(57)【要約】  本発明は、様々な疾患の発症や進行等に関連している、転写因子として存在するＫＬＦ５の働きを抑制する新たな薬剤を見いだし、上記疾患の予防・治療の新たな手段を提供することを目的とする発明である。  具体的には、上記ＫＬＦ５が、核内受容体を介したタンパク質の分解作用によって存在量が抑制されていることを見出し、ＫＬＦ５のタンパク質量を抑制する作用を有する核内受容体に対する結合物質を有効成分とする薬剤を提供することで、上記の課題を解決し得ることを見出した。さらに、本発明は、上記ＫＬＦ５の分解機序に即した当該薬剤の有効成分の選別方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子ＫＬＦ５のタンパク質量を抑制する作用を有する核内受容体に対する結合物質を有効成分とすることを特徴とする、ＫＬＦ５抑制剤。
【請求項２】
前記ＫＬＦ５抑制剤において、核内受容体の結合物質によるＫＬＦ５タンパク質量の抑制が、当該タンパク質の分解による抑制を伴うことを特徴とする、請求項１記載のＫＬＦ５抑制剤。
【請求項３】
前記ＫＬＦ５抑制剤において、核内受容体が、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、レチノイン酸受容体α、レチノイン酸受容体β、レチノイン酸受容体γ、甲状腺ホルモン受容体α、甲状腺ホルモン受容体β、ビタミンＤ受容体、レチノイドＸ受容体α、レチノイドＸ受容体β、レチノイドＸ受容体γ、ペルオキシソーム増殖活性化受容体α、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ、ペルオキソーム増殖活性化受容体δ、肝臓Ｘ受容体α、肝臓Ｘ受容体β、ファーネソールＸ受容体、ステロイド及び外来異物受容体、恒常的アンドロスタン受容体、逆アーブＡ受容体α、逆アーブＡ受容体β、ＲＡＲ関連オーファン受容体α、ＲＡＲ関連オーファン受容体β、ＲＡＲ関連オーファン受容体γ、肝細胞核内因子４α、肝細胞核内因子４γ、精巣オーファン受容体２、精巣オーファン受容体４、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子β、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子β、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子γ、エストロゲン関連受容体α、エストロゲン関連受容体β、エストロゲン関連受容体γ、神経成長因子誘導遺伝子Ｂα、神経成長因子誘導遺伝子Ｂβ、神経成長因子誘導遺伝子Ｂγ、胚細胞核内因子、ステロイドジェニック因子１、肝受容体相同蛋白、光受容体細胞特異的核内受容体、ショウジョウバエテイルレス遺伝子受容体ヒトホモローグ、小へテロダイマーパートナー蛋白、および、量感受性転換ＡＨＣに非常に重要なＸ染色体上の領域の遺伝子1からなる群から選ばれるいずれかの核内受容体であることを特徴とする、請求項１又は２記載のＫＬＦ５抑制剤。
【請求項４】
前記ＫＬＦ５抑制剤において、核内受容体がエストロゲン受容体であることを特徴とする、請求項１又は２記載のＫＬＦ５抑制剤。
【請求項５】
前記ＫＬＦ５抑制剤において、有効成分がエストロゲンであることを特徴とする、請求項３記載のＫＬＦ５抑制剤。
【請求項６】
前記ＫＬＦ５抑制剤において、核内受容体がペルオキシソーム増殖活性化受容体γであることを特徴とする、請求項１又は２記載のＫＬＦ５抑制剤。
【請求項７】
前記ＫＬＦ５抑制剤において、有効成分がトログリタゾンであることを特徴とする、請求項５記載のＫＬＦ５抑制剤。
【請求項８】
前記ＫＬＦ５抑制剤が、癌抑制剤又は循環器疾患治療剤であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のＫＬＦ５抑制剤。
【請求項９】
被験物質を、核内受容体及びＫＬＦ５と細胞内にて共存させて、ＫＬＦ５へのｍＲＮＡからの転写活性が減少する場合に、前記被験物質を、核内受容体の存在下でＫＬＦ５の分解を誘発する候補物質として選別し、さらに、当該候補物質と核内受容体及びＫＬＦ５を細胞内において共存させ、ＫＬＦ５の非遺伝子的な分解の検出を行い、当該非遺伝子的な分解が検出された場合に、当該被験物質を、請求項１〜８のいずれかに記載されたＫＬＦ５抑制剤の有効成分として選別することを特徴とする、物質の選別方法。
【請求項１０】
前記の物質の選別方法において、核内受容体及びＫＬＦ５の細胞内における共存を行うために、これらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを細胞内にて発現させることを特徴とする、請求項９記載の物質の選別方法。
【請求項１１】
