【手続補正書】
【提出日】平成15年9月11日(2003.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を動物の胃腸上皮に標的化する方法であって、該方法は、該化合物および送達増強輸送体を含む結合体を、該胃腸上皮に投与する工程を包含し、ここで：
ｉ．該化合物が、リンカーを介して該送達増強輸送体に結合され；そして、
ｉｉ．該送達増強輸送体が、５０未満のサブユニットを含み、そして、少なくとも５つのグアニジノ部分またはアミジノ部分を含み、これによって、該送達増強輸送体の非存在下での該化合物の送達と比較して、該胃腸上皮への該結合体の送達が増大される、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体の前記胃腸上皮への送達が、前記送達増強輸送体の非存在下における前記化合物の送達と比較して、少なくとも２倍増大される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体の前記胃腸上皮への送達が、前記送達増強輸送体の非存在下における前記化合物の送達と比較して、少なくとも１０倍増大される、方法。
【請求項４】
前記リンカーが、放出可能なリンカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サブユニットがアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体が、以下：
【化１】
2004530657.tif 000001
【化２】
2004530657.tif 000002
のような構造３、４および５からなる群より選択される構造を有し、ここで：
Ｒ１は、前記化合物を含み；
Ｘは、該活性化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間で形成された連結であり；
Ｙは、輸送部分上の官能基および該連結部分上の官能基から形成された結合であり；
Ａは、ＮまたはＣＨであり；
Ｒ２は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；
Ｒ３は、前記送達増強輸送体を含み、
Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、Ｈおよびアルキルからなる群から各々独立して選択され；
ｋおよびｍは１および２から各々独立して選択され；そして
ｎは１〜１０である、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群から選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、各々、Ｈおよびアルキルからなる群より独立して選択される、方法。
【請求項８】
前記結合体が構造３を含み、ＹはＮＨであり、そして、Ｒ２はメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジルまたはフェニルである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ２はベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎが各々１であり、そして、Ｘが−ＯＣ（Ｏ）−である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合体は構造４を含み；Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＮＨＲ６であり；そして、Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合体は構造４を含み；Ｒ５はＮＨＲ６であり；Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであり；そして、ｋおよびｍは各々１である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体が、以下：
【化３】
2004530657.tif 000003
のような構造６を含み、ここで：
Ｒ１は、前記化合物を含み；
Ｘは、該化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間で形成された連結であり；
Ｙは、輸送部分上の官能基および連結部分上の官能基から形成された連結であり；
Ａｒは、オルト位またはパラ位に配置されるラジカルが結合されたアリール基であり、該アリール基は置換されてもよいし、置換されなくてもよい；
Ｒ３は、前記送達増強輸送体を含み、
Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、水素またはアルキルから独立して選択され；そして
ｋおよびｍは１および２から各々独立して選択される、
方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群から選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、各々、Ｈおよびアルキルからなる群より独立して選択される、方法。
【請求項１４】
Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＮＨＲ６であり；そして、Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合体が、少なくとも２つの送達増強輸送体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合体が、頬に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合体が、坐薬として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記送達増強輸送体が、非ペプチド骨格を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記送達増強輸送体は、天然に存在するタンパク質中で該送達増強輸送体分子が結合されるアミノ酸配列に結合されない、方法。
【請求項２０】
前記送達増強輸送体が、５〜２５のグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記送達増強輸送体が、７と１５との間のグアニジノ部分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記送達増強輸送体が、少なくとも６つの連続したグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、本質的に５〜５０のアミノ酸からなり、これらのアミノ酸の少なくとも５０％がアルギニンまたはそのアナログである、方法。
【請求項２４】
