【手続補正書】
【提出日】平成16年12月20日(2004.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）の化合物：
【化１】
2004518674.tif 000001
ただし、Ｒ１は、Ｃ０−７−アルキル（Ｃ＝０である時は、Ｒ１は、単に水素である）、Ｃ３−６−シクロアルキルまたはＡｒ−Ｃ０−７−アルキル（Ｃ＝０である時は、Ｒ１は、単に芳香族部分Ａｒである）であり；
Ａｒは、不飽和である安定した５−若しくは６−員の一環または安定した９若しくは１０員の２環である芳香環部分であり、この際、芳香環部分は、必要であれば、Ｒ１９で置換されてもよく；
ｚは、ＯまたはＳであり；
Ｐ１は、ＣＲ５Ｒ６であり、
Ｐ２は、ＣＲ７Ｒ８であり、
Ｑは、ＣＲ９Ｒ１０またはＮＲ１１であり、この際、Ｒ１１は、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル及びＡｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれ；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル、Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、Ｏ−Ｃ０−７−アルキル、Ｏ−Ｃ３−６−シクロアルキル、Ｏ−Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、Ｓ−Ｃ０−７−アルキル、Ｓ−Ｃ３−６−シクロアルキル、Ｓ−Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、ＮＨ−Ｃ０−７−アルキル、ＮＨ−Ｃ３−６−シクロアルキル、ＮＨ−Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、Ｎ（Ｃ０−７−アルキル）２、Ｎ（Ｃ３−６−シクロアルキル）２及びＮ（Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル）２から選ばれ；
Ｙは、ＣＲ１２Ｒ１３−ＣＯであり、この際、Ｒ１２、Ｒ１３は、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル及びＡｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれ；
基（Ｘ）ｏにおいて、Ｘは、ＣＲ１４Ｒ１５であり、この際、Ｒ１４及びＲ１５は、独立して、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル及びＡｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれ、ならびにｏは、０〜３の数であり；
基（Ｗ）ｎにおいて、Ｗは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）若しくはＳ（Ｏ）２またはＮＲ１６であり、この際、Ｒ１６は、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル及びＡｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれ、ならびにｎは、０または１であり；
基（Ｖ）ｍにおいて、Ｖは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＳ（Ｏ）、ＮＨＳ（Ｏ）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨまたはＣＲ１７Ｒ１８であり、この際、Ｒ１７及びＲ１８は、独立して、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル、Ａｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれ、ならびにｍは、０〜３の数であり、ｍが１より大きい場合には、（Ｖ）ｍは、最大１個のカルボニルまたはスルホニル基を含み；
Ｕは、下記よりなる群より選ばれる、飽和または不飽和のいずれかであり、０〜４個のヘテロ原子を含む、安定した５−〜７−員の一環または安定した８−〜１１−員の２環であり；
【化２】
2004518674.tif 000002
ただし、Ｒ１９は、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル、Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、Ｏ−Ｃ０−７−アルキル、Ｏ−Ｃ３−６−シクロアルキル、Ｏ−Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、Ｓ−Ｃ０−７−アルキル、Ｓ−Ｃ３−６−シクロアルキル、Ｓ−Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、ＮＨ−Ｃ０−７−アルキル、ＮＨ−Ｃ３−６−シクロアルキル、ＮＨ−Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル、Ｎ（Ｃ０−７−アルキル）２、Ｎ（Ｃ３−６−シクロアルキル）２またはＮ（Ａｒ−Ｃ０−７−アルキル）２である；または、ＣＨＲ１９またはＣＲ１９基の一部である時は、Ｒ１９はハロゲンであってもよく；
Ａは、ＣＨ２、ＣＨＲ１９、Ｏ、Ｓ及びＮＲ２０から選ばれ；
この際、Ｒ１９は、上記と同様の定義であり；ならびにＲ２０は、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル及びＡｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれ；
Ｂ、Ｄ及びＧは、それぞれ独立して、ＣＲ１９及びＮから選ばれ、この際、Ｒ１９は、上記と同様の定義であり；
Ｅは、ＣＨ２、ＣＨＲ１９、Ｏ、Ｓ及びＮＲ２０から選ばれ、この際、Ｒ１９及びＲ２０は、上記と同様の定義であり；
Ｊ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４は、独立して、ＣＲ１９及びＮから選ばれ、この際、Ｒ１９は、上記と同様の定義であり；
