(57)【要約】培養期間が短いヒト骨膜の促成培養方法を開発する。（１）患者から採取した骨膜片を培養液を添加しない培養ディッシュに戴置するステップと、（２）前記培養ディッシュ上の骨膜片の表面に前記患者の多血小板血漿を滴下して骨膜片の表面を覆うように凝固させるステップと、（３）前記培養ディッシュに第１培養液を添加して培養するステップと、（４）前記ステップ（３）の後、塩基性繊維芽細胞成長因子を含むが前記多血小板血漿は含まない第２培養液で培養するステップとを含む、ヒト骨膜培養方法を提供する。
2009025374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）培養液を添加しない培養ディッシュに患者から採取した骨膜片を戴置するステップと、
（２）前記培養ディッシュ上の骨膜片の表面に前記患者の多血小板血漿を滴下して骨膜片の表面を覆うように凝固させるステップと、
（３）前記培養ディッシュに第１培養液を添加して培養するステップと、
（４）前記ステップ（３）の後、塩基性繊維芽細胞成長因子を含むが前記多血小板血漿は含まない第２培養液で培養するステップとを含むことを特徴とするヒト骨膜培養方法。
【請求項２】
前記ステップ（３）は、トランスフォーミング成長因子ベータを含む第１培養液を添加して培養することを特徴とする、請求項１に記載のヒト骨膜培養方法。
【請求項３】
前記トランスフォーミング成長因子ベータはトランスフォーミング成長因子ベータ１であることを特徴とする、請求項２に記載のヒト骨膜培養方法。
【請求項４】
前記ステップ（１）は、患者から採取した前記骨膜片に赤血球溶解処理を施し、生理食塩水による洗浄を行った後で第１培養液で培養することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のヒト骨膜培養方法。
【請求項５】
（５）前記ステップ（４）の後、骨芽細胞分化誘導剤を含む第３培養液で培養するステップを含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のヒト骨膜培養方法。
【請求項６】
前記骨芽細胞分化誘導剤は、デキサメタゾン、ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸からなることを特徴とする請求項５に記載のヒト骨膜培養方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の方法により培養されたことを特徴とするヒト骨膜由来の細胞。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の方法により得られたことを特徴とするヒト骨膜由来の造骨細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の造骨細胞から作成されることを特徴とする人工骨。
【請求項１０】
請求項８に記載の造骨細胞を基材に埋め込んで石灰化させるステップを含むことを特徴とする造骨細胞の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療に用いる自家骨膜の培養方法に関し、具体的には、歯周組織再生療法に用いる自家骨膜の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は我が国において成人の約８割が罹患しているといわれており、国民病といっても過言ではない。歯周病の病態が進行すると歯槽骨が失われ、結果として歯が脱落してしまう。現行の歯周病の治療は、炎症の原因となる歯垢や歯石、不良肉芽などを除去し、新しい歯周組織を回復させることを目的としている。しかしながら、炎症原因の除去を目的とする治療法では、歯周疾患の進行を防ぐことは可能であるが、一旦失われた組織を回復することはできない。欠損した歯槽骨を再生させる治療法として、自家移植による歯周組織再生細胞療法がある。本細胞療法では、骨芽細胞の前駆細胞として患者自身の骨髄幹細胞から付着性の細胞を選別し、人工的な基材と呼ばれる細胞の足場とともに移植することで、患者自身の細胞が本来維持している組織再生能力を引き出すことができる。新潟大学では、本細胞療法を積極的に実施しており（特許文献１及び２）、顕著な再生効果が認められた。
【特許文献１】特願２００７−０５１１５３明細書
