(57)【要約】  本発明はＨＧＦおよび精製白糖を含有するＨＧＦ製剤である。本ＨＧＦ製剤は長期間の保存でも安定であるという特長を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦおよび精製白糖を含有するＨＧＦ製剤。
【請求項２】
精製白糖の含有量がＨＧＦ１重量部に対して０．０１〜９重量部である請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ製剤
【請求項３】
さらに、中性アミノ酸を含有する請求の範囲第１または２項に記載のＨＧＦ製剤。
【請求項４】
中性アミノ酸がアラニンである請求の範囲第３項に記載のＨＧＦ製剤。
【請求項５】
さらに、緩衝剤を含有する請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のＨＧＦ製剤。
【請求項６】
緩衝剤がクエン酸塩である請求の範囲第５項に記載のＨＧＦ製剤。
【請求項７】
さらに、塩化ナトリウムを含有する請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のＨＧＦ製剤。
【請求項８】
ＨＧＦおよび精製白糖の他に、さらに中性アミノ酸、塩化ナトリウム、緩衝剤および界面活性剤を含有する請求の範囲第１または２項に記載のＨＧＦ製剤。
【請求項９】
中性アミノ酸がアラニンであり、緩衝剤がクエン酸塩であり、界面活性剤がポリソルベートである請求の範囲第８項に記載のＨＧＦ製剤。
【請求項１０】
凍結乾燥製剤である請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載のＨＧＦ製剤。
【請求項１１】
ＨＧＦに精製白糖を添加してＨＧＦ重合体生成を抑制することを特徴とするＨＧＦの安定化方法。
【請求項１２】
精製白糖の添加量がＨＧＦ１重量部に対して０．０１〜９重量部である請求の範囲第１１項に記載の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＧＦ（Hepatic  Growth  Factor、肝細胞増殖因子）を含有する製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＧＦは、中村らにより発見された、成熟肝細胞に対して最も強力な増殖促進活性を持つ生理活性ペプチドであり（例えば、非特許文献１参照）、近年生物工学的手法により量産が可能になった（例えば、非特許文献２参照）。このＨＧＦは、肝炎や肝硬変のみならず、腎炎や癌などに対する治療・予防薬として、また制癌剤の副作用抑制剤や創傷治癒剤などへの適用も期待されている。
ＨＧＦの製剤としては、特許文献１に、ＨＧＦにアルブミン、ヒト血清、ゼラチン、ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどを安定化剤として含有させた水溶液製剤が開示されている。しかしながら、前記ＨＧＦ水溶液製剤は保存中にＨＧＦが凝集、白濁、ゲル化が進行するという難点があり、また重合体が形成されるなど物理化学的安定性が低く、生物活性が低下するという問題がある。【０００３】
この問題を解決するために、特許文献２には、ＨＧＦにアルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸などを安定化剤として含有させた凍結乾燥製剤が開示されている。また、特許文献３には、ＨＧＦにグリシン、アラニン、ソルビトール、マンニトール、デキストラン硫酸などを安定化剤として含有させた凍結乾燥製剤が開示されている。
上記の凍結乾燥製剤は、ＨＧＦの安定化をある程度達成することができるが、さらに安定化効果のよいＨＧＦ製剤が望まれている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９０／１０６５１号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ００／７２８７３号パンフレット
【特許文献３】特開平９−２５２４１号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２，１４５０，１９８４
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０，１９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来のＨＧＦ製剤に比べて、長期間の保存でもより安定なＨＧＦ製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＧＦに精製白糖を添加することにより、ＨＧＦの重合体生成が阻害され、安定なＨＧＦ製剤が得られることを見出し、この知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］ＨＧＦおよび精製白糖を含有するＨＧＦ製剤、
