【手続補正書】
【提出日】平成15年8月27日(2003.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなる、単離され、精製され、若しくは濃縮されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する、単離され、精製され、若しくは濃縮されたポリペプチド。
【請求項３】
前記同一性の割合が少なくとも７５％である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の類似性を有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１０アミノ酸長の単離されたポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２で表される少なくとも１０の連続するアミノ酸を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の生物学的に活性なフラグメントからなるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２の生物学的に活性な変異体からなるポリペプチドであって、前記変異体は配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有する；
からなる群より選ばれるポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが少なくとも５０のアミノ酸を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記変異体が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、単離され、精製され、若しくは濃縮された、少なくとも５０アミノ酸長のポリペプチド。
【請求項９】
抗菌剤が配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、黄色ブドウ球菌に対して殺菌または静菌効果を有する抗菌剤。
【請求項１０】
前記剤が小有機分子、ペプチド疑似化合物、ペプチド、およびポリペプチドからなる群より選ばれる、請求項９に記載の抗菌剤。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがバクテリオファージタンパク質からなる、請求項１０に記載の抗菌剤。
【請求項１２】
前記バクテリオファージタンパク質が、３Ａ−ＯＲＦ３３（配列番号４）およびそのフラグメント若しくは変異体からなる群より選ばれる、請求項１１に記載の抗菌剤。
【請求項１３】
前記剤が、配列番号２を含む黄色ブドウ球菌ポリペプチドの活性を低下させまたは減少させる、請求項９ないし１２のいずれかに記載の抗菌剤。
【請求項１４】
請求項９ないし１３のいずれかに規定される抗菌剤、および医薬的に許容されるキャリア、を含む抗菌組成物。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列を含む生物学的に活性なＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドに対して活性のある化合物を同定する方法であって、前記方法は：
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド、それらの生物学的に活性なフラグメント若しくは生物学的に活性な変異体を、候補化合物と接触させること；および
ｉ）前記化合物の前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド、フラグメント若しくは変異体への結合；およびｉｉ）前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド、フラグメント若しくは変異体の生物学的活性；の少なくとも１つを検出すること、の工程を含み、
ここで、候補化合物の前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド、フラグメント若しくは変異体への結合、および／または前記候補物質が存在しない場合に比べた存在する場合の前記生物学的活性の減少が、前記候補化合物がＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドに対して活性のある化合物であることを示す、
方法。
【請求項１６】
生物学的に活性なＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドに対して活性のある化合物を同定する方法であって、前記方法は：
候補化合物を、配列番号２のアミノ酸を含むＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドを発現している細胞、または前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント若しくは生物学的に活性な変異体を発現している細胞、に接触させること；および
前記細胞中でＳＴＡＡＵ＿Ｒ４活性を測定すること；を含み、
ここで、前記候補化合物の存在下における前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４の活性の減少が、前記候補化合物がＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドに対して活性があることを示す、
方法。
【請求項１７】
配列番号２を含むＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドの活性のアゴニスト若しくはアンタゴニスト、または前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント若しくは変異体の活性のアゴニスト若しくはアンタゴニスト。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドと相互作用する化合物を同定する方法であって、前記方法は：
