(57)【要約】本発明は、ヒトＩｇＧへの特異的結合能を有するペプチドを提供する。特に本発明は、下記式Ｉ：  Ｃ−（Ｘ）ｎ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−（Ｘ）ｍ−Ｃ          （Ｉ）［式中、ｎ及びｍはそれぞれ１以上の整数であり、かつｎ＋ｍ＝４又は５である］で表されるアミノ酸配列であって、式Ｉ中のＸ−Ｘ−Ｘがシステイン残基を含まず、かつ以下のａ）及びｂ）：  ａ）式Ｉ中の（Ｘ）ｎ−Ｗが、Ｚａ−Ｇ−Ｙ−Ｗである  ｂ）式Ｉ中のＷ−（Ｘ）ｍが、Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂである［Ｚａ及びＺｂはそれぞれ０個又は１個以上のアミノ酸残基である］のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列を少なくとも含む、１１〜１６アミノ酸長のヒトＩｇＧ結合性ペプチドタグに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉ：
Ｃ−（Ｘ）ｎ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−（Ｘ）ｍ−Ｃ          （Ｉ）
［式中、ｎ及びｍはそれぞれ１以上の整数であり、かつｎ＋ｍ＝４又は５である］
で表されるアミノ酸配列であって、式Ｉ中のＸ−Ｘ−Ｘがシステインを含まず、かつ以下のａ）及びｂ）：
ａ）式Ｉ中の（Ｘ）ｎ−Ｗが、Ｚａ−Ｇ−Ｙ−Ｗである
ｂ）式Ｉ中のＷ−（Ｘ）ｍが、Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂである
［Ｚａ及びＺｂはそれぞれ０個又は１個以上のアミノ酸残基である］
のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列を少なくとも含む、１１〜１６アミノ酸長のヒトＩｇＧ結合性ペプチドタグ。
【請求項２】
式Ｉで表されるアミノ酸配列が、前記ａ）及びｂ）：
ａ）式Ｉ中の（Ｘ）ｎ−Ｗが、Ｚａ−Ｇ−Ｙ−Ｗである
ｂ）式Ｉ中のＷ−（Ｘ）ｍが、Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂである
［Ｚａ及びＺｂはそれぞれ０個又は１個以上のアミノ酸残基である］
の両方を満たす、請求項１に記載のペプチドタグ。
【請求項３】
以下の１）〜１１）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１又は２記載のペプチドタグ。
2008054030.tif 000013
2008054030.tif 000014
【請求項４】
式Ｉ中の２つのシステイン残基の間にジスルフィド結合が形成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドタグ。
【請求項５】
酸変性型ヒトＩｇＧに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドタグ。
【請求項６】
標識物質が付加されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドタグ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドタグを提示した組換えバクテリオファージ。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドタグと連結されたタンパク質からなる融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドタグを固定化した固相担体。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドタグをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
以下の工程ａ）〜ｃ）を含む、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を検出する方法：
ａ）試料を酸処理する工程、
ｂ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドタグを酸処理した試料と接触させる工程、及び
ｃ）工程ｂ）で生じた、ペプチドタグとヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片との結合を測定する工程。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴解析により前記結合を測定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程ａ）及びｂ）を含む、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を精製する方法：
ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドタグを酸処理した試料と接触させて、それにより試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片をペプチドタグに結合させる工程、
ｂ）工程ａ）でペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料から分離する工程。
【請求項１６】
以下の工程ａ）及びｂ）を含む、試料から酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を除去する方法：
ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドタグを試料と接触させる工程、及び
ｂ）工程ａ）でペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料から除去する工程。
【請求項１７】
以下の工程ａ）〜ｃ）を含む、タンパク質の精製方法：
ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドタグを連結したタンパク質からなる融合タンパク質を作製し、それを含む試料を調製する工程、
ｂ）工程ａ）の試料を酸処理したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片と接触させて、それにより融合タンパク質をヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片と結合させる工程、
ｃ）工程ｂ）でヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に結合した融合タンパク質を、試料から分離する工程。
【請求項１８】
請求項１〜６に記載のペプチドタグ、請求項７に記載の組換えバクテリオファージ、請求項９に記載の固相担体、請求項１１に記載のベクター、及び請求項１２に記載の形質転換体からなる群より選択される少なくとも１つを含む、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む断片を検出又は精製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩｇＧに対して結合親和性を有するペプチド、及びそれを用いるヒトＩｇＧの検出及び精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、米国では１０種類を超える抗体が医薬品として販売されている。抗体医薬は、最も確実性の高い分子標的医薬として注目されており、新しい医薬品分野を急速に拡大している。現在開発中又は使用されている抗体医薬のほとんどは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスに属する抗体を用いるものである。これまで、ＩｇＧ抗体の検出や精製には、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に特異的に結合する、抗Ｆｃ抗体やプロテインＡ／Ｇがしばしば使用されてきた（非特許文献１及び２）。しかし、ハイブリドーマ技術あるいは動物免疫化によって作製される抗Ｆｃ抗体には、高価であるだけでなく、ラベル化の際に変性しやすいことなどの欠点がある。一方、プロテインＡ／Ｇは、異なる生物種由来のＩｇＧを区別できず、またヒトＩｇＧ３には結合しないという欠点がある。さらにプロテインＡ／Ｇは、通常は細菌から単離されるため、ＬＰＳなどのエンドトキシンが混入する可能性がある点が、抗体医薬の精製におけるプロテインＡカラムの使用上の大きな問題となっている。さらに、プロテインＡカラムを用いて抗体の精製を行う場合、酸性溶液を用いてカラムから抗体を溶出する際に酸による抗体の変性が生じ、その結果として収率が大幅に低下したり、精製抗体の品質が低下したりする問題もある。このような抗ＩｇＧ抗体やプロテインＡ／Ｇを用いた抗体精製法が持つ問題を克服し、ヒトＩｇＧを特異的に検出及び精製できる新しい手法の開発は、非常に重要である。
ＩｇＧ精製に用いられうるＩｇＧ結合性ペプチドは、これまでに多数が報告されている。Ｆａｓｓｉｎａらは、合成多量体ペプチドライブラリをスクリーニングし、ビオチン標識免疫グロブリンとの相互作用についてプロテインＡと競合するプロテインＡミミックペプチドを同定した（非特許文献３及び４）。また、Ｅｈｒｌｉｓｈらは、１２ｍｅｒまたは７ｍｅｒの直鎖ペプチドを提示するＭ１３ファージディスプレイライブラリから、プロテインＡミミックな配列を有するＦｃ結合性ペプチドを単離した（非特許文献５）。Ｋｒｏｏｋらも、直鎖１０ｍｅｒペプチドを提示するランダムペプチドｆＵＳＥ５ファージライブラリをＩｇＧと反応させ、プロテインＡで溶出することにより、プロテインＡアナログペプチドを同定したことを報告している（非特許文献６）。２００５年には、Ｖｅｒｄｏｌｉｖａらが、環状の合成ペプチドライブラリから、ＩｇＧ抗体ヒンジ部に近い領域を認識し、ＦｃγＲＩＩＩとＩｇＧ  Ｆｃとの反応を競合阻害するようなペプチドモチーフを報告している（非特許文献７）。また鈴木らは、ＩｇＧ  Ｆｃフラグメントに結合性を有するペプチドを記載し、それらを利用したＩｇＧ検出方法を開示している（特許文献１）。しかし、これらのペプチドモチーフはいずれも、ＩｇＧ抗体の精製／検出用のタグとして充分なＩｇＧ結合親和性を有するものとはいえない。
一方２０００年に、ＤｅＬａｎｏらが、環状ペプチドを提示するＭ１３ファージライブラリを用いて、Ｆｃ−ＩＩＩペプチド（ＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴ；配列番号１５）を始めとする、ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメント上のヒンジ領域に結合親和性を有するポリペプチド配列を報告した（非特許文献８及び特許文献２）。さらに２００６年に、このペプチドＦｃ−ＩＩＩの環状形成をより安定化するようなエンジニアリングがＤｉａｓらによって行われた（非特許文献９）。ＤｅｌａｎｏらのペプチドＦｃ−ＩＩＩが示すＩｇＧ抗体との結合親和性はＫｄ値で１８５ｎＭであるが、Ｄｉａｓらの改良ペプチドＦｃＢＰ−２では、Ｋｄ値は約２ｎＭまで低下し、それが極めて結合力の強いペプチドであることが示された。しかし速度論的なパラメータの解析からは、ＦｃＢＰ−２の解離速度定数ｋｏｆｆは１０−２ｓｅｃ−１となった。この解離速度は抗体の通常のｋｏｆｆ（１０−３〜１０−５Ｓｅｃ−１）の値に比べ、非常に速い。このことは、ペプチドＦｃＢＰ−２を抗体の精製や検出用のタグとして使用したとしても、解離速度の速さにより、ペプチドＦｃＢＰ−２と抗体との結合は速やかに解離してしまうため、その結合を保持できないことを意味する。従ってＦｃＢＰ−２は、ヒトＩｇＧ精製／検出の用途には適さない。
多種多様なヒトＩｇＧ  Ｆｃ結合性ペプチドが特許文献３に開示されている。しかし、ヒトＩｇＧのいずれのサブクラスに対しても結合を十分に保持することができ、かつ他生物種のＩｇＧに対しては有意な結合を示さないような、ヒトＩｇＧ精製／検出に好適なペプチドは、特許文献３にも記載されていない。
【特許文献１】特開２００４−１８７５６３号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ０１／０４５７４６号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／０８６０７０号パンフレット
【非特許文献１】Ｅｙ  Ｐ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７８）１５，ｐ．４２９−４３６
【非特許文献２】Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９８５）１３５，ｐ．２５８９−２５９２
【非特許文献３】Ｆａｓｓｉｎａ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（１９９６）９，ｐ．５６４−５６９
【非特許文献４】Ｆａｓｓｉｎａ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（１９９８）１１，ｐ．１２８−１３３
【非特許文献５】Ｅｈｒｌｉｃｈ  Ｇ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂａｉｌｏｎ  Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（１９９８）１１，ｐ．１２１−１２５
【非特許文献６】Ｋｒｏｏｋ  Ｍ．，Ｍｏｓｂａｃｈ  Ｋ．，ａｎｄ  Ｒａｍｓｔｒｏｍ  Ｏ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）２２１，ｐ．１５１−１５７
【非特許文献７】Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ（２００５）６，ｐ．１２４２−１２５３
【非特許文献８】ＤｅＬａｎｏ  Ｗ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７，ｐ．１２７９−１２８３
【非特許文献９】Ｄｉａｓ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００６）１２８，ｐ．２７２６−２７３２
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ヒトＩｇＧに対し特異的な結合活性を有する、ヒトＩｇＧの精製又は検出に好適に使用可能なペプチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ある特定の配列パターンを有する短いペプチドが、ヒトＩｇＧ抗体の各サブクラス（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）に対し高い結合活性を示す一方、マウスなどの抗体には有意な結合を示さず種特異性を有することを見出した。さらにこれらのペプチドについて、ヒトＩｇＧ抗体との結合における解離速度が遅く、その結合をより保持しやすいことも示された。さらに、これらのペプチドとヒトＩｇＧ抗体との結合は、ヒトＩｇＧ抗体の酸処理により顕著に促進されることも示された。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］  下記式Ｉ：
Ｃ−（Ｘ）ｎ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−（Ｘ）ｍ−Ｃ          （Ｉ）
［式中、ｎ及びｍはそれぞれ１以上の整数であり、かつｎ＋ｍ＝４又は５である］
で表されるアミノ酸配列であって、式Ｉ中のＸ−Ｘ−Ｘがシステイン残基を含まず、かつ以下のａ）及びｂ）：
ａ）式Ｉ中の（Ｘ）ｎ−Ｗが、Ｚａ−Ｇ−Ｙ−Ｗである
ｂ）式Ｉ中のＷ−（Ｘ）ｍが、Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂである
［Ｚａ及びＺｂはそれぞれ０個又は１個以上のアミノ酸残基である］
のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列を少なくとも含む、１１〜１６アミノ酸長のヒトＩｇＧ結合性ペプチドタグ。
このペプチドタグにおいては、式Ｉで表されるアミノ酸配列が、前記ａ）及びｂ）：
ａ）式Ｉ中の（ｘ）ｎ−Ｗが、Ｚａ−Ｇ−Ｙ−Ｗである
ｂ）式Ｉ中のＷ−（Ｘ）ｍが、Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂである
［Ｚａ及びＺｂはそれぞれ０個又は１個以上のアミノ酸残基である］
の両方を満たすことがより好ましい。
上記［１］のペプチドタグの特に好適な例としては、以下の１）〜１１）のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
2008054030.tif 000002
2008054030.tif 000003
上記［１］のペプチドタグにおいては、式Ｉ中の２つのシステイン残基（Ｃ）の間にジスルフィド結合が形成されることが好ましい。
上記［１］のペプチドタグは、好ましくは、酸変性型ヒトＩｇＧに結合するものである。
上記［１］のペプチドタグには、標識物質が付加されていてもよい。
［２］上記［１］のペプチドタグを提示した組換えバクテリオファージ。
［３］上記［１］のペプチドタグと連結されたタンパク質からなる融合タンパク質。
［４］上記［１］のペプチドタグを固定化した固相担体。
［５］上記［１］のペプチドタグをコードするＤＮＡ。
［６］上記［５］のＤＮＡを含むベクター。
［７］上記［６］のベクターを含む形質転換体。
［８］以下の工程ａ）〜ｃ）を含む、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を検出する方法：
ａ）試料を酸処理する工程、
ｂ）上記［１］のペプチドタグを酸処理した試料と接触させる工程、及び
ｃ）工程ｂ）で生じた、ペプチドタグとヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片との結合を測定する工程。
この検出方法では、表面プラズモン共鳴解析により前記結合を測定することが好適である。
［９］  以下の工程ａ）及びｂ）を含む、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を精製する方法：
