(57)【要約】  形態の制御が可能で、且つ鋳型分子の選択性及び捕捉効率に優れた新規の分子識別材料、及びその簡便な製造方法を提供する。  すなわち、本発明にかかる分子識別材料は、コア粒子表面にシェル層を備えたコア−シェル粒子であり、前記シェル層に鋳型分子がインプリントされていることを特徴とする。  また、本発明にかかる分子識別材料の製造方法は、下記工程を含むことを特徴とする。（ａ）コア粒子表面にイニファータ基を導入する工程、（ｂ）（ａ）工程後、鋳型分子を前記コア粒子表面に吸着させる工程、（ｃ）（ｂ）工程後、前記コア粒子表面にシェル層を形成する工程。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア粒子表面にシェル層を備えたコア−シェル粒子であり、前記シェル層に鋳型分子がインプリントされていることを特徴とする分子識別材料。
【請求項２】
前記コア粒子が、単分散ポリマー微粒子であることを特徴とする請求項１に記載の分子識別材料。
【請求項３】
前記鋳型分子がタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の分子識別材料。
【請求項４】
下記工程を含むことを特徴とする請求項１〜３に記載の分子識別材料の製造方法。
（ａ）コア粒子表面にイニファータ基を導入する工程、
（ｂ）（ａ）工程後、鋳型分子を前記コア粒子表面に吸着させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程後、前記コア粒子表面にシェル層を形成する工程、
を含むことを特徴とする分子識別材料の製造方法。
【請求項５】
さらに、
（ｄ）（ｃ）工程後、前記粒子から鋳型分子を溶出させる工程、
を含むことを特徴とする請求項５に記載の分子識別材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００７年  ８月３０日付け出願の日本国特許出願２００７−２２４７７２号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は分子識別材料及びその製造方法に関し、特にその識別性及び捕捉性の改善に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体には、例えば、肺の膜が吸入された空気から酸素のみを選り分けるという、いわゆる分子識別能が備わっている。このように分子を特異的に識別する能力を人工的に付与した材料を創り出す試みは、従来盛んに行われてきた。分子識別材料は、その特定の分子のみを探知、選別、吸着ないし放出させる等の様々な機能の利用において、医療、美容、食品等をはじめとする多岐の分野に応用が予想され、その完成が強く望まれている。【０００４】
特に近年、分子識別能力を有する機能性高分子材料の創製に向けた研究が盛んに行われており、その開発手法のひとつとして「分子インプリント法」への注目が高まっている。
分子インプリント法とは、分子識別のターゲット分子（鋳型分子）とモノマーとの混在下で架橋高分子を作製した後に鋳型分子を取り除くことで、その形状や性質といった情報を高分子の網目に記憶させるといった非常に簡便な手法であり、これにより得られた鋳型分子を選択的に吸着（捕捉）することが可能であるインテリジェントゲルは高選択的・高感度な分離やセンサー、触媒などへの応用が期待されている。【０００５】
例えば、Derekらは、ターゲット分子としてBovine hemoglobin (BHb)を用い、acrylamide (AAm)との混在下でpolyacrylamide hydrogelsを作製している（非特許文献１）。ここで、アクリレート系の窒素含有ポリマーであるPAAｍは、水溶性であり安価、そして容易に生成でき、さらには魅力的な構造パラメータを有するように設計されているため、生体分子をインプリントする基板として適当であることが報告されている。次いで、前記polyacrylamide hydrogelsよりBHbを取り除くことでゲル内にBHbのインプリント空隙を有するHydrogel-based molecularly imprinted polymers (hydro MIPs)を作製し、これが他の構造類似体に比べBHbに対して高い選択性をもつことを示している。【０００６】
しかしながら、従来の分子インプリント法により得られるバルクゲルにおいては、そのインプリント空隙が形成される場を制御することは困難であった。３次元網目構造のゲル内部に形成されたインプリント空隙で鋳型分子の捕捉を行うには、鋳型分子がゲルに接近するだけでなく、その内部に侵入することが必須となる。タンパク質等のある程度分子量が大きな高分子を鋳型分子に用いた場合、タンパク質をゲル内部へ侵入させることは容易ではない。すなわち、より効率的な鋳型分子の捕捉を実現するには、インプリント空隙が材料の最表面もしくはその近傍に制御された形で存在していることが望ましい。【０００７】
そこで、Wangらは、ナノ多孔性アルミナの孔壁（内壁）にBHbを固定化し、次いでAAｍとN,N'-methylene-bis-(acrylamide)(MBAAm)の混合物で孔内を満たし重合を行った。その後、アルミナ膜を除去することで、最表面近傍のみにインプリント空隙を有する細いチューブ状のポリマーを作成し、高い選択性で効率よく鋳型分子を捕捉することを実現している（非特許文献２）。
しかしながら、前記技術はインプリント空隙の位置を制御することを可能にしたものの、ポリマー粒子の形やサイズはアルミナ孔に依って不均一にならざるを得なかった。
このように、分子認識材料の作製については従来盛んに研究が続けられているが、粒子形態の制御と、該粒子表面へのインプリント空隙形成とを両立するという問題点が未解決であるゆえに、いまだ産業利用に至っていなかった。
【非特許文献１】Derek et al., Anal. Chim. Acta, 542, 61-65 (2005)
【非特許文献２】Wang et al., Anal. Chem, 78, 317-320 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はこのような背景において行われたものであり、形態の制御が可能で、且つ鋳型分子の選択性及び捕捉効率に優れた新規の分子識別材料、及びその簡便な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために本発明者らが鋭意検討を行った結果、基材となる粒子表面をポリマーからなるシェル層で被覆し、該シェル層に鋳型分子と相補的なインプリントを施すことで、粒子表面近傍に分子識別性の高いインプリント部位を備えた分子識別材料が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明にかかる分子識別材料は、コア粒子表面にシェル層を備えたコア−シェル粒子であり、前記シェル層に鋳型分子がインプリントされていることを特徴とする。
また、本発明においては、前記コア粒子が、単分散ポリマー微粒子であることが好適である。
さらに、前記鋳型分子がタンパク質であることが好適である。【００１０】
また、前記分子識別材料の製造方法は、下記工程を含むことを特徴とする。
（ａ）コア粒子表面にイニファータ基を導入する工程、
（ｂ）（ａ）工程後、鋳型分子を前記コア粒子表面に吸着させる工程、
（ｃ）（ｂ）工程後、前記コア粒子表面にシェル層を形成する工程。
前記製造方法は、さらに、
（ｄ）（ｃ）工程後、前記粒子から鋳型分子を溶出させる工程、
を含むことが好適である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、多様な鋳型分子に対する選択性および捕捉効率に優れた分子識別材料を容易に得ることができる。また、本発明にかかる分子識別材料は、その分子吸着・放出機能を利用して、例えば、特定物質の精製、不要な物質の選択的な除去、有用な物質を保持・放出する担体としての使用等、様々な分野において応用することができる。また、従来分子識別材料に期待されてきたドラッグデリバリーなどにも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明にかかる分子識別材料の構造を模式的に表した図である。
【図２】Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（ＮａＤＣ）溶液の検量線を示すグラフである。
【図３】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるＳｔ−ＶＢＣ−ＡＡｍ共重合単分散微粒子（ＳＶＡ粒子）およびＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基を導入したＳＶＡ粒子（ＳＶＡ−ＤＣ粒子）の写真である。
【図４】ＳＶＡ−ＤＣ粒子のタンパク質吸着量を経時的に示したグラフである。
【図５】ＳＶＡ−ＤＣ粒子のタンパク質吸着量をタンパク質濃度ごとに示したグラフである。
【図６】ＴＥＭによるシェル層形成後のＳＶＡ−ＤＣ粒子の写真である。
【図７】分子識別粒子の電気泳動移動度（ＥＰＭ）および水中粒径を示したグラフである。
【図８】ＴＥＭによるＳＶＡ−ＤＣ粒子および、ＳＶＡ−ＤＣ粒子をコア粒子として表面にアクリルアミド（ＡＡｍ）を２０分重合させたコア−シェル粒子（ＳＶＡ−Ａ粒子）の写真である。
【図９】ＳＶＡ−Ａ一粒子あたりのウシヘモグロビン（ＢＨｂ）吸着量および溶出量を示したグラフである。
【図１０】分子識別粒子のタンパク質捕捉能を示したグラフである。
【図１１】ＳＶＡ−ＤＣ粒子へのＢＨｂ吸着量を示したグラフである。
【図１２】ＳＶＡ−ＤＣ粒子、ＳＶＡ−Ａ粒子、コントロール粒子について、ＤＳＬによる水中粒径測定、電気泳動移動度測定の結果を示したグラフである。
【図１３】コア粒子へのＢＨｂ吸着量に対するＳＶＡ−Ａ粒子からのＢＨｂ溶出量を示したグラフである。
【図１４】分子識別粒子（ＭＩＰ）及びコントロール粒子へのＢＨｂ吸着等温線を示したグラフである。
