(57)【要約】アレルギー性副作用がなく、血中（血漿中）安定性が高く、かつ障害臓器の細胞に取り込まれやすい、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質を用いた、ファブリー病治療用医薬組成物を提供する。本発明のファブリー病治療用医薬組成物は、例えば、野生型ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性部位の構造を変化させてα−ガラクトシダーゼ活性を獲得したタンパク質を含むものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性部位の構造を変化させてα−ガラクトシダーゼ活性を獲得したタンパク質を含むことを特徴とする、ファブリー病治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記タンパク質がα−ガラクトシダーゼの基質特異性を有するものである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含むことを特徴とする、ファブリー病治療用医薬組成物。
（ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｂ）上記（ａ）の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記（ａ）のタンパク質は、前記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記（ａ）のタンパク質は、前記アラニン以外のアミノ酸がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つである、請求項３又は４記載の組成物。
【請求項６】
前記（ａ）のタンパク質は、前記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、前記アラニン以外のアミノ酸がロイシンである、請求項３記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物をファブリー病患者に投与することを特徴とする、ファブリー病の治療方法。
【請求項８】
野生型ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性部位の構造を変化させてα−ガラクトシダーゼ活性を獲得したタンパク質であって、野生型ヒトα−ガラクトシダーゼ由来のシグナルペプチドを含むものである、前記タンパク質。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｂ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
前記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である、請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記アラニン以外のアミノ酸がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つである、請求項９又は１０記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、前記アラニン以外のアミノ酸がロイシンである、請求項９記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目〜第６０６番目の塩基がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６１３番目〜第６１５番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目〜第６０６番目の塩基がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換され第６１３番目〜第６１５番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｂ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
前記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である、請求項１４記載の遺伝子。
【請求項１６】
前記アラニン以外のアミノ酸がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つである、請求項１４又は１５記載の遺伝子。
【請求項１７】
前記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、前記アラニン以外のアミノ酸がロイシンである、請求項１４記載の遺伝子。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項２０】
請求項１９記載の形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含む、当該タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素補充療法用医薬組成物、具体的には、ファブリー病治療用医薬組成物に関する。また本発明は、当該医薬組成物に用い得る基質特異性を変換した新規高機能酵素、具体的にはα−ガラクトシダーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで根本的治療法がなかった遺伝性酵素欠損症に対して、当該酵素を遺伝子工学的に産生し、これを点滴静注等により血管内に投与する酵素補充療法が開発されつつある。また、遺伝性酵素欠損症としては、比較的発生頻度が高く、特定疾患（難病）に指定されている、ファブリー病（Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（遺伝性α−ガラクトシダーゼ欠損症；ライソゾーム病又はリソソーム病と呼ばれる遺伝子疾患群のひとつである）がよく知られている（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊ．Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，“Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｏｓｅｓ”，Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ａｌｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９７，ｐ．１７３−２１６参照）。
ファブリー病とは、ヒト細胞内小器官のひとつであるリソソームに存在する酵素のうち、「α−ガラクトシダーゼ」という酵素の活性低下もしくは欠損が原因となり、その生体内基質であるグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３；セラミドトリヘキソシド（ＣＴＨ）とも言う）という糖脂質が分解されずに体内（例えば、血管、皮膚、角膜、神経、腎臓、心臓等）に蓄積することによって生じる、糖脂質代謝異常性疾患である。
α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子はＸ染色体上にあるため、この疾患はＸ染色体性の遺伝型式をとる。そのため、本症では、主にヘミ接合体の男性において明確な臨床像を呈する。典型的な臨床経過をとる「古典型ファブリー病」は、約４万人の男児に１人の割合で発生すると考えられており、少年期や青年期に、手足の痛み、低汗症、被角血管腫、角膜混濁等の症状がみられ、それが進行して、中年期以後に腎不全、心不全、脳血管障害等の全身の臓器障害を生じ、これが死因となる。また、「古典型ファブリー病」のような典型的な臨床経過をとらず、発症が遅く比較的緩やかな経過を示すものとして、「亜型ファブリー病」も存在し、このタイプの患者においては、僅かながらα−ガラクトシダーゼの残存活性が認められる。亜型ファブリー病としては、例えば「心ファブリー病」が知られており、前記糖脂質の蓄積が主に心臓で生じ、それにより心臓肥大が発症して心不全や不整脈等の障害を生じる。一方、ヘテロ接合体のファブリー病女性患者では、Ｘ染色体の特性により、その臨床像としては様々な形がみられ、ヘミ接合体の男性と変わらない重症のものからほとんど無症状のものまで存在し得る。しかし、最近の調査により、ヘテロ接合体のファブリー病女性患者は、高年齢になると、そのほとんどが何らかの症状を示すことが明らかになり、これらを「保因者」としてではなく「患者」として扱うべきであるとの見方もある。
ところで、近年、このようなファブリー病に対しても酵素補充療法が確立され、ほ乳類由来の細胞で産生した組換えヒトα−ガラクトシダーゼが、上記療法におけるファブリー病治療薬の有効成分として広く使用されている（Ｅｎｇ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，６８：７１１−７２２（２００１）；Ｅｎｇ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４５：９−１６（２００１）；Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：３６５−３７０（２０００）参照）。
また、動物細胞以外の細胞（酵母など）を宿主として産生した組換えヒトα−ガラクトシダーゼをファブリー病の治療（酵素補充療法）に用い得るものとする方法（特開２００２−３６９６９２号公報参照）や、さらには、ヒトα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を障害組織の細胞に導入して発現させることで酵素の補充を行う遺伝子治療的な方法（特表２００２−５２２５０９号公報参照）なども提案されている。
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、現行のファブリー病治療用の補充用酵素薬は、もともと酵素（ヒトα−ガラクトシダーゼ）を持たない患者に対して投与されることが多いため、投与した患者の多くにおいて治療薬中の酵素が異物として認識され、抗体が産生されてしまい、その結果、アレルギー反応を主体とする副作用が高頻度に出現するという問題が生じる。このような問題は、遺伝子治療的な方法で酵素を補充する場合においても同様である。
また、補充用酵素薬は血管内に投与されるが、α−ガラクトシダーゼ自体は血液中で不安定であるため、実際の治療においては、頻繁に投与（２週間に１回の割合）しなければならず、また１回当たりの投与量を多くする必要も生じ得る。さらに、ヒトα−ガラクトシダーゼ（α−ＧＡＬ）には、障害臓器の細胞内（詳しくは細胞内のリソソーム）に取り込まれるために必要なマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基が結合し得る糖鎖（Ｎ型糖鎖）の数が少ないため、血液中から当該細胞に取り込まれ難い。特に、ファブリー病における主な障害臓器である腎臓や心臓での取り込み効率が低く、腎障害や心障害に対する治療効果が十分とは言い難い。これらのことから、治療において一定量の酵素を標的細胞に取り込ませるためには、大量の酵素が必要となり、補充用酵素薬をより頻繁に、より多く投与する必要が生じる。このような治療の現状は、患者にとって、体力的な面や精神的な面、さらには経済的な面において大きな負担となり、「生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ：ＱＯＬ）」に悪影響を及ぼすこととなっている。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、アレルギー性副作用がなく、血中（血漿中）安定性が高く、かつ障害臓器の細胞に取り込まれやすい、α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質を用いた、ファブリー病治療用医薬組成物を提供することにある。また本発明は、上記α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質のごとき、基質特異性を変換した新規高機能酵素を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、α−ＧＡＬとは基質特異性が異なるが全体として立体構造が酷似したタンパク質である「α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ＮＡＧＡ）」に着目した。そして、このα−ＮＡＧＡの活性部位の構造を変化させ、α−ＧＡＬ活性を有するように基質特異性を転換して得られた新規高機能酵素（α−ＮＡＧＡ変異体）を、酵素補充療法に用いるファブリー病治療用医薬組成物の有効成分として用いれば、上記課題を解決し得ると考えた。
しかしながら、当該分野においては、次のことが一般的に知られている。
１）タンパク質を構成するアミノ酸の一部を別のアミノ酸に置換すると、当該アミノ酸とその周囲に存在するアミノ酸との相互作用の状態（水素結合、疎水結合など）が変化する可能性がある。相互作用の状態が変換した場合、アミノ酸の一部が置換されたタンパク質の立体構造（３次元構造）は変化し、そのタンパク質の本来の機能（特に、酵素の場合は酵素活性）が損なわれるおそれがある。
２）タンパク質を構成するアミノ酸の一部を別のアミノ酸に置換することによる、上述の立体構造変化は、当該タンパク質の表面構造の変化につながる可能性がある。表面構造が変換したタンパク質を生体内に投与した場合、生体は、当該タンパク質とは異なるタンパク質（生体にとっては異物）を投与されたものと認識し、免疫反応が生じてしまう。この免疫反応は、タンパク質を医薬品として生体内に投与し使用する場合には、当該タンパク質の機能を低下させるだけでなく、アナフィラキシーを誘発する場合もあり、生命に関わる極めて大きな問題となる。
すなわち、医薬品として生体内に投与するタンパク質は、その機能（活性）を有していることのみでなく、投与後に免疫反応を生じないように設計をする必要がある。
上記の理由から、α−ＧＡＬに類似しているα−ＮＡＧＡにつき、その活性部位のアミノ酸をα−ＧＡＬの活性部位と同様のアミノ酸に置換したとしても、置換したアミノ酸の位置及び種類によっては、当然に、α−ＧＡＬ活性を有し、かつ立体構造上はα−ＮＡＧＡであるタンパク質（α−ＮＡＧＡ変異体）を作製することができるとは言えない。
本発明者は、これらの問題を解決するために、まず、ホモロジーモデリングによる立体構造解析によるシミュレーションを行い、α−ＮＡＧＡの表面構造を維持しつつ、α−ＧＡＬ活性を獲得することが可能なアミノ酸置換の態様を詳細に検討し、ファブリー病治療薬候補のα−ＮＡＧＡ変異体のアミノ酸配列を決定した。その上で、実際に、このα−ＮＡＧＡ変異体を発現させ、α−ＧＡＬの基質を分解する活性を持つことを確認した。さらに、このα−ＮＡＧＡ変異体を、実際にファブリー病モデルマウスに投与し、α−ＧＡＬ活性が障害組織に分布していることをも確認した。
これらの検証により、当該α−ＮＡＧＡ変異体が、初めてファブリー病治療用の医薬品として、有効に使用し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）野生型ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性部位の構造を変化させてα−ガラクトシダーゼ活性を獲得したタンパク質を含むことを特徴とする、ファブリー病治療用医薬組成物。
本発明の医薬組成物は、例えば、上記タンパク質がα−ガラクトシダーゼの基質特異性を有するものが挙げられる。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含むことを特徴とする、ファブリー病治療用医薬組成物。
（ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｂ）上記（ａ）の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質。
本発明の医薬組成物は、例えば、上記（ａ）のタンパク質において、上記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸若しくはアスパラギン酸であるもの、上記アラニン以外のアミノ酸がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つであるもの、又は、上記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、上記アラニン以外のアミノ酸がロイシンであるものが挙げられる。
（３）上記（１）及び（２）に記載の医薬組成物をファブリー病患者に投与することを特徴とする、ファブリー病の治療方法。
（４）野生型ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性部位の構造を変化させてα−ガラクトシダーゼ活性を獲得したタンパク質であって、野生型ヒトα−ガラクトシダーゼ由来のシグナルペプチドを含むものである、前記タンパク質。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｂ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質。
本発明のタンパク質は、例えば、上記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸若しくはアスパラギン酸であるもの、上記アラニン以外のアミノ酸がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つであるもの、又は、上記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、上記アラニン以外のアミノ酸がロイシンであるものが挙げられる。
（６）上記（６）又は（７）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目〜第６０６番目の塩基がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６１３番目〜第６１５番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目〜第６０６番目の塩基がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換され第６１３番目〜第６１５番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｂ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
本発明の遺伝子は、例えば、上記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸若しくはアスパラギン酸であるもの、上記アラニン以外のアミノ酸がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つであるもの、又は、上記セリン以外のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、上記アラニン以外のアミノ酸がロイシンであるものが挙げられる。
（８）上記（６）又は（７）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（９）上記（８）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１０）上記（９）記載の形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含む、当該タンパク質の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡのサブユニット全体の立体構造を表す模式図である。
図２Ａは、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡの活性部位の構造を表す模式図である。なお、図中に示したアミノ酸（スティック表示（基質を除く））は、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡの基質に近接するアミノ酸残基の中で、α−ＧＡＬとα−ＮＡＧＡに共通するアミノ酸残基の立体構造上での位置を示す。
図２Ｂは、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡの活性部位の構造を表す模式図である。なお、図中に示したアミノ酸（スティック表示（基質を除く））は、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡの基質に近接するアミノ酸残基の中で、α−ＧＡＬとα−ＮＡＧＡとの間で異なるアミノ酸残基の立体構造上での位置を示す。
図２Ｃは、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡの活性部位を構成するアミノ酸と、それぞれの基質との相互作用部位を示す概略図である。
図３は、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡの各サブユニットにおけるＮ型糖鎖結合部位（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ）の個数及び位置の比較を示す模式図である。
図４は、野生型α−ＧＡＬ及び野生型α−ＮＡＧＡの各サブユニットにおけるＮ型糖鎖結合部位（スティック表示（基質を除く））を、各サブユニットの立体構造中に示した模式図である。
図５は、（ａ）が、野生型α−ＮＡＧＡが自己の基質と結合する様子を示す模式図であり、（ｂ）が、α−ＮＡＧＡ変異体であるα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）がα−ＧＡＬの基質と結合する様子を示す模式図である。
図６は、野生型α−ＮＡＧＡ、及びα−ＮＡＧＡ変異体であるα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）の活性部位の構造を表す模式図である。
図７は、ファブリー病患者由来線維芽細胞内のＣＴＨ蓄積量について、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体、及び野生型α−ＧＡＬの添加による影響を示す、免疫染色の結果を表す図である。
図８は、α−ＮＡＧＡ変異体であるα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）の、各精製ステップでの試料のＣ．Ｂ．Ｂ．染色像を示す図である。
図９は、肝臓、腎臓及び心臓におけるα−ＧＡＬの基質であるＣＴＨの分析結果を示す図である。
図１０は、腎臓組織の免疫染色の結果を示す図である。
図１１は、心臓組織の免疫染色の結果を示す図である。
図１２は、肝臓組織の免疫染色の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００７−１３３５３６号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要等
