【手続補正書】
【提出日】平成14年7月4日(2002.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】サイトカインＺＣＹＴＯ１８
【特許請求の範囲】
【請求項１】（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
から成る群からのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るサイトカインポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ここで細胞により生成される前記ポリペプチドが、ｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１９）を含んで成るポリペプチドのための受容体を発現する細胞の増殖を誘発し、又はＫ５６２細胞における細胞毒性を誘発することを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド１２３〜ヌクレオチド５５７のようなポリヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド５７〜ヌクレオチド５５７のようなポリヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１に示されるヌクレオチド２１〜ヌクレオチド５５７のようなヌクレオチド配列；及び
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に対して相補的なポリヌクレオチド配列の群からである請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】前記ポリヌクレオチドが、配列番号４のヌクレオチド１〜ヌクレオチド５０１を含んで成る請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】前記サイトカインポリペプチドが、
（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
の群からのアミノ酸残基の配列を含んで成る請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなサイトカインポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び
転写ターミネーター；
を含んで成り、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項６】前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、請求項５記載の発現ベクターを含んで成る培養細胞。
【請求項８】融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体であって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１（Ａｌａ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号４１（Ｔｈｒ）〜アミノ酸番号５３（Ｌｅｕ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸番号８０（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号９１（Ｖａｌ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列１０３（Ｇｌｎ）〜アミノ酸番号１１６（Ａｒｇ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸番号１４９（Ｉｌｅ）〜アミノ酸番号１６２（Ｌｅｕ）に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｆ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
の群からのアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；並びに
追加のポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメント；
を含んで成り、ここで、前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り枠を整合して連結され；そして前記第１及び他のＤＮＡゼグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ構造体。
【請求項９】次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
請求項８記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体；及び
転写ターミネーター；
を含んで成り、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】請求項９記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記ＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１１】融合タンパク質の生成方法であって、
請求項１０記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１２】（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
から成る群からのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたサイトカインポリペプチドであって、
ここで細胞により生成される前記ポリペプチドが、ｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１９）を含んで成るポリペプチドのための受容体を発現する細胞の増殖を誘発し、又はＫ５６２細胞における細胞毒性を誘発することを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項１３】前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；
の群からアミノ酸残基の配列を含んで成る請求項１２記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】サイトカインポリペプチドの生成方法であって、
請求項７記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項１５】ポリペプチドに対する抗体の生成方法であって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｇｌｙ）〜アミノ酸番号７７９（Ｔｈｒ）におけるアミノ酸の連続配列に対して少なくとも９０％同一である、３０〜１４４個のアミノ酸から成るポリペプチド；
（ｂ）請求項１３記載のポリペプチド；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸番号２９（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号３４（Ａｓｎ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸番号１２１（Ｈｉｓ）〜アミノ酸番号１２６（Ａｓｐ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸番号１３４（Ｇｌｎ）〜アミノ酸番号１３９（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｆ）配列番号３のアミノ酸番号１３７（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号１４２（Ｌｙｓ）のアミノ酸配列から成る２ポリペプチド；
（ｇ）配列番号３のアミノ酸番号１４５（Ｇｌｕ）〜アミノ酸番号１５０（Ｌｙｓ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｈ）配列番号３のアミノ酸番号４１（Ｔｈｒ）〜アミノ酸番号５３（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｉ）配列番号３のアミノ酸番号８０（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号９１（Ｖａｌ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｊ）配列番号３のアミノ酸番号１０３（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１１６（Ａｒｇ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｋ）配列番号３のアミノ酸番号１４９（Ｉｌｅ）〜アミノ酸番号１６２（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；
の群からのポリペプチドにより動物を接種し、ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために動物において免疫応答を誘発し；そして
前記動物から抗体を単離することを含んで成る方法。
【請求項１６】配列番号２又は３のポリペプチドに結合する、請求項１５記載の方法により生成される抗体。
【請求項１７】前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】請求項１３記載のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。
【請求項１９】試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８タンパク質活性のアンタゴニストの存在を検出するための方法であって、
ＺＣＹＴＯ１８−刺激された細胞経路に応答性である細胞を培養し；
請求項１４記載の方法によりポリペプチドを生成し；
試験サンプルの存在及び不在下で、前記細胞に前記ポリペプチドを暴露し；
生物学的又は生化学アッセイにより、前記試験サンプルの存在及び不在下でのポリペプチドの応答のレベルを比較し；そして
前記試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８活性のアンタゴニストの存在を、前記比較から決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２０】試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８タンパク質活性のアゴニストの存在を検出するための方法であって、
ＺＣＹＴＯ１８−刺激された細胞経路に応答性である細胞を培養し；
試験サンプルを添加し；
生物学的又は生化学アッセイにより、前記試験サンプルの存在及び不在下での応答のレベルを比較し；そして
前記試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８活性のアゴニストの存在を、前記比較から決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２１】患者における遺伝子異常性の検出方法であって、
患者から遺伝子サンプルを得；
前記遺伝子サンプルを、配列番号１の少なくとも１４個の連続ヌクレオチド又は配列番号１の補体を含んで成るポリヌクレオチドと共に、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートすることによって、第１反応生成物を生成し；
前記第１反応生成物を明視化し；そして
野生型患者からの対照反応生成物に、前記第１反応生成物を比較し；
ここで前記第１反応生成物と前記対照反応生成物との間の差異が患者における遺伝子異常性の表示であることを特徴とする方法。
【請求項２２】患者における癌の検出方法であって、
患者から組織又は生物学的サンプルを得；
前記組織又は生物学的サンプルを、請求項１８記載の抗体と共に、前記抗体が前記組織又は生物学的サンプルにおけるその相補的ポリペプチドに対して結合する条件下でインキュベートし；
前記組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体を明視化し；そして
正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体のレベルを比較し；
ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルに結合される抗体のレベルの上昇又は低下が患者における癌の表示であることを特徴とする方法。
【請求項２３】患者における癌の検出方法であって、
患者から組織又は生物学的サンプルを得；
配列番号１の少なくとも１４個の連続したヌクレオチド又は配列番号１の補体を含んで成るポリヌクレオチドをラベリングし；
それと共に、前記組織又は生物学的サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートし；
前記組織又は生物学的サンプルにおける前記ラベルされたポリヌクレオチドを明視化し；
正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのレベルを比較し；
ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルへのラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの上昇又は低下が患者における癌の表示であることを特徴とする方法。
【請求項２４】癌細胞の殺害方法であって、
患者から癌細胞を含む組織又は生成物学的サンプルをエクスビボで得るか、又は癌細胞をインビボで同定し；
請求項１４記載の方法によりポリペプチドを生成し；
前記ポリペプチドを、医薬的に許容できるビークルにおいて配合し；そして
前記患者に投与するか、又は前記ポリペプチドに対して前記癌細胞を暴露し、
ここで前記ポリペプチドが前記細胞を殺害する方法。
【請求項２５】前記ポリペプチドがさらに、毒素に接合される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】患者又は損傷された組織において血小板を高めるための方法であって、
請求項１４記載の方法によりポリペプチドを生成し；
医薬的に許容できるビークル中、前記ポリペプチドを、前記患者又は損傷された組織に投与し、ここで前記ポリペプチドが、前記患者又は損傷された組織における血小板のレベルを高める方法。
【請求項２７】患者における炎症の検出方法であって、
患者から組織又は生物学的サンプルを得；
前記組織又は生物学的サンプルを、請求項１８記載の抗体と共に、前記抗体が前記組織又は生物学的サンプルにおけるその相補的ポリペプチドに対して結合する条件下でインキュベートし；
前記組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体を明視化し；そして
正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体のレベルを比較し；ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルに結合される抗体のレベルの上昇が患者における炎症の表示であることを特徴とする方法。
【請求項２８】患者における炎症の検出方法であって、
患者から組織又は生物学的サンプルを得；
配列番号１の少なくとも１４個の連続したヌクレオチド又は配列番号１の補体を含んで成るポリヌクレオチドをラベリングし；
それと共に、前記組織又は生物学的サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートし；
前記組織又は生物学的サンプルにおける前記ラベルされたポリヌクレオチドを明視化し；
正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのレベルを比較し；ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルへのラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの上昇が患者における炎症の表示であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
ホルモン及びポリペプチド増殖因子は、多細胞生物の細胞の増殖及び分化を制御する。それらの拡散性分子は、細胞のお互いの連絡を可能し、そして細胞、及び器官の形成、そして損傷された組織の修復に関して作用する。ホルモン及び成長因子の例は、ステロイドホルモン（例えば、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）及びカルシトニンを包含する。
【０００２】
ホルモン及び成長因子は、受容体に結合することによって細胞代謝に影響を及ぼす。受容体は、細胞内のシグナル化経路、例えば第２メッセンジャーシステムに結合される内在性膜タンパク質であり得る。他の種類の受容体は、可溶性分子、例えば転写因子である。
【０００３】
サイトカインは一般的に、造血系の細胞の増殖又は分化を刺激し、又は身体の免疫及び炎症応答に関係している。造血に影響を及ぼすサイトカインの例は、赤血球細胞の成長を刺激するエリトロポエチン（ＥＰＯ）；巨核球系の細胞の成長を刺激するトロンボポエチン（ＴＰＯ）；及び好中球の成長を刺激する顆粒球−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。それらのサイトカインは、貧血、血小板減少症及び好中球減少症を有する患者における正常な血液細胞レベルの回復、又は癌のための化学療法の受容において有用である。
【０００４】
インターロイキンは、免疫学的応答、例えば炎症を仲介するサイトカインのファミリーである。インターロイキンは、広範囲の種類の炎症病理学を仲介する。免疫応答の中枢は、多くのサイトカイン及び抗原に対する適合できる免疫性を生成するＴ細胞である。Ｔ細胞により生成されるサイトカインは、タイプ１及びタイプ２として分類されて来た（Ｋｅｌｓｏ， Ａ． Ｉｍｍｕｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７６： ３００−３１７， １９９８）。
【０００５】
タイプ１サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＬＴ−αを包含し、そして炎症応答、ウィルス免疫性、細胞内寄生体免疫性及び同種移植拒絶に包含される。タイプ２サイトカインは、ＩＬ−４， ＩＬ−５， ＩＬ−６， ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を包含し、そして体液性応答、寄生虫免疫性及びアレルギー応答に関与する。タイプ１とタイプ２との間の共有されるサイトカインは、ＩＬ−３， ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを包含する。Ｔ細胞集団を生成するタイプ１及びタイプ２が異なった型の炎症組織中に選択的に移動することを示すある証拠が存在する。
【０００６】
成熟Ｔ細胞は、例えばサイトカイン、生化学的シグナル分子、又はＴ細胞集団の運命にさらに影響を及ぼす受容体を生成するために、抗原又は他の刺激物により活性化され得る。
Ｂ細胞は、補助細胞機能、例えばサイトカインの生成を行うために、それらの細胞表面上の受容体、例えばＢ細胞受容体及び他の補助分子を通して活性化され得る。
【０００７】
天然のキラー（ＮＫ）細胞は、Ｔ細胞及びＢ細胞と共に、共通する前駆体細胞を有し、そして免疫監視において役割を演じる。１５％までの血液リンパ球を含んで成るＮＫ細胞は、抗原受容体を発現せず、そして従って、標的細胞への結合のために、必要なら、ＭＨＣ認識を使用しない。インビボで、ＮＫ細胞は、活性化を必要とすると思われるが、しかしながら、インビトロで、ＮＫ細胞は、活性化を伴なわないで、いくつかのタイプの腫瘍細胞を殺害することが示されている。
【０００８】
サイトカインファミリーの例示されたインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの莫大な臨床学的可能性及びそれらの必要性を説明する。本発明は、造血細胞を包含する多くの細胞型を刺激し、そして炎症応答及び腫瘍細胞増殖に関係する新規サイトカイン、並びに関連する組成物及び方法を提供することにより、それらの必要性と取り組む。
【０００９】
発明の記載：
本発明は、本明細書における教授から当業者に明らかになるべきであるそれらの及び他の用途のためにそのようなポリペプチドを提供する。
１つの観点においては、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るサイトカインポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで細胞により生成される前記ポリペプチドが、ｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１９）を含んで成るポリペプチドのための受容体を発現する細胞の増殖を誘発し、又はＫ５６２細胞における細胞毒性を誘発することを特徴とする。
【００１０】
１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１のヌクレオチド１２３〜ヌクレオチド５５７に示されるようなポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５７〜ヌクレオチド５５７に示されるようなポリヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２１〜ヌクレオチド５５７に示されるようなヌクレオチド配列；及び（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に対して相補的なポリヌクレオチド配列から成る群から選択される。もう１つの態様においては、前記単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド１〜ヌクレオチド５０１を含んで成る。
【００１１】
もう１つの態様においては、前記単離されたポリヌクレオチは、（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸残基の配列から成る群から選択されたアミノ酸残基の配列を含んで成るサイトカインポリペプチドをコードする。
【００１２】
第２の観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなサイトカインポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供し、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする。１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る。
【００１３】
第３の観点においては、本発明は、上記に開示される発現ベクターを含んで成る培養される細胞提供し、ここで前記細胞は、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。
【００１４】
第４の観点においては、本発明は、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体を提供し、前記ＤＮＡ構造体は（ａ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１（Ａｌａ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号４１（Ｔｈｒ）〜アミノ酸番号５３（Ｌｅｕ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）配列番号３のアミノ酸番号８０（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号９１（Ｖａｌ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列１０３（Ｇｌｎ）〜アミノ酸番号１１６（Ａｒｇ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）配列番号３のアミノ酸番号１４９（Ｉｌｅ）〜アミノ酸番号１６２（Ｌｅｕ）に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び追加のポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントを含んで成り、ここで、前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り枠を整合して連結され；そして前記第１及び他のＤＮＡゼグメントが前記融合タンパク質をコードする。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；上記に開示されるような融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供し、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能的に連結されることを特徴とする。
【００１６】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成る培養された細胞を提供し、ここで前記ＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する。
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る、融合タンパク質の生成方法に関する。
【００１７】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたサイトカインポリペプチドを提供し、ここで細胞により生成される前記ポリペプチドが、ｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１９）を含んで成るポリペプチドのための受容体を発現する細胞の増殖を誘発し、又はＫ５６２細胞における細胞毒性を誘発することを特徴とする。
【００１８】
１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは、（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１６７（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１７９（Ｉｌｅ）に示されるようなアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸残基の配列を含んで成る。
１つの観点においては、本発明は、上記に開示される細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る、サイトカインポリペプチドの生成方法を提供する。
【００１９】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸番号２３（Ｇｌｙ）〜アミノ酸番号７７９（Ｔｈｒ）におけるアミノ酸の連続配列に対して少なくとも９０％同一である、３０〜１４４個のアミノ酸から成るポリペプチド；（ｂ）請求項１３記載のポリペプチド；（ｃ）配列番号３のアミノ酸番号２９（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号３４（Ａｓｎ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；（ｄ）配列番号３のアミノ酸番号１２１（Ｈｉｓ）〜アミノ酸番号１２６（Ａｓｐ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；（ｅ）配列番号３のアミノ酸番号１３４（Ｇｌｎ）〜アミノ酸番号１３９（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；（ｆ）配列番号３のアミノ酸番号１３７（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号１４２（Ｌｙｓ）のアミノ酸配列から成る２ポリペプチド；（ｇ）配列番号３のアミノ酸番号１４５（Ｇｌｕ）〜アミノ酸番号１５０（Ｌｙｓ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；（ｈ）アミノ酸番号４１（Ｔｈｒ）〜アミノ酸番号５３（Ｌｅｕ）の配列番号３のアミノ酸配列から成るポリペプチド；（ｉ）配列番号３のアミノ酸番号８０（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号９１（Ｖａｌ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；（ｊ）配列番号３のアミノ酸番号１０３（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号１１６（Ａｒｇ）のアミノ酸配列から成るポリペプチド；（ｋ）配列番号３のアミノ酸番号１４９（Ｉｌｅ）〜アミノ酸番号１６２（Ｌｅｕ）のアミノ酸配列から成るポリペプチドの群から選択されたポリペプチドにより動物を接種し、ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために動物において免疫応答を誘発し；そして前記動物から抗体を単離することを含んで成る、ポリペプチドに対する抗体の生成方法を提供する。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２又は３のポリペプチドに結合する、上記に開示される方法により生成される抗体を提供する。１つの態様においては、前記抗体は、モノクローナル抗体である。もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。
【００２１】
もう１つの観点においては、本発明は、ＺＣＹＴＯ１８−刺激された細胞経路に応答性である細胞を培養し；上記に開示される方法によりポリペプチドを生成し；試験サンプルの存在及び不在下で、前記細胞に前記ポリペプチドを暴露し；生物学的又は生化学アッセイにより、前記試験サンプルの存在及び不在下でのポリペプチドの応答のレベルを比較し；そして前記試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８活性のアンタゴニストの存在を、前記比較から決定することを含んで成る、試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８タンパク質活性のアンタゴニストの存在を検出するための方法を提供する。
【００２２】
もう１つの観点においては、本発明は、ＺＣＹＴＯ１８−刺激された細胞経路に応答性である細胞を培養し；試験サンプルを添加し；生物学的又は生化学アッセイにより、前記試験サンプルの存在及び不在下での応答のレベルを比較し；そして前記試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８活性のアゴニストの存在を、前記比較から決定することを含んで成る、試験サンプルにおけるＺＣＹＴＯ１８タンパク質活性のアゴニストの存在を検出するための方法を提供する。
【００２３】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から遺伝子サンプルを得；前記遺伝子サンプルを、配列番号１の少なくとも１４個の連続ヌクレオチド又は配列番号１の補体を含んで成るポリヌクレオチドと共に、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートすることによって、第１反応生成物を生成し；前記第１反応生成物を明視化し；そして野生型患者からの対照反応生成物に、前記第１反応生成物を比較し、ここで前記第１反応生成物と前記対照反応生成物との間の差異が患者における遺伝子異常性の表示であることを特徴とする、患者における遺伝子異常性の検出方法を提供する。
【００２４】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から組織又は生物学的サンプルを得；前記組織又は生物学的サンプルを、上記に開示される抗体と共に、前記抗体が前記組織又は生物学的サンプルにおけるその相補的ポリペプチドに対して結合する条件下でインキュベートし；前記組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体を明視化し；そして正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体のレベルを比較し、ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルに結合される抗体のレベルの上昇又は低下が患者における癌の表示であることを特徴とする、患者における癌の検出方法を提供する。
【００２５】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から組織又は生物学的サンプルを得；配列番号１の少なくとも１４個の連続したヌクレオチド又は配列番号１の補体を含んで成るポリヌクレオチドをラベリングし；それと共に、前記組織又は生物学的サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートし；前記組織又は生物学的サンプルにおける前記ラベルされたポリヌクレオチドを明視化し；正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのレベルを比較し、ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルへのラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの上昇又は低下が患者における癌の表示であることを特徴とする、患者における癌の検出方法を提供する。
【００２６】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から癌細胞を含む組織又は生成物学的サンプルをエクスビボで得るか、又は癌細胞をインビボで同定し；上記に開示される方法によりポリペプチドを生成し；前記ポリペプチドを、医薬的に許容できるビークルにおいて配合し；そして前記患者に投与するか、又は前記ポリペプチドに対して前記癌細胞を暴露し、ここで前記ポリペプチドが前記細胞を殺害する、癌細胞の殺害方法を提供する。１つの胎教においては、前記ポリペプチドはさらに、毒素に接合される。
【００２７】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示される方法によりポリペプチドを生成し；医薬的に許容できるビークル中、前記ポリペプチドを、前記患者又は損傷された組織に投与し、ここで前記ポリペプチドが、前記患者又は損傷された組織における血小板のレベルを高める、患者又は損傷された組織において血小板を高めるための方法を提供する。
【００２８】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から組織又は生物学的サンプルを得；前記組織又は生物学的サンプルを、上記に開示される抗体と共に、前記抗体が前記組織又は生物学的サンプルにおけるその相補的ポリペプチドに対して結合する条件下でインキュベートし；前記組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体を明視化し；そして正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおいて結合される抗体のレベルを比較し、ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルに結合される抗体のレベルの上昇が患者における炎症の表示であることを特徴とする、患者における炎症の検出方法を提供する。
【００２９】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から組織又は生物学的サンプルを得；配列番号１の少なくとも１４個の連続したヌクレオチド又は配列番号１の補体を含んで成るポリヌクレオチドをラベリングし；それと共に、前記組織又は生物学的サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートし；前記組織又は生物学的サンプルにおける前記ラベルされたポリヌクレオチドを明視化し；正常な対照組織又は生物学的サンプルに、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのレベルを比較し、ここで前記正常な対照組織又は生物学的サンプルに対する、前記患者組織又は生物学的サンプルへのラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの上昇が患者における炎症の表示であることを特徴、患者における炎症の検出方法を提供する。
【００３０】
本発明のそれらの及び他の観点が、本発明の次の特定の記載に基づいて明確に成るであろう。
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる：
【００３１】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【００３２】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）， 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。親和性標識をコードするＤＮＡは、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈｅｖｅｎ， ＣＴ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から入手できる。
【００３３】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００３４】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００３５】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプタビジン）は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０９Ｍ−１の結合親和性を有する。
【００３６】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に対して相補的である。
用語“コンチグ（ｃｏｎｔｉｇ ）”とは、他のポリヌクレオチドに対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有するポリヌクレオチドを示す。連続した配列とは、ポリヌクレオチドの全体において、又はその一部に沿って、一定の長さのポリヌクレオチド配列を“オーバーラップ”すると言われる。
【００３７】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００３８】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状ＤＮＡ分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００３９】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノム  クローンを含む分子である。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する５’及び３’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６： ７７４―７８， １９８５を参照のこと）。
【００４０】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００４１】
“作用可能に連結された”とは、ＤＮＡセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（ｐａｒａｌｏｇｓ）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００４２】
“ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略語“ｂｐ”）、ヌクレオチド（“ｎｔ”）、又はキロ塩基（“ｋｂ”）として表される。
【００４３】
ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。
【００４４】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
【００４５】
“プローブ及び／又はプライマー”とは、本明細書において使用される場合、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。ＤＮＡはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかであり得る。ポリヌクレオチドプローブ及びプレイマーは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、一般的に合成オリゴヌクレオチドであるが、しかしクローン化されたｃＤＮＡ又はゲノム配列又はその補体から生成され得る。分析用プローブは一般的に、少なくとも２０個の長さのヌクレオチドであるが、但し幾分短いプローブ（１４〜１７個のヌクレオチド）が使用され得る。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５個の長さのヌクレオチド、好ましくは１５又はそれ以上のｎｔ、よりも好ましくは２０〜３０のｎｔである。
【００４６】
短いポリヌクレオチドは、遺伝子の小さな領域が分析のために標的化される場合に使用され得る。遺伝子の全体的な分析のためには、ポリヌクレオチドは、全エキソン又はそれ以上を含んで成る。プローブは、検出できるシグナルを供給するために、当業界において良く知られている技法を用いて多くの源、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬから市販されている、酵素、放射性核種、蛍光団、化学ルミネセンス、常磁性粒子及び同様のものによりラベルされ得る。
【００４７】
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡ ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【００４８】
用語“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００４９】
用語“受容体”は、生物活性分子（すなわち“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づけられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。
【００５０】
受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、ＡＭＰ生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体）、又はマルチマー（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ―ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポイエチン受容体及びＩＬ―６受容体）であり得る。
【００５１】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００５２】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００５３】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
【００５４】
本発明は、４−ヘリカル―束のサイトカインの構造を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ配列の発現に一部、基づかれている。クローニングの工程及び本明細書に記載される発現研究を通して、新規リガンドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が同定されて来た。ＺＣＹＴＯ１８と称するこのポリペプチドリガンドは、Ｔ−細胞ｃＤＮＡ及び混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）ｃＤＮＡから単離され、そしてＣＤ３のために選択された、活性化されたヒト末梢血液細胞（ｈＰＢＣ）において発現される。ＣＤ３はリンパ起原の細胞、特にＴ細胞に対してユニークである細胞表面マーカーである。ノザン及びＲＴ―ＰＣＲ分析に基づけば、ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドは、Ｔ−細胞、活性化されたＴ−及びＢ−細胞、及びリンパ組織において発現される。ヒトＺＣＹＴＯ１８ヌクレオチド配列は、配列番号１として表される。
