【手続補正書】
【提出日】平成16年2月13日(2004.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｄｚ２Ｌｚ４［式中、ｚ２はアミノ酸残基であり、かつｚ４はＴ又はＩである］を含み、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ又はＢＡＦＦＲ（配列番号１９５、１９６及び１９７）の断片を含まない、ＴＡＬＬ−１結合性構成物。
【請求項２】
ｚ４がＴである、請求項１の構成物。
【請求項３】
アミノ酸配列Ｄｚ２ＬＩ［式中、ｚ２はアミノ酸残基である］を含むＴＡＬＬ−１結合性構成物。
【請求項４】
式
【化１】
2004533249.tif 000001
［式中、
ａ１、ａ２、ａ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ａ６はアミノ酸残基であり；
ａ８はＴ又はＩであり；
ａ９は塩基性残基又は疎水性残基であり；
ａ１０はアミノ酸残基であり；
ａ１２は中性疎水性残基であり；かつ
ａ１３及びａ１４は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］のアミノ酸配列を含む、請求項１の構成物。
【請求項５】
ａ８がＴであり、かつａ９が塩基性残基である、請求項４の構成物。
【請求項６】
ａ９がＫであり、かつａ１２がＦである、請求項４の構成物。
【請求項７】
式
【化２】
2004533249.tif 000002
［式中、
ｂ１及びｂ２は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ３は酸性残基又はアミド残基であり；
ｂ５はアミノ酸残基であり；
ｂ６は芳香族残基であり；
ｂ８はアミノ酸残基であり；
ｂ１０はＴ又はＩであり；
ｂ１１は塩基性残基であり；
ｂ１２及びｂ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｂ１４は中性疎水性残基であり；かつ
ｂ１６、ｂ１７及びｂ１８は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］のアミノ酸配列を含む、請求項１の構成物。
【請求項８】
ｂ３がＤ、Ｑ又はＥであり；
ｂ６がＷ又はＹであり；
ｂ１０がＴであり；
ｂ１１がＫ又はＲであり；かつ
ｂ１４がＶ又はＬである、請求項７の構成物。
【請求項９】
式
【化３】
2004533249.tif 000003
［式中、
ｃ１、ｃ２及びｃ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｃ５はアミノ酸残基であり；
ｃ７はアミノ酸残基であり；
ｃ９はＴ又はＩであり；
ｃ１０は塩基性残基であり；
ｃ１１及びｃ１２は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｃ１３は中性疎水性残基であり；
ｃ１４はアミノ酸残基であり；
ｃ１６はアミノ酸残基であり；
ｃ１７は中性疎水性残基であり；かつ
ｃ１８はアミノ酸残基であるか又は存在しない］のアミノ酸配列を含む、請求項１の構成物。
【請求項１０】
ｃ９がＴであり；
ｃ１０がＫ又はＲであり；
ｃ１３がＩ、Ｌ又はＶであり；かつ
ｃ１７がＡ又はＬである、請求項９の構成物。
【請求項１１】
式
【化４】
2004533249.tif 000004
［式中、
ｄ１、ｄ２及びｄ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ５、ｄ６及びｄ７は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｄ１０はアミノ酸残基であり；
ｄ１２はＴ又はＩであり；
ｄ１３はアミノ酸残基であり；
ｄ１４はアミノ酸残基であり；かつ
ｄ１６、ｄ１７及びｄ１８は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］のアミノ酸配列を含む、請求項１の構成物。
【請求項１２】
式
【化５】
2004533249.tif 000005
［式中、
ｅ１、ｅ２及びｅ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｅ５、ｅ６、ｅ７、ｅ９及びｅ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｅ１１はＴ又はＩであり；かつ
ｅ１５、ｅ１６及びｅ１７は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］のアミノ酸配列を含む、請求項１の構成物。
【請求項１３】
式
【化６】
2004533249.tif 000006
［式中、
ｆ１、ｆ２及びｆ３は存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｆ５はＷ、Ｙ又はＦであり；
ｆ７はアミノ酸残基であり；
ｆ９はＴ又はＩであり；
ｆ１０はＫ、Ｒ又はＨであり；
ｆ１２はＣ、中性疎水性残基又は塩基性残基（好ましくは、Ｗ、Ｃ又はＲ）であり；
ｆ１３はＣであるか、中性疎水性残基であるか又は存在せず；かつ
ｆ１４は任意のアミノ酸残基であるか又は存在せず；
但し、ｆ１、ｆ２及びｆ３のうちの一つのみがＣであり得、かつｆ１２、ｆ１３及びｆ１４のうちの一つのみがＣであり得る］のアミノ酸配列を含む、請求項１の構成物。
【請求項１４】
ｆ５がＷである、請求項１３の構成物。
【請求項１５】
ｆ７がＬである、請求項１３の構成物。
【請求項１６】
ｆ９がＴである、請求項１３の構成物。
【請求項１７】
ｆ１０がＫである、請求項１３の構成物。
【請求項１８】
ｆ１２がＣであり、かつｆ１、ｆ２及びｆ３のうちの一つがＣである、請求項１３の構成物。
【請求項１９】
ｆ１３がＶである、請求項１３の構成物。
【請求項２０】
式
【化７】
2004533249.tif 000007
のアミノ酸配列を含む、請求項１３の構成物。
【請求項２１】
配列番号３２、３３、５８、６０、６３、６６、６７、６９、１１４、１１５、１２２、１２３、１２４、１４７〜１５０、１５２〜１７７、１７９、１８０及び１８７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０の構成物。
【請求項２２】
式
【化８】
2004533249.tif 000008
のアミノ酸配列を含む、請求項２０の構成物。
【請求項２３】
式
【化９】
2004533249.tif 000009
［式中、
ｇ１、ｇ２及びｇ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｇ５は中性疎水性残基であり；
ｇ８は中性疎水性残基であり；
ｇ１０は酸性残基であり；
ｇ１２及びｇ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；かつ
ｇ１４は存在しないか又はアミノ酸残基である］のアミノ酸配列を含む構成物。
【請求項２４】
ｇ２がＧであり；
ｇ５がＷであり；
ｇ８がＰであり；
ｇ１０がＥであり；かつ
ｇ１３が塩基性残基である、請求項２３の構成物。
【請求項２５】
式
【化１０】
2004533249.tif 000010
［式中、
ｈ１、ｈ２及びｈ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｈ６は疎水性残基であり；
ｈ７は疎水性残基であり；
ｈ１０は酸性残基又は極性疎水性残基であり；かつ
ｈ１２、ｈ１３及びｈ１４は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］のアミノ酸配列を含む構成物。
【請求項２６】
ｈ１がＧであり；
ｈ６がＡであり；
ｈ７が中性疎水性残基であり；かつ
ｈ１０が酸性残基である、請求項２５の構成物。
【請求項２７】
式
【化１１】
2004533249.tif 000011
［式中、
ｉ１は存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｉ２は中性疎水性残基であり；
ｉ３はアミノ酸残基であり；
ｉ５、ｉ６、ｉ７及びｉ８は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｉ９は酸性残基であり；
ｉ１０はアミノ酸残基であり；
ｉ１２及びｉ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；かつ
ｉ１４は中性疎水性残基である］のアミノ酸配列を含む構成物。
【請求項２８】
ｉ２がＷであり；かつ
ｉ１４がＷである、請求項２７の構成物。
【請求項２９】
式ＰＦＰＷＥ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＴＡＬＬ−１結合性構成物。
【請求項３０】
式
【化１２】
2004533249.tif 000012
［式中、
Ｖ１はビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立に、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４からなる群より選択され、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４のうちの一つ又はそれ以上は、各々独立に、Ｄｚ２Ｌｚ４を含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立に、リンカーであり；かつ
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、各々独立に、０又は１であり、但しａ及びｂのうちの少なくとも一つは１である］及びそれらの多量体を有する、請求項１の構成物。
【請求項３１】
式
【化１３】
2004533249.tif 000013
の、請求項３０の構成物。
【請求項３２】
式
【化１４】
2004533249.tif 000014
の、請求項３０の構成物。
【請求項３３】
Ｖ１がＦｃドメインである、請求項３０の構成物。
【請求項３４】
Ｖ１がＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項３０の構成物。
【請求項３５】
Ｖ１がＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項３０の構成物。
【請求項３６】
Ｖ１が配列番号２の配列を含む、請求項３０の構成物。
【請求項３７】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４のうちの一つ又はそれ以上が、各々独立に、
【化１５】
2004533249.tif 000015
［式中、
ａ１、ａ２、ａ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ａ６はアミノ酸残基であり；
ａ９は塩基性残基又は疎水性残基であり；
ａ８はトレオニル又はイソロイシルであり；
ａ１０はアミノ酸残基であり；
ａ１２は中性疎水性残基であり；
ａ１３及びａ１４は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ１及びｂ２は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ３は酸性残基又はアミド残基であり；
ｂ５はアミノ酸残基であり；
ｂ６は芳香族残基であり；
ｂ８はアミノ酸残基であり；
ｂ１０はＴ又はＩであり；
ｂ１１は塩基性残基であり；
ｂ１２及びｂ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｂ１４は中性疎水性残基であり；
ｂ１６、ｂ１７及びｂ１８は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｃ１、ｃ２及びｃ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｃ５はアミノ酸残基であり；
ｃ７はアミノ酸残基であり；
ｃ９はＴ又はＩであり；
ｃ１０は塩基性残基であり；
ｃ１１及びｃ１２は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｃ１３は中性疎水性残基であり；
ｃ１４はアミノ酸残基であり；
ｃ１６はアミノ酸残基であり；
ｃ１７は中性疎水性残基であり；かつ
ｃ１８は、アミノ酸残基であるか又は存在せず；
ｄ１、ｄ２及びｄ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ５、ｄ６及びｄ７は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｄ１０はアミノ酸残基であり；
ｄ１２はＴ又はＩであり；
ｄ１３はアミノ酸残基であり；
ｄ１４はアミノ酸残基であり；かつ
ｄ１６、ｄ１７及びｄ１８は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｅ１、ｅ２及びｅ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｅ５、ｅ６、ｅ７、ｅ９及びｅ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｅ１１はＴ又はＩであり；かつ
ｅ１５、ｅ１６及びｅ１７は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｆ１、ｆ２及びｆ３は存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｆ５はＷ、Ｙ又はＦであり；
ｆ７はアミノ酸残基であり；
ｆ９はＴ又はＩであり；
ｆ１０はＫ、Ｒ又はＨであり；
ｆ１２はＣ、中性疎水性残基又は塩基性残基であり；
ｆ１３はＣであるか、中性疎水性残基であるか又は存在せず；かつ
ｆ１４は任意のアミノ酸残基であるか又は存在せず；
但し、ｆ１、ｆ２及びｆ３のうちの一つのみがＣであり得、かつｆ１２、ｆ１３及びｆ１４のうちの一つのみがＣであり得；
ｇ１、ｇ２及びｇ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｇ５は中性疎水性残基であり；
ｇ８は中性疎水性残基であり；
ｇ１０は酸性残基であり；
ｇ１２及びｇ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；かつ
ｇ１４は存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｈ１、ｈ２及びｈ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｈ６は疎水性残基であり；
ｈ７は疎水性残基であり；
ｈ１０は酸性残基又は極性疎水性残基であり；かつ
ｈ１２、ｈ１３及びｈ１４は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｉ１は存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｉ２は中性疎水性残基であり；
ｉ３はアミノ酸残基であり；
ｉ５、ｉ６、ｉ７及びｉ８は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｉ９は酸性残基であり；
ｉ１０はアミノ酸残基であり；
ｉ１２及びｉ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；かつ
ｉ１４は中性疎水性残基である］より選択される配列を含む、請求項３０の構成物。
【請求項３８】
ａ９が塩基性残基であり；
ｂ３がＤ、Ｑ又はＥであり；
ｂ６がＷ又はＹであり；
ｂ１１がＫ又はＲであり；
かつｂ１４がＶ又はＬであり；
ｃ１０がＫ又はＲであり；
ｃ１３がＩ、Ｌ又はＶであり；
ｃ１７がＡ又はＬであり；
ｆ５がＷであり；
ｆ７がＬであり；
ｆ１０がＫであり；かつ
ｆ１３がＶである、請求項３７の構成物。
【請求項３９】
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４のうちの一つ又はそれ以上が、各々独立に、
【化１６】
2004533249.tif 000016
を含む、請求項３７の構成物。
【請求項４０】
式
【化１７】
2004533249.tif 000017
の、請求項３９の構成物。
【請求項４１】
式
【化１８】
2004533249.tif 000018
の、請求項３９の構成物。
【請求項４２】
配列番号１２２、１２３及び１２４より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３９の構成物。
【請求項４３】
Ｌ２が５アミノ酸より大きい、請求項４０の構成物。
【請求項４４】
Ｌ２が、
【化１９】
2004533249.tif 000019
［式中、ｘ１及びｘ３は、各々独立に、塩基性残基又は疎水性残基であり、かつｘ２及びｘ４は、各々独立に、疎水性残基である］より選択される、請求項４３の構成物。
【請求項４５】
Ｌ２が、
【化２０】
2004533249.tif 000020
より選択される、請求項４１の構成物。
【請求項４６】
表２（配列番号２９から３９、６０から７０及び１２６から１８８）より選択される配列を含む、請求項２８の構成物。
【請求項４７】
表４（配列番号４４から５５）より選択される配列を含む、請求項３０の構成物。
【請求項４８】
Ｖ１がＦｃドメインである、請求項４６の構成物。
【請求項４９】
Ｖ１がＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項４６の構成物。
【請求項５０】
Ｖ１がＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項４６の構成物。
【請求項５１】
請求項３４の構成物をコードするＤＮＡ。
【請求項５２】
請求項５１のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項５３】
請求項５２の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
大腸菌細胞である、請求項５３の細胞。
【請求項５５】
請求項１の構成物を投与することを含む、Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項５６】
請求項１３の構成物を投与することを含む、Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項５７】
請求項１の構成物を投与することを含む、ループスを治療する方法。
【請求項５８】
請求項１３の構成物を投与することを含む、ループスを治療する方法。
【請求項５９】
請求項１の構成物を投与することを含む、Ｂ細胞により媒介される癌を治療する方法。
【請求項６０】
請求項１３の構成物を投与することを含む、Ｂ細胞により媒介される癌を治療する方法。
【請求項６１】
請求項１の構成物を投与することを含む、Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法。
【請求項６２】
請求項１３の構成物を投与することを含む、Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＴＡＬＬ−１と結合するペプチド及び関連分子
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照して本明細書に組み込まれる２００１年５月１１日出願の米国仮出願第６０／２９０，１９６号に関連している。
【背景技術】
【０００２】
長年にわたる腫瘍壊死の研究の後、最終的に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びβが１９８４年にクローニングされた。それ以降、ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＡＧＰ−１とも呼ばれる）、オステオプロテジェリン結合タンパク質（ＯＰＧ−ＢＰ又はＯＰＧリガンド）、４−１ＢＢリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＡＰＲＩＬ及びＴＡＬＬ−１を含むＴＮＦサイトカインのスーパーファミリーが出現した。Ｓｍｉｔｈら（１９９４）、Ｃｅｌｌ  ７６：９５９−９６２；Ｌａｃｅｙら（１９９８）、Ｃｅｌｌ  ９３：１６５−１７６；Ｃｈｉｃｈｅｐｏｔｉｃｈｅら（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２４０１−３２４１０；Ｍａｕｒｉら（１９９８）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：２１−３０；Ｈａｈｎｅら（１９９８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１８５−９０；Ｓｈｕら（１９９９）、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６５：６８０−３。このファミリーは、その構造、特にＣ末端の構造によって統一されている。さらに、いくつかのメンバーはその他の組織又は器官にも発現しているが、現在までに既知の大部分のメンバーが免疫コンパートメントに発現している。Ｓｍｉｔｈら（１９９４）、Ｃｅｌｌ  ７６：９５９−６２。ＬＴ−αを除く全てのリガンドメンバーが、Ｃ末端細胞外ドメイン内の保存された１５０アミノ酸領域を特徴とするＩＩ型膜貫通タンパク質である。同一性はわずか２０％から２５％と限定されているが、保存された１５０アミノ酸ドメインは、特徴的なβプリーツシートサンドイッチに折り畳まれ、三量体を形成している。この保存された領域は、タンパク質分解により放出され、それにより可溶性の機能性の型が生成され得る。Ｂａｎｎｅｒら（１９９３）、Ｃｅｌｌ  ７３：４３１−４４５。
【０００３】
このリガンドファミリー内の多くのメンバーが、リンパ濃縮組織（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ）に発現しており、免疫系の発達及びモジュレーションにおいて重要な役割を果たしている。Ｓｍｉｔｈら（１９９４）。例えば、ＴＮＦαは、主としてマクロファージによって合成されており、炎症応答及び免疫防御のための重要なメディエーターである。Ｔｒａｃｅｙ＆Ｃｅｒａｍｉ（１９９４）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４５：４９１−５０３。主に活性化Ｔ細胞に発現しているＦａｓ−Ｌは、胸腺細胞のＴＣＲにより媒介されるアポトーシスをモジュレートする。Ｎａｇａｔａ，Ｓ．＆Ｓｕｄａ，Ｔ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １６：３９−４３；Ｃａｓｔｒｉｍら（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：６１７−２７。やはり活性化Ｔ細胞によって発現されるＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の生存、増殖及び免疫グロブリンアイソタイプスイッチングのための必須のシグナルを提供する。Ｎｏｅｌｌｅ（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：４１５−９。
【０００４】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの大部分について、コグネイト受容体が同定されている。これらの受容体は、細胞外ドメイン内の特徴的な複数のシステインリッチリピートを共有しており、細胞質領域には触媒モチーフを保有していない。Ｓｍｉｔｈら（１９９４）。受容体は、デスドメインタンパク質（例えば、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ）又はＴＲＡＦタンパク質（例えば、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６）との直接的な相互作用により、分岐しオーバーラップするシグナリング経路、例えば、アポトーシス、ＮＦ−κＢ活性化又はＪＮＫ活性化を誘発するシグナルを伝達する。Ｗａｌｌａｃｈら（１９９９）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７：３３１−６７。これらのシグナリングイベントは、細胞の死、増殖、活性化又は分化に至る。各受容体メンバーの発現プロファイルは、様々である。例えば、ＴＮＦＲ１は、広範囲の組織及び細胞に発現しているが、ＯＰＧＬの細胞表面受容体は、主として破骨細胞に限定されている。Ｈｓｕら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：３５４０−５。
