(57)【要約】本発明の目的は簡易に細菌の菌種を検出する方法を提供することである。この目的のため、本発明では、細菌の菌種を検出するにあたって、Staphｙlococcus属菌、Streptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacilｌus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、 Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上の細菌の菌種を検出対象とし、（ａ）検出対象細菌菌種の核酸を含有する可能性のある被験試料と検出しようとする菌種のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子とを接触させる工程と、（ｂ）前記核酸分子と前記被験試料中の核酸とのハイブリダイズの有無を検出する工程と、を備えるようにする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の菌種を検出する方法であって、
Staphylococcus属菌、Streptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacilｌus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上の細菌の菌種を検出対象とし、
（ａ）検出対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料と検出しようとする２種類以上の菌種のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする２種類以上の核酸分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記核酸分子と前記被験試料中の核酸とのハイブリダイズの有無を検出する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
前記細菌の菌種は、Streptococcus pyogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、 Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli、Mycobacterium tuberculosis、 Mycoplasma pneumoniae、 Mycoplasma genitarium、 Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、 Vibrio fluvialis、 Vibrio alginolytricus、Neisseria meningitides、 Neisseria gonorrhoae、Bacillus cereus、 Chlamydia trachomatis、 Chlamydophila pneumoniae及びCampylobacter jejuniから選択される２種以上である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Vibrio属菌、Bacilｌus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上の細菌の菌種を検出対象とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子は、同一種に属する菌株のDnaJ遺伝子の塩基配列をアラインメントして抽出される１種又は２種以上の菌種特異的な塩基配列又は当該塩基配列と実質的に同一である塩基配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記（ａ）工程は、タグ配列と前記ＤｎａＪ遺伝子の一部と選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットと、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、前記第１のプライマーセットによる前記ＤｎａＪ遺伝子の少なくとも一部の増幅と前記第２のプライマーセットによる前記第１のプライマーセットの増幅産物の増幅とを実施する工程である、請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程である、請求項５に記載の増幅方法。
【請求項７】
前記細菌がStreptococcus pyogenesを含むとき、前記核酸分子は、配列番号１〜４及び配列番号89〜90から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がStreptococcus agalactiaeを含むとき、前記核酸分子は、配列番号5〜8及び配列番号91〜92から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がStreptococcus pneumoniaeを含むとき、前記核酸分子は、配列番号9〜12及び配列番号93〜94から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がStaphylococcus aureusのとき、前記核酸分子は配列番号13〜16及び配列番号97〜98の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がKlebsiella pneumoniaeを含むとき、前記核酸分子は、配列番号17〜19及び配列番号109〜110から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がEscherichi  coliのとき、前記核酸分子は、配列番号21〜24及び配列番号101〜102から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がMycobacterium tuberculosisのとき、前記核酸分子は、配列番号25〜28及び配列番号103〜104から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がMycobacterium spp.（ただし、M.tuberculosiグループを除く）のとき、前記核酸分子は、配列番号29〜30及び配列番号131〜133から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がLegionella pneumophilaを含むとき、前記核酸分子は、配列番号35〜38及び配列番号115〜116から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がVibrio choleraeを含むとき、前記核酸分子は、配列番号43〜46及び配列番号127〜128から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がVibrio mimicusを含むとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号47〜49及び配列番号125〜126から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がVibrio parahaemolyticusを含むとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号50〜52及び配列番号123〜124から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がVibrio vulnificusを含むとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号53〜55及び配列番号119〜120から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がVibrio fluvialisを含むとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号134、 配列番号56〜57及び配列番号117〜118から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がVibrio alginolyticusを含むとき、前記核酸分子は、配列番号43、配列番号58〜60及び配列番号121〜122から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がBacillus cereusを含むとき、前記核酸分子は、配列番号61〜66及び配列番号87〜88から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がCampylobacter jejuniを含むとき、前記核酸分子は、配列番号67〜70及び配列番号129〜130の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がNeisseria meningitidisを含むとき、前記核酸分子は、配列番号83〜86及び配列番号111〜112の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がNeisseria gonorrohaeを含むとき、前記核酸分子は、配列番号79〜82及び配列番号113〜114の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がChlamydia trachomatisを含むとき、前記核酸分子は、配列番号75〜78及び配列番号109〜110の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌が、Chlamydophila pneumoniaeを含むとき、前記核酸分子は、配列番号39〜42及び配列番号107〜108の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がMycoplasma genitariumを含むとき、前記核酸分子は、配列番号71〜74及び配列番号105〜106の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含み、
前記細菌がMycoplasma pneumoniaeを含むとき、前記核酸分子は、配列番号31〜34及び配列番号95〜96の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
細菌を検出・同定するための核酸分子キットであって、
Streptococcus属菌、Staphylococcus属菌、Enterococcus属菌、Peptostreptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichi属菌、Enterobacter属菌、Legionella属菌、Neisseria属菌、Bacillus属菌、Helicobacter属菌、Corynebacteriuｍ属菌、Pseudomonas属菌、Burkholderia属菌、Haemophilus属菌、Bacteroides属菌、Enterococcus属菌、Nocardia属菌、Prevotella属菌、Neisseria属菌、Moraxella属菌、Flavobacterium属菌、Clostridium属菌、Treponema属菌、Sphingobacterium属菌、Leptospira属菌、Campylobacter属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上の細菌の菌種を検出・同定対象とし、
前記同定対象細菌のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子を含むキット。
【請求項９】
前記核酸分子は、タグ配列と前記ＤｎａＪ遺伝子の一部と選択的にハイブリダイズするする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の核酸分子キットを構成する核酸分子から選択される２種以上の核酸分子が固定化された固相体。
【請求項１１】
少なくとも１種類のターゲット核酸を増幅する方法であって、
タグ配列と前記ターゲット核酸の一部と選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程を、備え、
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、前記第１のプライマーセットによる前記ターゲット核酸の増幅と前記第１のプライマーセットによる増幅産物の前記第２のプライマーセットによる増幅とを実施する工程であり、
前記第１のプライマーセットは、微生物のＤｎａＪ遺伝子の一部をターゲット核酸とする、増幅方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程である、請求項１１に記載の増幅方法。
【請求項１３】
前記第２のプライマーセットのプライマー濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマー濃度の１０倍以上５０倍以下である、請求項１１又は１２に記載の増幅方法。
【請求項１４】
前記第１のプライマーセットのプライマー濃度は、０．００５μＭ以上０．１μＭ以下であり、前記第２のプライマーセットのプライマー濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマー濃度の１０倍以上５０倍以下であり、
前記第２のプライマーセットによる増幅産物が２５０塩基以下の核酸であり、
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程である、請求項１１に記載の増幅方法。
【請求項１５】
前記第１のプライマーセットは、Staphｙlococcus属菌、Streptococcus属菌、Serratia属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacillus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上の細菌のＤｎａＪ遺伝子の一部をターゲット核酸とする、請求項１１〜１４のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項１６】
病原微生物のマルチプレックスＰＣＲによる診断方法であって、
前記病原微生物は、Staphｙlococcus属菌、Streptococcus属菌、Serratia属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacillus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上であり、
前記病原微生物由来の核酸を含有する可能性のある被験試料に対して、タグ配列と前記病原微生物が保持するＤｎａＪ遺伝子上のターゲット核酸に選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程と、
前記ターゲット核酸を含む増幅産物を検出する工程と、
を備える方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１種類の病原微生物のターゲット核酸をマルチプレックスＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットを含むキットであって、
タグ配列と前記病原微生物が保持するＤｎａＪ遺伝子上のターゲット核酸と選択的にアニールする塩基配列とを有する第１のプライマーセットと、
前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する第２のプライマーセットと、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DnaJ遺伝子を利用した細菌の検出及びその利用に関し、詳しくはDnaJ遺伝子を利用して細菌を検出するための方法及びこの方法に用いる核酸分子並びにこれらの診断や同定への利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、病原細菌など各種細菌の検出や同定は特殊な試薬および熟練した技術を用い、対象とする細菌の培養を行う必要があった。病原細菌の増菌は危険度を伴うものであるほか、可能性ある病原菌が複数想定される場合には、種々の条件で培養を行う必要もあった。さらに菌種を同定するには、生化学的性状等を詳しく調べる必要があった。このように、細菌の検出や同定、特に、病原細菌の検出や同定には、危険性のほか多大な手間と時間を要していた。【０００３】
一方、細菌の分類や同定の手法として16S rDNAの塩基配列が用いられるようになってきている。こうした遺伝子の塩基配列を利用すれば、比較的短時間で細菌及び菌種を検出したり同定したりすることが期待される。【０００４】
しかしながら、16S rDNAの塩基配列の蓄積とともに、16S rDNAの塩基配列が独立かつ近縁の菌種間では９８％以上類似して菌種を識別できないことが多くあることがわかってきた（非特許文献１）。したがって、より複雑な全染色体の遺伝子の類似度を計測する方法を実施しなければ、菌種を決定できないこともわかってきた（非特許文献２）。このため、より多型に富んだ配列のデータの蓄積が要請されるようになり、GyrBやropBなどの遺伝子の塩基配列データの蓄積が進んでいる。（非特許文献３、４、５）。【０００５】
こうしたハウスキーピング遺伝子の一つとして、ヒートショックタンパク質であるDnaＪがある。DnaＪをコードするDnaJ遺伝子は、Mycobacterium属菌の菌種で分類に利用できることが報告されている（非特許文献６）。また、Mycobacterium aviumの血清型においてDnaJ遺伝子に多型が多いこと（非特許文献７）や同菌種において２００塩基と短い配列ではあるが、血清型でDnaJ遺伝子がよく保存され、同じ属の菌種レベルでは配列の違いが大きいことも報告された（非特許文献８）。さらに、レジオネラ（Legionella）属においては、DnaJ遺伝子は、L. pneumophliaの血清型で保存されており、菌種レベルでは多型に富むことが報告されている（非特許文献９）。【０００６】
一方、食品や動物から採取した検体中の病原微生物を迅速にかつ確実に検出し特定することは、感染症予防や治療の現場において強く求められている。病原微生物の特定にあたっては、複数種類の病原微生物に特徴的なターゲット核酸にそれぞれ対応する複数種類のプライマーセットを用いてＰＣＲを実施するマルチプレックスＰＣＲ法が有用である。マルチプレックスＰＣＲでは、一つのチューブ内で多種類のプライマーを用いてターゲット核酸を増幅する。こうしたマルチプレックスＰＣＲ法にあっては種々の検討がなされている（特許文献１〜４）。マルチプレックスＰＣＲは、感染症治療にあたってウイルスやバクテリア等病原微生物を特定することに有用性が高い。病原微生物を特定するには、病原微生物のゲノムに特異的な配列をターゲットとする必要がある。【０００７】
【非特許文献１】Fox、G.E. et al.1992． Int. J. Syst. Bacteriol. 42:166-170）
【非特許文献２】Ezaki、T. et al.1989. Int. J. Syst. Bacteriol、Amano、M. et al. 2005. Microbiol. Immunol. 49:255-263
【非特許文献３】Yamamoto、S. and S.Harayama. 1995. Appl. Environ. Microbiol.61: 1104-1109.、
【非特許文献４】Yamamoto、S. and S. Harayama.1996. Int. J. Syst. Bacteriol. 46:506-511
【非特許文献５】Cheunoy、W. et al.2005.Diagn. Microbiol. Infect.Dis.51：165-171
【非特許文献６】Takewaki、S. et al. 1994.Int. J. Syst. Bacteriol.44:159-166
【非特許文献７】Victor、 TC. et al. 1996. J. Med. Microbiol. 44:332-339
【非特許文献８】Morita、Y . et. al.2004. J. Med. Microbiol.53:813-817
【非特許文献９】Liu、 H. et al.2003. Microbiol. Immunol. 47:859-869
【発明の開示】
【０００８】
通常、ある遺伝子中の塩基配列が他の属の類縁菌に対して特異的であるとともに、同一属内の菌種レベルで特異的であり、しかも、菌種内の株レベルにおいては当該塩基配列がある程度保存されているとき、はじめてその遺伝子だけで特定菌種を検出したり同定したりすることができる。すなわち、特定の遺伝子が特定の菌種の検出や同定に用いることができるかどうかは、網羅的に特定菌種に含まれる多数の株について特定遺伝子の配列を決定しなければならなかった。
【０００９】
しかしながら、DnaJ遺伝子については、特定の菌種や血清型レベルで配列が決定されているに過ぎず、これら菌種内の株レベルでの配列情報については報告されていない。DnaJ遺伝子については、上記のような網羅的な遺伝子解析がなされていなかった。したがって、これまで、DnaJ遺伝子が単独で菌種の検出や同定に利用可能な特異的な塩基配列を有しているかどうかは不明であった。さらに、菌株による多型があるため菌種で保存された配列を見出すには多数の菌株の配列を決定する必要があった。
