【手続補正書】
【提出日】平成17年1月5日(2005.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ヒト破骨細胞特異的およびヒト破骨細胞関連遺伝子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞特異的および破骨細胞関連遺伝子産物をコードする単離ＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
破骨細胞による過剰な骨吸収は、関節炎、骨粗鬆症、歯周炎、および悪性高カルシウム血症など多くのヒト疾患の病態に寄与している。骨吸収時、破骨細胞は骨のミネラル成分と有機成分の両者を除去する（非特許文献１）。ミネラル相は破骨細胞より小さい骨小腔が酸性化されることで可溶化され、その結果、ヒドロキシアパタイトの溶解を招く（非特許文献２）。しかしながら、骨の主要構造タンパク質であるタイプＩコラーゲンが分解される機序（単数または複数）については議論の余地がある。また、破骨細胞活性の調節については一部わかっているにすぎない。破骨細胞機能に関する情報が不足しているのは、これらの細胞を純粋な集団として大量に単離することが極めて困難であるという事実が一因となっている。さらに、利用可能な破骨細胞株は存在しない。従来未知の破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子および遺伝子産物の同定を可能にするような破骨細胞機能研究法があれば、骨吸収および破骨細胞活性の調節に関与する遺伝子および遺伝子産物の同定が可能になるであろう。したがって、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子または遺伝子産物の同定は、骨吸収異常が関与する障害を治療する治療法を開発する上で有用であろう。
【非特許文献１】Blair, H.C., et al.,  J. Cell Biol. 102:1164 (1986)
【非特許文献２】Vaes, G., Clin. Orthop. Relat. 231:239 (1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、破骨細胞特異的および破骨細胞関連遺伝子産物をコードする単離ＤＮＡを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち、本発明は、
〔１〕単離された破骨細胞特異的ＤＮＡ、またはその相補的ＤＮＡであって、下記ａ）およびｂ）からなる群より選択される核酸配列を含むＤＮＡ、
ａ）  配列番号１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、およびそれらの相補鎖からなる群によって表されるＤＮＡ配列、
ｂ）  （ａ）で規定されたＤＮＡと、標準条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、ここで、前記標準条件には、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ  変性非相同ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション緩衝液、並びに６５℃で１２〜２０時間のインキュベーションを含む、
〔２〕宿主細胞中で、破骨細胞特異的ＤＮＡを複製することができる、下記ａ）およびｂ）を含むＤＮＡ構築物、
ａ）  前記〔１〕記載のＤＮＡ、および
ｂ）  （ａ）のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター、
〔３〕前記〔２〕記載のＤＮＡ構築物で安定に形質転換またはトランスフェクトされた細胞、
〔４〕前記〔１〕記載のＤＮＡの破骨細胞特異的遺伝子産物に特異的な抗体、
〔５〕破骨細胞特異的遺伝子産物をコードするＤＮＡを同定する方法であって、ａ）前記〔１〕に規定する標準条件下で、ＤＮＡを含む試料と間質細胞+ 、破骨細胞+ プローブとを接触させる工程；ｂ）前記〔１〕に規定する標準条件下で、前記試料と間質細胞+ 、破骨細胞- プローブとを接触させる工程；及びｃ）間質細胞+ 、破骨細胞+ プローブとハイブリダイズするが、間質細胞+ 、破骨細胞- プローブとハイブリダイズしないＤＮＡクローンを同定し、それにより、破骨細胞特異的遺伝子産物をコードするＤＮＡを同定する工程を含む方法、
〔６〕破骨細胞腫特異的遺伝子産物をコードするＤＮＡを同定する方法であって、ａ）前記〔１〕に規定する標準条件下で、ＤＮＡを含む試料と破骨細胞腫由来ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとを接触させる工程；ｂ）前記〔１〕に規定する標準条件下で、前記試料と間質細胞由来ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとを接触させる工程；及びｃ）破骨細胞腫由来のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズするが、破骨細胞腫由来の培養された間質細胞由来のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡクローンを同定し、それにより、破骨細胞腫特異的遺伝子産物をコードするＤＮＡを同定する工程を含む方法、ならびに
〔７〕配列番号１〜２４および２６〜３２のＤＮＡならびにそれらの相補的配列からなる群より選択されるＤＮＡを含むヌクレオチド配列によりコードされる破骨細胞特異的タンパク質、