【図１５】ＢＨｂをインプリントしたＭＩＰの各種タンパク質の吸着挙動を示すグラフである。
【図１６】吸着系溶媒によるＭＩＰのタンパク質吸着量の変化を示すグラフである。
【図１７】ＢＨｂをインプリントしたＭＩＰの、タンパク質２成分系における各種タンパク質の吸着挙動を示すグラフである。
【図１８】ＢＨｂをインプリントしたＭＩＰの、タンパク質２成分系における各種タンパク質の吸着挙動を時間変化で示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明にかかる分子識別材料は、基材となる粒子に下記処理を施すことにより製造することができる。図１は各段階の粒子の構造を模式的に表したものである。
（１）粒子表面へのイニファータ基の導入（図１（Ａ））
（２）粒子表面への鋳型分子（ターゲット分子）の吸着（図１（Ｂ））
（３）粒子表面におけるリビングラジカル重合によるシェル層の形成（図１（Ｃ））。
（４）鋳型分子の溶出によるインプリント空隙の形成（図１（Ｄ））【００１４】
各段階については後述するが、本発明の製造方法を図１に沿って簡約すると、基材粒子に導入したイニファータ基を開始種とするリビングラジカル重合を行い、該粒子表面にポリマーをグラフト化する。すなわち、本発明にかかる分子識別材料は、基材粒子（コア粒子）の外層にポリマー（シェル層）をグラフトしたコア−シェル型粒子を基本構造としている。
ここで、本発明においては、前記シェル層のグラフトに先立ち、コア粒子に識別の対象となる鋳型分子を吸着させておくことにより、鋳型分子がシェル層にインプリントされた粒子を得ることができる。また、必要に応じて前記シェル層から鋳型分子を溶出させれば、鋳型分子に相補的なインプリント空隙を備えた分子識別材料を得ることも可能となる。【００１５】
以下、本発明の分子識別材料の構造を、上記処理段階に沿って説明する。
（１）粒子表面へのイニファータ基の導入
まず、基材となる粒子について説明する。
本発明にかかる分子識別材料の基材としては、後述するイニファータ基の導入が可能なものであれば制限はないが、特に、粒子サイズおよび形状がほぼ均一な単分散ポリマー微粒子を用いることが好ましい。単分散ポリマー微粒子は、公知の合成方法、例えば、ソープフリー乳化重合法、懸濁重合法、シード乳化重合法といったラジカル重合による合成方法に準じて、モノマーからなる混合物を開始剤の存在下で重合させることにより得ることができる。特に、本発明においては、粒径が制御された高純度の粒子が得られる点から、ソープフリー乳化重合による単分散ポリマー微粒子を用いることが好ましい。【００１６】
ソープフリー乳化重合法は、イオン性残基を有する開始剤を使用し、これが粒子表面に電荷を与えることで、乳化剤に代わって粒子を安定化させる。また、乳化重合より粒径分布を狭めることができるという利点もある。本発明のように粒子表面に官能基を導入し、粒子表面を機能化したり、表面を反応場として使用する場合には、特に清浄な表面を有する粒子を作製することが重要となる。
ソープフリー乳化重合では、溶媒を水とし、水に不溶のモノマーと、水溶性の開始剤を用いる。その粒子発生のメカニズムは、まず水溶性の開始剤が水にわずかに溶解しているモノマーと反応して水相で活性オリゴマーを生成する。このオリゴマーは、ある臨界の鎖長で水に不溶となり析出し、粒子の核となるオリゴマーミセルを形成する。析出後もオリゴマーは成長を続けるが、互いに合一・凝集して重合体粒子としての特性を満たすようになる。油滴として存在していた未反応モノマーはオリゴマーミセルに分配され、重合の場は水相から粒子核へと移り反応が進行する。反応の場が析出粒子に移った段階では、溶解モノマーと開始ラジカルとの開始反応は重要ではなくなり、たとえ起こったとしても速やかに既存の粒子核に吸収され、粒子数は一定となる。
微粒子の表面構造は、主として重合開始剤とコモノマーによって制御され、開始剤残基が粒子表面に局在する確率は、微粒子のサイズや高分子の分子量、開始剤残基の極性に依存する。親水性モノマーと疎水性モノマーのソープフリー乳化共重合では、重合中に親水性モノマーユニットが表面に集まり、微粒子は表面に形成される水和構造により安定性を得る。【００１７】
単分散ポリマー微粒子を形成するモノマーに制限はないが、微粒子表面にイニファータ基を導入することを考慮して、側鎖および／または末端に置換基を有するものを１種以上選択しておくことが好適である。
単分散ポリマー微粒子を構成するモノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ジメチルスチレン、モノクロロスチレン、ジクロロスチレン、４−ビニルベンジルクロリド、エチレン、１−ペンテン、３−メチル−１−ブテン、４−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、ビニルシクロヘキサン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロへキセン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキシメチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキシメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、メタクリルアミド、アクロイルモルホリン、アクリロニトリル、酢酸ビニル、ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカルバゾール、ビニルピリジン；アクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ｔ−ブチル、アクリル酸ｎ−ヘキシル、アクリル酸シクロペンチル、アクリル酸シクロへキシル、アクリル酸フェニル、アクリル酸２−ピリジル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アクリル酸２−メトキシエチル、アクリル酸２−エトキシエチル、アクリル酸ｎ−ラウリル、アクリル酸ｎ−ドデシル、アクリル酸ｎ−ステアリル、アクリル酸ベンジル、アクリル酸テトラヒドロフルフリル、アクリル酸グリシジル、アクリル酸アリル、アクリル酸エチルカルビノール、ジメチルアミノアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、アクリル酸ソーダ、等のアクリル酸およびアクリル酸エステル化合物；メタクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸ｔ−ブチル、メタクリル酸ｎ−ヘキシル、メタクリル酸シクロペンチル、メタクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸２−ピリジル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸２−メトキシエチル、メタクリル酸２−エトキシエチル、メタクリル酸ｎ−ラウリル、メタクリル酸ｎ−ドデシル、メタクリル酸ｎ−ステアリル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸テトラヒドロフルフリル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸アリル、メタクリル酸エチルカルビノール、ジメチルアミノメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、１，４−ブタンジオールジメタクリレート、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、グリセロールメタクリレート、メタクリル酸ソーダ、等のメタクリル酸およびメタクリル酸エステル化合物などのラジカル重合性モノマーを挙げることができる。
特に好適なモノマーとして、スチレン、４−ビニルベンジルクロリド（ＶＢＣ）、アクリルアミド、アクリル酸、グリセロールメタクリレートが挙げられる。また、側鎖および／または末端に置換基を有し、微粒子表面においてイニファータ基を導入させるためのモノマーとしては、４−ビニルベンジルクロリド（ＶＢＣ）、グリセロールメタクリレート等が好ましい。【００１８】
重合開始剤としては、上記粒子合成方法においてラジカル重合を開始し得るものであれば特に制限はなく、例えば、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（イソ酪酸）ジメチル等のアゾ系化合物の他、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸系重合開始剤が挙げられる。また、これらの重合開始剤によらずとも、光化学反応や、放射線照射等によっても重合を行うことができる。
重合温度は使用する開始剤の重合開始温度により設定し得る。例えば、過酸化物系重合開始剤では、通常７０℃程度とすればよい。
重合時間は特に制限されず、生成する粒子の大きさに合わせて、通常２〜２４時間程度の間で適宜調整することができる。【００１９】
本発明においては、特に、モノマーとしてスチレン（Ｓｔ）、４−ビニルベンジルクロリド（ＶＢＣ）、アクリルアミド（ＡＡｍ）を適用した単分散ポリマー微粒子が好適に用い得る。前記粒子の製造例を以下に示すが、本発明はこれに制限されない。【００２０】
（製造例）Ｓｔ−ＶＢＣ−ＡＡｍ共重合単分散微粒子（ＳＶＡ粒子）
撹拌棒、アリーン式冷却管、セラムラバー、攪拌シールを取り付けた３００ｍｌ四つ口丸底フラスコに、モノマーとしてスチレン（Ｓｔ）２．８５ｇ、４−ビニルベンジルクロリド（ＶＢＣ）０．１０ｇ、アクリルアミド（ＡＡｍ）０．０５ｇ、溶媒として水７５ｇを入れ、７０℃で３００ｒｐｍにて攪拌した。所定温度の恒温槽中で３０分間窒素置換を行った後、開始剤として過硫酸カリウム（ＫＰＳ）０．１ｇを水１０ｇに溶解させたものを注射器で系内に添加した。その後さらに３０分間窒素置換を行い、重合反応を２４時間行った。重合終了後のラテックス分散液は１３５００ｒｐｍ、１２分間、１５℃の条件で遠心分離を行い、上澄みをデカンテーションにより除去した後、下層の粒子を水で再分散させる操作を４回繰り返して精製し、粒子分散液を得た。【００２１】
