【手続補正書】
【提出日】平成15年5月8日(2003.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮型紫外損傷エンドヌクレアーゼ（Ｕｖｅ１ｐ）をコードする部分を含む天然に存在しない核酸分子であって、該短縮型Ｕｖｅ１ｐは、配列番号２に示される３２９位と４７９位との間から伸長し、配列番号２のアミノ酸８２８を通じて伸長するアミノ酸配列により特徴付けられる、天然に存在しない核酸分子。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸３３０〜８２８に示されるアミノ酸配列により特徴付けられる安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐをコードする、請求項１に記載の天然に存在しない核酸分子。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸４５８〜８２８に示されるアミノ酸配列により特徴付けられる安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐをコードする、請求項１に記載の天然に存在しない核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸５１８〜８２８に示されるアミノ酸配列により特徴付けられる安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐをコードする、請求項１に記載の天然に存在しない核酸分子。
【請求項５】
安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐをコードする、請求項３に記載の天然に存在しない核酸分子であって、該安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、天然に存在しない核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子がベクター分子である、請求項１に記載の天然に存在しない核酸分子。
【請求項７】
実質的に精製された安定な短縮型ＵＶ損傷エンドヌクレアーゼ（Ｕｖｅ１ｐ）であって、ここで該Ｕｖｅ１ｐは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、ここでそのアミノ末端は、およそアミノ酸３２９とおよそアミノ酸４７９との間であり、そして配列番号２のアミノ酸８２８を通して伸長する、実質的に精製された安定な短縮型ＵＶ損傷エンドヌクレアーゼ（Ｕｖｅ１ｐ）。
【請求項８】
アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸４５８〜アミノ酸８２８に示される、請求項７に記載の実質的に精製された安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐ。
【請求項９】
アミノ末端で共有結合した、配列番号８に示されるアミノ酸配列により同定されるポリペプチド部分をさらに含む、請求項８に記載の実質的に精製された安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐ。
【請求項１０】
請求項７に記載の実質的に精製された安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１１】
前記短縮型Ｕｖｅ１ｐが配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ヒトまたは動物の皮膚への局所適用のために処方された、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒトまたは動物における内部使用のために処方された、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
ゆがんだ構造により特徴付けられる二本鎖ＤＮＡ分子の切断のための方法であって、ここで該ゆがんだ構造は、ヌクレオチドの紫外線照射損傷、光生成物、無塩基部位、ミスマッチのヌクレオチド対合、白金二付加物、インターカレート化分子、またはアルキル化により生じ、該方法は、ゆがんだ構造により特徴付けられたＤＮＡ分子を以下：
配列番号２のアミノ酸４５８〜８２８に示されるアミノ酸配列により同定されるエンドヌクレアーゼ；配列番号６に示されるアミノ酸配列により同定される安定な短縮型Ｕｖｅ１ｐ；配列番号３６に示されるアミノ酸配列により同定されるエンドヌクレアーゼ；配列番号３７に示されるアミノ酸配列により同定されるエンドヌクレアーゼ；配列番号３８に示されるアミノ酸配列により同定されるエンドヌクレアーゼ；配列番号３９に示されるアミノ酸配列により同定されるエンドヌクレアーゼからなる群より選択された広範に特異的なＤＮＡ損傷エンドヌクレアーゼと、該エンドヌクレアーゼの酵素活性を可能にする条件下で接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記短縮型Ｕｖｅ１ｐが配列番号４または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
