(57)【要約】  本発明は、偏性嫌気性細菌を、正確、迅速、かつ簡便に識別できるプローブおよびプライマーの提供をその目的とする。本発明によれば、配列番号１〜５、７〜１１、１３〜１６、１８〜２２、および２４〜２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、偏性嫌気性細菌の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス（Pectinatus frisingensis）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項３】
ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号６の１１４〜１４０番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号６の１５６〜１７４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項４】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項２または３に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項４に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項６】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項７】
少なくとも１種のプライマーが、配列番号６の１１４〜１７４番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項６に記載のＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項８】
配列番号１２の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項９】
請求項８に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項１０】
ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号１２の１８３〜２０７番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号１２の２４４〜２５８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項９に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項１１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項９または１０に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項１１に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項１３】
請求項８に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項１４】
少なくとも１種のプライマーが、配列番号１２の１８３〜２５８番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項１３に記載のＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項１５】
配列番号１７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株（Pectinatus sp. DSM20764）およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
【請求項１６】
請求項１５に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項１７】
ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号１７の１７４〜１９３番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号１７の１９５〜２１９番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項１６に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項１８】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１６または１７に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１５に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項２０】
少なくとも１種のプライマーが、配列番号１７の１７４〜２１９番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項１９に記載のＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項２１】
配列番号２３の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、メガスフェラ・セレビシェ（Megasphaera cerevisiae）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２２】
請求項２１に記載の二種以上のプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項２３】
ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号２３の２９７〜３２２番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号２３の３３０〜３４５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項２２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項２４】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項２２または２３に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号２２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項２４に記載のプライマーセット。
【請求項２６】
請求項２１に記載の二種以上のプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項２７】
少なくとも１種のプライマーが、配列番号２３の２９７〜３４５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項２６に記載のＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項２８】
配列番号２８の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ザイモフィラス・パウシボランス（Zymophilus paucivorans）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２９】
請求項２８に記載の二種以上のプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項３０】
ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号２８の１２３〜１４４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号２８の１４８〜１６５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項２９に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項３１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項２９または３０に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号２４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項２８に記載の二種以上のプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項３３】
少なくとも１種のプライマーが、配列番号２８の１２３〜１６５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項３２に記載のＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項３４】
配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１、８、１５、２１、または２８に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項３５】
配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の相補配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１、８、１５、２１、または２８に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項３６】
配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の相補配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号６、１２、１７、２３、または２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１、８、１５、２１、または２８に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項３７】
配列番号１〜５、７〜１１、１３〜１６、１８〜２２、または２４〜２７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項４、５、１１、１２、１８、２４、２５、および３１のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項３８】
配列番号１〜５、７〜１１、１３〜１６、１８〜２２、または２４〜２７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項４、５、１１、１２、１８、２４、２５、および３１のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項３９】
配列番号１〜５、７〜１１、１３〜１６、１８〜２２、または２４〜２７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項４、５、１１、１２、１８、２４、２５、および３１のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項４０】
請求項１に記載のプローブまたはプライマー、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット、または請求項６または７に記載のＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【請求項４１】
請求項８に記載のプローブまたはプライマー、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット、または請求項１３または１４に記載のＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【請求項４２】
請求項１５に記載のプローブまたはプライマー、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット、または請求項１９または２０に記載のＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【請求項４３】
請求項２１に記載のプローブまたはプライマー、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット、または請求項２６または２７に記載のＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、メガスフェラ・セレビシェの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【請求項４４】
請求項２８に記載のプローブまたはプライマー、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット、または請求項３２または３３に記載のＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、偏性嫌気性細菌の検出用プローブおよびプライマーに関し、詳細には、偏性嫌気性細菌の検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットに関する。
【０００２】
背景技術
