(57)【要約】  本発明により、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログの活性が親株より低下、または喪失している微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法、および配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログの活性が親株より低下、または喪失している微生物の培養物または該培養物の処理物、ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物または該培養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログの活性が親株より低下、または喪失している微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログの活性が親株より低下、または喪失している微生物の培養物または該培養物の処理物、ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物または該培養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【請求項３】
微生物が染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログをコードするＤＮＡの一部または全部が欠損している微生物である、請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログをコードするＤＮＡが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
［１］配列番号２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２で表される塩基配列中のコーディング領域と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一な活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
微生物がAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Methylobacillus属、Pseudomonas属、Xanthomonas属、Bacillus属、Corynebacterium属またはSalmonella属に属する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
微生物がAzotobacter vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Xanthomonas campestris、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium efficiensおよびSalmonella thypimuriumからなる群より選ばれる微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物のＡＴＰ供給活性を用いた有用物質の製造法については、これまでに数多くの報告がある（非特許文献１〜４）。しかしながらこれらの報告では、ＡＴＰを使用して有用物質を生産する酵素について詳細な検討がなされているが、ＡＴＰを供給する複合的な酵素活性あるいは細胞活性について、詳しい解析はなされていない。上記報告では、グルコースの異化代謝によって得られるエネルギーを利用してＡＴＰを供給していることが記載されているにすぎず、ＡＴＰ供給に関与する複合的な酵素系は十分には解析されていなかった。【０００３】
多くの微生物では、その染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかになっている（非特許文献５）。また、相同組換え手法を用いて、微生物の染色体ＤＮＡ上にある特定の遺伝子または染色体ＤＮＡ上の領域を意図した通りに欠損させる方法は知られている（非特許文献６）。また染色体ＤＮＡの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利用して微生物の染色体ＤＮＡ上の各遺伝子を網羅的に破壊した変異株ライブラリー、および２０ｋｂｐ程度の削除可能な染色体ＤＮＡ上の領域のそれぞれを網羅的に欠損させた変異株ライブラリーなども作製されている（非特許文献７および８）。【０００４】
E. coliのmiaA遺伝子産物は、tRNAの成熟過程におけるイソペンテニルピロリン酸転移酵素であることが知られており、大腸菌のmiaA遺伝子破壊株では、翻訳効率、codon context sensitivity、fidelityが低下することが報告されている（非特許文献９）。
しかしながら、miaA遺伝子が欠損した微生物が有用物質の生産において有用であることは知られていない。
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー）, 48, 693 (1997)
【非特許文献２】Biosci. Biotechnol. Biochem.（バイオサイエンス  バイオテクノロジー  アンド  バイオケミストリー）, 61, 960 (1997)
【非特許文献３】Nature Biotechnol.（ネーチャー  バイオテクノロジー）, 16, 847（1998）
【非特許文献４】J. Appl. Biochem. （ジャーナル  オブ  アプライド  バイオケミストリー）, 5, 43 （1983）
【非特許文献５】http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html
【非特許文献６】J. Bacteriol.（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー）, 180, 2063 (1998)
【非特許文献７】J. Biochem. Mol. Biol. （ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  アンド  モレキュラー  バイオロジー）, 37, 83 (2004)
【非特許文献８】Nature Biotechnol.（ネイチャー  バイオテクノロジー）, 20, 1018（2002）
【非特許文献９】J. Biol. Chem. （ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー）, 272, 13073-83 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＡＴＰをエネルギー源として用いる有用物質の製造法において、効率のよい該製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログの活性が親株より低下、または喪失している微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（２）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログの活性が親株より低下、または喪失している微生物の培養物または該培養物の処理物、ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物または該培養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（３）  微生物が染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログをコードするＤＮＡの一部または全部が欠損している微生物である、上記（１）または（２）の製造法。