（１）用語の定義
本明細書においては、特に言及した場合を除き、以下のように用語の定義をするものとする。
「α−ガラクトシダーゼ」及び「α−ＧＡＬ」とは、いずれも、「ヒトα−ガラクトシダーゼＡ」を意味する。
「α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ」及び「α−ＮＡＧＡ」は、いずれも、「ヒトα−ガラクトシダーゼＢ」、すなわち「ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ」を意味する。
「ｗｔ」とは、野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）を意味する。
「Ｍ６Ｐ」とは、「マンノース−６−リン酸」を意味する。
「α−ＧＡＬ活性」とは、後述するα−ＧＡＬの基質を加水分解し得る活性（後述の反応式（１）参照）を意味し、α−ＧＡＬタンパク質（野生型α−ＧＡＬ）が有する活性という意味に限定されるものではない。
「α−ＮＡＧＡ活性」とは、後述するα−ＮＡＧＡの基質を加水分解し得る活性（後述の反応式（２）参照）を意味し、α−ＮＡＧＡタンパク質（野生型α−ＮＡＧＡ）が有する活性という意味に限定されるものではない。
「α−ＧＡＬ活性を獲得した」とは、基質結合部位において、α−ＮＡＧＡの基質との結合反応性よりもα−ＧＡＬの基質との結合反応性が相対的に高くなったことを意味する。
「α−ＧＡＬの基質特異性を有する」とは、活性部位の構造（特に、基質の結合反応性に重要な役割を果たすアミノ酸残基の位置及び種類）が野生型α−ＧＡＬのそれと同じであることを意味する。
「第１８８番」及び「第１９１番」とは、野生型α−ＮＡＧＡのアミノ酸配列（配列番号２）からみた位置（当該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基を第１番としてＣ末端側方向へ数えたときの位置）を示す。
「α−ＮＡＧＡ変異体」とは、基本的には、野生型α−ＮＡＧＡの変異体を全て含む意味であり、特定の変異体（アミノ酸変異体）に限定はされるものではないが、本明細書においては、野生型α−ＮＡＧＡのアミノ酸配列（配列番号２）のうち第１８８番目のセリンがグルタミン酸に置換され、かつ、第１９１番目のアラニンがロイシンに置換された変異型タンパク質（すなわち「α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」と表記される）を、α−ＮＡＧＡ変異体と称して（定義づけて）、説明している場合がある。
「α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ」とは、通常、野生型α−ＮＡＧＡのシグナルペプチド部分（配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目〜第１７番目のアミノ酸からなるペプチド部分）が、野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチド部分（配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目〜第３１番目のアミノ酸からなるペプチド部分）に置換されたタンパク質を意味する。ここで、当該シグナルペプチド部分とは、一般に、タンパク質が細胞内で発現した後、細胞外に分泌された際には、既に除かれているものであるが、本発明においては、便宜上、細胞外に分泌された後のものに対しても、「α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ」と称することがある。
「α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体」及び「α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」とは、通常、α−ＮＡＧＡ変異体のシグナルペプチド部分（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目〜第１７番目のアミノ酸からなるペプチド部分）が、野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチド部分（配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目〜第３１番目のアミノ酸からなるペプチド部分）に置換されたタンパク質を意味する。ここで、当該シグナルペプチド部分とは、一般に、タンパク質が細胞内で発現した後、細胞外に分泌された際には、既に除かれているものであるが、本発明においては、便宜上、細胞外に分泌された後のものに対しても、「α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体」又は「α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」と称することがある。
（２）配列表の説明
本明細書に記載の配列番号１〜１０に示される塩基配列及びアミノ酸配列が、どのような酵素タンパク質に関する配列であるかについて、下記表Ａに示す。なお、表Ａ中、「本体」とは、タンパク質のシグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質となる部分を意味する。また、「＋」の表記は、所定のシグナルペプチド部分と本体部分とが結合したものであることを表す。
【表Ａ】
2008143354.tif 000002
（３）本発明の概要
本発明は、ファブリー病の酵素補充療法に有効に用いることができ優れた治療効果を発揮し得るファブリー病治療用医薬組成物、及び当該医薬組成物の有効成分として有用な新規高機能酵素としての組換えタンパク質を提供するものである。
現行のファブリー病治療用の補充用酵素薬は、ＣＨＯ細胞やヒト繊維芽細胞などのほ乳類由来の細胞で産生した組換えヒトα−ＧＡＬを使用している。しかしながら、このヒトα−ＧＡＬの使用には、アレルギー性副作用、血液中での不安定性、障害臓器の細胞への取り込まれ難さなどの問題点があり、実際の治療においては患者への負担が非常に大きいものとなっているため、その改善が課題となっている。
本発明者は、これらの課題を解決するため、α−ＧＡＬ以外の酵素をファブリー病治療用の補充用酵素として利用することができないか検討し、α−ＧＡＬと同様にリソソーム酵素であり（すなわち細胞内での局在性が同じであり）、かつα−ＧＡＬと全体の立体構造は酷似しているが基質特異性の点では異なる、「α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ＮＡＧＡ）」に着目した。
α−ＧＡＬは古くはα−ガラクトシダーゼＡと呼ばれ、このα−ＧＡＬと生化学的性状がよく似たα−ガラクトシダーゼＢと呼ばれるアイソザイムが存在すると考えられていた。このα−ガラクトシダーゼＢは、α−ＧＡＬに比べて安定性が高いが、ファブリー病で体内に蓄積するグロボトリアオシルセラミド（セラミドトリヘキソシド（ＣＴＨ））を分解する能力は無いことが知られていた。その後、このα−ガラクトシダーゼＢの実態はα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ＮＡＧＡ）であることが判明した。このα−ＮＡＧＡは、α−ＧＡＬをコードする遺伝子と同じ祖先遺伝子から派生したと考えられる遺伝子によりコードされている。α−ＮＡＧＡのｃＤＮＡは既にクローン化されており、１７アミノ酸残基から成るシグナルペプチドを含む合計４１１アミノ酸残基から構成されるタンパク質をコードするものであることが分かっている。また、ヒトα−ＮＡＧＡの構造は、ヒトα−ＧＡＬと比較して、塩基配列レベルで５７．９％、アミノ酸配列レベルで５２．２％の相同性を示す。さらに、ヒトα−ＮＡＧＡは、ヒトα−ＧＡＬと同様にホモ二量体の形で存在する酵素である。
本発明者は、以上の知見に基づいて、まずα−ＮＡＧＡとα−ＧＡＬの三次元構造モデルを構築し、比較を試みた。具体的には、プロテインデータバンク（ＰＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／））に登録されているニワトリのα−ＮＡＧＡの構造情報（ＩＤ：１ＫＴＣ）を参考にしてヒトα−ＮＡＧＡの三次元構造モデルを構築し、この構造と、ＰＤＢに登録されているヒトα−ＧＡＬの三次元構造（ＩＤ：１Ｒ４７）とを比較した。その結果、ヒトα−ＮＡＧＡの三次元構造は、全体としても活性部位についても、ヒトα−ＧＡＬの三次元構造と非常によく似ていることが分かった。しかしながら、活性部位に関しては、厳密には、数個のアミノ酸残基が異なるだけではあるが、これらのアミノ酸残基の中には、基質結合部位に存在しα−ＧＡＬ及びα−ＮＡＧＡの各々の基質特異性の違いに影響を与えている重要なアミノ酸残基が存在する。この点で、α−ＧＡＬ及びα−ＮＡＧＡの活性部位には顕著といえる三次元構造上の違いがあることが分かった。
このようにα−ＮＡＧＡは、活性部位のうち基質結合部位の一部の構造においてα−ＧＡＬと異なっているが、その他の部分については、触媒部位も含め、構造面及び性質面のいずれにおいてもα−ＧＡＬと非常によく似ているという特性を有する酵素である（図１、図２Ａ及び図２Ｂ参照）。そのため、α−ＮＡＧＡの触媒反応機構は、反応基質及び反応生成物の種類等において、α−ＧＡＬの触媒反応機構と非常に類似している。
そこで本発明者は、前述の通りα−ＮＡＧＡに着目し、このα−ＮＡＧＡに遺伝子操作を加えて活性部位（特に基質結合部位）の構造を変化させ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するようにα−ＮＡＧＡの基質特異性を転換すれば（例えばα−ＮＡＧＡの基質認識に関係するアミノ酸残基のうち、鍵となるものをα−ＮＡＧＡタイプからα−ＧＡＬタイプのものに置換すれば）、ファブリー病の治療に用い得る新規かつ優れた高機能酵素を創出できることを見出した。
α−ＮＡＧＡに着目した理由としては、さらに下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の点も挙げられる。
（ｉ）α−ＮＡＧＡは、Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ病及びＫａｎｚａｋｉ病の責任酵素であり（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ病の場合と同じ酵素の異常によって起こる異なる臨床表現型の疾患がＫａｎｚａｋｉ病と呼ばれる）、α−ＮＡＧＡの欠損がＳｃｈｉｎｄｌｅｒ病及びＫａｎｚａｋｉ病を発症する原因となっている。しかし、通常、ファブリー病患者であってもＳｃｈｉｎｄｌｅｒ病やＫａｎｚａｋｉ病の発生は極めて稀であるため、ファブリー病患者のほぼ全員においてα−ＮＡＧＡは正常に存在すると言える。そのため、α−ＮＡＧＡの基質特異性のみをα−ＧＡＬの基質特異性に転換したものを補充用酵素薬として投与しても、野生型α−ＮＡＧＡを投与した場合と同様に、その抗原性が現れる場合は極めて少なく、アレルギー性副作用などの有害な免疫反応を誘発する可能性は実質的に無いと考えられる。
（ｉｉ）α−ＮＡＧＡはα−ＧＡＬと同様にホモ二量体として機能するが、一般にα−ＮＡＧＡの方が二量体形成時の安定性が高い。これは、本発明者が構築した立体構造モデルからも推測され、具体的には、ヒトα−ＮＡＧＡでは二量体形成時に両サブユニット間でＡｓｐ４５とＡｒｇ３５０との間に静電相互作用による結合が２ヶ所存在することが認められたが、このような結合はα−ＧＡＬには認められなかった。従って、α−ＮＡＧＡと同様にα−ＮＡＧＡの変異体も、α−ＧＡＬに比べて高い血中（血漿中）安定性を有すると考えられ、酵素補充療法に非常に適している。また、当該安定性により二量体としての存在比がより多くなれば、下記（ｉｉｉ）の点との関係で、細胞内のリソソームへの取り込み効率もより向上することが期待される。さらに、投与前においては、酵素製剤としてその効果を長期間維持し得るというメリットも考えられる。
（ｉｉｉ）酵素補充療法で使用する酵素は、障害臓器の細胞内のリソソームに酵素が取り込まれる必要があり、通常、細胞膜からリソソームへの輸送は、酵素の糖鎖部分に存在するマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を認識するカルシウム非要求性Ｍ６Ｐレセプターを介して行われる。よって、このＭ６Ｐ残基が結合し得る糖鎖（Ｎ型糖鎖）を多く有する方がリソソームへの取り込み効率が高くなるため望ましい。この糖鎖の数については、α−ＧＡＬでは、Ｘ線結晶構造解析からサブユニット当たり３個（Ａｓｎ１３９，Ａｓｎ１９２，Ａｓｎ２１５の３ヶ所；二量体形成時は６個）存在することが明らかになっている。これに対して、α−ＮＡＧＡでは、サブユニット当たり５個（二量体形成時は１０個）存在するが（図３及び図４参照）、そのうち３個（Ａｓｎ１２４，Ａｓｎ１７７，Ａｓｎ２０１の３ヶ所）はα−ＧＡＬにおける糖鎖の位置に相当するものであり、残りの２個（Ａｓｎ３５９とＡｓｎ３８５の２ヶ所）はα−ＮＡＧＡに特有のものである。従って、α−ＮＡＧＡはα−ＧＡＬに比べて、血液中から障害臓器の細胞内のリソソームに取り込まれる効率が高いと考えられる。
本発明者は、以上のような観点から、α−ＮＡＧＡについて、その基質結合部位を構成するアミノ酸残基群のうち、第１８８番目のアミノ酸（セリン（Ｓｅｒ））及び第１９１番目のアミノ酸（アラニン（Ａｌａ））に着目した。そして、第１８８番目のセリン（Ｓｅｒ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換し、第１９１番目のアラニン（Ａｌａ）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換した組換え酵素（変異体酵素）の作製を試みた。次いで、この組換え酵素をファブリー病患者由来の線維芽細胞を用いて発現させて採取し、解析したところ、高いα−ＧＡＬ活性が認められ、しかもこの組換え酵素の血中安定性は、野生型α−ＧＡＬに比べてはるかに高いものであった。このような基質特異性を変換した組換え酵素を用いれば、ファブリー病の酵素補充療法に有用なファブリー病治療用医薬組成物として、現行のものより格段に優れたものを提供することができる。
２．タンパク質
本発明のタンパク質は、後述する本発明のファブリー病治療用医薬組成物の有効成分として利用可能なタンパク質であり、具体的には、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ＮＡＧＡ）の変異体酵素である。
詳しくは、本発明のタンパク質は、以下の（１ａ）のタンパク質、または（１ｂ）のタンパク質であり、好ましくは以下の（１ｃ）のタンパク質である。
（１ａ）野生型α−ＮＡＧＡの活性部位（特に基質結合部位）の構造を変化させることによりα−ガラクトシダーゼ（α−ＧＡＬ）活性を獲得したタンパク質、好ましくはα−ＧＡＬの基質特異性を有するタンパク質。
（１ｂ）シグナルペプチドを含むものである上記（１ａ）のタンパク質。ここで、シグナルペプチドの種類は特に限定はされず、野生型α−ＮＡＧＡ由来のシグナルペプチドであってもよいし、他のタンパク質由来のものであってもよい。
（１ｃ）シグナルペプチドが野生型α−ＧＡＬ由来のシグナルペプチドである上記（１ｂ）のタンパク質。
ここで、「α−ＧＡＬ活性を獲得した」とは、前述の通り、α−ＮＡＧＡの基質結合部位において、α−ＮＡＧＡの基質との結合反応性よりもα−ＧＡＬの基質との結合反応性が相対的に高くなったことを意味する。従って、上述した構造変化としては、α−ＮＡＧＡの基質との結合を完全に不可能にする構造変化には限定されず、本来α−ＧＡＬの基質との結合反応性よりもα−ＮＡＧＡの基質との結合反応性が相対的に有意に高かったのを、逆にα−ＧＡＬの基質との結合反応性が有意に高くなるようにする構造変化も含む。また「α−ＧＡＬの基質特異性を有する」とは、前述の通り、活性部位の構造（特に、基質の結合反応性に重要な役割を果たすアミノ酸残基の位置及び種類）がα−ＧＡＬと同じであることを意味する。
本発明において、α−ＧＡＬの基質とは、非還元末端にα結合したガラクトース残基を持つグロボトリアオシルセラミド（セラミドトリヘキソシド（ＣＴＨ））等の糖脂質などの天然化合物や、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトシドなどの合成化合物を意味する。また、α−ＮＡＧＡの基質とは、非還元末端にα結合したＮ−アセチルガラクトサミン残基を持つオリゴ糖、糖タンパク質及び糖脂質などの天然化合物や、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニドなどの合成化合物を意味する。
ここで、野生型α−ＧＡＬの触媒反応を下記反応式（１）に示し、野生型α−ＮＡＧＡの触媒反応を下記反応式（２）に示す。
2008143354.tif 000003
〔反応式（１）中、Ｒ１は、基質が天然化合物の場合は「糖複合体由来の基」を表し、基質が合成化合物の場合は「４−メチルウンベリフェリル基」を表す。〕
2008143354.tif 000004
〔反応式（２）中、Ｒ２は、基質が天然化合物の場合は「糖複合体由来の基」を表し、基質が合成化合物の場合は「４−メチルウンベリフェリル基」を表す。〕
本発明のタンパク質としては、例えば、以下の（２ａ）又は（２ｂ）のアミノ酸配列からなり、かつα−ＧＡＬ活性を有するタンパク質が好ましく挙げられる。
（２ａ）野生型α−ＮＡＧＡのアミノ酸配列における第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、好ましくは第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸がいずれも他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列。
（２ｂ）上記（２ａ）のアミノ酸配列のうち第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
なお、野生型α−ＮＡＧＡ（ホモ二量体）のサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）及び当該配列をコードする塩基配列（配列番号１）の情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋには「ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０００２６２」として公表されており、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／から取得可能）には「ｅｎｔｒｙ  ｎａｍｅ：ＮＡＧＡＢ＿ＨＵＭＡＮ、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１７０５０」として登録されている。また野生型α−ＧＡＬ（ホモ二量体）のサブユニットのアミノ酸配列（配列番号１０）及び当該配列をコードする塩基配列（配列番号９）の情報も同様に、例えばＧｅｎＢａｎｋには「ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿０００１６０」として公表されており、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／から取得可能）には「ｅｎｔｒｙ  ｎａｍｅ  ：ＡＧＡＬ＿ＨＵＭＡＮ、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０６２８０」として登録されている。
ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であることが好ましい。
また、上記「欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質」は、α−ＧＡＬ活性を安定して発揮し得るタンパク質であることが重要であるため、例えば、α−ＧＡＬの基質中のα−ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられる第２８番目〜第３１番目、第７７番目〜第８１番目、第１１７番目〜第１２７番目、第１５０番目〜第１５８番目、第１９２番目、第２０９番目〜第２２０番目及び第２４２番目〜第２５４番目のアミノ酸（特に、触媒部位である第１５６番目及び第２１７番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ））、ホモ二量体の形成に重要と考えられる第４５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）及び第３５０番目のアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、並びに、Ｎ型糖鎖結合部位である第１２４番目、第１７７番目、第２０１番目、第３５９番目及び第３８５番目のアミノ酸（いずれもアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ））などの全部又は一部（好ましくは全部）は、野生型α−ＮＡＧＡのアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。
上記他のアミノ酸としては、第１８８番目のアミノ酸残基に関しては、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）以外であれば特に限定はされないが、例えば、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）等を好ましく挙げることができ、グルタミン酸がより好ましい。同様に、第１９１番目のアミノ酸残基に関しては、アラニン（Ａｌａ：Ａ）以外であれば特に限定はされないが、例えば、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）及びメチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）等を好ましく挙げることができ、ロイシンがより好ましい。中でも、上記他のアミノ酸として、第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、第１９１番目のアミノ酸がロイシンであることが特に好ましい。なお、上記置換後のアミノ酸は、他の置換されていないアミノ酸からなる構造に実質的に影響を及ぼさないものであることが好ましく、この点でも、第１８８番目のアミノ酸残基をグルタミン酸とすること、第１９１番目のアミノ酸残基をロイシンとすることが、特に好ましい置換態様である。
基質結合部位に存在する第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸を、それぞれ上記のように置換することにより、次のような効果が得られる。すなわち、図５に例示するように、第１８８番目のアミノ酸残基に関しては、α−ＮＡＧＡの基質中のＮ−アセチル基（特に酸素原子）との相互作用を無くし、かつα−ＧＡＬの基質中のヒドロキシル基との結合作用を生じさせることができ、第１９１番目のアミノ酸残基に関しては、α−ＮＡＧＡの基質中のＮ−アセチル基（特にメチル基）との相互作用を無くし、かつ当該基質の結合空間（特にＮ−アセチル基の入り込む空間）を制限することができる。以上の結果、上記アミノ酸置換後の組換え酵素（組換えタンパク質）は、α−ＮＡＧＡの基質との結合反応性よりもα−ＧＡＬの基質との結合反応性の方が高いものとなり、α−ＮＡＧＡ活性と比較して有意に高いα−ＧＡＬ活性を有する酵素となり得る。少なくとも、第１８８番目のアミノ酸（セリン）がグルタミン酸に置換され且つ第１９１番目のアミノ酸（アラニン）がロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する組換え酵素は、上記効果が十分に得られる点で特に好ましい。