前記の物質の選別方法において、核内受容体が、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、レチノイン酸受容体α、レチノイン酸受容体β、レチノイン酸受容体γ、甲状腺ホルモン受容体α、甲状腺ホルモン受容体β、ビタミンＤ受容体、レチノイドＸ受容体α、レチノイドＸ受容体β、レチノイドＸ受容体γ、ペルオキシソーム増殖活性化受容体α、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ、ペルオキソーム増殖活性化受容体δ、肝臓Ｘ受容体α、肝臓Ｘ受容体β、ファーネソールＸ受容体、ステロイド及び外来異物受容体、恒常的アンドロスタン受容体、逆アーブＡ受容体α、逆アーブＡ受容体β、ＲＡＲ関連オーファン受容体α、ＲＡＲ関連オーファン受容体β、ＲＡＲ関連オーファン受容体γ、肝細胞核内因子４α、肝細胞核内因子４γ、精巣オーファン受容体２、精巣オーファン受容体４、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子β、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子β、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子γ、エストロゲン関連受容体α、エストロゲン関連受容体β、エストロゲン関連受容体γ、神経成長因子誘導遺伝子Ｂα、神経成長因子誘導遺伝子Ｂβ、神経成長因子誘導遺伝子Ｂγ、胚細胞核内因子、ステロイドジェニック因子１、肝受容体相同蛋白、光受容体細胞特異的核内受容体、ショウジョウバエテイルレス遺伝子受容体ヒトホモローグ、小へテロダイマーパートナー蛋白、および、量感受性転換ＡＨＣに非常に重要なＸ染色体上の領域の遺伝子1からなる群から選ばれるいずれかの核内受容体であることを特徴とする、請求項９又は１０記載の物質の選別方法。
【請求項１２】
前記の物質の選別方法において、核内受容体が、エストロゲン受容体又はペルオキシソーム増殖活性化受容体γであることを特徴とする、請求項９又は１０記載の物質の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の薬効を有する薬剤、具体的には、種々の疾患に関連している転写因子であるＫＬＦ５の働きを抑制する薬剤、及び、当該薬剤の有効成分の選別方法、に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
クッペル様因子5(Kruppel-like factor 5: 以下ＫＬＦ５と略す)は、KLFファミリーに属し、C末端のジンク・フィンガー(zinc finger)モチーフを特徴とする転写因子である。【０００３】
ＫＬＦ５は、BTEB2 (basic transcriptional element binding protein 2)あるいはIKLF (intestinal-enriched Kruppel-like factor)ともよばれる。ＫＬＦ５は、主に血管、小腸、胎盤等で発現し細胞分化や増殖に関与している(Watanabe et al., Circ. Res., 85, p. 182-191, 1999；Sogawa et al., Nucleic Acids Res., 11, p. 1527-1532, 1993)。ＫＬＦ５遺伝子は、胎児及び新生児期に血管に発現し、成体では発現が低下するが、心臓・血管領域では障害時に誘導され炎症・増殖因子の発現増強をもたらすと考えられており、本遺伝子の発現誘導は心臓血管病の病態を大きく左右する(Nagai et al., J. Thmb. Heamo., 3, p. 1569-1576, 2005)。【０００４】
近年、乳癌患者において本遺伝子の発現量が高いと生存率が低下すること (Tong et al., Clin. Cancer Res., 15, p. 2442-2448, 2006)、また、ガン遺伝子として知られているH-RasによりＫＬＦ５は活性化され、Cyclin D1またはCyclin B1/Cdc2の転写を活性化させることにより癌化を促すことが報告されている(Nandan et al., FEBS lett., 29, p. 4757-4762, 2005)。膀胱癌の細胞系統においても、ＫＬＦ５はCyclin D1の転写を活性化しがん細胞増殖を引き起こすことが報告されている(Nandan et al., Oncogene, 23, p. 3404-3413, 2004)。さらに、白血病の細胞系統において、ＫＬＦ５は多くのがん細胞においてアポトーシスを抑制しているタンパク質であるSurvivinの転写を活性化し、がん細胞の増殖、アポトーシス抑制、化学療法耐性に関与していることが報告されている (Zhu et al., J. Biol. Chem., 26, p. 14711-14718, 2006)。これらの報告から、ＫＬＦ５は様々な癌の増悪因子であると考えられている。【０００５】
上述したように、ＫＬＦ５は、平滑筋形質変換や心血管系の病態形成に関わるだけではなく、癌化または癌の悪性化に関わる転写因子であり、その機能発現には本遺伝子のタンパク質量の制御が極めて重要である。ＫＬＦ５は、広範な心臓血管病の疾患の発症ならびに進展、血管新生が関与する疾患の病態形成、あるいは癌等の細胞増殖、化学療法耐性に関与するため、この働きを抑制する薬剤が提供されれば、医療において多大な貢献がなされるものと考えられる。