【手続補正書】
【提出日】平成15年8月14日(2003.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのＮＯ２基をＮＨＯＨまたはＮＨ２に還元することを特徴とする、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子の蛍光を増大するための方法。
【請求項２】
少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子がシアニン色素である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子が、式Ｉ：
【化１】
2003522333.tif 000001
〔式中、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＸおよびＹを含む環に結合し、または、所望により、Ｚ１およびＺ２環構造の原子に結合し、ｎは１−３の整数である；
Ｚ１およびＺ２は各々１個または２個の縮合芳香族環を達成するのに必要な結合または原子を示し、各環は炭素原子、および所望により、２個を超えない酸素、窒素および硫黄原子から選択される５個または６個の原子を有する；
ＸおよびＹは同一または異なり、ビス−Ｃ１−Ｃ４アルキル−およびＣ４−Ｃ５スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−およびＮ−Ｗ(ここで、Ｎは窒素およびＷは水素、基−(ＣＨ２)ｍＲ８から選択され、ｍは１から２６の整数およびＲ８は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、ホスホネート、ポリエチレングリコール、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される)から選択される；
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して水素、置換または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＯＲ９、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネートおよびスルフェートからなる群から選択され、ここでＲ９は置換または非置換であり、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される；
基Ｒ１およびＲ２は非置換または置換され得るＣ１−Ｃ１０アルキルから選択される；
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、本質的に非蛍光であるように該色素の蛍光放出を減少させる、少なくとも一つのニトロ基を含むを特徴とする〕
を有する修飾シアニン色素である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子が、式IIまたは式III
【化２】
2003522333.tif 000002
の化合物、またはそれらの塩である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの該ＮＯ２基の還元が酵素により触媒される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの該ＮＯ２基の還元がニトロレダクターゼ、および好ましくは細菌ニトロレダクターゼにより触媒される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
組成物中のニトロレダクターゼ酵素活性の検出法であり、
ａ)該組成物と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を、ニトロレダクターゼ活性を促進する条件下で混合する；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である蛍光の増大を測定する：
ことを含む方法。
【請求項８】
組成物が細胞または細胞抽出物を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ａ)アッセイ試薬に結合したニトロレダクターゼ酵素を、酵素の活性の量がアッセイにおける検体の量と比例する条件下で提供する；
ｂ)少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を提供する；そして
ｃ)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度として蛍光の増大を測定する
ことを含む、検体の検出法。
【請求項１０】
ａ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させる；
ｂ)ニトロレダクターゼ酵素で標識されている特異的結合対の第２成分を、成分の間の結合を促進する条件下で添加する；
ｃ)少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を、ニトロレダクターゼ活性に適した条件下で添加する；そして
ｄ)第２成分の第１成分への結合を、結合ニトロレダクターゼ活性の尺度としての蛍光の増大の測定により検出する：
ことを含む、アッセイ法。
【請求項１１】
該特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／レセプター、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法。
【請求項１３】
シアニン色素分子が細胞に透過性である、請求項１２記載のアッセイ法。
【請求項１４】
シアニン色素分子が式Ｉの化合物である、請求項１２または１３に記載のアッセイ法。
【請求項１５】
式Ｉのシアニン色素分子の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、細胞膜透過性化(permeabilising)基を含む、請求項１４に記載のアッセイ法。
【請求項１６】
細胞透過性であることを特徴とする、少なくとも一つのＮＯ２基を含む式Ｉのシアニン色素分子。
【請求項１７】
該シアニン色素分子が式IIIａまたは式IIIｂ
【化３】
2003522333.tif 000003
の化合物、またはそれらの塩から選択される、請求項１６記載のシアニン色素分子。
【請求項１８】
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞の抽出物と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法。
【請求項１９】
シアニン色素分子の増大した蛍光を、５００−９００nmの範囲の蛍光放出の分析により測定する、請求項１から１５のいずれかまたは１８に記載の方法。
【請求項２０】
シアニン色素分子の増大した蛍光を、６６５nm−７２５nmの範囲の蛍光放出の分析により測定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ニトロレダクターゼ酵素を発現するための手段および少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を含む、レポーターシステムのためのキット。
【請求項２２】
特異的結合対の成分の一方の存在を検出するためのキットであり、結合対の他方の成分に結合したニトロレダクターゼ酵素と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を含むキット。
