(57)【要約】  細胞表面上に発現するClaudin3に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供された。本発明の抗体は、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌などのClaudin3が発現亢進している癌の診断に有用である。また本発明は、これらの癌細胞に対して細胞傷害作用を示すモノクローナル抗体を提供した。すなわち、Claudin3発現細胞とClaudin3に結合する抗体とを接触させることにより、Claudin3発現細胞に細胞傷害を引き起こす方法およびClaudin3発現細胞の増殖を抑制する方法が開示される。さらに、本発明により、癌の診断あるいは治療方法が開示される。
2008072723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Claudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
細胞膜上に発現した配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列中の30番目から80番目のアミノ酸配列からなるペプチド、または137番目から159番目のアミノ酸からなるペプチドと実質的に交叉しない請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
細胞膜上に発現した配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する請求項１から請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
細胞膜上に発現した配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する請求項１から請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
細胞膜上に発現した配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質の２つの細胞外ループによって形成される立体構造を認識して結合する抗体。
【請求項７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列中の30番目から80番目のアミノ酸配列からなるペプチド、または137番目から159番目のアミノ酸からなるペプチドと実質的に交叉しない請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体である請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項９】
細胞傷害活性を有する請求項１から請求項８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
細胞傷害活性がＡＤＣＣ活性である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
細胞傷害活性がＣＤＣ活性である請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
化学療法剤、または、毒性ペプチドを結合した請求項１から請求項１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
Claudin3タンパク質に結合する抗体であって、化学療法剤、毒性ペプチド、および放射性同位元素からなる群から選択されたいずれかの細胞傷害性物質が結合された抗体。
【請求項１４】
以下（１）から（６１）のいずれかに記載の抗体である、請求項１から請求項１３のいずれかに記載の抗体；
（１）CDR１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２）（１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列の１３９から４６２位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）（１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４）CDR１として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５）（４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３２に記載のアミノ酸配列の１３５から２４０位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（６）（４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（７）（１）に記載のH鎖、および（４）に記載のL鎖を含む抗体、
（８）（２）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
（９）（３）に記載のH鎖、および（６）に記載のL鎖を含む抗体、
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（１１）CDR１として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１２）（１１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：４４に記載のアミノ酸配列の１４０から４７６位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１３）（１１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１４）CDR１として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：４８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１５）（１４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：５４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１６）（１４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１７）（１１）に記載のH鎖、および（１４）に記載のL鎖を含む抗体、
（１８）（１２）に記載のH鎖、および（１５）に記載のL鎖を含む抗体、
（１９）（１３）に記載のH鎖、および（１６）に記載のL鎖を含む抗体、
（２０）（１１）から（１９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１１）から（１９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（２１）CDR１として配列番号：５６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２２）（２１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：６４に記載のアミノ酸配列の１３７から４７１位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２３）（２１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２４）CDR１として配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：６８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：７０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２５）（２４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：７４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２６）（２４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２７）（２１）に記載のH鎖、および（２４）に記載のL鎖を含む抗体、
（２８）（２２）に記載のH鎖、および（２５）に記載のL鎖を含む抗体、
（２９）（２３）に記載のH鎖、および（２６）に記載のL鎖を含む抗体、
（３０）（２１）から（２９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（２１）から（２９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（３１）CDR１として配列番号：７６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３２）（３１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：８４に記載のアミノ酸配列の１４０から４６３位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３３）（３１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３４）CDR１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：９０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３５）（３４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：９４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３６）（３４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３７）（３１）に記載のH鎖、および（３４）に記載のL鎖を含む抗体、
（３８）（３２）に記載のH鎖、および（３５）に記載のL鎖を含む抗体、
（３９）（３３）に記載のH鎖、および（３６）に記載のL鎖を含む抗体、
（４０）（３１）から（３９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（３１）から（３９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（４１）CDR１として配列番号：９６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：９８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１００に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４２）（４１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０４に記載のアミノ酸配列の１４０から４７４位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４３）（４１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４４）CDR１として配列番号：１０６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１０８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１１０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４５）（４４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：１１４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４６）（４４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４７）（４１）に記載のH鎖、および（４４）に記載のL鎖を含む抗体、
（４８）（４２）に記載のH鎖、および（４５）に記載のL鎖を含む抗体、
（４９）（４３）に記載のH鎖、および（４６）に記載のL鎖を含む抗体、
（５０）（４１）から（４９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（４１）から（４９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（５１）CDR１として配列番号：１６７に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１６９に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１７１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５２）（５１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：１７３に記載のアミノ酸配列の１１８から４４７位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５３）（５１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５４）CDR１として配列番号：１７９に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１８１に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１８３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５５）（５４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８５に記載のアミノ酸配列の１１３から２１８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５６）（５４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５７）（５１）に記載のH鎖、および（５４）に記載のL鎖を含む抗体、
（５８）（５２）に記載のH鎖、および（５５）に記載のL鎖を含む抗体、
（５９）（５３）に記載のH鎖、および（５６）に記載のL鎖を含む抗体、
（６０）（５１）から（５９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（５１）から（５９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、および
（６１）（１）から（６０）のいずれかに記載の抗体が結合するClaudin3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
【請求項１５】
前記請求項１から請求項１４のいずれかに記載の抗体をClaudin3タンパク質に結合させる工程を含む癌の診断方法。
【請求項１６】
以下の工程：
（ａ）  被検者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれるClaudin3タンパク質を、Claudin3タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程を含む癌の診断方法。
【請求項１７】
(1)放射性同位元素で標識されたClaudin3タンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程、および(2)前記放射性同位元素の集積を検出する工程を含む癌の診断方法。
【請求項１８】
放射性同位元素が、陽電子放出核種である請求項１７に記載の診断方法。
【請求項１９】
陽電子放出核種が11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、および124Iからなる群から選択されるいずれかの核種である請求項１８に記載の診断方法。
【請求項２０】
癌が、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌からなる群から選択されるいずれかの癌である請求項１５から請求項１９のいずれかに記載の診断方法。
【請求項２１】
癌が、原発性の癌である請求項２０に記載の診断方法。
【請求項２２】
癌が、転移性の癌である請求項２０に記載の診断方法。
【請求項２３】
Claudin3タンパク質に結合する抗体を含む、癌の診断方法に用いるための診断薬。
【請求項２４】
Claudin3タンパク質に結合する抗体と、Claudin3タンパク質を含む生体試料を含む、癌の診断方法に用いるためのキット。
【請求項２５】
Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２６】
Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
【請求項２７】
Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項２８】
癌が、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌からなる群から選択されるいずれかの癌である、請求項２７に記載の抗癌剤。
【請求項２９】
癌が、原発性の癌である請求項２８に記載の抗癌剤。
【請求項３０】
癌が、転移性の癌である請求項２８に記載の抗癌剤。
【請求項３１】
抗体が、請求項１から請求項１４のいずれかに記載の抗体である請求項２８に記載の抗癌剤。
【請求項３２】
細胞増殖抑制剤の製造における、Claudin3タンパク質に結合する抗体の使用。
【請求項３３】
抗癌剤の製造における、Claudin3タンパク質に結合する抗体の使用。
【請求項３４】
Claudin3タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む、細胞増殖を抑制する方法。
【請求項３５】
Claudin3タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む、癌を予防または治療する方法。
【請求項３６】
Claudin3タンパク質を発現する細胞とClaudin3タンパク質に結合する抗体とを接触させる工程を含む、Claudin3タンパク質を発現する細胞に細胞傷害を引き起こす方法。
【請求項３７】
Claudin3タンパク質を発現する細胞とClaudin3タンパク質に結合する抗体とを接触させる工程を含む、Claudin3タンパク質を発現する細胞の増殖を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断および治療方法、ならびに細胞増殖抑制および抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体の特徴である高い標的特異性と低い副作用という特質を利用して、近年、当該抗体を治療用薬剤として使用する癌の治療が注目されてきている。治療用薬剤として用いられる抗体の主な抗腫瘍作用機構として、たとえば次のようなメカニズムが挙げられる。
抗体による腫瘍細胞の正常細胞からの識別、
腫瘍細胞上に発現する抗原に対して特異的に結合した抗体に細胞傷害作用をもつエフェクター細胞の結合、又は、当該抗体に結合する補体複合体の形成、そして
エフェクター細胞や補体によって発揮される当該腫瘍細胞に対する細胞傷害活性
HER-2を標的とした乳癌治療抗体trastuzumab、CD20を標的にした非ホジキンリンパ腫治療抗体rituximabが抗体による癌の治療の例として挙げられる。しかし、実際に臨床上の有用性を示す抗体の数は現時点ではごく僅かである。従って、現在のところ抗体治療の適用が考えられる対象となる癌種は非常に限定されている。現行の治療薬では効果がほとんど得られないがために治療選択肢がほとんどない癌に対し、副作用が少なく、抗腫瘍効果の高い抗体治療薬を開発し、新たな治療法を確立することが強く望まれている。【０００３】
Claudin 3はClaudinファミリーに属する蛋白質の一つで、タイトジャンクションに局在し、タイトジャンクションに特徴的な細胞間スペースを除去する役割を有する。タイトジャンクション（tight junction;密着結合）とは、動物などの生体組織において、隣接する細胞膜を結合する強固な構造をいう。Claudin3はイオンなどの小さな溶質物質の細胞間透過性を制御する構造蛋白質である。卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌など数多くの癌組織でのClaudin 3分子の発現上昇が報告されている（非特許文献1-6）。Claudin 3の発現プロファイルは、The Swedish Human Protein Atlas (HPA)のWebサイト（http://www.proteinatlas.org/)でも参照することができる。婦人科癌のなかで米国において最も致死率が高いとされる子宮癌において、Claudin 3とClaudin 4の発現が化学療法剤耐性再発部で特に上昇していることが示されている。Claudin 4は、Claudin 3と同様にClaudinファミリーに属する蛋白質の一つである。現在のところ、ヒトの染色体上には、Claudin 3やClaudin 4を含む、24種類のClaudin遺伝子ファミリーの存在が報告されている。【０００４】
Claudin 3とClaudin 4は共にClostridium perfringens エンテロトキシン(CPE)の毒素受容体として機能することが知られている。CPE はClaudin 3, Claudin 4に結合した後、巨大複合体を形成することにより細胞膜に穴をあけ、細胞壊死を引き起こす。Claudin 3, Claudin 4を発現するヒト腫瘍細胞を移植して作製された胆癌モデルマウスに、致死量以下(sublethal)のCPEを投与することで、腫瘍体積が減少、生存率が向上するデータが示されている（非特許文献6-7）。CPEのヒトへの臨床応用の可能性は指摘されているものの、薬効と致死的な毒性を示す投与量の差異の狭さやCPE自体のヒトに対する抗原性が懸念されることから実際には臨床的に応用されるまでには至っていない。【０００５】
Claudin 3は4回膜貫通領域を持つ蛋白質であり、細胞外に2つのペプチドループを露出する構造をもつ。細胞外ループであると予想されるペプチド配列を構成するポリペプチド部分は、次に示すようにわずかに51アミノ酸残基（ループ１）と23アミノ酸残基（ループ２）である。
細胞外ループ１                      細胞外ループ２
[30-80]                                [137-159]
細胞膜 =[9-29]=====[81-101]=======[116-136]=======[160-180]==
[NH2-1-8]                      [102-115]                                [181-219-COOH]
Cytoplasmic                    Cytoplasmic                                 Cytoplasmic
加えて、動物種間におけるClaudinファミリーの配列の同一性が高いため、通常の免疫方法では、細胞外領域を認識する抗体の取得が極めて困難であった。更に、Claudinファミリーに属する分子は、互いによく似た構造を持つため、サブタイプを特異的に認識する抗体を得る方法も確立されていない（非特許文献8）。【０００６】
細胞上に発現するClaudin 3を認識する抗体としては、ニワトリにClaudin 3の部分ペプチドを免疫し、当該ペプチドに対するアフィニティ精製によって得られたポリクローナル抗体を単離した報告があるのみ（非特許文献3）である。細胞表面に発現した天然の分子型のClaudin-3に結合するモノクローナル抗体を単離し、その抗腫瘍作用を示した例は現在まで報告されていない。
【非特許文献１】Soini (2005) Histopathology 46, 551.
【非特許文献２】Santin et al. (2005) Br. J. Cancer 92, 1561.
【非特許文献３】Offner et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 431.
【非特許文献４】Long et al. (2001) Cancer Res. 61, 7878.
【非特許文献５】Rangel et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9, 2567.
【非特許文献６】Kominsky et al. (2004) Am. J. Path. 164, 1627.
【非特許文献７】Santin et al. (2005) Cancer Res. 65, 4334.
