【手続補正書】
【提出日】平成16年9月21日(2004.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
Ｌ−アスコルビン酸類及びローヤルゼリー類と共に、飲食品、特別用途食品、保健機能食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、ペットフードの分野の何れかにおいて使用される１種又は２種以上の他の成分を含んでなる請求項１に記載のコラーゲン産生増強剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
Ｌ−アスコルビン酸２−グリコシドが、少なくとも、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドを含有することを特徴とする請求項６に記載のコラーゲン産生増強剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
飲食品、特別用途食品、保健機能食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、ペットフードの何れかであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
ローヤルゼリー類と共にＬ−アスコルビン酸類を含有することを特徴とする請求項１２に記載のＴＧＦ−β産生増強剤。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、線維芽細胞を用いて、上記の課題を解決するための検討と検索をかさねた結果、Ｌ−アスコルビン酸類とローヤルゼリー類とを組み合わせることにより、Ｌ−アスコルビン酸類によるコラーゲン産生を、Ｌ−アスコルビン酸類単独の使用ではその産生が認められない濃度、或いは、低い産生量しか認められない濃度において、ローヤルゼリー類を添加することにより、その産生が効率的に増強するという予想外の知見に到達した。また、その結果として、Ｌ−アスコルビン酸類の失活が進み、もはや単独ではコラーゲン産生が認められない場合であっても、ローヤルゼリー類を存在させることによってＬ−アスコルビン酸類の活性が増強され、コラーゲン産生が顕現することを独自の知見として見いだした。一方、線維芽細胞のコラーゲン産生は、線維芽細胞などから分泌されるトランスフォーミング  グロース  ファクター（以下、「ＴＧＦ−β」と略記する。）により増強されることは知られていた。本発明者らは、この点にも着目してさらに研究を進めた結果、ローヤルゼリー類は線維芽細胞に対してアスコルビン酸類の存在下で、ＴＧＦ−βの産生を増強させ、加えて、真皮よりも皮膚の表面側に存在する表皮のケラチノサイトに対しては、ローヤルゼリー類単独で、ＴＧＦ−βの産生を増強させることを見いだした。このように、ローヤルゼリー類によるＬ−アスコルビン酸類のコラーゲン産生増強機構の一つが、ＴＧＦ−βの産生の増強によることを確認して、ローヤルゼリー類及び／又はローヤルゼリー類とＬ−アスコルビン酸類が、コラーゲン産生増強剤、ＴＧＦ−β産生増強剤及び／又はケラチノサイト増殖促進剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明のコラーゲン産生増強剤は、ヒトを含む動物類に、経口的、或いは、経皮的のいずれの経路で投与した場合にも、その有効成分が速やかに生体内に吸収されて、真皮、組織、臓器などに存在する線維芽細胞におけるＬ−アスコルビン酸類によるコラーゲン産生を持続して増強するので、ヒトを含む動物類が当該コラーゲン産生増強剤を摂取すると、コラーゲンの産生が安定的に持続し、加齢に伴う老化や、紫外線をはじめとする因子によりダメージを受けた皮膚のコラーゲン産生能の低下を回復し、皮膚にはりやうるおいを与え、小ジワ・シワを除去し、皮膚の弾力を回復する効果を奏することができる。また、特に、経皮投与にあっては、Ｌ−アスコルビン酸類及びローヤルゼリー類が、真皮に存在する線維芽細胞や表皮に存在するケラチノサイトに速やかに到達し、ＴＧＦ−βの産生を増強するなどして、Ｌ−アスコルビン酸類によるコラーゲン産生を持続して増強するとともに、ローヤルゼリーがケラチノサイトの増殖を促進して、その角化層を、強化して生体防御能を増強することから、加齢に伴う老化や、紫外線や有害微生物などをはじめとする因子によりダメージを受けた皮膚のコラーゲン産生能の低下を速やかに回復し、皮膚にはりやうるおいを与え、小ジワ・シワを除去し、皮膚の弾力を回復するのに極めて効果的である。