（４）  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質のホモログをコードするＤＮＡが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡである、上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
［１］配列番号２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２で表される塩基配列中のコーディング領域と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一な活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（５）  微生物がAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Methylobacillus属、Pseudomonas属、Xanthomonas属、Bacillus属、Corynebacterium属またはSalmonella属に属する微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（６）  微生物がAzotobacter vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Xanthomonas campestris、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium efficiensおよびSalmonella thypimuriumからなる群より選ばれる微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（７）  有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、上記（１）〜（６）のいずれか１つの製造法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＡＴＰをエネルギー源として製造される有用物質を、効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
１．本発明の製造法に用いられる微生物
本発明の製造法で用いられる染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、MiaA蛋白質とも称す）またはそのホモログの活性が親株より低下、もしくは喪失した微生物としては、染色体ＤＮＡ上の該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られるMiaA蛋白質が有するＡＴＰ生産抑制活性が親株より低下した微生物であればいずれの微生物でもよいが、例えば（ａ）塩基置換等の導入前の親株に比べ、ＡＴＰ生産活性が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上上昇した微生物、および（ｂ）塩基置換等の導入前の親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、特に好ましくは０％に低下した微生物、をあげることができる。より好ましくは該蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した微生物、さらに好ましくは該遺伝子中のコーディング領域全部が欠損した微生物をあげることができる。【０００９】
なお、本明細書中における親株とは改変または形質転換の対象である元株であり、野生株でも変異株であってもよい。該親株としては例えば微生物がEscherichia coli である場合、E. coliK-12株、B株、B/r株の野生株、またはその変異株をあげることができ、該変異株としてはE. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E. coli MG1655、E. coli BW25113、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coli W1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coli ME8415等をあげることができる。【００１０】
また、本明細書においてMiaA蛋白質と実質的に同一な活性を有するとは、MiaA蛋白質が有するＡＴＰ生産抑制活性を有していれば、その活性の程度は異なっていてもよいことを意味する。
MiaA蛋白質のホモログとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつMiaA蛋白質と実質的に同一な活性を有する蛋白質などをあげることができる。【００１１】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。【００１２】
MiaA蛋白質またはそのホモログをコードする遺伝子としては以下のＤＮＡ、
［１］配列番号２で表される塩基配列中のコーディング領域を有するＤＮＡ、
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［３］配列番号２で表される塩基配列中のコーディング領域と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつMiaA蛋白質と実質的に同一な活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、などをあげることができる。【００１３】
本明細書において遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含んでもよいＤＮＡである。
転写調節領域としては、染色体ＤＮＡ上におけるコーディング領域の５’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるＤＮＡをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。【００１４】
MiaA蛋白質またはそのホモログをコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入は、該蛋白質の活性を親株より低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。【００１５】
塩基の置換としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。
塩基の付加としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のＤＮＡ断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。【００１６】
MiaA蛋白質またはそのホモログの活性が親株より低下、または喪失した微生物であることは、イソペンテニルピロリン酸転移活性、またはＡＴＰ生産抑制活性が親株より低下している割合を公知の方法で測定することにより確認することができる。
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。【００１７】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。【００１８】
上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００１９】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００２０】
また、本発明の製造法で用いられる微生物は、上記したようにMiaA蛋白質またはそのホモログの活性が親株より低下、または喪失している微生物であれば、いずれの属に属する微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