ａ）上記［１］のペプチドタグを酸処理した試料と接触させて、それにより試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片をペプチドタグに結合させる工程、
ｂ）工程ａ）でペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料から分離する工程。
［１０］  以下の工程ａ）及びｂ）を含む、試料から酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を除去する方法：
ａ）上記［１］のペプチドタグを試料と接触させる工程、及び
ｂ）工程ａ）でペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料から除去する工程。
［１１］  以下の工程ａ）〜ｃ）を含む、タンパク質の精製方法：
ａ）上記［１］のペプチドタグを連結したタンパク質からなる融合タンパク質を作製し、それを含む試料を調製する工程、
ｂ）工程ａ）の試料を酸処理したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片と接触させて、それにより融合タンパク質をヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片と結合させる工程、
ｃ）工程ｂ）でヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に結合した融合タンパク質を、試料から分離する工程。
［１２］上記［１］のペプチドタグ、上記［２］の組換えバクテリオファージ、上記［４］の固相担体、上記［６］のベクター、及び上記［７］の形質転換体からなる群より選択される少なくとも１つを含む、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む断片を検出又は精製するためのキット。
本発明のペプチドタグは、ヒトＩｇＧと特異的に結合することができ、特に、酸変性したヒトＩｇＧに良好に結合することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎となる特願２００６−２９９５６６号の明細書に記載された内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ヒトＩｇＧ抗体に対するバイオパンニングによるＩｇＧ特異的ファージ（黒塗りのバー）の濃縮を示した図である。各ラウンドにおいて示したバーは、左からｈＩｇＧ、ゼラチン、ＢＳＡに結合性を示したファージを示す。
図２は、得られたＩｇＧ特異的ファージクローンのヒトＩｇＧに対する結合特異性を示した図である。各ファージについて示したバーは、左からｈＩｇＧ、ｈＩｇＡ、ｈＩｇＥ、ｈＩｇＭ、ｍＩｇＧ、ｍＩｇＡ、ｍＩｇＥ、ｈＴＦ、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ゼラチンに対する結合性を示す。
図３は、得られたＩｇＧ特異的ファージクローンのヒトＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に対する結合活性を示した図である。各ファージについて示したバーは、左からｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ＢＳＡ、ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ｂ、ｍＩｇＧ３に対する結合性を示す。
図４は、得られたＩｇＧ特異的ファージクローンのヒトＩｇＧへの結合に対するプロテインＡの阻害を示した図である。各ファージについて示したバーは、左から０ｎｇ／ウェル、１５ｎｇ／ウェル、３０ｎｇ／ウェル、６０ｎｇ／ウェル、１２５ｎｇ／ウェル、２５０ｎｇ／ウェル、５００ｎｇ／ウェルのプロテインＡ（ＳｐＡ）を添加した場合のヒトＩｇＧ結合性を示す。
図５は、還元条件下及び酸化条件下でのＩｇＧ特異的ファージクローンのヒトＩｇＧへの結合活性を示した図である。各実験群について示したバーは、左から０ｍＭ（添加せず）、３０ｍＭ、５０ｍＭのＧＳＳＧ又はＤＴＴを添加したファージのヒトＩｇＧ結合性を示す。
図６は、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドのヒトＩｇＧに対する結合特異性を示した図である。各合成ペプチドについて示したバーは、左からｈＩｇＧ、ｈＩｇＧ−Ｆｃ、ｈＩｇＡ、ｈＩｇＥ、ｍＩｇＧ、ｍＩｇＡ、ｍＩｇＥ、ｈＴＦ、ＦＢＳ、ＨＳＡ、ゼラチン、ＢＳＡに対する結合性を示す。
図７は、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドのヒトＩｇＧアイソタイプ抗体に対する結合活性を示した図である。各合成ペプチドについて示したバーは、左からｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４、ＢＳＡに対する結合性を示す。
図８は、各種ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドとヒトＩｇＧとの結合に関する表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。横軸は時間（秒）、縦軸はレスポンスユニット（ＲＵ）を表す。図８Ａは、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−１とヒトＩｇＧとの結合に関する表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。図８Ｂは、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−１Ｅ６ＱとヒトＩｇＧとの結合に関する表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。図８Ｃは、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−４とヒトＩｇＧとの結合に関する表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。図８Ｄは、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６ＲとヒトＩｇＧとの結合に関する表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。
図９は、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチド及びヒトＩｇＧ特異的ファージクローンを固定化したマグネットビーズを用いたヒトＩｇＧ抗体の免疫沈降の結果を示す写真である。
図１０は、ヒトＩｇＧ特異的合成ペプチドを用いた酸処理後のｈＩｇＧ抗体の免疫沈降の結果を示す写真である。
図１１は、酸処理（処理ｐＨ２．７、処理温度４０℃）後のＩｇＧサンプルとセンサーチップ上に固定化したペプチドＦｃ−ＩＩＩ又はＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒとの反応性を示すＳＰＲセンサーグラムを例示する図である。横軸は時間（秒）、縦軸はレスポンスユニット（ＲＵ）を表す。図中のｂとａの比率ａ／ｂの値に基づいて、酸変性型コンフォメーションを有するＩｇＧ（酸変性型ＩｇＧ）の生成率を算出した。図中、実線はＦｃ−ＩＩＩ固定化センサーチップ上に結合したヒトＩｇＧ、破線はＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化センサーチップ上に結合したヒトＩｇＧの量を示す。
図１２は、酸処理条件に応じた酸変性型ヒトＩｇＧの生成率の変化を示す図である。図中、白のバー、黒塗りバー、斜線バーは、それぞれ、酸処理時のインキュベーション温度が２０℃、３０℃、４０℃のサンプルを表す。
図１３は、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化カラムによる酸変性型ヒトＩｇＧの分離を示す図である。図中、実線が、酸処理した抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧ抗体サンプルを、破線が未処理の抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧ抗体サンプル（ハーセプチン）を、点線がＢＳＡを表す。
図１４は、酸変性型コンフォメーションを有するヒトＩｇＧ（酸変性型ヒトＩｇＧ）のＣＤスペクトルを示す図である。実線が未処理のＩｇＧを、点線が精製した酸変性型ＩｇＧを表す。
図１５は、酸変性型ヒト抗ＩＬ−６レセプター抗体ＭＲＡの分子篩クロマトグラフィーの結果を示す図である。図１５Ａ：未処理のヒトＩｇＧ（抗ＩＬ−６レセプターヒト抗体ＭＲＡ）、Ｂ：酸処理（ｐＨ２．７、３０℃、１０分）したヒトＩｇＧ（ＭＲＡ）、Ｃ：ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化カラムを通して精製された酸変性型ＭＲＡ、Ｄ：酸処理（ｐＨ２．７、３０℃、１０分）したヒトＩｇＧ（ＭＲＡ）をＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化カラムにアプライして得られた素通り画分（未変性のまま残存したＭＲＡ）。
図１６は、酸処理したヒトＩｇＧサンプルからＩＭＧｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムクロマトグラフィーにより分離した画分に対する、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化ビーズによる免疫沈降実験の結果を示す図である。レーン１：未処理の抗体ＭＲＡ、レーン２：ｐＨ２．２、４℃で１０分間処理した抗体ＭＲＡサンプル、レーン３：精製された酸変性型ＭＲＡ（ｐＨ２．２、４℃で１０分間処理をした抗体ＭＲＡサンプルをＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムに通過させて得られた吸着画分）、レーン４：ｐＨ２．２、４℃で１０分間処理した抗体ＭＲＡサンプルをビオチン化ＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムに通過させて得られる素通り画分。
図１７は、ヒトＩｇＧ抗体医薬や免疫グロブリン製剤中の、全ＩｇＧ量に対する酸変性型ヒトＩｇＧの含有率を示す図である。
図１８は、本発明のＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド（抗ヒトＩｇＧペプチド）を用いた、酸処理したＩｇＧ（ヒトＭＲＡ）のドットブロッティングの検出結果を示す写真である。図中、Ｋ６Ｒ（Ｎ）は、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチドで検出した酸処理をしていないヒトＩｇＧ；Ｆｃ−ＩＩＩ（Ｎ）は、Ｆｃ−ＩＩＩペプチドで検出した酸処理をしていないヒトＩｇＧ；Ｋ６Ｒ（Ａ）は、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチドで検出した酸処理（ｐＨ２．８、４０℃、１０分インキュベート）したヒトＩｇＧ；ＣＳ（Ｎ）は、ＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳペプチドで検出した酸処理をしていないヒトＩｇＧを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のペプチドタグ
本発明は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域、特に酸変性型ヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対して特異的に結合するペプチドタグと、それを利用したヒトＩｇＧの検出、精製又は除去方法に関する。
本発明において「ペプチドタグ」とは、その標的分子（ここでは、ヒトＩｇＧ若しくはそのＦｃ領域を含む断片又はそれらの標識物等）への特異的結合性を利用して、該標的分子の検出、捕捉、精製（濃縮などを含む）、分離除去などに使用するためのペプチドを意味する。
本発明にかかるペプチドタグは、共通モチーフである３アミノ酸配列Ｇ−Ｙ−ＷとＷ−Ｇ−Ｌの間に３個の任意のアミノ酸残基が挟まれた配列（Ｇ−Ｙ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−Ｇ−Ｌ）を含む９又は１０アミノ酸長の配列の両側にシステイン残基が１つずつ配置されたペプチド配列又はその類似配列を含む、短鎖長のペプチドである。この類似配列とは、上記ペプチド配列と相同性の高い配列を有し、かつ上記Ｇ−Ｙ−ＷとＷ−Ｇ−Ｌのうち少なくとも一方のモチーフ配列と、上記配列パターンＷ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗとが保存されているアミノ酸配列を意味する。そのような類似配列としては、例えば、アミノ酸配列Ｃ−（Ｘ）０−２−（Ｆ又はＹ）−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−（Ｇ又はＱ）−（Ｌ又はＩ）−（Ｘ）０−２−Ｃが挙げられる。ここで（Ｘ）０−２は、任意のアミノ酸残基Ｘが０〜２個連続している配列である。
より一般的には、本発明にかかるＩｇＧ結合性ペプチドタグは、下記式Ｉ：
Ｃ−（Ｘ）ｎ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−（Ｘ）ｍ−Ｃ          （Ｉ）
［式中、ｎ及びｍはそれぞれ１以上の整数であり、かつｎ＋ｍ＝４又は５である］
で表されるアミノ酸配列であって、さらに、式Ｉ中のＸ−Ｘ−Ｘがシステイン残基を含まず、かつ以下のａ）及びｂ）：
ａ）式Ｉ中の（Ｘ）ｎ−Ｗが、Ｚａ−Ｇ−Ｙ−Ｗである
ｂ）式Ｉ中のＷ−（Ｘ）ｍが、Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂである
［Ｚａ及びＺｂはそれぞれ０個又は１個以上（具体的には、ｎ＋ｍ＝４又は５を満たすように最大２個である）のアミノ酸残基（好ましくはシステイン残基を除く）である］
のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列、を少なくとも含むペプチドとして表される。またこのペプチドタグとしては、１１〜１６アミノ酸長、好ましくは１１〜１４アミノ酸長からなるペプチドが好ましい。
なお式Ｉ中のＸ−Ｘ−Ｘは、好ましくはシステイン残基を１個も含まない３アミノ酸配列である。さらに式Ｉ中のＸ−Ｘ−Ｘは、トリプトファン残基を１個も含まない３アミノ酸配列であることも好ましい。
原則として、本明細書中に示すアミノ酸配列（例えば、上記式Ｉ）は、通常のアミノ酸の３文字表記又は１文字表記を用いて表している。すなわち、例えば上記式Ｉ中、Ｃはシステイン残基（Ｃｙｓ）、Ｗはトリプトファン残基（Ｔｒｐ）を表す。またＸは任意の１個のアミノ酸残基を表し、（Ｘ）ｎ及び（Ｘ）ｍは任意のアミノ酸残基Ｘがそれぞれｎ個、そしてｍ個連続した配列を表す。またＸ−Ｘ−Ｘは連続した３個のアミノ酸残基の配列を表す。さらにＧはグリシン残基（Ｇｌｙ）、Ｙはチロシン残基（Ｔｙｒ）、Ｌはロイシン残基（Ｌｅｕ）を表す。
さらに、本発明のより好適なペプチドタグは、以下の通りである：
下記式ＩＩ：
（Ｘ）ｐ−Ｃ−（Ｘ）ｎ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−（Ｘ）ｍ−Ｃ−（Ｘ）ｑ    （ＩＩ）
［式中、ｐ＝０又は１であり、ｎ及びｍはそれぞれ１以上の整数であり、かつｎ＋ｍ＝４又は５であり、ｑ＝０又は１である］
で表されるアミノ酸配列であって、式ＩＩ中のＸ−Ｘ−Ｘがシステイン残基を含まず、かつ以下のａ）及びｂ）：
ａ）式ＩＩ中の（Ｘ）ｎ−Ｗが、Ｚａ−Ｇ−Ｙ−Ｗである
ｂ）式ＩＩ中のＷ−（Ｘ）ｍが、Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂである
［Ｚａ及びＺｂはそれぞれ０個又は１個以上のアミノ酸残基（好ましくはシステイン残基を除く）である］
のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列からなる、ヒトＩｇＧ結合性ペプチドタグ。
式ＩＩ中の（Ｘ）ｐ及び／又は（Ｘ）ｑは、存在しなくてもよい（ｐ，ｑ＝０の場合）。あるいは式ＩＩ中の（Ｘ）ｐ及び／又は（Ｘ）ｑがそれぞれ１個のグリシン残基（Ｇ）であることも好ましい。特に式ＩＩ中の（Ｘ）ｐ及び／又は（Ｘ）ｑは、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基からなることが好ましい。
ここで、式Ｉ又はＩＩによって表される本発明のペプチドタグは、上記ａ）及びｂ）に示すＺａ−Ｇ−Ｙ−Ｗ及びＷ−Ｇ−Ｌ−Ｚｂの配列を両方含む場合、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に対してより高い結合親和性を示し得る。
本発明のペプチドタグの特に好適な例として、以下のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。なおこれらのアミノ酸配列はアミノ酸の１文字表記を用いて表されている。
2008054030.tif 000004
2008054030.tif 000005
本発明のペプチドタグにおいては、その配列に含まれる２つのシステイン残基（Ｃ）の間でジスルフィド結合が形成されることが好ましい。このジスルフィド結合は、非還元条件下（例えば、１０ｍＭ〜５０ｍＭ酸化型グルタチオン存在下）では形成されるが還元条件下（例えば、１０ｍＭ〜５０ｍＭジチオスレイトール存在下）では形成されない。ジスルフィド結合が形成されることにより、本発明のペプチドタグはコンパクトな環状構造を形成する。
本発明のペプチドタグは、特に、酸変性したヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のＦｃ領域に対して高い結合活性を示し、そのような酸変性形態（酸変性型）のヒトＩｇＧ（全抗体）やそのＦｃ領域を含む断片と、強力に結合することができる。
