(57)【要約】  本発明は、タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)と、
リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、
前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤。
【請求項２】
前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、請求項１記載の徐放性製剤。
【請求項３】
前記リン酸カルシウムが、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属を含有することを特徴とする、請求項１又は２記載の徐放性製剤。
【請求項４】
前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が1.3〜3.4であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項５】
前記リン酸カルシウムが炭酸基を含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項６】
前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が1×102nm以下であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項７】
前記長径が1nm〜1×102nmであることを特徴とする、請求項６記載の徐放性製剤。
【請求項８】
前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項９】
前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項８記載の徐放性製剤。
【請求項１０】
前記多糖類の含有量が4×10重量％以下であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１１】
前記含有量が4×10重量％〜1×10-1重量％であることを特徴とする、請求項１０記載の徐放性製剤。
【請求項１２】
前記多孔質粒子の直径が1×102μm以下であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１３】
前記直径が1μm〜1×102μmであることを特徴とする、請求項１２記載の徐放性製剤。
【請求項１４】
前記多孔質粒子の比表面積が5×10m2/g〜2×102m2/gであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１５】
前記多孔質粒子の気孔率が3×10％〜8×10％であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１６】
前記多孔質粒子の生体内吸収が6ヶ月以内であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１７】
前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１８】
前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１９】
前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、請求項１８記載の徐放性製剤。
【請求項２０】
リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を得る工程と、
前記多孔質粒子を、タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)含有溶液に含浸し、前記タンパク質系薬物を前記多孔質粒子の孔内面全体に担持する工程と、
前記タンパク質系薬物を担持した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程と、
を含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)が多孔質粒子の孔内面全体に結合されてなる徐放性製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質等の生理活性物質の徐放性製剤には、生理活性物質を高分子によって直接包埋する方法が汎用されている。【０００３】
これまでに、リン酸カルシウムの一種であるアパタイトを用いた徐放性製剤が、報告されている(非特許文献１及び２)。非特許文献１では、抗生物質を吸着させ、徐放させたこと、一方、非特許文献２では結晶の大きさに応じてカルシウムの溶解により吸着タンパク質が放出されることが報告されている。さらに、非特許文献３は、比表面積3m2/g〜22m2/gで粒子径200nm〜500nmのアパタイト粒子を用いたヒト成長ホルモンの徐放を報告している。また、非特許文献４は、粒子径40μm〜80μmのアパタイト粒子に1％程度のヒト成長ホルモンを吸着させ、徐放させたことを報告している。しかし、これらに報告されるアパタイトを用いた徐放性製剤は、積極的に薬物をリン酸カルシウムから徐放させる形態のものではなかった。【０００４】
また、W. Paulらは、リン酸カルシウム顆粒からのタンパク質の徐放技術を数多く報告している（非特許文献５〜８）。これらの報告では、徐放化のためにポリ乳酸(PLA)やポリエチレン酢酸ビニル(PEVA)等の生分解性高分子を用いたコーティングを行っている。用いる粒子は、200μm〜1000μmの大きさで、1100℃で焼成した緻密体である。【０００５】
さらに、アパタイト粒子（バルクは除く）を用いた注射投与可能なタンパク質の徐放性製剤が、例えば特許文献１〜２及び非特許文献９に開示されている。特許文献１には、多孔性ハイドロキシアパタイト微粒子に存在する細孔に生物学的活性薬剤、ヒト血清タンパク質、ムコ多糖類を充填し、2価金属イオンを加えることにより栓塞することを特徴とする徐放性組成物が開示されている。【０００６】
また、特許文献２には、多孔性アパタイト誘導体と、その多孔性アパタイト誘導体に含有されるヒト成長ホルモン及び水溶性2価金属化合物から成ることを特徴とするヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤が開示されている。【０００７】
非特許文献９では、多孔性アパタイト粒子内にインターフェロンα等のタンパク質を含浸させ、亜鉛イオンを加えることで徐放させている。【０００８】
特許文献３には、スプレイドライ法により製造するカルシウム化合物とグリコサミノグリカンとの複合粒子及びその製造方法が開示されている。しかしながら、特許文献３には、当該複合粒子が骨充填材、細胞の足場材料、クロマトグラフィー用素材として有用な材料であることが記載されているものの、徐放性製剤に利用できることは記載されていない。
【特許文献１】特開2004-75662号公報
【特許文献２】特開2005-8545号公報
【特許文献３】特開2004-236895号公報
【非特許文献１】K. Yamamuraら, 「Journal of Biomedical Materials Research」, 1992年, 第26巻, p.1053-1064