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント若しくは変異体に特異的に結合するバクテリオファージポリペプチドの存在下で、前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメント若しくは変異体を、候補化合物に接触させること；
前記候補化合物が、前記結合を低下させるかどうかを測定すること；および、
前記結合を低下させる候補化合物を選択すること；
の工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記バクテリオファージポリペプチドが、３Ａ−ＯＲＦ３３（配列番号４）、およびそのフラグメント若しくは変異体からなる群より選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記バクテリオファージポリペプチド、フラグメント若しくは変異体が、直接的または間接的に検出可能にラベル化されている、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定が、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光、表面プラスモン共鳴、シンチレーション近接アッセイ、バイオセンサーアッセイ、およびファージディスプレイからなる群より選ばれる技術による測定を含む、請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５ないし２１のいずれかに規定される方法を実行することにより、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドと相互作用する化合物を同定すること；および
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドを自然に産生する細菌に感染した、または感染の危険のある生物に投与したときに、治療効果を提供するのに充分な量の前記化合物を合成または精製すること、
を含む、抗菌化合物の製造方法。
【請求項２３】
前記化合物が、小有機分子、ペプチド疑似化合物、ペプチドおよびポリペプチドからなる群より選ばれる、請求項１５ないし２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
細菌を、請求項９ないし１３のいずれかに規定される抗菌剤と接触させること、および／または請求項１４に規定される抗菌組成物と接触させることを含む、細菌を阻害する方法。
【請求項２５】
細菌を、配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有するＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドの生物学的活性を阻害する抗菌剤と接触させることを含む、細菌を阻害する方法。
【請求項２６】
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドが配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記活性の阻害が前記抗菌剤の前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドへの結合により引き起こされる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
黄色ブドウ球菌の感染を処置または予防するための、請求項２５ないし２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項２５ないし２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記接触が、非ヒト動物のｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項２５ないし２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
治療的に有効量のまたは予防的に有効量の、請求項９ないし１３のいずれかに規定された抗菌剤および／または請求項１４に規定された抗菌組成物、を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物において細菌感染を処置または予防する方法。
【請求項３２】
治療的に有効量のまたは予防的に有効量の、配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有するＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドの生物学的活性を阻害する化合物、を哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物において細菌感染を処置または予防する方法。
【請求項３３】
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドが配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性の阻害が、前記抗菌剤の前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドへの結合により引き起こされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
黄色ブドウ球菌の感染を処置または予防するための、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
細菌を、配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有する細菌ポリペプチドに結合する抗菌剤と接触させることを含む、細菌における脂肪酸および／またはリン脂質合成を阻害する方法。
【請求項３８】