【特許文献２】特願２００７−１４７９０６明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし従来技術では、骨膜片を患者から採取してから、培養下で骨膜シートを成長させて移植に供するまでに４５日程度の期間を要する。これは患者にとって長すぎるだけでなく、医療機関にとっては患者１人当たりの骨膜培養設備の占有期間が長いため、症例数の増加を妨げている。また長期間培養では感染や検体取り違えの危険性が高くなる。そのため、本細胞療法は、高い治療効果が認められるにもかかわらず、普及が進まない。そこで、培養期間が短いヒト骨膜の促成培養方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、（１）培養液を添加しない培養ディッシュに患者から採取した骨膜片を戴置するステップと、（２）前記培養ディッシュ上の骨膜片の表面に前記患者の多血小板血漿を滴下して骨膜片の表面を覆うように凝固させるステップと、（３）前記培養ディッシュに第１培養液を添加して培養するステップと、（４）前記ステップ（３）の後、塩基性繊維芽細胞成長因子を含むが前記多血小板血漿は含まない第２培養液で培養するステップとを含む、ヒト骨膜培養方法を提供する。【０００５】
本発明のヒト骨膜培養方法の前記ステップ（３）は、、トランスフォーミング成長因子ベータを含む第１培養液を添加して培養する場合がある。【０００６】
前記トランスフォーミング成長因子ベータはトランスフォーミング成長因子ベータ１の場合がある。【０００７】
本発明のヒト骨膜培養方法の前記ステップ（１）は、患者から採取した前記骨膜片に赤血球溶解処理を施し、生理食塩水による洗浄を行った後で第１培養液で培養する場合がある。【０００８】
本発明のヒト骨膜培養方法は、（５）前記ステップ（４）の後、骨芽細胞分化誘導剤を含む第３培養液で培養するステップを含む場合がある。【０００９】
本発明のヒト骨膜培養方法の前記ステップ（５）に用いる骨芽細胞分化誘導剤は、デキサメタゾン、ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸を含む場合がある。【００１０】
本発明は、本発明のいずれかのヒト骨膜培養方法により培養されたヒト骨膜由来の細胞を提供する。【００１１】
本発明は、骨芽細胞分化誘導剤を含む第３培養液で培養するステップを含む本発明のいずれかのヒト骨膜培養方法により培養された、ヒト骨膜由来の造骨細胞を提供する。【００１２】
本発明は、本発明のヒト骨膜由来の造骨細胞から作成される人工骨を提供する。【００１３】
本発明は、本発明のヒト骨膜由来の造骨細胞を基材に埋め込んで石灰化させるステップを含む、造骨細胞の使用方法を提供する。【００１４】
再生医療は、次の３つに大きく分類することができる。すなわち、増殖因子に加えて、基材（細胞の足場）単独の移植、細胞単独の移植、基材と細胞の組合せによる移植、である。さらに、基材と細胞の組合せは、細胞採取後の即時移植と培養による細胞操作後の移植の２つに分けられる。培養人工骨というのは、後者であり、「インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で造骨能を発現した状態まで細胞インテリジェント化を進めてから移植することにより、自家骨移植に匹敵する治療効果を引き出す」ことを目的としている。本発明の骨膜培養方法は、患者から採取したヒト骨組織、特にヒト骨膜片を試験管内で培養して、骨膜由来の細胞を増殖させ、その後、骨芽細胞に分化させる方法をいう。【００１５】
本発明の骨膜片は患者のいずれかの硬組織を覆う骨膜から採取された骨膜の断片をいう。本発明の骨膜片は歯肉下骨表面から採取される場合がある。本発明の骨膜片の形状及びサイズは特に制限はないが、骨膜片から遊走した細胞が培養ディッシュ上で形成する培養骨膜シートを得ることが目的であるから、大きなサイズである必要はない。１０ｍｍ  ｘ  １０ｍｍから１ｍｍ  ｘ  １ｍｍまでの範囲のサイズであることが好ましく、約５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍのサイズがより好ましい。【００１６】
本発明の生理食塩水は、０．９％ＮａＣｌ水溶液、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という。）その他これらに類するヒト骨膜細胞と等張の溶液をいう。本発明の生理食塩水は、ｐＨ緩衝剤を含まない場合があり、あるいは、ｐＨ緩衝剤として、リン酸バッファー、重炭酸バッファー、Ｈｅｐｅｓバッファーその他これらに類するバッファーを含む場合がある。本発明の生理食塩水には、Ｔｙｒｏｄｅ、Ｅａｒｌ、Ｈａｎｋ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏらの処方による平衡塩溶液を含むが、これらに限定されない。本発明の生理食塩水は高圧滅菌又は孔径０．２２μｍのフィルター濾過滅菌により無菌処理されたものを用いる。【００１７】
