(57)【要約】  試験片に適用可能なＬＤＬコレステロール測定方法を提供する。  試料中のＬＤＬコレステロールを測定するＬＤＬコレステロール測定方法において、（Ａ）総コレステロール測定部と、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール以外のコレステロールである非ＬＤＬコレステロールを測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを準備する工程、（Ｂ）前記総コレステロール測定部において前記試料中の総コレステロールを測定する工程、（Ｃ）前記非ＬＤＬコレステロール測定部において前記試料中の非ＬＤＬコレステロールを測定する工程、及び（Ｄ）前記（Ｂ）工程の前記総コレステロール測定値から、前記（Ｃ）工程の前記非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いて前記試料中のＬＤＬコレステロール量を求める工程を有することを特徴とする。
2009031506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを測定するＬＤＬコレステロール測定方法であって、下記（Ａ）工程から（Ｄ）工程を有することを特徴とするＬＤＬコレステロール測定方法。
（Ａ）  総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロールである非ＬＤＬコレステロールを測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを準備する工程
（Ｂ）  前記総コレステロール測定部において前記試料中の総コレステロールを測定する工程
（Ｃ）  前記非ＬＤＬコレステロール測定部において前記試料中の非ＬＤＬコレステロールを測定する工程
（Ｄ）  前記（Ｂ）工程の前記総コレステロール測定値から、前記（Ｃ）工程の前記非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いて前記試料中のＬＤＬコレステロール量を求める工程
【請求項２】
前記（Ａ）工程において、前記総コレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬を有し、
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬と、非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と、ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤とを有し、
前記（Ｂ）工程において、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記総コレステロールを測定し、
前記（Ｃ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤の作用により、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記非ＬＤＬコレステロールを選択的に測定する、
請求の範囲１記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項３】
前記（Ａ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、さらに、ＬＤＬコレステロール凝集剤を有し、
前記（Ｂ）工程において、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記総コレステロールを測定し、
前記（Ｃ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤の作用により、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記非ＬＤＬコレステロールを選択的に測定する、
請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項４】
前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの少なくとも一方の界面活性剤を含み、
前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの界面活性剤を含む請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項５】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含む請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項６】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを含む請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項７】
前記ＬＤＬコレステロール凝集剤が、ポリビニル硫酸塩である請求の範囲３記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項８】
前記非ＬＤＬコレステロールが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールである請求の範囲１記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項９】
請求の範囲１記載の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール測定方法に使用するＬＤＬコレステロール測定用試験片であって、
総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロール量である非ＬＤＬコレステロール量を測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを有し、
前記総コレステロール測定部での総コレステロール測定値から、前記非ＬＤＬコレステロール測定部での非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いてＬＤＬコレステロール量を求めることを特徴とするＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１０】
前記総コレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬を有し、
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬と、非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と、ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤とを有する請求の範囲９記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１１】
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、さらに、ＬＤＬコレステロール凝集剤を有する請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１２】
前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの少なくとも一方の界面活性剤を含み、
前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの界面活性剤を含む請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１３】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含む請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１４】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを含む請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１５】
前記ＬＤＬコレステロール凝集剤が、ポリビニル硫酸塩である請求の範囲１１記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１６】
前記非ＬＤＬコレステロールが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールである請求の範囲９記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１７】
支持体と、第一の試薬層および第二の試薬層とを有し、
前記支持体の上に、前記第一の試薬層および前記第二の試薬層が配置され、
前記第一の試薬層が、前記総コレステロール測定部であり、
前記第二の試薬層が、前記非ＬＤＬコレステロール測定部である
請求の範囲９記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１８】
第一の支持体および第二の支持体と、第一の試薬層および第二の試薬層とを有し、
前記第一の支持体の上に前記第一の試薬層が配置され、
前記第二の支持体の上に前記第二の試薬層が配置され、
前記第一の試薬層が、前記総コレステロール測定部であり、
前記第二の試薬層が、前記非ＬＤＬコレステロール測定部である
請求の範囲９記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール測定方法およびＬＤＬコレステロール測定用試験片に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＤＬは、コレステロールを運搬するリポタンパク質の一種である。ＬＤＬとコレステロールとの複合体であるＬＤＬコレステロールは、動脈硬化の原因物質の一つであることが医学的に明らかにされている。ＬＤＬコレステロール量は、労働安全衛生法に基づく健康診断における検査項目として、２００８年４月から、新たに追加されている。【０００３】
ＬＤＬコレステロールの測定方法には、例えば、超遠心分離によりＬＤＬを他のリポタンパク質（例えば、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）等）と分離した後、酵素を用いて、ＬＤＬコレステロールのみを測定する方法がある。また、電気泳動により、ＬＤＬを分離した後、脂質の染色を行い、その発色強度を測定する方法もある。これらの方法は、一般的な測定方法であるが、操作が煩雑であり、多数の検体を処理することが困難である。したがって、これらの方法は、臨床検査等では利用できない。【０００４】
そこで、酵素試薬を用いた、液系のＬＤＬコレステロール測定方法が種々開発され、一部で実施されている。前記酵素試薬を用いた測定方法は、自動分析装置に適用可能であるため、多数の検体の処理が必要な臨床検査に有用である。前記酵素試薬を用いた測定方法には、ＬＤＬコレステロールそのものを直接測定する直接法や、第一反応でＬＤＬコレステロール以外のコレステロール（非ＬＤＬコレステロール）を反応させて消去し、第二反応で残ったＬＤＬコレステロールを反応させることにより、ＬＤＬコレステロール量を測定する消去法等がある。【０００５】