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。製品となったビール中で増殖する菌種としてはラクトバチラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）の乳酸菌の報告例が多いが、１９７０年代以降から、グラム陰性の偏性嫌気性細菌が混濁したビールから分離されている。ペクチネイタス属細菌（Pectinatus）は、ビール混濁能を持つ胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、ペクチネイタス・セレビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス（Pectinatus frisingensis）、ペクチネイタス・ハイカラエ（Pectinatus haikarae）という菌種が提唱されている（Lee, S. Y. et al. 1978 International Journal of Systematic Bacteriology 28, 582-594、Haikara, A. et al. 1981 Applied and Environmental Microbiology 41, 511-517、Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27、Juvonen, R and Shihko, M. L. 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 4), 695-702）。グラム陰性球菌の偏性嫌気性ビール混濁菌としては、メガスフェラ・セレビシェ（Megasphaera cerevisiae）が分離されている（Weiss, N. et al. 1979 Brauwissenschaft 32, 189-194）。ザイモフィラス・パウシボランス（Zymophilus paucivorans）は、胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、遺伝学的背景がペクチネイタス属と近く、ビール製造に用いられる添加酵母から分離されている（Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27）。これらの細菌がビール中で増殖すると、混濁を起こすのみならず硫化水素や脂肪酸などの不快な香気成分を生産し、ビールの品質を著しく低下させる（Haikara, A. 1985 Monatsschr. fuer Brauwissenschaft 38, 239-243）。また、ペクチネイタス・セレビシフィラスとペクチネイタス・フリシンゲンシスは、ワイン中で増殖できることが報告されている（Gonzalez, J. M. et al. 2004 Antonie van Leeuwenhoek 86, 241-248）。従って、これらの細菌を検出し、同定する技術は酒類製造における品質管理に非常に重要である。
【０００３】
これまでに、ペクチネイタス・セレビシフィラスとペクチネイタス・フリシンゲンシスについてリボタイピングでハイブリダイズするＤＮＡ断片を比較してこれらの細菌の存在を同定する技術（特開平１０−２４３７９９号公報）が報告されている。また、メガスフェラ・セレビシェの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を用いた検出用プライマー（特開平１０−３２３１９０号公報）、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プライマー（特開２００４−１２１２５９号公報）、ザイモフィラス・パウシボランスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の塩基配列を用いた検出用プライマー（特開２０００−１０６８８１号公報）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスのそれぞれに優先的にハイブリダイズするプローブ、及びペクチネイタス属、メガスフェラ属、ザイモフィラス属、セレノモナス属菌に優先的にハイブリダイズするプローブ（特開２００１−１４５４９２号公報）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の塩基配列を用いた検出用プライマー（特開２００１−２１８５９８号公報）、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ（特開２００２−１７３５６号公報）、メガスフェラ・セレビシェの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ（特開２００２−３４５７１号公報）、メガスフェラ・セレビシェの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を明らかにし、その塩基配列を用いた検出用プローブ（特開２００２−１２５６７７号公報）、ザイモフィラス属菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ（特開２００３−６１６７４号公報）が報告されている。さらに、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子及び５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のスペーサー領域の塩基配列から開発されたＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ用のプローブ（特表２００３−５１００９１号公報）、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を使ったネスティッドＰＣＲ法用のプライマー（特開２００５−６５５６号公報）が報告されている。
【０００４】
しかし、ＰＣＲやＦＩＳＨは高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。このために、日々の微生物検査業務の中で行うことには問題があった。
【０００５】
一方、ペクチネイタス属菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するＬＡＭＰプライマーが開発されているが（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）、ペクチネイタス属の中の菌種を見分けることが出来ず、検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【０００６】
また、メガスフェラ・セレビシェとザイモフィラス・パウシボランスを特異的に検出するＬＡＭＰプライマーは、まだ報告されていない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者は、偏性嫌気性細菌であるペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株、メガスフェラ・セレビシェ、およびザイモフィラス・パウシボランスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列を明らかにし、これらの配列情報に基づいて各菌種において特異的な塩基配列を見出した。本発明者はまた、これらの特異的な塩基配列に基づいてペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスをそれぞれ正確に検出できるプライマーセットを開発することに成功した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
以下、ペクチネイタス・フリシンゲンシスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の塩基配列に関連する発明を第一の態様とし、ペクチネイタス・セレビシフィラスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の塩基配列に関連する発明を第二の態様とし、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の塩基配列に関連する発明を第三の態様とし、メガスフェラ・セレビシェのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の塩基配列に関連する発明を第四の態様とし、ザイモフィラス・パウシボランスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の塩基配列に関連する発明を第五の態様とする。
【０００９】
第一の態様
本発明者は、ペクチネイタス・フリシンゲンシスＤＳＭ６３０６株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列（配列番号６）を明らかにし、このうち配列番号６の１１４〜１７４番目の塩基配列がペクチネイタス・フリシンゲンシスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットによってペクチネイタス・フリシンゲンシスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス・フリシンゲンシスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００１０】
本発明の第一の態様によれば、配列番号６の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出用プローブまたはプライマー（以下、「第一の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある）が提供される。
【００１１】
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、配列番号６の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号６の１１４〜１７４番目の塩基配列（特に、配列番号６の１１４〜１４０番目および１５６〜１７４番目の塩基配列）を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００１２】
本発明の第一の態様によれば、二種以上の第一の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット（以下、「第一の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット」ということがある）が提供され、より具体的には、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなるペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットであって、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢが、それぞれ、本発明の第一の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００１３】
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号６の１１４〜１４０番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号６の１５６〜１７４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
第一の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００１４】
本発明の第一の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第一の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００１５】
本発明の第一の態様によれば、本発明の第一の態様による二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用ＰＣＲ法プライマーセット（以下、「第一の態様によるＰＣＲ法プライマーセット」ということがある）が提供される。
【００１６】
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、少なくとも１種のプライマーが、配列番号６の１１４〜１７４番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、第一の態様によるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００１７】
本発明の第一の態様によれば、本発明の第一の態様によるペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号６の１１４〜１７４番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
【００１８】
本発明の第一の態様によれば、本発明の第一の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第一の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット、または本発明の第一の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００１９】
第二の態様
本発明者は、ペクチネイタス・セレビシフィラスＤＳＭ２０４６７株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列（配列番号１２）を明らかにし、このうち配列番号１２の１８３〜２５８番目の塩基配列がペクチネイタス・セレビシフィラスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス・セレビシフィラス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットによってペクチネイタス・セレビシフィラスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス・セレビシフィラスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００２０】
本発明の第二の態様によれば、配列番号１２の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出用プローブまたはプライマー（以下、「第二の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある）が提供される。
【００２１】
本発明の第二の態様によれば、好ましくは、配列番号１２の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号１２の１８３〜２５８番目の塩基配列（特に、配列番号１２の１８３〜２０７番目および２４４〜２５８番目の塩基配列）を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス・セレビシフィラスの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００２２】
