【手続補正書】
【提出日】平成16年10月28日(2004.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  （ａ）配列番号１４８〜２５０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子、
（ｂ）配列番号１〜１４７の核酸配列を含む核酸分子、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸分子、または
（ｄ）（ａ）または（ｂ）の核酸分子と少なくとも６０％の配列同一性を有する核酸分子、
を含む、単離核酸分子。
【請求項２】  核酸分子がｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】  核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】  核酸分子が哺乳類の核酸分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】  核酸分子がヒトの核酸分子である、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】  試料中の大腸特異的核酸（ＣＳＮＡ）の存在を決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子を、該核酸分子が大腸特異的核酸に選択的にハイブリダイズする条件下で、試料と接触させる工程、および
（ｂ）該核酸分子の試料中のＣＳＮＡへのハイブリダイゼーションを検出する工程、
を含み、ハイブリダイゼーションの検出が、試料中のＣＳＮＡの存在を示す、前記方法。
【請求項７】  請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項８】  請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項９】  請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）１または２以上の発現制御配列に作動可能に連結した核酸分子を含む宿主細胞を提供する工程、および（ｂ）ポリペプチドが産生される条件下で宿主細胞を培養する工程、を含む、前記方法。
【請求項１０】  請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１１】  （ａ）配列番号１４８〜２５０と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｂ）配列番号１〜１４７の核酸配列を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群から選択される単離ポリペプチド。
【請求項１２】  請求項１０または１１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。
【請求項１３】  試料中の大腸特異的タンパク質の存在を決定する方法であって、
（ａ）請求項１２に記載の抗体またはその断片を、該抗体またはその断片が大腸特異的タンパク質に選択的に結合する条件下で、試料と接触させる工程、および
（ｂ）試料中の大腸特異的タンパク質への抗体またはその断片の結合を検出する工程、
を含み、結合の検出が試料中の大腸特異的タンパク質の存在を示す、前記方法。
【請求項１４】  患者における大腸癌の存在および転移を検出およびモニタリングする方法であって、
（ａ）患者試料中の請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子または請求項１０〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの量を決定する工程、および
（ｂ）患者試料中の決定された核酸分子またはポリペプチドの量を、正常対象中の請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子または請求項１０〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの量と比較する工程
を含み、試料中の核酸分子またはポリペプチドの量の、正常対照における核酸分子またはポリペプチドの量に対する差が、大腸癌の存在に関連している、前記方法。
【請求項１５】  患者における癌の危険性または癌の存在を検出するためのキットであって、該キットが、患者試料中の請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子または請求項１０〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの存在を決定するための手段を含む、前記キット。
【請求項１６】  請求項１２に記載の抗体またはその断片の、大腸癌を有する患者を処置するための医薬組成物の製造への使用。
【請求項１７】  請求項１０または１１に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含むワクチン。
【請求項１８】  請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項１０〜１１のいずれかに記載のポリペプチド、および請求項１２に記載の抗体またはその断片からなる群から選択される１種または２種以上の成分を含む、大腸癌の存在および／または転移を診断するための組成物。
【請求項１９】  請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項１０〜１１のいずれかに記載のポリペプチド、および請求項１２に記載の抗体またはその断片からなる群から選択される１種または２種以上の成分を含む、大腸癌を処置するための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