Ｔ５は、ＣＨ及びＮから選ばれ；
ｑは、０〜３の数であり、これにより５−、６−または７−員環が規定される。
【請求項２】
以下：
ｚは、Ｏであり；
Ｐ１及びＰ２は、ＣＨ２であり；および
Ｑは、ＣＨ２またはＮＨである、
を独立してまたは組み合わせてなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１は、Ｃ０−７−アルキルまたはＡｒ−Ｃ０−７−アルキルを有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１は、水素または下記部分：
【化３】
2004518674.tif 000003
の一から選ばれる、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｙは、ＣＲ１２Ｒ１３ＣＯであり、この際、Ｒ１２、Ｒ１３は、Ｃ０−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキルまたはＡｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｙは、下記部分：
【化４】
2004518674.tif 000004
ただし、Ｒ１９、Ｒ２０、（Ｘ）ｏ及びＡｒは、請求項１における定義と同様の定義である、
の一から選ばれる、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙは、ＣＨＲ１３ＣＯであり、この際、Ｒ１３は、Ａｒ−ＣＨ２−であり、この際、芳香族環は、必要であれば置換されてもよいフェニルまたは１環式ヘテロ環である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｙは、ＣＨＲ１３ＣＯであり、この際、Ｒ１３は、単一分岐鎖のアルキル基または直鎖ヘテロアルキル鎖である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｙは、ＣＨＲ１３ＣＯであり、この際、Ｒ１３は、シクロヘキシルメチルを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｙは、以下：
【化５】
2004518674.tif 000005
ただし、Ｒ１９、（Ｘ）ｏ及びＡｒは、請求項１における定義と同様の定義である、
から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
基（Ｘ）ｏにおいて、Ｘは、ＣＲ１４Ｒ１５であり、ならびにＲ１４及びＲ１５は、それぞれ、Ｃ０−７−アルキルまたはＡｒ−Ｃ０−７−アルキルから選ばれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
（Ｘ）ｏは、下記部分：
【化６】
2004518674.tif 000006
ただし、Ｒ１９、Ｒ２０、（Ｗ）ｏ及びＹは、請求項１における定義と同様の定義である、
の一である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
（Ｘ）ｏにおいて、Ｘは、ＣＲ１４Ｒ１５であり、この際、Ｒ１４は水素であり、Ｒ１５はＣ１−４−アルキルであり；ｏは、０または１である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
基（Ｗ）ｎにおいて：
Ｗは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２、ＳＯ、Ｃ（Ｏ）またはＮＲ１６であり、この際、Ｒ１６は、Ｃ０−４−アルキルであり；およびｎは、０または１である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
基（Ｗ）ｎにおいて：
Ｗは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２、Ｃ（Ｏ）またはＮＨであり、この際、ｎは、０または１である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
基（Ｗ）ｎにおいて：
Ｗは、ＮＨであり、ｎは、１である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
基（Ｖ）ｍにおいて：
Ｖは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨまたはＣＨＲ１８であり、この際、Ｒ１８は、Ｃ０−４−アルキルであり；およびｍは、０または１である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
（Ｖ）ｍ及び（Ｗ）ｍの組み合わせは、下記：
【化７】
2004518674.tif 000007
ただし、Ｕ及び（Ｘ）ｏは、請求項１における定義と同様の定義である、
の一である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
（Ｘ）ｏ、（Ｖ）ｍ及び（Ｗ）ｍの組み合わせは、下記：
【化８】
2004518674.tif 000008
ただし、Ｕ及びＹは、請求項１における定義と同様の定義である、
の一である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｕは、必要であれば置換されてもよい５−若しくは６−員の飽和若しくは不飽和ヘテロ環または必要であれば置換されてもよい飽和若しくは不飽和の９−若しくは１０−員のヘテロ環である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｕは、下記：
【化９】
2004518674.tif 000009
ただし、Ｒ１９は、請求項１における定義と同様の定義である、
の一を有する、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｕは、下記基：
【化１０】
2004518674.tif 000010
ただし、Ｒ１９、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｔ２、Ｔ３及びＴ４は、請求項１における定義と同様の定義である、
を表わす、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｕは、下記基：
