【手続補正書】
【提出日】平成15年5月23日(2003.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞において遺伝子を発現させるための方法であって、以下：
形質転換されていない細菌細胞の集団に発現ベクターを提供する工程であって、該発現ベクターが、目的のタンパク質に遺伝子的に融合された輸送タンパク質コード配列を含む発現カセットを含む、工程；
該発現カセットを発現させる工程であって、その結果、輸送タンパク質：：目的のタンパク質の融合タンパク質が、産生され、そして培養培地中に輸送される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記細菌細胞がＳ．Ｔｙｐｈｉ細胞である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｌｙＥ遺伝子からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、第１８０位、第１８５位、第１８７位、および第１９３位でのアミノ酸置換からなる群より選択されるアミノ酸置換を生じる１つ以上の変異を有する配列番号２のアミノ酸配列をコードし、該変異が、該輸送タンパク質の溶血活性を減弱する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記目的のタンパク質が、抗原である、方法。
【請求項８】
宿主の免疫応答を誘発するための方法であって、以下：
細菌細胞の集団を、該宿主に提供する工程であって、該細菌細胞は、発現ベクターで形質転換されており、該発現ベクターは、目的のタンパク質コード配列に遺伝子的に融合された輸送タンパク質コード配列を含む発現カセットを含む、工程；
該発現カセットを発現させる工程であって、その結果、輸送タンパク質：：目的のタンパク質の融合タンパク質が、産生され、そして該宿主中に輸送される、工程；および
該融合タンパク質に対する該被験体からの免疫応答を誘発する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記細菌細胞がＳ．Ｔｙｐｈｉ細胞である、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｌｙＥ遺伝子からなる群より選択される、方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、第１８０位、第１８５位、第１８７位、および第１９３位でのアミノ酸置換からなる群より選択されるアミノ酸置換を生じる１つ以上の変異を有する配列番号２のアミノ酸配列をコードし、該変異が、該輸送タンパク質の溶血活性を減弱する、方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法であって、前記目的のタンパク質が、抗原である、方法。
【請求項１５】
目的のタンパク質を発現するための系であって、以下：
発現カセットを含む発現ベクターであって、該発現カセットが、目的のタンパク質のコード配列に遺伝子的に融合された輸送タンパク質コード配列を含む、発現ベクター；
該発現ベクターで形質転換される宿主細胞；および
形質転換された宿主細胞のための培養環境であって、該発現カセットが、輸送タンパク質：：目的のタンパク質の融合タンパク質を発現し、該融合タンパク質が、該形質転換された宿主細胞の外に輸送される、培養環境、
を備える、系。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記宿主細胞がＳ．Ｔｙｐｈｉ細胞である、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｌｙＥ遺伝子からなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、前記輸送タンパク質コード配列が、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、輸送タンパク質コード配列が、第１８０位、第１８５位、第１８７位、および第１９３位のアミノ酸置換からなる群より選択されるアミノ酸置換を生じる１つ以上の変異を有する配列番号２のアミノ酸配列をコードし、該変異が、該輸送タンパク質の溶血活性を減弱する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
さらに、ｈｌｙＥによってコードされる配列と比較した場合、分泌されたＨｌｙＥのＮ末端配列決定は、ＨｌｙＥが、輸送の間に、Ｎ末端がプロセッシングをされないことを明らかにした。Ｏｓｃａｒｓｓｏｎらは、ＨｌｙＥが、コレステロールに結合すること、および標的膜中のコレステロールの存在が、孔形成および溶解を刺激することを報告した（Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ，Ｊ．、Ｙ．Ｍｉｚｕｎｏｅ、Ｌ．Ｌｉ、Ｘ．Ｌａｉ、Ａ．Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ、およびＢ．Ｅ．Ｕｈｌｉｎ．１９９９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣｌｙＡ（ＳｈｅＡ）  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：１２２６−１２３８）。約１０３分子のＨｌｙＥが、標的の赤血球の溶解のために必要とされると推定され、これは、細胞溶解検出の前のＨｌｙＥの有意な蓄積を示唆する。ＨｌｙＥは、３．０〜９．０の間のｐＨ値の範囲内で非常に安定であり、そしてトリプシンおよびペプシンを含むプロテアーゼによる切断に対して耐性である（Ａｔｋｉｎｓ，Ａ．、Ｎ．Ｒ．Ｗｙｂｏｒｎ、Ａ．Ｊ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｔ．Ｊ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ、Ｌ．Ｋ．Ｂｌａｃｋ、Ａ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｉｎｇ、Ｍ．Ｈｉｓａｋａｄｏ、Ｐ．Ｊ．Ａｒｔｙｍｉｕｋ、およびＪ．Ｇｒｅｅｎ．２０００．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｅｃｔｅｒｉａｌ  ｔｏｘｉｎ，ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ｅ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  αＧ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４１１５０−４１１５５）。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