【０００５】
多数の研究グループが、最近、同一であるか又は実質的に類似している配列を有するＴＮＦファミリーリガンドを同定した。このリガンドは、ニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）α（１９９８年５月７日公開のＷＯ９８／１８９２１）、６３９５４（１９９８年６月２５日公開のＷＯ９８／２７１１４）、ＴＬ５（１９９８年１０月７日公開の欧州特許第８６９１８０号）、ＮＴＮ−２（１９９８年１２月１０日公開のＷＯ９８／５５６２０及びＷＯ９８／５５６２１）、ＴＮＲＬ１−アルファ（１９９９年３月１１日公開のＷＯ９９１１７９１）、ｋａｙリガンド（１９９９年３月１８日公開のＷＯ９９／１２９６４）及びＡＧＰ−３（１９９９年２月１２日出願の米国仮出願第６０／１１９，９０６号及び１９９９年１１月１８日出願の第６０／１６６，２７１号）；並びにＴＡＬＬ−１（２０００年１１月１６日公開のＷＯ００／６８３７８）と様々に命名されている。これらの参照は、各々、参照して本明細書に組み込まれる。以後、これらにおいて報告されたリガンドを、集合的にＴＡＬＬ−１と呼ぶ。
【０００６】
ＴＡＬＬ−１は、機能的にはＢ細胞の生存及び増殖に関与しているＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーである。ＴＡＬＬ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、重度のＢ細胞過形成及びループス様自己免疫疾患を有していた。Ｋｈａｒｅら（２０００）ＰＮＡＳ  ９７（７）：３３７０−３３７５）。ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの両方が、ＴＡＬＬ−１の細胞表面受容体としてはたらく。Ｇｒｏｓｓら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：９９５−９９９；Ｗａｒｅ（２０００）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１１）：Ｆ３５−Ｆ３７；Ｗａｒｅ（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：９４９−９５０；Ｘｉａら（２０００）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１）：１３７−１４３；Ｙｕら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（３）：２５２−２５６；Ｍａｒｓｔｅｒｓら（２０００）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７８５−７８８；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕら（２０００）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６５：１３２２−１３３０；Ｓｈｕら（２０００）ＰＮＡＳ  ９７（１６）：９１５６−９１６１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１）：１２９−１３５；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２３）：１５９７８−８１；Ｓｈｕら（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６５：６８０−６８３；Ｇｒｕｓｓら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５（１２）：３３７８−３４０４；Ｓｍｉｔｈら（１９９４）、Ｃｅｌｌ  ７６：９５９−９６２；１９９９年１０月１９日発行の米国特許第５，９６９，１０２号；２０００年１１月９日公開のＷＯ００／６７０３４；２０００年７月１３日公開のＷＯ００／４０７１６；１９９９年７月１５日公開のＷＯ９９／３５１７０。両受容体はＢ細胞上に発現しており、ＴＲＡＦタンパク質との相互作用によりシグナルを伝達する。さらに、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの両方が、もう一つのＴＮＦリガンドファミリーメンバー、ＡＰＲＩＬとも結合する。Ｙｕら（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（３）：２５２−２５６。ＡＰＲＩＬも、Ｂ細胞増殖を誘導することが証明されている。
【０００７】
現在までに、ＴＡＬＬ−１のペプチドモジュレーターを利用した組換えタンパク質又は修飾型タンパク質は開示されていない。組換えタンパク質及び修飾型タンパク質は、新規の治療剤クラスである。タンパク質治療剤の有用な修飾には、抗体の「Ｆｃ」ドメインとの組み合わせ、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びデキストランのような重合体との連結が含まれる。このような修飾は、参照して完全に本明細書に組み込まれるＷＯ００／２４７８２として公開された「治療剤としての修飾型ペプチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ）」なる表題の特許出願において詳細に考察されている。
【０００８】
治療剤の開発のための大きく異なるアプローチが、ペプチドライブラリースクリーニングである。タンパク質リガンドのその受容体との相互作用は、しばしば比較的大きな界面において起こる。しかしながら、ヒト成長ホルモン及びその受容体に関して証明されているように、界面の少数の重要な残基のみが、結合エネルギーの大部分に寄与している。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：３８３−６。タンパク質リガンドの大半は、正確な位相で結合エピトープを示すか又は結合とは無関係な機能を果たしているにすぎない。従って、「ペプチド」の長さ（２〜４０アミノ酸）のみを有する分子が、所定の大きなタンパク質リガンドの受容体タンパク質と結合することは可能である。このようなペプチドは、大きなタンパク質リガンドの生理活性を模倣する場合もあるし（「ペプチドアゴニスト」）、又は競合結合を通して、大きなタンパク質リガンドの生理活性を阻害する場合もある（「ペプチドアンタゴニスト」）。
【０００９】
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、このようなペプチドアゴニスト及びペプチドアンタゴニストの同定における強力な方法として出現した。例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４；１９９３年６月２９日発行の米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日発行の米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日発行の米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日発行の米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日発行の米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日発行の米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日公開のＷＯ９６／４０９８７；並びに１９９８年４月１６日公開のＷＯ９８／１５８３３（各々、参照して完全に組み込まれる）を参照のこと。このようなライブラリーにおいては、ランダムなペプチド配列が、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって呈示される。典型的には、呈示されたペプチドは、固定化された標的タンパク質に対してアフィニティ溶出させることができる。保持されたファージを、アフィニティ精製及び再繁殖の繰り返しによって濃縮することができる。最も結合性の高いペプチドを、１個又はそれ以上の構造的に関連したペプチドファミリー内の重要な残基を同定するため、配列決定することができる。例えば、２つの別個のファミリーが同定されたＣｗｉｒｌａら（１９９７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１６９６−９を参照のこと。ペプチド配列は、いずれの残基が、ＤＮＡレベルでアラニンスキャニング又は突然変異誘発により安全に交換され得るかも示唆し得る。最良のバインダーの配列をさらに最適化するためには、突然変異誘発ライブラリーを作出しスクリーニングすることができる。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４。
【００１０】
タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析も、大きなタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆するために使用できる。このような分析においては、結晶構造が、ペプチドを設計することができる、大きなタンパク質リガンドの決定的な残基の同一性及び相対的方向を示唆し得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０を参照のこと。これらの分析法は、結合親和性を増加させるためのペプチドのさらなる修飾を示唆するかもしれない、ファージディスプレイによって選択された受容体タンパク質とペプチドとの間の相互作用を調査するためにも使用できる。
【００１１】
ペプチド研究においてファージディスプレイに匹敵する方法は、他にも存在する。ペプチドライブラリーを、ｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端に融合させ、大腸菌において発現させることが可能である。もう一つの大腸菌に基づく方法は、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合により、細胞外膜におけるディスプレイを可能にする。以後、これら及び関連する方法を、集合的に「大腸菌ディスプレイ」と呼ぶ。もう一つの方法においては、ランダムＲＮＡの翻訳をリボソーム放出の前に中止させ、まだ関連ＲＮＡが付加されているポリペプチドのライブラリーを生成させる。以後、これ及び関連する方法を、集合的に「リボソームディスプレイ」と呼ぶ。その他の方法、例えばプロフュージョン（ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ）技術（Ｐｈｙｌｏｓ，Ｉｎｃ．）は、ＲＮＡに連結されたペプチドを利用する。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２２９７−３０３を参照のこと。以後、これ及び関連する方法を、集合的に「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と呼ぶ。ペプチドが、ポリエチレンロッド又は溶媒浸透性樹脂のような安定な非生物学的材料に固定化されている、化学的に導出されたペプチドライブラリーが開発されている。もう一つの化学的に導出されたペプチドライブラリーは、ガラススライドに固定化されたペプチドをスキャンするために写真石版術を使用する。以後、これら及び関連する方法を、集合的に「化学的ペプチドスクリーニング」と呼ぶ。化学的ペプチドスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸及びその他の非天然のアナログ、並びに非ペプチドエレメントの使用を可能にするという点で有利な場合がある。生物学的方法及び化学的方法の両方が、Ｗｅｌｌｓ＆Ｌｏｗｍａｎ（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３５５−６２に概説されている。概念的には、ファージディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング及び前述のその他の方法を使用して、任意のタンパク質のペプチド模倣体を発見することができる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、ＴＡＬＬ−１の活性をモジュレートする治療剤に関する。本発明によると、ＴＡＬＬ−１のモジュレーターは、アミノ酸配列Ｄｚ２Ｌｚ４（配列番号１０８）［式中、ｚ２はアミノ酸残基であり、かつｚ４はトレオニル又はイソロイシルである］を含む。このようなＴＡＬＬ−１のモジュレーターは、下記式
【００１３】
【化１】
2004533249.tif 000021
［式中、
ａ１、ａ２、ａ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ａ６はアミノ酸残基であり；
ａ９は塩基性残基又は疎水性残基であり；
ａ８はトレオニル又はイソロイシルであり；
ａ１０はアミノ酸残基であり；
ａ１２は中性疎水性残基であり；かつ
ａ１３及びａ１４は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］
【００１４】
【化２】
2004533249.tif 000022
［式中、
ｂ１及びｂ２は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ３は酸性残基又はアミド残基であり；
ｂ５はアミノ酸残基であり；
ｂ６は芳香族残基であり；
ｂ８はアミノ酸残基であり；
ｂ１０はＴ又はＩであり；
ｂ１１は塩基性残基であり；
ｂ１２及びｂ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｂ１４は中性疎水性残基であり；かつ
ｂ１６、ｂ１７及びｂ１８は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］
【００１５】
【化３】
2004533249.tif 000023
［式中、
ｃ１、ｃ２及びｃ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｃ５はアミノ酸残基であり；
ｃ７はアミノ酸残基であり；
ｃ９はＴ又はＩであり；
ｃ１０は塩基性残基であり；
ｃ１１及びｃ１２は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｃ１３は中性疎水性残基であり；
ｃ１４はアミノ酸残基であり；
ｃ１６はアミノ酸残基であり；
ｃ１７は中性疎水性残基であり；かつ
ｃ１８はアミノ酸残基であるか又は存在しない］
【００１６】
【化４】
2004533249.tif 000024
［式中、
ｄ１、ｄ２及びｄ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ５、ｄ６及びｄ７は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｄ１０はアミノ酸残基であり；
ｄ１２はＴ又はＩであり；
ｄ１３はアミノ酸残基であり；
ｄ１４はアミノ酸残基であり；かつ
ｄ１６、ｄ１７及びｄ１８は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］
【００１７】
【化５】
2004533249.tif 000025
［式中、
ｅ１、ｅ２及びｅ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｅ５、ｅ６、ｅ７、ｅ９及びｅ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｅ１１はＴ又はＩであり；かつ
ｅ１５、ｅ１６及びｅ１７は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］
【００１８】
【化６】
2004533249.tif 000026
［式中、
ｆ１、ｆ２及びｆ３は、存在しないか又はアミノ酸残基であり（ｆ１２、ｆ１３及びｆ１４のうちの一つがＣである場合、ｆ１、ｆ２及びｆ３のうちの一つがＣであることが好ましい）；
ｆ５はＷ、Ｙ又はＦ（好ましくは、Ｗ）であり；
ｆ７はアミノ酸残基（好ましくは、Ｌ）であり；
ｆ９はＴ又はＩ（好ましくは、Ｔ）であり；
ｆ１０はＫ、Ｒ又はＨ（好ましくは、Ｋ）であり；
ｆ１２はＣ、中性疎水性残基又は塩基性残基（好ましくは、Ｗ、Ｃ又はＲ）であり；
ｆ１３はＣであるか、中性疎水性残基であるか又は存在せず（好ましくは、Ｖ）；かつ
ｆ１４は任意のアミノ酸残基であるか又は存在せず；
但し、ｆ１、ｆ２及びｆ３のうちの一つのみがＣであり得、かつｆ１２、ｆ１３及びｆ１４のうちの一つのみがＣであり得る］の分子を含む。
【００１９】
前記の式Ｉ（ａ）からＩ（ｆ）の化合物には、Ｄｚ２Ｌｚ４及び後述の配列番号６３が組み込まれている。Ｉ（ｆ）の配列は、下記実施例１に記載されるようなコンセンサス配列として導出された。式Ｉ（ｆ）に含まれる化合物のうち、式
【００２０】
【化７】
2004533249.tif 000027
を有するものが好ましい。Ｉ（ｆ’）に包含される化合物には、配列番号３２、５８、６０、６２、６３、６６、６７、６９、７０、１１４、１１５、１２２、１２３、１２４、１４７〜１５０、１５２〜１７７、１７９、１８０及び１８７が含まれる。
【００２１】
やはりＴＡＬＬ−１と結合するコンセンサスモチーフＰＦＰＷＥ（配列番号１１０）を有する化合物も、本発明による化合物である。
【００２２】
さらに、式
【００２３】
【化８】
2004533249.tif 000028
［式中、
ｇ１、ｇ２及びｇ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｇ５は中性疎水性残基であり；
ｇ８は中性疎水性残基であり；
ｇ１０は酸性残基であり；
ｇ１２及びｇ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；かつ
ｇ１４は存在しないか又はアミノ酸残基である］
【００２４】
【化９】
2004533249.tif 000029
［式中、
ｈ１、ｈ２及びｈ３は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｈ６は疎水性残基であり；
ｈ７は疎水性残基であり；
ｈ１０は酸性残基又は極性疎水性残基であり；かつ
ｈ１２、ｈ１３及びｈ１４は、各々独立に、存在しないか又はアミノ酸残基である］
【００２５】
【化１０】
2004533249.tif 000030
［式中、
ｉ１は存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｉ２は中性疎水性残基であり；
ｉ３はアミノ酸残基であり；
ｉ５、ｉ６、ｉ７及びｉ８は、各々独立に、アミノ酸残基であり；
ｉ９は酸性残基であり；
ｉ１０はアミノ酸残基であり；
ｉ１２及びｉ１３は、各々独立に、アミノ酸残基であり；かつ
ｉ１４は中性疎水性残基である］
の化合物が、本発明による化合物である。
【００２６】
式Ｉ（ｇ）からＩ（ｉ）により定義された化合物も、ＴＡＬＬ−１と結合する。
【００２７】
さらに、本発明によると、ＴＡＬＬ−１のモジュレーターは、
ａ）ＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメイン（例えば、式Ｉ（ａ）からＩ（ｉ）のアミノ酸配列）、好ましくはアミノ酸配列Ｄｚ２Ｌｚ４、又はファージディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニングもしくは前述のその他の技術によって、これらから導出された配列と；
ｂ）ＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインに共有結合的に付加された、重合体（例えば、ＰＥＧもしくはデキストラン）又はＦｃドメイン（好ましい）のようなビヒクルとを含む。ビヒクル及びＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインは、さらに後述されるように、ＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインのＮ末端又はＣ末端を通して連結されうる。好ましいビヒクルはＦｃドメインであり、好ましいＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。このようなＦｃ連結ペプチドは、本明細書において「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）」と呼ばれる。好ましいＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインは、下記表１及び２に記載されたアミノ酸配列を含む。その他のＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインは、ファージディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング及び本明細書に言及されたその他の技術によって生成し得る。
【００２８】
さらに、
ａ．ＴＡＬＬ−１と結合するペプチドを少なくとも１個選択すること；及び
ｂ．このペプチドを共有結合的にビヒクルに連結させること、を含む、ＴＡＬＬ−１モジュレーターを作成するための方法が、本発明による方法である。好ましいビヒクルはＦｃドメインである。工程（ａ）は、好ましくは、下記表２中のペプチド配列から、又はファージディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニングもしくは本明細書に言及されたその他の技術からの選択によって実施される。
【００２９】
本発明の化合物は、標準的な合成法、組換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製するその他の任意の方法によって調製され得る。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物は、適用可能な場合、標準的なペプチド化学反応に加え、標準的な有機化学反応によって合成されてもよい。
【００３０】
本発明の化合物に関して企図される第一の使用は、治療剤又は予防剤としての使用である。ビヒクルに連結されたペプチドは、ペプチドによって模倣された天然リガンドに匹敵する活性を有するか、又はそれ以上の活性を有する場合すらある。
【００３１】
本発明の化合物は、適切な薬学的担体材料を用いてこれらを製剤化し、その必要のあるヒト（又はその他の哺乳動物）のような患者へ有効量を投与することにより、治療又は予防の目的のために使用され得る。その他の関連する局面も、本発明に含まれる。
【００３２】
多数の付加的な本発明の局面及び利点が、本発明の図面及び詳細な説明を考慮することにより明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
用語の定義
特記しない限り、この明細書において使用される用語は、以下のように定義される。
【００３４】
一般的定義
「含む」という用語は、化合物が、与えられた配列のＮ末端もしくはＣ末端のいずれか又は両方に、追加のアミノ酸を含みうることを意味する。当然、これらの追加のアミノ酸は、化合物の活性を有意に妨害するべきではない。
【００３５】
さらに、本発明の化合物の生理学的に許容される塩も、本発明に包含される。「生理学的に許容される塩」という用語は、医薬適合性であることが既知であるか又は後に発見される任意の塩をさす。いくつかの具体例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩及び臭化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；並びにシュウ酸塩である。
【００３６】
アミノ酸
「酸性残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な酸性残基には、Ｄ及びＥが含まれる。
【００３７】
