(57)【要約】EphA受容体のリガンド、例えばephrin-A多量体、具体例としてephrin-A1の細胞外ドメインのＣ端にIgG(Fc)フラグメントを融合させたephrin-A1-Fcを多量体化したephrin-A1多量体やヒトトロンボスポンディン５由来のCoiled-Coil domain部位（hTSP5cc）を用いて多量体化したephrin-A1多量体を側脳室又は線条体に注入し、中枢神経系における神経幹細胞を分化、増殖、遊走させ、パーキンソン病や線条体黒質変性症等の中枢神経変性による障害を回復させる。【選択図】図１４
2008093827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EphAに結合してEphAからのシグナル伝達を刺激するリガンドからなることを特徴とする脳室又は線条体注入用中枢神経障害治療剤。
【請求項２】
Ephrin-A多量体（２量体を除く）からなることを特徴とする脳室又は線条体注入用中枢神経障害治療剤。
【請求項３】
前記ephrin-A多量体は、ephrin-A細胞外ドメインのＣ端にIgG(Fc)フラグメントを融合させたephrinA-Fc融合蛋白を多量体化したephrin-A多量体である請求項２に記載の脳室又は線条体注入用中枢神経障害治療剤。
【請求項４】
前記ephrin-A多量体は、TSP5 coiled-coilドメインをephrin-A細胞外ドメインのＣ末端に融合させたephrin-A融合蛋白を多量体化した多量体である請求項２に記載の脳室又は線条体注入用中枢神経障害治療剤。
【請求項５】
前記ephrin-A多量体は、複数のTSP5 coiled-coilドメインをephrin-A細胞外ドメインのＣ末端に融合させたephrin-A融合蛋白を多量体化した多量体である請求項４に記載の脳室又は線条体注入用中枢神経障害治療剤。
【請求項６】
前記ephrin-Aはephrin-A1である請求項２〜５のいずれか１項に記載の脳室又は線条体注入用中枢神経障害治療剤。
【請求項７】
パーキンソン病を治療対象とすることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の脳室又は線条体注入用中枢神経障害治療剤。
【請求項８】
EphAに結合してEphAからのシグナル伝達を刺激するリガンドを脳室又は線条体に注入してEphAからのシグナル伝達を刺激することを特徴とする中枢神経障害の治療方法。
【請求項９】
ephrin-A多量体（２量体を除く）を脳室又は線条体に注入することを特徴とする中枢神経障害の治療方法。
【請求項１０】
ephrin-A細胞外ドメインのＣ端にIgG(Fc)フラグメントを融合させたephrinA-Fc融合蛋白を多量体化したephrin-A多量体を脳室又は線条体に注入することを特徴とする中枢神経障害の治療方法。
【請求項１１】
TSP5coiled-coilドメインをephrin-A細胞外ドメインのＣ末端に融合させたephrinA融合蛋白を多量体化したephrin-A多量体を脳室又は線条体に注入することを特徴とする中枢神経障害の治療方法。
【請求項１２】
複数のTSP5coiled-coilドメインをephrin-A細胞外ドメインのＣ末端側に融合させたephrin-A融合蛋白を多量体化したephrin-A多量体を脳室又は線条体に注入することを特徴とする中枢神経障害の治療方法。
【請求項１３】
前記ephrin-A多量体を単回、間歇的若しくは持続的注入することを特徴とする請求項９〜１２のいずれか１項に記載の中枢神経障害の治療方法。
【請求項１４】
パーキンソン病を治療対象とすることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか１項に記載の中枢神経障害の治療方法。
【請求項１５】
配列番号１で示される塩基配列を有する核酸。
【請求項１６】
配列番号２で示される塩基配列を有する核酸。
【請求項１７】
配列番号１で示される塩基配列から発現されたephrin-A多量体。
【請求項１８】
配列番号２で示される塩基配列から発現されたephrin-A多量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中枢神経障害治療剤及び中枢神経障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は国民の高齢化と共に増加しており、有病率は人口１０万人当たり約１００人、日本では現在１２万人ぐらいの患者がいると推定されている。現在の治療法の原則は、ドパミン産生細胞の変性により産生不足となっている黒質線条体ドパミンを補充してやること、線条体で相対的に優位となっているアセチルコリンを是正することにある。このため、第一選択薬としてレボドーパ製剤や抗コリン薬が広く使用され、劇的な効果を見ることが多い。しかし、神経変性疾患であるパーキンソン病では、最終的にはドパミン産生細胞が死滅することとなるため、上記のような治療法は対症療法であり根本的な治療とはならない。【０００３】
根本的なパーキンソン病の治療のために、胎児黒質細胞の移植が試みられているが、倫理的問題や患者の数に見合う十分な移植組織量の入手の問題などのため、標準的な治療とは考えられていない。米国においてDouble Blindで実施された培養胎児黒質細胞又は胎児黒質組織の移植臨床試験（非特許文献１、２）では、６０歳以下の患者ないしは症状の軽度な患者でごく軽度の改善がみられたのみであった。【０００４】
さらに、ヒトＥＳ細胞のドパミン作動性神経細胞への分化誘導及びその分化した細胞の移植が考慮されている。サルにおける研究では、十分量のドパミン作動性細胞を得ることは可能で、症状の改善も見られているが（非特許文献３）、細胞の分化制御や移植細胞の腫瘍化等も考慮に入れて人間に対する応用には慎重を要する。また、この方法は他者由来の細胞の移植であり、胎児黒質細胞の移植と同様に免疫学的拒絶反応や倫理問題も生ずる。【０００５】
第三番目の方法として、成人の脳内で脳室下層及び海馬に存在する神経幹細胞（ＮＳＣ）を刺激することにより損傷又は変性した中枢神経を再生しようとする試みがある。この方法には主として２種類の方法が包含されている。一つは神経幹細胞を培養して増殖・分化させた上で線条体内に戻す方法であり、他者は神経幹細胞を体外に取り出さずに線条体内に遊走を誘導してドパミン作動性細胞に分化させるものである。前者では十分な数の細胞を得ることが不可能とされており、臨床応用の目処はたっていない。後者に関しては、これまでに種々の生物活性因子が使用されて限定的な成功を収めている。TGFα、EGF、FGF2は神経幹細胞の増殖、遊走及びグリア系細胞への分化をもたらすが、線条体内のドパミン作動神経を増やすことはなかった（非特許文献４、５、６）。GDNFは神経保護と神経再生作用を持つ因子である。小規模の臨床試験で脳室内注入は無効であるが、線条体内注入では効果があるとされ、最近Double Blindで臨床試験が実施されたが、薬剤群とコントロール群の間で差は認められなかった（非特許文献７）。Neuroimmunophilinは神経再生作用があるとされているが、作用機序は不明であり、サル及び人間での短期間の試験では効果は明確でないとされている（非特許文献８、９）。【０００６】
かかる状況下において、本願発明者らは、神経幹細胞の増殖・遊走・分化させる因子を脳室に注入することにより、側脳室側面に局在している脳室下層神経幹細胞を増殖し、線条体に遊走させた上で、ドパミン作動性神経細胞に分化させることができるのではないかという仮定のもと、鋭意努力を重ねてきた。【０００７】
そこで、神経幹細胞も含めた種々の体性幹細胞の増殖に関与するとされ、その目的で汎用されている上記FGF2の受容体であるFGF受容体に着目してきたところ、活性化されたEphA4とFGF受容体が複合体を形成し、お互いにさらに活性しあうことを見いだした（非特許文献１０）。しかしながら、この複合体の下流にあるシグナル分子には、MAPK、PI-3 kinase、Rho-GEFなどがあり、体性幹細胞の増殖、遊走及び分化にそれらのシグナル分子の制御がどのような作用を果たしているのかは未知であった。【０００８】
Ephは、後述するように膜貫通型のチロシンキナーゼであって、そのリガンドであるephrinの結合により活性化されることはよく知られている(例えば、非特許文献１１)。これまでに、EphAのリガンドであるephrin-A1及びephrin-A2の細胞外ドメインとIgG(Fc)（IgGのFcフラグメント）の融合蛋白を抗IgG(Fc)抗体により多量体化したものを培養液に入れ、胚前脳由来神経前駆細胞の球状細胞塊や胚前脳スライスを培養したところ、これら胚由来神経前駆細胞のドパミン作動性神経細胞への分化が促進されたという報告もあるが（非特許文献１２）、ephrin-A多量体による神経前駆細胞の増殖や遊走に関与する作用は報告されていない。一方、ephrin-A単量体を直接脳内に注入しようとする試み（特許文献１）やephrin-B2-Fcやephrin-B1-Fcを脳室内に注入しようとする試みが行われている（非特許文献１３）。前者の試みはephrin-A2ないしephrin-A5単量体を投与してEphA7受容体による伝達を抑制したものである。ephrin単量体はEphを介するシグナル伝達を抑制することは既に知られている（非特許文献１４、１５）。特許文献１において、結果として神経幹細胞の増殖が認められているが、神経幹細胞を分化させて線条体内ドパミン産生細胞を増加させ、脳機能を回復させたとは到底言えるものではなかった。後者も、ephrin-B2-Fcやephrin-B1-Fcとその受容体であるEphBのシグナル伝達を遮断することによって、神経幹細胞の増殖をさせようとしたものである。さらに、これまでに脳室内や線条体に直接薬剤を注入し、EphA受容体への結合によりEphAを介在させたシグナル伝達を刺激することによって、神経幹細胞の増殖、遊走及び分化を促し、障害を受けた神経細胞を再生させたという報告もなく、Eph受容体に仲介されるシグナル伝達（刺激）が脳内神経細胞の再生に寄与することは考えられないことであった。【０００９】
本願発明者らは、引き続き研究を進めた結果、EphA4のリガンドであるephrin-Aを多量体化して側脳室又は線条体に直接注入したところ、線条体内でのドパミン作動性神経細胞の著明な増加を認め、本願発明を完成するに至った。すなわち、パーキンソンモデルラットの患側の側脳室内又は線条体内に多量体化したephrin-A（具体的にはephrin-A1）を１回ないし持続的に注入することにより、脳室下層神経幹細胞を増殖させ、遊走させ、患側線条体内ドパミン作動性神経細胞を増加させた。さらに、このラットの行動解析によりパーキンソン行動の改善が認められた。【００１０】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ０３／０４０３０４
【非特許文献１】Freed, et al., 2001, N Engl J Med 344:710-9
【非特許文献２】Olanow, et al., 2003, Ann Neurol 54:403-14
【非特許文献３】Takagi, et al., 2005, J Clin Invest 115:102-9
【非特許文献４】Martens, et al., 2002, Eur J Neurosci 16:1045-57
【非特許文献５】Wang, et al., 2004, Neurosci Lett 364:154-8
【非特許文献６】Kuhn, H.G.et al.,1997, J Neurosci 17(15):5820-9
【非特許文献７】Lang, et al., 2006, Ann Neurol 59:459-66
【非特許文献８】Gold and Nutt, 2002, Curr Opin Pharmacol 2:82-6
【非特許文献９】Tanaka and Ogawa, 2004, Curr Pharm Des 10:669-77