前記送達増強輸送体が、５〜２５のアルギニン残基またはそのアナログを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのアルギニンが、Ｄ−アルギニンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルギニンの全てがＤ−アルギニンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記送達増強輸送体を含む前記アミノ酸の少なくとも７０％が、アルギニンまたはそのアナログである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記送達増強輸送体が、７つの連続したＤ−アルギニンからなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、炎症性腸疾患、結腸癌、潰瘍性大腸炎、胃腸潰瘍、便秘、ならびに、塩および水吸収の失調からなる群より選択される疾患のための治療薬である、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、免疫抑制剤、コルチコステロイド、緩下薬、抗生物質または抗腫瘍剤からなる群より選択される、方法。
【請求項３１】
前記化合物が、回腸および／または結腸に標的化される、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、Ｄ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸、またはＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物の単鎖からなる化合物をいう。一般に、ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含み、そして約５０アミノ酸長未満である。Ｄ−アミノ酸は、本明細書中で小文字の１文字アミノ酸記号（例えば、ｒはＤ−アルギニン）によって、Ｌ−アミノ酸は、大文字の１文字アミノ酸記号（例えば、ＲはＬ−アルギニン）によって表される。ホモポリマーペプチドは、１文字アミノ酸記号、続いてそのペプチド中に連続して存在するアミノ酸の数によって表される（例えば、Ｒ７（配列番号３）は、Ｌ−アルギニン残基からなるヘプタマーを表す）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
送達増強トランスポーターは、送達増強トランスポーターの非存在下での化合物の送達と比較して、１つ以上のインタクトな上皮組織層および内皮組織の層中へ、および通過する結合体の送達を増加させる。いくつかの実施形態において、この送達増強トランスポーターは、ＨＩＶ−１のｔａｔタンパク質を用いて得られるトランスポーターにおいて結合体の送達を有意に増加させる（Ｆｒａｎｋｅｌら（１９９１）ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９１／０９９５８）。送達はまた、ｔａｔ基本領域（配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２８）を有する残基４９〜５７）を含むｔａｔタンパク質のより短いフラグメントの使用において、有意に増加される（Ｂａｒｓｏｕｍら（１９９４）  ＷＯ  ９４／０４６８６およびＦａｗｅｌｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６６４−６６８）。好ましくは、本発明のトランスポーターを用いて得られる送達は、ｔａｔ残基４９〜５７で得られる送達よりも、２倍、なおより好ましくは６倍、なおより好ましくは１０倍、そしてなおより好ましくは２０倍より増加される。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｔａｔ残基４９〜５７を含まない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
同様に、本発明の送達増強トランスポーターは、培養されたニューロンによって迅速に内在化されるＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオドメイン由来の１６アミノ酸ペプチド−コレステロール結合体と比較して、増加した送達を提供し得る（Ｂｒｕｇｉｄｏｕら（１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：６８５−９３）。この領域（最小で４３〜５８残基）は、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２９）を有する。Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘタンパク質ＶＰ２２（ｔａｔおよびＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａドメインのような）は、細胞中への輸送を増強することが以前から公知であるが、内皮膜および上皮膜中への輸送および内皮膜および上皮膜を通過する輸送を増強することは知られていない（ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８  ：２２３−３３；Ｄｉｌｂｅｒら（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１２−２１；Ｐｈｅｌａｎら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４０−３）.現在好ましい実施形態において、送達増強トランスポーターは、ＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインおよびＶＰ２２タンパク質と比較して有意に増加した送達を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン、ＶＰ２２タンパク質または８つ連続したアルギニン（配列番号４）を含まない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
好ましい実施形態の１つの群において、輸送部分は、式（ＺＹＺ）ｎＺ（配列番号３３〜３６）を有し、ここで、各「Ｙ」は、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から独立して選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、２〜５の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは３である（配列番号３７）。実施形態のこの群において、グリシンの使用は、輸送部分が、組成物全体が、組換え方法によって調製され得るような、ポリペプチド生物学的薬剤に直接融合されるか、または共有結合される組成物にとって好ましい。例えば、固相方法を用いて輸送部分が収集される実施形態において、ε−アミノカプロン酸が好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