【化１１】
2004518674.tif 000011
ただし、Ｒ１９、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ、Ｌ、Ｍ、Ｒ及びＴは、請求項１における定義と同様の定義である、
を表わす、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｕは、下記基：
【化１２】
2004518674.tif 000012
ただし、Ｒ１９、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｊ及びＬは、請求項１における定義と同様の定義である、
を表わす、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
（ａ）単離された既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼへの請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物のインビトロでの結合を評価して、「潜在性」の基準を提供し；さらに必要であれば下記段階：
（ｂ）標的の及び一般的なハウスキーピングプロテアーゼの密接に関連する相同性プロテアーゼへの請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物の結合を評価して、「選択性」の基準を提供する；
（ｃ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物の存在下での、特定のシステインプロテアーゼ活性の細胞に基づく機能性マーカーをモニターする；および
（ｄ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物の存在下での、特定のシステインプロテアーゼ活性の動物モデルに基づく機能性マーカーをモニターする、
の一以上を有する、治療のための標的としての既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼの確認方法。
【請求項２６】
治療のための標的としての既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼの確認における請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２７】
病気の状態がシステインプロテアーゼを阻害することによって修飾される病気を予防または処置することを目的として、医薬に使用される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
病気の状態がシステインプロテアーゼを阻害することによって修飾される病気を予防または処置するための医薬の調製における請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２９】
シャーガス病の予防または処置に使用される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
シャーガス病の予防または処置に使用される請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
シャーガス病を予防または処置するための医薬の調製における請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項３２】
シャーガス病を予防または処置するための医薬の調製における請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項３３】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の一以上の化合物及び製薬上または獣医学上許容できる担体を含む薬剤または獣医薬組成物。
【請求項３４】
混合によって、性化合物を担体と組み合わせて取り入れることを有する、請求項３３に記載の薬剤または獣医薬組成物の調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
プロドラッグは、インビボで一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の活性のある親薬剤を放出する共有結合化合物である。プロドラッグは、例えば、テトラヒドロフロ［３，２−ｂ］ピロール−３−オン、テトラヒドロチエノ［３，２−ｂ］ピロール−３−オン、ヘキサヒドロピロロ［３，２−ｂ］ピロール−３−オン、ヘキサヒドロシクロペンタ［ｂ］ピロール−６−オン、テトラヒドロフロ［３，２−ｃ］ピラゾール−６−オン、テトラヒドロチエノ［３，２−ｃ］ピラゾール−６−オン、ヘキサヒドロピロロ［３，２−ｃ］ピラゾール−６−オン、ヘキサヒドロシクロペンタピラゾール−６−オン、ヘキサヒドロフロ［３，２−ｂ］ピリジン−３−オン、ヘキサヒドロチエノ［３，２−ｂ］ピリジン−３−オン、オクタヒドロピロロ［３，２−ｂ］ピリジン−３−オン、オクタヒドロシクロペンタ［ｂ］ピリジン−７−オン、ヘキサヒドロフロ［３，２−ｃ］ピリダジン−７−オン、ヘキサヒドロチエノ［３，２−ｃ］ピリダジン−７−オン、オクタヒドロピロロ［３，２−ｃ］ピリダジン−７−オンまたはオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピリダジン−７−オン足場に存在する環外ケトン官能性を有するケタールまたはヘミケタール誘導体を構成してもよい。キラル中心または他の形態の異性体中心が本発明の化合物に存在する際には、鏡像異性体及びジアステレオ異性体等の、すべての形態のこのような一つの異性体または複数の異性体は、本発明に包含される。キラル中心を含む本発明の化合物はラセミ混合物、鏡像異性体が多く含まれる混合物として使用されてもよい、またはラセミ混合物を既知の技術を用いて分離して、個々の鏡像異性体を単独で使用してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
本発明の第二の態様によると、（ａ）単離された既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼへの上記したような化合物のインビトロでの結合を評価して、潜在性(potency)の基準(measure)を提供し；さらに必要であれば下記段階：
