【手続補正書】
【提出日】平成16年4月26日(2004.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】  図1Aに示すアミノ酸配列（配列番号：２）を有する単離されたSTRAP-1蛋白質。
【請求項2】  請求項1記載の蛋白質の少なくとも15個の連続したアミノ酸からなる単離ポリペプチド。
【請求項3】  図1Aに示すアミノ酸配列（配列番号：２）と全長にわたって少なくとも90％一致しているアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項4】  （a）TがUであってもよい、図1Aに示す配列（配列番号：１）を有するポリヌクレオチド、（b）アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）に受入番号98849として登録されたプラスミド8P1D4クローン10.1中に含まれるcDNAによって配列がコードされるSTRAP-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（c）請求項1記載のSTRAP-1蛋白質をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項5】  請求項4記載のポリヌクレオチドに対して完全に相補的である、単離ポリヌクレオチド。
【請求項6】  請求項4記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項7】  請求項6記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項8】  ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項7記載の宿主細胞を培養すること、および培養物からSTRAP-1蛋白質を回収することを含む、STRAP-1蛋白質を生産するための方法。
【請求項9】  請求項8記載の方法によって生産されるSTRAP-1ポリペプチド。
【請求項10】  図9に示すアミノ酸配列（配列番号：１１）を含む単離STRAP-2蛋白質。
【請求項11】  請求項10記載の蛋白質の少なくとも15個の連続したアミノ酸からなる単離ポリペプチド。
【請求項12】  （a）TがUであってもよい、図9に示す配列（配列番号：１０）を有するポリヌクレオチド、および（b）請求項10記載のSTRAP-2蛋白質をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項13】  請求項12記載のポリヌクレオチドに対して完全に相補的である単離ポリヌクレオチド。
【請求項14】  （a）請求項1記載のSTRAP-1をコードする発現プラスミドによるトランスフェクションを受けた293T細胞であってSTRAP-1蛋白質を発現するトランスフェクト293T細胞を免疫組織化学的に染色し、かつ（b）トランスフェクションを受けていない293T細胞を免疫組織化学的に染色しない抗体。
【請求項15】  293T細胞が、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）に受入番号98849として登録されたプラスミド8P1D4クローン10.1中のSTRAP-1コード配列を含む発現プラスミドによるトランスフェクションを受けた、請求項14記載の抗体。
【請求項16】  請求項1記載のSTRAP-1蛋白質または請求項2記載のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体。
【請求項17】  請求項16記載のモノクローナル抗体。
【請求項18】  請求項17記載の抗体の断片。
【請求項19】  請求項17記載の抗体の抗原結合ドメインを含む組換え蛋白質。
【請求項20】  検出マーカーで標識された請求項17記載の抗体。
【請求項21】  毒素と結合した請求項17記載のモノクローナル抗体。
【請求項22】  治療薬と結合した請求項17記載のモノクローナル抗体。
【請求項23】  検出マーカーで標識された請求項18記載の抗体断片。
【請求項24】  検出マーカーで標識された請求項19記載の組換え蛋白質。
【請求項25】  請求項10記載のSTRAP-2蛋白質または請求項11記載のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体。
【請求項26】  請求項25記載のモノクローナル抗体。
【請求項27】  検出マーカーで標識された請求項26記載の抗体。
【請求項28】  毒素と結合した請求項26記載のモノクローナル抗体。
【請求項29】  治療薬と結合した請求項26記載のモノクローナル抗体。
【請求項30】  試料を請求項20記載の抗体、請求項23記載の抗体断片、または請求項24記載の組換え蛋白質と接触させること、およびそれに対する試料中のSTRAP-1蛋白質の結合を検出することを含む、生物試料中のSTRAP-1蛋白質の存在を検出するためのアッセイ法。
【請求項31】  試料を請求項27記載の抗体と接触させること、およびそれに対する試料中のSTRAP-2蛋白質の結合を検出することを含む、生物試料中のSTRAP-2蛋白質の存在を検出するためのアッセイ法。
