【手続補正書】
【提出日】平成16年6月22日(2004.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】工程：
a)サンプルの第１の生物分子を第２の固定化された生物分子にハイブリダイズさせることにより二本鎖ハイブリッドを形成し;そして
b)RNA：DNAハイブリッドの成分に特異的に結合する検出可能な存在物を使用してRNA：DNAハイブリッドを検出すること
からなる、RNA：DNAハイブリッドを検出するためのマイクロアレイ法。
【請求項２】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体の断片である、請求項１記載の方法。
【請求項４】抗体がモノクローナルである、請求項２及び３記載の方法。
【請求項５】抗体がポリクローナルである、請求項２及び３記載の方法。
【請求項６】第１の生物分子が固定化された第２の生物分子に結合する検出可能に標識された二本鎖ハイブリッドである、請求項１記載方法。
【請求項７】固定化された第２の生物分子がタンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項８】固定化された第２の生物分子が固相に結合した複数の生物分子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】工程：
a)サンプルの第１の生物分子を第２の固定化された生物分子にハイブリダイズさせることにより二本鎖ハイブリッドを形成し;そして
b)サンプルの生物分子の量を測定し;そして
c)RNA：DNAハイブリッドの成分に特異的に結合する検出可能な存在物を使用してRNA：DNAハイブリッドを検出すること
からなる、RNA：DNAハイブリッドを検出するためのマイクロアレイ法。
【請求項１０】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体の断片である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】抗体がモノクローナルである、請求項１０及び１１記載の方法。
【請求項１３】抗体がポリクローナルである、請求項１０及び１１記載の方法。
【請求項１４】第１の生物分子が固定化された第２の生物分子に結合する検出可能に標識された二本鎖ハイブリッドである、請求項９記載方法。
【請求項１５】固定化された第２の生物分子がタンパク質である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】固定化された第２の生物分子が固相に結合した複数の生物分子を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１７】工程：
a)サンプルの第１の生物分子を第２の固定化された生物分子にハイブリダイズさせることにより二本鎖ハイブリッドを形成し;そして
b)逆転写を促進させる条件下で酵素を用いて生物分子の配列を伸長合成し;
c)RNA：DNAハイブリッドの成分に特異的に結合する検出可能な存在物を使用してRNA：DNAハイブリッドを検出すること
からなる、RNA：DNAハイブリッドを検出するためのマイクロアレイ法。
【請求項１８】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体の断片である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】抗体がモノクローナルである、請求項１８及び１９記載の方法。
【請求項２１】抗体がポリクローナルである、請求項１８及び１９記載の方法。
【請求項２２】固定化された生物分子が公知の発現配列タグ(EST)である、請求項１７記載方法。
【請求項２３】固定化された生物分子が少なくとも５-又は６-塩基の全ての可能な核酸配列のユニバーサルアレイである、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】酵素がRNAse H機能を欠く好熱性逆転写酵素である、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】固定化された生物分子が固相に結合した複数の生物分子を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】工程：
a)サンプルの第１の生物分子を、相補な第２の固定化された生物分子にハイブリダイズさせ;そして
b)第２の生物分子を固定化された第３の生物分子にハイブリダイズさせるが、但し二本鎖ハイブリッドが工程a)及びb)の分子を含み;そして
c)RNA：DNAハイブリッドの成分に特異的に結合する検出可能な存在物を使用してRNA：DNAハイブリッドを検出すること
からなる、RNA：DNAハイブリッドを検出するためのマイクロアレイ法。
【請求項２７】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体の断片である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】抗体がモノクローナルである、請求項２７及び２８記載の方法。
【請求項３０】抗体がポリクローナルである、請求項２７及び２８記載の方法。
【請求項３１】工程a)及びb)が同時に起こる、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】工程a)及びb)が逐次的に起こる、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】固定化された生物分子が固相に結合した複数の生物分子を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】第２生物分子が：
a)第１生物分子に相補な領域;及び
b)固定化された第３の生物分子ユニバーサル捕捉用配列に相補な領域に相補な捕捉用配列