【００５５】
配列番号１の分析は、それから翻訳されるＺＣＹＴＯ１８サイトカインポリペプチドのための２個の可能な開始メチオニン残基が存在することを示す。それらの２個の推定されるＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドアミノ酸配列は、配列番号２（配列番号１におけるヌクレオチド２１で開始Ｍｅｔを有する１７９個のアミノ酸のポリペプチド）及び配列番号３（配列番号１におけるヌクレオチド５７で開始Ｍｅｔを有する１６７個のアミノ酸のポリペプチド）で示される。それらの両配列はＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードするが、ＩＬ−１０及び他のサイトカインに対するＺＣＹＴＯ１８配列の類似性及び強いシグナル配列の存在に基づけば、配列番号３は、十分に官能的な分泌されるサイトカインポリペプチドをコードする。
【００５６】
配列番号３で表されるような推定されるアミノ酸配列の配列分析は、２２個のアミノ酸残基の分泌シグナル配列（配列番号３のアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２１（Ａｌａ））を含む１６７個のアミノ酸のポリヌクレオチド、及び１４６個のアミノ酸（配列番号３のアミノ酸残基２２（Ａｌａ）〜１６７（Ｉｌｅ））の成熟ポリペプチドを示し、Ｎ−末端配列は、成熟が配列番号３の残基２２（Ａｌａ）又は配列番号２の３４（Ａｌａ）で開始することを示す。
【００５７】
一般的に、４−αヘリックス構造を有することが予測され、ここで第１及び第４のヘリックスがリガンド−受容体相互作用において最も重要である。前記第１及び第４のヘリックスは、そのファミリーのメンバー間でより高く保存される。配列番号３に示されるヒトＺＣＹＴＯ１８アミノ酸配列に関しては、ヒトＺＣＹＴＯ１８、ヒトＩＬ−１０， ヒトｚｃｙｔｏ１０（ＷＯ ＵＳ９８／２５２２８号）及びヒトＭＤＡ７（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ１３００７）アミノ酸配列の一列整列は、配列番号３において示されるように、ＺＣＹＴＯ１８ヘリックスＡはアミノ酸残基４１（Ｔｈｒ）−５３（Ｌｅｕ）により定義され；ヘリックスＢはアミノ酸残基８０（Ｍｅｔ）−９１（Ｖａｌ）により定義され；ヘリックスＣはアミノ酸残基１０３（Ｍｅｔ）−１１６（Ａｒｇ）により定義され；そしてヘリックスＤはアミノ酸残基１４９（Ｉｌｅ）−１６２（Ｌｅｕ）により定義されることを示す。
【００５８】
構造分析は、Ａ／Ｂループが長く、Ｂ／Ｃループが短く、そしてＣ／Ｄループが長いことを示す。このループ構造は、アップ−アップ−ダウン−ダウンヘリカル構成をもたらす。４個のシステイン残基が、ＩＬ−１０と配列番号３のアミノ酸残基８，２８，７７及び１２０に対応するＺＣＹＴＯ１８との間に保存される。一致したシステイン配置は、４−ヘリカル−束構造のさらなる確認である。
【００５９】
本明細書に記載されるＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコードするその対応するポリヌクレオチドは、配列番号１に示される通りである。さらに、本明細書に記載される、その対応するＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列はまた、配列番号２に示される通りである。
【００６０】
４−ヘリカル束サイトカインはまた、それらの成分ヘリックスの長さにより分類される。“長い−ヘリックス”形のサイトカインは一般的に、２４〜３０個の残基のヘリックスから成り、そしてＩＬ−６、繊毛好中球因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を包含する。“短い−ヘリックス”形のサイトカインは一般的に、１８〜２１個の残基のヘリックスから成り、そしてＩＬ−２， ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを包含する。ＺＣＹＴＯ１８は、短い−ヘリックス形のサイトカイングループの新規メンバーであると思われる。ＣＮＴＦ及びＩＬ−６を用いての研究は、ＣＮＴＦヘリックスがＩＬ−６における相当のヘリックスにより交換され得、キメラにＣＴＮＦ−結合性質を付与することを示した。
【００６１】
従って、４−ヘリカルサイトカインの機能的ドメインが配列同一性に関係なく、構造的相同性に基づいて決定され、そしてキメラにおいて機能的に組み込みを維持することができると思われる（Ｋａｌｌｅｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： １１８５９−１１８６７， １９９９）。類似する方法を用いれば、ＺＣＹＴＯ１８における受容体結合特異性を付与する推定上の領域は、残基５３−６０、残基８５−９１、残基１２１−１４０を包含する、配列番号３のアミノ酸残基の領域を含んで成る。それらの領域は、特に、受容体結合特異性を決定し、そして調整するために、他の短−ヘリックス形サイトカインを有するキメラ分子を調製するために有用であろう。
【００６２】
出願に続いて、ＺＣＹＴＯ１８は、ＩＬ−ＴＩＦとして文献において注釈されている。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１６（配列番号３２及び配列番号３３）、ｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１８及び配列番号１９）（所有されているアメリカ特許第５，９６５，７０４号）及びＣＲＦ２−４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１７２２７号）を含んで成るＺＣＹＴＯ１８のための受容体が同定されている。さらに、いくつかのＺＣＹＴＯ１８応答性細胞系（Ｄｕｍｏｎｔｉｅｒなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４： １８１４−１８１９， ２０００； Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ， Ｌ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７： １０１４４−１０１４９， ２０００； Ｘｉｅ ＭＨなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ３１３３５−３１３３９， ２０００； Ｋｏｔｅｎｋｏ ＳＶなど．， ＪＢＣ ｉｎ Ｐｒｅｓｓ）、及びＺＣＹＴＯ１８受容体サブユニットｚｃｙｔｏｒ１１を発現するそれらの細胞系は同定されている。
【００６３】
さらに、所有されるｚｃｙｔｏｒ１６受容体は、ＺＣＹＴＯ１８を結合し、そしてその活性を弱めることが示されており（配列番号３）；マウスＩＬ−ＴＩＦ（ＺＣＹＴＯ１８）配列は、Ｄｕｍｏｎｔｉｅｒなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：１８１４−１８１９， ２０００に示されており、そして独立してクローン化され、そこにおいてマウスＺＣＹＴＯ１８として命名され、そして配列番号３７で示され、そして対応するペプチド配列が配列番号３８で示される。
【００６４】
さらに、所有されるｚｃｙｔｏｒ１１（アメリカ特許第５，９６５，７０４号）及びＣＲＦ２−４受容体はまた、ＺＣＹＴＯ１８を結合する（ＷＩＰＯ公開ＷＯ００／２４７５８号；Ｄｕｍｏｎｔｉｅｒなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４； １８１４−１８１９， ２０００； Ｓｐｅｎｃｅｒ， ＳＤなど．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７： ５７１−５７８， １９９８； Ｇｉｂｂｓ， ＶＣ ａｎｄ Ｐｅｎｎｉｃａ Ｇｅｎｅ １８６； ９７−１０１， １９９７ （ＣＲＦ２−４ ｃＤＮＡ）； Ｘｉｅ， ＭＨなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５； ３１３３５−３１３３９， ２０００； 及びＫｏｔｅｎｋｏ， ＳＶなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｐｒｅｓｓ Ｍ００７８３７２００を参照のこと）。さらに、ＩＬ−１０β受容体は、ＺＣＹＴＯ１８のための受容体として包含され得、そしてＣＲＦ２−４と同じ意味を有すると思われる（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ， Ｌ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７： １０１４４−１０１４９， ２０００； Ｌｉｕ Ｙ． など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： １８２１−１８２９， １９９４ （ＩＬ−１０Ｒ ｃＤＮＡ））。それらの受容体は、ＺＣＹＴＯ１８に関して、本明細書において論じられる。
【００６５】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号４は、配列番号３のＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。当業者はまた、配列番号４の変性配列がＵとＴとを置換することによって、それぞれ、配列番号３をコードするすべてのＲＮＡ配列も供給することを理解するであろう。
【００６６】
従って、配列番号４のヌクレオチド１又は６６−５０１及びそれらのＲＮＡ相当物は、本発明により包含される。第１表は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号４内に使用される１文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードＹはＣ又はＴのいずれかを示し、そしてその補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、そしてＧはＣに対して相補的である。
【００６７】
【表１】
2003524415.tif 000001
与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号４に使用される縮重コドンが第２表に示される。
【００６８】
【表２】
2003524415.tif 000002
【００６９】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（ＡＧＲ）をコードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（ＡＧＹ）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号３のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【００７０】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。一般的には、Ｇｒａｎｔｈａｍ，など．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８： １８９３−９１２， １９８０； Ｈａａｓ， など．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６： ３１５−２４， １９９６；  Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、など．，Ｇｅｎｅ  １３：３５５−６４，１９８１；Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒａ，Ｇｅｎｅ  １８：１９９−２０９、１９８２；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３０７５−８７、１９８６；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３−９７，１９８２を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である（第２表を参照のこと）。
【００７１】
例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったＴｈｒコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。
【００７２】
例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号４に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【００７３】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、ＲＮＡは、多量のＺＣＹＴＯ１８ ＲＮＡを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５２０１， １９８０）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、又は標的細胞又は組織上の活性についての種々の細胞型からのならし培地のスクリーニングにより同定される。
【００７４】
前記活性、又はＲＮＡ生成細胞又は組織が同定されると、全ＲＮＡは、グアニジウム  ＨＣｌ抽出、続くＣｓＣｌグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２−９４， １９７９）。ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡは、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９： １４０８−１４１２， １９７２ ）の方法を用いて全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いて、ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡから調製される。他方では、ゲノムＤＮＡが単離され得る。次に、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
【００７５】
ＺＣＹＴＯ１８をコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようｃＤＮＡクローンを修飾することが好ましい。ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、ＺＣＹＴＯ１８フラグメントに対する抗体、受容体フラグメント、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
【００７６】
本明細書に開示されるＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチド配列はまた、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子の５’非コード領域をクローン化するためにプローブ又はプライマーとしても使用され得る。ノザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲによるＺＣＹＴＯ１８について観察される組織−特異的発現の観点においては（例２及び３を参照のこと）、この遺伝子領域は、造血−及びリンパ球−特異的発現を提供することが予測される。従ってＺＣＹＴＯ１８遺伝子からのプロモーター要素は、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子療法により処理された動物における異種遺伝子の組織−特異的発現を方向づけるために使用され得る。５’側フランキング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第５，６４１，６７０号に開示されるように、“遺伝子活性化”によるＺＣＹＴＯ１８タンパク質の生成を促進する。
【００７７】
手短に言及すれば、細胞における内因性ＺＣＹＴＯ１８遺伝子の発現が、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子中に、少なくとも１つの標的化配列、調節配列、エキソン、及びスプライスドナー部位を含んで成るＤＮＡ構造体を導入することによって変更される。前記標的化配列は、内因性ＺＣＹＴＯ１８遺伝子座による前記構造体の相同組換えを可能にし、それにより、前記構造体内の配列が内因性ＺＣＹＴＯ１８コード配列と操作可能的に連結されるようになる、ｚａｌｐｈａ１１リガンド５’非コード配列である。この場合、内因性ＺＣＹＴＯ１８プロモーターが、増強された組織−特異的又は他方では、調節された発現を提供するために、他の調節配列により置換され得るか又はそれにより補充され得る。
【００７８】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドである。ヒトＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。
【００７９】
例えば、ｃＤＮＡは、ＺＣＹＴＯ１８を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン  ブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。次に、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドコードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。
【００８０】
ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なヒトＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ， アメリカ特許第４，６８３，２０２号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム  クローンの単離に適用され得る。例５は、ＺＣＹＴＯ１８オルト体がマウスゲノムＤＮＡに存在することを示す。
【００８１】
ヒトＺＣＹＴＯ１８のマウスオルト体についてのポリヌクレオチド配列は、同定されており、そして配列番号３７で示されており、そしてその対応するアミノ酸配列は、配列番号３８で示される。配列番号３７のＤＮＡ配列によりコードされるマウスＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの分析は、３３個のアミノ酸残基（配列番号３８の残基１（Ｍｅｔ）〜残基３３（Ａｌａ））の推定される分泌シグナルペプチド及び１４６個のアミノ酸（配列番号３８の残基３４（Ｌｅｕ）〜残基１７９（ｖａｌ））の成熟ポリペプチドを含んで成る１７９個のアミノ酸をコードする読み取り枠を示した。
【００８２】
ＺＣＹＴＯ１８ヘリックスルＡは、配列番号３８のアミノ酸残基５３〜６５により定義され；ヘリックスＢは配列番号３８のアミノ酸残基９２〜１０３により定義され；ヘリックスＣは配列番号３８のアミノ酸残基１１５〜１２４により定義され；そしてヘリックスＤは配列番号３８のアミノ酸残基１６１〜１７４により定義される。マウスＺＣＹＴＯ１８における４個の保存されたシステイン残基は、配列番号３８のアミノ酸残基２０， ４０， ８９及び１３２に対応するヒト配列により保存される。さらに、マウス配列においては、他の出発メチオニン残基が、配列番号３８に示されるような位置８及び１３で存在するが、しかし残基３３（Ａｌａ）の後のシグナルペプチド切断が上記のように１４６個のアミノ酸成熟配列をもたらす。
【００８３】
マウスＺＣＹＴＯ１８についての成熟配列は、ヒト配列におけるＡｌａ２２（配列番号３に示されるような）に対応する、Ｌｅｕ３４（配列番号３８に示されるような）で開始する。配列番号３及び配列番号３８に対応する全アミノ酸配列にわたって、マウス及びヒト配列間に約７８％の同一性が存在する。上記の％同一性は、Ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開放ペナルティー＝１２、ギャップ延長ペナルティー＝２及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、並びにデフォールとして設定される他のＦＡＳＴＡパラメーターを有するＦＡＳＴＡプログラムを用いて決定された。上記に記載されるマウスＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコードする、その対応するポリヌクレオチドは、配列番号３７に示される通りである。
【００８４】
当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトＺＣＹＴＯ１８の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号１に示されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号３の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
【００８５】
ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００８６】
さらに、ＺＣＹＴＯ１８のゲノム構造は、配列番号１のｃＤＮＡ配列、及び配列番号３又は２の翻訳されたアミノ酸と、前記遺伝子が含まれるゲノムＤＮＡ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００７４５８号）とを比較することによって、当業者により容易に決定される。例えば、そのような分析は、本明細書に記載されるように、ＦＡＳＴＡを用いて容易に行われ得る。ゲノムＤＮＡの領域におけるイントロン及びエキソン連結が、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子のために決定され得る。従って、本発明は、ヒトゲノムＤＮＡに位置するようなＺＣＹＴＯ１８遺伝子を包含する。ＺＣＹＴＯ１８ゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００７４５８号）の一部を含むヒトゲノムＤＮＡのフラグメントの注釈に基づけば、ＺＣＹＴＯ１８は、染色体１２の１２ｑ１５領域に位置する。
【００８７】
本発明の好ましい態様においては、単離されたＺＣＹＴＯ１８−コードの核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、配列番号１のヌクレオチド８７〜５８７のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又は配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズすることができる。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。
【００８８】
１対の核酸分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ， ＲＮＡ−ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡは、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリッドのＴｍは、１〜１．５％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。
【００８９】
緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５〜２５℃低い温度、及び１ＭまでのＮａ＋を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドについて約１℃、ハイブリッドのＴｍを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。一般的に、そのような緊縮条件は、２０〜７０℃の温度、及び６×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。高い程度の緊縮性は、４０〜７０℃の温度で及び４×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。
【００９０】
高い緊縮条件は典型的には、４２〜７０℃の温度、及び１×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
【００９１】
上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペプチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのＴｍは、標的配列の５０％が完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下での）である。Ｔｍに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【００９２】
Ｔｍを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ など．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （ｅｄｓ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； 及びＷｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：２２７ （１９９０）を参照のこと）。
【００９３】
配列分析ソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ６．０（ＬＳＲ； Ｌｏｎｇ Ｌａｋｅ， ＭＮ）及びＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ４．０ （Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， 並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてＴｍを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、５０以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で行われる。５０以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Ｔｍ又はそれよりも５〜１０℃以下で行われる。これは、ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
【００９４】
ヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を及ぼす。小さなプローブ配列、すなわち５０個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベーション時間（およそ分〜時）が、ハイブリッド形成を達成するために使用され得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度でさえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコット時間の３倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により、特定の配列について計算され得る。
【００９５】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成が、ハイブリッド複合体の熱安定性をもたらし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。Ａ−Ｔ対は、塩化ナトリウムを含む水溶液においてＧ−Ｃ対よりも低い安定性である。従って、Ｇ−Ｃ含有率が高いほど、ハイブリッドはより安定する。配列内のＧ及びＣ残基の平等な分布がまた、ハイブリッド安定性に正に寄与する。さらに、塩基対組成は、所定の配列のＴｍを変えるために操作され得る。例えば５−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンはＴｍを高めるためにチミジンにより置換され、そして７−デアズ−２’−デオキシグアノシンは、Ｔｍに対する依存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
【００９６】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度はまた、ハイブッリドの安定性に影響お及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例えばＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、変性されたサケ精子ＤＮＡ、粉乳（ＢＬＯＴＴＯ）、ヘパリン又はＳＤＳ、及びＮａ＋源、例えばＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５：ＮのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）又はＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ：１．８ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）を含む。緩衝液のイオン濃度を低めることによって、ハイブッリドの安定性が高められる。
【００９７】
典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、１０ｍＭ〜１ＭのＮａ＋を含む。不安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液への添加が、ハイブリッドのＴｍを変更するであろう。典型的には、ホルムアミドが、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために、５０％までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、ＲＮＡプローブを用いる場合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
【００９８】
例示のように、変異体ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子により、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ；０．１５Ｍの塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液：２％（ｗ／ｖ）のＦｉｃｏｌｌ ４００， ２％ （ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン及び２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン）、１０％の硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌの変性され、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液において、４２℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【００９９】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動性を考慮することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高度で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液が入手でき（例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． からのＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ），そしてハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１００】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５５〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液、例えば５５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるＳＳＣをＳＳＰＥにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【０１０１】
典型的な高い緊縮洗浄条件は、５０〜６５℃での０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．１×〜０．２×ＳＳＣの溶液による洗浄を包含する。換言すれば、変異体ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５０〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液、例えば５０℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ溶液に等しい。
【０１０２】
本発明はまた、配列番号３のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号３で示される配列又はそれらのオルト体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【０１０３】
本発明はまた、配列番号３のアミノ酸残基１−１６７又は２３−１６７の配列、又は配列番号２のアミノ酸残基１−１７９又は３５−１７９の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドも包含する。本発明はさらに、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子も包含する。％同一性を決定するための方法は、下記に記載される。
【０１０４】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得る変異体ＺＣＹＴＯ１８核酸分子を企画する：上記記載のような、配列番号３のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなＺＣＹＴＯ１８変異体は、（１）５５〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【０１０５】
他方では、ＺＣＹＴＯ１８変異体は、（１）５０〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１０６】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び第３表（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ｂｌｏｓｕｍ ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【０１０７】
【数１】
2003524415.tif 000003
【０１０８】
【表３】
2003524415.tif 000004
【０１０９】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体ＺＣＹＴＯ１８のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【０１１０】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号３）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【０１１１】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。
【０１１２】
ＦＡＳＴＡ 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【０１１３】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは４〜６であり得る。
【０１１４】
変異体ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド及び実質的に類似する配列同一性は、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（第４表を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【０１１５】
従って、本発明は、配列番号３のその対応する領域に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは９５％又はそれ以上の同一性を有する配列を含んでなる、約１１０〜１８０個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Ｘａ因子分解部位を含む。
【０１１６】
【表４】
2003524415.tif 000005
【０１１７】
構造統合性の維持に対して決定的である領域又はドメインを含んで成るアミノ酸残基の決定が行われ得る。それらの領域内で、多かれ少なかれ、変化に耐性であり、そして分子の全体的な三次構造を維持するであろう特定の残基を決定することができる。配列構造を分析するための方法は、高いアミノ酸又はヌクレオチド同一性を有する複数配列の一列整列、二次構造性質、二元パターン、相補的パッケージング及び埋もれた極性相互作用を包含するが、但しそれらだけには限定されない（Ｂａｒｔｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：３７２−３７６， １９９５及びＣｏｒｄｅｓなど．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６： ３−１０， １９９６）。一般的に、分子への修飾を企画するか又は特定のフラグメントを同定する場合、構造の決定は、修飾された分子の活性を評価することによって付随されるであろう。
【０１１８】
アミノ酸配列の変更が、生物学的活性に対して必須である高次構造体の破壊を最少にするためにＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドにおいて行われる。例えば、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドが１又は複数のヘリックスを含む場合、アミノ酸残基の変更が、分子のヘリックス幾何学的及び他の成分を破壊しないよう行われ、ここでコンホメーションの変化が、いくらかの決定的な機能、例えば活性部位、又は分子の、その結合パートナーへの結合を妨害する。アミノ酸配列の変更の効果は、例えば上記に開示されるようなコンピューターモデルにより予測され得、又は結晶構造の分析により決定され得る（例えば、Ｌａｐｔｈｏｒｎなど．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ２６６−２６８， １９９５）。
【０１１９】
当業界において良く知られている他の技法は、標準の分子（例えば、生来のタンパク質）と変異体タンパク質の折りたたみを比較する。例えば、変異体及び標準の分子におけるシステインパターンの比較が行われ得る。質量分光及び還元及びアルキル化を用いての化学的修飾は、ジスルフィド結合に関連するか又はそのような関連を有さないシステイン残基を決定するための方法を提供する（Ｂｅａｎなど．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１： ２１６−２２６， １９９２； Ｇｒａｙ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： １７３２−１７４８， １９９３： 及びＰａｔｔｅｒｓｏｎなど．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６： ３７２７−３７３２， １９９４）。一般的に、修飾された分子が標準の分子と同じシステインパターンを有さない場合、折りたたみが影響を及ぼされると思われる。
【０１２０】
折りたたみを測定するためのもう１つの良く知られており、且つ許容できる方法は、円ニ色性（ＣＤ）である。修飾された分子及び標準の分子により生成されるＣＤスペクトルの測定及び比較は、通常のことである（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ７：２０５−２１４， １９９０）。結晶学は、折りたたみ及び構造を分析するためのもう１つの良く知られた方法である。核磁気共鳴（ＮＭＲ）、消化ペプチドマッピング及びエピトープマッピングはまた、タンパク質とポリペプチドとの間の折りたたみ及び構造的類似性を分析するための既知方法でもある（Ｓｃｈａａｎａｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６１−９６４， １９９２）。
【０１２１】
配列番号３に示されるようなＺＣＹＴＯ１８タンパク質配列のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールが生成され得る（Ｈｏｐｐなど．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８： ３８２８， １９８１； Ｈｏｐｐ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ． ８８： １−１８， １９８６及びＴｒｉｑｕｉｅｒなど．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１： １５３−１６９， １９９８）。前記プロフィールは、スライドする６−残基窓（ｓｌｉｄｉｎｇ ｓｉｘ−ｒｅｓｉｄｕｅ ｗｉｎｄｏｗ）に基づかれている。埋もれたＧ， Ｓ及びＴ残基及び暴露されたＨ， Ｙ及びＷ残基は無視された。
【０１２２】
例えば、ＺＣＹＴＯ１８においては、親水性領域は、（１）配列番号３のアミノ酸番号２９（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号３４（Ａｓｎ）；（２）配列番号３のアミノ酸番号１２１（Ｈｉｓ）〜アミノ酸番号１２６（Ａｓｐ）；（３）配列番号３のアミノ酸番号１３４（Ｇｌｎ）〜アミノ酸番号１３９（Ｔｈｒ）；（４）配列番号３のアミノ酸番号１３７（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号１４２（Ｌｙｓ）；及び（５）配列番号２のアミノ酸番号１４５（Ｇｌｕ）〜アミノ酸番号１５０（Ｌｙｓ）を包含する。
【０１２３】
当業者は、親水性又は疎水性が、全体的な構造及び生物学的プロフィールを破壊しないよう、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのアミノ酸配列における修飾を企画する場合、考慮されるであろうことを認識するであろう。Ｖａｌ， Ｌｅｕ及びＩｌｅから成る群、又はＭｅｔ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ａｌａ， Ｔｙｒ及びＴｒｐから成る群から選択された疎水性残基の置換が特に興味の対象である。例えば、置換に耐性の残基は、配列番号３に示されるような残基を包含する。配列番号３の位置８， ２７， ７７及び１２０でのシステイン残基は、置換に対して比較的耐性ではないであろう。
【０１２４】
必須アミノ酸の正体はまた、ＺＣＹＴＯ１８による、ＩＬ−１０， ｚｃｙｔｏ１０及びＭＤＡ７とＺＣＹＴＯ１８との間の配列類似性の分析から推定され得る。前に記載された“ＦＡＳＴＡ”分析のような方法を用いて、高い類似性の領域が、タンパク質ファミリー内に同定され、そして保存された領域のためのアミノ酸配列を分析するために使用される。構造に基づいて変異体ＺＣＹＴＯ１８オリゴヌクレオチドを同定するためのもう１つのアプローチは、可能性ある変異体ＺＣＹＴＯ１８遺伝子をコードする核酸分子が、上記で論じられたように、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを決定することである。
