【手続補正書】
【提出日】平成17年1月19日(2005.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  予め決定した化合物の分離の方法であって、
ｉ)少なくとも相の１つが熱分離性ポリマー(Ｉ)を多く含んでおり(相１)、他の相が少し含んでいる、２相システム(システムＡ)において化合物を分配すること、
ii)当該化合物を含む１つの相(相１または相２)を回収すること、そして
iii)必要ならば、ステップiiで回収した相から当該化合物を単離すること、
を含み、
ａ)ポリマー(Ｉ)は、その最低臨界溶液温度(ＬＣＳＴ)の濃度で水と混合し、当該温度より低い温度から高い温度に上昇させるときに２相となり、その両方は少なくとも７０％の水濃度を有する、ミセル形成熱分離性ポリマーであること、
ｂ)相２が、熱分離性ポリマー(Ｉ)の曇点低下性の少なくとも１つの試薬、例えばポリマー(Ｉ)に不適合なポリマー(II)または塩を含み得ること、
を特徴とする、方法。
【請求項２】  熱分離性ポリマー(Ｉ)が、９０℃以下、好ましくは７０℃以下、例えば３０℃以下または２０℃以下である、より低い臨界溶液温度(ＬＣＳＴ)を有することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】  １つまたはそれ以上の当該少なくとも１つの曇点低下試薬がポリマー(Ｉ)に不適合な水溶性ポリマー(II)であることを特徴とする、請求項１−２の何れかに記載の方法。
【請求項４】  ポリマー(II)が、セルロース、デキストラン、デンプン、末端が誘導化されていないエチレンオキシドとプロピレンオキシドの間のランダムまたはブロックコポリマー、およびポリエチレングリコールの水溶性型から選択されることを特徴とする、請求項３の方法。
【請求項５】  相１および相２が、互いから物理的に分離しており、その場合、相１において熱分離性ポリマー(Ｉ)が、および／または、存在するならば、相２においてポリマー(II)が、再利用され、システムＡにおいて当該方法の第２回目の実施に使用されることを特徴とする、請求項１−４の何れかに記載の方法。
【請求項６】  相１が、ステップ(ii)で回収される相であり、その相が有意な量の分離されるべき化合物を含んでいる場合に、次いで、相１をさらなる相分離に付して当該化合物を熱分離性ポリマー(Ｉ)の少ない相に向かわせ(相１：２)、必要であれば、ポリマーが多い相(相１：１)を再利用することを特徴とする、請求項１−５の何れかに記載の方法。
【請求項７】  相２が、ステップ(ii)で回収される相であり、曇点低下剤がポリマー(II)であり、相が有意な量の分離される化合物を含む場合に、次いで、相２をさらなる相分離に付して当該化合物をポリマー(II)の少ない相に向かわせ(相２：２)、必要であれば、ポリマー(II)が多い相(相２：１)を再利用することを特徴とする、請求項１−５の何れかに記載の方法。
【請求項８】  分離される化合物が、ｐＨ依存電荷を示し、相１と相２とのｂ)分配は、荷電に依存し、当該システムのｐＨは、ステップ(ii)で回収される相に分離される化合物を最大分配するように選択されることを特徴とする、請求項１−７の何れかに記載の方法。
【請求項９】  温度が、ステップ(ii)で回収される相に対して分離される化合物の最大分配を達成するように選択されることを特徴とする、請求項１−７の何れかに記載の方法。
【請求項１０】  １つまたはそれ以上の物質が、システムＡ中に存在し、その物質は、分離される化合物の、ステップ(ii)中に回収される相への分配の改善能を有することを特徴とし、当該物質は、ステップ(ii)において回収される相へ分離される化合物の最大分配を達成するように型および濃度に関して適応させられていることを特徴とする、請求項１−９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】  分離される化合物が電気的に荷電しており、少なくとも１つまたはそれ以上の物質が化合物の分配を改善する対イオンを含む塩であることを特徴とする、請求項１０の方法。
【請求項１２】  少なくとも１つの当該物質が、相１の親和性を有する界面活性剤であることを特徴とする、請求項１０−１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】  分離される化合物が、オリゴ−またはポリペプチドまたはタンパク質のようなペプチド構造を示すことを特徴とする、請求項１−１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】  ミセル形成熱分離性ポリマー(I)が、同一または異なり得る親水性モノマー単位の中央ポリマー部分を呈示するものから選択され、各末端が疎水性基であることを特徴とする、請求項１−１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】  各親水性モノマー単位が、少なくとも１／４、好ましくは少なくとも１／３である、酸素原子数と炭素原子数の間の割合を示し、疎水性基において多くとも１／５である酸素原子の数と炭素原子の数との間の割合を示すことを特徴とする、請求項１４の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、熱分離性ポリマーを含む少なくとも１つの相を含む水相システムの分離に関する。分離される化合物は、例えば、脂質、ペプチドおよび／または炭水化物構造を有する生物学的性質(生体分子)であり得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