【００１０】
また、細菌などの病原微生物を特定するのにあたっては、複数（２〜１０種類）種類のプライマーを、当該プライマーを個々に用いる場合と同じ濃度（０．２μＭ〜０．８μＭ程度）で用いると、プライマーの競合が生じて、増幅効率が低下して増幅産物が減少してしまい結果として増幅産物を検出できなくなるという問題があった。また、プライマー濃度を下げれば増幅効率が低下してしまい、この場合も増幅産物を検出できなくなる。したがって、一度に組み合わせることのできる実用的なプライマーの種類は実質的には６種類程度であった。
【００１１】
また、マルチプレックスＰＣＲを、多種類のプライマーによって実施するには、プライマーの特異性が重要である。多種類の病原微生物に対応するマルチプレックスＰＣＲにおいては、菌種特異的な配列をターゲットとする必要がある。しかしながら、多種類の病原微生物について、同時に使用可能で、かつ菌種特異的なターゲットを増幅するプライマーを設計するのは極めて困難であった。
【００１２】
本発明は、簡易に細菌の菌種を検出又は同定できる方法等及びこれに用いる核酸分子を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、高感度に細菌の菌種を検出又は同定する方法等及びこれに用いる核酸分子を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、2種類以上の菌種を検出又は同定することができる方法等及びこれに用いる核酸分子を提供することを他の一つの目的とする。また、本発明は、細菌などの微生物の迅速な検出に適したマルチプレックスＰＣＲによる微生物の増幅方法及びそのためのキット等を提供することを一つの目的とする。
【００１３】
本発明者らは、680菌種1250株についてDnaJ遺伝子の配列決定を行い、その結果の比較から、例えば、16S ｒDNA遺伝子の菌種間の配列類似度が９５％以上であるのに対し、DnaJ遺伝子では、ほとんどの属において菌種間の類似度が７５〜９０％であることを見出し、さらに、同一種内の株レベルでの配列情報から、DnaJ遺伝子だけで菌種を決定できる特異的な塩基配列を抽出できることを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１４】
本発明によれば、細菌の菌種を検出する方法であって、Staphｙlococcus属菌、Streptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacilｌus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上の細菌の菌種を検出対象とし、
（ａ）検出対象細菌菌種の核酸を含有する可能性のある被験試料と検出対象細菌菌種のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記核酸分子と前記被験試料中の核酸とのハイブリダイズの有無を検出する工程と、
を備える方法が提供される。
【００１５】
この発明においては、前記（ａ）工程は、前記核酸試料と２種類以上の菌種のDnaJ遺伝子のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズする２種類以上の前記核酸分子を同時に接触させる工程であることが好ましい。また、前記核酸分子は、同一種に属する菌株のDnaJ遺伝子の塩基配列をアラインメントして抽出される１種又は２種以上の菌種特異的な塩基配列又は当該塩基配列と実質的に同一である塩基配列を含むことができる。さらに、前記細菌の菌種は、Streptococcus pyogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、 Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli、Mycobacterium tuberculosis、 Mycoplasma pneumoniae、 Mycoplasma genitarium、 Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、 Vibrio fluvialis、 Vibrio alginolytricus、Neisseria meningitides、 Neisseria gonorrhoae、Bacillus cereus、 Chlamydia trachomatis、 Chlamydophila pneumoniae及びCampylobacter jejuniから選択される１種又は２種以上とすることができる。これらの特定の菌種を検出するのにあたり、特定の核酸分子を使用することができる。
【００１６】
また、前記細菌の菌種は、Streptococcus属菌、 Staphylococcus属菌、 Klebsiella属菌
、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Neisseria属菌、Mycoplasma 属菌から選択される１種又は２種以上とすることができる。これらの菌は肺炎及び／又は咽頭炎の原因菌である。前記細菌がStreptococcus  pyogenes、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pneumoniae、Staphylococcus  aureus、 Klebsiella  pneumoniae、Escherichi  coli、Mycobacterium tuberculosis、 Legionella pneumophila、Chlamydia trachomatis、 Chlamydophila pneumoniae、Neisseria gonorrhoae 、Neisseria meningitides及びMycoplasma pneumoniaeから選択されるいずれかとすることができ、その場合、前記核酸分子は、配列番号1〜42、131〜134及び配列番号89〜116から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができる。
【００１７】
また、前記細菌がVibrio属菌、Campylobacter属菌、Staphylococcus属菌、Bacillus属菌、Escherichia属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上とすることができる。これらの菌は、下痢及び／又は食中毒の原因菌である。前記細菌がVibrio cholerae、 Vibrio mimicus、 Vibrio parahaemolyticus、 Vibrio alginolyticus、 Vibrio fluvialis、 Vibrio vulnificus、 Vibrio vulnificus、Campylobacter jejuni、 Staphylococcus aureus、 Bacillus cereus及びEshcerichia coliから選択されるいずれかであるとき、前記核酸分子は、配列番号43〜70、134、配列番号87〜88、97〜98、101〜102及び117〜130から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができる。また、前記細菌が、Listeria monocytogenesであるとき、前記核酸分子は、配列番号135、136又は配列番号137、138に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができ、前記細菌が、Salmonella enteritidisであるとき、前記核酸分子は、配列番号139、140に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列を含むことができ、前記細菌がYersinia enterocoliticaのときには、前記核酸分子は、配列番号143、144に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができる。
【００１８】
また、前記細菌がNeisseria属菌、Chlamydia属菌及びMycoplasma属菌から選択される１種又は２種以上とすることができる。これらの菌は性病の原因菌である。前記細菌がNeisseria gonorrhoae、 Neisseria meningitides、 Chlamydia trachomatis及びMycoplasma genitarium のとき、前記核酸分子は、配列番号71〜86、配列番号105〜106及び109〜114から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができる。
【００１９】
本発明によれば、細菌を同定する方法であって、Streptococcus属菌、Staphylococcus属菌、Enterococcus属菌、Peptostreptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichi属菌、Enterobacter属菌、Legionella属菌、Neisseria属菌、Bacillus属菌、Helicobacter属菌、Corynebacteriuｍ属菌、Pseudomonas属菌、Burｋholderia属菌、Haemophilus属菌、Bacteroides属菌、Enterococcus属菌、Nocardia属菌、Prevotella属菌、Neisseria属菌、Moraxella属菌、Flavobacterium属菌、Clostridium属菌、Treponema属菌、Sphingobacterium属菌、Leptospira属菌、Campylobacter属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上の細菌を同定対象とし、（ａ）同定対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料中のDnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列を取得する工程、を備える、方法が提供される。
【００２０】
この同定方法では、（ｂ）前記被験試料から取得されたDnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と同定対象細菌のDnaJ遺伝子の塩基配列とを対比して前記被験試料中の細菌の菌種を同定する工程を備えることが好ましい。
【００２１】
本発明によれば、細菌同定プログラムであって、Streptococcus属菌、Staphylococcus属菌、Enterococcus属菌、Peptostreptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichi属菌、Enterobacter属菌、Legionella属菌、Neisseria属菌、Bacillus属菌、Helicobacter属菌、Corynebacteriuｍ属菌、Pseudomonas属菌、Burｋholderia属菌、Haemophilus属菌、Bacteroides属菌、Enterococcus属菌、、Nocardia属菌、Prevotella属菌、Neisseria属菌、Moraxella属菌、Flavobacterium属菌、Clostridium属菌、Treponema属菌、Sphingobacterium属菌、Leptospira属菌及びCampylobacter属菌から選択される１種又は２種以上の細菌を同定対象とし、同定対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料中から取得されたDnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と同定対象細菌のDnaJ遺伝子の塩基配列とを対比して前記被験試料中の細菌の菌種を同定するステップを１又は２以上のコンピュータに実行させるプログラムが提供される。
【００２２】
本発明によれば、細菌を検出・同定するための核酸分子であって、Streptococcus属菌、Staphylococcus属菌、Enterococcus属菌、Peptostreptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichi属菌、Enterobacter属菌、Legionella属菌、Neisseria属菌、Bacillus属菌、Helicobacter属菌、Corynebacteriuｍ属菌、Pseudomonas属菌、Burｋholderia属菌、Haemophilus属菌、Bacteroides属菌、Enterococcus属菌、Nocardia属菌、Prevotella属菌、Neisseria属菌、Moraxella属菌、Flavobacterium属菌、Clostridium属菌、Treponema属菌、Sphingobacterium属菌、Leptospira属菌、Campylobacter属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上の細菌を検出・同定対象とし、前記同定対象細菌のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子が提供される。前記核酸分子は遺伝子増幅用のプライマーであってもよいし、プローブであってもよい。また、これらの核酸分子から選択される１種又は２種以上が固相に固定化された固定化体の形態としてもよく、これら核酸分子から選択される１種又は２種以上の核酸分子を含む、細菌の同定検出キットの形態としてもよい。
【００２３】
また、本発明者らは、プライマーの機能を２つに分離することで微生物を迅速かつ高感度に検出できることを見出した。すなわち、ターゲット核酸に特異的にアニーリングするとともにターゲット核酸とアニーリングしないタグ配列を有する第１のプライマーセットと、第１のプライマーセットに付したタグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する第２のプライマーセットとを組み合わせることにより、複数種類のターゲットを指向する複数のプライマーセットを同時に作用させた場合であっても、十分な感度でターゲット配列を検出できることを見出した。また、複数種類の微生物を検出可能なプライマー混合物（以下、カクテルプライマーともいう。）を構成するために、各種微生物のDnaJ遺伝子をターゲットとすることで菌種特異的なプライマーを容易に設計することができ、実質的に単一のＰＣＲ反応サイクルで増幅効率よくターゲットを増幅して感度よく検出できることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【００２４】
また、本発明によれば、少なくとも１種類のターゲット核酸を増幅する方法であって、タグ配列と前記ターゲット核酸に特異的な塩基配列とをそれぞれ有する第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列をそれぞれ有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程を、備える方法が提供される。
【００２５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、前記第１のプライマーセットによる前記ターゲット核酸の増幅と前記第１のプライマーセットによる増幅産物の前記第２のプライマーセットによる増幅とを実施する工程とすることができる。また、前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、実質的に単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程とすることができる。
【００２６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、前記第１のプライマーセットのプライマー濃度は、０．００５μＭ以上０．１μＭ以下であり、前記第２のプライマーセットのプライマー濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマー濃度の１０倍以上５０倍以下であり、前記第２のプライマーセットによる増幅産物が２５０塩基以下の核酸であり、単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程とすることができる。
【００２７】
本発明によれば、病原微生物のマルチプレックスＰＣＲによる診断方法であって、前記病原微生物は、Staphｙlococcus属菌、Streptococcus属菌、Serratia属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacillus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上であり、前記病原微生物由来の核酸を含有する可能性のある被験試料に対して、タグ配列と前記病原微生物が保持するターゲット核酸（好ましくはＤｎａＪ遺伝子上にある。）に選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程と、前記ターゲット核酸を含む増幅産物を検出する工程と、を備える方法が提供される。この方法においては、前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程であることが好ましい。
【００２８】
本発明によれば、少なくとも１種類の微生物のターゲット核酸をマルチプレックスＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットを含むキットであって、タグ配列と前記微生物が保持するターゲット核酸（好ましくはＤｎａＪ遺伝子上にある。）と選択的にアニールする塩基配列とを有する第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する第２のプライマーセットと、を備える、キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】16SrDNA配列の比較について示す図。両菌種では、１２塩基（１．２％）しか違いがなかった。
【図１Ｂ】DnaJ配列の多型を示す図。両菌種では、１８３塩基（２０．６％）の違いがあった。
【図２】S.aureusのDnaJプライマー配列を示す図。
【図３】単独プライマー（プライマー液Ｂ）及びマルチプルプライマー（プライマー液Ａ）による増幅結果を示す図。
【図４】Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブで増幅したDNAをCYBR Greenの蛍光の増強をモニターした結果を示す図。
【図５】ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動で確認した結果を示す図。
【図６】遺伝子増幅による検出感度を電気泳動法で比較した図。
【図７】Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブで増幅したDNAをCYBR Green  の蛍光の増強をモニターした結果を示す図。
【図８】Mycobacterium属菌のdnaJ遺伝子を55菌種3亜種の基準株を示す図。
【図９】DnaJ遺伝子とRpoB遺伝子の配列を比較する図。
【図１０】各種遺伝子の塩基配列を比較する図。
【図１１】16S rDNA遺伝子及びDnaJ遺伝子の塩基配列の類似性を比較する図。
【図１２】各種菌株についてのDnaJ遺伝子による同定結果と生化学的性状による同定結果とを示す図。
【図１３】M.avium−M.intracellulare group(MAC group)として総称されていた臨床分離株16株(図中のKPM株)についてのDnaJ遺伝子の塩基配列に基づいて同定した結果を示す図。
【図１４】本発明の増幅方法に用いる第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとターゲット核酸との関係を示す図である。
【図１５】Legionella pneumophiaＧＴＣ1279DNAをターゲット核酸として設計したプライマー配列を示す図である。
【図１６】実施例８のＰＣＲにおける増幅モニター結果を示す図である。
【図１７】実施例９のＰＣＲにおける増幅モニター結果を示す図である。
【図１８】下痢の細菌性病原微生物を検出対象とするプライマーの配列を示す図である。
【図１９】下痢のウイルス性病原微生物を検出対象とするプライマーの配列を示す図である。
【図２０】実施例１０でシリコン基板に固定化したプローブの配列を示す図である。
【図２１】実施例１０のＰＣＲ産物をシリコン基板上のプローブとハイブリダイゼーションさせたときの蛍光を示す図である。
【図２２】ＳＴＤ病原微生物を検出するためのプライマーの配列を示す図である。
【図２３】実施例１１のＰＣＲ産物中の増幅産物の検出に用いたプローブの配列を示す図である。
【図２４】実施例１１で得られたハイブリダイゼーション産物の蛍光強度を示す図である。
【図２５】実施例１２で調製した４種類のプライマー混合物を構成するプライマーを示す図である。