しかし、現在のところある種の薬剤がＫＬＦ５の遺伝子発現を修飾することが知られているが（Fujiu et al., Cir. Res., 97, p. 1132-1141, 2005）、上記疾患を効果的に治療あるいはその発症・進展を抑制する薬剤は知られておらず、新たな機序によるＫＬＦ５作用抑制剤が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決すべき課題は、このＫＬＦ５の働きを抑制する新たな薬剤を見いだし、上記疾患の予防・治療の新たな手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題を解決するために、ＫＬＦ５の性質について深く検討を行ったところ、驚くべきことに、ＫＬＦ５は、核内受容体であるエストロゲン受容体を介して、その結合物質、特に作動物質依存的に分解されるが、その分解は、ｍＲＮＡの減少により認められるものではなく、タンパク分解系の働きにより行われ、このＫＬＦ５の分解による減少自体により、ｍＲＮＡにおけるＫＬＦ５への転写活性が減少することを見いだした。さらに、他の核内受容体であるペルオキシソーム増殖活性化受容体γでも、同様の作用があることを見出した。これらのことから、基本構造が共通する核内受容体全般が、細胞内におけるＫＬＦ５の減少を仲介していること結論付け、本発明を完成した。【０００８】
よって、本発明は、転写因子ＫＬＦ５のタンパク質量を抑制する作用を有する核内受容体に対する結合物質を有効成分とすることを特徴とする、ＫＬＦ５抑制剤（以下、本抑制剤ともいう）、並びに、当該抑制剤の有効成分を選別するための具体的手段、を提供する発明である。【０００９】
上記の核内受容体としては、上記の２種類の核内受容体の他に、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、レチノイン酸受容体α、レチノイン酸受容体β、レチノイン酸受容体γ、甲状腺ホルモン受容体α、甲状腺ホルモン受容体β、ビタミンＤ受容体、レチノイドＸ受容体α、レチノイドＸ受容体β、レチノイドＸ受容体γ、ペルオキシソーム増殖活性化受容体α、ペルオキソーム増殖活性化受容体δ、肝臓Ｘ受容体α、肝臓Ｘ受容体β、ファーネソールＸ受容体、ステロイド及び外来異物受容体、恒常的アンドロスタン受容体、逆アーブＡ受容体α、逆アーブＡ受容体β、ＲＡＲ関連オーファン受容体α、ＲＡＲ関連オーファン受容体β、ＲＡＲ関連オーファン受容体γ、肝細胞核内因子４α、肝細胞核内因子４γ、精巣オーファン受容体２、精巣オーファン受容体４、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子β、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子β、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子γ、エストロゲン関連受容体α、エストロゲン関連受容体β、エストロゲン関連受容体γ、神経成長因子誘導遺伝子Ｂα、神経成長因子誘導遺伝子Ｂβ、神経成長因子誘導遺伝子Ｂγ、胚細胞核内因子、ステロイドジェニック因子１、肝受容体相同蛋白、光受容体細胞特異的核内受容体、ショウジョウバエテイルレス遺伝子受容体ヒトホモローグ、小へテロダイマーパートナー蛋白、および、量感受性転換ＡＨＣに非常に重要なＸ染色体上の領域の遺伝子1を挙げることができる。【００１０】
なお、上述した２種類の核内受容体のうち、エストロゲン受容体は、エストロゲンα受容体とβ受容体が知られているが、本発明においては、これらの両者を含み、特に断らない限り、「エストロゲン受容体」と記載した場合には、αとβの両受容体の双方を含むものとする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、癌や循環器系疾患等の増悪に関連するＫＬＦ５を抑制することにより、これらの疾患の治療（改善）に適用可能な治療剤と、当該治療剤の有効成分を選別するための手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＫＬＦ５はＥＲβを介してエストロゲン依存的に分解されることを、ヒトＫＬＦ５とヒトＥＲβを共発現させウエスタンブロッティングによって確認した結果を示す図である。
【図２】KLF5はERβを介してエストロゲン依存的にユビキチンプロテアソーム経路により分解されることを示す、KLF5のユビキチン化量をユビキチン化アッセイによって確認した結果を示す図である。
【図３】ＫＬＦ５はＥＲβと結合することを示す、免疫沈降の結果を示す図である。
【図４】ＥＲβがエストロゲン依存的にＫＬＦ５により活性化される標的遺伝子の転写活性を抑制することを、レポーターアッセイによって確認した結果を示す図である。
【図５】核内転写因子であるＰＰＡＲγ２がリガンド依存的にＫＬＦ５を分解することを、ＫＬＦ５とＰＰＡＲγ２を共発現させウエスタンブロッティングによって確認した結果を示す図である。
【図６】ERβがエストロゲン依存的にKLF5の転写活性化能を抑制することを示す、レポーターアッセイによって確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
［有効成分］
本抑制剤の有効成分として用いることができる、「エストロゲン受容体あるいはペルオキシソーム増殖活性化受容体γ等の核内受容体の結合物質」は、エストロゲン受容体あるいはペルオキシソーム増殖活性化受容体γ等の核内受容体とＫＬＦ５との結合を強くさせ、かつＫＬＦ５の分解を促進する物質であれば、天然物であっても合成物であってもよい。代表的なエストロゲン受容体結合物質としては、その作動物質であるエストロゲンを挙げることができる。また、代表的なペルオキシソーム増殖活性化受容体γ結合物質として、その作動物質であるトログリタゾンを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。【００１４】
