(57)【要約】本発明は、複数のサイトカインの存在下でDC前駆細胞を培養する工程を含む、DCの製造方法、製造された樹状細胞およびその利用を提供する。本発明の方法は、DCへの高い分化能を持つ大量のDC前駆体を製造することを可能にする。本発明により、少ないDC前駆細胞から大量のDCを得ることが可能となるので、DCを用いた抗腫瘍免疫療法および感染症治療などにおいて投与するDC数を増やすことが容易になり、DCワクチンの効果の増大が期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞を製造する方法であって、樹状細胞前駆細胞を複数のサイトカインの存在下で培養する工程を含む方法。
【請求項２】
複数のサイトカインが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および幹細胞因子（SCF）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
樹状細胞前駆細胞は、ヒト由来の細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該工程が、樹状細胞前駆細胞を顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）1 ng/ml以上、および幹細胞因子（SCF）0.5 ng/ml以上の存在下で培養する工程である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
該工程が、樹状細胞前駆細胞を顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）10 ng/ml以上、および幹細胞因子（SCF）5 ng/ml以上の存在下で培養する工程である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該工程が、樹状細胞前駆細胞を顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）1 ng/mlから100 ng/ml 、および幹細胞因子（SCF）0.5 から50 ng/mlの存在下で培養する工程である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は樹状細胞の製造方法、製造された樹状細胞およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞 (dendritic cell; DC) は末梢血液、皮膚、リンパ器官及び胸腺などに存在する抗原提示細胞 (APC) の１つであり、リンパ組織及び非リンパ組織に広く分布している （Steinman, R. M. 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:271; Banchereau, J.B. および R.M. Steinman, 1998, Nature 392:245 参照）。樹状細胞は強力な抗原提示能を有し、樹状細胞上のクラスI、クラスIIに抗原ペプチドを発現させ、それぞれ、CD4、CD8 T細胞を活性化する。これにより特定の抗原（病原微生物の抗原、腫瘍関連抗原、移植抗原など）に対する生体内の免疫応答を誘導する。【０００３】
DCが持つ高い免疫誘導能は、多くの腫瘍に対する免疫療法（DC治療）に有用である。本発明者らは以前、マウスにおいてセンダイウイルス (SeV) で刺激したDCが強力な抗腫瘍効果を持つことを示してきた (S. Shibata et al., J. Immunol, 2006 177: 3564-3576; Yoneyama, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 355:129-135)。ところで抗腫瘍効果は接種するDCの数に依存する。臨床においても、接種するDCの数量が治療効果に大きく関与すると考えられるが、患者の容態によっては、採取可能なDC前駆細胞（DC progenitors）の数が限られる場合が多くあると予想され、結果的に得られるDCの数が十分でないために治療効果が不十分となる可能性がある。従って、限られたDC前駆細胞を効率的に増幅する方法が求められている。
【非特許文献１】Steinman, R. M., 1991, Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296
【非特許文献２】Banchereau, J.B. および R.M. Steinman, 1998, Nature 392: 245-252
【非特許文献３】Shibata, S. et al., J. Immunol, 2006 177: 3564-3576
【非特許文献４】Yoneyama, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 355:129-135
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、大量の樹状細胞を効率的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
DC前駆細胞を効率的に増幅しDCに分化させる方法を開発するため、本発明者らは、DC前駆細胞を様々なサイトカインの添加により期間を変えながら培養し、その後DCを分化させた後、DCの表面マーカーを指標に増幅した細胞を分析した。その結果、DC前駆細胞を幹細胞因子（Stem cell factor；SCF）およびインターロイキン(IL)-3 を含む培地で培養すると、DC前駆細胞は顕著な増殖を示すことを見出した。SCFおよびIL-3に加え、Flt-3リガンドおよびIL-6も加えた（すなわち、Flt-3リガンド、SCF、IL-3、およびIL-6 (FS36と略記) を含む）培地で培養すると、DC前駆細胞はさらに顕著な増殖を示した。増幅した細胞をGM-CSFおよびIL-4、またはGM-CSFおよびSCFにより分化させて得られたDCの数は、採取直後から分化させた場合と比べると数百倍に達した。特にFS36で約３週間培養した後に分化させた細胞集団は、DCの割合が顕著に高く、FS36による約３週間の培養がDCの増幅法として極めて優れていることが判明した。増幅後に得られた細胞は、従来の分化方法により得られたDCと同様に、RNAウイルスの感染またはLPS等によって、co-stimuratory molecules であるCD80およびCD86の発現が増強されることが確認された。また、ヒトCD34+細胞をGM-CSFおよびSCFを含む培地で培養することによっても、DCが顕著に増殖することを見出した。得られたDCは、上記と同様に、LPSによってCD86の発現が増強されることが確認された。このように本発明は、DC前駆細胞を大量に増幅させる方法、および得られたDC前駆細胞を高い効率でDCに分化させる方法を提供するものである。これらの方法により製造されたDCは、癌や感染症などに対する免疫療法に有用である。【０００６】
すなわち本発明は、樹状細胞の製造方法、製造された樹状細胞およびその利用等に関し、より具体的には、
〔1〕樹状細胞を製造する方法であって、樹状細胞前駆細胞を複数のサイトカインの存在下で培養する工程を含む方法。
〔2〕複数のサイトカインが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および幹細胞因子（SCF）である、〔1〕に記載の方法。
〔3〕樹状細胞前駆細胞は、ヒト由来の細胞である、〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕該工程が、樹状細胞前駆細胞をGM-CSF 1 ng/ml以上、およびSCF 0.5 ng/ml以上の存在下で培養する工程である、〔2〕または〔3〕に記載の方法。
〔5〕該工程が、樹状細胞前駆細胞をGM-CSF 10 ng/ml以上、およびSCF 5 ng/ml以上の存在下で培養する工程である、〔4〕に記載の方法。
〔6〕該工程が、GM-CSF 1 ng/mlから100 ng/ml 、およびSCF 0.5 ng/mlから50 ng/mlの存在下で培養する工程である、〔4〕に記載の方法。
〔7〕該工程が、樹状細胞前駆細胞をGM-CSF 10 ng/mlから100 ng/ml 、およびSCF 5 ng/mlから50 ng/mlの存在下で培養する工程である、〔5〕または〔6〕に記載の方法。
等に関する。
なお上記の各項において、同一の項を引用する各項に記載の発明の２つまたはそれ以上を任意に組み合わせた発明は、それらに引用される上位の項に記載の発明において、既に意図されている。また、本明細書に記載した任意の発明要素およびその任意の組み合わせは、本明細書において意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の要素またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本明細書は、明細書中に例えば好ましいとしてある特定の態様を記載した場合、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
【発明の効果】
【０００７】
樹状細胞は高い免疫誘導能を有するため、本発明の方法により得られた樹状細胞は、癌および感染症などの免疫治療に有用な樹状細胞（DC）ワクチンとして有用である。例えば、腫瘍免疫治療に関しては、樹状細胞に腫瘍抗原を提示をさせるために、腫瘍細胞のcell lysate (細胞溶解物) と混合、ペプチドでパルス、または樹状細胞に腫瘍抗原遺伝子を導入する方法などにより抗原を提示させ、腫瘍に対するDC治療に用いることができる。本発明の方法を用いれば、患者から採取したDCが少なくても、治療効果を得るのに十分な細胞数のDCを調製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
尚、下記図1、図2、図4から図10、図13、図15、図21（A）、図21(B)、図22（A）、図28、図29記載のグラフの縦軸の目盛の標記は、以下を意味するものとする。
1.E＋04、1e4、または1.00E+04：1.0×104（個）
1.E＋05または1.00E+05：1.0×105（個）
1.E＋06または1.00E+06：1.0×106（個）
1.E＋07または1.00E+07：1.0×107（個）
1.E＋08または1.00E+08：1.0×108（個）
1.E＋09または1.00E+09：1.0×109（個）
1.E＋10または1.00E+10：1.0×1010（個）
1.E＋11または1.00E+11：1.0×1011（個）
1.E＋12または1.00E+12：1.0×1012（個）
【図１】FS36投与群、GMSCF投与群、GMIL-4投与群の条件で培養したDC前駆細胞の増殖曲線を示す図である。FS36投与群では、42日間培養した。
【図２】DCを以下（ｉ）から（iii）の条件で調製した過程を示す増殖曲線を示した図と、（1）・（2）・（3）時点におけるDC及びDC前駆細胞の形態を表した写真である。（1）及び（3）時点においては、樹状突起が観察できた（（3））。各DCは、各々以下（ｉ）から（iii）の工程で調製した。（ｉ）前駆細胞をFS36投与群の条件で42日間培養して得られたDC。（ii）前駆細胞をFS36投与群の条件で21日間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、7日間培養して得られたDC。（iii）前駆細胞GMIL-4投与群の条件で7日間培養して得られたDC。
【図３】DC前駆細胞増殖培養期間中のCD11b、c-kit、CD131陽性率の推移を示す図である。左のカラムがCD11b+ 細胞の割合を、中のカラムがc-kit+ 細胞の割合を、右のカラムがCD131細胞の割合を示す。図面記載の各サンプル（１）〜（６）は、以下の培養条件で製造したＤＣである。（１）：通常DC（normal DC）。（２）：FS36投与群の条件で一週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（３）：FS36投与群の条件で二週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（４）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（５）：FS36投与群の条件で四週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（６）：FS36投与群の条件で五週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。
【図４】FS36投与群（１）、GMIL-4投与群（２）、GMSCF投与群（３）の条件による１週間の培養におけるDC前駆細胞の増殖曲線、およびCD11b+/CD11c+ 率を示す図である。
【図５】各サンプル（１）〜（４）においての、CD11b+ /CD11c+ 率と培養期間の増殖曲線を示す図である。（１）〜（４）は、以下の培養条件で製造したＤＣである。（１）：FS36投与群の条件で一週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（２）：FS36投与群の条件で一週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したもの。（３）：GMIL-4投与群の条件で二週間培養したもの。（４）：GMSCF投与群の条件で二週間培養したもの。
【図６】各サンプル（１）〜（２）においての、CD11b+ /CD11c+ 率と培養期間の増殖曲線を示す図である。（１）〜（２）は、以下の培養条件で製造したＤＣである。（１）：FS36投与群の条件で二週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（２）：FS36投与群の条件で二週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したもの。
【図７】各サンプル（１）〜（２）においての、CD11b+ /CD11c+ 率と培養期間の増殖曲線を示す図である。（１）〜（２）は、以下の培養条件で製造したＤＣである。（１）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（２）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したもの。
【図８】各サンプル（１）〜（２）においての、CD11b+ /CD11c+ 率と培養期間の増殖曲線を示す図である。（１）〜（２）は、以下の培養条件で製造したＤＣである。（１）：FS36投与群の条件で四週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（２）：FS36投与群の条件で四週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したもの。
【図９】各サンプル（１）〜（２）においての、CD11b+ /CD11c+ 率と培養期間の増殖曲線を示す図である。（１）〜（２）は、以下の培養条件で製造したＤＣである。（１）：FS36投与群の条件で五週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したもの。（２）：FS36投与群の条件で五週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したもの。
