(57)【要約】  本発明によれば、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組換え体DNA、該組換え体DNAで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたペプチドの製造法、およびペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたペプチドの製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１］請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選ばれるいずれか１つで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選ばれるいずれか１つで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項５】
形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項８】
微生物がバチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
バチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物が、それぞれバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、ヘルペトシホン・オウランティアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、ストレプトコッカス・ニウモニエ（Streptococcus pneumoniae）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）からなる群より選ばれる種に属する微生物である請求項８記載の製造法。
【請求項１０】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項７記載の製造法。
【請求項１１】
請求項１に記載の蛋白質、アミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる1種以上の基質、ならびにアデノシン−５´−三リン酸（以下、ATPと略す）を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体中から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
【請求項１２】
請求項１に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物ならびにアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる１種以上の基質を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体中から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
【請求項１３】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項１２記載の製造法。
【請求項１４】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物である請求項１２記載の製造法。
【請求項１５】
バチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物が、それぞれバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、ヘルペトシホン・オウランティアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、ストレプトコッカス・ニウモニエ（Streptococcus pneumoniae）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）からなる群より選ばれる種に属する微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項１６】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１２〜１５記載の製造法。
【請求項１７】
ペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる少なくとも１種以上の基質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にペプチドを生成、蓄積させ、該培地からペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
【請求項１８】
ペプチド合成活性を有する蛋白質が、請求項１に記載の蛋白質である、請求項１７の製造法。
【請求項１９】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる少なくとも1種以上の基質を生産する能力を有する微生物が請求項４〜６のいずれか１項に記載の形質転換体である、請求項１８記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、ペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたペプチドの製造法、ペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生物または形質転換体を用いたペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素法によるペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法（非特許文献１参照）、耐熱性アミノアシルt-RNA合成酵素を利用する方法 （特許文献１〜４参照）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、NRPS と称す）を利用する方法（非特許文献２、３および特許文献５、６参照）が知られている。
L-アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるペプチド生成が知られている蛋白質としては、バチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素（特許文献７参照）、ストレプトマイセス・アルボラス（Streptomyces albulus）由来のジケトピペラジン合成酵素（特許文献８参照）およびラルストニア・ソラナセラム（Ralstonia solanacearum）由来の蛋白質（特許文献９参照）が知られている。【０００３】
しかしながら、上記酵素による生成物はジペプチドのみであるため、該酵素とは異なる新たなジペプチドより長い鎖長のペプチドを合成する酵素が求められている。
現在、50残基以上の長鎖のペプチドに関しては、ＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が用いられるが、それより短いペプチドの合成に関しては効率的な製法でない。またエンペドバクター属の細菌由来の新規ペプチド生成酵素を用いたペプチド製造法（特許文献１０参照）も報告されている。しかしこの場合、ペプチド結合形成のために、N末端側に伸長するアミノ酸成分は、エステル化体またはアミド化体といった誘導体化した物を用いる必要があり、遊離のアミノ酸からの合成はできない。【０００４】
バチルス・サチルスATCC6633がペプチド抗菌物質であるリゾクチシンA(L-Arg-L-2-amino-5-phosphono-3-cis-pentenoic acid、L-Arg-L-APPA)、リゾクチシンB(L-Val-L-Arg-L-APPA)、リゾクチシンC(L-Ile-L-Arg-L-APPA)、リゾクチシンD(L-Leu-L-Arg-L-APPA)を生産することは知られている（非特許文献４参照）。しかしながら、生合成の経路、生合成に関わる蛋白質、生合成に関わる遺伝子は知られていない。【０００５】
バチルス・リケニホルミスのBL02410（GenBank Accession No. AAU21844）、ヘルペトシホン・オウランティアクスのHaurDRAFT_4222（GenBank Accession No. EAU19320）、ストレプトコッカス・ニウモニエのspr0969（GenBank Accession No. AAK99773）、クロモバクテリウム・ビオラセウムのCV0806（GenBank Accession No. AAQ58482）およびまたはビフィドバクテリウム・アドレスセンティスのBAD1200（GenBank Accession No. YP_910063）については、タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は知られているが、その機能に関する情報はない。
【特許文献１】特開昭58-146539号公報
【特許文献２】特開昭58-209991号公報
【特許文献３】特開昭58-209992号公報
【特許文献４】特開昭59-106298号公報
【特許文献５】米国特許第5795738号
【特許文献６】米国特許第5652116号
【特許文献７】国際公開第2004/058960号パンフレット
【特許文献８】国際公開第2005/103260号パンフレット
【特許文献９】国際公開第2006/101023号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第2004/011652号パンフレット
【非特許文献１】J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)
【非特許文献２】Chem. Biol., 7, 373-384 (2000)
【非特許文献３】FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)
【非特許文献４】Arch. Microbiol., 153, 276-281 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、該ペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたペプチドの製造法、および該ペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（１９）に関する。
（１）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質
（２）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１］（１）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選ばれるいずれか１つで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選ばれるいずれか１つで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）（２）記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（４）（３）記載の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
（５）形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である（４）記載の形質転換体。
（６）微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物である（５）記載の形質転換体。
（７）（１）記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する（１）記載の蛋白質の製造法。
（８）微生物がバチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物である（７）記載の製造法。
（９）バチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物が、それぞれバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、ヘルペトシホン・オウランティアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、ストレプトコッカス・ニウモニエ（Streptococcus pneumoniae）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）からなる群より選ばれる種に属する微生物である（８）記載の製造法。
（１０）（１）記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が（４）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体である、（７）記載の製造法。
（１１）（１）に記載の蛋白質、アミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる1種以上の基質、ならびにアデノシン−５´−三リン酸（以下、ATPと略す）を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体中から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
（１２）（１）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物ならびにアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる１種以上の基質を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体中から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
（１３）（１）記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が（４）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体である、（１２）記載の製造法。
（１４）（１）記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物である（１２）記載の製造法。
