(57)【要約】本発明は、簡易な構造でありながら隔離された反応領域と検出領域、および試料液の送液制御機構を有し、迅速で確実な分析が可能な試料液分析チップに関する。試料液分析チップは、両端が開放された管状の試料液移送路；ならびに前記試料液移送路の内壁面に配置された反応試薬層、および試料液の物理的あるいは化学的変化を検出するための検出領域を有する。試料液分析チップは、前記試料液移送路の壁面の一部に開口部および当該開口部と嵌合する蓋を有し、当該蓋の一部は前記壁面と蝶番を形成する。
2008126403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端が開放された管状の試料液移送路；ならびに前記試料液移送路の内壁面に配置された反応試薬層、および試料液の物理的変化または化学的変化を検出するための検出領域を含む試料液分析チップであって、
前記試料液移送路の壁面の一部に設けられた開口部と、
前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋と、をさらに有し、
前記蓋の前記壁面の一部を形成する部分の材質は、前記開口部近傍の前記壁面の材質と同じである、
試料液分析チップ。
【請求項２】
前記蓋の一部は、前記試料液移送路の壁面と蝶番を形成する、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項３】
前記蓋は、前記試料液移送路の壁面とは別個のものである、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項４】
前記蓋は、前記壁面の一部を形成する部分が使い捨て可能である、請求項３に記載の試料液分析チップ。
【請求項５】
試料液は毛細管現象により前記試料液移送路を移送し、
前記蓋を開いて前記試料液移送路内の内壁面を不連続な構造とすることにより、当該試料液の移送を停止させることができる、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項６】
試料液の移送方向の上流から順に、前記反応試薬層、前記開口部および前記検出領域が、前記試料液移送路に配置される、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項７】
前記試料液移送路の内壁面の２以上の部位に、前記反応試薬層を有し、かつそれぞれの反応試薬層の間に前記開口部が配置される、請求項６に記載の試料液分析チップ。
【請求項８】
前記反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に、試料液の到達または反応試薬層の変化を感知しうる感知領域をさらに有する、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項９】
前記蓋が四角形または円形であり、かつ
前記蓋の四角形の一辺または円の一部の弧の部分が、前記壁面と蝶番を形成する、請求項２に記載の試料液分析チップ。
【請求項１０】
前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも下流に配置された、請求項２に記載の試料液分析チップ。
【請求項１１】
前記開口部の前記蝶番と対向する部分に、Ｖ字状の切込が形成され、かつ
前記開口部に嵌合する蓋に、前記切込と嵌合するＶ字状の突起が形成された、請求項１０に記載の試料液分析チップ。
【請求項１２】
前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも上流に配置された、請求項２に記載の試料液分析チップ。
【請求項１３】
前記検出領域に、二以上の分割された導体からなり、かつ外部との接続部を有する電極が配置されている請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１４】
前記試料液移送路の壁面を、電磁波が透過することができる、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１５】
前記反応試薬層が、試料液中の特定成分の化学反応を触媒する酵素を含む、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１６】
前記反応試薬層が、試料液中の特定成分に特異的に結合する物質を含む、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１７】
試料液中の特定成分に特異的に結合する物質が抗体である、請求項１６に記載の試料液分析チップ。
【請求項１８】
ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程、
ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程、および
ｃ）前記基板と前記天井板を、前記基板の両端部にスペーサを介して貼り合わせることにより、両端が開放された試料液移送路を形成する工程を含む、請求項２に記載の試料液分析チップの製造方法。
【請求項１９】
前記ｂ）における蓋の一部が前記試料液移送路の壁面と蝶番を形成し、当該蓋を設ける工程が、前記試料液移送路の壁を、前記蝶番を形成する部分を残して切り取る工程である請求項１８に記載の試料液分析チップの製造方法。
【請求項２０】
請求項６に記載の試料液分析チップを用いた分析方法であって、
Ａ）試料液の移送方向に対して反応試薬層の下流に隣接する開口部を開口したまま、試料液を分析チップに導入し、試料液と反応試薬を反応させる工程、
Ｂ）前記反応終了後に、前記開口部の蓋を閉じて、試料液を検出領域に移送する工程、および
Ｃ）前記検出領域において試料液の化学的変化または物理的変化を検出する工程
を含む、分析方法。
【請求項２１】
前記Ｃ）の検出工程が、光学的手法による検出である請求項２０に記載の分析方法。
【請求項２２】
前記Ｃ）の検出工程が、電気的手法による検出である請求項２０に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、液体状の試料と固体状の試薬を反応させて試料の分析を行う分析チップに関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、分析技術、解析技術および検査技術の進歩によって、様々な物質を測定することが可能となっている。特に、臨床検査分野においては、生化学反応、酵素反応、免疫反応等の特異反応に基づく測定原理の開発により、病態に反映する体液中の物質を測定できるようになっている。
その中で、ポイント・オブ・ケアテスティング（ＰＯＣＴ）と呼ばれる臨床検査分野が注目されている。ＰＯＣＴにおいては、検体を採取してから検査結果が出るまでの時間の短縮を目的とした簡易迅速測定へ向けた取り組みが行われている。すなわち簡易な測定原理を採用し、かつ小型で携帯可能であって、操作性が良い測定装置が望まれている。【０００３】  このような要請の下、試料液の希釈や撹拌などを行うことなく簡易に検体中の特定物質を定量する方式が種々提案されている。その代表的なものとして１）酵素反応を用いるもの、２）抗原抗体反応を用いるものが知られている。【０００４】  １）の例としては、グルコースセンサが挙げられる。当該センサにおいては、酵素であるグルコースオキシダーゼが、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化し、酸素が過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を酸素電極で測定することでグルコースを定量できる。この際の過酸化水素の生成量を、白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定する方法も知られている。また、電子受容体としてフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の金属錯体を用いる方法が提案されている。さらには、電子受容体として有機化合物を用いるタイプのセンサも提案されている。【０００５】  このタイプのセンサは、酵素反応の結果生じた電子受容体の還元体を電極で酸化し、その酸化電流からグルコース濃度を求める。従って、グルコースにかぎらず他の基質の定量にも広く応用されている。
例えば、絶縁性の基板上にスクリーン印刷等の方法で測定極、対極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体とを含む反応試薬層を形成したバイオセンサが開示されている（特許文献１を参照）。本センサにおいては、基質を含む試料液を反応試薬層へ滴下して、酵素と基質を反応させるとともに、電子受容体を還元させる。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求める。【０００６】  ２）の方法としては、抗体を担持させたラテックス粒子を血漿中の抗原と反応させ、ラテックス粒子の凝集度合いから抗原を定量する方法が知られている。具体的には、ラテックス粒子の凝集に伴う光の透過率の変化や、凝集により変化する懸濁粒子の個数や粒径分布の変化を測定して、試料液中の特定成分を定量する。ラテックス粒子の凝集を促進するために電場を用いる方法も報告されている（特許文献２を参照）。【０００７】  しかしながら上記のようなセンサにおいては、複数の試薬を用いる場合、予め試薬を混合しておくと保存安定性が悪くなることがある。これを改善するために、酵素および界面活性剤を含む試薬と、電子受容体を含む試薬とを分けて配置するコレステロールセンサが開示されている（特許文献３を参照）。【０００８】  一方、上記したセンサでは、微量の測定対象である試料液を微小なチップ等に設けられた反応スペースで反応させるために、試料液の移送（以下「送液」という。）の制御が重要である。送液がうまく制御できないと、試薬等と十分反応させることができないためである。
送液制御の例として、毛細管現象を利用することが知られている。例えばイムノクロマトグラフ法（特許文献４を参照）では、クロマトグラフ媒体として多孔質の吸水性物質を用いて、毛細管現象を利用して試料液を移送する。イムノクロマトグラフ法とは、抗体が固定されたクロマトグラフ担体に試料液を流して、被検知物質と前記抗体を結合させて行う分析方法である。【０００９】  また特許文献５には、核酸の高処理量シークエンシングの方法において、遠心力、あるいは遠心力と毛細管現象を組み合わせて試料液の移送と静止を制御する方法が提案されている。【００１０】  さらに流路に電極を設けて、電圧印加して試料液の電極表面に対する表面張力を低下させて流体を移送する方法も提案されている。このような方法はエレクトロウエッティング現象を利用した方法とも呼ばれる。例えば、化学的アッセイ等において、２次元に配列された電極を有するマイクロ流体構造を用いて、液滴を２次元的に任意に移動させうる機構が開示されている（特許文献６を参照）。
【特許文献１】特開平２−６２９５２号公報
【特許文献２】特公平５−８８７８７号公報
【特許文献３】特開２０００−３９４１６号公報
【特許文献４】特開２００６−１８９３１７号公報
【特許文献５】特表２００２−５３４０９６号公報
【特許文献６】特表２００５−５１０３４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  試料液中の測定対象物質を試薬と混合および反応させ、それにより生じた試料液の化学的変化および物理的変化を計測する分析方法をＰＯＣＴに適応させるためには、使い捨てのチップ内で、反応および検出を行えることが望ましい。【００１２】  このような分析チップは、測定誤差を低減させ、正確な分析を行える必要がある。測定誤差を低減させるためには、試料液に生じた変化を検出する際に、試料液が均一であることが必要である。特に特許文献２に開示されているような、試料液の変化を吸光度測定等の光学的手段で測定する場合は、試料液中の試薬の濃度をより均一にする必要がある。光学的手段は、試料液の一部に光を照射しその吸収等を測定するため試料液が不均一であると特に測定誤差を生じやすいからである。【００１３】  この問題を解決するには、チップ上における、試料液と試薬を反応および混合させる領域（反応領域）と、試料液の変化を検出する領域（検出領域）を分けることが有効である。検出領域を反応領域と分けることで、反応領域で起こりうる測定誤差の要因を排除できるからである。例えば、試薬が過剰に存在している場合、試薬の一部が試料液に溶解しきれずに残留することがある。そのままこの領域で試料液の検出を行うと試料液は不均一の状態で検出されるので誤差を生じやすい。
また、反応領域と検出領域を分けると、反応領域から、試料液を検出領域に移送する際に、液体に流動が起こるため攪拌効果が得られる。その結果、さらに試料液を均一にできる効果がある。【００１４】  ＰＯＣＴにおいては、試料液と反応させる試薬が複数必要な場合が存在する。このとき、保存安定性の見地から、複数の試薬を、別の部位に配置する必要がある。例えば、特許文献３には、酵素および界面活性剤を含む試薬と、電子受容体を含む試薬とを分けて配置するコレステロールセンサが示されている。しかし試薬を分けて配置する方法は、流入された試料液が複数の試薬と一度に混合されると試薬成分の混合に時間がかかるという問題があった。例えば試薬Ａ、試薬Ｂがチップ上の別な部位に配置されていたところに、試料液が流入した場合、試料液はＡが設置されている部位の近傍ではＡの濃度が高い溶液となる。一方試料液は、Ｂが設置されている部位の近傍ではＢの高い濃度となる。このように試料液中に濃度分布を生じるため、試料液が全体として均一になりにくいのである。このことを改善するには、隔離されて設けられた各試薬に対して、試料液が個々に流入する構造とすればよい。【００１５】  以上から、ＰＯＣＴに適合可能な分析チップとするためには、反応領域と、検出領域を分けて配置することが有効である。さらには、前記反応領域を必要に応じて複数設置し、かつそれらを隔離して設けることが有効である。しかしながら、これまでこのような提案はされてこなかった。【００１６】  一方、検出領域および（複数の）反応領域が隔離されて配置されたチップを得るには、試料液の移送（送液）を制御することが必要になる。送液の制御方法には、特許文献４のように多孔質吸水性物質による毛細管現象を利用する方法がある。しかし、この方法では送液を一度停止し、再び開始するという制御が困難である。例えば、試料液を、試薬と反応するのに必要な間、反応領域に留めておき、その後、検出領域に移送するなどの制御が不可能である。【００１７】  特許文献５のように遠心力、あるいは遠心力と毛細管現象を組み合わせて、送液を制御する方法もある。しかし、遠心力を得るために回転付与のための機構が必要であり装置が複雑になる。また試料測定チップを遠心力に耐えうる強度に設計する必要が生じるため、チップの形状および材質が制限される。【００１８】  特許文献６のように送液制御にエレクトロウエッティング現象を用いる場合は、試料液の電極表面に対する表面張力が、電圧印加前においても十分小さい場合に問題が生じる。試料液が自発的に毛細菅に流入してしまうため、送液の制御が困難になるからである。特に、試料液の表面張力が試薬との反応により顕著に変化する場合、例えば試薬中に界面活性剤が含まれる場合などには、特に制御が困難である。【００１９】  本発明の目的は、簡易な構造でありながら隔離された反応領域と検出領域を有し、かつ試料液の送液制御が可能な試料液分析チップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】  本発明者らは、試料液の送液制御を、毛細管壁に不連続面を形成することで毛細管現象を制御する、いわゆるキャピラリバルブを利用することに着眼して、本発明を完成させた。
すなわち上記課題は、以下の試料液分析チップにより解決される。
［１］両端が開放された管状の試料液移送路；ならびに前記試料液移送路の内壁面に配置された反応試薬層、および試料液の物理的変化または化学的変化を検出するための検出領域を含む試料液分析チップであって、
前記試料液移送路の壁面の一部に設けられた開口部と、前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋と、をさらに有し、
前記蓋の前記壁面の一部を形成する部分の材質は、前記開口部近傍の前記壁面の材質と同じである、試料液分析チップ。
［２］前記蓋の一部は、前記試料液移送路の壁面と蝶番を形成する、［１］に記載の試料液分析チップ。
［３］前記蓋は、前記試料液移送路の壁面とは別個のものである、［１］に記載の試料液分析チップ。
［４］前記蓋は、前記壁面の一部を形成する部分が使い捨て可能である、［２］に記載の試料液分析チップ。
［５］試料液は毛細管現象により前記試料液移送路を移送し、
前記蓋を開いて前記試料液移送路内の内壁面を不連続な構造とすることにより、当該試料液の移送を停止させることができる、［１］〜［４］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［６］試料液の移送方向の上流から順に、前記反応試薬層、前記開口部および前記検出領域が、前記試料液移送路に配置される、［１］〜［５］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［７］前記試料液移送路の内壁面の２以上の部位に、前記反応試薬層を有し、かつそれぞれの反応試薬層の間に前記開口部が配置される、［１］〜［６］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［８］前記反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に、試料液の到達または反応試薬層の変化を感知しうる感知領域をさらに有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［９］前記蓋が四角形または円形であり、かつ
前記蓋の四角形の一辺または円の一部の弧の部分が、前記壁面と蝶番を形成する、［２］または［３］に記載の試料液分析チップ。
［１０］前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも下流に配置された、［２］、［３］または［９］に記載の試料液分析チップ。
［１１］前記開口部の前記蝶番と対向する部分に、Ｖ字状の切込が形成され、かつ前記開口部に嵌合する蓋に、前記切込と嵌合するＶ字状の突起が形成された、［１０］に記載の試料液分析チップ。
［１２］前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも上流に配置された、［２］、［３］、［９］〜［１１］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［１３］前記検出領域に、二以上の分割された導体からなり、かつ外部との接続部を有する電極が配置されている［１］〜［１２］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［１４］前記試料液移送路の壁面を、電磁波が透過することができる、［１］〜［１３］いずれかに記載の試料液分析チップ。