（発明の要旨）
精製された安定なＵＶＤＥ（Ｕｖｅ１ｐ）である、高いレベルの活性を保持するポリペプチドフラグメント（特にＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅの酵素由来のもの）を提供することが本発明の目的である。特定の実施態様では、このポリペプチドフラグメントは、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｕｖｅ１＋遺伝子産物のＮ末端領域の２２８アミノ酸欠失を含むΔ２２８−ＵＶＤＥである；第２の特定の実施態様は、融合タンパク質ＧＳＴ−Δ２８８−ＵＶＤＥである。Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＧＳＴ完全長ＵＶＤＥをコードするＤＮＡ配列は、配列番号１に示される。完全長ＧＳＴ−ＵＶＤＥの推定アミノ酸配列は、配列番号２に示される。Δ２２８−ＵＶＤＥをコードするＤＮＡ配列は、配列番号３に示される。Δ２２８−ＵＶＤＥの推定アミノ酸配列は、配列番号４に示される。ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥのＤＮＡコード配列および推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６に示される。短縮型ＵＶＤＥタンパク質もまた本発明に包含される。ここでこの短縮は配列番号２に関して約１００位〜約２５０位であり、そして短縮型タンパク質は、実質的に純粋な形態で安定である。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
Ｓ．ｐｏｍｂｅから単離されたＵｖｅ１ｐは、ＵＶ光生成物のすぐ５’側の単一のＡＴＰ依存性切り出し事象を触媒し、そして３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基を含む末端を生成すると最初に記載された（Ｂｏｗｍａｎら［１９９４］Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３０２６−３０３２）。精製されたＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、Δ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、ならびに組換えＧ−Ｕｖｅ１ｐおよび組換えＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐの粗細胞溶解産物は、天然タンパク質について観察されるのと同様にＣＰＤのすぐ５’側に切り込みを生じる。この研究では、本発明者らは、５’末端および３’末端の両方で標識された二重鎖ＣＰＤ−３０マー（ｃｓ−ＣＰＤ−３０マー）を用いて、Ｕｖｅ１ｐが、２つの部位で基質を含有するＣＰＤを切断する能力を実証した（図６Ａ〜図６Ｂ）。一次産物（矢印ａ）は、形成され、そして損傷のすぐ５’側の切断によってもたらされる総産物の約９０％を占める。この第２の切り込み部位は、１ヌクレオチド上流に位置し、そして切断産物を生じた（矢印ｂ）。この切断産物は、形成される産物の残りの１０％を表した。この副産物は、５’末端標識基質または３’末端標識基質のいずれが調べられるかに依存して、一次産物よりも１ヌクレオチド短いかまたは長い。同じ切断パターンが、用いられた各々の異なるＵｖｅ１ｐ調製物において観察された：すなわち、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを発現する細胞の粗抽出物、親和性精製されたＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ、およびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（それぞれ、図２Ａおよび図２Ｂ、レーン２、３、および４）、ならびにＧＳＴ−Ｕｖｅ１ｐを発現する細胞の抽出物。切断産物は、ｃｓ−ＣＰＤ−３０マー基質が緩衝液のみまたは精製されたＵｖｅ１ｐタンパク質と同じ様式で調製およびアフィニティー精製された精製組換えＧＳＴとともにインキュベートされる場合、観察されなかった（それぞれ、図６Ａ、図６Ｂ、レーン１およびレーン５）。このコントロールは、これらのＤＮＡ鎖切断産物が、微量の非特異的エンドヌクレアーゼ混入の存在の結果として形成される可能性を排除する。Ｕｖｅ１ｐは、二重鎖ｃｓ−ＣＰＤ含有オリゴヌクレオチド基質を認識し、そしてこの基質を２つの部位で切断する。９０％の産物を担う主な部位は損傷のすぐ５’側であり、そして２番目の部位（産物の残りの１０％を占める）は損傷部位の５’側１ヌクレオチドである。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
