(57)【要約】本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）またはその改変体を含有してなるＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）活性化剤、ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを組み合わせてなるＡＲＥ活性化剤などに関する。これらＡＲＥ活性化剤は、安全で優れた細胞死抑制剤、例えば循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌、糖尿病の予防・治療剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ遊走阻止因子またはその改変体を含有してなるＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ活性化剤。
【請求項２】
マクロファージ遊走阻止因子が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である請求項１記載の剤。
【請求項３】
マクロファージ遊走阻止因子の改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ端側、３２番目付近、６４番目付近、９５番目付近および９７番目付近から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が欠失、付加または（および）置換された改変体である請求項１記載の剤。
【請求項４】
Ｎ端側が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１〜５番目のアミノ酸配列である請求項３記載の剤。
【請求項５】
マクロファージ遊走阻止因子またはその改変体と、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質とを組み合わせてなるＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ活性化剤。
【請求項６】
物質が、マクロファージ遊走阻止因子を活性化する能力を有する物質である請求項５記載の剤。
【請求項７】
物質が、１，３−ベンゾチアジノン誘導体である請求項５記載の剤。
【請求項８】
１，３−ベンゾチアジノン誘導体が、式
2008035823.tif 000017
〔式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン化されていてもよいアルキル、置換基を有していてもよいアルコキシ、アシルまたは置換基を有していてもよいアミノを、
Ｒ２は置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノ、
ｎは１または２を示す〕で表される化合物またはその塩である請求項７記載の剤。
【請求項９】
マクロファージ遊走阻止因子の改変体を含有してなる細胞死抑制剤。
【請求項１０】
マクロファージ遊走阻止因子が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質である請求項９記載の剤。
【請求項１１】
マクロファージ遊走阻止因子の改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ端側、３２番目付近、６４番目付近、９５番目付近および９７番目付近から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が欠失、付加または（および）置換された改変体である請求項９記載の剤。
【請求項１２】
Ｎ端側が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１〜５番目のアミノ酸配列である請求項１１記載の剤。
【請求項１３】
マクロファージ遊走阻止因子またはその改変体と、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質とを組み合わせてなる細胞死抑制剤。
【請求項１４】
物質が、マクロファージ遊走阻止因子を活性化する能力を有する物質である請求項１３記載の剤。
【請求項１５】
物質が、１，３−ベンゾチアジノン誘導体である請求項１３記載の剤。
【請求項１６】
１，３−ベンゾチアジノン誘導体が、式
2008035823.tif 000018
〔式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン化されていてもよいアルキル、置換基を有していてもよいアルコキシ、アシルまたは置換基を有していてもよいアミノを、
Ｒ２は置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノ、
ｎは１または２を示す〕で表される化合物またはその塩である請求項１５記載の剤。
【請求項１７】
循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病の予防・治療剤である請求項１〜１６のいずれかに記載の剤。
【請求項１８】
マクロファージ遊走阻止因子を改変することを特徴とするＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔの活性化方法。
【請求項１９】
マクロファージ遊走阻止因子を改変することを特徴とする細胞死抑制方法。
【請求項２０】
マクロファージ遊走阻止因子を改変することを特徴とする循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病の予防・治療方法。
【請求項２１】
マクロファージ遊走阻止因子またはその改変体と、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質とを組み合わせることを特徴とする循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病の予防・治療方法。
【請求項２２】
Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ活性化剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体の使用。
【請求項２３】
Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ活性化剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体と、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質とを組み合わせた使用。
【請求項２４】
細胞死抑制剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子の改変体の使用。
【請求項２５】
細胞死抑制剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体およびマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用。
【請求項２６】
循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病を予防・治療する医薬を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体の使用。
【請求項２７】
循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病を予防・治療する医薬を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体およびマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞死抑制剤、Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）活性化剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、免疫担当細胞や脳下垂体などから生体侵襲などの刺激に即応して産生され、炎症性サイトカインカスケードの上流に位置して炎症反応を制御する種々の炎症性疾患の増悪因子であると考えられている（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、２４頁、１９９８年；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６６巻、１９７頁、１９９７年）。
リウマチ患者の滑膜液や血清中のＭＩＦ濃度、急性呼吸促迫症候群患者の肺胞洗浄液中のＭＩＦ濃度、腎臓移植を受けた患者の拒絶反応時における尿中のＭＩＦ濃度、急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病およびアトピー性皮膚炎の患者の血清中のＭＩＦ濃度は、健常人と比べて顕著に上昇している。
各種動物病態モデルにおいて、ＭＩＦに対する抗体投与およびＭＩＦの欠失は、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、エンドドキシンショックなどの症状の改善効果を示すことが報告されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、１７頁、１９９８年）。
近年、ＭＩＦが酸化ストレスで誘発した細胞死を抑制すること（非特許文献１  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０巻，１３７５−１３８２頁，１９９９年、非特許文献２  ＰＮＡＳ  ９９巻，３４５−３５０頁，２００１年）、ＧＳＴの発現を誘導すること（非特許文献３  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．５２巻，４３８−４４５頁，２００１年）が報告されている。ＷＯ  ０３／２０７１９号公報（特許文献１）には、細胞死抑制作用およびＭＩＦに結合する能力を有する１，３−ベンゾチアジノン誘導体が、ＷＯ  ０３／９０７８２号公報（特許文献２）には、ＭＩＦに結合する物質（例、１，３−ベンゾチアジノン誘導体等）が細胞死抑制作用、ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）制御下にある遺伝子の発現やタンパク質産生を増強することが報告されている。
立体構造解析より、ＭＩＦの１位Ｐｒｏは、３２位Ｌｙｓ、６４位Ｉｌｅ、９５位Ｔｙｒ、９７位Ａｓｎと疎水性ポケットを形成し、種々の化合物と結合することが報告されている（非特許文献４  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，７巻，１５３−１６４頁，２００３年）。
一方、近年、酸化ストレスによる細胞死が、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、心不全、脳卒中、脳梗塞、虚血性急性腎不全など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチなど）、消化器疾患（例、炎症性腸疾患、急性膵炎など）、肝疾患（例、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎など）、糖尿病、エイズなど種々の疾患の発症または進展に深く関わっていることが明らかとなってきている（別冊・医学のあゆみ、７９頁、２００５年；別冊・医学のあゆみ、８頁、１９９７年；日本臨床、第５４巻、１９９６年）。Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）は、酸化ストレスに対する多様な防御因子の発現を調節しており、その転写活性化は酸化ストレスに対する最も重要な細胞の防御機構の一つと考えられている（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  第１０巻、８７９頁、２００４年）。また、リウマチの治療に用いられる金製剤やＮＳＡＩＤの薬効にはＡＲＥで制御される防御因子の発現亢進が関与する可能性が指摘されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第２７６巻、３４０７４頁、２００１年；Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  第３７巻、６５０頁、２００２年）。
【発明の開示】
【０００３】
上記より、ＡＲＥ活性化は、酸化ストレスが関与する疾患の抑制につながることが予想され、ＡＲＥ活性化を主作用とする安全で強力な細胞死抑制剤の開発が切望されている。
以上のような状況に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ａ）ＭＩＦと特異的に結合する１，３−ベンゾチアジノン誘導体がＭＩＦのＮ末端付近に結合すること、ｂ）ＭＩＦが、ＭＩＦと結合する該誘導体の存在下で、ＡＲＥを活性化すること、ｃ）ＭＩＦが、ＡＲＥを活性化することなどを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
〔１〕ＭＩＦまたはその改変体を含有してなるＡＲＥ活性化剤（または組成物）、
〔２〕ＭＩＦが、配列番号：１または配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記〔１〕記載の剤、
〔２ａ〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記〔１〕記載の剤、
〔２ｂ〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩であって、ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用を有するものである上記〔１〕記載の剤、
〔２ｃ〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個（例えば、１〜６個）のアミノ酸が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩であって、ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用を有するものである上記〔１〕記載の剤、