［１５］前記反応試薬層が、試料液中の特定成分の化学反応を触媒する酵素を含む、［１］〜［１４］いずれかに記載の試料液分析チップ。
［１６］前記反応試薬層が、試料液中の特定成分に特異的に結合する物質を含む、［１］〜［１５］いずれかに記載の試料液分析チップ。
［１７］試料液中の特定成分に特異的に結合する物質が抗体である、［１６］に記載の試料液分析チップ。【００２１】  さらに上記課題は、以下の試料液分析チップの製造方法により解決される。
［１８］
ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程、
ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程、および
ｃ）前記基板と前記天井板を、前記基板の両端部にスペーサを介して貼り合わせることにより、両端が解放された試料移送路を形成する工程、を含む［２］に記載の試料液分析チップの製造方法。
［１９］前記ｂ）における蓋の一部が前記試料移送路の壁面と蝶番を形成する構造であり、当該蓋を設ける工程が、前記試料液移送路の壁を、前記蝶番を形成する部分を残して切り取る工程である［１８］に記載の試料液分析チップの製造方法。【００２２】  さらに上記課題は、以下の試料液分析チップを用いた分析方法により解決される。
［２０］前記［６］に記載の試料液分析チップを用いた分析方法であって、
Ａ）試料液の移送方向に対して反応試薬層の下流に隣接する開口部を開口したまま、試料液を分析チップに導入し、試料液と反応試薬を反応させる工程、
Ｂ）前記反応終了後に、前記開口部の蓋を閉じて、試料液を検出領域に移送する工程、および
Ｃ）前記検出領域において試料液の化学的変化または物理的変化を検出する工程
を含む、分析方法。
［２１］前記Ｃ）の検出工程が、光学的手法による検出である［２０］に記載の分析方法。
［２２］前記Ｃ）の検出工程が、電気的手法による検出である請求項［２０］に記載の分析方法。
【発明の効果】
【００２３】  本発明により、簡易な構造でありながら、互いに隔離された反応領域と検出領域を有し、かつ試料液の送液制御が可能である、測定の精度・迅速性に優れた試料液分析チップおよびその分析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】試料液分析チップの第一の態様を示す斜視図
【図２】試料液移送路に設けられる蓋と蝶番の構造を示す図
【図３】試料液分析チップの第二の態様を示す分解斜視図
【図４】図３に示す試料液分析チップを試料液移送路で切断した断面図
【図５】電極を有する試料液分析チップを示す分解斜視図
【図６】試料液分析チップの第三の態様を示す斜視図
【図７】試料液分析チップの第四の態様を示す斜視図
【図８】試料液分析チップの蓋の例を示す図
【図９】試料液分析チップを用いた分析方法を示す図
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】  １．本発明の試料液分析チップ
本発明の試料液分析チップは、試料液移送路、反応領域（反応試薬層）および検出領域を有する試料液分析チップであって、試料液移送路の壁面の一部に開口部が形成されており、前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋をさらに有することを特徴とする。蓋の材質は、試料液移送路の壁面の一部を構成することから、壁面を構成する材質（特に、開口部近傍の部分の材質）と同じであることが好ましい。開口部と嵌合する蓋は、試料液分析チップ本体と一体化されていてもよいし、別個のものであってもよい。以下、それぞれの態様について説明する。【００２６】  １−１．試料液分析チップ本体と蓋とが一体化されている態様
図１は本発明の試料液分析チップの態様の一例を示す図である。図１中、１は試料液分析チップであり、試料液移送路３、反応試薬層４、検出領域５を備えている。３３は開口部、３４は当該開口部と嵌合する蓋であり、当該蓋の一部が前記壁面と蝶番３５を形成している。３１は試料液流入口、３２は空気孔である。以下に図面を参照し、各構成要素については必要に応じ図中の符番を付して説明する。【００２７】  （１）送液制御について
本発明の試料液分析チップ１は、両端が開放された管状の試料液移送路３を有する。
試料液分析チップとは、液体の被検体を分析するために用いる微小な部材をいう。
両端が開放された管状の試料液移送路３とは、試料液流入口３１と空気孔３２として機能する開放口を両端に有する試料液を輸送するための流路である。【００２８】  当該試料液移送路３に試料液を移送する方法として、試料液移送路中の壁面への試料液の濡れ性に起因する毛細管現象による吸引力を用いる方法が用いられる。また外部から試料液に圧力を加える方法を用いてもよい。中でも加圧する装置を用いずに簡易な構造とできるため、当該試料液移送路３に試料液を移送する方法は毛細管現象を利用する方法が好ましい。【００２９】  毛管を液体中に垂直に差し込んだ場合に、液体が毛管内に侵入しようとする力による毛管上昇の高さは次の式の関係があることが知られている（田嶋和夫  他著「界面化学」、ｐ４１、丸善、２００５）。【００３０】  ｒｈρｇ  ＝  ２γｃｏｓθ
ｈ：毛管上昇高さ
ｒ：毛管半径
ρ：液体密度
ｇ：重力加速度
γ：液体の表面張力
θ：毛管表面と液体の接触角【００３１】  上記式より、液体と毛管表面のなす接触角が９０度以上であると、右辺はゼロまたは負となるので、毛管上昇高さｈもゼロまたは負の値となる。すなわち毛管に液体が侵入できない。従って、液体と毛管表面のなす接触角が９０度以下でないと毛管上昇が起こらないことが分かる。
つまり毛細管現象で試料液を移送する場合、移送路中の壁面の材質は、試料液、あるいは試料液と反応試薬層中の試薬が溶解した液に対して充分な濡れ性を有することが必要である。試料液移送路の内壁表面の濡れ性が低い場合には、内壁表面の濡れ性を高めるために、例えば界面活性剤等で処理することが好ましい。【００３２】  また、試料液移送路を形成する管の寸法も、毛細管現象による試料液の移送に影響する。本発明においては、断面が四角形の管の場合、管断面の幅が０．５〜５ｍｍ、高さが５〜５００μｍであることが好ましい。試料液移送路の管を形成する材料は特に限定されないが、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）やポリカーボネート等のポリマーフィルムが好ましい。さらに、上記材料を界面活性剤で処理したものがより好ましい。界面活性剤には公知のものが用いられる。その例にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル）、ホスファチジルコリンのブタノール溶液等が含まれる。処理方法も公知の方法を用いることができ、例えば界面活性剤を上記材料に塗布および乾燥させて行うことが好ましい。界面活性剤処理は、移送路を形成するすべての内壁に施してもよいが、例えば断面が四角形の管の場合、天井面のみに施す等内壁の一部であってもよい。また、表面処理を既に施してある市販のＰＥＴフィルムを用いてもよい。【００３３】  外部から試料液に圧力を加える方法を用いる場合には、試料液移送路中の壁面の材質は、試料液または試料液に上述した試薬層中の試薬が溶解した液に対して、充分な濡れ性を有していなくてもよい。外部からの圧力の付与によって、強制的に試料液を試料液移送路に浸入させることができるからである。外部から試料液に圧力を加える手段の例には、ポンプや回転による遠心力などが含まれる。また、この場合も上述したようなポリマーフィルムを用いて移送路を形成することが好ましい。さらにこの場合は、移送路の幅、高さが制限を受けないというメリットがある。【００３４】  本発明の試料液分析チップは、前記試料液移送路３の壁面の一部に、開口部３３および当該開口部と嵌合する蓋３４を有し、かつ当該蓋の一部は前記壁面と蝶番３５を形成している。
開口部とは、前記試料液移送路の壁面に設けられた外部に貫通する孔である。試料液移送路に不連続部分を設けて送液を停止する役割を担う。
開口部と嵌合する蓋とは、蓋を閉じた際に開口部をほぼ完全に覆い尽くすように設けられた扉である。当該蓋は試料液移送路の不連続構造を解消し、連続構造とする役割を担う。
蝶番とは、前記蓋と試料液移送路壁をつなぐ部分である。【００３５】  毛管に開放部分や段差による空間の不連続な部分が存在すると、その毛管に浸入した試料液の毛細管現象による移動は、当該不連続部分で停止する。これは、キャピラリバルブ現象などと呼ばれる。本発明の試料液分析チップは、移送路の壁面の一部に設けられた開口部を、外部からの操作により開いて移送路に不連続部分を発生させる。その結果、上記のキャピラリバルブ現象による試料液を停止させることができる。また、前記開口部を閉じることにより、移送路の不連続部分が解消されるので、再び試料液を移送することができる。【００３６】  このような開口部３３および当該開口部と嵌合する蓋３４は、例えば、移送路の壁面の一部を、蝶番３５となる部分を残して切り取ることにより設けることができる。すなわち「蝶番３５となる部分」は前記蓋と前記壁面とがつながる部分である。当該部分が蝶番となり、蝶番を軸にして蓋となる部分を移送路の外側へ折り曲げる。このようにして扉機能を有する蓋が形成される。開口部の形状は特に限定されないが、図２に示すとおり四角形または円形であって、かつ四角形の一辺または円の一部の弧の部分が、当該開口部と嵌合する蓋との蝶番を形成していることが好ましい。すなわち、前記開口部および当該開口部と嵌合する蓋は「Π字状」または「Ｃ字状」のような形状をなし、「Π」または「Ｃ」の字線のつながっていない部分が、前記蝶番を形成していることが好ましい。【００３７】  図２は開口部３３および当該開口部と嵌合する蓋３４の例を示す図である。これらは試料液移送路の壁面に設けられるが、壁面は図示していない。また符番は図１で説明したものと同一であるため説明を省略する（以下同じ）。
図２Ａは四角形であり、四角形の一辺が蝶番をなす構造（Π字状）である。図２Ｂは四角形であるが蝶番の位置が四角形の一辺より内部に存在する構造である。図２Ｃは上記のＣ字状である。図２Ｄは四角形の一辺が蝶番となる構造であるが、蝶番の一部が切断されている。図２Ｅは先端に突起３９を設けた構造である。図２Ｅの構造については後で詳しく説明する。【００３８】  前記開口部および蓋の幅（蓋の移送路の移送方向に垂直方向の最大長）は、移送路の移送方向に垂直な断面の内壁周囲長の３割以上５割未満であることが好ましい。キャピラリバルブ効果を効果的に発現させ、かつ蓋の形成加工性を高めるためである。また同様の理由から、前記開口部および蓋の幅は０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましい。【００３９】  前記蓋３４を折り曲げて蝶番３５を作製する場合、蝶番部が破断しないことが好ましい。さらに、このようにして設けた蓋の開閉動作を一回以上行っても、蝶番部は破断しないことが好ましい。蝶番が破断しないとは、前記蝶番近傍にひびが入ったりしないことを含む。このため、前記蓋および蝶番を形成する部材の材料は、外力による塑性変形が可能で、折り曲げに対して適切な強度を有する熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂の例には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアセタール、ポリブチルテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、６６ナイロンや６ナイロンなどのポリアミド等が含まれる。中でも、適切な強度を有し、かつ入手容易であること等からＰＥＴが好適である。後述のとおり前記蓋３４および蝶番３５は、試料液移送路の壁面を切り取って設けることが好ましい。この場合、蓋と蝶番は試料液移送路の壁面から形成される。従って、蓋、蝶番および試料液移送路は同一の材料となるので、試料液移送路の材料には、上記のものを用いることが好ましい。【００４０】  上記蓋および蝶番を形成する部材の厚みは、５０〜１００μｍであることが好ましい。強度、加工性、耐折り曲げ性、開閉動作適合性のバランスに優れるからである。【００４１】  前記開口部および蓋は、移送路の壁面に設けられていればよく、その部位は特に限定されないが、天井部に設けられることが好ましい。当該開口部および蓋の形成が容易であり、かつ開閉動作も容易に行えるからである。【００４２】  また前記開口部および蓋は、蝶番部分を前記試料液移送路の移送方向に垂直であって、前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも、下流に配置することが好ましい（図３の蓋３７参照）。
開口部および蓋をこのような構造で設けた場合、当該蓋を開けた状態で、移送路の上流から試料液を流入させると、試料液に対して移送路は確実に分断される。仮に蓋の開き具合が不十分であっても、試料液は当該蓋に触れることは困難となる。よって、キャピラリバルブ効果によって試料液を確実に停止させることができる。
次に、当該蓋を閉めて試料液移送路の開口部を塞ぐと、内壁面の不連続構造が解消されるので、試料液は毛細管現象により再び移送される。以上から、開口部および蓋を、蝶番部分が前記試料液移送路の移送方向に垂直であって、前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも下流になるようにして配置すると、送液制御の精度が高められる。【００４３】  ただし、上記構造の蓋や開口部を、移送路の壁の一部を切断して形成した場合、加工時の変形（反り等）により、蓋と開口部が完全に密着しないこともありうる。実際には、開口部の境界部分で停止している試料液の一部は、開口部よりもわずかに下流方向にしみ出し、液面がせり出している場合が多い。よって、蓋と開口部が密着していなくても、問題にならないことが多い。しかし試料液を蓋へより確実に接触させるためには、開口部の蝶番と対向する部分にＶ字状の切込を形成し、かつ前記開口部に嵌合する蓋に、前記切込と嵌合する∧字状の突起を形成することが好ましい（図２Ｅの切込３９参照）。Ｖ字状切込部分では、試料液の表面張力により、Ｖ字の先端部分に試料液がにじみ出すので、蓋を閉じると蓋の∧字状突起の先端ににじみ出ている試料液が接触し易く、送液をより確実に行える。【００４４】  「Ｖ字状」の切込の形状は、高さが０．２ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、特に０．３ｍｍ以上０．７ｍｍ以下であり、頂角の角度が１５度以上１２０度以下、特に１５度以上から６０度以下である二等辺三角形であることが好ましい。切り込みを入れるための加工が容易であり、また試料液を適切に滲みださせることができるからである。加工状の問題、および強度上の問題がなければ、「Ｖ字状」の切込は、頂角の角度を更に狭くした形状でもよい。【００４５】  このような切込や突起がない場合でも、本発明の試料液移送路に外力を加えて流路形状を変形させれば、開口部に静止した試料液を下流側にせり出させることができる。液体入りのチューブを押しつぶして、チューブ先端から液体をせり出させるのと同じ原理である。【００４６】  前記開口部および蓋は、蝶番部分が、前記試料液移送路の移送方向に垂直であって、前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも上流に位置するように設けてもよい。このような構造とした場合、開口部で試料液は停止するが、蝶番を超えて蓋の一部まで試料液がにじみ出す。したがって、蓋と開口部の間に加工に起因する隙間が生じていたとしても、蓋を閉じる際に試料液は扉構造の辺縁部（特に両側）からにじみ出し、下流側の内壁に接触しやすい。そのため下流側への送液を確実にすることができる。ただし、蓋の一部まで試料液がにじみ出すため、試料液を停止させるためには、蓋の開き具合を十分に確保する必要がある。【００４７】  以上は、前記移送路の壁面の一部に設けられた開口部および当該開口部と嵌合する蓋を用いたキャピラリバルブ効果による移送について説明した。この他、外力によって試料液を移送する場合にも、当該開口部および蓋により送液を制御できる。蓋を開けた状態で外圧により試料液を移送すると、開口部から余分な液は流れ出すので、開口部より下流へ送液できなくなる。そして、蓋を閉じて外圧をかければ、下流への送液が可能となる。【００４８】  （２）反応領域について
本発明の試料液分析チップは、試料液移送路を形成する内壁面に配置された反応試薬層４を有する。反応試薬層４は、試料液と接触させやすくするため、試料液移送路の底面に配置することが好ましい。反応試薬層とは、試料液中の特定成分の反応を進行させるための試薬を含む固形または半固形（ゲルなど）の部材をいう。試料液中の特定成分とは、分析の主たる対象となる被検知物質である。【００４９】  反応試薬層に含まれる好ましい試薬の例には、試料液中の特定成分の化学反応を触媒する酵素、同特定成分に特異的に結合する物質等が含まれる。酵素の例には、コレステロールの酸化を触媒するコレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、グルコースの酸化を触媒するグルコースオキシダーゼ、トリグリセリド（中性脂質）の酸化を触媒する、リポ蛋白リパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ等が含まれる。【００５０】  反応試薬層は、必要に応じて、酵素反応を活性化させる目的で界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤の例には、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルやコール酸ナトリウム塩などが含まれる。さらに、乾燥時の試薬層の表面形状を均一にし、かつ試料液点着時の溶解を迅速にするために、タウリン、マルチトール、カルボキシメチルセルロースなどの水溶液を添加してもよい。また、反応試薬層の例には、上記酵素反応と共に用いることが好ましいフェリシアン化カリウム等の酸化還元反応が可能な試薬が含まれる。【００５１】  特定成分に特異的に結合する物質とは、化学的あるいは物理的に結合する物質を意味する。この例には抗原に対して特異的な結合能力を有する抗体等が含まれる。抗体には、公知のものを用いることができる。その例には、抗アルブミン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プロスタグランジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホルモン抗体等が含まれる。【００５２】  さらに抗体を担持した粒子を用いてもよい。抗体を担持させる粒子は任意に選択されるが、その例には、磁性金属粉、Ｆｅ３Ｏ４粒子、γ−Ｆｅ２Ｏ３粒子，Ｃｏ−γ−Ｆｅ２Ｏ３粒子、ナイロンやポリアクリルアミド等のポリマーとフェライトとの複合微粒子等が含まれる。これらの粒子は公知の方法で調製できる。例えば特許文献２に示すとおりシランカップリング剤等を用いて調整してよい。【００５３】  反応試薬層は、試料液と接触したときに、確実に溶解、分散、または膨潤するように配置されることが好ましい。反応試薬層は、例えば、適当な溶媒に試薬を溶解させて得られる試薬溶液を、試料液移送路壁面に滴下し、風乾して固形化して形成できる。