に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物をコードするＤＮＡを同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物の全体または一部をコードする単離ＤＮＡ配列に関する。本発明はさらに、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物をコードするＤＮＡを複製する能力を有するＤＮＡ構築物に関する。別の態様においては、本発明は、宿主細胞中で破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物の全体または一部の発現を指示する能力を有するＤＮＡ構築物に関する。
【０００７】
破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物の全体または一部をコードするＤＮＡ構築物で形質転換またはトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞も本発明に包含される。特定の態様によれば、これらの細胞は、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を複製する能力を有し、場合によっては破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物を発現する能力を有する。破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物またはこれらの遺伝子産物の一部に対する抗体も請求対象である。
【０００８】
本発明はさらに、破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡ配列を同定する方法およびこのようにして同定されたＤＮＡ配列を包含する。一つの態様においては、破骨細胞をコードするｃＤＮＡは次のように同定される。まず、ヒト骨巨細胞腫を用いて、１）ｃＤＮＡライブラリーを構築し、２）間質細胞+ 、破骨細胞+ のプローブとして使用する32Ｐ標識ｃＤＮＡを作成し、３）破骨細胞を含まない間質細胞集団を作成する（培養によって）。巨細胞腫に破骨細胞が存在することは、破骨細胞マーカーであるタイプ５の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を検出する組織学的染色法およびモノクローナル抗体試薬を使用することによって確認された。
【０００９】
破骨細胞を含まない間質細胞集団は、巨細胞腫の細胞を解離させた後、細胞集団が均一かつ繊維芽細胞状になるまで細胞を組織培養で継代培養することによって作成した。培養間質細胞集団は破骨細胞を含んでいなかった。次いで、培養間質細胞を用いて、間質細胞+ 、破骨細胞- の32Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを作成した。
【００１０】
次いで、骨の巨細胞腫から作成したｃＤＮＡライブラリーを二重にスクリーニングして、ｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの有無を調べた。一方のスクリーニングは、巨細胞腫ｃＤＮＡプローブ（間質細胞+ 、破骨細胞+ ）を用いて実施し、もう一方のスクリーニングは培養間質細胞ｃＤＮＡプローブ（間質細胞+ 、破骨細胞- ）を用いて実施した。間質細胞+ 、破骨細胞+ のプローブとハイブリダイズするが間質細胞+ 、破骨細胞- のプローブとはハイブリダイズしないことは、そのクローンが破骨細胞によって特異的に発現された核酸配列を保持していることを示すものであった。
【００１１】
別の態様においては、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物をコードするゲノムＤＮＡを公知のハイブリダイゼーション技術または増幅技術で同定する。一つの態様においては、本発明は、表Ｉに示したＤＮＡ配列（配列番号：１〜３２）から成る群より選択される１つ以上の配列を含むｃＤＮＡプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、破骨細胞特異的または破骨細胞関連タンパク質または遺伝子産物をコードするＤＮＡを同定する方法に関する。最後に、本発明は、表Ｉに示した配列またはそれらの相補鎖からなる群より選ばれるＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる破骨細胞特異的または破骨細胞関連タンパク質に関する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本明細書で説明するように、本出願人は破骨細胞特異的または破骨細胞関連核酸配列を同定した。これらの配列は次のようにして同定された。ヒト骨の巨細胞腫を用いて、１）ｃＤＮＡライブラリーを構築し、２）間質細胞+ 、破骨細胞+ のプローブとして使用する32Ｐ標識ｃＤＮＡを作成し、３）破骨細胞を含まない間質細胞集団を作成した（培養によって）。巨細胞腫に破骨細胞が存在することが、破骨細胞マーカーであるタイプ５の酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を検出する組織学的染色法によって確認された。また、モノクローナル抗体試薬を用いて、巨細胞腫中の多核細胞のキャラクタライゼーションを行なったところ、この細胞はマクロファージとは明確に異なるが破骨細胞とは一致する表現型を有することがわかった。
