【誤訳訂正書】
【提出日】平成15年12月9日(2003.12.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の名称】      遺伝子導入により産生された融合タンパク質
【特許請求の範囲】
【請求項１】  トランスジェニック融合タンパク質を作成する方法であって、該融合タンパク質を発現するトランスジーンを含むトランスジェニック動物を提供し；該トランスジーンを発現させ；および、前記トランスジェニック動物の乳から前記融合タンパク質を回収する、各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】  前記融合タンパク質が、免疫グロブリンサブユニットと酵素とを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】  前記融合タンパク質が第２部分に融合した第１部分を含み、該第１部分はターゲティング分子のサブユニットを含み、さらに該第２部分は細胞毒素をコードすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】  前記融合タンパク質が、腫瘍抗原に特異的なＩｇのサブユニットを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】  前記腫瘍抗原が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、トランスフェリン受容体、ＴＡＧ−７２、上皮増殖因子受容体より成る群から選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】  前記融合タンパク質がＲＮａｓｅを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】  前記ＲＮａｓｅがＲＮａｓｅ Ａであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】  前記融合タンパク質がアンギオゲニンを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】  前記融合タンパク質がカルボキシペプチダーゼＢ酵素を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】  前記融合タンパク質がトランスジェニック哺乳動物の乳腺において作成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】  前記融合タンパク質が、約０.５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】  前記融合タンパク質が、約１.０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】  前記融合タンパク質が免疫グロブリンサブユニットを含み、該免疫グロブリンサブユニットがヒト化抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】  前記トランスジェニック融合タンパク質をコードするトランスジーンが：
（ａ）必要に応じてインスレーター配列と；
（ｂ）乳腺上皮細胞特異的プロモーターと；
（ｃ）例えば乳特異的タンパク質からのシグナル配列等の融合タンパク質の分泌を引き起こすシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と；
（ｄ）必要に応じて、例えば乳中に分泌されるタンパク質等の分泌タンパク質のアミノ末端コード領域の部分であって、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中等に非分泌タンパク質を分泌させるのに十分な部分をコードするヌクレオチド配列と；
（ｅ）融合タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列と；
（ｆ）必要に応じて、哺乳類遺伝子から得た３’側非翻訳領域；とを有する核酸構築体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】  （ａ）必要に応じてインスレーター配列と；
（ｂ）乳腺上皮細胞特異的プロモーターと；
（ｃ）例えば乳特異的タンパク質からのシグナル配列等の融合タンパク質の分泌を引き起こすシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と；
（ｄ）必要に応じて、例えば乳中に分泌されるタンパク質等の分泌タンパク質のアミノ末端コード領域の部分であって、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中等に非分泌タンパク質を分泌させるのに十分な部分をコードするヌクレオチド配列と；
（ｅ）請求項１記載の融合タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列と；
（ｆ）必要に応じて、乳腺上皮細胞特異的遺伝子（例えば乳タンパク質遺伝子）等の哺乳類遺伝子から得た３’側非翻訳領域；とを有する核
【請求項１６】  請求項１記載の融合タンパク質をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック動物。
【請求項１７】  ０.５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で乳中に前記融合タンパク質を分泌できることを特徴とする請求項１６記載のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
基金
ここに記載される作業は、契約番号NO1-CO-60000の下で、国立癌研究所、国立衛生研究所からの連邦基金により一部資金提供されている。
【０００２】
関連出願
本出願は、ここに引用される1998年9月18日に先に出願された米国仮特許出願第60/101,083号の恩恵を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、遺伝子導入により産生された融合タンパク質（例えば免疫グロブリン−酵素融合タンパク質）、該融合タンパク質をコードする核酸、および該融合タンパク質および核酸を作成および使用する方法に関する。
【０００４】
発明の背景
治療および診断の用途に開発される組換えタンパク質の数が増大している。しかしながら、これらのタンパク質の多くは、従来の方法を使用して機能的形態および／または必要な量で産生するのは困難であるまたは費用がかかる。従来の方法には、特定のタンパク質の産生を担う遺伝子を細菌、酵母、または哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞に挿入し、次に該細胞を培養培地で増殖する方法が含まれる。その後培養された細胞は所望のタンパク質を合成する。伝統的な細菌または酵母系では、機能的形態で多くの複合タンパク質を産生することができない。哺乳類細胞は複合タンパク質を複製することができるのに対し、それらは通常、増殖させるのが困難でありまたは費用がかかり、わずかにｍｇ／Ｌ量のタンパク質しか産生しないことが多い。細菌、酵母または哺乳類系を使用することの制限は、適切な翻訳後修飾および機能的形態への会合を必要とする、免疫グロブリン−酵素融合タンパク質のような複合タンパク質に特にあてはまる。
【０００５】
発明の概要
概して、本発明は、トランスジェニック融合タンパク質、例えば免疫グロブリン−酵素融合タンパク質を作成する方法を特徴とする。この方法には、融合タンパク質、例えば免疫グロブリン−酵素融合タンパク質を発現するトランスジーンを含む、トランスジェニック動物、例えばヤギまたはウシを提供し；該トランスジーンを発現させ；および好ましくは、トランスジェニック動物の乳から融合タンパク質を回収する、各工程を含む。（記載される実施の形態は、乳中での発現に関するが、他のプロモーター、例えば他の組織特異的プロモーター、例えば筋肉、毛、尿、血、または卵特異的プロモーターを使用して他の組織または産物中で融合タンパク質を産生することができる。）
好ましい実施形態において、トランスジーンは、第２部分に融合した第１部分を含む。第１部分は、例えば腫瘍抗原（例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、トランスフェリン受容体、ＴＡＧ−７２、上皮増殖因子受容体）に特異的なＩｇのサブユニットのようなＩｇサブユニット等の、ターゲティング分子のサブユニットを含んでいてよい。第２部分は：酵素；Ｉｇサブユニット以外のポリペプチドまたはその断片；例えばアンギオゲニンのようなＲＮａｓｅ Ａ等のＲＮａｓｅ；またはカルボキシペプチダーゼＢ酵素；であってよい。
【０００６】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、例えばヤギまたはウシのような反芻動物を含むトランスジェニック哺乳動物の乳腺で作られる。
【０００７】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、例えばヤギまたはウシのような乳用動物等の反芻動物を含むトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌される。
【０００８】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌される。
【０００９】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、例えば乳清タンパク質プロモーターまたはカゼインプロモーター等の乳特異的プロモーターを含む乳腺特異的プロモーターの制御下で産生される。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、乳清酸タンパク質プロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくはプロモーターはヤギβ−カゼインプロモーターである。
【００１０】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、式：Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；Ｒ２−Ｒ１；またはＲ１−Ｒ２で表され、ここでＲ１は免疫グロブリン部分であり、Ｌはペプチドリンカーであり、Ｒ２は酵素部分である。好ましくは、Ｒ１とＲ２は共有結合しており、例えばペプチドリンカーを介して直接融合または結合している。
【００１１】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は：
分泌タンパク質のシグナル配列等、融合タンパク質の分泌を引き起こすシグナル配列（例えば、乳中に分泌されるタンパク質からのシグナルや免疫グロブリン分泌シグナル）；および、
（必要に応じて）乳中に分泌されるタンパク質や免疫グロブリンなどの分泌タンパク質のアミノ末端コード領域の部分であって、トランスジェニック哺乳動物の乳中等への融合タンパク質の分泌を促すのに充分な部分をコードする配列；を更に有していてもよい。
【００１２】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、例えばヒト、ネズミ（例えばマウス）モノクローナル抗体サブユニット、または例えば抗原結合断片等のその断片のような、モノクローナル抗体サブユニットを含む。モノクローナル抗体サブユニットまたはその抗原結合断片は、一本鎖ポリペプチド、重鎖と軽鎖から成る２量体、２本の軽鎖と２本の重鎖から成る４量体のいずれであってもよい。好ましくは、モノクローナル抗体はヒト抗体、または例えば抗原結合断片のようなその断片である。例えば、ヒト抗体は、ヒト重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスシーンを含むゲノムを有する例えばトランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト動物から得られたＢ細胞を不死化細胞と融合させて得られたハイブリドーマによって産生させることができる。抗体は様々なアイソタイプから成るものであってよく、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡ．ｓｕｂ．ｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられる。好ましくは、抗体はＩｇＧアイソタイプである。抗体は完全長（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であっても、または抗原結合部分（例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片）のみを含んでいてもよい。
【００１３】
好ましい実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンサブユニットは、例えば非ヒト抗体（例えばネズミ抗体）から得られた可変領域または少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）を有しかつ残りの部分はヒト由来のものである、キメラまたはヒト化抗体、それらのサブユニットまたは抗原結合断片等の組換え抗体である。
【００１４】
好ましい実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンサブユニットは一価である（例えば、一対の重鎖および短鎖、またはそれらの抗原結合部分を含む）。他の実施形態では、融合タンパク質は二価抗体である（例えば２対の重鎖および軽鎖、またはそれらの抗原結合部分を含む）。
【００１５】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖またはその断片（例えばその抗原結合断片）を含む。好ましくは、免疫グロブリン重鎖またはその断片（例えばその抗原結合断片）は、例えばペプチドリンカーを介してまたは直接融合して、酵素に結合している。好ましくは、免疫グロブリン重鎖−酵素融合タンパク質は、例えば酵素活性を有する２量−、３量−、４量−、または多量−複合体のような機能的複合体を形成することができる。
【００１６】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖またはその断片（例えばその抗原結合断片）、および軽鎖またはその断片（例えばその抗原結合断片）を含む。好ましくは、免疫グロブリン重鎖は、例えばペプチドリンカーを介してまたは直接融合して、酵素に結合している。好ましくは、免疫グロブリン−酵素融合タンパク質は、例えば酵素活性を有する２量−、３量−、４量−、または多量−複合体のような機能的複合体を形成することができる。
【００１７】
好ましい実施形態では、融合タンパク質の酵素は、例えばアンギオゲニンのようなＲＮａｓｅ Ａ等のＲＮａｓｅ；またはカルボキシペプチダーゼＢ酵素である。診断用途において、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼであってよい。
【００１８】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質はペプチドリンカーを含んでおり、そのペプチドリンカーは１以上の以下の特徴を有する：ａ）第免疫グロブリンタンパク質と酵素タンパク質との相対回転を可能とする。ｂ）プロテアーゼによって消化されない。ｃ）免疫グロブリンまたは酵素と相互作用しない。ｄ）融合タンパク質が酵素活性を有する複合体（例えば２量体、３量体、４量体、または多量体）を形成することを妨げない。ｅ）活性複合体への融合タンパク質の折り畳み／編成を促進する。
【００１９】
好ましい一実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質はペプチドリンカーを有し、そのペプチドリンカーは、５〜６０アミノ酸、より好ましくは１０〜３０アミノ酸の長さを有する；またはペプチドリンカーは２０アミノ酸の長さを有する；またはペプチドリンカーは１７アミノ酸の長さを有する；ペプチドリンカー中のアミノ酸はそれぞれ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、およびＡｌａより成る群から選択される；またペプチドリンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒ部分を有する。
【００２０】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質はペプチドリンカーを有し、そのペプチドリンカーは、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙで表される配列を含み、ここでｙは１、２、３、４、５、６、７または８である。好ましくは、ペプチドリンカーは式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）３で表される配列を含む。好ましくは、ペプチドリンカーは式（（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）で表される配列を含む。
【００２１】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質は、２量−、３量−、４量−、またはそれ以上の多量−複合体を形成する。
【００２２】
好ましい実施形態では、トランスジェニック融合タンパク質をコードするトランスジーンは：
（ａ）必要に応じてインスレーター配列と；
（ｂ）乳タンパク質プロモーターなどの乳腺上皮細胞特異的プロモーターを含むプロモーターと；
（ｃ）例えば乳特異的タンパク質からのシグナル配列等の融合タンパク質の分泌を引き起こすシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と；
（ｄ）必要に応じて、例えば乳中に分泌されるタンパク質等の分泌タンパク質のアミノ末端コード領域の部分であって、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中等に非分泌タンパク質を分泌させるのに十分な部分をコードするヌクレオチド配列と；
（ｅ）本明細書中に記載されているタンパク質のような免疫グロブリン−酵素融合タンパク質等の融合タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列と；
（ｆ）必要に応じて、乳腺上皮細胞特異的遺伝子（例えば乳タンパク質遺伝子）等の哺乳類遺伝子から得た３’側非翻訳領域；とを有する核酸構築体である。
【００２３】
好ましい実施形態では、トランスジーンの要素ａ（含まれる場合）、ｂ、ｃ、ｄ（含まれる場合）、およびｆを同じ遺伝子由来のものであるか、またはトランスジーンの要素ａ（含まれる場合）、ｂ、ｃ、ｄ（含まれる場合）、およびｆは２以上の遺伝子に由来する。例えば、シグナル配列、プロモーター配列、および３’側非翻訳配列は、乳清タンパク質またはカゼイン遺伝子（例えばβカゼイン遺伝子）などの乳腺上皮細胞特異的遺伝子に由来するものであってよい。好ましくは、シグナル配列、プロモーター配列、および３’側非翻訳配列はヤギβカゼイン遺伝子由来のものである。
