(57)【要約】  本発明は、GLP-1と比べて、血中半減期が長く、かつ好ましくは高い血糖値抑制活性を示す糖鎖付加GLP-1ペプチドに関する。本発明は、(a) GLP-1；(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、(c) GLP-1の類縁体；において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) GLP-1；
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
(c) GLP-1の類縁体；
において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２】
(a) GLP-1；又は、
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項３】
(a) GLP-1；又は、
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、GLP-1活性を有するペプチド；
において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asn又は糖鎖付加Cysである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asnである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Cysである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が５〜１１個の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が、
【化１】
2008155900.tif 000022
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化２】
2008155900.tif 000023
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１３】
(a) GLP-1のＣ末端（３７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチドにおいて、当該付加されたアミノ酸の少なくとも１つが、糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)により定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１４】
(a) GLP-1のＣ末端（３７位）にさらに、１個のアミノ酸が付加されたペプチドにおいて、当該付加されたアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)により定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１５】
(a) GLP-1のＮ末端（７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチドにおいて、当該付加されたアミノ酸の少なくとも１つが、糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)により定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１６】
(a) GLP-1のＮ末端（７位）にさらに、１個のアミノ酸が付加されたペプチドにおいて、当該付加されたアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)により定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１７】
(a) GLP-1の１８、２０、２２、２６、３０、３４及び３６位から選択される１以上の部位のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換した糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は
(b) (a)で定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asn又は糖鎖付加Cysである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２０】
請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２２】
請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が、
【化３】
2008155900.tif 000024
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化４】
2008155900.tif 000025
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２３】
請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が９９％以上均一である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２４】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、
前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asnであり、
前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合しており、
前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖であり、
前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であり、
前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、GLP-1と比較して増大した血中安定性を有する、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、GLP-1と比較して１０倍以上のOGTT（Oral Glucose Tolerance Test）における血糖値抑制活性を有する、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、GLP-1と比較して３０倍以上のDPP-IV耐性を有する、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の医薬組成物であって、前記糖鎖が９０％以上均一である医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２８に記載の医薬組成物であってGLP-1に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２８に記載の医薬組成物であってGLP-1に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、GLP-1に関連する疾患の治療又は予防方法。
【請求項３３】
(a) GLP-1；
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
(c) GLP-1の類縁体；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項３４】
(a) GLP-1；又は、
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項３５】
(a) GLP-1；又は、
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、GLP-1活性を有するペプチド；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項３６】
請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asn及び／又は糖鎖付加Cysである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項３７】
請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、いずれも糖鎖付加Asnである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項３８】
請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、いずれも糖鎖付加Cysである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項３９】
請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４０】
請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも５〜１１個の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４２】
請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４３】
請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、
【化５】
2008155900.tif 000026
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化６】
2008155900.tif 000027
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４４】
請求項３３〜４３のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４５】
(a) GLP-1において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、少なくとも１つの置換部位が、１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位である糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)で定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４６】
(a) GLP-1において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、いずれの置換部位も１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位からなる群から選択される糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)で定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４７】
請求項４５又は４６に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asn及び／又は糖鎖付加Cysである、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４８】
請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項４９】
請求項４５〜４８に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５０】
請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５１】
請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、
【化７】
2008155900.tif 000028
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化８】
2008155900.tif 000029
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５２】
請求項４５〜５１のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、前記糖鎖が９９％以上均一である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５３】
請求項４５又は４６に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、
前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asnであり、
前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合しており、
前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖であり、
前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、
前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５４】
請求項３３〜５３のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、GLP-1と比較して増大した血中安定性を有する、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５５】
請求項３３〜５３のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、GLP-1と比較して１０倍以上のOGTT（Oral Glucose Tolerance Test）における血糖値抑制活性を有する、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５６】
請求項３３〜５３のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドであって、GLP-1と比較して３０倍以上のDPP-IV耐性を有する、糖鎖付加GLP-1ペプチド。
【請求項５７】
請求項３３〜５６のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項５８】
請求項５７に記載の医薬組成物であって、前記糖鎖が９０％以上均一である、医薬組成物。
【請求項５９】
請求項５７に記載の医薬組成物であってGLP-1に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項６０】
請求項５７に記載の医薬組成物であってGLP-1に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物。
【請求項６１】
請求項３３〜５７のいずれか１項に記載の糖鎖付加GLP-1ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、GLP-1に関連する疾患の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖付加GLP-1ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
GLP-1（グルカゴン様ペプチド−１：glucagon-like peptide-1）は、糖のホメオスタシスの制御に深く関与する腸起源のペプチドである。GLP-1は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され、食事に反応して循環中へ放出される。これらのペプチドは、腸島軸の主要メディエーターであり、特定の受容体に結合することによって作用する。【０００３】
GLP-1は、主として膵臓に作用し、β細胞によるインスリン放出をグルコース濃度依存的に促進することが知られている。また、グルカゴンの分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ、末梢のグルコース処理を高める可能性が示唆されている。【０００４】
GLP-1の投与によりインスリン非依存型糖尿病患者において食後のグルコースレベルが正常化され得ることから、GLP-1の治療薬としての可能性が示唆されている。また、GLP-1はインスリン依存型糖尿病患者において血糖コントロールを改善する作用も有している。さらに、GLP-1のインスリン放出促進作用は血漿グルコース濃度に依存しているため、低い血漿グルコース濃度ではGLP-1介在性のインスリン放出が低く、重篤な低血糖症を招かないメリットがある。従って、必要時に応じ、血中GLP-1量をコントロールすることによって、安全性の高い糖尿病治療が可能になると考えられる。しかしながら、GLP-1の血中の半減期は、２〜６分と極めて短く、その治療剤としての可能性が限定されるという問題がある。【０００５】
このような問題を解決する手段として、GLP-1を改変する試みがなされている。例えば、特許文献１には、少なくとも１個のポリエチレングリコール（PEG）分子に共役的に結合したGLP-1化合物を含むペグ化GLP-1化合物であって、各PEGがGLP-1化合物に、Cys又はLysアミノ酸にて、もしくはカルボキシ末端アミノ酸に結合し、ペグ化GLP-1化合物が少なくとも１時間の排出半減期を有するペグ化GLP-1化合物が開示されている。【０００６】
特許文献１によれば、非ペグ化（unPEGylated）ペプチドと比べて、半減期が延長され、クリアランスが遅延化された生物活性ペプチドが得られる。また、これらのペグ化（PEGylated）GLP-1化合物及び組成物は、糖尿病、肥満、過敏性腸症候群、ならびに血糖を低下させること、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、及び、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること、又は食物摂取を抑制すること等、健康状態の治療に有用であることが開示されている（例えば、非特許文献１）。【０００７】
しかしながら、PEGは、生体内で代謝されない化合物であり、そのためペグ化GLP-1化合物の投与を続けると、PEGが生体内に蓄積され、生体に薬害を与える危険性がある（非特許文献１）。【０００８】
また、GLP-1に類似した構造で、同様の活性を有し、かつ、血中安定性の高い化合物として、トカゲ(Heloderma)の唾液から発見されたエキセンジン-4(exendin-4)（非特許文献２）が米国で上市されているが、exendin-4は非ヒト型配列であり、長期投与による中和抗体の出現やそれに伴う薬効の減弱が懸念される（非特許文献３〜５）。【０００９】
一方、糖鎖は生体内において様々な役割を担っていることが明らかになってきており、その研究の重要性を認識されながらも、構造の複雑さや多様性によって研究が遅れている。組成が一定した糖ペプチドを得るための方法も試みられているが（特許文献2）、簡便さや大量生産の観点から充分な製造方法とは言えず、また、特に生体内に存在する長い糖鎖に関しては実用的な製造方法とはいえない。
【特許文献１】特表２００６−５２０８１８号公報
【特許文献２】再表２００５−０９５３３１号公報
【非特許文献１】Toxicological Science, 42,152-157 (1998)。
【非特許文献２】J Biol Chem. 267, 402-5 (1992)
【非特許文献３】Vascular Health and RiskManagement 2, 69-77 (2006)
【非特許文献４】JAMA. 298, 194-206(2007)
【非特許文献５】Endocrine Reviews 28, 187&#8211;218(2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、GLP-1と比べて、血中安定性が増大しており、さらに好ましくは、高い血糖値抑制活性を示す、糖鎖付加GLP-1ペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以上の課題を解決するために本発明は以下の特徴を有し得る。
すなわち、本発明は、
(a) GLP-1；
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
(c) GLP-1の類縁体；
において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１２】
また、本発明は、
(a) GLP-1；又は、
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、GLP-1活性を有するペプチド； 
において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１３】
本発明は、
(a) GLP-1のＣ末端（３７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチドにおいて、当該付加されたアミノ酸の少なくとも１つが、糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)により定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１４】
また、本発明は、
(a) GLP-1のＮ末端（７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチドにおいて、当該付加されたアミノ酸の少なくとも１つが、糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は、
(b) (a)により定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１５】
また、本発明は、
(a) GLP-1の１８、２０、２２、２６、３０、３４及び３６位から選択される１以上の部位のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換した糖鎖付加GLP-1ペプチド；又は
(b) (a)で定義される糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド；
であって、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１６】
また、本発明は、
(a) GLP-1；
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
(c) GLP-1の類縁体；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１７】
また、本発明は、
(a) GLP-1；又は、
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１８】
また、本発明は、
(a) GLP-1；又は、
(b) GLP-1において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、GLP-1活性を有するペプチド；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、GLP-1活性を有する糖鎖付加GLP-1ペプチドであり得る。【００１９】
本発明において、糖鎖付加アミノ酸は、実施態様によっては、好ましくは糖鎖付加Asn又は糖鎖付加Cysであり得るが、これらに限定されない。【００２０】
また、本発明において、糖鎖付加アミノ酸においては、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合することも、リンカーを介することなく結合することもできるが、実施態様によっては、好ましくは、リンカーを介することなく（直接に）結合している。【００２１】
また、本発明において、糖鎖は、４個以上の糖からなる糖鎖であることが、一般には好ましいといえ、さらに、実施態様によっては、５個〜１１個の糖からなる糖鎖であることが好ましい場合がある。【００２２】
また、本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であることが好ましい場合があるが、これらに限定されない。【００２３】
また、本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、以下の式で表される糖鎖が好ましい場合があるが、これらに限定されない。【００２４】
【化１】
2008155900.tif 000002
【００２５】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、【００２６】
【化２】
2008155900.tif 000003
【００２７】
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］【００２８】
本発明においては、糖鎖が実質的に均一であることが好ましく、また、本発明においては、そのように調整することができる。例えば、本発明の開示に従えば、９０％以上均一、あるいは、９９％以上均一を実現することができる。【００２９】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、好ましくは、GLP-1と比較して増大した血中安定性を有する。
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1と比較して好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上のOGTT（Oral Glucose Tolerance Test）における血糖値抑制活性を有し得る。【００３０】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1と比較して好ましくは、３０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上のDPP-IV耐性を有し得る。【００３１】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを新規な有効成分として医療用途に用いることができる。そのような医療用途としては、GLP-1に関連する疾患の治療又は予防が含まれる。そのような疾患の代表例は、例えば、糖尿病である。【００３２】
以上述べた本発明の特徴の一又は複数を、任意に組み合わせたものも、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドであることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1と比較して、血中安定性が増大し、また、本発明の一態様において、GLP-1と比較して、血糖値抑制活性が増大している。よって、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1と比較して、その投与量及び投与回数を低減することができる。【００３４】
また、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドに付加される糖鎖は、生体内で容易に分解されるので、その蓄積により生体に薬害を与えることはない。【００３５】
また、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドに付加される糖鎖の一部又は全部は、ヒトを含む哺乳類、鳥類等の生体内に存在する糖鎖であり、体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる等の心配がない。
さらに、これまで糖鎖、特に長鎖の糖鎖については、均一の構造を有する糖鎖を付加したペプチド（あるいはタンパク質）を大量に、一定の品質で得ることは困難であったが、本発明の製造方法によれば、糖鎖付加ペプチドである本発明の化合物を安定して簡便に大量に供給でき、医薬品の製造という観点からも、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、実施例４３におけるＨＰＬＣチャートの１例であり、18 AsnGLP-1-asialo及び18 Asn GLP-1-disialoのピークを示す。
【図２】図２は、実施例４４におけるＨＰＬＣチャートの１例であり、22 AsnGLP-1-asialo及び22 Asn GLP-1-disialoのピークを示す。
【図３】図３は、実施例４５におけるＨＰＬＣチャートの１例であり、30 AsnGLP-1-asialo及び30 Asn GLP-1-disialoのピークを示す。
【図４】図４は、実施例４７におけるＨＰＬＣチャートの１例であり、36 AsnGLP-1-asialo及び36 Asn GLP-1-disialoのピークを示す。
【図５】図５は、試験例１（血漿中における安定性試験）における、実施例７の糖鎖付加GLP-1ペプチドのＨＰＬＣによる分析結果を示すグラフである。
【図６】図６は、試験例１（血漿中における安定性試験）における、比較例１のGLP-1のＨＰＬＣによる分析結果を示すグラフである。
