(57)【要約】  【課題】  本発明は，糸状に凝集した自己線維芽細胞を製造するための自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法，及びそのような方法で製造された凝集塊を提供することを目的とする。また，本発明は，治療箇所に長期間留まることで効果的な治療効果を持続させることができる，皮膚または歯肉の軟組織の欠損を補修するための組成物，又はそのような組成物を具備する注射剤を提供することを目的とする。  【解決手段】  上記課題は，自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された培養培地で培養する工程と，自己線維芽細胞を前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程を含む自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法，及び製造される凝集塊などにより解決される。  【選択図】  図７
2008136183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって,    
ビタミンＣが添加された培養培地で培養する工程と，
自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，
を含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法。
【請求項２】
トリプシンを含む分離液で細胞を剥離する工程をさらに含む，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養培地で培養する工程は，
自己血清培地または無血清培地で培養する工程である，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記自己線維芽細胞は，
皮膚由来の線維芽細胞，または歯肉由来の線維芽細胞のいずれかである，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記培養する工程は，
回転培養により培養する工程であり，
前記回転培養は，
０．１〜２回転／分で行われる，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記培養方法で培養する工程は，
振とう培養を行う工程であり，
前記振とう培養は，
上下動培養，水平動培養，又は旋回培養のいずれかであり，
５〜５０回／分で振とうが行われる，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって，
前記培養する工程は，
回転培養を行う工程であり，
前記回転培養を行う工程は，
０．１〜０．５回転／分で細胞を培養する工程，
０．０１〜１ｍＭとなるようにビタミンＣを培地に添加し，１．５〜２回転／分で細胞を培養する工程，及び
０．５〜１．５回転／分で細胞を培養する工程，
をこの順で含む，請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって，
前記培養する工程は，
振とう培養を行う工程であり，
前記振とう培養を行う工程は，
５〜１０回／分で細胞を培養する工程，
０．０１〜１ｍＭとなるようにビタミンＣを培地に添加し，２０〜３０回／分で細胞を培養する工程，及び
１０〜２０回／分で細胞を培養する工程と，
をこの順に含む，請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法で製造される凝集塊。
【請求項１０】
凝集塊と，薬学的に許容される液剤とを含む，軟組織の欠損を修復するための組成物であって，
前記凝集塊は，
自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって,    
ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，
自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，
を含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法により製造され，
前記薬学的に許容される液剤は，
糖質，電解質，およびアミノ酸を含む液剤である，
組成物。
【請求項１１】
前記凝集塊は，
歯肉由来の線維芽細胞から作製される分化した線維芽細胞を含む凝集塊である，
請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，
自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，
培養した細胞を剥離する工程と，
を含み，
前記回収する工程で得られた凝集塊を，第１の注射針を介して前記凝集塊を注射器に収容した後に，
前記注射器から前記第１の注射針を取り除き，前記注射器に前記第１の注射針よりも内径の小さな第２の注射針を取り付ける，
注射剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，自己線維芽細胞として，自己コラーゲンを含む細胞外マトリックスにより被覆され，その結果凝集塊となったものを用いることで，治療箇所に自己線維芽細胞を留めさせることができる，皮膚または歯肉の軟組織の欠損を補修するための組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の軟組織の欠損を補修するために，顔などへコラーゲンや自己線維芽細胞などを注入する方法が知られている。たとえば，特公平７−１０７６３号公報（下記特許文献１）には，コラーゲンを含む美容整形剤が開示されている。【０００３】
また，特許第３５５９５６６号公報（下記特許文献２）では，自己の継代皮膚線維芽細胞を担体溶液に懸濁した懸濁物が開示されている。一方，この公報には，自己の皮膚線維芽細胞を無血清培地中でインキュベートして得られる凝集塊を注射器内に吸引して，患者に投与する方法が開示されている（たとえば，同公報第６頁３行目〜１８行目を参照。）。【０００４】
しかしながら，上記公報には医療上大きな問題があった。それは，被験者血漿を少量使用するものの，同種（他人）の血漿，フィブリンや非ヒト血清を用いた培養液を用いることで，ウィルス等の感染症のリスクがあった。更に，上記公報では，細胞同士を結合させるのではなく，血漿の凝集塊にふりかけている。しかも，自己線維芽細胞や血漿凝集塊とを同時に局所に注入しても，線維芽細胞には足場となるものがないので，生体内で速やかに移動する。その結果，線維芽細胞が治療を行いたい部分に留まらないため，治療効果が薄いという問題がある。また，同公報では，そもそも懸濁物を得ることを目的とするものであって，細胞の凝集塊を得ることを目的とするものではない。【０００５】
また，特表２００５−５３２０９０号公報（下記特許文献３）には，自己線維芽細胞を用いた治療に関する発明が開示されている。この公報には，自己の継代線維芽細胞及び筋細胞を含む組成物であって，それらがコラーゲンを含むマトリックスに組み込まれたものが，開示されている（たとえば，請求項８，段落［００６４］〜［００６７］）を参照。）。【０００６】
一方，特表２００５−５３２０９０号公報は，尿失禁，膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流現象の治療に関するものである。また，同公報の請求項１に記載されるように，同公報に開示される発明は，「培地血清由来のタンパク質および該線維芽細胞以外の細胞を実質的に含有しない，自己の継代皮膚線維芽細胞の懸濁物」に関する。このため，同公報に記載された発明は，コラーゲンを含む細胞外マトリックスで被覆された自己線維芽細胞を投与するものではない。もっとも，同公報に開示された発明は，自己のコラーゲンを皮膚の軟組織の欠損を補修するために用いるものでもない。【０００７】
また，特表２００６−５１０３９９号公報（下記特許文献４）には，皮膚，軟部組織,及び骨の欠損を修復する治療に関する発明が開示されている。この公報には，組織を修復するための組成物として，未分化間葉細胞及び線維芽細胞を含むことが開示されている。しかしながら，未分化細胞は細胞周期が短く盛んに分裂増殖を繰り返す傾向があるため，腫瘍化するリスクがあり，治療予後も不良であるという問題があった。
【特許文献１】特公平７−１０７６３号公報
【特許文献２】特許第３５５９５６６号公報
【特許文献３】特表２００５−５３２０９０号公報
