【手続補正書】
【提出日】平成16年5月20日(2004.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】  単分子結合した分子が疎水性鎖でありそして親水性の第二細胞壁膜ポリマーと両親媒性分子が結合している、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明に従う特に有利な用途は、第二細胞壁ポリマーがポリマー担体構造と機能性分子、分子基あるいは分子層との間の結合因子であり、それによってポリマー担体構造に相応する機能性分子を直接的に取り付けることができる。この場合、担体構造は微細濾過膜でもよい。更に分子層は単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層の状態で存在していてもよく、それによってタンパク質層の結晶質構造のために一方では鮮明なカットオフ(cut-off) を示す相応するフィルターをもたらすことができそしてもう一方ではタンパク質分子自身に再び機能性分子を直接的にまたは間接的に取り付けることができる。この目的のためには、単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層自身が機能性脂質膜の担体であることが重要であり、それによって例えば高性能濾過(Hyperfiltration) 等に使用することができる非常に安定な複合構造が達成される。更に単分子の規則正しい結晶質タンパク質層が第二細胞壁ポリマーに対峙する側に一つまたは二つの同じまたは異なる機能性領域を備えていてもよく、それによってタンパク質層は別の分子の規則正し結合のための媒介物として使用される。特異的な結合性のために単分子の規則正しい分子は両親媒性を有しそして疎水性鎖並びに親水性の第二細胞壁ポリマーよりなる。これによって水性または非水性相への付加方向が制御できる。更に担体の分子は単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層であってもよく、その際に第二細胞壁ポリマーは組み合わせた複合体の形成下に機能性脂質層の結合因子を生成する。この様に脂質分子はタンパク質層から相応して離され、その際に更にタンパク質層への脂質層の固定が達成される。この場合、機能性脂質層を介して組み合わされた２つの複合体が鏡像様に互いに結合され得る。このことはいわゆるサンドイッチ原理に相応して層を形成することを可能とする。この場合、単分子の結晶的に規則正しいタンパク質層は同じかまたは異なるタンパク質分子で構成され得る。このことは、複合体の外側に異なる結合領域、電荷、機能性分子等が存在することを可能とする。このことが用途分野を著しく拡大させる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
この場合、第二細胞壁ポリマー鎖は担体および／または結合すべき分子にレクチン様結合によって係留されていてもよく、それによってタンパク質分子の適当な領域に相応する結合が達成されていてもよい。安定した複合体を得るためには、ポリマーマトリックスに単分子の結晶的に配向したタンパク質層が第二細胞壁ポリマーを介して結合されていてもよい。その際に第二細胞壁ポリマーはアンカー並びに方向付けおよび／または意図する分配に役立つ。単分子の結晶的に配向したタンパク質層のところに第二細胞壁ポリマーと反対側に脂質膜または−小胞が配置されていてもよく、これによって別の用途分野も与えられる。更に、単分子の結晶的に配向したタンパク質層のところに、第二細胞壁ポリマーと反対側に機能性領域が規則的な間隔および配列で設けられてもよい。このことは別の機能性分子をタンパク質層に意図的に付加することを可能とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
更に第二細胞壁ポリマーは、好ましくは直接的に担体上に適用されている単分子の結晶的に配向したタンパク質層から飛び出しておりそして機能性脂質層を結合させていてもよい。従って、担体上に好ましくは直接的に適用されたタンパク質層のために安定な担体層が得られ、その際に脂質層がタンパク質層への相互作用なしに第二細胞壁ポリマーに結合している。この場合、２つのこの種のタンパク質層は機能性脂質層を介して鏡像的に互いに対峙して結合することができ、それによって安定なサンドイッチ様に結合した複合体が得られる。この場合、一方のタンパク質層がもう一方のタンパク質層と異なるタンパク質分子よりなり、その結果、複合体の両側に異なる結合挙動、領域および機能性が存在する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
