(57)【要約】  第１物質が特異的に結合することが可能な第１物質結合部位を含む、核酸増幅法によるＤＮＡ増幅断片を用意する。該ＤＮＡ増幅断片を上記第１物質に結合させることによって、該ＤＮＡ増幅断片を濃縮する。ＤＮＡは、濃縮により高感度に検出することができる。したがって、上記構成によれば、核酸増幅法によるＤＮＡ増幅断片を、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に検出することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を検出する核酸検出方法であって、
上記ＤＮＡ増幅断片は、第１物質が特異的に結合することが可能な第１物質結合部位を含み、
該ＤＮＡ増幅断片を上記第１物質に結合させることによって、該ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを含むことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
上記ＤＮＡ増幅断片は、２つのプライマーを用いて、上記核酸増幅法により得られた２本鎖ＤＮＡ断片であり、
上記２つのプライマーのうち、少なくとも一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに上記第１物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
上記第１物質が固定された展開媒体上の、上記第１物質が固定されている領域とは異なる領域に、上記ＤＮＡ増幅断片を配置し、
溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を、上記第１物質が固定されている領域の方向に、上記展開媒体上で拡散させ、
上記第１物質が固定されている領域において、上記第１物質と上記ＤＮＡ増幅断片とを結合させることにより、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
上記ＤＮＡ増幅断片は、第２物質が特異的に結合することが可能な第２物質結合部位をさらに含み、
上記ＤＮＡ増幅断片を、標識物質が結合した第２物質に結合させて複合体を形成させ、さらに、該複合体を上記第１物質に結合させることによって、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸検出方法。
【請求項５】
上記ＤＮＡ増幅断片は、２つのプライマーを用いて、上記核酸増幅法により得られた２本鎖ＤＮＡ断片であり、
上記２つのプライマーのうち、一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに上記第１物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーであり、もう一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに上記第２物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーであることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の核酸検出方法。
【請求項６】
上記第１物質が固定された展開媒体上の、上記第１物質が固定されている領域とは異なる領域の別々の領域に、上記ＤＮＡ増幅断片、および上記標識物質が結合した第２物質をそれぞれ配置し、
溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を、上記標識物質が結合した第２物質が配置されている領域の方向に拡散させ、
上記標識物質が結合した第２物質が配置されている領域において、上記ＤＮＡ増幅断片を、標識物質が結合した第２物質に結合させて複合体を形成させ、
さらに、上記溶媒を用いて、上記複合体を上記第１物質が配置されている方向に、展開媒体上で拡散させ、
上記第１物質が固定されている領域において、上記第１物質と上記複合体とを結合させることにより、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
上記第１物質と、上記第２物質とは異なる物質であることを特徴とする請求の範囲第４項〜第６項のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項８】
上記第１物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
上記第２物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第４項〜第６項のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を検出するために用いる展開媒体であって、
上記ＤＮＡ増幅断片を配置するための第１領域と、該ＤＮＡ増幅断片に特異的に結合可能な第１物質を固定させることが可能な第２領域とが設けられていることを特徴とする展開媒体。
【請求項１１】
標識物質が結合した上記第２物質を配置するための第３領域がさらに設けられており、
上記第２物質は、上記ＤＮＡ増幅断片に特異的に結合可能であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の展開媒体。
【請求項１２】
上記第２物質と特異的に結合可能な核酸断片を固定させることが可能な第４領域がさらに設けられていることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の展開媒体。
【請求項１３】
上記第２領域に、上記第１物質が固定されていることを特徴とする請求の範囲第１０項〜第１２項のいずれか１項に記載の展開媒体。
【請求項１４】
上記第４領域に、上記第２物質と特異的に結合可能な核酸断片が固定されていることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の展開媒体。
【請求項１５】
上記第１物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１０項〜第１４項のいずれか１項に記載の展開媒体。
【請求項１６】
上記第２物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１１項または第１２項に記載の展開媒体。
【請求項１７】
核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を検出するための核酸検出キットであって、
請求の範囲第１０項〜第１６項のいずれか１項に記載の展開媒体を備えることを特徴とする核酸検出キット。
【請求項１８】
相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに第１物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の核酸検出キット。
【請求項１９】
相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに第２物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の核酸検出キット。
【請求項２０】
標識物質が結合した第２物質をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の核酸検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出方法、および核酸検出キットに関するものであり、特に、核酸増幅法により増幅した核酸検出方法、および核酸検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法としては、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ポリメラーゼチェインリアクション（polymerase chain reaction；以下「ＰＣＲ」ともいう）法など様々な方法が知られている。中でも、ＰＣＲ法は、核酸を増幅する方法として、分子生物学の分野で広く用いられている。近年、ＰＣＲは、分子生物学分野のみならず、病原菌の検出、アレルゲンなど食品中の混入物の検出、家畜管理、一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」ともいう）の検出など、その用途はますます広がっている。【０００３】
いずれの用途においても、ＰＣＲにより増幅された核酸断片を検出する必要がある。ＰＣＲにより増幅された核酸の増幅産物の検出方法は、これまで多数の方法が知られている。【０００４】
核酸の増幅産物を検出する最も一般的な方法としては、増幅反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動にアプライし、エチジウムブロマイド等の蛍光インターカレータを結合させて特異的な蛍光を観察する方法を挙げることができる。【０００５】
上記以外の方法としては、例えば、特許文献１には、蛍光標識されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、蛍光偏光により該核酸増幅産物を検出する方法が開示されている。また、特許文献２には、核酸増幅反応における反応液に偏光を通過させ、その偏光の旋光度または円偏光二色性を測定することによって、核酸増幅産物を検出する方法が開示されている。【０００６】
さらに、特許文献３には、ポリヌクレオチド鎖上の標的領域を増幅し、増幅反応に伴い、沈殿するピロリン酸マグネシウムを検出することにより、核酸増幅の有無を検出する方法が開示されている。また、特許文献４には、ターゲット核酸断片の特定の塩基配列に基づくポリメラーゼ伸長反応の際に生成するピロリン酸に対して、酸化酵素を含む酵素反応試薬で処理し、酸化酵素が作用する際に起こる電子移動を、電気化学的活性インターカレータの存在下で増幅し、電気化学的に電流として検出する方法が開示されている。【０００７】
特許文献１〜４の技術は、核酸増幅反応により増幅された核酸の増幅断片を検出するものであるが、ＰＣＲによる核酸の増幅産物の検出には、あらゆる核酸の検出方法を用いることができる。【０００８】
核酸の検出方法としては、例えば、特許文献５には、酵素系を使用して固体支持体上に固定される核酸配列を発色させることにより核酸を検出する方法が開示されている。【０００９】
また、特許文献６には、金属染色法で染色した核酸に色素前駆体と補力剤とを作用させて該核酸を検出する方法が開示されている。
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開平９−１８７２７５号公報（公開日：平成９（１９９７）年７月２２日）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００２−１８６４８１号公報（公開日：平成１４（２００２）年７月２日）」
【特許文献３】国際公開ＷＯ０１／８３８１７号（平成１３（２００１）年１１月８日公開）
【特許文献４】日本国公開特許公報「特開２００３−２９９号公報（公開日：平成１５（２００３）年１月７日）」
【特許文献５】日本国公開特許公報「特開平２−９４００号公報（公開日：平成２（１９９０）年１月１２日）」
【特許文献６】日本国公開特許公報「特開昭６１−６６９６４号公報（公開日：昭和６１（１９８６）年４月５日）」
【発明の開示】
【００１０】
上述したように、ＰＣＲによって増幅した核酸断片の検出方法としては、様々な方法があるが、簡便性、迅速性、精度などの観点から、いずれの方法も問題点を抱えている。
【００１１】
例えば、電気泳動後にエチジウムブロマイドで染色する方法は、電気泳動に時間を要する上、蛍光を検出するための装置や設備が必要となる。ＰＣＲによる目的の核酸の増幅産物以外の核酸の混入が無視できる程度に小さい場合には、電気泳動の工程を省くことができるが、その場合でも、蛍光を検出するための装置や設備は必要である。
【００１２】