ヒトＩｇＧは、パパイン等による消化を受けて、２つのＦａｂ断片（可変領域と定常領域を含む腕部分）と、Ｆｃ断片（定常領域を含む体幹部）に切断される。ＩｇＧ抗体のＦｃ断片は、ＩｇＧをパパイン酵素で切断することによって得られる抗体断片のうち、２本のＨ鎖のカルボキシル末端側の約半分の断片（定常領域であるＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなる）が互いに２つのジスルフィド結合によって連結されたものである。一方、本発明においてＦｃ領域とは、このＦｃ断片に含まれるＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインからなるＨ鎖内の領域を言う。なお、本明細書において「ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む断片」とは、ヒトＩｇＧのプロテアーゼ分解断片（典型的には、パパイン又はトリプシン分解断片）であってもよいし、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含むがプロテアーゼ分解断片ではないヒトＩｇＧの一部分であってもよい。「ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む断片」は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインからなるＨ鎖断片を１つ又は２つ以上含むＩｇＧの一部分でありうる。
本発明において、酸変性型ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）とは、酸処理により通常のＩｇＧ抗体のコンフォメーション（構造）が変性して特定の（特殊な）コンフォメーションを有するようになったヒト免疫グロブリンＧ、又は酸処理の有無にかかわらずそれと同等のコンフォメーションを有するヒト免疫グロブリンＧを指す。この酸変性型ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）においては、ランダム化した構造が一部認められる一方で、βシート構造などの二次構造は大部分が保持されていることが好ましい。すなわち、酸変性型ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、変性中間状態のコンフォメーションを有するものと思われる。ここで酸処理とは、限定するものではないが、好ましくはｐＨ３．５以下、例えばｐＨ１．５〜２．７、より好ましくはｐＨ１．５〜２．１の条件下に免疫グロブリンＧが曝露されることを意味する。この酸処理は、前記酸性条件下で免疫グロブリンＧを４℃〜５０℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃でインキュベートすることによって行うことが好ましい。この酸処理工程は、例えば１〜３分又はそれ以上、例えば５分〜１０分にわたるものでありうる。ＩｇＧ含有溶液をそのような酸性条件とした後、例えばトリスなどの塩基性溶液の添加により溶液のｐＨを中和してもよい。一例として、抗体を含有する溶液のｐＨをｐＨ１．５に調整して５分間インキュベートすることにより酸処理した後、溶液のｐＨを中和することができるが、これに限定されるものではない。一方、酸処理によって生じるのと同等の変性コンフォメーションを有するヒト免疫グロブリンＧは、例えば、ヒトＩｇＧを冷凍又は冷蔵保存したり、中性ｐＨ条件下で長期保存したりすることによっても生じうるし、またヒトＩｇＧに変異を導入したり糖鎖を付加又は除去したりすることによっても生じうるが、これらに限定されるものではない。本発明の酸変性型ヒト免疫グロブリンＧは、その抗原結合活性を保持していても、いなくてもよい。一般的なヒトＩｇＧ調製物、例えば市販のポリクローナルヒトＩｇＧ抗体製品などには、ある程度の量の酸変性型ヒト免疫グロブリンＧが含まれ得る。特に、プロテインＡカラムなどから酸性溶出液を用いて溶出したヒトＩｇＧ精製品には、通常、酸変性型ヒト免疫グロブリンＧが混在する。
本発明のペプチドタグは、ヒトＩｇＧのサブクラス（アイソタイプ）であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のいずれに対しても高い結合活性を示す。本発明のペプチドタグは、酸変性型の各サブクラスのヒトＩｇＧに対して特に高い結合活性を示す。本発明のペプチドタグはまた、酸変性型ヒトＩｇＧのオリゴマー（例えば、ダイマーやトリマーなど）に対しても高い結合活性を示す。
さらに本発明のペプチドタグは、好ましくは、ＩｇＧ以外のヒト免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等）に対して結合活性を示さない。本発明のペプチドタグはまた、好ましくは、ヒト以外の動物（例えば、マウス）の各種クラス及びサブクラスの免疫グロブリンに対しても結合活性を示さない。従って本発明のペプチドタグは、特に酸変性型のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域に対して非常に特異的に結合することができる。なお、本発明のペプチドタグはプロテインＡによるヒトＩｇＧへの結合を競合阻害することから、プロテインＡの結合部位であるＩｇＧ  Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの連結部付近に結合するものと考えられる。
本発明のペプチドタグは、当業者に周知の液相合成法、固相合成法、Ｆｍｏｃ法などの任意のペプチド化学合成法によって作製することができる（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ．（１９９０）Ｖｏｌ．１２，ｐ．１−１９；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８９）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：ｐ．５１３２、「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」（１９９２）日本生化学会編，東京化学同人などを参照されたい）。自動ペプチド合成機によるペプチド合成も一般的に行われている。あるいは、本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡを用いた組換え法やファージディスプレイ法などによって、ペプチドを製造してもよい。例えば本発明のペプチドタグのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のペプチドタグを製造することができる。製造されたペプチドタグは、さらに、常法により、例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、硫安、アルコールなどを使用した溶解度差に基づく分画手法、免疫吸着法などにより、回収又は精製することができる。
本発明のペプチドタグについては、非還元条件下においてジスルフィド結合を形成させることが好ましい。例えば、調製した本発明のペプチドタグをｐＨ８の緩衝液中に放置して空気酸化を受けさせることによりジスルフィド結合を形成させることができる。
本発明のペプチドタグには、標識物質が付加されていてもよい。標識物質が付加されたペプチドタグ又はそのペプチドタグと結合したヒトＩｇＧは、高感度かつ容易に検出することができる。標識物質としては、限定するものではないが、例えば、ビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光タンパク質、蛍光色素、化学発光色素、酵素、放射性同位元素などがある。具体的には例えば、ビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、エクオリン、フルオレセインなどが挙げられる。これらの標識物質を用いたタンパク質の標識方法は当業者には周知である。例えば本発明のペプチドタグをＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）などの市販の試薬を用いてビオチン化修飾することによりペプチドタグにビオチンを付加することもできる。標識物質は、リンカーを介して本発明のペプチドタグに付加されていてもよい。このリンカーは、ペプチド、脂肪酸、脂肪酸エステルなどの、タンパク質とペプチドとの連結部を構成できる任意の物質でありうる。リンカーは、タンパク質の立体構造形成を阻害しないためのスペーサーとして、あるいはプロテアーゼ認識部位を含む切断可能な連結部分として、ペプチドタグとタンパク質との間に挿入されたものでもよい。
さらに本発明は、本発明のペプチドタグを提示した組換えバクテリオファージにも関する。このような組換えバクテリオファージは、当業者に公知のファージディスプレイ法を用いて作製することができる。例えば、本発明のペプチドタグをコードする各種ＤＮＡをＴ７ファージベクターなどのファージディスプレイライブラリ作製用のベクターに組み込み、それをバクテリオファージ中にパッケージングし、増幅させることにより、得られる組換えバクテリオファージに本発明のペプチドタグを提示させることができる。
本発明はまた、本発明のペプチドタグと連結されたタンパク質からなる融合タンパク質にも関する。本発明のペプチドタグは、任意のタンパク質の好ましくはＮ末端又はＣ末端に連結（付加）されることにより、そのタンパク質の検出／精製用のアフィニティータグとして利用できる。この融合タンパク質においては、本発明のペプチドタグがリンカーを介して目的のタンパク質に連結されていてもよい。このリンカーは、タンパク質とペプチドとの連結部を構成できる任意の物質であってよく、例えば、プロテアーゼ認識部位を含む切断可能な連結部分であってもよい。これらの融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域（特に、酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域）と本発明のペプチドタグとの特異的結合性を利用して、容易に単離することができる。
上記のような融合タンパク質は、例えば当業者に周知の遺伝子組換え法により作製することができる。例えば、該タンパク質をコードする遺伝子と該ペプチドタグをコードするＤＮＡとを、読み枠が合うように発現ベクター中又は発現カセット中に挿入し、それを宿主細胞に導入し、培養しながら発現させて、産生されるタンパク質を回収すればよい。本発明のペプチドタグと融合させるべきタンパク質としては、限定するものではないが、アミログリコシダーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、イソアミラーゼ、プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、レンニン、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、チトクローム、セアプローゼ、セラチオペプチダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ブロメライン、ウロキナーゼ、ヘモコアグラーゼ、サーモライシン、ウレアーゼ等の酵素；インターフェロン、インターロイキン等のサイトカイン；インスリン、グルカゴン、セクレチン、ガストリン、コレシストキニン、オキシトシン、バソプレッシン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン等のホルモン；エンドルフィン、エンケファリン、ダイノルフィン等のオピオイドペプチド；フィブリノーゲン、プロトロンビン等の血液凝固因子；ＳＳＩ等のプロテアーゼインヒビター；さらに、アルブミン、グロブリン、グロビン、ケラチン、コラーゲン等が挙げられる。
本発明は、本発明のペプチドタグを固定化した固相担体にも関する。ペプチドタグを固定化するのに用いる好適な固相担体としては、限定するものではないが、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂やシリカゲル系樹脂などの樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、アガロース等の高分子化合物、ガラス、金属、磁性物質及びこれらの組み合わせなどの基材が挙げられる。そのような固相担体の形状は、例えば、トレー、球、繊維、粒子、棒、盤、容器、セル、マイクロプレート、試験管、膜、ゲル、チップ（センサーチップなど）等の任意の形状でよい。具体的には例えば、磁性（マグネット）ビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、ポリスチレンプレート、ガラスプレート、ポリスチレンチューブなどが挙げられる。これら固相担体への本発明のペプチドの固定化は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。
このように本発明のペプチドタグを固定化した固相担体は、限定するものではないが、例えば、ヒトＩｇＧを検出、捕捉、精製、又は分離等するために、特に酸変性型ヒトＩｇＧを検出、捕捉、精製、又は除去するために、好適に使用できる。例えば、本発明のペプチドタグを固定化した固相担体は、アフィニティークロマトグラフィーカラム等のカラムに充填して、ヒトＩｇＧを高効率に検出、捕捉、精製又は分離するために用いることができる。より具体的な例としては、ヒトＩｇＧ含有試料を酸処理した後に、そのような固相担体と接触させることにより、ヒトＩｇＧを高効率に固相担体上のペプチドタグに結合させることができる。あるいは、ヒトＩｇＧ含有試料をそのような固相担体と接触させて、該試料中の酸変性型ヒトＩｇＧを特異的に捕捉し、該試料からそれを除去することにより、ヒトＩｇＧをより均一な品質で精製することもできる。本発明の固相担体を充填した上記のようなカラムも、本発明に包含される。
本発明は、本発明のペプチドタグをコードする核酸（特にＤＮＡ）にも関する。特に、例えば配列番号１〜１１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、本発明の好ましい態様である。このようなＤＮＡは、適当なベクター中に挿入し連結することにより、組換えベクターの形態で容易に取り扱うことができる。本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡが挿入されるベクターは、宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ファージベクターなどのウイルスベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター又はプラスミドベクター等が挙げられる。本発明は、このようなペプチドタグをコードするＤＮＡを含むベクターも提供する。
ファージベクターとしては、限定するものではないが、Ｔ７ファージディスプレイベクター（Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１−１ｂ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１−２ａ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１−２ｂ、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１−２ｃ等（Ｎｏｖａｇｅｎ））、λファージベクター（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ、λＺＡＰＩＩ等）が挙げられる。またレトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの任意の動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの任意の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Ｌｏｒｉｓｔ  ６、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９−２０、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９−４２などが挙げられる。
プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）などが挙げられる。
本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡ断片を含み、かつ他のタンパク質をコードする遺伝子を挿入するための制限酵素切断部位を有するような、本発明のペプチドタグを標識タグとして付加した融合タンパク質を作製するためのベクターも、本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡを含むベクターの範囲に含まれる。
ベクター中にペプチドタグをコードするＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたベクターＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、露出した制限酵素部位に本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡをイン・フレームで挿入し連結する方法などが採用される。
本発明の組換えベクターは、ペプチドタグをコードするＤＮＡが宿主内で良好な活性を有するペプチドとして発現されるように、組換え発現ベクターとして作製することも好ましい。この組換え発現ベクターを作製するために、様々な宿主生物に対応して各種が市販されている発現ベクターを用いることができる。発現ベクターには、通常、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須な各種エレメントの他、選択マーカー、リポーター遺伝子、ポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、ポリＡ付加シグナル、リポソーム結合配列（ＳＤ配列）等の有用な配列を必要に応じて連結してもよい。選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が用いられうる。
以上のようなベクターには、本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡを、適切に発現されるような位置及び向きで連結することが好ましい。本発明のペプチドタグを組換え法により発現させる場合には、ベクターはプロモーターを含む発現ベクターであることが好ましい。
