【手続補正書】
【提出日】平成15年4月24日(2003.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
プラスミドＨＮＴ２３６３（ＩＧＳ４ＢＤＮＡ挿入物を含む）を内包する細胞株を、１００μｇアンピシリン／ＭＬを含むＬＢアガプレート上に再プレーティングした後再クローンしそして両者をインノゲネティクスＮ．Ｖ．株表（ＩＣＣＧ４３４０）および”Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)” （Baarn, The Netherland 、受入番号ＣＢＳ１０２２２２）の両方に寄託した。プラスミドＤＮＡを再クローンした単離物から作製しそして送入物を再配列決定しそしてＩＧＳ４ＢＤＮＡ配列と同一であることを見いだした。
実施例２．ニューロメジンＵによりＣＨＯＧα１６−ＩＧＳ４細胞中に誘導された細胞内カルシウム濃度における特異性変化
実施例２ａ．実験手順：方法および材料
Ａ．ＩＧＳ−４をトランスフェクションしたＣＨＯＧα１６−細胞のための方法および材料
下記の材料を実験に使用した：ＩＧＳ４−ＤＮＡ配列を含むベクター（ＩＧＳ４−ｐｃＤＮＡ３．１）；スーパーフェクト(SuperFect) トランスフェクション試薬(Qiagen)；１０％ＦＣＳを含むナット−ミックス(Nut-Mix) Ｆ１２(Gibco)；０．０２８ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン(Gibco) ；０．２２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン(Gibco) 。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
下記の材料を使用した：ペプチド：ブタニューロメジンＵ２５、ラットニューロメジンＵ−２３、ブタニューロメジンＵ−８(Bachem)；希釈緩衝液：フェノールレッド(Gibco) を含まず２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ(Gibco) および０．１％ＢＳＡ(Sigma) を補足したハンク(Hank’s)ＢＳＳ溶液；プレート：透明、平底、９６ウエルプレート(Costar)。
Ｄ．アッセイ
ＦＬＩＰＲ設定パラメーターを０．４秒の暴露長さ、フィルター１．５０μｌ液体添加、ピペッター高さ１２５μｌ、分配スピード４０μｌ／秒、攪拌なしに設定した。
実施例２ｂ．結果
オーファンＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ＩＧＳ４のための内在性リガンドを同定するために、ＩＧＳ４（ＩＧＳ４ＡおよびＩＧＳ４Ｂの両方の形）をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内に安定にトランスフェクションした。ＩＧＳ４のＧ−タンパク質共役機構は未知であるので、特異性ＣＨＯ−細胞株を使用した。これらのＣＨＯ−細胞はＧ−タンパク質Ｇα１６（ＣＨＯＧα１６、Molecular Devices ）を安定に発現し、これはＧＰＣＲのための「汎用アダプター」として知られるものである（Milligan G., Marshall F. and Rees S. (1996), Gα16 as a universal G protein adapter: implications for agonist screening strategies. TIPS 17: 235-237）。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