（１５）バチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物が、それぞれバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、ヘルペトシホン・オウランティアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、ストレプトコッカス・ニウモニエ（Streptococcus pneumoniae）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）およびビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）からなる群より選ばれる種に属する微生物である（１４）記載の製造法。
（１６）培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、（１２）〜（１５）記載の製造法。
（１７）ペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる少なくとも１種以上の基質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にペプチドを生成、蓄積させ、該培地からペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
（１８）ペプチド合成活性を有する蛋白質が、（１）に記載の蛋白質である、（１７）の製造法。
（１９）（１）記載の蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる少なくとも1種以上の基質を生産する能力を有する微生物が（４）〜（６）のいずれか１つに記載の形質転換体である、（１８）記載の製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によりペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いてペプチドを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選ばれるいずれか１つで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質
をあげることができる。【００１０】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００１１】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号２、４、６、８、１０および１２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００１２】
また、アミノ酸の欠失、置換または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２、４、６、８、１０または１２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００１３】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がペプチド合成活性を有するためには、配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。【００１４】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。【００１５】
また、配列番号２、４、６、８、１０および１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。アミノ酸配列の相同性は、上記したようにBLASTやFASTAを用いて決定することができる。【００１６】
本発明においてペプチド合成活性とは、アミノ酸、アミノ酸誘導体またはこれらからなるペプチドなどを基質とし、アデノシン−５´−三リン酸（以下、ATPと略す）を利用してジペプチド以上の長さを有するペプチドを生成する活性をいい、好ましくはL-アミノ酸、グリシンもしくはカルボキシル基に修飾基を持たないL-アミノ酸誘導体をL-アミノ酸、グリシンもしくはL-アミノ酸誘導体またはL-アミノ酸、グリシンもしくはL-アミノ酸誘導体からなるペプチドのＮ末端に結合する反応を1回以上繰り返すことによりジペプチド以上の長さを有するペプチドを生成する活性をいう。【００１７】
本発明の蛋白質が、ペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、アミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる1種以上の基質、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、
［１］請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選ばれるいずれか１つで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選ばれるいずれか１つで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。【００１８】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いられるＤＮＡとしては少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。【００１９】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。【００２０】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mmol/Lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/Lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/Lの塩化ナトリウム、0.2mol/Lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/LのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００２１】
ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより、上記した様々な条件を設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加には、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記した［１］〜［３］いずれかのＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００２２】
塩基配列の相同性は、上記したBLASTまたはFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、並びに１種以上のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。
３．本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体
本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体としては、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物および形質転換体であれば特に限定されないが、該微生物としては、好ましくはバチルス（Bacillus）属、ヘルペトシホン（Herpetosiphon）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属またはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に属する微生物、好ましくはバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、ヘルペトシホン・オウランティアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、ストレプトコッカス・ニウモニエ（Streptococcus pneumoniae）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）またはビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）に属する微生物、より好ましくはバチルス・サチルス ATCC6633およびバチルス・リケニホルミスATCC14580、ストレプトコッカス・ニウモニエ ATCC BAA-255、ヘルペトシホン・オウランティアクス ATCC 23779、クロモバクテリウム・ビオラセウム NBRC 12614、またはビフィドバクテリウム・アドレスセンティスJCM1275をあげることができ、該形質転換体としては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体をあげることができる。【００２３】
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体としては、上記２のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができ、宿主細胞としては、細菌等の原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、より好ましくは細菌等の原核生物、さらに好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物をあげることができる。
４．本発明のＤＮＡの調製
本発明のDNAは、配列番号１、３、５、７、９または１１のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブやプライマーを用い、バチルス属、ヘルペトシホン属、ストレプトコッカス属、クロモバクテリウム属またはビフィドバクテリウム属に属する微生物などの、本発明のDNAを染色体上に有する微生物の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションや本発明のDNAを染色体上に有する微生物の染色体を用いたPCR等の手法により取得することができる。【００２４】
例えば、配列番号１で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用い、バチルス（Bacillus）属に属する微生物、好ましくはバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）に属する微生物、より好ましくはバチルス・サチルスATCC6633の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、または例えば配列番号１で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用い、微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物、より好ましくはバチルス・サチルスに属する微生物、さらに好ましくはバチルス・サチルスATCC6633の染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。【００２５】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体DNA、cDNAライブラリー等から上記した方法により本発明のDNA、または本発明の製造法に用いられるDNAを取得することもできる。【００２６】
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。【００２７】
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。【００２８】
上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するDNAをあげることができる。
本発明のDNAを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００２９】
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。【００３０】
組換え体DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号１で表される塩基配列を有するDNAを含有する組換え体DNAを保有する微生物であるエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/ pRBSをあげることができる。
５．本発明の製造法に用いられる形質転換体および微生物の製造法
本発明のDNAをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。【００３１】
該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌等の原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。【００３２】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００３３】
発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pHelix1（いずれもロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48,669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。【００３４】
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００３５】
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
また、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。【００３６】
本発明のDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体DNAとしては、例えばpBsRzをあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum） ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.）ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができる。【００３７】
