(57)【要約】  本発明により、以下のグルタチオンおよびγ−グルタミルシステインの製造法が提供される。  以下の細胞内のグルタチオンを細胞外へ輸送する活性を有する蛋白質の活性、およびグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を培地に培養し、該培地中にグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを生成、蓄積させ、培養物中からグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを採取するグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの製造法。［１］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質［２］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質［３］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞内のグルタチオンを細胞外へ輸送する活性（以下、グルタチオン輸送活性という）を有する蛋白質の活性、およびグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を培地に培養し、該培地中にグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを生成、蓄積させ、培養物中からグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを採取するグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの製造法。
［１］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質
【請求項２】
微生物が以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物である、請求項１記載の製造法。
［１］請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２７〜４６のいずれかで表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２７〜４６のいずれかで表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質がγ−グルタミルシステインシンセターゼ（GSHI）またはグルタチオンシンセターゼ（GSHII）である、請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
GSHIおよびGSHIIが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質である、請求項３記載の製造法。
［１］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
微生物がGSHIまたはGSHIIをコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
GSHIおよびGSHII をコードするＤＮＡが以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項５記載の製造法。
［１］請求項４の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号４９または５０で表される塩基配列を有するDNA
［３］配列番号４９または５０で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［４］配列番号４９または５０で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
微生物がグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性を有する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失した微生物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項８】
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性を有する蛋白質がγ−グルタミルトランスペプチダーゼである、請求項７記載の製造法。
【請求項９】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼが以下の［１］または［２］記載の蛋白質である、請求項８記載の製造法。
［１］配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号５１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を有する蛋白質
【請求項１０】
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性を有する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失した微生物がγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物である、請求項７記載の製造法。
【請求項１１】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子が以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項１０記載の製造法。
［１］請求項９の［１］または［２］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号５２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号５２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［４］配列番号５２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１２】
微生物がグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込みに関わる活性（以下、グルタチオン取り込み活性という）を有する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失している微生物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１３】
グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質が以下の［１］または［２］記載の蛋白質である請求項１２記載の製造法。
［１］配列番号５３〜５７のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号５３〜５７のいずれかに記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質
【請求項１４】
微生物がグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物である、請求項１２記載の製造法。
【請求項１５】
グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡである、請求項１４記載の製造法。
［１］請求項１３の［１］または［２］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号５８で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号５８で表される塩基配列中のいずれかのコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［４］配列番号５８で表される塩基配列中のいずれかのコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１６】
微生物がEscherichia属に属する微生物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオン（γ‐L-グルタミル−L−システニル‐グリシン）は、生物に広く存在する物質であり、補酵素として作用するほか、肝臓において解毒作用を有することが知られている。よってグルタチオンは医薬品、健康食品および化粧品等の製品、原料または中間体として広く用いられている。
また、γ-グルタミルシステイン（γ‐L-グルタミル−L−システイン）は、上記の通りグルタチオンの生合成の中間体であり、またシステインと同様の食品の風味改善効果や、生活習慣病やアルツハイマー病の治療薬として期待されるチオール化合物の一つである。【０００３】
グルタチオンは、Escherichia coliではγ−グルタミルシステインシンセターゼ（GSHI）によってL-グルタミン酸およびL-システインがγ-グルタミルシステインに変換された後、グルタチオンシンセターゼ（GSHII）によって、γ-グルタミルシステインにグリシンが付加されることにより生合成されることが知られており、GSHIをコードするgshA遺伝子およびGSHIIをコードするgshB遺伝子がE.coliから取得されている（非特許文献１および２）。【０００４】
グルタチオンの製造法としては、酵素法および発酵法が知られている。酵素法としては、L-グルタミン酸、L-システイン、グリシンおよび界面活性剤の存在下、E.coliの菌体を酵素源として用いる方法（特許文献１および２）が知られている。発酵法としては、Saccharomyces cerevisiaeおよびCandida utilisの野生株または突然変異株、並びにgshA遺伝子およびgshB遺伝子で形質転換されたE.coli、S.cerevisiaeおよびLactococcus lactisの組換え株を用いる方法が知られている（非特許文献３および４）が、該発酵法ではいずれもグルタチオンは菌体内に蓄積するとされている。【０００５】
一方、E. coliの野生株は、対数増殖後期に一時的に、グルタチオンをわずかではあるが菌体外に蓄積するとの報告がある（非特許文献５）。
また、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性が低下、または喪失したE. coliの変異株は、野生株に比べ培地中のグルタチオンの蓄積量が増加することが知られており（非特許文献６および７）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子（ggt遺伝子）およびグルタチオンの取り込み蛋白質をコードするyliAB遺伝子の欠損株は、ggt遺伝子単独欠損株よりさらにグルタチオンの蓄積量が増加することも知られている（非特許文献８）。【０００６】
また、ybiK遺伝子にコードされる蛋白質はグルタチオンの菌体内への取り込みを調節していること（非特許文献９）、およびybiK遺伝子はyliABCD遺伝子とオペロンを形成していることも知られている（非特許文献８）。
E. coliのcydDC遺伝子がコードする蛋白質は、細胞内のグルタチオンをペリプラズムに移行する活性を有することは知られている（非特許文献１０）が、該蛋白質の活性を上昇させたとき、培地中のグルタチオンの蓄積量が増加することは知られていない。【０００７】
また、E. coliのyceE遺伝子、marA遺伝子、marB遺伝子、acrA遺伝子、acrB遺伝子、emrA遺伝子、emrB遺伝子、emrE遺伝子、ydhC遺伝子、ydeA遺伝子、emrK遺伝子、emrY遺伝子、emrD遺伝子、yajR遺伝子、yegB遺伝子、yidY遺伝子、yieO遺伝子およびyjiO遺伝子は、薬剤輸送遺伝子と予測され、いくつかの遺伝子についてはその活性が確認されている（非特許文献１９）。【０００８】
ygeD遺伝子は、リゾリン脂質輸送遺伝子として知られている（非特許文献１１）。bcr遺伝子は、ビシクロマイシン耐性遺伝子として知られている（非特許文献１２）。cmr遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子として知られている（非特許文献１３）。marR遺伝子は、多剤耐性遺伝子として知られている（非特許文献１４）。evgA遺伝子は、薬剤排出遺伝子として知られている（非特許文献１５）。ydeE遺伝子の機能は知られていない。【０００９】
上記のとおり、細胞内のグルタチオンを細胞外へ輸送する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は知られていない。
γ-グルタミルシステインの製造法としては、グルタチオン合成酵素遺伝子が破壊または弱化した酵母変異株による製造法は報告されている（非特許文献１６〜１８）が、該発酵法ではいずれもγ-グルタミルシステインは菌体内に蓄積するとされている。
【特許文献１】特開昭６０−２７３９６号公報
【特許文献２】特開昭６０−２７３９７号公報
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol., 44, 1444 (1982)
【非特許文献２】Agric. Biol. Chem., 47, 1381 (1983)
【非特許文献３】Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 233 (2004)
【非特許文献４】Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 375 (1986)
【非特許文献５】J. Bacteriol., 168, 109 (1986)
【非特許文献６】Appl. Environ. Microbiol., 47, 653 (1984)
【非特許文献７】J. Bacteriol., 169, 3926 (1987)
【非特許文献８】J. Bacteriol., 187, 5861 (2005)
【非特許文献９】FEMS Microbiol. Letters, 209, 81 (2002)
【非特許文献１０】J. Biol. Chem., 280, 32254 (2005)
【非特許文献１１】J. Biol. Chem., 280, 12028 (2005)
【非特許文献１２】Gene, 127, 117 (1993)
【非特許文献１３】J. Bacteriol., 178, 3188 (1996)