多くの熱分離性ポリマーには、エチレンオキシド群が含まれる。ＰＥＧ自体が一例であるが、その曇点は、生体物質の分離用の熱分離工程での使用には温度が高過ぎる(１００℃以上)。エチレンオキシド(ＥＯ)−プロピレンオキシド(ＰＯ)ランダムコポリマーは、より低い曇点を有する。Ucon 50 HB-5100およびBreox 50A 1000は、５０％ＥＯおよび５０％ＰＯ群を構成するランダムコポリマーである(ＥＯＰＯ−ポリマー)。両方のコポリマーは、５０℃のＬＣＳＴを有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
種々のＥＯ／ＰＯ比を有するポリマーの相システムが、タンパク質の分離において研究されてきた(Harris et al., Biosep. 2 (1991) 237-246; Alred et al., J. Chromatogr. 659 (1994) 289-298; Persson et al., J. Chromatogr. 711 (1998) 97-109; Berggren et al., J. Chromatogr. A 718 (1995) 67-79; Johanssson et al., Biochim. Biophys. Acta 1290 (1996) 289-298)。ＥＯおよびＰＯ単位(Pluronics)のブロックからなる熱分離性ポリマーおよび酵素の分離におけるその使用が述べられている(Tani et al., Analytical Science 13 (1997) 925-929および14 (1998) 875-888)。Taniらにより使用されたポリマーは、中央に親水性ＥＯブロックおよび末端部分に疎水性ＰＯブロックを有する、またはその逆を有する(ＥＯＰＯブロックコポリマー)。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ミセル形成および非ミセル形成ポリマー
熱分離性ポリマーのミセル形成特性は、ポリマー濃度が純水およびポリマーからなる溶液中で変化するとき、曇点変化に反映する。図１参照：実験で使用したBreox PAG 50A 1000(International Speciality Chemicals Lt, Southampton, U.K.)が僅かに凹状に湾曲し、疎水性に修飾したエチレンオキシドプロピレンオキシドランダムコポリマー(ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー)が激しく凹状に湾曲していることは、Breoxがミセルを形成せずＨＭ−ＥＯＰＯポリマーがミセルを形成することを部分的に反映している。単純性のため、および本発明の好ましい様式の文書において、ミセル形成熱分離性ポリマーは、ＬＣＳＴの濃度で水と混合し、この温度を低温から高温に温度上げるとき、２つの相(その両方は、少なくとも７０％、８０％程の水濃度を有する)を得ることができるポリマーである。これらポリマーの多くは、ＬＣＳＴで明白な最小を示す。図１のＨＭ−ＥＯＰＯポリマー(ミセル形成)のカーブをBreox(非ミセル形成)と比較する。非ミセル形成ポリマーは、ミセル形成ポリマーの定義とは対応しない水溶性／水混和性ポリマーである。上記および下記のパーセンテージの値は、特記しなければ、ｗ／ｗに基く。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
非ミセル形成ポリマーは、通常、ミセル形成ポリマーと不適合であり、このため非ミセル形成ポリマーはしばしば水とミセル形成ポリマーの混合物に対して曇点低下試薬として作用し、そして逆に、水と非ミセル形成ポリマーの混合物にミセル形成ポリマーを導入しても同様に作用する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
熱分離性ポリマー(Ｉ)(ミセル形成ポリマー)
システムＡのポリマー(Ｉ)の総量は、通常、最大でも５０％である。本発明の最も重要な利点の１つは、ポリマー(Ｉ)の我々の選択が２０％未満、さらに１０％未満(ｗ／ｗ)の濃度とし得ることである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
有用なミセル形成熱分解性ポリマーは、９０℃以下、好ましくは５０℃以下、例えば４０℃以下または２０℃以下であるＬＣＳＴを典型的に有する。オリゴ−またはポリペプチド構造を有するタンパク質および他の化合物は、しばしば、熱感受性であり、そのため、４０℃以下または２０℃以下のＬＣＳＴを有するポリマーが必要となる。他方では、脂質または炭水化物を有する化合物は、しばしば、より熱に安定であり、９０℃までまたはそれよりも高いＬＣＳＴを有するミセル形成熱分離性ポリマーの使用が可能である。より低いＬＣＳＴを有するポリマーは、実質的な理由(加熱の必要が少ない)のためにより高いＬＣＳＴを有するポリマーよりも好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
ポリマーの中央部分は、直線状であるかまたは分枝状の鎖であり得る。中央部分は、多くの異なるまたは同一のサブユニットからなり、それぞれは、上記のような親水性モノマー単位の直鎖からなり、各サブユニットは他のサブユニットと２価架橋(divalent bridge)(サブユニット部分ではなく全体でポリマーに水不溶性を付与するわけではない)で結合している。当該架橋は、直線状、分枝状または環状の２価Ｃ２−６−炭化水素基、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＲ１−、−ＣＯＯ−、−ＮＲ２Ｒ３−、−ＳＯ２ＮＲ１−、−ＯＣＯ−、−ＮＲ１ＣＯＮＲ２−、−ＮＲ２ＣＯＯ−[式中、Ｒ１−３は、水素、ならびに１−１２炭素原子を含む低級炭化水素、例えばＣ１−１２−アルキル、−アリールアルキルおよび−アルキルアリールから選択される]から選択される１つまたはそれ以上の構造エレメントを含み得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
