(57)【要約】  遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、セリシン、その加水分解物又はそれらの化学修飾体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む混合物１を固相基材３に固着してあるトランスフェクションデバイス。
2009028421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、セリシン、その加水分解物、及びそれらの化学修飾体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む混合物を固相基材に固着してあるトランスフェクションデバイス。
【請求項２】
前記遺伝子試料は、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボ核酸、リボ核酸、アプタマー、あるいはこれらの化学修飾誘導体からなる群から少なくとも１種を選択する請求項１記載のトランスフェクションデバイス。
【請求項３】
前記遺伝子デリバリー材料は、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、ミネラルからなる群から少なくとも１種を含有する請求項１又は２に記載のトランスフェクションデバイス。
【請求項４】
前記混合物は、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物、細胞培養用培地成分又は、純水を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスフェクションデバイス。
【請求項５】
前記固相基材を構成する材料が、ガラス、合成高分子、金属類、天然高分子からなる群から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスフェクションデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞に外部から遺伝子試料（例えば、一本鎖又は、二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アプタマーあるいはこれらの化学修飾誘導体など）を導入するトランスフェクションデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスフェクション（遺伝子導入）を目的として遺伝子試料を固相基材に固着させたデバイスは、遺伝子治療用途や遺伝子解析用途に用いることが可能である。これまで報告されてきたトランスフェクションデバイス技術としては、遺伝子試料をゼラチンやフィブロネクチン等の細胞間マトリックスタンパク質と一緒に固着したものや（特許文献１，２又は非特許文献１参照）、遺伝子試料をリン酸カルシウム塩と一緒に固相表面に析出させたものなどがある（非特許文献２〜６参照）。
【特許文献１】米国特許第６５４４７９０号明細書
【特許文献２】米国特許第６９０５８７８号明細書
【非特許文献１】Ｊ．Ｚｉａｕｄｄｉｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃＤＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，１０７−１１０（２００１）．
【非特許文献２】Ｒ．Ｚ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ−ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，４８５−４８８（２００２）．
【非特許文献３】Ｔ．Ｏｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ：ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｐｅｌｌｅｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５，７０７−７１０（１９９９）
【非特許文献４】Ｋ．Ｈｏｎｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．２８９，１０７５−１０８１（２００１）
【非特許文献５】Ｔ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｎ−ｃｈｉｐ  ｓｉＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９６，２２７−２３２（２００４）．
【非特許文献６】Ｅ．Ｕｃｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎ−ｃｈｉｐ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＥＣＭ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｌｌａｇｅｎＩＶ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ．３７８，４０−４３（２００５）．
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、上記文献に記載される従来のトランスフェクションデバイス技術においては、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、細胞接着因子及びその誘導体を必要とした。フィブロネクチンやコラーゲンなどの細胞接着因子は、細胞表面のインテグリンレセプターなどと結合し細胞に外的刺激を入力する分子であり細胞機能に直接影響を与える分子である。そのため細胞接着因子をトランスフェクションデバイスに用いると、遺伝子導入以外に副作用として細胞機能影響（分化誘導、増殖亢進・抑制など）を及ぼすことが予想される。遺伝子試料の導入による細胞機能への影響を調べることを目的としたトランスフェクションデバイスにおいては、副作用を生じさせない物質を用いることが望まれる。