【請求項２３】
式IV：
【化４】
2003522333.tif 000004
〔式中、
Ｄ１は検出可能フルオロフォアである：
Ｄ２は式(Ｉ)を有するシアニン色素分子である：そして
Ｌはリンカー基である〕
の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーター。
【請求項２４】
該レポーターが膜透過性である、請求項２３記載の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーター。
【請求項２５】
Ｌが開裂可能リンカー基である、請求項２３または２４に記載の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーター。
【請求項２６】
請求項２３から２５のいずれかに記載の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーターを含む、請求項９から１５のいずれかに記載のアッセイ法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
酵素は、アッセイ成分、例えば、免疫アッセイにおける抗体または核酸ハイブリダイゼーションにおける核酸分子に結合し、典型的に非蛍光基質から蛍光シグナルを発生させるために使用され得る。このような方法において、生成物の蛍光強度は、アッセイシグナルを提供し、アッセイにおける検体(例えば、免疫アッセイにおける抗原または核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける相補的核酸配列)の量と相関する。このような酵素をベースにした蛍光法アッセイの例は、“Applications of Fluorescence in Immunoassays”, Chapter 9, pages 223-232, I.A. Hemmila, John Wiley & Sons, New York, 1991 (免疫アッセイ)および“Nonisotopic DNA Probe Techniques”, Chapter 1, pages 3-23, L.J. Kricka, Academic Press Inc., New York, 1992 (核酸ハイブリダイゼーションアッセイ)に記載され、このようなアッセイに使用される酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)およびアルカリホスファターゼを含む。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
あるいは、酵素はアッセイの過程においてタンパク質合成により製造し得る。例えば、インビボ遺伝子発現アッセイにおいて、酵素を、自然には存在しないか、低レベルでしか見られない細胞または生物に、レポーター遺伝子の発現が、目的の細胞性遺伝子の発現とリンクするように挿入された挿入された遺伝子、通常、レポーター遺伝子と呼ばれるが、から製造する。酵素の非蛍光基質の、蛍光生成物への続く加工は、レポーター遺伝子の発現と相関し、したがって、目的の細胞性遺伝子の発現の間接的尺度を提供する。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
レポーター遺伝子から合成され、そして現在インビボ遺伝子発現の測定のための蛍光アッセイに使用されている酵素は、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼを含む。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
β−ガラクトシダーゼは細菌酵素であり、このような酵素−レポーターアッセイに、酵素活性により蛍光を付与できる基質と組み合わせた使用が十分特徴付けされている。β−ガラクトシダーゼ発現の検出は、“Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes”, pages 211-215, J. Slavik, Plenum Press, London, 1996に記載されている。ここで、非蛍光基質、ＣＭＦＤＧを、酵素を発現する細胞に微小注入し、そこで酵素活性の尺度を提供する蛍光形に加水分解する。しかし、哺乳類細胞が幾分かの内因性β−ガラクトシダーゼ活性を示し、変換基質のあるバックグラウンド蛍光が、レポーター遺伝子からのβ−ガラクトシダーゼの発現を導くシグナルの非存在下でさえ、遺伝子発現のインビボアッセイにおいて観察される。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
より最近、β−ラクタマーゼのための蛍光基質が発表されている(米国特許第５,９５５,６０４号, Tsien et al.参照)。その中に記載されている基質ＣＣＦ２は、蛍光基質におけるドナーおよびアクセプター分子が、β−ラクタマーゼの酵素活性により分離され、ドナー分子から蛍光シグナルを発生させる、ＦＲＥＴベースのアッセイ(下記)における使用に適している。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
酵素蛍光基質の励起のこれらの短所を克服するため、非遍在性酵素のための基質であり、最初の形では０または低い蛍光を有し、酵素の反応により、広い範囲のスペクトルにわたり光を放出できる環境的に安定な蛍光生成物を産生する、一つの分子(または複数の分子)の必要性がある。放出の範囲は、例えば、スペクトルの５００−９００nm範囲である。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
この原則の一つの形において、蛍光部分は、励起ドナーフルオロフォアからのエネルギーがクエンチャーに移動し、蛍光エネルギーよりも熱として散乱させるような、“クエンチャー”分子と密接にさせる。この場合、残りの蛍光は、ドナー−クエンチャーペアの二つの成分が密接になったときに最少になり、シグナルの大きな変化が、それらが分離したとき得ることができる。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ＦＲＥＴアッセイにおけるアクセプターまたは“クエンチャー”としての使用に適したシアニン色素は、シアニン色素に、分子の蛍光を減少させるまたは無くす効果を有する化学基の導入を介してシアニン色素にある修飾を成すことにより開発されている(ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１７４６参照)。このような化学修飾の一つの例は、−ＮＯ２基の導入である。このような消光されたＣｙ色素は、−Ｃｙ−Ｑ色素または“暗色素”と呼ぶ。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
細菌ニトロレダクターゼは、抗腫瘍治療において、プロドラッグ分子をその対応する細胞毒性形(Anlezark et al 1995, Biochem-Pharmacol 50(5), 609-18)に、プロドラッグ基質上の１個以上の−ＮＯ２基を除去または還元することにより変換するために使用されている。そのような基質は、細胞毒性化合物のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体を含む。腫瘍細胞の選択的致死は、ニトロレダクターゼ遺伝子の腫瘍細胞へのターゲティング発現および感染細胞へのプロドラッグの投与により達成できる(例えば、米国特許第５,７８０,５８５号に記載のように)。プロドラッグ基質は、ニトロレダクターゼを発現する腫瘍細胞においてその細胞毒性形に変換されるが、回りの細胞(ニトロレダクターゼを含まない)は、影響されないままである。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
