(57)【要約】  本発明は、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤とを組み合わせてなる全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤に関する。本発明の医薬は、経口投与が可能で、副作用が少なくＳＬＥに伴う症状に対して優れた抑制作用を示し、ＳＬＥの予防及び治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤とを組み合わせてなる全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
副腎皮質ステロイド剤が、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン及びデキサメタゾン・パルチミン酸エステル並びにそれらの溶媒和物から選ばれる、請求項１記載の全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
副腎皮質ステロイド剤が、プレドニゾロン又はその溶媒和物である、請求項１記載の全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤。
【請求項４】
剤形が経口投与製剤である、請求項１〜３のいずれか１項記載の全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤。
【請求項５】
２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物及び副腎皮質ステロイド剤の、全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤製造のための使用。
【請求項６】
副腎皮質ステロイド剤が、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン及びデキサメタゾン・パルチミン酸エステル並びにそれらの溶媒和物から選ばれる、請求項５記載の使用。
【請求項７】
副腎皮質ステロイド剤が、プレドニゾロン又はその溶媒和物である、請求項５記載の使用。
【請求項８】
剤形が経口投与製剤である請求項５〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤とを組み合わせて投与することを特徴とする全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療方法。
【請求項１０】
副腎皮質ステロイド剤が、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン及びデキサメタゾン・パルチミン酸エステル並びにそれらの溶媒和物から選ばれる、請求項９記載の全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療方法。
【請求項１１】
副腎皮質ステロイド剤が、プレドニゾロン又はその溶媒和物である、請求項９記載の全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療方法。
【請求項１２】
投与手段が経口投与である請求項９〜１１のいずれか１項記載の全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）は、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体などの免疫複合体の組織沈着により起こる全身性炎症性病変を特徴とする自己免疫疾患である。症状は治療により軽快するものの、寛解と憎悪を繰り返して慢性の経過を取ることが多いという特徴を持っている。一般集団におけるＳＬＥの発病率は１０万人あたり１０〜１００人と推定されているが、一親等内にＳＬＥ患者がいる場合の発病率は２〜４％に、一卵性双生児では２５％に上昇することから、遺伝的要因が大きい疾患と考えられている。また、発症率の男女比は１：９であるが、出産可能な年齢を除くと男女比はほぼ１：１になり、２０〜４０歳代の若年女性に好発することが知られている（非特許文献１参照）。【０００３】
一方、環境的因子としては、紫外線、ウイルス感染、外傷、手術、妊娠、出産、薬剤処置等が挙げられている。その多くは組織傷害を起こすもので、細胞が破壊され、大量の核や細胞成分が血液中に遊離し、これが引き金となって自己抗原に対する免疫応答が惹起されると考えられている（非特許文献１参照）。【０００４】
ＳＬＥの症状は、その疾患名が示すように全身に様々な病態を発症することが知られており、大別すると以下の１０種類に分類可能である（非特許文献２参照）。
（１）全身症状：全身倦怠感、易疲労感、発熱などが先行することが多い。
（２）皮膚・粘膜症状 ：蝶形紅斑とディスコイド疹が特徴的である。蝶形紅斑は頬のみならず鼻梁に掛かるのが特徴である。日光暴露で憎悪する。皮膚生検では、真皮表皮結合部ＩｇＧの沈着が認められる（ループスバンドテスト陽性）。ディスコイド疹は顔面、耳介、頭部、関節背面などによくみられ、当初は紅斑であるが、やがて硬結、角化、瘢痕、萎縮をきたす。このほか凍瘡様皮疹、頭髪の脱毛、日光過敏も本症に特徴的である。口腔、鼻咽腔に無痛性の潰瘍が出現することもある。
（３）筋・関節症状：筋肉痛、関節痛は急性期によくみられる。関節炎もみられるが、骨破壊を伴うことはないのが特徴である。
（４）腎症状：糸球体腎炎（ループス腎炎）は約半数の症例で出現し、放置すると重篤となる。急性期では、蛋白尿がみられ、尿沈渣では赤血球、白血球、円柱などが多数出現する。
（５）神経症状：中枢神経症状を呈する場合は重症である（ＣＮＳループス）。うつ状態、失見当識、妄想などの精神症状と痙攣、脳血管障害がよくみられる。髄膜炎、脳炎、脳神経障害も稀ではあるがみられることがある。