【００１４】
破骨細胞を含まない間質細胞集団は、巨細胞腫の細胞を解離させた後、組織培養で少なくとも５回の継代培養を行なうことによって作成した。５継代後の培養細胞集団は均一で繊維芽細胞状であった。この時点で、培養細胞集団は多核細胞を含んでおらず、タイプ５の酸性ホスファターゼは陰性であり、アルカリホスファターゼは様々な程度に陽性であった。すなわち、培養間質細胞は破骨細胞を含んでいなかった。次いで、培養間質細胞を用いて、間質細胞+ 、破骨細胞- の32Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを作成した。
【００１５】
次いで、骨の巨細胞腫から作成したｃＤＮＡライブラリーを二重スクリーニングして、ｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの有無を調べた。一方のスクリーニングは、巨細胞腫ｃＤＮＡプローブ（間質細胞+ 、破骨細胞+ ）を用いて実施し、もう一方のスクリーニングは、培養間質細胞ｃＤＮＡプローブ（間質細胞+ 、破骨細胞- ）を用いて実施した。巨細胞腫ｃＤＮＡプローブ（間質細胞+ 、破骨細胞+ ）とハイブリダイズしたが間質細胞ｃＤＮＡプローブ（間質細胞+ 、破骨細胞- ）とはハイブリダイズしなかったクローンは、破骨細胞によって特異的に発現される核酸配列を含んでいると考えられた。
【００１６】
本明細書で説明する識別スクリーニング（differential screen ）の結果、本明細書で説明した特徴を有し破骨細胞中で特異的に発現されるＤＮＡが同定された。本明細書では、このＤＮＡおよび同等のＤＮＡ配列を破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡと呼ぶ。本発明の破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡは、そのものが天然に現れるソースから得ることができるが、組替え法で作成したり、化学的に合成することもできる。また、そのものはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組替え法で作成されたＤＮＡ、または化学的に製造されたＤＮＡであってもよい。同等なＤＮＡ配列とは、本明細書で説明するようにして同定された破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡと、またはその相補物と標準的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするものをいう。
【００１７】
ヒト破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーの識別スクリーニングを実施して、破骨細胞中で特異的に発現される遺伝子を同定した。スクリーニングした１２，０００個のクローンのうち、破骨細胞中でユニークに発現されるか破骨細胞関連である１９５個のクローンが同定された。さらに、これらのクローンは、上皮細胞、繊維芽細胞、リンパ球、骨髄単球、骨芽細胞、および神経芽細胞など様々な無関係のヒト細胞タイプに由来するｍＲＮＡとハイブリダイズしなかったことから、破骨細胞特異的であると同定された。これらのクローンのうちの３２個は、ゲンバンク（GenBank ）のデータベースに未登録の新規ｃＤＮＡ配列を含んでいる。
【００１８】
この手順によって得られた多数のｃＤＮＡクローンは、９２ｋＤａのタイプＩＶコラゲナーゼ（ゲラチナーゼＢ；Ｅ．Ｃ．３．４．２４．３５）ならびに酒石酸耐性酸性ホスファターゼに相当することがわかった。イン・シテュのハイブリダイゼーションで、ゲラチナーゼＢのｍＲＮＡはヒト破骨細胞腫の多核巨大細胞に存在することがわかった。合成ゲラチナーゼＢペプチドに対して作成されたポリクローナル抗血清を使用することで、８／８個の破骨細胞腫に由来する巨細胞、正常骨の破骨細胞、およびパジェット病の破骨細胞にゲラチナーゼＢ免疫反応性が認められた。一方、別の遺伝子の産物である７２ｋＤａのタイプＩＶコラゲナーゼ（ゲラチナーゼＡ；Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２４）に対する免疫反応性は、破骨細胞腫や正常破骨細胞には見られなかった。
【００１９】
本発明は、破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡを同定するのに有用な核酸プローブの作成と同定に有用性がある。本発明の破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡは、骨吸収異常が関与する障害の治療処置に有用な破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物を製造するのに用いることができる。また、本発明の破骨細胞特異的または破骨細胞関連配列は、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物を同定したり破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物の活性を変化させたりするのに有用な抗体を製造する目的に使用できるペプチドを作成する上でも有用である。このような抗体を破骨細胞特異的抗体という。破骨細胞特異的抗体は破骨細胞を同定する目的にも有用である。