組換え体DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。【００３８】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
酵母としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイミセス（Schwanniomyces）属、ピチア（Pichia）属、または、キャンディダ（Candida）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）等をあげることができる。【００３９】
組換え体DNAの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチウム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。【００４０】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００４１】
動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはナマルバ KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。【００４２】
組換え体DNAの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 84, 7413 (1987)]、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。【００４３】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。【００４４】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。【００４５】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。【００４６】
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Bombyx mori） N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等をあげることができる。【００４７】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００４８】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる方法（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。
６．本発明の蛋白質の製造法
上記５の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００４９】
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。【００５０】
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００５１】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００５２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜11に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００５３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００５４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle）のMEM培地[Science, 122, 501 (1952)]、DMEM培地[Virology, 8, 396 (1959)]、199培地[Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【００５５】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace's Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。  
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。【００５６】
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００５７】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。【００５８】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００５９】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００６０】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００６１】
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法[Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996)、Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭63-309192）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。【００６２】
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法[組織培養, 20(1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離、精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。【００６３】
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００６４】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００６５】
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００６６】
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００６７】
また、本発明の蛋白質をFlagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。【００６８】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、アプライドバイオシステムズ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明のペプチドの製造法
上記３の微生物または４の形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記１の本発明の蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、アミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる1種以上の基質を水性媒体中に存在せしめ、ペプチドを生成、蓄積させ、該媒体中から該ペプチドを採取することにより、ペプチドを製造することができる。
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、用いる1種以上の基質としては、L-アミノ酸、Glyおよびβ−アラニン（β-Ala）からなる群より選ばれるアミノ酸、該アミノ酸の誘導体または該アミノ酸または誘導体よりなるペプチドであれば、いずれの基質をいずれの組み合わせで用いてもよい。【００６９】
Ｌ−アミノ酸としては、例えばL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-シトルリン（L-Cit）、L-オルニチン(L-Orn)、L-4-ヒドロキシプロリン（L-4-HYP）、L-3-ヒドロキシプロリン（L-3-HYP）、L-α-アミノ酪酸（L-α-AB）、L-6-diazo-5-oxo-norleucine（L-DON）、L-アザセリン（L-Azaserine）およびL-テアニン（L-Theanine）をあげることができる。【００７０】
アミノ酸誘導体としては、上記L-アミノ酸、Glyおよびβ-Alaのメチルエステル化合物、エチルエステル化合物などのエステル化合物、アミド化合物およびヒドロキサメート等の誘導体化合物をあげることができる。  
ペプチドとしてはL-アミノ酸、Glyまたはβ-Alaが任意の組み合わせでα-ペプチド結合により連結したペプチドをあげることができる。【００７１】
また上記ペプチドの製造法において、L-アミノ酸、Gly、β-Alaからなる群から選ばれる1種以上のアミノ酸または該アミノ酸の誘導体がL-αペプチド結合で連結したペプチドを基質として用いることができる。
基質として用いるペプチドとしては、好ましくは、L-アミノ酸およびGlyより選ばれる１種以上のアミノ酸が２〜１０個結合したペプチド、より好ましくはL-アミノ酸およびGlyより選ばれる１種以上のアミノ酸が２〜５個結合したペプチド、さらに好ましくは1種のL-アミノ酸またはGlyが２〜５個結合したペプチドおよびL-アミノ酸またはGlyから選ばれる2種のアミノ酸が結合したジペプチドをあげることができる。【００７２】
上記製造法に用いられる基質としては、好ましくはL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Ala、ならびに該アミノ酸のメチルエステル化合物および該アミノ酸のヒドロキサメートからなる群より選ばれる1種のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、あるいは2種以上のアミノ酸またはアミノ酸誘導体の組み合わせをあげることができ、より好ましい基質としては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaならびに該アミノ酸のメチルエステル化合物および該アミノ酸のヒドロキサメートからなる群より選ばれるアミノ酸またはアミノ酸誘導体のうち、1種または２種のアミノ酸あるいは１種のアミノ酸と1種のアミノ酸誘導体との組み合わせをあげることができる。【００７３】
さらに好ましくは、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Ser、L-Cys、L-Lys、L-Pro、L-Trp、L-Phe、L-Ala、L-Asp、L-Tyr、L-Asn、L-Arg、L-Thr、L-HisおよびGlyからなる群より選ばれる1種または2種のアミノ酸、あるいはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Ser、L-Cys、L-Lys、L-Pro、L-Trp、L-Phe、L-Ala、L-Asp、L-Tyr、L-Asn、L-Arg、L-Thr、L-HisおよびGlyからなる群より選ばれる1種のアミノ酸と、L-アルギニンヒドロキサメート（L-ArgHx）、L-バリンメチルエステル（L-ValOMe）、L-LeuOMe、L-IleOMeおよびL-PheOMeからなる群より選ばれる1種のアミノ酸誘導体との組み合わせをあげることができる。【００７４】
特に好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いた場合はA群、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いた場合はB群、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いた場合はC群、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いた場合はD群、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いた場合はE群または配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いた場合はF群より選ばれる1種の基質または2種の基質の組み合わせをあげることができる。【００７５】
A群：L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、これらのL-アミノ酸が結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、これらのL-アミノ酸が２〜５個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-Arg、L-ProおよびL-Phe、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸のヒドロキシアミン化合物およびメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-IleおよびL-Met、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにL-ArgHx、L-ValOMeおよびL-PheOMe
B群：L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、これらのL-アミノ酸が結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、これらのL-アミノ酸が２〜５個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-Arg、L-ProおよびL-Phe、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸のヒドロキシアミン化合物およびメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-IleおよびL-Met、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにL-ArgHx