本発明は、本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡを含むベクターを導入した形質転換体（形質転換された、単細胞、カルス又は組織等）を作製し、それを発現可能な条件下で培養し、培養細胞又は培養液中に産生された本発明のペプチドタグを回収することにより、該ペプチドタグを製造することができる。本発明は、このような形質転換体及び該形質転換体を用いた本発明のペプチドを製造する方法も包含する。
形質転換には、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等、任意の宿主細胞を使用できる。
形質転換には、一般的に行われている手法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等を適用することができる。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカー又はリポータータンパク質を利用して行う。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した宿主生物（微生物）を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。
培養後、発現された本発明のペプチドタグが宿主細胞内に生産される場合にはその細胞を破砕する。一方、その本発明のペプチドタグが細胞外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去し、培養上清を得る。得られた液中に、本発明のペプチドタグが含まれる。本発明では、形質転換を行う代わりに、無細胞翻訳系を使用して本発明のペプチドタグを生産してもよい。
「無細胞翻訳系」とは、大腸菌等の宿主生物の細胞構造を機械的に破壊して得た懸濁液に、翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加え、試験管中などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。無細胞翻訳系としては、有利に使用可能なキットが市販されている。
産生された本発明のペプチドタグは、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、上記培養物中（細胞破砕液、培養液、又はそれらの培養上清中）あるいは無細胞翻訳系の溶液中から単離精製することができる。しかしながら、場合により、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて採取又は濃縮した培養上清や溶菌液上清、あるいはそれらの上清をさらに硫安分画後に透析にかけるなどして得た溶液を、そのままＩｇＧ結合性試験等に使用してもよい。
２．ペプチドタグのＩｇＧ結合性及びそれを利用したヒトＩｇＧの検出、精製、捕捉又は分離
本発明では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域、特に酸変性型のヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に特異的に結合できる本発明のペプチドタグを用いることにより、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を高感度に検出、捕捉、精製又は分離等することができる。特に本発明では、本発明のペプチドタグを用いることにより、試料中の酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を高感度に検出、捕捉、精製、又は除去等することができる。
ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に対する本発明のペプチドタグの結合状態は、解離定数Ｋｄ、アフィニティー定数Ｋａ、結合速度定数ｋａ、及び解離速度定数ｋｄなどを指標として表すことができる。
解離定数Ｋｄ及びアフィニティー定数Ｋａは、平衡状態にある２分子間の結合親和性、すなわち結合の強さを示す指標であり、解離定数Ｋｄはアフィニティー定数Ｋａの逆数である。そして解離定数Ｋｄの値が小さいほど、結合が強いことを意味する。一方、平衡状態にある２分子間の結合・解離反応の速さは、反応速度論的解析によって求められる結合速度定数ｋａ（ｋｏｎとも表記される）及び解離速度定数ｋｄ（ｋｏｆｆとも表記される）によって示される。結合速度定数ｋａは解離速度定数ｋｄの逆数である。解離速度定数ｋａの値が大きいほど、すみやかに解離し、結合状態がより短期間しか保持されないことを意味する。従って同等の解離定数Ｋｄを示す場合でも、ゆっくり会合するがゆっくり解離する場合（ｋａとｋｄの値が共に小さい）と、速やかに会合し速やかに解離する場合（ｋａとｋｄの値が共に大きい）とがあり、それぞれの結合保持状態は全く異なる。
ヒトＩｇＧに対する本発明のペプチドタグの結合状態を示すこれらの解離定数Ｋｄ、アフィニティー定数Ｋａ、結合速度定数ｋａ、及び解離速度定数ｋｄなどは、当業者に周知の任意の分子間相互作用測定法を用いて決定することができる。特に本発明においては、ヒトＩｇＧ（又はヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む断片）に対する本発明のペプチドタグの結合状態を、表面プラズモン共鳴スペクトル解析によって測定することが好ましい。表面プラズモン共鳴スペクトル解析は、限定するものではないが、バイオセンサー（生体分子間相互解析装置）であるＢＩＡＣＯＲＥシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ社）、例えばＢＩＡＣＯＲＥ２０００を用いて行うことができる。
ＢＩＡＣＯＲＥシステムとは、表面プラズモン共鳴スペクトル（ＳＰＲ）の原理に基づき、生体分子の相互作用（結合および解離）を、標識を用いることなく、リアルタイムでモニターできる解析装置である。表面プラズモン共鳴の原理については詳細な解説書が多数刊行されている（例えば、橋本せつ子著、「表面プラズモン共鳴現象を利用する生体分子相互作用の解説」、分析１９９７年５月号、（１９９７）（社）に本分析化学会発行、３６２〜３６８頁など）。この装置で用いる原理を簡単に説明すれば、金膜上で物質を結合／解離させて、その結合／解離によるチップ上の質量変化に伴う反射光の屈折率の変化を測定することにより、金膜上に結合した物質の量を算出するというものである。より具体的には、該装置では、センサーチップと呼ばれる金膜が貼られたガラス基板が、試料や試薬を流す流路の途中にその流れに曝露されるように設置されており、その流路に試料等を流しながら、センサーチップに７６０ｎｍの偏光をプリズム等でくさび型に集光させ、金膜上で反射させて、その反射光の屈折率をモニターすると、金膜上の物質の結合量の変化に比例して、表面プラズモン共鳴スペクトルの角度の変化が示される。そこでＢＩＡＣＯＲＥシステムでは、まずリガンドを流路に流して予めセンサーチップの金膜上にリガンドを固定化し、次いでリガンドが結合していない部位をブロッキングした後、そのリガンドとの結合／解離反応を調べるべき物質（アナライト）を流路に流しつつ、経時的に反射光の屈折率をモニターすることにより、その変化量から、リガンドとアナライトとの結合量を算出することができる。このシステムでは、表面プラズモン共鳴スペクトルの角度０．１°の変化を１０００レスポンスユニット（ＲＵ）と定義し、レスポンスユニットを単位とする値（ＲＵ値）に基づいて反射光の屈折率の変化を表す。ここで１レスポンスユニット（ＲＵ）はセンサーチップ表面上での１ｐｇ／１ｍｍ２の質量変化に相当する。すなわち、センサーチップ上の金膜への物質の結合量は、物質の結合前（添加前）の時点と結合完了時点のＲＵ値の差から算出できる。従ってＢＩＡＣＯＲＥシステムを用いれば、リガンド（例えば、本発明のペプチドタグ）とアナライト（例えば、試料中のＩｇＧ抗体）との結合量をセンサーチップ１ｍｍ２当たりのＲＵ値として求めることができ、その結合量（ＲＵ値）がリガンドへのアナライトの結合能に相当する。表面プラズモン共鳴スペクトル解析では、その結合能（結合量）の変化を示す結合曲線に基づいて、その初速度から結合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄを求めることができ、さらにその結合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄの値から解離定数Ｋｄ及びアフィニティー定数Ｋａを求めることができる（Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ）。この解析には通常は解析ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いる。
なおＢＩＡＣＯＲＥシステムで使用されうるセンサーチップには、該チップに固定化する物質（リガンド）、固定化方法、使用目的などに応じていくつかの種類があり、例えば、最もスタンダードなＣＭ５（ガラス面に金膜（典型的には５０ｎｍ）が貼られ、その上にデキストラン層（典型的には１００ｎｍ）を備える。アミノ基、チオール基、アルデヒド基を介してリガンドを固定化する）以外にも、ＣＭ４、ＣＭ３、Ｃ１、ＳＡ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ、ＮＴＡ、Ｌ１、ＨＰＡなどがある。
本発明においてセンサーチップへのリガンドの固定化は、例えばＢＩＡＣＯＲＥシステムのメーカー使用説明書に従って実施すればよいが、例えばセンサーチップＣＭ５へのアミンカップリングによって行うことができる。固定化方法は、例えば、物理的吸着による方法または共有結合による吸着であってもよい。例えば、センサーチップＳＡ上のストレプトアビジンへのビオチン化ペプチドタグの結合によって固定化することもできる。一例として、センサーチップとしてセンサーチップＳＡ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いる場合には、ビオチン化したペプチド（５０μＭ）を流路（フローセル等）に流し、センサーチップ上のデキストラン中に固定化されたストレプトアビジンにペプチドを固定化する。次いで、例えば酸変性型ヒトＩｇＧを含む試料（アナライト溶液）を流路に流し、チップ上のペプチドタグ（リガンド）と、試料中のヒトＩｇＧ等（アナライト）との結合量を算出する。限定するものではないが、この解析に使用できるＢＩＡＣＯＲＥ２０００の測定条件の一例を下記に示す。
ランニング緩衝液：ＨＢＳ−Ｔバッファー
流速：１０μｌ／分
反応温度：２５℃
再生溶液：０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７）
リガンド固定化量：４００〜１０００ＲＵ
固定化反応時のｐＨ：ｐＨ７．０
このような測定で得られた結合／解離曲線に基づき、結合後のＲＵ値から結合前のＲＵ値を差し引いたＲＵ値を、例えば、アナライトである酸変性型ヒトＩｇＧとリガンドであるペプチドタグとの１ｍｍ２当たりの結合量、すなわちそのペプチドタグの酸変性型ヒトＩｇＧへの結合能を示す値として用いることができる。
本発明のペプチドタグと、酸変性型ヒトＩｇＧとの結合状態を示す解離定数Ｋｄ、アフィニティー定数Ｋａ、結合速度定数ｋａ、及び解離速度定数ｋｄは、上記のような条件に従って表面プラズモン共鳴スペクトル解析により求めることが特に好ましい。この解析によれば、本発明のペプチドタグと酸変性型ヒトＩｇＧ（例えば、ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）中の酸変性型ヒトＩｇＧ）との結合に関する解離定数Ｋｄは、好ましくは０．１ｎＭ〜５０ｎＭ、例えば１０ｎＭ〜５０ｎＭである。これは、本発明のペプチドタグの酸変性型ヒトＩｇＧとの結合力は、従来の多くのＩｇＧ結合性ペプチドと比べるとかなり強いことを示している。一方、本発明のペプチドタグと酸変性型ヒトＩｇＧとの結合についての解離速度定数ｋｄは、好ましくは１０−３ｓｅｃ−１〜１０−５ｓｅｃ−１である。この解離速度定数ｋｄ値は、ヒトＩｇＧの一般的な解離速度定数（１０−４〜１０−６ｓｅｃ−１）とほぼ同等であり、本発明のペプチドタグは酸変性型ヒトＩｇＧに対する結合を十分保持できることが示される。
本発明のペプチドタグとヒトＩｇＧ、特に酸変性型ヒトＩｇＧとは、非還元条件下で上記のような結合を示す。本発明において「非還元条件下」とは、ジスルフィド結合の開裂が引き起こされないような還元的状態を意味する。より具体的には、「非還元条件下」とは、例えば、ジスルフィド結合を開裂させる還元剤（例えば、ＤＴＴ）が、その開裂を引き起こすような量で反応系に含まれないことを意味する。
本発明では、以上のような本発明のペプチドタグの酸変性型ヒトＩｇＧへの高い結合性を利用して、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を成功裡に検出することができる。本発明のペプチドタグは酸変性型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域との結合を安定に保持できるため、高い感度での検出が可能になる。
例えば本発明は、以下の工程ａ）〜ｃ）：
ａ）試料を酸処理する工程、
ｂ）本発明のペプチドタグを酸処理した試料と接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で生じた、ペプチドタグとヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片との結合を測定する工程、
を含む、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を検出する方法にも関する。
本発明のこの検出方法は、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む断片を含むか又は含む可能性がある任意の試料に適用できる。好適な試料の例としては、限定するものではないが、血液、体液（唾液、精液、涙、消化液、腹水など）、組織、組織液、細胞、細胞抽出液、培養物などの生体試料が挙げられる。この生体試料は、臨床検査標本であってもよい。好適な試料の他の例としては、モノクローナルヒトＩｇＧ産生ハイブリドーマの培養上清、免疫学的測定サンプルも挙げられる。試料は、酸変性した状態でペプチドタグと接触させることが好ましい。そのため、ペプチドタグと接触させる前に、上述したような酸処理により試料中のＩｇＧ等を酸変性させる。酸処理した試料は、ペプチドタグと接触させる前にｐＨを中和することが好ましい。あるいは試料は、もともと酸性条件下で調製又は採取されたものであってもよく、そのような試料については酸処理工程を省略して「酸処理した試料」として用いることもできる。また試料は、溶液又は懸濁液などの液体状に調製された状態で、本発明のペプチドタグと接触させることが好ましい。
本発明のペプチドタグを試料と接触させるには、例えば、酸処理した試料を本発明のペプチドタグに添加すればよく、その逆でもよい。本発明のペプチドタグと酸処理した試料との接触は、非還元条件下で行うことが好ましい。結合検出に用いる手法によっては、本発明のペプチドタグを試料と接触させた後、本発明のペプチドタグから、未結合物質を洗浄又は分画等によって除去することが好ましい。試料中にヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片が存在すれば、試料を酸処理した後に本発明のペプチドタグをその試料と接触させることにより、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片の少なくとも一部が酸変性型になり、それと本発明のペプチドタグが高効率で結合することになる。ここで「工程ａ）で生じた、ペプチドタグとヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片との結合」とは、本発明のペプチドタグと酸処理した試料との接触によって生じた、有意な量のペプチドタグが主に酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片と結合している状態を意味する。
ペプチドタグとヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片との結合は、当業者に周知の任意の分子間相互作用測定法によって測定することができる。そのような測定法としては、限定するものではないが、例えば免疫沈降法、ゲルシフトアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴解析、水晶振動子マイクロバランス法（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ（ＱＣＭ）；瀬尾眞浩著、「水晶振動微量天秤法」、表面技術、Ｖｏｌ．４５−Ｎｏ．１０、（１９９４）ｐ．１００３−１００８、米国特許５８６９７６３）、蛍光相関解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＦＣＳ）、他項目蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＦＩＭＤＡ））、相互相関解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦｘＣＳ））などが挙げられる。これらの方法は当業者に周知であり、またそれぞれの方法に対応した測定機器や測定用試薬も多数販売されている。本発明においては、例えば検出後にペプチドタグと結合したヒトＩｇＧを分離精製可能な点で、表面プラズモン共鳴解析を用いて結合を測定することが特に好ましい。上記結合の測定は、本発明のペプチドタグと酸処理した試料とを接触させる工程と同時に又は連続的に行ってもよい。
測定の結果、上記結合が認められた場合は、試料中に含まれるヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片の存在を検出できたことになる。
この方法によれば、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片が、試料中に単独で存在していても、標識物質などの他の物質に結合した状態で存在していても、うまく検出することができる。本発明の方法により、任意のタンパク質末端に融合されたヒトＩｇＧ等、ファージベクターに提示されたヒトＩｇＧ等、固相担体に固定化されたヒトＩｇＧ等も、検出できる。本発明では、このように他の物質と結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を検出する場合も、「ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片の検出」に含めるものとする。
