【手続補正書】
【提出日】平成16年5月12日(2004.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸多重鎖を作製する方法であって、
１）水、ワトソン‐クリック２重鎖、該ワトソン‐クリック２重鎖を含む多重鎖を形成するのに十分な数の１本鎖混合塩基配列分子、および多重鎖の形成速度または量を増加させる加速剤からなる混合物を作成する工程であって、前記多重鎖が３重鎖または４重鎖であり、１つまたは複数の前記１本鎖分子が、多重鎖内にある場合に、ワトソン‐クリックの塩基対法則または相同的結合の塩基対法則に従った接着によって多重鎖内の他のすべての鎖と関係付けられるように選択される工程と、
２）前記混合物をインキュベートして、多重鎖の各鎖が塩基対法則に従った接着によって該多重鎖内の他のすべての鎖と関係付けられた多重鎖を形成させる工程と
からなり、ただし該多重鎖内において工程（１）で加えたワトソン‐クリック２重鎖がＧＣ含量１０％〜９０％のヘテロポリマーである方法。
【請求項２】
前記２重鎖がその２重らせん構造を実質的に保っており、前記１本鎖分子が該２重らせん構造の溝内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１本鎖分子が、ワトソン‐クリックの塩基対法則によって前記２重鎖のうち一方の鎖と結合しており、相同的結合の塩基対法則によって前記２重鎖のうちの他方の鎖と関係付けられている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記２重鎖がその２重らせん構造を実質的に保っており、前記１本鎖分子が該２重らせん構造の溝内に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多重鎖内で、工程（１）で加える前記ワトソン‐クリック２重鎖は、１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーであり、さらに、そのうちのプリン‐ピリミジン２量体およびピリミジン‐プリン２量体の合計頻度が２５％を超える、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞中に存在しない核酸鎖および／または２重鎖を用いて工程（１）および（２）を実施する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質を使用せずに工程（２）を実施する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（１）で、混合物の最終体積のうち体積基準で少なくとも５０％を水が占めるように水を加える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記水性溶液の凝固点を超え、８５℃を超えない１つまたは複数の温度で工程（２）を実施する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
５℃〜３０℃の１つまたは複数の温度で工程（２）を実施する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）で陽イオンを前記加速剤として加える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記陽イオンが、５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度で提供されるＮａ＋、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されるＭｎ＋２、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されるＭｇ＋２、および２０ｍＭの濃度で提供されるＮｉ＋２からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（１）でインターカレーターを加速剤として加える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記インターカレーターが蛍光インターカレーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光インターカレーターが、ＹＯＹＯ‐１、ＴＯＴＯ‐１、ＹＯＹＯ‐３、ＴＯＴＯ‐３、ＰＯＰＯ‐１、ＢＯＢＯ‐１、ＰＯＰＯ‐３、ＢＯＢＯ‐３、ＬＯＬＯ‐１、ＪＯＪＯ‐１、シアニン２量体、ＹＯ‐ＰＲＯ‐１、ＴＯ‐ＰＲＯ‐１、ＹＯ‐ＰＲＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐５、ＰＯ‐ＰＲＯ‐１、ＢＯ‐ＰＲＯ‐１、ＰＯ‐ＰＲＯ‐３、ＢＯ‐ＰＲＯ‐３、ＬＯ‐ＰＲＯ‐１、ＪＯ‐ＰＲＯ‐１、シアニン単量体、エチジウムブロマイド、エチジウム・ホモ２量体‐１、エチジウム・ホモ２量体‐２、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジン・オレンジ、アクリジン誘導体、エチジウム‐アクリジン・ヘテロ２量体、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯ色素、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１、ＳＹＢＲ色素、ピコ・グリーン、ＳＹＴＯＸ色素、および７‐アミノアクチノマイシンＤからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記加速剤が非インターカレート型フルオロフォアである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記非インターカレート型フルオロフォアが、ビオチン、ローダミン、アレクサ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ビオチン・コンジュゲート、チオール反応性プローブ、フルオレセイン、および、ケージドプローブ、オレゴン・グリーン、ローダミン・グリーン、ＱＳＹ色素を含むがこれらに限定はされない誘導体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（１）で、前記加速剤が前記ワトソン‐クリック２重鎖の副溝および主溝のうち少なくともいずれかに結合するインターカレーターである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（１）で、前記ワトソン‐クリック２重鎖に対する凝縮剤である加速剤を加える、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（１）で、前記ワトソン‐クリック２重鎖に対する脱凝縮剤である加速剤を加える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（１）で、前記加速剤が２５℃では液体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（１）で、前記加速剤が水溶性の有機液体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
作製される前記多重鎖が３重鎖であり、工程（１）における１本鎖分子の前記十分な数は１であり、工程（２）で前記３重鎖が形成される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法に従って３重鎖を作製する工程、および３重鎖を検出する追加の工程（３）からさらになる、３重鎖を検出する方法。
【請求項２５】
前記３重鎖内の前記２重鎖と前記１本鎖分子との間の、塩基対法則との完全一致、１塩基の不一致または欠失、および２塩基の不一致または欠失を識別することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