【０００４】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、高い遺伝子材料導入効率と再現性、並びに副作用の少ないトランスフェクションを実現し得る新規なトランスフェクションデバイスを提供するものである。
【０００５】
上記目的を達成するための本発明のトランスフェクションデバイスの第一特徴構成は、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、セリシン、その加水分解物、及びそれらの化学修飾体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む混合物を固相基材に固着した点にある。
【０００６】
〔作用及び効果〕
本発明のトランスフェクションデバイスは、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料、細胞接着因子または、哺乳動物由来成分を含むものを固相基材に固着してある従来のトランスフェクションデバイスと比較して、同等又はそれ以上の遺伝子導入効率及び再現性を有している。さらに、従来のトランスフェクションデバイスでは、細胞接着因子または、哺乳動物由来成分を含有する固相基材上にて細胞分化や増殖（以下、副作用と称する）への影響が懸念されているのに対し、本発明では、そのような細胞接着因子または、哺乳動物由来成分を一切用いていないため、それらの副作用を生じさせることの少ない固相表面を提供できる。これにより、トランスフェクションデバイスの実用性、汎用性の向上が期待できる。さらに、セリシンは絹糸の精錬過程における水溶性分であり、加圧・加熱滅菌操作を行っても、その作用活性に変化がない。細胞接着因子または、哺乳動物由来成分は、加圧・加熱滅菌操作により生理活性を失うことから、セリシン化合物（セリシン、その加水分解物又はそれらの化学修飾体）とは大きく異なる。さらに、セリシン化合物の有する抗酸化作用・細胞保護効果による、トランスフェクション時の細胞毒性の緩和が期待できる。
副次的効果として、細胞接着因子はその精製工程が複雑で、非常に高価であるが、本発明では、比較的容易に精錬工程における水溶性分から分離精製可能なセリシン化合物を用いることで、安価かつ同等以上の、トランスフェクションデバイスを提供できる点にある。
尚、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料に加え、セリシン、その加水分解物又はそれらの化学修飾体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を固相基材に固着することで、例えば、細胞接着因子の存在に基づく分化誘導、増殖亢進・抑制による影響を受けずに遺伝子試料の導入による細胞機能への影響を測定することができ、トランスフェクションデバイスとしての実用性、汎用性が向上できるという知見は、本発明者らの鋭意研究によって初めて見出されたものである。
【０００７】
本発明の第２特徴構成は、前記遺伝子試料が、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボ核酸、リボ核酸、アプタマー、あるいはこれらの化学修飾誘導体からなる群から少なくとも１種を選択した点にある。
【０００８】
〔作用及び効果〕
遺伝子試料を一本鎖又は二本鎖のデオキシリボ核酸或いはリボ核酸とした場合、遺伝子の過剰発現、アンチセンス効果及び、ＲＮＡ干渉などが期待される。これによって、遺伝子の機能解析が可能となる。これら核酸の化学修飾は、核酸の安定化や非特異的反応を導くことが期待できる。
遺伝子試料をアプタマーとした場合、標的とするタンパク質に強固に結合することによって、機能阻害を生じさせることが可能である。特に化学修飾されたアプタマーでは、安定化及び非特異的反応を抑制する働きのほかに、ターゲットタンパク質の特異的ラベル化等の用途がある。
【０００９】
本発明の第３特徴構成は、前記遺伝子デリバリー材料が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、ミネラルからなる群から選択される少なくとも１種を含有する点にある。
【００１０】
〔作用及び効果〕
遺伝子デリバリー材料は、遺伝子試料を細胞に導入する際、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、細胞膜との融合などを誘導する物質である。当該遺伝子デリバリー材料が、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、ミネラルからなる群から選択される少なくとも１種を含有すれば、効率的に遺伝子試料を細胞内に送り込むことが可能となる。
【００１１】
本発明の第４特徴構成は、前記混合物が、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物、細胞培養用培地成分又は、純水を含む点にある。
【００１２】
〔作用及び効果〕
本構成のように混合物が、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物、細胞培養用培地成分又は、純水を含むものを固相基材に固着すると、遺伝子導入効率を向上させることができる。
本発明のトランスフェクションデバイスは、遺伝子試料、遺伝子デリバリー材料、細胞接着因子を含むものを固相基材に固着してある従来のトランスフェクションデバイスに比べて、細胞によって差はあるものの、およそ２倍から１０倍程度、遺伝子導入効率を向上させることが可能であり、その結果、高い再現性を確保することができる。これにより、トランスフェクションデバイスの実用性の向上が期待できる。
【００１３】
本発明の第５特徴構成は、前記固相基材を構成する材料が、ガラス、合成高分子、金属類、天然高分子からなる群から選択される点にある。
【００１４】
〔作用及び効果〕