【図７】図７は、試験例２（db/dbマウスにおける血糖値低下作用試験）における、実施例１〜５の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1化合物投与後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図８】図８は、試験例３（db/dbマウスにおける血糖値低下作用試験）における、実施例５の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1投与後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図９】図９は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−１における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１０】図１０は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−１における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１１】図１１は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−１における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１２】図１２は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの糖鎖構造の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−２における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１３】図１３は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの糖鎖構造の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−２における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１４】図１４は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの糖鎖構造の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−２における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１５】図１５は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの投与量の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−３における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１６】図１６は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの投与量の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−３における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１７】図１７は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの投与量の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−３における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１８】図１８は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの投与量の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−３における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図１９】図１９は、Ａｓｎ糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−４における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図２０】図２０は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの糖鎖付加数の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−５における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図２１】図２１は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に対する該ペプチドの糖鎖付加数の影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（OGTT）である試験例７−５における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【図２２】図２２は、糖尿病モデルマウスにおける糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値低下作用を調べるために実施した試験例８における、実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び比較例１のGLP-1添加後の血糖値の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本明細書において「GLP-1」とは、グルカゴン様ペプチド−１（glucagon-like peptide-1）を示し、GLP-1(7-37)を指す。【００３８】
GLP-1(7-37)は、下記のアミノ酸配列を有する。
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号２）【００３９】
本発明において、「GLP-1の類縁体」とは、GLP-1と構造上類似したペプチド及び／又はGLP-1と重複した構造を有するペプチド、例えば：GLP-1のアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；GLP-1のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；GLP-1改変体；GLP-1活性を有するGLP-1のフラグメント；GLP-1活性を有する伸長GLP-1；並びにエキセンジン-4及びその類縁体が挙げられる（Curr.Opin.Investig.Drugs 8,
842-8(2007), J.Pharmacol.Exp.Ther. 307, 490-496 (2003), Diabetes 50,
2530-9(2001）等)。【００４０】
本明細書中において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α-メチルアミノ酸(α-メチルアラニンなど)、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸(2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。GLP-1活性を有するGLP-1類縁体のいくつかは、非天然アミノ酸を含むことが知られる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。【００４１】
本明細書中において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、GLP-1活性を保持する限り特に限定されないが、1〜9個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個程度であるかあるいは全体の長さの20%以内、好ましくは10%以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。【００４２】
本明細書中において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、GLP-1活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。【００４３】
本明細書中において、「GLP-1改変体」とは、GLP-1を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、GLP-1の1又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。【００４４】
本明細書中において、「GLP-1活性を有するGLP-1のフラグメント」とは、GLP-1のN末端及び／又はC末端から1個又はそれ以上のアミノ酸の欠失が生じ、かつGLP-1活性を維持したペプチドである。【００４５】
本明細書中において、「GLP-1活性を有する伸長GLP-1」とは、GLP-1のN末端及び／又はC末端から1個又はそれ以上のアミノ酸の付加が生じ、かつGLP-1活性を維持したペプチドである(例えば、Endocrinology, 125, 3109-14 (1989)を参照)。【００４６】
本明細書中において、「GLP-1のＣ末端（37位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、GLP-1のＣ末端に付加されたアミノ酸から順に、38位のアミノ酸、39位のアミノ酸・・・等と呼び、また、「GLP-1のＮ末端（7位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、GLP-1のＮ末端に付加されたアミノ酸から順に、6位のアミノ酸、5位のアミノ酸・・・等と呼ぶものとする。例えば、「GLP-1のＣ末端（37位）にさらに、１個のアミノ酸が付加されたペプチド」として、GLP-1の37位のGlyにAsn又はCysが結合したペプチドが挙げられる。【００４７】
本発明の「糖鎖付加GLP-1ペプチド」は、少なくとも１個のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする。
本明細書中において、「糖鎖付加GLP-1ペプチド」には、GLP-1の少なくとも1個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチド、上記GLP-1類縁体において少なくとも1個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチドが含まれ、それぞれ、さらに糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていても、糖鎖付加GLP-1ペプチドに含まれる。これらのペプチドのＣ末端がアミド化されたペプチド（たとえば、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号３）のアミノ酸配列を有するGLP-1(7-36)NH2の少なくとも1個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチド）も、糖鎖付加GLP-1ペプチドに含まれる。さらに、これらのペプチドの塩も、糖鎖付加GLP-1ペプチドに含まれる。【００４８】
本明細書中において、塩とは、当業者に公知の塩であり、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸及びp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸である。塩基付加塩としては、水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の無機塩基から誘導された塩が挙げられる。特に、薬学的に許容される塩が好ましい。【００４９】
本明細書中において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖たんぱく質）として存在するものと同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Asn、Ｏ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ser及び糖鎖付加Thrが好ましく、特に糖鎖付加Asnが好ましい。【００５０】
また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましい。【００５１】
なお、後述の試験例７−４において、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位及び糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Asn（リンカーを介さない）の場合と糖鎖付加Cys（リンカーを介する）の場合で、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制活性に大きな違いはみられなかった。【００５２】
糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−
（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、
Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ−（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）
等を挙げることができる。【００５３】
糖鎖付加GLP-1ペプチドの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合と比較して、糖鎖付加GLP-1ペプチドの抗原性は低くなり得る。糖鎖付加GLP-1ペプチドの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合と比較して、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血中安定性が高くなり得る。【００５４】
なお、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法及びＢ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加GLP-1ペプチドであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合した糖鎖付加GLP-1ペプチド、糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、付加した糖鎖にさらに糖又は糖鎖を付加することですでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加GLP-1ペプチド、糖鎖付加アミノ酸のアミノ基及び／又はカルボキシル基に１又は数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを1又は複数のGLP-1フラグメントと連結させた糖鎖付加GLP-1ペプチドなども、最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドに含まれる。【００５５】
GLP-1のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する置換数は、血中安定性や血糖値抑制活性等の生理活性、最終的な糖鎖付加GLP-1ペプチドに存在するアミノ酸の個数や糖鎖付加前後の糖鎖付加GLP-1ペプチドの分子量、等により適宜調節すればよい。例えば、１〜５個置換することが好ましく、１〜３個置換することがより好ましい。簡便性の観点からは、１個の置換で所望の活性が得られるのであれば、１個の置換を選択することが好ましいであろう。一般に、GLP-1の１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１個以上をさらに糖鎖付加アミノ酸で置換した場合、血中安定性は増大し、血糖値抑制活性は減少する（但し、血中安定性が増大することで、減少した血糖値抑制活性を補償することが可能である）。【００５６】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、血中安定性や血糖値抑制活性により適宜調節することができる。【００５７】
本発明の一態様において、GLP-1アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、所望の活性に応じてGLP-1の任意の部位を選択することができ、例えばGLP-1の8、9、12、18、19、20、22、26、30、34、36及び38位（＝37位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは、18、20、22、26、30、34、36及び38位から選択される１以上の部位であり、例えば、26、30、34及び36位から選択される１以上の部位であり、特に30及び36位から選択される1以上の部位である。【００５８】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血中安定性という観点からは、GLP-1の任意の部位を選択することができ、例えばGLP-1の9、10、11、12、14、16、18、19、20、22、24、25、26、27、28、30、32、34、36及び38位（＝37位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは9、10、11、12、14及び28位から選択される１以上の部位であり、特に好ましくは9、10、11及び12から選択される１以上の部位である。特にGLP-1のＮ末端に近い部位のアミノ酸の置換も好ましい。特にGLP-1の２のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、例えばGLP-1の18位と36位の置換、26位と34位の置換などを挙げることができる。【００５９】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値抑制作用という観点からは、例えばGLP-1の18、20、22、26、30、34、36及び38位（＝37位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは26、30、34及び36位から選択される１以上の部位であり、特に30及び36位から選択され１以上の部位である。特にGLP-1の２のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値抑制作用という観点から、例えばGLP-1の18位と36位の置換、26位と34位の置換などを挙げることができる。【００６０】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加GLP-1ペプチドのGLP-1活性のうち、ｃAMP合成能に関する観点からは、好ましくは22、26、27、30、34、36及び38位（＝37位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、より好ましくは22、26、30、34、36及び38位から選択される１以上の部位である。【００６１】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、GLP-1の8、9及び12位以外の部位から選択される１以上の部位である。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、GLP-1の7、10、13、15、19、21、28及び29位以外の部位から選択される1以上の部位、特に、7、10、15及び28位以外の部位から選択される1以上の部位である。【００６２】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、GLP-1のGLP-1受容体への結合部位からも、決定することができる。【００６３】
本発明の一態様において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている場合に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、上記のいずれの組み合わせも採用することができるがこれに限定されない。例えば、１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がGLP-1の任意の部位から選択される組み合わせ；１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がGLP-1のＣ末端（３７位）にさらに付加された１若しくは数個のアミノ酸の任意の部位から選択される組み合わせ等もまた、本発明の好ましい一態様に含まれる。【００６４】
本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、GLP-1における： 
8位のAlaがGly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸での置換；
9位のGluがAsp又はLys からなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
11位のThrがAla, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
12位のPheがTrp又はTyrからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
13位のThrがSerで置換；
14位のSerがAla, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
15位のAspがGluで置換；
16位のValがPhe, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
17位のSerがAla, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
18位のSerがAla, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
19位のTyrがPhe, Trp, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
20位のLeuがAla, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
21位のGluがAsp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
22位のGlyがAla, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
23位のGlnがAsn, Arg, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換;
24位のAlaがGly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
25位のAlaが Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
26位のLysがArg, Gln, Glu, Asp又はHisからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
27位のGluがAsp, Ile又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
28位のPheがTrpで置換；
29位のIleがLeu, Val又はAlaからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
30位のAlaがGly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
31位のTrp がPhe, Tyr, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
32位のLeu がGly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
33位のVal がGly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
34位のLys がArg, Glu, Asp又はHisからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
35位のGly がAla, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
36位のArgがLys, Glu, Asp又はHisからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；及び／又は
37位のGlyがAla, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp又はLysからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。【００６５】
本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が生ずる部位は、GLP-1の7、10、13、15、19、21、28及び29位以外の部位から選択される１以上の部位、例えば、7、10、15及び28位以外の部位から選択される１以上の部位であることが好ましい（Structure-Activity  Studies of Glucagon-like Peptide-l, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL
CHEMISTRY Vol.269, No. 9, Issue of March 4, pp. 6276-6278.1994）。【００６６】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドとしては、例えば、
一般式（１）
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７                                                        （１）
［式中、Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、ＮＨ２、Ｇｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓ又はＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１８がＳｅｒであり、Ｘａａ１９がＴｙｒであり、Ｘａａ２２がＧｌｙであり、Ｘａａ２６がＬｙｓであり、かつＸａａ３６がＡｒｇである場合、Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓ又はＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示す。］
で表される糖鎖付加GLP-1ペプチドが挙げられる。本明細書において、一般式（１）で表されるペプチドを配列番号１で示す。【００６７】
具体的には、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドとしては、例えば、
（ａ１）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４）；
（ａ２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号５）；
（ａ３）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号６）；
（ａ４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号７）；
（ａ５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓを示すペプチド（配列番号８）；
（ａ６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号９）；
（ａ７）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１０）；
（ａ８）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１１）；
（ａ９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１２）；
（ａ１０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１３）；
（ａ１１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示すペプチド（配列番号１４）；
（ａ１２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１５）；
（ａ１３）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号１６）；
（ａ１４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号１７）；
（ａ１５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号１８）；
（ａ１６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号１９）；
（ａ１７）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２０）；
（ａ１８）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２１）；
（ａ１９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２２）；
（ａ２０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２３）；
（ａ２１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２４）；
（ａ２２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２５）；
（ａ２３）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓを示すペプチド（配列番号２６）；
（ａ２４）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号２７）；
（ａ２５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示すペプチド（配列番号２８）；
（ａ２６）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２９）等を挙げることができる。【００６８】
本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。【００６９】
また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。【００７０】
本発明において、好ましい糖鎖は、GLP-1に付加された場合(糖鎖付加アミノ酸の形でGLP-1のアミノ酸と置換された場合)に血中安定性を増大させ、かつ、より好ましくは血糖値抑制活性を消失させない糖鎖である。本発明のある態様において、好ましい糖鎖は、GLP-1に付加された場合に(糖鎖付加アミノ酸の形でGLP-1のアミノ酸と置換された場合)血糖値抑制活性を増大させる糖鎖である。【００７１】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドが生体に投与されるという観点から、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドにおける糖鎖は、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等である。【００７２】
好ましくは、本発明で使用する糖鎖は、Ｎ結合型糖鎖である。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。【００７３】
本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドにおける糖鎖は、4個以上、例えば5個以上、7個以上、特に9個以上、11個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。【００７４】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドにおける糖鎖は、5〜11個、9〜11個又は11個の糖からなる糖鎖である。【００７５】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドにおける糖鎖は、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群より選択される糖鎖であり、より好ましくは、ジシアロ糖鎖である。【００７６】
本発明で使用する好ましい糖鎖としては、例えば、下記一般式【００７７】
【化３】
2008155900.tif 000004
【００７８】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、【００７９】
【化４】
2008155900.tif 000005
【００８０】
を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。【００８１】
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖(例えば、「FEBS LETTERS Vol.50, No.3, Feb. 1975」に記載の糖鎖)と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表１〜４に記載の糖鎖を挙げることができる。【００８２】
【表１】
2008155900.tif 000006
【００８３】
【表２】
2008155900.tif 000007
【００８４】
【表３】
2008155900.tif 000008
【００８５】
【表４】
2008155900.tif 000009