培養液は、以下に説明する、多血小板血漿、塩基性繊維芽細胞成長因子又は骨芽細胞分化誘導剤を１０％ウシ胎児血清とともに添加することによりヒト骨膜片由来の細胞を増殖分化させることができることを条件として、いずれの培養液を用いてもよい。好ましい培養液はメディウム１９９である。なお、本発明のヒト骨膜培養方法で培養された細胞を最終的に該細胞を採取した患者の体内に戻す場合には、狂牛病のリスクを回避するために、狂牛病の発生がないオーストラリア産ウシ胎児血清を含む培地を用いることが好ましい。また、塩基性繊維芽細胞成長因子及び骨芽細胞分化誘導剤も動物から精製した標品ではなく遺伝子組換え技術により産生された標品を用いることが好ましい。本発明の培養液には、ビタミンＣ、すなわち、アスコルビン酸を２５μｇ／ｍＬ、抗菌剤として、ペニシリンＧカリウム塩を１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシンを０．１ｍｇ／ｍＬ、アムホテリシンＢを０．２５μｇ／ｍＬ含む場合がある。本発明の培養液は高圧滅菌又は孔径０．２２μｍのフィルター濾過滅菌により無菌処理されたものを用いる。【００１８】
本発明の第１培養液は多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ）を添加した培養液である。多血小板血漿の調製は、例えば、Ｏｋｕｄａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．（２００３）８４９−８５７及び特開２００４−２０１７９９号明細書に従って行う。簡潔には、患者から採血した新鮮な全血をクエン酸及びブドウ糖を含む抗凝固剤を添加した１０ｍＬ遠心管に分注し、最短径約５７ｍｍ、最長径約１４０ｍｍのスウィングバケット型ロータで２，４００ｒｐｍ、１０分間遠心する。遠心分離すると、赤血球が沈殿し、上清の血漿との間に血小板が集まる。次に、血小板及び血漿を別の１０ｍＬ遠心管に移して３，６００ｒｐｍ、１５分間遠心して、血小板を沈殿させ、最少量の血漿中に懸濁して回収した分画を多血小板血漿として使用する。本発明の多血小板血漿は患者から採取した新鮮なものを使用する場合もあるが、凍結保存したものを使用する場合もある。以下に説明するとおり、多血小板血漿は骨膜片からの細胞の遊走を促進することを可能にするいかなる条件で使用してもよい。例えば、直接骨膜片に滴下して５％ＣＯ２、９５％空気、飽和水蒸気雰囲気中で３７°Ｃで２０−３０分間インキュベートして骨膜片の表面を覆うように凝固させるのに使用される場合があり、１０％ウシ胎児血清を添加したメディウム１９９のような培養液中に多血小板血漿を約０．５％添加した第１培養液として使用する場合もある。培養液の量及び交換頻度も骨膜片からの細胞の遊走と、培養ディッシュ基質上での増殖とを促進することを可能にするいかなる条件であってもよい。例えば、１００ｍｍ径のディッシュについて培養開始時は５ｍＬの第１培養液を添加し、その後は１０ｍＬの第１培養液を添加する場合がある。培養液の交換頻度は１週間あたり２回の頻度の場合がある。【００１９】
第１培養液は、トランスフォーミング成長因子ベータを含む場合がある。トランスフォーミング成長因子ベータは、狂牛病等の感染症のリスクを回避するために、動物から精製した標品ではなく遺伝子組換え技術により産生された標品を用いることが好ましい。トランスフォーミング成長因子ベータは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（免疫生物研究所）、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（コスモ・バイオ株式会社）等のさまざまなメーカーの製品が商業的に入手可能である。第１培養液中のトランスフォーミング成長因子ベータの濃度は、骨膜片から培養ディッシュ基質上への細胞の遊走を促進することを可能にするいかなる濃度で使用してもよい。例えば、トランスフォーミング成長因子ベータの濃度は１ｎｇ／ｍＬの濃度の場合がある。トランスフォーミング成長因子ベータは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３をはじめとする遺伝子ファミリーの構成メンバーがある。本発明においてトランスフォーミング成長因子ベータは、前記遺伝子ファミリーのいずれであってもよいが、ＴＧＦβ１が好ましい。【００２０】
