(57)【要約】【課題】  食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体等として有用であり、有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要な光学活性アミノ酸を、簡便かつ経済的に製造できる工業的に実施可能な方法を提供する。【解決手段】  Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物からなるアミノニトリルに、両アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する新たに分離したロドコッカス属に属する微生物由来の生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドの何れか一方を対応のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒を作用させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示されるＤ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物からなるアミノニトリルに、両アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドの何れか一方を対応のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒を作用させることを特徴とする、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸からなる光学活性アミノ酸の製造方法。
【化１】
2008105493.tif 000005
（但し、式（１）中のＲは、炭素数が１〜４の直鎖若しくは分枝した低級アルキル基、フェニル基、またはフェニルメチル基で、置換基として水酸基またはメチルメルカプト基を有していてもよい。）
【請求項２】
Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒が、ロドコッカス属に属する微生物由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項３】
Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒が、ロドコッカス オパカス由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項４】
Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒が、アクロモバクター属に属する微生物由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒が、アクロモバクター オバエ由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項６】
Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＤ−アミノ酸アミドを、対応のＤ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、オクロバクトラム属に属する微生物由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＤ−アミノ酸アミドを、対応のＤ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、オクロバクトラム アンスロピ由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項８】
Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＬ−アミノ酸アミドを、対応のＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、ブレバンディモナス属またはキサントバクター属に属する微生物由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項９】
Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＬ−アミノ酸アミドを、対応のＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、ブレバンディモナス ディミニュータまたはキサントバクター フラバス由来のものである、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
生体触媒として、ロドコッカス オパカスおよびアクロモバクター オバエ由来のものと、オクトバクトラム アンスロピまたはブレバンディモス ディミニュータ由来のものを組み合わせて用いる、請求項１に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性アミノ酸、すなわちＤ体またはＬ体からなるアミノ酸の製造方法に関する。詳しくは、微生物に由来する生体触媒を利用して式（１）に示すアミノニトリルから光学活性アミノ酸を製造する方法に関する。さらに詳しくは、式（１）で示されるＤ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物からなるアミノニトリルを原料として用い、これに両アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドの何れか一方を対応のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒を作用させることにより、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸を得ることを特徴とする、式（１）で示されるアミノニトリルからのＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸からなる光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
光学活性アミノ酸は、食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品の合成中間体等として有用であり、有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要な物質である。
【化１】
2008105493.tif 000002
（但し、式（１）中のＲは、炭素数が１〜４の直鎖若しくは分枝した低級アルキル基、フェニル基、またはフェニルメチル基で、置換基として水酸基またはメチルメルカプト基を有していてもよい。）
【背景技術】
【０００２】