C群：L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、およびL-His、これらのL-アミノ酸が結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、およびL-His、これらのL-アミノ酸が２〜５個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、およびL-His、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸の誘導体、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-PheおよびL-Arg、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸のヒドロキシアミン化合物およびメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Trp、L-PheおよびL-Arg、これらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチドならびにL-ArgHx
D群：L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、L-His、L-Pro、L-Ser、Gly、L-Thr、L-AlaおよびL-Asn、これらのL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、L-His、L-Pro、L-Ser、Gly、L-Thr、L-AlaおよびL-Asn、これらのL-アミノ酸またはGlyが２〜５個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、L-His、L-Pro、L-Ser、Gly、L-Thr、L-AlaおよびL-Asn、これらのL-アミノ酸またはGlyが２または３個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Pro、L-Ser、Gly、L-AlaおよびL-Asn、これらのL-アミノ酸またはGlyが２または３個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyのヒドロキシアミン化合物およびメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Pro、L-Ser、Gly、L-AlaおよびL-Asn、これらのL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドならびにL-ArgHx、L-LeuOMeおよびL-PheOMe
E群：L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-AsnおよびGly、これらのL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-AsnおよびGly、これらのL-アミノ酸またはGlyが２〜５個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-AsnおよびGly、これらのL-アミノ酸またはGlyが２または３個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-Ser、L-Thr、L-AsnおよびGly、これらのL-アミノ酸またはGlyが２または３個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyのヒドロキシアミン化合物およびメチルエステル化合物、特に好ましくは、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Trp、L-Tyr、L-Ala、L-Ser、L-AsnおよびGly、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyが２または３個結合してなるペプチド
F群：L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、Gly、L-Thr、L-Arg、L-HisおよびL-Lys、これらのL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、Gly、L-Thr、L-Arg、L-HisおよびL-Lys、これらのL-アミノ酸またはGlyが２〜５個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、Gly、L-Thr、L-Arg、L-HisおよびL-Lys、これらのL-アミノ酸またはGlyが２または３個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyの誘導体、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、Gly、L-Thr、L-Arg、L-HisおよびL-Lys、これらのL-アミノ酸またはGlyが２または３個結合してなるペプチド、ならびにこれらのL-アミノ酸またはGlyのヒドロキシアミン化合物およびメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、L-Thr、L-ArgおよびL-HisこれらのL-アミノ酸が２または３個結合してなるペプチド、ならびにL-PheOMeおよびL-LeuOMe
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。【００７６】
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源として用いるATPは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。【００７７】
ペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
上記方法で製造されるペプチドを構成するアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドとしては、例えば上記製造法に基質として用いるアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドをあげることができる。【００７８】
また、上記の方法で製造されるペプチドの構成成分としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は好ましくは上記Ａ群、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は好ましくは上記Ｂ群、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は好ましくは上記Ｃ群、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は好ましくは上記Ｄ群、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は好ましくは上記Ｅ群および配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は好ましくは上記Ｆ群より選ばれる基質または該基質のアミノ酸誘導体をあげることができる。【００７９】
上記方法で製造されるペプチドの長さとしては、アミノ酸およびアミノ酸誘導体より選ばれる1種以上の基質が２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜８個、さらに好ましくは２〜６個ペプチド結合で結合したペプチドをあげることができる。
上記方法で製造されるペプチドとしては、アミノ酸およびアミノ酸誘導体より選ばれる1種以上の基質がペプチド結合で結合したペプチド、好ましくはL-アミノ酸およびGlyより選ばれる1種以上のアミノ酸がペプチド結合で結合したペプチド、または該ペプチドのC末端にアミノ酸誘導体が結合したペプチド、より好ましくはL-アミノ酸およびGlyより選ばれる1種のアミノ酸がペプチド結合で結合したペプチド、または該ペプチドのC末端にアミノ酸誘導体が結合したペプチドをあげることができる。【００８０】
また、上記の方法で製造されるペプチドとしては、
i）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trpより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドまたは該ペプチドの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trpより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-Arg、L-ProおよびL-Pheより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-ArgおよびL-Pheより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、
ii）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-Arg、L-His 、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、より選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドまたは該ペプチドの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-Arg、L-His 、L-Pro、L-Phe、L-TyrおよびL-Trp、より選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Lys、L-ProおよびL-Argより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-MetおよびL-Argより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドならびに該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、
iii）配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、およびL-Hisより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドまたは該ペプチドの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、およびL-Hisより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-PheおよびL-Argより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Trp、L-PheおよびL-Argより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、
iv）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、L-His、L-Pro、L-Ser、L-Thr、L-AlaおよびL-Asnより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Lys、L-His、L-Pro、L-Ser、L-Thr、L-AlaおよびL-Asnより選ばれる1種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Pro、L-Ser、L-AlaおよびL-Asnより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Arg、L-Pro、L-Ser、L-AlaおよびL-Asnより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、
v）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-Ser、L-ThrおよびL-Asnより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-Ser、L-ThrおよびL-Asnより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-SerおよびL-Asnより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Ala、L-SerおよびL-Asnより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、
vi）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を酵素源として用いる場合は、好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、L-Thr、L-Arg、L-HisおよびL-Lysより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドの誘導体、より好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、L-Thr、L-Arg、L-HisおよびL-Lysより選ばれる１種以上のL-アミノ酸またはGlyが結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、さらに好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、L-Thr、L-ArgおよびL-Hisより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、特に好ましくはL-Val、L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Cys、L-Trp、L-Phe、L-Tyr、L-Asp、L-Ser、L-Thr、L-ArgおよびL-Hisより選ばれる１種以上のL-アミノ酸が結合してなるペプチドあるいは該ペプチドのヒドロキシアミン化合物またはメチルエステル化合物、
をあげることができる。
（２）微生物もしくは形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いるペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養物としては、該微生物または形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものなどをあげることができる。【００８１】
微生物もしくは形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（１）と同様のアミノ酸またはその誘導体をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。【００８２】
基質として用いるアミノ酸またはその誘導体は、上記（１）と同じように水性媒体中に添加することができる。