本発明の第二の態様によれば、二種以上の第二の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット（以下、「第二の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット」ということがある）が提供され、より具体的には、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなるペクチネイタス・セレビシフィラス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットであって、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢが、それぞれ、本発明の第二の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００２３】
本発明の第二の態様によれば、好ましくは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号１２の１８３〜２０７番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号１２の２４４〜２５８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
第二の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００２４】
本発明の第二の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第二の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００２５】
本発明の第二の態様によれば、本発明の第二の態様による二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用ＰＣＲ法プライマーセット（以下、「第二の態様によるＰＣＲ法プライマーセット」ということがある）が提供される。
【００２６】
本発明の第二の態様によれば、好ましくは、少なくとも１種のプライマーが、配列番号１２の１８３〜２５８番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、第二の態様によるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００２７】
本発明の第二の態様によれば、本発明の第二の態様によるペクチネイタス・セレビシフィラス検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号１２の１８３〜２５８番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
【００２８】
本発明の第二の態様によれば、本発明の第二の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第二の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット、または本発明の第二の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００２９】
第三の態様
本発明者は、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列（配列番号１７）を明らかにし、このうち配列番号１７の１７４〜２１９番目の塩基配列がペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株により特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットによってペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種であるペクチネイタス・ハイカラエを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００３０】
本発明の第三の態様によれば、配列番号１７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の検出用プローブまたはプライマー（以下、「第三の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある）が提供される。
【００３１】
本発明の第三の態様によれば、好ましくは、配列番号１７の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号１７の１７４〜２１９番目の塩基配列（特に、配列番号１７の１７４〜１９３番目および１９５〜２１９番目の塩基配列）を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００３２】
本発明の第三の態様によれば、二種以上の第三の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット（以下、「第三の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット」ということがある）が提供され、より具体的には、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなるペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットであって、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢが、それぞれ、本発明の第三の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００３３】
本発明の第三の態様によれば、好ましくは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号１７の１７４〜１９３番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号１７の１９５〜２１９番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
第三の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００３４】
本発明の第三の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第三の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００３５】
本発明の第三の態様によれば、本発明の第三の態様による二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット（以下、「第三の態様によるＰＣＲ法プライマーセット」ということがある）が提供される。
【００３６】
本発明の第三の態様によれば、好ましくは、少なくとも１種のプライマーが、配列番号１７の１７４〜２１９番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、第三の態様によるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００３７】
本発明の第三の態様によれば、本発明の第三の態様によるペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号１７の１７４〜２１９番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
【００３８】
本発明の第三の態様によれば、本発明の第三の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第三の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット、または本発明の第三の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００３９】
第四の態様
本発明者は、メガスフェラ・セレビシェＤＳＭ２０４６２株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列（配列番号２３）を明らかにし、このうち配列番号２３の２９７〜３４５番目の塩基配列がメガスフェラ・セレビシェにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したメガスフェラ・セレビシェ検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットによってメガスフェラ・セレビシェを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたメガスフェラ・セレビシェのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００４０】
本発明の第四の態様によれば、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、メガスフェラ・セレビシェの検出用プローブまたはプライマー（以下、「第四の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある）が提供される。
【００４１】
本発明の第四の態様によれば、好ましくは、配列番号２３の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号２３の２９７〜３４５番目の塩基配列（特に、配列番号２３の２９７〜３２２番目および３３０〜３４５番目の塩基配列）を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるメガスフェラ・セレビシェの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００４２】
本発明の第四の態様によれば、二種以上の第四の態様によるプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット（以下、「第四の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット」ということがある）が提供され、より具体的には、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなるメガスフェラ・セレビシェの検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットであって、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢが、それぞれ、本発明の第四の態様によるプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００４３】
本発明の第四の態様によれば、好ましくは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号２３の２９７〜３２２番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号２３の３３０〜３４５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
第四の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００４４】
本発明の第四の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第四の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００４５】
本発明の第四の態様によれば、本発明の第四の態様による二種以上のプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用ＰＣＲ法プライマーセット（以下、「第四の態様によるＰＣＲ法プライマーセット」ということがある）が提供される。
【００４６】
本発明の第四の態様によれば、好ましくは、少なくとも１種のプライマーが、配列番号２３の２９７〜３４５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、第四の態様によるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００４７】
本発明の第四の態様によれば、本発明の第四の態様によるメガスフェラ・セレビシェ検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号２３の２９７〜３４５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
【００４８】
本発明の第四の態様によれば、本発明の第四の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第四の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット、または本発明の第四の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、メガスフェラ・セレビシェの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００４９】
第五の態様
本発明者は、ザイモフィラス・パウシボランスＤＳＭ２０７５６株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列（配列番号２８）を明らかにし、このうち配列番号２８の１２３〜１６５番目の塩基配列がザイモフィラス・パウシボランスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したザイモフィラス・パウシボランス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットによってザイモフィラス・パウシボランスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたザイモフィラス・パウシボランスのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００５０】
本発明の第五の態様によれば、配列番号２８の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、ザイモフィラス・パウシボランスの検出用プローブまたはプライマー（以下、「第五の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある）が提供される。
【００５１】