前記直接法には、例えば、シクロデキストリンおよび界面活性剤によりＬＤＬコレステロールに対する酵素試薬の特異性を高めて、ＬＤＬコレステロールを直接測定する方法がある（特許文献１）。また、前記消去法には、ポリアニオンと２価金属イオン（特許文献２）、ポリアニオン（特許文献３）、硫酸カリクスアレン（特許文献４）またはアミン（特許文献５）を用いて、ＬＤＬコレステロールと酵素試薬との反応を阻止したり、非ＬＤＬコレステロールと酵素試薬との反応性を高めたりする方法がある。そして、各メーカーからは、前記直接法や前記消去法を用いた液系試薬が市販されている。【０００６】
【特許文献１】特許第３０９１２３０号公報
【特許文献２】特許第３１９３６３４号公報
【特許文献３】特許第３７６７２３２号公報
【特許文献４】特許第３８２２３４０号公報
【特許文献５】特許第３０５８６０２号公報
【発明の開示】
【０００７】
しかしながら、従来の測定方法は、大型の自動分析装置を要する。大型の自動分析装置は、設置スペースを要し、コストがかかる。したがって、このような測定装置は、大規模病院であれば、導入可能であるが、一般の病院では、導入が困難である。また、従来の測定方法は、試薬を乾燥状態で保持する試験片（ドライ系）には適用できず、液系の測定のみに用途が限定されている。液系での測定では、大量の洗浄水が必要であり、洗浄により廃液が出る。
【０００８】
そこで、本発明は、小型で簡単な構成の測定装置でＬＤＬコレステロールを測定可能であり、かつ試験片にも適用可能なＬＤＬコレステロール測定方法およびそれを用いたＬＤＬコレステロール測定用試験片の提供を目的とする。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、
試料中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを測定するＬＤＬコレステロール測定方法であって、下記（Ａ）工程から（Ｄ）工程を有することを特徴とする。
（Ａ）  総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロールである非ＬＤＬコレステロールを測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを準備する工程
（Ｂ）  前記総コレステロール測定部において前記試料中の総コレステロールを測定する工程
（Ｃ）  前記非ＬＤＬコレステロール測定部において前記試料中の非ＬＤＬコレステロールを測定する工程
（Ｄ）  前記（Ｂ）工程の前記総コレステロール測定値から、前記（Ｃ）工程の前記非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いて前記試料中のＬＤＬコレステロール量を求める工程
【００１０】
本発明の試験片は、
本発明の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール測定方法に使用するＬＤＬコレステロール測定用試験片であって、
総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロール量である非ＬＤＬコレステロール量を測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを有し、
前記総コレステロール測定部での総コレステロール測定値から、前記非ＬＤＬコレステロール測定部での非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いてＬＤＬコレステロール量を求めることを特徴とする。
【００１１】
本発明者等は、前記目的を達成するために、一連の研究を重ねた。その過程で、従来の消去法を用いた測定方法について検討した。前記消去法を用いたＬＤＬコレステロール測定液系試薬（ウェットケミストリー法）では、前述のとおり、第１反応で非ＬＤＬコレステロールを反応させて消去し、第２反応で残ったＬＤＬコレステロールを反応させる。すなわち、この反応系では、非ＬＤＬコレステロールを消去した検体もしくは非ＬＤＬコレステロールを消去した検体を含む反応液を得る前処理工程が必要となる。したがって、前記消去法を用いたＬＤＬコレステロール測定液系試薬をそのまま試験片化することは、測定原理上不可能であることがわかった。そこで、さらに研究を重ねた結果、前記総コレステロール測定部と前記非ＬＤＬコレステロール測定部を別個独立に準備し、前記総コレステロール測定部で総コレステロールを測定し、前記非ＬＤＬコレステロール測定部で非ＬＤＬコレステロールを測定し、前記総コレステロール測定値から非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いてＬＤＬコレステロール値を求めるという構成にすれば、試験片化が可能であることを見出し、本発明に到達した。本発明によれば、測定装置の構造を単純化することができ、かつ測定装置を小型化することが可能であり、装置の低コスト化および省スペース化が実現可能となる。したがって、本発明により、例えば、大規模病院だけではなく、一般の病院でも、ＬＤＬコレステロールの測定装置を導入することが可能となる。また、本発明の測定方法は、試験片へ応用し易い原理である。そして、本発明の試験片を用いれば、洗浄水の必要がなく、廃液が出ないため、環境面および測定の簡素化にも貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の試験片の一例の斜視図である。図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＡ−Ａ方向に見た断面図である。
【図２】図２は、本発明の試験片のその他の例の断面図である。
【図３】図３は、本発明の試験片のさらにその他の例の断面図である。
【図４】図４は、本発明の試験片のさらにその他の例の断面図である。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の試験片のさらにその他の例の断面図である。図５（Ｂ）は、図５（Ａ）に示す試験片の平面図である。
【図６】図６は、本発明の測定方法の一例における、Ｋ／Ｓ値のタイムコースを示すグラフである。
【図７】図７は、測定方法の比較例および本発明の測定方法の一例における、Ｋ／Ｓ値のタイムコースを示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の測定方法のその他の例における測定値と、測定方法のその他の比較例における測定値との相関関係を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の測定方法のさらにその他の例における測定値と、測定方法のその他の比較例における測定値との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の測定方法は、前述のように、試験片に適用することが好ましいが、本発明は、これに限定されず、液系に適用してもよい。【００１４】
本発明の測定方法において、前記（Ｂ）工程および前記（Ｃ）工程の順番は特に制限されず、いずれの工程を先に実施してもよいし、同時に実施してもよい。【００１５】
本発明の測定方法において、
前記（Ａ）工程において、前記総コレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬を有し、
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬と、非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と、ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤とを有し、
前記（Ｂ）工程において、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記総コレステロールを測定し、
前記（Ｃ）工程において、非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤の作用により、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記非ＬＤＬコレステロールを選択的に測定するという構成が好ましい。従来技術ではＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬコレステロールとの分別測定が困難であったが、本構成によれば、前記分別測定が可能となり、ＬＤＬコレステロール測定の精度および信頼性が向上する。【００１６】
本発明の測定方法において、
前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの少なくとも一方の界面活性剤を含み、
前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの界面活性剤を含むことが好ましい。【００１７】
本発明の測定方法において、前記酵素試薬は、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含むという態様であってもよい。【００１８】
本発明の測定方法において、前記酵素試薬は、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを含むという態様であってもよい。【００１９】
本発明の測定方法において、前記（Ａ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、さらに、ＬＤＬコレステロール凝集剤を有し、前記（Ｃ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤の作用により、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記非ＬＤＬコレステロールを選択的に測定するという構成がより好ましい。従来技術ではＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬコレステロールとの分別測定が困難であったが、本構成によれば、前記分別測定が可能となり、ＬＤＬコレステロール測定の精度および信頼性が、さらに向上する。前記ＬＤＬコレステロール凝集剤は、ポリビニル硫酸塩であることが好ましい。【００２０】
本発明の測定方法において、前記非ＬＤＬコレステロールが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールであってもよい。【００２１】
前述と同様の理由により、本発明の試験片において、
前記総コレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬を有し、
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬と、非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と、ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤とを有するという構成が好ましい。【００２２】
