(57)【要約】  パルサー法における検出感度の向上と多遺伝子同時検出が可能な標的物質の検出方法及び検出用キットを提供する。  複数のダイマープローブ又はダイマー形成用プローブと、アシストプローブとを用いてシグナルプローブポリマーを形成させて標的物質を検出する方法であって、各ダイマープローブは５’側領域、中央領域及び３’側領域を含む、２種のダイマー形成用プローブ（２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ３’側領域及び５’側領域が互いに非相補的である）から形成され、複数のダイマープローブは自己集合反応によりダイマープローブのポリマーを形成し得るように構成されており、アシストプローブは１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有するようにした。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブと、アシストプローブとを用いて、シグナルプローブポリマーを形成させて、標的物質を検出する標的物質の検出方法であって、
前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、
前記アシストプローブは、前記ダイマープローブの１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有することを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
前記ダイマープローブが下記式（１）の構造を有する第１ダイマープローブ及び下記式（２）又は下記式（３）の構造を有する第２ダイマープローブの２組のダイマープローブであり、前記アシストプローブが下記式（１）の領域Ａに相補的な配列及び領域Ｆに相補的な配列を１又は複数回含む、又は下記式（１）の領域Ｄに相補的な配列及び領域Ｃに相補的な配列を１又は複数回含むことを特徴とする請求項１記載の標的物質の検出方法。
【化１】
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【化２】
2009022682.tif 000012
【化３】
2009022682.tif 000013
［前記式（１）〜（３）において、領域Ａと領域Ａ’、領域Ｂと領域Ｂ’、領域Ｃと領域Ｃ’、領域Ｄと領域Ｄ’、領域Ｅと領域Ｅ’及び領域Ｆと領域Ｆ’はそれぞれ相補的塩基配列を有する。］
【請求項３】
前記アシストプローブが、前記領域Ｆ’及び前記領域Ａ’からなる領域Ｆ’Ａ’を１以上含み、該領域Ｆ’Ａ’において、前記領域Ｆ’の３’側と前記領域Ａ’の５’側は隣接してなることを特徴とする請求項２記載の標的物質の検出方法。
【請求項４】
前記アシストプローブが、前記領域Ｃ’及び前記領域Ｄ’からなる領域Ｃ’Ｄ’を１以上含み、該領域Ｃ’Ｄ’において、前記領域Ｃ’の３’側と前記領域Ｄ’の５’側は隣接してなることを特徴とする請求項２又は３記載の標的物質の検出方法。
【請求項５】
標的物質、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブ、及びアシストプローブを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、
前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、
前記アシストプローブは、前記ダイマープローブの１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有することを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法により形成されることを特徴とするシグナルプローブポリマー。
【請求項７】
複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブと、アシストプローブと、を含む標的物質の検出用キットであって、
前記ダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、
前記アシストプローブは、前記ダイマープローブの１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有することを特徴とする標的物質の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブポリマーを形成する複数のダイマープローブ及び新規のアシストプローブを含む標的物質の検出用キット、該検出用キットを用いた標的物質の検出方法、及びシグナルプローブポリマーの形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を使用しないシグナル増幅方法として、特許文献１は、下記式（１）の構造を有するダイマープローブ及び下記式（２）又は下記式（３）の構造を有するダイマープローブの２組のダイマープローブを用い、該ダイマープローブの自己集合反応により集合体（ポリマー）を形成させるシグナル増幅方法（以下、パルサー法（ＰＡＬＳＡＲ法）と称する）を開示している。
【化１】
2009022682.tif 000003
【化２】
2009022682.tif 000004
【化３】
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【０００３】
前記式（１）〜（３）において、領域Ａと領域Ａ’、領域Ｂと領域Ｂ’、領域Ｃと領域Ｃ’、領域Ｄと領域Ｄ’、領域Ｅと領域Ｅ’及び領域Ｆと領域Ｆ’はそれぞれ相補的塩基配列を有し、複数のダイマープローブの結合により下記式（４）で示される構造を有する自己集合体が形成される。本願明細書中でシグナルプローブポリマーとは、ダイマープローブにより形成される前記自己集合体を含む核酸プローブのポリマーを言う。
【化４】
2009022682.tif 000006
【０００４】