〔３〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ端側、３２番目付近（例えば、２２〜４２番目、より好ましくは２７〜３７番目、さらに好ましくは３０〜３４番目）、６４番目付近（例えば、５４〜７４番目、より好ましくは５９〜６９番目、さらに好ましくは６２〜６６番目）、９５番目付近（例えば、８５〜９６番目、より好ましくは９０〜９６番目、さらに好ましくは９３〜９６番目）および９７番目付近（例えば、９７〜１０７番目、より好ましくは９７〜１０２番目、さらに好ましくは９７〜９９番目）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が欠失、付加または（および）置換された改変体である上記〔１〕記載の剤、
〔４〕Ｎ端側が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１〜５番目のアミノ酸配列である上記〔３〕記載の剤、
〔５〕ＭＩＦまたはその改変体と、ＭＩＦに結合する能力を有する物質とを組み合わせてなるＡＲＥ活性化剤、
〔５ａ〕物質が、抗ＭＩＦ抗体である、上記〔５〕記載の剤、
〔６〕物質が、ＭＩＦを活性化する能力を有する物質である上記〔５〕記載の剤、
〔７〕物質が、１，３−ベンゾチアジノン誘導体である上記〔５〕記載の剤、
〔８〕１，３−ベンゾチアジノン誘導体が、式
2008035823.tif 000002
〔式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン化されていてもよいアルキル、置換基を有していてもよいアルコキシ、アシルまたは置換基を有していてもよいアミノ、
Ｒ２は置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノ、
ｎは１または２を示す〕で表される化合物またはその塩である上記〔７〕記載の剤、
〔９〕ＭＩＦの改変体を含有してなる細胞死抑制剤、
〔１０〕ＭＩＦが、配列番号：１または配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質である上記〔９〕記載の剤、
〔１０ａ〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上記〔９〕記載の剤、
〔１０ｂ〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩であって、ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用を有するものである上記〔９〕記載の剤、
〔１０ｃ〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個（例えば、１〜６個）のアミノ酸が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩であって、ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用を有するものである上記〔９〕記載の剤、
〔１１〕ＭＩＦの改変体が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ端側、３２番目付近（例えば、２２〜４２番目、より好ましくは２７〜３７番目、さらに好ましくは３０〜３４番目）、６４番目付近（例えば、５４〜７４番目、より好ましくは５９〜６９番目、さらに好ましくは６２〜６６番目）、９５番目付近（例えば、８５〜９６番目、より好ましくは９０〜９６番目、さらに好ましくは９３〜９６番目）および９７番目付近（例えば、９７〜１０７番目、より好ましくは９７〜１０２番目、さらに好ましくは９７〜９９番目）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が欠失、付加または（および）置換された改変体である上記〔９〕記載の剤、
〔１２〕Ｎ端側が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１〜５番目のアミノ酸配列である上記〔１１〕記載の剤、
〔１３〕ＭＩＦまたはその改変体と、ＭＩＦに結合する能力を有する物質とを組み合わせてなる細胞死抑制剤、
〔１４〕物質が、マクロファージ遊走阻止因子を活性化する能力を有する物質である上記〔１３〕記載の剤、
〔１５〕物質が、１，３−ベンゾチアジノン誘導体である請求項〔１３〕記載の剤、
〔１６〕１，３−ベンゾチアジノン誘導体が、式
2008035823.tif 000003
〔式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン化されていてもよいアルキル、置換基を有していてもよいアルコキシ、アシルまたは置換基を有していてもよいアミノ、
Ｒ２は置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノ、
ｎは１または２を示す〕で表される化合物またはその塩である上記〔１５〕記載の剤、
〔１７〕循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病の予防・治療剤である上記〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の剤、
〔１８〕ＭＩＦを改変することを特徴とするＡＲＥの活性化方法、
〔１９〕ＭＩＦを改変することを特徴とする細胞死抑制方法、
〔２０〕ＭＩＦを改変することを特徴とする循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病の予防・治療方法、
〔２１〕マクロファージ遊走阻止因子またはその改変体と、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質とを組み合わせることを特徴とする循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病の予防・治療方法、
〔２２〕Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ活性化剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体の使用、
〔２３〕Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ活性化剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体と、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質とを組み合わせた使用、
〔２４〕細胞死抑制剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子の改変体の使用、
〔２５〕細胞死抑制剤を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体およびマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用、
〔２６〕循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病を予防・治療する医薬を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体の使用、
〔２７〕循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌または糖尿病を予防・治療する医薬を製造するためのマクロファージ遊走阻止因子またはその改変体およびマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用などに関する。
（ａ）ＭＩＦまたはその改変体はＡＲＥ活性化剤として、（ｂ）ＭＩＦまたはその改変体と、ＭＩＦに結合する能力を有する物質（例、１，３−ベンゾチアジノン誘導体、抗体など）との組み合わせはＡＲＥ活性化剤として、安全で優れた細胞死抑制剤、例えば循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌、糖尿病等の予防・治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ラットＭＩＦと化合物Ａの結合結果を示す。図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。
図２は、ｈＭＩＦと化合物ＡおよびｈＭＩＦ−Ｐ１Ｓと化合物Ａの結合結果を示す。図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。
図３は、ラットＭＩＦの化合物Ｂ存在下におけるＡＲＥ活性化作用の結果を示す。図中、縦軸はルシフェラーゼの発光量を、横軸はラットＭＩＦおよび化合物Ｂの量（培養液中濃度）を示す。
図４は、ラットＭＩＦと化合物Ａまたは化合物Ｃの結合結果の比較を示す。図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。
図５は、ｈＭＩＦと化合物Ａ、ｈＭＩＦ−Ｐ１Ｓと化合物ＡおよびＨｉｓ−ｈＭＩＦと化合物Ａの結合結果の比較を示す。図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。
図６は、ラットＭＩＦのＧＳＴ  ＹａまたはＨＯ−１発現誘導作用を示す。図中、縦軸はＧＳＴ  Ｙａ又はＨＯ−１のｍＲＮＡ量を、横軸はラットＭＩＦ量（培養液中濃度）を示す。
１．本発明で用いられるＭＩＦまたはその改変体
本発明で用いられるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）としては、配列番号：１（ｈＭＩＦ）または配列番号７（ｒＭＩＦ）で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩などが挙げられる。  ＭＩＦの改変体としては、配列番号：１又は配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩などが挙げられる。配列番号：１又は配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質は、配列番号：１または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、ＭＩＦと同様の生理活性（ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用）を有するものを含む。
また、配列番号：１又は配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質は、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよいタンパク質であって、ＭＩＦと同様の生理活性（ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用）を有するものを含む。
ＭＩＦの改変体としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ端側（例、第１〜５番目のアミノ酸配列など）、３２番目付近（例えば、２２〜４２番目、より好ましくは２７〜３７番目、さらに好ましくは３０〜３４番目）、６４番目付近（例えば、５４〜７４番目、より好ましくは５９〜６９番目、さらに好ましくは６２〜６６番目）、９５番目付近（例えば、８５〜９６番目、より好ましくは９０〜９６番目、さらに好ましくは９３〜９６番目）および９７番目付近（例えば、９７〜１０７番目、より好ましくは９７〜１０２番目、さらに好ましくは９７〜９９番目）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１または２個のアミノ酸）が欠失、付加または（および）置換された改変体などが挙げられる。  ＭＩＦと結合する物質がＭＩＦのＮ末端（Ｐｒｏ）付近に結合すること、ＭＩＦがＭＩＦと結合し得る物質の存在下でＡＲＥを活性化すること、ＭＩＦの１位Ｐｒｏは、３２位Ｌｙｓ、６４位Ｉｌｅ、９５位Ｔｙｒ、９７位Ａｓｎと疎水性ポケットを形成し種々の化合物と結合することが報告されている（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，７巻，１５３−１６４頁，２００３年）ことから、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ端側、３２番目付近、６４番目付近、９５番目付近および９７番目付近のアミノ酸は、ＡＲＥ活性化に密接に関連していることが考えられる。従って、上記部分のアミノ酸のうち、少なくとも一つのアミノ酸が欠失、付加または（および）置換されたＭＩＦ改変体は、有意なＡＲＥ活性化作用、細胞死抑制作用を有する可能性があると考えられる。
なお、これに限定されるわけではないが、以下の同一群に含まれるアミノ酸残基は一般的に相互に置換可能である。
（第１群）ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニン
（第２群）アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸および２−アミノスベリン酸
（第３群）アスパラギンおよびグルタミン
（第４群）リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸および２，３−ジアミノプロピオン酸
（第５群）プロリン、３−ヒドロキシプロリン、および４−ヒドロキシプロリン
（第６群）セリン、スレオニンおよびホモセリン
（第７群）フェニルアラニンおよびチロシン
したがって、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ端側、３２番目付近、６４番目付近、９５番目付近および９７番目付近におけるアミノ酸が上記第１群〜第７群に記載の置換可能なアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するＭＩＦの改変体は、本発明において好ましく用いることができる。