上記製造例は、開始剤を過硫酸カリウムとし７０℃の条件でソープフリー乳化重合を行うものである。アクリルアミドのモノマーユニットおよび電荷のある開始剤末端は親水性であるために成長過程において粒子内部に侵入せず、粒子の表面に留まっている。このため、得られる微粒子（ＳＶＡ粒子）は、表面に開始剤由来の負電荷を有し、静電反発力によって分散安定性を得ている。また、親水性であるアクリルアミドのモノマーユニットが粒子表面に存在することで、スチレン由来の疎水的な場の粒子表面への露出を少なくする、シェル層導入の際の反応の足場となる、などの役割が期待できる。【００２２】
また、上記製造例を含め、本発明に使用する基材粒子の形態及びサイズは、分子識別材料の使用目的や識別する分子の性質等により、粒子の製造において適宜調整して用いることができる。本発明の基材粒子として好ましくは、粒径が０．０５〜２μｍ、さらに好ましくは０．１〜０．５μｍのほぼ均一な球状粒子である。【００２３】
続いて、このように得られた粒子の表面に、イニファータ基（iniferter基）を導入する。イニファータとは、１９８２年にＯｔｓｕらによって提案された、開始剤への連鎖移動（ＣＴ）および／または一次ラジカル停止（ＰＲＴ）能をもつラジカル開始剤である。イニファータは、このようなリビングラジカル重合開始剤としてだけでなく、抑制剤、重合停止剤、連鎖移動剤としても機能し、これを利用することにより、後述のシェル層形成にかかるグラフト重合を制御することが可能となる。
すなわち、イニファータ基の導入とは、前記イニファータ機能を有する官能基の導入、延いては、シェル層形成の開始種を導入することを意味する。【００２４】
リビングラジカル重合の開始種となるイニファータ基としては、光、熱、または金属錯体の添加によりラジカルを生じる官能基がある。
紫外線によりラジカルとなる官能基（光イニファータ）の例として、Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバメート基、Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルジチオカルバメート基、Ｎ，Ｎ−ジメチルフェニルジチオカルバメート基、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルジチオカルバメート基、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルジチオカルバメート基、Ｎ−メチル−Ｎ−メチルフェニルジチオカルバメート基、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルジチオカルバメート基、Ｎ−エチル−メチルフェニルジチオカルバメート基、Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチルフェニルジチオカルバメート基等が挙げられる。
熱によりラジカルとなる官能基（熱イニファータ）の例として、１，１，２，２−テトラフェニルエタン誘導体があり、例えば１−メチル−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−エチル−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−ヒドロキシ−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−メトキシ−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−エトキシ−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−ベンジルオキシ−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−シアノ−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−カルボキシエチル−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基、１−トリメチルシリルオキシ−１，１，２，２−テトラフェニルエチル基等が挙げられる。
また、金属錯体の添加によってラジカルを生成する、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）による開始種の官能基としては、ハロゲン化アルキル誘導体があり、ハロアルカン類、ハロケトン類、ハロニトリル類、ハロエステル類、ハロアルキルベンゼン類などがある。【００２５】
本発明においては、いずれの種類のイニファータ基を導入することも可能であるが、低温下で重合反応を進めることのできる点で、特に光イニファータ基の適用が好ましい。熱イニファータ基の場合、加熱により重合が開始されることから、タンパク質を鋳型分子とした際に熱変性を誘起してしまうことがある。【００２６】
粒子表面への上記イニファータ基の導入は、粒子の有する置換基と、イニファータ基を有するイニファータ化試薬とを、水系溶媒中において撹拌下で反応させることにより行なわれる。反応後、溶媒を除去すれば、表面にイニファータ基を備えた粒子を得ることができる。
イニファータ化試薬としては、例えば、カルバメート系化合物、アミノキシル化合物、セレン化合物、ジセレニド化合物およびジフェニルエタン誘導体が挙げられる。【００２７】
カルバメート系化合物としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート、ｎ−ブチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバメート、ベンジルジチオカルバメート、ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバメート、ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート、チウラムモノスルフィド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチウラムモノスルフィド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルチウラムモノスルフィド、Ｎ，Ｎ’−ジエチルチウラムモノスルフィド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルチウラムモノスルフィド、チウラムジスルフィド、Ｎ，Ｎ−ジメチルチウラムジスルフィド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルチウラムジスルフィド、Ｎ，Ｎ’−ジエチルチウラムジスルフィド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチウラムテトラスルフィド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド、ｐ−キシレンビス（ジチオカルバメート）、ｐ−キシレンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバメート）、ｐ−キシレンビス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート）、１，２−ビス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）エタン、１，２−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバミル）エタン、１，２，３−トリス（Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバミル）プロパン、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン、１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）エチルアセテート、またはそれらの塩、ないしはその水和物等が挙げられる。
また、前記化合物として、下記構造式で示されるジメチルジチオカルバメート基を有するポリエチレンオキシド誘導体（ＰＯＥ２Ｋ）を用いることができる。
【化１】
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【００２８】
アミノキシル化合物としては、例えば、（（２’，２’，６，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）メチル）ベンゼン、１−フェニル−１−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）エタン、１−（４’−ブロモフェニル）−１−（２”，２”，６”，６”−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）エタン、１−ナフチル−１−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１”−ピペニルジニルオキシ）エタン、１−フェニル−１−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）プロパン、１−（ベンジルオキシ）−２−フェニル−２−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）エタン、１−ヒドロキシ−２−フェニル−２−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）エタン、フェニル−４−シアノ−４−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）ペンタノアート、ペンタフルオロフェニル−４−シアノ−４−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）ペンタノアート、３−フェニル−１−（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）プロパン、１−（（２’，２’，６’，６’−テトラメチル−１’−ピペリジニルオキシ）メチル）−４−（トリフルオロメチル）ベンゼン、またはそれらの塩、ないしはその水和物等が挙げられる。【００２９】
