(57)【要約】  本発明は、サッカロミセス・セレビシエのα1因子由来の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列において特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成る、分泌効率が高い分泌シグナルペプチドに関する。
2008032659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)の分泌シグナルペプチド。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列において、第19番目のアラニン、第20番目のアラニン、第21番目のプロリン、第22番目のバリン、第23番目のアスパラギン及び第24番目のトレオニンから成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチド
(b)上記(a)の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列において、上記第19番目〜第24番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ配列番号２記載のアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチドと比較して、C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を3倍以上向上させる、分泌シグナルペプチド
【請求項２】
上記第19番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項３】
上記第19番目のアラニンがバリンに置換されていることを特徴とする、請求項１又は２記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項４】
上記第20番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項５】
上記第20番目のアラニンがトレオニンに置換されていることを特徴とする、請求項１又は４記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項６】
上記第21番目のプロリンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項７】
上記第21番目のプロリンがロイシンに置換されていることを特徴とする、請求項１又は６記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項８】
上記第22番目のバリンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項９】
上記第22番目のバリンがフェニルアラニン又はアラニンに置換されていることを特徴とする、請求項１又は８記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項１０】
上記第23番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項１１】
上記第23番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることを特徴とする、請求項１又は１０記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項１２】
上記第24番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項１３】
上記第24番目のトレオニンがアラニンに置換されていることを特徴とする、請求項１又は１２記載の分泌シグナルペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の分泌シグナルペプチドをコードするDNA。
【請求項１５】
請求項１４記載のDNAを含むDNA断片。
【請求項１６】
請求項１４記載のDNAを含む組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の分泌シグナルペプチドと外来タンパク質とを連結した融合タンパク質。
【請求項１８】
上記分泌シグナルペプチドのC末端側に上記外来タンパク質が連結されていることを特徴とする、請求項１７記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１７又は１８記載の融合タンパク質をコードするDNA。
【請求項２０】
請求項１９記載のDNAを含むDNA断片。
【請求項２１】
請求項１９記載のDNAを含む組換えベクター。
【請求項２２】
請求項２０記載のDNA断片又は請求項２１記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項２３】
宿主が酵母であることを特徴とする、請求項２２記載の形質転換体。
【請求項２４】
上記酵母がサッカロミセス・セレビシエであることを特徴とする、請求項２３記載の形質転換体。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか１項記載の形質転換体を培養し、上記外来タンパク質を分泌発現又は膜に発現させることを特徴とする、タンパク質生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌シグナルペプチド及びそれらを利用したタンパク質生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質には、細胞内で合成された後、細胞内に留まるもの、細胞外に放出されるものが存在する。細胞外に放出されるタンパク質を、一般的には分泌タンパク質と呼ぶ。また、細胞内で合成された後、細胞膜や小胞体膜等に貫通した、或いは一部が挿入された形態で存在するタンパク質が存在する。これらのタンパク質は膜タンパク質と呼ばれる。【０００３】
分泌タンパク質及び膜タンパク質には、それ以外のタンパク質とは異なるアミノ酸配列上の特徴があることが知られている。それらのタンパク質のN末端側には、比較的疎水性の高いアミノ酸配列がしばしば見出される。このアミノ酸配列は、「分泌シグナルペプチド」(その配列を「分泌シグナル配列」という)と呼ばれる。分泌シグナルペプチドが分泌タンパク質(細胞外への分泌)や膜タンパク質(膜への局在)の生産において重要であることは、分泌タンパク質や膜タンパク質のアミノ酸配列から分泌シグナル配列を除去することで、それぞれ細胞外への分泌や膜への局在が見られなくなることから、広く認識されている。【０００４】
また、分泌タンパク質又は膜タンパク質の分泌シグナルペプチドを別のタンパク質由来の分泌シグナルペプチドで置換しても、多くの場合、同様の分泌シグナルペプチド活性(分泌や膜への局在)が見られることや、生物種の異なるタンパク質由来の分泌シグナルペプチドで置換された分泌タンパク質又は膜タンパク質も同様に細胞外へ分泌されるか、或いは膜に局在されることが知られている。このように、分子生物学等の分野では、分泌シグナルペプチドは汎用的である。【０００５】
分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌生産には、次のような利点がある。【０００６】
(1) 細胞内で生産され、蓄積されるタンパク質の細胞内発現系では、細胞内に存在するタンパク質分解酵素等により、蓄積される目的のタンパク質が分解されてしまうことがしばしば生じる。一方、分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系では、培養液中に目的タンパク質が分泌されることから、比較的分解等の虞が少ない。【０００７】
（2） タンパク質の細胞内発現系では、目的のタンパク質を精製するためには、細胞の破砕が必要であり、且つ細胞内のあらゆる物質が夾雑物となる。一方、分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系では、生産されたタンパク質が培養液中に分泌されるため、細胞の破砕が不要であると共に、初発粗試料、即ち培養液中に目的のタンパク質以外の夾雑物が少なく、目的のタンパク質の精製が比較的容易である。【０００８】
(3) タンパク質の細胞内発現系では、目的のタンパク質は限りある細胞内スペースに蓄積されるため、高濃度になると凝集体を形成する等の虞がある。一方、分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系では、培養液中に目的タンパク質が移行するため、結果として細胞内で生産されるよりも希釈され、そのような虞が少ない。この理由から、分泌発現系がタンパク質の大量生産に適しており、実用的にも医薬品の生産等でよく用いられている。【０００９】
(4) 分泌シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌発現系では、目的のタンパク質のN末端が天然型のタンパク質として得ることができる。一方、タンパク質が細胞内に留まるような細胞内発現系では、N末端がメチオニン又はホルミルメチオニンであることが多く、これにより必ずしも天然型のタンパク質と同一であるとは限らず、生化学的活性も天然型とは違う場合がある。【００１０】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のα1因子(α1 mating factor )は、分泌タンパク質であり、分泌シグナルペプチドを有する。具体的には、α1因子由来の分泌シグナルペプチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列から成るペプチドである。当該分泌シグナルペプチドは、配列番号２において、第1番目から第19番目までのアミノ酸配列から成るプレ配列と、第20番目から第89番目までのアミノ酸配列から成るプロ配列とを含む。当該プレ配列とプロ配列とを合わせて、プレプロ配列と呼ばれる。なお、狭義には、プレ配列が分泌シグナル配列であるが、プレプロ配列を含む配列を、分泌シグナル配列と呼ぶことが多い。【００１１】