【非特許文献８】Hoevel et al. (2002) J. Cell. Physiol. 191, 60.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、抗Claudin3抗体とその用途を提供することを課題とする。より詳細には、新規な抗Claudin3抗体、若しくは、抗Claudin3抗体を用いて癌を治療する新規方法、抗Claudin3抗体を含む新規な細胞増殖抑制剤又は抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、Claudin3ポリペプチドをコードするDNAをマウスに免疫することにより、抗Claudin3抗体の取得に成功した。更に、本発明者は、このようにして得られた抗体について、細胞表面上に発現する次のClaudinファミリーに属する分子に対する、その結合活性を測定した。
ヒトClaudin3タンパク質、
マウスClaudin3タンパク質、
ヒトClaudin1タンパク質、
ヒトClaudin4タンパク質、および
ヒトClaudin6タンパク質
その結果、本発明の抗Claudin3抗体は、次のような結合活性のいずれか、あるいは全てを持つことが確認された。
ヒトClaudin3タンパク質に対する高い結合活性、
ヒト及びマウスのClaudin3タンパク質に対する高い結合活性、および
ヒトClaudin3タンパク質及びヒトClaudin4タンパク質に対する結合活性【０００９】
また、本発明者は、取得された抗Claudin3抗体には、細胞外ループであると予想されるペプチド配列を有する合成ペプチドに対しては実質的に結合活性を示さず、細胞表面上に発現したヒトClaudin3タンパク質に対して特異的に結合する抗体が含まれることを見出した。【００１０】
更に、本発明者は、取得された抗Claudin3抗体が、Claudin3を内在的に発現するヒト乳癌細胞株MCF7に対して結合活性を示すことを見出し、当該抗体が原発性の又は転移性の各種の癌細胞の診断に有用であることを明らかにした。また、本発明者は抗Claudin3抗体を使用することによって次のような各種の癌組織の、いずれか、あるいは全てを診断することができることを見出した。
Claudin3タンパク質を発現する各種の癌組織、
Claudin4タンパク質を発現する各種の癌組織、および
Claudin3タンパク質とClaudin4タンパク質を共に発現する癌組織【００１１】
更に、本発明者は、ヒトClaudin3タンパク質を安定的に発現するDG44細胞及び前記MCF7細胞に対する抗Claudin3抗体による補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity; CDC）活性を測定し、本発明の抗Claudin3抗体が、いずれの細胞に対してもCDC活性を有することを見出した。加えて、本発明者は、MCF7細胞に対する抗Claudin3抗体による抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC）活性を測定し、本発明の抗Claudin3抗体がMCF7細胞に対してADCC活性を有することも見出した。
以上の知見により、本発明者は、抗Claudin3抗体が、原発性の、あるいは転移性の各種の癌の診断、予防、あるいは治療に有効であることを見出して、本発明を完成させた。【００１２】
本発明は、Claudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。好ましくは、Claudin3タンパク質に結合する抗体は細胞傷害活性を有する抗体である。本発明の好ましい態様において、治療の対象とできる癌は、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌である。特に好ましくは、乳癌である。本発明に基づく抗Claudin3抗体を含む抗癌剤は、これらのClaudin3が発現亢進した癌であって、原発性、あるいは転移性の癌の治療に有用である。【００１３】
あるいは本発明は、Claudin3タンパク質に結合する抗体と、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、Claudin3が発現亢進している癌の治療および予防のいずれか、または両方に有用である。すなわち本発明は、Claudin3タンパク質に結合する抗体の、癌の治療および予防の、いずれか、または両方のための医薬組成物の製造における使用に関する。【００１４】
別の態様においては、本発明は、Claudin3発現細胞とClaudin3タンパク質に結合する抗体とを接触させることによりClaudin3タンパク質を発現する細胞に細胞傷害を引き起こす方法を提供する。本発明はまた、Claudin3タンパク質を発現する細胞とClaudin3タンパク質に結合する抗体とを接触させることによりClaudin3タンパク質を発現する細胞の増殖を抑制する方法を提供する。好ましくは、Claudin3タンパク質に結合する抗体は細胞傷害活性を有する抗体である。また好ましくは、Claudin3タンパク質を発現する細胞は癌細胞である。【００１５】
更に別の態様においては、本発明は、Claudin3タンパク質に結合し、かつ、Claudin3タンパク質を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有する抗体を提供する。好ましくは、該細胞傷害活性はADCC活性である。好ましくは、該細胞傷害活性はCDC活性である。本発明はまた、細胞傷害性物質を結合した抗体を提供する。本発明において、抗体に結合される細胞傷害性物質としては、化学療法剤、放射性同位元素、および毒性ペプチドを示すことができる。本発明における抗体は、好ましくは抗体自身が細胞傷害活性を有する抗体であることができる。【００１６】
更に別の態様においては、本発明は、Claudin3タンパク質に結合する抗体を用いてClaudin3タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。本発明の方法においては、好ましくは、Claudin3タンパク質の細胞外領域が検出される。また好ましくは、本発明の方法はClaudin3タンパク質を認識する抗体を用いて行われる。【００１７】
別の態様においては、本発明は、以下の工程：
（ａ）  被検者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれるClaudin3タンパク質を、Claudin3タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程
を含む癌の診断方法を提供する。本発明において上記試料は被検者から採取できるものであればいかなるものでも使用することができる。一の態様においては被検者から採取した血液試料が使用される。また別の態様では被検者から外科的に、あるいは生検（バイオプシー）により採取された試料も使用される。該診断方法に係る癌は、対象とする癌細胞がClaudin3タンパク質を発現する癌であればいずれの癌でもよい。本発明における好ましい癌は、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌である。特に好ましくは、乳癌である。本発明に基づいて、これらの癌の原発性病巣、および転移性病巣のいずれをも診断することができる。本発明においては、被験者から試料を採取する工程は、被験者から採取された試料を提供する工程と言うこともできる。【００１８】
さらに別の態様においては、本発明は、(1)放射性同位元素で標識されたClaudin3タンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程、および(2)前記放射性同位元素の集積を検出する工程を含む癌の診断方法を提供する。ある態様において、放射性同位元素は、陽電子放出核種である。本発明における好ましい陽電子放出核種は、たとえば11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、および124Iからなる群から選択することができる。【００１９】
また別の態様においては、本発明は、Claudin3タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。さらに別の態様においては、本発明は、本発明の診断方法に用いるための診断薬やキットを提供する。すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
〔１〕Claudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体。
〔２〕細胞膜上に発現した配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する〔１〕に記載のモノクローナル抗体。
〔３〕配列番号２に記載のアミノ酸配列中の30番目から80番目のアミノ酸配列からなるペプチド、または137番目から159番目のアミノ酸からなるペプチドと実質的に交叉しない〔２〕に記載のモノクローナル抗体。
〔４〕細胞膜上に発現した配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
〔５〕細胞膜上に発現した配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
〔６〕細胞膜上に発現した配列番号：２、配列番号：４、および配列番号：８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質の２つの細胞外ループによって形成される立体構造を認識して結合する抗体。
〔７〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列中の30番目から80番目のアミノ酸配列からなるペプチド、または137番目から159番目のアミノ酸からなるペプチドと実質的に交叉しない〔６〕に記載の抗体。
〔８〕モノクローナル抗体である〔６〕又は〔７〕に記載の抗体。
〔９〕細胞傷害活性を有する〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の抗体。
〔１０〕細胞傷害活性がＡＤＣＣ活性である〔９〕に記載の抗体。
〔１１〕細胞傷害活性がＣＤＣ活性である〔９〕に記載の抗体。
〔１２〕化学療法剤、または、毒性ペプチドを結合した〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体。
〔１３〕Claudin3タンパク質に結合する抗体であって、化学療法剤、毒性ペプチド、および放射性同位元素からなる群から選択されたいずれかの細胞傷害性物質が結合された抗体。
〔１４〕以下（１）から（６１）のいずれかに記載の抗体である、〔１〕から〔１３〕のいずれかに記載の抗体；
（１）CDR１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２）（１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列の１３９から４６２位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）（１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４）CDR１として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５）（４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３２に記載のアミノ酸配列の
１３５から２４０位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（６）（４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（７）（１）に記載のH鎖、および（４）に記載のL鎖を含む抗体、
（８）（２）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
（９）（３）に記載のH鎖、および（６）に記載のL鎖を含む抗体、
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（１１）CDR１として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１２）（１１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：４４に記載のアミノ酸配列の１４０から４７６位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１３）（１１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１４）CDR１として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：４８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１５）（１４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：５４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１６）（１４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１７）（１１）に記載のH鎖、および（１４）に記載のL鎖を含む抗体、
（１８）（１２）に記載のH鎖、および（１５）に記載のL鎖を含む抗体、
（１９）（１３）に記載のH鎖、および（１６）に記載のL鎖を含む抗体、
（２０）（１１）から（１９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１１）から（１９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（２１）CDR１として配列番号：５６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２２）（２１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：６４に記載のアミノ酸配列の１３７から４７１位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２３）（２１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２４）CDR１として配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：６８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：７０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２５）（２４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：７４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２６）（２４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２７）（２１）に記載のH鎖、および（２４）に記載のL鎖を含む抗体、
（２８）（２２）に記載のH鎖、および（２５）に記載のL鎖を含む抗体、
（２９）（２３）に記載のH鎖、および（２６）に記載のL鎖を含む抗体、
（３０）（２１）から（２９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（２１）から（２９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（３１）CDR１として配列番号：７６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３２）（３１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：８４に記載のアミノ酸配列の１４０から４６３位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３３）（３１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３４）CDR１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：９０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３５）（３４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：９４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３６）（３４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３７）（３１）に記載のH鎖、および（３４）に記載のL鎖を含む抗体、
（３８）（３２）に記載のH鎖、および（３５）に記載のL鎖を含む抗体、
（３９）（３３）に記載のH鎖、および（３６）に記載のL鎖を含む抗体、
（４０）（３１）から（３９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（３１）から（３９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（４１）CDR１として配列番号：９６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：９８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１００に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４２）（４１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０４に記載のアミノ酸配列の１４０から４７４位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４３）（４１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４４）CDR１として配列番号：１０６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１０８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１１０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４５）（４４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：１１４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４６）（４４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４７）（４１）に記載のH鎖、および（４４）に記載のL鎖を含む抗体、
（４８）（４２）に記載のH鎖、および（４５）に記載のL鎖を含む抗体、
（４９）（４３）に記載のH鎖、および（４６）に記載のL鎖を含む抗体、
（５０）（４１）から（４９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（４１）から（４９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（５１）CDR１として配列番号：１６７に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１６９に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１７１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５２）（５１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：１７３に記載のアミノ酸配列の１１８から４４７位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５３）（５１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５４）CDR１として配列番号：１７９に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１８１に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１８３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５５）（５４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８５に記載のアミノ酸配列の１１３から２１８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５６）（５４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５７）（５１）に記載のH鎖、および（５４）に記載のL鎖を含む抗体、
（５８）（５２）に記載のH鎖、および（５５）に記載のL鎖を含む抗体、
（５９）（５３）に記載のH鎖、および（５６）に記載のL鎖を含む抗体、
（６０）（５１）から（５９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（５１）から（５９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、および