セレン化合物としては、例えば、ベンジルフェニルセレニド、ｐ−メチルベンジルフェニルセレニド、ｐ−エチルベンジルフェニルセレニド、ベンジルトリルセレニド、キシレニルジフェニルジセレニド、キシレニルジトリルジセレニド等が挙げられる。【００３０】
ジセレニド化合物としては、例えば、ジフェニルジセレニド、ジトリルジセレニド、ジ−（ｐ−クメニル）ジセレニド、ジ−（１−ナフチル）ジセレニド、ジ−（２−ナフチル）ジセレニド、ジ−（ｐ−ｔ−ブチルフェニル）ジセレニド、またはそれらの塩、ないしはその水和物等が挙げられる。【００３１】
ジフェニルエタン誘導体としては、例えば、１，２−ジシアノ−１，２−ジフェニルコハク酸ジエチル、３，４−ジメチル−３，４−ジフェニルヘキサン、３，４−ジエチル−３，４−ジフェニルヘキサン、４，５−ジメチル−４，５−ジフェニルオクタン、２，３−ジメチル−２，３−ジフェニルブタン、２，２，３，３−テトラフェニルブタン、１，２−ジシアノ−１，１，２，２−テトラフェニルエタン、３，３，４，４−テトラフェニルヘキサン、またはそれらの塩、ないしはその水和物等が挙げられる。【００３２】
本発明においては、特にＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートまたはＰＥＯ２Ｋを用い、粒子上にＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基を導入することが好適である。
例えば、前記製造例によるＳＶＡ粒子に光イニファータ基Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基を導入する場合、ＳＶＡ粒子の表面に存在するＶＢＣ残基のクロロメチル基にイニファータ化試薬を反応させると、粒子表面に光イニファータ基が導入される。
具体的には、ＳＶＡ粒子にイニファータ化試薬としてＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（ＮａＤＣ）を作用させ、下記の置換反応を経て粒子表面にＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基を導入することができる。【００３３】
2009028661.tif 000004
【００３４】
（２）粒子表面への鋳型分子の吸着
次に、イニファータ基を導入した前記粒子へ、識別のターゲットとなる分子、すなわち鋳型分子を吸着させる。
鋳型分子となる分子は、タンパク質が好適であるが、その他の天然または合成化合物、さらにウイルス等であってもよい。
鋳型分子となる分子のサイズは、吸着させる基材粒子の大きさや形状にもよるが、単体で１〜２０ｎｍ程度が好ましい。また、特に分子量５００〜１００万のタンパク質が好適に使用され得る。
鋳型分子が大きすぎると、基材粒子への鋳型分子の吸着や、その後のシェル層の形成が不十分なことがあり、また、鋳型分子が小さすぎると、シェル層に十分な厚みをもたせることができず、形成したインプリント間隙が潰れてしまうことがある。【００３５】
イニファータ基を導入した粒子への鋳型分子の吸着は、基材粒子や使用する鋳型分子の特性に応じ、公知の方法により行うことができる。一般的には、粒子と鋳型分子を適当な溶媒中で混合し、その分子間力や静電相互作用を利用して鋳型分子を粒子表面へ吸着せしめることで鋳型吸着粒子を得ることができる。
例えば、単分散ポリマー微粒子にタンパク質を吸着させる際、重合開始剤の影響からポリマー微粒子の表面電位が負になっているとすれば、タンパク質分子の等電点を基準にして、該分子が正に帯電するｐＨに溶媒を調整することで、静電相互作用によりタンパク質を粒子に吸着させることができる。
なお、特にタンパク質の鋳型分子を適用する場合、タンパク質が溶媒へ完全に溶解せず、溶解しきれない分子が沈降を起こしてしまうことがある。そのような場合、遠心分離等により沈降部を除く上澄みを予め分取しておき、この上澄みを粒子との混合に用いることが好ましい。【００３６】
粒子に吸着させる鋳型分子の濃度や処理時間は、粒子および鋳型分子の種類、サイズ、または処理量により適宜設定することができる。また、本工程における鋳型分子の吸着量は、分子識別に機能するインプリント部の数を決定する条件の一つであることから、吸着量の調整によって分子識別材料の機能性制御が可能であると考えられる。
一方で、鋳型分子の粒子への吸着量は、ある程度で飽和に達し、過剰に高濃度の鋳型分子を作用させても、吸着量は一定以上にはならないと考えられる。同様に、吸着処理時間を過剰に長くしても、飽和量以上の吸着は得られないことを考慮する必要がある。【００３７】
通常、鋳型分子濃度は、粒子１個あたりの表面を１０〜５０％覆うことのできる程度であれば十分に機能性の高い分子識別材料を製造することができ、吸着処理は、室温下にて１５分〜２４時間程で達成し得る。【００３８】
（３）粒子表面へのシェル層の被覆
鋳型分子を吸着させた粒子は、これをコア粒子とし、先に導入したイニファータ基を開始種としてリビングラジカル重合を誘起して、粒子表面にシェル層を構成する重合性モノマーをグラフトしていく。
コア粒子表面におけるシェル層の形成は、公知のイニファータ法に準じて行なうことができる。具体的には、コア粒子、重合性モノマー、および架橋剤を溶媒中において混合し、開始種に応じてリビングラジカル重合を開始させる。すなわち、コア粒子へ光イニファータ基を導入したのであれば紫外線（ＵＶ）の照射、熱イニファータ基であれば加熱、または金属錯体の添加によってラジカルを生成するイニファータ基であれば金属錯体の添加により重合を開始する。【００３９】
粒子表面におけるグラフト重合に適用し得る重合性モノマーは、ラジカル重合によりポリマーを形成できるものであれば問題なく使用することができる。
このようなモノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ジメチルスチレン、モノクロロスチレン、ジクロロスチレン、エチレン、プロピレン、クロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、１−ブテン、イソブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ブテン、４−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、ビニルシクロヘキサン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ブトキシアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキシメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、メタクリルアミド、アクロイルモルホリン、アクリロニトリル、酢酸ビニル、ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカルバゾール、ビニルピリジン；アクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ｔ−ブチル、アクリル酸ｎ−ヘキシル、アクリル酸シクロペンチル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸フェニル、アクリル酸２−ピリジル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アクリル酸２−メトキシエチル、アクリル酸２−エトキシエチル、アクリル酸ｎ−ラウリル、アクリル酸ｎ−ドデシル、アクリル酸ｎ−ステアリル、アクリル酸ベンジル、アクリル酸テトラヒドロフルフリル、アクリル酸グリシジル、アクリル酸アリル、アクリル酸エチルカルビノール、ジメチルアミノアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、アクリル酸ソーダ、等のアクリル酸及びアクリル酸エステル化合物；メタクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−プロピル、メタリル酸イソプロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸ｔ−ブチル、メタクリル酸ｎ−ヘキシル、メタクリル酸シクロペンチル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸２−ピリジル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸２−メトキシエチル、メタクリル酸２−エトキシエチル、メタクリル酸ｎ−ラウリル、メタクリル酸ｎ−ドデシル、メタクリル酸ｎ−ステアリル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸テトラヒドロフルフリル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸アリル、メタクリル酸エチルカルビノール、ジメチルアミノメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、１，４−ブタンジオールジメタクリレート、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、メタクリル酸ソーダ、等のメタクリル酸及びメタクリル酸エステル化合物などのラジカル重合性モノマーを挙げることができる。上記モノマーは単独もしくは２種以上を組合わせて用いること���可能である。本発明においては、特にアクリル酸、アクリルアミドが好適に使用し得る。【００４０】