【００２４】
好ましい実施形態では、トランスジーンのプロモーターは、乳清タンパク質またはカゼインプロモーター（例えばβカゼインプロモーター）などの乳腺上皮細胞特異的プロモーターである。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、乳清酸タンパク質プロモーターやラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、プロモーターはヤギβカゼインプロモーターである。
【００２５】
好ましい実施形態では、トランスジーンによってコードされるシグナル配列は細胞の外部または細胞膜内でのタンパク質の発現を誘導するアミノ末端配列である。好ましくは、シグナル配列はトランスジェニック動物の乳などの乳中に分泌されるタンパク質から得られる。
【００２６】
好ましい実施形態では、トランスジーンの３’側非翻訳領域はポリアデニル化部位を有し、乳清タンパク質遺伝子やカゼイン遺伝子などの乳腺上皮細胞特異的遺伝子等の哺乳類上皮細胞特異的遺伝子から得られる。３’側非翻訳領域は、カゼイン遺伝子（例えばβカゼイン遺伝子）、βラクトグロブリン遺伝子、乳清酸遺伝子やラクトアルブミン遺伝子から得ることが可能である。好ましくは３’側非翻訳領域はヤギβカゼイン遺伝子から得たものが用いられる。
【００２７】
好ましい実施形態では、本明細書中に述べるトランスジーンのようなトランスジーンをトランスジェニック動物の生殖細胞および／または体細胞に組み込む。
【００２８】
別の態様では、本発明は、核酸構築体、好ましくは単離核酸構築体に関するものであり：
（ａ）必要に応じてインスレーター配列と；
（ｂ）乳タンパク質プロモーターなどの乳腺上皮細胞特異的プロモーターを含むプロモーターと；
（ｃ）例えば乳特異的タンパク質からのシグナル配列等の融合タンパク質の分泌を引き起こすシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と；
（ｄ）必要に応じて、例えば乳中に分泌されるタンパク質等の分泌タンパク質のアミノ末端コード領域の部分であって、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中等に非分泌タンパク質を分泌させるのに十分な部分をコードするヌクレオチド配列と；
（ｅ）本明細書中に記載されている融合タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列と；
（ｆ）必要に応じて、乳腺上皮細胞特異的遺伝子（例えば乳タンパク質遺伝子）等の哺乳類遺伝子から得た３’側非翻訳領域；とを有する。
【００２９】
好ましい実施形態では、プロモーターは、乳清タンパク質またはカゼインプロモーター（例えばβカゼインプロモーター）などの乳腺上皮細胞特異的プロモーターである。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、乳清酸タンパク質プロモーターやラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、プロモーターはヤギβカゼインプロモーターである。
【００３０】
好ましい実施形態では、シグナル配列は、細胞の外部または細胞膜内でのタンパク質の発現を誘導するアミノ末端配列である。好ましくは、シグナル配列は乳特異的タンパク質から得られる。好ましくは、シグナル配列は、トランスジェニック哺乳動物等のトランスジェニック動物の乳中に、コードされる融合タンパク質の分泌をもたらす。
【００３１】
好ましい実施形態では、３’側非翻訳領域はポリアデニル化部位を有し、乳清タンパク質遺伝子やカゼイン遺伝子などの哺乳類乳腺上皮細胞特異的遺伝子等の哺乳類遺伝子から得られる。３’側非翻訳領域は、カゼイン遺伝子（例えばβカゼイン遺伝子）、βラクトグロブリン遺伝子、乳清酸遺伝子やラクトアルブミン遺伝子から得ることが可能である。好ましくは、３’側非翻訳領域はヤギβカゼイン遺伝子から得たものが用いられる。
【００３２】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸（例えば本明細書に記載されている核酸構築体等のトランスジーン）を含む、例えば単離宿主細胞のような宿主細胞に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、効果量の融合タンパク質（例えば本明細書に記載されている免疫グロブリン−酵素融合タンパク質）と、薬剤的に許容される担体とを含む薬剤組成物または栄養補給組成物に関する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、融合タンパク質（例えば本明細書に記載されている免疫グロブリン−酵素融合タンパク質）をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック動物に関する。
【００３５】
好ましいトランスジェニック動物として、哺乳類、鳥類、爬虫類、有袋類、および両生類が挙げられる。好適な哺乳類としては、反芻動物、有蹄類、家畜哺乳類、および乳用動物が挙げられる。特に好ましい動物としては、マウス、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、雄牛、およびラマが挙げられる。好適な鳥類としては、ニワトリ、ガチョウ、および七面鳥が挙げられる。トランスジェニック動物の乳中にトランスジェニックタンパク質を分泌させる場合、これらの動物は年間に少なくとも１Ｌ、より好ましくは少なくとも１０Ｌまたは１００Ｌの乳を生産可能なものである必要がある。好ましくはトランスジェニック動物はヤギ、ウシ、またはヒツジなどの反芻動物である。最も好ましくはトランスジェニック動物はヤギである。
【００３６】
好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、本明細書中に述べられる融合タンパク質等の融合タンパク質をコードするトランスジーンを含む生殖細胞および体細胞を有する。
【００３７】
好ましい実施形態では、トランスジェニック動物の体内で発現される融合タンパク質は、乳清タンパク質やカゼインプロモーターなどの乳特異的プロモーターを含む乳腺特異的プロモーターの制御下におかれる。乳特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、β−ラクトグロブリンプロモーター、乳清酸タンパク質プロモーターやラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、プロモーターはヤギβカゼインプロモーターである。
【００３８】
好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は哺乳動物であり、免疫グロブリン−酵素融合タンパク質は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でトランスジェニック動物の乳中に分泌される。
【００３９】
別の態様では、本発明は、その表面上に標的抗原を発現する異常細胞または病的細胞を選択的に殺滅または溶解させる方法に関する。本方法は、遺伝子導入によって産生される本明細書中で述べる免疫グロブリン−酵素融合タンパク質のような遺伝子導入によって産生される融合タンパク質と、異常細胞または病的細胞とを接触させる工程を含み、前記融合タンパク質の免疫グロブリンが標的抗原を認識することを特徴とする。
【００４０】
本明細書では、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドなる用語を互換的に用いている。
【００４１】
本明細書で用いる精製調製物、ポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または単離ポリペプチドなる用語は、これらを発現する細胞や生物内でこれらと混在する少なくとも１種の他のタンパク質、脂質または核酸から分離されたポリペプチドを指すものであり、例えば、トランスジェニック動物またはトランスジェニック動物が産生する乳や卵などの他の物質のような液体中に存在するタンパク質、脂質、または核酸から分離されたものを指す。このポリペプチドは、これを精製する目的で使用される抗体やポリアクリルアミドなどのゲルマトリクスのような物質から分離されることが好ましい。こうしたポリペプチドは、乾燥重量に基づいて精製調製物の少なくとも１０、２０、５０、７０、８０または９５％を構成することが好ましい。この調製物は、タンパク質の配列決定を行うのに充分な量のポリペプチド、詳細には少なくとも１、１０、または１００μｇのポリペプチド、より詳細には少なくとも１、１０、または１００ｍｇのポリペプチドを含有することが好ましい。
【００４２】
実質的に純粋な核酸とは、次のものの少なくとも一方に該当する核酸を指すものである：すなわち、当該核酸が由来する生物の天然ゲノム中で当該核酸が隣接するコード配列（５’末端側の１個と３’末端側の１個）の一方もしくは両方に隣接していないもの、あるいは、当該核酸が由来する生物内で当該核酸と混在する核酸配列を実質的に含まないもの。実質的に純粋な核酸なる用語には、例えば自己複製能を有するプラスミドやウイルス、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡなどのベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他のＤＮＡ配列とは独立した別の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ＰＣＲや制限酵素処理によって生成するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）が含まれる。実質的に純粋なＤＮＡには、更なる融合タンパク質配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部をなす組換えＤＮＡも含まれる。
【００４３】
本明細書で用いるトランスジーンなる用語は、トランスジェニック生物のゲノムに導入された核酸配列（例えば１以上の融合タンパク質ポリペプチドをコードするもの）を意味する。トランスジーンは、融合タンパク質をコードする核酸の最適な発現および分泌に必要な１以上の転写調節配列やイントロンなどの他の核酸を含んでいてよい。トランスジーンはエンハンサー配列を含む場合もある。融合タンパク質配列は、トランスジェニック哺乳動物の乳中にタンパク質を分泌させる乳腺特異的プロモーター配列、尿特異的プロモーター、または卵特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターに機能的に関連したものであってもよい。
【００４４】
本明細書で用いる「トランスジェニック細胞」なる用語は、トランスジーンを含む細胞を指すものである。
【００４５】
本明細書で用いるトランスジェニック生物とは、トランスジェニック動物または植物を指すものである。
【００４６】
本明細書で用いる「トランスジェニック動物」とは、公知のトランスジェニック技術などによって人為的に導入されたトランスジーンが１以上、好ましくはほぼ全ての細胞に含まれるヒト以外の動物を指すものである。トランスジーンは、マイクロインジェクションや組換えウイルスを感染させるなどの人為的な遺伝子操作によって、直接的にまたは導入細胞の前駆細胞に導入することにより間接的に、細胞に導入することが可能である。
【００４７】
本明細書で用いる哺乳動物とは、乳腺を有し乳を産生するヒトを除く全ての動物を指すものである。
【００４８】
本明細書で用いる「乳用動物」とは、齧歯類よりも大型の、乳を産生するヒト以外の動物を指すものである。好ましい実施形態では、乳用動物は大量の乳を産生しかつ授乳期の長いウシやヤギなどの動物が用いられる。
【００４９】
本明細書で用いる「被験体」とは、ヒトおよびヒト以外の動物を含む。本発明で云う「ヒト以外の動物」には、ヒト以外の霊長類、反芻動物、鳥類、両生類、爬虫類、ならびにマウスやラットを含む齧歯類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。なおこの用語にはウサギも含まれる。
【００５０】
本明細書で用いる「トランスジェニック植物」とは、公知のトランスジェニック技術などにより人為的に導入されたトランスジーンが１以上、好ましくはほぼ全ての細胞に含まれる植物、好ましくは多細胞植物もしくはこれよりも高等な植物を指すものである。
【００５１】
本明細書で用いる「植物」なる用語は、植物体の全体、植物体の一部、植物細胞、またはある群の植物細胞を指すものである。本発明の方法で使用することが可能な植物綱には、トランスジェニック技術によって形質導入可能な、単子葉植物および双子葉植物を含む高等植物まで広範な植物綱が含まれる。この用語には、多倍数体、２倍体および半数体などの倍数性の異なる植物が含まれる。
【００５２】
本明細書で用いる「栄養補給食品」なる用語は、融合タンパク質を含む、食材(food substance)または食品の部分を称する。栄養補給食品は、疾患の予防、治療、または治癒を含む医療的または健康的利益をもたらすことができる。トランスジェニックタンパク質は、１００μｇ／ｋｇ以上、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以上、最も好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以上の濃度で栄養補給食品中に存在する。栄養補給食品は、トランスジェニック動物の乳を含んでいてよい。
【００５３】
本明細書で用いる「免疫グロブリン」および「抗体」なる用語は、ジスルフィド結合によって連結された少なくとも２個の重鎖（Ｈ鎖）と２個の軽鎖（Ｌ鎖）を含む糖タンパク質を指すものである。各重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＲと略す。）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細かく分けられ、ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域と交互に存在している。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲと４つのＦＲが、アミノ末端からカルボキシル末端の方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配された構造を有する。重鎖と軽鎖の可変領域は抗原と作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞（例えばエフェクター細胞）や古典的補体活性化系の第１成分（Ｃｌｑ）などの宿主の組織や因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介する。
【００５４】
本明細書で用いる抗体の「抗原結合部位」（または単に「抗体部位」）なる用語は、抗原（例えば標的抗原）に特異的に結合する能力を保持する１以上の抗体断片を指すものである。抗体の抗原結合能は、完全長抗体の断片によって与えられることが示されている。抗体の「抗原結合部位」なる用語に含まれる結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ断片からなる２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）、および(ｖｉ)単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。更に、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用いて、これらのドメインを合成リンカーによって連結してＶＬ領域とＶＨ領域が１価の分子を構成する単鎖タンパク質とすることが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えばBird et al., (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883）。こうした一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部位」なる用語にも含まれるものである。これらの抗体断片は当業者には周知の従来方法によって得ることが可能であり、これらの断片を完全な抗体と同様にスクリーニングして使用に供する。
【００５５】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」なる用語は、単一の分子組成から成る抗体分子を指すものである。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列から得られる可変領域および定常領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指すものである。１つの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖トランスジーンと軽鎖トランスジーンとを含むゲノムを有するトランスジェニックマウスなどのヒト以外のトランスジェニック動物から得たＢ細胞を、不死化細胞と融合させたハイブリドーマによって産生される。
【００５６】
本明細書で用いる「組換えヒト抗体」なる用語は、組換え技術を用いて調製、発現、創出もしくは単離される全てのヒト抗体を含むものであり、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離した抗体、宿主細胞に組換え発現ベクターをトランスフェクトすることで発現される抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングする他の手段によって調製、発現、創出もしくは単離される抗体を含むものである。こうした組換えヒト抗体はヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列から得られる可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、こうした組換えヒト抗体にｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異誘発させる（または、ヒトＩｇ配列について遺伝導入した動物を使用する場合にはｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発させる）ことから、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来するものでこれに関連しているにも関わらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系のレパートリーに自然に存在しない配列となる場合がある。
【００５７】
核酸が「機能的に関連している」とは、その核酸が別の核酸配列と機能的な関連を有する場合を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが、あるコード配列の転写に影響を与える場合、その配列に機能的に関連しているという。転写調節配列に関しては、機能的に関連しているとは、関連するＤＮＡ配列同士が隣接している場合を指し、２個のタンパク質コード領域を連結させる必要がある場合には、ＤＮＡ配列同士が隣接し、かつ同一リーディングフレーム内に存在することを指す。