最後に、本発明の破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡ配列は遺伝子治療に有用である。たとえば、本発明の破骨細胞特異的または破骨細胞関連ＤＮＡ配列は、異常な破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物の破骨細胞中での発現を変化させたり、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物の異常発現を矯正するのに用いることができる。本明細書で説明する配列はさらに、発現が通常起きない細胞すなわち破骨細胞以外の細胞中で破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子の発現を引き起こすのにも用いることができる。
【実施例】
【００２０】
実施例１：破骨細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築
ヒト破骨細胞腫（「骨の巨細胞腫」）から得たメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーを構築した。破骨細胞腫は骨吸収活性の強い腫瘍であるが、通常は転移しない。凍結切片において、破骨細胞腫の約３０％は、イン・ビボで破骨細胞に特異的であり汎用されている表現型マーカーである酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）に陽性の多核細胞で占められている［ミンキン（Minkin）、Calcif. Tissue Int. 34:285-290 (1982) ］。残りの細胞は特徴不明の（uncharacterized ）「間質」細胞、すなわち繊維芽細胞状／間葉状形態を有する複数の細胞タイプの混合物である。証明されてはいないが、これらの腫瘍の破骨細胞は形質転換されないこと、および間質細胞要素によって産生される単数または複数の物質によってイン・ビボで活性化されて骨を吸収するようになると一般に考えられている。
【００２１】
モノクローナル抗体試薬を用い、長骨巨細胞腫の多核細胞の表面発現型の一部をキャラクタライズした。凍結切片において、全ての多核細胞はＣＤ６８を発現した。ＣＤ６８は、既報の中で破骨細胞とマクロファージの両方に対して特異的な抗原と定義されている［ホートンとヘルフリッヒ（Horton, M.A. and M.H. Helfrich）、In Biology and Physiology of the Osteoclast 、リフキンとゲイ（B.R. Rifkin and C.V. Gay）編、CRC Press, Inc. Boca Raton, FL, 33-54 (1992)］。一方、単核球／マクロファージおよび顆粒球上に存在するＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４表面抗原については巨大細胞の染色は観察されなかった［アルナアウトら（Arnaout, M.A. et al.）、J. Cell Physiol. 137:305 (1988) ；ハジオットら（Haziot, A. et al. ）、J. Immunol. 141:547 (1988)］。ヒト末梢血単核球の細胞遠心分離標本はＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４に対し陽性であった。これらの結果から、破骨細胞腫の多核巨大細胞は、マクロファージのものとは明確に区別されるが破骨細胞のものとは一致する表現型を有することが明らかである。
【００２２】
破骨細胞腫組織を液体窒素中で瞬時凍結させたものを用いて、常法に従ってポリＡ+ ｍＲＮＡを調製した。市販キット（Librarian 、InVitrogen社）を用い、ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡＩＩベクターにクローン化した。約２．６×１０6 個のクローンが得られたが、そのうちの＞９５％は平均長０．６ｋＢの挿入断片を含んでいた。
【００２３】
実施例２：間質細胞ｍＲＮＡの調製
各破骨細胞腫の一部を液体窒素中で瞬時凍結させてｍＲＮＡを調製した。腫瘍の残部は短時間トリプシン処理と機械的分散によって解離させ、組織培養に付した。これらの細胞を、１０％ウシ新生仔血清（MA Bioproducts社）、ゲンタマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）（Gibco 社）を添加したダルベッコのＭＥＭ（高グルコース、Sigma 社）中で増殖させた。間質細胞集団を少なくとも５回継代培養したところ、多核細胞を含まない均一な繊維芽細胞状細胞集団が得られた。これらの間質細胞は単核性で、酸性ホスファターゼ陰性で、アルカリホスファターゼに対しては様々な程度に陽性であった。これらの知見は、増殖した間質細胞（継代培養されている間質細胞）は非破骨細胞性で非活性であることを示している。
【００２４】
実施例３：破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーの識別スクリーニングによる破骨細胞腫特異的または破骨細胞腫関連遺伝子産物をコードするＤＮＡの同定