病期０は、上皮内癌 (Tis)によって特徴付けられ、ここで癌細胞は、腺基底膜（上皮内）または固有層（粘膜内）の内側に局在している。同書84-85; Burdette、上記127。この病期において、癌は領域リンパ節に広がっておらず（N0）、遠隔転移もない（M0）。Fleming et al. eds.、上記85; Burdette、上記127。病期１において、未だ領域リンパ節への癌の広がりはなく、遠隔転移もないが、腫瘍は粘膜下組織に侵入しているか（T1）、または進行し、さらに固有筋層に侵入している（T2）。Fleming et al. eds.、上記84-85; Burdette、上記127。病期２もまた、領域リンパ節への癌の広がりはなく、遠隔転移もないが、腫瘍は、漿膜下組織または非腹膜結腸周囲（nonperitonealized pericolic）または直腸周囲組織に侵入しているか（T3）、または他の器官もしくは構造に侵入する程に進行しているか、および／または臓側腹膜を穿孔している（T4）。同書。病期３は、任意のTのサブステージによって特徴付けられ、遠隔転移がなく、１〜３の領域リンパ節に転移があるか（N1）、または４もしくは５以上の領域リンパ節に転移がある（N2）。Fleming et al. eds.、上記85; Burdette、上記127。最後に、病期４は、遠隔転移とともに、任意のTまたはNのサブステージを含む。同書。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
近年、病理学的病期分類がより正確な予後を提供するので、大腸癌の病理学的病期分類は、臨床的な病期分類に対し好ましい。病理学的病期分類は、典型的には、切除した大腸切片の検査を含み、これは腹腔の外科的検査を伴なう。Fleming et al. eds.、上記84。臨床的な病期分類は、対応物の浸襲性手順に依存しないので、少なくとも病理学的な病期分類と同様に正確であれば、その病期分類は好ましい。
結腸直腸癌の処置になれば、外科的切除によって、およそ５０％の患者が治癒する。Burdette、上記125。放射線照射は、結腸直腸癌の処置において、術前にも術後にも用いられる。同書125、132-33。化学療法剤、特に5-フルオロウラシルもまた、結腸直腸癌の処置において強力な武器である。同書125、133。他の剤には、イリノテカン（irinotecan）およびフロクスウリジン、シスプラチン、レバミゾール、メトトレキサート、インターフェロン・アルファおよびロイコボリンが含まれる。同書133。それでもなお、３０〜４０％の患者が、外科的切除の後、大腸癌の再発を発症し、これは多くの患者において死の最大要因である。Wayne De Vos, Follow-up After Treatment of Colon Cancer, Colon and Rectal Cancer 225 (Peter S. Edelstein ed., 2000)。したがって、大腸癌患者を緊密にモニターし、治療への応答を決定し、持続性または再発性の疾患および転移を検出しなくてはならない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、または、分子種、例えば本発明のポリペプチドへの特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト抗体の酵素的または化学的開裂により作製することができる。抗原結合部分は、とりわけ、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dAbおよび相補性決定領域断片、一本鎖抗体、キメラ抗体、ダイアボディ(diabody)、および、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの部分を少なくとも含むポリペプチドを含む。Fab断片は、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる単価断片であり、F(ab')2断片は、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって架橋した2個のFab断片を含む二価の断片であり、Fd断片は、VHおよびCH1ドメインからなり、Fv断片は、抗体の短腕のVLおよびVHドメインからなり、そしてdAb断片は、VHドメインからなる。例えば、Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)を参照。
本明細書中で、「特異的に結合する」および「特異的結合」とは、抗体および第一の分子種とともに混合されている他の分子種への結合に優先して、第一の分子種に結合する抗体の能力を意味する。抗体は、それが第一の分子種に特異的に結合する場合、特別に、第一の分子種を「認識する」という。
一本鎖抗体（scFv）は、VLおよびVH領域が組になり、これらを単一のタンパク質鎖として作出されること可能にする合成リンカーを介して、単価分子を形成している抗体である。例えば、Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)を参照。ダイアボディは、二価の両特異的抗体であって、VHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上の２つのドメイン間の対合を許容するには短すぎるリンカーを用いており、これによって、該ドメインを他の鎖の相補ドメインと対合することを余儀なくさせ、２つの抗原結合部位が創出されるものである。例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)を参照。１または２以上のCDRは、共有結合的に、または非共有結合的に分子中に組み込まれ、それを免疫付着因子（immunoadhesin）にすることができる。免疫付着因子は、CDRをより大きなポリペプチド鎖の部分として組み込んでもよく、CDRを他のポリペプチド鎖に共有結合させてもよく、または、CDRを非共有結合的に組み込んでもよい。CDRにより、免疫付着因子は、対象となる特定の抗原に特異的に結合することができる。キメラ抗体は、１の抗体からの１または２以上の領域と１または２以上の他の抗体の１または２以上の領域とを含む抗体である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
他の修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、リン原子は含まないが、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１または２以上の短鎖へテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合(一部ヌクレオシドの糖部分から形成されている)を有するもの、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、および混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の構成部分を有するその他のものを含む。上記主鎖の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されることなく、米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号および第5,677,439号が挙げられ、その開示の全体は、参照により本明細書中に組み込まれる。