【非特許文献２】T. Matsumotoら, 「Biomaterials」, 2004年, 第25巻, p.3807-3812
【非特許文献３】H. Gautierら, 「Journal of Biomedical Materials Research」, 1998年, 第40巻, p.606-613
【非特許文献４】J. Guicheuxら, 「Journal of Biomedical Materials Research」, 1997年, 第34巻, p.165-170
【非特許文献５】W. Paul及びCP. Sharma, 「Journal of Materials Science Letters」, 1997年, 第16巻, p.2050-2051
【非特許文献６】W. Paul及びCP. Sharma, 「Journal of materials Science-materials in medicine」, 1999年, 第10巻, p.383-388
【非特許文献７】W. Paulら, 「Journal of Biomedical Materials Research」, 2002年, 第61巻, p.660-662
【非特許文献８】W. Paul及びCP. Sharma, 「Journal of Biomaterials Applications」 2003年, 第17巻, p.253-264
【非特許文献９】Y. Mizushimaら, 「Journal of Controlled Release」, 2006年, 第110巻, 第2号, p.260-265
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述した実情に鑑み、タンパク質系薬物の徐放性製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記特許文献３と同様な方法で製造したリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とから成る複合多孔質粒子から薬物を放出させる製剤化方法等の鋭意検討を進めた結果、タンパク質系薬物を徐放させる基材として当該複合多孔質粒子が最適であり、さらに徐放化させる際に、二価金属イオンを用いることで初期バーストを制御したゼロ次放出を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
本発明は以下を包含する。【００１２】
（１）タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤。【００１３】
（２）前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、（１）記載の徐放性製剤。【００１４】
（３）前記リン酸カルシウムが、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属を含有することを特徴とする、（１）又は（２）記載の徐放性製剤。【００１５】
（４）前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が1.3〜3.4であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００１６】
（５）前記リン酸カルシウムが炭酸基を含有することを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００１７】
（６）前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が1×102nm以下であることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００１８】
（７）前記長径が1nm〜1×102nmであることを特徴とする、（６）記載の徐放性製剤。【００１９】
（８）前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００２０】
（９）前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、（８）記載の徐放性製剤。【００２１】
（１０）前記多糖類の含有量が4×10重量％以下であることを特徴とする、（１）〜（９）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００２２】
（１１）前記含有量が4×10重量％〜1×10-1重量％であることを特徴とする、（１０）記載の徐放性製剤。【００２３】
（１２）前記多孔質粒子の直径が1×102μm以下であることを特徴とする、（１）〜（１１）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００２４】
（１３）前記直径が1μm〜1×102μmであることを特徴とする、（１２）記載の徐放性製剤。【００２５】
（１４）前記多孔質粒子の比表面積が5×10m2/g〜2×102m2/gであることを特徴とする、（１）〜（１３）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００２６】
（１５）前記多孔質粒子の気孔率が3×10％〜8×10％であることを特徴とする、（１）〜（１４）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００２７】
（１６）前記多孔質粒子の生体内吸収が6ヶ月以内であることを特徴とする、（１）〜（１５）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００２８】
（１７）前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、（１）〜（１６）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００２９】
（１８）前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、（１）〜（１７）のいずれか１記載の徐放性製剤。【００３０】
（１９）前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、（１８）記載の徐放性製剤。【００３１】
（２０）リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を得る工程と、前記多孔質粒子を、タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)含有溶液に含浸し、前記タンパク質系薬物を前記多孔質粒子の孔内面全体に担持する工程と、前記タンパク質系薬物を担持した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程とを含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、安定に、且つ多量にタンパク質系薬物を担持した徐放性製剤が提供される。本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンによって多孔質粒子とタンパク質系薬物との結合性が改善されており、初期バーストがほとんど無く、一定期間安定してタンパク質系薬物を徐放することができる。【００３３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006-271077号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のBSA放出挙動を示す。