本発明のタンパク質はまた、以下の（３ａ）又は（３ｂ）のタンパク質であることが好ましい。
（３ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（３ｂ）上記（３ａ）の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、野生型α−ＮＡＧＡを構成する４１１個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
上記（３ａ）のタンパク質は、詳しくは、この配列番号２に示されるアミノ酸配列において上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載のように置換されたアミノ酸配列のうち、野生型α−ＮＡＧＡのシグナルペプチドを構成する第１番目〜第１７番目のアミノ酸を除いた、第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質である。前述したように、第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸残基はいずれも基質結合部位を構成するアミノ酸の一つである。
ここで、上記第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列としては、例えば、当該第１８番目〜第４１１番目のアミノ酸配列のＮ末端に、各種シグナルペプチドが結合したアミノ酸配列などが好ましく挙げられる。当該シグナルペプチドとしては、障害臓器の細胞膜を通過させ得るものであればよく、限定はされないが、例えば、野生型α−ＮＡＧＡ及び野生型α−ＧＡＬ等の各種リソソーム酵素のシグナルペプチド並びにプレプロトリプシン等の分泌酵素のシグナルペプチドが好ましく、より好ましくは野生型α−ＮＡＧＡ及び野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチドであり、さらに好ましくは野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチドである。なお、野生型α−ＮＡＧＡのシグナルペプチドは、上述の通り、配列番号２に示される野生型α−ＮＡＧＡのアミノ酸配列のうち第１番目〜第１７番目のアミノ酸からなるペプチドであり、野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチドは、配列番号１０に示される野生型α−ＧＡＬのアミノ酸配列のうち第１番目〜第３１番目のアミノ酸からなるペプチドである。また、プレプロトリプシンのシグナルペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質のうち、上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質が特に好ましい。
また、上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸又はアスパラギン酸である場合のタンパク質が好ましく挙げられる。同様に、上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つである場合のタンパク質も好ましく挙げられる。
さらに、上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸」がロイシンである場合のタンパク質が、特に好ましく挙げられる。当該タンパク質としては、例えば、野生型α−ＮＡＧＡのアミノ酸配列（配列番号２）のうち第１８８番目のセリンがグルタミン酸に置換され、かつ、第１９１番目のアラニンがロイシンに置換されたタンパク質（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））が好ましく挙げられる（図６及び配列番号４参照）。なお、アミノ酸のアルファベット表記は、一般に、３文字（例えば「Ｓｅｒ」）又は１文字（例えば「Ｓ」）で表し、Ｎ末端からのアミノ酸位置を示す数字（例えば「１８８」）の前に表示したアルファベットは置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、数字の後に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。従って、例えば第１８８番目のＳｅｒをＧｌｕに置換した場合は「Ｓ１８８Ｅ」と表示する（以下同様）。
上記（３ｂ）のタンパク質は、上記（３ａ）のタンパク質に含まれる上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ＧＡＬ活性を有するタンパク質であればよく、限定はされない。ここで、「前記置換部位」とは、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する３９４個のアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第１８８番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）、並びに、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第１９１番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）を意味する。より具体的には、前者のアミノ酸残基は、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列における第１７１番目のアミノ酸残基を意味し、後者のアミノ酸残基は、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列における第１７４番目のアミノ酸残基を意味する。
なお、上記（３ｂ）のタンパク質は、α−ＧＡＬ活性を安定して発揮し得るタンパク質であることが重要である。そのため、例えば、α−ＧＡＬの基質中のα−ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基は、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第２８番目〜第３１番目、第７７番目〜第８１番目、第１１７番目〜第１２７番目、第１５０番目〜第１５８番目、第１９２番目、第２０９番目〜第２２０番目及び第２４２番目〜第２５４番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（特に、触媒部位である第１５６番目及び第２１７番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ））が好ましく挙げられる。
同様に、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第４５番目及び第３５０番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（具体的には、第４５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）及び第３５０番目のアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ））が好ましく挙げられる。
さらに、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第１２４番目、第１７７番目、第２０１番目、第３５９番目及び第３８５番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（いずれもアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ））が好ましく挙げられる。
本発明のタンパク質はさらに、以下の（４ａ）又は（４ｂ）のタンパク質であることが好ましい。
（４ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（４ｂ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
配列番号６に示されるアミノ酸配列は、野生型α−ＮＡＧＡを構成する４１１個のアミノ酸において、シグナルペプチド部分である第１番目〜第１７番目のアミノ酸が野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチド部分に変換されたアミノ酸配列（計４２５アミノ酸）であり、いわゆる融合タンパク質である。ここで、野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチド部分は、前述した通り、配列番号１０に示される野生型α−ＧＡＬを構成するアミノ酸配列のうちの第１番目〜第３１番目のアミノ酸からなるペプチド部分である。
上記（４ａ）のタンパク質を構成するアミノ酸配列において、第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸残基はいずれも基質結合部位を構成するアミノ酸の一つである。
上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質のうち、上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質が特に好ましい。
また、上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸又はアスパラギン酸である場合のタンパク質が好ましく挙げられる。同様に、上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つである場合のタンパク質も好ましく挙げられる。
さらに、上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸」がロイシンである場合のタンパク質が、特に好ましく挙げられる。当該タンパク質としては、例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち第２０２番目のセリンがグルタミン酸に置換され、かつ、第２０５番目のアラニンがロイシンに置換されたタンパク質（α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ２０２Ｅ／Ａ２０５Ｌ））が好ましく挙げられる。
上記（４ｂ）のタンパク質は、上記（４ａ）のタンパク質に含まれる上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつα−ＧＡＬ活性を有するタンパク質であればよく、限定はされない。ここで、「前記置換部位」とは、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第２０２番目のアミノ酸残基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）並びに第２０５番目のアミノ酸残基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）を意味する。
なお、上記（４ｂ）のタンパク質は、α−ＧＡＬ活性を安定して発揮し得るタンパク質であることが重要である。そのため、例えば、α−ＧＡＬの基質中のα−ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基は、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第４２番目〜第４５番目、第９１番目〜第９５番目、第１３１番目〜第１４１番目、第１６４番目〜第１７２番目、第２０６番目、第２２３番目〜第２３４番目及び第２５６番目〜第２６８番目のアミノ酸残基（特に、触媒部位である第１７０番目及び第２３１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ））が好ましく挙げられる。
同様に、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第５９番目及び第３６４番目のアミノ酸残基（具体的には、第５９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）及び第３６４番目のアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ））が好ましく挙げられる。
さらに、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第１３８番目、第１９１番目、第２１５番目、第３７３番目及び第３９９番目のアミノ酸残基（いずれもアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ））が好ましく挙げられる。
以上に述べた本発明のタンパク質について、α−ＧＡＬ活性は、例えば、ＣＨＯ細胞やヒト線維芽細胞等の哺乳類由来の細胞に目的タンパク質を発現させて採取し、当該タンパク質（酵素溶液）と、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトシド（α−Ｄ−ガラクトース及び４−メチルウンベリフェロン（蛍光基質）から得られる合成基質）とを混合して、酸性条件下で反応させた場合に、当該酵素溶液の単位量が単位時間当たりに遊離させ得る４−メチルウンベリフェロンの量を検出することにより測定することができる。
なお、α−ＮＡＧＡ活性も、上記α−ＧＡＬ活性と同様に、目的タンパク質を発現させて採取し、当該タンパク質（酵素溶液）と、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド（α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン及び４−メチルウンベリフェロン（蛍光基質）から得られる合成基質）とを混合して、酸性条件下で反応させた場合に、当該酵素溶液の単位量が単位時間当たりに遊離させ得る４−メチルウンベリフェロンの量を検出することにより測定することができる。
上記α−ＧＡＬ活性及びα−ＮＡＧＡ活性の測定方法において、蛍光基質の検出には、公知の各種検出方法を採用できるが、例えば、蛍光光度計等により検出する方法が好ましい。また、目的タンパク質の発現は、公知の各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し発現させればよい。
３．組換え遺伝子
本発明の遺伝子は、上述した本発明のタンパク質をコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子としては、例えば、以下の（１ａ）又は（１ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子が好ましく挙げられる。なお、以下の（１ａ）及び（１ｂ）のＤＮＡは、いずれも本発明のタンパク質の構造遺伝子であることが好ましいが、これらＤＮＡを含む遺伝子としては、これらＤＮＡのみからなるものであってもよいし、これらＤＮＡを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。
（１ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列において第５６２番目〜第５６４番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列のうち、第５２番目〜第１，２３６番目の塩基からなる塩基配列
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列において第５７１番目〜第５７３番目の塩基「ｇｃｃ」がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列のうち、第５２番目〜第１，２３６番目の塩基からなる塩基配列
（ｉｉｉ）配列番号１に示される塩基配列において第５６２番目〜第５６４番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換され第５７１番目〜第５７３番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列のうち、第５２番目〜第１，２３６番目の塩基からなる塩基配列
（１ｂ）上記（１ａ）の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本発明において「コドン」とは、転写後のＲＮＡ配列上の３塩基連鎖（トリプレット）に限らず、ＤＮＡ配列上の３塩基連鎖をも意味する。よって、ＤＮＡ配列上のコドンの表記は、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）を用いて行う。
配列番号１に示される塩基配列は、野生型α−ＮＡＧＡをコードする１，２３６個の塩基からなる塩基配列である。
上記（１ａ）のＤＮＡは、詳しくは、この配列番号１に示される塩基配列において上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載のように塩基置換がなされた塩基配列のうち、野生型α−ＮＡＧＡのシグナルペプチドをコードする第１番目〜第５１番目の塩基を除いた、第５２番目〜第１，２３６番目の塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡである。
ここで、上記第５２番目〜第１，２３６番目の塩基配列を含む塩基配列としては、例えば、当該第５２番目〜第１，２３６番目の塩基配列の５’側に、各種シグナルペプチドをコードする塩基配列（ポリヌクレオチド）が結合した塩基配列が好ましく挙げられる。当該シグナルペプチドとしては、障害臓器の細胞膜を通過させ得るものであればよく、限定はされないが、例えば、野生型α−ＮＡＧＡ及び野生型α−ＧＡＬ等の各種リソソーム酵素のシグナルペプチド、並びにプレプロトリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）等の分泌酵素のシグナルペプチドが好ましく、より好ましくは野生型α−ＮＡＧＡ及び野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチドであり、さらに好ましくは野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチドである。なお、野生型α−ＮＡＧＡのシグナルペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１に示される野生型α−ＮＡＧＡの塩基配列のうち第１番目〜第５１番目の塩基からなる塩基配列であり、野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチドをコードする塩基配列は、配列番号９に示される野生型α−ＧＡＬの塩基配列のうち第１番目〜第９３番目の塩基からなる塩基配列である。また、プレプロトリプシンのシグナルペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１１に示される塩基配列である。
上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡのうち、上記（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡが特に好ましい。
また、上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸又はアスパラギン酸のコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが好ましく挙げられる。同様に、上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡも好ましく挙げられる。ここで、上記の各アミノ酸のコドンを示す塩基（左端の塩基を５’側の塩基とする）については、グルタミン酸のコドンを示す塩基は「ｇａｇ」又は「ｇａａ」（好ましくは「ｇａｇ」）であり、アスパラギン酸のコドンを示す塩基は「ｇａｔ」又は「ｇａｃ」である。同様に、ロイシンのコドンを示す塩基は「ｃｔｃ」、「ｃｔｔ」、「ｃｔａ」又は「ｃｔｇ」（好ましくは「ｃｔｃ」）であり、バリンのコドンを示す塩基は「ｇｔｔ」、「ｇｔｃ」、「ｇｔａ」又は「ｇｔｇ」であり、イソロイシンのコドンを示す塩基は「ａｔｔ」、「ａｔｃ」又は「ａｔａ」であり、フェニルアラニンのコドンを示す塩基は「ｔｔｔ」又は「ｔｔｃ」であり、メチオニンのコドンを示す塩基は「ａｔｇ」である。なお、セリンのコドンを示す塩基としては、前記「ａｇｃ」以外に「ａｇｔ」があり、アラニンのコドンを示す塩基としては、前記「ｇｃｃ」以外に「ｇｃｔ」、「ｇｃａ」及び「ｇｃｇ」がある。
さらに、上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸のコドンを示す塩基であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシンのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが、特に好ましく挙げられる。当該ＤＮＡとしては、例えば、野生型α−ＮＡＧＡの塩基配列（配列番号１）のうち第５６２番目〜第５６４番目の塩基がセリンのコドンを示す塩基からグルタミン酸のコドンを示す塩基に置換され（「ａｇｃ」→「ｇａｇ」）、かつ、第５７１番目〜第５７３番目の塩基がアラニンのコドンを示す塩基からロイシンのコドンを示す塩基に置換された（「ｇｃｃ」→「ｃｔｃ」）塩基配列（配列番号３）からなるＤＮＡが好ましく挙げられる。この例示においては、置換後の第５６２番目〜第５６４番目の塩基は、グルタミン酸のコドンを示す塩基であれば上記「ｇａｇ」以外の塩基であってもよいし、同様に、置換後の第５７１番目〜第５７３番目の塩基は、ロイシンのコドンを示す塩基であれば上記「ｃｔｃ」以外の塩基であってもよく、限定はされない。
以上のような変異置換型のＤＮＡは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
また、後述する実施例に記載のように、所望のアミノ酸のコドンを示す塩基となるようにミスセンス変異が導入されるように設計したＰＣＲプライマーを用い、野生型α−ＮＡＧＡをコードする塩基配列を含むＤＮＡ等をテンプレートとして、適当な条件下でＰＣＲを行うことにより調製することもできる。ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、限定はされないが、正確性の高いＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、例えば、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼの最適温度、合成するＤＮＡの長さや種類等により適宜設定すればよいが、例えば、サイクル条件であれば「９０〜９８℃で５〜３０秒（熱変性・解離）→５０〜６５℃で５〜３０秒（アニーリング）→６５〜８０℃で３０〜１２００秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計２０〜２００サイクル行う条件が好ましい。
