(57)【要約】本発明は、ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス開始剤、光増感剤からなりｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を光照射によって重合した含水ゲルが担持体に充填された電気泳動用プレキャストゲルに関する。  本発明の電気泳動用スラブゲルは、従来技術と比較して短時間かつ簡易な方法で電気泳動用プレキャストゲルを製造できる。従って、生産性、コスト及び品質の面で高品位な電気泳動用プレキャストゲルの製造が可能となり、産業上の利用可能性は甚だ大きい。
2009025135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス重合開始剤、光増感剤からなりｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を光照射によって重合した含水ゲルが担持体に充填された電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項２】
前記ラジカル重合性単量体がアクリルアミドであることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項３】
前記還元剤がテトラメチルエチレンジアミンであることを特徴とする請求項１または２に記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項４】
前記緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項５】
前記緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、塩酸、及び両性電解質からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項６】
前記緩衝液が、グリシンとグリシンを除く両性電解質を含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項７】
前記緩衝液が、ホウ酸、酢酸およびグリシンから選択される一種以上の酸によるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの部分中和物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項８】
前記緩衝液が、ビス−トリス［ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］と塩酸からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項９】
前記水溶液のｐＨが６．０〜７．０の範囲にあることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項１０】
前記担持体が、２枚のガラス板あるいはガラス板とプラスチック板の二辺に所定厚さのスペーサーを挟みこんで形成したケースであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項１１】
前記担持体が、厚さ０．１ｍｍ〜１．０ｍｍである二枚のプラスチック製シートの二辺あるいは三辺に所定厚さのスペーサーを挟みこんで形成したケースであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項１２】
前記担持体が射出成型にて形成したプラスチックケースであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲル。
【請求項１３】
ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス重合開始剤、光増感剤からなりｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を担持体に充填し、光照射によって重合することを特徴とする電気泳動用プレキャストゲルの製造方法。
【請求項１４】
前記光照射によって前記水溶液が５分以内に硬化することを特徴とする請求項１３に記載の電気泳動用プレキャストゲルの製造方法。
【請求項１５】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びグリシンを含有する泳動用緩衝液を用い、ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、レドックス重合開始剤、光増感剤からなりｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を光照射によって重合した含水ゲルが担持体に充填された電気泳動用スラブゲルによって蛋白質あるいは核酸の分離分析を行うことを特徴とする電気泳動用スラブゲルの使用方法。
【請求項１６】
前記泳動用緩衝液が、ドデシル硫酸塩を含有することを特徴とする請求項１５に記載の電気泳動用スラブゲルの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学医薬分析を目的とし、電気泳動を用いてタンパク質、核酸等の分離を行うときに使用する電気泳動用スラブゲル、その製造方法及びそれを使用した電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動とは、荷電粒子または分子が電場中を移動する現象のことを言い、前記現象を分子生物学分野でタンパク質、または核酸の分離に応用した方法が一般に電気泳動方法と言われている。電気泳動方法は分子生物学のみならず、医学、水産学、獣医学、薬学などの多くの分野における基礎的研究手段として広く使用されている。特に近年、ゲノムの解読後、プロテオーム解析が盛んとなり、タンパク質の機能解析、またそれを利用した創薬などに、電気泳動方法はなくてはならない手法として位置づけられている。