【請求項32】  下記の段階を含む、生物試料中のSTRAP-1ポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイ法：
（a）試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）に受入番号98849として登録されたプラスミド8P1D4クローン10.1中に含まれるSTRAP-1 cDNAまたは図1Aに示すポリヌクレオチド（配列番号：１）もしくはその相補物と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる段階、および
（b）ハイブリダイゼーション複合体の存在によって試料中にSTRAP-1ポリヌクレオチドが存在することが示されるような、プローブと試料中のSTRAP-1ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって形成されるハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する段階。
【請求項33】  下記の段階を含む、生物試料中のSTRAP-2ポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイ法：
（a）試料を、請求項12記載のポリヌクレオチドまたはその相補物と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる段階、および
（b）ハイブリダイゼーション複合体の存在によって試料中にSTRAP-2ポリヌクレオチドが存在することが示されるような、プローブと試料中のSTRAP-2ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって形成されるハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する段階。
【請求項34】  生物試料中のSTRAP-1 mRNAの存在を検出するためのアッセイ法であって、
（a）少なくとも1つのプライマーを用いる逆転写によって試料からcDNAを作製する段階、
（b）そのようにして作製されたcDNAを、その中のSTRAP-1 cDNAを増幅するために、STRAP-1ポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅する段階、
（c）増幅されたSTRAP-1 cDNAの存在を検出する段階を含み、
センスおよびアンチセンスプローブとして用いるSTRAP-1ポリヌクレオチドが図1Aに示すポリヌクレオチド（配列番号：１）を増幅しうるアッセイ法。
【請求項35】  生物試料中のSTRAP-2 mRNAの存在を検出するためのアッセイ法であって、
（a）少なくとも1つのプライマーを用いる逆転写によって試料からcDNAを作製する段階、
（b）そのようにして作製されたcDNAを、その中のSTRAP-2 cDNAを増幅するために、STRAP-2ポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅する段階、
（c）増幅されたSTRAP-2 cDNAの存在を検出する段階を含み、
センスおよびアンチセンスプローブとして用いるSTRAP-2ポリヌクレオチドが図9に示すポリヌクレオチド（配列番号：１０）を増幅しうるアッセイ法。
【請求項36】  STRAP-1の細胞外ドメインと結合する請求項17、21または22記載の抗体を含む、前立腺癌の治療のための組成物。
【請求項37】  STRAP-1の細胞外ドメインと結合する請求項17、21または22記載の抗体を含む、結腸癌の治療のための組成物。
【請求項38】  STRAP-1の細胞外ドメインと結合する請求項17、21または22記載の抗体を含む、膀胱癌の治療のための組成物。
【請求項39】  STRAP-2の細胞外ドメインと結合する請求項26または28記載の抗体を含む、前立腺癌の治療のための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
STRAPポリヌクレオチドには、図1Aに示すヒトSTRAP-1のヌクレオチド配列（配列番号：１）もしくは図9に示すヒトSTRAP-2のヌクレオチド配列（配列番号：１０）を有するポリヌクレオチド、上記のもののいずれか一方に対して相補的な配列、または上記のもののいずれかのポリヌクレオチド断片が含まれうる。もう1つの態様には、図1Aに示すヒトSTRAP-1蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：２）をコードする、もしくは図9に示すヒトSTRAP-2蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：１１）をコードするポリヌクレオチド、上記のもののいずれか一方に対して相補的な配列または上記のもののいずれかのポリヌクレオチド断片が含まれる。もう1つの態様には、図1Aに示すヒトSTRAP-1 cDNA（配列番号：１）またはそのポリヌクレオチド断片とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしうるポリヌクレオチドが含まれる。もう1つの態様には、図9に示すヒトSTRAP-2 cDNA（配列番号：１０）またはそのポリヌクレオチド断片とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしうるポリヌクレオチドが含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明のこの局面のさらに詳細な態様には、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能とするプライマーおよびプライマー対、ならびに本発明の核酸分子またはその任意の部分と選択的または特異的にハイブリダイズするプローブが含まれる。プローブは例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出マーカーで標識してもよい。このようなプローブおよびプライマーは、試料中のSTRAPポリヌクレオチドの存在を検出するために、およびSTRAP蛋白質を発現する細胞を検出するための手段として用いることができる。このようなプローブの例には、図1Aに示すヒトSTRAP-1 cDNA配列（配列番号：１）の全体または一部を含むポリペプチド、および図9に示すヒトSTRAP-2 cDNA配列（配列番号：１０）の全体または一部を含むポリペプチドが含まれる。STRAP mRNAを特異的に増幅しうるプライマー対の例は、以下の実施例でも述べる。当業者には理解されると思われるが、本明細書で提示する配列に基づいて極めて多くの異なるプライマーおよびプローブを調製し、STRAP mRNA、またはSTRAPファミリーの特定のメンバー（例えば、STRAP-1）をコードするmRNAを増幅および／または検出するために有効に用いることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
STRAP蛋白質
本発明のもう1つの面は、種々のSTRAP蛋白質およびそのポリペプチド断片を提供する。本明細書で用いるSTRAP蛋白質とは、図1Aに提示するヒトSTRAP-1のアミノ酸配列（配列番号：２）、図9に提示するヒトSTRAP-2（配列番号：１１）、他の哺乳動物のSTRAP相同体および変異体、ならびにSTRAPの生物活性を有するこれらの蛋白質の対立遺伝子変異体および保存置換変異体のアミノ酸配列を有するか、それを含む蛋白質のことを意味する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
STRAP蛋白質の1つの具体的な態様は、図1Aに示すヒトSTRAP-1のアミノ酸配列（配列番号：２）を含む。STRAP蛋白質のもう1つの態様は、図9に示すSTRAP-2部分アミノ酸配列（配列番号：１１）を含むポリペプチドを含む。もう1つの態様は、図11Bに示すSTRAP-3部分アミノ酸配列（配列番号：４）を含むポリペプチドを含む。さらにもう1つの態様は、図11Bに示すSTRAP-4部分アミノ酸配列（配列番号：５）を含むポリペプチドを含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明は、図1Aに示すSTRAP-1（配列番号：２）、図9に示すSTRAP-2 （配列番号：１１）または図11Bに示すSTRAP-3（配列番号：４）またはSTRAP-4（配列番号：５）のアミノ酸配列の一部に対応するポリペプチドなどの、STRAPアミノ酸配列の生物活性断片を含むSTRAPポリペプチドも提供する。本発明のこの種のポリペプチドは、STRAP蛋白質に付随するエピトープと特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力というようなSTRAP蛋白質の特性を示す。特定のSTRAP蛋白質に特有な（他のSTRAP蛋白質と比較して）アミノ酸配列を含むポリペプチドは、その特定のSTRAP蛋白質と特異的に反応すると思われる抗体を産生するために用いうる。例えば、図11Aに示すSTRAP-1およびSTRAP-2構造のアミノ酸の整列化物を参照すれば、各分子がその構造に特有な配列鎖（stretch of sequence）を含むことを当業者は容易に理解すると考えられる。これらの特有の配列鎖は、STRAP-1またはSTRAP-2特異的抗体の作製のために用いることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
図1Aに示すSTRAPのアミノ酸配列（配列番号：２）を、抗体の作製を目的としてSTRAP蛋白質の特定の領域を選択するために用いてもよい。例えば、STRAPアミノ酸配列の疎水性および親水性分析を用いて、STRAP構造における親水性領域を同定することができる。シュウ-ファスマン（Chou-Fasman）、ガルニエ-ロブソン（Garnier-Robson）、カイト-ドゥーリトル（Kyte-Doolittle）、アイゼンバーグ（Eisenberg）、カープラス-シュルツ（Karplus-Schultz）もしくはジェームソン-ウルフ（Jameson-Wolf）分析などの当技術分野で知られた他の種々の方法を用いて、免疫原性構造が認められるSTRAP蛋白質の領域のほか、他の領域およびドメインを容易に用いることもできる。変異型STRAP蛋白質を特異的に認識する抗体を作製するためには、変異体に特有な（野生型STRAPと比較して）アミノ酸配列が好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