架橋剤としては、モノマーの反応性官能基と反応して共有結合を形成し得る官能基を２以上有する多官能性化合物を用いることができる。具体的には、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド等のビスアクリルアミド類、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の長鎖ジアクリレート類、ジビニルベンゼン等が挙げられ、特にＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが好適である。【００４１】
重合溶媒は、グラフト重合によるシェル層の形成を阻害するものでなければ、特に限定されない。例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環族炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、テトラヒドロフランなどのエーテル系化合物類を使用する。
また、重合温度は、ラジカル重合の開始剤により適宜決定される。リビングラジカル重合の開始種が光イニファータ基であれば、紫外線照射によってラジカルを発生するため、特に制限されない。また、金属錯体の添加によってラジカルが生成されるイニファータ基を開始種とした場合も、重合温度は特に制限されない。開始種が、熱イニファータ基である場合には、熱でラジカルが発生するため、５０〜１５０℃で重合を行う。【００４２】
重合の停止は、紫外線照射によってラジカル生成を起こしているのであれば紫外線照射の停止による。加熱によってラジカルが生成しているのであれば加熱の停止による。また、金属錯体の添加によってラジカルを生成しているのであれば、金属錯体の除去、もしくは酸素の封入などによる不活性化によって速やかに重合は停止される。また、モノマーを全て重合により消費した場合にも重合は停止される。
生成したコア−シェル粒子の精製は、一般的なポリマーの精製方法に従い、貧溶媒による沈殿、透析、重合溶媒の留去などによって行うことができる。【００４３】
リビングラジカル重合によるポリマー生成は、ラジカル重合と異なり、再結合や不均化により停止せず、上記の停止処理を行うまで均一に進行するため、各開始種の重合量はほぼ同じになる。したがって、本発明によれば、シェル層を粒子表面にほぼ均一な厚さで形成することができる。
また、本発明においては、このようなリビングラジカル重合の性質を利用し、重合処理時間、またはモノマーないし架橋剤濃度を適宜調整することにより、重合量すなわちシェル層の厚みを制御することが可能である。また、粒子へのイニファータ基の導入量によってリビンググラフト重合の開始種の数を調整することでも、重合量の制御が可能である。
本発明では、鋳型のインプリント部が粒子表面近傍となるようにするため、コア粒子に吸着させた鋳型分子の厚みに応じてシェル層の厚みを制御することが好ましい。【００４４】
（４）鋳型分子の溶出によるインプリント空隙の形成
上記したコア−シェル粒子には、粒子表面のシェル層に鋳型分子が埋まった状態で分散している。本発明においては、これらの鋳型分子をシェル層から溶出させることにより、鋳型分子の構造が模られたインプリント空隙を表面に備えた粒子を得ることができる。
なお、本発明にかかる分子識別材料は、インプリント部に鋳型分子を保持した粒子、および鋳型分子を除いたインプリント空隙を備えた粒子の両方を包含することを意図するものである。したがって、シェル層からの鋳型分子の溶出は必要に応じて行うことができ、また、一度鋳型分子を溶出した後で、粒子に洗浄等を施し、再度インプリント空隙へ適合分子を保持させて用いてもよい。【００４５】
シェル層中の鋳型分子の溶出は、形成したコア−シェル粒子を適当な溶媒に溶出させることにより、除去することができる。溶出に使用する溶媒は、粒子を損ねるものでなければ、溶出する鋳型分子の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、タンパク質を鋳型分子とした場合、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む酢酸溶液が溶媒として好適に使用され得る。【００４６】
以上の工程により得られる本発明にかかる分子識別材料は、化粧品、医薬品および食品等、分子識別材料の利用が想定される全ての分野において適用することができる。
また、本発明にかかる分子識別材料の粒子形態は、その効果を損なわない限り任意であり、使用目的に応じた形および粒径とすることができる。
前記分子識別材料の使用用途としては、例えば、ＨＰＬＣカラム担体として、特定分子の高精度な分離に利用することができる。また、インプリント空隙等に酵素などの特定分子を保持させた微粒子を化粧品等に配合して、ケミカルピーリング剤として利用することも可能である。さらに、肌上の不用な物質を選択的に吸収する粉体として化粧料に配合するなど、本発明の分子識別材料を成分として各種製品に適用する他、高価な医薬品原料を分離精製するなど原料生産の段階での利用も期待できる。
以下、実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１
まず、下記方法により、Ｓｔ−ＶＢＣ−ＡＡｍ共重合単分散微粒子（ＳＶＡ粒子）を得た。
ＳＶＡ粒子の製造方法
撹拌棒、アリーン式冷却管、セラムラバー、攪拌シールを取り付けた３００ｍｌ四つ口丸底フラスコに、モノマーとしてスチレン（Ｓｔ）２．８５ｇ、４−ビニルベンジルクロリド（ＶＢＣ）０．１０ｇ、アクリルアミド（ＡＡｍ）０．０５ｇ、溶媒として水７５ｇを入れ、７０℃で３００ｒｐｍにて攪拌した。所定温度の恒温槽中で３０分間窒素置換を行った後、開始剤として過硫酸カリウム（ＫＰＳ）０．１ｇを水１０ｇに溶解させたものを注射器で系内に添加した。その後さらに３０分間窒素置換を行い、集合反応を２４時間行った。重合終了後のラテックス分散液は１３５００ｒｐｍ、１２分間、１５℃の条件で遠心分離を行い、上澄みをデカンテーションにより除去した後、下層の粒子を水で再分散させる操作を４回繰返して精製し、粒子分散液を得た。
上記ソープフリー乳化共重合における転化率を重量法により求めたところ、８３．５％であった。【００４８】
続いて、上記で得たＳＶＡ粒子表面に、下記方法によりイニファータ基を導入した。
イニファータ基導入方法
３００ｍｌ三つ口丸底フラスコにＳＶＡ粒子を固形分で２．０ｇ入れ、全量が７０ｇとなるように蒸留水を加えた。この反応容器に撹拌棒、攪拌シールを取りつけ氷冷下２００ｒｐｍで攪拌した。Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（ＮａＤＣ）０．７４ｇを３０ｇの水に溶解させ、系内に少しずつ加えた。その後、室温にて一晩反応させた後、１３５００ｒｐｍ、１２分、１５℃の条件で遠心精製を４回行い、イニファータ基としてＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基を有するＳＶＡ−ＤＣ粒子を得た。【００４９】
上記にて得たイニファータ基導入ＳＶＡ粒子に関し、その形態を以下の方法で確認した。
＜イニファータ基の定量＞
ＮａＤＣはＣ＝Ｓ結合（ｎ→π＊）に起因する紫外領域での吸収が３５２（ｎｍ）付近にあり、希薄な溶液ではLambert-Beerの法則に従い、濃度に比例して吸光度が上昇した。そこでＳＶＡ粒子とＮａＤＣとの改質反応後、遠心精製の際に得られる上澄み液（ＦＴ、Ｗ１〜３）の３５２（ｎｍ）における吸光度から粒子へ導入されたイニファータ量を測定した。
吸光度の測定は超純水を用いてベースラインを引き、サンプルを分光光度計（BioSpec-1600 Series、島津製作所製）に入れ、２０℃にて行なった。１つのサンプルから得られた上澄みの吸光度の和（ＦＴ＋Ｗ１＋Ｗ２＋Ｗ３）を求め、母液から得た検量線（図２）より上澄み液中に残存するＮａＤＣ量を求めた。さらに、仕込みイニファータ量から残存量を差引くことで、粒子への固定化量を算出した。【００５０】
以上の上澄み定量から求めた粒子表面のイニファータ量は、２．６ｕｎｉｔｓ／ｎｍ２であった。したがって、上記イニファータ基導入処理により、ＳＶＡ粒子に十分な量の官能基を導入できたことが示された。【００５１】
＜粒子の形態＞
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）において凹凸のある試料に電子線を照射すると試料の厚さによって吸収が起こり、濃淡のある像が得られる。また、対物絞りを焦面の位置に挿入して観察すると、試料によって散乱された電子のうち、ある角度以上の角度で散乱されたものは遮蔽される。このようにして生じるコントラストは試料の厚さによって異なる。
試料はＣｕのＴＥＭ用グリッドにコロジオン膜を貼り付けて、支持膜の上に載せた。コロジオンとは、硝化度の低い（１１〜１２％）＝ニトロセルロースの酢酸アミル溶液である。コロジオン溶液は、１．５〜２％酢酸アミル溶液である。コロジオン溶液を水面上に一滴落とすと、水の表面張力によって液滴は水面上に広がる。そして、溶媒が蒸発すると水面上に１００Å程度の薄膜ができる。コロジオン膜の厚さは水温でコントロールできるため、４０℃程度の水面を利用して膜を作製した。これを銅メッシュ上に貼り付けて乾燥させ、支持膜とした。【００５２】
作製した各ラテックス粒子を適当な濃度に希釈し、金属メッシュ上に支持されたコロジオン膜に沈着固定した。これをＴＥＭ（ＪＳＭ−５２００、日本電子製）にて適当な倍率にて撮影し、粒子径体を観察した。ＴＥＭによって撮影したＳＶＡ（図３（Ａ）およびＳＶＡ−ＤＣ（図３（Ｂ））の写真を図３に示す。