特許文献２は、上記パルサー法を利用して試料中の被験遺伝子を検出する方法を開示している。特許文献２は、被験遺伝子とプローブポリマーの複合体を形成させ、該プローブポリマーを検出することにより被験遺伝子を高感度に検出する方法を開示し、被験遺伝子上にシグナルプローブポリマーを形成させる方法として、ポリマー形成に使用する複数種のプローブの一方の一部を、被験遺伝子と相補的塩基配列となるようにデザインする方法、及び被験遺伝子と相補的な塩基配列、及びポリマー形成に使用するプローブと相補的な塩基配列の両方を別途有するプローブ（アシストプローブ）を用いる方法を開示している。なお、本発明において、アシストプローブとは、検出する標的物質と結合可能な領域、及びポリマー形成に使用するプローブと相補的な配列の両方を有するプローブを言い、標的物質とシグナルプローブポリマーをつなぐ働きをする。アシストプローブを用いた方法は、被験遺伝子と相補的な部分を変えた複数のアシストプローブを準備することにより、同じ複数種のプローブのセットにより複数の遺伝子を同時に検出できるという利点を有している。
特許文献２は、ダイマープローブの１領域と相補的な配列を有するアシストプローブが記載されているが、高感度に標的物質を検出できるアシストプローブに関する検討はなされていない。
【特許文献１】国際公開０２／０３１１９２号
【特許文献２】国際公開２００６／０２８１６２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、多種遺伝子同時検出にも対応したパルサー法による検出感度の向上を可能にすべく鋭意研究を重ねてきた。その結果、パルサー法に適したアシストプローブのデザイン方法を見出した。
本発明は、パルサー法における検出感度の向上と多種遺伝子同時検出が可能な標的物質の検出方法、該方法に用いられるダイマープローブ及びアシストプローブを含む検出用キット、並びに該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法により形成されたシグナルプローブポリマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明者らはアシストプローブのデザインについて鋭意研究を重ねた結果、パルサー法に最適なアシストプローブの設計方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明の標的物質の検出方法は、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブと、アシストプローブとを用いて、シグナルプローブポリマーを形成させて、標的物質を検出する標的物質の検出方法であって、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、前記アシストプローブは、前記ダイマープローブの１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有することを特徴とする。【０００７】
前記ダイマープローブが下記式（１）の構造を有する第１ダイマープローブ及び下記式（２）又は下記式（３）の構造を有する第２ダイマープローブの２組のダイマープローブであり、前記アシストプローブが下記式（１）の領域Ａに相補的な配列及び領域Ｆに相補的な配列を１又は複数回含む、又は下記式（１）の領域Ｄに相補的な配列及び領域Ｃに相補的な配列を１又は複数回含むことが好ましい。
【化５】
2009022682.tif 000007
【化６】
2009022682.tif 000008
【化７】
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［前記式（１）〜（３）において、領域Ａと領域Ａ’、領域Ｂと領域Ｂ’、領域Ｃと領域Ｃ’、領域Ｄと領域Ｄ’、領域Ｅと領域Ｅ’及び領域Ｆと領域Ｆ’はそれぞれ相補的塩基配列を有する。］【０００８】
前記アシストプローブが、前記領域Ｆ’及び前記領域Ａ’からなる領域Ｆ’Ａ’を１以上含み、該領域Ｆ’Ａ’において、前記領域Ｆ’の３’側と前記領域Ａ’の５’側は隣接
してなることが好ましい。
また、前記アシストプローブが、前記領域Ｃ’及び前記領域Ｄ’からなる領域Ｃ’Ｄ’を１以上含み、該領域Ｃ’Ｄ’において、前記領域Ｃ’の３’側と前記領域Ｄ’の５’側は隣接してなることが好適である。【０００９】
本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、標的物質、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブ、及びアシストプローブを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、前記アシストプローブは、前記ダイマープローブの１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有することを特徴とする。【００１０】
本発明のシグナルプローブポリマーは、本発明方法により形成されることを特徴とする。【００１１】
本発明の標的物質の検出用キットは、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブと、アシストプローブと、を含む標的物質の検出用キットであって、前記ダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、前記アシストプローブは、前記ダイマープローブの１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、パルサー法を利用した標的物質の検出感度を著しく向上させることができる。また、本発明のアシストプローブのターゲット領域を変化させる事により複数の標的物質を同時に検出する事が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の検出用キットの一例を示す概略説明図であり、（ａ）は、第１ダイマープローブ、（ｂ）は第２ダイマープローブ、及び（ｃ）はアシストプローブの第１の例を示す。
【図２】図１記載のアシストプローブにダイマープローブ及び標的物質が結合した模式図である。
【図３】図１記載の検出用キットを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示す概略説明図である。
【図４】第２ダイマープローブの他の例を示す概略説明図である。
【図５】アシストプローブの第２の例を示す概略説明図である。
【図６】図５記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。
【図７】アシストプローブの第３の例を示す概略説明図である。
【図８】図７記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。