上記（１ｂ）のＤＮＡは、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ（すなわち上記（１ａ）のＤＮＡ）若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を適宜参照することができる。
ハイブリダイゼーション法を実施における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が１５〜３３０ｍＭ、温度が２５〜６５℃、好ましくは塩濃度が１５〜１５０ｍＭ、温度が４５〜５５℃の条件を意味する。具体的には、例えば８０ｍＭで５０℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記（１ｂ）のＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記（１ａ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも４０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上である。
また、上記（１ｂ）のＤＮＡは、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一である。
ここでいう「置換部位」とは、上記（１ａ）のＤＮＡに含まれる上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列においてなされた塩基置換の部位であり、詳しくは、当該塩基置換により生じた変更後のコドンを示す塩基（トリプレット）の部位を意味する。具体的には、「置換部位」とは、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列を構成する１，１８５個の塩基のうち、配列番号１に示される塩基配列における第５６２番目〜第５６４番目の塩基の位置に対応する塩基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）、並びに、配列番号１に示される塩基配列における第５７１番目〜第５７３番目の塩基の位置に対応する塩基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）を意味する。さらに具体的には、前者の塩基は、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列における第５１１番目〜第５１３番目の塩基を意味し、後者の塩基は、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列における第５２０番目〜第５２２番目の塩基を意味する。
また「前記置換部位の塩基に対応する塩基」の「対応する塩基」とは、上記（１ｂ）のＤＮＡが上記（１ａ）のＤＮＡに対する相補鎖とハイブリダイズした場合に、このハイブリッドにおいて、前記置換部位の塩基に対する相補塩基（トリプレット）と、位置的に対向する関係にある塩基（トリプレット）を意味する。例えば、上記（１ｂ）のＤＮＡの塩基配列が、上記（１ａ）のＤＮＡと比較して欠失及び付加の変異が無い場合（つまり両ＤＮＡの長さ（塩基数）が同じ）であれば、上記（１ｂ）のＤＮＡの塩基配列における第５１１番目〜第５１３番目の塩基及び／又は第５２０番目〜第５２２番目の塩基が、上記「対応する塩基」となる。
なお、上記（１ｂ）のＤＮＡは、α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが重要である。そのため、例えば、α−ＧＡＬの基質中のα−ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基は、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち配列番号１に示される塩基配列における第８２番目〜第９３番目（４コドン）、第２２９番目〜第２４３番目（５コドン）、第３４９番目〜第３８１番目（１１コドン）、第４４８番目〜第４７４番目（９コドン）、第５７４番目〜第５７６番目（１コドン）、第６２５番目〜第６６０番目（１２コドン）及び第７２４番目〜第７６２番目（１３コドン）の塩基の位置に対応する塩基が好ましく挙げられ、中でも特に、触媒部位のアミノ酸残基のコドンを示す第４６６番目〜第４６８番目及び第６４９番目〜第６５１番目の塩基に対応する塩基が好ましい。
また、上記（１ｂ）のＤＮＡは、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち、配列番号１に示される塩基配列における第１３３番目〜第１３５番目及び第１，０４８番目〜第１，０５０番目の塩基の位置に対応する塩基が好ましく挙げられる。
さらに、上記（１ｂ）のＤＮＡは、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち、配列番号１に示される塩基配列における第３７０番目〜第３７２番目、第５２９番目〜第５３１番目、第６０１番目〜第６０３番目、第１，０７５番目〜第１，０７７番目及び第１，１５３番目〜第１，１５５番目の塩基の位置に対応する塩基が好ましく挙げられる。
上記（１ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、上記（１ａ）のＤＮＡと比較して、塩基配列については完全に同一ではないが、翻訳された後のアミノ酸配列については完全に同一となるような塩基配列からなるＤＮＡ（すなわち上記（１ａ）のＤＮＡにサイレント変異が施されたＤＮＡ）が、特に好ましい。
また、本発明の遺伝子としては、以下の（２ａ）又は（２ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子も好ましく挙げられる。以下の（２ａ）及び（２ｂ）のＤＮＡは、いずれも本発明のタンパク質の構造遺伝子であることが好ましいが、これらＤＮＡを含む遺伝子としては、これらＤＮＡのみからなるものであってもよいし、これらＤＮＡを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。
（２ａ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目〜第６０６番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６１３番目〜第６１５番目の塩基「ｇｃｃ」がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目〜第６０６番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換され第６１３番目〜第６１５番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（２ｂ）上記（２ａ）の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号５に示される塩基配列は、野生型α−ＮＡＧＡをコードする１，２３６個の塩基配列において、シグナルペプチド部分をコードする第１番目〜第５１番目の塩基からなる配列が野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチド部分をコードする塩基配列に変換された塩基配列であり、いわゆる融合タンパク質をコードする塩基配列である。ここで、野生型α−ＧＡＬのシグナルペプチド部分をコードする塩基配列は、前述した通り、配列番号９に示される野生型α−ＧＡＬをコードする塩基配列のうち、第１番目〜第９３番目の塩基からなる配列である。
上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡのうち、上記（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡが特に好ましい。
また、上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸又はアスパラギン酸のコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが好ましく挙げられる。同様に、上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡも好ましく挙げられる。ここで、上記の各アミノ酸のコドンを示す塩基については、前記（１ａ）のＤＮＡに関する説明が同様に適用できる。
さらに、上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸のコドンを示す塩基であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシンのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが、特に好ましく挙げられる。当該ＤＮＡとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列のうち、第６０４番目〜第６０６番目の塩基がセリンのコドンを示す塩基からグルタミン酸のコドンを示す塩基に置換され（「ａｇｃ」→「ｇａｇ」）、かつ、第６１３番目〜第６１５番目の塩基がアラニンのコドンを示す塩基からロイシンのコドンを示す塩基に置換された（「ｇｃｃ」→「ｃｔｃ」）塩基配列（配列番号７）からなるＤＮＡが好ましく挙げられる。この例示においては、置換後の第６０４番目〜第６０６番目の塩基は、グルタミン酸のコドンを示す塩基であれば上記「ｇａｇ」以外の塩基であってもよいし、同様に、置換後の第６１３番目〜第６１５番目の塩基は、ロイシンのコドンを示す塩基であれば上記「ｃｔｃ」以外の塩基であってもよく、限定はされない。
以上のような変異置換型のＤＮＡの調製法などについては、前記（１ａ）のＤＮＡに関する説明が同様に適用できる。
上記（２ｂ）のＤＮＡは、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ（すなわち上記（２ａ）のＤＮＡ）若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ハイブリダイゼーション法の種類、手順及び条件、並びに各ライブラリーについては、前記（１ｂ）のＤＮＡに関する説明が同様に適用できる。
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記（２ａ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも４０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上である。
また、上記（２ｂ）のＤＮＡは、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一である。
ここでいう「置換部位」とは、上記（２ａ）のＤＮＡに含まれる上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列においてなされた塩基置換の部位であり、詳しくは、当該塩基置換により生じた変更後のコドンを示す塩基（トリプレット）の部位を意味する。具体的には、「置換部位」とは、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列を構成する１，２７５個の塩基のうち、第６０４番目〜第６０６番目の塩基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）並びに第６１３番目〜第６１５番目の塩基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）を意味する。
また「前記置換部位の塩基に対応する塩基」の「対応する塩基」とは、上記（２ｂ）のＤＮＡが上記（２ａ）のＤＮＡに対する相補鎖とハイブリダイズした場合に、このハイブリッドにおいて、前記置換部位の塩基に対する相補塩基（トリプレット）と、位置的に対向する関係にある塩基（トリプレット）を意味する。例えば、上記（２ｂ）のＤＮＡの塩基配列が、上記（２ａ）のＤＮＡと比較して欠失及び付加の変異が無い場合（つまり両ＤＮＡの長さ（塩基数）が同じ）であれば、上記（２ｂ）のＤＮＡの塩基配列における第６０４番目〜第６０６番目の塩基及び／又は第６１３番目〜第６１５番目の塩基が、上記「対応する塩基」となる。
なお、上記（２ｂ）のＤＮＡは、α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが重要である。そのため、例えば、α−ＧＡＬの基質中のα−ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基は、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち第１２４番目〜第１３５番目（４コドン）、第２７１番目〜第２８５番目（５コドン）、第３９１番目〜第４２３番目（１１コドン）、第４９０番目〜第５１６番目（９コドン）、第６１６番目〜第６１８番目（１コドン）、第６６７番目〜第７０２番目（１２コドン）及び第７６６番目〜第８０４番目（１３コドン）の塩基が好ましく挙げられ、中でも特に、触媒部位のアミノ酸残基のコドンを示す第５０８番目〜第５１０番目及び第６９１番目〜第６９３番目の塩基が好ましい。
また、上記（２ｂ）のＤＮＡは、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち第１７５番目〜第１７７番目及び第１，０９０番目〜第１，０９２番目の塩基が好ましく挙げられる。
さらに、上記（２ｂ）のＤＮＡは、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち第４１２番目〜第４１４番目、第５７１番目〜第５７３番目、第６４３番目〜第６４５番目、第１，１１７番目〜第１，１１９番目及び第１，１９５番目〜第１，１９７番目の塩基が好ましく挙げられる。
上記（２ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、上記（２ａ）のＤＮＡと比較して、塩基配列については完全に同一ではないが、翻訳された後のアミノ酸配列については完全に同一となるような塩基配列からなるＤＮＡ（すなわち上記（２ａ）のＤＮＡにサイレント変異が施されたＤＮＡ）が、特に好ましい。
以上に述べた本発明のタンパク質をコードする遺伝子としては、翻訳後の個々のアミノ酸に対応するコドンは、特に限定はされないため、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すＤＮＡを含むものであってもよいし、また、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すＤＮＡを含むものであってもよい。
４．組換えベクター及び形質転換体
本発明のタンパク質を発現させる場合、通常は、まず上述の本発明の遺伝子を発現ベクターに組込んだ組換えベクターの構築が行われる。この際、発現ベクターに組込む遺伝子には、必要に応じて、予め、上流に転写プロモーター、ＳＤ配列（宿主が原核細胞の場合）及びＫｏｚａｋ配列（宿主が真核細胞の場合）を連結しておいてもよいし、下流にターミネーターを連結しておいてもよく、その他、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を連結しておくこともできる。なお、上記転写プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要素は、初めから当該遺伝子に含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、各要素の使用態様は特に限定されない。
発現ベクターに当該遺伝子を組込む方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法など、公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法が採用できる。また、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、レトロウイルスベクター、人工染色体ＤＮＡなど、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保持し得るものであれば、限定はされず、使用する宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
次いで、構築した上記組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。なお、本発明で言う「形質転換体」とは宿主に外来遺伝子が導入されたものを意味し、例えば、宿主にプラスミドＤＮＡ等を導入すること（形質転換）で外来遺伝子が導入されたもの、並びに、宿主に各種ウイルス及びファージを感染させること（形質導入）で外来遺伝子が導入されたものが含まれる。
宿主としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明のタンパク質を発現し得るものであれば、限定はされず、適宜選択することができるが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母等の公知の宿主が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、例えば、ヒト繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。また、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
細菌を宿主とする場合、例えば、大腸菌、枯草菌等が用いられる。
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が用いられる。
植物細胞を宿主とする場合は、例えば、タバコＢＹ−２細胞等が用いられる。
形質転換体を得る方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターとの種類の組み合わせを考慮し、適宜選択することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、並びに、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
得られる形質転換体においては、組換えベクターに含まれる遺伝子のコドン型は、実際に用いた宿主のコドン型と一致していてもよいし、異なっていてもよく、限定はされない。
５．タンパク質の製法
本発明のタンパク質（α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質）は、例えば、野生型α−ＮＡＧＡの活性部位（特に基質結合部位）の構造を、α−ＧＡＬの基質が結合できるように変化させることにより製造することができる。α−ＧＡＬの基質を結合させることができれば、野生型α−ＮＡＧＡの触媒部位による触媒作用により当該基質は加水分解され得る。
このような構造変化は、例えば、前述したように、遺伝子組換え技術により、野生型α−ＮＡＧＡの活性部位（基質結合部位）を構成するアミノ酸配列中、（ｉ）第１８８番目のセリンをグルタミン酸又はアスパラギン酸等の他のアミノ酸に置換し、（ｉｉ）第１９１番目のアラニンをロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン又はメチオニン等の他のアミノ酸に置換し、あるいは（ｉｉｉ）第１８８番目のセリン及び第１９１番目のアラニンを共に上記（ｉ），（ｉｉ）のように置換する。このようにして、置換前と置換後のアミノ酸側鎖の立体構造を変化させることで行うことができ、野生型α−ＮＡＧＡの基質特異性を変化させることができる。特に、上記構造変化は、第１８８番目のセリンをグルタミン酸に置換し且つ第１９１番目のアラニンをロイシンに置換して行うことが好ましく、これによりα−ＮＡＧＡにα−ＧＡＬの基質特異性を付与することができる。なお、以上の構造変化において、顕著な立体構造変化をもたらすアミノ酸置換は、第１９１番目のアラニンをロイシン等に置換することである。詳しくは、第１９１番目のアミノ酸の側鎖が、アラニンの側鎖である「−ＣＨ３」から、ロイシンの側鎖である「−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ３」等のように占有空間の大きな側鎖に変わることで、α−ＮＡＧＡの基質中のＮ−アセチル基が活性部位に入り込む空間が制限され、当該基質との結合性が低減し、その分α−ＧＡＬの基質との結合性が高まることとなる。
ここで、上述した本発明のタンパク質の製造方法は、構造変化前の野生型α−ＮＡＧＡとして、野生型α−ＧＡＬ由来のシグナルペプチドを含む野生型α−ＮＡＧＡを用いて行ってもよいし、あるいは、構造変化により変異型α−ＮＡＧＡを得た後、この変異型α−ＮＡＧＡに野生型α−ＧＡＬ由来のシグナルペプチドを付加する（結合させる）工程、若しくは、変異型α−ＮＡＧＡが野生型α−ＮＡＧＡのシグナルペプチドを含むものである場合はこのシグナルペプチドを野生型α−ＧＡＬ由来のシグナルペプチドに変換する工程を行ってもよく、限定はされない。
そのため、本発明のタンパク質の製造方法としては、例えば、野生型ヒトα−ガラクトシダーゼ由来のシグナルペプチドを含む野生型ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの活性部位の構造を、α−ガラクトシダーゼの基質が結合できるように変化させることを特徴とする、α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質の製造方法が好ましく挙げられる。
また、本発明のタンパク質の製造方法としては、野生型α−ＮＡＧＡの活性部位の構造をα−ＧＡＬの基質が結合できるように変化させたタンパク質に野生型α−ＧＡＬ由来のシグナルペプチドを付加する（結合させる）、又は、野生型α−ＮＡＧＡの活性部位の構造をα−ＧＡＬの基質が結合できるように変化させたタンパク質のシグナルペプチド部分を野生型α−ＧＡＬ由来のシグナルペプチドに変換することを特徴とする、α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質の製造方法も好ましく挙げられる。
なお、上述したシグナルペプチド部分の変換は、野生型α−ＮＡＧＡ及び野生型α−ＧＡＬについての公知の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を用いて、遺伝子組換え技術の常法により行うことができる。
