(57)【要約】  本発明は、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： (a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び(c)工程(b)と比較して塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；を含む、前記製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項２】
-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項３】
システイン残基を含むペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項４】
式(1)で示されるトレオニン誘導体A
【化１】
2009017154.tif 000023
をアミノ酸残基として含むペプチドにおいて、前記トレオニン誘導体A残基をトレオニン残基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項５】
-SMe基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SMe基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(b)及び(c)： 
(b)ペプチド中の-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項６】
前記反応中間体がエステル体である、請求項2〜5のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項７】
工程(c)における塩基性条件が、弱塩基性条件である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項８】
工程(c)における塩基性条件が、強塩基性条件である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項９】
工程(a)におけるペプチド中のメチオニン残基が、保護メチオニン残基であり、さらに所望により以下の工程(d)：
(d)保護メチオニン残基を脱保護する工程；
を工程(b)又は(c)の後に含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１０】
-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得る工程；
(a)工程(o)で得られたペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項１１】
セリン残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、システイン残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結してシステイン残基を含むペプチドを得る工程；
(a)工程(o)で得られたペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項１２】
トレオニン残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、トレオニン誘導体残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して式(1)で示されるトレオニン誘導体A
【化２】
2009017154.tif 000024
をアミノ酸残基として含むペプチドを得る工程；
(a) 工程(o)で得られたペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項１３】
前記反応中間体がエステル体である、請求項10〜12のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１４】
工程(c)における塩基性条件が、弱塩基性条件である、請求項10〜13のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１５】
工程(c)における塩基性条件が、強塩基性条件である、請求項10〜13のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１６】
工程(a)におけるペプチド中のメチオニン残基が、保護メチオニン残基であり、さらに所望により以下の工程(d)：
(d)保護メチオニン残基を脱保護する工程；
を工程(b)又は(c)の後に含む、請求項10〜15のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１７】
前記第1のペプチドがシステイン残基を含まないペプチド又はシステイン残基が保護システイン残基であるペプチドであり、
前記第2のペプチドがN末端以外にシステイン残基を含まないペプチド又はN末端以外のペプチドのシステイン残基が保護システイン残基であるペプチドである、
請求項10〜16のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項１８】
-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項１９】
-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項２０】
システイン残基を含む糖ペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項２１】
式(1)で示されるトレオニン誘導体A
【化３】
2009017154.tif 000025
をアミノ酸残基として含む糖ペプチドにおいて、前記トレオニン誘導体A残基をトレオニン残基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項２２】
前記反応中間体がエステル体である、請求項19〜21のいずれか1項に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項２３】
工程(c)における塩基性条件が、弱塩基性条件である、請求項18〜22のいずれか1項に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項２４】
工程(c)における塩基性条件が、強塩基性条件である、請求項18〜22のいずれか1項に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項２５】
前記糖ペプチドがN結合型糖鎖を有する、請求項18〜24のいずれか1項に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項２６】
前記糖ペプチドがO結合型糖鎖を有する、請求項18〜24のいずれか1項に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項２７】
セリン残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド：
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、
Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、システイン残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結してシステイン残基を含む糖ペプチドを得る工程；
(a)工程(o)で得られた糖ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項２８】
トレオニン残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド：
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、
Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、トレオニン誘導体残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して式(1)で示されるトレオニン誘導体A
【化４】
2009017154.tif 000026
をアミノ酸残基として含む糖ペプチドを得る工程；
(a) 工程(o)で得られた糖ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法。
【請求項２９】
前記反応中間体がエステル体である、請求項27又は28に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項３０】
工程(c)における塩基性条件が、弱塩基性条件である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項３１】
工程(c)における塩基性条件が、強塩基性条件である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の糖ペプチドの製造方法。
【請求項３２】
以下の式：
-糖Asn-X-Y-
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Yは、式(2)で示されるトレオニン誘導体A残基
【化５】
2009017154.tif 000027
である）
で示される構造を含む糖ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及び糖ペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドの製造方法として、ライゲーション法が有用である。その中でも、天然型化学的ライゲーション法(Native Chemical Ligation、NCL法)は、連結部位(ライゲーション部位)に天然アミド結合(ペプチド結合)を有するペプチドを製造することができる方法である。NCL法は、無保護のペプチド鎖同士でも行うことができ、連結部位に天然アミド結合を生成するための有用な方法であることが知られている(例えば、特許文献1)。NCL法は、以下に図示するように、C末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにした第1のペプチドとN末端にシステイン残基を有する第2のペプチドとの化学選択反応であり、システインの側鎖のチオール基(SH基。スルフヒドリル基ともいう。)がチオエステル基のカルボニル炭素に選択的に反応し、チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成する。この中間体は、自発的に分子内転位して、連結部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。この反応を用いることで様々なポリペプチドを効率よく合成することが可能となった。【０００３】
【化１】
2009017154.tif 000002
【０００４】
典型的なNCL法の主な欠点は、この方法においては、連結される2つのペプチド断片のうち、一方は、N末端においてシステイン残基を有していなければならず、連結後において得られるペプチドも連結部位においてシステイン残基を有することになる点である。故に、合成して得ようとする所望のペプチドにシステイン残基が存在しない場合には、この方法を用いることができなかった。【０００５】
また、典型的なNCL法においては、連結しようとする２つまたはそれ以上のペプチド断片を、例えば固相合成法等によって用意するが、例えば生体内に存在するペプチドのように、システイン含有量が非常に少ない場合(又はシステインが存在しない場合)、NCL法に供するために、非常に長いペプチド断片を用意する必要があり、効率的とは言えなかった。【０００６】
一方、生体内には様々な糖ペプチド及び糖タンパク質が存在することが知られている。これらの糖ぺプチド又は糖タンパク質の糖鎖はN結合型とO結合型の2種類に大別される。N結合型糖鎖は、一般的に、アスパラギン側鎖のアミドの窒素にN-グリコシド結合をした糖鎖であり、通常、天然の状態においては、しばしば、-Asn-X-Ser/Thr- (式中、Xはプロリン以外のアミノ酸である。)というコンセンサス配列におけるAsnに結合している。O結合型糖鎖はセリン又はトレオニン側鎖の水酸基にO-グリコシド結合をしている糖鎖である。以下にその一例を示す(Gal:ガラクトース、GlcNAc:N-アセチルグルコサミン、Man:マンノース、Fuc:フコース、GalNAc:N-アセチルガラクトサミン)。O結合型糖鎖を有する天然の糖ペプチドは、プロリン、トレオニン及びセリンの含有率が高いことが知られている(非特許文献1及び2)。【０００７】
【化２】
2009017154.tif 000003
【特許文献１】国際公開WO96/34878号
【非特許文献１】TRENDS in biochemical sciences, Vol.27, No.3,March 2002
【非特許文献２】Cancer Biology & Therapy 6:4, 481-486, April 2007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ペプチド及び糖ペプチドの新規な製造方法を提供することである。
特に、従来、典型的なNCL法においては、連結される2つのペプチド断片のうち、片方は、N末端においてシステイン残基を有していなければならず、また、連結後において得られるペプチドも連結部位においてシステイン残基を有することになるため、最終的に得ようとする所望のペプチド(又は糖ペプチド)におけるシステイン残基を連結部位として、NCL法を設計し適用するほかなかった。そこで、本発明は、得ようとする所望のペプチドにおけるシステイン残基以外にも、セリン残基やトレオニン残基に対応する部分を連結部位としたライゲーション法を設計可能とする、ペプチド及び糖ペプチドの新規な製造方法を提供する。【０００９】
より具体的には、本発明の一態様によれば、ペプチド(又は糖ペプチド)中のシステイン残基をセリン残基に変換することができる。そのため、N末端にシステイン残基を有するペプチドを他のペプチドとNCL法により連結し、その後、このシステイン残基をセリン残基に変換することができる。よって、本発明によれば、得ようとする所望の配列にシステイン残基が存在しなくてもセリン残基が存在すれば、その位置をNCL法における連結部位として設計することができる。【００１０】
また、本発明の一態様によれば、N末端に-SH基を有するトレオニン誘導体(または該-SH基がジスルフィド結合等により保護されたトレオニン誘導体)残基をN末端に有するペプチドを他のペプチドとライゲーション法により連結し、その後、得られるトレオニン誘導体残基をトレオニン残基に変換することができる。よって、本発明によれば、得ようとする所望の配列にシステイン残基が存在しなくてもトレオニン残基が存在すれば、その位置をライゲーション法における連結部位として設計することができる。
このように、本発明は、糖ペプチド中に豊富に存在するセリンやトレオニンをライゲーション法による連結部位として設計可能とする、ライゲーション法を用いたペプチド及び糖ペプチドの新規な製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以上の課題を解決するために本発明は以下の特徴を有し得る。
すなわち、本発明は、
-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００１２】
本発明は、また、
-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００１３】
本発明はまた、
システイン残基を含むペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００１４】
本発明はまた、
式(1)で示されるトレオニン誘導体A【００１５】
【化３】
2009017154.tif 000004
【００１６】
をアミノ酸残基として含むペプチドにおいて、前記トレオニン誘導体A残基をトレオニン残基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００１７】
本発明はまた、
-SMe基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SMe基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(b)及び(c)： 
(b)ペプチド中の-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００１８】
本発明はまた、
-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得る工程；
(a)工程(o)で得られたペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００１９】
本発明はまた、
セリン残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、システイン残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結してシステイン残基を含むペプチドを得る工程；
(a)工程(o)で得られたペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２０】
本発明はまた、
トレオニン残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、トレオニン誘導体残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して上記式(1)で示されるトレオニン誘導体Aをアミノ酸残基として含むペプチドを得る工程；
(a) 工程(o)で得られたペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２１】
本発明はまた、
-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２２】
本発明はまた、
-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２３】
本発明はまた、
システイン残基を含む糖ペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２４】
本発明はまた、上記式(1)で示されるトレオニン誘導体Aをアミノ酸残基として含む糖ペプチドにおいて、前記トレオニン誘導体A残基をトレオニン残基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c)： 
(a)糖ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２５】
本発明はまた、
-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチド又は糖ペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチド又は糖ペプチド（ここで、第1のペプチド又は糖ペプチド及び第2のペプチド又は糖ペプチドの少なくとも一方は糖ペプチドである）とを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドを得る工程；