別の好ましい実施形態において、輸送部分は式（ＺＹ）ｎＺ（配列番号３８〜４４）を有し、ここで各「Ｙ」は、好ましくはグリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは６である（配列番号４５）。特定の実施形態の上記の群と同様に、グリシンの使用は、輸送部分が、組成物全体が組換え方法によって調製され得るような、ポリペプチド生物学的薬剤に直接融合されるか、または共有結合される組成物にとって好ましい。輸送部分の溶液または固相構築物について、ε−アミノカプロン酸が好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は、式（ＺＹＹ）ｎＺ（配列番号４６〜５２）を有し、ここで、各「Ｙ」は、好ましくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくは、Ｌ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは６である（配列番号５３）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は、式（ＺＹＹＹ）ｎＺ（配列番号５４〜６０）を有し、ここで、各「Ｙ」は、好ましくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、「Ｙ」はグリシンであり、そしてｎは６である（配列番号６１）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
当業者は、輸送部分が、より大きいポリペプチド内のポリペプチドフラグメントであり得ることを理解する。例えば、輸送部分は、この部分に隣接するさらなるアミノ酸をなお有する式（ＺＹＹ）ｎＺ（配列番号４６〜５２）（例えば、Ｘｍ（ＺＹＹ）ｎＺ−Ｘｐ（配列番号６２〜６８）、ここで、添え字ｍおよびｐは、０〜約１０の整数を表し、そして各Ｘは、独立して天然アミノ酸または非天然アミノ酸である）であり得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
１つのアプローチにおいて、結合体は、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号  ＷＯ０１／１３９５７）（ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）もまた参照のこと）の図５Ａ中に図示されるように、ジスルフィド結合を含み得、この出願は、リンカーとして役立つＮ−アセチル保護されたシステイン基により、細胞傷害性薬剤の６−メルカプトプリンと連結された輸送ポリマーＴを包含する、結合体（Ｉ）を示す。従って、この細胞傷害性薬剤はジスルフィド結合により６−メルカプト基と結合されて、そしてこの輸送ポリマーはアミド結合を介してシステインカルボニル部分と結合される。還元またはジスルフィド交換によるジスルフィド結合の開裂は、遊離した細胞傷害性薬剤の放出を生じる。ジスルフィド含有結合体を合成する方法は、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ａ中に提供される。そこで記載される生成物は、Ｎ−アセチル−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａリンカーにより６−メルカプトプリンと連結されるＡｒｇ残基のヘプタマー（配列番号  ３）を含み、ここでこのＡｌａ残基は、そのジスルフィドをチオールにより接近させるための追加のスペーサー、そして細胞内の開裂のための還元剤として含まれる。この例におけるリンカーもまた、アミド結合の使用を例示し、そしてこの結合は細胞内で酵素的に開裂され得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
放出可能なＲ７  ＣｓＡ結合体を、接触皮膚炎のマウスモデルを使用して機能的活性についてインビボでアッセイした。１％の放出可能なＲ７  ＣＳＡ結合体での処理は、耳の炎症において７３．９％±４．０の減少を生じた（図７）。炎症の減少は、未処置の耳では全く見られず、処置された耳において見られた効果が、局所的でありかつ全身的ではないということを示していた。０．１％および０．０１％のＲ７−ＣｓＡで処置されたマウスの耳においてより低い阻害が観察され（それぞれ、６４．８％±４．０および４０．９％±３．３）、この効果が力価測定が可能であることを実証した。フッ素化コルチコステロイドポジティブコントロールでの処置は、耳腫大における減少（３４．１％±６．３）を生じたが、０．１％の放出可能なＲ７  ＣｓＡについて観察された減少より有意に低かった（図７）。未修飾のシクロスポリンＡ、ビヒクル単独、Ｒ７（配列番号３）、または放出可能でないＲ７  ＣｓＡで処置されたマウスのいずれにおいても炎症の減少は観察されなかった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
ＤＴＰＡ−ａｃａ−Ｒ７−ＣＯ２Ｈ（配列番号３１）（１０ｍｇ，０．００６３ｍｍｏｌ）および硫酸銅（１．６ｍｇ，０．００６３ｍｍｏｌ）を、水（１ｍＬ）に溶解した。１８時間穏やかに攪拌させ、そして凍結乾燥して生成物を白色粉末（１０ｍｇ）として得た。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
ｒ５結合体−１２ｍｇ獲得（２９％単離収率）
ｒ７結合体−２２ｍｇ獲得（５５％単離収率）
Ｒ７結合体（配列番号７３）−１３ｍｇ獲得（３３％単離収率）
（Ｂ．皮膚を横断する輸送の分析）
ＰＢＳに溶解された様々な濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、Ｄ−アルギニンのビオチン化五量体、七量体、または九量体（ｂｉｏ  ｒ５、ｂｉｏ  ｒ７、またはｂｉｏ  ｒ９）のいずれかに結合体化したヒドロコルチゾンを、ヌードマウスの背中に塗布した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤内の液体として塗布し、そして、ＶａｓｅｌｉｎｅＴＭバリアによって分散することを妨げ、３０分、６０分、および１２０分間浸透させた。この期間の終わりに、動物を屠殺し、皮膚の関連切片を切除し、封入剤（ＯＣＴ）で包埋し、凍結させた。凍結切片を、クリオスタットを用いて切断し、スライド上に収集し、そして、実施例１に記載されるように、蛍光標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡によって分析した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
【化１５】
2004530657.tif 000004