本発明の試験片において、
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含むという形態であってもよい。【００２３】
本発明の試験片において、
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを含むという形態であってもよい。【００２４】
本発明の試験片において、
前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの少なくとも一方の界面活性剤を含み、
前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの界面活性剤を含むことが好ましい。【００２５】
前述と同様の理由により、本発明の試験片において、
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、さらに、ＬＤＬコレステロール凝集剤を有するという構成がより好ましい。前記ＬＤＬコレステロール凝集剤は、ポリビニル硫酸塩であることが好ましい。【００２６】
本発明の試験片において、
前記非ＬＤＬコレステロールが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールであってもよい。【００２７】
本発明の試験片は、
支持体と、第一の試薬層および第二の試薬層とを有し、
前記支持体の上に、前記第一の試薬層および前記第二の試薬層が配置され、
前記第一の試薬層が、前記総コレステロール測定部であり、
前記第二の試薬層が、前記非ＬＤＬコレステロール測定部である
という形態であってもよい。【００２８】
本発明の試験片は、
第一の支持体および第二の支持体と、第一の試薬層および第二の試薬層とを有し、
前記第一の支持体の上に前記第一の試薬層が配置され、
前記第二の支持体の上に前記第二の試薬層が配置され、
前記第一の試薬層が、前記総コレステロール測定部であり、
前記第二の試薬層が、前記非ＬＤＬコレステロール測定部である
という形態であってもよい。【００２９】
つぎに、本発明について、例をあげて詳細に説明する。なお、本発明において、試料適用時における全成分中の配合割合とは、試料（検体）を前記総コレステロール測定部（例えば、前記第一の試薬層）または前記非ＬＤＬコレステロール測定部（例えば、前記第二の試薬層）に適用した場合の全成分中の割合であり、全成分とは、前記試料、前記コレステロール測定用酵素試薬、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤等の、試料適用時に存在する成分全てをいう。通常、一検体の量は、その種類により予測可能若しくは決定可能である。【００３０】
本発明の試験片は、例えば、１つの支持体上に、前記総コレステロール測定部および前記非ＬＤＬコレステロール測定部を配置した構成であってもよい。また、本発明の試験片は、第一の支持体の上に、前記総コレステロール測定部を配置し、第二の支持体の上に前記非ＬＤＬコレステロール測定部を配置したという構成であってもよい。【００３１】
本発明の試験片において、前記総コレステロール測定部は、例えば、支持体の上に第一の試薬層が形成され、前記第一の試薬層が、コレステロール測定用酵素試薬を含むという構成をとることができる。前記第一の試薬層は、さらに、コレステロール可溶化用界面活性剤を含むことが好ましい。前記第一の試薬層は、反応層と検出層を有し、前記反応層が前記コレステロール可溶化用界面活性剤を有し、前記検出層が前記コレステロール測定用酵素試薬を有するという構成であってもよい。また、前記反応層が前記コレステロール測定用酵素試薬の一部、前記コレステロール可溶化用界面活性剤を有し、前記検出層が、前記コレステロール測定用酵素試薬の残部を有することも好ましい。【００３２】
本発明の試験片において、前記非ＬＤＬコレステロール測定部は、例えば、支持体の上に第二の試薬層が形成され、前記第二の試薬層が、コレステロール測定用酵素試薬、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤を有するという構成をとることができる。前記第二の試薬層は、反応層と検出層を有し、前記反応層が、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤を有し、前記検出層がコレステロール測定用酵素試薬を有するという構成であってもよい。さらに、前記反応層内部において、その上部（上層）に前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤を有し、その下部（下層）に前記非コレステロール可溶化用界面活性剤を有するという構成であることが好ましい。また、前記反応層が前記コレステロール測定用酵素試薬の一部、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤を有し、前記検出層が、前記コレステロール測定用酵素試薬の残部を有するという構成も好ましい。【００３３】
前記第二の試薬層は、さらに、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を有することが好ましい。前記第二の試薬層は、反応層と検出層を有し、前記反応層が、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を有し、前記検出層がコレステロール測定用酵素試薬を有するという構成であってもよい。さらに、前記反応層内部において、その上部（上層）に前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を有し、その下部（下層）に前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤を有するという構成であることが、より好ましい。また、前記反応層が前記コレステロール測定用酵素試薬の一部、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を有し、前記検出層が、前記コレステロール測定用酵素試薬の残部を有するという構成も、より好ましい。【００３４】
本発明において、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤は、ＬＤＬコレステロールに比べ、非ＬＤＬコレステロール（ＨＤＬコレステロールやＶＬＤＬコレステロール等）に対する可溶化性能が高いものであれば、特に制限されない。前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤は、非ＬＤＬリポタンパク質に内包されるコレステロール若しくはコレステロールエステルを可溶化する働きを有し、その結果として、コレステロール若しくはそのエステルと前記酵素試薬の反応を促進することになる。前述のように、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルが好ましく、これらは単独で使用してもよいし、併用してもよい。この中でより好ましいのは、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルである。ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルの市販品としては、例えば、商品名「エマルゲンＡ−６０」（花王株式会社製）や商品名「ノニポール４０」（三洋化成工業株式会社製）等があり、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの市販品としては、商品名「エマルゲンＢ６６」（花王株式会社製）や商品名「ブラウノン  ＴＢＰ−１５−９５」（青木油脂工業株式会社製）等がある。【００３５】
本発明において、前記総コレステロール測定部で用いるコレステロール可溶化用界面活性剤としては、全てのリポタンパク質を可溶化するものであれば特に制限はされず、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（ｎ）オクチルフェニルエーテル（例えば、商品名「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」（和光純薬社製））が使用できる。【００３６】
本発明において、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤は、ＬＤＬコレステロールの溶解を阻害するものであれば、特に制限されない。前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤が、ＬＤＬコレステロールの溶解を阻害することにより、ＬＤＬコレステロール若しくはそのエステルと前記酵素試薬との反応を阻害することになる。前述のように、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、これらは単独で使用してもよく、２種類以上併用してもよい。この中でより好ましいのは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体である。ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、ポリオキシエチレンセチルエーテル（例えば、商品名「エマルゲン２２０」（花王株式会社製））が好ましい。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（例えば、商品名「ブラウノン  Ｎ−５０２」（青木油脂工業株式会社製））が好ましい。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体としては、商品名「プルロニックＦ−８８」（株式会社ＡＤＥＫＡ社製）が好ましい。ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（例えば、商品名「エマール２０Ｃ」（花王株式会社製））が好ましい。アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが好ましい。これらは単独で、若しくは二種類以上を併用できる。【００３７】
本発明の試験片における前記総コレステロール測定部（例えば、第一の試薬層）において、試料適用時における全成分中の前記コレステロール可溶化用界面活性剤の割合は、例えば、０．０５〜３．０重量％の範囲であり、好ましくは、０．１〜１．０重量％の範囲であり、より好ましくは、０．３〜０．７重量％の範囲である。【００３８】
本発明の試験片における前記非ＬＤＬコレステロール測定部（例えば、第二の試薬層）において、試料適用時における全成分中の前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤の配合割合は、例えば、１〜１５重量％の範囲であり、好ましくは、２〜１０重量％の範囲であり、より好ましくは４〜８重量％の範囲である。また、試料適用時における全成分中の前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤の配合割合は、例えば、１〜１５重量％の範囲であり、好ましくは、１．５〜１０重量％の範囲であり、より好ましくは、２〜６重量％の範囲である。前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤（Ａ）と前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤（Ｂ）の重量比（Ａ／Ｂ）は、例えば、１／１〜４／１の範囲であり、好ましくは、１．１／１〜３／１の範囲であり、より好ましくは、１．２／１〜２．５／１の範囲である。【００３９】