【００５８】
本明細書で用いる「ベクター」または「構築体」とは、それ自身が連結された別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指すものである。ベクターの１つに「プラスミド」があるが、これは別のＤＮＡ断片を連結することが可能な環状の２本鎖ＤＮＡ環のことを指して云う。別のベクターとしてウイルスベクターがあり、別のＤＮＡ断片をウイルスゲノムに連結することが可能である。ある種のベクターは導入された宿主細胞内で自己複製することが可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターやエピソーム哺乳類ベクター）。宿主細胞への導入に際して他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）を宿主細胞のゲノムに組み込むことが可能であり、これによりこのベクターは宿主ゲノムとともに複製することになる。更にある種のベクターは、機能的に関連した遺伝子を発現させることが可能である。こうしたベクターを「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形で与えられる。プラスミドが最も普通に用いられるベクターであることから、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に用いている場合がある。しかしながら本発明は、ウイルスベクター（例えば複製能を失ったレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ベクター）などのこうした他の発現ベクターをも包含するものである。
【００５９】
本明細書で用いる「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）なる用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すものである。この用語は、特定の対象細胞のみでなくこうした細胞の子孫をも指す点は理解されよう。突然変異や環境要因によって後の世代に所定の変化をもたらすことが可能であることから、実際には子孫細胞は親細胞と同じでない場合があるが、本明細書で云うところの「宿主細胞」の用語の指す範囲には含まれるものとする。
【００６０】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００６１】
詳細な説明
図面をまず説明する。
【００６２】
図１は、抗体および抗体アンギオゲニン(angiogenin)融合タンパク質の遺伝子の略図である。
【００６３】
図２Ａは、トランスフェリン受容体抗体（Ｅ６）およびアンギオゲニン−酵素融合体（ＣＨ２Ａｎｇ）のトランスジェニック発現ベクターの構造の略図である。以下のＤＮＡを、マウスの乳腺での発現のために修飾されたヤギβ−カゼイン遺伝子のエキソン２と７との間で融合した(DiTullio et al., 1992)；抗ヒトトランスフェリン受容体モノクローナル抗体、Ｅ６の重鎖（Ｉ）；前述されるのと同じ、アンギオゲニン（Ａｎｇ）をコードする遺伝子の５’端にＣＨ２領域において融合される重鎖(Rybak et al., 1992）（ＩＩ）；Ｅ６抗体の軽鎖(III)。白いボックス、重鎖；斜交平行線のボックス、軽鎖：斜線のボックス、Ａｎｇ。
【００６４】
図２Ｂは、Ｅ６  ＩｇＧ抗体またはＣＨ２Ａｎｇ融合タンパク質を産生する泌乳する雌から採取された乳の還元条件下での抗−アンギオゲニンまたは抗−ＩｇＧ抗体を使用したウェスタン分析を示す。等量のＰＢＳで希釈した１５μｌの乳をゲルに適用した。
【００６５】
図２Ｃは、生成されたＥ６抗体またはＣＨ２Ａｎｇの還元または非還元条件下でのウェスタン分析を示す。ブロットを、それぞれ示された抗体、０.３μ  Ｅ６、レーン１および２；４μ  Ｅ６、レーン３；０.７および０.２μｇ  ＣＨ２Ａｎｇ、レーン４および５で分析した。
【００６６】
図３は、アンギオゲニンまたはアンギオゲニン−抗体融合体（ＣＨ２Ａｎｇ）のｍＲＮＡ翻訳に対する効果を示すグラフである。アンギオゲニンまたは融合タンパク質を、ＢＭＶ  ｍＲＮＡおよび［３５Ｓ］メチオニンを含有する溶解産物混合液に加えた。タンパク質合成を、Newton et al., 1996に記載されるように新しく合成されたタンパク質への標識の組込みを測定することにより測定した。２−３回の実験からのデータをプールし、±ＳＥＭプロットした。結果は、偽処理した対照反応に対するパーセンテージで示す。ＩＣ５０は、タンパク質合成を５０％抑制するのに必要なＡｎｇまたはＡｎｇ融合タンパク質の濃度であり、用量反応曲線から測定した。黒丸、Ａｎｇ；白丸、ＣＨ２  Ａｎｇ。
【００６７】
図４は、培養細胞中のアンギオゲニン−抗体融合体の細胞毒性効果を示す用量反応曲線を示すグラフである。ＳＦ５３９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１］ｍｄｒ細胞に対するＣＨ２Ａｎｇのインビボにおける毒性をタンパク質合成の抑制により査定した。細胞毒性アッセイを、本発明の方法において記載されるように細胞タンパク質中への［１４Ｃ］ロイシンの組込みを測定することにより行った。アッセイは、血清の存在下で行い、［１４Ｃ］ロイシンを添加する前にロイシンおよび血清を有しない培地に変えた。ＩＣ５０は、３日後にタンパク質合成を５０％抑制するのに必要なアンギオゲニン融合タンパク質の濃度であり、用量反応曲線から直接測定した。印より大きい時にＳＥＭを行った。黒い印、ＳＦ５３９ヒトグリオーマ細胞；白い印、ＭＤＡ−ＭＢ−２３］ｍｄｒ１、ヒト乳癌細胞。
【００６８】
本発明は、少なくとも一部、遺伝子導入により産生された融合タンパク質を提供する。一つの実施の形態において、融合タンパク質には、毒素（例えば酵素のサブユニット）に融合された免疫グロブリンサブユニット（例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖）が含まれる。ここに記載される免疫グロブリン−酵素融合タンパク質は、所望でない細胞、例えば腫瘍細胞に細胞毒性作用物質（例えば酵素）を方向付ける作用をする。例えば、以下の実施例に記載される融合タンパク質、（すなわち、酵素、例えばＲＮａｓｅ Ａ、またはカルボキシペプチダーゼに融合された癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する抗体）を使用して、腫瘍細胞をターゲティングすることができる。免疫グロブリン−酵素融合体が腫瘍部位に集まるのに十分な時間を与えた後、無毒性のプロドラッグを投与してもよい。このプロドラッグは、腫瘍部位に局在する目的酵素の作用により強い細胞毒性の薬に変わり、患者に許容できない毒性を与えずに薬の治療レベルを達成できる。
【００６９】
免疫グロブリンの作成
細胞の細胞表面タンパク質（例えば受容体）などの標的抗原に対するモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによる標準的な体細胞融合法（Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)）などの従来のモノクローナル抗体技術を含む各種方法によって作成することが可能である。原則的には体細胞融合法が好ましいが、ウイルスやオンコジーンによるＢリンパ球の変換などモノクローナル抗体を生産するための他の方法を使用することも可能である。
【００７０】
ハイブリドーマを作成するための好ましい動物系はマウスを使用した系である。マウスにおけるハイブリドーマの作成は非常によく確立された手法である。細胞融合用の免疫脾細胞を単離するためのプロトコールおよび技術は当該技術分野では周知のものである。融合相手となる細胞（例えばマウスミエローマ細胞）および融合法もまた周知のものである。
【００７１】
ヒトタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウスの免疫系の代わりに完全なヒトの免疫系を有するトランスジェニックマウスを用いて生産することが可能である。対象とする抗原で免疫したトランスジェニックマウスから得た脾細胞を用いることで、ヒトタンパク質のエピトープに対して特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを作成することが可能である（Wood et al., 国際公開第９１／００９０６号パンフレット、Kucherlapati et al., 国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、Lonberg et al., 国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、Kay et al., 国際公開第９２／０３９１７号パンフレット、 Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368: 856-859; Green, L. L. et al., 1994 Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, S. L. et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman et al., 1993 Year Immunol 7: 33-40; Tuaillon et al., 1993 PNAS 90: 3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21: 1323-1326）。
【００７２】
モノクローナル抗体は組換えＤＮＡ技術の分野の当業者に周知の他の方法によって作成することも可能である。「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法と呼ばれる方法が特定の抗原特異性を有する抗体断片を識別、単離するために開発され、この方法を利用してモノクローナル抗体を作成することが可能である（コンビナトリアル抗体ディスプレイ法の説明は例として下記を参照。Sastry et al., 1989 PNAS 86: 5728; Huse et al. 1989 Science 246: 1275; and Orlandi et al. 1989 PNAS 86: 3833）。上記に述べたように動物を特定の免疫原で免疫した後、得られたＢ細胞プールの抗体のレパートリーをクローニングする。オリゴマープライマーの混合物とＰＣＲを用いて免疫グロブリン分子の多様な集団の可変領域のＤＮＡ配列を得る方法は広く知られている。例えば、５’末端側のリーダー（シグナルペプチド）配列および／またはフレームワーク１（ＦＲ１）配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーの混合物と、保存されている３’末端側の定常領域に対するプライマーとを用いて、多数のマウス抗体から重鎖および軽鎖の可変領域をＰＣＲ増幅することが可能である（Larrick et al., 1991, Biotechniques 11: 152-156）。同様の方法を用いてヒト抗体からヒト重鎖および軽鎖の可変領域を増幅することが可能である（Larrick et al., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106-110）。
【００７３】
説明のための１つの実施形態では、標準的プロトコールを用いて末梢血細胞、骨髄、または脾臓調製物などのＢ−リンパ球からＲＮＡを単離する（例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書、Orlandi et al., PNAS (1989) 86: 3833-3837; Sastry et al., PNAS (1989) 86: 5728-5732; and Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281）。重鎖およびκおよびλ軽鎖のそれぞれの定常領域に特異的なプライマーと、シグナル配列に特異的なプライマーとを使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成する。可変領域のＰＣＲプライマーを用いて重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれ単独または組合わせで増幅し、ディスプレイパッケージ作成において更なる操作を行うために適当なベクターに連結させる。増幅プロトコールで有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、固有のまたは縮重プライマーか、あるいは縮重部位にイノシンを取り込んだものを使用することが可能である。このプライマーに更に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を組み込むことにより、ベクターの所定のリーディングフレームに増幅断片をクローニングして発現させることが可能である。
【００７４】
免疫化により得られた抗体のレパートリーからクローニングしたＶ遺伝子ライブラリーは、好ましくは線状ファージから得られるディスプレイパッケージ群により発現させて抗体ディスプレイライブラリーを構築することができる。理想的にはこうしたディスプレイパッケージは、極めて大きく多様な抗体ディスプレイライブラリーのサンプリングを可能とし、親和性に基づいた分離の各ラウンド毎に速やかな選別を可能とし、更に精製ディスプレイパッケージからの抗体遺伝子の単離を容易とするような系であることが望ましい。ファージディスプレイライブラリーを構築するための市販のキット（例えばPharmacia Recombinant Phage Antibody System, カタログ番号No. 27-9400-01；Stratagene SurfZAPTM phage display kit, カタログ番号No. 240612）の他にも、多様化抗体ディスプレイライブラリーを作成するのに特に有効な方法および試薬の例として次に挙げるものがある。Ladner et al., 米国特許第５，２２３，４０９号明細書; Kang et al., 国際公開第９２／１８６１９号パンフレット; Dower et al., 国際公開第９１／１７２７１号パンフレット; Winter et al., 国際公開第９２／２０７９１号パンフレット; Markland et al., 国際公開第９２／１５６７９号パンフレット; Breitling et al., 国際公開第９３／０１２８８号パンフレット、McCafferty et al., 国際公開第９２／０１０４７号パンフレット; Garrad et al., 国際公開第９２／０９６９０号パンフレット; Ladner et al., 国際公開第９０／０２８０９号パンフレット; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al., (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281; Griffths et al., (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; Barbas et al., (1991) PNAS 88: 7978-7982。
【００７５】
特定の実施形態においては、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインを柔軟なリンカーにより繋いで一本鎖Ｆｖ断片としたものを同一のポリペプチド上で発現させてから、ｓｃＦＶ遺伝子を所望の発現ベクターやファージのゲノムにクローニングすることが可能である。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等により概略述べられているが（McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554）、抗体の完全なＶＨドメインとＶＬドメインを柔軟な（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーによって繋いだものを用いることで抗原親和性に基づくディスプレイパッケージの分離を可能にする一本鎖抗体を作成することが可能である。これにより、抗原に対して免疫活性を有する単離ｓｃＦＶ抗体を薬剤として製剤化して本発明の方法で使用することができる。
【００７６】
ディスプレイパッケージ（例えば線状ファージ）表面に表出された抗体ライブラリーを標的抗原またはそのペプチド断片によってスクリーニングして標的抗原に対する特異性を有する抗体を発現しているパッケージを特定、単離する。選択した抗体をコードする核酸をディスプレイパッケージから（例えばファージのゲノムから）回収し、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて他の発現ベクターにサブクローニングすることが可能である。
【００７７】
当業者には周知の方法にしたがって、特定の表面タンパク質に高い親和性を示す特定の抗体分子を作成することが可能である。こうした方法の例としてライブラリーのスクリーニングを行う方法がある（Ladner, R. C., et al., 米国特許第５，２３３，４０９号明細書、Ladner, R. C., et al., 米国特許第５，４０３，４８４号明細書）。更にこうしたライブラリーを用いる方法をスクリーニングに利用して、抗体の構造決定因子を模倣した結合決定因子を得ることが可能である。
【００７８】
詳細には、特定の抗体分子のＦｖ結合表面はタンパク質−タンパク質の相互作用の原則にしたがって標的リガンドと相互作用することから、ＶＨおよびＶＬの配列データ（後者はκまたはλ鎖型であり得る）は当業者に周知のタンパク質工学の基礎となるものである。ＮＭＲや結晶解析データから得られた他の抗体について予め決定された３次元構造を用いたモデリングによって、結合決定因子となるタンパク質表面の詳細を抗体の配列情報から得ることが可能である。例については下記を参照。Bajorath, J. and S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Funct., and Genet. 24 (2), 152-157; Webster, D. M. and A. R. Rees, 1995, "Molecular modeling of antibody-combining sites," in S. Paul, Ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp 17-49; and Johnson, G., Wu, T.T. and E.A. Kabat, 1995, "Seqhunt: A Program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences," in Methods in Molecular Biol. 51, op. cit., pp 1-15.