破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーから得た合計１２，０００個のクローンを、（１）巨細胞腫ｍＲＮＡ（間質細胞+ 、ＯＣ+ ）および（２）同じ腫瘍から培養した間質細胞由来ｍＲＮＡ（間質細胞+ 、ＯＣ- ）から得た32Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ混合物を用いる識別ハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ランダムプライミングによって約１０9 ＣＰＭ／μｇの活性になるまで、プローブを32［Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。これら１２０００個のクローンのうち１９５個は、巨大細胞（破骨細胞および間質細胞）ｍＲＮＡに対して陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示したが、間質細胞ｍＲＮＡに対しては示さなかった。さらに、これらのクローンは、上皮細胞、繊維芽細胞、リンパ球、骨髄単球、骨芽細胞、および神経芽細胞など様々な無関係のヒト細胞タイプ由来のｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡとはハイブリダイズしなかった。これらのクローンが他の細胞タイプ由来のｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡとハイブリダイズしないという事実は、これらのクローンが破骨細胞中でユニークに発現されるか破骨細胞と関連があるという結論を支持するものである。
【００２５】
破骨細胞（ＯＣ）ｃＤＮＡライブラリーは、次のようにして、ＯＣ  ｃＤＮＡ（間質細胞+ 、ＯＣ+ ）と間質細胞ｃＤＮＡ（間質細胞+ 、ＯＣ- ）とを用いる識別ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
【００２６】
成育培地とアンピシリンを含む寒天平板上にNYTRANフィルター（Schleicher & Schuell社）を載置した。ＯＣライブラリー由来の個々の細菌コロニーをランダムに採取し、あらかじめ仕切っておいたフィルター３枚づつに移した後、マスター寒天平板に移した。これらの手法を用い、最大２００個のクローンを１枚の９０ｍｍフィルター／平板に接種した。平板を倒置し、細菌接種物が直径０．５〜１．０ｍｍに成長するまで（フィルター上）３７℃でインキュベートした。
【００２７】
次いで、コロニーを溶菌した後、フィルターを０．５ＮのＮａＯＨで５分間飽和させた２枚のホワットマン３ＭＭ濾紙上に載置することによって、ＤＮＡをフィルターに結合させた。１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で３〜５分間飽和させた２枚のホワットマン３ＭＭ濾紙上にフィルターを載置することによってフィルターを中和した。中和処理後、１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）／１．５ＭＮａＣｌで３〜５分間飽和させた別の２枚のホワットマン３ＭＭ濾紙上でインキュベートした。次いで、フィルターを２ｘＳＳＣで短時間洗った。
【００２８】
フィルターを８０℃で３０分間加熱することによって、ＤＮＡをフィルター上に固定した。フィルターはただちに使用するのが最良であったが、真空ジャーに入れて室温で最高１週間までなら保存可能であった。
【００２９】
フィルターは、熔封可能なバッグ中、１枚あたり５〜８ｍｌのハイブリダイゼーション液中で、あらかじめ２〜４時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションバッグにフィルターを１枚追加するごとに２ｍｌの溶液を追加した。ハイブリダイゼーション緩衝液は、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト液（Denhardt's solution ）、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性非相同ＤＮＡから成るものであった。
【００３０】
ハイブリダイゼーションに先立ち、標識プローブを１ｘＳＳＣ中１００℃で５分間加熱して変性させ、次いで直ちに氷上で冷却した。変性させたプローブをハイブリダイゼーション溶液中のフィルターに加え、フィルターを６５℃で１２〜２０時間連続攪拌しながらハイブリダイズさせた。
【００３１】
ハイブリダイゼーション終了後、フィルターを２ｘＳＳＣと０．２％ＳＤＳ中、５０〜６０℃で３０分間洗った後、０．２ｘＳＳＣと０．２％ＳＤＳ中、６０℃で６０分間洗った。
【００３２】
次いで、フィルターを空気乾燥させ、−７０℃で一晩、増強スクリーンを用いてオートラジオグラフィーを行なった。
【００３３】
実施例４：選抜クローンのＤＮＡ配列決定
混合腫瘍プローブとは反応するが間質細胞プローブとは反応しないクローンは、破骨細胞関連またはイン・ビボ「活性化」間質細胞関連遺伝子産物を含んでいると予想される。腫瘍細胞ｃＤＮＡとはハイブリダイズしたが間質細胞ｃＤＮＡとはハイブリダイズしなかった１４４個のｃＤＮＡクローンにつき、シークエナーゼ（US Biochemical社）を用いてサンガーら（Sanger et al. ）のジデオキシ鎖終止法［サンガーら（Sanger F., et al. ）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977) ］によって配列を決定した。ＤＮＡＳＩＳ（日立）プログラムを用いて配列分析およびGenBank ／EMBLデータベースでの相同性サーチを行なった。