（ｂ）標的の及び一般的なハウスキーピングプロテアーゼ(house-keeping protease)（例えば、トリプシン）の密接に関連する相同性プロテアーゼへの化合物の結合を評価して、選択性の基準を提供する；
（ｃ）化合物の存在下での、特定のシステインプロテアーゼ活性の細胞に基づく機能性マーカーをモニターする；および
（ｄ）化合物の存在下での、特定のシステインプロテアーゼ活性の動物モデルに基づく機能性マーカーをモニターする、
の一以上を有する、治療のための標的としての既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼの確認方法が提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
したがって、本発明は、治療標的としての既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼの確認方法を提供する。様々なアプローチ及び複雑さのレベルが特定の標的の効果的な阻害及び「確認」に適当である。第一の場合では、本方法は、単離された既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼへの一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物のインビトロでの結合を評価して、「潜在性」の基準を提供する。標的の及び一般的なハウスキーピングプロテアーゼ（例えば、トリプシン）の密接に関連する相同性プロテアーゼへの一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の結合のさらなる評価は、「選択性」の基準を提供する。複雑さの第二のレベルは、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の存在下で、特定のシステインプロテアーゼ活性の細胞に基づく機能性マーカーをモニターすることによって評価されてもよい。例えば、「ヒト破骨細胞性吸収アッセイ」が、カテプシンＫの活性及びプロテアーゼ阻害剤の生物学的な効果をモニターするための細胞に基づく第二のインビトロの試験系として使用された（例えば、ＷＯ−Ａ−９８５０５３３を参照）。「ＭＨＣ−ＩＩプロセシング−Ｔ細胞活性化アッセイ」は、カテプシンＳの活性及びプロテアーゼ阻害剤の生物学的な効果をモニターするための細胞に基づく第二のインビトロの試験系として使用された(Shi, G-P., et al, Immunity, 10, 197-206, 1999)。ウィルスまたは細菌感染を調べる際には、このようなマーカーは、単に、ウィルスの（例えば、ｍＲＮＡコピーのカウント）または細菌のローディングの機能的な評価及びプロテアーゼ阻害剤の生物学的な効果の評価であってもよい。複雑さの第三のレベルは、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の存在下で、特定のシステインプロテアーゼ活性の動物モデルに基づく機能性マーカーをモニターすることによって評価されてもよい。例えば、リーシュマニア(Leishmania )感染、ピー．ビンクケイ(P. vinckei)感染、マラリア（ファルシパイン(falcipain)の阻害）及びトリパノソーマ クルージ感染（クルジパイン(cruzipain)）のマウスモデルは、病原の伝播に鍵となる役割を果たすシステインプロテアーゼの阻害が、病気の症状を阻止し、当該標的を「確認する」のに有効であることを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
したがって、本発明は、治療のための標的としての既知のまたは推定上のシステインプロテアーゼの確認における一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の使用を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３０】
（１）シス−ｒａｃ−（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
シス−ｒａｃ−（３−ヒドロキシ）ピペリジン−２−カルボン酸（市販の３−ヒドロキシピコリン酸の水素化によって得た、Drummond、J.etal、J.Med.Chem.、32、2116-2128、1989を参照）（１５．０ｇ、１０３．４ｍｍｏｌｅ）を、水（２００ｍＬ）における炭酸ナトリウム（２２．９０ｇ、２１７．１ｍｍｏｌｅ）の激しく攪拌した、氷冷した溶液に添加した。１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）を添加して、透明な薄黄色の溶液を得た。１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）における９−フルオレニルメチルクロロホルメート（２７．５２ｇ、１０８．４ｍｍｏｌｅ）を１時間かけて添加した後、氷冷を取り除き、混合物をさらに１時間室温で攪拌した。さらなる水（１５０ｍＬ）を添加して、反応混合物をクロロホルムで洗浄し（２×２５０ｍＬ）、合わせた有機層を捨てた。水相を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ  約２に酸性にして、濃稠な不透明な混合物を得た。酸性にされた水性混合物をクロロホルムで抽出し（２×５００ｍＬ）、ここで透明になった水相を捨てた。不透明な合わせたクロロホルム層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、瀘過して、真空中で還元して、白色のフォームを得た、収率３０．２ｇ（８２．２ｍｍｏｌｅ、７９．５％）。ＴＬＣ（マイナーなＵＶスポット、Ｒｆ＝０．５８、メジャーなＵＶスポット  Ｒｆ＝０．２５、メタノール：クロロホルム  １：４）、分析用ＨＰＬＣ  メジャーなピーク  Ｒｔ＝１６．９９０分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝７．９７６分、３６８．０［Ｍ＋Ｈ］＋、３９０．０［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３２】