【非特許文献１０】Yokote, et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102:18866-71
【非特許文献１１】Wilkinson, 2001, Nat Rev Neurosci 2:155-164
【非特許文献１２】Aoki, et al., 2004, J Biol Chem 279(31):32643-32650
【非特許文献１３】Conover, et al., 2000, Nat Neurosci., 2000, 3:1091-1098
【非特許文献１４】Davis et al., 1994, Science, 266:816-819
【非特許文献１５】Vearing, and Lackmann, 2005, Growth Factors, 23:67-76
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、本発明は中枢において患者自身の神経幹細胞を分化させて、変性を受けた中枢神経による障害を有効に回復させることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明では、EphAに結合してEphAからのシグナル伝達を刺激するリガンド、具体的な例としてephrin-A多量体、より具体的には、ephrin-AとIgG(Fc)フラグメントからなるephrin-A-Fc融合蛋白を多量体化したephrin-A多量体若しくはephrin-AとTSP5 (thrombospondin 5) coiled-coilドメインからなるephrin-A融合蛋白を多量体化したephrin-A多量体を脳室下層又は線条体に注入することにしている。つまり、本発明の中枢神経障害治療剤は、例えばephrin-A細胞外ドメインのＣ端にIgG(Fc)フラグメントを融合させたephrin-A-Fcを多量体化したephrin-A多量体のように、EphAに結合してEphAからのシグナル伝達を刺激するリガンドからなり、側脳室又は線条体に直接注入されることを目的とする薬剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、脳室下層の神経幹細胞を増殖させ、線条体を含めた脳内に遊走させ、脳神経に分化させて各種の中枢神経障害を回復させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ベクターpMXs-IGの構成図である。
【図２】水泡性口内炎ウイルスの表面抗原をニワトリβ-actinプロモーター下に発現させるようにしたプラスミドpCAGVSVGの構成図である。
【図３】マウス胚由来の神経幹細胞（球状塊）の増殖に対する影響を示す写真であって、（ａ）は培地のみを、（ｂ）はIgG(Fc)多量体のみを、（ｃ）はephrin-A1多量体（ephrin-A1-Fc多量体）を、（ｄ）はFGF2を、（ｅ）はephrin-A1多量体とFGF2の両者を投与したものである。写真中のバーは５０μｍである。
【図４】（ａ）〜（ｅ）はそれぞれ、図１における枠囲みの部分を拡大した像を示す写真である。写真中のバーは５０μｍである。
【図５】マウス胚由来の神経幹細胞へのBrdUの取り込みを示した図である。レトロウイルスベクターを用いて各種分子（横軸の下に記載）を発現させ、それらの異なる分子を発現している細胞群個々について左から順にコントロール緩衝液、ephrin-A1多量体、FGF2、ephrin-A1多量体＋FGF2の薬剤を投与したものを示す。＊は、同じ薬剤で処理した、ベクター由来のEGFPのみを発現するレトロウイルスに感染させた細胞（Vector）と比べた場合にTukeyの複数群比較検定にてp<0.01（n＝４）と有意差があるものを示している。
【図６】マウス胚由来の神経幹細胞の自己再生能力を示した図である。図５と同様に各種分子（横軸の下に記載）発現細胞群個々について左から順にコントロール緩衝液、ephrin-A1多量体、FGF2、ephrin-A1多量体＋FGF2の薬剤を投与したものを示す。＊は、同じ薬剤で処理した、ベクター由来のEGFPのみを発現するレトロウイルスに感染させた細胞（Vector）と比べた場合にTukeyの複数群比較検定にてp<0.01（n＝４）と有意差があるものを示している。
【図７】成熟マウス側脳室への薬剤注入２日後の神経幹細胞増殖を示すネスチンの免疫染色顕微鏡写真であって、矢状断で側脳室側面を示している。（ａ）はコントロールとしてIgG(Fc)多量体のみを注入したもの、（ｂ）はephrin-A1多量体を注入したもの、（ｃ）はFGF2を注入したもの、（ｄ）ephrin-A1多量体＋FGF2を注入したものである。写真中のバーは１ｍｍである。
【図８】成熟マウス側脳室への薬剤注入５日後の神経幹細胞増殖を示すネスチンの免疫蛍光顕微鏡写真である。（ａ）はephrin-A1多量体（0.75μg）を注入したもの、（ｂ）はコントロールとしてIgG(Fc)多量体のみ（0.75μg）を注入したものである。写真中のバーは４０μｍである。
【図９】成熟マウス側脳室に薬剤注入２日後の神経幹細胞に特異的なネスチン量の増減を示す図である。（ａ）はウエスタンブロッティング図、（ｂ）はそのバンドの濃度を測定した図である。＊はｐ＜０．０２、＊＊はｐ＜０．０１で有意差があったことを示す。図（ａ）（ｂ）共に左から順に、IgG(Fc)多量体のみを注入したもの（コントロール）、ephrin-A1多量体を注入したもの、FGF2を注入したもの、ephrin-A1多量体＋FGF2を注入したものを示す。
【図１０】成熟正常ラット脳室下層細胞におけるephrin-Aの発現を示す写真である。各写真の右側は側脳室を、左側は脳室下層から線条体を示している。写真中のバーは５０μｍである。
【図１１】成熟正常ラット脳室下層細胞におけるEphAの発現を示す写真である。各写真の右側は側脳室を、左側は脳室下層から線条体を示している。写真中のバーは５０μｍである。
【図１２】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体又はコントールとしてIgG(Fc)多量体を注入してから６週間後の線条体内Tyrosine hydroxylase(ＴＨ)陽性細胞を示す写真である。同図（ａ）（ｂ）はephrin-A1多量体を投与したものであって、（ａ）は障害側を（ｂ）は同じラットの健側を、同図（ｃ）（ｄ）はIgG(Fc)多量体を投与したものであって、（ｃ）は障害側を（ｄ）は同じラットの健側を示す。写真中のバーは１ｍｍである。
【図１３】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体を注入してから６週間後の線条体におけるＴＨ陽性細胞の発現を示す写真である。（ａ）は障害側を、（ｂ）は同じラットの健側を示す。写真中のバーは１００μｍである。写真の矢印は薬剤の注入箇所を示す。
【図１４】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体又はコントロールとしてIgG(Fc)を注入してから６週間後の線条体におけるＴＨ陽性細胞の発現を示す写真である。（ａ）はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を注入したラットの障害側を、（ｂ）はephrin-A1多量体を注入したラットの障害側を示す。写真中のバーは１００μｍである。写真の矢印は薬剤の注入箇所を示す。
【図１５】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体を注入してから６週間後の線条体を示すＴＨ及びＤＡＴ（dopamine transporter）に対する間接二重免疫蛍光染色標本の写真である。（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）の合成写真、（ｂ）はＴＨ陽性細胞を示す写真、（ｃ）はＤＡＴ陽性細胞を示す写真である。写真中のバーは１０μｍである。
【図１６】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を１週間持続注入し、同時にBrdU（Bromodeoxyuridine）の腹腔内注入も実施した時のＴＨ陽性細胞の分布とBrdUを核内に取り込んだ細胞の分布を示す間接二重免疫蛍光染色標本の写真である。ＴＨ陽性細胞質とBrdUを取り込んだ核に分解して示している。（ａ）はephrin-A1多量体を注入したラットの障害側線条体を、（ｂ）はephrin-A1多量体を注入したラットの健側線条体を示す。また、（ｃ）はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を注入したラットの障害側線条体を、（ｄ）はコントロールとしてIgG(Fc)を注入したラットの健側線条体を示す。（ａ）（ｃ）ではそれぞれ左側の写真はＴＨ陽性細胞を、右側はBrdUを取り込んだ核を示し、（ｂ）（ｄ）ではそれぞれ左側の写真はBrdUを取り込んだ核を、右側の写真はＴＨ陽性細胞を示す。写真中のバーは１００μｍである。
【図１７】図１６と同じ組織内で、高倍率での共焦点顕微鏡下連続切片像を撮影することにより、TH陽性細胞とBrdU陽性細胞の関係を詳細に調べたものであって、パーキンソンモデルラットの障害側脳室にephrin-A1多量体を注入した後の障害側線条体における間接三重（TH、BrdU、DAPI）免疫蛍光染色標本の共焦点顕微鏡下での写真である。（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）（ｄ）の合成写真、（ｂ）はＴＨ陽性細胞質を示す写真、（ｃ）はBrdUを取り込んだ核を示す写真、（ｄ）はＤＡＰＩ染色を示す写真である。図に示す矢印は、ＴＨ陽性であると確認できた細胞、つまりドパミン作動性細胞である神経細胞を示している。
【図１８】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を１週間持続注入し、同時にBrdUの腹腔内注入を実施し、その操作終了６週間後の線条体におけるNeuNに対する抗体とBrdUに対する抗体による間接二重免疫蛍光染色の結果を示す写真である。（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）の合成写真、（ｂ）はBrdUを取り込んだ核を示す写真、（ｃ）はNeuN染色を示す写真である。
【図１９】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体を注入してから６週間後の線条体の組織染色を示す写真である。（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）（ｄ）の合成写真、（ｂ）はＴＨ陽性細胞を示す写真、（ｃ）はGFAP陽性細胞を示す写真、（ｄ）はDAPIで染色された核を示す写真である。図（ａ）の矢印は、ＴＨ陽性の神経細胞体が確認された部分を示している。写真中のバーは５０μｍである。
【図２０】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体及びEGFP発現レトロウイルスを注入してから６週間後の線条体におけるEGFPの発現を調べた結果を示す写真である。同図（ａ）はＴＨ陽性細胞を、同（ｂ）はEGFP発現細胞を、同（ｃ）はそれらの合成写真を示す。図の円はEGFP陽性でかつTH陽性の神経細胞（神経線維）が認められた部位を示す。写真中のバーは５０μｍである。
【図２１】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を１週間持続注入し、同時にBrdUの腹腔内注入を実施し、その操作終了６週間後、脳室下層におけるBrdUの取り込み及びS100βとGFAPの分布を示す間接二重免疫蛍光染色標本の写真である。（ａ）〜（ｄ）はIgG(Fc)多量体を注入したコントロールラットの障害側を、同図（ｅ）〜（ｈ）はephrin-A1多量体を注入したラットの障害側を示す写真であって、（ａ）（ｅ）はそれぞれ（ｂ）（ｃ）（ｄ）及び（ｆ）（ｇ）（ｈ）の合成写真、（ｂ）（ｆ）はS100β陽性細胞を示す写真、（ｃ）（ｇ）はGFAP陽性細胞を示す写真、（ｄ）（ｈ）はBrdU陽性細胞を示す写真である。写真中のバーは１００μｍである。