この開示された研究中に用いられるＣｌｙＡタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１および配列番号２として提供する。他のＨｌｙＥファミリーメンバーもまた、当業者に入手可能かつ公知である。例えば、細胞溶解素Ａの別のＳ．Ｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子は、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＪ３１３０３４の下で入手可能であり；細胞溶解素ＡのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ｃｌｙＡ遺伝子配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＪ３１３０３３の下で入手可能であり；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ短縮型ＨｌｙＥ（ｈｌｙＥ）遺伝子の完全なコード配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＦ２００９５５の下で入手可能であり；そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｌｙＡ遺伝子配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＪ００１８２９の下で入手可能である。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
発現ベクターの例を、図１に示す。図１Ａに、ｐＳＥＣ８４発現ベクターを示す。ｐＳＥＣ８４ベクターのヌクレオチド配列が、配列番号１に見出され得る。ｃｌｙＡ遺伝子によってコードされたＣｌｙＡのアミノ酸配列が、配列番号２に見出される。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
自己免疫抗原の例としては、ＩＡＳβ鎖が挙げられる。ＩＡＳβ鎖由来の１８アミノ酸ペプチドを用いたマウスのワクチン接種が、マウスに対する実験的自己免疫脳脊髄炎の防御および処置を提供することを実証した。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
これを果たすために、トランスポゾンＴｎｐｈｏＡを用いて、ｃｌｙＡをランダムに変異させた。この「ＴｎｐｈｏＡ」の「ｐｈｏＡ」は、アルカリホスファターゼをコードする（ＭａｎｏｉｌおよびＢｅｃｈｗｉｔｈ、ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ８２、ｐｐ  ８１２９−８１３３、１９８５を参照のこと）。ＴｎｐｈｏＡのトランスポゾンは、所定の標的タンパク質上に、ＰｈｏＡのＮ末端のインフレーム融合物のランダムな形成を可能とする。ＴｎｐｈｏＡ変異誘発を、ＤＨ５αへの機能的Ｓ．Ｔｙｐｈｉ  ＣｌｙＡ溶血素を発現する、ｐＧＥＭ−ＴｃｌｙＡのエレクトロポレーションを行ってＤＨ５α（ｐＧＥＭ−ＴｃｌｙＡ）を生成した後に、実施した。次いで、交差画線接合（ｃｒｏｓｓ  ｓｔｒｅａｋ  ｍａｔｉｎｇ）を、ＤＨ５α（ｐＧＥＭ−ＴｃｌｙＡ）およびＴｎｐｈｏＡのドナー株ＳＭ１０（ｐＲＴ７３３）の間で実施し、そしてテトラシクリン、カルベニシリン、およびカナマイシンを各々１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌ補充した２×ＬＢ５０（２×ＬＢ５０＋Ｔ１０Ｃ５０Ｋ１０）上でトランス接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）選択をした。次いで、細菌を、プラスミド精製のためにブロス（ｂｒｏｔｈ）培養中にプールし、そして増殖させ、そして精製したプラスミドを、２００μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充した２×ＬＢ５０＋Ｔ１０Ｃ５０Ｋ１０上でのＰｈｏ＋形質転換株の選択のために、ｐｈｏＡΔ２０変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＣ１１８へと再び形質転換した。ペリプラズムへとＮ末端が分泌されるか、表面に露出されるか、または全体が細胞外に輸送される、標的のタンパク質融合物を、色素生産性基質ＢＣＩＰを用いて加水分解の濃青色のハロを検出することによって、容易にスクリーニングし得る；Ｃ末端が分泌されるタンパク質は、この方法を用いて検出されない。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（実施例２）
（ＣｌｙＡに対する試験抗原のカルボキシル末端融合物の構築）
ＣｌｙＡのカルボキシル末端で融合されたパッセンジャータンパク質を輸送する能力を試験するために、アンピシリンおよびカルベニシリンの両方に対する耐性を与えるＲＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼタンパク質をコードするｂｌａ遺伝子を、実験に選択した。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