また反応試薬層は、同様にして滴下した試薬溶液を凍結乾燥させ固形化して形成してもよい（凍結乾燥法）。凍結乾燥法により形成される反応試薬層は、滴下した溶液の体積とほぼ同じ体積を有し、内部に空隙を有する。よって、反応試薬層の試料液への溶解が迅速となる。また凍結乾燥法を用いると、風乾の場合よりも乾燥後の残留水分量が少なくなるので、酵素や抗体などの保存安定性が高まる。【００５４】  上記反応試薬層は例えば円盤状に成形され、その直径は０．２〜１．５ｍｍであることが好ましい。円盤の高さは特に限定されないが、５０μｍ以下であることが好ましい。また反応試薬層が内部に空隙を有する場合には、試料液が反応試薬層でせき止められることがないため、反応試薬層の高さは５０μｍより高くてもよい。本発明において「〜」はその両端の数値を含むことを意味する。【００５５】  反応試薬層は、複数の部位に設けてもよい。そのとき、反応試薬層を設けた箇所のそれぞれの間には、開口部を設けられることが好ましい。試薬、開口部、検出領域の位置に関しては後述する。図３は、本発明の試料液分析チップの第二の態様を示す図であり、試料液分析チップの分解斜視図である。実際は両端の点線矢印で示すように各部材が組み合わされてチップを構成する。図３中、２ａは試料液分析チップであり、基板１０、天井板１１、スペーサ１２から構成される。４１は第一の反応試薬層、４２は第二の反応試薬層である。３３は第一の開口部、３６は第二の開口部であり、これらに嵌合する蓋３４、３７をそれぞれ備えている。３５は蝶番である。
天井板１１および基板１０に示す一点鎖線直線は、各部材が組み合わされたときに試料液移送路を形成する部分である。開口部３３、３４を基板１０に投影した位置も一点鎖線で示される。【００５６】  （３）検出領域について
本発明の試料液分析チップは、試料液の物理的あるいは化学的変化を検出するための検出領域５を含む。試料液の物理的変化とは、試料液の性状が変化することを意味する。性状の変化とは、色の変化、液体から固体への状態の変化等を意味する。また、試料液の化学的変化とは、試料液の特定成分が化学的に別の物質に変化することをいう。【００５７】  検出領域とは試料液の上記変化を検出するのに用いられる部位をいう。つまり、光学的に上記変化を検出しうる検出領域とは、試料液の状態の変化を光学的に認識するための部位である。この場合、検出領域は検出に用いる電磁波（目視の場合は可視光線）を透過させる必要がある。また、電気的に検出する場合は、電極等が形成されているチップ上の部位を意味する。前述の図３においては５で示される領域が該当する。【００５８】  まず、光学的に上記変化を検出する場合について説明する。光学的に検出するとは、化学的または物理的な変化の挙動を、特定波長の電磁波に対する試料液の吸光度、透過率、または一定領域に含まれる試料液中の固形物の外観的性状により判断することである。光学的に検出するための計測器の例には、吸光度計、画像処理装置等が含まれる。また、肉眼で観測してもよい。【００５９】  光学的な検出を可能にするためには、チップ全体が透明の材料で形成されていることが好ましい。このような材料の例には、熱可塑性樹脂が含まれ、中でも、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートが好ましい。特に、ポリカーボネートは可視光に対して非常に高い透明性を有するものがある。【００６０】  次に、電気的に検出する場合について説明する。図５は試料液分析チップの検出領域に電極を設けた態様を示す図である。電極とは電場をつくるため、または電流を流すために、対にして設ける導体または半導体である。図５において、分割された２つの導体（５１と５４）が一対の電極を形成している。これらの電極を用いて、試料液中の物質または試料液中の物質と反応試薬の化学反応によって生成した物質の酸化反応、または還元反応による電流値が測定される。その測定された電流値から、試料液中の特定の物質の濃度が検出される。このように２以上の分割された導体で形成された電極を、電極対ともいう。【００６１】  電極対は、試料液移送路の内壁の一部、好ましくは底面に設けられる。本発明における電極は、平面電極とすることが好ましい。平面電極は、例えば、導体を含むペーストの印刷により形成するか、スパッタ法、蒸着法などの公知の方法を用いて形成することができる。また、平面電極は、ポリエチレンテレフタレート等の基板表面に、金、白金、銀、銅、パラジウム、クロム、カーボンなどを薄膜状に蒸着して形成してもよい。ただし導体の材料は、試料液中で電気化学的に反応してイオン化したり、酸化作用や還元作用を受けたりするものでないことが好ましい。【００６２】  さらに電極対は導線（リード線）を介して外部の端子と接続されていることが好ましい。電気化学測定装置等の外部の装置と接続できるからである。導線の材料には、導体一般を用いることができるが、好ましくは金、白金、銀、銅などである。
電極対の電極の幅は特に限定されないが、０．１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下が好ましく、より好ましくは０．２ｍｍ以上０．４ｍｍ以下である。【００６３】  （４）反応試薬層、開口部、検出領域の位置について
本発明の試料液分析チップは、図１に示すとおり反応試薬層４、開口部３３、検出領域５が、移送方向の上流からこの順に配置される。移送方向の上流とは、試料液分析チップにおける試料液流入口３１に、より近い位置を意味する。
反応試薬層４、開口部３３、検出領域５を、このように配置すれば、流入した試料液と反応試薬層の混合および反応が、反応領域において十分になされる。反応領域は限られた小さなスペースであるため、試料液と反応試薬の混合および反応が容易に起こる。この後、十分に反応した試料液を検出領域に移送する過程で、さらに試料液は攪拌される。よって試料液はより均一となり、試料液の物理的変化および化学的変化を確実に検出することができる。
即ち、試料液分析チップの反応試薬層４、開口部３３、検出領域５を移送方向の上流からこの順に配置することにより、反応試薬の溶解；試料液と反応試薬との化学反応；検出を、時系列的にも空間的にも、分離して行なうことができる。その結果、試料液の均一性が確保できるので、誤差の少ない検出が可能となる。【００６４】  例えば、血中の抗原と、当該抗原に対する抗体を担持させた担体粒子とを反応させ、粒子の凝集度合いを測定する抗原の定量においては、抗体担持粒子が反応試薬層４として配置される。本測定においては、吸光度測定などで凝集の度合いを検出するため、試料液中の試薬の濃度はより均一であることが求められる。そこで、図１に示すように反応試薬層４、開口部３３、検出領域５を配置すれば、試料液である血漿が、反応試薬層４の抗体担持粒子と反応領域で充分に混合および反応してから、検出領域５に移動する。そして、検出領域５で粒子の凝集度合いが測定されるため、誤差の少ない測定が可能となる。【００６５】  また、反応試薬層が複数の部位に配置されている場合には、反応試薬層が配置された部位はそれぞれ、開口部をはさんで設けられることが好ましい。個々の反応試薬との反応が、他の反応試薬の影響を受けることなく行われうるからである。【００６６】  例えば、血漿中のコレステロール濃度を測定する場合について図４を参照して説明する。診断指針として用いられる血清コレステロール値は、コレステロールとコレステロールエステルの濃度を合計したものである。コレステロールの測定は、酵素（コレステロールオキシダーゼ：ＣｈＯＤ）を用いて、コレステロールを酸化する方法で測定することが一般的である。しかし、コレステロールエステルはＣｈＯＤによる酸化反応の基質になることができないので、コレステロールエステルをコレステロールに変化させるコレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）を用いる方法が知られている。すなわち血清コレステロール濃度は、二種の酵素を用いて、以下の反応Ａおよび反応Ｂを利用して測定される。
反応Ａ：コレステロールエステル→コレステロール＋脂肪酸（酵素ＣｈＥによる反応）
反応Ｂ：コレステロール＋フェリシアン化イオン→コレステノン＋フェロシアン化イオン（酵素ＣｈＯＤによる反応）【００６７】  本測定においては、フェリシアン化イオンを主成分とする試薬を第一反応試薬層４１として；ＣｈＯＤおよびＣｈＥを主成分とする試薬を第二反応試薬層４２とすることが好ましい。まず、試料液である血液が、第一反応試薬と混合される。第一反応試薬層のフェリシアン化イオンは、それ単独ではコレステロールまたはコレステロールエステルと反応できないので、第一反応試薬層４１では単に試薬同士が混合される。【００６８】  次に試料液が、第二反応試薬層４２のＣｈＥ、ＣｈＯＤと混合されると、コレステロールエステルが上記Ａ反応でコレステロールに変化する。コレステロール（元から存在していたコレステロールと、Ａ反応により生じたコレステロール）は、上記Ｂ反応によりコレステノンに酸化されるとともに、これにより生じる電子によりフェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還元される。このときのフェリシアン化イオンの減少量は、酸化反応により減少するコレステロールの量に対応するので、フェリシアン化イオンの減少量を検出領域５で定量すれば、コレステロール濃度を算出することが可能である。【００６９】  本反応に用いる試薬を総て混合した試薬層を一の部位に配置すると、長期保存によって試薬の劣化が起こる。これを避けるためには、上記のようにそれぞれの試薬を分けて試料液分析チップに配置することが好ましい。【００７０】  さらに、試薬層を分けて設けることで、反応の順序も制御することができ、より測定の精度を高められる。上記の例において、仮にＣｈＯＤおよびＣｈＥを主成分とする試薬を第一の反応試薬層（上流側）に配置した場合には、試料液は反応試薬と混合されるとすぐに、反応Ｂが開始される。反応Ｂはフェリシアン化物イオンが存在せずとも、試料液中に酸素が存在すれば進行するからである。反応Ｂが開始すると、酸素が還元されて過酸化水素が生成される。その後に第二反応試薬層のフェリシアン化イオンと反応させても、既に酸化反応が開始しているので、フェリシアン化イオンを定量してもコレステロールの濃度は正確に測定できない。【００７１】  以上から、フェリシアン化カリウムを主成分とする反応試薬層と、ＣｈＯＤおよびＣｈＥを主成分とする反応試薬層を分けて設け、かつ前者を後者よりも上流に配置することで、測定精度を向上させることができる。【００７２】  （５）感知領域
本発明の試料液分析チップは、前記反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に、試料液の到達または反応試薬層の変化を感知しうる感知領域を有していてもよい。感知領域を設けることにより、より正確な分析を行うことができる。試料液の到達とは、反応試料層に試料液が移送されたことを意味する。反応試薬層の変化とは、試料液と混合されることにより、反応試薬層が溶解あるいは反応すること等を意味する。すなわち感知領域とは、試料液の到達または反応試薬層の変化を、光学的または電気的に感知するための部位を意味する。感知領域は、検出領域と同様に電磁波を透過できる部材で構成されていてもよい。【００７３】  感知領域は、反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に設けることが好ましく、反応試薬層のやや下流側に設けることがより好ましい。反応試薬層での上記挙動をより確実に観察できるからである。具体的には図４における６で示される位置に設けることが好ましい。図４は、図３の試料液分析チップ２ａを、試料液流入口３１と空気孔３２を結ぶ線で切断し、紙面正面から見た図である。感知領域６はそれぞれ、第一の反応試薬層４１、第二の反応試薬層４２が配置された部位と同一の部位か、それよりやや下流の部位に配置される。【００７４】  また、感知領域には図５に示すとおり電極が設けられていてもよい。「５１と５２」の感知領域に存在する部分が電極対を形成し、試料液の到達または反応試薬層の変化を電気的に感知する。「５１と５３」の感知領域に存在する部分も同様に機能する。電極は前記検出領域に設ける方法と同様の方法で設けてよい。【００７５】  以上、本発明の試料液分析チップについて、図１に示す試料液分析チップを例にして説明したが、この他に図６に示すような分析チップとしてもよい。図６は、第三の態様の試料液分析チップを示す図である。図６に示される試料液分析チップは、開口部およびこれに嵌合する蓋３４の蝶番３５は、試料液の移送方向に平行に設けられている。【００７６】  本発明の試料液分析チップは、試料液流入口３１の上流域に、試料液の流入を容易にするための点着部を設けてもよい。さらに、試料液を血液とする場合には、血球などの固形成分の除去が必要なことがあるので、血球除去用のフィルタを試料液移送路の任意の位置に配置してもよい。【００７７】  １−２．試料液分析チップ本体と蓋とが別個である態様【００７８】  本態様の試料液分析チップは、（１）送液制御についてのみ前述のチップと異なり、（２）反応領域、（３）検出領域、および（４）反応試薬層、開口部、検出領域の位置については前述のチップと同様である。また、（１）送液制御についても、開口部に嵌合する蓋が試料液分析チップ本体と別個の部材であること以外は前述のチップと同様である。以下、開口部に嵌合する蓋について主に説明する。【００７９】  図７は、本態様の試料液分析チップの例を示す図である。試薬、流路等の位置関係は図３と同様であるが、蓋３４、３７が試料液分析チップ２ｂから分離されている点が異なる。図中３００および３０１は、蓋３４、３７の搬送用の保持具である。この保持具３００、３０１は、必要に応じて上下左右に移動して、下端部に保持した蓋���４、３７を開口部３３、３６に嵌合させることができる。保持具が蓋を保持する方法としては、例えば、中空構造の保持具の内部を陰圧にして蓋を吸着させたり、蓋の流路内面を構成する部分以外の部分を常磁性体として、保持具を電磁石としたりすればよい。蓋の特定の部分を常磁性体とする方法としては、例えば、常磁性体粉を含む塗料を塗布したり、常磁性体製の粘着テープを貼り付けたりすればよい。【００８０】  保持具は、チップが装着される測定装置に組み込まれていてもよい。図７では、測定装置が開口部の数と同数（２つ）の保持具を備える例を示しているが、保持具の数はこれに限定されない。例えば、測定装置は、１つの保持具を移動させて各開口部に蓋を嵌合させてもよい。【００８１】  また、このように蓋を試料液分析チップと別個のものとする場合、開口部の閉鎖性を向上させ、かつ、移送路内面と蓋の内面との平滑性を向上させるために、図８に示すように、平坦部６０の上（移送路内面側）に天井板１１の厚みと同じ厚みの嵌合部６１を設けてもよい。この嵌合部６１は、開口部と嵌合した際に移送路内面の一部として機能する。このような形状にすることで、開口部を閉鎖した際に試料液の移送をより確実に再開させることができる。このような蓋を使用する場合、壁面の一部を形成する部分（嵌合部６１）は使い捨て可能であってもよい。【００８２】  以上のように、本発明の試料液分析チップは、試料液移送路の壁面の一部に開口部が形成されており、前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋を有するため、キャピラリバルブ現象などを利用して試料液の移送を制御することができる。【００８３】  ２．本発明の試料液分析チップの製造方法
本発明の試料液分析チップは、発明の効果を損なわない限り任意の方法で製造できるが、以下好ましい製造方法について説明する。
本発明の試料液分析チップは、
ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程
ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程
ｃ）前記基板と前記天井板を、前記基板の両端部にスペーサを介して貼り合わせることにより、両端が開放された試料液移送路を形成する工程
を経て製造できる。これらの順番は特に限定されないが、作業性からは最後にｃ）工程を経ることが好ましい。【００８４】  ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程は、すでに述べたとおり、試薬を適当な溶媒に溶解させて調製した試薬溶液を基板に滴下し、風乾して固形化することによって行われる。滴下には、ピペットまたはディスペンサを用いることが好ましい。これらを用いて行う場合、１回の滴下量は５０ｎｌ〜５μｌ程度であることが好ましい。特に５０ｎｌ〜１μｌ程度の液滴を滴下する場合にはディスペンサを用いることが好ましい。また、滴下した試薬溶液は乾燥されるがこのときの条件は、５０℃×１０分程度あるいは、２５℃、湿度６０％未満で１５分程度とすればよい。
また、試薬溶液は凍結乾燥してもよい。凍結乾燥は定法で行えるが、例えば以下のようにして行ってよい。まず、基板に試薬溶液を滴下し、直ちに予備凍結する。予備凍結は基板を液体窒素などに浸漬して行うことができる。次に、予備凍結した基板を常圧雰囲気下、−４０℃で放置する。続いて−４０℃にて雰囲気を真空にし、１５分程度放置する。さらに真空状態のまま−４０℃から−１０℃まで２時間かけて昇温し、−１０℃で１時間保持、−１０℃から２５℃まで２時間かけて昇温、２５℃で２時間程度保持する。【００８５】  試薬を滴下する場所は試料液移送路の内壁となる部位であることが好ましく、より好ましくは、試料液移送路の内壁であって底面となる部位である。
さらに、フィルム状基板の試料液移送路の内壁となる部分を、予め親水化処理してもよい。親水化処理は既に述べたとおり、界面活性剤を壁面に塗布および乾燥することで施すことができる。【００８６】  ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程は、任意の方法で行えばよい。例えば、開口部を切り抜いて得た部材を、テープ等で開口部の一部と接着して設けてもよい。また、フィルム状天井板に、蝶番とする部分を除いて切削痕を設け、蝶番とする部分を軸としてフィルムを折り曲げて形成してもよい。加工の容易さからは後者の方法が好ましい。