本抑制剤の有効成分として用いることができるエストロゲンは、公知の合成法により合成したものを用いることも、市販品を用いることも可能である。また、同トログリタゾンについても、公知の合成法により合成したものを用いることも、市販品を用いることも可能である。【００１５】
［有効成分の選別方法］
本発明の選別方法（以下、本選別方法ともいう）は、２段階のスクリーニング工程からなる物質の選別方法である。【００１６】
すなわち、第１スクリーニングとして、被験物質を、核内受容体及びＫＬＦ５と細胞内にて共存させて、当該ＫＬＦ５の転写活性化能が抑制される場合に、当該被験物質を、核内受容体の存在下でＫＬＦ５の分解を誘発する候補物質として選別する工程を行う。【００１７】
そして、第２スクリーニングとして、第１スクリーニングにて候補物質として選択された物質を、核内受容体及びＫＬＦ５を細胞内において共存させ、ＫＬＦ５の非遺伝子的な分解の検出を行い、当該非遺伝子的な分解が検出された場合に、当該被験物質を、本抑制剤の有効成分として選別することを特徴とする、物質の選別方法である。【００１８】
以下に、本選別方法の概略を、エストロゲン受容体結合物質の場合について例示するが、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γの場合でも選別手順は概ね同一である。【００１９】
第１スクリーニングとして、まず、好適には、ＫＬＦ５の転写活性化能を抑制する物質をスクリーニングする。すなわち、細胞内の試験系において、ＫＬＦ５とエストロゲン受容体を共存させ、被験物質の存在下にてＫＬＦ５の転写活性化能が抑制されることが確認されれば、当該被験物質が所望するエストロゲン受容体の作動物質であることが強く推測される。この転写活性化能の抑制の検出は、常法、例えば、ルシフェラーゼアッセイやＣＡＴアッセイ等のレポーターアッセイ(DeWet.J.R.et.al., Mol.Cell.Biol.,7:725-737,1987；Gorman.C.N.et.al., Mol.Cell.Biol.,2:1044-1051；Herbomel.P.et.al., Cell.39:653-662,1984；Edlund.T.et al.,: Science, 230:912-916,1985；Sleigh.M.J.Analyt.Biochem., 156:251-256,1986；Sudo.T.et al.,: Oncogene.7:1999-2006,1992等)を用いることにより行うことができる。具体的には、本実施例６に準じた手法をそのまま、又は、これらの個別の技術に応じて当業者が自明の範囲であてはめて容易に行うことができる。【００２０】
次に、第２スクリーニングとして、第１スクリーニングにより選ばれたＫＬＦ５の転写活性化能を抑制させる物質の中から、ＫＬＦ５を分解する物質をスクリーニングする。エストロゲン受容体とＫＬＦ５の結合を起こさせる物質の中からＫＬＦ５を分解する物質をスクリーニングする。具体的には、例えば、ヒト腎臓繊維芽細胞(293)等にＫＬＦ５と核内受容体（エストロゲン受容体、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ等）タンパク質を発現させ、発現細胞に作動物質候補を加え培養液中で培養する。細胞内破砕液中のタンパク質をSDS-PAGEにより分離した後、目的誘導タンパク質（ＫＬＦ５）に特異的な抗体を用いたウエスタンブロット法により目的タンパク質の検出および定量を行う。ここで、作動物質候補の添加により目的タンパク質であるＫＬＦ５量が減少すれば、実際に細胞内においてＫＬＦ５分解が促進されたと判断することが可能であり、当該候補物質が、所望するエストロゲン受容体の作動物質であることを確定させることができる。【００２１】
このようにして得られたエストロゲン受容体の作動物質を、本抑制剤の有効成分として用いることができる。【００２２】
なお、ＫＬＦ５は、その公知の遺伝子配列（Gene bank登録番号: AF287272）を基に、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法にて当該遺伝子の増幅を行い、当該増幅産物を、遺伝子発現ベクターに組み込み、当該組換えベクターを宿主にトランスフェクションして、宿主中に所望する組換えＫＬＦ５を発現させ、これを精製して、上記のアッセイ方法に用いることができる。また、上記組換えベクターの組換え予定部位の上流に、myc遺伝子やFlag遺伝子を組み入れて、これらのTagタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。【００２３】
また、細胞内でのアッセイ系の場合には、これらの発現ベクターを当該アッセイ細胞にトランスフェクションして、当該細胞内発現を行って、所望のアッセイを行うことも可能である。【００２４】
［本抑制剤の形態］
上述したように、本抑制剤の投与により、その有効成分である核内受容体の結合物質（エストロゲン受容体やペルオキシソーム増殖活性化受容体γの作動物質等）の働きによって、生体内のＫＬＦ５の働きを抑制することができる、ＫＬＦ５の関連疾患の予防・治療剤としての態様を採ることが可能である。具体的には、ＫＬＦ５の働きを抑制することによる、癌抑制剤、さらには、動脈硬化、高血圧、虚血性心疾患、虚血性脳疾患等の循環系疾患の治療剤等)を挙げることができる。【００２５】