本発明の第五の態様によれば、配列番号２８の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、具体的には、配列番号２８の１２３〜１６５番目の塩基配列（特に、配列番号２８の１２３〜１４４番目および１４８〜１６５番目の塩基配列）を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるザイモフィラス・パウシボランスの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００５２】
本発明の第五の態様によれば、二種以上の第五の態様によるプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット（以下、「第五の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット」ということがある）が提供され、より具体的には、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなるザイモフィラス・パウシボランス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットであって、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢが、それぞれ、本発明の第五の態様によるプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００５３】
本発明の第五の態様によれば、好ましくは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３、並びに場合によってはＬＦおよび／またはＬＢを含んでなり、
ＦＩＰが、配列番号２８の１２３〜１４４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなり、
ＢＩＰが、配列番号２８の１４８〜１６５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも３８塩基のポリヌクレオチドからなる、
第五の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００５４】
本発明の第五の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号２４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００５５】
本発明の第五の態様によれば、本発明の第五の態様による二種以上のプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用ＰＣＲ法プライマーセット（以下、「第五の態様によるＰＣＲ法プライマーセット」ということがある）が提供される。
【００５６】
本発明の第五の態様によれば、好ましくは、少なくとも１種のプライマーが、配列番号２８の１２３〜１６５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなる、第五の態様によるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００５７】
本発明の第五の態様によれば、本発明の第五の態様によるザイモフィラス・パウシボランス検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号２８の１２３〜１６５番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１５塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
【００５８】
本発明の第五の態様によれば、本発明の第五の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第五の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセット、または本発明の第五の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５９】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスを正確に検出することができる。特に、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセット（特に、ＬＡＭＰ法プライマーセット）によれば、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスを、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００６０】
ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスは、ビール、発泡酒、およびワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【００６１】
特に、第三の態様によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株のみならず、その近縁種（ペクチネイタス・ハイカラエ）をも検出することができる。従って、第三の態様による発明は、各種飲料において混濁を生じさせる可能性がある偏性嫌気性細菌を漏れなく検出できる点でも有利である。
【発明の具体的説明】
【００６２】
定義
本発明において「近縁種」とは、ある菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または約１５００ヌクレオチドの領域を少なくとも含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部と、少なくとも９８％以上、好ましくは９９％以上の同一性を示す１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはその一部を有する菌種を意味する。遺伝子の塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴなどの周知の相同性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターを設定して算出することができる。
【００６３】
ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株の近縁種としては、ペクチネイタス・ハイカラエ（例えば、Pectinatus haikarae  DSM 16980株）が挙げられる。ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（特開２００４−１２１２５９号公報）をペクチネイタス・ハイカラエの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（ＤＱ２２３７３１）とＢＬＡＳＴにより比較したところ、約１５００ｂｐの範囲で９９％以上の同一性を示しており、少なくともペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株の近縁種であることを確認している。
【００６４】
プライマー、プローブ、およびプライマーセット
本発明によるプライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００６５】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００６６】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００６７】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００６８】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００６９】
ＬＡＭＰ法プライマーの作製に当たっては、ＦＩＰおよびＢＩＰを構成するＦ１ｃ（Ｆ１）領域およびＢ１（Ｂ１ｃ）領域は、識別性のより高い部分配列を含むように設計することが好ましい。特に、Ｆ１およびＢ１の３’末端領域は、識別性が特に高い配列に対応するように設計することが好ましい。Ｆ３およびＢ３は、ＦＩＰおよびＢＩＰを構成する領域の周辺領域から設計できることは当業者に自明である。
【００７０】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００７１】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の領域、あるいはＢ１領域とＢ２領域の間の領域にアニールするように設計できる。このようにして設計したループプライマーをＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００７２】
具体的には、本発明による第一の態様のプライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００７３】
本発明による第二の態様のプライマーセットは、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００７４】
本発明による第四の態様のプライマーセットは、配列番号２２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００７５】
本発明では、配列番号１〜５、７〜１１、１３〜１６、１８〜２２、および２４〜２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜５、７〜１１、１３〜１６、１８〜２２、および２４〜２７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
【００７６】
本発明では、配列番号６、１２、１７、２３、および２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号６、１２、１７、２３、および２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、プライマーやプローブとして用いることができる。
【００７７】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００７８】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００７９】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基、より好ましくは、少なくとも３８塩基、特に好ましくは、少なくとも４３塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で６０塩基、より好ましくは、最大で５７塩基とすることができる。ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、３０〜６０塩基、３８〜５７塩基、または４３〜５７塩基とすることができる。
【００８０】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも３０個、好ましくは少なくとも３８個、より好ましくは少なくとも４３個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００８１】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１９塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、好ましくは、最大で２５塩基、より好ましくは、最大で２４塩基とすることができる。Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、１５〜３０塩基、１９〜３０塩基、または１９〜２４塩基とすることができる。
【００８２】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００８３】
配列番号１〜５、７〜１１、１３〜１６、１８〜２２、および２４〜２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
【００８４】
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも３８個（３８〜４６個）、より好ましくは、少なくとも４３個（４３〜４６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５０塩基とすることができる）。
【００８５】
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００８６】
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも３８個（３８〜４５個）、より好ましくは、少なくとも４３個（４３〜４５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５０塩基とすることができる）。
【００８７】
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００８８】
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも１５個（１５〜１９個）、より好ましくは、少なくとも１７個（１７〜１９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００８９】
・配列番号７の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号７の連続する少なくとも３８個（３８〜４３個）、より好ましくは、少なくとも４０個（４０〜４３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５０塩基とすることができる）。
【００９０】
・配列番号８の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号８の連続する少なくとも１５個（１５〜２２個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００９１】
・配列番号９の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号９の連続する少なくとも３８個（３８〜４３個）、より好ましくは、少なくとも４０個（４０〜４３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５０塩基とすることができる）。
【００９２】