この方法は、特に、生化学分野や分子生物学分野でよく利用されるヒトＦｃ融合タンパク質（ヒトＦｃ断片と任意のタンパク質との融合タンパク質）、例えば、ＴＮＦレセプターの細胞外ドメインとヒトＦｃ断片との融合タンパク質などの検出にも、好適に使用できる。
本発明では、本発明のペプチドタグの酸変性型ヒトＩｇＧへの高い結合性を利用して、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を成功裡に分離又は精製することもできる。本発明のペプチドタグは酸変性型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域との結合を安定に保持できるため、高い回収効率での分離又は精製が可能になる。
例えば本発明は、以下の工程ａ）及びｂ）：
ａ）本発明のペプチドタグを酸処理した試料と接触させて、それにより試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片をペプチドタグに結合させる工程、
ｂ）工程ａ）でペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料から分離する工程、
を含む、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を精製する方法にも関する。
本発明のこのＩｇＧ分離又は精製方法は、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む断片を含むか又は含む可能性がある任意の試料に適用できる。試料については、上記検出方法に記載した通りであり、同様に、酸変性した状態でペプチドタグと接触させることが好ましい。そのため、ペプチドタグと接触させる前に、上述したような酸処理により試料を酸変性させる。あるいは試料は、もともと酸性条件下で調製又は採取されたものであってもよく、そのような試料も「酸処理した試料」として用いることができる。酸処理した試料は、ペプチドタグと接触させる前にｐＨを中和することが好ましい。
本発明のペプチドタグを試料と接触させるには、例えば、酸処理した試料を本発明のペプチドタグに添加すればよく、その逆でもよい。本発明のペプチドタグと酸処理した試料との接触は、非還元条件下で行うことが好ましい。本発明のペプチドタグを酸処理した試料と接触させることにより、試料中のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片の少なくとも一部が酸変性型になり、それと本発明のペプチドタグが結合することになる。
本発明のペプチドタグを酸処理した試料と接触させた後、その接触によりペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、生体分子の分離精製に用いられる当業者に周知の手法により、試料から分離することができる。例えば、カラム、プレート、センサーチップなどの固相担体に固定化されたペプチドタグを用いた場合であれば、接触後の固相担体をペプチドタグが遊離しない条件で洗浄することにより、固相担体上のペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料中の他の成分から分離することができる。あるいは、磁性ビーズのような固相担体に固定化されたペプチドタグを用いた場合には、接触後の磁性ビーズ等を試料から磁石などで取り出し、好ましくはさらに洗浄することにより、磁性ビーズ上のペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料中の他の成分から分離することができる。この分離工程は、本発明のペプチドタグと試料との接触工程と同時に（又は並行して）あるいは連続的に行ってもよい。例えば、本発明の方法において例えば表面プラズモン共鳴解析法やクロマトグラフィー法を用いる場合には、アプライされた試料溶液中のヒトＩｇＧ等が固定化されたペプチドタグに接触し結合してそこに保持されるのと同時に、試料溶液中の他の成分はペプチドタグに結合されずに流出し、ペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ等とは分離される。
試料から分離された、ペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片については、そのＩｇＧ等の存在をウェスタンブロッティング等により確認してもよい。
必要に応じて、分離したペプチドタグと酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片との結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）から、さらにヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を遊離させ、単離することもできる。ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片は、限定するものではないが、例えば酸性条件下に置くことによって、ペプチドタグから遊離させることもできる。そのような酸性条件は、当業者であれば容易に調整することができるが、例えばグリシン−塩酸（ｐＨ２．１）などの酸性の溶液を、ペプチドタグと結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に添加すればよい。ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片は、透析法によりペプチドタグから分離させてもよい。ペプチドタグから遊離させたヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片は、当業者に周知のタンパク質精製法（各種クロマトグラフィー法、免疫沈降法など）を用いてさらに精製してもよい。
この方法により、試料中に単独で存在しているヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片も、標識物質などの他の物質に結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片も、好適に分離又は精製することができる。本発明の方法により、任意のタンパク質末端に融合されたヒトＩｇＧ等、ファージベクターに提示されたヒトＩｇＧ等、磁性ビーズなどの固相担体に固定化されたヒトＩｇＧ等も、分離又は精製できる。本発明の方法は、特に、生化学分野や分子生物学分野でよく利用されるヒトＦｃ融合タンパク質（ヒトＦｃ断片と任意のタンパク質との融合タンパク質）、例えば、ＴＮＦレセプターの細胞外ドメインとヒトＦｃ断片との融合タンパク質などの分離又は精製にも、好適に使用できる。本発明では、このように他の物質と結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を精製する場合も、「ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片の精製」に含めるものとする。
さらに本発明では、本発明のペプチドタグの酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域への高い結合性を利用して、試料中にもともと存在する酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を捕捉し、該試料から分離（除去）することもできる。この方法を利用すれば、例えば、ヒトＩｇＧを含有する試料から、混在する酸変性型のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を除去し、ヒトＩｇＧを均一かつ高純度に精製することができる。
従って、本発明は例えば、以下の工程ａ）及びｂ）：
ａ）本発明のペプチドタグを試料と接触させる工程、及び
ｂ）工程ａ）でペプチドタグに結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料から除去する工程。
を含む、試料から酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を除去する方法にも関する。
また本発明は、例えば、以下の工程ａ）〜ｃ）：
ａ）本発明のペプチドタグを、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を含有する試料と接触させて、それにより該試料中の酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片をペプチドタグに結合させる工程、
ｂ）工程ａ）でペプチドタグに結合した酸変性型ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を、試料から分離する工程、
ｃ）前記分離後の試料を採取する工程、
を含む、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片の精製方法にも関する。
このような酸変性型ヒトＩｇＧ等の除去法（ヒトＩｇＧ等の精製法）は、従来のヒトＩｇＧ精製技術の様々な問題を克服することができる。例えば、抗体医薬等の抗体生産におけるプロテインＡカラムを用いたヒト抗体の精製においては、酸性（典型的にはｐＨ２．１〜２．７）の溶液を用いてカラムから抗体を溶出することが一般的である。しかしこの方法では主として溶出時の酸処理により一部の抗体が変性し、その結果、得られる抗体製品の品質が低下する。そして、このようにして変性した抗体を除去するためには、通常、イオン交換法やゲルろ過法などの比較的煩雑な操作をさらに必要とする。しかし本発明のペプチドタグ、例えば本発明のペプチドタグを固定化したアフィニティカラムを用いれば、一段階の操作により、酸変性したＩｇＧ抗体を効率的に除去することができる。また、プロテインＡカラムを用いたヒト抗体の精製においては、酸性（典型的にはｐＨ２．１〜２．７）溶液で抗体をカラムから溶出する場合、収率が大幅に低下（６０〜８０％）するという問題もある。これは、酸処理により変性しコンフォメーションが変化した抗体が凝集しやすくなること、そのように凝集した抗体は樹脂と結合して溶出されにくくなることに起因するものと考えられる。本発明では、このようなヒトＩｇＧの回収率の低下を避けるため、本発明のペプチドタグに例えば可溶化能の高いＰＥＧや糖を付加し、それを酸性溶出液に添加することにより、酸変性した抗体とＰＥＧや糖を付加した本発明のペプチドタグとをカラム中で速やかに結合させて、抗体がカラム樹脂に吸着されることなく回収されるようにすることができる。回収した抗体からは、透析操作などにより、結合した本発明のペプチドタグを除去することもできる。
３．その他の実施形態
ペプチドタグのＩｇＧ結合性を利用したタンパク質の精製
本発明のペプチドタグと酸変性型ヒトＩｇＧとの高い結合性を利用すれば、そのペプチドタグが付加（連結）されたタンパク質を特異的に分離することができる。本発明では、このことを利用して、本発明にかかるペプチドタグを目的のタンパク質に付加し、そのタンパク質を、酸処理したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を用いて分離精製する方法も提供する。
例えば本発明は、以下の工程ａ）〜ｃ）：
ａ）本発明のペプチドタグを連結したタンパク質からなる融合タンパク質を作製し、それを含む試料を調製する工程、
ｂ）工程ａ）で調製した試料を酸処理したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片と接触させて、それにより融合タンパク質を該ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片と結合させる工程、
ｃ）工程ｂ）でヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に結合した融合タンパク質を、試料から分離する工程、
を含む、タンパク質の精製方法に関する。
上記の融合タンパク質は、本発明のペプチドタグが、好ましくはＮ末端またはＣ末端に付加（連結）されたタンパク質を言う。この融合タンパク質は、ペプチドタグと目的のタンパク質との間に、切断可能な連結部分（例えばプロテアーゼ認識部位）を含むリンカーを有していてもよい。
融合タンパク質は、分離精製すべき任意のタンパク質の好ましくはＮ末端又はＣ末端に、例えば組換え法などにより、本発明のペプチドタグを連結することにより作製することができる。より具体的には、例えば、ベクター中に組み込まれた本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡの５’側又は３’側に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ断片をイン・フレームで挿入した組換え発現ベクターを作製し、それを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、発現可能な条件下（例えば、発現誘導物質の存在下）で培養し、産生された融合タンパク質をその培養液又は培養細胞から回収することにより、ペプチドタグとタンパク質部分とからなる一本のポリペプチドを融合タンパク質として取得することができる。
本発明の方法では、好ましくは、まずそのような融合タンパク質を作製し、それを含む試料を調製する。試料は、限定するものではないが、好ましくは溶液又は懸濁液などの液体調製物であることが好ましい。
一方、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片は、ビーズ、カラム、プレートなどの固相担体に固定化したものを用いることがより好ましい。ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片は、試料と接触させる前に、酸処理しておくことが好ましい。酸処理は、上述の通り行えばよいが、例えば、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を含有する溶液をｐＨ１．５〜２．７に調整して少なくとも５分間処理することによって行うことができる。このような酸処理により、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片が酸変性型に変化し、本発明のペプチドタグを有する融合タンパク質の捕捉効率を大幅に向上させることができる。酸処理した試料は、ペプチドタグを有する融合タンパク質と接触させる前にｐＨを中和することが好ましい。このような酸処理したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に、上記の通り調製した融合タンパク質を含む試料を接触させると、試料中の融合タンパク質が、ペプチドタグを介して、酸変性型となったヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に結合する。
この方法では、そのようにしてヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片に結合した融合タンパク質を、さらに試料から分離することが好ましい。
以上のような試料と酸処理したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片との接触工程、及び融合タンパク質の試料からの分離工程は、基本的には上述した本発明の検出又は精製方法と同様にして行えばよい。
さらに、融合タンパク質が切断可能な連結部分（例えば、プロテアーゼ認識部位）を含むリンカーを有する場合には、融合タンパク質を試料から分離した後、さらにプロテアーゼ処理などの切断操作に供して本発明のペプチドタグと目的のタンパク質とを切り離し、それらを単独で回収及び精製することもできる。
この本発明のタンパク質精製方法によれば、目的のタンパク質を、高いトラップ効率で簡便かつ特異的に分離精製することができる。
キット
本発明は、本発明のペプチドタグ、そのペプチドタグを提示した組換えバクテリオファージ、そのペプチドタグに連結されたタンパク質からなる融合タンパク質、そのペプチドタグを固定化した固相担体、そのペプチドタグをコードするＤＮＡを含むベクター、及びそのベクターを含む形質転換体のうち少なくとも１つを含む、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む断片を検出又は精製するためのキットも提供する。本キットは、上記の本発明のヒトＩｇＧ等の検出又は精製方法において、本発明のペプチドタグを提供するために好適に使用することができる。
さらに本発明は、本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡ、本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡを含むベクター（特に、発現ベクター）、及びそのベクターを含む形質転換体のうち少なくとも１つを含む、酸変性型ヒトＩｇＧとの結合性を利用して容易に精製可能な精製タグ融合タンパク質を製造するためのキットを提供する。「精製タグ」とは、ＨｉｓタグやＧＳＴタグなどの、タンパク質のアフィニティー精製を容易にする付加的ペプチド配列を意味する。「精製タグ融合タンパク質」は、ここでは特に、本発明のペプチドタグが付加（連結）された融合タンパク質を指す。
本キットを利用して、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のペプチドタグをコードするＤＮＡとイン・フレームで連結したＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製し、それを発現条件下に置くことにより（例えば、その発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を発現誘導物質の存在下で培養することにより）、本発明のペプチドタグが連結された融合タンパク質を生産することができる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、下記実施例で用いたポリクローナルヒトＩｇＧ抗体、ポリクローナルヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ポリクローナルヒトＩｇＡ抗体、ポリクローナルヒトＩｇＥ抗体、ポリクローナルマウス抗体ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥは、Ｓｉｇｍａ社より購入した。また、ペプチドのシステイン残基間のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の形成は、ｐＨ８の緩衝液中での空気酸化によって行い、その後、逆相ＨＰＬＣとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて確認した。
