【手続補正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項５】
Ａで示される脂質がリン脂質である請求項１〜４のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項７】
Ｙで示される光反応性化合物残基がアジド基、ジアゾ基およびジアジリン基からなる群から選択される光反応性基を有する光反応性化合物の残基である請求項１〜６のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項８】
Ｙで示される光反応性化合物残基が光反応性基としてアリールアジド基を有する光反応性化合物残基である請求項１〜７のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項９】
ＸとＹがエステル結合またはアミド結合によって結合している請求項１〜８のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１０】
ＸとＹがジスルフィド結合を有するスペーサー基を介して結合している請求項１〜８のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
〔１〕下記式で表される光反応性糖化合物。
Ａ−Ｘ−Ｙ
Ａ：脂質
Ｘ：糖化合物
Ｙ：光反応性化合物残基
−：共有結合
〔２〕Ｘで示される糖化合物がヒドロキシル基、アミノ基および／またはカルボキシル基を有する多糖またはオリゴ糖である〔１〕に記載の光反応性糖化合物。
〔３〕ヒドロキシル基、アミノ基および／またはカルボキシル基を有する多糖またはオリゴ糖がグリコサミノグリカンまたはそのオリゴ糖である〔２〕に記載の光反応性糖化合物。
〔４〕グリコサミノグリカンまたはそのオリゴ糖がヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸およびこれらのオリゴ糖からなる群から選択される〔３〕に記載の光反応性糖化合物。
〔５〕Ａで示される脂質がリン脂質である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
〔６〕リン脂質がホスファチジルエタノールアミンである〔５〕に記載の光反応性糖化合物。
〔７〕Ｙで示される光反応性化合物残基がアジド基、ジアゾ基およびジアジリン基からなる群から選択される光反応性基を有する光反応性化合物の残基である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
〔８〕Ｙで示される光反応性化合物残基が光反応性基としてアリールアジド基を有する光反応性化合物残基である〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
〔９〕ＸとＹがエステル結合またはアミド結合によって結合している〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
〔１０〕ＸとＹがジスルフィド結合を有するスペーサー基を介して結合している〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の光反応性糖化合物。
〔１１〕〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の光反応性糖化合物と標識化合物残基が結合した標識化光反応性糖化合物。
〔１２〕〔１１〕記載の標識化光反応性糖化合物を含む光反応性標識試薬。
〔１３〕〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の光反応性糖化合物を固着した固相と、糖受容体とを接触させて光反応性糖化合物と糖受容体を結合させ、次いで光を照射し、該光反応性糖化合物の光反応性化合物残基と該糖受容体を結合することによって該糖受容体を固相に捕捉することを特徴とする糖受容体の捕捉方法。
〔１４〕〔１１〕記載の標識化光反応性糖化合物を固着した固相と、糖受容体とを接触させて該標識化光反応性糖化合物と糖受容体を結合させ、次いで光を照射し、該標識化光反応性糖化合物の光反応性化合物残基と該糖受容体を光反応により結合させることによって該糖受容体を固相に捕捉すると共に標識化し、標識化された該受容体を固相に結合した状態または固相から遊離させた後に検出することを特徴とする糖受容体の測定方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の光反応性糖化合物において脂質結合糖化合物の糖部分と光反応性化合物残基とは、エステル結合またはアミド結合により結合していることが好ましい。その結合方法としては、糖部分のヒドロキシル基またはアミノ基に光反応性化合物の活性エステルを反応させる方法（活性エステル法）、糖部分にウロン酸が含まれる場合、該ウロン酸のカルボキシル基と光反応性化合物のアミノ基とをカルボジイミド類などの縮合剤により縮合させる方法、糖部分のウロン酸のカルボキシル基を活性エステル、酸アジドまたはカルボキシクロリドのような活性型とし、光反応性化合物のアミノ基と縮合させる方法、糖部分がＮ−アセチルヘキソサミンを含む場合、Ｎ−アセチルヘキソサミンにヒドラジンを作用させ、アセチル基を遊離させてアミノ基とし、前記活性エステル法もしくは縮合剤により縮合させる方法等が挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