上記（１）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、ＡＴＰまたは形質転換体もしくは微生物が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。【００８３】
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
また上記製造法においては、必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ガラクトース含有複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常0. 1〜50 g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられる。【００８４】
ペプチドの生成反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるペプチドとしては、上記（１）と同様のペプチドをあげることができる。
（３）ペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる少なくとも１種以上の基質を生産する能力を有する微生物を用いたペプチドの製造法
ペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる少なくとも１種以上の基質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中にペプチドを生成、蓄積させ、該培地からペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法もまた、本発明の製造法である。【００８５】
ペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる少なくとも１種以上の基質を生産する能力を有する微生物としては、例えば本発明のペプチドの製造法において基質となるアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドを生産する能力を有する微生物、好ましくはL-アミノ酸もしくはGlyまたはペプチド、より好ましくはL-アミノ酸またはGlyを生産する能力を有する微生物を本発明のDNAで形質転換して得られる微生物をあげることができる。【００８６】
アミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドを生産する能力を有する微生物としては、自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所望の基質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
公知の方法により、微生物にアミノ酸を生産する能力を人為的に付与する方法としては、
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独で又は組み合わせて用いることができる。【００８７】
上記（ａ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに、上記（ｂ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに、上記（ｃ）については、例えばAppl. Microbiol.Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに、上記（ｄ）については、例えばAppl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに、上記（ｅ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００８８】
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、または組み合わせた方法によるアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996)  section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００８９】
アミノ酸を生産する微生物の具体例としては、Ｌ−グルタミン生産株としてエシェリヒア・コリ JGLE1およびエシェリヒア・コリ JGLBE1など、Ｌ−アラニン生産株としてald遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ JM101株など、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてpPHEA2および／またはaroF 遺伝子発現プラスミドを保有するエシェリヒア・コリ JM101株など、Ｌ−グルタミンおよびＬ−アラニン生産株としてald遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリJGLE1およびエシェリヒア・コリ JGLBE1など、Ｌ−アラニンおよびＬ−フェニルアラニン生産株としてald遺伝子発現プラスミドおよび脱感作型pheA遺伝子および／または脱感作型aroF遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ JM101など、Ｌ−スレオニンおよびＬ−フェニルアラニン生産株として脱感作型pheA遺伝子および／または脱感作型aroF遺伝子発現プラスミドを保持するATCC21277株などをあげることができる。【００９０】
さらに、アミノ酸を生産する能力を有する微生物の具体的例としては、Ｌ−グルタミン酸生産株としてFERM BP-5807およびATCC13032など、Ｌ−グルタミン生産株としてFERM P-4806およびATCC14751など、Ｌ−スレオニン生産株としてATCC21148、ATCC21277およびATCC21650など、Ｌ−リジン生産株としてFERM P-5084およびATCC13286など、Ｌ−メチオニン生産株としてFERM P-5479、VKPM B-2175およびATCC21608など、Ｌ−イソロイシン生産株としてFERM BP-3757およびATCC14310など、Ｌ−バリン生産株としてATCC13005およびATCC19561など、Ｌ−ロイシン生産株としてFERM BP-4704およびATCC21302など、Ｌ−アラニン生産株としてFERM BP-4121およびATCC15108など、Ｌ−セリン生産株としてATCC21523およびFERM BP-6576など、Ｌ−プロリン生産株としてFERM BP-2807およびATCC19224など、Ｌ−アルギニン生産株としてFERM P-5616およびATCC21831など、Ｌ−オルニチン生産株としてATCC13232など、Ｌ−ヒスチジン生産株としてFERM BP-6674およびATCC21607など、Ｌ−トリプトファン生産株としてDSM10118、DSM10121、DSM10123およびFERM BP-1777など、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてATCC13281およびATCC21669など、Ｌ−チロシン生産株としてATCC21652など、Ｌ−システイン生産株としてW3110/pHC34(特表2003-511086記載)など、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン生産株としてWO96/27669記載のエシェリヒア・コリSOLR/pRH71など、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン生産株としてFERM BP-5026およびFERM BP-5409など、Ｌ−シトルリン生産株としてFERM P-5643およびFERM P-1645などをあげることができる。【００９１】
なお、上記のFERM番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本）、ATCC番号で表される菌株は、American Type Culture Collection（米国）、VKPM番号で表される菌株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms（ロシア）、DSM番号で表される菌株はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ドイツ）からそれぞれ入手することができる。【００９２】
ペプチドを生産する能力を有する微生物としては、例えばWO2006/001379に記載のジペプチドを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
上記のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドを生産する能力を有する微生物を本発明のDNAで形質転換する方法としては、上記５の本発明の形質転換体の製造法と同様の方法をあげることができる。【００９３】
上記のようにして得られるペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する能力を有し、かつアミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドより選ばれる１種以上の基質を生産する能力を有する微生物の培養は、上記６に記載の方法と同様に行うことができる。
上記（１）から（３）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により行うことができる。【００９４】
以下に本発明の実施例を示すが、実施例中で用いているエシェリヒア・コリJPNDABPOPepT1株は、下記の方法で作製した。
エシェリヒア・コリJM101株の染色体ＤＮＡ上のpepD遺伝子、pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子、pepT遺伝子、dppオペロンおよびoppオペロンが欠損した菌株を、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645（2000）］に従って作製した。【００９５】
プラスミドpKD46、pKD3およびpCP20は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
（１）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
pepD遺伝子の欠損に用いるＤＮＡ断片の増幅には配列番号２７および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、pepN遺伝子の欠損に用いるＤＮＡ断片の増幅には配列番号２９および３０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、pepA遺伝子の欠損に用いるＤＮＡ断片の増幅には配列番号３１および３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとし、pepB遺伝子の欠損に用いるＤＮＡ断片の増幅には配列番号３３および３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、pepT遺伝子の欠損に用いるＤＮＡ断片の増幅には配列番号３５および３６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、dppオペロンの欠損に用いるＤＮＡ断片の増幅には配列番号３７および３８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ならびに、oppオペロンの欠損に用いるＤＮＡ断片の増幅には配列番号３９および４０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、pKD3を鋳型として、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲは10ngのpKD3、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5units のPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×１０緩衝液、200μmol/L の各deoxyNTPを含む40μLの反応液を用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。【００９６】
それぞれの反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃で30分間放置した。該溶液を遠心分離し、pepD遺伝子、pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子、pepT遺伝子、dppオペロンおよびoppオペロン欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片を取得した。
（２）pepD遺伝子欠損エシェリヒア・コリJM101の作製
エシェリヒア・コリJM101株をプラスミドpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で培養することでpKD46を保持するエシェリヒア・コリJM101株（以下、エシェリヒア・コリ JM101/pKD46と称す）を選択した。【００９７】
10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリ JM101/pKD46に、電気パルス法により上記（１）で取得したpepD遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を導入した後、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で一晩培養した。クロラムフェニコール耐性を指標に、大腸菌JM101の染色体ＤＮＡ上にpepD遺伝子欠損用ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を選択した。【００９８】
選択したクロラムフェニコール耐性株を、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地及び100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にそれぞれ植菌し、37℃で培養した。    
クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択することにより、pKD46脱落株を取得した。【００９９】