【図９】アシストプローブの第４の例を示す概略説明図である。
【図１０】図９記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。
【図１１】アシストプローブの第５の例を示す概略説明図である。
【図１２】図１１記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。
【図１３】ダイマープローブの他の例を示す概略説明図である。
【符号の説明】
【００１４】
１０ａ：第１ダイマープローブ、１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ：第２ダイマープローブ、１０ｅ：第３ダイマープローブ、１１ａ〜１１ｈ、１１ｊ、１１ｋ：ダイマー形成用プローブ、１２ａ〜１２ｅ：アシストプローブ、２０：標的物質、３０：シグナルプローブポリマー。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。【００１６】
図１は本発明の標的物質の検出用キットの第１の例を示す概略説明図である。図２は、図１記載の検出用キットを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法における、標的物質とアシストプローブとダイマープローブの結合態様の一例を示す概略説明図である。図３は、図１記載の検出用キットを用いたシグナルプローブポリマーの形成を示す概略説明図である。【００１７】
本発明の標的物質の検出用キットは、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブと、アシストプローブと、を含むものである。
本発明で用いられる複数のダイマープローブは、複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ前記複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成されており、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、特許文献１記載の核酸プローブが用いられる。【００１８】
図１〜図３は２組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ１０ａ，第２ダイマープローブ１０ｂ）を用いた場合の一例を示した。
図１（ａ）に示した如く、第１ダイマープローブ１０ａは２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ１１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ１１ｂ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第１ダイマー形成用プローブ１１ａは、５’側領域（領域Ａ）、中央領域（領域Ｂ）及び３’側領域（領域Ｃ）の３領域を含み、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂは、５’側領域（領域Ｄ）、中央領域（領域Ｂ’）及び３’側領域（領域Ｆ）の３領域を含み、第１ダイマー形成用プローブ１１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ１１ｂは、中央領域（領域Ｂ及びＢ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ及びＦ）及び該５’側領域（領域Ａ及びＦ）が互いに非相補的である。【００１９】
図１（ｂ）に示した如く、第２ダイマープローブ１０ｂは、２種の一本鎖核酸プローブ（第３ダイマー形成用プローブ１１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ１１ｄ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第３ダイマー形成用プローブ１１ｃは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、第４ダイマー形成用プローブ１１ｄは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、第３ダイマー形成用プローブ１１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ１１ｄは、中央領域（領域Ｅ及びＥ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）及び該５’側領域（領域Ａ’及びＦ’）が互いに非相補的である。
なお、本発明において、領域Ａ’は領域Ａに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｃ’は領域Ｃに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｄ’は領域Ｄに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｆ’は領域Ｆに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。【００２０】
第１ダイマープローブ１０ａの５’側領域（領域Ａ及びＤ）は第２ダイマープローブ１０ｂの５’側領域（領域Ａ’及びＤ’）と相補的であり、第１ダイマープローブ１０ａの３’側領域（領域Ｃ及びＦ）は第２ダイマープローブ１０ｂの３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）と相補的であり、前記第１及び第２ダイマープローブ１０ａ及び１０ｂをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー３０を形成することができる（図３）。【００２１】
図１では、第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第３ダイマー形成用プローブ１１ｃの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第４ダイマー形成用プローブ１１ｄの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、ダイマープローブは、１つのダイマープローブの５’側領域が他のダイマープローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマープローブの３’側領域が他のダイマープローブの３’側領域と相補的であればよいものである。【００２２】