【表１３】
2002517214.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１Ｃは、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの精製および活性を示す。過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＹ１５０細胞からのＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥを、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。図１Ａは、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥの精製を示す。タンパク質を、銀染色した１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で可視化した。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー（サイズを→に示す）。レーン１：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの過剰発現細胞の粗抽出物からの０．５／ｇの可溶性タンパク質（カラムにロードした）。レーン２：アフィニティーカラムフロースルーからの０．５μｇの結合していないタンパク質。レーン３：カラム洗浄画分からの１．０μｇの結合していないタンパク質。レーン４−８：総タンパク質５ｎｇ、１５ｎｇ、６５ｎｇ、５５ｎｇおよび３５ｎｇにそれぞれ対応するグルタチオンを用いて溶出したアフィニティーカラムに結合したタンパク質からのカラム画分の等量(２０μＬ）ロード。図１Ｂは、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥをグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに再適用し、カラム上でトロンビン切断を行ってＧＳＴタグを除去した後のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(銀染した１２％ゲル）を例示する。レーンＭ：タンパク質分子量マーカーサイズを左に示す）。レーン１：１００ｎｇのＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(カラムロード）。レーン２：２５０ｎｇのトロンビン参照マーカー。レーン３：トロンビン切断後にカラムから溶出された２５０ｎｇのΔ２２８−ＵＶＤＥ。レーン４：トロンビン切断およびグルタチオンを用いた溶出の後にアフィニティーカラムに結合したままの４００ｎｇ(総タンパク質）のＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびＧＳＴ。矢印は、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(Ａ、６８．７  ｋＤａ）、Δ２２８−ＵＶＤＥ(Ｂ、４１．２  ｋＤａ）、トロンビン(Ｃ、３７  ｋＤａ）、およびＧＳＴ(Ｄ、２７．５  ｋＤａ）の位置を示す．図１Ｃは、ＣＰＤ３０マーに対するＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥおよびΔ２２８−ＵＶＤＥの調製物の活性を示す。ＣＰＤ−３０マーを、ＵＶＤＥの以下の調製物とともにインキュベートした：ベクター単独(レーン１）、ＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(レーン２）、ＦＬ−ＵＶＤＥ(レーン３）、アフィニティー精製したＧＳＴ単独(レーン４）、アフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(レーン５）およびアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ(レーン６）を含む過剰発現細胞の粗抽出物。ＣＰＤ部位のすぐ５’側のＣＰＤ−３０マーのＵＶＤＥ媒介性のＤＮＡ鎖切断に対応するオリゴヌクレオチド切断産物(１４マー）を、ＤＮＡ配列決定ゲル上で分析し、そしてオートラジオグラフィーおよびホスホルイメジャー分析に供した。
【図２】