担体に脂質膜を付加するためにいわゆるリポソームヒュージョン技術が色々な場合に使用される。この場合、脂質膜は脂質小胞（いわゆるリポソーム）の状態で提供される。このリポソーム中には好ましくは既に所望の機能性分子が取り込まれている。相応する実験条件の下では脂質小胞は、つながり合った脂質膜を最終的に形成するために、固体担体の表面に接触した際に開放する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
ＤＣＷＰ−系は場合によっては図９に相応して、この小胞融合を促進しそして脂質膜のＳＵＭへの結合を強化するために使用してもよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
ＳＵＭ−小管状物を使用する場合の他の長所は、脂質膜の適用後に別のＳ−層を付加または再結晶（図７および図８参照）によって適用できることにある。この追加的Ｓ−層は（更なる）安定化並びに保護機能を満足する。この関係ではＳ−層の鮮明な分子分離境界を指摘する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
アミドの生成は、炭化水素（ＳＣＷＰ）のカルボン酸部分のところで臭素酸化ラクタル- ラクトンにより、還元的アミン化と同様にアミノ成分のところで、炭化水素（ＳＣＷＰ）のアミノ成分のところでカルボニル成分とエチレンジアミンまたは他のジアミン化合物との反応による生成によっておよび官能性分子のカルボン酸部分のところで長鎖脂肪酸および分岐した脂肪酸の活性エステルとして、アスパラガス酸(Spargelsaere)またはリポン酸(Liponsaere)の活性エステルとして並びにメタクリル酸（誘導体）および他の不飽和カルボン酸の活性エステルとして行うことができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
【実施例】
グループ１：第二細胞壁ポリマーの変性
第二細胞壁ポリマー（ＳＣＷＰ）を種々桿菌類のペプチドグリカン含有小胞から４８％濃度フッ素酸（ＨＦ）を使用してRies等の処方(1997)に従って抽出し、ゲルクロマトグラフィーによって精製し、溶出液を蒸留水で透析し、内部透析物を−２０℃で凍結しそして凍結乾燥する。Ｓ−層タンパク質およびＳＣＷＰを持つ微生物は以下の通りである: バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) ＰＶ７２／ｐ６（Sara等、1996) 、SbsA(Kuen 等、1994) 、タイプＡのＳＣＷＰ（Egelseer等、1998);バシラス・ステアロサーモフィラス ATCC 12980( Egelseer 等、1996) 、SbsC( Jarosch 等、2000) 、タイプＡのＳＣＷＰ（Egelseer等、1998);バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) ＰＶ７２／ｐ２（Sara等、1996) 、SbsB(Kuen 等、1997) 、タイプＢのＳＣＷＰ（Ries等、1997;Sara 等、1998);バシラス・スフェリカス(B.sphaericus) CCM 2177 （Sara等、1989) 、SbpA、タイプＣのＳＣＷＰ(Ilk等、1999);テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカス (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus) L 111- 69 , （Sara等、1988) 、Stta、タイプＤのＳＣＷＰ。個々のＳ−層タンパク質の性質および相応するＳＣＷＰの正確な一覧表を以下の表１に示す：
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
【表１】
2003531390.tif 000001
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例１：ポリマー鎖の潜在アルデヒド基（還元性末端）の遊離アミノ基への            転化