【図２】図２は、結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のHb放出挙動を示す。
【図３】図３は、結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のcyt c放出挙動を示す。
【図４】図４は、CATの放出挙動を示す。
【図５】図５は、BSAの放出挙動を示す。
【図６】図６は、Hbの放出挙動を示す。
【図７】図７は、Tryの放出挙動を示す。
【図８】図８は、Papの放出挙動を示す。
【図９】図９は、cyt cの放出挙動を示す。
【図１０】図１０は、LYZの放出挙動を示す。
【図１１】図１１は、HSTの放出挙動を示す。
【図１２】図１２は、結合処理における亜鉛イオンの添加量を変化させた時の各タンパク質((a)BSA、(b)cyt c、(c)Hb)の放出挙動を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明を詳細に説明する。【００３６】
本発明に係る徐放性製剤は、タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含むものである。本発明に係る徐放性製剤において、当該タンパク質系薬物が、多孔質粒子の孔内面全体に担持されている。また、本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンを介してタンパク質系薬物と多孔質粒子の孔内面全体とが結合している。【００３７】
ここで、タンパク質系薬物(破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く)としては、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体以外のタンパク質(ポリペプチド、ペプチドを含む)自体、又は当該タンパク質を含むいずれの薬物であってもよい。例えば、タンパク質系薬物としては、多孔質粒子の孔内面に対して、当該薬物のタンパク質側鎖に存在するカルボキシル基を介して結合できるもの及び/又はアミノ基を介して配位結合できるものが挙げられる。具体的には、タンパク質系薬物としては、例えばエリスロポエチン(EPO)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、トロンボポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)、インターロイキン-11(IL-11)、抗TNF-α抗体、線維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮増殖因子(EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、レプチン、ニュートロフィン-3(NT-3)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、インスリン、ヒト成長ホルモン、骨形成因子(BMP群)等が挙げられる。【００３８】
一方、リン酸カルシウムナノ結晶とは、リン酸三カルシウム（Ca3(PO4)2）、リン酸八カルシウム（Ca8H2(PO4)6・5H2O）、アパタイト化合物等であって、大きさが1μmより小さい結晶の総称を意味する。また、アパタイト化合物とは、一般式Ca10(PO4X)6Y2（式中、Xは炭酸基又は欠損を、Yは水酸基、炭酸基、ハロゲン基又は欠損を示す）で表される水酸アパタイト、炭酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイト等を意味する。さらに、リン酸カルシウムは、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウム等の1種以上の二価金属を含有していてもよい。なお、リン酸カルシウムにおけるリンに対するカルシウムのモル比は、例えば、1.3〜3.4、好ましくは1.5〜3.0である。【００３９】
リン酸カルシウムナノ結晶の製造に関しては、例えば、水酸アパタイトナノ結晶を製造する場合には、湿式法により製造することができ、下記の式に従って行うことができる(H. Aoki, 「Medical Applications of hydroxyapatite」, 1994, Ishiyaku EuroAmerica, Inc., Tokyo, St.Lousi)。
【化１】
2008041704.tif 000002
【００４０】
このようにして、製造したリン酸カルシウムナノ結晶の長径は、例えば、1×102nm以下、好ましくは1nm〜1×102nm、特に好ましくは1×10nm〜5×10nmである。【００４１】
また、本発明において多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸が挙げられ、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸が好ましい。なお、本発明に係る徐放性製剤における多糖類含有量は、例えば、4×10重量％以下、好ましくは4×10重量％〜1×10-1重量％、特に好ましくは1重量％〜2×10重量％である。なお、多糖類としてコンドロイチン硫酸を用いる場合には、例えば、分子量10kDa〜40kDa、好ましくは15kDa〜35kDaのものを用いる。【００４２】
本発明に係る徐放性製剤は、以上に説明したタンパク質系薬物、リン酸カルシウムナノ結晶、及び多糖類から製造する。【００４３】
本発明に係る徐放性製剤の製造方法(以下、「本方法」という)においては、先ずリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供することで、これらリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を製造する。当該多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることが好ましい。リン酸カルシウムナノ結晶に対する多糖類の量は、例えば、リン酸カルシウムナノ結晶に対して、1重量％〜2×10重量％、好ましくは2重量％〜1×10重量％とする。また、懸濁液のpHは、例えば5〜9、好ましくは6〜8に調整する。さらに、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液は、撹拌操作を継続しながら複合化を促進するために、例えば0時間〜12時間(好ましくは1時間〜4時間)熟成させた後、スプレイドライに供する。ここで、熟成とは、最終pHを7.5〜8.0の範囲に一定に保ち、複合化により得られる結晶の表面状態を生体とほぼ同じpHに保つことで安定させることをいう。具体的には、強アルカリ(水酸化カルシウム)と強酸(リン酸)の中和反応を用いて前記最終pHに設定することにより、熟成を行う。【００４４】
スプレイドライは、例えばBuchi社、ヤマト科学社、大川原工業社等の二流体ノズル及び四流体ノズルを装備した市販の装置を用いて定法により行うことができるが、表面積を大きくするために、懸濁液を1μm〜5×102μm程度の微細な液滴にし、1×102℃〜3×102℃の熱風中に噴出させ、乾燥させる。【００４５】