【図１０】DC前駆細胞を、FS36投与群の条件による培養後に、GMIL-4投与群またはGMSCF投与群の条件で培養した期間の細胞数の推移、および得られたCD11b+ CD11c+ 細胞数を示す図である。
【図１１】下記(A)〜(D)のDCに、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）（図中ではDC(SeV)と表記）またはLPS（図中ではDC(LPS)と表記）を加えて2日後のCD80、CD86、MHC class II、およびCD40の発現量の比較を示す図である。何も加えなかった対照（図中ではDC(NT)と表記）の結果も示した。図中の（Ａ）〜（Ｄ）で示しているもので用いたDCは、以下の通りである。（Ａ）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDC。（Ｂ）：通常DC（normal DC）。（Ｃ）：FS36投与群の条件で二週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDC。（Ｄ）：FS36投与群の条件で四週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDC。
【図１２】下記(A)〜(D)のDCに、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）またはLPSを加えて2日後のCD80、CD86、およびCD40の発現量の比較を示す図である。何も加えなかった対照（DC(NT)）の結果も示した。図中の（Ａ）〜（Ｄ）で示しているもので用いたDCは、以下の通りである。（Ａ）：GMSCF投与群の条件で一週間培養培養したことにより得られたDC。（Ｂ）：FS36投与群の条件で二週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDC。（Ｃ）： FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDC。（Ｄ）：FS36投与群の条件で四週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDC。
【図１３】ヒトCD34+ 細胞の増殖曲線を示す図である。GMIL-4投与群（１）またはGMSCF投与群の条件の培地中での細胞の増殖を示す。
【図１４】ヒトCD34+ 細胞のCD11c+ 率の推移を示す図である。GMIL-4投与群（１）またはGMSCF投与群の条件の培地中で細胞を培養し、CD11c+ 率の推移を決定した。
【図１５】ヒトCD34+ 細胞から得たCD11c+ 細胞数（全細胞×CD11c+ 率）の推移を示す図である。GMIL-4投与群（１）またはGMSCF投与群の条件の培地中で細胞を培養し、CD11c+ 細胞数を測定した。
【図１６】GMSCF投与群の条件で35日間培養したヒトCD34+ 細胞と、35日間の最後の3日間にLPSで刺激したヒトCD34+ 細胞のCD86の発現量の比較を示す図である。ヒトの臍帯血由来DC前駆細胞は、GM-CSFとSCFで増幅と同時に分化する。
【図１７】FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したDCのＥＬＩＳＡ法によるサイトカイン産生量の検討した結果である。DCに、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）（図中ではSeVと標記している）またはLPS（図中ではLPSと標記している）を加えて2日後の培養上清液(105cells/ml)をサンプルとして用いて、サイトカイン産生量を測定した。図中のＤＣ（ＮＴ）とは、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）またはLPSを加えていないサンプルを示す。GMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したDCにおいて、サイトカイン処理されていないDCと同様に、ＩＬ-12及びＩＦＮ−βの産生が確認された。図中の（１）〜（４）の詳細は、以下の通りである。（１）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDCにおける、ＩＦＮ−βの産生量の測定結果。（２）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDCにおける、ＩＬ-12の産生量の測定結果。（３）：通常DC（normal DC）における、ＩＦＮ−βの産生量の測定結果。（４）：通常DC（normal DC）における、ＩＬ-12の産生量の測定結果。
【図１８】FS36投与群の条件により培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、更に1週間培養して得られたDCに、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）またはLPSを加えて2日後のFITC-dextran 取り込み能 (endo-/phagocytotic activity)を測定した。図中のＤＣ（ＮＴ）とは、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）（図中ではSeVと標記している）またはLPS（図中ではLPSと標記している）を加えていないサンプルを示す。DCのFITC-dextran (MW=40,000)取り込みは37℃で活発で、4℃で阻害される。各反応は37℃及び4℃において、FITC-dextran 1mg/ml で30分取り込ませた。FS36投与群の条件により培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、更に1週間培養して得られたDCは、抗原取り込み能を保持していた。図中の（１）・（２）の詳細は、以下の通りである。（１）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養して得られたDCにおける測定結果。（２）：通常DC（normal DC）における測定結果。
【図１９】FS36投与群の条件により培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、更に1週間培養して得られたDCについてT cell (C57BL/6) に対する増殖刺激の強度を測定した。尚、T細胞は全て106細胞とした。FS36投与群の条件により培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、更に1週間培養して得られたDCは、Ｔ細胞の増殖・活性化能を保持している。（１）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養して得られたDC（F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）やLPSによる刺激を行っていないサンプル）における測定結果。（２）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養して得られたDCにおいて、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）を加えて2日後のサンプルにおける測定結果。（３）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養して得られたDC前駆細胞において、LPSを加えて2日後のサンプルにおける測定結果。（４）：通常DC（normal DC）（F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）やLPSによる刺激を行っていないDC）における測定結果。（５）：通常DC（normal DC）において、F遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）を加えて2日後のサンプルにおける測定結果。（６）：通常DC（normal DC）において、LPSを加えて2日後のサンプルにおける測定結果。（７）：同系リンパ球による混合培養によるサンプルの測定結果。（８）：通常DC（normal DC）自体（T細胞なし）の測定結果。
【図２０】FS36投与群の条件により培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、更に1週間培養して得られたDCについてのin vivoでの治療効果を検討した。図中のサンプル（１）〜（４）の詳細は、以下の通りである。（１）：DCを投与していないマウスにおける、肺への転移結節数のカウント結果。（２）：通常DC（normal DC）をマウスの尾静脈に投与したマウスにおける、肺への転移結節数のカウント結果。（３）：FS36投与群の条件で二週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養して得られたDCをマウスの尾静脈に投与したマウスおける、肺への転移結節数のカウント結果。（４）：FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMSCF投与群の条件にし、一週間培養して得られたDCをマウスの尾静脈に投与したマウスおける、肺への転移結節数のカウント結果。
【図２１】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の増殖分化を曲線を示す図（A）及び図（B）と増殖した細胞のＣＤ11ｃ陽性細胞の割合を示した図（C）である。図（B）は、図（A）におけるサンプル（５）の投与群及びサンプル（６）の投与群においての、培養期間0日から15日の期間についての上記細胞の増殖について、詳細に示したものである。また、別の実験においてGMSCF培地中で5週間培養したヒト臍帯血由来CD34+ 細胞のFACS解析の結果を図（D）に示した（CD11c陽性率 88.87％）。図（D）の黒塗りのグラフはCD11c抗体の結果を、白抜きのグラフはアイソタイプコントロール（iso）の結果を示す。図（D）内の右の数値はCD11c抗体、左の数値はアイソタイプコントロール（iso）におけるM1領域の細胞数の割合(％)を示す。  図の(A)のサンプル (1)〜(8) の詳細は、以下の通りである。なお、図(A)及び図（B）で記載されているサンプル (1)〜(8)の標記の末尾のA〜Eとは、それぞれ異なる被験者由来の細胞の結果であることを示している。 (1) から (5)：GMSCF投与群の条件で培養。 (6）：GMIL4投与群(2)の条件で培養。 (7) 及び (8)：GMIL4投与群(1)の条件で培養。
【図２２】ヒトG-CSF処置末梢血由来CD34+ 細胞の増殖曲線を示す図（Ａ）と増殖した細胞のＣＤ11ｃ陽性細胞の割合を示した図（Ｂ）である。図のサンプル (1)〜(3) の詳細は、以下の通りである。図(A)で記載されているサンプル (1)〜(3)の標記の末尾のA及びBとは、それぞれ異なる被験者由来の細胞の結果であることを示している。(1) 及び (2)：GMSCF投与群の条件で培養。(3)：GMIL4投与群(1)の条件で培養。
【図２３】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、GMSCF投与群の条件で35日間培養した時点の細胞について、樹状突起の有無についての確認した結果である。パネルBは、パネルAの中央のサンプル（GMSCF投与群の条件で5週間培養後、LPSで48時間刺激したもの）の拡大図である。樹状突起がはっきりと確認できる。
【図２４】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養14日（2W）または35日（5W）の時点の細胞（GMSCF投与群の条件により培養した細胞）について、CD11b、CD33、HLA-ABC発現を解析した結果である。
【図２５】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養35日の時点の細胞について、LPS処理又はSeV/dF処理した場合における、ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80、及びCCR7の発現を解析した結果である。尚、図中の標記は以下の通りである。iDC：iDC処理、SeV：SeV/dF処理、LPS：LPS処理。
【図２６】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養35日の時点の細胞（GMSCF投与群の条件により培養した細胞）について、未成熟DC（iDC）、またはLPSを加えて2日後のDCのFITC-dextran 取り込み能 (endo-/phagocytotic activity)を測定した。樹状細胞のFITC-dextran (MW=40,000) 取り込みは37℃で活発で、4℃で阻害される。各反応は37℃及び4℃において、FITC-dextran 1mg/ml で30分取り込ませた。上記細胞は、樹状細胞のように、FITC-dextran (MW=40,000)取り込みは37℃で活発で、4℃で阻害される結果となった。
【図２７】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養35日の時点の細胞（GMSCF投与群の条件により培養した細胞）について、ＥＬＩＳＡ法によりサイトカイン産生量を検討した結果である。上記培養した細胞に、下記所定の処理を行った。上記処理後の培養上清液(105 cells/ml)をサンプルとして用いて、サイトカイン産生量を測定した。図中のＮＴとは、下記所定の処理を行っていないサンプルを示す。尚、「所定の処理」とは、具体的には以下を指す。（１）iDC処理：図中ではiDCと標記している。（２）SeV/dF処理：図中ではSeVと標記している。（３）LPS処理：図中ではLPSと標記している。（４）Poly(I:C)処理：図中ではPoly(I:C)と標記している。（５）CpG処理：図中ではCpGと標記している。（６）R-848処理：図中ではR-848と標記している。（７）OK432処理：図中ではOK432と標記している。
【図２８】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養35日の時点の細胞（図21記載の (1) 又は (2) の条件により培養した細胞）について、T細胞 (allogenicT cell from volunteer) に対する増殖刺激の強度を測定した。尚、T細胞は全て105 細胞とした。右上のパネルにおいて、DC細胞数が1.00E+03（1x103個）の結果が、DC：CD3+ T細胞＝1：100（混合群1）に対応し、DC細胞数が1.00E+04（1x104個）の結果が、DC：CD3+ T細胞＝1：10（混合群2）に対応する。iDC：iDC + T細胞、SeV：SeVで刺激したDC + T細胞、LPS：LPSで刺激したDC + T細胞、iDCのみ：iDCのみでT細胞なし、Tのみ：T細胞のみ。
【図２９】ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の下記 (1)〜(3) の条件における培養結果である。(1)：GMSCF投与群の条件で培養したもの（図の標記は、「GMSCF」）。(2)：0.1GMSCF投与群の条件で培養したもの（図の標記は、「GMSCF0.1」）。(3)：0.01GMSCF投与群の条件で培養したもの（図の標記は、「GMSCF0.01」）。