（ペプチド合成のための一般的な手順）Ｔａｔ４９〜５７（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号２８）（Ｔａｔ４９〜５７由来の短縮化およびアラニン置換ペプチド）、アンテナペディア４３〜５８（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２９））、ならびにアルギニン（Ｒ５〜Ｒ９；配列番号１〜配列番号５）およびｄ−アルギニン（ｒ５−ｒ９）のホモポリマーを、ペプチドカップリング試薬としてＨＡＴＵを用いる標準的な固相Ｆｍｏｃ化学（３５）を使用して、自動ペプチド合成機（ＡＢＩ４３３）により調製した。フルオレセイン部分を１２時間、ＤＭＦ（１０ｍＬ）におけるフルオレセインイソチオシアネート（１．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５ｍｍｏｌ）を使用して樹脂結合ペプチド（１．０ｍｍｏｌ）を処理することによって、アミノヘキサン酸スペーサーを介して付着させた。樹脂からの切断を、９５：５  ＴＦＡ／トリイソプロピルシランを用いて達成した。減圧下における溶媒の除去は、冷エーテルで粉砕した原油を与える。従って、得られた粗混合物を遠心分離し、デカンテーションによってエーテルを除去し、そして、得られたオレンジ色の固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）によって精製した。生成物を、凍結乾燥によって単離し、そして、エレクトロスプレー質量分析によって特徴付けた。ペプチドの純度は、分析用逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）によって決定される場合、９５％を超えた。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
【化１６】
2004530657.tif 000005
であった。細胞表面結合と内部移行との間の差異を、アジ化ナトリウムの存在下および非存在下における並行の組のアッセイを行なうことによって、完全に達成した。アジ化ナトリウムは、エネルギー依存の細胞の取り込みを阻害するが、細胞表面結合は阻害しないので、２つのアッセイの間の蛍光の差異は、内部移行から生じる蛍光の量を提供した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
【化１７】
2004530657.tif 000006
。Ｔａｔ４９〜５７の非荷電グルタミン残基のアラニン（Ａ−５４）との置換は、細胞内部移動における緩やかな減少を生じた。他方、陽イオン残基のそれぞれのアラニン置換は、細胞の取り込みの７０〜９０％の喪失を個別に産生した。これらの場合では、アラニンと、リジン（Ａ−５０、Ａ−５１）またはアルギニン（Ａ−４９、Ａ−５２、Ａ−５５、Ａ−５６、Ａ−５７）の置換は、取り込みを減少させる際に類似の効果を有した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
これらの最初の結果は、アルギニン含有量が、Ｔａｔ４９〜５７の細胞の取り込みについて主な原因であることを示す。さらに、これらの結果は、アルギニンの短いオリゴマーが、細胞に入る際、リジン、オルニチン、およびヒスチジンの対応する短いオリゴマーよりもより効果的であることを実証した、本発明者らの以前の結果と一貫していた。確立されていなかったことは、アルギニンホモオリゴマーが、Ｔａｔ４９〜５７よりもより効果的であるか否であった。この点に関して、Ｔａｔ４９〜５７を、ｌ−アルギニン（Ｒ５−Ｒ９；配列番号１〜配列番号５）およびｄ−アルギニン（ｒ５−ｒ９）オリゴマーと比較した。Ｔａｔ４９〜５７は、陽イオン性残基を含むが、その細胞内部移行は、Ｒ６（配列番号２）およびＲ７（配列番号３）との間の内部移行であり（図２４）、このことは６つのアルギニン残基の存在が、細胞の取り込みについて最も重要な因子であることを示す。重要なことに、７−９アルギニン残基を含む結合体は、Ｔａｔ４９〜５７よりもより優れた取り込みを示した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
これらのアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ４９〜５７の細胞に入る能力を定量的に比較するために、ミカエリス−メンテン速度分析を行なった。細胞の取り込みの速度は、３０、６０、１２０および２４０秒間、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるペプチドのインキュベーション（３℃）後に決定した（表１）。結果のＫｍ値は、ｒ９およびＲ９（配列番号５）が、Ｔａｔ４９〜５７よりもそれぞれ、約１００倍および２０倍速い速度で、細胞に入ることを明らかにした。比較のために、アンテナペンディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）４３〜５９をまた分析し、そして、Ｔａｔ４９〜５７より約２倍速く細胞に入ることを示したが、ｒ９およびＲ９（配列番号５）よりも有意に遅かった。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
【表１】
2004530657.tif 000007
（実施例１４）
（Ｔａｔ４９−５７のペプチド模倣アナログの設計および合成）
（方法）
ペプトイドポリアミン合成の一般的手順。ペプトイドを、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎによって開発された文献の手順に従って、樹脂を混合するために、フリッティングしたガラス装置および窒素の正圧を使用して、手動で合成した。例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１５１７−１５２２（１９９８）；Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，９３６７−９３７１（１９９２）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１０６４６−１０６４７（１９９２）を参照のこと。Ｆｍｏｃ置換Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．２ｍｍｏｌ）の、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）での３０分間（２×）の処理により、遊離樹脂結合アミンを得、これをＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のブロモ酢酸（２．０ｍｍｏｌ）の溶液で３０分間処理した。この手順を繰り返した。次いで、この樹脂を洗浄し（３×５ｍＬ  ＤＭＦ）、そしてＤＭＦ（５ｍＬ）中のモノ−Ｂｏｃジアミン（８．０ｍｍｏｌ）の溶液で１２時間処理した。これら２つの工程を、所望の長さのオリゴマーが得られるまで繰り返した（注記：ＤＭＦ中のモノ−Ｂｏｃジアミンの溶液を、収率を明らかに低下させることなく再利用し得た）。次いで、この樹脂を、ＤＭＦ中のＮ−Ｆｍｏｃ−アミノヘキサン酸（２．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（２．０ｍｍｏｌ）で１時間処理し、そしてこれを繰り返した。次いで、Ｆｍｏｃを、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）で３０分間処理することによって、除去した。