前記抗菌剤が、小有機分子、ペプチド疑似化合物、ペプチド、およびポリペプチドからなる群より選ばれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチドがバクテリオファージタンパク質からなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記バクテリオファージタンパク質が、３Ａ−ＯＲＦ３３（配列番号４）およびそのフラグメント若しくは変異体からなる群より選ばれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記阻害が前記細菌の成長を低下させまたは遮蔽する、請求項３７ないし４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
お互いに特異的に相互作用する第１のポリペプチドドメインと第２のポリペプチドドメインを含む組成物であって、前記第１のポリペプチドは配列番号２を含むＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド由来であり、前記第２のドメインは前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドに特異的に結合するバクテリオファージポリペプチド由来である、組成物。
【請求項４３】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドに対して活性のある化合物の同定のための、
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性なフラグメント若しくは変異体を含むＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド；
ｂ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性なフラグメント若しくは変異体、およびＳＴＡＡＵ＿Ｒ４と特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによってエンコードされるポリペプチド、を含む特異的に相互作用するドメインのペアを含む組成物；
ｃ）ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、またはｉｉ）ｉ）の生物学的に活性なフラグメント若しくは変異体、のうちの１つを含む第１のポリペプチド、およびｉ）またはｉｉ）のうちの１つと特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによってエンコードされる第２のポリペプチド、を含むアッセイ混合物；
のうちの１つの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
２つの以前の発明の方法論（米国特許６，３７６，６５２、およびＰＣＴ国際出願ＷＯ００／３２８２５）を用いて、黄色ブドウ球菌からの本質的なポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定し特徴づけた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
黄色ブドウ球菌ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４配列の同定
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドを同定するために用いられる方法論は、米国特許６，３７６，６５２、およびＰＣＴ国際出願ＷＯ００／３２８２５に詳細に記載されている。要約すると、このＰＣＴ出願は、選択された細菌に感染できるバクテリオファージに関する。ファージの遺伝子情報の配列決定および特徴付けにより、それらの宿主を阻害するのに本質的または助けになるもの等の、ファージによりエンコードされるすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定ができる。各々のＯＲＦは、コンピュータソフトウエアを用いて同定され、宿主中で個々に発現される。そして、宿主の生存力に対するこの発現の効果が測定される。宿主細菌を阻害するファージゲノムからのＯＲＦの同定は、それ自体細菌阻害因子化合物として使用できる化合物（またはさらなる阻害因子を得るために誘導体化または修飾される）、およびファージがエンコードする阻害因子により影響される細菌標的の同定のための道具として使用できる化合物、の両方を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
本発明は、配列番号１のコード配列に対してその全長にわたり同一なポリヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、それ自身成熟したポリペプチドまたはそれらのフラグメントについてのコード配列、およびリーダー配列もしくは分泌配列、プレ−、プロ−、またはプレプロ−タンパク質配列をエンコードする配列のような、他のコード配列を有するリーディングフレームの成熟ポリペプチド若しくはフラグメントについてのコード配列を提供する。本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、限定されないが、転写されたが翻訳されていない配列、（ロー依存およびロー独立ターミネーションシグナルのような）ターミネーションシグナル、リボソーム結合部位、コザック配列、ｍＲＮＡを安定化するかまたは不安定化する配列、イントロン、およびポリアデニル化シグナルのような、少なくとも１つの非コード５’および３’配列等の、少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、さらなるアミノ酸をエンコードするさらなるコード配列を含んでもよい。例えば、融合したポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をエンコードすることができる。本発明の特定の態様として、マーカー配列は、ｐＱＥTMベクターとして提供され（キアゲン社）、Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されたヘキサヒスチジンペプチド、またはＨＡペプチドタグ［Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）］であり、その両方がそれらに融合したポリペプチド配列を精製するのに有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、限定されないが、構造遺伝子および遺伝子発現を制御するそれに自然に関係する配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ＲＡＣＥ）に基づくもの［例えば、Ｆｒｏｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８−９００２，１９８８を参照のこと］等、完全長ＤＮＡを得るため、または短いＤＮＡを伸ばすための利用可能で当業者によく知られたいくつかの方法がある。