【図３０】上記図29のアスタリスク（*）で示した時点（35日間培養時点）における各条件で培養した細胞のCD11ｃ陽性細胞率を測定した結果である。図の標記は以下の通りである。（１）GMSCF：GMSCF投与群の条件で培養したもの。（２）GMSCF0.1：0.1GMSCF投与群の条件で培養したもの。（３）GMSCF0.01：0.01GMSCF投与群の条件で培養したもの。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、樹状細胞前駆細胞を複数のサイトカインの存在下で培養する工程を含む、樹状細胞を製造する方法に関する。当該工程により、DC前駆細胞を効率的に増幅および/または分化させることができる。本発明の方法は、複数のサイトカインを添加した培地中で、DC前駆細胞を培養することにより実施する。複数のサイトカインとしては、SCFおよびインターロイキン-3（IL-3）を含むことが好ましく、より好ましくはFLT-3リガンド（FLT-3L）またはインターロイキン-6（IL-6）をさらに含む。すなわち、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6のすべてを添加した培地を好適に用いることができ、患者から採取したDCが少なくても、治療効果を得るのに十分な細胞数のDCを調製することが可能となる。
さらに好ましくは、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6のすべてを添加した培地の存在下で培養した工程の後で、(i) GM-CSFおよびIL-4、または (ii) GM-CSFおよびSCFの存在下で培養する工程をさらに含むことが好ましい。DC前駆細胞を効率よくDCへ分化する上で有効である。すなわち、患者から採取したDCが少なくても、治療効果を得るのに十分な細胞数のDCを効率よく調製することが可能となる。【００１０】
本発明において樹状細胞（Dendritic cell; DC）とは、成熟状態において樹枝状形態をとり、抗原を提示してT細胞を活性化する能力を持つ細胞である。また本発明において樹状細胞前駆細胞とは、適当なサイトカイン（すなわちG-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-4、IL-13、SCF (c-kitリガンド)、Flt-3リガンド、またはそれらの組み合わせ）の存在下でDCに分化する細胞を言い、好ましくは4週間以内、より好ましくは20日以内、より好ましくは18日以内、より好ましくは16日以内に樹状細胞に分化できる細胞である。このような細胞には、CD34+幹細胞、造血始原細胞、骨髄単核球等が挙げられる。これらの細胞は、例えば細胞画分として調製することができる。細胞画分とは、細胞の分離（または分画）により得られた細胞集団である。細胞画分は、細胞および薬学的に許容される担体を含む組成物であってよい。担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培養液、血清など、生細胞を懸濁することができる所望の溶液が挙げられる。樹状細胞への分化は、例えばSCF (50 ng/ml)、GM-CSF (500 U/ml)、TNF-α (50 ng/ml) の存在下で3日間程度培養後、SCF (50 ng/ml)、GM-CSF (500 U/ml)、IL-4 (250 U/ml)、TNF-α (50ng/ml) の存在下で培養することで実施することであってよい。より好ましくは、GM-CSF（20 ng/ml）およびIL-4（20 ng/ml）の存在下、あるいはGM-CSF（20 ng/ml）およびSCF（10 ng/ml）の存在下で培養する。【００１１】
樹状細胞には、生体内各種組織器官に分布する骨髄細胞由来の樹枝状形態をとる細胞群、および骨髄または血液由来の幹細胞から、in vitroでサイトカイン等を利用して分化誘導をかけた生体内組織器官に分布する樹枝状形態をとる細胞、およびそれと同等の細胞群が含まれる。具体的には、樹状細胞には、例えばリンパ球系樹状細胞（Th2への誘導または免疫寛容を誘導するものであってもよい）、骨髄球系樹状細胞 (一般的に用いられる樹状細胞。未熟樹状細胞および成熟樹状細胞を含む)、ランゲルハンス細胞（皮膚の抗原提示細胞で重要な樹状細胞）、相互連結細胞（リンパ節、脾臓のT細胞領域にあり、T細胞への抗原提示に働いていると考えられている細胞）、ろ胞樹状細胞（B細胞への抗原提示細胞として重要、抗原と抗体複合体、抗原と補体複合体を抗体レセプター、補体レセプターにより、樹状細胞上に提示することで、B細胞に抗原提示している。）などを含むものであり、好ましくは、MHCクラスIおよびクラスIIを高発現しており、さらに好ましくはCD11cを発現している細胞である。本発明においては、より好ましくは、骨髄または末梢血から回収された細胞からDCまたはDC前駆細胞が用いられる。またDCの由来する生物種は特に限定されず、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類、ウサギ、ウシ、ヤギなどの哺乳類のDCであってよい。【００１２】
また、樹状細胞は、樹枝状形態を有し、CD11c、HLA-class II (HLA-DR、-DP、または -DQ)、CD40、およびCD1aからなる群より選択される表面マーカーの２つ以上が陽性の細胞であってよい。本発明において樹状細胞は、より好ましくは、HLA-class II+およびCD11c+の細胞、より好ましくはCD1a+、HLA-class II+、およびCD11c+の細胞で、かつ系統マーカーが陰性（Lin-）、すなわちT細胞マーカー（CD3）、B細胞マーカー（CD19、CD20）、NK細胞マーカー（CD56）、好中球マーカー（CD15）、単球マーカー（CD14）を発現してない細胞である。骨髄球系樹状細胞（Myeloid DC）の場合、CD11bをさらに発現していることが好ましい。例えば、CD11b+ CD11c+ 細胞は、本発明においてDCに含まれる。リンパ球系樹状細胞（Lymphoid DC）においては、CD8をさらに発現していてよい。【００１３】
また、本発明において樹状細胞には成熟樹状細胞および未成熟樹状細胞が含まれる。未成熟樹状細胞とは、成熟状態に比べT細胞活性化能力が有意に低い樹状細胞を言う。具体的には、未成熟樹状細胞は、LPS (1μg/ml) を添加し2日間培養して成熟を誘導した樹状細胞に比べ、抗原提示能が1/2未満、好ましくは1/4未満のものであってよい。抗原提示能は、例えばアロT細胞活性化能（混合リンパ球試験；アロT細胞と樹状細胞の混合培養で、T細胞対樹状細胞の割り合いは1：10で培養、好ましくはその比率を変化させて培養したもので、培養終了8時間前に3H-thymidineを添加し、そのT細胞のDNA内の取込み量によって、T細胞増殖能力を定量したもの；文献 Gene Therapy 2000; 7; 249-254）、あるいはペプチドを用いた特異的細胞傷害性T細胞（CTL）の誘導能試験（樹状細胞に、ある抗原のあるClass I 拘束性の既知のペプチドを添加して、樹状細胞を採取したのと同じ健常人末梢血のT細胞を共培養（3日目以降はIL-2を25U/ml、好ましくは100U/ml)（好ましくは21日間３回の樹状細胞による刺激、更に好ましくは14日間2回の樹状細胞の刺激）し、得られたエフェクター細胞と51Crでラベルされたターゲット細胞（ペプチドの拘束性のClass I陽性の腫瘍細胞）を100:1〜2.5:1（100:1、50:1、25:1、20:1、12.5:1、10:1、5:1、または 2.5:1）、好ましくは10:1 で４時間混合培養してターゲット細胞の51Cr遊出量で定量したもの（文献 Arch Dermatol Res 2000; 292; 325-332））により定量することができる。また未成熟樹状細胞は、好ましくは抗原貪食能を持ち、更に好ましくはT細胞活性化のための副刺激を誘導する受容体の発現が低発現（例えば上記のようにLPS誘導した成熟DCに比べ有意に）あるいは陰性である。一方で、成熟樹状細胞とはT細胞活性化などの為の抗原提示能力が未成熟状態に比べて有意に高い樹状細胞を言う。具体的には、成熟樹状細胞は、LPS (1μg/ml) を添加し2日間培養して成熟を誘導した樹状細胞の抗原提示能の1/2以上、好ましくは同等以上の抗原提示能を持つ細胞であってよい。また成熟樹状細胞は、好ましくは抗原貪食能が低いか、または持たず、更に好ましくはT細胞活性化のための副刺激を誘導する受容体の発現が陽性のものをいう。また、樹状細胞の活性化とは、未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への移行を言い、活性化樹状細胞には、成熟樹状細胞、および、活性化刺激により副刺激を誘導するCD80、CD86の発現を上昇させている途中経過の樹状細胞が、その範疇に含まれる。【００１４】
成熟ヒト樹状細胞は、CD40、CD80、CD86およびHLA-class IIの発現が陽性の細胞である。例えば、CD80、およびCD86からなる群より選択されるマーカーを基に、未成熟樹状細胞と成熟樹状細胞を見分けることができる。未成熟樹状細胞ではこれらのマーカーは弱いか、好ましくは陰性であるが、成熟樹状細胞では陽性である。【００１５】
上記のように、未成熟樹状細胞は、通常、高い貪食能を保持している。樹状細胞にLPS (1μg/ml) を添加し2日間培養すると、樹状細胞は活性化され貪食能は低下する。貪食能は、樹状細胞内への小分子の取り込み量または取り込み細胞の割合を測定して知ることができる。好ましくは、貪食能は、樹状細胞内への小分子の取り込み量で決定される。例えば、直径 1μm程度の着色ビーズを用いて、樹状細胞内へのビーズの取り込みを測定することができる。4℃で陽性となるバックグランドを差し引いて定量する。高い貪食能とは、樹状細胞内への小分子の取り込み量が、樹状細胞を上記のようにLPS (1μg/ml) で2日間刺激した樹状細胞の4倍以上、より好ましくは5倍以上、より好ましくは6倍以上の貪食能を言う。あるいは、小分子の取り込み細胞の割合が2倍以上、より好ましくは3倍以上である。低い貪食能とは、樹状細胞内への小分子の取り込み量が、LPS (1μg/ml) で2日間刺激した樹状細胞の4倍未満、より好ましくは2倍未満、より好ましくは1.5倍未満である。あるいは、小分子の取り込み細胞の割合で測定した場合に、2倍未満、より好ましくは1.5倍未満である。【００１６】
成熟樹状細胞の判別は当業者が通常行っており、上記の各マーカーおよびその発現の測定方法も当業者に周知である。例えばCD11cは約150 kDの接着糖蛋白 (p150, インテグリンα鎖) である。CD11cはCD18と結合してCD11c/CD18複合体を形成し、フィブリノーゲンへの結合力を有し、また、iC3bおよびICAM-1の受容体となることが報告されている。また、CD11c/CD18は刺激を受けた上皮の受容体に結合する接着分子として働きうることが報告されている（Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Barclay, N.A. et al., eds., 1993, The Leucocyte Antigen FactsBook, CD11 Section, Academic Press Inc., San Diego, California, p. 124; Stacker, S.A. and T.A. Springer, 1991, J. Immunol. 146:648）。【００１７】
CD1aは約49 kDのポリペプチドでβ 2ミクログロブリンと結合する。CD1aはMHC class I抗原と構造的に類似しており、抗原提示に機能するとみなされる（Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Hanau, D. et al., 1990, J. Investigative Dermatol. 95: 503; Calabi, F. and A. Bradbury., 1991., Tissue Antigens 37: 1）。【００１８】
CD11bは、インテグリンαM鎖、Mac-1、CR3、iC3bR（complement receptor type 3）、Mo1とも呼ばれる、分子量が約165〜約170のI型膜貫通糖蛋白質である。補体 (iC3b)、フィブリノーゲン、凝固因子X のレセプターとして機能し、食細胞運動に関与する（Todd R.F. et al. J. Immunol.,126,1435-1442 (1981); Leong A.S.Y. Appl. Immunohistochem. Surg. Pathol.,120-128 (1993); Todd R.F. et al. Hybridoma, 1, 329-337 (1982); Cobbold S. et al. Leucocyte Typing III, 788-803 (1987); Keizer G. et al. Eur. J. Immunol., 15,1142-1148. (1985); Laffon A. et al. J.Clin. Invest., 88, 546-552 (1991); Acevedo A. et al. J. Invest. Dermatol., 97, 659-666 (1991)）。【００１９】
CD11c（インテグリンαXサブユニット、もしくはp150白血球表面抗原）は、インテグリンファミリーの分子であり、他の白血球インテグリン（CD11a、CD11b、CD11d）と同様に、インテグリンβ2サブユニット（CD18）と非共有結合的に結合している。CD11cは、分子量145-150kDaの膜貫通糖タンパクで、樹状細胞のマーカーとしてよく知られている（Molica S. et al. Blood, 81, 2466 (1993); Van der Vieren M. et al. Immunity, 3, 683-690 (1995); Hogg N. et al. Leucocyte Typing III, 576-602 (1987)）。【００２０】
CD14は53-55 kDのグリコシルホスファチジルイノシトール (GPI) アンカー型単鎖糖蛋白で、細網樹状細胞およびある種のランゲルハンス細胞で発現する。CD14はLPSと血清LPS結合蛋白質 (LPB) の複合体に対する高親和性の表面受容体として同定された（McMichael, A.J. et al., eds., 1987, Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Wright , S.D. et al., 1990, Science 249:1434）。【００２１】
CD40は45-48 kDのI型膜嵌入型蛋白質（type I integral membrane glycoprotein）であり、抗CD40抗体は細胞マーカーとしてよく使用されている（Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Galy, A.H.M.; and H. Spits, 1992, J. Immunol. 149: 775; Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4494; Itoh, H. et al., 1991, Cell 66: 233; Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book., Academic Press）。