（２）シス−ｒａｃ−（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
シス−ｒａｃ−（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（２８．２ｇ、７６．７ｍｍｏｌｅ）を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置でトルエン（２００ｍＬ）に溶解した。アリルアルコール（５０ｍＬ）、次にｐ−トルエンスルホン酸水和物（１５．１ｇ、７８．２ｍｍｏｌｅ）を添加した。この混合物を１時間還流し、冷却して、ＣＨＣｌ３（５００ｍＬ）を添加した。有機層をＮａＨＣＯ３（２×２５０ｍＬ）、０．１Ｎ  ＨＣｌ（２５０ｍＬ）及びブライン（２５０ｍＬ）で洗浄した後、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。瀘過及び真空中での還元によって、薄黄色の流動性のある油（３５ｇ）が得られた。この未精製油を、ヘプタン：酢酸エチル  ３：１→１：１の勾配で溶出してシリカゲル（２４０ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、無色のガムを２０．４ｇ得た（５０．１ｍｍｏｌｅ、６５．３％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．２０、ヘプタン：酢酸エチル２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２０．００３分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝９．４７３分、４０８．１［Ｍ＋Ｈ］＋、４３０．１［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３４】
（３）シス−ｒａｃ−（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの（２Ｒ，３Ｓ）（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル及び（２Ｓ，３Ｒ）（３−アセトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルへの酵素による分解
シス−ｒａｃ−（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（１９．６ｇ、４８．１ｍｍｏｌｅ）、リパーゼＰＳ（２５ｇ、例えば、AmanoEnzymeInc.）、酢酸ビニル（３００ｍＬ）及びイソプロピルエーテル（２００ｍＬ）を、３８℃で攪拌した。５日後、ＨＰＬＣにより、２ピーク（５２％：４８％、これから９５％の変換が示される）の平衡が示され、反応混合物をセライト（３ｃｍ×１０ｃｍ  床）で瀘過した。セライト床をクロロホルムで洗浄し（３×２５０ｍＬ）、合わせた有機濾液を真空中で還元して、粘性のある黄褐色の油を得た（２３．０ｇ）。この未精製油を、ヘプタン：酢酸エチル  ３：１→１：２の勾配で溶出してシリカゲル（３００ｇ）で精製した。主要な画分を同定し、真空中で還元した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３５】
生成物１  （２Ｓ，３Ｒ）（３−アセトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル
粘性のある非常に薄い黄色の油、収率９．５ｇ（２１．１ｍｍｏｌｅ、４３．９％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．４０、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２２．６３３分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝１０．７１４分、４５０．１［Ｍ＋Ｈ］＋、４７２．１［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３７】
生成物２  （２Ｒ，３Ｓ）（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル
白色の結晶性固体、収率９．０５ｇ（２２．２ｍｍｏｌｅ、４６．１％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．２０、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１９．９７０分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝９．４５０分、４０８．１［Ｍ＋Ｈ］＋、４３０．１［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３９】
（４）（２Ｓ，３Ｒ）（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
（２Ｓ，３Ｒ）（３−アセトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（４．５ｇ、１０ｍｍｏｌｅ））を、アリルアルコール（５０ｍＬ）に溶解し、濃Ｈ２ＳＯ４（２００μＬ）を添加して、２４時間、加熱、還流した。この混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）を添加し、ＮａＨＣＯ３（２５０ｍＬ）、ブライン（２５０ｍＬ）で洗浄して、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、黄褐色の油を得た（４．２ｇ）。この未精製油を、ヘプタン：酢酸エチル  ３：１→１：１の勾配で溶出してシリカゲル（１７０ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、白色の結晶性固体を得た、収率３．０ｇ（７．３７ｍｍｏｌｅ、７３．７％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．２０、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１９．４７４分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝９．５０７分、４０８．２［Ｍ＋Ｈ］＋、４３０．２［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４１】