図２は、ＵＶＤＥ活性に対する塩濃度の効果を示す。末端標識したＣＰＤ−３０マーにおけるＤＮＡ鎖切断アッセイを、１５０ｎｇのアフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(白丸）または４０ｎｇのアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ（黒丸）を、ｐＨ７．５および種々の濃度のＮａＣｌで、それ以外は標準的な反応条件下で２０分間行った(材料および方法）。ＤＮＡ鎖切断の程度を、ゲルのホスホルイメジャー分析で決定した。酵素活性を１００ｍＭ  ＮａＣｌで観察された切断されたＣＰＤ−３０マー（１００％と規定する）に対して、切断されたＣＰＤ−３０マーの百分率として表現する。
【図３】
図３は、ＵＶＤＥ活性に対するｐＨの効果を例示する。末端標識したＣＰＤ−３０マーに対するＤＮＡ鎖切断アッセイを、１５０ｎｇのアフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(白丸）または４０ｎｇのアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ(黒丸）を用いて、種々のｐＨ条件下で、それ以外は標準的な反応条件下で２０分間行った（本明細書に記載されるように）。ＤＮＡ鎖切断の程度を、ホスホルイメジャー分析から決定し、そして酵素活性をｐＨ６．５で観察された切断されたＣＰＤ−３０マー（１００％と規定する）に対して、切断されたＣＰＤ−３０マーの百分率として表現する。
【図４】
図４は、ＵＶＤＥ活性の温度依存性を示す。末端標識したＣＰＤ−３０マーに対するＤＮＡ鎖切断アッセイを、１５０ｎｇのアフィニティー精製したＧＳＴ−Δ２２８−ＵＶＤＥ(白丸）または４０ｎｇのアフィニティー精製したΔ２２８−ＵＶＤＥ(黒丸）を用いて、示された温度で、それ以外は標準的な反応条件下で２０分間行った（本明細書において以下の実施例を参照のこと）。ＤＮＡ鎖切断の程度を、ホスホルイメジャー分析から決定し、そして酵素活性を３０℃で観察された切断されたＣＰＤ−３０マー（１００％と規定する）に対して、切断されたＣＰＤ−３０マーの百分率として表現する。
【図５】
図５Ａ−５Ｂは、精製したΔ２２８−ＵＶＤＥによって切断されたＣＰＤ−３０マー切断の反応速度論的分析を例示する。Δ２２８−ＵＶＤＥ(５ｎＭ）を、漸増量の５’末端標識したＣＰＤ−３０マーと反応させ、そしてＤＮＡ鎖切断について、実施例に記載されるように分析した。図５Ａは、３つの別個の実験からの平均標準偏差を用いた反応速度(速度）対基質濃度のプロットである。示した曲線は、平均したデータのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ等式に最適合させた。図５Ｂは、反応速度データのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。
【図６】
図６Ａ−６Ｂは、基質を含むＣＰＤのＵｖｅ１ｐ切断の部位を示す。種々のＵｖｅ１ｐ調整物を、５’または３’を末端標識した (＊）ｃｓ−ＣＰＤ−３０マーと共にインキュベートした。ｃｓ−ＣＰＤ−３０マーのＵｖｅ１ｐ媒介性の鎖切断に対応する切断産物を、ＤＮＡ配列決定型のゲル上で可視化した。図６Ａ：５’末端標識したｃｓ−ＣＰＤ−３０マー二重鎖を、緩衝液単独(レーン１）、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを過剰発現する細胞の抽出物(５μｇ）（レーン２）、アフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン３）およびアフィニティー精製したΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(各々５０ｎｇ）(レーン４）ならびにアフィニティー精製したＧＳＴ単独（２μｇ）(レーン５）とともインキュベートした。図６Ｂ：３’末端標識したｃｓ−ＣＰＤ−３０マー二重鎖を、同じＵｖｅ１ｐ調製物とともにインキュベートした。レーンの順序は、図６Ａについてと同じである。矢印はａおよびｂは、一次切断部位および二次切断部位を示す。ｃｓ−ＣＰＤ−３０マーの部分を含む光生成物(Ｔ＾ＴはＣＰＤに対応する）を、この図の下に示す。単純化のために、相補鎖を示さない。
【図７】