［２］精製白糖の含有量が、ＨＧＦ１重量部に対して０．０１〜９重量部である前記［１］に記載のＨＧＦ製剤、
［３］さらに、中性アミノ酸を含有する前記［１］または［２］に記載のＨＧＦ製剤、
［４］中性アミノ酸がアラニンである前記［３］に記載のＨＧＦ製剤、
［５］さらに、緩衝剤を含有する前記［１］〜［４］のいずれかに記載のＨＧＦ製剤、
［６］緩衝剤がクエン酸塩である前記［５］に記載のＨＧＦ製剤、
［７］さらに、塩化ナトリウムを含有する前記［１］〜［６］のいずれかに記載のＨＧＦ製剤、
［８］ＨＧＦおよび精製白糖の他に、さらに中性アミノ酸、塩化ナトリウム、緩衝剤および界面活性剤を含有する前記［１］または［２］に記載のＨＧＦ製剤、
［９］中性アミノ酸がアラニンであり、緩衝剤がクエン酸塩であり、界面活性剤がポリソルベートである前記［８］に記載のＨＧＦ製剤、
［１０］凍結乾燥製剤である前記［１］〜［９］のいずれかに記載のＨＧＦ製剤、
［１１］ＨＧＦに精製白糖を添加してＨＧＦ重合体生成を抑制することを特徴とするＨＧＦの安定化方法、および
［１２］精製白糖の添加量がＨＧＦ１重量部に対して０．０１〜９重量部である前記［１１］に記載の安定化方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＨＧＦ製剤は、長期間保存しても、従来のＨＧＦ製剤に比べてより安定であるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＨＧＦおよび精製白糖を含有してなるＨＧＦ製剤である。【０００９】
本発明の有効成分であるＨＧＦは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。また、本発明に用いるＨＧＦはアミノ酸５残基が欠失したデリーションタイプ（ｄＬｅＨＧＦ）であってもよい。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られており、例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器、血小板、白血球などの血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる。また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞など）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養物から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature,342,440,1989など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物または動物細胞などを用いることができる。【００１０】
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの通常の蛋白質精製法にて精製することができる。また、遺伝子組換法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。【００１１】
本発明の精製白糖は、第十五改正日本薬局方に収載されている精製白糖を安定化剤として好適に使用することができる。精製白糖の添加量は、ＨＧＦ１重量部に対して、０．０１〜９重量部が好ましく、特に０．１〜５重量部の範囲が好ましいが、下限のより好ましい値は０．５重量部であり、上限のより好ましい値は４重量部、さらに好ましい値は３重量部、特に好ましい値は２重量部である。【００１２】
本発明の製剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤、クリーム剤、スプレー剤など）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦおよび精製白糖のみまたはそれらと慣用の添加物（担体など）と共に水溶性製剤、凍結乾燥製剤などとするのが好ましく、とりわけ凍結乾燥製剤が好ましい。【００１３】
本発明のＨＧＦ製剤は、ＨＧＦおよび精製白糖を含有する水溶液とすることで水溶液製剤とすることができ、また該水溶液を通常の凍結乾燥方法で凍結乾燥することでＨＧＦ凍結乾燥製剤を製造できる。前記水溶液における精製白糖の含有量は０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上であって、９重量％以下、好ましくは５重量％以下、より好ましくは４重量％以下、さらに好ましくは３重量％以下、特に好ましくは２重量％以下である。凍結乾燥製剤における精製白糖の含有量は１０〜８０重量％が好ましく、特に２０〜６０重量％が好ましい。例えば、凍結乾燥製剤は、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌水、注射用蒸留水、緩衝液、生理食塩水など）に溶解した後、精製白糖を好ましくは０．