(57)【要約】  本発明は、アジュバントを含まなくても免疫活性の高い経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法を提供する。  無傷の皮膚への製剤の適用によって免疫応答を調節する経皮製剤であって、基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸が積層されていることを特徴とする経皮免疫製剤、抗原を水又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させた水溶液若しくは懸濁液を、基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原が濃縮された抗原層を基剤表面に積層することを特徴とする経皮免疫製剤の製造方法及び経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用し、免疫応答を調節することを特徴とする経皮免疫方法。
2008105504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷の皮膚への製剤の適用によって免疫応答を調節する経皮製剤であって、基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸が積層されていることを特徴とする経皮免疫製剤。
【請求項２】
抗原が、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される病原体由来の抗原、腫瘍関連抗原、自己抗原、アレルゲン又は抗原がコードされた核酸であることを特徴とする請求項１記載の経皮免疫製剤。
【請求項３】
人工合成核酸がデコイ核酸、アンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であることを特徴とする請求項１記載の経皮免疫製剤。
【請求項４】
抗原若しくは人工合成核酸の分子量が１，０００ダルトンより大きいことを特徴とする請求項１記載の経皮免疫製剤。
【請求項５】
基剤が、水及び／又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質であることを特徴とする請求項１記載の経皮免疫製剤。
【請求項６】
親水性高分子物質が、ポリアクリル酸アルコキシアルキル系高分子物質、でんぷん- アクリル酸グラフト系高分子物質、ポリアクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルアルコール系高分子物質、酢酸ビニル- アクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルピロリドン系高分子物質、イソブチレン- マレイン酸系高分子物質又はＮ−ビニルアセトアミド系高分子物質であることを特徴とする請求項５記載の経皮免疫製剤。
【請求項７】
ポリビニルアルコール系高分子物質が、ポリビニールアルコールハイドロゲルであることを特徴とする請求項６記載の経皮免疫製剤。
【請求項８】
基剤が、アクリル酸メトキシエチル４０〜６０重量％、（メタ）アクリル酸ラウリル３０〜４０重量％及び極性モノマー１０〜２５重量％よりなる共重合体１００重量部、乳酸オクチルドデシル２〜１５重量部、グリセリン２〜１０重量部及びヒアルロン酸０．０１〜０．１重量部からなることを特徴とする請求項５記載の経皮免疫製剤。
【請求項９】
基剤が、可塑剤、化学的吸収促進剤及び／又は酵素を含有することを特徴とする請求項１記載の経皮免疫製剤。
【請求項１０】
アジュバンドを含有することを特徴とする請求項１記載の経皮免疫製剤。
【請求項１１】
抗原若しくは人工合成核酸を水及び／又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させた水溶液若しくは懸濁液を、基剤表面に滴下し、水及び／又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原若しくは人工合成核酸が濃縮された抗原層を基剤表面に積層することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載の経皮免疫製剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用し、免疫応答を調節することを特徴とする経皮免疫方法。
【請求項１３】
無傷の皮膚を酵素処理した後、経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用することを特徴とする請求項１２記載の経皮免疫方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答を調節するための、経皮的免疫に有用な経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
経皮的免疫を成立させるには、抗原が皮膚（皮膚は通常抗原を通さない）を通過することと、抗原に対する免疫応答の両方が必要である。抗原は通常１,０００ダルトンよりも大きい高分子物質であり、皮膚を通過することは極めて困難である。そのため、経皮免疫を行うためには、皮膚から角質層を剥離し、角質層を剥離した皮膚に抗原を含んだ製剤を貼付することが行われていた（例えば、特許文献１参照）。しかし、皮膚から角質層を剥離することは抗原投与の手間がかかるばかりでなく剥離部位からの細菌感染などの恐れがあるなどの欠点を有していた。【０００３】