を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】固定化された第３の生物分子が：
a)検出可能なように標識された第２の生物分子の共通領域に相補な領域;及び
b)第１生物分子の可変領域に相補な可変領域
を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】第２生物分子が第３相補生物分子の共通領域に結合する標識核酸n-マーである、請求項２６記載の方法。
【請求項３７】標識が検出可能な発色蛍光標識であり、そして分析が２色検出法を利用する、請求項３５及び３６記載の方法。
【請求項３８】第１生物分子が核酸であり、第２生物分子が第１生物分子に相補な核酸であり、そして固定化された第３の生物分子がタンパク質である、請求項２６記載の方法。
【請求項３９】第１生物分子が核酸に予め結合したペプチドであり、固定化第３生物分子であるタンパク質に結合し、但し第１生物分子に予め結合した上記核酸が第２生物分子の核酸に相補である、請求項２６記載の方法。
【請求項４０】第１生物分子が核酸に予め結合したタンパク質であり、固定化第３生物分子であるタンパク質に結合し、但し第１生物分子に予め結合した上記核酸が第２生物分子の核酸に相補である、請求項２６記載の方法。
【請求項４１】工程：
a)第１の生物分子を、標識した第２の生物分子にハイブリダイズさせることにより二本鎖ハイブリッドを形成させ;そして
b)上記標識二本鎖ハイブリッドを固定化された第３の生物分子に結合させ;
そして
c)RNA：DNAハイブリッドの成分に特異的に結合する検出可能な存在物を使用してRNA：DNAハイブリッドを検出すること
からなる、RNA：DNAハイブリッドを検出するための方法。
【請求項４２】
a)生物サンプルの安定化のためのサンプル輸送培地;
b)固相に結合した生物分子;
c)二本鎖ハイブリッド複合体の形成のための相補生物分子;
d)核酸配列を伸長合成する酵素;
e)ハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーションバッファー;
f)あらゆる非ハイブリダイズ核酸配列を除去する洗浄バッファー;及び
g)RNA：DNAハイブリッドの成分に特異的に結合する検出可能な存在物を使用してRNA：DNAハイブリッドを検出する手段
の全て又は一部を含む、RNA：DNAハイブリッド検出キット。
【請求項４３】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体である、請求項４２記載のキット。
【請求項４４】実在物がRNA：DNAハイブリッド特異的抗体の断片である、請求項４２記載のキット。
【請求項４５】抗体がモノクローナルである、請求項４３及び４４記載のキット。
【請求項４６】抗体がポリクローナルである、請求項４３及び４４記載のキット。
【請求項４７】固定化された生物分子が固相に結合した複数の生物分子を含む、請求項４２記載のキット。
【請求項４８】酵素がRNAse H機能を欠く好熱性逆転写酵素である、請求項４２記載のキット。
【請求項４９】  工程：
（a）標的核酸をマイクロアレイに結合している生体分子プローブにハイブリダイズさせ、固定化されたRNA：DNAハイブリッド複合体を形成し；
（b）検出可能なように標識された生体分子プローブを、マイクロアレイに結合している生体分子プローブのハイブリダイズしていない部分にハイブリダイズさせ、固定化されたRNA：DNAハイブリッド複合体を形成し；
（c）固定化されたRNA：DNAハイブリッド複合体を、RNA：DNAハイブリッドおよび該検出可能なように標識された生体分子プローブに対して特異的に反応性である、検出可能な抗体に結合させることにより、該複合体を測定することによって標的核酸を検出し；かつ
（d）複数のサンプル検出部位のそれぞれにおいて、工程（a）〜（c）を繰り返すこと
を含む、複数のサンプル検出部位を有するマイクロアレイ上で、標的核酸を検出または定量するための方法。
【請求項５０】  繰り返す工程が連続的に行われる、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】  繰り返す工程が同時に行われる、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】  工程：
（a）標的核酸の一部を、マイクロアレイに結合している生体分子プローブにハイブリダイズさせ、固定化されたRNA：DNAハイブリッドを形成し；
（b）標的核酸のハイブリダイズしていない部分を、検出可能なように標識された相補的核酸プローブにハイブリダイズさせ、固定化されたRNA：DNAハイブリッド複合体を形成し；
（c）RNA：DNAハイブリッド複合体を、RNA：DNAハイブリッドおよび該検出可能なように標識された生体分子プローブに対して特異的に反応性である検出可能な抗体に結合させることにより、該複合体を測定することによって標的核酸を検出し；かつ
（d）複数のサンプル検出部位のそれぞれにおいて、工程（a）〜（c）を繰り返すこと
を含む、複数のサンプル検出部位を有するマイクロアレイ上で、標的核酸を検出または定量するための方法。
【請求項５３】  繰り返す工程が連続的に行われる、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】  繰り返す工程が同時に行われる、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】  工程：
（a）標的核酸を相補的核酸プローブにハイブリダイズさせ、RNA：DNAハイブリッドを形成し；
（b）標的核酸のハイブリダイズしていない部分を、マイクロアレイに結合している生体分子プローブにハイブリダイズさせ、固定化されたRNA：DNAハイブリッド複合体を形成し；