図４は、図１記載の第１ダイマープローブ１０ａと共に用いられる第２ダイマープローブの他の例を示す概略説明図である。
図４に示した如く、５’側領域が第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域に相補的な領域（領域Ａ’）であり且つ３’側領域が第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域に相補的な領域（領域Ｆ’）であるダイマー形成用プローブ１１ｅと、５’側領域が第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの５’側領域に相補的な領域（領域Ｄ’）であり且つ３’側領域が第１ダイマー形成用プローブ１１ａの３’側領域に相補的な領域（領域Ｃ’）であるダイマー形成用プローブ１１ｆと、をハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブ１０ｃを、第２ダイマープローブとして用いることもできる。【００２３】
また、図１では、２種類のダイマープローブを使用した例を示したが、相補的な領域の位置関係を工夫すれば、さらに多種類のダイマープローブを使用することもできる（特許文献１）。
図１３は、３組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ１０ａ，第２ダイマープローブ１０ｄ，第３ダイマープローブ１０ｅ）を用いた場合の一例を示す概略説明図である。
図１３（ａ）において、第１ダイマープローブ１０ａは図１（ａ）と同様に構成されている。
図１３（ｂ）において、第２ダイマープローブ１０ｄは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ１１ｇ，１１ｈ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ１１ｇは、５’側領域（領域Ｇ）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、３’側領域（領域Ｃ’）が第１ダイマープローブ１０ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ１１ｈは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｈ）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｄ’）が第１ダイマープローブ１０ａの５’側領域（領域Ｄ）と相補的である。【００２４】
図１３（ｃ）において、第３ダイマープローブ１０ｅは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ１１ｊ，１１ｋ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ１１ｊは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｊ）及び３’側領域（領域Ｈ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ａ’）が第１ダイマープローブ１０ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｈ’）が第２ダイマープローブ１０ｄの３’側領域（領域Ｈ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ１１ｋは、５’側領域（領域Ｇ’）、中央領域（領域Ｊ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｇ’）が第２ダイマープローブ１０ｄの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｆ’）が第１ダイマープローブ１０ａの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である。なお、図中、領域J’は領域Ｊに相補的な領域である。【００２５】
即ち、図１３において、第１ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域は、第２ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第１ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第２ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域と相補的であるように構成されている。【００２６】
図１３に示した如く、各ダイマープローブの各３’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的とし、且つ各ダイマープローブの各５’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的となるように構成した複数種のダイマープローブを用いて、これら複数種のダイマープローブをハイブリダイズさせることにより、ダイマープローブの集合体であるシグナルプローブポリマーが形成される。
なお、本発明において、相補的な関係を有するダイマープローブの組み合わせに特に制限はないが、図１３に示した如く、各ダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域が、他の１つのダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域とそれぞれ相補的となるように構成することが好ましい。【００２７】
ダイマー形成用プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。【００２８】
ダイマー形成用プローブの各領域の塩基配列は、本発明のダイマープローブが形成されるように所定の領域が相補的な塩基配列となるように構成されればよく特に制限はないが、各領域の両末端の塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。各領域の両末端の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、反応時間を短縮させることができ、さらにより低い反応温度で安定したプローブポリマーを形成させることができ、作業性及び検出感度を向上させることができる。【００２９】