【０１２５】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸を同定する他の方法は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１ （１９８９）；Ｂａｓｓ など．， Ｐｒｏ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８ （１９９１）； Ｃｏｏｍｂｓ ａｎｄ Ｇｏｒｅｙ， “Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｕａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ， Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ （ｅｄ．）， Ｐ． ２５９−３１１ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８））。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子におけるあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるように、生物学的又は生化学的活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９ （１９９６） を参照のこと。
【０１２６】
本発明はまた、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの機能的フラグメント及びそのような機能的フラグメントをコードする核酸分子を包含する。本明細書に定義されるように、“機能的” ＺＣＹＴＯ１８又はフラグメントは、その増殖又は分化活性により、特殊化された細胞機能を誘発し、又は阻害するその能力により、又は抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体又はＺＣＹＴＯ１８受容体（可溶性であるか又は固定されている）に対して特異的に結合するその能力により特徴づけられる。本明細書においてこれまでに記載されたように、ＺＣＹＴＯ１８は、配列番号２に示されるように、ヘリックスＡ（アミノ酸残基４１−５３）、ヘリックスＢ（アミノ酸残基８０−９１）、ヘリックスＣ（アミノ酸１０３−１１６）及びヘリックスＤ（アミノ酸残基１４９−１６２）を含んで成る４−ヘリカル−束構造により特徴づけられる。
【０１２７】
従って、本発明はさらに、（ａ）上記に記載される１又は複数のヘリックスを含んで成るポリペプチド分子；及び（ｂ）１又は複数のそれらのヘリックスを含んで成る機能的フラグメントを包含する融合タンパク質を提供する。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、もう１つの４−ヘリカル−束サイトカイン、例えばＩＬ−１０， ｚｃｙｔｏ１０，ＭＤＡ７，ＩＬ−１５，ＩＬ−２，ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦにより、又は融合タンパク質の分泌を促進する、非生来の及び／又は関連しない分泌シグナルペプチドにより寄与され得る。
【０１２８】
核酸分子の通常の欠失分析は、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを有するＤＮＡ分子は、一連の欠失を得るためにＢａｌ３ Ｔヌクレアーゼにより消化され得る。次に、それらのＤＮＡフラグメントが正しい読み取り枠を整合して発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドが単離され、そしてＺＣＹＴＯ１８について、又はＺＣＹＴＯ１８抗体又はＺＣＹＴＯ１８受容体を結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化のための１つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するＺＣＹＴＯ１８フラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方では、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。
【０１２９】
機能的ドメインを同定するための標準の方法は、当業者に良く知られている。例えば、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に対する研究が、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６６： ５０７ （１９９５） により要約されている。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばＴｒｅｕｌｔｅｒなど．， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４０： １１３ （１９９３）， Ｃｏｎｔｅｎｔ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓｉ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｋＤａ ２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ”， ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＩＳＩＲ−ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｎｔｅｌｌ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ ６５−７２ （Ｎｉｊｈｏｆｆ １９８７）， Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ， “Ｔｈｅ ＥＧＦ Ｅｎｚｙｍｅ”， ｉｎ Ｃｏｒｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １， Ｂｏｙｎｔｏｎ など．， （ｅｄｓ．） ｐａｇｅｓ １６９−１９９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）， Ｃｏｕｎａｉｌｌｅａｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２９２７０ （１９９５）； Ｆｕｋｕｎａｇａ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２５２９１ （１９９５）； Ｙａｍａｇｕｃｈｉ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０： １２９５ （１９９５）； 及びＭｅｉｓｅｌなど．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ３０： １ （１９９６）により記載される。
【０１３０】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【０１３１】
開示されるＺＣＹＴＯ１８ヌクレオチド及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡ分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１３２】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。生物学的に活性のポリペプチド又は抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体又は可溶性ＺＣＹＴＯ１８受容体と結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１３３】
さらに、本発明のタンパク質（又はそのポリペプチドフラグメント）は、多機能分子を供給するために、他の生物活性分子、特に他のサイトカインに連結され得る。例えば，ＺＣＹＴＯ１８からの１又は複数のヘリックスが、それらの生物学的性質又は生成の効率を高めるために、他のサイトカインに連結され得る。
【０１３４】
従って、本発明は、ＺＣＹＴＯ１８の１又は複数のヘリックスを含んで成るセグメントが他のポリペプチドに融合されている一連の新規ハイブリッド分子を提供する。融合は好ましくは、組換え生成システムにおけるキメラ分子の発現を可能にするためにＤＮＡレベルをスプライシングすることにより行われる。次に、その得られる分子は、改良された溶解性、改良された安定性、延長されたクリアランス半減期、改良された発現及び分泌レベル、及び薬物力学についてアッセイされる。そのようなハイブリッド分子はさらに、成分タンパク質又はポリペプチド間に追加のアミノ酸残基（例えば、ポリペプチドリンカー）を含んで成る。
【０１３５】
天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。
【０１３６】
例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【０１３７】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【０１３８】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、ＺＣＹＴＯ１８アミノ酸により置換され得る。
【０１３９】
本発明はまた、本明細書に記載されるＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ８１： ３９８８， １９８３を参照のこと）。
【０１４０】
対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてそのようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９： ６６０， １９８３を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールは、最も抗原性の可能性を有する領域を決定するために使用され得る（Ｈｏｐｐなど．， １９８１， 前記；及びＨｏｐｐ、１９８６、前記）。
【０１４１】
ＺＣＹＴＯ１８おいては、それらの領域は、（１）配列番号３のアミノ酸番号２９（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号３４（Ａｓｎ）；（２）配列番号３のアミノ酸番号１２１（Ｈｉｓ）〜アミノ酸番号１２６（Ａｓｐ）；（３）配列番号３のアミノ酸番号１３４（Ｇｌｎ）〜アミノ酸番号１３９（Ｔｈｒ）；（４）配列番号３のアミノ酸番号１３７（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号１４２（Ｌｙｓ）；及び（５）配列番号２のアミノ酸番号１４５（Ｇｌｕ）〜アミノ酸番号１５０（Ｌｙｓ）を包含する。さらに、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｐｒｏｔｅａｎ  プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロットにより推定されるようなＺＣＹＴＯ１８抗原エピトープが、好ましい抗原として作用し、そして当業者により容易に決定される。
【０１４２】
抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは、配列番号３の少なくとも４〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜１５個のアミノ酸、又は約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのフラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５： ２６８， １９９３， 及びＣｏｒｔｅｓｅ など．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７： ６１６， １９９６を参照のこと）。
【０１４３】
エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を生成するための標準の方法は、例えばＭｏｌｅ， “Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １０， Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １０５−１６ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９２）， Ｐｒｉｃｅ， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｄｙｍａｎ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ ６０−８４ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， 及びＣｏｌｉｇａｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ９．３．１−９．３．５ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ９．４．１−９．４．１１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９７）により記載される。
【０１４４】
変異体ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列にもかかわらず、そのポリヌクレオチドは、その増殖又は分化活性、特殊化された細胞機能を誘発するか又は阻害する能力、又は抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体又はＺＣＹＴＯ１８受容体に対して特異的に結合する能力に特徴づけられるポリペプチドをコードする。より特定には、変異体ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるようなポリペプチドの活性の少なくとも５０％及び好ましくは、７０％， ８０％又は９０％以上の活性を示すポリヌクレオチドをコードするであろう。
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする、十分な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。
【０１４５】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体（及びい又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質）を提供する。例えば、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドは、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示されるようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫グロブリン−ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド融合体は、（種々のマルチマーＺＣＹＴＯ１８類似体を生成するために）、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子に対してそれらを標的化するためにＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドに融合され得る。
【０１４６】
例えば、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド又はタンパク質が、標的細胞の表面上の受容体又は受容体に特異的に結合するリガンドにＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドを融合せしめることによって、予定された細胞型に標的化され得る。この場合、ポリペプチド及びタンパク質は、治療又は診断目的のために標的化され得る。ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： １−９， １９９６を参照のこと。
【０１４７】
本明細書において論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号３の残基１−１６７又は２３−１６７に対して実質的に類似する配列同一性を有する種々のポリペプチド、又はその機能的フラグメント及び融合体を同定し、そして／又は調製することができ、ここでそのようなポリペプチド、又はフラグメント又は融合体は野生型タンパク質の性質、例えば増殖、分化を刺激し、特殊化された細胞機能を誘発し、又はＺＣＹＴＯ１８受容体又はＺＣＹＴＯ１８抗体を結合する能力を保持する。
【０１４８】
本発明のＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、機能的フラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。
【０１４９】
クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は次の文献に開示される：Ｓａｍｂｒｏｏｌ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌ など．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｓ．， ＮＹ， １９８７。
【０１５０】
一般的に、本発明のＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
【０１５１】
ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、ＺＣＹＴＯ１８の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばｔ−ＰＡ ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、ＺＣＹＴＯ１８ＤＮＡ配列に操作可能的に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【０１５２】
他方では、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌路中に他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドが製造され得、ここで配列番号３のアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）−２１（Ａｌａ）に由来する分泌シグナル配列が当業界において知られている方法及び本明細書に開示される方法を用いて、もう１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作用可能的に連結されている。
【０１５３】
本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、分泌路中い追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペプチドにアミノ末端的に融合される。そのような構造体は、当業界において知られている多くの用途を有する。例えば、それらの新規の分泌シグナル配列融合構造体は通常分泌されないタンパク質の活性成分、例えば受容体の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。
【０１５４】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性ＤＮＡを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｃｅｌｌ １４ ： ７２５， １９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７ ：６０３， １９８１； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２； ４５６， １９７３），エレクトロポレーション（ Ｎｅｕｍａｎｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． １： ８４１−８４５， １９８２ ）； ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ −Ｎｅｌｓｏｎ など．， Ｆｏｃｕｓ １５： ７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ  など．，Ｆｏｃｕｓ １５： ８０， １９９３ ）を包含する。
【０１５５】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばｌｅｖｉｎｓｏｎ など．， アメリカ特許第４，７１３，３３９ 号； Ｈａｇｅｎ など．， アメリカ特許第４，７８４，９５０ 号； Ｐａｌｍｉｔｅｒ など．， アメリカ特許第 ４，５７９，８２１ 号； 及びＲｉｎｇｏｌｄ， アメリカ特許第 ４，６５６，１３４ 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １０３１４ ）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １５７３ ； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏ． ３６： ５９−７２， １９７７ ）、及びチャイニーズ  ハムスター卵巣（例えば  ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ６１ ）細胞系を包含する。
【０１５６】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばＳＶ−４０ 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第４，９５６，２８８ 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 ４，５７９，８２１ 号及び第 ４，６０１，９７８ 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【０１５７】
薬物選択は一般的に、外来性ＤＮＡが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。
【０１５８】
増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン  アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４，  ＣＤ８，クラスＩ  ＭＨＣ、胎盤アルカリホスファターゼが、ＦＡＣＳ分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１５９】
他の高等真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒなど．、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （ Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ） １１： ４７−５８， １９８７ により再考されている。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏ など．，アメリカ特許第５，１６２，２２２号；及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号により公開される。
【０１６０】
昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染され得る。Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， １９９４； 及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， Ｅｄ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９５を参照のこと。
【０１６１】
組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ （ Ｌｕｃｋｏｗ， ＶＡ， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６−７９， １９９３ ） により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。このシステムは、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）として市販されている。このシステムは、“ｂａｃｍｉｄ”  と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃＩ ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を利用する。ｐＦａｓｔＢａｃｌＴＭ トランスファーベクターは、興味ある遺伝子、この場合、ＺＣＹＴＯ１８の発現を誘導するためにＡｃＮＰＶポリヒドリンプロモーターを使用する。
【０１６２】
しかしながら、ｐＦａｓｔＢａｃｌＴＭは相当の程度まで修飾され得る。前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Ｐｃｏｒ， ｐ６．９又はＭＰプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【０１６３】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のＺＣＹＴＯ１８分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチＭｅｌｉｔｔｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ） 又はバキュロウィルスｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）は、生来の分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【０１６４】
さらに、トランスファーベクターは発現されたＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端でエピトープ標識、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕ  エピトープ標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． など．， Ｐｅｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ７９５２−６， １９８５）。当業界において知られている技法を用いて、ＺＣＹＴＯ１８を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａ についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ が、通常の技法を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）細胞、例えばＳｆ９ 細胞をトランスフェクトするために使用される。ＺＣＹＴＯ１８を発現する組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス  ストックは、当業者において通常使用される方法により製造される。
【０１６５】
組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， ＡＳＭ Ｐｒｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９４を参照のこと。もう１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に由来するＨｉｇｈ ＦｉｖｅＯＴＭ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である（アメリカ特許第５，３００，４３５号）。市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。適切な培地は、Ｓｆ９細胞のためには、ＳＦ９００ＩＩＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），又はＥＳＴ  ９２１ＴＭ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）； 及びＴ． ｎｉ 細胞のためには、Ｅｘ−ＣｅｌｌＯ４０５ＴＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｚａ， ＫＳ）又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）である。
【０１６６】
細胞は、約２〜５×１０５個の細胞１〜２×１０６個の細胞の接種密度から増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、０．１〜１０、より典型的にはほぼ３の感染の多重度（ＭＣＩ）で添加される。使用される方法は一般的に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ． Ｄ．， 前記； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． など．， 前記；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， 前記）。上清液からのＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成され得る。
【０１６７】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） を包含する。外因性ＤＮＡによりＳ．  セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。
【０１６８】
形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。
【０１６９】
また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０１７０】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【０１７１】
組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４５０， ＷＯ９７／１７４５１、ＷＯ９８／０２５３６及びＷＯ９８／０２５６５に開示される。Ｐ．メタノリカの形質転換に使用するためのＤＮＡ分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、Ｐ．メタノリカ遺伝子、例えばＰ．メタノリカ  アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１又はＡＵＧ２）のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、及びカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものを包含する。
【０１７２】
宿主染色体中へのＤＮＡの組み込みを促進するためには、宿主ＤＮＡ配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア  メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ． ４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１及びＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０１７３】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、Ｐ．メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ，好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電場の強さ、及び１〜４０ｍ秒、最も好ましくは約２０ｍ秒の時定数（ｔ）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０１７４】
原核宿主細胞、例えば細菌Ｅ．コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化される外来性ＤＮＡ配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記を参照のこと）。細菌、例えばＥ．コリにおいてＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。
【０１７５】
次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１７６】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
【０１７７】
Ｐ．メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地において、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーションを提供される。Ｐ．メタノリカのための好ましい培養培地は、ＹＥＰＤ（２％Ｄ−グルコース、２％のＢａｃｔｏＴＭペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）， １％のＢａｃｔｏＴＭ  酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）， ０．００４％のアデニン及び０．００６％のＬ−ロイシン）である。
【０１７８】
本発明のポリペプチドを８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、９９．９％以上の純度であり、そして感染性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０１７９】
発現された組換え体ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド（又はキメラＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド）は、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましい。
【０１８０】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−Ｓｅｐｈａｒｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０１８１】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド  カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８を参照のこと。
【０１８２】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される（ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３： １−７， １９８５）。
【０１８３】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， （ ｅｄ．）， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ｐｐ． ５２９−３９）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、ＦＬＡＧ標識、Ｇｌｕ−Ｇｋｕ標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０１８４】
さらに、当業界において記載される方法を用いて、ポリペプチド融合体又はハイブリッドＺＣＹＴＯ１８タンパク質が、他のヒトサイトカインファミリータンパク質（例えば、インターロイキン又はＧＭ−ＣＳＦ）、又は異種タンパク質と組合して、本発明のｚａｌｐｈａ１１リガンドの領域又はドメインを用いて構成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， 前記；Ａｌｔｓｃｈｕｌ など．， 前記；Ｐｉｃａｒｄ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ５１１−５， １９９４及びそれらにおける引例）。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在性を変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【０１８５】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するヘリックスの一部又はすべてが、本発明のＺＣＹＴＯ１８と、もう１つのファミリーメンバー、例えばＩＬ−１０、 ｚｃｙｔｏ１０、 ＭＤＡ７、 ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、又はＧＭ−ＣＳＦからのその機能的に同等のヘリックスとの間で交換され得る。
【０１８６】
そのような成分は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：分泌シグナル配列；ヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及び４−ヘリカル−束サイトカイン。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知の４−ヘリカル−束サイトカインファミリータンパク質と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【０１８７】
標準の分子生物学及びクローニング技法が、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドと、それらが融合されるそれらのポリペプチドとの間の同等のドメインを交換するために使用され得る。一般的に、興味あるドメイン、例えばＺＣＹＴＯ１８ヘリックスＡ〜Ｄ、又は本明細書に記載される他のドメインをコードするＤＮＡセグメントが、追加のポリペプチド（例えば、他のサイトカイン、例えばＩＬ−１０、 ｚｃｙｔｏ１０、 ＭＤＡ７又は同様のものからのドメイン又は領域）をコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントに読み取り枠を接合して作用可能的に結合され、そして本明細書に記載されるように、適切な発現ベクター中に挿入される。
【０１８８】
一般的に、ＤＮＡ構造体は、ポリペプチドのその対応する領域をコードするいくつかのＤＮＡセグメントが、完全な融合タンパク質又はその機能的部分をコードする単一の構造体を製造するために読み取り枠を整合して、作用可能的に連結されるように、製造される。例えばＤＮＡ構造体は、Ｎ−末端からＣ−末端側に、単一のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質、続いて、ヘリックスＡ、ヘリックスＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＤ、又は例えばもう１つの４−ヘリカル−束サイトカインファミリータンパク質からの同等の領域により交換されるような上記のいずれかを含む成熟４−ヘリカル−束サイトカイン融合タンパク質をコードする。
【０１８９】
そのような融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、発現され、単離され、そして活性についてアッセイされ得る。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体を生成するために動物を接種するために使用される、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのフラグメントを発現し、そして分泌するために使用され得る。例えば、分泌シグナル配列は、本明細書に記載されるように、精製され得るＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのフラグメント分泌し、そして本明細書に記載されるように、抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体を生成するために動物中に接種されるべき抗原として作用すせしめるために、ヘリックスＡ， Ｂ， Ｃ又はＤ又はそれらの組み合わせ（例えば、ヘリックスＡ−Ｂ， Ｂ−Ｃ， Ｃ−Ｄ， Ａ−Ｄ， Ｂ−Ｄ又はＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドフラグメントを含んで成る、作用可能に連結されたポリペプチド）に作用可能的に連結され得る。
【０１９０】
ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学的合成を通して調製され得る。ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドはモノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペルギレ−ト化されても又はペルギレ−トされなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い、例えば、ポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． ＳＯＣ． ８５： ２１４９， １９６３により記載されるように、固相ペプチド合成により調製され得る。
【０１９１】
本発明の分子の活性は、ＺＣＹＴＯ１８受容体を発現する細胞の増殖及び／又はその細胞への結合を側定する種々のアッセイを用いて測定され得る。ＺＣＹＴＯ１８−依存性細胞における変化が特に興味の対象である。ｚａｌｐｈａ１１リガンド−依存性である構築され得るべき適切な細胞系は、ＩＬ−３−依存性ＢａＦ３細胞系（Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ ４１： ７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔ など．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６： ４１３３−４１３５， １９８６）、ＦＤＣ−Ｐ１（Ｈａｐｅｌ など．， Ｂｌｏｏｄ ６４： ７８６−７９０， １９８４）及びＭＯ７ｅ（Ｋｉｓｓなど．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７： ２３５−２４０， １９９３）を包含する。
【０１９２】
成長因子−依存性細胞系は、公開された方法（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒなど．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ． ８： ３６３−３７５， １９８４； Ｄｅｘｔｅｒなど．， ｉｎ Ｂａｕｍ など．， Ｅｄｓ．， Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ， ８ｔｈ ａｎｎ． Ｍｔｇ． Ｉｎｔ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． １９７９， １４５−１５６， １９８０）に従って確立され得る。例えば、本明細書に記載されるように、ＺＣＹＴＯ１８ヘテロダイマー受容体ｚｃｙｔｏｒ／ＣＲＦ２−４を発現するＢａＦ３細胞が、本発明のＺＣＹＴＯ１８、ＺＣＹＴＯ１８受容体結合フラグメント及びＺＣＹＴＯ１８変異体の活性をアッセイするために使用され得る。Ｚｃｙｔｏｒ１１及びＣＲＦ２−４（ＺＣＹＴＯ１８受容体）を同時発現するＢａＦ３安定細胞系は、ＩＬ−３を有さない培地においてＺＣＹＴＯ１８タンパク質に対して用量−依存性増殖応答を示す。
【０１９３】