本発明のタンパク質の製造は、具体的には、前述した形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からα−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含む方法により実施することができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的のタンパク質は、上記培養物中に蓄積される。
上記培養に用いる培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、公知の各種天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。
培養中は、形質転換体に含まれる組換えベクターの脱落及び目的タンパク質をコードする遺伝子の脱落を防ぐために、選択圧をかけた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には、相当する薬剤を培地に添加することができ、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合には、相当する栄養因子を培地から除くことができる。例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むベクターで形質導入したヒト線維芽細胞を培養する場合、培養中、必要に応じてＧ４１８（Ｇ４１８硫酸塩）を添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体等を培養する場合は、必要に応じて、好適なインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ等）を培地に添加してもよい。
形質転換体の培養条件は、目的タンパク質の生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定はされず、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。
培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより目的タンパク質を採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したタンパク質溶液とすることができる。
また、目的のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合は、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
一方、目的のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により、培養物中から目的タンパク質を採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
なお、前述のように、目的タンパク質が菌体又は細胞を用いて（菌体内又は細胞内に、あるいは菌体外又は細胞外に）生産される場合は、通常、シグナルペプチド部分が、菌体内又は細胞内の小胞体から細胞質に移動する際や、菌体外又は細胞外への分泌の際に除去され、最終的に、シグナルペプチド部分を有しない成熟タンパク質の状態で回収されることになる。しかしながら、本発明においては、この態様には限定はされず、例えば、上述した小胞体から細胞質への移動や菌体外又は細胞外への分泌の際に必要なシグナルペプチド部分を２つ以上重複して（連続して）有するタンパク質を一旦発現させ、当該移動及び分泌後においてもシグナルペプチド部分を少なくとも１つは有する状態のものを回収するようにしてもよい。この場合、得られた目的タンパク質を医薬組成物等の有効成分として利用する場合は、例えば、シグナルペプチド部分を酵素等を用いて切断又は分解し、成熟タンパク質の状態にしてから利用すればよい。
形質転換体等を培養して得られたタンパク質の生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）等により確認することができる。
また、目的タンパク質の製造は、上述したような形質転換体を用いたタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を用いて行うこともできる。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内で目的タンパク質を合成する系である。また、使用し得る無細胞タンパク質合成系としては、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
この場合、使用する細胞抽出液の由来は、前述の宿主細胞であることが好ましい。細胞抽出液としては、例えば真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、より具体的には、ＣＨＯ細胞、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、ＨｅＬａ細胞、小麦胚芽、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は、濃縮又は希釈して用いてもよいし、そのままでもよく、限定はされない。
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。
このような無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭＳｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって産生された目的のタンパク質は、前述したようにクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して、精製することができる。
６．ファブリー病治療用医薬組成物
（ｉ）補充用酵素薬等としての医薬組成物
本発明のタンパク質は、前述したように、ファブリー病の治療に関して種々の優れた効果を発揮し得るものであり、ファブリー病治療用医薬組成物（ファブリー病治療剤）の有効成分として好適に用いることができる。すなわち、本発明は、前述した本発明のタンパク質を含有するファブリー病治療用医薬組成物を提供するものである。当該医薬組成物としては、具体的には、酵素補充療法に用い得る補充用酵素薬の形態であることが好ましい。
当該医薬組成物において有効成分となる、本発明のタンパク質は、必要に応じて各種塩や水和物等の状態で用いられてもよいし、また、治療剤としての保存安定性（特に酵素活性の維持）を考慮した適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよく、特に限定はされない。
当該医薬組成物は、本発明のタンパク質等以外にも他の成分を含むことができる。他の成分としては、当該医薬組成物の用法（使用形態）に応じて必要とされる、製薬上許容され得る各種成分（薬学的に許容し得る各種担体等）が挙げられる。他の成分は、本発明のタンパク質等により発揮される効果が損なわれない範囲で適宜含有することができる。
当該医薬組成物を補充用酵素薬として用いる場合は、本発明のタンパク質の配合割合や、他の成分の種類及び配合割合は、公知の補充用酵素薬（特に、ファブリー病治療用の補充用酵素薬）の調製法に準じて適宜設定することができる。
当該医薬組成物の投与については、その用法は限定はされないが、補充用酵素薬である場合は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用される。非経口用法等の各種用法に用い得る製剤は、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。
当該医薬組成物の形態は、限定はされないが、補充用酵素薬である場合は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供され得る。
当該医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類、病状のほか、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜、広範囲に設定することができる。特に、当該医薬組成物が補充用酵素薬である場合は、その投与回数は、２〜４週間に１回程度が好ましく、またその投与量（／１回）は、例えば、有効成分である本発明のタンパク質等（組換え酵素）を、患者の体重に対して０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度投与できる量であることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ程度、さらに好ましくは０．２〜１ｍｇ／ｋｇ程度である。
本発明においては、有効成分となる本発明のタンパク質（組換え酵素）は、血中安定性に優れ、障害臓器の細胞への取り込み効率も高いため、従来に比べて少量の使用であっても従来と同様又はそれ以上の酵素補充効果を得ることができ、またアレルギー性副作用も極めて少ないので、患者への体力的、精神的及び経済的な負担を大いに低減することができる。
（ｉｉ）遺伝子治療剤としての医薬組成物
本発明の遺伝子は、前述したように、ファブリー病の治療に関して種々の優れた効果を発揮し得る本発明のタンパク質をコードするものであり、ファブリー病治療用医薬組成物（ファブリー病治療薬（遺伝子治療剤））の有効成分として用いることができる。すなわち、本発明は、前述した本発明の遺伝子を含有するファブリー病治療用医薬組成物を提供するものである。
当該医薬組成物が遺伝子治療剤に用いられる場合は、注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等が挙げられる。これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。なお、市販の遺伝子導入キット（例えば、製品名：アデノエクスプレス、クローンテック社製）を用いることもできる。
また、当該医薬組成物を遺伝子治療剤に用いる場合、当該組成物をリポソーム等のリン脂質小胞体に導入し、この小胞体を投与することも可能である。本発明の遺伝子を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内又は動脈内等に投与する。ファブリー病の障害臓器に局所投与することもできる。例えば、成人に当該医薬組成物を投与する場合は、患者の体重に対し、一日あたり０．１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ程度であることが好ましく、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度である。
７．ファブリー病の治療方法
本発明は、上述した本発明の医薬組成物をファブリー病患者に投与することを特徴とする、ファブリー病の治療方法を含むものである。また本発明は、ファブリー病を治療するための本発明の医薬組成物の使用、及び、ファブリー病の治療のための薬剤を製造するための本発明の医薬組成物又は本発明のタンパク質の使用も含むものである。
本発明の治療方法に使用する医薬組成物は、本発明のタンパク質を含む医薬組成物（前記「６．（ｉ）」）、又は本発明の遺伝子を含む医薬組成物（前記「６．（ｉｉ）」）、あるいはこれら両医薬組成物の併用であってもよく、限定はされず、患者の病状や副作用の有無、あるいは投与効果などを考慮し、適宜選択することができる。ここで、ファブリー病患者に投与する各医薬組成物は、前述した補充用酵素薬や遺伝子治療剤としての使用態様で投与することが好ましい。
特に、上記併用の場合は、それぞれの医薬組成物の投与量の割合、投与回数及び投与期間などを、個々の患者に合わせて適宜設定することができる。なお、各医薬組成物等の好ましい投与方法及び投与量等については、前述の通りである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ＮＡＧＡ）に導入する変異部位の選択＞
ヒトα−ＮＡＧＡの基質特異性をヒトα−ＧＡＬ様に変換した新規酵素を設計するため、タンパク質立体構造モデルを用いた比較検討により、ヒトα−ＮＡＧＡへの変異の導入部位（アミノ酸位置）を決定した。以下にその手順及び結果を具体的に示す。
１．使用したデータ
ヒトα−ＮＡＧＡ及びヒトα−ＧＡＬのアミノ酸配列データは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに、それぞれ下記の通り登録されているものを使用した（表１参照）。また、ニワトリα−ＮＡＧＡ及びヒトα−ＧＡＬタンパク質立体構造データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に、それぞれ下記の通り登録されているものを使用した（表２参照）。
（１）アミノ酸配列データ
使用データベース：Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／）
【表１】
2008143354.tif 000005
（２）タンパク質立体構造データ
使用データベース：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）
【表２】
2008143354.tif 000006
２．ヒトα−ＮＡＧＡの立体構造モデルの構築
ヒトα−ＮＡＧＡの立体構造モデルの構築は、ニワトリα−ＮＡＧＡの立体構造に基づいて、既存の手法であるホモロジーモデリング法（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１９８７，１，３７７−８４；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１９８７，１，３８５−９２参照）を用いて行った。ホモロジーモデリングで使用するテンプレートの立体構造として、ＰＤＢに登録されているニワトリ由来α−ＮＡＧＡ（基質複合体）の立体構造を使用した。ヒトα−ＮＡＧＡとニワトリα−ＮＡＧＡのアミノ酸一致度（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は７５％であり、ホモロジーモデリング法による立体構造モデルの構築の条件（ｉｄｅｎｔｉｔｙ≧３０％）を満たす。ホモロジーモデリング法による立体構造モデルの構築は、既存のソフトウエアであるＭＯＤＥＬＬＥＲ（ＭＯＤＥＬＬＥＲ  ＣＢＳＵ  Ｗｅｂ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｓｕａｐｐｓ．ｔｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｍｏｄｅｌｌｅｒ．ａｓｐｘ）にアクセスすることにより利用可能）を使用して行った。さらに、ニワトリα−ＮＡＧＡに結合している基質の位置に準じて、当該基質を、構築したヒトα−ＮＡＧＡの立体構造モデルにはめ込むことにより、ヒトα−ＮＡＧＡの基質複合体モデルを構築した。
３．ヒトα−ＧＡＬとヒトα−ＮＡＧＡの基質特異性に寄与する立体構造の比較
ヒトα−ＮＡＧＡとヒトα−ＧＡＬの立体構造は類似しており、いずれも、触媒ドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）は（βα）８バレル構造をとる。活性部位（触媒部位及び基質結合部位）に存在する触媒作用に必要なアミノ酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）は、（βα）８バレル構造の各ストランドのＣ末端側に局在している。図１、図２Ａ及び図２Ｂに、ヒトα−ＮＡＧＡとヒトα−ＧＡＬの立体構造をリボンモデル表示で示し、各構造における触媒部位及び基質結合部位のアミノ酸残基をスティック表示で示した。これら触媒部位及び基質結合部位の残基と基質との立体構造上の位置関係を比較するため、Ｋａｂｓｃｈの重ね合わせ法（Ｋａｂｓｃｈ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．；１９７６：Ａ３２，８２７−８２８．；Ｋａｂｓｃｈ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．；１９７８：Ａ３４，９２２−９２３．参照）により、α−ＮＡＧＡとα−ＧＡＬの立体構造の重ね合わせを行った。その後、ヒトα−ＮＡＧＡモデルにおいて、基質に近接するアミノ酸残基を抽出することにより、基質の結合に関与するアミノ酸残基を選定した。その結果を下記表３に示す。表３の右欄にはヒトα−ＮＡＧＡから選択された１４アミノ酸残基を示し、左欄には当該１４アミノ酸残基に位置的に相当するヒトα−ＧＡＬにおけるアミノ酸を示す。
【表３】
2008143354.tif 000007
これらのアミノ酸残基をヒトα−ＮＡＧＡとヒトα−ＧＡＬの立体構造を重ね合わせて比較し、一致する残基と異なる残基を検出にすることにより、ヒトα−ＧＡＬとヒトα−ＮＡＧＡのアミノ酸配列における共通点と相違点を明らかにした。
４．ヒトα−ＧＡＬとヒトα−ＮＡＧＡの共通点
その結果、抽出された１４残基中、ヒトα−ＮＡＧＡの触媒部位であるＡｓｐ１５６及びＡｓｐ２１７を含む１２残基が、α−ＮＡＧＡとα−ＧＭＬとで一致していることがわかった。重ね合わせた立体構造でもこれらのアミノ酸残基中の原子はよく重なり合い、立体構造上の位置も酷似していることが確認された。α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬに共通するアミノ酸残基の立体構造上での位置を図２Ａに示す。また、各アミノ酸残基と基質との相互作用を図２Ｃに示す。これらの残基はいずれも、水素結合又は疎水性結合により基質と関与していると推測される。なお、図２Ｃでは、下線を付していないアミノ酸がα−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬに共通するアミノ酸であり、下線を付しているアミノ酸がα−ＮＡＧＡとα−ＧＡＬとの間で異なるアミノ酸である。
５．ヒトα−ＧＡＬとヒトα−ＮＡＧＡの相違点
ヒトα−ＧＡＬとヒトα−ＮＡＧＡとの間で異なる残基は２残基あり（図２Ｃ参照）、α−ＮＡＧＡでのＳｅｒ１８８及びＡｌａ１９１に対応するアミノ酸残基が、α−ＧＡＬではそれぞれＧｌｕ２０３及びＬｅｕ２０６であった。α−ＮＡＧＡとα−ＧＡＬとで異なるアミノ酸残基の立体構造上での位置を図２Ｂに示した。
図２Ｃに示すように、α−ＧＡＬ及びα−ＮＡＧＡに対する各基質中の糖（６員環）の２位の炭素原子には、α−ＧＡＬでは「−ＯＨ基（ヒドロキシル基）」が、α−ＮＡＧＡでは「−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｏ基（Ｎ−アセチル基）」が、それぞれ存在する。
α−ＮＡＧＡでは、Ｓｅｒ１８８の側鎖のヒドロキシル基が、基質中のＮ−アセチル基の酸素原子と水素結合していることが推測され、Ａｌａ１９１の側鎖のメチル基が、基質中のＮ−アセチル基のメチル基と疎水性結合していることが推測された。これらの推測から、α−ＮＡＧＡのＳｅｒ１８８及びＡｌａ１９１は、基質中のＮ−アセチル基を認識するために重要な残基であると考えられた。
一方、ヒトα−ＧＡＬでは、α−ＮＡＧＡとの間で異なる残基であるＧｌｕ２０３及びＬｅｕ２０６が、α−ＧＡＬの基質の認識に重要であると報告されている（Ｇａｒｍａｎ  ＳＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４，１９；３３７（２）：３１９−３５．）。そして、α−ＧＡＬのＧｌｕ２０３の側鎖のカルボキシル基は、基質中の前記ヒドロキシル基と水素結合を形成することがＸ線結晶構造解析から明らかになっている。また、α−ＧＡＬのＬｅｕ２０６は、かさ高い側鎖を有する残基であり、α−ＧＡＬの基質結合部位の空間を一部占有する。一方、α−ＧＡＬの基質中の前記ヒドロキシル基（２位）は、かさの小さい官能基であり、例えばα−ＮＡＧＡの基質中のＮ−アセチル基と比較すると前記ヒドロキシル基が小さいことは明らかである。従って、α−ＧＡＬと基質との結合においては、α−ＧＡＬの基質結合部位の空間の大きさは、基質中の前記ヒドロキシル基の大きさにちょうど適していると考えられる。よって、α−ＧＡＬにおいては、Ｇｌｕ２０３及びＬｅｕ２０６の２残基が基質特異性の高さに寄与していると考えられた。
６．立体構造モデルによる基質特異性の検証
さらに、α−ＮＡＧＡの基質に対する相互作用、及びα−ＧＡＬの基質に対する相互作用を検証するため、相互の基質を交換したモデル、すなわち（ｉ）α−ＧＭＬの基質とα−ＮＡＧＡとの複合体モデル、及び（ｉｉ）α−ＮＡＧＡの基質とα−ＧＡＬとの複合体モデルを構築し、α−ＮＡＧＡとα−ＧＡＬとの間で異なる２残基の基質に対する関与について調べた。
その結果、α−ＮＡＧＡモデル構造にα−ＧＡＬの基質をはめ込んだ複合体モデルでは、α−ＮＡＧＡのＳｅｒ１８８の側鎖はα−ＧＡＬの基質の２位のヒドロキシル基とは相互作用せず、Ａｌａ１９１とα−ＧＡＬの基質との間には隙間が生じ、ヒドロキシル基との相互作用は見られなかった。一方、α−ＧＡＬの構造にα−ＮＡＧＡの基質をはめ込んだ複合体モデルでは、α−ＮＡＧＡの基質の２位のＮ−アセチル基はα−ＧＡＬのＧｌｕ２０３及びＬｅｕ２０６と衝突することが確認され、これらの２残基の存在により、基質の結合が阻害されることが予測された。
これらの予測結果は、これまでの実験結果を支持するものであり、α−ＮＡＧＡのＳｅｒ１８８及びＡｌａ１９１、並びにα−ＧＡＬのＧｌｕ２０３及びＬｅｕ２０６が、α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬのそれぞれの基質特異性に重要であることが裏付けられた。
７．ヒトα−ＮＡＧＡの基質特異性をヒトα−ＧＡＬ様に変換するためのアミノ酸残基置換
以上のように、ヒトα−ＧＡＬとヒトα−ＮＡＧＡとでは、各基質中の糖（６員環）の２位の炭素原子に存在する官能基を認識する２残基以外は、アミノ酸配列は、触媒部位を含めて全て共通であり、基質特異性の高さに寄与するこれら２残基の置換により、触媒活性は置換前のものを維持しつつ、基質特異性のみをα−ＧＡＬ及びα−ＮＡＧＡの相互間で変更できる可能性が示された。ヒトα−ＮＡＧＡの基質特異性を変更し、α−ＮＡＧＡにα−ＧＡＬ活性を発現させるためには、これら２ヶ所のアミノ酸置換が重要である。ヒトα−ＮＡＧＡのＳｅｒ１８８をＧｌｕに置換することにより、α−ＮＡＧＡの基質のＮ−アセチル基との水素結合による認識をなくし、α−ＧＡＬの基質のヒドロキシル基への水素結合による相互作用を導入することができる。さらに、ヒトα−ＮＡＧＡのＡｌａ１９１をＬｅｕに置換することにより、α−ＮＡＧＡの基質の結合の際にＮ−アセチル基が入る空間を、Ｌｅｕのかさ高い側鎖により占有させ、この立体障害により当該基質の結合を阻害する。これらの効果により、α−ＮＡＧＡにおいて、本来のα−ＮＡＧＡの基質への認識をなくし、α−ＧＡＬの基質への高い特異性を持たせることが可能であると予測された。
８．ヒトα−ＮＡＧＡアミノ酸置換体モデルの評価
α−ＮＡＧＡに対し、Ｓｅｒ１８８をＧｌｕに置換し、Ａｌａ１９１をＬｅｕに置換した場合、周辺の立体構造に与える影響を確認するため、α−ＮＡＧＡ変異体（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））モデルを構築し、野生型α−ＮＡＧＡの立体構造と比較した。その結果、上記置換は周辺アミノ酸残基からなる立体構造に影響を及ぼさないことを確認した。このため、ヒトα−ＮＡＧＡへこれらの変異を導入したα−ＮＡＧＡ変異体は、立体構造上、問題なく存在することができると推測された。