特許文献１に開示される方法では、核酸増幅反応において核酸増幅産物に取り込まれなかったフリーの蛍光標識されたプライマーを分離する必要であるため、手間がかかるという問題がある。また、プライマーの分離操作により、ＰＣＲにより得られた核酸増幅断片の収量が低下し、結果的に検出感度が低下する恐れがある。
【００１３】
また、特許文献３に開示される方法は、沈殿による検出は極めて簡便であるため、一見、実用的であるように見えるが、検出感度が低いという問題がある。さらに、特許文献４に開示される方法は、操作が煩雑であり、簡便さの点で問題がある。
【００１４】
同様に、特許文献５および６に開示されるような方法もまた、工程が煩雑であるという問題がある。
【００１５】
このように、ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ増幅断片に限らず、従来の核酸増幅法によって増幅されたＤＮＡ増幅断片を検出する方法は、それぞれ問題を抱えており、さらに新しい技術の開発が求められている。
【００１６】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に、核酸増幅法によって増幅されたＤＮＡ増幅断片を検出する核酸検出方法、および核酸検出キットを提供することにある。
【００１７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、試料遺伝子を核酸増幅法により増幅したＤＮＡ増幅断片の両端領域に、特定の物質が特異的に結合できるように、プライマーを設計することにより、上記特定の物質を利用して、特殊な装置を必要とすることなく、上記ＤＮＡ増幅断片を簡便かつ高精度に検出できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
【００１８】
（１）核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を検出する核酸検出方法であって、上記ＤＮＡ増幅断片は、第１物質が特異的に結合することが可能な第１物質結合部位を含み、該ＤＮＡ増幅断片を上記第１物質に結合させることによって、該ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを含むことを特徴とする核酸検出方法。
【００１９】
（２）上記ＤＮＡ増幅断片は、２つのプライマーを用いて、上記核酸増幅法により得られた２本鎖ＤＮＡ断片であり、上記２つのプライマーのうち、少なくとも一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに上記第１物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーであることを特徴とする（１）に記載の核酸検出方法。
【００２０】
（３）上記第１物質が固定された展開媒体上の、上記第１物質が固定されている領域とは異なる領域に、上記ＤＮＡ増幅断片を配置し、溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を、上記第１物質が固定されている領域の方向に、上記展開媒体上で拡散させ、上記第１物質が固定されている領域において、上記第１物質と上記ＤＮＡ増幅断片とを結合させることにより、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを特徴とする（１）または（２）に記載の核酸検出方法。
【００２１】
（４）上記ＤＮＡ増幅断片は、第２物質が特異的に結合することが可能な第２物質結合部位をさらに含み、上記ＤＮＡ増幅断片を、標識物質が結合した第２物質に結合させて複合体を形成させ、さらに、該複合体を上記第１物質に結合させることによって、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを特徴とする（１）に記載の核酸検出方法。
【００２２】
（５）上記ＤＮＡ増幅断片は、２つのプライマーを用いて、上記核酸増幅法により得られた２本鎖ＤＮＡ断片であり、上記２つのプライマーのうち、一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに上記第１物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーであり、もう一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに上記第２物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーであることを特徴とする（４）に記載の核酸検出方法。
【００２３】
（６）上記第１物質が固定された展開媒体上の、上記第１物質が固定されている領域とは異なる領域の別々の領域に、上記ＤＮＡ増幅断片、および上記標識物質が結合した第２物質をそれぞれ配置し、溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を、上記標識物質が結合した第２物質が配置されている領域の方向に拡散させ、上記標識物質が結合した第２物質が配置されている領域において、上記ＤＮＡ増幅断片を、標識物質が結合した第２物質に結合させて複合体を形成させ、さらに、上記溶媒を用いて、上記複合体を上記第１物質が配置されている方向に、展開媒体上で拡散させ、上記第１物質が固定されている領域において、上記第１物質と上記複合体とを結合させることにより、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することを特徴とする（４）または（５）に記載の核酸検出方法。
【００２４】
（７）上記第１物質と、上記第２物質とは異なる物質であることを特徴とする請求項（４）〜（６）のいずれかに記載の核酸検出方法。
【００２５】
（８）上記第１物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸検出方法。
【００２６】
（９）上記第２物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする（４）〜（６）のいずれかに記載の核酸検出方法。
【００２７】
（１０）核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を検出するために用いる展開媒体であって、上記ＤＮＡ増幅断片を配置するための第１領域と、該ＤＮＡ増幅断片に特異的に結合可能な第１物質を固定させることが可能な第２領域とが設けられていることを特徴とする展開媒体。
【００２８】
（１１）標識物質が結合した上記第２物質を配置するための第３領域がさらに設けられており、上記第２物質は、上記ＤＮＡ増幅断片に特異的に結合可能であることを特徴とする（１０）に記載の展開媒体。
【００２９】
（１２）上記第２物質と特異的に結合可能な核酸断片を固定させることが可能な第４領域がさらに設けられていることを特徴とする（１１）に記載の展開媒体。
【００３０】
（１３）上記第２領域に、上記第１物質が固定されていることを特徴とする（１０）〜（１２）のいずれかに記載の展開媒体。
【００３１】
（１４）上記第４領域に、上記第２物質と特異的に結合可能な核酸断片が固定されていることを特徴とする（１２）に記載の展開媒体。
【００３２】
（１５）上記第１物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする（１０）〜（１４）のいずれかに記載の展開媒体。
【００３３】
（１６）上記第２物質は、核酸結合タンパク質であることを特徴とする（１１）または（１２）に記載の展開媒体。
【００３４】
（１７）核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を検出するための核酸検出キットであって、（１０）〜（１６）のいずれかに記載の展開媒体を備えることを特徴とする核酸検出キット。
【００３５】
（１８）相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに第１物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーをさらに備えていることを特徴とする（１７）に記載の核酸検出キット。
【００３６】
（１９）相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに第２物質が結合可能な塩基配列を含んでいるプライマーをさらに備えていることを特徴とする（１８）に記載の核酸検出キット。
【００３７】
（２０）標識物質が結合した第２物質をさらに備えていることを特徴とする（１９）に記載の核酸検出キット。
【００３８】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の一実施形態にかかる核酸検出方法の原理の概要を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態にかかる核酸検出方法のＰＣＲ工程の概要を示す図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態にかかる核酸検出キットに含まれる展開媒体を示す上面図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態にかかる核酸検出方法の利用の一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の一実施形態について図１〜図４に基づいて説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。【００４１】
＜Ｉ．核酸検出方法＞
本発明にかかる核酸検出方法は、核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を、該ＤＮＡ増幅断片と特異的に結合することが可能な第１物質に結合させることにより、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮する工程（以下、「ＤＮＡ増幅断片濃縮工程」ともいう）を少なくとも含んでいればよい。【００４２】
上記構成によれば、上記ＤＮＡ増幅断片は、上記第１物質と特異的に結合することができる。したがって、このＤＮＡ増幅断片と第１物質との親和性を利用して、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することができる。具体的には、例えば、上記第１物質を担体等に固定しておけば、このような第１物質が固定された担体を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を容易に濃縮することができる。【００４３】
このように、ＤＮＡ増幅断片を濃縮すれば、従来公知の方法とは全く異なる原理によって、上記ＤＮＡ増幅断片を検出することができる。なお、本明細書において、「核酸増幅法」とは、核酸を増幅するためのあらゆる核酸増幅方法が意図される。具体的には、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法等を挙げることができる。【００４４】
また、「ＤＮＡ増幅断片を検出する」とは、ＤＮＡ増幅断片を直接検出することに加えて、ＤＮＡ増幅断片に結合した物質を検出することにより、該ＤＮＡ増幅断片を間接的に検出することが意図される。【００４５】
本発明にかかる核酸検出方法は、別の実施形態として、核酸増幅法によって増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を、該ＤＮＡ増幅断片と特異的に結合することが可能な第２物質と標識物質とが結合した結合体に結合させることにより、複合体を形成させる工程（以下、「複合体形成工程」ともいう）と、該複合体を、上記ＤＮＡ増幅断片と特異的に結合することが可能な第１物質に結合させることにより、上記ＤＮＡ増幅断片（換言すれば、上記複合体）を濃縮する工程（以下、「ＤＮＡ増幅断片濃縮工程」ともいう）とを含む構成とすることができる。【００４６】
上記構成によれば、上記ＤＮＡ増幅断片は、上記第１物質および第２物質と特異的に結合することができる。上記構成では、まず、上記ＤＮＡ増幅断片を、上記標識物質が結合した第２物質と結合させる。これにより、上記ＤＮＡ増幅断片と、上記標識物質が結合した第２物質とが結合した複合体が形成される。【００４７】