第２培養液は塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）を添加した培養液である。塩基性繊維芽細胞成長因子は、狂牛病等の感染症のリスクを回避するために、動物から精製した標品ではなく遺伝子組換え技術により産生された標品を用いることが好ましい。塩基性繊維芽細胞成長因子は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（免疫生物研究所）、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（コスモ・バイオ株式会社）等のさまざまなメーカーの製品が商業的に入手可能である。第２培養液中の塩基性繊維芽細胞成長因子の濃度は、骨膜片から遊走した細胞の培養ディッシュ基質上での増殖を促進することを可能にするいかなる濃度で使用してもよい。例えば、塩基性繊維芽細胞成長因子の濃度は５−１０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合がある。培養液の量及び交換頻度も骨膜片から遊走した細胞の培養ディッシュ基質上での増殖を促進することを可能にするいかなる条件であってもよい。例えば、１０ｍｍ径のディッシュに１０ｍＬの体積の第２培養液を１週間あたり２回の頻度で交換する場合がある。第１培養液から第２培養液に切り替える時期は、骨膜片から培養ディッシュ上に遊走した細胞の数がその後の増殖により患者に戻す自家移植治療に十分であることを条件として、特に制限はない。例えば骨膜片の全周にわたって骨膜片から培養ディッシュへの遊走が認められる時期に第１培養液から第２培養液に切り替える場合がある。【００２１】
第３培養液は骨芽細胞分化誘導剤を添加した培養液である。骨芽細胞への分化は、アルカリ性ホスファターゼ活性の上昇を指標として判断される。骨芽細胞分化誘導剤には、デキサメタゾン、ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物が含まれる。これらの骨芽細胞分化誘導剤は、シグマ、カルビオケムその他のメーカーから単剤として入手して混合使用する場合があり、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（コスモ・バイオ株式会社）から入手可能なＳｔｅｍＸＶｉｖｏ（商標）骨形成サプリメントのような商業的に入手可能な合剤試薬を使用する場合がある。培養液中の骨芽細胞分化誘導剤の濃度は、骨芽細胞への分化を可能にするいかなる濃度であってもかまわない。例えば、デキサメタゾンが１０ｎＭ、ビタミンＣが２５μｇ／ｍＬ、β−グリセロリン酸が２ｍＭの場合がある。培養液の量及び交換頻度も骨膜片から遊走し増殖した細胞の培養ディッシュ基質上でのアルカリ性ホスファターゼ発現を促進することを可能にするいかなる条件であってもよい。例えば、１０ｍｍ径のディッシュに１０ｍＬの体積の第２培養液を１週間あたり２回の頻度で交換する場合がある。第２培養液から第３培養液に切り替える時期は、骨膜片由来の細胞の数が第２培養液中の増殖により患者に戻す自家移植治療に十分であることを条件として、特に制限はない。例えば、骨膜片由来の細胞が直径６０ｍｍ程度まで増殖するときに第２培養液から第３培養液に切り替える場合がある。図１は、第１ないし第３培養液を用いる順序とそれぞれの培養液に添加されるサプリメントとを示す。【００２２】
培養ディッシュその他の容器は、本発明のヒト骨膜培養方法で培養された細胞を最終的に該細胞を採取した患者の体内に戻す場合に、狂牛病等の感染症のリスクを回避できることを条件として、いかなるものを使用してもよい。例えば、ガンマ線照射滅菌されたＴＰＰ、ファルコン（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）又はヌンク（ナルジェ  ヌンク  インターナショナル株式会社）の１００ｍｍ径組織培養用ディッシュを用いる場合がある。【００２３】
本発明の骨膜片は、患者から採取された後、培養液で湿らせたガーゼの上に載せて無菌的に培養室に運ばれ、無菌的に前処理及び培養され、最終的に患者に自家移植される。【００２４】
本発明の骨膜片の培養に先立つ前処理として、赤血球溶解処理及び培養ディッシュへの骨膜片の貼り付けを行なう場合がある。赤血球溶解処理は、溶血処理ともよばれ、赤血球が多数混入することにより骨膜片と培養ディッシュとの接着の阻害が起こることを防ぐための処理である。赤血球溶解処理は、固定剤を含まない少量のＮＨ４Ｃｌ溶液、例えば、ＶｅｒｓａＬｙｓｅ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標、ベックマン  コールター株式会社）又はＰｈａｒｍＬｙｓｅ（商標、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ  バイオサイエンス、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）で短時間（３分間以内）処理した後、ＰＢＳで３回洗浄することによって行なう場合がある。ＰＢＳ洗浄後、骨膜片は、乾燥した培養ディッシュの上に戴置し、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和水蒸気雰囲気中で３７°Ｃで２０−３０分間インキュベートして、過剰な水分を蒸発させて、骨膜片を培養ディッシュ上に貼り付ける場合がある。【００２５】