また、α−ＮＡＧＡ変異体の構造にα−ＧＡＬの基質をはめ込んだ複合体モデルを構築した結果、α−ＮＡＧＡ変異体のＧｌｕ１８８の側鎖は、当該基質の２位のヒドロキシル基と水素結合をし得る距離に存在することが確認された（図５（ｂ）参照）。さらに、変異体α−ＮＡＧＡの構造にα−ＮＡＧＡの基質をはめ込んだ複合体モデルでは、当該基質の２位のＮ−アセチル基がＬｅｕ１９１の側鎖と立体障害を起こし、基質が結合できない構造になっていると推測された。
以上により、変異体α−ＮＡＧＡは、本来のα−ＮＡＧＡの基質への特異性を失い、α−ＧＡＬの基質への高い特異性を獲得すること（すなわち、実質的にα−ＮＡＧＡ活性を失い、α−ＧＡＬ活性を獲得すること）が期待される結果となった。
構築したα−ＮＡＧＡ変異体（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））の構造を図６に示す。
９．ヒトα−ＮＡＧＡアミノ酸置換のその他の候補
以上に述べた基質特異性の改変は、α−ＮＡＧＡの基質への立体障害による結合阻害と、α−ＧＡＬの基質との水素結合の形成という、２つの作用によりもたらされるが、上述したアミノ酸置換について、他のアミノ酸への置換可能性の有無を検討した。
まず上記結合阻害作用のために、第一候補としてα−ＧＡＬと同じＬｅｕへの置換を行ったが、同様の作用をもたらす置換としては、疎水性アミノ酸残基であるＶａｌ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ又はＭｅｔへの置換が考えられた。
また、上記水素結合の形成作用のために、第一候補としてα−ＧＡＬと同じＧｌｕへの置換を行ったが、同様の作用をもたらす置換としては、Ｇｌｕと同じくカルボキシル基を持つＡｓｐへの置換が考えられた。
１０．野生型ヒトα−ＮＡＧＡのアミノ酸配列と改変型α−ＮＡＧＡのアミノ酸配列
野生型ヒトα−ＮＡＧＡのアミノ酸配列を「配列番号２」に示し、α−ＮＡＧＡ変異体（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））のアミノ酸配列を「配列番号４」に示した。
【実施例２】
【０００７】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の作製＞
以下の手順により、α−ＮＡＧＡ変異体であるα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）にα−ＧＡＬのシグナルペプチドを融合した、「α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体（α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））」を作製した。
１．α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ＮＡＧＡ）レトロウイルスベクターの作製
α−ＮＡＧＡ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ，ａｌｐｈａ，ｍ−ＲＮＡ，Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＢＣ００００９５，ＩＭＡＧＥ：３５０４２２１）はＯｐｅｎ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社より購入した。購入したα−ＮＡＧＡ  ｃＤＮＡをテンプレートとし、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡）を用いて、以下の反応液組成及び反応条件のＰＣＲにより、α−ＮＡＧＡのコーディングシークエンスを増幅した。
ＮＡＧＡ−５’プライマー：
2008143354.tif 000008
ＮＡＧＡ−３’プライマー：
2008143354.tif 000009
＜反応液組成＞
テンプレート（１０ｎｇ／μｌ）：            ２μｌ
１０×バッファー：                          １０μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                      １０μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：                      ４μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：            ２μｌ
ＮＡＧＡ−５’プライマー（１０μＭ）：      ２μｌ
ＮＡＧＡ−３’プライマー（１０μＭ）：      ２μｌ
滅菌水：                                    ６８μｌ    
合計：                                      １００μｌ
＜反応条件＞
９４℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９４℃（１５ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：６８℃（９０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル行い、４℃で冷却した。
得られたα−ＮＡＧＡ  ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製した。
Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ：ＮＥＢ）で末端をリン酸化したα−ＮＡＧＡ  ＤＮＡフラグメントと、制限酵素ＨｐａＩ（Ｂｌａｎｔ  ｅｎｄ）（ＮＥＢ）で切断した後にＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＮＥＢ）を用いて脱リン酸化したレトロウイルスベクターｐＣＸ４Ｎｅｏ（Ｔｓｕｙｏｓｈｉ  Ａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，１３５６７−１３５７２（２００３））とを、ライゲーションした。ライゲーション反応により得られたα−ＮＡＧＡｐＣＸ４Ｎｅｏを、ＤＨ５αコンピテントセル（インビトロジェン）にトランスフォームし、アンピシリン含有ＬＢプレートに撒いた後、アンピシリン耐性コロニーを得た。
得られたそれぞれの耐性コロニーをＬＢ培地で懸濁し、その菌液をテンプレートとし、下記プライマー及びＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（プロメガ社製）を用いて、以下の反応液組成及び反応条件でコロニーＰＣＲを行った。
ＮＡＧＡ−５’プライマー：
2008143354.tif 000010
ｐＣＸ４−３’プライマー：
2008143354.tif 000011
＜反応液組成＞
テンプレート（１コロニー／１０μｌ）：          １μｌ
ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ：                  １０μｌ
ＮＡＧＡ−５’プライマー（１０μＭ）：          ０．５μｌ
ｐＣＸ４−３’プライマー（１０μＭ）：          ０．５μｌ
滅菌水：                                        ８μｌ    
合計：                                          ２０μｌ
＜反応条件＞
９５℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９５℃（３０ｓｅｃ）→アニーリング：５５℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（９０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却した。
得られた増幅産物から、α−ＮＡＧＡ  ＤＮＡを正方向に組込んだクローンを選別した。具体的には、１．４ｋｂの増幅断片が得られた大腸菌テンプレートを、α−ＮＡＧＡ  ＤＮＡを正方向に組込んだクローンとして選別した。選別したα−ＮＡＧＡ  ｐＣＸ４Ｎｅｏの大腸菌クローンを大量培養して、１ｍｇ以上（１ｍｇ／ｍＬ）のα−ＮＡＧＡ  ｐＣＸ４ＮｅｏプラスミドＤＮＡを得た。
２．α−ＮＡＧＡ変異体の作製
α−ＮＡＧＡ変異体であるα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）は、まずα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ）を作製した後、これを基にして作製した。作製方法は、適宜、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン）を使用説明書の記載を参照して行った。
まず、α−ＮＡＧＡ  ｐＣＸ４Ｎｅｏ（１００ｎｇ）をＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｓｅ（４Ｕ）でメチル化した。α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ）の作製は、メチル化したα−ＮＡＧＡ  ｐＣＸ４Ｎｅｏをテンプレートとし、第１８８番目のセリン（Ｓ）をグルタミン酸（Ｅ）とするミスセンス変異（Ｓ１８８Ｅ）が導入されるように設計したＮＡＧＡ  Ｓ１８８Ｅ−ＧＴ−５’プライマー（Ｓ１８８Ｅミスセンス変異を導入した箇所にアンダーライン）及びＮＡＧＡ  Ｓ１８８Ｅ−ＧＴ−３’プライマー、並びにＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼを用いて、以下の反応液組成及び反応条件のＰＣＲによりＤＮＡを増幅した。
ＮＡＧＡ  Ｓ１８８Ｅ−ＧＴ−５’プライマー：
2008143354.tif 000012
ＮＡＧＡ  Ｓ１８８Ｅ−ＧＴ−３’プライマー：
2008143354.tif 000013
＜反応液組成＞
テンプレート（６ｎｇ／μｌ）：                                １μｌ
１０×バッファー：                                            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                                        ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：                                        ２μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：                              １μｌ
ＮＡＧＡ  Ｓ１８８Ｅ−ＧＴ−５’プライマー（１０μＭ）：      １μｌ
ＮＡＧＡ  Ｓ１８８Ｅ−ＧＴ−３’プライマー（１０μＭ）：      １μｌ
滅菌水：                                                      ３４μｌ  
合計：                                                        ５０μｌ
＜反応条件＞
９４℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９４℃（１５ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：６８℃（８ｍｉｎ）」を１サイクルとして計３５サイクル行い、４℃で冷却した。
増幅したＤＮＡフラグメント（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ）ｐＣＸ４Ｎｅｏ）は、メチル化されたＤＮＡを切断するＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼを持つＤＨ５ａ−Ｔ１  コンピテントセル（インビトロジェン）にトランスフォームした。テンプレートとしたα−ＮＡＧＡ  ｐＣＸ４Ｎｅｏはメチル化されたものであるため、ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼにより切断されコロニーを形成できず、Ｓ１８８Ｅ変異を持つプラスミドはメチル化されていないため切断されず形成できる。形成された数個のコロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを抽出及び精製し、Ｓ１８８Ｅ変異が導入されていることを、シークエンサーを用いた公知の塩基配列決定法で確認した。
次に、α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）の作製は、精製したα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ）ｐＣＸ４Ｎｅｏをテンプレートとし、第１９１番目のアラニン（Ａ）をロイシン（Ｌ）とするミスセンス変異（Ａ１９１Ｌ）が導入されるように設計したＮＡＧＡ  Ａ１９１Ｌ−ＧＴ−５’プライマー（Ａ１９１Ｌミスセンス変異を導入した箇所にアンダーライン）及びＮＡＧＡ  Ａ１９１Ｌ−ＧＴ−３’プライマー、並びにＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼを用いて、以下の反応液組成及び反応条件のＰＣＲにより増幅して行った。
ＮＡＧＡ  Ａ１９１Ｌ−ＧＴ−５’プライマー：
2008143354.tif 000014
ＮＡＧＡ  Ａ１９１Ｌ−ＧＴ−３’プライマー：
2008143354.tif 000015
＜反応液組成＞
テンプレート（６ｎｇ／μｌ）：                                １μｌ
１０×バッファー：                                            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                                        ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：                                        ２μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：                              １μｌ
ＮＡＧＡ  Ａ１９１Ｌ−ＧＴ−５’プライマー（１０μＭ）：      １μｌ
ＮＡＧＡ  Ａ１９１Ｌ−ＧＴ−３’プライマー（１０μＭ）：      １μｌ
滅菌水：                                                      ３４μｌ  
合計：                                                        ５０μｌ
＜反応条件＞
９４℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９４℃（１５ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：６８℃（８ｍｉｎ）」を１サイクルとして計３５サイクル行い、４℃で冷却した。
増幅したＤＮＡフラグメント（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）ｐＣＸ４Ｎｅｏ）を、ＤＨ５ａ−Ｔ１  コンピテントセルにトランスフォームした後、プラスミドＤＮＡを抽出及び精製し、Ｓ１８８Ｅ変異に加えてＡ１９１Ｌ変異が導入されていることを、シークエンサーを用いた公知の塩基配列決定法で確認した。
３．α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の作製
α−ＮＡＧＡ遺伝子を動物細胞に遺伝子導入した場合、培養上清中に分泌されるリコンビナントα−ＮＡＧＡ酵素タンパク質は少量で、大部分は細胞内に存在したままであることが判明した。そこで、α−ＮＡＧＡ（野生型）及びα−ＮＡＧＡ変異体（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））を培養上清中に大量に分泌させる目的で、それらのシグナルペプチド部分（α−ＮＡＧＡ由来のシグナルペプチド部分）を、培養上清中に大量に分泌されることがよく知られているα−ＧＡＬ由来のシグナルペプチド部分に変えた、リコンビナントα−ＮＡＧＡ酵素タンパク質を作製した。
α−ＧＡＬ  ｃＤＮＡは、公知の塩基配列情報及びクローニング方法を用いて得た。まず、α−ＧＡＬ  ｃＤＮＡを鋳型にして、α−ＧＡＬのシグナルペプチドをコードする塩基配列をＧＬＡ−５’プライマーとＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−３’プライマーとを用いて、以下の反応液組成及び反応条件のＰＣＲにより増幅した。ここで、ＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−３’プライマーは、α−ＧＡＬのシグナルペプチドをコードする塩基配列の３’末端部分に相同のシークエンスと、α−ＮＡＧＡをコードする塩基配列の５’末端に相同のシークエンスとを有するプライマーである。当該ＰＣＲにより、増幅産物として、α−ＧＡＬのシグナルペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片（以下、ＰＣＲ産物Ａ）を得た。
ＧＬＡ−５’プライマー：
2008143354.tif 000016
ＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−３’プライマー：
2008143354.tif 000017
＜反応液組成＞
テンプレート（６ｎｇ／μｌ）：                        １μｌ
１０×バッファー：                                    ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                                ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：                                ２μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：                      １μｌ
ＧＬＡ−５’プライマー（１０μＭ）：                  １μｌ
ＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−３’プライマー（１０μＭ）：  １μｌ
滅菌水：                                              ３４μｌ  
合計：                                                ５０μｌ（ＰＣＲ産物Ａ）
＜反応条件＞
９４℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９４℃（１５ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：６８℃（１５ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル行い、４℃で冷却した。
次に、α−ＮＡＧＡ及びα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）のｃＤＮＡをそれぞれ鋳型にし、そのうちα−ＮＡＧＡ由来のシグナルペプチド部分をコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるｃＤＮＡ領域を、ＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−５’プライマーとＮＡＧＡ−３’プライマーとを用いて、以下の反応液組成及び反応条件のＰＣＲにより増幅した。ここで、ＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−５’プライマーは、α−ＧＡＬのシグナルペプチドをコードする塩基配列の３’末端部分に相同のシークエンスと、α−ＮＡＧＡの５’末端部分に相同のシークエンスとを有するプライマーである。当該ＰＣＲにより、増幅産物として、α−ＮＡＧＡ及びα−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）のシグナルペプチド部分を除いた部分をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片（以下、ＰＣＲ産物Ｂ）を得た。
ＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−５’プライマー：
2008143354.tif 000018
ＮＡＧＡ−３’プライマー：
2008143354.tif 000019
＜反応液組成＞
テンプレート（６ｎｇ／μｌ）：                        １μｌ
１０×バッファー：                                    ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                                ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：                                ２μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：                      １μｌ
ＳｉｇＧＡＬＮＡＧＡ２−５’プライマー（１０μＭ）：  １μｌ
ＮＡＧＡ−３’プライマー（１０μＭ）：                １μｌ
滅菌水：                                              ３４μｌ  
合計：                                                ５０μｌ（ＰＣＲ産物Ｂ）
＜反応条件＞
９４℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９４℃（１５ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：６８℃（１ｍｉｎ２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル行い、４℃で冷却した。
最後に、上記各ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物Ａ及びＰＣＲ産物Ｂを共に鋳型とし、ＧＬＡ−５’プライマーとＮＡＧＡ−３’プライマーとを用いて、以下の反応液組成及び反応条件のＰＣＲにより増幅した。