また、本発明で用いることができるＭＩＦの改変体は、所望の薬理活性（ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用）を有する限り、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、そのＮ端側、３２番目付近、６４番目付近、９５番目付近および９７番目付近のアミノ酸以外を変異させることもできる。このようなＭＩＦの改変体としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、そのＮ端側、３２番目付近、６４番目付近、９５番目付近および９７番目付近のアミノ酸以外の配列部分において、１〜複数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜数個（例えば、１〜６個）、さらに好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
さらに、ＭＩＦの改変体としては、ＭＩＦと特異的に結合する物質（例、１，３−ベンゾチアジノン誘導体、抗ＭＩＦ抗体など）がＭＩＦと結合している状態のＭＴＦなども含まれる。
ＭＩＦおよびその改変体は、市販品を購入してもよく、あるいは自体公知の方法またはそれに準じた方法により製造できる。例えば、本発明で用いられるＭＩＦまたはその改変体は、公知の遺伝子工学的手法（例えば、後述の実施例、参考例、実験例などの記載を参照）、公知のタンパク質・ペプチド合成法などを用いて製造することができる。公知のタンパク質・ペプチドの合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法などを含む（（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）；（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）；（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）；（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座  １、  タンパク質の化学  ＩＶ、２０５、（１９７７年）；（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店、など参照）。
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質・ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるタンパク質・ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。なお、ＭＩＦおよびその改変体は、ＡＲＥ活性化作用または／および細胞死抑制作用を有している限り、公知の方法により、糖鎖修飾、リン酸化、カルボニル化、ユビキチン化、アセチル化、メチル化、脂質修飾等されていてもよい。
２．ＭＩＦ又はその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを組み合わせてなるＡＲＥ活性化剤
本発明は、ＭＩＦ又はその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質（以下、結合物質ともいう。）とを組み合わせてなるＡＲＥ活性化剤をも包含する。
ＭＩＦ又はその改変体としては、上述のＭＩＦ又はその改変体を用いることができる。ＭＩＦ又はその改変体と結合物質とを組み合わせてなるＡＲＥ活性化剤においては、配列番号：１または７で表されるＭＩＦ又はその改変体の１番目のアミノ酸がＰｒｏであることが好ましく、さらに、配列番号１または７で表されるＭＩＦ又はその改変体のＮ末端のアミノ酸がＰｒｏであることが好ましい。ＭＩＦ又はその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを組み合わせてなるとは、ＭＩＦ又はその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とが、共有結合している場合のほか、疎水的、電気的、イオン的に相互に影響する状態で結合していることをも意味する。
（ＭＩＦ又はその改変体に結合または活性化する能力を有する物質）
ＭＩＦ又はその改変体に結合する能力を有する物質としては、ＭＩＦ又はその改変体に結合する能力を有する物質であればいずれでもよく、ＭＩＦ又はその改変体の機能を調節する物質であってもよい。例えば、ＭＩＦを活性化する能力を有する物質などが挙げられる。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質としては、例えば、置換基を有していてもよい５〜８員の環状化合物であって環を構成する原子に少なくとも一つの炭素原子を含む化合物、各々が５〜８員である置換基を有していてもよい２環性化合物であって環を構成する原子に少なくとも一つの炭素原子を含む化合物などが挙げられる。ここで、置換基としては、１，３−ベンゾチアジノン誘導体の式中Ｒ１又はＲ２における置換基と同様のものが挙げられる。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質としては、例えば、（ａ）ＭＩＦに対する抗体、（ｂ）１，３−ベンゾチアジノン誘導体などが挙げられる。
結合物質としては、１，３−ベンゾチアジノン誘導体である場合が好ましい。また、結合物質が１，３−ベンゾチアジノン誘導体である場合には、上述のように配列番号：１または７で表されるＭＩＦ又はその改変体の１番目のアミノ酸がＰｒｏであることが好ましく、さらに、配列番号１または７で表されるＭＩＦ又はその改変体のＮ末端のアミノ酸がＰｒｏであることが好ましい。
ＭＩＦを活性化する能力を有する物質としては、例えば、（ｂ）１，３−ベンゾチアジノン誘導体などが挙げられる。
ＭＩＦに対する抗体としては、ＭＩＦに特異的に反応するものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。該抗体は、ＭＩＦを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
（１，３−ベンゾチアジノン誘導体）
１，３−ベンゾチアジノン誘導体としては、式
2008035823.tif 000004
〔式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン化されていてもよいアルキル、置換基を有していてもよいアルコキシ、アシルまたは置換基を有していてもよいアミノ、
Ｒ２は置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノ、
ｎは１または２を示す〕で表される化合物またはその塩、ＷＯ  ０３／２０７１９号公報、ＷＯ  ０３／９０７８２号公報、ＷＯ２００６−１３２４３８号公報などに記載されている化合物などが挙げられる。
上記式中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン化されていてもよいアルキル、置換基を有していてもよいアルコキシ、アシルまたは置換基を有していてもよいアミノを示す。
Ｒ１で示される「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられる。
Ｒ１で示される「ハロゲン化されていてもよいアルキル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ１−６アルキルなど）などが挙げられる。具体例としては、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシルなどが挙げられる。
Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアルコキシ」の「アルコキシ」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどのＣ１−８アルコキシなどが挙げられる。
Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアルコキシ」の「置換基」としては、後述のＲ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」などが、１ないし３個置換可能な位置に用いられる。
Ｒ１で示される「アシル」としては、例えば、式：−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ３、−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ３、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ３Ｒ４、−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨＲ３、−ＳＯ−Ｒ５、−ＳＯ２−Ｒ５  または−ＳＯ２−ＮＨＲ３〔式中、Ｒ３は水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基または置換基を有していてもよい複素環基、Ｒ４は水素原子またはＣ１−６アルキル、Ｒ５は置換基を有していてもよい炭化水素基または置換基を有していてもよい複素環基を示す〕で表されるアシルなどが挙げられる。
前記式中、Ｒ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「炭化水素基」としては、例えば、鎖状または環状炭化水素基（例、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルなど）などが挙げられる。このうち、炭素数１ないし１６個の鎖状または環状炭化水素基などが好ましい。
「アルキル」としては、例えばＣ１−６アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）などが好ましい。
「アルケニル」としては、例えばＣ２−６アルケニル（例、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニルなど）などが好ましい。
「アルキニル」としては、例えば  Ｃ２−６アルキニル（例、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニルなど）などが好ましい。
「シクロアルキル」としては、例えばＣ３−６シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）などが好ましい。
「アリール」としては、例えばＣ６−１４アリール（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリルなど）などが好ましい。
「アラルキル」としては、例えばＣ７−１６アラルキル（例、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチルなど）などが好ましい。
Ｒ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、例えばハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、Ｃ１−３アルキレンジオキシ（例、メチレンジオキシ、エチレンジオキシなど）、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル、ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルケニル、カルボキシＣ２−６アルケニル（例、２−カルボキシエテニル、２−カルボキシ−２−メチルエテニルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルキニル、ハロゲン化されていてもよいＣ３−６シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ１−８アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル−Ｃ１−６アルコキシ（例、エトキシカルボニルメチルオキシなど）、ヒドロキシ、Ｃ６−１４アリールオキシ（例、フェニルオキシ、１−ナフチルオキシ、２−ナフチルオキシなど）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ（例、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなど）、メルカプト、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ、Ｃ６−１４アリールチオ（例、フェニルチオ、１−ナフチルチオ、２−ナフチルチオなど）、Ｃ７−１６アラルキルチオ（例、ベンジルチオ、フェネチルチオなど）、アミノ、モノ−Ｃ１−６アルキルアミノ（例、メチルアミノ、エチルアミノなど）、モノ−Ｃ６−１４アリールアミノ（例、フェニルアミノ、１−ナフチルアミノ、２−ナフチルアミノなど）、ジ−Ｃ１−６アルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノなど）、ジ−Ｃ６−１４アリールアミノ（例、ジフェニルアミノなど）、ホルミル、カルボキシ、Ｃ１−６アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニルなど）、Ｃ３−６シクロアルキル−カルボニル（例、シクロプロピルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニルなど）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニル（例、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイルなど）、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル（例、フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニルなど）、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル（例、フェノキシカルボニルなど）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニルなど）、５ないし６員複素環カルボニル（例、ニコチノイル、イソニコチノイル、テノイル、フロイル、モルホリノカルボニル、チオモルホリノカルボニル、ピペラジン−１−イルカルボニル、ピロリジン−１−イルカルボニルなど）、カルバモイル、モノ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイルなど）、ジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイルなど）、アミノ化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルバモイル、Ｃ６−１４アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル、１−ナフチルカルバモイル、２−ナフチルカルバモイルなど）、５ないし６員複素環カルバモイル（例、２−ピリジルカルバモイル、３−ピリジルカルバモイル、４−ピリジルカルバモイル、２−チエニルカルバモイル、３−チエニルカルバモイルなど）、Ｃ１−６アルキルスルホニル（例、メチルスルホニル、エチルスルホニルなど）、Ｃ６−１４アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル、１−ナフチルスルホニル、２−ナフチルスルホニルなど）、ホルミルアミノ、Ｃ１−６アルキル−カルボニルアミノ（例、アセチルアミノなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルアミノ（例、ベンゾイルアミノ、ナフトイルアミノなど）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ（例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノなど）、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノなど）、Ｃ６−１４アリールスルホニルアミノ（例、フェニルスルホニルアミノ、２−ナフチルスルホニルアミノ、１−ナフチルスルホニルアミノなど）、Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ（例、アセトキシ、プロピオニルオキシなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルオキシ（例、ベンゾイルオキシ、ナフチルカルボニルオキシなど）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルオキシ（例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシなど）、モノ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ（例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシなど）、ジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ（例、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシなど）、Ｃ６−１４アリール−カルバモイルオキシ（例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシなど）、ニコチノイルオキシ、置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ、５ないし１０員芳香族複素環基（例、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニルなど）、スルホなどが挙げられる。
該「炭化水素基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいアルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ１−６アルキルなど）などが挙げられる。具体例としては、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシルなどが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルケニル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ２−６アルケニル（例、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、２−ブテン−１−イル、４−ペンテン−１−イル、５−ヘキセン−１−イルなど）などが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ２−６アルキニル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ２−６アルキニル（例、２−ブチン−１−イル、４−ペンチン−１−イル、５−ヘキシン−１−イルなど）などが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ３−６シクロアルキル」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ３−６シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）などが挙げられる。具体例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、４，４−ジクロロシクロヘキシル、２，２，３，３−テトラフルオロシクロペンチル、４−クロロシクロヘキシルなどが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ１−８アルコキシ」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ１−８アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなど）などが挙げられる。具体例としては、例えばメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、エトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、４，４，４−トリフルオロブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。
前記「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ」としては、例えば１ないし５個、好ましくは１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいＣ１−６アルキルチオ（例、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオなど）などが挙げられる。具体例としては、メチルチオ、ジフルオロメチルチオ、トリフルオロメチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、４，４，４−トリフルオロブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオなどが挙げられる。
前記「置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ」の「５ないし７員飽和環状アミノ」としては、例えば、１個の窒素原子と炭素原子以外に、窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含んでいてもよい５ないし７員飽和環状アミノが挙げられ、具体例としては、ピロリジン−１−イル、ピペリジノ、ピペラジン−１−イル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロアゼピン−１−イルなどが挙げられる。
該「置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ」の「置換基」としては、例えばＣ１−６アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）、Ｃ６−１４アリール（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリルなど）、Ｃ１−６アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニルなど）、５ないし１０員芳香族複素環基（例、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニルなど）、オキソなどが１ないし３個挙げられる。
Ｒ３で示される「置換基を有していてもよい複素環基」の「複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（単環、２環または３環式）複素環、好ましくは（ｉ）５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環、（ｉｉ）５ないし１０員非芳香族複素環または（ｉｉ）７ないし１０員複素架橋環から任意の１個の水素原子を除いてできる１価基などが挙げられる。
上記「５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
上記「５ないし１０員非芳香族複素環」としては、例えば、ピロリジン、イミダゾリン、ピラゾリジン、ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサゾール、オキサジアゾリン、チアジアゾリン、トリアゾリン、チアジアゾール、ジチアゾールなどが挙げられる。
上記「７ないし１０員複素架橋環」としては、例えば、キヌクリジン、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタンなどが挙げられる。
該「複素環基」として好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、好ましくは、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の（単環または２環式）複素環基である。具体的には、例えば２−チエニル、３−チエニル、２−フリル、３−フリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、ピラジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、３−ピロリル、２−イミダゾリル、３−ピリダジニル、３−イソチアゾリル、３−イソオキサゾリル、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ「ｂ］フラニルなどの芳香族複素環基、例えば１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、２−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノ、２−ピペリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノなどの非芳香族複素環基などである。
このうち、例えば炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし３個のヘテロ原子を含む５ないし６員の複素環基等がさらに好ましい。具体的には、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−フリル、３−フリル、ピラジニル、２−ピリミジニル、３−ピロリル、３−ピリダジニル、３−イソチアゾリル、３−イソオキサゾリル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、２−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノ、２−ピペリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノなどが挙げられる。
該「置換基を有していてもよい複素環基」の「置換基」としては、例えば前記Ｒ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。
該「複素環基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
Ｒ４で示される「Ｃ１−６アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
Ｒ５で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」および「置換基を有していてもよい複素環基」としては、例えば前記Ｒ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」および「置換基を有していてもよい複素環基」がそれぞれ挙げられる。
Ｒ１で示される「置換基を有していてもよいアミノ」の「置換基」としては、前記のＲ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」などが、１ないし２個挙げられる。
Ｒ１の具体例としては、（１）水素原子、（２）ハロゲン原子、（３）ヒドロキシ、（４）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル、（５）カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルおよびＣ６−１０アリールから選ばれる置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ、（６）Ｃ１−６アルキル−カルバモイル、（７）Ｃ３−６シクロアルキル−カルバモイル、（８）５または６員飽和環状アミノ−カルボニルなどが挙げられる。
Ｒ１として好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン化されていてもよいアルキル（好ましくはＣ１−６アルキル）またはハロゲン化されていてもよいアルコキシ（好ましくはＣ１−６アルコキシ）などが挙げられる。特に好ましくは水素原子である。