本発明のアシストプローブは、ダイマープローブの１つのダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域を有し、少なくとも１つのダイマープローブの一端の２つの一本鎖領域と結合される。【００３０】
図１（ｃ）に本発明のアシストプローブの一例を示す。図１（ｃ）において、１２ａは本発明のアシストプローブの第１の例であり、ダイマープローブ１０ａの第１ダイマー形成用プローブ１１ａの５’側領域（領域Ａ）に相補的な配列を有する領域（領域Ａ’）、ダイマープローブ１０ａの第２ダイマー形成用プローブ１１ｂの３’側領域（領域Ｆ）に相補的な配列を有する領域（領域Ｆ’）、及び標的物質に結合可能なターゲット領域（領域Ｔ）を有する。該アシストプローブ１２ａにおいて、領域Ｆ’の３’側と領域Ａ’の５’側は隣接してなる。【００３１】
本発明のアシストプローブにおいて、各領域の位置関係に特に制限はないが、図１に示した如く、ダイマープローブと結合する領域が隣接してなることが好ましく、ダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な１領域（例えば、領域Ａ’）の５’側と、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な１領域（例えば、領域Ｆ’）の３’側が隣接してなることがより好ましい。【００３２】
具体的には、図１記載の２組のダイマープローブ（１０ａ，１０ｂ）を用いる場合、アシストプローブが、領域Ｆ’Ａ’（領域Ｆ’と領域Ａ’とからなり且つ領域Ｆ’の３’側と領域Ａ’の５’側が隣接してなる領域）、領域Ｃ’Ｄ’（領域Ｃ’と領域Ｄ’とからなり且つ領域Ｃ’の３’側と領域Ｄ’の５’側が隣接してなる領域）、領域ＦＡ（領域Ｆと領域Ａとからなり且つ領域Ｆの３’側と領域Ａの５’側が隣接してなる領域）、及び領域ＣＤ（領域Ｃと領域Ｄとからなり且つ領域Ｃの３’側と領域Ｄの５’側が隣接してなる領域）からなる群から選択される領域を１以上含むことが好ましい。また、第２ダイマープローブとして図４記載のダイマープローブ１０ｃを用いた場合、領域Ｆ’Ａ’、領域Ｃ’Ｄ’、領域ＣＡ（領域Ｃと領域Ａとからなり且つ領域Ｃの３’側と領域Ａの５’側が隣接してなる領域）、及び領域ＦＤ（領域Ｆと領域Ｄとからなり且つ領域Ｆの３’側と領域Ｄの５’側が隣接してなる領域）からなる群から選択される領域を１以上含むアシストプローブを用いることが好ましい。該構成とすることにより、図２に示した如く、アシストプローブは、１つのダイマープローブの一端の一本鎖の２領域と連続して結合し、標的物質を高感度に検出することができる。【００３３】
なお、図１〜３では、領域Ｆ’Ａ’及び領域Ｔからなるアシストプローブ１２ａを用いて、該アシストプローブ１２ａの領域Ｆ’Ａ’を、１つの第１ダイマープローブ１０ａの一端の２つの一本鎖領域（領域Ｆ及びＡ）と連続して結合させ、領域Ｔを標的物質２０と結合させた例を示したが、本発明において、アシストプローブと結合させるダイマープローブは、使用するダイマープローブから適宜選択すればよく、特に制限されない。【００３４】
本発明のアシストプローブにおいて、ターゲット領域は標的物質に応じて適宜選択可能である。標的物質が核酸の場合は、ターゲット領域が標的核酸に相補的な塩基配列を有するように構成することが好ましい。標的物質が抗原等のタンパク質の場合は、抗体等の標的物質と特異的に結合する物質を直接又は間接的に結合させることが好ましい。なお、図２では、アシストプローブ１２ａを標的物質２０に直接結合させた例を示したが、アシストプローブ１２ａと標的物質２０を他の核酸プローブ等を介して間接的に結合させてもよい。
ターゲット領域（領域Ｔ）は、アシストプローブの端部に位置することが好ましい。なお、図１では、３’末端にターゲット領域（領域Ｔ）を設けた例を示したが、５’末端にターゲット領域（領域Ｔ）を設けてもよい。【００３５】
図１記載の２組のダイマープローブ（符号１０ａ，１０ｂ）、アシストプローブ１２ａ、及び標的物質２０を反応させることにより、図３に示した如く、２組のダイマープローブ１０ａ，１０ｂから形成されたポリマー、アシストプローブ１２ａ及び標的物質２０を含む複合体からなるシグナルプローブポリマー３０が形成される。
本発明において、ダイマープローブ、アシストプローブ、及び標的物質は同時に反応させることもできるが、標的物質とアシストプローブを反応させた後、該反応物にダイマープローブを反応させることが好ましい。
本発明において、ダイマープローブの代わりに、ダイマープローブ形成前のダイマー形成用プローブを用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。【００３６】
形成されたシグナルプローブポリマー３０を検出することにより、標的物質２０を検出することができる。
シグナルプローブポリマーの検出方法は特に限定されないが、標識物質で標識したダイマープローブを用い、該標識物質を検出することによりシグナルプローブポリマーを検出することが好適である。標識物質としては、例えば、前記標識物質としては、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。また、形成されたシグナルプローブポリマーに、エチジウムブロマイド、Oligreen、SYBR Green I等のインターカレーターを結合させて、蛍光等により検出してもよい。【００３７】
図５は、図１記載の２組のダイマープローブと共に用いられるアシストプローブの第２の例を示す概略説明図であり、図６は、図５記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。図７は、図１記載の２組のダイマープローブと共に用いられるアシストプローブの第３の例を示す概略説明図であり、図８は、図７記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。図９は、図１記載の２組のダイマープローブと共に用いられるアシストプローブの第４の例を示す概略説明図であり、図１０は、図９記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。図１１は、図１記載の２組のダイマープローブと共に用いられるアシストプローブの第５の例を示す概略説明図であり、図１２は、図１１記載のアシストプローブにダイマープローブが結合した模式図である。【００３８】