【特許文献４】特表２００６−５１０３９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は，糸状に凝集した自己線維芽細胞を製造するための自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法，及びそのような方法で製造された凝集塊を提供することを目的とする。【０００９】
本発明は，治療箇所に長期間留まることで効果的な治療効果を持続させることができる，皮膚または歯肉の軟組織の欠損を補修するための組成物，又はそのような組成物を具備する注射剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
注射により液剤を投与する場合，注射液中に凝集塊が存在すると，注射針内部に凝集塊がつまり，うまく注射をすることができない。そのため，線維芽細胞やコラーゲンなどを注射により投与する場合，注射液に凝集抑制剤を混合し，凝集塊ができないようにするのが通常である。しかしながら，自己線維芽細胞を局所に注入しても，線維芽細胞には足場となるものがないので，生体内で速やかに移動する。その結果，線維芽細胞が治療を行いたい部分に留まらないため，治療効果が薄いという問題がある。そこで，本発明は，基本的には，注射には適さないと考えられた凝集塊をあえて製造し，そのような凝集塊を投与することで，コラーゲンによる足場を与えることができ，その結果，患部に自己線維芽細胞が長期間にわたり留まることができるという知見に基づくものである。【００１１】
本発明の第１の側面は，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法に関する。すなわち，自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された培養培地で培養する工程と，自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程とを含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法である。後述する実施例で示されたとおり，このような工程を行うことによって，糸状の凝集塊を製造することができる。さらに,後述する実施例で示されたとおり，上記工程によって製造される凝集塊は，コラーゲンを多く含有する。よって，線維芽細胞同士が強力につながった糸状の凝集塊を製造することができる。そして，後述する実施例で示されたとおり，プロテアーゼ抵抗性を有する凝集塊を製造することができる。すなわち，本発明の製造方法によれば，患部に投与した際，凝集塊が患部外へ移動しにくく，さらに生体内のプロテアーゼでバラバラに分散されにくい，治療効果の高い凝集塊を製造することができる。【００１２】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，トリプシンを含む分離液で細胞を剥離する工程をさらに含む上記に記載の製造方法である。後述する実施例に示されたとおり，本発明の製造方法では，得られる糸状の凝集塊は，コラーゲンを多く含有し，トリプシンを含む分離液を用いて剥離しても，バラバラに分散することがない。すなわち，プロテアーゼ抵抗性を有する。よって，本発明の製造方法によれば，患部に投与した際，凝集塊が患部外へ移動しにくく，さらに生体内のプロテアーゼでバラバラに分散されにくい，治療効果の高い凝集塊を製造することができる。【００１３】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記培養培地で培養する工程は，自己血清培地または無血清培地で培養する工程である，上記に記載の製造方法である。培養培地として，自己血清培地または無血清培地を用いることで，凝集塊を患部に投与した際，患部で炎症反応が起こりにくい凝集塊を製造することができる。また，自己由来の原料を用いることで，ウィルスなどによる感染や汚染などを防止することができることになるので，高い治療効果を得ることができる。【００１４】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記自己線維芽細胞は，皮膚由来の線維芽細胞，または歯肉由来の線維芽細胞のいずれかである，上記に記載の製造方法である。【００１５】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記培養する工程は，回転培養により培養する工程であり，前記回転培養は，０．１〜２回転／分（Ａ〜Ｂは，Ａ以上Ｂ以下を意味する。以下同じ）で行われる，上記に記載の製造方法である。回転培養を行うと，その回転方向に応じて，線維芽細胞から分泌されたコラーゲンに方向性をもたせることができるので，効果的に糸状の凝集塊を得ることができる。【００１６】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記培養方法で培養する工程は，振とう培養を行う工程であり，前記振とう培養は，上下動培養，水平動培養，又は旋回培養のいずれかであり，５〜５０回／分で振とうが行われる，上記に記載の製造方法である。後述する実施例で示されたとおり，振とう培養を行うと，その振とう方向に応じて，線維芽細胞から分泌されたコラーゲンに方向性をもたせることができるので，効果的に糸状の凝集塊を得ることができる。【００１７】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記培養する工程は，回転培養を行う工程であり，前記回転培養を行う工程は，０．１〜０．５回転／分で細胞を培養する工程，０．０１〜１ｍＭとなるようにビタミンＣを培地に添加し，１．５〜２回転／分で細胞を培養する工程，及び０．５〜１．５回転／分で細胞を培養する工程をこの順で含む，上記に記載の製造方法である。このように回転数を変化させる培養工程とすることで，効率よく線維芽細胞から分泌されるコラーゲン同士でつながった線維芽細胞の凝集塊を得ることができる。また線維芽細胞から分泌されるコラーゲンに方向性を持たせることができるので，効果的に糸状の細胞凝集塊を製造することができる。【００１８】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記培養する工程は，振とう培養を行う工程であり，前記振とう培養を行う工程は，５〜１０回／分で細胞を培養する工程，０．０１〜１ｍＭとなるようにビタミンＣを培地に添加し，２０〜３０回／分で細胞を培養する工程，及び１０〜２０回／分で細胞を培養する工程とをこの順に含む，上記に記載の製造方法である。このように振とう数を変化させる培養工程とすることで，効率よく線維芽細胞から分泌されるコラーゲン同士でつながった線維芽細胞の凝集塊を得ることができる。また線維芽細胞から分泌されるコラーゲンに方向性を持たせることができるので，効果的に糸状の細胞凝集塊を作製することができる。【００１９】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，上記に記載の方法で製造される凝集塊に関する。後述する実施例で示されたとおり，このように製造された凝集塊は，コラーゲンを多く含有し，自己線維芽細胞から分泌されるコラーゲンを含む細胞外マトリックスを介して前記自己線維芽細胞同士がつなげられることにより糸状となった凝集塊である。また，後述する実施例で示されたとおり，本発明の凝集塊は，プロテアーゼ抵抗性を有する。このようなコラーゲンを含む細胞外マトリックスでつながった凝集塊は，患部に投与したとき，コラーゲンを含む細胞外マトリックスが足場となり，患部外に凝集塊が移動しにくくなる。また，プロテアーゼ抵抗性を有するので，生体内のプロテアーゼによって分散されにくい。よって，本発明の凝集塊は，患部に留まることできるので，高い治療効果を得ることができる。また，細胞を多数まとめて患部に投与することができるため，線維芽細胞の増殖性が高く，高い治療効果を得ることができる。【００２０】