通常、電気泳動を行う場合、緩衝液を含有した媒体を用いる。媒体としては、アガロース、寒天、セルロースアセテート膜、ポリアクリルアミドゲルなどが公知であり、目的に合わせて使い分けられている。
特に、ポリアクリルアミドゲルは、人工的に合成された物質であるため、処方を変えることで分離特性の異なるゲルを容易に作成することが出来る。ポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動方法は汎用されている。
近年は研究の効率化とアクリルアミドのような毒性の強い試薬の取り扱いを懸念する傾向から、予め様々な分離条件のゲルが充填されているポリアクリルアミドプレキャストゲルが普及している。
従来、電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは蛋白質の生化学医薬分析用に、オルンスタイン（Ｌ．Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１，３２１−３４９（１９６４））とデービス（Ｂ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１，４０４−４２７（１９６４））によって提案された方法や、レムリー（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０（１９７０））によって提案された方法が広く使用され、使用者がゲルを製造して使用してきた。特にドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）をゲルや泳動用緩衝液に添加することで手軽に蛋白質の分子量を推定できるレムリーの方法が広く普及している。レムリーの方法はゲル緩衝液としてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略す）の塩酸による部分中和物を使用し、泳動用緩衝液としてはトリス、グリシン塩を使用している（レムリーの泳動緩衝液）。この方法におけるゲル緩衝液ではｐＨが８．８になるようにトリスの約１０〜２０モル％を塩酸により部分中和する（レムリーのゲル緩衝液）。しかしレムリーのゲル緩衝液のｐＨでは、アミド基は経時的に加水分解反応を受ける。加水分解反応は低温条件でも進行し、ポリアクリルアミドゲルは部分的にアニオン基を有することになる。この結果、蛋白質の泳動距離が短くなると共に分離像は不鮮明となるのでゲルを長期に保存することは出来ない。
このため、予め量産したゲルを供給するプレキャストゲルにおいては、保管期限を限定して供給する必要があり保存安定性が良好であることが望まれている。
本出願人においても、ＪＰ特許２５８８０５９号公報、ＪＰ特許２５９７１４５号公報、ＪＰ特許３０７６２００号公報及びＪＰ特許３９４２００１号公報等に報告されているように、電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの品質向上や製造方法、使用方法について鋭意研究を行い、課題を解決してきた経緯がある。前記発明を応用し、ポリアクリルアミドプレキャストゲルの品質、生産性の面で技術の向上を図ることが出来、高品質なプレキャストゲルの生産性向上に寄与した。
電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの形状は、ガラス管内にゲルを作成して用いる方法、２枚のガラス板の間にゲルを作成して用いる方法がある。後者のタイプのゲルはスラブゲルと呼ばれている。
ポリアクリルアミドスラブゲルは、一般にはガラスプレートを担持体として用いるが、プレキャストゲルとしてはガラスプレートの他にプラスチック製のプレートを用いたものも欧米を始め日本国内で上市されている。
従来、ポリアクリルアミドスラブゲルの製造方法は、所定厚さのスペーサーを挟んだ２枚のガラスプレートの間にレドックス触媒を添加した高濃度アクリルアミド溶液を充填して分離層と呼ばれるゲルを形成させた後、同じくレドックス触媒を添加した低濃度アクリルアミド溶液を充填し、さらに目的となる形状のクシバ（コーム）を挿入して濃縮層と呼ばれるゲルとサンプル注入口を同時に分離ゲルの上に形成させて作成する。
アクリルアミドの未反応モノマーがゲル中に残存することを防止するため、アクリルアミド溶液を脱気した後に、レドックス触媒を添加してゲルを形成させることもできる。
しかしながら、アクリルアミドは反応性に富み、脱気雰囲気下で触媒と混合すると急速にゲル化反応が進行してしまう。量産化のために、アクリルアミド溶液を低温に保つ方法や触媒濃度を調整して順次反応を進める方法が提案されている。（ＪＰ特開平５−２０３６２１号公報）
また、アクリルアミド溶液のフィルム上への塗工によるゲルの製造方法では光重合方法によりプレキャストゲルの生産性を向上させることができるが、塗工による製造方法の場合、濃縮層と分離層の２層の形成や高品位な濃度勾配ポリアクリルアミドゲルの製造が難しい。このため、ゲルの厚さを変化させる方法や、アクリルアミド溶液の粘性を上げる方法が提案されている。（ＪＰ特開平６−５２２５４号公報、ＪＰ特開平６−６０８８５号公報）また、均一な膜厚のゲルを作成するためには、塗工機などの特殊な装置が必要である。
つまり、電気泳動用に最適なポリアクリルアミドプレキャストゲルを製造するためには、様々な創意工夫が必要であり、生産性と品質確保の面から、高品位なプレキャストゲルを提供することは従来技術では困難であった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下に述べる発明に到達した。本発明はまた電気泳動用スラブゲルの製造方法およびその使用方法に関しても述べる。
すなわち本発明は