（５）（２Ｓ，３Ｒ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
（２Ｓ，３Ｒ）（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（１．７５ｇ、４．３０ｍｍｏｌｅ）を、５０ｍＬのガラス圧力管で乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かし、−７８℃に冷却した。イソブチレンガス（〜１０ｍＬ）を溶液中で凝縮して、濃Ｈ２ＳＯ４（１００μＬ）を添加した。攪拌棒を加え、管を密閉し、冷却を取り除き、室温で７２時間攪拌した。密閉した管を−７８℃に冷却し、Ｎ−メチルモルホリン（２００μＬ、１当量  ｗ．ｒ．ｔ．濃Ｈ２ＳＯ４）、及び室温まで加温して、２時間攪拌しながら、開けた。ジクロロメタン（７５ｍＬ）を添加し、有機溶液をＮａＨＣＯ３（７５ｍＬ）、次にブライン（７５ｍＬ）で洗浄して、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、薄黄褐色の油を得た（１．９１ｇ）。この未精製油を、ヘプタン：酢酸エチル  ５：１→３：１の勾配で溶出してシリカゲル（１００ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、濃稠な透明な油を１．５９ｇ得た（３．４３ｍｍｏｌｅ、７９．８％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．５０、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２４．１２３分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝１１．９１分、４０８．２［Ｍ＋Ｈ−Ｂｕｔ］＋、４８６．３［Ｍ＋Ｎａ］＋、９４９．５［２Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４３】
（６）（２Ｓ，３Ｒ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
（２Ｓ，３Ｒ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（１．５２ｇ、３．２９ｍｍｏｌｅ）を、攪拌しながら乾燥ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（７６ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌｅ、０．０２当量）、次にフェニルトリヒドロシラン（０．７１ｇ、０．６２２ｍＬ、６．５８ｍｍｏｌｅ、２当量）を添加した。１時間後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）を添加し、有機溶液を０．０１Ｎ  ＨＣｌ（１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄して、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、暗い灰色の固体を得た（２．０５ｇ）。この未精製固体を、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１→１：２の勾配で溶出してシリカゲル（７５ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、白色の結晶性固体を０．９７ｇ得た（２．２９ｍｍｏｌｅ、６９．６％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．２５、ヘプタン：酢酸エチル  １：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２１．３１０分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝１０．２５４分、３６８．２［Ｍ＋Ｈ−Ｂｕｔ］＋、４４６．２［Ｍ＋Ｎａ］＋、８６９．３［２Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４５】
（７）（２Ｓ，３Ｒ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（２−ジアゾアセチル）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
（２Ｓ，３Ｒ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（８３０ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌｅ）を、攪拌しながら乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した。反応物に窒素を流し、−１５℃に冷却した。イソブチルクロロホルメート（２９６ｍｇ、乾燥ジクロロメタン（２．５ｍＬ）において２．１６ｍｍｏｌｅ）及びＮ−メチルモルホリン（３９７ｍｇ、乾燥ジクロロメタン（２．５ｍＬ）において３．９２ｍｍｏｌｅ）を、１５分かけて０．５ｍＬアリコートに同時に添加した。エーテル性ジアゾメタン（６０℃で水（４．３ｍＬ）／エタノール（８．６ｍＬ）における水酸化ナトリウム（２．７５ｇ）にジアザルド（ｄｉａｚａｌｄ）（２．５ｇ、ジエチルエーテル（４０ｍＬ）において〜８ｍｍｏｌｅ）から生成）を活性化アミノ酸溶液に添加して、室温で２４時間攪拌した。酢酸（〜２ｍＬ）を添加して、反応を止めた後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、有機溶液を水で洗浄した（３×１５０ｍＬ）後、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、濃稠な黄色の油を得た（１．