【００８６】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドにおける糖鎖の構造は、均一である。本明細書中において、糖鎖の構造が均一であるとは、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖鎖付加GLP-1ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造などの分野において好ましい。【００８７】
本発明において、好ましい糖鎖付加GLP-1ペプチドは、例えば、後述の実施例１〜４９において製造した糖鎖付加GLP-1ペプチド（配列番号１０３〜１５１）である。すなわち、以下のGLP-1の配列：
Ｈｉｓ7−Ａｌａ8−Ｇｌｕ9−Ｇｌｙ10−Ｔｈｒ11−Ｐｈｅ12−Ｔｈｒ13−Ｓｅｒ14−Ａｓｐ15−Ｖａｌ16−Ｓｅｒ17−Ｓｅｒ18−Ｔｙｒ19−Ｌｅｕ20−Ｇｌｕ21−Ｇｌｙ22−Ｇｌｎ23−Ａｌａ24−Ａｌａ25−Ｌｙｓ26−Ｇｌｕ27−Ｐｈｅ28−Ｉｌｅ29−Ａｌａ30−Ｔｒｐ31−Ｌｅｕ32−Ｖａｌ33−Ｌｙｓ34−Ｇｌｙ35−Ａｒｇ36−Ｇｌｙ37（配列番号２）
において：
（ｂ１）１８位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１）（配列番号１０３）； 
（ｂ２）２２位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２）配列番号１０４）； 
（ｂ３）２６位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３）（配列番号１０５）； 
（ｂ４）３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４）（配列番号１０６）； 
（ｂ５）３７位のＧｌｙにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例５）（配列番号１０７）； 
（ｂ６）３７位のＧｌｙにアシアロ糖鎖付加Ａｓｎが付加した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例６）（配列番号１０８）； 
（ｂ７）１９位のＴｙｒがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例７）（配列番号１０９）； 
（ｂ８）７位のＨｉｓにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例８）（配列番号１１０）； 
（ｂ９）８位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例９）（配列番号１１１）； 
（ｂ１０）９位のＧｌｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１０）（配列番号１１２）； 
（ｂ１１）１０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１１）（配列番号１１３）；
（ｂ１２）１１位のＴｈｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１２）（配列番号１１４）；
（ｂ１３）１２位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１３）（配列番号１１５）；
（ｂ１４）１４位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１４）（配列番号１１６）；
（ｂ１５）１６位のＶａｌがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１５）（配列番号１１７）；
（ｂ１６）２０位のＬｅｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１６）（配列番号１１８）；
（ｂ１７）２４位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１７）（配列番号１１９）；
（ｂ１８）２５位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１８）（配列番号１２０）；
（ｂ１９）２７位のＧｌｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１９）（配列番号１２１）；
（ｂ２０）２８位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２０）（配列番号１２２）；
（ｂ２１）３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２１）（配列番号１２３）；
（ｂ２２）３２位のＬｅｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２２）（配列番号１２４）；
（ｂ２３）３４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２３）（配列番号１２５）；
（ｂ２４）２２位のＧｌｙがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２４）（配列番号１２６）；
（ｂ２５）２６位のＬｙｓがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２５）（配列番号１２７）；
（ｂ２６）３０位のＡｌａがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２６）（配列番号１２８）；
（ｂ２７）３４位のＬｙｓがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２７）（配列番号１２９）；
（ｂ２８）３６位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２８）（配列番号１３０）；
（ｂ２９）２２位のＧｌｙがジグルクナック糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２９）（配列番号１３１）；
（ｂ３０）３０位のＡｌａがジグルクナック糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３０）（配列番号１３２）；
（ｂ３１）３４位のＬｙｓがジグルクナック糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３１）（配列番号１３３）；
（ｂ３２）２２位のＧｌｙがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３２）（配列番号１３４）；
（ｂ３３）３０位のＡｌａがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３３）（配列番号１３５）；
（ｂ３４）３４位のＬｙｓがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３４）（配列番号１３６）；
（ｂ３５）１２位のＰｈｅがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３５）（配列番号１３７）；
（ｂ３６）１８位のＳｅｒがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３６）（配列番号１３８）；
（ｂ３７）２２位のＧｌｙがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３７）（配列番号１３９）；
（ｂ３８）２６位のＬｙｓがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３８）（配列番号１４０）；
（ｂ３９）２７位のＧｌｕがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３９）（配列番号１４１）；
（ｂ４０）２８位のＰｈｅがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４０）（配列番号１４２）；
（ｂ４１）３０位のＡｌａがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４１）（配列番号１４３）；
（ｂ４２）３６位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４２）（配列番号１４４）；
（ｂ４３）１８位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４３）（配列番号１４５）；
（ｂ４４）２２位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４４）（配列番号１４６）；
（ｂ４５）３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４５）（配列番号１４７）；
（ｂ４６）３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４６）（配列番号１４８）；
（ｂ４７）３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４７）（配列番号１４９）；
（ｂ４８）２６位のＬｙｓ及び３４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４８）（配列番号１５０）；
（ｂ４９）１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４９）（配列番号１５１）；
である。【００８８】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置及び付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。【００８９】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加GLP-1ペプチドの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Asnを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加GLP-1ペプチドを製造する方法（Ａ法）及びGLP-1の任意のアミノ酸をCysで置換したペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Cysに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加GLP-1ペプチドを製造する方法（Ｂ法）を例示する。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加GLP-1ペプチドを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加GLP-1ペプチド及びその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。また、これらのＡ法及びＢ法は、組み合わせて行うことも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法に関しては、国際公開番号WO2004/005330の記載を、Ｂ法に関しては、国際公開番号WO2005/010053の記載を参照することができ、また、それぞれの方法において用いる糖鎖に関しては、国際公開番号WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等を参照することができる。これらの文献は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。【００９０】
糖鎖付加GLP-1ペプチドを製造する方法（Ａ法）
先ず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
次に（２）上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）次に、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギン（糖鎖付加アスパラギン）のアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させ、
（７）更に上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し、
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させることにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有し、中間に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドが得られる。
（１１）そして、酸で樹脂（レジン）を切断することにより、糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。【００９１】
更に、上記（６）の脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させる工程を、適宜追加することにより少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。またこの時、異なる糖鎖アスパラギンを用いることにより２種以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することもできる。【００９２】
また、この糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の端部に導入することもできる。【００９３】
水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。【００９４】
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。【００９５】
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。【００９６】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。【００９７】
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。【００９８】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。【００９９】
この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。【０１００】
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。【０１０１】
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。【０１０２】
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。【０１０３】
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。【０１０４】
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。【０１０５】
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。【０１０６】
上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加することにより、少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。【０１０７】
また上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程で行うことにより、少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドを製造することができる。【０１０８】
また上記（６）の工程に代えて、あるいは（６）の工程に加えて、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基をエステル化反応させることにより、端部に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドを製造することができる。【０１０９】
このようにして、糖鎖付加Asnで置換した糖鎖付加GLP-1ペプチドを得ることができる。【０１１０】
糖鎖付加GLP-1ペプチドを製造する方法（Ｂ法）
先ず、Cysを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。【０１１１】
次に、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体を上記で得たＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより製造する。上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法［例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］で精製するのが良い。【０１１２】
ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）で置換した化合物である。【０１１３】
具体的には、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Cysで置換した糖鎖付加GLP-1ペプチドを得ることができる。【０１１４】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1活性を有する。
本明細書中において、「GLP-1活性」とは、GLP-1について公知の生理活性の一部又は全部をいう。GLP-1は、血糖値抑制作用のほか、例えば、膵島作用として、cAMP合成誘導に伴うインスリン分泌、膵島保護（アポトーシス抑制）、膵島増殖、膵外作用として、食欲抑制、消化管運動抑制、カルシトニン分泌促進、虚血時の心保護作用等を有することが知られる。従って、GLP-1活性とは、これらの作用に関連する生理活性の全部又は一部を指し、それぞれ、当業者に公知の手法を用いて測定することができる。【０１１５】
例えば、GLP-1活性のうち、血糖値抑制活性は、糖尿病マウス（db/dbマウス）における血糖値低下作用の測定や、経口耐糖能試験（OGTT: Oral
Glucose Tolerance Test）における血糖値上昇抑制作用の測定などを用いて測定することができる。なお、本明細書中において、「血糖値抑制」とは、血糖値の上昇を抑制すること及び血糖値を低下させることのいずれの概念も含む。特に、本明細書中において、db/dbマウスにおける血糖値抑制作用を「血糖値低下作用」、OGTTにおける血糖値抑制作用を「血糖値上昇抑制作用」ということがある。【０１１６】
OGTTによる血糖値抑制活性は、マウスに強制的に糖を飲ませた際の血糖値上昇の抑制の測定によって判断することができる。例えば、後述の試験例７の手法を用いた場合、まず、被験化合物を一晩絶食させたマウスに投与し、その３０分後にグルコース溶液を経口投与する。グルコース投与によりマウス血糖値は上昇し、投与後約３０分後に最大となり徐々に減少する。グルコース投与後３０分の血糖値を測定し、GLP-1投与の場合の血糖値と比較することで、糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値抑制作用を測定することができる。この３０分後の血糖値をGLP-1を投与した場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、好ましくは80％以下、より好ましくは60％以下、さらに好ましくは40%以下、特に好ましくは20％以下の血糖値を示す。また、OGTTにおいて同程度の血糖値上昇抑制作用が確認された際の投与量を比較することで、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値抑制活性の強さを判断することができる。例えば、GLP-1を10投与した場合とある糖鎖付加GLP-1ペプチドを1投与した場合で同じ血糖値抑制作用が得られる場合、該糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値抑制活性は、GLP-1の10倍である。本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1と比較して、好ましくは5倍以上、より好ましくは10倍以上、さらに好ましくは20倍以上、特に好ましくは50倍もしくはそれ以上の血糖値抑制活性を有する。【０１１７】
db/dbマウスを用いた血糖値抑制活性は、糖尿病マウスに被験化合物を投与後の血糖値の測定によって判断することができる。例えば後述の試験例８に記載の手法を用いた場合、被験化合物投与後の血糖値を経時で測定し、例えば投与後１２０分の血糖値が投与時より低下していれば、血糖値低下作用を確認することができる。また、例えば投与後３００分の血糖値を測定することで、血糖値低下作用の持続性も判断することができる。後述の試験例８の手法を用いて、投与後１２０分の血糖値をGLP-1投与の場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、好ましくは80％以下、より好ましくは70％以下、特に好ましくは60％以下、の血糖値を示す。また、投与後１２０分の血糖値を、投与時の血糖値と比較した場合、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、好ましくは70％以下、より好ましくは60％以下、特に好ましくは50％以下（例えば45％以下）の血糖値を示す。投与後３００分の血糖値をGLP-1投与の場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下の血糖値を示す。また、投与後３００分の血糖値を、投与時の血糖値と比較した場合、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下の血糖値を示す。【０１１８】
なお、血糖値抑制活性がGLP-1と比較して低い場合あっても、血中安定性が増大することで、この活性の低さを補償することができる。【０１１９】
例えば、GLP-1活性のうち、インスリン分泌活性は、in vitroでのcAMP合成能試験などを用いて測定することができる。GLP-1はGLP-1受容体と結合することにより細胞内cAMP濃度を上昇させ、インシュリン分泌を促進させる。従って、例えば、マウスGLP-1受容体発現ＣＨＯ-K1細胞を糖鎖付加GLP-1ペプチドで刺激し、細胞内で合成されるcAMP量を測定し、EC50値をGLP-1と比較することで、糖鎖付加GLP-1ペプチドのインスリン分泌活性を測定することができる。【０１２０】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1よりも増大した血中安定性を有する。血中安定性は当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、血漿中における安定性や、DPP-IV（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対する耐性を測定し、半減期、AUC（薬物血中濃度−時間曲線下面積）等を指標に判断することができる。また、腎クリアランスの増大も血中安定性の増大に寄与する。【０１２１】
血漿中における安定性は、例えば後述の試験例１のような手法を用いて判断することができる。本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1と比較して、血漿中における安定性が増大している。【０１２２】
DPP-IVに対する耐性は、例えば後述の試験例４のように、DPP-IV溶液中における半減期の測定により判断することができる。本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、GLP-1と比較して、DPP-IVに対する耐性が増大しており、例えば後述の試験例４の手法を用いてDPP-IVに対する耐性を測定した場合、その半減期は、GLP-1と比較して1.2倍以上、（例えば2倍以上）、好ましくは5倍以上、より好ましくは10倍以上、特に好ましくは20倍以上増大している。【０１２３】
また、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、好ましくは少なくとも1時間、より好ましくは少なくとも3、5、7、10、15、20時間及びさらに好ましくは少なくとも24時間の血中半減期を有する。【０１２４】
次に、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、GLP-1に関連する疾患の治療又は予防に有効である。上述の通り、GLP-1には種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、GLP-1が、インスリン放出を刺激することにより、細胞によるグルコース取り込み及び血糖値の低下を引き起こすことが見出されている。また、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること並びに食物摂取を抑制することも見出されている。従って、GLP-1に関連する疾患には、例えば、非インスリン依存性糖尿病(NIDDM)、インスリン依存性糖尿病、脳卒中（EfendicによるWO00/16797を参照）、心筋梗塞（EfendicによるWO98/08531を参照）、肥満（EfendicによるWO98/19698を参照）、機能性消化不良、過敏性腸症候群（EfendicによるWO99/64060を参照）、膵島移植が含まれる。本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、特に糖尿病の治療又は予防に有効であり、より特定すれば、１型糖尿病の予防、２型糖尿病の治療に有効である。【０１２５】
上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。【０１２６】
医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを１〜７０重量％含有させるのが好ましい。【０１２７】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含有することもできるし、異なる１以上の本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。【０１２８】
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。【０１２９】
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、通常、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドが０．１〜９００ｎｍｏｌ、好ましくは１〜９０ｎｍｏｌとなる投与量である。本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドはGLP-1に比べ、血中安定性が非常に高く、また、一態様において、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドはGLP-1に比べ、血糖値抑制活性が非常に高いため、投与量を減らすことができるという利点がある。【０１３０】
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドはGLP-1に比べ、血中安定性が非常に高いため、投与回数を減らすことができるという利点がある。【０１３１】
本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチド及び該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。【０１３２】
さらに、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
本発明はまた、本発明の糖鎖付加GLP-1ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、GLP-1に関連する疾患の治療又は予防方法も提供する。
【実施例】
【０１３３】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。なお、図７〜２２中、例えば、GLP-1の２２位のアミノ酸がジシアロ糖鎖付加Cysで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチドである「22Cys GLP-1-disialo」を、必要に応じて「22Cys-disialoGLP-1」、「C22」又は「C22-disialo」と記載することがある。他の糖鎖及びアミノ酸部位に関しても同様である。【０１３４】
実施例１  １８位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加 GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０.２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０.２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０.２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１３５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０.５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１３６】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０.４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０.８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１３７】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号３０）。なお、Ｆｍｏｃ法の性質上、Ｃ末端側から３７→７方向へ配列表記をしている。【０１３８】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、３１残基のペプチド５μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  ８．０ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１８位のセリンがCysで置換されたペプチドが得られた。【０１３９】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３ｍｇ【０１４０】
【化５】
2008155900.tif 000010
【０１４１】
と上記で合成したペプチド鎖１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１７０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１８位のＳｅｒが糖鎖付加Cysで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（１）（18Cys GLP-1-disialo）を１ｍｇ得た。【０１４２】
実施例２〜５