１）ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス開始剤、光増感剤からなりｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を光照射によって重合した含水ゲルが担持体に充填された電気泳動用プレキャストゲルに関する。
２）前記ラジカル重合性単量体がアクリルアミドであることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
３）前記還元剤がテトラメチルエチレンジアミンであることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
４）前記緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸からなることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
５）前記緩衝液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、塩酸、及び両性電解質からなることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
６）前記緩衝液が、グリシンとグリシンを除く両性電解質を含有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲであるル。
７）前記緩衝液が、ホウ酸、酢酸およびグリシンから選択される一種以上の酸によるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの部分中和物であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
８）前記緩衝液が、ビス−トリス［ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］と塩酸からなることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
９）前記水溶液のｐＨが６．０〜７．０の範囲にあることを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
１０）前記担持体が、２枚のガラス板あるいはガラス板とプラスチック板の二辺に所定厚さのスペーサーを挟みこんで形成したケースであることを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
１１）前記担持体が、厚さ０．１ｍｍ〜１．０ｍｍである二枚のプラスチック製シートの二辺あるいは三辺に所定厚さのスペーサーを挟みこんで形成したケースであることを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
１２）前記担持体が射出成型にて形成したプラスチックケースであることを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれかに記載の電気泳動用プレキャストゲルである。
１３）前記水溶液が、ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス重合開始剤、光増感剤からなりｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を担持体に充填し、光照射によって重合することを特徴とする電気泳動用プレキャストゲルの製造方法である。
１４）前記光照射によって前記水溶液が５分以内に硬化することを特徴とする（１３）に記載の電気泳動用プレキャストゲルの製造方法である。
１５）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びグリシンを含有する泳動用緩衝液を用い、ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、レドックス重合開始剤、光増感剤からなりｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を光照射によって重合した含水ゲルが担持体に充填された電気泳動用スラブゲルによって蛋白質あるいは核酸の分離分析を行うことを特徴とする電気泳動用スラブゲルの使用方法である。
１６）前記泳動用緩衝液が、ドデシル硫酸塩を含有することを特徴とする請求項１５に記載の電気泳動用スラブゲルの使用である。
本明細書は本願の優先権の基礎であるＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６６４０３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明のプラスチック製担持体の分解斜視図である。
図２は、図１に示された電気泳動プレキャストゲルケースの組み立てられた状態における前面斜視図であり、２枚のプラスチック製シートとスペーサーを接着して作製され、三方が固定された電気泳動用スラブゲルのケースを示す斜視図である。
図３は、図１に示された電気泳動プレキャストゲルケースの組み立てられた状態における背面斜視図であり、２枚のプラスチック製シートとスペーサーを接着して作製され、三方が固定された電気泳動用スラブゲルのケースを示す斜視図である。
図４は、担持体としてガラス板を用いた本発明により電気泳動を行った結果を示す図である。
図５は、担持体としてＰＥＴ製のケースを用いた本発明により電気泳動を行った結果を示す図である。
【符号の説明】
【０００５】
１．前面プラスチックシート
２．スペーサー
３．背面プラスチックシート
４．通電用スリット
５．シール
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の電気泳動用プレキャストゲルは、ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス重合開始剤、光増感剤からなるｐＨが６．０〜７．５の範囲にある水溶液を光照射によって重合した含水ゲルが担持体に充填されている。