【図２２】図２１の一部(ephrin-A1多量体を注入したラットの障害側線条体部)を拡大した写真である。（ａ）は（ｂ）（ｃ）の合成写真、（ｂ）はS100β陽性細胞を示す写真、（ｃ）はGFAP陽性の細胞を示す写真である。写真中のバーは２０μｍである。
【図２３】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体（（ｅ）〜（ｈ））又はコントロールとしてIgG（Fc）多量体（（ａ）〜（ｄ））を持続注入した後の脳質下層の組織像を示す写真である。（ａ）（ｅ）はそれぞれ（ｂ）（ｃ）（ｄ）及び（ｆ）（ｇ）（ｈ）の合成写真、（ｂ）（ｆ）はCD133陽性細胞を示す写真、（ｃ）（ｇ）はGFAP陽性細胞を示す写真、（ｄ）（ｈ）はRECA-1（Rat Endothelial Cell Antigen-1）陽性の毛細血管内皮細胞を示す写真である。図中矢印で示す細胞は、CD133陽性でかつGFAP陽性細胞であり、多分化能を持った細胞ないしは神経系への分化を運命付けられた神経幹細胞であると考えられる。
【図２４】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を単回投与してから２週間後の前額断での脳室下層の組織像を示す写真である。（ａ）〜（ｅ）はIgG(Fc)を（ｆ）〜（ｊ）はephrin-A1多量体を投与した場合であって、（ａ）は（ｂ）〜（ｅ）の合成写真、（ｆ）は（ｇ）〜（ｊ）の合成写真、（ｂ）（ｇ）はGFAP陽性細胞を示す写真、（ｃ）（ｈ）はGFAPとRECA-1陽性細胞を示す写真、（ｄ）（ｉ）はRECA-1陽性細胞を示す写真、（ｅ）（ｊ）は存在する全ての核を示す写真である。写真中のバーは１００μｍである。
【図２５】図２４の（ｃ）及び（ｈ）の四角で囲んだ部位を拡大したものである。(ａ)は(ｂ)(ｃ)の合成写真、(ｄ)は(ｅ)(ｆ)の合成写真、(ｂ)(ｅ)はそれぞれGFAP陽性細胞を示す写真、(ｃ)(ｆ)はそれぞれRECA-1陽性細胞を示す写真である。写真中のバーは５０μｍである。
【図２６】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体を１週間持続的に注入し、同時にBrdUの腹腔内注入を実施し、６週間後の線条体毛細血管部におけるＴＨ及びBrdU染色像を示す写真である。（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）の合成写真、（ｂ）はＴＨ陽性細胞を示す写真、（ｃ）はBrdUを取り込んだ核を示す写真である。図（ａ）中矢印はTH陽性の神経突起を伸ばしているBrdU陽性細胞を示す。写真中のバーは２５μｍである。
【図２７】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体を単回注入してから６時間おきに３回のみBrdUを腹腔内に注入し、１日、７日、１４日後における線条体内BrdU陽性細胞の動きを示す写真である。線条体は前額断面であり、BrdUおよびTHでの染色を施行している。図中左側は障害側側脳室に注入した場合の障害側脳室下層および線条体を、図中右側はコントロールとして健側脳室下層および線条体を示している。左右のいずれも上段は前部線条体を、下段はその中部線条体を示す。また、図中の白線はそれぞれBrdU陽性細胞の遊走前線を示す。写真中のバーは１００μｍである。
【図２８】図２７のコントロールであり、パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にIgG(Fc)多量体を単回注入してからBrdUを６時間おきに３回のみ腹腔内に注入し、１日、７日、１４日後における線条体内BrdU陽性細胞の動きを示す写真である。中部線条体の前頭断面であり、BrdUおよびTHでの染色を施行している。図中左側は障害側側脳室に注入した場合の障害側脳室下層および線条体を、図中右側はコントロールとしての健側を示す。また、図中の白線はそれぞれ遊走前線を示す。写真中のバーは１００μｍである。
【図２９】FGF受容体阻害剤であるSU5402の存在下及び非存在下でephrin-A1多量体又はコントロールとしてのIgG(Fc)多量体を障害側側脳室（図の右端）に一週間持続投与し、同時にBrdUの腹腔内注入を実施した時のBrdU陽性細胞の分布に対する効果を示す写真である。BrdUは特異的抗体を使って間接免疫蛍光染色により検出している。（ａ）はIgG(Fc)多量体を投与した場合（コントロール）を、（ｂ）はephrin-A1多量体のみを投与した場合を、（ｃ）はSU5402とともにephrin-A1多量体を投与した場合を示す。写真中のバーは１００μｍである。
【図３０】パーキンソンモデルラットの障害側線条体内に薬剤を単回注入してから６週間後の線条体におけるＴＨ陽性細胞の発現を示す図である。（ａ）はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を注入したラットの障害側線条体を、（ｂ）はその健側線条体を示す。（ｃ）はephrin-A1多量体を注入したラットの障害側線条体を、（ｄ）はその健側線条体を示す。写真中のバーは１００μｍである。写真の矢印は薬剤の注入箇所を示す。
【図３１】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室内にephrin-A1多量体（３μg）又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体（１.５μg）を注入する前後の行動解析を示した図である。（ａ）はephrin-A1多量体投与群を、（ｂ）はIgG(Fc)多量体投与群を示す。（ａ）（ｂ）それぞれのパネルにつき左側は注入前の解析を、右側は注入６週間後の解析を示している。
【図３２】パーキンソンモデルラットの障害側線条体内にephrin-A1多量体（３μg）又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体（１.５μg）を注入した後の行動解析を示した図である。（ａ）はephrin-A1多量体投与群を、（ｂ）はIgG(Fc)多量体投与群を示す。（ａ）（ｂ）それぞれのパネルにつき左側は注入前の解析を、右側は注入６週間後の解析を示している。
【図３３】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室内にephrin-A1多量体又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を１週間持続注入した前後の行動解析を示した図である。注入後の行動解析は一週間の注入終了時点を起点としている。
【図３４】別な実施例であるephrin-A1多量体（ephrin-A1-hTSP5cc多量体）を作製するための遺伝子カセットを示す図である。
【図３５】精製したephrin-A1-hTSP5cc多量体をSDS-ポリアクリラミドゲル電気泳動法により分子量に従って分離した後にタンパク質をRuby染色法またはウエスタンブロッティング法にて検出したものである。（ａ）（ｂ）はそれぞれ精製したephrin-A1-hTSP5cc多量体を非還元下において分離した場合、（ｃ）は還元下において分離した場合を示す。また（ａ）はその後にRuby染色法を適用した場合を、（ｂ）（ｃ）はそれぞれ抗ephrin-A1抗体を適用してウエスタンブロッティングを実施した場合を示す。左端の数値は、分子量マーカーをkDa単位で示している。
【図３６】EphA4を発現させたL6細胞（L6/EphA4）を使って、ephrin-A1-Fc多量体とephrin-A1-hTSP5cc多量体のEphA4リン酸化効力を抗リン酸化チロシン抗体によるウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す。レーン１，２はephrin-A1-Fc多量体刺激による場合を、レーン３，４はephrin-A1-hTSP5cc多量体刺激による場合を，レーン５は無処置の場合を、Ｍは分子量マーカーをkDa単位で示す。
【図３７】パーキンソンモデルラットの障害側側脳室にephrin-A1多量体（ephrin-A1-hTSP5cc多量体）又はコントールとしてPBSを注入してから４週間後の線条体内ＴＨ陽性細胞を示す写真である。同図（ａ）（ｂ）はephrin-A1多量体を注入したラットであり、（ａ）は障害側を（ｂ）は同じラットの健側を、同図（ｃ）（ｄ）はPBSを注入したものであって、（ｃ）は障害側を（ｄ）は同じラットの健側を示す。写真中のバーは１ｍｍである。
【図３８】さらに別な実施例であるephrin-A1多量体（ephrin-A1-W-hTSP5cc多量体）を作製するための遺伝子カセットを示す図である。
【図３９】精製したephrin-A1-W-hTSP5cc多量体をSDS-ポリアクリラミドゲル電気泳動法により分子量に従って分離した後に抗ephrin-A1抗体を使用したウエスタンブロッティン法にて検出したものである。（ａ）は非還元下で、（ｂ）は還元下でそれぞれ分離した場合を示す。左端の数値は、分子量マーカーをkDa単位で示している。
【図４０】EphA4を発現させたL6細胞（L6/EphA4）を使ってephrin-A1-hTSP5cc多量体とephrin-A1-W-hTSP5cc多量体のEphA4リン酸化効力を抗リン酸化チロシン抗体によるウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す。レーン１，２はephrin-A1-hTSP5cc多量体によるリン酸化を、レーン３，４はephrin-A1-W-hTSP5cc多量体によるリン酸化を，レーン５は無処置の場合の変化を示す。左端の数値は、分子量マーカーをkDa単位で示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ephrin-A多量体、具体的には、ephrin-A細胞外ドメインとIgG(Fc)フラグメントからなるephrin-A-Fc融合蛋白などを多量体化したephrin-A多量体を側脳室又は線条体に直接注入することにより、神経幹細胞を分化させてパーキンソン病等の中枢系の神経障害を改善することを目的としている。【００１６】
A群のephrin（ephrin-A）は、ＧＰＩアンカー蛋白質であり、A群のEph（EphA）に結合することによりシグナル伝達を行なうリガンドである（Deroanne, et al., J. Cell Sci., 116:1367-1376、Carter, et al., 2002, Nat. Cell Biol. 4,:565-73）。Ephは膜貫通型チロシンキナーゼの大きな一ファミリーを構成し、２つのサブグループ（EphA及びEphB）に分けられる。EphAはEphA1〜EphA8及びEphA10の９種類に分類され、EphBはEphB1〜EphB4, EphB6の５種類に分類される。EphAは、一部の例外を除いてそのリガンドであるephrin-Aと結合し、EphBはそのリガンドであるephrin-Bと結合する。EphAのリガンドであるephrin-Aは、ephrin-A1〜A5までの５種類が、またEphBのリガンドであるephrin-Bは、ephrin-B1〜B3までの３種類が知られている。これらの受容体のうちEphA4には、ephrin-Aに加えてephrin-B2及びB3も結合すると言われている（Wilkinson, 2001, Nat Neurosci., 12:155-164; Palmer, et al., 2003, Genes & Dev 17:1429-1450, Aasheim et al., 2005, Biochim Biophys Acta 1723:1-7）。【００１７】