そのため、皮膚から角質層を剥離することなく無傷の皮膚へ貼付し、経皮的免疫が成立する経皮免疫製剤の研究が盛んに行われており、例えば、「１つ以上の抗原とアジュバント成分を含む経皮的免疫のための製剤であって、該成分の少なくとも１つは乾燥型であり、それにより無傷の皮膚への製剤の適用が、抗原に特異的な免疫応答を誘導する製剤及び経皮的免疫のための乾燥製剤の製造であって、（ａ）少なくとも１つの免疫活性成分を提供する工程（ここで製剤は、抗原活性を有する少なくとも１つの免疫活性成分を含有する）；（ｂ）免疫活性成分の少なくとも１つを溶解して、免疫活性液体を作成する工程；（ｃ）包帯等の固体基質上の免疫活性液体を乾燥する工程；そして（ｄ）免疫活性成分を一緒にして製剤を製造する工程を任意の順序で含み、ここで、少なくとも免疫すべき被験体の皮膚に製剤が適用されるまでは、免疫活性成分の少なくとも１つは乾燥型である、上記製造」（例えば、特許文献２参照）が提案されている。【０００４】
アジュバントは、免疫系の抗原提示細胞（例えば、表皮のランゲルハンス細胞、皮膚樹状細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球）を活性化する及び／又は抗原提示細胞を誘導して、抗原を貧食させると記載されている。しかしながら、アジュバンドはそれ自身起炎性物質であり、皮膚に炎症を起こすのみならず免疫系のバランスを崩す作用もあり、人体への投与が好ましいものではない。又、上記製剤では抗原は包帯、ガーゼ等のマトリックスに分散付着されていたり、液体に溶解されているので、皮膚に接触する抗原濃度は薄く免疫活性が低かった。
【特許文献１】特開平１０−３１６５８５号公報
【特許文献２】特表２００３−５２３９３７号公報
【発明の開示】
【０００５】
本発明の目的は、上記欠点に鑑み、アジュバントを含まなくても免疫活性の高い経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法を提供することにある。
本発明の経皮免疫製剤は、無傷の皮膚への製剤の適用によって免疫応答を調節する経皮免疫製剤であって、基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸が積層されていることを特徴とする。本発明において“調節する”とは正の調節、即ち、免疫系を賦活、促進する調節導と、負の調節、即ち、免疫系を抑制する調節の両方を意味するものである。
【０００６】
我々の観察結果を説明するために述べると、経皮免疫製剤は抗原を免疫系の細胞まで運搬し、アジュバンドの助けを必要とせずに免疫応答が調節されると考えられる。抗原は、皮膚の正常な防御的外層（例えば、角質層）を通過し、直接又はＴリンパ球に、処理した抗原を提示する抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、皮膚樹状細胞、Ｂリンパ球、またはクッパー細胞）を介して、免疫応答が調節する。場合により抗原は、毛嚢または皮膚の小器官（例えば、汗腺、脂腺）を介して角質層を通過してもよい。
【０００７】
上記抗原は、生物の免疫細胞に提示された時、特異的免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、単一の免疫原性エピトープ又はＢ細胞受容体（即ち、Ｂ細胞の膜上の抗体）若しくはＴ細胞受容体により認識される複数の免疫原性エピトープを含んでよい。
【０００８】
上記抗原としては、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される生物を感染することができる病原体由来の抗原、細胞（例えば、腫瘍細胞又は正常細胞）を感染することができる病原体由来の抗原が挙げられる。
【０００９】
上記細菌としては、例えば、炭疽菌、キャンピロバクター、コレラ、クロストリディウム（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））を含む）、ジフテリア、腸管出血性大腸菌、毒素原性大腸菌、ジアルジア（ｇｉａｒｄｉａ）、淋菌、ヘリコバクターピロリ又はヘリコバクターピロリが産生するウレアーゼ、インフルエンザ菌Ｂ、型別不能インフルエンザ菌、レジオネラ菌、髄膜炎菌、マイコバクテリウム（結核に関与する生物を含む）、百日咳菌、肺炎双球菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌及びその腸毒素、Ａ群ベータ溶血性連鎖球菌、連鎖球菌Ｂ、破傷風菌、コレラ菌（Ｖｉｂｒｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ボレリア・ブルグドルフィ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｉ）、エルシニア及びこれらの生成物等が挙げられる。
【００１０】
上記ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、デングウイルス血清型１〜４、エボラウイルス、腸内ウイルス、ハンタウイルス、肝炎血清型Ａ〜Ｅ、単純ヘルペスウイルス１又は２、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ノーウォークウイルス、ウマ日本脳炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、ワクシニアウイルス、成人Ｔ細胞性白血病ウイルス、他の抗原（例えば、マラリア抗原、水痘、黄熱等）をコードする遺伝子を含むウイルス発現ベクター及びこれらの生成物等が挙げられる。
【００１１】