この工程を繰り返し、そしてこの樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、遊離アミン樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のフルオレセインイソチオシアネート（０．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）で１２時間処理した。次いで、この樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびジクロロメタン（５×５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂からの切断を、９５：５  ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（８ｍＬ）を使用して達成した。減圧下での溶媒の除去により、粗製油を得、これを冷エーテル（２０ｍＬ）で粉砕した。このように得た粗製混合物を遠心分離し、エーテルをデカンテーションによって除去し、そして得られる橙色固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％  ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）により精製した。この生成物を、凍結乾燥によって単離し、そして電子スプレー質量分析によって、そして選択され場合には１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって、特徴付けた。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
蛍光標識されたポリグアニジンＮ−ａｒｇ５ペプトイド（配列番号７６）、ポリグアニジンＮ−ａｒｇ７ペプトイド（配列番号７８）、ポリグアニジンＮ−ａｒｇ９ペプトイド（配列番号８０）の細胞取り込みを、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＦＡＣＳ分析を使用して、対応するｄ−アルギニンペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９（類似のタンパク分解性特性）と比較した。Ｎ−ａｒｇ５（配列番号７６）、Ｎ−ａｒｇ７（配列番号７８）、Ｎ−ａｒｇ９（配列番号８０）を含む細胞の内側で測定した蛍光の量は、ｒ５、ｒ７、ｒ９に関して見出される量に類似して、グアニジン残基の数に比例した：Ｎ−ａｒｇ９＞Ｎ−ａｒｇ７＞Ｎ−ａｒｇ５（図２６）。さらに、Ｎ−ａｒｇ５ペプトイド（配列番号７６）、Ｎ−ａｒｇ７ペプトイド（配列番号７８）、Ｎ−ａｒｇ９ペプトイド（配列番号８０）は、対応するペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９と比較して、わずかに低い量の細胞侵入のみを示した。これらの結果は、Ｔａｔ４９−５７またはアルギニンオリゴマーのペプチド骨格に沿った水素結合が、細胞取り込みのために必要とされる構造的エレメントではなく、そしてオリゴマーのグアニジン置換ペプトイドが、アルギニンに富むペプチドの代わりに、分子トランスポーターとして利用され得ることを実証する。アジ化ナトリウムの添加は、インターナリゼーションを阻害し、このことは、ペプトイドの細胞取り込みもまたエネルギー依存性であることを示した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
（実施例１５）
（細胞取り込みに対する側鎖長の効果）
Ｎ−ａｒｇペプトイドが効果的に細胞膜と交差することを確認した後に、細胞取り込みに対する側鎖長（メチレンの数）の効果を調査した。所定の数のグアニジン残基（５、７、９）については、細胞取り込みは、側鎖長に比例した。より長い側鎖を有するペプトイドは、より効率的な細胞取り込みを示した。グアニジンヘッド基と骨格との間に６つのメチレンスペーサーを有する９マーペプトイドアナログ（Ｎ−ｈｘｇ９）は、対応するｄ−アルギニンオリゴマー（ｒ９）より顕著により高い細胞取り込みを示した。取り込みの相対的順序は、Ｎ−ｈｘｇ９（６メチレン）＞Ｎ−ｂｔｇ９（４メチレン）＞ｒ９（３メチレン）＞Ｎ−ａｒｇ９（配列番号８０）（３メチレン）＞Ｎ−ｅｔｇ９（２メチレン）であった（図２７）。注記として、Ｎ−ｈｘｇペプトイドは、対応するｄ−アルギニンオリゴマーよりさらに大きな、顕著に高い細胞取り込みを示した。対応するヘプタマーおよびペンタマーの細胞取り込みもまた、同じ相対的傾向を示した。Ｎ−ｈｘｇペプトイドに含まれる側鎖がより長いほど、インターナリゼーションの量がさらに１つ多いグアニジン残基を含む対応するｄ−アルギニンオリゴマーに匹敵するような程度まで、細胞取り込みが改善された（図２８）。例えば、Ｎ−ｈｘｇ７ペプトイドは、ｒ８に匹敵する細胞取り込みを示した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５０】
（考察）
ノナペプチドＴａｔ４９−５７は、以前に、原形質膜を通して効率的に転座することが示された。この研究の目的は、この効果のための構造的基礎を決定すること、およびこの情報を使用してより単純かつより効果的な分子トランスポーターを開発することであった。この目的のために、フルオレセイン標識に結合体化した、Ｔａｔ４９−５７の短縮型誘導体およびアラニン置換誘導体を調製した。これらの誘導体は、Ｔａｔ４９−５７と比較して非常に減少した細胞取り込みを示し、このことは、Ｔａｔ４９−５７のカチオン性残基の全てが、効率的な細胞取り込みのために必要とされることを示す。カチオン性オリゴマーの短いオリゴマーに関する本発明者らの以前の研究と比較した場合に、これらの知見は、アルギニンのオリゴマーが、Ｔａｔ４９−５７より優れており、そして確かにより容易かつ費用効率的に調製され得ることを示唆した。短いアルギニンオリゴマーとＴａｔ４９−５７との比較は、前者のメンバーが、実際に、より効率的に細胞に取り込まれることを示した。これは、初めて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの速度論分析によって、さらに定量され、この分析は、Ｒ９（配列番号５）およびｒ９オリゴマーが、Ｔａｔ４９−５７に関して見出される値より３０倍および１００倍大きなＫｍ値を有することを示した。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