Ｒ２で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」および「置換基を有していてもよい複素環基」としては、例えば前記Ｒ３で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」および「置換基を有していてもよい複素環基」がそれぞれ挙げられる。
Ｒ２で示される「置換基を有していてもよいアミノ」としては、前記のＲ１で示される「置換基を有していてもよいアミノ」が挙げられる。
Ｒ２として好ましくは、（１）ハロゲン原子、
（２）（ｉ）ハロゲン原子、（ｉｉ）ヒドロキシ、（ｉｉｉ）カルボキシ、（ｉｖ）シアノ、（ｖ）カルボキシ−Ｃ１−６アルコキシ、（ｖｉ）Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルコキシ、（ｖｉｉ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル−Ｃ１−６アルコキシ、（ｖｉｉｉ）Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ、（ｉｘ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル、（ｘ）（ａ）カルボキシを有していてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ１−６アルキルスルホニルおよび（ｃ）Ｃ６−１０アリールスルホニルから選ばれる１または２個の置換基を有していてもよいカルバモイル、（ｘｉ）カルボキシを有していてもよい５または６員飽和環状アミノ−カルボニル、（ｘｉｉ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルを有していてもよいＣ１−６アルキルチオ、（ｘｉｉｉ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルを有していてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル、（ｘｉｖ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルを有していてもよいＣ１−６アルキルスルホニル、（ｘｖ）Ｃ７−１２アラルキルチオ、（ｘｖｉ）Ｃ７−１２アラルキルスルフィニル、（ｘｖｉｉ）Ｃ７−１２アラルキルスルホニル、（ｘｖｉｉ）５または６員芳香族複素環−チオ、（ｘｉｘ）（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル、（ｃ）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル、（ｄ）Ｃ６−１０アリール−カルボニル、（ｅ）チエニルカルボニル、（ｆ）Ｃ１−６アルキルチオ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル、（ｇ）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル、（ｈ）Ｃ１−６アルキルスルホニル、（ｉ）Ｃ６−１０アリールスルホニル、（ｊ）ジ−Ｃ１−６アルキルホスホノ、（ｋ）ジ−Ｃ１−６アルキルチオホスホノおよび（ｌ）Ｃ６−１０アリール−カルバモイルから選ばれる１または２個の置換基を有していてもよいアミノ、（ｘｘ）フタルイミド、（ｘｘｉ）Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、（ｘｘｉｉ）５または６員芳香族複素環基、（ｘｘｉｉｉ）Ｃ１−６アルキルを有していてもよいホスホノ、（ｘｘｉｖ）（ａ）Ｃ７−１２アラルキル、（ｂ）ハロゲン化されていてもよいＣ６−１０アリールおよび（ｃ）ヒドロキシから選ばれる１または２個の置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノおよび（ｘｘｖ）５ないし７員環状アミノ−カルボニルから選ばれる１〜５個の置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、
（３）カルボキシまたはＣ１−６アルコキシ−カルボニルを有していてもよいＣ１−６アルケニル、
（４）Ｃ１−６アルコキシを有していてもよいＣ６−１０アリール、
（５）Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル、フタルイミド、ジ−Ｃ１−６アルキルスルホンアミドおよびジ−Ｃ１−６アルキルアミノメチレンスルホンアミドから選ばれる置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ、
（６）Ｃ１−６アルキルチオを有していてもよいＣ６−１０アリールオキシ、
（７）Ｃ７−１２アラルキルオキシ、
（８）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、カルボキシ、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルチオ、
（９）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、カルボキシ、カルバモイルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルを有していてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル、
（１０）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、カルボキシおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルスルホニル、
（１１）ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる置換基を有していてもよいＣ６−１０アリールチオ、
（１２）Ｃ１−６アルキルを有していてもよいＣ６−１０アリールスルフィニル、
（１３）Ｃ１−６アルキルを有していてもよいＣ６−１０アリールスルホニル、
（１４）カルボキシ、
（１５）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル、
（１６）Ｃ７−１２アラルキルチオ、
（１７）Ｃ７−１２アラルキルスルフィニル、
（１８）Ｃ７−１２アラルキルスルホニル、
（１９）Ｃ１−６アルキル、Ｃ７−１２アラルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル−Ｃ１−６アルキル、カルボキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ６−１０アリール−カルボニル、Ｃ３−６シクロアルキル−カルボニル、チエニルカルボニル、フリルカルボニルおよびモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ−カルボニルから選ばれる１〜２個の置換基を有していてもよいアミノ、
（２０）（ｉ）ハロゲン化されていてもよいＣ６−１０アリール、（ｉｉ）Ｃ７−１２アラルキル、（ｉｉｉ）ヒドロキシ、（ｉｖ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルまたはカルボキシを有していてもよいＣ１−６アルキル、（ｖ）オキソ、（ｖｉ）Ｃ１−６アルキル−カルボニル、（ｖｉｉ）Ｃ６−１０アリール−カルボニルおよび（ｖｉｉｉ）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルから選ばれる置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ、
（２１）（ｉ）ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、アミノ、Ｃ１−６アルコキシ−カルボキサミドおよびヒドロキシから選ばれる置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、（ｉｉ）Ｃ７−１２アラルキルおよび（ｉｉｉ）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ−カルボニルから選ばれる置換基を有していてもよいカルバモイル、
（２２）５ないし７員環状アミノ−カルボニル、
（２３）Ｃ１−６アルキルを有していてもよい５または６員芳香族複素環基、
（２４）シアノ、
（２５）Ｃ１−６アルキルを有していてもよい５ないし１０員芳香族複素環基−チオ、
（２６）Ｃ１−６アルキルカルボニル、および
（２７）オキソから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有している芳香族複素環〔例、ピリジル、フリル、チエニル、ピロリル、キノリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、テトラヒドロキノリルまたはチアゾリル（好ましくはピリジルさらに好ましくは２−または４−ピリジル）〕などが挙げられる。該ピリジルは、Ｎ−オキシド化されていてもよい。該ピリジルの置換基としては、アミノ化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニルが好ましい。
さらに好ましくは、Ｒ２は、（１）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル−Ｃ１−６アルコキシ、カルボキシ−Ｃ１−６アルコキシ、カルボキシ、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルおよびＣ１−６アルキルスルホニルオキシから選ばれる置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、（２）カルボキシまたはＣ１−６アルコキシ−カルボニルを有していてもよいＣ１−６アルケニル、（３）モノ−もしくはジ−Ｃ１−６アルキルアミノまたはＣ１−６アルコキシ−カルボニルを有していてもよいＣ１−６アルキルチオ、（４）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノを有していてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル、（５）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノを有していてもよいＣ１−６アルキルスルホニル、（６）Ｃ７−１２アラルキルチオ、（７）Ｃ７−１２アラルキルスルフィニル、（８）Ｃ７−１２アラルキルスルホニル、（９）（ｉ）ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシおよびアミノから選ばれる置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、（ｉｉ）Ｃ７−１２アラルキルおよび（ｉｉｉ）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ−カルボニルから選ばれる置換基を有していてもよいカルバモイルおよび（１０）５ないし７員環状アミノ−カルボニルから１ないし３個選ばれる置換基をそれぞれ有しているピリジル、フリル、チエニル、ピロリル、キノリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、テトラヒドロキノリルまたはチアゾリル（好ましくはピリジル、さらに好ましくは２−または４−ピリジル）などが挙げられる。該ピリジルは、Ｎ−オキシド化されていてもよい。該ピリジルの置換基としては、アミノ化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニルが好ましい。
式（Ｉ）で表される化合物の「塩」としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
式（Ｉ）で表される化合物が、コンフィギュレーショナル  アイソマー（配置異性体）、ジアステレオマー、コンフォーマーなどとして存在する場合には、所望により、前記の分離、精製手段によりそれぞれを単離することができる。また、式（Ｉ）で表される化合物がラセミ体である場合には、通常の光学分割手段によりＳ体およびＲ体に分離することができる。
式（Ｉ）で表される化合物に立体異性体が存在する場合には、この異性体が単独の場合およびそれらの混合物の場合も本発明に含まれる。
式（Ｉ）で表される化合物は、市販品を購入してもよく、あるいは自体公知の方法またはそれに準じた方法により製造できる。なお、上記のような１，３−ベンゾチアジノン誘導体およびその製造法法の詳細については、例えば、ＷＯ  ０３／２０７１９号公報、ＷＯ  ０３／９０７８２号公報、ＷＯ２００６−１３２４３８号公報などを参照することができる。
（ＭＩＦまたはその改変体の薬理作用、治療用途など）
ＭＩＦまたはその改変体は、細胞保護因子（例、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）など）の発現を誘導し、ＡＲＥ活性化作用を有していることより、細胞死を抑制することができる。さらには薬物（例、抗癌剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬など）による副作用を軽減することもできる。ＭＩＦまたはその改変体と結合物質とを組み合わせてなるＡＲＥ活性剤は、細胞保護因子（例、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）など）の発現を誘導し、ＡＲＥ活性化作用を有していることより、細胞死を抑制することができる。さらには薬物（例、抗癌剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬など）による副作用を軽減することもできる。