本抑制剤の有効成分であるエストロゲン受容体あるいはペルオシキソーム増殖活性化受容体γ等の核内受容体結合物質の投与量は、当該結合物質の種類や上記の本抑制剤の様態等に応じて自由に選択が可能である。【００２６】
例えば、当該結合物質がエストロゲンの場合、本抑制剤の投与量および投与回数は特に限定されないが、エストロゲンの場合は、有効成分質量として一日０．１mg〜１０mg程度の間で選択することが出来、典型的には成人一日当たり１〜５mg程度である。当該結合物質がトログリタゾンの場合は、有効成分重量として一日１０mg〜３００mg程度の間で選択することが出来、典型的には成人一日当たり１００〜２００mg程度である。上記の投与量は患者の年齢や体重などの条件、疾病の種類などに応じて適宜増減することが望ましい。また、上記の一日投与量を数回に分けて投与することもできる。【００２７】
当該作動物質の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれの投与経路を選択することも可能である。【００２８】
本抑制剤の剤型は、特に限定されず、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤等が例示可能である。【００２９】
また、本抑制剤には、各種の添加剤をその剤型等に応じて添加することが可能である。当該添加剤としては、例えば、基礎剤として、溶剤、基剤、賦形剤を添加することが可能である。また、補助剤として、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、可塑剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保湿剤等の補助剤を添加することが可能である。また、緩衝剤、等張化剤、安定剤、無痛化剤、保存剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、着色剤等を添加することも可能である。さらに、これらを２種以上組み合わせて用いてもよい。これらの製剤用添加物の具体例は、例えば、医薬品添加物辞典（日本医薬品添加物協会編集、薬事日報発行）に説明されているので、当事者は医薬組成の形態に応じて適宜の製剤用添加物を選択し、当業界の汎用の方法に従って所望の形態の医薬組成物を製造することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明を、実施例を用いてさらに具体的に説明するが、この記載により、本発明が限定的に解釈されるべきものではない。【００３１】
［試験例１］  ＫＬＦ５の分解経路とエストロゲンの作用の検討（１）
ヒト腎臓繊維芽細胞である２９３細胞（Tateishi et al., EMBO J., 23, p. 4813-4823, 2004）は、通常１０％ウシ胎児血清（FBS）を添加したDulbecco’s modified Eagle’s  medium (DMEM, Sigma)で維持した。この２９３Ｅ細胞に、myc-ＫＬＦ５及びFlag-ＥＲ（エストロゲン受容体の略称）βのトランスフェクションを行った。ヒトＫＬＦ５をコードする遺伝子（Gene bank #: AF287272：配列番号１）は、THP1（ヒト単球細胞）細胞から、市販の RNA抽出薬（ISOGEN, Nippon Gene）を用いてTotal RNAを抽出し、オリゴ（dT）プライマーを用いて1st strand cDNAを合成し、それらをテンプレートとし、PCR法により得た。得られたPCR産物を6×myc配列を付加した哺乳類細胞用発現ベクターpcDNA3 (Invitrogen)の制限酵素切断部位（XhoIとEcoRV）の間に挿入した。ヒトＥＲβをコードする遺伝子（Gene bank #: NM_001437：配列番号２）は、293E（ヒト腎臓繊維芽細胞）から、前記RNA抽出薬（ISOGEN, Nippon Gene）を用いてTotal RNAを抽出し、オリゴ（dT）プライマーを用いて1st strand cDNAを合成し、それらをテンプレートとし、PCR法により得た。得られたPCR産物を、FLAG配列を付加した哺乳類細胞用発現ベクターpCMV5 (Invitrogen)の制限酵素切断部位（BamHI）の間に挿入した。目的の配列（ＥＲβ及びＫＬＦ５をコードする遺伝子）を挿入した哺乳類細胞用発現ベクターから、プラスミドを調製し、これらを上記の２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションを行う２４時間前に、培地を４％のチャコール処理を行ったFBSを含んだDMEM（フェノールレッド不含）に交換した。トランスフェクションにはPerfectin (Gene Therapy Systems)のトランスフェクション試薬を製造元のプロトコールに従って使用した。さらに２４時間後に、培地を２％のチャコール処理を行ったFBSを含んだDMEM（フェノールレッド不含）に交換し、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２ (10-6M)やリガンドであるエストロゲン (10-8M)を添加し、その後２４時間、培養した。