上記したように、ephrin-A1及びephrin-A2（それぞれ多量体化されたもの）が、培養下で胚由来神経幹細胞を分化誘導することは知られてはいるが（非特許文献１２）、分化させた培養細胞の移植では障害された神経細胞の回復には十分ではない。また、特許文献１においては、EphAを介するシグナルを阻害すべく、ephrin-A2又はephrin-A5単量体を直接脳内に注入しようとする試みが行われており、神経幹細胞を増殖させることには成功しているが、神経幹細胞を分化してドパミン産生細胞を産生させるには至っていない。本発明者らは、ephrin-A1を多量体化し、かつこれを成熟動物の側脳室又は線条体に直接注入することによって、EphAを介するシグナルを活性化し、神経幹細胞の増殖、分化及び遊走を誘導して、線条体内にドパミン産生細胞を増加させることに成功した。本発明は、これまで薬剤の投与など対象療法に限られていたパーキンソン病などの中枢神経障害の根本的な回復を可能とするものである。【００１８】
ephrin-Aは、単量体としてEphAに結合した場合にはEphAからのシグナル伝達（EphAの活性）を抑制する方向に働き、多量体として結合した場合に、EphAからのシグナル伝達（EphAの活性）を活性化すると言われている（非特許文献１４、１５）。本発明においては、シグナル伝達を活性化（刺激）して、神経幹細胞の増殖、分化及び遊走を誘導する必要があり、EphAのリガンドであるephrin-Aは、多量体化して用いられることが必要である。多量体化は２量体では不十分であって、少なくとも３量体以上に多量体化する必要があり、４量体、５量体などそれ以上の多量体とするのが好ましい。もっとも、本発明の治療剤としては３量体や５量体またはそれ以上の多量体が含まれていればよく、２量体がそれらと共に含まれていても差し支えない。また、ephrin-Aは、EphAのリガンドであるephrin-A1〜A5のうちいずれかであればよく、これらA1〜A5の２種以上を混合して用いても差し支えない。【００１９】
多量体化のためには、例えば、ephrin-AのＣ端にヒトIgG(Fc)を融合した組み替え蛋白を抗ヒトIgG(Fc)抗体で重合して多量体化する方法が使用される。こうして得られるephrin-A多量体が、本発明に係る中枢神経障害治療剤として用いられる。もっとも、多量体化の方法はこれ以外の方法で行っても差し支えない。例えば、Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP)のCoiled-Coil domainは４５アミノ酸からなる小ペプチドであり５量体化を起こさせることが知られている。このペプチドを融合させたFasやAngiopoietinは多量体化し、FasLやTie受容体の強力な抑制因子ないしは活性化因子となることが報告されている（Cho, et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101:5547-52; Holler, et al., 2000, J Immnunol Methods 237: 159-73; 特表２００６−５０４４０５号公報）。従って、このようなペプチドを用いて、多量化することも考えられる。また、これ以外にも特表２００６−５０４４０５号公報に開示された軟骨基質タンパク質ＣＭＰやＭＡＴなどを用いる方法も適用可能である。さらに、ヒトトロンボスポンディン５由来のCoiled-Coil domain部位（hTSP5cc）を用いて、ephrin-A多量体とすることもできる。【００２０】
このときephrin-A多量体として、ephrin-A細胞外ドメイン全体を用いて多量体化したものでも、ephrin-Aの活性中心である受容体結合領域のみを用いて多量体化したものを用いてもよい。また、本発明の目的を達成する限り受容体結合領域以外の部分が含まれていても差し支えない。【００２１】
本発明では、ephrin-A多量体は脳室より具体的には側脳室若しくは線条体に直接注入される。注入に際しては、生理食塩水やＰＢＳ（リン酸緩衝液）など薬理活性を失わない、すなわち多量体を保持できる媒体に溶解若しくは懸濁した医薬組成物として用いられる。また、必要であれば用時溶解して用いるために、リガンド（ephrin-A多量体）と溶解用の液剤とを組み合わせても差し支えない。注入は、定位脳注入装置などの適当なデバイスにより行われるが、単回投与あるいは点滴のような持続注入のいずれであってもよい。注入箇所は側脳室又は線条体であれば特に限定されることはないが、好ましくは側脳室であって障害箇所の近位に注入するのが望ましい。また、注入（投与）に際しては、鎮痛剤や保存剤、緩衝剤などの添加剤を適宜用いても差し支えなく、予め医薬組成物中に含有させておくこともできる。注入量は、１回あたり主成分として0.01μg／kg〜1mg／kg、好ましくは0.1μg／kg〜0.1mg／kgであるが、症状や性別、年齢、体重などによって適宜定められる。また、投与の対象は成人ヒトのみならず幼弱のヒト、他の動物種等にも適用が可能である。【００２２】
本発明の対象となる中枢神経障害は、中枢神経（例えば、脳神経、脊髄神経等）の変性又は傷害を伴う障害の全てを意味し、その病因によって限定されるものではない。具体的には、パーキンソン病、パーキンソン症候群、多系統萎縮症（線条体黒質変性症を含む）、ハンチントン舞踏病、進行性核上麻痺、びまん性レビー小体病、大脳皮質基底核変性症、アルツハイマー病、老年性痴呆、ピック病、前頭側頭葉型痴呆症、家族性痴呆症、運動神経病（例えば、筋萎縮性側索硬化症、家族性筋萎縮性側索硬化症等）、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、汎発硬化症、急性散在性脳脊髄炎、急性小脳炎、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群等）だけでなく、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞（例えば、脳血栓、脳塞栓等）、一過性脳虚血発作、再灌流障害、脳出血（例えば、高血圧性脳内出血、クモ膜下出血等）等）・血液量減少性ショック・外傷性ショック・頭部損傷及び／又は脳脊髄外傷（例えば、脳挫傷・貫入・せん断・圧迫・裂傷、分娩時外傷、乳児むち打ち揺さぶり症候群等）に伴う神経機能障害、感染症に伴う脳脊髄疾患（例えば、髄膜炎、脳炎、インフルエンザ脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、エイズ脳症による痴呆等）、毒物（ヒ素、カドミウム、有機水銀、サリン、ソマン、ブタン、ＶＸガス等）・放射線等による神経機能障害、精神疾患（例えば、神経症、心身症、不安、統合失調症、躁うつ病等）、てんかん、メイジュ症候群、各種ジストニア、ダウン症、睡眠障害（例えば、過眠、ナルコレプシー、睡眠時無呼吸症候群等）等が例示され、特に好ましくは、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症又は脳梗塞に伴う神経機能障害等に適用される。
【実施例１】
【００２３】
次に、下記の実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものでないのは言うまでもない。【００２４】
〔ephrin-A多量体の調製〕
ヒトIgG(Fc)とephrin-A1の融合体（ephrin-A1-Fc融合体：ephrin-A1細胞外ドメインの受容体結合領域（図３４及び図３８にephrin-A1として示された塩基配列で示された領域と同じ領域）のＣ端にヒトIgG(Fc)を融合した組み換え蛋白：シグマ社製（Sigma-Aldrich Co.））と、家兎の抗ヒトIgG(Fc)抗体（Jackson ImmunoResearch Lab.）を質量比１：2.4の割合で、リン酸緩衝液に混合し４℃で１時間以上インキュベートしてephrin-A1多量体（ephrin-A1-Fc多量体）とした後に使用した。また、コントロールとして用いるIgG(Fc)についても、ephrin-A1-Fc融合体と同モル数のIgG(Fc)と家兎抗ヒトIgG(Fc)抗体を質量比１：4.8（モル比ではephrin-A1-Fcと抗ヒトIgG−Fc抗体の比と同じ）でインキュベーションしてIgG(Fc)を多量体とした後に使用した。【００２５】
〔レトロウイルスベクターの構築〕
神経幹細胞やその他の細胞中での受容体の機能を調べるために、次のレトロウイルスベクターが用いられた。レトロウイルスベクターの構築方法は次のとおりである。【００２６】
EphA4（WT:Wild Type）、EphA4(ΔJM,ΔK)(EphA4の傍細胞膜ドメイン及びキナーゼドメインが削除された分子)、EphA4(DN)（EphA4の細胞内ドメインが完全に削除された分子）、FRS2α(WT:Wild Type)、FRS2α(DN)（FRS2のミリスチル化ドメインとPTBドメインのみを保持した分子：図においては、FRS2(DN)で示される）のいずれかをコードする遺伝子を、ベクターpMXs-IG（東京大学、北村教授の寄贈による；Kitamura, et al., 2003, Exp.Hematol. 31:1007-1014：図１参照）中にIRES(internal ribosomal entry site)の配列を介在させてマーカー遺伝子であるEGFP(enhanced green fluorescence protein)に結合させるべく、MCS部分に挿入した。このpMXs-IG構築物を、pCAGVSVG（水泡性口内炎ウイルスの表面抗原をニワトリβ-actinプロモーター下に発現させるようにしたプラスミド：図２参照）とともに293/gpIRES cells（大阪大学、宮澤教授の寄贈による）にトランスフェクトした。293/gpIRES cellsは、東京大学の北村教授によって作製されたpGag-pol-IRES-bsrを、トランスフェクションにより安定的に発現させているＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。こうして得られた細胞指向性を変化させたレトロウイルスを遠心分離（140,000g、９０分）によって集めた後、再び、導入細胞用の培地に調整した。【００２７】
〔マウス胚由来神経幹細胞に与える影響〕
（１）球状塊での培養
マウス胎生１４.５日目の胚の線条体を取り出してマウス胚神経幹細胞を球状塊として培養し（培地：50% Dulbecco's MEM/50% Ham's F12 supplemented with 5mM HEPES buffer, pH7.4, 0.6%glucose, 25μg/ml insulin, 100μg/ml transferin, 20nM progesterone, 60μM putrescine, 30nM sodium selenite, 20ng/ml FGF2, and 20ng/ml EGF）、poly-L-lysineでコートした培養皿上に同数の球状塊を播種した。この時の培地には上記の培地構成成分中FGF2及びEGFを欠き、その代わりに図に記載の薬剤（None（添加なし）、IgG(Fc)、ephrin-A1（ephrin-A1-Fc多量体）、FGF2、ephrin-A1+FGF2）を添加したものを使用した。FGF2は神経幹細胞の増殖作用に対する陽性コントロールとして使用し、また、対比用として何も薬剤を含まない培地（None）でも培養した。２日間培養後、各細胞について位相差顕微鏡で観察した。その顕微鏡写真を図３（ａ）〜（ｅ）に示す。また、図４（ａ）〜（ｅ）に図３の各枠囲みの部分を拡大した写真を示した。図３及び図４から分かるように、ephrin-A1多量体を添加した場合には、コントロールと比べて格段に細胞増殖が盛んであり、FGF2添加と比べても差が無いほど細胞が増殖していた。また、ephrin-A1多量体＋FGF2の添加群では少なくとも相加的な（若しくは相乗的な）細胞増殖が認められた。FGF受容体は活性化されたEphと多量体化することを私達が発見しており（非特許文献１０）、そのリガンドであるFGF2は神経幹細胞をはじめとする体性幹細胞の増殖因子として良く使用されている。このため、ephrin-A1多量体の作用と対比する目的でFGF2を上記実験および以下のいくつかの実験において使用した。未発表ではあるが、ephrin-A1多量体と比べた場合、FGF2は僅かにより強い神経幹細胞増殖作用を持っているが、神経幹細胞の神経細胞への分化作用はほとんどないことを発見している。【００２８】