このタンパク質融合物を、ｐＳＥＣ８４のｃｌｙＡ  ３’末端のタンデム終止コドン隣接するＮｈｅＩ部位へとインフレームで挿入されたＳｐｅＩカセットの遺伝子融合物として操作した。最初に、２３残基のシグナル配列を有さない、成熟２６８アミノ酸β−ラクタマーゼをコードする８０７ｂｐのＳｐｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ＰＣＲによってｐＢＲ３２２誘導体から合成した。次いで、精製したフラグメントを、ｃｌｙＡの操作されたカルボキシル末端のＮｈｅＩ部位へとインフレームで挿入し、推定６２．９ｋＤａの融合タンパク質をコードする１７４２ｂｐのｃｌｙＡ−ｂｌａ遺伝子融合物を作製した。所望のプラスミド構築物は、５μｇ／ｍｌのカルベニシリンの存在下で増殖した培養物由来の単離されたコロニー中に容易に回収されたが、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを用いた選択後に回収したプラスミドは、不安定かつ遺伝子的に再構成されているようであった。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡの導入の後、コロニーを、溶血素活性の保持についてスクリーニングし、次いで、２×ＬＡ５０＋ＤＨＢ＋Ｔ１０中の１００μｇ／ｍｌの濃度の色素生産性基質ニトロセフィン（ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎ）を用いて、β−ラクタマーゼ活性についてスクリーニングし；プレートを、３０℃で、少なくとも１６時間インキュベートし、そしてニトロセフィンの切断を示すコロニー周辺の赤色ハロの存在について試験した。赤色ハロが、ＣＶＤ  ９０８−ｈｔｒＡ（ｐＳＥＣ８４ｂｌａ）周辺で観察され、これは、ニトロセフィンの切断を示し、酵素的に活性なβ−ラクタマーゼの存在を確認した。３４ｋＤａから６３ｋＤａへのＣｌｙＡの分子量のおよその倍加は、両方のドメインが、明らかに、各々のドメインの予想される生物学的活性を維持するように正しく折りたたまれた、２ドメインの融合タンパク質を生じることが結論づけられた。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
（結論）
本研究の結果は、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ由来の潜在性溶血素ＣｌｙＡを用いて、弱毒化ワクチン株ＣＶＤ  ９０８−ｈｔｒＡから周辺の培地への異種抗原ドメインの輸送を促進させ得るという結論を明白に支持する。さらに、本研究は、ＣｌｙＡを用いて、細菌から周辺の培地への融合タンパク質の輸送を促進させ得ることを実証する。上に例示されるように、ＣｌｙＡのカルボキシル末端に融合された適切に折りたたまれた目的のタンパク質を輸送する能力が、アンピシリンおよびカルベニシリンの両方に対する耐性を与えるＲＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼタンパク質をコードするｂｌａ遺伝子を用いて示された。ｐＢＲ３２２のｂｌａ遺伝子は、８６１ｂｐ長であり、かつペリプラズム空間へのラクタマーゼのＮ末端分泌を指向する２３アミノ酸シグナル配列を有する３１．５ｋＤａのタンパク質をコードする。上記の研究は、機能的ＣｌｙＡ−β−ラクタマーゼタンパク質融合物をコードする遺伝子融合物の好首尾な操作を示し、このタンパク質融合物は、溶血活性および色素原性β−ラクタマーゼ基質ニトロセフィンを切断して、切断されていないニトロセフィンの黄色の背景に対して赤色環を産生する能力の両方を保持した。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
興味深いことに、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンまたはアンピシリンのいずれかを補充した栄養豊富な培地中で形質転換株を増殖させている場合、そのような発現ベクターについて選択するための試みは、成功せず、そして大幅に再構成したプラスミドのみが、制限マッピングによって判断した場合に回収された。細胞質で発現したβ−ラクタマーゼが、約５μｇ／ｍｌのアンピシリンに対する耐性を与えながら、一方で適切に発現したペリプラズムのβ−ラクタマーゼが、４０００μｇ／ｍｌを超えるアンピシリンに対する耐性を与えることが、結局、実証された。しかし、β−ラクタマーゼタンパク質融合物の表面ディスプレイが、約１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに対する耐性を与えることが示された。実際、Ｃｈｅｒｖａｕｘらは、Ｅ．ｃｏｌｉからのβ−ラクタマーゼ融合物のＨｌｙＡ媒介分泌は、約５μｇ／ｍｌのアンピシリンに対する低レベルの耐性を再び与えることを報告している。彼らは、融合物表面のインタクトのβ−ラクタマーゼドメインの比活性が、改変されていないβ−ラクタマーゼの比活性と同様であるままであったけれども、高レベルのアンピシリンに対する耐性が観察されなかったことを実証し、そして彼らは、β−ラクタム抗生物質に対する細菌の耐性が、死滅させる標的に近いペリプラズム空間内のβ−ラクタマーゼの十分な濃度を必要とすると結論付けた。そのような観察に基づき、適切に折りたたまれたＣｌｙＡ−β−ラクタマーゼタンパク質融合物が、ＣＶＤ  ９０８−ｈｔｒＡ（ｐＳＥＣ８４ｂｌａ）内で合成され、そして輸送されて、アンピシリンまたはカルベニシリンに対する耐性を与えることなく、溶血性表現型、および色素原性セファロスポリンニトロセフィンのβ−ラクタマーゼ媒介加水分解を与えると結論付けられた。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
【表２】
2004532634.tif 000001
2004532634.tif 000002
2004532634.tif 000003
2004532634.tif 000004
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
図１は、本発明の発現ベクターの例を提供する。図１Ａは、ｐＳＥＣ８４発現ベクターを例示する。図１Ｂは、ｐＳＥＣ８４ｂｌａ発現ベクターを例示する。図１Ｃは、ｐＳＥＣ８４ｓａｃＢ（配列番号１８）を例示する。図１Ｄは、ｐＳＥＣ８４ｇｆｐｕｖを例示する。