上記真菌としては、躯幹白癬、爪白癬、スポロトリクム症、アスペルギルス症、カンジダ症を引き起こす起こす真菌、及び他の病原性真菌等があげられ、上記寄生体としては、例えば、赤痢アメーバ、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、蠕虫、住血吸虫及びこれらの生成物等が挙げられる。
【００１２】
抗原としては、腫瘍関連抗原又は自己抗原等が挙げられる。例えば、自己抗原としては、花粉、動物のふけ、カビ、ほこりのダニ、ノミ抗原、唾液アレルゲン、草、食物（例えば、ピーナツと他のナッツ類）、Ｂｅｔｖ１等のアレルゲンが挙げられる。
【００１３】
化学的には、抗原は、炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリペプチド又はこれらの化学的または組換え型結合体でもよい。抗原は、組換え手段、化学合成又は天然起源からの精製により得られる。タンパク質性抗原、または多糖との結合体が好適である。抗原は少なくとも部分的に精製された、無細胞型である。あるいは抗原は、生きたウイルス、弱毒化した生きたウイルス、または不活性化ウイルスの型で提供される。抗原は、適宜抗原をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）でもよい。
【００１４】
上記人工合成核酸は、人工的に合成された核酸であり、例えば、デコイ核酸、アンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等が挙げられる。
【００１５】
上記抗原及び人工合成核酸の分子量が１，０００ダルトン以下であると親水性高分子物質からなる基剤上に溶液状態で滴下した時内部に吸収されがちであり、抗原及び人工合成核酸が基剤の表面上に充分濃縮されないので抗原の分子量は、１，０００ダルトンより大きいことが好ましい。
【００１６】
上記基剤は、水及び／又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質が好ましい。上記抗原及び人工合成核酸は水及び／又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁されるので、その水溶液若しくは懸濁液を水及び／又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質からなる基剤に滴下すると親水性高分子物質が水及び／又は含水アルコールを吸収するので基剤表面に濃縮された抗原若しくは人工合成核酸層が積層される。
【００１７】
上記親水性高分子物質としては、例えば、ポリアクリル酸アルコキシアルキル系高分子物質、でんぷん- アクリル酸グラフト系高分子物質、ポリアクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルアルコール系高分子物質、酢酸ビニル- アクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルピロリドン系高分子物質、イソブチレン- マレイン酸系高分子物質、Ｎ−ビニルアセトアミド系高分子物質等が挙げられる。
【００１８】
親水性高分子物質は架橋していると、水及び／又は含水アルコールの吸収によって膨潤しても高分子物質の強度の低下は全くないか、あっても少ないので架橋されているのが好ましい。架橋方法は、従来公知の任意の方法が採用されればよく、例えば、公知の多官能性イソシアネート、アルミニウムアセチルアセトネートなどの金属錯体を架橋剤として親水性高分子物質に添加すればよい。
【００１９】
又、上記ポリビニルアルコール系高分子物質の一種であるポリビニールアルコールハイドロゲルが好適に使用できる。ポリビニールアルコールハイドロゲルシートの製造は従来公知の方法が採用されればよく、例えば、５〜５０重量％程度のポリビニールアルコール水溶液をポリエチレンテレフタレートフィルム等の基材フィルム上に流延してポリビニールアルコール水溶液層を形成し、−１０〜−２℃程度で１日程度凍結した後常温に戻すことにより、架橋したポリビニールアルコールハイドロゲルシートが得られる。
【００２０】
又、基剤は、アクリル酸メトキシエチル４０〜６０重量％、（メタ）アクリル酸ラウリル３０〜４０重量％及び極性モノマー１０〜２５重量％よりなる共重合体１００重量部と、乳酸オクチルドデシル２〜１５重量部、グリセリン２〜１０重量部及びヒアルロン酸０．０１〜０．１重量部からなる、親水性高分子物質である基剤が好ましい。
【００２１】
上記極性モノマーとしては、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、（メタ）アクリル酸、アクリル酸２−ヒドロキシエチル等が挙げられる。共重合体中のアクリル酸メトキシエチルの含有量は多くなると、重合中にゲル化を起こし不溶性になりやすく、得られた粘着剤の粘着性が低下する傾向がある。又、（メタ）アクリル酸ラウリルの含有量は少なくなると、得られた粘着剤の粘着性が低下する傾向がある。更に、極性モノマーの含有量は少なくなると、得られた粘着剤の凝集力が低下する傾向があり、多くなると、皮膚に貼付するのに適当な粘着性が得られなくなる傾向があるので、アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸ラウリル及び極性モノマーの比率は上記範囲が好ましい。
【００２２】
乳酸オクチルドデシル、グリセリン及びヒアルロン酸は上記親水性高分子物質の親水性をさらに向上し水の吸収性を高めるとともに皮膚への接着性を良好にして皮膚貼付性を上げる効果を有するものであり、少量では効果が小さく多量になると親水性高分子物質が柔らかくなりすぎて実用性が低下するので上記範囲が好ましい。