＜反応液組成＞
ＰＣＲ産物Ａ（６ｎｇ／μｌ）：              １μｌ
ＰＣＲ産物Ｂ（６ｎｇ／μｌ）：              １μｌ
１０×バッファー：                          ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                      ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：                      ２μｌ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：            １μｌ
ＧＬＡ−５’プライマー（１０μＭ）：        １μｌ
ＮＡＧＡ−３’プライマー（１０μＭ）：      １μｌ
滅菌水：                                    ３４μｌ  
合計：                                      ５０μｌ
＜反応条件＞
９４℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９４℃（１５ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：６８℃（１ｍｉｎ２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル行い、４℃で冷却した。
当該ＰＣＲにより、増幅産物として、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を、それぞれ得た。得られた各ＤＮＡ断片を、ローメルティングアガロースゲルによる電気泳動で分離した後、市販のＤＮＡ断片精製キットを用いて精製した。
次いで、上記精製後に得られた各ＤＮＡ断片の末端をＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ）でリン酸化したものと、制限酵素ＨｐａＩ（Ｂｌａｎｔ  ｅｎｄ）（ＮＥＢ）で切断後にＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＮＥＢ）を用いて脱リン酸化したレトロウイルスベクターｐＣＸ４Ｎｅｏ（Ｔｓｕｙｏｓｈｉ  Ａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，１３５６７−１３５７２（２００３））とを、遺伝子組換え技術の常法によりライゲーションした。ライゲーション反応により得られた、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡｐＣＸ４Ｎｅｏ、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）ｐＣＸ４Ｎｅｏを、それぞれＤＨ５αコンピテントセル（インビトロジェン）にトランスフォームし、アンピシリン含有ＬＢプレートに撒いた後、アンピシリン耐性コロニーを得た。
得られたそれぞれの耐性コロニーをＬＢ培地で懸濁し、その菌液をテンプレートとし、下記プライマー及びＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（プロメガ社製）を用いて、以下の反応液組成及び反応条件でコロニーＰＣＲを行った。
ｐＣＸ４−５’プライマー：
2008143354.tif 000020
ＮＡＧＡ−３’プライマー：
2008143354.tif 000021
＜反応液組成＞
テンプレート（１コロニー／１０μｌ）：      １μｌ
ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ：              １０μｌ
ｐＣＸ４−５’プライマー（１０μＭ）：      ０．５μｌ
ＮＡＧＡ−３’プライマー（１０μＭ）：      ０．５μｌ
滅菌水：                                    ８μｌ      
合計：                                      ２０μｌ
＜反応条件＞
９５℃で２分間加熱後、「熱変性・解離：９５℃（３０ｓｅｃ）→アニーリング：５５℃（３０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（１ｍｉｎ２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却した。
当該ＰＣＲにより得られた増幅産物から、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）のＤＮＡ断片が正方向に組込まれたクローンをそれぞれ選別した。具体的には、１．４ｋｂの増幅断片が得られた大腸菌テンプレートを、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）のＤＮＡ断片が正方向に組込まれたクローンとして選別した。選別したα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ  ｐＣＸ４Ｎｅｏ及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）ｐＣＸ４Ｎｅｏの大腸菌クローンを、それぞれ大量培養して、１ｍｇ以上（１ｍｇ／ｍＬ）のプラスミドＤＮＡを得た。
【実施例３】
【０００８】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体を発現する組換えレトロウイルスの作製＞
レトロウイルスのパッケージング細胞（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ  Ｂａｔｃｈ＃：Ｆ−１４７２７  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  ＨＥＫ２９３）は、ＡＴＣＣより購入した（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｓｕｐｐｌ．３１，１０．２８．１−１０．２８．１７（１９９９））。Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞は、１０％不動化済みＦＢＳと抗生物質を加えたＤＭＥＭ（高グルコース）培養液で、３７℃，５％ＣＯ２濃度条件下で培養した。
組換えレトロウイルスを作製するため、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞に、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ  ｐＣＸ４Ｎｅｏレトロウイルスベクター、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）ｐＣＸ４Ｎｅｏレトロウイルスベクターを、それぞれトランスフェクションした。トランスフェクションは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏ細胞（５×１０５／６０ｍｍ  ｄｉｓｈ）に、１μｇのレトロウイルスベクター、１μｇのｐＣＬＡＭＰ（ＲＫ  Ｎａｖｉａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５７０１−５７０５（１９９６））、及び１８μｌのＤｏｆｅｃｔ−ＧＴ１（トランスフェクション試薬；同仁化学）入りの２ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液（インビトロジェン）を加えて、３７℃で４時間インキュベートし、その後通常の培地に交換して、４８時間培養して行った。培養後、上清を回収し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心して、上清中に含まれる組換えレトロウイルスを分注し、当該ウイルスを−８０℃でストックした。
【実施例４】
【０００９】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体を発現するＣＨＯ−Ｋ１安定発現株の樹立＞
実施例３で作製したα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）を発現する組換えレトロウイルスを、それぞれＣＨＯ−Ｋ１細胞に感染させ、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）の安定発現株を樹立した。具体的には、下記（ｉ）〜（ｖ）のようにして行った。
（ｉ）１×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈにまき、１０％不動化済みＦＢＳと抗生物質を加えたαＭＥＭ培養液で、３７℃で一晩培養した。
（ｉｉ）最終濃度２μｇ／ｍＬになるようにポリブレン（シグマ  Ｈ−９２６６，Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）を培地に加え、３７℃で３０分間培養した。
（ｉｉｉ）培地を除きウイルス液を１ｍＬ入れて３７℃で６０分間吸着させた。
（ｉｖ）ウイルス液を除き、培地を５ｍＬ加えて一晩培養した。
（ｖ）Ｇ４１８（２５０μｇ／ｍＬ）を培地に加えた選択培地で培養して、Ｇ４１８耐性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を樹立した。なお、選択培地の交換は３日に１回の間隔で１４日以上行った。また、樹立した細胞は目的のタンパク質を発現しているか、酵素活性及びウエスタンブロット法（詳細は下記の通り）で確認した。
〔ウエスタンブロット法による目的タンパク質の発現確認〕
レトロウイルスを用いて樹立したα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞が、それぞれ目的のタンパク質を発現しているかどうかを調べる目的で、ウエスタンブロットを行った。なお、当該ウエスタンブロットで用いる抗体として、公知の抗体作製方法により得られた抗α−ＮＡＧＡポリクローナル抗体を準備した。
ウエスタンブロットにおけるサンプルは、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清を、それぞれ使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルのタンパク質濃度を測定した後、５μｇ分のタンパク質を含むサンプルに当容量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，３０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％ＢＰＢ）を加え、５分間煮沸した後、当該サンプルを４〜２０％ゲル（ＰＡＧ  ｍｉｎｉ：第一化学薬品）にアプライし、３０ｍＡの定電流で２時間電気泳動を行った。
電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦメンブラン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にトランスファーするために、ゲルをブロッティングバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３，１９２ｍＭ  グリカン，２０％メタノール）に２０分間浸し、ブロッティングバッファーで平衡化したＰＶＤＦメンブランに上に置き、Ｈｏｅｆｅｒ  ＴＥ  ７０  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｕｎｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）を使用して６０ｍＡの定電流で１時間トランスファーを行った。
トランスファーの終了後、メンブランをブロッキングバッファー（５％スキムミルク  ｉｎ  ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＮａＣｌ））で３０分間ブロッキングした後、ブロッキングバッファーで５００倍希釈した抗ＮＡＧＡポリクローナル抗体（一次抗体）を加え、４℃で一晩インキュベートした。
一次抗体とのインキュベーション後のメンブランは、ＴＢＳにより５分間の洗浄を３回行った後、ブロッキングバッファーで５０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧＨＲＰ標識抗体（二次抗体；アマシャムバイオサイエンス）を加え、室温で１時間インキュベートした。
二次抗体とのインキュベーション後のメンブランは、ＴＢＳにより５分間の洗浄を３回行った後、ＥＣＬ発色試薬（ナカライテスク）を加え、室温で２分間反応させた。その後、暗室内でＨｙｐｅｒｆｉｌｍＴＭ  ＥＣＬと１分間コンタクトして現像した。
以上の結果、樹立したα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、それぞれ、約４５ｋＤの野生型α−ＮＡＧＡ及びα−ＮＡＧＡ変異体（α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））を培養上清中に分泌していることを確認した。
【実施例５】
【００１０】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の酵素活性の遷移＞
α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）が、α−ＧＡＬの基質特異性を獲得したものであることを、以下の手順で確認した。
実施例４で樹立したα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清を、それぞれサンプルにして、α−ＧＡＬ活性及びα−ＮＡＧＡ活性の酵素活性測定を行った。酵素活性は、蛍光基質である４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）誘導体の合成基質を用い、酵素溶液１ｍＬが１時間当たりに遊離させることのできる４−ＭＵ量を蛍光強度として測定した。具体的には、α−ＧＡＬの合成基質としては、４−ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵ−α−ＧＡＬ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を用い、α−ＮＡＧＡの合成基質としては、４−ＭＵ−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニド（４−ＭＵ−α−ＮＡＧＡ；生化学工業）を用いた。なお、α−ＧＡＬ活性の測定には、４−ＭＵ−α−ＧＡＬに対して同時に反応するα−ＮＡＧＡの阻害剤として、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（シグマ，ＭＯ）を、最終濃度１１７ｍＭとなるように予め基質溶液に添加した。
培養上清（１０μＬ）に対して、５ｍＭの４−ＭＵ−α−ＧＡＬを含有するＭｃＩｌｖａｉｎバッファー（クエン酸／リン酸，ｐＨ４．６，４０μＬ）、又は、１ｍＭの４−ＭＵ−α−ＮＡＧＡを含有するＭｃＩｌｖａｉｎバッファー（クエン酸／リン酸，ｐＨ４．７，４０μＬ）を添加し混合した後、３７℃で３０分間反応させた。０．２Ｍグリシンバッファー（ｐＨ１０．７，９５０μＬ）を添加して当該反応を停止させ、遊離した４−ＭＵの量を検出するため、蛍光分光光度計（ＡＲＶＯ  ＭＸ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定した。α−ＧＡＬ及びα−ＮＡＧＡの酵素活性は、酵素溶液の容積および反応時間当たりの遊離させることのできる４−ＭＵ量（ｎｍｏｌ  ４−ＭＵ／ｈ／ｍｌ）で算出した。
酵素活性測定の結果、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させたα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）は、培養上清中に分泌され、高いα−ＧＡＬ活性を示すものであり、α−ＧＡＬの基質特異性を獲得したものであることが分かった。
以上の結果を表４に示す。
【表４】
2008143354.tif 000022
【実施例６】
【００１１】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の血中（血漿中）安定性＞
α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）の血中（血漿中）安定性について、以下の手順で確認した。
まず、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）の酵素溶液は、実施例４と同様にして調製した。また、対照として、野生型α−ＧＡＬの遺伝子をＦ３７７に導入した細胞を用い、上記と同様にして酵素溶液を調製した。それぞれの酵素溶液（５０μＬ）に対して健常者の血漿（５０μＬ）を添加し混合した後、３７℃で反応を開始し、経時的に１０μＬずつサンプリングしてα−ＧＡＬ活性を測定した。酵素活性の測定は、実施例４と同様にして行った。酵素溶液及び血漿を混ぜた時点でサンプリングした試料のα−ＧＡＬ活性を基準（１００％）とし、経時的な酵素活性の低下を百分率で表した。
その結果、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）は、野生型α−ＧＡＬと比べて、血中（血漿中）における経時的なα−ＧＡＬ活性保持能に優れており、高い血中安定性を有するものであった。
【実施例７】
【００１２】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体によるファブリー病患者由来線維芽細胞内に蓄積したセラミドトリヘキソシド（ＣＴＨ）の分解＞
α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清を、それぞれ回収し、酵素サンプルとして使用した。ファブリー病患者由来培養線維芽細胞（Ｆ３３７）に対して、１，０００ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｌの活性を有するα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）、及びα−ＧＡＬを培地中に加え、２日間培養を行った。培養後、以下の方法により、細胞内蓄積しているＣＴＨを蛍光抗体染色により検出した。
まず、酵素添加により培養したファブリー病患者由来の線維芽細胞を培養後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１分間固定し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、室温で３０分間ブロッキングしたのち、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１００倍に希釈した抗−ＣＴＨモノクローナル抗体（１次抗体）を加え、室温で１時間インキュベートした。１次抗体とのインキュベーション後、ＰＢＳにより５分間の洗浄を３回行ったのち１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１０００倍に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ（２次抗体：インビトロジェン）を加え、室温で１時間インキュベートした。２次抗体とのインキュベーション後、ＰＢＳにより５分間の洗浄を３回行ったのち、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ  Ｍｏｕｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）で封入後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡システムＬＳＭ５１０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で観察を行った。
抗体染色の結果、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）、及びα−ＧＡＬを培地中に加えたファブリー病患者由来の培養線維芽細胞では、有意なＣＴＨの減少が観察されたが、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡではＣＴＨの有意な減少は観察されなかった（図７）。
【実施例８】
【００１３】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の精製技術の確立（１）＞
α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）の精製方法を確立するための予備実験を行った。実施例４で得られたＣＨＯ−Ｋ１安定発現株細胞から分泌された、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）を含む培養上清（約６リットル）を回収し、限外ろ過（分画分子量３０ｋＤ：ミリポア  ＹＭ３０）により約１７０ｍｌ（３０倍）に濃縮した。その後、透析により２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）バッファーに置換した。
まず、第１ステップとして、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で平衡化した陰イオン交換ＨｉＬｏａｄ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムに酵素活性５００μｍｏｌ／ｈ（約６ｍｇ）のα−ＮＡＧＡ変異体を吸着させ、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）でカラム洗浄し、さらに、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で洗浄した。その後、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）でα−ＮＡＧＡ変異体を溶出し、酵素活性の高い画分を回収した。ＨｉＬｏａｄ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換カラムの回収率は、４７％程度で、Ｆｏｌｄは７．４倍であった。
第２ステップとして、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラムに、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムの溶出液（酵素活性２２４μｍｏｌ／ｈ：約３ｍｇ）をアプライし、不純物をカラムに吸着させた。２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）をカラムに通し、素通りしてくるα−ＮＡＧＡ変異体の分画を集めた。Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム後の回収率は、４４％で、Ｆｏｌｄは１５．７倍になった。