【００３４】
１９５個の腫瘍＋、間質細胞- のクローンのうち１４個は、破骨細胞マーカーであるタイプ５の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）と同一の配列を有する挿入断片を含むものであると同定された（Genbank 寄託番号Ｊ０４４３０  Ｍ１９５３４）。ＴＲＡＰ陽性クローンが高率で出現したことも、破骨細胞特異的または破骨細胞関連ｃＤＮＡ配列を含むクローンの数を増やす上でこのスクリーニング法の効果が高かったことを示している。
【００３５】
おもしろいことに、より高比率の腫瘍+ 、間質細胞- のクローン（７７／１９５；３９．５％）がヒトゲラチナーゼＢ（マクロファージ由来ゲラチナーゼＢ）［ウイルヘルム（Wilhelm, S.M. ）、J. Biol. Chem. 264:17213 (1989) ］として同定された。この事実も、この酵素が破骨細胞によって高率で発現されることを示すものである。これらのゲラチナーゼＢクローンのうちの２５個をジデオキシ配列分析によって同定したところ、２５個全てが公知のゲラチナーゼＢ配列（Genbank 寄託番号Ｊ０５０７０）と１００％の配列相同性を示した。これらのクローンによってカバーされているゲラチナーゼＢ  ｃＤＮＡ配列の一部を図に示した（配列番号：３３）。ゲラチナーゼＢを検出する32Ｐ標識プローブとの反応性によりさらに５２個のゲラチナーゼＢクローンが同定された。
【００３６】
配列決定されたクローンのうちの１３個は読み取り可能配列を生じなかった。GenBank ／EMBLデータベースのＤＮＡＳＩＳサーチで、残りの９１個のクローンのうちの３２個はデータベースや文献に未だ報告のない新規配列を含むことがわかった。これらの部分配列を表Ｉに示す。これらの配列のうちの３つはリピート配列であることに注意されたいが、このことは、この配列に関連するｍＲＮＡの発現がかなり高頻度であることを示している。リピート配列は上付き文字a 、b で示される〔表Ｉ（以下の表１〜５）のクローン１９８Ｂ、２２３Ｂ、および３２Ｃ〕。
【００３７】
【表１】
2004254698.tif 000001
【００３８】
【表２】
2004254698.tif 000002
【００３９】
【表３】
2004254698.tif 000003
【００４０】
【表４】
2004254698.tif 000004
【００４１】
【表５】
2004254698.tif 000005
【００４２】
ＯＣ+ 、間質細胞- のクローン化ＤＮＡ配列の配列分析によって、新規配列に加えて複数の既報遺伝子が見つかった。同定された公知遺伝子（タイプ５の酸性ホスファターゼ、ゲラチナーゼＢ、シスタチンＣ（１３クローン）、Ａｌｕリピート配列（１１クローン）、クレアチンキナーゼ（creatnine kinase）（６クローン）、およびその他のものを含む）を表ＩＩににまとめた。イン・シテュのハイブリダイゼーション（以下に説明する）で、ゲラチナーゼＢのｍＲＮＡは多核破骨細胞中で発現され、間質細胞中では発現されないことが直接証明された。ゲラチナーゼＢは特徴がよくわかっているプロテアーゼであるが、破骨細胞中で高レベル発現されることは未記載である。システインプロテアーゼ阻害剤であるシスタチンＣの破骨細胞中での発現も予想されていない。この知見はイン・シテュのハイブリダイゼーションでは未確認である。これらの結果を総合すると、これらの同定遺伝子のほとんどのものは破骨細胞によって発現されることが明らかであるので、破骨細胞特異的または破骨細胞関連遺伝子産物をコードするＤＮＡを同定する識別スクリーニング法の有効性が確認されたことになる。したがって、本法によって同定された新規遺伝子はＯＣ特異的またはＯＣ関連である可能性が高い。
【００４３】
また、このスクリーニング法で同定された遺伝子のうちの少数のものはおそらくＯＣによっては発現されない〔表ＩＩ（以下の表６〜７）〕。たとえば、タイプＩＩＩコラーゲン（６クローン）、コラーゲンタイプＩ（１クローン）、デルマタン硫酸（１クローン）、およびタイプＶＩコラーゲン（１クローン）は、間質細胞に由来するか、腫瘍中に存在する骨芽細胞に由来する可能性の方が高い。これらのｃＤＮＡ配列は、それらを腫瘍中でイン・ビボ産生する細胞が間質細胞増殖期に死滅するか、イン・ビトロでの産物産生を停止するかといういずれかの理由によって、識別スクリーニングプロセスを素通りしてしまう。これらのクローンは、識別ハイブリダイゼーションによって選択された配列全体の５〜１０％以上を占めることはない。
【００４４】
【表６】
2004254698.tif 000006
【００４５】
【表７】
2004254698.tif 000007
【００４６】
実施例５：ＯＣ発現遺伝子のイン・シテュのハイブリダイゼーション
ＯＣ特異的またはＯＣ関連と推定される新規遺伝子がヒト巨細胞腫の破骨細胞中で異なったふうに発現されるかどうか（および間質細胞中で発現されないかどうか）を調べるために、新規クローン化配列由来のプローブを用いてイン・シテュのハイブリダイゼーションを行なった。まず、35Ｓ−ＵＴＰで標識したヒトタイプＩＶコラゲナーゼ／ゲラチナーゼＢに対するアンチセンス（陽性）およびセンス（陰性対照）ｃＲＮＡプローブを用いて、イン・シテュのハイブリダイゼーションを行なった。
【００４７】
ヒト巨細胞腫薄切標本はアンチセンスプローブと反応して、全てのＯＣが高度標識されたことが、これらの細胞全面に銀色粒子が沈着したことで明らかになったが、間質細胞要素は標識しなかった。一方、センス（陰性対照）プローブの場合は、バックグランド標識はほとんど見られなかった。この結果から、ゲラチナーゼＢがヒトＯＣ中で発現されることが確認された。