（６１）（１）から（６０）のいずれかに記載の抗体が結合するClaudin3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
〔１５〕前記〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の抗体をClaudin3タンパク質に結合させる工程を含む癌の診断方法。
〔１６〕以下の工程：
（ａ）  被検者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれるClaudin3タンパク質を、Claudin3タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程を含む癌の診断方法。
〔１７〕(1)放射性同位元素で標識されたClaudin3タンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程、および(2)前記放射性同位元素の集積を検出する工程を含む癌の診断方法。
〔１８〕放射性同位元素が、陽電子放出核種である〔１７〕に記載の診断方法。
〔１９〕陽電子放出核種が11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、および124Iからなる群から選択されるいずれかの核種である〔１８〕に記載の診断方法。
〔２０〕癌が、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌からなる群から選択されるいずれかの癌である〔１５〕から〔１９〕のいずれかに記載の診断方法。
〔２１〕癌が、原発性の癌である〔２０〕に記載の診断方法。
〔２２〕癌が、転移性の癌である〔２０〕に記載の診断方法。
〔２３〕Claudin3タンパク質に結合する抗体を含む、癌の診断方法に用いるための診断薬。
〔２４〕Claudin3タンパク質に結合する抗体と、Claudin3タンパク質を含む生体試料を含む、癌の診断方法に用いるためのキット。
〔２５〕Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
〔２６〕Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
〔２７〕Claudin3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
〔２８〕癌が、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌からなる群から選択されるいずれかの癌である、〔２７〕に記載の抗癌剤。
〔２９〕癌が、原発性の癌である〔２８〕に記載の抗癌剤。
〔３０〕癌が、転移性の癌である〔２８〕に記載の抗癌剤。
〔３１〕抗体が、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の抗体である〔２８〕に記載の抗癌剤。
〔３２〕細胞増殖抑制剤の製造における、Claudin3タンパク質に結合する抗体の使用。
〔３３〕抗癌剤の製造における、Claudin3タンパク質に結合する抗体の使用。
〔３４〕癌が、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌からなる群から選択されるいずれかの癌である、〔３３〕に記載の使用。
〔３５〕癌が、原発性の癌である、〔３３〕に記載の使用。
〔３６〕癌が、転移性の癌である、〔３３〕に記載の使用。
〔３７〕抗体が、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の抗体である〔３２〕又は〔３３〕に記載の使用。
〔３８〕Claudin3タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む、細胞増殖を抑制する方法。
〔３９〕Claudin3タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む、癌を予防または治療する方法。
〔４０〕癌が、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌からなる群から選択されるいずれかの癌である、〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕癌が、原発性の癌である、〔３９〕に記載の方法。
〔４２〕癌が、転移性の癌である、〔３９〕に記載の方法。
〔４３〕抗体が、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の抗体である〔３８〕又は〔３９〕に記載の方法。
〔４４〕Claudin3タンパク質を発現する細胞とClaudin3タンパク質に結合する抗体とを接触させる工程を含む、Claudin3タンパク質を発現する細胞に細胞傷害を引き起こす方法。
〔４５〕Claudin3タンパク質を発現する細胞とClaudin3タンパク質に結合する抗体とを接触させる工程を含む、Claudin3タンパク質を発現する細胞の増殖を抑制する方法。
〔４６〕Claudin3タンパク質を発現する細胞が癌細胞である、〔４４〕又は〔４５〕に記載の方法。
〔４７〕抗体が細胞傷害活性を有する抗体である、〔４４〕から〔４６〕のいずれかに記載の方法。
〔４８〕抗体が〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の抗体である、〔４４〕から〔４６〕のいずれかに記載の方法。
〔４９〕癌の治療方法に使用するための、Claudin3タンパク質に結合する抗体。
〔５０〕癌が、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌からなる群から選択されるいずれかの癌である、〔４９〕に記載の抗体。
〔５１〕癌が、原発性の癌である〔５０〕に記載の抗体。
〔５２〕癌が、転移性の癌である〔５０〕に記載の抗体。
〔５３〕〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の抗体である、〔５０〕に記載の抗体。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ヒトClaudinファミリー分子に対するClaudin3細胞外ループのアライメント及びデンドログラムを示す図である。
【図２】ヒト・マウスClaudin3のアミノ酸配列アライメントを示す図である。下線部は予想膜貫通領域を、ボックス部は予想細胞外領域を示す。
【図３】Claudin3を発現するDG44細胞とBa/F3細胞あるいは乳癌細胞株MCF7における抗Claudin3抗体結合反応性の違いを示す図である。（A）Ba/F3細胞、(B)乳癌細胞株MCF7。縦軸,横軸はX Geometric Mean値（蛍光強度(相対値)）を示す。
【図４】Claudin 3細胞外ループペプチド領域に対する抗Claudin3モノクローナル抗体の結合性を示す図である。縦軸は４０５nmにおける吸光度（参照波長６５５nm）を、横軸は抗Claudin3抗体の抗体濃度（ng/ml）を示す。
【図５】抗Claudin 3抗体による抗原発現依存的な細胞傷害活性誘導を示す図である。縦軸は、補体添加による死細胞の増加割合（％）を示す。
【図６】抗Claudin 3抗体によるMCF7細胞に対する補体依存的傷害活性の誘導を示す図である。縦軸は、特異的クロムリリース（％）を示す。
【図７】抗Claudin 3抗体によるMCF7細胞に対する抗体依存的細胞性傷害活性の誘導を示す図である。縦軸は、特異的クロムリリース（％）を示す。
【図８】フローサイトメトリーを用いて、組換えキメラ抗体によるClaudin3強制発現細胞に特異的な結合を示した図である。縦軸は、細胞数（蛍光係数）、横軸は、蛍光強度値を示す。
【図９−１】種々の抗Claudin3抗体の、次の発現細胞に対する結合活性を解析したFACSの結果を示すグラフである（モノクローナル抗体CDN1、CDN2、およびCDN3の結果）。CLD3/3：天然型のClaudin3発現細胞、1/3：CLD1/3キメラ蛋白質発現細胞、3/1:CLD3/1キメラ蛋白質発現細胞、Ba/F3:宿主細胞であるBa/F3。X軸は蛍光強度を、Y軸は各蛍光強度における相対細胞数を示す。
【図９−２】図９−１の続き（抗Claudin3モノクローナル抗体CDN4、CDN5、およびCDN7の結果）。
【図９−３】図９−２の続き（抗Claudin3モノクローナル抗体CDN8、CDN16、およびCDN17の結果）。
【図９−４】図９−３の続き（抗Claudin3モノクローナル抗体CDN24、CDN27、およびCDN28の結果）。
【図９−５】図９−４の続き（抗Claudin3モノクローナル抗体CDN29、CDN30、およびCDN31の結果）。
【図９−６】図９−５の続き（抗Claudin3モノクローナル抗体CDN32、CDN33、およびCDN35の結果）。
【図９−７】図９−６の続き（抗Claudin3モノクローナル抗体CDN36、CDN37、およびCDN38の結果）。
【図９−８】図９−７の続き（抗Claudin3抗血清［２００倍希釈］、抗Claudin3抗血清［１０００倍希釈］、および未添加陰性の結果）。
【図１０】図９−１から図９−７で示したヒストグラムプロット横軸相対蛍光強度100以上の細胞の全細胞に対する割合を示すグラフである。
【図１１】フローサイトメトリー法による組換えキメラ抗体がClaudin3強制発現細胞への結合する結果を示す図である。縦軸は細胞数（蛍光係数）、横軸は蛍光強度を示す。灰色点線、黒色実線はそれぞれキメラ抗体未添加、添加時の細胞蛍光強度分布を表す。
【図１２】軟寒天コロニー形成/MTTハイブリッドアッセイ系において抗Claudin3抗体がMCF7細胞の増殖を抑制する様子を示すグラフである。
【図１３】wound-healingアッセイにおいて、抗Claudin3抗体(CDN04)添加により細胞運動能が抑制される様子を示す写真である。点線ではさまれた領域の細胞が剥離処理後移動した細胞である。
【００２１】
〔発明の実施の形態〕
Claudin3は、claudinファミリーに属する蛋白質の一つであって、細胞間透過性を制御する構造蛋白質である。ヒトClaudin3のアミノ酸配列およびこれをコードする塩基配列は、それぞれ配列番号：２および配列番号：１に示した(GenBank Accession No. NM_001306)。本発明において、モノクローナル抗体が認識するClaudin3タンパク質は、天然のClaudin3蛋白質の立体構造を維持したタンパク質をいう。また本発明のモノクローナル抗体は、好ましくはClaudin3の細胞外領域を認識して結合する。Claudin3タンパク質の細胞外領域は配列番号：２のアミノ酸配列において３０−８０番目（ループ１）、及び配列番号：２のアミノ酸配列において１３７−１５９番目（ループ２）が相当する。【００２２】
これらの細胞外領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、細胞表面のClaudin3の立体構造を維持している限り、本発明のモノクローナル抗体は当該ポリペプチドを認識することができる。本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、細胞表面に発現した天然のClaudin3の立体構造を維持したポリペプチドに結合する。ポリペプチドが、天然のClaudin3の立体構造を維持していることは、たとえば次のようにして確認することができる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体と、Claudin3を細胞表面に発現している細胞との免疫学的な結合があるポリペプチドによって阻害されるとき、当該ポリペプチドは、天然のClaudin3の細胞外領域の立体構造を維持していることが確認できる。【００２３】
特に、本発明の好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は、Claudin3の２つの細胞外ループ領域によって構成される立体構造からなるエピトープを認識する。本発明において、立体構造からなるエピトープとは、１つあるいは複数のペプチド鎖間の相互作用によって構成された構造を含む。このようなエピトープは、立体構造エピトープ(conformational epitope)とも呼ばれる。たとえば、Claudin3の細胞外ドメインを構成する２つのループの間の相互作用によって構成されるエピトープは、本発明における立体構造からなるエピトープに含まれる。すなわち本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、Claudin3の２つの細胞外ループによって構成される立体構造エピトープを認識する。【００２４】
モノクローナル抗体が立体構造エピトープを認識することは、たとえば次のようにして確認することができる。たとえば、Claudin3の細胞外ループを構成するアミノ酸配列からなる線状のペプチドを合成する。当該ペプチドは、化学的に合成することができる。あるいは、Claudin3のcDNA中の、ループ部分に相当するアミノ酸配列をコードする領域を利用して、遺伝子工学的手法により得ることもできる。次に、ループ部分を構成するアミノ酸配列からなる線状ペプチドと、被験抗体との結合活性が評価される。たとえば、固定化された線状ペプチドを抗原とするELISAによって、当該ペプチドに対する被験抗体の結合活性を評価することができる。あるいは、Claudin3発現細胞に対する被験抗体の結合における、線状ペプチドによる阻害のレベルに基づいて、線状ペプチドに対する結合活性を明らかにすることもできる。これらの試験によって、線状ペプチドに対する被験抗体の結合活性を明らかにすることができる。【００２５】
本発明において、Claudin3発現細胞に結合する抗体が、線状ペプチドに対しても結合活性を有するとき、「抗体が線状ペプチドに交叉性を有する」という。本発明における好ましいモノクローナル抗体は、Claudin3の細胞外ループを構成するアミノ酸配列からなる線状ペプチドとの交叉性を実質的に持たない抗体である。線状ペプチドに対する交叉性を実質的に持たないとは、Claudin3発現細胞に対する抗体の結合活性と比較して、線状ペプチドに対する結合活性が、たとえば５０％以下、通常３０％以下、好ましくは２０％以下であることをいう。【００２６】
本発明のモノクローナル抗体が立体構造エピトープを認識することは、次のようにして確認することもできる。まず、Claudin3の２つの細胞外ループを、それぞれ他のClaudin3様分子の細胞外ループと連結したキメラ分子を発現する細胞を用意する。Claudin3様分子としては、たとえばヒトClaudin1を用いることができる。すなわち、次のような構成のキメラ分子を発現する強制発現細胞を作成する。
３／１キメラ  １／３キメラ    Native
ループ１    Claudin3      Claudin1    Claudin3
ループ２    Claudin1      Claudin3    Claudin3【００２７】
これらの強制発現細胞に被験抗体を接触させ、NativeタイプのClaudin3発現細胞に対する結合活性に比べて、３／１キメラ発現細胞および１／３キメラ発現細胞の双方に対する結合活性が低いモノクローナル抗体は、Claudin3の立体構造エピトープを認識する抗体である。前記のように、たとえばClaudin3の細胞外ドメインを構成する２つのループの間の相互作用によって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明におけるClaudin3の立体構造エピトープを認識する抗体の好ましい態様の一つである。より具体的に表現すれば、本発明における好ましいモノクローナル抗体は、ヒトClaudin3を強制発現した細胞に強く結合する一方、３／１キメラ発現細胞および１／３キメラ発現細胞の双方に対して、実質的に結合しない。ここで、実質的に結合しないとは、ヒトClaudin3発現細胞に対する結合活性の８０％以下、通常５０％以下、好ましくは３０％以下、特に好ましくは１５％以下の結合活性をいう。【００２８】
細胞に対する抗体の結合活性を測定する方法としては、例えば、Antibodies A Laboratory Manual.（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）中の359 - 420ページに記載されている方法が挙げられる。即ち、細胞を抗原とするELISAやFACS（fluorescence activated cell sorting）の原理によって評価することができる。【００２９】
ELISAフォーマットにおいては、細胞への抗体の結合活性は、酵素反応によって生成するシグナルレベルを比較することによって定量的に評価される。すなわち、各強制発現細胞を固定化したELISAプレートに被験抗体を加え、細胞に結合した抗体が、被験抗体を認識する酵素標識抗体を利用して検出される。あるいはFACSにおいては、被験抗体の希釈系列を作成し、各強制発現細胞に対する抗体結合力価(titer)を決定することにより、細胞に対する結合活性を比較することができる。【００３０】
緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原に対する抗体の結合は、フローサイトメーターによって検出することができる。フローサイトメーターとしては、例えば、次のような装置が知られている。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM （いずれもBD Biosciences社の商品名）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC     EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC（いずれもBeckman Coulter社の商品名）【００３１】
被験Claudin3抗体の抗原に対する結合活性の好適な測定方法の一例として、次の方法を挙げることができる。まず、Claudin3を発現する細胞と反応させた被験抗体を認識するFITC標識した二次抗体で染色する。被験抗体の濃度は適宜好適な緩衝液によって希釈することによって所望の濃度に調整して用いることができる。例えば、10μg/mlから10ng/mlまでの間のいずれかの濃度で使用することができる。次に、FACSCalibur (BD社) により蛍光強度と細胞数を測定する。当該細胞に対する抗体の結合量は、CELL QUEST Software (BD社) を用いて解析することにより得られた蛍光強度、すなわちGeometric Meanの値に反映する。すなわち、当該Geometric Meanの値を得ることにより、抗体の結合量によって表される抗体の結合活性を測定することができる。
本方法において、例えば「３／１キメラ発現細胞に実質的に結合しない」ことは、以下の方法によって判断することができる。まず、前記３／１キメラ分子を発現する細胞に対して結合した被験抗体を、二次抗体で染色する。たとえば、被験抗体がマウスの抗体であれば、FITC標識した抗マウスイムノグロブリン抗体を二次抗体として利用することができる。次いで細胞の蛍光強度を検出する。蛍光検出にフローサイトメトリーとしてFACSCaliburを用いた場合、得られた蛍光強度はCELL QUEST Softwareを用いて解析することができる。被験抗体存在下および非存在下でのGeometric Meanの値から、この比（ΔGeo-Mean）を下記の計算式に基づいて算出することにより、被験抗体の結合による蛍光強度の増加割合を求めることができる。
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean（被験抗体存在下）／Geo-Mean（被験抗体非存在下）
解析によって得られる被験抗体の３／１キメラ分子発現細胞に対する結合量が反映されたGeometric Mean比値（３／１キメラ分子ΔGeo-Mean値）を、被験抗体のClaudin3発現細胞に対する結合量が反映されたΔGeo-Mean比値と比較する。この場合において、３／１キメラ分子発現細胞及びClaudin3発現細胞に対するΔGeo-Mean比値を求める際に使用する被験抗体の濃度は互いに同一又は実質的に同一の濃度で調整することが特に好ましい。対照抗体としては、予めClaudin3の立体構造エピトープを認識していることが確認されたモノクローナル抗体を利用することができる。たとえば、図９に示した次の本発明のモノクローナル抗体は、Claudin3の立体構造エピトープを認識する抗体として利用することができる。
CDN 01, CDN 02, CDN 03, CDN 04, CDN 05, CDN 07, CDN 08, 
CDN 16, CDN 17, CDN 24, CDN 27, CDN 28, CDN 29, 
CDN 30, CDN 31, CDN 32, CDN 33, CDN 35, CDN 36, CDN 37, あるいはCDN 38
本発明においては、被験抗体の３／１キメラ分子発現細胞に対するΔGeo-Mean比値が、被験抗体のCludin3発現細胞に対するΔGeo-Mean比値の、少なくとも８０％、好ましくは５０％、更に好ましくは３０％、特に好ましくは１５％より小さければ、「３／１キメラ分子発現細胞に実質的に結合しない」ものとする。Geo-Mean値 (Geometric Mean) を求める計算式は、CELL QUEST Software User’s Guide (BD biosciences社)に記載されている。１／３キメラ分子発現細胞に対する結合活性も同様にして評価することができる。公知の結合活性の評価に用いる、３／１キメラ分子、１／３キメラ分子、そしてClaudin3の各分子を発現する細胞は、いずれも共通の発現ベクターと宿主細胞を利用して調製し、それぞれの細胞での発現量が同等程度であることが好ましい。【００３２】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトClaudin3発現細胞に結合し、かつヒトClaudin3の細胞外ループおよびヒトClaudin1の細胞外ループを含むキメラ分子を発現する細胞に対する結合活性が、前記ヒトClaudin3発現細胞に対する結合活性よりも低いモノクローナル抗体を含む。あるいは本発明の好ましいモノクローナル抗体は、ヒトClaudin3発現細胞に結合し、かつヒトClaudin3の細胞外ループおよびヒトClaudin1の細胞外ループを含むキメラ分子を発現する細胞に対して実質的に結合しないモノクローナル抗体を含む。【００３３】