（２）細胞へのBrdUの取り込み
次に、培養された神経幹細胞について、増殖している細胞にのみ取り込まれるBrdUの取り込みを調べた。その結果を図５に示す。マウス胎生１４.５日目の胚の線条体を取り出して３〜５日間神経細胞球塊として培養した後、EGFPのみ、又はEGFPと図に記載の分子（詳細は前記）を同時に発現するレトロウイルスベクターを感染多重度（MOI）５で感染させた後、試験に供した。EGFPの緑色の蛍光から判断すると９５％以上の細胞でこれらの蛋白を発現していることが確認された。これらの異なる分子を発現している細胞を、薬剤（図中左からコントロール用の緩衝液、ephrin-A1多量体、FGF2、並びにephrin-A1多量体+FGF2）を含む上記培地（EGF及びFGF2を除いた培地）中で３日間培養し、その後８時間のBrdUの取り込みを測定した。測定は、市販のELISA kit（Roche Diagnostics Co.）を用いて調べた。図に示す各バーは平均値＋標準偏差（ｎ＝４）を示している。Tukeyの複数群比較検定法により群間比較した。＊は、同じ薬剤で処理した、ベクターのみを発現するレトロウイルスに感染させた細胞と比べた場合にこの複数群比較検定にてp<0.01（n＝４）と有意差があるものを示している。EphA4のシグナル伝達を阻害する分子（EphA4(ΔJM,ΔK)及びEphA4(DN)）の発現により上記すべての薬剤による増殖シグナルが抑制され、FRS2αを介するシグナルの抑制分子（FRS2α(DN)）の発現も同様の作用があることが判明した。これらのことから、ephrin-A1多量体を用いた場合にはシグナルがEphA4及びFRS2αを介して伝達されること、FRS2αはFGF受容体及びEphA4の共有の下流シグナル伝達分子であることなどが推測できる。【００２９】
（３）マウス胚由来神経幹細胞の自己再生能
以下の方法によって、神経幹細胞の自己再生能力を測定した。その結果を図６に示す。マウス胎生１４.５日目の胚の線条体を取り出して３〜５日間神経細胞球塊として培養した後、EGFPのみ（Vector）、又はEGFPと図に記載の分子を同時に発現するレトロウイルスベクターに感染多重度（MOI）５で感染させた。EGFPの発現を示す緑色の蛍光から判断すると９５％以上の細胞でこれらの蛋白を発現していることが確認された。次に、感染後の細胞を５００細胞／穴の密度で９６穴培養皿に播き、EGFPの蛍光を指標として神経幹細胞の再生能力を調べた。９６穴培養皿に播いた直後、３日目及び５日目に上記培地中にephrin-A1多量体、FGF2並びにephrin-A1多量体+FGF2を添加した。図中の種々分子発現細胞毎に左からコントロール（IgG(Fc)）、ephrin-A1多量体、FGF2、及びephrin-A1多量体＋FGF2の添加群を示している。それぞれの群で少なくとも３０穴においてEGFP用の光学フィルターを装着した倒立蛍光顕微鏡下で蛍光を発している神経細胞球塊の数を、７日目から９日目の間に数えた。図に示す各バーは平均値＋標準偏差（ｎ＝４）を示している。測定値は、Tukeyの複数群比較検定法により群間比較した。その結果、EphA4を介するシグナルの阻害分子（EphA4(DN)）の発現及びFRS2αを介するシグナルの阻害分子（FRS2α(DN)）の発現により、自己再性能が抑制された。これらのことから、ephrin-A1多量体はEphA4を介して神経幹細胞の自己再生を促進していること、また、EphA4及びFGF受容体の共有の下流分子であるFRS2α分子を介するシグナルにより自己再生を促進している可能性が高いことが判明した。
【実施例２】
【００３０】
〔成熟マウス側脳室への注入〕
（１）成熟マウス神経幹細胞の増殖試験１
ephrin-A1多量体（0.75μg/側脳室）、IgG(Fc)多量体（0.75μg/側脳室）、FGF2（20 ng/側脳室）又はephrin-A1多量体とFGF2の混合液を、６週齢の正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスの側脳室に注入した。注入は麻酔下で、頭蓋骨の冠状及び矢状縫合の交叉点（ブレグマ）の後方０.０mm、側方１.１mm（両側）、深さ１.５mmで行った。注入２日後に神経幹細胞のマーカーであるネスチンに対する特異的一次抗体にて間接免疫染色を行った。【００３１】
ネスチンに対する間接免疫whole-mount染色のためには、まずマウスを麻酔下で氷冷された生理食塩水で灌流し、引き続いて４％パラホルムアルデヒドで灌流した。その後、マウスの脳を取り出し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。両側脳室を矢状断で切断し、マウス抗ネスチンモノクロナール抗体（rat-401：Chemicon International）を第１の抗体として、Doetsch and Alvarez-buyllaらの方法（1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA:14895-14900）に準じてDAB法を用いてwhole-mount染色を行った。その後、実体顕微鏡により観察した。その顕微鏡写真を図７に示す。同図（ａ）はIgG(Fc)多量体を、（ｂ）はephrin-A1多量体を、（ｃ）はFGF2を、（ｄ）はephrin-A1多量体とFGF2を投与したものである。中心部の黒く染色されたところはネスチン陽性細胞が存在するところである。ネスチンの染色程度に関しては、ephrin-A1多量体はFGF２よりやや弱いが十分な作用があり、ephrin-A1多量体+FGF2は両者の少なくとも相加作用がある。これらの実験結果から、Nestin陽性の細胞増殖に関してephrin-A1多量体はFGF2に劣らず有効であり、ephrin-A1多量体とFGF2は少なくとも相加的な作用があることが判明した。【００３２】
（２）成熟マウス神経幹細胞の増殖試験２
次に、上記と同様にして、ephrin-A1多量体(0.75μg/側脳室)又はIgG(Fc)多量体(0.75μg/側脳室)を正常マウス側脳室に注入し、５日後にネスチンに対する特異的一次抗体にて間接免疫蛍光染色を行った。その顕微鏡写真を図８に示す。各写真は前頭断で、側脳室側面を示している。薄くなっているところが、ネスチン陽性細胞である。ephrin-A1多量体の単独注入によって、ネスチンの増加が観察され、神経幹細胞が増殖していることが明らかとなった。【００３３】
さらに上記ネスチンの増加を定量的に調べるために、各種薬剤注入２日後に前脳全体を用いた免疫ブロットを行った（図９）。組織溶解用の緩衝液に、１%のTritonX-100、５mMのEDTA、５０mMのNaCl、１０mMのsodium pyrophosphate、５０mMのsodium fluoride、１mMのsodium orthovanadate 及び protease inhibitors（１mMのphenylmethylsulfonylfluoride、１μMのaprotinin、１μMのleupeptin及び１μMのpepstatin A）を含む５０mMのHEPES緩衝液を用いた。ネスチンに対する特異的抗体（家兎抗ネスチンポリクロナール抗体：Santa Cruz, Cat.#sc-20978）により免疫沈降したタンパクをSDS-PAGE法により分離した後、PVDF膜にブロットし、第１の抗体（マウス抗ネスチンモノクロナール抗体：Chemicon International, rat-401）とインキュベーションした。ウェスタンブロッティングは、ECL Western Blotting Detection System (Amersham Biosciences, Code#RPN2108)を用いて製造業者のマニュアルに従って行われた。ウェスタンブロッティングの結果を図９（ａ）に、各バンドの濃度分析を同図（ｂ）に示す。同図（ａ）（ｂ）は、それぞれ左から順にIgG(Fc)多量体のみを注入したもの（コントロール）、ephrin-A1多量体を注入したもの、FGF2を注入したもの、ephrin-A1多量体＋FGF2を注入したものを示す。この結果をStudentのt-testを用いて統計学的に解析すると、ephrin-A1多量体やFGF2の注入により、ネスチン量はコントロール（IgG(Fc)）と比べて有意に増加することが判明した（＊：ｐ<０.０２、＊＊：ｐ<０.００１）。ephrin-A1多量体＋FGF2の注入はそれぞれの単独注入の少なくとも相加的（若しくは相乗的）効果を示した。この結果は上記の組織学的な所見を支持するものである。
【実施例３】
【００３４】
〔正常成熟ラット脳におけるephrin及びEphの発現〕
パーキンソンモデル動物としての地位が確立しているラットにおいてephrin-A1多量体の効果を調べる目的で、まずは正常ラットの脳内にephrin-A及びEphAが発現して、機能しうる状態にあるのかどうかを薬剤刺激のない状態で確認した。各種ephrin-A（ephrin-A1〜A5）に特異的な一次抗体（Santa Cruz, Cat.#sc-911; sc-912; sc-1012; sc-914; sc-6075）を用い、DAB法（ENVISION Kit, DAKO）によって正常な成熟ラット（生後７−９週齢のSprague Dawley系雄ラット）の側脳室脳室下層の細胞を間接免疫染色した。その写真を図１０に示す。写真で濃く染まっているのが発現陽性の細胞であって、脳室下層近傍に内因性ephrin-A1〜A5が発現されていることが示された。【００３５】
続いて、各種EphA（EphA1〜8）に特異的な一次抗体（Santa Cruz, Cat.#sc-925; sc-924; sc-920; sc-921; sc-1014; sc-8172; sc-1015; sc-7287）を用い、前記ephrinに対する間接免疫染色と同様の方法によって正常な成熟ラット（同上）の側脳室脳室下層の細胞を間接免疫染色した。その写真を図１１に示す。写真で濃く染まっているところが発現陽性の細胞であって、ephrin-A1多量体により刺激されうる内因性のEphA1-A8が上衣細胞から脳室下層細胞にかけて発現されていることが示された。このように、薬剤刺激のない正常成熟ラットにおいてephrin-A群及びEphA群が側脳室周辺に発現されていることが確認された。【００３６】
次に、パーキンソンモデル動物の作製法及びその症状の測定基準がはっきりしているラットを用いて以下の実験を実施した。【００３７】
〔パーキンソンモデルラットの作製方法とその確認方法〕
麻酔下で生後７−９週齢のSprague Dawley系雄ラットに、ブレグマの後方２.２mm、側方１.５mm（今回は右側のみ）、深さ８.０mmに６−ハイドロキシドパミン（6-OHDA）を注入し、右側黒質−線条体ドパミン作動性神経路を障害することにより作製した。6-OHDAは生理食塩水に６μg/μlで溶解し、最終濃度０.２％のアスコルビン酸を含めた溶液を２４μg（４μl）〜３０μｇ（５μl）／ラットで注入した。6-OHDAの脳内注入後６週間以上経た時点でアポモルフィンを腹腔内に注入し（０.５mg/kg）、パーキンソンモデルラット特有の回転運動数を２０分単位で３回連続して測定し、平均回転数１００回以上／２０分のラットを疾患確定モデルラットとして選択した。【００３８】
〔間接免疫蛍光染色法〕