骨膜片は、培養ディッシュ上に戴置された後直ちに、あるいは、インキュベートにより骨膜片を培養ディッシュに貼り付けた後、第１培養液を添加して培養が開始される場合がある。また第１培養液を添加する前に、多血小板血漿によるコーティングを行なう場合もある。多血小板血漿によるコーティングは、培養ディッシュ上に貼り付けられた骨膜片の表面に、多血小板血漿を滴下して多血小板血漿が骨膜片を覆った状態でゲル状に凝固させることによって行なう場合がある。凝固は、例えば、５％ＣＯ２、９５％空気、飽和水蒸気雰囲気中で３７°Ｃで多血小板血漿が注がれた骨膜片を２０−３０分間インキュベートすることによって行なわれる。多血小板血漿による骨膜片のコーティングにより、多層性の細胞遊走が誘導され、骨膜本来の解剖学的構造を比較的保存したまま骨膜由来の細胞を培養下で成長させることができる。【００２６】
本発明のヒト骨膜由来の細胞の骨芽細胞への分化は、アルカリ性ホスファターゼ活性の上昇を指標として判断される。骨組織の石灰化がアルカリ性ホスファターゼ活性に依存しているからである。アルカリ性ホスファターゼ活性は細胞内のアルカリ性ホスファターゼ酵素を抽出して呈色反応産物を比色定量することができる。代替策として、細胞を固定して、アルカリ性ホスファターゼの不溶性反応産物の局在か、抗アルカリ性ホスファターゼ抗体による酵素タンパク質の局在かを検出する場合がある。【００２７】
本発明の造骨細胞は、試験管内でアルカリ性ホスファターゼを発現し、生体内で骨組織の石灰化を行なう細胞をいう。本発明の造骨細胞の使用方法に用いる基材は、本発明の造骨細胞が立体的な組織を構築するための足場であって、多孔質ハイドロキシアパタイトブロック体、ハイドロキシアパタイト顆粒、多血小板血漿その他の無機及び／又は有機物質で作られる。本発明の基材は生体適合性があることが好ましい。本発明の人工骨は、歯周病その他の原因による骨欠損に対応するために、本発明の造骨細胞を基材に埋め込んで作成される。
（生命倫理）
ヒト由来歯根膜細胞を使用するに当たって、新潟大学医歯学総合病院の倫理規定に基づき作成した実験計画を新潟大学歯学部倫理委員会で承認を受けた（平成１７年５月９日、平成１８年６月２２日）。さらに、インフォームドコンセントにより、その都度、患者に対して歯根膜組織からの歯根膜細胞の採取と実験への供与について説明し、同意を得られることを前提とした。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】第１ないし第３培養液を用いる順序とそれぞれの培養液に添加されるサプリメントとを示す模式図。
【図２】培養５日目の骨膜片からの細胞遊走を示す光学顕微鏡写真。
【図３】さまざまな条件下での培養５日目の骨膜片から遊走した細胞の増殖を示す光学顕微鏡写真。
【図４】培養１５日目の骨膜片から遊走した細胞の増殖を示す光学顕微鏡写真。
【図５】培養２７日目に固定、染色した培養骨膜シートのアルカリ性ホスファターゼ発現を示す写真。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
１．採取した骨膜片の輸送と培養への前処置
採取した骨膜片は原法にしたがって、培地で湿したガーゼの上に載せ、無菌的に培養室に運び、クリーンベンチ内で以降の操作を行った。ＶｅｒｓａＬｙｓｅ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標、ベックマン  コールター株式会社）で最長３分間赤血球溶解処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄してから、１００ｍｍ径ディッシュ（ＴＰＰ、＃９３１００）の中央に静置した。その後、ＣＯ２インキュベータ内で２０−３０分間程度インキュベートし、過剰な水分を蒸発させた後、骨膜片をディッシュに接着させた。【００３１】
２．骨膜片の培養ディッシュへの付着と多血小板血漿の処置