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体においては、糖およびヌクレオシド間結合の両方が、ペプチド核酸(ＰＮＡ)などの新規な基で置換されている。ＰＮＡ化合物では、核酸のホスホジエステル主鎖は、アミド含有主鎖で、特にアミド結合で連結された反復するＮ−(2−アミノエチル)グリシンユニットによって置換されている。核酸塩基は、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に、典型的には、メチレンカルボニル結合で結合している。ＰＮＡは、ペプチド合成プロトコル変法を用いて合成することができる。ＰＮＡオリゴマーは、ＦｍｏｃおよびｔＢｏｃ法の両方によって合成することができる。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されることなく、米国特許第5,539,082、5,714,331および5,719,262号が挙げられ、その開示の全体は、参照により本明細書中に組み込まれる。自動ＰＮＡ合成は、市販の合成機で容易に達成できる(例えば、"PNA User’s Guide," Rev. 2, February 1998, Perseptive Biosystems Part No. 60138, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA参照)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
タンパク質の、種々のアミン反応性またはチオール反応性フルオロフォアとの結合を可能にするキットが市販されている。例えばMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR, USA)は、アレクサフルオール350、アレクサフルオール430、フルオレセイン-EX、アレクサフルオール488、オレゴングリーン488、アレクサフルオール532、アレクサフルオール546、アレクサフルオール546、アレクサフルオール568、アレクサフルオール594およびテキサスレッド-Xへタンパク質を結合するためのキットを提供している。
多種多様なタンパク質のアミノ反応性およびチオール反応性フルオロフォアが市販されており、これは、アレクサフルオール（登録商標）350、アレクサフルオール（登録商標）488、アレクサフルオール（登録商標）532、アレクサフルオール（登録商標）546、アレクサフルオール（登録商標）568、アレクサフルオール（登録商標）594、アレクサフルオール（登録商標）647（モノクローナル抗体標識キットがから入手可能）、BODIPY色素、例えば、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、カスケードブルー、カスケードイエロー、ダンシル、リサミンローダミンＢ、マリナブルー、オレゴングリーン488、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、ローダミン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、テキサスレッド（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USAから入手可能)を含む。
本発明のポリペプチドはまた、二価性架橋試薬を用いて、フルオロフォア、他のタンパク質、および他の巨大分子に結合することができる。一般的なホモ二価性試薬としては、例えば、APG、AEDP、BASED、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM[PEO]3、BM[PEO]4、BS3、BSOCOES、DFDNB、DMA、DMP、DMS、DPDPB、DSG、DSP (Lomant’s Reagent)、DSS、DST、DTBP、DTME、DTSSP、EGS、HBVS、Sulfo-BSOCOES、Sulfo-DST、Sulfo-EGS（すべてPierce, Rockford, IL, USAから入手可能)が挙げられ、一般的なヘテロ二価性架橋剤としては、ABH、AMAS、ANB-NOS、APDP、ASBA、BMPA、BMPH、BMPS、EDC、EMCA、EMCH、EMCS、KMUA、KMUH、GMBS、LC-SMCC、LC-SPDP、MBS、M2C2H、MPBH、MSA、NHS-ASA、PDPH、PMPI、SADP、SAED、SAND、SANPAH、SASD、SATP、SBAP、SFAD、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、SMPT、SPDP、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-HSAB、Sulfo-KMUS、Sulfo-LC-SPDP、Sulfo-MBS、Sulfo-NHS-LC-ASA、Sulfo-SADP、Sulfo-SANPAH、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMCC、Sulfo-SMPB、Sulfo-LC-SMPT、SVSB、TFCS (すべてPierce, Rockford, IL, USAから入手可能)が挙げられる。
本発明のポリペプチド、断片および融合タンパク質は、かかる架橋剤を用いて、アミンまたはチオール反応性ではないフルオロフォアに結合させることができる。本発明のポリペプチド、断片および融合タンパク質に有効に結合させることができるタンパク質の標識としては、放射性標識、超音波検査用造影試薬およびＭＲＩ造影剤が挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
その他の有用な融合タンパク質は、上記されているように、ファージまたは細胞の表面にコードされたタンパク質の表示、内在性蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））への融合、およびＩｇＧＦｃ領域への融合を可能にする融合タンパク質を包含する（これらの説明を、その全体を引用しここに組入れる）。