後者において切断痕を設ける方法は、カッティングプロッタ（グラフテック社製）を用い、切削痕の平面図形を入力し、その形状に対応するようにカッティングプロッタの刃を用いて切削することが好ましい。この他に、腐蝕刃型（ピナクルダイ）やトムソン刃型等の機械的方法を用いてもよいし、また、レーザー照射等によって形成してもよい。【００８７】  フィルムの切断された部分を、蝶番とする部分を軸として折り曲げるには、ピンセットなどを用いて行えばよい。また、蓋となる部分と嵌合する雄型を設けた金型を準備し、その金型の上に上記フィルムをセットし、プレス加工により行ってもよい。蝶番部分が白化する程度に曲げること、すなわちフィルムが塑性変形するように曲げることが好ましい。折り曲げた後の蓋は、試料液移送路の壁面に対して一定の角度で開いていることが好ましい。この角度は特に限定されないが、蓋を閉じる操作の容易性から２０〜６０度が好ましい。【００８８】  つづいて前記ａ）工程で反応試薬層が設けられた基板１０と、ｂ）工程で開口部３３、３６および蓋３４、３７が設けられた天井板１１を、スペーサ１２を介して貼り合わせる。スペーサは試料液移送路３を形成できるように図に示すとおりチップの両端に配置することが好ましい。
基板１０と天井板１１の貼り合わせは、接着剤による接着や、熱プレスによる接着によって行えばよい。加工容易性から接着剤を用いて貼り合わせることが好ましい。接着剤は、アクリル樹脂系など公知の接着剤を用いればよい。【００８９】  また、図６に示すタイプの試料液分析チップは、一枚のフィルムに、反応試薬層を形成し、かつ開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設けて；そのフィルムを巻くようにしてフィルム端同士を接着して、製造されうる。【００９０】  ３．本発明の試料液分析チップを用いた分析方法
図９を参照して二つの反応試薬層を有する試料液分析チップを例に、分析方法を説明する。図９は、試料液分析チップを用いた分析方法の一例を示す図であり、図９において７は試料液である。
まず、試料液７の移送方向に対して、第一の反応試薬層４１の下流に隣接する蓋３４を開口したまま、試料液を試料液流入口３１から分析チップに導入する（図９Ａ）。試料液７は、開口部３３より下流には浸入できない。試料液７は、試料液流入口３１と開口部３３の最上流部分（上流端）との間に形成される反応領域において、第一の反応試薬層４１と混合され、反応する。例えば、試料液７が血液で、第一の反応試薬層４１がフェリシアン化カリウムを主成分とする場合、この反応領域で血液とフェリシアン化カリウムが混合される。【００９１】  試料液７と第一反応試薬層４１の試薬との混合が十分になされた後に、蓋３７を開放した状態で蓋３４を閉じる。試料液７は、開口部３６まで移送され、第二の反応試薬層４２と混合され、反応がおこる（図９Ｂ）。第二の反応試薬層がＣｈＥ、ＣｈＯＤを主成分とする場合、試料液中のコレステロールエステルがＣｈＥによりコレステロールに変化し、変化したコレステロールと、もとから存在したコレステロールが、ＣｈＯＤによりコレステノンに酸化される。そして、試料液中に存在するフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。【００９２】  当該反応が十分に進行した後に、蓋３７を閉じると試料液は検出領域５に移送され、化学的または物理的変化が検出される（図９Ｃ）。検出は、例えば、目視で色の変化を観察し、予め作成しておいた色見本と比較して行えばよい。また検出は、検出領域５に設けられた電極にパルス電圧を印可して、フェロシアン化カリウムのフェリシアン化カリウムへの酸化電流を測定してもよい。フェロシアン化カリウムの定量ができれば、血中コレステロール濃度が定量できる。【００９３】  上記蓋は、試験者がピンセット等を用いて直接押して閉じてもよいが、その他に外力を付与する機構を付与してもよい。例えば、可動な棒状構造体を蓋に押し当てて閉じてもよい。あるいは蝶番と平行な軸を有するローラー状構造体を、扉構造の蝶番部部分から先端境界部まで転がして閉じてもよい。【００９４】  血中のコレステロールを測定する方法を例に説明したが、他の測定も同様に行うことができる。さらに、第一、第二の反応試薬層へ試料液が送液されたかどうか、試薬と混合されたかどうかを、前記反応試薬層の近傍に感知領域を設けて確認しながら測定を行ってもよい。例えば、感知領域を特定の電磁波に対して透明な部材で形成した場合は、目視または光学的な変化（特定の電磁波の透過度の変化）を観察することで確認できる。また、当該場所に電極を設けて電位の変化を測定してもよい。
【実施例】
【００９５】  ［実施例１］図３に示すコレステロールセンサ
厚み０．１ｍｍ；長さ５ｍｍ；幅３ｍｍのポリカーボネート製の天井板を準備した。グラフテック社製カッティングプロッタに切削痕の平面図形を入力し、図２Ａおよび図２Ｅに示される形状の切削痕を、準備した天井板に形成した。形成した切削部を、図３に示されたように折り曲げて、蓋（３４および３７）とし、開口部（３３および３６）を形成した。蝶番部（３５および３８）が白化するように折り曲げて、蓋が開いたままになるようにした。試料液流入口３１から第一の開口部３３の蝶番３５までの距離を１ｍｍに；第二の開口部３６の蝶番部３８から空気孔３２までの距離も１ｍｍとした。【００９６】  試料液移送路の幅を０．８ｍｍに、蓋３４および蓋３７の幅を０．８ｍｍとした。蓋３４の蝶番を、開口部３３の蝶番に対向する部分よりも上流に配置した。蓋３７の蝶番を、開口部３６の蝶番と対向する部分よりも下流に配置した。蓋３７には、頂角が３０°、高さが０．３ｍｍの二等辺三角形の突起を設け、開口部３６にもこれに嵌合する同形状の切込を設けた。【００９７】  一方、厚みが０．１ｍｍ、長さが５ｍｍ、幅が３ｍｍのポリカーボネート製の基板を準備した。当該基板の試料液移送路を形成する部位に、反応試薬層４１および４２を、以下のとおりに形成した。【００９８】  ＜反応試薬層４１＞
７０ミリモル／ｌのフェリシアン化カリウム；０．０５ｗｔ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；タウリン１．３３ｗｔ％；マルチトール０．１ｗｔ％を含む混合水溶液を調製した。基板上の試料液移送路となる部位であって、試料液流入口３１と第一の開口部に設けられた蝶番３７の中間地点に、調製した混合水溶液の０．２μｌを滴下した。滴下した溶液を、室温２５℃中の実験室内で乾燥固化させた。この滴下および乾燥の工程を１０回繰り返して、反応試薬層を形成した。当該試薬層は、試料液流入口３１と蝶番３５の中間地点を中心とする、直径約０．８ｍｍの円盤状となり、試料液移送路内に収められた。一方、混合水溶液の２．０μｌを一度に滴下した場合は、液滴が拡がりすぎて、試薬層４１の直径を０．８ｍｍ以内に収めることができなかった。【００９９】  ＜反応試薬層４２＞
ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）由来のコレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯＤ）を０．７５キロユニット／ｍｌ（約２．３４ｗｔ％）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のコレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）を２キロユニット／ｍｌ（約１．１ｗｔ％）；およびコレステロールエステラーゼの反応を活性化させる作用を有する界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を０．５ｗｔ％；界面活性剤であるコール酸ナトリウム塩を７５ミリモル／ｌ；タウリン１ｗｔ％；マルチトール０．２５ｗｔ％；ＣＭＣ０．２ｗｔ％を水に溶解させた混合溶液を調製した。次に、基板上の試料液移送路となる部位であって、第一の開口部３３の下流端と第二の開口部３６の上流端の中間地点に、当該混合溶液の０．２μｌを滴下し、試薬層４１と同様にして室内で乾燥させた。この操作を１回のみ行なうことで、直径が０．８ｍｍの円盤状の反応試薬層４２を形成した。
本実施例ではフェリシアン化カリウムを主成分とする反応試薬層４１を、ＣｈＯＤ、ＣｈＥを主成分とする反応試薬層４２よりも、上流側に設けた。【０１００】  厚み７５μｍ；長さ５ｍｍ；幅１．１ｍｍのＰＥＴフィルムを用意した。当該ＰＥＴフィルムの上面および底面に、厚み１２．５μｍのアクリル系接着剤を塗布し、総厚みを１００μｍとした両面粘着剤ＰＥＴフィルムを調製して、スペーサとした。当該スペーサを前記基板と天井板の間に挟みこみ、これらを貼り合せることでコレステロールセンサ用試料液分析チップを作製した。【０１０１】  このようにして作製したチップに、試料液として血漿を供給した。樹脂板片に１μｌの血漿を滴下して血漿液滴を形成し、形成された血漿液滴に、チップの試料液流入口３１に接触させた。血漿は、試料液移送路３に流入した。まず流入した血漿が、開口部３３の手前の蝶番３５の位置で静止したことが、感知領域６を目視観察することにより確認された。作製した試料液分析チップは、すべての部材が透明部材であるため、視認性に優れていた。【０１０２】  試薬層４１が血漿に溶解したことを確認した後に、蓋３４を外部からピンセットで押し込んで蓋３４を閉じた。その結果、血漿が反応試薬層４２部分まで到達し、さらに開口部３６の上流端で静止した。このときの様子を、感知領域６を目視観察することにより確認した。さらに、開口部３６のＶ字状の切込部分では、血漿が僅かににじみ出ていることも確認できた。【０１０３】  反応試薬層４２が血漿に溶解して、その輪郭がぼやけたことを確認してから、蓋３７を閉じた。その結果、血漿は空気孔３２に到達して静止した。
この間、チップの試料液流入口３１に血漿液滴を接触させ続けて、試料液流入口３１から新たな血漿を供給し続けた。【０１０４】  血漿が空気孔３２に到達してから２分経過後に、検出領域５に存在する血漿の色を観察した。同時に、所定の濃度のコレステロールを反応させたときの色を記録した色見本と比較して、コレステロール濃度を算出した。【０１０５】  ［実施例２］図５に示すコレステロールセンサ
実施例１と同様にして、図５に示すような基板、天井板、スペーサを準備した。天井板はＰＥＴ製とした。さらに基板１に、図５に示すとおりの４系統の電極を形成した。これらの電極は、基板１０にステンレス製のマスクパターンを被せて、スパッタ装置内で、パラジウムの皮膜を形成して作製された。基板は、幅を天井と同じとして、長さを７．５ｍｍとして、天井板よりも長くした。そのため、スペーサと貼り合せたときには、基板は空気孔３２側から２．５ｍｍはみ出した。【０１０６】  前記はみ出し部分の下流端から１．５ｍｍまでの領域に、端子（５１０〜５４０）を設置して外部との接続部とした。当該接続部における端子の幅は、それぞれ０．５ｍｍとした。当該接続部における前記端子同士の間隔は０．２ｍｍとした。端子５１０〜５４０は、紙面手前より、５１０、５４０、５２０、５３０の順に設けた。【０１０７】  前記接続部に設置された端子５１０を始点として、反応試薬層４１が設けられている領域を終点とする線状の導体（リード線５１）を基板上に設けた。リード線５１は、試料液移送路３よりも紙面手前の領域に、試料液移送路３に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）；平行直線部から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に分岐した部分を２つ（「第一の分岐リード部」および「第二の分岐リード部」ともいう）を有する。【０１０８】  平行直線部の幅は０．３ｍｍとした。垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入させた。また、第一の分岐リード部は、反応試薬層４２が設けられている部位に到達しており、第二の分岐リード部は検出領域に到達している。第一および第二の分岐リード部のいずれも、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入させた。分岐リード部の幅は０．３ｍｍとした。【０１０９】  前記接続部に設置された端子５２０を始点として、反応試薬層４１が設けられている領域を終点とする線状の導体（リード線５２）を基板上に設けた。リード線５２は、試料液移送路３よりも紙面奥の領域に、試料液移送路３に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）を有する。リード線の幅は０．３ｍｍとした。また、垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入している。【０１１０】  前記外部接続部に設置された端子５３０を始点とし、反応試薬層４２が設けられている部位と同じ部位を終点とする線状の導体（リード線５３）を基板上に設けた。リード線５３は、試料液移送路３よりも紙面奥であって、リード線５２よりも紙面手前の領域に、試料液移送路に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）；平行直線部の下流端と端子５３０を接続するための直線部を有する。平行直線部の下流端は、天井板１１の下流端より、やや下流側であ��て、端子５２０には接触しない位置とした。リード線の幅は０．３ｍｍとした。また、垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入している。【０１１１】  前記外部接続部に設置された端子５４０を始点とし、検出領域が設けられている部位と同じ部位を終点とする線状の導体（リード線５４）を基板上に設けた。リード線５４は、試料液移送路３よりも紙面奥であって、リード線５３よりも紙面手前の領域に、試料液移送路に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）；平行直線部の下流端と端子５４０を接続するための直線部を有する。平行直線部の下流端は、天井板１１の下流端より、やや下流側であって、端子５３０には接触しない位置とした。リード線の幅は０．５ｍｍとした。また、垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．５ｍｍ進入している。【０１１２】  上記導体は、それぞれが対になり電極対を形成する。本実施例においては、「端子５１０と端子５２０」および「端子５１０と端子５３０」からなる電極対は、試料液移送中に試料液が到達したかどうかを電気抵抗値の変化により感知するために用いた。また、「端子５１０と端子５４０」からなる電極対は、試料液が検出領域まで到達した後に、試料液の電気化学的変化を測定するために用いた。【０１１３】  このようにして作製した試料液分析チップに、実施例１と同様の方法で血漿を点着した。点着前から、端子５１０と端子５２０との間の抵抗値の測定を開始した。血漿が第一の開口部３３の上流端に到達したときに、抵抗値が急激に低下したことを確認した。直ちに、端子５１０と端子５２０の間の抵抗値の測定を終了し、同時に端子５１０と端子５３０との間の抵抗値の測定を開始した。【０１１４】  端子５１０と端子５２０との間の抵抗値の低下を確認してから、反応試薬層４１の溶解と拡散に要すると思われる時間として１０秒間待機した。その後、実施例１と同様の方法で蓋３４を閉じた。蓋３４を閉じた後、数秒後に端子５１０と端子５３０の間の抵抗値の低下が確認された。直ちに端子５１０と端子５３０の間の抵抗値の測定を終了し、同時に端子５１０と端子５４０の間の抵抗値の測定を開始した。【０１１５】  端子５１０と端子５３０の間の抵抗値の低下を確認してから、血漿に反応試薬層４２が溶解し拡散するのに要すると思われる時間として１０秒間待機した。その後、実施例１と同様の方法で蓋３７を閉じた。蓋３７を閉じた後、数秒後に端子５１０と端子５４０の間の抵抗値の低下が確認された。直ちに、端子５１０と端子５４０の間の抵抗値の測定を終了した。そのままコレステロールの酸化反応の進行に必要と思われる時間として２分間待機した。その後、端子５１０を基準にして端子５４０に対しアノード方向へ＋０．４Ｖのパルス電圧を印加し、３秒後の電流値を測定した。測定された電流値は、総コレステロール濃度に依存した応答性を示した。【０１１６】  ［実施例３］蝶番位置の検討
実施例２と同様にしてコレステロールセンサを作製した。ただし、第一、第二の開口部および蓋の構造を入れ替えた。すなわち第一の蓋３４を、蝶番３５の位置が開口部３３の上流端よりも下流になるように設けた。蓋３４には、頂角が３０°、高さが０．３ｍｍの二等辺三角形の突起を設け、開口部３３にもこれに嵌合する同形状の切込を設けた。
第二の蓋３７を、蝶番の位置が開口部３６の下流端よりも上流になるように設けた。蓋３７は、突起を設けない長方形とした。開口部３６もこれに嵌合する長方形とした。同形状の切込を設けた。【０１１７】  また、実施例２における第一の蓋３４を、形状は同じ四角形の蓋であり、かつ蝶番を移送路と平行な一辺とする蓋とした試料液分析チップを調製し、実施例２と同様の実験を行った。その結果、概ね良好な移送制御が可能であることを確認した。【０１１８】  ［実施例４］蓋形状の検討
実施例２における第一の蓋３４を、図２Ｂ、図２Ｃまたは図２Ｄに示される形状の蓋とした試料液分析チップを調製した。図２Ｂ、図２Ｃの形状の蓋は、実施例１と同様にして形成した。図２Ｄの形状の蓋は、実施例１と同様に、蝶番の幅が０．８ｍｍである蓋を形成し、さらに当該蝶番を両端から０．１ｍｍずつ切削して形成した。
このようにして調製した試料液分析チップを用い、実施例２と同様にして測定試験を行ったところ、実施例２と同様の移送制御が可能であることを確認した。【０１１９】  図２Ｃの形状の蓋の形成の加工容易性は、図２Ａの形状の蓋を形成する場合の加工容易性と大差なかった。図２Ｂの形状の蓋の形成は、図２Ａの形状の蓋を形成するよりも、蝶番を折り曲げる作業が容易であった。図２Ｄの形状の蓋の形成は、蝶番部での折り曲げ作業が容易であり、かつ分析時に蓋を閉じる工程も容易であった。【０１２０】  本出願は、２００７年４月５日出願の特願２００７−０９９６９３に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】  本発明の試料液分析チップは、簡易な構造でありながら、チップ内で試料の迅速かつ確実な分析が可能である。このため血液成分測定装置等、ＰＯＣＴ用の分析装置として有用である。
【符号の説明】
【０１２２】  １，２ａ，２ｂ  試料液分析チップ
１０  基板
１１  天井板
１２  スペーサ
３  試料液移送路
３１  試料液流入口
３２  空気孔
３３，３６  開口部
３４，３７  蓋
３５，３８  蝶番
３９  切欠
３００，３１０  保持具
４  反応試薬層
４１  第一の反応試薬層
４２  第二の反応試薬層
５  検出領域
５１，５２，５３，５４  導体
５１０，５２０，５３０，５４０  端子
６  試料液の流入等を検出する感知領域
６０  平坦部
６１  嵌合部
７  試料液
【図１】
2008126403.tif 000003
【図２】
2008126403.tif 000004
【図３】