「アミド残基」という用語は、酸性基のアミド誘導体を含む側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸をさす。例示的な残基には、Ｎ及びＱが含まれる。
【００３８】
「芳香族残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な芳香族残基には、Ｆ、Ｙ及びＷが含まれる。
【００３９】
「塩基性残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な塩基性残基には、Ｈ、Ｋ及びＲが含まれる。
【００４０】
「親水性残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な親水性残基には、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｎ及びＱが含まれる。
【００４１】
「非官能性残基」という用語は、酸性、塩基性又は芳香族の基を欠いた側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な非官能性アミノ酸残基には、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ及びノルロイシン（Ｎｌｅ）が含まれる。
【００４２】
「中性疎水性残基」という用語は、塩基性、酸性又は極性の基を欠いた側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な中性疎水性アミノ酸残基には、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ及びＦが含まれる。
【００４３】
「極性疎水性残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な極性疎水性アミノ酸残基には、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ及びＮが含まれる。
【００４４】
「疎水性残基」という用語は、塩基性又は酸性の基を欠いた側鎖を有するＤ形又はＬ形のアミノ酸残基をさす。例示的な疎水性アミノ酸残基には、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ及びＮが含まれる。
【００４５】
ペプチド
「ペプチド」という用語は、１〜４０アミノ酸の分子（好ましくは、５〜２０アミノ酸の分子）をさす。例示的なペプチドには、天然に存在する分子のＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメイン又はランダム化された配列が含まれ得る。
【００４６】
ペプチド配列をさすために使用されるような「ランダム化された」という用語は、（例えば、ファージディスプレイ法又はＲＮＡ−ペプチドスクリーニングによって選択された）完全にランダムな配列、及び天然に存在する分子の１個又はそれ以上の残基が、天然に存在する分子においてはその位置に出現しないアミノ酸残基に交換されている配列をさす。ペプチド配列を同定するための例示的な方法には、ファージディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング等が含まれる。
【００４７】
「ＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメイン」という用語は、天然に存在する配列又はランダム化された配列を含む、ＴＡＬＬ−１と結合する任意のアミノ酸配列をさす。例示的なＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインは、ファージディスプレイ又は本明細書に言及されたその他の方法によって同定又は導出されうる。
【００４８】
「ＴＡＬＬ−１アンタゴニスト」という用語は、ＴＡＬＬ−１と結合し、かつ１個又はそれ以上のアッセイパラメーターを、全長天然型ＴＡＬＬ−１によるパラメーターに対する効果とは反対に増加又は減少させる分子をさす。このような活性は、例えば、ＷＯ００／４７７４０として２０００年８月１７日に公開された「ＴＮＦ関連タンパク質（ＴＮＦ−ＲＥＬＡＴＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」なる表題の特許出願の材料及び方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｍｅｔｈｏｄｓ）のセクションの「ＡＧＰ−３の生物学的活性（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＡＧＰ−３）」なる表題のサブセクションに記載されたようなアッセイによって決定できる。
【００４９】
ビヒクル及びペプチボディ
「ビヒクル」という用語は、治療用タンパク質の分解を防止し、かつ／もしくは半減期を増加させるか、毒性を減少させるか、免疫原性を減少させるか又は生物学的活性を増加させる分子をさす。例示的なビヒクルには、Ｆｃドメイン（好ましい）のみならず、直鎖型重合体（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストラン等）；分岐型重合体（例えば、１９８１年９月１５日発行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日発行のＴａｍの第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔらのＷＯ９３／２１２５９を参照のこと）；脂質；（ステロイドのような）コレステロール基；炭水化物又はオリゴ糖（例えば、デキストラン）；サルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体と結合する任意の天然又は合成のタンパク質、ポリペプチド又はペプチド；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むアルブミン、ロイシンジッパードメイン、並びにその他のこのようなタンパク質及びタンパク質断片が含まれる。ビヒクルはさらに後述される。
【００５０】
「天然Ｆｃ」という用語は、単量体であってもよいし又は多量体であってもよい、完全抗体の消化により生じる非抗原結合性断片の配列を含む分子又は配列をさす。天然型Ｆｃの最初の免疫グロブリン起源は、好ましくはヒト由来のものであり、任意の免疫グロブリンであり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然型Ｆｃは、共有結合性（即ち、ジスルフィド結合）及び非共有結合性の会合によって二量体又は多量体に連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。天然型Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に依って、１〜４の範囲である。天然型Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化により生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９参照）。「天然型Ｆｃ」という用語は、本明細書において使用されるように、単量体、二量体及び多量体の総称である。
【００５１】
「Ｆｃバリアント」という用語は、天然型Ｆｃから修飾されているが、依然としてサルベージ受容体、ＦｃＲｎに対する結合部位を含んでいる分子又は配列をさす。国際出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ９６／３２４７８は、例示的なＦｃバリアント及びサルベージ受容体との相互作用を記載しており、参照して完全に本明細書に組み込まれる。従って、「Ｆｃバリアント」という用語には、非ヒト天然型Ｆｃからヒト化された分子又は配列が含まれる。さらに、天然型Ｆｃは、本発明の融合分子にとって必要でない構造的特色又は生物学的活性を提供するため除去され得る部位を含んでいる。従って、「Ｆｃバリアント」という用語には、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現の際のＮ末端の不均質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合又は（７）抗体依存性細胞性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）、に影響するか又はそれらに関与する１個又はそれ以上の天然型Ｆｃの部位又は残基を欠いた分子又は配列が含まれる。Ｆｃバリアントは、さらに詳細に後述される。
【００５２】
「Ｆｃドメイン」という用語には、前記定義のような天然型Ｆｃ及びＦｃバリアントの分子及び配列が包含される。Ｆｃバリアント及び天然型Ｆｃの場合と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語には、完全抗体から消化されたか又はその他の手段によって作製されたかに関わらず、単量体又は多量体の分子が含まれる。
【００５３】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用されるような「多量体」という用語は、共有結合的に、非共有結合的に、又は共有結合性相互作用及び非共有結合性相互作用の両方によって会合した２個以上のポリペプチド鎖を有する分子をさす。ＩｇＧ分子は、典型的には、二量体を形成し；ＩｇＭは五量体を形成し；ＩｇＤは二量体を形成し；ＩｇＡは、単量体、二量体、三量体又は四量体を形成する。多量体は、Ｆｃの天然型Ｉｇ起源の配列及びそれから生ずる活性の活用により、又はこのような天然型Ｆｃの（下記定義のような）誘導体化により形成され得る。
【００５４】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用されるような「二量体」という用語は、共有結合的又は非共有結合的に会合した２個のポリペプチド鎖を有する分子をさす。従って、本発明の範囲に含まれる例示的な二量体は、図１に示されるようなものである。
【００５５】
「誘導体化」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、（１）化合物が環状部分；例えば化合物内のシステイニル残基間の架橋を有する；（２）化合物が、架橋されているか又は架橋部位を有する；例えば、化合物がシステイニル残基を有しており、従って培養物中又はインビボで架橋された二量体を形成する；（３）１個又はそれ以上のペプチジル結合が、非ペプチジル結合に交換される；（４）Ｎ末端が、−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基又は置換型もしくは非置換型のベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−［式中、Ｒ及びＲ１及び環置換基は下記定義の通りである］に交換される；（５）Ｃ末端が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又はＮＲ３Ｒ４［Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は下記定義の通りである］；及び（６）個々のアミノ酸部分が、選択された側鎖又は末端残基と反応することができる薬剤による処理を通して修飾されている化合物、のような過程及びその結果生ずる化合物をそれぞれ含む。誘導体はさらに後述される。
【００５６】
「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｄｏｂｙ）」及び「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｄｏｂｉｅｓ）」という用語は、Ｆｃドメインと少なくとも１個のペプチドとを含む分子をさす。このようなペプチボディは、それらの多量体又は二量体又は断片であってもよく、また、誘導体化されていてもよい。本発明において、下記式ＩＩからＶＩの分子は、Ｖ１がＦｃドメインである場合、ペプチボディである。
【００５７】
化合物の構造
一般。本発明者らは、ＴＡＬＬ−１と結合し、その生物学的活性をモジュレートする能力を有する配列を同定した。これらの配列は、ペプチドの結合親和性を維持するか、又はさらには改良しつつ、１個又はそれ以上のアミノ酸を変化させることができる前述の技術によって修飾され得る。
【００５８】
本発明により調製された構成物において、（１個又はそれ以上の）ペプチドは、ペプチドのＮ末端又はＣ末端を通してビヒクルに付加され得る。これらのペプチドは、リンカーにより又はリンカーなしで、タンデムに（即ち、連続的に）連結され得る。従って、本発明のビヒクル−ペプチド分子は、下記式
【００５９】
【化１１】
2004533249.tif 000031
［式中、
Ｖ１はビヒクル（好ましくは、Ｆｃドメイン）であり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立に、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４からなる群より選択され、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立に、式Ｉ（ａ）からＩ（ｉ）のもののようなＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインの配列であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立に、リンカーであり；かつ
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、各々独立に、０又は１であり、但しａ及びｂのうちの少なくとも一つは１である］により記載され得る。
【００６０】
従って、化合物ＩＩは、好ましくは、
式
【００６１】
【化１２】
2004533249.tif 000032
［式中、Ｖ１はＦｃドメインであり、Ａ１のＣ末端に付加されている］の化合物及びそれらの多量体；
式
【００６２】
【化１３】
2004533249.tif 000033
［式中、Ｖ１はＦｃドメインであり、Ａ２のＮ末端に付加されている］の化合物及びそれらの多量体；
式
【００６３】
【化１４】
2004533249.tif 000034
［式中、Ｖ１はＦｃドメインであり、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１のＮ末端に付加されている］の化合物及びそれらの多量体；並びに
式
【００６４】
【化１５】
2004533249.tif 000035
［式中、Ｖ１はＦｃドメインであり、−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ２−Ｐ２のＮ末端に付加されている］の化合物及びそれらの多量体を含む。
【００６５】
ペプチド
本発明のペプチドは、ＴＡＬＬ−１モジュレーティングペプチドとして、又は式ＩＩからＶＩの分子内のＴＡＬＬ−１モジュレーティングドメインとして有用である。これらのペプチド配列を含む本発明の分子は、当技術分野において既知の方法によって調製され得る。
【００６６】
好ましいペプチド配列は、以下に同定される置換基を有する前記式Ｉ（ａ）のものである。
【００６７】
【表１】
2004533249.tif 000036
【００６８】
好ましいペプチド配列を下記表２に示す。
【００６９】
【表２】
2004533249.tif 000037
2004533249.tif 000038
【００７０】
既知のＴＡＬＬ−１受容体は、好ましいペプチドと、ある程度の配列相同性を保持していることに注目すべきである。
【００７１】
【化１６】
2004533249.tif 000039
【００７２】
システイニル残基を含有しているペプチドは、もう一つのＣｙｓ含有ペプチドと架橋されることができ、それらの一方又は両方が、ビヒクルに連結され得る。複数個のＣｙｓ残基を有する任意のペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合も形成しうる。これらのペプチドは、後記のように誘導体化され得る。
【００７３】
さらなる有用なペプチド配列が、表２中の配列のアミノ酸配列の保存的修飾及び／又は非保存的修飾により生じ得る。
【００７４】
保存的修飾は、このような修飾が施されるペプチドのものと類似した機能的特徴及び化学的特徴を有するペプチドを生成させるであろう。対照的に、ペプチドの機能的特徴及び／又は化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）置換の区域における分子骨格の構造、例えばシート状もしくはらせん状のコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性又は（ｃ）分子のサイズ、の維持に対する効果が有意に異なるアミノ酸配列の置換を選択することにより、達成され得る。
【００７５】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷に対する効果がほとんど又は全く存在しないような、天然型アミノ酸残基の非天然型残基への置換を含みうる。さらに、「アラニンスキャニング突然変異誘発」に関して以前に記載されたように、ポリペプチド内の任意の天然型残基が、アラニンに置換されうる（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発について考察している、ＭａｃＬｅｎｎａｎら、１９９８、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４を参照のこと）。
【００７６】
所望のアミノ酸置換は、（保存的であるか又は非保存的であるかに関わらず）、このような置換が望まれる時点で、当業者によって決定されうる。例えば、アミノ酸置換は、ペプチド配列の重要な残基を同定するため、又は本明細書に記載されたペプチド分子もしくはビヒクル−ペプチド分子（前記式参照）の親和性を増加もしくは減少させるため、使用されうる。例示的なアミノ酸置換を、表３に示す。
【００７７】
【表３】
2004533249.tif 000040
【００７８】
ある種の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的には生物学的な系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基も包含する。
【００７９】
前述のセクション「用語の定義」において記述されたように、天然に存在する残基は、配列の修飾にとって有用であるかもしれない共通の側鎖特性に基づくクラスに分類され得る。例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーと、もう一つのクラスのメンバーとの交換を含み得る。このような置換された残基は、非ヒトオルソログと相同なペプチドの領域又は分子の非相同領域に導入され得る。さらに、鎖の方向に影響を及ぼす目的で、Ｐ又はＧを使用した修飾を施すことも可能である。
【００８０】
このような修飾においては、アミノ酸のハイドロパシックインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸には、それらの疎水性及び電荷の特徴に基づくハイドロパシックインデックスが割り当てられており、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００８１】
相互作用性の生物学的機能をタンパク質に付与する際のハイドロパシックアミノ酸インデックスの重要性は、当技術分野において理解されている。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似したハイドロパシックインデックス又はスコアを有する他のアミノ酸と置換された場合に、類似した生物学的活性を保持しうることが知られている。ハイドロパシックインデックスに基づき変化を施す際には、ハイドロパシックインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００８２】
類似アミノ酸の置換が、親水性に基づき効率的に施され得ることも、当技術分野において理解されている。隣接したアミノ酸の親水性によって支配されるような、タンパク質の最も大きい局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、即ちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【００８３】
以下のような親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づき変化を施す際には、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。親水性に基づき、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することも可能である。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００８４】
当業者であれば、周知の技術を使用して、前述の配列に示されたようなポリペプチドの適切なバリアントを決定することができるであろう。活性を破壊することなく変化させることができる分子の適切な区域を同定するため、当業者は、活性にとって重要ではないと考えられる区域を標的とすることができる。例えば、同一種又は他種からの類似した活性を有する類似ポリペプチドが既知である場合、当業者は、ペプチドのアミノ酸配列を類似ペプチドと比較することができる。このような比較により、類似ポリペプチド間で保存されている分子の残基及び部分を同定できる。このような類似ペプチドと比べて保存されていないペプチドの区域の変化は、ペプチドの生物学的活性及び／又は構造に悪影響を及ぼす可能性が低いであろうことが認識されよう。当業者は、比較的保存された領域ですら、活性を保持しながら、天然に存在する残基を、化学的に類似したアミノ酸に置換できることも承知しているであろう（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性又は構造にとって重要であるかもしれない区域ですら、生物学的活性を破壊することなく、又はペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【００８５】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要な類似ペプチド内の残基を同定する構造−機能研究を再検討することができる。このような比較を考慮して、類似ペプチド内の活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に相当する、ペプチド内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測されたペプチドの重要なアミノ酸残基のための、化学的に類似したアミノ酸への置換を選ぶこともできる。
【００８６】
当業者は、類似ポリペプチドの構造に関して、三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。その情報を考慮して、当業者は、三次元構造に関するペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。タンパク質の表面上にあると予測されたアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与している可能性があるため、当業者は、このような残基には根本的な変化を施さないことを選択することができる。さらに、当業者は、所望の各アミノ酸残基の単一アミノ酸置換を含有している試験バリアントを生成させることができる。次いで、バリアントを、当業者に既知の活性アッセイを使用してスクリーニングすることができる。このようなデータは、適切なバリアントに関する情報を集めるために使用できる。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、望ましくなく低下した活性又は不適切な活性をもたらすことが発見された場合、このような変化を有するバリアントは回避されるであろう。換言すると、このようなルーチンの実験から集められた情報に基づき、当業者であれば、単独の又はその他の変異と組み合わせられたさらなる置換を回避すべきアミノ酸を、容易に決定することができる。