１つの実施形態では、ディスプレイパッケージ群によって多様化ペプチドライブラリーを発現させてペプチドディスプレイライブラリーを構築する。理想的にはこうしたディスプレイパッケージは、極めて大きく多様なペプチドディスプレイライブラリーのサンプリングを可能とし、親和性に基づいた分離の各ラウンド毎に速やかな選別を可能とし、更にペプチドをコードする遺伝子の精製ディスプレイパッケージからの単離を容易とするような系であることが望ましい。ペプチドディスプレイライブラリーは、速やかな増幅が可能であり比較的扱いが容易で多数のクローンの作成が可能な例えば原核生物やウイルスなどで構築することが可能である。好ましいディスプレイパッケージとしては、増殖期の細菌細胞、細菌の胞子があり、細菌ウイルス（特にＤＮＡウイルス）が最も好ましいが、本発明では可能性のあるディスプレイパッケージとして酵母やその胞子などの真核細胞の使用も考慮している。ファージを用いたディスプレイライブラリーについては上記に述べた。
【００７９】
別の方法としては、標的抗原などの適当な「受容体」を用いた親和性クロマトグラフィを行った後に、従来法（例えば質量分析およびＮＭＲ）によって単離された結合物質やリガンドの同定を行う方法がある。可溶性の受容体を検出可能な標識（例えば蛍光体、比色酵素、放射性同位体や発光化合物など）と共役させてリガンドの結合を示すことが好ましい。また、固定化した化合物を選択的に遊離させ、さらに膜を通じて拡散させて受容体と相互作用させることも可能である。
【００８０】
各化合物を識別するための「タグ」を有する化合物のコンビナトリアルライブラリーを合成することも可能である（例えばW.C. Still et al., 国際公開第９４／０８０５１号パンフレット）。概略述べるとこの方法では不活性かつ検出が容易なタグを固体支持体や化合物に結合させて使用する。活性化した化合物が検出された場合、固有の付属タグを識別することで化合物を特定する。タグを用いるこうした方法により化合物の大きなライブラリーを合成することが可能であり、ライブラリーの全化合物の組から極めて低濃度で各化合物を識別することが可能である。
【００８１】
更に改変抗体なる用語にも、抗体の部分的欠失、付加または置換によって改変されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体が含まれる。例えば、ヒンジ領域を欠失させて抗体を改変して１価の抗体を作成することが可能である。抗体が少なくとも１個の特異的抗原結合領域を有していれば本発明の範囲内でいかなる改変を行うことも可能である。
【００８２】
当該技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いてマウス−ヒトキメラモノクローナル抗体（キメラ抗体）を作成することが可能である。例えば、マウス（または他の動物種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化してマウスＦｃをコードする領域を取り除き、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の相当部分に置き換える（参照、Robinson et al., 国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号； Akira, et al., 欧州特許出願公開第１８４，１８７号明細書; Taniguchi, M., 欧州特許出願公開第１７１，４９６号明細書; Morrison et al., 欧州特許出願公開第１７３，４９４号明細書; Neuberger et al., 国際公開第８６／０１５３３号パンフレット; Cabilly et al., 米国特許第４，８１６，５６７号明細書; Cabilly et al., 欧州特許出願公開第１２５，０２３号明細書; Better et al, (1988 Science 240: 1041-1043); Liu et al., (1987) PNAS 84; 3439-3443; Liu et al,. 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al., (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559）。
【００８３】
このキメラ抗体は、抗原結合に直接関与していないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域から得た相当する配列に置き換えることによって更にヒト化することが可能である。ヒト化キメラ抗体についてはＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ等により概説されている（Morrison, S.L., 1985, Science 229: 1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214）。これらの方法では、重鎖または軽鎖の少なくとも１つの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全体もしくは一部をコードする核酸配列を単離、操作、発現させる。こうした核酸の入手源は当業者にはよく知られたものであり、例えば抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ抗体産生ハイブリドーマである７Ｅ３から得ることが可能である。こうしたキメラ抗体またはその断片をコードする組換えＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングすることが可能である。また、ＣＤＲ置換法によって適当なヒト化抗体を作成することも可能である（米国特許第５，２２５，５３９号明細書; Jones et al., 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al., 1988 Science 239: 1534; Beidler et al., 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060）。
【００８４】
特定のヒト抗体の全てのＣＤＲをヒト以外のＣＤＲの少なくとも一部と置き換えるか、一部のＣＤＲのみをヒト以外のＣＤＲと置換することが可能である。その場合、Ｆｃ受容体へのヒト化抗体の結合に必要とされる数だけＣＤＲを置換するだけでよい。
【００８５】
抗体は、ヒト抗体のＣＤＲの少なくとも一部をヒト以外の抗体から得たＣＤＲに置換することが可能ないずれの方法によってヒト化してもよい。Ｗｉｎｔｅｒによって本発明のヒト化抗体の調製に利用可能な一方法が述べられている（１９８７年３月２６日出願の英国特許出願公開第２１８８６３８号明細書）。その記載内容をここに援用するものである。ヒトＣＤＲはオリゴヌクレオチド部位指向的突然変異誘発法によってヒト以外のＣＤＲに置換することも可能である。
【００８６】
やはり本発明の範囲に含まれるものとして、特定のアミノ酸を置換、欠失、付加したキメラおよびヒト化抗体がある。具体的には、好ましいヒト化抗体では抗原に対する結合性を高めるなどの目的でフレームワーク領域内のアミノ酸を置換する。例えば、マウスのＣＤＲを有するヒト化抗体では、ヒトのフレームワーク領域内のアミノ酸をマウス抗体の対応する位置のアミノ酸と置換することが可能である。こうした置換によってヒト化抗体の抗原に対する結合性が高められる場合があることが知られている。本明細書ではアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換された抗体を改変抗体と呼ぶ。
【００８７】
標的抗原
好適な実施形態において、本発明の融合タンパク質の第1部分は、抗体、リガンド、または酵素などの標的に対して高い親和性を有するポリペプチドなどのターゲティング物質である。したがって本発明の融合タンパク質を用いることにより、融合タンパク質の第２部分を望ましからざる細胞の近傍に選択的に誘導（局在化）することが可能である。
【００８８】
例えば、第1部分として標的抗原と相互作用（例えば結合）する免疫グロブリンを使用することが可能である。特定の実施形態では、標的抗原は、異常増殖細胞（例えば癌細胞）を含む異常細胞などの細胞の表面に存在する。標的抗原の例としては特に癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、上皮増殖因子受容体、トランスフェリン受容体が挙げられる。
【００８９】
本明細書で用いる「標的細胞」とは、本発明の融合タンパク質によってターゲティングすることが可能な被験体（ヒトまたは動物）内のあらゆる好ましからざる細胞を指す。標的細胞の例としては、癌や腺癌由来の細胞（例えば大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌）などの腫瘍細胞が挙げられる（Thor, A. et al., (1997) Cancer Res 46: 3118; Soisson A. P. et al., (1989) Am. J. Obstet. Gynecol.: 1258-63）。「癌」なる用語は当該技術分野では周知であり、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、睾丸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、内分泌系癌、およびメラノーマなどの上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指すものである。こうした癌の例としては、子宮頚部、肺、前立腺、乳房、頭部および頚部、大腸、ならびに卵巣の組織に形成されるものが含まれる。この用語には更に癌性または肉腫性組織からなる悪性腫瘍などの癌肉腫が含まれる。「腺癌」とは、腺組織に生ずる癌や腫瘍細胞が著明な腺構造を形成する癌を指すものである。「肉腫」なる用語は当該技術分野では周知であり、間葉由来の悪性腫瘍を指すものである。
【００９０】
融合タンパク質の作成
本発明の融合タンパク質の第1部分と第２部分は好ましくは所定のリンカー配列によって連結される。リンカー配列は融合タンパク質の各部分がそれぞれの２次構造および３次構造に適宜折り畳まれるような充分な距離をもって第1部分と第２部分を離間させるものである必要がある。好ましいリンカー配列とは、（１）柔軟で引き延ばされたコンフォメーションを有し、（２）機能性の第１および第２部分と相互作用するような規則的な２次構造をとりにくく、（３）タンパク質の機能性ドメインとの相互作用を促進するような疎水性または荷電性が最小であるものである。タンパク質の柔軟領域に通常存在する表面アミノ酸としてはＧｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒがある。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含むアミノ酸配列の順列はリンカー配列に求められる上記の基準を満たすものと考えられる。ＴｈｒやＡｌａなどの中性に近い他のアミノ酸をリンカー配列に用いることも可能である。
【００９１】
２０アミノ酸からなるリンカー配列を使用すればタンパク質の機能性ドメイン間に適当な間隔が設けられるが、これよりも長いかまたは短いリンカー配列を用いることも可能である。第1部分と第２部分とを分離するこうしたリンカー配列は５〜５００アミノ酸の長さを有し、より好ましくは５〜１００アミノ酸の長さを有する。好ましくはリンカー配列は５〜１００アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態ではリンカー配列は約５〜約２０アミノ酸の長さを有し、１０〜約２０アミノ酸の長さを有するものが有利である。これに限られるものではないが、第1部分と第２部分とのリンカーとして有用なアミノ酸配列は、ｙを８以上の数として（ＳｅｒＧｌｙ４）ｙで表されるものかまたはＧｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒである。好ましいリンカー配列の１つは式（ＳｅｒＧｌｙ４）４で表されるものである。別の好ましいリンカーとして（（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）の配列を有するものがある。
【００９２】
第1部分と第２部分はリンカー配列を用いずに直接融合させることも可能である。融合されるタンパク質が、不可欠ではないＮ−またはＣ−末端のアミノ酸領域を有する場合、これを機能性ドメイン間の分離に利用することで立体干渉が防止されることからリンカー配列を必要としない。好ましい実施形態では、第1部分のＣ−末端を第２部分のＮ−末端に直接融合させるかあるいはこの逆とする。
【００９３】
組換え産物
本発明の融合タンパク質は融合タンパク質をコードする核酸分子を用いた標準的な組換えＤＮＡ技術によって調製することが可能である。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は標準的なＤＮＡ合成法によって合成することが可能である。
【００９４】
融合タンパク質をコードする核酸を初代細胞株または不死化細胞株の細胞などの宿主細胞に導入することができる。この組換え細胞を利用して融合タンパク質を生産することができる。融合タンパク質をコードする核酸は相同組換えなどの方法によって宿主細胞に導入することが可能である。多くの場合、融合タンパク質をコードする核酸は組換え発現ベクターに組み込まれる。
【００９５】
融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１以上の調節配列に機能的に関連させることが可能である。「機能的に関連している」とは、融合タンパク質をコードする配列が、融合タンパク質の発現を可能とするように調節配列に関連付けられていることを意味する。「調節配列」なる語は、プロモーター、エンハンサー、および他の調節エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を指すものである。こうした調節配列については例えばＧｏｅｄｄｅｌによって述べられており、その記載をここに援用するものである（Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）。調節配列としては、異なる種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列を構成的に発現させるもの、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列を発現させるもの（例えば組織特異的調節配列）、およびこれによるヌクレオチド配列の発現が調節可能であるもの（例えば誘導物質の存在下でのみ発現）がある。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望の融合タンパク質の発現レベルなどの要素によって異なり得ることは当業者には認識されよう。こうした融合タンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入することによって核酸がコードする融合タンパク質を産生させることが可能である。
【００９６】
組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞において融合タンパク質を発現するように設計することが可能である。例えば融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現系による）、酵母細胞や哺乳動物細胞で発現させることが可能である。Ｇｏｅｄｄｅｌによって好ましい宿主細胞の幾つかについて更に述べられている（Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）。酵母菌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅにおける発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari et al., (1987) EMBO J. 6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herkowitz, (1982) Cell 30: 933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123）およびｐＹＥＳ２（インビトロジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ）が挙げられる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）での融合タンパク質の発現に用いることができるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系列（Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165）およびｐＶＬ系列（Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989) Virology 170: 31-39）が挙げられる。
【００９７】
哺乳動物用の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed, B., (1987) Nature 329: 840）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al., (1987), EMBO J. 6: 187-195）が挙げられる。これらの発現ベクターを哺乳動物の細胞で使用する場合、ベクターの調節機能はしばしばウイルスの調節要素によって与えられる。広く用いられているプロモーターとして例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスやＳＶ（Simian Virus）４０から得られるものがあげられる。
【００９８】