合成された新生α1因子は、N末端側に上述したプレプロ配列を含む分泌シグナルペプチドを有することとなる。細胞内で合成された分泌シグナルペプチドを有するα1因子は、小胞体内に移行する過程でプレ配列部分がエンドペプチダーゼにより切断され、α1因子前駆体となる。次いで、プロ配列が小胞体のKex2エンドペプチダーゼにより、配列番号２の第85番目のアルギニンと第86番目のグルタミン酸との間のペプチド結合に代表される部位で切断される。さらに、ゴルジ体のSte13エンドペプチダーゼにより、配列番号２の第87番目のアラニンのC末端側及び第89番目のアラニンのC末端側のペプチド結合に代表される部位で切断され、これらのプロセッシングを経て、成熟α1因子が合成されることとなる。合成された成熟α1因子は、細胞外に分泌される。【００１２】
サッカロミセス・セレビシエのタンパク質由来の分泌シグナルペプチドとしては、上述したα1因子由来の分泌シグナルペプチド以外にも、例えば、α因子受容体、インベルターゼ、ホスファターゼ等のタンパク質由来の分泌シグナルペプチドが知られており、これまでに用いられている。しかしながら、これらの分泌シグナルペプチドは、そのC末端側に接続されているタンパク質やペプチドを分泌させる(膜タンパク質の場合には、膜に生産させる)能力という点では共通性を有するが、どの程度の量のタンパク質やペプチドを細胞外に輸送し、分泌させることができるか（膜タンパク質の場合には膜に生産させることができるか）という効率(以下、「分泌効率」という)は同一ではない。実際には、それらの中でも、α1因子由来の分泌シグナルペプチドがその高い分泌効率から非常によく用いられ、種々のタンパク質の分泌生産に関する多くの実績が知られている。【００１３】
α1因子由来の分泌シグナルペプチドを用いて分泌生産させたタンパク質としては、例えば、インベルターゼ(非特許文献１)、上皮細胞増殖因子(非特許文献２)、インターフェロン-α1(非特許文献３)、β-エンドルフィン(非特許文献４)、抗CD33シングル鎖抗体(非特許文献５)、フィターゼ(非特許文献６)等が知られている。また、α1因子由来の分泌シグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのみならず、他の酵母種でも分泌シグナルペプチドとして機能し、タンパク質を分泌させることができることが知られている(非特許文献７)。さらに、α1因子由来の分泌シグナルペプチドは、メタノール酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)を用いた発現系(Invitrogen社)等においても用いられている。このように、α1因子由来の分泌シグナルペプチドは、タンパク質を分泌発現させるために広く適用可能である。【００１４】
ところで、分泌タンパク質又は膜タンパク質由来のプレ配列やプロ配列を改変し、連結したタンパク質の分泌効率を向上させる試みがなされている。【００１５】
特許文献１には、プレ配列の改変に関する発明が開示されている。特許文献１記載の発明では、卵白リゾチームの天然のシグナル配列(狭義のシグナル配列)の大部分を疎水性アミノ酸であるロイシンに置換している。特許文献１の記載によれば、その改変シグナル配列をコードするDNA配列とヒトリゾチームをコードするDNA配列とを連結した融合タンパク質をコードする遺伝子をサッカロミセス・セレビシエで発現させると、天然のシグナル配列を用いた場合と比較して該タンパク質の分泌量が増大する。しかしながら、分泌量の向上は2.5倍程度にとどまっている。【００１６】
一方、特許文献２には、プロ配列の改変に関する発明が開示されている。特許文献２には、α1因子由来のプロ配列の3つあるうちの1つの糖鎖付加部位(例えば、配列番号２における第23番目のアスパラギン)とその糖鎖付加認識配列(第23番目のアスパラギンとそれに続く2アミノ酸）とをコードする部分を残し、それよりC末端側にあるプロ配列の一部或いは全部を欠失させたプロ配列をコードする遺伝子と、その3'末端側にKex2切断部位をコードする遺伝子とを連結し、さらにその3'末端側にインシュリン様物質タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合タンパク質をコードする遺伝子を構築したことが開示されている。特許文献２の記載によれば、その融合タンパク質をコードする遺伝子をサッカロミセス・セレビシエで発現させると、天然のプロ配列を用いた場合と比較して、該タンパク質の分泌量が増大する。しかしながら、分泌量の増大は3倍に満たず、劇的に向上したとは言い難い。【００１７】
近年、医薬としてのタンパク質、工業用酵素の生産はもとより、文部科学省の「タンパク質3000」プロジェクトにみられるように、生化学的現象解明のためのタンパク質試料の提供の手段として、所望のタンパク質が簡便且つ多量に生産できるタンパク質発現系の開発が強く求められている。そのため、タンパク質の分泌発現系は、分泌効率の向上という点においてさらなる改善の必要性がある。【００１８】
また、膜タンパク質が合成される際には、シグナル配列による小胞体膜の通過という、分泌タンパク質と共通したメカニズムを利用することが一般的に知られている。従って、上述した分泌シグナルペプチドは、膜タンパク質を効率的に生産することにも適応可能であると考えられる。
【特許文献１】特許第2564536号公報
【特許文献２】特許第2793215号公報
【非特許文献１】Emr, S.D., Schekman, R., Flessel, M.C., Thorner, J., 「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America」, 1983年, 第80巻, p.7080-7084
【非特許文献２】Brake, A.J., Merryweather, J.P., Coit, D.G., Heberlin, U.A., Masiarz, F.R., Mullenback, G.T., Urdea, M.S., Valenzuela, P., Barr, P.J., 「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America」, 1984年, 第81巻, p.4642-4646
【非特許文献３】Singh, A., Lugovoy, J., Kohr, W., Perry, L.J., 「Nucleic Acids Research」, 1984年, 第12巻, 第23号, p.8927-8938
【非特許文献４】Bitter, G.A., Chen, K.K., Banks, A.R., Lai, P-H., 「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America」, 1984年, 第81巻, p.5330-5334
【非特許文献５】Emberson, L.M., Trivett, A.J., Blower, P.J., Nicholls, P.J., 「JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS」, 2005年, 第305巻, 第2号, p.135-151
【非特許文献６】Xiong, A.S., Yao, Q.H., Peng, R.H., Han, P.L., Cheng, Z.M., Li, Y., 「JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY」, 2005年, 第98巻, 第2号, p.418-428
【非特許文献７】Kalandadze, A., Galleno, M., Foncerrada, L., Strominger, J.L., Wucherpfennig, K.W., 「THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY」, 1996年, 第271巻, 第33号, p.20156-20162
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上述したように、分泌タンパク質や膜タンパク質の生産効率を現在よりもさらに向上させることは極めて重要な課題である。【００２０】
そこで、本発明は、例えば、従来用いられてきた分泌シグナルペプチドよりも分泌効率が高い分泌シグナルペプチドを同定し、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、サッカロミセス・セレビシエのα1因子由来の分泌シグナルペプチドにおいて、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチドが、天然型のα1因子由来の分泌シグナルペプチドと比較して、C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を少なくとも3倍以上に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２２】
本発明は以下を包含する。【００２３】
（１）以下の(a)又は(b)の分泌シグナルペプチド。【００２４】
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列において、第19番目のアラニン、第20番目のアラニン、第21番目のプロリン、第22番目のバリン、第23番目のアスパラギン及び第24番目のトレオニンから成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチド
(b)上記(a)の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列において、上記第19番目〜第24番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ配列番号２記載のアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチドと比較して、C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を3倍以上向上させる、分泌シグナルペプチド
（２）上記第19番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、（１）記載の分泌シグナルペプチド。【００２５】
（３）上記第19番目のアラニンがバリンに置換されていることを特徴とする、（１）又は（２）記載の分泌シグナルペプチド。【００２６】
（４）上記第20番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、（１）記載の分泌シグナルペプチド。【００２７】
（５）上記第20番目のアラニンがトレオニンに置換されていることを特徴とする、（１）又は（４）記載の分泌シグナルペプチド。【００２８】
（６）上記第21番目のプロリンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、（１）記載の分泌シグナルペプチド。【００２９】
（７）上記第21番目のプロリンがロイシンに置換されていることを特徴とする、（１）又は（６）記載の分泌シグナルペプチド。【００３０】
（８）上記第22番目のバリンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、（１）記載の分泌シグナルペプチド。【００３１】
（９）上記第22番目のバリンがフェニルアラニン又はアラニンに置換されていることを特徴とする、（１）又は（８）記載の分泌シグナルペプチド。【００３２】
（１０）上記第23番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、（１）記載の分泌シグナルペプチド。【００３３】
（１１）上記第23番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることを特徴とする、（１）又は（１０）記載の分泌シグナルペプチド。【００３４】
（１２）上記第24番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、（１）記載の分泌シグナルペプチド。【００３５】
（１３）上記第24番目のトレオニンがアラニンに置換されていることを特徴とする、（１）又は（１２）記載の分泌シグナルペプチド。【００３６】
（１４）（１）〜（１３）のいずれか１記載の分泌シグナルペプチドをコードするDNA。【００３７】
（１５）（１４）記載のDNAを含むDNA断片。【００３８】
（１６）（１４）記載のDNAを含む組換えベクター。【００３９】
（１７）（１）〜（１３）のいずれか１記載の分泌シグナルペプチドと外来タンパク質とを連結した融合タンパク質。【００４０】
（１８）上記分泌シグナルペプチドのC末端側に上記外来タンパク質が連結されていることを特徴とする、（１７）記載の融合タンパク質。【００４１】
（１９）（１７）又は（１８）記載の融合タンパク質をコードするDNA。【００４２】
（２０）（１９）記載のDNAを含むDNA断片。【００４３】
（２１）（１９）記載のDNAを含む組換えベクター。【００４４】
（２２）（２０）記載のDNA断片又は（２１）記載の組換えベクターを有する形質転換体。【００４５】
（２３）宿主が酵母であることを特徴とする、（２２）記載の形質転換体。【００４６】
（２４）上記酵母がサッカロミセス・セレビシエであることを特徴とする、（２３）記載の形質転換体。【００４７】
（２５）（２２）〜（２４）のいずれか１記載の形質転換体を培養し、上記外来タンパク質を分泌発現又は膜に発現させることを特徴とする、タンパク質生産方法。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によれば、サッカロミセス・セレビシエを始めとする種々の生物種の細胞等を宿主とした場合における、連結したタンパク質の高い分泌効率を示す分泌シグナルペプチドが提供される。本発明に従えば、タンパク質の分泌生産性が向上し、産業上、又は研究用試料としてのタンパク質の供給手段が大きく改善される。【００４９】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006-249721号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、各変異体及び野生型の培養上清におけるルシフェラーゼ(CLuc)についての相対発光強度を示す。
【図２】図２は、各変異体及び野生型の培養上清におけるルシフェラーゼ(CLuc)についての菌体量(OD600)当たりの発光値(相対値)を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明を詳細に説明する。【００５２】
本発明に係る分泌シグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのα1因子由来の分泌シグナルペプチドの変異体である。具体的には、以下の(a)又は(b)の分泌シグナルペプチドである。【００５３】
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列において、第19番目のアラニン、第20番目のアラニン、第21番目のプロリン、第22番目のバリン、第23番目のアスパラギン及び第24番目のトレオニンから成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチド；
(b)上記(a)の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列において、上記第19番目〜第24番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ配列番号２記載のアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチドと比較して、C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を3倍以上向上させる、分泌シグナルペプチド。【００５４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのα1因子由来の分泌シグナルペプチドである。配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目から第19番目のアミノ酸配列がプレ配列であり、一方、第20番目から第89番目のアミノ酸配列がプロ配列である。また、配列番号１に示される塩基配列は、サッカロミセス・セレビシエのα1因子由来の分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子(cDNA)である。【００５５】
上記(a)記載の分泌シグナルペプチドは、α1因子由来分泌シグナルペプチド(配列番号２記載のアミノ酸配列)において、第19番目のアラニン、第20番目のアラニン、第21番目のプロリン、第22番目のバリン、第23番目のアスパラギン及び第24番目のトレオニンから成る群より選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成る分泌シグナルペプチドである。このアミノ酸置換により、酵母等の宿主において、野生型α1因子由来分泌シグナルペプチド(即ち、配列番号２記載のアミノ酸配列から成るペプチド)と比較して、C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を3倍以上(例えば、3〜20倍、好ましくは5〜20倍)向上させることができる。或いは、このアミノ酸置換により、酵母等の宿主において、野生型α1因子由来分泌シグナルペプチド(即ち、配列番号２記載のアミノ酸配列から成るペプチド)と比較して、C末端側に連結したタンパク質の膜(細胞膜、小胞体膜等)への局在を向上させることができる。【００５６】
なお、上述したアミノ酸位置での置換は、単独であっても、或いは2以上を組合わせてもよい。【００５７】
ここで、他のアミノ酸とは、上述した各位置の野生型α1因子由来分泌シグナルペプチドの特定のアミノ酸以外のいずれのアミノ酸であってよいが、各位置においては、下記のアミノ酸に置換されることが好ましい。【００５８】
(1) 第19番目のアラニン：バリン、ロイシン又はイソロイシンへの置換
(2) 第20番目のアラニン：トレオニン又はセリンへの置換
(3) 第21番目のプロリン：ロイシン、バリン又はイソロイシンへの置換
(4) 第22番目のバリン：フェニルアラニン又はアラニンへの置換
(5) 第23番目のアスパラギン：チロシン又はフェニルアラニンへの置換
(6) 第24番目のトレオニン：アラニン又はバリンへの置換【００５９】
一方、上記(b)記載の分泌シグナルペプチドは、(a)記載の分泌シグナルペプチドにおいて、上記第19番目〜第24番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ野生型α1因子由来分泌シグナルペプチドと比較して、C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を3倍以上向上させることができるものである。第19番目〜第24番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第18番目や第25番目のアミノ酸が挙げられる。【００６０】