【００８７】
多数の科学的出版物が、二次構造の予測を扱っている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、２６：３６７−３８４（１９７９）を参照のこと。さらに、現在では、コンピュータプログラムが、二次構造の予測を補助するために利用可能である。二次構造を予測する一つの方法は、ホモロジーモデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）に基づく。例えば、３０％超の配列同一性又は４０％超の類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、しばしば、類似した構造的位相を有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の可能性のある折り畳みの数を含む、増強された二次構造の予測を提供した。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照のこと。所定のポリペプチド又はタンパク質には限定された数の折り畳みが存在すること、及び決定的な構造の数が解明された後は、構造的な予測の精度が劇的に高まるであろうことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．、７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【００８８】
さらなる二次構造予測法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４（１）：１５−９（１９９６））、「プロファイル分析（ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４（１３）：４３５５−８（１９８７））及び「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ（前記）及びＢｒｅｎｎｅｒ（前記）参照）が含まれる。
【００８９】
ビヒクル。本発明は、Ｎ末端、Ｃ末端又はアミノ酸残基のいずれか一つの側鎖を通してペプチドに付加された少なくとも１個のビヒクル（Ｖ１）の存在を必要とする。複数のビヒクルが使用されてもよく；例えば、各末端にＦｃが使用されてもよいし、又は一方の末端にＦｃ、他方の末端もしくは側鎖にＰＥＧ基が使用されてもよい。例示的なビヒクルには、
・Ｆｃドメイン；
・サルベージ受容体と結合する能力を有する他のタンパク質、ポリペプチド又はペプチド；
・ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；
・ロイシンジッパー（ＬＺ）ドメイン；
・５ｋＤ、２０ｋＤ及び３０ｋＤ  ＰＥＧを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、並びにその他の重合体；
・デキストラン；
並びに、延長された半減期及び／又はタンパク質分解もしくはクリアランスからの防御を提供することが当技術分野において既知のその他の分子が含まれる。
【００９０】
Ｆｃドメインは、好ましいビヒクルである。Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方に融合させることができる。Ｎ末端への融合が好ましい。
【００９１】
前述のように、Ｆｃバリアントは、本発明の範囲内の適切なビヒクルである。天然型Ｆｃは、サルベージ受容体との結合が維持されることを条件として、本発明によるＦｃバリアントを形成するよう広範に修飾され得る；例えば、ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８を参照のこと。このようなＦｃバリアントにおいては、本発明の融合分子にとって必要でない構造的特色又は機能的活性を提供する天然型Ｆｃの１個又はそれ以上の部位が除去されていてもよい。これらの部位は、例えば、残基の置換もしくは欠失、これらの部位への残基の挿入、又はこれらの部位を含有している部分の短縮により、除去できる。挿入又は置換される残基は、ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）又はＤ−アミノ酸のような改変されたアミノ酸であってもよい。Ｆｃバリアントが望ましい理由は多数存在するが、これらのいくつかを以下に記載する。例示的なＦｃバリアントは、以下のような分子及び配列を含む。
【００９２】
１．ジスルフィド結合形成に関与している部位が除去されている。このような除去により、本発明の分子を作製するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。この目的のためには、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを短縮するか、又はシステイン残基を欠失させるかもしくは他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）に置換することができる。特に、配列番号２のＮ末端の２０アミノ酸セグメントを短縮するか、又は配列番号２の７位及び１０位のシステイン残基を欠失させるかもしくは置換することが可能である。システイン残基が除去された場合ですら、単鎖Ｆｃドメインは、非共有結合的に維持された二量体Ｆｃドメインを形成することができる。
【００９３】
２．天然型Ｆｃが、選択された宿主細胞との適合性を高めるために修飾されている。例えば、プロリンイミノペプチダーゼのような大腸菌の消化酵素によって認識され得る、典型的な天然型ＦｃのＮ末端近傍のＰＡ配列を除去することが可能である。分子が大腸菌のような細菌細胞において組換え発現される場合には特に、Ｎ末端メチオニン残基を追加することもできる。配列番号２のＦｃドメインは、このようなＦｃバリアントの一つである。
【００９４】
３．選択された宿主細胞において発現された場合のＮ末端不均質性を防止するため、天然型ＦｃのＮ末端の一部が除去されている。この目的のためには、Ｎ末端の最初の２０個のアミノ酸残基のいずれか、特に１位、２位、３位、４位及び５位のものを欠失させることが可能である。
【００９５】
４．１個又はそれ以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解応答を付与する場合がある。このような残基は、欠失させるか、又はグリコシル化されない残基（例えば、アラニン）に置換することが可能である。
【００９６】
５．Ｃ１ｑ結合部位のような補体との相互作用に関与している部位が除去されている。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるか又は置換することが可能である。補体動員は、本発明の分子にとって有利ではない場合があり、従って、このようなＦｃバリアントによって回避してもよい。
【００９７】
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合に影響する部位が除去されている。天然型Ｆｃは、本発明の融合分子にとって必要でないある種の白血球との相互作用のための部位を有する場合があり、従って、除去してもよい。
【００９８】
７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野において既知である；例えば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関しては、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照のこと。これらの部位は、同様に、本発明の融合分子にとっては必要でなく、従って、除去してもよい。
【００９９】
８．天然型Ｆｃが非ヒト抗体に由来する場合、天然型Ｆｃはヒト化され得る。典型的には、天然型Ｆｃをヒト化するためには、非ヒト天然型Ｆｃの選択された残基が、ヒト天然型Ｆｃに通常見出される残基に置換されるであろう。抗体ヒト化のための技術は、当技術分野において周知である。
【０１００】
好ましいＦｃバリアントには、以下のものが含まれる。配列番号２（図３）において、１５位のロイシンはグルタミン酸に；９９位のグルタミン酸はアラニンに；そして１０１及び１０３位のリジンはアラニンに置換できる。さらに、１個又はそれ以上のチロシン残基を、フェニルアラニン残基に交換してもよい。
【０１０１】
別のビヒクルは、サルベージ受容体と結合する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片又は低分子（例えば、ペプチド模倣（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）化合物）であろう。例えば、１９９８年４月１４日発行のＰｒｅｓｔａらの米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているようなポリペプチドが、ビヒクルとして使用できる。ペプチドは、ＦｃＲｎサルベージ受容体との結合に関するファージディスプレイスクリーニング又はＲＮＡ−ペプチドスクリーニングによって選択してもよい。このようなサルベージ受容体結合化合物も、「ビヒクル」の意味に含まれ、本発明の範囲内である。このようなビヒクルは、（例えば、プロテアーゼにより認識される配列の回避による）増加した半減期及び（例えば、抗体ヒト化において発見されたような非免疫原性配列の優先による）減少した免疫原性に関して、選択されるべきである。
【０１０２】
前述のように、重合体ビヒクルもＶ１として使用することができる。ビヒクルとして有用な化学部分を付加するための様々な手段が、現在、利用可能であり、例えば、参照して完全に本明細書に組み込まれる、「Ｎ末端が化学的に修飾されたタンパク質組成物及び方法（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」なる表題の特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号を参照のこと。このＰＣＴ公報は、タンパク質のＮ末端への水溶性高分子の選択的な付加を特に開示している。
【０１０３】
好ましい重合体ビヒクルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、任意の便利な分子量のものであってよく、そして直鎖型であってもよいし又は分岐型であってもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤ、より好ましくは約５ｋＤから約５０ｋＤ、最も好ましくは約５ｋＤから約１０ｋＤの範囲であろう。ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）による、本発明の化合物の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ又はエステル基）に対するアシル化又は還元的アルキル化を介して、本発明の化合物に付加されるであろう。
【０１０４】
合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中での共役連結の形成を通して、相互に他方に対して反応性の特別の官能性を各々保持しているペプチド及びＰＥＧ部分を組み合わせることからなる。ペプチドは、従来の固相合成により容易に調製できる。ペプチドを、特定の部位において適切な官能基により「予備活性化」することができる。前駆体を精製され、完全に特徴決定した後、ＰＥＧ部分と反応させることができる。ペプチドのＰＥＧとのライゲーションは、通常水相で行い、逆相分析用ＨＰＬＣによって容易にモニタリングすることができる。ＰＥＧ化されたペプチドは、調製用ＨＰＬＣにより容易に精製でき、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザ脱着質量分析によって特徴決定できる。
【０１０５】
多糖重合体は、タンパク質修飾のため使用できるもう一つの型の水可溶性重合体である。デキストランは、α１−６連結によって主に連結されたグルコースの個々のサブユニットから構成された多糖重合体である。デキストラン自体は、多くの分子量範囲のものが入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量のものが容易に入手可能である。デキストランは、単独で又はもう一つのビヒクル（例えばＦｃ）と組み合わせて、ビヒクルとして本発明において使用するのに適した水溶性重合体である。例えば、ＷＯ９６／１１９５３及びＷＯ９６／０５３０９を参照のこと。治療用又は診断用の免疫グロブリンと共役したデキストランの使用は報告されており；例えば、参照して完全に本明細書に組み込まれる欧州特許公開第３１５４５６号を参照のこと。デキストランを本発明によるビヒクルとして使用する場合、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。
【０１０６】
リンカー。「リンカー」基が、場合により存在してもよい。存在する場合、これは、主としてスペーサーとしてはたらくため、化学構造は重大ではない。このリンカーは、好ましくはペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される。従って、好ましい実施形態において、このリンカーは、ペプチド結合によって連結された１個から３０個のアミノ酸（アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸より選択される）から構成される。当業者にはよく理解されるように、これらのアミノ酸のいくつかは、グリコシル化されうる。より好ましい実施形態において、この１個から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。さらに好ましくは、このリンカーは、グリシン及びアラニンのような立体障害を受けないアミノ酸の過半数から構成される。従って、好ましいリンカーは、ポリグリシン（特に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。その他のリンカーの具体例は、
【０１０７】
【化１７】
2004533249.tif 000041
である。上記の命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４とは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４０）を意味する。ＧｌｙとＡｌａとの組み合わせも好ましい。ここに示されたリンカーは、例示的なものであり；本発明の範囲内のリンカーは、はるかに長くてもよく、そしてその他の残基を含んでいてもよい。
【０１０８】
好ましいリンカーは、５個超のアミノ酸を含むアミノ酸リンカーであり、適切なリンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、リジン、トレオニン、セリン又はアスパラギン酸より選択されるアミノ酸を最大約５００個有する。約２０〜５０アミノ酸のリンカーが、最も好ましい。好ましいリンカーの一つの群は、式
【０１０９】
【化１８】
2004533249.tif 000042
［式中、ｘ１及びＸ３は、各々独立に、塩基性残基又は疎水性残基であり、かつｘ２及びｘ４は、各々独立に、疎水性残基である］のものである。特に好ましいリンカーは
【０１１０】
【化１９】
2004533249.tif 000043
である。
【０１１１】
非ペプチドリンカーも、可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−［式中、ｓ＝２〜２０］のようなアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル（例えばＣ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等のような任意の立体障害を起こさない基によって置換されていてもよい。例示的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカー
【０１１２】
【化２０】
2004533249.tif 000044
［式中、ｎは、リンカーが１００ｋＤから５０００ｋＤ、好ましくは１００ｋＤから５００ｋＤの分子量を有するようなものである］である。ペプチドリンカーは、前記と同様にして誘導体を形成するため改変されてもよい。
【０１１３】
誘導体。本発明者らは、化合物のペプチド部分及び／又はビヒクル部分の誘導体化も企図する。このような誘導体は、化合物の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改良するかもしれない。別法として、この部分により、化合物の望ましくない副作用等を排除するか又は弱めることもできる。例示的な誘導体は、以下のような化合物を含む。
【０１１４】
１．化合物又はその一部が環状である。例えば、ジスルフィド結合形成によって環化できる２個以上のＣｙｓ残基を（例えばリンカー内に）含有するよう、ペプチド部分を修飾することが可能である。
【０１１５】
２．化合物が架橋されているか又は分子間架橋可能にされている。例えば、１個のＣｙｓ残基を含有し、それにより類似分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるよう、ペプチド部分を修飾することが可能である。化合物は、以下に示された分子のように、Ｃ末端を通して架橋されてもよい。
【０１１６】
【化２１】
2004533249.tif 000045
式ＶＩＩＩ中、各「Ｖ１」は、典型的には、１本のＦｃドメイン鎖を表しうる。
【０１１７】
３．１個又はそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）が、非ペプチジル連結に交換されている。例示的な非ペプチジル結合は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−第二級アミン、並びにアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−（Ｒ６は低級アルキルである）］である。
【０１１８】
４．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端をアシル化するか又は置換型アミンへ修飾することが可能である。例示的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ’（−ＮＨ２を除く）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）［式中、Ｒ及びＲ１は、各々独立に、水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群より選択される１個から３個の置換基により置換されていてもよい］が含まれる。
【０１１９】
５．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端をエステル化又はアミド化することが可能である。例示的なＣ末端誘導体基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２［式中、Ｒ２は低級アルコキシである］又は−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素又はＣ１〜Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル）である］が含まれる。
【０１２０】
６．ジスルフィド結合が、もう一つの、好ましくはより安定な架橋部分（例えば、アルキレン）に交換されている。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９９３）Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．、３５７−９を参照のこと。
【０１２１】
７．１個又はそれ以上の個々のアミノ酸残基が修飾されている。以下に詳述されるように、様々な誘導体化剤が、選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応することが既知である。
【０１２２】
リジニル残基及びアミノ末端残基は、リジニル残基の電荷を逆転させるコハク酸又はその他のカルボン酸の無水物と反応させることができる。アルファ−アミノ含有残基の誘導体化のためのその他の適切な試薬には、メチルピコリンイミダート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｃｏｌｉｎｉｍｉｄａｔｅ）のようなイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド（ｃｈｌｏｒｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；及びトランスアミナーゼにより触媒されるグリオキシル酸塩との反応が含まれる。
【０１２３】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンを含むいくつかの従来の試薬のいずれか又は組み合わせとの反応によって修飾できる。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルカリ性条件下で反応を実施することを必要とする。さらに、これらの試薬は、アルギニンのイプシロン−アミノ基のみならず、リジンの基とも反応できる。
【０１２４】
チロシル残基の特異的な修飾は、広範囲に、特に、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入において研究されている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンが、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成させるために使用される。
【０１２５】
カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾できる。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基へ変換することができる。
【０１２６】
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基へ脱アミドされ得る。別法として、温和な酸性条件下でこれらの残基を脱アミドすることもできる。これらの残基は、いずれの形態も、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２７】
システイニル残基は、ジスルフィド結合を排除するか又は反対に架橋を安定化するため、アミノ酸残基又はその他の部分に交換することができる。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９参照。
【０１２８】
二官能剤による誘導体化は、ペプチド又はそれらの機能性誘導体の、水不溶性支持マトリックス又はその他の巨大分子ビヒクルへの架橋にとって有用である。一般的に使用されている架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）イミドエステル及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート（ｐｒｏｐｉｏｉｍｉｄａｔｅ）のような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成させる能力を有する光活性化可能中間体を与える。別法として、臭化シアンにより活性化された炭水化物のような反応性水不溶性マトリックス、並びに米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；及び第４，３３０，４４０号に記載された反応性基質が、タンパク質固定化のため利用される。
【０１２９】
