(57)【要約】本発明は、関節内投与用の関節症治療剤及び関節保護剤の提供を目的とする。本発明は、スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与用の関節症治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与用の関節症治療剤。
【請求項２】
スタチンが、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の関節症治療剤。
【請求項３】
スタチンがメバスタチンである、請求項１に記載の関節症治療剤。
【請求項４】
関節症が変形性関節症である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の関節症治療剤。
【請求項５】
スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与用の関節保護剤。
【請求項６】
スタチンが、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の関節保護剤。
【請求項７】
スタチンがメバスタチンである、請求項５に記載の関節保護剤。
【請求項８】
関節内投与用の関節症治療剤又は関節保護剤を製造するための、スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用。
【請求項９】
スタチンが、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
スタチンがメバスタチンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
関節症が変形性関節症である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与のための関節症治療用又は関節保護用キット。
【請求項１３】
スタチンが、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
スタチンがメバスタチンである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
関節症が変形性関節症である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタチンを含有する関節内投与用の関節症治療剤及び関節保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節症の一つである変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＯＡ）は、関節軟骨の損傷及び／又は変性を特徴とし、軟骨の損傷及び／又は変性が進行することにより、二次的に関節炎を生じ得る疾患である。変形性関節症は、全身性の自己免疫疾患ではないこと、血液検査において炎症反応（赤血沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ））やリウマチ因子が陰性であること等により、関節リウマチとは区別される。
変形性関節症は、主に物理的要因と化学的要因によって発症する。物理的要因として、荷重、摩擦、機械的ストレスなどが考えられ、化学的要因として、軟骨細胞から産生されるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、アグリカナーゼ（Ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）等による細胞外マトリクス（軟骨コラーゲン、プロテオグリカン等）の破壊が考えられる。
変形性関節症の治療には、非ステロイド性鎮痛消炎剤の経口投与、局所麻酔薬又はステロイド薬の局所投与などが行われているが、これらの治療法は対症療法に過ぎず、使用される治療薬の副作用も問題となる。また、ヒアルロン酸製剤の関節内投与も行われているが、その作用は一時的な潤滑作用であり、軟骨保護作用は弱く、現在のところ変形性関節症に対する有効な治療剤は存在しない状況にある。
ところで、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチンともいう）は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素を競合的に阻害することにより、肝臓におけるアセチル−ＣｏＡからのコレステロール生合成を初期段階で阻害する分子である。このことから、スタチンは、コレステロール合成阻害作用を介した高脂血症治療薬として、広く臨床で使用されている。
また、最近の報告において、スタチンは抗炎症作用を有することが示されており（Ｕｗｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０９［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−１８−２６，２００４）、スタチンを免疫抑制剤や抗炎症剤として用いることが示唆されている（米国特許出願公開第２００２０１５６１２２号）。しかしながら、これらの文献は、自己免疫疾患やアテローム性動脈硬化症に関するものであり、関節症、特に変形性関節症の治療又予防に関するものではない。