上記複合体は、上記ＤＮＡ増幅断片を含んでいるため、上記第１物質と特異的に結合することができる。したがって、上記複合体と第１物質との親和性を利用して、上記複合体を濃縮することができる。その結果として、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することができる。このとき、上記ＤＮＡ増幅断片が濃縮されるとともに、上記標識物質も同様に濃縮される。【００４８】
したがって、上記構成によれば、濃縮された上記標識物質を検出することにより、上記ＤＮＡ増幅断片を間接的に検出することができる。【００４９】
以上のように、本発明にかかる核酸検出方法によれば、ＤＮＡ増幅断片を、該ＤＮＡ増幅断片との親和性を有する物質を用いて、効率よく濃縮できる。それゆえ、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度（高感度）にＤＮＡ増幅断片を検出することができる。【００５０】
本発明にかかる核酸検出方法は、上説したいずれの実施形態においても、試料ＤＮＡを核酸増幅法により増幅して、上記ＤＮＡ増幅断片を取得する工程（以下、「核酸増幅工程」ともいう）をさらに含んでいてもよい。【００５１】
以下、本発明にかかる核酸検出方法の一実施形態として、ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ増幅産物を検出する実施形態について主に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。つまり、各核酸増幅法に応じて、該核酸増幅法に適した鋳型、プライマー設計を行うことにより、本発明にかかる核酸検出方法を用いて、該核酸増幅方法により増幅された２本鎖のＤＮＡ増幅断片を検出できることは当業者は容易に理解できる。【００５２】
上述したように、ここでは、本発明にかかる核酸検出方法の一実施形態として、ＰＣＲ工程（核酸増幅工程）、複合体形成工程、およびＤＮＡ断片濃縮工程を含む構成を例に、各工程について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。【００５３】
（Ｉ−１）ＰＣＲ工程
上記ＰＣＲ工程では、鋳型となる試料ＤＮＡに対して、特定のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡ増幅断片を取得する。以下、ＰＣＲ工程で用いる試料ＤＮＡおよびプライマー、並びにＰＣＲ条件について具体的に説明する。【００５４】
〔試料ＤＮＡ〕
上記鋳型となる試料ＤＮＡは特に限定されるものではなく、ＰＣＲの鋳型として用いることができるＤＮＡであればよい。具体的には、血液、体液、組織、口腔内粘膜、毛髪、爪、および培養細胞など、動物、植物、微生物等のあらゆる生物学的試料由来のＤＮＡを用いることができる。また、上記試料ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、および葉緑体ＤＮＡ（plastid DNA）など、いずれであってもよい。これらＤＮＡは、増幅させるＤＮＡ断片に応じて、適宜選択すればよい。【００５５】
また、上記ＰＣＲ工程において、増幅させるＤＮＡ断片（すなわち、ＤＮＡ増幅断片）は、特に限定されるものではなく、鋳型となる試料ＤＮＡに含まれる部分塩基配列を含むものであればよい。具体的には、例えば、翻訳領域、非翻訳領域、またはそれらの部分領域を挙げることができる。また、上記ＤＮＡ増幅断片の長さも特に限定されるものではないが、５０ｂｐ〜１０００ｂｐとすることが好ましい。【００５６】
なお、上記試料ＤＮＡにおいて、ＰＣＲにより増幅させる領域の塩基配列は既知であることが好ましいが、未知である場合には、その塩基配列を解読して決定すればよい。また、ＰＣＲにより増幅させる領域は、プライマーの設計を考慮して選択することが好ましいが、プライマー設計上の問題を克服する手段について、多数知られており、そのような手段を適宜組み合わせてプライマー設計を行うことは、当業者によって日常的に行われていることである。つまり、このようなＰＣＲにより増幅させる領域の決定や、プライマー設計は、ここで説明するまでもなく、当業者が日常的に行う手段を適宜組み合わせて用いることにより、容易になしうるものである。【００５７】
さらに、上記ＤＮＡ増幅断片には、第１物質が特異的に結合することが可能な第１物質結合部位が含まれている。すなわち、第１物質結合部位を形成する塩基配列が含まれている。上記第１物質結合部位は、上記ＤＮＡ増幅断片の両端にあるプライマーの結合領域（プライマー配列に由来する領域）のいずれか一方に位置することが好ましい。【００５８】
また、上記ＤＮＡ増幅断片は、第２物質に特異的に結合することが可能な第２物質結合部位を、さらに含むことが好ましい。すなわち、第２物質結合部位を形成する塩基配列をさらに含むことが好ましい。上記第２物質結合部位は、上記ＤＮＡ増幅断片の両端にあるプライマーの結合領域（プライマー配列に由来する領域）のいずれか一方に位置することが好ましい。【００５９】
第１物質結合部位を形成する塩基配列および第２物質結合部位を形成する塩基配列は、それぞれ、ＰＣＲに用いるプライマーの塩基配列に含めておくことにより、上記ＤＮＡ増幅断片に容易に導入することができる。【００６０】
上記ＤＮＡ増幅断片には、第１物質結合部位を形成する塩基配列および第２物質結合部位を形成する塩基配列以外にも、上記試料ＤＮＡに由来しない塩基配列（例えば、制限酵素認識配列）が含まれていてもよい。このような塩基配列もまた、ＰＣＲに用いるプライマーに組み込んでおくことによって、上記ＤＮＡ増幅断片に付加することができる。そのような方法は、当業者にとって周知である。【００６１】
なお、上記第１物質、第２物質、並びに、第１物質および第２物質が特異的に結合する塩基配列については、後述するので、ここでは、詳細な説明は省略する。【００６２】
〔プライマー〕
ＰＣＲ工程で用いるプライマーセットは、上記試料ＤＮＡにおいて、所望の領域を増幅させることが可能な２つのプライマーからなる。【００６３】
上記２つのプライマーのうち、少なくとも一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに第１物質が結合可能な塩基配列を含んでいる。つまり、上記試料ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより得られるＤＮＡ増幅断片に第１物質に対する特異的な結合能を付与する塩基配列（以下、「第１認識配列」ともいう）を含んでいる。【００６４】
さらに、上記２つのプライマーのうち、少なくとも一方は、相補鎖と結合して２本鎖を形成したときに上記第２物質が結合可能な塩基配列を含んでいることが好ましい。つまり、上記ＤＮＡ増幅断片に第２物質に対する特異的な結合能を付与する塩基配列（以下、「第２認識配列」ともいう）を含んでいることが好ましい。【００６５】
なお、本発明にかかる核酸検出方法において、上記複合体形成工程を含まない実施形態では、上記２つのプライマーは、上記第２認識配列を含んでいなくてもよい。そのような実施形態では、上記２つのプライマーのうち、少なくとも一方は、標識物質で標識されていることが好ましい。具体的には、例えば、放射性同位体元素等によって標識されていることが好ましい。【００６６】
上記２つのプライマーが第１認識配列および／または第２標識配列を含む場合、（ａ）上記２つのプライマーのうち、一方が上記第１認識配列と第２認識配列とを含み、他方はいずれの認識配列も含まない形態、（ｂ）上記２つのプライマーの両方が上記第１認識配列と第２認識配列とを含む形態、（ｃ）上記２つのプライマーのうち、一方が上記第１認識配列と第２認識配列とを含み、他方は上記第１認識配列のみを含む形態、（ｄ）上記２つのプライマーのうち、一方が上記第１認識配列と第２認識配列とを含み、他方は上記第２認識配列のみを含む形態、（ｅ）上記２つのプライマーのうち、一方が上記第１認識配列のみを含み、他方が上記第２認識配列のみを含む形態のいずれであってもよいが、本発明では、（ｅ）上記２つのプライマーのうち、一方が上記第１認識配列のみを含み、他方が上記第２認識配列のみを含む形態が特に好ましい。このような上記（ｅ）のプライマーセットでＰＣＲを行えば、図２に示すように、一方の末端（より詳しくは、上記第１認識配列を含むプライマーの配列領域）には、第１物質が結合可能な塩基配列をもち、もう一方の末端（第２認識配列を含むプライマーの配列領域）には、第２物質が結合可能な塩基配列をもつＤＮＡ増幅断片を取得することができる。【００６７】
なお、以下の説明では、（ｅ）上記２つのプライマーのうち、一方が上記第１認識配列を含み、他方が上記第２認識配列を含む形態について説明するが本発明はこれに限定されるものではない。当業者は、以下の説明によれば、上記（ａ）〜（ｄ）の形態のプライマーセットを容易に設計することができる。【００６８】
また、本明細書では、説明の便宜上、上記第１認識配列を含むプライマーを第１プライマー、上記第２認識配列を含むプライマーを第２プライマーと称することもある。【００６９】
上記第１物質および第２物質は、それぞれ、上記ＤＮＡ増幅断片の両端にある２つのプライマーの結合領域にある特定の塩基配列を特異的に認識し、該塩基配列に結合するものであればよい。また、上記第１物質および第２物質は、２本鎖ＤＮＡを特異的に認識することが好ましい。【００７０】
このように上記第１物質および第２物質が２本鎖ＤＮＡを特異的に認識する場合、上記第１物質および第２物質は、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ増幅断片とは結合するが、未反応のプライマーとは結合することができない。【００７１】
よって、後述する複合体形成工程やＤＮＡ増幅断片濃縮工程において、ＤＮＡ増幅断片を含む試料として、ＰＣＲ反応液をそのまま用いても、未反応のプライマーの影響を受けることなく、ＤＮＡ増幅断片を検出することができる。【００７２】
上記第１物質および第２物質は、特に限定されるものではなく、塩基配列特異的に結合できる領域を含むタンパク質であればよい。なかでも、核酸の特定の塩基配列に特異的かつ強く結合できるものであることが好ましい。具体的には、例えば、核酸結合タンパク質等を挙げることができる。【００７３】
上記核酸結合タンパク質は、特に限定されるものではないが、上記核酸結合タンパク質としては、具体的には、例えば、制限酵素および該制限酵素に対応するメチラーゼ、転写・翻訳因子、並びにＤＮＡ修飾に関与するタンパク質等を挙げることができる。【００７４】
上記制限酵素としては、例えば、ＡｃｃＩ、ＡｌｕＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＣｌａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ等を挙げることができる。【００７５】
上記転写・翻訳因子としては、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、およびＪｕｎ、Ｆｏｓ、ＡＴＦ３、Ｍａｆ、Ｎｒｆ２、Ｂａｃｈ２等の転写制御因子などを挙げることができる。【００７６】
上記ＤＮＡ修飾に関与するタンパク質としては、Ｄｎｍｔ、ＭＡＰＫ等を挙げることができる。【００７７】
なお、上記第１物質および第２物質は、同一でも、異なっていてもよいが、本発明では、両者は異なる物質であることが好ましい。【００７８】
また、上記第１認識配列および第２認識配列は、それぞれ、特に限定されるものではなく、上記第１物質または第２物質がそれぞれ部位特異的に認識し得る配列であればよい。また、上記第１認識配列および第２認識配列の長さも特に限定されるものではなく、上記第１物質または第２物質が認識し得る長さであればよい。一般的には、２〜２０塩基とすることが好ましく、４〜１２塩基とすることがより好ましい。【００７９】
上記第１認識配列および第２認識配列としては、例えば、制限酵素および該制限酵素に対応するメチラーゼの認識配列、転写・翻訳因子の認識配列、並びにＤＮＡ修飾に関与するタンパク質の認識配列等を挙げることができる。【００８０】