ポリマー(II)は、例えば、低いミセル形成傾向を有することにより、ポリマー(Ｉ)に不適合であるポリマーから選択され得る。例は、セルロース、デキストラン、デンプンなどのようなポリサッカライド（それは、必要ならば、適当に誘導および／または断片化し得る）、末端を誘導体化していないエチレンオキシドとプロピレンオキシドの間のランダムまたはブロックコポリマー、ポリエチレングリコールである。ポリマー(II)は、例えば、Galaevら(Enzyme Microb. Technol. 15 (1993) 354-66)により得られたもののから選択される、ポリマー(Ｉ)に不適合である熱分離性ポリマーであり得る。登録商標Breox、UconおよびPluronicsで販売されているポリマーについての上記考察もまた参照。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
曇点上昇試薬
例は、脂肪族アルコールであり、荷電界面活性剤などである。この型の試薬は、通常、システムの曇点を上げるためだけに加えるのではなく、それらが有する幾つか他の性質を利用するために加えられる。例えば、荷電界面活性剤が、分離されるべき化合物の特定相への好ましい分配に使用され得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
分離されるべき化合物が陽性に荷電している場合、比較的大きい(低濃度の荷電)陰イオンを含む塩は、より疎水的な相、この場合相１(ポリマー(Ｉ)を多く含む)への分配を改善し得る。典型例は、ハリドイオン(Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−など)、ＳＣＮ−、ＣｌＯ４−および例えばカルボン酸陰イオン基、スルホン酸陰イオン基(例えばドデシルスルホン酸)、硫酸陰イオン基、ホスホン酸陰イオン基、リン酸陰イオン基を含む陰イオン性界面活性剤を含む塩である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
最も低濃度の熱分離性ポリマー(Ｉ)を有する相(＝相２)への荷電化合物の分配を改善したい場合、分離されるべき化合物に対し可能性ある対イオンが少量であり、高濃度の荷電を有する水溶性塩を選択すべきである。この場合、陽性荷電化合物の分離に使用する典型的な塩は、ＰＯ４３−、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、ＳＯ４２−、ＡｃＯ−のような陰イオンおよび陰性荷電親水性ポリマー、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、ホスホン酸基、リン酸基のような陰イオン含有基を含むデキストラン、デンプンである。この場合、陰性荷電化合物の分離に使用される典型的な塩は、陽イオンが第一級、第二級、第三級および／または第四級アンモニウム基(−＋ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４[式中、Ｒ１−４は、ＨおよびＣ１−１２アルキル基、好ましくはＨまたはあるＣ１−１２アルキル基から選択される])を示す親水性ポリマーである塩である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
ステップ(ii)で回収される相および更なる処理
この相は、添加成分がどのように選択されるかおよび分離されるべき化合物の分配後の結果に依存して相１または相２の何れかである。特定の環境下では、例えば、粗開始サンプルが異なる相に優先性を有する２つの望ましい化合物を含むとき、相１および相２の両方が回収され、更に処理される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本目的が、精製型でステップ(ｉ)で分離される化合物である場合、ポリマー(ポリマー(Ｉ)またはポリマー(II)のいずれか)が少ない相、すなわち水相中に化合物が存在するように相システムの成分を選択することが、しばしば有利点となる。これは、当該化合物を相２へ、または、ポリマー(II)を多く含む場合、相２：２または相１：２へ向かわせることを意味する。これを達成するため、上記と同じ原理が、ポリマー(Ｉ)および／またはポリマー(II)の再利用を伴うかまたは伴わずに適用され得る。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
実験部分
物質および方法
物質：使用するＨＭ−ＥＯＰＯポリマーは、ジイソシアン酸イソホロンの各イソシアネート基を有する各鎖の一端基の反応から誘導される中央基に隣接するエチレンオキシドおよびプロピレンオキシド鎖のランダムコポリマーである。残りの端の両方には、Ｃ１４Ｈ２９アルキル基が存在する。合成の場合、ＥＰ２６０４３０参照。使用するポリマーの分子質量は、約７５００−８０００Ｄａであった。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーは、Akzo Nobel, Stenungsund, Swedenから得た。無脂肪酸ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)は、Boehringer Mannheim, Mannheim, Germanyから得、ニワトリの卵のリゾチームは、Sigma Chemicals Co, St Louis, MO, U.S.A.