・配列番号１０の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１０の連続する少なくとも１９個（１９〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００９３】
・配列番号１１の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号１１の連続する少なくとも１９個（１９〜２７個）、より好ましくは、少なくとも２３個（２３〜２７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００９４】
・配列番号１３の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１３の連続する少なくとも３８個（３８〜４３個）、より好ましくは、少なくとも４０個（４０〜４３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５０塩基とすることができる）。
【００９５】
・配列番号１４の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１４の連続する少なくとも１５個（１５〜２２個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００９６】
・配列番号１５の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１５の連続する少なくとも４３個（４３〜４９個）、より好ましくは、少なくとも４５個（４５〜４９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【００９７】
・配列番号１６の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１６の連続する少なくとも１５個（１５〜１９個）、より好ましくは、少なくとも１７個（１７〜１９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００９８】
・配列番号１８の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１８の連続する少なくとも４３個（４３〜５０個）、より好ましくは、少なくとも４８個（４８〜５０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【００９９】
・配列番号１９の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１９の連続する少なくとも１９個（１９〜２４個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【０１００】
・配列番号２０の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号２０の連続する少なくとも４３個（４３〜４８個）、より好ましくは、少なくとも４５個（４５〜４８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【０１０１】
・配列番号２１の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２１の連続する少なくとも１５個（１５〜２２個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【０１０２】
・配列番号２２の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号２２の連続する少なくとも１９個（１９〜２５個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【０１０３】
・配列番号２４の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号２４の連続する少なくとも４３個（４３〜４８個）、より好ましくは、少なくとも４５個（４５〜４８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【０１０４】
・配列番号２５の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２５の連続する少なくとも１９個（１９〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【０１０５】
・配列番号２６の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号２６の連続する少なくとも４３個（４３〜４９個）、より好ましくは、少なくとも４５個（４５〜４９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【０１０６】
・配列番号２７の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２７の連続する少なくとも１５個（１５〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【０１０７】
本発明では、また、配列番号６、１２、１７、２３および２８の塩基配列並びにそれらの相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ＬＡＭＰ法プライマー、ＰＣＲ法プライマー、およびプローブとして使用できる。
【０１０８】
配列番号６、１２、１７、２３および２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰおよびＢＩＰとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基、より好ましくは、少なくとも３８塩基、特に好ましくは、少なくとも４３塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で６０塩基、より好ましくは、最大で５７塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、３０〜６０塩基、３８〜５７塩基、または４３〜５７塩基とすることができる。
【０１０９】
配列番号６、１２、１７、２３および２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢプライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１９塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、好ましくは、最大で２５塩基、より好ましくは、最大で２４塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜３０塩基、１９〜３０塩基、または１９〜２４塩基とすることができる。
【０１１０】
配列番号６、１２、１７、２３および２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２４塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜３０塩基、１８〜２４塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【０１１１】
配列番号６、１２、１７、２３および２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２４塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１２〜３０塩基、１５〜３０塩基、１８〜２４塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【０１１２】
本発明の第一の態様では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【０１１３】
本発明の第一の態様においては、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・フリシンゲンシスを検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の１１４〜１７４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号６の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号６の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【０１１４】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰおよびＢＩＰとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列（好ましくは、１１４〜１７４番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１１５】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号６の１１４〜１４０番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１１６】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＢＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号６の１５６〜１７４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１１７】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、好ましくは、少なくとも１９個（例えば、１９〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１１８】
本発明の第一の態様においては、また、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・フリシンゲンシスを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号６の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号６の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号６の１１４〜１７４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【０１１９】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列（好ましくは、１１４〜１７４番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１２０】
本発明の第一の態様においては、また、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・フリシンゲンシスを検出するためのプローブを選択することができる。
【０１２１】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列（好ましくは、１１４〜１７４番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１２個（例えば、１２〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプローブとして使用できる。
【０１２２】
本発明の第二の態様では、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１２の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１２の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号１２の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【０１２３】
本発明の第二の態様においては、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・セレビシフィラスを検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号１２の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号１２の１８３〜２５８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号１２の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号１２の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号１２の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【０１２４】
配列番号１２の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰおよびＢＩＰとして用いる場合には、配列番号１２の塩基配列（好ましくは、１８３〜２５８番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１２５】
配列番号１２の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号１２の１８３〜２０７番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１２６】
配列番号１２の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＢＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号１２の２４４〜２５８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１２７】
配列番号１２の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦとして用いる場合には、配列番号１２の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、好ましくは、少なくとも１９個（例えば、１９〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１２８】