本発明者らのペプチドの研究において明らかとなった、グアニジノヘッド基の重要性およびオリゴマーキラリティーの明らかな不感受性を考慮して、本発明者らは、新規な一連のポリグアニジンペプトイドを設計し、そして合成した。アルギニン側鎖を組み込むペプトイドであるＮ−ａｒｇ５（配列番号７６）、Ｎ−ａｒｇ７（配列番号７８）、Ｎ−ａｒｇ９（配列番号８０）は、対応するｄ−アルギニンペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９に匹敵する細胞取り込みを示した。このことは、ペプチド骨格に沿った水素結合および骨格キラリティーが、細胞取り込みのために必須ではないことを示す。この観察は、これらのペプトイド、アルギニンオリゴマー、およびＴａｔ４９−５７（これらは全て、深く埋め込まれた骨格およびグアニジニウム優性表面を有する）の分子モデルと一致する。分子モデルは、これらの構造的特性が、ペプトイド骨格とグアニジノヘッド基との間に異なるアルキルスペーサーを有するオリゴマーにおいて、様々な程度で保持されることを、さらに明らかにする。従って、骨格と側鎖との間に２−（Ｎ−ｅｔｇ）、４−（Ｎ−ｂｔｇ）、および６−ａｔｏｍ（Ｎ−ｈｘｇ）のスペーサーを組み込む一連のペプトイドを調製し、そして細胞取り込みについて、Ｎ−ａｒｇペプトイド（３原子スペーサー）およびｄ−アルギニンオリゴマーと比較した。側鎖の長さは、細胞侵入に対して、劇的な影響を有した。細胞取り込みの量は、Ｎ−ｈｘｇ＞Ｎ−ｂｔｇ＞Ｎ−ａｒｇ＞Ｎ−ｅｔｇの順で、側鎖の長さに比例した。細胞取り込みは、グアニジンヘッド基と骨格との間のアルキルスペーサーユニットの数が増加する場合に、改善された。重要なことに、Ｎ−ｈｘｇ９は、ｒ９より優れており、後者は、Ｔａｔ４９−５７より１００倍良好であった。この結果により、本発明者らは、グアニジノ基と骨格との間により長いオクチルスペーサー（Ｎ−ｏｃｇ）を含むペプトイド誘導体を調製した。溶解度に関する問題点に起因して、本発明者らは、これらの化合物を試験しなかった。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中の上記ヒドラゾン（３）（０．０２５ｇ、２４．７μｍｏｌ）、トランスポーター（１×Ｂａｃａｒ９ＣＣＯＮＨ２・９ＴＦＡ、Ｂａｃａｒ７ＣＣＯＮＨ２・７ＴＦＡ、ＢａｃａＣＣＯＮＨ２、ＮＨ２ｒ７ＣＣＯＮＨ２・８ＴＦＡ、ＮＨ２Ｒ７ＣＣＯＮＨ２・８ＴＦＡ；配列番号３２）およびジイソプロピルエチルアミン（１×）の溶液を、窒素下で３６時間室温で攪拌し、この時点で、ＴＬＣは、出発ヒドラゾンの完全な消失を示した。溶媒を反応混合物からエバポレートし、そして残渣を、トリフルオロ酢酸緩衝化水およびアセトニトリルを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
【化１８】
2004530657.tif 000008
である。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０６】
この実施例において、シクロスポリンを、無水クロロ酢酸を用いてそのα−クロロ酢酸エステルに変換し、６ｉを得る（図６を参照のこと）。次いで、このエステル６ｉをベンジルアミンで処理し、６ｉｉを得る。アミンとＢｏｃ−保護無水イミノニ酢酸との反応は、酸６ｉｉｉを提供し、次いで、これを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化エステル（６ｉｖ）に変換する。Ｌ−アルギニン７量体（配列番号３）との６ｉｖのカップリングは、ＢＯＣ−保護結合体６ｖを提供し、これを、確立された方法に従ってＢＯＣ保護基を除去することによって結合体６ｖｉに変換し得る。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５０】
【図１】図１は、α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体の調製のための反応スキームを示す。
【図２】図２は、システイン含有ペプチドのα−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体とのカップリングのための一般的な手順を示す。
【図３】図３は、シクロスポリンＡ誘導体のビオチン標識ペプチド（配列番号８３〜８５）へのカップリングのための反応スキームを示す。
【図４】図４は、シクロスポリンＡ誘導体の標識していないペプチド（配列番号７）とのカップリングのための反応スキームを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｈは、切断可能なリンカーの種々の型を示し、これらのリンカーは、送達増強トランスポーターの生物学的に活性な薬剤または他の目的の分子との連結のために使用され得る。図５Ａは、ジスルフィド結合の例を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、光切断可能な（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを示す。このリンカーは、電磁放射への曝露によって切断される。
【図５Ｃ】図５Ｃは、切断可能なリンカーとして使用される修飾されたリジル残基を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、送達増強トランスポーターＴが、抗癌剤パクリタキセルの２’酸素に連結された、結合体を示す。連結部分は、以下を含む（ｉ）送達増強トランスポーターに付着した窒素原子、（ｉｉ）窒素原子に対しパラ位に位置するリン酸モノエステル、および（ｉｉｉ）窒素原子に対しメタ位のカルボキシメチル基（このカルボキシルメチル基は、カルボン酸エステル連結によってパクリタキセルの２’酸素に結合されている）。
【図５Ｅ】図５Ｅは、アミノアルキルカルボン酸による、送達増強トランスポーターの生物学的に活性な薬剤（例えば、パクリタキセル）への架橋であり；リンカーアミノ基は、アミド連結によって送達増強トランスポータに結合され、そして、エステル連結によってパクリタキセル部分に結合される。
【図５Ｆ】図５Ｆおよび図５Ｇは、パクリタキセルおよび「ＴＡＸＯＴＥＲＥＴＭ」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ’’＝ＢＯＣ）についての構成骨格原子の化学構造および従来の番号付けを示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）化合物についての一般的な化学構造および環原子番号付けを示す。
【図６】図６は、Ｌ−アルギニンの七量体（配列番号３）とシクロスポリンＡとの間の化学結合体についての合成スキーム（パネルＡ）、およびそのｐＨ依存性化学放出（配列番号６）（パネルＢ）を示す。α−クロロエステル（６ｉ）を、置換をするためにヨウ化ナトリウムの存在下でベンジルアミンを用いて処理し、２級アミン（６ｉｉ）を得る。アミン（６ｉｉ）を、無水物（６）を用いて処理し、そして得られた粗酸（６ｉｉｉ）を、その対応するＮＨＳエステル（６ｉｖ）に変換した。次いで、エステル（６ｉｖ）を、へプタ−Ｌ−アルギニン（配列番号３）のアミノ末端とカップリングし、Ｎ−Ｂｏｃ保護されたＣｓＡ結合体（６ｖ）を得る。最後に、ギ酸を用いるＢｏｃ保護基の除去によって、ＨＰＬＣ精製の後、そのオクタトリフルオロ酢酸塩として結合体（６ｖｉ）を得た。