【図２６】実施例１２でＰＣＲを行った結果のＣＴｍを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の検出方法によれば、前記被験試料と、検出しようとする菌種のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子とを接触させてハイブリダイズの有無を検出することにより、特定菌種を検出することができる。DnaJ遺伝子は、菌種間において類似度が低い一方、同一菌種の菌株間において一定以上保存されている。このため、菌種特異的な塩基配列を容易に抽出でき、当該塩基配列を用いることで容易に特定菌種を検出できる。特に、菌種間の類似度が低いため、類縁種であっても感度よく特定菌種を検出することができる。また、菌種間類似度が低いために、特異的なプライマー等を設計できる。この結果、複数のプライマーセットの混合物を用いても特定の菌種を検出することができる。したがって、複数種のプライマーセットを含む１種のプライマー混合物で複数の菌種を検出することができる。なお、DnaJ遺伝子は生命維持に不可欠なハウスキーピング遺伝子であって全ての菌株が保有している点において、菌種の検出同定には有利である。【００３１】
また、本発明の同定方法によれば、DnaJ遺伝子は、菌種間において類似度が低いため、同定対象細菌のDnaJ遺伝子の塩基配列を決定又は所定のプローブとハイブリダイズさせること等により解析し、既存の類縁菌種のDnaＪ遺伝子の塩基配列の解析結果と比較等することに
より、同定対象細菌の菌種を同定することができる。【００３２】
以下、本発明の実施の形態について、本発明の細菌の検出方法及び同定方法並びにこれらの方法に用いる核酸分子等について詳細に説明する。【００３３】
（細菌の検出方法）
（検出対象）
本発明の細菌の検出方法は、Staphylococcus属菌、Streptococcus属菌、Klebsiella属
菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacilｌus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、 Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上の菌の菌種を検出対象としている。これらの属に属する菌種においては、DnaJ遺伝子の塩基配列は16S rDNA遺伝子の塩基配列よりも類似度が低いため、同一菌種内の株の間で保存されている菌種特異的な塩基配列を見出すのが容易であり、DnaJ遺伝子を用いて菌種を検出するのに適している。例えば、DnaＪ遺伝子については、Stapylocuccus属菌においては16S rDNAでは菌種間で平均97.4%であるがDnaJは菌種間で平均７７．６％、Streptococcus属菌においては1６S rDNAでは菌種間で平均95.8%であるがDnaJは同平均７６．４％、Mycobacterium属菌においては1６S rDNAでは菌種間で平均93%であるがDnaJは同平均８３．７％、Legionella属菌については1６S rDNAでは菌種間で平均96.1%であるがDnaJは同平均82.5％である。Vibrio属菌については1６S rDNAでは菌種間で平均97.4%であるがDnaJは同平均８２％、Aeromonas属菌については1６S rDNAでは菌種間で平均98.8%であるがDnaJは同平均８９．８％、Family Enterobacteriaceae科については1６S rDNAでは菌種間で平均97.1%であるがDnaJは同平均８７．６％の配列類似度となっている。【００３４】
なかでも、検査対象菌種は、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Vibrio属菌、Bacilｌus属菌Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、 Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌の菌種とすることが好ましい。これらの属については、遺伝子工学的手法による菌種の検出や同定が困難であったが、DnaJ遺伝子の利用により遺伝子工学的に検出や同定が可能となったからである。【００３５】
また、16S rDNAが極めて類似している腸内細菌科FamilyであるEnterobacteriaceaeのなかでも、属中の菌種別に違いを見るとKlebsiella属の4つの菌種では、16S rDNAは1.4%の
違いしかないが、DnaJでは７.８％の違いがある。さらに、Serratia属では１６S rDNAで2.3%であるのにたいして、DnaJでは5.5%、Salmonella属では16SｒDNAは1.4％、DnaJは6．3%と多型が大きくなっている。このように、DnaJ遺伝子を用いればより適切に菌を検出したり菌種を同定することができる。【００３６】
本発明の検出方法においては、複数種類の菌種をそれぞれ検出する核酸分子の混合物を用いることで、2種類以上の菌種を検出対象菌種することもできる。DnaJ遺伝子の塩基配列が属間及び菌種間で類似度が低く、菌株間で類似度が高い配列部位があるため、互いに干渉しないでDnaJ遺伝子をハイブリダイズする核酸分子を設計できるからである。【００３７】
（被験試料）
本発明の検出方法は、（ａ）検査対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料と検出しようとする菌種のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子とを接触させる工程を備えることができる。ここで、被験試料は、菌種を検出しようとする検査対象細菌の核酸を含有する可能性があればよく、特に限定されないが、例えば、血液、血清、ヒトを含む動物から採取された細胞又は組織、便や尿などの排泄物、痰、井戸水、食品などが挙げられる。被験試料は、こうした採取物等から核酸を抽出した核酸抽出試料であってもよいし、さらに、DnaJ遺伝子又はその一部（検出しようとする領域を含む）の増幅産物を含む試料であってもよい。【００３８】
（核酸分子）
本発明方法で用いることのできる核酸分子としては、同一種に属する菌株のDnaJ遺伝子の塩基配列をアライメントして抽出される１種又は２種以上の菌種特異的な塩基配列を含むことができる。こうした核酸分子によれば、菌種特異的であり、かつ当該菌種に属する株を確実に検出することができる。なお、こうしたアライメント及び特徴的配列の抽出には、DNASIS pro ver.（日立ソフト）、Beacon designerver.5.1(Molecular beacon社)及びClustal W (Free soft)などのソフトウエアを利用することができる。【００３９】
核酸分子は、抽出された菌種特異的な塩基配列を１つ含んでいてもよいし、２以上含んでいてもよい。また、核酸分子は、こうして抽出された菌種特異的な塩基配列と実質的に同一である塩基配列を含むことができる。ここで、実質的に同一である配列とは、当該塩基配列に基づくDnaJ遺伝子とのハイブリダイゼーションの特異性を維持できる範囲で改変された塩基配列が挙げられる。たとえば、当該塩基配列と相補的な塩基配列や、当該塩基配列において、１又は２以上の塩基が置換、挿入、欠失及び付加から選択された１種又は２種以上の形態で改変された塩基配列が挙げられる。また、こうした改変は、特定菌株のDnaJ遺伝子の塩基配列に対応させて行われていてもよい。【００４０】
核酸分子は具体的には、こうした特異的な塩基配列からなる又はこうした塩基配列を含むプライマーやプローブである。核酸分子は、塩基配列に基づくハイブリダイゼーションが可能であれば特に限定されない。核酸分子としては、DNA、RNA、DNA-RNAキメラ、修飾塩基等を含む人工核酸、ペプチド核酸（PNA）のいずれの形態を採ることができるが、典型的にはDNAである。また、こうした核酸分子は、各種の蛍光色素や蛍光色素のクエンャー等で修飾されていてもよい。【００４１】
次に、菌種毎に好ましい核酸分子を例示する。細菌がStreptococcus pyogenesのとき、配列番号１〜４（プライマー）及び配列番号89〜90（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。また、前記細菌がStreptococcus agalactiaeのとき、配列番号5〜8（プライマー）及び配列番号91〜92（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列又は当該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がStreptococcus pneumoniaeのとき、配列番号9〜12（プライマー）及び配列番号93〜94（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がStaphylococcus aureusのとき、配列番号13〜16（プライマー）及び配列番号97〜98（プローブ）の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がKlebsiella pneumoniaeのとき、配列番号１７〜２０（プライマー）及び配列番号109〜110（プライマー）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がEscherichi  coliのとき、前記核酸分子は、配列番号21〜24（プライマー）及び配列番号101〜102（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がMycobacterium tuberculosisのとき、前記核酸分子は、配列番号25〜28（プライマー）及び配列番号103〜104（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がMycobacterium spp.（ただし、M.tuberculosiグループを除く）のとき、前記核酸分子は、配列番号29〜30（プライマー）及び配列番号131〜133（プライマー）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がLegionella pneumophilaのとき、配列番号35〜38（プライマー）及び配列番号115〜116（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がVibrio choleraeのとき、前記核酸分子は、配列番号43〜46（プライマー）及び配列番号127〜128（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がVibrio mimicusのとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号47〜49（プライマー）及び配列番号125〜126から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列（プローブ）又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がVibrio parahaemolyticusのとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号50〜52（プライマー）及び配列番号123〜124（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がVibrio vulnificusのとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号53〜55（プライマー）及び配列番号119〜120（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がVibrio fluvialisのとき、前記核酸分子は、配列番号43、 配列番号134、配列番号56〜57（プライマー）及び配列番号117〜118（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がVibrio alginolyticusのとき、配列番号43、配列番号58〜60（プライマー）及び配列番号121〜122（プライマー）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がBacillus cereusのとき、配列番号61〜66（プライマー）及び配列番号87〜88（プローブ）から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がCampylobacter jejuniのとき、前記核酸分子は、配列番号67〜70（プライマー）及び配列番号129〜130（プライマー）の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がNeisseria meningitidisのとき、配列番号83〜86（プライマー）及び配列番号111〜112（プローブ）の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がNeisseria gonorrohaeのとき、配列番号79〜82（プライマー）及び配列番号113〜114（プローブ）の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がChlamydia 
trachomatisのとき、配列番号75〜78（プライマー）及び配列番号109〜110（プローブ）
の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌が、Chlamydophila pneumoniaeのとき、前記核酸分子は、配列番号39〜42（プライマー）及び配列番号107〜108（プローブ）の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がMycoplasma genitariumのとき、配列番号71〜74（プライマー）及び配列番号105〜106（プローブ）の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。細菌がMycoplasma pneumoniaeのとき、配列番号31〜34（プライマー）及び配列番号95〜96（プローブ）の１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。【００４２】
肺炎、咽頭炎の原因菌の検出にあたっては、Streptococcus属菌、Staphylococcus属菌、 Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Neisseria属菌及びMycoplasma 属菌から選択される１種又は２種以上を検出対象とすることができる。このとき、細菌がStreptococcus  pyogenes、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pneumoniae、Staphylococcus  aureus、 Klebsiella  pneumoniae、Escherichi  coli、Mycobacterium tuberculosis、 Legionella pneumophila、Chlamydia trachomatis、 Chlamydophila pneumoniae、Neisseria gonorrhoae 、Neisseria meningitides及びMycoplasma pneumoniaeから選択されるいずれかであるとき、前記核酸分子としては、配列番号1〜42、131〜133及び配列番号89〜116から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。これらのうち、２種類以上又は３種類以上の菌種の各DnaJ遺伝子に対応するプライマーセットを組み合わせることが好ましい。【００４３】
また、下痢、食中毒の原因菌の検出にあたっては、Vibrio属菌、Campylobacter属菌、Staphylococcus属菌、Bacillus属菌、Escherichia属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される１種又は２種以上を検出対象とすることができる。このとき、細菌がVibrio cholerae、 Vibrio mimicus、Vibrio parahaemolyticus、 Vibrio alginolyticus、 Vibrio fluvialis、 Vibrio vulnificus、 Vibrio vulnificus、 Campylobacter jejuni、 Staphylococcus aureus、 Bacillus cereus及びEshcerichia coliから選択されるいずれかであるとき、前記核酸分子としては、配列番号43〜70、134、配列番号87〜88、97〜98、101〜102及び117〜130から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。また、細菌が、Listeria monocytogenesであるとき、前記核酸分子は、配列番号135、136又は配列番号137、138に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができ、前記細菌が、Salmonella enteritidisであるとき、前記核酸分子は、配列番号139、140に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列を含むことができ、前記細菌がYersinia enterocoliticaのときには、前記核酸分子は、配列番号143、144に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができる。これらのうち、２種類以上又は３種類以上の菌種の各DnaJ遺伝子に対応するプライマーセットを組み合わせることが好ましい。【００４４】
また、性病の原因菌の検出にあたっては、Neisseria属菌、Chlamydia属菌、あるいはMycoplasma属菌から選択される１種又は２種以上を検出対象とすることもできる。このとき、Neisseria gonorrhoae、 Neisseria meningitides、 Chlamydia trachomatis及びMycoplasma genitariumのとき、前記核酸分子としては、配列番号71〜86、配列番号105-106及び109-114から選択される１種又は２種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。これらのうち、２種類以上又は３種類以上の菌種の各DnaJ遺伝子に対応するプライマーセットを組み合わせることが好ましい。【００４５】
以下に、核酸分子に適用するのに好ましい塩基配列を検出対象細菌名とともに列挙する。なお、プライマーとして利用するものは、基本的にフォワードプライマーとリバースプライマーの順で１セットとなるように記載した。【００４６】
（プライマーとして利用するのに好ましい核酸分子の塩基配列）
（気道感染の原因菌のプライマー）
Streptococcus  pyogenes
配列番号01: 5-ATAAGGATGTTCAAGAAGCTTACG
配列番号02: 5-CACCAAAGCCGCCTTGAG
配列番号03: 5-TTTTGAAGAGGCTGTATTTGG
配列番号04: 5-GAGCGGTACCAGGTTTTG
Streptococcus  agalactiae
配列番号05 :5-GCTTATGAAACCTTGAGTGATAC
配列番号06: 5-AAACCGCCACCATCGAAG
配列番号07:5-GGAGATGACCTACAATATCG
配列番号08:5-GGCTAGTACCTGGCTTAG
Streptococcus  pneumoniae
配列番号09 :5-GCCTATGAGACTTTGAGTGAC
配列番号10 :5-ACCAGCTCCACCAAAACC
配列番号11 :5-GCAATCCAAACGCTCCTC
配列番号12 :5-TGTACGACAGCCAGCTTC
Staphylococcus  aureus
配列番号13 :5-GGACAAGGATTCAATGGCTCT
配列番号14 :5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCT
配列番号15：5- GAAGCGGTATTTGGTACAAC
配列番号16：5- GCCATTACAGTAACTACAAGTC
Klebsiella  pneumoniae
配列番号17：5-CCCTGTCGGTTAAAATTCC
配列番号18：5-CTCAAAGATAGCGTGCTG
配列番号19：5-GCGTAGAAAAGACCAAAACC
配列番号20：5- CAGGTTCAGGTGAAGCAG
Escherichia  coli、
配列番号21：5-TGTTGAGCGCAGCAAAAC
配列番号22：5-CAAGACGGATGCGGTCTC
配列番号23：5- CTCGAAGAAGCTGTACGTG
配列番号24：5- CTGTGTACCTGGTTTTGC
Mycobacterium tuberculosis  
配列番号25：5- GTTCGACAGCGGCTTTGG
配列番号26：5- GAACAAGTCGTTGAGGTTGAAC
配列番号27：5-AAGACTTCTACCAGGAGCTG
配列番号28：5-ACTTCCGATAGGCACGTTT
Mycobacterium spp.(M. tuberculosis以外)
配列番号29：5-CGIGARTGGGTYGARAARG
配列番号30：5-GGIGAYYTITTCGGIGGIYT
配列番号131:5- GTGARTGGGTCGARAARGACT
配列番号132:5- CGIGTYTCGTCGTAYTCCTT
配列番号133: 5-CAGCGRTTACCYGCCCA
Mycoplasma pneumoniae