しかも、本発明のコラーゲン産生増強剤は、ヒトを含む動物が簡便に利用できて、健康の維持・増進にも利用でき、例えば、強壮剤、ＴＧＦ−β産生増強剤、ケラチノサイト増殖促進剤、健康食品、健康補助食品、特別用途食品、保健機能食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、ペットフード、雑貨などとしてもとりわけ有用である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明のコラーゲン産生増強剤の摂取量又は投与量は、対象とするヒトをはじめとする動物やペットなどの種類、齢、性別などによって異なるものの、Ｌ−アスコルビン酸としての重量換算で、体重１ｋｇあたり、通常、０．１ｍｇ乃至０．２５ｇ、望ましくは、１ｍｇ乃至０．５ｇ、ローヤルゼリーとしての重量換算で、体重１ｋｇあたり、通常、０．５ｍｇ乃至２ｇ、望ましくは、１ｍｇ乃至１ｇ、経口的に、１日１回又は数回に分けて、効果に応じて、連日又は１日以上の間隔をおいて摂取するか、あるいは投与すればよい。経口的に投与される強壮剤、健康食品、健康補助食品、特別用途食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、ペットフードなどでは、例えば、液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、ペースト剤、シラップ剤、カプセル剤など、各々の用途に応じた形態のものを用いることができる。また、本発明のコラーゲン産生増強剤を、化粧品などの皮膚外用剤として皮膚に直接塗布する場合には、当該コラーゲン産生増強剤に使用されるＬ−アスコルビン酸類或いはローヤルゼリー類は、各々、Ｌ−アスコルビン酸或いはローヤルゼリーとしての重量換算で、皮膚外用剤全量中、０．００１乃至２０重量％、好ましくは、０．００５重量％乃至１５重量％であり、１日１回又は数回に分けて、効果に応じて、連日又は１日以上の間隔をおいて直接皮膚に塗ればよい。なお、Ｌ−アスコルビン酸類或いはローヤルゼリー類は、０．００１重量％未満では、その効果は発揮され難くなり、３０重量％を越える製品にあっては、製品の物性の面で好ましくない場合がある。また、当該皮膚外用剤は、例えば、ローション、乳液、クリーム、固形、粉末、ゼリー、パック、フェイスマスクなど、その使用目的に応じた形態のものとして用いることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
固状の形態の本発明のコラーゲン産生増強剤は、例えば、Ｌ−アスコルビン酸と非加熱処理ローヤルゼリーとを混合し、必要に応じて他の成分を更に混合した後、当該混合物を、減圧乾燥、真空乾燥、温風乾燥などの通常の乾燥工程に供することにより得ることができる。また、例えば、同じ出願人による特開平６−１７０２２１号公報に開示される無水α，α−トレハロースなどを賦形剤として利用することにより、通常の乾燥工程を経ることなく固状の形態の当該コラーゲン産生増強剤を得ることもできる。すなわち、結晶又は非結晶のα，α−トレハロース無水物を、Ｌ−アスコルビン酸と非加熱処理ローヤルゼリーの混合物に添加し、当該混合物を、常温以下で静置すればよい。α，α−トレハロースの無水物を用いて通常の乾燥工程を経ずに調製されたものは、非加熱処理ローヤルゼリーによるＬ−アスコルビン酸類のコラーゲン産生を増強する作用はもちろんのこと、非加熱処理ローヤルゼリーが有する様々な作用の安定性がとりわけ優れているので、本発明に有利に利用できる。これら固状の形態の当該コラーゲン産生増強剤は、必要に応じて、粉砕機、造粒機、打錠機などを用いて、粉末、顆粒、錠剤など所望の形態にしたり、さらに必要に応じて、例えば、該粉末又は該顆粒をカプセルに充填して利用することも有利に実施できる。なお、本発明のコラーゲン産生増強剤の粉末化に使用する脱水剤は、ローヤルゼリーの活性を安定に保持しつつ、脱水できる可食性の脱水剤であればいずれでも良く、好ましくは、無水α，α−トレハロースの他に、無水α，β−トレハロース、無水マルトース、無水あるいは１含水の環状四糖などが例示される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の組成物の形態には特に制限はない。望ましい食品としては、例えば、アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベットなどの氷菓、氷蜜などのシロップ、バタークリーム、カスタードクリーム、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのスプレッド及びペースト、チョコレート、ゼリー、キャンディー、グミゼリー、キャラメル、チューインガム、プリン、シュークリーム、スポンジケーキなどの洋菓子、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖菓などの加工果実ないしは加工野菜、まんじゅう、ういろう、あん、羊羮、水羊羮、カステラ、飴玉、米菓などの和菓子、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの調味料などが挙げられる。