次に、上記で得られたpKD46脱落株を、pCP20を用いて形質転換し、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上でアンピシリン耐性株を選択することにより、pCP20を保持するpKD46脱落株を取得した。
上記で取得したpCP20保有pKD46脱落株を薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地および100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にそれぞれ植菌し、30℃で培養した後、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。【０１００】
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを常法に従って調製した。
得られた染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号４１および４２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記（１）と同様の組成の反応液を調製して、同様の反応サイクルにより、ＰＣＲを行った。
その結果、増幅ＤＮＡ断片が検出されなかった株をpepD遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリJPD1株と名づけた。
（３）エシェリヒア・コリJM101の染色体ＤＮＡ上のpepD遺伝子、pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子、pepT遺伝子、dppオペロンおよびoppオペロンが欠損した株の作製
エシェリヒア・コリJM101株の染色体ＤＮＡ上のpepD遺伝子、pepN遺伝子、pepA遺伝子、pepB遺伝子、pepT遺伝子、dppオペロンおよびoppオペロンが欠損した株は、上記（２）で得られたエシェリヒア・コリJPD1株と、上記（１）で得たpepN、pepA、 pepB、pepT、 dppオペロンおよびoppオペロンの各遺伝子欠損用DNA断片をもとに上記（２）と同様の方法を繰り返すことにより作製した。【０１０１】
上記方法により各々の遺伝子が欠損したことは、各々の欠損遺伝子の内部塩基配列に基づき設計、合成した配列番号４３〜５４で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、上記（２）と同様のＰＣＲにより確認した。ここで、配列番号４３および４４で表される塩基配列からなるＤＮＡはpepN遺伝子欠損確認用、配列番号４５および４６で表される塩基配列からなるＤＮＡはpepA遺伝子欠損確認用、配列番号４７および４８で表される塩基配列からなるＤＮＡはpepB遺伝子欠損確認用、配列番号４９および５０で表される塩基配列からなるＤＮＡはpepT遺伝子欠損確認用、配列番号５１および５２で表される塩基配列からなるＤＮＡはdppオペロン欠損確認用、配列番号５３および５４で表される塩基配列からなるＤＮＡはoppオペロン欠損確認用欠損確認用プライマーセットである。【０１０２】
上記方法で取得されたpepD、 pepN、 pepA、 pepB、pepT、dppA、 dppB、dppC、 dppD、 dppF、 oppA、 oppB、 oppC、 oppDおよびoppFの各遺伝子が欠損した株をエシェリヒア・コリJPNDABPOPepT1株と名付けた。
また、以下の実施例においてジペプチドおよびアミノ酸のHPLCによる分析、定量は以下に示す方法により行った。【０１０３】
ジペプチドおよびアミノ酸は、Ｎα-1-フルオロ-2,4-ジニトロフェニル-5-L-アラニンアミドナトリウム（Nα-1-Fuluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide、以下Ｎα−ＦＤＡＡと略す）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。Ｎα−ＦＤＡＡを用いた誘導体化は、純水で希釈した試料100μlに、50μlの0.5％のＮα−ＦＤＡＡアセトン溶液と40μlの0.5mol/lの炭酸ナトリウム水溶液を加えて攪拌した後、40℃で60分間静置することにより行った。【０１０４】
次に、40μlの1mol/lの塩酸と770μlのメタノールを加えて攪拌したものを、ＦＤＡＡ化試料とした。
該ＦＤＡＡ化試料を、ＷＨ−Ｃ１８Ａカラム(日立サイエンスシステムズ、4×150mm)を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、下記の条件を用いた。
移動相には、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が18:1:1の移動相Ａ、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が12:7:1の移動相Ｂ、アセトニトリルとテトラヒドロフランおよび水の混合比が３：１：１の移動相Ｃを用いた。移動相の流速は0.5ml/min、移動相Ａと移動相Ｂおよび移動相Ｃの混合比は、0〜24分は100:0:0から55:45:0への勾配、24〜30分は55:45:0の一定、30〜50分は55:45:0から0:100:0への勾配、50〜55分は0:100:0の一定で、55〜60分は0:100:0から0:0:100への勾配、60〜62分は0:0:100の一定、62〜62.1分は0:0:100から100:0:0への勾配、62.1〜80分は100:0:0の一定に変化させた。カラム温度は40℃、340nmの紫外吸収を測定した。
【実施例１】
【０１０５】
ペプチド合成酵素発現株の造成
（１）バチルス・サチルスATCC6633株由来ペプチド合成酵素発現株の造成
バチルス・サチルスATCC6633株の染色体DNAより配列番号１で表される塩基配列を有するDNA断片を以下のように取得した。
まず、バチルス・サチルスATCC6633株をYPGA培地[7g/L イーストエキス（ディフコ社製）、7g/L バクトペプトン（ディフコ社製）、7g/L グルコース、1.5g/L 寒天]に塗布して30℃で一晩静置培養した。生育した菌体１白金耳を3mLのYPG培地[7g/L イーストエキス（ディフコ社製）、7g/L バクトペプトン（ディフコ社製）、7g/L グルコース]に植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を分離し、得られた菌体からDNeasy Kit（キアゲン社製）を用いて染色体DNAを調製した。【０１０６】
配列番号１３および１４で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、バチルス・サチルスATCC6633株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、0.50pgの染色体DNA、0.3μmol/Lの各プライマー、1 unitのKOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）、5μLのKOD plus DNAポリメラーゼ用×10緩衝液（東洋紡社製）、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）を含む反応液50μLを調製し、94℃で120秒間加温した後、94℃で15秒間、50℃で30秒間、68℃で120秒間の工程を25回繰り返し、さらに68℃で5分間加温することにより行った。【０１０７】
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、該PCRにより約1.2kbのDNA断片が増幅していることを確認した。
次に、残りの反応液を等量のTE［10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、１mmol/L EDTA］飽和フェノール/クロロホルム（1vol/1vol）溶液と混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間静置した。該溶液を遠心分離してDNAを沈殿させた後、該DNAを20μLのTEに溶解した。【０１０８】
該溶解液5μLを用い、制限酵素NdeIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット（GENECLEAN II kit、BIO 101 社製）を用いて、約1.2kbのDNA断片を回収した。
pET-21a(+)（ノバジェン社製）0.2μgを制限酵素NdeIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により約5.4kbのＤＮＡ断片を回収した。【０１０９】
上記で得られたそれぞれ約1.2kbおよび約5.4kbの断片を、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて16℃で16時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)］によって形質転換し、該形質転換体を５０μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１１０】
該形質転換株を５０μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pET-21a(+)に上記で得られた約1.2kbのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpRBSと命名した。【０１１１】
pRBSを用いてエシェリヒア・コリ BL21 (DE3)株（ノバジェン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pRBSが保持されていることを確認した。【０１１２】
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pRBSと命名した。
（２）バチルス・リケニホルミスATCC14580株由来ペプチド合成酵素発現株の造成
バチルス・リケニホルミスATCC14580株の染色体DNAより、配列番号３で表される塩基配列を有するDNA断片を、以下のように取得した。
まず、バチルス・リケニホルミスATCC14580株をYPGA培地に塗布し、30℃で一晩静置培養した。生育した菌体１白金耳を3mLのYPG培地に植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を分離し、得られた菌体からDNeasy Kitを用いて染色体DNAを調製した。【０１１３】
配列番号１５および１６で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、バチルス・リケニホルミスATCC14580株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の反応液を調製し、同様の反応条件により行った。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、該PCRにより約1.2kbのDNA断片が増幅していることを確認した。【０１１４】
次に、上記の反応液を等量のTE飽和フェノール/クロロホルム（1vol/1vol）溶液と混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間静置した。該溶液を遠心分離してDNAを沈殿させた後、該DNAを20μLのTEに溶解した。  
該溶解液5μLを用い、制限酵素NdeIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットを用いて、約1.2kbのDNA断片を回収した。【０１１５】
pET-21a(+)0.2μgを制限酵素NdeIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により約5.4kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたそれぞれ約1.2kbおよび約5.4kbの断片を、ライゲーションキットを用いて16℃で16時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を５０μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１１６】
該形質転換株を５０μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pET-21a(+)に上記で得られた約1.2kbのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpRBLと命名した。【０１１７】
pRBLを用いてエシェリヒア・コリ BL21 (DE3)株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pRBLが保持されていることを確認した。【０１１８】
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pRBLと命名した。
（３）ヘルペトシホン・オウランティアクスATCC23779株由来ペプチド合成酵素発現株の造成
ヘルペトシホン・オウランティアクスATCC23779株の染色体DNAより、配列番号５で表される塩基配列を有するDNA断片を、以下のように取得した。【０１１９】
まず、ヘルペトシホン・オウランティアクスATCC23779株をCY寒天培地[3g/L ポリペプトン（日本製薬社製）、１g/L イーストエキス（ディフコ社製）、１g/L 塩化カルシウム、1.5g/L 寒天]に塗布して30℃で一晩静置培養した。生育した菌体１白金耳を3mLのCY培地[3g/L ポリペプトン（日本製薬社製）、１g/L イーストエキス（ディフコ社製）、１g/L 塩化カルシウム]に植菌し、30℃で48時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を分離し、得られた菌体からDNeasy Kitを用いて染色体DNAを調製した。【０１２０】
配列番号１７および１８で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、ヘルペトシホン・オウランティアクスATCC23779株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の反応液を調製し、同様の反応条件により行った。
次に、上記の反応液1.46μL、2.5mmol/LのdGTP、5mmol/Lのジシオスレイトール(DTT)、1 unitのT4 DNA polymerase、2μLのT4 DNAポリメラーゼ用×10緩衝液(ノバジェン社製)を含む反応液20μLを調製し22℃で30分間反応した後、75℃20分間加温することで反応を停止した。【０１２１】