１〜５重量％、特に好ましくは０．５〜２重量％となるように添加し、必要に応じて、精製白糖以外の安定化剤、緩衝剤、界面活性剤、塩化ナトリウムなどを加え、フィルターなどで濾過して滅菌し、バイアルまたはアンプルに注入して凍結乾燥する。フィルターは、ポアサイズ０．２２μｍ以下の滅菌用フィルターを使用するのが好ましい。滅菌用フィルターとしては、例えば、デュラポア（登録商標、日本ミリポア株式会社製）またはザルトポア２（登録商標、ザルトリウス株式会社製）などが挙げられる。凍結乾燥方法としては、例えば、常圧下で冷却凍結する凍結過程、溶質に拘束されない自由水を減圧下で昇華乾燥する一次乾燥過程、溶質固有の吸着水や結晶水を除去する二次乾燥過程の３つの単位操作による方法が挙げられる。凍結過程の冷却温度は−６０℃〜−４０℃が好ましく、一次乾燥過程の温度は−５０℃〜０℃が好ましく、さらに二次乾燥過程の温度は４℃〜４０℃が好ましい。真空圧力は０．１〜１．５Ｐａが好ましく、特に０．５〜１．２Ｐａが好ましい。凍結乾燥後の乾燥庫内は復圧させる。復圧の方法としては、無菌の空気または不活性ガス（例えば、無菌窒素ガス、無菌ヘリウムガスなど）を庫内に送入して約７０〜１００ｋＰａ、好ましくは約８０〜９５ｋＰａまで一次復圧し、次いで大気圧まで復圧（二次復圧）する方法が好ましい。バイアルの打栓は、一次復圧後に行うのが好ましい。【００１４】
安定化剤は精製白糖のみでもよいが、精製白糖と共に従来安定化剤として用いられていたグリシン、アラニン、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどのアミノ酸、ヘパリン、デキストラン硫酸などの多糖類、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコールなどを好適に使用できる。これらのうち、アミノ酸が好ましく、とりわけアミノ酸のうちグリシン、アラニンなどの中性アミノ酸が好ましい。これらの精製白糖以外の安定化剤の添加量は特に制限されないが、例えばグリシン、アラニンなどの中性アミノ酸を用いる場合の添加量は、精製白糖１重量部に対して、０．０１〜５０重量部が好ましく、０．１〜２０重量部がより好ましい。
安定化剤として、精製白糖と共に中性アミノ酸などの従来の安定化剤を併用することにより、精製白糖のみを用いる場合に比べて安定性をより向上させることができる。【００１５】
本発明で用いられる緩衝剤としては、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。緩衝剤は、再溶解後の水溶液のｐＨを調整しＨＧＦの溶解性を保つ作用を有する。緩衝剤は、再溶解後の水溶液のｐＨが４．５〜６．５となるものが好ましい。緩衝剤として好ましいものは、クエン酸緩衝液が挙げられ、特に好ましくはクエン酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。このクエン酸緩衝液は、再溶解後の水溶液中でのＨＧＦの安定化にも寄与する。緩衝剤の添加量は、凍結乾燥製剤を製造する際の凍結乾燥直前の水溶液中の濃度が、１〜１００ｍＭの範囲となるようにするのが好ましい。【００１６】
本発明で用いられる界面活性剤としては、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコールなどが挙げられ、二種以上を併用してもよい。界面活性剤として特に好ましくは、ポリソルベート系界面活性剤が好ましく、とりわけポリソルベート８０が好ましい。ＨＧＦが容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすいため、このような界面活性剤を添加することによって、再溶解後のＨＧＦの容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量は、凍結乾燥製剤を製造する際の凍結乾燥直前の水溶液中の濃度が、０．００１〜２．０重量％の範囲であるのが好ましい。【００１７】
塩化ナトリウムは、ＨＧＦの溶解性を保つ作用を有する。すなわち、例えば実施例で使用した組換ＨＧＦの場合、塩化ナトリウムの添加により組換ＨＧＦの溶解度が向上し、特に３００ｍＭ以上では著しく溶解性が向上する。塩化ナトリウムの添加量は浸透圧比により制限を受けるが、一般的に用いられる注射剤の浸透圧比を示す量でよい。特に医療用または動物薬用注射剤の浸透圧比として許容される浸透圧比１〜３となる量が好ましい。通常、凍結乾燥製剤を製造する際の凍結乾燥直前の水溶液中の塩化ナトリウム濃度が１５０〜１０００ｍＭとすることが好ましい。【００１８】
本発明においては、製剤化に必要な他の添加剤、例えば、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤などを含んでもよい。【００１９】