上記制限酵素、該制限酵素に対応するメチラーゼ、転写・翻訳因子、およびＤＮＡ修飾に関与するタンパク質については、上説した通りである。【００８１】
また、上記第１認識配列と第２認識配列とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。本発明では、両者は異なる配列であることが好ましい。【００８２】
上記プライマーセットを構成する２つのプライマーは、それぞれ、上記試料ＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列（以下、「鋳型結合配列」ともいう）と、上記第１認識配列および第２認識配列のうち少なくとも一方の認識配列とを含む。上記２つのプライマーにおいて、上記鋳型結合配列は、上記第１認識配列および／または第２認識配列よりも、３’側に位置していることが好ましい。【００８３】
上記構成によれば、効率よく、ＰＣＲにより試料ＤＮＡの特定の領域を増幅させることができる。【００８４】
また、上記２つのプライマーは、それぞれ、上記鋳型結合配列、第１認識配列、および第２認識配列以外の塩基配列を含んでいてもよい。例えば、５’末端に１〜５塩基程度の塩基を付加してもよい。【００８５】
さらに、上記２つのプライマーは、それぞれ、上記第１認識配列または第２認識配列の３’末端側に、鋳型結合配列および／または第１認識配列もしくは第２認識配列とハイブリダイズする配列を含んでいてもよい。このような配列は、特に限定されるものではなく、上記第１物質および第２物質が結合できない配列であればよい。【００８６】
また、上記配列の長さは特に限定されるものではないが、具体的には、２〜２０塩基からなることが好ましく、４〜１２塩基からなることがより好ましい。【００８７】
このような配列を含む構成によれば、プライマー自身で２本鎖を形成することができる。したがって、上記構成によれば、増幅する対象となるＤＮＡが存在しない場合、プライマー自身で２本鎖を形成するため、非特異的な増幅、しいては、非特異的な核酸検出を抑えることができる。【００８８】
上記２つのプライマーは、上記鋳型結合配列と、上記第１認識配列および／または第２認識配列とを含んでいればよく、その長さは特に限定されるものではない。すなわち、Ｔｍ値等を考慮して設計すればよい。上記鋳型結合配列は、上記試料ＤＮＡの特定の領域にハイブリダイズするのに十分な長さであればよく、特に限定されないが、一般的には、１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基とすればよい。【００８９】
また、上記第１認識配列および第２認識配列は、それぞれ、上記第１物質および第２物質が認識できる長さであればよく、特に限定されるものではないが、一般的に２〜２０塩基、好ましくは４〜１２塩基とすればよい。【００９０】
また、上記２つのプライマーは、ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ増幅断片の長さが、５０〜５００ｂｐとなるように設計することが好ましい。このような条件となるように、プライマーを設計することにより、ＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片を確実に取得することができる。なお、本発明は、これに限定されるものではないことは言うまでもない。【００９１】
設計したプライマーを製造する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いて製造することができる。具体的には、ＤＮＡ合成装置を用いて製造することができる。また、オリゴオリゴヌクレオチドの受託合成サービス（商業的サービス）を利用しても、設計したプライマーを容易に取得することができる。さらに、製造した各プライマーは、例えば、ＨＰＬＣにより、精製を行ってもよい。【００９２】
なお、ここでは、ＰＣＲ法に用いるプライマー設計について説明したが、核酸増幅法としてＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法のような等温核酸増幅法を用いる場合にも、プライマー設計においては、プライマー中に第１認識配列、さらに必要に応じて第２認識配列が含まれるように設計すればよい。【００９３】
〔ＰＣＲ条件〕
上記ＰＣＲ工程におけるＰＣＲ条件は、特に限定されるものではなく、上説した試料ＤＮＡを鋳型として、上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行ったときに、試料ＤＮＡの所望の領域が増幅される条件であればよい。【００９４】
具体的は、ＰＣＲ工程において用いるＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されるものではないが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることがより好ましい。このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Platinum Taq（GIBCO社製）、Ampli-Taq（Applied Biosystems社製）、Ex-Taq（TaKaRa社製）等を挙げることができる。【００９５】
また、ＰＣＲの反応条件（具体的には、ＰＣＲの温度、時間、緩衝液組成等の条件）もまた、特に限定されるものではなく、選択したＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの配列、目的配列部分の長さ等に応じて、適宜設定すればよい。【００９６】
一例として、ＤＮＡポリメラーゼとして、Ex-Taqを用いる場合は、例えば、ＰＣＲ反応液を、まず９４℃で３０秒間〜２分間加熱した後、９４℃、３０秒間で変性させ、５５℃〜６０℃（プライマーの配列によって公知の方法で算出されるＴｍ値に基づいて決定する）、３０秒間でアニーリングを行い、７２℃で１ｋｂ当たり１分間の伸長させる温度サイクルを２５〜３５回繰り返すことによってＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ反応液は４℃で安定に保存することができる。【００９７】
（Ｉ−２）複合体形成工程
上記複合体形成工程では、上記ＰＣＲ工程で得られたＤＮＡ増幅断片を、標識物質が結合した第２物質に結合させることにより、複合体を形成させる。なお、上記複合体形成工程は、上記ＤＮＡ増幅断片が上記第２物質との結合能を有さない実施形態では行う必要はない。【００９８】
上記標識物質が結合した第２物質は、上記第２物質に標識物質が結合したものである。上記標識物質は特に限定されるものではなく、第２物質に応じて、該第２物質に結合させることができる標識物質を選択して用いればよい。【００９９】
具体的には、例えば、上記第２物質が核酸結合タンパク質である場合、上記標識物質としては、タンパク質を標識する物質として従来公知のあらゆる物質を用いることができる。そのような標識物質としては、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物質などを挙げることができる。【０１００】
上記着色粒子には、具体的には、例えば、金、銀、銅などの金属からなるコロイド粒子；スダンブルーやスダンレッドＩＶ、スダンＩＩＩ、オイルオレンジ、キニザリングリーン等に代表される顔料や染料などでラテックスを着色してなる着色ラテックスなどを含まれる。同様に、上記酵素には、具体的には、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が含まれる。さらに、上記蛍光物質には、具体的には、例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等が含まれる。【０１０１】
これらの中でも、本発明では、上記標識物質として、着色粒子を用いることが好ましい。着色粒子は、肉眼で検出することが可能である。したがって、上記ＤＮＡ増幅断片濃縮工程において、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮後、肉眼で上記ＤＮＡ増幅断片を検出することができる。それゆえ、上記構成によれば、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅断片を、特殊な装置を必要とすることなく、より簡便に検出することができる。【０１０２】
また、上記着色粒子としては、上記例示したもののうち、金コロイドや青、赤、緑もしくはオレンジ色に着色した着色ラテックスを用いることが好ましい。このような着色粒子によれば、ＤＮＡ増幅断片の目視確認をより容易なものとすることができる。【０１０３】
さらに、上記着色粒子としては、青色、赤色等に着色された水分散型高分子重合体からなる着色ラテックスを用いることがより好ましい。このような着色ラテックスによれば、上記標識物質が結合した第２物質の水系溶媒中への分散を安定なものとすることができる上、ＤＮＡ増幅断片の検出感度を容易に調節することが可能となる。【０１０４】
上記標識物質として、着色粒子を用いる場合、その粒径は、特に限定されるものではないが、上記複合体形成工程およびＤＮＡ増幅断片濃縮工程の実施に悪影響が小さく、かつ、ＤＮＡ増幅断片の検出の際に発色のよいものであることが好ましい。具体的には、上記着色粒子の粒径としては、０．１ｎｍ〜５０ｎｍとすることが好ましく、１ｎｍ〜１０ｎｍとすることがより好ましい。このような粒径範囲であれば、調製が容易で保存安定性に優れた着色粒子とすることができる。【０１０５】
具体的には、例えば、上記複合体形成工程およびＤＮＡ増幅断片濃縮工程を、展開媒体上で水系溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片、および標識物質が結合した第２物質を拡散させることにより行う場合、上記着色粒子の粒径が上記範囲よりも大きくなるにつれて、着色粒子がわずかに凝集しただけで吸水性基材に目詰まりを起こして吸水性を低下させたり、非特異的発色を生じたりする傾向がある。つまり、このような実施形態では、吸水性基材の吸水性を低下させない程度で、該基材中での移動性を有する粒径とすることが好ましい。【０１０６】
上記第２物質に上記標識物質を結合させる方法（換言すれば、上記標識物質で上記第２物質を標識する方法）は、特に限定されるものでなく、上記第２物質と上記標識物質との組み合わせに応じて、適切な方法を適宜選択して用いればよい。【０１０７】
例えば、上記第２物質が核酸結合タンパク質であり、上記標識物質が着色粒子である場合、共有結合法、物理的吸着法、およびイオン結合法等といった従来公知の方法を用いて、着色粒子を核酸結合タンパク質に結合させることができる。中でも、共有結合法により、上記着色粒子を核酸結合タンパク質に結合させることが好ましい。このような構成によれば、上記着色粒子と核酸結合タンパク質との結合は強固であるため、上記複合体形成工程や、ＤＮＡ増幅断片濃縮工程において、上記着色粒子が、上記第２物質から脱離することなく、安定した結合を維持することができる。【０１０８】
上記複合体形成工程において、上記ＤＮＡ増幅断片と、上記標識物質が結合した第２物質とを結合させて、複合体を形成させる方法は、特に限定されるものではなく、上記ＤＮＡ増幅断片と、上記第２物質との結合させることが可能な方法であれば、どのような方法を用いてもよい。【０１０９】
例えば、上記ＤＮＡ増幅断片を含む溶液と、上記標識物質が結合した第２物質を含む溶液（上記標識物質が結合した第２物質が分散媒に分散した分散液を含む）とを混合することにより、上記複合体を形成させることができる。なお、上記ＤＮＡ増幅断片と上記第２物質との結合様式や結合反応に応じて、上記溶液には、必要な触媒や物質を適宜加えてもよい。【０１１０】
また、このとき、上記ＤＮＡ増幅断片および上記標識物質が結合した第２物質を溶解または分散させる溶媒は特に限定されるものではなく、両者の結合反応に適した溶媒であればよい。具体的には、上記溶媒は、両者の結合反応に適したｐＨおよび塩濃度を有する緩衝液であることが好ましい。このような緩衝液によれば、両者の結合反応は阻害されることはない。上記緩衝液もまた特に限定されるものではないが、核酸を溶解させるために用いることが可能な緩衝液であることが好ましい。具体的には、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を挙げることができる。【０１１１】