【００２３】
本発明の経皮免疫製剤は基剤表面に抗原若しくは人工合成核酸層が積層されており、基剤の厚さは特に限定されるものではいが、薄すぎると抗原若しくは人工合成核酸の水及び／又は含水アルコール水溶液若しくは懸濁液の水及び／又は含水アルコールを充分に吸収できなくなり、厚すぎると柔軟性が失われて皮膚への接触性が低下するので２０〜５，０００μｍが好ましく、より好ましくは５０〜２，０００μｍである。基材の形状は特に限定されるものではないが、パッチ状であるのが好ましい。又、基剤及び抗原若しくは人工合成核酸層の表面には、離型シートやポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ウレタンフィルム等の支持フィルムが積層されていてもよい。
【００２４】
上記基剤は、水及び／又は含水アルコールの吸収性を向上させるために親水性高分子物質と相溶する可塑剤を含有することが好ましい。該可塑剤は親水性の液体可塑剤が好ましく、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、乳酸ドデシルオクチル、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等が挙げられる。
【００２５】
又、上記基剤は抗原若しくは人工合成核酸の経皮吸収を促進させるために、化学吸収促進剤を含有するのが好ましい。上記化学的吸収促進剤は、従来公知の任意の化学的吸収促進剤が使用可能であり、例えば、メンソール、カンフル、セチルアルコール等のアルコール類；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；モノラウリン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン等のグリセリンエステル；ラウリン酸ジエタノールアミド等の酸アミド；ポリエチレングリコールジラウリルエーテル等の中性界面活性剤等が挙げられる。化学的経皮吸収促進剤の添加量は、少なすぎると経皮吸収効果が向上せず、多すぎると基剤の粘着性が低下するので、基剤１００重量部に対して３〜４０重量部が好ましい。
【００２６】
更に、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等の酵素を基剤中に含有させることにより、それらの酵素が皮膚角質層に作用し、抗原若しくは人工合成核酸の経皮透過を更に促進することができる。プロテアーゼとしては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、エンドプロテナーゼ、プロナーゼ等が挙げられる。リパーゼは動物すい臓から抽出精製して使用できるが、市販品を用いてもよい。
【００２７】
本発明の経皮免疫製剤はアジュバンドを含有する必要はないが、抗原若しくは人工合成核酸層又は基剤がアジュバンドを含有していてもよい。アジュバントとは、抗原若しくは人工合成核酸に対する免疫応答の誘導を助ける物質であり、ある物質が、免疫刺激及び特異的抗体応答又はＴ細胞応答を誘導することにより、アジュバント及び抗原の両方として作用することがある。
【００２８】
上記アジュバントとしては、例えば、完全又は不完全フロイントアジュバント、ケモカイン（例えば、デフェンシンズ（ｄｉｆｅｎｓｉｎｇ）１又は２、ＲＥＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８又はサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、−２、−６、−１０又は−１２；インターフェロンガンマ；腫瘍壊死因子−α又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子））、ムラミルジペプチド誘導体（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰ又はムラミルトリペプチド）、熱ショックタンパク質若しくはその誘導体、リーシュマニアメージャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）ＬｅＩＦの誘導体、コレラ毒素又はコレラ毒素Ｂ、細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素及びそのサブユニット、細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素若しくはそのサブユニットを使用する組み換え体、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導体（例えば、脂質Ａ、モノホスホリル脂質Ａ又は脂質Ａ類似体）、スーパー抗原、トリプシン切断部位の突然変異体を含むＡＤＰ−リボシル化に影響を与える突然変異細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素、ＱＳ２１、キル（Ｑｕｉｌｌ）Ａ、みょうばん等が挙げられる。
【００２９】
本発明の経皮免疫製剤の製造方法は、抗原若しくは人工合成核酸を水及び／又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させた水溶液若しくは懸濁液を、基剤表面に滴下し、水及び／又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより、抗原若しくは人工合成核酸が濃縮された抗原層を基剤表面に積層することを特徴とする上記経皮免疫製剤の製造方法である。