本発明のアシストプローブは、ダイマープローブの一方のダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な１領域、該ダイマープローブの他方のダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な１領域、及び標的物質に結合可能なターゲット領域に加えて、用いるダイマープローブの一本鎖領域に相補的な領域を１以上更に含むことにより、１本のアシストプローブを２個以上のダイマープローブと結合させることができる。【００３９】
２個のダイマープローブと結合するアシストプローブの例を図５〜図１２に示す。図５〜図１２において、１２ｂ〜１２ｅはアシストプローブであり、図１記載のアシストプローブ１２ａに対してさらにダイマープローブの一本鎖領域（領域Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ａ’，Ｃ’，Ｄ’又はＦ’）に相補的な追加領域（領域Ａ’，Ｃ’，Ｄ’，Ｆ’，Ａ，Ｃ，Ｄ又はＦ）を１以上追加した構成、即ち、第１ダイマープローブ１０ａの一端部の２領域と相補的であり、該２領域と連続して結合可能な領域Ｆ’Ａ’並びに標的物質と結合可能なターゲット領域Ｔに加えて、追加領域を１以上有するように構成され、且つターゲット領域Ｔがアシストプローブの端部に位置するように構成されている。【００４０】
１本のアシストプローブと２個以上のダイマープローブとを結合させる場合、ダイマープローブの組み合わせは特に限定されない。例えば、図５〜図８に示した如く、１種のダイマープローブを２以上結合させてもよく、図９〜図１２に示した如く、異種のダイマープローブを組み合わせて結合させてもよい。なお、図５〜図１２は、ダイマープローブと結合する必須の２領域として、第１ダイマープローブ１０ａの一端の２領域（領域Ａ及びＦ）に相補的な２領域（領域Ｆ’Ａ’）を選択した例を示したが、本発明において、アシストプローブと結合させるダイマープローブは、使用するダイマープローブから適宜選択すればよく、特に制限されない。【００４１】
アシストプローブの追加領域の数及び種類は特に限定されず、例えば、図７及び図９に示した如く、アシストプローブの追加領域を１領域とし、図８及び図１０に示した如く、ダイマープローブの１領域と結合させてもよいが、図５及び図１１に示した如く、アシストプローブの追加領域をダイマープローブの一端の２領域と結合可能な２領域（例えば、領域Ｆ’Ａ’、領域Ｃ’Ｄ’、領域ＦＡ、領域ＣＤ）を１個以上含む２以上の領域とし、図６及び図１２に示した如く、ダイマープローブの一端の２領域と連続して結合させることが好ましい。【００４２】
本発明のアシストプローブは、図５及び図６に示した如く、ダイマープローブの一端の２領域に相補的な２領域（例えば、領域Ｆ’及び領域Ａ’）を交互に含むことが好ましい。該構成とすることにより、１本のアシストプローブは、同種のダイマープローブの同一端側の２領域と交互に連続して結合可能となり、標的物質を極めて高感度に検出することができる。ダイマープローブの一端の２領域に相補的な２領域を交互に含む配列において、最初及び最後の領域は該２領域のいずれも選択可能であるが、図５及び図６に示した如く、ダイマープローブの一端の２領域と連続して結合可能な領域（例えば、領域Ｆ’Ａ’、領域Ｃ’Ｄ’、領域ＦＡ、領域ＣＤ）を複数回含む構成とすることが好ましい。【００４３】
本発明の標的物質の検出方法は、標的物質を捕捉可能な物質を固定化させた担体を用いることが好ましい。例えば、標的物質が核酸の場合は、アシストプローブとの結合部位とは異なる部位に相補的な配列を有する核酸プローブを捕捉用プローブ（キャプチャープローブ）として用い、該捕捉用プローブを表面に固定化させた担体を用いることが好ましい。アシストプローブと捕捉用プローブが隣接する状態で標的核酸に結合するように構成することが好適である。
前記担体としては、例えば、蛍光微小粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。【００４４】
本発明において、ターゲット領域Ｔが異なる複数のアシストプローブを併用することにより、複数種の標的物質を同時に検出することが可能である。複数種の標的物質の同時検出において、ダイマープローブは同一のものが使用可能であり、アシストプローブ及び標的物質を捕捉する担体のみを複数種準備すればよく、作業性に優れ、低コストである。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。【００４６】
（実施例１）
ダイマープローブとして、図１記載の２種のダイマープローブを用いた。ダイマープローブの形成に用いられる核酸プローブとして、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する４種のオリゴヌクレオチドプローブ［第１ダイマー形成用プローブ−１，第２ダイマー形成用プローブ−１，第３ダイマー形成用プローブ−１，第４ダイマー形成用プローブ−１］を用いた。
第１ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-ABC-3'）
5'-DIG-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG-3'（配列番号１）
第２ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-DB'F-3'）
5'-DIG-GCACATTCACACCG CGACGCAGCCGAGG CCTGACCTCTATGC-3'（配列番号２）
第３ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-A'EC'-3'）
5'-DIG-GACCAGCAGAGATG GCAGCGACGGCACC CGTCTATGGCGAAC-3'（配列番号３）
第４ダイマー形成用プローブ−１の塩基配列（5'-D'E'F'-3'）
5'-DIG-CGGTGTGAATGTGC GGTGCCGTCGCTGC GCATAGAGGTCAGG-3'（配列番号４）【００４７】