もう1つの態様では、STRAP-1の細胞表面エピトープを認識するmAbを産生させるための免疫原としてSTRAP-1を発現するNIH 3T3細胞を用いて、STRAP-1モノクローナル抗体を作製することが可能である。反応性mAbは、STRAP-1を過剰発現するPC-3細胞を用いる細胞式（cell-based）ELISAによってスクリーニングしうる。もう1つの具体的な態様では、STRAP-1蛋白質の細胞外領域である3種のペプチド（具体的には、REVIHPLATSHQQYFYKIPILV（配列番号：２２）、RRSYRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDVWRMEI（配列番号：２３）およびWIDIKQFVWYTPPTF（配列番号：２４））を免疫化のためにヒツジ赤血球と結合させる。もう1つの具体的な態様では、適切な発現系（例えば、バキュロウイルス発現系pBlueBac4.5、Invitrogen）を用いて作製したアミノ末端にHis-タグを有する組換えSTRAP-1蛋白質を、ニッケルカラムを用いて精製し、免疫原として用いる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
1つの態様において、生物試料中のSTRAP mRNAを検出するための方法は、少なくとも1つのプライマーを用いる逆転写によって試料からcDNAを作製すること、そのようにして作製したcDNAをその中のSTRAP cDNAを増幅するためにSTRAPポリヌクレオチドをセンスおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅すること、ならびに増幅されたSTRAP cDNAの存在を検出することを含む。もう1つの態様において、生物試料中のSTRAP遺伝子を検出するための方法は、試料からゲノムDNAをまず単離すること、単離されたゲノムDNAをその中のSTRAP遺伝子を増幅するためにSTRAPポリヌクレオチドをセンスおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅すること、ならびに増幅されたSTRAP遺伝子の存在を検出することを含む。STRAP-1（図1A、配列番号：１）、STRAP-2（図9、配列番号：１０）、STRAP-3（図10、配列番号：１４）またはSTRAP-4（図10、配列番号：１５）に関して提示したヌクレオチド配列から適宜、任意の数の適したセンスおよびアンチセンスプローブの組み合わせを設計し、この目的に用いることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
本出願者らは、前立腺内部の腺上皮細胞および前立腺癌細胞の表面全体にわたってSTRAP-1が強く均一に発現されるという強力かつ有力な証拠を数多く得ている。詳細については、実施例3Dおよび3Cに提示したSTRAP-1蛋白質発現の免疫組織化学およびウエスタンブロット分析、ならびに実施例3A,3Bおよび1に提示したノーザンブロット法およびRT-PCRによるデータから得られたSTRAP-1 mRNA発現プロファイルを参照されたい。特に、免疫組織化学分析の結果は、ヒト前立腺上皮細胞（正常および癌）の表面がSTRAP-1によって均一に覆われていると思われることを示している。生化学分析の結果、その6回膜貫通型の一次構造要素によって、および免疫組織化学染色により明瞭に可視化された細胞周囲染色によって最初に推測されたSTRAP-1の細胞表面局在が確認された。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
オリゴヌクレオチド：
HPLCで精製した以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
2002517184.tif 000001
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
複数組織に由来する第1ストランドのcDNAの標準化は、β-アクチンを増幅するためのプライマー5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3'（配列番号：３２）および5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3'（配列番号：３３）を用いて行った。第1ストランドのcDNA（5μl）は、0.4μMのプライマー、0.2μMの各dNTP、1×PCRバッファー（Clontech、10mM Tris-HCL、1.5mM MgCI2、50mM KCI、pH8.3）および1×クレンタック（Klentaq）DNAポリメラーゼ（Clontech）を含む総容積50μl中で増幅した。18、20および22サイクルの時点でPCR反応物5μlを採取し、アガロースゲル電気泳動に用いた。PCRは、MJリサーチ（MJ Research）社のサーマルサイクラーを以下の条件で用いて行った：最初に94℃ 15秒間の変性処理を行った後、94℃ 15秒間、65℃ 2分間、72℃ 5秒間を18、20および22サイクル。72℃での最後の伸長処理は2分間行った。アガロースゲル電気泳動を行った後、複数組織で得られた283bpのβ-アクチンバンドのバンド強度を肉眼で比較した。22サイクルのPCRの後のすべての組織におけるβ-アクチンバンド強度が等しくなるように、第1ストランドのcDNAに関する希釈係数を算出した。22サイクルのPCR後のすべての組織におけるバンド強度が等しくなるまでには標準化を3回行う必要があった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