さらに、スタチンが関節症の原因の一つとされるＭＭＰ−３の軟骨培養細胞からの産生を抑制すること、及び滑膜培養細胞からのＩＬ−６とＩＬ−８の産生を抑制することがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験により示されている（Ｌａｚｚｅｒｉｎｉ  ＰＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３（７）：８６７−９，２００４、Ｙｏｋｏｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３３（３）：４６３−７１，２００６）。しかしながら、これらの実験は、培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験にすぎず、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるスタチンの関節症、特に変形性関節症に対する効果は明らかではない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、スタチンを含有する関節内投与用の関節症治療剤及び関節保護剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、スタチンを哺乳動物の関節内に投与することによって、関節症、特に変形性関節症を治療及び／又は予防する効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与用の関節症治療剤。
（２）スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与用の関節保護剤。
（３）関節内投与用の関節症治療剤又は関節保護剤を製造するための、スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用。
（４）スタチン、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与のための関節症治療用又は関節保護用キット。
本発明において、スタチンとしては、例えばプラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
また、本発明の治療剤の適用の対象となる関節症としては、好ましくは、変形性関節症である。
本発明により、スタチンを含有する関節内投与用の関節症治療剤及び関節保護剤を提供することができる。本発明の治療剤により、経口投与よりも効果的に関節症を治療することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ウサギの変形性関節症モデルに対しスタチンを経口投与又は関節内投与した後の関節軟骨を示す図である。黒く染色された部位は、損傷又は変性箇所を示す。
図２は、ウサギの変形性関節症モデルに対しスタチン又は生理食塩水を関節内投与した後の関節軟骨を示す図である。黒く染色された部位は、損傷又は変性を示す。
図３は、ウサギの変形性関節症モデルに対しスタチン又は生理食塩水を関節内投与した後の膝関節の関節軟骨の組織切片をサフラニン−Ｏ染色した結果を示す図である。正常関節軟骨は、サフラニン−Ｏにより赤色に染色されるのに対し、関節症発症部位は染色されない。
図４は、ウサギの変形性関節症モデルに対しスタチン又は生理食塩水を関節内投与した後の膝関節の滑膜組織の組織切片をＨＥ染色した結果を示す図である。細胞核は青色に染色され、増殖組織は赤色に染色される。炎症細胞が多いほど染色された核の数が多く、また増殖組織が強く（濃く）染色される。
図５は、ウサギの変形性関節症モデルに対しスタチン又は生理食塩水を関節内投与した後の膝関節の滑膜組織の組織切片を免疫染色したときの炎症性細胞（ＣＤ６８陽性細胞）を解析した結果を示す図である。（Ａ）：膝関節の滑膜組織の組織切片を免疫染色した結果を示す図である。炎症細胞（ＣＤ６８陽性細胞）は褐色に染色される。（Ｂ）：ＣＤ６８陽性細胞数の比較をスタチンの濃度ごとに示すグラフである。
図６は、ウサギの変形性関節症モデルに対しスタチン又は生理食塩水を関節内投与した後の膝関節の滑膜組織における遺伝子発現結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２００７年３月３０日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２００７−９２０９６号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与用の関節症治療剤に関する。
変形性関節症などの関節症に対しては、その原因となる軟骨破壊を抑制する有効な治療法はなく、人工関節が使用されているに過ぎないのが現状である。この点、スタチンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭＭＰ−３など軟骨破壊に関与する分子の産生を抑制することが報告されているため、関節症治療への応用が期待される。しかしながら、これらの報告は培養細胞を用いた実験結果によるものに過ぎず、実際に関節症に対して治療又は予防し得るか否か、その効果は明らかではない。
そこで、本発明者らは、ウサギ変形性関節症モデルを用いて、スタチンを関節内に投与することにより、スタチンが軟骨保護作用、及び軟骨破壊に伴う関節炎の抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を関節症患者に投与することを特徴とする関節症の治療方法も提供する。また、本発明は、関節内投与用の関節症治療剤又は関節保護剤を製造するための、スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用を提供する。
本発明において、「関節症」とは、関節に疼痛、変形又は炎症などを生じる疾患を意味する。治療又は保護の対象となる関節症としては、限定されるものではないが、変形性関節症、関節リウマチ、半月板損傷、靭帯損傷、離断性骨軟骨炎、関節炎などが挙げられ、好ましくは変形性関節症である。
「変形性関節症」とは、荷重、摩擦、機械的ストレス等の物理的要因、細胞外マトリクス破壊分子等（マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、アグリカナーゼ（Ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ））による軟骨破壊などの化学的要因、あるいは遺伝的要因、年齢、肥満、性別その他の要因により関節において発生する疾患であり、軟骨損傷の進行により二次的に発生する関節炎も含まれる。なお、変形性関節症は、血液検査、及びＸ線検査などによる所見から、関節リウマチや痛風などと区別される。