光学活性アミノ酸の製造方法として、従来から、醗酵法、合成法、酵素法等、多くの方法が知られている。
ラセミ体のアミノニトリルは、ストレッカー法によるアミノ酸合成の中間体として比較的容易に合成することができることから、ラセミ体のアミノニトリルから微生物に由来する生体触媒を利用して光学活性アミノ酸を製造する方法も報告されており、次のような方法が知られている。【０００３】
ラセミ体のアミノニトリルに鏡像異性体選択的なアミノニトリルヒドラターゼを作用させて光学活性なアミノ酸およびアミノ酸アミドを調製する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この報告は、ラセミ体のアミノニトリルからＬ−アミノ酸アミドを得ることを開示しているが、その鏡像異性体選択性は低く、得られるＬ−アミノ酸アミドの鏡像異性体過剰率は４０％e.e.にすぎない。また、最終目的物のＬ−アミノ酸を得るためには、酵素的加水分解と化学的加水分解を5回も繰り返すような極めて煩雑な手段で原料のＬ−アミノ酸アミドの加水分解を進めて行く必要があり、得られるＬ−アミノ酸の鏡像異性体過剰率は３５％e.e.と更に低い値となっている。【０００４】
ラセミ体のアミノニトリルに微生物に由来する生体触媒を作用させてＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸アミドまたはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸アミドを調製する方法が開示されている（例えば、特許文献２、３参照）。しかしながら、これらの方法では、アミノ酸とアミノ酸アミドが1対１の割合で生成するため、それぞれの収率は何れも５０％を超えることはなく、また目的とするＬ体またはＤ体の光学活性アミノ酸を取得するには、何らかの方法で両者を分割し、その一方を目的とする光学活性アミノ酸に変換する必要がある。【０００５】
ラセミ体のアミノニトリルに微生物に由来する生体触媒を作用させて、Ｌ−アミノ酸を直接得る方法が開示されている（例えば、特許文献４〜７参照）。しかしながら、反応に関与する酵素の活性が著しく低いためか、または酵素の発現量が著しく低いためか、詳細に関しては不明であるが、原料のラセミ体のアミノニトリルより得られるＬ−アミノ酸の収率は実施例によると最高でも３５％程度と極めて生産性が低い。【０００６】
ラセミ体のアミノニトリルにアシネトバクター属に属する微生物由来の生体触媒を作用させてラセミ体のアミノ酸アミドに変換し、さらにアミノ酸アミドラセマーゼとＬ−アミノ酸アミドアミダーゼ活性を有する微生物（アースロバクター属またはコリネバクテリウム属に属する微生物）を作用させてＬ−アミノ酸を得る方法が開示されている（例えば、特許文献８参照）。この方法は各酵素反応が良好に進行すれば、ラセミ体のアミノニトリルからＬ−アミノ酸が理論的には１００％の収率で得られるはずであるが、得られるＬ−アミノ酸の収率は実施例によると最高でも６５％と低く、工業的に採用する方法としては生産性の点で満足できるものではない。【０００７】
ニトリルヒドラターゼのクローン化遺伝子およびアミダーゼ、Ｄ−アミダーゼのクローン化遺伝子、およびアミノ酸アミドラセマーゼのクローン化遺伝子を含む微生物の全細胞を触媒として使用する方法が開示されている（例えば、特許文献９参照）。しかしながら、該全細胞触媒の具体的調製方法や、該全細胞触媒を使用したラセミ体のアミノニトリルからの光学活性アミノ酸の製造に関する具体的方法や実施例に関する記載は、一切ない。【０００８】
α−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼとＤ体選択的加水分解酵素またはＬ体選択的加水分解酵素による、ラセミ体のアミノ酸アミドからのＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の取得に関する記載がある（例えば、非特許文献１参照）。ラセミ体のアミノニトリルを化学的にラセミ体のアミノ酸アミドにした後、上記非特許文献記載の方法に使用することも可能ではあるが、実際に工業的に実施する場合、化学的アミド化反応液を精製せずにそのまま使用すると酵素反応が著しく阻害されたり、得られるアミノ酸の純度が低下したり、また純度を向上させるために精製工程が必要となるため精製によるロスが生じ、結果的に通算単離収率が低下したりする問題点がある。一方、化学的アミド化反応液からラセミ体のアミノ酸アミドを単離精製した後、上記非特許文献記載の方法に使用する場合、酵素反応阻害は低減されるが、ここでの精製によるロスが生じ、結果的に通算単離収率が低下する。また遊離のアミノ酸アミドを含む水溶液や遊離のアミノ酸アミドは、長期間保管する場合、徐々に加水分解を受けてアミノ酸に変換されるため、酵素反応によって得られるアミノ酸の光学純度が低下するといった品質的問題も生じる。このようにラセミ体のアミノニトリルを化学的にアミノ酸アミドに変換する方法を用いた場合は、反応をワンポットで行えず、加水分解反応後の晶析分離、溶剤回収等の煩雑な操作、装置、時間を要し、またアルカリ触媒や金属触媒の使用やアルコールやアセトン類等の有機溶媒の使用等、環境への負荷も大きくなるなど、工業的実施にあたって解決しなければならない多くの課題を抱えている。【０００９】
【非特許文献１】Yasuhisa Asano, J. Mol. Catal. B: Enzymatic 36, 22-29, 2005.
【特許文献１】特表昭６３−５００００４号公報
【特許文献２】特公平３−１６１１８号公報
【特許文献３】特開平２−３１６９４号公報
【特許文献４】特公平７−２０４３２号公報
【特許文献５】特公平７−２４５９０号公報
【特許文献６】特許第２６７０８３８号公報
【特許文献７】特許第２８６４２７７号公報、
【特許文献８】特表平３−５００４８４号公報
【特許文献９】特開２００３−２２５０９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体等として有用であり、有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要な光学活性アミノ酸を、簡便かつ経済的に製造できる工業的に実施可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、光学活性アミノ酸を簡便な方法で収率よく製造できる方法を確立すべく鋭意検討を行った結果、式（１）で示されるＤ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物を原料として用い、これに両アミノニトリルをＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒を作用させることにより、光学活性体であるＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸を効率的に生産することが可能となることを見出した。【００１２】