また、ＭＩＦまたはその改変体は、ＡＲＥ活性化作用を有していることより、細胞保護因子（例、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）など）の発現を誘導し、細胞死を抑制することができる。さらには薬物（例、抗癌剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬など）による副作用を軽減することもできる。ＭＩＦまたはその改変体と結合物質とを組み合わせてなるＡＲＥ活性剤は、ＡＲＥ活性化作用を有していることより、細胞保護因子（例、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）など）の発現を誘導し、細胞死を抑制することができる。さらには薬物（例、抗癌剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬など）による副作用を軽減することもできる。  これより、（ａ）ＭＩＦまたはその改変体、（ｂ）ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質との組み合わせは、安全で低毒性なＡＲＥ活性化剤（例、ＡＲＥ遺伝子の発現促進剤、ＡＲＥタンパク質の発現促進剤、ＡＲＥタンパク質の活性促進剤、ＡＲＥ制御下遺伝子（例、ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）、Ｌｉｖｅｒ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｙａ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｌｉｖｅｒ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｙｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｙｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｙｃ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｇａｍｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｅｘｏｎ  １、Ｂｉｌｉｒｕｎｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｍｅｎａｄｉｏｎｅ  ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅなど）発現促進剤、ＡＲＥ制御下遺伝子タンパク質（遺伝子産物）の産生亢進（促進）剤または活性促進剤など）、細胞死抑制剤（例、酸化ストレスによる細胞死、血清除去による細胞死、増殖因子の欠乏による細胞死、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬による細胞死、抗癌剤による細胞死、ＮＯによる細胞死、アミロイドβタンパク質による細胞死などの抑制剤）、細胞保護剤などとして、例えば循環器系疾患〔例、心筋症（例、拡張型心筋症、肥大型閉塞性心筋症、肥大型非閉塞性心筋症、特発性心筋症、収縮性心筋症、糖尿病性心筋症など）、心不全（例、慢性心不全、慢性うっ血性心不全、急性心不全、心代償不全、左心不全、右心不全、うっ血性心不全、急性うっ血性心不全、代謝性心不全心、拡張型心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全、難治性心不全、筋梗塞予後不全など）、狭心症、心筋梗塞、動脈硬化症（動脈瘤、冠動脈硬化症、脳動脈硬化症、末梢動脈硬化症など）、虚血後再灌流障害など〕、骨・関節疾患〔例、慢性関節リウマチ、変形性関節症、変形性膝関節炎など〕、感染症疾患〔例、サイトメガルウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス等のウイルス感染症、リケッチア感染症、細菌感染症など〕、炎症性疾患〔例、網膜症、腎症、神経障害、大血管障害等の糖尿病性合併症；リウマチ様脊髄炎、骨膜炎等の関節炎；手術・外傷後の炎症；腫脹の緩解；咽頭炎；膀胱炎；肺炎；アトピー性皮膚炎；クローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患；髄膜炎；炎症性眼疾患；肺炎、珪肺、肺サルコイドーシス、肺結核等の炎症性肺疾患など〕、腎疾患〔例、虚血性急性腎不全、溶血性尿毒症症候群、急性尿細管壊死、水腎症、腎炎、糸球体腎炎、糸球体硬化症、腎不全、血栓性微小血管症、移植拒絶腎、透析の合併症、放射線照射による腎症を含む臓器障害など〕、中枢疾患〔例、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症、エイズ脳症など）、中枢神経障害（脳出血および脳梗塞等の障害およびその後遺症・合併症、頭部外傷、脊椎損傷、脳浮腫、知覚機能障害、知覚機能異常、自律神経機能障害、自律神経機能異常、多発性硬化症など）、痴呆症、記憶障害、意識障害、健忘症、不安症状、緊張症状、不快精神状態、末梢神経障害など〕、癌〔例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など〕、糖尿病〔例、１型糖尿病、２型糖尿病、合併症（糖尿病性網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病性腎症、糖尿病性神経症など）など〕などの予防・治療剤として有用である。
３．ＭＩＦまたはその改変体を含有する医薬（単剤）またはＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを併用する医薬（併用剤）
本発明においては、ＭＩＦまたはその改変体は、これを含有する単剤として用いることができる。また、ＭＩＦまたはその改変体と、ＭＩＦに結合する能力を有する物質とを併用して用いることもできる。
以下、ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを併用して使用することを「本発明の併用剤」と称する。
ＭＩＦまたはその改変体と、ＭＩＦに結合する能力を有する物質は、それぞれ単独で、あるいは両者を、自体公知の方法に従って、薬理学的に許容される担体と混合して医薬組成物、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤、（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等として、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に哺乳動物（例、ヒト、サル等）安全に投与することができる。注射剤は、静脈内、筋肉内、皮下または臓器内投与または直接病巣に投与することができる。
上記薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
ＭＩＦまたはその改変体、およびＭＩＦに結合する能力を有する物質の上記製剤中の含有量は、剤全体の約０．０１ないし１００重量％である。
本発明の併用剤の使用に際しては、ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質の投与時期は限定されず、ＭＩＦまたはその改変体またはその医薬組成物とＭＩＦに結合する能力を有する物質またはその医薬組成物とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。本発明の併用剤の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。
本発明の併用剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の投与の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）ＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与などが挙げられる。
本発明の併用剤におけるＭＩＦまたはその改変体とＭＩＦに結合する能力を有する物質との配合比または使用比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
例えば、本発明の併用剤におけるＭＩＦまたはその改変体の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して約０．０１〜１００重量％、好ましくは約０．１〜５０重量％、さらに好ましくは約０．５〜２０重量％である。
本発明の併用剤におけるＭＩＦに結合する能力を有する物質の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して約０．０１〜１００重量％、好ましくは約０．１〜５０重量％、さらに好ましくは約０．５〜２０重量％である。
本発明の併用剤における担体等の添加剤の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して約１〜９９．９９重量％、好ましくは約１０〜９０重量％である。
また、ＭＩＦまたはその改変体およびＭＩＦに結合する能力を有する物質をそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の含有量でよい。
ＭＩＦまたはその改変体、および本発明の併用剤の投与量は、症状の程度；投与対象の年齢、性別、体重；投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類；有効成分の種類などによって異なり、特に限定されないが、炎症性腸疾患の治療に用いる場合は、通常、成人に対して一日につき、活性成分として約１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１００μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。通常１日１〜４回に分けて投与する。
なお、ここでは、併用剤についての有効成分の製剤化、投与方法などについて述べたが、これらの記載は、ＭＩＦまたはその改変体を含有するＡＲＥ活性化剤を単剤として使用する場合にも適用し得る。
さらに、本発明のＡＲＥ活性化剤および細胞死抑制剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（例、  シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、アトロバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）など）、フィブラート系高脂血症薬（例、ゲムフィブロジル（Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）など）、抗癌剤（例、イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ＵＦＴ、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、シクロフォスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、５−ＦＵ、メトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、マイトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）など）などと併用して用いてもよく、これによりＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬、抗癌剤などの、正常細胞に障害を及ぼす副作用が軽減される。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＮＯ            ：一酸化窒素
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＭＩＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
参考例１で使用した抗−センス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
参考例１で使用したセンス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
参考例１で使用した抗−センス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
参考例１で使用したセンス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ラットＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｙａ  ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子のＡＲＥの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ラットＭＩＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
参考例２で用いた５’末端側にＮｄｅＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＮ末端と一致するセンス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
参考例２で用いた５’末端側にＳａｐＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＣ末端と一致する抗―センス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
参考例３で用いたｈＭＩＦ−５’−プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
参考例３で用いたｈＭＩＦ−３”−プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
参考例３で用いたＮ末端に付加したヒスチジンタグを含む３０アミノ酸ペプチドのアミノ酸配列を示す。
Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ
〔配列番号：１３〕