【図７】図７は、放出可能なＲ７  ＣｓＡによる接触皮膚炎マウスにおける炎症の阻害を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜７週）に、アセトンオリーブオイル中の０．７％ＤＮＦＢ（９５：５）を１００μｌ腹部に塗布した。３日後、動物の両耳を、アセトン中の０．５％  ＤＮＦＢで再刺激した。再刺激の１時間後、５時間後、および２０時間後に、ビヒクルのみ、１％  Ｒ７（配列番号３）ペプチドのみ、１％  ＣｓＡ、１％  放出不可能なＲ７  ＣｓＡ、０．０１％／０．１％／１．０％  放出可能なＲ７  ＣｓＡ、およびフッ化ステロイド陽性コントロール０．１％  トリアムシノロンアセトニドのいずれかで、マウスを処置した。耳の炎症を、再刺激の２４時間後に、バネを装着したキャリパーを用いて測定した。炎症の減少の百分率を、以下の式：（ｔ−ｎ）／（ｕ−ｎ）（ここで、ｔ＝処置した耳の厚さ、ｎ＝正常な未処置の耳の厚さ、およびｕ＝いかなる処置もしていない炎症した耳の厚さである）を用いて計算した。各群において、Ｎ＝２０動物である。
【図８】図８は、銅−ジエチレントリアミンペンタ酢酸錯体（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）の調製のための手順を示す。
【図９】図９は、Ｃｕ−ＤＴＰＡをアミノカプロン酸を介してトランスポーター（配列番号７０〜７２）に連結するための手順を示す。
【図１０】図１０は、ヒドロコルチゾンの無水クロロ酢酸でのアシル化のための反応を示す。
【図１１】図１１は、アシル化ヒドロコルチゾンをトランスポーターに連結するための反応を示す。
【図１２】図１２は、タキソールのＣ−２’誘導体の調製のための反応を示す。
【図１３】図１３は、タキソール誘導体をビオチン標識ペプチドにカップリングするための反応の概略を示す。
【図１４】図１４は、標識していないペプチドをタキソールのＣ−２’誘導体にカップリングするための反応を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体（配列番号３、７４および７５）の形成のための反応スキームを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体（配列番号３、７４および７５）の形成のための反応スキームを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体（配列番号３、７４および７５）の形成のための反応スキームを示す。
【図１６】図１６は、薬物または他の生物学的因子がｐＨ−放出可能なリンカーによって送達増強トランスポーターに連結される結合体を合成するための、一般的なストラテジーを示す。
【図１７】図１７は、タキソール２’−クロロアセチル誘導体を合成するためのプロトコルの概略図を示す。
【図１８】図１８は、タキソール２’−クロロアセチル誘導体が、アルギニン七量体送達増強トランスポーターに連結されるストラテジーを示す。
【図１９】図１９は、図１８に図示される反応条件を用いて作製され得る、３つのさらなるタキソール−ｒ７結合体を示す。
【図２０】図２０は、タキソールおよび２つの異なるリンカーを用いる、３日間のＭＴＴ細胞傷害性アッセイの結果を示す。
【図２１】図２１は、以下のものの短縮型アナログのＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す：Ｔａｔ４９〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号８）、Ｔａｔ４９〜５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲ；配列番号９）、Ｔａｔ４９〜５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲ；配列番号１０）、Ｔａｔ５０〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１１）、およびＴａｔ５１〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１２）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で１５分間インキュベートした。
【図２２】図２２は、以下のもののアラニン置換アナログのＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す：Ｔａｔ４９〜５７：Ａ−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＡＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１３）、Ａ−５０（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＡＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１４）、Ａ−５１（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＡＲＲＱＲＲＲ；配列番号１５）、Ａ−５２（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＡＲＱＲＲＲ；配列番号１６）、Ａ−５３（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＡＱＲＲＲ；配列番号１７）、Ａ−５４（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＡＲＲＲ；配列番号１８）、Ａ−５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＡＲＲ；配列番号１９）、Ａ−５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＡＲ；配列番号２０）、およびＡ−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＡ；配列番号２１）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で１２分間インキュベートした。
【図２３】図２３は、Ｔａｔ４９〜５７のｄ−異性体およびｒｅｔｒｏ−異性体：ｄ−Ｔａｔ４９−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｋｋｒｒｑｒｒｒ）、Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ；配列番号２２）、およびｄ−Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ）のＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに、２３℃で１５分間インキュベートした。