抗Claudin3モノクローナル抗体の作製：
本発明のモノクローナル抗体は、DNA免疫(DNA Immunization)によって得ることができる。本発明の抗Claudin3モノクローナル抗体は、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。【００３４】
本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、DNA免疫を使用し、以下のようにして作製できる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
−Claudin3のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
−免疫抗原を精製する必要が無い【００３５】
しかし一方で、DNA免疫においては、アジュバントなどの免疫刺激手段と組み合わせることが困難である。Claudin3のヒト−マウス間の同一性は、特に細胞外領域を構成するループ１においては、４６／５１ときわめて高い。このような種間で同一性の高いタンパク質を認識するモノクローナル抗体がDNA免疫によって得られたことは、予想外の成果である。【００３６】
DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、Claudin3タンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。Claudin3をコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、gene gunで細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。【００３７】
本発明者の知見によれば、Claudin 3強制発現細胞を腹腔内に投与することによって免疫したマウスからはClaudin3結合性抗体を産生するハイブリドーマを効率よく得ることができなかった。一方、DNA免疫を利用して免疫したマウスからはClaudin3結合性の抗体を産生するハイブリドーマを効率よく取得することができた。特に、DNA免疫の後に、更にClaudin 3強制発現細胞を投与したマウスにおいて、目的とするハイブリドーマを容易に取得することができた。すなわち、DNA免疫後に、Claudin3発現細胞による追加免疫(boost)を行うことは、本発明のモノクローナル抗体を得る好ましい方法である。【００３８】
本発明においては、任意の非ヒト動物を免疫動物として利用することができる。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。【００３９】
このように免疫動物が免疫され、血清中における目的とする抗体価の上昇が確認された後に、免疫動物から抗体産生細胞を採取し、クローニングされる。好ましい免疫細胞（抗体産生細胞）は、脾細胞である。【００４０】
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。【００４１】
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅する。他方、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明のモノクローナル抗体の製造に利用することができる。
P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123, 1548-1550）
P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）
NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）
MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）
SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）
FO（de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）
S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、
R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等【００４２】
基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。【００４３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。【００４４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。【００４５】
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、Claudin3を認識する抗体を国際公開WO03/104453に記載された方法によって作製することもできる。【００４６】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングが、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、本発明における好ましいモノクローナル抗体は、細胞表面に発現したClaudin3に結合することができる。このようなモノクローナル抗体は、たとえば、FACS(fluorescence activated cell sorting)によってスクリーニングすることができる。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞をレーザー光で解析し、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面への抗体の結合を測定することができるシステムである。【００４７】
FACSによって本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするためには、まずClaudin3を発現する細胞を準備する。スクリーニングのための好ましい細胞は、Claudin3を強制発現させた哺乳動物細胞である。宿主とした形質転換されていない哺乳動物細胞を対照として用いることによって、細胞表面のClaudin3に対する抗体の結合活性を選択的に検出することができる。すなわち、宿主に結合せず、Claudin3強制発現細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、本発明における好ましいモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。【００４８】
あるいは固定化したClaudin3発現細胞に対する抗体の結合活性をELISAの原理で評価することもできる。たとえば、ELISAプレートのウェルにClaudin3発現細胞が固定化される。ハイブリドーマの培養上清をウェル内の固定化細胞に接触させ、固定化細胞に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出することができる。これらのスクリーニングによって選択された、抗原に対する結合能を有する目的とする抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングすることができる。【００４９】
あるいは、Claudin3の立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体を得るためにたとえば次のようなスクリーニングを行うことができる。まず、Claudin3の２つの細胞外ループを、それぞれ他のClaudin3様分子の細胞外ループと連結したキメラ分子を発現する細胞を用意する。Claudin3様分子としては、たとえばヒトClaudin1を用いることができる。すなわち、次のような構成のキメラ分子を発現する強制発現細胞を作成する。
３／１キメラ  １／３キメラ    Native
ループ１    Claudin3      Claudin1    Claudin3
ループ２    Claudin1      Claudin3    Claudin3
これらの強制発現細胞に被験抗体を接触させ、NativeタイプのClaudin3発現細胞に対する結合活性に比べて、３／１キメラ発現細胞および１／３キメラ発現細胞の双方に対する結合活性が低いモノクローナル抗体を選択することによって、本発明におけるClauidn3の立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体を得ることができる。スクリーニングのための好ましい細胞は、哺乳動物細胞である。これらの細胞に対するモノクローナル抗体の反応性は、細胞を抗原として利用するELISAや、FACSによって確認することができる。【００５０】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。【００５１】
本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775参照）。【００５２】
たとえば、抗Claudin3抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗Claudin3抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）
AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）【００５３】
抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA 増幅キット（Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）を利用することができる。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。【００５４】
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認できる。【００５５】
可変領域をコードする遺伝子を得るためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使った5’-RACE法を利用するのがもっとも簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出されたRNAを鋳型としてcDNAを合成し、5’-RACE cDNAライブラリーを得る。5’-RACE cDNAライブラリーの合成にはSMART RACE cDNA 増幅キットなど市販のキットを用いるのが便利である。【００５６】
得られた5’-RACE cDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(ロシュ・ダイアグノスティックス)などの市販キットを用いて決定しておくことが望ましい。【００５７】
具体的には、たとえばマウスIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１、γ2a、γ2b、γ3軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、5’ RACE cDNAライブラリー作製キットに付属するプライマーが利用できる。【００５８】
こうして増幅されたPCR産物を利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、Claudin3に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。
たとえばClaudin3に対する抗体の取得を目的とするとき、抗体のClaudin3への結合は、特異的であることがさらに好ましい。Claudin3に結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングすることができる。
(１)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をClaudin3発現細胞に接触させる工程、
(２)Claudin3発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(３)Claudin3発現細胞に結合する抗体を選択する工程【００５９】
抗体とClaudin3発現細胞との結合を検出する方法は公知である。具体的には、先に述べたFACSなどの手法によって、抗体とClaudin3発現細胞との結合を検出することができる。抗体の結合活性を評価するためにClaudin3を発現する細胞の固定標本を利用することもできる。【００６０】
結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv(scFv)とすることができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、scFvを表面に発現するファージを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するscFvを濃縮することができる。【００６１】
本発明において抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の全長をコードしていてもよいし、あるいは抗体の一部をコードしていてもよい。抗体の一部とは、抗体分子の任意の部分をいう。以下、抗体の一部を示す用語として、抗体断片を用いる場合がある。本発明における好ましい抗体断片は、抗体の相補鎖決定領域(complementarity determination region;CDR)を含む。更に好ましくは、本発明の抗体断片は、可変領域を構成する３つのCDRの全てを含む。【００６２】
目的とする抗Claudin3抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素が好ましい。上記のように消化された抗Claudin3抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターを得ることができる。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させることによって、キメラ抗体を得ることができる。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス−ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト−ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入して、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列を配置しておくことができる。両者を同じ組み合わせの制限酵素で消化し、インフレームで融合させることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。【００６３】
本発明の抗Claudin3モノクローナル抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗Claudin3抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。【００６４】
抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換(co-transfect)することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO 94/11523参照）。【００６５】
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
（１）哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK （baby hamster kidney ）、Hela、Veroなど
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など【００６６】
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces ）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus ）属【００６７】
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E. coli ）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
これらの細胞中に、目的とする抗体遺伝子を含む発現ベクターを形質転換により導入する。形質転換された細胞をin vitroで培養することにより、該形質転換細胞の培養物から所望の抗体を取得できる。【００６８】
また、組換え抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。【００６９】
本発明の組換え抗体のC領域として、動物抗体由来のＣ領域を使用できる。例えばマウス抗体のH鎖C領域としては、Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεが、L鎖C領域としてはCκ、Cλが使用できる。また、マウス抗体以外の動物抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物抗体が使用できる。これらの配列は公知である。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、C領域を修飾することができる。【００７０】
本発明において、抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。【００７１】
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。【００７２】
例えばH鎖においては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、およびCεをC領域として利用することができる。またL鎖においてはCκ、およびCλをC領域として使用できる。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾することができる。【００７３】
一般にキメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成される。これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity determining region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework region）およびヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。【００７４】
たとえば本発明に基づいて作成された抗Claudin3モノクローナル抗体の可変領域と、ヒト定常領域を構成するアミノ酸配列と連結することによって得られるマウス−ヒトキメラ抗体は、本発明におけるモノクローナル抗体として好ましい。すなわち本発明は、次の（１）〜（６）いずれかのアミノ酸配列を含むH鎖の可変領域とL鎖の可変領域とを含む、マウス−ヒトキメラモノクローナル抗体を提供する。
（１）CDN04
H鎖：配列番号：１８に記載のアミノ酸配列
L鎖：配列番号：３０に記載のアミノ酸配列
（２）CDN16
H鎖：配列番号：４２に記載のアミノ酸配列
L鎖：配列番号：５２に記載のアミノ酸配列
（３）CDN27
H鎖：配列番号：６２に記載のアミノ酸配列
L鎖：配列番号：７２に記載のアミノ酸配列
（４）CDN28
H鎖：配列番号：８２に記載のアミノ酸配列
L鎖：配列番号：９２に記載のアミノ酸配列
（５）CDN35
H鎖：配列番号：１０２に記載のアミノ酸配列
L鎖：配列番号：１１２に記載のアミノ酸配列
（６）CDN38
H鎖：配列番号：１６５に記載のアミノ酸配列
L鎖：配列番号：１７７に記載のアミノ酸配列
また、本発明は、このようなマウス−ヒトキメラ抗体の一例として、CDN38の可変領域とヒト定常領域とを連結することによって得られる、配列番号：１７５に記載のアミノ酸配列を含むH鎖と、配列番号：１８７に記載のアミノ酸配列を含むL鎖とを含むマウス−ヒトキメラ抗体を提供する。【００７５】
抗体の可変領域は、通常、４つのフレーム(FR)にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。【００７６】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。【００７７】
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。【００７８】
最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400 、国際公開WO 96/02576参照）。【００７９】
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。【００８０】