配列番号31：5- AGCTTGCTATGCAGTACC
配列番号32：5- CTCTTTAAACTTCTCTTCGTTTTG
配列番号33：5-TTGAGATGACTAATGGTTGTACTC
配列番号34：5- CCCTTCAGCCCCAAAACC
Legionella penumophila 
配列番号35：5- ACTGTTTGTGAGGGATCG
配列番号36：5- AAAACCTTGTTGAATTCTGAC
配列番号37：5- TTGAAGAAGCGGCTATAGG
配列番号38：5- CTCACAAACAGTACAAGTACC
Chlamydophila pneumoniae 
配列番号39：5- TCTCAGTGATCCTCAGAA
配列番号40：5-CCAAAGGCTCCCATGAAAG
配列番号41：5- TTTGGAATGCGCTCAGATC
配列番号42：5- GCTTCTTCAAAAGTCAAATTAATATG【００４７】
（下痢食中毒をおこす菌のプライマー）
Vibrio cholerae
配列番号43 :5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号44 :5-AGCAGCTTATGACCAATACGCC
配列番号45：5- AAACACGTCACCGAAAATATC
配列番号46：5- TTATGACCAATACGGCCATG
Vibrio mimicus
配列番号43 :5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号47 :５-YCTTGAAGAAGCGGTTCGTGCA
配列番号48：5-ATATCGCCAAAGTCAG
配列番号49：5-GCATCGGTCAGAATTTCATAC
Vibrio parahaemolyticus  
配列番号43 :5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号50 :5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG
配列番号51：5- CCAAAGATGTCGCCGAAG
配列番号52：5- CGAAGTTCTAACCGACTCTC
Vibrio vulnificus 
配列番号43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号53：5-GTACGAAATTCTGACCGATCAA
配列番号54：5-CCACCGCCTTGTTCAAAAG
配列番号55：5-ACGAAATTCTGACCGATCC
Vibrio fluvialis  
配列番号43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号134：5-GTACGAAATTCTGACCGATCAA
配列番号56：5-CAATCTCTTTCGAGCAACCAC
配列番号57：5-CAACGTGGTGCGGATCTG
Vibrio alginolyticus
配列番号43 :5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号58 :5-GATCGAAGTRCCRACACTMGGA
配列番号59：5- CCGAATACATCGCCAAAG
配列番号60：5- ATGCTGCTTTTGAACAAGG
Bacillus cereus  
配列番号61： :5-GATCAATTTGGTCATGCTGGT
配列番号62： 5-GAAGCCACCACCGAAGTC
配列番号63:  5- AAAGCGTATCGTCGTTTGG
配列番号64:  5- ATCATCACTTAACACTTCATATGC
配列番号65:  5-CGCAGTACGATCAATTTGG
配列番号66:  5-CAAAGAAAGAACTAAATATATCTTC
Campylobacter jejuni 
配列番号67 :5-TACTTATAAATGCTCTTGTAAAAC
配列番号68 :5-CTTTGGACAAGTTTGAAG
配列番号69：5- TAGACTTTACTTATAAATGCTCTTG
配列番号70：5- GACACTTTGGACAAGTTTG【００４８】
（性病の原因菌のプライマー）
Mycoplasma genitarium
配列番号71 :5- GAAGGGTTAAATGCTTCTGG
配列番号72 :5-CACCATCCATTCCAAAGG
配列番号73：5- AAGGGATTATTATGAAGTTCTAGGG
配列番号74：5- CATTTTCTGCTTTATGACGATC
Chlamydophila trachomatis
配列番号75 :5-GGGATTTCCTTCTTGATCC 
配列番号76 :5-CATGGGGATGATTTAGTTTTAG
配列番号77：5- AAAGAAACCGCCTCCATTA
配列番号78：5- GCATGGGGAATATGGAAGAC
Neisseria gonorrhoae
配列番号79 : 5-GGCGGGGAGTTAGAAGTG
配列番号80: 5-GACACCCTTACCTTTCACG
配列番号81：5- CGGGCAAACATATTAAAGAACC
配列番号82：5- CGGGAATATTGACTTCCAC
Neisseria meningitidis
配列番号83: 5-TTGGAAGTGCCGACCTTG
配列番号84: 5-GATTTGACACCCTTACCCTTCG
配列番号85:  5- GGGCAAACACATTAAAGAACC
配列番号86:  5- GCGGGAATATTGACTTCCA【００４９】
（プローブとして利用することが好ましい核酸分子の塩基配列）
Bacillus  cereus：
配列番号87：TTACCATCCAGACGTAAGTAAAGAAGAA
配列番号88：TTAGCCACCGCCGAAGTCTCCTCC
Streptococcus  pyogenes
配列番号89：TTCGCCGTATTGATCATAAGCAGCA
配列番号90：TTCCTGAGCCTAAACAAGTGCCG
Streptococcus  agalactiae
配列番号91：TTAAAACCGCCATTTGCCCCAG
配列番号92：TCTTCCTGAACAAGTATGACATGATGAC 
Streptococcus pneumoniae
配列番号93：TTCGTGCTGCCTATGACCAGTATG
配列番号94：TCGATGATACTTAACTTCCTTCTCAGT 
Mycoplasma  pneumoniae
配列番号95：TACAGTCTCACCCTCACCCTTATG
配列番号96：TTCACAGGCACTACAGGTCACC
Staphylococcus  aureus：
配列番号97：TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCG
配列番号98:   TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCGAA
Klebsiella  pneumoniae 
配列番号99：TTCGTACAGATCGCCTGCCG
配列番号100:   CGCGCCGGCAGGCGATCTGTACGT
Eshcerichia coli 
配列番号101   AAGAGATCCGCATTCCGACTCTGGAAG
配列番号102：TTAAGAGATCCGCATTCCGACT
Mycobacterium  tuberculosis
配列番号103：  TCGGGGTCGGTGGAGACGGCG
配列番号104：TTCTCCTCTGATGCCAGTCCTGAAGA 
Mycoplasma  genitarium 
配列番号105: TAGCAGGGTTTAATCCTTTTGACATCT
配列番号106：TAAACGCTAGTTCTCAAGACATAAA
Chlamydophila  pneumoniae 
配列番号107：TTCGCAAGGCATCTTCCATGTTCC
配列番号108: TTTCTTACTGGCTCCTTGACGA
Chlamydia trachomatis 
配列番号109：TTAGCCGCATCAACAAATCCAATAGG
配列番号110：TTACCGAAATCGCCGCCAAA
Neisseria meningitidis 
配列番号111：TTCTTGACCGCCTTATTCCGCC
配列番号112：TGCCGTGGCGCGGGGCGGAATA
Neisseria gonorrhoeae 
配列番号113：TTCTTGACCGCCTTATTCCGCC
配列番号114：TGCCGTGGCGTGGGGCGGAATA
Legionella  pneumophila 
配列番号115：TAAGAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGAC
配列番号116：AAAGAAGTTGAAATTACCGTTCC
Vibrio  fluvialis
配列番号117：TTCCAGCGTCAGTTCCATGTTG
配列番号118:：TCGAGCAGCCGCGTACCGCTTCT
Vibrio  vulnificus
配列番号119：TCCATATTGATCGTAAGCCGCT
配列番号120：TCGAGACACCACGAACGGCCTCT
Vibrio  alginolyticus 
配列番号121：TTAATCAGCACCGCCGCCAC
配列番号122：TCGTTACACCACGAACCGCTTCT 
Vibrio  parahaemolyticus 
配列番号123：TTCAGCACCGCCTCCACCAA
配列番号124：TAGTTACACCACGAACGGCTTCT
Vibrio mimicus 
配列番号125：TTCGAAGCCGCCGCCACCAA
配列番号126:：TCGAACATCCACGAACCGCTTCT
Vibrio cholerae 
配列番号127：TTAATCAGCACCGCCACCGC
配列番号128：TCGAGCAGCCGCGAACCGCTTCT
Campylobacter  jejuni 
配列番号129: TGTAATGGAACAGGGGCTA
配列番号130：TCCATCTTTAGCCCCTGTTCCAT【００５０】
被験試料と核酸分子とを接触させるには、被験試料中に含まれる可能性のある検出対象のDnaJ遺伝子と核酸分子とをハイブリダイズ可能な状態におけばよい。例えば、液相内で両者を共存させてもよいし、一方を固相に結合させて他方を当該固相に接触する液相に含めるようにしてもよい。後述するように、こうした接触を実現する工程は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ法、転写介在増幅法（ＴＭＡ法）、分枝DNA法（bDNA法）、リアルタイムＰＣＲ法、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）などの遺伝子増幅法、サザンブロッティング法、マイクロアレイ法、マイクロビーズ法、核酸（DNA）クロマトグラフィなどの核酸のハイブリダイゼーションに基づく塩基配列の検出法の一部として実施することができる。使用する核酸分子がプライマーとして設計されているかあるいはプローブとして設計されているか等によっても本工程に用いる手法を適宜選択することができる。【００５１】
本発明方法は、核酸分子と被験試料中の核酸とのハイブリダイズの有無を検出する工程を備えることができる。こうしたハイブリダイズの有無を検出するには、例えば、（１）核酸分子と被験試料中の核酸との特異的なハイブリダイズの有無の直接的な検出、（２）核酸分子と被験試料中の核酸との特異的ハイブリダイズに基づく遺伝子増幅反応の有無、（３）遺伝子増幅反応産物中の特定塩基配列の有無の検出等により行うことができる。【００５２】
上記（１）の場合、例えば、核酸分子及び被験試料から抽出した核酸の少なくとも一方に検出可能なシグナルを発する標識化合物あるいはハイブリダイズを介したインターカレーション等によりシグナルを生じる変化を生じるシグナル形成化合物を付加しておくことで、ハイブリダイゼーションを検出することができる。ハイブリダイズ産物を効率的に検出するには、核酸分子又は被験試料中の核酸を固相に結合しておくことが好ましい。こうした検出は、サザンブロッティング法、マイクロアレイ法、マイクロビーズ法（フローサイトメーター）、核酸（DNA）クロマトグラフィなどの核酸のハイブリダイゼーションに基づく塩基配列の検出法として実施することができ、核酸分子はプローブの形態を採ることができる。【００５３】
上記（２）の場合、例えば、核酸分子をプライマーとして機能させてDnaJ遺伝子を鋳型として特異的にハイブリダイズした核酸分子を伸張させ、所定の増幅産物が得られたか否かを電気泳動等で検出することができる。こうした遺伝子増幅及び検出は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ法、転写介在増幅法（ＴＭＡ法）、分枝DNA法（ｂDNA法）、リアルタイムＰＣＲ法、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）などの遺伝子増幅法あるいは増幅産物の検出法として実施できる。なお、ＰＣＲを用いる方法については後段にて詳述する。【００５４】
上記（３）の場合、上記（２）と上記（1）とを組み合わせて実施することができる。例えば、一定範囲の属あるいは菌種に特異的なプライマーを核酸分子として用いて遺伝子増幅産物を得、さらに、この遺伝子増幅産物に対して特定菌種に特異的なプローブを核酸分子として用いてハイブリダイズの有無を検出することができる。【００５５】
（細菌の同定方法）
本発明の細菌の同定方法は、同定対象細菌あるいはその核酸を含有する可能性のある臨床サンプルなどの被験試料中のDnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列を取得する工程、を備えることができる。DnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列を取得することで、同定対象細菌の菌種を同定することが可能である。また、その系統樹を作製することもできる。細菌の検出方法において検出対象とするのに好ましい細菌の菌種は、Streptococcus属菌、Staphylococcus属菌、Enterococcus属菌、Peptostreptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichi属菌、Enterobacter属菌、Legionella属菌、Neisseria属菌、Bacillus属菌、Helicobacter属菌、Corynebacteriuｍ属菌、Pseudomonas属菌、Burkholderia属菌、Haemophilus属菌、Bacteroides属菌、Enterococcus属菌、Nocardia属菌、Prevotella属菌、Neisseria属菌、Moraxella属菌、Flavobacterium属菌、Clostridium属菌、Treponema属菌、Sphingobacterium属菌、Leptospira属菌、Campylobacter属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌である。DnaJ遺伝子は、これらの細菌において多様性のある遺伝子であるため、菌種を同定するのに有用である。DnaJ遺伝子の塩基配列を取得するにあたり、上記した核酸分子をプライマーとして得られるＰＣＲ増幅産物や上記した核酸分子をプローブとして用いて得られるハイブリダイゼーション産物の塩基配列を取得してもよい。【００５６】
塩基配列の取得にあたっては、ＰＣＲ法等で取得した遺伝子の少なくとも一部について公知の手法によるシークエンサーによる塩基配列決定法や所定の塩基配列を有するプローブとハイブリダイゼーションさせることによる方法（マイクロアレイ等の利用）が挙げられる。【００５７】
被験試料から取得されたDnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列に基づいて菌種を同定する際には、取得した塩基配列と予め取得しておいた同定対象細菌のDnaJ遺伝子の塩基配列とを対比することが好ましい。すなわち、菌種の同定に際しては、予め、各種細菌のDnaJ遺伝子の全部あるいは一部についての塩基配列のデータベースを準備しておくことが好ましい。こうしたデータベースを予め準備しておくことで、速やかに菌種を同定できる。また、菌種内の各種菌株についてのDnaJ遺伝子の塩基配列に関する情報を含むデータベースを準備しておくことが好ましい。こうしたデータベースによれば、菌株に共通であって菌種特異的な塩基配列を容易に抽出することができる。こうして抽出された塩基配列を用いることにより、容易にかつ正確に菌種と同定することができる。また、同時に、系統樹の作成にも都合がよい。【００５８】
特に、DnaJ遺伝子による菌種の同定にあたっては、被験試料について16S rDNAの塩基配列を取得する工程を先立って行うことが有用である。16S rDNA遺伝子の塩基配列において類縁菌種と高い類似度であってもDnaJ遺伝子については類似度が低いからである。例えば、予め16S rDNA遺伝子について最も類似度の高い菌種候補（菌種は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。）を決定し、こうして決定された候補菌種のDnaJ遺伝子と分離株などの被験試料中のDnaJ遺伝子の塩基配列を決定することにより、簡易かつ迅速に分離株の菌種を同定することができる。また、16S rDNA遺伝子によって同定可能なときには、DnaJ遺伝子による同定をする必要もない。このような手法を採用する場合の既存菌種の16S rDNA遺伝子との類似度は特に限定しないが、分離株と既存の菌種との16S rDNA遺伝子の塩基配列が98％以上類似しているときに、DnaJ遺伝子の塩基配列について当該既存の菌株と分離株とを対比することが好ましい。【００５９】
16S rDNA遺伝子の塩基配列の取得にあたっては、DnaJ遺伝子の塩基配列の取得と同様、適宜公知の手法を用いることができる。また、被験試料中の16S rDNA遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と既存の菌種の16S rDNA遺伝子の塩基配列とを対比することで、これらの間の塩基配列類似度を取得することが好ましい。その際、各種の菌種又は菌株についての16S rDNA遺伝子の塩基配列のデータベースを予め準備しておくことが好ましい。【００６０】
なお、被験試料中のDnaＪ遺伝子等の塩基配列を解析するのにあたっては、同定対象細菌の採取源は特に限定されないが、既に説明したような臨床サンプルなどを含む被験試料を用いることができる。また、既に説明した細菌の検出方法と同様に、細菌の核酸抽出物あるいは細菌遺伝子の所定領域の増幅産物を被験試料とすることができる。【００６１】
また、以上のことから、本発明によれば、DnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列を取得する細菌同定プログラムであって、上記同定方法におけるのと同様の菌を同定対象細菌とし、同定対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料中から取得されたDnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と同定対象細菌のDnaJ遺伝子の塩基配列とを対比して前記被験試料中の細菌の菌種を同定するステップを１又は２以上のコンピュータに実行させるプログラムも提供される。このプログラムによれば、被験試料から取得できたDnaJ遺伝子の配列を塩基配列に一致する配列をDnaＪ遺伝子の配列データベースから検索することで、被験試料の細菌の種を同定することができる。このプログラムにおいては、上記ステップに先立って、前記被験試料中から取得された16S rDNA遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と同定対象細菌の16S rDNA遺伝子の塩基配列とを対比して前記取得した塩基配列と最も類似度の高い16S rDNA遺伝子の塩基配列を有する菌種候補を決定し、これらの菌種候補と被験試料由来のDnaJ遺伝子の塩基配列を対比するステップを備えるようにしてもよい。【００６２】
なお、プグラムの形態は、特に問うものではなく、インターネットを介してダウンロードされる形態であってもよいし、適当な記憶媒体に格納されたものであってもよい。さらに、コンピュータ等の装置のＲＯＭ等に格納されたものであってもよい。さらに、本発明によれば、こうしたプログラムを実行可能に格納した装置も提供される。この装置のコントローラには、こうしたプログラムを実行可能なＣＰＵ、プログラムを格納するＲＯＭ又はハードディスクなどの記憶装置及び適当な配列入力手段を備えることができる。また、DnaJ遺伝子の配列データベースを装置内のハードディスクなどの記憶手段に備えることもできるし、インターネットに接続可能な環境であれば、こうした配列データベースが格納されたサーバーにアクセスして必要な処理を行うようにしてもよい。さらに、配列を対比するステップ、すなわち、配列間の類似度等を決定したり、アラインメントを行ったりするステップは、DNASIS pro ver.（日立ソフト）、Beacon designerver.5.1(Molecular beacon社)及びClustal W (Free soft)などのソフトウエアの全部又は一部を利用することができる。【００６３】
（核酸分子及び核酸分子を含む細菌検出・同定キット）