2008126403.tif 000005
【図４】
2008126403.tif 000006
【図５】
2008126403.tif 000007
【図６】
2008126403.tif 000008
【図７】
2008126403.tif 000009
【図８】
2008126403.tif 000010
【図９】
2008126403.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月17日(2009.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端が開放された管状の試料液移送路；ならびに前記試料液移送路の内壁面に配置された反応試薬層、および試料液の物理的変化または化学的変化を検出するための検出領域を含む試料液分析チップであって、
前記試料液移送路の壁面の一部に設けられた開口部と、
前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋と、をさらに有し、
前記蓋の前記壁面の一部を形成する部分の材質は、前記開口部近傍の前記壁面の材質と同じである、
試料液分析チップ。
【請求項２】
前記蓋の一部は、前記試料液移送路の壁面と蝶番を形成する、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項３】
前記蓋は、前記試料液移送路の壁面とは別個のものである、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項４】
前記蓋は、前記壁面の一部を形成する部分が使い捨て可能である、請求項３に記載の試料液分析チップ。
【請求項５】
試料液は毛細管現象により前記試料液移送路を移送し、
前記蓋を開いて前記試料液移送路内の内壁面を不連続な構造とすることにより、当該試料液の移送を停止させることができる、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項６】
試料液の移送方向の上流から順に、前記反応試薬層、前記開口部および前記検出領域が、前記試料液移送路に配置される、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項７】
前記試料液移送路の内壁面の２以上の部位に、前記反応試薬層を有し、かつそれぞれの反応試薬層の間に前記開口部が配置される、請求項６に記載の試料液分析チップ。
【請求項８】
前記反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に、試料液の到達または反応試薬層の変化を感知しうる感知領域をさらに有する、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項９】
前記蓋が四角形または円形であり、かつ
前記蓋の四角形の一辺または円の一部の弧の部分が、前記壁面と蝶番を形成する、請求項２に記載の試料液分析チップ。
【請求項１０】
前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも下流に配置された、請求項２に記載の試料液分析チップ。
【請求項１１】
前記開口部の前記蝶番と対向する部分に、Ｖ字状の切込が形成され、かつ
前記開口部に嵌合する蓋に、前記切込と嵌合するＶ字状の突起が形成された、請求項１０に記載の試料液分析チップ。
【請求項１２】
前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも上流に配置された、請求項２に記載の試料液分析チップ。
【請求項１３】
前記検出領域に、二以上の分割された導体からなり、かつ外部との接続部を有する電極が配置されている請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１４】
前記試料液移送路の壁面を、電磁波が透過することができる、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１５】
前記反応試薬層が、試料液中の特定成分の化学反応を触媒する酵素を含む、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１６】
前記反応試薬層が、試料液中の特定成分に特異的に結合する物質を含む、請求項１に記載の試料液分析チップ。
【請求項１７】
試料液中の特定成分に特異的に結合する物質が抗体である、請求項１６に記載の試料液分析チップ。
【請求項１８】
ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程、
ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程、および
ｃ）前記基板と前記天井板を、前記基板の両端部にスペーサを介して貼り合わせることにより、両端が開放された試料液移送路を形成する工程
を含む、請求項２に記載の試料液分析チップの製造方法。
【請求項１９】
前記ｂ）における蓋の一部が前記試料液移送路の壁面と蝶番を形成し、当該蓋を設ける工程が、前記試料液移送路の壁を、前記蝶番を形成する部分を残して切り取る工程である請求項１８に記載の試料液分析チップの製造方法。
【請求項２０】
請求項６に記載の試料液分析チップを用いた分析方法であって、
Ａ）試料液の移送方向に対して反応試薬層の下流に隣接する開口部を開口したまま、試料液を分析チップに導入し、試料液と反応試薬を反応させる工程、
Ｂ）前記反応終了後に、前記開口部の蓋を閉じて、試料液を検出領域に移送する工程、および
Ｃ）前記検出領域において試料液の化学的変化または物理的変化を検出する工程
を含む、分析方法。
【請求項２１】
前記Ｃ）の検出工程が、光学的手法による検出である請求項２０に記載の分析方法。
【請求項２２】
前記Ｃ）の検出工程が、電気的手法による検出である請求項２０に記載の分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体状の試料と固体状の試薬を反応させて試料の分析を行う分析チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析技術、解析技術および検査技術の進歩によって、様々な物質を測定することが可能となっている。特に、臨床検査分野においては、生化学反応、酵素反応、免疫反応等の特異反応に基づく測定原理の開発により、病態に反映する体液中の物質を測定できるようになっている。
その中で、ポイント・オブ・ケアテスティング（ＰＯＣＴ）と呼ばれる臨床検査分野が注目されている。ＰＯＣＴにおいては、検体を採取してから検査結果が出るまでの時間の短縮を目的とした簡易迅速測定へ向けた取り組みが行われている。すなわち簡易な測定原理を採用し、かつ小型で携帯可能であって、操作性が良い測定装置が望まれている。
【０００３】
このような要請の下、試料液の希釈や撹拌などを行うことなく簡易に検体中の特定物質を定量する方式が種々提案されている。その代表的なものとして１）酵素反応を用いるもの、２）抗原抗体反応を用いるものが知られている。
【０００４】
１）の例としては、グルコースセンサが挙げられる。当該センサにおいては、酵素であるグルコースオキシダーゼが、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化し、酸素が過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を酸素電極で測定することでグルコースを定量できる。この際の過酸化水素の生成量を、白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定する方法も知られている。また、電子受容体としてフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の金属錯体を用いる方法が提案されている。さらには、電子受容体として有機化合物を用いるタイプのセンサも提案されている。
【０００５】
このタイプのセンサは、酵素反応の結果生じた電子受容体の還元体を電極で酸化し、その酸化電流からグルコース濃度を求める。従って、グルコースにかぎらず他の基質の定量にも広く応用されている。
例えば、絶縁性の基板上にスクリーン印刷等の方法で測定極、対極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体とを含む反応試薬層を形成したバイオセンサが開示されている（特許文献１を参照）。本センサにおいては、基質を含む試料液を反応試薬層へ滴下して、酵素と基質を反応させるとともに、電子受容体を還元させる。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求める。
【０００６】
２）の方法としては、抗体を担持させたラテックス粒子を血漿中の抗原と反応させ、ラテックス粒子の凝集度合いから抗原を定量する方法が知られている。具体的には、ラテックス粒子の凝集に伴う光の透過率の変化や、凝集により変化する懸濁粒子の個数や粒径分布の変化を測定して、試料液中の特定成分を定量する。ラテックス粒子の凝集を促進するために電場を用いる方法も報告されている（特許文献２を参照）。
【０００７】
しかしながら上記のようなセンサにおいては、複数の試薬を用いる場合、予め試薬を混合しておくと保存安定性が悪くなることがある。これを改善するために、酵素および界面活性剤を含む試薬と、電子受容体を含む試薬とを分けて配置するコレステロールセンサが開示されている（特許文献３を参照）。
【０００８】
一方、上記したセンサでは、微量の測定対象である試料液を微小なチップ等に設けられた反応スペースで反応させるために、試料液の移送（以下「送液」という。）の制御が重要である。送液がうまく制御できないと、試薬等と十分反応させることができないためである。
送液制御の例として、毛細管現象を利用することが知られている。例えばイムノクロマトグラフ法（特許文献４を参照）では、クロマトグラフ媒体として多孔質の吸水性物質を用いて、毛細管現象を利用して試料液を移送する。イムノクロマトグラフ法とは、抗体が固定されたクロマトグラフ担体に試料液を流して、被検知物質と前記抗体を結合させて行う分析方法である。
【０００９】
また特許文献５には、核酸の高処理量シークエンシングの方法において、遠心力、あるいは遠心力と毛細管現象を組み合わせて試料液の移送と静止を制御する方法が提案されている。
【００１０】
さらに流路に電極を設けて、電圧印加して試料液の電極表面に対する表面張力を低下させて流体を移送する方法も提案されている。このような方法はエレクトロウエッティング現象を利用した方法とも呼ばれる。例えば、化学的アッセイ等において、２次元に配列された電極を有するマイクロ流体構造を用いて、液滴を２次元的に任意に移動させうる機構が開示されている（特許文献６を参照）。
【特許文献１】特開平２−６２９５２号公報
【特許文献２】特公平５−８８７８７号公報
【特許文献３】特開２０００−３９４１６号公報
【特許文献４】特開２００６−１８９３１７号公報
【特許文献５】特表２００２−５３４０９６号公報
【特許文献６】特表２００５−５１０３４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
試料液中の測定対象物質を試薬と混合および反応させ、それにより生じた試料液の化学的変化および物理的変化を計測する分析方法をＰＯＣＴに適応させるためには、使い捨てのチップ内で、反応および検出を行えることが望ましい。
【００１２】
このような分析チップは、測定誤差を低減させ、正確な分析を行える必要がある。測定誤差を低減させるためには、試料液に生じた変化を検出する際に、試料液が均一であることが必要である。特に特許文献２に開示されているような、試料液の変化を吸光度測定等の光学的手段で測定する場合は、試料液中の試薬の濃度をより均一にする必要がある。光学的手段は、試料液の一部に光を照射しその吸収等を測定するため試料液が不均一であると特に測定誤差を生じやすいからである。
【００１３】
この問題を解決するには、チップ上における、試料液と試薬を反応および混合させる領域（反応領域）と、試料液の変化を検出する領域（検出領域）を分けることが有効である。検出領域を反応領域と分けることで、反応領域で起こりうる測定誤差の要因を排除できるからである。例えば、試薬が過剰に存在している場合、試薬の一部が試料液に溶解しきれずに残留することがある。そのままこの領域で試料液の検出を行うと試料液は不均一の状態で検出されるので誤差を生じやすい。
また、反応領域と検出領域を分けると、反応領域から、試料液を検出領域に移送する際に、液体に流動が起こるため攪拌効果が得られる。その結果、さらに試料液を均一にできる効果がある。
【００１４】
ＰＯＣＴにおいては、試料液と反応させる試薬が複数必要な場合が存在する。このとき、保存安定性の見地から、複数の試薬を、別の部位に配置する必要がある。例えば、特許文献３には、酵素および界面活性剤を含む試薬と、電子受容体を含む試薬とを分けて配置するコレステロールセンサが示されている。しかし試薬を分けて配置する方法は、流入された試料液が複数の試薬と一度に混合されると試薬成分の混合に時間がかかるという問題があった。例えば試薬Ａ、試薬Ｂがチップ上の別な部位に配置されていたところに、試料液が流入した場合、試料液はＡが設置されている部位の近傍ではＡの濃度が高い溶液となる。一方試料液は、Ｂが設置されている部位の近傍ではＢの高い濃度となる。このように試料液中に濃度分布を生じるため、試料液が全体として均一になりにくいのである。このことを改善するには、隔離されて設けられた各試薬に対して、試料液が個々に流入する構造とすればよい。
【００１５】
以上から、ＰＯＣＴに適合可能な分析チップとするためには、反応領域と、検出領域を分けて配置することが有効である。さらには、前記反応領域を必要に応じて複数設置し、かつそれらを隔離して設けることが有効である。しかしながら、これまでこのような提案はされてこなかった。
【００１６】
一方、検出領域および（複数の）反応領域が隔離されて配置されたチップを得るには、試料液の移送（送液）を制御することが必要になる。送液の制御方法には、特許文献４のように多孔質吸水性物質による毛細管現象を利用する方法がある。しかし、この方法では送液を一度停止し、再び開始するという制御が困難である。例えば、試料液を、試薬と反応するのに必要な間、反応領域に留めておき、その後、検出領域に移送するなどの制御が不可能である。
【００１７】
特許文献５のように遠心力、あるいは遠心力と毛細管現象を組み合わせて、送液を制御する方法もある。しかし、遠心力を得るために回転付与のための機構が必要であり装置が複雑になる。また試料測定チップを遠心力に耐えうる強度に設計する必要が生じるため、チップの形状および材質が制限される。
【００１８】
特許文献６のように送液制御にエレクトロウエッティング現象を用いる場合は、試料液の電極表面に対する表面張力が、電圧印加前においても十分小さい場合に問題が生じる。試料液が自発的に毛細菅に流入してしまうため、送液の制御が困難になるからである。特に、試料液の表面張力が試薬との反応により顕著に変化する場合、例えば試薬中に界面活性剤が含まれる場合などには、特に制御が困難である。
【００１９】
本発明の目的は、簡易な構造でありながら隔離された反応領域と検出領域を有し、かつ試料液の送液制御が可能な試料液分析チップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、試料液の送液制御を、毛細管壁に不連続面を形成することで毛細管現象を制御する、いわゆるキャピラリバルブを利用することに着眼して、本発明を完成させた。
すなわち上記課題は、以下の試料液分析チップにより解決される。
［１］両端が開放された管状の試料液移送路；ならびに前記試料液移送路の内壁面に配置された反応試薬層、および試料液の物理的変化または化学的変化を検出するための検出領域を含む試料液分析チップであって、
前記試料液移送路の壁面の一部に設けられた開口部と、前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋と、をさらに有し、
前記蓋の前記壁面の一部を形成する部分の材質は、前記開口部近傍の前記壁面の材質と同じである、試料液分析チップ。
［２］前記蓋の一部は、前記試料液移送路の壁面と蝶番を形成する、［１］に記載の試料液分析チップ。
［３］前記蓋は、前記試料液移送路の壁面とは別個のものである、［１］に記載の試料液分析チップ。
［４］前記蓋は、前記壁面の一部を形成する部分が使い捨て可能である、［２］に記載の試料液分析チップ。
［５］試料液は毛細管現象により前記試料液移送路を移送し、
前記蓋を開いて前記試料液移送路内の内壁面を不連続な構造とすることにより、当該試料液の移送を停止させることができる、［１］〜［４］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［６］試料液の移送方向の上流から順に、前記反応試薬層、前記開口部および前記検出領域が、前記試料液移送路に配置される、［１］〜［５］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［７］前記試料液移送路の内壁面の２以上の部位に、前記反応試薬層を有し、かつそれぞれの反応試薬層の間に前記開口部が配置される、［１］〜［６］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［８］前記反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に、試料液の到達または反応試薬層の変化を感知しうる感知領域をさらに有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［９］前記蓋が四角形または円形であり、かつ
前記蓋の四角形の一辺または円の一部の弧の部分が、前記壁面と蝶番を形成する、［２］または［３］に記載の試料液分析チップ。
［１０］前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも下流に配置された、［２］、［３］または［９］に記載の試料液分析チップ。
［１１］前記開口部の前記蝶番と対向する部分に、Ｖ字状の切込が形成され、かつ前記開口部に嵌合する蓋に、前記切込と嵌合するＶ字状の突起が形成された、［１０］に記載の試料液分析チップ。
［１２］前記蝶番が、前記試料液移送路の移送方向に対して垂直であり、かつ前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも上流に配置された、［２］、［３］、［９］〜［１１］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［１３］前記検出領域に、二以上の分割された導体からなり、かつ外部との接続部を有する電極が配置されている［１］〜［１２］のいずれかに記載の試料液分析チップ。