さらに、本発明に係る分泌シグナルペプチドには、上記(a)記載の分泌シグナルペプチドの第19番目〜第24番目のアミノ酸の位置における所定のアミノ酸置換を保持し、上記(a)記載の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列と少なくとも70％以上、80％以上、90％以上、好ましくは95％以上のアミノ酸配列同一性を有し、且つ野生型α1因子由来分泌シグナルペプチドと比較して、C末端側に連結したタンパク質の分泌生産量を3倍以上向上させることができるペプチドも含まれる。【００６１】
本発明に係る分泌シグナルペプチドは、外来タンパク質と連結された融合タンパク質とすることができる。ここで、外来タンパク質とは、本発明に係る分泌シグナルペプチドに対して外因的なタンパク質を意味する。当該外来タンパク質には、ペプチドも含まれる。【００６２】
ここで、外来タンパク質としては、特に限定されるものではなく、天然に存在する分泌タンパク質、膜タンパク質、又は他の非分泌性タンパク質のいずれであってもよい。ただし、非分泌性タンパク質を分泌シグナルペプチドと連結した場合においては、分泌が全く見られないケースも多い。そこで、本発明においては、非分泌性タンパク質の中でも分泌が達成されるタンパク質を外来タンパク質とする。なお、分泌タンパク質又は膜タンパク質を連結する場合には、当該タンパク質が天然に有する分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質を本発明に係る分泌シグナルペプチドに連結することが好ましい。例えば、分泌タンパク質又は膜タンパク質の分泌シグナルペプチド部分は、成熟タンパク質をN末端アミノ酸分析に供することによって、cDNAの塩基配列から得られる推定アミノ酸配列とこれを比較して知ることができる。或いは、SignalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/及びNielsen H.ら, (1997) Protein Engineering, 10:1-6)等のシグナルペプチド予測プログラムによって推定することも可能である。【００６３】
外来タンパク質の例としては、タンパク質又はペプチドの各種ホルモン(インシュリン等)、エリスロポエチン、サイトカイン(インターフェロン等)、各種酵素(インベルターゼ、アミラーゼ等)が挙げられる。或いは、近年のゲノムの大規模解析により発見された、機能が未知であるタンパク質も対象とすることができる。【００６４】
本発明に係る分泌シグナルペプチドに対して外来タンパク質を連結する位置は、本発明に係る分泌シグナルペプチドと外来タンパク質とがそれぞれの機能又は活性を有するように適宜選択することができるが、本発明に係る分泌シグナルペプチドのC末端側に外来タンパク質が連結されることが好ましい。【００６５】
本発明に係るDNAは、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNA又は上述の融合タンパク質をコードするDNA(以下、「本発明に係る融合タンパク質をコードするDNA」という)である。特に、本発明に係る融合タンパク質をコードするDNAを含むDNA断片又は組換えベクターを宿主に導入することで、融合タンパク質中の外来タンパク質を分泌発現又は膜に発現させることができる。また、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAを発現ベクター(プロモーター等を有し、タンパク質生産を主目的に用いられるベクター)に予め組み込むことにより、外来タンパク質生産のためのプラスミド構築を容易にすることが可能である。【００６６】
以下では、本発明に係る融合タンパク質をコードするDNA、又はそれを含むDNA断片若しくは組換えベクターの作製を説明する。【００６７】
先ず、本発明に係る融合タンパク質をコードするDNAの作製では、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAと外来タンパク質をコードするDNAとを準備する。本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAの準備では、例えばサッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAを鋳型として、α1因子由来分泌シグナルペプチドをコードする領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用いたPCRによって、野生型α1因子由来分泌シグナルペプチドコード領域を増幅する。次いで、増幅させたPCR産物に対して、公知の変異導入法(例えばKunkel法や変異導入を目的とした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCR)によって、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAを作製できる。或いは、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAを化学合成することも可能である。【００６８】
一方、所望の外来タンパク質をコードするDNAは、外来タンパク質が由来する生物のゲノムDNA、cDNA、mRNA等を鋳型として、該外来タンパク質コード領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用いたPCRによって増幅することで得ることができる。或いは、外来タンパク質をコードするDNAが既にクローン化されている場合には、例えば、該DNAを含むベクターより、制限酵素でベクターから切り出すことで得ることができる。或いは、外来タンパク質をコードするDNAを化学合成することもできる。【００６９】
本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAと外来タンパク質をコードするDNAとの連結においては、コドンのフレームが合うように連結させる。本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAと外来タンパク質をコードするDNAとの連結の際の位置関係は、上述したように、発現される融合タンパク質が機能するように適宜選択することができるが、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAの3'末端側に外来タンパク質をコードするDNAが機能的に連結されることが好ましい。連結手段としては、酵素(DNAリガーゼ）の反応によるものが一般的である。或いは、既に連結された状態の配列を有する二本鎖DNAを化学合成してもよい。【００７０】
本発明に係る組換えベクターは、適当なベクターに本発明に係る融合タンパク質をコードするDNAを挿入することにより得ることができる。使用するベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド等が挙げられる。シャトルベクターを用いた場合には、例えば該ベクターに大腸菌（Escherichia coli)で該ベクターが自立的に複製可能ならしめるDNA配列を含めることにより、タンパク質発現に利用する宿主と大腸菌との双方で細胞内に保持され、複製されるようにすることができる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入すること等によって複製可能となるDNA断片であってもよい。【００７１】
本発明に係る組換えベクターでは、宿主において転写開始活性を有するプロモーターが本発明に係る融合タンパク質をコードするDNAの5'末端側に機能的に連結されていることが好ましい。即ち、本発明に係る組換えベクターには、宿主に適したプロモーターが本発明に係る融合タンパク質をコードするDNAの5'末端側に機能的に連結されるように挿入されていることが好ましい。プロモーターとしては、誘導性であっても非誘導性(構成的)であってもよい。タンパク質の分泌生産性という観点より、用いる宿主において転写開始活性が強力であると認知されているもの、例えば、サッカロミセス・セレビシエ解糖系の酵素をコードする遺伝子由来のプロモーターが望ましい。例えば、そのようなプロモーターとしては、TDH3（グリセロアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子由来のプロモーター等が挙げられる。【００７２】
或いは、本発明に係る組換えベクターの作製では、プロモーター、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNA及び外来タンパク質をコードするDNAをそれぞれ別々に挿入し、連結することにより構築することもできる。【００７３】
一方、本発明に係るDNA断片では、上述の本発明に係る組換えベクターの作製に準じて、宿主において転写開始活性を有するプロモーターが本発明に係る融合タンパク質をコードするDNAの5'末端側に機能的に連結されていることが好ましい。【００７４】
なお、上述した本発明に係る組換えベクター又はDNA断片の作製に準じて、例えば、外来タンパク質生産用DNA断片又は組換えベクターとして、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするDNAを含むDNA断片又は組換えベクターを作製することもできる。次いで、分泌発現又は膜発現対象の外来タンパク質をコードするDNAを当該DNA断片又は組換えベクターに適宜挿入する。【００７５】