細菌としてはAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Methylobacillus属、Pseudomonas属、Xanthomonas属、Bacillus属、Corynebacterium属またはSalmonella属に属する微生物、より好ましくはAzotobater vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Xanthomonas campestris、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium efficiensおよびSalmonella thypimuriumに属する微生物をあげることができ、さらに好ましくはE. coliをあげることができる。
２．本発明の製造法に用いられる微生物の製造法
（１）MiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡの取得
MiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列中の構造遺伝子の全部または一部をプローブに用いた、各種微生物の染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号２で表される塩基配列に基づき設計したプライマーＤＮＡを用い、各種微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりMiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡを同定、取得した後、常法により該ＤＮＡの塩基配列を解析することにより決定することができる。【００２１】
サザンハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに供する染色体ＤＮＡは、いずれの微生物の染色体ＤＮＡであってもよく、好ましくはAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Methylobacillus属、Pseudomonas属、Xanthomonas属、Bacillus属、Corynebacterium属またはSalmonella属に属する微生物、より好ましくはAzotobater vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Xanthomonas campestris、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium efficiensおよびSalmonella thypimuriumの染色体ＤＮＡをあげることができる。【００２２】
また、各種の遺伝子配列データベースに対してMiaA蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する微生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりMiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡを取得することもできる。【００２３】
具体的なMiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡの塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列、Azotobacter vinelandii由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AF421351）、Erwinia carotovora由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.BX950851）、Pseudomonas fluorescens由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AF245440）、Pseudomonas putida由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AF260132）、Bacillus halodurans由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.BA000004）、Bacillus subtilis由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.Z99113）、Corynebacterium glutamicum由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.BA000036）、Corynebacterium efficiens由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.BA000035）、Salmonella thypimurium由来のmiaA遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AE008833）などをあげることができる。【００２４】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該遺伝子の塩基配列を決定することができる。【００２５】
上記のベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
宿主細胞としては、Escherichia属に属する微生物などをあげることができる。Escherichia属に属する微生物としては、例えば、E. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coli W1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coli ME8415等をあげることができる。【００２６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。【００２７】
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得される遺伝子として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
（２）MiaA蛋白質またはそのホモログの活性が親株より低下、または喪失した微生物の取得
MiaA蛋白質またはそのホモログの活性が親株より低下、または喪失した微生物は、UV照射、変異剤などで親株を変異処理する方法、または親株の染色体ＤＮＡ上のMiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡの塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。【００２８】
微生物の染色体ＤＮＡ上のＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加を導入する位置は、上記１のとおりである。
微生物の染色体ＤＮＡ上の遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、MiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡを用いて、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を作製し、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、E. coliで頻用される相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。【００２９】
MiaA蛋白質またはそのホモログの活性が親株より低下、もしくは喪失した微生物であることは、該微生物のイソペンテニルピロリン酸転移活性、またはＡＴＰ生産抑制活性が親株より低下している割合を公知の方法で測定することにより確認することができる。
本発明の製造法で用いられる微生物は、（１）親株として有用物質を生産する能力を有する微生物を用い、その親株の染色体ＤＮＡ上に存在するMiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡの一部または全部を欠損させる方法、または（２）親株である微生物の染色体ＤＮＡ上のMiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡの一部または全部を欠損させてから、該微生物に有用物質の生産性を付与する方法により製造することができる。【００３０】
有用物質を生産する能力を有する微生物は、１種以上の有用物質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）親株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。【００３１】
上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合については、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。【００３２】
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996)  section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００３３】
アミノ酸以外の有用物質を生産する能力を微生物に付与する方法もまた、多くの報告があり、従来知られているすべての方法は、本発明の製造法に用いられる微生物の製造に用いることができる。
染色体ＤＮＡ上のMiaA蛋白質またはそのホモログをコードするＤＮＡの一部または全部が欠損した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば下記した微生物の染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、またはmiaA遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列情報を利用して、微生物の染色体ＤＮＡ上にあるmiaA遺伝子またはそのホモログ遺伝子に塩基の欠損を導入する方法により取得することができる。【００３４】
微生物の染色体ＤＮＡ上の遺伝子に塩基の欠損を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠損が導入された変異遺伝子を、塩基の欠損を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、E. coliで頻用される相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。
３．本発明の有用物質の製造法
本発明の製造法で製造される有用物質は、ＡＴＰおよび微生物または細胞が有する代謝能を用いて製造する際、その生合成において直接または間接的にＡＴＰを必要とする、工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、該物質としては、好ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質などをあげることができ、より好ましくはタンパク質としては、イノシンキナーゼ、Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11)、Glutamate-5- semialdehyde dehydrogenase   (EC 1.2.1.41)、Pyrroline-5-carboxylate reductase (EC 1.5.1.2)、γ−グルタミルシステイン合成酵素(EC 6.3.2.2)、グルタチオン合成酵素(EC 6.3.2.3)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、キシロースレダクターゼ、Ｐ４５０などをあげることができ、ペプチドとしてはグルタチオンなどをあげることができ、アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリンなどをあげることができ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸などをあげることができ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができ、糖としては、キシロースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトールなどをあげることができ、アルコールとしてはエタノールなどをあげることができ、有機酸としては乳酸、コハク酸などをあげることができ、生理活性低分子化合物としてはグルタチオンなどをあげることができ、脂質としては、EPA(エイコサペンタエン酸)やDHA（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。【００３５】
本発明の有用物質の製造法としては、１）上記２の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取する方法、および２）上記２の微生物の培養物または該培養物の処理物、ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物または該培養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取する方法をあげることができる。
（１）発酵法による有用物質の製造
上記１）の方法において、該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【００３６】
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。【００３７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００３８】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００３９】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００４０】
培養物中に生成、蓄積した有用物質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
（２）上記２の微生物をATPの供給源として用いる方法
上記２）の方法で用いられる上記２の微生物の培養物は、上記（１）の培養方法で上記２の微生物を培養することにより取得することができる。【００４１】
微生物の培養物の処理物としては、微生物がATPを生産する活性を有する限り、特に制限されないが、例えば、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の溶媒処理物および該細胞の固定化物などの細胞の形態を保持している処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物などの粗酵素抽出物などをあげることができる。【００４２】
媒体としては、水、水性媒体もしくは有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。また水性媒体としては、上記（１）の微生物を培養する培養液、および培養して得られる培養液もあげることができる。【００４３】
ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素としては、該酵素が担う反応にATPが必要な酵素であれば、特に制限されない。またATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する細胞としては、該細胞が有用物質の前駆体を代謝して該有用物質を生成する過程に直接または間接的にATPが関与する代謝系を有する細胞である限り、特に制限されず、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などをあげることができ、好ましくは微生物をあげることができる。該微生物としては、上記２の方法により、所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物が好ましい。【００４４】
該細胞の培養物の処理物としては、該処理物がATPを用いて有用物質を製造する能力を有する限り特に制限されないが、例えば培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物を遠心分離して得られる細胞、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の溶媒処理物および該細胞の固定化物などの細胞の形態を保持している処理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕物などの粗酵素抽出物、並びに該細胞からの蛋白質分画物および酵素の固定化物などの粗精製酵素などをあげることができる。【００４５】
炭素源としては、本発明の製造法で用いられる微生物が代謝し、ATPの生成に用いることができる炭素源であれば特に制限されないが、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等をあげることができる。【００４６】
有用物質の前駆物質としては、細胞内で代謝されて有用物質に変換される物質であれば、特に限定されず、所望の有用物質の公知の生合成経路上流にある物質から適宜選択することができる。
上記２）の製造法において用いられる微生物、およびATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する細胞の量は、その比活性等により異なるが、例えば、1mgの有用物質の前駆物質あたり、湿重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素の量は、有用物質の前駆物質1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1〜10mg添加する。反応は20〜50℃で行なうことが好ましく、特に25〜37℃で行なうことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常2〜150時間、好ましくは6〜120時間である。【００４７】
媒体からの有用物質の採取は、上記（１）の方法により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
MiaA蛋白質をコードするＤＮＡが欠損した微生物の取得
MiaA蛋白質をコードするＤＮＡが欠損した微生物は、奈良先端科学技術大学院大学より、カナマイシン耐性マーカーによってmiaA遺伝子が破壊されている大腸菌(E. coli BW25113 ΔmiaA::km。以下、E. coliBW25113ΔmiaA-K株と表記する)として入手した。また以下に記載する方法でテトラサイクリン耐性マーカーによってmiaA遺伝子が破壊された大腸菌を作製することもできた。【００４９】
トランスポゾンTn10を染色体ＤＮＡ上に持つE. coli CGSC7465株（米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手）の染色体ＤＮＡを鋳型に用い、配列番号３および４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、LA-Taq(タカラバイオ社製)を用い、染色体ＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ 各50pmolを含む100μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で90秒間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。【００５０】
精製した増幅ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号５および６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、テトラサイクリン耐性遺伝子を中央部に持ち、両端にmiaA遺伝子の５’末端側ならびに３’末端側と相同な配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、鋳型 1ng、プライマーＤＮＡ 各40pmolを含む反応液50μlをLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で2分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。増幅ＤＮＡ断片をQIA quick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、30μｌのＤＮＡ溶液を得た。【００５１】
E. coli BW25113/pKD46株（米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手）のコンピテントセルを、文献［Gene, 246, 321-330 (2000)］に記載の方法に従って調製し、先に調製した0.5μlのＤＮＡ溶液を用いてエレクトロポレーションにより形質転換を行った。
形質転換した細胞を、1mlのＬＢ液体培地［10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム、1ml/lの1mol/l 水酸化ナトリウム］を用いて30℃で2時間培養した後、15μg/mlのテトラサイクリン、100μg/mlのアンピシリン、1％グルコースを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を1.5％含むもの）上に塗布し、30℃で一晩培養した。生育してきた株は、E. coli BW25113/pKD46株の染色体ＤＮＡ上のmiaA遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と置換された株であった。該株をE. coli BW25113/pKD46ΔmiaA-T株と命名した。【００５２】
E. coli BW25113/pKD46ΔmiaA-T株をＬＢ寒天培地［10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム、1ml/lの1mol/l 水酸化ナトリウム、15g/l 寒天］上に塗布し、43℃で一晩培養した。複数のコロニーを100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地と含まないＬＢ寒天培地に同時にスポットし、アンピシリンを含まないＬＢ寒天培地のみで生育したコロニーを選択することにより温度感受性プラスミドpKD46が脱落した株を取得し、E. coli ΔmiaA-T株と命名した。
【実施例２】
【００５３】
miaA遺伝子欠損株のATP生産活性の測定
ATPは生体の様々な反応に必須な高エネルギーリン酸化合物であり、補酵素である。ルシフェラーゼはルシフェリンとATPを基質として発光する。大腸菌はATP生産活性を有しており、発光を指標として大腸菌が有するATP生産能力を評価することができる。
（１）miaA遺伝子が欠失した微生物の培養物の調製