上記複合体を形成させる方法の別の実施形態として、吸水性基材を含む展開媒体上に、上記ＤＮＡ増幅断片を含む溶液と、上記標識物質が結合した第２物質を含む溶液と、それぞれ別の領域に配置し、溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を上記展開媒体上を拡散させ、上記標識物質が結合した第２物質が配置された領域で、上記複合体を形成させることができる。なお、上記標識物質が結合した第２物質を拡散させ、上記ＤＮＡ増幅断片が配置された領域で、上記複合体を形成させてもよい。【０１１２】
（Ｉ−３）ＤＮＡ断片濃縮工程
上記ＤＮＡ断片濃縮工程では、上記複合体形成工程で形成された複合体を、上記第１物質に結合させることにより、上記複合体（換言すれば、上記ＤＮＡ増幅断片）を濃縮する。【０１１３】
なお、上記ＤＮＡ増幅断片が上記第２物質との結合能を有さない実施形態では、ＤＮＡ断片濃縮工程において、上記ＤＮＡ増幅断片を、上記第１物質と結合させることにより、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮する。【０１１４】
上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体を、上記第１物質と結合させることにより濃縮する方法は特に限定されるものではなく、上記ＤＮＡ増幅断片と第１物質との親和性（結合性）を利用する濃縮方法であればあらゆる方法を用いることができる。【０１１５】
具体的には、例えば、第１物質が固定された担体と、上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体とを混合して、上記第１物質に上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体を結合させたのち、上記担体を回収することにより、上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体を濃縮することができる。【０１１６】
また、別の実施形態として、図１に示すように、第１物質が一部の領域（図１中、テストライン）に固定された展開媒体上の、上記第１物質が固定されている領域とは異なる領域（図１中、サンプルパッド）に、上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体を配置し、溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体を拡散させ、上記第１物質が固定されている領域において、上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体を捕捉することにより、該領域において、上記ＤＮＡ増幅断片または上記複合体を濃縮することができる。【０１１７】
また、本発明にかかる核酸検出方法において、上記複合体形成工程と上記ＤＮＡ増幅断片濃縮工程とを行う実施形態では、この両工程を連続的に行うことができる。具体的には、例えば、図３に示すように、第１物質が一部の領域（図３中、テストライン）に固定された展開媒体上の、上記第１物質が固定されている領域とは異なる領域（図３中、サンプルパッド、およびコンジュゲートパッド）に、上記ＤＮＡ増幅断片（図３のサンプルパッドに配置）と、上記標識物質が結合した第２物質（図３のコンジュゲートパッドに配置）とを互いに異なる領域に配置する。【０１１８】
次に、溶媒を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を上記標識物質が結合した第２物質が配置されている領域の方向に拡散させる。そして、上記標識物質が結合した第２物質が配置されている領域（図３中、コンジュゲートパッド）において、上記複合体を形成させる。【０１１９】
続いて、該複合体を、上記第１物質が固定されている領域の方向に拡散させる。そして、上記第１物質が固定されている領域（図３中、テストライン）において、上記複合体を捕捉する。これにより、上記第１物質が固定されている領域において、上記複合体（換言すれば、上記ＤＮＡ増幅断片）を濃縮することができる。【０１２０】
このような実施形態とすれば、上記複合体形成工程と上記ＤＮＡ増幅断片濃縮工程とを連続的に行うことができる。【０１２１】
上説したような方法で、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮した後、該ＤＮＡ増幅断片を検出する。上説したように、上記ＤＮＡ増幅断片には、上記標識物質が結合している。したがって、上記ＤＮＡ増幅断片が濃縮されることによって、上記標識物質も濃縮される。上記標識物質は、いずれも、従来公知の方法で検出可能なものであり、濃縮されることにより、そのシグナル強度が増幅される。【０１２２】
よって、本発明にかかる核酸検出方法によれば、高感度に上記ＤＮＡ増幅断片を検出することができる。【０１２３】
上記標識物質を検出する方法は特に限定されるものではなく、該標識物質の種類に応じて、適宜適切な手段を選択して用いればよい。例えば、上記標識物質が酵素や蛍光物質の場合、ＥＩＡや蛍光抗体法（ＦＩＡ）で従来使用されている検出方法を用いて、検出することができる。また、上記標識物質が着色粒子の場合、肉眼で検出することができる。【０１２４】
さらに、上記ＤＮＡ増幅断片が上記第２物質との結合能を有さず、かつ、検出可能な標識物質に結合されていない場合、該ＤＮＡ増幅断片を濃縮後、核酸染色法等の核酸を検出するための従来公知の手段を用いて、上記ＤＮＡ増幅断片を検出することもできる。【０１２５】
以上のように、本発明にかかる核酸検出方法によれば、特殊な装置を必要とすることなく、ＰＣＲ産物を簡便かつ精度よく検出することができる。【０１２６】
＜ＩＩ．核酸検出キット＞
本発明にかかる核酸検出キットは、上説した本発明にかかる核酸検出方法を実施するために、好適に用いることができる核酸検出キットである。本発明にかかる核酸検出キットは、具体的には、（１）ＤＮＡ増幅断片を配置するための第１領域と、該ＤＮＡ増幅断片に特異的に結合可能な第１物質が固定させることが可能な第２領域とが設けられている展開媒体、および（２）上記ＤＮＡ増幅断片に上記第１物質に対する特異的な結合能を付与する塩基配列を含むプライマー；のうち、少なくとも一方を備えている。【０１２７】
また、本発明にかかる核酸検出キットは、上記以外に、（３）上記ＤＮＡ増幅断片に第２物質に対する特異的な結合能を付与する塩基配列を含むプライマー、（４）第１物質、（５）第２物質、（６）ＤＮＡポリメラーゼ含んでいてもよい。【０１２８】
このうち、上記（２）〜（６）について、＜Ｉ．核酸検出方法＞で説明した通りである。したがって、ここでは、これらの詳細な説明は省略する。【０１２９】
また、本発明にかかる核酸検出キットには、さらに、核酸増幅反応に用いられる緩衝液や、核酸増幅反応に用いられる各種試薬および器具が含まれてもよいが、これらは、当業者に容易に理解されるものである。【０１３０】
上記（１）の展開媒体について、以下詳細に説明する。【０１３１】
〔展開媒体〕
上記展開媒体には、図３に示すように、ＤＮＡ増幅断片を配置するための第１領域（図３中、サンプルパッド）と、該ＤＮＡ増幅断片に特異的に結合可能な第１物質が固定させることが可能な第２領域（図３中、テストライン）とが少なくとも設けられていればよい。【０１３２】
上記構成によれば、上記第２領域に上記第１物質を固定し、さらに、ＤＮＡ増幅断片を、上記第１領域に配置すれば、溶媒を用いて、ＤＮＡ増幅断片を拡散し、上記第２領域において上記ＤＮＡ増幅断片と第１物質とが結合するため、上記第２領域において、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することができる。なお、上記第１物質が固定されている第２領域は、固定化相と称することもできる。【０１３３】
また、上記展開媒体上には、図３に示すように、標識物質が結合した第２物質を配置するための第３領域（図３中、コンジュゲートパッド）がさらに、設けられていることが好ましい。このとき、第１領域、第２領域、および第３領域の位置関係は特に限定されるものではなく、上説した本発明にかかる核酸検出方法を実施することが可能な位置関係であればよい。具体的には、例えば、図３に示すように、第１領域、第３領域、および第２領域の順に、直線上に配置する構成を挙げることができる。また、第１領域と第３領域とは隣接していることが好ましい。【０１３４】
上記構成によれば、上記第２領域に上記第１物質を固定し、ＤＮＡ増幅断片を、上記第１領域に配置し、さらに、上記第３領域に上記標識物質が結合した第２物質を配置すれば、溶媒を用いて、ＤＮＡ増幅断片を拡散し、上記第３領域において、上記ＤＮＡ増幅断片と上記標識物質が結合した第２物質とが結合し、複合体を形成する。該複合体をさらに拡散させれば、上記第２領域において上記複合体と第１物質とが結合する。その結果、上記第２領域において、上記ＤＮＡ増幅断片を濃縮することができる。【０１３５】
さらに、上記展開媒体上には、図３に示すように、上記第２物質と特異的に結合可能な核酸断片を固定させることが可能な第４領域が設けられていることが好ましい。このとき、第１領域、第２領域、第３領域、および第４領域の位置関係は特に限定されるものではなく、上説した本発明にかかる核酸検出方法を実施することが可能な位置関係であればよい。具体的には、例えば、図３に示すように、第１領域、第３領域、第２領域、および第４領域の順に、直線上に配置する構成を挙げることができる。【０１３６】
上記構成によれば、上記第４領域に、上記第２物質と特異的に結合可能な核酸断片を固定することができる。したがって、上記第４領域に、上記核酸断片を固定しておけば、上記第３領域から拡散した上記標識物質が結合した第２物質は、上記第４領域において、上記核酸断片と結合する。その結果、上記第４領域において、上記標識物質が結合した第２物質は濃縮される。その後、濃縮された上記標識物質を検出することにより、上記展開媒体上で、上記標識物質が結合した第２物質が拡散したことを確認することができる。【０１３７】
つまり、上記構成によれば、上記第１領域において、上記ＤＮＡ増幅断片が検出されなかった場合、ＤＮＡ増幅断片の拡散が行っていないことによるものであるのか、もしくは、ＤＮＡ増幅断片が存在しない（ＰＣＲによってＤＮＡ増幅断片が増幅されていない）ことによるものであるのかを容易に判別することができる。【０１３８】
なお、上記第２物質と特異的に結合可能な核酸断片は、特に限定されるものではないが、具体的には、上記第２物質と特異的に結合できるＤＮＡ断片が挙げられる。より具体的には、例えば、上記ＤＮＡ増幅断片の末端にある、上記第２物質が特異的に結合する領域を含む核酸断片を挙げることができる。また、この核酸断片は天然由来であってもよいし、合成した核酸断片であってもよい。【０１３９】
上記展開媒体上には、さらに、図３に示すように、上記第１領域および第３領域から拡散し、上記第２領域および第４領域において捕捉されなかった物質を吸収するための第５領域（図３中、吸収パッド）が設けられていてもよい。このとき、第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、および第５領域の位置関係は特に限定されるものではなく、上説した本発明にかかる核酸検出方法を実施することが可能な位置関係であればよい。具体的には、例えば、図３に示すように、第１領域、第３領域、第２領域、第４領域、および第５領域の順に、直線上に配置する構成を挙げることができる。【０１４０】
また、第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、および第５領域は、水平方向に配置されていてもよいし、垂直方向に配置されていてもよい。また、斜め方向に配置されたり、ジグザグに配置されていてもよい。【０１４１】
上記展開媒体は、ＤＮＡ増幅断片、および標識物質が結合した第２物質が拡散できるものであればよく、その材質は特に限定されるものではない。通常、ＤＮＡ増幅断片、および標識物質が結合した第２物質を、水系溶媒によって拡散させるため、上記展開媒体は、吸水性基材を含むことが好ましい。【０１４２】