得られたＣＨＯＧα１６−ＩＧＳ４細胞を蛍光測定イメージングプレートリーダー(Fluorometric Imaging Plate Reader, FLIPR)を用いて機能的にスクリーニングして、推定ペプチドリガンドに応答する細胞内カルシウムの可動度を測定した。１０ｎＭの濃度で、ニューロメジンＵ−２３は大きく、一時的そして強いカルシウム応答を誘発した。反対に、ＣＨＯＧα１６細胞および他の非関連オーファンＧＰＣＲを発現するＣＨＯＧα１６細胞は、ニューロメジンＵ−２３に応答しなかった。ＩＧＳ４Ｂを用いたこれらの実験の結果を図４に示す。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
ニューロメジンＵによるＩＧＳ４の活性化に続いて見られるカルシウム可動化応答は、この受容体がＧｑ／１１サブファミリーのＧタンパク質に共役することを示唆する。さらに細胞内ｃＡＭＰの基底レベルは、ＣＨＯＧα１６−ＩＧＳ４細胞内のブタニューロメジンＵ−８（１および１０μＭ）により調節されず、この受容体がＧサブファミリー類のＧタンパク質に共役しないことを示唆する（データは記載しない）。
実施例３．ヒト多重組織発現アレイ（ＭＴＥTM）上のＩＧＳ４ハイブリダイゼーション
ヒトＩＧＳ４  ＤＮＡ（ｐＧＥＭＴ−ｈＩＧＳ４Ａからの±７３０ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物〔ＩＣＣＧ＃４３２０〕）を、プライムイット(Prime-It)ＩＩキットTM(Stratagene)を用いて比放射能＞１０9 ｃｐｍ／μｇに〔s ｘ −32Ｐ〕−ｄＣＴＰのランダムプライム組込みを介して放射能標識した。標識したプローブをセファデックス(Sephadex)Ｇ−５０クロマトグラフィーを用いて無標識物から精製し、５分間、９５での変性そしてエクスプレスハイブ(ExpressHyb)ハイブリダイゼーション溶液に最終濃度1 〜１．５ｘ１０6 ｃｐｍ／ｍｌまで加えた。それぞれ供給者の推奨に従って、ヒト多重組織発現（ＭＴＥTM）アレイ(Clontech #7775-1)をプレハイブリダイズしそしてエクスプレスハイブ溶液中、６５℃で３０分間および一晩ハイブリダイズした。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
共通ＩＧＳ４  ｃＤＮＡ配列を生成するように単離された種々のｃＤＮＡクローンの相対位置の図示。使用された５’および３’ＲＡＣＥプライマー（それぞれＩＧＳ４Ｒ＃およびＩＧＳ４Ｆ＃）ならびにＥＳＴ受入番号Ｎ４５４７４の位置も示した。プライマーＩＧＳ４Ｒ６はイントロン１内に位置する。一部のクローン（例えばＨＮＴ２３１１、ＨＮＴ２３１２およびＨＮＴ２３１３）は、部分的にのみ配列決定された（配列決定された部分のみを示す）。ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ  ＡおよびＣＯＮＳＥＮＳＵＳ  Ｂは、それぞれＩＧＳ４対立遺伝子タイプＡおよびＢの共通配列を表す。４個の多型位置のそれぞれで同定されたヌクレオチドは、それぞれのクローンについて示した（影付き四角形）。「Ｓ」は、クローンＨＮＴ２２１１およびＨＮＴ２２１２中の配列未確定を示し、そして「Ｃ」または「Ｔ」のいずれかを意味する。ＩＧＳ４ＡおよびＩＧＳ４Ｂ共通配列のコード領域は、「**」で示す。共通配列の５’末端に幾らかの配列不確定が残っているので、ＩＧＳ４ＡＤＮＡおよびＩＧＳ４ＢＤＮＡ配列は位置８６から末端までのみを取り上げた。
【図２】