ラットを４％のパラフォルムアルデハイドで還流固定した後に脳を取り出し一晩同溶液中で固定する。２０％及び３０％の蔗糖溶液中でそれぞれ一晩インキュベーションした後に凍結し−８０℃にて保存する。必要に応じてクリオスタットで厚さ４０μmの切片を作製する。染色は小容器中で浮遊切片の状態で行う。まずはPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄した後に0.25%TritonX-100及び１％家兎血清を含むPBS中で３０分間透過処理をする。続いて１％家兎血清のみを含むPBS中で１０分間の洗浄を３回繰り返した後、前もって決定した適当な希釈を施した一次抗体を洗浄液と同じ組成の液中に加えて４℃で３６時間切片とインキュベーションする。次にPBSで１５分間の洗浄を３回繰り返した後に二次抗体（Alexa Fluor結合抗体; Molecular Probes; 500倍希釈）を加え、４℃で２時間インキュベーションしPBSで１０分間の洗浄を３回繰り返す。必要に応じて細胞核のDAPI染色を３００ｎＭの濃度で実施し、PBSで洗浄する。その後スライドグラスにマウントする。【００３９】
〔パーキンソンモデルラットへのephrin-A1多量体注入効果の組織学的解析〕
（１）パーキンソンモデルラット側脳室内へのephrin-A1単回注入の神経細胞再生作用
（線条体内全体におけるドパミン産生細胞の発現）
上記にて作製したパーキンソンモデルラットの障害側側脳室内に３μｇのephrin-A1多量体を注入した。ラットへの注入は、麻酔下において、ブレグマの後方０.９mm、側方１.３５mm（今回は右側のみ）、深さ５.０mmで行われた。以下、ラット側脳室内への注入は同条件で行われた。注入６週間後に線条体内ドパミン産生細胞の存在をチロジンヒドロキナーゼ（ＴＨ:tyrosine hydroxylase）に対する特異的抗体（Chemicon International, Cat.#AB152）を用いて間接免疫染色法（DAB法）にて調べた。その写真を図１２に示す。対比として同じラットの健側も示した。各切片（厚さ４０μm）は前頭断で、線条体の中部を示している。各図において濃く染色されている部分がＴＨ陽性の細胞が存在する部分である。また、パーキンソンモデルラットにコントロールとしてIgG(Fc)多量体を注入し、同様に線条体内ドパミン産生細胞の有無を調べた。ephrin-A1多量体を脳室に注入した障害側線条体（同図（ａ））では、IgG(Fc)多量体を注入した線条体（同図（ｃ））と比べて明らかに線条体内にドパミン産生細胞が増加していることが証明された。【００４０】
（高拡大でのドパミン産生細胞の発現）
ephrin-A1多量体又はIgG(Fc)多量体（3μg/側脳室）をパーキンソンモデルラットの障害側側脳室に注入して、線条体でのＴＨ陽性細胞の発現を調べた。注入及び間接蛍光免疫染色は、上記方法と同様にして行った。図１３は前頭断切片で、線条体の中部をTH染色後共焦点顕微鏡にて調べたものである。図１３（ａ）（ｂ）は、それぞれ同一切片内の右側障害側及び左側健常側を示している。図１４は、ＴＨ陽性細胞の発現をIgG(Fc)を注入した場合とephrin-A1多量体を注入した場合とで比較した写真を示す。各図の矢印は注入箇所を示している。各図それぞれ白くなっている部分がＴＨ陽性の細胞が存在する部分である。ephrin-A1多量体を注入した障害側では、明らかに線条体内にＴＨ陽性細胞が増加しているが、IgG(Fc)多量体のみを注入したラットではほとんどＴＨ細胞の発現が見られなかった。【００４１】
また、ＴＨ陽性細胞が真にドパミン作動性神経細胞であることを明確化するために、上記と同様にしてephrin-A1多量体を注入した障害側線条体の切片について、ＴＨ及びドパミン作動性神経細胞の他の指標であるDAT（Dopamine transporter）について間接二重免疫蛍光染色を行った。二重染色では、一次抗体として２つの異種動物で作製された、ＴＨに特異的な抗体（家兎抗tyrosine hydroxylaseポリクローナル抗体 Chemicon International, Cat.#AB152）及びDATに特異的な抗体（Chemicon International, Cat.# MAB369）を用い、二次抗体としてそれらの異種動物免疫グロブリンに特異的で異なる蛍光物質でラベルされた抗体を用いて間接免疫染色を行い、共焦点顕微鏡にて１μm間隔で連続切片撮影を施行した。その結果を図１５に示す。同図（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）の合成写真、同図（ｂ）はＴＨ陽性細胞を示す写真、同図（ｃ）はDAT陽性細胞を示す写真である。ＴＨとDATが共局在しているのが明確に認められ、明らかにＴＨ陽性細胞はDATも陽性であることが分かる。ＴＨはアドレナリン作動性神経細胞でもドパミン作動性神経細胞でも陽性となるが、DATはドパミン作動性神経細胞でのみ陽性となる。つまり、再生した神経細胞はドパミン作動性であることが確実であると言える。同図に示されるように、ephrin-A多量体の投与により線条体内に出現したＴＨ陽性細胞はDAT陽性細胞であることから、ephrin-A多量体がドパミン作動性神経を誘導することが確認された。【００４２】
（２）パーキンソンモデルラット側脳室内へのephrin-A1持続注入の神経細胞再生作用
（ＢｒｄＵの取り込み細胞の分布及び分化）
ephrin-A1多量体又はIgG(Fc)多量体を障害側側脳室内に３μg/日で持続的に１週間注入し、その注入開始直後からBrdUを腹腔内に１週間８０mg/kg/回で１２時間置きに注入した。薬剤注入開始から６週間後に脳を取り出し、間接二重免疫蛍光染色により組織学的解析を行なった。二重染色では、一次抗体として２つの異種動物で作製された、ＴＨに特異的な抗体（前記家兎抗tyrosine hydroxylaseポリクローナル抗体）及びBrdUに特異的な抗体（マウス抗BrdUモノクローナル抗体 DAKO,Code#m0744）を用い、二次抗体としてそれらの異種動物免疫グロブリンに特異的で異なる蛍光物質でラベルされた抗体を用いて間接免疫染色を行い、共焦点顕微鏡にて１μm間隔で連続切片撮影を施行した。その写真を図１６及び図１７に示す。図１６の（ａ）（ｂ）はephrin-A1多量体を注入したものであって、（ａ）は障害側を、（ｂ）は健側を示している。また、同図（ｃ）（ｄ）はIgG(Fc)多量体を注入したものであって、（ｃ）は障害側を、（ｄ）は健側を示している。（ａ）〜（ｄ）各図はＴＨ陽性細胞質とBrdUが取り込まれた核に分解して示している。同図（ａ）（ｃ）ではそれぞれ左側の写真はＴＨ陽性細胞を、右側はBrdUを示し、同図（ｂ）（ｄ）ではそれぞれ左側の写真はBrdUを、右側の写真はＴＨ陽性細胞を示す。図１７は、パーキンソンモデルラットにephrin-A1多量体を注入した後の障害側線条体における三重（TH、BrdU、DAPI（4'-6-Diamidino-2-phenylindole））間接免疫蛍光染色標本の共焦点顕微鏡写真（図１６（ａ））の一部を拡大した写真を、それぞれＴＨ陽性細胞質（ｂ）、BrdUが取り込まれた核（ｃ）及びDAPI（全ての核）（ｄ）に分解して示した写真である。図１６において白く斑点状となっているのがBrdUを取り込んだ核であり、全体が白くなっているのがＴＨ発現細胞を示している。ephrin-A1多量体を注入したラットでIgG(Fc)多量体注入ラットよりも多くのBrdU陽性細胞が障害側脳室下層および線条体に存在し、線条体内にTH陽性細胞も出現して来ていることが分かる（図１６（ａ）参照）。また、図１７に示す矢印は、ＴＨ陽性であると確認できた細胞、つまりドパミン作動性細胞である神経細胞を示している。この図から、BrdUを取り込んだ細胞の内約５０％の細胞がＴＨ陽性であること、つまり、神経幹細胞の多くのものが神経細胞に分化していることが分かる。以上の結果から、ephrin-A1多量体注入により脳室下層の神経幹細胞が刺激されて増殖し、障害側線条体内へ遊走し、かなりの割合の細胞がドパミン作動性細胞に分化誘導されているものと考えられる。【００４３】
BrdUはBrdU注入期間（最初の１週間）中に細胞分裂を行なった細胞の核内に取り込まれる。障害側を健側と比べた場合、IgG(Fc)多量体を注入したコントロールにおいてもややBrdU陽性の細胞が障害側で増えていたが、ephrin-A1多量体注入により著明にBrdU陽性の細胞が障害側で増えていた。また、脳室下層にBrdU陽性細胞が著明に増加しており、線条体内では脳室下層より遠位になるほどより疎に分布している。このことは脳室下層の神経幹細胞が線条体内へ遊走している可能性が大きいことを示している。【００４４】
（線条体における神経幹細胞の神経細胞への分化）
ＴＨ以外の指標を用いて神経幹細胞の神経細胞への分化をさらに確認するため、以下の実験を施行した。パーキンソンモデルラットの障害側側脳室内にephrin-A1多量体又はIgG(Fc)多量体を３μg/日で１週間持続注入し、その注入開始直後から１週間の間１２時間置きにBrdUを腹腔内に８０mg/kg/回で注入した。薬剤注入開始から６週間後の線条体切片をBrdUに対する抗体とNeuNに対する抗体を用いて、上記と同様に間接二重免疫蛍光染色を実施した。その結果を図１８に示す。NeuNは核で染色されるためBrdUとの相関を取りやすい利点がある。上記の実験結果と同様、BrdU陽性細胞の約５０％がNeuN陽性であった。BrdU陽性の細胞は元来神経幹細胞であったものであり、NeuN陽性の神経細胞に分化するものが多いことが判明した。【００４５】
次いで、ドパミン作動性神経細胞の指標であるＴＨと神経幹細胞及び星状細胞の指標であるGFAP（glial fibrillary acidic protein）の染色を用いて両細胞の線条体内での存在を調べた。その結果を図１９に示す。図１９は、上記で得た線条体の切片についてＴＨに特異的な抗体（Chemicon International, Cat.#MAB318）及びGFAPに特異的な抗体（DAKO, cat.#Z0334）を用いて上記と同様に間接二重免疫蛍光染色後、核はDAPIを用いた蛍光染色を実施し、共焦点顕微鏡にて調べた写真である。同図（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）（ｄ）の合成写真、同図（ｂ）はＴＨ陽性細胞を示す写真、同図（ｃ）はGFAP染色細胞を示す写真を、同図（ｄ）は核を示す写真である。GFAP陽性の細胞（神経幹細胞と星状細胞の両者の混在）に混じって、ＴＨ陽性の神経細胞線維や矢印で示すようなドパミン作動性神経細胞の細胞体が認められた。【００４６】
また、レトロウイルスは増殖する細胞にのみ取り込まれるため、側脳室に注入したレトロウイルスが神経幹細胞に取り込まれた後に神経細胞に分化するかどうかを調べた。上記のephrin-A1多量体を側脳室へ注入する際に、EGFP発現レトロウイルスを同時に側脳室内に注入し、線条体のＴＨによる染色とEGFP発現を共焦点顕微鏡にて調べた。その結果を図２０に示す。同図（ａ）はＴＨ陽性細胞を示す写真、同（ｂ）はEGFP発現細胞を示す写真、同（ｃ）はそれらの合成写真である。レトロウイルスベクターにはEGFP（enhanced green fluorescence protein）の発現誘導配列が組み込まれている。レトロウイルスは増殖細胞においてのみ核内に組み込まれ、EGFPをそれらの細胞において発現する。図の円の部分にEGFP陽性でかつＴＨ陽性の神経細胞（神経線維）が認められた。以上から、少なくとも一部の神経幹細胞は脳室に直接接触している事、これらの神経幹細胞由来のドパミン作動性神経細胞が線条体内に出現してきた事が確認された。【００４７】
以上の各種実験から、ephrin-A1多量体を側脳室へ注入すれば神経幹細胞の分化によりドパミン作動性神経細胞が線条体内に出現することが確認された。【００４８】
（側脳室脳室下層における神経幹細胞の増殖及びその分化）