(a)工程(o)で得られた糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２６】
本発明はまた、
セリン残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド：
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、
Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、システイン残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結してシステイン残基を含む糖ペプチドを得る工程；
(a)工程(o)で得られた糖ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２７】
本発明はまた、
トレオニン残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド：
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、
Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、トレオニン誘導体残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して上記式(1)で示されるトレオニン誘導体Aをアミノ酸残基として含む糖ペプチドを得る工程；
(a) 工程(o)で得られた糖ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含む糖ペプチドに変換する工程；
を含む、前記製造方法を提供し得る。【００２８】
本発明はまた、以下の式：
-糖Asn-X-Y-
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Yは、式(2)で示されるトレオニン誘導体A残基【００２９】
【化４】
2009017154.tif 000005
【００３０】
である）
で示される構造を含む糖ペプチドを提供し得る。【００３１】
本発明において、実施態様によっては、工程(a)又は工程(o)におけるペプチド若しくは糖ペプチド中のメチオニン残基が、保護メチオニン残基であり、さらに所望により以下の工程(d)：
(d)保護メチオニン残基を脱保護する工程；
を工程(b)又は(c)の後、特に工程(c)の後に含むことが好ましい場合がある。【００３２】
本発明において、実施態様によっては、工程(b)で得られる反応中間体は、好ましくはエステル体であり得る。
本発明において、実施態様によっては、工程(b)は、酸性条件下、特にpH2〜3で行うことが好ましい場合がある。
本発明において、実施態様によっては、工程(b)で用いるシアン化剤は、好ましくは臭化シアンであり得る。【００３３】
本発明において、実施態様によっては、工程(c)を、弱塩基性条件下、例えば、pH7〜9、特にpH7〜8で行うことが好ましい場合がある。弱塩基性条件下で工程(c)を行う場合、実施態様によっては、工程(c)を約10分以上、特に約15分以上(例えば、約10分〜30時間程度、特に約15分〜30時間程度)行うことが好ましい場合がある。【００３４】
本発明において、実施態様によっては、工程(c)を、強塩基性条件下、例えば、pH9〜13、特にpH10〜11で行うことが好ましい場合がある。強塩基性条件下で工程(c)を行う場合、実施態様によっては、工程(c)を約1時間以下、特に約10分以下(例えば、約5分〜1時間程度、特に約5分〜10分程度)行うことが好ましい場合がある。【００３５】
本発明において、第2のペプチドのN末端にトレオニン誘導体残基が含まれる場合、実施態様によっては、前記トレオニン誘導体残基は、式(3)：【００３６】
【化５】
2009017154.tif 000006
（式中、Rは、H又はライゲーション反応の条件下で容易に脱保護されるチオール基の保護基であり、好ましくはH又はジスルフィド基である。）
で表されるトレオニン誘導体のN末端アミノ酸残基であり得る。【００３７】
本発明において、実施態様によっては、第1のペプチド(又は糖ペプチド)及び第2のペプチド(又は糖ペプチド)のいずれか、より特定すれば両方が、システインを含まないかシステインが保護システインであるペプチド(又は糖ペプチド)であることが好ましい場合がある。【００３８】
本発明において、実施態様によっては、第1のペプチド(又は糖ペプチド)及び第2のペプチド(又は糖ペプチド)のいずれかは、80個以下、好ましくは50個以下、より好ましくは30個以下のアミノ酸残基を有するペプチド(又は糖ペプチド)であることが好ましい場合がある。【００３９】
本発明において、糖ペプチドにおける糖鎖は、実施態様によっては、N結合型糖鎖又はO結合型糖鎖であることが好ましい場合がある。
本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、以下の式(4)で表される糖鎖が好ましい場合がある。【００４０】
【化６】
2009017154.tif 000007
【００４１】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素原子、又は、式(5)〜(8)で示される基である。］【００４２】
【化７】
2009017154.tif 000008
【００４３】
【化８】
2009017154.tif 000009
【００４４】
【化９】
2009017154.tif 000010
【００４５】
【化１０】
2009017154.tif 000011
【００４６】
本発明において、実施態様によっては、工程(c)又は工程(d)の後、更に糖鎖を付加する工程を含むことが好ましい場合がある。【００４７】
本発明の製造方法で得られるペプチド又は糖ペプチドは、実施態様によっては、全てのアミド結合が天然アミド結合であることが好ましい場合がある。
本発明の製造方法で得られるペプチド又は糖ペプチドは、実施態様によっては、全ての構成アミノ酸が、生体内にペプチド又は糖ペプチドの構成アミノ酸として存在するアミノ酸であることが好ましい場合がある。
【発明の効果】
【００４８】
本発明のペプチドの製造方法によれば、-SH基を有するペプチドの-SH基を-OH基に変換することができる。また、-C(=O)-SRで表されるα-カルボキシチオエステル部分をC末端に有するようにした第1のペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に有する第2のペプチドとをライゲーション法により連結して得られた、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドの-SH基を-OH基に変換することができる。これらの方法は糖ペプチドに応用することもできる。【００４９】
従って、本発明のペプチドの製造方法によれば、ペプチド中のシステイン残基をセリン残基に変換することが可能になり、得ようとする所望の配列にシステイン残基が存在しなくてもセリン残基が存在すれば、NCL法を適用することが可能になる。【００５０】
また、本発明は、-SH基を有するトレオニン誘導体を連結部位としたライゲーション法をも提供し、このライゲーション法で得られたペプチド中の-SH基を有するトレオニン誘導体残基をトレオニン残基に変換することができるため、トレオニンを有するペプチドの製造に、トレオニン残基を連結部位として、ライゲーション法を適用することが可能になる。【００５１】
従来の天然型化学的ライゲーション法における連結部位であったシステインは、生体内のペプチド中における含有率が低かったが、本発明の方法によれば、生体内のペプチド、特に糖ペプチド中において含有率の高いセリン及びトレオニンを、ライゲーション法における新たな連結部位として設計することができる。【００５２】
さらに、上記の方法を糖ペプチド、特に、セリン及びトレオニンの含有率の高いO結合型糖鎖や、コンセンサス配列として-糖Asn-X-Ser-又は-糖Asn-X-Thr-(式中、糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基である)の配列を有するN結合型糖鎖を有する糖ペプチドに適用することで、ライゲーション法を利用して天然型と同じ構造の、N結合型糖鎖又はO結合型糖鎖を有する糖ペプチドを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明の第1の側面は、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、下記の工程(a)〜(c)を含む工程を経ることにより、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得ることである。
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程。【００５４】
上記工程(a)〜(c)は、より特定すれば、
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
である。【００５５】
本発明の第2の側面は、以下の工程:
カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得る工程；
及び、上記の工程(a)〜(c)を含む工程を経ることにより、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得ることである。【００５６】
本発明の第3の側面は、-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、上記の工程(a)〜(c)を含む工程を経ることにより、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドを得ることである。【００５７】
本発明の第4の側面は、以下の工程：
C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド：
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドを得る工程；
及び、上記の工程(a)〜(c)を含む工程を経ることにより、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドを得ることである。【００５８】
本明細書中において、「ペプチド」とは、2以上のアミノ酸がアミド結合により結合しているものであれば特に限定されず、公知ペプチド及び新規ペプチド並びにペプチド改変体を含む。一般にタンパク質と呼ばれるものも、本発明においてはペプチド中に含むものとする。好ましい態様において、本発明の製造方法で得られるペプチド(又は糖ペプチド)は、天然型と同じアミド結合(ペプチド結合)で2以上のアミノ酸が結合している。【００５９】
本明細書中において、「ペプチド改変体」とは、ペプチドを天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、ペプチドの1又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化(例えばアセチル化)、アミド化(例えば、ペプチドのC末端のアミド化)、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。【００６０】
本明細書中において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン(Ser)、アスパラギン(Asn)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、アラニン(Ala)、チロシン(Tyr)、グリシン(Gly)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、トリプトファン(Trp)、プロリン(Pro)のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばL-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチン等生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、以下に詳述するトレオニン誘導体Aのほか、α-メチルアミノ酸(α-メチルアラニンなど)、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸(2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸(システイン酸など)が挙げられる。【００６１】
本明細書中において、「トレオニン誘導体」とは、以下の式(3)： 【００６２】
【化１１】
2009017154.tif 000012
【００６３】
で示される化合物をいう。式(3)中、RはH又はライゲーション反応の条件下で容易に脱保護されるチオール基の保護基であり、好ましくはH又はジスルフィド基である。特に、上記式(3)において、RがHである以下の式(1)の化合物を、トレオニン誘導体Aと呼ぶ。【００６４】
【化１２】
2009017154.tif 000013
【００６５】
式(3)のトレオニン誘導体は、トレオニンの-OH基の部位が-SR基である化合物であり、いずれの立体配置を有するものも含む。本発明の製造方法において、ペプチド中のアミノ酸残基の-SH基が-OH基に変換する際に、立体反転が起こると考えられるため、特に天然に存在するトレオニンを得ようとする際には、天然に存在するトレオニンの-OH基と立体が反転した-SR基を有するトレオニン誘導体を用いることが好ましい場合がある。【００６６】
上記のトレオニン誘導体は、例えば後述の実施例及び合成例も参照し、以下の方法で得ることができる。
まず、トレオニンのアミノ基及びカルボキシル基を保護したものを用意する。それぞれの保護基は以降の反応で目的のペプチドが得られる限り特に限定されないが、例えば、アミノ基をBoc基で保護し、カルボキシル基をTMSE(トリメチルシリルエチル)基で保護したものを用いることができる。次に公知の手法を用いてβ位の水酸基をメシル化する。次いで、例えばDBUとチオ酢酸を用いて、このメシル基をチオアセチル基へと置換する(D. Crich et al, J. Am. Chem. Soc., 129, 10064(2007)参照)。【００６７】
このチオアセチル基を、公知の手法により、ジスルフィド基、アセトアミドメチル基、ニトロベンジル基、トリチル基等、当業者に公知の保護基で保護したチオール基に変換する。例えば、ジスルフィド基で保護したチオール基とする場合、後述の合成例1を参照することができる。ジスルフィド基は、その後のライゲーション法の反応条件下で容易に脱保護される。【００６８】
好ましい態様において、本発明の製造方法で得られるペプチド(又は糖ペプチド)は、全て生体内にペプチド(又は糖ペプチド)の構成アミノ酸として存在するアミノ酸からなる。また、本発明の一態様において、本発明の製造方法によって得られるペプチドは、システイン残基を含まないかあるいは構成アミノ酸中のシステイン含有量が少ないペプチドであることが好ましい。さらに、本発明の一態様において、本発明の製造方法によって得られるペプチドは、任意のセリン残基又はトレオニン残基から、次のセリン残基若しくはトレオニン残基又はN末端若しくはC末端までのいずれかの間に、80個以下、好ましくは50個以下、より好ましくは30個以下のアミノ酸残基を有する。例えば、本発明の一態様において、本発明の製造方法によって得られるペプチドは、5〜40アミノ酸残基中、好ましくは20〜30アミノ酸残基中に1つ以上、セリン残基又はトレオニン残基を有する。【００６９】
本明細書中において、「反応中間体」とは、広い意味において、ペプチド中の-SMe基にシアン化剤を反応させた後、-OH基に変換されるまでの各化合物のいずれもを指す。本発明の反応スキームは、以下のスキーム1のようであると考えられ、以下のスキーム1中、Ｃで示されるエステル体も本発明における反応中間体の1つである。なお、本明細書中において、例えば以下のスキーム1中に「ペプチド-OH」との記載があるが、この-OHは特筆しない限り、ペプチドのC末端カルボキシル基の-OHを示す。【００７０】
【化１３】
2009017154.tif 000014
【００７１】
本明細書において、「糖ペプチド」とは、前記のペプチドに少なくとも1の糖鎖が付加した化合物であれば特に限定されず、公知の糖ペプチド及び新規の糖ペプチドを含む。一般に糖タンパク質と呼ばれるものも、本発明における糖ペプチドの定義に含むものとする。【００７２】
好ましい態様において、本発明の製造方法で得られる糖ペプチドは、N結合型糖鎖又はO結合型糖鎖を有するペプチドであり、例えば、エリスロポエチン、インターロイキン、インターフェロン-β、抗体、単球走化性因子タンパク質-3(MCP-3、monocyte chemotactic protein-3)等のペプチドの一部分あるいは全部が挙げられる。【００７３】
本発明の一態様において、本発明の製造方法によって得られる糖ペプチドは、糖鎖を付加していない任意のセリン残基又はトレオニン残基から、次のセリン残基若しくはトレオニン残基又はN末端若しくはC末端までのいずれかの間に、80個以下、好ましくは50個以下、より好ましくは30個以下のアミノ酸残基を有する。例えば、本発明の一態様において、本発明の製造方法によって得られる糖ペプチドは、5〜40アミノ酸残基中、好ましくは20〜30アミノ酸残基中に1つ以上、セリン残基又はトレオニン残基を有する。【００７４】
糖ペプチドにおいて、糖鎖とペプチド中のアミノ酸残基とは、直接結合していても、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。【００７５】
糖鎖が結合するアミノ酸の種類は特に限定されず、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれに結合していてもよい。糖ペプチドが生体内に存在する糖ペプチド(糖たんぱく質)と同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖は、N結合型糖鎖のようにAsnに結合していること、又はO結合型糖鎖のようにSer若しくはThrに結合していることが好ましい。特に、N結合型糖鎖の場合、本発明の製造方法により得られる糖ペプチドは、Asnに糖鎖が結合し、該AsnのC末端側にプロリン以外のアミノ酸(X)がアミド結合(ペプチド結合)し、さらに該XのC末端側にThr又はSerがアミド結合(ペプチド結合)した構造(-糖Asn-X-Thr/Ser-)を有する糖ペプチドであることが好ましい。【００７６】
糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖が結合するアミノ酸は：アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に2以上のカルボキシル基を持つアミノ酸；リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に2以上のアミノ基を持つアミノ酸；セリン、トレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸；システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸；又はアスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン又はグルタミンが好ましい。【００７７】
糖ペプチドにおいて、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば：