さらに、本発明に係る融合タンパク質をコードするDNAを含む本発明に係るDNA断片又は組換えベクター(以下、「本発明に係る組換えベクター等」という)を宿主中に導入することにより形質転換体を作製する。宿主としては、特に限定されるものではないが、例えば各種酵母を含む真性菌類及び動物細胞が挙げられる。酵母としては、いずれの酵母であってもよいが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）が挙げられ、形質転換法や遺伝子操作技術が確立されているという観点から、特にサッカロミセス・セレビシエが好ましい。また、サッカロミセス・セレビシエのα1因子由来分泌シグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ以外の異種の酵母でも機能できることが確認されている(非特許文献７)。その他の菌類としては、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム(Penicillium)属、トリコデルマ（Trichoderma）属、リゾプス(Rhizopus)属、ムコール(Mucor)属等が挙げられる。【００７６】
宿主への本発明に係る組換えベクター等の導入方法は、宿主にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、YIp系等のベクター或いは染色体への置換・挿入等の酵母等の形質転換法であってもよい。さらに酵母等を含む真性菌類又は動物細胞への本発明に係る組換えベクター等の導入方法は、一般的学術書や学術論文等に記載されているいかなる方法によってもよい。【００７７】
また、プロモーターと本発明に係る融合タンパク質をコードする遺伝子とが連結された本発明に係るDNA断片を、その両端に宿主染色体DNA配列と相同性を有するDNAを付加することで、ベクターを用いずに、宿主が本来有する相同組換え機能により、宿主細胞の染色体DNAに組み込むことも可能である。該DNA断片の宿主の導入は、上述の本発明に係る組換えベクター等の導入方法に準じて行うことができる。【００７８】
本発明に係る組換えベクター等が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR(登録商標) Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光、酵素反応等により増幅産物を確認する方法を採用してもよい。【００７９】
次いで、得られた形質転換体を生育可能な条件下で培養する。いずれの場合においても、形質転換体の培養条件は宿主の特性及び所望の外来タンパク質の安定性等を考慮して設定されることが望ましい。例えば、本実施例に示すように、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエを宿主としてウミホタル由来ルシフェラーゼ(外来タンパク質に相当する)を分泌発現させる場合には、酵母が生育し且つルシフェラーゼが失活しないように、培養温度は、例えば4〜37℃、好ましくは20〜30℃に設定する。また培地のpHは、例えば3.5〜6.5、好ましくは5.5〜6.0に設定すればよい。培養時間は、例えば1〜120時間、好ましくは対数増殖期である1〜24時間である。【００８０】
外来タンパク質が分泌タンパク質となる場合には、外来タンパク質の分泌生産量の評価は、該外来タンパク質の生産量を特異的に測定できる限り、いかなる方法によってもよく、例えば、培養液を遠心分離に供することで得られた培養上清について、該外来タンパク質の有する酵素活性、生理活性等を指標として測定可能である。また、対象の外来タンパク質に特異的な抗体を利用したウエスタンブロット法、ELISA等の一般的な免疫学的手法によって、外来タンパク質の分泌生産量を測定することができる。或いは、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを使った方法であってもよい。【００８１】
一方、外来タンパク質が膜タンパク質となる場合には、形質転換体を分離した後、膜画分を分離することで、上述した分泌タンパク質の分泌生産量の測定方法に準じて細胞膜等の膜への局在量を測定することができる。或いは、形質転換体をそのまま、外来タンパク質に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー等に供することで、細胞膜への局在量を測定してもよい。【００８２】
このようにして、分泌生産された所望の外来タンパク質は、培養上清から通常のタンパク質精製法、例えば硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等によって精製することができる。【００８３】
以上に説明したように、本発明に係る分泌シグナルペプチドによれば、宿主において外来タンパク質を効率的に分泌生産することができる。本発明に係る分泌シグナルペプチドを使用したタンパク質発現系は、分泌タンパク質発現系である。分泌タンパク質発現系は、細胞内に所望のタンパク質を蓄積させる発現系よりも、初発粗試料、即ち培養液中に所望のタンパク質以外の夾雑物が少なく、精製が比較的容易であるという利点を有する。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００８５】
本実施例では、本発明に係る分泌シグナルペプチドの改良された分泌機能により分泌される外来タンパク質として、ウミホタル(シプリディナ・ノクティルカ(Cypridina noctiluca))由来のルシフェラーゼ(以下、「CLuc」と称する)を用いた。【００８６】
一方、宿主としては、サッカロミセス・セレビシエを用いた。【００８７】
発現プラスミドpCLuRA-TDH3は、サッカロミセス・セレビシエにおいて、CLucを分泌発現させる発現ベクターであり、国際公開第2006/132350号パンフレット(国際出願PCT/JP2006/311597号;日本国特許出願2005-169768号を優先権の基礎とする)に開示されている。【００８８】
このプラスミドpCLuRA-TDH3は、野生型α1因子由来分泌シグナルペプチド(アミノ酸配列：配列番号２）とCLucの成熟タンパク質（配列番号３に示すCLucのアミノ酸配列において、1-18番目のアミノ酸配列(CLucの分泌シグナルペプチドに相当する配列)を除いたアミノ酸配列）との融合タンパク質をコードする遺伝子（以下、「αCLuc遺伝子」という)を含んでいる。【００８９】
さらにプラスミドpCLuRA-TDH3には、αCLuc遺伝子の上流(5'側)に、サッカロミセス・セレビシエのTDH3(系統的遺伝子名：YGR192C)遺伝子のプロモーターが作動可能に組み込まれている。よって、このプロモーターが作動することで、αCLuc遺伝子が発現され、α1因子由来分泌シグナルペプチドの機能によってCLucが細胞外に分泌されることとなる。【００９０】
また、プラスミドpCLuRA-TDH3には、大腸菌において機能するプラスミド複製に必要なDNA配列及びアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。従って、このプラスミドは、サッカロミセス・セレビシエ及び大腸菌の双方で複製され、保持されるシャトルベクターである。【００９１】
配列番号４に示す塩基配列は、プラスミドpCLuRA-TDH3の部分塩基配列であり、TDH3遺伝子のプロモーター、αCLuc遺伝子及びそれらの5'側と3'側の塩基配列を示している。【００９２】
〔実施例１〕変異型α1因子由来分泌シグナルペプチド(本発明に係る分泌シグナルペプチドに相当)を用いたCLucの分泌発現
1-1. 変異型α1因子由来分泌シグナルペプチド遺伝子ライブラリーの構築
プラスミドpCLuRA-TDH3において、α1因子由来分泌シグナルペプチドをコードする領域（配列番号４に示す塩基配列において第701番目から第955番目の塩基の間に相当する領域)をターゲットとして、Error Prone PCR(誤りがちPCR)を施した。このError Prone PCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した。【００９３】
sg1-f: CACCAAGAACTTAGTTTCGAGGG（配列番号５）
sg2-r: TCAGGTTCGTAAGGACAGTCCTG（配列番号６）
このError Prone PCRの反応液の組成は以下の通りであった：Taq DNA polymerase(Roche社、5 unit/μl) 1μl; 10xPCR buffer without magnesium ion 10μl; Error Prone PCR用デオキシヌクレオチド混合溶液10μl; 25mM塩化マグネシウム28μl; 5mM塩化マンガン5.0μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(150ng/μl) 1μl; sg1-f(配列番号５)(10pmol/μl)3μl; sg2-r(配列番号６)(10pmol/μl) 3μl; 滅菌水39μl。【００９４】
なお、上述のError Prone PCR用デオキシヌクレオチド混合溶液の組成は以下の通りであった：100mM dCTP 100μl; 100mM dTTP 100μl; 100mM dGTP 20μl; 100mM dATP 20μl; 滅菌水760μl。【００９５】
Error Prone PCRは、94℃で1分(変性)、45℃で1分(アニーリング)及び72℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。なお、このError Prone PCRによって得られるDNA断片は、配列番号４に示す塩基配列において第678番目から第990番目の塩基の間の領域に相当する。【００９６】