本発明において、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤としては、特に制限されないが、例えば、ポリビニル硫酸塩、アニオン性水溶性ポリマー、植物由来のレクチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リンタングステン酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸塩、ヘパリン等が挙げられ、好ましくは、前述のように、ポリビニル硫酸塩である。【００４０】
前記ポリビニル硫酸塩としては、例えば、ポリビニル硫酸カリウム、ポリビニル硫酸ナトリウム、ポリビニル硫酸リチウム、ポリビニル硫酸アンモニウム等が挙げられ、これらは単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。この中で好ましいのは、ポリビニル硫酸カリウムである。前記ポリビニル硫酸塩は、側鎖に硫酸基を７０％以上有するものが好ましい。また、前記ポリビニル硫酸塩のエステル化度は、８０％以上が好ましく、より好ましくは９０％以上である。また、前記ポリビニル硫酸塩にポリグリコールメチルエーテルまたはポリビニルピロリドンを添加すると、ＬＤＬの凝集反応がさらに良くなり好ましい。【００４１】
前記アニオン性水溶性ポリマーとしては、特に限定されないが、例えば、アクリル酸（２−ホスホ−１，１−ジメチルエチルアミド）、２−アクリルアミドグリコール酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸−ＣＯ−２−アクリルアミドグリコール酸等のモノマーのホモポリマー、前記モノマーのコポリマー、ポリ（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。前記アニオン性水溶性ポリマーの具体例としては、例えば、ポリアクリル酸−（２−ホスホ−１，１−ジメチルエチルアミド）（ＰＡＰ）、ポリ−２−アクリルアミドグリコール酸（ＰＡＡＧ）、ポリ−（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）（ＰＡＭＰＳ）、ポリ−（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸−ＣＯ−２−アクリルアミドグリコール酸）［Ｐ（ＡＭＰＳ−ＡＡＧ）］等が挙げられる。【００４２】
前記植物由来のレクチンとしては、特に限定されないが、例えば、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の実、ダイズ等由来のレクチンが挙げられる。【００４３】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リンタングステン酸、デキストラン硫酸およびヘパリンは、単独で用いてもよく、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、ニッケルイオン等のカチオンと併用してもよい。【００４４】
本発明の試験片において、試料適用時における全成分中の前記ＬＤＬコレステロール凝集剤の配合割合は、例えば、０．０１〜０．３０重量％の範囲であり、好ましくは、０．０２〜０．２０重量％の範囲であり、より好ましくは、０．０４〜０．１５重量％の範囲である。本発明の試験片において、試料適用時における全成分中の前記ポリグリコールメチルエーテルの配合割合は、例えば、３〜１２重量％の範囲であり、好ましくは、３．５〜１１重量％の範囲であり、より好ましくは、４〜１０重量％である。【００４５】
前述のように、前記コレステロール測定用酵素試薬としては、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの組み合わせ、またはコレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼの組み合わせが好ましい。より好ましいのは、前者の組み合わせである。【００４６】
本発明の試験片において、試料適用時における全成分中のコレステロールエステラーゼの割合は、例えば、５〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲であり、好ましくは、１０〜１００Ｕ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは３０〜７０Ｕ／ｍＬの範囲である。また、本発明の試験片において、試料適用時の全成分中のコレステロールオキシダーゼの割合は、例えば、５〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲であり、好ましくは１０〜１００Ｕ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは２０〜５０Ｕ／ｍＬの範囲である。そして、本発明の試験片において、試料適用時における全成分中のコレステロールデヒドロゲナーゼの割合は、例えば、５〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲であり、好ましくは１０〜１００Ｕ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは３０〜７０Ｕ／ｍＬの範囲である。【００４７】
前記コレステロール測定用酵素試薬としては、例えば、市販品を使用することができ、一連の反応を阻害する夾雑物等を含まない純正品や、遺伝子組換え製品等を好ましく使用することができる。【００４８】
前記コレステロールエステラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）等の微生物由来の酵素が挙げられる。前記酵素は、特に限定されないが、例えば、下記表に示す基質特異性を有するものが挙げられる。また、前記酵素には、例えば、ＢＳＡ等が添加されていてもよく、特に制限されない。【００４９】
（酵素の基質特異性）
基質                              比活性（％）の範囲  
コレステロールアセテート          ０．１〜５０
コレステロールプロピオネート        ０〜５０
コレステロールブチレート              １〜５０
コレステロールパルミテート            １〜２００
コレステロールステアレート            ０〜５０
コレステロールオレエート              １〜２００
コレステロールリノレート                １００
コレステロールカプリネート            ０〜１００
コレステロールラウリネート            ０〜２００
コレステロールミリステート              ０〜２００【００５０】
通常、生体内において、コレステロールは、遊離型状態と、脂肪酸とエステル結合している状態の２種類に分類される。そこで、後者をコレステロールエステラーゼにより、コレステロールと脂肪酸とに加水分解する。そして、生じたコレステロールと前者遊離型コレステロールを、コレステロールオキシダーゼで処理すれば、コレステノンと過酸化水素を生じる。この過酸化水素を測定すれば、コレステロール量を求めることができる。過酸化水素の測定は、電気化学的測定若しくは化学的測定があるが、パーオキシダーゼ(ＰＯＤ)と、酸化されると発色する基質（以下「酸化発色性基質」という)を用いた化学的測定が好ましい。この場合、前記コレステロール測定用酵素試薬に、ＰＯＤおよび前記酸化発色性基質が含まれることになる。本発明の試験片において、試料適用時における全成分中のＰＯＤの割合は、例えば、５０〜５０００Ｕ／ｍＬの範囲、好ましくは１００〜１５００Ｕ／ｍＬの範囲、より好ましくは７００〜８００Ｕ／ｍＬの範囲である。本発明の試験片において、試料適用時における全成分中の前記酸化発色性基質の割合は、その種類により適宜決定されるが、例えば、１０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、より好ましくは３０〜７０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。【００５１】
前記酸化発色性基質としては、例えば、ＡＬＰＳ［Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ]、ＤＡＯＳ［Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ]、ＭＡＯＳ［Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ]、ＴＯＯＳ［Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ]、フェノール等があり、この中から、測定機器が用いる波長に合う発色を呈する基質を適宜選択することができる。【００５２】
本発明の試験片において、前記総コレステロール測定部および非ＬＤＬコレステロール測定部は、試料適用時におけるｐＨがｐＨ６〜９の範囲になるように調整されていることが好ましい。前記ｐＨの好ましい範囲はｐＨ７〜８の範囲であり、最適には、前記総コレステロール測定部がｐＨ７．５、前記非ＬＤＬコレステロール測定部がｐＨ７．７である。前記ｐＨに調整するために、前記総コレステロール測定部（例えば、第一の試薬層）および非ＬＤＬコレステロール測定部（例えば、第二の試薬層）は、緩衝液（バッファー）を含むことが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、後述のものが挙げられる。【００５３】
本発明の測定対象となる試料は、特に制限されず、例えば、全血、血漿、血清等のＬＤＬコレステロールを含有する可能性のある検体試料（特に生物学的液体）である。【００５４】
つぎに、本発明の試験片の一例を図１に示す。図１（Ａ）は、本例の試験片の斜視図であり、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＡ−Ａ方向にみた断面図である。本例の試験片は、細長い長方形板状の支持体１の一端上に、二つの試薬層２および試薬層３が配置されているという構成である。前記二つの試薬層２および３のうち、一方が、前記総コレステロール測定部（第一の試薬層）であり、他方が、前記非ＬＤＬコレステロール測定部（第二の試薬層）である。【００５５】
前記支持体１は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリエステル、酢酸セルロース等の樹脂を用いて製造でき、この中でもＰＥＴが好ましい。支持体１の厚みは、特に制限されないが、例えば、０．１〜１ｍｍの範囲であり、好ましくは０．１〜０．５ｍｍの範囲であり、より好ましくは０．２〜０．３ｍｍの範囲である。【００５６】