実験例４においてｒＧＳＴ  Ｙａの定量に用いたプライマー（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実験例４においてｒＧＳＴ  Ｙａの定量に用いたプライマー（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実験例４においてｒＧＳＴ  Ｙａの定量に用いたプローブ（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実験例４においてｒＧＡＰＤの定量に用いたプライマー（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実験例４においてｒＧＡＰＤの定量に用いたプライマー（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実験例４においてｒＧＡＰＤの定量に用いたプローブ（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実験例４においてｒＨＯ−１の定量に用いたプライマー（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実験例４においてｒＨＯ−１の定量に用いたプライマー（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実験例４においてｒＨＯ−１の定量に用いたプローブ（ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ）の塩基配列を示す。
【実施例】
【０００５】
以下に、参考例、実験例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１
ヒトＭＩＦタンパク質およびそのＮ末端改変体の調製
（１）ヒトＭＩＦタンパク質およびそのＮ末端改変体の発現ベクターの構築
ヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）より、５’末端側にＮｄｅＩ切断部位を含むヒトＭＩＦのＮ末端と一致するセンス鎖（配列番号：５）と５’末端側にＳａｐＩ切断部位を含むヒトＭＩＦのＣ末端と一致する抗−センス鎖（配列番号：２）を使用して、ＭＩＦをコードする領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅した。増幅したＭＩＦｃＤＮＡは、ＮｄｅＩとＳａｐＩで切断後、ｐＣＹＢ１（ＩＭＰＡＣＴ  Ｉ：Ｏｎｅ−Ｓｒｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）のＮｄｅＩとＳａｐＩ部位の間に挿入してｐＣＹＢ１−ｈＭＩＦを得た。次に、ｐＣＹＢ１−ｈＭＩＦをＢｇｌＩで切断後、切断面を平滑末端化し、これをさらにＮｄｅＩで切断してヒトＭＩＦとインテイン−キチンバインディングドメインの融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を回収した。次に、回収したＤＮＡ断片をＴ７プロモータ発現プラスミドｐＥＴ３２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩとＥｃｏＲＶ部位の間に挿入して、ヒトＭＩＦ−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質発現プラスミドｐＥＴ３２ｂ−ｈＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを得た。得られた発現プラスミド内のＭＩＦｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡシーケンス・システム（アプライド・バイオシステム社）を用いて確認した。
ヒトＭＩＦのＮ末端のプロリン（Ｐｒｏ１）をセリンに置換した変異ＭＩＦタンパク質（ｈＭＩＦ−Ｐ１Ｓ）の発現プラスミドは、センス鎖（配列番号：３）と抗−センス鎖（配列番号：４）を使用し、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてｐＥＴ３２ｂ−ｈＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤのＰｒｏ１をコードするＤＮＡ配列（ＣＣＧ）をセリンをコードする配列（ＴＣＧ）に置換することで作製した。得られた発現プラスミド内のＭＩＦｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡシーケンス・システム（アプライド・バイオシステム社）を用いて確認した。
（２）ヒトＭＩＦタンパク質の調製
ｐＥＴ３２ｂ−ｈＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した後、アンピシリンを添加したＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストイクストラクト、０．５％ＮａＣｌ）（ＬＢａｍｐ培地）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。これをＬＢａｍｐ培地に１％となるように移し、３７℃で約２．５時間振とう培養した後、０．４ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して１５℃でさらに約２４時間培養してヒトＭＩＦ−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質の発現を誘導した。培養終了後、大腸菌を回収し１／１０量の０．１％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁して超音波破砕した。この菌体破砕液を４℃、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してその上清を回収した。回収した上清は０．１％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファーで平衡化したキチンビーズカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を通過させて、ヒトＭＩＦ−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質をカラムに結合させた後、カラムサイズの１０倍容量の０．１％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファーとカラムサイズの１０倍容量のカラムバッファーで洗浄して非特異的に結合したタンパク質および随伴する物質を除去した。次にカラム内のバッファーを５０ｍＭのジチオスレイトールを含むカラムバッファーと置換して４℃で一晩放置することで、インテインのタンパク質スプライシング活性を利用して融合タンパク質よりＭＩＦタンパク質を切り出した。切り出したＭＩＦタンパク質はカラムバッファーで溶出した後、２０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液で透析した。変異ＭＩＦタンパク質（ｈＭＩＦ−Ｐ１Ｓ）も同様の方法で調製した。
参考例２
ラットＭＩＦタンパク質の調製
（１）ラットＭＩＦタンパク質発現ベクターの構築
Ｔ７プロモータ発現プラスミドｐＥＴ３２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＳａｐＩとＴｔｈＩＩＩで切断後、切断面を平滑末端化して再び環状化することで、ｐＥＴ３２ｂ（＋）よりＳａｐＩ切断部位を除去したｐＥＴ３２ｂ−１を得た。次に、ｐＣＹＢ１（ＩＭＰＡＣＴ  Ｉ：Ｏｎｅ−Ｓｒｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）をＮｄｅＩとＢｇｌＩで切断して、マルチクローニング部位とインテイン−キチンバインディングドメイン融合蛋白質をコードする領域のＤＮＡ断片を回収し、このＢｇｌＩ切断部位を平滑末端化した後、ｐＥＴ３２ｂ−１のＮｄｅＩとＥｃｏＲＶ部位の間に挿入してｐＥＴ３２ｂ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを得た。
次にラットの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）よりＭＩＦをコードする領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅した。ラットＭＩＦのｃＤＮＡ増幅には５’末端側にＮｄｅＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＮ末端と一致するセンス鎖；配列番号：８）と５’末端側にＳａｐＩ切断部位を含むラットＭＩＦのＣ末端と一致する抗―センス鎖；配列番号：９）を使用した。増幅したＭＩＦｃＤＮＡはＮｄｅＩとＳａｐＩで切断後、ｐＥＴ３２ｂ−Ｉｎｔ−ＣＢＤのＮｄｅＩ切断部位とＳａｐＩ切断部位の間に挿入して、ラットＭＩＦ―インテイン―キチンバインディングドメイン融合蛋白質発現プラスミドｐＥＴ３２ｂ−ｒＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを得た。得られた発現プラスミド内のＭＩＦｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡシーケンス・システム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて確認した。
（２）ラットＭＩＦタンパク質の調製
ｐＥＴ３２ｂ−ｒＭＩＦ−Ｉｎｔ−ＣＢＤを大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した後、アンピシリンを添加したＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストイクストラクト、０．５％ＮａＣｌ）（ＬＢａｍｐ培地）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。これをＬＢａｍｐ培地に１％となるように移し、３７℃で約２．５時間振とう培養した後、０．４ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して１５℃でさらに２４時間培養してラットＭＩＦ―インテイン―キチンバインディングドメイン融合蛋白質の発現を誘導した。培養終了後、大腸菌を回収し１／１０量の０．１％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁して超音波破砕した。この菌体破砕液を４℃、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してその上清を回収した。回収した上清は０．１％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファーで平衡化したキチンビーズカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を通過させて、ラットＭＩＦ―インテイン―キチンバインディングドメイン融合蛋白質をカラムに結合させた後、カラムサイズの１０倍容量の０．１％トライトンＸ−１００を含むカラムバッファーとカラムサイズの１０倍容量のカラムバッファーで洗浄して非特異的に結合した蛋白質および随伴する物質を除去した。次にカラム内のバッファーを５０ｍＭのジチオスレイトールを含むカラムバッファーと置換して４℃で１６時間以上放置することで、インテインの蛋白質スプライシング活性を利用して融合蛋白質よりＭＩＦ蛋白質を切り出した。切り出したＭＩＦ蛋白質はカラムバッファーで溶出した後、２０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液で透析した。ラットＭＩＦタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：７に示すとおりである。
参考例３
Ｎ末端にヒスチジンタグを含有するペプチドを付加したヒトＭＩＦ蛋白質のＮ末端改変体（Ｈｉｓ−ｈＭＩＦ）の調製
（１）Ｈｉｓ−ｈＭＩＦ発現プラスミドの調製
参考例１と同様に、ヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーより、ｈＭＩＦ−５’ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＴＣＡＴＣＧＴ−３’；配列番号：１０）とｈＭＩＦ−３’  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＴ−３’；配列番号：１１）を用いてＭＩＦをコードする領域をＰＣＲ法により増幅した。
増幅したＭＩＦｃＤＮＡはＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断後、Ｔ７プロモーター発現プラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入してｐＥＴ３２ａ／ｈＭＩＦベクターを得た。次にｐＥＴ３２ａ／ｈＭＩＦをＮｄｅＩで切断後、再び環状化することで、チオレドキシンをコードする配列を除去した。このベクターをＥｃｏＲＩとＮｓｐＶで切断し、切断面を平滑末端化した後、再び環状化することで、ＭＩＦのＮ末端にヒスチジンタグを含む３０アミノ酸のペプチド（配列番号：１２）を付加したヒトＭＩＦ蛋白質の（Ｈｉｓ−ｈＭＩＦ）発現ベクターｐＥＴ３２ａ−Ｈｉｓ−ｈＭＩＦを得た。
（２）Ｈｉｓ−ｈＭＩＦ蛋白質の調製