［実施例１］  ヒト抗体結合モチーフの探索
１）Ｔ７ファージランダムペプチドライブラリの構築
Ｃ−（Ｘ）８−１０−Ｃ又は（Ｘ）３−Ｃ−（Ｘ）８−１０−Ｃ−（Ｘ）３の８つのアミノ酸配列パターンを示すランダムなペプチドをＴ７ファージ上に提示（ｄｉｓｐｌａｙ）するライブラリを、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に従って、それぞれ構築した。Ｔ７ファージランダムペプチドライブラリの作製の詳細についてはＫｒｕｍｐｅ  ＬＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００６）６（１５）：ｐ．４２１０−４２２２、及びＴ７Ｓｅｌｅｃｔ（Ｒ）  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を参照されたい。なおＣ−（Ｘ）８−１０−Ｃとは、Ｎ末端及びＣ末端のシステイン残基（Ｃｙｓ）の間に連続した８〜１０個の任意のアミノ酸残基（Ｘ）が挟まれたペプチド配列を表す。また（Ｘ）３−Ｃ−（Ｘ）８−１０−Ｃ−（Ｘ）３とは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、連続した３個の任意のアミノ酸残基、システイン残基（Ｃｙｓ）、連続した８〜１０個の任意のアミノ酸残基、システイン残基、及び連続した３個の任意のアミノ酸残基が連結したペプチド配列を表す。
簡単に説明すると、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、上記ランダムペプチドをコードするＤＮＡ断片集団をＴ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂベクター中にクローニングし、それをファージ中にパッケージングし、増幅することにより、ライブラリを作製した。作製したライブラリにおいては、上記ペプチドがＴ７  １０Ｂキャプシドタンパク質（約３４８アミノ酸）のＣ末端側に融合されて発現され、ファージ表面に提示された。
２）ヒトＩｇＧに対するバイオパンニング
９６穴のマイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルにヒトＩｇＧ（５００ｎｇ／１００μｌ／ウェル；血清由来ポリクローナル抗体（以下同じ））をコートし、０．５％ＢＳＡを添加してブロッキングした。そのウェルに、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に溶解した上記１）で作製したファージライブラリ（５．０×１０１０ｐｆｕ）を加え、室温で１時間反応させた。反応後のウェルをＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、大腸菌ＢＬＴ５６１５を加え、ファージ感染後に回収して、ファージ増殖のため培養した。１０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧによって培養後の上清からファージを回収し、それをさらに次のパンニングに用いた。このバイオパンニングプロセスを合計５ラウンド繰り返して、ヒトＩｇＧに特異的に結合するファージを濃縮した。ウェル洗浄工程では、第１〜第３ラウンドでは５回、第４、５ラウンドでは１０回の洗浄を繰り返した。洗浄液に含まれる界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０の濃度は、第１、第２ラウンドでは０．１％としたが、第３、第４ラウンドでは０．３％、第５ラウンドでは０．５％に上昇させた。５回のバイオパンニングの後、大腸菌ＢＬＴ５６１５を播いたプレートにファージを添加して感染させ、ファージ・プラークを形成させてファージをクローン化した。
３）ＥＬＩＳＡ試験
９６穴のマイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）のウェルに、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液中に溶解したヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／５０μｌ／ウェル）をコートし、ＰＢＳに溶解した０．５％  ＢＳＡを添加してブロッキングした。コントロールタンパク質としては、ヒトＩｇＧの代わりにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）をＰＢＳに溶解して用いた。ブロッキングした各ウェルに、上記２）の各ラウンドで得たＴ７ファージ集団（５×１０１０  ｐｆｕ／ウェル）を加えて１時間反応させた後、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。洗浄後のウェルにはビオチン化マウス抗Ｔ７ファージ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加し、次いでＨＲＰで標識したストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。さらに、ＴＭＢ溶液（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた呈色反応により、ウェル上のヒトＩｇＧに結合したＴ７ファージを検出した。検出は、４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｉ  ＮＪ−２３００，ＩｎｔｅｒＭｅｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定することにより行った。
このＥＬＩＳＡ試験で評価した、各ラウンドにおけるヒトＩｇＧに結合するファージの濃縮経過を、図１に示した。図１より、Ｃ−（Ｘ）８−１０−Ｃタイプのライブラリでは、第４ラウンドにヒトＩｇＧ結合ファージの著しい濃縮が起こったことがわかる。一方、（Ｘ）３−Ｃ−（Ｘ）８−１０−Ｃ−（Ｘ）３タイプのライブラリでは、効果的なヒトＩｇＧ結合ファージの濃縮がみられなかった（図１）。またいずれのライブラリでも、ＢＳＡ結合ファージの十分な濃縮は認められなかった。
そこで次に、上記のＣ−（Ｘ）８−１０−Ｃタイプの第５ラウンド後の混合集団からクローン化した個々のファージクローンについて、ヒトＩｇＧに対する結合活性を、上記と同様のＥＬＩＳＡ試験によって評価した。その結果、４０クローン中２５クローンについて、ヒトＩｇＧへの特異的結合活性が認められた。そこで、結合活性が示されたファージクローンが提示するペプチドのアミノ酸配列を決定するため、ファージＤＮＡのＧ１０キャプシドタンパク質遺伝子の３’側に連結されたペプチドコードＤＮＡについて、ＡＢＩ  ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ−３６Ｓを用いて塩基配列決定を行った。シークエンス反応用のプライマーとしては、上流プライマー：５’−ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣ−３’、及び下流プライマー：５’−ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡ−３’を用いた。配列決定の結果、ヒトＩｇＧへの結合活性が示されたファージクローンが提示するペプチドのアミノ酸配列は、下記表１の６種類（ｈＧ−１〜ｈＧ−６ペプチド）に分類された。これら６種類のペプチドは、ヒトＩｇＧに特異的に結合すると考えられた。さらにこれら６種類のペプチド配列はいずれも、Ｎ末端及びＣ末端のシステイン残基の間に、３アミノ酸配列からなるＧＹＷとＷＧＬという２つの共通モチーフの少なくとも一方を含むことが示された。表１中、各ペプチド配列は、アミノ酸１文字表記を用いて記載されている。
【表１】
2008054030.tif 000006
［実施例２］  ヒトＩｇＧへの結合特異性の評価
１）ＥＬＩＳＡ試験による評価
実施例１で単離されたファージクローンのうち、ペプチドｈＧ−１〜ｈＧ−６をそれぞれ提示する代表的なファージクローンＧ−１〜Ｇ−６について、実施例１と同様のＥＬＩＳＡ試験によりヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）に対する結合特異性を評価した。コントロールタンパク質としては、ヒトのＩｇＡ（ｈＩｇＡ）、ＩｇＥ（ｈＩｇＥ）、ＩｇＭ（ｈＩｇＭ）、マウスのＩｇＧ（ｍＩｇＧ）、ＩｇＡ（ｍＩｇＡ）、ＩｇＥ（ｍＩｇＥ）、ヒトトランスフェリン（ｈＴＦ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンを用いた。その結果を図２に示す。
ファージクローンＧ−１〜Ｇ−６はいずれも、ある程度の強弱の差はあるものの、ヒトＩｇＧに対して非常に高い結合特異性を示し（図２中、黒塗りのバー）、ヒトのＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、マウスのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＴｈＦ、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ゼラチンを含む他のコントロールタンパク質に対してはほとんど結合活性を示さなかった。従ってファージクローンＧ−１〜Ｇ−６が提示するペプチドｈＧ−１〜ｈＧ−６は、ヒトＩｇＧに特異的に結合し、他のクラスの抗体や他の生物種の抗体、あるいは他のタンパク質には実質的に結合しないことが示された。
さらにファージクローンＧ−１〜Ｇ−６について、ヒトＩｇＧのアイソタイプ（サブクラス）であるｈＩｇＧ１〜ｈＩｇＧ４に対する結合活性も、上記と同様のＥＬＩＳＡ試験で確認した。コントロールタンパク質としては、マウスＩｇＧアイソタイプであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３、そしてＢＳＡを用いた。その結果を図３に示す。図３に示される通り、ファージクローンＧ−１〜Ｇ−６は、ヒトＩｇＧのいずれのアイソタイプにも強く結合した。一方Ｇ−１〜Ｇ−６は、ＢＳＡにはもちろん、いずれのマウスＩｇＧアイソタイプにも有意な結合活性を示さなかった。
２）表面プラズモン共鳴解析による評価
より強い結合活性が認められたファージクローンＧ−１、Ｇ−２及びＧ−４について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を行った。ＳＰＲ解析は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ）にて２５℃にて行い、必要な試薬とセンサーチップは、ＢＩＡｃｏｒｅ社のものを購入して用いた。ヒトＩｇＧ（リガンド）を、製造元が推奨するアミンカップリングプロトコールに従って、センサーチップＣＭ５上に固定化した。コントロールとして、ヒトＩｇＡ又はＩｇＥを固定化したセンサーチップＣＭ５も調製した。固定化反応は、ｐＨ５の条件で行い、固定化量は、ＲＵ（レスポンスユニット）が１５００〜２０００の範囲内になるように調整した。次いで超遠心によって精製したＴ７ファージクローンＧ−１、Ｇ−２又はＧ−４（アナライト）を、１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍｌで、ヒトＩｇＧを固定化したセンサーチップを備えたフローセルに１０μｌ／ｍｉｎの流速で注入し、ヒトＩｇＧとの結合反応を測定した。その後、ランニング緩衝液（ＨＢＳ−Ｔ［バッファー組成：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．４）］）で洗浄することにより、解離反応を測定した。結合したアナライトのセンサーチップからの洗浄溶出には、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７）を用いた。結合パラメータの解析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて行った。
この結果、クローンＧ−１、Ｇ−２及びＧ−４はいずれも、センサーチップに固定化されたヒトＩｇＧに対して特異的な結合を示したが、固定化されたヒトＩｇＡやＩｇＥに対しては結合しなかった。この結果は、上記のＥＬＩＳＡ試験による結合特異性評価の結果とよく一致した。
［実施例３］  ｈＩｇＧ中の結合部位の推定
ヒトＩｇＧ内のファージクローンＧ−１〜Ｇ−６の結合部位を同定するために、ＩｇＧのＦｃ断片と特異的に結合することが知られるプロテインＡ（ＳｐＡ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の細胞壁構成タンパク質）との競合ＥＬＩＳＡ試験を行った。このＥＬＩＳＡ試験は基本的には実施例１と同様にして行った。具体的には、ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／５０μｌ／ウェル）をコートしたウェルを０．５％ＢＳＡでブロッキングし、このウェルに、Ｔ７ファージクローンＧ−１〜Ｇ−６（５×１０１０ｐｆｕ／ウェル）と各種濃度のＳｐＡとを同時に添加し、室温で一時間インキュベーションした後に、検出を行った。ＳｐＡの添加濃度は、０ｎｇ／ウェル、１５ｎｇ／ウェル、３０ｎｇ／ウェル、６０ｎｇ／ウェル、１２５ｎｇ／ウェル、２５０ｎｇ／ウェル、５００ｎｇ／ウェルとした。
この結果を図４に示す。図４に示される通り、Ｇ−１〜Ｇ−６によるいずれのヒトＩｇＧ抗体への結合も、ＳｐＡの添加濃度が高くなるほど強く阻害された。この結果から、Ｇ−１〜Ｇ−６は、ＩｇＧ内のＳｐＡ結合部位と同じ部位か又はその近傍を認識し結合していることが示された。ＳｐＡはヒトＩｇＧ  ＦｃのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの連結部に結合することが知られていることから、ファージクローンＧ−１〜Ｇ−６もその連結部付近に結合すると考えられた。
［実施例４］  ジスルフィド結合の評価
上記実施例で得たファージクローンが提示するペプチドについて、ヒトＩｇＧ結合活性におけるその分子内ジスルフィド結合の意義を評価するため、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下の還元的条件と、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）存在下の酸化的条件において、Ｔ７ファージクローンのｈＩｇＧへの結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。このＥＬＩＳＡ試験は基本的には実施例１と同様にして行った。具体的には、ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／５０μｌ／ウェル）をコートしたウェルを０．５％ＢＳＡでブロッキングし、このウェルに、ＧＳＳＧ又はＤＴＴ（５０、３０、１０ｍＭ）とＴ７ファージクローンＧ−１とを前もって１時間前から反応させておいたものを添加し、室温で一時間インキュベーションした後に、検出を行った。その結果を図５に示す。
図５に示される通り、還元的条件下（ジスルフィド結合が開裂する）では１０ｍＭ以上のＤＴＴ濃度でＧ−１はほぼ完全にヒトＩｇＧへの結合活性を失ったのに対し、酸化的条件下（ジスルフィド結合が形成される）では、いずれのＧＳＳＧ濃度でもＧ−１のヒトＩｇＧ結合活性に変化はみられなかった。なお、これらの条件下でもファージの大腸菌への感染性には何ら変化は認められなかったことから、還元条件下でのファージクローンＧ−１のＩｇＧ結合活性の低下は、ファージ粒子の崩壊等によるものではなく、Ｇ−１に提示されているペプチドｈＧ−１における分子内ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）の開裂によって生じたと考えられた。
以上の結果から、上記実施例で得たファージクローンが提示するペプチドにおいては、そのシステイン残基間での分子内ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）の形成が、ヒトＩｇＧに対する結合活性において重要な役割を持っていることがわかった。
［実施例５］  合成ペプチドのヒトＩｇＧへの結合活性
上記実施例で特に高いＩｇＧ結合活性が示されたファージクローンＧ−１及びＧ−４が提示するペプチドのアミノ酸配列に基づき、合成ペプチドを設計及び合成し、それを常法によりビオチン化して、ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−１（ビオチン−スペーサー−ＧＣＧＹＷＲＳＥＷＧＬＣＧ）、及びビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４（ビオチン−スペーサー−ＧＣＴＧＹＷＰＫＡＷＧＬＣＧ）を作製した。また、ＩＭＧｐｅｐ−１配列中の共通モチーフＧＹＷとＷＧＬの間に位置する「Ｅ（Ｇｌｕ）」を「Ｑ（Ｇｌｎ）」に置換したビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−１Ｅ６Ｑ（ビオチン−スペーサー−ＧＣＧＹＷＲＳＱＷＧＬＣＧ）を作製した。また、ＩＭＧｐｅｐ−４配列中の共通モチーフＧＹＷとＷＧＬの間に位置する「Ｋ（Ｌｙｓ）」を「Ｒ（Ａｒｇ）」に置換したビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ（ビオチン−スペーサー−ＧＣＴＧＹＷＰＲＡＷＧＬＣＧ）を作製した。さらに、ＩＭＧｐｅｐ−１配列の２つのシステイン残基（Ｃ）をセリン（Ｓ）に置換したビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳ（ビオチン−スペーサー−ＧＳＧＹＷＲＳＥＷＧＬＳＧ）を合成した。なお合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−１（ＧＣＧＹＷＲＳＥＷＧＬＣＧ；配列番号７）、ＩＭＧｐｅｐ−４（ＧＣＴＧＹＷＰＫＡＷＧＬＣＧ；配列番号９）、ＩＭＧｐｅｐ−１Ｅ６Ｑ（ＧＣＧＹＷＲＳＱＷＧＬＣＧ；配列番号１０）、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ（ＧＣＴＧＹＷＰＲＡＷＧＬＣＧ；配列番号１１）、ＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳ（ＧＳＧＹＷＲＳＥＷＧＬＳＧ；配列番号１２）はＦｍｏｃ法により合成し、逆相カラムで精製した。次いで、それらのＮ末端のアミノ基をＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン化修飾することにより、ビオチン化した。