-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-
(式中、aは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは0〜4の整数を示す。)；
C1-10ポリメチレン；
-CH2-R3-
(ここで、R3は、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が1つ脱離して生ずる基である)；
等を挙げることができる。【００７８】
本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖(単糖及び/又はその誘導体)が2つ以上連なってできた化合物の他、１つの単位糖(単糖及び/又はその誘導体)からなる化合物をも含む。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類(グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体)の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。単位糖が2つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。【００７９】
また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖(例えば、C-1位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸(例えば、D-グルコースが酸化されたD-グルコン酸)、末端のC原子がカルボン酸となったウロン酸(D-グルコースが酸化されたD-グルクロン酸))、アミノ基又はアミノ基の誘導体(例えば、アセチル化されたアミノ基)を有する糖(例えば、N-アセチル-D-グルコサミン、N-アセチル-D-ガラクトサミンなど)、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖(例えば、N-アセチルノイラミン酸(シアル酸)、N-アセチルムラミン酸など)、デオキシ化された糖(例えば、2-デオキシ-D-リボース)、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。【００８０】
本発明の糖鎖は、好ましくは、生体内で複合糖質(糖ペプチド(又は糖タンパク質)、プロテオグリカン、糖脂質等)として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖ペプチド(又は糖タンパク質)としてペプチド(又はタンパク質)に結合している糖鎖であるN-結合型糖鎖、O-結合型糖鎖等である。O-結合型糖鎖が結合している糖ペプチドにおいては、ペプチドのSer又はThrにN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、キシロース、フコース等がO-グリコシド結合で結合し、これにさらに糖鎖が付加する。N結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース(ハイマンノース)型、複合(コンプレックス)型、混成(ハイブリッド)型を挙げることができ、複合型が好ましい。【００８１】
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、下記式(4)で表される糖鎖である。【００８２】
【化１４】
2009017154.tif 000015
【００８３】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素原子、又は、式(5)〜(8)で示される基である。］【００８４】
【化１５】
2009017154.tif 000016
【００８５】
【化１６】
2009017154.tif 000017
【００８６】
【化１７】
2009017154.tif 000018
【００８７】
【化１８】
2009017154.tif 000019
【００８８】
本発明の糖ペプチドの製造方法を、医薬品等の製造の分野に適用することを考慮した場合に抗原性等の問題を回避し得るという観点からは、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖(例えば、FEBS LETTERS Vol.50, No.3, Feb. 1975に記載の糖鎖)と、同一の構造を有する糖鎖(構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖)又はこれの非還元末端から1又は複数の糖を失った糖鎖を挙げることができる。【００８９】
糖ペプチドにおける、糖鎖の付加数は、1鎖以上であれば特に限定されないが、生体内に存在する糖ペプチドと類似した構造の糖ペプチドを提供するという観点からは、体内に存在する糖ペプチドと同程度の付加数であれば、より好ましいであろう。【００９０】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖ペプチドにおける糖鎖の構造は、均一である。本明細書中において、糖ペプチドにおける糖鎖の構造が均一であるとは、糖ペプチド間で比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。【００９１】
本発明の製造方法において原料として用いるペプチドは、例えば、固相合成、液相合成、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等、当業者に公知のペプチド製造方法を適用することにより製造することができる。また、原料として糖ペプチドを用いる場合、上記の公知のペプチドの製造方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加工程で用いる糖鎖の製造方法に関しては、例えば、国際公開番号WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等を参照することができる。【００９２】
具体例として、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチド又は糖ペプチドを固相合成法により製造する方法を以下に示す。以下に示す方法において、国際公開番号WO2004/005330も参照することができる。【００９３】
先ず、(1)水酸基を有する樹脂(レジン)の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。【００９４】
次に(2)上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
(3)この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護された所望のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
(4)上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
(5)上記(3)及び(4)の工程を必要に応じて繰り返すことにより、所望の数の所望のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。【００９５】
上記(1)〜(5)の工程でアミノ酸として-SH基を有する(-SH基は保護されていてもよい)アミノ酸(例えば、システインや既出の式(3)のトレオニン誘導体)を使用することにより、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得ることができる。なお、上記(1)〜(5)の工程で用いる際には、-SH基を有するアミノ酸の-SH基は当業者に公知の保護基、例えば、ジスルフィド基、アセトアミドメチル基、ニトロベンジル基、トリチル基等の保護基で保護されていることができ、その後、必要に応じ脱保護することができる。また、上記(1)〜(5)の工程でアミノ酸として、糖鎖が付加したアミノ酸(例えば、アスパラギンに糖鎖が付加した糖鎖アスパラギン、セリン又はトレオニンに糖鎖が付加した糖鎖セリン又は糖鎖トレオニン等)を用いることにより、さらに、所望の位置に１つ又は２つ以上の糖鎖を有するN結合型及び/又はO結合型糖ペプチドを得ることもできる。このようなN結合型又はO結合型の糖ペプチドは、上述のとおり、所望の位置に、-SH基を有するアミノ酸残基を含むことが可能である。【００９６】
(6)そして、酸で樹脂(レジン)と(1)のアミノ酸との間のエステル結合を切断することにより、所望のペプチド(又は糖ペプチド)を製造することができる。【００９７】
固相樹脂(レジン)としては、通常、固相合成で使用する樹脂(レジン)であればよく、例えば、Amino-PEGAレジン(メルク社製)、Wangレジン(メルク社製)、HMPA-PEGAレジン(メルク社製)、Trt Chlorideレジン(メルク社製)等を用いることができる。
また、Amino-PEGAレジン(樹脂)とアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸(HMPA)、4-(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)-ブチル酢酸(HMPB)等を挙げることができる。【００９８】
脂溶性保護基としては、例えば、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)基、ｔ-ブチルオキシカルボニル(Boc)基、アリルオキシカルボニル(Alloc)基等のカルボニル含有基、アセチル(Ac)基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
脂溶性保護基を導入するには、例えばFmoc基を導入する場合には9-フルオレニルメチル-N-スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は0〜50℃、好ましくは室温で、約1〜5時間程度行うのが良い。【００９９】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、既出のアミノ酸を上記の方法で保護したものを用いることができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Proを挙げることができる。【０１００】
エステル化触媒として、例えば1-メシチレンスルホニル-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール(MSNT)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCDI)等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者1重量部に対して、後者が、通常1〜10重量部、好ましくは2〜5重量部である。【０１０１】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、2-プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)、DMF、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は0〜50℃、好ましくは室温で、約10分〜30時間程度、好ましくは15分〜24時間程度行うのが良い。
この時固相上の未反応の官能基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。【０１０２】
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばDMSO、DMF、メタノール等を挙げることができる。
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。【０１０３】
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩(WSC/HCl)、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)、カルボニルジイミダゾール(CDI)、ジエチルシアノホスホネート(DEPC)、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI)、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、3-ジエトキシホスホリルオキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(DEPBT)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、ヒドロキシスクシンイミド(HOSu)、ジメチルアミノピリジン(DMAP)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)、3-ヒドロキシ-4-オキソ-3,4-ジヒドロ-5-アザベンゾ-1,2,3-トリアジン(HODhbt)、ヒドロキシフタルイミド(HOPht)、ペンタフルオロフェノール(Pfp-OH)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスホネート(HATU)、O-ベンゾトリアゾール-1-イル-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート(TBTU)等を挙げることができる。
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、1〜20当量、好ましくは1〜10当量、さらに好ましくは、1〜5当量とするのが好ましい。【０１０４】
上記活性化剤のみでも反応は進行するが、補助剤としてアミンを併用することが好ましい。アミンとしては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、N-エチルモルホリン(NEM)、N-メチルモルホリン(NMM)、N-メチルイミダゾール(NMI)等を用いることができる。補助剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、1〜20当量、好ましくは1〜10当量、さらに好ましくは、1〜5当量とするのが好ましい。【０１０５】
溶媒としては、例えばDMSO、DMF、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は0〜50℃、好ましくは室温で、約10〜30時間程度、好ましくは15分〜24時間程度行うのが良い。この際にも固相上の未反応のアミノ基を無水酢酸等を用いてアセチル化しキャッピングするのが好ましい。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。【０１０６】
レジン(樹脂)からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸(TFA)、弗化水素(HF)等を挙げることができる。その際、アミノ酸に使用していた脂溶性保護基およびレジン(樹脂)上のリンカーから、反応性の高いカチオン種が生成する場合があるため、このものを捕獲するため求核性試薬を添加することが好ましい。求核性試薬としてはトリイソプロピルシラン(TIS)、フェノール、チオアニソール、エタンジチオール(EDT)等を挙げることができる。【０１０７】
このようにして、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチド(又は糖ペプチド)を得ることができる。
また、上述のようにして得られた、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチド又は糖ペプチドに、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法を用いて糖鎖を付加することで、-SH基を有するアミノ酸を含む糖ペプチドを得ることもできる。
さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。【０１０８】
上述のようにして得られた、ぺプチド又は糖ペプチドのうち、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含むペプチド(又は糖ペプチド)と、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)とを、ライゲーション法を用いて連結することができる。
なお、本明細書中において、「ライゲーション法」とは、特許文献1に記載の天然型化学的ライゲーション法(Native Chemical Ligation、NCL法)のみならず、後述の実施例に記載のように、非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体(例えば、式(1)のトレオニン誘導体A、保護メチオニン、糖鎖付加アミノ酸等)を含むペプチドについて、上記天然型化学的ライゲーション法を応用する場合をも含む。ライゲーション法により、連結部位に天然アミド結合(ペプチド結合)を有するペプチドを製造することができる。【０１０９】
ライゲーション法を用いた連結は、ペプチド-ペプチド間、ペプチド-糖ペプチド間、糖ペプチド-糖ペプチド間の、いずれにおいても行うことができる。
ライゲーション法に用いる、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)は、特許文献1に記載のように、当業者に公知の手法を用いて製造することができる。【０１１０】
例えば、後述の実施例に記載のように、固相合成法によって、アミノ酸側鎖とN末端のアミノ基が保護された保護ペプチド(又は糖ペプチド)を得て、このC末端側のカルボキシル基を、液相中において縮合剤にPyBOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate)/DIPEAを用いてベンジルチオールと縮合させ、その後、95%TFA溶液を用いてアミノ酸の鎖を脱保護することで、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)を得ることができる。【０１１１】
ライゲーション法は、特許文献1に記載のような当業者に公知の手法を用いて、また、後述の実施例の記載を参照して実施することができる。例えば、C末端に-C(=O)-SRにより表されるα-カルボキシチオエステル部分を有するようにした第１のペプチドと、N末端に-SH基を有するアミノ酸残基を有する第2のペプチドとを上述の記載を参照して用意する。なお、第1のペプチドにおいて、Rはチオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素への求核置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されないが、好ましくはベンジルメルカプタン等のベンジル型、チオフェノール、4-(カルボキシメチル)-チオフェノール等のアリール型、2-メルカプトエタンスルホン酸塩、3-メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型等から選択することができる。また、第2のペプチドのN末端の-SH基は、所望により保護基により保護されていてもよいが、この保護基は以下のライゲーション反応までの所望の時点で脱保護し、N末端に-SH基を有する第2のペプチドが、第1のペプチドと反応する。例えばジスルフィド基等、ライゲーションが起こる条件において自然に脱保護される保護基であれば、保護基により保護した第2のペプチドをそのまま以下のライゲーション反応に用いることもできる。 【０１１２】