ｐＥＴ３２ａ−Ｈｉｓ−ｈＭＩＦを大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、アンピシリンを添加したＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストイクストラクト、０．５％ＮａＣｌ）（ＬＢ  ａｍｐ培地）に植菌して３７℃で一晩培養した。これをＬＢａｍｐ培地に１％となるように移し、３７℃で約２．５時間振とう培養した後、０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加して、１５℃でさらに５時間培養した。培養終了後、大腸菌を回収して０．１％ＮＰ−４０を添加したバインディングバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に懸濁して超音波破砕した。この菌体破砕液を４℃、１２，０００ｇで２０分間遠心分離し、その上清を回収して、０．２２μｍのフィルターでろ過した。次にＨｉｓ  Ｂｉｎｄ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、カラムサイズの５倍量のチャージバッファー（５０ｍＭ  ＮｉＳＯ４）でチャージした後、３倍量のバインディングバッファーで平衡化し、これに上記の細胞破砕液を通過させてカラムにＨｉｓ−ｈＭＩＦを結合させた後、カラムサイズの１０倍量のバインディングバッファーと６倍量の洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，６０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で洗浄して非特異的に結合した蛋白質及び随伴する物質を除去した。次に、Ｈｉｓ−ｈＭＩＦ蛋白質を、６倍量の溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１Ｍ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した。得られたＨｉｓ−ｈＭＩＦは８Ｍ  ｕｒｅａと５ｍＭ  ＤＴＴを添加した２０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）で透析後、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）で透析し、さらに２０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）のみで透析した。
実験例１（１）
ラットＭＩＦとＮ−（６−アミノヘキシル）−６−（４−オキソ−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−２−イル）−２−ピリジンカルボキサミドまたはその塩酸塩（以下、化合物Ａと略記）との結合
参考例２で得られたラットＭＩＦと化合物Ａ（ＷＯ  ０３／０２０７１９号公報の実施例１０７記載参照：下式参照）との結合をＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ビアコア株式会社製）を用いて解析した。
2008035823.tif 000005
化合物ＡをセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）に固定化後、１μｇ／ｍｌのラットＭＩＦを含む０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０含有燐酸緩衝生理食塩水をチップ上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化をラットＭＩＦに対する化合物の結合として測定した。
結果を図１に示す。
これより化合物ＡはラットＭＩＦに強く結合することがわかる。
実験例１（２）
ラットＭＩＦとＮ−（６−アミノヘキシル）−６−（８−メチル−４−オキソ−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−２−イル）ピリジン−２−カルボキサミドまたはその塩酸塩（以下、化合物Ｃと略記）との結合
参考例２で得られたラットＭＩＦと化合物Ｃ（下式参照）との結合をＢＩＡＣＯＲＥ３０００を用いて解析した。実験例１（１）同様に、化合物ＣをセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）に固定化後、１μｇ／ｍｌのラットＭＩＦを含む０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０含有燐酸緩衝生理食塩水をチップ上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化をラットＭＩＦに対する化合物の結合として測定した。
結果を図４に示す。これより化合物Ｃでは化合物Ａと比較してラットＭＩＦに対する結合活性が弱いことがわかり、ＭＩＦとの結合には１，３−ベンゾチアジノン
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誘導体の８位が重要であると考えられる。
実験例２
ＭＩＦまたは変異型ＭＩＦと化合物Ａとの結合
参考例１で得られたヒトＭＩＦ（ｈＭＩＦ）および変異型ヒトＭＩＦ（ｈＭＩＦ−Ｐ１Ｓ）と化合物Ａの結合をＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ビアコア株式会社製）を用いて解析した。
化合物ＡをセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社製）に固定化後、１０μｇ／ｍｌのｈＭＩＦまたはｈＭＩＦ−Ｐ１Ｓを含むＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ（ビアコア株式会社製）をチップ上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化をヒトＭＩＦに対する化合物の結合として測定した。
結果を図２に示す。
化合物ＡのヒトＭＩＦに対する結合能は、ヒトＭＩＦのＮ末端のプロリンに変異を導入することで大幅に減弱することがわかる。これより、ＭＩＦと特異的に結合する１，３−ベンゾチアジノン誘導体は、ＭＩＦのＮ末端付近に結合することがわかる。
同様にして、化合物Ａと参考例３で得られたＮ末端にペプチドを付加したＨｉｓ−ｈＭＩＦとの結合解析を行った。結果を図５に示す。
化合物ＡのヒトＭＩＦに対する結合能は、ヒトＭＩＦのＮ末端のプロリンにヒスチジンタグを含む３０アミノ酸ポリペプチドを付加することによって大幅に減弱することがわかる。これより、ＭＩＦと１，３−ベンゾチアジノン誘導体の結合には、Ｎ末端のプロリンがフリーであることが適していると推測される。
実験例３
ＭＩＦの２−（２−ピリジル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（以下、化合物Ｂと略記）存在下におけるＡＲＥ活性化作用
参考例２で得られたラットＭＩＦ（ｒＭＩＦ）をＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｅｒ（アマシャム・バイオサイエンス社）を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（アマシャム・バイオサイエンス社）でゲルろ過してさらに精製した後、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（ピアス社製）でエンドトキシン除去した。次にこの精製ＭＩＦが、ＭＩＦと結合する化合物Ｂ（ＷＯ  ０２／１８３５６号公報の参考例１記載参照：下式参照）存在下でＡＲＥ活性化作用を示すかどうかを調べた。
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ラットＨ９ｃ２細胞を７×１０４個／ｍｌとなるように１０％熱不活化牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（１０％ＦＢＳ、Ｄ−ＭＥＭ培地）に懸濁して５％ＣＯ２、３７℃で約１６時間培養した。これにＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ社製）を用いて、ラットＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｙａ  ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子のＡＲＥ（配列番号：６）をｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）に組み込んだルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３−ＡＲＥをトランスフェクションし、さらに約７時間培養した。培養終了後、細胞を回収し、１０％ＦＢＳ、Ｄ−ＭＥＭ培地に１×１０５個／ｍｌとなるように懸濁し、９６ウェル白色オパックプレート（ファルコン社製）の各ウェルに１００μｌずつ播種して５％ＣＯ２、３７℃で約１７時間培養した。次に０．３％ＦＢＳを含有するＤ−ＭＥＭ培地と交換して一日培養した後、０．３％ＦＢＳを含有するＤ−ＭＥＭ培地と交換してさらに約５時間培養し、化合物ＢおよびラットＭＩＦを添加して５％ＣＯ２、３７℃で約２４時間培養した。培養終了後、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）を各ウェルに８０μｌづつ添加し、４０分間室温で放置した後、ルシフェラーゼによる発光量をＷＡＬＬＡＣＡＲＶＯ  ＳＸ（パーキンエルマ社製）で測定した。
結果を図３に示す。  これよりＭＩＦと結合する化合物Ｂ（１μＭ）存在下で、ラットＭＩＦが濃度依存的にＡＲＥ活性化作用を示すことがわかる。
実験例４
ＭＩＦによるＧＳＴ  Ｙａ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｙａ  ｓｕｂｕｎｉｔ）及びＨＯ−１（Ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）遺伝子の発現誘導
日本チャールスリバー社より購入した妊娠ウイスター・ラットより新生仔（生後１日以内のもの）を得、これをエーテル麻酔し、７０％エタノールで消毒後、ピンセットで心臓を摘出した。摘出した心臓をリン酸緩衝生理食塩水（タカラ社製、Ｔ９００）で洗浄後、手術用のハサミで細片化した。この組織片を、リン酸緩衝生理食塩水で４〜５回洗浄し、大部分の血液由来の非心筋細胞を除去した。この新生仔１０匹分の組織片に対し、５ｍｌの酵素液〔リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（１ｍｌ）にトリプシン（１．２５ｍｇ）（ディフコ社製）およびコラゲナーゼ（０．２５ｍｇ）（シグマ社製）を溶解したもの〕を加え、３７℃に保ちながらスターラーで１５分間攪拌した。
これに２．５ｍｌの酵素液を追加し、さらに１５分間攪拌し、この操作を２回繰り返した。続いて、１０％牛胎仔血清（バイオウィカー社製）を含むＭｅｄｉｕｍ１９９（ギブコ社製）を５ｍｌ添加して酵素反応を停止させ、これをセルストレイナー（ファルコン社製）で濾過後、４００ｘｇで５分間遠心分離して細胞を集めた。このように集めた新生仔１０匹分の細胞を、５０ｍｌの１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ１９９に懸濁し、１００ｍｍシャーレ（イワキ社製）に１０ｍｌずつ播種し、５％ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１時間培養した。その後、非接着性の細胞をセルストレイナーで濾過後、４００ｘｇで５分間遠心分離し集めた。次に集めた細胞を２ｍｌの低張液〔水（１Ｌ）にＮＨ４Ｃｌ（８．２９ｇ）、ＫＨＣＯ３（１．０ｇ）およびＥＤＴＡ／２Ｎａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ；同仁化学研究所製）（３７ｍｇ）を溶かしたもの〕に懸濁し、３分間放置して赤血球を破砕した。これに１０ｍｌの１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ１９９を加え、４００ｘｇで５分間遠心分離して集めた細胞を心筋細胞とした。
このようにして調製したラット新生仔由来初代心筋細胞を３ｘ１０５個／ｍｌとなるように、１０％牛胎仔血清を含むＭｅｄｉｕｍ１９９に懸濁し、４８穴プレートに０．５ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、５％ＣＯ２、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター中で１日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないＭｅｄｉｕｍ１９９と２回交換して血清を除去し、ラットＭＩＦを加えてさらに１時間培養した後、１０μＭのＮＯＲ３（（±）−（Ｅ）−４−Ｅｔｈｙｌ−２−［（Ｅ）−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ］−５−ｎｉｔｒｏ−３−ｈｅｘｅｎａｍｉｄｅ；同人化学研究所製）を添加してさらに３時間または６時間培養した。なお、ラットＭＩＦは参考例２で得られたラットＭＩＦをＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｅｒ（アマシャム・バイオサイエンス社）を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（アマシャム・バイオサイエンス社製）でゲルろ過してさらに精製した後、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（ピアス社製）でエンドトキシン除去したものを用いた。
培養終了後、ＲＮｅａｓｙ  ９６  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＲＮＡを精製し、以下のプライマー及びプローブを用いてリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）にてＨＯ−１及びＧＳＴ  ＹａのｍＲＮＡ量を定量した。
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ＨＯ−１ｍＲＮＡはＭＩＦ添加４時間後に、ＧＳＴ  Ｙａ  ｍＲＮＡはＭＩＦ添加７時間後に回収したｍＲＮＡを用いて測定した。
結果を図６に示す。これにより、ＭＩＦがＡＲＥによって発現を支配されているＧＳＴ  ＹａやＨＯ−１の発現を亢進することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
（ａ）ＭＩＦまたはその改変体はＡＲＥ活性化剤として、（ｂ）ＭＩＦまたはその改変体と、ＭＩＦに結合する能力を有する物質（例、１，３−ベンゾチアジノン誘導体、抗体など）との組み合わせはＡＲＥ活性化剤として、安全で優れた細胞死抑制剤、例えば循環器系疾患、骨・関節疾患、感染症疾患、炎症性疾患、腎疾患、中枢疾患、癌、糖尿病等の予防・治療剤として有用である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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