に導入し、ＣＡＮ１遺伝子が上記（Ｇ）断片により置換された酵母細胞株を作製した。
上記断片のＰＣＲ法による増幅に用いたプライマー配列を下記表１に示した。【００７８】
【表１】
2008156048.tif 000002
【００７９】
上記により構築した酵母細胞株において、ＭＦＡ１-ＵＲＡ３マーカーが働くことを確認したところ、接合型がＭＡＴαの場合はウラシル要求性であり、ＭＡＴａの場合にはウラシル要求性が消失することを確認することができた。このＭＡＴα株をバリアフリーＹＫＯ作製のためのパートナー株（以下、ＫＥ４５８という）とした。【００８０】
＜ＭＡＴａ型バリアフリーＹＫＯ＞
１０倍希釈したパートナー株（５０ｍｌチューブ中のＫＥ４５８に１０ｍｌのＹＰＡＤを入れて３〜７日間静置培養したもの）の各６０μｌをMultiMek（３８４ウェル対応分注機：Beckman Coulter社製）を用いて３８４ウェルプレートに植えた。ここに、３８４ウェルプレート中に１ウェル当たり１株として培養しているＹＫＯ株（インビトロジェン社製、95401.H2）５μｌを、MultiMekを用いて添加し、２５℃で２日間培養した。このプレートを３０００ｒｐｍ、２分間遠心し、MultiMekを用いて上清を捨てて、滅菌水２０μｌを加え懸濁した。この懸濁液から５μｌを取り、滅菌水６０μｌと混和することにより希釈した。その希釈液の５μｌを６０μｌの二倍体選択培地（SD-(Ura+,Met+)/G418）に添加し、３０℃で１〜３日間培養することにより二倍体細胞のみを生育させた。プレートを遠心し（３０００ｒｐｍ、２分間）、MultiMekを用いて上清を捨てて、滅菌水２０μｌ加えて懸濁した。この懸濁液の１０μｌを分注ロボットShotMaster3000（武蔵エンジニアリング製、96spots/plate）を用いて寒天Ｓｐｏ培地上にスポットし、２５℃で約１週間培養することにより胞子形成させた。【００８１】
寒天Ｓｐｏ培地上にスポットされた胞子を、ディスポーザブル９６ピンレプリケーター（Ｃａｔ＃４７３２４５、Ｎｕｎｃ製）にて絡めとり、９６ウェル丸底プレートに入った２０μｌの滅菌水中に懸濁した。この懸濁液の１０μｌをＭＡＴａ選択寒天培地（SD-(Met+)/G418/canavanine）上にスポットし、３０℃で７〜１０日間培養することにより、ＭＡＴａ遺伝子の接合型を持つ一倍体細胞コロニーを生育させた。生育してきた株をディスポーザブル９６ピンレプリケーターにて絡めとり、１００μｌのＭＡＴａ選択液体培地中に懸濁し、２５℃で２〜７日間培養した。その後、分注ロボットShotMaster3000にて３８４ウェルプレートに植え替えた。【００８２】
上記で得られた株についてシクロヘキシミド感受性を調べたところ、バリアフリー化されていれば生育できないはずの５０ｎｇ/ｍｌで生育可能な株が存在することが判明した。これらの株についてＰＣＲによるゲノムＤＮＡチェックを行ったところ、ＭＡＴａ／ＭＡＴａの二倍体細胞であって、ＰＤＲ１もしくはＰＤＲ３の野生型遺伝子が、少なくとも一つ含まれていることが判明した。これら二倍体細胞を除去するために、全ての株についてシクロヘキシミド感受性を調べて５０ｎｇ／ｍｌで生育できない株を選択した。【００８３】
これにより、ＰＤＲ１遺伝子とＰＤＲ３遺伝子が破壊され、ＭＡＴａ遺伝子を有する酵母細胞３１１１株からなる酵母遺伝子破壊株セット（ＭＡＴａ型バリアフリーＹＫＯ）の作製に成功した（図１）。【００８４】
（実施例２）
＜ＭＡＴα型バリアフリーＹＫＯの作製＞