炭水化物（オリゴ糖）基は、便利なことに、タンパク質内のグリコシル化部位であることが既知の部位へ付加され得る。一般に、Ｏ結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）残基又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基へ付加され、Ｎ結合型オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ［式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸でありうる］の一部であるアスパラギン（Ａｓｎ）残基へ付加される。Ｘは、好ましくは、プロリン以外の１９個の天然に存在するアミノ酸のいずれかである。Ｎ結合型及びＯ結合型のオリゴ糖の構造、並びに各型に見い出される糖残基は異なっている。両方に共通して見出される一つの糖の型は、（シアル酸と呼ばれる）Ｎ−アセチルノイラミン酸である。シアル酸は、通常、Ｎ結合型及びＯ結合型両方のオリゴ糖の末端残基であり、その負の電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を付与することができる。このような（１個又はそれ以上の）部位が、本発明の化合物のリンカーに組み込まれてもよく、好ましくは、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳのような哺乳動物細胞における）ポリペプチド化合物の組換え作製中に細胞によってグリコシル化される。しかしながら、このような部位は、当技術分野において既知の合成法又は半合成法によって、さらにグリコシル化されてもよい。
【０１３０】
その他の可能な修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ内の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニンのアルファ−アミノ基及びヒスチジン側鎖のメチル化が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、サンフランシスコ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ））、７９〜８６頁（１９８３）。
【０１３１】
本発明の化合物は、ＤＮＡレベルで変化させることもできる。化合物の任意の部分のＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞とより適合性のコドンへ変化させることができる。好ましい宿主細胞である大腸菌に関して、最適化されたコドンは、当技術分野において既知である。制限部位を排除するため、又は選択された宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを援助し得るサイレント制限部位を含めるため、コドンを置換してもよい。ビヒクル、リンカー及びペプチドのＤＮＡ配列を、前述の配列変化のいずれかを含むよう修飾することができる。
【０１３２】
作成法
本発明の化合物は、主として、組換えＤＮＡ技術を使用して形質転換宿主細胞において作成することができる。そのためには、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、適切な制限酵素を使用して、ペプチドをコードする配列をＤＮＡから切り出すことができる。別法として、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）法のような化学合成技術を使用して、ＤＮＡ分子を合成してもよい。また、これらの技術の組み合わせを使用することもできる。
【０１３３】
本発明は、適切な宿主においてペプチドを発現することができるベクターも含む。ベクターは、適切な発現調節配列に機能的に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子がベクターへ挿入される前又は後に、この機能的な連結を達成する方法は、周知である。発現調節配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、終止シグナル、キャッピングシグナル、ポリアデニル化シグナル及び転写又は翻訳の調節に関与するその他のシグナルが含まれる。
【０１３４】
内部にＤＮＡ分子を有する得られたベクターが、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、当技術分野において周知の方法を使用して実施できる。
【０１３５】
多数の利用可能かつ周知の宿主細胞のいずれかを、本発明の実施において使用することができる。特定の宿主の選択は、当技術分野において認識されている多数の要因に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされたペプチドの毒性、形質転換効率、ペプチド回収の容易さ、発現特徴、生物学的安全性及びコストが含まれる。全ての宿主が、特定のＤＮＡ配列の発現のために等しく有効ではないことを理解し、これらの要因のバランスをとらなければならない。これらの一般的な指針として、有用な微生物宿主には、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｐ．のような）細菌、（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．のような）酵母及びその他の真菌、昆虫、植物、（ヒトを含む）哺乳動物の培養細胞又は当技術分野において既知のその他の宿主が含まれる。
【０１３６】
次に、形質転換宿主を培養し精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるよう、従来の発酵条件下で培養することができる。このような発酵条件は、当技術分野において周知である。最後に、当技術分野において周知の方法によって、培養物からペプチドを精製する。
【０１３７】
この化合物は、合成法によって作成されてもよい。例えば、固相合成技術を使用することができる。適切な技術は、当技術分野において周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９７３）、Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、３３５〜６１頁（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ及びＰａｎａｙｏｔｉｓ編）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓら（１９８５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ（１９６９）、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら（１９７６）、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２：１０５−２５３；並びにＥｒｉｃｋｓｏｎら（１９７６）、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２：２５７−５２７に記載されたものを含む。固相合成は、小さなペプチドを作成する最も費用対効果の高い方法であるため、個々のペプチドを作成する好ましい技術である。
【０１３８】
誘導体化されたペプチドを含有しているか又は非ペプチド基を含有している化合物は、周知の有機化学技術によって合成することができる。
【０１３９】
化合物の使用
本発明の化合物は、Ｂ細胞により媒介される自己免疫疾患の治療において特に有用であろう。特に、本発明の化合物は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むループス並びにループスに関連した疾患及び状態の治療、予防、寛解、診断又は予後判定において有用であろう。その他の好ましい適応症には、Ｂ細胞リンパ腫を含む、Ｂ細胞により媒介される癌が含まれる。
【０１４０】
本発明の化合物は、関節の炎症状態を治療するためにも使用され得る。関節の炎症状態は、世界中の数百万人の人々が様々な程度に罹患し障害されている慢性関節疾患である。慢性関節リウマチとは、滑膜に由来するパンヌスと呼ばれる増殖性、侵襲性の結合組織によって軟骨及び骨が徐々に侵食される関節の疾患である。この疾患は、包、腱鞘及び腱のような関節周囲構造のみならず、浅在筋膜、心臓血管系、肺、脾臓、リンパ節、骨格筋、神経系（中枢及び末梢）並びに眼のような関節外組織も侵す場合がある（Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ（１９８５）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ’ｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｋｉｓｓａｎｅ編、ＩＩ：１８２８）。骨関節炎とは、関節軟骨の変性性の変化、並びに関節周囲の骨及び軟骨の反応性の増殖を特徴とする一般的な関節疾患である。骨関節炎は、異化及び同化の刺激に対する軟骨細胞の不適切な応答によって生じうる、細胞により媒介される活動性の過程である。報告によると、初期の骨関節炎においては、関節軟骨のいくつかのマトリックス分子に変化が起こる（Ｔｈｏｎａｒら（１９９３）、Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ編、１９：６３５−６５７及びＳｈｉｎｍｅｉら（１９９２）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、３５：１３０４−１３０８）。ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１Ｒ及びそれらのモジュレーターは、これら及び関連状態の治療において有用であると考えられる。
【０１４１】
本発明の化合物は、
・急性膵炎；
・ＡＬＳ；
・アルツハイマー病；
・喘息；
・アテローム性動脈硬化症；
・自己免疫性溶血性貧血；
・癌、特にＢ細胞に関連した癌；
・悪液質／食欲不振；
・慢性疲労症候群；
・肝硬変（例えば、原発性胆汁性肝硬変）；
・糖尿病（例えば、インスリン糖尿病）；
・発熱；
・ＩｇＡ糸球体腎炎及び原発性糸球体腎炎を含む糸球体腎炎；
・グッドパスチャー症候群；
・ギヤン−バレー症候群；
・移植片対宿主病；
・橋本甲状腺炎；
・出血性ショック；
・痛覚過敏；
・炎症性腸疾患；
・骨関節炎、乾癬性関節炎及び慢性関節リウマチを含む関節の炎症状態；
・挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又はその他の疾患過程に起因する炎症状態；
・インスリン依存性糖尿病；
・脳虚血を含む虚血性傷害（例えば、各々、神経変性に至る場合がある外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳傷害）；
・学習障害；
・肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）；
・多発性骨髄腫；
・多発性硬化症；
・重症筋無力症；
・骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬ及びＣＭＬ）並びにその他の白血病；
・ミオパシー（例えば、特に敗血症における筋肉タンパク質代謝）；
・神経毒性（例えば、ＨＩＶによって誘導されるようなもの）；
・骨粗鬆症；
・疼痛；
・パーキンソン病；
・天疱瘡；
・多発性筋炎／皮膚筋炎；
・自己免疫性肺炎症を含む肺炎症；
・早産；
・乾癬；
・ライター病；
・再灌流障害；
・敗血症性ショック；
・放射線療法の副作用；
・シェーグレン症候群；
・睡眠障害；
・顎関節症；
・特発性血小板減少症及び自己免疫性新生児血小板減少症を含む血小板減少症；
・腫瘍転移；
・ブドウ膜炎；並びに
・脈管炎
を含む多数のさらなる疾患及び障害の治療においても有用であるかもしれない。
【０１４２】
本発明の化合物は、単独で投与されてもよいし、又は鎮痛剤、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）並びに任意の免疫及び／もしくは炎症モジュレーターを含む、治療的に有効な量の他の薬物と組み合わせて投与されてもよい。従って、本発明の化合物は、以下のものと共に投与されてもよい。
【０１４３】
・エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標））、ｓＴＮＦ−ＲＩ、オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、Ｄ２Ｅ７及びレミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）のようなＴＮＦアンタゴニストを含むＴＮＦ／ＴＮＦ受容体ファミリーの他のメンバーのモジュレーター
・神経増殖因子（ＮＧＦ）モジュレーター
・アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）のようなＩＬ−１ｒａ分子並びにＩＬ−１Ｈｙ１及びＩＬ−１Ｈｙ２のようなより最近発見されたＩＬ−１ｒａ様分子；１９９８年１２月１日発行の米国特許第５，８４４，０９９号に記載されたようなＩＬ−１「トラップ」分子；ＩＬ−１抗体；可溶型ＩＬ−１受容体等を含むＩＬ−１阻害剤
・ＩＬ−６阻害剤（例えば、ＩＬ−６に対する抗体）
・ＩＬ−８阻害剤（例えば、ＩＬ−８に対する抗体）
・ＩＬ−１８阻害剤（例えば、ＩＬ−１８結合タンパク質、可溶型ＩＬ−１８受容体又はＩＬ−１８抗体）
・インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）モジュレーター
・インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）及びそれらのモジュレーター
・トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−βファミリーメンバー及びＴＧＦ−βモジュレーター
・繊維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０及びＦＧＦモジュレーター
・オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、ＯＰＧアナログ、骨保護（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）剤及びＯＰＧリガンド（ＯＰＧ−Ｌ）に対する抗体
・副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ＰＴＨ断片及びＰＴＨ断片が組み込まれた分子（例えば、ＰＴＨ（１−３４）−Ｆｃ）のような骨同化剤
・ＰＡＦアンタゴニスト
・ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ関連分子（例えば、ＫＧＦ−２）及びＫＧＦモジュレーター
・セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）及びビオックス（Ｖｉｏｘｘ）（登録商標）のようなＣＯＸ−２阻害剤
・プロスタグランジンアナログ（例えば、プロスタグランジンＥ）
・マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）モジュレーター
・誘導型ＮＯＳのモジュレーターを含む一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）モジュレーター
・グルココルチコイド受容体のモジュレーター
・グルタミン酸受容体のモジュレーター
・リポ多糖（ＬＰＳ）レベルのモジュレーター
・癌遺伝子（例えば、ｆｏｓ、ｊｕｎ）の阻害剤及びインターフェロンを含む抗癌剤
・ノルアドレナリン並びにそのモジュレーター及び模倣体
医薬組成物
一般。本発明は、本発明の化合物の医薬組成物を使用する方法も提供する。このような医薬組成物は、注射投与用であってもよいし、又は経口、肺内、鼻腔内、経皮もしくはその他の投与形態用であってもよい。一般に、本発明は、医薬適合性の希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び／又は担体と共に、有効量の本発明の化合物を含む医薬組成物を包含する。このような組成物は、様々な緩衝剤（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、トゥイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）並びに賦形物質（例えば、乳糖、マンニトール）のような添加剤；ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のような重合体化合物の粒状調製物又はリポソームへの材料の取り込みを含む。ヒアルロン酸が使用されてもよく、これは、循環系における持続性を促進するという効果を有しうる。このような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼしうる。例えば、参照して完全に本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、イーストン、ペンシルヴェニア州（Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）１８０４２）１４３５〜１７１２頁を参照のこと。この組成物は、液体の形態で調製されてもよいし又は凍結乾燥形態のような乾燥粉末として調製されてもよい。経皮製剤と同様に、埋め込み可能徐放性製剤も企図される。
【０１４４】
経口剤形
参照して完全に本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．イーストン、ペンシルヴェニア州（Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）１８０４２のチャプター８９に一般に記載されている経口固体剤形が、本発明における使用のため企図される。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくはロゼンジ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、カシェ剤又はペレット剤（ｐｅｌｌｅｔｓ）が含まれる。（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号で報告されたプロテイノイドマイクロスフェアのような）リポソーム又はプロテイノイドへの封入も、本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。リポソーム封入を使用してもよく、リポソームは、様々な重合体により誘導体化されてもよい（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬のための可能な固体剤形の説明は、参照して完全に本明細書に組み込まれる、Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編のＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９）のチャプター１０（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．）に与えられている。一般に、この製剤は、本発明の化合物と、胃環境からの保護を可能にし腸内で生物学的活性を有する材料を放出する不活性成分とを含むであろう。
【０１４５】
前記の本発明の化合物の経口剤形も、特に企図される。必要であれば、化合物は、経口送達が有効であるよう、化学的に修飾されてもよい。一般に、企図される化学的修飾は、（ａ）タンパク質分解の阻害；及び（ｂ）胃又は腸から血流への取り込み、を許容する少なくとも１個の部分を、化合物分子自体へ付加することである。化合物の全体的な安定性の増加及び体内循環時間の増加も望まれる。本発明における共有結合的に付加されるビヒクルとして有用な部分も、この目的のため使用され得る。このような部分の例には、ＰＥＧ、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが含まれる。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ、Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ（１９８１）、Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ及びＲｏｂｅｒｔｓ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、ニューヨーク州（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、３６７〜８３頁；Ｎｅｗｍａｒｋら（１９８２）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−９を参照のこと。使用できるその他の重合体は、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。前述のように、薬学的使用のため好ましいのは、ＰＥＧ部分である。
【０１４６】
経口送達剤形に関して、本発明の治療用化合物の吸収を増強するための担体として、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）のような修飾された脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。ＳＮＡＣを使用したヘパリン製剤の臨床的有効性は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより実施された第二相治検において証明されている。米国特許第５，７９２，４５１号「経口薬物送達組成物及び方法（Ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」を参照のこと。
【０１４７】
本発明の化合物は、粒子サイズ約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の微小多重粒子（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ）として製剤中に含まれてもよい。カプセル投与用の材料は、粉末、軽度に圧縮されたプラグ又はさらには錠剤として製剤化されてもよい。この治療薬は、圧縮によって調製されてもよい。
【０１４８】
着色剤及び芳香剤は、全て、含まれていてもよい。例えば、タンパク質（又は誘導体）を（リポソーム又はマイクロスフェアへの封入等により）製剤化し、次いで着色剤及び芳香剤を含有している冷飲料のような食品にさらに含有させることもできる。
【０１４９】
不活性材料により本発明の化合物を希釈すること、又はその容積を増加させることが可能である。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α−乳糖、無水乳糖、セルロース、ショ糖、修飾型デキストラン及びデンプンが含まれ得る。第三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含むある種の無機塩も、増量剤として使用できる。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤は、ファストフロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ）、エンデックス（Ｅｍｄｅｘ）、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、エンコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）及びアビセル（Ａｖｉｃｅｌｌ）である。
【０１５０】
治療薬の固体剤形への製剤化において崩壊剤が含まれてもよい。崩壊剤として使用される材料には、以下に限定されないが、デンプンに基づく市販の崩壊剤エクスプロタブ（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）を含むデンプンが含まれる。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性（ａｃｉｄ）カルボキシメチルセルロース、天然海綿及びベントナイトは、全て、使用できる。崩壊剤のもう一つの型は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末ゴムが、崩壊剤及び結合剤として使用されてもよく、これらには、天草、カラヤゴム又はトラガカントゴムのような粉末ゴムが含まれ得る。アルギン酸及びそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