前記ラジカル重合性単量体とは、非イオン性の水溶性ビニル単量体であり、特に限定されるものではないが、例として、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルスクシイミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、ダイアセトンアクリルアミドなどが挙げられる。
前記ラジカル重合性単量体はアクリルアミドであることが特に好ましい。
前記架橋性単量体とは、２個以上のビニル基を持つラジカル重合性単量体であり、例えば、メチレンビスアクリルアミド、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ピペラジンジアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアリル酒石酸アミド、１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−ｓ−トリアジンなどが挙げられる。
また、前記ラジカル重合性単量体に対し前記架橋性単量体を５重量％以下の範囲で共重合した場合が、電気泳動による蛋白質あるいは核酸の分離に適している。
前記光増感剤は、リボフラビンあるいはリボフラビンリン酸ナトリウムの使用が好ましい。
前記酸化剤／還元剤からなるレドックス重合開始剤とは、過酸化物、またはペルオクソ二硫酸塩と還元剤との組み合わせからなるラジカル重合開始剤である。過酸化物の例としては、ペルオクソ二硫酸アンモニウム、ペルオクソ二硫酸カリウム、過酸化水素などをあげることができる。また還元剤の例としては、トリメチルアミン、テトラメチルエチレンジアミンなどをあげることができ、特に好ましくはテトラメチルエチレンジアミンである。これら酸化剤／還元剤の組み合わせの例としては、ペルオクソ二硫酸アンモニウム／トリメチルアミンあるいはテトラメチルエチレンジアミン、ペルオクソ二硫酸カリウム／トリメチルアミンあるいはテトラメチルエチレンジアミンなどがあげられる。特に好ましい組み合わせは、ペルオクソ二硫酸アンモニウム／テトラメチルエチレンジアミンである。
前記緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸からなる緩衝液、あるいは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸と両性電解質からなる緩衝液、あるいはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸とグリシンとグリシンをのぞく両性電解質からなる緩衝液、あるいはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとホウ酸からなる緩衝液、あるいはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと酢酸からなる緩衝液、あるいはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとグリシンからなる緩衝液、あるいはビストリスと塩酸からなる緩衝液であっても良い。
特に好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸とグリシンとグリシンを除く両性電解質からなるｐＨ６．０〜７．５の緩衝液である。
また、前記ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス重合開始剤、光増感剤からなる水溶液は、水溶液のｐＨが６．０から７．５、特に好ましくはｐＨ６．０〜７．０にある範囲ならば、使用目的に応じて任意の濃度となるように混合し使用することができる。ｐＨ６．０以下では、電気泳動による蛋白質あるいは核酸の分離が不鮮明で使用目的に適さないし、ｐＨ７．５以上では、前記重合体の加水分解が進行しプレキャストゲルとして長期安定性を維持できない。
本発明の電気泳動用プレキャストゲルは、ラジカル重合性単量体、架橋性単量体、緩衝液、酸化剤／還元剤からなるレドックス重合開始剤、光増感剤からなるｐＨが６．０〜７．５、特に好ましくはｐＨ６．０〜７．０の範囲にある水溶液を担持体に充填し、光照射することによって重合して製造される。
特に、光照射によってラジカルを発生する光増感剤とレドックス触媒を併用して前記ラジカル重合性単量体を重合することにより、一般に知られているラジカル重合開始剤のみでの反応を用いる方法に比べ重合速度を任意に調整することができる。
前記光増感剤とレドックス触媒は前記ラジカル重合性単量体に対し、０．０００５〜５％が使用される。この場合の光増感剤には、使用する光源に適した水溶性の光増感剤を使用することができる。紫外光を使用する場合にはリボフラビンが挙げられる。
光照射に使用される光源は一般に知られている光源を使用することができる。
温度は、必要な重合速度に応じて選択することができるが、通常５〜５０℃の範囲が好ましい。
前記水溶液には、ラジカル重合性単量体、架橋性単量体と緩衝液に加えて、重合物の強度の向上あるいはケースと重合物との接着性の向上などを目的として、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメチルビニルエーテル、ポリヒドロキシメチルアクリルアミドなどの水溶性高分子やグリセリン等を含有しても良い。
前記水溶液には、目的に応じて、ドデシル硫酸ナトリウムを含有しても良い。
本発明の電気泳動用プレキャストゲルは、含水ゲルが担持体に充填されている電気泳動用スラブ型プレキャストゲルである。
前記担持体は、ガラス板あるいはプラスチック板と、上部に凹状の切り込みの入った同寸法のガラス板あるいはプラスチック板の間に、厚さ１ｍｍのスペーサーとモノマー液が漏れないようにシリコンパッキンを挟むことで形成することができる。