ephrin-A1多量体又はコントロールとしてIgG(Fc)多量体を障害側側脳室内に３μg/日で持続的に１週間注入し、その注入開始直後からBrdUを腹腔内に１週間８０mg/kg/回で１２時間置きに注入した。薬剤注入開始から６週間後に脳を取り出し、ラットの側脳室脳室下層について間接三重免疫蛍光染色により組織学的解析を行なった。染色では、一次抗体として、S100βに特異的な抗体（Mouse monoclonal antibody Clone SH-B1, Sigma Cat#2532）、GFAPに特異的な抗体（Rabbit polyclonal antibody, DAKO Cat#Z0334）及びBrdUに特異的な抗体（Sheep polyclonal antibody, abcam Cat#ab1893）を用い、二次抗体としてそれらの異種動物免疫グロブリンに特異的で異なる蛍光物質でラベルされた抗体を用いて間接免疫染色を行い、共焦点顕微鏡にて１μm間隔で連続切片撮影を施行した。その結果を図２１及び図２２に示す。図２１（ａ）〜（ｄ）はIgG(Fc)を注入したコントロールラットの障害側を、同図（ｅ）〜（ｈ）はephrin-A1多量体を注入したラットの障害側を示す写真であって、（ａ）（ｅ）はそれぞれ（ｂ）（ｃ）（ｄ）及び（ｆ）（ｇ）（ｈ）の合成写真、（ｂ）（ｆ）はS100β陽性細胞を示す写真、（ｃ）（ｇ）はGFAP陽性細胞を示す写真、（ｄ）（ｈ）はBrdU陽性細胞を示す写真である。また、図２２はephrin-A1多量体を注入した障害側線条体部の拡大写真であって、（ａ）は同図（ｂ）（ｃ）の合成写真、（ｂ）はS100β陽性細胞を示す写真、（ｃ）はGFAP陽性細胞を示す写真である。【００４９】
コントロールラットの脳室下層は図２１（ａ）〜（ｄ）に示すようにS100β陽性の一層の上衣細胞及びGFAP陽性の神経幹細胞と考えられる脳室下層細胞から構成されており、両者が同時に陽性である細胞はほとんどない。しかし、ephrin-A1多量体の注入により図２１（ｅ）〜（ｈ）に示すように、S100β陽性でかつGFAP陽性の細胞が著明に増加している。増殖している細胞の核にのみ取り込まれるBrdUはGFAP陽性細胞に取り込まれ、本来なら取り込まれないはず（Spassky et al.,2005, J Neurosci 25:10-18）の上衣細胞にも取り込まれていることも明らかである。また、図２２に示すように、ephrin-A1多量体を側脳室内に注入することにより線条体内ではS100β陽性でかつGFAP陽性の細胞が出現してきているが、GFAPのみ陽性の細胞も存在する。線条体内ではS100βは星状細胞に分化した細胞で陽性になるものであり（Raponi et al, 2007, Glia 55:165-177）、GFAPのみ陽性の細胞はまだ神経幹細胞の性質を保っているものと考えられる。以上のことより、上衣細胞（S100β陽性）及び脳室下層神経幹細胞（GFAP陽性）で構成される神経幹細胞Nicheがephrin-A1多量体の脳室内注入により再構築され、脳室内及び線条体内において神経幹細胞の著明な増殖と神経細胞（特にドパミン作動性神経細胞）及び星状細胞への分化が生じていると推察できる。【００５０】
さらに、ephrin-A1多量体の側脳室内注入により脳室下層に多能性幹細胞が出現するかどうかを調べた。CD133に特異的な抗体（Goat polyclonal antibody, Santa Cruz Biotech Cat#sc-23797）及びGFAPに特異的な抗体（Rabbit polyclonal antibody, DAKO Cat#z0334）及びRECA-1に特異的な抗体（Mouse monoclonal antibody, Santa Cruz Biotech Cat#sc-23797）を用い、二次抗体としてそれらの異種動物免疫グロブリンに特異的で異なる蛍光物質でラベルされた抗体を用いて脳室下層組織について間接三重免疫蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡にて撮影を施行した。その結果を図２３に示す。図２３（ａ）〜（ｄ）はIgG(Fc)を注入したコントロールラットの障害側を示す写真、同図（ｅ）〜（ｈ）はephrin-A1多量体を注入したラットの障害側を示す写真であって、（ａ）（ｅ）はそれぞれ（ｂ）（ｃ）（ｄ）及び（ｆ）（ｇ）（ｈ）の合成写真、（ｂ）（ｆ）はCD133陽性細胞を示す写真、（ｃ）（ｇ）はGFAP陽性細胞を示す写真、（ｄ）（ｈ）はRECA-1陽性血管内皮細胞を示す写真である。これらの写真から、ephrin-A1多量体の脳室内注入により多能性幹細胞（CD133陽性細胞）および神経系への分化が運命づけられたいわゆる神経幹細胞（CD133陽性及びGFAP陽性の細胞；図中矢印）が脳室下層で増加し、線条体内部へ移動していることが分かる。また、ephrin-A1多量体を注入した側の脳室下層では、このような細胞が血管内皮細胞に沿って認められたが、コントロール注入脳では血管に沿ってそのような細胞は認められなかった。【００５１】
（３）パーキンソンモデルラット側脳室へのephrin-A1注入による毛細血管再生と神経細胞再生の連携）
パーキンソンモデルラットの障害側側脳室内に４μgのephrin-A1多量体を単回注入した。注入２週間後に脳室下層における血管の増加をラット血管内皮細胞に特異的な抗体RECA-1及びGFAPに特異的な抗体を用いた間接二重免疫蛍光染色で、また核はDAPIによる染色で調べた。その結果を図２４及び図２４（ｃ）（ｈ）の四角で囲んだ部分を拡大した図２５に示す。ephrin-A1注入により図２４（ｉ）に示すように脳室下層から線条体内への血管が増加しており、図２４（ｇ）（ｈ）及び図２５に示すように血管内皮細胞（RECA-1陽性細胞）に接してGFAP陽性細胞（神経幹細胞又は星状細胞と考えられる細胞）の増加が認められた。このように脳内毛細血管と神経幹細胞が緊密な関係を保っている事が判明した。【００５２】
次に毛細血管と神経細胞の関係を詳細に調べた。IgG(Fc)多量体又はephrin-A1多量体を障害側側脳室内に３μg/日で持続的に１週間注入し、その注入開始直後からBrdUを腹腔内に１週間８０mg/kg/回で１２時間置きに注入した。薬剤注入開始から６週間後に、ＴＨに特異的な抗体（前記家兎抗tyrosine hydroxylaseポリクローナル抗体）とBrdUに特異的な抗体（マウス抗BrdUモノクローナル抗体 DAKO,Code#m0744）を用いて上記と同様に線条体切片の間接二重免疫蛍光染色を実施した。その結果を図２６に示す。同図（ｂ）はＴＨ陽性細胞を、（ｃ）はBrdUが核に取り込まれた細胞を示す写真であって、（ａ）はそれらの合成写真である。線条体内の毛細血管（Cap）を取り囲む形で血管内皮細胞の核にBrdUの取り込みがあり、そのいくつかのBrdU陽性細胞（白矢印）がＴＨ陽性の神経突起を伸ばしているのが分かる。これらの結果から、ephrin-A1の脳室内投与下では、ドパミン作動性神経細胞と毛細血管内皮細胞が同じ幹細胞から分化している可能性が高いと考えられる。また、これらの両細胞は上記図２３で示した血管周囲に出現するCD133陽性細胞に由来している可能性もある。【００５３】
（４）パーキンソンモデルラット側脳室内へのephrin-A1注入の神経幹細胞遊走作用
（成熟ラット神経幹細胞の脳室下層から線条体内への遊走：パルス−チェイス実験）
パーキンソンモデルラットの障害側側脳室内に３(gのephrin-A1多量体又はIgG(Fc)多量体を１回で注入した後、６時間おきに３回のみBrdUを腹腔内に注入し、その後１日、７日、１４日後に線条体内BrdU陽性細胞の動きを調べた。その結果を図２７及び図２８に示した。図２７はephrin-A1多量体を注入した場合を、図２８はコントロールであるIgG(Fc)多量体を注入した場合を示している。各写真は、側脳室下層および線条体内の細胞を間接二重免疫蛍光染色法により染色したものである。図２７の左右写真のいずれも上段は前部線条体を、下段はその中部線条体を示す。障害側側脳室内へのephrin-A1多量体の注入により障害側線条体ではBrdU陽性細胞の遊走前線（白線で示される）は時間と共に脳室下層から線条体内部に移動した（図２７左側）。一方、健側線条体では、BrdU陽性細胞はまばらであり、線条体内部への移動はほとんど認められなかった（図２７右側）。障害側側脳室内にIgG(Fc)多量体を注入した場合には、障害側線条体内においても線条体内部へのBrdU陽性細胞の遊走はほとんど認められなかった。以上から、ephrin-A1の脳室内注入が神経幹細胞の脳室下層から線条体内への遊走に関与している事が実証された。【００５４】
ephrin-A/Eph系のシグナルはFGF受容体にも影響を与えることが本発明者らによって以前に報告されている（Yokote, et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102:18866-71）。そこで、ephrin-A1により惹起される脳室下層から線条体内への神経幹細胞遊走にFGF受容体を介するシグナルが関与しているかどうかを調べた。FGF受容体阻害剤であるSU5402の存在下及び非存在下で、ephrin-A1多量体又はIgG(Fc)多量体を３μg/日の注入量で１週間障害側側脳室内（図の右端）に注入し、その間BrdUの腹腔内注入を行い、ephrin-A1多量体およびSU5402の効果をBrdU陽性細胞の分布によって調べた。図２９は側脳室下層における細胞を間接二重免疫蛍光染色したものであって、同図（ａ）はコントロールであるIgG(Fc)多量体のみを、同図（ｂ）はephrin-A1多量体のみを、同図（ｃ）はephrin-A1多量体及びSU5402をそれぞれ投与したものを示す。同図（ｃ）に示すようにSU5402存在下ではBrdU陽性細胞の線条体内への遊走が著明に抑制されており、ephrin-A1の神経幹細胞遊走作用の少なくとも一部はFGF受容体を介していると考えられる。【００５５】
（５）パーキンソンモデルラット線条体内へのephrin-A1多量体単回注入の神経細胞再生作用
パーキンソンモデルラットの障害側線条体内にIgG(Fc)多量体又はephrin-A1多量体１.５μgを注入し、注入６週間後に脳を取り出してＴＨ特異的抗体によりドパミン作動性神経の発現を組織学的に調べた。その結果を図３０に示す。図３０（ａ）（ｂ）はIgG(Fc)を注入したコントロールラットを、同図（ｃ）（ｄ）はephrin-A1多量体を注入したラットを示し、各図（ａ）（ｃ）はそれぞれ障害側を、各図（ｂ）（ｄ）はそれぞれ健側を示す写真である。また、図の矢印は薬剤注入箇所を示している。ephrin-A1多量体を注入した障害側線条体の脳室寄りの部分にのみドパミン作動性神経の出現が認められた（同図（ａ））。健側（同図（ｂ）（ｄ））は障害側と同一切片内のものであり、コントロールとして示している。このことは、障害側線条体から拡散により脳室下層に及んだephrin-A1多量体が、そこに存在する神経幹細胞を刺激してドパミン作動性神経細胞に分化誘導させたと考えられる。【００５６】
〔パーキンソンモデルラットへのephrin-A1多量体投与後の行動解析〕
（１）ラット側脳室への投与
パーキンソンモデルラットの障害側側脳室内に、ephrin-A1多量体３μg又はIgG(Fc)多量体１.５μg（ephrin-A1多量体と同モル量）を注入し、その６週間後に再度回転数を２０分単位で３回測定し、その平均値を個々のラットの処置後の回転数値とした。これらの結果を図３１に示す。Student's t-testを行ったところ、両者の回転数に有意差（P<0.01）が認められ、ephrin-A1多量体の側脳室への投与によりパーキンソン症状が明らかに改善することが確認された。【００５７】
（２）ラット線条体への投与
上記と同様にして、パーキンソンモデルラットの障害側線条体内に、ephrin-A1多量体又はIgG(Fc)多量体を注入して、投与前後におけるラットの行動を観察した。その結果を図３２に示す。Student's t-testを行ったところ、両者の回転数に有意差（P<0.01）が認められ、線条体内への投与によりパーキンソン症状が明らかに改善することが確認された。【００５８】
（３）ラット側脳室内への持続注入
上記の方法にて作製したパーキンソンモデルラットの障害側側脳室内にIgG(Fc)多量体（投与量2.0μg/日）又はephrin-A1多量体（投与量1.0μg/日及び2.0μg/日）を体内埋め込み型浸透圧ポンプにて持続注入した。注入開始４週間後、８週間後及び１２週間後に再度回転数を２０分単位で３回測定し、その平均値を個々のラットのephrin-A1多量体注入処置後の回転数値とした。その結果を図３３に示した。【００５９】