すなわち、Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒、特にＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒およびＤ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒と同一の酵素反応系・酵素反応条件においても高活性を示す生体触媒を取得すべく、自然界から広く探索した。その結果、ロドコッカス属に属する微生物、具体的には、ロドコッカス オパカス  ７１Ｄ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２３３または国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５２）が、活性ならびに基質特異性等の点で、極めて好適な生体触媒であることを見出した。なお、この微生物は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００７年２月２７日付けで寄託されている。この微生物はＤ体またはＬ体の両アミノニトリルを対応するアミノ酸アミドに変換する活性が高く、かつ、それ以外の副反応、例えば生成したアミノ酸アミドをさらに加水分解してＤ体またはＬ体のアミノ酸にしてしまうような活性が実質的に認められない。このように、本菌は、例えばラセミ体のアミノニトリルを高い選択率かつ高い収率でラセミ体のアミノ酸アミドに変換する能力を有する。また、この微生物は、併用するＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する生体触媒およびＤ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用して対応するアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒と同一の酵素反応条件においても高い活性を有する特徴を示すことから、本発明の方法に極めて好適に使用することが可能であることを見出し、本発明に到達するに至った。【００１３】
即ち、本発明は新たに分離したロドコッカス属に属する微生物（ロドコッカス オパカス  ７１Ｄ）由来のものを含めた生体触媒を複合的に用いた、以下の（１）から（１０）に示すアミノニトリルからの光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
（１）式（１）で示されるＤ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物からなるアミノニトリルに、両アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドの何れか一方を対応のＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒を作用させることを特徴とする、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸からなる光学活性アミノ酸の製造方法。    
【化２】
2008105493.tif 000003
（但し、式（１）中のＲは、炭素数が１〜４の直鎖若しくは分枝した低級アルキル基、フェニル基、またはフェニルメチル基で、置換基として水酸基またはメチルメルカプト基を有していてもよい。）
（２）Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒が、ロドコッカス属に属する微生物由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（３）Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの各々をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒が、ロドコッカス オパカス由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（４）Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒が、アクロモバクター属に属する微生物由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（５）Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドを互いにラセミ化する活性を有する生体触媒が、アクロモバクター オバエ由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（６）Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＤ−アミノ酸アミドを、対応のＤ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、オクロバクトラム属に属する微生物由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（７）Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＤ−アミノ酸アミドを、対応のＤ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、オクロバクトラム アンスロピ由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（８）Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＬ−アミノ酸アミドを、対応のＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、ブレバンディモナス属またはキサントバクター属に属する微生物由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（９）Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドのうちのＬ−アミノ酸アミドを、対応のＬ−アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が、ブレバンディモナス ディミニュータまたはキサントバクター フラバス由来のものである、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（１０）生体触媒として、ロドコッカス オパカスおよびアクロモバクター オバエ由来のものと、オクトバクトラム アンスロピまたはブレバンディモス ディミニュータ由来のものを組み合わせて用いる、（１）に記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体等として有用であり、有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要な光学活性アミノ酸を、ワンポットで容易に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳しく説明する。
本発明の原料は、式（１）に示されるＤ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物であればよく、その製法に制限はないが、通常はアルデヒドを出発原料としたシュトレッカー反応によるアミノ酸合成の中間体として取得することができる。
具体的には、アルデヒドとシアン化水素およびアンモニアから、あるいは、アルデヒドとシアン化水素からシアンヒドリンを合成した後アンモニアと反応させるといった方法により合成できるが、アミノニトリルは極めて不安定であり、室温以下に保存していても次第に赤褐色に着色し、ついには黒変してタール状物を生成するという取扱い上の問題点を有する。また、反応液に微量混入するシアン化水素をはじめとする不純物により、酵素反応が阻害されるという問題点を有する。アミノニトリルを晶析や再結晶といった方法によって遊離体として精製することも可能ではあるが、一般にアミノニトリルの結晶性は低く、反応液からの単離回収率が低い。
すなわち、反応後のアミノニトリルに酸を加えて塩として単離することにより、これらの問題点を回避することができ、本発明をより実施し易くすることができる。添加する酸としては、塩酸、硫酸等の鉱酸および酢酸等の有機酸が挙げられるが、塩の結晶性や取り扱いやすさ、さらには価格等を総合的に考慮すると塩酸、硫酸が特に好適に用いられる。【００１６】
式（１）で示されるアミノニトリルの構造式中のＲは、本発明で組み合わせて用いられる３種類の生体触媒、すなわち３種類の生体触媒が何れも高い活性を示す基質の構造によって決まる。同一反応条件における３種類の生体触媒の基質特異性を詳細に検討した結果、Ｒとしてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−メチルメルカプトエチル基、フェニル基、フェニルメチル基などが挙げられ、特に好ましくは、メチル基、エチル基などが挙げられることを見出した。
本発明には、Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドの何れか一方を対応のアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒が用いられる。
ここで、活性を有する生体触媒とは、微生物の生菌体あるいは該生菌体の処理物であり、該生菌体の処理物としては、アセトンパウダー、粗精製酵素および精製酵素、生菌体や精製酵素を固定化した固定化酵素等が挙げられる。
微生物に由来する生体触媒とは、該微生物の生菌体あるいは該生菌体の処理物である他、該微生物の酵素をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換株の生菌体あるいは該生菌体の処理物をいう。【００１７】
Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒、特にＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒およびＤ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒と同一の酵素反応条件においても高活性を示す生体触媒を取得すべく、自然界から広く探索した。その結果、ロドコッカス属に属する微生物、具体的には、ロドコッカス オパカス（Rhodococcus opacus）  ７１Ｄ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２３３または国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５２）が、活性ならびに基質特異性等の点で、極めて好適であることを見出した。この微生物は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566））に２００７年２月２７日付けで寄託され、２００８年２月１８日付けで同センターの国際寄託へ移管されている。この微生物はアミノ酸アミドに変換する際の立体選択性が低く、かつ、それ以外の副反応に関与する酵素活性が低く、ラセミ体のアミノニトリルを高い収率でラセミ体のアミノ酸アミドに変換するという優れた特性を有する。また、この微生物は、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する生体触媒、およびＤ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用して対応の光学活性アミノ酸に変換する生体触媒と同一の酵素反応系においても高い活性を示すことから、本発明の方法に極めて好適に使用することが可能である。【００１８】
上記のように、この微生物は、例えばラセミ体のアミノニトリルをラセミ体のアミノ酸アミドに変換する生体触媒活性が高く、それ以外の活性、例えばアミノ酸アミドをアミノ酸に変換する活性が極めて低いため、生じたアミノ酸アミドがこの微生物の酵素によってさらに加水分解されることは実質的に認められない。従って、この微生物の菌体または粗精製若しくは精製酵素と、それ以外のＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒、およびＤ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用して対応の光学活性アミノ酸に変換する活性を有する生体触媒と組み合わせて使用することにより、ラセミ体のアミノニトリルから反応収率としてほぼ定量的に、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸の何れかを任意に製造することが可能となった。具体的には、この微生物と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒、およびＤ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒と組み合わせて使用することにより、ラセミ体のアミノニトリルからＤ−アミノ酸のみを製造することができ、また、この微生物と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒およびＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒と組み合わせて使用することにより、ラセミ体のアミノニトリルからＬ−アミノ酸のみを製造することができる。【００１９】
ラセミ体のアミノニトリルをラセミ体のアミノ酸アミドに変換する生体触媒の活性が高く、それ以外の活性、例えばアミノ酸アミドをアミノ酸に変換する活性が極めて低いというこの微生物に特徴的な性質により、Ｄ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性が高い生体触媒と組み合わせることにより、光学純度の高い光学活性アミノ酸を得ることができる。