また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得できる。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のＶ領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製できる。該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより該ヒト抗体が取得できる。これらの方法は既に公知である（国際公開WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388）。【００８１】
本発明のモノクローナル抗体には、Claudin3タンパク質に結合する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明でのモノクローナル抗体は、抗体の全長分子に限られず、Claudin3タンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。【００８２】
低分子化抗体は、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含む。Claudin3抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにClaudin3抗原への結合能を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。【００８３】
抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。【００８４】
消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
パパイン消化：F(ab)2またはFab
ペプシン消化：F(ab’)2またはFab’
プラスミン消化：Facb【００８５】
したがって、本発明における低分子化抗体は、Claudin3に対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片であることができる。更に、特に、本発明による癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい低分子化抗体は、Claudin3に対する結合親和性とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、ADCC活性およびCDC活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性およびCDC活性のいずれか、または両方をエフェクター機能として備える。【００８６】
Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。Diabodyは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。Diabodyにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、Diabodyは2つの抗原結合部位を有することとなる。【００８７】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883.)。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。【００８８】
Ｖ領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
前記抗体のH鎖またはH鎖Ｖ領域をコードするDNA配列、および
前記抗体のL鎖またはL鎖Ｖ領域をコードするDNA配列【００８９】
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によってH鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。【００９０】
アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5’側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。【００９１】
また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。【００９２】
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］【００９３】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、更に好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。【００９４】
ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１４９）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：１５０）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１５１）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１５２）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１５３）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１５４）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１５５）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１５６）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１５７）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１５８）)n
［nは１以上の整数である］【００９５】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば前記ペプチドリンカーの長さを決定するｎは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１または２である。
よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる。
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］【００９６】
あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してV領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。
N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、および
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など【００９７】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明において好ましい低分子化抗体はDiabody又はsc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。【００９８】
本発明のモノクローナル抗体としては、Claudin3を認識して結合する任意の抗体が含まれる。たとえば以下（１）から（６１）に記載の抗体が好ましい抗体として例示できる。これらの抗体は、例えば、全長抗体、低分子化抗体、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体であってよい。
（１）CDR１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２）（１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２０に記載のアミノ酸配列の１３９から４６２位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３）（１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４）CDR１として配列番号：２４に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５）（４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３２に記載のアミノ酸配列の
１３５から２４０位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（６）（４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（７）（１）に記載のH鎖、および（４）に記載のL鎖を含む抗体、
（８）（２）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
（９）（３）に記載のH鎖、および（６）に記載のL鎖を含む抗体、
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（１１）CDR１として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：３８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１２）（１１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：４４に記載のアミノ酸配列の１４０から４７６位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１３）（１１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（１４）CDR１として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：４８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１５）（１４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：５４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１６）（１４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（１７）（１１）に記載のH鎖、および（１４）に記載のL鎖を含む抗体、
（１８）（１２）に記載のH鎖、および（１５）に記載のL鎖を含む抗体、
（１９）（１３）に記載のH鎖、および（１６）に記載のL鎖を含む抗体、
（２０）（１１）から（１９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１１）から（１９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（２１）CDR１として配列番号：５６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２２）（２１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：６４に記載のアミノ酸配列の１３７から４７１位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２３）（２１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（２４）CDR１として配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：６８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：７０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２５）（２４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：７４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２６）（２４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（２７）（２１）に記載のH鎖、および（２４）に記載のL鎖を含む抗体、
（２８）（２２）に記載のH鎖、および（２５）に記載のL鎖を含む抗体、
（２９）（２３）に記載のH鎖、および（２６）に記載のL鎖を含む抗体、
（３０）（２１）から（２９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（２１）から（２９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（３１）CDR１として配列番号：７６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：７８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：８０に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３２）（３１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：８４に記載のアミノ酸配列の１４０から４６３位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３３）（３１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（３４）CDR１として配列番号：８６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：８８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：９０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３５）（３４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：９４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３６）（３４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（３７）（３１）に記載のH鎖、および（３４）に記載のL鎖を含む抗体、
（３８）（３２）に記載のH鎖、および（３５）に記載のL鎖を含む抗体、
（３９）（３３）に記載のH鎖、および（３６）に記載のL鎖を含む抗体、
（４０）（３１）から（３９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（３１）から（３９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（４１）CDR１として配列番号：９６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：９８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１００に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４２）（４１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：１０４に記載のアミノ酸配列の１４０から４７４位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４３）（４１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（４４）CDR１として配列番号：１０６に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１０８に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１１０に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４５）（４４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：１１４に記載のアミノ酸配列の１３３から２３８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４６）（４４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（４７）（４１）に記載のH鎖、および（４４）に記載のL鎖を含む抗体、
（４８）（４２）に記載のH鎖、および（４５）に記載のL鎖を含む抗体、
（４９）（４３）に記載のH鎖、および（４６）に記載のL鎖を含む抗体、
（５０）（４１）から（４９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（４１）から（４９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（５１）CDR１として配列番号：１６７に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１６９に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１７１に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５２）（５１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：１７３に記載のアミノ酸配列の１１８から４４７位のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５３）（５１）に記載のH鎖であって、ＣＨとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
（５４）CDR１として配列番号：１７９に記載のアミノ酸配列、CDR２として配列番号：１８１に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１８３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５５）（５４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：１８５に記載のアミノ酸配列の１１３から２１８位のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５６）（５４）に記載のL鎖であって、ＣＬとして配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
（５７）（５１）に記載のH鎖、および（５４）に記載のL鎖を含む抗体、
（５８）（５２）に記載のH鎖、および（５５）に記載のL鎖を含む抗体、
（５９）（５３）に記載のH鎖、および（５６）に記載のL鎖を含む抗体、
（６０）（５１）から（５９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（５１）から（５９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、および
（６１）（１）から（６０）のいずれかに記載の抗体が結合するClaudin3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。【００９９】
本発明において、好ましいモノクローナル抗体は、CDRのアミノ酸配列として、CDN04、CDN16、CDN27、CDN28、CDN35、CDN38のいずれかに由来する重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3を構成するアミノ酸配列を含む。これらのモノクローナル抗体のCDRのアミノ酸配列は、次のとおりである。したがって、以下の配列番号に示すアミノ酸配列からなるCDRを可変領域に含むモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体として好ましい。たとえば、各モノクローナル抗体についてV領域配列および全長アミノ酸配列は、それぞれ以下に示す配列番号のとおりである。これらのアミノ酸配列をV領域として含むモノクローナル抗体は、本発明における好ましいモノクローナル抗体として示すことができる。
-------------------------------------------------------
重鎖                    軽鎖  
-------------------------------------------------------
CDR1  配列番号：１２     配列番号：２４
CDN04  CDR2  配列番号：１４     配列番号：２６
CDR3  配列番号：１６     配列番号：２８
［CDN04V領域  配列番号：１８     配列番号：３０］
［CDN04C領域  配列番号：２０     配列番号：３２
の１３９-４６２位    の１３５-２４０位］
［CDN04全長   配列番号：２０     配列番号：３２］
-------------------------------------------------------
CDR1  配列番号：３６     配列番号：４６
CDN16  CDR2  配列番号：３８     配列番号：４８
CDR3  配列番号：４０     配列番号：５０
［CDN16V領域  配列番号：４２     配列番号：５２］
［CDN16C領域  配列番号：４４     配列番号：５４
の１４０-４７６位    の１３３-２３８位］
［CDN16全長   配列番号：４４     配列番号：５４］