本発明のタンパク質は、造血機能及び免疫機能の関連する恒常性の細胞の特殊化された細胞機能の増殖、活性化、分化及び／又は誘発又は阻害を刺激するために有用である。特に、ＺＣＹＴＯ１８ポリペピチドは、造血系の細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球及びマクロファージ（但し、それらだけには限定されない）の特殊化された細胞機能の増殖、活性化、分化、誘発又は阻害を刺激するために有用である。造血細胞の増殖及び／又は分化は、培養された細胞を用いてインビトロで、又は本発明の分子を適切な動物モデル中に投与することによって、インビトロで測定され得る。細胞増殖又は分化を測定するアッセイは、当業者において良く知られている。
【０１９４】
たとえば、増殖を測定するアッセイは、次のようなアッセイを包含する：中性赤色素に対する化学感受性（Ｃａｒａｎａｕｇｈ など．， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒａｇｓ ８： ３４７−３５４， １９９０； 引用により本明細書に組み込まれる）、放射性ラベルされたヌクレオチドの組み込み（ＣｏｏＫ など．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７９： １−７， １９８９； 引用により本明細書に組み込まれる）、増殖する細胞のＤＮＡへの５−ブロモー２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組み込み（Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８２： １６９−１７９， １９８５； 引用により本明細書に組み込まれる）、及びテトラゾリウム塩の使用（Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５： ５５−６３， １９８３； Ａｌｌｅｙ など．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８： ５８９−６０１， １９８； Ｍａｒｓｈａｌｌ など．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇ． ５： ６９−８４， １９９５； 及びＳｃｕｄｉｅｒｏ など．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８： ４８２７−４８３３， １９８８； すべては引用により本明書に組み込まれる）。
【０１９５】
分化を測定するアッセイは、たとえば組織の段階−特異的発現に関連する細胞表面マーカー、酵素活性、官能的活性、又は形態変化の測定を包含する（Ｗａｔｔ， ＦＡＳＥＢ ５： ２８１−２８４， １９９１； Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５７ ： ６３−７５， １９９４； Ｒａｅｓ， Ａｄｖ． Ａｎｉｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， １ｉ６１−１７１， １９８９； すべては引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１９６】
ＩＬ−１０は、他のサイトカインの生成を阻害し、活性化されたＢリンパ球の増殖及び分化を誘発し、ＨＩＶ−１複製を阻害し、そしてγインターフェロンに対する拮抗効果を示すサイトカインである。ＩＬ−１０は、１８０度回転により関連する２種のα−ヘリカルポリペプチド領域から形成されるダイマーとして存在するように思える。例えば、Ｚｄａｎｏｖなど．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ： ３（６）： ５９１−６０１ （１９９６） を参照のこと。ＩＬ−１０は、Ｔｈ１ Ｔ−細胞応答を調節することができる、活性化されたＴｈ２ Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ケラチノサイト及び単球／マクロファージの生成物であることが報告されている。
【０１９７】
そのような調節は、Ｔｈ１ Ｔ−細胞によりサイトカイン合成を阻害することによって達成され得る。例えば、Ｈｕｓなど．， Ｉｎｔ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４： ５６３ （１９９２） 及びＤ’Ａｎｄｒｅａ など．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８： １０４２ （１９９２） を参照のこと。ＩＬ−１０はまた、天然のキラー細胞及び単級／マクロファージによりサイトカイン合成を阻害することが報告されている。例えば、Ｈｕｓなど．， 上記及びＦｉｏｒｅｎｔｉｎｏなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６： ３４４４ （１９９１） を参照のこと。さらに、ＩＬ−１０は、インスリン依存性糖尿病に応答して保護効果を有することが見出された。同様に、サイトカインはＩＬ−１０とペプチド構造及びいくつかの配列類似性を共有するので、ＺＣＹＴＯ１８は上記に開示される活性を有することができ、そしてＩＬ−１０活性を評価するために使用されるアッセイが、ＺＣＹＴＯ１８活性をアッセイするために適用され得る。
【０１９８】
本発明の分子は、ウィルス供給システムを用いてインビボでアッセイされ得る。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種拡散の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｔ． Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと）。
【０１９９】
アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ ｉ ）アデノウィルスは比較的大きなＤＮＡ挿入体を適応せしめることができ；（ ｉｉ ）高い力価に増殖され得；（ ｉｉｉ ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ ｉｖ ）多数の異なったプロモーター、例えば偏在する、組織特異的、及び調節可能なプロモーターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【０２００】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスを用いて、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞（ヒト２９３細胞系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。
【０２０１】
アデノウィルス供給システムがＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう（そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
【０２０２】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、Ｅ１−欠失され、そしてさらに、Ｅ２Ａ又はＥ４の欠失を含む（Ｌｕｓｋｙなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２０２２ （１９９８）； Ｒａｐｅｒ など．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ６７１ （１９９８））。さらに、Ｅ２ｂの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９２６ （１９９８））。さらに、完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種ＤＮＡの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（ｇｕｔｌｅｓｓ）”アデノウィルスの生成は、異種ＤＮＡの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Ｙｅｈ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１： ６１５ （１９９７） を参照のこと）。
【０２０３】
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使用され得る。アデノウィルス感染された細胞を、その細胞が急速に分裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を生成することができる。例えば、ＢＨＫ細胞は、細胞工場において集密性まで増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクターに暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。
【０２０４】
他方では、アデノウィルスベクター感染された２９３Ｓ細胞が、有意な量のタンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養において増殖せしめられ得る（ Ｇａｒｎｉｅｒ など．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： １４５−５５， １９９４ を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞における発現されたタンパク質の素因に依存して、細胞培養物上清液、溶解物又は、膜画分から反復して単離され得る。感染された２９３Ｓ 細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得られる。
【０２０５】
ＺＣＹＴＯ１８受容体に関して観察され組織分布の観点においては、アゴニスト（例えば、天然のリガンド／基質／補因子／等）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。ＺＣＹＴＯ１８アゴニストとして同定される化合物は、造血機能及び免疫機能の恒常性に関連する細胞の特殊化された細胞機能の拡張、増殖、活性化、分化及び／又は誘発又は阻害を刺激するために有用である。
【０２０６】
例えば、ＺＣＹＴＯ１８及びアゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の成分として有用であり、そして細胞培養物において通常使用される血清を置換するために、単独で、又は他のサイトカインと組合して使用され得る。従って、アゴニストは、培養物におけるＴ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ細胞、細胞毒性リンパ球、及びリンパ球及び骨髄系の増殖及び／又は成長を特異的に促進することにおいて有用である。
【０２０７】
アンタゴニストはまた、リガンド−受容体相互作用の部位を特徴づけるための研究試薬として有用である。アンタゴニストは、造血機能の調節に関与する細胞の拡張、増殖、活性化、及び／又は分化を阻害するために有用である。ＺＣＹＴＯ１８活性のインヒビター（ＺＣＹＴＯ１８アンタゴニスト）は、抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体、及び可溶性ＺＣＹＴＯ１８受容体、並びに他のペプチド及び非ペプチド剤（例えば、リボザイム）を包含する。
【０２０８】
ＺＣＹＴＯ１８はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するためにも使用され得る。試験化合物は、ＺＣＹＴＯ１８の活性を阻害する化合物を同定するために、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれらのアッセイの他に、サンプルは、受容体結合を測定するよう企画された種々のアッセイ内のＺＣＹＴＯ１８活性の阻害、ＺＣＹＴＯ１８−依存性細胞応答の刺激／阻害、又はＺＣＹＴＯ１８受容体発現細胞の増殖について試験され得る。
【０２０９】
ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドは、免疫グロブリンＨ鎖不変領域、典型的には２つの不変領域ドメインを含み、そして可変領域を欠いているＦｃフラグメントとの融合体として発現され得る。そのような融合体を調製するための方法は、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示される。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここで前記分子においては、Ｆｃ部分はお互いにジスルフィド結合され、そして２つの非Ｉｇポリペプチドはお互いに接近して配列されている。
【０２１０】
このタイプの融合体は、ニ量体化のために、安定性及びインビボ半減期を高めるために、リガンドを親和性精製するために、インビトロアッセイ手段又はアンタゴニストとして使用され得る。アッセイへの使用のためには、キメラは、Ｆｃ領域を通して支持体に結合され、そしてＥＬＩＳＡ形に使用される。Ｆｃ融合体は、異なった薬物運動学及び変更された作用を有する好ましい治療用タンパク質を提供することができる。
【０２１１】
リガンドの受容体−結合領域を含むポリペプチドはまた、受容体の精製のためにも使用される。前記リガンドポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド又は使用の条件下で安定している同様の材料のビーズ上に固定される。
【０２１２】
固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアノゲン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が、リガンドポリペプチドへの受容体の結合を可能にするために、カラムに１又は複数回、通される。次に、受容体が、塩濃度の変化、カオトロピック剤（ＭｎＣｌ２）、又はリガンド−受容体結合を破壊するｐＨを用いて溶出される。
【０２１３】
ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド又はＺＣＹＴＯ１８融合タンパク質が、ＺＣＹＴＯ１８受容体を同定するために使用される。ラベルされたＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドを用いて、受容体を発現する細胞は、蛍光免疫赤血球学又は免疫組織化学により同定される。ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドは、組織又は特定の細胞系上での受容体の分布の決定において、及び受容体／リガンド生物学を洞察することにおいて有用である。
【０２１４】
インビボ又はインビトロで、例えば細胞系においてＺＣＹＴＯ１８受容体を同定するための典型的な方法は、Ｆｅｉｎｅｒ， Ｌ． など．， Ｎｅｕｒｏｎ １９： ５３９−５４５， １９９７に記載のように、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の触媒ドメインに融合されるＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドを使用することである。そのようなＡＰ融合体、及び標準のクローニング技法により結合される、放射性ラベルされたＺＣＹＴＯ１８、蛍光ラベルとのＺＣＹＴＯ１８融合体、及び本明細書に記載される他の物は、ＺＣＹＴＯ１８受容体の明視化、同定及びクローン化を当業者に可能にする。
【０２１５】
逆に言えば、ＺＣＹＴＯ１８−結合ポリペプチドはまた、リガンドの精製のためにも使用される。前記ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド又は使用の条件下で安定している同様の材料のビーズ上に固定される。
【０２１６】
固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアノゲン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が、受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にするために、カラムに１又は複数回、通される。次に、リガンドが、塩濃度の変化、カオトロピック剤（グアニジンＨＣｌ）、又はリガンド−受容体結合を破壊するｐＨを用いて溶出される。
【０２１７】
リガンド−結合受容体（又は抗体、補体／抗補体対の１つのメンバー）、又はその結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され得る。そのような受容体、抗体、補体／抗補体対のメンバー、又はフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５： ２２９−４０， １９９１ 及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３４： ５５４−６３，１９９３により開示される。受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。
【０２１８】
試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は補体／抗補体対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。他方では、リガンド／受容体結合は、ＳＥＬＤＩＴＭ技術を用いて分析され得る（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）。
【０２１９】
リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスカチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２， １９４９）及び熱量測定アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３： ５４５−４８， １９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： ８２１−２５， １９９１）を包含する。
【０２２０】
ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドはまた、ＺＣＹＴＯ１８エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド又はそのフラグメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するための剤（免疫原）として作用する。当業者は、抗原性エピトープ担持のポリペプチドがＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド（例えば、配列番号３）の少なくとも６、好ましくは少なくとも９及びより好ましくは少なくとも１５〜約３０個の連続したアミノ酸残基を含むことを認識するであろう。ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの大きな部分、すなわちアミノ酸配列の３０〜１０個の残基〜その全体の長さの残基を含んでなるポリペプチドが含まれる。抗原又は免疫原エピトープはまた、本明細書に記載されるように、結合された標識、アジュバンド及びキャリヤーを含むことができる。
【０２２１】
適切な抗原は、配列番号３のアミノ酸番号２３〜アミノ酸番号１６７によりコードされるＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド、又は連続した９〜１４４個又は３０〜１４４個のそのアミノ酸フラグメントを含む。他の適切な抗原は、本明細書に記載されるように、４−ヘリカル−束構造のヘリックスを包含する。抗原として使用するための好ましいペプチドは、親水性ペプチド、例えば本明細書に記載されるように、疎水性プロットから当業者により予測されるそれらのものを包含する。
【０２２２】
例えば、適切な親水性ペプチドは、次のものを包含する：（１）配列番号３のアミノ酸番号２９（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号３４（Ａｓｎ）；（２）配列番号３のアミノ酸番号１２１（Ｈｉｓ）〜アミノ酸番号１２６（Ａｓｐ）；（３）配列番号３のアミノ酸番号１３４（Ｇｌｎ）〜アミノ酸番号１３９（Ｔｈｒ）；（４）配列番号３のアミノ酸番号１３７（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号１４２（Ｌｙｓ）；及び（５）配列番号２のアミノ酸番号１４５（Ｇｌｕ）〜アミノ酸番号１５０（Ｌｙｓ）。さらに、例えばＤＮＡＳＴＡＲ  Ｐｒｏｔｅａｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆにより推定されるように、ＺＣＹＴＯ１８抗原性エピトープは、好ましい抗原として作用し、そして当業者により容易に決定される。
【０２２３】
それらの抗原（又は免疫原）による動物の接種により生成される免疫応答からの抗体は、本明細書に記載のようにして単離され、そして精製され得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など．， （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５； Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； 及びＨｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｇ．Ｒ．， Ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８２ を参照のこと。
【０２２４】
当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットをＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得る。ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン  ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばＺＣＹＴＯ１８又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０２２５】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２及びＦａｂタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（ｃｌｏａｋｉｎｇ）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。
【０２２６】
多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。さらに、ヒト抗体は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９８／２４８９３号に開示されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むよう構築されたトランスジェニック非−ヒト動物において生成される。好ましくは、それらの動物における内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えにより不活性化されるか又は排除される。
【０２２７】
抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合すると考えられる。限界レベルの結合は、本明細書における抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体が対照（非−ＺＣＹＴＯ１８）ポリペプチドへの結合親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性を伴って、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合するかどうか決定される。好ましくは、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を示す。抗体の結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ．， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０−６７２， １９４９）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０２２８】
ＺＣＹＴＯ１８抗体は関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しないかどうかは、例えば、標準のウェスターンブロット分析を用いてＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドであるが、しかし知られていない関連するポリペプチドを検出する抗体により示される（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、従来技術に開示されているそれらのもの、例えば既知のオルト体及びパラ体、及びタンパク質ファミリーの類似する既知メンバーである。スクリーニングはまた、非ヒトＺＣＹＴＯ１８及びｚａｌｐｈａ１１リガンド変異体ポチペプチドを用いて行われ得る。さらに、抗体は、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。
【０２２９】
例えば、ＺＣＹＴＯ１８に対して生ぜしめられた抗体は不溶性マトリックスに付着される関連するポリペプチドに吸着され；ＺＣＹＴＯ１８に対して特異的な抗体は適切な緩衝液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。スクリーニングは、既知の溶接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など． （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５）。
【０２３０】
特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知られている。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ （ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９３； Ｇｅｔｚｏｆｆなど．， Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： １−９８， １９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ．Ｗ． （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， １９９６； Ｂｅｎｊａｍｉｎ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： ６７−１０１， １９８４を参照のこと。特異的に結合する抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体は、当業界において知られており、そして下記に開示される多くの方法により検出され得る。
【０２３１】
当業者に知られている種々のアッセイがＺＣＹＴＯ１８タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｅｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８ に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体のＺＣＹＴＯ１８タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０２３２】
本明細書において有用な抗体を生成するか又は選択するための他の技法は、インビトロで、ＺＣＹＴＯ１８タンパク質又はペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたＺＣＹＴＯ１８タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。可能性あるＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【０２３３】
前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。
【０２３４】
そのようなランダム  ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号、及びＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６））、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。
【０２３５】
ランダムペプチド表示ライブラリーは、ＺＣＹＴＯ１８に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるＺＣＹＴＯ１８配列を用いてスクリーンされ得る。ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合ポリペプチド”は、細胞を標識するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に接合され得る。それらの結合ポリペプチドはまた、分析方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するために、例えばリガンドと受容体又は受容体に結合するウィルスとの間の相互作用を阻止しするためにも使用され得る。
【０２３６】
結合ポリペプチドはまた、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの循環レベルを決定するために；病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断アッセイにも使用され得る。それらの結合ポリペプチドはまた、ＺＣＹＴＯ１８結合及びシグナル  トランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、ＺＣＹＴＯ１８ “アンタゴニス”として使用することができる。それらの抗−ＺＣＹＴＯ１８結合ポリペプチドは、ＺＣＹＴＯ１８活性又はタンパク質を阻害するために有用である。
【０２３７】
ＺＣＹＴＯ１８に対する抗体は、ＺＣＹＴＯ１８を発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製によりＺＣＹＴＯ１８を単離するために；ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学のマーカーとして可溶性ＺＣＹＴＯ１８を検出し又は定量化するために；ＦＡＣＳ を使用する分析方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗−インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロでＺＣＹＴＯ１８活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の相補体／抗−相補体対の使用を特徴とする。
【０２３８】
本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。さらに、ＺＣＹＴＯ１８又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性されたＺＣＹＴＯ１８又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る。
【０２３９】
本明細書における抗体又はポリペプチドはまた、薬剤、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体は、インビボ診断又は治療用途のために使用される。例えば、本発明のポリペプチド又は抗体は、対応する抗−相補的分子（例えば、受容体又は抗原）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。より特定には、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド又は抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体、又はその生物活性フラグメント又は一部が、検出可能な又は細胞毒性の分子に連結され、そして抗−相補的分子を発現する細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。
【０２４０】
適切な検出可能分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばＩ−１３１、レニウム−１８８又はイットニウム−９０（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ−ト成分により間接的に結合される）を包含する。
【０２４１】
ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は細胞毒性分子は相補的／抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメンバーはポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビオチン／ストレプタビジンが典型的な相補的／抗相補的対である。
【０２４２】
もう１つの態様においては、ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞又は組織を処理するために）のために使用され得る。他方では、ポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型に向けるために適切である。
【０２４３】
ドメインのみの融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そのようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能／細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。そのようなサイトカイン毒素融合タンパク質は、標的組織のインビトロ殺害のために使用され得る。
【０２４４】
もう１つの態様においては、ＺＣＹＴＯ１８−サイトカイン融合タンパク質又は抗体−サイトカイン融合タンパク質は、ＺＣＹＴＯ１８受容体が発現される場合、標的組織（例えば、白血病、リンパ腫、肺癌、結腸癌、メラノーマ、膵臓癌、卵巣癌、血液及び骨髄癌、又は他の癌）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（一般的には、Ｈｏｒｎｉｃｋなど．， Ｂｌｏｏｄ ８９： ４４３７−４４４７， １９９７を参照のこと）。記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。
【０２４５】
適切なＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド又は抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＭ）を包含する。
【０２４６】
さらにもう１つの態様においては、ＺＣＹＴＯ１８ポチペプチド又は抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体が血管細胞又は組織を標的化する場合、そのようなポリペプチド又は抗体は、再狭窄を低めるために、放射性核種、及び特にβ線放射性核種により接合され得る。そのような治療アプローチは、放射性治療を管理する臨床医にほとんど危険性を与えない。例えば、必要とされる放射線量が供給されるまで患者のステント管中に配置される、イリジウム−１９２含浸されたリボンは、前記管における低められた組織増殖、及びプラシーボリボンを受けた対照グループよりも大きな管腔直径を示した。さらに、再血管化及びステント血栓症は、処理グループにおいて有意に低かった。類似する結果が、本明細書に記載されるように、放射性核種を含む生活性接合体の標的化により推定される。
【０２４７】
本明細書に記載される生活性ポリペプチド又は抗体接合体は、静脈内、動脈内又は管内供給され得、又は作用の意図された部位に局部的に導入され得る。
ＺＣＹＴＯ１８は、重要な免疫学的機能を有することが知られており、そして免疫系において役割を演じる細胞を含む組織から単離される。ＺＣＹＴＯ１８は、ＣＤ３＋選択された、活性化された末梢血液細胞において発現る。これは、ＺＣＹＴＯ１８発現が、Ｔ細胞活性化の後、調節され、そして高められることを示している。さらに、本発明のポリペプチドは、Ｔ−又はＢ−細胞、Ｔ−又はＢ−細胞前駆体、ＮＫ細胞又はＮＫ前駆体の増殖／拡張及び／又は分化された状態に対して効果を有する。さらに、ＺＣＹＴＯ１８はインビボでＴ細胞及びＢ細胞の増殖及び／又は分化に影響を及ぼす。
【０２４８】
造血前駆体の増殖を刺激し、そして成熟細胞を活性化する因子は一般的に知られている。ＮＫ細胞は単独でＩＬ−２に対して応答性であるが、しかし増殖及び活性化は一般的に、追加の成長因子を必要とする。例えば、ＩＬ−７及びＳｔｅｅｌ因子（ｃ−キットリガンド）がＮＫ前駆体のコロニー形成のために必要とされたことが示されてる。ＩＬ−７及びＳｔｅｅｌ因子と組合してのＩＬ−１５＋ＩＬ−２はより効果的であった（Ｍｒｏｚｅｋなど．， Ｂｌｏｏｄ ８７：２６４０， １９９６）。
【０２４９】
しかしながら、未確認のサイトカインが、ＮＫ細胞及び／又はＮＫ前駆体の特定サブユニットの増殖のために必要である（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ など．， Ｂｌｏｏｄ ７６： ２４５１−２４３８， １９９０）。ＺＣＹＴＯ１８及びＩＬ−１５を含んで成る組成物は、ＮＫ前駆体及びＮＫ細胞を刺激し、そしてこの組成物は、これまで記載されて来た因子および因子の組み合わせよりもより効果的である。同様に、ＺＣＹＴＯ１８を包含する因子のそのような組み合わせはまた、他の造血及びリンパ細胞型、例えばＴ−細胞、Ｂ−細胞、マクロファージ、樹状突樹細胞、及び同様のものにも影響を及ぼすことができる。
【０２５０】
ほとんどの４−ヘリックス束サイトカイン、及び活性化されたリンパ球により生成される他のタンパク質は、身体を通して細胞の分化、活性化、レクルートメント及び恒常性において重要な生物学的役割を演じる。治療有用性は、免疫調節を必要とする疾病、例えば自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎、多発生硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び糖尿病の処理を包含する。ＺＣＹＴＯ１８は、炎症の調節において重要であり、そして従って、リウマチ様関節炎、ぜん息、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン症、膵炎及び敗血症の処理において有用である。腫瘍細胞殺害の仲介においてＺＣＹＴＯ１８の役割が存在し、そして従って、癌、例えば卵巣癌、肺癌、メラノーマ及び結腸癌の処理において有用である。ＺＣＹＴＯ１８は、移植片拒絶を低めるために重要である免疫系の抑制において有効的な治療剤である。ＺＣＹＴＯ１８は、移植片−対−宿主疾病の予防において有用である。
【０２５１】
本発明のタンパク質はまた、エクスビボ、例えば自己由来の骨髄培養物においても使用され得る。手短に言及すれば、骨髄が、化学治療又は器官移植の前、患者から除去され、そして任意には、１又は複数の他のサイトカインと組合して、ＺＣＹＴＯ１８により処理される。次に、処理された骨髄が、骨髄の回復を早めるために化学治療の後、又は移植片−対−宿主疾病を抑制するために移植の後、患者に戻される。さらに、本発明のタンパク質はまた、骨髄又は末梢血液前駆体（ＰＢＰＣ）細胞のエクスビボ拡張のために使用され得る。
【０２５２】
処理の前、骨髄が、末梢循環中に初期前駆体細胞を解放するために、幹細胞因子（ＳＣＦ）により刺激され得る。それらの前駆体が、末梢血液から集められ、そして濃縮され、そして次に、培養において、任意には、１又は複数の他のサイトカイン、例えばＩＬ−１０， ｚｃｙｔｏ１０， ＭＤＡ７， ＳＣＦ， ＩＬ−２， ＩＬ−４， ＩＬ−７又はＩＬ−１５と組合してＺＣＹＴＯ１８により処理され、分化され、そして高密度リンパ球培養物中に増殖され、次に、化学治療又は移植に続いて、患者に戻され得る。
【０２５３】
他方では、ＺＣＹＴＯ１８は、感染性疾病に対する免疫性を高めることにおいて、免疫無防備状態の患者、例えばＨＩＶ＋患者の処理において、又はワクチンを改良することにおいて重要である免疫系を活性化することができる。特に、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ細胞及び同様のもの、又はそれらの前駆体のＺＣＹＴＯ１８刺激又は拡張は、ウィルス感染の処理において治療的価値を、及び抗−腫瘍因子として提供する。ＮＫ細胞は転移性腫瘍細胞の排除において重要な役割を演じると思われ、そして転移及び固形腫瘍を有する患者は、低められたレベルのＮＫ細胞活性を有する（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅなど．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３０： ２２１−２４４， １９９８）。
【０２５４】
ＺＣＹＴＯ１８アデノウィルスを注射されたマウスのさらなる分析は、アルブミンレベルが、対照のアデノウィルスを注射された動物に比較して低められ、そしてグルコースレベルが有意に低められることを示す。しかしながら、肝臓酵素（ＡＬＴ及びＡＳＴ）は、対照アデノウィルスを注射されたマウスに関して見られるそれらの酵素レベルに類似する。ＺＣＹＴＯ１８は特に、肝臓細胞機能を阻害するか又は変更することができる。他方では、過剰のＺＣＹＴＯ１８は、肝臓に対して悪影響を導くウィルス感染の活動を補強する。従って、アンタゴニスト（抗体、ムテイン、可溶性受容体）は、ウィルス疾患、特に肝臓を標的化するウィルス疾患、例えばＢ型肝炎及びアデノウィルスを処理するために有用である。他の組織におけるウィルス性疾患、例えばウィルス性髄膜炎、及びＨＩＶ−関連疾病が、ＺＣＹＴＯ１８に対するアンタゴニストにより処理され得る。
【０２５５】
ＺＣＹＴＯ１８アデノウィルスを注射されたマウスは、体重の低下、移動性の損失及び循環リンパ球の低下を示す。それらの変化は、敗血性ショック及び他の炎症状態の間に見られるそれらの変化において典型的である。それらの効果は、ＺＣＹＴＯ１８により直接的に、又は高いレベルの前炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１，ＴＮＦα及びＩＬ−６の誘発により間接的に引き起こされ得る。ＺＣＹＴＯ１８に対するアンタゴニストは、敗血性ショック、成人呼吸困難症症候群、内毒血症及び髄膜炎を処理するために有用である。ＺＣＹＴＯ１８アンタゴニストから有益である他の疾病は、出血性ショック、散在性血管内凝固障害、心筋虚血、ストローク、移植された器官の拒絶、肺線維症、炎症性痛炎過敏症及び悪液質を包含する。
【０２５６】
ＺＣＹＴＯ１８アデノウィルスを注射されたマウスは、低められた数の末梢白血球を示す。これはたぶん、末梢リンパ球に対するＺＣＹＴＯ１８の直接的な阻害効果である。拮抗性ＺＣＹＴＯ１８は、特にそれらが細菌、ウィルス又は寄生病原体を根絶するために必要とされる場合、リンパ球維持及び増殖を促進することができる。従って、拮抗性ＺＣＹＴＯ１８は、次の疾病を有する患者のために有益であり得る：結核、原因不明の線維性肺胞炎、肺炎、髄膜炎性疾患、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ−関連肺疾患、肝炎、ウィルス性髄膜炎、マラリア及び赤痢（シゲラ・ダイセンテリアエ）。
【０２５７】
ＺＣＹＴＯ１８のリンパ球阻害効果は、自己免疫を低めるために、及びリンパ腫瘍、特に非−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ腫及びリンパ性白血病の増殖を阻害するために使用され得る。ＺＣＹＴＯ１８はまた、器官移植患者のためのリンパ球を阻害し、そして移植片受容を促進するために使用され得る。腎臓及び骨髄移植が、適切な表示であ得る。
【０２５８】