次いで、リガンドであるエストロゲンの処理を行った２９３Ｅ細胞のタンパク質をTNEバッファー (10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 1 % Nonidet-P 40 (NP-40), 0.15 M NaCl, 1mM EDTA)で抽出した。溶出したタンパク質をSDS-PAGEで分離後、polyvinylidine diflueride membranes (Milipore)にトランスファーし、それぞれのタンパク質は、抗c-MycマウスモノクローナルIGg-κ抗体（NAKARAI TESQUE）と抗FLAG M2マウスモノクローナル抗体 (Sigma)、抗βアクチンマウスモノクローナル抗体 (Sigma)を用いて、ウエスタンブロット法による細胞内発現タンパク質の検出を行った。その結果を図１にて示す。ＫＬＦ５を細胞に導入し、発現させた場合、エストロゲン添加によるＫＬＦ５タンパク質の減少は見られないが（レーン１＆２）、ＥＲβを共発現させた場合、エストロゲンを添加することにより、ＫＬＦ５タンパク質の減少が見られた（レーン３＆４）。さらに、ＫＬＦ５とＥＲβを共発現させエストロゲンと共にＭＧ１３２を添加すると、ＫＬＦ５タンパク質の減少が見られなくなった（レーン５＆６）。この結果により、ＫＬＦ５タンパク質はＥＲβを介してエストロゲン依存的に分解し、この分解は、プロテアソーム系を介したものであることが明らかになった。【００３２】
また、この試験系を、エストロゲンを被験物質に代えて行うことで、当該被験物質が本抑制剤の有効成分であるか否かの選別を行うことができる。すなわち、当該被験物質の添加により、系内のＫＬＦ５量が減量する場合には、当該被験物質を本抑制剤の有効成分とすることが可能となる。また、ＥＲβを他の核内受容体に代えて、この選別試験系を行うこともできる。さらに、この試験系の実施に先立ち、好適には、上述した２段階アッセイの第一段階の試験、すなわち、好適には試験管内において、被験物質を核内受容体と共存させた場合に、当該核内受容体にＫＬＦ５が結合するか否かの試験を行い、結合する場合には、上記のような細胞内アッセイを行い、その具体的なＫＬＦ５抑制効果について検証することができる。【００３３】
［試験例２］ＫＬＦ５の分解経路とエストロゲンの作用の検討（２）
Flag-HA-KLF5は試験例１で用いたmyc-KLF5を制限酵素XhoIとEcoRVで切り出し、FlagとHA配列を付加した哺乳類細胞用発現ベクターpcDNA3 (Invitrogen)の制限酵素切断部位（XhoIとEcoRV）の間に挿入した。His-Ub（ヒトユビキチンをコードする遺伝子(NCBI#：CAA44911)は、試験例１の要領にて1st strand cDNAを合成し、それらをテンプレートにしてPCR法により得た。得られた産物にHis配列を付加した哺乳類細胞用発現ベクターpcDNA3の制限酵素切断部位（KpnI）の間に挿入した。目的の配列をコードする遺伝子を挿入した哺乳類細胞用発現ベクターから、プラスミドを調製し、試験例1の要領にて２９３細胞にトランスフェクションした。Flag-HA-KLF5, ERβ, His-Ubをトランスフェクションしてから２４時間後にエストロゲン(10-7 M)を添加して培養した。その後、細胞を回収し、radioimmuno precipitation (RIPA)バッファー(50 mM Tris-HCl [pH7.5], 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)にて溶解した。細胞抽出物を遠心した後、得られた上清を抗FLAG M2アガロース（Sigma）を用いて免疫沈降を行った（Yanagisawa et al., 1198491356343_0。結合したタンパク質を400μg/mlのFLAGペプチド(Sigma)を用いて溶出した。溶出したタンパク質を試験例1の要領にてSDS-PAGEで分離後、適切な一次抗体によって検出した。その結果を図２にて示す。KLF5のユビキチン化量がERβを介すことによりエストロゲン依存的の増加することから、KLF5のERbを介したエストロゲン依存的な分解は、ユビキチンプロテアソーム経路を介したものであることが明らかになった。【００３４】
［試験例３］  ＫＬＦ５のＥＲβへの結合の確認
試験例1の要領にて２９３細胞にFLAG-ＥＲβ, myc-ＫＬＦ５をトランスフェクションし、ＭＧ１３２とエストロゲン処理をおこなった後に回収した細胞からタンパク質をTNEバッファー で抽出した。抽出したタンパク質を抗FLAG M2アガロース（Sigma）を用いて免疫沈降を行った（Yanagisawa et al., Science, 26, p. 1317-1321, 1999）。結合したタンパク質を400μg/mlのFLAGペプチド(Sigma)を用いて溶出した。溶出したタンパク質を試験例1の要領にてSDS-PAGEで分離後、適切な一次抗体によって検出した。その結果を図３にて示す。ＥＲβを共発現させない場合は、ＫＬＦ５のバンドは認められないが（レーン２）、ＥＲβを共発現させるとＫＬＦ５のバンドが検出された（レーン４）。このことから、ＫＬＦ５は、ＥＲβと特異的に直接結合することが明らかになった。【００３５】
［試験例４］  本抑制剤の有効成分とアポトーシスとの関係