［１４］前記試料液移送路の壁面を、電磁波が透過することができる、［１］〜［１３］いずれかに記載の試料液分析チップ。
［１５］前記反応試薬層が、試料液中の特定成分の化学反応を触媒する酵素を含む、［１］〜［１４］いずれかに記載の試料液分析チップ。
［１６］前記反応試薬層が、試料液中の特定成分に特異的に結合する物質を含む、［１］〜［１５］いずれかに記載の試料液分析チップ。
［１７］試料液中の特定成分に特異的に結合する物質が抗体である、［１６］に記載の試料液分析チップ。
【００２１】
さらに上記課題は、以下の試料液分析チップの製造方法により解決される。
［１８］
ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程、
ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程、および
ｃ）前記基板と前記天井板を、前記基板の両端部にスペーサを介して貼り合わせることにより、両端が解放された試料移送路を形成する工程、を含む［２］に記載の試料液分析チップの製造方法。
［１９］前記ｂ）における蓋の一部が前記試料移送路の壁面と蝶番を形成する構造であ
り、当該蓋を設ける工程が、前記試料液移送路の壁を、前記蝶番を形成する部分を残して切り取る工程である［１８］に記載の試料液分析チップの製造方法。
【００２２】
さらに上記課題は、以下の試料液分析チップを用いた分析方法により解決される。
［２０］前記［６］に記載の試料液分析チップを用いた分析方法であって、
Ａ）試料液の移送方向に対して反応試薬層の下流に隣接する開口部を開口したまま、試料液を分析チップに導入し、試料液と反応試薬を反応させる工程、
Ｂ）前記反応終了後に、前記開口部の蓋を閉じて、試料液を検出領域に移送する工程、および
Ｃ）前記検出領域において試料液の化学的変化または物理的変化を検出する工程
を含む、分析方法。
［２１］前記Ｃ）の検出工程が、光学的手法による検出である［２０］に記載の分析方法。
［２２］前記Ｃ）の検出工程が、電気的手法による検出である請求項［２０］に記載の分析方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、簡易な構造でありながら、互いに隔離された反応領域と検出領域を有し、かつ試料液の送液制御が可能である、測定の精度・迅速性に優れた試料液分析チップおよびその分析方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
１．本発明の試料液分析チップ
本発明の試料液分析チップは、試料液移送路、反応領域（反応試薬層）および検出領域を有する試料液分析チップであって、試料液移送路の壁面の一部に開口部が形成されており、前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋をさらに有することを特徴とする。蓋の材質は、試料液移送路の壁面の一部を構成することから、壁面を構成する材質（特に、開口部近傍の部分の材質）と同じであることが好ましい。開口部と嵌合する蓋は、試料液分析チップ本体と一体化されていてもよいし、別個のものであってもよい。以下、それぞれの態様について説明する。
【００２５】
１−１．試料液分析チップ本体と蓋とが一体化されている態様
図１は本発明の試料液分析チップの態様の一例を示す図である。図１中、１は試料液分析チップであり、試料液移送路３、反応試薬層４、検出領域５を備えている。３３は開口部、３４は当該開口部と嵌合する蓋であり、当該蓋の一部が前記壁面と蝶番３５を形成している。３１は試料液流入口、３２は空気孔である。以下に図面を参照し、各構成要素については必要に応じ図中の符番を付して説明する。
【００２６】
（１）送液制御について
本発明の試料液分析チップ１は、両端が開放された管状の試料液移送路３を有する。
試料液分析チップとは、液体の被検体を分析するために用いる微小な部材をいう。
両端が開放された管状の試料液移送路３とは、試料液流入口３１と空気孔３２として機能する開放口を両端に有する試料液を輸送するための流路である。
【００２７】
当該試料液移送路３に試料液を移送する方法として、試料液移送路中の壁面への試料液の濡れ性に起因する毛細管現象による吸引力を用いる方法が用いられる。また外部から試料液に圧力を加える方法を用いてもよい。中でも加圧する装置を用いずに簡易な構造とできるため、当該試料液移送路３に試料液を移送する方法は毛細管現象を利用する方法が好ましい。
【００２８】
毛管を液体中に垂直に差し込んだ場合に、液体が毛管内に侵入しようとする力による毛管上昇の高さは次の式の関係があることが知られている（田嶋和夫  他著「界面化学」、ｐ４１、丸善、２００５）。
【００２９】
ｒｈρｇ  ＝  ２γｃｏｓθ
ｈ：毛管上昇高さ
ｒ：毛管半径
ρ：液体密度
ｇ：重力加速度
γ：液体の表面張力
θ：毛管表面と液体の接触角
【００３０】
上記式より、液体と毛管表面のなす接触角が９０度以上であると、右辺はゼロまたは負となるので、毛管上昇高さｈもゼロまたは負の値となる。すなわち毛管に液体が侵入できない。従って、液体と毛管表面のなす接触角が９０度以下でないと毛管上昇が起こらないことが分かる。
つまり毛細管現象で試料液を移送する場合、移送路中の壁面の材質は、試料液、あるいは試料液と反応試薬層中の試薬が溶解した液に対して充分な濡れ性を有することが必要である。試料液移送路の内壁表面の濡れ性が低い場合には、内壁表面の濡れ性を高めるために、例えば界面活性剤等で処理することが好ましい。
【００３１】
また、試料液移送路を形成する管の寸法も、毛細管現象による試料液の移送に影響する。本発明においては、断面が四角形の管の場合、管断面の幅が０.５〜５ｍｍ、高さが５〜５００μｍであることが好ましい。試料液移送路の管を形成する材料は特に限定されないが、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）やポリカーボネート等のポリマーフィルムが好ましい。さらに、上記材料を界面活性剤で処理したものがより好ましい。界面活性剤には公知のものが用いられる。その例にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル）、ホスファチジルコリンのブタノール溶液等が含まれる。処理方法も公知の方法を用いることができ、例えば界面活性剤を上記材料に塗布および乾燥させて行うことが好ましい。界面活性剤処理は、移送路を形成するすべての内壁に施してもよいが、例えば断面が四角形の管の場合、天井面のみに施す等内壁の一部であってもよい。また、表面処理を既に施してある市販のＰＥＴフィルムを用いてもよい。
【００３２】
外部から試料液に圧力を加える方法を用いる場合には、試料液移送路中の壁面の材質は、試料液または試料液に上述した試薬層中の試薬が溶解した液に対して、充分な濡れ性を有していなくてもよい。外部からの圧力の付与によって、強制的に試料液を試料液移送路に浸入させることができるからである。外部から試料液に圧力を加える手段の例には、ポンプや回転による遠心力などが含まれる。また、この場合も上述したようなポリマーフィルムを用いて移送路を形成することが好ましい。さらにこの場合は、移送路の幅、高さが
制限を受けないというメリットがある。
【００３３】
本発明の試料液分析チップは、前記試料液移送路３の壁面の一部に、開口部３３および当該開口部と嵌合する蓋３４を有し、かつ当該蓋の一部は前記壁面と蝶番３５を形成している。
開口部とは、前記試料液移送路の壁面に設けられた外部に貫通する孔である。試料液移送路に不連続部分を設けて送液を停止する役割を担う。
開口部と嵌合する蓋とは、蓋を閉じた際に開口部をほぼ完全に覆い尽くすように設けられた扉である。当該蓋は試料液移送路の不連続構造を解消し、連続構造とする役割を担う。
蝶番とは、前記蓋と試料液移送路壁をつなぐ部分である。
【００３４】
毛管に開放部分や段差による空間の不連続な部分が存在すると、その毛管に浸入した試料液の毛細管現象による移動は、当該不連続部分で停止する。これは、キャピラリバルブ現象などと呼ばれる。本発明の試料液分析チップは、移送路の壁面の一部に設けられた開口部を、外部からの操作により開いて移送路に不連続部分を発生させる。その結果、上記のキャピラリバルブ現象による試料液を停止させることができる。また、前記開口部を閉じることにより、移送路の不連続部分が解消されるので、再び試料液を移送することができる。
【００３５】
このような開口部３３および当該開口部と嵌合する蓋３４は、例えば、移送路の壁面の一部を、蝶番３５となる部分を残して切り取ることにより設けることができる。すなわち「蝶番３５となる部分」は前記蓋と前記壁面とがつながる部分である。当該部分が蝶番となり、蝶番を軸にして蓋となる部分を移送路の外側へ折り曲げる。このようにして扉機能を有する蓋が形成される。開口部の形状は特に限定されないが、図２に示すとおり四角形または円形であって、かつ四角形の一辺または円の一部の弧の部分が、当該開口部と嵌合する蓋との蝶番を形成していることが好ましい。すなわち、前記開口部および当該開口部と嵌合する蓋は「Π字状」または「Ｃ字状」のような形状をなし、「Π」または「Ｃ」の字線のつながっていない部分が、前記蝶番を形成していることが好ましい。
【００３６】
図２は開口部３３および当該開口部と嵌合する蓋３４の例を示す図である。これらは試料液移送路の壁面に設けられるが、壁面は図示していない。また符番は図１で説明したものと同一であるため説明を省略する（以下同じ）。
図２Ａは四角形であり、四角形の一辺が蝶番をなす構造（Π字状）である。図２Ｂは四角形であるが蝶番の位置が四角形の一辺より内部に存在する構造である。図２Ｃは上記のＣ字状である。図２Ｄは四角形の一辺が蝶番となる構造であるが、蝶番の一部が切断されている。図２Ｅは先端に突起３９を設けた構造である。図２Ｅの構造については後で詳しく説明する。
【００３７】
前記開口部および蓋の幅（蓋の移送路の移送方向に垂直方向の最大長）は、移送路の移送方向に垂直な断面の内壁周囲長の３割以上５割未満であることが好ましい。キャピラリバルブ効果を効果的に発現させ、かつ蓋の形成加工性を高めるためである。また同様の理由から、前記開口部および蓋の幅は０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましい。
【００３８】
前記蓋３４を折り曲げて蝶番３５を作製する場合、蝶番部が破断しないことが好ましい。さらに、このようにして設けた蓋の開閉動作を一回以上行っても、蝶番部は破断しないことが好ましい。蝶番が破断しないとは、前記蝶番近傍にひびが入ったりしないことを含む。このため、前記蓋および蝶番を形成する部材の材料は、外力による塑性変形が可能で、折り曲げに対して適切な強度を有する熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂の例には
、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアセタール、ポリブチルテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、６６ナイロンや６ナイロンなどのポリアミド等が含まれる。中でも、適切な強度を有し、かつ入手容易であること等からＰＥＴが好適である。後述のとおり前記蓋３４および蝶番３５は、試料液移送路の壁面を切り取って設けることが好ましい。この場合、蓋と蝶番は試料液移送路の壁面から形成される。従って、蓋、蝶番および試料液移送路は同一の材料となるので、試料液移送路の材料には、上記のものを用いることが好ましい。
【００３９】
上記蓋および蝶番を形成する部材の厚みは、５０〜１００μｍであることが好ましい。強度、加工性、耐折り曲げ性、開閉動作適合性のバランスに優れるからである。
【００４０】
前記開口部および蓋は、移送路の壁面に設けられていればよく、その部位は特に限定されないが、天井部に設けられることが好ましい。当該開口部および蓋の形成が容易であり、かつ開閉動作も容易に行えるからである。
【００４１】
また前記開口部および蓋は、蝶番部分を前記試料液移送路の移送方向に垂直であって、前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも、下流に配置することが好ましい（図３の蓋３７参照）。
開口部および蓋をこのような構造で設けた場合、当該蓋を開けた状態で、移送路の上流から試料液を流入させると、試料液に対して移送路は確実に分断される。仮に蓋の開き具合が不十分であっても、試料液は当該蓋に触れることは困難となる。よって、キャピラリバルブ効果によって試料液を確実に停止させることができる。
次に、当該蓋を閉めて試料液移送路の開口部を塞ぐと、内壁面の不連続構造が解消されるので、試料液は毛細管現象により再び移送される。以上から、開口部および蓋を、蝶番部分が前記試料液移送路の移送方向に垂直であって、前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも下流になるようにして配置すると、送液制御の精度が高められる。
【００４２】
ただし、上記構造の蓋や開口部を、移送路の壁の一部を切断して形成した場合、加工時の変形（反り等）により、蓋と開口部が完全に密着しないこともありうる。実際には、開口部の境界部分で停止している試料液の一部は、開口部よりもわずかに下流方向にしみ出し、液面がせり出している場合が多い。よって、蓋と開口部が密着していなくても、問題にならないことが多い。しかし試料液を蓋へより確実に接触させるためには、開口部の蝶番と対向する部分にＶ字状の切込を形成し、かつ前記開口部に嵌合する蓋に、前記切込と嵌合するΛ字状の突起を形成することが好ましい（図２Ｅの切込３９参照）。Ｖ字状切込部分では、試料液の表面張力により、Ｖ字の先端部分に試料液がにじみ出すので、蓋を閉じると蓋のΛ字状突起の先端ににじみ出ている試料液が接触し易く、送液をより確実に行える。
【００４３】
「Ｖ字状」の切込の形状は、高さが０．２ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、特に０．３ｍｍ以上０．７ｍｍ以下であり、頂角の角度が１５度以上１２０度以下、特に１５度以上から６０度以下である二等辺三角形であることが好ましい。切り込みを入れるための加工が容易であり、また試料液を適切に滲みださせることができるからである。加工状の問題、および強度上の問題がなければ、「Ｖ字状」の切込は、頂角の角度を更に狭くした形状でもよい。
【００４４】
このような切込や突起がない場合でも、本発明の試料液移送路に外力を加えて流路形状を変形させれば、開口部に静止した試料液を下流側にせり出させることができる。液体入りのチューブを押しつぶして、チューブ先端から液体をせり出させるのと同じ原理である。
【００４５】
前記開口部および蓋は、蝶番部分が、前記試料液移送路の移送方向に垂直であって、前記開口部の前記蝶番と対向する部分よりも上流に位置するように設けてもよい。このような構造とした場合、開口部で試料液は停止するが、蝶番を超えて蓋の一部まで試料液がにじみ出す。したがって、蓋と開口部の間に加工に起因する隙間が生じていたとしても、蓋を閉じる際に試料液は扉構造の辺縁部（特に両側）からにじみ出し、下流側の内壁に接触しやすい。そのため下流側への送液を確実にすることができる。ただし、蓋の一部まで試料液がにじみ出すため、試料液を停止させるためには、蓋の開き具合を十分に確保する必要がある。
【００４６】
以上は、前記移送路の壁面の一部に設けられた開口部および当該開口部と嵌合する蓋を用いたキャピラリバルブ効果による移送について説明した。この他、外力によって試料液を移送する場合にも、当該開口部および蓋により送液を制御できる。蓋を開けた状態で外圧により試料液を移送すると、開口部から余分な液は流れ出すので、開口部より下流へ送液できなくなる。そして、蓋を閉じて外圧をかければ、下流への送液が可能となる。
【００４７】
（２）反応領域について
本発明の試料液分析チップは、試料液移送路を形成する内壁面に配置された反応試薬層４を有する。反応試薬層４は、試料液と接触させやすくするため、試料液移送路の底面に配置することが好ましい。反応試薬層とは、試料液中の特定成分の反応を進行させるための試薬を含む固形または半固形（ゲルなど）の部材をいう。試料液中の特定成分とは、分析の主たる対象となる被検知物質である。
【００４８】
反応試薬層に含まれる好ましい試薬の例には、試料液中の特定成分の化学反応を触媒する酵素、同特定成分に特異的に結合する物質等が含まれる。酵素の例には、コレステロールの酸化を触媒するコレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、グルコースの酸化を触媒するグルコースオキシダーゼ、トリグリセリド（中性脂質）の酸化を触媒する、リポ蛋白リパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ等が含まれる。
【００４９】
反応試薬層は、必要に応じて、酵素反応を活性化させる目的で界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤の例には、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルやコール酸ナトリウム塩などが含まれる。さらに、乾燥時の試薬層の表面形状を均一にし、かつ試料液点着時の溶解を迅速にするために、タウリン、マルチトール、カルボキシメチルセルロースなどの水溶液を添加してもよい。また、反応試薬層の例には、上記酵素反応と共に用いることが好ましいフェリシアン化カリウム等の酸化還元反応が可能な試薬が含まれる。
【００５０】
特定成分に特異的に結合する物質とは、化学的あるいは物理的に結合する物質を意味する。この例には抗原に対して特異的な結合能力を有する抗体等が含まれる。抗体には、公知のものを用いることができる。その例には、抗アルブミン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プロスタグランジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホルモン抗体等が含まれる。
【００５１】
さらに抗体を担持した粒子を用いてもよい。抗体を担持させる粒子は任意に選択されるが、その例には、磁性金属粉、Ｆｅ３Ｏ４粒子、γ−Ｆｅ２０３粒子，Ｃｏ−γ−Ｆｅ２０３粒子、ナイロンやポリアクリルアミド等のポリマーとフェライトとの複合微粒子等が含まれる。これらの粒子は公知の方法で調製できる。例えば特許文献２に示すとおりシランカップリング剤等を用いて調整してよい。
【００５２】
反応試薬層は、試料液と接触したときに、確実に溶解、分散、または膨潤するように配
置されることが好ましい。反応試薬層は、例えば、適当な溶媒に試薬を溶解させて得られる試薬溶液を、試料液移送路壁面に滴下し、風乾して固形化して形成できる。