また前記担持体は、図１および図２のような２枚のプラスチック製のシートにコの字型の厚さ１ｍｍのスペーサーを挟みこんで形成したケースである。プラスチック製シートの厚さは０．１ｍｍ〜１．０ｍｍであることが好ましい。重合物と陽極の泳動用緩衝液を接触させ通電させるため図３に記載したようなスリットを形成させておく必要がある。前記スリットは製造時にはテープ等で封鎖しておき、使用時にテープを剥がすことで通電スリットとして機能させることができる。
また前記担持体は、射出成型にて形成したプラスチック製のケースも使用できる。
前記プラスチック製シートあるいはプラスチック製ケースの材質は、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、スチレン−アクリルニトリル系樹脂、アクリル系樹脂、ポリカーボネートなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。プラスチック製シートは同種の材質を二枚使用してケースを形成しても良いし、異なる材質のものを組合せて使用しても良い。
前記プラスチック製シートは、酸素透過係数が１００ｃｍ３／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であることが好ましい。酸素透過係数が１００ｃｍ３／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以上では、重合時にケースに含有される酸素により重合阻害が発生し電気泳動に適した重合物を得ることができない。
また前記プラスチック製シートの曲げ弾性率は７０００ｋｇ／ｃｍ２以上であることが好ましい。曲げ弾性率はプラスチックの剛性を示す指標であり一般に７０００ｋｇ／ｃｍ２以上が硬質プラスチックであると言われている。曲げ弾性率が７０００ｋｇ／ｃｍ２以上であることにより、取り扱いや輸送時の衝撃によるケースの破損や変形を防止できる。
本発明の電気泳動用プレキャストゲルは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび両性電解質を含有する水溶液である泳動用緩衝液を用いて蛋白質の分離を行うことができる。前記泳動用緩衝液にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有させても良い。
また、本発明の電気泳動用プレキャストゲルは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび両性電解質を含有する水溶液である泳動用緩衝液を用いて核酸の分離を行うことも可能である。
以下に本発明の電気泳動用プレキャストゲルおよびその製造方法およびその使用方法について実施例を挙げて詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０００７】
担持体として横幅１２ｃｍ、縦１０ｃｍの長方形のガラス板と、上部に凹状の切り込みの入った同寸法のガラス板の間に、厚さ１ｍｍのスペーサーとモノマー液が漏れないようにシリコンパッキンを挟みガラスプレートを組み立てた。分離層溶液として、アクリルアミド濃度１０％（％Ｔ）、ＢＩＳ濃度３％（％Ｃ）、グリセリン８％、並びに表１に記載する濃度の緩衝液組成から成るモノマー溶液に対し、０．１％リボフラビン燐酸ナトリウム溶液を２０μｌ／ｍｌ、ＴＥＭＥＤを０．８μｌ／ｍｌ及び１０％ＡＰＳ溶液を６μｌ／ｍｌ添加し、濃縮層溶液として、アクリルアミド濃度５％Ｔ、ＢＩＳ濃度３％Ｃ、並びに表１に記載する濃度の緩衝液組成からなるモノマー溶液に対し、０．１％リボフラビン燐酸ナトリウム溶液を５μ／ｍｌ、ＴＥＭＥＤを１．２μｌ／ｍｌ及び１０％ＡＰＳ溶液を１０μｌ／ｍｌを添加攪拌した。分離層溶液、濃縮層溶液の順にプレート内に注入後コームを設置し、４００Ｗ高圧水銀灯にてＵＶ照射（３６５ｎｍの光量２０ｍＷ／ｃｍ２）を１分間行いゲル化させた。
【表１】
2009025135.tif 000003
得られた電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルを用いて電気泳動を行った。泳動用緩衝液はトリス０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、グリシン０．１９２ｍｏｌ／Ｌ、ＳＤＳ０．１重量％からなる緩衝液を使用した。前記緩衝液はレムリー処方として公知である。上記で作製した電気泳動ゲルを用い、電気泳動を行った。
泳動試料として、アプロサイエンス社製アプロ分子量マーカー（Ａ）、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製プレシジョンプラスマーカー（Ｂ）、鶏肉抽出物（Ｃ）を使用した。電気泳動は２００Ｖ定電圧で５０分間行った。染色は、０．０５％ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）−Ｇ２５０、１２％酢酸、３０％メタノール溶液中で振とう機を使用して４５分間行い、脱色は１２％酢酸、１５％メタノール溶液中で振とう機を使用して９０分間行い、最後に純水中にて６０分間浸漬させた。
染色、脱色後の結果を図４に示す。
電気泳動の結果、タンパク質の分離は正常に行われ、非常に鮮明良好な泳動像を得ることができた。また、バンドの位置も歪みや波状になることなく、全て横一線に並んだ。従来一般的に使用されている電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルと比較しても、バンドの分離能、鮮明さ、シャープさはほぼ同等であった。よって、本発明より作製した電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルは、従来一般的に用いられている電気泳動用ポリアクリルアミドゲルと同等の性能を示した。