CD80は約60 kDの膜貫通型糖蛋白であり Ig supergene familyの一員である。CD80はT細胞で発現するCD28およびCD152 (CTLA-4) のリガンドである（Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Schwarts, R.H., 1992, Cell 71: 1065; Azuma, M. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 845; Koulova, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 759; Freeman, G.J. et al., 1998, J. Immunol. 161: 2708; Behrens, L. et al., 1998, J. Immunol., 161(11):5943; Guesdon, J.-L. et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139）。【００２２】
CD83は約45 kDの膜貫通蛋白質でIg superfamilyの一員である。CD83は短鎖のV型Igの細胞外ドメインとC末の細胞質tailを持つ。CD83は主にろ胞樹状細胞、循環樹状細胞、リンパ組織の相互連結 (interdigitating) 樹状細胞、in vitroで生成させた樹状細胞、および胸腺樹状細胞に発現する（Zhou, L-J., and T.F. Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821; Zhou, L-J. et al., 1992, J. Immunol. 149: 735; Summers, K.L. et al., 1995, Clin Exp. Immunol. 100:81; Weissman, D. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92: 826; Hart, D.N.J., 1997, Blood 90: 3245）。
CD86 (B70/B7-2) は約75 kDの細胞表面蛋白質でCD28およびCTLA-4の第2のリガンドであり初期免疫応答におけるT細胞の副刺激に重要な役割を持つ（Azuma M. et al., 1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P. et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al., CD86 Workshop Report. In: Leukocyte Typing V. Schlossman, S.F. et al. eds., 1994, Oxford University Press; Yang, X.F. et al., 1994, Upregulation of CD86 antigen on TPAstimulated U937 cells, 1994, (abstract). American Society of Hematology, Nashville, TN; Guesdon, J.-L.et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139）。【００２３】
CCR7はBLR-2、EBI-1、およびCMKBR7とも呼ばれる7回膜貫通型G蛋白質結合受容体であり、CCケモカインである MIP-3β/Exodus 3/ELC/CCL19 および 6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21 の受容体である（Sallusto, F. et al., 1999, Nature 401:708-12; Lipp, M. et al., 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 251:173-9; Birkenbach, M.et al., 1993, J. Virol. 67:2209-20; Schweickart, V. L. et al., 1994, Genomics 23:643-50; Burgstahler, R. et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:737-43; Yoshida, R. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:13803-9; Yoshida, R. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:7118-22; Yoshida, R. et al., 1998, Int. Immunol. 10:901-10; Kim, C. H. et al., 1998, J. Immunol. 161:2580-5; Yanagihara, S. et al., 1998, J. Immunol. 161:3096-102）。【００２４】
HLA-class IIはDR, DP, およびDQがあり、その全てに結合する抗体により網羅的に検出することができる（Pawelec, G. et al., 1985, Human Immunology 12:165; Ziegler, A. et al., 1986, Immunobiol. 171:77）。HLA-DRはMHCのヒトclass II抗原の1つでα鎖 (36 kDa) とβサブユニット (27 kDa) からなる膜貫通糖蛋白質である。表皮のランゲルハンス細胞ではCD1a抗原と共発現する。CD1aは抗原提示において細胞の相互作用に主要な役割を果たす（Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press）。【００２５】
上記のマーカー遺伝子およびそれらの相同遺伝子産物を指標に、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物に関して樹状細胞を特定することができる。これらのマーカーに対する抗体は、例えばBD Biosciences社（BD PharMingen）より入手することができ、その詳細は同社または販売代理店のウェブサイトで知ることができる。【００２６】
また、樹状細胞マーカーに関しては、以下のKiertscherらおよびOehlerらの文献も参照のこと（Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+ leukocytes acquire the phenotype and function of antigen-presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL-4, J. Leukoc. Biol., 1996, 59(2):208-18; Oehler, L. et al., Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics., J. Exp. Med., 1998, 187(7):1019-28）。また、フローサイトメトリーに関しては、Okanoら、およびStitesらの文献を参照することができる（Okano, S. et al., Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes., Gene Ther., 2003, 10(16):1381-91; Stites, D. et al., Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence., Clin. Immunol. Immunopathol., 1986, 38:161-177）。各マーカーの発現については、例えば、isotype control antibodyで染色した時に、陽性率が1％以下の蛍光強度を境界として、それ以上は陽性、それ未満は陰性と判断される。【００２７】
樹状細胞またはその前駆細胞の調製は、公知の方法に従ってまたは準じて行うことができる。例えば、血液（例えば末梢血または臍帯血）、骨髄、リンパ節、他のリンパ器官、脾臓、皮膚などから分離することができる（Bishop et al., Blood 83: 610-616, 1994; Bontkes, H. J. et al. (2002) J. Leukoc. Biol. 72, 321-329; Katsuaki, S. et al. (1998) CRYOBIOLOGY 37, 362-371; Ladan, K. et al. (2006) Stem Cells 24, 2150-2157; Ueda, T. et al. (2000) J. Clin. Invest. 105: 1013-1021）。好ましくは、樹状細胞は、本発明に使用するために血液または骨髄から得られる。また、本発明で用いられる樹状細胞は、皮膚のランゲルハンス細胞、輸入リンパ管のベール細胞、ろ胞樹状細胞、脾臓の樹状細胞、およびリンパ器官の指状突起細胞などであってもよい。また本発明で用いられる樹状細胞は、CD34+由来樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、脾細胞由来樹状細胞、皮膚由来樹状細胞、濾胞樹状細胞、および胚中心樹状細胞からなる群から選択される樹状細胞が含まれる。DC前駆細胞としては、特に骨髄または末梢血から得られた造血幹細胞または造血始原細胞等が好ましい。造血幹細胞または造血始原細胞は、市販のキットなどを用いたネガティブセレクションや、CD34+ などのポジティブセレクションにより単離することができる（米国特許出願 08/539,142参照）。例えば、磁気ビーズ、蛍光ラベルによるソーティング、ビオチンまたはアビジン結合担体等により、表面抗原を利用した細胞の単離方法が知られている（Berenson et al., J. Immunol. Meth., 91:11, 1986; WO 93/08268）。【００２８】
DCやDC前駆細胞とそれ以外の細胞とを含む組成物からDCやDC前駆細胞を選択（または濃縮）する場合は、DCおよびDC前駆細胞以外の細胞を取り除くいわゆるネガティブ選択を実施することが好ましい。ネガティブ選択を用いることにより、DC-granulocytesのprecursor（J. Exp. Med., 1998, 187: 1019-1028; Blood, 1996, 87: 4520-4530) が除去されずに残り、接着性のCD14細胞から分化したDCだけでなく、それらのprecursorから分化したDCをあわせて回収することが可能と考えられる。これにより、DCにベクターを導入する際などにおける細胞障害性を軽減することが期待できる。【００２９】
例えば、T細胞、NK細胞、B細胞などに特異的な抗体を用いて、これらの細胞を取り除くことにより、DCを濃縮することが可能である。具体的には、例えば、CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、CD66bから選択される表面マーカーまたはその任意の組み合わせの発現がlowまたはnegativeの細胞を得ることが好ましい。より好ましくは、CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、およびCD66bの全てがlowまたはnegativeの細胞である。そのために、これらのマーカーに対する抗体を用いて、これらのマーカーを発現する細胞を除去するとよい（Hsu et al. (1996) Nature Med. 2: 52）。なお、ネガティブ選択においては多価抗体を用いて行うことができるし、あるいは磁気細胞分離 (MACS) のためにビーズ等を用いても、同様のセレクションを実施することが可能である。血球分離等を用いて単核球を採取するなど、細胞を大量に調製する場合は、ビーズを用いることが好ましい。例えば生体から得た細胞溶液から単球をエンリッチし、これに対してネガティブ選択を行って調製したDC前駆細胞を本発明において好適に用いることができる。【００３０】
樹状細胞の具体的な単離方法は、例えば Cameron et al., 1992, Science 257: 383、Langhoff et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7998、Chehimi et al., 1993,J. Gen. Viol. 74: 1277、Cameron et al., 1992, Clin．Exp．Immunol. 88: 226、Thomas et al., 1993, J. Immunol. 150: 821、Karhumaki et al.， 1993, Clin．Exp．Immunol. 91: 482 などに記載されている。また、フローサイトメトリーによる樹状細胞の単離については、例えば、Thomas et al., 1994, J．Immunol. 153: 4016、Ferbas et al., 1994, J．Immunol. 152: 4649、および O'Dohelrty et al., 1994, Immunology 82: 487 に記載されている。また、磁気細胞選別については、例えば Miltenyi et al., 1990, Cytometry 11: 231-238 に記述されている。【００３１】
また、例えばヒト樹状細胞の単離および増殖に関しては、Macatonia et al., 1991, Immunol. 74: 399-406、O'Doherty et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1067-1078、Markowicz et al., 1990, J. Clin. Invest. 85: 955-961、Romani et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 83-93、Sallusto et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118、Berhard et al., 1995, J. Exp. Med. 55: 1099-1104 などに記載の方法を用いてもよい。また、骨髄、臍帯血、または末梢血等から得られるCD34+細胞および末梢血由来の単核細胞からの樹状細胞形成については Van Tendeloo et al., 1998, Gene Ther. 5: 700-707 に記載の方法を用いて実施してもよい。【００３２】