前記非ＬＤＬコレステロール測定部となる前記試薬層には、例えば、前記コレステロール測定用酵素試薬、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤等が含まれ、好ましくは、さらに、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤が含まれる。前記総コレステロール測定部である前記試薬層には、例えば、前記コレステロール測定用酵素試薬、前記コレステロール可溶化用界面活性剤等が含まれる。【００５７】
試薬層２および３は、例えば、前記コレステロール測定用酵素試薬、前記各種界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤等の各種試薬および親水性ポリマーを溶媒に溶解して混合した溶液を、繊維質構造体等に含浸または塗布し、その後乾燥して作製することができる。【００５８】
前記親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリアクリル酸、ゼラチン、酸加水分解ゼラチン、ポリアクリルアミド、アガロース等が挙げられる。【００５９】
また、前記溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。前記総コレステロール測定部における前記溶媒としては、リン酸緩衝液が、前記非ＬＤＬコレステロール測定部における前記溶媒としては、グッドの緩衝液がそれぞれ好ましい。グッドの緩衝液としては、例えば、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＭＥＳ等が好ましく、より好ましくはＴＥＳである。試料適用時におけるｐＨが前記所定の範囲になるように、前記緩衝液のｐＨは、ｐＨ６〜９の範囲に調整することが好ましく、より好ましくはｐＨ７〜８の範囲に調整することであり、最適には、前記総コレステロール測定部はｐＨ７．５、前記非ＬＤＬコレステロール測定部はｐＨ７．７に調整することである。前記親水性ポリマーの配合割合は、塗布溶液全体に対し、例えば、０〜４０重量％の範囲であり、好ましくは１０〜３０重量％の範囲であり、その種類により適宜調整できる。前記コレステロール測定用酵素試薬、前記各種界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤は、前述の割合になるように予め調整して前記溶媒に配合する。【００６０】
前記繊維質構造体は特に制限されず、繊維の種類は測定に障害とならない材質であればよく、構成は編物あるいは不織布のいずれでもよい。前記繊維としては、例えば、レーヨン、ナイロン、ポリエステル等の繊維が挙げられ、またこれらの複合繊維でもよい。【００６１】
前記塗布の方法としては、特に制限されず、例えば、刷毛等を用いる方法、スプレーコート法、ロールコーターを用いる方法、ディッピング法等を用いることができる。【００６２】
前記試薬層２および３の厚みは、例えば、５０〜２５０μｍの範囲であり、好ましくは８０〜２００μｍの範囲であり、より好ましくは１００〜１５０μｍの範囲である。なお、前記試薬層２および３の厚みとは、塗布乾燥後の厚みではなく、塗布時の塗布厚みである。前記試薬層２および３は、前記成分の他に、必要に応じ、酸化防止剤等の添加剤を含んでいてもよい。前記試薬層２および３を、支持体１の所定の位置に、貼着することにより、本例の試験片を作製できる。なお、本発明において、試験片の形状は、特に制限されないが、例えば、板状もしくは短冊状である。短冊状の場合の大きさは、例えば、全長５０〜１５０ｍｍの範囲で幅３〜１５ｍｍの範囲、好ましくは、全長６０〜１００ｍｍの範囲で幅５〜１０ｍｍの範囲である。【００６３】
本例の試験片は、例えば、次のようにして使用する。なお、以下において、前記試薬層２が、非ＬＤＬコレステロール測定部であり、前記試薬層３が、総コレステロール測定部である。すなわち、まず、前記試薬層２および前記試薬層３の上から、血液等の検体を滴下する。前記試薬層２において、滴下された検体は、前記試薬層２に含まれる前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤の作用により、非ＬＤＬコレステロールのみが前記コレステロール測定用酵素試薬と反応する。前記試薬層２に、さらに、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤が含まれると、その作用が付加され、非ＬＤＬコレステロールのみが、前記コレステロール測定用酵素試薬とさらに効果的に反応する。一方、前記試薬層３の場合、滴下された検体は、試薬層に含まれる前記コレステロール可溶化用界面活性剤の作用により、全てのコレステロールが前記コレステロール測定用酵素試薬と反応する。そして、前記試薬層２および前記試薬層３にＰＯＤと前記酸化発色性基質が含まれている場合は、分光光度計や反射率計等の光学的測定機器により、前記基質の発色を測定する。血漿や血清の試料について発色を測定する場合、前記支持体１が光透過性であれば、前記支持体１側から光照射してもよいし、前記試薬層２および前記試薬層３側から光照射してもよく、光照射による透過率や反射率等を測定する。また、前記支持体１が光透過性でない場合は、前記試薬層２および前記試薬層３側から光照射して反射率を測定する。なお、後述のように、全血を試料とする場合には、赤血球の着色による測光妨害の防止のため、前記検出層と前記反応層との間に血球遮断層および光反射層を設け、光透過性支持体を用い、この前記支持体１側から測定することが好ましい。【００６４】
図２に、本発明の試験片のその他の例の断面図を示す。本例の試験片では、支持体１の上に、前記非ＬＤＬコレステロール測定部の試薬層２と、前記総コレステロール測定部の試薬層３が形成されており、前記両試薬層２および３は、同図に示すように、反応層４と検出層５を備えている。これ以外は、前述の図１に示す試験片と同様であり、使用方法も同様である。前記試薬層２において、前記反応層４は、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬ溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を含み、前記反応層５は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含む。前記試薬層３において、前記反応層４は、前記コレステロール可溶化用界面活性剤を含み、前記検出層５は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含む。【００６５】
さらに、前記試薬層２において、前記反応層４は、上層４１および下層４２に分かれ、前記上層４１に、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を含有し、前記下層４２に前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤を含有していてもよい。このようにすれば、試料は、まず、前記上層４１において、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤に接触し、その後、前記下層４２に移動して前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤に接触した後に、前記検出層５において前記酵素試薬と接触する。このように試料の移動順に応じて反応層を上層と下層の二層に分けることにより、さらにＬＤＬコレステロールの可溶化を効果的に阻止することができ、非ＬＤＬコレステロールの測定精度が向上する。このような前記反応層４は、例えば、繊維質構造体に、前記コレステロール測定用酵素試薬の溶液を塗布して乾燥して前記検出層５を形成した後、この上に、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と親水性ポリマーを溶媒に溶解した溶液を塗布して乾燥し、この上に、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤および親水性ポリマーを溶媒に溶解した溶液を塗布して乾燥すれば形成できる。この場合の親水性ポリマーおよび溶媒の種類や濃度等は、前述と同様であり、塗布の方法も前述と同様である。また、二層構造の前記試薬層３は、前述の試薬層２の溶液を重層する方法に準じて、形成することができる。また、溶液を重層して多層構造の試薬層を形成する方法の他に、複数の繊維質構造体に、各試薬溶液を塗布して乾燥させ、これらを積層することによっても、多層構造の試薬層を形成できる。【００６６】
図３に、本発明の試験片のさらにその他の例の断面図を示す。本例の試験片では、支持体を有さず、前記非ＬＤＬコレステロール測定部の試薬層２と前記総コレステロール測定部の試薬層３が、それぞれ異なる試験片として形成されている。前記両試薬層２および３は、同図に示すように、反応層４と検出層５を備えている。前記試薬層２において、前述のように、前記反応層４は、上層４１および下層４２に分かれ、前記上層４１に、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を含有し、前記下層４２に前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤を含有していてもよい。これ以外は、前述の図１に示す試験片と同様であり、使用方法も同様である。前記試薬層２において、前記反応層４は、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬ溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を含み、前記検出層５は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含む。前記試薬層３において、前記反応層４は、前記コレステロール可溶化用界面活性剤を含み、前記検出層５は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含む。【００６７】
図４に、本発明の試験片のさらにその他の例の断面図を示す。本例の試験片では、試料適用面に対して試験片を垂直に半分に区切り、半区画それぞれを前記非ＬＤＬコレステロール測定部の試薬層２と前記総コレステロール測定部の試薬層３としたものである。前記両試薬層２および３は、図に示すように、反応層４と検出層５を備えている。前記試薬層２において、前述のように、前記反応層４は、上層４１および下層４２に分かれ、前記上層４１に、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を含有し、前記下層４２に前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤を含有していてもよい。これ以外は、前述の図１に示す試験片と同様であり、使用方法も同様である。前記試薬層２において、前記反応層４は、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬ溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を含み、前記検出層５は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含む。前記試薬層３において、前記反応層４は、前記コレステロール可溶化用界面活性剤を含み、前記検出層５は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含む。【００６８】