また特に、基質特異性に関しては、置換基が脂肪族で炭素数の少ない基質、具体的にはα−アミノブチロニトリルから、置換基に芳香環を有する基質、具体的にはフェニルグリシノニトリルに至るまで、幅広い基質に対して高い活性を示すことから、他の生体触媒と組み合わせて使用する際には好適な性質であるといえる。【００２０】
この微生物の菌学的性状を示す。グラム染色性：＋、形状：桿菌、抗酸性：−、運動性：−、胞子の有無：−、好気性：＋、嫌気性：−、カタラーゼ：＋、オキシダーゼ：−、グルコース：−、OFテスト：−／−、硝酸塩の還元：−、脱窒反応：−、MR反応：−、VP反応：−、インドール産生：−、Ｈ２Ｓ産生：−、デンプン加水分解：＋、クエン酸利用：＋、硫酸アンモニウム利用：−、色素生成：−、ウレアーゼ：＋、ジヒドロキシアセトン産生：−、セルロース加水分解：−、マロン酸利用：−、５％NaCl：−、DNase：−、Tween加水分解：−、ビタミン要求性：−、ゼラチン液化：−、ｎ−ヘキサデカン利用：＋、リトマスミルク：−、生育温度：30℃、生育pH：６−９。
上記のように、この微生物は、グラム染色陽性の非運動性桿菌であり、胞子を形成せず、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陽性等であることからロドコッカス属に属する微生物と判断された。さらに１６SrDNA（１６SrRNA遺伝子）の部分塩基配列による帰属分類群を推定した結果、高い相同率でロドコッカス オパカスと一致したことから、ロドコッカス オパカスと同定し、７１Ｄ株と命名した。【００２１】
この微生物に由来するラセミ体のアミノニトリルをラセミ体のアミノ酸アミドに変換する活性に関与する酵素を、硫安分画、ブチルトヨパール、DEAEトヨパール、ギガパイト、モノQ、ヒドロキシアパタイト等の公知の各種精製手法を組み合わせて精製し、酵素の性質を調べた結果を表１に示す。なお、実験操作方法は、実施例に記載する。【００２２】
＜酵素精製結果＞
【表１】
2008105493.tif 000004
＜酵素の性質＞
分子量：119,000、サブユニット：（α）27,200、（β）32,300、サブユニット構造：α２β２、活性を示すｐH：4−11、至適ｐH：8、活性を示す温度：〜70℃、至適温度：20℃。
2−アミノブチロニトリルに対する活性を100としたときの各基質に対する相対活性を次に示す。アラニノニトリル77、バリノニトリル15.1、ロイシノニトリル11.8、ｔ-ロイシノニトリル1.80、フェニルグリシノニトリル177、フェニルアラニノニトリル42.9である。【００２３】
Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する微生物としては、例えば、非特許文献１記載のアクロモバクター オバエが挙げられ、該微生物由来のＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する酵素、および該酵素をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換株、たとえばエッシェリヒア コリ等を使用することができる。該酵素の性質は、分子量：51,000（ゲルろ過）、45,568（遺伝子シーケンス）、サブユニット：モノマー、活性を示すｐH：5−10、至適ｐH：8.8、活性を示す温度：〜55℃。L−２−アミノ酪酸アミドに対する活性を100としたときの各基質に対する相対活性を次に示す。Ｌ−アラニンアミド78、Ｌ−スレオニンアミド63、Ｌ−ノルバリンアミド63、Ｌ−ノルロイシンアミド56、Ｌ−ロイシンアミド48、Ｌ−メチオニンアミド35、Ｌ−セリンアミド17、Ｌ−フェニルアラニンアミド2である。【００２４】
Ｄ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する微生物としては、例えば非特許文献２（J. Biological Chemistry 264(24), 14233-14239, 1989）記載のオクロバクトラム アンスロピが挙げられ、該微生物由来のＤ−アミノ酸アミドを選択的にＤ−アミノ酸に変換する活性を有する酵素、および該酵素をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換株、例えばエッシェリヒア コリ等を使用することができる（非特許文献３Biochemistry,  31,  2316-2328,  1992）。該酵素の性質は、分子量：122000、サブユニット：59000、サブユニット数2、活性を示すｐH：5‐10  、至適ｐH：8.5、活性を示す温度：〜55℃、至適温度：45℃。D−２−アミノ酪酸アミドに対する活性を100としたときの各基質に対する相対活性を次に示す。Ｄ−アラニンアミド333、Ｄ−セリンアミド97、Ｄ−スレオニンアミド30、Ｄ−メチオニンアミド6.7、Ｄ−ノルバリンアミド6、Ｄ−ノルロイシンアミド2.7、Ｄ−フェニルグリシンアミド2.3である。【００２５】
Ｌ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する微生物としては、例えば非特許文献４（Appl. Microbiol. Biotechnol. 70, 412-421, 2006）記載のブレバンディモナス ディミニュータ、非特許文献５（Adv. Synth. Catal. 347, 1132-1138, 2005）記載のキサントバクター フウラバス等が挙げられ、該微生物由来のＬ−アミノ酸アミドを選択的にＬ−アミノ酸に変換する活性を有する酵素、および該酵素をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換株、たとえばエッシェリヒア コリ等を使用することができる。該酵素の性質は、ブレバンディモナス ディミニュータの場合、分子量：288000、サブユニット：53000、サブユニット数：6、活性を示すｐH：5‐10、至適ｐH：7.5、活性を示す温度：〜80℃、至適温度：50℃。L−２−アミノ酪酸アミドに対する活性を100としたときの各基質に対する相対活性を次に示す。Ｌ−アラニンアミド3.4、Ｌ−バリンアミド17.7、Ｌ−ロイシンアミド92.7、Ｌ−ｔ−ロイシンアミド0.2、Ｌ−イソロイシンアミド30.2、Ｌ−セリンアミド2.9、Ｌ−スレオニンアミド14.6、Ｌ−メチオニンアミド85.4、Ｌ−フェニルアラニンアミド104である。
キサントバクター フラバスの場合、分子量：38555、サブユニット数：１、活性を示すpH：4−10、至適ｐH：7.0、活性を示す温度：〜80℃、至適温度：55℃。L−２−アミノ酪酸アミドに対する活性を100としたときの各基質に対する相対活性を次に示す。Ｌ−バリンアミド65、Ｌ−ｔ−ロイシンアミド8.4、Ｌ−フェニルグリシンアミド113、Ｌ−フェニルアラニンアミド111である。【００２６】