（６）心血管症状：心外膜炎はよくみられる。心筋炎を起こすと、頻脈、不整脈が出現する。弁膜病変は一般に無症状であるが、軽度の大動脈弁不全や僧帽弁不全を起こすことがある。また、反復する血栓性静脈炎を起こす場合には、抗リン脂質抗体症候群の合併が疑われる。
（７）肺症状：胸膜炎は急性期によくみられる。このほか、間質性肺炎、細胞出血、肺高血圧症は予後不良の病態として注意が必要である。
（８）消化器症状：腹痛を伴う腸間膜血管炎やループス腹膜炎を発症することがある。
（９）造血器症状：溶血性貧血はよくみられ、網状赤血球の増加とハプトグロビンの低下などの所見から診断される。白血球減少や血小板減少もよくみられ、抹梢での破壊によるものと考えられている。
（１０）その他： リンパ節腫脹が急性期によくみられる。【０００５】
上述した様に、ＳＬＥの症状は多岐にわたっていることから、その治療は、以下の要素の組み合わせにより成り立っている（非特許文献３参照）。
（１）ＳＬＥの自己免疫に対する強力な免疫抑制療法。
（２）ＳＬＥの全身性の多臓器病変に対する治療。
（３）慢性疾患であるＳＬＥに対する、生命予後や臓器予後を考慮した長期的な治療計画。
（４）若年女性に対する配慮（特に妊娠、骨粗鬆症）。
（５）Ｋｅｙ  Ｄｒｕｇである副腎皮質ステロイド剤の副作用に対する配慮。
（６）環境的因子に対する配慮（患者の教育・指導）。【０００６】
ＳＬＥの治療剤の中心は、現在においてもプレドニゾロンをはじめとした副腎皮質ステロイド剤である。副腎皮質ステロイド剤は、抗炎症作用と免疫抑制作用を有し、臓器病変を生じている局所の炎症を鎮静化すると共に、自己抗体産生の抑制や自己反応性リンパ球の鎮静化を介して、疾患に対する治療効果を挙げていると考えられている。一方、副腎皮質ステロイド抵抗性の症例や、重篤な副作用が出現する症例においては、免疫抑制剤の投与が考慮される。免疫抑制剤としては、プリン代謝抑制剤であるアザチオプリンやＤＮＡアルキル化剤であるシクロホスファミドの経口投与がよく用いられる。また、プリン生合成経路の律速酵素であるイノシン１リン酸（ＩＭＰ）脱水素酵素の阻害剤であるミゾリビンの経口投与は、ループス腎炎に対して有効であることも報告されている（非特許文献３参照）。免疫抑制剤と副腎皮質ステロイド剤との併用効果については、その有用性が報告されている（非特許文献４参照）。【０００７】
一方、近年になって、ＣＤ２０やＢＡＦＦ等のＢ細胞をターゲットにした生物製剤が開発されており（非特許文献５参照）、ＳＬＥの新たな治療剤として期待されている。さらに、インターフェロン誘導性遺伝子とＳＬＥの活動性との間に相関があることが報告され（非特許文献６参照）、新たな治療ターゲットとして注目されている。【０００８】
炎症性サイトカインであるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、多くの疾患、例えば関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、炎症性大腸炎、免疫不全症候群、敗血症、肝炎、腎炎、虚血性疾患、インスリン依存性糖尿病、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病、白血病等において、その産生亢進が認められる。特に、動物において関節内注射をするとリウマチ様関節炎に非常に似た関節破壊をもたらすことが知られていることから、炎症性疾患の治療剤としてＩＬ−１β阻害剤が研究・開発されており、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（非特許文献７参照）等の生体成分由来物質や、Ｔ−６１４（非特許文献８参照）、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン（特許文献１参照）等の低分子化合物が知られている。【０００９】
ＳＬＥの病態は、自己免疫によって誘導される炎症性疾患の側面も有している。特に代表的な症状であるループス腎炎の発症には、マクロファージが中心的な役割を果たしており、その活性化に関与するサイトカインや、活性化によって産生されるサイトカインが注目されている（非特許文献９参照）。その中でもＩＦＮ−γ（非特許文献１０参照）やＴＮＦ−α（非特許文献１１参照）の阻害、或いはＩＬ−１レセプターアンタゴニストであるアナキンラの投与（非特許文献１２参照）が、ＳＬＥの病態改善に繋がることが示唆されている。
しかしながら、ＳＬＥに対する副腎皮質ステロイド剤とＩＬ−１β阻害剤との併用効果については、いまだ知られていない。
【特許文献１】国際公開第９９／２５６９７パンフレット
【非特許文献１】Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ６３，Ｓｕｐｐｌ５，ｐｐ２４７−２５２，２００５
【非特許文献２】“難病情報センター”、［online］、厚生労働省、［平成１９年２月２８日検索］、インターネット＜URL:http://www.nanbyou.or.jp/sikkan/063_i.htm＞
【非特許文献３】Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ６３，Ｓｕｐｐｌ５，ｐｐ２５３−２５９，２００５
【非特許文献４】Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｔ．４４，ｐｐ１９９−２０４，２００２
【非特許文献５】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １０，ｐｐ８０３−８１５，２００６