固相基材を構成する材料が、硬質板（ガラス・プラスチック・金属類）の場合は、細胞アレイなどの基材として適した環境を提供することができる。特に光透過性の高い基材では、顕微鏡観察などが容易に可能となり、金属などの導電基材では、電位変化の測定などが可能となる。
軟質板（高分子フィルムなど）では、シート状トランスフェクションデバイスの提供や、パッチ基材などへ適用可能である。
基材が、粒子及び高分子マトリクスの場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏデリバリーや、徐放化基材への利用用途が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】は、固相基材としてガラススライドを用いた場合の本発明のトランスフェクションデバイス（ガラスアレイ）の製造方法（一例）を示す図である。
【図２】は、固相基材としてマルチウェルプレートを用いた場合の本発明のトランスフェクションデバイスの製造方法（一例）の概要を示す図である。
【図３】は、実施例１にて使用した５６種類の試料の溶液組成を示す図である。
【図４】は、本発明のトランスフェクションデバイスにおける蛍光画像を示す図である。
【図５】は、本発明のプラスミドＤＮＡトランスフェクションデバイスを使用してトランスフェクションを実施する手順（概要）を示す図である。
【図６】は、本発明のプラスミドＤＮＡトランスフェクションデバイスにおける蛍光画像（ａ）及び位相差画像（ｂ）を示す図である。
【図７】は、本発明のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスを使用してトランスフェクションを実施する手順（概要）を示す図である。
【図８】は、本発明のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスにおけるトランスフェクション結果を示す図である。
【図９】は、本発明のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスを使用してトランスフェクションを実施する手順（概要）を示す図である。
【図１０】は、本発明のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスにおけるトランスフェクション結果（ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスのｓｉＲＮＡ導入による阻害効果測定結果）を示す図である。
【図１１】は、実施例５にて使用した６種類の試料の溶液組成を示す図である。
【図１２】は、本発明のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスにおけるトランスフェクション結果（加熱滅菌後のセリシン加水分解物溶液の活性保持）を示す図である。
【図１３】は、実施例６にて使用した混合液の溶液組成を示す図である。
【図１４】は、本発明のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスにおけるトランスフェクション結果（セリシンの細胞毒性の緩和効果）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の実施の形態を説明する前に、特許請求の範囲及び明細書にて用いられる用語について以下に説明する。【００１７】
（遺伝子試料）
本発明に適用可能な遺伝子試料としては、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボ核酸（例えばプラスミドＤＮＡ等）、リボ核酸（例えばｓｉＲＮＡ等）、アプタマー、あるいはこれらの化学修飾誘導体等が挙げられる。【００１８】
（遺伝子デリバリー材料）
本発明に適用可能な遺伝子デリバリー材料としては、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、ミネラル等が挙げられ、これらを単独で、あるいは任意に組み合わせて使用することができる。【００１９】
（セリシン、その加水分解物、及びそれらの化学修飾体）
本発明に適用可能なセリシンとは、繭糸又は生糸に存在する天然タンパク質であり、繭糸又は生糸から非加水分解物の状態で得られたものをいう。
本発明に適用可能なセリシンの加水分解物とは、天然のセリシンに対して適当な酸・アルカリ・酵素等を使用して加水分解処理して得られた種々の分子量を有するペプチド若しくはポリペプチドの混合物、天然のセリシンを加水分解処理した際に得られる特定のアミノ酸配列を有するペプチド若しくはポリペプチドあるいはそのような特定のアミノ酸配列を有するペプチド若しくはポリペプチドを化学合成や遺伝子工学的手法によって人工的に得られたもの等であって、且つ、遺伝子導入能を有するものをいう。
尚、本発明においては、特に５，０００〜４０，０００程度の分子量を有するセリシン加水分解物が好ましい。
本発明に適用可能なセリシン又はその加水分解物の化学修飾体とは、セリシン又はその加水分解物に適当な置換基（アルキル基等）を導入したものや、あるいは、セリシン又はその加水分解物のアミノ酸配列の１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであっても良く、遺伝子導入能を有するものであれば、これらに限定されるものではない。【００２０】
（固相基材）
本発明に適用可能な固相基材を構成する材料としては、例えば、ガラス、合成樹脂や合成繊維等の合成高分子、金属類、天然樹脂や天然繊維等の天然高分子等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、本発明に適用可能な固相基材の形状としては、例えば、板状体、マルチウェルプレート、織布、ニードル、多孔性繊維、ビーズ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００２１】
（溶媒）