次いで、Error Prone PCRによって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約300bpのDNA断片を確認した。このDNA断片を、シグマ社GenEluteTM MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA, pH8.0)に溶解させ、「DNA溶液A」とした。「DNA溶液A」にはError Prone PCRによりランダム点突然変異が導入されたDNA分子が含まれる。【００９７】
また、配列番号４に示す塩基配列において第460番目から第700番目の塩基の間の領域をPCRにて増幅した。このPCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した。【００９８】
SQ-GPD1-F0: CATGTATCTATCTCATTTTCTTAC（配列番号７）
sg1-r: CCCTCGAAACTAAGTTCTTGGTG（配列番号８）
このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績) 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム0.8μl; SQ-GPD1-F0(配列番号７)(10pmol/μl) 0.6μl; sg1-r（配列番号８）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水12.6μl。【００９９】
PCRは、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。このPCRによって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約250bpのDNA断片を確認した。このDNA断片を、シグマ社GenEluteTM MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解させ、「DNA溶液B」とした。【０１００】
さらに、配列番号４に示す塩基配列において第968番目から第1663番目の塩基の間の領域をPCRにて増幅した。このPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した。【０１０１】
sg2-f: CAGGACTGTCCTTACGAACCTGA（配列番号９）
SQ-CLuc-CR1: TGGACAACCGTCAAACTCCTGGTTGATCTT（配列番号１０）
このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム0.8μl; sg2-f(配列番号９)(10pmol/μl) 0.6μl; SQ-CLuc-CR1（配列番号１０）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水12.6μl。【０１０２】
PCRは、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。このPCRによって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約700bpのDNA断片を確認した。このDNA断片を、シグマ社GenEluteTM MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解させ、「DNA溶液C」とした。【０１０３】
次いで、得られたDNA溶液A、DNA溶液B及びDNA溶液Cの混合物を鋳型として、PCRを行った。このPCRによって得られるDNA断片は、配列番号４に示す塩基配列において第460番目から第1663番目の塩基の間の領域に相当する。しかしながら、Error Prone PCRによって得られたDNA溶液Aを鋳型の一部として使用しているので、α1因子由来分泌シグナルペプチドをコードする領域に、点突然変異が導入されたDNA分子が含まれる。【０１０４】
このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム2μl; SQ-GPD1-F0(配列番号７)(10pmol/μl) 1.5μl; SQ-CLuc-CR1（配列番号１０）(10pmol/μl) 1.5μl; DNA溶液A 3μl; DNA溶液B 1μl; DNA溶液C 1μl; 滅菌水29μl。【０１０５】
PCRは、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分20秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。このPCR反応によって得られたPCR反応溶液の一部を1％アガロースで電気泳動した結果、約1.2kbpのDNA断片を確認した。残りのPCR反応溶液を、シグマ社GenEluteTM PCR Clean-Up Kitとエタノール沈殿で精製し、50μlのTE緩衝液に溶解させ、「DNA溶液D」とした。【０１０６】
一方、プラスミドpCLuRA-TDH3の塩基配列のうち、配列番号４に示す塩基配列において第526番目から第1555番目の塩基の間の領域を欠いた領域をPCRにて増幅した。このPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した。【０１０７】
SQ-GPD1-R0: CAGCTTTTTCCAAATCAGAGAGAGCAG（配列番号１１）
mut-CLuc-CF1: TCTCTGGCCTCTGTGGAGATCTTAAAATGA（配列番号１２）
このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム2μl; SQ-GPD1-R0(配列番号１１)(10pmol/μl) 1.5μl; mut-CLuc-CF1（配列番号１２）(10pmol/μl) 1.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水33μl。【０１０８】
PCRは、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で7分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。このPCR反応によって得られたPCR反応溶液の一部を1％アガロースで電気泳動した結果、約6.5kbpのDNA断片を確認した。残りのPCR反応溶液を、シグマ社GenEluteTM PCR Clean-Up Kitで精製し、エタノール沈殿を行った後、50μlのTE緩衝液に溶解させ、「DNA溶液E」とした。【０１０９】
このようにして得られたDNA溶液DとDNA溶液Eとにそれぞれ含まれるDNA断片は、配列番号４に示す塩基配列において第460番目から第525番目の塩基の間の配列及び第1556番目から第1663番目の塩基の間の配列を共有している。【０１１０】
サッカロミセス・セレビシエは、一般に細胞内で高い確率で相同組換えを起こす。そこで、DNA溶液DとDNA溶液Eとを同時にサッカロミセス・セレビシエに導入すれば、サッカロミセス・セレビシエ内で環状DNA(α1因子由来分泌シグナルペプチドをコードする領域に点突然変異が導入された変異型プラスミドpCLuRA-TDH3）が相同組換えにより再構成され、サッカロミセス・セレビシエはこの再構成されたプラスミドで形質転換され得る。【０１１１】
そこで、DNA溶液DとDNA溶液Eとの等量混合液を用いて、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。形質転換は、Zymo Research社のFrozen-EZ Yeast Transformation IIを用いて該製品のプロトコルに従って行った。【０１１２】
1-2. 変異型α1因子由来分泌シグナルペプチド遺伝子のスクリーニング
上記第1-1節で形質転換されたサッカロミセス・セレビシエを、ウラシルを含まない合成寒天平板培地(0.67％ Yeast nitrogen base without amino acids(ベクトンディッキンソン)、40μg/mlアデニン、20μg/ml L-アルギニン一塩酸塩、100μg/ml L-アスパラギン酸、100μg/ml L-グルタミン酸ナトリウム一水和物、20μg/ml L-ヒスチジン、60μg/ml L-ロイシン、30μg/ml L-リジン塩酸塩、20μg/ml L-メチオニン、50μg/ml L-フェニルアラニン、375μg/ml L-セリン、200μg/ml L-トレオニン、40μg/ml L-トリプトファン、30μg/ml L-チロシン、150μg/ml L-バリン、30μg/ml L-イソロイシン、2％D-グルコース及び2％寒天：以下では、単に「SD-ura寒天培地」という)に塗布し、30℃で3日間培養し、形質転換体（以下では、単に「変異体」と称する）のコロニーを形成させた。【０１１３】
変異体の各コロニーを、コロニーピッカー装置を用い、合成液体培地（SD-ura寒天培地から寒天を除き、最終濃度200mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を加えたもの：以下では、単に「buffered SD-ura培地」という)が各ウェルに0.95mlずつ分注された96穴ディープウェルプレート（各ウェル2ml容積）に接種した。ただし、96穴のうち6穴には、対照として変異導入されていないプラスミドpCLuRA-TDH3で形質転換されたサッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株（以下では、単に「野生型」と称する）を接種した。【０１１４】