本発明の核酸分子は、既に説明した各種核酸分子を含むことができる。また、上記した各種核酸分子を１種又は２種以上を含む細菌検出又は同定するための検出同定キットとしてもよい。こうした検出同定キットに含まれる核酸分子は、プローブ及び／又はプライマーとして機能する核酸分子とすることができる。検出同定キットにおける核酸分子の組み合わせは特に限定しないが、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上の細菌の菌種を検出又は同定することができる核酸分子を組み合わせたキットとすることが好ましい。また、好ましい対象菌種の組み合わせとしては、例えば、Chlamydophila属2種Chlamydia属1種、Coxiella属1種、Haemophilus属1種、 Legionella属4種、 Streptococcus属2種、Mycobacterium属菌3種、 Pseudomonas属1種、 Mycoplasma属1種、 Stapylococcus属1種、 Bordetella属1種、 Corynebacterium属1種、 Bordetella属1種、 Klebsiella属1種、 Serratia属1種及びEscherichia属1種を含むことができる。こうした核酸分子のキットは肺炎および咽頭炎の原因菌を検出・同定するのに好ましい。また、例えば、Chlamydia属1種、Neisseria属２種、Mycoplasma属２種、Ureaplasma属２種、Candida属1種、 Treponema属1種、Trichomonasa属1種及びHaemophilus属２種、を含むことができる。こうした核酸分子のキットは性病の尿道炎の原因菌を検出・同定するのに好ましい。さらに、例えば、Yersinia属２種、Escherichia-Shigella属４種、Campylobacter属１種、Salmonella属１種、Vibrio属４種、Aeromonas属３種、Plesiomonas属１種、Giardia属１種、Entamoeba属１種 及びClostridium属４種、を含むことができる。こうした核酸分子のキットは食中毒―下痢症の原因菌を検出・同定するのに好ましい。【００６４】
以上の好ましい組み合わせは、特に、16SrDNAをターゲットとして被験試料中の核酸に対してPCR等により増幅してその産物によって菌種を同定する手法と組み合わせてもよい。たとえば、16SrDNA遺伝子を増幅できるプライマーセットを含んだプライマーカクテル（組成物）としてもよいし、最初に16SrDNAによる菌種の同定を試みたうえ、同定不能のときにDnaJによる同定を試みるようにしてもよい。こうすることで、一挙に菌種を検出又は同定したり、むだなく菌種を検出又は同定することができる。【００６５】
こうした検出同定キットは、核酸分子をプライマーとして含む遺伝子増幅用の形態とするなど、単に1種又は２種以上の核酸分子のキットとしてもよいし、核酸分子としての１種又は２種以上のプローブをビーズや基板等の固相に固定化可能にキット化したものであってもよい。【００６６】
（固定化体）
本発明の固定化体は、上記した核酸分子の１種又は２種以上がビーズや基板などの固相に固体化されたものとすることができる。固相に固定化された核酸分子は、基板等においてはその配列の位置情報により、また、ビーズにおいてはその色によって識別されるようになっている。固相に固定化された核酸分子は、ハイブリダイズによりシグナルを発するような化合物が結合されていてもよい。また、固相表面上においてプライマー伸長反応が可能に核酸分子が固定化されていてもよい。なお、固相の形態は特に限定しないし、また、その材質も特に限定されないで、ガラス、プラスチック、セラミックス等を使用できる。【００６７】
また、本発明の固定化体は、プローブとしての核酸分子がフィルターなどのクロマトグラフ基材に固定化された核酸クロマトグラフ装置であってもよい。【００６８】
本発明は、また、少なくとも１種類のターゲット核酸を増幅し又は検出するための増幅方法及びその利用にも関する。これらの発明は、不特定のターゲット核酸を増幅し、検出するのに有用であるほか、上記したDnaJ遺伝子又はその一部をターゲット核酸とする、DnaJ遺伝子の配列を利用した細菌の検出や同定に有用である。すなわち、DnaJ遺伝子の塩基配列に基づく菌種特異的なプライマーを用いることで、１種又は２種以上（好ましくは２種以上）の菌種の検出や同定に対して、本発明の有用性を一層高めることができる。【００６９】
本発明のターゲット核酸の増幅方法は、少なくとも１種類のターゲット核酸を増幅する方法であって、タグ配列と前記ターゲット核酸に特異的な塩基配列とをそれぞれ有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列をそれぞれ有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程を、備えることができる。【００７０】
本発明のターゲット核酸の増幅方法によれば、第１のプライマーセットによりターゲット核酸を増幅し、ターゲット核酸配列を含む第１のプライマーセットの増幅産物を第２のプライマーセットにより増幅する。すなわち、第１のプライマーセットによるターゲット核酸の増幅効率が小さくても、第２のプライマーセットによる増幅により、検出に必要量のターゲット核酸を含む増幅産物として容易に得ることができる。したがって、複数種類の第１のプライマーセットが低濃度であっても、第１のプライマーセットによる増幅効率の低さを補って、第１のプライマーセットによって一つ以上のターゲット核酸を増幅することができる。また、主として第２のプライマーセットによりターゲット配列を増幅するため、増幅効率を容易に均一化することができる。【００７１】
また、前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、前記第１のプライマーセットによる前記ターゲット核酸の増幅と前記第１のプライマーセットによる増幅産物の前記第２のプライマーセットによる増幅とを同時に実施する工程とすることができる。こうしたポリメラーゼ連鎖反応工程によれば簡易にターゲット核酸を検出することができる。【００７２】
本発明では、第１のプライマーセットを、微生物のＤｎａＪ遺伝子上のターゲット核酸に特異的な塩基配列を有するように設計することができる。ＤｎａＪ遺伝子を用いることで、異なる属のほか同属の異なる種の微生物を含んでいても、微生物を菌種レベルで容易に検出することができる。本発明者らによれば、ＤｎａＪ遺伝子は、菌種間の類似度は低い一方同一菌種内で保存されている配列が判明している。このため、菌種によって毒性や悪性度が異なる病原微生物の検出に有利である。また、ＤｎａＪ遺伝子を用いることで増幅産物の長さを、増幅産物の競合を効果的に回避できる２５０塩基以下に容易に設定することができる。【００７３】
以下、当該実施形態について、本発明のターゲット核酸の増幅方法及び増幅用のキット等について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図１４には、本発明の増幅方法に用いる第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとターゲット核酸との関係を示す。【００７４】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
本発明においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、試験管内で特定のＤＮＡ配列を酵素反応で増幅する反応である。ＰＣＲには、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法のほか多様な変法やほかの分析手法との組み合わせが存在するが、本発明のＰＣＲにはそれらをすべて包含することができる。【００７５】
（ターゲット核酸）
本発明においてターゲット核酸とは、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅しようとする塩基配列の全体又はその一部である核酸である。ターゲット核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅が可能であれば特に限定しないが、生物の遺伝情報媒体であるゲノムとしてのＤＮＡ又はＲＮＡのほか、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が挙げられる。また、一本鎖であっても二重鎖であってもよい。【００７６】
ターゲット核酸は、また、生物又はその一部の組織から抽出等により抽出されたもの、発現解析によって得られたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムに対するＰＣＲで得られた増幅産物等各種の形態を採ることができるが、その形態は特に限定されない。取得源である生物及び組織も特に限定しないで。ヒト及び非ヒト哺乳類、その他の動物のほか、細菌、真菌、ウイルス等の微生物とすることができる。感染症の予防・治療や衛生の観点からは、ターゲット核酸が由来する生物は、微生物であることが好ましく、より好ましくは、衛生上又は治療上検出又は同定されるべき微生物であり、より好ましくは病原微生物である。【００７７】
ターゲット核酸が由来する微生物としては、Staphylococcus属菌、Streptococcus属菌、Serratia属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella属菌、Vibrio属菌、Bacillus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌が挙げられる。微生物としては、これらから選択される１種又は２種以上の菌の菌種から選択される。これらの属に属する菌種は、ＤｎａＪ遺伝子上において好ましいターゲット核酸を備えている。すなわち、これらの属に属する菌においては、菌種間のＤｎａＪ遺伝子の塩基配列が１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列よりも類似度が低く、同一菌種内の株の間で保存されている菌種特異的な塩基配列を見出すのが容易だからである。【００７８】
なかでも、Staphylococcus属菌、Streptococcus属菌、Mycobacterium属菌、Legionella属菌及びVibrio属菌の菌種とすることが好ましい。これらの属に属する菌は、属間及び同一属内の菌種間でＤｎａＪ遺伝子の類似度が低く、ＤｎａＪ遺伝子による菌種の検出に適しているからである。例えば、ＤｎａＪ遺伝子については、Stapylocuccus属菌においては１６ＳｒＤＮＡでは菌種間で平均９７．４％であるがＤｎａＪは菌種間で平均７７．６％、Streptococcus属菌においては１６ＳｒＤＮＡでは菌種間で平均９５．８％であるがＤｎａＪは同平均７６．４％、Mycobacterium属菌においては１６ＳｒＤＮＡでは菌種間で平均９３％であるがＤｎａＪは同平均８３．７％、Legionella属菌については１６ＳｒＤＮＡでは菌種間で平均９６．１％であるがＤｎａＪは同平均８２．５％、Vibrio属菌については１６ＳｒＤＮＡでは菌種間で平均９７．４％であるがＤｎａＪは同平均８２％となっている。【００７９】
こうしたターゲット核酸は、例えば、血液、血清、ヒトを含む動物から採取された細胞又は組織、便や尿などの排泄物、痰、井戸水、食品などの被験試料として提供される。なお、被験試料は、こうした採取物等から核酸を抽出した核酸抽出試料であってもよいし、さらに、DnaJ遺伝子又はその一部（検出しようとする領域を含む）の増幅産物を含む試料であってもよい。【００８０】
（第１のプライマーセット）
本発明の増幅方法では、タグ配列とターゲット核酸に選択的にアニールする塩基配列とをそれぞれ有する第１のプライマーセットを用いる。第１のプライマーセットは、フォワードプライマーとリバースプライマーとから構成されている。図１に示すように、フォワードプライマー及びリバースプライマーはいずれも、その５’側にタグ配列を有し、３’側にターゲット核酸に対するアニーリング配列を有している。【００８１】
第１のプライマーセット（プライマー対）は、ターゲット核酸の種類に応じて設定される。通常は、一つのターゲット核酸に対して一つのセットの第１のプライマーセットが設定される。なお、二つ以上のターゲット核酸に対して一つの第１のプライマーセットが設定される場合もありうる。【００８２】
第１のプライマーセット（対）のそれぞれのプライマーが有するターゲット核酸に選択的にアニールする塩基配列（以下、アニール配列ともいう。）は、ターゲット核酸とのみハイブリダイズしてアニール可能な特異性が高い配列を選択することが好ましい。なお、同一遺伝子をターゲット核酸としてプライマーを設計する場合には、異なるプライマーセット間でアニール配列は部分的にまた全体が一致している場合もありえる。アニール配列は、ターゲット核酸に対する特異性のほか、プライマーダイマーの形成回避、ＰＣＲ工程での反応温度を考慮して決定することができる。好ましくは、当該塩基配列とターゲット核酸とのＴｍは５０℃以上７０℃以下であり、より好ましくは５５℃以上６５℃以下である。【００８３】
微生物の検出や同定を目的に増幅方法を実施する場合、こうしたアニール配列は、検出等しようとする微生物に特異的な配列を選択することができるが、上述のようにＤｎａＪ遺伝子上の塩基配列をターゲット核酸とすることが好ましい。複数の微生物について同一遺伝子上の塩基配列をターゲット核酸とするときには、例えば、複数の微生物のＤｎａＪ遺伝子の塩基配列をアライメントすることにより、微生物特異的な塩基配列を選択することができる。こうしたアニール配列によれば、菌種特異的であり、かつ当該菌種に属する株を確実に検出することができる。なお、こうしたアライメント及び特徴的配列の抽出には、ＤＮＡＳＩＳ ｐｒｏ ｖｅｒ．（日立ソフト）、Ｂｅａｃｏｎ ｄｅｓｉｇｎｅｒｖｅｒ．５．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ社）及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｆｒｅｅ  ｓｏｆｔ）などのソフトウエアを利用することができる。【００８４】
タグ配列は、増幅しようとするターゲット核酸にはハイブリダイズしない配列から選択することができる。タグ配列は、好ましくは、その長さが１２塩基以上４０塩基以下であり、より好ましくは１８塩基以上３０塩基以下である。【００８５】
第１のプライマーセットを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーとは、それぞれ、タグ配列とアニール配列とをリンカー配列等を介して備えていてもよいが、好ましくは、２種類の配列のみからなる。また、フォワードプライマーとリバースプライマーは、いずれも全体として３０塩基以上８０塩基以下であることが好ましく、より好ましくは、３５塩基以上である。【００８６】
また、こうした第１のプライマーセットによって増幅される増幅産物は８０塩基以上280塩基以下であることが好ましい。この範囲であると、病原微生物等の遺伝子において共通の保存された配列が含まれる可能性が減少し検出感度が上昇するからである。より好ましくは増幅産物は、２５０塩基以下である。２５０塩基以下であると増幅された領域に異なった菌種に共通の保存された配列が含まれる可能性が減少し、増幅効率と感度を上昇させることができるからである。さらに好ましくは２００塩基以下である。２００塩基以下であると種特異的なプライマー及びプローブを設計し易いからである。特に、微生物のＤｎａＪ遺伝子をターゲット核酸とした場合、Ｄｎａ遺伝子の構造上、増幅産物の長さが２００塩基を超えると種特異的なプライマーやプローブを設計しにくくなるが、２００塩基以下であれば種特異的プライマーを設計しやすくなる。また、ＤｎａＪ遺伝子の場合、遺伝子の構造から増幅産物がこの長さであっても、特異的プローブを設計するのが１６ｓｒＤＮＡよりも容易である。すなわち、ＤｎａＪ遺伝子上にターゲット核酸を配することで、多数の微生物において好ましくは２５０塩基以下、より好ましくは２００塩基以下の増幅産物が得られるような第１のプライマーセットを設計することができる。本発明においては、第１のプライマーセットによる増幅産物をこうした一定範囲の塩基長で取得できるため、第２のプライマーセットによってこの増幅産物をさらに増幅するためのＰＣＲサイクルと第１のプライマーセットによるＰＣＲ反応サイクルとを同一のサイクルとすることが可能となる。【００８７】
第１のプライマーセットは、少なくとも１種類用いるが、本増幅方法がマルチプレックスＰＣＲによる増幅工程を実施する場合等、複数種類の第１のプライマーセットを用いることができる。好ましくは、６種類以上の第１のプライマーセットを用い、より好ましくは１０種類以上の第１のプライマーセットを用いる。さらに好ましくは、１５種類以上の第１のプライマーセットを用いる。また、５０種類以下の第１のプライマーセットを用いることが好ましい。特に、微生物のターゲット核酸を増幅する場合、ＤｎａＪ遺伝子上の配列をターゲット核酸とすることが好ましい。この遺伝子を用いることで、菌種特異的であり、かつ増幅産物の競合も起こりにくいプライマーを設計することができるため、マルチプレックスＰＣＲによって多種類の微生物のターゲット核酸を容易に検出することができる。【００８８】
（第２のプライマーセット）
本増幅方法では、第１のプライマーセットに用いたタグ配列と実質的に同一のタグ配列をそれぞれ有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットを用いる。第２のプライマーセットは、第１のプライマーセットがターゲット核酸にアニールして得られる増幅産物に対してタグ配列を介してアニールして、増幅産物をさらに増幅することができる。【００８９】
第２のプライマーセットを構成する第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーは、それぞれ第１のフォワードプライマーのタグ配列及び第１のリバースプライマーのタグ配列と実質的に同一のタグ配列を有している。第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーは、好ましくは、それぞれ第１のフォワードプライマー及びリバースプライマーのタグ配列と実質的に同一のタグ配列からなる。【００９０】
ここで、タグ配列と実質的に同一なタグ配列とは、第１のフォワードプライマーのタグ配列と同一のタグ配列のほか、第１のタグ配列と相補的な塩基配列とのハイブリダイゼーション特異性を維持できる範囲で改変された塩基配列が挙げられる。たとえば、当該塩基配列と相補的な塩基配列や、当該塩基配列において、１又は２以上の塩基が置換、挿入、欠失及び付加から選択された１種又は２種以上の形態で改変された塩基配列が挙げられる。好ましくは第１のプライマーセットにそれぞれ付加されているタグ配列と同一のタグ配列を用いる。【００９１】
第２のプライマーセットは、特定の第１のプライマーセットに対応して使用するものでなく、第１のプライマーセットに用いられるタグ配列に対応して使用するものである。したがって、増幅反応で用いる２種類以上の第１のプライマーセットが１種類のタグ配列対を用いている場合には、第２のプライマーセットは１種類である。また、２種類以上の第１のプライマーセットが２種類以上のタグ配列対を用いている場合には、２種類以上の第２のプライマーセットを用いる。【００９２】
このような第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとは、第１のプライマーセットの各プライマー濃度をより低くし、第２のプライマーセットの各プライマー濃度を個々の第１のプライマーセットのプライマー濃度より高くして用いることが好ましい。第２のプライマーセットを用いるため、第１のプライマーセットは、第２のプライマーセットの鋳型となりうる程度の増幅産物を産生できればよいからである。【００９３】
ＰＣＲ反応液における第２のプライマーセットの個々のプライマーの濃度は、ＰＣＲ反応液における個々の第１のプライマーセットの個々のプライマーの濃度の１０倍以上５０倍以下であることが好ましい。この範囲内であると、多種類の第１のプライマーセットを用いた場合であっても、単独のプライマーセットで増幅したときと同等の検出感度を得ることができる。なお、第１のプライマーセットのプライマー濃度と第２のプライマーセットのプライマー濃度との比率は、使用する第１のプライマーセットの種類数に応じて決定することが好ましい。例えば、使用する第１のプライマーセットの種類が１０種類のときには、第２のプライマーセットの個々のプライマー濃度を個々の第１のプライマーセットのプライマー濃度の１０倍以上とすることが好ましい。同様に、第１のプライマーセットが２０種類であるときには、第２のプライマーセットのプライマー濃度は２０倍以上とすることが好ましい。【００９４】
第１のプライマーセットの個々のプライマー濃度は、０．００５μＭ以上０．２μＭ以下であることが好ましい。この範囲であると、第２のプライマーセットにより増幅可能な程度に増幅産物を生成できる。より好ましくは、０．１μＭ以下である。一方、第２のプライマーは、０．１μＭ以上であり、さらに好ましくは０．２５μＭ以上であることが好ましい。【００９５】
本発明で用いる第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとは、以下の特徴：（ａ）前記第１のプライマーセットによる増幅産物が２５０塩基以下の核酸である
（ｂ）前記第１のプライマーセットのプライマーの使用時濃度が０．００５μＭ以上０．２μＭ以下（好ましくは０．１μＭ以下）である
（ｃ）前記第２のプライマーセットのプライマーの使用時濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマーの使用時濃度の１０倍以上５０倍以下である