本発明の第二の態様においては、また、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・セレビシフィラスを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１２の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号１２の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１２の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号１２の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号１２の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号１２の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号１２の１８３〜２５８番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【０１２９】
配列番号１２の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号１２の塩基配列（好ましくは、１８３〜２５８番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１３０】
本発明の第二の態様においては、また、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・セレビシフィラスを検出するためのプローブを選択することができる。
【０１３１】
配列番号１２の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号１２の塩基配列（好ましくは、１８３〜２５８番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１２個（例えば、１２〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプローブとして使用できる。
【０１３２】
本発明の第三の態様では、配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１７の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号１７の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【０１３３】
本発明の第三の態様においては、配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種を検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号１７の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号１７の１７４〜２１９番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号１７の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号１７の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号１７の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【０１３４】
配列番号１７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰおよびＢＩＰとして用いる場合には、配列番号１７の塩基配列（好ましくは、１７４〜２１９番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１３５】
配列番号１７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号１７の１７４〜１９３番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１３６】
配列番号１７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＢＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号１７の１９５〜２１９番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１３７】
配列番号１７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦとして用いる場合には、配列番号１７の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、好ましくは、少なくとも１９個（例えば、１９〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１３８】
本発明の第三の態様においては、また、配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種を検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１７の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号１７の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１７の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号１７の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号１７の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号１７の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号１７の１７４〜２１９番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【０１３９】
配列番号１７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号１７の塩基配列（好ましくは、１７４〜２１９番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１４０】
本発明の第三の態様においては、また、配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種を検出するためのプローブを選択することができる。
【０１４１】
配列番号１７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号１７の塩基配列（好ましくは、１７４〜２１９番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１２個（例えば、１２〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプローブとして使用できる。
【０１４２】
本発明の第四の態様では、配列番号２３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号２３の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２３の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号２３の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【０１４３】
本発明の第四の態様においては、配列番号２３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・セレビシェを検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号２３の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号２３の２９７〜３４５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号２３の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号２３の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【０１４４】
配列番号２３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）として用いる場合には、配列番号２３の塩基配列（好ましくは、２９７〜３４５番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１４５】
配列番号２３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号２３の２９７〜３２２番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１４６】
配列番号２３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＢＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号２３の３３０〜３４５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１４７】
配列番号２３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦとして用いる場合には、配列番号２３の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、好ましくは、少なくとも１９個（例えば、１９〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１４８】
本発明の第四の態様においては、また、配列番号２３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・セレビシェを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号２３の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号２３の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号２３の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号２３の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号２３の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号２３の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号２３の２９７〜３４５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【０１４９】
配列番号２３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号２３の塩基配列（好ましくは、２９７〜３４５番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１５０】
本発明の第四の態様においては、また、配列番号２３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・セレビシェを検出するためのプローブを選択することができる。
【０１５１】
配列番号２３の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号２３の塩基配列（好ましくは、２９７〜３４５番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１２個（例えば、１２〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプローブとして使用できる。
【０１５２】
本発明の第五の態様では、配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号２８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２８の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号２８の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【０１５３】
本発明の第五の態様においては、配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ザイモフィラス・パウシボランスを検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。ＬＡＭＰ法は周知であり、当業者であればＬＡＭＰ法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。ＬＡＭＰ法においては、好ましくは、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種のプライマーのうち、少なくともＦＩＰおよびＢＩＰのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号２８の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号２８の１２３〜１６５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、ＬＡＭＰ法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号２８の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号２８の塩基配列およびその相補配列以外の配列（配列番号２８の配列の外側の領域）に対合するように選択してもよい。
【０１５４】
配列番号２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰおよびＢＩＰとして用いる場合には、配列番号２８の塩基配列（好ましくは、１２３〜１６５番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１５５】