-------------------------------------------------------
CDR1  配列番号：５６     配列番号：６６
CDN27  CDR2  配列番号：５８     配列番号：６８
CDR3  配列番号：６０     配列番号：７０
［CDN27V領域  配列番号：６２     配列番号：７２］
［CDN27C領域  配列番号：６４     配列番号：７４
の１３７-４７１位    の１３３-２３４位］
［CDN27全長   配列番号：６４     配列番号：７４］
-------------------------------------------------------
CDR1  配列番号：７６     配列番号：８６
CDN28  CDR2  配列番号：７８     配列番号：８８
CDR3  配列番号：８０     配列番号：９０
［CDN28V領域  配列番号：８２     配列番号：９２］
［CDN28C領域  配列番号：８４     配列番号：９４
の１４０-４６３位    の１３３-２３８位］
［CDN28全長   配列番号：８４     配列番号：９４］
-------------------------------------------------------
CDR1  配列番号：９６     配列番号：１０６
CDN35  CDR2  配列番号：９８     配列番号：１０８
CDR3  配列番号：１００   配列番号：１１０
［CDN35V領域  配列番号：１０２   配列番号：１１２］
［CDN35C領域  配列番号：１０４   配列番号：１１４
の１４０-４７４位    の１３３-２３８位］
［CDN35全長   配列番号：１０４   配列番号：１１４］
-------------------------------------------------------
CDR1 配列番号：１６７   配列番号：１７９
CDN38    CDR2 配列番号：１６９   配列番号：１８１
CDR3 配列番号：１７１   配列番号：１８３
［CDN38V領域  配列番号：１６５   配列番号：１７７］
［CDN38C領域  配列番号：１７３   配列番号：１８５
の１１８-４４７位    の１１３-２１８位］
［CDN38全長   配列番号：１７３   配列番号：１８５］
-------------------------------------------------------【０１００】
本発明のモノクローナル抗体は、前記CDRを含む可変領域に加えて、定常領域を含むことができる。各モノクローナル抗体の定常領域を含む全長配列は、それぞれ上記のとおりである。更に、本発明のモノクローナル抗体を構成する定常領域として、たとえば次のようなヒト由来のアミノ酸配列を示すことができる。
配列番号：２１（ヒトIgG1_CH配列）    配列番号：３３（ヒトIgG1_CLkappa配列）
配列番号：２２（ヒトIgG1_CH配列）    配列番号：３４（ヒトIgG1_CLkappa配列）【０１０１】
したがって、前記CDR1,2,3を含む可変領域に、上記の配列番号に示すヒト由来のアミノ酸配列からなる定常領域を接合したモノクローナル抗体は、本発明における好ましいモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体として、上記（３）、（１３）、（２３）、（３３）、（４３）、および（５３）に記載されたモノクローナル抗体を示すことができる。これらのモノクローナル抗体は、軽鎖として、それぞれ、上記（６）、（１６）、（２６）、（３６）、（４６）、および（５６）に記載された軽鎖を含むことができる。【０１０２】
上記（１０）、（２０）、（３０）、（４０）、（５０）、（６０）に記載の抗体の好ましい態様は、CDRに改変が生じていない抗体である。一例として、上記（１０）に記載の抗体のうち、「（１）に記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）に記載の抗体と同等の活性を有する抗体」の好ましい態様は、「（１）に記載の抗体と同等の活性を有し、（１）に記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、CDR1として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、およびCDR３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体」である。上記（１０）、（２０）、（３０）、（４０）、（５０）、（６０）に記載の抗体のうち、その他の抗体の好ましい態様も同様に表現することができる。【０１０３】
ポリペプチドに変異を導入する方法は、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。【０１０４】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）【０１０５】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 ）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いとされている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換という。【０１０６】
また本発明は、本願発明で開示されたモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。すなわち本発明は、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体と、その用途に関する。このような抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。【０１０７】
被験抗体が、ある抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合すること、即ちある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。本発明において、抗体間の競合は、FACSや交叉ブロッキングアッセイなどによって検出することができる。FACSにおいては、まず本発明のモノクローナル抗体をClaudin3発現細胞に結合させて蛍光シグナルが測定される。次に、候補の競合抗体を反応後に本発明のモノクローナル抗体を同じ細胞と反応させて、同様にFACSにより解析する。あるいは、本発明のモノクローナル抗体と被験競合抗体とを同時に同じ細胞に反応させることもできる。競合抗体を反応させたときに、本発明のモノクローナル抗体のFACSの解析パターンが変化すれば、競合抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープを認識することが確認できる。【０１０８】
その他、例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にClaudin3タンパク質を発現した細胞が固定される。候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、本発明のモノクローナル抗体が添加される。ウェル中のClaudin3タンパク質発現細胞に結合した本発明のモノクローナル抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能と逆相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明のモノクローナル抗体のClaudin3タンパク質発現細胞を固定したウェルへの結合量は低下する。あるいは逆に、同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、被験抗体のClaudin3タンパク質発現細胞を固定したウェルへの結合量は増加する。【０１０９】
ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイという。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。【０１１０】
更に被験抗体が本発明のモノクローナル抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合したいずれかの抗体を、いずれかの種に由来する定常領域を特異的に認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを特異的に識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。【０１１１】
候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０-５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、本発明のモノクローナル抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明のモノクローナル抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。【０１１２】
モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体としては、例えば、上記（６１）に記載の抗体が挙げられる。
また、上記（１）から（６１）に記載の抗体には、上述の通り、一価抗体だけでなく、多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。【０１１３】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などを結合することも可能である。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。尚、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。また後に述べるように、claudin3タンパク質のみならず、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などを認識するように遺伝子組換え技術を用いて設計した二重特異性抗体(bispecific antibody)のような分子型として取得することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。【０１１４】
本発明のモノクローナル抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる。
azaribine、anastrozole、azacytidine、bleomycin、bortezomib、
bryostatin-1、busulfan、camptothecin、10-hydroxycamptothecin、carmustine、
celebrex、chlorambucil、cisplatin、irinotecan、carboplatin、cladribine、
cyclophosphamide、cytarabine、dacarbazine、docetaxel、dactinomycin、
daunomycin glucuronide、daunorubicin、dexamethasone、diethylstilbestrol、
doxorubicin、doxorubicin glucuronide、epirubicin、ethinyl estradiol、
estramustine、etoposide、etoposide glucuronide、floxuridine、fludarabine、
flutamide、fluorouracil、fluoxymesterone、gemcitabine、
hydroxyprogesterone caproate、hydroxyurea、idarubicin、ifosfamide、
leucovorin、lomustine、mechlorethamine、medroxyprogesterone acetate、
megestrol acetate、melphalan、mercaptopurine、methotrexate、mitoxantrone、
mithramycin、mitomycin、mitotane、phenylbutyrate、prednisone、procarbazine、
paclitaxel、pentostatin、semustine streptozocin、tamoxifen、taxanes、
taxol、testosterone propionate、thalidomide、thioguanine、
thiotepa, teniposide、topotecan、uracil mustard、vinblastine、
vinorelbine、vincristine【０１１５】
本発明において、好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常１００〜２０００、好ましくは２００〜１０００の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。【０１１６】
また、ricin、abrin、ribonuclease、onconase、DNase I、Staphylococcal enterotoxin-A、pokeweed antiviral protein、gelonin、diphtheria toxin、Pseudomonas exotoxin、Pseudomonas endotoxin、L-asparaginase、PEG L-Asparaginaseなどの毒性ペプチドで抗体を修飾することもできる。また別の態様では、一または二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。モノクローナル抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合または非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。【０１１７】
更に、タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗Claudin3抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素を配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。【０１１８】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいう。本発明において、二重特異性抗体はClaudin3分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のClaudin3に対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。【０１１９】
あるいは、一方の抗原結合部位がClaudin3を認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、Claudin3を発現している細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質をClaudin3発現細胞に直接作用させることができる。すなわち細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体によって、腫瘍細胞を特異的に傷害し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。【０１２０】
また本発明においては、Claudin3以外の抗原を認識する二重特異性抗体を組み合わせることもできる。たとえば、Claudin3と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、Claudin3とは異なる抗原を認識するような二重特異性抗体を組み合わせることができる。【０１２１】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。【０１２２】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。【０１２３】
また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。【０１２４】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。【０１２５】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。【０１２６】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素のグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。【０１２７】
発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカー挿入することができる。具体的には、次のような選択マーカーを利用することができる。
アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、
チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、
ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等【０１２８】
本発明のモノクローナル抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系が使用できる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられる。原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、哺乳類細胞を用いて発現される。哺乳類細胞としては、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、Hela細胞などを利用することができる。【０１２９】
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。【０１３０】
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。【０１３１】
抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。【０１３２】
本発明のモノクローナル抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、次のような抗体が公知である。
グリコシル化が修飾された抗体（WO99/54342など）、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など））、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）など【０１３３】
本発明におけるモノクローナル抗体は、好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。【０１３４】
本発明において、モノクローナル抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。【０１３５】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。
（１）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。【０１３６】
（２）補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement（CEDARLANE社製）を10％ FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
（３）標的細胞の調製
Claudin3タンパク質を発現する細胞を0.2 ｍCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％ FBS含有DMEM培地中で37℃にて１時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。Claudin3タンパク質を発現する細胞としては、Claudin3タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌細胞等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％ FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。【０１３７】
ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗Claudin3抗体を50 μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100 μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C) / (B-C) x 100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％ NP-40（nacalai tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。【０１３８】
一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗Claudin3抗体を50 μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100 μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は0または3 μg/mlとする。培養後、100 μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。【０１３９】