本発明の治療剤及び保護剤の対象となる関節部位としては、例えば膝関節、股関節、指関節、脊椎、腰椎、肘関節、肩関節、手関節、足関節等が挙げられる。
本発明の治療剤及び保護剤は、細胞外マトリクスの破壊を抑制することにより関節症の症状を消失又は軽減できると考えられ、関節内に投与した場合に軟骨保護作用を示し、関節炎を抑制する効果を示すものである。
本発明において関節症の「治療」とは、関節軟骨の損傷、変性および関節内の炎症を抑制することによって、関節破壊に伴う疼痛、機能障害を緩和することを意味する。
また、本発明において関節の「保護」とは、関節軟骨破壊物質の産生や炎症細胞の浸潤を抑制することで、関節軟骨の破壊を止めることを意味し、関節症の予防も含まれる。
本発明の治療剤として使用されるスタチンは、限定されるものではないが、例えばプラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン等が挙げられる。本発明においては、これらのスタチンを単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。
プラバスタチンは（＋）−（３Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［（１Ｓ，２Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ヒドロキシ−２−メチル−８−［（Ｓ）−２−メチルブチリルオキシ］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−１−ナフチル］ヘプタン酸であり（特公昭６１−１３６９９号）、次式Ｉに示される構造を含む化合物である。
2008123602.tif 000002
シンバスタチンは、（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル  ２，２−ジメチルブチレートであり、次式ＩＩに示される化合物である（特公昭６４−１４７６号）。
2008123602.tif 000003
フルバスタチンは、（±）（３Ｒ＊，５Ｓ＊，６Ｅ）−７−［３−（４−フルオロフェニル）−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−インド−ル−２−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸であり、次式ＩＩＩに示される化合物である（特公平２−４６０３１号）。
2008123602.tif 000004
アトルバスタチンは、（３Ｒ，５Ｓ）−７−［２−（４−フルオロフェニル）−５−（１−メチルエチル）−３−フェニル−４−フェニルアミノカルボニル−１Ｈ−ピロ−ル−１−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプタン酸であり、次式ＩＶに示される構造を含む化合物である（特開平３−５８９６７号）。
2008123602.tif 000005
ピタバスタチンは、（Ｅ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［４′−（４″−フルオロフェニル）−２′−シクロプロピルキノリン−３′−イル］−６−ヘプテン酸であり、次式Ｖに示される構造を含む化合物である（特開平１−２７９８６６号）。
2008123602.tif 000006
ロスバスタチンは、（＋）−（３Ｒ，５Ｓ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メタンスルフォニルアミノ）ピリミジン−５−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６（Ｅ）−ヘプテン酸であり、次式ＶＩに示される構造を含む化合物である（特開平５−１７８８４１号）。
2008123602.tif 000007
メバスタチンは、式ＶＩＩに示される化合物である（特開昭５０−１５５６９０号）。
2008123602.tif 000008
上記スタチンは、それぞれの公報に記載の方法により得ることができるが、以下の商品として購入することもできる。
プラバスタチン：「メバロチン」（登録商標）、第一三共株式会社
シンバスタチン：「リポバス」（登録商標）、万有製薬株式会社
フルバスタチン：「ローコール」（登録商標）、ノバルティスファーマ株式会社
アトルバスタチン：「リピトール」（登録商標）、ファイザー株式会社
ピタバスタチン：「リバロ」（登録商標）、興和株式会社
ロスバスタチン：「クレストール」、塩野義製薬株式会社
メバスタチン：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
本発明において使用されるスタチンは、製薬上許容される塩を形成する場合もある。製薬上許容される塩は、本発明の治療剤としての効果を有する限り特に限定されるものではなく、酸との塩を形成しても塩基との塩を形成してもよい。
酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩との塩、蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩などを挙げることができる。
また、塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン，Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩（有機アミン塩）、あるいはアンモニウム塩などを挙げることができる。
