【手続補正書】
【提出日】平成16年8月19日(2004.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法であって、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入することを含み、ここで、最終的に得られた分化・誘導された細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導方法。
【請求項２】
骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経前駆細胞を得る方法であって、以下のステップ：
（１）骨髄から骨髄間質細胞を単離し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地          中で上記細胞を培養し；及び
（２）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子          を導入し、そしてさらに培養して神経前駆細胞を得る；
を含む、前記分化・誘導方法。
【請求項３】
前記の単離された骨髄間質細胞がヒト細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の方法により製造された神経前駆細胞。
【請求項５】
神経前駆細胞マーカー、ＧＬＡＳＴ、３ＰＧＤＨ、及びネスチンを発現する神経前駆細胞。
【請求項６】
骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経細胞に分化・誘導する方法であって、以下のステップ：
（１）骨髄から骨髄間質細胞を単離し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地          中で上記細胞を培養し；
（２）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子          を導入し、そしてさらに培養し；及び
（３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／          又は細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養して神          経細胞を得る；
を含み、ここで、最終的に得られた分化・誘導された細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導方法。
【請求項７】
前記標準的な基礎培地がイーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血清がウシ胎児血清である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｎｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入が、哺乳動物発現ベクターを用いたリポフェクションによる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（２）と（３）の間に、前記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行うステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞分化生存作用性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞分化生存作用性因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記の単離された骨髄間質細胞がヒト細胞である、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法により製造された神経細胞。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法により製造された神経細胞。
【請求項１８】
神経細胞マーカー、３型β−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ３）、及びＴｕＪ−１を発現する神経細胞。
【請求項１９】
骨髄間質細胞をインビトロにおいてドーパミン作動性ニューロンに分化・誘導する方法であって、以下のステップ：
（１）骨髄から骨髄間質細胞を単離し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地          中で上記細胞を培養し；
（２）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子          を導入し、そしてさらに培養し；
（３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／          又は細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養して神          経細胞を得；
（４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標準的な基礎培地に血清を加え          た培地中で培養し；及び
（５）グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐ          ｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））、及びサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤          又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上記グリア由来神経栄養因子以          外の細胞分化生存作用性因子を、上記培養液に添加し、そしてさらに培養して          、ドーパミン作動性ニューロンを得る；
を含み、ここで、最終的に得られた分化・誘導されたドーパミン作動性ニューロンが、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導方法。
【請求項２０】
前記ステップ（４）における標準的な基礎培地が、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地である、請求項１９に記載の分化・誘導方法。
【請求項２１】
前記ステップ（４）における血清はウシ胎児血清である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（５）における、グリア由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（５）におけるグリア由来神経栄養因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（５）におけるグリア由来神経栄養因子の濃度が、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（５）における、グリア由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記の単離された骨髄間質細胞がヒト細胞である、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法により製造されたドーパミン作動性ニューロン。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法により製造されたドーパミン作動性ニューロン。
【請求項３１】
骨髄間質細胞をインビトロにおいてアセチルコリン作動性ニューロンに分化・誘導する方法であって、以下のステップ：
（１）骨髄から骨髄間質細胞を単離し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地          中で上記細胞を培養し；
（２）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子          を導入し、そしてさらに培養し；
（３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／          又は細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養して神          経細胞を得；
（４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標準的な基礎培地に血清を加え          た培地中で培養し；及び
（５）神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＮＧＦ）、及び          サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又          は上記神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記培養液に添加し、          そしてさらに培養して、アセチルコリン作動性ニューロンを得る；
を含み、ここで、最終的に得られた分化・誘導されたアセチルコリン作動性ニューロンが、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導方法。
【請求項３２】
前記ステップ（４）における標準的な基礎培地が、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（４）における血清がウシ胎児血清である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップ（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ステップ（５）における神経成長因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ステップ（５）における神経成長因子の濃度が、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステップ（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記の単離された骨髄間質細胞がヒト細胞である、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法により製造されたアセチルコリン作動性ニューロン。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法により製造されたアセチルコリン作動性ニューロン。
【請求項４３】
骨髄間質細胞をインビトロにおいて骨格筋細胞に分化・誘導する方法であって、以下のステップ：
（１）骨髄から骨髄間質細胞を単離し、そして標準的な基礎培地に血清を加えた培地          中で上記細胞を培養し；
（２）上記培養液に脱メチル化剤を添加し、そしてさらに培養し；
（３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／          又は細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し；
（４）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子          を導入し、そしてさらに培養し；
（５）上記の遺伝子導入された細胞と、遺伝子導入のされていない無処理の上記骨髄          間質細胞とを共培養し；及び
（６）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログを上記培          養液に添加し、そしてさらに培養して骨格筋細胞を得る；
を含み、ここで、最終的に得られた分化・誘導された細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導方法。
【請求項４４】
前記標準的な基礎培地がイーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記血清がウシ胎児血清である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記脱メチル化剤が５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記５−アザシチジンの濃度が３０ｎｍｏｌ／ｌ〜３００μｍｏｌ／ｌである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ステップ（３）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記ステップ（３）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求項４３に記載方法。
【請求項５０】
前記細胞分化生存作用性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞分化生存作用性因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｎｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入が、哺乳動物発現ベクターを用いたリポフェクションによる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記ステップ（４）と（５）の間に、前記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行うステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
前記の単離された骨髄間質細胞がヒト細胞である、請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の方法により製造された骨格筋細胞。
【請求項５８】
請求項５６に記載の方法により製造された骨格筋細胞。