本発明に適用可能な溶媒としては、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む水溶液、細胞培養用培地成分を含む水溶液、又は純水等が挙げられる。【００２２】
（プリント装置）
本発明に適用可能なプリント装置としては、例えば、インクジェットプリンターやリキッドハンドリング装置等が挙げられるが、これに限定されるものではない。【００２３】
（細胞）
本発明のトランスフェクションデバイスを使用して遺伝子試料を導入し得る細胞としては、培養可能な真核細胞であれば任意の細胞に適用可能であり、例えば、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）等が挙げられるがこれに限定されるものではない。【００２４】
次いで、以下に本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
〔第１実施形態〕
図１は、固相基材としてガラススライドを用いた場合の本発明のトランスフェクションデバイス（ガラスアレイ）の製造方法（一例）を示したものである。
図１（ａ）に示すように、例えばエッペンドルフチューブなどの適当な容器において、例えば１０μＬ〜２５μＬの前記溶媒に、例えば０．１μｇ〜５μｇの前記遺伝子試料を溶解させた後、例えば０．１μＬ〜１０μＬの前記遺伝子デリバリー材料を加えて混合し、例えば室温にて２０分間の所定条件下にて反応させる。
所定の反応時間が経過した後、その反応液に、セリシン、その加水分解物及びそれらの化学修飾体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を、例えば０．００１μｇ〜１ｍｇ加えて混合して、混合液１を調製する。【００２５】
次いで、図１（ｂ）に示すように、その混合液１を、適当なプリント装置２により、固相基材であるガラススライド３上へプリントしてスポット形成し、自然乾燥で完全に乾燥させる。
また、トランスフェクション（遺伝子導入）を実施する際は、図１（ｂ）に示すように、スポット形成されたガラススライド３をシャーレ５内に収容し、適当な細胞を含有する細胞懸濁液４を注ぎ込んで播種し、細胞培養を行うことで遺伝子導入が完了する。
尚、遺伝子導入された細胞は、混合液１のプリント領域（スポット領域）のみで観察される。【００２６】
〔第２実施形態〕
図２は、固相基材としてマルチウェルプレートを用いた場合の本発明のトランスフェクションデバイスの製造方法の一例の概要を示したものである。
所望の遺伝子試料、及び適当な遺伝子デリバリー材料を適切な溶媒中にて溶解したものに、セリシン、その加水分解物及びそれらの化学修飾体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに加えて混合して混合液を調製し、その混合液をマルチウェルプレート上の各ウェル６にリキッドハンドリング装置などを使用して分注した後、真空乾燥装置により乾固させて製造する。
トランスフェクション（遺伝子導入）を実施する際は、遺伝子試料等が固着されている前記各ウェル中に、適当な細胞を含有する所定の量の細胞懸濁液を注ぎ込んで播種し、細胞培養を行うことで遺伝子導入が完了する。【００２７】
（実施例１）
従来のトランスフェクションデバイスでは、フィブロネクチンなどの細胞接着因子を用いたデバイス製造を行っていたが、本実施例では、接着因子及び、細胞接着因子ではない生体由来成分（アルブミン複合体、アルブミン）を用いることなく、セーレン株式会社により製造されたセリシン加水分解物（分子量５，０００〜４０，０００程度）をトランスフェクションデバイス製造に用いた。【００２８】
本実施例にて使用した遺伝子試料（ＤＮＡ）は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するプラスミドＤＮＡ）であり、このプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）は、エンドトキシン除去工程を経て生成されたものを使用し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）及びＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）を含まない滅菌蒸留水に溶解して、１μｇ／μＬに調製したものを使用した。
また、溶媒として、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地成分（細胞培養用培地成分）を含む水溶液）を使用し、遺伝子デリバリー材料として、ＬＦ２０００（市販のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（インビトロジェン社製））を使用した。【００２９】
図３に示される溶液組成にて、５６種類の混合液（試料１〜５６）を調製した。試料１〜８については、セリシン加水分解物の替わりにフィブロネクチンを使用した。その後、ガラススライドのデバイス上に１試料につき９スポットずつプリントした。次いで、ＨｅＬａ細胞（５×１０4ｃｅｌｌ/ｍＬ）を播種して、４８時間の細胞培養を経た後、導入した遺伝子試料ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）の発現により生成された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の蛍光画像を取得してトランスフェクションの確認を行った。その蛍光画像を図４に示した。
その結果、セリシン加水分解物を使用したものは、フィブロネクチンを用いた場合と比較しても同等かそれ以上のトランスフェクション効率・局在性を有していることが明らかとなった。【００３０】
（実施例２）