本発明において、スタチンの水和物などの溶媒和物が存在する場合には、これら溶媒和物も本発明における関節症治療剤及び関節保護剤に含まれる。溶媒和物は、例えば、水和物、非水和物などを挙げることができ、好ましくは水和物である。溶媒は、例えば、水、アルコール（例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール等）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の治療剤又は関節保護剤に用いる添加剤として、関節投与に適切なものを適宜選択することができる。このような添加剤としては、例えば、乳化剤、界面活性剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、保存剤、溶解補助剤、等張化剤、吸収促進剤などが挙げられる。これらを単独又は適宜組み合わせ、定法により関節投与用製剤を製造することができる。
ここで、関節投与用製剤としては、注射剤、点滴注射剤などの液体製剤が好ましく、注射剤がより好ましい。液体製剤は、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
本発明の治療剤又は関節保護剤の投与経路としては、関節内投与が好ましく、投与する関節としては、好ましくは膝関節、股関節、指関節、脊椎、腰椎、肘関節、肩関節、手関節、足関節である。
本発明の治療剤又は関節保護剤は哺乳動物に対して投与することができる。ここで、哺乳動物としては、例えば、ヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどが挙げられる。
本発明の治療剤又は関節保護剤に含まれるスタチンの有効投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、投与期間、又は調剤の種類などにより異なるが、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、成人（体重６０ｋｇ）に週１回から数回、好ましくは１〜７回投与することができ、その投与量は、１回当たり下限は０．００１ｍｇであり、上限は１００ｍｇである。好ましくは、１回あたり下限は０．０１ｍｇであり、上限は１０ｍｇである。より好ましくは０．１ｍｇ〜５ｍｇ、さらに好ましくは０．５ｍｇ〜３ｍｇである。投与時期は、症状に応じて適宜定めることができ、複数回分を同時に又は時間を置いて別々に投与することができる。
なお、本発明の治療剤を他の関節症治療薬と併用する場合は、投与量を適宜下げることも可能である。
本発明の治療剤が有効であるか否かの確認は、例えばサフラニン−Ｏ染色、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ染色）、免疫染色、ＲＴ−ＰＣＲ等により実施することができる。これらの確認手法は、当業者に周知の技術である。
本発明は、スタチン、その製薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、関節内投与のための関節症治療用又は関節保護用キットを提供する。
本発明のキットは、スタチンの他に、溶解液、緩衝液、使用説明書、注射器など、関節症の治療に必要な他の任意の構成要素を適宜含めることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
以下の実施例においては、スタチンとしてメバスタチン（ｓｉｇｍａ社）を用いた。
１．ウサギの変形性関節症モデルへのメバスタチンの投与
（１）変形性関節症モデル動物
変形性関節症モデルは、６ヶ月齢のオスの日本白色ウサギを購入し（入手先：九動株式会社）、膝前十字靱帯を切離し、内側半月板を切除することにより作製した。
（２）メバスタチンの関節内投与
メバスタチン（ｓｉｇｍａ社）を生理食塩水に溶解することにより、０．１ｍｇ／ｍｌのメバスタチン溶液を調製した。また、コントロールとして生理食塩水を用いた。
本実施例では、変形関節症モデルウサギに、テルモシリンジ（１ｍｌ）を用いて週に１回、６週間にわたり、メバスタチン又は生理食塩水を関節内投与した。メバスタチン（０．０１５ｍｇ／０．１５ｍｌ／ｋｇ）を関節内投与した群をメバスタチン関節内投与群とし、生理食塩水を関節内投与した群をコントロール群として、後述する各種評価に用いた。
（３）メバスタチンの経口投与
メバスタチンの関節内投与がメバスタチンの経口投与と比較してどの程度の治療又は保護効果を有するかを検討するため、変形性関節症モデルに対する経口投与試験も行なった。
具体的には、０．５ｍｇ／ｍｌのメバスタチン生食溶液を調製し、変形性関節症モデルに対し、７回／週の投与間隔で６週間経口投与した（メバスタチン経口投与群）。
２．メバスタチンの関節内投与による治療効果についての各種評価
（１）肉眼的評価
メバスタチン関節内投与群又はメバスタチン経口投与群のそれぞれに属する個体について、関節内投与又は経口投与後６週目に膝関節を摘出し、両者の軟骨表面を墨汁で染色し、粗雑化などを肉眼的に評価した。なお、メバスタチンの代わりに生理食塩水を関節注射した群をコントロール群とした。
その結果、メバスタチン関節内投与では墨汁の染色が認められなかったのに対し、メバスタチン経口投与群では、墨汁による染色が認められ、軟骨の損傷又は変性が生じていた（図１）。また、メバスタチン関節内投与群では、コントロール群と比較して墨汁の染色割合が低く、メバスタチンの関節内投与により関節軟骨の損傷が抑制されることが示された（図２）。
従って、メバスタチンの関節内投与は、経口投与よりも関節症の治療効果を有することがわかった。
（２）サフラニン−Ｏ染色による関節軟骨の組織学的評価
メバスタチンの軟骨保護作用について、サフラニン−Ｏ染色により組織学的に評価した。具体的には、メバスタチン関節内投与群とコントロール群（生理食塩水を関節内投与した群）のそれぞれの膝関節軟骨から、軟骨組織を含む組織切片を作製後、組織切片のサフラニン−Ｏ染色を行った。