電気泳動の結果、タンパク質の分離は正常に行われ、非常に鮮明良好な泳動像を得ることができた。また、バンドの位置も歪みや波状になることなく、全て横一線に並んだ。従来一般的に使用されているガラス板を使用した電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルと比較しても、バンドの分離能、鮮明さ、シャープさはほぼ同等であった。よって、本発明より作製した電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルは、従来一般的に用いられているガラス板を使用した電気泳動用ポリアクリルアミドゲルと同等の性能を示した。
【実施例２】
【０００８】
担持体を図１から図３で示したようなＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）製のケースに変更したこと以外は実施例１と同様に行った。実施例１と同様にＵＶ照射１分間でゲル化させることができた。得られた電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルにて電気泳動を行ったところ、実施例１と同様に非常に鮮明なバンドが得られた。その結果を図５に示す。
【実施例３】
【０００９】
担持体を射出成型にて形成したＰＥＴ製ケースをガラス板からＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）板に変更したこと以外は実施例１と同様に行った。実施例１と同様にＵＶ照射１分間でゲル化させることができた。得られた電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルにて電気泳動を行ったところ、実施例１と同様に非常に鮮明なバンドが得られた。
比較例１
ＵＶ照射を行わずに暗所で反応させたこと以外は実施例１と同様に行った。ゲル化までに３０分程度の時間を必要とし、重合時の体積の減少によりプレート上部のゲルに少し凹みがみられた。得られた電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルにて実施例１と同様の条件で電気泳動を行ったところ、実施例１と比較してやや不鮮明なバンドが得られた。
比較例２
ＡＰＳを使用しなかったこと以外は実施例１と同様に行った。ＵＶ照射を５分にてゲル化させることができたが、濃縮層部分が重合不良により乱れたゲルになった。得られた電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルにて電気泳動を行ったところ、不鮮明なバンドが得られた。
比較例３
アクリルアミド溶液を窒素ガスにて脱気したこと以外は実施例１と同様に行った。ゲル化時間が早すぎ十分に充填時間を確保することが出来なかった。
比較例４
ＵＶ照射を行わずに暗所で反応させたこと以外は実施例２と同様に行った。３０分程度でみかけゲル化はしていたが、濃縮層部分は重合不良により乱れたゲルになった。得られた電気泳動用ポリアクリルアミドスラブゲルにて電気泳動を行ったところ、不鮮明なバンドが得られた。
以上の結果を表２に挙げる。
【表２】
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実施例１、２、３共に１分間でゲル化が完了し、いずれも電気泳動用ポリアクリルアミドゲルとして十分利用できるものであった。１分間でゲル化が完了し、かつプレート内のゲル化状態も良好なので、大量生産をおこなう場合においては非常に有効な製造方法である。
比較例１では、実施例１、２と同様に電気泳動用ポリアクリルアミドゲルとして十分利用できるものであったが、ゲル化までに３０分程度の時間を必要とした。また、重合時の体積の減少によりプレート上部のゲルに少し凹みがみられ、プレキャストゲルとしての製品価値の低いものであった。
比較例２では、ＡＰＳを添加しなかったところＵＶ照射５分でみかけ上はゲル化していたが、残存ＡＡｍが非常に多く、結果として電気泳動用ポリアクリルアミドゲルとして利用するのは不十分なものであった。
比較例３では短時間での反応を目的に、モノマー液を窒素による脱気を行ってから液の注入を行おうとしたところ、充填前にゲル化が始まってしまった。室温条件では窒素脱気を行うと重合が開始してしまい、液を充填させるのが困難であった。
比較例４ではプレートとしてＰＥＴ板を使用し、ＵＶ照射を行わずに暗所で反応させたところ、ＰＥＴ表面に存在する酸素の重合阻害による影響で濃縮層部分のゲルが乱れてしまった。電気泳動後のバンドも不鮮明となり、電気泳動用ポリアクリルアミドゲルとして利用するには不十分なものであった。
リボフラビン燐酸ナトリウム、ＴＥＭＥＤ及びＡＰＳを共存させて、ＵＶ照射による重合を行うことで１分間でのゲル化を行うことが可能となり、且つ、ＰＥＴのようなプラスチックのプレートを利用してもガラスプレートと同等の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを製造することができた。
以上の結果から、本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドプレキャストゲルが、電気泳動用に最適であり、かつ生産性、コスト及び品質確保の面からも高品位なプレキャストゲルを提供できることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明の電気泳動用スラブゲルは、従来技術と比較して短時間かつ簡易な方法で電気泳動用プレキャストゲルを製造できる。従って、生産性、コスト及び品質の面で高品位な電気泳動用プレキャストゲルの製造が可能となり、産業上の利用可能性は甚だ大きい。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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