固相基材として１５３６ウェルのマルチウェルプレート（ＮＵＮＣ  １５３６  ＷＥＬＬ  Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅｓ，Ｎｏ．１５３６１３  Ｇｒｅｉｎｅｒ  １５３６  Ｂｌａｃｋ  ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ７８２０９２（ｗｉｔｈ  ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ，ＨＩ−Ｂａｓｅ））を使用して、プラスミドＤＮＡトランスフェクションデバイス（本発明のトランスフェクションデバイスの一例）を作製した。【００３１】
作製したプラスミドＤＮＡトランスフェクションデバイスについて、以下に記載の条件下でトランスフェクションを実施し、セリシン加水分解物が、プラスミドＤＮＡトランスフェクションデバイスにおいて有効に機能し得るかどうかを確認した。【００３２】
図５に示すように、遺伝子試料ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（０．５μｇ〜２．０μｇ）、遺伝子デリバリー材料ＬＦ２０００（０．５μＬ〜８．０μＬ）、滅菌済み純水（４０μＬ〜４９μＬ）、及び０．２ｍｇ/ｍＬ〜８ｍｇ/ｍＬのセリシン加水分解物溶液（セーレン株式会社製）（５μＬ〜５０μＬ）を混合して混合液を調製した。この混合液を、上記マルチウェルプレートの各ウェル中に、１ウェル当たり０．５μＬ〜４μＬとなるようにリキッドハンドリング装置などを使用して分注し、２時間以上真空乾燥装置により完全に乾固させた。
そして、１ウェル当たり約５００個のＨｅＬａ細胞を播種し、２４時間の細胞培養を経た後、導入した遺伝子試料ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）の発現により生成された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の蛍光画像を倒立型顕微鏡ＩＸ−７１（オリンパス株式会社製）を使用して取得し、トランスフェクションの確認を行った。その蛍光画像を図６（ａ）に示す。【００３３】
また、２４時間の細胞培養を経た細胞について、位相差顕微鏡を使用してその位相差画像を取得し、細胞毒性による細胞の形態変化の有無を確認した。その位相差画像を図６（ｂ）に示す。【００３４】
図６（ａ）に示されるように、本実施例のプラスミドＤＮＡトランスフェクションデバイスにおいて、高いトランスフェクション効率が確認されたと共に、図６（ｂ）の結果から、本実施例においては特に細胞の形態的な変化が見られず、細胞毒性も確認されなかった。【００３５】
（実施例３）
固相基材として１５３６ウェルのマルチウェルプレート（ＮＵＮＣ  １５３６  Ｗｅｌｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂａｓｅ  Ｐｌａｔｅｓ，Ｎｏ．１６４７０８）を使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイス（本発明のトランスフェクションデバイスの一例）を作製した。
作製したｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスについて、以下に記載の条件下でトランスフェクションを実施し、セリシン加水分解物が、ｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスにおいて有効に機能し得るかどうかを確認した。【００３６】
本実施例にて使用した遺伝子試料ｐＤｅＲｅｄ２−１は、プラスミドＤＮＡであるが、プロモータを有しないため発現せず、本実施例においては単なる核酸のキャリアとして使用した。また、このプラスミドＤＮＡ（ｐＤｅＲｅｄ２−１）は、エンドトキシン除去工程を経て生成されたものを使用し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）及びＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）を含まない滅菌蒸留水に溶解して、１μｇ／μＬに調製したものを使用した。
また、本実施例にて使用した遺伝子試料ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（キアゲン社製：カタログ番号１０２２０７６）及びｓｉＣＯＮＴＲＯＬ  ＴＯＸ（ダーマコン社製：カタログ番号Ｄ−００１５００−０１−０５）である。
また、溶媒として滅菌済み純水を使用し、遺伝子デリバリー材料としてＬＦ２０００を使用した。細胞数の測定には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（Ｄ-ＰＢＳにより４倍に希釈したもの：プロメガ社製）を使用した。【００３７】
図７に示すように、遺伝子試料としてｐＤｅＲｅｄ２−１（０．５μｇ〜２．０μｇ）および２０μＭ  ｓｉＲＮＡ（ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ  ＴＯＸ（以下、ｓｉＴＯＸと略称する））（１μＬ〜１０μＬ）、遺伝子デリバリー材料ＬＦ２０００（０．５μＬ〜８．０μＬ）、純水（３０μＬ〜４８μＬ）、及び、０．２ｍｇ/ｍＬ〜８ｍｇ/ｍＬのセリシン加水分解物溶液（セーレン株式会社製）（５μＬ〜５０μＬ）を混合して混合液を調製した。
当該混合液を、上記マルチウェルプレートの各ウェル中に、リキッドハンドリング装置などを使用して所定量（１ウェル当たり０．５μＬ〜４μＬ）ずつ分注し、２時間以上真空乾燥装置により完全に乾固させた。そして、１ウェル当たり約５００個のＨｅＬａ細胞を播種し、４８時間の細胞培養を経た後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬を加えて１時間放置し、蛍光量をプレートリーダーで取得した。【００３８】
尚、トランスフェクションの確認については、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを含有するウェル（ネガティブコントロールｓｉＲＮＡによるトランスフェクトを行うウェル）の蛍光量と、ｓｉＴＯＸを含有するウェル（ｓｉＴＯＸによるトランスフェクトを行うウェル）の蛍光量との比較を行って確認した。【００３９】
