【手続補正書】
【提出日】平成17年1月17日(2005.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  約５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定である合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項２】  ５０℃の水溶液中で５時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項３】  約６０℃の水溶液中で５時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４】  約５０℃の水溶液中で１０時間後にその活性を保持する請求項２に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項５】  約６０℃の水溶液中で１０時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項３に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項６】  約６０℃の水溶液中で２４時間後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項５に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項７】  ６５℃の水溶液中で６時間後にその活性の少なくとも９４％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項８】  ６５℃の水溶液中で２日後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項７に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項９】  ２２℃の水溶液中で３ヶ月後にその活性の少なくとも５０％を保持する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１０】  ２２℃の水溶液中で６週間後にその活性の少なくとも９５％を保持する請求項９に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１１】  図１９に示される甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位に少なくとも一つの変異を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１２】  図１９に示される甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列の共通部位に一つの変異を有する請求項１１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１３】  各変異が元のアミノ酸を共通アミノ酸に変化させる請求項１１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１４】  図２７、図２８、図２９、図３０、図３１、図３６、図３７、図３８、図３９、図４１、図４３および図４６からなる群から選択される図に示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１５】  図２７、図３６、図４３および図４６からなる群から選択される図に示されるアミノ酸配列を有する請求項１４に記載の合成甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１６】  請求項１〜１５いずれか一項に記載の甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】  ＤＮＡである請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】  約５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定である甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、図２２、図２３、図２４、図２５、図２６、図３２、図３３、図３４、図３５、図４０、図４２および図４７からなる群から選択される図に示される配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１９】  請求項１６ないし１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】  請求項１６ないし１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現するように形質転換された宿主。
【請求項２１】  大腸菌である請求項２０に記載の宿主。
【請求項２２】  請求項１〜１５、４６および４７のいずれか一項に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２３】  ＡＴＰを検出するための請求項２２に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２４】  分子を標識するための請求項２２に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２５】  遺伝子レポーターとしての請求項２２に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２６】  固体表面へ固定化するための請求項２２に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２７】  ハイブリッドタンパク質を作るための請求項１６ないし１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２８】  高温反応のための請求項２２に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項２９】  発光溶液を作るための請求項２２に記載の合成ルシフェラーゼの使用。
【請求項３０】  請求項１〜１５、４６および４７のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを含むハイブリッドタンパク質。
【請求項３１】  下記の工程：
（ａ）甲虫ルシフェラーゼをコードする出発ポリヌクレオチド配列を変異させて、それぞれが異なる第二の甲虫ルシフェラーゼをコードする第二のポリヌクレオチド配列の少なくとも一つのライブラリーを作り；
（ｂ）各選択された第二のポリヌクレオチドが好ましい範囲で一つ以上の所望の特性を有する第二のルシフェラーゼをコードするように一つ以上の第二のポリヌクレオチドを選択し；そして
（ｃ）最終ルシフェラーゼが約５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持するように熱安定であるように最終ルシフェラーゼが作られるまで、（ａ）での出発ポリヌクレオチドとして第二の選択されたヌクレオチドのそれぞれを各回利用して（ａ）と（ｂ）を繰り返す
ことからなる、熱安定変異体ルシフェラーゼの製造方法。
【請求項３２】  特性が、熱安定性、および発光強度、シグナル安定性および基質の利用を含む群から選ばれる少なくとも二つの別の特性を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】  （ａ）がさらに組換え変異誘発と点変異誘発の利用からなる請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】  （ｂ）が自動化多パラメータースクリーニング法により実施される請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】  出発ポリヌクレオチド配列が図４４に示される配列である請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】  請求項１ないし１５、４６および４７のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼが得られるように請求項２０に記載の宿主を培養することを含む、合成ルシフェラーゼの製造方法。
【請求項３７】  サンプルを請求項１ないし１５、４６および４７のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼと接触させ、サンプル中のルシフェラーゼの存在またはその量を検出することにより、サンプル中のＡＴＰの存在またはその量を検出することを含む、ＡＴＰの検出方法。
【請求項３８】  対象となる分子を請求項１ないし１５、４６および４７のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼまたはその基質に結合させ、合成ルシフェラーゼまたは基質を含む分子を得ることを含む、分子の標識方法。
【請求項３９】  分子が核酸分子またはタンパク質である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】  請求項１９に記載のベクターによりコードされるルシフェラーゼのサンプル中における存在またはその量を検出することを含む、ルシフェラーゼの検出方法。
【請求項４１】  サンプルが細胞または細胞ライセートを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】  固体表面上に請求項１ないし１５、４６および４７のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを固定することを含む、ルシフェラーゼの固定方法
【請求項４３】  請求項１６ないし１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドおよび合成ルシフェラーゼ以外のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを発現させ、合成ルシフェラーゼおよび合成ルシフェラーゼ以外のタンパク質を含むハイブリッドタンパク質を合成することを含む、ハイブリッドタンパク質の合成方法。
【請求項４４】  請求項１ないし１５、４６および４７のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを、４０℃を超える温度においてルミネッセンス反応用試薬と接触させることを含む、高温においてルミネッセンスを検出する方法。
【請求項４５】  請求項１ないし１５、４６および４７のいずれかに記載の合成ルシフェラーゼを１以上の他の試薬と組合わせることを含む、ルミネッセンス用溶液の製造方法。
【請求項４６】  ポリヌクレオチドによりコードされる合成熱安定性甲虫ルシフェラーゼであって、約５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持し、該ポリヌクレオチドが図２２、２３、２４、２５、２６、３２、３３、３４、３５、４０、４２および４７から成る群より選択される図に示される配列を含む、前記合成熱安定性甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項４７】  合成熱安定性甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞から得られる該熱安定性甲虫ルシフェラーゼであり、約５０℃の水溶液中で２時間後にその活性の少なくとも５０％を保持し、該ポリヌクレオチドが図２２、２３、２４、２５、２６、３２、３３、３４、３５、４０、４２および４７から成る群より選択される図に示される配列を含む、前記合成熱安定性甲虫ルシフェラーゼ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３３】
2001516585.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３４】
2001516585.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３５】
2001516585.tif 000003
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３６】
2001516585.tif 000004
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３７】
2001516585.tif 000005
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４２】
2001516585.tif 000006
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３】
2001516585.tif 000007
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４４】
2001516585.tif 000008
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４５】
2001516585.tif 000009
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４７】
2001516585.tif 000010
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４９】
2001516585.tif 000011
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５２】
2001516585.tif 000012