【非特許文献１４】J. Bacteriol., 175, 1484 (1993)
【非特許文献１５】Microbiology, 149, 2819 (2003)
【非特許文献１６】Agr. Biol. Chem., 54, 3145 (1990)
【非特許文献１７】Molecular Biology of the Cell, 8, 1699 (1997)
【非特許文献１８】Biochinica et Biophysica Acta, 1395, 315 (1998)
【非特許文献１９】J. Bacteriol., 183, 5803 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、効率のよいグルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの製造法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の（１）〜（１６）に関する。
（１）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞内のグルタチオンを細胞外へ輸送する活性（以下、グルタチオン輸送活性という）を有する蛋白質の活性、およびグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を培地に培養し、該培地中にグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを生成、蓄積させ、培養物中からグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを採取するグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの製造法。
［１］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質
［３］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質
（２）微生物が以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物である、上記（１）の製造法。
［１］上記（１）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号２７〜４６のいずれかで表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号２７〜４６のいずれかで表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質がγ−グルタミルシステインシンセターゼ（GSHI）またはグルタチオンシンセターゼ（GSHII）である、上記（１）または（２）の製造法。
（４）GSHIおよびGSHIIが以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質である、上記（３）の製造法。
［１］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質
（５）微生物がGSHIまたはGSHIIをコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
（６）GSHIおよびGSHII をコードするＤＮＡが以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡである、上記（５）の製造法。
［１］上記（４）の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号４９または５０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号４９または５０で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［４］配列番号４９または５０で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（７）微生物がグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性を有する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失した微生物である、上記（１）〜（６）のいずれか１の製造法。
（８）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性を有する蛋白質がγ−グルタミルトランスペプチダーゼである、上記（７）の製造法。
（９）γ−グルタミルトランスペプチダーゼが以下の［１］または［２］記載の蛋白質である、上記（８）の製造法。
［１］配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号５１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を有する蛋白質
（１０）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性を有する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失した微生物がγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物である、上記（７）の製造法。
（１１）γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子が以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡである、上記（１０）の製造法。
［１］上記（９）の［１］または［２］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号５２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号５２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［４］配列番号５２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１２）微生物がグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込みに関わる活性（以下、グルタチオン取り込み活性という）を有する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失している微生物である、上記（１）〜（１１）のいずれか１つの製造法。
（１３）グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質が以下の［１］または［２］記載の蛋白質である上記（１２）の製造法。
［１］配列番号５３〜５７のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号５３〜５７のいずれかに記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質
（１４）微生物がグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物である、上記（１２）の製造法。
（１５）グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が以下の［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡである、上記（１４）の製造法。
［１］上記（１３）の［１］または［２］記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号５８で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号５８で表される塩基配列中のいずれかのコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ
［４］配列番号５８で表される塩基配列中のいずれかのコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１６）微生物がEscherichia属に属する微生物である、上記（１）〜（１５）のいずれか１つの製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、効率よく安価にグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１．本発明の製造法に用いられる微生物
（１）細胞内のグルタチオンを細胞外へ輸送する活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物
細胞内のグルタチオンを細胞外へ輸送する活性（以下、グルタチオン輸送活性という）を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物とは、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株より該蛋白質の比活性が向上した微生物、およびｉｉ）親株よりグルタチオン輸送活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物、ならびに（ｂ）親株をグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物、である。なお、本明細書中における親株とは、野生株でも、変異株であってもよく、改変または形質転換の対象である元株である。該親株としては例えば微生物がEscherichia coli である場合、E. coli K-12株、B株、B/r株の野生株、またはその変異株をあげることができ、該変異株としてはE.coliXL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E.coliMC1000、E. coli ATCC 12435、E. coli W1485、E.coliJM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E.coliW3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E.coliNM522、E. coli BL21、E. coli ME8415等をあげることができる。【００１４】
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質としては、
［１］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質、および
［３］配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。【００１５】
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質は、MolecularCloning,A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、NucleicAcidsResearch, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,6409(1982)、Gene,34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)、Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００１６】
欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。【００１７】
アミノ酸残基の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１０アミノ酸残基をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００１８】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質としては、配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をあげることができる。【００１９】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90,5873(1993)]やFASTA[MethodsEnzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J.Mol.Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGappedBLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。【００２０】
配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質であることは、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、ラベル化したグルタチオン、および該形質転換体から調製できる反転膜小胞［J.Biol.Chem., 277, 49841 (2002)］を用いる方法[J. Biol. Chem., 280, 32254(2005)]により確認することができる。【００２１】
上記（ａ）のｉ）の親株よりグルタチオン輸送活性を有する蛋白質の比活性が向上した微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において１アミノ酸以上、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸、さらに好ましくは１〜３アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質と比較して、その活性が向上した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。【００２２】
上記（ａ）のｉｉ）の親株よりグルタチオン輸送活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１〜３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質の生産量と比較して、該蛋白質の生産量が向上している微生物をあげることができる。【００２３】