また、本実施例のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスにおける細胞毒性を評価するため、トランスフェクションを実施しない未処理のＨｅＬａ細胞（約５００個）を含有するウェルを用意して、その蛍光量についても同時に測定した。
ネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞内に導入されてもその細胞の細胞死を生じさせないｓｉＲＮＡであり、ｓｉＴＯＸは、ＨｅＬａ細胞内に導入されるとその細胞の細胞死を引き起こし得るｓｉＲＮＡである。
即ち、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入しても細胞は生存し得るが、ｓｉＴＯＸを導入された細胞は、細胞死を引き起こされて死滅し得る。【００４０】
また、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬は、生細胞が酸化還元色素（レサズリン）を蛍光産物（レゾルフィン）に変換し得るという性質を利用することによって、蛍光で細胞の生存性をモニタリングすることが可能となる試薬であり、蛍光量は、生細胞数に比例する。
即ち、トランスフェクションの確認については、導入したｓｉＲＮＡの細胞増殖阻害効果を指標としており、上記ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、又はｓｉＴＯＸを細胞にトランスフェクションし、それらの細胞の生死をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬により確認して生細胞数（蛍光量）を比較することによって、トランスフェクション効率を測定することができる。【００４１】
図８に示されるように、本実施例のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスにおいては、トランスフェクトを行わない場合（何も含まないウェルに細胞を播種しただけのものであって、図８において未処理と略称する）と、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合（図８において、ネガティブコントロールと略称する）とではその蛍光量にほとんど差がなく、細胞毒性はほとんど確認されなかった。
また、ｓｉＴＯＸをトランスフェクトした場合（図８において、ｓｉＴＯＸと略称する）については、未処理やネガティブコントロールと比べてその蛍光量（生細胞数）が非常に少なく、ｓｉＴＯＸが確実に細胞に導入されたものと考えられ、高いトランスフェクション効率が確認された。
尚、本実施例におけるネガティブコントロールとｓｉＴＯＸとの間のＺ´因子（Ｚ´ｆａｃｔｏｒ）値は、０．４０９であった。このことは、ネガティブコントロールとｓｉＴＯＸとの間には、その蛍光量において明確な差が生じており、本実施例のｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスが、高いｓｉＲＮＡ導入効率を有することを示唆するものである。【００４２】
（実施例４）
ＴＲＡＩＬ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）は、アポトーシス誘導活性が確認されているサイトカインの一種であり、ＴＲＡＩＬの存在下において細胞培養を実施した場合、略全ての細胞がアポトーシスによって死滅し得ることが知られている。
一方、図９の配列番号１〜５に示されるｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＲＰ５４ｃ、ｓｉＳＲＰ５４ｄ、ｓｉＳＲＰ７２ａ、ｓｉＳＲＰ７２ｃ、及びｓｉＤＲ４）については、３８４ウェルを用いた液相系トランスフェクションスクリーニングにおいて、ＴＲＡＩＬにより誘導されるアポトーシスを阻害し得ることが、Ａｚａ−Ｂｌａｎｃらによって既に報告されている（公知文献：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１２，６２７−６３７，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００３参照）。【００４３】
本実施例においては、配列番号１〜５に示される上記ｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイスを作製し、これらのｓｉＲＮＡによるアポトーシス阻害効果を再現できるかどうかの確認を行った。【００４４】
図９に示す実験系を用いて、１５３６ウェル固相系トランスフェクションデバイスにて、配列番号１〜５に示されるｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞へ導入し、ＴＲＡＩＬが誘導するアポトーシスを阻害する効果が確認できるかどうか実験を行った。
固相基材として１５３６ウェルのマルチウェルプレート（ＮＵＮＣ  １５３６  Ｗｅｌｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂａｓｅ  Ｐｌａｔｅｓ，Ｎｏ．１６４７０８）を使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションデバイス（本発明のトランスフェクションデバイスの一例）を作製した。【００４５】
本実施例にて使用した遺伝子試料ｐＤｅＲｅｄ２−１は、実施例３と同じものとした。
本実施例にて使用した遺伝子試料であるネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（キアゲン社製：Ａｌｌｓｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ  カタログ番号１０２７２８０）を、ｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したものである。