これらの2つのペプチドを、必要に応じ、4-メルカプトフェニル酢酸、ベンジルメルカプタン、チオフェノール等の触媒チオールの存在下、100mMリン酸緩衝溶液等の溶液中で混合する。好ましくは、第1のペプチド1当量に対し第2のペプチドを0.5〜2当量及び触媒チオールを5当量程度の割合で反応を行う。反応はpH6.5〜7.5程度、20〜40℃程度の条件下、約1〜30時間程度行うのが望ましい。反応の進行は、HPLC、MS等を組み合わせた公知の手法を用いて確認することができる。【０１１３】
これに、ジチオスレイトール(DTT)、トリス2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩(TCEP)のような還元剤を加えて副反応を抑制し、所望により精製することで、第1のペプチドと第2のペプチドとを連結することができる。【０１１４】
なお、C末端にカルボキシチオエステル部分(-C=O-SR)を有するようにしたペプチドにおいて、R基の異なるペプチドが存在する場合、ライゲーション反応の順序を操作することが可能であり(Protein Science (2007), 16:2056-2064等参照)、複数回のライゲーションを行う場合にはこれを考慮することができる。例えば、Rとしてアリール基、ベンジル基及びアルキル基が存在する場合には、一般に、この順に、連結反応が進行する。【０１１５】
本発明において、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチド(又は糖ペプチド)の-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチド(又は糖ペプチド)の製造方法を具体的に示す。原料としては、上述の方法で得られたペプチド又は糖ペプチドを用いる。本発明の一態様においては、ライゲーション法を用いて得られたペプチド又は糖ペプチドを用いることが好ましい。次いで、以下の工程(a)〜(c)：
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程；
を含む工程行う。以下、原料としてペプチドを用いた場合について例示する。【０１１６】
工程(a)
工程(a)のメチル化において用いるメチル化剤はペプチド中の-SH基を-SMe基に変換することができるものであれば特に限定されず、例えば、ヨードメタン、メチル-4-ニトロベンゼンスルホネート等を挙げることができる。
メチル化剤の使用量は、原料ペプチドの-SH基1残基に対して、1〜1000当量とすることができ、好ましくは、10〜100当量、より好ましくは、15〜30当量とすることができる。メチル化反応は、0〜50℃、好ましくは20〜30℃で、約10分〜30時間程度、好ましくは15分〜1時間程度行うことが望ましい。【０１１７】
メチル化反応を行う際の溶媒としては緩衝溶液が好ましく、そのpHは7〜9、特に8〜9を示すものを好適に用いることができる。例えば、0.25Mトリス塩酸緩衝溶液(6Mグアニジン塩酸液、3.3mM EDTA含有、pH8.6)等を用いることができる。【０１１８】
なお、ペプチド中にアミノ酸としてシステイン残基が含まれ、これをセリン残基に変換せず、本発明の製造方法で得られるペプチド中にシステイン残基として存在させる場合、システインを保護した保護システインの形で公知の手法を用いてペプチドに導入することで、システインの-SH基が工程(a)においてメチル化されることを防ぐことができる。システインの保護基としては、本発明の製造方法の各工程におけるチオール交換反応、酸処理、塩基処理等を考慮し、適切な保護基を用いることができ、例えば、アセトアミドメチル(Acm)基、ベンジル基、アセトアミド基、トリチル基等、好ましくはAcm基を用いることができる。工程(a)〜(c)の後、所望により、公知の手法を用いて保護システイン残基を脱保護する。例えば、Acm基、ニトロベンジル基、トリチル基等を保護基とした保護システインを導入した場合、酢酸銀酢酸水溶液による脱保護法、光による脱保護法、酸処理による脱保護法等を用いた工程を追加することで、システイン残基に変換される。このようにして、本発明の製造方法で得られるペプチドにシステイン残基を存在させることができる。【０１１９】
なお、本発明の一態様によれば、-SMe基を有するペプチドから-SMe基を-OH基に変換することで-OH基を有するペプチドを得ることも可能であり、このような場合には、上記工程(a)を省略することが可能である。【０１２０】
工程(b)
工程(b)において用いるシアン化剤としては、例えば、安定性等の観点から、臭化シアン、フェニルシアネート等を用いることができ、好ましくは、入手容易な臭化シアンを用いることができる。
シアン化剤の使用量は、-SMe基1に対して、1〜1000当量とすることができ、好ましくは、10〜100当量、より好ましくは、15〜30当量とすることができる。シアン化剤との反応は、0〜50℃、好ましくは30〜40℃で、約30分〜100時間程度、好ましくは12時間〜50時間程度行うことが望ましい。【０１２１】
シアン化剤との反応は、酸性条件下で行い、特に好ましくはpH2〜3で行う。酸性水溶性物質、具体的には、蟻酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸等の使用により、反応を酸性条件下で行うことができる。この際、使用する酸性水溶性物質は、硫黄原子の酸化防止のため脱気したものであることが特に好ましい。また、シアン化剤の安定性の観点から、反応は遮光下で行うことが好ましい。【０１２２】
溶媒としては上記のpH2〜3を示す水溶性溶媒、例えば、80%蟻酸溶液、70%蟻酸溶液、2%トリフルオロ酢酸/39%アセトニトリル含有水溶液等を好適に用いることができる。
工程(b)で得られる反応中間体の一例は、以下の構造で示されるエステル体である。【０１２３】
【化１９】
2009017154.tif 000020
【０１２４】
なお、ペプチド中にアミノ酸としてメチオニン残基が含まれる場合には、メチオニン残基の-SMe基と工程(a)で得られる-SMe基を区別することが好ましい。本明細書中において、保護メチオニンとは、工程(b)におけるシアン化剤と反応しない化合物であれば特に限定されず、例えば、スルホキシド型メチオニン(Met(O)：-CH2-CH2-S(=O)-CH3)を挙げることができる。後述の実施例5に記載のように、保護メチオニン(例えばMet(O))を公知の手法を用いてペプチドに導入することで、メチオニン残基と工程(a)で得られる-SMe基とが区別され、工程(b)のシアン化剤との反応に対し、メチオニン残基が不活性となる。その後、適宜公知の手法を用いて保護メチオニン残基をメチオニン残基に変換する(後述の工程(e))。このようにして、メチオニン残基を有するペプチドも、本発明の製造方法を用いて得ることができる。【０１２５】
また、必要に応じ、工程(b)のシアン化剤との反応の際に形成された副生成物である、システインの酸化体の除去を行うことができる。このような除去工程は、例えば、工程(b)で得られた反応中間体を含む混合物を、ヨウ化アンモニウム及びジメチルスルフィドの存在下、室温下に30分程度反応させ、その後分液洗浄することで行うことができる。除去工程は、工程(b)の後であればどの時点で行ってもよく、好ましくは工程(c)の後に行うことができる。【０１２６】
工程(c)
工程(c)においては、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体のO-からN-への分子内アシル転移によって-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドが得られる。
工程(c)における塩基性条件は、工程(b)と比較してより塩基性条件であれば酸性又は中性であってもよく、より特定すれば、工程(b)で得られた反応中間体のエステル結合に隣接するC原子上の-NH2基がプロトン化されない条件であればよい。反応中間体から-OH基を有するペプチドへの変換を効率よく行うという観点からは、弱塩基性条件又は強塩基性条件を用いることができる。【０１２７】
工程(c)における塩基性条件が弱塩基性である場合、そのpHは、pH7〜9であり、好ましくはpH7〜8である。例えば、グアニジン、燐酸二ナトリウム、トリス、炭酸水素ナトリウム等、当業者に公知のpH調整剤である塩基性化合物を溶液に添加することで、弱塩基性条件とすることができる。このとき、塩基性化合物の使用量は、原料ペプチドに対して、1〜1000当量とすることができ、好ましくは、10〜100当量、より好ましくは、15〜30当量とすることができる。【０１２８】
工程(c)における塩基性条件が弱塩基性である場合、反応は、0〜50℃、好ましくは20〜40℃で、約10分〜30時間程度、好ましくは15分〜30時間程度行うことが望ましく、pH7〜9、好ましくはpH7〜8を示す緩衝溶液中で行うことが望ましい。例えば、0.2Mリン酸緩衝液(6Mグアニジン塩酸液含有、pH7.2)中で工程(c)を行うことができる。
工程(c)における塩基性条件が弱塩基性である場合、さらにpHを下げて工程(c)を終了することもできるが、そのままpHを変化させずに、HPLC等による精製工程に移ることも可能である。【０１２９】
工程(c)における塩基性条件が強塩基性である場合、そのpHは、pH9〜13であり、好ましくはpH10〜11である。強塩基性条件は、水酸基に過剰反応した化合物を加水分解により取り除ける条件であることが好ましく、塩基性水溶性物質、例えば、ヒドラジン含水物、50mM水酸化ナトリウム水溶液等を溶液に添加して強塩基性条件とすることができる。このとき、塩基性水溶性物質の使用量は、原料ペプチドに対して0.5〜100当量とすることができ、好ましくは、0.1〜10当量、より好ましくは、0.5〜1当量とすることができる。例えば、pH10〜11を示す5%ヒドラジン水溶液中で工程(c)を行うことができる。【０１３０】
工程(c)における塩基性条件が強塩基性である場合、工程(b)で得られた反応中間体のO-からN-への分子内アシル転移によって-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドが得られるとともに、工程(a)〜(b)で過剰に反応した-OH基について、脱シアノ化(過剰反応したシアン化剤を加水分解により取り除く脱シアノ化反応)、脱ホルミル化(過剰反応した蟻酸の脱ホルミル化反応)等が起こり得る。【０１３１】
工程(c)における塩基性条件が強塩基性である場合、工程(c)は、0〜50℃、好ましくは20〜30℃で、約5分〜3時間程度、好ましくは5分〜1時間、より好ましくは5分〜10分程度行うことが望ましい。工程(c)における塩基性条件が強塩基性である場合、工程(c)を長時間行うと、ラセミ化、ペプチド結合の切断等の副反応が起こり得る。【０１３２】
工程(c)における塩基性条件が強塩基性である場合、工程(c)は、pHをpH4〜9、好ましくは5〜9、例えばpH7付近やpH8〜9等に下げることで終了することができる。【０１３３】
なお、工程(c)において、得られる-OH基を有するアミノ酸残基のβ位の立体は、工程(b)で得られた反応中間体から反転すると予想される。【０１３４】
工程(d) 
保護メチオニン残基を含むペプチドを原料とした場合、さらに所望により以下の工程(d)を、工程(b)又は(c)の後に行う：
(d)保護メチオニンを脱保護する工程。【０１３５】
脱保護は、用いた保護メチオニンに応じて、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。例えば、保護メチオニンとしてメチオニンをスルホキシド型(Met(O))で導入した場合、ヨウ化アンモニウム/ジメチルスルフィド/TFA混合液等を用いた還元工程を追加することで、保護メチオニンがメチオニンに変換される。副反応を回避するという観点からは、好ましくは工程(c)の後に、工程(d)を行う。
このようにして、メチオニン残基を有するペプチドを得る場合についても本発明の製造方法を適用することができる。【０１３６】
生成物の精製は、数種類の高速液体クロマトグラフィー条件下で97%以上の精製物を与える手法を用いることが好ましい。具体的には結晶化、交流分配法、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等が挙げられる。好ましくは高速液体クロマトグラフィー等を用いることができる。【０１３７】
上記の工程に加え、さらに糖鎖の付加工程を行うことができる。糖鎖の付加は、ペプチド及び糖ペプチドのいずれについても行うことができ、目的とする糖ペプチドを得られる限りどの時点で行うことも可能であるが、工程(c)の後に行うことが好ましい。【０１３８】
糖鎖の付加は、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法や、以下のように国際公開番号WO2005/010053の記載を参照した方法を用いて行うことができる。
まず、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体を、上記で得たペプチド(特に、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸；リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に2以上のアミノ基を持つアミノ酸；セリン、トレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸；システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸；アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸等を含むペプチド。特に、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン又はグルタミンを含むペプチド)と反応させることにより製造する。上記反応は、通常0〜80℃、好ましくは、10〜60℃、更に好ましくは15〜35℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常30分〜5時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法(例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー(HPLC))で精製するのが良い。【０１３９】
ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の1位の炭素に結合している水酸基を、-NH-(CO)-(CH2)a-CH2X(式中、Xはハロゲン原子、aは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは0〜4の整数を示す。)で置換した化合物である。
具体的には、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体と、上記で得たペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、HPLCで精製することにより糖鎖が付加された糖ペプチドを得ることができる。【０１４０】
上記の方法に加え、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。このようにして得られた糖ペプチドもまた、本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【０１４１】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。【０１４２】
実施例１  Ａｃ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕの製造
固相合成用カラムにＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（０.５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃にて１時間攪拌した。なお、ＤＣＭは１．５ｍＬとすることもできる。攪拌後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で１５分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１４３】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７．０μＬ、６３．１ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。なお、ＤＭＦは２ｍＬとすることもできる。２５℃で１時間攪拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ（１４８．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（２９２．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（１５５．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕの保護基を有する４残基ペプチド（配列番号１）を得た。その後、樹脂上で、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で２０分間処理して脱保護し、２０％無水酢酸／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を用いて、遊離アミノ基に対し、アセチル保護を行った。なお、２０％無水酢酸／ＤＭＦ溶液は１．７ｍＬとすることもできる。ＤＭＦ，ＤＣＭを用いて洗浄した後に、予め用意した試薬（ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ（１，２−エタンジチオール）／ＴＩＰＳ＝８１．５／５／５／５／２．５／１）を樹脂が十分に浸る程度に加え、２時間２５℃で攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８５：１５−＞５０：５０  ６０分  流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、Ａｃ-Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕの保護基を有する４残基ペプチド（配列番号２）を得た。【０１４４】
得られた４残基のペプチド（配列番号２）３０ｍｇ（７３μｍｏｌ）をナスフラスコにいれ、０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液７３ｍＬ（ｐＨ８．６、６Ｍ  グアニジン塩酸液、３．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）とアセトニトリル２４ｍＬに溶解させた後、２５℃にてメチル−４−ニトロベンゼンスルホネート（３１６ｍｇ）を加えた。３０分後、１０％ＴＦＡ溶液（７．３ｍＬ）加え、ｐＨ４にした後、ジエチルエーテルを加え抽出操作を行った。濃縮後、得られた残渣をＯＤＳカラムにて精製を行いＡｃ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕのシステイン残基の硫黄原子がメチル化された保護基を有する４残基ペプチド（配列番号３）を２５ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１７Ｈ３０Ｎ４Ｏ６Ｓ：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ４１９．２、ｆｏｕｎｄ、４１９．１【０１４５】