これらのＤ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒、Ｄ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒は、いずれも微生物の生菌体、または該生菌体処理物を用いることができる。生菌体処理物としては、粗精製酵素、精製酵素、アセトンパウダー等が挙げられ、特にアセトンパウダーとすることで、生菌体を腐敗させることなく、また少ないスペースで、活性を保ったまま長期間保存することができ、工業的な利用を考慮すると好適な使用形態といえる。アセトンパウダー化は、例えば非特許文献６（J.Org.Chem.,55. 5567-5571, 1990）記載のそれ自体公知の方法で実施することができる。
また生菌体や精製酵素を、包括固定化法や吸着固定化法等、それ自体公知の方法で固定化して使用することもできる。【００２７】
本発明は、Ｄ−アミノニトリルとＬ−アミノニトリルの混合物をＤ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドに変換する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドをラセミ化する活性を有する生体触媒と、Ｄ−アミノ酸アミドまたはＬ−アミノ酸アミドに選択的に作用してアミノ酸に変換する活性を有する生体触媒を組み合わせて使用することに特徴があり、それぞれの生体触媒の性質、特に活性を有するｐHや温度を考慮して、反応条件を決めることが重要である。酵素反応のｐHは、４以下あるいは１０以上のような酵素活性を著しく阻害するような場合を除き、例えばｐH５−９の範囲で反応を行うことができ、特にｐH6−8.8の範囲が好適である。反応温度は、酵素活性を著しく失活させる80℃以上の温度や、また反応速度低下が著しい0℃以下の温度を除き、例えば5℃〜60℃の範囲で行うことができ、20℃〜45℃の範囲が特に好適である。原料となるアミノニトリルの濃度は、薄いと釜効率が低くなり、工業的実施を考慮すると不利であり、濃いと基質阻害や生成物阻害が生じるため、実際は、0.1％〜10％、好ましくは0.1％〜１％の範囲で使用される。【００２８】
それぞれの微生物に由来する生体触媒の使用量は、生体触媒の有する重量あたりの活性により異なり、一概に規定することは困難であるが、所定の反応時間で各素反応がいずれも終了するに十分な量を使用することで、目的を達成することができる。工業的実施に際しては、小規模の予備試験により、予め微生物に由来する生体触媒の有する重量あたりの活性を明らかにしておき、所定の反応時間で各素反応がいずれも終了するに十分な量を決定することができる。具体的な使用量に関しては、実施例で例示する。【００２９】
反応終了後の反応液からの光学活性アミノ酸を分離精製する方法は、はじめに遠心分離やろ過等により菌体や菌体由来の成分の大部分を除去した後、濃縮晶析、溶媒置換、イオン交換樹脂を用いる方法等々、それ自体公知の方法を適用することができるが、本発明の方法によると、原料であるアミノニトリルがほぼ定量的に目的の光学活性アミノ酸に変換されることから、原料であるアミノニトリルや中間体であるアミノ酸アミドと目的物の光学活性アミノ酸を分離する必要がほとんどなく、目的の光学活性アミノ酸の分離精製は極めて容易であり、この点も工業的実施に当たっての優位点といえる。
本発明の方法により、具体的にはラセミ体の２−アミノプロピオニトリル、２−アミノブチロニトリル、２−アミノ−３−メチルブチロニトリル、２−アミノ−４−メチルペンタニトリル、２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオニトリル、２−アミノ−３−ヒドロキシブチロニトリル、２−アミノ−４−メチルメルカプトブチロニトリル、２−アミノ−２−フェニルアセトニトリル、２−アミノ−３−フェニルプロピオニトリルなどから、それぞれ、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アミノ酪酸、Ｌ−アミノ酪酸、Ｄ−バリン、Ｌ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−セリン、Ｌ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−メチオニン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−フェニルグリシン、Ｌ−フェニルグリシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニンなどの、食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体等として有用であり、有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要な光学活性アミノ酸を、容易に製造することが可能である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例および比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
１）ロドコッカス オパカスの培養、酵素精製および酵素の基質特異性
ポリペプトン1.0％、酵母エキス0.5％及びNaCl 1.0％を含有する培地５ｍｌを試験管に入れ、滅菌後、ロドコッカス オパカス７１Ｄ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１２３３または国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５２）を接種し、30℃で24時間、前培養を行なった。K2HPO4 0.2％、NaCl 0.1%、MgSO4・7H2O 0.02%、CaCl2 0.001％、ポリペプトン0.05%、微量ミネラル混液0.1%  およびブチロニトリル 0.3%を含有する培地500mlを2L容の坂口フラスコに入れ、滅菌後、前培養液を植菌し、30℃で72時間、96rpmで本培養を行なった。なお、微量ミネラル混液１L中に含まれる成分組成は以下のとおりである。ZnSO4・7H2O 0.01g、CuSO4・5H2O 0.001g、MnSO4・5H2O 0.001g、FeSO4・7H2O 0.01g、Na2MoO4・2H2O 0.01g及びCoCl2・6H2O 0.01g。
培養液10Lを15,000Gで5分間、4℃で遠心分離して湿菌体を得、pH7.0の10mMリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次いで0.001％のCoCl2、0.001％のFeSO4、0.05％のn-酪酸を含むpH7.0の10mMリン酸カリウム緩衝液で洗浄した後、同一組成の緩衝液230mlに再懸濁した。この懸濁液を10分間×2回超音波処理し、15,000Gで10分間、4℃で遠心分離して上清を無細胞抽出液として得た。