本発明の第２の側面は，凝集塊と，薬学的に許容される液剤とを含む，軟組織の欠損を修復するための組成物に関する。前記凝集塊は，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程とを含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法により製造される。前記薬学的に許容される液剤は，糖質，電解質，およびアミノ酸を含む液剤である。本発明の組成物に含まれる凝集塊は，上記したとおり，コラーゲンを多く含有し，プロテアーゼ抵抗性を有する。そして，動物や他人のタンパク質を利用しないので，炎症反応やウィルス感染なのどのリスクを軽減することができる。後述する実施例により示されたとおり，高カロリー輸液など電解質及びアミノ酸を含む液剤中に懸濁させた場合，自己線維芽細胞の生存性を高めることができる。よって，本発明の組成物は，高い治療効果を得ることができるので，軟組織の欠損を修復するために好適に用いることができる。【００２１】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記凝集塊は，分化した線維芽細胞を含む凝集塊である，上記に記載の組成物である。分化した線維芽細胞を含むことによって，投与後の線維芽細胞が腫瘍化するリスクを軽減することができ，軟組織の欠損を補修する組成物として好ましく用いることができる。【００２２】
本発明の第３の側面は，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，培養した細胞を凝集塊として回収する工程とを含み，前記回収する工程で得られた凝集塊を，第１の注射針を介して前記凝集塊を注射器に収容した後に，前記注射器から前記第１の注射針を取り除き，前記注射器に前記第１の注射針よりも内径の小さな第２の注射針を取り付ける，注射剤の製造方法に関する。【００２３】
このように，一端内径の太い注射針で凝集塊を吸い上げておいて，内径の細い注射針に替えるので，施術の際に適度な凝集塊の大きさに成形でき，細胞への物理的なダメージを最小限にでき，更に，注射針内に固まる事態を効果的に防止できる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば，糸状に凝集した自己線維芽細胞を製造するための自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法，及びそのような方法で製造された凝集塊を提供することができる。【００２５】
本発明によれば，治療箇所に長期間留まることで効果的な治療効果を持続させることができる，皮膚または歯肉の軟組織の欠損を補修するための組成物，又はそのような組成物を具備する注射剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は，実施例１により得られた線維芽細胞を含む液剤を示す図面に替わる写真である。
【図２】図２は，従来方法により得られる線維芽細胞を含む液剤を示す図面に替わる写真である。
【図３】図３は，実施例１において得られた凝集塊を分散させた様子を示す図面に替わる写真である。
【図４】図４は，線維芽細胞の細胞塊を分散させた様子を示す図面に替わる写真である。
【図５】図５は，高カロリー注射液で懸濁した場合の細胞の様子を示す図面に替わる写真である。
【図６】図６は，生理食塩水で懸濁した場合の細胞の様子を示す図面に替わる写真である。
【図７】図７は，静置培養または回転培養により得られた線維芽細胞の様子を示す図面に替わる写真である。図７Ａは，静置培養をして得られた線維芽細胞の様子を示し，図７Ｂ及び図７Ｃは，回転培養をして得られた線維芽細胞の様子を示す。
【図８】図８は，４℃で一定時間おいた細胞の状態を示す図面に替わる写真である。図８Ａは，培養開始２４時間後の細胞の状態を示す図面に替わる写真である。図８Ｂは，培養開始４８時間後の細胞の状態を示す図面に代わる写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の第１の側面は，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法に関する。すなわち，自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程とを含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法である。従来，線維芽細胞を培養すると，線維芽細胞の細胞塊が偶然得られる場合があった。しかしながら，このような細胞塊は，通常取り除かれたし，細胞同士がバラバラな状態であり，仮に生体内に注入しても移動しやすいものであった。一方，本発明では，積極的に，コラーゲンを含む細胞外マトリックスを分泌させ，自己線維芽細胞の凝集塊を得ることを目的とする。本発明では，細胞外マトリックスを介して，自己線維芽細胞同士がつなげられるため，生体内に注入された際に，良好な足場が得られ，長期間患部に滞留する凝集塊を製造することができる。【００２８】
凝集塊を製造するための線維芽細胞は，公知の方法で，補修する軟組織などから採取し，培養することができる。培養条件は，当業者であれば，培養する線維芽細胞の由来に応じて適宜調整することができる。また，線維芽細胞を培養する培地は，培養する線維芽細胞の由来に応じて，当業者であれば，適宜公知の培地を用いることができる。本発明の凝集塊は，凝集塊を製造するために線維芽細胞を提供した患者本人に投与するため，線維芽細胞を培養する培地は自己血清培地や，動物由来成分を使用していない無血清培地（例えばＡＳＦ培地１０４など）が好ましい。動物や他人のタンパク質を利用しないことで，ウィルスの感染や，汚染などのリスクを軽減できる。また，動物や他人のタンパク質が，患者に投与されたときにおこる免疫反応を防ぐことができる。【００２９】
「自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックス」は，自己線維芽細胞を培養することにより得られた自己コラーゲンや，コラーゲン同士を接着する機能を有するフィブロネクチンなどを含む物があげられる。後述する実施例により示されたように，具体的な細胞外マトリックスは，Ｉ型コラーゲン，ＶＩ型コラーゲン，フィブロネクチン，ビメンチン及びミクロフィブリル関連糖タンパク質などがあげられる。なお，細胞外マトリックスの主成分は，通常自己コラーゲンであるから，本明細書において，「自己コラーゲンを含む細胞外マトリックス」を含むとは「自己コラーゲンを含む」と読み替えてもよい。【００３０】
本発明の培養工程では，自己線維芽細胞を培養する際に，培地にビタミンＣを０．００１ｍＭ以上１０ｍＭ以下（好ましくは０．０１ｍＭ以上１ｍＭ以下，より好ましくは０．０５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下）添加する。そして，自己線維芽細胞からコラーゲンを分泌させ，それにより自己線維芽細胞の凝集塊を得る。本発明の凝集塊を得るための培養期間は，２日〜１か月があげられ，４〜２０日が好ましく，７〜１４日がさらに好ましい。培養工程では，数日おきに培地を交換することが好ましい。培地交換を行う期間として，１〜７日があげられ，好ましくは２〜４日である。定期的に培地を交換することで，長期間培養する細胞の生存率を高めることができるので，治療効果の高い凝集塊を製造することができる。また，培地交換を行う場合は，培地交換を行う毎に培地に添加するビタミンＣの濃度を上げていってもよい。徐々に濃度を高くすることで，コラーゲンの方向をそろえることができ，効率的に糸状の凝集塊を製造することができる。【００３１】
本発明において，コラーゲンの方向とは，コラーゲンの伸長方向のことをさす。コラーゲンに方向性を持たせるとは，コラーゲンを特定の方向に伸長させることをいう。そして，コラーゲンの方向をそろえるとは，複数の線維芽細胞から分泌されるコラーゲンをそれぞれ同じ方向に向かって伸長させることをいう。【００３２】
本発明の培養工程では，自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する。【００３３】
回転培養は，円筒状の培養容器など公知の回転培養用の容器を用い，公知の装置を用いて行うことができる。回転培養を行う場合の回転速度は，０．０１〜５回転／分があげられ，０．０５〜３回転／分が好ましく，０．１〜２回転／分がより好ましい。回転培養工程は，培養工程の途中で回転速度を変更してもよい。回転速度を変更する具体的な培養工程としては，回転培養を開始後１〜２日は，０．１〜０．５回転／分で培養する工程，その後，細胞が７０〜８０％コンフルエントになるまで１．５〜２回転／分で培養する工程，その後培養を終了するまで０．５〜１．５回転／分で培養する工程があげられる。細胞のコンフルエントの割合は当業者であれば適宜判断することができる。培地に添加するビタミンＣは，全行程の培地に添加しておいてもよいが，１．５〜２回転／分で培養する工程，及び０．５〜１．５回転／分で培養する工程の培地に添加することが好ましい。これら工程に添加するビタミンＣ濃度は，０．００１ｍＭ〜１０ｍＭがあげられ，０．０１ｍＭ〜１ｍＭが好ましく，０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭがより好ましい。このような工程とすることで，コラーゲンの方向をそろえることができ，効率的に糸状の凝集塊を製造することができる。【００３４】