一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗Claudin3抗体コンジュゲートを50 μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。炭酸ガスインキュベーター内で１から４時間培養する。抗体の終濃度は0または3 μg/mlとする。培養後、100 μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。【０１４０】
本発明において、モノクローナル抗体が増殖を抑制する細胞は、Claudin3タンパク質が発現している細胞であれば特に限定されない。好ましいClaudin3発現細胞は、たとえば癌細胞である。より好ましくは、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌細胞である。従って、抗Claudin3抗体は、細胞増殖に起因する疾患、例えば卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌などの治療、予防を目的として使用できる。【０１４１】
医薬組成物
別の観点においては、本発明は、Claudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明はClaudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する抗癌剤に関する。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または再発する可能性がある対象に投与されることが好ましい。【０１４２】
また、本発明において、Claudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する抗癌剤は、Claudin3タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法、または、抗癌剤の製造におけるClaudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体の使用と表現することもできる。【０１４３】
本発明において、「Claudin3に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含有する」とは、抗claudin3モノクローナル抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、モノクローナル抗体の含有率を制限するものではない。
更に本発明における医薬組成物、あるいは抗癌剤には、必要に応じて複数種類のモノクローナル抗体を配合することができる。たとえば、Claudin3に結合する複数のモノクローナル抗体のカクテルとすることによって、Claudin3発現細胞に対する細胞傷害作用を強化できる可能性がある。あるいは、Claudin3に結合する抗体に加えて、他の腫瘍関連抗原を認識する抗体を配合することにより、治療効果を高めることもできる。【０１４４】
本発明の医薬組成物（例えば、細胞増殖抑制剤、抗癌剤。以下同様。）に含有されるモノクローナル抗体はclaudin3タンパク質と結合する限り特に制限はなく、本明細書中に記載された抗体が例示できる。
本発明の医薬組成物、あるいは抗癌剤は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。【０１４５】
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。【０１４６】
また、本発明は、Claudin3発現細胞とClaudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体とを接触させることによりClaudin3発現細胞に傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する方法を提供する。Claudin3タンパク質に結合するモノクローナル抗体は、本発明の細胞増殖抑制剤に含有されるClaudin3タンパク質に結合する抗体として上述したとおりである。抗Claudin3抗体が結合する細胞はClaudin3が発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいClaudin3発現細胞は癌細胞である。具体的には、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、及び大腸癌細胞は、本発明におけるClaudin3発現細胞として好適である。【０１４７】
本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているClaudin3発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。この場合において、添加される抗体の形状としては、溶液又は凍結乾燥等により得られる固体等の形状が適宜使用できる。水溶液として添加される場合にあっては純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。添加する濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは1 pg/mlから1 g/mlの範囲であり、より好ましくは1 ng/mlから1 mg/mlであり、更に好ましくは1 μg/mlから1 mg/mlが好適に使用されうる。【０１４８】
また本発明において「接触」は更に、別の態様では、Claudin3発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にClaudin3を発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物細胞増殖阻害剤および抗癌剤が全身または局部的に投与できる。また、被験動物の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋に抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の抗体投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。【０１４９】
抗Claudin3抗体の接触によってClaudin3発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記に記載の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などの測定法を挙げることができる。抗Claudin3抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗Claudin3抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞傷害活性を有しない結合抗体を、抗Claudin3抗体と同様に使用して、抗Claudin3抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示すことにより活性を判定することができる。【０１５０】
抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列のH鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。【０１５１】
また、生体内で細胞傷害活性を評価又は測定するために、例えばClaudin3発現癌細胞を非ヒト被験動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体を静脈又は腹腔内に投与される。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞傷害活性と規定することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗Claudin3抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことにより細胞傷害活性を判定することができる。非ヒト被験動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被験動物中のＴリンパ球の関与を除くことができる。【０１５２】
抗Claudin3抗体の接触によるClaudin3発現細胞の増殖に対する抑制効果を評価又は測定する方法としては、アイソトープラベルしたthymidineの細胞へ取込み測定やMTT法を好適に用いることができる。
また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、上記記載の生体内において細胞傷害活性を評価又は測定する方法と同じ方法を好適に用いることができる。【０１５３】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１５４】
以下実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
[実施例１]遺伝子クローニングおよび強制発現細胞の作製
ヒトClaudin 3、Claudin 1、 Claudin 4、Claudin 6およびマウスClaudin 3 の遺伝子をクローニングし、哺乳動物細胞発現ベクターを作製、強制発現細胞を樹立した。それぞれのGenBank参照配列をもとにプライマーを作製し、遺伝子発現組織cDNAライブラリーを鋳型にそれぞれの遺伝子のPCR増幅を行い、目的遺伝子を単離した。得られた遺伝子の配列をDNA配列解析により確認した。遺伝子クローニングに用いたプライマー、cDNAライブラリー（クローンテック社マラソンcDNAライブラリー）を表1に示した。【０１５５】
【表１】
2008072723.tif 000003
【０１５６】
得られた各遺伝子をマウスCMVプロモーターによって転写される発現ベクターに組み込み哺乳動物発現ベクターを作製した。発現ベクターの構築に用いたcDNAの塩基配列を配列番号：１、３、５、７、９に示した。これらの発現ベクターは、ヒトおよびマウスClaudin3を除きいずれも、組み換え蛋白質のC末端にFLAGタグをコードする塩基配列が付加されている。発現ベクターを以下の細胞株にエレクトロポレーション法で導入した。Ba/F3はマウスのリンパ球由来癌細胞株である。一方DG44は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞由来のジヒドロ葉酸還元酵素欠損（dhfr-）株である。各形質転換細胞は、発現ベクターの選択マーカーであるジェネティシン(インビトロジェン)を用いて選択した。
Ba/F3（理化学研究所バイオソースセンター, 細胞番号RCB0805）、
DG44（インビトロジェン, 12613014）【０１５７】
ジェネティシン耐性株における組換え蛋白質発現の有無をSDS-PAGE・ウェスタンブロッティング法により検出した。ヒトClaudin 1, Claudin 4, Claudin 6蛋白質を、蛋白質C末端に遺伝子工学的に付加したFLAG配列を発現タグとして利用し、抗FLAG M2抗体(シグマ)により検出した。ヒトおよびマウスClaudin 3 蛋白質発現は、抗Claudin 3抗体(Zymed, 34-1700)により検出した。高い蛋白質発現量が確認されたクローンをそれぞれ選抜し、細胞を培養維持して以降の解析に用いた。【０１５８】
[実施例２]抗Claudin 3モノクローナル抗体ハイブリドーマの樹立
Helios Gene Gunシステム(バイオラッド)を用いたDNA免疫法により、マウスを免疫し、抗Claudin 3モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。
まずDNA免疫に用いた発現ベクターは次のように構築した。ヒトClaudin3のcDNAを腎cDNAライブラリ(Clontech)からPCRで増幅した。PCRには、LA Taq DNAポリメラーゼ反応溶液（Takara）を用いた。cDNA増幅用のプライマーには、クローニングプライマー1、クローニングプライマー2（表１に示した）を用いた。増幅されたcDNA断片をpGEM-T Easyベクターに組み込み、塩基配列を確認した。Claudin 3を含むcDNA断片をEcoRIで切り出し、この断片を動物細胞発現ベクターであるpMCのEcoRIサイトに組み込んで、DNA免疫用の発現ベクター（ヒトClaudin 3全長発現ベクター）を得た。ヒトClaudin 3全長発現ベクターの塩基配列を配列番号：１５９に示す。配列番号：１５９の塩基配列中、８３６〜１４９８塩基の塩基配列が、Claudin3のアミノ酸配列をコードしている。【０１５９】
金-DNA(ヒトClaudin 3全長発現ベクター)粒子のカートリッジチューブへのコーティングはHelios Gene Gun操作マニュアルにしたがった。1.0μm金粒子50mgを測り取り0.1ml の0.05Mスペルミジン溶液で懸濁して混和し、1mg/ml の0.1mlのプラスミド溶液を加えてvortexした。さらに、1M CaCl2を0.1ml加え、10分間放置し、軽く遠心後、上清を取り除き、エタノールで懸濁、遠心した。エタノール脱水の操作を３回繰り返したのち、最終的に6mlの0.05mg/ml polyvinylpyrollidone・エタノール溶液に懸濁した。この溶液をコート用チューブに吸い上げ、チューブをコート、乾燥させ、チューブカッターで0.5インチの長さに切断した。【０１６０】
４−５週令に達したマウス(日本チャールス・リバー, MRL/MpJ-Tnfrsf6lpr/Crlj)に、1〜3回/週の間隔でDNA免疫(〜200psiヘリウム圧)を行い、この間、断続的に血清中の抗Claudin 3抗体価のモニターを行った。血清抗体価上昇が確認された個体に対し、Claudin 3強制発現細胞株(5x106 cells/head)を腹空内投与した。２−３日飼育後、脾臓を摘出し、抗体産生細胞を含む単核細胞を単離した。脾臓由来細胞をP3-X63Ag8U.1（ATCC CRL-1597）と約2:1の割合で混合し、PEG1500（ロシュ・ダイアグノスティック社）を徐々に加える事により細胞融合を行った。慎重にRPMI1640培地（GIBCO BRL社）を加えPEG1500を希釈し、遠心操作によりPEG1500を除去した。その後、下記組成を含むRPMI1640培地(以降、HAT培地と記載する)を200μL /wellとなるように96穴培養プレートに播種し、37℃、5% CO2で約1週間培養した。
10％FBS、
1 x HAT media supplement (SIGMA社)、および
0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement (ロシュ・ダイアグノスティック)【０１６１】
ハイブリドーマコロニーの形成を顕微鏡下で確認した後、培養上清中におけるClaudin 3結合抗体の有無をClaudin 3強制発現細胞を用いたフローサイトメトリー法によりスクリーニングした。強制発現細胞に結合したマウス抗体は、FITCラベルしたヤギ抗マウスIgG抗体(ベックマン・コールター)を結合させて、FASCalibur（ベクトン・ディッキンソン）を用いて検出した。強制発現細胞と非組換えの親株との比較で抗体のClaudin 3結合選択性が認められた陽性ウェルのハイブリドーマは限界希釈法により、クローニングした。【０１６２】
Claudin 3強制発現細胞の腹腔内に投与することによって免疫したマウスからはClaudin 3結合性抗体を産生するハイブリドーマがあまり取得できなかった。一方、予めDNA免疫後にClaudin 3強制発現細胞を腹腔内投与したマウスからは、Claudin 3結合性の抗体を産生するハイブリドーマが効率よく取得することができた。【０１６３】
クローン化したハイブリドーマが産生する抗体サブタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (ロシュ・ダイアグノスティック)で解析した。【０１６４】
モノクローナル抗体の精製を目的として、FBS, Ultra low IgG（インビトロジェン）を用いて調製したHAT培地にてハイブリドーマを培養し、その上清を回収した。サブタイプ IgG1、IgG2a、ならびにIgG2bに属する抗体は、HiTrap ProteinG HP(アマシャム・バイオサイエンス)を用いて製造者の指示に従い精製した。サブタイプIgG3およびIgMに属する抗体は、Protein L Agarose(シグマ)カラムを用いて、ProteinG同様の条件にて精製した。溶出画分については、PD-10カラム（アマシャム・バイオサイエンス）を用いてPBSに置換した後、限外濾過濃縮、4℃で保管した。精製抗体の濃度はマウスIgGをスタンダードとしたBradford法により算出した。【０１６５】
[実施例３]モノクローナル抗体の結合性特異性解析
ヒト染色体上には、24のClaudin遺伝子ファミリーが存在する。Claudin 3にアミノ酸配列全長領域で相同性の高い分子はClaudin 4である。モノクローナル抗体によって認識される細胞表面エピトープの重複度と特異性を特徴づけるために、Claudin 3予想細胞外領域部分配列とこれに相当する相同性が高いファミリー分子配列のクラスタリングならびに配列アライメント図を作製した（図１）。細胞外ループ１領域でもっとも同一性が高いファミリー分子は、Claudin 4(51残基中48残基が同一)である。次いでClaudin6そしてClaudin 9(51残基中41残基が同一)が、Claudin3との同一性が高い。細胞外ループ2領域は細胞外ループ1領域に比べると相同性はあまり高くない(Claudin 6とClaudin 8 は22残基中15残基が同一 )。ヒト-マウス種間でのClaudin 3配列保存性は高く、細胞外ループ1領域で46/51残基、ループ2領域で22/23残基の同一性を示した（図２）。【０１６６】
モノクローナル抗体の特異性を検証し、エピトープを分類するために、ヒトClaudin 3強制発現細胞とともに、同一性の高い次のClaudinファミリー分子の強制発現細胞に対する結合反応性をフローサイトメトリー法にて評価した。
マウスClaudin 3、
ヒトClaudin 1、
ヒトClaudin 4、および
ヒトClaudin 6【０１６７】
各強制発現細胞にモノクローナル抗体を添加し、4℃で30分間インキュベーションした。インキュベーション後の細胞を、1%牛胎児血清を含むPBS溶液で一回洗浄し、次いで150倍希釈したFITC-ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体（ベックマン・コールター）を添加し、さらに4℃で30分間インキュベーションした。細胞あたりの結合抗体量をFACSCaliburで計測し、細胞蛍光強度の幾何平均値にあたる、X Geometric Mean値をFACSCalibur付属解析ソフトウェアCELLQuest Proを用いて算出した。結果を、表2にまとめた。【０１６８】
【表２】
2008072723.tif 000004
【０１６９】
終濃度5, 1, 0.1μg/mLになるようにヒトClaudin 3強制発現DG44に抗体を添加した場合には、いずれの抗体ともに濃度増加に伴う結合量の増加が観察された。Ba/F3に強制発現させたヒトClaudin 3, ヒトClaudin 1, ヒトClaudin 4, ヒトClaudin 6, マウスClaudin 3を用い、抗体終濃度2μg/mLでの交叉反応性を評価した。強制発現株の親株であるBa/F3細胞に比べ、単離したすべての抗体がヒトClaudin 3強制発現細胞に対して強く結合した。また、いずれの抗体も、配列同一性が高くないヒトClaudin 1, ヒトClaudin 6強制発現細胞に対してほとんど結合しなかった。Claudin 3選択的に高い結合性を示す抗体は次のとおりであった。
CDN 08, CDN 16, CDN 14, CDN 28, CDN 29, 
CDN 30, CDN 32, CDN 33, およびCDN 36【０１７０】
CDN16, CDN 35はヒトおよびマウスClaudin 3に対してほぼ同等の高い結合性を示した。動物種間で共通のエピトープを認識する特異抗体は、病態モデル動物での薬効と毒性との乖離を解析するツールとして有用であると考えられる。即ち、動物種間でその配列が保存されているエピトープを特異的に認識する抗体を病態モデル動物に投与してその薬物動態を観察する場合において、当該病態の治療対象となる動物種における動態と同様の挙動を当該抗体が示すことが期待される。ヒトClaudin 3に結合するCDN02, CDN 05, CDN 17, CDN 24, CDN 27, およびCDN 31は、ヒトClaudin 4にも結合することが示され、両者に共通もしくはよく似た配列構造を認識する抗体であることが示唆された。【０１７１】
内在的にClaudin 3を発現する乳癌細胞株MCF7(ATCC, HTB-22)に対する抗体の結合性をフローサイトメトリー法で調べた。強制発現細胞同様に抗体濃度依存的な結合量の増強が認められた一方で、MCF7に対する結合の強弱は強制発現細胞の結果と必ずしも相関せず（図３）、エピトープ露出の様子が強制発現細胞と癌細胞株で異なることが示唆された。【０１７２】
[実施例４]モノクローナル抗体の細胞外ループ領域配列ペプチドへの結合性
一般に、複数膜貫通蛋白質の短いループを線状のペプチドとして免疫し、首尾よく抗体を得ることができた場合でも、天然型蛋白質へ高い親和性を持って結合するケースはほとんどない、とされている。逆に、確固な立体構造部分に結合する抗体の場合、線状化したペプチドへはほとんど結合しない可能性がある。細胞上に発現するClaudin 3に結合するモノクローナル抗体の細胞外ループ領域に相当する線状化したペプチド配列への結合性をGST-細胞外ペプチドループ融合蛋白質を用いて評価した。ヒトClaudin 3の細胞外領域として予想される部分は次のとおりである。