図７Ａ−７Ｄは、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐが１２の異なる塩基ミスマッチの組合せを認識することを示す。３’末端標識したオリゴのシリーズＸ／Ｙ−３１マー（配列を下に示し、アスタリスクは、標識された鎖および標識された末端を示す）を利用して、１６の異なる塩基対および塩基誤対合の組合せについてＵｖｅ１ｐ切断活性を評価した。（表１Ｂ）。数字で示したレーンの上にアスタリスクで示される塩基誤対合は、精製されたＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（奇数レーン）または偽反応（偶数レーン）で処理した、Ｇシリーズ（図７Ａ）、Ａシリーズ（図７Ｂ）、Ｃシリーズ（図７Ｃ）およびＴシリーズ（図７Ｄ）について標識された鎖における塩基を示す。反応産物を、ＤＮＡ配列決定型のゲルで分析した。矢印は、そのミスマッチ部位の５’側直ぐ（矢印ａ）、１ヌクレオチド（矢印ｂ）および２ヌクレオチド（矢印ｃ）のＵｖｅ１ｐ切断部位を示す。ＧおよびＣ＋Ｔの塩基特異的化学切断ＤＮＡ配列決定ラダーを、ヌクレオチド位置マーカーとして、隣接するレーンにおいて流した。
【図８】
図８Ａ−８Ｅは、ビピリミジンＵＶ誘導光生成物に対するＵｖｅ１ｐ活性を示す。Ｕｖｅ１ｐが広範囲のＵＶ誘導光生成物を認識し得るか否かを決定するために、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン１）およびＧ−Ｕｖｅ１ｐ(レーン２）(各々５μｇ）、ならびにアフィニティー精製したΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン３）およびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン４）(各５０ｎｇ）を発現する細胞由来の粗抽出物を、以下の５’末端標識(＊）二重鎖オリゴヌクレオチド基質：(図８Ａ）ｃｓ−ＣＰＤ−４９マー、(図８Ｂ）６−４ＰＰ−４９マー、(図８Ｃ）ｔｓＩ−ＣＰＤ−４９マー、(図８Ｄ）ｔｓＩＩ−ＣＰＤ−４９マー、および(図８Ｅ）Ｄｅｗａｒ−４９ｍｅｒとともにインキュベートした。この配列の部分を含むＵＶ光生成物（Ｔ＾Ｔ）を、図の下に示す。矢印ａおよびｂは、Ｕｖｅ１ｐ媒介性切断によって形成された主な生成物および微量生成物を示す。矢印ｕｃは、切断されていない基質を示す。相補鎖の配列を省略する。
【図９】
図９は、白金−ＤＮＡ  ＧＧ二付加物含有基質に対するＵｖｅ１ｐ活性を示す。アフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン４）およびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(１−２μｇ）(レーン５）を、５’末端標識した二重鎖(＊）Ｐｔ−Ｇｇ−３２マーとともにインキュベートした。この基質もまた、緩衝液単独(レーン２）、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ(１５０単位(Ｐｒｏｍｅｇａ））(レーン３）およびアフィニティー精製したＧＳＴ(２、Ｌｇ）(レーン６）とともにインキュベートした。ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔのオリゴヌクレオチド配列決定(レーン１）を行って、切断部位を同定した。矢印ｃおよびｄは、それぞれ、主な切断部位および少数の切断部位を示す。基質の部分を含む白金−ＤＮＡ  ＧＧ二付加物を、この図の下に示す。相補鎖の配列を省略する。
【図１０】
図１０Ａは、Ｕｖｅ１ｐによる、ＡＰ部位を含むオリゴヌクレオチド基質の切断を示す。加水分解様式でＵｖｅ１ｐが無塩基部位を切断し得るか否かを調べるために、本発明者らは、５’末端標識した(＊）無塩基基質ＡＰ−３７マーを調製し、そしてこの基質と、緩衝液単独（レーン１）、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩ(ＡＰリアーゼ、レーン２）、アフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐおよびΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(各々２μｇ）(レーン３および４）、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを過剰発現する細胞の抽出物(５μｇ）(レーン５）、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ(加水分解性ＡＰエンドヌクレアーゼ、レーン６）および精製した組換えＧＳＴ(２μｇ）(レーン７）とともにインキュベートした。図１０Ｂは、ＡＰ部位認識および切断の競合的阻害を実証する。精製された産物が、ＡＰ部位でのＵｖｅ１ｐ媒介性切断の結果であることを実証するために、ＡＰ−３７マーを、緩衝液単独(レーン１）、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶ(レーン２）、およびアフィニティー精製したＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(２μｇ）(レーン３）と、１０×および４０×の標識していないｃｓ−ＣＰＤ−３０マー(それぞれ、レーン４および５）ならびに１０×および４０×の標識していないＵＤ−３７マー(それぞれ、レーン６および７）とともに、インキュベートした。矢印ａおよびｂは、それぞれ、一次および二次のＵｖｅ１ｐ媒介性切断産物を示す。矢印ｕｃは、切断されていない基質を示す。ＡＰ基質の配列の一部を、この図の下に示す。Ｓは、デオキシリボースに対応し、そしてｐは、ホスフェートに対応する。エンドヌクレアーゼＩＩＩ(ＥＩＩＩ）およびエンドヌクレアーゼＩＶ(ＥＩＶ）の切断部位の位置もまた示す。単純化のために、相補鎖を図から省略した。