また、この写真の粒子径をノギスを用いて測定し、次式に従って乾燥状態における粒子の数平均粒子径（Ｄｎ）、および重量平均粒子径（Ｄｗ）を算出した。また、Ｄｗ／Ｄｎの値から粒子径の単分散性を評価した。
Ｄｎ＝ΣＮｉＤｉ／Ｎｉ
Ｄｗ＝ΣＮｉＤｉ４／ＮｉＤｉ３
＊Ｎｉ：直径Ｄｉである粒子数【００５３】
電子線が物質に衝突すると散乱を受ける。この散乱電子は対物レンズの絞りによってカットされて像面に到着しないために暗いコントラストを生じる。この散乱に程度は重量厚さに比例する。非晶質試料がコロジオン支持膜状に分散している場合のコントラストは、この散乱コントラストが支配的となる。したがって、図３において、黒く写っている影がスチレンを主成分とするコア部分である。【００５４】
図３よりＳＶＡ粒子の乾燥粒径は数平均粒子径（Ｄｎ）が３３４．２（ｎｍ）、重量平均粒子径（Ｄｗ）が３３４．６（ｎｍ）、単分散性（Ｄｗ／Ｄｎ）は１．００１となり、単分散コア粒子が作製できたことが確認された。
なお、一般に粒子懸濁液を平滑な基板上で乾燥させると、媒体の流れによって粒子が移動し、蒸発速度の大きいところで粒子は基板に集積する。また、粒子と基板の相互作用が弱い場合には、媒体の表面張力により粒子間に引力が働き、粒子は局所的に集積する。そのため、図３の各サンプルは粒子が密集した状態となったと考えられる。
図３および測定値より明らかなように、ＳＶＡ粒子は形およびサイズの均一な単分散粒子であった。また、粒子表面へイニファータ基導入した後も、同様に均一粒子を維持していることが確認された。【００５５】
＜水中粒子径の測定＞
動的光散乱法とは微粒子分散液の散乱光のゆらぎを測定することにより粒子径を求める方法である。懸濁溶液や溶液中に分散した微粒子は常にミクロブラウン運動をしている状態にあり、その動きは大きな粒子ほど遅く、小さな粒子ほど速い。粒子間相互作用が無視できるような十分希薄なラテックス中にレーザー光（Ｈｅ−Ｎｅレーザー：６３２．８ｎｍ）を入射すると、粒子により光は散乱されるが、散乱される光の波長は粒子自体のミクロブラウン運動により時間とともにゆらぐ。この光の波長のゆらぎは、それぞれの粒子の粒径に対応している。ピンホール系の光子検出装置によりこのゆらぎを観察し、光子相関法を用いてその自己相関関数などを解析することにより、粒径やその分布についての情報を得ることができる。この方法により求められた粒径は、流体力学的半径（ｄ）であり、Stokes-Einsteinの式により算出される。
ｄ＝ｋＴ／（６πηＤ）
Ｄ：拡散係数、ｋ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度【００５６】
実際の測定では、生成した各粒子を少量取り、蒸留水で適当な濃度に希釈して全透明セルに入れ、ＰＣＳ（Photon Correlation Spectroscopy：PAR III、大塚電子製）を用いて、ラテックス粒子の水中粒径を適当な温度にて測定した。また、単分散性の指標となる分散度Ｄｗ／Ｄｎを計算した。
前記動的光散乱法により測定したＳＶＡ粒子の流体力学的半径は、３７０（ｎｍ）であり、分散度は１．０１４であった。
以上の測定結果から、本発明にかかる分子識別材料において、ソープフリー乳化重合による単分散粒子が、形態的にもイニファータ基の導入に対しても、基材となる粒子として好適であると考えられる。【００５７】
続いて、上記製造方法によるＳＶＡ−ＤＣ粒子に鋳型分子（タンパク質）を吸着させ、その吸着状態を分析した。まず、タンパク質の吸着方法を説明する。
タンパク質の吸着方法
上記方法で作製したＳＶＡ−ＤＣ粒子２．５ｍｇ（固形分）を２ｍＬマイクロチューブに取り、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＳＰＢ）（ｐＨ７．０）で３回バッファー置換をして完全に上澄みを取り除いた。その後、５００ｐｐｍのウシヘモグロビン（ＢＨｂ）溶液を２００μＬ加え、サーモミキサーで振り混ぜながら３７℃で１時間、粒子とタンパク質を作用させた。
粒子とタンパク質を作用させた後、遠心分離にて上澄み１８０μＬを除去し（非結合画分ＦＴ）、さらに同バッファー１８０μＬを加えて遠心分離を行い、３回洗浄した（洗浄画分Ｗ１〜Ｗ３）。【００５８】
＜タンパク質吸着量の定量＞
下記２つの定量法により、タンパク質吸着量を定量した。
一つはビシンコニン酸（ＢＣＡ）法によるタンパク質吸着量である。
９６穴マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ製）に２００μＬのＢＣＡ溶液（ReagentA：ReagentB＝５０：１で混合）と、ＦＴ、Ｗ１〜Ｗ３のサンプル溶液５μＬを打ち、３７℃で２時間インキュベートした。測定はマイクロプレートリコーダー（MPR A4i、東ソー製）で行い、波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。また、このとき濃度既知のタンパク質溶液を調製し、検量線を作成した。
粒子へのタンパク質の吸着量は、仕込みのタンパク質量から上澄み（ＦＴ、Ｗ１〜Ｗ３）中の未吸着タンパク質量を差引くことによって求めた。【００５９】
他方は、Ｓｏｒｅｔ吸収帯スペクトル測定による定量である。
ＢＨｂの構成成分であるヘムは、鉄−ポルフィリン錯体の構造をもつ。ポルフィリン環の吸収スペクトルを測定すると、４００ｎｍ付近にＳｏｒｅｔ吸収帯スペクトルが観察される。この性質を利用して、遠心分離により得た上澄み（ＦＴ、Ｗ１〜Ｗ３）の波長４０５．５での吸光度を測定した。また、このとき濃度既知のタンパク質溶液を調製し、検量線を作成した。
粒子へのタンパク質の吸着量は、ＢＣＡ法と同様に、仕込みのタンパク質量から上澄み（ＦＴ、Ｗ１〜Ｗ３）中の未吸着タンパク質量を差引くことによって求めた。【００６０】
上記両測定から求めたタンパク質吸着量を経時的に表したグラフを図４に示す。
また、ＢＨｂ溶液を５００ｐｐｍとしたサンプルと、１０００ｐｐｍとしたサンプルについて、ＳＶＡ−ＤＣ粒子へのＢＨｂ吸着量の比較を行った。一粒子あたりのタンパク質吸着量（図５（Ａ））、仕込みタンパク質を１００としたときの吸着した全タンパク質の割合（図５（Ｂ））を図５に示す。【００６１】
図４より、タンパク質は反応開始後直ちに粒子上へ吸着していることが明らかである。吸着は反応時間１５分で平衡に達し、その後吸着量はほぼ一定であった。
したがって、イニファータ基を導入した単分散微粒子をタンパク質溶液中で作用させることにより、容易に吸着が可能であることが分かった。
また、図５（Ａ）より、鋳型分子タンパク質溶液を５００ｐｐｍとした際も、１０００ｐｐｍとした際も、吸着量はほぼ同じであったが、タンパク質濃度が５００ｐｐｍあるいは１０００ｐｐｍの場合、それぞれのＢＨｂ全量に対しての吸着率は約５０％と２５％であった（図５（Ｂ））。コア粒子１個あたりの表面のうちＢＨｂにより被覆されている割合（表面被覆率）は、どちらの濃度においても３割程度であった。
この結果から、タンパク質の粒子への吸着量には上限があり、本試験例においてＳＶＡ−ＤＣ粒子にＢＨｂを吸着させた場合には、表面被覆率３割が上限であると考えられる。また、タンパク質濃度５００ｐｐｍと１０００ｐｐｍで粒子に吸着したタンパク質量が同じであったことから、より低濃度で上限までの吸着が可能であることが示唆された。【００６２】
続いて、上記方法により鋳型分子（タンパク質）を吸着させたＳＶＡ−ＤＣ粒子へ下記方法でシェル層を導入し、その粒子の状態を分析した。
シェル層の導入
表面に光イニファータ基をもつＳＶＡ−ＤＣ粒子をコア粒子とし、ＵＶ照射によるリビングラジカル重合によって表面にＡＡｍシェル層を有するコアシェル粒子の作製を行った。
上記方法により作製したＳＶＡ−ＤＣ（水中粒径３６０ｎｍ）、モノマーとしてアクリルアミド（ＡＡｍ）を２．０ｇ、アクリル酸（ＡＡｃ）０．０４ｇ、架橋剤としてＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−（アクリルアミド）（ＭＢＡＡｍ）を０．３６ｇに、溶媒を全量が２００ｇとなるように加え、反応容器に入れた。前記反応容器にリービッヒ冷却管を取り付け、スターラーチップにて攪拌、窒素雰囲気下で、室温にて１時間、４００Ｗの高圧ＵＶランプにてＵＶ照射を行った。ＵＶ照射後の反応液は、１３５００ｒｐｍで３５分、１５℃の条件で上澄みが透明になるまで遠心分離、デカンテーション、再分散を３回繰り返して精製を行った。これにより、表面にＡＡｍシェル層を有するＳＶＡ−Ａ粒子を得た。【００６３】
下記表１に示すようなＳＶＡ−ＤＣの添加量（ｘ）、溶媒の種類、ＳＶＡ−ＤＣ粒子上へのタンパク質（ＢＨｂ）吸着の有無の条件とした試験例１〜３について、シェル層導入後の動的光散乱およびＴＥＭによる粒子径、導入前後での粒径の増大をそれぞれ評価した。結果を下記表１に示す。また、下記試験例２のシェル層形成後のＴＥＭ画像を図６に示す。【００６４】
【表１】
2009028661.tif 000005
【００６５】
図６の画像から、コアシェル型粒子が形成されていることが明らかである。中央の黒い影がコア部分であり、その周囲の灰色の影がシェル部分である。ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）シェル層の厚さは１５０ｎｍ程度であり、イニファータ法によるＵＶグラフト重合が十分に進行したといえる。【００６６】
表１に示すとおり、いずれの試験例においても粒径の増大が認められ、ＰＡＡｍシェル層の導入が達成されたことが示唆された。また、粒子添加量が減少するにつれ、得られるＳＶＡ−Ａ粒子の粒径が増大する傾向にあった。これは、粒子添加量の違いはすなわち反応系内の重合開始点濃度の違いであることから、重合開始点濃度が低いほど一つの開始点に取り込まれるモノマー量が増加するため、結果として粒径が増大したものと考えられる。
また、溶媒を水としてもリン酸バッファー（ＳＰＢ）としても重合の進行は十分に認められ、タンパク質を吸着させたＳＶＡ−ＤＣ粒子においても著しい粒径の増加、すなわちＰＡＡｍによるシェル層の形成が認められた。