本発明のポリペプチドおよび断片はまた、タンパク質毒素、例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、シガ毒素Ａ、炭疽菌毒素致死因子、リシン（ricin）へ有用に融合することができ、これにより本発明のタンパク質を結合しまたは取り込む細胞の除去を行うことができる。
融合相手には、中でも、下記相手が包含される：ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＧＳＴ、免疫グロブリン、β−ガラクトシダーゼ、ビオチンｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、マルトース結合性タンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ、ポリヒスチジン（例えば、当該ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端の６個のヒスチジン）、ｌａｃＺ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、酵母α接合因子、ＧＡＬ４転写活性化またはＤＮＡ結合性ドメイン、ルシフェラーゼ、および血清タンパク質、例えばオボアルブミン、アルブミンおよびＩｇＧの定常ドメイン。一例として、Ａｕｓｕｂｅｌによる上記文献（１９９２年）およびＡｕｓｕｂｅｌによる上記文献（１９９９年）を参照することができる。融合タンパク質はまた、特異的酵素開裂にかかわる部位、例えばファクターＸＩＩＩ、トリプシン、ペプシン、またはいずれかその他の当該技術分野で公知の酵素により認識される部位を含有することができる。上記したように、融合タンパク質は代表的に、当該技術分野で周知の技術（例えば、メリフィールド（Merrifield）合成）を用いて化学的に合成されるか、または化学架橋により生成される組換え核酸法によって形成される。
融合タンパク質のもう一つの利点は、エピトープ標識を使用し、結合タンパク質またはＣＳＰに結合するその他の分子のスクリーニング用アフィニティ結合によって、融合タンパク質をプレートまたはカラムに結合させることができることにある。
以下でさらに説明するように、本発明による単離されたポリペプチド、突然変異タンパク質、融合タンパク質、相同性タンパク質または対立遺伝子変異体は、ＣＳＰ、それらの対立遺伝子変異体および相同体を特異的に認識する抗体を作製するための特異的免疫原として容易に使用することができる。これらの抗体は次いで、中でも、本発明のポリペプチド、特にＣＳＰにかかわる特異的試験（例えば血清などのタンパク質液体試料検出用ＥＬＩＳＡによる、もしくは組織試料中のタンパク質検出用免疫組織化学またはレーザー走査サイトメトリーによる）、または細胞懸濁液中の細胞内タンパク質検出、または例えば免疫沈澱法によるなどのＣＳＰの抗体媒介単離および／または精製、およびＣＳＰの特異的アゴニストまたはアンタゴニストとして使用するためのフローサイトメトリーによる分析に使用することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【外８】
2004528823.tif 000001
半定量的PCRは、以下のプライマーを用いて行なった：
【表１】
2004528823.tif 000002
１２の異なる組織由来の１２の正常な試料におけるsqcln033の相対発現レベルを決定した。これらのＲＮＡ試料は市販のプールであり、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることによって作出されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用い、デュプリケートした４つの１０倍連続希釈ｃＤＮＡから、発現レベルを分析した。０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いて、遺伝子発現を評価した。最も希釈された試料における陽性反応は、最も高い相対発現値を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
上記表において、発現の相対レベルは、sqcln033が膀胱、腎臓、前立腺および精巣の癌で極めて低いレベルで発現していることを示している。高レベルの発現が大腸癌について観察された。
６つの対応ペアの大腸試料において、sqcln033の発現の相対レベルを決定した。各対応ペアは、特定の組織に対する癌試料由来のmRNAおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のmRNAによって形成されている。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用い、デュプリケートした４つの１０倍連続希釈ｃＤＮＡから、発現レベルを分析した。０、１、１０、１００および１０００の相対発現レベルを用いて、遺伝子発現を評価した。最も希釈された試料における陽性反応は、最も高い相対発現値を示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
上記表において発現の相対レベルは、sqcln033が、６つの大腸癌試料の４つにおいて低いレベルで、そして１つにおいて中程度のレベルで発現されていることを示している。発現の中程度のレベルは、対応正常隣接組織（NAT）において観察された。
とくに上記表の結果に示された半定量的PCR実験から、大腸組織に対するsqcln033の高い程度の特異性が観察される。
実験は、定量的PCR実験のためのプライマーおよびプローブを設計および試験するために行なわれている。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
本発明のＣＳＰの翻訳後修飾（ＰＴＭ）の例を以下に列挙する。さらに、かかる翻訳後修飾に特異的に結合する抗体は、診断薬としてまたは治療薬として有用でありえる。ProSiteデータベース(Bairoch et al., Nucleic Acids Res. 25(1):217-221 (1997) 。その内容は参照によって組込まれる)を用いて、次のＰＴＭが、本発明のＣＳＰについて予測された(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_prosite.html、最後にアクセスしたのは２００１年１０月２３日)。ＰＴＭの十分な定義のためには、http://www.expasy.org/cgi-bin/prosite-list.pl参照、最後にアクセスしたのは２００１年１０月２３日。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
