【手続補正書】
【提出日】平成16年12月28日(2004.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  下記方法；
細菌DNA制限フラグメントのPFGE分離がCHEF（Contour Clamped Homogeneous Electric Field）又はTAFE（Transversal Alternating Field Electrophoresis）システムのミニチャンバー中において7から13時間行われ；該フラグメントのDNA移動（D）はDNAサイズ（L）、電場（E）、緩衝液粘度（η，緩衝液温度の関数）を代入することにより種々のパルス時間（tp）において、そして既知の理論式のグループにおけるパルス時間すなわち、式1：
2004513375.tif 000001
（n,パルス回ランプの数；Np，パルスの数）としてのD，式2：
2004513375.tif 000002
としてのd（パルス当りの移動）、式3：
2004513375.tif 000003
としてのvr (DNAリオリエンテーション速度)、式4：
2004513375.tif 000004
としてのvm（リオリエンテーション後のDNA速度）、0.134（L1.14/Vr）0.926としてのtr（DNAリオリエンテーション時間）において計算され；式中、式5：
2004513375.tif 000005
そして電気泳動は1.5％アガロースゲル及び0.5X TBE緩衝液中で行われ；その改良が以下を含む：
a)下記により行われるEscherichia coli, Pseudomonas aeruginosa又は Staphylococcus aureus細胞の完全な固定化DNAの調製の段階：
i) それにより固定化完全DNA分子が該細菌細胞から調製される試薬キットを構成する化学試薬の溶液のセット、以下の成分を有するキットの溶液：
-  塩（0.15 M NaCl）又は金属キレート剤（0.01 M EDTA）及び塩（0.15 M NaCl）、細菌細胞を洗いそしてアガロースミニプラグ中に包埋する該キットの溶液、
-  金属キレート剤（0.1 M EDTA）、2種の陰イオン界面活性剤（1％サルコシル及び1％ Nonidet P-40）及び0.01 M Tris塩基、さらに4 M 尿素を含む溶液、細菌細胞が処理される該キットの溶液、
-  金属キレート剤（0.1 M EDTA）及び0.01 M Tris塩基、ミニプラグを洗いそして保存する該キットの溶液；
ii)細菌細胞を含むアガロースミニプラグを成型するための柔軟な鋳型；鋳型はシリコーンのような材料のシートであり、硝子の蓋で覆われている；シートは0.5 cmまでの厚さでそしてその片面に0.3 cmの大きさのいくつかの正方形で0.03から約0.1 cmの深さの窪みを打ち抜き、その窪みの中でアガロース-細菌細胞混合物が固化しそして該サイズのミニプラグを提供し、その鋳型は該ミニプラグを取り出すことができる十分な柔軟性がありそして高圧蒸気滅菌後に再使用でき、該鋳型と硝子蓋は完全に組み合わされそして方法にしたがって細菌細胞を固定化するために使用される、
iii)各細菌種による柔軟性鋳型及び該試薬キットの使用方法、
（b）該細菌種のDNA制限フラグメントのミニチャンバー中での分離に先立つ計算の段階；ミニCHEFの最適電気泳動実施条件を選択する段階；段階は以下を含む計算方法によって行われる；
i)電場1から20 V/cm及び温度4から30℃に対してd，tr，vr，及び細菌DNA制限フラグメントのVm のデータセットの入力、数値のセットはDNAサイズ、電場及び温度をtr，vr，vm及びdを記述する既知理論式のグループに代入することにより得られる、
ii)ランプのパルス持続時間又はDNA分子を最も効果的に分離するパルス時間のシリーズの計算、
iii)段階（ii）において計算されたパルス持続時間のシリーズに対する総電気泳動時間、又は最も有効な電気泳動時間の計算、
iv)該最適電気泳動条件又は最も有効なパルス持続および電気泳動時間のランプに対するバンドパターン図の計算、図はこの方法の結果として与えられそしてDNA移動に従って分離された種々の色の線によって描かれたバンドによって示される；図の中の色によってそれぞれの大きさの制限フラグメントを確認する；そのため単一の対応カラーコードによりフラグメントの大きさを同定する、いくつかの段階により各計算を行う；そしていくつかのタームにより形成されたシリーズ又はランプであり、その中の各タームはパルス持続時間（tp）であり、そして各タームは最も有効な電気泳動時間を与える対応するパルス数（Np）を伴っている、
よりなるパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）による迅速細菌型分類方法。
【請求項２】  該柔軟性がありそして高圧蒸気滅菌できる鋳型を形成するシートがシリコーン、ゴム又はいずれかの柔軟性材料から造られており、シートには片面にいずれかの形、大きさ及び数の同じ正方形の窪み（望ましくは50まで）が打ち抜かれている請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項３】  アガロースミニプラグ中に完全な固定化DNAを作るための該柔軟な鋳型の一つの組み立て及び使用方法が以下の段階を有する：
i)細菌細胞及びアガロースの懸濁を鋳型の窪みの打ち抜かれた表面に注ぐ；