ＩＧＳ４  ｃＤＮＡ配列と比較した種々のＤＮＡデータベースエントリーの相対位置の図示。ＩＧＳ４  ｃＤＮＡ配列は、四角形で示す（ＩＧＳ４コーディング配列の位置は黒四角形で示す）。ＩＧＳ４エキソン１〜４の相対位置は、ＩＧＳ４  ｃＤＮＡ配列の上に示す（「＝＝」）。エキソン１〜４をコードするゲノム配列ＡＣ００８５７１の部分は、それぞれＡＣ００８５７１ａ〜ｄで示す。ＡＣ００８５７１配列内のこれらの断片の位置は下記である：ＡＣ００８５７１ａ（ＡＣ００８５７１の逆補体の１３１２９−１３９０８）、ＡＣ００８５７１ｂ（ＡＣ００８５７１の５１６７６−５１７６０）、ＡＣ００８５７１ｃ（ＡＣ００８５７１の逆補体の７９９７８−８０１０３）およびＡＣ００８５７１ｄ（ＡＣ００８５７１の逆補体の８３０６０−８３７２８）。Ｇ０５７２５およびＧ２０６１５はＳＴＳ（配列タグ配列）エントリーであり、一方Ｆ０５１０７、Ｆ０５１０８、Ｆ０７５３１、Ｒ１３３５３、Ｒ１３８９０、Ｈ１１３５９、Ｎ４５４７４、Ｗ６１１６９、ＡＩ４３２３８４、Ｗ６１１３１、ＡＩ０２３５７０、Ｆ０１３５８、Ｆ０３７７０、Ｚ３８１５８、Ｒ４０８６９、Ｒ３７７２５、Ｈ１１３３３はＥＳＴエントリーである。ＩＧＳ４エキソン２を含むゲノムクローンＡＱ０１９４１１およびＡＱ０１５０６５の部分は「：」で示す。ＩＧＳ４  ｃＤＮＡ配列とは全く異なるＥＳＴ配列Ｆ０５１０７、Ｆ０５１０８、Ｆ０７５３１、Ｒ１３３５３、Ｒ１３８９０およびＨ１１３５９の５’部分は、「* 」で示す。ＡＱ０７８５６３はゲノムクローンである。
【図３ａ】
種々のニューロメジンＵアイソフォームによるＩＧＳ４受容体活性化。ＣＨＯＧα１６−ＩＧＳ４Ｂ細胞を９６−ウエルプレート内で一晩培養しそしてＦｌｕｏ−４ＡＭを負荷した。受容体媒介Ｃａ2+は、ＦＬＩＰＲ(Molecular Devices) を用いて測定した。ＣＣＤカメラで検出した蛍光変化の極大を１に正規化しそしてカウントで表した。ニューロメジンＵ−８の結果。
【図３ｂ】
種々のニューロメジンＵアイソフォームによるＩＧＳ４受容体活性化。ＣＨＯＧα１６−ＩＧＳ４Ｂ細胞を９６−ウエルプレート内で一晩培養しそしてＦｌｕｏ−４ＡＭを負荷した。受容体媒介Ｃａ2+は、ＦＬＩＰＲ(Molecular Devices) を用いて測定した。ＣＣＤカメラで検出した蛍光変化の極大を１に正規化しそしてカウントで表した。ニューロメジンＵ−２３の結果。
【図３ｃ】
種々のニューロメジンＵアイソフォームによるＩＧＳ４受容体活性化。ＣＨＯＧα１６−ＩＧＳ４Ｂ細胞を９６−ウエルプレート内で一晩培養しそしてＦｌｕｏ−４ＡＭを負荷した。受容体媒介Ｃａ2+は、ＦＬＩＰＲ(Molecular Devices) を用いて測定した。ＣＣＤカメラで検出した蛍光変化の極大を１に正規化しそしてカウントで表した。ニューロメジンＵ−２５の結果。
【図４】
ＩＧＳ４Ｂを発現するＣＨＯＧα１６−細胞中のニューロメジンＵ−２３誘導細胞内Ｃａ2+可動化。細胞株ＣＨＯＧα１６−ＡＩ、ＣＨＯＧα１６および他のオーファンＧＰＣＲを用いてトランスフェクションされたＣＨＯＧα１６への１０ｎＭニューロメジンＵ−２３の適用。細胞は９６ウエルプレート中で一晩培養しそしてＦｌｕｏ−４ＡＭを負荷した。受容体媒介細胞内Ｃａ2+変化は、ＦＬＩＰＲ(Molecular Devices) を用いて測定し、ＣＣＤカメラで検出したカウントで表した。
【図５】
ヒトＩＧＳ４プローブを用いたヒト多重組織発現アレイ。
【図６】
ＩＧＳ４プローブを用いたノーザンブロット分析。
【図７】
ＩＧＳ４発現分析（ＭＴＥブロット）。
【図８】
脊髄中で観察された発現と比較したＩＧＳ４  ｍＲＮＡの相対発現レベル。非−正規化およびＧＡＰＤＨ正規化発現レベルの両方を示す。