哺乳類細胞用発現ベクターに組み込んだmyc-ＫＬＦ５とFLAG-ＥＲβ、および、細胞のアポトーシスを司ることが知られているヒトSurvivin遺伝子の-220 bpから+49 bp（ＫＬＦ５遺伝子の翻訳開始部位を+1とした場合の位置である）までの領域をpGL3 basicプラスミド(Promega)のルシフェラーゼ遺伝子の上流に結合したコンストラクト(pLuc-269)を作成した。これらのコンストラクトを試験例１の要領にて２９３細胞にトランスフェクションし、ＥＲのリガンドであるエストロゲンを添加した。エストロゲン添加２４時間経過後、Dual Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を定量した。その結果を図４にて示す。この結果から、ＫＬＦ５の導入によりSurvivinプロモーターの活性化が認められた。このＫＬＦ５強発現下におけるＫＬＦ５依存のSurvivinプロモーター活性化作用は、エストロゲン依存的にＥＲβによって抑制された。さらに、この抑制はＭＧ１３２を加えることにより解除された。従って、試験例１等の結果と総合して、エストロゲンはＥＲβを介してＫＬＦ５のタンパク質量を減少せしめ、減少したＫＬＦ５はＫＬＦ５依存性のプロモーターに作用してその作用を負に制御することが分かった。この結果は、核内受容体依存的に、本抑制剤の有効成分となり得る物質でＫＬＦ５タンパク質量を減じることにより、ＫＬＦ５依存的な遺伝子発現を調節できることを初めて実証したものである。また、同時に、ＥＲβ作動薬のような本抑制剤の有効成分となり得る物質は、Survivinの活性化抑制作用を有することが分かった。【００３６】
［試験例５］  ペルオキシソーム増殖活性化受容体γにおける検討
試験例1の要領にて２９３細胞にmyc-ＫＬＦ５とFlag-ＰＰＡＲγ２をトランスフェクションしてから２４時間後に、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ２（ＰＰＡＲγ２：ＰＰＡＲγのアイソフォームの一つ）のリガンドであるトログリタゾン(10-6 M)を添加して培養した。それぞれのタンパク質は抗myc抗体、抗FLAG抗体と抗β-actin抗体を用いてウエスタンブロット法により検出した。【００３７】
ＰＰＡＲγ２のアミノ酸配列(NCBI#：NP_056953：配列番号４)をコードする遺伝子は、試験例１の要領にて1st strand cDNAを合成し、それらをテンプレートにしてPCR法により得た。得られた産物にFLAG配列を付加した哺乳類細胞用発現ベクターpcDNA3の制限酵素切断部位（EcoRIとXbaI）の間に挿入した。その結果を図５にて示す。この結果により、ＫＬＦ５タンパク質はＰＰＡＲγ２を介してトログリタゾンの存在により減少することが明らかになった。さらに、このＫＬＦ５のタンパク質の減少はＭＧ１３２により抑えられることから、プロテアソーム系を介した分解によるものであることが明らかになった。【００３８】
［試験例６］レポーターアッセイによる検討
哺乳類細胞用発現ベクターに組み込んだFLAG-ERβ、およびKLF5遺伝子の+1 bpから+879bp（KLF5遺伝子の翻訳開始部位を+1とした場合の位置を示す）までの領域をpMプラスミド(Clontech)のGAL4 DBD遺伝子の上流に結合したコンストラクト(Gal4-KLF5)を作成した。これらのコンストラクトとリポーターベクター17mTATA-Luc（pGL3 basicプラスミド(Promega)に17mTATA配列を付加したもの）を、試験例１の要領にて２９３細胞にトランスフェクションし、ERのリガンドであるエストロゲンを添加した。エストロゲン添加２４時間経過後、Dual Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を定量した。その結果を図６にて示す。この結果から、KLF5の転写活性化能は、エストロゲン依存的に抑制された。さらに、この抑制はMG132を加えることにより解除された。従って、[試験例１]の結果と総合して、エストロゲンはERβを介してKLF5のタンパク質量を減少せしめ、KLF5の転写活性化能を負に制御することが分かった。この成績は、KLF5の転写活性化能を指標とした、ERβに対するエストロゲン受容体の作動物質のスクリーニングが可能であることを強く示唆している。【００３９】
以上述べた結果により、ＫＬＦ５が、エストロゲン受容体（ＥＲ）を介して、エストロゲン存在下で、また、ＰＰＡＲγを介してトログリタゾン存在下で、タンパク質分解経路（ユビキチンプロテアソーム経路）により、非遺伝子的に分解されることが明らかになった。よって、ＥＲあるいはＰＰＡＲγの結合物質、例えばエストロゲンあるいはトログリタゾン等の作動物質を投与することにより、生体内のＫＬＦ５が減少し、ＫＬＦ５量が減少すると結論付けられる。さらに、このような機序で減少したＫＬＦ５が、ＫＬＦ５により転写が活性化される機能遺伝子の発現を抑制することが、抗アポトーシス因子であるSurvivinについてエストロゲン受容体とエストロゲンについて示されたことから、ＥＲあるいはＰＰＡＲγの結合物質（主に作動物質）が、ＫＬＦ５タンパク質の分解促進を介してＫＬＦ５依存的な遺伝子発現を抑制できると結論付けられる。【００４０】