上記の如くして得られる本発明の製剤、例えば凍結乾燥製剤は、使用に当たっては、ＨＧＦ濃度が０．１〜４０ｍｇ／ｍＬとなるように注射用蒸留水に溶解し、注射液として用いることができる。さらに、凍結乾燥製剤を含有するクリーム剤、スプレー剤などの外用剤とすることもできる。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例においては、ＨＧＦとして５アミノ酸欠失型ＨＧＦを用いた。ＨＧＦの重合体の面積百分率（％）（以下、重合体含量（％）という）は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量した値を用いて下記式１により求めた。
【式１】
【００２１】
2008102849.tif 000002
式中、ＡＭはＨＧＦピーク面積、ＡＡは重合体ピーク面積を示す。
【００２２】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ゲルろ過カラム（商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００、アマシャムバイオサイエンス社製）
移動相：塩化ナトリウム５８．４４ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物２．９４ｇ、ポリソルベート８０  ０．１ｇを水に溶かし、１Ｌとした液をＡ液とする。塩化ナトリウム５８．４４ｇ、クエン酸一水和物２．１０ｇ、ポリソルベート８０  ０．１ｇを水に溶かし、１Ｌとした液をＢ液とする。Ａ液にＢ液を加え、ｐＨ６．０に調整後、０．４５μｍのフィルター（商品名：Ｍｉｌｌｃｕｐ−ＨＶ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）でろ過し、使用前に脱気する。室温で保存し、２週間以内に使用する。
カラム温度：２５℃
流量：０．５ｍＬ／分
検液注入量：２５μＬ
分析時間：６０分
検出器：吸光光度計
検出波長：２８０ｎｍ
サンプルクーラー：５分
分子量マーカーは、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（カタログ番号：１５１−１９０１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）バイアル１本に水５００μＬを加え溶解し、少量試液調整用ろ過フィルター（商品名：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、孔径：０．４５μｍ、ミリポア社製）でろ過し、２〜８℃で保存し、３ヶ月以内のものを使用する。
【００２３】
また、下記実施例および試験例で用いた希釈用緩衝液は下記のように調製した。
（希釈用緩衝液の調製）
塩化ナトリウム１．１６８８ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物２．９４ｇ、ポリソルベート８０  ０．３ｇを超純水に溶かし、全量１Ｌとした液をＡ液とした。塩化ナトリウム１．１６８８ｇ、クエン酸一水和物２．１０ｇ、ポリソルベート８０  ０．３ｇを超純水（超純水製造装置（商品名：ＭｉｌｌｉＱ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ、ミリポア社製）を用いて調製、以下同じ）に溶かし、全量１Ｌとした液をＢ液とした。Ａ液にＢ液を加えてｐＨ６．０に調整し、希釈用緩衝液（１）とした。
塩化ナトリウム１７．５３ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物２．９４ｇ、ポリソルベート８０  ０．１ｇを超純水に溶かし、全量１Ｌとした液をＣ液とした。塩化ナトリウム１７．５３ｇ、クエン酸一水和物２．１０ｇ、ポリソルベート８０  ０．１ｇを超純水に溶かし、全量１Ｌとした液をＤ液とした。Ｃ液にＤ液を加えてｐＨ６．０に調整し、希釈用緩衝液（２）とした。
【００２４】
［実施例１］
希釈用緩衝液（１）に、５アミノ酸欠失型ＨＧＦ（以下、単にＨＧＦという）を１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、精製白糖を０．５重量％濃度となるように添加することによって下記表１の組成の溶液が得られた。
【表１】
2008102849.tif 000003
得られた上記溶液をバイアル（φ２３×４３ｍｍ）に２ｍＬずつ無菌的に分注した。バイアルにゴム栓を半打栓し、トレイに整列させ、凍結乾燥機（トリオマスター；共和真空技術株式会社製）に入れ、下記表２に記載した条件で凍結乾燥を実施した。なお、表中の→は、温度を変化させたことを示す。
【表２】
2008102849.tif 000004