この反応液2μLとLIVベクターpET-30 Xa/LIC（ノバジェン社製）1μLを混合して22℃で5分間反応した後に、1μLの25mmol/L EDTAを加えてさらに22℃で分間反応した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１２２】
該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pET-30 Xa/LICに上記で得られた約1.2kbのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpRHAと命名した。【０１２３】
pRHAを用いてエシェリヒア・コリ BL21 (DE3)株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を50μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pRHAが保持されていることを確認した。【０１２４】
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pRHAと命名した。
（４）ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-255株由来ペプチド合成酵素発現株の造成１
ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-255株の染色体DNAより、配列番号７で表される塩基配列を有するDNA断片を、以下のように取得した。【０１２５】
ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-255株の染色体DNAは、American Type Culture Collection(ATCC)より購入した。
配列番号１９および２０で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-255株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の反応液を調製し、同様の反応条件により行った。【０１２６】
次に、上記の反応液1.46μL、2.5mmol/LのdGTP、5mmol/Lのジシオスレイトール(DTT)、1 unitのT4 DNA polymerase、2μLのT4 DNAポリメラーゼ用×10緩衝液を含む反応液20μLを調製し22℃で30分間反応した後、75℃20分間加温することで反応を停止した。
この反応液2μLとLIVベクターpET-30 Xa/LIC 1μLを混合して22℃で5分間反応した後に、1μLの25mmol/L EDTAを加えてさらに22℃で分間反応した。【０１２７】
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。【０１２８】
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pET-30 Xa/LICに上記で得られた約1.2kbのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpRSPと命名した。
pRSPを用いてエシェリヒア・コリ BL21 (DE3)株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１２９】
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pRSPが保持されていることを確認した。
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pRSPと命名した。
（５）クロモバクテリウム・ビオラセウムNBRC12614株由来ペプチド合成酵素発現株の造成
クロモバクテリウム・ビオラセウムNBRC12614株の染色体DNAより、配列番号９で表される塩基配列を有するDNA断片を、以下のように取得した。【０１３０】
まず、クロモバクテリウム・ビオラセウムNBRC12614株（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門、NITE Biological Resource Centerより分譲可能）をNBRC medium 802寒天培地[10g/L ポリペプトン（日本製薬社製）、3g/L イーストエキス（ディフコ社製）、１g/L 硫酸マグネシウム、1.5g/L 寒天]に塗布して30℃で一晩静置培養した。生育した菌体１白金耳を3mLのNBRC medium 802培地[10g/L ポリペプトン（日本製薬社製）、3g/L イーストエキス（ディフコ社製）、1g/L 硫酸マグネシウム]に植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を分離し、得られた菌体からDNeasy Kitを用いて染色体DNAを調製した。【０１３１】
配列番号２１および２２で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、クロモバクテリウム・ビオラセウムNBRC12614株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の反応液を調製し、同様の反応条件により行った。
次に、上記の反応液1.46μL、2.5mmol/LのdGTP、5mmol/Lのジシオスレイトール(DTT)、1 unitのT4 DNA polymerase、2μLのT4 DNAポリメラーゼ用×10緩衝液を含む反応液20μLを調製し22℃で30分間反応した後、75℃20分間加温することで反応を停止した。【０１３２】
この反応液2μLとLIVベクターpET-30 Xa/LIC 1μLを混合して22℃で5分間反応した後に、1μLの25mmol/L EDTAを加えてさらに22℃で分間反応した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１３３】
該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pET-30 Xa/LICに上記で得られた約1.2kbのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpRCVと命名した。【０１３４】
pRCVを用いてエシェリヒア・コリRosetta(DE3)株（ノバジェン社製）をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンと25μg/mLのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pRCVが保持されていることを確認した。【０１３５】
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリRosetta(DE3)/ pRCVと命名した。
（６）ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスJCM1275株由来ペプチド合成酵素発現株の造成
ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスJCM1275株の染色体DNAより、配列番号１１で表される塩基配列を有するDNA断片を、以下のように取得した。【０１３６】
まず、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスJCM1275株（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターJAPAN COLLECTION OF MICROORGANISMSより分譲可能）をGAMブイヨン寒天培地（日水製薬社製）に塗布して密閉容器中においてアネクロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて３０℃にて二晩嫌気条件下で静置培養した。培養後のプレート上のコロニーをかき集めて菌体を回収し、得られた菌体からDNeasy Kitを用いて染色体DNAを調製した。【０１３７】
配列番号２３および２４で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスJCM1275株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、上記（１）と同様の反応液を調製し、同様の反応条件により行った。
次に、上記の反応液1.46μL、2.5mmol/LのdGTP、5mmol/Lのジシオスレイトール(DTT)、1 unitのT4 DNA polymerase、2μLのT4 DNAポリメラーゼ用×10緩衝液を含む反応液20μLを調製し22℃で30分間反応した後、75℃20分間加温することで反応を停止した。【０１３８】
この反応液2μLとLIVベクターpET-30 Xa/LIC 1μLを混合して22℃で5分間反応した後に、1μLの25mmol/L EDTAを加えてさらに22℃で分間反応した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１３９】
該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pET-30 Xa/LICに上記で得られた約1.2kbのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpRBADと命名した。【０１４０】
pRBADを用いてエシェリヒア・コリ BL21 (DE3)株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を25μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pRBADが保持されていることを確認した。【０１４１】
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリBL21(DE3)/ pRBADと命名した。
【実施例２】
【０１４２】
ペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例１の（１）および（２）で得られたエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/pRBSおよびエシェリヒア・コリBL21（DE3）/pRBLを50μg/mLのアンピシリンを含む3mLのＬＢ培地が入った試験管に接種し、30℃で18時間振盪培養した。得られた培養液のうち1mLを50μg/mLのアンピシリンと0.1mmol/Lのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むＬＢ培地100mLが入った500mL三角フラスコに接種し、25℃で24時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【０１４３】
実施例１の（３）、（４）および（６）で得られたエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/pRHA、エシェリヒア・コリBL21 (DE3)/pRSP、およびエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/pRBADを30μg/mLのカナマイシンを含む3mLのＬＢ培地が入った試験管に接種し、37℃で5時間振盪培養した。得られた培養液のうち1mLを30μg/mLのカナマイシン、0.4mmol/LのIPTGを含むＬＢ培地100mLが入った500mL三角フラスコに接種し、30℃で19時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【０１４４】
また実施例１の（５）で得られたエシェリヒア・コリRosetta (DE3)/pRCVを30μg/mLのカナマイシンと30μg/mLのクロラムフェニコールを含む3mLのＬＢ培地が入った試験管に接種し、37℃で5時間振盪培養した。得られた培養液のうち1mLを30μg/mLのカナマイシン、30μg/mLのクロラムフェニコールおよび0.4mmol/LのIPTGを含むＬＢ培地100mLが入った500mL三角フラスコに接種し、30℃で19時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【０１４５】
上記で得られたそれぞれの湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られた上清から、HisTrap（アマシャム社製）を用いてペプチド合成活性を有する蛋白質をそれぞれ精製した。
【実施例３】
【０１４６】
ペプチド合成活性を有する蛋白質を用いた単一アミノ酸からのペプチドの生産
実施例２で得られたそれぞれの精製蛋白質を0.1mg/mL、50mmol/LのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/LのATP、12.5mmol/LのＬ‐アルギニン(L-Arg)、Ｌ‐アラニン（L-Ala）、Ｌ‐グルタミン（L-Gln）、Ｌ‐グルタミン酸（L-Glu）、Ｌ‐バリン（L-Val）、Ｌ‐ロイシン（L-Leu）、Ｌ‐イソロイシン（L-Ile）、Ｌ‐プロリン（L-Pro）、Ｌ−チロシン（L-Tyr）、Ｌ‐フェニルアラニン（L-Phe）、Ｌ‐トリプトファン（L-Trp）、Ｌ‐メチオニン（L-Met）、Ｌ‐セリン（L-Ser）、Ｌ‐スレオニン（L-Thr）、Ｌ‐システイン（L-Cys）、Ｌ‐アスパラギン（L-Asn）、Ｌ‐リジン（L-Lys）、Ｌ‐アルギニン（L-Arg）、Ｌ‐ヒスチジン（L-His）およびＬ‐アスパラギン酸（L-Asp）より選ばれる１種のＬ‐アミノ酸またはグリシン（Gly）からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド生成反応を行った。【０１４７】
反応終了後、ペプチド生成反応によって反応液中に生成する遊離リン酸をデタミナーL  IP（協和メデックス社製）により測定する方法、LC/MS（Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry）分析、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による分析の３つの方法により、生成物の分析を行った。
表１から表６に、デタミナーL IPを用いた測定により遊離のリン酸検出されたものについて結果を示した。表１から表６はそれぞれBL21(DE3)/pRBS、BL21(DE3)/pRBL、BL21(DE3)/pRHA、BL21(DE3)/pRSP、Rosetta(DE3)/pRCVおよびBL21(DE3)/pRBADを用いて実施例２で生産したペプチド合成酵素を用いた反応の結果を示している。【０１４８】
また、デタミナーL IPによって遊離のリン酸が検出されたサンプルについて、LC/MS分析を行った。LC/MS分析により、ペプチドが検出されたものについて表１から表６の右列に記載した。表１から表６において、右列の空欄はLC/MS分析にてαペプチド結合により結合したペプチドが検出されなかったことを示す。