ii)該懸濁をスパーテルで該窪みを満たすように均等に配分する；
iii)鋳型を蓋で覆いそしてミニプラグが形成されるまで置く；
iv)フラスコ上で鋳型を曲げてミニプラグを取り出す、
請求項1及び2に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項４】  該試薬キットの細胞洗浄溶液の組成が0.15 M NaClおよび0.01 M EDTA，pH 8.0（溶液No.1）である請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項５】該試薬キットの細胞洗浄溶液の組成が0.15 M NaCl（溶液No.2）である請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項６】  該試薬キットの細胞包埋溶液の組成が0.15 M NaCl 中の1.5から2 ％の低融点アガロース懸濁（溶液No.3）である請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項７】  該試薬キットの細胞包埋溶液の組成が0.15 M NaClおよび0.01 M EDTA，pH 8.0中の1.5から2 ％の低融点アガロース懸濁（溶液No.4）である請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項８】  該試薬キットの細胞処理溶液の組成が0.1 M EDTA, 1% サルコシル，1% Nonidet P-40及び0.01 M Tris塩基，pH 8.0（溶液No.5）である請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項９】  該試薬キットの細胞処理溶液の組成が0.1 M EDTA, 1% サルコシル，1% Nonidet P-40，0.01 M Tris塩基，及び4 M尿素，pH 9.5（溶液No.6）である請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１０】  該試薬キットのミニプラグ洗浄及び保存溶液の組成が0.1 M EDTA及び0.01 M Tris塩基，pH 8.0（溶液No.7）である請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１１】  P. aeruginosa 細胞の完全固定化DNAを調製するための該試薬キット及び該柔軟な鋳型の一つの使用方法が以下の段階を含む：
i)ブロス又はプレートから細胞を回収しそして該試薬キットの溶液No.2の中で洗い、
ii)該試薬キットの溶液No.3 中に細胞を懸濁しそしてその懸濁を柔軟な鋳型に注ぐ、
iii)アガロースが固化した後該鋳型を曲げることにより鋳型からミニプラグを取り出し、そしてそれを該試薬キットの溶液No.6 中30分間50℃でインキュベートし、
iv)ミニプラグを2回50℃で10分間該試薬キットの溶液No.7 中で洗い、そしてさらに該溶液中で保存する請求項1〜10に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１２】  S. aureus 細胞の完全固定化DNAを調製するための該試薬キット及び該柔軟な鋳型の一つの使用方法が以下の段階を含む：
i)ブロス又はプレートから細胞を回収しそして該試薬キットの溶液No.1の中で洗い、
ii)該試薬キットの溶液No.4 中に細胞を懸濁しそしてその懸濁を柔軟な鋳型に注ぐ、
iii)アガロースが固化した後該鋳型を曲げることにより鋳型からミニプラグを取り出し、そしてそれを該試薬キットの溶液No.6 中60分間50℃でインキュベートし、
iv)ミニプラグを2回50℃で10分間該試薬キットの溶液No.7 中で洗い、そしてさらに該溶液中で保存する請求項1〜10に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１３】  E. coli 細胞の完全固定化DNAを調製するための該試薬キット及び該柔軟な鋳型の一つの使用方法が以下の段階を含む：
i)ブロス又はプレートから細胞を回収しそして該試薬キットの溶液No.1の中で洗い、
ii)該試薬キットの溶液No.3 中に細胞を懸濁しそしてその懸濁を柔軟な鋳型に注ぐ、
iii)アガロースが固化した後該鋳型を曲げることにより鋳型からミニプラグを取り出し、そしてそれを該試薬キットの溶液No.5 中10分間37℃でインキュベートし、
iv)ミニプラグを30分間50℃で該試薬キットの溶液No.6 中でインキュベートし、
v)ミニプラグを該試薬キットの溶液No.7 で洗い、そしてさらに該溶液中で保存する請求項1〜10に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１４】  該ミニチャンバーにおいて該細菌種のDNA制限フラグメントを分離するのに先立つ計算の段階がミニCHEFで実施する最適電気泳動条件が選択できる計算方法により達成され、その方法は下記段階を含む：
i) 計算方法に該細菌種のDNA制限フラグメントのパルス当りの移動（d）、リオリエンテーション時間（tr）、リオリエンテーションの間の移動速度（vr）及びリオリエンテーション後の移動速度（vm）のデータセット、DNA分子のtr，vr，vm及びdを記述する既知理論式のグループにDNAサイズ、電場及び実施温度を代入することにより計算されるデータセットを特定する、