タイプＡ、Ｂ、ＣおよびＤのＳＣＷＰの還元性末端（潜在アルデヒド基）を変性するために以下の処置を行う：１０ｍｇの凍結乾燥物質を２ｍＬのカルバゾールヒドラジド飽和溶液（ｐＨ６．２）に溶解する。次いで２００μＬのナトリウムシアノホウ化水素（ＮａＢＨ3 ＣＮ：２０ｍｇ／ｍＬ蒸留水）を添加し、１００℃で１５分、次いで９０℃で１６時間培養（inkubiert)する。過剰の試薬を除くために蒸留水で２４時間透析し、試料を−２０℃で凍結させそして凍結乾燥する。遊離アミノ基を測定するためにそれぞれ１ｍｇのＳＣＷＰを２ｍＬの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）に溶解し、そして１００μＬのブチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［ＢＯＣ−Ｌｅｕｓｅ；３．５ｍｇ／ｍＬ（１００％濃度エタノール）］を添加する。反応混合物を１８時間２０℃で撹拌し、次いでエタノールと蒸留水との３０／７０容量比の混合物に対してそして次に蒸留水で透析する。内部透析物を次いで凍結乾燥しそして０．５ｍｇの凍結乾燥物質を６ＮのＨＣｌで１１０℃で６時間、アミノ酸およびアミノ糖分析（アミノ酸分析器のBiotronik;Maintal, D) に関して加水分解する。グルコースアミンとロイシンとの比からポリマー鎖の変性度を決めることができる。この変性度は全てのＳＣＷＰについて＞９５％であった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
実施例２：ＳＣＷＰ中に導入されたアミノ基のチオール基への転化
ＳＣＷＰ中に導入されたアミノ基を転化するために、実施例１で変性された５ｍｇのＳＣＷＰを５ｍＬの０．２５Ｍ濃度トリエタノールアミン−ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解する。４ｍｇの２−イミノチオラン（４−メルカプトブチルイミダート）の添加後に、この溶液を窒素雰囲気で３７℃において２時間培養し、次いで試薬を除くために、脱気された蒸留水で１８時間、４℃で透析する。内部透析物を次いで凍結させそして凍結乾燥する。導入されたチオール基の数はエルマン(Ellman)(1959)の方法に従って測定する。アミノ基が定量的にチオール基に転化できることがわかる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
実施例５：ＨＦ抽出された天然のおよび化学変性されたＳＣＷＰの生物学的活            性の実証
冒頭に挙げたＳ−層タンパク質と色々なタイプのＳＣＷＰとの間の特異的結合を実証するために、“Surface Plasmon Resonance Technique ”（SPR ）を使用する( 装置: Biacore 2000, Biacore, Uppsala, スエーデン) 。Ｓ−層タンパク質を組み合わされていないモノマーおよび／またはオリゴマーとして水溶液の状態で１００μｇ／ｍＬ（蒸留水）の濃度で予備活性化されたカルボキシ−デキストラン−金−チップ上に固定する。共鳴装置はチップの表面が約７０％までＳ−層タンパク質で覆われており、その際に使用された方法のためにサブユニット（Subeinheiten) の固定化が統計的配向で行われることがわかる。例えば、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus) ＰＶ７２／ｐ２のＳ−層タンパク質ＳｂｓＢ、エシェリキア・コリ(Escherichia coli ）での組み替え製造されたＳ−層タンパク質（ r SbsB32-920 ；野生型菌株の成熟した SbsB に相当する）およびＮ−末端短縮型（ r SbsB208-920  ；三つのＳＬＨ−モチーフが欠ける）を用いる実験である。吸着曲線によって、チップ上への固定化がわかる。  SbsBおよび r SbsB はＢタイプのＳＣＷＰ［濃度範囲１〜１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液）、ｐＨ７．２］が特異的に認められる；
r SbsB258-920（＝Δ３ＳＬＨ−モチーフ）はタイプＢのＳＣＷＰに対して親和性を有していない；
SbsBおよび r SbsB32-920 は実施例１〜４に従って変性されたタイプＢのＳＣＷＰに対して天然のタイプＢのＳＣＷＰに対してと匹敵する親和性を有している；
ＨＦで抽出されたSbsBおよび r SbsB32-920 は、リゾチームで消化したペプチドグルカンに結合しない。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
実施例７：固体担体としての酸化珪素ウエファー（ＳＯＷ）の使用