前記第１ダイマー形成用プローブ−１及び第２ダイマー形成用プローブ−１を各５００ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶液［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］に溶解した後、該溶液を９４℃で１分加熱後、６０℃で２時間反応させ、第１ダイマープローブ溶液を調製した。
また、前記第３ダイマー形成用プローブ−１及び第４ダイマー形成用プローブ−１を各５００ｐｍｏｌ／ｍＬになるように溶液［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］に溶解した後、該溶液を９４℃で１分加熱後、６０℃で２時間反応させ、第２ダイマープローブ溶液を調製した。【００４８】
標的物質として、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のｒＲＮＡと同じ塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ターゲットオリゴＤＮＡ）を用いた。
ターゲットオリゴＤＮＡの塩基配列
5'-TTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGAT GGATCCGCGCTGCATTAGCTA-3'（配列番号５）【００４９】
アシストプローブとして、５’側から順に、前記第２ダイマー形成用プローブの３’側領域に相補的な領域、前記第２ダイマー形成用プローブの５’側領域に相補的な領域、及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−１、図１記載のアシストプローブ）を用いた。
アシストプローブ−１の塩基配列（5'-F'A'-T1-3'）
5'-GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号６）
アシストプローブ−１を２５ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］に溶解させ、アシストプローブ溶液を調製した。【００５０】
キャプチャープローブとして、前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な配列を有する核酸プローブを用いた。
キャプチャープローブの塩基配列
5’-CGTCTTTCACTTTTGAACCATGCGGTTCAAAATATTATCCGG-3’-Amino link（配列番号７）
前記キャプチャープローブを各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、実験に用いた。【００５１】
前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに各濃度のターゲットオリゴＤＮＡ（０．１，１又は１０ｆｍｏｌ／ｍＬ）を５０μＬ、アシストプローブ溶液を５０μＬずつ添加し、プレートシーラーでしっかりとシールし、マイクロプレートの上部２０℃、下部５５℃に設定した条件下で４５分間反応させた。反応後、洗浄液［50mM-Tris, 0.3M-NaCl, 0.01％-TritonX-100, pH7.6］で洗浄した。【００５２】
洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートに第１ダイマープローブ溶液を２５μＬ、第２ダイマープローブ溶液を２５μＬ、溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking
reagent（Roche製）］を５０μＬ添加し、プレートシーラーでしっかりとシールした。マイクロプレートの上部２０℃、下部５５℃に設定した条件下で３０分間反応させた後、洗浄液で洗浄した。【００５３】
マイクロプレートウェルを洗浄後、15mU/mLのALP標識抗ジゴキシゲニン(100mM Tris, pH 7.5)を１００μＬ加え、３７℃のインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄後、発光基質液（CDP-Star、TROPIX製）を１００μＬ加え、暗所で２０分反応後、ルミノメーター（Centro  LB960、Berthold製）で発光強度（RLU）を測定した。結果を表１に示す。【００５４】
（実施例２）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−２の塩基配列（5'-F'A'-F'A'-T1-3'）
5'-GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATG GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATGATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号８）【００５５】
（実施例３）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−３を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−３の塩基配列（5'-CD-F'A'-T1-3'）
5'-GTTCGCCATAGACG GCACATTCACACCG GCATAGAGGTCAGG GACCAGCAGAGATGATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号９）【００５６】
（実施例４）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−４を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−４の塩基配列（5'-A-C'D'-T1-3'）
5'-CATCTCTGCTGGTC CGTCTATGGCGAAC CGGTGTGAATGTGC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１０）【００５７】