振とう培養としては，上下動培養，水平動培養，旋回培養などがあげられる。これらの培養には，培養面が平面な公知の培養用容器を用いて行うことができる。振とう培養するための振とう培養装置は，公知の装置を用いることができる。【００３５】
上下動培養は，シーソー状態での振とう培養である。上下動培養においての１回とは，例えば，上下動培養用装置が，培養用容器を載置する板の中心に支点を有し，板の両端が上下に動く場合，板が水平の状態から，一端が上方向または下方向に動き，その後，反対の方向に動き，そして水平の状態に戻るという１サイクルを１回とカウントする。上下動培養を行う場合の振とう速度は，１〜５０回／分があげられ，５〜３０回／分が好ましく，１０〜２０回／分がより好ましい。シーソー状態の上下動をする角度は，培養用容器を水平に置いた位置を０度としたときに，±１〜１５度があげられ，±３〜１３度が好ましく，±５〜１０度がより好ましい。【００３６】
上下動培養工程は，培養工程の途中で振とう速度，又は振とう角度を変更してもよい。振とう速度を変更する具体的な培養工程としては，上下動培養を開始後１〜２日は，５〜１０回／分で培養する工程，その後，細胞が７０〜８０％コンフルエントになるまで２０〜３０回／分で培養する工程，その後培養を終了するまで１０〜２０回／分で培養する工程があげられる。また，振とう角度を変更する具体的な培養工程としては，上下動培養を開始後１〜２日は，±１〜２度で培養する工程，その後，細胞が７０〜８０％コンフルエントになるまで±１０〜１３度で培養する工程，その後培養を終了するまで±５〜１０度で培養する工程があげられる。培地に添加するビタミンＣは，全行程の培地に添加しておいてもよいが，振とう速度を変更する工程では，２０〜３０回／分で培養する工程，及び１０〜２０回／分で培養する工程の培地に添加することが好ましい。また，振とう角度を変更する工程では，±１０〜１３度で培養する工程，及び±５〜１０度で培養する工程の培地にビタミンＣを添加することが好ましい。これら工程に添加するビタミンＣ濃度は，０．００１ｍＭ〜１０ｍＭがあげられ，０．０１ｍＭ〜１ｍＭが好ましく，０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭがより好ましい。振とう速度，及び振とう角度を変更する培養工程は，振とう速度，または振とう角度の一方を固定にして，もう一方だけを変更してもよいし，両工程を変更してもよい。このような工程とすることで，コラーゲンの方向をそろえることができ，効率的に糸状の凝集塊を製造することができる。【００３７】
水平動培養は，水平面を保って一方向を往復する振とう培養であり，１往復を１回とする。水平動培養を行う場合の振とう速度は，１〜５０回／分があげられ，５〜３０回／分が好ましく，１０〜２０回／分がより好ましい。水平動培養工程は，培養工程の途中で振とう速度を変更してもよい。振とう速度を変更する具体的な培養工程としては，水平動培養を開始後１〜２日は，５〜１０回／分で培養する工程，その後，細胞が７０〜８０％コンフルエントになるまで２０〜３０回／分で培養する工程，その後培養を終了するまで１０〜２０ｒｐｍで培養する工程があげられる。培地に添加するビタミンＣは，全行程の培地に添加しておいてもよいが，振とう速度を変更する工程では，２０〜３０回／分で培養する工程，及び１０〜２０回／分で培養する工程の培地に添加することが好ましい。これら工程に添加するビタミンＣ濃度は，０．００１ｍＭ〜１０ｍＭがあげられ，０．０１ｍＭ〜１ｍＭが好ましく，０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭがより好ましい。このような工程とすることで，コラーゲンの方向をそろえることができ，効率的に糸状の凝集塊を製造することができる。【００３８】
旋回培養は，水平面を保ち一定方向に旋回する振とう培養である。旋回培養においての１回とは，１回転をさす。旋回培養を行う場合の振とう速度は，１〜５０回／分があげられ，５〜３０回／分が好ましく，１０〜２０回／分がより好ましい。旋回培養工程は，培養工程の途中で振とう速度を変更してもよい。振とう速度を変更する具体的な培養工程としては，旋回培養を開始後１〜２日は，１〜３回／分で培養する工程，その後，細胞が７０〜８０％コンフルエントになるまで２０〜３０回／分で培養する工程，その後培養を終了するまで１０〜２０回／分で培養する工程があげられる。培地に添加するビタミンＣは，全行程の培地に添加しておいてもよいが，振とう速度を変更する工程では，２０〜３０回／分で培養する工程，及び１０〜２０回／分で培養する工程の培地に添加することが好ましい。これら工程に添加するビタミンＣ濃度は，０．００１ｍＭ〜１０ｍＭがあげられ，０．０１ｍＭ〜１ｍＭが好ましく，０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭがより好ましい。このような工程とすることで，コラーゲンの方向をそろえることができ，効率的に糸状の凝集塊を製造することができる。【００３９】
傾斜培養は，培養面が平面な公知の培養用容器を用いて行うことができる。傾斜培養を行うときの傾斜角度は，１〜１５度があげられ，５〜１０度が好ましい。傾斜培養を行う際は，培養開始後１〜２日は，傾斜をつけず水平な状態で培養し，その後培養を終了するまで傾斜角度１〜１５度で傾斜培養することが望ましい。培地に添加するビタミンＣは，培養開始時の培地から添加しておいてもよいが，傾斜培養を開始してから添加してもよい。添加するビタミンＣ濃度は，０．００１ｍＭ〜１０ｍＭがあげられ，０．０１ｍＭ〜１ｍＭが好ましく，０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭがより好ましい。このような工程とすることで，コラーゲンの方向をそろえることができ，効率的に糸状の凝集塊を製造することができる。【００４０】
本発明の培養工程を終了後は，公知の方法で細胞を剥離し，細胞の凝集塊を回収することができる。本発明の細胞の凝集塊を剥離させる分離液は，公知の分離液を使用することができる。具体的な分離液として，トリプシンやＥＤＴＡを含む分離液があげられる。静置培養した細胞から糸状の凝集塊を得るためには，細胞がバラバラにならないように分解力の弱いＥＤＴＡや非酵素系の分離液を使用する必要がある。しかしながら，後述する実施例で示されたとおり，本発明の製造方法で製造される凝集塊は，自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより線維芽細胞同士が強力につながっているので，プロテアーゼ活性を有するトリプシンなどの酵素を用いても凝集塊がほぐれることがない。よって，トリプシンなどの分解力の大きいプロテアーゼ等を含む分離液を使用して細胞を剥離させることができる。【００４１】
本発明の細胞を剥離する工程で使用する分離液に含まれるトリプシンは，動物由来原料を使用していないトリプシンであることが好ましい。動物由来ではないトリプシンを使用することで，製造された凝集塊を患部に投与した際，動物由来のトリプシンに対する免疫反応を防ぐことができる。動物由来ではないトリプシンは，市販されている組換え酵素であるトリプシンなど公知のものを使用すればよい。【００４２】
本発明の凝集塊を製造する線維芽細胞として，皮膚または歯肉由来の線維芽細胞が好ましい。皮膚または歯肉由来の線維芽細胞は，コラーゲン分泌量が多いので，効率よく糸状の凝集塊を製造することができる。【００４３】
本発明の凝集塊は，後述する実施例で示されたとおり，コラーゲンを多く含有し，自己線維芽細胞から分泌されるコラーゲンを含む細胞外マトリックスを介して前記自己線維芽細胞同士がつなげられることにより糸状となった凝集塊である。また，後述する実施例で示されたとおり，本発明の凝集塊は，プロテアーゼ抵抗性を有する。このようなコラーゲンを含む細胞外マトリックスでつながった凝集塊は，患部に投与したとき，コラーゲンを含む細胞外マトリックスが足場となり，患部外に凝集塊が移動しにくくなる。また，プロテアーゼ抵抗性を有するので，生体内のプロテアーゼによって分散されにくい。さらに，自己血清培地または無血清培地を用いて製造された凝集塊は，凝集塊を患部に投与した際，患部で炎症反応が起こりにくい。また，自己由来の原料を用いることで，ウィルスなどによる感染や汚染などを防止することができることになるので，高い治療効果を得ることができる。本発明の製造方法によって製造された凝集塊は，は，動物や他人のタンパク質を利用しない。よって，本発明の製造方法によって製造された凝集塊は，ウィルスの感染や，汚染などのリスクを軽減できる。よって，本発明の凝集塊は，患部に留まることでき，凝集塊を投与した際におこる免疫反応やウィルス感染などのリスクを軽減でき，高い治療効果を得ることができるので，軟組織の欠損を修復するために好適に用いることができる。【００４４】