凍結乾燥終了後、トリオマスター庫内に無菌窒素を送入して復圧（庫内圧力：８８．０ｋＰａ；一次復圧）し、ゴム栓を全打栓してから無菌窒素でトリオマスター庫内を大気圧に戻し（二次復圧）、バイアルを取り出した後、速やかにバイアルをキャップで締めた。このようにして、本発明のＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
本ＨＧＦ凍結乾燥製剤における精製白糖の含有量は、ＨＧＦ１重量部に対して０．５重量部であり、ＨＧＦ凍結乾燥製剤に対して２６．３重量％である。
【００２５】
［実施例２］
精製白糖の添加濃度を１．０重量％とする以外は、実施例１と同様にして、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
本ＨＧＦ凍結乾燥製剤における精製白糖の含有量は、ＨＧＦ１重量部に対して１重量部であり、ＨＧＦ凍結乾燥製剤に対して４１．７重量％である。
【００２６】
［実施例３］
精製白糖の添加濃度を２．０重量％とする以外は、実施例１と同様にして、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
本ＨＧＦ凍結乾燥製剤における精製白糖の含有量は、ＨＧＦ１重量部に対して２重量部であり、ＨＧＦ凍結乾燥製剤に対して５８．８重量％である。
【００２７】
［実施例４］
精製白糖の添加濃度を１．０重量％とし、さらにアラニンを５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加する以外は、実施例１と同様にして、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
本ＨＧＦ凍結乾燥製剤における精製白糖の含有量は、ＨＧＦ１重量部に対して１重量部であり、ＨＧＦ凍結乾燥製剤に対して３４．５重量％である。
【００２８】
［比較例１］
添加剤を精製白糖の代わりに、アラニンを２０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加する以外は、実施例１と同様にして、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
【００２９】
［比較例２］
精製白糖を添加しない以外は、実施例１と同様（以下、基本処方という）にして、ＨＧＦ凍結乾燥製剤を得た。
【００３０】
［試験例１］
上記実施例および比較例記載の凍結乾燥製剤を５０℃で保存し、１週間後にサンプリングし、タンパク質濃度５ｍｇ／ｍＬになるように希釈用緩衝液（２）で希釈し、ＨＰＬＣを用いて定量後、上記式１から重合体含量（％）を算出した。その結果を下記表３に示す。
【表３】
2008102849.tif 000005
表３から明らかなように、基本処方に精製白糖または精製白糖とアラニンを添加した本発明のＨＧＦ製剤は、基本処方または基本処方にアラニンを添加したＨＧＦ製剤に比べて、顕著に重合体含量が抑制されていた。
【００３１】
［試験例２］
希釈用緩衝液（２０ｍＭ クエン酸緩衝液, １Ｍ塩化ナトリウム,ポリソルベート８０  ０．０１重量％）に、ＨＧＦを１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、精製白糖を０重量％濃度、１重量％濃度、５重量％濃度、１０重量％または２０重量％濃度となるように添加した試料溶液１〜５を各５０μＬ調製した。各試料溶液は、測定に供するまで、約２４時間凍結した。凍結した各試料溶液を再融解し、ＨＧＦの分子量（約８４ｋＤａ）分布を動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，  ＤＬＳ）法で測定した。測定装置は、蛋白質溶液専用のＰｒｏｔｅｉｎ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ社製Ｄｙｎａ−Ｐｒｏを用いた。測定温度は４℃に設定した。バックグランドには、ＨＧＦを含まない希釈用緩衝液（各５０μＬ）を用いた。各試料溶液中におけるＨＧＦの分子量の多分散度（Ｐｄ％）を表４に示す。
【表４】
2008102849.tif 000006
表４から明らかなように、精製白糖を１重量％または５重量％となるように添加した試料溶液２および３では、Ｐｄ％値が極めて小さく、ＨＧＦの分子量分布が単分散（単一様相）であることを示した。試料溶液１、４および５では、ＨＧＦの分子量分布ピークがブロードであり、異なる分子量を有するものを含むことが示唆された。また試料溶液４および５では高分子側にもう一つピークが現れ、試料溶液５においては、さらに低分子のものが多量に含まれていることを示すピークも現れた。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、医薬として有用な保存安定性の優れたＨＧＦ製剤を提供できる。
【国際調査報告】
2008102849.tif 000007
2008102849.tif 000008
2008102849.tif 000009
2008102849.tif 000010