この技術の最近の改良では、例えばＭＡＲＡＴＨＯＮTM技術（クロンテックラボラトリーズ社）により例示されるように、長いｃＤＮＡついての顕著に単純化された探索がある。ＭＡＲＡＴＨＯＮTM技術では、ｃＤＮＡは、選択された細胞から抽出されたｍＲＮＡから調製され、「アダプター」配列がそれぞれの末端にリゲートされる。そして、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてＤＮＡの「失われた」５’末端を増幅するために、ＰＣＲによる核酸の増幅が行われる。「巣に入った」プライマーを用いて、これは増幅産物内でアニールするように設計されたプライマーであり（典型的には、アダプター配列中のさらなる３’にアニールするアダプター特異的プライマーおよび選択された遺伝子配列中のさらなる５’にアニールする遺伝子特異的プライマーである）、ＰＣＲ反応が繰り返される。この反応生成物は、ＤＮＡ配列決定により分析でき、完全配列を得るために生成物を既存のＤＮＡに直接結合すること、または５’プライマーの設計のために新たな配列情報を用いて別個の完全長ＰＣＲを実行すること、のいずれかにより完全長ＤＮＡを構築できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
ｉｉｉ）表面プラスモン共鳴
タンパク質：タンパク質相互作用の阻害因子をスクリーニングするための他の強力なアッセイは、表面プラスモン共鳴である。表面プラスモン共鳴は、水溶液相（検体）からセンサー（リガンド）上に固定化された第２のタンパク質若しくは生体分子への１つのタンパク質若しくは他の生体分子の結合により引き起こされるセンサー表面近くの質量の変化により２つ（またはそれ以上）の分子間の結合を測定する、定量的な方法である。この質量の変化は、第２のタンパク質若しくは生体分子（検体）の注入若しくは除去後の時間に対する共鳴単位として測定され、およびビアコアバイオセンサーTM（ビアコア社）若しくは同様の装置を用いて測定される。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４若しくはＳＴＡＡＵ＿Ｒ４のフラグメントを含むポリペプチドは、共有結合方法を用いて（例えば、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中でのアミンカップリング）、センサーチップ（例えば、研究グレードＣＭ５TM、ビアコア社）上にリガンドとして固定化できる。空の表面は、タンパク質の固定化をせずにセンサーチップを活性化および不活性化することにより調製される。あるいは、リガンド表面は、ペプチドアフィニティータグ、抗体、若しくはビオチン化によるセンサーチップ表面上のリガンドの非共有結合の捕捉により調製できる。３Ａ  ＯＲＦ  ３３のＳＴＡＡＵ＿Ｒ４若しくはそれらのフラグメントへの結合は、リガンドチップ表面上の精製した３Ａ  ＯＲＦ  ３３を注入することにより測定される。測定は、４℃と３７℃の間のいずれの所望の温度でも実行できる。アッセイ（即ち、結合をおこなうもの）に用いられる条件は、以下のとおりである：２５ｍＭのヘペス−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５％のグリセリン、１ｍＭのジチオトレイトール、および０．００１％のＴｗｅｅｎTM２０、１０μｌ／ｍｉｎの流速。候補阻害因子によるセンサーチップのプレインキュベーションは、予想どおり３Ａ  ＯＲＦ  ３３とＳＴＡＡＵ＿Ｒ４との相互作用を減少させることとなる。３Ａ  ＯＲＦ  ３３結合の減少は、センサーグラム上の低下した反応として検出され、また共鳴単位で測定され、候補化合物による競争結合の表示となる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７８】
Ａ．融合３Ａ  ＯＲＦ  ３３組み換えタンパク質の製造
バクテリオファージ３ＡからのＯＲＦ３３を、ＧＳＴとのフレーム単位での翻訳による融合のための発現ベクターであるｐＧＥＸ４Ｔ−１TM（ファルマシア）中に、およびポリヒスチジン（ヒスタグ）とのフレーム単位での発現ベクターであるｐＥＴ１５ｂＭＣＳ２中にサブクローニングした。プラスミドｐＴＭ３ＡＯＲＦ３３（図３Ａ）をキアゲンTMカラムで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理し、そしてＢａｍＨＩで消化した。３Ａ  ＯＲＦ  ３３を含むＤＮＡ制限産物を、キアクイックTMスピンカラム（キアゲン）でゲル精製し、（ＳａｌＩでの消化、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントでの処理、そしてＢａｍＨＩでの消化、その後のキアクイックTMスピンカラムによるゲル精製により調製した）ｐＧＸＴ４Ｔ−１TMおよびｐＥＴ１５ｂＭＣＤ２発現ベクターにリゲートした。組み換え発現ベクターを、プラスミドミニプレップの制限酵素分析により同定した。大規模ＤＮＡ調製をキアゲンTMカラムにより実行し、得られたプラスミドを配列決定した。発現プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ）中での試験発現を行い、最適なタンパク質発現条件を確認した。発現構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、２ＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液中３７℃でＯＤ600が０．４から０．６（１ｃｍ経路長）となるまで成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧで最適時間および最適温度（３０℃で３時間）で誘導した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