8P1D4遺伝子の発現レベルを判定するために、標準化した第1ストランドcDNA 5μlを、（MIT、詳細についてはwww.genome.wi.mit.eduを参照）の助けを借りて設計した以下のプライマー対を用い、25、30および35回の増幅サイクルを用いるPCRによって分析した：
2002517184.tif 000002
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
8P1D4と命名したcDNAクローンの1つは436bp長であり、NCI-CGAP腫瘍遺伝子データベース中のEST配列と相同性が認められた。続いてこのcDNAを用いて、8P1D4遺伝子をコードする完全長cDNAを単離し、新たにSTRAP-1と命名した（以下の実施例2）。8P1D4 cDNAのヌクレオチド配列は、図1に示すSTRAP-1 cDNA配列ヌクレオチド残基150から585までに対応する。28P3E1と命名した561bp長のもう1つのクローンは、NCI-CGAP腫瘍遺伝子データベース中または他のデータベース中の多数のEST配列と相同性を示した。28P3E1配列の一部（356bp）は、ヒト胎児組織に由来するESTと同一であった。完全長STRAP-1 cDNAを入手してシークエンシングを行ったところ、このクローンがSTRAP-1（より具体的には、図1Aに示すSTRAP-1ヌクレオチド配列の残基622から3'末端まで）とも対応することが明らかになった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
実施例2：
完全長STRAP-1をコードするcDNAの単離
8P1D4／STRAP-1遺伝子をコードする別のcDNAを単離するために、436bpの8P1D4遺伝子断片（実施例1）を用いた。簡潔に述べると、436bpの8P1D4 cDNAから作製した標識プローブにより、正常ヒト前立腺cDNAライブラリー（Clontech）をスクリーニングした。陽性クローンの1つであるクローン10は1195bp長であり、既知のヒト遺伝子または蛋白質のいずれとも明らかな相同性がないヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列を有する339アミノ酸の蛋白質をコードする（国際出願・国際公開公報第98／53071号に最近記載されたラット腎損傷蛋白質との相同性は認められる）。コードされる蛋白質は膜貫通モチーフと予想されるものを少なくとも6つ含んでおり、これは細胞表面に配置することを意味する（図1A参照、膜貫通モチーフと予想される部分には下線を施している）。これらの構造的特徴から、「前立腺の蛇行性膜貫通抗原（Serpentine TRansmembrane Antigens of the Prostate）」の頭文字である「STRAP」という命名に至った。後に別のSTRAP蛋白質が同定されたため、8P1D4遺伝子産物を「STRAP-1」と新たに命名した。STRAP-1 cDNAおよびコードされるアミノ酸配列は図1Aに示しており、これはそれぞれ配列番号：１および２に対応する。STRAP-1 cDNAクローン10は、1998年8月26日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（「ATCC」）（Mannassas、VA）にプラスミド8P1D4クローン10.1としての形でATCC受入番号98849として登録されている。STRAP-1 cDNAクローンは、EcoRI／XbaI二重消化（5'末端にEcoRI、3'末端にXbal）を用いてそれから切り出すことができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
実施例3C：前立腺およびその他の癌におけるSTRAP-1蛋白質発現に関するウエスタンブロット分析
図1Aに示すSTRAP-1アミノ酸配列のアミノ酸残基 14から28までに対応する15量体ペプチド（WKMKPRRNLEEDDYL）（配列番号：３６）を合成し、以下の通りに、この蛋白質のアミノ末端に対するヒツジポリクローナル抗体（抗STRAP-1）を作製するためのヒツジの免疫化に用いた。このペプチドをKLH（キーホールリンペットヘモシアニン）と結合させた。ヒツジにまず完全フロイントアジュバント中に含めた400μgのペプチドによる免疫処置を行った。続いてこのヒツジに、不完全フロイントアジュバント中に含めた200μgのペプチドによる追加免疫処置を2週毎に行った。affi-gel 10（Bio Rad）と結合させたSTRAPペプチドを用いて、ヒツジ血清から抗STRAP抗体をアフィニティー精製した。精製した抗体は、0.1％アジ化ナトリウムを加えたリン酸緩衝生理食塩水中で保存する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
実施例3D：前立腺腫瘍生検および手術標本におけるSTRAP-1蛋白質発現に関する免疫組織化学分析