実施例１において、ＭＡＴａ遺伝子を有する酵母細胞を選択する代わりに、５-ＦＯＡ（5-fluoroorotic acid）を用いたカウンターセレクションを行った以外は実施例２と同様にして、ＭＡＴα遺伝子を有する酵母遺伝子破壊株セットを作製した。具体的には、ＭＡＴａ選択寒天培地（SD-(Met+)/G418/canavanine）の代わりにＭＡＴα選択寒天培地（SD-(Met+, Ura+)/G418/canavanine/5FOA）を用いることにより、ＰＤＲ１遺伝子とＰＤＲ３遺伝子が破壊され、ＭＡＴα遺伝子を有する酵母細胞１３７４株からなる酵母遺伝子破壊株セット（ＭＡＴα型バリアフリーＹＫＯ）の作製に成功した（図２）。【００８５】
（実施例３）
＜パートナー株の作製＞
（１)ＧＡＬ１０プロモーターにより制御されるＥＲＧ６遺伝子の導入
ＥＲＧ６遺伝子の調節領域にＧＡＬ１０プロモーターが挿入されたパートナー株を作製するために、以下の遺伝子断片を作製した。
まずＧＡＬ１０プロモーターは酵母ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＡＬ１０遺伝子と隣接するＧＡＬ１遺伝子の間の領域にプライマー（配列番号９、配列番号１０）を設計し、ＰＣＲにより増幅した。また、遺伝子導入の際のマーカー遺伝子として、分裂酵母のＬ−アゼチジン−２−カルボン酸耐性遺伝子ＰＰＲ１+を、ＧＡＬ１０プロモーターの後ろに連結した。さらに、ＥＲＧ６のＯＲＦの５’側の領域にプライマー（配列番号１１、配列番号１２）を設計し、酵母ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅したフラグメントをＧＡＬ１０プロモーターの前に逆向きに連結した。また、ＹＭＬ００７Ｃ−Ａを含むＥＲＧ６プロモーター領域にもプライマー（配列番号１３、配列番号１４）を設計し、ＰＣＲで増幅したフラグメントをｐｐｒ１＋遺伝子の後ろに逆向きに連結した。このフラグメントを上述のバリアフリーパートナー株ＫＥ４５８に導入し、染色体上のＥＲＧ６遺伝子の５'非翻訳領域に正しく挿入された株を作製した。これにより、ＧＡＬ１プロモーターによりＥＲＧ６遺伝子が制御される株が作製された。これを親株（ＢＹ４７４１）に対してバッククロスを行い、スーパーバリアフリーＹＫＯ作製用パートナー株(以下、ＫＥ５１３という)とした。
ＫＥ５１３株の構築に用いたＰＣＲプライマーの配列を下記表２に示した。【００８６】
【表２】
2008156048.tif 000003
【００８７】
＜ＭＡＴａ型スーパーバリアフリーＹＫＯの作製＞
１０倍希釈したパートナー株（５０ｍｌチューブ中のＫＥ５１３に１０ｍｌのＹＰＡＤを入れて３〜７日間静置培養したもの）の各６０μｌを、MultiMekを用いて３８４ウェルプレートに植えた。ここに、３８４ウェルプレート中に１ウェル当たり１株として培養しているＹＫＯ株（インビトロジェン社製、95401.H2）５μｌを、MultiMekを用いて添加し、２５℃で２日間培養した。このプレートを３０００ｒｐｍ、２分間遠心し、MultiMekを用いて上清を捨てて、滅菌水２０μｌを加え懸濁した。この懸濁液から５μｌを取り、滅菌水６０μｌと混和することにより希釈した。その希釈液の５μｌを６０μｌの二倍体選択培地（SD-(Ura+,Met+)/G418）に添加し、３０℃で１〜３日間培養することにより二倍体細胞のみを生育させた。プレートを遠心し（３０００ｒｐｍ、２分間）、MultiMekを用いて上清を捨てて、滅菌水２０μｌ加えて懸濁した。この懸濁液の１０μｌを分注ロボットShotMaster3000（武蔵エンジニアリング製、96spots/plate）を用いて寒天Ｓｐｏ培地（胞子形成用寒天培地）上にスポットし、２５℃で約１週間培養することにより胞子形成させた。【００８８】