【００３０】
本発明においては、先ず、抗原若しくは人工合成核酸を水又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させて水溶液若しくは懸濁液を作成する。水又は含水アルコールとしては、水、水を含有するメタノール、エタノール等のアルコールがあげられ、これらの緩衝液が好適に用いられる。緩衝液としては、例えば、Ｃａ++／Ｍｇ++の無いリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、正常な食塩水（１５０ｍＭＮａＣｌ水溶液）、トリス緩衝液等が挙げられる。
【００３１】
抗原若しくは人工合成核酸は、一般に水又は含水アルコール及びその緩衝液に溶解するが、溶解しない抗原若しくは人工合成核酸は、１０ｍＭの酢酸で可溶化し、次に中性の水、含水アルコール、緩衝液で所望の容量に希釈すればよい。又、酸性ｐＨでのみ溶解する抗原若しくは人工合成核酸の場合は、希酢酸で可溶化した後、酸性ｐＨで酢酸−ＰＢＳを希釈剤として希釈すればよい。抗原若しくは人工合成核酸がそれ自体不溶性である疎水性抗原若しくは人工合成核酸（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、膜を横切るドメインを含有するポリペプチド等）は界面活性剤で懸濁化してもよい。
【００３２】
次に、得られた水溶液若しくは懸濁液を、前記基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させる。上記基剤は水及び／又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質からなるので、水溶液若しくは懸濁液中の水及び／又は含水アルコールは容易に基剤（親水性高分子物質）に吸収され、基剤（親水性高分子物質）表面に抗原若しくは人工合成核酸が取り残され濃縮した抗原層が形成される。
【００３３】
本発明の経皮免疫方法は、上記経皮免疫製剤を無傷の皮膚へ適用し、免疫応答を調節することを特徴とする。上記経皮免疫製剤の構成は上述の通りであり、皮膚から角質層を剥離することなく無傷の皮膚へ貼付することにより、抗原若しくは人工合成核酸は容易に皮膚を通過するか又は皮膚内に入る。
【００３４】
皮膚を通過するか又は皮膚内に入った抗原若しくは人工合成核酸は、免疫応答を直接調節するか、又は表皮中の抗原提示細胞集団（例えば、マクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、表皮の樹状細胞、Ｂ細胞、またはクッパー細胞）に捕捉され、リンパ球に提示される。場合により抗原若しくは人工合成核酸は、毛包又は皮膚小器官（例えば、汗腺、脂線）を介して角質層を通過する。
【００３５】
例えば、例として細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素（ｂＡＲＥ）を用いる経皮的免疫は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の中で最も効率的であることが知られている表皮性ランゲルハンス細胞を標的とする。ｂＡＲＥは、無傷の皮膚の表皮下に適用すると、ランゲルハンス細胞を活性化する。ランゲルハンス細胞は、抗原の食作用及びリンパ節への移動により特異的免疫応答を指令し、ここでＡＰＣとして作用して、抗原をリンパ球に提示し、強力な抗体応答を誘導する。
【００３６】
一方、人工合成核酸を用いる経皮的免疫においては、炎症因子の遺伝子が発現することを防ぎ過剰な免疫反応を抑える、即ち、負の調節を行うものである。人工合成核酸が角質を通過し表皮層に存在する免疫担当細胞の遺伝子発現を抑える。
【００３７】
ランゲルハンス細胞は、すべての哺乳動物の重層扁平上皮上に存在する骨髄由来の細胞である。これらは、非炎症性の表皮中に存在する付属細胞活性の全てを構成し、表皮に適用された抗原に対する免疫応答の開始と伝播に必須である。ランゲルハンス細胞は、表皮及び固体臓器並びにリンパ系組織中に広く分布しているがあまり現れていない強力付属細胞（「樹状細胞」）のファミリーのメンバーである。
【００３８】
ランゲルハンス細胞（及びおそらく他の樹状細胞）は、少なくとも２つの明確な段階を有する生活史を有すると認識されている。表皮に存在するランゲルハンス細胞は、抗原捕捉性の「歩哨」細胞の正規のネットワークを構成する。表皮ランゲルハンス細胞は、粒状物（微生物を含む）を取り込むことができ、複雑な抗原の効率的な処理物質である。しかしこれらは、低レベルのＭＨＣクラスＩとII抗原および同時刺激性分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６）を発現するのみであり、プライムされていないＴ細胞の弱い刺激物質である。
【００３９】
抗原と接触後、一部のランゲルハンス細胞は活性化され、表皮を出て、局所的リンパ節のＴ細胞依存性領域に移動し、ここで成熟樹状細胞として局在化する。表皮を出てリンパ節に移動する過程で、抗原担持表皮ランゲルハンス細胞は、形態、表面表現型および機能の劇的な変化を示す。表皮ランゲルハンス細胞に比較して、リンパ系樹状細胞は基本的に非食作用性であり、タンパク質抗原の処理が非効率的であるが、高レベルのＭＨＣクラスＩとクラスII抗原および種々の同時刺激性分子を発現し、同定されている天然のＴ細胞の最も強力な刺激物質である。
【００４０】