作製される前記多重鎖は４重鎖であり、工程（１）における前記ワトソン‐クリック２重鎖は第１のワトソン‐クリック２重鎖であり、また工程（１）における１本鎖分子の十分な数は２であって、これらの１本鎖分子は第２のワトソン‐クリック２重鎖内にあり、工程（２）で前記第１および第２の２重鎖から４重鎖が形成される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法に従って４重鎖を作製する工程、および４重鎖を検出する追加の工程（３）からさらになる、４重鎖を検出する方法。
【請求項２８】
前記第１のワトソン‐クリック２重鎖と第２のワトソン‐クリック２重鎖の間の、塩基対法則との完全一致、１塩基の不一致または欠失、および２塩基の不一致または欠失を識別することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
２本鎖核酸標的に結合した１本鎖プローブからなる３重鎖であって、前記プローブがヘテロポリマーの核酸またはヘテロポリマーの核酸類似体からなり、前記３重鎖のすべての塩基トリプレットがＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐ＧおよびＣ‐Ｇ‐Ｃからなる群から選択されたメンバーである３重鎖。
【請求項３０】
前記２本鎖核酸標的がその２重らせん構造を実質的に保っており、前記へテロポリマーの核酸または類似体が該２重らせん構造の溝の中に存在する、請求項２９に記載の３重鎖。
【請求項３１】
前記へテロポリマーの核酸および類似体がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有する、請求項２９または請求項３０に記載の３重鎖。
【請求項３２】
第１の核酸塩基配列を含む第１鎖と、
第２の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第１鎖と会合している第２鎖と、
第３の核酸塩基配列を含む第３鎖と、
第４の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第２鎖および第３鎖と会合している第４鎖と
からなる４重鎖。
【請求項３３】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項３２に記載の４重鎖。
【請求項３４】
（１）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、前記第２鎖および第４鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、前記第１鎖および第３鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３２または請求項３３に記載の４重鎖。
【請求項３５】
（１）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、前記第２鎖および第４鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、前記第１鎖および第３鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３２または請求項３３に記載の４重鎖。
【請求項３６】
（１）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、前記第１鎖および第４鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、前記第２鎖および第３鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３２または請求項３３に記載の４重鎖。
【請求項３７】
（１）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、前記第１鎖および第４鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第２鎖および３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、前記第２鎖および第３鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３２または請求項３３に記載の４重鎖。
【請求項３８】
前記第１鎖の相互作用する塩基のそれぞれが、前記第３鎖上の隣接する塩基、および前記第３鎖の塩基が結合している前記第４鎖上の塩基のどちらとも特異的に相互作用する、請求項３２または請求項３３に記載の４重鎖。
【請求項３９】
前記第２鎖の相互作用する塩基のそれぞれが、前記第４鎖上の隣接する塩基、および前記第４鎖の塩基が結合している前記第３鎖上の塩基のどちらとも特異的に相互作用する、請求項３２または請求項３３に記載の４重鎖。
【請求項４０】
３重鎖を検出する方法であって、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列からなる標的２本鎖核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなるプローブを提供すること、
加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的配列および前記加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなる３重鎖複合体を含む試験試料を提供することと、前記複合体のすべての塩基トリプレットがＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐ＧおよびＣ‐Ｇ‐Ｃからなる群から選択されるメンバーであることと、
前記試験試料を励起放射で照射して、該試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列の一致度を決定すること、
からなり、前記標的配列または前記プローブにシグナル消光剤を与えずに実施する均一アッセイである方法。
【請求項４１】
３重鎖を検出する方法であって、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列を有する、標的核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなる２本鎖プローブを提供すること、
ハイブリダイゼーション加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的および前記ハイブリダイゼーション加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなるワトソン‐クリック３重鎖を含む試験試料を提供すること、
前記試験試料を励起放射で照射して、試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列の一致度を決定すること、
からなり、前記標的配列または前記プローブにシグナル消光剤を与えずに実施する均一アッセイである方法。
【請求項４２】
４重鎖を検出する方法であって、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列を有する、標的核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなる２本鎖プローブを提供すること、
ハイブリダイゼーション加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的および前記ハイブリダイゼーション加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなるワトソン‐クリック４重鎖を含む試験試料を提供すること、
前記試験試料を励起放射で照射して、試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列の一致度を決定すること、
からなり、前記標的配列または前記プローブにシグナル消光剤を与えずに実施する均一ア
ッセイである方法。