このようにして、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の直径は、例えば1×102μm以下、好ましくは1μm〜1×102μm、特に好ましくは1μm〜3×10μmである。また、多孔質粒子は、例えば、比表面積5×10m2/g〜2×102m2/g、気孔率3×10％〜8×10％である。多孔質粒子の比表面積が5×10m2/gより小さい場合には、十分な量のタンパク質系薬物を担持させることができず、目的とする放出期間にわたって徐放することができない。一方、多孔質粒子の気孔率が3×10％未満である場合には、タンパク質系薬物を粒子内部まで均一に担持できず、また8×10％を超える場合には、多孔質粒子が製剤化途中で壊れる。【００４６】
スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の生体内吸収は、例えば6ヶ月以内、好ましくは1/2ヶ月〜3ヶ月、特に好ましくは1ヶ月〜2ヶ月である。【００４７】
次いで、本方法では、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子を、担持対象のタンパク質系薬物含有溶液(例えば、担持対象のタンパク質系薬物を含む水溶液の形態)に含浸し、混合することで均一に分散させ、当該多孔質粒子の孔内面全体に当該タンパク質系薬物を担持させる。担持対象のタンパク質系薬物の添加量は、例えば多孔質粒子1mg当たり1×10-1μg〜2×102μg、好ましくは1μg〜1×102μgとする。多孔質粒子と担持対象のタンパク質系薬物との混合は、例えば1時間〜12時間(好ましくは3時間〜6時間)転倒撹拌することにより行われる。【００４８】
さらに、混合終了後、多孔質粒子と担持対象のタンパク質系薬物とを含む混合物を遠心分離に供し、上清(上澄み)を除去する。なお、この段階で、遠心分離を行わずに、二価金属イオンによる結合処理に供することもできる。【００４９】
多孔質粒子の孔内面全体に担持対象のタンパク質系薬物が担持されたことの評価は、上述の遠心分離後に除去した上清(上澄み)を当該タンパク質系薬物に対する特異的抗体を用いた免疫学的手法(例えば、ELISA)に供し、上清に残存する担持対象のタンパク質系薬物量を測定することにより行うことができる。このような評価により、上清中に担持対象のタンパク質系薬物が僅かにしか残存していないことを確認することにより、多孔質粒子の孔内面全体に当該タンパク質系薬物が十分担持されたと判断することができる。【００５０】
次いで、得られたタンパク質系薬物を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加し、結合処理に供する。この工程により、タンパク質系薬物と、これを担持した多孔質粒子との結合が行われる。【００５１】
本発明において、結合とは、リン酸カルシウム表面とタンパク質系薬物とを金属イオンを介した配位・イオン・共有性の結合等により担持・結合させること、又は多糖類とタンパク質系薬物との官能基同士の結合を誘起させること、又はリン酸カルシウム表面とタンパク質系薬物と多糖類との間全てに結合を誘起させることを意味する。当該結合によれば、タンパク質系薬物と多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合されることとなる。【００５２】
結合に用いる二価金属イオンとしては、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンが挙げられるが、亜鉛イオンが最適である。タンパク質系薬物を担持した多孔質粒子に対する二価金属イオン量は、例えばタンパク質系薬物を担持した多孔質粒子1mg当たり1×10-3mg〜1mg、好ましくは1×10-2mg〜1×10-1mgとする。【００５３】
結合処理では、タンパク質系薬物を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加した後、転倒撹拌する。次いで、転倒撹拌後、混合物を遠心分離に供し、上清(上澄み)を除去する。さらに、上清を除去することで得られた残渣を例えば精製水で洗浄した後、沈殿物を例えば1時間〜24時間(好ましくは1時間〜12時間)凍結乾燥又は真空乾燥に供する。このようにして、本発明に係る徐放性製剤を得ることができる。【００５４】
本発明に係る徐放性製剤は、担持するタンパク質系薬物について少なくとも7日以上(例えば、7日間〜180日間、特に14日間〜30日間)の長期間の徐放性を発揮する。【００５５】
また、本発明に係る徐放性製剤は、単独で、或いは薬学的に許容される添加物と共に用いることができる。本発明に係る徐放性製剤による治療対象の疾患は、本発明に係る徐放性製剤において多孔質粒子上に担持されるタンパク質系薬物の作用や効果に応じて適宜決定される。【００５６】
本発明に係る徐放性製剤は、各種剤形に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明に係る徐放性製剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であってよい。また、本発明に係る徐放性製剤を非経口投与する場合は、静脈内注射剤(点滴を含む)、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等に製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。【００５７】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。【００５８】
本発明に係る徐放性製剤の投与経路としては、用途に応じて適宜決定することができるが、例えば、経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、皮下、筋肉内等が挙げられる。また投与経路としては、患部付近への直接投与も挙げられる。【００５９】
本発明に係る徐放性製剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数等に応じて適宜決定することができる。例えば、包含されるタンパク質系薬物の有効量として、1回につき体重1kgあたり1×10-2mg〜1×102mgの範囲の投与量を選ぶことができ、1日数回から1ヶ月数回の頻度で投与することが好ましい。【００６０】
以上に説明したように、本発明に係る徐放性製剤によれば、一定期間安定して特定のタンパク質系薬物を徐放することができる。【００６１】
また、本発明に係る徐放性製剤は、特許文献１記載の徐放性組成物とは異なり、基材としては(すなわち、担持するタンパク質系薬物としてではなく)ヒト血清タンパク質を含まず、またムコ多糖類等を粒子の孔に充填する必要がない。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００６３】
〔実施例１〕ヒドロキシアパタイト/コンドロイチン硫酸複合(以下、「HAp/ChS」という)多孔質粒子(本発明における多孔質粒子に相当)のタンパク質系薬物放出試験
本実施例では、HAp/ChS多孔質粒子のタンパク質系薬物放出試験を行った。更に、亜鉛イオンを用いた製剤化条件によりタンパク質系薬物の放出特性の制御を試みた。【００６４】
そこで、(1)亜鉛イオン添加量、(2)コンドロイチン硫酸(以下、「ChS」という)の分子量を変化させた時の放出挙動の変化を検討した。【００６５】