望ましい飲料の形態としては、例えば、合成酒、醸造酒、果実酒、洋酒などの酒類、ジュース、ミネラル飲料、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、スポーツドリンク、ドリンク剤、緑茶・紅茶・ウーロン茶などの茶飲料、コーヒー、ココアなどの清涼飲料などが挙げられる。望ましい化粧品の形態としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、固形、粉末、ゼリー、パック、フェイスマスクなどの形態の、基礎化粧品、洗浄用化粧品、入浴用化粧品、口腔化粧品、日焼け・日焼け止め化粧品、メークアップ化粧品、頭髪化粧品（発毛剤、育毛剤など）や、台所用洗剤のように肌に直接影響を及ぼす雑貨類などが挙げられる。以上のような本発明による組成物を製造するには、目的とする製品を慣用の製造方法にしたがって製造する過程の適宜の時期に本発明のコラーゲン産生増強剤を添加するか、あるいは、Ｌ−アスコルビン酸類とローヤルゼリー類とを個々に、適宜、添加すればよい。添加の時期に特に制限はないけれども、目的とする製品が加熱工程を経て製造されるものの場合には、Ｌ−アスコルビン酸類や他の熱に不安定な成分については、加熱工程の後、常温、望ましくは、３０℃以下に冷却した後に添加することにより、製造工程でのコラーゲン産生増強作用の減衰を防ぐことができる。以上のような本発明の組成物は、本発明のコラーゲン産生増強剤を、製品重量あたり、通常、０．０１重量％乃至２０重量％、望ましくは、０．１重量％乃至１０重量％含有する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【実験１】
＜Ｌ−アスコルビン酸類或いはローヤルゼリー類によるコラーゲン産生作用の検討＞
（１）アスコルビン酸類
アスコルビン酸類としては、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（試薬特級  和光株式会社販売）を使用した。
（２）ローヤルゼリー類
本実験において、ローヤルゼリー類として非加熱処理ローヤルゼリー及び加熱処理ローヤルゼリーを使用した。非加熱処理ローヤルゼリーとしては、未加工のブラジル産ローヤルゼリー（水分６７重量％、−２０℃で保存。）を、使用の際に随時常温で解凍し、直後に必要量を小分けして用いた。また、加熱処理ローヤルゼリーは、前記非加熱処理ローヤルゼリーを、口径が１８ｍｍのガラス試験管に５ｇずつ採取し、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃の処理の場合は、恒温槽の中で３０分間保持し、１００℃の処理の場合は、オイルバス中で３０分間保持した。加熱処理後、直ちに、３０℃以下に冷却して以後の実験に供した。
（３）ハムスター新生児線維芽細胞の調製
常法に従い、ハムスター新生児の背部皮膚を切開し、剥離した皮膚の切片から、線維芽細胞を単離した。以下、その方法を略記する。予め、ディスパーゼ（株式会社合同酒精販売）を、０．０３ｍＭ  Ｃａ＋＋を含むイーグルのＭＥＭ培地（株式会社日水販売）に、５００単位／ｍｌとなるように溶解した培地中に、当該切片を、４℃で一晩静置後、表皮と真皮を剥離した。剥離した真皮を、０．２５％（ｖ／ｖ）となるようにコラゲナーゼ（株式会社天野製薬販売）を溶解したダルベッコのＭＥＭ培地（株式会社日水販売、以下「Ｄ−ＭＥＭ」と略記する。）中で、３７℃で１時間保持した。その後、真皮の細片を、同培地中でピペッティングすることにより、ハムスター新生児線維芽細胞の単細胞の懸濁液を調製後、遠心分離により、細胞を回収した。回収した細胞をリン酸緩衝食塩水に懸濁し、３０分放置後、線維芽細胞を含む上清を遠心分離して当該細胞を回収し、１０％（ｖ／ｖ）の牛胎児血清（ギブコＢＲＬ社販売、以下「ＦＣＳ」と略記する。）含有Ｄ−ＭＥＭに再懸濁して、以後のコラーゲン産生量測定用の線維芽細胞として使用した。
（４）Ｌ−アスコルビン酸によるコラーゲン産生の測定