その結果、関節内投与群の関節軟骨はサフラニン−Ｏにより赤色に染色されたのに対し、コントロール群では染色されずに関節軟骨の破壊が認められた（図３）。従って、メバスタチン関節内投与群では、軟骨の破壊が抑制されることが示された。
（３）ＨＥ染色による滑膜組織の組織学的評価
メバスタチンの関節炎抑制効果について、ＨＥ染色により組織学的に評価した。具体的には、メバスタチン関節内投与群とコントロール群それぞれの膝関節から滑膜組織を採取し、組織切片を作製後、組織切片のＨＥ染色を行った。
その結果、コントロール群では滑膜細胞の増殖による炎症所見を示す青色及び赤色の染色及び組織細胞増殖が認められた。これに対し、メバスタチン関節内投与群では炎症が抑制された（図４）。
（４）免疫染色による滑膜組織の組織学的評価
メバスタチンの関節内投与による関節炎抑制効果を評価するため、免疫染色により組織学的検査を行った。具体的には、メバスタチン関節内投与群及びコントロール群のそれぞれの膝関節から滑膜組織を採取し、組織切片を作製後、組織切片の免疫染色を行い、メバスタチン関節内投与群とコントロール群とを比較した。ここで、一次抗体としては、抗ＣＤ６８抗体を用い、二次抗体として抗ＩｇＧ抗体を用いた。また、メバスタチン関節内投与群とコントロール群のＣＤ６８陽性細胞の数を比較した。
その結果、炎症性細胞であって軟骨破壊物質を産生するＣＤ６８陽性細胞は褐色に染色された。また、コントロール群では、ＣＤ６８陽性細胞の遊走及び浸潤が認められたのに対し、メバスタチン関節内投与群では、ＣＤ６８陽性細胞の遊走及び浸潤が抑制された（図５Ａ）。さらに、滑膜組織に浸潤したＣＤ６８陽性細胞の数は、０．１ｍｇ／ｍｌ以上のメバスタチンを関節内投与した群ではコントロール群と比較して有意に少なく（図５Ｂ）、メバスタチンの関節内投与による関節炎抑制効果が示された。図５Ａにおける顕微鏡の倍率は、上パネルが１００倍、下パネルが４００倍である。
（５）ＲＴ−ＰＣＲによる滑膜組織における遺伝子発現解析
メバスタチンの関節内投与による関節炎抑制効果について、ＲＴ−ＰＣＲにより生化学的評価を行った。具体的には、メバスタチン関節内投与群とコントロール群それぞれの膝関節から滑膜組織を採取し、採取した滑膜組織からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を評価した。
ここで、ＲＴ−ＰＣＲにより発現を確認するための遺伝子としては、炎症関連遺伝子、軟骨関連遺伝子、骨関連遺伝子等のほか、分化、増殖、細胞死に関連する遺伝子などが挙げられるが、炎症性関連遺伝子及び軟骨関連遺伝子を使用することが好ましい。炎症関連遺伝子として、例えば、炎症性細胞の遊走を促進するケモカインであるＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、インターロイキンなどを使用することができ、軟骨関連遺伝子として、例えば軟骨破壊に関与するＭＭＰ−３、軟骨で発現するＣｏｌ２、Ｓｏｘ９、Ａｇｇｒｅｃａｎなどを使用することができる。
そこで、本実施例では、遺伝子発現を評価する遺伝子として、ＭＣＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ−１β、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１３を選択した。
また、ＭＭＰの生体内における活性を検討するためには、ＭＭＰの発現量のみならず、ＭＭＰの活性を制御するインヒビターであるＴＩＭＰ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現量も検討する必要があることから、ＴＩＭＰ−１も遺伝子発現を評価する遺伝子として選択した。
ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは以下の通りである。
ＭＣＰ−１：
2008123602.tif 000009
ＭＭＰ−３：
2008123602.tif 000010
ＩＬ−１β：
2008123602.tif 000011
ＭＭＰ−１：
2008123602.tif 000012
ＭＭＰ−１３：
2008123602.tif 000013
ＴＩＭＰ−１：
2008123602.tif 000014
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＲＮＡ  ＰＣＲＴＭ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０（タカラバイオ株式会社）キットを用いて、添付の製品説明書に従いＰＣＲ反応組成液を調製し、３０サイクルの条件にて行った。発現量の測定は、ＰＣＲエクスプレスＩＩ（英国サーモハイベイト社）を用いて行った。各遺伝子の発現量の値は、ＧＡＰＤＨを用いて標準化した。
その結果、メバスタチン投与群の滑膜組織におけるＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３の遺伝子発現は、いずれもコントロール（無処置）と比較して有意に抑制されることが示された（図６）。
一方、ＴＩＭＰ−１の発現量は、メバスタチン投与群とコントロールとの比較において有意差は認められなかった。
この結果は、ＭＭＰの活性がメバスタチン投与群において抑制されていることを示すものである。
以上より、本発明の関節治療剤の治療効果および関節保護剤の保護効果が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の治療剤及び関節保護剤は、例えば、変形性関節症の患者に定期的に関節内投与することにより、変形性関節症の治療又は関節の保護に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１〜１２：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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