組換え発現ベクターは、上記の調節配列の他に更なるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターが導入された宿主細胞を識別するための選択マーカー遺伝子を組換え発現ベクターにコードさせてもよい。また、宿主細胞、特に哺乳動物の宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を促進するため、融合タンパク質のアミノ末端をコードする配列に機能的に関連したシグナル配列を組換え発現ベクターにコードさせて、その発現に際してアミノ末端にシグナル配列を有する融合タンパク質が合成されるようにすることも可能である。このシグナル配列は細胞の分泌経路に融合タンパク質が導かれた後に切断され、成熟融合タンパク質（シグナル配列のない融合タンパク質）が宿主細胞から放出される。哺乳動物宿主細胞からのタンパク質やペプチドの分泌を促進するためのシグナル配列の使用は当該技術分野では周知のものである。
【００９９】
ベクターＤＮＡは従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞や真核細胞に導入することが可能である。本明細書で用いる「形質転換」または「トランスフェクション」なる用語は宿主細胞に外来の核酸（例えばＤＮＡ）を導入するために用いられる当該技術分野では周知の各種方法を指すものであり、リン酸カルシウムまたは塩酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、およびウイルス介在トランスフェクションなどが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする適当な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ等によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇや他の実験マニュアルに見ることができる（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)）。
【０１００】
哺乳動物の細胞では極一部の細胞にしかゲノムに外来ＤＮＡが取り込まれないことがよくある。ゲノムに外来ＤＮＡが取り込まれた細胞を識別、選択するため、選択マーカー（例えば抗生物質に対する耐性遺伝子）をコードする遺伝子を、融合遺伝子をコードする遺伝子とともに宿主細胞に導入することが可能である。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ヒグロマイシンやメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は融合遺伝子と同じベクターに組み込んで宿主細胞に導入するか、あるいは別々のベクターに組み込んで導入する。導入した核酸によって安定的に形質転換した細胞は、薬剤による選択によって選別することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが取り込まない細胞は死滅する）。
【０１０１】
組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列やＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写、翻訳させることが可能である。
【０１０２】
トランスジェニック哺乳動物
本明細書ではヒト以外のトランスジェニック動物を作成する方法について述べる。哺乳動物の生殖細胞系にＤＮＡ構築体を導入してトランスジェニック動物を作成することが可能である。例えば標準的な遺伝子導入技術によってこうした構築体の１以上のコピーを哺乳動物の胎児のゲノムに導入することができる。
【０１０３】
こうしたトランスジェニックタンパク質はトランスジェニック哺乳動物の乳中に発現させることがしばしば望ましい。この目的では大量の乳を生産し、授乳期が長い哺乳動物が好ましい。好ましい哺乳動物としては、ウシ、ヒツジ、ラクダや、アルパイン、ザーネン、トッゲンブルク種などのスイスを産地とするヤギなどの反芻動物が挙げられる。他の動物としては雄牛、ウサギ、およびブタが好ましい。
【０１０４】
例示的な１つの実施形態では、ヒト以外の動物の生殖細胞系にトランスジーンを導入して非ヒトトランスジェニック動物を作成する。トランスジーンは発生の異なる段階で標的胎児細胞に導入することが可能である。標的胎児細胞の発生の段階に応じて異なる方法が用いられる。可能であれば、使用する動物の特定の系列はいずれも、良好な健康状態、高い胎児発生率、胎児の前核の観察のしやすさ、および高い繁殖能力について選ばれたものを使用する。
【０１０５】
融合タンパク質トランスジーンの胎児への導入は、マイクロインジェクション、電気穿孔法やリポフェクションなどの当該技術分野にあっては周知の各種方法のいずれによっても行うことができる。例えば、哺乳動物受精卵の前核に構築体をマイクロインジェクションによって注入することにより融合タンパク質トランスジーンを哺乳動物に導入することが可能であり、これにより構築体の１以上のコピーが発生段階の哺乳動物の細胞で維持される。受精卵にトランスジーン構築体を導入した後、この卵をｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な時間培養するか、あるいは代理母に再移植するか、あるいはこの両方を行う。一般的な方法の１つは、動物種に応じて約１〜７日間胎児を培養した後、代理母に再移植するものである。
【０１０６】
トランスジェニック胎児の子孫は、組織片にサザンブロット法を行って構築体の存在を確認することが可能である。外因性の構築体クローンの１以上のコピーがゲノムに安定的に挿入された胎児を使用して、導入された構築体を保有する恒久的なトランスジェニック哺乳動物系を樹立することが可能である。
【０１０７】
形質転換した哺乳動物の同腹仔を、これら子孫のゲノムに構築体が取り込まれているかについて生後にアッセイを行って調べることが可能である。これは、融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列に対応するプローブを子孫の染色体調製物にハイブリダイズさせることによって行われる。ゲノムに少なくとも１つの構築体のコピーが組み込まれたこのような哺乳動物の子孫を成体にまで生育させる。これらの子孫の雌はその乳中に、もしくは乳とともに目的タンパク質を産生する。こうしたトランスジェニック哺乳動物を交配して目的タンパク質を乳中に産生させるのに有用な別のトランスジェニック子孫動物を作出することが可能である。
【０１０８】
ウェスタンブロットや酵素アッセイなどの、当該技術分野にあっては周知のアッセイを行って乳中にタンパク質が分泌されているかについてトランスジェニック動物の雌を調べることが可能である。
【０１０９】
他のトランスジェニック動物
融合タンパク質は様々なトランスジェニック動物で発現させることができる。トランスジェニックブタの作出のためのプロトコールが次の文献に述べられている。White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94; 米国特許第５，５２３，２２６号明細書; 米国特許第５，５７３，９３３号明細書; 国際公開第９３／２５０７１号パンフレット、および国際公開第９５／０４７４４号パンフレット。米国特許第５，５３０，１７７号明細書にはトランスジェニックマウスの作出のためのプロトコールが述べられている。トランスジェニックラットの作出のためのプロトコールが次の文献に述べられている。Bader and Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3: S81-S87, 1996。トランスジェニックウシの作出のためのプロトコールが次の文献に述べられている。Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.。トランスジェニックヒツジの作出のためのプロトコールが次の文献に述べられている。Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.。トランスジェニックウサギの作出のためのプロトコールが次の文献に述べられている。Hammer et al., Nature 315: 680-683, 1985 および Taylor and Fan, Frontiers in Bioscience 2: d298-308, 1997。
【０１１０】
トランスジェニック動物の乳中でのトランスジェニックタンパク質の産生
乳特異的プロモーター
この目的で有用な転写プロモーターは、カゼイン、β−ラクトグロブリン（Clark et al., (1989) Bio/Technology 7: 487-492）、乳清酸タンパク質（Gorton et al., (1987) Bio/Technology 5: 1183-1187）、およびラクトアルブミン（Soulier et al,. (1992) FEBS Letts. 297: 13）などの乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターを含む、哺乳動物の上皮細胞中で選択的に活性化されるプロモーターである。乳房での発現はあらゆる哺乳動物種のαカゼイン、βカゼイン、γカゼインまたはκカゼイン遺伝子のプロモーターを用いて行うことが可能であるが、ヤギのβカゼイン遺伝子プロモーターが好ましい（DiTullio, (1992) Bio/Technology 10: 74-77）。乳特異的タンパク質のプロモーターまたは乳房組織で特異的に活性化されるプロモーターはｃＤＮＡやゲノム配列から単離することができるが、これらのプロモーターはゲノムから得たものであることが好ましい。
【０１１１】
上記に列記した乳腺特異的遺伝子のＤＮＡ配列の情報は少なくとも１種類、しばしば複数の生物種で得られている。例として下記を参照されたい。Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (αラクトアルブミン・ラット); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984) (rat WAP); Jones et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985) (ラットβカゼイン); Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (ラットγカゼイン); Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987) (αラクトアルブミン・ヒト); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (ウシαｓ１およびκカゼインのｃＤＮＡ); Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96 (1988) (ウシβカゼイン); Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (ウシκカゼイン); Brignon et al, FEBS Lett. 188, 48-55 (1977) (ウシαＳ２カゼイン); Jamieson et al., Gene 61,85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (ウシβラクトグロブリン); Vilotte et al,. Biochimie 69, 609-620 (1987) (ウシαラクトアルブミン)。ＭｅｒｃｉｅｒおよびＶｉｌｏｔｔｅにより、異なる乳タンパク質遺伝子の構造および機能について述べられている（Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993)（ここにその全容を援用する））。更なるフランキング配列が発現の最適化に有用である場合には既存の配列をプローブとして用いてこうした配列をクローニングすることが可能である。既知のコグネイトヌクレオチド配列またはコグネイトタンパク質に対する抗体をプローブとして用いて異なる生物種のライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる生物種の乳腺特異的調節配列を得ることが可能である。
【０１１２】
シグナル配列
この目的で有用なシグナル配列は、乳特異的シグナル配列または真核生物または原核生物のタンパク質を分泌させる他のシグナル配列である。好ましくはこうしたシグナル配列は、乳特異的シグナル配列、すなわち乳中に分泌される産物をコードする遺伝子から選択される。最も好ましくは乳特異的シグナル配列は本発明の発現系で用いる乳特異的プロモーターに関連したものである。シグナル配列のサイズは本発明にとってさほど重要ではなく、目的とする組換えタンパク質を例えば乳房組織中に分泌させるのに充分な大きさであればよい。例えば、αカゼイン、βカゼインまたはγカゼインなどのカゼイン、βラクトグロブリン、乳清酸タンパク質、およびラクトアルブミンをコードする遺伝子から得られるシグナル配列が本発明では有用である。好ましい配列の１つにヤギのβカゼインシグナル配列がある。
【０１１３】
免疫グロブリンや、肝細胞、腎細胞または膵細胞が分泌するタンパク質などの他の分泌タンパク質からのシグナル配列を使用することも可能である。
【０１１４】
インスレーター配列
本発明のＤＮＡ構築体は更に少なくとも１個のインスレーター配列を有する。本明細書では、「インスレーター」、「インスレーター配列」および「インスレーターエレメント」なる用語を互換可能に用いている。インスレーターエレメントとは、その作用範囲にある遺伝子の転写を遮断するが、遺伝子の発現にネガティブにもポジティブにも影響を与えない調節エレメントのことである。好ましくは、インスレーター配列は転写させるＤＮＡ配列の両側に挿入される。例えばインスレーターを目的遺伝子の３’末端側においてプロモーターから５’末端側に約２００ｂｐ〜約１ｋｂの位置でプロモーターから少なくとも約１ｋｂ〜５ｋｂの位置に配することができる。プロモーターおよび目的遺伝子の３’末端とインスレーター配列との距離は、当業者であれば、構築体に用いられる目的遺伝子、プロモーターおよびエンハンサーの相対的サイズに応じて決めることができる。更に、１個以上のインスレーター配列をプロモーターの５’末端側もしくはトランスジーンの３’末端に配することが可能である。例えば２個以上のインスレーター配列をプロモーターの５’末端側に配することが可能である。トランスジーンの３’末端に配される１乃至複数のトランスジーンは、目的遺伝子の３’末端側か、もしくは３’末端側の非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’末端側のフランキング配列などの３’末端側の調節配列の３’末端に配することができる。
【０１１５】
好ましいインスレーターの１つとしては、ここに援用する国際公開第９４／２３０４６号パンフレットに記載されるような、ニワトリβグロブリン遺伝子座を含み、ニワトリ５’末端構成性超感受性部位に対応するＤＮＡセグメントがある。
【０１１６】
ＤＮＡ構築体
融合タンパク質は、ヤギβカゼインプロモーターを含むカゼインプロモーターなどの、乳腺上皮細胞に特異的なプロモーターと、βカゼインシグナル配列を含むカゼインシグナル配列などの乳特異的シグナル配列と、融合タンパク質をコードするＤＮＡとを有する構築体から発現させることができる。
【０１１７】
構築体は更に、非分泌タンパク質をコードするＤＮＡ配列の下流に３’末端の非翻訳領域を有する場合もある。こうした領域は発現系のＲＮＡ転写産物を安定化させ、発現系における目的タンパク質の収率を高めるものである。本発明の構築体において有用な３’非翻訳領域としてはポリＡシグナルを与える配列がある。こうした配列は例えばＳＶ４０のｓｍａｌｌ ｔ抗原、カゼインの３’非翻訳領域や当該技術分野では周知の他の３’非翻訳配列から得ることが可能である。この３’非翻訳領域は乳特異的タンパク質から得られたものが好ましい。３’非翻訳領域の長さはさほど重要ではないが、そのｐｏｌｙＡ転写産物の安定化効果は発現配列のＲＮＡを安定化させるのに重要である。
【０１１８】
構築体はプロモーターとシグナル配列をコードするＤＮＡ配列の間に５’非翻訳領域を有していても良い。こうした非翻訳領域はプロモーターが得られたのと同じ制御領域から得るか、あるいは、他の合成、半合成または天然の遺伝子などの異なる遺伝子から得ることが可能である。ここでもやはり非翻訳領域の特定の長さはさほど重要ではないが、非翻訳領域は発現レベルを高めるのに有用であるようである。
【０１１９】
構築体は更に、乳腺上皮細胞中で選択的に発現される遺伝子のＮ末端コード領域の約１０％、２０％、３０％、またはそれ以上の部分を有していてもよい。このＮ末端コード領域は、例えばヤギβカゼインのＮ末端コード領域などの使用されるプロモーターに対応するものなどが用いられる。
【０１２０】
従来の方法では、構築体を作成し、これをトランスジェニック動物に導入する以前に所定産物を産生する能力について培養細胞中でテストする。予期しなかったことであるが、発明者等はこうしたプロトコールが、例えばトランスジェニック動物の乳中に通常は分泌されないタンパク質が分泌されるか否かを予測しえないことを見出した。したがって、ＣＨＯ細胞において分泌されない構築体の中にはトランスジェニック動物の乳中に分泌されるものがあることから、構築体をトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物において直接的にテストすることが望ましい。
【０１２１】
乳からの精製
トランスジェニック融合タンパク質は比較的高濃度かつ大量に乳中で生産することが可能であり、正常にプロセシングされたペプチドを継続的に高レベルで発現させることができる。こうしたペプチドは再生可能な供給源から容易に回収可能である。乳からタンパク質を分離するための方法が幾つか知られている。
【０１２２】
乳中のタンパク質は通常、複数の処理の組合わせによって単離される。未加工乳はまず、スキミング、遠心分離、沈降分離法（H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982）、酸沈降法（米国特許第４，６４４，０５６号明細書）、またはレニンやキモトリプシンによる酵素的凝固法（Swaisgood, ibid.）などによって分画化して脂肪を除去する。次いで乳中の主立ったタンパク質を、透明な溶液または大まかな沈降物に分画化することで特定の目的タンパク質を容易に精製することが可能である。
【０１２３】