Ｂ．ＧＳＴ／３Ａ  ＯＲＦ  ３３およびＭＣＳ２／３Ａ  ＯＲＦ  ３３融合体のタンパク質精製
ＧＳＴ／３Ａ  ＯＲＦ  ３３融合タンパク質を含む細胞を、１０ｍｌＧＳＴ溶解バッファー／リットルの細胞培地（ＧＳＴ溶解バッファー：２０ｍＭのヘペス  ｐＨ７．２、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのベンズアミジン、および１ＰＭＳＦ）に懸濁させ、フレンチプレッシャーにより細胞を溶解した後、４℃での超音波による２０秒間の３回バーストした。溶解物をソーヴァルＳＳ３４TMローターにより１００００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離した。上清を溶解バッファーによりあらかじめ平衡化した４ｍｌのグルタチオンセファロースカラムに投入し、重力により流した。カラムを１０カラム容積の溶解バッファーで洗浄し、ＧＳＴ溶出バッファー（２０ｍＭのヘペス  ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および２５ｍＭの還元型グルタチオン）により４ｍｌの画分として溶出させた。画分を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ラーミリ）により分析し、クマシーブリリアントブルーTMＲ−２５０染料により染色することにより視覚化し、溶出したＧＳＴ／３Ａ  ＯＲＦ  ３３タンパク質の量を評価した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
ＭＣＳ２／３Ａ  ＯＲＦ  ３３（ヒスタグ）融合タンパク質を含む細胞を、ヒスタグ溶解バッファー（２０ｍＭのヘペス  ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、１ｍＭのベンズアミジン、および１ｍＭのＰＭＳＦ）とともに、１０ｍｌ溶解バッファー／リットルの細胞培地に懸濁させ、フレンチプレッシャーを通すことにより細胞を溶解した後、４℃での超音波による２０秒間の３回バーストした。溶解物をソーヴァルＳＳ３４TMローターにより１００００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離した。上清をＮｉ2+によりあらかじめ平衡化した４ｍｌの金属キレートセファロースカラムに投入し、ヒスタグ溶解バッファーにより洗浄し、重力により流した。カラムを５ｍＭのイミダゾールを含む１０カラム容積のヒスタグ溶解バッファー、５０ｍＭのイミダゾールを含む６カラム容積のヒスタグ溶解バッファーで洗浄し、ヒスタグ溶出バッファー（２０ｍＭのヘペス  ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセリン）により４ｍｌの画分として溶出させた。画分を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ラーミリ）により分析し、クマシーブリリアントブルーTMＲ−２５０染料により染色することにより視覚化した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
Ｃ．黄色ブドウ球菌抽出物の調製
黄色ブドウ球菌抽出物を、超音波照射およびヌクレアーゼ消化に続くリソスタフィン消化を用いて細胞ペレットから調製した。細胞ペレット（２．９ｇ）を、２０ｍＭのヘペスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのベンズアミジン、１０００単位のリソスタフィン、０．５ｍｇのＲＮａｓｅＡ、７５０単位のミクロコッカルヌクレアーゼ、３７５単位のＤＮａｓｅ１の、８ｍｌに懸濁させた。細胞懸濁液を、３７℃で３０分間インキュベートし、４℃に冷却し、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５００ｍＭのＮａＣｌの最終濃度とした。溶解物を、それぞれ２０秒間の３回のバーストを用いて氷上で超音波照射した。溶解物を、Ｔｉ７０TM固定角度ベックマンローターにより２００００ｒｐｍで１時間遠心分離した。上清を採取し、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのベンズアミジン、および１ｍＭのＰＭＳＦを含むアフィニティークロマトグラフィーバッファー（ＡＣＢ：２０ｍＭのヘペスｐＨ７．５、１０％のグリセリン、１ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＥＤＴＡ）に対して、１００００Ｍｒ透析膜により一晩透析した。透析されたタンパク質抽出物を透析管から採取し、１ｍｌの部分標本として−７０℃で凍結させた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
Ｄ．アフィニティーカラムの調製
ＧＳＴ、ＧＳＴ／３Ａ  ＯＲＦ  ３３、およびＭＣＳ２／３Ａ  ＯＲＦ  ３３を、１ＭのＮａＣｌを含むＡＣＢに対して一晩透析した。タンパク質濃度をバイオラッドTMタンパク質アッセイにより測定し、タンパク質を０、０．１、０．５、１．０、および２．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質／樹脂濃度でアフィゲルTM１０樹脂（バイオラッド）に架橋させた。架橋した樹脂を、カラム充填および１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢにより平衡化する前に、エタノールアミンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下で連続的にインキュベートした。黄色ブドウ球菌抽出物を、４℃でマイクロ遠心分離により１５分間遠心分離し、１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢで５ｍｇ／ｍｌに希釈した。４００μｌの抽出物を、０、０．１、０．５、１．０、および２．０ｍｇ／ｍｌのリガンドを含む４０μｌのカラムに投入し、そして１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ（４００μｌ）を２．０ｍｇ／ｍｌのリガンドを含むさらなるカラムに投入した。カラムを１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ（４００μｌ）により洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ（１００μｌ）、１ＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ（１６０μｌ）、および１％のＳＤＳ（１６０μｌ）により連続的に溶出させた。各々の溶出物８０μｌを１６ｃｍ１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５］、タンパク質を銀染色により視覚化した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８５】