臨床材料におけるSTRAP-1蛋白質発現の程度を判定する目的で、さまざまな前立腺癌生検および外科標本から免疫組織化学分析のための組織切片を調製した。組織を10％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋した上で、標準的な手順に従って切片を作製した。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したLNCaP細胞の切片を陽性対照として用いた。STRAP-1のN末端エピトープを標的とする抗STRAP-1ポリクローナル抗体（直前に述べた通り）で切片を染色した。ポリクローナル抗体（ペプチド1）の作製に用いたSTRAP-1 N末端ペプチド免疫原またはSTRAP-1蛋白質の異なる領域に由来する非特異的ペプチド（ペプチド2；YQQVQQNKEDAWIEH（配列番号：３７））の過剰量の存在下でLNCaP切片を染色した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
実施例4：
TRAP-1蛋白質の生化学的特徴分析
STRAP-1蛋白質の特徴をまず分析するために、カルボキシ末端に6Hisを付加したものをコードするpcDNA 3.1Myc-Hisプラスミド（Invitrogen）中にcDNAクローン10（配列番号：１）をクローニングし、293T細胞へのトランスフェクションを行った後に抗Hisモノクローナル抗体（His-probe、Santa Cruz）ならびに上記の抗STRAP-1ポリクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによって分析した。細胞の染色は無傷細胞ならびに透過処理細胞に対して行った。その結果、いずれの抗体でも透過処理細胞のみが染色され、このことからSTRAP-1蛋白質の両端は細胞内に位置することが示唆された。このため、STRAP-1蛋白質の1つまたは複数の末端は、形質膜ではなく細胞内オルガネラに付随することが可能である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
STRAP-2の部分ヌクレオチドおよびコードされるORFのアミノ酸配列を図9に示す。STRAP-1および部分的なSTRAP-2一次構造のアミノ酸を整列化したものを図11Aに示す。STRAP-1および-2の171アミノ酸残基の重複部にわたる一致率は61％である（図11A）。相同ではあるものの、正常および癌性の組織および細胞におけるSTRAP-1および-2の発現パターンは著しく異なり、ヒト第7番染色体の対側の腕上という明瞭に異なる位置にマッピングされる（以下の実施例6および7参照）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
STRAP-1に関しては以下のPCRプライマーを用いた：
2002517184.tif 000003
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
98P4B6／STRAP-2に関しては以下のPCRプライマーを用いた：
2002517184.tif 000004
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
AI139607に関しては以下のPCRプライマーを用いた：
2002517184.tif 000005
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
R80991に関しては以下のPCRプライマーを用いた：
2002517184.tif 000006
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】  STRAP-1の構造。1A：STRAP-1（8P1B4）クローン10 cDNAのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号：１および２）。開始メチオニンはアミノ酸残基の1位に太字で示し、6つの膜貫通ドメインと推定される部分は太字で示した上に下線を施した。1B：STRAP-1の膜貫通型配置の模式図。図1Aの付番方式に対応する形で、細胞外ドメインと推定される部分に接するアミノ酸残基を示している。1C：クローン10およびクローン3の重複配列によって決定した高G／C含有5'非コード配列。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】  STRAP-1の前立腺組織における顕著な発現。最初のストランドのcDNAは16種の正常組織、LAPC異種移植片（4AD、4AIおよび9AD）およびヒーラ（HeLa）細胞から調製した。標準化はアクチンおよびGAPDHに対するプライマーを用いるPCRによって行った。STRAP-1（8P1D4）cDNA（図1A）に由来するプライマーを用いた半定量的PCRでは、STRAP-1が正常前立腺およびLAPC異種移植片で主に発現されることが見てとれる。STRAP-1の増幅には以下のプライマーを用いた：
2002517184.tif 000007