本発明の第２の側面は，凝集塊と，薬学的に許容される液剤とを含む，軟組織の欠損を修復するための組成物に関する。前記凝集塊は，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程とを含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法により製造される。前記薬学的に許容される液剤は，糖質，電解質，およびアミノ酸を含む液剤である。薬学的に許容される液剤として，注射剤などに用いられる公知の液剤を適宜用いることができる。具体的には，精製水，蒸留水，生理食塩水などがあげられる。本発明の組成物は，凝集塊を剥離させ，遠心分離により細胞を分離し，その後，生理食塩水などの洗浄液で洗浄し，薬学的に許容される液剤を加えることで得ることができる。なお，本発明の組成物には，凝集塊となっていない分散した細胞が含まれていてもよい。分散した細胞は，組成物を患部に投与した際，凝集塊と凝集塊の隙間を埋めることができるので，治療効果を高めることができる。本発明の組成物において，凝集塊と分散した細胞の割合は，５０：５０〜９９：１があげられ，７０：３０〜８０：２０でもよく，８０：２０〜９５：５でもよい。分散した細胞の割合が多すぎると，患部に細胞をとどめにくくなるので，好ましくは８０：２０〜９５：５である。【００４５】
一方，後述する実施例により示されたとおり，高カロリー輸液など糖類，電解質及びアミノ酸を含む液剤中に懸濁させた場合，自己線維芽細胞の生存性を高めることができる。高いカロリー輸液として，公知のものを適宜用いることができる。糖類として，主にブドウ糖が用いられる。ブドウ糖の他の糖類として，フルクトース，キシリトース，又はソルビトースを用いてもよい。電解質として，Ｎａ（ナトリウム），Ｋ（カリウム），Ｃｌ（クロール），Ｃａ（カルシウム），Ｍｇ（マグネシウム）等があげられる。また，必要により，Ｚｎ（亜鉛），Ｐ（リン），Ｆｅ（鉄），Ｃｕ（銅）等の微量金属類，及びクエン酸，グルコン酸，酢酸（アセテート類），乳酸（ラクテート類）等の有機酸が添加されてもよい。アミノ酸として，グリシン，Ｌ−アラニン，Ｌ−プロリン，Ｌ−アスパラギン酸，Ｌ−セリン，Ｌ−チロシン，Ｌ−グルタミン酸，Ｌ−システイン，Ｌ−ロイシン，Ｌ−イソロイシン，Ｌ−バリン，Ｌ−リジン，Ｌ−メチオニン，Ｌ−フェニルアラニン，Ｌ−トレオニン，Ｌ−トリプトファン，Ｌ−アルギニン，又はＬ−ヒスチジンがあげられる。これらの組成は，公知の高カロリー輸液におけるものを適宜採用すればよい。【００４６】
本発明の組成物は，低温（たとえば，１℃以上１０℃以下，好ましくは２℃以上８℃以下）に保持することが好ましい。保持期間は，５日以下があげられ，１２時間以内が好ましく，４時間以内が最も好ましい。後述する実施例に示されたとおり，本発明の凝集塊は低温で一定時間保存した後も，細胞の増殖能が保たれている。よって，このような凝集塊を含む組成物を患部に投与することで，高い治療効果をえることができる。本発明の組成物は，低温で保存した組成物を低温のまま患部に投与してもよいが，投与前に組成物を３４〜３７度まで温めて投与してすることが好ましい。投与前に組成物を温めることによって，患部に投与後の細胞増殖や，凝集塊の患部への接着性を高めることができる。【００４７】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記凝集塊は，分化した線維芽細胞を含む凝集塊を含む組成物である。線維芽細胞を分化させる方法は，公知の方法で培養することによって分化させることができる。細胞の分化速度は，培養日数，培養条件によって異なるが，当業者であれば適宜調整することができる。細胞の分化度は公知の方法で測定することができる。たとえば，未分化の細胞にのみ発現するタンパク質の活性を測定すればよい。また，未分化の細胞にのみ発現するタンパク質を染色してもよい。当業者であれば，細胞の分化度を適宜測定することができる。未分化の細胞は，細胞周期が短く盛んに分裂増殖を繰り返す傾向があるため，分化した細胞と比較して腫瘍化のリスクがある。一方，分化度の高い細胞は，臓器の構造・機能的性質が残っており，治療予後が良好である。よって，分化度の高い線維芽細胞を含む凝集塊を含む組成物は，軟組織の欠損を修復するため好適に使用することができる。【００４８】
本発明の組成物の好ましい態様は，皮膚の軟組織の欠損を補修するための組成物であり，しわや皮膚のたるみを除去するなど美容のために用いられるもののほか，何らかの疾患により失った皮膚の何組織を回復するための医薬組成物としても用いることができる。この組成物の好ましい利用態様は，注射剤であるが，それ以外の用途に用いてもよい。【００４９】
また，本発明の組成物の好ましい態様は，歯肉の軟組織の欠損を補修するための組成物であり，老化，歯茎の傷，または歯肉を切るような外科的治療などによって生じた歯肉退縮などの治療のために用いることができる。この組成物の好ましい利用態様は，注射剤であるが，それ以外の用途に用いてもよい。【００５０】
本発明の第３の側面は，注射剤の製造方法に関する。具体的には，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，自己線維芽細胞を，前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，培養した細胞を剥離する工程とを含み，前記回収する工程で得られた凝集塊を，第１の注射針を介して前記凝集塊を注射器に収容した後に，前記注射器から前記第１の注射針を取り除き，前記注射器に前記第１の注射針よりも内径の小さな第２の注射針を取り付ける，注射剤の製造方法である。このように，一端内径の太い注射針で凝集塊を吸い上げておいて，内径の細い注射針に替えるので，施術の際に適度な凝集塊の大きさに成形でき，細胞への物理的なダメージを最小限にでき，更に，凝集塊が注射針内に固まる事態を効果的に防止できる。【００５１】
本発明の自己線維芽細胞を含む凝集塊は，線維芽細胞同士がコラーゲンを含む細胞外マトリックスによりつなげられたものである。凝集塊が大きすぎると，注射針で注入できなくなり，小さすぎると，患部に留まらない。そのような観点から，注射剤に含まれる凝集塊の形状や大きさとして，糸状で，１８〜２０Ｇ（ゲージ）の注射針により吸引できて，２４Ｇから３０Ｇの注射針で注入できることが好ましい。このような大きさの凝集塊は，培養容器の培養面積に占める細胞の割合を調整すること，細胞を剥離する分離液の濃度を調整すること，又は剥離して回収した細胞を静置することで得ることができる。培養容器の培養面積に占める細胞の割合としては，７０〜１００％コンフルエントがあげられ，８０〜９０％コンフルエントでもよく，９０〜９５％コンフルエントでもよい。細胞を剥離する分離液の濃度は，用いる分離液に応じて適宜調整することができる。例えば，トリプシンを含む分離液を用いる場合，分離液中のトリプシン濃度は，０．１〜２％があげられる。細胞を剥離した際，細胞の凝集塊が小さい場合は，剥離した細胞を公知の容器に回収し静置する。静置時間は３０秒〜１０分があげられ，１分〜３分でもよく，３分〜５分でもよい。剥離した細胞の大きさによって適宜調整することができる。細胞を静置し沈殿させることで，分離した細胞同士が再度つながるので，凝集塊の大きさを大きくすることができる。沈殿させた細胞は，タッピング等でほぐすことで，凝集塊を得ることができる。【００５２】
以下，実施例を用いて本発明を具体的に説明するが，本発明は以下の実施例に限定されるものではない。すなわち，当業者に自明は範囲において，適宜修正を加えることができ，そのようなものも本発明に含まれる。
【実施例１】
【００５３】
実施例１  自己線維芽細胞の凝集塊の調製
皮膚組織から分離した線維芽細胞の培養を，公知の方法（R.  I.  Freshney編，Culture  of  Animal  Cells  :  A  MANUAL  OF  BASIC  TECHNIQUE  (Wiley-Liss,Inc.2000)）にしたがって，行った。具体的には皮膚組織片から分離した線維芽細胞を継代培養しながら，順次拡大培養して最終的にはＴ−２２５フラスコ数個まで増殖させた。培養終了（注入予定日）の３日前に０．０１ｍＭ以上１ｍＭ以下の範囲でビタミンＣを培地に添加した。更に，培養終了前日に，ビタミンＣ無添加で２％以上５％以下の自己血清添加培地に交換した。培養した線維芽細胞を，培養容器からＥＤＴＡ溶液や酵素を用いない分散液で剥離させ，遠心により細胞と分散液を分離した。その後，生理食塩水で３回以上洗浄した。【００５４】