ループ１：配列番号：2におけるアミノ酸残基番号30から80までに相当する配列
ループ２：配列番号：2におけるアミノ酸残基番号137から159までに相当する配列【０１７３】
大腸菌発現ベクターpGEX-4T2を利用し、ループ配列のN末端側にGST融合蛋白質、C末端側にHisタグがつくように、発現ユニットを構築し、大腸菌発現系にて蛋白質発現誘導を行い、融合蛋白質を精製した。ループ1、ループ2融合蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：１１６および配列番号：１１７にそれぞれ示した。ループ1融合蛋白質は不溶性蛋白質として大腸菌内に蓄積したために、大腸菌破砕後、不溶性画分を回収し、7M尿素で可溶化、尿素存在下にてニッケルアフィニティカラムを用いて精製した。イミダゾール溶出後、50mM Tris-HCl(pH 8)に対して透析することにより、尿素を除去した。ループ2融合蛋白質は可溶型蛋白質として発現したことから、グルタチオンアフィニティにより融合蛋白質を精製した。精製した融合蛋白質をNuncイムノプレートにコートし、BSAを含む溶液でブロッキングのちに、モノクローナル抗体の結合反応性を解析した。コートした融合蛋白質に結合する陽性抗体として抗Hisマウスモノクローナル抗体(サンタクルーズ)を用いた。【０１７４】
一時間反応後、プレート洗浄、アルカリフォスファターゼ標識した抗マウスIgG(H+L)抗体を添加、反応させた。洗浄を行ったあと、検出試薬Sigma104を加えることにより抗体結合量を解析した（図４）。陽性コントロールである抗His抗体がプレートにコートした融合蛋白質に結合する一方で、抗Claudin 3モノクローナル抗体はループ１、およびループ２のいずれのペプチド断片にもほとんど結合しなかった。わずかに結合が見られる抗体も、ループ１、およびループ２融合蛋白質に対し、同等に結合しており、結合特異性は観察されなかった。以上の結果は、今回単離した抗体すべてがClaudin 3蛋白質のrigidな構造部分に結合することを示唆している。【０１７５】
これまでに唯一報告のあるClaudin 3に結合するポリクローナル抗体がペプチドを免疫し、ペプチドアフィニティ精製を経て得られていることを考えると、既報告の抗体と今回単離した抗体の抗原への結合様式の違いは明らかである。細胞上に発現するClaudin 3へより効率的に結合する点において、本発明のモノクローナル抗体が、有用であることが裏付けられた。【０１７６】
[実施例５]モノクローナル抗体による細胞傷害性の誘導
モノクローナル抗体によるClaudin 3発現細胞選択的な補体依存的細胞傷害活性を、幼ウサギ補体を用いて評価した。ヒトClaudin 3発現細胞として、ヒトClaudin 3強制発現DG44細胞を、対照として親株であるDG44細胞を用い、最終反応濃度5μg/mLとなるように精製したモノクローナル抗体を添加した後、4℃で30分間インキュベーションした。終濃度1%となるように幼ウサギ補体(Cederlane, Cat. No. CL3441)を添加し、37℃、5% CO2下、90分間インキュベーションした。【０１７７】
インキュベーション後、DNA結合蛍光試薬である７- aminoactinomycin D(7-AAD, インビトロジェン)を終濃度1μg/mLになるように添加し、遮光して10分間放置した。遠心後、上清を除去し細胞を1%牛胎児血清含有PBSに懸濁し、細胞の染色蛍光強度をフローサイトメーターで測定した。抗体・補体ともに非添加の状態における7-AADによる陽性染色細胞が5%以下になるよう、機器と測定ゲート条件を予め設定した後、抗体による補体依存的細胞傷害活性を測定した。【０１７８】
親株であるDG44細胞には、抗体未添加の場合同様にほとんど細胞傷害を誘導しない一方で、サブタイプIgG1の抗体以外の抗体すべてがヒトClaudin 3強制発現DG44細胞に対して細胞傷害活性を示した（図５）。CDN28, CDN32の抗体サブタイプはIgG1であるが、細胞傷害誘導活性を示した。以上、今回単離した抗体の多くが、抗原発現依存的な補体依存的な細胞傷害活性誘導能を有することが示された。【０１７９】
続いてモノクローナル抗体による乳癌細胞株MCF7に対する補体依存的細胞傷害活性をクロムリリース法で調べた。MCF7の培養には10% ウシ胎児血清、10μg/mlヒトインシュリンを含むRPMI1640培地（インビトロジェン）を用いた。MCF7細胞を96ウェルプレートにまきこみ終夜培養し、その後、Chromium-51 (Code No. CJS4、アマシャム・バイオサイエンス)を添加し、さらに数時間培養をつづけた。この細胞を培地で洗浄した後、あらためて培地を添加した。次に、抗Claudin 3モノクローナル抗体およびコントロールマウスIgG2a抗体を各ウェルに添加した。抗体は終濃度10μg/mLとした。続いて、幼ウサギ補体を終濃度2%となるように添加し、プレートを5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて1.5時間静置した。静置後プレートを遠心(1000 rpm、5分間、4℃)し、各ウェルより上清を100μLずつ回収し、ガンマカウンター(1480 WIZARD 3"、Wallac)にて放射活性を測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)
式中、A、B、およびCはそれぞれ次の数値を示す。
A：各ウェルにおける放射活性(cpm)、
B：細胞を100μL、2% NP-40溶液(Nonidet P-40、Code No.252-23、ナカライテスク株式会社)を100μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、
C：細胞を100μL、培地を100μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値【０１８０】
各々の実験条件に関して3点測定し、特異的クロム遊離率について平均値及び標準偏差を算出した（図６）。次のモノクローナル抗体は、MCF7に対し、強い補体依存的細胞傷害活性を示した。
CDN 27, CDN 31, CDN 35, CDN 02,
CDN 08, CDN 16, CDN 17, およびCDN 24【０１８１】
傷害活性の強さはフローサイトメトリー法で測定した抗体結合量とほぼ相関していた。一方コントロールマウスIgG2a抗体は同濃度で補体依存的細胞傷害活性を示さなかった。
MCF7細胞を標的に抗体依存的細胞性傷害活性をクロムリリース法で測定した。すなわち、細胞を96ウェル平底プレートにて培養しChromium-51と反応させた後、RPMI1640培地にて洗浄し、新たな100μLの培地を添加した。次に、抗Claudin 3モノクローナル抗体およびコントロール（抗体なし）を終濃度0.1μg/mLとなるように添加した。続いて、MCF7に比し約50倍の細胞数のエフェクター細胞溶液を各ウェルに添加し、プレートを5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて培養した。エフェクター細胞としてC3H/HeNCrlCrljマウス(日本チャールス・リバー株式会社)の脾臓細胞を50 ng/mLリコンビナントヒトinterleukin-2 (Cat. No. 200-02, Peprotech) を含む培地で培養したものを使用した。6時間静置後、特異的クロム遊離率を測定し、それぞれの平均および標準偏差を算出した（図７）。【０１８２】
抗体未添加およびコントロール抗体(サブタイプIgG2a)に比べ、CDN04, CDN27, CDN35, CDN16添加により、クロム放出が誘導され、Claudin 3発現細胞に対して抗体依存的細胞性傷害活性を示す抗体であることが確認された。【０１８３】
[実施例６]抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の作製
SMART RACE cDNA Amplification kit(クローンテック)を利用し、抗体可変領域をコードするcDNAをクローニングし、その塩基配列を決定した。培養したハイブリドーマ細胞より、RNeasy Mini（キアゲン）を用いて全RNAを回収した。これをもとに、SMART RACE cDNA Amplification kitマニュアルに従い、cDNAを合成し、サブタイプ特異的なプライマーを用いて抗体遺伝子可変領域のcDNAをPCRで増幅した。増幅に用いたサブタイプ特異的プライマー配列を表3に示した。【０１８４】
【表３】
2008072723.tif 000005
【０１８５】
Takara Ex Taq DNAポリメラーゼ（タカラ）を用いて増幅したフラグメントをpGEM-T Easyベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。決定した抗体可変領域をもとに組換え抗体発現ベクターを作製した。すなわち、ヒト抗体IgG1定常領域、およびヒトIgκ定常領域に、それぞれ別にクローニングした重鎖、軽鎖可変配列を翻訳フレームが一致するように連結した。こうして構築されたマウス-ヒトキメラ抗体遺伝子が、マウスCMVプロモーターにより転写される発現ベクターを作製した。発現ベクターをCOS7細胞に導入し、一過的な組換え抗体発現細胞を得た。2日間培養後の上清と抗ヒトIgG(H+L)-FITCを二次抗体に使用したフローサイトメトリーにより、組換え抗体がClaudin 3強制発現細胞特異的な結合を示すことを確認した（図８）。【０１８６】
［実施例７］モノクローナル抗体の細胞上に発現提示させたループへの結合解析
先に述べたように、本発明のモノクローナル抗体は、GST蛋白質に融合させた直鎖状の予想細胞外ループペプチドに対しては、結合性が認められなかった。当該モノクローナル抗体のエピトープに関する情報を得るために、それぞれの抗体が、ループ1とループ2のどちらに結合しているのかを解析した。今回単離したモノクローナル抗体はヒトClaudin 1にはほとんど結合しない。Claudin 3のループ1とClaudin 1のループ2をもつキメラ分子(CLD1/3)、Claudin 1のループ1とClaudin 3のループ2をもつキメラ分子(CLD3/1)を細胞上に発現させ、抗体の細胞への結合性をフローサイトメトリー法で解析した。CLD1/3発現細胞に結合し、CLD3/1発現細胞に結合しなければ、抗体はループ2に結合、CLD1/3発現細胞に結合せずに、CLD3/1発現細胞に結合すれば抗体はループ1に結合していることになる。【０１８７】
Claudin 3とClaudin 1のアミノ酸配列を比較すると第３番目の予想膜貫通領域に共通の配列モチーフFLLAが存在する。この部分を境界とし、その前後のアミノ酸配列が置き換えて連結されたキメラ構造をデザインした。デザインされたキメラ分子のアミノ酸配列情報は次のとおりである。
CLD1/3蛋白質：Claudin1アミノ酸配列1-127とClaudin 3アミノ酸配列126-220
CLD3/1蛋白質：Claudin 3 アミノ酸配列1-125とClaudin 1アミノ酸配列128-211
各キメラ分子の塩基配列およびアミノ酸配列は、次の配列番号に示した。
塩基配列        アミノ酸配列
CLD1/3蛋白質：  配列番号：１６０  配列番号：１６１
CLD3/1蛋白質：  配列番号：１６２  配列番号：１６３【０１８８】
具体的には、次のように遺伝子構築を行った。Claudin1,3 cDNA配列を鋳型に、遺伝子部分断片をPCR増幅した上で、PCRアセンブリーによりキメラ分子構造をもつように遺伝子断片を連結した。これをC末端にFLAGタグが付加されるように加工された動物細胞発現ベクターに翻訳フレームをあわせ組み込んだ。Ba/F3細胞にベクター導入し、薬剤耐性細胞株を取得した。薬剤耐性株における蛋白質発現を、抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロットにより確認し、発現量の高い株を選択してキメラ分子発現細胞を樹立した。【０１８９】
キメラ分子発現細胞株を用いたモノクローナル抗体結合エピトープ解析は、予想外の結果を示した。解析されたモノクローナル抗体の多くは、天然型アミノ酸配列を持つClaudin 3 (CLD3/3)に強く結合した。すなわち、図９のFACSの結果において、蛍光シグナルが検出された明瞭なピークが確認された。一方、ほとんどのモノクローナル抗体は、実験に使った２種類のキメラ蛋白質発現細胞にまったく結合しなかった。一部の抗体に関しても、弱い蛍光ピークが見られ、わずかに結合傾向が見られる程度にとどまっていた。たとえば、CDN16とCLD1/3、CDN35とCLD1/3の間で弱い結合が見られた。抗Claudin3マウス抗血清に関しても同様の傾向を示す結果が観察された。これらの結果から、ハイブリドーマ選抜の段階でスクリーニングバイアスがかかったためではないこと、抗体が細胞上に発現するClaudin 3に対して強く結合するためにはループ１とループ２の両方が必要であることが推察された。【０１９０】
[実施例８]抗Claudin3キメラ抗体定常発現細胞株の作製
ヒトキメラ抗体発現ベクターを用いて、エレクトポレーション法にてDG44細胞を形質転換した。ヒトキメラ抗体発現ベクター上に存在する選択マーカーにより獲得されるジェネティシン耐性を指標に組換え細胞クローン選択を行った。クローン化された組換え細胞培養上清中の抗体量を、抗ヒト抗体を用いたサンドイッチELISA法で検出し、組換え抗体発現細胞を選抜した。選抜した組換え細胞の培養上清よりHiTrap Protein Aカラム(Amersham Bioscience)を用いて添付マニュアルに従い、ヒトキメラ抗体の精製を行った。【０１９１】
Claudin3強制発現DG44細胞、Claudin3強制発現Ba/F3に対するヒトキメラ抗体の結合性をフローサイトメトリーで解析した。Claudin3強制発現細胞にキメラ抗体を添加し反応させた後、結合したキメラ抗体を抗ヒトIgG(H+L)-FITCを用いて検出した。図11に示したように、キメラ抗体添加によるヒストグラムの顕著なシフトが観察され、キメラ抗体のClaudin3への結合が確認された。【０１９２】
[実施例９]抗Claudin3抗体添加による軟寒天中コロニー形成および細胞遊走能の阻害
Agarwalらは、Claudin3, 4強制発現およびsmall interfering RNAを用いた解析より、Claudin3、Claudin4の過剰発現が、卵巣癌細胞の生存能向上、浸潤性の獲得に関与していることを報告している（Agarwal et al. (2005) Cancer Res 65, 7378-7385）。一方、MichlらはClaudin4過剰発現により、膵癌細胞の転移・浸潤能が抑制されると報告している（Michl et al (2003) Cancer Res 63, 6265-6271）。
上記報告は発現の有無もしくは増減による影響を調べたものであり、Claudin3タンパク質に結合する抗体で細胞機能が修飾可能であることを示す文献報告はこれまでない。抗Claudin3抗体の結合により癌細胞の生存能や浸潤性が変化するか否か、MCF7細胞の軟寒天中コロニー形成および細胞移動能に対する抗体添加の影響を解析した。【０１９３】
軟寒天中でのコロニー形成への抗体添加による影響をCytoSlect 96-well In Vitro Tumor Sensitivity Assay（Cell Biolabs, Inc.）を用いて評価した。1ウェルあたり、5000個のMCF7細胞を添加マウス抗体とともに軟寒天中にまき込み、7日間37℃、5% CO2下で培養した。培養後、細胞数をMTT法にて定量化した(図12)。抗Claudin3抗体添加により、コロニー形成が抑制され、その効果はCDN04が特に強かった。
細胞移動能への抗体添加の影響を以下の方法(wound-healingアッセイ)で評価した。MCF7細胞を12ウェルプラスティックプレートにまき込み、付着増殖できる細胞密度が飽和するまで培養を続けた。ピペットチップの先で、細胞単層を線状に傷つけた。培養液を新しいものに換えたのち、終濃度10μg/mlになるように抗体を添加して4日間培養を続けた。培養後、抗体を添加しない対照ウェルにおいては傷つけた領域を細胞が覆うように移動しているのに対し、CDN04抗体添加ウェル(10μg/ml)において、傷つけた領域への細胞移動はほとんど認められなかった（図13）。CDN16, CDN27, CDN28, CDN35, CDN38添加ウェルでは顕著な細胞遊走阻害は観察されなかった。
Claudin3結合抗体により、癌細胞に特徴的な足場非依存的増殖、細胞移動といった細胞機能の制御が可能なことが本実施例で初めて確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
本発明は、抗Claudin3モノクローナル抗体を提供した。Claudin3は、種間の同一性が高いことから、一般的な免疫方法では抗体を得ることは容易でなかった。したがって、Claudin3を認識する抗体を提供した本発明の意義は大きい。特に本発明によって提供されたモノクローナル抗体は、好ましい態様において、細胞表面に発現したClaudin3に結合することができる一方、Claudin3の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列からなる線状ペプチドとの反応性は実質的に観察されない。すなわち、本発明のモノローナル抗体は、細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列を利用したドメインペプチド免疫では得ることのできない抗体であると予測される。【０１９５】
更に、Claudinファミリーに属する多くの分子は、構造的に類似している。その上、細胞外ドメインの長さが短いことから、細胞表面に発現しているClaudinファミリー分子を相互に識別することができる抗体を得ることは困難が予測された。しかし本発明によって提供されたモノクローナル抗体は、好ましい態様において、Claudin3とClaudin6とを免疫学的に識別することができる。Claudin3の細胞外ループ１を構成するアミノ酸配列５１残基中、４１残基はClaudin6の細胞外ループ１のアミノ酸配列と同一である。このように同一性の高い分子を免疫学的に識別することができる抗体は、特異性に優れる抗体であるといえる。【０１９６】
したがって、本発明は、癌細胞の細胞表面上に発現したClaudin3を特異的に認識し結合することができる抗体を提供した。本発明の抗体によって、Claudin3を高発現する癌を検出することができる。たとえば、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、および大腸癌などにおけるClaudin3の発現亢進が確認されている。すなわち本発明のモノクローナル抗体は、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、および大腸癌などのClaudin3が発現亢進している癌の診断に有用である。【０１９７】
また本発明のモノクローナル抗体は、好ましい態様において、Claudin3発現細胞に対して、細胞傷害作用を示すことが確認された。具体的には、たとえば乳癌に対するCDC作用、並びにADCC作用を有するモノクローナル抗体が提供された。加えて、好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は、Claudin3のみならず、Claudin4を認識した。Claudin4は、子宮癌患者の化学療法剤耐性を有する再発部における発現亢進が報告された遺伝子である。【０１９８】
したがって本発明のモノクローナル抗体は、Claudin3あるいはClaudin4を高発現している癌の治療に有用であることが示された。更に本発明のモノクローナル抗体は、定常領域をヒト由来のアミノ酸配列に置換したキメラ化の後も、Claudin3に対する結合活性を維持していた。このことは、本発明によって提供されたモノクローナル抗体をキメラ化し、ヒトへの投与が可能な癌治療用の抗体とできることを裏付けた。すなわち本発明のモノクローナル抗体は、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、および大腸癌などのClaudin3およびClaudin4のいずれか、あるいは両方が発現亢進している癌の治療に有用である。
【図１】
2008072723.tif 000006
【図２】
2008072723.tif 000007
【図３】
2008072723.tif 000008
【図４】
2008072723.tif 000009
【図５】
2008072723.tif 000010
【図６】
2008072723.tif 000011
【図７】
2008072723.tif 000012
【図８】
2008072723.tif 000013
【図９−１】
2008072723.tif 000014
【図９−２】
2008072723.tif 000015
【図９−３】
2008072723.tif 000016
【図９−４】
2008072723.tif 000017
【図９−５】
2008072723.tif 000018
【図９−６】
2008072723.tif 000019
【図９−７】
2008072723.tif 000020
【図９−８】
2008072723.tif 000021
【図１０】
2008072723.tif 000022
【図１１】
2008072723.tif 000023
【図１２】
2008072723.tif 000024
【図１３】
2008072723.tif 000025
【配列表】
2008072723000001.app
【国際調査報告】
2008072723.tif 000026
2008072723.tif 000027
2008072723.tif 000028
2008072723.tif 000029
2008072723.tif 000030
2008072723.tif 000031
2008072723.tif 000032
2008072723.tif 000033