から得た。精製されたアポリポタンパク質Ａ−１は、Pharmacia & Upjohn, Stockholm, Swedenから頂き、それは、組換え体変異体、Milanoであり、通常のモノマー型とは対照的な二量体である(Persson et al., J. Chromatog. 711 (1998) 97-109)。すべての塩は、分析用の品質である。Millipore水をすべての溶液に使用した。リン酸トリエチルアンモニウムのストック溶液を、リン酸をトリエチルアンモニウムに滴下することにより調製した。トリエチルアンモニウムリン酸塩溶液塩は、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートと略する。ヒトの血漿およびE.coli抽出物はPharmacia & Upjohn, Stockholm, Swedenから頂いた。ヒトの血漿は、通常のモノマー型のアポリポタンパク質Ａ−１を含んでいた。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
塩分配の研究
塩の分配は、無タンパク質システムにおける伝導率測定で測定した。ポリマー濃度は４％(ｗ／ｗ)であり、システム中の塩濃度は５０ｍＭであった。Ｎａ−ホスフェートを含む当該相システムは、２２℃で分離し、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートおよびＮａＣｌＯ４を有するシステムは、２７℃で分離した。ｐＨ７のＮａ−ホスフェートおよびＥｔ３ＮＨ−ホスフェートは陰イオンＨ２ＰＯ４−およびＨＰＯ４２−を含む。当該サンプルを、水浴中で一晩静置し、分離した。使用する伝導率測定器はMetrohm 644 (Herisan, Switzerland)であった。すべてのシステムについて２つ調製し、平均値をとった。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
E. coli抽出物からのアポリポタンパク質の精製
組換えアポリポタンパク質Ａ−１、変異型MilanoをE. coli発酵で発現させた。アポリポタンパク質Ａ−１はペリプラズム空間に運搬され、続いて発酵ブロス中に得られた。細胞を凝集および続く遠心により除去した。アポリポタンパク質Ａ−１を含む上清を、１００００Ｍｒカットオフの膜を使用した限外濾過で８倍に濃縮した(Persson et al., J. Chromatog. 711 (1998) 97-109)。限外濾過後のアポリポタンパク質の濃度は２.５ｍｇ／ｍｌ（ELISAアッセイで測定)、総タンパク質濃度は２７ｍｇ／ｍｌであった(Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254)にしたがって決定)。このE. coli抽出物中の緩衝液は２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１％  Tween 80であった。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー水システムにおける精製を、７.０ｇシステムで行った。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー濃度は４％(ｗ／ｗ)であり、E. coli抽出物１.０ｇを３.７ｇの上記緩衝液に加えて添加した。システム中の総タンパク質濃度は４ｍｇ／ｍｌであり、アポリポタンパク質Ａ−１濃度は０.４ｍｇ／ｍｌであった。システムのｐＨは混合システムで測定して７.５であった。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
結果
水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステム
水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー(■)および水／Breox PAG 50A 1000システム(●)に関する温度対ポリマー濃度相ダイアグラムを図１に示す。相分離は温度の上昇により誘導する。共存曲線の上で溶液相は二つの肉眼で見える相に分離する。形成された層は両方とも水性であり、一つはポリマーに富み、他方はポリマーが少ない(図１)。共存曲線の最小である低臨界点は３％ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーおよび１４℃である。数個の試験された熱分離性水／ポリマーシステムとは異なり(Saeki et al., Polymer 17 (1976) 685-; Karlstroem, J. Phys. Chem. 89 (1985) 4962-; Johansson et al., Macromolecules 26 (1993) 4478-; およびNystroem et al., Langmuir 11 (1995) 1994-2002)、水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステムは相分離のポリマー濃度への強い依存性を示し、即ち、共存曲線が明白な凹状上部形を有する。ポリマー富化相はＥＯおよびＰＯの他の熱分離性ランダムコポリマーと比較して、高濃度の水を含む(Johansson et al., Macromolecules 26 (1993) 4478-; およびJohansson et al., Biochim. Biophys Acta 1290 (1996))。１７から３０℃の間で、ポリマー富化相中のポリマー濃度は５−９％であり、水相中でポリマー濃度は１％以下である。水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステムは先に試験された熱分離性水／Ｕｃｏｎシステムよりも、より高い粘性を示す。ポリマーの相対的に高い粘性は、注意深い混合および長い平衡時間を必要とする。試験した全てのシステムにおいて、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相は下部相であり、水相は上部相であった(図２および図３)。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