（実施例５）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、下記塩基配列を有するアシストプローブ−５を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−５の塩基配列（5'-A'-C'D'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG CGTCTATGGCGAAC CGGTGTGAATGTGC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１１）【００５８】
（実験例１）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域と相補的な領域及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−６）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−６の塩基配列（5'-A'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１２）【００５９】
（実験例２）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第１ダイマー形成用プローブ−１全てと同じ塩基配列（即ち、第３ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域に相補的な領域、ダイマープローブと結合しない領域、及び第３ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域に相補的な領域からなる）及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−７）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−７の塩基配列（5'-ABC-T1-3'）
5'-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG GTTCGCCATAGACG ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１３）【００６０】
（実験例３）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１の代わりに、第３ダイマー形成用プローブ−１全てと同じ塩基配列（即ち、第１ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域に相補的な領域、ダイマープローブと結合しない領域、及び第１ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域に相補的な領域からなる）及び前記ターゲットオリゴＤＮＡに相補的な領域を有する核酸プローブ（アシストプローブ−８）を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−８の塩基配列（5'-A'EC'-T1-3'）
5'-GACCAGCAGAGATG GGTGCCGTCGCTGC CGTCTATGGCGAAC ATCTATAAGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１４）【００６１】
（実験例４）
ターゲットオリゴＤＮＡと相補的な配列を有するダイマープローブを用いて実験を行った。
第１ダイマー形成用プローブ−１の代わりに、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する第１ダイマー形成用プローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に第１ダイマープローブ溶液を調製した。
第１ダイマー形成用プローブ−２の塩基配列（5'-AB-T2-3'）
5'-DIG-CATCTCTGCTGGTC CCTCGGCTGCGTCG AGTGACAGCAAGAC-3'（配列番号１５）
第３ダイマー形成用プローブ−１の代わりに、５’末端をジゴキシゲニンで標識した下記塩基配列を有する第３ダイマー形成用プローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に第２ダイマープローブ溶液を調製した。
第３ダイマー形成用プローブ−２の塩基配列（5'-A'E-T2'-3'）
5'-DIG-GACCAGCAGAGATG GCAGCGACGGCACC GTCTTGCTGTCACT-3'（配列番号１６）【００６２】
アシストプローブ溶液の代わりに、アシストプローブを含まない溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］を用い、さらに、第１及び第２ダイマープローブ溶液を前述の如く変更した以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。【００６３】
（実験例５）
アシストプローブ溶液の代わりに、実験例４記載の第１ダイマー形成用プローブ−２を２５ｐｍｏｌ／ｍＬ含む溶液［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］を用い、さらに、第１及び第２ダイマープローブ溶液を実験例４と同様に変更した以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。【００６４】
【表１】
2009022682.tif 000010
【００６５】
表１に示した如く、本発明のアシストプローブを用いた実施例１〜５は、検出感度が著しく向上した。
【図１】
2009022682.tif 000014
【図２】
2009022682.tif 000015
【図３】
2009022682.tif 000016
【図４】
2009022682.tif 000017
【図５】
2009022682.tif 000018
【図６】
2009022682.tif 000019
【図７】
2009022682.tif 000020
【図８】
2009022682.tif 000021
【図９】
2009022682.tif 000022
【図１０】
2009022682.tif 000023
【図１１】
2009022682.tif 000024
【図１２】
2009022682.tif 000025
【図１３】
2009022682.tif 000026
【配列表】
2009022682000001.app
【国際調査報告】
2009022682.tif 000027
2009022682.tif 000028