上記（ｂ）の親株をグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物としては、
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号２７〜４６のいずれかで表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ、または
［６］配列番号２７〜４６のいずれかで表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
を用いて親株を形質転換して得られる微生物をあげることがでる。【００２４】
該微生物としては、外来のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをｉ）染色体ＤＮＡ上に有する微生物、およびｉｉ）染色体外に有する微生物をあげることができる。すなわち、ｉ）の微生物は、親株がグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを保有していない場合は、新たに導入された該ＤＮＡを１つまたは２つ以上、染色体ＤＮＡ上に有する微生物であり、親株がグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを元来保有する場合には、新たに導入された該ＤＮＡを含む２つ以上のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物である。ｉｉ）の微生物は、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをプラスミドＤＮＡ上に有する微生物である。【００２５】
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。【００２６】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、MethodsforGeneral and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methodsmanual,Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。【００２７】
上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００２８】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号２７〜４６のいずれかで表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（２）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物とは、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株より該蛋白質の比活性が向上した微生物、およびｉｉ）親株よりグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の生産量が向上した微生物、ならびに（ｂ）親株をグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物、である。【００２９】
該親株は、上記（１）と同義であり、同様の菌株を例示することができる。
グルタチオンの生合成に関わる蛋白質とは、L-グルタミン酸、L-システインおよびグリシンからグルタチオンを生成する反応に関わる蛋白質であり、該蛋白質としては、γ−グルタミルシステインシンセターゼおよびグルタチオンシンセターゼをあげることができる。γ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質とは、L-グルタミン酸およびL-システインからγ-グルタミルシステインを生成する反応に関わる蛋白質であり、該蛋白質としてはγ−グルタミルシステインシンセターゼをあげることができる。【００３０】
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物は、γ−グルタミルシステインシンセターゼもしくはグルタチオンシンセターゼ、またはγ−グルタミルシステインシンセターゼおよびグルタチオンシンセターゼの両方の活性が親株より高い微生物であってもよい。
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡは、γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質および該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれも本発明に用いることができる。【００３１】
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質としては、
［７］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［８］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質、および
［９］配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質、
をあげることができる。【００３２】
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質は、上記（１）と同様の方法によって得られ、同様の数のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
欠失、置換または付加が許容されるアミノ酸残基の位置、種類などは、上記（１）と同様である。【００３３】
また、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質としては、配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質をあげることができる。【００３４】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記（１）と同義である。
配列番号４７または４８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質がグルタチオンシンセターゼ活性またはγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該蛋白質を製造した後、該蛋白質、ならびにγ-グルタミルシステインおよびグリシン、またはL-グルタミン酸およびL-システインを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。【００３５】
上記（ａ）のｉ）の親株よりグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の比活性が向上した微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において１アミノ酸以上、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸、さらに好ましくは１〜３アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質と比較して、その活性が向上した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。【００３６】
上記（ａ）のｉｉ）の親株よりグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の生産量が向上した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードするＤＮＡの転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１〜３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株のグルタチオンの生合成に関わる蛋白質の生産量と比較して、該蛋白質の生産量が向上している微生物をあげることができる。【００３７】
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体としては、
［１０］上記［７］〜［９］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１１］配列番号４９または５０で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１２］配列番号４９または５０で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ、または
［１３］配列番号４９または５０で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性またはグルタチオンシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
を用いて形質転換して得られる微生物をあげることができる。【００３８】
該微生物としては、外来のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡをｉ）染色体ＤＮＡ上に有する微生物、およびｉｉ）染色体外に有する微生物をあげることができる。すなわち、ｉ）の微生物は、親株がグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡを保有していない場合は、新たに導入された該ＤＮＡを１つまたは２つ以上、染色体ＤＮＡ上に有する微生物であり、親株がグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡを元来保有している場合には、新たに導入された該ＤＮＡを含め２つ以上のグルタチオンの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物である。ｉｉ）の微生物は、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡをプラスミドＤＮＡ上に有する微生物である。【００３９】
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、上記（１）と同義である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号４９または５０で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（３）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性が親株より低下、または喪失した微生物
本発明で用いられるグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性が親株より低下、または喪失した微生物としては、染色体ＤＮＡ上のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）塩基置換等の導入前の親株に比べ、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）塩基置換等の導入前の親株に比べ、該遺伝子の転写量またはグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解に関与する蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、をあげることができる。より好ましくはグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した微生物、さらに好ましくは該遺伝子中のコーディング領域全部が欠損した微生物をあげることができる。【００４０】
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解に関与する蛋白質は、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解のいずれの工程に関与する蛋白質であってもよく、好ましくはγ−グルタミルトランスペプチダーゼおよびγ−グルタミル−γ−アミノ酪酸ハイドロラーゼ［YcjL蛋白質:J.Bacteriol., 280, 4602（2005）］などをあげることができる。【００４１】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼとしては、
［１４］配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、および
［１５］配列番号５１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。【００４２】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記（１）と同義である。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子としては以下のＤＮＡ、
［１６］上記［１４］または［１５］のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１７］配列番号５２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１８］配列番号５２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ、および
［１９］配列番号５２で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。【００４３】
本明細書において遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含んでもよいＤＮＡである。
転写調節領域としては、染色体ＤＮＡ上におけるコーディング領域の５’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるＤＮＡをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。【００４４】
グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入は、該蛋白質の活性を親株より低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。【００４５】
塩基の置換としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。
塩基の付加としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のＤＮＡ断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。【００４６】
グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの分解活性が親株より低下、または喪失した微生物であることは、グルタチオンの分解活性が親株より低下している割合を公知の方法で測定することにより確認することができる。
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、上記（１）と同義である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号９で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（４）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込みに関わる蛋白質の活性が親株より低下、または喪失した微生物
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込みに関わる活性（以下、グルタチオン取り込み活性と略す）を有する蛋白質の活性が親株より低下、もしくは喪失した微生物としては、染色体ＤＮＡ上のグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードするいずれかの遺伝子の塩基配列に塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）塩基置換等の導入前の親株に比べ、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込み活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）塩基置換等の導入前の親株に比べ、グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードするいずれかの遺伝子の転写量またはグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、をあげることができる。より好ましくはグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した微生物、さらに好ましくはグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子全部が欠損した微生物をあげることができる。【００４７】
グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質としては、
［２０］配列番号５３〜５７のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、および
［２１］配列番号５３〜５７のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。【００４８】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記（１）と同義である。
グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては以下のＤＮＡ、
［２２］上記［２０］または［２１］のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２３］配列番号５８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［２４］配列番号５８で表される塩基配列中のいずれかのコーディング領域の塩基配列を有するＤＮＡ、および
［２５］配列番号５８で表される塩基配列中のいずれかのコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオン取り込み蛋白質をコードするＤＮＡ、
などをあげることができる。【００４９】
上記の遺伝子、転写調節領域、およびプロモーターは、上記（３）と同義である。
グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入は、該蛋白質の活性を親株より低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、上記（３）と同様の塩基の欠失、置換または付加の導入をあげることができる。【００５０】
グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの取り込み活性が親株より低下、または喪失した微生物であることは、グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの取り込み活性が親株より低下している割合を、ラベル化したグルタチオンを用いた取り込み活性測定法［J.Bacteriol.,186, 343 (2004）］で測定することにより確認することができる。【００５１】
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、上記（１）と同義である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号５８で表される塩基配列中のいずれかのコーディング領域の塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００５２】
本発明で用いられる微生物は、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性、およびグルタチオンの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物であれば、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、さらに好ましくはEscherichia属に属する微生物、特に好ましくはEscherichia coliをあげることができる。
２．本発明で用いられる微生物の調製
（１）グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物の調製
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物のうち、比活性が親株のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質より高い微生物は、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをin vitroにおける変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、該変異ＤＮＡを親株の染色体ＤＮＡ上に存在する変異導入前のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡと公知の方法［Proc.Natl.Acad. Sci. U S A., 97, 6640 (2000)］を用いて置換することにより該変異ＤＮＡを発現する改変体を作製し、上記した反転膜小胞を用いる方法により親株と改変体のグルタチオン輸送活性を比較することにより取得することができる。【００５３】
また、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物のうち、該蛋白質の生産量が親株の生産量より向上している微生物は、親株が有するグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するＤＮＡをin vitroにおける変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、該変異ＤＮＡを親株の染色体ＤＮＡ上に存在する変異導入前のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域と公知の方法［Proc.Natl.Acad. Sci. U S A., 97, 6640 (2000)］を用いて置換することにより変異型の転写調節領域またはプロモーター領域を有する改変体を作製し、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションなどにより、親株と改変体のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量を比較する方法、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥなどにより親株と改変体のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質の生産量を比較する方法により確認することもできる。【００５４】
また、親株のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりグルタチオン輸送活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
そのようなプロモーターとしては、E. coliで機能するtrpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。【００５５】
以下に、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得法、および親株を該ＤＮＡで形質転換して得られる微生物の調製法について詳細に説明する。
（ａ）グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば上記１（１）のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはE.coliの染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはE.coliの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ[PCRProtocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。【００５６】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して上記１（１）のグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する微生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。【００５７】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法[Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【００５８】
上記のベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18,6069(1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
宿主細胞としては、Escherichia属に属する微生物などをあげることができる。Escherichia属に属する微生物としては、例えば、E.coliXL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E.coliMC1000、E. coli ATCC 12435、E. coli W1485、E.coliJM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E.coliW3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E.coliNM522、E. coli BL21、E. coli ME8415等をあげることができる。【００５９】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc.Natl.Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[NucleicAcidsRes., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。【００６０】
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１〜２６のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および配列番号２７〜４６のいずかで表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
（ｂ）グルタチオン輸送活性を有する蛋白質を発現するプラスミドベクターで形質転換された微生物の取得
上記（ａ）の方法で得られるグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。【００６１】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性が宿主細胞、すなわち親株より向上した形質転換体を得ることができる。【００６２】
宿主細胞としては、微生物、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、さらに好ましくはEscherichia属に属する微生物、最も好ましくはE.coliを用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００６３】
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００６４】
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric.Biol.Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptII KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERMBP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103(1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。【００６５】