【非特許文献６】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ５０，ｐｐ３９５８−３９６７，２００４
【非特許文献７】Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．  ５９（ｓｕｐｐｌ  Ｉ）ｐｐ１０３−１０８，２０００
【非特許文献８】Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏ−Ｄｙｎ．１５，ｐｐ６４９−６５５，１９９２
【非特許文献９】Ｌｕｐｕｓ  １３，ｐｐ３４４−３４７，２００４
【非特許文献１０】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６，ｐｐ７９８−８０３，１９８７
【非特許文献１１】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ５０，ｐｐ３１６１−３１６９，２００４
【非特許文献１２】Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６４，ｐｐ６３０−６３３，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、全身性エリテマトーデス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）の予防及び治療効果に優れた薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、鋭意研究した結果、ＩＬ−１β阻害剤である２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オンと副腎皮質ステロイド剤を併用投与することにより、相乗的に優れたＳＬＥの症状、特に腎臓におけるＳＬＥ関連遺伝子発現の抑制効果が得られ、その効果はそれぞれを単独投与した場合の効果からは予想できない程度に強力であることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤とを組み合わせてなる全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤を提供するものである。
また、本発明は、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物及び副腎皮質ステロイド剤の、全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療のための、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤の組み合わせを提供するものである。
さらにまた、本発明は、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤とを組み合わせて投与することを特徴とする全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＳＬＥの予防及び／又は治療剤は、経口投与が可能で、副作用が少なくＳＬＥに伴う症状に対して優れた抑制作用を示し、ＳＬＥの予防及び治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＬＥモデルマウスの腎臓におけるＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現量に及ぼす薬剤の効果を示す図である。
【図２】ＳＬＥモデルマウスの腎臓におけるＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量に及ぼす薬剤の効果を示す図である。
【図３】ＳＬＥモデルマウスの腎臓におけるＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現量に及ぼす薬剤の効果を示す図である。
【図４】ＳＬＥモデルマウスの腎臓におけるＢＡＦＦのｍＲＮＡ発現量に及ぼす薬剤の効果を示す図である。
【図５】ＳＬＥモデルマウスの腎臓におけるＩＦＩＴ１のｍＲＮＡ発現量に及ぼす薬剤の効果を示す図である。
【図６】ＳＬＥモデルマウスの腎臓におけるＩＰ−１０のｍＲＮＡ発現量に及ぼす薬剤の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のＳＬＥの予防及び／又は治療剤で用いる２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オンは、例えば国際公開番号第ＷＯ９９／２５６９７に記載の方法又は類似の方法で製造することができる。【００１６】
また、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オンは水和物に代表される溶媒和物の形態で存在し得るが、それらの当該溶媒和物も本発明に包含される。【００１７】
本発明のＳＬＥの予防及び／又は治療剤で用いる副腎皮質ステロイド剤は、その作用強度がプレドニゾロン換算される全ての副腎皮質ステロイド剤を包含するものである。ここで、副腎皮質ステロイド剤としては、ステロイド骨格を有し、糖質コルチコイド作用及び／又は鉱質コルチコイド作用を有する化合物が挙げられる。また、これらの化合物及びその塩の水和物やエステル、医薬品として許容される溶媒との溶媒和物、更にこれらの化合物に不斉炭素原子が存在する場合及び不飽和結合を有しその立体異性体が存在する場合には、それら全ての異性体を包含するものである。【００１８】
本発明における好適な副腎皮質ステロイド剤としては、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン・パルチミン酸エステルが挙げられ、特にプレドニゾロンが好ましい。これらの副腎皮質ステロイド剤は、試薬あるいは医薬品等の市販品として入手することができる。例えば、プレドニゾロンは、ＳＩＧＭＡ社より入手可能である。【００１９】