前記(1)については、亜鉛イオン添加量を変化させることで、実用面においてどの程度の亜鉛イオンを添加すれば初期バーストを抑えることができるかを明らかにした。【００６６】
一方、前記(2)については、PBS中でHAp/ChS多孔質粒子からのChS溶出率が分子量によって異なる結果が出ている。また、吸着特性においてもChSの分子量変化によりタンパク質の最大吸着量・吸着平衡定数が異なる結果が出ている(H. Watanabe, T. Ikoma, GP Chen, J. Tanaka, 「Transactions of the Materials Research Society of Japan」, vols. 31(2) (2006) 341-344)。これらのことから、ChSの分子量変化によりタンパク質系薬物の放出特性が変化する可能性が予想される。そこで、各タンパク質系薬物についてChSの分子量変化が与える放出特性への影響を検討した。【００６７】
1. サンプル作製
1-1. HAp/ChS多孔質粒子の合成
ChS(分子量15kDa、20kDa又は35kDa)を分散させた0.25mol/lの水酸化カルシウム懸濁液に、0.15mol/lのリン酸水溶液を滴下し、最終pHを7.5〜8.0に調整し、HAp/ChSゲルを作製した。なお、ChS添加量は理想的に得られるヒドロキシアパタイト(以下、「HAp」という)重量に対して2重量％になるように加えた。12時間熟成させた後、スプレイドライヤー(商品名：Mini Spray Dryer B-290 Buchi社製)によりHAp/ChS多孔質粒子を得た。【００６８】
また、得られたHAp/ChS多孔質粒子を粒度分布測定に供した。その結果、得られた球状のHAp/ChS多孔質粒子は、1μm〜20μmの分布を有し、平均粒子径4μmであった。【００６９】
1-2. 担持対象のタンパク質系薬物
担持対象のタンパク質系薬物には、それぞれ等電点の異なる8種類のタンパク質：カタラーゼ（以下、「CAT」という, 分子量(MW): 240kDa, 等電点(pI): 4.5）、ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」という, MW: 66kDa, pI: 4.8）、ヘモグロビン（以下、「Hb」という, MW: 65kDa, pI: 6.8-7.0）、トリプシノーゲン（以下、「Try」という, MW: 24kDa, pI: 9.3）、パパイン（以下、「Pap」という, MW: 24kDa, pI: 8.8-9.5）、シトクロムC（以下、「cyt c」という, MW: 12.4kDa, pI: 10.2）、リゾチーム（以下、「LYZ」という, MW:14kDa, pI: 10.5）、ヒストン（以下、「HST」という, MW: 12kDa, pI: 11.0）を用いた。【００７０】
1-3. サンプル作製
5mlの各タンパク質水溶液(800μg/ml、10％PBSで溶解)に200mgの粒子（純HAp、HAp/ChS(15kDa:2重量％)多孔質粒子、HAp/ChS(20kDa：2重量％)多孔質粒子又はHAp/ChS(35kDa：2重量％）多孔質粒子)を加え、室温で4時間転倒撹拌させた。すなわち、粒子1mg当たりタンパク質を最大20μg担持させた。【００７１】
未結合粒子(結合処理なし)については、4時間の転倒撹拌後、遠心分離（3500rpm, 10分）に供することで上澄み液を取り、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。【００７２】
一方、結合粒子(結合処理あり)については、4時間の転倒撹拌後、1ml、2ml又は3mlの塩化亜鉛水溶液（10mg/ml、0.1M HCl水溶液でpH 5.5に調整）を加えて2時間転倒撹拌させることで、結合処理を行った。すなわち、加える塩化亜鉛の添加量をそれぞれ10mg、20mg、30mgと振った。当該結合処理によれば、各タンパク質と多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。【００７３】
2時間の転倒撹拌後、遠心分離（3500rpm, 10分）にて上澄み液を分抽し、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。なお、遠心分離後の上澄み液のタンパク質濃度をADV01（Advanced Protein Assay Reagent）で定量することで吸着量を算出した。なお、亜鉛イオン添加量変化による放出挙動については、BSA、Hb及びcyt cの3種類のみ調べた。【００７４】
2. 放出試験
前記1-3で製剤化したサンプル(各タンパク質を担持したHAp/ChS多孔質粒子)を、10mg測り取り、5mlのPBSに浸漬させ、36.5℃で転倒撹拌させた。なお、予備実験により回転撹拌の回転速度が高すぎるとタンパク質の凝集が起こることが分かっている。また、容器壁面にタンパク質が吸着することも分かっている。そこで、回転速度は最も低い速度に設定にし、タンパク質低吸着遠心管（住友ベークライト製）を用いて試験した。【００７５】
放出試験は、1時間〜1週間の期間で行った。撹拌させたサンプルを遠心分離に供し、上澄み液を分抽し、ADV01により放出量を定量した。【００７６】
3. 結果
3-1. 各HAp/ChS多孔質粒子に対する各タンパク質の吸着率
以下の表１に、各HAp/ChS多孔質粒子に対するタンパク質の吸着率を示す。
【表１】
2008041704.tif 000003
【００７７】
表１において、各略号は、以下の通りである。【００７８】
「HAp」:ヒドロキシアパタイトのみ、「HAp/ChS(15kDa)2％」：HAp/ChS(分子量：15kDa、2重量％)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS(20kDa)2％」：HAp/ChS(分子量：20kDa、2重量％)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS(35kDa)2％」：HAp/ChS(分子量：35kDa、2重量％)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp+3Zn」：ヒドロキシアパタイトのみ(3mlの塩化亜鉛水溶液による結合処理あり)、「HAp/ChS(15kDa)2％+3Zn」：HAp/ChS(分子量：15kDa、2重量％)多孔質粒子(3mlの塩化亜鉛水溶液による結合処理あり)、「HAp/ChS(20kDa)2％+3Zn」：HAp/ChS(分子量：20kDa、2重量％)多孔質粒子(3mlの塩化亜鉛水溶液による結合処理あり)、「HAp/ChS(35kDa)2％+3Zn」：HAp/ChS(分子量：35kDa、2重量％)多孔質粒子(3mlの塩化亜鉛水溶液による結合処理あり)
なお、以下の本実施例の結果においてもサンプル名の略号は同様である(ただし、「+1Zn」は「1mlの塩化亜鉛水溶液による結合処理あり」、「+2Zn」は「2mlの塩化亜鉛水溶液による結合処理あり」を示す)。【００７９】
前記1-3でも述べたように、200mgの各HAp/ChS多孔質粒子に4mgの各タンパク質を加えているので、粒子1mg当たり最大でタンパク質が20μg吸着することになる。以下の放出試験結果では、担持量に対して放出されたタンパク量の割合を放出率として表す。【００８０】
3-2. 亜鉛イオン添加量変化のタンパク質放出特性への影響