ＺＣＹＴＯ１８アデノウィルスを注射されたマウスは、有意に高められた数の血小板を示す。血小板機能不全に関連する軽い出血性障害（ＭＢＤ）は、血小板機能の多くの先天性障害、例えばＢｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群（血小板ＧＰＩｂの欠失）、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ’ｓ血小板無力症（ＧＯＩＩｂ及びＧＰＩＩＩａの欠失）、先天性無フィブリノーゲン血症（血漿及び血小板における減じられた又は不在レベルのフィブリノーゲン）及びグレー血小板症候群（ａ−顆粒の不在）と同じように、比較的一般的である（Ｂａｃｈｍａｎｎ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １７： ２９２−３０５， １９８０）。さらに、血小板分泌、貯蔵プール欠損、血小板アラキドン酸経路の異常性、血小板シクロオキシゲナーゼ及びトロンボキサンシンセターゼの欠失、及び血小板活性化の欠失に関連する多くの障害が存在する（Ｒａｏ ａｎｄ Ｈｏｌｍｓｅｎ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２３： １０２−１１８， １９８６により再考される）。
【０２５９】
本発明のタンパク質は、動物においてインビボで血小板及び好中球を高めることが示されており、そして血球減少症、例えば再生不良性貧血、骨髄形成異常症候群、化学療法又は先天性血球減少症により誘発される症状の処理において、血小板及び好中球のレベルを高めることが所望される場合いつでも、治療的に使用され得る。タンパク質はまた、血小板減少症の処理において血小板生成を高めるためにも有用である。血小板減少症は、その状態を生成するために単独で又は強力して作用することができる種々のグループの疾病及び臨床学的状況に関連している。低められた血小板計数は、例えば血小板生成の欠損、異常血小板分布、多量の輸血による希釈損失、又は血小板の異常破壊に起因する。
【０２６０】
例えば、癌治療に使用される化学療法薬物は、骨髄における血小板前駆体の増殖を抑制し、そしてその得られる血小板減少が化学療法を制限し、そして輸血を必要とする。さらに、一定の悪性疾患が血小板生成及び血小板分布をそこなう。悪性細胞を殺害するために使用される放射線療法はまた、血小板前駆体細胞も殺害する。血小板減少症はまた、薬物、新生児同種免疫性又は血小板輸血同種免疫性により誘発される種々の血小板自己疾患から発生する。
【０２６１】
本発明のタンパク質は、輸血の必要性を減じるか又は排除し、それによって、血小板同種免疫性の発生を減じる。血小板の異常破壊は、（１）血管移植片又は外傷組織における高められた血小板消費；又は（２）例えば薬物誘発された血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫疾患、血液学的障害、例えば白血病及びリンパ腫、又は骨髄に関与する転移性癌に関連する免疫機構に起因することができる。本発明のタンパク質についての他の徴候は、再生不良性貧血及び例えば化学療法又はＡＺＴによるＨＩＶ感染の処理に起因する薬物−誘発された骨髄抑制を包含する。
【０２６２】
血小板減少症は、高められた出血、例えば鼻−経口領域又は胃腸管からの粘膜出血、及び創傷、潰瘍又は注射部位からのにじみ出として表される。
医薬使用のためには、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口、特に静脈内又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤は、造血タンパク質を、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共にを含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【０２６３】
さらに、本発明の造血タンパク質は、他のサイトカイン、特に初期作用性サイトカイン、例えば幹細胞因子、ＩＬ−３， ＩＬ−６， ＩＬ−１１又はＧＭ−ＣＳＦと共に組合され得る。そのような組み合わせ療法を用いる場合、サイトカインは単一の製剤において組合され得るか、又は別々の薬剤において投与され得る。配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示される。治療用量は、一般的に、０．１〜１００μｇ／ｋｇ患者の体重／日、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。
【０２６４】
用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は通常、化学療法又は骨髄移植の後、２８日間までにわたって、又は２０，０００／ｍｍ３以上、好ましくは５０，０００／ｍｍ３以上の血小板計数が達成されるまで、投与されるであろう。より通常には、タンパク質は、１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間、投与されるであろう。一般的に、ＺＣＹＴＯ１８の治療的有効量とは、成熟細胞（例えば、血小板又は好中球）の循環レベルの上昇として明らかであろう、リンパ又は骨髄前駆体細胞の増殖及び／又は分化の臨床学的に有意な上昇をもたらすのに十分な量である。
【０２６５】
従って、血小板障害の処理は、少なくとも２０，０００／ｍｍ３，好ましくは５０，０００／ｍｍ３の血小板計数が達成されるまで続けられるであろう。本発明のタンパク質はまた、他のサイトカイン、例えばＩＬ−３， −６， 及び−１１；幹細胞因子、エリトロポエチン；Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＧＳＦと組合して投与され得る。組み合わせ療法のレジメンにおいては、他のサイトカインの毎日の用量は一般的に次の通りである：ＥＰＯ、１５０Ｕ／ｋｇ；ＧＭ−ＣＳＦ，５−１５ ｌｇ／ｋｇ； ＩＬ−３， １−５ ｌｇ／ｋｇ； 及びＧ−ＣＳＦ， １−２５ ｌｇ／ｋｇ。例えば、ＥＰＯとの組み合わせ療法は、低ＥＰＯレベルの貧血患者において示される。
【０２６６】
本発明のタンパク質はまた、エクスビボ、例えば自己由来の骨髄培養又は肝臓培養においても使用され得る。例えば、手短には、骨髄が、化学療法の前、患者から除去され、そして任意には、１又は複数の他のサイトカインと組合して、ＺＣＹＴＯ１８により処理される。次に、処理された骨髄が、骨髄の再性を早めるために、化学療法の後、患者に戻される。さらに、本発明のタンパク質はまた、骨髄又は末梢血液前駆体（ＰＢＰＣ）細胞のエクスビボ拡張のためにも使用され得る。化学療法処理の前、骨髄が末梢循環中に初期前駆体細胞を開放するために、幹細胞因子（ＳＣＦ）又はＧ−ＣＳＦにより刺激され得る。
【０２６７】
それらの前駆体は、末梢血液から集められ、そして濃縮され、そして次に、高用量化学療法に従って、患者に戻され得る、高密度骨髄巨核球培養物中に分化し、そして増殖するよう、１又は複数の他のサイトカイン、例えばＳＣＦ， Ｇ−ＣＳＦ， ＩＬ−３， ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−６，又はＩＬ−１１（但し、それらだけには限定されない）と組み合して、ＺＣＹＴＯ１８により、培養物において処理される。そのようなエクスビボ使用は特に、全身性投与が患者により耐えられない場合に所望される。従って、本発明は、哺乳類、例えばヒトにおける血小板及び好中球の生成を刺激するための方法を提供する。
【０２６８】
本発明は、哺乳類、エクスビボ組織サンプル又は細胞培養物における血小板及び好中球生成を刺激するための方法を提供する。前記方法は、（ａ）配列番号３アミノ酸残基２２〜１６７のアミノ酸の配列を含んで成るタンパク質；（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の種相同体から成る群から選択された、治療的有効量の造血タンパク質（ここで、前記タンパク質は骨髄又はリンパ前駆体の増殖又は分化、又は血小板の生成を刺激する）を、医薬的に許容できるビークルと組合して、哺乳類、エクスビボ組織サンプル、又は細胞培養物に投与することを含んで成る。
【０２６９】
さらに、血小板及び好中球の増加は、上記のような血液疾患を有するか、又は化学療法を受ける患者においてのみならず、また、正常な条件下でさえ、創傷部位で所望される。インビボで血小板レベルを高めるポリペプチド、例えばＺＣＹＴＯ１８は、通常の切傷、熱傷、裂傷、擦過傷及び同様のものの治療を助けるために、局部製剤、例えばゲル、メッシュ、湿布、液体及び同様のものに使用され得る。さらに、そのような用途は、皮膚、筋肉又は同様のものの治療が内部的に、例えば手術の後でさえ、所望されるいずれかの場合ででも適用され得る。
【０２７０】
本発明のタンパク質はまた、造血細胞の分化及び進化のインビトロ研究のための、例えば細胞分化の機構の解明のための、及び成熟細胞の系統の決定のための価値ある手段であり、そしてまた、細胞培養物における増殖剤として使用され得る。
【０２７１】
分化は進行性で且つ動的な工程であり、多能性幹細胞で始まり、そして最終的に分化された細胞で終結する。拘束なしに系統に再生することができる多能性幹細胞は、細胞系統への拘束が行われる場合、失われる一組の分化マーカーを発現する。前駆体細胞は、細胞が成熟に向かって細胞系統路を進行する場合、発現され続けることができても又はできなくても良い一組の分化マーカーを発現する。成熟細胞により独占的に発現される分化マーカーは通常、機能的性質のもの、例えば細胞生成物、細胞生成物を生成するための酵素、及び受容体である。
【０２７２】
細胞集団の分化の段階は、細胞集団に存在するマーカーの同定によりモニターされる。筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞及び網様細胞は、通常の間葉幹細胞に起因すると思われる（Ｏｗｅｎなど．， Ｃｉｂａ Ｆｄｎ． Ｓｙｍｐ． １３６： ４２−４６， １９８８）。間葉幹細胞のためのマーカーは十分には同定されておらず（Ｏｗｅｎなど．， Ｊ． ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ８７： ７３１−７３８， １９８７）、その結果、同定は通常、前駆体及び成熟細胞段階で行われる。本発明の新規ポリペプチドは、間葉幹細胞及び筋細胞又は他の前駆体細胞を、インビボ及びエクスビボの両者で単離する研究のために有用であり得る。
【０２７３】
最終分化又は脱分化の方の経路に特定細胞型を刺激する因子が、通常の前駆体又は幹細胞に起因する全細胞集団に影響を及ぼすことを示唆する証拠が存在する。従って、本発明は、筋細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神経及び内皮細胞の増殖を刺激するか又は阻害することを包含する。例えば、本発明の分子は、心筋細胞の増殖又は分化を刺激しながら、それらの共通する前駆体／幹細胞に対する効果により、脂肪細胞の増殖又は分化を阻害することができる。従って、本発明の分子は、軟骨肉腫、アテローム硬化症、再狭窄及び肥満症の阻害に使用できる。
【０２７４】
分化を測定するアッセイは、例えば、組織の段階−特異的発現、酸素活性、機能的活性又は形態学的変化に関連する細胞マーカーを測定することを包含する（Ｗａｔｔ， ＦＡＳＥＢ，５：２８１−２８４， １９９１； Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５７： ６３−７５， １９９４； Ｒａｅｓ， Ａｄｖ． Ａｎｉｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， １６１−１７１， １９８９； すべては、引用により本明細書に組み込まれる）。他方では、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド自体は、組織の段階−特異的発現に関連する追加の細胞表面又は分泌されたマーカーとして作用することができる。それ自体、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの直接的な測定、又は分化するにつれて、組織における発現のその損失が、組織の分化のためのマーカーとして作用することができる。
【０２７５】
同様に、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの直接的な測定、又は組織における発現のその損失が、それらが腫瘍の進行を受けるにつれて、組織又は細胞において決定され得る。前癌又は癌状態における細胞の侵襲性及び運動性の上昇、又はＺＣＹＴＯ１８の発現の獲得又は損失が、正常な組織に比較して、腫瘍進行における形質転換、侵襲性及び転移についての診断として作用することができる。進行又は転移の腫瘍段階の知識は、所定の個々の癌患者のために、最も適切な治療又は処理の攻撃性を選択する上で医薬を助けるであろう。
【０２７６】
発現（ｍＲＮＡ又はタンパク質のいずれかの）の獲得及び損失を測定する方法は、当業界において良く知られており、そして本明細書に記載されており、そしてＺＣＹＴＯ１８発現に適用され得る。例えば、細胞運動性を調節するポリペプチドの出現又は消出が、前立腺癌の診断及び予後を助けるために使用され得る（Ｂａｎｙａｒｄ， Ｊ． ａｎｄ Ｚｅｔｔｅｒ， Ｂ． Ｒ．， Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔ． Ｒｅｖ． １７： ４４９−４５８， １９９９）。細胞運動性のエフェクターとして、発現のＺＣＹＴＯ１８獲得又は損失が前立腺及び他の癌についての診断分析として作用することができる。
【０２７７】
さらに、腫瘍進行及び転移に対するＺＣＹＴＯ１８の活性及び効果が、インビボで測定され得る。いくつかの同系マウスモデルが、腫瘍進行に対するポリペプチド、化合物又は他の処理の影響を研究するために開発されて来た。それらのモデルにおいては、培養継代された腫瘍細胞が、腫瘍ドナーと同じ株のマウス中に移植される。細胞は、受容体マウスにおいて類似する特徴を有する腫瘍中に増殖し、そして転移がまた、そのモデルのいくつかにおいて生じるであろう。本発明者の研究のための適切な腫瘍モデルは、中でも、Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１６４２）及びＢ１６黒色腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ． Ｃｒｌ−６３２３）を包含する。
【０２７８】
それらは、インビトロで容易に培養され、そして操作される、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスと同種の通常使用される腫瘍系である。それらの細胞系のいずれかの移植に起因する腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの肺に転移することができる。Ｌｅｗｉｓ肺癌モデルが最近、脈管形成のインヒビターを同定するためにマウスに使用されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， など． Ｃｅｌｌ ７９： ３１５−３２８， １９９４）。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスが、組換えタンパク質、アゴニスト又はアンタゴニストの毎日の注入、又は組換えアデノウィルスの１回の注入を通して、実験剤により処理される。この処理に続いて３日で、１０５〜１０６個の細胞が背面の皮膚下に移植される。
【０２７９】
他方では、細胞自体が、タンパク質が全身的によりもむしろ腫瘍部位で又は細胞内で合成されるよう、移植の前、組換えアデノウィルス、例えばＺＣＹＴＯ１８を発現するアデノウィルスにより感染され得る。マウスは、通常５日以内に眼に見える腫瘍を進行する。腫瘍が３週間までの間、増殖され、この間、それらは対照の処理グループにおいて１５００−１８００ｍｍ３のサイズに達することができる。腫瘍サイズ及び体重が、その実験を通して注意してモニターされる。殺害の時点で、腫瘍が、肺及び肝臓と共に除去され、そして計量される。肺の重量が、転移性腫瘍負荷量と相互関係することが示された。
【０２８０】
さらなる測定として、肺表面転移が計数される。切除された腫瘍、肺及び肝臓が、当業界において知られており、そして本明細書に記載される方法を用いて、組織学的試験、免疫組織化学及び現場ハイブリダイゼーションのために調製される。従って血管構造を回復し、そして転移を受ける腫瘍の能力に対する、問題の発現されたポリペプチド、例えばＺＣＹＴＯ１８の影響が評価され得る。さらに、アデノウィルスとは別に、移植された細胞がＺＣＹＴＯ１８により一時的にトランスフェクトされ得る。
【０２８１】
安定したＺＣＹＴＯ１８ランスフェクトの使用、及びインビボでのＺＣＹＴＯ１８発現を活性化する誘発性プロモーターの使用は、当業界において知られており、そして転移のＺＣＹＴＯ１８誘発を評価するためにこのシステムに使用され得る。さらに、精製されたＺＣＹＴＯ１８又はＺＣＹＴＯ１８ならし培地が、このマウスモデルに直接的に注入され、そして従って、このシステムに使用される。一般的な文献については、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， など． Ｃｅｌｌ ７９： ３１５−３２８， １９９４， 及びＲｕｓｃｉａｎｏ Ｄ， など、Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １４： ３４９−３６１，１９９５を参照のこと。
【０２８２】
ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＺＣＹＴＯ１８活性を高め、又は阻害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異誘発されたＺＣＹＴＯ１８遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子が哺乳類の細胞中に導入され得る。１つの態様においては、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドをコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベクターは、弱毒化された又は欠陥ＤＮＡウィルス、例えばヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２８３】
ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好ましい。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ など．， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２： ３２０−３０， １９９１）、弱毒化されたアデノウィルス  ベクター、例えばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄａｔ など． （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０： ６２６−３０， １９９２） により記載されるベクター、及び欠陥アデノ−関連ウィルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： ３０９６−１０１， １９８７； Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３： ３８２２−２８，１９８９）。
【０２８４】
もう１つの態様においては、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レトロウィルスベクターに導入され得る：Ａｎｄｅｒｓｏｎ など．， アメリカ特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ など．， Ｃｅｌｌ ３３： １５３， １９８３； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２： １１２０， １９８８； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第５，１２４，２６３ 号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ など．， ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９５／０７３５８ 号；及びｋｕｏ など．， Ｂｌｏｏｄ ８２： ８４５−５２， １９９３。 他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−１７， １９８７； 及びＭａｃｋｅｙ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−３１， １９８８）。
【０２８５】
インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。特定細胞へのリポソームの分子標的化は、１つの領域の利点を表す。特定細胞へのトランスフェクションの方向づけが１つの領域の利点を表すことは明白である。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０２８６】
身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子治療のための裸ＤＮＡベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入され得る（例えば、Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ９６３−７， １９９２； Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４６２１−２４， １９８８）。
【０２８７】
アンチセンス方法論が、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子転写を阻害するために、例えば細胞増殖をインビボで阻害するために使用され得る。ＺＣＹＴＯ１８−コードポリヌクレオチドのセグメント（例えば、配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド）に対して相補的であるポリヌクレオチドは、ＺＣＹＴＯ１８−コードのｍＲＮＡに結合し、そしてそのようなｍＲＮＡの翻訳を企画される。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養物又は対象においてＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド−コードの遺伝子の発現を阻害するために使用される。
【０２８８】
本発明はまた、診断用途に使用される試薬を提供する。例えば、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子、すなわちＺＣＹＴＯ１８ ＤＮＡ又はＲＮＡ又はその副配列を含んで成るプローブは、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子がヒト染色体、例えば染色体１２上に存在するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用され得る。ＺＣＹＴＯ１８ゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００７４５８号）の一部を含むヒトゲノムＤＮＡのフラグメントの注釈に基づけば、ＺＣＹＴＯ１８は、染色体１２の１２ｑ１５領域に位置する。ＺＣＹＴＯ１８遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピー数変化、異種性の損失（ＬＯＨ）、トランスロケーション、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２８９】
それらの異常性は、コード配列内、イントロン内、又は上流のプロモーター及び調節領域を包含するフランキング配列内で発生することができ、そしてコード配列内での物理的変更、又は遺伝子発現レベルでの変化として明らかである。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（ＲＥＬＰ）分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記；Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記；Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８： ２５５−６５， １９９５）。
【０２９０】
遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばＹＡＣ， ＢＡＣ又はｃＤＮＡクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照。
【０２９１】
ＺＣＹＴＯ１８は、染色体１２の１２ｑ１５領域に位置する。もう１つのＴ細胞は、サイトカイン、すなわちこの遺伝子座（１２ｑ１４）近くのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）地図を発現し、このことは、１２ｑ１４−１５遺伝子座がＴ−細胞により発現されたサイトカインのために重要な領域であることを示唆する。さらに、ＩＦＮ−γにおける突然変異は、免疫不全に関連する（例えば、Ｔｚｏｎｅｖａ， Ｍ． など．， Ｃｌｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． ３３： ４５４−４５６， １９８８を参照のこと）。ＺＣＹＴＯ１８における突然変異は、たぶん、ヒト疾病、例えば免疫不全、自己免疫疾患、リンパ細胞癌又は他の免疫機能不全を引き起こす。
【０２９２】
さらに、ヒト疾病状態、例えば癌に関連するＺＣＹＴＯ１８遺伝子座を位置決定するいくつかの遺伝子が存在する。１２ｑ１３−ｑ１５領域は、通常の分解点として１２ｑ１５と共に、種々の悪性及び良性固形腫瘍（例えば、唾液腺腫及び子宮平滑筋腫）に関連する。さらに、高い移動性グループのタンパク質イソフォームＩ−Ｃ（ＨＭＧＩＣ）が１２ｑ１５を位置決定し、そして良性脂肪腫及び他の腫瘍に関与する。ＺＣＹＴＯ１８が１２ｑ１５を位置決定するので、ＺＣＹＴＯ１８機能の損失と腫瘍形成又は進行との間に関連性が存在する。
【０２９３】
さらに、１２ｑ１３−１５におけるトランスロケーションは、軟質組織、多発性脂肪腫症及び悪性ミクソイド脂肪肉腫において有力である。ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドプローブは、それらの癌感受性マーカーに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。１２ｑ１５領域における突然変異に起因する癌についての多くの証拠が存在し、そしてＺＣＹＴＯ１８がまたこの染色体遺伝子座を位置決定するので、ＺＣＹＴＯ１８における突然変異はまた、癌、例えばリンパ細胞癌又は他の腫瘍に直接的に包含されるか又は関与する。
【０２９４】
診断は、疾病のタイプ及び適切な関連する治療の決定において医者を助けることができるか、又は遺伝的カウンセリングを助けることができる。それ自体、本発明の抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体、ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド、ｍＲＮＡ又は抗−ＺＣＹＴＯ１８抗体の検出のために使用され、従って当業界において知られており、そして本明細書において記載される方法を用いて、本明細書に記載されるようにして、遺伝的疾病又は癌の検出のためのマーカーとして作用し、そしてそのために直接的に使用される。
【０２９５】
さらに、ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドプローブは、ヒト癌、例えば多発生性脂肪腫瘍症及び悪性ミクソイド脂肪肉腫（上記）に関連する染色体１２ｑ１５欠失及びトランスロケーション、又は悪性又は他の癌における染色体転位に関与することが予測される、腫瘍の悪性進行又は他の１２ｑ１５突然変異に関与する他のトランスロケーションに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。同様に、ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドプローブが、染色体１２ｑ１５三染色体性、及びヒト疾病又は自然流産に関連する染色体欠失に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０２９６】
さらに、他の遺伝子座の中で、肩甲上腕筋萎縮（１２ｑ１３．３−ｑ１５）、コム多糖症（１２ｑ１４）、チトクロームＣＹＰ２７Ｂ１における突然変異の結果としての偽ビタミンＤ抵抗性くる病（１２ｑ１４）及び他のものすべて、ヒト疾病状態においてそれら自体明白であり、そしてヒトゲノムのこの領域を位置決定する。ＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ−ｐｏｓｔ／ｏｍｉｍ／ｇｅｔｍａｐ？ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ＝１２ｑ１５）上の染色体３の２の領域について、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ） 遺伝子地図を参照のこと。それらのすべては、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子と同じ染色体領域への連鎖を示す遺伝性疾病についての可能性ある候補体遺伝子として作用する。従って、ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠失に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０２９７】
上記で論じられるように、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子自体における欠陥は、遺伝性ヒト疾病状態をもたらすことができる。本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子欠陥に関連する疾病の検出、診断予防及び処理を助ける。さらに、ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドプローブは、ＺＣＹＴＯ１８染色体遺伝子座で、疾病又は非疾病の個人間での対立遺伝子差異を検出するために使用され得る。それ自体、ＺＣＹＴＯ１８配列は、法的なＤＮＡプロフィーリングにおける診断として使用され得る。
【０２９８】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。分析用プローブは一般的に、少なくとも２０個の長さのｎｔを有するが、但し幾分短いプローブも使用され得る（例えば、１４−１７ｎｔ）。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５個の長さのｎｔ、好ましくは１５又はそれ以上の長さのｎｔ、より好ましくは２０−３０個の長さのｎｔである。遺伝子又は染色体ＤＮＡの全体的な分析のために、ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドプローブは、完全なエキソン又はそれ以上を含むことができる。エキソンは、ＺＣＹＴＯ１８配列（配列番号１）とＺＣＹＴＯ１８についてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００７４５８号）とを比較することによって、容易に決定される。
【０２９９】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界に知られている。ほとんどの診断方法は、（ｉ）潜在的に疾病の患者、疾病の患者又は劣性疾病対立遺伝子の可能性ある非疾病キャリヤーから遺伝子サンプルを得；（ｉｉ）ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドプローブと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより（ここで、前記ポリヌクレオチドは、ＲＦＩＰ分析においては、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）、又は適切なＰＣＲ反応条件下でＰＣＲ反応において、センス及びアンチセンスプライマーと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより、第１反応生成物を生成し；
【０３００】
（ｉｉｉ）前記第１反応生物を、電気泳動及び／又は他の既知方法により可視化し、例えば、前記第１反応生成物を、ＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチドプローブ（ここで、前記ポリヌクレオチドは第１反応の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）により可視化し、そして（ｉＶ）正常又は対照の個人からの遺伝子サンプルの第２対照反応生成物と、前記可視化された第１反応生成物とを比較する段階を含んで成る。
【０３０１】
第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、疾病又は潜在的に疾病の患者における遺伝子異常性の、又は非疾病患者についてのヘテロ接合性劣性キャリヤー表現型の存在の、又は疾病患者からの腫瘍における遺伝子欠陥の存在の、又は胎児又は移植前胚における遺伝子異常性の存在の表示である。例えば、制限フラグメントパターン、ＰＣＲ生成物の長さ、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子座の反復性配列の長さ、及び同様のもの差異は、遺伝子異常性、遺伝子異常型、又は正常な対照に比較しての対立遺伝子差異の表示である。対照は、サンプルの試験及び利用性に依存して、影響されていないファミリーメンバー又は無関係の個人からであり得る。
【０３０２】
本発明内への使用のための遺伝子サンプルは、患者からのいずれかの組織又は他の生物学的サンプル、例えば血液、唾液、精子、胚細胞、羊水及び同様のもの（但し、それらだけには限定されない）から単離されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、そして配列番号１の一部、配列番号１の補体、又はそれらのＲＮＡ同等物を含んで成る。ヒト疾病表現型ヘの遺伝子連鎖分析を示すそのような方法は、当業界において良く知られている。
【０３０３】
診断における、ＰＣＲに基づく方法の参照のためには、一般的、次の文献を参照のこと：Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９１）， Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ， １９９３）， Ｃｏｔｔｅｒ （ｅｄ）， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｈａｎａｕｓｅｋ ａｎｄ Ｗａｌａｓｚｅｋ （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ。（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）． Ｌｏ （ｅｄ）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）， 及びＭｅｌｔｚｅｒ （ｅｄ）， ＰＣＲ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９８））。
【０３０４】
ＺＣＹＴＯ１８遺伝子座に関連する逸脱は、直接的名突然変異分析のための標準の方法、例えば制限フラグメント長さ他型現象分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体分析、増幅−不応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、ＲＮアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る
【０３０５】
（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９１）， Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５ （１９９５）， Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｅｌｌｅｓ （ｅｄ．） Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （ｅｄ．）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｂｕｒｒｅｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏｌ． ２： Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８）， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）， 及び
【０３０６】
Ｒｉｃｈａｒｄｓ ａｎｄ Ｗａｒｄ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ，” ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｐａｇｅｓ ８３−８８ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓａ． Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）。突然変異についてのＺＣＹＴＯ１８遺伝子の直接的な分析は、対象のゲノムＤＮＡを用いて行われ得る。末梢血液リンパ球から得られるゲノムＤＮＡを増幅するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ａｔ ｐａｇｅ ７．１．６ ｔｏ ７．１．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８） を参照のこと）。
【０３０７】
“トランスジェニックマウス”として言及される、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子を発現するように構築されたマウス、及び“ノックアウトマウス”として言及される、ｚａｌｐｈａ１１リガンド遺伝子機能の完全な不在を示すマウスがまた、生成され得る（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： １０８３， １９９２； Ｌｏｗｅｌｌなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６： ７４０−７４２， １９９３； Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １２８８−１２９２， １９８９； Ｐａｌｍｉｔｅｒなど．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２０： ４６５−４９９， １９８６）。例えば、偏在的に、又は組織−特異的又は組織−制限されたプロモーター下でＺＣＹＴＯ１８を過剰発現するトランスジェニックマウスは、過剰発現が表現型を引き起こすかどうかを決定するために使用さえ得る。
【０３０８】
例えば、野生型ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド、そのポリペプチドフラグメント又は変異体の過剰発現は、正常な細胞工程を変更することができ、ＺＣＹＴＯ１８発現が機能的に適切であり、そしてＺＣＹＴＯ１８、そのアゴニスト又はアンタゴニストのための治療標的物を示すことができる組織を同定する表現型をもたらす。例えば、構築する好ましいトランスジェニックマウスは、成熟ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド （配列番号３のアミノ酸残基２３（Ｐｒｏ）−１６７（Ｉｌｅ））を過剰発現するものである。さらに、そのような過剰発現は、ヒト疾病との類似性を示す表現型をもたらすことができる。
【０３０９】
同様に、ノックアウトＺＣＹＴＯ１８マウスは、ＺＣＹＴＯ１８がインビボで絶対的に必要とされる場所を決定するために使用され得る。ノックアウトマウスの表現型は、ＺＣＹＴＯ１８アンタゴニスト、例えば本明細書に記載されるそれらのもののインビボ効果を予測することができる。ヒト又はマウスＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡは、ノックアウトマウスを生成するために使用される。それらのマウスは、ＺＣＹＴＯ１８遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質をインビボシステムにおいて研究するために使用され得、そして対応するヒト疾病のためのインビボモデルとして使用され得る。さらに、本明細書に記載される、ＺＣＹＴＯ１８に対して向けられた、ＺＣＹＴＯ１８アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムのトランスジェニックマウス発現がまた、上記トランスジェニックマウスと同じようにして使用され得る。研究が、精製されたＺＣＹＴＯ１８タンパク質の投与により行われ得る。
【０３１０】
医薬使用のためには、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口、特に静脈内又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤は、ＺＣＹＴＯ１８タンパク質を、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共にを含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【０３１１】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示される。治療用量は、一般的に、０．１〜１００μｇ／ｋｇ患者の体重／日、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。
【０３１２】
用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与され得、又は慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。一般的に、ＺＣＹＴＯ１８の治療的有効量は、造血又は免疫機能における臨床学的に有意な変化を生成するのに十分な量である。
本発明は、次の非制限的な例によりさらに例示される。
【０３１３】
実施例
実施例１．ＺＣＹＴＯ１８を同定し、クローン化するためのＥＳＴ配列の利用
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドをコードしている新規ＺＣＹＴＯ１８は、サイトカインファミリー内の保存モチーフに相同的な配列に関するＥＳ１データベースに問い合わせすることでまず同定された。ヒトＴリンパ細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の一次発現配列タグ（ＥＳＴ）が同定された。
【０３１４】
ＥＳＴ（ＵＮＣ４３４５４８６）の配列分析より最初の部分配列を得た。追加の５‘配列はノーザン分析（実施例２、以下）からのＰＣＲにより、およびヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）ｃＤＮＡを用いたＰＣＲにてオリゴヌクレオチドＺＣ２５．８４０（配列番号５）およびＺＣ２５，８４１（配列番号６）を使用する別のＰＣＲにより得たｃＤＮＡ断片の配列分析から得た。サーモサイクラーの条件は、下記実施例２に記載されている。えら得た１０８２ｂｐの完全長配列は配列番号１に開示されており、そして対応するアミノ酸配列は配列番号２および配列番号３に示されている。完全長の新規サイトカインはＺＣＹＴＯ１８と命名された。
実施例２．Ｚｃｙｔｏ１８の組織分布
ノーザンは、ヒトＺＣＹＴＯ１８の組織分布を決定するために、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア（ＣＡ）州）製ヒトマルチプル組織ブロット（ＭＴＮ１、ＭＴＮ２およびＭＴＮ３）を使い実施された。２３７ｂｐのｃＤＮＡプローブはＰＣＲを用い得た。オリゴヌクレオチドＺＣ２５，８３８（配列番号７）およびＺＣ２５，８３９（配列番号８）をプライマーとして用いた。マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）ｃＤＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）およびプロトコルを用い自家調製されたマラソンｃＤＮＡを鋳型に用いた。ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に加え、次のヒト組織特異的ｃＤＮＡも用いた：リンパ節、骨髄、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、脾臓およびＭＬＲ。