後記実施例に示すように、全身性エリトマトーデスの動物モデルとして広く知られるＮＺＢ／ＷＦ１マウスを用いた評価系において、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物を単独で使用した場合は、腎臓におけるＳＬＥ関連遺伝子の有意な発現抑制作用は認められなかったのに対し、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤とを併用投与することにより、腎臓におけるＳＬＥ関連遺伝子の発現を強力に低下させた。従って、本発明によれば、全身性エリトマトーデスを予防及び／又は治療することができる。【００２０】
本発明のＳＬＥの予防及び／又は治療剤で用いる薬剤の投与形態は、特に限定されず治療目的に応じて適宜選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、フィルムコ−ティング剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられるが、特に経口投与するのが好ましい。【００２１】
これらの投与形態に適した医薬製剤は、薬学的に許容される担体、例えば、デンプン類、ラクト−ス、ショ糖、マンニト−ル、珪酸等の賦形剤や増量剤；寒天、炭酸カルシウム、バレイショもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合珪酸塩等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、アラビアゴム等の結合剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコ−ル類、ラウリル硫酸ナトリウム、又はその混合物等の滑沢剤；乳糖、トウモロコシデンプン等の希釈剤；クエン酸、酒石酸、乳酸等の有機酸、リン酸、塩酸等の無機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化アルカリ、トリエタノ−ルアミン、ジエタノ−ルアミン、ジイソプロパノ−ルアミン等のアミン類等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム等の防腐剤；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の陽イオン性界面活性剤、モノステアリン酸グリセリル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル等の非イオン性界面活性剤等の乳化剤；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソ−ル、エデト酸等の安定化剤の他、必要に応じてさらに矯臭剤、分散剤、保存剤、香料等を適宜組み合わせて用いることができる。【００２２】
本発明の薬剤の使用形態は、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤とを組み合わせて用い、両薬剤の投与による相乗的なＳＬＥ症状の抑制効果が得られる形態であれば特に限定されない。２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤は、同時に投与しても良いし、間隔を置いて別々に投与しても良い。すなわち、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物及び副腎皮質ステロイド剤は、両薬剤を単一製剤化するか又は両薬剤を別々に製剤化してセット（キット）として使用してもよい。【００２３】
本発明において、両薬剤を単一製剤として投与する場合、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤の配合比は、質量比で１００：１〜１：１００、さらに１０：１〜１：１０の範囲であることが、特に優れた相乗効果が得られる点から好ましい。【００２４】
また、本発明において、両薬剤を別々に製剤化する場合、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物を含有する製剤は、副腎皮質ステロイド剤と併用投与される全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤として提供され、一方、副腎皮質ステロイド剤を含有する製剤は、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と併用投与される全身性エリテマトーデスの予防及び／又は治療剤として提供される。両薬剤の剤型は同一でもよく、異なっていてもよい。また、各成分の投与回数は異なっても良い。【００２５】
本発明において、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状等によって適宜選択されるが、通常成人の場合、１日当たり２〜３２０ｍｇ、好ましくは４〜１６０ｍｇ投与するのがよい。また、副腎皮質ステロイド剤の投与量は、症状によって増減するが、成人の場合、プレドニゾロン換算で１日当たり１０〜２００ｍｇ投与するのがよい。さらに、投与は、１日１回、あるいは２回以上に分けて投与してもよい。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２７】
実施例１
２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン（以下薬剤Ａと表す）とプレドニゾロン（以下薬剤Ｂと表す）の併用投与及びそれぞれの単独投与による、腎臓における疾患関連遺伝子の発現抑制作用を、ＳＬＥの自然発症モデルとしてよく知られているＮＺＢ×ＮＺＷ（ＮＺＢ／Ｗ）Ｆ１マウスを用いて評価した。【００２８】