DC前駆細胞は、１または複数のサイトカインを含む培地中で増幅される。例えば、IL-3単独でも約10日にわたりDC前駆細胞を増幅することが可能である。しかし、より長期に渡る増幅は、IL-3単独では見られない。本発明者らは、SCFおよびIL-3を含む培地でDC前駆細胞を培養することにより、極めて高い効率でDCへの分化能を持つ細胞を増幅できることを見出した。従って、２週以上の増幅にはIL-3とSCFの組合せることが好ましい。特に、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6の４種のサイトカインを含む培地でDC前駆細胞を培養することにより、DCへの高い分化能を持つDC前駆細胞を大量に得ることができる。本発明は、IL-3およびSCFを含みFLT-3LおよびIL-6を含まない培地、FLT-3L、SCF、およびIL-3を含みIL-6を含まない培地、あるいはSCF、IL-3、およびIL-6を含みFLT-3Lを含まない培地でDC前駆細胞を増幅する工程を含む、DCの製造方法に関する。また本発明は、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6を含む培地、例えばそれらを含み、G-CSF、GM-CSF、IL-4、およびTNF-αから選択される１つ以上（またはそれらの任意の組み合わせ）のサイトカインを有意に含まない培地でDC前駆細胞を増幅する工程を含む、DCの製造方法にも関する。【００３３】
FLT-3L （Fms様チロシンキナーゼ3リガンド）は、Flt-3のリガンドであり、造血系前駆細胞の分化、増殖を促す (Namikawa R. et al., BLOOD 87: 1881-1890, 1996)。EP 0627487 A2およびWO 94/2839に記載されている一群のポリペプチドは、本発明においてFlt-3Lに含まれる。ヒトFLT-3L cDNAは、accession number ATCC 69382 としてAmerican Type Culture Collection (ATCC) より入手できる。SCFは、c-kitリガンド、マスト細胞増殖因子(MGF)、またはスチール因子とも呼ばれる（Zsebo et al., Cell 63: 195-201, 1990; Huan, E. Cell 63: 225-233; Williams, D.E., Cell 63: 167-174, 1990; Toksoz. D et al, PNAS 89: 7350-7354, 1992）。SCFとしては、EP 423,980 に記載されているポリペプチドが含まれる。【００３４】
IL-3は、活性化T細胞、肥満細胞、好酸球によって産生される造血因子である。本発明においてIL-3には、米国特許第5,108,910号に記載されているIL-3ポリペプチドが含まれる。ヒトIL-3蛋白質をコードするDNA配列は、accession number ATCC 67747として入手可能である。IL-6はB細胞の分化誘導因子として発見され、抗体産生系のみならず、肝における急性期蛋白の生合成誘導やIL-3との相乗作用に基づく造血幹細胞の増殖促進など多彩な生理活性を有する (Paul SR et al., Blood, 1991, 77: 1723-1733)。IL-4は主にヘルパーT細胞より産生され、T細胞、B細胞および他の血球細胞に広汎な生理活性を有する (Mosley et al., Cell 59: 335 (1989); Idzerda et al., J. Exp. Med. 171: 861 (1990); Galizzi et al., Intl. Immunol. 2: 669 (1990))。GM-CSFは、マクロファージまたは顆粒球を含有するコロニーの成長を刺激した因子として単離されたサイトカインである（米国特許第5,108,910号および5,229,496号）。GM-CSFは、顆粒球およびマクロファージの前駆細胞の成長および発生に必須の因子であり、骨髄芽球および単芽球を刺激し分化を誘導する。【００３５】
各サイトカインの濃度は適宜調整してよいが、FLT-3Lであれば 5〜35 ng/ml、好ましくは 10〜30 ng/ml、より好ましくは 15〜25 ng/ml、より好ましくは約20 ng/ml である。SCF、IL-3、IL-6については、例えばFS36などのGM-CSF不含の培地を用いる場合は、3〜20 ng/ml、好ましくは 5〜15 ng/ml、より好ましくは 7〜12 ng/ml、より好ましくは約10 ng/ml であるが、これらに限定されない。培地としては、例えばRPMI1640またはIMDMを用いることができる。培地には、5〜20％、好ましくは約10％の血清、好ましくはウシ胎児血清 (FBS) を適宜添加する。DC前駆細胞は、1×105 〜 5×105 細胞程度、例えば約2.5×105 細胞から培養を開始することができる。好ましくは3日〜4日ごとに継代する。継代時には、2×106 /ml 以下の濃度となるように細胞数を調整することが好ましい。ヒトCD34+細胞などの霊長類CD34+ 細胞をGM-CSFとSCFを組み合わせて培養する場合は、GM-CSFは例えば 1〜500 ng/ml（1〜200 ng/ml または 1〜100 ng/ml）、より好ましくは 2〜300 ng/ml、例えば 5〜200 ng/ml、好ましくは 10〜150 ng/ml、より好ましくは 20〜120 ng/ml、より好ましくは 30〜100 ng/ml で用いるとよい。SCFは例えば 0.5〜500 ng/ml（0.5〜100 ng/ml または 0.5〜50 ng/ml）、より好ましくは 1〜300 ng/ml、より好ましくは 2〜200 ng/ml、より好ましくは 5〜100 ng/ml、例えば 10〜70 ng/ml、より好ましくは 例えば 20〜60 ng/ml、より好ましくは 25〜50 ng/ml 程度で用いるとよい。【００３６】
本発明者らは、DC前駆細胞の増幅期間を約３〜４週間とすることで、その後のDCへの分化効率を顕著に高められることを見出した。これより長い期間培養すれば、より多くの細胞を得ることができるが、DCへの分化効率は低下する。特にFS36培地において５週間増幅させたDC前駆細胞は、DCへの分化効率が顕著に低下する。従って、例えばFS36などのGM-CSF不含の培地を用いる場合は、DC前駆細胞の培養期間は約３週間から約４週間、好ましくは約３週間にすることが好ましく、例えば 18〜24日間、より好ましくは20〜22日間培養し、その期間を超えて同じサイトカインの組み合わせを含む培地でDC前駆細胞を増幅させることは避けることが好ましい。その期間培養した後、以下に記載するようにDC分化培地で培養し、DCを分化させる。例えば、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6を含む培地でDC前駆細胞を培養する場合は、上記の期間培養後、FLT-3L、SCF、IL-3、およびIL-6の全て含む培地以外の培地で培養される。【００３７】
増幅したDC前駆細胞は、サイトカインによりDCに分化させることができる。例えば顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、GM-CSF、腫瘍ネクローシスファクター (TNF)-α、IL-4、IL-13、SCF（c-kitリガンド）、Flt-3リガンド、またはそれらの組み合わせなどにより分化させることができる。例えば、GM-CSF不含の培地（FS36など）で増幅させたDC前駆細胞を、GM-CSFおよびIL-4の存在下、あるいはGM-CSFおよびSCFの存在下でDCに分化させることが好ましい。TNF-αでさらに刺激することにより成熟樹状細胞へと分化させることもできる。本発明においては、好ましくは、上記の方法に従いGM-CSF不含の培地（FS36など）で増幅したDC前駆細胞を、(i) GM-CSFおよびIL-4、または (ii) GM-CSFおよびSCFの存在下で培養する。サイトカインの濃度は適宜調整してよいが、GM-CSF不含の培地を用いてDC前駆細胞を増幅した場合は、GM-CSFおよびIL-4については、例えば 1〜500 ng/ml、より具体的には 2〜300 ng/ml、例えば 5〜100 ng/ml、好ましくは 10〜50 ng/ml、より好ましくは 15〜25 ng/ml、より好ましくは約20 ng/ml である。SCFについては、例えば 1〜200 ng/ml、より具体的には 2〜100 ng/ml、2〜80 ng/ml、または 2〜60 ng/ml、より具体的には、例えば 3〜20 ng/ml、好ましくは 5〜15 ng/ml、より好ましくは 7〜12 ng/ml、より好ましくは約10 ng/ml である。培地としては、例えばRPMI1640またはIMDMを用いることができる。5〜20％、好ましくは約10％の血清、好ましくはウシ胎児血清 (FBS) を適宜添加する。培養期間は、例えば5〜15日間、好ましくは 6〜10日、より好ましくは約７日間である。FS36で細胞を増幅した場合は、GM-CSFおよびIL-4の存在下で分化させるよりも、GM-CSFおよびSCFの存在下で分化させる方が、より効率的にDCを得ることができる。【００３８】
またヒトCD34+ 細胞などのヒトDC前駆細胞または他の霊長類DC前駆細胞であれば、上記のようにSCFおよびIL-3（S3）、あるいはFS36で増幅しなくても、(i) GM-CSFおよびIL-4、または (ii) GM-CSFおよびSCFの存在下で培養することにより、増幅と同時に分化させることが可能である。この場合、培養期間は1〜10週間、例えば 1〜6週間、好ましくは2〜5週間、好ましくは3〜6週間、好ましくは3〜5週間、好ましくは4〜5週間とする。霊長類CD34+ 細胞としては、例えば臍帯血由来CD34+ 細胞、骨髄由来CD34+ 細胞、および末梢血由来CD34+ 細胞等を用いることができる。【００３９】
培養液としては、適宜所望の培地を用いることができるが、例えば DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、MEM（Minimum Essential Medium）、RPMI-1640、X-VIVOTM（Lonza）、IMDM（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）等が挙げられる。最も好ましくは IMDM が用いられる。適宜血清を添加することが好ましく、例えば 1〜20％（v/v）、より好ましくは 2〜20％、より好ましくは 5〜15％、より好ましくは 5〜10％（例えば 約10％）を添加する。血清は、ウシ由来の血清が好ましく、最も好ましくはウシ胎児血清（FCS）である。ヒトCD34+ 細胞からiDCを増幅する際には、TNF-αおよび/またはIL-4を添加しないことが好ましい。例えば培地中のTNF-αおよびIL-4濃度は、加える血清中に含まれる各濃度と比較して、それを著しく超えない範囲、例えば血清（例えば正常FCS）中の各サイトカイン濃度の3、2、または1倍以下であることが好ましく、好ましくは 1/2以下、より好ましくは1/3以下、または1/5以下、具体的には 50 ng/ml以下、好ましくは 40、30、20、10、5、3、または 1 ng/ml 以下である。ヒトCD34+ 細胞からiDCを増幅するための培地は、好ましくはサイトカインとしてはGM-CSFおよびSCFのみが添加された培地である。培地は、好ましくは、サイトカインとしてはGM-CSFおよびSCFのみを含み、他のサイトカインを含まない。【００４０】
本発明は、GM-CSFおよびSCFを含む、樹状細胞増幅用組成物、樹状細胞調製用組成物、樹状細胞製造用組成物、樹状細胞増幅用培地、樹状細胞調製用培地、および樹状細胞製造用培地を提供する。組成物は、適宜滅菌水、緩衝液、塩等を含んでもよい。また培地としては、上記に記載した培養液などが挙げられるが、それらに限定されない。培地は、血清を含んでもよいし、含まなくてもよい。また、抗生物質を含んでもよいし、含まなくてもよい。また本発明は、これらの組成物または培地の製造における、GM-CSFおよびSCFの使用にも関する。また本発明は、GM-CSFおよびSCFをキットの要素として含む、樹状細胞増幅用キット、樹状細胞調製用キット、樹状細胞製造用キットにも関する。当該キットは、培養液（例えば血清を含まない）または培養液を調製するための粉末（アミノ酸や塩等を含み、血清や抗生物質等が含まれていないもの）をさらに含んでもよい。これらの組成物、培地、およびキットは、好ましくはヒトを含む霊長類樹状細胞を増幅、調製、および製造するためのものであり、より好ましくはヒトを含む霊長類CD34+細胞から樹状細胞を増幅、調製、および製造するためのものである。これらは、TNF-αおよび/またはIL-4を含まないことが好ましい。例えば組成物および培地中のTNF-αおよびIL-4濃度は、血清を含む場合は血清中に含まれる各濃度と比較して、それを著しく超えない範囲、例えば血清（例えば正常FCS）中の各サイトカイン濃度の3、2、または1倍以下であることが好ましく、好ましくは 1/2以下、より好ましくは1/3以下、または1/5以下、具体的には 50 ng/ml以下、好ましくは 40、30、20、10、5、3、または 1 ng/ml 以下である。血清を含まない場合は、好ましくはサイトカインとしてはGM-CSFおよびSCFのみを含む。【００４１】
本発明の方法に従えば、CD34+ 細胞からDCを例えば 102倍、好ましくは 0.5×103倍、より好ましくは 1×103倍、より好ましくは 0.5×104倍、より好ましくは 1×104倍、より好ましくは 0.5×105倍、より好ましくは 1×105倍、より好ましくは 0.5×106倍以上に増幅して得ることができる。細胞は、例えば１週間の培養で5倍、好ましくは6、7、8、9、10、11、12、または13倍以上の速度で増加させることができる。増幅された細胞は、高純度でDC（iDC）を含む。増幅された細胞のCD11c陽性率（全細胞中のCD11c+細胞の割合）は、例えば30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、または85％以上である。また、iDCをLPSまたはPoly(I:C)、あるいはセンダイウイルス等で処理することにより、成熟DCを得ることができる。【００４２】
本発明の方法により得られる樹状細胞は、感染症、癌、その他、免疫誘導により有益な効果を期待できる所望の疾患の免疫治療に有用なDCワクチンとして有用である。例えば、腫瘍免疫治療に関しては、樹状細胞に腫瘍抗原を提示をさせるために、腫瘍細胞のcell lysate (細胞溶解物) と混合、ペプチドでパルス、または樹状細胞に腫瘍抗原遺伝子を導入する方法などにより抗原を提示させ、腫瘍に対するDC治療に用いることができる。【００４３】
例えば樹状細胞に腫瘍抗原を遺伝子導入すれば、腫瘍ライセートおよびペプチドパルスよりもin vivoでの腫瘍抗原提示時間の延長が期待でき、さらにHLAの制限（ペプチドの場合; ペプチドは抗原由来のあるペプチドを使用するが、HLAとの結合の関係上、HLAの種類が変われば、その抗原の中の使用するペプチドの部位が変化する）などを受けなくなる利点を有する。【００４４】
樹状細胞に遺伝子を導入するベクターとして、プラスミドを導入するリポソーム法、electroporationなどある（Cancer Gene Ther 1997, 4, 17-25）。より実用的なベクターとして、以下の3種類のベクターがある。i) アデノウイルスベクター（J. Immnotherapy 2002; 25; 445-454, Gene therapy 2000; 7; 249-254）、ii) レトロウイルスベクター（J. Leuko. Biol., 1999; 263-267., Br. J. Haematol. 2000; 108; 817-824）、iii) レンチウイルスベクター（J. Gene Med. 2001; 3; 311-320, J. Immunol. Meth. 2002; 153-165, Mol. Ther., 2002; 283-290, Cancer Gene Therapy 2002; 9: 715-724）。ベクターと樹状細胞との接触は、in vivoまたはin vitroで行うことができ、例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶液中で実施すればよい。【００４５】
例えばレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターを用いて、CD34陽性の幹細胞に遺伝子を導入し、その後 in vitroで樹状細胞を得ることができる。また、サル免疫不全ウイルス (SIV) の場合、helper constructにおいてvpx（proviral DNAの核内移行を促進する）を残すことによって、あるいは、HIVでDNA-flapシーケンスを挿入（これもproviral DNAの核内移行を促進する）することによって、末梢血由来単球及び分化した樹状細胞への遺伝子導入が可能となった（Mol. Ther. 2002; 283-290）。【００４６】
一方、アデノウイルスに関しては、その高い導入効率（約80％）と分化した樹状細胞へ直接遺伝子導入できることから、樹状細胞遺伝子導入用ベクターとして期待されている（J. Immnotherapy 2002; 25; 445-454）。但し、遺伝子導入効率を高くするMOIではアロT細胞の混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction; MLR）を低下させる免疫抑制作用がある（Gene Therapy 2000; 7; 249-254）ので、高MOIでの使用は注意を要する（特に高いDC:Tの比率で）。また、episomeの希釈のため、CD34陽性細胞などの幹細胞に遺伝子導入後に樹状細胞を分化させるよりも、より分化が進んだ段階で導入することが好ましい。【００４７】
また、上記のウイルスベクターの他に、マイナス鎖RNAウイルスなどのRNAウイルスをDCへ導入することも好適である。マイナス鎖RNAウイルスベクターによる遺伝子導入は非常に短期間の接触で終了し、100％近い導入効率を得ることができ、しかもアロT細胞応答の抑制程度は比較的軽度であり、T細胞の刺激性が保持される（WO2005/042737）。マイナス鎖RNAウイルスとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスであり、ネガティブ鎖RNAウイルスとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae科; Respirovirus属, Morbillivirus属, Rubulavirus属, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae科; Vesiculovirus属, Lyssavirus属, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae科）、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae科; Infuluenza virus A, B, C, および Thogoto-like viruses 等を含む）、ブニヤウイルス（Bunyaviridae科; Bunyavirus属, Hantavirus属, Nairovirus属, および Phlebovirus属等を含む）、アレナウイルス（Arenaviridae科）などの科に属するウイルスが含まれる。【００４８】
本発明においてマイナス鎖RNAウイルスは、より好ましくは、パラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモルビリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体が用いられ、より好ましくはセンダイウイルスを含むレスピロウィルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（genus Paramyxovirus）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体が用いられる。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。例えばF遺伝子欠損型のマイナス鎖RNAウイルスは好適である。様々なマイナス鎖RNAウイルスにおいて、組み換えウイルスの製造方法が知られている（WO97/16539; WO97/16538; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404）。【００４９】
マイナス鎖RNAウイルスベクターの導入効率は、樹状細胞が非活性化状態（未成熟状態）の方が、成熟樹状細胞に対するものよりも有意に高い。従って、マイナス鎖RNAウイルスベクターは、未成熟樹状細胞に接触、または未成熟樹状細胞を含む細胞画分と混合することが好ましい。樹状細胞は、細菌またはリポポリサッカライド（LPS）、二本鎖RNA、またはRNAウイルス等との接触により活性化することができる。遺伝子導入する樹状細胞をこのような方法で別途活性化させる場合は、活性化してからベクターを導入してもよいが、ベクターの導入効率が低下しないようにするため、活性化の操作をベクターの導入前ではなく、ベクターにより遺伝子を導入した後（またはベクターを樹状細胞に接触させるのと同時）に行うことが好ましい。【００５０】
例えば本発明の方法により増幅したDC前駆細胞を、GM-CSFおよびSCFの存在下で培養してDCに分化させた後に、LPSまたはRNAウイルス等の存在下で培養することにより、DCを活性化させる。培養期間は適宜調整してよいが、例えば２〜７日間である。例えばマイナス鎖RNAウイルスなどのRNAウイルスは、免疫賦活（腫瘍免疫など）に使用するにあたって遺伝子導入に利用できることに加え、RNAウイルスの感染自体が樹状細胞の活性化を惹起するため、導入後のサイトカインなどでの活性化処理の工程が省略可能で、細胞のviabilityの維持やコスト削減、さらなるex vivoでの操作時間の削減に寄与するものと考えられる。また、RNAウイルスベクターで遺伝子導入された樹状細胞を用いて、T細胞移入療法に必要な活性化T細胞、特に腫瘍特異的細胞傷害性T細胞などをex vivoで効率良く、短期間、簡単に誘導できる（WO2005/042737；WO2006/001122）。【００５１】
DCは、適宜薬学的に許容される担体と組み合わせて組成物とすることができる。担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培養液、血清など、生細胞を懸濁することができる所望の溶液が挙げられる。また組成物は、樹状細胞に提示させる抗原ペプチドが含まれていてもよい。また、DCをワクチンとして使用する場合、ワクチン組成物には、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またワクチンには、ミョウバン、不完全Freund'sアジュバント、MF59 (オイルエマルジョン)、MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、および QS-21 (soapbark tree Quilaja saponaria 由来）などのアジュバントを組み合わせることもできる。【００５２】
抗原は、抗原とする細胞ライセートとの混合、ぺプチドパルス、またはベクターにコードさせた抗原遺伝子をDCに導入することによりDCに提示させることができる。抗原としては、感染微生物、ウイルス、寄生虫、病原体、および癌などに関連する所望の抗原が挙げられる。これらは、構造タンパク質または非構造タンパク質であってよい。このような抗原（またはそのプロセスされたペプチド）は、樹状細胞表面のMHC分子に結合して細胞表面に提示され、免疫応答が誘導される。【００５３】
ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対して適用することができる。感染症の治療としては、例えば感染性微生物の抗原蛋白のエピトープを解析し、これを樹状細胞で発現または提示させることができる。
例えば病原体由来の抗原としては、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、乳頭腫ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘−帯状疱疹ウイルス（VZV）、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、HIV、およびマラリアなどが有する蛋白質またはその部分ペプチドが挙げられる（G.L. Mandell et al. (Ed.) Hinman et al., Principles and Practice of Infectious Diseases，3rd Ed., Churchill Livingstone Inc., NY, pp. 2320-2333）。これらの抗原を提示するDCを、感染症に対して予防的および治療的に用いることができる。具体的には、例えばインフルエンザにおいては、強毒株H5N1型等のエンベロープ、日本脳炎においては、例えば日本脳炎ウイルスのエンベロープ蛋白質（Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882 (1999)）、エイズにおいては、例えばHIV gagまたは SIV gag 蛋白質（J. Immunology (2000) vol. 164, 4968-4978）、HIVエンベロープ蛋白質、Nef蛋白質、その他のウイルス蛋白質などが挙げられる。コレラにおいては、例えばコレラ毒素のBサブユニット（CTB）（Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292-7）、狂犬病においては、例えば狂犬病ウイルスの糖タンパク（Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8):949-52）、子宮頚癌においては、ヒトパピローマウイルス6型のカプシドタンパクL1（J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)）などが挙げられる。また、日本脳炎のJE-E抗原タンパク質（特開昭64-74982、特開平1-285498）、ヒト単純ヘルペスウイルスの gD2タンパク質（特開平5-252965）、Ｃ型肝炎ウイルス由来ポリペプチド（特開平5-192160）、仮性狂犬病ウイルス由来ポリペプチド（特表平7-502173）などを用いることもできる。例えば、これらの病原性微生物に感染した患者由来の細胞を解析して、抗原提示細胞（APC）において提示された抗原蛋白のエピトープを同定し、これを用いてもよい。HLA型を適宜選択することにより、所望のHLA型に対するエピトープを同定して用いることも好ましい。【００５４】
腫瘍に対する免疫応答を特異的に促進させるには、１以上の腫瘍抗原を樹状細胞に提示させる。腫瘍関連抗原は、例えば腫瘍細胞の粗抽出液を調製したり、または抗原を部分的に精製することにより得ることができる（Cohen et al., Cancer Res. 54: 1055 (1994); Cohen et al., Eur. J. Immunol. 24: 315 (1994); Itoh et al., J. Immunol. 153: 1202 (1994)）。得られた腫瘍抗原はさらに精製してもよく、また、組み換えペプチドとして合成または発現させてもよい。【００５５】
精製した樹状細胞に抗原をパルス（暴露）しDCに抗原を取り込ませると、抗原はDCにより処理され、細胞表面に提示される（Germain, R.N., Cell 76: 287 (1994)）。樹状細胞を抗原でパルスする多数の方法が知られており、当業者であれば、提示させる抗原に応じて適用な方法を選択することは日常行われている。本発明は、本発明の方法により製造したDCに抗原を提示させたものを含む組成物およびその免疫治療への使用を提供する。本発明の組成物は、免疫応答を刺激するために、インジェクション、連続点滴、インプラントからの持続的放出、もしくは他の適当な技術によって投与され得る。典型的には、生理学的に受容可能な担体、賦形剤もしくは希釈剤とともに、樹状細胞を含む組成物を投与する。担体としては、使用される薬量および濃度において投与個体に有意な毒性が無いものであり、例えば生理食塩水が挙げられる。【００５６】
腫瘍抗原は腫瘍細胞に特異的なもの（すなわち、腫瘍細胞に存在するが、非腫瘍細胞には存在しないもの）であっても、同じタイプの非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に高レベルで存在するものであってもよい。この樹状細胞を投与することにより免疫系が刺激される。CTLが主なエフェクターとして働く場合は、抗原としては細胞内外に発現する所望の腫瘍抗原を用いることができる。樹状細胞を用いて、CD4 T細胞の活性化から引き続くB細胞の活性化による抗体産生を惹起し、抗体をエフェクターとして作用させる場合には、抗原としては細胞表面に表出するものが好ましく、例えば、細胞表面受容体または細胞接着蛋白質を用いることができる。腫瘍抗原の例としては、卵巣癌等にするMuc-1 または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、子宮頸癌を引き起こすヒト乳頭腫ウイルス蛋白質E6およびE7、メラノーマ抗原MART-1、MAGE-1、-2、-3、gp100およびチロシナーゼ、前立腺癌抗原PSA、その他にも、CEA（Kim, C. et al., Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 90-96）、およびHer2neu（HER2p63-71、p780-788; Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3338-3346）などが挙げられる。【００５７】
本発明によって調製される樹状細胞は、癌および感染症に対する有効な免疫療法において有用であり、腫瘍抗原もしくは感染症関連抗原の遺伝子が導入された樹状細胞またはその樹状細胞で刺激されたT細胞による免疫感作は、患者において抗腫瘍または抗感染症免疫を誘導する有効な方法となる。本発明は、本発明の方法により得られた樹状細胞の免疫反応の誘導における使用にも関する。すなわち本発明は、本発明の方法により得られた樹状細胞の、免疫療法における使用、具体的には、例えば腫瘍または感染症の治療における使用に関する。また本発明は、本発明の方法により得られた樹状細胞の、免疫活性化剤の製造における使用に関する。すなわち本発明は、本発明の方法により得られた樹状細胞の、免疫治療剤の製造における使用、具体的には、例えば抗腫瘍剤（腫瘍増殖抑制剤）または感染症治療薬の製造における使用に関する。【００５８】
また、一般病への適用も考えられる。糖尿病においては、例えばI型糖尿病患者またはそのモデル動物において、インシュリン断片のペプチドをエピトープとして利用することが考えられる（Coon, B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104(2):189-94）。【００５９】