プロモーターとしては、E. coli等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、E.coliやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００６６】
さらにBacillus属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35,594-599(1991)］やCorynebacterium属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl.Microbiol.Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。【００６７】
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するpCYD1、pBcr2、pYgeD2、pYceE2、pCmr、pMarRAB、pAcrAB、pEmrAB、pEmrE、pYdhC、pYdeE、pYdeA、pEmrKY、pEmrD、pYajR、pYegB、pYidY、pYieO、およびpYjiOをあげることができる。【００６８】
該組換え体ＤＮＡの宿主としては、Escherichia属、Bacillus属、Brevibacterium属、またはCorynebacterium属等に属する微生物、例えば、E.coliXL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coliDH1、E.coliMC1000、E. coli ATCC 12435、E. coliW1485、E.coliJM109、E. coli HB101、E. coliNo.49、E.coliW3110、E. coli NY49、E. coliMP347、E.coliNM522、E. coli BL21、E. coliME8415、Bacillus subtilisATCC33712、Batillus megaterium、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentumATCC13869、Corynebacterium glutamicumATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870等をあげることができる。より好ましい宿主としてはE.coliをあげることができる。
（ｃ）グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた微生物の取得
上記（ａ）の方法で得られるグルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことにより、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物を取得することもできる。【００６９】
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物の染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込む方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができ、宿主、すなわち親株としてE.coliを用いる場合にはProc.Natl. Acad. Sci. U S A., 97, 6640 (2000)に記載の方法をあげることができる。
（２）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物の調製
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物のうち、比活性が親株の該蛋白質より高い微生物、および該蛋白質の生産量が親株より向上している微生物は、上記（１）と同様、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡをin vitroで変異処理する、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより取得できる変異型酵素遺伝子と親株の遺伝子とを置換することにより取得できる。【００７０】
取得された変異型酵素遺伝子を有する微生物と親株とをそれぞれ液体培地に培養し、培養物中に含有されるグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの量を公知の方法で測定、比較することにより、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高いことを確認することができる。
以下に、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡの取得法および親株を該ＤＮＡで形質転換して得られる微生物の調製法について説明する。
（ａ）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡの取得
グルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質であるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡ、ならびグルタチオンの生合成に関わる蛋白質であるグルタチオンシンセターゼをコードするＤＮＡは、上記１（２）のグルタチオンまたはγ−グルタミルシステインシンの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に従い、上記２（１）（ａ）と同様の方法により取得することができる。【００７１】
上記方法で取得することができるＤＮＡとしては、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を有するγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードする、配列番号４９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号４８で表されるアミノ酸配列を有するグルタチオンシンセターゼをコードする、配列番号５０で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
（ｂ）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質を発現するプラスミドベクターで形質転換された微生物の取得
γ−グルタミルシステインシンセターゼ、またはグルタチオンシンセターゼを発現するプラスミドベクターは、上記２（２）（ａ）で得られるγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡ、またはグルタチオンシンセターゼをコードするＤＮＡを用い、上記２（１）（ｂ）と同様の方法により取得することができる。【００７２】
上記方法で取得できるγ-グルタミルシステインまたはグルタチオンの生合成に関わる蛋白質を発現するプラスミドベクターとしては、例えば後述するγ−グルタミルシステインシンセターゼを発現するpGH1、ならびにγ−グルタミルシステインシンセターゼおよびグルタチオンシンセターゼの２つの酵素を発現するpGH3をあげることができる。
（ｃ）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた微生物の取得
上記２（２）（ａ）の方法で得られるグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことにより、グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を取得することもできる。【００７３】
染色体ＤＮＡに組み込むグルタチオンの生合成に関わる蛋白質をコードするＤＮＡは、γ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡ、およびグルタチオンシンセターゼをコードするＤＮＡの２つのＤＮＡでもよいし、どちらか一方のＤＮＡであってもよい。
ＤＮＡを微生物の染色体ＤＮＡの任意の位置への組み込みは、上記２（１）（ｃ）と同様の方法により行うことができる。【００７４】
また、公知の比活性が向上した変異型のγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードするＤＮＡ［Appl. Envir. Microbiol., 44,1444(1982）、J. Gen. Microbiol., 128, 1047 (1982)］、または変異型のグルタチオンシンセターゼ［J.Biol.Chem., 263, 11646 (1988)、Biochemistry, 31, 2259 (1992)］もまた、本発明の製造法で用いることができる。
（ｄ）基質の供給が強化された微生物の取得
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が高い微生物のL-グルタミン酸、L-システインおよびグリシンから選ばれるアミノ酸の生産能力を強化することにより、さらに該微生物のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成能力を強化することができる。【００７５】
微生物のL-グルタミン酸、L-システインおよびグリシンから選ばれるアミノ酸の生産能力を強化する方法としては、
ｉ）上記のいずれかのアミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
ｉｉ）上記のいずれかのアミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
ｉｉｉ）上記のいずれかのアミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
ｉｖ）上記のいずれかのアミノ酸の生合成経路から該アミノ酸酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
ｖ）親株に比べ、上記のいずれかのアミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。【００７６】
上記ｉ）の具体的な方法は、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110,761-763(1972)およびAppl.Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに記載されている。上記ｉｉ）の具体的な方法は、Agric.Biol.Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110,761-763(1972)などに記載されている。上記ｉｉｉ）の具体的な方法は、Appl.Microbiol. Biotechnol., 39,318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39,371-377(1987)などに記載されている。上記ｉｖ）の具体的な方法は、Appl.Environ. Microbiol., 38,181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42,1773-1778(1978)などに記載されている。上記ｖ）の具体的な方法は、Agric.Biol. Chem., 36,1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric.Biol.Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51,2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に上記アミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００７７】
さらに上記ｉ）〜ｖ）のいずれかまたは組み合わせた方法による上記アミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology2nded., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH VerlagsgesellschaftmbH,Weinheim, 1996)  section 14a, 14bやAdvances in BiochemicalEngineering/Biotechnology, 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（1986）に記載されており、上記文献等を参照することにより上記アミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００７８】
L-グルタミン酸を生産する能力を有する微生物の具体的な調製法としては、例えばα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（SucA蛋白質）活性が低下、または喪失したE.coliを調製する方法［Mol.Gen. Genet., 105, 182 (1969)］、およびマレートシンターゼ（AceB蛋白質）、イソシトレートリアーゼ（AceA蛋白質）、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（AceK蛋白質）オペロンの発現が構成的になったE.coliを調製する方法［J.Bacteriol. 96, 2185 (1968）］をあげることができる（特開平5-244970号）。【００７９】
L-システインを生産する能力を有する微生物の具体的な調製法としては、例えばE. coliのセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子において、該酵素の256番目のメチオニンに対応するコドンをイソロイシンをコードするコドンに置換することにより、野生型酵素に比べL-システインによるフィードバック阻害が低減した変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを発現するE.coliを調製する方法をあげることができる［J.Gen. Microb., 133, 515 (1987）］。【００８０】