得られたシステイン残基の硫黄原子がメチル化された４残基ペプチド（配列番号３）６．５ｍｇ（１５μｍｏｌ）をエッペンチューブに入れ、８０％蟻酸溶液（６．５ｍＬ）に溶解させた後、２５℃にて臭化シアン１５９．０ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を遮光した後、３７℃にて反応を行い、２８．５時間後、反応溶液を凍らせ反応を停止させた。このものを凍結乾燥後、得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝１００：０−＞６０：４０  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、反応中間体であるエステル体を３．８ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６Ｈ２８Ｎ４Ｏ７：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ３８９．４、ｆｏｕｎｄ、３８９．２【０１４６】
同様にして得られた反応中間体５ｍｇをエッペンチューブにいれ、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２、６Ｍ  グアニジン塩酸含有）０．６ｍＬにて溶解させた後、３７℃にて反応させた。１時間後、反応が終了していることをＨＰＬＣで確認後、ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝１００：０−＞６０：４０  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、目的とする保護基を有する４残基ペプチドＡｃ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号４）を３．５ｍｇ得た。なお、反応終了は３０分後とすることもできる。
ＥＳＩ-ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６Ｈ２８Ｎ４Ｏ７：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ３８９．４、ｆｏｕｎｄ、３８９．１【０１４７】
実施例２  Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕの製造
固相合成用カラムにＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（０.５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃にて１時間攪拌した。なお、ＤＣＭは１．５ｍＬとすることもできる。攪拌後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で１５分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１４８】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７．０μＬ、６３．１ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。なお、ＤＭＦは２ｍＬとすることもできる。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ（１４８．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（２９２．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１６９．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（１５５．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（２３４．３ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（２０５．８ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１６９．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）―Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕの保護基を有する８残基ペプチド（配列番号５）を得た。その後、樹脂上で、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で２０分間処理し脱保護し、ＤＭＦ，ＤＣＭを用いて洗浄した後に、予め用意した試薬Ｋ（ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ＝８２．５／５／５／５／２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、２時間２５℃で攪拌した。なお、試薬Ｋの代わりに、ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ＝８１．５／５／５／５／２．５／１．０を用いることもできる。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８５：１５−＞５０：５０  １５分  流速２．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、８残基のペプチド、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号６）を得た。【０１４９】
得られた８残基のペプチド（配列番号６）３２ｍｇ（４０μｍｏｌ）をナスフラスコにいれ、０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液４０ｍＬ（ｐＨ８．６、６Ｍ  グアニジン塩酸液、３．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）とアセトニトリル１３ｍＬに溶解させた後、２５℃にてメチル−４−ニトロベンゼンスルホネート（２６１ｍｇ）を加えた。１時間後、１０％ＴＦＡ溶液（３．８ｍＬ）を加え、ｐＨ４にした後、ジエチルエーテルを加え抽出操作を行った。濃縮後、得られた残渣をＯＤＳカラムにて精製を行い、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕのシステイン残基の硫黄原子がメチル化された８残基ペプチド（配列番号７）を３０ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３５Ｈ６４Ｎ９Ｏ１１Ｓ：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ８１９．０、ｆｏｕｎｄ、８１８．８【０１５０】
得られたシステイン残基の硫黄原子がメチル化された８残基ペプチド（配列番号７）２９ｍｇ（３６μｍｏｌ）をナスフラスコに入れ、８０％蟻酸溶液１５ｍＬにて溶解させた後、２５℃にて臭化シアン３８１ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を遮光した後、２５℃で反応を行い、３２時間後、反応溶液を凍らせ反応を停止させた。このものを凍結乾燥後、得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９０：１０−＞７０：３０  ６０分  流速４．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、反応中間体であるエステル体を１８ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３４Ｈ６２Ｎ９Ｏ１２：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ７８８．９、ｆｏｕｎｄ、７８８．５【０１５１】
得られた反応中間体５ｍｇをエッペンチューブにいれ、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２、６Ｍ  グアニジン塩酸含有）０．６３ｍＬで溶解させた後、３７℃にて反応させた。９．２５時間後、反応が終了していることを確認後、ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝１００：０−＞４０：６０  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、目的とする８残基ペプチドＶａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号８）を４．１ｍｇ得た。なお、反応終了は７．２５時間後とすることもできる。
ＥＳＩ-ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３４Ｈ６２Ｎ９Ｏ１２：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ７８８．９、ｆｏｕｎｄ、７８８．７【０１５２】
実施例３  Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの製造
固相合成用カラムにＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０.５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃にて１時間攪拌した。なお、ＤＣＭは１．５ｍＬとすることもできる。攪拌後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で１５分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１５３】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７．０μＬ、６３．１ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）（３２４．４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（１７６．７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（１９３．７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（１７７．２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（２９２．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（２２９．８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１６９．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）（３２４．４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（１９３．７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（１７６．７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙの保護基を有する１１残基ペプチド（配列番号９）を得た。その後、樹脂上で、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液２ｍＬで２０分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。ＤＭＦ，ＤＣＭを用いて洗浄した後に、予め用意した試薬Ｋ（ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ＝８２．５／５／５／５／２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、２時間２５℃で攪拌した。なお、試薬Ｋの代わりに、ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ＝８１．５／５／５／５／２．５／１．０を用いることもできる。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝７０：３０−＞４０：６０  １５分  流速２．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの１１残基のペプチド（配列番号１０）を得た。【０１５４】
得られた１１残基のペプチド（配列番号１０）２１ｍｇ（１５μｍｏｌ）をナスフラスコにいれ、０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液１５ｍＬ（ｐＨ８．６、６Ｍ  グアニジン塩酸液、３．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）とアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解させた後、２５℃にてメチル−４−ニトロベンゼンスルホネート（６６ｍｇ）を加えた。３０分間後、１０％ＴＦＡ溶液（１．５ｍＬ）加え、ｐＨ４にした後、ジエチルエーテルを加え抽出操作を行った。濃縮後、得られた残渣をＯＤＳカラムにて精製を行い、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙのシステイン残基の硫黄原子がメチル化された１１残基ペプチド（配列番号１１）を１９ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６６Ｈ１００Ｎ１８Ｏ１４Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ７０１．４、ｆｏｕｎｄ、７０１．５【０１５５】
得られたシステイン残基の硫黄原子がメチル化された１１残基ペプチド（配列番号１１）１８ｍｇ（１３μｍｏｌ）をナスフラスコに入れ、２．４ｍＭ  ８０％蟻酸溶液５．４ｍＬで溶解させた後、２５℃にて臭化シアン１３６ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を遮光した後、２５℃にて反応を行い、約５０時間後、反応溶液を凍らせ反応を停止させた。このものを凍結乾燥後、得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８５：１５−＞５０：５０  ６０分  流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、反応中間体であるエステル体を７．５ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６５Ｈ１００Ｎ１８Ｏ１５：［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ６８６．４、ｆｏｕｎｄ、６８６．５【０１５６】
得られた反応中間体７ｍｇをエッペンチューブにいれ、りん酸緩衝溶液（ｐＨ７．２、６Ｍ  グアニジン塩酸含有）０．５０ｍＬで溶解させた後、３７℃にて反応させた。１時間後、反応が終了していることを確認後、ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０−＞４０：６０  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、目的とするＬｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの１１残基ペプチド（配列番号１２）を５．４ｍｇ得た。
ＥＳＩ-ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６５Ｈ100Ｎ１８Ｏ１５：［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ６８６．４、ｆｏｕｎｄ、６８６．４【０１５７】
実施例４  Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａの製造
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０.２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０.２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０.２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、これを固相合成用の固相担体として用いた。【０１５８】
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（０.５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。なお、ＤＣＭは２．５ｍＬとすることもできる。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）で１５分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。
ＤＭＦで洗浄後、１残基のペプチド２μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。下記式（９）で表される糖鎖アスパラギン（１０ｍｇ，３.６μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（２ｍｇ，６μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．１２ｍＬ）に溶解させ、エッペンチューブに入れ、ＤＩＰＥＡ（０．６８μｌ，４μｍｏｌ）を加えて２５℃で１８時間攪拌した。【０１５９】
【化２０】
2009017154.tif 000021
【０１６０】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）で１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後の糖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１６１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（１．３５ｍｇ、０.０１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（１．５３μＬ、１．２６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．０２ｍＬ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｖａｌ（３．４ｍｇ、０.０１ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（３．５ｍｇ、０.０１ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（３．５ｍｇ、０.０１ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（３．１ｍｇ、０.０１ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）の保護基を有する６残基糖付加ペプチド（配列番号１３）を得た。このものを、酢酸：トリフルオロエタノール（＝１：１）を樹脂が十分に浸る程度に加え、４時間後、樹脂をろ過して除き、ろ液部分を別途用意したジエチルエーテルに加え晶析を行い、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで、保護基を有する６残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号１３）を含む残渣が得られた。【０１６２】