Ｇ．ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４のバイオインフォマティック分析
配列相同性（ＢＬＡＳＴ）および隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）解析を、両プログラムの実行により行った。配列分析に用いたダウンロードした公開データベースは、以下の通りである。
ｉ）  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ＧｅｎＢａｎｋTM  （ｎｒ）（ｗｗｗ．    ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）
ｉｉ）  ｐｄｂａａ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ    ．ｇｏｖ）
ｉｉｉ）  ＰＲＯＤＯＭTM  （ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）
ｉｖ）  ＳｗｉｓｓｐｒｏｔTM    ａｎｄ  ＴＲＥＭＢＬTM（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）
ｖ）  Ｂｌｏｃｋ  ｐｌｕｓTM  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  ｐｒｉｎｔｓTM（ｈｔ    ｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ）
ｖｉ）  ＰｆａｍTM  （ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）
ｖｉｉ）  ＰｒｏｓｉｔｅTM  （ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
図８に示すように、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４について行ったＢＬＡＳＴ解析の結果から、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ等の種々の細菌からの脂肪酸／リン脂質合成ＰｌｓＸタンパク質に似ていることが明らかとなった。特に、図９Ａに示される、全体最適アライメントの結果から、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４のアミノ酸配列とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｌｓＸ（ＧｅｎＢａｎｋTMアクセッション番号：６６８６３２５）との間に、５３％の同一性、７１％の類似性があることが明らかとなった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
Ａ．アフィニティーブロッティングアッセイのためのＧＳＴ／３Ａ  ＯＲＦ  ３３およびＧＳＴ／ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４組み換えポリペプチドの作製
プレシジョンTMプロテアーゼ切断部位を融合したＧＳＴを含むｐＧＥＸ−６Ｐ１TMを、ファルマシアアマシャムバイテックから購入した。心筋キナーゼ（ＨＭＫ）リン酸化部位（配列番号５：５’−ＧＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３’および配列番号６：５’−ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴ−ＧＣＡＣＧＡＣＧＡ−３’）に対応する合成によりアニールしたオリゴヌクレオチドを、固有のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩにクローニングすることにより、ｐＧＥＸ−６ＰＫTMを得た［Ｋａｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０：３５１−３６４］。結果として、ＨＭＫ部位は、ＧＳＴと融合してクローニングされ、固有のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩクローニング部位に続く。２本鎖の挿入を、ＤＮＡ配列分析により確認し、そのプラスミドをｐＧＥＸ−６ＰＫTMと呼ぶ（図１０Ｃ）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
図１０Ｂに示すように、バクテリオファージ３Ａ  ＯＲＦ  ３３を、３Ａ  ＯＲＦ  ３３配列を含むｐＧＡＤＴ７TMベクター（クロンテックラボラトリーズ）のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ消化によりｐＧＥＸ−６ＰＫTM中にサブクローニングした。３Ａ  ＯＲＦ  ３３を含むＤＮＡフラグメントを、キアゲンカラムによりゲル精製し、ＨＭＫラベル化部位の３’末端でフレーム単位で（事前にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化しておいた）ｐＧＥＸ−６ＰＫTMにリゲートし、ｐＧＥＸ−６ＰＫ３Ａ  ＯＲＦ  ３３を作製した。組み換え発現ベクターを、プラスミドミニプレップの制限酵素分析により同定し、大規模ＤＮＡ調製を、キアゲンTMカラムにより行った。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９４】