無細胞抽出液に硫酸アンモニウムを30％飽和となるように添加し、攪拌した後、20,000Gで20分間、4℃で遠心分離し、得られた沈殿を0.001％のCoCl2、0.001％のFeSO4、0.05％のn-酪酸を含むpH7.0の10mMリン酸カリウム緩衝液少量に溶解し、同一組成の緩衝液を用いて透析して、硫安分画粗酵素液を得た。
硫安分画粗酵素液を、同一組成の緩衝液で平衡化したDEAEトヨパール650Mカラムにのせ、同一組成の緩衝液で洗浄した後、0→500mMのNaCl直線的濃度勾配をつけた同一組成の緩衝液で溶出し、DEAEトヨパール分画粗酵素液を得た。
DEAEトヨパール分画粗酵素液に硫酸アンモニウムを30％飽和となるように添加し、15,000Gで10分間、4℃で遠心分離し、上清を30％飽和の硫酸アンモニウム、0.001％のCoCl2、0.001％のFeSO4、0.05％のn-酪酸を含むpH7.0の10mMリン酸カリウム緩衝液で平衡化したブチルトヨパールカラムにのせ、20％飽和の硫酸アンモニウムを含む同一組成の緩衝液で洗浄した後、20→0％飽和の硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により溶出し、硫酸アンモニウムを含まない同一組成の緩衝液を用いて透析して、ブチルトヨパール分画粗酵素液を得た。
ブチルトヨパール分画粗酵素液を、同一組成の緩衝液で平衡化したギガパイトカラムにのせ、同一組成の緩衝液で洗浄した後、0→0.3Mのリン酸カリウム緩衝液の直線的濃度勾配により溶出し、同一組成の緩衝液を用いて透析して、ギガパイト分画粗酵素液を得た。
ギガパイト分画粗酵素液を、同一組成の緩衝液で平衡化したモノQ5/5カラムにのせ、0.001％のCoCl2、0.001％のFeSO4、0.05％のn-酪酸を含む200mMリン酸カリウム緩衝液で洗浄した後、200→400mMのNaCl直線的濃度勾配をつけた同一組成の緩衝液で溶出し、モノQ分画粗酵素液を得た。
モノQ分画粗酵素液を、0.001％のCoCl2、0.001％のFeSO4、0.05％のn-酪酸を含むpH7.0の10mMリン酸カリウム緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにのせ、同一組成の緩衝液で洗浄した後、0→0.3Mのリン酸カリウム緩衝液の直線的濃度勾配により溶出し、同一組成の緩衝液を用いて透析して、ヒドロキシアパタイト精製酵素液を得た。
各種アミノニトリルを基質とし、pH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液中、30℃で酵素反応を行い、生成したアミノ酸アミドをHPLCで定量して、各種基室に対する酵素活性を調べた。２−アミノブチロニトリルに対する活性を１００としたときの各基質に対する相対活性を表２に示す。
〈表２〉
基質（20mM）              相対活性
アラニノニトリル              77.0
２−アミノブチロニトリル     100
バリノニトリル                15.1
ｔ−ロイシノニトリル           1.8
フェニルグリシノニトリル     177
フェニルアラニノニトリルa)    42.9
a) :基質濃度10mM
２）アクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼ産生菌の培養と酵素精製
アクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼをコードする遺伝子を有する組換え大腸菌JM109/pACL60  を、非特許文献1記載の方法、すなわち終濃度0.5mMのIPTGと終濃度80μg/mlのアンピシリンを含むLB培地（トリプトン1％、酵母エキス0.5％、NaCl1％、pH7.2）中、37℃で12時間培養し、同じく非特許文献1記載の方法にしたがって精製酵素液を得た。
３）オクロバクトラム アンスロピ由来のD-アミノペプチダーゼ産生菌の培養と酵素精製
オクロバクトラム アンスロピ由来のD-アミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換え大腸菌  JM109/ｐC138DP  を、非特許文献３記載の方法、すなわち終濃度1％のグリセリンと終濃度2mg/Lの塩酸チアミンと終濃度50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地中、37℃で12時間培養し、同じく非特許文献３記載の方法にしたがって精製酵素液を得た。
４）精製酵素を用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（R）−２−アミノ酪酸（Ｄ−２−アミノ酪酸）の製造
20mMの（R,S）−２−アミノブチロニトリル・1/2硫酸塩と500nMのピリドキサールリン酸と、ロドコッカス オパカス由来の上記精製酵素液3.0U、アクロモバクター オバエ由来の上記アミノカプロラクタムラセマーゼ精製酵素液1.6U、およびオクロバクトラム アンスロピ由来の上記D-アミノペプチダーゼ精製酵素液0.52Uを含むpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液1mlを30℃で反応させ、反応液をHPLCで分析した結果、図１に示すように、6時間でほぼ定量的に（R）−２−アミノ酪酸（D‐２−アミノ酪酸）が生成した。このとき（S）−２−アミノ酪酸（L-２−アミノ酪酸）の生成は認められなかった。【００３１】
実施例２
アセトンパウダーを用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（R）−２−アミノ酪酸（D−２−アミノ酪酸）の製造（基質濃度を変えた例）
実施例１記載の方法と同様の方法で微生物を培養し、常法にしたがってアセトンパウダーを調製して以下実施例２−４に使用した。
（R,S）-２-アミノブチロニトリル・1/2硫酸塩の量を25mg（18.8mM）と50mg（37.6mM）として、500nMのピリドキサールリン酸、ロドコッカス オパカス７１D由来のニトリルヒドラターゼ312U/gのアセトンパウダー10mg、オクロバクトラム アンスロピ由来のD-アミノペプチダーゼ135U/gのアセトンパウダー50mg及びアクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼ175U/ｇのアセトンパウダー100mgを含むpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液10ml中、30℃で12時間反応させ、反応液をHPLCで分析した結果、25mgのとき収率85.9%、50mgのとき収率69.2%で、（R）−２−アミノ酪酸（D‐２−アミノ酪酸）が生成した。【００３２】
実施例３