のいずれかを備えることが好ましい。これらを備えることで、複数種類の第１のプライマーセットを用いても、特異性を維持してかつターゲット配列を必要量増幅することができる。さらに、後述するように簡易なＰＣＲ工程により複数種類の第１のプライマーセットを用いた増幅工程を実施できる。【００９６】
なお、こうした第１のプライマーセットや第２のプライマーセット構成する核酸分子は、塩基配列に基づくハイブリダイゼーションが可能であれば特に限定されない。核酸分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、修飾塩基等を含む人工核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれの形態を採ることができるが、典型的にはＤＮＡである。また、こうした核酸分子は、必要に応じ各種の蛍光色素や蛍光色素のクエンチャー等で修飾されていてもよい。【００９７】
（ＰＣＲ工程）
第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとを用いたＰＣＲ工程における反応条件等は特に限定しないで第１のプライマーセットによるターゲット核酸の増幅産物を第２のプライマーセットによって増幅可能であればよい。第１のプライマーセットによるターゲット核酸の増幅ステップと第２のプライマーセットによる第１のプライマーセットの増幅産物の増幅ステップとは、それぞれ異なる「変性−アニーリング−伸長」のサイクルで実施することができる。例えば、第１のプライマーセットによる増幅ステップは、９０℃以上９７℃以下で１０秒〜６０秒、５５℃以上６５℃以下で１０秒〜６０秒、７０℃以上７５℃以下で１秒〜３０秒で実施することができる。また、例えば、サイクル数は、１サイクル以上数サイクル以下であることが好ましい。１０サイクルを超えても、最終的な増幅産物の増量程度が大きくないからである。好ましくは１〜２サイクルであり、より好ましくは１サイクルである。また、例えば、第２のプライマーセットによる増幅ステップは、９０℃以上９７℃以下で０．５秒〜５秒、５５℃以上６５℃以下で０．５秒〜５秒、７０℃以上７５℃以下で１秒〜２０秒で実施することができる。また、例えば、サイクル数は、２０サイクル以上７０サイクル以下であることが好ましい。より好ましくは３０サイクル以上であり、より好ましくは４０サイクル以上６０サイクル以下である。【００９８】
また、第１のプライマーセットによる増幅ステップと第２のプライマーセットによる増幅ステップとは、単一の「変性−アニーリング−伸長」のＰＣＲサイクルで実施してもよい。特に、第１のプライマーセットによる増幅産物の長さを好ましくは２５０塩基以下、より好ましくは２００塩基以下とする場合には、第２のプライマーセットによるＰＣＲ反応サイクルを第１のプライマーセットによるＰＣＲサイクルと同一条件とすることが好ましい。このような場合には、同一条件のＰＣＲサイクルで第１のプライマーセットも第２のプライマーセットもそれぞれ有効に機能させることができ、結果として、第２のプライマーセットによる増幅産物を効率的に得ることができる。したがって、第１のプライマーセットのためのＰＣＲサイクルを別個実施する必要がない。【００９９】
既に説明したように、ターゲット核酸をＤｎａＪ遺伝子上に置くこと等により、複数のターゲット核酸に対する複数の第１のプライマーセットによる増幅産物の長さを２５０塩基以下、好ましくは２００塩基以下とする場合、単一のＰＣＲサイクルを実施することは、マルチプレックスＰＣＲを実施する場合において特に好ましい。こうした塩基長に第１のプライマーセットの増幅産物を設定することで、第１のプライマーセットによる増幅時に競合を抑制することができるとともに、全てのターゲット核酸に対して均等な増幅条件を付与することができるからであり、どのターゲット核酸も同等の検出感度で検出することができる。また、単一のＰＣＲサイクルで第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとを作用させることにより、リアルタイムＰＣＲ等、定量的分析にも適しているといえる。【０１００】
第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットを単一のＰＣＲサイクルを用いて増幅ステップを実施する場合、９０℃以上９７℃以下で０．５秒〜５秒、５５℃以上６５℃以下で０．５秒〜５秒、７０℃以上７５℃以下で１秒〜２０秒で実施することができる。また、例えば、サイクル数は、２０サイクル以上７０サイクル以下であることが好ましい。より好ましくは３０サイクル以上６０サイクル以下である。【０１０１】
また、こうしたＰＣＲ工程では、第１のプライマーセットのプライマー濃度は、０．００５μＭ以上０．２μＭ以下であり、前記第２のプライマーセットのプライマー濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマー濃度の１０倍以上５０倍以下であることが好ましい。こうした濃度範囲であると、効率的にターゲット核酸を増幅することができる。また、第１のプライマーセットによる増幅産物が２５０塩基以下の核酸であると、類似の配列を持った領域が含まれる可能性が減少し、増幅時の競合がおきずに感度を増大させることができる。【０１０２】
本発明を先に説明した細菌の菌種の検出方法に適用する場合、前記（ａ）工程を、タグ配列と前記ＤｎａＪ遺伝子の一部と選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、前記第１のプライマーセットによる前記ＤｎａＪ遺伝子の少なくとも一部の増幅と前記第１のプライマーセットによる増幅産物の前記第２のプライマーセットによる増幅とを実施する工程とすることが好ましい。こうすることで、複数の菌種にわたる細菌の存在可能性がある場合においても、少ない実験数で網羅的に多くの菌種についてその菌種が存在するか否かを検出することができる。この場合において、ＰＣＲ工程を単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程とすることで、より実験を簡略化することができる。【０１０３】
（病原微生物のマルチプレックスＰＣＲによる診断方法）
本発明の病原微生物のマルチプレックスＰＣＲによる診断方法は、Staphｙlococcus属菌、Streptococcus属菌、Serratia属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacillus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上の病原微生物を対象とし、前記病原微生物由来の核酸を含有する可能性のある被験試料に対して、タグ配列と前記病原微生物が保持するＤｎａＪ遺伝子上のターゲット核酸に選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程と、前記ターゲット核酸を含む増幅産物を検出する工程と、を備えることができる。ＰＣＲ工程は、上記と同様にして実施することができる。特に、ＰＣＲ工程を単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程とすることが好ましい。こうすることで迅速に病原微生物を診断することができる。検出工程で、増幅産物を検出する方法は、特に限定されない。増幅産物を電気泳動等によりその分子量により分離して検出することもできるし、第２のプライマーに標識化合物を付しておき、サザンブロッティング法、マイクロアレイ法、マイクロビーズ法（フローサイトメーター）、核酸（ＤＮＡ）クロマトグラフィなどにおけるハイブリダイゼーションに基づいてターゲット配列を検出してもよい。【０１０４】
本発明の診断方法によれば、前記ＰＣＲ工程を備えることにより、少量のターゲット核酸しか存在しない場合であっても特異的にかつ検出感度よくターゲット核酸を検出することができる。複数種類のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲによりターゲット核酸を検出するにあたっても特異的に感度よくしかも容易にターゲット核酸を検出することができる。また、ターゲット核酸がＤｎａＪ遺伝子にあるため、異なる微生物のＤｎａ遺伝子上のできるだけ保存されている配列をアニーリング配列として選択して第１のプライマーセットを設計すると、第１のプライマーセットが均一に異なるＤｎａＪ遺伝子上のターゲット核酸を増幅し、さらに、この増幅産物を第２のプライマーセットが均一に増幅することで、定量的にターゲット核酸を増幅でき、ターゲット核酸、すなわち、微生物量を定量することができる。この種の定量的解析は、他のターゲット核酸にも適用できる。例えば、発現解析の産物であるｍＲＮＡやｃＤＮＡなどのターゲット核酸にも適用して、発現量を定量することもできる。【０１０５】
（少なくとも１種類の病原微生物のターゲット核酸をマルチプレックスＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットを含むキット）
本発明のキットは、タグ配列と前記病原微生物のターゲット核酸と選択的にアニールする塩基配列とを有する第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する第２のプライマーセットと、を備えることができる。この検出キットにおける第１のプライマーセットと第２のプライマーセットについてはいずれもすでに説明した本発明の増幅方法における第１のプライマーセットと第２のプライマーセットとついにいての実施態様を適用することができる。【０１０６】
さらに、本発明のキットとしては好ましくは、以下のいずれかの特徴：
（ａ）前記第１のプライマーセットによる増幅産物が２５０塩基以下の核酸である
（ｂ）前記第１のプライマーセットのプライマーの使用時濃度が０．００５μＭ以上０．２μＭ以下（好ましくは０．１μＭ以下）である
（ｃ）前記第２のプライマーセットのプライマーの使用時濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマーの使用時濃度の１０倍以上５０倍以下であるを備えることが好ましい。【０１０７】
これらの特徴を備えることで、少量のターゲット核酸を増幅又は検出することが容易であるとともに、複数のプライマーセットを同時に用いた場合であっても、ターゲット核酸を確実にかつ高感度に検出することができる。【０１０８】
本発明のキットはＤｎａＪ遺伝子上にターゲット核酸を備えることが好ましい。ＤｎａＪ遺伝子上にターゲット核酸を有することで、第１のプライマーセットによる増幅産物が２００塩基以下の核酸であっても他の増幅産物と競合しないような増幅産物を設計することができる。本検出キットは、ターゲット核酸を微生物のＤｎａＪ遺伝子上に有することが好ましい。これらの微生物は既に説明したが、以下の表に示すいずれかの微生物のＤｎａＪ遺伝子上にターゲット核酸を有するとき、同表に示す第１のフォワードプライマーとリバースプライマーとを用いることが好ましい。
【表１】
2008041354.tif 000002
【０１０９】
ＤｎａＪ遺伝子については、その配列の一部が公知ではある。ＤｎａＪ遺伝子を本発明におけるターゲット核酸とするには、多型の多いＤｎａＪ遺伝子の菌種レベルでの保存配列とＳＮＰ多型箇所を取得する必要があったが、これらは知られていなかった。本発明者らは、多数の野生株のＤｎａＪ遺伝子の配列を決定し、菌種特異的に保存されている領域とＳＮＰの箇所とを特定し、これにより、第１のプライマーセットの特異的プローブのための配列を初めて決定することができた。また、増幅産物に特異的なプローブのための配列を決定することができた。本発明者らによれば、ＤｎａＪ遺伝子については、Mycobacterium属では属内の菌種の株の多型は１％以内、腸内細菌科の菌種やStreptococcus属、Staphylococcus属の菌種では１−３％に多型が収まっていた一方、独立した近縁種とは５％以上の配列の開きがあることがわかっている。【０１１０】
本発明のキットは、Staphylococcus属菌、Streptococcus属菌、Serratia属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella属菌、Vibrio属菌、Bacillus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌からなる群から選択される１種又は２種以上を検出対象とするプライマーセットのキットとすることができる。好ましくはこれらの検出対象のDnaJ遺伝子上の一部をターゲット核酸とするようにプライマーを設計する。プライマーの設計には、既に説明したこれらの菌に属する各種菌種特異的な部分を増幅するプライマー配列を利用できる。本発明のキットには、これらの検出対象のうち、２種類以上又は３種類以上の菌種の各ＤｎａＪ遺伝子に対応するプライマーセットを組み合わせることが好ましい。【０１１１】
本発明のキットは、既に説明した肺炎、咽頭炎の各種原因菌から選択される１種又は２種以上を検出対象とするキットとすることができる。また、本発明のキットは、既に説明した下痢、食中毒の各種原因菌から選択される１種又は２種以上を検出対象とするキットとすることができる。さらに、本発明のキットは、既に説明した性病の各種原因菌から選択される１種又は２種以上を検出対象とするキットとすることができる。本発明のキットにあっては、好ましくはこれらの検出対象のＤｎａＪ遺伝子上の一部をターゲット核酸とする。プライマーの設計には、既に説明したこれらの菌に属する各種原因菌について特定されたプライマー配列を利用できる。本発明のキットにあっては、これらの検出対象のうち、２種類以上又は３種類以上の菌種の各ＤｎａＪ遺伝子に対応するプライマーセットを組み合わせることが好ましい。【０１１２】
本発明のキットは、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上の微生物のターゲット核酸を同時に増幅可能に構成することができる。例えば、こうした検出キットにおける好ましい対象菌種の組み合わせとしては、例えば、Chlamydophila属菌、Chlamydia属菌、Coxiella属菌、Haemophilus属菌、Legionella属菌、Streptococcus属菌、Mycobacterium属菌、Pseudomonas属菌、Mycoplasma属菌、Stapylococcus属菌、Bordetella属菌、Corynebacterium属菌、Bordetella属菌、Klebsiella属菌、Serratia属菌及びEscherichia属菌を含むことができる。こうしたキットは肺炎および咽頭炎の原因菌を検出・同定するのに好ましい。また、例えば、Chlamydia属菌、Neisseria属菌、Mycoplasma属菌、Ureaplasma属菌、Candida属菌、Treponema属菌、Trichomonasa属菌及びHaemophilus属菌、を含むことができる。こうしたキットは性病の尿道炎の原因菌を検出・同定するのに好ましい。さらに、例えば、Yersinia属菌、Escherichia-Shigella属菌、Campylobacter属菌、Salmonella属菌、Vibrio属菌、Aeromonas属菌、Plesiomonas属菌、Giardia属菌、Entamoeba属菌、Clostridium属菌及びListeria 属菌を含むことができる。こうしたキットは食中毒−下痢症の原因菌を検出・同定するのに好ましい。【０１１３】
以上のことから、本発明によれば、Staphylococcus属菌、Streptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichia属菌、Mycobacterium属菌、Legionella 属菌、Vibrio属菌、Bacilｌus属菌、Neisseria属菌、Campylobacter属菌、Chlamydia属菌、Chlamydophila属菌、Mycoplasma属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上の細菌の菌種を検出対象とし、
（ａ）検出対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料と検出しようとする２種類以上の菌種のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする２種類以上の核酸分子とを接触させる工程と、（ｂ）前記核酸分子と前記被験試料中の核酸とのハイブリダイズの有無を検出する工程と、を備える方法であって、前記（ａ）工程は、タグ配列と前記ＤｎａＪ遺伝子の一部と選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットと、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、前記第１のプライマーセットによる前記ＤｎａＪ遺伝子の少なくとも一部の増幅と前記第２のプライマーセットによる前記第１のプライマーセットの増幅産物の増幅とを実施する工程である、方法が提供される。前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、単一のＰＣＲ反応サイクルを実施する工程とすることができる。【０１１４】
細菌を検出・同定するための核酸分子キットであって、Streptococcus属菌、Staphylococcus属菌、Enterococcus属菌、Peptostreptococcus属菌、Klebsiella属菌、Escherichi属菌、Enterobacter属菌、Legionella属菌、Neisseria属菌、Bacillus属菌、Helicobacter属菌、Corynebacteriuｍ属菌、Pseudomonas属菌、Burkholderia属菌、Haemophilus属菌、Bacteroides属菌、Enterococcus属菌、Nocardia属菌、Prevotella属菌、Neisseria属菌、Moraxella属菌、Flavobacterium属菌、Clostridium属菌、Treponema属菌、Sphingobacterium属菌、Leptospira属菌、Campylobacter属菌、Listeria 属菌、Salmonella属菌及びYersinia属菌から選択される２種以上の細菌の菌種を検出・同定対象とし、前記同定対象細菌のDnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子を含むキットが提供される。また、このキットにおいて、前記核酸分子は、タグ配列と前記ＤｎａＪ遺伝子の一部と選択的にハイブリダイズするする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットとを含むことができる。さらに、これら核酸分子キットを構成する２種以上の核酸キットが固定化された固相体の形態を採ってもよい。
【実施例１】
【０１１５】
Staphylococcus属のS.aureusは食中毒上重要な菌種であるが、１６S rDNAでは類縁種であるS.epidermidisと99.5%類似度があり(図１Ａ、特異的なprimerをデザインすることは不可能であったが、DnaJでは両者は81.1％の類似度しかない(図１Ｂ)ことがわかった。このため、容易にprimerをデザインできた。しかも、このprimer配列は、配列を決定した１１株のS.aureusの間でよく保存されていた(図２)。本実施例では、食中毒を起こす９種の病原体について決定したDnaJ配列等に基づいて、これらの病原体につきプライマーを作製した。各病原体についてのプライマー配列は以下のとおりとした。【０１１６】
Staphylococcus aureus用のプライマー
配列番号13 :5-GGACAAGGATTCAATGGCTCT
配列番号14 :5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCT
Campylobacter jejuni用のプライマー
配列番号67 :5-TACTTATAAATGCTCTTGTAAAAC
配列番号68 :5-CTTTGGACAAGTTTGAAG
Vibrio cholerae用プライマー
配列番号43 :5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号44 :5-AGCAGCTTATGACCAATACGCC
Vibrio parahaemolyticus用プライマー
配列番号43 :5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
配列番号50 :5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG
Escherichia coli用プライマー
配列番号21：5-TGTTGAGCGCAGCAAAAC
配列番号22：5-CAAGACGGATGCGGTCTC
Listeria monocytogenes用プライマー
配列番号135：GTACAAGCTACATTAGGTGAC
配列番号136：GTTCGTTTGAAAATTCCAAGT
（もしくは、
配列番号137:GGACAACACCTGAAAAATGT
配列番号138：AATGGGGTATTTTGTTCCACGT）
Salmonella enteritidis用プライマー
配列番号139：AAATCAAAAAGGCGTACAAG
配列番号140：GAGATTAAAGCAGCCTACGA
Yersinia spp用プライマー
配列番号141: CGTTCAGGTACAAGTCAAGG
配列番号142：GTGAGGTTCCTATTAACTTTGC
（もしくは、
Yersinia enterocolitica用プライマー
配列番号143：TACGCGGTGTGACTAAAGAA
配列番号144：TATGTACCTGACCTGCACCA）