表皮ランゲルハンス細胞の強力な抗原提示能力は、経皮的に送達されるワクチンに利用することができる。皮膚免疫系を使用する経皮的免疫応答は、例えば、受動的拡散と、次にランゲルハンス細胞を活性化して抗原を取り込ませ、これらの抗原をＴ細胞に提示するためにリンパ節に運ばれ、次にその抗原（例えば、ＢＳＡ）に特異的な免疫応答を誘導する。
【００４１】
上記経皮免疫製剤の無傷の皮膚への適用する前に、抗原若しくは人工合成核酸の経皮透過を促進するために無傷の皮膚を酵素処理するのが好ましい。酵素としては、前述のプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等の酵素が挙げられる。酵素処理方法は、特に限定されるものではなく、例えば、酵素を適当なｐＨに調整した精製水等に溶解させた酵素水溶液を皮膚部位に適用する方法が挙げられる。その際、酵素水溶液をろ紙やその他多孔質単体にしみ込ませて適用すると実用上便利である。又、異なる酵素処理方法として、酵素を軟膏基剤に溶解させた酵素軟膏を皮膚に適用する方法、水性ゲル中に酵素を溶解させた酵素入り水性ゲルを皮膚に貼付する方法が挙げられる。
（発明の効果）
【００４２】
本発明の経皮免疫製剤の構成は上述の通りであるから、アジュバントを含まなくても免疫活性が高い。又、本発明の経皮免疫製剤の製造方法により、濃縮された抗原若しくは人工合成核酸層を有する経皮免疫製剤を容易に製造方法することができ、本発明の経皮免疫方法により皮膚が炎症を起こしたりすることなく免疫系のバランスを予防・治療に有利なように変更することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は実施例１、２及び比較例１、２で測定したＯＶＡ特異的抗体力価を示す棒グラフである。
【図２】図２は実施例７、８及び比較例４〜７で測定したルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
次に実施例を説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
基剤の調製
（１）基剤１
攪拌機付きの５００ｍｌ反応容器に、酢酸エチル２００ｇ、アクリル酸メトキシエチル４３ｇ、アクリル酸ラウリル３６ｇ、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン６ｇ、アクリル酸３ｇ、アクリル酸２−ヒドロキシエチル１０ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル０．００５ｇを仕込み、反応容器内を窒素置換した後、７５℃で１５時間重合を行った。【００４５】
得られた重合溶液（固形分換算）１００ｇ、グリセリン３ｇ、乳酸オクチルドデシル１０ｇ及びヒアルロン酸ナトリウム０．０２ｇを良く混合し得られた溶液をポリエチレンテレフタレートフィルム上に、乾燥後の厚さが２００μｍになるよう設定したナイフコーターを使用して塗膜をつくり、温度５０℃で２４時間溶媒を乾燥させて基剤シートを得た。得られたシートを直径１ｃｍの円形に打ち抜いてパッチ状の基剤１を得た。【００４６】
（２）基剤２
ポリビニルアルコールの４０％水溶液をポリエチレンテレフタレートフィルムに厚さ４００μｍに流延し、−６０℃で２４時間保存して凍結成型し、しかる後常温に戻すことによって架橋されたポリビニルアルコールハイドロゲルシートを得、得られたシートを直径１ｃｍの円形に打ち抜いてパッチ状の基剤２を得た。【００４７】
（３）基剤３
ポリアクリル酸ナトリウム１．５ｇ、グリセリン２．５ｇ及び水１２．０ｇを混合した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と０．１Ｎ塩酸を適宜滴下してｐＨを６．０付近に調整してポリアクリル酸ナトリウム水溶液を得た。得られたポリアクリル酸ナトリウム水溶液を不織布上に乾燥後の厚さが厚さ４００μｍになるように塗布乾燥した後、直径１ｃｍの円形に打ち抜いてパッチ状の基剤３を得た。【００４８】
（実施例１）
分子量４５，０００ダルトンの蛋白質であるニワトリ卵白アルブミン（シグマ社製、商品名「ＯｖａｌｂｕｍｉｎＧｒａｄｅＶ」、以下「ＯＶＡ」という。）をモデル抗原として抗体誘導の実験を行った。ＯＶＡ１０ｍｇをＣａ++／Ｍｇ++の無いリン酸緩衝化生理食塩水「以下、「ＰＢＳ」という。）１ｍｌに溶解した溶液１０μｌを基剤１に滴下し、基剤１にＰＢＳを吸収させ基剤１表面に１００μｇのＯＶＡ層が積層されたＯＶＡパッチを得た。【００４９】
得られたＯＶＡパッチをＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ；７週齢、メス、ＳＬＣ社から購入）の耳介皮膚の両面に貼付して第１回の免疫操作を行い、２４時間に貼付されていたＯＶＡパッチを剥離し、更に２週間後に新しいＯＶＡパッチを同様に貼付して第２回の免疫操作を行った。第２回免疫操作から２週間後、マウスの眼窩よりヘマトクリット毛細管を用いて血液を回収した。【００５０】
回収した血液の血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を酵素免疫測定法により測定し、結果を図１に示した。抗体力価は酵素免疫測定法における測定値（吸光度）が０．１未満まで減少する最高の希釈倍率をタイター値（Ｔｉｔｅｒ）として、Ｌｏｇ２  Ｔｉｔｅｒ値の逆数で示した。この値をＯＶＡ特異的抗体力価とする。【００５１】
酵素免疫測定法は以下の通りであった。