寒天Ｓｐｏ培地上にスポットされた胞子を、ディスポーザブル９６ピンレプリケーター（Ｃａｔ＃４７３２４５、Ｎｕｎｃ製）にて絡めとり、９６ウェル丸底プレートに入った２０μｌの滅菌水中に懸濁した。この懸濁液の１０μｌをＭＡＴａ選択寒天培地（SG-(Met+)/G418/canavanine/AZC）上にスポットし、３０℃で７〜１０日間培養することにより、ＭＡＴａ遺伝子の接合型を持つ一倍体細胞コロニーを生育させた。【００８９】
出現したコロニー群全体を９６ピンレプリケーターで絡め取る代わりに、出現したコロニーを１株につき１つずつ爪楊枝でひろって新しいＭＡＴａ選択寒天培地に植え継ぎ、３０℃で７日間培養した。生育してきた株をディスポーザブル９６ピンレプリケーターにて絡めとり、１００μｌのＭＡＴａ選択液体培地中に懸濁し、２５℃で２〜７日間培養した。その後分注ロボットShotMaster3000にて３８４ウェルプレートに植え替えた。これらの株は全て２５ｎｇ／ｍｌのシクロヘキシミド存在下で生育できなかった。【００９０】
以上により、ＰＤＲ１遺伝子とＰＤＲ３遺伝子とが破壊され、ＥＲＧ６遺伝子の発現がＧＡＬ１０プロモーターによって制御され、ＭＡＴａ遺伝子を有する酵母細胞４０４４株からなる酵母遺伝子破壊株セット（ＭＡＴａ型スーパーバリアフリーＹＫＯ）の作製に成功した（図３）。【００９１】
また、シングルコロニーを選択する操作を行うことにより、もともと存在比率が低いにも関わらず増殖スピードが早い二倍体酵母細胞の混入を効果的に防止することができることがわかる。【００９２】
（実施例４）
＜二倍体バリアフリーＹＫＯの作製＞
上記実施例１で作製したＭＡＴａ型バリアフリーＹＫＯの酵母と、上記実施例２で作製した対応する非必須遺伝子を破壊したＭＡＴα型バリアフリーＹＫＯの酵母とを掛け合わせることにより、非必須遺伝子を破壊した二倍体酵母遺伝子破壊株セット（二倍体バリアフリーＹＫＯ）を作製した。【００９３】
（実施例５）
＜ロバスタチンに対する感受性の評価＞
上記で作製したバリアフリーＹＫＯ（ＢＦ−ＹＫＯ）およびスーパーバリアフリーＹＫＯ（ＳＢＦ−ＹＫＯ）の薬物感受性を確認するため、親株およびパートナー株を用いてロバスタチンによる増殖抑制効果に対する酵母の感受性変化を調べた。
９６ウェルプレートに、ロバスタチン（Sigma-aldrich社、＃M2147）の濃度が０．３９μＭ〜１００μＭの濃度範囲になるようにロバスタチン溶液を加えた。そこへＹＰＡＤ中で室温にて２日間静置培養した親株（ＷＴ:ＢＹ４７４２、Open biosystems社、#YSC1049）、バリアフリー用パートナー株（ＢＦ:ＫＥ４５８）、およびスーパーバリアフリー用パートナー株（ＳＢＦ:ＫＥ５１３）を、最終細胞数が２０００倍希釈となるように添加し、３０℃で静置培養した。
その後、６２０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（SUNRISE、テカン社製）にて経時的に４８時間目まで測定した。細胞増殖抑制活性の算出には、特開２００６−１４１２９８号公報に記載のエリアスコア法（ＡＲＳ）を用いた。ＡＲＳにおいては、数値の大きいほうが、細胞増殖抑制活性が高いことを意味する。結果を図４に示した。