Ｂ．ＧＳＴ融合タンパク質の精製と放射線ラベル化
プラスミドｐＧＥＸ−６ＰTMからのＧＳＴ／３Ａ  ＯＲＦ  ３３およびＧＳＴ／ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４組み換えタンパク質の発現を、ＯＤ600〜０．５において培地に１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。タンパク質を３７℃で３時間発現させ、細胞をＪＡ−１０TMローター（ベックマン）により４℃で１５分間５０００ｒｐｍで遠心分離することにより採取した。細菌ペレットを、１００ｍｌの氷冷リン酸バッファー塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、４つの部分標本に分けて上記のように遠心分離した。各々の部分標本を、７ｍｌのＳＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム）に再懸濁した。１５分間のインキュベーションの後、１０ｍＭのジチオトレイトール（ギブコＢＲＬ）および１．４％のサルコシル（シグマ）を加え、溶解した細胞に氷上で２０秒間の超音波のバーストを３回行った。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９５】
細胞溶解物をＪＡ−２０TMローター（ベックマン）により４℃で２０分間１６，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を全容積２０ｍｌの２％のＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００（シグマ）により、室温で３０分間、倒置回転させて処理した。溶解物をＪＡ−２０TMローターにより４℃で２０分間１６，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を１ｍｌのグルタチオンセファロース−４ＢTMビーズ（アマシャム−ファルマシア）により４℃で６０分間インキュベートした。ビーズをＰＢＳで完全に洗浄し、エッペンドルフチューブに移し、純粋なタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴの５００μｌ中の４０単位のプレシジョンTMプロテアーゼ（ファルマシア−アマシャム）による消化により、ＧＳＴ部分から切断した。倒置回転による４℃での５時間のインキュベーションの後、サンプルをミクロ遠心で５分間１３，０００ｇで遠心分離し、上清を採取した。タンパク質濃度を、使用説明書（バイオラッド）にしたがってバイオラッドTM試薬を用いて測定し、タンパク質を使用するまで−８０℃で保存した。タンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、クマシーブリリアントブルーTMＲ−２５０染色により視覚化した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９６】
［32Ｐ］−ＡＴＰによる放射性ラベル化のため、４μｇのＧＳＴ切断ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドを、ｃＡＭＰ依存タンパク質キナーゼ「心筋キナーゼ」（シグマ）の５０単位の触媒サブユニットにより、２００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ、１２０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴおよび５０μＣｉの［γ32Ｐ］−ＡＴＰ（３０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）（ＮＥＮ／マンデル）を含む全容積１００μｌ中で、室温で３０分間インキュベートした。結合していないヌクレオチドを除去するために、タンパク質をセファデックス−Ｇ５０TMＮＩＣＫカラム（アマシャム−ファルマシア）に投入し、Ｚ−バッファー（２５ｍＭのヘペス  ｐＨ７．７、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２０％のグリセリン、１００ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＤＴＴ）により溶出させ、γ32Ｐ−ＡＴＰの取り込みを、液体シンチレーションカウンターでカウントすることにより測定した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３００】
一般的に記載された発明として、それらの好ましい態様を例示する目的で示される、以下の図面が参照されることとなる。
【図１】図１は、黄色ブドウ球菌ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図２】図２は、黄色ブドウ球菌バクテリオファージ３Ａ  ＯＲＦ  ３３のヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸（配列番号４）配列を示す。
【図３】図３は、バクテリオファージ３Ａ  ＯＲＦ  ３３の細菌阻害性ポテンシャルおよび黄色ブドウ球菌中でその発現を誘導するのに使用される発現ベクターを示す。Ａ）黄色ブドウ球菌細胞中の発現を誘導するのに使用される発現ベクターｐＴＭ／ＯＲＦの模式図；Ｂ）半固体担体培地上で成長した黄色ブドウ球菌中で発現させたときの３Ａ  ＯＲＦ  ３３の阻害性ポテンシャルを評価するためのスクリーニングの結果；Ｃ）、Ｄ）プラスミドに対する選択圧を維持するのに必要な抗生物質を含む（Ｃ）または含まない（Ｄ）いずれかの半固体培地上で培養した後に液体培地中で成長させた黄色ブドウ球菌中で発現させたときの、３Ａ  ＯＲＦ  ３３の阻害性ポテンシャルのアッセイ結果。