アミノ酸の縮合順を変えた以外は実施例１と同様にして、GLP-1の２２位のＧｌｙが糖鎖付加Cysで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（２）（22Cys GLP-1-disialo）、GLP-1の２６位のＬｙｓが糖鎖付加Cysで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（３）（26Cys GLP-1-disialo）、GLP-1の３６位のＡｒｇが糖鎖付加Cysで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（４）（36Cys GLP-1-disialo）、及びGLP-1の３７位のＧｌｙにさらに糖鎖付加Cysが結合した糖鎖付加GLP-1ペプチド（５）（38Cys GLP-1-disialo）を得た。結果を表５に示す。【０１４３】
比較例１
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（１００μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０.２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０.２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルモルホリン（０.２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１４４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０.５０ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１４５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０.４ｍｍｏｌ）を加えた後に，固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０.８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１４６】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号３１）。【０１４７】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、３１残基のペプチド５μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ    Ｃ１８  １００×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５&#10141;５：９５  １５分  流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、GLP-1を得た。結果を表５に示す。【０１４８】
【表５】
2008155900.tif 000011
【０１４９】
実施例６  ３８位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加 GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（１００μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０.２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０.２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルモルホリン（０.２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１５０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０.５０ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１５１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０.４ｍｍｏｌ）を加えた後に，固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０.８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
（最後のアミノ酸はＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを使用。縮合方法はＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨと同様に行った。）【０１５２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号３２）。【０１５３】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度に加え、１８時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、保護ペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｂｏｃを得た（配列番号３３）。３１残基の保護ペプチド２μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（０．０３ｍｌ）に溶解させた。別途用意したエッペンチューブにアシアロ糖鎖アスパラギン（アミンフリー体）（４．９ｍｇ、１μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１ｍｇ、１．９μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．３ｍｇ、２μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．０４ｍｌ）に溶解させ入れ、最後にＤＩＰＥＡ（０．０００５２ｍｌ，３μｍｏｌ）を加えた。このエッペンチューブ中の混合溶液を先ほど用意したナスフラスコに入れ、室温で２．５時間撹拌した。反応終了後、溶液を濃縮し、得られ残渣物にトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え晶析を行い、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで目的とする糖鎖付加GLP-1ペプチドを含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO  UG-120 (C18 5μm)、φ２０
x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  ８．０ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３８位を糖鎖付加Asnで置換した糖鎖付加GLP-1ペプチド（３８Asn-GLP-1-asialo）が得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２１７Ｈ３３６Ｎ４６Ｏ９４：  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １６９７．８，  ｆｏｕｎｄ．１６９７．９。【０１５４】
実施例７  １９位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加 GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（１００μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０.２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０.２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルモルホリン（０.２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１５５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０.５０ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（０.５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０.３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１５６】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０.４ｍｍｏｌ）を加えた後に，固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０.８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１５７】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕの１８残基ペプチドを得た（配列番号３４）。【０１５８】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、１８残基のペプチド５μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）（１８ｍｇ，１０μｍｏｌ）【０１５９】
【化６】
2008155900.tif 000012
【０１６０】
とＤＥＰＢＴ（４．５ｍｇ，１５μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３４ｍｌ）に溶解させ、エッペンチューブに入れた。ＤＩＰＥＡ（２．６μｌ，１５μｍｏｌ）を加えて室温で２４時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の１９残基糖鎖ペプチドが得られた（配列番号３５）。その後、アミノ基がＦｍｏｃ保護されたアミノ酸をＨＯＢｔ（３．４ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３．８μｌ，０．０２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．１ｍｌ）によって縮合させ、固相上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基の糖鎖ペプチドを形成させた（配列番号３６）。【０１６１】
得られた糖鎖ペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  ７．０ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１９位を糖鎖付加Asnで置換した糖鎖付加GLP-1ペプチド（１９Asn-GLP-1-asialo）が得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２１４Ｈ３３１Ｎ４５Ｏ９２：  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １６６８．８，  ｆｏｕｎｄ．１６６８．１。【０１６２】
【表６】
2008155900.tif 000013
【０１６３】
実施例８  ６位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１６４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１６５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１６６】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）, Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の３２残基ペプチドを得た（配列番号３７）。【０１６７】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の6位にＣｙｓが付加されたペプチドが得られた。【０１６８】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３４ｍｇと上記で合成したペプチド鎖９．６ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１ｍｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の６位に糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加GLP-1ペプチド（６Cys GLP-1-disialo）を９．９ｍｇ得た。【０１６９】
実施例９  ８位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１７０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１７１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１７２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号３８）。【０１７３】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の８位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０１７４】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）２５ｍｇと上記で合成したペプチド鎖７．３ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、７３０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  ８ ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の８位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（8Cys GLP-1-disialo）を９．３ｍｇ得た。【０１７５】
実施例１０  ９位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１７６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１７７】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１７８】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号３９）。【０１７９】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の９位のＧｌｕがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０１８０】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）５０ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１６．４ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１．７ｍｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の９位のＧｌｕが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（9Cys GLP-1-disialo）を７．３ｍｇ得た。【０１８１】
実施例１１  １０位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１８２】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１８３】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１８４】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４０）。【０１８５】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１０位のＧｌｙがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０１８６】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１６．８ｍｇと上記で合成したペプチド鎖５．６ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、５６０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１０位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（10Cys GLP-1-disialo）を３．０ｍｇ得た。【０１８７】
実施例１２  １１位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１８８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１８９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１９０】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｃ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４１）。【０１９１】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１１位のＴｈｒがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０１９２】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）４１ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１２．８ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１．３ｍｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１１位のＴｈｒが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（11Cys GLP-1-disialo）を１１．９ｍｇ得た。【０１９３】
実施例１３  １２位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１９４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１９５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１９６】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｃ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４２）。【０１９７】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１２位のＰｈｅがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０１９８】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３３ｍｇと上記で合成したペプチド鎖９．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１ｍｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１２位のＰｈｅが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（12Cys GLP-1-disialo）を１０．０ｍｇ得た。【０１９９】
実施例１４  １４位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２００】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２０１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２０２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４３）。【０２０３】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１４位のＳｅｒがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２０４】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３２ｍｇと上記で合成したペプチド鎖８．８ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１ｍｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１４位のＳｅｒが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（14Cys GLP-1-disialo）を８．４ｍｇ得た。【０２０５】
実施例１５  １６位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２０６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２０７】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２０８】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４４）。【０２０９】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１６位のＶａｌがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２１０】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３６ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１２ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１．２mｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１６位のＶａｌが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（16Cys GLP-1-disialo）を１１．２ｍｇ得た。【０２１１】
実施例１６  ２０位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２１２】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２１３】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２１４】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４５）。【０２１５】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２０位のＬｅｕがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２１６】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３６．９ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１２．３ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１．５mｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２０位のＬｅｕが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（20Cys GLP-1-disialo）を１３．４ｍｇ得た。【０２１７】
実施例１７  ２４位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２１８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２１９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２２０】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４６）。【０２２１】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２４位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２２２】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）６．６ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．２ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、２５０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２４位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（24Cys GLP-1-disialo）を１．８ｍｇ得た。【０２２３】
実施例１８  ２５位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２２４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２２５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２２６】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４７）。【０２２７】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２５位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２２８】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）２８ｍｇと上記で合成したペプチド鎖８．３ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、８３０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２５位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（25Cys GLP-1-disialo）を５．６ｍｇ得た。【０２２９】
実施例１９  ２７位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２３０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２３１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２３２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４８）。【０２３３】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２７位のＧｌｕがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２３４】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３４ｍｇと上記で合成したペプチド鎖1０．８ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１．１ｍｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  ８ ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２７位のＧｌｕが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（27Cys GLP-1-disialo）を８．７ｍｇ得た。【０２３５】
実施例２０  ２８位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２３６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２３７】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２３８】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号４９）。【０２３９】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２８位のＰｈｅがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２４０】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３０．６ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１０．２ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、1.２mｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２８位のＰｈｅが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（28Cys GLP-1-disialo）を１０．３ｍｇ得た。【０２４１】
実施例２１  ３０位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２４２】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２４３】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２４４】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５０）。【０２４５】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２４６】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）２１．３ｍｇと上記で合成したペプチド鎖７．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．７mｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（30Cys GLP-1-disialo）を６．６ｍｇ得た。【０２４７】