グリシンを生産する能力を有する微生物の具体的な調製法としては、例えば
グリシン分解酵素活性が親株より低下、または喪失したE. coliを調製する方法［Mol. Gen. Genet., 192,15(1983）］をあげることができる。 
（３）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解活性が親株より低下、または喪失した微生物の取得
以下ではγ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性が親株より低下、または喪失した微生物の取得について説明するが、他のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの分解に関与する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失した微生物も、同様の方法で取得することができる。
（ａ）γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子の取得
γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子は、例えば上記１（３）のγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子の塩基配列に従い、上記２（１）（ａ）と同様の方法により取得することができる。【００８１】
上記方法で取得することができる遺伝子としては、配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする、配列番号５２で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。
（ｂ）γ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性が低下、または喪失した微生物の取得
γ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性が親株より低下、または喪失した微生物は、UV照射、変異剤などで微生物を異処理した後、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性が親株より低下または喪失した菌株を選択する方法、または微生物の染色体ＤＮＡ上のγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。【００８２】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する位置は、上記１（３）のとおりである。
微生物の染色体ＤＮＡの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、上記２（３）（ａ）で取得できるγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子を用いて、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を作製し、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、E.coliで頻用される相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法［Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。【００８３】
グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの分解活性が親株より低下、または喪失した微生物であることは、グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの分解活性が親株より低下している割合を公知の方法で測定することにより確認することができる。
（４）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込み活性が親株より低下、または喪失した微生物の取得
（ａ）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の取得
グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば上記１（４）のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に従い、上記２（１）（ａ）と同様の方法により取得することができる。【００８４】
上記方法で取得することができる遺伝子としては、配列番号５３〜５７で表されるアミノ酸配列を有するグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込みに関わる蛋白質をコードする、配列番号５８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該塩基配列中のコーディング領域を含むＤＮＡをあげることができる。
（ｂ）グルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの取り込み活性が親株より低下、または喪失した微生物の取得
グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの取り込み活性が親株より低下、または喪失した微生物は、上記２（３）（ｂ）と同様、UV照射、変異剤などで微生物を異処理した後、グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの取り込み活性が低下または喪失した菌株を選択する方法、または微生物の染色体ＤＮＡ上のグルタチオンの取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。【００８５】
微生物の染色体ＤＮＡ上の遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、上記２（３）（ｂ）の方法をあげることができる。
グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの取り込み活性が低下、または喪失した微生物であることは、グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの取り込み活性が親株より低下している割合を、ラベル化したグルタチオンまたはγ−グルタミルシステインを用いた取り込み活性測定法［J.Bacteriol.,186, 343 (2004）］で測定することにより確認することができる。
３．本発明のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの製造法
本発明のグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの製造法としては、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高く、かつグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を培地に培養し、該培地中にグルタチオンを生成、蓄積させ、培養物中からグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを採取することを特徴とする、グルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの製造法をあげることができる。【００８６】
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明に用いられる微生物の増殖、およびグルタチオンの生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
また、必要に応じてL-グルタミン酸、L-システインおよびグリシンから選ばれるアミノ酸を培地に添加してもよい。培地に添加する量としては、個々のアミノ酸として0.1〜100g/l、好ましくは1〜50g/l、より好ましくは5〜20g/lである。【００８７】
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。【００８８】
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。
ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。【００８９】
培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは20〜42℃、より好ましくは28〜38℃である。培養時のpHは5〜9、好ましくは6〜7.5である。培養時間は、5時間〜5日間、好ましくは16時間〜3日間である。
培養物中に蓄積したグルタチオンは、通常の精製方法によって採取することができる。例えば、培養終了後、遠心分離などで培養物中の菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。【００９０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９１】
γ−グルタミルシステインシンセターゼまたはグルタチオンシンセターゼを発現するプラスミドの造成
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号４９で表される塩基配列を有するE. coliのγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードする遺伝子（gshA遺伝子）に基づき、配列番号５９および６０で表される塩基配列を有するＤＮＡ、並びに配列番号５０で表される塩基配列を有するE.coliのグルタチオンシンセターゼをコードする遺伝子（gshB遺伝子）の塩基配列に基づき、配列番号６１および６２で表される塩基配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成した。【００９２】
E. coliW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５９および６０、並びに配列番号６１および６２で表される塩基配列からなるＤＮＡを、それぞれプライマーセットに用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液、200μmol/Lの各dNTPを含む40μLの反応液を調製し、94℃で１分間、55℃で２分間、72℃で2分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。【００９３】
配列番号５９および６０を用いたＰＣＲではgshA遺伝子断片に相当する約1.6kbの断片（以下、gshA遺伝子増幅断片という）、配列番号６１および６２を用いた反応ではgshB遺伝子断片に相当する約1.0kbの断片（以下、gshB遺伝子増幅断片という）が得られた。
上記で得られたgshA遺伝子増幅断片をClaIおよびBamHIで、またgshB遺伝子増幅断片をBglIIおよびBamHIで切断した後、ジーンクリーンIIキットを用いて、それぞれの増幅断片を精製した。【００９４】
同様に、trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30をClaIおよびBamHIで切断後、4.5kbのＤＮＡ断片を精製した。
上記で得られたgshA遺伝子増幅断片および4.5kbのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて連結した。
得られた連結ＤＮＡを用いてE. coli NM522株を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。【００９５】
該形質転換体より公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、trpプロモーター下流にgshA遺伝子が連結している発現ベクターが取得されていることを確認し、該プラスミドをpGH1と命名した。
pGH1をBamHIで切断後、上記と同様の方法により約6.1kbのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ断片を、60℃で30分間、アルカリホスファターゼ（E.coliC75、タカラバイオ社製）処理することにより脱リン酸化を行った。【００９６】
上記で得られたgshB遺伝子増幅断片とアルカリホスファターゼ処理した6.1kbのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて連結した。
得られた連結ＤＮＡを用いてE. coli NM522株を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、gshA 遺伝子の下流にgshB遺伝子が順向きに挿入されたプラスミドが取得されていることを確認し、該プラスミドをpGH3と命名した。
【実施例２】
【００９７】
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドの造成
（１）cydDC遺伝子を発現するプラスミドの造成
上記実施例１と同様、ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２７で表される塩基配列を有するE. coliのcydD遺伝子およびcydC遺伝子（以下、cydD-cydC遺伝子という）に基づき、配列番号６３および６４で表される塩基配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成した。【００９８】
E. coli W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６３および６４で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのPfuDNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液、200μmol/L の各dNTPを含む反応液40μLを調製し、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で4分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。【００９９】