米国特許出願公開第０８／６４８，２３５号明細書には、クロスフロー濾過によって全乳または乳分画からペプチドなどの可溶性乳成分を生物学的活性型として単離する方法が開示されている。上述の単離法と異なり、この方法によれば全乳の第１分画を用いて脂肪およびカゼインのミセルを取り除く必要がなくなるため、処理が簡単となって回収率および生物活性の損失が避けられる。この方法を別の精製工程と組み合わせることにより不純物を更に除去して目的成分を更に精製することも可能である。
【０１２４】
トランスジェニック動物の卵中でのトランスジェニックタンパク質の生産
融合タンパク質はトランスジェニック動物の組織、分泌物または卵などの他の産物中で生産することが可能である。例えば、当該技術分野では周知の方法（Sang et al., Trends Biotechnology, 12:415-20, 1994）を用いて、トランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニック七面鳥、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、ホロホロ鳥、クジャク、ヤマウズラ、キジ、ハト、より好ましくはトランスジェニックニワトリの卵中で融合タンパク質を生産することが可能である。卵黄タンパク質遺伝子やアルブミンタンパク質遺伝子など、卵中で特異的に発現されるタンパク質をコードする遺伝子を改変して融合タンパク質を発現させることができる。
【０１２５】
卵特異的プロモーター
この目的で有用なプロモーターは、オボアルブミン、ライソザイム、およびアビジンなどの卵タンパク質をコードする遺伝子を調節するプロモーターを含む、卵内で選択的に活性化されるプロモーターである。ニワトリのオボアルブミン、ライソザイムまたはアビジン遺伝子から得られるプロモーターが好ましい。卵特異的タンパク質プロモーターすなわち卵組織で特異的に活性化されるプロモーターはｃＤＮＡやゲノム配列から得たものを用いることが可能である。卵特異的プロモーターはゲノム由来のものであることが好ましい。
【０１２６】
卵特異的遺伝子のＤＮＡ配列は当該技術分野では周知のものである（参照、 e.g., Burley et al., 'The Avian Egg", John Wiley and Sons, p. 472, 1989, この全容をここに援用する）。発現を最適化するために更なるフランキング配列が有用である場合、既存の配列をプローブとして用いてこうした配列をクローニングすることが可能である。既知のコグネイトヌクレオチド配列またはコグネイトタンパク質に対する抗体をプローブとして用いて異なる生物種のライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる生物種の卵特異的調節配列を得ることが可能である。
【０１２７】
トランスジェニック植物
細胞核またはプラスチドのゲノムにＤＮＡトランスジーンが挿入されたトランスジェニック植物などのトランスジェニック植物を含むトランスジェニック生物内で融合タンパク質を発現させることが可能である。植物の形質転換は周知のものである（参照、Methods in Enzymology Vol. 153 ("Recombinant DNA Part D") 1987, Wu and Grossman Eds., Academic Press および欧州特許出願公開第６９３５５４号明細書）。
【０１２８】
幾つかの方法によって植物細胞やプロトプラストに外来の核酸を導入することができる。例えばマイクロピペットを用いたマイクロインジェクションによって植物細胞に核酸を直接機械的に導入することが可能である。また、遺伝物質とともに細胞に取り込まれる沈殿複合体を形成するポリエチレングリコールを用いることによって外来核酸を植物細胞に導入することも可能である（Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2712-22）。電気穿孔法によって外来遺伝子を植物細胞に導入することも可能である（Fromm et al. (1985) Proc. Nati. Acad Sci. USA 82:5824）。この方法では関連する遺伝子構築体を含むプラスミドや核酸の存在下で植物細胞のプロトプラストに電気穿孔する。強力な電気的インパルスを作用させることで生体膜が可逆的に透過性を有するようになるため、プラスミドの導入が可能となる。電気穿孔した植物細胞のプロトプラストは細胞壁を再形成し、細胞分裂を行って植物カルスを形成する。遺伝子導入されたトランスジェニック植物細胞の選択は表現型マーカーを用いて行われる。
【０１２９】
植物細胞に外来の核酸を導入するためのベクターとしてカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を使用することができる（Hohn et al. (1982) 'Molecular Biology of Plant Tumors,' Academic Press, New York, pp. 549-560; Howell, 米国特許第４，４０７，９５６号明細書）。ＣａＭＮのウイルスＤＮＡゲノムを親細菌プラスミドに挿入して細菌間で伝播する組換えＤＮＡ分子を作成する。目的ＤＮＡ配列を導入することによって組換えプラスミドを更に改変することも可能である。組換えプラスミドの改変ウイルス部分を親細菌プラスミドから切り出して植物細胞または植物体に接種する。
【０１３０】
微小粒子による高速弾道貫通法によって外来の核酸を植物遺伝子に導入することが可能である。核酸は微小ビーズまたは粒子の基材中やその表面に置かれる（Klein et al. (1987) Nature 327:70-73）。通常新たな核酸セグメントは１回導入されればよいが、この方法では多数回の導入も可能である。
【０１３１】
核酸にて形質転換したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを植物細胞、外植片、分裂組織、および種子に感染させることによって核酸を植物細胞に導入することが可能である。このトランスジェニック植物細胞は適当な条件の下で増殖して芽、根を生じ、更に植物体に成長する。こうした核酸は、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドによって植物細胞に導入することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの感染によりＴｉプラスミドは植物細胞に移入されて植物のゲノムに安定的に組み込まれる（Horsch et al. (1984) "Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants," Science 233:496-498; Fraley et al. (1983) Proc. Nati. Acad Sci. USA 80:4803）。
【０１３２】
プロトプラストを単離、培養して完全な植物体を再生することが可能な植物からは、形質転換によって導入された外来遺伝子を有する完全な植物体を再生することが可能である。適当な植物の例としては、イチゴ、ミヤコグサ、ウマゴヤシ、オノブリキス、シャジクソウ、トリゴネラ、ササゲ、ミカン、アマ、ゼラニウム、マニホット、ニンジン、シロイヌナズナ、アブラナ、ダイコン、シロガラシ、アトロパ、カプシカム、ヒヨス、トマト、タバコ、ナス、ペチュニア、ジギタリス、ハナハッカ、Ｃｉｏｈｏｒｉｕｍ、ヒマワリ、アキノノゲシ、スズメノチャヒキ、アスパラガス、キンギョソウ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、ネメシア、ペラルゴニウム、キビ、チカラシバ、キンポウゲ、セネシオ、サルピグロッシス、キュウリ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、ダイズ、ドクムギ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、およびチョウセンアサガオの各属に属する植物種が挙げられる。
【０１３３】
培養プロトプラストからの植物体の再生に関しては下記に述べられている。Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-176 (MacMillan Publishing Co. New York 1983); M.R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts," Protoplasts (1983)-Lecture Proceedings, pp. 12-29, (Birkhauser, Basal 1983); P.J. Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops," Protoplasts (1983)-Lecture Proceedings, pp. 31-41, (Birkhauser, Basel 1983); and H. Binding, "Regeneration of Plants," Plant Protoplasts, pp. 21-73, (CRC Press, Boca Raton 1985)。
【０１３４】
プロトプラストからの再生法は植物種毎に異なるが、一般には外来配列のコピーを含む形質転換プロトプラストの懸濁液を最初に調製する。植物種によってはこのプロトプラスト懸濁液から天然胚として成熟および発芽の段階にまで胚形成を誘導することが可能である。培地には各種アミノ酸およびオーキシンやサイトカイニンなどのホルモンを添加することが可能である。特にトウモロコシやアルファルファなどの植物種では培地にグルタミン酸やプロリンを添加することが有利である。芽および根が同時かつ正常に発生する。再生が効率的に行われるかは、培地、遺伝子型、および培養歴に依存する。これら３つの変数が制御されるならば、再生は完全に再現かつ反復可能である。
【０１３５】
栄養繁殖させた作物の場合、成熟したトランスジェニック植物を挿し木や組織培養法によって増殖させて複数の同じ植物体を作成し、生産性などについて試験を行うことができる。これにより所望のトランスジェニック植物が選択されることから新たな変種が得られ、商業用に栄養増殖させることができる。種子増殖させた作物の場合、成熟したトランスジェニック植物を自家交配させてホモ近交系植物を作成することが可能である。こうした近交系植物はトランスジーンを有する種子を生じ、新たに導入された外来遺伝子の活性レベルが得られる。これらの種子を育成して選択した表現型を有する植物を得る。本発明の近交系を用いて新たな雑種を開発することが可能である。この方法では選択した近交系を別の近交系と交雑して雑種を得る。
【０１３６】
花、種子、葉、枝、果実などのトランスジェニック植物から得られる部分は、これらの部分が形質転換された細胞を含むならば発明の範囲に包含されるものである。上記の再生植物体の子孫、変種、および突然変異体もこれらが導入されたＤＮＡ配列を有する限り本発明の範囲に含まれるものである。上記の再生植物体の子孫、変種、および突然変異体も本発明の範囲に含まれるものである。
【０１３７】
トランスジェニック植物または植物細胞の選択は、色の変化の観察（例えば、白色の花、異なる色素生成、および花の均一な色パターンや不規則なパターン）などの視覚的な評価に基づいて行うことも可能であるが、酵素活性または生成物の定量の生化学的なアッセイによって行ってもよい。トランスジェニック植物または植物細胞は目的とする植物部分を有する植物体にまで成長させて、視覚的外観（フラボノイド遺伝子について）、生化学的検定（ノーザンブロット）、ウェスタンブロット、酵素アッセイおよび分光法を含むフラボノイド化合物アッセイ（参照、Harborne et al. (Eds.), (1975) The Flavonoids, Vols. 1 and 2, [Acad. Press]）などによって遺伝子の活性を監視する。適宜植物を選択して更なる評価を行う。遺伝子操作した植物の作成方法については、米国特許第５，２８３，１８４号明細書、米国特許第５，４８２，８５２号明細書、ならびに欧州特許出願公開第６９３５５４号明細書に更に述べられている。これは全て本明細書中に援用するものである。
【０１３８】
本発明の実施形態を以下の実施例によって更に説明するが、これらの実施例は発明を何ら限定するものではない。本願の全体を通じて引用される全ての引用文献（各種文献、登録となった特許、特許出願公報、同時係属中の特許出願など）の内容をここに援用するものである。
【０１３９】
実施例１：抗体−カルボキシペプチダーゼＢ融合体の産生および試験
Ｆ(ａｂ')２−酵素融合タンパク質を、ヤギベータ−カゼイン発現ベクターＢＣ３５０中にサブクローニングした。３つの構築体：２１３（ＭＦ２１ｑ３−１３、Ｆｄ−酵素融合遺伝子）、ＬＣ（ＬＣ３、軽鎖）、および１４１（ＭＦ１４１−４、Ｃ末端ロイシンを有するｐｒｏ領域）のそれぞれについて、発現カセットを細菌性プラスミド配列から分離した。次に３つのトランスジーンをマウス接合体中で共−マイクロインジェクションした。Ｆ（ａｂ’）−酵素融合タンパク質抗体の３つのサブユニット全てを提供する７つのトランスジェニックマウス系およびトランスジーンＬＣおよび２１３のみを提供する３つの系を分析した。乳のサンプルをファウンダーおよび第１世代の雌から集め、ＥＬＩＳＡおよび酵素活性アッセイを行った。３つのトランスジーンを提供する７つの系のうち４つは、１ｍｇ／ｍｌより高いレベルで（おそらく４−６ｍｇ／ｍｌまで）Ｆ(ａｂ')２−酵素融合タンパク質を発現するのに対し、ＬＣおよび２１３トランスジーンのみを提供する３つの系は全て、０.１ｍｇ／ｍｌより低いレベルで発現する。
【０１４０】
材料および方法
制限酵素はNew England Biolabs, Beverly, MAから購入した。ナイロンメンブラン(MagnaGraph ナイロントランスファーメンブラン）はSepasrations Inc(MSI, Westboro, MA 01581)から購入した。α３２Ｐ−ｄＡＴＰはNEN Life Science Products, Inc. Boston, MAから購入した。配列決定はSequegen Company, Worcester, MAによって行われた。ＭＦ２１ｑ３−１３Ｆｄ−酵素融合遺伝子を含むプラスミド２１３、８０６.０７７軽鎖コード領域を含むＬＣ、および１４１はZeneca Pharmaceuticalsから購入した。ＣＤ１マウスはCharles River Labs, Wilmington, MAから購入した。
【０１４１】
注入断片の調製
プラスミドＤＮＡをDr. Michael D. Edge(Zeneca Pharmaceuticals)から得て、ＳａｌＩで完全に消化することによってベクターから発現カセット（各１００μｇ）を分離した。次に移動バッファーとして１Ｘ ＴＥＡ(Maniatis et al., 1982)を用いてアガロースゲル中で消化物を電気泳動した。発現カセットに相当するＤＮＡ断片を含むゲルの領域を紫外線（長波）下で可視化した。関心ＤＮＡを含むバンドを切り出し、透析バッグに移し、さらにそのＤＮＡを電気溶出によって１Ｘ ＴＡＥ中に単離する。その方法は、各発現カセットに適用される。
【０１４２】
塩基溶出の後、添付のプロトコールに基づいて「Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡクリーンアップシステム」(Promega, カタログ番号Ａ７２８０）を用いてＤＮＡ断片を濃縮および浄化し、さらに１２５ｍｌのマイクロインジェクションバッファー(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５）、ＥＤＴＡ ０.２ｍＭ）中に溶出した。比較アガロースゲル電気泳動によって断片濃度を評価した。マイクロインジェクション断片ストックの推定濃度は以下の通りである：ＬＣ、１５ｎｇ／ｍｌ；１４１、１８０ｎｇ／ｍｌ；および２１３、２７０ｎｇ／ｍｌ。各断片の最終濃度が０.５ｎｇ／ｍｌになるように、前核注入の直前にストック液をマイクロインジェクションバッファーで同時に希釈した。
【０１４３】
マイクロインジェクション
イソプロパノールで沈殿させることによって尾組織からゲノムＤＮＡを単離し、ニワトリβ−グロブリンインスレーターＤＮＡ配列の存在に関してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。この配列は、Goat Beta-Caseベクター(GBC350)の部分である。ＰＣＲ反応のため、約２５０ｎｇのゲノムＤＮＡを、２.５単位のＴａｑポリメラーゼを含む５０μｌのＰＣＲバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭデオキシヌクレオチド３リン酸、ならびに６００ｎＭの濃度の各プライマー）で希釈し、以下の温度プログラムを用いて処理した：
2003509040.tif 000001
プライマーセット：
ＣＢＣ３３２およびＣＢＣ３８６、アンプリコンは２０６ｂｐ
ＧＢＣ３３２：ＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧ
ＧＢＣ３８６：ＴＧＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＣＡＴＧＴ
トランスジェニックファウンダーのサザンブロット分析
インスレーターＰＣＲに関して陽性である各ファウンダーマウス由来のゲノムＤＮＡ（２４μｇ全タンパク質、８μｇ／レーン）を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化した。消化されたＤＮＡを三重で電気泳動し、標準的方法（Maniatis et al., 19982)に従ってナイロンメンブランに転写させた。それぞれＳａｌＩ、Ｘｈｏｌ、およびＸｈｏｌで切断することによって、ＶＫ（ｐＳＰ７２中のＬＣ１０、７２ｂｐプローブ）、ＰｒｏＬ（ｐＳＰ７２中のｐＭＦ１４１−１、３４５ｂｐプローブ）、およびｆｄ−ＣＰＢ（ｐＳＰ７２中のｐＭＦ２１３−２０、１８６１ｂｐプローブ）プラスミドから各発現カセットに特異的なプローブを単離した。取扱説明書にしたがってPrime-It"IIキット(Stratagene, LaJolla CA 92037)の試薬を用いて各プローブを標識し、標準的プロトコール(Maniatis et al., 1982)に従って４２℃で５０％ホルムアミド中において１組のナイロンフィルターにハイブリダイズさせた。０.２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳを用いて６０℃で洗浄を行った。