配列番号１及び２にて示されるｓｉＲＮＡ（遺伝子試料）は、アポトーシス時に発現し得るＳＲＰ５４遺伝子の塩基配列における２つの異なる塩基配列領域をそれぞれターゲットとしており、ｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したものである。
配列番号３及び４にて示されるｓｉＲＮＡ（遺伝子試料）は、アポトーシス時に発現し得るＳＲＰ７２遺伝子の塩基配列における２つの異なる塩基配列領域をそれぞれターゲットとしており、ｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したものである。
配列番号５にて示されるｓｉＲＮＡ（遺伝子試料）は、アポトーシス時に発現し得るＤＲ４遺伝子の塩基配列の一部をターゲットとしており、ｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したものである。
溶媒として滅菌済み純水を使用し、遺伝子デリバリー材料としてＬＦ２０００を使用した。【００４６】
遺伝子試料としてｐＤｅＲｅｄ２−１（０．５μｇ〜２．０μｇ）および遺２０μＭ  ｓｉＲＮＡ（配列番号１〜５に示されるｓｉＲＮＡ、及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡ）（１μＬ〜１０μＬ）、遺伝子デリバリー材料ＬＦ２０００（０．５μＬ〜８．０μＬ）、純水（３０μＬ〜４８μＬ）、及び、０．２ｍｇ/ｍＬ〜８ｍｇ/ｍＬのセリシン加水分解物溶液（セーレン株式会社製）（５μＬ〜５０μＬ）を混合して、上記ｓｉＲＮＡの種類に対応する６種類の混合液（６試料）を調製した。各試料を、上記マルチウェルプレート（１５３６ウェル）の各ウェル（１試料に付き８ウェル）中に、リキッドハンドリング装置などを使用して所定量（１ウェル当たり０．５μＬ〜４μＬ）ずつ分注し、２時間以上真空乾燥装置により完全に乾固させることにより製造した。
そして、１ウェル当たり約５００個のＨｅＬａ細胞を播種し、ＤＥＭＥ及び１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）の存在下で４８時間の細胞培養を行った。次いで、ＴＲＡＩＬ（０．５μｇ／ｍＬ）を含む培地（ＤＭＥＭ及び１％ＦＢＳ）に培地交換してさらに２０時間細胞培養した後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（プロメガ社製）を加えて１時間放置し、蛍光量をプレートリーダーで取得した。【００４７】
図１０にその結果を示した。１試料につき８検体（ｎ＝８）あることから、それらの平均値を算出してグラフ化した（Ｐ＜０．０１）。
この結果、対照としたネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞（図１０において、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡと略称する）は、ＴＲＡＩＬ存在下で殆どが死滅していることと比較して、配列番号１〜５に示されるｓｉＲＮＡ配列を導入した細胞（図１０において、それぞれｓｉＳＲＰ５４ｃ、ｓｉＳＲＰ５４ｄ、ｓｉＳＲＰ７２ａ、ｓｉＳＲＰ７２ｃ、及びｓｉＤＲ４と略称する）では、細胞の生存割合が有為に向上していることが明らかとなった。このことから、１５３６ウェル固相系トランスフェクションデバイスにおいて、効率よくｓｉＲＮＡ導入が行われていることが確認できた。【００４８】
（実施例５）
フィブロネクチンなどの生体由来分子は加熱滅菌を行うことにより、その活性を失うため、滅菌にはフィルター滅菌を用いている。一方セリシンは、精練過程からの抽出成分であるため、加熱滅菌してもその生理活性に変化が無いことが特徴である。
オートクレーブにて１２１℃、２０分で加熱滅菌を行ったセリシン加水分解物溶液（１ｍｇ／ｍＬ：セーレン株式会社製）を使用して、マルチウェルプレート（１５３６ウェル）を使用してＨｅＬａ細胞へのｓｉＲＮＡ導入を行って、フィルター孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）でフィルター滅菌したセリシン加水分解物溶液（１ｍｇ／ｍＬ：セーレン株式会社製）との活性の違いを比較した。【００４９】
本実施例にて使用した遺伝子試料であるネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（キアゲン社製：カタログ番号１０２２０７６）を、ｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したものである。
また、遺伝子試料であるｓｉＲＮＡは、ｓｉＴＯＸ（ダーマコン社製：カタログ番号Ｄ−００１５００−０１−０５）、及び、ＫＩＦ１１−７（キアゲン社製：カタログ番号ＳＩ０２６５３７７０）を、それぞれｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したものである。
溶媒として滅菌済み純水を使用し、遺伝子デリバリー材料としてＨｉＰｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製：カタログ番号３０１７０２）を使用した。【００５０】
図１１に示される組成の６種類の混合液（試料５７〜試料６２）を調製し、上記マルチウェルプレートの各ウェル中に所定量（１ウェル当たり１μＬ〜６μＬ）ずつ分注した後、真空乾燥機により完全に乾燥させて１５３６ウェルトランスフェクションデバイスを作製した。
真空乾燥後の１５３６ウェルトランスフェクションデバイスに、ＨｅＬａ細胞（１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、１ウェル当たり４μＬとなるように播種し、炭酸ガスインキュベータ内にて４８時間培養を行った。その後、細胞数の測定にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（プロメガ社製）を使用して、ｓｉＲＮＡ導入細胞の細胞増殖に与える影響を評価した。【００５１】