骨膜片を採取したのと同じ患者から採取した血液から多血小板血漿分画を採取した。患者から採血した新鮮な全血をクエン酸及びブドウ糖を含む抗凝固剤を添加した１０ｍＬ遠心管に分注し、最短径約５７ｍｍ、最長径約１４０ｍｍのスウィングバケット型ロータで２，４００ｒｐｍ、１０分間遠心した。遠心分離すると、赤血球が沈殿し、上清の血漿との間に血小板が集まった。次に、血小板及び血漿を別の１０ｍＬ遠心管に移して３，６００ｒｐｍ、１５分間遠心して、血小板を沈殿させ、最少量の血漿中に懸濁して回収した分画を多血小板血漿として使用した。これを１０−２０μＬだけ骨膜片の表面に滴下し、２０−３０分インキュベートした。多血小板血漿がややゲル状に凝固した後、第１培養液として多血小板血漿を０．５％、ペニシリンＧカリウム塩を１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシンを０．１ｍｇ／ｍＬ、アムホテリシンＢを０．２５μｇ／ｍＬ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００ｘ）ｌｉｑｕｉｄ（＃１５２４０−０６２、インビトロジェン株式会社）を１００倍希釈して使用）、ビタミンＣを２５μｇ／ｍＬ、オーストラリア産ウシ胎児血清を１０％含むメディウム１９９培養液を５ｍＬ添加した。【００３２】
骨膜片からの細胞遊走を促進する培養条件の検討には以下の条件（Ａ）〜（Ｆ）
を用いた。条件（Ａ）は、前記培養ディッシュ上の骨膜片の表面に前記患者の多血小板血漿を滴下して骨膜片の表面を覆うように凝固させること（以下、「ＰＲＰコーティング」という。）を行わずに、多血小板血漿もいかなる成長因子も含まない第１培養液を添加する条件（以下、「ｃｏｎｔｒｏｌ」という。）であった。条件（Ｂ）は、ＰＲＰコーティングを行わずに、５ｎｇ／ｍＬの塩基性繊維芽細胞成長因子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ（＃１００−１８Ｂ）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、免疫生物研究所）を添加した第１培養液を添加する条件（以下、「ｂＦＧＦ」という。）であった。条件（Ｃ）は、ＰＲＰコーティングを行わずに、１ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む第１培養液を添加する条件（以下、「ＴＧＦβ１」という。）であった。条件（Ｄ）は、ＰＲＰコーティングを行い、多血小板血漿もいかなる成長因子も含まない第１培養液を添加する条件（以下、「ＰＲＰ」という。）であった。条件（Ｅ）は、ＰＲＰコーティングを行い、５ｎｇ／ｍＬの塩基性繊維芽細胞成長因子を含む第１培養液を添加する条件（以下、「ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ」という。）であった。条件（Ｆ）は、ＰＲＰコーティングを行い、１ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング成長因子ベータ１を含む第１培養液を添加する条件（以下、「ＰＲＰ＋ＴＧＦβ１」という。）であった。【００３３】
３．培養液交換のタイミング
培養液は１週間に２回交換した。１００ｍｍ径の培養ディッシュに添加する培養液の体積は、培養開始時は５ｍＬであったが、最初の培養液交換以降は１０ｍＬに増やした。培養開始第７日に第１培養液から第２培養液として、５−１０ｍｇ／ｍＬの塩基性繊維芽細胞成長因子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ（＃１００−１８Ｂ）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、免疫生物研究所）、ペニシリンＧカリウム塩を１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシンを０．１ｍｇ／ｍＬ、アムホテリシンＢを０．２５μｇ／ｍＬ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００ｘ）ｌｉｑｕｉｄ（＃１５２４０−０６２、インビトロジェン株式会社）を１００倍希釈して使用）、ビタミンＣを２５μｇ／ｍＬ、オーストラリア産ウシ胎児血清を１０％含むメディウム１９９培養液に切り替えた。その後、培養開始第２１日目に第２培養液から、第３培養液として、デキサメタゾンを１０ｎＭ、ビタミンＣを２５μｇ／ｍＬ、β−グリセロリン酸を２ｍＭ、ペニシリンＧカリウム塩を１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシンを０．１ｍｇ／ｍＬ、アムホテリシンＢを０．２５μｇ／ｍＬ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００ｘ）ｌｉｑｕｉｄ（＃１５２４０−０６２、インビトロジェン株式会社）を１００倍希釈して使用）、オーストラリア産ウシ胎児血清を１０％含むメディウム１９９培養液に切り替えた。【００３４】