光反応性糖化合物と標識化合物との結合方法は、あらかじめ光反応性試薬に標識化合物残基を結合させておく方法（Bioconjugate Techniques, pp.289-291 Academic Press, 1994）、糖残基あるいは光反応性化合物残基に蛍光物質を結合させる方法（Carbohydr. Res., 105, 69-85, 1982）、光反応性化合物中のヒドロキシフェニル（hydroxyphenyl）残基にラジオアイソトープ125Ｉを結合させる方法（Glycobiology, vol.7 no.1 pp.15-21, 1997）、糖残基に１２５Ｉを結合させる方法（Anal. Biochem., 139, 168-177, 1984）、光反応で結合させる蛋白質分子（糖受容体）をあらかじめ遺伝子工学的に蛍光蛋白質や発光蛋白質との融合蛋白質として調製しておく方法、あるいは化学的に蛍光蛋白質や発光蛋白質を結合させておく方法、などが挙げられる。また、糖化合物自体を標識化合物として扱うことも可能である。すなわち、糖化合物特異的に認識する特異抗体（ポリクローン抗体やモノクローン抗体）や糖結合分子（レクチンやヘパリン結合性サイトカイン、ヒアルロン酸結合性蛋白質など）を用いて光反応性糖化合物を認識する方法なども挙げられる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、光反応性糖化合物において、糖化合物と光反応性化合物とはジスルフィド結合を有するスペーサーを介して結合していることが好ましい。より具体的には、NH-(CH2)n-S-S-(CH2)m-CO-〔式中、n,mは１〜８の整数〕で示されるスペーサーを介し、該スペーサーのNH-が光反応性化合物に由来するCO-とアミド結合し、CO-が糖化合物に由来するOH-またはNH2-と結合していることが好ましい。ジスルフィド結合を有するスペーサーを導入することにより、光反応性糖化合物と糖受容体を親和性により結合させた後、ジチオスレイトール等のジスルフィド結合を開裂させる物質を作用させることにより、糖部分と結合した糖受容体を遊離させることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本明細書において「光反応性標識試薬」とは、糖受容体に親和性を有する光反応性糖化合物を含む標識試薬を意味するものとし、糖受容体とは糖化合物と親和性を有する、すなわち、糖化合物との特異的な相互作用により糖化合物に結合性示す蛋白質を意味し、具体的には糖化合物に特異的なレクチン、受容体、酵素、抗体などを包含する。
また、本発明の標識化光反応性糖化合物を用いて糖受容体を標識する方法は以下の通りである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
すなわち、本発明の標識化光反応性糖化合物をプラスチックプレート、プラスチックビーズおよび多孔性担体等の固相に固着し、種々の糖受容体を含む混合系と接触させることにより、糖受容体と糖化合物との特異的相互作用によって両者を結合させる。その結合反応と同時に又はその後に、光を照射し、光反応により、光反応性糖化合物の糖部分に特異的に相互作用する糖受容体のアミノ酸残基側鎖や末端アミノ基あるいは末端カルボキシル基と、該光反応性糖化合物の光反応性基とがラジカル反応で結合し、糖受容体を標識することができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
上記の方法により標識した糖受容体は、糖受容体に結合した標識化光反応性糖化合物を検出する自体公知の検出系、例えば、パーオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いた酵素免疫測定法（ELISA）様のビオチン検出系、標識ラジオアイソトープを検出するシンチレーションカウンターやガンマーカウンター、蛍光物質や発光物質を検出する蛍光検出機やルミノメーター、糖化合物に特異的に反応する抗体や糖結合分子を使ったELISA様の糖鎖検出系などによって高感度で検出することができる。また、標識した糖受容体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動などで分離し、ウエスタンブロッティングして、上記各種検出系により糖受容体を識別することが出来る。