【手続補正書】
【提出日】平成16年11月8日(2004.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌剤のスクリーニング方法であって、細菌の二成分情報伝達系の阻害活性を指標にして、抗菌剤候補化合物から抗菌剤を選択する工程を含み、
前記工程が、プロモーターと、二量体を形成して前記プロモーターに結合するレプレッサーとからなる遺伝子転写制御系を有する細菌を、下記（ａ）および（ｂ）の塩基配列の少なくとも一方を含むベクターにより形質転換した細菌変異株を用い、前記転写制御される遺伝子を指標として、抗菌剤候補化合物に対する前記細菌変異株の二成分情報伝達系の阻害活性を検出し、抗菌剤を選択する方法。
（ａ）前記レプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列、
（ｂ）前記レプレッサーのＤＮＡ結合ドメインにレギュレータータンパク質を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列。
【請求項２】
前記細菌が、大腸菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二成分情報伝達系の阻害が、センサータンパク質の二量体化の阻害（ＨＫ-ＨＫ阻害）、センサータンパク質からレギュレータータンパク質へのリン酸基の転移の阻害（ＨＫ−ＲＲ阻害）およびレギュレータータンパク質の二量体化の阻害（ＲＲ−ＲＲ阻害）からなる群から選択される少なくとも一つの阻害である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記転写制御を受ける遺伝子が、β-galactosidase（lacZ）遺伝子、tetracycline（tet）耐性遺伝子およびGreen Florence Protein（GFP）からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記２つの融合タンパク質におけるセンサータンパク質細胞内領域およびレギュレータータンパク質が、枯草菌、ブドウ球菌および大腸菌からなる群から選択される少なくとも一つの菌由来である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ブドウ球菌が、黄色ブドウ球菌である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項２から６のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用する大腸菌変異株であって、プロモーターと、二量体を形成して前記プロモーターに結合するレプレッサーとからなる遺伝子転写制御系を有する大腸菌を、下記（ａ）および（ｂ）の塩基配列の少なくとも一方を含むベクターにより形質転換した大腸菌変異株。
（ａ）前記レプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列、
（ｂ）前記レプレッサーのＤＮＡ結合ドメインにレギュレータータンパク質を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列。
【請求項８】
前記転写制御を受ける遺伝子が、β-galactosidase（lacZ）遺伝子、Green flororence protein（ＧＦＰ）およびtetracycline（tet）耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つである請求項７に記載の大腸菌変異株。
【請求項９】
前記２つの融合タンパク質におけるセンサータンパク質細胞内領域およびレギュレータータンパク質が、枯草菌、ブドウ球菌および大腸菌からなる群から選択される少なくとも一つの菌由来である請求項７または８に記載の大腸菌変異株。
【請求項１０】
前記ブドウ球菌が、黄色ブドウ球菌である請求項９に記載の大腸菌変異株。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載の方法によるスクリーニング工程を含む抗菌剤の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の抗菌剤のスクリーニング方法は、抗菌剤のスクリーニング方法であって、細菌の二成分情報伝達系の阻害活性を指標にして、抗菌剤候補化合物から抗菌剤を選択する工程を含み、前記工程が、プロモーターと、二量体を形成して前記プロモーターに結合するレプレッサーとからなる遺伝子転写制御系を有する細菌を、下記（ａ）および（ｂ）の塩基配列の少なくとも一方を含むベクターにより形質転換した細菌変異株を用い、前記転写制御される遺伝子を指標として、抗菌剤候補化合物に対する前記細菌変異株の二成分情報伝達系の阻害活性を検出し、抗菌剤を選択する工程であることを特徴とする。
（ａ）前記レプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列、
（ｂ）前記レプレッサーのＤＮＡ結合ドメインにレギュレータータンパク質を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のスクリーニング方法において、二成分情報伝達系の阻害は、例えば、センサータンパク質の二量体化の阻害（ＨＫ-ＨＫ阻害）、センサータンパク質からレギュレータータンパク質へのリン酸基の転移の阻害（ＨＫ−ＲＲ阻害）およびレギュレータータンパク質の二量体化の阻害（ＲＲ−ＲＲ阻害）がある。スクリーニングにおいては、これらの阻害の一つを対象としてもよいし、２種類以上の阻害を対象としてもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
つぎに、本発明のスクリーニング方法に使用する細菌は、例えば、大腸菌があげられる。前記大腸菌に加えて、例えば、枯草菌を使用することもできるが、本発明は、これらの微生物に限定されない。枯草菌と大腸菌は、安全で、よく調べられているので扱いやすく、培養等のコストが低い等の利点がある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
前記細菌が大腸菌である場合、プロモーターと、二量体を形成して前記プロモーターに結合するレプレッサーとからなる遺伝子転写制御系を有する大腸菌を、レプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列および前記レプレッサーのＤＮＡ結合ドメインにレギュレータータンパク質を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一方を含むベクターにより形質転換する。このような形質転換を行った大腸菌変異株を用いれば、前記転写制御される遺伝子をマーカーとして、抗菌剤候補化合物から抗菌剤をスクリーニングできる。例えば、抗菌剤候補化合物を含有する培地で前記変異株を培養し、前記転写制御される遺伝子が発現すれば、前記候補化合物によって前記レプレッサー二量体化が阻止されたことになり、これは二成分情報伝達系の阻害されたことになる。したがって、前記遺伝子が発現した場合の候補化合物は、前記二成分情報伝達系を阻害すると判定できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
また、枯草菌の場合、レギュレータータンパク質ＹｙｃＦの第２１５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換する。このような置換を行った枯草菌変異株は、４７℃以上で生育不可である。この枯草菌変異株を用いれば、前述の４つの阻害を指標に、抗菌剤をスクリーニングできる。例えば、抗菌剤候補化合物を含有する培地により、枯草菌の野生株と前記変異株とを培養し、野生株が生育し、前記変異株が生育しなければ、その候補化合物は、二成分情報伝達系を阻害すると判定できる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
前記２つの融合タンパク質におけるセンサータンパク質細胞内領域およびレギュレータータンパク質において、その由来は特に制限されず、例えば、枯草菌、ブドウ球菌および大腸菌等の菌由来であってもよい。前記ブドウ球菌は、例えば、黄色ブドウ球菌がある。