【図１１】
図１１Ａ−１１Ｂは、全長Ｕｖｅ１ｐのＵｖｅ１ｐ生成ＤＮＡ鎖切断産物および活性を特徴付ける。図１１Ａ：＊ＣＸ／ＡＹ−３ｌマーを用いた、Ｕｖｅ１ｐ生成されたＤＮＡ切断産物の５'末端の分析。Ｃ／Ａミスマッチを有する３’末端標識したオリゴ (配列を下に示す）を、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐと反応させ、次いで、さらに、（＋）および（−）のレーンで示すようにＰＮＫまたはＣＩＰで処理した。レーン１は、緩衝液のみで処理した。矢印ａおよびｂは、Ｕｖｅ１ｐ切断の部位を示す。図１１Ｂ：全長Ｕｖｅ１ｐは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する。５’末端標識した二重鎖＊ＣＸ／ＡＹ−３ｌマーを、全長のＧＳＴ−タグ化Ｕｖｅ１ｐ(ＧＦＬ−Ｕｖｅ１ｐ）(レーン１）、短縮型Ｕｖｅ１ｐ(ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ）（レーン２）を過剰発現する細胞、ＧＳＴタグ単独 (レーン３）を発現する細胞の粗抽出物またはＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（これは、公知のミスマッチエンドヌクレアーゼ）(レーン４）のいずれかとともにインキュベートした。矢印は、ミスマッチ部位の５’側の直ぐ (矢印ａ）および１ヌクレオチドの切断部位を示す。矢印Ｖは、ミスマッチ部位の３’側のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ切断を示し、そしてこれを、位置の参照として使用した。矢印の下のバンド(アスタリスクで示す）は、Ｕｖｅ１ｐ調製物に存在する弱い５’から３’エキソヌクレアーゼ活性に起因して短縮された生成物に対応する。
【図１２】
図１２は、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐミスマッチエンドヌクレアーゼおよびＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐＵＶ光生成物エンドヌクレアーゼが、同じ基質について競合することを示す。ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐを、３’−末端標識した二重鎖＊ＣＸ／ＡＹ−３ｌマー（表１）とともに、漸増量の標識されていない二重鎖ＣＰＤ−３０マー(四角）または二重鎖ＧＸ／ＣＹ−３１マー(三角）または二重鎖ＣＸ／ＡＹ−３１マー(丸）の存在下でインキュベートした。Ｕｖｅ１ｐ媒介性のＤＮＡ切断産物を、ＤＮＡ配列分析のためのゲル上で分析し、そして鎖切断の程度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ホスホルイメジャー）分析で定量した。Ｕｖｅ１ｐ活性を、任意の競合因子の非存在下で観察された切断(１００％活性として規定）と比較して観察された切断の百分率として表現する。誤差バーは、３つの別個に実験からの平均標準偏差を示す。
【図１３】
図１３Ａ−１３Ｂは、Ｕｖｅ１ｐが塩基ミスマッチを含む二重鎖の一方の鎖のみを切断することを示す。図１３Ａは、制限酵素ＤｄｅＩ(レーン１）、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ(レーン２）、または緩衝液(レーン３）とインキュベートされた３’−末端標識した＊ＣＸ／ＡＹ−４１マーを示す。この反応生成物をＤＮＡ二本鎖分解産物（矢印ｄｓｂ）について、以下に記載するように非変性ゲル上で分析した。矢印ｂおよびｃは、この基質に対するＵｖｅ１ｐについての一次切断部位を示す。図１３Ｂは、ＧΔ２２８−Ｕｖｅ１ｐ（＋レーン）または緩衝液(−レーン）と共にインキュベートされ、そして変性ＤＮＡ配列決定型ゲル上で分析された３’末端標識した＊ＣＸ／ＡＹ−４１マーまたはＣＸ／＊ＡＹ−４１マーを示す。矢印ｂおよびｃは、ミスマッチ塩基（アスタリスク）位置に比して、主要なＵｖｅ１ｐ切断事象の位置を示す。Ｇ＋ＡおよびＣ＋Ｔの塩基特異的な配列決定ラダーを、ヌクレオチド位置マーカーとしてレーンの外側に包含させる。