ＯＶＡを固相化バッファーに１００μｇ／ｍｌの濃度に溶解し、エライザプレート（Ｎｕｎｃ社製、商品名「９６  ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ」）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、4 ℃で１夜放置してＯＶＡを固相化した。固相化したプレートにブロックキング剤（大日本住友製薬社製、商品名「Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ」を２倍希釈した溶液）を２００μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。次に、回収したマウスの血液から血清を分離し、ブロッキング剤を用いて２倍系列で段階希釈した。これらの希釈血清をブロッキングしたプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し３７℃で２時間インキュベートした。【００５２】
次に、緩衝液でプレートを３ 回洗浄した後、ブロッキング剤で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」という。）標識羊抗マウスＩｇＧ（５０００倍希釈）を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、緩衝液でプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ基質溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。更に、１５分間インキュベートした後、２ＮのＨ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止させ、吸光波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＯＶＡ特異的抗体力価を評価した。【００５３】
（実施例２）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介皮膚の両面を、セロハンテープで８回ストリッピングして角質層を除去した後、実施例１で行ったと同様にして免疫操作を行い、第２回免疫操作後に血液を回収し、血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を測定して結果を図１に示した。【００５４】
（比較例１）
ＰＢＳ１μｌを基剤１に滴下し吸収させて得られたパッチを使用した以外は実施例２で行ったと同様にして免疫操作を行い、第２回免疫操作後に血液を回収し、血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を測定して結果を図１に示した。【００５５】
（比較例２）
１０ｍｇのＯＶＡを１ｍｌのＰＢＳに溶解した溶液１０μｌをＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介皮膚に皮下注射して第１回の免疫操作を行い、２週間後に再度皮下注射して第２回の免疫操作を行った。第２回免疫操作から２週間後、マウスの眼窩よりヘマトクリット毛細管を用いて血液を回収した。回収した血液の血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を実施例１で行ったと同様にして測定して結果を図１に示した。【００５６】
（実施例３）
１０ｍｇのＯＶＡを１ｍｌのＰＢＳに溶解した溶液１０μｌを基剤２に滴下し、基剤２にＰＢＳを吸収させ基剤２表面に１００μｇのＯＶＡ層が積層されたＯＶＡパッチを得た。得られたＯＶＡパッチを用い、実施例１で行ったと同様にして免疫操作を行い、第２回免疫操作後に血液を回収し、血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を測定９．５であった。【００５７】
（実施例４）
１０ｍｇのＯＶＡを１ｍｌのＰＢＳに溶解した溶液１０μｌを基剤３に滴下し、基剤３にＰＢＳを吸収させ基剤３表面に１００μｇのＯＶＡ層が積層されたＯＶＡパッチを得た。得られたＯＶＡパッチを用い、実施例１で行ったと同様にして免疫操作を行い、第２回免疫操作後に血液を回収し、血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を測定１０．５であった。【００５８】
（実施例５）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介皮膚の両面に、トリプシン（ナカライテスク社より入手）の０．１重量％水溶液に浸したガーゼを密着させて３６℃で０．５時間保持して角質処置した。次に、皮膚を精製水により洗浄し、ガーゼで水をぬぐった後、実施例１で得られたＯＶＡパッチを用い、実施例１で行ったと同様にして免疫操作を行い、第２回免疫操作後に血液を回収し、血清中のＯＶＡ特異的抗体力価を測定１２．０であった。【００５９】
（実施例６）
組み替えＨＢｓタンパク（シグマ社より入手）４０μｇを１０μｌのＰＢＳに溶解した溶液を基剤２に滴下し、基剤２にＰＢＳを吸収させ基剤２表面に４０μｇの組み替えＨＢｓタンパク層が積層された組み替えＨＢｓタンパクパッチを得た。ＨＢｓに特異的な抗体に対して陰性である日本白色種雄性ウサギ（体重２〜２．５ｋｇ）３羽の背中を除毛した後、得られたパッチを貼付し、その上をドレッシングテープで覆い免疫感作操作を実施した。２４時間後にパッチを除去した。免疫感作操作後３週間して、ウサギの静脈血液試料を採取し、ＨＢｓ抗原に特異的な抗体力価を測定したところ、三羽とも陽性であった。尚、抗体力価の測定はバイオクリット−抗ＨＢｓ（三光純薬製）を用いた。【００６０】
（比較例３）