【０３１５】
サーモサイクラー条件は次の通りであった：９４℃２分間１サイクル；９４℃１５秒間、６２℃２０秒間および７２℃３０秒間を３５サイクル；７２℃７分間１サイクル；以後４℃に維持。正確な予想バンドサイズ（２３７ｂｐ）は、ゲノムＤＮＡ反応に加え、ＣＤ４＋およびＭＬＲ反応の４％アガロースゲルに観察された。バンドは切り出され、そしてゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、チャトワース（Ｃｈａｔｏｗｏｒｔｈ）、カリフォルニア州（ＣＡ））をメーカー指示通りに使用し精製された。ｃＤＮＡはレディプライム（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ）ＩＩＤＮＡ標識キット（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｉｇｈｔｓ）、イリノイ州（ＩＬ））をメーカー指示通りに使用し、放射線標識された。
【０３１６】
プローブはＮＵＣＴＲＡＰプッシュカラム（ソトラタジーンクローニングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ラジョラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用い精製された。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））液はプレハイブリダイゼーション用およびハイブリダイゼーション液として使用された。
【０３１７】
ハイブリダイゼーションは、２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ標識プローブを用い、５５℃にて一晩行われた。次にブロットは２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、室温にて洗浄され、続いて２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにより６５℃にて洗浄され、さらに０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにより６５℃にて洗浄された。ブロットはバイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）ＭＳフィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ）、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ））に５日間感光させた。転写シグナルは現像後ＭＴＮブロット上に観察された。
【０３１８】
８種類のハウスキーピング遺伝子に標準化された各種組織由来ＲＮＡを含むＲＮＡマスタードットブロット（クローンテック）も上記同様にプローブ処理しハイブリダイゼーションした。ゲノムＤＮＡにシグナルが観察された。リンパ節に弱いシグナルが、そして胎児肝臓、平滑筋および胎盤に非常に弱いシグナルが観察されたが、これらシグナルがバックグランドより有意に高いか否かは確定されなかった。
【０３１９】
実施例３．ＲＴ−ＰＣＲを用いたＺＣＹＴＯ１８発現細胞の同定
特定のタイプのヒト細胞を単離し、ＲＴ−ＰＣＲを利用しＺＣＹＴＯ１８発現についてスクリーニングした。Ｂ細胞は、１００μｍナイロン製ストレーナー（ベクトンディッキンソンバイオサイエンス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、フラクリンレイク（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅ）、ニュージャージー（ＮＪ））を通過させ機械的に破壊し、新鮮ヒト扁桃より得た。Ｂ細胞懸濁液は、ＶａｒｉｏＭＡＣＳ ＶＳ＋磁性カラムおよびＣＤ１９マイクロビーズ（ミルテニルバイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、アーバン（Ａｕｂｕｒｎ）、カリフォルニア州（ＣＡ））をメーカー指示書通りに使用したポジティブ選別により濃縮された。
【０３２０】
Ｔ細胞はヒトアフェレーシス血液サンプルより単離された。ＣＤ３＋Ｔ細胞はＣＤマイクロビーズＶａｒｉｏＭＡＣＳポジティブ選別により精製され、そして単球はＶａｒｉｏＭＡＣＳネガティブ選別カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）をメーカー指示書通りに使用し精製された。各集団からのサンプルは染色され、蛍光抗体セルソーティング（ＦＡＣＳ）（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｉｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、サンジョース（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）、カリフォルニア州（ＣＡ））分析装置により分析され、濃縮率および収率を決定した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は約９６％精製され、ＣＤ３＋Ｔ細胞は約９５％精製され、そして単球は約９６％精製された。
【０３２１】
ＲＮＡは当業界標準的方法を用い、休止状態または活性状態のいずれかにある３種類全ての細胞より調製された。ＲＮＡは上記カラム標本より直接、休止細胞から単離された。ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞は、５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（カリビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラジョラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））およびイノマイシン０．５ｕｇ／ｍｌ（カリビオケム（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ）を含むＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中に５００、０００細胞／ｍｌの割合で４時間および２４時間培養することで活性化された。
【０３２２】
単球は１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズリー州（ＭＯ））および１０ｎｇ／ｍｌのｒＨＩＦＮ−ｇ（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス（Ｍｉｎｅｎｅａｐｏｌｉｓ）、ミネソタ州（ＭＮ））を含むＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中に２４時間培養することで活性化された。細胞は集められ、ＰＢＳ中に洗浄された。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ＭｉｄｉｐｒｅＴＭキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））をメーカー指示書通りに用い細胞より調製され、第１鎖ｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＴＭキット（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州（ＮＹ））をメーカー指示書通りに使用し作成された。
【０３２３】
オリゴＺＣ２５，８３８（配列番号７）およびＺＣ２５，８４０（配列番号５）はＰＣＲ反応中に用いられ、上記サンプルをＺＣＹＴＯ１８メッセージに相当する４７３ｂｐ断片についてスクリーニングした。ＰＣＲ増幅はＴａ１ポリメラーゼ（ＢＲＬ、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州（ＮＹ））および以下の反応条件を用い行われた：９４℃１５秒間、６２℃２０秒間、７２℃３０秒間を３５サイクル；７２℃７分間１サイクル；および４℃浸漬。各容積５０μｌのうち５μｌを０．９％のアガロース、０．５ＸＴＢＥゲルに泳動し、得られた産物を同定した。下の第５表に結果を示す。ＰＣＲマスターミックス産物は、産物が無い場合には（−）、予想されたＰＣＲ産物が視認された場合には（＋）、ＰＣＲ産物が多く存在する場合には（＋＋）、そして最もシグナルが強い場合を（＋＋＋）と等級付けされた。
【０３２４】
【表５】
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【０３２５】
これらの結果は、ＺＣＹＴＯ１８メッセージが休止状態のＣＤ３＋細胞に存在すること、そして分裂促進物質による活性化により増加することを示している。さらに４時間活性化されたヒトＣＤ１９＋Ｂ細胞でも発現されていること、２４時間活性化したＢ細胞では減少していることも明らかにされた。
【０３２６】
実施例４．活性化Ｔ細胞ライブラリー中のｈＺＣＹＴＯ１８メッセージの同定
Ａ．ＣＤ３＋選別ライブラリー構築に適したベクター
ＣＤ３＋選別ライブラリーの構築に適したベクターはｐＺＰ７ＮＸであった。ＺＰ７ＮＸベクター以下の様にして事前に構築された：ベクターｐＺｐ７中のＤＨＦＲ選択マーカーのコーディング領域が、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ制限酵素（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いたＤＮＡ消化により取り出された。消化したＤＮＡは１％アガロースゲルにかけられた後切り出され、キアゲンゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））をメーカー指示書通りに使用してゲル精製された。
【０３２７】
Ｚｅｏｃｉｎ選択マーカーのコーディング域を示すＤＮＡ断片は、プライマーＺＣ１３，９４６（配列番号９）およびＺＣ１３，９４５（配列番号１０）と、鋳型としてｐＺｅｏＳＶ２（＋）を用いたＰＣＲにより増幅された。プライマーＺＣ１３，９４６（配列番号９）にはさらにＰｓｔＩおよびＢｃｌＩ制限部位が、そしてＺＣ１３，９４５（配列番号１０）にはＮｃｏＩおよびＳｆｕＩ部位が存在している。ＰＣＲ断片はＰｓｔＩおよびＮｃｏＩ制限酵素で切断され、前記２酵素を用いた切断とそれに続くゲル精製により調製されたｐＺＰ７ベクター内にクローン化された。このベクターをｐＺＰ７Ｚと命名した。次にベクターｐＺＰ７ＺをＢｃｌＩとＳｆｕＩ制限酵素でＤＮＡ消化し、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）コーディング域を取り出した。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル上に泳動し、切り出し、ゲル精製し、同じ制限酵素（ＢｃｌＩとＳｆｕＩ）を用いｐＺｅｍ２２８より切り出したネオマイシンコーディング域のＤＮＡ断片に連結した。
【０３２８】
この新規ベクターはｐＡＰ７Ｎと命名されたが、このベクターではＤＨＦＲ選択マーカーのコーディング領域はベクターｐＺｅｍ２２８由来のネオマイシン選択マーカーのコーディング領域に置き換えられている。ｃＤＮＡの効率的な指向型クローニングに好適なベクターを作り出すためにＸｈｏ１部位を含むスタッファー断片がｐＺＰ７Ｎに加えられた。ｃＤＮＡ用ベクターを調製するため、２０μｇのｐＺＰ７ＮＸを２０単位のＥｃｏＲＩ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ガイザーブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州（ＭＤ））および２０単位のＸｈｏ１（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ州（ＩＮ）で５時間、３７度、次に６８度１５分間消化された。
【０３２９】
次に、消化体は０．８％の低融点アガロース１×ＴＡＥゲルで泳動し、ベクターからスタッファーを分離した。ベクターのバンドを切り出し、“ベータアガロース”（ニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、バーバーリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））でメーカー推奨に従い消化された。エタノール沈殿後消化されたベクターは、下記ＣＤ３＋選択ｃＤＮＡライブラリーの連結を目的として、水中に４５ｎｇ／ｍｌで懸濁された。
【０３３０】
Ｂ．一次ヒト活性化ＣＤ３＋選択細胞ｃＤＮＡライブラリーの調製
イノマイシン／ＰＭＡ中にて刺激された約１．５×１０８一次ヒトＣＤ３＋選択細胞は、３７度にて１３時間培養した後遠心分離により単離された。全ＲＮＡはキアゲン社（バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））”ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ”キットを使って、細胞沈査より単離された。ｍＲＮＡは２２５ｍｇの全ＲＮＡよりＣＰＧ社（リンカンパーク、ニュージャージ州（ＮＪ））製“ＭＰＧｍＲＮＡ精製キット”を使い単離された。３．４ｍｇのｍＲＮＡが単離され、以下の手順により２本鎖ｃＤＮＡに変換された。
【０３３１】
刺激されたヒトＣＤ３＋選択細胞由来の第１鎖ｃＤＮＡは次の様に合成された。０．３４μｇ／μｌの濃度のオリゴｄ（Ｔ）−選択ポリ（Ａ）ＣＤ３＋ＲＮＡを９μｌおよびＸｈｏＩ制限部位を含む第１鎖プライマーＺＣ１８，６９８（配列番号１１）１μｇ／μｌと混合し、６５℃で４分間加熱した後氷上で冷却した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は、第１鎖バッファー（５×ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）バッファー、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を９μｌ、４μｌの１００ｍＭジチオスレイトールおよびｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび５−メチル−ｄＣＴＰを各１０ｍＭ含むデオキシヌクレオチド３リン酸液（ファルマシアバイオテック社（Ｐｈａｒｍａｉｃａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）をＲＮＡ−プライマー混合液に加え、開始した。
【０３３２】
反応混合液は４５℃にて４分間インキュベーションされた後、８μｌの２００Ｕ／μｌのＳＵｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標）、ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））が追加された。反応液は４５℃にて４５分間インキュベーションされ、続いて２分ごとに１℃の割合で５０℃までインキュベーション温度を上げていった。
【０３３３】
２次構造を変性させｃＤＮＡをさらに延長するため、反応液を次に７０℃にて２分間加熱してから４分間５５℃まで下げ、その後２μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩを加えて更に１５分間インキュベーションし、続いて７０℃まで１分／１℃の割合で温度を上げていった。２μｇのグリコーゲンキャリアー、２．０Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５倍量のエタノール存在下に２回沈殿を行った後、７０％エタノール１００μｌを使った洗浄を行い、ｃＤＮＡから見取り込みヌクレオチドを取り除いた。ｃＤＮＡは第２鎖合成に使用するために、９８μｌの水に懸濁した。
【０３３４】
第２鎖合成は、第１鎖ｃＤＮＡを使い、第２鎖合成の第１鎖プライミングを促進し、結果としてＤＮＡヘアピンを形成させる条件で実施された。第２鎖反応液は第１鎖ｃＤＮＡ９８μｌ、３０μｌの５×ポリメラーゼＩバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５００ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２μｌの１００ｍＭジチオスレイトール、各デオキシヌクレオチド３リン酸を１０ｍＭづつ含む６μｌの溶液、５μｌの５ｍＭのｂ−ＮＡＤ、３Ｕ／μｌの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．））１μｌおよび１０Ｕ／μｌの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ニューイングランドバイオラブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．））を含んだ。
【０３３５】
反応液は室温にて混ぜ合わされ、そして室温にて２分間インキュベーションされ、続いて３．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））４μｌが加えられた。反応液は１５℃にて２時間インキュベーションされた後、室温で１５分間インキュベーションされた。１ＭのＴＩＲＳ、ｐＨ７．４を１０μｌ反応液に加え、フェノール／クロロフォルムで２回、クロロフォルムで１回抽出した後有機相を５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で逆抽出し、その他水性物とプールし、０．３Ｍ酢酸ナトリウム存在下にエタノール沈殿した。沈殿を１００μｌの７０％エタノールで洗浄した後、風乾し、４０μｌの水に懸濁した。
【０３３６】
ヘアピン構造の第１鎖ＤＮＡを大豆ヌクレアーゼで切断した。反応混合液は第２鎖ｃＤＮＡ４０μｌ、１０×大豆ヌクレアーゼバッファー（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５μｌ、１×大豆ヌクレアーゼバッファー中に１Ｕ／μｌに希釈された大豆ヌクレアーゼ（ファルマシアバイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．））を含んだ。反応液を３７℃にて４５分間インキュベーションした。反応は１ＭのＴｉｒｓ：ＨＣｌ，ｐＨ７．４を添加して停止した後、上記同様に連続してフェノール／クロロフォルムおよびクロロフォルム抽出を行った。抽出後、ｃＤＮＡは０．３Ｍ酢酸ナトリウム存在下にエタノール沈殿された。沈殿は１００μｌの７０％エタノールで洗浄、風乾した後、３８μｌの水に懸濁された。
【０３３７】
懸濁されたｃＤＮＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いブラントエンド処理された。３８μｌの水に懸濁されたｃＤＮＡを１２μｌの５×Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ：ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、各デオキシヌクレオチド３リン酸を１０ｍＭ含む溶液６μｌ、および２μｌの１Ｕ／μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．））と混合した。１５℃にて４５分間インキュベーションした後、反応を３０μｌのＴＥを添加し停止し、続いて上記同様に連続してフェノール／クロロフォルムおよびクロロフォルム抽出を行い、２０μｌのＴＥにて逆抽出した。ＤＮＡは２μｌのＰｅｌｌｅｔ ＰａｉｎｔＴＭ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）キャリアーおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウム存在下にエタノール沈殿された後、１１μｌの水に懸濁された。
【０３３８】
ＥｃｏＲＩアダプターを上記ｃＤＮＡの５’末端に連結し、発現ベクター内にクローニングできる様にした。１１μｌのｃＤＮＡと６５ｐｍｏｌｅ／μｌのＥｃｏＲＩ半ホスホリル化アダプター（ファルマシアバイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．））を、５μｌの５×リガーゼバッファー（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μｌの１０ｍＭＡＴＰおよび３μｌの１Ｕ／μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１μｌの１０×ライゲーションバッファー（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）、９μｌの水と混合した。１×バッファーによる追加希釈を行い、沈殿によるペレットペイントを防止した。反応液は９時間かけ１０℃から２２℃に温度上昇した水槽中でインキュベーションされ、その後２５℃で４５分間インキュベーションされた。反応は６８℃、１５分間インキュベーションすることで終止された。
【０３３９】
ｃＤＮＡの発現ベクター内への指向クローニングを容易にするため、ｃＤＮＡはＸｈｏＩで消化され、その結果５’ＥｃｏＲＩ接着端および３’ＸｈｏＩ接着端を持つｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡ３’端のＸｈｏＩ制限部位はＺＣ１８６９８プライマーを用い事前に導入された。制限酵素消化は、上記ライゲーション混合液３５μｌ、１０×Ｈバッファー（ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．）、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（バイオラブス社（Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃｏｒｐ）１μｌ、１７μｌの水および４０Ｕ／μｌのＸｈｏＩ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｍｉ））１μｌを含む反応混合液中に実施された。反応は６８℃１５分間インキュベーションすることで終止され、続いて上記同様にエタノール沈殿、洗浄乾燥され、３０μｌの水に懸濁された。
【０３４０】
懸濁されたｃＤＮＡは６５℃に５分間加熱された後氷上にて冷却され、４μｌの５×ゲルローディング色素（リサーチジェネティクス社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．））が加えられ、ｃＤＮＡは０．８％低融点アガロース１×ＴＡＥゲル（ＳＥＡ ＰＬＡＱＵＥ ＧＴＧＴＭ低融点アガロース：ＦＭＣ社）にかけられ、電気泳動された。混入したアダプターおよび０．６Ｋｂより短いｃＤＮＡをゲルから切り出した。電極を逆にし、溶解したアガロースを加えウエルを満たし、バッファーを交換しｃＤＮＡをレーンの出発点近くに濃縮するまで電気泳動した。濃縮したｃＤＮＡを含むゲル領域を切り出し、微量遠心チューブに入れ、アガロースを６５℃に１５分間加熱し溶解した。
【０３４１】
サンプルを４５℃に平衡化した後、２μｌの１Ｕ／μｌのＢｅｔａ−アガロースＩ（バイオラブス社（Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ）を加え、混合体を９０分間、４５℃にインキュベーションしアガロースを消化した。インキュベーション後、１／１０容積量の３Ｍ酢酸ナトリウムをサンプルに加え、そして混合体を１５分間氷上にてインキュベーションした。サンプルを１４，０００×ｇで１５分間、室温にて遠心分離し、未消化のアガロースを除き、ｃＤＮＡをエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄、風乾後に４０μｌの水に懸濁した。ベクターに対するｃＤＮＡの最適比を決定するために、複数の連結体を組み立て電気泳動した。
【０３４２】
簡単に述べると、２μｌの５×Ｔ４リガーゼバッファー（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、１０ｍＭのＡＴＰ１μｌ、ＥｃｏＲ１−Ｘｈｏ１で消化されたｐＺＰ７ＮＸ１μｌ、０．２５ｕ／μｌ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈されたＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｌｌを水で１０μｌにしたもの、およびｃＤＮＡ０．５、１、２、または３μｌを別々に４種類の連結体として混合し、２２℃にて４時間、６８℃で２０分間インキュベーションした後アセテート−エタノール沈殿し、洗浄、乾燥後１０ｌｌに懸濁した。
【０３４３】
各連結体の１マクロリットルを４０μｌのＤＨ１０ｂ ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＴＭエレクトロコンペテント細菌（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））内に、０．１ｃｍキュベット（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））と２．５ＫＶ、２５ＩＦ、２００オームにセットされたパルスコントローラであるセットジーンパルサー（Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ）（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））を用いエレクトロポレーションされた。
【０３４４】
これらの細胞はすぐに１ｍｌのＳＯＣブロス（Ｍａｎｎｉａｔｉｓら、上記）に懸濁され、続いて５００ｌｌの５０％グリセロール−ＳＯＣに懸濁され保存液とした。これら“グリセロール保存液”は複数に小分けされ、−７０℃に凍結された。それぞれの小分け１つを溶解し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが添加されたＬＢ−寒天培地に連続的に接種された。コロニー数は、ｐＺＰ７ＮＸベクターに対するＣＤ３＋ｃＤＮＡの最適比が４５ｎｇに対し１μｌであること、そしてこの様な結合体が４．５百万個の一次コロニーを生ずることを示した。
【０３４５】
Ｃ．活性化Ｔ細胞ライブラリー内のＺＣＹＴＯ１８メッセージのＰＣＲ同定
ＰＣＲはオリゴＺＣ２５，８３８（配列番号７）およびＺＣ２５，８４０（配列番号５）を用い実施され、ＺＣＹＴＯ１８クローンに対応する４７３ｂｐ産物の存在に関し、上記ライブラリーをスクリーニングした。ＰＣＲ僧服はＴａｑポリメラーゼ（ＢＲＬ、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｌａｎｄ）ニューヨーク州（ＮＹ））を用い行われ、条件は次の通りである：９４℃１５秒間、６２℃２０秒間、７２℃３０秒間を３０サイクル、７２℃７分間を１サイクル；および４℃に浸漬。各５０μｌの反応容積から５μｌを０．９％アガロース０．５×ＴＢＥゲルで泳動し、得られた産物を同定した。下の第６表にその結果を示す。ＰＣＲ産物は、産物が無い場合には（−）、予想されたＰＣＲ産物が視認された場合には（＋）、ＰＣＲ産物が多く存在する場合には（＋＋）、そして最もシグナルが強い場合を（＋＋＋）と等級付けされた。
【０３４６】
【表６】
2003524415.tif 000007
これらの結果は、活性化されたＣＤ３＋Ｔ細胞にＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡクローンが、即ちメッセージが存在することを示している。
【０３４７】
実施例５．サザンブロット分析
サザンブロット分析は、ＥＶＯ哺乳動物群／ＥｃｏＲＩサザンブロット（クオンタムバイオテクノロジーズ社（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、モントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａｌ）、カナダ（Ｃａｎａｄａ））を用い実施し、オルトログ型ＺＣＹＴＯ１８配列の存在を決定した。ＺＣＹＴＯ１８プローブは２５ｎｇの実施例２記載のＺＣＹＴＯ１８断片を、Ｐｒｉｍｅ−ＩｔＩＩランダムプライマー標識化キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用い標識し、作製した。ハイブリダイゼーションは、Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を須加って５×１０５ｃｐｍ／ｍｌプローブと６５℃一晩の条件で実施された。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い、４５℃にて厳密洗浄が行われた。ブロットは−８０℃にて一晩Ｘ線フィルムに感光され、分析された。
【０３４８】
結果はヒトゲノムＤＮＡサンプル中に約１ｋｂの強いバンドを示すと同時に、マウスゲノムＤＮＡについて約７および２０ｋｂの位置に弱いバンドがあることを示し、ＺＶＹＴＯ１８に関しマウス相同体と思われるものあることを提示した。マウスｃＤＮＡ配列を標準的方法を用いクローン化し配列番号３７に示し、それに対応するポリペプチド配列を配列番号３８に示す。
【０３４９】
実施例６．Ｚｃｙｔｏ１８の局在染色体と位置
Ｚｃｙｔｏ１８は市販版“スタンフォード（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）Ｇ３放射ハイブリッドマッピングパネル”（リサーチジェネティクス社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， ハウンツヴィル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州（ＡＬ））を用い、第１２染色体にマップされた。“スタンフォードＧ３ＲＨパネル”は、全ヒトゲノムの８３放射ハイブリッドクローンそれぞれに由来するＤＮＡと、２種類のコントロールＤＮＡ（ＲＭドナーおよびＡ３レシピエント）を含む。公開ＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｈｇｃ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）でマーカーおよび遺伝子の染色体局在を知ることができる。
【０３５０】
“スタンフォードＧ３ＲＨパネル”を用いＺｙｔｏ１８をマッピングするために、２０μｌの反応液をＰＣＲに対応した９６ウエルマイクロタイタープレート（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア（ＣＡ））に準備し、“ロボサイクラーグラジエント９６（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６）”サーマイルサイクラー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に用いた。８５種類のＰＣＲ反応液はそれぞれ２μｌの１０×ＫｌｅｎＴａｑ ＰＣＲ反応バッファー（クローンテックラボラトリーズ社（ＣＬＯＮＴＨＥＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））、
【０３５１】
１．６μｌのｄＮＴＰｓｍｉｘ（各２．５ｍＭ、パーキンエルマー（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州（ＣＡ））、１μｌセンスプライマー、ＺＣ２６，４１４（配列番号１２）、１μｌアンチセンスプライマー、ＺＣ２６，４１５（配列番号１３）、２μｌ“レディロード（ＲｅｄｉＬｏａｄ）”（リサーチジェネティクス社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， ハウンツヴィル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州（ＡＬ））、０．４μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックス（クローンテックラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｈｅｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、各ハイブリッドクローンまたはコントロール由来のＤＮＡ２５ｎｇ、合計容積２０μｌに必要な蒸留水より構成されている。
【０３５２】
反応液には等量のミネラルオイルが重層され、密封される。ＰＣＲサイクラー条件は次の通りである：９４℃に於ける５分間変性の初期１サイクル、９４℃４５秒変性、６６℃４５秒アニーリングおよび７２℃１分１５秒の伸長を３５サイクルの後、７２℃７分間の最終伸長サイクル１回。反応物は２％アガロースゲル（ＥＭサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ギブスタウン（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）を用いた電気泳動で分離され、エチジウムブロマイド染色され視覚化された。
【０３５３】
結果は、ＬＯＤスコア＞１２で第１２染色体マーカーＳＨＧＣ−１７５３３とＺｃｙｔｏ１８は連鎖していること、およびマーカーとの距離が０ｃＲ＿１００００であることが示された。周辺遺伝子およびマーカーを利用し、Ｚｃｙｔｏ１８が１２ｑ１４−ｑ２４．３染色体域内に位置付けられた。
【０３５４】
実施例７．ＣＥＥタグ付きＺＣＹＴＯ１８作製用構築体
オリゴヌクレオチドはコザック（Ｋｏｚａｋ）配列および停止コドンを除くＺＣＹＴＯ１８のコーディング域を含むＰＣＲ断片を作製するためにデザインされた。これらオリゴヌクレオチドは、我々のＣ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ付き（配列番号１４）蛋白質の哺乳動物発現用標準的ベクターであるｐＨＺ２００−ＣＥＥへのクローニングを容易にするために５’末端にＫｐｎＩ部位を、３’末端にＢａｍＨＩ部位を持つ様デザインされた。ｐＨＺ２００ベクターはＭＴ−１プロモーターを含む。
【０３５５】
ＰＣＲ反応はＴｕｒｂｏ Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用い実施され、ＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡ断片が増幅された。約２０ｎｇのヒトＺＣＹＴＯ１８ポリヌクレオチド鋳型（配列番号１）およびオリゴヌクレオチドＺＣ２８５９０（配列番号１６）とＺＣ２８５８０（配列番号１７）がＰＣＲ反応に用いられた。ＰＣＲ反応条件は次の通りであった：９５℃５分間；９５℃６０秒、５５℃６０秒および７２℃６０秒を３０サイクル；および７２℃１０分間；その後４℃に維持。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動にて分離され、ＱｉａＱｕｉｃｋ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用い精製された。単離された約６００ｂｐのＤＮＡ断片はＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化され、ゲル精製された後事前にＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化しておいたｐＨＺ２００−ＣＥＥ内に連結された。
【０３５６】
約１マイクロリッターの連結反応体は、メーカー指示書に従いＤＨ１０Ｂ ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＴＭコンペテント細胞（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ガイザースブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州（ＭＤ））内にエレクトロポレーションされ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＰプレート上に接種され、一晩インキュベーションされた。コロニーを拾い上げ、オリゴヌクレオチドＺＣ２８，５９０（配列番号１６）およびＺＣ２８，５８０（配列番号１７）と、上記ＰＣＲ条件を用いたＰＣＲによりスクリーニングした。次にインサートを含むクローンを配列解析し、ＺＣＹＴＯ１８インサートに誤りがないことを確認した。配列分析で確認しながら、ｐＨＺ２００−ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥ構築体の最大調整を行った。
【０３５７】
実施例８．ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥポリペプチドのトランスフェクションと発現
ＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ番号、ＣＲＬ−１０３１４）を無血清（ＳＦ）ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ  高グルコース）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ガイザースブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州（ＭＤ））６．４ｍｌ中に、約１×１０６細胞／１００ｍｍ培養皿の割合に接種した。細胞は、メーカー指示書に従って無血清（ＳＦ）ＤＭＥＭ中にリポフェクチン（ＬｏｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を使用し、上記（実施例７）ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥを含む発現ベクターでトランスフェクションされた。
【０３５８】
細胞は３７℃で約５時間インキュベーションされ、続いて１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ州（ＵＴ））が加えられた。プレートは３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベーションされ、翌日ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地を選択培地（１μＭメトトレキセート（ＭＴＸ）添加５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）に交換した。
【０３５９】
トランスフェクション後約７−１０日目に、細胞またはコロニーのプールを機械的にて５μＭ ＭＴＸ入添加５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭが１ｍｌ入った１２ウエル型プレートに取り上げ、集密状態まで増殖させた。次に細胞は１０μＭのＭＴＸが添加された５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中に最低１４日間インキュベーションされた。陽性発現したクローナルなコロニーおよびプールからのコンディショニング培地サンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析を用い発現レベルを試験した。高発現クローンのプールを取り上げ、細胞が発現しているＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥを精製するためのコンディショニング培地を大量に得るため拡張した（実施例９）。
【０３６０】
実施例９．ＢＨＫ５７０細胞からのＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥの精製
特に記載ない限り、全ての作業は４℃にて実施された。Ｃ−末端ＧｌｕＧｌｕ（ＥＥ）タグ（配列番号１４）を含むＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドを精製するために、次の方法を用いた。プロテアーゼ阻害剤液を、ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥを含む濃縮コンディショニング培地（実施例８）に最終濃度が２．５ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズリー州（ＭＯ））、０．００３ｍＭロイペプチン（ベーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒーＭａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ州（ＩＮ）、０．００１ｍＭペプスタチン（ベーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒーＭａｎｎｈｅｉｍ））および０．４ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ（ベーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒーＭａｎｎｈｅｉｍ））になるように加えた。
【０３６１】
抗ＥＥ Ｇ−セファロース（下記に従い調製）約１００ｍｌのカラムをウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＡＰ−５、５ｃｍ×１０ｃｍガラスカラムに注ぎ入れた。カラムはフロー充填され、ＢｉｏＣａｒｄ Ｓｐｒｉｎｔ（パーセプティブバイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、フラミンガム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））を用いてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐｈ７．４で平衡化された。濃縮コンディショニング培地は０．２ミクロン滅菌濾過、ｐＨを７．４に調製されてから、約１ｍｌ／分の流速で一晩カラムに負荷された。
【０３６２】
カラムは１０倍のカラム容積量（ＣＶｓ）のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄され、次に０．１ｍｇ／ｍｌのＥＥペプチド（アナスペック（Ａｎａｓｐｅｃ）、サンジョーズ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）、カリフォルニア（ＣＡ））を含む２００ｍｌのＰＢＳを用い５ｍｌ／分で溶出された。使用したＥＥペプチドは配列ＥＹＭＰＭＥ（配列番号１３）を有している。全溶出クロマトグラフィーについて５ｍｌ分画を採取し、２８０および２１５ｎＭの吸光度をモニターした：通過液および洗浄液のプールも集め、分析した。ＥＥ−ポリペプチドの溶出ピーク分画を対象に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色法および抗ＥＥ−ＨＲＰ標識抗体を用いたウエスタンブロッティングにより標的蛋白質について分析した。関心のポリペペプチド溶出分画をプールし、１０，０００ダルトン分子量カットオフのメンブレンスピン濃縮装置（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）をメーカー指示書通りに使用し６０ｍｌから５．０ｍｌに濃縮した。
【０３６３】
遊離型ＥＥペプチドおおび混入した共精製蛋白質とＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥポリペプチドを分離するため、プールした濃縮分画をＢｉｏＣａｒｄ Ｓｐｒｉｎｔを用い１．０ｍｌ／分の流速でＰＢＳと平衡化し、負荷された１．５×９０ｃｍセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｓ２００（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスキャタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー（ＮＪ））カラムにかけ、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。全クロマトグラフィーについて１．５ｍｌ分画を集め、２８０および２１５ｎＭの吸光度をモニターした。
【０３６４】
この精製物質を最後に４ｍｌのＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘ（ステロジーン（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ））カラムにかけ残存するエンドトキシンを除去した。サンプルをＰＢＳで平衡化した重力カラムに４回通した後、カラムを３ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、これを“清浄化”サンプルと一緒にプールした。この物質を次に０．２ミクロン無菌濾過を行い、小分けするまで−８０℃に保存した。