該ＰＣＲにより、cydD-cydC遺伝子断片に相当する約3.7kbの断片（以下、cydD-cydC遺伝子増幅断片という）が得られた。
得られたcydD-cydC遺伝子増幅断片をHindIIIおよびBamHIで切断した後、ジーンクリーンIIキットを用いて精製した。
pACYC184の複製起点をもちクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドベクターpSTV29(タカラバイオ社製) をHindIIIおよびBamHIで切断後、上記と同様の方法により3.0kbのＤＮＡ断片を精製した。【０１００】
上記で得られた3.7kbのcydD-cydC遺伝子増幅断片と3.0kbのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて連結した。
得られた連結ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ NM522株を形質転換し、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、cydD-cydC遺伝子発現ベクターが取得されていることを確認し、該プラスミドをpCYD1と命名した。
（２）bcr遺伝子、ygeD遺伝子、およびyceE遺伝子を発現するプラスミドの造成
上記実施例１と同様、ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号２８で表される塩基配列を有するE. coliのbcr遺伝子に基づき、番号６５および６６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号２９で表される塩基配列を有するE.coliのygeD遺伝子に基づき、番号６７および６８で表される塩基配列を有するＤＮＡ、並びに配列番号３０で表される塩基配列を有するE.coliのyceE遺伝子に基づき、番号６９および７０で表される塩基配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成した。【０１０１】
E. coliW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、bcr遺伝子断片の増幅には上記の配列番号６５および６６、ygeD遺伝子断片の増幅には配列番号６７および６８、yceE遺伝子断片の増幅には配列番号６９および７０で表される塩基配列をからなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、用いるプライマーＤＮＡがそれぞれ異なる以外、上記（２）と同様の条件で行った。【０１０２】
該ＰＣＲにより、各遺伝子断片に相当する約1.2kbの断片（以下、それぞれbcr遺伝子増幅断片、ygeD遺伝子増幅断片、およびyceE遺伝子増幅断片という）が得られた。
得られたbcr遺伝子増幅断片をHindIIIおよびSacIで、ygeD遺伝子増幅断片およびyceE遺伝子増幅断片をClaIおよびBamHIで切断した後、ジーンクリーンIIキットを用いてそれぞれ精製した。【０１０３】
trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30をHindIIIおよびSacIまたはClaIおよびBamHIで切断後、上記と同様の方法により各4.5kbのＤＮＡ断片を精製した。
bcr遺伝子増幅断片と上記で得られたpTrS30のHindIIIおよびSacI切断断片とをライゲーションキットを用いて連結した。またygeD遺伝子増幅断片およびyceE遺伝子増幅断片は、上記で得られたpTrS30のClaIおよびBamHI切断断片と、ライゲーションキットを用いてそれぞれ連結した。【０１０４】
得られた各連結ＤＮＡを用いてE. coli NM522株を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、trpプロモーター（以下Ptrpと記す）下流にbcr遺伝子、ygeD遺伝子またはyceE遺伝子を含む発現ベクターが取得されていることを確認し、それぞれpBcr1、pYgeD1およびpYceE1と命名した。【０１０５】
次にpBcr1をEcoRIとSacI、pYgeD1およびpYceE1をEcoRIとBamHIで切断した後、Ptrpの下流に各遺伝子が配置されている約1.6kbのＤＮＡ断片（それぞれPtrp-bcr遺伝子、Ptrp-ygeD遺伝子およびPtrp-yceE遺伝子という）をジーンクリーンキットを用いてそれぞれ精製した。
pACYC184の複製起点をもちクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドベクターpSTV28(タカラバイオ社製) EcoRIおよびSacI、またはEcoRIおよびBamHIで切断後、上記と同様の方法により3.0kbのＤＮＡ断片を精製した。【０１０６】
上記で得られたPtrp-bcr遺伝子を含む約1.6kbのＤＮＡ断片とpSTV28のEcoRIおよびSacI切断断片、Ptrp-ygeD遺伝子またはPtrp-yceE遺伝子を含む1.6kbのＤＮＡ断片とpSTV28のEcoRIおよびBamHI切断断片とをライゲーションキットを用いてそれぞれ連結した。
得られた連結ＤＮＡを用いてE. coli NM522株を形質転換した後、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。【０１０７】
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、bcr、ygeD、およびyceE遺伝子発現ベクターが取得されていることを確認し、該プラスミドをそそれぞれpBcr2、pYgeD2、およびpYceE2と命名した。
（３）cmr遺伝子、marR-marA-marB遺伝子、acrA- acrB遺伝子、emrA-emrB遺伝子、emrE遺伝子、ydhC遺伝子、ydeE遺伝子、ydeA遺伝子、evgA-emrK-emrY遺伝子、emrD遺伝子、yajR遺伝子、yegB遺伝子、yidY遺伝子、yieO遺伝子、およびyjiO遺伝子を発現するプラスミドの造成
上記（１）と同様、ＤＮＡ合成機を用いて、cmr遺伝子、marR、marAおよびmarB遺伝子（以下、marR-marA-marB遺伝子という）、acrAおよびacrB遺伝子（以下、acrA-acrB遺伝子という）、emrAおよびemrB遺伝子（以下、emrA-emrB遺伝子という）、emrE遺伝子、ydhC遺伝子、ydeE遺伝子、ydeA遺伝子、evgA、emrKおよびemrY遺伝子（以下、evgA-emrK-emrY遺伝子という）、emrD遺伝子、yajR遺伝子、yegB遺伝子、yidY遺伝子、yieO遺伝子、およびyjiO遺伝子の各塩基配列に基づき、該遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡを合成した。各遺伝子を増幅するために用いたプライマーＤＮＡの塩基配列は表１のとおりである。【０１０８】
【表１】
2008126784.tif 000002
E. coli W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記表１の配列番号で表される塩基配列からなる２種のＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、用いるプライマーＤＮＡが異なる以外、上記（２）と同様の条件で行った。【０１０９】
該ＰＣＲにより、cmr遺伝子として約1.3kbのＤＮＡ断片（以下、cmr遺伝子増幅断片という）、marR-marA-marB遺伝子として約1.0kbのＤＮＡ断片（以下、marR-marA-marB遺伝子増幅断片という）、acrA-acrB遺伝子として約4.4kbのＤＮＡ断片（acrA-acrB遺伝子増幅断片という）、emrA-emrB遺伝子として約2.8kbのＤＮＡ断片（以下、emrA-emrB遺伝子増幅断片という）、emrE遺伝子として約0.4kbのＤＮＡ断片emrE遺伝子増幅断片に、ydhC遺伝子として約1.3kbのＤＮＡ断片（以下、ydhC遺伝子増幅断片という）、ydeE遺伝子として約1.2kbのＤＮＡ断片（以下、ydeE遺伝子増幅断片という）、ydeA遺伝子として約1.2kbのＤＮＡ断片（以下、ydeA遺伝子増幅断片という）、evgA-emrK-emrY遺伝子として約3.4kbのＤＮＡ断片（以下、evgA-emrK-emrY遺伝子増幅断片という）、emrD遺伝子として約1.2kbのＤＮＡ断片（以下、emrD遺伝子増幅断片という）、yajR遺伝子として約1.4kbのＤＮＡ断片（以下、yajR遺伝子増幅断片という）、yegB遺伝子として約1.5kbのＤＮＡ断片（以下、yegB遺伝子増幅断片という）、yidY遺伝子として約1.2kbのＤＮＡ断片（以下、yidY遺伝子増幅断片という）、yieO遺伝子として約1.5kbのＤＮＡ断片（以下、yieO遺伝子増幅断片という）、yjiO遺伝子として約1.3kbのＤＮＡ断片（以下、yjiO遺伝子増幅断片という）が得られた。【０１１０】
上記で得られたcmr遺伝子増幅断片をEcoRIおよびSalIで、acrA-acrB遺伝子増幅断片をSphIおよびSalIで、marR-marA-marB、emrA-emrB、emrE、ydhC、ydeE、ydeA、evgA-emrK-emrY各遺伝子増幅断片をEcoRIおよびBamHIで、emrD、yajR、yegB、yidY、yieO、yjiO各遺伝子増幅断片をEcoRIおよびPstIで切断した後、ジーンクリーンIIキットを用いてそれぞれの増幅断片を精製した。【０１１１】
次にプラスミドベクターpSTV28をEcoRIおよびSalI、SphIおよびSalI、EcoRIおよびBamHIで切断後、それぞれの約3.0kbのＤＮＡ断片を精製した。
cmr遺伝子増幅断片とpSTV28のEcoRIおよびSalI 切断断片、acrA-acrB遺伝子増幅断片とpSTV28のSphIおよびSalI切断断片、marR-marA-marB遺伝子増幅断片、emrA-emrB遺伝子増幅断片、emrE遺伝子増幅断片、ydhC遺伝子増幅断片、ydeE遺伝子増幅断片、ydeA遺伝子増幅断片、evgA-emrK-emrY遺伝子増幅断片の各増幅断片とpSTV28のEcoRIおよびBamHI切断断片、並びにemrD遺伝子増幅断片、yajR遺伝子増幅断片、yegB遺伝子増幅断片、yidY遺伝子増幅断片、yieO遺伝子増幅断片、yjiO遺伝子増幅断片の各増幅断片とpSTV28のEcoRIおよびPstI切断断片とをライゲーションキットを用いてそれぞれ連結した。【０１１２】
得られた各連結ＤＮＡを用いてE. coli NM522株を形質転換し、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。
該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、それぞれの遺伝子発現ベクターが取得されていることを確認し、各該プラスミドＤＮＡをpCmr、pMarRAB、pAcrAB、pEmrAB、pEmrE、pYdhC、pYdeE、pYdeA、pEmrKY、pEmrD、pYajR、pYegB、pYidY、pYieO、およびpYjiOと命名した。
【実施例３】
【０１１３】
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より強化され、かつグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を用いたグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインの製造
実施例１および実施例２（１）で造成したプラスミドpGH1、pGH3およびpCYD1を用いてE.coli JM101株を形質転換し、アンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性を指標にして形質転換体を選択した。【０１１４】
得られた形質転換株を50μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのクロラムフェニコールを含む8mlのLB培地の入った試験管に接種し、28℃で17時間培養した。得られた培養物を100μg/mlのアンピシリンおよび50μg/mlのクロラムフェニコールおよびアミノ酸を含む8mlの培地（リン酸水素二カリウム  16g/L、リン酸二水素カリウム  14g/L、硫酸アンモニウム  4g/L、クエン酸（無水）  5g/L、カザミノ酸（Difco社製）4g/L、チオ硫酸ナトリウム・5水和物  2g/L、グルコース  20g/l、ビタミンB1  10mg/L、硫酸マグネシウム・７水和物  2g/L、硫酸鉄７水和物  50mg/L、、硫酸マンガン７水和物  10mg/L、10mol/Lの水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.2に調整。グルコースおよび硫酸マグネシウム・７水和物、は別個に蒸煮後添加）を試験管に１％添加し、28℃で24時間培養した。【０１１５】
得られた培養物を遠心分離し、その上清中の生産物をHPLC法により分析した。
HPLC法による分析は、分離カラムにNucleosil 100-5C18 4.6mm× 150mm(250mm)（GLサイエンス）を用い、溶離液として0.4%(ｗ/v)ヘプタンスルホン酸、20％(ｖ/ｖ)アセトニトリル溶液（リン酸にてpH2.0に調整）を用い、流速1.0ml/min、温度40℃、検出210nmで行った。分析結果を表２に示す。なお表中のGLTはグルタチオン、GCはγ-グルタミルシステインを表す。【０１１６】
【表２】
2008126784.tif 000003
上記のとおり、グルタチオンの生合成に関わる蛋白質の活性を強化することにより、対数増殖期以降であっても培地中にグルタチオンを蓄積させることができた。またさらにcydDおよびcydC遺伝子の発現を強化することにより培地中のグルタチオンの蓄積量がさらに向上することから、cydDおよびcydC遺伝子にコードされる蛋白質はグルタチオン輸送活性を有していることがわかった。
【実施例４】
【０１１７】
グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性およびグルタチオンの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を用いたグルタチオンの製造