ｃ)リゾチーム、ｐＩ１１.０(Righetti et al., J. Chromat. 220 (1981) 115-194)は、ＮａＣｌＯ４が存在するとき、ポリマー富化相に最も強く分配した(Ｋ＝０.６)。ポリマー富化相への優勢は、しかし、この場合、アポリポタンパク質Ａ−１よりも弱かった。ＢＳＡの場合には、塩Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートとリン酸ナトリウムは同様の分配係数を提供し、リゾチームは水に分配された。酵素活性の有意な損失はこれらのシステムで見られなかった。上部および底部相で一緒に回収されたリゾチーム活性は、ＮａＣｌＯ４、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートおよびＮａ−ホスフェートシステムで１０２、１０３および１０３％であった。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
ＢＳＡの分配におけるｐＨの効果
これらの実験におけるシステムの組成は４％(ｗ／ｗ)ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー、１００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ緩衝液および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡであった。使用した緩衝液はクエン酸ナトリウム(ｐＨ３.０)、酒石酸ナトリウム(ｐＨ５.０)およびリン酸ナトリウム(ｐＨ６.０および７.０)であった。分離後に上部相で測定したｐＨ値は各々３.３、４.３、５.０、６.０および７.０であった。非荷電(ｐＨ５.０)および陰性荷電(５.０を越えるｐＨ)ＢＳＡは、水相により分配した。ＢＳＡの等電点以下の分配係数の劇的な減少があった、ｐＨ＝５.０でＫ＝１.９、ｐＨ４.３でＫ＝０.０３およびｐＨ３.３でＫ＝０.０１。異なる塩の低いｐＨでの効果を比較するために、唯一の塩としてＮａ−ホスフェート(１００ｍＭ)を有する水／BermodolシステムにおけるＢＳＡの分配を行った。ｐＨは４.３であり、このシステムのＫ値は１.２±０.１であった。したがって、フォスフェートからＣｌＯ４−へのアニオンの変化は、ポリマー富化相への非常な分配をもたらした。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
逆抽出
ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相から水相への逆抽出の技術を純粋アポリポタンパク質Ａ−１で試験した(図２の原理参照)。このタンパク質を４％ＨＭ−ＥＯＰＯ−水システムに分配し、２７℃で分離した。システム中の塩および緩衝液は２０ｍｍ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７.４、１５０ｍｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１％  Tween 80であった。アポリポタンパク質Ａ−１は、２７℃でＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配した(Ｋ＝０.０１５±０.００５)。９６±のアポリポタンパク質Ａ−１がこの相で検出された。上部水相を回収し、等量の１０ｍＭ  Tris−Ｈｃｌ緩衝液ｐＨ８.５および１００ｍＭのＮａＣｌＯ４と交換した。システムを混合し、再び５０℃で２０分分離させた。この処理の後、先にＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に分配していたタンパク質の９４±１％が、新規水相に分配係数Ｋ＝４.０±１.０で逆抽出された。したがって、タンパク質の総回収は９０±１％であった。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
ヒト血漿からのアポリポタンパク質の精製
ヒト血漿を、水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステム中での分配によるアポリポタンパク質Ａ−１の単離のためのタンパク質溶液として使用した。１００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４の添加をしたシステム、および余分の塩を添加しなかった他のシステムを試験した。アルブミン、ｐＩ４.８(１８)はヒト血漿で優位なタンパク質であり、ヒトアルブミンはＢＳＡと非常に類似した分配行動を有すると予期された。したがって、ＮａＣｌＯ４をアルブミンを水相に向かわせるために添加した。相分離を２６℃で８０分行った。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ゲル電気泳動からの結果は、アポリポタンパク質Ａ−１が殆ど排他的にポリマー富化相に分配され、アルブミンは水相に優勢に分配されたことを示す。ＮａＣｌＯ４の添加ありまたはなしのシステムで比較したとき、総タンパク質の分配に殆ど変化はなかった、各々Ｋ＝５.６±０.５およびＫ＝４.７±０.５。アポリポタンパク質Ａ−１に関して、対応する分配係数は各々０.０９±０.０１およびＫ＝０.０８±０.０１であった。約７の精製係数が、アポリポタンパク質Ａ−１の、水／ＨＭ−ＥＯＰＯシステムにおけるＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相への抽出により達成された。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