したがって、本発明は、第１の態様において、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子の、少なくとも一つの該ＮＯ２基をＮＨＯＨまたはＮＨ２に還元することを特徴とする、蛍光を増大するための方法を提供する。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
第１の態様の一つの実施態様において、本発明で使用するための少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子は、式Ｉ：
【化６】
2003522333.tif 000005
〔式中、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＸおよびＹを含む環に結合し、または、所望により、Ｚ１およびＺ２環構造の原子に結合し、ｎは１−３の整数である；
Ｚ１およびＺ２は各々１個または２個の縮合芳香族環を達成するのに必要な結合または原子を示し、各環は炭素原子、および所望により、２個を超えない酸素、窒素および硫黄原子から選択される５個または６個の原子を有する；
ＸおよびＹは同一または異なり、ビス−Ｃ１−Ｃ４アルキル−およびＣ４−Ｃ５スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−およびＮ−Ｗ(ここで、Ｎは窒素およびＷは水素、基−(ＣＨ２)ｍＲ８から選択され、ｍは１から２６の整数およびＲ８は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、ホスホネート、ポリエチレングリコール、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される)から選択される；
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して水素、置換または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＯＲ９、ＣＯＯＲ９、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネートおよびスルフェートからなる群から選択され、ここでＲ９は置換または非置換であり、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される；
基Ｒ１およびＲ２は非置換または置換され得るＣ１−Ｃ１０アルキルから選択される；
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、本質的に非蛍光であるように該色素の蛍光放出を減少させる、少なくとも一つのニトロ基を含むを特徴とする〕
を有する修飾シアニン色素である。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
特に好ましいのは、以下のＣｙ色素のいずれでも、ＮＯ２−含有“暗色素”形である。非修飾色素の励起(Ａｂｓ)および放出(Ｅｍ)特性を示す：
【表１】
2003522333.tif 000006
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明の第３の態様において、
ａ)アッセイ試薬に結合したニトロレダクターゼ酵素を、酵素の活性の量がアッセイにおける検体の量と比例する条件下で提供する；
ｂ)少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を提供する；そして
ｃ)ニトロレダクターゼの量の尺度として蛍光の増大を測定する
ことを含む、検体の検出法を提供する。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本発明の第４の態様において、
ａ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させる；
ｂ)ニトロレダクターゼで標識されている特異的結合対の第２成分を、成分の間の結合を促進する条件下で添加する；
ｃ)少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を、ニトロレダクターゼ活性に適した条件下で添加する；そして
ｄ)第２成分の第１成分への結合を、結合ニトロレダクターゼ活性の尺度としての蛍光の増大の測定により検出する：
ことを含む、アッセイ法を提供する。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
したがって、本発明の第５の態様において、
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞と、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法を提供する。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本発明の第５の態様の好ましい実施態様において、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子は、細胞に透過性である。好ましくは、式Ｉのシアニン色素分子の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、細胞膜透過性化(permeabilising)基を含む。膜浸透化合物は、親水性基をマスキングし、より疎水性の化合物とすることにより産生できる。マスキング基は、細胞内の蛍光基質から開裂し、細胞内で誘導された基質を産生するように設計できる。基質が膜浸透誘導体よりも親水性であるため、次いでそれは細胞にトラップされる。適当な細胞膜透過性化基は、内因性哺乳類細胞内エステラーゼにより容易に開裂されるアセトキシメチルエステル(Jansen, A.B.A. and Russell, T.J., J. Chem Soc. 2127-2132 (1965)およびDaehne W. et al. J. Med-.Chem. 13, 697-612(1970))およびピバロイルエステル(Madhu et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 1998, 14, 5, pp 389-399)から選択されるが、デリバリー分子(デリバリーペプチドのような)を含む他の適当な基が、当業者に認識されよう。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
測定した蛍光を、試験薬に曝していないコントロール細胞からの蛍光と比較し、もしあれば、調節配列を介して調節した遺伝子発現への試験薬の効果を、コントロール細胞における蛍光に対する試験細胞における蛍光から決定する。
適当な場合、細胞抽出物を慣用法を使用して調製できる。


【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
したがって、本発明の第７の態様において、
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞の抽出物と、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法を提供する。