実施例２２  ３２位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２４８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２４９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２５０】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５１）。【０２５１】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３２位のＬｅｕがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２５２】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）２０ｍｇと上記で合成したペプチド鎖５．６ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、６００μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ４．６x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３２位のＬｅｕが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（32Cys GLP-1-disialo）を３．５ｍｇ得た。【０２５３】
実施例２３  ３４位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２５４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２５５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２５６】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５２）。【０２５７】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３４位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２５８】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３３ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１０．０ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１ｍｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ２０x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３４位のＬｙｓが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（34Cys GLP-1-disialo）を７．９ｍｇ得た。【０２５９】
実施例２４  ２２位Ｃｙｓ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２６０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２６１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２６２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５３）。【０２６３】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
ブロモアセチル化したアシアロ糖鎖（ｃ）（大塚化学株式会社製）１５ｍｇ【０２６４】
【化７】
2008155900.tif 000014
【０２６５】
と上記で合成したペプチド鎖３．４ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、３４０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（22Cys GLP-1-asialo）を０．７ｍｇ得た。【０２６６】
実施例２５  ２６位Ｃｙｓ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２６７】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２６８】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２６９】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５４）。【０２７０】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２６位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２７１】
ブロモアセチル化したアシアロ糖鎖（ｃ）（大塚化学株式会社製）１３ｍｇと上記で合成したペプチド鎖３．９ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、４００μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２６位のＬｙｓが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（26Cys GLP-1-asialo）を１．０ｍｇ得た。【０２７２】
実施例２６  ３０位Ｃｙｓ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２７３】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２７４】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２７５】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５５）。【０２７６】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２７７】
ブロモアセチル化したアシアロ糖鎖（ｃ）（大塚化学株式会社製）９．０ｍｇと上記で合成したペプチド鎖４．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、４10μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（30Cys GLP-1-asialo）を２．４ｍｇ得た。【０２７８】
実施例２７  ３４位Ｃｙｓ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２７９】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２８０】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２８１】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５６）。【０２８２】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３４位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２８３】
ブロモアセチル化したアシアロ糖鎖（ｃ）（大塚化学株式会社製）１０ｍｇと上記で合成したペプチド鎖３．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、３５０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３４位のＬｙｓが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（34Cys GLP-1-asialo）を２．２ｍｇ得た。【０２８４】
実施例２８  ３６位Ｃｙｓ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２８５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２８６】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２８７】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５７）。【０２８８】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０２８９】
ブロモアセチル化したアシアロ糖鎖（ｃ）（大塚化学株式会社製）３．０ｍｇと上記で合成したペプチド鎖０．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１００μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（36Cys GLP-1-asialo）を０．２ｍｇ得た。【０２９０】
実施例２９  ２２位Ｃｙｓ-ジグルクナック糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２９１】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２９２】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０２９３】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５８）。【０２９４】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
ブロモアセチル化したジグルクナック糖鎖（ｄ）（大塚化学株式会社製）８．４ｍｇ【０２９５】
【化８】
2008155900.tif 000015
【０２９６】
と上記で合成したペプチド鎖３．４ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、３４０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（22Cys GLP-1-diGlcNAc）を２．２ｍｇ得た。【０２９７】
実施例３０  ３０位Ｃｙｓ-ジグルクナック糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０２９８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０２９９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３００】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号５９）。【０３０１】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０３０２】
ブロモアセチル化したジグルクナック糖鎖（ｄ）（大塚化学株式会社製）９．３ｍｇと上記で合成したペプチド鎖４．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、４１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（30Cys GLP-1-diGlcNAc）を２．２ｍｇ得た。【０３０３】
実施例３１  ３４位Ｃｙｓ-ジグルクナック糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３０４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３０５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３０６】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号６０）。【０３０７】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３４位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０３０８】
ブロモアセチル化したジグルクナック糖鎖（ｄ）（大塚化学株式会社製）１２ｍｇと上記で合成したペプチド鎖３．９ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、3９0μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の34位のLysが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（34Cys GLP-1-diGlcNAc）を１．５ｍｇ得た。【０３０９】
実施例３２  ２２位Ｃｙｓ-ジマンノース糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３１０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３１１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３１２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号６１）。【０３１３】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０３１４】
ブロモアセチル化したジマンノース糖鎖（ｅ）（大塚化学株式会社製）７．２ｍｇ【０３１５】
【化９】
2008155900.tif 000016
【０３１６】
と上記で合成したペプチド鎖３．４ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、３４０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（22Cys GLP-1-dimannose）を１．６ｍｇ得た。【０３１７】
実施例３３  ３０位Ｃｙｓ-ジマンノース糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３１８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３１９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３２０】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号６２）。【０３２１】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０３２２】
ブロモアセチル化したジマンノース糖鎖（ｅ）（大塚化学株式会社製）１０．２ｍｇと上記で合成したペプチド鎖４．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、４１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（30Cys GLP-1-dimannose）を２．４ｍｇ得た。【０３２３】
実施例３４  ３４位Ｃｙｓ-ジマンノース糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。【０３２４】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３２５】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号６３）。【０３２６】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３４位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０３２７】
ブロモアセチル化したジマンノース糖鎖（ｅ）（大塚化学株式会社製）１０ｍｇと上記で合成したペプチド鎖３．９ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、3９０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３４位のＬｙｓが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（34Cys GLP-1-dimannose）を１．３ｍｇ得た。【０３２８】
実施例３５  １２位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３２９】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３３０】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３３１】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）を用い、固相樹脂上にＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）の１２残基のペプチドを得た（配列番号６４）。この１２残基のペプチド７．０μｍｏｌ分を別途用意した固相合成用カラムに移し変え、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にアシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（２７．７ｍｇ，１４．０μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（６．３ｍｇ，２１．１μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（4:1混合溶液、０．３５ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ（２．４μｌ，１４．１μｍｏｌ）を加えて室温にて１８時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の１３残基糖鎖ペプチドが得られた（配列番号６５）。【０３３２】
その後Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（４．７ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（５．４μｌ，０．０３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．８７５ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／DMF溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸には，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の１８残基の糖鎖ペプチドを得た（配列番号６６）。【０３３３】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、保護糖鎖ペプチドＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）―NH-Bocを得た（配列番号６７）。【０３３４】
１８残基の保護糖鎖ペプチド２．４５μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（０．１ｍｌ）に溶解させたのち、アルゴン雰囲気下、−１５〜−２０℃に冷却した。このものにベンジルチオール（８．７μｌ，７３．６μｍｏｌ）を加えた後、別途用意したＰｙＢＯＰ（６．４ｍｇ，１２．３μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（０．２３１ｍｌ）を加え、続いて、ＤＩＰＥＡ（２．１μｌ，１２．３μｍｏｌ）を加えた。−１５〜−２０℃において２時間攪拌した後、冷却したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加えペプチド成分を沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除いた。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradientで精製し、Ｃ末端がベンジルチオエステルであるペプチドPhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Asn(Oligosaccharide
chain)-Thr-Gly-Glu-Ala-Hiｓ２．１ｍｇを得た（配列番号６８）。【０３３５】
一方、  固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３３６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３３７】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上に，Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）の１３残基のペプチドを得た（配列番号６９）。このものをトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で３．５時間撹拌した。その後、別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］で精製し、目的とするペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓを得た（配列番号７０）。【０３３８】
このようにして調製した１８残基のＣ末端がベンジルチオエステルペプチド（２．１ｍｇ）と１３残基のペプチド（２．６ｍｇ）の二種類を同じ遠沈管にいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（０．５８ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、室温にてチオフェノール（２．９μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、３１残基の糖鎖ペプチド１．５ｍｇを得た。
得られた糖鎖ペプチドを遠沈管に入れ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（３５ｍＭＴＣＥＰ液、６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた。この反応溶液を室温にて、活性化したラネーニッケルを加え、２６時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をメンブレンフィルターで濾過し、目的とする糖鎖付加GLP-1ペプチドを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120
(C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、目的とするGLP-1の１２位のＰｈｅがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（12Asn GLP-1-asialo）を０．８ｍｇ得た。【０３３９】
実施例３６  １８位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（0.125mｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．125ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．125ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３４０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．25ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．25ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．175ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３４１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．25ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．25ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．25ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３４２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）の１９残基ペプチドを得た（配列番号７１）。【０３４３】
アシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）１９８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ３０．０ｍｇ（１００μｍｏｌ）をＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２．４／０．６ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れた。ＤＩＰＥＡ２６μｌ（１５０μｍｏｌ）を加えて室温で２４時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の20残基糖鎖ペプチドが得られた（配列番号７２）。その後、アミノ基がＦｍｏｃ保護されたアミノ酸をＨＯＢｔ３４ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ３８μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基の糖鎖ペプチドを形成させた（配列番号７３）。【０３４４】
得られた糖鎖ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１８位のＳｅｒがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（18Asn GLP-1-asialo）８．２ｍｇが得られた。【０３４５】
実施例３７  ２２位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．１２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．１２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．１２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３４６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．１７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３４７】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．25ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．２５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３４８】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）の１５残基ペプチドを得た（配列番号７４）。【０３４９】
アシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）１９８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ３０ｍｇ（１００μｍｏｌ）をＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２．４／０．６ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れた。ＤＩＰＥＡ（２６μｌ，１５０μｍｏｌ）を加えて室温で２４時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の１６残基糖鎖ペプチドが得られた（配列番号７５）。その後、アミノ基がＦｍｏｃ保護されたアミノ酸をＨＯＢｔ３４ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ３８μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基の糖鎖ペプチドを形成させた（配列番号７６）。【０３５０】
得られた糖鎖ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（22Asn GLP-1-asialo）１２．２mgが得られた。【０３５１】
実施例３８  ２６位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３５２】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３５３】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３５４】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）（配列番号７７）の１８残基のペプチドを得た。【０３５５】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、保護ペプチドＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨＢｏｃを得た（配列番号７８）。【０３５６】
１８残基の保護ペプチド３５μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．７ｍｌ）に溶解させたのち、アルゴン雰囲気下、−１５〜−２０℃に冷却した。このものにベンジルチオール（１２５μｌ，１．０６ｍｍｏｌ）を加えた後、別途用意したＰｙＢＯＰ（９４．７ｍｇ，１８２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１．０ｍｌ）を加え、続いて、ＤＩＰＥＡ（２９．８μｌ，１７５μｍｏｌ）を加えた。−１５〜−２０℃において２時間攪拌した後、冷却したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加えペプチド成分を沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除いた。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］で精製し、Ｃ末端がベンジルチオエステルである１８残基のペプチドPhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-Hisを得た（配列番号７９）。【０３５７】