ii)パルス持続時間の最も有効なシリーズ（ランプ）を計算する、
iii)段階（ii）で計算したパルス持続時間のシリーズに対する最も有効な電気泳動実施時間を計算する、
iv) 最も有効なパルス持続時間のシリーズ及び最も有効な電気泳動時間に対する全てのDNA制限フラクションの移動距離（D）を計算する、
v)推定バンドバターン及びミニゲルの図を描く、図はミニゲルの図にスケールを合わせたDNA移動によって描かれる、
vi)異なるd，tr，vr及びvmのデータセットで段階（i）から(v)を反復し、種々の電場及び温度において得られ、そして最後にバンドパターン図において仮説的バンドの最善の分離を与えるパルス持続のシリーズ及びパルス数を選択する、
請求項1に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１５】  DNA分子を最も有効に分離するパルス持続時間tprのシリーズ（ランプ）を計算する段階が下記段階に従って行われる：
i) 選択された電場及び温度において最小及び最大のDNAフラグメントのリオリエンテーション時間（それぞれ、trA及びtrB）をこの段階に特定する、
ii)trAより1.5倍少ない値から初めそしてtrBより1.5倍大きい値で終わるパルス持続（tpr=tp1，tp2, ...,tpn）のシリーズ（ランプ）のnターム（nは2から1000）を計算する；シリーズの増分Δは続くタームの間の共通差である；したがって、最も有効なシリーズは：tp1=trA/1.5，tp2=tp1＋Δ，tp3=tp1＋2Δ，...,tpn=1.5・tpB；式中Δ=｜(tp1- tpn)｜/(n-1)，そしてn=te/(tp1＋tpn);teは電気泳動実施時間、
請求項1及び14に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１６】  パルス持続の計算されたシリーズに対する最も有効な電気泳動実施時間を計算する段階が下記段階に従って行われる：
i) パルス持続の該シリーズ（r=1..nに対するtpr）のターム（tp1，tp2, ...,tpn）及び該シリーズのタームの数nをこの段階に特定する、
ii)最小DNA制限フラグメントのパルス当りの移動（drA）のセットをこの段階に特定する；その中の該分子のパルス当りの移動のセットは選択したシリーズのパルス（tp1，tp2, ...,tpn）及び電場及び温度に対して決められる；パルス当りの移動のセットはdを記述する既知理論式に最小DNA制限フラグメントのtr，vr及びvmを代入して計算される、
iii)シリーズの全タームに相当するパルスの数（Npr）の初期値をセットする；1からnの間のrに対する全てのNprに対する推奨される初期値は1である、
iv)各タームtprを伴うNpr（全てのtpr，Npr、及びr=1..nに対して）を1増加し、そしてシリーズのnタームに対して最小分子の移動Dを計算する；計算は
2004513375.tif 000006
として行われる；
v)  該分子が該仮説的ミニゲルの端から0.1から1 cm離れたミニゲルの領域に達することをDの値が示すまで段階iv)を反復する；そして、Nprの増加を終了し、そして最も有効な実行時間を推測する現在のNpr値を選択する、
vi)総実施時間として
2004513375.tif 000007
として計算された値を採る、
請求項1，14及び15に記載の迅速細菌型分類方法。
【請求項１７】  所与のミニゲルのスケールに合わせてバンドパターンの図を描くための段階が最も有効なパルス持続のシリーズ（ランプ）及び最も有効な電気泳動実施時間における全てのDNAフラグメントにより移動した距離Dの計算に基づいている；描画は下記段階を含む：
i) パルス持続のシリーズ（ランプ）のタームnの数、シリーズの各タームのパルス持続（tpr）、及び各tprに伴うパルスの数（Npr）、このｒは1からnの間、をこの段階に特定する、
ii)該細菌種の全てのDNA制限フラグメント（f1，f2...）のパルス当りの移動（dr1，dr2..）のセットをこの段階に特定する；該フラグメントのパルス当りの移動の該セットはシリーズのパルス（tp1，tp2, ...,tpn）及び選定される電場及び温度に対して決められる；パルス当りの移動のセットはdを記述する既知理論式に各DNA制限フラグメントのtr，vr及びvmを代入して計算される；dr1，dr2は二つの異なるフラグメントのパルス当りの移動のセットである、
iii)該DNAフラグメントが仮説的ミニゲル中を移動する距離を計算する、計算においてミニゲル中の各フラグメントの移動距離Dは
2004513375.tif 000008
として得られる、
iv)実際のミニゲルと同じ矩形を描き、そして大きな該矩形の中に種々の小さな矩形を描く、図の中の小さな矩形はDNA検体が仮説的に負荷されたスロットを示す、
v)パターンの図の中で各フラグメントは特定の色が指定される、バンドパターンの推定及び描画の後にその色は該フラグメント及びその大きさを同定する；すなわち、分離図に線として描かれたバンドに仮説的に含まれている分子の大きさを同定するカラーコードを使用する、
vi)フラグメントにより形成される仮説的バンドを示す小さな矩形のそれぞれの下に着色した線を描く、その中の各線は該小さな矩形、又はスロット、対応するフラグメントが実際のミニゲル中を移動した距離Dから離れている、
請求項1及び14〜16に記載の迅速細菌型分類方法。