【０３６５】
ウエスタンブロット、クマシーブルーおよび銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは、ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥポリペプチドは２本のメジャーバンドと２本のマイナーバンドを示した。精製物質の蛋白質濃度はＢＣＡ分析（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））により決定され、蛋白質は小分けされ、標準的方法により−８０℃に保存された。ウエスタンブロット分析では、全てのバンドがウサギ抗ＺＣＹＴＯ１８−ペプチド抗体（実施例１６）と免疫反応した。４本のバンドはＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドの異なる糖化型を示すと思われる。
【０３６６】
抗−ＥＥセファロースを調製するために、１００ｍｌのベッドボリュームのプロテインＧセファロース（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスキャタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー（ＮＪ））を、５００ｍｌのナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）０．４５ミクロンフィルターユニットを用い、０．０２％のアジ化ナトリウムを含む１００ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。ゲルは６．０倍量の２００ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ８．２（ＴＥＡ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズリー州（ＭＯ））で洗浄され、次に９００ｍｇの抗体を含む等量のＥＥ抗体液が加えられた。４℃にて一晩インキュベーションした後、未結合抗体は樹脂を５倍量の上記の２００ｍＭ ＴＥＡで洗浄することで除かれた。
【０３６７】
樹脂は２倍量のＴＥＡに懸濁され、好適容器に移され、そしてＴＥＡに溶解されたジメチルピミリミデート−２ＨＣｌ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））がプロテインＧ−セファロースゲルの最終濃度が３６ｍｇ／ｍｌになるよう加えられた。ゲルは室温にて４５分間振盪され、液体は上記フィルターユニットを用い除かれた。次にゲルの非特異的部位は、１０分間、室温にて５倍量の２０ｍＭメタノールアミンの２００ｍＭ ＴＥＡ液と共にインキュベーションすることでブロックされた。次にゲルは０．０２％のアジ化ナトリウムを含む５倍量のＰＢＳで洗浄され、この溶液中に４℃にて保存された。
【０３６８】
実施例１０．タグ無しＺＣＹＴＯ１８組換え体アデノウイルスの作製
ヒトＺＣＹＴＯ１８（配列番号１；配列番号２）の蛋白質コーディング域は、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ制限部位をそれぞれ５’および３’末端に加えたプライマーを用いたＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲプライマーＺＣ２６６６５（配列番号２０）およびＺＣ２６６６６（配列番号２１）はは以下のＰＣＲ反応に於いて完全長ＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡを含むｐＩＮＣＹ鋳型プラスミドと共に用いられた：９５℃５分間１サイクル、９５℃０．５分間、５８℃０．５分間および７２℃０．５分間を１８サイクル；続いて７２℃７分間；続いて４℃に浸漬。ＰＣＲ反応産物はＴＡＥバッファー中、１．２％（低融解型）ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧ（ＦＭＣ、ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、マイン州（ＭＥ））ゲルにかけられた。ＺＣＹＴＯ１８ＰＣＲ産物はゲルから切り出され、ゲルスライスは７０μ℃で融解され、等量のＴｒｉｓ緩衝化フェノールで２回洗浄された後、ＥｔＯＨで沈殿された。
【０３６９】
５４０ｂｐのＺＣＹＴＯ１８ＰＣＲ産物はＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ酵素で消化された。ｃＤＮＡは１％低融点ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧＴＭ（ＦＭＣ、ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、マイン州（ＭＥ））ゲル上に単離され、次にゲルより切り出され、ゲルスライスを７０℃て融解してから等量のＴｒｉｓ緩衝化フェノールで２回抽出され、そしてＥｔＯＨ沈殿された。ＤＮＡは１０μｌのＨ２Ｏに懸濁された。
【０３７０】
ＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡは改良型ｐＡｄＴｒａｃ ＣＭＶ（Ｈｅ， Ｔ−Ｃら、ＰＮＡＳ ９５：２５０９−２５１４， １９９８）のＦｓｅＩ−ＡｓｃＩ部位内にクローニングされた。この構築体はＧＦＰマーカー遺伝子を含んでいる。ＧＦＰ発現を駆動するＣＭＰプロモーターは、ＳＶ４０プロモーターに置き換えられ、そしてＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルはヒト成長ホルモンポリアデニレーションシグナルに置き換えられた。さらに、未変性ポリリンカーはＦｓｅＩ、ＥｃｏＲＶおよびＡｓｃＩ部位に置き換えられた。この改良型ｐＡｄＴｒａｃｋ ＣＭＶはｐＺｙＴｒａｃｋと命名された。連結反応はファーストリンク（Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ）ＴＭＤＮＡライゲーション・スクリーニングキット（エピセントレテクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウイスコンシン（ＷＩ））を用い行われた。
【０３７１】
ＺＣＹＴＯ１８インサートを含むクローンは、標準のミニプレップ分析により同定された。クローン化されたＺＣＹＴＯ１８のｃＤＮＡを配列分析し、ＰＣＲ中に誤りが持ち込まれなかったこがを実証された。プラスミドを直線化するために、約５μｇのｐＺｙＴｒａｃｋ ＺＣＹＴＯ１８プラスミドをＰｍｅＩにて消化した。約１μｇの直線化プラスミドを２００ｎｇの超螺旋ｐＡｄＥａｓｙ（Ｈｅら、上記）と共にＢＪ５１８３細胞内に形質転換した。この共形質転換はバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ジーンパルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）を使用し、２．５ｋＶ、２００オーム、２５ｍＦａにて実施した。
【０３７２】
全ての共形質転換体を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む４枚のＬＢプレートに接種した。最小コロニーを取り上げ、ＬＢ／カナマイシン中に拡大し、標準的ミニプレップ法により組み換えアデノウイルスＤＮＡを同定した。組換え体アデノウイルスＤＮＡをＦｓｅＩ−ＡｓｃＩにて消化し、ＺＣＹＴＯ１８の存在を確認した。組換え体アデノウイルスミニプレップＤＮＡは、ＤＨ１０Ｂコンペテント細胞内に形質転換され、キット指示書通りにキアゲンマキシプレップキットを使用してＤＮＡを調製した。
【０３７３】
組換え体ＤＮＡによる２９３ａ細胞のトランスフェクション
約５μｇの組換え体アデノウイルスＤＮＡを、２０−３０ＵのＰａｃＩ（ニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む１００μｌの反応溶液中にて３時間、３７℃でＰａｃＩ酵素消化した。消化されたＤＮＡは２回等量のフェノール／クロロフォルムで抽出され、エタノールで沈殿された。ＤＮＡのペレットは５μｌの蒸留水に懸濁された。その前日に接種し６０−７０％集密度まで増殖させたＱＢＩ−２９３Ａ細胞のＴ２５フラスコ（クオンタムバイオテクノロジーズ社（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、モントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａｌ）、カナダ（Ｃａｎａｄａ））に、ＰａｃＩ消化ＤＮＡをトランスフェクションした。
【０３７４】
ＰａｃＩ−消化ＤＮＡは滅菌ＨＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）により総容積５０μｌまで希釈された。別のチューブに２５μｌのＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１ｍｇ／ｍｌ）を総容積１００μｌになるようＨＢＳで希釈した。ＤＮＡをＤＯＴＡＰに加え、ピペットを上下してゆっくり混合した後室温に１５分間放置した。培地を２９３Ａ細胞から除き、１ｍＭのピル敏酸ナトリウム（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を含む５ｍｌの無血清ＭＥＭａｌｐｈａ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）で洗浄した。
【０３７５】
５ｍｌの無血清ＭＥＭを２９３Ａ細胞に加え、３７℃に維持した。ＤＮＡ／脂質混合体を２９３Ａ細胞のＴ２５フラスコに滴下し加え、ゆっくり混合して３７℃で４時間インキュベーションした。４時間後ＤＮＡ／脂質混合体を含む培地を吸引して除き、５％の胎児ウシ血清を含む５ｍｌの完全ＭＥＭと置き換えた。トランスフェクト細胞を緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現および細胞増殖巣、即ちウイルスプラークの形成についてモニターした。
【０３７６】
組換え体アデノウイルスＤＮＡによる２９３Ａ細胞トランスフェクション後７日目に、細胞はＧＦＰ蛋白質を発現し、細胞増殖巣の形成を開始した。これら細胞増殖巣はウイルス性“プラーク”であり、２９３Ａ細胞を全て集めるために細胞スクレーパーを使って粗なウイルス溶解体を集めた。溶解体は５０ｍｌのコニカルチューブに移された。細胞から大部分のウイルス粒子を放出させるために、ドライアイス／エタノール槽および３７℃の水槽中で凍結／融解サイクルを３回繰り返した。
【０３７７】
組換え体アデノウイルス（ｒＡｄＶ）の増幅
粗溶解体を増幅し（１次（１°）増幅）を行いｚｓｉｇ４５ｒＡｄＶ溶解体の作業用“ストック”を得た。２０時間前にほぼ集密化（８０−９０％）した２９３細胞の１０ｃｍのプレート１０枚を準備し、２００ｍｌの粗ｒＡｄＶ溶解体を各１０ｃｍプレートに加え、４８時間から７２時間白色光下に顕微鏡を用いてＣＰＥを、そして蛍光顕微鏡を用いＧＦＰを調べた。全ての２９３Ａ細胞がＣＰＥ（細胞変性効果）を示した時点で、この１°ストック溶解体を集め、粗ｒＡｄＶ溶解体の項で記した様に凍結／融解サイクルにかけた。
【０３７８】
Ｚｓｉｇ４６ｒＡｄＶの二次（２°）増幅は次の様に行った：１２枚の２９３Ａ細胞の１５ｃｍ組織培養皿を、細胞集密度が８０−９０％になるよう準備した。２０ｍｌの５％ＭＥＭ培地を除いた全てを取り除いてから、各皿を３００−５００ｍｌの１°増幅ｒＡｄｖ溶解体と一緒にインキュベーションした。４８時間後、２９３Ａ細胞をウイルス産生物を溶解し取り出し、この溶解体を２５０ｍｌのポリプロピレン製遠心ボトルに集め、ｒＡｄＶを精製した。
【０３７９】
ｒＡｄＶ／ｃＤＮＡ精製
ＮＰ−４０界面活性剤を最終濃度０．５％まで粗溶解体のボトルに加え、全ての細胞を溶解した。ボトルを１０分間回転するプラットフォーム上に置き、ボトルからこぼれない様にして可能な限り素早く攪拌した。分解物を２０，０００×Ｇ、１５分間遠心分離して沈殿させた。上清を２５０ｍｌのポリカーボネート製遠心ボトルに移し、０．５容積量の２０％ＰＥＧ８０００／２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えた。ボトルを一晩氷上で振盪した。ボトルを２０，０００×Ｇにて１５分間遠心分離し、上清を漂白液内に捨てた。ボトルのスピンマーク側の壁に沿った２本の垂直線白色の中にある沈殿が、ウイルス／ＰＥＧ沈殿である。無菌の細胞スクレーパーを用い、２本のボトルの沈殿を２．５ｍｌのＰＢＳに懸濁した。
【０３８０】
ウイルス液を２ｍｌの微量遠心チューブに入れ、微量遠心器を用い１４，０００×Ｇで１０分間遠心分離し、追加の細胞分解物を除いた。２ｍｌの微量遠心チューブの上清を１５ｍｌのポリプロピレン製スナップキャップ付きチューブに移し、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）を使って比重を１．３４ｇ／ｍｌに調整した。ウイルス液の容積を算定し、０．５５ｇ／ｍｌのＣｓＣｌを加えた。ＣｓＣｌは溶解され、得られた液体１ｍｌの重量は１．３４ｇであった。この溶液をポリカーボネート製肉厚壁遠心チューブ３．２ｍｌ（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）＃３６２３０５）に移し、ＴＬＡ−４１００．４ローターを装備したベックマンオプティマ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ）ＴＬＸ微量遠心分離装置にて、８０，０００ｒｐｍ（３４８，００×Ｇ）２５℃、３−４時間遠心分離した。
【０３８１】
勾配より得たウイルスは大量のＣｓＣｌを有しており、このＣｓＣｌはウイルスを細胞に使用する前に除かねばならない。セファデックスＧ−２５Ｍ充填済みのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＰＤ−１０カラムを用い、ウイルス標本を脱塩した。このカラムは２０ｍｌのＰＢＳにより平衡化された。ウイルスが加えられ、カラム内を通過させた。５ｍｌのＰＢＳをカラムに加え、８−１０滴の分画を集めた。各分画の１：５０希釈液の光学密度を分光光度計を用い２６０ｎｍで測定した。明瞭な吸光度のピークが７−１２分画に存在した。これら分画をプールし、１：２５希釈体の光学密度（ＯＤ）を測定した。次式を用いＯＤをウイルス濃度に変換した：（２６０ｎｍのＯＤ）（２５）（１．１×１０１２）＝ウイルス粒子／ｍｌ。ＺＣＹＴＯ１８ｒＡｄＶの１：２５希釈体のＯＤは０．１３４であり、ウイルス濃度は３．７×１０１２ウイルス粒子／ｍｌであった。
【０３８２】
ウイルスを保存するため、精製ウイルスに最終濃度１５％のグリセロールを加え、ゆっくりかつ効果的に混合し、小分けして−８０℃に保存した。
【０３８３】
組織培養感染用量５０％ＣＰＥ（ＴＣＩＤ５０）に於けるウイルス力価アッセイ
クオンタムバイオテクノロジーズ社（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）（モントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａｌ）、カナダ（Ｃａｎａｄａ））によって開発されたプロトコールに従い組換え体ウイルスの感染性を測定した。簡単に述べると、アッセイ対象となる組換え体それぞれについて、２％の胎児ウシ血清を含むＭＥＭの入った９６ウエル組織培養プレートに１×１０４２９３Ａ細胞／ウエルの割合で２９３Ａ細胞を接種した。２４時間後、各ウイルスの１×１０−２ないし１×１０−１４の１０倍希釈体を、２％胎児ウシ血清を含むＭＥＭ中に作成した。各希釈体１００μｌを２０個のウエルそれぞれに加えた。３７℃、５時間後、細胞を細胞変性作用（ＣＰＥ）について陽性あるいは陰性判定し、“プラーク形成単位／ｍｌ”（ＰＦＵ）の値を計算する。
【０３８４】
使用したＴＣＩＤ５０式は上記クオンタムバイオテクノロジーズ社（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に拠った。力価（Ｔ）は使用ウイルスを１０−２ないし１０−１４に希釈したプレートより決定され、感染８日後に読みとる。各希釈率について、ウエル総数当たりのＣＰＥについて陽性ウエルの割合が決定される。
【０３８５】
未希釈ウイルスサンプルの力価を計算するには：係数、“Ｆ”＝１＋ｄ（Ｓ−０．５）であり：式中“Ｓ”は比（Ｒ）の合計であり；そして“ｄ”は希釈系列のＬｏｇ１０であり、例えば１０倍希釈系列では“ｄ”は１である。未希釈サンプルの力価はＴ＝１０（１＋Ｆ）＝ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。ＴＣＩＤ５０／ｍｌをｐｆｕ／ｍｌに変換するには、力価（Ｔ）計算のべき指数から０．７を引く。ＺＣＹＴＯ１８アデノウイルスの力価は２．８×１０１１ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０３８６】
実施例１１．ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのインビボ作用
マウス（メス、Ｃ５７Ｂ１、８週齢：チャールスリバーラブス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）、キングソトン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）、ニューヨーク州（ＮＹ））を３群に分けた。０日目、親またはＺＣＹＴＯ１８アデノウイルス（実施例１０）を、第１群（ｎ＝８）および第２群（ｎ＝８）それぞれ尾静脈から投与し、ウサギはそれぞれ〜０．１ｍｌ容積中に〜１×１０１１個の粒子投与量を受け取った。第３群（ｎ＝８）は無処置であった。１２日目にマウスの体重測定と採血を行った。サンプルは全血球計算（ＣＢＣ）と血清化学について分析された。
【０３８７】
親アデノウイルス処置群に比べＺＣＹＴＯ１８アデノウイルス投与群より得た血液サンプルでは、好中球および血小板数の統計有意な増加が検知された。同様に１２日目のリンパ球数は、親アデノウイルス処置群に比べＺＣＹＴＯ１８アデノウイルス投与群では有意に減少し、そして値は２１日目には正常レベルまで跳ね上がった。さらにＺＣＹＴＯ１８アデノウイルス処置マウスは体重が減少していたが、親アデノウイルス処置マウスでは体重は増加していた。血小板および好中球の増加、ならびに体重減少はコントロール群に比べても有意であった。肝臓化学試験からは、グロブリンレベルの上昇とアルブミン濃度の減少が示されたが、これはＩＦＮ−αにより誘導された炎症反応の観察結果に一致した。
【０３８８】
結果は、ＺＣＹＴＯ１８が造血、即ち血液細胞のインビボ形成に影響することを示唆した。ＺＣＹＴＯ１８自体が、様々な血液前駆細胞、始原細胞または幹細胞に影響し、結果として特定系列にある特定分化血液細胞を増加または減少させる生物学的活性を有しているのだろう。例えばＺＣＹＴＯ１８はリンパ球を減少させると考えられているが、これはリンパ細胞になることが約束された始原細胞の阻害によるものだろう。この見解はＺＣＹＴＯ１８の骨髄幹細胞の増殖および／または成長に及ぼす阻害作用（実施例２３）に一致しており、ＺＣＹＴＯ１８が貧血、感染、炎症および／または免疫疾患に於いて、これら工程に関係する血液細胞に影響することで何らかの役割を果たしているという考えを支持している。
【０３８９】
抗体または可溶性受容体拮抗体の様なＺＣＹＴＯ１８に対す拮抗体は、これら疾患の治療薬として利用できるだろう。またＺＣＹＴＯ１８が直接末梢血液中または肝臓の様なその他血管組織中の血小板の放出および生存に影響する可能性もある。即ち、造血ループ（幹細胞の分化、増殖）を介して作用することに加え、ｚｃｙｔｏ１８は末梢血または幾つかの標的組織および臓器中の血小板および好中球の放出、安定化、または消耗に直接影響するかもしれない。ＺＣＹＴＯ１８はまた末梢血中の顆粒球数にも影響する。骨髄外造血部位（例えば肝臓）もまたＺＣＹＴＯ１８作用の標的である。
【０３９０】
さらにマウスにＺＣＹＴＯ１８アデノウイルスを用いたこれら実験は、ＺＣＹＴＯ１８が過剰発現すると好中球および血小板のインビボのレベルが増加することを示唆している。好中球および血小板の増加はここに論ずる特定の治療応用には望ましいが、これら細胞の慢性的増加または活性の上昇は心臓結果病にある役割を果たすだろう。抗体またはその可溶性受容体といったＺＣＹＴＯ１８に対する拮抗体はこれら疾患の治療薬として利用できるだろう。
【０３９１】
Ｋ５６２細胞に見られた見解（実施例１２）と矛盾する様に思えるが、インビトロとインビボである蛋白質の活性が異なることは良く観察される。この場合、全動物系でのＺＣＹＴＯ１８への反応に関与するその他要素（サイトカインおよび修飾遺伝子といった）が存在すことが考えられる。しかし、これらデータは造血へのＺＣＹＴＯ１８の関与を強く示唆している。即ち、ＺＣＹＴＯ１８およびその受容体は炎症、免疫障害、感染、貧血、血液癌およびその他癌等といった様々な障害の診断および治療の好適治療薬／標的である。
【０３９２】
実施例１２．ＺＣＹＴＯ１８は細胞障害性アッセイに於いてＫ−５６２細胞の成長を阻害する
Ｋ−５６２細胞（ＣＲＬ−２４３、ＡＴＣＣ）は細胞障害性アッセイに好適な、極めて高感度のインビトロ標的として広く受け入れられている。Ｋ−５６２芽細胞は多分化能の造血性悪性細胞であり、赤血球、顆粒球および単球系の認識可能な前駆細胞に偶発的に分化する（Ｌｏｚｚｉｏ， ＢＢら、Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １６６：５４６−５５０， １９８１）。Ｋ５６２細胞は９６ウエル型組織培養クラスター（コースター（Ｃｏｓｔａｒ））中、ピルビン酸塩および１０％血清（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））が添加されたＤＭＥＭ無フェノール増殖培地（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に５，０００細胞／ウエルの割合に接種された。翌日ヒト組換え体ＺＣＹＴＯ１８（実施例１９）、ＢＳＡコントロールまたはレチノイン酸（Ｋ５６２細胞に対し細胞障害性であることが知られている）が加えられた。
【０３９３】
７２時間後、ミトコンドリア活性および細胞増殖のインジケーターとして広く用いられている生体染色剤ＭＴＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）、ミズリー州（ＭＯ））を細胞に最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌになるよう加えた。ＭＴＴはミトコンドリア脱水酵素により紫色のフォルマザン誘導体に転換される。４時間後、等量の酸性イソプロパノール（０．０４Ｎ ＨＣｌの無水イソロパノール液）をウエルに加え、変換されたＭＴＴを可溶化した。５７０ｎｍの吸光を測定し、６５０ｎｍのバックグランドを差し引いた。この実験条件では、吸光は細胞の生存率を反映している。第７表に示す結果は％細胞障害性で表されている。
【０３９４】
【表７】
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【０３９５】
この結果はＺＣＹＴＯ１８が骨髄幹細胞に影響するらしいことを示している。骨髄幹細胞は共通血液幹細胞の嬢細胞である。それらは赤血球、単球（または移動するマクロファージ）、好中球、好塩基球、好酸球の前駆細胞である。Ｋ−５６２芽細胞は赤血球、顆粒球および単球系列に分化することから、それらは骨髄幹細胞のモデルと考えられている。即ち結果はＺＣＹＴＯ１８が前骨髄球腫瘍細胞株の増殖および／または成長に対し阻害活性を持つことを示している。
【０３９６】
即ちＺＣＹＴＯ１８は貧血、感染症、炎症、および／または免疫疾患に何らかの役割を果たしているだろう。さらに抗体または可溶性受容体拮抗体の様なＺＣＹＴＯ１８に対する拮抗体は骨髄幹細胞に対するＺＣＹＴＯ１８の活性遮断に、または貧血、感染、炎症および／または免疫疾患といった疾患の治療薬として利用できるだろう。しかしＺＣＹＴＯ１８は腫瘍細胞に対し細胞障害性を示すことから、それは直接または抗ガン剤としての他サイトカインと組み合わせ抗ガン剤として利用できる。
【０３９７】
実施例１３．ノーザンブロットおよびＰＣＲを用いた組織パネル中のヒトｚｃｙｔｏｒ１６組織分布
Ａ．ノーザンブロットおよびドットブロットを用いたヒトｚｃｙｔｏｒ１６組織分布
一般に認められているヒトｚｃｙｔｏｒ１６（配列番号３２および配列番号３３）（ＰＣＴ国際出願番号［＃＃＃＃＃］）はＺＣＹＴＯ１８の天然に発現された可溶性受容体拮抗体である。ノーザンブロット分析は、ヒトマルチプル組織ノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および自家製Ｕ−９３７ノーザンブロットを用い実施された。Ｕ−９３７はヒト前単球芽細胞株である。ｃＤＮＡプローブはオリゴＺＣ２５，９６３（配列番号２４）およびＺＣ２８，３５４（配列番号２５）を用い作製された。
【０３９８】
ＰＣＲ条件は次の通りである：９４℃１分間；９４℃１５秒間；６０℃３０秒間、７２℃３０秒間を３０サイクルおよび７２℃５分間の最終伸長。３６４ｂｐ産物は、１％ＴＢＥゲル上にてゲル電気泳動されゲル精製され、バンドをカミソリで切り出された。ｃＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いアガロースから抽出された。この断片９４ｎｇをランダムプライム標識システムであるＲｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））をメーカー指示に従い用い、３２Ｐ−ｄＣＴＰにより放射線標識した。未取り込み放射活性は、Ｎｕｃ−Ｔｒａｐカラム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））をメーカー指示書に従い用い取り除かれた。
【０３９９】
ブロットはＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中、６５°にて３時間前ハイブリダイゼーションされた。ブロットは１．０×１０６ｃｐｎｎ／ｍｌの標識プローブ、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび０．５μｇ／ｍｌのヒトｃｏｔ−１ＤＮＡを含むＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ液中、６５°にて一晩ハイブリダイゼーションされた。ブロットは数回溶液を変えながら、室温にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中に洗浄され、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて５５°、３０分間２回洗浄された。約１．６ｋｂおよび３．０ｋｂの転写体が脾臓及び胎盤に検出されたが、調べたその他組織には検知されなかった。Ｕ−９３７細胞株では同一サイズの転写体に加え、約１．２ｋｂの転写体も検出された。
【０４００】
Ｂ．ＰＣＲを用いた組織ｃＤＮＡパネルでの組織分布
ヒト組織由来のｃＤＮＡのパネルを、ＰＣＲを用いてｚｃｙｔｏｒ１６発現についてスクリーニングした。パネルは自家調製されたものであり、下の第８表に示されている類のマラソンｃＤＮＡと、各種正常および癌ヒト組織ならびに細胞株に由来する９４種ｃＤＮＡサンプルを含んだ。ｃＤＮＡは自家製ライブラリー、または自家製ＲＮＡ標本、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＲＮＡまたはインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＲＮＡ由来のマラソンｃＤＮＡである。マラソンｃＤＮＡはｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭキット（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用い作製され、クラスリンプライマーＺＣ２１１９５（配列番号２６）およびＺＣ２１１９６（配列番号２７）を用いＱＣ試験された後、カルセリンバンドの強度に基づき希釈された。
【０４０１】
パネルサンプルの品質を確かめるために、３種類の品質管理（ＱＣ）試験を行った；即ち（１）ライブラリーに使用されたＲＮＡの品質を確認するために、個々のｃＤＮＡライブラリーのベクター配列に特異的であるベクターオリゴを使ったＰＣＲにより平均挿入体のサイズについて自家製ｃＤＮＡを試験した；（２）パネルサンプル中のｃＤＮＡ濃度は、５’ベクターオリゴＺＣ１４，０６３（配列番号２８）と３’アルファチューブリン特異的オリゴプライマーＺＣ１７．５７４（配列番号２９）または３’Ｇ３ＰＤＧ特異的オリゴプライマーＺＣ１７，６００（配列番号３０）を使った標準的ＰＣＲ法を用い完全長のアルファチューブリンまたはＧ３ＰＤＨｃＤＮＡを増幅することで標準化した；そして（３）サンプルを配列分析にかけ、考え得るリボソームまたはミトコンドリアＤＮＡの混入についてチェックした。
【０４０２】
パネルはヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））陽性コントロールサンプルを含んだ９６ウエル型に準備された。各ウエルは約０．２−１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応は、オリゴＺＣ２５，９６３（配列番号２４）とＺＣ２７，６５９（配列番号２５）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＤＮＡポリメラーゼミックス（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））およびＲｅｄｉｌｏａｄ色素（リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ）、ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州（ＡＬ））を用い準備された。
【０４０３】
増幅は次の様に行われた：９４℃１分間；９４℃２０秒間、５８℃３０秒間、７２°１分間を３０サイクル、続いて５分間、７２°を１サイクル。ＰＣＲ反応産物約１０μｌを２％アガロースゲルを用いた標準的アガロースゲル電気泳動にかけた。いずれの組織または細胞株にも、推定ＤＮＡ断片サイズそのものは観察されなかった。その後行ったｚｃｙｔｏｒ１６発現を示す実験からは、このパネルの結果が陰性であったことは、使用したプライマーが原因であるらしいことが示めされた。
【０４０４】
【表８】
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【０４０５】
【表９】
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【０４０６】
ヒト組織由来の別のｃＤＮＡパネルを、ＰＣＲを用いｚｃｙｔｏｒ１６発現についてスクリーニングした。このパネルは自家製であり、下の第９表に示す７７種類のマラソンｃＤＮＡおよび各種正常ならび癌性のヒト組織、そして細胞株由来のｃＤＮＡサンプルを含んだ。ＰＣＲ反応以外アッセイは上記と同じに実施された。ＰＣＲ反応はオリゴＺＣ２５，９６３（配列番号２４）およびＺＣ２５，９６４（配列番号３１）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＤＮＡポリメラーゼミックス（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））およびＲｅｄｉｌｏａｄ色素（リサーチジェネティクス社（Ｒｅｓｅａｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）、ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州（ＡＬ））を用い準備された。
【０４０７】
増幅は以下の様に実施された：９４℃１分間を１サイクル、９４℃１０秒、６０℃３０秒および７２℃３０秒を３８サイクル；続いて７２℃５分間１を１サイクル。正確な予想ＤＮＡ断片サイズは骨髄、胎児心臓、胎児腎臓、胎児筋肉、胎児皮膚、心臓、乳腺、胎盤、唾液腺、平滑筋、小腸、脊髄、脾臓、腎臓、胎児脳、食道腫瘍、子宮腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、直腸腫瘍、肺腫瘍およびＲＰＭＩ−１７８８（Ｂ−リンパ細胞株）に観察された。試験されたパネル中のその他組織および細胞株について、ｚｃｙｔｏｒ１６発現は観察されなかった。
【０４０８】
ｚｃｙｔｏｒ１６の発現パターンは特定の組織特異的腫瘍、例えば卵巣癌、胃癌、子宮癌、直腸癌、肺癌および食道癌での発現を示しているが、この場合ｚｃｙｔｏｒ１６は正常組織では発現していないが腫瘍組織では発現している。当業者は本発明の天然リガンド、ＣＹＴＯ１８およびＺＣＹＴＯ１８の受容体結合断片が生検、組織または組織サンプル中の癌または癌組織、例えば卵巣癌、胃癌、子宮癌、直腸癌、肺癌および食道癌組織の検出用診断薬として利用できることを認識するだろう。この様な本発明の分子に関する診断への利用は当分野既知であり、ここに記載されている。
【０４０９】
さらにＺＣＹＴＯ１８の受容体の一つであるｚｃｙｔｏｒ１６の発現パターンが特定の即位組織および組織特異的腫瘍で発現を示すことから、天然リガンドであるＺＣＹＴＯ１８を含む結合パートナーは、生検、組織または組織サンプル中のＺＣＹＴＯ１８受容体が発現している特異組織（正常または異常）、癌または癌組織、例えば卵巣癌、胃癌、子宮癌、直腸癌、肺癌および食道癌組織を検出するための診断薬としても利用できる。
【０４１０】
ＩＺＣＹＴＯ１８はさらにその受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１６およびｚｃｙｔｏｒ１１（一般的に米国特許第５，９６５、７０４号に記載）が発現している、その他組織を標的化するのにも使用できる。さらにこの様な結合パートナーに化学療法剤、毒性成分等を結合し、腫瘍または疾患組織部位を狙った治療を行うことができる。この様な診断薬および標的治療への利用は当分野既知であり、ここに記載されている。
【０４１１】
市販の１本鎖ｃＤＮＡパネル（ヒト血液分画ＭＴＣパネル（Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ）、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））も上記同様にアッセイされた。パネルには次のサンプルが含まれていた：単球、活性化単球、休止ＣＤ４＋細胞、活性化ＣＤ４＋細胞、休止ＣＤ８＋細胞、活性化ＣＤ８＋細胞、休止ＣＤ１４＋細胞、休止ＣＤ１９＋細胞および活性化ＣＤ１９＋細胞。活性化ＣＤ４＋細胞および活性化ＣＤ１９＋細胞はｚｃｙｔｏｒ１６の発現を示したが、試験したその他の細胞は休止ＣＤ４＋細胞および休止ＣＤ１９＋細胞を含め上記抗原の発現を示さなかった。
【０４１２】
【表１０】
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【０４１３】
【表１１】
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【０４１４】
Ｃ． ＲＴ−ＰＣＲを用いたヒト組織および細胞株ＲＮＡパネルでの組織分布
ヒト細胞株由来のＲＮＡのパネルを、ＲＴ−ＰＣＲを利用しｚｃｙｔｏｒ１６発現についてスクリーニングした。パネルは自家製であり、下の第１０表〜第１３表に示す各種正常および癌性ヒト組織および細胞株に由来する８４種類のＲＮＡを含んだ。ＲＮＡは、自家製または購入した組織および細胞株より、ＲＮＡｅａｓｙＭｉｄｉまたはＭｉｎｉキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使って得た。パネルはサンプル当たり１００ｎｇのＲＮＡを使い９６ウエル形式に準備された。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、オリゴＺＣ２５，９６３（配列番号２４）およびＺＣ２５，９６４（配列番号３１）、Ｒｅｄｉｌｏａｄ色素およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）， ガイザースブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州（ＭＤ））を用い準備された。
【０４１５】
増幅は次の様に実施された：５５℃３０分間１サイクル後に、９４°１５秒間、５９°３０秒間、７２°３０秒間を４０サイクル、続いて７２°５分間の最終伸長で終了した。ＰＣＲ反応産物８ないし１０μｌを、４％アガロースゲルを利用した標準的なアガロースゲル電気泳動にかけた。１８４ｂｐｓの予想通りのｃＤＮＡ断片サイズが細胞株Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、ＡＲＰＥ−１９、ＨａＣａｔ＃１、ＨａＣａｔ＃２、ＨａＣａｔ＃３およびＨａＣａｔ＃４；膀胱、乳ガン、癌近傍の正常乳房、気管、結腸、潰瘍性大腸炎を起こした結腸、十二指腸、子宮内膜、食道、胃−食道、心臓左心室、心室、回腸、腎臓、肺、リンパ節、リンパ腫、乳腺腫、乳腺、卵巣癌、膵臓、耳下腺および皮膚、膵臓リンパ腫および小腸に観察された。このパネルの中にある試験された他組織および細胞株についてｚｃｙｔｏｒ１６の発現は観察されなかった。
【０４１６】
Ｚｃｙｔｏｒ１６は例えば食道、胃−食道、膵臓、十二指腸、回腸、結腸、小腸の様な消化系；例えば乳腺、子宮内膜、乳房（癌組織近傍の）といった女性生殖器、およびリンパ節、皮膚、耳下腺、膀胱、気管、心室や腎臓といった正常組織中に、ＰＣＲにより検出できる程度に発現されている。さらにＺｃｙｔｏｒ１６は、例えば乳腺腫、卵巣癌、子宮癌、その他乳癌の様な女性生殖器に関係した腫瘍、そしてリンパ腫、胃腫瘍および肺腫瘍の様なその他組織に関係する腫瘍といった複数のヒト腫瘍に於いて、ＰＣＲにより検知できる程度発現されている。
【０４１７】
Ｚｃｙｔｏｒ１６の発現は女性生殖臓器の正常組織、およびこれら臓器に関係した幾つかの腫瘍に見いだされる。この様にＺＣＹＴＯ１８またはその受容体結合断片の様なｚｃｙｔｏｒ１６のリガンドは、ｚｃｙｔｏｒ１６が過剰発現していると思われるこれら腫瘍に関するマーカーとして利用できる。ｚｃｙｔｏｒ１６陽性の複数の癌は、内皮／上皮起源（乳腺およびその他乳ガン）に関係している。従ってＺＣＹＴＯ１８またはその受容体結合断片の様なｚｃｙｔｏｒ１６のリガンドは消化系や女性生殖臓器の上皮組織（例えば内膜組織、円柱上皮）ならびに上皮組織を含む癌の様な、上皮組織のマーカーとして利用できる。
【０４１８】
さらに好適実施態様では、ＺＣＹＴＯ１８またはその受容体結合断片は特定の組織特異的腫瘍、特に正常組織ではｚｃｙｔｏｒ１６が発現されていないが腫瘍組織では発現されている、例えば卵巣癌、胃癌、子宮癌、直腸癌、肺癌および食道癌の様な腫瘍のマーカーとして利用できる。診断目的での本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体の使用は当分野既知であり、ここに記載されている。
【０４１９】
【表１２】
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【０４２０】
【表１３】
2003524415.tif 000014
【０４２１】
【表１４】
2003524415.tif 000015
【０４２２】
【表１５】
2003524415.tif 000016
【０４２３】
【表１６】
2003524415.tif 000017
【０４２４】
実施例１４．ノーザンブロットおよびＰＣＲを用いた組織パネル中のヒトｚｃｙｔｏｒ１１組織分布
Ａ．ＰＣＲを用いた組織パネル中のヒトｚｃｙｔｏｒ１１組織分布
ヒト組織由来のｃＤＮＡのパネルについて、ＰＣＲを用いｚｃｙｔｏｒ１６発現のスクリーニングを行った。一般に認められるヒトｚｃｙｏｔｒ１１（配列番号１８、および配列番号１９）（米国特許第５，９６５、７０４号）はＺＣＹＴＯ１８の受容体である。パネルは自家調製されたものであり、上表９に示されているマラソンｃＤＮＡおよび各種正常ならび癌ヒト組織そして細胞株に由来する９４種類のｃＤＮＡサンプルを含んだ。使用した方法は、ＰＣＲ反応以外は実施例１３に示した通りである。
【０４２５】
ＰＣＲ反応は、オリゴＺＣ１４，６６６（配列番号２２）とＺＣ１４，７４２（配列番号２３）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））およびＲｅｄｉｌｏａｄ色素（リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ）、ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州（ＡＬ））を用い準備された。増幅は次の様に行われた：９４℃２分間１サイクル；９４℃１５秒間、５１℃３０秒間、７２°３０秒間を４０サイクル、続いて７２℃７分間１サイクル。
【０４２６】
妥当な、予想通りのＤＮＡ断片サイズは膀胱、脳、子宮頸部、結腸、胎児脳、胎児心臓、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、胎児皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、メラノーマ、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、直腸、唾液腺、小腸、精巣、胸腺、気管、脊髄、甲状腺、肺腫瘍、卵巣腫瘍、直腸腫瘍および胃腫瘍に観察された。パネルの中の試験された他の組織および細胞株についてＺｃｙｔｏｒ１１発現は観察されなかった。
【０４２７】
市販の１本鎖ｃＤＮＡパネル（ヒト血液分画ＭＴＣパネル（Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ）、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））についても上記同様にアッセイした。パネルは次のサンプルを含んだ：単球、活性化単球、休止ＣＤ４＋細胞、活性化ＣＤ４＋細胞、休止ＣＤ８＋細胞、活性化８＋細胞、休止ＣＤ１４＋細胞、休止ＣＤ１９＋細胞および活性化ＣＤ１９＋細胞。活性化ＣＤ８＋細胞および活性化ＣＤ１９＋細胞を除き、全てのサンプルがｚｃｙｔｏｒ１１の発現を示した。
【０４２８】
Ｂ． ＲＴ−ＰＣＲを用いたヒト組織および細胞株ＲＮＡパネルに於けるＺｃｙｔｏｒ１１の組織分布
ヒト細胞株由来のＲＮＡのパネルを、ＲＴ−ＰＣＲを利用しｚｃｙｔｏｒ１１発現についてスクリーニングした。パネルは自家製であり、表１０−１３に示す各種正常および癌性ヒト組織および細胞株に由来する８４種類のＲＮＡを含んだ。ＲＮＡは、自家製または購入した組織および細胞株より、ＲＮＡｅａｓｙＭｉｄｉまたはＭｉｎｉキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使い得た。パネルはサンプル当たり１００ｎｇのＲＮＡを使い、９６ウエル形式に準備された。
【０４２９】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、オリゴＺＣ１４，６６６（配列番号２２）およびＺＣ１４，７４２（配列番号２３）、Ｒｅｄｉｌｏａｄ色素およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）， ガイザースブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州（ＭＤ））を用い準備された。増幅は以下の如く実施された：５０℃３０分間１サイクル後に、９４°１５秒間、５２°３０秒間、７２°３０秒間を４５サイクル；続いて７２°７分間の最終伸長を行い終了した。８ないし１０ｕｌのＰＣＲ反応産物を、４％アガロースゲルを利用した標準的なアガロースゲル電気泳動にかけた。
【０４３０】
妥当な、予想通りのｃＤＮＡ断片サイズが副腎、膀胱、乳房、気管、正常結腸、結腸癌、十二指腸、子宮内膜、食道、胃癌、胃−食道癌、心室、回腸、正常腎臓、腎臓癌、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、耳下腺、皮膚、小腸、胃、甲状腺および子宮で観察された、ｚｃｙｔｏｒ１１の発現を示した細胞株はＡ−４３１、分化型ＣａＣＯ２、ＤＬＤ−１、ＨＢＬ−１００、ＨＣＴ−１５、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２＋ＩＬ６、ＨｕＨ７およびＮＨＥＫ＃１−４であった。このパネルで試験されたその他の組織および細胞株についてｚｃｙｔｏｒ１１発現は観察されなかった。
【０４３１】
さらにＺＣＹＴＯ１８の受容体の一つであるｚｃｙｔｏｒ１１の発現パターンが特定の組織特異性を示すことから、天然リガンドであるＺＣＹＴＯ１８を含む結合パートナーもまた、特異組織（正常または異常）、生検、組織または組織サンプル中、特にＺＣＹＴＯ１８受容体が発現されているサンプル中の癌または癌組織を検出するための診断薬として利用できる。ＺＣＹＴＯ１８はまたその受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１６およびｚｃｙｔｏｒ１１が発現されているその他組織を標的化するのにも利用できる。さらにこの様な結合パートナーに化学療法剤、毒性分等を結合し、腫瘍または病気組織部位を狙って治療することもできるだろう。この様な診断および標的治療への利用は当分野既知であり、ここに記載されている。