また反応試薬層は、同様にして滴下した試薬溶液を凍結乾燥させ固形化して形成してもよい（凍結乾燥法）。凍結乾燥法により形成される反応試薬層は、滴下した溶液の体積とほぼ同じ体積を有し、内部に空隙を有する。よって、反応試薬層の試料液への溶解が迅速となる。また凍結乾燥法を用いると、風乾の場合よりも乾燥後の残留水分量が少なくなるので、酵素や抗体などの保存安定性が高まる。
【００５３】
上記反応試薬層は例えば円盤状に成形され、その直径は０．２〜１．５ｍｍであることが好ましい。円盤の高さは特に限定されないが、５０μｍ以下であることが好ましい。また反応試薬層が内部に空隙を有する場合には、試料液が反応試薬層でせき止められることがないため、反応試薬層の高さは５０μｍより高くてもよい。本発明において「〜」はその両端の数値を含むことを意味する。
【００５４】
反応試薬層は、複数の部位に設けてもよい。そのとき、反応試薬層を設けた箇所のそれぞれの間には、開口部を設けられることが好ましい。試薬、開口部、検出領域の位置に関しては後述する。図３は、本発明の試料液分析チップの第二の態様を示す図であり、試料液分析チップの分解斜視図である。実際は両端の点線矢印で示すように各部材が組み合わされてチップを構成する。図３中、２ａは試料液分析チップであり、基板１０、天井板１１、スペーサ１２から構成される。４１は第一の反応試薬層、４２は第二の反応試薬層である。３３は第一の開口部、３６は第二の開口部であり、これらに嵌合する蓋３４、３７をそれぞれ備えている。３５は蝶番である。
天井板１１および基板１０に示す一点鎖線直線は、各部材が組み合わされたときに試料液移送路を形成する部分である。開口部３３、３４を基板１０に投影した位置も一点鎖線で示される。
【００５５】
（３）検出領域について
本発明の試料液分析チップは、試料液の物理的あるいは化学的変化を検出するための検出領域５を含む。試料液の物理的変化とは、試料液の性状が変化することを意味する。性状の変化とは、色の変化、液体から固体への状態の変化等を意味する。また、試料液の化学的変化とは、試料液の特定成分が化学的に別の物質に変化することをいう。
【００５６】
検出領域とは試料液の上記変化を検出するのに用いられる部位をいう。つまり、光学的に上記変化を検出しうる検出領域とは、試料液の状態の変化を光学的に認識するための部位である。この場合、検出領域は検出に用いる電磁波（目視の場合は可視光線）を透過させる必要がある。また、電気的に検出する場合は、電極等が形成されているチップ上の部位を意味する。前述の図３においては５で示される領域が該当する。
【００５７】
まず、光学的に上記変化を検出する場合について説明する。光学的に検出するとは、化学的または物理的な変化の挙動を、特定波長の電磁波に対する試料液の吸光度、透過率、または一定領域に含まれる試料液中の固形物の外観的性状により判断することである。光学的に検出するための計測器の例には、吸光度計、画像処理装置等が含まれる。また、肉眼で観測してもよい。
【００５８】
光学的な検出を可能にするためには、チップ全体が透明の材料で形成されていることが好ましい。このような材料の例には、熱可塑性樹脂が含まれ、中でも、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートが好ましい。特に、ポリカーボネートは可視光に対して非常に高い透明性を有するものがある。
【００５９】
次に、電気的に検出する場合について説明する。図５は試料液分析チップの検出領域に
電極を設けた態様を示す図である。電極とは電場をつくるため、または電流を流すために、対にして設ける導体または半導体である。図５において、分割された２つの導体（５１と５４）が一対の電極を形成している。これらの電極を用いて、試料液中の物質または試料液中の物質と反応試薬の化学反応によって生成した物質の酸化反応、または還元反応による電流値が測定される。その測定された電流値から、試料液中の特定の物質の濃度が検出される。このように２以上の分割された導体で形成された電極を、電極対ともいう。
【００６０】
電極対は、試料液移送路の内壁の一部、好ましくは底面に設けられる。本発明における電極は、平面電極とすることが好ましい。平面電極は、例えば、導体を含むペーストの印刷により形成するか、スパッタ法、蒸着法などの公知の方法を用いて形成することができる。また、平面電極は、ポリエチレンテレフタレート等の基板表面に、金、白金、銀、銅、パラジウム、クロム、カーボンなどを薄膜状に蒸着して形成してもよい。ただし導体の材料は、試料液中で電気化学的に反応してイオン化したり、酸化作用や還元作用を受けたりするものでないことが好ましい。
【００６１】
さらに電極対は導線（リード線）を介して外部の端子と接続されていることが好ましい。電気化学測定装置等の外部の装置と接続できるからである。導線の材料には、導体一般を用いることができるが、好ましくは金、白金、銀、銅などである。
電極対の電極の幅は特に限定されないが、０．１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下が好ましく、より好ましくは０．２ｍｍ以上０．４ｍｍ以下である。
【００６２】
（４）反応試薬層、開口部、検出領域の位置について
本発明の試料液分析チップは、図１に示すとおり反応試薬層４、開口部３３、検出領域５が、移送方向の上流からこの順に配置される。移送方向の上流とは、試料液分析チップにおける試料液流入口３１に、より近い位置を意味する。
反応試薬層４、開口部３３、検出領域５を、このように配置すれば、流入した試料液と反応試薬層の混合および反応が、反応領域において十分になされる。反応領域は限られた小さなスペースであるため、試料液と反応試薬の混合および反応が容易に起こる。この後、十分に反応した試料液を検出領域に移送する過程で、さらに試料液は攪拌される。よって試料液はより均一となり、試料液の物理的変化および化学的変化を確実に検出することができる。
即ち、試料液分析チップの反応試薬層４、開口部３３、検出領域５を移送方向の上流からこの順に配置することにより、反応試薬の溶解；試料液と反応試薬との化学反応；検出を、時系列的にも空間的にも、分離して行なうことができる。その結果、試料液の均一性が確保できるので、誤差の少ない検出が可能となる。
【００６３】
例えば、血中の抗原と、当該抗原に対する抗体を担持させた担体粒子とを反応させ、粒子の凝集度合いを測定する抗原の定量においては、抗体担持粒子が反応試薬層４として配置される。本測定においては、吸光度測定などで凝集の度合いを検出するため、試料液中の試薬の濃度はより均一であることが求められる。そこで、図１に示すように反応試薬層４、開口部３３、検出領域５を配置すれば、試料液である血漿が、反応試薬層４の抗体担持粒子と反応領域で充分に混合および反応してから、検出領域５に移動する。そして、検出領域５で粒子の凝集度合いが測定されるため、誤差の少ない測定が可能となる。
【００６４】
また、反応試薬層が複数の部位に配置されている場合には、反応試薬層が配置された部位はそれぞれ、開口部をはさんで設けられることが好ましい。個々の反応試薬との反応が、他の反応試薬の影響を受けることなく行われうるからである。
【００６５】
例えば、血漿中のコレステロール濃度を測定する場合について図４を参照して説明する。診断指針として用いられる血清コレステロール値は、コレステロールとコレステロール
エステルの濃度を合計したものである。コレステロールの測定は、酵素（コレステロールオキシダーゼ：ＣｈＯＤ）を用いて、コレステロールを酸化する方法で測定することが一般的である。しかし、コレステロールエステルはＣｈＯＤによる酸化反応の基質になることができないので、コレステロールエステルをコレステロールに変化させるコレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）を用いる方法が知られている。すなわち血清コレステロール濃度は、二種の酵素を用いて、以下の反応Ａおよび反応Ｂを利用して測定される。
反応Ａ：コレステロールエステル→コレステロール＋脂肪酸（酵素ＣｈＥによる反応）
反応Ｂ：コレステロール＋フェリシアン化イオン→コレステノン＋フェロシアン化イオン（酵素ＣｈＯＤによる反応）
【００６６】
本測定においては、フェリシアン化イオンを主成分とする試薬を第一反応試薬層４１として；ＣｈＯＤおよびＣｈＥを主成分とする試薬を第二反応試薬層４２とすることが好ましい。まず、試料液である血液が、第一反応試薬と混合される。第一反応試薬層のフェリシアン化イオンは、それ単独ではコレステロールまたはコレステロールエステルと反応できないので、第一反応試薬層４１では単に試薬同士が混合される。
【００６７】
次に試料液が、第二反応試薬層４２のＣｈＥ、ＣｈＯＤと混合されると、コレステロールエステルが上記Ａ反応でコレステロールに変化する。コレステロール（元から存在していたコレステロールと、Ａ反応により生じたコレステロール）は、上記Ｂ反応によりコレステノンに酸化されるとともに、これにより生じる電子によりフェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還元される。このときのフェリシアン化イオンの減少量は、酸化反応により減少するコレステロールの量に対応するので、フェリシアン化イオンの減少量を検出領域５で定量すれば、コレステロール濃度を算出することが可能である。
【００６８】
本反応に用いる試薬を総て混合した試薬層を一の部位に配置すると、長期保存によって試薬の劣化が起こる。これを避けるためには、上記のようにそれぞれの試薬を分けて試料液分析チップに配置することが好ましい。
【００６９】
さらに、試薬層を分けて設けることで、反応の順序も制御することができ、より測定の精度を高められる。上記の例において、仮にＣｈＯＤおよびＣｈＥを主成分とする試薬を第一の反応試薬層（上流側）に配置した場合には、試料液は反応試薬と混合されるとすぐに、反応Ｂが開始される。反応Ｂはフェリシアン化物イオンが存在せずとも、試料液中に酸素が存在すれば進行するからである。反応Ｂが開始すると、酸素が還元されて過酸化水素が生成される。その後に第二反応試薬層のフェリシアン化イオンと反応させても、既に酸化反応が開始しているので、フェリシアン化イオンを定量してもコレステロールの濃度は正確に測定できない。
【００７０】
以上から、フェリシアン化カリウムを主成分とする反応試薬層と、ＣｈＯＤおよびＣｈＥを主成分とする反応試薬層を分けて設け、かつ前者を後者よりも上流に配置することで、測定精度を向上させることができる。
【００７１】
（５）感知領域
本発明の試料液分析チップは、前記反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に、試料液の到達または反応試薬層の変化を感知しうる感知領域を有していてもよい。感知領域を設けることにより、より正確な分析を行うことができる。試料液の到達とは、反応試料層に試料液が移送されたことを意味する。反応試薬層の変化とは、試料液と混合されることにより、反応試薬層が溶解あるいは反応すること等を意味する。すなわち感知領域とは、試料液の到達または反応試薬層の変化を、光学的または電気的に感知するための部位を意味する。感知領域は、検出領域と同様に電磁波を透過できる部材で構成されていてもよい。
【００７２】
感知領域は、反応試薬層が配置された部位と同じ部位か、またはその近傍に設けることが好ましく、反応試薬層のやや下流側に設けることがより好ましい。反応試薬層での上記挙動をより確実に観察できるからである。具体的には図４における６で示される位置に設けることが好ましい。図４は、図３の試料液分析チップ２ａを、試料液流入口３１と空気孔３２を結ぶ線で切断し、紙面正面から見た図である。感知領域６はそれぞれ、第一の反応試薬層４１、第二の反応試薬層４２が配置された部位と同一の部位か、それよりやや下流の部位に配置される。
【００７３】
また、感知領域には図５に示すとおり電極が設けられていてもよい。「５１と５２」の感知領域に存在する部分が電極対を形成し、試料液の到達または反応試薬層の変化を電気的に感知する。「５１と５３」の感知領域に存在する部分も同様に機能する。電極は前記検出領域に設ける方法と同様の方法で設けてよい。
【００７４】
以上、本発明の試料液分析チップについて、図１に示す試料液分析チップを例にして説明したが、この他に図６に示すような分析チップとしてもよい。図６は、第三の態様の試料液分析チップを示す図である。図６に示される試料液分析チップは、開口部およびこれに嵌合する蓋３４の蝶番３５は、試料液の移送方向に平行に設けられている。
【００７５】
本発明の試料液分析チップは、試料液流入口３１の上流域に、試料液の流入を容易にするための点着部を設けてもよい。さらに、試料液を血液とする場合には、血球などの固形成分の除去が必要なことがあるので、血球除去用のフィルタを試料液移送路の任意の位置に配置してもよい。
【００７６】
１−２．試料液分析チップ本体と蓋とが別個である態様
【００７７】
本態様の試料液分析チップは、（１）送液制御についてのみ前述のチップと異なり、（２）反応領域、（３）検出領域、および（４）反応試薬層、開口部、検出領域の位置については前述のチップと同様である。また、（１）送液制御についても、開口部に嵌合する蓋が試料液分析チップ本体と別個の部材であること以外は前述のチップと同様である。以下、開口部に嵌合する蓋について主に説明する。
【００７８】
図７は、本態様の試料液分析チップの例を示す図である。試薬、流路等の位置関係は図３と同様であるが、蓋３４、３７が試料液分析チップ２ｂから分離されている点が異なる。図中３００および３０１は、蓋３４、３７の搬送用の保持具である。この保持具３００、３０１は、必要に応じて上下左右に移動して、下端部に保持した蓋３４、３７を開口部３３、３６に嵌合させることができる。保持具が蓋を保持する方法としては、例えば、中空構造の保持具の内部を陰圧にして蓋を吸着させたり、蓋の流路内面を構成する部分以外の部分を常磁性体として、保持具を電磁石としたりすればよい。蓋の特定の部分を常磁性体とする方法としては、例えば、常磁性体粉を含む塗料を塗布したり、常磁性体製の粘着テープを貼り付けたりすればよい。
【００７９】
保持具は、チップが装着される測定装置に組み込まれていてもよい。図７では、測定装置が開口部の数と同数（２つ）の保持具を備える例を示しているが、保持具の数はこれに限定されない。例えば、測定装置は、１つの保持具を移動させて各開口部に蓋を嵌合させてもよい。
【００８０】
また、このように蓋を試料液分析チップと別個のものとする場合、開口部の閉鎖性を向上させ、かつ、移送路内面と蓋の内面との平滑性を向上させるために、図８に示すように、平坦部６０の上（移送路内面側）に天井板１１の厚みと同じ厚みの嵌合部６１を設けて
もよい。この嵌合部６１は、開口部と嵌合した際に移送路内面の一部として機能する。このような形状にすることで、開口部を閉鎖した際に試料液の移送をより確実に再開させることができる。このような蓋を使用する場合、壁面の一部を形成する部分（嵌合部６１）は使い捨て可能であってもよい。
【００８１】
以上のように、本発明の試料液分析チップは、試料液移送路の壁面の一部に開口部が形成されており、前記開口部と嵌合して前記壁面の一部を形成する蓋を有するため、キャピラリバルブ現象などを利用して試料液の移送を制御することができる。
【００８２】
２．本発明の試料液分析チップの製造方法
本発明の試料液分析チップは、発明の効果を損なわない限り任意の方法で製造できるが、以下好ましい製造方法について説明する。
本発明の試料液分析チップは、
ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程
ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程
ｃ）前記基板と前記天井板を、前記基板の両端部にスペーサを介して貼り合わせることにより、両端が開放された試料液移送路を形成する工程
を経て製造できる。これらの順番は特に限定されないが、作業性からは最後にｃ）工程を経ることが好ましい。
【００８３】
ａ）フィルム状基板に反応試薬層を形成する工程は、すでに述べたとおり、試薬を適当な溶媒に溶解させて調製した試薬溶液を基板に滴下し、風乾して固形化することによって行われる。滴下には、ピペットまたはディスペンサを用いることが好ましい。これらを用いて行う場合、１回の滴下量は５０ｎｌ〜５μｌ程度であることが好ましい。特に５０ｎｌ〜１μｌ程度の液滴を滴下する場合にはディスペンサを用いることが好ましい。また、滴下した試薬溶液は乾燥されるがこのときの条件は、５０℃×１０分程度あるいは、２５℃、湿度６０％未満で１５分程度とすればよい。
また、試薬溶液は凍結乾燥してもよい。凍結乾燥は定法で行えるが、例えば以下のようにして行ってよい。まず、基板に試薬溶液を滴下し、直ちに予備凍結する。予備凍結は基板を液体窒素などに浸漬して行うことができる。次に、予備凍結した基板を常圧雰囲気下、−４０℃で放置する。続いて−４０℃にて雰囲気を真空にし、１５分程度放置する。さらに真空状態のまま−４０℃から−１０℃まで２時間かけて昇温し、−１０℃で１時間保持、−１０℃から２５℃まで２時間かけて昇温、２５℃で２時間程度保持する。
【００８４】
試薬を滴下する場所は試料液移送路の内壁となる部位であることが好ましく、より好ましくは、試料液移送路の内壁であって底面となる部位である。
さらに、フィルム状基板の試料液移送路の内壁となる部分を、予め親水化処理してもよい。親水化処理は既に述べたとおり、界面活性剤を壁面に塗布および乾燥することで施すことができる。
【００８５】
ｂ）フィルム状天井板に、開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設ける工程は、任意の方法で行えばよい。例えば、開口部を切り抜いて得た部材を、テープ等で開口部の一部と接着して設けてもよい。また、フィルム状天井板に、蝶番とする部分を除いて切削痕を設け、蝶番とする部分を軸としてフィルムを折り曲げて形成してもよい。加工の容易さからは後者の方法が好ましい。
後者において切断痕を設ける方法は、カッティングプロッタ（グラフテック社製）を用い、切削痕の平面図形を入力し、その形状に対応するようにカッティングプロッタの刃を用いて切削することが好ましい。この他に、腐蝕刃型（ピナクルダイ）やトムソン刃型等の機械的方法を用いてもよいし、また、レーザー照射等によって形成してもよい。
【００８６】
フィルムの切断された部分を、蝶番とする部分を軸として折り曲げるには、ピンセットなどを用いて行えばよい。また、蓋となる部分と嵌合する雄型を設けた金型を準備し、その金型の上に上記フィルムをセットし、プレス加工により行ってもよい。蝶番部分が白化する程度に曲げること、すなわちフィルムが塑性変形するように曲げることが好ましい。折り曲げた後の蓋は、試料液移送路の壁面に対して一定の角度で開いていることが好ましい。この角度は特に限定されないが、蓋を閉じる操作の容易性から２０〜６０度が好ましい。
【００８７】
つづいて前記ａ）工程で反応試薬層が設けられた基板１０と、ｂ）工程で開口部３３、３６および蓋３４、３７が設けられた天井板１１を、スペーサ１２を介して貼り合わせる。スペーサは試料液移送路３を形成できるように図に示すとおりチップの両端に配置することが好ましい。