【０１５１】
硬い錠剤が形成されるよう治療剤をつなぎ合わせるために結合剤が使用されてもよく、これらには、アラビアゴム、トラガカントゴム、デンプン及びゼラチンのような天然生成物由来の材料が含まれる。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の両方は、治療薬を粒状にするためアルコール性溶液中で使用されうる。
【０１５２】
製剤化過程におけるスティッキングを防止するため、抗摩擦剤が、治療薬の製剤化において含まれてもよい。滑沢剤が、治療薬とダイ壁との間の層として使用されてもよく、これらには、以下に限定されないが、そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油並びにロウが含まれ得る。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）４０００及び６０００のような可溶性の潤滑剤も使用できる。
【０１５３】
製剤化中の薬物の流動性を改良し、圧縮中の再編成を補助しうる流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔｓ）が添加されてもよい。この流動促進剤には、デンプン、タルク、発熱性シリカ及びシリコアルミネート水和物（ｈｙｄｒａｔｅｄ  ｓｉｌｉｃｏａｌｕｍｉｎａｔｅ）が含まれうる。
【０１５４】
水性環境への本発明の化合物の溶解を補助するため、湿潤剤として界面活性剤が添加されてもよい。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムのようなアニオン界面活性剤が含まれうる。カチオン界面活性剤が使用されてもよく、これらには、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが含まれうる。界面活性剤として製剤中に含まれる可能性のある非イオン性界面活性剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、単独で、又は種々の比率の混合物として、このタンパク質又は誘導体の製剤中に存在しうる。
【０１５５】
この化合物の取り込みを増強するための添加剤が、製剤に含まれていてもよい。この特性を有する可能性のある添加剤は、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
【０１５６】
放出制御製剤が望ましい場合もある。拡散又は浸出いずれかのメカニズムによる放出を許容する不活性マトリックス、例えばゴムに、本発明の化合物を組み込むことができる。徐々に変性するマトリックス、例えばアルギン酸塩、多糖を、製剤へ組み込むこともできる。本発明の化合物の制御放出のもう一つの型は、オロス（Ｏｒｏｓ）治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものである。即ち、浸透圧作用によって水が浸入し単一の小さな開口部から薬物を押し出すことを可能にする半透膜に、その薬物が包囲される。いくつかの腸溶性コーティングも、放出遅延効果を有する。
【０１５７】
その他のコーティングも、製剤化のため使用できる。これらには、コーティングパンにおいて適用できる多様な糖が含まれる。この治療剤は、フィルムコーティング錠として与えられてもよく、この場合に使用される材料は、二群に分類される。第一は、非腸溶性材料であり、これらには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン（ｐｒｏｖｉｄｏｎｅ）及びポリエチレングリコールが含まれる。第二の群は、一般的にはフタル酸のエステルである腸溶性材料からなる。
【０１５８】
最適なフィルムコーティングを提供するため、材料の混合物が使用されてもよい。フィルムコーティングは、パンコーティング装置において、流動床において、又は圧縮コーティングにより実施され得る。
【０１５９】
肺内送達形態。本発明のタンパク質（又はそれらの誘導体）の肺内送達も、本発明において企図される。このタンパク質（又は誘導体）は、吸入により哺乳動物の肺に送達され、肺上皮裏打ちを通過して血流へ移行する。これに関する他の報告には、Ａｄｊｅｉら、Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９；Ａｄｊｅｉら（１９９０）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９）、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９）、Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６−１２（α１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら（１９８９）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら（１９９０年３月）、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）並びにＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる。
【０１６０】
以下に限定されないが、全て当業者に周知である噴霧器、定量噴霧式吸入器及び粉末吸入器を含む、治療用生成物の肺内送達用に設計された広範囲の機械的装置が、本発明の実施における使用のため企図される。本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの具体例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．（セントルイス、ミズーリ州（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ））製のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器；Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（エングルウッド、コロラド州（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ））製のＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器；Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．（リサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ州（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ））製のＶｅｎｔｏｌｉｎ定量噴霧式吸入器；並びにＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．（ベッドフォード、マサチューセッツ州（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））製のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【０１６１】
このような装置は、全て、本発明の化合物の分配に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、利用される装置の型に特異的であり、療法において有用な希釈剤、佐剤及び／又は担体に加え、適切な推進材料の使用を含んでいてもよい。
【０１６２】
本発明の化合物は、最も有利には、遠位肺への最も効果的な送達のため、１０μｍ（又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒子サイズを有する粒状形態で調製されるべきである。
【０１６３】
医薬適合性の担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ショ糖、乳糖及びソルビトールのような炭水化物が含まれる。製剤中に使用するためのその他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣが含まれ得る。天然又は合成の界面活性剤を使用することができる。（このタンパク質又はアナログの誘導体化における使用とは別に）ＰＥＧを使用してもよい。シクロデキストランのようなデキストランを使用することができる。胆汁酸塩及びその他の関連エンハンサーを使用してもよい。セルロース及びセルロース誘導体を使用してもよい。緩衝液製剤における使用のように、アミノ酸を使用してもよい。
【０１６４】
また、リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフェア、包接錯体又はその他の型の担体の使用も、企図される。
【０１６５】
ジェット式又は超音波式いずれかの噴霧器と共に使用するのに適した製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり生物学的活性を有するタンパク質約０．１ｍｇから２５ｍｇという濃度で水に溶解した本発明の化合物を含むであろう。この製剤は、（例えば、タンパク質の安定化及び浸透圧の制御のため）緩衝液及び単糖を含んでいてもよい。噴霧器製剤は、エアロゾル形成中の溶液の原子化によって引き起こされるタンパク質の表面により誘導される凝集を減少させるか又は防止するため、界面活性剤を含有していてもよい。
【０１６６】
定量噴霧式吸入装置と共に使用するための製剤は、一般に、界面活性剤の補助により推進剤に懸濁した本発明の化合物を含有している微細に粉砕された粉末を含むであろう。この推進剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン又はそれらの組み合わせを含む、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン又は炭化水素のような、この目的のために利用される任意の従来の材料であってよい。適切な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタン及びダイズレシチンが含まれる。オレイン酸も、界面活性剤として有用であるかもしれない。
【０１６７】
粉末吸入装置から分配するための製剤は、本発明の化合物を含有している微細に粉砕された乾燥粉末を含むであろう。そして、それらは、装置からの粉末の分散を助長する量、例えば製剤の５０重量％から９０重量％の、乳糖、ソルビトール、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はキシリトールのような賦形剤を含んでいてもよい。
【０１６８】
鼻腔内送達形態。本発明の化合物の鼻腔内送達も、企図される。鼻腔内送達では、肺のように生成物の沈着を必要とすることなく、治療用生成物を鼻へ投与した後、タンパク質が直接血流へ移行することができる。鼻腔内送達用の製剤には、デキストラン又はシクロデキストランを含むものが含まれる。その他の粘膜を介した輸送による送達も、企図される。
【０１６９】
投薬量。前記状態を治療するための方法に含まれる投薬計画は、薬物の作用を修飾する様々な要因、例えば患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、感染の重度、投与の時間並びにその他の臨床的要因を考慮して、主治医によって決定されるであろう。一般に、その１日計画は、体重１キログラム当たり０．１マイクログラムから１０００マイクログラムの本発明の化合物、好ましくは１キログラム当たり０．１マイクログラムから１５０マイクログラムという範囲にあるべきである。
【０１７０】
特定の好ましい実施形態
本発明者らは、下記表４に列挙された好ましいペプチドのための好ましい構造を決定した。「Λ」という記号は、本明細書に記載されたリンカーのいずれかであってもよいし、又は単に通常のペプチド結合を表してもよい（即ち、リンカーが存在しない）。タンデムのリピート及びリンカーは、明瞭のためダッシュによって隔離されて示されている。
【０１７１】
【表４】
2004533249.tif 000046
【０１７２】
「Ｖ１」は、本明細書において既に定義されたようなＦｃドメインである。表４に列挙されたものに加え、本発明者らは、Ｆｃ二量体の各鎖が異なるペプチド配列に連結されている異種二量体、例えば各Ｆｃが表２から選択された異なる配列に連結されているものをさらに企図する。
【０１７３】
本発明の化合物は、全て、ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５０４４に記載された方法によって調製できる。
【０１７４】
限定ではなく例示的である以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１７５】
ペプチド
ペプチドファージディスプレイ
１．磁性ビーズ調製
Ａ．Ｆｃ−ＴＡＬＬ−１の磁性ビーズへの固定化
製造業者からのビーズストック１００μｌ当たりＦｃ−ＴＡＬＬ−１  ８μｇという濃度で、組換えＦｃ−ＴＡＬＬ−１タンパク質をプロテインＡダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（Ｄｙｎａｌ）へ固定化した。磁石を使用してチューブの片側へビーズを引き込み、ピペットで液体を除去することにより、ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させた。上記の濃度でＦｃ−ＴＡＬＬ−１タンパク質を洗浄されたビーズへ添加し、室温で１時間回転させながらインキュベートした。次いで、最終濃度１％でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、回転させながら４℃で一晩インキュベートすることにより、Ｆｃ−ＴＡＬＬ−１でコーティングされたビーズをブロッキングした。次いで、得られたＦｃ−ＴＡＬＬ−１でコーティングされたビーズを、ＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン−２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄した後、選択手法に供した。
【０１７６】
Ｂ．ネガティブ選択ビーズ調製
さらにネガティブ選択のためのビーズも調製した。各パニング条件のため、製造業者からのビーズストック２５０μｌを、Ｆｃ−ＴＡＬＬ−１とのインキュベーション工程を省略した点を除き、上記の手法（セクション１Ａ）に供した。最後の洗浄工程において、ビーズを５０μｌに５等分した。
【０１７７】
２．ＴＡＬＬ−１結合ファージの選択
Ａ．全体的な戦略
２個の繊維状ファージライブラリー、ＴＮ８−ＩＸ（５×１０９個の独立の形質転換体）及びＴＮ１２−Ｉ（１．４×１０９個の独立の形質転換体）（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．）を、ＴＡＬＬ−１結合ファージを選択するために使用した。各ライブラリーを、ｐＨ２溶出又は「ビーズ溶出」（セクション２Ｅ）のいずれかに供した。従って、４つの異なるパニング条件を、ＴＡＬＬ−１プロジェクトのために実施した（ｐＨ２溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、ビーズ溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、ｐＨ２溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ及びビーズ溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ）。各条件について３回の選択を実施した。
【０１７８】
Ｂ．ネガティブ選択
各パニング条件について、約１００ランダムライブラリー当量（ＴＮ８−ＩＸについては５Ｘ１０１１ｐｆｕ、ＴＮ１２−Ｉについては１．４Ｘ１０１１ｐｆｕ）を、ライブラリーストックから等分し、ＰＢＳＴで３００μｌに希釈した。ネガティブ選択用に調製されたビーズ（セクション１Ｂ）の最初の５０μｌアリコートから最後の洗浄液を引き出した後、３００μｌの希釈されたライブラリーストックをビーズに添加した。得られた混合物を、回転させながら室温で１０分間インキュベートした。ファージ上清を磁石を使用して引き出し、もう一回のネガティブ選択工程のため、第二の５０μｌアリコートに添加した。このようにして、５回のネガティブ選択工程を実施した。
【０１７９】
Ｃ．Ｆｃ−ＴＡＬＬ−１タンパク質でコーティングされたビーズを使用した選択
最後のネガティブ選択工程（セクション１Ｂ）後のファージ上清を、最後の洗浄工程（セクション１Ａ）後のＦｃ−ＴＡＬＬ−１でコーティングされたビーズに添加した。この混合物を、回転させながら室温で２時間インキュベートし、特異的なファージを標的タンパク質に結合させた。上清を廃棄した後、ビーズをＰＢＳＴで７回洗浄した。
【０１８０】
Ｄ．結合ファージのｐＨ２溶出
最後の洗浄工程（セクション２Ｃ）の後、ＣＢＳＴ（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％トゥイーン−２０、ｐＨ２）２００μｌを添加することにより、結合ファージを磁気ビーズから溶出させた。室温で５分間インキュベートした後、溶出したファージを含有している液体を引き出し、もう一つのチューブへ移した。ＣＢＳＴ２００μｌを添加し、５分間インキュベートすることにより、溶出工程を再び繰り返した。２回の溶出工程からの液体を合わせ、ｐＨを中和するため２Ｍトリス溶液（ｐＨ８）１００μｌを添加した。Ｍｉｎ  Ａ塩溶液（６０ｍＭ  Ｋ２ＨＰ０４、３３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７．６ｍＭ（ＮＨ４）ＳＯ４及び１．７ｍＭクエン酸ナトリウム）５００μｌを添加して、最終容量を１ｍｌにした。
【０１８１】
Ｅ．「ビーズ溶出」
最後の洗浄液を引き出した後（セクション２Ｃ）、Ｍｉｎ  Ａ塩溶液１ｍｌをビーズに添加した。このビーズ混合物を、感染（セクション３Ａ及び３Ｂ）のため濃縮細菌試料に直接添加した。
【０１８２】
３．増幅
Ａ．播種細胞の調製
新鮮な大腸菌（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）培養物を、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有しているＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．５になるまで増殖させた。各パニング条件について、２０ｍｌのこの培養物を氷上で冷却し、遠心分離した。細菌ペレットを、Ｍｉｎ  Ａ塩溶液１ｍｌに再懸濁させた。
【０１８３】
Ｂ．形質導入
異なる溶出法（セクション２Ｄ及び２Ｅ）からの各混合物を、濃縮細菌試料（セクション３Ａ）に添加し、１５分間３７℃でインキュベートした。ＮＺＣＹＭ培地（２ＸＮＺＣＹＭ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）２ｍｌを各混合物へ添加し、室温で１５分間インキュベートした。得られた４ｍｌの溶液を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有している大型ＮＺＣＹＭ寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８４】
Ｃ．ファージ採集
大型ＮＺＣＹＭ寒天プレート上で一晩増殖させた各細菌／ファージ混合物（セクション３Ｂ）を、ＬＢ培地３５ｍｌ中に剥離し、寒天プレートをさらに３５ｍｌのＬＢ培地でさらに濯いだ。得られたＬＢ培地中の細菌／ファージ混合物を、細菌をペレット化するため遠心分離した。ファージ上清５０ｍｌを新鮮なチューブに移し、ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、３．５Ｍ酢酸アンモニウム）１２．５ｍｌを添加し、ファージを沈殿させるため２時間氷上でインキュベートした。沈殿したファージを遠心分離し、ファージ再懸濁緩衝液（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭトリスｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）６ｍｌに再懸濁させた。このファージ溶液を、残存している細菌を遠心分離し、ＰＥＧ溶液１．５ｍｌを添加することにより再度ファージを沈殿させることにより、さらに精製した。遠心分離工程の後、ファージペレットをＰＢＳ４００μｌに再懸濁させた。この溶液を、残存する細菌片を除去するため、最後の遠心分離に供した。得られたファージ調製物を、標準的なプラーク形成アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、第３版）によって力価測定した。
【０１８５】
４．さらなる２回の選択及び増幅
２回目においては、選択及び増幅の工程（セクション２及び３）を実施するために、１回目からの増幅されたファージ（１０１０ｐｆｕ）（セクション３Ｃ）をインプットファージとして使用した。次に、２回目からの増幅されたファージ（１０１０ｐｆｕ）を、３回目の選択及び増幅（セクション２及び３）を実施するため、インプットファージとして使用した。３回目の溶出工程（セクション２Ｄ及び２Ｅ）の後、プラーク形成アッセイ（セクション３Ｃ）の場合と同様に、溶出したファージの小さな画分を播種した。個々のプラークを拾い上げ、各ウェルにＴＥ緩衝液１００μｌを含有している９６穴マイクロタイタープレートに入れた。ファージをＴＥ緩衝液中に溶出させるため、これらのマスタープレートを３７℃のインキュベーター内で１時間インキュベートした。
【０１８６】
５．クローン分析（ファージＥＬＩＳＡ及び配列決定）
ファージＥＬＩＳＡ及び配列決定法により、ファージクローンを分析した。これら２つのアッセイからの結果の組み合わせに基づき、配列のランキングを行った。
【０１８７】
Ａ．ファージＥＬＩＳＡ
ＯＤ６００が０．５に達するまで、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’培養物を増殖させた。この培養物３０μｌを、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに等分した。溶出したファージ（セクション４）１０μｌを各ウェルに添加し、室温で１５分間細菌に感染させた。１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有しているＬＢ培地１３０μｌを各ウェルに添加した。次いで、マイクロタイタープレートを３７℃で一晩インキュベートした。４℃で一晩かけて９６穴マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレート（ＮＵＮＣ）に組換えＴＡＬＬ−１タンパク質（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）をコーティングした。対照として、組換えＦｃ−Ｔｒａｉｌタンパク質を、ＴＡＬＬ−１タンパク質と同じモル濃度で別のマキシソーププレートにコーティングした。
【０１８８】
翌日、これらのタンパク質でコーティングされたマキシソーププレート中の液体を廃棄し、３７℃で１時間２％ＢＳＡ溶液３００μｌで各ウェルをブロッキングした。ＢＳＡ溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。最後の洗浄工程の後、ＰＢＳＴ５０μｌを、それらのタンパク質でコーティングされたマキシソーププレートの各ウェルへ添加した。９６穴マイクロタイタープレート中の５０μｌの一晩培養物を、各々、ＴＡＬＬ−１でコーティングされたプレート及び対照Ｆｃ−Ｔｒａｉｌでコーティングされたプレートの対応するウェルに移した。２種類のプレート中の１００μｌの混合物を、室温で１時間インキュベートした。液体をマキシソーププレートから廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した。ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１：７，５００に希釈し、希釈された溶液１００μｌを、室温１時間インキュベートするため、マキシソーププレートの各ウェルに添加した。この液体を再び廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで７回洗浄した。呈色反応を起こさせるためテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウェルに添加し、５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４溶液５０μｌにより反応を停止させた。ＯＤ４５０を、プレートリーダ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。