さらにHPLC分析によって濃度が測定できたものについて、表１から表６の右列の括弧内に測定値を示す。【０１４９】
またエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/pRSP由来の蛋白質を用い、L-ValおよびL-Leuを基質とした場合、BL21(DE3)/pRBADを用いたL-TrpおよびL-Pheを基質として行った反応において、反応終了時に沈殿が生じているのを確認した。これら沈殿を遠心分離により回収して、酢酸：水＝1：1の溶液を加えて溶解し、MALDI-TOFMS（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/ Time Of Flight/ Mass Spectrometry）分析を行った。【０１５０】
なお、生成物であるペプチドを構成するアミノ酸は全てL体であるが、表中では省略して記載している。【０１５１】
【表１】
2009028253.tif 000002
【０１５２】
【表２】
2009028253.tif 000003
【０１５３】
【表３】
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【０１５４】
【表４】
2009028253.tif 000005
【０１５５】
【表５】
2009028253.tif 000006
【０１５６】
【表６−１】
2009028253.tif 000007
【０１５７】
【表６−２】
2009028253.tif 000008
【０１５８】
以上により、本発明のタンパク質が、２以上のアミノ酸がペプチド結合で結合したペプチドを生成する活性を有することがわかった。
【実施例４】
【０１５９】
ペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたヘテロペプチドの生産
実施例２で得られたそれぞれのペプチド合成酵素を0.1mg/mL、50mmol/LのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/LのATP、表７から表１２に示す各12.5mmol/Lの２種類のアミノ酸またはアミノ酸誘導体からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド生成反応を行った。表７から表１２はそれぞれBL21(DE3)/pRBS、BL21(DE3)/pRBL、BL21(DE3)/pRHA、BL21(DE3)/pRSPおよびBL21(DE3)/pRBADを用いて実施例２で生産したペプチド合成酵素を用いた反応の結果を示している。また表７から表１２において、ArgHxはL-アルギニンヒドロキサメート（L-Arginine hydroxamate）を、ValOMeはL-バリンメチルエステル(L-Valine methyl ester)を、PheOMeはL-フェニルアラニンメチルエステル(L-Phenylalaine methyl ester)を、LeuOMeはL-ロイシンメチルエステル(L-Leucine methyl ester)をそれぞれ示す。【０１６０】
反応終了後、反応液中に遊離したリン酸をデタミナーL IPを用いて測定した。その結果、表７から表１２に示す全てのアミノ酸の組み合わせにおいてリン酸の遊離が確認された。
さらに全てのサンプルについてLC/MSによる生成物の分析を行った。上清中に生成したヘテロペプチドについて、ペプチド内に含まれる各アミノ酸残基数をLC/MS分析で測定された分子量より推定し、表７から表１２の右列に示す（ホモペプチドも生成しているが未記載）。【０１６１】
なお、生成物であるペプチドを構成するアミノ酸は全てL体であるが、表中では省略して記載している。【０１６２】
【表７】
2009028253.tif 000009
【０１６３】
【表８】
2009028253.tif 000010
【０１６４】
【表９】
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【表１０】
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【０１６５】
【表１１】
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【０１６６】
【表１２】
2009028253.tif 000014
【０１６７】
以上により、本発明の蛋白質が、２種のアミノ酸またはアミノ酸誘導体がペプチド結合で結合した、種々のヘテロペプチドを生成する活性を有することがわかった。
【実施例５】
【０１６８】
ペプチド合成酵素を用いたL-アミノ酸とペプチドからの伸長したペプチドの生産（１）
実施例２で得られたそれぞれのペプチド合成酵素を0.1mg/mL、50mmol/LのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/LのATP、各12.5mmol/LのＬ−バリンジペプチド（L-Val-L-Val）またはトリペプチド（L-Val-L-Val-L-Val）およびL-Valからなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド生成反応を行った。【０１６９】
反応終了後、LC/MS分析およびHPLC分析により生成物を分析した。生成したL-Valホモペプチドおよびその濃度を、表１３から表１８に示す。
なお、生成物であるペプチドを構成するアミノ酸は全てL体であるが、表中では省略して記載している。  【０１７０】
【表１３】
2009028253.tif 000015
【０１７１】
【表１４】
2009028253.tif 000016
【０１７２】
【表１５】
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【０１７３】
【表１６】
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【０１７４】
【表１７】
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【０１７５】
【表１８】
2009028253.tif 000020
【０１７６】
これにより、本発明のタンパク質は、ペプチドを基質としてさらにペプチド結合により伸長したペプチドを生成する活性を有することがわかった。
【実施例６】
【０１７７】
ペプチド合成酵素を用いた、L-アミノ酸とペプチドから伸長したペプチドの生産（２）
BL21(DE3)/pRSPから取得したペプチド合成酵素を0.1mg/mL、50mmol/LのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/LのATP、12.5mmol/LのＬ−バリンジペプチド（L-Val-L-Val）またはトリペプチド（L-Val-L-Val-L-Val）および12.5mmol/LのL-Proからなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド生成反応を行った。【０１７８】
反応終了後、LC/MS分析により生成物を分析した。その結果、L-ProとL-Val-L-ValまたはL-Val-L-Val-L-Valが1分子ずつ結合したペプチドが生成したことがわかった。
【実施例７】
【０１７９】
ペプチド合成酵素を用いた、L-アミノ酸とペプチドから伸長したペプチドの生産（３）
BL21(DE3)/pRBSから取得したペプチド合成酵素を0.1mg/mL、50mmol/LのTris-HCl緩衝液（pH8.0）、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、12.5mmol/LのATP、12.5mmol/LのＬ−アルギニル−L−セリン（L-Arg-L-Ser）またはＬ−アルギニル−L−グルタミン酸（L-Arg-L-Glu）および12.5mmol/LのL-Valからなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド生成反応を行った。反応終了後、LC/MS分析の方法で生成物を分析した。【０１８０】
その結果、L-ValおよびL-Arg-L-Serを基質とした反応では、L-Valが1分子およびL-Arg-L-Serが1分子結合したトリペプチド、ならびにL-Valが２分子およびL-Arg-L-Serが1分子結合したテトラペプチドが生成していることがわかった。また、L-ValおよびL-Arg-L-Gluを基質とした反応では、L-Valが1分子およびL-Arg-L-Gluが1分子結合したトリペプチド、ならびにL-Valが２分子およびL-Arg-L-Gluが1分子結合したテトラペプチドが生成していることがわかった。
【実施例８】
【０１８１】
ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-255株由来ペプチド合成酵素発現株の造成２
ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-255株の染色体DNAより、配列番号７で表される塩基配列を有するDNA断片を、以下のように取得した。
配列番号２５および２６で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーセットとして用い、ストレプトコッカス・ニューモニエATCC BAA-255株の染色体DNAを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRは、上記実施例１の（１）と同様の反応液を調製し、同様の反応条件により行った。【０１８２】
次に、上記の反応液1.46μL、2.5mmol/LのdGTP、5mmol/Lのジシオスレイトール(DTT)、1 unitのT4 DNA polymerase、2μLのT4 DNAポリメラーゼ用×10緩衝液を含む反応液20μLを調製し22℃で30分間反応した後、75℃で20分間加温することで反応を停止した。
pTrcHis2B（インビトロジェン社製）0.2μgを制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により約4.4kbのＤＮＡ断片を回収した。【０１８３】
上記で得られたそれぞれ約1.2kbおよび約4.4kbの断片を、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて16℃で16時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ JM109株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１８４】
該形質転換株を50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pTrcHis2Bに約1.2kbのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。該プラスミドをpTrcSPと命名した。
pTrcSPを用いて、エシェリヒア・コリJPNDABPOPepT1株を、カルシウムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、30℃で一晩培養し形質転換株を選択した。【０１８５】
生育してきた形質転換体のコロニーよりアルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析した結果、pTrcSPが保持されていることを確認した。
上記で得られた形質転換株をエシェリヒア・コリJPNDABPOPepT1/ pTrcSPと命名した。
【実施例９】
【０１８６】
Valホモペプチドの発酵生産
実施例８で得られたエシェリヒア・コリJPNDABPOPepT1/pTrcSPを100μg/mLのアンピシリンを含む3mLのＬＢ培地が入った試験管に接種し、37℃で5時間振盪培養した。得られた培養液のうち3mLを100μg/mLのアンピシリンと0.4mmol/Lのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)および10g/LのL-バリンを含むＬＢ培地100mLが入った500mL三角フラスコに接種し、30℃で19時間振盪培養した後、該培養液全量を遠心分離して培養上清と湿菌体を取得した。菌体内成分の分析のため、得られた湿菌体を4 mLの100 mmol/L Tris-HCl 緩衝液(pH8.0)に懸濁した。これを超音波破砕し、遠心分離によって残渣を除去し、得られた無細胞抽出液を煮沸処理（100℃、5 min）して、遠心分離によって得られた上清を菌体内成分分析サンプルとした。【０１８７】
得られた培養開始時（植菌直後）と培養終了時（19時間）の培養上清と、培養終了時の菌体内成分に関して、LC/MS分析により、生成物の分析を行った。
その結果、培養開始時の培養上清には、Valのホモペプチドの存在は確認できなかったが、培養終了時の培養上清にはValの2、3、4および5量体が存在していることがわかった。また培養終了時の菌体内には、Valの2、3、4、5および6量体の存在を確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明により、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組換え体DNA、該組換え体DNAで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたペプチドの製造法、およびペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたペプチドの製造法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１８９】
配列番号１３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２０−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３０−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４０−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５０−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５４−人工配列の説明：合成DNA
【配列表】
2009028253000001.app
【国際調査報告】
2009028253.tif 000021
2009028253.tif 000022
2009028253.tif 000023
2009028253.tif 000024
2009028253.tif 000025
2009028253.tif 000026