図１〜３は、結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のタンパク質放出挙動を示す。図１、２、３は、それぞれBSA、Hb、cyt cの放出曲線を示している。【００８１】
図１〜３に示すように、亜鉛イオン添加量の増加につれて初期バーストが軽減された。しかし、BSA(図１)に関しては、亜鉛イオン添加量増加につれて時間経過に伴う放出量が増加し、1週間の放出総量は亜鉛イオン添加量に依存せず同程度であった。一方、Hb(図２)に関しては、塩化亜鉛添加量が20mg以上で初期バーストを完全に抑えることができた。未結合粒子については、初期バースト後、時間経過に伴う放出量の増加が見られた。cyt c(図３)に関しては、結合粒子については時間経過に伴う放出量の若干の増加が見られた。【００８２】
3-3. 等電点の異なるタンパク質の放出挙動
3-3-1. 酸性タンパク質の放出挙動（CAT、BSA、Hb）
図４〜６は、それぞれCAT、BSA、Hbの放出挙動を示す。図４〜６において、(a)が未結合粒子からのタンパク質放出挙動、(b)が結合粒子からのタンパク質放出挙動を示す。【００８３】
(1) CAT(図４)に関して
未結合粒子：浸漬後1時間で3％程度放出し、その後は放出量の不安定な増加が見られた。放出挙動はChS分子量に依存していなかった。【００８４】
結合粒子：初期放出量は1％未満に抑え、その後はほぼ直線的な放出量の増加が見られた。純HApが他のHAp/ChS多孔質粒子に比べて若干放出量が低かった。【００８５】
(2) BSA(図５)に関して
未結合粒子：初期バーストを起こし、その後の放出量の増加は見られなかった。ChSの分子量の増加に伴い放出量が増加した。更に、純HApはHAp/ChS多孔質粒子よりも放出量が低かった。【００８６】
結合粒子：浸漬1時間後の放出量を抑えることができたが、時間経過と共に放出量が増加した。放出挙動はChS分子量に依存していなかった。【００８７】
(3) Hb(図６)に関して
未結合粒子：浸漬後1時間で30％程度の放出が見られた。1週間後は放出量が60％程度にまで増加した。【００８８】
結合粒子：浸漬1時間後の放出量は全て1％未満であった。1週間後は2％程度まで徐々に増加した。【００８９】
3-3-2. 塩基性タンパク質の放出挙動（Try、Pap、cyt c、LYZ、HST）
図７〜１１は、それぞれTry、Pap、cyt c、LYZ、HSTの放出挙動を示す。図７〜１１において、(a)が未結合粒子からのタンパク質放出挙動、(b)が結合粒子からのタンパク質放出挙動を示す。【００９０】
(1) Try(図７)に関して
未結合粒子：浸漬後1時間で60％以上の初期バーストが起こった。その後は、放出量が減少していった。なお、放出試験を行う際、回転はゆっくり行い、容器はタンパク質低吸着のものを用いた。従って、タンパク質の凝集及び容器壁面への吸着は考えられず、タンパク質が粒子へ再吸着したものと思われる。【００９１】
結合粒子：初期バーストをほとんど抑えることができなかった。未結合と同様にその後は放出量が減少していった。これも、粒子への再吸着が原因と考えられる。【００９２】
(2) Pap(図８)に関して
未結合粒子：浸漬1時間後の放出量は10％未満であったが、その後の放出量の増加率が高いために1週間で100％近くまで放出した。【００９３】
結合粒子：未結合粒子と同様に、浸漬1時間後の放出量は10％未満であったが、1週間後の放出率は100％近くまで増加した。しかし、純HApだけは50％程度であった。【００９４】
(3) cyt c(図９)に関して
未結合粒子：放出率40％程度の初期バーストが起こり、その後の増加率の増減は不安定な傾向を示した。【００９５】
結合粒子：浸漬1時間後は1〜2％程度の増加率を示し、1週間後は10％程度まで増加した。【００９６】
(4) LYZ(図１０)に関して
未結合粒子：50％以上の初期バーストが見られ、放出量の時間依存性はなかった。ChS分子量の増加につれて放出量は減少したが、純HApは他のHAp/ChS多孔質粒子と比べて放出量が低かった。【００９７】
結合粒子：純HApを除いて、結合することで初期バーストを若干軽減することができた。更に、放出量は時間経過と共に直線的に増加した。なお、ChS分子量の増加につれて放出量が減少した。【００９８】
(5) HST(図１１)に関して
未結合粒子：浸漬1時間後の放出量は15〜20％程度であった。その後放出量が減少した。これも、Tryと同様に粒子へ再吸着したものと考えられる。なお、HAp/ChS(分子量：35kDa、2重量％)多孔質粒子が最も低い放出量であった。【００９９】
結合粒子：結合することで初期バーストを10％以下にまで軽減することができた。その後の放出量は若干減少した。【０１００】
4. 考察
亜鉛イオンによる結合処理により9種類全てのタンパク質の初期バーストを軽減することができた。しかし、軽減の度合いはタンパク質によって様々であり、等電点には依存しなかった。【０１０１】
特に、初期バーストをほぼ完全に抑えることができたタンパク質に関しては、粒子の生分解性の制御と共にin vivoでの徐放効果が期待できる。【０１０２】
〔実施例２〕結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のタンパク質系薬物放出挙動の変化
実施例１では、製剤化の過程で亜鉛イオンを用いた結合処理により初期バーストを抑えることを検証した。しかし、実用化を考慮すると、添加する亜鉛イオンの量はなるべく少ないほうが望ましい。そこで本実施例では、結合処理における亜鉛イオンの添加量を変化させた時のタンパク質系薬物の放出挙動の変化を検討した。【０１０３】
1. サンプル作製
HAp/ChS多孔質粒子は、実施例１と同様のものを用いた。一方、担持対象のタンパク質系薬物としては、BSA、cyt c及びHbを用いた。【０１０４】
10％PBSを溶媒として、800μg/mlのタンパク質(BSA、cyt c又はHb)水溶液を作製した。この各水溶液5mlに200mgのHAp/ChS(分子量：15kDa、2重量％)多孔質粒子を浸漬させて、4時間回転撹拌させて吸着させた。【０１０５】
4時間の回転撹拌後、そのまま30mg/mlの塩化亜鉛水溶液（0.1MのHCl水溶液を加えてpH5.5に調整）を1ml、2ml、3ml加え、2時間回転撹拌させることで、結合処理を行った（それぞれのサンプル名を「HAp/ChS(15kDa)2％+1Zn」、「HAp/ChS(15kDa)2％+2Zn」、「HAp/ChS(15kDa)2％+3Zn」と呼ぶ）。当該結合処理によれば、各タンパク質と多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。【０１０６】
2時間の回転撹拌後、遠心分離して上澄み液を分離させて、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。【０１０７】
なお、実施例１と同様に、結合処理を行わない未結合粒子(HAp/ChS(15kDa)2％)のサンプルも作製した。【０１０８】
2. 放出試験
前記1で作製した各サンプルを、10mg測り取り、5mlのPBSに浸漬させ、36.5℃でゆっくり回転撹拌させた。【０１０９】
放出試験は、1時間〜1週間の期間で行った。放出量の定量は、遠心管を遠心分離させて、上澄み液のタンパク質濃度を測定することで定量した。タンパク質定量は、ADV01により行った。【０１１０】