【０１８９】
Ｂ．ファージクローンの配列決定
各ファージクローンについて、配列決定鋳型をＰＣＲ法により調製した。以下のオリゴヌクレオチド対を、約５００ヌクレオチドの断片を増幅するために使用した。
【０１９０】
【化２２】
2004533249.tif 000047
以下の混合物を各クローンのため調製した。
【０１９１】
【表５】
2004533249.tif 000048
【０１９２】
サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、以下のプログラムを実行するために使用した：９４℃５分；［９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒］×３０サイクル；７２℃７分；４℃に冷却。各ＰＣＲ反応物５μｌを１％アガロースゲル上で泳動することにより、このＰＣＲ産物をチェックした。各反応からの残りの４５μｌのＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従い、キアクイックマルチウェル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して清浄化した。次いで、得られた産物を、製造業者により推奨されたプロトコルに従い、ＡＢＩ  ３７７シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して配列決定した。
【０１９３】
６．配列ランキング及びコンセンサス配列決定
Ａ．配列ランキング
可変ヌクレオチド配列から翻訳されたペプチド配列（セクション５Ｂ）を、ＥＬＩＳＡデータと相関させた。ＴＡＬＬ−１でコーティングされたウェルにおいて高いＯＤ４５０を示し、Ｆｃ−Ｔｒａｉｌでコーティングされたウェルで低いＯＤ４５０を示したクローンを、より重要であると見なした。複数回存在する配列も、重要であると見なした。ペプチド又はペプチボディとしてのさらなる分析のため、これらの基準に基づき候補配列を選択した。ＴＮ８−ＩＸライブラリー及びＴＮ１２−Ｉライブラリーから、それぞれ５個及び９個の候補ペプチド配列が選択された。
【０１９４】
Ｂ．コンセンサス配列決定
ＴＮ１２−Ｉライブラリーから選択された配列の大多数が、極めて保存されたＤＢＬモチーフを含有していた。このモチーフは、ＴＮ８−ＩＢライブラリーから選択された配列にも観察された。もう一つのモチーフＰＦＰＷＥ（配列番号１１０）も、ＴＮ８−ＩＢライブラリーから入手された配列に観察された。
【０１９５】
コンセンサスペプチドＦＨＤＣＫＷＤＬＬＴＫＱＷＶＣＨＧＬ（配列番号５８）を、ＤＢＬモチーフに基づき設計した。ＴＮ１２−Ｉライブラリーに由来するペプチドが最も活性の高いペプチドであったため、上記のランキング基準（セクション５Ａ）に基づき、上位２６個のペプチド配列をＤＢＬモチーフにより整列化した。下線が施された「コアアミノ酸配列」は、各位置に最も多く存在するアミノ酸を決定することにより入手された。コア配列に隣接している２個のシステインは、ＴＮ１２−Ｉライブラリーにおいて固定されたアミノ酸であった。コンセンサスペプチド内のアミノ酸配列の残りは、候補ペプチドの１つであるＴＡＬＬ−１−１２−１０（表２、配列番号３７）から採られたものである。このコンセンサス配列に由来するペプチド及びペプチボディは、Ｂ細胞増殖アッセイにおいて最も活性が高かった。
【実施例２】
【０１９６】
ペプチボディ
各ペプチドの単量体がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とインフレームで融合している１２個のＴＡＬＬ−１阻害性ペプチボディのセット（表５）を構築した。各ＴＡＬＬ−１阻害性ペプチボディは、そのペプチドと、５個のグリシン残基及び１個のバリン残基で構成されたリンカーとをコードする二重鎖をＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片として生成させるため、表６に示されたオリゴヌクレオチド対をアニール化することにより構築された。これらの二重鎖分子を、やはりＮｄｅＩ及びＳａｌＩで消化された、ヒトＦｃ遺伝子を含有しているベクター（本明細書に記載のｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃ）とライゲートさせた。得られたライゲーション混合物を、エレクトロポレーションにより大腸菌株２５９６細胞（本明細書に記載されたＧＭ２２１）に形質転換した。組換えタンパク質産物を産生し、かつ正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を保有する能力に関して、クローンをスクリーニングした。各ペプチボディについて１個のこのようなクローンを選択した。この融合タンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図４Ａから４Ｆに示す。
【０１９７】
【表６】
2004533249.tif 000049
2004533249.tif 000050
【０１９８】
【表７】
2004533249.tif 000051
2004533249.tif 000052
【０１９９】
【表８】
2004533249.tif 000053
2004533249.tif 000054
【０２００】
ｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクター
ｐＡＭＧ２１。発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ登録番号９８１１３）は、Ａｍｇｅｎ発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）から誘導することができ、ｐＣＦＭ１６５６は、米国特許第４，７１０，４７３号に記載されたＡｍｇｅｎ発現ベクター系から下記により誘導することができる。
【０２０１】
・Ｔ４ポリメラーゼ酵素により末端を充填した後、平滑末端ライゲーションを行うことにより、２個の内因性ＮｄｅＩ制限部位を破壊すること；
・合成ＰＬプロモーターを含有している特有のＡａｔＩＩ制限部位とＣｌａＩ制限部位との間のＤＮＡ配列を、ＰＬプロモーターを含有しているｐＣＦＭ６３６（特許第４，７１０，４７３号）から得られた類似した断片（下記の配列番号９５を参照のこと）と交換すること；及び
・特有のＣｌａｌ制限部位とＫｐｎｌ制限部位との間の小さなＤＮＡ配列を、配列番号９６の配列を有するオリゴヌクレオチドと置換することによって、記載されたｐＣＦＭ８３６プラスミド（米国特許第４，７１０，４７３号）から誘導することができる。
【０２０２】
【化２３】
2004533249.tif 000055
【０２０３】
次いで、ＰＣＲ重複オリゴヌクレオチド突然変異誘発及びＤＮＡ配列置換により、一連の部位特異的塩基変化を作成することにより、ｐＣＦＭ１６５６から発現プラスミドｐＡＭＧ２１を誘導することができる。プラスミド複製プロモーターＰｃｏｐＢの直ぐ５’側のＢｇｌＩＩ部位（プラスミドｂｐ＃１８０）から出発して、プラスミド複製遺伝子に進む、その塩基対変化は、下記表７に示されるようなものである。
【０２０４】
【表９】
2004533249.tif 000056
【０２０５】
特有のＡａｔＩＩ制限部位（ｐＣＦＭ１６５６の４３６４位）とＳａｃＩＩ制限部位（ｐＣＦＭ１６５６の４５８５位）との間のＤＮＡ配列は、下記ＤＮＡ配列（配列番号９７）に置換される。
【０２０６】
【化２４】
2004533249.tif 000057
2004533249.tif 000058
【０２０７】
この置換ＤＮＡ配列の粘着末端のライゲーションの過程で、外側のＡａｔＩＩ部位及びＳａｃＩＩ部位は破壊される。置換されたＤＮＡには、特有のＡａｔＩＩ部位及びＳａｃＩＩ部位が存在する。
【０２０８】
ＦｃのＮ末端に融合したヒトＲＡＮＫをコードする遺伝子を、Ａｍｇｅｎ株＃４１２５を生成させるため、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＡＭＧ２１とライゲートさせた。この構築物を、ＲＡＮＫとＦｃとの接合部にバリンコドンを挿入するため修飾した。隣接するバリンコドン及びアスパラギン酸コドンは、特有のＳａｌＩ部位を作り出す。これは、特有のＮｄｅＩ部位とＳａｌＩ部位との間のＦｃ３のＮ末端のペプチドの融合を可能にする。ＲＡＮＫ配列は、新たなＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片の挿入の際に欠失する。このベクターの配列を、図５Ａから５Ｍに示す。
【０２０９】
ＧＭ２２１（Ａｍｇｅｎ＃２５９６）。Ａｍｇｅｎ宿主株＃２５９６は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ（ＣＧＳＣ株６１５９）から入手される大腸菌Ｗ１４８５の誘導体であるＡｍｇｅｎ株＃３９３から誘導した大腸菌Ｋ−１２株である。これは、初期ｅｂｇ領域の温度感受性ラムダリプレッサーｃＩ８５７ｓ７及び後期ｅｂｇ領域（６８分）のｌａｃＩＱリプレッサーの両方を含有するよう修飾されている。これら２個のリプレッサー遺伝子の存在は、多様な発現系でのこの宿主の使用を可能にするが、これらのリプレッサーは、いずれもｌｕｘＰＲからの発現には適していない。未形質転換宿主は、抗生物質耐性を有していない。
【０２１０】
ｃＩ８５７ｓ７遺伝子のリボソーム結合部位は、増強されたＲＢＳを含むよう修飾されている。これは、ｅｂｇオペロンのＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ６４４４１Ｇｂ＿Ｂａにおいて番号付けられたヌクレオチド１１７０位と１４１１位との間に挿入されており、その間のｅｂｇ配列は欠失している。このインサートの配列を以下に示す。ここで、小文字は、以下に示されるインサート（配列番号９８）の両側に隣接しているｅｂｇ配列を表す。
【０２１１】
【化２５】
2004533249.tif 000059
【０２１２】
ＭＭｅｂｇ−ｃＩ８５７ｓ７  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＲＢＳ＃４と呼ばれる組換えファージを使用して、この構築物をＦ’ｔｅｔ／３９３の染色体に伝達した。組換え及び分解の後、前記の染色体インサートのみが細胞内に残る。それを、Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１と改名した。次いで、ｅｂｇオペロンのＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ６４４４１Ｇｂ＿Ｂａにおいて番号付けられたヌクレオチド２４９３位と２９３７位との間にｌａｃＩＱ構築物を伝達し、その間のｅｂｇ配列を欠失させることにより、Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１を修飾した。インサートの配列を以下に示す。ここで、小文字は、以下に示されるインサート（配列番号９９）の両側に隣接しているｅｂｇ配列を表す。
【０２１３】
【化２６】
2004533249.tif 000060
【０２１４】
この構築物を、ＡＧｅｂｇ−ＬａｃＩＱ＃５と呼ばれる組換えファージを使用して、Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ１０１の染色体に伝達した。組換え及び分解の後、前記の染色体インサートのみが細胞内に残る。それを、Ｆ’ｔｅｔ／ＧＭ２２１と改名した。ＬＢ中の２５μｇ／ｍｌの濃度のアクリジンオレンジを使用して、Ｆ’ｔｅｔエピソームを株から除去した。この除去された株を、テトラサイクリン感受性として同定し、ＧＭ２２１として保管した。
【０２１５】
大腸菌における発現。各ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物を含む大腸菌ＧＭ２２１の培養物を、ルリアブロス（Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ）培地中で３７℃で増殖させた。ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導を、２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で合成自己誘導因子Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを培養培地に添加することにより達成した。培養物を、さらに３時間３７℃でインキュベートした。３時間後、細菌培養物を、封入体の存在に関して顕微鏡検によって検査し、次いで遠心分離によって収集した。誘導された培養物には屈折封入体が観察され、このことから、Ｆｃ融合体が大腸菌においては不溶性画分に産生される可能性が最も高いことが示された。細胞ペレットを、１０％β−メルカプトエタノールを含有しているレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝液への再懸濁によって直接溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。各々の場合において、適切な分子量の強いクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色バンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に観察された。
【実施例３】
【０２１６】
ＴＡＬＬ−１ペプチボディはＴＡＬＬ−１により媒介されるＢ細胞増殖を阻害する
ネガティブ選択（ＭＡＣＳ  ＣＤ４３（Ｌｙ−４８）マイクロビーズ（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によって、Ｃ５７ＢＬ／６の脾臓からマウスＢリンパ球を単離した。精製された（１０５個の）Ｂ細胞を、ＭＥＭ、１０％熱不活化ＦＣＳ、５Ｘ１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの中で、示された量の組換えＴＡＬＬ−１ペプチボディと共に、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＡＬＬ−１タンパク質及び２μｇ／ｍｌヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を含む９６穴平底組織培養プレートにおいてトリプリケートで３７℃、５％ＣＯ２で４日間培養した。１８時間のインキュベーション時間の後、放射性３［Ｈ］チミジンの取り込みにより増殖を測定した。
【実施例４】
【０２１７】
ＴＡＬＬ−１ペプチボディはＴＡＬＬ−１とその受容体との結合を阻止する
Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ  ６ｘ（Ｐｉｅｒｃｅ）に、ヒトＡＧＰ３（ＴＡＬＬ−１としても知られる。Ｋｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：３３７０−３３７５、２０００）をプレコーティングし、ＢＳＡによりブロッキングした。１００ｐＭ及び４０ｐＭのＡＧＰ３ペプチボディ試料を、示された様々な濃度のヒトＡＧＰ３と共に室温で８時間インキュベートした後、ヒトＡＧＰ３でコーティングされたビーズに通した。ビーズ結合ペプチボディの量を、蛍光（Ｃｙ５）標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により定量した。結合シグナルは、結合平衡時の遊離ペプチボディの濃度に比例する。解離平衡定数（ＫＤ）を、二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘ（登録商標）ソフトウェア）を使用して、競合曲線の非線形回帰から入手した。ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）とヒトＡＧＰ３との結合に関するＫＤは、約４ｐＭである（図９）。
【０２１８】
このＡＧＰ３ペプチボディがヒトＡＧＰ３と同様にマウスＡＧＰ３の結合も中和し得るか否かを決定するため、ビアコア中和アッセイを利用した。全ての実験を、室温にてビアコア３０００で実施した。ヒトＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質（Ｘｉａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２、１３７−１４４、２０００）を、１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．０を使用して、２９００ＲＵのレベルにＢ１チップへ固定化した。ブランクのフローセルを、バックグラウンド対照として使用した。０．００５％Ｐ２０を含有しているＰＢＳ（カルシウム又はマグネシウムを含なない）のランニングバッファーを使用して、１ｎＭ組換えヒトＡＧＰ３（ランニングバッファー＋０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中）を、示された様々な量のＡＧＰ３ペプチボディ（ｘ軸）の非存在下及び存在下でインキュベートした後、受容体表面に注入した。再生は、８ｍＭグリシンｐＨ１．５、１分間、２５ｍＭ  ３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）ｐＨ１０．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、１分間を使用して実施した。マウスＡＧＰ３結合の決定については、ヒトｈｉｓタグ化ＴＡＣＩを、上記の緩衝液で１０００ＲＵに固定化した。５ｎＭ組換えマウスＡＧＰ３（ランニングバッファー＋０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中）を、図１１に示された様々な量のＡＧＰ３ペプチボディ（ｘ軸）の非存在下及び存在下でインキュベートした後、受容体表面に注入した。再生は、１０ｍＭ  ＨＣｌ  ｐＨ２、３０秒、２回により実施した。ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）の非存在下に対する存在下でのヒトＡＧＰ３及びマウスＡＧＰ３の両方の相対結合を測定した（ｙ軸）。相対結合応答は、（ＲＵ−ＲＵブランク／ＲＵ０−ＲＵブランク）として決定した。ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）は、ヒト及びマウス両方のＡＧＰ３と受容体ＴＡＣＩとの結合を阻害した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
【０２１９】
このＡＧＰ３ペプチボディがＡＧＰ３と３個の受容体（ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＡＦＦＲ）全てとの結合を阻止するか否かを調査するため、組換え可溶性受容体ＴＡＣＩタンパク質、ＢＣＭＡタンパク質及びＢＡＦＦＲタンパク質をＣＭ５チップに固定化した。１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４を使用して、ヒトＴＡＣＩ−Ｆｃを、６３００ＲＵに固定化し、ヒトＢＣＭＡ−Ｆｃを５０００ＲＵに固定化し、ＢＡＦＦＲ−Ｆｃを６０００ＲＵに固定化した。１ｎＭ組換えヒトＡＧＰ３（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ及び０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンを含有しているランニングバッファー中）又は１ｎＭ組換えＡＰＲＩＬタンパク質（Ｙｕら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１：２５２−２５６、２０００）を、示された量のＡＧＰ３ペプチボディと共にインキュベートした後、各受容体表面に注入した。ＡＧＰ３実験のための再生は、８ｍＭグリシン、ｐＨ１．５、１分、続いて２５ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、１分間により行った。ＡＰＲＩＬ実験のための再生は、８ｍＭグリシン、ｐＨ２、１分、続いて２５ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、１分により実施した。ＡＧＰ３又はＡＰＲＩＬの相対結合を測定した。ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）は、ＡＧＰ３と３個の受容体全てとの結合を阻止した（図１１Ａ）。ＡＧＰ３ペプチボディは、ＡＰＲＩＬとこれらの受容体との結合には影響しなかった（図１１Ｂ）。
【実施例５】
【０２２０】
ＡＧＰ３ペプチボディはＡＧＰ３により媒介されるＢ細胞増殖を阻止する
ネガティブ選択（ＭＡＣＳ  ＣＤ４３（Ｌｙ−４８）マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によって、Ｃ５７ＢＬ／６の脾臓からマウスＢリンパ球を単離した。精製された（１０５個の）Ｂ細胞を、最小必須培地（ＭＥＭ）、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの中で、示された量の組換えＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）と共に、１０ｎｇ／ｍｌ  ＡＧＰ３（ＴＡＬＬ−１）タンパク質及び２μｇ／ｍｌヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を含む９６穴平底組織培養プレートにおいてトリプリケートで３７℃、５％ＣＯ２で４日間培養した。１８時間のインキュベーション時間の後、放射性３［Ｈ］チミジンの取り込みにより増殖を測定した。
【実施例６】
【０２２１】
マウスにおけるＡＧＰ３により刺激されるＩｇ産生に対するＡＧＰ３ペプチボディ
マウス（９〜１４週齢及び体重１９〜２１ｇのＢａｌｂ／ｃ雌）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡより購入した。マウス（ｎ＝１０）を、５日連続で１日１回、１ｍｇ／ＫｇのヒトＡＧＰ３により腹腔内処理した後、５ｍｇ／Ｋｇもしくは０．５ｍｇ／ＫｇのＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）、又は生理食塩水、又は５ｍｇ／ＫｇのヒトＦｃにより処理した。他のマウスは未処理のままにした。血清ＩｇＭ及びＩｇＡを測定するため、６日目にマウスを屠殺し、ＩｇＭ及びＩｇＡをＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に説明すると、プレートに、ＩｇＭ又はＩｇＡに特異的な捕捉抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）をコーティングし、ブロッキングし、標準（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡのＩｇＭ及びＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓのＩｇＡ）又は試験試料の希釈物を添加した。捕捉されたＩｇを、ＩｇＭ又はＩｇＡに特異的なビオチン化抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）結合ペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）マイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して可視化した。光学密度を、サーモマックス（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ）ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）で定量した。