【００４８】
次いで、公知方法に従いジゴキシゲニンＵＴＰで標識した１１／３２個の新規遺伝子に由来するｃＲＮＡプローブを用いてイン・シテュのハイブリダイゼーションを行なった。
【００４９】
この分析の結果を表ＩＩＩにまとめた。クローン２８Ｂ、１１８Ｂ、１４０Ｂ、１９８Ｂ、および２１２Ｂはいずれも、巨細胞腫の凍結切片中でＯＣと陽性反応を示し、陽性対照ゲラチナーゼＢも同様であった。したがって、これらの新規クローンはＯＣ中で発現され、ＯＣ関連性の基準を全て満たしたことになる。１９８Ｂは３回反復され、比較的高率で発現されていることを示している。クローン４Ｂ、３７Ｂ、８８Ｃ、および９８Ｂは腫瘍組織と陽性反応を示したが、シグナルはＯＣに充分に局在していなかった。したがって、これらのクローンは有用でないと思われ、以後の検討対象から除外する。クローン８６Ｂおよび８７Ｂはどの細胞タイプとも陽性反応を示さなかったので、おそらく非常に低レベルの発現であったと思われる。このグループのクローンは有用性があるが、これ以上調べるのは困難かもしれない。この分析の結果から、５／１１個の新規遺伝子がＯＣ中で発現されたことが示され、新規配列の約５０％はＯＣ関連であることがわかる。
【００５０】
イン・シテュのハイブリダイゼーションに使用するプローブを作成するために、新規クローン化破骨細胞に特異的であるか関連するｃＤＮＡに由来するｃＤＮＡをＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）ベクターにサブクローニングした。クローン化した挿入断片の方向をサブクローンの制限酵素分析によって決定した。ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩベクター中のＴ７およびＴ３プロモーターを用いて35Ｓ標識（35Ｓ−ＵＴＰ、８５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Amersham社、アーリントンハイツ、イリノイ州）またはＵＴＰジゴキシゲニン標識ｃＲＮＡプローブを作成した。
【００５１】
【表８】
2004254698.tif 000008
【００５２】
既報［チャンら（Chang,L.-C. et al.）、Cancer Res. 49:6700 (1989)］に従い、ヒト破骨細胞腫の７ミクロン凍結切片に対してイン・シテュのハイブリダイゼーションを行なった。手順を簡単にまとめる。まず４％パラホルムアルデヒドで組織を固定し、ＯＣＴ（Miles Inc.社、カンカケー、イリノイ州）に包埋した。切片を再水和し、４％ホルムアルデヒドで後固定し、洗浄し、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭヨードアセタミド、１０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド、０．１ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣＬで前処理した。５０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｘデンハルト液、５００ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、８０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００ｍＭ  ＤＴＴで４５℃で２時間のプレハイブリダイゼーションを行なった。１０％デキストラン硫酸と１．５ｎｇ／ｍｌの35Ｓ標識またはジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを含む新鮮ハイブリダイゼーション溶液を熱変性後に加えた。切片にカバーガラスをかけた後、４５〜５０℃で一晩加湿チャンバー中でインキュベートした。ハイブリダイズした切片を４５℃で５０％ホルムアミド、および１０ｍＭ  ＤＴＴと０．５％トリトンＸ−１００を含む２ｘＳＳＣで４回洗った。切片をＲＮアーゼＡとＲＮアーゼＴ１で処理して一本鎖ＲＮＡを消化し、２ｘＳＳＣ／１０ｍＭ  ＤＴＴで４回洗った。
【００５３】
オートラジオグラフィーで35Ｓ標識を検出するために、スライド標本を脱水し、乾燥させ、コダックＮＴＢ−２乳剤で被覆した。２枚づつのスライド標本をそれぞれ２分割し、各組を乾燥剤入りの黒箱に入れ、密封し、４℃で２日間インキュベートした。コダック現像剤Ｄ１９とコダック定着剤を用いて、スライド標本を現像し（４分）、定着（５分）させた。対照染色剤としてヘマトキシリンとエオシンを用いた。
【００５４】
ジゴキシゲニン標識プローブを検出するために、核酸検出キット（Boehringer-Mannheim 社、カタログ番号１１７５０４１）を用いた。スライド標本を１００ｍＭトリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）から成る緩衝液１中で１分間洗った。１００μｌの緩衝液２（メーカー提供の２ｍｇ／ｍｌのブロッキング試薬を加えることによって作成）を緩衝液１に加えたものを各スライド標本に加えた。スライド標本を振とう器に載置し、２０℃で静かに振とうした。
【００５５】