E. coli BW25113ΔmiaA-K株とその親株であるE. coli BW25113株（米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手）を、それぞれ1mlの3％グルコースを含むＬＢ液体培地（ＬＢＧ培地）を用いて、30℃で24時間、振盪培養した。培養終了時に濁度を測定（590nmの透過度を測定。以下、OD590nmと表記する）したところ、BW25113株の値を100としたとき、E. coli BW25113ΔmiaA-K株は110であった。得られた培養液200μlをそれぞれ遠心分離して菌体を沈殿させ、上清を取り除いた後に、100μlの40mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）を用いて該菌体を1回洗浄した後、30μlの40mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）に懸濁した。得られた菌体懸濁液に30μlのＧＴ溶液（40％グルコース、0.8％トライトンX-100）を加えてATP生産活性測定用の菌体懸濁液を調製した。
（２）ATPの生産活性の測定
90μlの反応液（0.5 mmol/l  Ｄ-ルシフェリン、1.25μg/ml  ホタルルシフェラーゼ、5 mmol/l  硫酸マグネシウム、100mmol/l エチレンジアミンテトラ硫酸、1mmol/l ジチオスレイトール、0.4％トライトンX-100、15mmol/lリン酸一カリウム、25mmol/l トリシンバッファー、pH7.4）に、上記（１）で取得した菌体懸濁液を10μl添加して室温で3分間発光を測定した。発光値の測定には、パーキンエルマー社製のプレートリーダーを用いた。発光値とは、測定器に依存する相対的な発光の検出値で、一般的にRLUと呼ばれているものである。RLUの時間変化［RLU（3分）−RLU（0分）］／3からATPの生産速度を比較したところ、E. coli BW25113株のATPの生産速度を100としたとき、E. coli BW25113ΔmiaA-K株のATPの生産速度は213であった。この結果は、miaA遺伝子欠損株ではATP生産活性が上昇していることを示している。
【実施例３】
【００５４】
miaA遺伝子欠損株を用いたグルタチオンの生産
グルタチオンは、3種類のアミノ酸（グルタミン酸、システイン、グリシン）からなるペプチド性物質である。γ−グルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素の働きにより、前述の３つのアミノ酸が縮合しグルタチオンが生合成される。ＡＴＰは、この縮合反応に必須な補酵素である。大腸菌はＡＴＰ生産活性を有しており、グルタチオンの生産性を指標として大腸菌が有するＡＴＰ生産活性を評価することができる。
（１）グルタチオン生合成酵素遺伝子の取得
特開昭58-20196号およびJ. Gen. Microbiol., 128, 1047-1052(1982) に記載の方法に従い、グルタチオンによるγ−グルタミルシステイン合成酵素の阻害が解除された変異株（大腸菌RC912株）を作製する。本菌株は微工研条寄第47号として入手することもできる。【００５５】
次に特開平2-31690号およびAppl. Environ. Microbiol., 44, 1444-1448 (1982)に記載の方法に従い、大腸菌RC912株染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素構造遺伝子を含むPstI断片を、プラスミドpBR322上にクローニングする。
さらに特開平2-31690号およびAgric. Biol. Chem., 47, 1381-1383 (1983) に記載の方法に従い、大腸菌RC912株染色体上のグルタチオン合成酵素構造遺伝子を含むHindIII断片を、プラスミドpBR322上にクローニングする。また特開平2-31690号およびBioprocess Technol., 19, 159-183(1994) に記載の方法に従い、それら二つのクローン化断片を一つのベクタープラスミドpBR325上に導入し、特開平2-31690号またはBioprocess Technol., 19, 159-183(1994) に記載のpBR325-gshI・IIまたはpGS500と同様のプラスミドを作成することもできる。該プラスミドを保有する株はFERM BP-337株として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに保存されている。FERM BP-337株から該プラスミドを分離し、pGS600と命名して以下の実験に用いた。【００５６】
上記方法により得られたpBR325-gshI・IIを用いて、大腸菌C600株を、塩化カルシウム法により形質転換した。形質転換体は20μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢｃｍプレートを用いて選択し、大腸菌C600/pGS600と命名した。大腸菌C600/pGS600を、5ｍｌの3％グルコースを含むＬＢ液体培地（ＬＢＧ培地）を用いて、30℃で24時間、振盪培養した。次に得られた培養液4ｍｌを400mlの新しいＬＢＧ培地に植菌し、30℃で24時間、振盪培養した。得られた培養物を遠心分離して菌体を沈殿させ、100mlの100mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）を用いて該菌体を２回洗浄した。該洗浄菌体は-80℃で保存し、使用直前に10mlの100mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）を加えて懸濁したものを、酵素液として用いた。
（２）miaA欠損株の培養物の調製
E. coli BW25113株、およびE. coli BW25113を親株とするmiaA遺伝子欠損株であるE. coli ΔmiaA-K株を、それぞれ2.5mlの3％グルコースを含むＬＢ液体培地（ＬＢＧ培地）を用いて、30℃で24時間、振盪培養し、得られた培養物200μlを20mlの新しいＬＢＧ培地が入った三角フラスコに植菌し、30℃で24時間、振盪培養した。培養終了時に測定した濁度(OD 660nm)を表１に記載した。【００５７】
得られた培養物はそれぞれ遠心分離して菌体を沈殿させ、5mlの100mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）を用いて該菌体を2回洗浄した。得られた洗浄菌体に200μlのＧＴ溶液（20％グルコース、0.4％トライトンX-100）を加えて得られた菌体懸濁液を、ATP供給源として用いた。
（３）グルタチオンの生産
900μlの反応液（2％グルコース、20mmol/l 硫酸マグネシウム、20mmol/l 硫酸二カリウム、0.22mmol/l 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、0.14mmol/l フラビンモノヌクレオチド、5mmol/l グルタミン酸、5mmol/lシステイン、5mmol/l グリシン、0.4％ トライトンX-100、15mmol/l リン酸一カリウム、200 mmol/l MOPSバッファー、pH7.8）に、上記（１）で取得した酵素液を100μl、および上記（２）で取得した菌体懸濁液を100μl添加して30℃で60分間振盪しながら反応を行った。反応液を100℃で2分間熱し、熱水中に蓄積したグルタチオンの定量は、グルタチオン定量キット（同仁化学研究所社製）を用いて行った。結果を表１に示す。【００５８】
【表１】
2008126785.tif 000002
【００５９】
表１に示すとおり、miaA遺伝子欠損株のグルタチオン生産速度は、親株に比べ菌体量の増加割合以上に速かった。この結果からmiaA遺伝子欠損株のＡＴＰ合成活性の向上は、物質の生産性の向上につながることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、ＡＴＰをエネルギー源として製造される有用物質の製造法において、効率の良い方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
【配列表】
2008126785000001.app
【国際調査報告】
2008126785.tif 000003
2008126785.tif 000004