3. 結果
図１２は、結合処理における亜鉛イオンの添加量を変化させた時の各タンパク質((a)BSA、(b)cyt c、(c)Hb)の放出挙動を示す。【０１１１】
BSA(図１２(a))及びcyt c(図１２(b))は、共に亜鉛イオン添加量の増加につれて初期放出量が減少した。cyt cに関しては、その後の時間経過に伴う放出量の増加は見られなかった。しかし、BSAに関しては、1週間で放出された量は亜鉛イオン添加量に関わらず同程度であった。【０１１２】
Hb(図１２(c))については、初期の放出量は測定しなかったが、1週間後の放出量に違いが見られた。また、HAp/ChS(15kDa)2％+2Znで放出量がほぼ抑えられていた。HAp/ChS(15kDa)2％+2Zn及びHAp/ChS(15kDa)2％+3Znについては、1週間ほとんどHbが放出されなかった。【０１１３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2008041704.tif 000004
【図２】
2008041704.tif 000005
【図３】
2008041704.tif 000006
【図４】
2008041704.tif 000007
【図５】
2008041704.tif 000008
【図６】
2008041704.tif 000009
【図７】
2008041704.tif 000010
【図８】
2008041704.tif 000011
【図９】
2008041704.tif 000012
【図１０】
2008041704.tif 000013
【図１１】
2008041704.tif 000014
【図１２】
2008041704.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月26日(2008.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質系薬物（破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く）が、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とからなる多孔質粒子内に含有され、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合されていることを特徴とする、徐放性製剤。
【請求項２】
前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、請求項１記載の徐放性製剤。
【請求項３】
前記リン酸カルシウムのカルシウムがマグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属と置換されていることを特徴とする、請求項１又は２記載の徐放性製剤。
【請求項４】
前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が１．３〜３．４であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が１×１０２ｎｍ以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項７】
前記長径が１ｎｍ〜１×１０２ｎｍであることを特徴とする、請求項６記載の徐放性製剤。
【請求項８】
前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜４、６及び７のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項９】
前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項８記載の徐放性製剤。
【請求項１０】
前記多糖類の含有量が４×１０重量％以下であることを特徴とする、請求項１〜４及び６〜９のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１１】
前記含有量が４×１０重量％〜１×１０−１重量％であることを特徴とする、請求項１０記載の徐放性製剤。
【請求項１２】
前記多孔質粒子の直径が１×１０２μｍ以下であることを特徴とする、請求項１〜４及び６〜１１のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１３】
前記直径が１μｍ〜１×１０２μｍであることを特徴とする、請求項１２記載の徐放性製剤。
【請求項１４】
前記多孔質粒子の比表面積が５×１０ｍ２／ｇ〜２×１０２ｍ２／ｇであることを特徴とする、請求項１〜４及び６〜１３のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１５】
前記多孔質粒子の気孔率が３×１０％〜８×１０％であることを特徴とする、請求項１〜４及び６〜１４のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１６】
前記多孔質粒子の生体内吸収が６ヶ月以内であることを特徴とする、請求項１〜４及び６〜１５のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１７】
前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、請求項１〜４及び６〜１６のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１８】
前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜４及び６〜１７のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１９】
前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、請求項１８記載の徐放性製剤。
【請求項２０】
リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが分散された懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とからなる多孔質粒子を得る工程と、
前記多孔質粒子を、タンパク質系薬物（破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く）含有溶液と混合し、前記タンパク質系薬物を前記多孔質粒子の孔内面全体に含有させる工程と、
前記タンパク質系薬物を含有した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程と、
を含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
年，第１７巻，ｐ．２５３−２６４
非特許文献９Ｙ．Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」，２００６年，第１１０巻，第２号，ｐ．２６０−２６５
発明の開示
発明が解決しようとする課題
［０００９］
本発明は、上述した実情に鑑み、タンパク質系薬物の徐放性製剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［００１０］