得られた保護基を有する６残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号１３）２ｍｇ（０．５５μｍｏｌ）とモレキュラーシーブ（ＭＳ）４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（２μｌ，１６．４μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（８５μｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（１．４ｍｇ，２．７μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．４６μｌ，２．７μｍｏｌ）を加え２．５時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテル（５ｍｌ）を加え化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をアセトニトリル５０％水溶液で回収した。これを凍結乾燥し、得られた凍結乾燥品に９５％ＴＦＡ水溶液を加えて２５℃で２時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した後に、５０％アセトニトリル水溶液に溶かして凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０−＞４０：６０  ６０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、Ｃ末端がベンジルチオエステルであるＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ−ＳＢｎの６残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号１５）を得た。【０１６３】
なお、エッペンチューブ内での糖鎖アスパラギンとの反応から配列番号１５の６残基の糖鎖付加ペプチドを得る上記の工程として、以下の手法を用いることも可能であった：
ＤＭＦで洗浄後、１残基のペプチド４．３μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。式（９）で表される糖鎖アスパラギン（１７ｍｇ，８.６μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（６ｍｇ，８．６μｍｏｌ）をＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝４：１、０.２９ｍＬに溶解させ、エッペンチューブに入れ、ＤＩＰＥＡ（１．５μｌ，８．６μｍｏｌ）を加えて２５℃で１８時間攪拌した。【０１６４】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）で１０分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後の糖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１６５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（２．９ｍｇ、０.０２２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３．３μＬ、０．０２２ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（０．５４ｍＬ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。アミノ基を保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｖａｌ（７．３ｍｇ、０.０２２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（７．６ｍｇ、０.０２２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（７．６ｍｇ、０.０２２ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ａｌａ（４．０ｍｇ、０.０２２ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＢｏｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）の保護基を有する６残基糖付加ペプチド（配列番号１４）を得た。このものを、酢酸：トリフルオロエタノール（＝１：１）を樹脂が十分に浸る程度に加え、２４時間後、樹脂をろ過して除き、ろ液部分を別途用意したジエチルエーテルに加え晶析を行い、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで、保護基を有する６残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号１４）を含む残渣が得られた。【０１６６】
得られた保護基を有する６残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号１４）１８ｍｇ（７．５μｍｏｌ）とモレキュラーシーブ（ＭＳ）４Ａ（１９０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（２６μｌ，３７．５μｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（１．９ｍL）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（２０ｍｇ，３７．５μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６．７μｌ，３７．５μｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテル（１０ｍｌ）を加え化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで溶解した。これを減圧下に濃縮し、得られた残渣に９５％ＴＦＡ水溶液を加えて２５℃で２時間攪拌した。反応液を濃縮後、ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝１００：０−＞４０：６０  ６０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製して、Ｃ末端がベンジルチオエステルであるＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ−ＳＢｎの６残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号１５）を得た。【０１６７】
一方、固相合成用カラムにＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（０.５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃にて１時間攪拌した。なお、ＤＣＭは１．５ｍＬとすることもできる。攪拌後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で１５分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は１０分間行うこともできる。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１６８】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７．０μＬ、６３．１ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。なお、ＤＭＦは２ｍＬとすることもできる。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（２３４．３ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（２０５．８ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１６９．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）（３０９．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（１７６．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（１８４．２ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（１７６．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（１６８．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）（２１２．８ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）（２６３．３ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（１６８．７ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（１８４．２ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（２９２．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ）を用い、固相樹脂にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ―Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）―Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａの保護基を有する１４残基ペプチド（配列番号１６）を得た。その後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍＬ）で２０分間処理し脱保護し、ＤＭＦ，ＤＣＭを用いて洗浄した後に、予め用意した試薬Ｋ（ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ＝８２．５／５／５／５／２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、２時間２５℃で攪拌した。なお、試薬Ｋの代わりに、ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ＝８１．５／５／５／５／２．５／１．０を用いることもできる。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０−＞４０：６０  ３０分  流速４．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、Ｃｙｓ−Ｇｌｎ―Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ―Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａの１４残基ペプチド（配列番号１７）を得た。【０１６９】
このようにして調製した１４残基ペプチド（配列番号１７）１．１ｍｇと先に合成したＣ末端がベンジルチオエステルである６残基の糖付加ペプチド（配列番号１５）１．３ｍｇとの二種類を同じエッペンチューブにいれ、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２、６Ｍ  グアニジン塩酸含有）２７５μＬに溶解させた後、２５℃にてチオフェノール（１μＬ）とベンジルメルカプタン（１μＬ）を加え、３７℃で反応を行った。２６時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０−＞５０：５０  ６０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａの２０残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１８）を１．５ｍｇ得た。【０１７０】
得られた２０残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１８）１．５ｍｇ（０．３９μｍｏｌ）をナスフラスコにいれ、０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液０．３９ｍＬ（ｐＨ８．６、６Ｍ  グアニジン塩酸液、３．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）とアセトニトリル０．１３ｍＬに溶解させた後、２５℃にてメチル−４−ニトロベンゼンスルホネート（１．７ｍｇ）を加えた。４０分間後、１０％ＴＦＡ溶液（１．５ｍＬ）加え、ｐＨ４にした後、ジエチルエーテルを加え抽出操作を行った。水層を濃縮後、得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０−＞５５：４５  ６０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い（なお、精製には上記Ｃ４カラムの代わりにＣ１８カラムを用いることもできる）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａのシステイン残基の硫黄原子がメチル化された２０残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号１９）を１．６ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６５Ｈ２６５Ｎ３１Ｏ７４Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １３００．７、ｆｏｕｎｄ、１３００．４【０１７１】
得られたシステイン残基の硫黄原子がメチル化された２０残基糖鎖付加ペプチド（配列番号１９）１．６ｍｇ（０．４μｍｏｌ）をエッペンチューブに入れ、８０％蟻酸溶液０．４ｍＬにて溶解させた後、２５℃にて臭化シアン４．３ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を遮光した後、３７℃にて反応を行い、３５時間後、反応溶液を凍らせ反応を停止させた。このものを凍結乾燥後、得られた残渣に５％ヒドラジン含水和物（２００μＬ）加え反応系内をｐＨ１０〜１１にした。５分後、酢酸（５μＬ）を加え反応系内をｐＨ８〜９にした。このものをＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ４  ２５０×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０−＞５０：５０  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にて精製を行い、目的とする糖ペプチドＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａの２０残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号２０）を０．７ｍｇ得た。【０１７２】
なお、臭化シアンとの反応後、３４時間後、反応溶液を減圧下に濃縮し、得られた残渣に５％ヒドラジン含水和物（２００μＬ）加え１０分間撹拌した後、反応液に酢酸５μＬを加え、ＨＰＬＣで精製を行っても、同様に２０残基の糖鎖付加ペプチド（配列番号２０）を得ることができた。
ＥＳＩ-ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６４Ｈ２６３Ｎ３１Ｏ７５：［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １２９０．６、ｆｏｕｎｄ、１２９０．７【０１７３】
実施例５  Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａの製造
固相合成用カラムにＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎ(メルク社製)(１００μｍｏｌ)を入れ、塩化メチレン(ＤＣＭ)、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ(０.５０ｍｍｏｌ)、ＭＳＮＴ(０.５０ｍｍｏｌ)及びＮ−メチルイミダゾール(０.３７５ｍｍｏｌ)をＤＣＭ(１．５ｍＬ)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃にて２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１７４】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ(６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(７７．０μＬ、６３．１ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、をＤＭＦ(２ｍＬ)に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｍｅｔ(Ｏ)(１９３．８ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ(１４８．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)(２９２．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ(１４８．９ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)を用い、固相樹脂上にＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ(Ｏ)−Ａｌａの保護基を有する５残基ペプチド(配列番号２１)を得た。その後、樹脂上で、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で１０分間処理して脱保護し、２０％無水酢酸／ＤＭＦ溶液(１．２５ｍＬ)を用いて、遊離アミノ基に対し、アセチル保護を行った。ＤＭＦ，ＤＣＭを用いて洗浄した後に、予め用意した試薬(ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ＝９５／２．５／２．５)を樹脂が十分に浸る程度に加え、２時間２５℃で攪拌した。樹脂をろ過して除き、ろ液にジエチルエーテル２０ｍＬを加え沈殿させた。沈殿をろ過した後、０．１％ＴＦＡ水溶液にて溶解させた。このものを減圧下に濃縮した後、凍結乾燥を行い、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ(Ｏ)−Ａｌａである４位のメチオニンの硫黄原子が酸化された５残基ペプチド(配列番号２２)を含む混合物を得た。【０１７５】