図４から、親株（ＷＴ）ではロバスタチン濃度が１００μＭであっても、わずかな細胞増殖抑制効果しか示さないのに対し、ＢＦ株では５０μＭで最大の抑制活性を示し、またＳＢＦ株では２５μＭで最大の抑制活性を示したことが分かる。
また、エリアスコアが約１０となるロバスタチン濃度で比較すると、ＷＴ株に対しＢＦ株で８倍、ＳＢＦ株で１６倍の高感受性化が達成されたことが分かる。【００９４】
（実施例６）
＜スーパーバリアフリーＹＫＯを用いたロバスタチン標的分子の同定及び作用機序解析＞
上記で作製された４０４４株からなるスーパーバリアフリーＹＫＯ（ＳＢＦ-ＹＫＯ）を用いて、ロバスタチンの標的分子の同定を行った。ＳＢＦ-ＹＫＯの各株を３８４ウェルプレート１２枚に１ウェル当たり１株として順序良く並べて植えた。３〜７日間静置培養することにより全ての株の細胞数を揃えた。これを１９６倍希釈して細胞希釈液とした。
一方、３．９μＭのロバスタチンを含むＹＰＡＤ培地２０μｌをそれぞれのウェルに添加した３８４ウェルプレートと、ロバスタチンを含まないＹＰＡＤ培地２０μｌをそれぞれのウェルに添加した３８４ウェルプレートとを準備した。それぞれのウェルに作製した細胞希釈液の各５μｌを添加した。この操作により、細胞濃度は１０００倍希釈、また化合物濃度は３．１２５μＭとなった。
これを２５℃で培養し、培養開始後約２２時間から４８時間までの間、プレートリーダー（SpectraMax340PC384、モレキュラーデバイス社）を用いて、６５０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。得られたデータからエリアスコア（ＡＲＳ)を算出し、感受性の順位づけをした。【００９５】
その結果、ロバスタチンの標的分子であるＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子ＨＭＧ１の破壊株が高い感受性を示す株として見出された。S. cerevisiaeにはＨＭＧ１以外に同じ酵素をコードするＨＭＧ２遺伝子が存在するため、ＨＭＧ１を破壊しても酵母は致死とならないが、ＨＭＧ２によって産生される同酵素量はＨＭＧ１のそれと比較して５分の１程度であり、ＨＭＧ１破壊株中に残存した同酵素を阻害するロバスタチン濃度はＨＭＧ１遺伝子を持つ株と比較して低下することは容易に理解できる。
さらに、最も感受性の高い遺伝子破壊株としてＢＴＳ１破壊株が見出された。ＢＴＳ１はファルネシル基転移酵素をコードしており、ステロール生合成経路上でＨＭＧ１の下流に存在する。ＢＴＳ１破壊株では下流のイベントが滞っており、その結果ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素の阻害効果が他の株に比べて強く現れたことが考えられる。【００９６】
（実施例７）
バリアフリーＹＫＯを用いたロバスタチン標的分子の同定および作用機序解析
上記で作製された３０１１株からなるバリアフリーＹＫＯ（ＢＦ-ＹＫＯ）を用いて、ロバスタチンの標的分子の同定を行った。ＢＦ-ＹＫＯの各株を３８４ウェルプレート１２枚に１ウェル当たり１株として順序良く並べて植えた。３〜７日間静置培養することにより全ての株の細胞数を揃えた。これを１９６倍希釈して細胞希釈液とした。
一方、３．９μＭ、７．８μＭ又は１５．６μＭのロバスタチンを含むＹＰＡＤ培地２０μｌをそれぞれのウェルに添加した３８４ウェルプレートと、ロバスタチンを含まないＹＰＡＤ培地２０μｌをそれぞれのウェルに添加した３８４ウェルプレートとを準備した。それぞれのウェルに作製した細胞希釈液の各５μｌを添加した。この操作により、細胞濃度は１０００倍希釈、また化合物濃度はそれぞれ３．１２５μＭ、６．２５μＭ及び１２．５μＭとなった。