図５（Ａ）に、本発明の試験片のさらにその他の例の断面図を示し、図５（Ｂ）に、その例の平面図を示す。本例の試験片では、図４に示す試験片と同様に、境界面７により、試料適用面に対して試験片を垂直に半分に区切り、半区画それぞれを前記非ＬＤＬコレステロール測定部の試薬層２と前記総コレステロール測定部の試薬層３としたものである。また、本例の試験片の外周縁は、外枠６の溝に嵌入した状態になっている。前記両試薬層２および３は、図４の試験片と同様に、反応層と検出層を備えていてもよい。前記試薬層２において、前述のように、前記反応層は、上層および下層に分かれ、前記上層に、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を含有し、前記下層に前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤を含有していてもよい。これ以外は、前述の図１に示す試験片と同様であり、使用方法も同様である。前記試薬層２の前記検出層は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含む。前記試薬層３において、前記反応層は、前記コレステロール可溶化用界面活性剤を含み、前記検出層は、前記コレステロール測定用酵素試薬を含んでいてもよい。【００６９】
さらに、本発明の試験片は、必要に応じ、前記試薬層の上に、血球分離層を形成してもよい。これは、血球をろ過できるような多孔性部材と、場合により反射層を配置すればよい。前記多孔性部材としては、例えばガラスフィルターなどの公知の血球分離素材が使用できる。このように血球分離層を備えていれば、全血をそのまま供給するだけで、血漿若しくは血清中のＬＤＬコレステロールを測定できる。【００７０】
前述のように、本発明の測定方法は、液系の測定方法にも適用できる。前記液系の測定方法は、例えば、総コレステロール測定部である第１の反応容器と、非ＬＤＬコレステロール測定部である第２の反応容器とを用いて実施できる。前記反応容器としては、特に限定されないが、例えば、キュベット、試験管等が挙げられる。【００７１】
前記液系の測定方法において、
前記（Ａ）工程において、前記第１の反応容器が、前記コレステロール測定用酵素試薬を有し、
前記第２の反応容器が、前記コレステロール測定用酵素試薬と、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤とを有し、
前記（Ｂ）工程において、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記総コレステロールを測定し、
前記（Ｃ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤の作用により、前記コレステロール測定用酵素試薬により非ＬＤＬコレステロールを選択的に測定するという構成が好ましい。そして、前記第２の反応容器が、さらに、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を有するという構成が、より好ましい。前記液系の測定方法において、前記コレステロール測定用酵素試薬、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤等の測定試薬としては、前述と同様のものを使用できる。そして、測定手法としては、特に限定されないが、例えば、前記酵素試薬を用いた際に生じる過酸化水素を、電気化学的手法または化学的手法により測定する手法等が挙げられる。なお、前記ＬＤＬコレステロール凝集剤を用いる場合等、反応液に濁りが生じて化学的測定法が適用できない場合には、酵素電極等を用いた電気化学的測定法を適用することが好ましい。
【実施例】
【００７２】
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。なお、以下において、「Ｋ／Ｓ値」とは、下記式で計算される変数であり、反射率（Ｒ）を濃度に換算する際に使用される。
（式）    Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）２／２Ｒ【００７３】
［実施例１］
（Ａ）非ＬＤＬコレステロール測定部の作製
まず、白色ＰＥＴフィルム（厚み１２５μｍ）の支持板上に、下記組成の検出層形成用溶液を厚み１５０μｍで塗布した後、４０℃で１０分間乾燥し、検出層を形成した。一方、ポリエチレン製編物（厚み２５０μｍ）に下記組成の第一試薬液を含浸し、４０℃で１０分間乾燥した。このポリエチレン製編物の片面に下記組成の第二試薬液を塗布し、４０℃で１０分間乾燥して、試料供給層を作製した。つぎに、前記検出層表面に、ラミネート液を噴霧した。そして、前記ラミネート液を噴霧した前記検出層上に、前記第二試薬液の塗布面が上になるようにして前記試料供給層をさらに積層し、４０℃で１０分間乾燥して、非ＬＤＬコレステロール測定部を作製した。なお、下記組成に示す各成分の濃度は、試料適用時における全成分中の配合割合、すなわち５μＬの試料を供給した際の最終濃度（酵素反応時の濃度）である。【００７４】
（検出層形成用溶液の組成）
成分                                                                    濃度          
ＰＯＤ（東洋紡株式会社製）                                    ７６４Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（キシダ化学株式会社製）              ４３ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡＯＳ(株式会社同仁化学研究所製)                          ５１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＥＳバッファー（株式会社同仁化学研究所製、ｐＨ７．７）３００ｍｍｏｌ／Ｌ【００７５】
（第一試薬液の組成）
成分                                                                      濃度        
ＴＥＳバッファー（同仁化学研究所製、ｐＨ７．７）              ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ                                      ４６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ                                      ３５Ｕ／ｍＬ
ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル
（花王株式会社製、商品名：エマルゲンＢ６６）                  ５重量％【００７６】
（第二試薬液の組成）
成分                                                          濃度          
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物
（ＡＤＥＫＡ社製、商品名：プルロニックＦ８８）        ４重量％
ポリビニル硫酸カリウム                                  ０．１０重量％
ポリグリコールメチルエーテル                          ５重量％【００７７】
（ラミネート液の組成）
蒸留水            １００重量％【００７８】
（Ｂ）総コレステロール測定部の作製
さらに、前記非ＬＤＬコレステロール測定部に隣接した前記支持板上に、下記組成の検出層形成用溶液を厚み１５０μｍで塗布後、４０℃で１０分間乾燥して、検出層を形成した。一方、ポリエチレン製編物（厚み２５０μｍ）に、下記組成のラミネート液を噴霧した。そして、前記ラミネート液を噴霧したポリエチレン製編物を、前記検出層上に積層し、４０℃で１０分間乾燥して、総コレステロール測定部を形成させ、本例の試験片を作製した。なお、下記組成に示す各成分の濃度は、試料適用時における全成分中の配合割合、すなわち５μＬの試料を供給した際の最終濃度（酵素反応時の濃度）である。【００７９】
（検出層形成用溶液の組成）
成分                                                        濃度          
リン酸バッファー（ｐＨ７．５）                            ９０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ                        ７９５Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ                        ２３３Ｕ／ｍＬ
ＰＯＤ                                                    ７５０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（キシダ化学株式会社製）  ４４ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡＯＳ（株式会社同仁化学研究所製）            ５３ｍｍｏｌ／Ｌ【００８０】
（ラミネート液の組成）
成分                                                  濃度          
リン酸バッファー（ｐＨ７．５）                  １７ｍｍｏｌ／Ｌ
デオキシコール酸ナトリウム                    ０．５重量％【００８１】
［実施例２］
実施例２の試験片は、非ＬＤＬコレステロール測定部におけるポリビニル硫酸カリウムの試料供給時の最終濃度（試料適用時における全成分中の配合割合）を０．０５重量％としたこと以外は、実施例１と同様にして作製した。【００８２】
［実施例３］
実施例３の試験片は、非ＬＤＬコレステロール測定部が、ポリビニル硫酸カリウムおよびポリグリコールメチルエーテルのいずれも含まないこと以外は、実施例１と同様にして作製した。【００８３】
＜既知濃度との相関関係の確認＞
このようにして得られた実施例１〜３の各試験片を用いて、ＬＤＬコレステロール量が既知の血清試料５５検体中のＬＤＬコレステロール量を測定した。なお、前記ＬＤＬコレステロール量は、つぎにようにして測定した。すなわち、まず、各試験片の総コレステロール測定部、非ＬＤＬコレステロール測定部に、それぞれ血液試料５μＬを滴下した。そして、各測定部の反射率を、専用反射率計（商品名スポットケム、アークレイ社製）を用いて、測定した。前記測定において、測定波長は、６１０ｎｍであった。つぎに、得られた反射率から、ＬＤＬコレステロール量（Ｋ／Ｓ値）を求めた。そして、この実測により得た各試験片のＬＤＬコレステロール量と、前記既知濃度との相関係数を算出した。この結果を下記表１に示す。【００８４】