また、本発明では、ＤＮＡ増幅断片を、上記展開媒体上に拡散させながら、標識物質が結合した第２物質、および第１物質と結合させる。そのため、吸水性基材の吸水性が低すぎると、ＤＮＡ増幅断片や、ＤＮＡ増幅断片と標識物質が結合した第２物質とからなる複合体の拡散速度が低くなりすぎ、迅速な測定ができなくなる傾向がある。一方、吸水性基材の吸水性が高すぎると、ＤＮＡ増幅断片の拡散速度が高くなりすぎ、該ＤＮＡ増幅断片は、標識物質が結合した第２物質、および第１物質に十分に結合することができなくなる。その結果、ＤＮＡ増幅断片の検出感度が低下する傾向がある。【０１４３】
したがって、上記展開媒体としては、ＤＮＡ増幅断片と他の分子との結合反応が効率よく起こる程度の拡散速度で、ＤＮＡ増幅断片が拡散できる吸水性基材を選択することが好ましい。【０１４４】
このような吸水性基材としては、具体的には、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、多孔質材料などを挙げることができる。これらの吸水性基材は、適度な吸水速度を有するとともに、標識物質が着色粒子の場合、着色粒子が結合して発色した際の目視確認性に優れるなどの利点を有する。【０１４５】
また、上記展開媒体は、吸水性を調整するために、表面を親水性重合体や界面活性剤で被覆したり、含浸させたりしてもよい。【０１４６】
上記展開媒体において、第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、第５領域、およびそれ以外の領域は、すべて同一の材質からなってもよいし、互いに異なる材質からなってもよい。また、ある材質の基材をベースとして、その上に、該基材と同一もしくは異なる材質からなる第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、および第５領域を設けても、展開媒体を形成してもよい。その場合、上記基材上に、各領域を設ける方法は特に限定されないが、例えば、上記基材上に、該基材と同一もしくは異なる材質の基材を、任意の接着手段によって接合して設けることができる。このような方法によれば、第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、第５領域、およびそれ以外の領域が、連続した展開媒体とすることができる。【０１４７】
上記第１領域および第３領域は、ＤＮＡ増幅断片を含む溶液や標識物質が結合した第２物質を含む溶液の吸水性基材への移動を妨げない材質で別途形成することが好ましい。この場合、上記第１領域および第３領域は、不織布や織布等で形成することが好ましい。【０１４８】
上記展開媒体において、上記第１領域と第２領域との間の距離は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ増幅断片を高感度かつ高精度に検出可能な距離であればよい。具体的には、１ｃｍ〜６ｃｍとすることが好ましく、３〜４ｃｍとすることがより好ましい。上記範囲よりも遠すぎると、ＤＮＡ増幅断片が上記第２領域まで到達しなかったり、検出シグナル感度が強すぎたり、あるいは測定に時間がかかりすぎたりする等の問題が生じる場合がある。一方、上記範囲よりも距離が近すぎると、上記第２領域に濃縮されたＤＮＡ増幅断片に結合している標識物質の発色が均一ではなくまばらになったり、検出シグナル感度が低すぎたりするという問題が生じる場合がある。【０１４９】
上記展開媒体の形状は特に、限定されるものではなく、ＤＮＡ増幅断片、および標識物質が結合した第２物質が拡散できる形状であればよい。具体的には、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状などの形状のものを好適に用いることができる。【０１５０】
また、本発明では、上記展開媒体上に、上記第１物質を固定するが、その固定化方法（換言すれば、固定化相の作製方法）は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、物理吸着法や共有結合法を好適に用いることができる。特に、共有結合法を用いることが好ましい。共有結合法によれば、上記展開媒体上に、上記第１物質を強固に結合させることができる。よって、使用時に、上記第１物質が展開媒体から解離することを防止することができる。【０１５１】
また、上記展開媒体に含まれる吸水性基材が共有結合法によって第１物質を結合させるための官能基を有しないときは、例えば、適当な官能基を有する重合体を用いて基材を作製し、吸水性基材の吸水性を阻害しない程度に付着させることができる。【０１５２】
また、第１物質および親水性重合体を含む溶液を吸水性基材に塗布した後、上記親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することによって、上記第１物質を展開媒体に固定することもできる。この場合、上記親水性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースなどを用いることができる。さらに、上記凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、メタノール、エーテルなどを用いることができる。【０１５３】
また、上記展開媒体上には、上記第１物質、および第２物質と特異的に結合する核酸断片は、それぞれ、上記第１領域および第４領域に予め固定されていてもよいし、ユーザーが使用前に固定する構成としてもよい。さらに、いずれか一方は、予め固定されており、残りの一方は、ユーザーが使用前に固定する構成してもよい。【０１５４】
上記第１物質、および第２物質と特異的に結合する核酸断片が、上記展開媒体上に予め固定されていない実施形態では、本発明にかかる核酸検出キットには、上記展開媒体上に、上記第１物質および核酸断片を固定するための試薬や器具（該第１物質や核酸断片を含む）が含まれていてもよい。【０１５５】
＜ＩＩＩ．本発明の利用＞
本発明にかかる核酸検出方法、および核酸検出キットは、核酸増幅法を用いるあらゆる技術に用いることができる。換言すれば、核酸増幅法によるＤＮＡ増幅断片（例えば、ＰＣＲ産物）を検出することを含むあらゆる分野の技術に用いることができる。【０１５６】
具体的には、例えば、分子生物学の研究分野、病原菌の検出、アレルゲンなど食品中の混入物の検出、家畜管理、塩基多型（以下、「ＳＮＰ」ともいう）の検出等に用いることができる。【０１５７】
したがって、本発明には、本発明にかかる核酸検出方法を一工程として含む、病原体の検出方法、食品中の混合物（例えば、アレルゲン）の検出方法、家畜の管理方法、および塩基多型の検出方法等も含まれる。【０１５８】
ここで、本発明の利用の一実施形態として、本発明にかかる塩基多型の検出方法、病原体の検出方法、およびアレルゲンの検出方法、について詳細に説明する。【０１５９】
〔塩基多型の検出方法〕
まず、本明細書において、「塩基多型」とは、染色体またはその断片中のある部位において、個体間で２種以上の塩基が存在することを指す。この際、特定の塩基型を野生型といい、野生型とは異なる塩基型を有するものを変異型という。また「塩基多型部位」とは、野生型と変異型とが存在している塩基多型の位置をいう。なお、「塩基多型」のうち、一塩基が相違する塩基多型を一塩基多型（ＳＮＰｓ）と称する。【０１６０】
また、本明細書において、塩基多型部位を含む染色体又はその断片であって、野生型の塩基配列を含むものを、単に「野生型核酸」と称することもある。一方、塩基多型部位を含む染色体又はその断片であって、（１）野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されている塩基配列からなるもの；（２）野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む塩基配列からなるもの等を、「変異型核酸」と称することもある。本発明では、上記変異型核酸は、塩基多型部位を含む野生型核酸の少なくとも１つの塩基が、異なる塩基に置換されているものであることが好ましい。【０１６１】
また、上記変異型核酸において、どの部位のヌクレオチドが変異しているか（すなわち、変異部位）が公知であることが好ましい。【０１６２】
近年、ＳＮＰのような塩基多型の検出は、医学分野で、疾患の治療、予防、または予後診断や、人の体質評価などに有用であることが明らかとなってきた。【０１６３】
具体的には、個体間における遺伝子の塩基多型は、薬物代謝における副作用および薬物投与の時期、投与量などからなる治療成績低下の原因の一つとして考えられている。そのため、グリベックやハーセプチンなど抗体医薬では、その塩基多型と治療成績低下との関係が調査されている。【０１６４】
また、この塩基多型は、基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。さらに、肥満の型や肌質などの鑑定にも利用可能であることが示唆されている。加えて、塩基多型は多数の疾患の遺伝マーカーとしての利用も期待されている。【０１６５】
それゆえ、これら塩基多型の解析は、臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類は精神医学患者および自殺志願者を対象とした臨床研究に特に推奨されている（Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics．Commission of the European Communities, Luxembourg, p87-96 (1990)；Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol．Vol. 36, p551〜554 (1989)を参照）。【０１６６】
上記のような理由から、原因となる変異型遺伝子の塩基多型部位の同定と、それに続くそれぞれの塩基多型の分析法の開発が求められている。【０１６７】
従来の塩基多型の分析技術としては、例えば核酸配列決定法がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出および同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および核酸配列の解析等を行うため、多大な労力と時間が必要であるという問題がある。【０１６８】
また、核酸配列決定法は、近年の自動シークエンサーを用いることである程度の省力化を図ることができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。【０１６９】
このような問題を解決すべく、近年、ＰＣＲを用いたＳＮＰの検出方法が開発されている（特開昭６１−２７４６９７号公報（昭和６１（１９８６）年１２月４日公開）、特開昭６２−２８１号公報（昭和６２（１９８７）年１月６日公開）を参照）。【０１７０】
この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のプライマーの一方のプライマーとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用プライマーと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用プライマーとを用いる。【０１７１】
上記変異型用プライマーは、その３’末端が予想される塩基多型部位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドとなるように設計されている。このような野生型用及び変異型用プライマーをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。このとき、試料遺伝子が野生型であれば、野生型用プライマーを用いた場合には核酸は、増幅される。一方、変異型用プライマーを用いた場合には、プライマーの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ため、伸長反応が起きず、核酸は増幅されない。【０１７２】
これに対して、試料遺伝子が変異型であれば、野生型用プライマーを用いた場合に、核酸は増幅されず、変異型用プライマーを用いた場合に増幅される。【０１７３】