組み替えＨＢｓタンパク４０μｇを１０μｌのＰＢＳに溶解した溶液を、ガーゼを直径１ｃｍの円形に打ち抜いた基剤に滴下し、基剤にＰＢＳを吸収させ基剤表面に４０μｇの組み替えＨＢｓタンパクを含有する組み替えＨＢｓタンパクパッチを得た。得られたパッチを用いて実施例６で行ったと同様にして、ＨＢｓ抗原に特異的な抗体力価を測定したところ、三羽とも陰性であった。【００６１】
（実施例７）
アデノウイルスベクターを微粉砕し、１０ｍｇ蛋白質／ｍｌのアデノウイルスベクター粉砕水溶液を得た。得られた溶液１０μｌを基剤１に滴下し、基剤１にＰＢＳを吸収させ基剤１表面に１００μｇのアデノウイルスベクター由来蛋白質層が積層されたアデノウイルスパッチを得た。【００６２】
得られたアデノウイルスパッチを用いて実施例１で行ったと同様にして２回の免疫操作を行った。第２回免疫操作から２週間後にルシフェラーゼ遺伝子を発現するアデノウイルスベクター（以下「Ａｄ−Ｌｕｃ」という。）をマウスに尾静脈内注射し、その４８時間後に肝臓を摘出した。肝臓ホモジネート液を調製し、ルシフェラーゼアッセイ試薬を加えてマイクロプレートリーダー（テカン社製、商品名「スペクトラフルオロプラス」）により肝臓におけるルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図２に示した。【００６３】
（比較例４）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介皮膚の両面を、セロハンテープで８回ストリッピングして角質層を除去した後、基剤１にＰＢＳを滴下し吸収させて得られたパッチを使用した以外、実施例７で行ったと同様にして免疫操作、Ａｄ−Ｌｕｃをマウスに尾静脈内注射し、ルシフェラーゼ  アッセイによりルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図２に示した。【００６４】
（実施例８）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介皮膚の両面を、セロハンテープで８回ストリッピングして角質層を除去した後、実施例７で行ったと同様にして免疫操作、Ａｄ−Ｌｕｃをマウスに尾静脈内注射し、ルシフェラーゼ  アッセイによりルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図２に示した。【００６５】
（比較例５）
１０ｍｇ蛋白質／ｍｌのアデノウイルス粉砕溶液１０μｌをＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介皮膚に皮下注射して第１回の免疫操作を行い、２週間後に再度皮下注射して第２回の免疫操作を行った。第２回免疫操作から２週間後、実施例７で行ったと同様にしてＡｄ−Ｌｕｃのマウスに尾静脈内注射及びルシフェラーゼ  アッセイによりルシフェラーゼ活性を測定し、結果を図２に示した。【００６６】
（比較例６）
Ａｄ−ＬｕｃをＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈内注射し、その４８時間後の肝臓におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ  アッセイにより測定し、結果を図２に示した。【００６７】
（比較例７）
ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ  アッセイにより測定し、結果を図２に示した。本比較例は全くのバックグラウンド値の測定である。【００６８】
（実施例９）
フロロレッセンチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」という。）標識ＮＦ−κＢデコイ核酸（北海道システム・サイエンスより購入）水溶液を基剤１に５０μｇ滴下して表面にＦＩＴＣ標識ＮＦ−κＢデコイ核酸層が積層されたデコイ核酸パッチを得た。得られたデコイ核酸パッチをヘアレスマウスの背部皮膚に貼付し、２４時間後にデコイ核酸パッチを剥がし、へアレスラット皮膚を摘出し皮膚切片を作成して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、ＦＩＴＣの緑色蛍光が皮膚表面から５０ミクロンの厚さまで浸透していることが明瞭に観察された。本試験はＮＦ−κＢデコイ核酸が十分な皮膚深さまで浸透しアトピー性皮膚炎に対する有効性を証するものである。【００６９】
（比較例８）
ＦＩＴＣ標識ＮＦ−κＢデコイ核酸の５ｍｇ/ｍｌ水溶液１０μｌ（５０μｇのＦＩＴＣ標識ＮＦ−κＢデコイ核酸相当）をヘアレスマウスの背部皮膚に塗布し、２４時間後へアレスラット皮膚を摘出し皮膚切片を作成して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、ＦＩＴＣの緑色蛍光は皮膚表面にとどまり皮膚深部にはまったく拡散していないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の製剤は非侵襲的製剤として、免疫製剤、アトピー治療製剤、等に有効に利用できるものである。
【図１】
2008105504.tif 000003
【図２】
2008105504.tif 000004
【国際調査報告】
2008105504.tif 000005
2008105504.tif 000006
2008105504.tif 000007
2008105504.tif 000008
2008105504.tif 000009
2008105504.tif 000010
2008105504.tif 000011
2008105504.tif 000012