このようにして得られた分散液を図１に示す。図１は，実施例１により得られた線維芽細胞を含む液剤を示す図面に替わる写真である。一方，図２に，培地にビタミンＣを添加せず，ＥＤＴＡ溶液や酵素を用いて線維芽細胞を剥離した分散液を図２に示す。図２は，従来方法により得られる線維芽細胞を含む液剤を示す図面に替わる写真である。【００５５】
図１と図２とを比較すると，美容に用いられる注射液の外観としては，従来方法の方が優れることがわかる。そして，図１から，上記の方法によれば，線維芽細胞が凝集塊を多く形成することがわかる。一方，図２から，従来の培養方法では，凝集塊を形成しないことがわかる。【００５６】
また，実施例１により得られた線維芽細胞を含む液剤から細胞凝集塊をピペットで分散させ，生理食塩水に浮遊させた後，顕微鏡写真を撮影した。その結果を図３に示す。図３は，実施例１において得られた凝集塊を分散させた様子を示す図面に替わる写真である。一方，培地にビタミンＣを添加せず，ＥＤＴＡ溶液や酵素を用いて線維芽細胞を剥離した分散液における細胞塊をピペットで分散させ，生理食塩水に浮遊させた後，顕微鏡写真を撮影した。その結果を図４に示す。図４は，線維芽細胞の細胞塊を分散させた様子を示す図面に替わる写真である。【００５７】
図４から，従来法により線維芽細胞を得た場合は，細胞がバラバラな状態であることがわかる。一方，図３から，本発明の方法に従えば，コラーゲン線維に線維芽細胞が結合し，帯状の細胞塊を得ることができることがわかる。特に，このような帯状（糸状）の細胞塊となるので，注射針で吸引でき，注入することができる。しかしながら，帯状（糸状）となった凝集塊の量は少なかった。
【実施例２】
【００５８】
実施例２  ビタミンＣを添加することによるコラーゲン産生への効果
実施例１のビタミンＣ添加培地で培養した線維芽細胞の培養上清と，ビタミンＣ無添加の培養上清に含まれるコラーゲン濃度を，ヒトコラーゲンＥＬＩＳＡ定量キット（ＡＣバイオ社）で測定した。その結果を，表１に示す。【００５９】
【表１】
2008136183.tif 000003
【００６０】
表１から，培地にビタミンＣを添加することで，コラーゲンの産生能は飛躍的に高まることがわかる。このことは，培地にビタミンＣを添加することで，線維芽細胞が凝集塊を形成しやすくなることを意味する。
【実施例３】
【００６１】
実施例３  本発明の組成物の効果の検証
ボランティア４名から採取した皮膚組織片から，アウトグロウス(outgrowth)法により細胞を分離し，実施例１に示される方法で，自己血清添加培地で培養した。凝集塊を含む液を，高カロリー輸液中に懸濁させて，４℃で保管した。このけん濁状態の線維芽細胞は，図１に示されるように凝集塊を形成していた。注入前に遠心により細胞と輸液に分け，細胞に適当量の生理食塩水を加えて，軽く撹拌し，懸濁状態にした。凝集塊ごと１８Ｇの注射針で注射器に吸引し，２６Ｇ注射針または２７Ｇ注射針に付け代えて，必要とする局所に注入した。【００６２】
注入後，ボランティア４名の効果を医師や美容専門家が判定した。なお，これら専門家による判定が得られない場合は，自己評価とした。その結果を表２に示す。【００６３】
【表２】
2008136183.tif 000004
【００６４】
いずれのボランティアも，本注射剤を注入した翌日には腫れが引いたものの，注入箇所に盛り上がりが認められた。数日後には注入部位の周囲にも張りがでて，陥没部位が修復され，皺が消えた。また，目の下のくまも消失し，医学的，美容的な効果が認められた。この効果は，いずれのボランティアにおいても，少なくとも１年半は持続した。
【実施例４】
【００６５】
実施例４  高カロリー注射剤による細胞培養への影響の検討
通常の方法で培養したフラスコから線維芽細胞を剥離し，その直後で生細胞の割合が１００％であったことを確認し，５０ｍｌディスポ遠沈管に線維芽細胞２×１０７個を生理食塩水２５ｍｌに懸濁させた状態と，同数の細胞を高カロリー注射剤（アミノフリード等）２５ｍｌに懸濁させた状態のものを調整した。これらを保冷剤で冷却した状態で２時間輸送した後，生細胞数を測定した。その後，１／５の細胞数分をそれぞれＴ−２２５フラスコで培養した。【００６６】
生細胞数はトリパンブルー染色後に血球計算版で生細胞と死細胞数を計測した。表３に生細胞の割合を示す。また，２４時間後のフラスコ培養の後の細胞を写真撮影した。図５は，高カロリー注射液で懸濁した場合の細胞の様子を示す図面に替わる写真である。一方，図６は，生理食塩水で懸濁した場合の細胞の様子を示す図面に替わる写真である。【００６７】
【表３】
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【００６８】
表３から，高カロリー注射剤に懸濁した方が１０％も生細胞率が高まることがわかる。また図５と図６から，高カロリー注射剤に懸濁した細胞の方が，増殖性も良いことが明らかである。
【実施例５】
【００６９】
実施例５  細胞凝集塊のタンパク質成分の解析
実施例１で作製した細胞の凝集塊を生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に浮遊させ，細胞を更に分散させるためにディスパーゼＩ（合同酒精）を終濃度で１，０００ＰＵ／ｍｌに調製し，３７℃で１時間処理した。その後，遠心にて細胞と上清に分離し，その上清中の分子量３，０００以上の蛋白質を遠心濃縮器（ミリポア）で濃縮した。２次元電気泳動にて蛋白質成分をスポットとして分離し，そのスポットをゲルより切り出し，トリプシン消化後に質量分析計にてタンパク質を同定した。【００７０】
その結果，Ｉ型コラーゲン，ＶＩ型コラーゲン，フィブロネクチン，ビメンチン及びミクロフィブリル関連糖タンパク質等の細胞外マトリックスが検出された。
【実施例６】
【００７１】
実施例６  糸状細胞凝集塊の調整方法
実施例１より更に糸状の細胞凝集塊の割合を多くするために，皮膚組織片から分離した線維芽細胞を以下の２つの方法で培養を行った。
１）Ｔ２２５フラスコ２個で，それぞれ１００％コンフルエントになるまで培養した線維芽細胞をローラーボトル（表面積８５０ｃｍ２）に播種して，０．２〜２回転／分で回転培養を行った。最適条件は０．４〜０．５回転／分であった。
２）Ｔ２２５フラスコに播種した細胞を，水平，上下，旋回運動を行う振とう器（５〜５０回／分）で振とう培養した。最適条件は，上下振とう（１０〜２０回／分）培養であった。培地組成や培養環境は，実施例１と同じ条件で行った。
線維芽細胞は，１００％コンフルエントになるまで培養し，細胞分散液により細胞を分散させ，回収した。細胞分散液は，トリプシンを使用しない（動物由来原料を使用していない）タイプの分散液（例えば，インビトロジェン社製のＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ，ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓなど）を用いた。同じ濃度の分散液を添加し，同じ条件でインキュベートして細胞を分散させると，静置培養と回転培養で細胞塊の有無に差が生じた。その結果を図７に示した。図７Ａは，フラスコで静置培養した細胞を分散させて回収した細胞の写真である。図７Ｂ，及び図７Ｃは，回転培養で培養した細胞を分散させて回収した細胞の写真である。図７で示されたように，静置培養した細胞は，凝集塊を形成せず，通常の分散状態である。一方，回転培養した細胞は，糸状の細胞凝集塊を形成した。この細胞塊は，注射針２４〜２６Ｇ（ゲージ）に注入できる大きさであり，細胞塊の割合や大きさは，培養時間と分散液の濃度で調整できる。また，図７Ｂ，図７Ｃに示した糸状細胞凝集塊は，回収後，静置して沈殿させることでも細胞塊の割合や大きさを調整することができる。
【実施例７】
【００７２】
実施例７  糸状細胞凝集塊の特徴１：コラーゲン量の比較