抗体溶液を緩衝液２（メーカー提供のもの）で１：１００に希釈した。１００μｌの希釈抗体溶液をスライド標本に加えた後、スライド標本をチャンバー中室温で１時間インキュベートした。乾燥しないようスライド標本をモニターした。抗体溶液とのインキュベーション終了後、スライド標本を緩衝液１中で１０分間洗った後、２ｍＭレバミゾールを含む緩衝液３中で２分間洗った。
【００５６】
洗浄後、１００μｌの色素液をスライド標本に加えた。色素液は、ニトロブルー／テトラゾリウム塩（ＮＢＴ）（１：２２５希釈液）４．５μｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（１：２８５希釈液）３．５μｌ、緩衝液３（メーカー提供のもの）に溶かしたレバミゾール０．２ｍｇを合わせた合計１ｍｌから成っていた。色素液は使用直前に調製した。
【００５７】
色素液を添加した後、スライド標本を２０℃の暗黒加湿チャンバーに２〜５時間入れ、発色をモニターした。ＴＥ緩衝液中でスライド標本をすすいで発色反応を停止させた。
【００５８】
スライド標本を０．２５％メチルグリーン中で６０秒間染色し、水道水で洗った後、水性Permount（Fisher社）を用いてマウントした。
【００５９】
実施例６：免疫組織化学
凍結組織およびパラフィン包埋組織ならびに細胞遠心分離標本について免疫組織化学的染色を行なった（表ＩＶ参照）。次の抗体を用いた。すなわち、ポリクローナルウサギ抗ヒトゲラチナーゼ抗体、ゲラチナーゼＢ抗体Ａｂ１１０、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ６８抗体（クローンＫＰ１）（DAKO社、デンマーク）、ＡＴＣＣ細胞株ＨＢ  ＣＲＬ８０２６およびＴＩＢ２２８／ＨＢ４４由来のＭｏ１（抗ＣＤ１１ｂ）およびＭｏ２（抗ＣＤ１４）である。抗ヒトゲラチナーゼＢ抗体Ａｂ１１０は、ヒトゲラチナーゼＢに対して特異的な［コーコランら（Corcoran, M.L. et al. ）、J. Biol. Chem. 267:515 (1992) ］アミノ酸配列ＥＡＬＭＹＰＭＹＲＦＴＥＧＰＰＬＨＫ（配列番号：３４）を有する合成ペプチドに対して作成されたものである。
【００６０】
免疫組織化学的染色の検出は、メーカーの指示に従いヤギ抗ウサギグルコースオキシダーゼキット（Vector Laboratories 社、Burlingame CA ）を用いて行なった。手順を簡単に説明する。まず、切片を再水和させ、アセトンまたは０．１％トリプシンで予備試験を行なった。正常ヤギ血清を用いて非特異的結合をブロックした。一次抗体とのインキュベーションを２時間または一晩行なった後（Ａｂ１１０：１／５００希釈）、グルコースオキシダーゼ標識二次抗ウサギ血清を加えるか、マウスモノクローナル抗体の場合には、精製ウサギ抗マウスＩｇと反応させた後で二次抗体とのインキュベーションを行なった。
【００６１】
破骨細胞腫（ＧＣＴ）由来のパラフィン包埋および凍結切片を抗ゲラチナーゼＢウサギ抗血清（抗体１１０）［コーコランら（Corcoran, M.L. et al. ）、J. Biol. Chem. 267:515 (1992) ］と反応させた後、グルコースオキシダーゼ結合試薬を用いて発色を調べた。巨細胞腫の破骨細胞は均一で強いゲラチナーゼＢ陽性を示したのに対し、間質細胞は反応しなかった。あらかじめ免疫化させておいたウサギ血清と反応させた対照切片は陰性であった。調べた８つの長骨巨細胞腫の全てで同様の結果が得られた（表ＩＶ）。下顎骨の中心巨細胞肉芽腫（ＧＣＧ）４つのうちの３つに存在する破骨細胞でも、ゲラチナーゼＢ発現に対して陽性であった。これらの新生物は顎に存在する点は共通していたが、長骨巨細胞腫と類似してはいるものの同じものではなかった［シェイファーら（Shafer, W.G. et al. ）、Textbook of Oral Pathology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, pp. 144-149 (1983) ］。一方、一般に口腔軟組織にできる非吸収性腫瘍である末梢巨細胞腫に由来する多核細胞は、抗体１１０と反応しなかった［シェイファーら（Shafer, W.G. et al. ）、Textbook of Oral Pathology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, pp. 144-149 (1983) ］。
【００６２】
抗体１１０を用いて正常骨（ｎ＝３）、および骨再形成の増強と破骨細胞活性の上昇が見られるパジェット病にゲラチナーゼＢが存在するかどうかも判定した。正常骨（２歳児の下顎骨）およびパジェット病の両方の破骨細胞で強いゲラチナーゼＢ染色が見られた。あらかじめ免疫しておいた血清とともにインキュベーションした対照では、染色は見られなかった。どの組織切片でも骨芽細胞は染色しなかったことから、ゲラチナーゼＢ発現は骨の破骨細胞に限定されることがわかる。末梢血単核球も抗体１１０と反応した〔表ＩＶ（以下の表９〜１０）〕。
【００６３】
【表９】
2004254698.tif 000009
【００６４】
【表１０】
2004254698.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、破骨細胞特異的および破骨細胞関連遺伝子産物をコードする単離ＤＮＡを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ヒトゲラチナーゼＢのｃＤＮＡ配列（配列番号：３３）を示したもので、本発明の破骨細胞特異的または破骨細胞関連ｃＤＮＡクローンによって表される配列の一部分を強調表示している。