試験動物には、雌性ＮＺＢ／ＷＦ１マウス（日本エスエルシー株式会社）を使用した。【００２９】
２０週齢ＮＺＢ／ＷＦ１マウスの体重を測定し、これを指標として、一変数によるブロック化割付を行なうことにより、各群が均質になるように群分けを行なった。【００３０】
薬物投与は、群分け翌日から１０週間後まで行なった。薬剤Ａ単独投与群へは、朝（９：００−１１：００）及び夕（１５：３０−１７：３０）２回、３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。また、薬剤Ｂ単独投与群には、昼（１１：３０−１３：３０）に１回、３ｍｇ／ｋｇを経口投与した。一方、薬剤Ａと薬剤Ｂの併用投与群には、朝（９：００−１１：００）及び夕（１５：３０−１７：３０）に薬剤Ａ  ３０ｍｇ／ｋｇを、昼（１１：３０−１３：３０）に薬剤Ｂ  ３ｍｇ／ｋｇをそれぞれ経口投与した。【００３１】
群分けの１０週間後（３０週齢時）に、各個体より腎臓を摘出し、水平方向に２分割した後、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に４℃で２４時間浸漬して、ＲＮａｓｅ不活化処理を行なった。次いで２分割した腎臓を前端部、中央部、後端部に３分割し、腎門、髄質及び皮質を含む中央部より、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）及びＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ(R)７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＴａｑＭａｎ(R)  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＬＥ関連遺伝子（ＩＦＮ−γ（プローブ番号：Ｍｍ００８０１７７８＿ｍ１）、ＴＮＦ−α（プローブ番号：Ｍｍ００４４３２５８＿ｍ１）、ＩＬ−１β（プローブ番号：Ｍｍ００４３４２２８＿ｍ１）、ＢＡＦＦ（プローブ番号：Ｍｍ００４４６３４７＿ｍ１）、ＩＦＩＴ１（プローブ番号：Ｍｍ００５１５１５３＿ｍ１）及びＩＰ−１０（プローブ番号：Ｍｍ００４４５２３５＿ｍ１））のｍＲＮＡ発現量の定量を行なった。なお、ＩＦＮ−γはマクロファージ活性化因子として、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βは活性化マクロファージから産生される炎症性サイトカインとして、ＢＡＦＦはＢ細胞に関与する因子として、ＩＦＩＴ１及びＩＰ−１０はインターフェロン誘導性遺伝子群として、評価対象に選択した。【００３２】
表及び図に、コントロール群、薬剤Ａ  ３０ｍｇ／ｋｇ単独投与群、薬剤Ｂ  ３ｍｇ／ｋｇ単独投与群、及び両薬物併用投与群の腎臓中のＩＦＮ−γ（表１、図１）、ＴＮＦ−α（表２、図２）、ＩＬ−１β（表３、図３）、ＢＡＦＦ（表４、図４）、ＩＦＩＴ１（表５、図５）、ＩＰ−１０（表６、図６）のｍＲＮＡの発現量を、コントロール群の平均値を１００％として換算した値でそれぞれ示す。ｍＲＮＡの発現量は、各群マウス１０〜１１匹の平均値±標準誤差で表す。また、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定により統計解析を行い、評価した（＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５；いずれも対照群に対して）。【００３３】
【表１】
2008111295.tif 000002
【００３４】
【表２】
2008111295.tif 000003
【００３５】
【表３】
2008111295.tif 000004
【００３６】
【表４】
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【００３７】
【表５】
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【００３８】
【表６】
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【００３９】
薬剤Ａは３０ｍｇ／ｋｇの投与量で本モデルの腎臓におけるＳＬＥ関連遺伝子の発現に対し作用を示さないか、或いは弱い発現抑制傾向しか認められなかった。一方、薬剤Ｂは３ｍｇ／ｋｇの投与量でいずれの遺伝子に対しても発現抑制傾向を示した。しかしながら、薬剤Ａ及び薬剤Ｂを併用投与することにより、腎臓におけるＳＬＥ関連遺伝子の発現を強力に低下させた。また、ＳＬＥ関連遺伝子発現量の相対指数は、各薬剤単独投与群の相対指数の積よりも小さく、併用による明確な相乗効果が認められた。このように、薬剤Ａと薬剤Ｂの併用によるＳＬＥ予防及び治療効果は、それぞれ単独の効果の予想をはるかに超えるものであった。【００４０】
以上の結果から、２−ベンジル−５−（４−クロロフェニル）−６−［４−（メチルチオ）フェニル］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン又はその溶媒和物と副腎皮質ステロイド剤との併用投与は、全身性エリトマトーデスに対してそれぞれ単独で投与する場合には予測できないほどの優れた予防及び治療効果が発揮されるので、全身性エリトマトーデスの予防及び／又は治療剤として有用であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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