１２週間後の回転数では、コントロールであるIgG(Fc)多量体注入ラットにおいては注入前の値より上昇したが、ephrin-A1多量体注入ラットにおいてはいずれも前値の５０％以下に下降し、ephrin-A1多量体の投与効果が明確に認められた。【００６０】
以上の各種実験から、ephrin-A1多量体は、側脳室内又は／及び線条体内に投与することにより、脳室下層神経幹細胞を線条体内に増殖・遊走・分化させてドパミン作動性神経を増加させ、ラットのパーキンソン症状を軽減させることが明確となった。
【実施例４】
【００６１】
〔ephrin-A多量体（ephrin-A1-hTSP5cc多量体）の調製〕
５量体形成を促進するTSP5 (thrombospondin 5) coiled-coilドメインを用いてephrin-A1多量体（ephrin-A1-hTSP5cc多量体）を遺伝子工学的に作製した。ephrin-A1を多量体化するcoiled-coilドメインには、ヒトのトロンボスポンディン５（human thrombospondin 5：hTSP5）由来のものを用いた。ephrin-A1-hTSP5cc多量体は、hTSP5 coiled-coilドメインをephrin-A細胞外ドメインのＣ末端に融合させた融合蛋白（ephrin-A1-hTSP5cc）を多量体化したものである。融合蛋白分子ephrin-A1-hTSP5ccは、ephrin-A1の細胞外ドメインとhTSP5のcoiled-coilドメインをFlag（peptide epitope）の３連続アミノ酸配列を介在させて結合させ、さらにhTSP5のcoiled-coilドメインのC末端に６つのヒスチジン残基を結合させた蛋白である。融合蛋白分子ephrin-A1-hTSP5ccをコードする塩基配列を配列番号１に示す。この塩基配列を前述のベクターpMXs-IG中にIRES(internal ribosomal entry site)の配列を介在させてマーカー遺伝子であるEGFPに結合した（図３４）。そして、このpMXs-IG構築物を実施例１に前述のpCAGVSVGとともにやはり実施例１に前述の293/gpIRES cells（大阪大学、宮澤教授の寄贈による）にトランスフェクトした。こうして、ephrin-A1-hTSP5ccを発現するレトロウイルスを作製し、それをNS0細胞に感染させる事によりephrin-A1-hTSP5ccを安定的に分泌産生するNS0/ephrin-A1-hTSP5ccを作製した。この細胞のクローンを複数クローニングし、その中で最も多量のephrin-A1-hTSP5ccを分泌するクローン細胞の上清をephrin-A1-hTSP5cc分子を精製する材料とした。このタンパク分子は、ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (SIGMA社製, cat# A2220)及びTALON Superflow Metal Affinity Resin (Clontech社製, cat# 635506)の２種類の親和性カラムを用いて分離した後に、Amicon Ultra-4 Ultracel-100k (Millipore社製, cat# UFC805008)で100kDa以上の分子量を分別することによりさらに精製した。このephrin-A1多量体は、hTSP5のcoiled-coilドメインにより複数のephrin-A1が多量体化されていると考えられる。【００６２】
次に、精製したephrin-A1-hTSP5cc多量体を非還元下でSDS-ポリアクリラミドゲル電気泳動法により分離した後に、全てのタンパク質を染色する鋭敏なRuby染色法（図３５（ａ））及び抗ephrin-A1抗体を使用したウエスタンブロッティング法（図３５（ｂ））により検出した。両検査法によりephrin-A1-hTSP5ccの３量体以上の分子塊が検出された。また、精製したephrin-A1-hTSP5cc多量体を還元下でSDS-ポリアクリラミドゲル電気泳動法により分離した後に、抗ephrin-A1抗体を使用したウエスタンブロッティング法により検出したところ、１量体として約４０kDaの分子が検出された（図３５（ｃ））。これらの結果から、タンパクの精製が効率的に行われている事、ephrin-A1-hTSP5ccが理論通りに多量体を形成している事が確認された。【００６３】
〔ephrin-A多量体（ephrin-A1-Fc多量体及びephrin-A1-hTSP5cc多量体）のEphA4リン酸化効力〕
EphA4を発現させたL6細胞（L6/EphA4）を使って、多量体化されたephrin-A1であるephrin-A1-Fc多量体とephrin-A1-hTSP5cc多量体のEphA4リン酸化効力を調べた。L6/EphA4を各ephrin-A1多量体の最終濃度0.05及び0.5μg/mlで血清を除いた培養液（Dulbecco's Minimum Essential Medium）中で３７℃にて１時間インキュベートし、細胞を溶解液（実施例２において使用した組織溶解用緩衝液）で処理した後に、抗EphA4抗体で免疫沈降させ、その沈降物をSDS-ポリアクリラミド電気泳動にて分離し、抗リン酸化チロシン抗体を用いてウエスタンブロッティングにて検出した。その結果を図３６に示す。両者いずれも１２０kDa付近にバンドが現れ、EphA4がほぼ同等にリン酸化されていることが確認された。これらの２種類のephrin-A1多量体はこの細胞において同等の作用があり、hTSP5 coiled-coilドメインによって多量体化されたephrin-A1-TSP5cc多量体も、ephrin-A1-Fc多量体と同様に、脳神経幹細胞の増殖、分化、遊走作用を発揮するものと推測できる。【００６４】
〔ephrin-A1-hTSP5cc多量体のパーキンソンモデルラット脳室内への単回注入〕
パーキンソンモデルラットの障害側線条体に隣接した側脳室内に、上記精製した３μgのephrin-A1-TSP5cc多量体又はPBSを単回注入し、４週間後に抗ＴＨ抗体を使ってDAB法にて線条体を染色した。その結果を図３７に示す。同図（ａ）（ｂ）はephrin-A1-hTSP5cc多量体を注入した同一ラットの両側線条体を示し、同図（ｃ）（ｄ）はコントロールであるPBSを注入した同一ラットの両側線条体を示している。また、（ａ）（ｃ）はそれぞれ障害側を、（ｂ）（ｄ）はそれぞれ健側を示す。ドパミン作動性神経細胞は濃く染色される。【００６５】
ephrin-A1-hTSP5cc多量体を脳室内に注入することにより、障害された線条体内にドパミン作動性神経細胞が明らかに増加していることが分かる（同図（ａ）参照）。一方、コントロールであるPBSが注入されたラットの線条体内にはドパミン作動性神経細胞は全く増加していない（同図(ｃ)参照）。このように、ephrin-A1-hTSP5cc多量体もephrin-A1-Fc多量体と同様に神経幹細胞の再生、発現を促すものと言える。
【実施例５】
【００６６】
〔ephrin-A多量体（ephrin-A1-W-hTSP5cc多量体）の調製〕
同じく５量体形成を促進するTSP5 coiled-coilドメインを１分子中に２個用いて、さらに高度にephrin-Aが多量体化されたephrin-A1多量体（ephrin-A1-W-hTSP5cc多量体）を遺伝子工学的に作製した。ephrin-A1-W-hTSP5cc多量体は、２つのTSP5 coiled-coilドメインをephrin-A細胞外ドメインのＣ末端側に融合させたephrin-A融合蛋白（ephrin-A1-W-hTSP5cc）を多量体化したものである。この融合蛋白ephrin-A1-W-hTSP5ccは、ephrin-A1の細胞外ドメインとhTSP5 coiled-coilドメインをFlag（peptide epitope）の３連続アミノ酸配列を介在させて結合させ、さらにこのhTSP5 coiled-coilドメインのC末端に第２のFlag（peptide epitope）の３連続アミノ酸配列を介在させて第２のhTSP5 coiled-coil ドメインを結合させた後、６つのヒスチジン残基を結合させた蛋白である。融合蛋白ephrin-A1-W-hTSP5ccをコードする塩基配列を配列番号２に示す。この塩基配列を前述のベクターpMXs-IG中に、IRES(internal ribosomal entry site)の配列を介在させてマーカー遺伝子であるEGFPに結合した（図３８参照）。こうして構築したpMXs-IG構築物を用いて実施例４と同様にして、精製されたタンパク分子を得た。融合蛋白ephrin-A1-W-hTSP5ccをコードする塩基配列には２カ所にhTSP5 coiled-coilドメインをコードする塩基配列が組み込まれており、実施例４の多量体に比べてさらに多数のephrin-A1の受容体結合領域が多量体化されることとなる。【００６７】
次に、精製したephrin-A1-W-TSP5cc多量体を非還元下及び還元下のSDS-ポリアクリラミドゲル電気泳動法により分離した後に、抗ephrin-A1抗体を使用したウエスタンブロッティング法により検出した。その結果を図３９に示す。非還元下では分子量約１００kDa以上の多量体が検出され（同図（ａ）参照）、還元下では約５０kDaの１量体と少量の約４０kDaの分子が検出されている（同図（ｂ））。ephrin-A1-W-hTSP5ccはhTSP5のcoiled-coilドメインをephrin-A1のＣ端に２個融合した分子であり、これによりhTSP5のcoiled-coilドメインを１個融合した分子（ephrin-A1-hTSP5cc）と比べてephrin-A1-Fc融合蛋白の高度な多量体が形成されている事が確認された。なお、約４０kDaの分子はペプチダーゼ等により分解を受けたタンパクであると考えられる。【００６８】
〔ephrin-A多量体（ephrin-A1-hTSP5cc多量体及びephrin-A1-W-hTSP5cc多量体）のEphA4リン酸化効力〕
EphA4を発現させたL6細胞（L6/EphA4）を使って、多量体化されたephrin-A1であるephrin-A1-hTSP5cc多量体とephrin-A1-W-hTSP5cc多量体のEphA4リン酸化効力を、前記実施例４と同様にして調べた。その結果を図４０に示す。両者いずれも１２０kDa付近にほぼ同じ濃さのバンドが現れ、EphA4が同等にリン酸化されていることが確認された。つまり、２個のhTSP5 coiled-coilドメインによって多量体化されたephrin-A1-W-hTSP5cc多量体も１個のhTSP5 coiled-coilドメインによって多量体化されたephrin-A1-hTSP5cc多量体（実施例４）と同等なEphA4活性化効力を有し、神経幹細胞の増殖、分化、遊走作用を発揮するものと考えられる。【００６９】
実施例４や５では、hTSP5 coiled-coilドメインを用いてephrin-A1多量体を作製する際に、ephrin-A1の受容体結合領域とhTSP5 coiled-coilドメインの間にFlag（peptide epitope）を介在させた融合蛋白を用いているが、本発明においては、ephrin-A1多量体を形成させることができれば他のアミノ酸残基やペプチド残基を介在させてもよいのは言うまでもなく、Ｃ末端のヒスチジン残基についても同様に他のアミノ酸残基を結合させてもよい。また、それらがなくても差し支えない。そして、塩基配列１や塩基配列２には、本発明の機能を発揮する限りにおいて、塩基置換や塩基挿入、塩基脱落した塩基配列も含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、パーキンソン病やパーキンソン症候群、アルツハイマーなどの中枢神経変性障害のための新たな治療薬を提供する。
【図３４】
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【図３８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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