一方、  固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３５８】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３５９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７．０μｌ、６３．１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに加えた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３６０】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）を用い，固相樹脂上にＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）の１１残基のペプチドを得た（配列番号８０）。この１１残基のペプチド１０μｍｏｌ分を別途用意した固相合成用カラムに移し変え、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にアシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）４０．０ｍｇ（２０．０μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ９．０ｍｇ（３０．０μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（４：１混合溶液、０．５ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ３．４μｌ（２０μｍｏｌ）を加えて室温にて１６時間攪拌した。【０３６１】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、ＨＯＢｔ６．８ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ７．７μｌ（０．０５ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、樹脂をＤＣＭ，ＤＭＦを用いて洗浄することで固相樹脂上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の１３残基の糖鎖ペプチドを得た（配列番号８１）。このものをトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で３．５時間撹拌した。その後、別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離操作を行い、目的とする糖鎖ペプチドを含む沈殿物と溶液部分とを分けた。その後、溶液部分を除去した後、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、目的とする糖鎖ペプチド７．１ｍｇを得た。【０３６２】
このようにして調製した１８残基のＣ末端がベンジルチオエステルペプチド（１．６ｍｇ）と１３残基の糖鎖ペプチド（２．５ｍｇ）の二種類を同じ遠沈管にいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（０．８ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、室温にてチオフェノール（８．０μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をそのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、目的とする３１残基の糖鎖ペプチド２．０ｍｇを得た。【０３６３】
得られた糖鎖ペプチド（１．０ｍｇ）を遠沈管に入れ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（３５ｍＭＴＣＥＰ液、６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた。この反応溶液を室温にて、活性化したラネーニッケルを加え、１８時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をメンブレンフィルターで濾過し、目的とする糖鎖ペプチドを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、目的とするGLP-1の２６位のＬｙｓがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（26Asn GLP-1-asialo）０．２ｍｇを得た。【０３６４】
実施例３９  ２７位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３６５】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３６６】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３６７】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の１８残基のペプチドを得た（配列番号８２）。【０３６８】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、１８残基の保護ペプチドＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨＢｏｃを得た（配列番号８３）。【０３６９】
１８残基の保護ペプチド３５μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．７ｍｌ）に溶解させたのち、アルゴン雰囲気下、−１５〜−２０℃に冷却した。このものにベンジルチオール１２５μｌ（１．０６ｍｍｏｌ）を加えた後、別途用意したＰｙＢＯＰ９４．７ｍｇ（１８２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１．０ｍｌ）を加え、続いて、ＤＩＰＥＡ２９．８μｌ（１７５μｍｏｌ）を加えた。−１５〜−２０℃において２時間攪拌した後、冷却したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加えペプチド成分を沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除いた。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、Ｃ末端がベンジルチオエステルである１８残基のペプチドPhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-Hisを得た（配列番号８４）。【０３７０】
一方、固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３７１】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３７２】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ６７．６ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ７７．０μｌ（６３．１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに加えた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３７３】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅを用い，固相樹脂上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅの１０残基のペプチドを得た（配列番号８５）。この１０残基のペプチド１０μｍｏｌ分を別途用意した固相合成用カラムに移し変え、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にアシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）３７．２ｍｇ（１８．８μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ８．５ｍｇ（２８．４μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（４：１混合溶液、１．０ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ３．２μｌ（１８．８μｍｏｌ）を加えて室温にて１６時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後の糖鎖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３７４】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ６．８ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ７．７μｌ（０．０５ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／DMF溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の１３残基の糖鎖ペプチドを得た（配列番号８６）。このものをトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で３．５時間撹拌した。その後、別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離操作を行い、目的とする糖鎖ペプチドを含む沈殿物と溶液部分とを分けた。その後、溶液部分を除去した後、目的物をＨＰＬＣで確認した後、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、１３残基の糖鎖ペプチド６．１ｍｇを得た。【０３７５】
このようにして調製した１８残基のＣ末端がベンジルチオエステルペプチド（１．３ｍｇ）と１３残基の糖鎖ペプチド（２．０ｍｇ）の二種類を同じ遠沈管にいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（０．６４ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、室温にてチオフェノール（６．４μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をそのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、３１残基の糖鎖ペプチド１．０ｍｇを得た。【０３７６】
得られた糖鎖ペプチド（１．０ｍｇ）を遠沈管に入れ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（３５ｍＭＴＣＥＰ液、６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた。この反応溶液を室温にて、活性化したラネーニッケルを加え、１８時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をメンブレンフィルターで濾過し、糖鎖ペプチドを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、目的とするGLP-1の２７位のＧｌｕがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（27Asn GLP-1-asialo）０．５ｍｇを得た。【０３７７】
実施例４０  ２８位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３７８】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３７９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３８０】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の１８残基のペプチドを得た（配列番号８７）。【０３８１】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、１８残基の保護ペプチドＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨＢｏｃを得た（配列番号８８）。【０３８２】
１８残基の保護ペプチド３５μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．７ｍｌ）に溶解させたのち、アルゴン雰囲気下、−１５〜−２０℃に冷却した。このものにベンジルチオール１２５μｌ（１．０６ｍｍｏｌ）を加えた後、別途用意したＰｙＢＯＰ９４．７ｍｇ（１８２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１．０ｍｌ）を加え、続いて、ＤＩＰＥＡ２９．８μｌ（１７５μｍｏｌ）を加えた。−１５〜−２０℃において２時間攪拌した後、冷却したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加えペプチド成分を沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除いた。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、Ｃ末端がベンジルチオエステルである１８残基のペプチドPhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-Hisを得た（配列番号８９）。【０３８３】
一方、固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３８４】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３８５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ６７．６ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ７７．０μｌ（６３．１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに加えた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅを用い，固相樹脂上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅの９残基のペプチドを得た（配列番号９０）。この９残基のペプチド１１μｍｏｌ分を別途用意した固相合成用カラムに移し変え、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にアシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）８２．６ｍｇ（４１．８μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ１８．７ｍｇ（６２．５μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（４：１混合溶液、１．４ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ７．０μｌ（４１．２μｍｏｌ）を加えて室温にて１６時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後の糖鎖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３８６】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ６．８ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ７．７μｌ（０．０５ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／DMF溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の１３残基の糖鎖ペプチドを得た（配列番号９１）。このものをトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で３．５時間撹拌した。その後、別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離操作を行い、目的とする糖鎖ペプチドを含む沈殿物と溶液部分とを分けた。その後、溶液部分を除去した後、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、１３残基の糖鎖ペプチド１０．１ｍｇを得た。【０３８７】
このようにして調製した１８残基のＣ末端がベンジルチオエステルペプチド（３．６ｍｇ）と１３残基の糖鎖ペプチド（５．６ｍｇ）の二種類を同じ遠沈管にいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（１．８ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、室温にてチオフェノール（１８μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をそのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、３１残基の糖鎖ペプチド３．８ｍｇを得た。【０３８８】
得られた糖鎖ペプチド（１．３ｍｇ）を遠沈管に入れ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（３５ｍＭＴＣＥＰ液、６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた。この反応溶液を室温にて、活性化したラネーニッケルを加え、４０時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をメンブレンフィルターで濾過し、糖鎖ペプチドを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、目的とするGLP-1の２８位のＰｈｅがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（28Asn GLP-1-asialo）０．８ｍｇを得た。【０３８９】
実施例４１  ３０位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．１２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．１２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．１２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３９０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．１７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３９１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．２５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０３９２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の７残基ペプチドを得た（配列番号９２）。【０３９３】
アシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）１９８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ３０．０ｍｇ（１００μｍｏｌ）をＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２．４／０．６ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れた。ＤＩＰＥＡ２６μｌ（１５０μｍｏｌ）を加えて室温で２４時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の8残基糖鎖ペプチドが得られた（配列番号９３）。その後、アミノ基がＦｍｏｃ保護されたアミノ酸をＨＯＢｔ３４ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ３８μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基の糖鎖ペプチドを形成させた（配列番号９４）。【０３９４】
得られた糖鎖ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３０位のＡｌａがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（30Asn GLP-1-asialo）６．４ mgが得られた。【０３９５】
実施例４２  ３６位Ａｓｎ-アシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．１２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．１２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．１２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０３９６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．１７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０３９７】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。
アシアロ糖鎖アスパラギン（ｂ）（大塚化学株式会社製）１９８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ３０．０ｍｇ（１００μｍｏｌ）をＮＭＰ／ＤＭＳＯ（２．４／０．６ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れた。ＤＩＰＥＡ２６μｌ（１５０μｍｏｌ）を加えて室温で２４時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＧｌｙ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）の2残基糖鎖ペプチドが得られた。【０３９８】
その後、アミノ基がＦｍｏｃ保護されたアミノ酸をＨＯＢｔ３４ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ３８μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させ、Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基の糖鎖ペプチドを形成させた（配列番号９５）。【０３９９】
得られた糖鎖ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の３６位のＡｒｇがアシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（36Asn GLP-1-asialo）８．０ mgが得られた。【０４００】
実施例４３  １８位Ａｓｎ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
実施例３６で合成した18 Asn GLP-1-asialo（０．６ｍｇ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，２００μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加えた。これに、ＣＭＰ−シアル酸（５ｍｇ）、Alkaline phosphatase（１μｌ）を加え均一化し、最後に、α2,６-Sialyltransferase（ＪＴ社製、１０ｍＵ）を加え３０℃で２４時間反応させた。（ＨＰＬＣ反応モニター条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０mm、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡ  アセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６０／４０→３０／６０  ４０分  流速０．７ｍｌ／分）図１にＨＰＬＣチャートの１例を示す。図中、手前のピークが原料である18 Asn GLP-1-asialo、後ろのピークが18 Asn
GLP-1-disialoである。ＨＰＬＣ同条件にて精製し、GLP-1の１８位のＳｅｒがジシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（18 Asn GLP-1-disialo）が０．３ｍｇ得られた。【０４０１】
実施例４４  ２２位Ａｓｎ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
実施例３７で合成した22 Asn GLP-1-asialo（１．３ｍｇ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，２００μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加えた。これに、ＣＭＰ−シアル酸（５ｍｇ）、Alkaline phosphatase（１μｌ）を加え均一化し、最後に、α2,６-Sialyltransferase（ＪＴ社製、１０ｍＵ）を加え３０℃で２４時間反応させた。（ＨＰＬＣ反応モニター条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０mm、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡ  アセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６０／４０→３０／６０  ４０分  流速０．７ｍｌ／分）図２にＨＰＬＣチャートの１例を示す。図中、手前のピークが原料である22Asn GLP-1-asialo、後ろのピークが22 Asn
GLP-1-disialoである。ＨＰＬＣ同条件にて精製し、GLP-1の２２位のＧｌｙがジシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（22Asn GLP-1-disialo）が１．３ｍｇ得られた。【０４０２】
実施例４５  ３０位Ａｓｎ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
実施例４１で合成した30 Asn GLP-1-asialo（０．９ｍｇ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，２００μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加えた。これに、ＣＭＰ−シアル酸（５ｍｇ）、Alkaline phosphatase（１μｌ）を加え均一化し、最後に、α2,６-Sialyltransferase（ＪＴ社製、１０ｍＵ）を加え３０℃で２４時間反応させた。（ＨＰＬＣ反応モニター条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０mm、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡ  アセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６０／４０→３０／６０  ４０分  流速０．７ｍｌ／分）図３にＨＰＬＣチャートの１例を示す。図中、手前のピークが原料である30 Asn GLP-1-asialo、後ろのピークが30 Asn GLP-1-disialoである。ＨＰＬＣ同条件にて精製し、GLP-1の３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（30 Asn GLP-1-disialo）が０．６ｍｇ得られた。【０４０３】
実施例４６  ３０位Ａｓｎ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０４０４】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０４０５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０４０６】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の１８残基のペプチドを得た（配列番号９６）。【０４０７】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、保護ペプチドＡｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨＢｏｃを得た（配列番号９７）。【０４０８】
１８残基の保護ペプチド３５μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．７ｍｌ）に溶解させたのち、アルゴン雰囲気下、−１５〜−２０℃に冷却した。このものにベンジルチオール１２５μｌ（１．０６ｍｍｏｌ）を加えた後、別途用意したＰｙＢＯＰ９４．７ｍｇ（１８２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１．０ｍｌ）を加え、続いて、ＤＩＰＥＡ２９．８μｌ（１７５μｍｏｌ）を加えた。−１５〜−２０℃において２時間攪拌した後、冷却したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加えペプチド成分を沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除いた。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、溶液部分をメンブレンフィルターで除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、Ｃ末端がベンジルチオエステルで１８残基のペプチドPhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-Hisを得た（配列番号９８）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ88Ｈ125Ｎ21Ｏ31S：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １００２．９，  ｆｏｕｎｄ．１００３．３【０４０９】
一方、  固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０４１０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０４１１】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ６７．６ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ７７．０μｌ（６３．１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに加えた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０４１２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）を用い，固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の７残基のペプチドを得た（配列番号９９）。この７残基のペプチド３４．６μｍｏｌ分を別途用意した固相合成用カラムに移し変え、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管に糖鎖アスパラギン（ｆ）（大塚化学株式会社製）１３２．７ｍｇ（４８．４μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ３１．２ｍｇ（１０４．３μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（１：４混合溶液、０．６ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ１８．１μｌ（１０３．８μｍｏｌ）を加えて室温にて１８時間攪拌した。【０４１３】