同じ培養面積から得られた回転培養の細胞凝集塊と静置培養の単離細胞に付着しているコラーゲン量の定量を行った。具体的には，それぞれの細胞ペレットを数回，生理食塩水で洗浄し，最終濃度が０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬになるようにペプシン（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し，４℃で一晩振とうしてコラーゲンを抽出し，その上清中のコラーゲン量をヒトコラーゲン  タイプＩ  ＥＬＩＳＡキット（エーシーバイオテクノロジーズ社製）を用いて測定した。その結果を表４に示す。表４で示されたように，回転培養の細胞凝集塊は，静置培養の単離細胞と比較して，約５倍もコラーゲン量が多いことがわかった。回転培養で得られた細胞凝集塊を，培養面積１００ｃｍ２あたりの細胞凝集塊が含むコラーゲン量に換算すると２μｇ以上含むことになる。
【表４】
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【実施例８】
【００７３】
実施例８  糸状細胞凝集塊の特徴２：細胞凝集塊の増殖能
調整した細胞凝集塊の細胞が生存するか，以下の方法で確認した。すなわち，ローラーボトルを用いて回転培養した細胞を分散液で剥離させ，遠心分離により分散液を除去し細胞ペレットを得た。その細胞を遠沈管に入れて，ピペッティングによりペレットを解して，４℃で８時間放置した。その後，再度細胞ペレットをピペッティングによりペレットを解して，１０分間静置した。細胞凝集塊は沈殿し，単離状態の細胞は浮遊しているので，沈殿した細胞凝集塊を集めて，フラスコで培養した。培養開始２４時間後の細胞凝集塊がフラスコに付着し（図８Ａ），４８時間後には付着した細胞が増殖を始めた（図８Ｂ）。このように凝集した細胞は，４℃で一定時間経過後でも増殖できることがわかった。
このように凝集した細胞は，４℃一定時間後でも培養を開始すれば，また増殖できることから，生体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも細胞増殖が可能性が高いことを示している。
【実施例９】
【００７４】
実施例９  シミ改善効果
臨床実験への参加の同意を得たボランティアから，線維芽細胞を採取して，培養し，細胞凝集塊を調整して，顔の右コメカミにある２ｃｍ×１ｃｍのシミ（肝班）の周囲に適当量（合計５×１０６個の細胞）を２週間間隔で２回注入した。その結果，１ヶ月後からシミが薄くなり，半年後には完全に消えて（痕跡程度），その後１年半以上消えた状態を維持している。その間，特別なことはせず，通常の化粧品を使用していた。
【実施例１０】
【００７５】
実施例１０  歯肉由来線維芽細胞の増殖性
歯肉由来線維芽細胞の分離法
来院した患者から研究目的での使用の了承を得て抜去歯を入手し，抗生物質（５００Ｕ／ｍｌペニシリンと５００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン）を添加した生理食塩水でよく洗浄した後，抜去歯の周囲に付着している歯肉をメスで分離し，その歯肉組織片を細切した。その組織片を６ウェルの組織培養プレートに貼り付け，５分間静置して固定した組織片が浸るように，抗生物質，１０％自己血清を添加した培地をできるだけ少ない液量加えて，３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。プレートに固定（付着）した組織片に上記培養液を加えて約２週間培養し，細胞が組織片から遊走して増殖し，局所的にコンフルエントになった時点で継代を開始した。継代は以下のように行った。細胞を生理食塩水で洗浄し，分離液で処理して浮遊化させ，自己血清を加えて酵素を不活化するか，生理食塩水で分散液を希釈して，遠沈により細胞を回収した。この細胞を上記培地に懸濁してＴ−７５フラスコに播種して培養し，以後目的の細胞数まで拡大培養した。【００７６】
歯肉由来線維芽細胞の増殖性
皮膚由来線維芽細胞及び歯肉由来線維芽細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに５×１０３個／ｗｅｌｌで播種し，培養翌日から１，２，３日間培養し，細胞増殖性をＷＳＴ−１（タカラバイオ社製）試薬の発色（吸光度４５０ｎｍ）で比較した。吸光度が大きいほど細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙが高く，比例して細胞数も多くなる。結果を表５に示した。表５に示したように，皮膚由来よりも歯肉由来の線維芽細胞の方が増殖性が良かった。
【表５】
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【実施例１１】
【００７７】
実施例１１  歯肉由来線維芽細胞の糸状凝集塊の調製方法
上記の糸状細胞凝集塊の調製方法に準じて，歯肉由来線維芽細胞をローラーボトルに播種し回転培養，又はフラスコに播種し振とう培養を行った。細胞は１００％コンフルエント状態にして，細胞分散液により細胞を剥離，分散させた。皮膚線維芽細胞と同様に回転培養の細胞は凝集塊を形成した。実施例７（表４）と同様に，同一培養条件で，回転培養とフラスコでの静置培養から得られた細胞ペレット中のコラーゲン量を測定した。その結果を表６に示した。表６に示したように，回転培養により得られた細胞凝集塊のコラーゲン量は，静置培養により得られた細胞のコラーゲン量よりも約１６倍多いことがわかった。回転培養で得られた細胞凝集塊を，培養面積１００ｃｍ２あたりの細胞凝集塊が含むコラーゲン量に換算すると２００μｇ以上含むことになる。実施例７の皮膚由来線維芽細胞を回転培養して得られた細胞凝集塊と，本実施例１１の歯肉由来線維芽細胞を回転培養して得られた細胞凝集塊のコラーゲン量を比較すると，歯肉由来線維芽細胞から得られた細胞凝集塊は，皮膚由来線維芽細胞から得られた細胞凝集塊の１００倍多いことがわかった。
【表６】
2008136183.tif 000008
【実施例１２】
【００７８】
実施例１２  細胞凝集塊の特徴１：ＡＬＰ活性の検討
歯肉由来の線維芽細胞の分化度を，ＡＬＰを指標に検討した。上記細胞と細胞凝集塊をＰＢＳ（−）で洗浄後，メタノールで１０分間固定し，数回ＰＢＳ（−）で洗浄した。ＡＬＰ染色は，ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅの方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８））に準じて以下の通りに行った。
すなわち，０．０５Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）,に０．１５ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インヒドリルに０．３ｍｇ／ｍｌ  ニトロブルー  テトラゾリウム  クロライド（共にインビトロジェン社製）を溶解した反応液を細胞及び細胞凝集塊に添加し，室温暗所で２時間反応させた。その結果，２時間では染色させず，一晩おいて漸く青色に染色したことから，ＡＬＰは殆ど発現していない（ＡＬＰ活性がない）ことが判明した。【００７９】
実施例１２の結果から，本発明で得られる線維芽細胞は，ＡＬＰ活性を殆ど発現していないので，分化した線維芽細胞であることがわかった。分化度が低い細胞は，転移後の増殖も早く，腫瘍化に進みやすく，治療予後が不良であることが知られている。本発明で得られる線維芽細胞は，分化度が高いため，腫瘍化へは容易に進めないと考えられるので，歯肉難組織の欠損を修復するために好ましく使用することができる。
【実施例１３】
【００８０】
実施例１３  細胞凝集塊の特徴２：ＧＧＴ活性の測定
歯周ポケットには歯周病菌が存在し，炎症反応を惹起させるＧＧＴを発現していることから，分離した線維芽細胞に歯周病菌やＧＧＴを発現する炎症系（Ｔ細胞やマクロファージ）細胞の混入の可能性が考えられる。そのため，分離した線維芽細胞がＧＧＴを発現していないことを確認するために，ＧＧＴ活性の測定を行った。
上記実施例で培養した培養上清中のＧＧＴ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）活性をエーシーバイオテクノロジーズ社製のキット（ＧＧＴ活性測定キット  品番：ＡＤ１０１）を用いて測定した。本キットは勧告法（ＪＳＣＣ）に基づいた測定法で，ＧＧＴは供与体基質であるグリシルグリシン存在下で，Ｌ−γ−グルタミルグリシルグリシンと５−アミノ−２−ニトロ安息香酸を作成させる。この作成された５−アミノ−２−ニトロ安息香酸を吸光度（４１０ｎｍ）における単位時間あたりの吸光度の増加を測定して活性値を求めた。その結果を表７に示した。表７に示したとおり，培養時間によるＧＧＴ活性の増加はなく，皮膚及び歯肉の線維芽細胞とも同じ活性であった。よって，本発明で得られる線維芽細胞はＧＧＴ活性陰性であり，この細胞を回転培養することで歯肉を上げる効果を有する細胞凝集塊を調整することができる。