E. coli抽出物からのアポリポタンパク質の逆抽出による精製
E. coliの無細胞発酵溶液からの組換えアポリポタンパク質の精製を試験した。E. coli抽出物を４％水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステムに分配した。システムにおいて、２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ  ｐＨ７.４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１％  Tween 80を含む緩衝液を使用した。システムを６０分、３０℃で水浴中で２相に分離させた。表４において、第１の抽出システムにおけるアポリポタンパク質の分配係数を示し、Ｋ＝０.０４±０.０１である。アポリポタンパク質はＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配し、より親水性の汚染タンパク質は、水相に分配された。アポリポタンパク質Ａ−１は、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相への分配により約７倍(７±２)精製され、この相からのタンパク質の回収は９５％以上であった。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
２ポリマー２層システム
分離実験において、水、ＨＭ−ＥＯＰＯおよびBreox PAG 50A(International Speciality Chemicals Ltd, Southhamptoin, U.K.)から形成される２層システムを試験した。Breox PAG 50A 1000は等量のエチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイドのランダムコポリマーであり、相対的に高い曇点(１０％濃度でＬＣＳＴ５０℃)を有する。温度をコポリマー曇点以上に上げることにより、両方のコポリマーを相分離することが可能である。図３参照。ＰＥＧ／デキストランシステムと比較して、相対的に低い濃度のコポリマーが２層の形成に必要である(各コポリマー２％(ｗ／ｗ))。Breox／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーから成る水性２相システムは、タンパク質の分離に使用できる。ＢＳＡとリゾチームの分離は、ＰＥＧ／デキストランシステムと類似の方法における塩添加により指示できる。両親媒性アポリポタンパク質Ａ−１はＨＭ−ＥＯＰＯポリマーにより形成されたミセルと相互作用し、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配する。上部Breox相および底部ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相の熱分離後、水溶液中のタンパク質の回収およびコポリマーの回収と再利用が可能である。熱分離後、９７.５％のＨＭ−ＥＯＰＯポリマーおよび７３％のBreoxコポリマーが回収できた。アポリポタンパク質Ａ−１は、無細胞E. coli発酵溶液からＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に抽出できた。再利用コポリマーのシステムは、３つのポリマー再利用の間、類似の精製係数を示した。
製品名：Breox、Ucon、Triton、Tween、Metrohm、Phast SystemおよびCoomassieは商標登録されている。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  水／ＨＭ−ＥＯＰＯシステム(●)および水／Breox PAG 50A 100(■)に関する実験的に測定した相ダイアグラム。
【図２】  水／ポリマー水性２相システムにおけるタンパク質精製。標的タンパク質(白色点)をポリマー相(ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー)にポリマーの曇点(ＣＰＴ、１４℃)を越える温度で分配する。汚染タンパク質(黒色点)は主に水相に分配する。相を分離し、逆抽出のために新規水相をポリマー相に添加する。ｐＨ(および／または塩)を変え、熱分離を第１抽出よりも高い温度で行う。標的タンパク質は水相に逆抽出し、ポリマーは再利用される。
【図３】  熱分離性ポリマーを有する水性２相システムにおけるタンパク質分離およびポリマーの再利用。最初に、ポリマーBreox PAG 50A 100およびＨＭ−ＥＯＰＯポリマーから成る水性２相システムを混合する。相分離後、上部Breooxおよび底部ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相を単離し、ポリマーの曇点を越える温度の水浴に移す。これは水相およびポリマ富化相の形成を導く。水相の回収後、ポリマーを回収し、新規水性２層システムに再使用できる。