得られた４位のメチオニンの硫黄原子が酸化された５残基ペプチド(配列番号２２)混合物５ｍｇをナスフラスコにいれ、０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液(ｐＨ８．６、６Ｍ  グアニジン塩酸液、３．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有)１０ｍＬで溶解した。このものに２−メルカプトエタノール(７μＬ)を加え１０分間撹拌を行った後、反応液にメチル−４−ニトロベンゼンスルホネート(６６ｍｇ)を含有するアセトニトリル溶液３．３ｍＬを加えた。２５分後、１０％ＴＦＡ溶液(１．０ｍＬ)加え、中和した後、ジエチルエーテルを加え抽出操作を３回行った。水層を減圧下に濃縮後、得られた残渣をＨＰＬＣ(Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ−１８  ２５０×１０ｍｍ、  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０９％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０、  グラジエントＡ：Ｂ＝１００：０→１００：０→６０：４０、  ０分→５分→３５分  流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ)で精製し、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ(Ｍｅ)−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ(Ｏ)−Ａｌａである２位のシステイン残基の硫黄原子がメチル化、４位のメチオニン残基が酸化された５残基ペプチド(配列番号２３)を４ｍｇ得た。【０１７６】
得られた２位のシステイン残基の硫黄原子がメチル化、４位のメチオニン残基が酸化された５残基ペプチド(配列番号２３)３．８ｍｇをエッペンチューブに入れ、８０％蟻酸溶液３．１ｍＬに溶解させた後、臭化シアン７９．０ｍｇを加え遮光した後、アルゴン置換下、３７℃にて３９時間撹拌した。反応後、減圧濃縮を行い、反応中間体であるエステル体を含む残渣を得た。【０１７７】
得られた残渣をエッペンチューブにいれ、ｐＨ７．２のリン酸ナトリウム緩衝溶液１．２５ｍＬ(６Ｍグアニジン塩酸含有)にて溶解させた後、４５分間撹拌した。その後、反応液に、トリフルオロ酢酸３．６ｍＬ、ヨウ化アンモニウム２２ｍｇ、ジメチルスルフィド１１μＬを加え、室温にて撹拌した。３０分後、反応液に水１０ｍＬを加えた後、四塩化炭素にて分液洗浄を行った。水層を減圧下に濃縮し、得られた残渣をＨＰＬＣ(Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  ２５０×４．６ｍｍ、  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０９％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０、  グラジエントＡ：Ｂ＝１００：０→１００：０→６０：４０、  ０分→５分→６５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ)にて精製を行い、目的とするＡｃ―Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａの保護基を有する５残基ペプチド(配列番号２４)を２．６ｍｇ得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６Ｈ２８Ｎ４Ｏ７：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ４６４．２、ｆｏｕｎｄ、４６４．５【０１７８】
実施例６  Ｓｅｒ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの製造
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ(メルク社製)(１００μｍｏｌ)を入れ、塩化メチレン(ＤＣＭ)、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸(ＨＭＰＢ)(０.２５ｍｍｏｌ)、ＴＢＴＵ(０.２５ｍｍｏｌ)及びＮ−エチルモルホリン(０.２５ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(２ｍＬ)に溶解させてカラムに入れ、２５℃で２時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、これを固相合成用の固相担体として用いた。【０１７９】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ(０.５０ｍｍｏｌ)、ＭＳＮＴ(０.５０ｍｍｏｌ)及びＮ−メチルイミダゾール(０.３７５ｍｍｏｌ)をＤＣＭ(４．５ｍＬ)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で１０分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１８０】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ(６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(７７．０μＬ、６３．１ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、をＤＭＦ(４ｍＬ)に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａを用い、固相樹脂上にＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの保護基を有する１８残基ペプチド(配列番号２５)を得た。【０１８１】
この保護基を有する１８残基ペプチド(配列番号２５)を、樹脂上で、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で１０分間処理して脱保護した。ＤＭＦ，ＤＣＭを用いて洗浄した後にＦｍｏｃ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)(０.２０ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ(０.５０ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(０.５０ｍｍｏｌ)、をＤＭＦ(３．６ｍＬ)に溶解させ、１５分間活性化させたものを加えた。５時間反応後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で２０分間処理し脱保護し、固相樹脂上にＴｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの保護基を有する１９残基糖付加ペプチド(配列番号２６)を得た。【０１８２】
得られた固相樹脂上の保護基を有する１９残基糖付加ペプチド(配列番号２６)の０．０２ｍｍｏｌ相当を別途固相合成用カラムにとり、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)(０．１ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(０．１ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ(０．１ｍｍｏｌ)をＤＭＦ０．５ｍＬに溶解させ、１５分間活性化させたものを加え１時間反応を行った。反応液をろ過後、酢酸：トリフルオロエタノール＝１：１を樹脂が十分に浸る程度に加え、１４時間後、樹脂をろ過して除き、ろ液を減圧下に濃縮し、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの保護基を有する２０残基糖付加ペプチド(配列番号２７)を含む残渣が得られた。【０１８３】
得られた２０残基の保護基を有する糖付加ペプチド(配列番号２７)７５ｍｇ(３５μｍｏｌ)とベンジルメルカプタン１２３μｌ(１０５μｍｏｌ)をＤＭＦ３．５ｍｌに加え、アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ(９１ｍｇ，１７５μｍｏｌ)、ＤＩＰＥＡ(３０μｌ，１７５μｍｏｌ)を加え２．５時間攪拌した。反応液にジエチルエーテルを加え、結晶を沈殿させた後、ろ過、得られた残渣にＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ＝９５／２．５／２．５を樹脂が十分に浸る程度に加え、２時間２５℃で攪拌した。樹脂をろ過して除いた後、ろ液を濃縮し残渣を回収した。得られた残渣を、ＨＰＬＣ(Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０９％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９０：１０−＞６０：４０  ３０分  流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ)で精製して、Ｃ末端がベンジルチオエステルである、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＳＢｎの２０残基糖付加ペプチド(配列番号２８)を得た。【０１８４】
一方、先に得られた固相樹脂上の１９残基の保護基を有する糖付加ペプチド(配列番号２６)の０．０２ｍｍｏｌ相当を別途固相合成用カラムにとり、Ｂｏｃ−Ｔｈｉａ(０．０４ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(０．１ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ(０．１ｍｍｏｌ)をＤＭＦ１．５ｍＬに溶解させ、１５分間活性化させたものを加え２０分間反応を行った。反応液をろ過後、試薬(ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ＝９５／２．５／２．５)を樹脂が十分に浸る程度に加え、２時間２５℃で攪拌した。樹脂をろ過して除いた後、ろ液を濃縮した。得られた残渣を、０．２Ｍメトキシアミン及び０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ４、６Ｍ塩酸グアニジン含有)２．１ｍｌに溶解させ、Ｎ末端のチアゾリンを開環した後、ＨＰＬＣ(Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９０：１０−＞６０：４０  ３０分  流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ)で精製して、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの２０残基の糖付加ペプチド(配列番号２９)を得た。【０１８５】
このようにして得られた、２０残基の糖付加ペプチド(配列番号２９)１３ｍｇと先に得られたＣ末端がベンジルチオエステルである２０残基のペプチド(配列番号２８)１２ｍｇを、リン酸緩衝溶液(ｐＨ７．２、６Ｍ  グアニジン塩酸含有)２．９ｍＬに溶解させ、このものに４−メルカプトフェニル酢酸３０ｍｇ、トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン１７ｍｇを加え、３時間反応させた。反応液を、ＨＰＬＣ(Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ８  ２５０×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０９％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９０：１０→６０：４０  ３０分  流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ)で精製して、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの４０残基糖付加ペプチド(配列番号３０)を１８ｍｇ得た。【０１８６】
得られた４０残基の糖付加ペプチド(配列番号３０)１６ｍｇをナスフラスコにいれ、０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液(ｐＨ８．６、６Ｍ  グアニジン塩酸液、３．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有)３．８ｍＬで溶解した。このものに２−メルカプトエタノール(３μＬ)を加え１０分間撹拌を行った後、メチル−４−ニトロベンゼンスルホネート２５ｍｇを含有したアセトニトリル１．２７ｍＬを加えた。２５分後、１０％ＴＦＡ溶液０．４５ｍＬ加え、中和した後、ジエチルエーテル２ｍＬを加え分液洗浄を３回行った。水層を減圧下に濃縮後、得られた残渣をＨＰＬＣ(Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ−４  ２５０×４．６ｍｍ、  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.０８％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０、  グラジエントＡ：Ｂ＝１００：０→１００：０→９０：１０→６０：４０、  ０分→１０分→４０分  流速１．２ｍｌ／ｍｉｎ)で精製し、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ(Ｍｅ)−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの２１位のシステイン残基の硫黄原子がメチル化された４０残基糖付加ペプチド(配列番号３１)を含む混合物を１３ｍｇ得た。【０１８７】
得られた２１位のシステイン残基の硫黄原子がメチル化された４０残基糖付加ペプチド(配列番号３１)を含む混合物１２ｍｇをナスフラスコに入れ、８０％蟻酸水溶液２．９ｍＬにて溶解させた後、２５℃にて臭化シアン１５２ｍｇを加えた。反応容器を遮光した後、３７℃にて反応を行い、３６時間後、反応溶液を減圧下に濃縮した。残渣をトリフルオロ酢酸２．９ｍＬに溶解させ、ヨウ化アンモニウム２．４ｍｇ、ジメチルスルフィド２４μＬを加え、室温下に３０分反応させた。３０分後、反応系に水６ｍＬを加えた後、四塩化炭素にて分液洗浄を行った。水層を、減圧下に濃縮後、残渣を５％ヒドラジン水溶液１．４ｍＬに溶解させ、１０分間室温にて反応させた。１０分後、反応液に酢酸０．１４ｍＬを加えた後、ＨＰＬＣ(Ｖｙｄａｃ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ−４  ２５０×４．６ｍｍ、  展開溶媒Ａ：５０ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４水溶液  Ｂ：アセトニトリル、  グラジエントＡ：Ｂ＝９０：１０→７０：３０、６０分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ)で精製し、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ(ＧａｌＮＡｃ)−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの目的とする４０残基糖付加ペプチド(配列番号３２)を２．３ｍｇ得た。
ＥＳＩ-ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １３８８．５、ｆｏｕｎｄ、１３８８．６【０１８８】
実施例７  Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕの製造
固相合成用カラムにＴｒｔ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ(メルク社製)(１００μｍｏｌ)を入れ、塩化メチレン(ＤＣＭ)、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。ろ過後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ(０.２０ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＥＡ(０．４ｍｍｏｌ)をＤＣＭ(０．６６ｍＬ)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃にて２時間攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１７：２：１、ＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(１ｍＬ)で２０分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１８９】
アミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ(６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(７７．０μＬ、６３．１ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、をＤＭＦ(２ｍＬ)に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｓｎ(１７７．２ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)(１９１．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)(１５１．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)を用い、固相樹脂上にＢｏｃ−Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−Ａｓｎ−Ｇｌｙの保護基を有する４残基ペプチド(配列番号３３)を得た。【０１９０】