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は，化粧料などとして化粧品産業や美容産業などにおいて，効果的に利用されうる。また，歯科などの医療分野においても，効果的に利用されうる。
【図１】
2008136183.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月17日(2009.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって,    
培養容器に接着した自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された培養培地で培養する工程と，
前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，前記自己線維芽細胞が培養容器に接着した状態で，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，
前記回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養した細胞を，前記培養容器から剥離する工程と，
を含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法。
【請求項２】
前記培養容器から剥離する工程は，
トリプシンを含む分離液で細胞を剥離する工程である，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養培地で培養する工程は，
自己血清培地または無血清培地で培養する工程である，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記自己線維芽細胞は，
皮膚由来の線維芽細胞，または歯肉由来の線維芽細胞のいずれかである，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記培養する工程は，
回転培養により培養する工程であり，
前記回転培養は，
０．１〜２回転／分で行われる，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記培養方法で培養する工程は，
振とう培養を行う工程であり，
前記振とう培養は，
上下動培養，水平動培養，又は旋回培養のいずれかであり，
５〜５０回／分で振とうが行われる，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって，
前記培養する工程は，
回転培養を行う工程であり，
前記回転培養を行う工程は，
０．１〜０．５回転／分で細胞を培養する工程，
０．０１〜１ｍＭとなるようにビタミンＣを培地に添加し，１．５〜２回転／分で細胞を培養する工程，及び
０．５〜１．５回転／分で細胞を培養する工程，
をこの順で含む，請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって，
前記培養する工程は，
振とう培養を行う工程であり，
前記振とう培養を行う工程は，
５〜１０ｒｐｍ回／分で細胞を培養する工程，
０．０１〜１ｍＭとなるようにビタミンＣを培地に添加し，２０〜３０回／分で細胞を培養する工程，及び
１０〜２０回／分で細胞を培養する工程と，
をこの順に含む，請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法で製造される凝集塊。
【請求項１０】
凝集塊と，薬学的に許容される液剤とを含む，軟組織の欠損を修復するための組成物であって，
前記凝集塊は，
自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって,    
培養容器に接着した自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，
前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，前記自己線維芽細胞が培養容器に接着した状態で，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，
前記回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養した細胞を，前記培養容器から剥離する工程と，
を含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法により製造され，
前記薬学的に許容される液剤は，
糖質，電解質，およびアミノ酸を含む液剤である，
組成物。
【請求項１１】
前記凝集塊は，
歯肉由来の線維芽細胞から作製される分化した線維芽細胞を含む凝集塊である，
請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
培養容器に接着した自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，
前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，前記自己線維芽細胞が培養容器に接着した状態で，回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養する工程と，
前記回転培養，振とう培養，または傾斜培養のいずれかの培養方法で培養した細胞を前記培養容器から剥離する工程と，
を含み，
前記回収する工程で得られた凝集塊を，第１の注射針を介して前記凝集塊を注射器に収容した後に，
前記注射器から前記第１の注射針を取り除き，前記注射器に前記第１の注射針よりも内径の小さな第２の注射針を取り付ける，
注射剤の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月23日(2009.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法であって,    
培養容器に接着した自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された培養培地で培養する工程と，
前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，前記自己線維芽細胞が培養容器に接着した状態で，０．２回転／分以上２回転／分以下回転培養により培養する工程と，
前記回転培養した細胞を，前記培養容器から剥離する工程と，
を含む，自己線維芽細胞の凝集塊の製造方法。
【請求項２】
前記回転培養は，０．４回転／分以上０．５回転／分以下の回転培養である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養容器から剥離する工程は，
トリプシンを含む分離液で細胞を剥離する工程である，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記培養培地で培養する工程は，
自己血清培地または無血清培地で培養する工程である，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記自己線維芽細胞は，
皮膚由来の線維芽細胞，または歯肉由来の線維芽細胞のいずれかである，
請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
培養容器に接着した自己線維芽細胞を，ビタミンＣが添加された自己血清培地または無血清培地で培養する工程と，
前記自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状の凝集塊となるように，前記自己線維芽細胞が培養容器に接着した状態で，０．２回転／分以上２回転／分以下の回転培養により培養する工程と，
前記回転培養により培養した細胞を前記培養容器から剥離する工程と，
を含み，
前記回収する工程で得られた凝集塊を，第１の注射針を介して前記凝集塊を注射器に収容した後に，
前記注射器から前記第１の注射針を取り除き，前記注射器に前記第１の注射針よりも内径の小さな第２の注射針を取り付ける，
注射剤の製造方法。
【請求項７】
前記回転培養は，０．４回転／分以上０．５回転／分以下の回転培養である請求項６に記載の製造方法。
【国際調査報告】
2008136183.tif 000018
2008136183.tif 000019
2008136183.tif 000020
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