第３ステップとして、１ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）で平衡化したヘパリンカラム素通り画分（酵素活性２１３μｍｏｌ／ｈ：約３ｍｇ）をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ−２  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムに吸着させた。１ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄後、３７．５ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０））で溶出し、酵素活性の高い画分を集めた。Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  ＣＨＴ−２  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム後の回収率は１８％、Ｆｏｌｄは５５倍に達した。
以上の精製過程を表５に示す。
【表５】
2008143354.tif 000023
【実施例９】
【００１４】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の各種臓器への取込み試験＞
市販のα−ＧＡＬ製剤（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ；Ｇｅｎｚｙｍｅ社）１ｍｇ／ｋｇ又は０．３ｍｇ／ｋｇと同程度のα−ＧＡＬ酵素活性を有するα−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体（粗精製；実施例８で得られたもの）を、ファブリー病モデルマウスに、腹腔内投与（ｉｐ投与）又は静脈内投与（ｉｖ投与）し、肝臓への取込みを調べた。なお、本実施例において、「α−ＮＡＧＡ変異体」とは、「α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」を意味する。
〔方法〕
１．ファブリー病モデルマウス（ファブリー病マウスともいう。）（雄，９〜１３ｇ）及び野生型マウスを用い、以下の実験群を設定した（野生型マウスは１）の実験群のみ）。
１）非投与群（コントロール）（ｎ＝１）
２）α−ＮＡＧＡ変異体（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ  １ｍｇ／ｋｇ相当活性）ｉｐ投与群（ｎ＝３）
３）α−ＮＡＧＡ変異体（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ  ０．３ｍｇ／ｋｇ相当活性）ｉｖ投与群（ｎ＝２）
２．コントロールを除き、投与から６０分後、麻酔下で、ＰＢＳ  ３０ｍｌにて全身還流を行い、肝臓、心臓、腎臓を摘出した。各臓器のα−ＧＡＬ活性は常法に従い行った。
〔結果〕
それぞれの実験群における各臓器でのα−ＧＡＬ活性の比較結果を表６に示す。
【表６】
2008143354.tif 000024
上記結果から分かるように、非投与群（コントロール）の肝臓におけるα−ＧＡＬ活性はほぼ０であった。これに対し、α−ＮＡＧＡ変異体ｉｐ投与群では、肝臓でのα−ＧＡＬ活性が平均で３１（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ）となり、野生型マウスの肝臓におけるα−ＧＡＬ活性を上回る結果となった。また、α−ＮＡＧＡ変異体ｉｖ投与群においても、肝臓でのα−ＧＡＬ活性が平均で３１（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ）という高い値が得られた。
α−ＮＡＧＡ変異体のｉｐ投与群とｉｖ投与群との肝臓への取込み能の比較については、上記の通り、３１となり同じ値となった。しかし、ｉｐ投与群及びｉｖ投与群における投与量は、それぞれ、１．０ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇであったため、ｉｖ投与による投与経路の方が、ｉｐ投与による投与経路よりも有効に肝臓に取込まれることが分かった。
心臓及び腎臓におけるα−ＧＡＬ活性は、肝臓におけるα−ＧＡＬ活性に比べて低い値となり、心臓及び腎臓におけるα−ＮＡＧＡ変異体の取り込み効率が、肝臓における取り込み効率と比べて低いことが分かった。しかしながら、通常、正常値（すなわち野生型マウスの非投与群の値）の２０％程度の活性があれば、生体内では異常をきたさないと考えられている。そのため、上記の心臓及び腎臓におけるα−ＧＡＬ活性であっても、α−ＮＡＧＡ変異体の有用性が十分に示されていると考えられた。
なお、腎臓及び心臓は、ファブリー病発病時における機能不全が特に問題となる臓器の一つであり、治療薬投与の際に、血管内皮細胞と並んで、標的臓器となる組織である。また、従来の酵素補充療法用治療薬では、血管内皮細胞にはある程度の効果は示すものの、腎臓及び心臓での効果が不十分であった。そのため、上記の心臓及び腎臓において（ファブリー病モデルマウスのα−ＮＡＧＡ変異体非投与群と比べて）α−ＧＡＬ活性が向上する結果が得られたことにより、α−ＮＡＧＡ変異体が、ファブリー病治療薬の有効成分として極めて優れた酵素タンパク質であることが示された。
【実施例１０】
【００１５】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の精製技術の確立（２）＞
α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体（α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）。以下、本実施例において「α−ＮＡＧＡ変異体」と称する。）の精製を行った。
実施例４で得られたＣＨＯ−Ｋ１安定発現株細胞から分泌された、α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）を含む培養上清（約２０リットル）を回収し、限外ろ過（分画分子量３０ｋＤ：ミリポア  ＹＭ３０）により約７４０ｍｌ（２７倍）に濃縮した。その後、硫酸アンモニウムを５０％となるように添加し、その沈殿を遠心分離（１７０００ｒｐｍ）により、回収した。これを２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／９００ｍＭ硫酸アンモニウムに溶解し、１，４００ｍｌとした。
次に、この溶液を２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／９００ｍＭ硫酸アンモニウムで平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムに添加し、α−ＮＡＧＡ変異体を吸着させた。これを、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／９００ｍＭ硫酸アンモニウム、及び、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／５００ｍＭ硫酸アンモニウムにて洗浄した後、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／２００ｍＭ硫酸アンモニウムにてα−ＮＡＧＡ変異体を溶出し、酵素活性の高い画分を回収した。ＨｉＬｏａｄ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムまでの回収率は６３％程度で、Ｆｏｌｄ（精製倍率）は１２倍であった。
ＨｉＬｏａｄ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムクロマトグラフィーの活性画分を２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で透析をした後、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムに添加した。α−ＮＡＧＡ変異体は、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）素通り画分に回収された。ＨｉＬｏａｄ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムまでの活性回収率は４０％程度で、Ｆｏｌｄは１８８倍であった。
この活性画分を２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムに添加し、α−ＮＡＧＡ変異体を吸着させた。これを、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、及び、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／１９０ｍＭ  塩化ナトリウムにて洗浄した後、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）／２５０ｍＭ  塩化ナトリウムにてα−ＮＡＧＡ変異体を溶出し、酵素活性の高い画分を回収した。ＨｉＬｏａｄ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（２６／１０）カラムまでの活性回収率は３８％程度で、Ｆｏｌｄは４８９倍に達した。
以上のα−ＮＡＧＡ変異体の精製過程を、下記表７に示す。
【表７】
2008143354.tif 000025
また、各精製段階における試料（タンパク量として１０μｇ）を定法により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離した後、これをＣＢＢ染色した結果を図８に示した。図８では、α−ＮＡＧＡ変異体を示すバンドが２本認められるが（図中の矢印参照）、Ｎ−グリカナーゼで処理後のものは１本のバンドのみとなる（図示せず）。従って、前記２本のバンドに由来のタンパク質は、糖鎖の本数が異なる以外は、いずれも同一のα−ＮＡＧＡ変異体であると言える。
【実施例１１】
【００１６】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体の各種臓器への取込み試験＞
実施例１０により精製して得られたα−ＮＡＧＡ変異体を、ファブリー病モデルマウス（ファブリー病マウスとも言う）に静脈内投与（ｉｖ投与）し、各種臓器への取り込みを調べた。
なお、本実施例において、「α−ＮＡＧＡ変異体」とは、「α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」を意味する。
〔方法〕
１．ファブリー病モデルマウス（雄，２５〜３５ｇ）及び野生型マウスを用い、以下の１）〜３）の実験群を設定した。
１）野生型マウス（ｎ＝３）
２）ファブリー病マウス（ｎ＝３）
３）ファブリー病マウスα−ＮＡＧＡ変異体投与群（ｎ＝３）（投与量：１．９ｍｍｏｌ／ｈｒ／ｋｇマウス体重（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ  １ｍｇ／ｋｇの活性相当量））
２．α−ＮＡＧＡ変異体を投与した３）群については、投与から６０分後、麻酔下で、ＰＢＳ  ３０ｍｌにて全身還流を行い、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、骨格筋を摘出した。各臓器のα−ＧＡＬ活性は常法に従い行った。
〔結果〕
各臓器でのα−ＧＡＬ活性の比較結果を、下記表８に示す。
【表８】
2008143354.tif 000026
上記結果から分かるように、ファブリー病マウスの各組織におけるα−ＧＡＬ活性は１．０ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であった。これに対し、α−ＮＡＧＡ変異体投与群では、脳と骨格筋を除き、４つの臓器で、ファブリー病マウスに比べて、α−ＧＡＬ活性が増加していた。ファブリー病における主な障害臓器である腎臓と心臓では、野生型マウスの腎臓と心臓それぞれにおけるα−ＧＡＬ活性を上回る結果となり、α−ＮＡＧＡ変異体の有用性が示された。
【実施例１２】
【００１７】
＜α−ＧＡＬシグナルペプチド融合α−ＮＡＧＡ変異体複数回投与による各種臓器におけるα−ＧＡＬ活性の獲得及び蓄積物質の分解効果確認実験＞
実施例１０により精製して得られたα−ＮＡＧＡ変異体を、ファブリー病モデルマウス（ファブリー病マウスとも言う）に複数回静脈内投与（ｉｖ投与）した後、２４時間経過後の各種臓器への取り込み及び各種臓器における蓄積物質の分解効果を調べた。
なお、本実施例において、「α−ＮＡＧＡ変異体」とは、「α−ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」を意味する。
〔方法〕
１．ファブリー病モデルマウス（雄，１５〜２０ｇ）及び野生型マウスを用い、以下の１）〜３）の実験群を設定した。なお、下記１），２）は、実施例１１の１），２）と同様である。
１）野生型マウス（ｎ＝３）
２）ファブリー病マウス（ｎ＝３）
３）ファブリー病マウスα−ＮＡＧＡ変異体投与群（ｎ＝４）（１回あたり１．９ｍｍｏｌ／ｈｒ／ｋｇマウス体重の投与量を２４時間毎に４回投与）
２．《α−ＧＡＬ活性の測定》α−ＮＡＧＡ変異体を投与した３）群は、４回目投与から２４時間後に、麻酔下で脱血した後、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、骨格筋を摘出した。各臓器のα−ＧＡＬ活性は常法に従い行った。
３．《基質分解効果の解析：ＴＬＣ解析》各臓器における基質分解効果は、臓器に蓄積するセラミドトリヘキソシド（ＣＴＨ）を測定することで判定した。摘出した肝臓、腎臓、心臓を−８０℃で凍結し、各臓器の総糖脂質の抽出に用いた。凍結保存した臓器（５０ｍｇ〜２５０ｍｇ）を水に対し２５０ｍｇ／ｍｌとなるようにホモジナイズし、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  Ｌ  ＆  Ｆｒｅｄｍａｎ  Ｐの方法（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  Ｌ，Ｆｒｅｄｍａｎ  Ｐ，Ａ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９８０；６１７：９７−１０９．参照）に従い、溶媒組成クロロホルム：メタノール：水＝４：８：３の溶媒で抽出をした。遠心分離をした後、抽出液を回収した。残渣には、溶媒組成クロロホルム：メタノール：水＝５：１０：４の溶媒にて再度抽出を行った後、遠心分離を行い、抽出液を前述の抽出液と合わせた。合わせた抽出液は窒素気流下、乾固した。
ＣＴＨの分析の際には、乾固した試料を溶媒組成クロロホルム：メタノール：水＝４０：２０：３で臓器湿重量１ｍｇ当り２μｌで溶解した。調製した臓器抽出溶液を、ＣＴＨ標準品（ブタ赤血球性ＣＴＨ、和光純薬）と共にシリカゲル６０  ＨＰＴＨＬに添加し、クロロホルム：メタノール：０．２２％塩化カルシウム水溶液＝１１：９：２の展開溶媒にて展開した。ＨＰＴＬＣを乾燥後、オルシノール試薬にて化学発色させた。
４．《基質分解効果の解析：免疫組織化学的解析》各臓器における基質分解効果を、免疫組織化学的に解析した。定法（埜中征哉、臨床のための筋病理［第３版贈補］、日本医事新報社  参照）に従い、摘出した肝臓、腎臓、心臓をクライオスタットにより６μｍの薄層凍結薄切切片を作製した。さらに定法（Ｈ．Ｓａｋｕｒａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｈａｖｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ−ｌｉｋｅ−ｍａｎｎｏｓｅ−ｔｙｐｅ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｏｎ  Ｆａｂｒｙ  ｍｉｃｅ．，Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．，５１，３４１−３５２，２００６．参照）に従い、免疫組織染色を行った。凍結切片を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１５分間固定し、１０％  Ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳを加え、室温で１時間ブロッキングしたのち、１０％  Ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳで２倍に希釈した抗−ＣＴＨモノクローナル抗体（１次抗体）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。１次抗体とのインキュベーション後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）により５分間の洗浄を３回行ったのち１０％  Ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳで１０００倍に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ（２次抗体：インビトロジェン）を加え、室温で１時間インキュベートした。２次抗体とのインキュベーション後、ＰＢＳ−Ｔにより５分間の洗浄を３回行ったのち、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ  Ｍｏｕｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）で封入後、蛍光顕微鏡システムＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で観察を行った。
〔結果〕
１．《残存活性の測定》各臓器でのα−ＧＡＬ活性の比較結果を、下記表９に示す。
【表９】
2008143354.tif 000027
α−ＮＡＧＡ変異体４回投与群は、最終投与後２４時間後、脳では、α−ＧＡＬ活性が検出されなかった。一方、脳を除いた残りの臓器においては、ファブリー病マウスに比較して、多くのα−ＧＡＬ活性が残存していた。ファブリー病における主な障害臓器である腎臓と心臓では、野生型マウスの腎臓と心臓それぞれにおけるα−ＧＡＬ活性を上回る結果となった。このことは、α−ＮＡＧＡ変異体は、投与直後だけでなく、数日間は主な障害臓器である腎臓と心臓に残存していることを示している。通常、正常値の２０％程度の活性があれば、生体内では異常をきたさないと考えられていることも考慮すると、α−ＮＡＧＡ変異体は一定の間隔で、投与をされても、心臓及び腎臓において十分な活性を保てることが示された。
腎臓及び心臓は、ファブリー病発病時における機能不全が特に問題となる臓器の一つであり、治療薬投与の際に、血管内皮細胞と並んで、標的臓器となる組織である。また、従来の酵素補充療法用治療薬では、血管内皮細胞にはある程度の効果は示すものの、腎臓及び心臓での効果が不十分であった。そのため、上記の心臓及び腎臓におけるα−ＧＡＬ活性の結果により、α−ＮＡＧＡ変異体が、ファブリー病治療薬の有効成分として極めて優れた酵素タンパク質であることが示された。
２．《基質分解効果の解析》肝臓、腎臓、心臓におけるα−ＧＡＬの基質であるＣＴＨの分析結果を図９に示した。なお、ＴＬＣシートを乾燥後、抗ＣＴＨ抗体を用いたＴＬＣ免疫染色を常法（Ｋｏｔａｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂｏ−ｓｅｒｉｅｓ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９４；３１０：８９−９６．参照）に従って行い、図中のＣＴＨのマークのバンドがＣＴＨであることを確認した。
α−ＮＡＧＡ変異体４回投与を行ったファブリー病マウスにおける肝臓、腎臓、心臓のＣＴＨは、投与を行っていないファブリー病マウスの各臓器のＣＴＨに比べ、いずれにおいてもＣＴＨが減少した。
３．《基質分解効果の解析：免疫組織化学的解析》各臓器における基質分解効果を、定法により免疫組織化学的解析の結果を図１０（腎臓）、図１１（心臓）及び図１２（肝臓）に示した。
抗体染色の結果、α−ＮＡＧＡ改変体を投与したファブリー病マウスの肝臓、腎臓、心臓では、ファブリー病マウスの臓器に比べ、ＣＴＨの減少が観察され、α−ＮＡＧＡ改変体が臓器内のＣＴＨを分解していることが示された。
これらの結果において、ファブリー病における主な障害臓器である腎臓と心臓のＣＴＨが減少していたことは、α−ＮＡＧＡ改変体は生体内でも十分にα−ＧＡＬの代わりに基質ＣＴＨを分解し得ることを示しており、ファブリー病の治療や予防に有効であることを示すものであった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明によれば、アレルギー性副作用がなく、血中（血漿中）安定性が高く、かつ障害臓器の細胞に取り込まれやすい、α−ＧＡＬ活性を有するタンパク質（α−ＮＡＧＡ変異体）を用いた、ファブリー病治療用医薬組成物を提供することができる。ここで、上記タンパク質がアレルギー性副作用の要因とならないのは、通常、ファブリー病患者であっても、健常者と同様に生体内にα−ＮＡＧＡを有しているため、α−ＮＡＧＡと表面構造が実質的に同一であるα−ＮＡＧＡ変異体に対してはアレルギー反応を起こさないからである。また、上記タンパク質の血中（血漿中）安定性が高いのは、本来α−ＮＡＧＡはα−ＧＡＬよりも血中安定性が高く、この特性はα−ＮＡＧＡ変異体においても同様に発揮されるためである。さらに、上記タンパク質が障害臓器の細胞に取り込まれやすいのは、もともとα−ＮＡＧＡはα−ＧＡＬよりもＭ６Ｐが結合し得る糖鎖を多く有しており、この構造的特徴はα−ＮＡＧＡ変異体においても同様であるためである。
このように、本発明の医薬組成物は、ファブリー病の治療方法の一つである酵素補充療法に有効に用いることができ、優れた治療効果を発揮し得る医薬組成物として、極めて有用なものである。
また本発明によれば、基質特異性を変換した新規高機能酵素としての上述したα−ＧＡＬ活性を有するタンパク質（α−ＮＡＧＡ変異体）のほか、当該タンパク質をコードし得る遺伝子、当該遺伝子を含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、及び当該タンパク質の製造方法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列番号３：組換えＤＮＡ
配列番号４：組換えタンパク質
配列番号５：組換えＤＮＡ
配列番号６：組換えタンパク質
配列番号７：組換えＤＮＡ
配列番号８：組換えタンパク質
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２Ａ】
2008143354.tif 000063
【図２Ｂ】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
2008143354.tif 000067
【図８】
2008143354.tif 000068
【図９】
2008143354.tif 000069
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2008143354.tif 000075
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