配列番号２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号２８の１２３〜１４４番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１５６】
配列番号２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＢＩＰとして用いる場合には、好ましくは、配列番号２８の１４８〜１６５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも３０個（例えば、３０〜６０個）、好ましくは、少なくとも３８個（例えば、３８〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４３個（例えば、４３〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１５７】
配列番号２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法のＦ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦとして用いる場合には、配列番号２８の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、好ましくは、少なくとも１９個（例えば、１９〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１５８】
本発明の第五の態様においては、また、配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ザイモフィラス・パウシボランスを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号２８の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号２８の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号２８の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号２８の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号２８の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。ＰＣＲ法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号２８の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号２８の１２３〜１６５番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
【０１５９】
配列番号２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号２８の塩基配列（好ましくは、１２３〜１６５番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【０１６０】
本発明の第五の態様においては、また、配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ザイモフィラス・パウシボランスを検出するためのプローブを選択することができる。
【０１６１】
配列番号２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号２８の塩基配列（好ましくは、１２３〜１６５番目の塩基配列）またはその相補配列の連続する少なくとも１２個（例えば、１２〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプローブとして使用できる。
【０１６２】
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号６、１２、１７、２３および２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【０１６３】
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号６、１２、１７、２３および２８の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、更に、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【０１６４】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【０１６５】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【０１６６】
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【０１６７】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットまたはＰＣＲ法プライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、偏性嫌気性細菌を正確に区別して検出することが可能となる。
【０１６８】
本発明によるプライマーセットは、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第四の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第五の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；およびこれらの一部または全部の組み合わせからなる群から選択されるプライマーセット含んでなる、偏性嫌気性細菌の検出キットが提供される。本発明によれば、また、第一の態様のＰＣＲ法プライマーセット；第二の態様のＰＣＲ法プライマーセット；第三の態様のＰＣＲ法プライマーセット；第四の態様のＰＣＲ法プライマーセット；第五の態様のＰＣＲ法プライマーセット；およびこれらの一部または全部の組み合わせからなる群から選択されるプライマーセット含んでなる、偏性嫌気性細菌の検出キットが提供される。
【０１６９】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【０１７０】
ＰＣＲ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【０１７１】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、各種飲料（例えば、酒類）の品質低下の原因となる偏性嫌気性細菌を正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【０１７２】
ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスは、ビール、発泡酒、およびワインの製造工程あるいは最終製品の品質に影響する能力を持つ細菌種である。従って、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第四の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第五の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；並びにこれらの一部または全部の組み合わせは、好ましくは、ビール、発泡酒、およびワインの品質管理に用いることができる。
【０１７３】
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、およびザイモフィラス・パウシボランスのような偏性嫌気性細菌の検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、上記偏性嫌気性細菌の検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、上記偏性嫌気性細菌の検出方法が提供される。
【０１７４】
ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、およびザイモフィラス・パウシボランスのような偏性嫌気性細菌は各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、上記偏性嫌気性細菌の検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットにより検出対象菌種が検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。
【０１７５】
従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１７６】
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
【０１７７】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【０１７８】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
（ａ）本発明の第一の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
【０１７９】
本発明の第一の態様によれば、また、
（ａ）本発明の第一の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１８０】
本発明の第二の態様によれば、
（ｃ）本発明の第二の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
【０１８１】
本発明の第二の態様によれば、また、
（ｃ）本発明の第二の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１８２】
本発明の第三の態様によれば、
（ｅ）本発明の第三の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の検出方法が提供される。
【０１８３】
本発明の第三の態様によれば、また、
（ｅ）本発明の第三の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１８４】
本発明の第四の態様によれば、
（ｇ）本発明の第四の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｈ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
【０１８５】
本発明の第四の態様によれば、また、
（ｇ）本発明の第四の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｈ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１８６】
本発明の第五の態様によれば、
（ｉ）本発明の第五の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｊ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
【０１８７】
本発明の第五の態様によれば、また、
（ｉ）本発明の第五の態様によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｊ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１８８】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【０１８９】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【０１９０】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【０１９１】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【０１９２】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
（ａ’）本発明の第一の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
【０１９３】
本発明の第一の態様によれば、また、
（ａ’）本発明の第一の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１９４】
本発明の第二の態様によれば、
（ｃ’）本発明の第二の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
【０１９５】
本発明の第二の態様によれば、また、
（ｃ’）本発明の第二の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１９６】
本発明の第三の態様によれば、
（ｅ’）本発明の第三の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の検出方法が提供される。
【０１９７】
本発明の第三の態様によれば、また、
（ｅ’）本発明の第三の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０１９８】
本発明の第四の態様によれば、
（ｇ’）本発明の第四の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｈ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
【０１９９】
本発明の第四の態様によれば、また、
（ｇ’）本発明の第四の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｈ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０２００】
本発明の第五の態様によれば、
（ｉ’）本発明の第五の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｊ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
【０２０１】
本発明の第五の態様によれば、また、