【化１０】
2008155900.tif 000017
【０４１４】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後の糖鎖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０４１５】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ３３．８ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ３８．５μｌ（３１．５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０分２０％ピペリジン／DMF溶液（１ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），  Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上に，Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）の１３残基の糖鎖ペプチドを得た（配列番号１００）。このものをトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で３．５時間撹拌した。その後、別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離操作を行い、糖鎖ペプチドを含む沈殿物と溶液部分とを分けた。その後、溶液部分を除去した後、得られた沈殿物をｐＨ６．８の５０ｍＭジチオスレイトール溶液バッファー（５０ｍＭ  ジチオスレイトール溶液、６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させ、一晩反応させた。目的物をＨＰＬＣで確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、１３残基の糖鎖ペプチド１８．２ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１６９Ｈ２６０Ｎ２６Ｏ７８Ｓ：  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １３１２．２，  ｆｏｕｎｄ．１３１３．０【０４１６】
このようにして調製した１８残基のＣ末端がベンジルチオエステルペプチド（９．３ｍｇ）と１３残基の糖鎖ペプチド（１８．２ｍｇ）の二種類を同じ遠沈管にいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（０．１５ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、室温にてチオフェノール（１５．４μｌ）を加え、３７℃で反応を行った。２４時間後、反応溶液をそのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、３１残基の糖鎖ペプチド９．２ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５０Ｈ３７７Ｎ４７Ｏ１０９Ｓ：  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １４５４．４，  ｆｏｕｎｄ．１４５５．０【０４１７】
得られた糖鎖ペプチド（９．２ｍｇ）を遠沈管に入れ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（３５ｍＭＴＣＥＰ液、６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた。この反応溶液を室温にて、活性化したラネーニッケルを加え、７２時間後、反応終了をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液をメンブレンフィルターで濾過し、目的とする糖鎖ペプチドを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製し、３１残基の糖鎖ペプチド１．３ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２５０Ｈ３７７Ｎ４７Ｏ１０９：  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １４４６．４，  ｆｏｕｎｄ．１４４７．２【０４１８】
このようにして得られた３１残基の糖鎖ペプチド１．３ｍｇをエッペンチューブにいれ、蒸留水（２５μｌ）で溶解させた後、室温にて１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（２５μｌ）を加えた。３０分後、ＨＰＬＣにて目的物の生成を確認した後、０℃に冷却し、５０ｍＭ酢酸水溶液（５０μｌ）を加え中和操作を行い、その後、ＨＰＬＣ［カラム：Vydac column  (C18 5μm)、φ4.6 x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  7.0ml/min、；B液２５→４５%（１５min）→６０％（１０min）→９５％（１０min）、linear gradient］にて精製を行い、目的とするGLP-1の３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（30Asn GLP-1-disialo）０．３ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２３６Ｈ３６５Ｎ４７Ｏ１０９：  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １４０１．４，  ｆｏｕｎｄ．１４０２．１【０４１９】
実施例４７  ３６位Ａｓｎ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
実施例４２で合成した36 Asn GLP-1-asialo（０．８ｍｇ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，２００μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加えた。これに、ＣＭＰ−シアル酸（５ｍｇ）、Alkaline phosphatase（１μｌ）を加え均一化し、最後に、α2,６-Sialyltransferase（ＪＴ社製、１０ｍＵ）を加え３０℃で２４時間反応させた。（ＨＰＬＣ反応モニター条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０mm、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡ  アセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６０／４０→３０／６０  ４０分  流速０．７ｍｌ／分）図４にＨＰＬＣチャートの１例を示す。図中、手前のピークが原料である36Asn GLP-1-asialo、後ろのピークが36 Asn
GLP-1-disialoである。ＨＰＬＣ同条件にて精製し、GLP-1の３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖Ａｓｎで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（36Asn GLP-1-disialo）が０．６ｍｇ得られた。【０４２０】
実施例４８  ２６位−３４位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加GLP-1ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０４２１】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０４２２】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基のペプチドを得た（配列番号１０１）。【０４２３】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２６位及び３４位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０４２４】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１０．５ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、２１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の２６及び３４位のＬｙｓが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（26-34Cys GLP-1-disialo）を０．１ｍｇ得た。【０４２５】
実施例４９  １８位−３６位Ｃｙｓ-ジシアロ糖鎖付加 GLP-1の合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０４２６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０４２７】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０４２８】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号１０２）。【０４２９】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18 5μm)、φ２０ x２５０mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  8.0ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。【０４３０】
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１０．５ｍｇ
と上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、２１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO UG-120 (C18,  5μm)、φ4.6x250mm、グラジエント：A液:0.1%TFA水、B液:0.09%TFA/10%水/90%AN  0.7ml/min、；B液35→60% 20min linear gradient］で精製し、GLP-1の１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加GLP-1ペプチド（18-36Cys GLP-1-disialo）を０．８ｍｇ得た。【０４３１】
以下の表７は、実施例８〜４９で得られた糖鎖付加GLP-1ペプチドのＭＳスペクトルデータである。表中、[M+H]+は、MALDI-TOF massで、[M+3H]3+及び[M+4H]4+は、EMI-MSで測定した結果を示す。【０４３２】
【表７】
2008155900.tif 000018
【０４３３】
試験例１（血漿中における安定性）
実施例７又は比較例１で製造したペプチド０．１ｍｇをエッペンチューブにいれ、全量０．１１４ｍｌになるようにＰＢＳ（０．０８ｍｌ、全体量の７０％）、及び血漿（０．０３４ｍｌ、全体量の３０％）を順次いれ、３７℃で反応させた。
血漿を反応容器に加えた時間を０分とし、１０、３０、６０、１８０、３６０、７２０及び１４４０分に、反応溶液から０．０１ｍｌを取り出すことによりサンプリングを行った。【０４３４】
サンプリングした反応溶液を、あらかじめエッペンチューブに用意した１０％トリフルオロ酢酸溶液０．０２ｍｌと混和させた後、遠心分離を行い、その混和溶液の上澄み分より０．０２５ｍｌをＨＰＬＣにインジェクションし、反応溶液の組成を分析した（反応モニタリング条件：ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８，ＵＧ１２０，２５０×４．６ｍｍ，展開溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０.１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５：９５  １５分  流速０．７ｍｌ／ｍｉｎ）。結果を図５（実施例７）及び図６（比較例１）に示す。【０４３５】
図５において、１３．３分付近に、糖鎖付加GLP-1ペプチドのピークが認められる。図５に示されるように、血漿添加後２４時間（１４４０分）後まで、実施例７の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、そのほとんどが残存していた。
一方、図６において、１６〜１６．５分の間のピークは、分解されていないGLP-1を示し、１７．５〜１８分の間のピークは、７位及び８位のＨｉｓ−Ａｌａが脱離したGLP-1フラグメント（９−３６）を示す。図６に示されるように、糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1は、血漿添加後１８０分までにそのほとんどが分解された。【０４３６】
試験例２（db/dbマウスにおける血糖値低下作用１）
実施例１〜５又は比較例１で製造したペプチドを、８週齢の雄、２型糖尿病モデルマウス（BKS.Cg-+
Leprdb / Leprdb / Jcl*）に全量８ｍｌ/ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗａｉｇｈｔ（サンプル濃度９ｎｍｏｌ/ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗａｉｇｈｔ）になるように、投与サンプル同一のものをモデルマウス３匹それぞれに腹腔内投与した。すなわち、該ペプチドのＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）を、BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/Jclマウス（８週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。投与後、０、３０、６０、９０、１２０、１８０分後に眼底採血法により０．０３ｍｌ採血を行い、得られた血液を全量０．３ｍｌになるようにＰＢＳで希釈、その溶液を遠心分離操作し血漿成分と血球成分に分離した。その後、血漿成分のみを別途用意したエッペンチューブに移し替え、冷蔵保存した。血漿中のグルコース濃度を、吸光光度計を利用したグルコースＣＩＩ―テストワコーを用いて測定した。統計学的処理を行い結果を得た。結果を図７に示す。【０４３７】
図７に示されるように、糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1は、血糖値をほとんど低下させなかった。これに対し、実施例１〜５の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、いずれも血糖値を有意に低下させ、かつその効果は、１２０分後も持続した。【０４３８】
試験例３（db/dbマウスにおける血糖値低下作用２）
実施例５又は比較例１で製造したペプチドを、８週齢の雄、２型糖尿病モデルマウス（BKS.Cg-+
Leprdb / Leprdb / Jcl*）に全量８ｍｌ/ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗａｉｇｈｔ（サンプル濃度（ｂｏｄｙ  ｗａｉｇｈｔ）：０．９ｎｍｏｌ/ｋｇ、９ｎｍｏｌ/ｋｇ、９０ｎｍｏｌ/ｋｇ、９００ｎｍｏｌ/ｋｇ）になるように、投与サンプル同一のものをモデルマウス３匹それぞれに腹腔内投与した。すなわち、該ペプチドのＰＢＳ溶液（それぞれ０．９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ、９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ、９０ｎｍｏｌ／１０ｍｌ、９００ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）を、BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/Jclマウス（８週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。サンプル投与の、０、３０、６０、９０及び１２０分後に眼底採血法により０．０３ｍｌ採血を行い、得られた血液を全量０．３ｍｌになるようにＰＢＳで希釈、その溶液を遠心分離操作し血漿成分と血球成分に分離した。その後、血漿成分のみを別途用意したエッペンチューブに移し替え冷蔵保存した。血漿中のグルコース濃度を、吸光光度計を利用したグルコースＣＩＩ―テストワコーを用いて測定した。統計学的処理を行い結果を得た。結果を図８に示す。【０４３９】
図８の結果から、糖鎖付加GLP-1ペプチドが、GLP-1の投与量を９００ｎｍｏｌ／ｋｇにしたときに比し、１／１００の投与量でも優れた血糖値低下作用を示すことが分かる。【０４４０】
試験例４  （ジペプチジルペプチダーゼＩＶ （DPP-IV）に対する耐性試験１）
０．５ｍｌのエッペンチューブ中に実施例１〜５、１３〜２３、２５、２７、３１、３４、３６、４８若しくは４９で製造した糖鎖付加GLP-1ペプチド又は比較例１で製造したGLP-1１７．７ｎｍｏｌとDPP-IV（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ、ＳＩＧＭＡ社製）２．２ｍＵとを加え、それぞれ１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で全量１００μｌになるように調製し、３７℃で反応させた。反応液１０μｌを、あらかじめ別のエッペンチューブに用意した１０％トリフルオロ酢酸１５μｌと混和させ、ＨＰＬＣに２０μｌインジェクションし、原料の消失をモニターした（ＨＰＬＣ条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ
ＣＡＰＣＥＬＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０mm、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡ
アセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６５／３０→３０／６０ ２０分 流速０．７ｍｌ／分）。【０４４１】
DPP-IVに対する耐性の指標となる半減期（t1/2）を、糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1の半減期（t1/2）を基準（＝１）として、各実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチドについて評価した値を表８に示す。【０４４２】
【表８】
2008155900.tif 000019
【０４４３】
各実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、比較例１のGLP-1のDPP-IV耐性の１．２倍〜１２８倍のDPP-IV耐性を示した。１８，３６位(Cys-ジシアロ) 糖鎖付加GLP-1ペプチドが最大の耐性を示し、次いで１２位(Cys-ジシアロ)、２６，３４位(Cys-ジシアロ)、２８位(Cys-ジシアロ)、１４位(Cys-ジシアロ)、２６位(Cys-ジシアロ)、２６位(Cys-アシアロ)、３２位(Cys-ジシアロ)、２５位(Cys-ジシアロ)、２２位(Cys-ジシアロ)、２４位(Cys-ジシアロ)、３４位(Cys-ジシアロ)、２０位(Cys-ジシアロ)、３０位(Cys-ジシアロ)、２７位(Cys-ジシアロ)、３４位(Cys-アシアロ)、３４位(Cys-ジグルクナック)、３８位(Cys-ジシアロ)、３６位(Cys-ジシアロ)、３４位(Cys-ジマンノース)、１８位(Cys-ジシアロ)、１８位(Asn-アシアロ)、１６位(Cys-ジシアロ)の順で大きなDPP-IV耐性を示した。【０４４４】
実施例３、２３及び４８又は実施例１、４及び４９の糖鎖付加GLP-1ペプチドのDPP-IV耐性の比較から、糖鎖付加GLP-1ペプチドにおいて、２本以上の糖鎖付加を行うことにより、１本の糖鎖付加を行った場合と比べて、DPP-IV耐性増大について、相乗効果が生じることが示された。
糖鎖構造に関しては、ジシアロ糖鎖＞アシアロ糖鎖＞ジグルクナック糖鎖＞ジマンノース糖鎖の順に、付加した糖鎖付加GLP-1ペプチドが高いDPP-IV耐性を示した。【０４４５】
試験例５  （ジペプチジルペプチダーゼＩＶ （DPP-IV）に対する耐性試験２）
０．５ｍｌのエッペンチューブ中に実施例１０〜１３のいずれかで製造した糖鎖付加GLP-1ペプチド１７．７ｎｍｏｌとDPP-IV（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ、ＳＩＧＭＡ社製）２２ｍＵとを加え、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で全量１００μｌになるように調製し、３７℃で反応させた。反応液１０μｌを、あらかじめ別のエッペンチューブに用意した１０％トリフルオロ酢酸１５μｌと混和させ、ＨＰＬＣに２０μｌインジェクションし、原料の消失をモニターした（ＨＰＬＣ条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ
ＣＡＰＣＥＬＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０mm、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡ
アセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６５／３０→３０／６０ ２０分 流速０．７ｍｌ／分）。【０４４６】
DPP-IVに対する耐性の指標となる半減期（t1/2）を、実施例１３の糖鎖付加GLP-1ペプチドの半減期（t1/2）を基準（＝１）として、実施例１０〜１２の糖鎖付加GLP-1ペプチドについて評価した値を表９に示す。【０４４７】
【表９】
2008155900.tif 000020
【０４４８】
試験例４において、実施例１３の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1と比較して、約３４倍のDPP-IV耐性を示した。この実施例１３の糖鎖付加GLP-1ペプチド（１２位(Cys-ジシアロ)）と比較して、実施例１０〜１２の糖鎖付加GLP-1ペプチドは、１．１倍〜１７．２倍のDPP-IV耐性を示した。９位(Cys-ジシアロ)が最大の耐性を示し、次いで１０位(Cys-ジシアロ)、１１位(Cys-ジシアロ)、１２位(Cys-ジシアロ)と、GLP-1のＮ末端に近い部位にの順で増大したDPP-IV耐性を示した。なお、DPP-IVに対する反応部位はGLP-1のN末端に存在することが知られている部位に糖鎖を付加したものほど、高いDPP-IV耐性を示した。【０４４９】
試験例６  （cAMP合成能試験）
１．  マウスGLP-1受容体発現ベクターの構築
マウスGLP-1受容体ｃＤＮＡの５’末端と３’末端に結合するマウスGLP-1受容体センスプライマー（5’-GTTGCTAGCGCCACCATGGCCAGCACCCCAAGCCT-3’）（配列番号１５２）及びマウスGLP-1受容体アンチセンスプライマー（5’-CCTGAATTCTCAGCTGTAGGAACTCTGGCAG-3’）（配列番号１５３）をそれぞれ合成し、ｃＤＮＡ（Clone ID:40046534、Open Biosystems社）を鋳型としてExTaq polymerase（TaKaRa社）を用いてＰＣＲを行なった。すなわち、テンプレートｃＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）１μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μＬ、プライマー混合液（各５０μＭ）１μＬ、×１０  Ex Taq polymerase Buffer  ５μＬ、Ex Taq
polymerase  ０．２５μＬ及び滅菌水３８．７５μＬからなる合計５０μＬの反応液を用い、９４℃  １分；９４℃  ４５秒、５５℃  １分、７２℃  ２分（３５サイクル）；７２℃  １０分で反応させた。ＰＣＲ反応産物は１％アガロースゲル電気泳動後、ｃＤＮＡ断片をWizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社）を用いて精製し、さらに制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＮheＩ）処理を行ない、マウスGLP-1受容体ｃＤＮＡを得た。【０４５０】
マウスGLP-1受容体高発現細胞の効率的取得のため、発現ベクターとしてpIRES-gfpベクターを用いた。本ベクターはpIRESpuro2（Clontech社）の制限酵素処理（Ｓａｌ  Ｉ、ＢａｍＨＩ）により得られたIRES遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターpEGFP-N1（Clontech社）に挿入することにより作製した。
マウスGLP-1受容体ｃＤＮＡ断片をpIRES-gfpに挿入することによりマウスGLP-1受容体発現ベクターmGLP-1R/pIRES-gfpを得た。得られたベクターはABI3100-Avant（Applied Biosystems社）を用いてＤＮＡ塩基配列の確認を行った。【０４５１】
２．  マウスGLP-1受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の作製
得られたmGLP-1R /pIRES-gfpは、FuGENE（登録商標）（Roche社）を用い、取扱説明書に従ってＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号CCL-61）に遺伝子導入した。遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は１０％ＦＣＳ（Hyclone社）、ペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA社）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬社）にて培養し、さらにＧ４１８（和光純薬工業株式会社）1.0ｍｇ／ｍｌを添加して薬剤選択を行なった。薬剤耐性を獲得した細胞はセルソーター（EPICS
ALTRA、Beckman Coulter社）を用いてＧＦＰ発現量を指標にソーティングを行った。ソーティング後の細胞は限界希釈を行い、ＧＦＰ高発現細胞、すなわちマウスGLP-1受容体を高発現する細胞を得た。得られた細胞をマウスGLP-1受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞として下記実験に使用した。【０４５２】
３．  糖鎖付加GLP-1ペプチドのアゴニスト作用（cAMP合成能）解析
上記２で作製したマウスGLP-1受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて、糖鎖付加GLP-1ペプチドのアゴニスト作用をcAMP合成能を指標に評価した。
マウスGLP-1受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０５個／ｍｌの濃度になるよう懸濁した。細胞懸濁液は１００μＬずつ平底９６穴プレート（Falcon社）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて１６時間培養した。培養上清を捨て、２．５ｍＭグルコース含有Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒにて溶解した糖鎖付加GLP-1ペプチドを１００μＬ／ウェルずつ添加、３７℃にて３０分培養し、速やかに培養上清を捨てた。マウスGLP-1受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で合成されたcAMP量はcAMP  ＥＬＩＳＡキット（GEヘルスケアバイオサイエンス社あるいはCayman社）を用いて測定し、糖鎖付加GLP-1ペプチドのマウスGLP-1受容体に対するアゴニスト作用の指標とした。【０４５３】
GLP-1はGLP-1受容体と結合することにより細胞内cAMP濃度を上昇させ、インシュリン分泌を促進させる。そこで糖鎖付加GLP-1ペプチドの活性を、cAMP合成能を指標に評価した。マウスGLP-1受容体発現ＣＨＯ-K1細胞を糖鎖付加GLP-1ペプチドで刺激し、細胞内で合成されるcAMP量を測定した。糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1のＥＣ５０値を１とした場合の実施例１〜５、８〜２３、２５、２７の糖鎖付加GLP-1ペプチドの相対活性を、表１０に示す。【０４５４】
【表１０】
2008155900.tif 000021
【０４５５】
糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1と同等以上の活性を示す実施例の糖鎖付加GLP-1ペプチドとして22Cys GLP-1-disialo, 26Cys
GLP-1-asialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-asialo,  36Cys GLP-1-disialo, 38Cys GLP-1-disialoが、見出された。22, 26,  30, 34, 36, 38位（＝37位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）のアミノ酸が糖鎖付加に適した位置であると考えられた。【０４５６】
試験例７  経口耐糖能試験（OGTT: Oral Glucose
Tolerance Test）
実施例１〜５、９、１０、１３、１６、２１、２３〜２７、２９〜３４、３８、４５、４８若しくは４９で製造した糖鎖付加GLP-1ペプチド又は比較例１で製造したGLP-1のＰＢＳ溶液を、一晩絶食させたC57BL/6JJclマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。３０分後にグルコース溶液を１ｍｇ／ｇの投与量で経口投与した。グルコース投与前、グルコース投与３０分後、６０分後、１２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロッシュダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。【０４５７】
試験例７−１（各種糖鎖付加GLP-1ペプチドのOGTT）
一晩絶食させた上記マウスにグルコース溶液を経口投与後、経時的に採血し血糖値を測定した。グルコース投与によりマウス血糖値は上昇し、投与後３０分に最大となり、その後徐々に減少する。グルコース投与３０分前に、各実施例で製造した糖鎖付加GLP-1ペプチド（8Cys GLP-1-disialo、9Cys GLP-1-disialo、12Cys GLP-1-disialo、18Cys GLP-1-disialo、20Cys GLP-1-disialo、22Cys GLP-1-disialo、26Cys GLP-1-disialo、26Cys GLP-1-asialo、30Cys GLP-1-disialo、34Cys GLP-1-disialo、34Cys GLP-1-asialo、36Cys GLP-1-disialo、38Cys GLP-1-disialo）又は比較例１で製造したGLP-1をそれぞれ９ｎｍｏl／ｋｇの投与量で腹腔内に投与し血糖値上昇抑制作用を比較した。結果を図９〜１１に示す。【０４５８】
糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1は血中安定性が低く、投与後、速やかに分解されるため、血糖値上昇抑制作用は小さい。