変異体及び野生型のサッカロミセス・セレビシエが接種されたディープウェルプレートを、30℃で48時間、1200rpmにて振盪培養した。その後、培養液を各ウェル当たり50μlずつ、同じ培地が各ウェルに0.95mlずつ分注された96穴ディープウェルプレート（各ウェル2ml容積）に96穴フォーマットそのままに移植した。次いで、移植された培養液を含むディープウェルプレートを、30℃で48時間、1200rpmにて振盪培養した。【０１１５】
培養後、ディープウェルプレートを遠心分離し、各ウェルにつき培養上清を20μlずつ96穴フォーマットそのままに96穴プレート(黒色)に移した。【０１１６】
次いで、ベルトールド社Centro LB 960を用いてそれぞれのウェルに、ウミホタルルシフェリン溶液（1μMウミホタルルシフェリン、100mM Tris-HCl, pH7.5)を80μl加え、発光強度(1秒積算)を測定した。【０１１７】
結果の一例を図１に示す。図１は、各変異体及び野生型の培養上清におけるルシフェラーゼ(CLuc)についての相対発光強度(RLU)を示す。各バーは、1つの変異体又は野生型の結果である。右端の6本のバーは野生型の相対発光強度を示し、その他は変異体の相対発光強度を示している。【０１１８】
図１に示すような変異体の中から、野生型6クローンが示す相対発光強度平均値の3倍以上の相対発光強度を示した変異体を選択した。【０１１９】
1-3. 野生型の3倍以上の相対発光強度を示す変異体におけるアミノ酸置換の特定
上記第1-2節で選択した変異体からタカラバイオの「Genとるくん酵母用」を用いてプラスミドを含むDNAを抽出・精製した。【０１２０】
次いで、抽出・精製したDNAを使用して、大腸菌DH5α株を形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンナトリウム(100μg/ml)を含むLB(10g/l NaCl, 10g/l Bacto Trypton, 5g/l酵母エキス）寒天平板培地に塗抹し、コロニーを形成させた。【０１２１】
形成したそれぞれの1コロニーから常法によりプラスミドを抽出・精製し、配列番号４における第1番目から第2700番目の塩基の間の塩基配列を調べた。その結果、以下の変異体のアミノ酸置換を特定した(以下の記述において、例えば「G79A」とは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、第79番目のグリシン(G)がアラニン(A)に置換されていることを表す。アミノ酸の一文字記号は国際純正・応用化学連合(IUPAC)が定める記号である）。【０１２２】
(1) A19V変異体(以下、この変異体から得られたプラスミドを「pCLuRA-TDH3[αA19V]」と称する）
(2) P21L/D43V/E45G変異体
(3) V22F変異体(以下、この変異体から得られたプラスミドを「pCLuRA-TDH3[αV22F]」と称する）
(4) T24A変異体(以下、この変異体から得られたプラスミドを「pCLuRA-TDH3[αT24A]」と称する）
(5) A20T/I33V変異体
(6) V22A/T26T変異体(ここで「T26T」とは、26位のトレオニンをコードする塩基配列について、アミノ酸置換を伴わない塩基置換があることを意味する)
(7) N23Y/L64W変異体
なお、プラスミドpCLuRA-TDH3[αA19V]、pCLuRA-TDH3[αV22F]及びpCLuRA-TDH3[αT24A]について、全塩基配列を調べた結果、表記のアミノ酸置換に対応する塩基置換以外の変異が生じていないことを確認した。【０１２３】
1-4. プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L]の作製
以下のようにしてP21L単独アミノ酸置換変異プラスミド(以下、このプラスミドを「pCLuRA-TDH3[αP21L]」と称する）を作製した。【０１２４】
先ず、PCRにより直鎖状のpCLuRA-TDH3[αP21L]のDNA断片を作製した。作製にあたりPCRに使用したオリゴDNAプライマーは、以下のものであった。【０１２５】
P21L-for: CTAGTCAACACTACAACAGAAGATG（配列番号１３）
P21-rev: AGCAGCTAATGCGGAGGATGCT（配列番号１４）
プライマーP21L-forの5'末端の「CTA」なる配列は、プロリンコドンをロイシンコドンに置換する配列である。【０１２６】
このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績)0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム0.8μl; P21L-for(配列番号１３)(10pmol/μl) 0.6μl; P21-rev（配列番号１４）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水12.6μl。【０１２７】
PCRは、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で8分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。このPCRによって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約7.5kbpのDNA断片を確認した。このDNA断片をシグマ社GenEluteTM MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した。【０１２８】
次いで、得られたDNA断片の両5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。これをDNA基質としてT4 DNAリガーゼにより連結し、環状化させた。環状化させたDNAについてエタノール沈殿を行った後、50μlのTE緩衝液に溶解した。【０１２９】
さらに、この環状化されたDNAを鋳型として再度PCRを行った。用いたプライマーは、以下のものであった。【０１３０】
FAR-f: AACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCT（配列番号１５）
mut-CLuc-R: AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGT（配列番号１６）
このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績) 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム2μl; FAR-f(配列番号１５)(10pmol/μl) 1.5μl; mut-CLuc-R（配列番号１６）(10pmol/μl) 1.5μl; 上記環状化DNA溶液1μl; 滅菌水33μl。【０１３１】
PCRは、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で3分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。【０１３２】
このPCRによって得られるDNA断片は、配列番号４に示す塩基配列において第1番目から第2663番目の塩基の間の領域である。【０１３３】
次いで、このPCRによって得られたPCR反応溶液の一部を1％アガロースで電気泳動した結果、約2.5kbpのDNA断片を確認した。残りのPCR反応溶液を、シグマ社GenEluteTM PCR Clean-Up Kitとエタノール沈殿で精製した。【０１３４】
精製後のDNA断片を、制限酵素BamHI(配列番号４に示す塩基配列において第40番目の塩基から始まる6塩基が認識サイト）とXbaI(配列番号４に示す塩基配列において第2576番目の塩基から始まる6塩基が認識サイト）とで二重消化した後、全量を1％アガロースで電気泳動した。電気泳動後、約2.5kbpのDNA断片を、シグマ社GenEluteTM MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、TE緩衝液に溶解させ、「DNA溶液F」とした。【０１３５】
一方、プラスミドpCLuRA-TDH3を、同様に、制限酵素BamHIとXbaIとで二重消化した後、全量を1％アガロースで電気泳動した。電気泳動後、約5kbpのDNA断片を、シグマ社GenEluteTM MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、TE緩衝液に溶解させ、「DNA溶液G」とした。【０１３６】
次いで、DNA溶液FとDNA溶液Gとを等量混合し、T4 DNAリガーゼにより連結した。この反応溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリンナトリウム(100μg/ml)を含むLB寒天平板培地に塗抹し、コロニーを形成させた。【０１３７】
形成した1コロニーから常法によりプラスミドを抽出・精製し、全塩基配列を調べた結果、目的とするP21L置換に対応する塩基置換が生じていること、及び他の変異が生じていないことを確認した。【０１３８】
このようにして、pCLuRA-TDH3[αP21L]を作製した。【０１３９】
1-5. プラスミドpCLuRA-TDH3[αA20T]の作製
以下のようにしてA20T単独アミノ酸置換変異プラスミド(以下、このプラスミドを「pCLuRA-TDH3[αA20T]」と称する)を作製した。【０１４０】
先ず、PCRにより直鎖状のpCLuRA-TDH3[αA20T]のDNA断片を作製した。作製にあたりPCRに使用したオリゴDNAプライマーは、以下のものであった。【０１４１】
A20T-c: ACTCCAGTCAACACTACAACAGA（配列番号１７）
A20-rev: AGCTAATGCGGAGGATGCTGCG（配列番号１８）