４．ＡＬＰ活性と石灰化物の組織化学的検出
細胞のＡＬＰ活性は、１０％中性ホルマリン固定の後、市販のキット（アルホス染色キット、武藤化学）を用いて検出した。簡潔には、培養ディッシュをＰＢＳでリンスした後、ホルマリン固定し、基質としてナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート、ジアゾニウム塩としてファーストブルーＲＲ塩を用いて酵素反応を行わせ、不溶性の青色の反応産物によって酵素の局在を検出した。なお、細胞は１％サフラニン０で赤紫色に後染色した。【００３５】
５．結果
（１）骨膜片からの細胞遊走
図２は培養５日目の骨膜片からの細胞遊走を示す位相差顕微鏡写真である。右は、本発明の骨膜培養方法にしたがって、赤血球溶解処理及び多血小板血漿によるコーティング処理を施した骨膜片を多血小板血漿を０．５％含む第１培養液で培養した結果の位相差顕微鏡写真であり、骨膜片の周辺全体から細胞の遊走がみられ、骨膜片から１ｍｍ以上の距離の移動が観察された。左は、赤血球溶解処理及び多血小板血漿によるコーティング処理をともに施さない対照実験の骨膜片を多血小板血漿を含まない培養液で培養した結果の位相差顕微鏡写真であり、骨膜片の周辺の一部のみから細胞の遊走はみられず、０．１ないし０．２ｍｍの距離の移動しか観察されなかった。【００３６】
（２）骨膜片からの細胞遊走を促進する培養条件の検討
図３はさまざまな培養条件下での培養５日目の骨膜片からの細胞遊走を示す位相差顕微鏡写真である。左上段は条件（Ａ）、右上段は条件（Ｂ）、左中段は条件（Ｃ）、右中段は条件（Ｄ）、左下段は条件（Ｅ）、右下段は条件（Ｆ）でそれぞれ５日間培養した骨膜片の培養である。前記骨膜片にＰＲＰコーティングを施して成長因子を含まない第１培養液で培養した場合（条件（Ｄ）、図３右中段）には図２と同様に活発な細胞遊走がみられたが、ＰＲＰコーティングを施さないときには、塩基性繊維芽細胞成長因子を添加した第１培養液で培養した場合（条件（Ｂ）、図３右上段）でも、トランスフォーミング成長因子ベータ１を添加した第１培養液で培養した場合（条件（Ｃ）、図３左中段）でも、成長因子を含まない第１培養液で培養した対照実験（条件（Ａ）、図３左上段）と同様で、ほとんど細胞遊走がみられなかった。ＰＲＰコーティングを施すときには、塩基性繊維芽細胞成長因子を添加した第１培養液で培養した場合（条件（Ｅ）、図３左下段）には、成長因子を含まない第１培養液で培養した場合（条件（Ｄ）、図３右中段）に比べて細胞遊走がほぼ同程度であった。逆に、トランスフォーミング成長因子ベータ１を添加した第１培養液で培養した場合（条件（Ｆ）、図３左下段）には、成長因子を含まない第１培養液で培養した場合（条件（Ｄ）、図３右中段）に比べて細胞遊走が促進された。これらの実験結果から、本発明のヒト骨膜培養方法における前記培養ディッシュ上の骨膜片の表面に前記患者の多血小板血漿を滴下して骨膜片の表面を覆うように凝固させるステップ（ＰＲＰコーティング）は、塩基性繊維芽細胞成長因子又はトランスフォーミング成長因子ベータを含む培養液では置換できないことが明らかになった。また、ＰＲＰコーティングを施す場合に、さらに塩基性繊維芽細胞成長因子を添加しても細胞遊走を促進することはないが、さらにトランスフォーミング成長因子ベータ１を添加すると、成長因子を含まない培養液の場合よりも細胞遊走を促進することがわかった。【００３７】
（３）培養ディッシュ上での細胞増殖
図４は培養１５日目の骨膜片細胞の増殖を示す位相差顕微鏡写真である。右は、本発明の骨膜培養方法にしたがって、赤血球溶解処理及び多血小板血漿によるコーティング処理を施した骨膜片を１週間多血小板血漿を０．５％含む第１培養液で培養した後、塩基性繊維芽細胞成長因子を１０ｎｇ／ｍＬ含む第２培養液に切り替えてさらに８日間培養した結果の位相差顕微鏡写真であり、顕著な細胞増殖が観察された。左は、赤血球溶解処理及び多血小板血漿によるコーティング処理をともに施さない対照実験の骨膜片をサプリメントを含まない培養液で１５日間培養した結果の位相差顕微鏡写真であり、細胞の遊走及び増殖は低調であった。【００３８】
（４）アルカリ性ホスファターゼの発現