３×５ｍｍの大きさのＳＯＷをアミノシラン（蒸留水中５％、ｐＨ３．５）の５００μＬの溶液に３７℃で３０分培養する。蒸留水およびエタノールで５度洗浄した後に、シラン化されたＳＯＷを１１０℃で１５分乾燥し、次いでｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルの溶液（スルホ−ＭＢＳ、Pierce; １５０μｇ／ｍＬ（０．１Ｍ濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ７．０）中で３７℃で２時間予備活性化し、そして蒸留水で洗浄する。（実施例２に記載した様な）変性されたタイプＢのＳＣＷＰを結合させるために、１ｍｇの凍結乾燥物／ｍＬ（０．１Ｍ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を溶解し、そして５００μＬをＳＯＷに適用する。Ｎ2 雰囲気で２０℃で２時間培養した後にこの小板状物を０．１Ｍ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液および蒸留水で洗浄し、配向結合させるためにSbsBまたは r SbsB ［１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝液；ｐＨ７．２］を供給し、そしてタイプＢのＳＣＷＰで機能化されたＳＯＷをこの溶液中で２０℃で４時間培養する。ＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液で洗浄することによって過剰のＳ−層タンパク質を除き、ＳＯＷをＡＦＭ中で試験しそして傾斜したＳ−層格子の配向が測定される。SbsBおよび r SbsB がサブユニットの内側（３ＳＬＨ−モチーフであるＮ−末端領域）と結合していることがわかる。ＳＯＷｓの沢山の実験で、SbsBがタイプＢのＳＣＷＰの不存在下に外側と結合することが知られている（Neubauer等、2000) 。従ってS-層のサブユニットのＳＯＷへの配向結合は固体担体に共役結合したタイプＢのＳＣＷＰを介して行われる。SbsBの代わりに組み換え製造されたSbsB- ストレプトアビヂン(Streptavidin)- ヒュージョンタンパク質も使用できる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
実施例９：固体担体としてのＭＦの使用
実施例１に記載した様に変性されたタイプＡのＳＣＷＰをカルボジイミドで活性化されたＭＦと結合させる（実施例６参照）。以下の形のSbsCを１５０μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液；ｐＨ７．２）の濃度で供給し、そして１４ｍｍの直径を有する円盤状膜を２０℃で８時間培養する：r SbsC31-1099 、r SbsC258-1099、r SbsC342-1099、r SbsC31-844、r SbsC31-860、r SbsC31-880、r SbsC31-900、r SbsC31-920および SbsC 。培養後にＭＦを５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）で洗浄し、１ｍｍ2 の大きさの粒子に切断し、ＳＤＳ−溶液で抽出しそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験する（実施例６参照）。相応する標準系列のために、完全なＮ−境界を誤解させるそれぞれの状態の結合量は８０〜１００μｇ／ｃｍ2 （ＭＦ）で評価することができる。これに対してr SbsC258-1099およびｒSbsC342-1099  の場合にはタイプＡのＳＣＷＰで機能化されたＭＦへの結合が生じない。種々の短縮形態を使用することが親和性研究の結果を証明し（Egelseer等、1998; Jarosch 等、2000) そしてＳＰＲ−測定が専らＮ−境界はＳＣＷＰとの相互作用に原因することを証明している。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
実施例１５： r SbsB-ストレプトアビジン- ヒュージョン蛋白質の使用
E.coli中で C- ターミナル組み換えで製造されたSbsB- ストレプトアビジン- ヒュージョン蛋白質（４ｍｇの凍結乾燥物）を、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で２ｍＬの６Ｍのグアニジン塩酸塩に溶解し、０．８ｍｇのストレプトアビジンを添加しそしてこの溶液を２０℃で１時間、蒸留水で透析する。内部透析物を取り出した後に、４０，０００ｘｇで遠心分離処理しそして可溶性の r SbsB-ストレプト(4）を含有する透明な上澄液を１２０μｇ／ｍＬ（０．２  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液）（ｐＨ７．２）の蛋白質濃度に調整する。１ｍＬの蛋白質溶液を次に、実施例１３に従って製造された１ｍＬのリポソーム懸濁液と混合し、そしてこの試料を２０℃で２時間培養する。