DC組成物には、可溶性サイトカイン受容体もしくはサイトカインまたは他の免疫制御分子をさらに含んでもよい（Schrader, J.W. Mol. Immunol. 28: 295 (1991)）。これらのサイトカインは、DC組成物とは別の組成物として調製し、DCと同時に、別々に、または逐次的に投与することもできる。また、樹状細胞からサイトカイン類を発現させれば、免疫系を刺激して、感染微生物または癌に対する免疫応答を高めることから、サイトカインをコードする遺伝子を導入した樹状細胞も、癌やその他のサイトカイン治療が有効と考えられる疾患の治療において有用である。免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を搭載するベクターが導入された樹状細胞は効果的な免疫誘導剤となる。例えば、免疫刺激性サイトカインとして、インターロイキン（例えば、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-27）、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ）、腫瘍壊死因子（TNF）、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、GM-CSF、IL-3とGM-CSFを含む融合蛋白質、インスリン様増殖因子 (IGF)-Ｉ、IGF-2、Flt-3リガンド、Fasリガンド、およびc-kitリガンド、CD40リガンド (CD40L)、ならびに他の免疫調節タンパク質（ケモカインおよびコスティミュラトリー分子など）が含まれる。これらは単独もしくは組み合わせて用いられ得る。【００６０】
これらのサイトカインのアミノ酸配列は当業者には周知であり、IL-4については、例えば、Araiら (1989)、J. Immunol. 142(1) 274-282、IL-6については、例えば、Yasukawaら (1987)、EMBO J.、6(10): 2939-2945、IL-12は、例えば、Wolfら (1991)、J. Immunol. 146(9): 3074-3081、IFN-αは、例えば、Grenら (1984) J. Interferon Res. 4(4): 609-617、およびWeismannら (1982) Princess Takamatsu Symp. 12: 1-22、TNFは、例えば、Pennicaら (1984) Nature 312: 724-729、G-CSFは、例えば、Hiranoら (1986) Nature 324:73-76、GM-CSFは、例えば、Cantrellら (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254 を参照することができる。より具体的には、GM-CSFをコードする核酸配列としては Accession number NM_000758の84〜461番目の配列（アミノ酸配列はNP_000749の18〜144番目）を含む配列が挙げられる。IL-4をコードする核酸配列としては、Accession number NM_000589の443〜829番目の配列（アミノ酸配列はNP_000580の25〜153番目）を含む配列が挙げられる。これらのサイトカインをコードする天然の遺伝子または遺伝子暗号の縮重を利用して、機能的サイトカインをなおコードする変異遺伝子を含むベクターを設計し、樹状細胞に導入することができる。【００６１】
また、これらのサイトカインの改変体を発現するように遺伝子改変してもよい。例えば、前駆体および成熟体の２つの形態を持つサイトカイン（例えば、シグナルペプチドの切断により活性フラグメントを生成するもの、または蛋白質の限定分解により活性フラグメントを生成するものなど）について、前駆体または成熟体のいずれかを発現するように遺伝子改変してもよい。その他の改変体（例えば、サイトカインの活性フラグメントと異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との間の融合タンパク質）を用いてもよい。【００６２】
樹状細胞は、患者自身のT細胞をin vivoで刺激するのに有用であり、あるいは樹状細胞はT細胞をin vitroで刺激するのにも有用である。感作したT細胞を患者に投与し、エクスビボ免疫療法を介して患者の免疫系を刺激することもできる。例えば、抗原を提示させた成熟樹状細胞をT細胞に接触させることで、樹状細胞により刺激されたT細胞を作り出すことができる。樹状細胞で提示させる抗原は、ベクターから発現させた蛋白質（またはそのプロセスされた産物）であってもよいし、外から樹状細胞にパルスしてもよい。活性化されたT細胞によりCTLが誘導される。【００６３】
また本発明は、本発明の方法により製造した樹状細胞を用いて、免疫系を刺激する方法に関する。例えば感染症または癌などに罹患した患者において免疫系を刺激する治療を行うことができる。この方法は、樹状細胞またはT細胞を投与する工程を含む方法である。この方法は、具体的には本発明により製造されたDCまたは該DCにより刺激されたT細胞の治療上有効量を患者に投与する工程を含む方法である。樹状細胞に、抗原ペプチドをパルスして、所望の抗原を提示させることで、所望の抗原に対する免疫を誘導することができる。インビトロでT細胞と樹状細胞を接触させる場合、患者からT細胞を採取して、エクスビボ投与を行うことが好ましい。【００６４】
DCまたはT細胞を含む組成物の個体への投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができ、例えば罹患部位に投与されることが好ましい。一般的には、筋肉内、腹腔内、皮下もしくは静脈内注射、あるいは、リンパ節への直接注入によって注入することができる。好ましくは皮下、腹腔内注射またはリンパ節への直接注入により、患者に投与する。樹状細胞は、一般的には105〜109細胞、好ましくは106〜108細胞、より好ましくは約107細胞を患者に投与することができる。投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能である。投与対象としては特に制限はないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物）、およびその他の脊椎動物が挙げられる。【００６５】
樹状細胞は、抗腫瘍剤として有用である。例えば腫瘍抗原を提示させた樹状細胞を腫瘍部位に投与することによって、腫瘍の増殖を抑制することができる。腫瘍部位とは、腫瘍またはその周囲（例えば腫瘍から5 mm以内、好ましくは3 mm以内）の領域を言う。樹状細胞を腫瘍に投与する前に、樹状細胞に腫瘍抗原を接触させるとより高い効果を得ることができる。樹状細胞への腫瘍抗原の接触は、樹状細胞と腫瘍細胞のcell lysate (細胞溶解物) とを混合する方法、腫瘍抗原ペプチドを樹状細胞にパルスする方法、あるいは樹状細胞に腫瘍抗原遺伝子を導入して発現させる方法などを用いることができる。また、IFN-βまたはIFN-β遺伝子を搭載するベクターでDCを処理したり、あるいは腫瘍に直接注入することにより抗腫瘍効果が増大されることが期待できる。例えばIFN-β遺伝子を搭載するRNAウイルスベクター（例えばマイナス鎖RNAウイルスベクター）は、抗腫瘍剤として優れている。RNAウイルスベクターを導入した樹状細胞の投与と、IFN-β遺伝子を搭載するベクターの腫瘍部位への注入を組み合わせれば、より高い抗腫瘍効果が発揮される。【００６６】
樹状細胞により活性化したT細胞を投与する場合は、例えばT細胞は、1 m2の体表面積あたり約105〜109細胞、好ましくは106〜109細胞、より好ましくは108〜109細胞の用量で、静脈内注入によって投与され得る（Ridellら、1992、Science 257: 238-241 を参照）。注入は、所望の間隔（例えば、毎月）で繰り返され得る。投与後のレシピエントは、必要に応じて任意の副作用について、T細胞注入の間または注入後にモニターされてよい。このとき、T細胞は樹状細胞を得た患者と同じ患者から得ることが好ましい。あるいは、T細胞を患者から採取し、T細胞を刺激するために用いる樹状細胞は、HLA適合性の健常なドナーに由来してもよい。または逆に、樹状細胞を患者から採取し、T細胞はHLA適合性の健常なドナーに由来してもよい。【００６７】
本発明により製造されるワクチンの有効成分である樹状細胞を含む細胞は、ヒト体内に治療用のワクチンとして接種することから、安全性を高めるために細胞増殖性を無くしておくこともできる。例えば、臍帯血由来の単球は分化誘導することにより増殖能が極度に低下することが知られているが、細胞ワクチンとしてより安全に利用するため、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンC（MMC）処理などで処理し、ワクチンとしての機能を残したまま、増殖性をなくすことができる。例えば、X線照射を利用する場合、総放射線量1000〜3300 Radで照射することができる。マイトマイシンC処理法は、例えば、樹状細胞に25〜50μg/mlのマイトマイシン Cを添加し、37℃、30〜60分間保温処理することができる。熱による細胞処理方法は、例えば、50〜65℃で20分間加熱処理を行うことができる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。【００６９】
以下、実施例1、2、4、5、及びそれら実施例に係る図面において、FS36投与群、GMSCF投与群、および GMIL-4投与群とは、以下の組成とする。
FS36投与群：Flt-3リガンド（20ng/ml）、幹細胞因子（Stem cell factor；SCF）（10ng/ml)、IL-3（10ng/ml）、IL-6（10ng/ml） (FS36と略記) を含む10%FBS添加RPMI1640
GMIL-4投与群：GM-CSF（20ng/ml）、IL-4（20ng/ml）を含む10%FBS添加RPMI1640
GMSCF投与群：GM-CSF（20ng/ml）、SCF（10ng/ml)を含む10%FBS添加RPMI1640【００７０】
以下、実施例3、6、7及びそれら実施例に係る図面において、GMIL-4投与群（１）、GMIL-4投与群（２）、GMSCF投与群、0.1 GMSCF投与群、及び0.01 GMSCF投与群とは、以下の組成とする。
GMIL-4投与群（１）：組換えヒトGM-CSF（25 ng/ml）（Wako, Japan）、組換えヒトIL-4（50 ng/ml）（Wako,Japan）を含む10%FBS添加IMDM
GMIL-4投与群（２）：組換えヒトGM-CSF（100 ng/ml）（Wako, Japan）、組換えヒトIL-4（50 ng/ml）（Wako,Japan）を含む10%FBS添加IMDM
GMSCF投与群：組換えヒトGM-CSF（100 ng/ml）（Wako, Japan）、組換えヒトSCF（50 ng/ml）（Wako, Japan）を含む10%FBS添加IMDM
0.1 GMSCF投与群：組換えヒトGM-CSF（10 ng/ml）（Wako, Japan）、組換えヒトSCF（5 ng/ml）（Wako, Japan）を含む10%FBS添加IMDM
0.01 GMSCF投与群：組換えヒトGM-CSF（1 ng/ml）（Wako, Japan）、組換えヒトSCF（0.5 ng/ml）（Wako, Japan）を含む10%FBS添加IMDM【００７１】
以下、実施例6及びそれら実施例に係る図面において、（１）iDC処理、（２）SeV/dF処理、（３）LPS処理とは以下の処理とする。
（１）iDC処理：下記濃度の培地で２日間インキュベーションすることである。
10%FBS添加IMDM
（２）SeV/dF処理：下記濃度の培地で２日間インキュベーションすることである。
F遺伝子が欠失しているセンダイウイルス (moi=50) を含む10%FBS添加IMDM
（３）LPS処理：下記濃度の培地で２日間インキュベーションすることである。
LPS(1μg/ml) を含む10%FBS添加IMDM
尚本実験では以下のLPSを用いた。
SIGMA カタログNo. L7895-1MG（由来生物=Salmonella typhosa）
（４）Poly(I:C)処理：下記濃度の培地で２日間インキュベーションすることである。
Poly(I:C) (100μg/ml) を含む10%FBS添加IMDM
（５）CpG処理：下記濃度の培地で２日間インキュベーションすることである。
CpG (10μg/ml) を含む10%FBS添加IMDM
（６）R-848処理：下記濃度の培地で２日間インキュベーションすることである。
R-848 (1μg/ml) を含む10%FBS添加IMDM
（７）OK432処理：下記濃度の培地で２日間インキュベーションすることである。
OK432（0.5KE/ml）（中外製薬  日本標準商品分類番号874299）を含む10%FBS添加IMDM【００７２】
〔実施例１〕サイトカインによる樹状細胞（DC）前駆細胞の増幅及び分化の確認
先ず、マウス (C3H) の大腿骨・脛骨の骨髄からネガティブセレクションによって、造血前駆細胞を採取した (SpinSep mouse hematopoietic progenitor enrichment kit, StemCell technologies, Canada)。この前駆細胞を、FS36投与群、GMIL-4投与群、GMSCF投与群と3グループに分けて、培養した。培養は2.4×105 cellsから始め、3〜4日ごとに200万cells/ml 以下の濃度となるように継代を続け、6週間まで培養した。尚、その過程において、樹状細胞（DC）前駆細胞が調製される（図1）。その間、細胞数をカウントし、増殖速度を確認するとともに、抗CD11b-FITC、抗CD11c-PE、抗c-kit-PE、抗CD131-PEにて染色後、FACS解析を行い、上記前駆細胞の分化能を確認した（図3）。
FS36投与群においては、他の投与群に比べ、マウス造血前駆細胞は顕著に増幅され、FS36を用いた培養により21日間で約10,000 倍に増幅された（図1、図2）。尚、図2において（1）で示している写真は、グラフ中に(1)で示した時点に対応しており、マウス造血前駆細胞をGMIL-4投与群の条件で7日間培養して得られたＤＣの細胞形態を表した写真（顕微鏡で観察）であるが、実施例1、2、4、5、及びそれら実施例に係る図面で示す通常ＤＣ（normal DC）とは、この細胞、すなわちマウス造血前駆細胞をGMIL-4投与群の条件で7日間培養して得られたＤＣとする。尚通常ＤＣ（normal DC）においても、樹状突起が確認できる。更に、図2（3）は、図8で示しているFS36投与群の条件で四週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養して得られたＤＣの細胞形態を表した写真（顕微鏡で観察）を示しているが、樹状突起が確認できた。尚、図2においては、（3）で示している写真は、曲線（ii）に該当する過程を経て得られたものである。【００７３】
FS36投与群においては、マウス造血前駆細胞を培養することにより、その後GM-CSFおよびIL-4等で一週間培養により樹状細胞のマーカーであるCD11cの陽性になる細胞へ分化能を保つ前駆細胞を増幅できた。マウス造血前駆細胞は、FS36を用いた培養により21日間で約10,000 倍に増幅された（図1、図2）。これらの細胞をGM-CSFおよびIL-4、またはGM-CSFおよびSCFにより分化させて得られたDCにおけるCD11b+CD11c+細胞数は、採取直後から分化させた場合と比べると約470倍にもなった。【００７４】
