【手続補正書】
【提出日】平成16年8月19日(2004.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験サンプルをリン脂質及びトロンボプラスチンを含んでなる凝固試薬と組み合わせること；被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；を含んでなる被験サンプルの分析方法。
【請求項２】
少なくとも１つの確認アッセイを利用することを含んでなり、ここで該確認アッセイが基準：ａ）リン脂質依存的スクリーニングアッセイの延長；ｂ）プールされた正常血漿との１：１混合物を用いる延長されたアッセイの修正の欠如；及びｃ）過剰のリン脂質の添加による延長されたアッセイの修正；に従ってＡＰＬＡを同定するためのアッセイである請求項１の方法。
【請求項３】
ａ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｂ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして被験サンプルからの光の反射率またはそれを通る透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｃ）時間依存的測定プロファイルの値または勾配を決定すること；ｄ）工程ａ）からｃ）を繰り返すこと；及びｅ）値または勾配を互いに比較すること；を含んでなる被験サンプルの分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
図８Ａで示されるように、正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１はＰＴ試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ）を患者の血漿に添加した場合に示され、そして図８Ｂはリン脂質混合物を血漿に添加した場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１を示す。図９はデタージェント（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の添加の、ＡＰＬＡ患者血漿のＰＴ勾配１に及ぼす効果を説明している。これらのデータはリン脂質表面に関する要件を示している。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は用量依存的な様式で勾配１の変化を減じた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本発明のアッセイは定量的または反応定量的アッセイでもよい。図１４Ａ及び１４Ｂに示されるように、勾配１の程度をリン脂質抗体（この場合抗β２糖タンパク質抗体及び抗カルジオリピン抗体）の量、ＡＰＳの程度及び／または血栓性事象の可能性に相関させることができる。しばしば抗リン脂質抗体を伴う患者で上昇する抗体レベルとの相関性研究により、６６人のＡＰＬＡ患者のこの集団において、負の勾配１の値と抗カルジオリピンＩｇＧ（ｒ＝０．７）のレベル及びβ２糖タンパク質に対する抗体のレベル（ｒ＝０．６）との相関性を示した。このように、ＡＰＬＡを定量でき、及び／または患者の進行もしくは退行を勾配１に関して繰り返し行った試験に基づいて（または前記したような複数のパラメーターの繰り返し行った分析に基づいて）モニター観察することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
【図１】この図は勾配１の変化がＡＰＬＡを有する患者４１人中２６人（６３％）で同定されたことを示している。
【図２】この図は透過率の第１及び第２誘導を含む、正常な標本のＰＴまたはＡＰＴＴアッセイに関する光学透過率対時間を示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照のＡＰＴＴ凝固時間（図３Ａ）及び勾配１の結果（図３Ｂ）の分布を示している。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照に由来するＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）ＬでのＰＴ凝固時間（図４Ａ）及び勾配１の結果（図４Ｂ）の分布を示している。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、正常（図５Ａ）及びＡＰＬＡ患者（図５Ｂ）の血漿サンプルのＰＴアッセイの透過率波形プロファイルを示している。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、異なるヘパリン量がＰＴ及びＰＴ勾配１の値に及ぼす影響を示している。
【図７】この図はＡＰＬＡ患者の血漿のＰＴ勾配１に及ぼすトロンビンインヒビター・ヒルジンの添加の影響を示し、これは変化がトロンビン生成とは独立していることを実証している。
【図８】図８Ａは、ＰＴ試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ）を患者の血漿に加えた場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１を示し、そして図８Ｂはリン脂質混合物を患者の血漿サンプルに加えた場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１値を示している。