ＫＬＦ５は、広範な心臓血管病の疾患の発症ならびに進展、血管新生が関与する疾患の病態形成などに関与するため、この働きを抑制する薬剤が提供されれば、医療において多大な貢献がなされるものと考えられる。また、ＫＬＦ５は血管新生および抗アポトーシス因子であるSurvivinの発現を促して癌等の増殖に関与しており（Zhu et al., J. Biol. Chem., 26, p. 14711-14718, 2006）、Survivin遺伝子発現を抑制すると癌の増殖が抑制されるほか（Tu SP et al., Cancer Res., 63, p. 7724-7732, 2003）、Survivinは癌の化学療法あるいはＸ線照射療法に対する耐性獲得とも密接に関与しており、その発現を抑制すると感受性が回復することから（Lu B et al., Cancer Res., 64, p. 2840-2845, 2004）、Survivinは新しい癌療法の標的と想定されている。【００４１】
また、本発明はＫＬＦ５のタンパク質量を減少させる作用を示す、核内受容体と核内受容体作動薬を選択する方法を提供する。実施例は、ＥＲあるいはＰＰＡＲγ受容体とそれらの代表的な作動薬に関するものであるが、上記受容体は異なった受容体ファミリーに属することから、本発明が提供する核内受容体と核内受容体作動薬を選択する方法は、両受容体が属する共通のスーパーファミリーである核内受容体にまで及ぶことは容易に推察される。すなわち、本発明が提供する方法によって、ＥＲあるいはＰＰＡＲγ受容体に限らない核内受容体とその結合薬（主に作動薬）の組み合わせから、ＫＬＦ５のタンパク質量を減少させる作用を持つ多様な薬剤を選択することが可能となる。疾患の治療に用いられる薬剤は、その疾患の治療に当たって、副作用がないかあるいは少なく、かつ、求める作用が疾患特異的に発揮されるような特性を持つことが望ましいことを考えると、この多様な結合薬（主に作動薬）の選択の可能性は本発明の極めて重要な特性である。上述の望ましい薬剤要件を満たす結合薬は、より多様な核内受容体と組になって、ＫＬＦ５への転写を、ＫＬＦ５の直接的な分解によるタンパク質量の減少を介して抑制する、受容体作動薬の中から選択される。【００４２】
以上、述べたごとく、本選別方法により、ＫＬＦ５タンパク質量を減少させる薬剤を選択することが可能となる。【００４３】
以下に本抑制剤の製剤例を記載する。【００４４】
［製剤例１］  錠剤
（配合成分）                                                    （質量部）
エストロゲン                                                      ０．１
結晶セルロース                                                  ９８．９
ショ糖脂肪酸エステル                                              １．０【００４５】
上記の配合で常法に従い錠剤を製造する。【００４６】
［製剤例２］  カプセル剤
（配合成分）                                                    （質量部）
エストロゲン                                                      １．５
ラクトース                                                      ８５．０  
コーン・スターチ                                                ５８．０  
ステアリン酸マグネシウム                                          ２．０【００４７】
上記で示される各成分の粉末を良く混合し、60メッシュの篩（メッシュの基準はTyler
基準による）を通す。得られる粉末をはかり分け、ゼラチンカプセル(No. 3)に充填し、
カプセル剤を調製する。【００４８】
［製剤例３］  錠剤
（配合成分）                                                    （質量部）
トログリタゾン                                                  ４５．０
ラクトース                                                      ３５．０
コーン・スターチ                                                ３４．０  
微結晶セルロース                                                ２０．０  
ステアリン酸マグネシウム                                          １．０  【００４９】
上記で示される各成分の粉末を良く混合し、錠剤に圧縮成型する。必要ならば、これらの錠剤は糖またはフィルムで被覆してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2008078785000001.app
【国際調査報告】
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