０２ｇ）。この未精製の油を、精製せずに次に段階に使用した。ＴＬＣ（単一の主要なＵＶスポット、Ｒｆ＝０．４０、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１８．８８７分（５０．８％）プラス多くのマイナーなピーク、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝９．０９５分、３６４．２［Ｍ＋Ｈ］＋、７４９．２［２Ｍ＋Ｎａ］＋及びＲｔ＝１０．８５６分、４２０．２［Ｍ＋Ｈ−Ｎ２］＋、４７０．２［Ｍ＋Ｎａ］＋、９１７．３［２Ｍ＋Ｎａ］＋の２個のメインＵＶピーク）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４７】
（８）（３ａＳ，７ａＲ）３−オキソ−ヘキサヒドロフロ［３，２−ｂ］ピリジン−４−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルへの環化
水（５ｍＬ）及び酢酸（２０ｍＬ）における塩化リチウム（８４４ｍｇ、２０ｍｍｏｌｅ）の溶液を、（２Ｓ，３Ｒ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（２−ジアゾアセチル）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（１０００ｍｇ、〜２ｍｍｏｌｅ）に添加した。ガスを展開して、黄色の油状の固体を１時間かけて溶かして、ほとんど無色の溶液を得た。９０分後、クロロホルム（１５０ｍＬ）を添加して、有機溶液をＮａＨＣＯ３（２×１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、薄黄色のガムを得た（９２０ｍｇ）。この未精製ガムを、ヘプタン：酢酸エチル  ３：１→１：１の勾配で溶出してシリカゲル（１３５ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、白色の結晶性固体を３７０ｍｇ得た（１．０２ｍｍｏｌｅ、出発酸から５１．９％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．２５、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１８．７３４分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝９．０５１分、３６４．２［Ｍ＋Ｈ］＋、３８６．２［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７０２】
必要な２環式の構成単位である（３ａＲ，７ａＳ）３−オキソ−ヘキサヒドロフロ［３，２−ｂ］ピリジン−４−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルを、以下のようにして（２Ｒ，３Ｓ）（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルからさらなる４段階で調製した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７０３】
（１）（２Ｒ，３Ｓ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
（２Ｒ、３Ｓ）（３−ヒドロキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（１．７５ｇ、４．３０ｍｍｏｌｅ）を、５０ｍＬのガラス圧力管で乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かし、−７８℃に冷却した。イソブチレンガス（〜１０ｍＬ）を溶液中で凝縮して、濃Ｈ２ＳＯ４（１００μＬ）を添加した。攪拌棒を加え、管を密閉し、冷却を取り除き、室温で７２時間攪拌した。密閉した管を−７８℃に冷却し、Ｎ−メチルモルホリン（２００μＬ、１当量  ｗ．ｒ．ｔ．濃Ｈ２ＳＯ４）、及び室温まで加温して、２時間攪拌しながら、開けた。ジクロロメタン（７５ｍＬ）を添加し、有機溶液をＮａＨＣＯ３（７５ｍＬ）、次にブライン（７５ｍＬ）で洗浄して、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、薄黄褐色の油を得た（１．９３ｇ）。この未精製油を、ヘプタン：酢酸エチル  ５：１→３：１の勾配で溶出してシリカゲル（１００ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、濃稠な透明な油を１．４８ｇ得た（３．１９ｍｍｏｌｅ、７４．３％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．５０、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２４．０８３分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝１１．９９６分、４０８．２［Ｍ＋Ｈ−Ｂｕｔ］＋、４８６．３［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７０５】
（２）（２Ｒ，３Ｓ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