（表１）
実施例  ポリビニル硫酸カリウム濃度（重量％）  相関係数（ｒ）
実施例１              ０．１０                            ０．９６５１
実施例２              ０．０５                            ０．９６４０
実施例３              ０．００                            ０．９４５７【００８５】
表１に示すように、実施例１〜３の試験片を用いて測定したＬＤＬコレステロール量は、既知濃度と高い相関係数を示した。特に、ポリビニル硫酸カリウムを含む実施例１および実施例２の試験片では、非常に高い相関係数が得られた。【００８６】
＜Ｋ／Ｓ値のタイムコースの確認＞
図６のグラフに、実施例１〜３の各試験片により得られた、前記ＬＤＬコレステロール量（Ｋ／Ｓ値）のタイムコースを示す。同図のグラフにおいて、横軸は、測定時間（秒）であり、縦軸は、前記Ｋ／Ｓ値である。また、同図のグラフにおいて、丸のプロットは、実施例１の結果であり、四角のプロットは、実施例２の結果であり、三角のプロットは、実施例３の結果である。【００８７】
図６のグラフに示すように、実施例１〜３の試験片を用いたＬＤＬコレステロール量の測定では、いずれも反応が終点に達していた。したがって、実施例１〜３の試験片を用いた前記測定では、ＬＤＬコレステロールの反応が防止され、非ＬＤＬコレステロールのみが反応し、ＬＤＬコレステロール量を高精度に測定できた。そして、ポリビニル硫酸カリウムを含む実施例１および２の試験片を用いた前記測定では、Ｋ／Ｓ値がさらに低くなり、非ＬＤＬコレステロールのみが反応し、より高精度にＬＤＬコレステロール量を測定できた。【００８８】
＜液状試薬のドライ化試験片との比較＞
［比較例１］
比較例１は、特許文献１（特許第３０９１２３０号公報）の実施例１における試薬組成を参考に、前記直接法によるＬＤＬコレステロール測定用液状試薬（ウェットケミストリー法）を試験片としてドライ化した。比較例１の試験片は、ポリエチレン製編物（２５０μｍ）に下記組成の試薬液を含浸させ、４０℃で１０分間乾燥して作製した。下記組成の各成分の濃度は、５μＬの試料を供給した際の最終濃度（酵素反応時の濃度）である。【００８９】
（試薬液の組成）
成分                                                        濃度          
α−シクロデキストリン                            ５ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンモノラウレート              ０．５重量％
コレステロールエステラーゼ                    ０．２５Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ                    １．２５Ｕ／ｍＬ
ＰＯＤ                                                ６．２５Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン                            ０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡＯＳ                                              ０．８３ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）              ３０ｍｍｏｌ／Ｌ【００９０】
なお、特許文献１の実施例１では、発色剤にＥＭＳＥ（Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニル−エチレンジアミン）が用いられているが、比較例１では、代わりにＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン）を使用した。【００９１】
このようにして得られた比較例１および実施例１の試験片について、濃度既知の管理血清を検体として、前述と同様にして、前記試験片の各測定部の反射率（タイムコース）を測定し、ＬＤＬコレステロール量（Ｋ／Ｓ値）を求めた。この結果を、図７のグラフに示す。同図のグラフにおいて、横軸は、測定時間（秒）であり、縦軸は、前記Ｋ／Ｓ値である。また、同図のグラフにおいて、四角のプロットは、実施例１の総コレステロール測定部の結果であり、丸のプロットは、実施例１の非ＬＤＬコレステロール測定部であり、三角のプロットは、比較例１の試験片の測定結果である。【００９２】
図７のグラフから明らかなように、実施例１の総コレステロール測定部および非ＬＤＬコレステロール測定部は、反応が終点に達している。したがって、実施例１の試験片では各測定部において測定対象物以外の測定が防止され、総コレステロール測定部は総コレステロールのみを、非ＬＤＬコレステロール測定部は非ＬＤＬコレステロールのみを各々測定できていることが分かる。これに対し、液系のＬＤＬコレステロール測定用液状試薬をドライ化した比較例１の試験片では、全く反応がおこらず、ＬＤＬコレステロールを測定できなかった。このことから、前述のとおり、ＬＤＬコレステロール測定用液状試薬を単純にドライ化するだけでは、ＬＤＬコレステロールの測定はできないことが分かる。【００９３】
＜液状試薬との測定値精度の比較＞
［実施例４］
実施例４の試験片は、ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの最終濃度を７．５重量％にして非ＬＤＬコレステロール測定部を形成したこと以外は、実施例１と同様にして作製した。【００９４】
［比較例２］
比較例２としては、消去法によるＬＤＬコレステロール測定用液状試薬である、血清ＬＤＬコレステロール測定キット（商品名「コレステストＬＤＬ」、積水メディカル株式会社製）を用いた。【００９５】
こうして得られた実施例４と比較例２を用い、７０検体の血清試料中のＬＤＬコレステロール量を測定した。実施例４の試験片を用いた測定では、前述と同様に反射率を測定し、ＬＤＬコレステロール量（Ｋ／Ｓ値）を求めた。一方、比較例２の市販測定キットを用いた測定では、呈色反応後の反応液の吸光度を、吸光度計を用いて測定し、ＬＤＬコレステロール量を求めた。そして、実施例４の測定値と、比較例２の測定値との相関関係を調べた。この結果を図８のグラフに示す。同図のグラフにおいて、縦軸は、実施例４の測定値であり、横軸は、比較例２の測定値である。【００９６】
図８のグラフに示すように、実施例４の測定値と比較例２の測定値とは、良好な相関関係を示し、その相関係数はｒ＝０．９８３４であった。したがって、本発明の試験片は、市販の血清ＬＤＬコレステロールキットと同等以上の精度でＬＤＬコレステロール量を測定できることが示された。しかし、比較例２は液状試薬のため、大量の洗浄水が必要となり、また、測定時に廃液が発生した。これに対し、実施例４の試験片では、洗浄水は不要であり、当然廃液の発生はなく、測定を簡便に行うことが可能であった。【００９７】
［実施例５］
実施例５では、下記組成の検出層形成用溶液、第一試薬液およびラミネート液を用い、前記ポリエチレン製編物の片面に第二試薬液を塗布せずに非ＬＤＬコレステロール測定部を形成したこと以外は、実施例１と同様にして、試験片を作製した。【００９８】
（検出層形成用溶液の組成）
成分                                                                      濃度        
ＰＯＤ（東洋紡株式会社製）                                      ７６４Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（キシダ化学株式会社製）              ４３ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡＯＳ(株式会社同仁化学研究所製)                          ５１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＥＳバッファー（株式会社同仁化学研究所製、ｐＨ７．７）３００ｍｍｏｌ／Ｌ【００９９】
（第一試薬液の組成）
成分                                                                  濃度      
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物
（ＡＤＥＫＡ社製、商品名：プルロニックＦ８８）                ４重量％【０１００】
（ラミネート液の組成）
成分                                                                      濃度          
ＴＥＳバッファー（同仁化学研究所製、ｐＨ７．７）              ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ                                      ４６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ                                      ３５Ｕ／ｍＬ
ポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテル
（花王株式会社製、商品名：エマルゲンＢ６６）                  ５重量％【０１０１】
こうして得られた実施例５と比較例２を用い、６１検体の血清試料中のＬＤＬコレステロール量を測定した。実施例５の試験片を用いた測定では、前述と同様に反射率を測定し、ＬＤＬコレステロール量（Ｋ／Ｓ値）を求めた。一方、比較例２の市販測定キットを用いた測定では、前述と同様に、吸光度を測定し、ＬＤＬコレステロール量を求めた。そして、実施例５の測定値と、比較例２の測定値との相関関係を調べた。図９のグラフに、実施例５の測定値と、比較例２の測定値との相関関係を示す。同図のグラフにおいて、縦軸は、実施例５の測定値であり、横軸は、比較例２の測定値である。【０１０２】
図９のグラフに示すように、実施例５の測定値と比較例２の測定値とは、良好な相関関係を示し、その相関係数はｒ＝０．９７８０であった。したがって、実施例５の試験片は、市販の血清ＬＤＬコレステロールキットと同等以上の精度でＬＤＬコレステロール量を測定できることが示された。しかし、比較例２は液状試薬のため、大量の洗浄水が必要となり、また、測定時に廃液が発生したのに対し、実施例５の試験片では、洗浄水は不要であり、当然廃液の発生はなく、測定を簡便に行うことが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明のＬＤＬコレステロール測定用試験片を用いれば、簡単な構造で小型の測定装置によって、ＬＤＬコレステロールを測定することができる。したがって、本発明のＬＤＬコレステロール測定用試験片は、例えば、臨床検査等の大量の検体を測定する必要がある分野に有用であり、広い分野に適用可能である。