【０４３２】
ｚｃｙｔｏｒ１１（上記）およびｚｃｙｔｏｒ１６（実施例１２および実施例１５）の発現パターンは、ＺＣＹＴＯ１８の作用する、即ちＺＣＹＴＯ１８拮抗体の標的組織および細胞を示している。ｚｃｙｔｏｒ１１は一般に次の３生理学的系に於いてｚｃｙｔｏｒ１６と重複し発現している：即ち消化器系、女性生殖系、および免疫系である。さらに、受容体（ｚｃｙｔｏｒ１１）の発現パターンは、ｚｃｙｔｏｒ１６の様なＺＣＹＴＯ１８拮抗物質がヒトの病気の２分野、即ち炎症（例えばＩＢＤ、クローン病、膵炎）および癌（例えば卵巣、結腸）の治療に応用できることを示している。即ち、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は、炎症およびＺＣＹＴＯ１８とｚｃｙｔｏｒ１１受容体発現細胞との相互作用に対し他サイトカインにより誘導された影響を拮抗するのに使用できる。
【０４３３】
さらにｚｃｙｔｏｒ１１の発現は、潰瘍性大腸炎組織、ＩＬ−６誘導されたＨｅｐＧ２肝臓細胞株、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞ではダウンレギュレーションされるか、または無いと考えられている。しかしｚｃｙｔｏｒ１６は活性化ＣＤ１９＋Ｂ細胞（実施例１２）ではアップレギュレーションされているのに対し、ｚｃｙｔｏｒ１１はｚｃｙｔｏｒ１９＋細胞では休止ＣＤ１９＋細胞（上記）に比べダウンレギュレーションされていると思われる。この例ではｚｃｙｔｏｒ１１およびｚｃｙｏｔｒ１６の発現は逆関係にある。これらＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＣＤ１９＋末梢血細胞、Ｂリンパ細胞がＺＣＹＴＯ１８の受容体、即ちｚｃｙｔｏｒ１１およびｚｃｙｔｏｒ１６を発現していることを示している。さらにＢ細胞は制御されたｚｃｙｔｏｒ１１およびｚｃｙｔｏｒ１６の発現を示す。
【０４３４】
有糸分裂促進剤で活性化されたＢリンパ細胞ではｚｃｙｔｏｒ１１の発現は低下し、ｚｃｙｔｏｒ１６の発現は増加する。これは典型的なフィードバック阻害であり、これがＢ細胞おおび他細胞へのＺＣＹＴＯ１８の活性を弱めているのだろう。可溶性ｚｃｙｔｏＲ１６はＢ細胞に対するＺＣＹＴＯ１８の効果を中和する拮抗物質として機能するだろう。これはＢ細胞が重要な役割を果たしている病気、即ち全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、免疫複合疾患を含む自己免疫疾患、およびＺＣＹＴＯ１８により悪化するＢ細胞癌の治療に有益であろう。同様にＢ細胞が病因となる自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）およびリューマチ関節炎もまたｚｃｙｔｏｒ１６治療の対象となるだろう。
【０４３５】
ｚｃｙｔｏｒ１６治療は、喘息、アレルギーおよびアトピー性皮膚炎を含むアトピー性疾患に於けるＢ細胞のＩｇＥ産生を低下させるか、または阻害する上で有益でり、これら病気ではＩｇＥ産生が病因となる。Ｂ細胞悪性腫瘍は上記“フィードバック阻害”を消失しているだろう。ｚｃｙｔｏｒ１６投与はＺＣＹＴＯ１８シグナル発生の制御を回復し、Ｂ細胞腫瘍の増殖を阻害するだろう。外科切除または化学療法後のｚｃｙｔｏＲ１６投与は、Ｂ細胞悪性腫瘍患者に於ける微細な残存病の治療に有益であろう。制御の消失はｚｃｙｔｏＲ１１の発現の維持または増加をもたらすだろう。その結果ｚｃｙｔｏＲ１１を標的とする治療的モノクローナル抗体の標的が創り出される。
【０４３６】
実施例１５．インサイチューハイブリダイゼーションを用いたｚｃｙｔｏｒ１６発現細胞の同定
特定ヒト組織を単離し、インサイチューハイブリダイゼーションを利用してｚｃｙｔｏｒ１６発現についてスクリーニングした。調整され切片作製され、インサイチューハイブリダイゼーションにかけられた各種ヒト組織には、軟骨、結腸、虫垂、小腸、胎児肝臓、肺、リンパ節、リンパ腫、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、皮膚、脾臓および胸腺が含まれる。組織は標準的技法により１０％の緩衝化フォルマリンで固定されてからパラフィン包埋された。組織は４ないし８ミクロンで切片にされた。組織は標準的方法（“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”， Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＬＥＰ）内， ＮＩＥＨＳ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， ＮＣ；ウエブアドレス ｈｔｔｐ：／／ｄｉｒ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｒｌｅｐ／ｉｓｈ．ｈｔｍｌ）を用い準備された。
【０４３７】
簡単に述べると、組織切片はＨｉｓｔｏＣｌｅａｒ（ナショナルダイアグノスティクス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、アトランタ（Ａｔｌａｎｔａ）、ジョージア州）を用い脱パラフィン処理され、続いてエタノールで脱水された。つぎにそれらはプロテネース（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ（５０μｇ／ｍｌ）（ベーリンガーダイアグノスティクス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ州（ＩＮ））により、３７℃、２ないし７分間消化された。この段階に続いて組織はアセチル化され、そして再水和処理された。
【０４３８】
インサイチュープローブの一つはヒトｚｃｙｔｏｒ１６配列（配列番号３２のヌクレオチド１−６９３）を対象にデザインされ、配列番号３２を含むプラスミドより標準的方法を用いて単離された。Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いアンチセンスプローブが作られた。プローブはインビトロ転写システム（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウイスコンシン州（ＷＩ））をメーカー指示書通りに使用し、ジゴキシゲニン（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））で標識された。インサイチューハイブリダイゼーションはジゴキシゲニン標識ｚｃｙｔｏｒ１６プローブ（上記）を用い実施された。
【０４３９】
プローブはスライドに１ないし５ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で、１２ないし１６時間、６２．５℃で加えられた。続いてスライドは５５℃で２×ＳＳＣと０．１×ＳＳＣで洗浄された。シグナルはチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）（ＴＳＡ、インサイチューインダイレクトキット；ＮＥＮ）を使い増幅され、ベクターレッドサブストレートキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ）（ベクターラブ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ））をメーカー指示書通りに使って視覚化された。次にスライドはヘマトキシリン（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、カリフォルニア州（ＣＡ））で二重染色された。
【０４４０】
試験した幾つかの組織でシグナルが観察された。リンパ節、プラズ細胞および末梢組織中のその他単核細胞が強陽性であった。リンパ結節中の大部分の細胞は陰性であった。リンパ腫サンプルでは、有糸分裂中の多核細胞で陽性シグナルが観察された。脾臓では陽性シグナルは濾胞周辺部に散在する単核細胞に認められた。胸腺では陽性シグナルは皮質と髄質の両方の散在性単核細胞に認められた。胎児肝臓では、強いシグナルが類洞空間中にある単核細胞の混合集団に観察された。肝細胞の亜集団も陽性と思われた。炎症を起こした虫垂では、バイエル板および浸潤部位にある単核細胞が陽性であった。小腸では幾つかのプラズマ細胞と神経節神経細胞が陽性であった。正常肺では、ｚｃｙｔｏｒ１６は小葉上皮および間質組織と血液中の単核細胞に発現していた。
【０４４１】
肺癌組織の場合は、大部分のプラズマ細胞およびリンパ系集合体周辺部にある幾つかのその他単核細胞で強いシグナルが観察された。卵巣癌では、上皮細胞が強陽性であった。単核細胞と思われる幾つかの間質細胞もまた陽性であった。正常な卵巣にはシグナルは観察されなかった。正常膵臓および膵炎を起こした膵臓のサンプルでは、いずれも隔膜内の腺房細胞と幾つかの単核細胞が陽性であった。初期（８週）胎盤では、栄養芽細胞にシグナルが観察された。皮膚では、浅部真皮内の炎症浸潤部にある幾つかの単核細胞が陽性であった。ケラチノ細胞も弱陽性であった。前立腺癌では、間質組織内に散在する単核細胞が陽性であった。
【０４４２】
関節軟骨では、軟骨細胞が陽性であった。試験したその他組織については、正常卵巣および結腸腺癌を含め陰性であった。
まとめると、インサイチューのデータはｚｃｙｔｏｒ１６に関する上記の発現データに一致した。ｚｃｙｔｏｒ１６の発現は主に単核細胞に観察され、上皮の一部亜集団もまた陽性であった。これらの結果は、免疫細胞中に於けるｚｃｙｔｏｒ１６発現を確認し、そして炎症や自己免疫疾患または、例えば、これに限定されるものではないが、ＺＣＹＴＯ１８を含む前炎症性サイトカインが関係する他免疫機能での役割を指摘する。さらにｚｃｙｔｏｒ１６の発現の検出は、例えば組織サンプル中の単核細胞のマーカーとして用いることができる。
【０４４３】
ｚｃｙｔｏｒ１６は正常組織（リンパ節、脾臓、胸腺、膵臓および胎児肝臓、肺）および異常組織（炎症を起こした虫垂、肺癌、卵巣癌、膵炎、炎症を起こした皮膚および前立腺癌）を含む単核細胞に発現されている。リンパ節、小腸および肺癌中のプラズマ細胞がｚｃｙｔｏｒ１６陽性であることは注目に値する。プラズマ細胞は抗体合成を担当する免疫的に活性なリンパ細胞である。さらにＺＣＹＴＯ１８は活性化Ｔ細胞に発現されている。またｚｃｙｔｏｒ１６の発現は活性化された（休止状態ではない）ＣＤ４＋およびＣＤ１９＋細胞にのみ検出される（実施例１３）。従ってｚｃｙｔｏｒ１６は、単核白血球の様な特定リンパ細胞、および活性化ＣＤ４＋やＣＤ１９＋の様な特定の活性化白血球を単離する際のマーカーまたは標的として利用できる。
【０４４４】
さらに、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ１９＋細胞の様な活性化免疫細胞でｚｃｙｔｏｒ１６が発現されていることは、ｚｃｙｔｏｒ１６が微生物や細胞破壊物の様な異物に対する体の防御免疫反応に関係している可能性、および炎症および癌形成時の免疫反応に役割を果たしている可能性を示している。
【０４４５】
またここに論ずる様に、肝細胞（内胚葉由来細胞）、肺小葉上皮（内胚葉由来上皮）および卵巣癌上皮（中胚葉由来上皮）といった幾つかの上皮型組織は、ｚｃｙｔｏｒ１６発現について陽性である。ｚｃｙｔｏｒ１６の上皮での発現は、肝臓および肺では炎症反応および／または癌状態によって変化する。従って、ＺＣＹＴＯＲ１８またはその受容体結合断片の様なｚｃｙｔｏｒ１６に関するリガンドは、炎症または癌の結果としてこれら組織に生じる変化をモニターするためのマーカーとして利用することができる。
【０４４６】
さらにｚｃｙｔｏｒ１６のインサイチュー発現の分析は、正常卵巣上皮がｚｃｙｔｏｒ１６発現について陰性であるのに対し卵巣癌上皮では強陽性であることを示しており、ｚｃｙｔｏｒ１６のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体がここに記した様に、卵巣癌および卵巣カルチノーマの診断および治療の診断マーカーおよび／または治療標的として利用できることの更なる証拠を提供している。
【０４４７】
ｚｃｙｔｏｒ１６はまた、膵臓（正常および膵炎組織）の腺房細胞、胎盤の栄養芽細胞（外胚葉由来）、軟骨の軟骨細胞（中胚葉由来）および腸の神経節細胞（外胚葉由来）の様なその他組織にも検出された。この様なことから、ｚｃｙｔｏｒ１６はこれら臓器の各細胞に於ける分化および／または正常機能に関係していると思われる。従って、ｚｃｙｔｏｒ１６の潜在的な利用法として、正常な代謝および妊娠の維持、骨形成／恒常性そして小腸の生理学的機能等が挙げられる。
【０４４８】
実施例１６．ｈｕＺＣＹＴＯＲ１８抗ペプチド抗体
ポリクローナル抗ペプチド抗体は２匹のニュージーランド白色ウサギをペプチドｈｕＺＣＹＴＯ１８−１（配列番号３４）またはｈｕＺＣＹＴＯＲ１８−２（配列番号３５）またはｈｕＺＣＹＴＯ１８−３（配列番号３６）で免疫して調整された。ペプチドはアプライドバイオシステムズモデル４３１Ａペプチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州（ＣＡ））をメーカー支持通りに使用し合成された。
【０４４９】
ペプチドｈｕＺＣＹＴＯ１８−１、ｈｕＺＣＹＴＯ１８−２およびｈｕＺＣＹＴＯ１８−３は次にキャリアー蛋白質であるマレイミド活性化スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））にシステイン残基を介して結合された。各ウサギには最初２００μｇの標識蛋白質を含む完全フレンドアジュバント（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））を腹腔内（ＩＰ）注射し、続いて１００μｇの標識蛋白質を含む不完全フレンドアジュバントのブースターを３週毎にＩＰ注射された。３回目のブースター注射後７ないし１０日目に、動物より採血し、血清を集めた。その後３週毎にウサギをブーストし採血した。
【０４５０】
Ｚｃｙｔｏｒ１８ペプチド−特異的ウサギ血清は、抗体標的として抗体作成に使用されたペプチドを１μｇ／ｍｌ用いたＥＬＩＳＡでチェックし、特性を分析した。２匹のウサギのｈｕＺＣＹＴＯ１８−１（配列番号３４）に対する血清は、それら特異的ペプチドに対し１：５Ｅ６（１：５，０００，０００）希釈の力価を有している。
【０４５１】
ｈｕＺＣＹＴＯＲ１８−１ペプチド特異抗体は、１ｇのＥＰＯＸＹ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６Ｂ当たり各ペプチド１０ｍｇを用い、その後一晩ＰＢＳ中に透析して調整されたＥＰＯＸＹ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６Ｂペプチドカラム（ファルマシアＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ））を用いウサギ血清より精製された。ペプチド特異的ｈｕＺＣＹＴＯＲ１８抗体は、抗体標的として用いた適当なペプチド１μｇ／ｍｌを用いたＥＬＩＳＡ力価チェックにより特性分析された。ＨｕＺＣＹＴＯＲ１８−１ペプチド特異抗体の検出下限値（ＬＬＤ）は、その適切な抗体標的を用いたＥＬＩＳＡによれば５００ｐｇ／ｍｌであった。ＨｕＺＣＹＴＯ１８−１ペプチド特異抗体は、ウエスタンブロットによれば、完全長組換え体蛋白質（ＢＶ産生）を認識する。
【０４５２】
実施例１７．ヒトＺＣＹＴＯ１８トランスジェニックプラスミドの構築
確認済みのヒトＺＣＹＴＯ１８コーディング域の配列を含むＺｙｔｒａｃｋベクター約１０μｇをＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで消化した。つぎにベクターをエタノール沈殿し、沈殿をＴＥに懸濁した。放出された５４０ｂｐのヒトＺＣＹＴＯ１８断片は、消化ベクターを１．２％ＳｅａＰｌａｑｕｅゲル上で泳動し、断片を切り出すことで単離された。ＤＮＡはＱｉａＱｕｉｃｋ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））ゲル抽出キットを用い精製された。
【０４５３】
次にヒトＺＣＹＴＯＲ１８断片は我々の標準的トランスジェニックプラスミドであり、事前にＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで消化しておいたｐＴＧ１２−８内に連結された。トランスジェニックマウス中に所望遺伝子を発現させるためにデザインされたＰＴＧ１２−８プラスミドは、１０ｋｂのＭＴ−１５’ＤＮＡおよび７ｋｂのＭＴ−１３’ＤＮＡに接した発現ベクターを含む。この発現ベクターはＭＴ−１プロモーター、ラットインシュリンＩＩイントロン、所望クローンの挿入に適したポリリンカーおよびヒト成長ホルモンポリＡ配列を含んでいる。
【０４５４】
約１マイクロリットルの連結反応体をメーカー支持通りにしてＤＨ１０Ｂ ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ（商標）コンペテント細胞（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ、ガイザースブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド（ＭＤ）内にエレクトロポレーションし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに接種し、３７℃で一晩インキュベーションした。コロニーを拾い上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖させた。拾い上げたクローンからミニプレップＤＮＡを調製し、ＦｓｅＩ／ＡｓｃＩにより制限消化しヒトＺＣＹＴＯ１８インサートについてスクリーニングし、引き続いてアガロースゲル電気泳動にかけた。正確なｐＴＧ１２−８ヒトＺＣＹＴＯ１８構築体の大規模調製を行った。
【０４５５】
５’および３’フランキング配列を含むＳａｌＩ断片、ＭＴプロモーター、ラットインシュリンＩＩイントロン、ヒトＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡおよびヒト成長ホルモンポリＡ配列を調製し、マウス受精卵内へのマイクロインジェクションに使用した。
【０４５６】
第２トランスジェニック構築体は、上記同様にしてヒトＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡを含むＦｓｅＩ／ＡｓｃＩ断片をリンパ芽球特異的トランスジェニックベクターｐＫＦ５０１内にサブクローニングすることで作成された。ＰＫＦ０５１トランスジェニックベクターはｐ１０２６Ｘ（Ｉｒｉｔａｎｉ，Ｂ．Ｍ．，ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：７０１９−３１， １９９７）に由来し、Ｔ細胞特異的ｌｃｋ近位プロモーター、Ｂ／Ｔ細胞特異的免疫グロブリンＥμ重鎖エンハンサー、所望クローンの挿入に適したポリリンカー、および不活性型成長ホルモン蛋白質をコードしている変異型ｈＧＨ遺伝子（３’イントロンおよびポリアデニレーションシグナルを提供する）を含んでいる。
【０４５７】
大規模調製されたＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、そのｌｃｋ近位プロモーター、免疫グロブリンＥμエンハンサー、ヒトＺＣＹＴＯ１８ｃＤＮＡおよび変異型ｈＧＨ遺伝子を含む断片を調製し、マウス受精卵へのマイクロインジェクションに使用した。
【０４５８】
マウスＺＣＹＴＯ１８トランスジェニックプラスミドの構築
トランスジェニック構築体はマウスＺＣＹＴＯ１８についても作成された。オリゴヌクレオチドはコンセンサスコザック配列および正確なマウスＺＣＹＴＯ１８コーディング域を含むＰＣＲ断片を作成する様デザインされた。これらオリゴヌクレオチドはＺＣＹＴＯ１８を発現させるｅｕＬＣＫプロモーターを含むリンパ芽球特異的トランスジェニックベクターであるＰＫＦ０５１へのクローニングを容易にするため、５’端部のＦｓｅＩ部位と３’端部のＡｓｃＩ部位で消化された。
【０４５９】
ＰＣＲ反応は２００ｎｇのマウスＺＣＹＴＯ１８鋳型（配列番号３７）およびオリゴヌクレオチドＺＣ３７，１２５（配列番号３９）とＺＣ３７，１２６（配列番号４０）を用い行われた。ＰＣＲ反応はＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ ｃＤＮＡポリメラーゼ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を次の条件で用い行われた：９５℃５分間；９５℃６０秒間、６０℃６０秒間、７２℃９０秒間を１５サイクル；および７２℃７分間。ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動で分離され、ＱｉａＱｕｉｃｋ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））ゲル抽出キットを用い精製された。単離された５４０ｂｐのＤＮＡ断片はＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化され、エタノール沈殿した後上記に従いｐＫＦ０５１にクローン化された。ＰＫＦ０５１マウスＺＣＹＴＯ１８の正確なクローンは配列分析により検証され、什器に従いこのクローンを大規模調製しインジェクションに供した。
【０４６０】
実施例１８．ｚＣｙｔｏ１８−ＣＥＥのバキュロウイスル発現
昆虫細胞中にｚＣｙｔｏ１８−ＣＥＥポリペプチドを発現させるために、発現ベクターであるｚＣｙｔｏ１８−ＣＥＥ／ｐＺＢＶ３２１を調製した。ＺＣｙｔｏ１８−ＣＥＥ／ｐＺＢＶ３２１はＣ末端ＧＬＵ−ＧＬＵタグ（配列番号１４）を持つｚＣｙｔｏ１８ポリペプチドを発現する様にデザインされた。この構築体はシグナルペプチドを切り落とした後にｚＣｙｔｏ１８のＮ−末端アミノ酸配列を決定するのに使用できる。
【０４６１】
Ａ．ｚＣｙｔｏ１８−ＣＥＥ／ｐＺＢＶ３２１の構築
５’および３’末端それぞれにＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位を含む５６１ｂｐのｚＣｙｔｏ１８断片は、ｚＣｙｔｏ１８ｃＤＮＡを含むプラスミドよりプライマーＺＣ２８，３４８（配列番号４１）およびＺＣ２８，３４５（配列番号４２）を用いたＰＣＲ増幅により作成された。ＰＣＲ反応条件は以下の通りである：９４℃５分間１サイクル；９４℃９０秒、６０℃１２０秒および７２℃１８０秒を３５サイクル；７２℃１０分間を１サイクル；その後４℃に浸漬。断片はゲル電気泳動（１％アガロース）により視覚化された。バンドを切り出し、次にＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号２８７０４）を用い抽出された。ｃＤＮＡはＢａｍＨＩおよびＸｂａＩにより消化され、続いてベクターｐＺＢＶ３２１に連結された。
【０４６２】
ＰＺＢＶ３２１ベクターはｐＦａｓｔＢａｃ１ＴＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））発現ベクターを改良したもので、ポリへドロンプロモーターが除かれ後期活性塩基性蛋白質プロモーターに交換されており、そしてＧｌｕ−Ｇｌｕタグおよび停止シグナルに関するコーディング配列がマルチプルクローニング領域の３’末端に挿入されている。制限消化されたｚＣｙｔｏ１８インサートを約６８ナノグラムとそれに対応するｐＺＢＶ３２Ｌベクター約１００ｎｇを一晩、１６℃にて連結した。連結混合体を水で１０倍希釈し、２ｍｍのギャップを持つエレクトロポレーションキュベット内にて、ＥｌｅｃｔｏＭＡＸＴＭＤＨ１２ｓＴＭ細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号１８３１２−０１７）内に４００オーム、２Ｖおよび２５μＦ（ＢＴＸ、モデルＮｏ．６２０）にて希釈連結混合液１ｆｍｏｌをエレクトロポレーションし、形質転換した。
【０４６３】
形質転換細胞は４５０μｌのＳＯＣ培地（２％バクトトリプトン（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、０．５％バクト酵母抽出物、１０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２，１０ｍＭのＭｇＳＯ４および２０ｍＭのグルコース）で希釈され、その希釈液１００μｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに加えた。クローンをＰＣＲで分析し、２種類の陽性クローンを選択して増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）スピンミニプレップキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号２７１０６）を用いて精製した。各陽性クローン２μｌを２０μｌのＤＨ１０ＢａｃＴＭＭａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｙ（商標）コンペテント細胞（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬカタログ番号１０３６１−０１２）内に、４２℃のヒートブロック内にて熱ショックを加え形質転換した。
【０４６４】
形質転換されたＤＨ１０ＢａｃＴＭ細胞を９８０μｌのＳＯＣ培地（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母抽出物、１０ｍＭの１Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２，１０ｍＭのＭｇＳＯ４および２０ｍＭのグルコース）で希釈し、１００μｌを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、４０μｇ／ｍＬのＩＰＴＧおよび２００μｇ／ｍＬのＢｌｕｏ Ｇａｌを含むルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレートに加えた。プレートは３７℃にて４８時間インキュベーションされた。色調選別を利用して、転移ウイルスＤＮＡを持つ細胞を特定した（“バクシミド”と称する）。分析にかけるために、該当する白色のクローンを拾い上げた。コロニーはＰＣＲで分析され、陽性コロニー（所望バクシミドを含む）を選別して増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）スピンミニプレップキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号２７１０６）を用いて精製した。
【０４６５】
クローンは、プライマーＺＣ４４７（配列番号４３）およびＺＣ９７６（配列番号４４）を用いたＰＣＲによりバクシミド中の転移エレメントに対するプライマーを利用しＤＮＡを増幅することで、正確な挿入体についてスクリーニングを行った。ＰＣＲ反応条件は次の通りである：９４℃５分間１サイクル；９４℃６０秒、５０℃９０秒および７２℃１８０秒を３０サイクル；７２℃１０分間を１サイクル；続いて４℃に浸漬。ＰＣＲ産物は挿入体のサイズがチェックするために１％アガロースゲルにかけられた。正確な挿入体を持った産物を用い、Ｓｐｎｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞をトランスフェクションした。
【０４６６】
Ｂ．トランスフェクション
Ｓｆ９細胞はウエル当たり１×１０６細胞で６ウエルプレートに播き、１時間２７°で接着させた。５マイクロリットルのバクシミドＤＮＡを１００μｌのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で希釈した。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カタログ番号１８３２４−０１２）２０μｌを１００μｌのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭで希釈した。バクシミドＤＮＡおよび脂質液をゆっくり混合し、３０−４５分間、室温でインキュベーションした。
【０４６７】
細胞のウエル１つから培地を吸引し、細胞を２ｍｌの新鮮Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ培地で１回洗浄した。８００マイクロリットルのＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭを脂質−ＤＮＡ混合液に加えた。洗浄培地を吸引し、ＤＮＡ−脂質混合液を細胞に加えた。細胞を２７℃にて一晩インキュベーションした。ＤＮＡ−脂質混合液を吸引し、２ｍｌのＳｆ−９００ＩＩ培地を各プレートに加えた。プレートを２７℃、９０％湿度で９６時間インキュベーションした後ウイルスが集められた。
【０４６８】
Ｃ．増幅
Ｓｆ９細胞はウエル当たり１×１０６細胞で６ウエルプレートに播かれた。トランスフェクションプレートから得た５０μｌのウイルスをウエル中に加え、２７℃、９０％湿度で９６時間インキュベーションした後、ウイルスが集められた。Ｓｆ９細胞を、１２５ｍｌ振盪フラスコ中の５０ｍｌＳｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ中で約１×１０６細胞／ｍｌの密度まで増殖させた。次に細胞に上記プレートより得た１００μｌのウイルス保存液を感染させ、２７℃にて３日間インキュベーションした後ウイルスを集めた。
【０４６９】
実施例１９．Ｓｆ９細胞からのＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥの精製
バキュロウイルス中に発現したＣ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ）タグ（配列番号１４）を含むｚＣｙｔｏ１８ポリペプチドの精製には以下の方法を用いた。ｚＣｙｔｏ１８−ＣＥＥを発現するＳｆ９細胞（実施例１８）由来のコンディショニング培地を０．２２μｍＳｔｅｒｉｆｌｉｐＴＭフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使って濾過し、それから培地５０ｍＬ当たり１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））を加えた。濃縮コンディショニング培地の総標的蛋白質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＥＥ抗体（自家製）に続いて抗ｍＩｇＨＲＰ標識抗体を用いるウエスタンブロットから決定された。
【０４７０】
バッチ精製は、抗ＥＥ抗体で処理された２５０μｌのプロテインＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））（プロテインＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ／抗ＥＥビーズ）を４０ｍＬのＳｆ９コンディショニング培地に加えることで達成された。ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥを捕捉するため、培地−ビーズ混合体を一晩、４℃にて振盪した。ビーズはベックマンＧＳ６Ｒ遠心分離器で１０００ＲＰＭ、１０分間遠心分離された。このビーズを以下の手順で洗浄した（洗浄毎に遠心分離および吸引工程が実施された）：１ｍＬの細胞溶解バッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８．０および１％ＮＰ−４０）で１回；１ｍＬの細胞洗浄バッファー（６５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８．０および１％ＮＰ−４０）で１回；１ｍＬの細胞溶解バッファーで１回。次にビーズは５００μｌの細胞溶解バッファー中に懸濁され、Ｎ−末端の配列分析にかけられた。
【０４７１】
実施例２０．Ｎ−末端アミノ酸配列分析：
アプライドバイオシステムズ製試薬を用い、標準的な自動化Ｎ−末端ポリペプチド配列分析（エドマン分解）を行った。Ｎ−末端配列分析はモデル４９４蛋白質シークエンサーシステム（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用い行われた。データ分析は蛋白質配列分析用モデル６１０Ａデータ分析システム（Ｍｏｄｅｌ ６１０Ａ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、バージョン２．１ａ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて行われた。
【０４７２】
精製ヒトＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥサンプルは、プロテインＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ／抗ＥＥビーズ（実施例１９）に捕捉された形で供給された。ビーズはＮＯｖｅｘ ＳＤＳ ＰＡＧＥシステム（４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＭＥＳ ＮｕＰＡＧＥ；インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をメーカー指示通りに使用するＳＤＳ ＰＡＧＥにかけるまえに、煮沸した水槽内に置かれた還元ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプルバッファー中に入れられた。
【０４７３】
ゲルはＮｏｖｅｘ ＰＶＤＦ膜（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にエレクトロトランスファーされ、標準的方法を用いクマシーブルー（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズリー州（ＭＯ））で染色された。対応する抗ＥＥウエスタンブロットを行い、Ｎ−末端蛋白質配列に関しＺＣＹＴＯ１８バンドを同定した。マウス抗ＥＥＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体は自家調製された。分泌型ＺＣＹＴＯ１８ポリペプチドのＮ−末端配列より、配列番号３に示すＺＣＹＴＯ１８前駆体配列の成熟が開始するシグナル配列の予定切断場所が実証された。
【０４７４】
実施例２１．ＣＲＦ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞（ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞）およびＣＲＦ２−４受容体をｚｃｙｔｏｒ１１受容体と同時発現するＢａＦ３細胞（ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞）の構築
完全長のＣＦＲ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞を、下記ＣＦＲ２−４発現ベクターを３０μｇ用い構築した。ＣＦＲ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞はＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞と命名された。これら細胞をコントロールに用い、さらに完全長ｚｃｙｔｏｒ１１受容体（配列番号１８およおび配列番号１９）（米国特許第５，９６５，７０４号）をトランスフェクションし、これを用い以下示す様にしてＺＣＹＴＯ１８活性に関するスクリーニング法を構築した。
【０４７５】
Ａ． ＣＲＦ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞の構築
完全長のＣＲＦ２−４のｃＤＮＡ配列（ジーンバンク登録番号Ｚ１７２２７）をＤａｕｄｉ細胞株ｃＤＮＡライブラリーより単離し、続いて実施例６記載の様にして発現ベクターｐＺＰ７Ｐ内にクローン化した。
マウス骨髄由来のインターロイキン３（ＩＬ−３）依存性前リンパ細胞株であるＢａＦ３（ＰａｌａｃｉｏｓとＳｔｅｉｎｍｅｔｚ、Ｃｅｌｌ ４１：７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６： ４１３３−４１３５， １９８６）は、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、２ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−３（ｍＩＬ−３）（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｌｏｉｓ）、ミネソタ州（ＭＮ））、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａＭａｘ−１ＴＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）およびＰＳＮ抗生物質（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）添加完全培地（ＲＰＭＩ培地（ＪＲＨバイオサイエンス社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）、レネクサ（Ｌｅｎｅｘａ）、カンサス州（ＫＳ）中に維持された。
【０４７６】
エレクトロポレーションにかける前に、ＣＲＦ２−４／ｐＺＰ７Ｐを調製し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））をメーカー指示書に従い用い精製した。エレクトロポレーションに合わせ、ＢａＦ３細胞は一度無血清ＲＰＭＩ培地で洗浄され、次に無血清ＲＰＭＩ培地中に１０７細胞／ｍｌの細胞密度に懸濁された。１ｍｌのＢａＦ３細胞懸濁液を３０μｇのＣＲＦ２−４／ｐＺＰ７ＰプラスミドＤＮＡと混合し、独立型使い捨て式エレクトロポレーションチャンバー（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ）に移した。１５分間室温でインキュベーションした後、エレクトロポレーション装置（ＣＥＬＬ−ＰＯＲＡＴＯＲＴＭ；ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ）を使って細胞に２回連続ショック（８００ ｌＦａｄ／３００Ｖ．；１１８０ ｌＦａｄ／３００Ｖ．）を加えた。
【０４７７】
５分間の回復期間の後、エレクトロポレーションした細胞を５０ｍｌの完全培地に移し、１５−２４時間（３７℃、５％ＣＯ２）インキュベーター内に入れた。次に細胞を遠心により落とし、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む５０ｍｌの完全培地入りＴ−１６２フラスコ中に懸濁し、ピューロマイシン耐性プールを単離した。以後ＢａＦ３／ＣＦＲ２−４細胞を呼ぶトランスフェクションされたＢａＦ３細胞細胞のプールを、下記方法によりシグナル発信能についてアッセイした。さらにこれら細胞を、以下記載の様にしてｚｃｙｔｏｒ１１受容体でトランスフェクションした。
【０４７８】
Ｂ． ＣＲＦ２−４およびｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現するＢａＦ３細胞の構築
完全長ｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現するＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞は、上記実施例２１Ａの様に、３０μｇのｚｃｙｔｏｒ１１ｃＤＮＡ（配列番号１８）を含む発現ベクターを用い構築された。回収後トランスフェクタントを２００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）と２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを使い選別した。ｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現しているＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞はＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞と命名された。これら細胞をはＺＣＹＴＯ１８活性のスクリーニングに用いられた。
【０４７９】
実施例２２．アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）増幅アッセイを利用した、ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞を用いたＺＣＹＴＯ１８活性スクリーニング
Ａ．  アラマーブルー増殖アッセイを利用した、ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞を用いたＺＣＹＴＯ１８活性のスクリーニング
精製ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥ（実施例９）を用い、以下記載の様に増殖活性の存在を試験した。
ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞は遠心により落とされ、ｍＩＬ−３を含まない上記実施例２１の完全培地（以後“無ｍＩＬ−３培地”と呼ぶ）で洗浄された。細胞は３回遠心および洗浄され、ｍＩＬ−３は確実に除かれた。つぎに血球計算器を用い細胞数が測定された。細胞は、ウエル当たり１００μｌの無ｍＩＬ−３培地が加えられたウエルに５０００細胞の割合で、９６ウエル形式に接種された。
【０４８０】
ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞の増殖は、無ｍＩＬ−３培地を用いて５０、１０、２、１、０．５、０．２５、０．１３、０．０６ｎｇ／ｍｌ濃度に希釈されたＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥ蛋白質を使ってアッセイされた。希釈蛋白質１００μｌがＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞に加えられた。合計アッセイ容積は２００μＬである。アッセイプレートは３７℃、５％ＣＯ２にて３日間インキュベーションされ、その時点でアラマーブルー（アキュメッド（Ａｃｃｕｍｅｄ）、シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ）、イリノイ州（ＩＬ）が２０μｌ／ウエル加えられた。プレートは再度３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションされた。アラマーブルーは生細胞の数に基づき蛍光測定値を与え、従って陰性コントロールと比較した細胞増殖の直接測定法である。プレートは再度３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションされた。
【０４８１】
プレートはＳｏｆｔＭａｘＴＭＰｒｏプログラムを使ったＦｍａｘＴＭプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用い、波長５４４（励起）と５９０（発光）で読み取られた。結果より、ＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥに対するＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞の用量依存的増殖反応が確認された。測定された反応は上限値５０ｎｇ／ｍｌでバックグランドの約１５倍、そして下限値０．０６ｎｇ／ｍｌでは２倍増殖反応が誘導された。野生型ＢａＦ３およびＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞はＺＣＹＴＯ１８−ＣＥＥに反応し増殖することはなく、ＺＣＹＴＯ１８がＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロ２量型受容体に特異的であることが示された。
【０４８２】
前記より、ここでは例示を目的として本発明の具体的実施態様が記載されているが、発明の精神および範囲より逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されるだろう。従って発明は添付請求項以外に限定されることはない。
本発明は、次の非制限的な例によりさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のヒトＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド（ｈＺＣＹＴＯ１８）（配列番号３）及びマウスＺＣＹＴＯ１８ポリペプチド（ｍＺＣＹＴＯ１８）（配列番号３８）の複数の一列整列である。図における“：”は、マウス配列とヒト配列との間で同一であるアミノ酸を示し、そして図における“．”は、保存された置換であるアミノ酸を示す。全配列にわたってのヒト及びマウス配列間に７８．４％の同一性が存在する（１６８個のアミノ酸のオーバーラップ）。