これに対し、糖鎖付加GLP-1ペプチドである18Cys GLP-1-disialo、20Cys GLP-1-disialo、22Cys GLP-1-disialo、26Cys GLP-1-disialo、26Cys GLP-1-asialo、30Cys GLP-1-disialo、34Cys GLP-1-disialo、34Cys GLP-1-asialo、36Cys GLP-1-disialo、38Cys GLP-1-disialoは強い血糖値上昇抑制作用を示した。【０４５９】
試験例７−２（糖鎖付加GLP-1ペプチドのOGTTにおける糖鎖構造の影響）
11糖（ジシアロ糖鎖）、9糖（アシアロ糖鎖）、7糖(ジグルクナック糖鎖)又は5糖（ジマンノース糖鎖）を付加した糖鎖付加GLP-1ペプチド（22Cys GLP-1-disialo、22Cys GLP-1-asialo、22Cys GLP-1-diGlcNAc、22Cys GLP-1-dimannose、30Cys GLP-1-disialo、30Cys GLP-1-asialo、30Cys GLP-1-diGlcNAc、30Cys GLP-1-dimannose、34Cys GLP-1-disialo、34Cys GLP-1-asialo、34Cys GLP-1-diGlcNAc、34Cys GLP-1-dimannose）又は比較例１で製造したGLP-1をそれぞれ９ｎｍｏl／ｋｇの投与量で腹腔内に投与し、糖鎖構造-活性相関をマウスOGTTで検討した。結果を図１２〜１４に示す。【０４６０】
２２位、３０位、３４位いずれの付加部位においても、最も強い血糖値上昇抑制作用を示したのは最も大きい11糖（ジシアロ糖鎖）を付加した糖鎖付加GLP-1ペプチドであった。血糖値上昇抑制活性は、11糖≧9糖≧7糖≧5糖の順で高かった。【０４６１】
試験例７−３（糖鎖付加GLP-1ペプチドのOGTTにおける投与量の影響）
高活性糖鎖付加GLP-1ペプチドの順位付けを目的として、26Cys GLP-1-disialo、30Cys GLP-1-disialo、34Cys GLP-1-disialo、36Cys GLP-1-disialoについて投与量をそれぞれ１／１０（０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ）又は１／１００（０．０９ｎｍｏｌ／ｋｇ）としたマウスOGTTを実施した。結果を図１５〜１８に示す。図１５〜１８中、GLP-1については、試験例７−２で得た、９ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量でのOGTTの結果を示す。【０４６２】
26Cys GLP-1-disialo、30Cys GLP-1-disialo、34Cys GLP-1-disialo、36Cys GLP-1-disialoいずれの糖鎖付加GLP-1ペプチドも投与量依存的な血糖値上昇抑制活性を示した。０．９ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で血糖値上昇を最も強く抑制したのは30Cys GLP-1-disialoおよび36Cys GLP-1-disialoであり、ほぼ完全に血糖値上昇を抑制していた。
また、投与量０．０９ｎｍｏｌ／ｋｇの36Cys GLP-1-disialo の血糖値上昇抑制活性は、投与量９ｎｍｏｌ／ｋｇのGLP-1の活性と同等であることから、36Cys GLP-1-disialo の活性はGLP-1に比べ約１００倍増大したと考えられた。同様に、投与量０．０９ｎｍｏｌ／ｋｇの30Cys  GLP-1-disialoの血糖値上昇抑制活性は同投与量の36Cys
GLP-1-disialo の活性よりも弱いことから、30Cys GLP-1-disialo の活性はGLP-1の１０倍〜１００倍以下であると考えられた。投与量０．９ｎｍｏｌ／ｋｇにおける26Cys
GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialoの薬効は同投与量の30Cys
GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialoの血糖上昇抑制活性の1/2程度であったことから26Cys GLP-1-disialo, 34Cys  GLP-1-disialoの活性はGLP-1の５倍〜５０倍程度であると考えられた。上記のOGTTにおいて高い活性を示した糖鎖付加部位は３０位および３６位であった。【０４６３】
試験例７−４（Ａｓｎ糖鎖付加GLP-1ペプチドのOGTT）
GLP-1の２２位又は３０位のアミノ酸を、糖鎖付加Asn（天然結合型糖鎖）又は糖鎖付加Cysで置換した、糖鎖付加GLP-1ペプチドについて、投与量０．９ｎｍｏｌ／ｋｇにおける活性をマウスＯＧＴＴで比較した。結果を図１９に示す。図１９中、GLP-1については、試験例７−２で得た、９ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量でのOGTTの結果を示す。【０４６４】
２２位に９糖（アシアロ糖鎖）を付加した場合、３０位に１１糖（ジシアロ糖鎖）を付加した場合共に、糖鎖付加Ａｓｎと糖鎖付加Ｃｙｓとの間で糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用に違いは無く、いずれの糖鎖付加アミノ酸を付加した場合でも糖鎖付加GLP-1ペプチドは活性を示した。【０４６５】
試験例７−５（糖鎖付加GLP-1ペプチドのOGTTにおける、糖鎖付加数の影響）
２本の糖鎖を付加した実施例４８及び４９の糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値上昇抑制作用について、マウスOGTTを用いて評価した。投与量９ｎｍｏｌ／ｋｇにおける26,34Cys  GLP-1-disialo及び18,36Cys GLP-1-disialoのOGTTの結果を図２０に示す。図２０中、GLP-1については、試験例７−２で得た、９ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量でのOGTTの結果を示す。【０４６６】
投与量９ｎｍｏＬ／ｋｇの18,36Cys GLP-1-disialoの作用は、図５、１４における36Cys GLP-1-disialoとほぼ同等であった。投与量９ｎｍｏｌ／ｋｇの26,34Cys  GLP-1-disialoの血糖値上昇抑制活性は、同投与量のGLP-1と比較して、若干改善していた。【０４６７】
次に18,36Cys GLP-1-disialoについて、投与量を１／１０（０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ）としてOGTTを行った。同様に、投与量９ｎｍｏｌ／ｋｇのGLP-1についてOGTTを行い、18,36Cys GLP-1-disialoと比較した。結果を図２１に示す。【０４６８】
投与量０．９ｎｍｏｌ／ｋｇの18,36Cys GLP-1-disialoの血糖値低下作用は投与量９ｎｍｏｌ／ｋｇのGLP-1とほぼ同等であった。18,36Cys GLP-1-disialoの血糖値上昇抑制活性はGLP-1に比べ１０倍程度増大していると考えられた。【０４６９】
試験例８  （糖尿病モデルマウスにおける糖鎖付加GLP-1ペプチドの血糖値低下作用）
実施例２、３、４、２１若しくは２３で製造した糖鎖付加GLP-1ペプチド又は比較例１で製造したGLP-1のＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）を、BKS.Cg-+ Leprdb/+Leprdb/Jclマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。化合物投与前、３０分後、６０分後、１２０分、１８０分、３００分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロッシュダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。【０４７０】
糖尿病モデルマウスである、db/db（BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/Jcl）マウスは摂食抑制／エネルギー代謝亢進ホルモンであるレプチンの受容体に変異が生じたマウスで、肥満、高血糖等の症状を発症する。
マウスOGTT（試験例７）で血糖値上昇抑制活性を示した糖鎖付加GLP-1ペプチドのうち、22Cys GLP-1-disialo, 26Cys  GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys
GLP-1-disialoをdb/dbマウスに９ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与し、経時的に血糖値を測定することにより、血糖値低下作用を、糖鎖が付加していない比較例１のGLP-1と比較した。結果を図２２に示す。【０４７１】
GLP-1の血中安定性は低く、投与後、速やかに分解される。このため血糖値低下作用は小さくPBS投与マウスの血糖値と殆ど変わらない。
これに対し、糖鎖付加GLP-1ペプチド（26Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys  GLP-1-disialo）は強い血糖値低下作用を示し、マウスOGTTにおいて血糖値上昇抑制活性を示したものはdb/dbマウスでも血糖値低下作用を示した。（120分における血糖値低下作用：26Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys  GLP-1-disialo≧22Cys GLP-1-disialo）【０４７２】
26Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialoを投与した場合の血糖値はその後徐々に上昇し、経時で若干血糖値低下作用が弱まった。30Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialoを投与した場合の血糖値は300分まで低いレベルを維持していた（300分における血糖値低下作用：30Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo≧22Cys  GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo）。【０４７３】
配列表フリーテキスト
配列番号１は、一般式（１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２は、ＧＬＰ−１（７−３７）である。
配列番号３は、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２である。
配列番号４は、（ａ１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５は、（ａ２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６は、（ａ３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号７は、（ａ４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号８は、（ａ５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号９は、（ａ６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０は、（ａ７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１は、（ａ８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２は、（ａ９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３は、（ａ１０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４は、（ａ１１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１５は、（ａ１２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１６は、（ａ１３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１７は、（ａ１４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１８は、（ａ１５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１９は、（ａ１６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２０は、（ａ１７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。【０４７４】
配列番号２１は、（ａ１８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２２は、（ａ１９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２３は、（ａ２０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２４は、（ａ２１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２５は、（ａ２２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２６は、（ａ２３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２７は、（ａ２４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２８は、（ａ２５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２９は、（ａ２６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３０は、実施例１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号３１は、比較例１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号３２は、実施例６において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号３３は、実施例６において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号３４は、実施例７において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号３５は、実施例７において合成された保護基を有する１９残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号３６は、実施例７において合成された保護基を有する３１残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号３７は、実施例８において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号３８は、実施例９において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号３９は、実施例１０において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４０は、実施例１１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。【０４７５】
配列番号４１は、実施例１２において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４２は、実施例１３において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４３は、実施例１４において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４４は、実施例１５において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４５は、実施例１６において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４６は、実施例１７において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４７は、実施例１８において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４８は、実施例１９において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号４９は、実施例２０において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５０は、実施例２１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５１は、実施例２２において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５２は、実施例２３において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５３は、実施例２４において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５４は、実施例２５において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５５は、実施例２６において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５６は、実施例２７において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５７は、実施例２８において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５８は、実施例２９において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号５９は、実施例３０において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号６０は、実施例３１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。【０４７６】
配列番号６１は、実施例３２において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号６２は、実施例３３において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号６３は、実施例３４において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号６４は、実施例３５において合成された保護基を有する１２残基ペプチドである。
配列番号６５は、実施例３５において合成された保護基を有する１３残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号６６は、実施例３５において合成された保護基を有する１８残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号６７は、実施例３５において合成された保護基を有する１８残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号６８は、実施例３５において合成された脱離基を有する１８残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号６９は、実施例３５において合成された保護基を有する１３残基ペプチドである。
配列番号７０は、実施例３５において合成された１３残基ペプチドである。
配列番号７１は、実施例３６において合成された保護基を有する１９残基ペプチドである。
配列番号７２は、実施例３６において合成された保護基を有する２０残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号７３は、実施例３６において合成された保護基を有する３１残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号７４は、実施例３７において合成された保護基を有する１５残基ペプチドである。
配列番号７５は、実施例３７において合成された保護基を有する１６残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号７６は、実施例３７において合成された保護基を有する３１残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号７７は、実施例３８において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号７８は、実施例３８において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号７９は、実施例３８において合成された脱離基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号８０は、実施例３８において合成された保護基を有する１１残基ペプチドである。【０４７７】
配列番号８１は、実施例３８において合成された保護基を有する１３残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号８２は、実施例３９において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号８３は、実施例３９において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号８４は、実施例３９において合成された脱離基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号８５は、実施例３９において合成された保護基を有する１０残基ペプチドである。
配列番号８６は、実施例３９において合成された保護基を有する１３残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号８７は、実施例４０において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号８８は、実施例４０において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号８９は、実施例４０において合成された脱離基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号９０は、実施例４０において合成された保護基を有する９残基ペプチドである。
配列番号９１は、実施例４０において合成された保護基を有する１３残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号９２は、実施例４１において合成された保護基を有する７残基ペプチドである。
配列番号９３は、実施例４１において合成された保護基を有する８残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号９４は、実施例４１において合成された保護基を有する３１残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号９５は、実施例４２において合成された保護基を有する３１残基糖鎖付加ペプチドである。
配列番号９６は、実施例４６において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号９７は、実施例４６において合成された保護基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号９８は、実施例４６において合成された脱離基を有する１８残基ペプチドである。
配列番号９９は、実施例４６において合成された保護基を有する７残基ペプチドである。
配列番号１００は、実施例４６において合成された保護基を有する１３残基糖鎖付加ペプチドである。【０４７８】
配列番号１０１は、実施例４８において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号１０２は、実施例４９において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号１０３は、（ｂ１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０４は、（ｂ２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０５は、（ｂ３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０６は、（ｂ４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０７は、（ｂ５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０８は、（ｂ６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０９は、（ｂ７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１０は、（ｂ８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１１は、（ｂ９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１２は、（ｂ１０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１３は、（ｂ１１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１４は、（ｂ１２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１５は、（ｂ１３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１６は、（ｂ１４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１７は、（ｂ１５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１８は、（ｂ１６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１９は、（ｂ１７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２０は、（ｂ１８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。【０４７９】
配列番号１２１は、（ｂ１９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２２は、（ｂ２０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２３は、（ｂ２１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２４は、（ｂ２２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２５は、（ｂ２３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２６は、（ｂ２４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２７は、（ｂ２５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２８は、（ｂ２６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２９は、（ｂ２７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３０は、（ｂ２８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３１は、（ｂ２９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３２は、（ｂ３０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３３は、（ｂ３１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３４は、（ｂ３２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３５は、（ｂ３３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３６は、（ｂ３４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３７は、（ｂ３５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３８は、（ｂ３６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３９は、（ｂ３７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４０は、（ｂ３８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。【０４８０】
配列番号１４１は、（ｂ３９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４２は、（ｂ４０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４３は、（ｂ４１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４４は、（ｂ４２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４５は、（ｂ４３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４６は、（ｂ４４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４７は、（ｂ４５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４８は、（ｂ４６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４９は、（ｂ４７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１５０は、（ｂ４８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１５１は、（ｂ４９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１５２は、試験例６において合成された４５残基のマウスＧＬＰ−１受容体センスプライマーである。
配列番号１５３は、試験例６において合成された４１残基のマウスＧＬＰ−１受容体アンチセンスプライマーである。
【産業上の利用可能性】
【０４８１】
本発明は、GLP-1と比べて、血中安定性が増大し、好ましくは、血糖値抑制活性の増大した、糖鎖付加GLP-1ペプチドを提供する。本発明は、特に医薬品の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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