以下の細胞の培養は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２濃度のインキュベーター中で行った。前記（３）で調製したハムスター新生児の線維芽細胞懸濁液３ｍｌを６ウエルのプレートに、４×１０５細胞／ウエルとなるように蒔き込み、７日間培養した。１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含有したＤ−ＭＥＭに、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムを、Ｌ−アスコルビン酸としての重量換算で、各々０．０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０、５０．０、１００．０、２００．０μｇ／ｍｌとなるように溶解した。同様に、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含有したＤ−ＭＥＭに、非加熱処理ローヤルゼリー又は加熱処理ローヤルゼリーを、各々０．０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０、５０．０、１００．０、２００．０、５００．０μｇ／ｍｌとなるように溶解した。当該Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム又はローヤルゼリーを溶解した各々の培地５ｍｌを、当該線維芽細胞の培養上清を除去したウエルに加え、さらに、３日間培養した。その後、各々のウエルの培養上清を、同一のアスコルビン酸、又は、ローヤルゼリー濃度に調製した培地５ｍｌで置換し、３日間培養した後、前記と同一のアスコルビン酸、或いは、ローヤルゼリー濃度の培地１ｍｌと置換し、さらに３時間培養後、Ｄ−ＭＥＭに溶解した［２，３−３Ｈ］プロリン（４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム社販売）を３μＣｉ／ウエルとなるように添加し、一晩さらに培養した。本実験に使用した培地類（Ｌ−アスコルビン酸、或いは、ローヤルゼリー添加のものを含む）は、いずれも、０．２２μｍのフィルターで濾過したものを使用した。
（５）線維芽細胞の産生したコラーゲンに取り込まれたプロリンの定量
前記（４）で［２，３−３Ｈ］プロリンの存在下で、ハムスター新生児の線維芽細胞を一晩培養した後、常法にしたがって細胞からコラーゲンを抽出し、取り込まれた［２，３−３Ｈ］プロリンを定量した。プロリンの定量は、セオ・ジン  キム（Ｓｅｏｎｇ−Ｊｉｎ  Ｋｉｍ）ら、『ダーマトロジック  サージェリー』（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）、第２４巻、第１０５４−１０５８頁（１９９８年）に記載された方法に基づいて行った。以下、その方法を略記すると、前記（４）で［２，３−３Ｈ］プロリンを加えて一晩培養した細胞の上清を除去後の各ウエルに、トリプシン（ギブコＢＲＬ社販売）０．３ｍｌ／ウエルを添加し、３７℃で１０分間静置し、さらに、０．３ｍｌのＤ−ＭＥＭを添加して、細胞を当該培地に懸濁した。当該細胞懸濁液を、遠心分離して上清を除去して線維芽細胞を回収し、当該細胞に、１ｍｇ／ｍｌのペプシン（シグマ社販売）含有１Ｍ酢酸０．１ｍｌを添加し、撹拌して混合し、室温で、４時間振盪した。次に、２００μｇ／ｍｌのタイプＩコラーゲン（株式会社高研販売）含有０．５Ｍ酢酸０．８ｍｌを添加し、３，０００回転／分、４℃で５分間遠心分離後、上清を５Ｍ塩化ナトリウムで、０．１５Ｍに調整し、１２，０００回転／分、４℃で１０分間遠心分離した。上清を５Ｍ塩化ナトリウムで、０．４５Ｍに調整し、３，２００回転／分、４℃で３０分間遠心分離後上清を除去した。さらに、沈澱に、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液４ｍｌを添加し、３，２００回転／分、４℃で１０分間遠心分離後上清を除去した。最後に、沈澱に、０．５Ｍ酢酸を０．２５ｍｌ添加し、撹拌して、沈澱を懸濁し、その懸濁液を５ｍｌのシンチレーション溶液に懸濁し、液体シンチレーションカウンターで、コラーゲンに取り込まれた３Ｈプロリンの量を常法に従って定量した。実験は、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、ローヤルゼリーの各々の濃度について、３ウエルを使用して実験をおこなった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