これを２５℃で培養し、培養開始後約２２時間から４８時間までの間、プレートリーダー（SpectraMax340PC384、モレキュラーデバイス社）を用いて、６５０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。得られたデータからエリアスコア（ＡＲＳ)を算出し、感受性の順位づけをした。【００９７】
その結果、ロバスタチンの標的分子であるＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子ＨＭＧ１の破壊株は、化合物濃度が６．２５μＭ及び１２．５μＭの場合において、感受性を示す株として見出すことができた。このことからバリアフリーＹＫＯを用いることにより、化合物濃度が低い場合であっても、ロバスタチンの標的分子探索が可能であることが分かる。【００９８】
（比較例１）
＜ＹＫＯコレクションを用いたロバスタチン標的分子の同定及び作用機序解析＞
実施例７において、ＢＦ−ＹＫＯの代わりに、市販の４８４７株からなるＹＫＯ（インビトロジェン社、＃９５４０１．Ｈ２）を用いた以外は、実施例７と同様にして、ロバスタチンの標的分子の同定を行った。
その結果、ロバスタチンの標的分子であるＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子ＨＭＧ１の破壊株を、化合物濃度が３．１２５μＭ及び１２．５μＭのすべての場合において、感受性を示す株として見出すことはできなかった。また、ＢＴＳ１破壊株についても同様に感受性を示す株として見出すことはできなかった。【００９９】
（実施例８）
＜ラパマイシンに対する感受性の評価＞
実施例５と同様にして、バリアフリーＹＫＯ（ＢＦ−ＹＫＯ）およびスーパーバリアフリーＹＫＯ（ＳＢＦ−ＹＫＯ）の薬物感受性を確認するため、親株およびパートナー株を用いてラパマイシンによる増殖抑制効果に対する酵母の感受性変化を調べた。
９６ウェルプレートに、ラパマイシン（Sigma-aldrich社、＃R0395）の濃度が０．２ｎＭ〜５０ｎＭの濃度範囲になるようにラパマイシン溶液を加えた。そこへＹＰＡＤ中で室温にて２日間静置培養した親株（ＷＴ:ＢＹ４７４１、Open biosystems社、#YSC1048）、バリアフリー株（ＢＦ:ＫＥ４５７）、およびスーパーバリアフリー株（ＳＢＦ:ＫＥ４７７）を、最終細胞数が１０００倍希釈となるように添加し、３０℃で静置培養した。
その後、６２０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（SUNRISE、テカン社製）にて経時的に４８時間目まで測定した。細胞増殖抑制活性の算出には、特開２００６−１４１２９８号公報に記載のエリアスコア法（ＡＲＳ）を用いた。ＡＲＳにおいては、数値の大きいほうが、細胞増殖抑制活性が高いことを意味する。結果を図５に示した。【０１００】
図５から、親株（ＷＴ）とＢＦ株ではラパマイシン濃度が５０ｎＭで最大の細胞増殖抑制効果を示すのに対し、ＳＢＦ株では６．２５ｎＭで最大の活性を示したことが分かる。
また、エリアスコアが約１０となるラパマイシン濃度で比較すると、ＷＴ株に対しＳＢＦ株で８倍の高感受性化が達成されたことが分かる。【０１０１】
（実施例９）
＜スーパーバリアフリーＹＫＯを用いたラパマイシン標的分子の同定及び作用機序解析＞