（c）RNA：DNAハイブリッド複合体を、RNA：DNAハイブリッドおよび該検出可能なように標識された生体分子プローブに対して特異的に反応性である検出可能な抗体に結合させることにより、該複合体を測定することによって標的核酸を検出し；かつ
（d）複数のサンプル検出部位のそれぞれにおいて、工程（a）〜（c）を繰り返すこと
を含む、複数のサンプル検出部位を有するマイクロアレイ上で、標的核酸を検出または定量するための方法。
【請求項５６】  繰り返す工程が連続的に行われる、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】  繰り返す工程が同時に行われる、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】  工程：
（a）標的核酸を試薬により修飾された核酸にハイブリダイズさせることにより、試薬により修飾されたRNA：DNAハイブリッドを形成し；
（b）試薬により修飾されたRNA：DNAハイブリッドを、固体化された試薬結合分子に結合させ；
（c）RNA：DNAハイブリッドに対して特異的に反応性である検出可能な抗体を用いて、固定化されたRNA：DNAハイブリッドを測定することによって標的核酸を検出し；かつ
（d）複数のサンプル検出部位のそれぞれにおいて、工程（a）〜（c）を繰り返すこと
を含む、複数のサンプル検出部位を有するマイクロアレイ上で、標的核酸を検出または定量するための方法。
【請求項５９】  繰り返す工程が連続的に行われる、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】  繰り返す工程が同時に行われる、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】  工程：
（a）標的核酸をマイクロアレイに結合している生体分子プローブにハイブリダイズさせ、RNA：DNAハイブリッドを形成し；
（b）ハイブリダイズしていない、マイクロアレイに結合している生体分子を、検出可能なように標識された生体分子プローブの相補的な領域にハイブリダイズさせ、ここで該ハイブリダイズしていないマイクロアレイに結合している生体分子プローブは、工程（a）のマイクロアレイに結合している生体分子プローブとは異なり；
（c）RNA：DNAハイブリッドおよび検出可能なように標識された生体分子プローブに対して特異的に反応性である検出可能な抗体に、RNA：DNAハイブリッドを結合させることにより、該RNA：DNAハイブリッドを測定することによって標的核酸を検出し；かつ
（d）複数のサンプル検出部位のそれぞれにおいて、工程（a）〜（c）を繰り返すこと
を含む、複数のサンプル検出部位を有するマイクロアレイ上で、標的核酸を検出または定量するための方法。
【請求項６２】  繰り返す工程が連続的に行われる、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】  繰り返す工程が同時に行われる、請求項６１記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
核酸分子(即ち、RNA)検出のためのハイブリダイゼーションアッセイが開発されてきた。例えば、RNAのためのハイブリダイゼーション保護アッセイがGen-Probe Inc.(San Diego, CA)から市販品として入手可能である。ハイブリダイゼーション保護アッセイは、Engleberg, N. C., ASM News 57:183-186(1991), Amold et a1. Clin. Chem. 35:1588-1594 (1989) および米国特許第4,851,330、に記載されているように、アクリジニウム エステルヘ連結された一本鎖核酸プローブを用いる。標的RNA分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、熱加水分解からアクリジニウム エステル結合を保護し、そのため検出された化学発光信号は試料中の標的RNA量に比例する。この保護アッセイの感度はハイブリダイズされていないプローブにより起こされるバックグラウンド発光により制限される。
RNAを検出するための別のアッセイは、逆転写酵素（国際公開公報第99/40224号、公開日：1999年8月12日）を利用する。このアッセイは、関心対象のRNA分子をRNAase Hを欠く逆転写酵素を用いて特異的に逆転写する。国際公開公報第99/40224号に記載されたアッセイは、RNAを検出するための逆転写酵素の使用に限定される。
核酸を検出するための非マイクロアレイ法は一般的である。国際公開公報第99/29909号（公開日：1999年6月17日）は、ウイルス核酸配列、具体的にはB型肝炎ウイルスの検出について記載しており、ここでRNA：DNAハイブリッドはRNA：DNAハイブリッドに対して向けられた抗体によって捕捉される。好ましくは試験管内で使用される、非放射性ハイブリダイゼーションアッセイおよびキットは、国際公開公報第93/10263号（公開日：1993年5月27日）に記載されている。さらに、国際公開公報第00/60116号（公開日：2000年10月12日）には、細胞を培養して核酸を検出する方法が記載されており、ここで好ましい手段は、固体の支持体、例えばピンなどに付着させた一本鎖プローブの使用である。一般的に、これらのアッセイは制限されており、核酸を検出するための迅速な手段を提供しない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
RNA:DNAハイブリッドに対する好ましい抗体は、Kitawaga, Y.およびStollar,
B. D. (Mol. lmmunology 19:413-420 (1982))の方法により、あるいは1988年3月
22日にStuartらに対して発行されたU.S.特許No. 4,732,847中に記載された方法
にしたがって調製される。