その結果、図１２に示すように、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを細胞導入した場合（図１２おいて、ネガティブコントロールと略称する）においては、フィルター滅菌したセリシン加水分解物溶液、オートクレーブ滅菌したセリシン加水分解物溶液のどちらを使用した場合にも、顕著な細胞毒性は見られなかった。一方、細胞増殖抑制効果が確認されているｓｉＴＯＸ、及びＫＩＦ１１−７を細胞導入した場合（図１２おいて、それぞれｓｉＴＯＸ及びＫＩＦ１１−７と略称する）には、フィルター滅菌又はオートクレーブ滅菌のいずれの方法で滅菌処理したセリシン加水分解物溶液を用いても、明瞭な細胞増殖阻害効果が確認された。この結果から、オートクレーブ滅菌を行っても、セリシンの活性（核酸導入効率向上）には変化が見られなかった。【００５２】
（実施例６）
固相系遺伝子導入では、溶液を基板上にプリントした後に乾燥させる工程を含む。この工程では、溶液中に溶け込んでいる成分が析出し、時にはこれが細胞増殖を抑制、つまり、細胞毒性を生じる場合がある。フィブロネクチンを含有するトランスフェクションデバイスでは、プリント溶液組成により細胞毒性が観察されることがあった。
セリシンには、細胞保護効果があることが知られているが、トランスフェクションデバイスにおいて細胞毒性の緩和効果が観察されるかどうか、フィブロネクチンを対象として比較検討を行った。【００５３】
本実施例にて使用した遺伝子試料ｐＤｅＲｅｄ２−１は、実施例３と同じものとした。
本実施例にて使用した遺伝子試料であるｓｉＲＮＡは、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（キアゲン社製：カタログ番号１０２２０７６）を、ｓｉＲＮＡ溶解用溶媒（キアゲン社製）に２０μＭの濃度で溶解したものである。
溶媒として滅菌済み純水及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を使用し、遺伝子デリバリー材料としてＬＦ２０００を使用した。細胞数の測定には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（プロメガ社製）を使用した。【００５４】
図１３に示される組成において、遺伝子試料（ｐＤｅＲｅｄ２−１、及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡ）及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を含有する第１溶液と、遺伝子デリバリー材料（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００）及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を含有する第２溶液とを調製し、第１溶液と第２溶液とを混合して混合液を調製した。
この混合液を、滅菌蒸留水にて溶解したセリシン加水分解物溶液（４ｍｇ／ｍＬ）、又は滅菌蒸留水にて溶解したフィブロネクチン溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を用いて所定の倍率（１．５倍〜２０倍）に希釈したものを、マルチウェルプレート（１５３６ウェル）の各ウェルに所定量（１μＬ〜６μＬ）ずつ分注した。その後、真空乾燥機により完全に乾燥させて１５３６ウェルトランスフェクションデバイスを作製した。【００５５】
真空乾燥後の１５３６ウェルトランスフェクションデバイスに、ＨｅＬａ細胞（１．２５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１ウェル当たり４μＬとなるように播種し、炭酸ガスインキュベータ内にて４８時間培養を行った。その後、細胞数の測定に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（プロメガ社製）を使用して、核酸導入細胞の細胞増殖に与える影響を評価した。【００５６】
その結果、図１４に示すように、フィブロネクチン溶液（図１４において、フィブロネクチンと略称する）を用いて希釈を行ったトランスフェクションデバイスに比べ、セリシン加水分解物溶液（図１４において、セリシンと略称する）を用いて希釈を行ったトランスフェクションデバイスにおいて、明瞭な細胞毒性の緩和効果が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、動物細胞に外部から遺伝子試料（例えば、一本鎖又は、二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アプタマーあるいはこれらの化学修飾誘導体など）を導入するトランスフェクションデバイスに利用できる。
【図１】
2009028421.tif 000003
【図２】
2009028421.tif 000004
【図３】
2009028421.tif 000005
【図４】
2009028421.tif 000006
【図５】
2009028421.tif 000007
【図６】
2009028421.tif 000008
【図７】
2009028421.tif 000009
【図８】
2009028421.tif 000010
【図９】
2009028421.tif 000011
【図１０】
2009028421.tif 000012
【図１１】
2009028421.tif 000013
【図１２】
2009028421.tif 000014
【図１３】
2009028421.tif 000015
【図１４】
2009028421.tif 000016
【配列表】
2009028421000001.app
【国際調査報告】
2009028421.tif 000017
2009028421.tif 000018
2009028421.tif 000019
2009028421.tif 000020