（２Ｒ，３Ｓ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（１．４２ｇ、３．０７ｍｍｏｌｅ）を、攪拌しながら乾燥ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（７１ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌｅ、０．０２当量）、次にフェニルトリヒドロシラン（０．６６ｇ、０．５８１ｍＬ、６．１４ｍｍｏｌｅ、２当量）を添加した。１時間後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）を添加し、有機溶液を０．０１Ｎ  ＨＣｌ（１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄して、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、暗い灰色の固体を得た（２．０ｇ）。この未精製固体を、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１→１：２の勾配で溶出してシリカゲル（７５ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、白色の結晶性固体を１．０７ｇ得た（２．５３ｍｍｏｌｅ、８２．３％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．２５、ヘプタン：酢酸エチル  １：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２１．３０６分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝１０．２６９分、３６８．２［Ｍ＋Ｈ−Ｂｕｔ］＋、４４６．２［Ｍ＋Ｎａ］＋、８６９．３［２Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のメインＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７０７】
（３）（２Ｒ，３Ｓ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（２−ジアゾアセチル）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの調製
（２Ｒ，３Ｓ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（８３０ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌｅ）を、攪拌しながら乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した。反応物に窒素を流し、−１５℃に冷却した。イソブチルクロロホルメート（２９６ｍｇ、乾燥ジクロロメタン（２．５ｍＬ）において２．１６ｍｍｏｌｅ）及びＮ−メチルモルホリン（３９７ｍｇ、乾燥ジクロロメタン（２．５ｍＬ）において３．９２ｍｍｏｌｅ）を、１５分かけて０．５ｍＬアリコートに同時に添加した。エーテル性ジアゾメタン（６０℃で水（４．３ｍＬ）／エタノール（８．６ｍＬ）における水酸化ナトリウム（２．７５ｇ）にジアザルド（ｄｉａｚａｌｄ）（２．５ｇ、ジエチルエーテル（４０ｍＬ）において〜８ｍｍｏｌｅ）から生成）を活性化アミノ酸溶液に添加して、室温で３時間攪拌した。酢酸（〜３ｍＬ）を添加して、反応を止めた後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、有機溶液を水で洗浄した（３×１５０ｍＬ）後、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、粘着性の黄色の油を得た（９１０ｍｇ）。この未精製の油を、ヘプタン：酢酸エチル  ４：１→３：１の勾配で溶出してシリカゲル（７５ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、薄黄色の油／固体を５６０ｍｇ得た（１．２５ｍｍｏｌｅ、６３．９％）。ＴＬＣ（単一のメインＵＶスポット、Ｒｆ＝０．３５、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１８．７５４分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝９．０９５分、３６４．２［Ｍ＋Ｈ］＋、３８６．１［Ｍ＋Ｎａ］＋、７４９．２［２Ｍ＋Ｎａ］＋及びＲｔ＝１０．８５６分、４２０．２［Ｍ＋Ｈ−Ｎ２］＋、４７０．２［Ｍ＋Ｎａ］＋、９１７．３［２Ｍ＋Ｎａ］＋のＵＶピーク）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７１１】
（４）（３ａＲ，７ａＳ）３−オキソ−ヘキサヒドロフロ［３，２−ｂ］ピリジン−４−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルへの環化
水（３ｍＬ）及び酢酸（１２ｍＬ）における塩化リチウム（４９４ｍｇ、１１．６ｍｍｏｌｅ）の溶液を、（２Ｒ，３Ｓ）（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（２−ジアゾアセチル）ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（５２０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌｅ）に添加した。ガスを展開して、黄色の油状の固体を１時間かけて溶かして、ほとんど無色の溶液を得た。９０分後、クロロホルム（１５０ｍＬ）を添加して、有機溶液をＮａＨＣＯ３（２×１５０ｍＬ）、ブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶剤を真空中で除去して、白色の結晶性固体を得た（３９０ｍｇ）。この未精製固体を、ヘプタン：酢酸エチル  ３：１→２：１の勾配で溶出してシリカゲル（７５ｇ）で精製した。所望の画分を合わせて、真空中で還元することによって、白色の結晶性固体を３４０ｍｇ得た（０．９４ｍｍｏｌｅ、出発酸から４７．７％）。ＴＬＣ（単一のＵＶスポット、Ｒｆ＝０．２５、ヘプタン：酢酸エチル  ２：１）、分析用ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝１８．５６３分、ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｒｔ＝９．０７４分、３６４．２［Ｍ＋Ｈ］＋、３８６．２［Ｍ＋Ｎａ］＋の単一のＵＶピーク）。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによる分析によって、３°アミド結合の付近にｃｉｓ及びｔｒａｎｓの幾何異性体の存在が示された。