ＤＭＦ、ＤＣＭを用いて洗浄した後に、ＡｃＯＨ：ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝５：４：１、２ｍＬを加え、室温で２時間反応させた。２時間後、反応液をろ過して回収し、減圧下に濃縮を行い、残渣を得た。この残渣にベンゼン１ｍＬを加え共沸操作を２回行った後、ＤＭＦ０．８１ｍＬにて溶解させた。この溶液に対し、アルゴン気流下０℃で、ＰｙＢＯＰ４２．１ｍｇ、ＤＩＰＥＡ１４μｌ、ベンジルメルカプタン５７μＬを加え３０分攪拌した。反応後、飽和塩化アンモニウム水溶液で中和後、水および飽和食塩水にて分液洗浄を行った。有機層を、硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過、次いでろ液を減圧下に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒；酢酸エチル：ＭｅＯＨ：水＝２０：２：１)にて精製し、目的とするペプチドが含まれるフラクションを集め、減圧下に濃縮を行った。得られた残渣を、９５％ＴＦＡ水溶液で溶解し、１０分間反応させた。反応液を減圧下に濃縮し、Ｃ末端にベンジルチオエステルを有するＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ＳＢｎの４残基ペプチド(配列番号３４)を得た。【０１９１】
一方、固相合成用カラムにＷａｎｇ  ｒｅｓｉｎ(メルク社製)(０．１ｍｍｏｌ)を入れ、塩化メチレン(ＤＣＭ)、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ(０.５０ｍｍｏｌ)、ＭＳＮＴ(０.５０ｍｍｏｌ)及びＮ−メチルイミダゾール(０.３７５ｍｍｏｌ)をＤＣＭ(２ｍＬ)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃にて２時間攪拌した。２時間後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で２０分間処理し脱保護した。ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１９２】
アミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ(６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(７７．０μＬ、０.５０ｍｍｏｌ)、をＤＭＦ２ｍＬに溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。２５℃で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)(１９８．８ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ(１７６．８ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)を用い、固相樹脂上にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ｌｅｕの保護基を有する３残基ペプチドを得た。その後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液(２ｍＬ)で２０分間処理し脱保護した後、別途合成例１で合成したＢｏｃ−Ｔｈｒ(Ｓ−ＳｓｅｃＢｕ)の保護基を有するトレオニン誘導体を、ＨＯＢｔ(６７．６ｍｇ、０.５０ｍｍｏｌ)、ＤＩＰＣＩ(７７．０μＬ、０.５０ｍｍｏｌ)、をＤＭＦ２ｍＬに溶解させ、１５分間活性化させたものを加え３時間反応させ、固相樹脂上に、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(Ｓ−ＳｓｅｃＢｕ)−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−Ｌｅｕの保護基を有する４残基ペプチド(配列番号３５)を得た。このものに、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で２時間反応させた後、樹脂をろ過して除き、ろ液を減圧下に濃縮し、Ｔｈｒ(Ｓ−ＳｓｅｃＢｕ)−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕの保護基を有する４残基ペプチド(配列番号３６)を得た。【０１９３】
このようにして得られた保護基を有する４残基ペプチド(配列番号３６)２．２ｍｇと、先に得られたチオエステルを有する４残基ペプチド(配列番号３４)２．２ｍｇを０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．３、６Ｍ  塩酸グアニジン、４−メルカプトフェニル酢酸  ２０ｍｇ含有)ｘｘｍＬに溶解し、３．５時間反応させた。反応後、ジチオスレイトールを加え、１０分間撹拌した後、反応液をＨＰＬＣ(Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  ７５×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９０：１０→３５：６５  １５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ)で精製し、５位のトレオニン残基の側鎖水酸基がチオール基で置換された、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ(ＳＨ)−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕである８残基のペプチド、(配列番号３７)を得た。得られたペプチドに含まれるトレオニン誘導体残基は、主に以下の式で示される立体配置を有すると考えられた。【０１９４】
【化２１】
2009017154.tif 000022
【０１９５】
得られた５位のトレオニン残基の側鎖水酸基がチオール基で置換された８残基のペプチド、(配列番号３７)３．５ｍｇをナスフラスコにいれ、０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液(ｐＨ８．６、６Ｍ  グアニジン塩酸液、３．３ｍＭ  ＥＤＴＡ含有)４．１ｍＬで溶解した。このものに２−メルカプトエタノール(２．９μＬ)を加え１５分間撹拌を行った後、メチル−４−ニトロベンゼンスルホネート(２６．２ｍｇ)をアセトニトリル１．３７ｍＬに溶解したものを加え５０分間反応させた。反応後、１０％ＴＦＡ溶液(１．０ｍＬ)加え、中和した後、反応液をＨＰＬＣ(Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  ７５×４．６ｍｍ、  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０、  グラジエントＡ：Ｂ＝９０：１０→３５：６５  １５分  流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ)で精製し、５位のトレオニン残基の置換されたチオール基の硫黄原子がメチル化された、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ(ＳＭｅ)−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕである８残基ペプチド(配列番号３８)を得た。【０１９６】
得られた５位のトレオニン残基の置換されたチオール基の硫黄原子がメチル化された８残基ペプチド(配列番号３８)４ｍｇをナスフラスコに入れ、７０％蟻酸溶液４．６３ｍＬに溶解させた後、臭化シアン４９．０ｍｇを加え遮光、アルゴン置換下、３７℃にて撹拌した。４８時間後、減圧濃縮を行った後、５％ヒドラジン水溶液０．９３ｍＬを加え１５分間反応した。このものに酢酸６０μＬを加えた後、反応液をＨＰＬＣ(Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  ７５×４．６ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８５：１５→４５：５５  １５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ)で精製し、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕの目的とする８残基ペプチド、(配列番号３９)を得た。得られたペプチド中に含まれるトレオニン残基の立体配置は、天然のものと同様であると反応機構から推察された。
ＥＳＩ-ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３４Ｈ５９Ｎ９Ｏ１５：［Ｍ＋１Ｈ］１＋  ８３４．４１、ｆｏｕｎｄ、８３５．１【０１９７】
合成例１  Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(Ｓ−ＳｓｅｃＢｕ)の合成
Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(３００ｍｇ,１．３７ｍｍｏｌ)を蒸留したＤＭＦ(６．８５ｍＬ,２００ｍＭ)に溶かした後にＮ−(３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ)−Ｎ’−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ(７８６ｍｇ,４．１ｍｍｏｌ)とＨＯＢｔ(３７０ｍｇ,２．７４ｍｍｏｌ)を加え、０℃で１５分撹拌した後、ＴＭＳＥｔＯＨ(１．９５ｍＬ,１３．７ｍｍｏｌ)を加え、０℃で撹拌した。20時間後、ＴＬＣで反応終了確認後、反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水で中和し、水で2回、飽和食塩水で1回分液洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過を行い、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒、酢酸エチル:ヘキサン＝１：３)で精製し、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ−ＴＭＳエステル(収量:３４２ｍｇ,収率:７８％)を得た。【０１９８】
得られたＢｏｃ−Ｔｈｒ−ＴＭＳエステルを、ベンゼンで2回共沸した後、残渣をＤＣＭ２０．８ｍＬに溶かした。メタンスルホニルクロライド３２２ｍＬ(４．１６ｍｍｏｌ)とトリエチルアミン１．１６ｍＬ(８．３２ｍｍｏｌ)を加えて、０℃で撹拌した。１０分後、TLCで反応終を了確認後、反応溶液をＤＣＭで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液で中和後、水で2回、飽和食塩水で1回分液洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過を行い、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒、酢酸エチル:ヘキサン＝１：４)で精製し、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(ＯＭｓ)−ＴＭＳエステル(収量７２４．６ｍｇ,収率８８％)を得た。【０１９９】
得られたＢｏｃ−Ｔｈｒ(ＯＭｓ)−ＴＭＳエステル１．０６ｇを、ベンゼンで2回共沸した後、一晩デシケーターで乾燥させた。このものをＤＭＦ８．９ｍＬに溶解させた後、チオ酢酸０．５７ｍＬ(７．９５ｍｍｏｌ)とＤＢＵ０．７９ｍＬ(５．３ｍｍｏｌ)をＤＭＦ４．４ｍＬに溶解させ２０分間反応させた溶液を加え、４５℃で撹拌した。１８時間後、ＴＬＣにて反応の終了を確認した後、飽和塩化アンモニウム水溶液で中和後、水で2回、飽和食塩水で1回分液洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過を行い、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒、酢酸エチル:ヘキサン＝１：２０)で精製し、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(ＳＡｃ)−ＴＭＳエステル(収量５３６．８ｍｇ、収率５３．７％)を得た。【０２００】
得られたＢｏｃ−Ｔｈｒ(ＳＡｃ)−ＴＭＳエステル１．１ｇをメタノール１００ｍＬに溶解した後、ジピリジルジスルフィド(３．２１ｇ、１４．６ｍｍｏｌ)、Ｓｅｃ−ＢｕＳＨ１．７５ｍＬ(１６．１ｍｍｏｌ)をメタノール５．５ｍＬに溶解させた溶液を加えた。その後、水酸化ナトリウムのメタノール溶液(５００ｍＭ) １１．７ｍＬを加えた。１８時間後、ＴＬＣにて反応の終了を確認後、１％酢酸水溶液で中和後、減圧下に濃縮した後、酢酸エチルで希釈した。このものを水で2回、飽和食塩水で1回分液洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後ろ過を行い、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒、酢酸エチル:ヘキサン＝１：４０)で精製した。得られた混合物をベンゼンで2回共沸した後、ＤＭＦ２９ｍＬ(１００ｍＭ)に溶解させた。これにテトラブチルアンモニウムフルオライド・３水和物２．２８ｍｇ(７．３ｍｍｏｌ)を加え、０℃で撹拌した。１５分撹拌後、ＴＬＣにて反応の終了を確認、次いで飽和塩化アンモニウム水溶液で中和を行った。この反応液を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄した後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥を行い、ろ過後、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(展開溶媒、酢酸エチル:ヘキサン＝１：４→酢酸エチル：メタノール：水＝２０：２：１)で精製し、目的とするＢｏｃ−Ｔｈｒ(Ｓ−ＳｓｅｃＢｕ)(収量６５０ｍｇ、収率６９％)を得た。【０２０１】
配列表フリーテキスト
配列番号1は、実施例1の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号2は、実施例1の、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号3は、実施例1の、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号4は、実施例1の、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号5は、実施例2の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号6は、実施例2の、アミノ酸配列である。
配列番号7は、実施例2の、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号8は、実施例2の、アミノ酸配列である。
配列番号9は、実施例3の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号10は、実施例3の、アミノ酸配列である。
配列番号11は、実施例3の、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号12は、実施例3の、アミノ酸配列である。
配列番号13は、実施例4の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号14は、実施例4の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号15は、実施例4の、糖鎖が付加された、ベンジルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。
配列番号16は、実施例4の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号17は、実施例4の、アミノ酸配列である。
配列番号18は、実施例4の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号19は、実施例4の、糖鎖が付加された、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号20は、実施例4の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。【０２０２】
配列番号21は、実施例5の、保護基及びメチオニンスルホキシドを有するアミノ酸配列である。
配列番号22は、実施例5の、メチオニンスルホキシドを有する、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号23は、実施例5の、メチル化されたシステイン及びメチオニンスルホキシドを有する、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号24は、実施例5の、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号25は、実施例6の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号26は、実施例6の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号27は、実施例6の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号28は、実施例6の、糖鎖が付加された、ベンチルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。
配列番号29は、実施例6の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号30は、実施例6の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号31は、実施例6の、糖鎖が付加された、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号32は、実施例6の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号33は、実施例7の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号34は、実施例7の、ベンチルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。
配列番号35は、実施例7の、保護基及びトレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号36は、実施例7の、トレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号37は、実施例7の、トレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号38は、実施例7の、トレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号39は、実施例7の、アミノ酸配列である。
【産業上の利用可能性】
【０２０３】
本発明は、ペプチド及び糖ペプチドの製造方法を提供する。本発明によれば、システインを含まないペプチドを得ようとする場合にも、ライゲーション法を用いることができる。本発明はまた、N結合型糖ペプチド及びO結合型糖ペプチドの製造に有用である。
【配列表】
2009017154000001.app
【国際調査報告】
2009017154.tif 000028
2009017154.tif 000029
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