実施例６と同様にして、スーパーバリアフリーＹＫＯ（ＳＢＦ-ＹＫＯ）を用いて、ラパマイシンの標的分子の同定を行った。ＳＢＦ-ＹＫＯの各株を３〜７日間静置培養することにより全ての株の細胞数を揃えた。これを１９６倍希釈して細胞希釈液とした。
一方、１．２５ｎＭのラパマイシンを含むＹＰＡＤ培地２０μｌをそれぞれのウェルに添加した３８４ウェルプレートと、ラパマイシンを含まないＹＰＡＤ培地２０μｌをそれぞれのウェルに添加した３８４ウェルプレートとを準備した。それぞれのウェルに作製した細胞希釈液の各５μｌを添加した。この操作により、細胞濃度は１０００倍希釈、また化合物濃度は１ｎＭとなった。
その結果、ラパマイシンの濃度が１ｎＭの場合において、ラパマイシンの標的分子であるＴＯＲキナーゼをコードする遺伝子ＴＯＲ１の破壊株が、高い感受性を示す株として見出された。
S. cerevisiaeにはＴＯＲ１以外に同じ酵素をコードするＴＯＲ２遺伝子が存在するため、ＴＯＲ１を破壊しても酵母は致死とならないが、ＴＯＲ１破壊株中に残存した同酵素を阻害するラパマイシン濃度はＴＯＲ１遺伝子を持つ株と比較して低下することは容易に理解できる。
また、ＴＯＲ２は生存に必須であるため、非必須遺伝子の破壊株のセットであるＳＢＦ-ＹＫＯ中にはＴＯＲ２破壊株は存在せず、ＳＢＦ-ＹＫＯを用いた検討ではＴＯＲ２破壊株は感受性株として見出されなかった。【０１０２】
（比較例２）
＜ＹＫＯコレクションを用いたラパマイシン標的分子の同定及び作用機序解析＞
実施例９において、ＳＢＦ−ＹＫＯの代わりに、市販の４８４７株からなるＹＫＯ（インビトロジェン社、＃９５４０１．Ｈ２）を用い、化合物濃度を１０ｎＭ、１２．５ｎＭ及び１５ｎＭとした以外は、実施例９と同様にして、ラパマイシンの標的分子の同定を行った。【０１０３】
その結果、ラパマイシンの標的分子であるＴＯＲキナーゼをコードする遺伝子ＴＯＲ１の破壊株が、１０ｎＭ、１２．５ｎＭ及び１５ｎＭの化合物濃度で、感受性を示す株として見出された。【０１０４】
以上の結果より、ＢＦ−ＹＫＯ、ＳＢＦ−ＹＫＯを用いることで、低濃度のロバスタチンを用いた場合でも、標的分子が見出されること、および作用機序予測が可能であることが示された。特に、ＳＢＦ−ＹＫＯを用いることで、化合物濃度が３．１２５μＭという低濃度であっても、標的分子が見出されること、および作用機序予測が可能なことが示された。また、ＳＢＦ−ＹＫＯを用いることで、ＹＫＯと比較して１／１０の低濃度のラパマイシンを用いた場合でも、標的分子が見出されること、および作用機序予測が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
Industrial Applicability
本発明の酵母細胞セットは、高感度な、標的候補分子の同定、作用機序の解析、スクリーニングに好適に適用することができ、産業上の極めて有用である。
【図１】
2008156048.tif 000004
【図２】
2008156048.tif 000005
【図３】
2008156048.tif 000006
【図４】
2008156048.tif 000007
【図５】
2008156048.tif 000008
【配列表】
2008156048000001.app
【国際調査報告】
2008156048.tif 000009
2008156048.tif 000010
2008156048.tif 000011
2008156048.tif 000012