したがって、野生型用プライマーおよび変異型用プライマーの各プライマーを用いた場合に、核酸が増幅されるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができる。つまり、それによって試料遺伝子中の塩基多型を検出することができる。【０１７４】
特開昭６１−２７４６９７号公報では、上記核酸の増幅の有無は、該核酸に特異的に結合するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより確認している。一方、特開昭６２−２８１号公報では、上記核酸の増幅の有無は、該核酸を電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色することにより確認している。【０１７５】
また、ＰＣＲを用いたＳＮＰの検出方法としては、Invader法やTaqMan法と呼ばれる手法が知られている。【０１７６】
さらに、ＳＮＰの検出方法として、ＰＣＲを用いる方法以外にも、例えば、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイ等を応用した方法も提案されている。具体的には、例えば、ＤＮＡアレイを応用する方法では、多数のプローブＤＮＡを高密度に固相基板上に配列し、検体ＤＮＡと固相表面とでハイブリダイズさせることにより、ＳＮＰを検出することができる。【０１７７】
しかしながら、特開昭６１−２７４６９７号公報および特開昭６２−２８１号公報に記載されているようなＳＮＰの検出方法では、ＰＣＲにより試料遺伝子を増幅した後、その増幅産物を電気泳動、場合によってはさらにハイブリダイゼーションによって確認する必要である。そのため、手間および時間がかかるという問題がある。【０１７８】
また、Invader法やTaqMan法と呼ばれる手法は、高価な蛍光プライマーや、試料遺伝子の増幅産物の蛍光検出のために、高価な機器が別途必要であるという問題がある。加えて、Invader法やTaqMan法は、その原理上、ＰＣＲ以外の酵素反応が必要であるため、操作が煩雑であるという問題も抱えている。【０１７９】
さらに、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイ等を応用した方法では、固相表面と検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行うため、効率が悪く、長い反応時間を要するという問題がある。また、一塩基置換ではそのＴｍ値がほとんど変化しないため、高感度にミスマッチを検出することは不可能であるという問題がある。加えて、ＰＣＲを用いたInvader法やTaqMan法と同様に、高価な装置が必要な上、操作に手間がかかるという問題を抱えている。【０１８０】
これに対して、本発明にかかる塩基多型の検出方法は、上説した本発明にかかる核酸検出方法を一工程として含むため、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ、高精度に塩基多型を検出することができる。【０１８１】
したがって、疾患の発症や体質との関連性が明らかになっている塩基多型を検出対照とすれば、本発明にかかる塩基多型の検出方法によって、疾患の治療、予防、もしくは予後診断や、体質評価を行うためのデータを取得することができる。【０１８２】
ここで、本発明にかかる塩基多型の検出方法について、図４を参照しながら、より具体的に説明する。【０１８３】
まず、本発明にかかる塩基多型の検出方法においては、上記試料ＤＮＡとして、塩基多型部位を含むＤＮＡ試料を用いる。一般的には、疾病、体質、代謝、分泌、分化、受容体等に関連することが公知の遺伝子の塩基多型部位を含むＤＮＡ試料を用いることが好ましい。具体的には、例えば、ＣＹＰ２Ｃ９（フェニトイン、ワーファリン、トルブタミド、ＮＳＡＩＤの代謝に関連）、ＣＹＰ２Ｃ１８（ジアゼパムの代謝に関連）、ＣＹＰ２Ｃ１９（オメプラゾール、ジアゼパム等の代謝に関連）、ＣＹＰ２６Ｄ（アミトリプチリン等の代謝に関連）、ＣＹＰ２Ａ６（クマリン、ニコチンの代謝に関連）等のチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）遺伝子、チオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、コレステロールエステルトランスファータンパク（ＣＥＴＰ）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、β２アゴニストレセプター（β２ＡＲ）、ミトコンドリアＡ１５５５Ｇ、ライアノジンレセプター、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体等の遺伝子、およびＱＴ延長症候群に関連する遺伝子（ＬＱＴ１、ＬＱＴ２遺伝子）等の塩基多型部位を含むＤＮＡ試料を挙げることができる。このようなＤＮＡ試料としては、具体的には、例えば、血液もしくは血液から単離したゲノムＤＮＡを含む溶液を挙げることができる。【０１８４】
また、上記ＰＣＲ工程では、変異型核酸を検出するためのプライマーセットおよび野生型核酸を検出するためのプライマーセットのうち、少なくとも一方を用いてＰＣＲを行う。【０１８５】
検出精度の観点からは、変異型核酸を検出するためのプライマーセットおよび野生型核酸を検出するためのプライマーセットをそれぞれ用いて、ＰＣＲを行うことが好ましい。この点について、より詳しく説明すると、塩基多型のタイプとしては、一対の遺伝子のうち、いずれにも塩基多型がない場合（ｗｔ／ｗｔ）、一方に塩基多型がある場合（ｍｔ／ｗｔ）、両方に塩基多型がある場合（ｍｔ／ｍｔ）がある。ここで、ｗｔは野生型、ｍｔは変異型を示す。ｍｔ／ｗｔタイプの場合は、変異型核酸を検出するためのプライマーセットおよび野生型核酸を検出するためのプライマーセットのいずれのプライマーセットを用いたときにも、ＤＮＡ増幅断片（ＰＣＲ産物）が生成される。【０１８６】
そのため、上記２つのプライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲを行う構成とすれば、変異型の塩基型をホモで持つのか、ヘテロで持つのか、または、全く持たないのかを判別することができる。【０１８７】
上記２つのプライマーセットには、それぞれ２つずつプライマー（すなわち、フォワード（Forward）プライマーおよびリバース（Reverse）プライマー）が含まれている。上記２つのプライマーセットでは、２つのプライマーのうち、一方のプライマーは同一であり、もう一方のみが、変異型核酸または野生型核酸を特異的に検出できるように塩基配列が異なっていることが好ましい。なお、塩基配列が同一のプライマー（以下、「共通プライマー」ともいう）は、野生型核酸および変異型核酸の間で保存されている塩基配列に結合するプライマーである。さらに、このような実施形態では、塩基配列が異なっているプライマー同士（以下、「野生型検出用プライマー」および「変異型検出用プライマー」ともいう）は、長さは同一であることが好ましい。【０１８８】
また、野生型検出用プライマーおよび変異型検出用プライマーは、フォワードプライマーであってもよいし、リバースプライマーであってもよい。つまり、野生型検出用プライマーおよび変異型検出用プライマーがフォワードプライマーで、共通プライマーがリバースプライマーであってもよいし、野生型検出用プライマーおよび変異型検出用プライマーがリバースプライマーで、共通プライマーがフォワードプライマーであってもよい。なお、図４には、変異型検出用プライマーがフォワードプライマーであり、共通プライマーがリバースプライマーである場合を示している。【０１８９】
また、上記野生型検出用プライマーおよび変異型検出用プライマーは、それぞれ、＜Ｉ．核酸検出方法＞で説明したとおり、鋳型結合配列を含んでおり、さらに、第１認識配列および／または第２認識配列を含んでいてもよい。上記第１認識配列および第２認識配列については、上説したので、ここではその説明は省略する。【０１９０】
上記野生型検出用プライマーおよび変異型検出用プライマーにおける鋳型結合配列は、上記試料ＤＮＡにおいて、塩基多型部位の塩基（塩基配列）を含むように設計する。より具体的に説明すると、検出する塩基多型が一塩基多型である場合、本発明にかかる塩基多型の検出方法では、一塩基の相違を検出する。つまり、上記塩基多型部位は、１つの塩基からなる。【０１９１】
このような実施形態では、上記野生型検出用プライマーおよび変異型検出用プライマーにおける鋳型結合配列の３’末端、好ましくは、プライマーの３’末端が、塩基多型部位の塩基（変異型検出用プライマーでは変異型核酸の塩基多型部位の塩基；野生型検出用プライマーでは野生型核酸の塩基多型部位の塩基）となるように設計する。なお、図４には、変異型検出用プライマー（図４中、第１プライマー）を模式的に示している。【０１９２】
また、上記野生型検出用プライマーおよび変異型検出用プライマーにおいて、鋳型に結合する領域全長の長さが、１５〜３０塩基となるように設計することが好ましく、１８〜２５塩基となるように設計することがより好ましい。つまり、塩基多型部位の塩基（変異型核酸を検出するプライマーでは変異型核酸の塩基多型部位の塩基；野生型核酸を検出するプライマーでは野生型核酸の塩基多型部位の塩基）を３’末端として、５’末端方向に試料ＤＮＡと相補的な１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基を並べることが好ましい。【０１９３】
さらに、上記第１認識配列および／または第２認識配列は、上記試料ＤＮＡと相補的な１５〜３０塩基よりも５’側に付加することが好ましい。【０１９４】
また、上記共通プライマーも、鋳型結合配列を含んでおり、さらに、第１認識配列および／または第２認識配列を含んでいてもよい。【０１９５】
上記共通プライマーにおいて、鋳型結合配列は、上記試料ＤＮＡのＰＣＲにより増幅する領域の塩基配列に基づいて、上記変異検出用プライマーまたは野生型検出用プライマーと組み合わせて用い、ＰＣＲを行った場合に、所望のＤＮＡ増幅断片（ＰＣＲ産物）が得られるような部分を選択すればよい。上記共通プライマーの鋳型結合配列の長さは特に限定されるものではないが、一般的には、１５〜３０塩基となるように設計することが好ましく、１８〜２５塩基となるように設計することがより好ましい。また、上記共通プライマーは、ＤＮＡ増幅断片の長さが、５０〜５００ｂｐとなるように設計することが好ましい。【０１９６】
上説したような方法で、変異検出用プライマーおよび野生型検出用プライマー、並びに共通プライマーを設計することにより、変異型核酸を検出するためのプライマーセットおよび野生型核酸を検出するためのプライマーセットをそれぞれ設計することができる。【０１９７】
このようなプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行うと、試料ＤＮＡが野生型の塩基型をもつ場合、野生型核酸を検出するためのプライマーセットを用いたＰＣＲではＤＮＡ増幅断片（ＰＣＲ産物）は得られるが、変異型核酸を検出するためのプライマーセットを用いたＰＣＲではＤＮＡ増幅断片は得られない。【０１９８】
逆に、試料ＤＮＡが変異型の塩基型をもつ場合、図４に示すように、野生型核酸を検出するためのプライマーセットを用いたＰＣＲではＤＮＡ増幅断片（ＰＣＲ産物）は得られないが、変異型核酸を検出するためのプライマーセットを用いたＰＣＲではＤＮＡ増幅断片は得られる。【０１９９】
上記プライマーセットには、第１認識配列および／または第２認識配列を含むプライマーが含まれているため、上記ＤＮＡ増幅断片が得られたか否かは、本発明にかかる核酸検出方法によって、容易に検出することができる。【０２００】
なお、ここでは、野生型と変異型の２つの塩基型を検出する実施形態について説明したが、変異型の塩基型は、複数の変異型からなっている場合、その変異型の数に応じて、同様の原理により、複数のプライマーセットを設計すれば、同様の方法により、試料ＤＮＡの塩基型を判定することができる。【０２０１】
このように、本発明にかかる核酸検出方法によれば、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ高感度に塩基多型を検出することができる。【０２０２】