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】  STRAP-1が前立腺組織で主に発現されることを示す、種々の正常ヒト組織および前立腺癌異種移植片におけるSTRAP-1発現のノーザンブロット分析。図3A：完全長STRAP cDNAクローン10（図1A、配列番号：１）によるプローブ検索を行った2つの複数組織ノーザンブロット（Clontech）。側方にサイズ標準物質をキロベース（kb）単位で示している。各レーンは、β-アクチンプローブを用いて標準化したmRNA 2μgを含む。図3B：発現が明らかに検出される他の組織と比べて前立腺における発現がほぼ5倍強いことを示す、STRAP-1 cDNAクローン10（図1A、配列番号：１）によるプローブ検索を行った複数組織RNAドットブロット（Clontech、ヒトマスターブロット（Human Master Blot）カタログ番号7770〜1）。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】  ノーザンブロット（図3A）上の4kbのmRNAに対応するSTRAP-1 GTH9クローンのヌクレオチド配列（配列番号：９）。この配列は、図1AのSTRAP-1クローン10の配列に対して2399塩基対のイントロンを含む。コード領域はヌクレオチド96〜857および3257〜 3510である（太字で示している）。開始ATGは太字および下線で示し、停止コドンも太字および下線で示しており、イントロン-エクソンには下線を施している。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】  組織および複数の細胞株におけるSTRAP-1蛋白質の発現に関するウエスタンブロット分析。前立腺癌異種移植片および細胞株から調製した細胞可溶化物のウエスタンブロットを、ポリクローナル抗STRAP-1抗体調製物（詳細は実施例3C参照）によりプローブ検索した。試料は蛋白質20μgを含み、ウエスタンブロットの抗Grb-2プローブ検索によって標準化した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】  STRAP-2（98P4B6）クローンGTA3 cDNAの部分ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号：１１）。このクローンの5'末端配列は173アミノ酸からなるORFを含む。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】  STRAPファミリー蛋白質の一次構造の比較。図11A：STRAP-1（8P1D4クローン10、配列番号：２）およびSTRAP-2（98P4B6、配列番号：１１）配列のアミノ酸配列の整列化。 整列化は、ベイラー医科大学（Baylor College of Medicine）検索ランチャーウェブサイト（Search Launcher Web site）のSIM整列化プログラムを用いて行った。その結果、 171アミノ酸の重複部における一致率61.4％、スコア：576.0、ギャップ頻度：0.0％であった。図11B：PIMAプログラム（PIMA 1.4プログラム、インターネットアドレス<http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/multialign.html>）を用いた、STRAP-1とSTRAP-2およびファミリーのメンバーと推定される他の2つの蛋白質の部分ORF配列とのアミノ酸配列の整列化。SOSUIプログラム（インターネットアドレス<http://www.tuat.ac.jp/~mitaku/adv_sosui/submit.html>で入手可能）によって同定した膜貫通ドメインを太字で示している。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】  AI139607の胎盤および前立腺における顕著な発現。最初のストランドのcDNAは16種の正常組織から調製した。標準化はアクチンおよびGAPDHに対するプライマーを用いるPCRによって行った。AI139607に対するプライマーを用いた半定量的PCRでは、25サイクルの増幅後に、胎盤および前立腺においてAI139607の顕著な発現が認められる。AI139607の増幅には以下のプライマーを用いた：
2002517184.tif 000008
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】  R80991の肝臓における顕著な発現。最初のストランドのcDNAは16種の正常組織から調製した。標準化はアクチンおよびGAPDHに対するプライマーを用いるPCRによって行った。R80991に対するプライマーを用いた半定量的PCRでは、25サイクルの増幅後に肝臓においてR80991の顕著な発現が認められる。R80991の増幅には以下のプライマーを用いた：
2002517184.tif 000009
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】  STRAP-2（98P4B6）の前立腺組織における顕著な発現。最初のストランドのcDNAは8種の正常組織、LAPC異種移植片（4AD、4A1および9AD）およびヒーラ（HeLa）細胞から調製した。標準化はアクチンおよびGAPDHに対するプライマーを用いるPCRによって行った。98P4B6に対するプライマーを用いた半定量的PCRでは、正常前立腺およびLAPC異種移植片における98P4B6の顕著な発現が認められる。STRAP IIの増幅には以下のプライマーを用いた：
2002517184.tif 000010