基板１０と天井板１１の貼り合わせは、接着剤による接着や、熱プレスによる接着によって行えばよい。加工容易性から接着剤を用いて貼り合わせることが好ましい。接着剤は、アクリル樹脂系など公知の接着剤を用いればよい。
【００８８】
また、図６に示すタイプの試料液分析チップは、一枚のフィルムに、反応試薬層を形成し、かつ開口部および当該開口部と嵌合する蓋を設けて；そのフィルムを巻くようにしてフィルム端同士を接着して、製造されうる。
【００８９】
３．本発明の試料液分析チップを用いた分析方法
図９を参照して二つの反応試薬層を有する試料液分析チップを例に、分析方法を説明する。図９は、試料液分析チップを用いた分析方法の一例を示す図であり、図９において７は試料液である。
まず、試料液７の移送方向に対して、第一の反応試薬層４１の下流に隣接する蓋３４を開口したまま、試料液を試料液流入口３１から分析チップに導入する（図９Ａ）。試料液７は、開口部３３より下流には浸入できない。試料液７は、試料液流入口３１と開口部３３の最上流部分（上流端）との間に形成される反応領域において、第一の反応試薬層４１と混合され、反応する。例えば、試料液７が血液で、第一の反応試薬層４１がフェリシアン化カリウムを主成分とする場合、この反応領域で血液とフェリシアン化カリウムが混合される。
【００９０】
試料液７と第一反応試薬層４１の試薬との混合が十分になされた後に、蓋３７を開放した状態で蓋３４を閉じる。試料液７は、開口部３６まで移送され、第二の反応試薬層４２と混合され、反応がおこる（図９Ｂ）。第二の反応試薬層がＣｈＥ、ＣｈＯＤを主成分とする場合、試料液中のコレステロールエステルがＣｈＥによりコレステロールに変化し、変化したコレステロールと、もとから存在したコレステロールが、ＣｈＯＤによりコレステノンに酸化される。そして、試料液中に存在するフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。
【００９１】
当該反応が十分に進行した後に、蓋３７を閉じると試料液は検出領域５に移送され、化学的または物理的変化が検出される（図９Ｃ）。検出は、例えば、目視で色の変化を観察し、予め作成しておいた色見本と比較して行えばよい。また検出は、検出領域５に設けられた電極にパルス電圧を印可して、フェロシアン化カリウムのフェリシアン化カリウムへの酸化電流を測定してもよい。フェロシアン化カリウムの定量ができれば、血中コレステロール濃度が定量できる。
【００９２】
上記蓋は、試験者がピンセット等を用いて直接押して閉じてもよいが、その他に外力を付与する機構を付与してもよい。例えば、可動な棒状構造体を蓋に押し当てて閉じてもよい。あるいは蝶番と平行な軸を有するローラー状構造体を、扉構造の蝶番部部分から先端
境界部まで転がして閉じてもよい。
【００９３】
血中のコレステロールを測定する方法を例に説明したが、他の測定も同様に行うことができる。さらに、第一、第二の反応試薬層へ試料液が送液されたかどうか、試薬と混合されたかどうかを、前記反応試薬層の近傍に感知領域を設けて確認しながら測定を行ってもよい。例えば、感知領域を特定の電磁波に対して透明な部材で形成した場合は、目視または光学的な変化（特定の電磁波の透過度の変化）を観察することで確認できる。また、当該場所に電極を設けて電位の変化を測定してもよい。
【実施例】
【００９４】
［実施例１］図３に示すコレステロールセンサ
厚み０．１ｍｍ；長さ５ｍｍ；幅３ｍｍのポリカーボネート製の天井板を準備した。グラフテック社製カッティングプロッタに切削痕の平面図形を入力し、図２Ａおよび図２Ｅに示される形状の切削痕を、準備した天井板に形成した。形成した切削部を、図３に示されたように折り曲げて、蓋（３４および３７）とし、開口部（３３および３６）を形成した。蝶番部（３５および３８）が白化するように折り曲げて、蓋が開いたままになるようにした。試料液流入口３１から第一の開口部３３の蝶番３５までの距離を１ｍｍに；第二の開口部３６の蝶番部３８から空気孔３２までの距離も１ｍｍとした。
【００９５】
試料液移送路の幅を０．８ｍｍに、蓋３４および蓋３７の幅を０．８ｍｍとした。蓋３４の蝶番を、開口部３３の蝶番に対向する部分よりも上流に配置した。蓋３７の蝶番を、開口部３６の蝶番と対向する部分よりも下流に配置した。蓋３７には、頂角が３０°、高さが０．３ｍｍの二等辺三角形の突起を設け、開口部３６にもこれに嵌合する同形状の切込を設けた。
【００９６】
一方、厚みが０．１ｍｍ、長さが５ｍｍ、幅が３ｍｍのポリカーボネート製の基板を準備した。当該基板の試料液移送路を形成する部位に、反応試薬層４１および４２を、以下のとおりに形成した。
【００９７】
＜反応試薬層４１＞
７０ミリモル／ｌのフェリシアン化カリウム；０．０５ｗｔ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；タウリン１．３３ｗｔ％；マルチトール０．１ｗｔ％を含む混合水溶液を調製した。基板上の試料液移送路となる部位であって、試料液流入口３１と第一の開口部に設けられた蝶番３７の中間地点に、調製した混合水溶液の０．２μｌを滴下した。滴下した溶液を、室温２５℃中の実験室内で乾燥固化させた。この滴下および乾燥の工程を１０回繰り返して、反応試薬層を形成した。当該試薬層は、試料液流入口３１と蝶番３５の中間地点を中心とする、直径約０．８ｍｍの円盤状となり、試料液移送路内に収められた。一方、混合水溶液の２．０μｌを一度に滴下した場合は、液滴が拡がりすぎて、試薬層４１の直径を０．８ｍｍ以内に収めることができなかった。
【００９８】
＜反応試薬層４２＞
ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）由来のコレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯＤ）を０．７５キロユニット／ｍｌ（約２．３４ｗｔ％）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のコレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）を２キロユニット／ｍｌ（約１．１ｗｔ％）；およびコレステロールエステラーゼの反応を活性化させる作用を有する界面活性剤であるポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を０．５ｗｔ％；界面活性剤であるコール酸ナトリウム塩を７５ミリモル／ｌ；タウリン１ｗｔ％；マルチトール０．２５ｗｔ％；ＣＭＣ０．２ｗｔ％を水に溶解させた混合溶液を調製した。次に、基板上の試料液移送路となる部位であって、第一の開口部３３の下流端と第二の開口部３６の上流端の中間地点に、当該混合溶液の０．２μｌを滴下
し、試薬層４１と同様にして室内で乾燥させた。この操作を１回のみ行なうことで、直径が０．８ｍｍの円盤状の反応試薬層４２を形成した。
本実施例ではフェリシアン化カリウムを主成分とする反応試薬層４１を、ＣｈＯＤ、ＣｈＥを主成分とする反応試薬層４２よりも、上流側に設けた。
【００９９】
厚み７５μｍ；長さ５ｍｍ；幅１．１ｍｍのＰＥＴフィルムを用意した。当該ＰＥＴフィルムの上面および底面に、厚み１２．５μｍのアクリル系接着剤を塗布し、総厚みを１００μｍとした両面粘着剤ＰＥＴフィルムを調製して、スペーサとした。当該スペーサを前記基板と天井板の間に挟みこみ、これらを貼り合せることでコレステロールセンサ用試料液分析チップを作製した。
【０１００】
このようにして作製したチップに、試料液として血漿を供給した。樹脂板片に１μｌの血漿を滴下して血漿液滴を形成し、形成された血漿液滴に、チップの試料液流入口３１に接触させた。血漿は、試料液移送路３に流入した。まず流入した血漿が、開口部３３の手前の蝶番３５の位置で静止したことが、感知領域６を目視観察することにより確認された。作製した試料液分析チップは、すべての部材が透明部材であるため、視認性に優れていた。
【０１０１】
試薬層４１が血漿に溶解したことを確認した後に、蓋３４を外部からピンセットで押し込んで蓋３４を閉じた。その結果、血漿が反応試薬層４２部分まで到達し、さらに開口部３６の上流端で静止した。このときの様子を、感知領域６を目視観察することにより確認した。さらに、開口部３６のＶ字状の切込部分では、血漿が僅かににじみ出ていることも確認できた。
【０１０２】
反応試薬層４２が血漿に溶解して、その輪郭がぼやけたことを確認してから、蓋３７を閉じた。その結果、血漿は空気孔３２に到達して静止した。
この間、チップの試料液流入口３１に血漿液滴を接触させ続けて、試料液流入口３１から新たな血漿を供給し続けた。
【０１０３】
血漿が空気孔３２に到達してから２分経過後に、検出領域５に存在する血漿の色を観察した。同時に、所定の濃度のコレステロールを反応させたときの色を記録した色見本と比較して、コレステロール濃度を算出した。
【０１０４】
［実施例２］図５に示すコレステロールセンサ
実施例１と同様にして、図５に示すような基板、天井板、スペーサを準備した。天井板はＰＥＴ製とした。さらに基板１に、図５に示すとおりの４系統の電極を形成した。これらの電極は、基板１０にステンレス製のマスクパターンを被せて、スパッタ装置内で、パラジウムの皮膜を形成して作製された。基板は、幅を天井と同じとして、長さを７．５ｍｍとして、天井板よりも長くした。そのため、スペーサと貼り合せたときには、基板は空気孔３２側から２．５ｍｍはみ出した。
【０１０５】
前記はみ出し部分の下流端から１．５ｍｍまでの領域に、端子（５１０〜５４０）を設置して外部との接続部とした。当該接続部における端子の幅は、それぞれ０．５ｍｍとした。当該接続部における前記端子同士の間隔は０．２ｍｍとした。端子５１０〜５４０は、紙面手前より、５１０、５４０、５２０、５３０の順に設けた。
【０１０６】
前記接続部に設置された端子５１０を始点として、反応試薬層４１が設けられている領域を終点とする線状の導体（リード線５１）を基板上に設けた。リード線５１は、試料液移送路３よりも紙面手前の領域に、試料液移送路３に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して
垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）；平行直線部から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に分岐した部分を２つ（「第一の分岐リード部」および「第二の分岐リード部」ともいう）を有する。
【０１０７】
平行直線部の幅は０．３ｍｍとした。垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入させた。また、第一の分岐リード部は、反応試薬層４２が設けられている部位に到達しており、第二の分岐リード部は検出領域に到達している。第一および第二の分岐リード部のいずれも、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入させた。分岐リード部の幅は０．３ｍｍとした。
【０１０８】
前記接続部に設置された端子５２０を始点として、反応試薬層４１が設けられている領域を終点とする線状の導体（リード線５２）を基板上に設けた。リード線５２は、試料液移送路３よりも紙面奥の領域に、試料液移送路３に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）を有する。リード線の幅は０．３ｍｍとした。また、垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入している。
【０１０９】
前記外部接続部に設置された端子５３０を始点とし、反応試薬層４２が設けられている部位と同じ部位を終点とする線状の導体（リード線５３）を基板上に設けた。リード線５３は、試料液移送路３よりも紙面奥であって、リード線５２よりも紙面手前の領域に、試料液移送路に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）；平行直線部の下流端と端子５３０を接続するための直線部を有する。平行直線部の下流端は、天井板１１の下流端より、やや下流側であって、端子５２０には接触しない位置とした。リード線の幅は０．３ｍｍとした。また、垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．３ｍｍ進入している。
【０１１０】
前記外部接続部に設置された端子５４０を始点とし、検出領域が設けられている部位と同じ部位を終点とする線状の導体（リード線５４）を基板上に設けた。リード線５４は、試料液移送路３よりも紙面奥であって、リード線５３よりも紙面手前の領域に、試料液移送路に平行に配置された部分（「平行直線部」ともいう）；平行直線部の上流端から試料液移送路３に向かって、送液方向に対して垂直方向に延びた部分（「垂直直線部」ともいう）；平行直線部の下流端と端子５４０を接続するための直線部を有する。平行直線部の下流端は、天井板１１の下流端より、やや下流側であって、端子５３０には接触しない位置とした。リード線の幅は０．５ｍｍとした。また、垂直直線部は、その一部が試料液移送路３の領域内に延びており、０．５ｍｍ進入している。
【０１１１】
上記導体は、それぞれが対になり電極対を形成する。本実施例においては、「端子５１０と端子５２０」および「端子５１０と端子５３０」からなる電極対は、試料液移送中に試料液が到達したかどうかを電気抵抗値の変化により感知するために用いた。また、「端子５１０と端子５４０」からなる電極対は、試料液が検出領域まで到達した後に、試料液の電気化学的変化を測定するために用いた。
【０１１２】
このようにして作製した試料液分析チップに、実施例１と同様の方法で血漿を点着した。点着前から、端子５１０と端子５２０との間の抵抗値の測定を開始した。血漿が第一の開口部３３の上流端に到達したときに、抵抗値が急激に低下したことを確認した。直ちに、端子５１０と端子５２０の間の抵抗値の測定を終了し、同時に端子５１０と端子５３０との間の抵抗値の測定を開始した。
【０１１３】
端子５１０と端子５２０との間の抵抗値の低下を確認してから、反応試薬層４１の溶解と拡散に要すると思われる時間として１０秒間待機した。その後、実施例１と同様の方法で蓋３４を閉じた。蓋３４を閉じた後、数秒後に端子５１０と端子５３０の間の抵抗値の低下が確認された。直ちに端子５１０と端子５３０の間の抵抗値の測定を終了し、同時に端子５１０と端子５４０の間の抵抗値の測定を開始した。
【０１１４】
端子５１０と端子５３０の間の抵抗値の低下を確認してから、血漿に反応試薬層４２が溶解し拡散するのに要すると思われる時間として１０秒間待機した。その後、実施例１と同様の方法で蓋３７を閉じた。蓋３７を閉じた後、数秒後に端子５１０と端子５４０の間の抵抗値の低下が確認された。直ちに、端子５１０と端子５４０の間の抵抗値の測定を終了した。そのままコレステロールの酸化反応の進行に必要と思われる時間として２分間待機した。その後、端子５１０を基準にして端子５４０に対しアノード方向へ＋０．４Ｖのパルス電圧を印加し、３秒後の電流値を測定した。測定された電流値は、総コレステロール濃度に依存した応答性を示した。
【０１１５】
［実施例３］蝶番位置の検討
実施例２と同様にしてコレステロールセンサを作製した。ただし、第一、第二の開口部および蓋の構造を入れ替えた。すなわち第一の蓋３４を、蝶番３５の位置が開口部３３の上流端よりも下流になるように設けた。蓋３４には、頂角が３０°、高さが０．３ｍｍの二等辺三角形の突起を設け、開口部３３にもこれに嵌合する同形状の切込を設けた。
第二の蓋３７を、蝶番の位置が開口部３６の下流端よりも上流になるように設けた。蓋３７は、突起を設けない長方形とした。開口部３６もこれに嵌合する長方形とした。同形状の切込を設けた。
【０１１６】
また、実施例２における第一の蓋３４を、形状は同じ四角形の蓋であり、かつ蝶番を移送路と平行な一辺とする蓋とした試料液分析チップを調製し、実施例２と同様の実験を行った。その結果、概ね良好な移送制御が可能であることを確認した。
【０１１７】
［実施例４］蓋形状の検討
実施例２における第一の蓋３４を、図２Ｂ、図２Ｃまたは図２Ｄに示される形状の蓋とした試料液分析チップを調製した。図２Ｂ、図２Ｃの形状の蓋は、実施例１と同様にして形成した。図２Ｄの形状の蓋は、実施例１と同様に、蝶番の幅が０．８ｍｍである蓋を形成し、さらに当該蝶番を両端から０．１ｍｍずつ切削して形成した。
このようにして調製した試料液分析チップを用い、実施例２と同様にして測定試験を行ったところ、実施例２と同様の移送制御が可能であることを確認した。
【０１１８】
図２Ｃの形状の蓋の形成の加工容易性は、図２Ａの形状の蓋を形成する場合の加工容易性と大差なかった。図２Ｂの形状の蓋の形成は、図２Ａの形状の蓋を形成するよりも、蝶番を折り曲げる作業が容易であった。図２Ｄの形状の蓋の形成は、蝶番部での折り曲げ作業が容易であり、かつ分析時に蓋を閉じる工程も容易であった。
【０１１９】
本出願は、２００７年４月５日出願の特願２００７−０９９６９３に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明の試料液分析チップは、簡易な構造でありながら、チップ内で試料の迅速かつ確実な分析が可能である。このため血液成分測定装置等、ＰＯＣＴ用の分析装置として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】試料液分析チップの第一の態様を示す斜視図
【図２】試料液移送路に設けられる蓋と蝶番の構造を示す図
【図３】試料液分析チップの第二の態様を示す分解斜視図
【図４】図３に示す試料液分析チップを試料液移送路で切断した断面図
【図５】電極を有する試料液分析チップを示す分解斜視図
【図６】試料液分析チップの第三の態様を示す斜視図
【図７】試料液分析チップの第四の態様を示す斜視図
【図８】試料液分析チップの蓋の例を示す図
【図９】試料液分析チップを用いた分析方法を示す図
【符号の説明】
【０１２２】
１，２ａ，２ｂ  試料液分析チップ
１０  基板
１１  天井板
１２  スペーサ
３  試料液移送路
３１  試料液流入口
３２  空気孔
３３，３６  開口部
３４，３７  蓋
３５，３８  蝶番
３９  切欠
３００，３１０  保持具
４  反応試薬層
４１  第一の反応試薬層
４２  第二の反応試薬層
５  検出領域
５１，５２，５３，５４  導体
５１０，５２０，５３０，５４０  端子
６  試料液の流入等を検出する感知領域
６０  平坦部
６１  嵌合部
７  試料液
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2008126403.tif 000019
【図９】
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【国際調査報告】
2008126403.tif 000021
2008126403.tif 000022