【図２４】図２４は、一連のアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ４９−５７：Ｒ５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲ；配列番号２３）、Ｒ６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲ；配列番号２４）、Ｒ７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号２５）、Ｒ８（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号２６）、Ｒ９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号２７）、ｒ５（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒ）、ｒ６（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒ）、ｒ７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ８（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ９（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）のＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２５】図２５は、グアニジン置換ペプトイド；（配列番号７６〜８０）の調製を示す。
【図２６】図２６は、ポリグアニジンペプトイド（配列番号７６、７８および８０）およびｄ−アルギニンオリゴマーのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２７】図２７は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびポリグアニジンペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２８】図２８は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｈｘｇペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（６．３μＭを示す）の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２９】図２９は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｃｈｇペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図３０】図３０は、送達増強トランスポーターをトリアゾール環構造を含む薬物に結合するための一般的なストラテジーを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａおよび図３１Ｂは、ＦＫ５０６が送達増強トランスポーター（配列番号８１および８２）に結合された結合体を作製するための合成スキームを示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａおよび図３１Ｂは、ＦＫ５０６が送達増強トランスポーター（配列番号８１および８２）に結合された結合体を作製するための合成スキームを示す。
【図３２】図３２は、Ｃａｃｏ−２細胞に効果的に導入された、アルギニン（リジンではない）の短いオリゴマーを示す。Ｃａｃｏ−２細胞を、示される各ペプチドと、異なる濃度でインキュベートし、洗浄し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。取り込みは、アジ化ナトリウムを含むプレインキュベーションによって阻害され得、取り込みが、エネルギー依存性であったことを実証する。
【図３３】図３３は、蛍光性タキソールまたはＤ−アルギニンの七量体（ｒ７）もしくはデカマー（ｒ１０）のいずれかとの放出不可能な蛍光性タキソール結合体に曝露されたＣａｃｏ−２細胞の測定された蛍光を示す。
【図３４】図３４は、本報告において記載される実験の持続時間の間での１００オームｃｍ２より大きい安定な経上皮電気抵抗の測定により、Ｃａｃｏ−２単層の完全性を実証する。
【図３５】図３５は、Ｃａｃｏ−２細胞単層を介する輸送１時間後の拡散装置の基底外側チャンバーにおけるＦｌ  ａｃａ  ｒ５、Ｆｌ  ａｃａ  ｒ９、ルシファーイエロー、またはヒドロコルチゾンのいずれかの蓄積を示す。
【図３６】図３６は、結腸内注射後、３０分間隔のＬＣ  ＭＳ  ＭＳにより測定されたラットにおけるＣｓＡの血中レベルを示す。ＣｓＡを、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ｅｌ：エタノール  １：１の中において投与し、一方、ＣｓＡ結合体を、ＰＢＳの中において投与した。ＣｓＡ結合体（ＣＧＣ１０７２）のＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃での半減期は１．５時間であった。
【図３７】図３７は、結腸内注射後、３０分間隔のＬＣ  ＭＳ  ＭＳにより測定されたラットにおけるタキソールの血中レベルを示す。タキソールを、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：エタノール  １：１の中において投与し、一方、２つのタキソール結合体を、ＰＢＳの中において投与した。遅延して放出する結合体（１４）のＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃での半減期は、５時間であったが、速放性結合体（１３）の半減期は、１０分であった。実施例１８を参照のこと。
【図３８】図３８は、口腔送達後、３０分間隔のＬＣ  ＭＳ  ＭＳにより測定されたラットにおけるタキソールの血中レベルを示す。タキソールを、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  Ｅｌ：エタノール  １：１の中において投与し、一方、タキソール結合体を、ＰＢＳの中において投与した。結合体（１３）のＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃での半減期は、１０分であった。
【図３９】図３９は、Ｎ末端システイン基を介すｒ７−アミドに対するアシクロビルの結合体を描く。ビオチン含有トランスポーターとの結合体もまた、示す。
【図４０】図４０は、レチナールとｒ９との間に形成される結合体を示す（スペーシングアミノ酸なしで示す）。
【図４１】図４１は、レチノール酸−ｒ９結合体の調製における切断可能なリンカーの使用を描く。
【図４２】図４２は、アシクロビルのような活性薬剤のトランスポーター部分への連結方法を描く。
【図４３】図４３は、アシクロビルのような活性薬剤のトランスポーター部分への連結方法を描く。
【図４４】図４４は、コルチコイドステロイドのような活性な薬剤のトランスポーター部分への連結方法を描く。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2004530657.tif 000009