アセトンパウダーを用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（R）−２−アミノ酪酸（D−２−アミノ酪酸）の製造（反応温度を変えた例）
（R,S）-２-アミノブチロニトリル・1/2硫酸塩50mg（37.6mM）と、500nMのピリドキサールリン酸、ロドコッカス オパカス７１D由来のニトリルヒドラターゼ312U/gのアセトンパウダー0.1g、オクロバクトラム アンスロピ由来のD-アミノペプチダーゼ135U/gのアセトンパウダー0.2g及びアクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼ175U/ｇのアセトンパウダー0.3gを含むpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液10mlを、反応温度20℃と30℃で12時間反応させ、反応液をHPLCで分析した結果、反応温度20℃のとき収率95.7％、30℃のとき79.0％で、（R）−２−アミノ酪酸（D‐２−アミノ酪酸）が生成した。【００３３】
実施例４
アセトンパウダーを用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（R）−２−アミノ酪酸（D−２−アミノ酪酸）の製造（反応ｐHを変えた例）
（R,S）-２-アミノブチロニトリル・1/2硫酸塩50mg（37.6mM）と、500nMのピリドキサールリン酸、ロドコッカス オパカス７１D由来のニトリルヒドラターゼ312U/gのアセトンパウダー0.05g、オクロバクトラム アンスロピ由来のD-アミノペプチダーゼ135U/gのアセトンパウダー0.1g及びアクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼ175U/ｇのアセトンパウダー0.1gを含むpH 6.0とpH 7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液10mlを、30℃で12時間反応させ、反応液をHPLCで分析した結果、pH 6.0のとき収率62.0％
、pH 7.0のとき88.9％で、（R）−２−アミノ酪酸（D‐２−アミノ酪酸）が生成した。【００３４】
実施例５
１）ブレバンディモナス ディミニュータ由来のL-アミノ酸アミダーゼ産生菌の培養と酵素精製
ブレバンディモナス ディミニュータ由来のL-アミノ酸アミダーゼをコードする遺伝子を有する組換え大腸菌JM109株を、非特許文献４記載の方法、すなわち終濃度80μg/mlのアンピシリンと終濃度0.5mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを含むLB培地中、37℃で12時間培養し、同じく非特許文献４記載の方法にしたがって精製酵素液を得た。
２）精製酵素を用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（S）−２−アミノ酪酸（L−２−アミノ酪酸）の製造
20mMの（R,S）−２−アミノブチロニトリル・1/2硫酸塩と500ｎMのピリドキサールリン酸、0.5mMのCoCl2と、ロドコッカス  オパカス由来の精製酵素液0.59U、アクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼ精製酵素液1.6U、およびブレバンディモナス ディミニュータ由来の上記L-アミノ酸アミダーゼ精製酵素液0.39Uを含むpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液1mlを30℃で反応させ、反応液をHPLCで分析した結果、図−２に示すように、12時間でほぼ定量的に（S）−２−アミノ酪酸（L‐２−アミノ酪酸）が生成した。このとき（R）−２−アミノ酪酸（D-２−アミノ酪酸）の生成は認められなかった。【００３５】
実施例６
アセトンパウダーを用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（S）−２−アミノ酪酸（L−２−アミノ酪酸）の製造
実施例５記載の方法と同様の方法で微生物を培養し、常法にしたがってアセトンパウダーを調製して実施例６に使用した。
（R,S）-２-アミノブチロニトリル・1/2硫酸塩を30mg（22.5.mM）と、500nMのピリドキサールリン酸、0.5mMのCoCl2、ロドコッカス オパカス７１D由来のニトリルヒドラターゼ312U/gのアセトンパウダー10mg、ブレバンディモナス ディミニュータ由来のL-アミノ酸アミダーゼ143U/gのアセトンパウダー50mg及びアクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼ175U/ｇのアセトンパウダー100mgを含むpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液10mlを、30℃で6時間反応させ、反応液をHPLCで分析した結果、収率77.8％で（S）−２−アミノ酪酸（L‐２−アミノ酪酸）が生成した。【００３６】
実施例７
（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（S）−２−アミノ酪酸（L−２−アミノ酪酸）の製造（反応ｐHの影響）
20mMの（R,S）−２−アミノブチロニトリル・1/2硫酸塩と500ｎMのピリドキサールリン酸、0.5mMのCoCl2と、ロドコッカス オパカス由来の精製酵素液8U、アクロモバクター オバエ由来のアミノカプロラクタムラセマーゼ精製酵素液0.1U、およびブレバンディモナス ディミニュータ由来のL-アミノ酸アミダーゼ精製酵素液17Uを含む、下記に示すpH5.5〜9.0の緩衝液1mlを30℃で12時間反応させ、反応液をHPLCで分析した結果を以下に示す。
〈表３〉
ｐH    （S）−２−アミノ酪酸収率（％）
5.5              28.9
6.0              42.1
6.5              67.2
7.0              65.2
7.5              76.9
8.0              88.9
9.0              16.8
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】精製酵素を用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（R）−２−アミノ酪酸（Ｄ−２−アミノ酪酸）の製造。
【図２】精製酵素を用いた（R,S）−２−アミノブチロニトリルから（S）−２−アミノ酪酸（L−２−アミノ酪酸）の製造。
【図１】
2008105493.tif 000006
【図２】
2008105493.tif 000007
【国際調査報告】
2008105493.tif 000008
2008105493.tif 000009
2008105493.tif 000010
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