プライマーA20T-cの5'末端の「ACT」なる配列は、アラニンコドンをトレオニンコドンに置換する配列である。【０１４２】
このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績)0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム0.8μl; A20T-c(配列番号１７)(10pmol/μl) 0.6μl; A20-rev(配列番号１８)(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水12.6μl。【０１４３】
PCRは、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、48℃で30秒(アニーリング)及び68℃で8分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。このPCRによって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約7.5kbpのDNA断片を確認した。このDNA断片をシグマ社GenEluteTM MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した。【０１４４】
次いで、得られたDNA断片の両5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。これをDNA基質としてT4 DNAリガーゼにより連結し、環状化させた。この反応溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリンナトリウム(100μg/ml)を含むLB寒天平板培地に塗抹し、コロニーを形成させた。【０１４５】
形成した1コロニーから常法によりプラスミドを抽出・精製し、全塩基配列を調べた結果、目的とするA20T置換に対応する塩基置換が生じていること、及び他の変異が生じていないことを確認した。【０１４６】
このようにして、pCLuRA-TDH3[αA20T]を作製した。【０１４７】
1-6. プラスミドpCLuRA-TDH3[αV22A]及びpCLuRA-TDH3[αN23Y]の作製
上記第1-5節のプラスミドpCLuRA-TDH3[αA20T]の作製方法に準じて、V22A単独アミノ酸置換変異プラスミド(以下、このプラスミドを「pCLuRA-TDH3[αV22A]」と称する)及びN23Y単独アミノ酸置換変異プラスミド(以下、このプラスミドを「pCLuRA-TDH3[αN23Y]」と称する)を作製した。ただし、PCRで用いたプライマーは、pCLuRA-TDH3[αV22A]については以下のものであった。【０１４８】
V22A: GCTAACACTACAACAGAAGATGAAA（配列番号１９）
V22-rev-c: TGGAGCAGCTAATGCGGAGGAT（配列番号２０）
一方、pCLuRA-TDH3[αN23Y]についてPCRで用いたプライマーは以下のものであった。【０１４９】
N23Y: TACACTACAACAGAAGATGAAACGG（配列番号２１）
N23-rev-c: GACTGGAGCAGCTAATGCGGAG（配列番号２２）
それぞれのプラスミドについて、全塩基配列を調べた結果、目的とするアミノ酸置換に対応する塩基置換が生じていること、及び他の変異が生じていないことを確認した。【０１５０】
このようにして、pCLuRA-TDH3[αV22A]及びpCLuRA-TDH3[αN23Y]を得た。【０１５１】
1-7. 再現実験(1)
プラスミドpCLuRA-TDH3、pCLuRA-TDH3[αA19V]、pCLuRA-TDH3[αP21L]、pCLuRA-TDH3[αV22F]及びpCLuRA-TDH3[αT24A]を用いて、それぞれサッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。【０１５２】
形質転換後、SD-ura寒天培地上のコロニーをそれぞれ3つずつ任意に選択して、96穴ディープウェルプレート（各ウェル2ml容積）の各穴(ウェル)に0.95mlずつ分注されたbuffered SD-ura培地にそれぞれ接種した。接種後のディープウェルプレートを、30℃で48時間、1200rpmにて振盪培養した。【０１５３】
培養後、培養液を各ウェル当たり50μlずつ、同じ培地が各ウェルに0.95mlずつ分注された96穴ディープウェルプレート（各ウェル2ml容積）に96穴フォーマットそのままに移植した。【０１５４】
次いで、移植された培養液を含むディープウェルプレートを、30℃で48時間、1200rpmにて振盪培養した。【０１５５】
培養後、各ウェルの培養液から100μlずつを透明な96穴プレートに移し、600nmにおける吸光度(即ち、菌体密度)を測定した（ブランクはbuffered SD-ura培地）。さらに、ディープウェルプレートを遠心分離し、上記第1-2節で説明した方法と同じ方法により培養上清中のルシフェラーゼ(CLuc)についての相対発光強度(RLU)を測定した。【０１５６】
結果を以下の表１に示す。
【表１】
2008032659.tif 000003
【０１５７】
表１から明らかなように、野生型(プラスミドpCLuRA-TDH3)と比較して、A19V変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αA19V])とP21L変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L])では少なくとも7倍、V22F変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αV22F])では少なくとも4倍、T24A変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αT24A])では少なくとも3.5倍の菌体量(OD600)当たりの発光値の増強、即ちルシフェラーゼタンパク質分泌量の増加が観察された。【０１５８】
1-8. 再現実験(2)
プラスミドpCLuRA-TDH3、pCLuRA-TDH3[αA19V]、pCLuRA-TDH3[αA20T]、pCLuRA-TDH3[αP21L]、pCLuRA-TDH3[αV22A]、pCLuRA-TDH3[αV22F]、pCLuRA-TDH3[αN23Y]及びpCLuRA-TDH3[αT24A]を用いて、それぞれサッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。【０１５９】
形質転換後、SD-ura寒天培地上のコロニーをかき取り、1mlのbuffered SD-ura培地が予め分注されたディープウェルプレートの各ウェルに植菌した。各変異体(形質転換体)につき、6ウェルづつ植菌した。植菌後のディープウェルプレートを、30℃で45時間、1200rpmにて振盪培養した。【０１６０】
培養後、培養液を各ウェル当たり50μlずつ、同じ培地が各ウェルに0.95mlずつ分注された96穴ディープウェルプレートに96穴フォーマットそのままに移植した。【０１６１】
次いで、移植された培養液を含むディープウェルプレートを、30℃で23時間、1200rpmにて振盪培養した。【０１６２】
培養後、各ウェルの培養液から50μlずつを透明な96穴プレートに移し、600nmにおける吸光度(即ち、菌体密度)を測定した。さらに、ディープウェルプレートを遠心分離し、上記第1-2節で説明した方法と同じ方法により培養上清中のルシフェラーゼ(CLuc)についての相対発光強度(RLU)を測定した。ただし、分注するルシフェリンの濃度は5μMとした。また、相対発光強度を菌体密度で除し、さらに野生型の値が1になるように正規化した。【０１６３】
結果を、図２及び以下の表２に示す。図２において、各バーは表記した各変異体又は野生型の結果であり、横軸は菌体量(OD600)当たりの発光値(相対値)を示す。なお、図２及び表２における結果は、上記において各変異体又は野生型が植菌された後、移植された6ウェル(N=6)由来の各培養液からの平均値及び標準偏差である。
【表２】
2008032659.tif 000004
【０１６４】
図２及び表２から明らかなように、野生型(プラスミドpCLuRA-TDH3)と比較して、A19V変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αA19V])とP21L変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L])では約20倍、V22A変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αV22A])では約15倍、A20T変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αA20T])、V22F変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αV22F])、N23Y変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αN23Y])及びT24A変異体(プラスミドpCLuRA-TDH3[αT24A])でもそれぞれ5倍以上の菌体量(OD600)当たりの発光値の増強、即ちルシフェラーゼタンパク質分泌量の増加が観察された。【０１６５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2008032659.tif 000005
【図２】
2008032659.tif 000006
【配列表】
2008032659000001.app
【国際調査報告】
2008032659.tif 000007
2008032659.tif 000008