以上のことから、鋳型分子を吸着させたコア粒子表面において、イニファータ法によるＵＶグラフト重合を行うことにより、シェル層の導入が可能であることが確認された。
また、コア粒子の添加量の調整により、前記シェル層の層厚の制御が可能であることが示唆された。【００６７】
続いて、シェル層を導入したＳＶＡ−Ａ粒子から、鋳型分子（タンパク質）を溶出し、得られた分子識別材料を評価した。
タンパク質の溶出
上記したシェル層の導入例において、ＳＶＡ−ＤＣ０．５ｇ、ＡＡｍ０．５ｇ、ＭＢＡＡｍ０．０９ｇ、ＡＡｃ０．０１ｇとし、溶媒としてＳＰＢを全量が２００ｇとなるように加えて作製したサンプルを用い、シェル層からのタンパク質の溶出を行った。
ここで用いたＳＶＣ−ＤＣ粒子は、タンパク質（ＢＨｂ）吸着反応を行った後のものである。また、高圧ＵＶランプの照射によるグラフト重合の開始から１０分、２０分に定量送液ポンプを用いてサンプリングを行い、３０分で重合反応を終了した。これにより、所定の重合時間に応じたコアシェル（ＳＶＡ−Ａ）粒子を得た。それぞれのサンプルについて上記の方法で遠心精製を行い、下記キャラクタリゼーションを行った。【００６８】
前記各コアシェル粒子サンプル２．５ｍｇ（固形分）は、２ｍＬマイクロチューブに入れ、コア粒子表面に吸着させたＢＨｂの溶出を行った。すなわち、前記マイクロチューブに、タンパク質溶出液として１０ｗｔ％ＳＤＳを含む１０％ＡｃＯＨ溶液（ＳＤＳ：ＡｃＯＨａｑ）を１８０μＬ加え再分散させた後に、１３５００ｒｐｍ、１０分、５℃の条件で遠心分離を行い、上澄み１８０μＬを除去する操作を３回繰り返した（溶出画分Ｒ１〜Ｒ３）。タンパク質溶出後のサンプルは１０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）で十分に洗浄し、インプリント空隙を有する粒子（分子識別粒子）を得た。【００６９】
＜コアシェル粒子のキャラクタリゼーション＞
上記で得たコアシェル粒子は、ＰＣＳ（動的光散乱法による水中粒径）、ＴＥＭ、および電気泳動移動度の測定により行なった。ＰＣＳおよびＴＥＭによる測定は前述の方法と同様とした。以下、電気泳動移動度の測定方法を説明する。【００７０】
コンパクトゼータ電位測定装置（ZEECOM、マイクロテック・ニチオン社製：セル厚み０．７６ｎｍ、静止層０．１５ｎｍ、電極間距離９ｃｍ）を用いて各粒子の電気泳動移動度を測定した。１ｍMのＫＣｌ水溶液に分散させた各粒子（ＳＶＡ−ＤＣ粒子および重合時間を１０分、２０分、３０分とした各ＳＶＡ−Ａ粒子）をセル内に満たし、循環水を用いてセル内を所定の温度に保った。ここに電圧をかけ静止面に浮遊している粒子の移動度を測定し、次式を用いて電気泳動移動度を算出した。測定はそれぞれ２０個の粒子について行い、その平均値を用いた。
μ＝ｖ×ｄ／Ｖ
ｖ：移動速度、ｄ：電極間距離、Ｖ：電圧
電気泳動移動度（ＥＰＭ）およびＰＣＳの測定結果を図７に示す。また、ＳＶＡ−ＤＣ粒子および重合時間２０分としたＳＶＡ−Ａ粒子のＴＥＭ画像を図８に示す。【００７１】
図７において、重合前後の各サンプルの水中粒径に大きな変化は見られなかった。動的光散乱法による測定値は±２５ｎｍ程度の標準偏差を含んでおり、この範囲内における粒径変化を正確に測定することは困難であると考えられる。一方、電気泳動移動度では、重合の進行に伴い、移動度が負へ増大する傾向が認められた。
コア粒子はアニオン性開始剤であるＫＰＳを用いて作製しているため、その表面はＫＰＳ由来の負電荷を帯びている。重合に伴い負方向へ移動度が増大する理由としては、ＰＡＡｍシェル層導入の際、モノマーとして微量のＡＡｃを用いていることに起因すると考えられる。ＡＡｃは構造中にビニル基とカルボキシル基を有しており、このカルボキシル基がｐＨ依存的に解離し負電荷をもつ。すなわち、本測定は１ｍＭのＫＣｌ中で行なったため、ＡＡｃを有するシェル層が導入されるほど、コアシェル型粒子表面の電荷はコア粒子と比較して負方向に強くなったと考えられる。
以上から、電気泳動移動度により、鋳型分子を吸着したコア粒子上にシェル層が形成されたことが定性的に確認された。また、重合反応時間に比例して重合度合いに変化が見られたことから、反応時間によるシェル層の層厚制御の可能性が示唆された。【００７２】
さらに、図８より、重合前後で粒子の様子が明らかに変化していることが観察された。ＳＶＡ−ＤＣ粒子においては、一つ一つの粒子の表面がはっきりとしているのに対し、グラフト重合を２０分行なったＳＶＡ−Ａ粒子においては、各粒子の輪郭が不明瞭であり、表面にぼんやりと薄いスキン層が存在する様子が伺えた。このことからも、コア粒子の表面へ薄いＰＡＡｍシェル層が導入されていることが示唆された。【００７３】
＜タンパク質溶出量の定量＞
定量は、前述のＳｏｒｅｔ吸収帯スペクトル測定と同様に行った。ただし、遠心分離により得た上澄み（Ｒ１〜Ｒ３）の波長３９５．０ｎｍでの吸光度を測定した。また、溶出液に所定のタンパク質（ＢＨｂ）を溶かした濃度既知のＢＨｂ−ＳＤＳ：ＡｃＯＨａｑを調製し、検量線を作成した。
前記方法により、上澄み（Ｒ１〜Ｒ３）中のタンパク質量として算出される値として、粒子から溶出されたタンパク質量を得た。ＳＶＡ−Ａ一粒子あたりのＢＨｂ吸着量および溶出量を図９に示す。なお、各サンプルにおける吸着量とは、コア（ＳＶＡ−ＤＣ）粒子表面にもともと吸着していたＢＨｂ量を表し、溶出量とはＰＡＡｍシェル層のグラフト重合反応後に得られたコアシェル（ＳＶＡ−Ａ）粒子から溶出されたＢＨｂ量を表す。【００７４】
図９によれば、重合時間１０分のサンプルにおいては、ほぼ完全にＢＨｂが溶出された。一方、重合時間２０分および３０分のサンプルでは、吸着量の７割程度のＢＨｂが溶出した。このことから、重合時間が長くなるほど、導入されるＰＡＡｍシェル層の厚さは増大し、コア粒子表面に存在するＢＨｂの溶出量は減少すると推察された。
以上より、表面に鋳型分子を吸着し、シェル層を導入したコアシェル粒子から、十分量の鋳型分子の溶出が可能であることが明らかになるとともに、該粒子表面において、鋳型分子溶出量に相当する程度のインプリント空隙が形成されたことが示唆された。【００７５】
＜ターゲット分子の捕捉＞
上記したタンパク質の溶出工程により得た、重合時間の異なる各分子識別粒子（ＭＩＰ）について、ターゲットタンパク質の捕捉能を検討した。
すなわち、各粒子２．５ｍｇに２００μLのＢＨｂ溶液（５００ｐｐｍ）を加え、３７℃において１時間インキュベートを行い、粒子へのＢＨｂの捕捉を試みた。粒子に捕捉されたタンパク質の定量は、上記したタンパク質溶出量の定量と同様の方法による。
また、コントロールとして、タンパク質未溶出の各コアシェル（ＳＶＡ−Ａ）粒子についても、重合時間の異なるサンプル毎に同様の試験を行った。結果を図１０に示す。【００７６】
ここで、図１０において、各ＭＩＰは図９の各サンプルに相当し、ＳＶＡ−Ａ粒子からのＢＨｂ溶出量に相当する程度のインプリント空隙を有すると考えられる。一方、コントロールの粒子においては、コア粒子表面に吸着させたＢＨｂはそのままシェル層内に存在しており、インプリント空隙は存在しない。すなわち、コントロールにおけるＢＨｂ吸着量は、シェル層表面に不可逆的に吸着したＢＨｂ量を示す。ＭＩＰのシェル層表面にもこれと同程度のＢＨｂの吸着が起きていると考えられる。このことから、ＭＩＰの再捕捉量は、各重合時間におけるＭＩＰへのＢＨｂの全吸着量からコントロールへのＢＨｂの吸着量を差引いた値とした。再捕捉量として有意な値が得られることは、すなわち、ＭＩＰ表面にインプリント空隙が存在し、その空隙に対して位置選択的なＢＨｂの吸着が起きていることを定性的に裏付けるものである。【００７７】
図１０によれば、どの重合時間のＭＩＰにおいても再捕捉が認められ、シェル層表面にＢＨｂのインプリント空隙を有する微粒子が得られたことが示唆された。【００７８】
実施例２
下記ＭＩＰ製造例における製造過程、及び製造された分子識別粒子（ＭＩＰ）について、以下記載する各試験を行った。
ＭＩＰ製造例
（１）Ｓｔ−ＶＢＣ−ＡＡｍ共重合単分散微粒子（ＳＶＡ粒子）にイニファータ基としてＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基を導入し、ＳＶＡ−ＤＣ粒子（コア粒子）を得た。
（２）５００ｐｐｍ  ＢＨｂ溶液４０ｍＬに前記ＳＶＡ−ＤＣ  ０．５ｇを添加し、ｐＨ７．０及び３７℃の条件下で１時間インキュベートした。その後、遠心分離により粒子を分離し、これを洗浄してＢＨｂを表面に吸着させたＳＶＡ−ＤＣ粒子を得た。
（３）続いて、前記ＳＶＡ−ＤＣ粒子  ０．５ｇ、アクリルアミド（ＡＡｍ）  ０．２５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−（アクリルアミド）（ＭＢＡＡｍ）  ０．０４５ｇ、アクリル酸（ＡＡｃ）  ０．００５ｇに１０ｍＭ  ＳＰＢ（リン酸バッファー、ｐＨ７．０）を加え、合計２００ｇの混合液とした。この混合液にＵＶを照射し、室温で１時間重合反応させた。反応後、遠心分離及び洗浄を繰り返して表面にＡＡｍのシェル層を有するＳＶＡ−Ａ粒子（コア−シェル粒子）を得た。
（３）１０ｗｔ％ＳＤＳ：１０％ＡｃＯＨ溶液（ｐＨ２．８）に前記ＳＶＡ−Ａ粒子を加え、室温下で遠心分離を３回繰り返して粒子に吸着したＢＨｂを溶出させ、固形分としてＢＨｂをインプリントしたＭＩＰを得た。【００７９】
＜コア粒子表面へのターゲット分子の吸着＞
上記ＭＩＰ製造例の（２）工程において、ＳＶＡ−ＤＣ粒子に吸着したＢＨｂ量を定量した。５００ｐｐｍ  ＢＨｂ溶液中のＢＨｂ量（投入量）に対する実際のＢＨｂ吸着量（吸着量）を図１１に示す。
図１１に示すとおり、ＢＨｂ投入量の４３％がＳＶＡ−ＤＣ粒子への吸着に消費され、これらはＳＶＡ−ＤＣ粒子表面の約３０％を被覆していた。【００８０】
＜シェル層の形成＞
上記ＭＩＰ製造例において、（２）工程で得たＳＶＡ−ＤＣ粒子、（３）工程で得たＳＶＡ−Ａ粒子、（２）工程を経ずに（３）工程を行なったコントロール粒子（ＢＨｂ未吸着）のそれぞれについて、ＤＬＳによる水中粒径測定及び電気泳動移動度測定を行なった。結果を図１２に示す。