【０１４４】
マウスの搾乳
雌マウスに自然にその子供を分娩させ、通常、分娩後７および９日目に搾乳した。搾乳手順の前約１時間の間、マウスをその子供から離した。その１時間の保持期間の後、滅菌リン酸緩衝生理食塩水中の５i.U.のオキシトシンを２５ゲージの針を用いてマウスに腹腔内注射して、乳分泌するように誘導した。オキシトシンの効果を発揮させるため、ホルモン注射の後１から５分の待機期間を設けた。２本の１８ゲージの針が挿入されたゴム栓で封をした１５mlの円錐チューブから成り、１本の針の受け口がヒトの搾乳機に接続されたゴム管に挿入されている、吸引採取システムを搾乳に用いた。マウスをケージの一番上に置き、その尾のみによって捕まえ、それ以外は制限または限定しなかった。１５ｍｌの円錐チューブ中に置かれた個々のエッペンドルフチューブ中に乳を採取するために、他方の針の受け口をマウス乳首（１度に１つ）に付けた。各試料採取の後、エッペンドルフチューブを変えた。少なくとも１５０μｌの乳が得られるまで搾乳を続けた。採取の後、マウスをその子供達のところへ戻した。
【０１４５】
マウス胚のマイクロインジェクション
１７０８のマウス胚にＤＮＡ断片を同時注入し、そのうちの９４５をレシピエント雌に移植した。それら雌のうち、２７匹が妊娠満期まで継続し、１７２匹のマウスを出産し、それらのうち２０匹がＰＣＲ分析によってトランスジェニックであると思われた。注入された胚の内１.２％がトランスジェニックであり；生まれたマウスの内１１.６％がトランスジェニックであると思われた。
【０１４６】
ファウンダーマウス系統のサザンブロット分析
インスレーターＰＣＲで同定された２０匹のトランスジェニックファウンダーを、サザンブロットハイブリダイザーションによってさらに分析して、３つ全てに関して陽性であるファウンダー（３５、６３、７３、８１、８６、９２、１２０、１６９）が弱いモザイクであることを特定した。それらは、非常に高感度のＰＣＲアッセイを用いると明らかに陽性であったが、サザンハイブリダイゼーションを用いると疑わしい陽性シグナルは全く検出できなかった。６匹の他のファウンダー（５、７６、１２１、１２８、１３１、および１６１）は、少なくとも１つのトランスジーンに関して明らかに陽性であったが、少なくとも１つの他のトランスジーンに関して明らかに陰性またはモザイクであった。最後に、６匹のファウンダー（２５、６７、８９、１０６、１６１、１６６）は、各トランスジーンの少なくとも１つのコピーを指示するハイブリダイゼーション信号を示した。
【０１４７】
【表１】
2003509040.tif 000002
マウス系統の繁殖
サザンブロットの後、１０系統のファウンダーを繁殖用に選択した：５、２５、６７、７６、８９、１０６、１２１、１２８、１５２、および１６６。表２は、各系統の繁殖を要約する；表３は、ＰＣＲ陽性Ｆ１子孫のサザンブロット分析を要約する。その分析から、＃１２１を除く全てのファウンダーが次世代にトランスジェニック組込みを伝えた。他の系統（５、２５、７６、１２８、表２を参照）も、低いパーセンテージのトランスジーン陽性子孫をもたらす生殖細胞系モザイク現象の兆候を示した。
【０１４８】
サザンブロット分析はまた、あるファウンダーがトランスジーンのいくつかに関して多重組込み(multiple integration)を有することを示唆した。例えば、ファウンダー１６６の子孫である２００と２０１は、トランスジーンＬＣおよび１４１に関しては異なるコピー数、トランスジーン２１３に関しては同じコピー数を有すると思われる。１つの説明は、１６６ファウンダーが、異なる染色体上に２以上の組込み部位を有し、一方の部位はＬＣおよび１４１トランスジーンのみを含み、他方は３つ全てのトランスジーンを含むためであろう。２００は両方の組込み部位を受け継いだが、２０１は全てのトランスジーンを含む部位のみを受け継いだと考えられる（他のシナリオも可能である）。多重組込みは、特に３つの異なるトランスジーンが含まれる場合に、サザンロット分析によって同定するのが困難である。しかしながら、大動物において、ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）および核型分析を用いることによって、多重組込み状態を区別することが可能である。
【０１４９】
要約すると、２匹のファウンダー（５、７６）は、二重のトランスジーン組込み（ＬＣおよび２１３）をその子孫に伝え、６系統（２５、６７、８９、１０６、１５２、および１６６）は、３つ全てのトランスジーンを次世代に伝えた。別のファウンダー１２８は、ＬＣおよび２１３に関して二重トランスジェニック系統であり、１匹のトランスジェニック子孫をもたらした（２３２）。しかしながら、この子孫は分析されなかった（１２８を繁殖させるのが遅れたため後で生まれた）。１２８系統の乳のタンパク質分析は融合タンパク質の顕著な産生を示さなかったため、その系統はそれ以上追跡しなかった。
【０１５０】
【表２】
2003509040.tif 000003
【表３】
2003509040.tif 000004
トランスジェニックマウス乳試料の分析
ファウンダー雌ならびにＦ１トランスジェニック雌からマウス乳試料を採取した。酵素アッセイの干渉の可能性を回避するため、乳をＰＢＳで希釈しないことを決めた。試験まで試料を−２０℃で凍結した。以下の表４にアッセイの結果を要約する。
【０１５１】
【表４】
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ヤギβ−カゼイン調節配列を、ヒト化抗ＣＥＡ Ｆ(ａｂ’)２の軽鎖および重鎖のコード領域、修飾ヒトカルボキシペプチダーゼＢ酵素に融合させた８０６．０７７、ならびにＣＰＢ（Ｃ末端ロイシンを含む）のプロドメインのコード領域に連結させた構築体を作成した。ＣＰＢプロドメインを発現するトランスジーンを含むまたは含まないトランスジェニックマウス系統を作成した。３つ全ての構築体に関してトランスジェニックであるマウスは、予測された酵素活性をもって、高レベル（４−６ｍｇ／ｍｌまで）でトランスジェニックマウスの乳中に (Ｆａｂ’)２−ＣＰＢ融合タンパク質を産生できることが示された（４／６の三重トランスジェニック系統は１ｍｇ／ｍｌを超えるレベルで発現した）。しかしながら、ＣＰＢプロドメイン発現の不在は、低レベルの活性融合タンパク質の分泌に関連するように思われる。しかしながら、３匹の二重トランスジェニック系統しか分析していないため、慎重にこの結果を考察しなければならない。
【０１５２】
要約すると、ヒト遺伝子の部位特異的突然変異誘発によってＣ末端グルタミン酸およびアスパラギン酸の加水分解に対する特異性を有するヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＣＰＢ）の変異体を調製し、大腸菌のペリプラズムで発現させた。酵素のＳ１’ポケットの内面の残基を変えることによって、基質特異性を変更させて、通常のＣ−末端塩基性残基ではなくＣ―末端酸性アミノ酸残基の前で加水分解できる変異体をもたらすことが可能である。これは、通常基質の塩基性側鎖と相互作用するＳ１’特異性ポケットの塩基におけるＡｓｐ２５３をＬｙｓまたはＡｒｇの何れかに変異させることによって達成された。得られた酵素は所望の逆転された極性を有し、２５１残基でさらに突然変異させることによって酵素活性は顕著に改善された。［Ｇ２５１Ｔ、Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ二重突然変異体は、シングル変異体よりも１００倍高い基質としてのヒプリル−Ｌ−グルタミン酸（ｈｉｐｐ−Ｇｌｕ）に対する活性を有していた。Ａｌａ２４８にさらに変化を有する［Ｄ２５３Ｋ］ＪＣＰＢ三重突然変異体は、位置２５１がＡｓｎであった場合にｈｉｐｐ−Ｇｌｕ基質に対して改善された活性を有していた。それらヒト酵素の逆転極性突然変異体は、癌の抗体−標的指向酵素プロドラッグ療法(antibody-directed enzyme prodrug therapy)で用いられる可能性を有する。
【０１５３】
実施例２：抗トランスフェリン受容体抗体／アンギオゲニン融合構築体の作成および試験
この実施例は、トランスジェニックマウスの乳腺における抗トランスフェリン受容体抗体／アンギオゲニン融合タンパク質の発現を示す。ヒトトランスフェリン受容体に対するキメラマウス／ヒト抗体（Ｅ６）を、そのＣＨ２ドメインとして、ヒト血管新生リボヌクレアーゼのアンギオゲニン（Ａｎｇ）の遺伝子に融合させた。それはマウスの乳腺で発現され、さらにマウス乳中に分泌された。乳中の発現レベルは約０.８ｇ／Ｌであった。キメラタンパク質は、Ａｎｇを含まない抗体と同等の抗体結合活性およびタンパク質合成阻害活性を保持した。そのキメラタンパク質はin vivoでヒト腫瘍細胞に対して特異的に細胞毒性であった。
【０１５４】
材料および方法
トランスジェニックマウス
標準的な公開された方法(Roberts et al., 1992; DiTullio et al., 1992; Gutierrez et al., 1996)に従ってトランスジェニックマウスを作成した。ファウンダーマウスを交配させて乳を分泌する雌を作成し、前述したようにその乳を採取し、さらに等量のリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。乳を−７０℃で保存した。
【０１５５】
乳の分画
Ｅ６ ＩｇＧ抗体を含む乳をプロテインＡセファロースカラムに装填し、０.１Ｍグリシン（ｐＨ３.０）を用いて１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を含有するチューブ中に溶出して、ｐＨを中性に調整した。融合タンパク質（ＣＨ２Ａｎｇ）を含む乳を０.２Ｍ ＥＤＴＡ溶液にして、氷上で２０分間インキュベートした後、遠心チューブ中において４℃で１０分間遠心した。注意深く脂肪層から脱脂粉乳を取り除き、再度遠心した後、０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.４）で平衡化および溶出させるＴＳＫ３０００カラム(Toso Haas Corp., PA)でのサイズ排除高性能液体クロマトグラフィによって精製を行った。流速は０.５ｍｇ／分であり、１分画分を回収した。アンギオゲニンに対する抗体と反応する物質の大部分は、カラムの空隙容量中に溶出した。この物質をプールし、アルギニン粉末を最終濃度１Ｍになるまで添加した。一晩４℃でインキュベートした後、上記のようにＴＳＫ ３０００カラムで再度試料をクロマトグラフィーにかけた。ＣＨ２Ａｎｇ含有乳は、１Ｍアルギニンでの２回目の処理、およびサイズ排除カラムでの再クロマトグラフィーを必要とした。
【０１５６】
タンパク質の特定
以下の吸光係数を用いてタンパク質を特定した：Ｅ６ ＩｇＧ抗体、Ｅ１％／２８０ｎｍ＝１４.０；ＣＨ２Ａｎｇ、Ｅ１％／２８０ｎｍ＝１０.０。
【０１５７】
タンパク質合成アッセイ
９６穴マイクロタイタープレートに、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ最小必須培地中、２５００細胞／ウェルで細胞を播種した。全容量１０μＬ中で添加し、プレートを３７℃で３日間インキュベートした後、０.１ｍＣｉの［１４Ｃ］−ロイシンを２−４時間添加した。ＰＨＤ細胞ハーベスターを用いて細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、水で洗浄し、エタノールで乾燥し、さらに計測した。結果は、模擬処理ウェル中における［１４Ｃ］−ロイシン取込みに対する割合（％）を示す。
【０１５８】
実施例３： トランスジェニックマウスの乳中における抗ヒトトランスフェリン受容体抗体および抗体−アンギオゲニン融合タンパク質の発現
トランスジェニックマウスを作成するのに用いたＤＮＡ構築体は図１および図２Ａに図示されている。記載の研究で用いたキメラ抗トランスフェリン受容体抗体は、もともとヒト腫瘍壊死因子に融合されており(Hoogenboom et al., 1991)、さらにヒトリボヌクレアーゼであるアンギオゲニンに融合させた(Ang, Ryback, et al., 1992)。抗体のＣＨ２ドメインの５'領域の最初の３つのアミノ酸残基の後にＡｎｇ遺伝子を融合させ、従ってヒンジ領域をそのままにして重鎖の二量化を可能にする。目的は、患者に投与した際により少ない免疫原性副作用を誘起し得るヒト化イムノトキシン様タンパク質を作成することであった。in vivo哺乳類細胞発現系は、特に抗体をヒトＲＮａｓｅアンギオゲニン（Ａｎｇ）（ＡｎｇはＲＮａｓｅ Ａスーパーファミリーのメンバーである）に融合させた場合に、ほんの僅かな物質機能的研究しかもたらさなかった。このスーパーファミリーの全てのメンバーは小さい（１２−１４ｋＤａ）。基本的なリボ核酸分解酵素は、哺乳類および両生類の膵臓ならびに他の臓器、体液および組織で見出される。それらＲＮａｓｅは、例えば血管新生を誘導する等、ＲＮＡの生理作用を残すことができるが、様々なＲＮａｓｅメンバーに関して宿主防御作用および抗ウイルス効果が記載されている。ＲＮａｓｅは自然の防御系の一部であるため、それらを用いて、抗体との化学複合体および組換え融合タンパク質を作成した。それら研究はＲＮａｓｅベースの治療が癌およびＡＩＤＳの治療の可能性を有することを示唆することから、もとのヒトトランスフェリン受容体に対するキメラ抗体とＲＮａｓｅとの研究が、トランスジェニック動物の乳中での複合タンパク質の産生のために新規に開発された技術を用いて再探索された。それら研究で用いられた遺伝子構築体の分子の詳細は上記の通りである。ローマ数字は図２のパネルＡに示される数字に対応し、ヤギβ−カゼイン遺伝子のエキソン２と７との間にクローン化されたＤＮＡについてさらに詳細に説明する。
【０１５９】
ヒトトランスフェリン受容体に対するキメラ抗体であるＥ６抗体の重鎖全体をコードするＤＮＡ(Hoogenboom et al., 1990)を、乳分泌しているトランスジェニックマウスの乳中に高レベルで発現される改変ヤギβ−カゼイン遺伝子のエキソン２と７との間で用いた（図２Ａ，Ｉ）(Roberts et al., 1992)。ヒトＲＮａｓｅアンギオゲニン（Ａｎｇ）の遺伝子を、抗体のＣＨ２ドメインに連結させて抗体−酵素融合体をコードする第２のトランスジーンを調整した（図１および図２Ａ，II）。それら遺伝子ならびに同じ抗体の軽鎖をコードする遺伝子（図２Ａ，III）を全て別々にクローン化し、原核生物ＤＮＡを含まないように適当な対（重鎖（Ｈ）と軽鎖（Ｌ）；ＣＨ２ ＡｎｇとＬ鎖）を精製し、マウス胚に共注入し、その胚を標準的方法で再移植した(Roberts et al., 1992)。得られた子孫の尾から得たＤＮＡのＰＣＲおよびサザンブロット分析によってトランスジェニックマウスを同定した。
【０１６０】
ファウンダーマウスを交配させて、乳分泌トランスジェニック雌を作成した。乳を採取し、ＰＢＳで希釈し、抗体鎖およびＡｎｇの存在に関して分析した。ヒトＡｎｇに対して生じたポリクロナール抗体は、融合タンパク質中の予測されたＭ（４３ｋＤａ；抗体重鎖、２９ｋＤａ；Ａｎｇ、１４ｋＤａ）のバンドとのみ反応した（図２Ｂ，左パネル）。しかしながら、抗ＩｇＧ抗血清はキメラＥ６抗体のＨおよびＬ鎖の両方と強く反応した（図２Ｂ，右パネル）。抗体融合タンパク質のＬ鎖は抗ＩｇＧ抗血清を用いてはっきりと観察されたが、ＣＨ２Ａｎｇの切断Ｈ鎖はほとんど検出できず、アンギオゲニンのＣＨ２ドメインへの融合がＨ鎖への抗血清の結合を妨害したことを示唆した。
【０１６１】
プロテインＡセファロースでのクロマトグラフィーによってキメラＩｇＧ抗体を精製した。図２Ｃのレーン１および２に示すように、還元条件下でのゲル電気泳動による最終精製産物は、軽鎖（２８ｋＤａ）および重鎖（約５５ｋＤａ）タンパク質の存在を示した。非還元条件下でのウェスタン分析（図２Ｃのレーン３）は、トランスジェニック抗体がＩｇＧとＦａｂ形態（それぞれ１６８ｋＤａおよび８４ｋＤａ）の混合物として存在することを示した。少量のフリーの重鎖（５５ｋＤａ）も見られた。
【０１６２】
ＣＨ２Ａｒｇ融合タンパク質を含有する乳を同様に採取し、ＰＢＳで希釈した。プロテインＡセファロースはアンギオゲニン融合タンパク質を結合することができなかった。同じＣＨ２抗体断片を以前ＴＮＦに融合させたときも同様の結果が得られ、これは、ＣＨ２−ＣＨ３接合部近くにあると思われるプロテインＡ結合部位の欠失のせいであるとみなされた(Hoogenboom et al., 1991)。トランスジェニック抗体−Ａｎｇ融合タンパク質の性質をウェスタンブロッティングによって特定した。鎖間のジスルフィド結合の還元の後、Ｈ鎖−Ａｎｇ融合体（４３ｋＤａ）と軽鎖（２８ｋＤａ）とが解離した（図２Ｃのレーン２）。非還元条件下での抗ＩｇＧ抗体を用いたウェスタン分析（図２Ｃのレーン５）は、トランスジェニック抗体−酵素融合タンパク質がＦ(ａｂ)２とＦａｂ形態（それぞれ１４２および７１ｋＤａ）の混合物として存在することを示した。抗Ａｎｇ抗血清を用いて分析を実施した場合も同様の結果が得られた（データは示していない）。後者の結果を総合すれば、軽鎖は重鎖−Ａｎｇ融合体と結合していることを示す。
【０１６３】
実施例４： 抗体−アンギオゲニン融合タンパク質の生物学的特徴付け
アンギオゲニンは、そのリボ核酸分解活性に基づく機序によってウサギの網状赤血球溶解物の翻訳能力の強力な阻害剤である(St. Clair et al., 1987)。図２は、ＡｎｇまたはＣＨ２Ａｎｇを溶解物に添加すると、[３５Ｓ］メチオニンの酸沈殿タンパク質への取込みによって測定したタンパク質合成の阻害を生じさせた。ＩＣ５０Ｓ（４０ｎＭ）の非融合ＡｎｇまたはＣＨ２Ａｎｇはこの測定法では区別できず、この配向（ＮＨ２−末端）でＡｎｇをＣＨ２抗体ドメインに融合させても活性部位残基が影響を受けないことの確認を示唆した。
【０１６４】
競合結合実験によって融合タンパク質の抗体部分を特徴付けした（表５）。乳由来Ｅ６抗体（ＩｇＧ）のヒトトランスフェリン受容体への結合を評価し、もともとハイブリドーマ抗体から精製された同じ抗体の結合性と比較した(Heyligen et al., 1985)。両方の抗体が［１２５Ｉ］標識親抗体に置き換わる両方の抗体の能力は同じであった（それぞれ０.８ｎＭで５０％置換）。ＣＨ２Ａｎｇ融合タンパク質は、Ｅ６無傷抗体よりも１７５倍活性が低かった（１４０ｎＭ ＣＨ２Ａｎｇに対して０.８ｎＭ Ｅ６）。
【０１６５】