例６：ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化の決定方法
ＲＮＡは、対象となる表現型を有する個々の患者または個体の家族からのＲＮＡの単離によって決定される。次に、当該技術分野において既知のプロトコルを用いて、これらのＲＮＡ試料からｃＤＮＡが生成される。これらの技法を詳述した多くの実験室マニュアルの代表例である、例えば、上記Sambrook (2001)を参照。次いで、ｃＤＮＡを、配列番号１〜１４７において対象となる領域を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲ用の鋳型として使用する。ＰＣＲ条件は、Sidransky et al., Science 252(5006): 706-9 (1991)に記載される緩衝溶液を用いて、９５℃での３０秒間、５２〜５８℃での６０〜１２０秒、および７０℃での６０〜１２０秒の３５サイクルから構成される。Sidransky et al., Science 278(5340): 1054-9 (1997)も参照。
次に、SequiThermポリメラーゼ(Epicentre Technologies)を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端において標識したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を配列決定する。選択エクソンのイントロン−エクソン境界もまた決定され、ゲノムＰＣＲ産物を分析して、結果を確認する。次に、突然変異が疑われるＰＣＲ産物をクローニングして、配列決定して、直接シークエンスの結果を確認する。Holton et al., Nucleic Acids Res., 19: 1156 (1991)に記載されるように、ＰＣＲ産物をＴ尾状(T-tailed)ベクターにクローニングし、Ｔ７ポリメラーゼ(United States Biochemical)を用いて配列決定する。病気に冒されていない個体に存在しない突然変異により、病気に冒された個体を同定する。
ゲノム再配列もまた決定することができる。ゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸塩(Boehringer Manheim)でニックトランスレーションし、Johnson, C, et al., Methods Cell Biol. 35: 73-99 (1991)に記載されるように、ＦＩＳＨを実施する。標識プローブを用いたハイブリダイゼーションは、対応するゲノム座への特異的ハイブリダイゼーションのための、大過剰のヒトcot-1ＤＮＡを用いて行なわれる。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールおよびヨウ化プロピジウムで染色体を対比染色し、ＣおよびＲバンドの組合せを生じさせる。正確なマッピングのための整列画像（aligned image）は、冷却電荷結合素子カメラ(Photometrics, Tucson, AZ)および可変励起波長フィルターを併合したトリプルバンドフィルターセット(Chroma Technology, Brattleboro, VT)を用いて得られる。同書。画像取込み、分析および染色体分画長測定は、ISee Graphicalプログラムシステム(Inovision Corporation, Durham, NC)を用いて行なう。プローブによりハイブリダイズされるゲノム領域の染色体変化は、挿入、欠失および転座として同定される。これらの変化は、関連疾患用診断マーカーとして用いられる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
例１１：遺伝子療法を用いた処置の方法
遺伝子治療の一方法では、ポリペプチドを発現することが可能な線維芽細胞を、患者に移植する。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により対象から得られる。得られた組織を組織培養培地に置き、小片に分離する。組織の小片を組織培養フラスコの湿った表面上へ載せ、各フラスコにおいて約１０片を載せる。フラスコを上下ひっくり返し、きつく閉めて、室温で一晩放置する。室温にて２４時間後、フラスコをひっくり返し、組織片をフラスコの底に固定させたままで、新鮮な培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン加）を添加する。次に、フラスコを３７℃にて約１週間インキュベートする。
この時点で、新鮮な培地を添加し、続いて数日毎に取り換える。さらに２週間の培養の後、線維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理し、大きなフラスコへはがし取る。モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列に隣接したｐＭＶ−７(Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988))をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼ（calf intestinal phosphatase）で処理する。アガロースゲル上で線状ベクターを分画し、ガラスビーズを用いて精製する。
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、例１に記載のとおり、それぞれ５’および３’末端配列に相当するＰＣＲプライマー用いて増幅することができる。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含有し、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状主鎖ならびに増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、一緒に添加する。得られた混合物を、２つの断片の連結に適した条件下において保持する。次に、連結混合物を用いて、バクテリアＨＢ  １０１を形質転換した後、ベクターが適切に挿入された所定の遺伝子を有することを確認する目的で、カナマイシンを含有する寒天上に蒔く。