【０２２２】
ヒトＡＧＰ３により刺激される血清中のＩｇＭ及びＩｇＡのレベルの増加は、５ｍｇ／Ｋｇの抗ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）によって阻止され、０．５ｍｇ／Ｋｇによっては阻止されなかった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【実施例７】
【０２２３】
ＡＧＰ３ペプチボディはマウスにおいて脾臓Ｂ細胞数を低下させた
マウス（前記、ｎ＝７）を、７日連続で、５ｍｇ／Ｋｇもしくは１．５ｍｇ／Ｋｇもしくは０．５ｍｇ／ＫｇのＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）、又は生理食塩水、又は５ｍｇ／ＫｇのヒトＦｃにより腹腔内処理した。脾臓Ｂ細胞数を計数するため、８日目にマウスを屠殺した。脾臓を、生理食塩水中に収集し、細胞懸濁物を得るため手動の均質化によって穏和に破砕した。全細胞数を、Ｈ１Ｅカウンター（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）により入手した。ＣＤ３に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合Ａｂ及びＢ２２０に対するフィコエリトリン（ＰＥ）結合Ａｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）並びにＦＡＣＳｃａｎアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用した免疫蛍光二重染色及びフローサイトメトリーによって、Ｂ細胞の割合（％）を導出した。Ｂ細胞はＣＤ３−Ｂ２２０＋として同定した。全ての用量において、ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）は、用量応答的に脾臓Ｂ細胞数を減少させた（図１２Ａ及び１２Ｂ）（配列番号１２３）。
【０２２４】
【表１０】
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【実施例８】
【０２２５】
ＡＧＰ３ペプチボディはマウスＣＩＡモデルにおいて関節炎重度を低下させた
８〜１２週齢のＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから入手）を、完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）で乳化されたウシコラーゲンＩＩ型（ｂＣＩＩ）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈから購入）により、尾の基部において皮内免疫感作した。各注射は、１００μｇのｂＣＩＩを含有している１００μｌであった。初回免疫感作の３週間後、不完全フロイントアジュバントで乳化されたｂＣＩＩにより、マウスを追加免疫感作した。追加免疫感作の日から４週間、処理を開始した。マウスを関節炎の発症に関して調査した。以前に記載されたようにして（Ｋｈａｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３６５３−９、１９９５）、四肢全てを個々に０〜３にスコア化した。従って、各動物について、関節炎重度は０〜１２の範囲となり得る。ＡＧＰ３（配列番号１２３）ペプチボディ処理は、関節炎スコアの重度を有意に低下させた（図１３）。
【０２２６】
抗コラーゲン抗体レベルの分析のため、最終処理の１週間後（３５日目）に、血清試料を採取した。高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ、Ｎｕｎｃ）に、炭酸緩衝液中のウシＣＩＩの４μｇ／ｍｌ溶液５０μｌをコーティングし、プレートを冷却装置内で一晩冷却した。プレートを冷水により３回洗浄した。ＰＢＳ／．０５％トゥイーン２０／１％ＢＳＡで構成されたブロッキング溶液７５μｌを使用して、１時間、非特異的結合をブロッキングした。試料を、希釈液プレートにおいて１：２５、１：１００、１：４００及び１：１６００に（ブロッキング緩衝液で）希釈し、これらの試料２５μｌを、１００μｌ／ウェルという最終容量で、最終希釈率１００、４００、１６００及び６４００となるよう、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。室温で３時間インキュベートした後、プレートを再び３回洗浄した。ブロッキング緩衝液で希釈された二次抗体（ラット抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３−ＨＲＰ）１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを少なくとも２時間インキュベートした。プレートを４回洗浄した。ＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを各ウェルに添加し、２５％硫酸５０μｌを使用して反応を停止させた。プレートを、４５０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った。ＯＤを、単位／ｍｌを表す標準プールと比較した。ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）処理は、ＰＢＳ又はＦｃ対照処理群と比較して、血清中の抗コラーゲンＩＩ  ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのレベルを低下させた（図１４）。
【実施例９】
【０２２７】
ＮＺＢ／ＮＺＷループスマウスにおけるＡＧＰ３ペプチボディの処理
５ヶ月齢のループスの素因を有するＮＺＢ×ＮＺＢＷＦ１マウスを、ＰＢＳ、又は示された用量のＡＧＰ３ペプチボディもしくはヒトＦｃタンパク質により、週３回８週間、腹腔内処理した。処理前に、アルブスティックス試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）を用いて、尿中タンパク質に関して動物をプレスクリーニングした。１００ｍｇ／ｄｌを越える尿中タンパク質を有するマウスは、研究に含めなかった。尿中タンパク質を、実験期間中、毎月評価した。ＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）処理は、タンパク尿症開始を遅延させ、生存率を改善した（図１５及び１５Ｂ）。
【０２２８】
ＡＧＰ３ペプチボディ処理は、マウスにおいてＢ細胞数を低下させた。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、示された量のＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）又はヒトＦｃタンパク質の腹腔内注射を７日間毎日与えた。８日目、脾臓を収集し、表８に示されるようなＢ２２０＋Ｂ細胞に関するＦＡＣＳ分析に供した。
【０２２９】
以上、本発明を充分に記載したが、本明細書に記載されたような本発明の本旨及び範囲を逸脱することなく、多くの変化及び修飾をこれらに施しうることが、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】ＩｇＧ１抗体から導出されうる例示的なＦｃ二量体を示す。図中の「Ｆｃ」は、本明細書における「Ｆｃドメイン」の意味に含まれる任意のＦｃバリアントを表す。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、下記定義のようなペプチド又はリンカー−ペプチド組み合わせを表す。特定の二量体は、以下の通りである。  Ａ、Ｄ：単一ジスルフィド結合二量体。ＩｇＧ１抗体は、典型的には、抗体のヒンジ領域に２個のジスルフィド結合を有している。図１Ａ及び１Ｄ中のＦｃドメインは、２個のジスルフィド結合部位の間での短縮によって、又はシステイニル残基の非反応性残基（例えばアラニル）への置換によって形成され得る。図１Ａにおいては、Ｆｃドメインはペプチドのアミノ末端で連結されており、図１Ｄにおいては、カルボキシル末端で連結されている。  Ｂ、Ｅ：二重ジスルフィド結合二量体。このＦｃドメインは、Ｆｃドメイン鎖内の両方のシステイニル残基が保持されるような親抗体の短縮によって、又はこのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発現によって形成され得る。図１Ｂにおいては、Ｆｃドメインはペプチドのアミノ末端で連結されており、図１Ｅにおいては、カルボキシル末端で連結されている。  Ｃ、Ｆ：非共有結合二量体。このＦｃドメインは、短縮又は置換のいずれかによるシステイニル残基の排除によって形成され得る。宿主細胞中に存在する他のタンパク質のシステイニル残基とのシステイニル残基反応によって形成される不純物を回避するため、システイニル残基を排除することが望ましい場合がある。Ｆｃドメインの非共有結合性の結合は、二量体を維持するのに十分である。  異なる型の抗体（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＭ）から導出されたＦｃドメインを使用することにより、その他の二量体も形成され得る。
【図２】薬理学的活性を有するペプチドのタンデムリピートを特色とする、本発明の好ましい化合物の構造を示す。図２Ａは、単鎖分子を示し、その分子のためのＤＮＡ構築物も表し得る。図２Ｂは、リンカー−ペプチド部分が二量体の一方の鎖のみに存在する二量体を示す。図２Ｃは、両方の鎖にペプチド部分を有する二量体を示す。図２Ｃの二量体は、ある種の宿主細胞においては、図３Ａに示される単鎖をコードするＤＮＡ構築物の発現により、自然に形成されるであろう。その他の宿主細胞においては、二量体の形成にとって都合のよい条件の下に細胞を置くか、又は二量体をインビトロで形成させることができる。
【図３】本発明において使用され得るヒトＩｇＧ１  Ｆｃの例示的な核酸配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。
【図４Ａ】ペプチド及びリンカーをコードするＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号３から２７）を示す。
【図４Ｂ】ペプチド及びリンカーをコードするＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号３から２７）を示す。
【図４Ｃ】ペプチド及びリンカーをコードするＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号３から２７）を示す。
【図４Ｄ】ペプチド及びリンカーをコードするＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号３から２７）を示す。
【図４Ｅ】ペプチド及びリンカーをコードするＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号３から２７）を示す。
【図４Ｆ】ペプチド及びリンカーをコードするＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号３から２７）を示す。
【図５Ａ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｂ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｃ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｄ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｅ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｆ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｇ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｈ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｉ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｊ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｋ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｌ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図５Ｍ】本発明のＦｃ連結分子を構築するために使用されたｐＡＭＧ２１−ＲＡＮＫ−Ｆｃベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。これらの図面は、以下のものを含む多数の核酸の特色を同定する。  ・プロモーター領域ＰｃｏｐＢ、ＰｒｅｐＡ、ＲＮＡＩ、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＰＲ及びｌｕｘＰＬ；  ・ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲのｍＲＮＡ；  ・タンパク質ｃｏｐＢタンパク質、ｃｏｐＴ、ｒｅｐＡＩ、ｒｅｐＡ４、ＡＰＨＩＩ、ｌｕｘＲ、ＲＡＮＫ及びＦｃのコーディング配列及びアミノ酸配列；  ・タンパク質ｃｏｐＢ、ＣＲＰの結合部位；  ・ヘアピンＴ１、Ｔ２、Ｔ７及びｔｏｏｐ；  ・ｌｕｘタンパク質のオペレーター部位；  ・Ｐｆｌｌｌ０８Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ＢｍｎＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｇｌＩ、ＳｆｉＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｐＬｕｌｌＩ、ＮｓｐＶ、ＢｐｌＩ、ＥａｇＩ、ＢｃｇＩ、ＮｓｉＩ、ＢｓａＩ、Ｐｓｐｌ４０６Ｉ、ＡａｔＩＩ、ＢｓｍＩ、ＮｒｕＩ、ＮｄｅＩ、ＡｐａＬＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｐＥＩ、ＡｈｄＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏｎＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｅｘＡＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｌｐＩの酵素制限部位。
【図６Ａ】発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ登録番号９８１１３）を形成させるため、ｐＣＦＭ１６５６の特有のＡａｔＩＩ制限部位（ｐＣＦＭ１６５６の４３６４位）とＳａｃＩＩ制限部位（ｐＣＦＭ１６５６の４５８５位）との間に挿入されたＤＮＡ配列（配列番号９７）を示す。
【図６Ｂ】発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ登録番号９８１１３）を形成させるため、ｐＣＦＭ１６５６の特有のＡａｔＩＩ制限部位（ｐＣＦＭ１６５６の４３６４位）とＳａｃＩＩ制限部位（ｐＣＦＭ１６５６の４５８５位）との間に挿入されたＤＮＡ配列（配列番号９７）を示す。
【図７】ＴＡＬＬ−１ペプチボディ（配列番号７０）が、ＴＡＬＬ−１により媒介されるＢ細胞増殖を阻害することを示す。Ｂ６マウスから精製されたＢ細胞（１０５個）を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＡＬＬ−１＋２μｇ／ｍｌ抗ＩｇＭ抗体の存在下で、示された量のＴＡＬＬ−１コンセンサスペプチボディと共に、９６穴プレートにおいてトリプリケートで培養した。増殖は、パルスの最後の１８時間における放射性［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定された。示されたデータは、トリプリケートウェルの平均±ＳＤを表す。
【図８】ＴＡＬＬ−１  Ｎ末端タンデム二量体ペプチボディ（下記表５Ｂ中の配列番号１２３、１２４）が、ＴＡＬＬ−１により媒介されるＢ細胞増殖の阻害にとって好ましいことを示す。Ｂ６マウスから精製されたＢ細胞（１０５個）を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＡＬＬ−１＋２μｇ／ｍｌ抗ＩｇＭ抗体の存在下で、示された量のＴＡＬＬ−１  １２−３ペプチボディ及びＴＡＬＬ−１コンセンサスペプチボディ（表５Ｂの配列番号１１５及び１２２）又は関連する二量体ペプチボディ（配列番号１２３、１２４）と共に、９６穴プレートにおいてトリプリケートで培養した。増殖は、パルスの最後の１８時間における放射性［３Ｈ］チミジン取り込みによって測定された。示されたデータは、トリプリケートウェルの平均±ＳＤを表す。
【図９】ＡＧＰ３ペプチボディは高い親和性でＡＧＰ３と結合する。解離平衡定数（ＫＤ）は、二重曲線一部位均一結合モデル（ｄｕａｌ−ｃｕｒｖｅ  ｏｎｅ−ｓｉｔｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）（ＫｉｎＥｘ（登録商標）ソフトウェア）を使用して、競争曲線の非線形回帰から得られた。ＡＧＰ３ペプチボディのヒトＡＧＰ３との結合に関するＫＤは、約４ｐＭである（配列番号１２３）。
【図１０Ａ】ＡＧＰ３ペプチボディは、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）競合アッセイにおいて、ヒトＡＧＰ３及びマウスＡＧＰ３の両方を阻止する。可溶性ヒトＴＡＣＩタンパク質を、Ｂ１チップに固定化した。１ｎＭ組換えヒトＡＧＰ３タンパク質（上パネル）又は５ｎＭ組換えマウスＡＧＰ３タンパク質（下パネル）を、示された量のＡＧＰ３ペプチボディと共にインキュベートした後、受容体の表面の上に注入した。ヒトＡＧＰ３及びマウスＡＧＰ３の相対結合応答を示した（配列番号１２３）。
【図１０Ｂ】ＡＧＰ３ペプチボディは、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）競合アッセイにおいて、ヒトＡＧＰ３及びマウスＡＧＰ３の両方を阻止する。可溶性ヒトＴＡＣＩタンパク質を、Ｂ１チップに固定化した。１ｎＭ組換えヒトＡＧＰ３タンパク質（上パネル）又は５ｎＭ組換えマウスＡＧＰ３タンパク質（下パネル）を、示された量のＡＧＰ３ペプチボディと共にインキュベートした後、受容体の表面の上に注入した。ヒトＡＧＰ３及びマウスＡＧＰ３の相対結合応答を示した（配列番号１２３）。
【図１１Ａ】ＡＧＰ３ペプチボディは、ビアコア競合アッセイにおいて、ＡＧＰ３と、３個の受容体ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＡＦＦＲ全てとの結合を阻止した。組換え可溶性受容体ＴＡＣＩタンパク質、ＢＣＭＡタンパク質及びＢＡＦＦＲタンパク質をＣＭ５チップに固定化した。１ｎＭ組換えヒトＡＧＰ３（上パネル）を、示された量のＡＧＰ３ペプチボディと共にインキュベートした後、各受容体表面の上に注入した。ＡＧＰ３の相対結合を測定した。同様に、１ｎＭ組換えＡＰＲＩＬタンパク質を、示された量のＡＧＰ３ペプチボディと共にインキュベートした後、各受容体表面の上に注入した。ＡＧＰ３ペプチボディは、ＡＰＲＩＬと３個の受容体全てとの結合を阻害しなかった（配列番号１２３）。
【図１１Ｂ】ＡＧＰ３ペプチボディは、ビアコア競合アッセイにおいて、ＡＧＰ３と、３個の受容体ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＡＦＦＲ全てとの結合を阻止した。組換え可溶性受容体ＴＡＣＩタンパク質、ＢＣＭＡタンパク質及びＢＡＦＦＲタンパク質をＣＭ５チップに固定化した。１ｎＭ組換えヒトＡＧＰ３（上パネル）を、示された量のＡＧＰ３ペプチボディと共にインキュベートした後、各受容体表面の上に注入した。ＡＧＰ３の相対結合を測定した。同様に、１ｎＭ組換えＡＰＲＩＬタンパク質を、示された量のＡＧＰ３ペプチボディと共にインキュベートした後、各受容体表面の上に注入した。ＡＧＰ３ペプチボディは、ＡＰＲＩＬと３個の受容体全てとの結合を阻害しなかった（配列番号１２３）。
【図１２Ａ】ＡＧＰ３ペプチボディは、ヒトＡＧＰ３の接種によって誘導されるマウス血清免疫グロブリンレベル増加を阻害する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１日１回７日間、示された用量の生理食塩水、ヒトＦｃ又はＡＧＰ３ペプチボディと共に１ｍｇ／ＫｇヒトＡＧＰ３タンパク質を腹腔内注射し、８日目に採血した。血清中の全ＩｇＭ及びＩｇＡレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した（配列番号１２３）。
【図１２Ｂ】ＡＧＰ３ペプチボディは、ヒトＡＧＰ３の接種によって誘導されるマウス血清免疫グロブリンレベル増加を阻害する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１日１回７日間、示された用量の生理食塩水、ヒトＦｃ又はＡＧＰ３ペプチボディと共に１ｍｇ／ＫｇヒトＡＧＰ３タンパク質を腹腔内注射し、８日目に採血した。血清中の全ＩｇＭ及びＩｇＡレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した（配列番号１２３）。
【図１３】ＡＧＰ３ペプチボディ処理は、マウスＣＩＡモデルにおいて関節炎重度を低下させた。８〜１２週齢のＤＢＡ／１雄マウスを、完全フロイントアジュバントで乳化されたウシコラーゲンＩＩ型（ｂＣＩＩ）で、尾の基部において皮内免疫感作し、初回免疫感作の３週間後に、不完全フロイントアジュバントで乳化されたｂＣＩＩで追加免疫感作した。示された投薬量のＡＧＰ３ペプチボディによる処理を、追加免疫感作の日から４週間開始した。以前に記載されたようにして（Ｋｈａｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３６５３−９、１９９５）、四肢全てを個々に関節炎重度に関して０〜３にスコア化した（配列番号１２３）。
【図１４】ＡＧＰ３ペプチボディ処理は、マウスＣＩＡモデルにおいて抗コラーゲン抗体生成を阻害した。前記のような最終処理の１週間後（３５日目）に血清試料を採取した。血清中の抗コラーゲンＩＩ抗体レベルを、ＥＬＩＳＡ分析によって決定した（配列番号１２３）。
【図１５Ａ】ＡＧＰ３ペプチボディ処理は、ＮＺＢ／ＮＺＷループスマウスにおいて、タンパク尿症開始を遅延させ、生存率を改善した。５ヶ月齢のループスの素因を有するＮＺＢ×ＮＺＢＷＦ１マウスを、ＰＢＳ、又は示された用量のＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）もしくはヒトＦｃタンパク質により、週３回８週間、腹腔内処理した。アルブスティックス（Ａｌｂｕｓｔｉｘ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）を用いて、実験期間中、毎月、尿中タンパク質を評価した。
【図１５Ｂ】ＡＧＰ３ペプチボディ処理は、ＮＺＢ／ＮＺＷループスマウスにおいて、タンパク尿症開始を遅延させ、生存率を改善した。５ヶ月齢のループスの素因を有するＮＺＢ×ＮＺＢＷＦ１マウスを、ＰＢＳ、又は示された用量のＡＧＰ３ペプチボディ（配列番号１２３）もしくはヒトＦｃタンパク質により、週３回８週間、腹腔内処理した。アルブスティックス（Ａｌｂｕｓｔｉｘ）試薬ストリップ（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）を用いて、実験期間中、毎月、尿中タンパク質を評価した。
【図１６Ａ】好ましいＴＡＬＬ−１結合ペプチボディ（配列番号１８９及び１２３）の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。
【図１６Ｂ】好ましいＴＡＬＬ−１結合ペプチボディ（配列番号１８９及び１２３）の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。