新規に合成されたタンパク質への［１４Ｃ］ロイシンの取込みを測定することによって、Ａｎｇ融合タンパク質のヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を評価した。典型的な用量反応曲線を図３に示す。ＣＨ２Ａｎｇは、それぞれ１５および４５ｎＭでＩＣ５０ＳでＳＦＳ３９ヒト神経膠腫細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｍｄｒｌ乳癌細胞のタンパク質合成を阻害した。他のヒト腫瘍細胞株での細胞毒性を表６で比較する。ＩＣ５０Ｓは１５から７０ｎＭまでの範囲に及ぶ。抗原陰性細胞株（マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、データは示していない）では全く活性は観察されず、さらに５倍モル過剰な非融合キメラ抗体が約５０％の細胞毒性を示したことから、その細胞毒性は融合タンパク質に特異的であった。ＣＨ２Ａｎｇは疑似処理細胞の９９％までタンパク質合成を阻害したが、５倍モル過剰な抗体の存在下でタンパク質合成は疑似処理細胞の４５％まで低下した。非融合タンパク質(Rybak et al., 1992)もフリーのＡｎｇ(Newtonet al., 1996)も細胞毒性であるため、細胞毒性を誘起するには融合タンパク質中の２つのドメインが共有結合しなければならない。
【０１６６】
以下のニワトリ胚漿尿膜におけるアンギオゲニン活性およびウサギ角膜アッセイによって、腫瘍細胞ならし培地からアンギオゲニンを単離した(Fett et al., 1985)。リボヌクレアーゼに対するその相同性およびその血管新生活性に連結した顕著な核酸分解活性(Fett et al., 1985)は、細胞特異的ターゲティング剤を用いてＡｎｇが腫瘍細胞にターゲティングされた場合に、腫瘍細胞の殺傷の増強を促進させる独自の生物学的特性をもたらす。Ａｎｇが融合タンパク質として発現された場合、血管新生活性は維持される(Newton et al., 1996)。アンギオゲニンはヒト大腸癌細胞の細胞表面プロテオグリカンにも結合する。(Soncin et al., 1994)。従って、抗体による腫瘍部位への局在化はＡｎｇの腫瘍細胞結合特性によって高められるが、高められた血管新生は腫瘍の血管形成を増加させることによって腫瘍の侵入を助けると考えられる(Newton et al., 1996)。さらには、Ａｎｇのアンタゴニストは、腫瘍増殖を防止する(Piccoli et al., 1998; Olson et al., 1995)。従って、Ａｎｇ活性は多面発現であり；それらの発現はＡｎｇが曝される細胞環境によって支配され、例えばサイトソルタンパク質合成機構のターゲティングは細胞毒性を生じさせるが、上皮細胞中の核へのＡｎｇのエンドサイトーシスおよび移動は血管新生を誘導することが報告されている(Moroianu and Riordan, 1994)。それらＡｎｇの生物学的特性は、それぞれこのタンパク質を中和しまたは特異的にターゲティングすることによって細胞増殖抑制性（抗血管新生）でかつ細胞毒性（抗腫瘍細胞）の治療計画を設計する独自の機会をもたらす。
【０１６７】
癌(Rybak et al., 1991; Rybak et al., 1992; Newton et al., 1992; Newtonetal.,1994; Newton et al., 1996; Jinno et al., 1996; Zewe et al., 1997; Deonarain＆Epenetos, 1998)および心血管疾患(Haber, 1994; Collen, 1997)のためのヒト酵素ベースの複数ドメインターゲティング療法は、前臨床での特徴付けおよび最終的な臨床での使用のためにそれら試薬を産生することができる発現系を開発することに依存する。トランスジェニックマウスの乳中での２本鎖抗体Ａｎｇ融合タンパク質の発現は、本研究において達成されかつ示されている。おそらく低い産生体の選択につながる分泌の間における逆行性の輸送のせいで類似の融合タンパク質が培養骨髄腫細胞から非常に低レベルでしか発現されなかったため、Ａｎｇがトランスジェニックマウスにおいて融合タンパク質としてうまく発現されることは明らかではなかった(Rybak et al., 1992)。明らかに、乳腺の自然環境において、発現効率は細胞培養系に関係なく１６０,０００倍に高められた(乳中および骨髄腫細胞においてそれぞれ０.８ｇ／Ｌ対５μｇ／Ｌ）。従って、十分な量のＡｎｇ融合タンパク質を生物学的特徴付けのために精製することができた。この研究の重要な点は、融合タンパク質におけるＡｎｇの配向の重要性が初めて実証されたことである。一本鎖抗体Ａｎｇ融合タンパク質において、Ａｎｇは抗体のＣ末端において、Ｎ末端に向けて融合された(Newton et al., 1996)。続いて、ＡｎｇのＣ末端領域の最後の３つのアミノ酸残基は、活性中心サブサイト(active center subsite)に寄与することが明らかとなった(Russo et al., 1996)。ＣＨ２融合タンパク質中のＡｎｇおよびフリーのＡｎｇは、ウサギの網状赤血球溶解物アッセイにおいて同等の効果であったが、一本鎖融合タンパク質中のＡｎｇは、フリーのＡｎｇよりも２倍低い効率で溶解物アッセイにおいてタンパク質合成を阻害した(Newton et al., 1996)。
【０１６８】
概して、抗体−酵素融合タンパク質を乳腺において高レベルで発現させ得ることを初めて実証した。特に、抗体−Ａｎｇ融合体を乳腺で発現させ得ることの実証は、乳癌に関するトランスジェニックマウスモデルの開発と関連する。他の乳特異的遺伝子からのプロモーターを用いて、乳分泌の間にトランスジーンの発現を生じさせて腫瘍形成の開始を模倣する(Amundadottier et al., 1996)。本研究の結果は、特定のプロモーターが活性イムノトキシンの発現を誘導できることを示すため、二重トランスジェニック系統を開発して、人工的腫瘍形成に対して標的化されたＡｎｇ融合タンパク質の発現が疾患の進行を防止または変更できるか否かを評価することができた。マウス対応物が利用可能であるため、それら結果は特にＡｎｇに関連する(Bond et al., 1993)。
【０１６９】
要約すると、これら結果は、複合異種融合タンパク質が、哺乳類細胞培養(Rybaket al., 1992)および大腸菌発現系(Newton et al., 1996)によるよりも大量にかつ優れた生物学的特性をもってマウス乳腺において発現され得ることを初めて実証する。その結果は、それら融合タンパク質を薬剤として製造する可能性ならびに乳癌のための新規な動物モデルを作成する可能性の両方を含む。
【０１７０】
以下の省略形は、本明細書において用いられた：Ａｎｇ，ヒトアンギオゲニン；Ｅ６，抗トランスフェリン受容体ＩｇＧモノクローナル抗体；ＲＮａｓｅ，リボヌクレアーゼ；Ｈ鎖，重鎖；Ｌ鎖，軽鎖；ＣＨ２Ａｎｇ，Ｅ６重鎖のＣＨ２ドメインに融合したアンギオゲニン；ＩＣ５０，タンパク質合成を５０％阻害する融合タンパク質の濃度。
【０１７１】
【表５】
2003509040.tif 000006
【表６】
2003509040.tif 000007
実施例７：トランスジェニックヤギの作成および特徴付け
以下に概要を説明した欄は、トランスジェニックヤギの産生における主な工程を簡単に説明する。
【０１７２】
ヤギの種類および品種：
アルパイン、ザーネン、トッゲンブルク種などのスイスを産地とするヤギがトランスジェニックヤギの作成において好ましい。
【０１７３】
ヤギ過剰排卵
０日目に６ｍｇのノルジェストメット（ｎｏｒｇｅｓｔｍｅｔ）（Ｓｙｎｃｒｏｍａｔｅ−Ｂ、ＣＥＶＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ．，カンザス州オーバーランドパーク）を耳根部皮下に移植してドナー動物の発情のタイミングを同期させた。７〜９日後にプロスタグランジンを投与してプロゲステロンの体内合成を阻止した。インプラント挿入後１３日目より、全体で１８ｍｇの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ニュージャージー州ケニルワース）を１日２回、３日間にわたって筋肉内投与した。１４日目にインプラントを取り除いた。インプラント除去の２４時間後、ドナー動物を繁殖能を有する雄と２日間にわたり数回交尾させた（Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205）。
【０１７４】
胚採取
交尾２日後（またはインプラント除去の７２時間後）に外科的に胚を採取した。過剰排卵を誘発した雌に手術の３６時間前から餌および水を与えなかった。これらの雌に０．８ｍｇ／ｋｇのジアゼパム（Ｖａｌｉｕｍ（登録商標））を静脈内投与し、直後に５．０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｋｅｔｅｓｅｔ）を静脈内投与した。術中、ハロタン（２．５％）を２Ｌ／分の酸素に混入したものを気管内チューブによって与えた。腹部正中切開によって生殖道を体外に出した。黄体、直径６ｍｍ以上の未破裂卵胞、および卵巣嚢胞を計数することにより過剰排卵の結果を評価し、卵管洗浄によって採取される胚の数を予測した。卵管口にカニューレを留置し、３．０Ｐｒｏｌｅｎｅ糸で一重に仮結紮した。子宮内の子宮卵管移行部から約０．５ｃｍの位置にゲージ２０の針を留置した。挿管した卵管を１０〜２０ｍｌの滅菌リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、この溶液を回収した。以上の操作を反対側でも行い、生殖道を腹腔に戻した。縫合前に１０〜２０ｍｌの滅菌グリセリン溶液を腹腔に注入して癒着を防止した。白線を２．０ＰｏｌｙｄｉｏｘａｎｏｎｅまたはＳｕｐｒａｍｉｄで単純に結節縫合し、滅菌創傷クリップで皮膚を閉鎖した。立体顕微鏡上でＰＢＳによる卵管洗浄液からヤギ受精卵を採取し、Ｓｉｇｍａ社より購入した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）中で洗浄した。前核が視認された場合、直ちに胚にマイクロインジェクションを行った。前核が視認されない場合、胚を１０％ＦＢＳを含有するＨａｍ’ｓＦ１２培地に入れ、前核が視認されるようになるまで５％ＣＯ２を含む空気で満たされた湿潤ガスチャンバー内で３７℃にて短期間培養することも可能である（Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205）。
【０１７５】
マイクロインジェクション処置
ヤギの一細胞期胚を培地の小滴に入れ、凹みを有するスライドグラスに置いてオイルを滴下する。視認可能な２個の前核を有する受精卵を、ノマルスキー製光学系を用いた固定ステージを有するツァイス製直立顕微鏡上で、火炎にて艶だしした保持ピペットに固定する。次いで、例えば、ヤギβ-カゼイン遺伝子の調節エレメントに機能的に関連した融合タンパク質遺伝子を有するＢＣ３５５ベクターなどの対象ＤＮＡ構築体を注入バッファー（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）に入れ、精密なガラス製マイクロニードルを用いて前核にマイクロインジェクトする（Selgrath et al., Theriogenology, 1990. pp.1195-1205）。
【０１７６】
胚発生
マイクロインジェクション後、生存した胚を１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地に入れ、レシピエント動物が胚移植可能となるまで５％ＣＯ２を含む空気で満たされた湿潤ガスチャンバー内で３７℃にて培養する（Selgrath et al., Theriogenology, 1990. pp.1195-1205）。
【０１７７】
レシピエントの準備
６ｍｇのノルジェストメットインプラント（Ｓｙｎｃｈｒｏｍａｔｅ−Ｂ）を耳根部に移植してレシピエント動物の発情を同期させる。インプラント挿入後１３日目に、Ｓｉｇｍａ社より入手した妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）の非過剰排卵誘発量（４００Ｉ．Ｕ．）を動物に単回投与した。レシピエント雌動物は精管切除を施した雄動物と交尾させて発情の同期化を図った（Selgrath et al., Theriogenology, 1990. pp.1195-1205）。
【０１７８】
胚移植
同じドナー雌動物から得た全ての胚を一緒に保管し、可能な場合には１頭のレシピエントに移植した。そのための外科処置は、卵管に挿管しない点を除いて上述の胚採取におけるものと同様であり、胚は最小量の１０％ＦＢＳ含有Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に入れ、ガラス製マイクロピペットを用いてフィンブリアを介して卵管内腔に移植する。卵巣に６〜８個以上の排卵点を有する動物はレシピエントとしては不適当である。創口の閉鎖および術後の処置はドナー動物の場合と同様である（Selgrath et al., Theriogenology, 1990. pp.1195-1205）。
【０１７９】
妊娠および分娩の監視
継続的発情の初日から数えて４５日目に超音波診断によって妊娠を判定する。１１０日目に２回目の超音波診断を行って妊娠を確認し、ｆｅｔａｌ ｓｔｒｅｓｓを評価する。１３０日目に妊娠状態にあるレシピエント雌動物に破傷風トキソイドおよびクロストリジウムＣおよびＤを接種する。セレンおよびビタミンＥ（Ｂｏ−Ｓｅ）を筋肉内投与し、イベルメクチンを皮下投与する。１４５日目にこれらの雌を清潔な房に移し、約１４７日目の分娩に備えてこの環境に順応させる。１４７日目に４０ｍｇのＰＧＦ２ａ（Ｌｕｔａｌｙｓｅ（登録商標）、アップジョン・カンパニー、ミシガン州、カラマズー）により分娩を誘発させる。ＰＧＦ２ａの投与は２回に分けて行い、２０ｍｇの投与の４時間後に更に２０ｍｇを筋肉内投与する。１４７日目のＬｕｔａｌｙｓｅ（登録商標）の初回投与後、昼夜にわたって定期的に雌動物を観察する。２日目の朝からは観察頻度を３０分毎に増やす。初回投与の３０〜４０時間後に分娩が起きる。出産後、雌動物から初乳を採取して胎盤の通過を確認する。
【０１８０】
Ｆ０動物の形質転換の確認
トランスジェニックＦ０動物をスクリーニングするには、２つの異なる細胞系からゲノムＤＮＡを単離してモザイク形質転換体のとりこぼしのないようにする。モザイク動物とは、全ての細胞にトランスジーンのコピーが１つもないヤギとして定義される。したがって、ゲノムＤＮＡを単離するために生後２日目のＦ０動物から耳組織標本（中胚葉）および血液標本を採取する（Lacy, et al., A Laboratory Manual, 1986, Cold Springs Harbor, NY; and Herrmann and Frischauf, Methods Enzymology, 1987. 152: pp. 180-183）。そのＤＮＡ試料を、融合タンパク質遺伝子に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（Gould, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 1989. 86:pp. 1934-1938）および第1部分または第２部分のランダムなｃＤＮＡプローブ（Feinberg and Vogelstein, Anal. Bioc., 1983. 132: pp. 6-13）をもちいたサザンブロット（Thomas, Proc Natl. Acad. Sci., 1980. 77:5201-5205）によって分析する。アッセイの感度は体細胞の１０％においてトランスジーンのコピーが１つ検出される程度である。
【０１８１】
生産集団の作出および選択
上述の処置によってトランスジェニックファウンダー（Ｆ０）としてのヤギや他のトランスジェニックヤギを作出することが可能である。例えばトランスジェニックＦ０ファウンダーヤギを交尾させて、動物が雌である場合には乳を産生させ、雄ファウンダーである場合には雌のトランスジェニック子孫を作出する。雄のトランスジェニックファウンダーを非トランスジェニック雌動物と交配して雌のトランスジェニック子孫を作出することができる。
【０１８２】
トランスジーンの伝達および好ましい特性
このヤギの系列における目的トランスジーンの伝達を耳組織および血液にＰＣＲおよびサザンブロットを行って分析した。例えば、雌ファウンダーおよびその３頭のトランスジェニック子孫について行ったサザンブロットでは世代間で遺伝子再編成およびコピー数の変化は見られなかった。サザンブロットにおけるブロットを免疫グロブリン−酵素融合タンパク質ｃＤＮＡプローブでプローブした。このブロットをベータスコープ６０３で分析し、トランスジーンとヤギベータ−カゼインの内因性遺伝子との比較によってコピー数を求めた。
【０１８３】
発現レベルの評価
トランスジェニック動物の乳中のトランスジェニックタンパク質の発現レベルを酵素アッセイまたはウェスタンブロットにより求める。
【０１８４】
【参考文献】
2003509040.tif 000008
2003509040.tif 000009
2003509040.tif 000010
2003509040.tif 000011
2003509040.tif 000012
他の実施形態は特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
抗体および抗体アンギオゲニン融合タンパク質の遺伝子の略図
【図２Ａ】
トランスフェリン受容体抗体（Ｅ６）およびアンギオゲニン−酵素融合体（ＣＨ２Ａｎｇ）のトランスジェニック発現ベクターの構造の略図
【図２Ｂ】
Ｅ６  ＩｇＧ抗体またはＣＨ２Ａｎｇ融合タンパク質を産生する泌乳する雌から採取された乳の還元条件下でのウェスタン分析を示す図
【図２Ｃ】
生成されたＥ６抗体またはＣＨ２Ａｎｇの還元または非還元条件下でのウェスタン分析を示す図
【図３】
アンギオゲニンまたはアンギオゲニン−抗体融合体（ＣＨ２Ａｎｇ）のｍＲＮＡ翻訳に対する効果を示すグラフ
【図４】
培養細胞中のアンギオゲニン−抗体融合体の細胞毒性効果を示す用量反応曲線を示すグラフ


【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2003509040.tif 000013
【図２】
2003509040.tif 000014
【図３】
2003509040.tif 000015
【図４】
2003509040.tif 000016