得られたビオチン化合成ペプチドについて、ヒトＩｇＧに対する結合活性をＥＬＩＳＡ試験にてアッセイした。ＥＬＩＳＡ試験は、基本的には実施例１と同様にして行った。具体的には、ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／５０μｌ／ウェル）でコートしたウェルに、０．５％ＢＳＡを添加してブロッキングした後、ビオチン化合成ペプチドとアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＳＡ−ＡＰ）をあらかじめ４：１のモル比で混合したものを加えて、１時間反応させた。呈色にはパラニトロフェニルリン酸（Ｗａｋｏ）を用いた。検出は、４０５ｎｍの吸光度を測定することによって行った。ヒトＩｇＧの陽性コントロールとしては、ｈＩｇＧのＦｃ断片を用いた。他のコントロールタンパク質としては、ヒトのＩｇＡ、ＩｇＥ、マウスのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｈＴＦ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ゼラチンを用いた。
その結果を図６に示す。ＩＭＧｐｅｐ−１及びＩＭＧｐｅｐ−４は、上記実施例で示したファージクローンＧ−１〜Ｇ−６と同様に、ヒトＩｇＧに特異的に結合すること、またヒトＩｇＧのＦｃ断片に結合することが示された。さらに、１アミノ酸残基を置換したＩＭＧｐｅｐ−１Ｅ６ＱとＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒについては、その元のペプチドＩＭＧｐｅｐ−１及びＩＭＧｐｅｐ−４と比較して、いずれも有意に結合活性が大幅に上昇したことが示された。一方、２つのシステイン残基をセリン残基に置換したＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳでは、ヒトＩｇＧとの結合活性がほぼ消失したことから、ファージクローンＧ−１〜Ｇ−６と同様に、これら合成ペプチドにおいても、ＩｇＧとの特異的結合において分子内ジスルフィド結合の形成が必要であることが示された。
また、上記のビオチン化合成ペプチドについて、ヒトＩｇＧのアイソタイプであるｈＩｇＧ１〜ｈＩｇＧ４に対する結合活性を、同様にＥＬＩＳＡ試験にてアッセイした。ヒトＩｇＧのコントロールタンパク質としては、ＢＳＡを用いた。その結果を図７に示す。ＩＭＧｐｅｐ−１及びＩＭＧｐｅｐ−４は、上記実施例で示したファージクローンＧ−１〜Ｇ−６と同様に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のいずれに対しても強い結合活性を示した。１アミノ酸残基を置換したＩＭＧｐｅｐ−１Ｅ６ＱとＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒも、ヒトＩｇＧ１〜ＩｇＧ４に対して強い結合活性を示し、かつ、ＩＭＧｐｅｐ−１及びＩＭＧｐｅｐ−４と比べて上昇した結合活性を示した。ＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳについては、ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４に対する結合活性がほぼ消失していた。
以上の結果から、実施例１で同定されたペプチド配列又は共通モチーフを含むその類似配列からなる合成ペプチドが、ヒトＩｇＧ抗体（特に、そのＦｃ領域）に対して特異的に結合できることが実証された。
［実施例６］  本発明のペプチドとヒトＩｇＧとの結合に関する速度論的結合解析
合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−１、ＩＭＧｐｅｐ−１Ｅ６Ｑ、ＩＭＧｐｅｐ−４、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６ＲとヒトＩｇＧとの間の結合について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて速度論的結合解析を行った。ＳＰＲ解析は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ）にて２５℃にて行い、必要な試薬とセンサーチップは、ＢＩＡｃｏｒｅ社のものを購入して用いた。４種のビオチン化合成ペプチド（ＩＭＧｐｅｐ−１、ＩＭＧｐｅｐ１Ｅ６Ｑ、ＩＭＧｐｅｐ４、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ）５０μＭ溶液（ｐＨ５）をセンサーチップＳＡ上に流すことにより、該チップ上に固定化した。固定化量は、ＲＵ（レスポンスユニット）が１５００〜２０００の範囲内になるように調整した。次いで各種濃度（６６０ｎＭ、３３０ｎＭ、１６５ｎＭ、８２ｎＭ、４１ｎＭ）のヒトＩｇＧ（アナライト）を、ビオチン化ペプチドを固定化した上記センサーチップＳＡを備えたフローセルに１０μｌ／ｍｉｎの流速で注入し、ヒトＩｇＧとペプチドとの結合反応を測定した。その後、ランニング緩衝液（ＨＢＳ−Ｔ）で洗浄することにより、解離反応を測定した。結合したアナライトのセンサーチップからの洗浄溶出には、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７）を用いた。結合パラメータの解析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて行った。
上記ＳＰＲ解析により得られたセンサーグラムを、図８Ａ〜Ｄに示す。このセンサーグラムから求めたＩＭＧｐｅｐ−１、ＩＭＧｐｅｐ−１Ｅ６Ｑ、ＩＭＧｐｅｐ４又はＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６ＲとヒトＩｇＧとの間の結合反応の解離定数Ｋｄは、それぞれ、１７、２１、２８、２４ｎＭであり、さらに結合速度定数ｋａは、２．０×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、１．５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、１．４×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、１．６×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、解離速度定数ｋｄは、３．４×１０−４ｓｅｃ−１、３．１×１０−４ｓｅｃ−１、４．１×１０−４ｓｅｃ−１、３．８×１０−４ｓｅｃ−１と算出された。
一方、ジスルフィド結合形成による環状化が生じないようにＩＭＧｐｅｐ−１のシステイン残基をセリン残基に置換したビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳをコントロールリガンドとしてセンサーチップに固定化して使用し、アナライトとしてヒトＩｇＧをフローセルに流した場合には、結合に由来するレスポンスシグナルの増加は全く見られなかった。
［実施例７］  本発明のペプチドをタグとして用いたヒトＩｇＧの免疫沈降
ファージクローンＧ−１及びＧ−２が提示するペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計した合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−１（ＧＣＧＹＷＲＳＥＷＧＬＣＧ；配列番号７）及びＩＭＧｐｅｐ−２（ＧＣＴＧＦＷＥＲＥＷＧＬＣＧ；配列番号８）は、Ｆｍｏｃ法により合成し逆相カラムで精製して、以下の実験に用いた。
トシル基活性化Ｍ４５０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓマグネットビーズ３ｍｇ（Ｄｙｎａｌ）に、超遠心精製した上記のクローン化Ｔ７ファージＧ−１（１．０×１０１２  ｐｆｕ）、又は合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−１（１５０ｎｍｏｌ）を、製造元推奨のプロトコールに従って、その末端アミノ基への共有結合を介して固定化した。そのビーズを、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロッキングした後、１ｍｌのｈＩｇＧ／ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｈＩｇＧは１０μｇ／ｍｌ、ＢＳＡは１ｍｇ／ｍｌ）に添加し、それを室温で１時間、撹拌により混合しながら反応させた。ビーズを３回ＰＢＳＴで洗浄後、ＳＤＳ−サンプル緩衝液を加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って分画した。続いて、ビオチン化抗ｈＩｇＧヤギポリクローナル抗体（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｈＩｇＧ−ｐＡｂ−ｂｉｏｔｉｎ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とＳＡ−ＨＲＰを用いてウェスタンブロッティング解析を行うことにより、ビーズに結合して免疫沈降したヒトＩｇＧを検出した。
また、ファージＧ−１又はＩＭＧｐｅｐ−１の代わりにファージクローンＧ−１  ４１５型又はＩＭＧｐｅｐ−２を用いて、同様に免疫沈降反応を行い、ヒトＩｇＧを検出した。ここで、ファージクローンＧ−１  ４１５型（Ｎｏｖａｇｅｎ）とは、Ｔ７ファージのキャプシドを構成する４１５個のＧ１０タンパク質の全てにおいてＧ−１ペプチドを提示したファージである。さらに、ファージＧ−１又はＩＭＧｐｅｐ−１のコントロールとして、抗ｈＩｇＧヤギ（Ｆａｂ’）２フラグメント、野生型Ｔ７ファージ、ＢＳＡも同様に用いて免疫沈降反応及び検出を行った。
結果を図９に示す。図９中、レーン１：抗ｈＩｇＧヤギ（Ｆａｂ’）２フラグメント、レーン２：野生型Ｔ７ファージ、レーン３：ファージＧ−１、レーン４：ファージＧ−１  ４１５型、レーン５；ＢＳＡ、レーン６：ＩＭＧｐｅｐ−１、レーン７：ＩＭＧｐｅｐ−２。レーン８及び９には、コントロールとして、それぞれＢＳＡ、ヒトＩｇＧを直接アプライした。
図９に示される通り、野生型Ｔ７ファージ又はＢＳＡを固定化したビーズでは免疫沈降したヒトＩｇＧは認められなかったのに対し、ファージＧ−１、ファージＧ−１  ４１５型、ＩＭＧｐｅｐ−１、ＩＭＧｐｅｐ−２をそれぞれ固定化したビーズでは免疫沈降したヒトＩｇＧがはっきりと認められた。また、ファージＧ−１  ４１５型を固定化したビーズを用いた場合、ファージＧ−１の場合と比較して、より多量のヒトＩｇＧが検出された。このことは、４１５個のＧ１０タンパク質全てにおいてＧ−１ペプチドを提示しているファージＧ−１  ４１５型が、そのＧ−１ペプチドの提示数に応じて増加した数のヒトＩｇＧをトラップし、免疫沈降したことを示している。さらに、合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−１は、ＩＭＧｐｅｐ−２よりも明らかに高いヒトＩｇＧトラップ効率を示した。この免疫沈降アッセイによってＩＭＧｐｅｐ−１とＩＭＧｐｅｐ−２が示したヒトＩｇＧ結合量の結果は、それら合成ペプチドの配列のベースとしたファージクローンＧ−１及びＧ−２についてＥＬＩＳＡ試験で確認したＩｇＧ結合活性の結果と相関していた。何も固定化していない空ビーズを用いた場合のレーンでは、ヒトＩｇＧは全く検出されなかった。
以上の結果から、上記合成ペプチドを用いて、ヒトＩｇＧを特異的に免疫沈降させることができることが示された。
［実施例８］  本発明のペプチドを用いたヒトＩｇＧ免疫沈降における酸処理の効果
ストレプトアビジンＭ２８０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓマグネットビーズ（Ｄｙｎａｌ）４ｍｇに、ビオチン化合成ペプチドＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ（１００ｎｍｏｌ）を４００μｌにて混合することにより固定化し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロッキングした。
一方、ＳｐＡセファロースビーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でヒト血清から精製したｈＩｇＧ（溶出時ｐＨ２．２）、ポリクローナルヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗ＩＬ−６レセプターＭＲＡ（ヒト化抗インターロイキン６レセプターモノクローナル抗体、中外製薬社製）、抗ＨＥＲ２ヒト抗体（ハーセプチン）、又はヒト血清を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ溶液中（ｐＨ１．５）で５分間にわたり処理した後、トリスを添加してｐＨを中和した。このようにして酸処理した試料（抗体試料は１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液中、ヒト血清試料は２０倍希釈したＰＢＳ溶液中に調製）に、上記の通りブロッキングしたビーズを０．２ｍｇ加え、それを室温で１時間、撹拌により混合しながら反応させた。反応後、ビーズを回収し、ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＳＤＳ−サンプル緩衝液を加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをＣＢＢ染色して、免疫沈降したｈＩｇＧを可視化した。コントロール実験としては、同じ抗体及び血清試料、並びにポリクローナルマウスＩｇＧ抗体を用いて、酸処理せずに（未処理で）同じ反応を実施した。さらに、ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒを固定化していない空ビーズを用いて、同様のコントロール実験を行った。
結果を図１０に示す。図１０Ａ中、Ｍ：分子量マーカー（８３、６２、４７、３２、２５ｋＤａ）、レーン１：ＳｐＡセファロースビーズでヒト血清から精製したｈＩｇＧ（溶出時のｐＨ２．２）、レーン２：未処理のポリクローナルｈＩｇＧ抗体、レーン３：酸処理したポリクローナルｈＩｇＧ抗体、レーン４：未処理の抗ＩＬ−６レセプターＭＲＡ、レーン５：酸処理した抗ＩＬ−６レセプターＭＲＡ、レーン６：未処理の抗ＨＥＲ２ヒト抗体（ハーセプチン）、レーン７：酸処理した抗ＨＥＲ２ヒト抗体（ハーセプチン）、レーン８：未処理のヒト血清、レーン９：酸処理したヒト血清、レーン１０：ポリクローナルマウスＩｇＧ抗体。図１０Ｂには、ビオチン化ペプチドを固定化せずビオチンのみを反応させた空のストレプトアビジンＭ２８０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓマグネットビーズを上記抗体又は血清試料と反応させた結果を示す。図１０Ｂ中、Ｍ：分子量マーカー（８３、６２、４７、３２、２５ｋＤａ）、レーン１：ＳｐＡセファロースビーズでヒト血清から精製したｈＩｇＧ（溶出時のｐＨ２．２）、レーン２：酸処理したポリクローナルｈＩｇＧ抗体、レーン３：酸処理した抗ＩＬ−６レセプターＭＲＡ、レーン４：酸処理した抗ＨＥＲ２ヒト抗体（ハーセプチン）、レーン５：酸処理したヒト血清、レーン１０：ポリクローナルマウスＩｇＧ抗体。
図１０に示される通り、調製したすべてのｈＩｇＧを含むサンプルにおいて、酸処理を行うことにより、本発明のペプチドを固定したビーズによって回収されるｈＩｇＧ量が顕著に増大した。一方、ペプチドを固定化していない空のビーズでは、ｈＩｇＧは全く回収されなかった。このことは、酸処理した抗体の回収率の向上が、例えば、ビーズに対する非特異的吸着の増加によるものではないことを示している。
以上の結果から、本発明のペプチドによるヒトＩｇＧの免疫沈降は、ヒトＩｇＧを酸処理することによって促進できることが示された。
本実施例の結果からは、本発明のペプチドが特異的に結合するヒトＩｇＧが、酸処理によって誘導することができる特定のコンフォメーションを有するものであることも示された。すなわち本発明のペプチドは、酸変性した形態のヒトＩｇＧのＦｃ領域を特異的に認識することができる。図１０から分かるように、このような特定の（酸変性型の）コンフォメーションを有するヒトＩｇＧは、未処理のヒト血清中にはほとんど検出されなかったが、市販の抗体試薬や抗体医薬中にはある程度の量で含まれることが分かった。
本実施例を考慮すると、上記実施例１〜７において本発明のペプチド又はそれを提示するファージクローンとの結合が示されたヒトＩｇＧも、酸処理によって誘導されるのと同様のコンフォメーションを有していたことが考えられた。
［実施例９］  各種酸処理条件下での酸変性型ヒトＩｇＧの生成
酸性条件下で誘導されるコンフォメーション（酸変性型コンフォメーション）を有するヒトＩｇＧコンフォーマー（酸変性型ヒトＩｇＧ）の生成に影響を与える因子として、特にｐＨと温度に関して詳細な検討を行った。その際に、酸変性型コンフォメーションを有する分子種の含有量を評価するために、ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド（ビオチン−スペーサー−ＧＣＴＧＹＷＰＲＡＷＧＬＣＧ）とビオチン化Ｆｃ−ＩＩＩペプチド（ビオチン−スペーサー−ＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴ；Ｆｃ−ＩＩＩペプチドについては非特許文献８を参照）を、実施例２と同様にして表面プラズモン共鳴スペクトル（ＳＰＲ）のセンサーチップ上にそれぞれ固定化した。
次いで、ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒを固定化したセンサーチップを備えたフローセル、及びビオチン化Ｆｃ−ＩＩＩペプチドを固定化したセンサーチップを備えたフローセルのそれぞれに、酸処理したＩｇＧサンプルを流速２０μｌ／ｍｉｎで流し、センサーチップ上での結合反応を測定した。
ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒを固定化したセンサーチップ上でのレスポンス値は、酸変性型ヒトＩｇＧの含有量を示す。一方、Ｆｃ−ＩＩＩペプチドは、中性条件下で得られる未変性コンフォメーションを有するヒトＩｇＧを認識するが、同時に酸性条件下で誘導される酸変性型ヒトＩｇＧも認識することから、ビオチン化Ｆｃ−ＩＩＩペプチドを固定化したセンサーチップ上でのＳＰＲレスポンス値は、ＳＰＲに注入したＩｇＧサンプル中の抗体全体量を表す。
そこで、酸処理後のヒトＩｇＧサンプル中の酸変性型ヒトＩｇＧの含有量を、ビオチン化Ｆｃ−ＩＩＩペプチドを固定化したセンサーチップ上でのＳＰＲレスポンス値に対する、ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒを固定化したセンサーチップ上でのＳＰＲレスポンス値の比率（酸変性型ヒトＩｇＧの生成率）を算出することにより、評価した。
このＳＰＲ解析では、各種条件で酸処理したヒトＩｇＧサンプルを以下のようにして調製し、試験した。まず、抗ＨＥＲ２ヒト抗体（１２５μｇ／ｍｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ溶液）８０μｌに各種ｐＨ（１．５、２．１、２．７）の１Ｍグリシン−ＨＣｌを２０μｌ加えて調製した反応液（ＩｇＧ  ４０μｇ／ｍｌ、２５０ｎＭ）を、さらに各種温度（２０、３０、４０℃）にて１０分間インキュベーションし、その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）を３０μｌ（ｐＨ２．７のグリシン−ＨＣｌを加えたサンプルについては、２０μｌ）加えて中和した。中和後、抗体溶液をランニングバッファーで２５０ｎＭまで希釈した後に、センサーチップ上に注入し、ＳＰＲ解析を行った。なお中和後とセンサーチップ上への注入前にｐＨ試験紙にてｐＨの確認を行った。
図１１には、ｐＨ２．７及び４０℃で酸処理したヒトＩｇＧサンプルとＦｃ−ＩＩＩペプチド及びＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒとの反応性を示すＳＰＲセンサーグラムを一例として示す。図中のｂとａの比率ａ／ｂの値に基づき、酸変性型ＩｇＧの生成率を算出した。
各種酸処理条件について酸変性型ＩｇＧの生成率を調べた結果を図１２にまとめた。ｐＨ２．７、２０℃で酸処理した場合、酸変性型ＩｇＧの生成率は５％程度であったが、ｐＨを２．１、さらに１．５に下げると、生成率はそれぞれ７．８％、１２．８％へと少し上昇した。一方、処理ｐＨ２．７の場合、処理温度を２０℃から３０℃、そして４０℃へと上昇させると、生成率は急激に上昇してそれぞれ９．７％、４０％となった。４０℃でのその生成率は、ｐＨを２．１、そして１．５へと下げても大きく変化することは無く、４０％程度を維持した。このことから、酸変性型ＩｇＧの生成率は、ｐＨの相違によっても影響を受けるが、少なくともこのｐＨ領域（ｐＨ１．５〜２．７）においては温度に対する感受性がより高いことが示された。
［実施例１０］  酸処理したＩｇＧサンプル中の酸変性型ＩｇＧの分離
次に、酸処理したヒトＩｇＧサンプル中の酸変性型ＩｇＧと未変性ＩｇＧの分離を、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒを固定化したカラムを用いて行った。
抗体サンプルは、実施例９と同様にして、抗ＨＥＲ２ヒト抗体（ハーセプチン）を、ｐＨ２．７、４０℃、１０分間のインキュベーションという条件下で酸処理することにより調製した。また、ビオチン化ＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド（ビオチン−スペーサー−ＧＣＴＧＹＷＰＲＡＷＧＬＣＧ）の溶液（５００μＭ、１ｍｌ）をＨｉＴｒａｐ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入することにより、ＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒを固定化したカラムを作製した。このＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化カラムに、０．４ｍｌ／ｍｉｎの流速で、抗体サンプルを注入した後、０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）から０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）までのグラジエント溶出を行った。その結果を図１３に示す。
図１３に示される通り、主として未変性コンフォメーションを有すると思われる未処理の抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧサンプルがＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化カラムを素通りしているのに対し、酸処理した抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧサンプルでは、約３５％のＩｇＧが一旦カラムに吸着された後、酸性グラジエント溶出で約１０分の溶出時間にて溶出された。このようにして溶出されたＩｇＧは、大部分が酸変性型コンフォメーションを有する抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧと考えられる。
［実施例１１］  本発明のペプチドを用いて分離した酸変性型の抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧの特性解析
実施例１０において溶出された酸変性型の抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧを分取し、それを直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）によって中和し、さらにＰＢＳに対して透析を行った。そのようにして得られた精製ＩｇＧサンプルについて、その特性解析を行った。
図１４には、この精製サンプルについて測定した円偏光二色性スペクトル（ＣＤスペクトル）を示す。酸変性型ヒトＩｇＧでは、未処理のヒトＩｇＧに比べ、２０５ｎｍ付近の吸収極大が増加しており、ランダム構造の含有量が増加したことが推定された。一方、２１５ｎｍ付近の、免疫グロブリンドメインのβシート構造に由来する負の吸収は、未処理のヒトＩｇＧとほぼ同等の吸収量を示した。従って、酸変性型ヒトＩｇＧでは、ランダムな構造が増加しているが、抗体全体のβシート構造は大部分保持されていると考えられた。
［実施例１２］  本発明のペプチドを用いた酸変性型ＩｇＧの除去
ヒト化抗ヒトＩＬ−６レセプターモノクローナルＩｇＧ抗体（ＭＲＡ；一般名：トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、中外製薬）を酸処理したサンプルから分離した酸変性型コンフォメーションを有するＭＲＡ（酸変性型ＭＲＡ）について、分子篩クロマトグラフィーによりそのみかけの分子量を解析した。
まず、ヒト化抗ヒトＩＬ−６レセプターＩｇＧ抗体（ＭＲＡ）（２０００μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ溶液）２００μｌに、ｐＨ２．７の１Ｍグリシン−ＨＣｌを２０μｌ加え、さらに３０℃にて１０分間インキュベーションを行った後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）３０μｌを加えて中和することにより、酸処理した抗体サンプルを得た。また、実施例１０と同様にしてビオチン化ＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムを作製し、そのカラムに０．４ｍｌ／ｍｉｎの流速で、酸処理した抗体サンプルを注入した後、０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）から０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）までのグラジエント溶出を行った。このようにして溶出したＩｇＧは、精製された酸変性型のヒト化抗ヒトＩＬ−６レセプターＩｇＧ抗体（ＭＲＡ）である。
続いて、精製された酸変性型ＭＲＡを、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分子篩クロマトグラフィーに供した。同様に、未処理のＭＲＡ、酸処理した抗体サンプル、酸処理した抗体サンプルをビオチン化ＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムに注入して得られた素通り画分（未変性のままのＭＲＡ）も、それぞれＨｉＬｏａｄ  Ｓｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分子篩クロマトグラフィーに供した。カラムからの溶出は、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎにて０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて行った。その結果を図１５に示す。
図に示された通り、未処理のヒト抗ＩＬ−６レセプター抗体ＭＲＡは、ほぼすべてがモノマーのＩｇＧであった（図１５Ａ）。一方、酸処理した抗体サンプル中には、モノマーよりも早く溶出されるダイマー又はトリマーのピークが若干生じており、酸処理によってＩｇＧ抗体のオリゴマー化が引き起こされたことが示された（図１５Ｂ）。
精製された酸変性型ＭＲＡでは、オリゴマーのピークが増加しており（図１５Ｃ）、より多い量のダイマーやトリマーを含むものと思われる。しかし一方で、精製された酸変性型ＭＲＡのうち約６５％は依然としてモノマーであり、酸変性型ＭＲＡは、変性の進行により凝集体を生じるわけではないことも示された（図１５Ｃ）。
また、酸処理した抗体サンプルのＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムを通した素通り画分には、オリゴマーはほとんど見られなかった（図１５Ｄ）。
これらの結果から、ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化カラムを用いることにより、酸変性型コンフォメーションを有するヒトＩｇＧ  ＭＲＡ、特にそのオリゴマーを、効率的に抗体サンプルから除去できることが示された。
そこで次に、実施例１０で行ったように、ＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒ固定化カラムクロマトグラフィーにより、酸処理したヒトＩｇＧサンプルを酸変性型ＩｇＧと未変性ＩｇＧとに分離することによって、酸変性型ＩｇＧを実際に抗体サンプルから十分に除去できるかどうかを確認する試験を行った。未処理のＭＲＡ、酸処理したＭＲＡサンプル（ｐＨ２．２、４℃で１０分間の酸処理）、酸処理したＭＲＡサンプルをビオチン化ＩＭＧＰｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムに通過させて得られる素通り画分、精製された酸変性型ＭＲＡ（ｐＨ２．２、４℃で１０分間の酸処理をしたヒトＩｇＧサンプルをＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムに通過させて得られた吸着画分）の各サンプルについて、実施例８で用いたのと同様の方法で、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチドを用いた免疫沈降実験を行いマグネットビーズに固定化されたペプチドと共に沈降したＩｇＧを１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでＣＢＢ染色して観察した。結果を図１６に示す。
図１６に示される通り、未処理のＭＲＡ抗体は、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチドによって免疫沈降されなかった（レーン１）。しかし酸処理したＭＲＡ（レーン２）及び精製された酸変性型ＭＲＡ（レーン３）には、酸変性型コンフォメーションを有するＩｇＧが含まれることがはっきりと示された。一方、素通り画分（レーン４、図１５Ｄと同じ画分）においては免疫沈降が全く観察されなかったことから、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド固定化カラムによって素通り画分からは酸変性型ＩｇＧが十分に除去されたことが示された。
［実施例１３］  市販ＩｇＧ製品中の酸変性型ＩｇＧの含有率の測定
いくつかの市販の抗体医薬や免疫グロブリン製剤等について、酸変性型コンフォメーションを有するヒトＩｇＧの含有率を、実施例９に開示したのと同様の方法を用いて評価した。具体的には、４０μｇ／ｍｌに調製した抗体医薬や免疫グロブリン製剤等のヒトＩｇＧ溶液を、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６ＲとＦｃ−ＩＩＩペプチドを別々に固定化したＳＰＲのセンサーチップを備えたセルに注入し、センサーチップ上での結合反応を測定した。Ｆｃ−ＩＩＩペプチドを固定化したセルでのレスポンス値ｂに対するＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチドを固定化したセルでのレスポンス値ａの比率ａ／ｂから、酸変性型ＩｇＧの含有率を算出した。
図１７に示すように、検討した２つの抗体医薬（図１７中、Ａ社Ｘヒト抗体医薬、Ｂ社Ｙヒト抗体医薬）では、いずれも０．５％以下とその酸変性型ＩｇＧの含有率は低かった。一方、免疫グロブリン製剤では、いずれも３％以上と高い含有率を示した。この違いは、それぞれの製剤を製造する際に使用したヒトＩｇＧの精製法の違いによるものと考えられる。
［実施例１４］  本発明のペプチドによるＩｇＧ検出感度の検討
本発明のペプチドＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒ、ならびにＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳペプチドを用いて、酸処理したヒトＭＲＡ（ＩｇＧ）のメンブレン上での検出を行った。具体的には、酸処理したヒトＭＲＡ（ＩｇＧ）、未処理のヒトＭＲＡ（ＩｇＧ）を、１スポットあたり各々１．５ｎｇ、３ｎｇ、６ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、及び１００ｎｇでニトロセルロース膜上にスポットし、５分間乾燥させた後、０．５％ＢＳＡを添加して室温にて２時間かけてブロッキングを行った。ここで、酸処理したヒトＭＲＡは、ヒト化抗ヒトＩＬ−６レセプターＩｇＧ抗体（ＭＲＡ）（２０００μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ溶液）１００μｌに、ｐＨ２．８の１Ｍグリシン−ＨＣｌを１０μｌ加え、さらに４０℃にて１０分間インキュベーションを行った後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）３０μｌを加えて中和することによって調製したものである。
次に、ビオチン化ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチド又はビオチン化Ｆｃ−ＩＩＩペプチド、もしくはＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳと、ＨＲＰコンジュゲートＳＡ（ストレプトアビジン）（１２０ｎＭ）とをモル比４：１で前もって混合し、それを上記の通りブロッキングしたメンブレンに加えて１時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した後、化学発光試薬（Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ，Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を加えて、ＬＡＳ−１０００イメージアナライザー（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）にて画像を検出した。この結果を図１８に示す。
未処理のヒトＭＲＡ（ＩｇＧ）のブロッティングに対する検出では、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６Ｒペプチドは１．５ｎｇ／ｍｌのスポットも検出はできるものの、その全体的なシグナル強度はかなり弱かった（Ｋ６Ｒ（Ｎ）を参照）。同じ未処理のＭＲＡサンプルをＦｃ−ＩＩＩペプチドを用いて検出すると、高濃度のスポットに対しては高い検出強度が得られるものの検出限界はなお６ｎｇ／スポットであった（Ｆｃ−ＩＩＩ（Ｎ）を参照）。一方、酸処理により酸変性型ＩｇＧを多量に含むようになった抗体サンプル（Ｋ６Ｒ（Ａ）を参照）では、ＩＭＧｐｅｐ−４Ｋ６ＲペプチドによるＩｇＧの検出感度と検出強度は共に格段に増強され、１．５ｎｇ／ｍｌの抗体サンプルも十分に検出が可能であった。尚、コントロールとして用いたＩＭＧｐｅｐ−１ＣＳペプチドでは、未処理のヒトＭＲＡ（ＩｇＧ）に対するスポットは、まったく検出されなかった。
このように、酸処理することにより、本発明のペプチドによるヒトＩｇＧ検出感度を格段に増強させることができた。この結果から、本発明のペプチドを用いた酸処理を利用したヒトＩｇＧ抗体の検出方法が非常に高感度であり有用であることが示された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のペプチドタグは、高効率にヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域を含む断片を捕捉することができるヒトＩｇＧの検出、精製又は分離方法に用いることができる。本発明のペプチドタグは、特に、酸変性型ヒトＩｇＧの検出や除去のために用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１〜１２及び１５〜１６は、合成ペプチドである。
配列番号１３〜１４は、プライマーである。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１６】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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