Clostridium perfringens用プライマー（ただし、16S rDNAをターゲット核酸とする）
配列番号145：GGTGCTTCAGATGATGAG
配列番号146：GGAGATAAGGAAGCGGAA【０１１７】
上記各種プライマーを以下のように混合して、これらの９種のプライマーセット全てを含むプライマー液Ａを調製し、さらに以下のＰＣＲ反応液を調製した。
プライマー液A(各プライマー1μM)          ：２μｌ
２XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara)  ：10μｌ
S.aureus DNA(GTC 250  株)                 ：５ng
蒸留水で 全量を20ulとした。【０１１８】
なお、コントロールとして、S.aureusについてのプライマーのみを用いて、Ｐプライマー液Ｂを調製し、さらに以下のＰＣＲ反応液を調製した。
プライマー液Ｂ（各プライマー1μM)           ：２μl
２XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara)     ：10μｌ 
S.aureus DNA  (GTC 250  株)               ：５ng
蒸留水を加えて全量を20ulとした。【０１１９】
上記の各PCR反応液を各々Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブに試薬をいれ、Light Cyclerで遺伝子の増幅（９５℃：1秒、５５℃:1秒、７２℃：10秒を50サイクル）を行なった。結果を図３に示す。【０１２０】
プライマー液Ａで増幅したＰＣＲ産物とプライマー液Ｂで増幅したＰＣＲ産物とは、最終的にほぼ同じ増幅効率で増幅が確認された。すなわち、９種類のプライマーセットを含むプライマー混合物と単独のプライマーセットとによる増幅効率は同等レベルであり、これらの各プライマーは、それぞれ干渉することなく意図した菌のDnaJ遺伝子の特定配列を増幅できることがわかった。
【実施例２】
【０１２１】
実施例１で用いたＳ.aureusのDNAに替えて下記菌株のDNAを使用し、同様の条件で混合したプライマーセットを使用した。Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブで増幅したDNAをCYBR Greenの蛍光の増強をモニターした。結果を図４に示す。
[用いた菌株]
１．Campylobacter jejuni     GTC 0259  型株
２．Vibrio cholerae            GTC 0037   O1 El Tol型
３．Vibrio parahaemolyticus   GTC 0056（＝CDC A3308）
４．Escherichia coli           GTC 1061  O157（VT1 and VT2 陽性）
５．Listeria monocytogenes   GTC 0149 (=ATCC15313) type strain
６．Salmonella enterica var.Typhimurium    GIFU 11566 ST-1
７．Yersinia enterocolitica     GTC 0127 型株
８．Clostridium perfringens GTC 0785 (=ATCC13124)【０１２２】
図４に示すように、各菌のDNAはプライマー混合液Ａ中の特異的プライマーセットで増幅することが確認された。すなわち、これらの各プライマーは、それぞれ干渉することなく意図した菌のDnaJ遺伝子の特定配列を増幅できることがわかった。
【実施例３】
【０１２３】
（Vibrio属菌のDnaＪ遺伝子の増幅）
Vibrio属菌の共通のフォワードプライマー（配列番号43）と同属内の下記のほかの菌種に特異的なリバースプライマーを混合したプライマー液を以下のようにして調製した。【０１２４】
Vibrio属共通のプライマー（配列番号43）  ２μＭ
Vibrio cholerae（配列番号44）            1μＭ 
Vibrio mimicus（配列番号47）              1μＭ
Vibrio vulnificus（配列番号53）            1μＭ
Vibrio fluvialis（配列番号134）            1μＭ
Vibrio  parahaemolyticus（配列番号50）    1μＭ
Vibrio alginolyticus（配列番号58）        1μＭ【０１２５】
さらに、このプライマー液を下記のようにしてＰＣＲ反応液を調製した。
プライマー混合液（Foward２μＭ、Reverse各1μＭ）：2μｌ
２XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara)                     ：10μｌ
各vibrioのDNA(単独)                                       ：５ng
水を加えて全量を２０μｌとした。【０１２６】
［使用したVibrio の菌株］
Vibrio cholerae   GTC 0037 O1 El Tol型
Vibrio mimicus    GTC 0334  type  株
Vibrio vulnificus   GTC 0116 type  株
Vibrio fluvialis   GTC 0315 type  株
Vibrio  parahaemolyticus   GTC 0056（＝CDC A3308）
Vibrio alginolyticus  GTC 0057(=ATCC17449) 型株【０１２７】
上記のPCR反応液を各々Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブに試薬をいれ、Light Cyclerを用いて遺伝子の増幅（９５℃：1秒、５５℃ 1秒、７２℃：10秒を50サイクル）を行なった。ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動で確認した結果を図５に示す。【０１２８】
図５に示すように、各々の菌種に予測されたサイズの増幅産物を得ることができた。すなわち、これらの各プライマーは、それぞれ干渉することなく意図した菌のDnaJ遺伝子の特定配列を増幅できることがわかった。
【実施例４】
【０１２９】
（Vibrio属菌におけるDnaJ遺伝子の増幅による検出感度と特異的増幅）
実施例３で作成したプライマー液を用いてVibrio cholerae GTC 0037株の検出感度を糞便で希釈したサンプルを使って比較した。Vibrio cholerae GTC 0037株の菌液を生理食塩水、および10％の糞便懸濁液と混合し、フェノール−クロロフォルム法でDNAを抽出した。抽出した核酸を連続希釈して、実施例３のＰＣＲ反応液におけるＤＮＡに替えて用いてＰＣＲ反応を実施し、遺伝子増幅の感度を電気泳動法で比較した。結果を図６に示す。【０１３０】
図６に示すように、DNAを定量希釈し検出感度を測定したところ、図中に示した検出レベルにおいて増幅産物を検出できた。またコレラ菌のDNAを人の正常糞便から抽出したDNAと混合し、検出感度を求めたところ、蒸留水で希釈したのと同じレベルまで検出感度が確認できた。以上のことから、このプライマー液の各プライマーセットは、糞便由来の夾雑物存在下においても、それぞれ意図した菌種のＤnaＪ遺伝子の特定領域を特異的に増幅することができるとともに高感度に菌種を検出できることがわかった。
【実施例５】
【０１３１】
（性病の病原体菌種のDnaJ遺伝子増幅及び同定）
性病診断に使用する菌種のDnaJ遺伝子の特定領域に基づいて設計したプライマーを混合し、プライマー液を調製した。
Mycoplasma genitarium用プライマー（配列番号71、72）
Chlamydia trachomatis用プライマー（配列番号75、76）
Neisseria gonorrhoae用プライマー（配列番号79、80）
なお、以下の菌種に関してはDnaJ遺伝子でない遺伝子の特定領域に基づいてプライマーを設計した。
Ureaplasma spp.用プライマー(Tuf遺伝子)
配列番号147：GGATGGTGCAATCTTAGTTATT
配列番号148:ACTTGACGCGCTAATAGG
Treponema pallidum用プライマー(16S rDNA遺伝子)
配列番号149： TGGGGATAGCCTCTAGAAATAG
配列番号150: CCCTTTCCTCTCAAAGACCT
Herpes simplex virus用プライマー(GlycoproteinB蛋白遺伝子)
配列番号151：CTGGTCAGCTTTCGGTACG
配列番号152:CCGCAGCTCGTTGTTCTC
Papilloma virus用プライマー (蛋白E6遺伝子)
配列番号153: TCAAAAGCCACTGTGTCCT
配列番号154:CGACCCCTTATATTATGGAATCTT
Candida albicans用プライマー (26S rDNA遺伝子)
配列番号155:TCAGTAGCGGCGAGTGAA
配列番号156:GCCCAAAGATACCTTCTTCAAAT
Trichomonas vaginalis用プライマー （18S rDNA遺伝子）
配列番号157：GAAATCATAGTTCTTGGGCTCTG
配列番号158：CCTTCCGTCAATTCCTTCAAG【０１３２】
上記の各プライマーを下記の要領で混合したＰＣＲ反応液を調製した。
プライマー液（各プライマー1uM）：２μｌ
２XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara)                     ：10ul
各菌株の  DNA                                               ：５ng
水を加えて全量を２０μｌとした。【０１３３】
上記のＰＣＲ反応液を各々Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブに試薬をいれ、Light Cyclerを用いて遺伝子の増幅（９５℃：1秒、５５℃ 1秒、７２℃：10秒を50サイクル）を行なった。この実験には下記の菌株を使用した。Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブで増幅したDNAをCYBR Greenの蛍光の増強をモニターした結果を図７に示
す。【０１３４】
［用いた菌株］
１Mycoplasma genitarium     GGS 2289 (clone from clinical sample)  
２Chlamydia trachomatis     GGS 922 (Clone from clinical sample)    
３Neisseria gonorrhoae       GTC  02085(=ATCC 49226)    
４Ureaplasma spp.              GGS 1699 (Clone from clinical sample)
５Treponema pallidum            GGS 745 (Clone from clinical sample)
６Herpes simplex virus          GGS 1943 (Clone from clinical sample)
７Papilloma virus               GGS 1944 (Clone from clinical sample)
８Candida albicans              GTC  00654(=IFM 5801)
9 Trichomonas vaginalis         GGS 1941 (Clone from clinical sample)
GTC: Gifu type culture collection
GGS: Gifu Recombinant strain Collection 
ATCC: American type culture collection、 USA
NCTC: National collection of type culture、 UK
IFM: Research Center for pathogenic & microbial toxicoses、 Chiba University)【０１３５】
図７に示すように、各菌株のDNAは増幅されていた。すなわち、これらの各プライマーは、それぞれ干渉することなく意図した菌のDnaJ遺伝子の特定配列を増幅できることがわかった。
【実施例６】
【０１３６】
（肺炎・咽頭炎の病原体菌種のＤnaJ遺伝子増幅及び同定）
肺炎や咽頭炎を起こす病原体菌種のDnaJ遺伝子の特定領域に基づいて設計したプライマーを混合し、プライマー液を調製した。
Streptococcus pneumoniae用プライマー（配列番号9、10）
Streptococcus pyogenes用プライマー（配列番号1、2）
Staphylococcus aureus用プライマー（配列番号13、14）
Klebsiella pneumoniae用プライマー（配列番号17、18）
Escherichia coli用プライマー（配列番号21、22）
Mycobacterium tuberculosis用プライマー（配列番号25、26）
Chlamydia pneumoniae用プライマー（配列番号39、40）
Legionella  pneumophila用プライマー（配列番号35、36）
Mycoplasma pneumoniae用プライマー（配列番号31、32）
Mycobacterium  group用プライマー（配列番号29、30）【０１３７】
［用いた菌株］
Streptococcus pneumoniae   GTC  01147(=NCTC 7465) 
Streptococcus pyogenes   GTC  01839
Staphylococcus aureus   GTC  02805
Klebsiella pneumoniae   GTC  00107(=NCTC 9633)
Escherichia coli   GTC  09975(=ATCC 25868)
Mycobacterium tuberculosis  GTC  12850(=ATCC 27294)
Chlamydia pneumoniae     ATCC VR 145
Legionella  pneumophila   GTC  00702(=ATCC 33737)
Mycoplasma pneumoniae   GTC  00666(-ATCC 15531)
Mycobacterium  avium   GTC  00603 (=ATCC 25291)
GTC: Gifu type culture collection
GGS: Gifu Recombinant strain Collection 
ATCC: American type culture collection、 USA
NCTC: National collection of type culture、 UK
IFM: Research Center for pathogenic & microbial toxicoses、 Chiba University)【０１３８】
上記の各プライマーを下記の要領で混合したＰＣＲ反応液をを調製した。
プライマー液（各プライマー1uM）：２μｌ
２XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara)                   ：10μl
各菌株のDNA                                            ：５ng
水を加えて全量を２０μｌとした。【０１３９】
上記のＰＣＲ反応液を各々Light Cycler(ロッシュ社)用の毛細管チューブに試薬をいれ、Light Cyclerを用いて遺伝子の増幅（９５℃：1秒、５５℃ 1秒、７２℃：10秒を50サイクル）を行なった。この実験には上記の菌株DNAを使用した。ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動で確認したところ、これらのプライマーセットは、それぞれ意図した菌種のＤnaＪ遺伝子の特定領域を特異的に増幅することができるとともに高感度に菌種を検出できることがわかった。
【実施例７】
【０１４０】
（Mycobacterium属菌の菌種のＤnaJ遺伝子の増幅及びシークエンスによる同定）
Mycobacterium属菌のdnaJ遺伝子を55菌種3亜種の基準株（図８に示す）のほぼ全領域をPrimer working法でシークエンス(Applied biosystem社、)し、配列番号29、30、131、132及び133による386bpの増幅配列と、ほぼ全領域の1188bpの両者で配列を比較した。その結果を、すでに解析が行なわれている既存の遺伝子RpoBと比較した。結果を図９、１０に示す。【０１４１】
図９及び図１０に示すように、16S rDNA配列が平均して96.6％の類似度であったのに対し、dnaJでは80.7%であり、比較したrpoB、hsp65が90.0-90.7%に対して最も多型が大きかった。【０１４２】
また、M.kansasii-M.gastriは16S rDNA配列が100％一致して区別できないが（図１１）、DnaJ遺伝子を比較してみると、M.kansasii-M.gastriは95.5%と開きがあった。そこで生化学的性状でM.kansasii（20株）とM.gastri(2株)の臨床分離株23株(KPM番号株)、を上記配列番号29、30、131、132及び133で増幅し、既に配列を決定した全基準株の配列を使って系統樹を作成した。その結果、図１２に示すように、すべての株が生化学的性状で同定した結果と一致した。【０１４３】
また、M.avium とM.intracellulaeは生化学的性状が類似し識別が困難であるのでM.avium ―M.intracellulare  group(MAC  group)として総称されていた臨床分離株16株(図のKPM株)を同様に配列を決定し、比較した。その結果を図１３に示す。【０１４４】
図１３に示すように、9株はM.avium、3株がM.intracellulareであり、3株が新しく分類されたM.chimaera、1株がM.scroflaceumと同定された。以上のことから、この全塩基配列、および部分配列で同定する方法が、生化学性状で識別できない菌群の正確な同定に有効であることがわかった。
【実施例８】
【０１４５】
本実施例では、Legionella pneumophiaＧＴＣ1279DNAをターゲット核酸としてマルチプレックスＰＣＲを実施した。プライマーとしては、１８種類のタグ付きアニーリングプライマーセットの混合液（フォワードプライマー（配列番号１〜１８）及びリバースプライマー（配列番号１９〜３６）（いずれもタグ付き）各最終濃度０．１μＭ）とこれらのプライマーに付したそれぞれのタグと同一配列のタグを有する増幅プライマーセットの混合液（フォワードプライマー（配列番号３７）及びリバースプライマー（配列番号３８）（いずれもタグのみ）各最終濃度１μＭ）を準備した。これらのプライマーの配列を図１５に示す。【０１４６】
これらのプライマー混合液及びDNA溶液（Legionella pneumophiaＧＴＣ1279DNA１μｇ／ｍｌ）を用いて以下の組成でＰＣＲ反応溶液を調製し、ライトサイクラー（ロッシュ株式会社製）を用いて以下の条件でＰＣＲを実施した。比較例として、上記１８種類のプライマーセットのフォワードプライマーから５’末端から１８塩基のタグ配列を取り除いたアニーリングプライマーと、リバースプライマーの５’末端から２７塩基のタグ配列を除いたアニーリングプライマーとタグ無しアニーリングプライマーセットの混合液（フォワードプライマー及びリバースプライマー（いずれもタグ無し）各最終濃度０．１μＭ）を準備して、以下の組成でＰＣＲ反応溶液を調製し、実施例と同様にしてＰＣＲを行った。増幅モニター結果を図１６に示す。【０１４７】
（実施例８のＰＣＲ反応液の組成）
２×SYBR  premix  Ｅｘ  ＴａｑＴａＫａＲａ）        １０μｌ
プライマー混合液（Fプライマー、Ｒプライマー各１μＭ）  ２μｌ
増幅プライマー混合液（Ｆプライマー、Ｒプライマー各１０μＭ）２μｌ
Legionella pneumophiaＧＴＣ1279DNA （１ｎｇ／ｍｌ）    １μｌ
dＨ2Ｏ                                                  ５μｌ
全量                                                    ２０μｌ【０１４８】
（比較例のＰＣＲ反応液の組成）
２×SYBR  premix  Ｅｘ  ＴａｑＴａＫａＲａ）        １０μｌ
プライマー混合液（Fプライマー、Ｒプライマー各１μＭ）  ２μｌ
Legionella pneumophiaＧＴＣ1279DNA （１ｎｇ／ｍｌ）    １μｌ
ｄＨ2Ｏ                                                  ７μｌ
全量                                                    ２０μｌ【０１４９】
（反応条件）
９５℃、１秒、６０℃、１秒、７２℃、５秒      ６０サイクル【０１５０】
図１６に示すように、実施例８のタグ付きプライマーセットと増幅プライマーセットとによってLegionella pneumophiaＧＴＣ1279DNAを３５サイクル付近で増幅シグナルが増加しはじめ、４０サイクル程度で良好な検出感度を示した。これに対し、増幅プライマーを用いない比較例では、５０サイクルでもまったくターゲット核酸は増幅されなかった。以上のことから、ターゲット核酸に対して選択的にアニールするアニール配列とタグ配列とを有するアニーリングプライマーと、当該タグ配列と同一のタグ配列を有する増幅用プライマーとを用いることで多種類のプライマーセットを用いても十分に特定のターゲット核酸を増幅できることがわかった。