【図９】この図はＡＰＬＡ患者血漿のＰＴ勾配１に及ぼすデタージェント（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の添加の影響を説明している。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＰＴアッセイ（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｌ）に関する透過率波形プロファイルを示し、正常血漿サンプル（図１０Ａ）；全ＩｇＧ除去前のＡＰＬＡ患者血漿サンプル（図１０Ｂ）；全ＩｇＧ除去後のＡＰＬＡ患者血漿サンプル（図１０Ｃ）である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、全ＩｇＧでスパイクされたＩｇＧ涸渇正常血漿に関するＰＴとＡＰＴＴアッセイの透過率波形プロファイルを示し、ＩｇＧを添加する前の正常なＰＴ透過率波形を示すＡＰＬＡ患者（図１１Ａ）；負の勾配１を示すＡＰＬＡ患者のＩｇＧを８ｍｇ／ｍｌを添加した同一のドナー血漿に関する異常ＰＴ  ＴＷ（図１１Ｂ）；ＩｇＧを添加する前の正常ＡＰＴＴ  ＴＷ（図１１Ｃ）；及び正常な勾配１を示すＡＰＬＡ患者のＩｇＧ（８ｍｇ／ｍｌ）を添加した同一のドナー血漿に関する延長されたＡＰＴＴ  ＴＷ。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、全ＩｇＧでスパイクされたＩｇＧ−涸渇の経口抗凝血薬を投与した血漿に関するＰＴ及びＡＰＴＴアッセイのＴＷプロファイルを示し、延長されたＰＴ凝固時間を示すＩｇＧを添加する前のＰＴ  ＴＷを示すＡＰＬＡ患者（図１２Ａ）；負の勾配１を示す、ＡＰＬＡ患者のＩｇＧを添加した同一のドナー血漿に関する異常ＰＴ  ＴＷ（図１２Ｂ）；ＩｇＧを添加する前のＡＰＴＴ  ＴＷ（図１２Ｃ）；及びＡＰＬＡ患者のＩｇＧを添加した同一のドナー血漿に関する正常な勾配１を伴う延長されたＡＰＴＴ凝固時間。
【図１３】ワルファリンの投与を受けていた６人の対照からのＩｇＧ涸渇血漿における国際標準比率（ＩＮＲ）に及ぼすＡＰＬＡ  ＩｇＧの影響を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｌは、種々の試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ；Ｄａｄｅ  Ｃ  Ｐｌｕｓ；ＨＴＦ；Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ：Ｉｎｎｏｖｉｎ；及びＲｅｃｏｍｂｉｐｌａｓｔｉｎ）と２つの異なるリン脂質結合タンパク質（抗−β２糖タンパク質”抗β２ＧＰＩ”及び抗カルジオリピン抗体”ＡＣＬ”）を用いた場合のＰＴ勾配１を示す。
【図１５】図１５は、全ＩｇＧをＰＴ基盤のアッセイにおける血漿の代わりに用いた場合、正常ドナーサンプルと比較して２つのＩｇＧサンプルのみが異常な凝固前相を表示したことを示すチャートである。
【図１６】図１６は列挙した血漿タンパク質のうち、プロトロンビン及びβ２ＧＰＩのみがＩｇＧ波形アッセイにおいて異常プロファイルの作成に寄与したことを説明している。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、負のＰＴ勾配１のβ２ＧＰＩへの依存性（図１７Ａ）、及びプロトロンビン濃度を利用した９人のＡＰＳ患者と２人の正常なドナーのＩｇＧ波形結果（図１７Ｂ）の定義を示している。
【図１８】図１８は１つの被験サンプルに関して、非リン脂質結合β２ＧＰＩは、特定の被験サンプルからのＩｇＧの存在下で、その野生型の対応物と同一の濃度で試験する場合、この個体からの抗体がＥＬＩＳＡにおいて切断されたβ２ＧＰＩに結合したが、異常ＩｇＧ波形を誘導しなかったことを示している。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、β２ＧＰＩの存在下、ＡＰＬＡ被験サンプルと正常との間の識別の程度を、用いたＰＴ試薬に依存して変化させることができることを示しており、図１９ＡはＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌでの異常ＩｇＧ波形アッセイを示し、図１９Ｂはトロンボプラスチン  Ｉｎｎｏｖｉｎでの異常ＩｇＧ波形アッセイを示している。
【図２０】図２０は単純なＰＣ：ＰＳ（７５：２５）リン脂質混合物の識別能力を説明している。
【図２１】試薬Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ（図２１Ａ）、及び種々ＰＥ：ＰＣ：ＰＳリン脂質混合物（図２１Ｂ〜２１Ｅ）の識別能力の改善を示している。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＮＡで表される正常ドナー及びＡＰＬＡで表される抗リン脂質抗体ドナーにおける種々トロンボプラスチン（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ；Ｄａｄｅ  Ｃ  Ｐｌｕｓ；Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  ＨＴＦ；Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ：Ｉｎｎｏｖｉｎ；ＲｅｃｏｍｂｉＰｌａｓｔｉｎ）の勾配１の感受性を示している。