【図１】
2009031506.tif 000003
【図２】
2009031506.tif 000004
【図３】
2009031506.tif 000005
【図４】
2009031506.tif 000006
【図５】
2009031506.tif 000007
【図６】
2009031506.tif 000008
【図７】
2009031506.tif 000009
【図８】
2009031506.tif 000010
【図９】
2009031506.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月24日(2008.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
試料中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを測定するＬＤＬコレステロール測定方法であって、下記（Ａ）工程から（Ｄ）工程を有することを特徴とするＬＤＬコレステロール測定方法。
（Ａ）  コレステロール測定用酵素試薬を有する総コレステロール測定部と、
コレステロール測定用酵素試薬と、非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と、ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤とを有し、ＬＤＬコレステロール以外のコレステロールである非ＬＤＬコレステロールを測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを準備する工程
（Ｂ）  前記総コレステロール測定部において、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記試料中の総コレステロールを測定する工程
（Ｃ）  前記非ＬＤＬコレステロール測定部において、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤の作用により、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記試料中の非ＬＤＬコレステロールを選択的に測定する工程
（Ｄ）  前記（Ｂ）工程の前記総コレステロール測定値から、前記（Ｃ）工程の前記非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いて前記試料中のＬＤＬコレステロール量を求める工程
【請求項３】
前記（Ａ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、さらに、ＬＤＬコレステロール凝集剤を有し、
前記（Ｂ）工程において、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記総コレステロールを測定し、
前記（Ｃ）工程において、前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤、前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤および前記ＬＤＬコレステロール凝集剤の作用により、前記コレステロール測定用酵素試薬により前記非ＬＤＬコレステロールを選択的に測定する、請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項４】
前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの少なくとも一方の界面活性剤を含み、
前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの界面活性剤を含む請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項５】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含む請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項６】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを含む請求の範囲２記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項７】
前記ＬＤＬコレステロール凝集剤が、ポリビニル硫酸塩である請求の範囲３記載のＬＤＬコレステロール測定方法。
【請求項８】
試料中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを測定するＬＤＬコレステロール測定方法であって、
下記（Ａ）工程から（Ｄ）工程を有し、下記非ＬＤＬコレステロールが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールであることを特徴とするＬＤＬコレステロール測定方法。
（Ａ）  総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロールである非ＬＤＬコレステロールを測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを準備する工程
（Ｂ）  前記総コレステロール測定部において前記試料中の総コレステロールを測定する工程
（Ｃ）  前記非ＬＤＬコレステロール測定部において前記試料中の非ＬＤＬコレステロールを測定する工程
（Ｄ）  前記（Ｂ）工程の前記総コレステロール測定値から、前記（Ｃ）工程の前記非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いて前記試料中のＬＤＬコレステロール量を求める工程
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
請求の範囲２記載の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール測定方法に使用するＬＤＬコレステロール測定用試験片であって、
総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロール量である非ＬＤＬコレステロール量を測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを有し、
前記総コレステロール測定部での総コレステロール測定値から、前記非ＬＤＬコレステロール測定部での非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いてＬＤＬコレステロール量を求め、
前記総コレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬を有し、
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、コレステロール測定用酵素試薬と、非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤と、ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤とを有するＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１１】
前記非ＬＤＬコレステロール測定部が、さらに、ＬＤＬコレステロール凝集剤を有する請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１２】
前記非ＬＤＬコレステロール可溶化用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルの少なくとも一方の界面活性剤を含み、
前記ＬＤＬコレステロール溶解阻止用界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの界面活性剤を含む請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１３】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含む請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１４】
前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを含む請求の範囲１０記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１５】
前記ＬＤＬコレステロール凝集剤が、ポリビニル硫酸塩である請求の範囲１１記載のＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１６】
試料中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを測定するＬＤＬコレステロール測定方法に使用するＬＤＬコレステロール測定用試験片であって、
総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロール量である非ＬＤＬコレステロール量を測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを有し、
前記総コレステロール測定部での総コレステロール測定値から、前記非ＬＤＬコレステロール測定部での非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いてＬＤＬコレステロール量を求め、
前記非ＬＤＬコレステロールが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールである
ＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
試料中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを測定するＬＤＬコレステロール測定方法に使用するＬＤＬコレステロール測定用試験片であって、
総コレステロール測定部と、
ＬＤＬコレステロール以外のコレステロール量である非ＬＤＬコレステロール量を測定する非ＬＤＬコレステロール測定部とを有し、
前記総コレステロール測定部での総コレステロール測定値から、前記非ＬＤＬコレステロール測定部での非ＬＤＬコレステロール測定値を差し引いてＬＤＬコレステロール量を求め、
第一の支持体および第二の支持体と、第一の試薬層および第二の試薬層とを有し、
前記第一の支持体の上に前記第一の試薬層が配置され、
前記第二の支持体の上に前記第二の試薬層が配置され、
前記第一の試薬層が、前記総コレステロール測定部であり、
前記第二の試薬層が、前記非ＬＤＬコレステロール測定部である
ＬＤＬコレステロール測定用試験片。
【国際調査報告】
2009031506.tif 000012
2009031506.tif 000013
2009031506.tif 000014
2009031506.tif 000015