【図４】図４は、ＧＳＴ／３Ａ  ＯＲＦ  ３３リガンドを用いた、１０．０ｍｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌抽出物についてのアフィニティークロマトグラフィーを示す。樹脂中に０、０．１、０．５、１．０、および２．０ｍｇ／ｍｌでリガンドを含むアフィニティーカラムからの溶出液を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分解し、ゲルを硝酸銀で染色した。０．１％のＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥは示していない）、１ＭのＮａＣｌ  ＡＣＢ、および１％のＳＤＳを含む１００ｍＭのＡＣＢにより、ミクロカラムを連続的に溶出した。それぞれの分子量マーカーは、約２００ｎｇである。ＡＣＢが付されたレーンは、１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢバッファーのみを流した２．０ｍｇ／ｍｌのリガンドのカラムからの溶出液を示す。ＰＴ４０で示された矢印は、タンパク質同定のために切断されたバンド位置を示す。
【図５】図５は、リガンドとしてポリヒスチジン配列（ＭＳＣ２／３Ａ  ＯＲＦ  ３３）に融合した３Ａ  ＯＲＦ  ３３を用いた、１０．０ｍｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌抽出物についてのアフィニティークロマトグラフィーを示す。樹脂中に０、０．１、０．５、１．０、および２．０ｍｇ／ｍｌでリガンドを含むアフィニティーカラムからの溶出液を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分解し、ゲルを硝酸銀で染色した。０．１％のＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥは示していない）、１ＭのＮａＣｌ  ＡＣＢ、および１％のＳＤＳを含む１００ｍＭのＡＣＢにより、ミクロカラムを連続的に溶出した。それぞれの分子量マーカーは、約２００ｎｇである。ＡＣＢが付されたレーンは、１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢバッファーのみを流した２．０ｍｇ／ｍｌのリガンドのカラムからの溶出液を示す。ＰＴ４０で示された矢印は、タンパク質同定のために切断されたバンド位置を示す。
【図６】図６は、リガンドとして対照ＧＳＴを用いた、１０．０ｍｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌抽出物についてのアフィニティークロマトグラフィーを示す。樹脂中に０、０．１、０．５、１．０、および２．０ｍｇ／ｍｌでリガンドを含むアフィニティーカラムからの溶出液を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分解し、ゲルを硝酸銀で染色した。０．１％のＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥは示していない）、１ＭのＮａＣｌ  ＡＣＢ、および１％のＳＤＳを含む１００ｍＭのＡＣＢにより、ミクロカラムを連続的に溶出した。それぞれの分子量マーカーは、約２００ｎｇである。ＡＣＢが付されたレーンは、１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢバッファーのみを流した２．０ｍｇ／ｍｌのリガンドのカラムからの溶出液を示す。
【図７】図７は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて３Ａ  ＯＲＦ  ３３と相互作用するＰＴ４０タンパク質のトリプシン消化によるペプチドの質量分析を示す。ＰＴ４０のバンドは、オープンリーディングフレームとして同定され、ここではＳＴＡＡＵ＿Ｒ４と呼ばれ、オクラホマ大学のゲノム配列決定プロジェクトデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｓｔａｐｈ．ｈｔｍｌ）のＣｏｎｔｉｇ７８２中に見出された。
【図８】図８は、ＮＣＢＩ（ｎｒ）を含む公衆に利用可能なＢＬＡＳＴ検索解析の結果を示す。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ＧｅｎＢａｎｋTMアクセッション番号：６６８６３２５）を含む、種々の細菌からのＰｌｓＸタンパク質に極めて似ている。
【図９】図９は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｌｓＸのアミノ酸配列の全体最適アライメント、並びに黄色ブドウ球菌遺伝子の開始コドンの同定を示す。Ａ）全体最適アライメントの結果から、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＰｌｓＸとの間に５３％の同一性があることがわかる。Ｂ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４を含む黄色ブドウ球菌の終止コドンから終止コドンまでのＤＮＡ領域の解析結果から、予測されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列（ヌクレオチド配列の強調文字）に関係したＡＴＧ開始コドンの存在が明らかとなる。
【図１０】図１０は、Ａ）黄色ブドウ球菌ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４のクローニングの概略；Ｂ）ｐＧＥＸ−６ＰＫTMベクター中でのファージ３Ａ  ＯＲＦ  ３３のクローニングの概略；Ｃ）ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩクローニング部位の後に、プレシジョンTMプロテアーゼ切断部位および心筋キナーゼ（ＨＭＫ）リン酸化部位に融合したＧＳＴを含むベクターｐＧＥＸ−６ＰＫTM；およびＤ）精製した３Ａ  ＯＲＦ  ３３と［32Ｐ］−ＡＴＰ−放射性ラベル化ＳＴＡＡＵ＿Ｒ４ポリペプチドとの相互作用を試験するために設計されたファーウエスタンアフィニティーブロッティング分析の結果；を示す。レーン１から４は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解し、ニトロセルロース膜にブロットした増加させた量の（０．１２５、０．２５０、０．５および１．０μｇ）の３Ａ  ＯＲＦ  ３３を示す。