前記特許文献３と同様な方法で製造したリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とから成る複合多孔質粒子から薬物を放出させる製剤化方法等の鋭意検討を進めた結果、タンパク質系薬物を徐放させる基材として当該複合多孔質粒子が最適であり、さらに徐放化させる際に、二価金属イオンを用いることで初期バーストを制御したゼロ次放出を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
［００１１］
本発明は以下を包含する。
［００１２］
（１）タンパク質系薬物（破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く）が、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とからなる多孔質粒子内に含有され、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合されていることを特徴とする、徐放性製剤。
［００１３］
（２）前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、（１）記載の徐放性製剤。
［００１４］
（３）前記リン酸カルシウムのカルシウムがマグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属と置換されていることを特徴とする、（１）又は（２）記載の徐放性製剤。
［００１５］
（４）前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が１．３〜３．４であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００１６］
（５）前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が１×１０２ｎｍ以下であることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００１７］
（６）前記長径が１ｎｍ〜１×１０２ｎｍであることを特徴とする、
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
（５）記載の徐放性製剤。
［００１８］
（７）前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００１９］
（８）前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、（７）記載の徐放性製剤。
［００２０］
（９）前記多糖類の含有量が４×１０重量％以下であることを特徴とする、（１）〜（８）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００２１］
（１０）前記含有量が４×１０重量％〜１×１０−１重量％であることを特徴とする、（９）記載の徐放性製剤。
［００２２］
（１１）前記多孔質粒子の直径が１×１０２μｍ以下であることを特徴とする、（１）〜（１０）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００２３］
（１２）前記直径が１μｍ〜１×１０２μｍであることを特徴とする、（１１）記載の徐放性製剤。
［００２４］
（１３）前記多孔質粒子の比表面積が５×１０ｍ２／ｇ〜２×１０２ｍ２／ｇであることを特徴とする、（１）〜（１２）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００２５］
（１４）前記多孔質粒子の気孔率が３×１０％〜８×１０％であることを特徴とする、（１）〜（１３）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００２６］
（１５）前記多孔質粒子の生体内吸収が６ヶ月以内であることを特徴とする、（１）〜（１４）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００２７］
（１６）前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、（１）〜（１５）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００２８］
（１７）前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、（１）〜（１６）のいずれか１記載の徐放性製剤。
［００２９］
（１８）前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、（１７）記載の徐放性製剤。
［００３０］
（１９）リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが分散された懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とからなる多孔質粒子を得る工程と、前記多孔質粒子を、タンパク質系薬物（破骨細胞形成抑制因子、その類縁体、変異体及びそれらの修飾体を除く）含有溶液と混合し、前記タンパク質系薬物を前記多孔質粒子の孔内面全体に含有させる工程と、前記タンパク質系薬物を含有した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記タンパク質系薬物と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程とを含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
発明の効果
［００３２］
本発明によれば、安定に、且つ多量にタンパク質系薬物を担持した徐放性製剤が提供される。本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンによって多孔質粒子とタンパク質系薬物との結合性が改善されており、初期バーストがほとんど無く、一定期間安定してタンパク質系薬物を徐放することができる。
［００３３］
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２７１０７７号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
［００３４］
［図１］図１は、結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のＢＳＡ放出挙動を示す。
［図２］図２は、結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のＨｂ放出挙動を示す。
［図３］図３は、結合処理における亜鉛イオン添加量を変化させた時のｃｙｔ  ｃ放出挙動を示す。
［図４］図４は、ＣＡＴの放出挙動を示す。
［図５］図５は、ＢＳＡの放出挙動を示す。
［図６］図６は、Ｈｂの放出挙動を示す。
［図７］図７は、Ｔｒｙの放出挙動を示す。
［図８］図８は、Ｐａｐの放出挙動を示す。
［図９］図９は、ｃｙｔ  ｃの放出挙動を示す。
【国際調査報告】
2008041704.tif 000016
2008041704.tif 000017
2008041704.tif 000018
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