【手続補正書】
【提出日】平成15年9月26日(2003.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのバイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産することができる真核微生物から、ポリエン脂肪酸を含む脂質を生産する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、非アルコール炭素源と制限栄養素源とを加えることから成る方法。
【請求項２】
そのバイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産することができる真核微生物から、ポリエン脂肪酸を含む脂質を生産する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、フェッドバッチ法で炭素源を加えることから成る方法。
【請求項３】
その微生物により生産される総脂質の少なくとも約１５％を多価不飽和脂質として生産することができる真核微生物から、ポリエン脂肪酸を含む脂質を生産する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、非アルコール炭素源と制限栄養素源とを加えることから成る方法。
【請求項４】
その微生物により生産される脂質の合計の少なくとも約１５％を多価不飽和脂質として生産することができる真核微生物から、ポリエン脂肪酸を含む脂質を生産する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、フェッドバッチ法で炭素源を加えることから成る方法。
【請求項５】
そのバイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産することができる真核微生物を生育する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、炭素源と制限栄養素源とを加えることから成り、前記方法は約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、前記微生物によって生産された脂質の合計の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、方法。
【請求項６】
真核微生物を生育する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、炭素源と制限栄養素源とを加えることから成り、前記微生物は、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物は、自身のバイオマスの少なくとも約２０％を、いくつかのポリエン脂肪酸を含む脂質として生産することができる、方法。
【請求項７】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるために前記発酵培地で真核微生物を生育するステップと、
（ｂ）前記微生物が前記脂質を生産できるのに十分な発酵条件を提供するステップと、
（ｃ）約１５％よりも多くが多価不飽和脂質である前記脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項８】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）微生物を含む発酵培地に、非アルコール炭素源および制限栄養素源を加えるステップと、
（ｂ）前記微生物が前記微生物脂質を生産するのに十分な条件を提供するステップと、
（ｃ）少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である前記微生物脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項９】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）真核微生物を含む発酵培地に、炭素源および制限栄養素源を加え、少なくとも約１００ｇ／Ｌのバイオマス密度を生産するよう前記発酵培地中の溶存酸素レベルを少なくとも約４％の飽和度に維持するのに十分な条件を提供するステップと、
（ｂ）前記発酵培地中の溶存酸素レベルを約３％以下の飽和度に維持するのに十分な条件を提供し、前記微生物が前記脂質を生産することができるのに十分な条件を提供するステップと、
（ｃ）少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である前記微生物脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項１０】
産物と微生物を生産する従属栄養方法であって、
（ａ）ポリケチドシンターゼ遺伝子を有する前記微生物を成長培地中で培養するステップと、
（ｂ）溶存酸素レベルを前記発酵培地の約１０パーセント未満の飽和度に維持するステップと、から成る方法。
【請求項１１】
前記方法はフェッドバッチ法である、請求項１，３，５，６，７，８，９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法はバイオマス密度増大段階と生産段階とから成り、かつ前記バイオマス密度増大段階は炭素源と制限栄養素源とを加えることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、バイオマス密度増大段階と生産段階とから成り、前記バイオマス密度増大段階は、前記炭素源と前記制限栄養素源とを加えること含み、前記生産段階は、脂質生産を引き起こす前記栄養素制限状態を誘導するために前記制限栄養素源を全く加えないかあるいはほとんど加えない状態で前記炭素源を加えることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
生産段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、バイオマス密度増大段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量よりも低い、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマス密度増大段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、前記発酵培地の少なくとも約４％の飽和度である、請求項１〜８または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
生産段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、前記発酵培地の約１％未満の飽和度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
総発酵時間が少なくとも約９０時間の発酵プロセスについて、発酵培地中の溶存酸素レベルは、最初の２４時間には約８％、約２４時間目から約４０時間目までは約４％、約４０時間目から発酵プロセスの終りまでは約０．５％以下に維持される、請求項１〜８または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
発酵培地中の溶存酸素レベルは、約４０時間目から発酵プロセスの終りまでは約０．５％以下に維持される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記発酵培地中の炭素源は炭水化物を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記発酵培地中の制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２源、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵培地中の制限栄養素源は、微量金属源または主要金属源であって、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記発酵培地中の制限栄養素源は窒素源を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵培地中の制限栄養素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記発酵培地中の制限栄養素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
発酵培地のｐＨは制限栄養素源によって調節される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記発酵培地は少なくとも約２０℃の温度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産する、請求項１〜４または６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、前記脂質の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、請求項１〜４または６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、ω‐３およびω‐６脂肪酸の合計量は、前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸または好気的条件下で生産可能な他の脂質を生産することができる、請求項１〜５または７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸または好気的条件下で生産可能な他の脂質を生産することができ、前記微生物はフェッドバッチ法で増殖される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸または好気的条件下で生産可能な他の脂質を生産することができ、前記微生物はフェッドバッチ法で増殖され、かつ、前記発酵方法の生産期の間、前記発酵培地で約３％未満の飽和度の酸素レベルを維持することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法は、
（ａ）発酵培地中の溶存酸素レベルが少なくとも約４％の飽和度である、バイオマス密度増大段階；
（ｂ）発酵培地中の溶存酸素レベルが約３％未満の飽和度である、高い脂質生産段階；からさらに成る、請求項１〜８または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
炭素源は非アルコール炭素源である、請求項２，４〜７または９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度でドコサヘキサエン酸を生産する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
脂質を回収するステップからさらに成る、請求項１〜６または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記脂質を回収するステップは、
（ａ）前記発酵培地から水を除去し、乾燥微生物を提供するステップと、
（ｂ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項７〜９または４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記脂質を回収するステップは、
（ａ）発酵培地を処理して、微生物細胞を透過化、溶解、または破裂させるステップと、
（ｂ）脂質／水エマルションの破壊を援助する作用物質の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法により発酵培地から脂質を回収するステップと、から成る、請求項７〜９または４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記脂質を回収するステップは、
（ａ）前もって遠心せずに前記発酵培地から水を蒸発させて乾燥微生物を提供するステップと、
（ｂ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項７〜９または４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
溶存酸素レベルは前記発酵培地の５パーセント未満の飽和度である、請求項１〜８または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
溶存酸素レベルは前記発酵培地の１パーセント未満の飽和度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
最初の成長期の間、溶存酸素レベルは前記発酵培地の約１０パーセントより大きい飽和度であり、後の生産期の間、溶存酸素レベルは前記発酵培地の１０パーセント未満の飽和度である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記微生物はポリケチドシンターゼ遺伝子を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリケチドシンターゼ遺伝子が前記微生物中で天然で生じる、請求項１０または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリケチドシンターゼ遺伝子は前記微生物へ遺伝学的に導入される、請求項１０または４８に記載の方法。
【請求項５１】
最初の成長期の間、溶存酸素レベルは前記発酵培地の約１０パーセントより大きい飽和度であり、後の生産期の間、溶存酸素レベルは前記発酵培地の約１０パーセント未満の飽和度である、請求項１０または４８に記載の方法。