実施例１で造成したプラスミpGH1およびpGH3、並びに実施例２（２）および（３）で造成したプラスミドpBcr2、pYgeD2、pYceE2、pCmr、pMarRAB、pAcrAB、pEmrAB、pEmrE、pYdhC、pYdeE、pYdeA、pEmrKY、pEmrD、pYajR、pYegB、pYidY、pYieO、pYjiO、およびpSTV28から選ばれるプラスミドを用いてE.coliJM101株を形質転換し、アンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性を指標にして形質転換体を選択した。【０１１８】
得られた形質転換株を実施例３と同様の方法で培養し、培地中のグルタチオンの濃度を測定した。結果を表３に示す。なお表中のGLTはグルタチオンを表す。【０１１９】
【表３】
2008126784.tif 000004
上記のとおり、グルタチオンの生合成に関わる蛋白質の活性が高い株において、bcr遺伝子、ygeD遺伝子、yceE遺伝子、cmr遺伝子、marR-marA-marB遺伝子、acrA-acrB遺伝子、emrA-emrB遺伝子、emrE遺伝子、ydhC遺伝子、ydeE遺伝子、ydeA遺伝子、evgA-emrK-emrY遺伝子、emrD遺伝子、yajR遺伝子、yegB遺伝子、yidY遺伝子、yieO遺伝子またはyjiO遺伝子の発現を強化することにより培地中のグルタチオンの蓄積量がさらに向上することから、上記遺伝子にコードされる蛋白質は、cydDおよびcydC遺伝子産物と同様、グルタチオン輸送活性を有していることがわかった。
【実施例５】
【０１２０】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物の作製
E. coliの染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645（2000）］に従って作製した。
以下に記載のプラスミドpKD46、pKD3およびpCP20は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
（１）ggt遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
E. coli K12株の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号５２で表される塩基配列を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子（ggt遺伝子）を欠損させることを目的に、上記ＤＮＡ合成機を用い、エシェリヒア・コリK12株の染色体ＤＮＡ上におけるggt遺伝子の上流および下流に位置する400から500bpからなる塩基配列と相同な塩基配列、および酵母由来Flprecombinaseが認識する塩基配列を有するＤＮＡを合成した。【０１２１】
すなわち、ggt遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号１０１および１０２、並びに１０３および１０４で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成した。  次に、上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、E.coliW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのPfuDNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×１０緩衝液、200μmol/L の各deoxyNTPを含む40μLの反応液を用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で1分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。【０１２２】
該ＰＣＲにより、目的とするggt遺伝子欠損用の上流および下流域の相同配列断片（それぞれ、上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片という）を取得した。
次に上記の上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片、およびHindIIIで切断したpKD3を鋳型に、配列番号１０１および１０４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたクロスオーバーＰＣＲ法[J.Bacteriol., 179, 6228-6237 (1997)]により、中心部にpKD3のクロラムフェニコール耐性遺伝子部分が挿入し、３つのＤＮＡ断片が連結したＤＮＡ断片（ggt遺伝子欠損用ＤＮＡ断片）を取得した。
（２）γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子が欠損したE. coliの作製
エシェリヒア・コリJM101株をpKD46で形質転換した後、アンピシリン耐性を指標にして形質転換体を選択し、該形質転換体をE. coliJM101/pKD46と命名した。【０１２３】
10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたE. coli JM101/pKD46に、電気パルス法により上記で取得したggt遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を導入し、クロラムフェニコール耐性を指標にしてE.coliJM101/pKD46の染色体ＤＮＡ上に該ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体（E. coliJM101/pKD46ggt::cat）を選択した。【０１２４】
E. coliJM101/pKD46 ggt::catを、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地、及び100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして37℃で培養し、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を指標にしてpKD46脱落株（E.coliJM101 ggt::cat）を選択した。【０１２５】
次に上記で得られたE. coli JM101 ggt::catをpCP20を用いて形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして形質転換体を選択することにより、pCP20を保持するpKD46脱落株（E.coliJM101/pCP20ggt::cat）を取得した。
上記で取得したE. coli JM101/pCP20 ggt::catを薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地および100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして、30℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示す株を数株選択した。【０１２６】
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを調製し、染色体ＤＮＡ上において、ggt遺伝子の外側に位置するＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、0.1gの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5unitsのPfuDNAポリメラーゼ、4μLのPfuDNAポリメラーゼ用×１０緩衝液、200μmol/L の各deoxyNTPを含む40μLの反応液を用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。【０１２７】
上記ＰＣＲにおいて、ggt遺伝子を含まない、短い増幅断片を与えた株をggt遺伝子欠損株とし、E. coliJGT2株と命名した。
【実施例６】
【０１２８】
グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が欠損した微生物の作製
（１）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片のクローニング
E. coli K12株の染色体ＤＮＡ上に存在する配列番号５８で表される塩基配列を有するグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子（ybiK-yliA-yliB-yliC遺伝子）を欠損させることを目的に、上記ＤＮＡ合成機を用い、E.coliK12株の染色体ＤＮＡ上におけるybiK-yliA-yliB-yliC遺伝子の上流および下流に位置する400から500bpからなる塩基配列と相同な塩基配列を合成した。【０１２９】
すなわち、ybiK、yliA、yliB、およびyliC遺伝子はオペロンをなしているので、グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を欠損するためのプライマーセットとしてybiK遺伝子の上流領域を増幅するための配列番号１０５および１０６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、並びにyliC遺伝子の下流域を増幅するためのプライマーセットとして配列番号１０７および１０８で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成した。【０１３０】
次に、上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、実施例５（１）と同様の方法により、ybiK-yliA-yliB-yliC遺伝子欠損用の上流および下流域の相同配列断片（それぞれ、上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片という）を取得した後、該上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片、およびHindIIIで切断したpKD3を鋳型に、配列番号１０５および１０８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたクロスオーバーＰＣＲ法により、中心部にpKD3のクロラムフェニコール耐性遺伝子部分が挿入し、３つのＤＮＡ断片が連結したＤＮＡ断片（ybiK-yliA-yliB-yliC遺伝子欠損用ＤＮＡ断片）を取得した。
（２）グルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が欠損した微生物の作製
E. coliJM101および実施例５（２）で得られたE. coli JGT2株を、それぞれpKD46で形質転換した後、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択し、該形質転換体をそれぞれE.coliJM101/pKD46、およびE. coli JGT2/pKD46と命名した。【０１３１】
次にE. coliJM101/pKD46、およびE. coli JGT2/pKD46に、電気パルス法により上記（１）で取得したybiK-yliA-yliB-yliC遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を導入し、E.coliJM101/pKD46、およびE. coli JGT2/pKD46の染色体ＤＮＡ上にybiK-yliA-yliB-yliC遺伝子欠損用ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体（E.coliJM101/pKD46 ybiK-yliC::cat、およびE. coliJGT2/pKD46ybiK-yliC::cat）を取得した。【０１３２】
次に、実施例５（２）と同様の操作を行うことにより、pKD46が脱落しており、かつ染色体ＤＮＡ上からクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、それぞれE.coliJBK19、およびE.coli JGTBK1と命名した。表４は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。【０１３３】
【表４】
2008126784.tif 000005
【実施例７】
【０１３４】
グルタチオン分解活性およびグルタチオン取り込み活性が喪失したエシェリヒア・コリを用いたグルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの生産性の評価
実施例５および６で得られたγ−グルタミルトランスペプチダーゼまたはグルタチオン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の欠損株を、実施例１および２（１）で造成したプラスミドpGH1、pGH3およびpCYD1を用いて形質転換し、アンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性を指標に形質転換株を選択した。【０１３５】
得られた形質転換株を実施例３と同様の方法で培養し、培地中のグルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの濃度を測定した。結果を表５に示す。【０１３６】
【表５】
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上記のとおり、グルタチオンまたはγ−グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性、およびグルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性を強化した微生物において、さらにグルタチオンの分解活性、および／またはグルタチオン取り込み蛋白質の活性を喪失させることにより、培地中のグルタチオンおよびγ−グルタミルシステインの蓄積量がさらに向上することが明らかとなった。
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【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明により、効率よく安価にグルタチオンまたはγ-グルタミルシステインを製造することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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