（ｉ’）本発明の第五の態様によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｊ’）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０２０２】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【０２０３】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【０２０４】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【０２０５】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
（ａ”）本発明の第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
【０２０６】
本発明の第一の態様によれば、また、
（ａ”）本発明の第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０２０７】
本発明の第二の態様によれば、
（ｃ”）本発明の第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｄ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
【０２０８】
本発明の第二の態様によれば、また、
（ｃ”）本発明の第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｄ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０２０９】
本発明の第三の態様によれば、
（ｅ”）本発明の第三の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｆ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種の検出方法が提供される。
【０２１０】
本発明の第三の態様によれば、また、
（ｅ”）本発明の第三の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｆ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０２１１】
本発明の第四の態様によれば、
（ｇ”）本発明の第四の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｈ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
【０２１２】
本発明の第四の態様によれば、また、
（ｇ”）本発明の第四の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｈ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０２１３】
本発明の第五の態様によれば、
（ｉ”）本発明の第五の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｊ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
【０２１４】
本発明の第五の態様によれば、また、
（ｉ”）本発明の第五の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｊ”）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【０２１５】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【０２１６】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
【０２１７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
【０２１８】
ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【０２１９】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【０２２０】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【０２２１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【０２２２】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【０２２３】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【０２２４】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【０２２５】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、偏性嫌気性細菌の識別に用いることができる。
【０２２６】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【０２２７】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【０２２８】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【０２２９】
これらをＬＡＭＰ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする細菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする細菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白  核酸  酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【０２３０】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いた偏性嫌気性細菌の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【０２３１】
まず、試料中に存在すると考えられる偏性嫌気性細菌を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法を実施し、偏性嫌気性細菌の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【０２３２】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０２３３】
実施例：偏性嫌気性細菌の検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。【０２３４】
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
以下の偏性嫌気性細菌各菌種用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。【０２３５】
［ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用プライマーセット（ＰＦＧ４ＬＦ１）］
FIP    GTCTTGGTGA TGCCATATTC AAAAGTGTCA GCCAAGCGAT GAAAGT  （配列番号１）
F3     GGTGTGTCCG TAGTCAATGC  （配列番号２）
BIP    TAGGCACTAC CGACAGTACC GCGTAATCGT AGGTTGTTTC AGTGA  （配列番号３）
B3     AAAATGCCAA TTCACGCAGG  （配列番号４）
LF     TCCGCCGCGT TTAACTTGA  （配列番号５）
［ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用プライマーセット（ＰＣＧ１ＬＢ１）］
FIP    AGTGTCATCC GGTTTAAAAT GCACACGTTG CACGAAATCG GCA  （配列番号７）
F3     GCCTATGGAG TAACAAAGGA AC  （配列番号８）
BIP    CGGCAGCGTT TACGTGAATT GTCTTCACGT TCATCAATCA AGG （配列番号９）
B3     CCCCTTCGTC ATAAAACACT TCT （配列番号１０）
LB     GCATTTTTAA ATTGCGGTAT TCATATC  （配列番号１１）
［ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株検出用プライマーセット（ＰＳＧ１）］
FIP    GGAAGCGGAC TGTGGTTCCA GATCCTTCGC TTATGGAATG ACT  （配列番号１３）
F3     GTGGCGGAAA AATATACGGT AT  （配列番号１４）
BIP    ACCGGATGAC ACTATTTTTA CGGAAACCCG CAATTTAGAA AAGCCAATT （配列番号１５）
B3     TCGCGTTCAT CTGTGAGTG  （配列番号１６）
［メガスフェラ・セレビシェ検出用プライマーセット（ＭＣＧ１ＬＦ１）］
FIP    GTGCACGTTT ATCATTCAAG GTAATATGAA TGATACGCTG AAAACACGCC  （配列番号１８）
F3     GCAGATGAAG ATATTTTCCC TGAT  （配列番号１９）
BIP    AAGTGAAGTA TACTGTTATG AAGGAGGGAC CGTCGTATTG ATTGCCTG  （配列番号２０）
B3     CATCGTTTTT TTTGCCTTCC AA  （配列番号２１）
LF     CCCTTATTTA AAAAAGCCAA CTCAC （配列番号２２）
［ザイモフィラス・パウシボランス検出用プライマーセット（ＺＰＧ１）］
FIP    AGGCACTTAC TGTATACCCC TTGTGAAGTT GAAGTAAAAA GAGATGGA  （配列番号２４）
F3     AATCTCTGTT GTAAATGCAC TGA  （配列番号２５）
BIP    TGAAAGTTGT TGGTGATACG GATGAAACAA CCTCATCAAA AATCTCAGC  （配列番号２６）
B3     CCAATTCTCG CAAACGATGT T  （配列番号２７）
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。【０２３６】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。【０２３７】
（ｅ）各菌種用プライマーの特異性評価
各種偏性嫌気性細菌用プライマーとして開発したＬＡＭＰプライマーセット、ＰＦＧ４ＬＦ１、ＰＣＧ１ＬＢ１、ＰＳＧ１、ＭＣＧ１ＬＦ１、およびＺＰＧ１について、各種偏性嫌気性菌標準株を用いてＬＡＭＰ法で特異性を評価した。その結果、各ＬＡＭＰプライマーセットは、対象とした菌種の菌株と反応させた場合にＤＮＡ増幅に伴う濁度上昇が観察された（表１）。各ＬＡＭＰプライマーセットは各菌種の標準株のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子配列に基づいて設計されたものであるが、同じ菌種に属するそれ以外の菌株を用いた場合もＤＮＡ増幅に伴う濁度上昇が観察された（表１）。【０２３８】
また、ＰＳＧ１プライマーはペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株用に作成したプライマーであるが、ペクチネイタス・ハイカラエ（Pectinatus haikarae）ＤＳＭ１６９８０についても同程度の反応時間で増幅が起こった（表１）。ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（特開２００４−１２１２５９号公報）をペクチネイタス・ハイカラエの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（ＤＱ２２３７３１）とＢＬＡＳＴにより比較したところ、約１５００ｂｐの範囲で９９％以上の相同性があり、両者は分類学的に非常に近縁であることが推定された。このように、ＰＳＧ１プライマーはペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株の近縁種も検出できることが示された。【０２３９】
ＰＳＧ１、ＺＰＧ１プライマーは増幅までに５０〜６０分と他のプライマーに比べて若干長い時間が必要であったが、対象とする菌株に対する特異性は十分なものであった。【０２４０】
表１：各種偏性嫌気性菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
2009028644.tif 000002
【０２４１】
さらに、各種乳酸菌標準株、工場分離乳酸菌株を用いて各プライマーセットの特異性を評価した。その結果、各ＬＡＭＰプライマーセットが検出対象としている菌種以外の菌株ではＤＮＡ増幅に伴う濁度上昇は観察されなかった（表２および表３）。これにより、各ＬＡＭＰプライマーセットは特異性が高いことが確認された。【０２４２】
表２：各種乳酸菌標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
2009028644.tif 000003
【０２４３】
表３：ビール工場分離乳酸菌株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表３】
2009028644.tif 000004
【０２４４】
以上により、偏性嫌気性細菌であるペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種ＤＳＭ２０７６４株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とする偏性嫌気性細菌を菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけで、これら菌種を同定・検出することができる。
【配列表】
2009028644000001.app
【国際調査報告】
2009028644.tif 000005
2009028644.tif 000006
2009028644.tif 000007
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2009028644.tif 000009
2009028644.tif 000010
2009028644.tif 000011
2009028644.tif 000012