実験１に示したように、Ｌ−アスコルビン酸単独ではその濃度が０．５μｇ／ｍｌ以上でないと、コラーゲン産生作用は認められないにもかかわらず、ローヤルゼリーを併用することにより、０．２μｇ／ｍｌの濃度で、すでに、コラーゲン産生作用が認められる。実験で使用したローヤルゼリーには、Ｌ−アスコルビン酸は含まれていないので、この結果から、ローヤルゼリーは、Ｌ−アスコルビン酸以外の成分により、Ｌ−アスコルビン酸によるコラーゲン産生能を増強しており、また、コラーゲン産生作用に必要なＬ−アスコルビン酸の濃度を、Ｌ−アスコルビン酸単独の場合より低くする作用も有していることが確認された。加えて、Ｌ−アスコルビン酸が２０．０μｇ／ｍｌの濃度の場合、少なくとも、１０μｇ／ｍｌ以上のローヤルゼリーを添加すれば、Ｌ−アスコルビン酸によるコラーゲン産生が、ローヤルゼリーにより増強されることが確認された。このことは、アスコルビン酸類が、生体内で分解を受け、単独での使用であれば、そのコラーゲン産生作用を発揮できない、乃至、産生能が低下する濃度となった場合でも、ローヤルゼリーを併用することにより、アスコルビン酸によるコラーゲン産生が増強され、当該コラーゲンの産生能が安定に維持できることを示すものである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
その結果を、ローヤルゼリー存在下及び非存在下でのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドの添加量と、ハムスター新生児線維芽細胞によるコラーゲン産生の関係をＬ−アスコルビン酸類及びローヤルゼリーの何れも添加しない時の線維芽細胞のコラーゲン産生量を１００とする相対値により、表３に示す。ハムスター新生児線維芽細胞は、ローヤルゼリー類の添加の有無に係わらず、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドを無添加の場合には、コラーゲンの産生は、実験１の対象と同様に低いレベルであった。また、０．２μｇ／ｍｌ以上の濃度のアスコルビン酸２−グルコシドを添加した場合には、無添加に比してコラーゲン産生が増強され、さらに、ローヤルゼリー類の添加により、コラーゲンの産生量は増強された。一方、具体的なデータは示さないが、実験１では、１μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸を添加して３日間培養し、同一の培地で置換後さらに３日間培養した場合には、コラーゲン産生が認められたのに対して、陰性対照では、１μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸を添加した培地で培養したにもかかわらず、３日間培養した後に、同一の培地で置換していなかったために、コラーゲン産生の増強は認められなかった。このことは、培地に溶解したＬ−アスコルビン酸２−グルコシドが、培地中で、Ｌ−アスコルビン酸に比して極めて安定であり、細胞に存在するグルコシダーゼにより徐々に、Ｌ−アスコルビン酸とグルコースに分解されるため、Ｌ−アスコルビン酸としての活性が７日間安定に持続したためと考えられ、ローヤルゼリー類とアスコルビン酸類とを組み合わせる際のＬ−アスコルビン酸２−グルコシドの優位性を示すものである。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
ハムスター新生児線維芽細胞は、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド及びローヤルゼリーの非存在下でも、約３００ピコグラム（以下、「ｐｇ」と略記する。）／ｍｌのＴＧＦ−βを産生していた。実験の結果は、このＬ−アスコルビン酸２−グルコシド及びローヤルゼリーの非存在下での線維芽細胞のＴＧＦ−β産生量を１００とする相対値により、表４に示す。線維芽細胞のＴＧＦ−β産生量は、２００μｇ／ｍｌのローヤルゼリーの添加では変化しなかった。一方、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドをＬ−アスコルビン酸の重量換算で０．２μｇ／ｍｌとなるように溶解した培地を添加した場合には、無添加に比してＴＧＦ−β産生が増強される傾向にあり、その産生量は、２００μｇ／ｍｌのローヤルゼリーの添加により、有意に増強された。このＴＧＦ−βの産生増強は、実験３に示す、ハムスターの新生児線維芽細胞のＬ−アスコルビン酸２−グルコシドによるコラーゲン産生のローヤルゼリーによる増強とよく相関しており、Ｌ−アスコルビン酸類によるコラーゲン産生をローヤルゼリー類が増強する機構の一つに、ＴＧＦ−βの産生の増強を介する系が存在することを示している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【実験５】
＜ローヤルゼリーによるケラチノサイトのＴＧＦ−β産生に与える影響の検討＞
Ｌ−アスコルビン酸類による線維芽細胞のＴＧＦ−βの産生がローヤルゼリーによって増強されることが確認されたため、線維芽細胞の存在する真皮に隣接する表皮中のケラチノサイトについても、線維芽細胞へ影響を及ぼす可能性があると考えて、そのＴＧＦ−βの産生に対するローヤルゼリー及び／又はＬ−アスコルビン酸２−グルコシドの影響を、以下の方法で検討した。
（１）ケラチノサイト培養用培地