遠心分離処理した後にリポソームを０．２ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ−緩衝溶液（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後にビオチニル化された(biotinliern) 人間のＩｇＧと一緒に培養しそしてMader 等(2000)によって開発された処方に従って結合を検査する。ビオチニル化された人間のＩｇＧの結合はＳ−層外側で露出したストレプトアビジン残基によるだけで可能である。所望の配向は（Ｓ−層内側にあるＮ−境界上での結合）タイプＢのＳＣＷＰがＨＤＡに共有結合したリポソームについてのみ観察される。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
グループ５の例：脂質二重層の構造
実施例１６：固体表面として珪素ウエファーとの管状蛋白質の脂質二重層
ＳＯＷ（３×５ｍｍ）に、メルカプトシランでシラン化すること（実施例８参照）によってチオール基を導入し、これに、異種二官能性架橋剤としてのスルホ- ＭＢＳによって実施例1 に従って変性されたタイプＡのＳＣＷＰ［１ｍｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度リン酸カリウム緩衝溶液；ｐＨ７．０］を結合させる。リン酸塩緩衝溶液および蒸留水でのＳＯＷの徹底的な洗浄の後に、SbsA- 蛋白質の５００μＬの溶液［１００μｇ／ｍＭ（５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液；ｐＨ７．２］を適用し、２０℃で６時間培養し、緩衝溶液で洗浄しそして単分子層として存在するSbsA- 蛋白質をグルタルアルデヒド（５０ｍＭ濃度リン酸カリウム緩衝溶液中０．５％；ｐＨ７．２］で２０℃で２０分架橋させる。次いでSchuster等(1998)によって提案された方法に従ってＤＰＰＥよりなる二分子層を、α- 溶血素またはバリノマイシンを挿入することによって(Schuster 等, 1998 a,b) 適用する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
実施例１7 ：固体担体としてのＳ−層−限外濾過膜（ＳＵＭ）の使用
ＳＵＭ−円盤（直径２５ｍｍ）を、Ｓ−層外側だけを露出する様に限外濾過セル中にはめ込む。Ｓ−層蛋白質の遊離カルボキシル基をＥＤＣ−溶液［６ｍｇ／ｍＬ（蒸留水）；ｐＨ４．７］の添加によって２０℃で８０分活性化し、膜表面を氷冷された蒸留水で３度洗浄しそして次に実施例１に従って変性されたタイプＡのＳＣＷＰの２ｍＬの溶液［１ｍｇ／ｍＬ；ｐＨ９．０］を、Ｓ−層外側に共有結合させるために適用する。２０℃で５時間培養した後にこのＳＵＭを５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．２）で３度そして蒸留水で３度洗浄し、最後にSbsA- 蛋白質の溶液［１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ濃度ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝溶液）；ｐＨ７．２］で２０℃で５時間培養する。膜円盤を緩衝溶液で洗浄した後に一部を粉砕し、そして結合したSbsA- 量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定するためにＳＤＳ−溶液で抽出処理する。平行するプロセスで製造されるSbsA- ＳＣＷＰ−ＳＵＭを、Ｓ−層蛋白質を安定化させるために（実施例１６に記載されている様に）グルタルアルデヒドで架橋させ、そしてＤＰＰＥ膜および必須の膜蛋白質（例えばα−溶血素）で被覆するために使用する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例１８：ＳＵＭへのＧＬの共有結合
ＳＵＭの使用および実施例１０または１１に記載の、タイプＣのＳＣＷＰとＤＰＰＥよりなるＧＬでの被覆。次いでタイプＣのＳＣＷＰで機能化されたＳＵＭを SbpA-蛋白質の溶液［５０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭ濃度ＣａＣｌ2 ）］と一緒に２０℃で６時間培養しそしてＳＵＭ表面を１０ｍＭ濃度のＣａＣｌ2 溶液で徹底的に洗浄する。 SbpA-蛋白質の配向した単分子結合を確認するために、このＳＵＭを透過型電子顕微鏡での検査並びに凍結乾燥に付し、超薄切片のために使用する。四角形の格子を有する密集した単分子層が存在し、Ｓ−層格子の滑らかな外側が露出していることが分かる。