図１２に示すとおり、各サンプルの水中粒径はＳＶＡ−ＤＣ粒子で３４２ｎｍ、ＳＶＡ−Ａ粒子で３５０ｎｍ、コントロール粒子で３５２ｎｍとなり、（３）工程によりシェル層が形成され、粒径が増大していることが明らかである。また、電気泳動移動度測定の結果から、ＳＶＡ−ＤＣ粒子表面にアクリル酸を含むシェル層ができたことがわかる。【００８１】
＜ＢＨｂの除去＞
上記ＭＩＰ製造例において、（２）工程でＳＶＡ−ＤＣ粒子に吸着したＢＨｂ量（吸着量）と、（３）工程でＳＶＡ−Ａ粒子から溶出したＢＨｂ量（溶出量）をそれぞれ定量した。ＳＶＡ−ＤＣ粒子のＢＨｂ量については、（３）工程と同様に１０ｗｔ％ＳＤＳ：１０％ＡｃＯＨ溶液（ｐＨ２．８）に溶出させたものを定量した。結果を図１３に示す。
図１３に示す結果から、コア粒子に吸着させたＢＨｂ粒子の約６０％が（３）工程において除去され、インプリント空隙が形成されていることが分かる。【００８２】
＜ターゲット分子の吸着＞
上記ＭＩＰ製造例により得たＭＩＰと、（２）工程を経ずに（３）工程を行なったコントロール粒子（インプリント空隙未形成）について、各粒子２．５ｍｇを異なる濃度（０〜５００ｐｐｍ）のＢＨｂ溶液（１０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０））２００μＬに添加し、３７℃の条件下で１時間反応させた。これらの結果から得られたＢＨｂの吸着等温線を図１４に示す。
図１４に示すとおり、ＢＨｂのインプリント空隙を有するＭＩＰは、空隙をもたないコントロール粒子に比べ、同じ濃度下でほぼ倍のＢＨｂ吸着量を示した。また、両粒子ともＢＨｂ溶液の濃度に応じてＢＨｂ吸着量は上昇するが、吸着量が飽和に達するとほぼ一定となった。すなわち、ＭＩＰを用いることで、より多くのターゲット分子を補足することができる。【００８３】
＜ターゲット分子の識別＞
上記製造例により得たＭＩＰの各種タンパク質に対する吸着量を検討した。
試験方法
ウシヘモグロビン（ＢＨｂ）、ミオグロビン（Ｍｂ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、α−ラクトアルブミン（α−ＬＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、リゾチーム（ＬＺＭ））のそれぞれについて、前記タンパク質を５００ｐｐｍの濃度で含む１０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）を調製し、吸着系溶媒とした。ＭＩＰ２．５ｍｇを前記吸着系溶媒２００μＬへ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルのＭＩＰに吸着したタンパク質量を定量した。結果を図１５に示す。なお、図１４中のインプリント空隙の量は、前記ＭＩＰ調製例においてコアシェル粒子から溶出されたタンパク質の量を示し、ＭＩＰのインプリント空隙へのターゲットタンパク質の吸着許容量を表す。【００８４】
図１５に示すとおり、ＢＨｂをインプリントしたＭＩＰは、ほぼインプリント空隙の吸着許容量に至るまで該空隙にＢＨｂを捕捉した。しかしながら、ＩｇＧ及びＬＺＭにも、ＭＩＰに吸着が認められた。これは、ＭＩＰの表面電荷が負であり、ＩｇＧ及びＬＺＭはｐＨ７．０において正に荷電しているため、静電引力によって該タンパク質がＭＩＰ表面に吸着したと考えられた。また、ＩｇＧ及びＬＺＭの吸着には、その特性から疎水性相互作用も関係していると考えられる。
一方、ｐＨ７．０において中性を示すＭｂ、負に荷電するＢＳＡ及びα−ＬＡとのようなタンパク質については、いずれも負に荷電するＭＩＰにほとんど吸着しなかった。なお、ＢＨｂもまたｐＨ７．０において中性を示すタンパク質であることを考慮すれば、インプリント部が特定タンパク質に対し、極めて高い捕捉力を有していることが示唆される。
したがって、本発明にかかる分子識別材料であるＭＩＰをもって、インプリントされた分子を識別し、捕捉させることが可能である。【００８５】
さらに、下記の吸着系溶媒（ＰＢＳ）を用い、ＢＨｂ及びＩｇＧについて上記と同様の方法で試験を行った。結果を図１６に示す。
なお、図１６において、インプリント空隙の量は、前記ＭＩＰ調製例においてコアシェル粒子から溶出されたタンパク質の量を示し、ＭＩＰのインプリント空隙へのターゲットタンパク質の吸着許容量を表す。また、「ＳＰＢ」は上記試験における結果を示し、「ＰＢＳ」は下記吸着系溶媒を用いた本試験の結果を示す。
吸着系溶媒の調製
１０ｍＭ  ＳＰＢへ１５０ｍＭ  ＮａＣｌを加えてｐＨ７．０に調整し、吸着系溶媒（ＰＢＳ）を得た。【００８６】
図１６に示すとおり、塩を添加した吸着系溶媒（ＰＢＳ）を使用したサンプルでは、ＳＰＢを吸着系溶媒としたものに比べ、ＭＩＰへのＩｇＧ吸着量が大幅に低減されていた。一方で、インプリント分子であるＢＨｂの捕捉量は、吸着系溶媒における塩の有無に係わらず良好であった。
ＩｇＧ吸着量の低減は、吸着系溶媒へ添加した塩の作用によって、ＭＩＰとＩｇＧの間の静電引力が遮蔽されたことによると考えられる。
したがって、本発明にかかる分子識別材料の適用において、吸着系溶媒に塩を添加することにより、識別性の精度を向上させることが可能である。【００８７】
次に、インプリント分子を含むタンパク質２成分系において、ＭＩＰへの吸着挙動を以下の試験方法により検討した。
試験方法
ウシヘモグロビン（ＢＨｂ）及び競合させるタンパク質（competitor）の１：１（ｗ／ｗ）混合物を５００ｐｐｍの濃度で含む１０ｍＭ  ＳＰＢ（ｐＨ７．０）を調製し、吸着系溶媒とした。ＭＩＰ２．５ｍｇを前記吸着系溶媒２００μＬへ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、各サンプルのＭＩＰに吸着したタンパク質を定量した。タンパク質の定量は、上記したタンパク質溶出量の定量と同様の方法による。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミオグロビン（Ｍｂ）、α−ラクトアルブミン（α−ＬＡ）、フィブリノーゲン（ＦＢＧ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、リゾチーム（ＬＺＭ）をそれぞれcompetitorとして用いた結果を図１７に示す。
図１７に示すとおり、競合するタンパク質の種類に係わらず、ＭＩＰはインプリント分子に対して優れた捕捉性を示した。【００８８】
さらに、ＢＳＡ、ＦＢＧ、ＩｇＧをcompetitorとする上記２成分系吸着試験において、反応時間によるタンパク質吸着量の変化を調査した。
ＢＨｂ及びcompetitorのＭＩＰ吸着試験は上記方法にしたがい、反応時間のみを０．５、１、４、６、２４時間に変えてそれぞれ行った。結果を図１８に示す。
図１８に示すとおり、インプリント分子（ＢＨｂ）の吸着は、１〜４時間の反応で飽和に至り、反応時間が４時間を越えると吸着量はほぼ一定となった。この吸着量変化は、いずれのcompetitorを用いたサンプルにおいても同様であることから、ＭＩＰのインプリント分子に対する反応は、competitorの吸着挙動にほとんど影響を受けていないと推察された。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月26日(2009.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面積の１０〜５０％を鋳型分子に覆われたコア粒子表面にシェル層を形成したコア−シェル粒子から前記鋳型分子を溶出して得られ、前記シェル層に前記鋳型分子によるインプリント空隙を有することを特徴とする分子識別材料。
【請求項２】
前記コア粒子が、単分散ポリマー微粒子であることを特徴とする請求項１に記載の分子識別材料。
【請求項３】
前記鋳型分子がタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の分子識別材料。
【請求項４】
下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の分子識別材料の製造方法。
（ａ）コア粒子表面にイニファータ基を導入する工程。
（ｂ）（ａ）工程後、鋳型分子を前記コア粒子表面に吸着させる工程。
（ｃ）（ｂ）工程後、前記コア粒子表面にシェル層を形成する工程。
【請求項５】
さらに、下記工程（ｄ）を含むことを特徴とする請求項４に記載の分子識別材料の製造方法。
（ｄ）（ｃ）工程後、前記粒子から鋳型分子を溶出させる工程。
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月20日(2010.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  表面積の１０〜５０％を鋳型分子に覆われたコア粒子表面にシェル層を形成したコア−シェル粒子から前記鋳型分子のみを溶出して得られ、
前記シェル層に前記鋳型分子によるインプリント空隙を有することを特徴とする分子識別材料。
【請求項２】  前記コア粒子が、単分散ポリマー微粒子であることを特徴とする請求項１に記載の分子識別材料。
【請求項３】  前記鋳型分子がタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の分子識別材料。
【請求項４】  下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の分子識別材料の製造方法。
（ａ）コア粒子表面にイニファータ基を導入する工程。
（ｂ）（ａ）工程後、鋳型分子を前記コア粒子表面に吸着させる工程。
（ｃ）（ｂ）工程後、前記コア粒子表面にシェル層を形成する工程。
【請求項５】  さらに、下記工程（ｄ）を含むことを特徴とする請求項４に記載の分子識別材料の製造方法。
（ｄ）（ｃ）工程後、前記粒子から鋳型分子のみを溶出させる工程。
【国際調査報告】
2009028661.tif 000024
2009028661.tif 000025