〔病原体の検出方法〕
本発明にかかる病原体の検出方法は、本発明にかかる核酸検出方法を用いて、病原体が特異的に有する遺伝子を検出する工程を含んでいればよい。【０２０３】
上記病原体は、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、病原性細菌、病原性ウィルス、食中毒細菌、院内感染原因細菌およびウィルス等を挙げることができる。【０２０４】
より具体的には、例えば、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）等のウィルス、Ｏ１５７等の大腸菌、結核菌、チフス菌、サルモネラ菌もしくは腸炎ビブリオ菌等の細菌、またはマイコプラズマ等の微生物を例示することができる。【０２０５】
本発明にかかる病原体の検出方法について、より具体的に説明すると、例えば、病原体の有無を検査する対象となる試料から調製したＤＮＡ試料に、上記病原体が特異的に有する遺伝子が含まれるか否かを上記核酸検出方法を用いて判定する。その結果、このような遺伝子が検出された場合には、該試料には、病原体が含まれていると判定する。【０２０６】
これにより、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ、高精度に、試料中に病原体が含まれているか否かを判定することができる。すなわち、本発明にかかる病原体の検出方法は、微生物の感染症の診断に用いることができる。【０２０７】
〔アレルゲンの検出方法〕
本発明にかかるアレルゲンの検出方法は、本発明にかかる核酸検出方法を用いて、アレルゲンをコードする遺伝子を検出する工程を含んでいればよい。【０２０８】
上記アレルゲンは特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、食品中に含まれるアレルゲンを挙げることができる。より具体的には、卵白アレルゲン、乳アレルゲン、小麦アレルゲン、そばアレルゲン、および落花生アレルゲン等を挙げることができる。【０２０９】
本発明にかかるアレルゲンの検出方法について、より具体的に説明すると、例えば、食品から調製したＤＮＡ試料に、卵、乳、小麦、そば、落花生などのアレルゲンをコードする遺伝子が含まれるか否かを上記核酸検出方法を用いて判定する。その結果、このような遺伝子が検出された場合には、該食品には、アレルゲンを含有する原料が含まれていると判定する。【０２１０】
これにより、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ、高精度に食品等の試料中に、アレルゲンを含有する原料が含まれているか否かを判定することができる。なお、アレルゲンの由来は、上記例示したものに限定されるものではなく、例えば、穀類を例に取れば、イネ、トウモロコシ、アワ、キビ、ヒエ、ソバ、およびマメ類がすべてが含まれる。【０２１１】
また、ＤＮＡは、熱に安定であり、加工食品中でも微量に検出される。したがって、本発明にかかるアレルゲンの検出方法により得られたデータは、食品の表示に利用したり、食品のアレルギー情報として利用したりすることに加えて、加工助剤やキャリーオーバー等食品添加物のごく微量の残存、あるいは製造ライン間の相互汚染の有無等の生産者の意図していない物質の混入の検出に用いることができる。【０２１２】
そのほか、本発明は、ヒトを含む哺乳動物の親子鑑定、家畜の血統の特定、農産物の品種の特定等に用いることができる。具体的には、例えば、家畜についていえば、血統登録、個体識別、親子判定、病原遺伝子のキャリア個体の除去などの目的に利用することができる。【０２１３】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示した技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０２１４】
本発明について、実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。【０２１５】
〔実施例１：ＰＣＲ増幅産物の作製〕
（１）鋳型ＤＮＡおよびプライマー
鋳型としてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ増幅により１００塩基対が増幅されるように、以下のプライマーＥ１およびプライマーＢ１を設計した。
プライマーＥ１：5'-gctcgaattcactggccgtcg-3'（配列番号１）
プライマーＢ１：5'-ctatggatcctacgccagctggcgaaaggg-3'（配列番号２）
プライマーＥ１は、配列中、５’末端から５番目の塩基から１０番目の塩基にＧＡＡＴＴＣのＥｃｏＲＩメチラーゼ認識配列が存在するように設計した。また、プライマーＢ１は、配列中、５’末端から５番目の塩基から１０番目の塩基にＧＧＡＴＣＣのＢａｍＨＩメチラーゼ認識配列が存在するように設計した。【０２１６】
また、プライマーＥ１のＥｃｏＲＩメチラーゼ認識配列の下流には、ｐＵＣ１９にマッチする１１塩基の配列をもつようにプライマーの配列を設計した。同様に、プライマーＢ１のＢａｍＨＩメチラーゼ認識配列の下流には、ｐＵＣにマッチする２０塩基の配列を持つようにプライマーの配列を設計した。その後、設計した配列に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成した。【０２１７】
得られたプライマーＥ１およびプライマーＢ１を用いてＰＣＲを行い、１００塩基対からなるＤＮＡ増幅産物を作製した。【０２１８】
（２）ＰＣＲ
プライマーＥ１およびプライマーＢ１をそれぞれ１０ｐｍｏｌずつと、ｐＵＣ１９ １０ｎｇとを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ  ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）の説明書に従い、５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した（チューブ２０本分）。【０２１９】
その後、ＰＣＲ用サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ社製））にセットし、９５℃、５分間の熱処理後、９５℃、３０秒間→５５℃、３０秒間→５５℃、３０秒間→７４℃、３０秒間のＰＣＲを３５サイクル行い、目的の１００塩基対の増幅を行った。【０２２０】
そのＰＣＲ反応液を電気泳動した後、Ｓｕｐｒｅｃ０１（タカラバイオ社製）により、プライマー除去を行った。なお、その際にはＳｕｐｒｅｃ０１に添付のプロトコルに従って操作を行った。【０２２１】
この結果、ＥｃｏＲＩメチラーゼ認識配列とＢａｍＨＩメチラーゼ認識配列とをもつ１００塩基対からなるＰＣＲ増幅産物（約２００μｇ）が得られた。なお、この増幅断片を以下、「ＥＢ１００」と称する。【０２２２】
〔実施例２：ＰＣＲ増幅産物の検出〕
（１）金コロイド標識ＥｃｏＲＩメチラーゼの作製
コロイド金溶液（金コロイド粒径１０ｎｍ、ＧＥヘルスケア社製）８．０ｍｌに０．２Ｍ Ｋ２ＣＯ２３０μｌを加えて、ｐＨ７．６に調整した後、市販のＥｃｏＲＩメチラーゼ（ＮＥＢ社製）５００ユニット分を添加し、室温で１０分間撹拌後、０．１％ ＰＥＧ６０００溶液を４０μｌ加え、１０分間撹拌した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、６０分間遠心分離した。【０２２３】
得られた沈殿に０．３％ ＢＳＡ、０．２５％ ＰＥＧ６０００含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を４．０ｍｌ添加して均一に懸濁させた後、１５．０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、同様な洗浄操作を２回繰り返した後、得られた沈殿に０．３％ ＢＳＡ、０．２５％ ＰＥＧ６０００、４％シュークロース、０．１％ ＮａＮ３含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）０．８ｍｌを加えて均一に懸濁させて金コロイド標識ＥｃｏＲＩメチラーゼ溶液を得た。【０２２４】
（２）検査片の作製
ニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケア社製、孔径８μｍ、６ｍｍ×６０ｍｍ）の一端から３０ｍｍの箇所に、ＢａｍＨＩメチラーゼ（ＮＥＢ社製、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）中）５００ユニット分を、ディスペンサーを用いてライン状に塗布し、テストライン（第２領域）を作製した。【０２２５】
このメンブレンを１重量％ウシ血清アルブミンおよび０．１重量％ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）からなる水溶液中に１０分間浸漬させた後、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、このメンブレンの裏側（酵素塗布面の反対側）に、ポリエステルフィルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせた。さらに、メンブレンの両端０〜５ｍｍの箇所にクロマトグラフィー用濾紙（アドバンテック東洋社製、６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ約３ｍｍ）をそれぞれ貼り合せて検査片（展開媒体）を作製した。なお、該クロマトグラフィー用濾紙の片方をＰＣＲ増幅産物−金コロイド複合体を配置する領域であるサンプルパッド（第１領域）、もう片方を未反応複合体を吸収するための吸収パッド（第５領域）
（３）ＰＣＲ増幅産物の検出
実施例１で調製したＥＢ１００溶液を０．９重量％ＮａＣｌ含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）に、上記（１）で作製した金コロイド標識ＥｃｏＲＩメチラーゼ溶液を混合して、供試サンプルを調製した。なお、その際には固形分濃度が約０．０２重量％となるように混合し、６０μｌの供試サンプル中に含まれるＥＢ１００量は１μｇ、１０μｇ、１００μｇとした。【０２２６】
この供試サンプル６０μｌを上記（２）で作製した検査片のクロマトグラフィー用濾紙に滴下した。混合液が検査片に展開した後、３０分後の検査片上にテストラインでの発色の有無を目視観察した。その結果を表１に示す。なお、表１には、比較として、ＥＢ１００溶液を用いず、金コロイド標識ＥｃｏＲＩメチラーゼ溶液のみを使用して同様の操作を行った場合の結果を併せて示している。【０２２７】
【表１】
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【０２２８】
本発明にかかる核酸検出方法は、以上のように、第１物質が特異的に結合することが可能な第１物質結合部位を含むＤＮＡ増幅断片を、該第１物質を用いて濃縮する。それゆえ、特殊な装置を必要とすることなく、核酸増幅法により増幅された２本鎖ＤＮＡ増幅断片を簡便かつ高精度に検出することができるという効果を奏する。【０２２９】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２３０】
以上のように、本発明では、核酸増幅法により増幅されたＤＮＡ増幅断片に形成されたアフィニティタグを用いて、該ＤＮＡ増幅断片を濃縮して該ＤＮＡ増幅産物を検出するため、特殊な装置を必要とすることなく、簡便な方法で、高精度に核酸増幅法によるＤＮＡ増幅断片を検出することができる。そのため、本発明は、分子生物学をはじめとする基礎研究分野、医療分野、食品分野、公衆衛生分野、環境分野、医薬品分野、農林水産分野など、ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用するあらゆる産業分野に広く用いることができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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