ケラチノサイトの培養には、エピライフ（Ｅｐｉｌｉｆｅ）培地（カスケードバイオロジック  インク社、米国：Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に、０．０６ｍＭ  Ｃａ＋＋と増殖添加剤ＨＫＧＳ（最終濃度：５μｇ／ｍｌ  ウシインシュリン、５μｇ／ｍｌ  ウシトランスフェリン、０．５μＭ  ハイドロコーチゾン、０．２％ウシ脳下垂体抽出物）（カスケード  バイオロジック  インク社製、米国）、１００単位／ｍｌ  ペニシリン（明治製菓株式会社販売）、及び、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（明治製菓株式会社販売）を添加したエピライフ＋ＨＫＧＳ培地を、ケラチノサイト用基礎培地として使用した。
（２）ハムスター新生児ケラチノサイトの調製
実験１と同様にして調製した４日齢ハムスター新生児の背部皮膚片から、表皮を剥離し、ハサミを用いて細切後、遠心分離により、沈澱を回収した。回収した沈澱に、２０単位／ｍｌのＤＮａｓｅ（シグマ社販売）を添加し、室温で穏やかに３分間撹拌後、標準ＭＥＭ培地（株式会社日水販売、以下、「Ｓ−ＭＥＭ」と略記する。）を添加して、更に２分間撹拌後、遠心分離により細胞を回収して、Ｓ−ＭＥＭに懸濁した。以下の細胞の培養は、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２濃度のインキュベーター中で行った。
（３）ローヤルゼリーによるＴＧＦ−β産生増強の測定
Ｓ−ＭＥＭに懸濁したケラチノサイトを、遠心分離して細胞を回収し、ケラチノサイト用基礎培地に再懸濁し、タイプＩＶコラーゲンコート９６ウエルマイクロプレート（ベクトン  デキンソン社製）に、１×１０４細胞／１００μｌ／ウエルで蒔き込んだ。ケラチノサイトが、ウエルの底面に付着後、培養液を除去し、あらかじめ、ケラチノサイト用基礎培地に、実験１で使用したものと同じローヤルゼリーを、１０００μｇ／ｍｌとなるように溶解した溶液及び、それをケラチノサイト用基礎培地で２倍段階希釈して調製した、ローヤルゼリーを、各々５００、２５０、１２５、６２．５、及び３１．３μｇ／ｍｌ含有する試験液で置換した。３日後に試験液を除去し、同一濃度のローヤルゼリーを含有する試験液を添加して、さらに、２４時間培養し、その上清中のＴＧＦ−β量を、実験４と同様にＴＧＦ−β１  Ｅｍａｘ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより測定した。ケラトノサイトは、Ｌ−アスコルビン酸類及びローヤルゼリー無添加の場合、約７０ｐｇ／ｍｌのＴＧＦ−βを産生していた。実験の結果は、このＬ−アスコルビン酸類及びローヤルゼリー無添加の場合のＴＧＦ−β産生量を１００とする相対値により、表５に示す。
（４）ローヤルゼリーによるケラチノサイトの増殖促進の測定
（３）の実験と同一の条件で同一の期間ケラチノサイトを培養し、その後さらに３日間培養を継続した後、アラマー  ブルー（ａｌａｍｅｒ  ｂｌｕｅ）（トレック  ダイアゴノスティク  システムズ  インク社製：ＴＲＥＫ  ＤＩＡＧＯＮＯＳＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＩＮＣ．）を２０μｌ／ウエル添加し、３７℃で３時間保持した後で、フルオロスキャンＩＩ（ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩ、ラボシステムズ（Labsystems）社製）を使用して、励起波長５４４ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで蛍光強度を測定した。結果は、ローヤルゼリー無添加で培養したケラチノサイト量（蛍光強度）を１００とした相対値により、表６示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本品は、Ｌ−アスコルビン酸によるコラーゲン産生を増強する作用を示し、皮膚にうるおいを与え、皮膚の老化防止に奏効する、簡便に利用できかつ著効を示すコラーゲン産生増強剤である。また、本品は、適度な酸味により良好な呈味を示すので、日常的に利用する健康食品と有用であるばかりでなく、ＴＧＦ−β産生増強剤或いはケラチノサイト増殖促進剤としても利用できる。本品は、このまま経口的に摂取することも、又、水やその他の飲料などに溶解して摂取することも自由である。さらには、特別用途食品、保健機能食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、ペットフード、雑貨などに配合して、これらにコラーゲン産生作用、ＴＧＦ−β産生増強作用及び／又はケラチノサイト増殖促進作用を付与することも自由である。