この増幅は６週に渡ったが（図１）、分化能は４週の増幅後より徐々に落ちた。５週増幅させた後は、分化後のCD11c陽性細胞数は急速に減少した。従って、CD11c陽性細胞数を多く得られるのは、３週増幅後１週分化あるいは、４週増幅後１週分化させた時であることが判明した（図10）。【００７５】
また、図4から図9においては、FS36投与群、GMIL-4投与群、GMSCF投与群の条件による１週間のマウス造血前駆細胞の培養におけるDC前駆細胞の増殖曲線、および抗CD11b-FITC、抗CD11c-PEを用いた細胞の分化を確認した結果を示している。各図に、CD11b+/CD11c+ 率（％）を示した。培養方法は、FS36投与群の条件により増幅継代培養させたマウスの骨髄造血前駆細胞から、1週ごとに106前後の細胞を取り出し、GMIL-4投与群、あるいはGMSCF投与群の条件で7日間培養した。分化の確認を抗CD11b-FITC、抗CD11c-PEを用いFACS解析で行った後、CD11b+/CD11c+率により、細胞の分化効率を確認した。CD11b+/CD11c+ 率が一番高い条件は、図7に示しているFS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したものである。ここで、CD11b+/CD11c+ 率が一番高いということは、DC前駆細胞からDCへ分化した細胞の割合が高いということを指し示している。尚、図2（3）で、図7で示しているFS36投与群の条件で四週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養して得られたＤＣの細胞形態を表した写真（顕微鏡で観察）を示しているが、樹状突起が確認できた。【００７６】
〔実施例２〕DCの分化
マウス造血前駆細胞から得られたDCにF遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）をmoi50で感染、あるいはLPS (1μg/ml) 添加後、さらに2日間培養を行い、CD80-PerCP、CD86-PerCP、MHC classII-PerCP、CD40-PerCPを用いてDCの表面マーカーの発現をFlow cytometer により分析した（図11、図12）。その結果、センダイウイルスの感染またはLPSによって、通常DC（normal DC）と同様に（図11（Ｂ））、FS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したことにより製造したDCにおいては、co-stimuratory molecule であるCD80、CD86 の発現、MHC ClassIIの発現、接着分子（CD40）を発現していることが確認できた（図11（Ａ））。【００７７】
〔実施例３〕GM-CSFおよびSCFによるDCの増幅
ヒト臍帯血CD34+ 細胞 (Cambrex社より購入) をGMSCF投与群又はGMIL-4投与群（1）の条件で35日間培養し、増幅と分化を行った。培養期間中、培養3日〜7日ごとにc-kit、CD11c、CD86の発現をFlow cytometer により分析した。1×105個のヒト臍帯血CD34+細胞をGM-CSFおよびSCFを添加した培地中で培養することにより、CD11c+細胞が徐々に増殖し、35日後には3.8×109個得ることが出来た。また32日目にLPSを加え、その3日後にCD11c-PE、CD86-PEでFACSを行った。その結果、上記実施例２の結果と同様に、LPSによってCD86の発現が増強されることが確認された（図16）。このように、マウス、ヒト共に、CD11c+ 細胞をサイトカインカクテルにより増幅させることができる（図13、14、および 15）。【００７８】
〔実施例４〕増幅されたＤＣのサイトカイン産生量及び抗原取り込み能及びＴ細胞への増殖・活性化能の検討
FS36投与群の条件により培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、更に1週間培養して得られたDCについて、サイトカイン産生量（図17）及び抗原取り込み能（図18）及びＴ細胞への増殖・活性化能の検討（図19）を行った。
マウス骨髄由来造血前駆細胞をFS36投与群の条件で三週間培養し、その後培地をGMIL-4投与群の条件にし、一週間培養したことにより得られたDCは、通常DC（normal DC）（マウス造血前駆細胞をGMIL-4投与群の条件で7日間培養して得たもの）と同様に、IL-12 及びIFN-βの産生が確認され（図17）、抗原取り込み能（図18）及び T細胞の増殖・活性化能（図19）を有していることが示された。【００７９】
〔実施例５〕増幅DC投与によるマウス骨肉腫の肺転移抑制
<サンプルの調製>
マウス造血前駆細胞由来のＤＣ（1×105個）に腫瘍溶解液（3×105個腫瘍細胞が入っている）を加え、８時間インキュベーションした。その後、そのDCにF遺伝子欠失型センダイウイルス（SeV/dF）（moi50）を導入し、さらに2日間培養を行った。その培養後のＤＣをマウス（Ｃ3Ｈ、7週齢雌マウス）の尾静脈に投与した。投与２日後、ＬＭ8マウス骨肉腫細胞をマウスの尾静脈に投与した。ＬＭ8マウス骨肉腫細胞投与１７日後、マウスを開胸し、肺への転移結節数を肉眼でカウントした（図20）。【００８０】
<結果>
FS36投与群の条件により培養し、その後更にGMIL-4投与群またはGMSCF投与群の条件にして1週間培養して得られたDC（図20の (3) 及び (4) 参照）の投与において、通常ＤＣ（normal DC）（マウス造血前駆細胞をGMIL-4投与群の条件で7日間培養して得たもの）と同様に、肺への癌転移が抑制されたのが確認できた。FS36投与群の条件により培養し、その後培地をGMIL-4投与群またはGMSCF投与群の条件にし、更に1週間培養して得られたDCが、癌治療に有用であることが示唆された。【００８１】
〔実施例6〕GM-CSFおよびSCFによるヒト由来樹状細胞前駆細胞からのDCの増幅（その1）
<実験1>
ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞 (Lonza社より購入)及び ヒトG-CSF処置末梢血由来CD34+ 細胞 (Lonza社より購入)を、GM-CSFおよびSCFを含む培地で、35日間培養し、増幅と分化を行った。【００８２】
<実験1の結果>
図21(A)、 (B)に示した結果より臍帯血由来CD34+ 細胞の培養及び ヒトG-CSF処置後末梢血由来CD34+ 細胞の培養によっても、GM-CSFおよびSCFを添加した培地中で培養することにより、大量に細胞を得ることができた（図21、図22）。またその細胞は、CD11ｃ陽性（＋）細胞の割合が高い（図21（C）、(D)、図22（B））。
また図記載のGMSCF投与群において、培養35日時点での細胞に上記LPS処理をしたものについては、樹状突起が確認できた（図23）。【００８３】
<実験2>
実験1で示しているヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養14日と培養35日の時点の細胞のうちCD11ｃ陽性（＋）細胞についてのCD11b、CD33、HLA-ABCの発現をFlow cytometer により分析した（図24）。成熟した樹状細胞であれば、CD11c陽性（＋）でかつCD11b陽性（＋）、CD11c陽性（＋）でかつCD33陽性（＋）、及びCD11c陽性（＋）でかつHLA-ABC陽性（＋）という傾向が示される。
また、ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養35日の時点の細胞について、LPS処理又はSeV/dF処理した場合における、ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80、及びCCR7の発現をFlow cytometer により分析した（図25）。成熟した樹状細胞であれば、LPS処理又はSeV/dF処理した場合において、処理していない場合（iDC処理）と比べ、ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80、及びCCR7の発現が亢進する傾向が示される（Nauta AJ., et al. Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells. J Immunol  177(4), 2080-2087  (2006)）（Yoneyama, Y., et al. Development of immunostimulatory virotherapy using non-transmissible Sendai virus-activated dendritic cells. Biochem Biophys Res Commun 355, 129-135 (2007)）。【００８４】
<実験2の結果>
図24で示している結果から（図面中の矢印を参照）、CD11c陽性（＋）でかつCD11b陽性（＋）、CD11c陽性（＋）でかつCD33陽性（＋）、及びCD11c陽性（＋）でかつHLA-ABC陽性（＋）という傾向が示された。
また、図25で示している結果から、LPS処理又はSeV/dF処理した場合において、処理していない場合（iDC処理）と比べ、ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80、及びCCR7の発現が亢進する傾向が示された。
よって、図24及び図25に示された結果から、GM-CSF及びSCFを含む培地で培養し増幅された細胞は、表面マーカの発現の傾向から、樹状細胞である可能性が示唆される。【００８５】
<実験3>
ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養35日の時点の細胞について、ファゴサイトーシス（食作用）の能力を調べた（図26）。【００８６】
<実験3の結果>
細胞の食作用の能力が極めて低い4℃の条件と比べ、37℃の条件においては、細胞の食作用の能力が亢進していることが判明した（図26）。
そして、37℃の条件において、iDC処理と比べ、LPS処理をしたものにおいては、細胞の食作用の能力が低下していることが判明した。樹状細胞は成熟に伴い貪食能力が低下する事が知られていることから踏まえると（Yoneyama, Y., et al. Development of immunostimulatory virotherapy using non-transmissible Sendai virus-activated dendritic cells. Biochem Biophys Res Commun 355, 129-135 (2007)）、本実験で用いている細胞（GM-CSFおよびSCFを含む培地で培養し増幅させた細胞）は、樹状細胞である可能性が示唆される。【００８７】
<実験4>
ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞の培養期間中、培養35日の時点の細胞について、サイトカイン産生能を調べた。実験においては、ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー（ＢＤ）社のHuman Inflammation Kit（カタログ番号：551811）を用いた（図27）。【００８８】
<実験4の結果>
ＬＰＳなどの刺激により、IL-6、TNF-α、IL-1βの産生能が高まった。GM-CSFおよびSCFを含む培地で培養し増幅させた細胞は、サイトカインを産生する能力があると考えられる（図27）。【００８９】
<実験5>
リンパ球の増殖刺激能の検討を行った（図28）。ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞からGMSCF培地での培養を通して得たDCをマイトマイシンC（MMC）で処理し、CD3+ T細胞と以下の割合で混合した。
混合群1について
MMC処理したDC数：CD3+ T細胞数＝1：100
混合群2について
MMC処理したDC数：CD3+ T細胞数＝1：10
上記混合した細胞を5日間培養した。なお、混合群2については、T細胞の増殖を測定した。【００９０】
<実験5の結果>
混合群2において、混合群1に比べて、LPS等の刺激による効果が高いことが示された（図28）。また上記DCが、T細胞の増殖・活性化能（図28）を有していることが示された。【００９１】
よって、実験1から実験5の結果から、ヒト臍帯血由来CD34+ 細胞のGMSCF投与群の条件での培養を通して得た細胞が、成熟した樹状細胞であるということが確認できた。【００９２】
以上の結果は、得られた細胞が、刺激により典型的な樹状突起を形成すること、MHC Class II分子、接着分子、co-stimulatory分子を発現すること、炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α、IL-1βを含む）を発現すること、エンドサイトーシス活性を持ち、allostimulatory活性を持つことを示している。すなわち実験2から5の結果より、実験1で示されているGMSCF投与群の条件で培養した細胞は、生物活性のある樹状細胞であると考えられる。よって、GM-CSFおよびSCFを含む培地で、樹状細胞前駆細胞から樹状細胞を製造できるということが明らかとなった。【００９３】
〔実施例7〕GM-CSFおよびSCFによるヒト由来細胞からのDCの増幅（その2）【００９４】
図29では、GM-CSF/SCFの濃度によるDC増殖の影響を示している。GM-CSF (100 ng/ml) および SCF (50 ng/ml) の濃度を1/10に低下させても（10 ng/ml GM-CSF, 5 ng/ml SCF）、細胞数は若干低下するものの高い増殖性は維持された。GM-CSF (100 ng/ml) および SCF (50 ng/ml) の濃度を1/100に低下させた場合（1 ng/ml GM-CSF, 0.5 ng/ml SCF）でも、DCを増幅できる。そして、35日間培養時点におけるCD11ｃ陽性細胞率について図30で示している。いずれの投与群も、CD11ｃ陽性細胞率が高い。
図29及び図30に示しているデータより、効率よくDCを増幅させるためには、GM-CSF を1 ng/mlより高い濃度で、およびSCFを 0.5 ng/ml より高い濃度で用いることが好ましい。また、0.01GMSCF投与群の条件で培養しても、DCを増幅できることから、少ないサイトカイン量で効率よくDCを増幅することができることが示唆され、本発明の方法が、製造コストが抑えられるDC製造方法となることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明により、樹状細胞を大量に製造することが可能となった。製造されたDCは、癌抗原を提示させて抗腫瘍DCワクチンとして利用することができる。本発明の方法を用いれば、患者から得られるDC前駆細胞が少なくても大量のDCを効率よく製造することが可能となった。この製造方法により得られたＤＣは、高い抗腫瘍効果があり、癌および感染症などの免疫治療に有用なDCワクチンとして有用である。本発明は、癌に対する免疫療法に大きく貢献することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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