図５は培養２７日目に固定、染色した培養骨膜シートのアルカリ性ホスファターゼ発現を示す写真である。薄灰色は細胞を示し、濃灰色はアルカリ性ホスファターゼ活性の検出された部分を示す。右は本発明の骨膜培養方法にしたがって、赤血球溶解処理及び多血小板血漿によるコーティング処理を施した骨膜片を多血小板血漿を０．５％含む第１培養液で１週間培養した後、塩基性繊維芽細胞成長因子を１０ｎｇ／ｍＬ含む第２培養液に切り替えて２週間培養し、その後、デキサメタゾンを１０ｎＭ、ビタミンＣを２５μｇ／ｍＬ、β−グリセロリン酸を２ｍＭ含む第３培養液に切り替えて５日間培養した培養ディッシュの染色結果である。顕著な細胞増殖と強いアルカリ性ホスファターゼ活性が認められた。左は、赤血球溶解処理及び多血小板血漿によるコーティング処理をともに施さない対照実験の骨膜片をサプリメントを含まない培養液で２７日間培養した培養ディッシュの染色結果である。アルカリ性ホスファターゼ活性はわずかしか認められなかった。【００３９】
本発明の骨膜培養方法で増殖成長した骨膜シートの大きさは２０日間で平均直径が６０ｍｍ程度、２７日間で平均直径９０−１００ｍｍであった。これに対し、従来の培養方法で増殖成長した骨膜シートの大きさは４５日間で平均直径が６０ｍｍ程度にすぎなかった。そこで、本発明の培養方法は、従来の培養方法より５０％以上の短縮を実現したと考えられる。
【図１】
2009025374.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月22日(2009.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）患者から採取した骨膜片に赤血球溶解処理を施し、生理食塩水で洗浄して、培養液を添加しない培養ディッシュに戴置するステップと、
（２）前記培養ディッシュ上の骨膜片の表面に前記患者の多血小板血漿を滴下して骨膜片の表面を覆うように凝固させるステップと、
（３）トランスフォーミング成長因子ベータ１、トランスフォーミング成長因子ベータ２及びトランスフォーミング成長因子ベータ３からなるグループから選択される少なくとも１種類のトランスフォーミング成長因子ベータを含む第１培養液を前記培養ディッシュに添加して培養するステップと、
（４）前記ステップ（３）の後、塩基性繊維芽細胞成長因子を含むが前記多血小板血漿は含まない第２培養液で培養するステップとを含むことを特徴とするヒト骨膜培養方法。
【請求項２】
前記トランスフォーミング成長因子ベータはトランスフォーミング成長因子ベータ１であることを特徴とする、請求項１に記載のヒト骨膜培養方法。
【請求項３】
（５）前記ステップ（４）の後、デキサメタゾン、ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸からなる骨芽細胞分化誘導剤を含む第３培養液で培養するステップを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のヒト骨膜培養方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月5日(2009.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）患者から採取した骨膜片に赤血球溶解処理を施し、生理食塩水で洗浄して、乾燥した培養ディッシュに戴置するステップと、
（２）前記培養ディッシュ上の骨膜片の表面に前記患者の多血小板血漿を滴下して骨膜片の表面を覆うように凝固させるステップと、
（３）トランスフォーミング成長因子ベータ１、トランスフォーミング成長因子ベータ２及びトランスフォーミング成長因子ベータ３からなるグループから選択される少なくとも１種類のトランスフォーミング成長因子ベータを含む第１培養液を前記培養ディッシュに添加して培養するステップと、
（４）前記ステップ（３）の後、塩基性繊維芽細胞成長因子を含むが前記多血小板血漿は含まない第２培養液で培養するステップとを含むことを特徴とするヒト骨膜培養方法。
【請求項２】
前記トランスフォーミング成長因子ベータはトランスフォーミング成長因子ベータ１であることを特徴とする、請求項１に記載のヒト骨膜培養方法。
【請求項３】
（５）前記ステップ（４）の後、デキサメタゾン、ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸からなる骨芽細胞分化誘導剤を含む第３培養液で培養するステップを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のヒト骨膜培養方法。
【国際調査報告】
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2009025374.tif 000009
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