【実施例９】
【０１５１】
本実施例は、実施例８で作成したタグ付きアニーリングプライマーと増幅プライマーとの配合比率を、表２に示すように、１：１〜１：５０にまで変化させた。以下に示すようにしてＰＣＲ反応液を調製するとともに以下の条件でＰＣＲを実施した。なお、ターゲット核酸としては、Mycoplasma pneumoniaeＧＴＣ2987DNAを用いた。比較例として従来の単独プライマー溶液（４μｍ、８μＭ）を用いて以下の組成でＰＣＲ反応液を調製して、実施例と同様の条件でＰＣＲを行った。結果を図１７に示す。なお、単独プライマーは、Mycoplasma pneumoniae16S ｒDNAのフォワードプライマー及びリバースプライマーからタグ配列を除いた配列である。
【表２】
2008041354.tif 000003
【０１５２】
（実施例９のＰＣＲ反応液の組成）
２×SYBR  premix  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（ＴａＫａＲａ）  １０μｌ
Mycoplasma pneumoniaeＧＴＣ2987DNA（１ｎｇ／ｍｌ）    １μｌ
プライマー混合液                                      ４μｌ
dＨ2Ｏ                                                ５μｌ
全量                                                  ２０μｌ【０１５３】
（比較例のＰＣＲ反応液の組成）
２×SYBR  premix  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（ＴａＫａＲａ）  １０μｌ
Mycoplasma pneumoniaeＧＴＣ2987DNA（１ｎｇ／ｍｌ）    １μｌ
単独プライマー＊（４μＭ、８μＭ）混合液              ４μｌ
dＨ2Ｏ                                                ５μｌ
全量                                                  ２０μｌ【０１５４】
（反応条件）
９５℃、１秒、６０℃、１秒、７２℃、５秒      ６０サイクル【０１５５】
図１７に示すように、アニーリングプライマーに対する増幅プライマーの比率の上昇に伴って増幅効率は上昇して、当該比率が１０倍以上のとき、単独のプライマーを０．４μＭ濃度で用いて増幅した場合と同等の増幅効率を示した。
【実施例１０】
【０１５６】
本実施例では、図１８及び図１９に示す下痢の細菌性病原微生物及びウイルス性病原の保有する遺伝子の所定の領域をターゲット核酸とするアニーリングプライマーと増幅プライマーとの比率を１：５０に設定となるよう、以下の組成でＰＣＲ反応液を調製するとともに以下の反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ実施後、ＰＣＲ産物を、図２０に示すプローブを搭載したシリコンチップ（東洋鋼鈑製）と５５℃で３０分ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、チップを洗浄し、レーザースキャナScan Array ４０００（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）でＣｙｅ５の蛍光強度を計測した。結果を図２１に示す。なお、図２１には併せてスポットしたプローブの位置情報を示す。【０１５７】
（実施例１０のＰＣＲ反応液の組成）
２×ＳYBR  premix  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（ＴａＫａＲａ）  １０μｌ
Vibrio choleraeDNA（１ｎｇ／ｍｌ）        １μｌ
AdenovirusDNA（１ｎｇ／ｍｌ）        １μｌ
アニーリングプライマー混合液（各０．２μＭ）  ２μｌ
増幅プライマー混合液（各１０μＭ）            ２μｌ
dＨ2Ｏ                                        ４μｌ
全量                                          ２０μｌ【０１５８】
（反応条件）
９５℃、１秒、６０℃、１秒、７２℃、５秒      ６０サイクル【０１５９】
図２１に示すように、４９種類のアニーリングプライマーセットを含んでいても、２種類のターゲット核酸をそれぞれ特異的にかつ良好な感度で検出することができた。
【実施例１１】
【０１６０】
本実施例では、図２２に示す１６種類のＳＴＤ用アニーリングプライマーセットの混合（各プライマー最終濃度0.0２μＭ）及び増幅プライマーセット混合液（各１０μＭ）を準備、以下に示すようにアニーリングプライマーに対する増幅プライマーの比率を２０となるように、以下の組成でＰＣＲ反応液を調製し、以下の条件でＰＣＲを行った。増幅反応後、ＰＣＲ産物を図２３に示すプローブを結合させたｌｕｍｉｎａｘ社の蛍光ビーズおStreptavidin-phycoerythrinを加え、室温で３０分間反応させ、Luminax社の蛍光測定機器(Luminax１００)で蛍光強度を測定した。結果を図２４に示す。【０１６１】
図２４に示すように、ＰＣＲ反応液に含まれる唯一のターゲット核酸であるChlamydia  toracomatisのプローブと高い特異性で結合した。以上のことからＰＣＲ産物中には、このターゲット核酸が特異的に増幅されていたことがわかった。
【実施例１２】
【０１６２】
本実施例では、図２５に示す４種類のプライマー混合物を調製した。図２５に示す各プライマーは既に記載した配列のものを用いた。プライマーＰＣＲ反応液には、図２５に示す各菌種のDNAをそれぞれ２００ｐｇ／ｍｌ、各アニーリングプライマーを０．０７５μＭ、各増幅プライマーを０．８μＭ、共通１６ＳｒＲＮＡプライマーを０．２μＭ含めるようにした。なお、ＤＮＡポリメラーゼはＳYBR  premix  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（ＴａＫａＲａ）を使用した。このＰＣＲ反応液につき、９５℃、１分間加熱後、９５℃、１秒、５５℃、１秒、７２℃、１０秒のサイクルを５０回実施した。結果（ＣＴｍ値）を図２６に示す。なお、ＣＴｍ値は、を１回微分したときの増幅曲線の半分値となる蛍光シグナル強度等のシグナルに到達するまでのＰＣＲサイクル数である。ＣＴｍ値が小さいほど、増幅効率が良いといえる。【０１６３】
図２６に示すように、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲット核酸とし、アニーリングプライマーと増幅プライマーとからなるプライマー混合物ＡでＰＣＲを実施した場合、ＣＴｍ値は４０〜４６程度であったのに対し、１６ＳｒＲＮＡの共通配列をリバースプライマーとするプライマー混合物ＢではＣＴｍ値が低下する傾向が観察された。すなわち、１６ＳｒＲＮＡをターゲット核酸としてアニーリングプライマーを設計すると、系統的に異なった菌種８種類のプライマーを混合しても、かえって対照例よりも増幅効率が低下する傾向があった。したがって、１６ＳｒＲＮＡは、本発明のような多重化したマルチプレックスＰＣＲのターゲット核酸として不向きであることがわかった。【０１６４】
これに対して、プライマー混合物Ｃ及びＤの結果から明らかなように、ＤｎａＪ遺伝子をターゲット核酸としてアニーリングプライマーと増幅プライマーとを用いる場合には、多数の他のプライマー（合計１８種類）が存在していても特異的にターゲット配列にアニールして効率的に増幅できることがわかった。したがって、ＤｎａＪ遺伝子は、こうした多重化マルチプレックスＰＣＲのターゲット核酸として有利であることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１６５】
配列番号１〜８６、１３１，１３２，１３３、１３５〜１５８、１５９〜２９４及び３２６〜３５７：プライマー
配列番号８７〜１３０、１３４、２９５〜３２５及び３５８〜３６７：プローブ
【図８】
2008041354.tif 000004
【図１０】
2008041354.tif 000005
【図１１】
2008041354.tif 000006
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２１】
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【図２４】
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【配列表】
2008041354000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月4日(2008.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
細菌の菌種を検出する方法であって、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌、Ｖｉｂｒｉｏ属菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属菌、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属菌及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌から選択される２種以上の細菌の菌種を検出対象細菌とし、
（ａ）前記検出対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料と、検出しようとする前記検出対象細菌の各菌種に菌種特異的な領域とそれぞれハイブリダイズする２種類以上のプライマーセットとを同時に接触させてＰＣＲ法により遺伝子増幅する工程と、
（ｂ）前記プライマーセットによる遺伝子増幅産物を検出する工程と、
を備える、方法。
【請求項２０】
前記検出対象細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌、Ｖｉｂｒｉｏ属菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属菌からなる群から選択される２種以上である、請求の範囲１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出対象細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｒｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからなる群から選択される２種以上である請求の範囲２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマーセットは、
前記検出対象細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのとき、前記核酸分子は配列番号１３〜１６から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ  ｃｏｌｉのとき、前記核酸分子は、配列番号２１〜２４から選択される塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３〜４６から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記、検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｍｉｍｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号４７〜４９から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号５０〜５２から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号５３〜５５から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３、配列番号１３４及び配列番号５６〜５７から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号５８〜６０から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号６１〜６６から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを含むとき、前記核酸分子は、配列番号６７〜７０から選択される２種以上の塩基配列を含む、請求の範囲１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記（ａ）工程は、タグ配列と前記ＤｎａＪ遺伝子の一部と選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも１種類の第１のプライマーセットと前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも１種類の第２のプライマーセットと、を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、前記第１のプライマーセットによる前記ＤｎａＪ遺伝子の少なくとも一部の増幅と前記第２のプライマーセットによる前記第１のプライマーセットの増幅産物の増幅とを実施する工程である、請求の範囲１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、単一のＰＣＲ反応サイクルで前記第１のプライマーセットと前記第２のプライマーセットによる増幅とを実施する工程である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細菌の菌種を検出・同定するための核酸分子キットであって、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌、Ｖｉｂｒｉｏ属菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属菌、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属菌及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌から選択される２種以上の細菌の菌種を検出対象細菌とし、前記検出対象細菌の各菌種に菌種特異的な領域とそれぞれハイブリダイズする２種類以上のプライマーセットを含む、キット。
【請求項２６】
前記検出対象細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、  Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、  Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｒｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからなる群から選択される２種以上であり、
前記プライマーセットは、
前記検出対象細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのとき、前記核酸分子は配列番号１３〜１６から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ  ｃｏｌｉのとき、前記核酸分子は、配列番号２１〜２４から選択される塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３〜４６から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｍｉｍｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号４７〜４９から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号５０〜５２から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号５３〜５５から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３、配列番号１３４及び配列番号５６〜５７から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＶｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号４３及び配列番号５８〜６０から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓを含むとき、前記核酸分子は、配列番号６１〜６６から選択される２種以上の塩基配列を含み、
前記検出対象細菌がＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを含むとき、前記核酸分子は、配列番号６７〜７０から選択される２種以上の塩基配列を含む、請求の範囲２５に記載のキット。
【請求項２７】
２種類以上のターゲット核酸を増幅する方法であって、
タグ配列と前記ターゲット核酸の一部と選択的にアニールする塩基配列とを有する少なくとも２種類の第１のプライマーセットと、前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも２種類の第２のプライマーセットとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程を、備え、
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、前記第１のプライマーセットによる前記ターゲット核酸の増幅と前記第１のプライマーセットによる増幅産物の前記第２のプライマーセットによる増幅とを同時に実施する工程であり、
前記第１のプライマーセットは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌、Ｖｉｂｒｉｏ属菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属菌、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属菌及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌から選択される２種以上の細菌の菌種のＤｎａＪ遺伝子をターゲット核酸とする、増幅方法。
【請求項２８】
前記検出対象細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌、Ｖｉｂｒｉｏ属菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属菌からなる群から選択される２種以上の細菌の菌種を検出対象細菌とする、請求の範囲２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出対象細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｒｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからなる群から選択される２種以上である請求の範囲２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、単一のＰＣＲ反応サイクルで前記第１のプライマーセットと前記第２のプライマーセットによる増幅とを実施する工程である、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のプライマーセットのプライマー濃度は、前記第１のプライマーセットの種類の数だけ第１のプライマーセットのプライマー濃度に乗じた濃度とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２のプライマーセットのプライマー濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマー濃度の１０倍以上５０倍以下である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のプライマーセットのプライマー濃度は、０．００５μＭ以上０．１μＭ以下であり、前記第２のプライマーセットのプライマー濃度は、前記第１のプライマーセットのプライマー濃度の１０倍以上５０倍以下である、請求の範囲３２に記載の方法。
【国際調査報告】
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2008041354.tif 000032
2008041354.tif 000033
2008041354.tif 000034
2008041354.tif 000035
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2008041354.tif 000037
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