(57)【要約】本発明は、心筋細胞以外の細胞を含まず、また他種由来の成分を含まないように精製された心筋細胞の、移植後の生着率を改善することを課題とする。  本発明者らは、上記課題を解決するために、精製された心筋細胞について細胞塊が構築できるか検討を行った。その結果、多能性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を凝集させることを特徴とする、多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法を提供することにより、上記課題を解決することができることを明らかにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を、無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を凝集させることを特徴とする、多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法。
【請求項２】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、生殖幹細胞及び誘導多能性幹細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地がインスリンを含有する培地である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培地がトランスフェリン、セレニウム、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）及びエンドセリン−１（ＥＴ−１）からなる物質群から選択される少なくとも１つの物質を含有する培地である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
培地における含有量がインスリン０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン０．１〜１０μｇ／Ｌ、セレニウム０．１〜１０μｇ／Ｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、上皮細胞増殖因子１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、血小板由来成長因子１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、エンドセリン−１（ＥＴ−１）１×１０−８〜１×１０−６Ｍである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させて得られた細胞塊を、個体の心臓組織に移植して生着させることを特徴とする心疾患の治療方法。
【請求項７】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、生殖幹細胞及び誘導多能性幹細胞から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
心筋細胞塊が請求項１〜５のいずれか１項の方法により得られた心筋細胞塊である請求項６記載の方法。
【請求項９】
移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
移植がシート状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞塊を、壁面によって仕切られた細胞非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続ける程度に隙間なく並べて播種し、浮遊培養を行ない、細胞塊同士が接合して５０〜３００μｍの間で任意の厚みを有するまで当該培養を行うことを特徴とするシート状細胞塊の作製方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、生殖幹細胞及び誘導多能性幹細胞から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
心筋細胞塊が請求項１〜５のいずれか１項の方法により得られた心筋細胞塊である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
多能性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を得、その心筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、そして当該細胞を凝集させることにより作製された、多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を含む、個体の心臓組織に移植して生着させるための医療機器。
【請求項１５】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、生殖幹細胞及び誘導多能性幹細胞から成る群から選択される、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項１６】
移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる、請求項１４又は１５に記載の医療機器。
【請求項１７】
移植がシート状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる、請求項１４又は１５に記載の医療機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させて細胞塊を作製する方法、並びに当該心筋細胞塊を心臓組織に生着させることからなる心疾患の治療方法及び当該心筋細胞塊を用いたシート状細胞塊の作製方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
成体における心筋細胞は増殖活性を喪失しており、重症な心筋梗塞、心筋症などの心疾患では心臓移植に頼らざるを得ない。しかし、現状では心臓のドナー不足の問題を克服するには至っておらず、心臓移植以外の治療方法を見出すことが急務である。
これに対して、心筋細胞を体外で作製し、心筋細胞の補充に充てることは、心臓移植に頼らなくてはならない患者を救済する最も有望な方法と予想されている。当該治療方針は、心臓の細胞治療と呼ばれる。当該治療を実現させるために、様々な試行錯誤が行われている。たとえば、実験的に胎仔、新生仔、成体から、心筋細胞もしくは、骨格筋芽細胞、及び骨髄細胞等を摘出し用いる方法、胚性幹細胞を分化させて用いる方法、並びに生体内に存在することが示唆されている幹細胞（体性幹細胞）を取り出し、分化を誘導する方法などが検討されている（非特許文献１：Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２００３，８３，１８１８−２２）。
これらを分類すると主に２つの方向性があげられる。ひとつは、心筋細胞を細胞のまま移植に用いるもので、単一の細胞へと分散させた心筋細胞を注射針を用いて直接組織内へ注入する方法（以後「インジェクション法」と記載）である。もうひとつは、体外で組織や臓器を構築し（以後、Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ法と記載）、この人工組織や人工臓器を体内に移して治療するという方法である。
このＴｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ法においては、１）心筋細胞をシート状に形成して組織上に貼り付ける方法（非特許文献２：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，９０（３）：ｅ−４０）、２）心筋細胞と非心筋細胞を心臓組織内と同様の割合で混合し、立体的に形成して組織を置換する方法、３）単一の細胞へと分散させた心筋細胞を立体的に形成し、さらには血管構造も構築し、組織置換するもの、もしくは、４）心臓組織を置換するのではなく本来の臓器機能を補助するために新たな補助臓器として異所的に移植して用いる方法（非特許文献３：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７  ２，１００：２６３−２７２）などが試みられている。
しかしながら、現段階では臨床治療応用に向けた様々な試行錯誤が行われている段階であって、どの方法も十分に実用的なデータを示していない。心筋細胞を心臓に移植するためには、いくつかの問題点、たとえば、心筋細胞以外の細胞が包含されること、心筋細胞の生着性が低いこと、他種由来の成分を排除できないこと、などの問題点が存在するためである。
心筋細胞を細胞塊として移植に用いるために、胎仔や新生仔齧歯類心筋細胞を含む細胞塊の構築方法が知られており、最近の報告では、胎仔心臓由来の全細胞（非心筋細胞を含む）を用いて細胞塊が構築されている（非特許文献４：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｄｙｎａｍｉｃｓ  ２３５；２２００−２２０９，２００６）。そして心筋細胞の移植に関しては、胎仔マウス心筋細胞を成体マウスの心臓内に移植して、生着を確認した例も報告されている（非特許文献５：Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６４（５１５５）：９８−１０１）。但し、当該心筋細胞の調製方法では、胎仔の心臓をコラゲナーゼによって分散させた全細胞を用いているため、移植された細胞は心筋細胞と非心筋細胞が混合された細胞集団である。また、未精製の生体由来心筋細胞を心臓へ移植することが可能であることも知られている（非特許文献５：Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６４（５１５５）：９８−１０１、非特許文献１：Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２００３，８３，１８１８−２２）。
また、ＥＳ細胞の胚様体分化の過程において、胚様体を不完全にタンパク質分解酵素で処理し、その結果心筋細胞を多く含む細胞塊とそうでない細胞塊を含む細胞塊集団を得、それを密度勾配遠心法で分離することによって、心筋細胞を最大で７０％程度含有する細胞塊を得る方法が知られている（特許文献１：ＵＳ２００５−０２１４９３８Ａ）。
しかしながら、これらの方法はいずれも、心筋細胞以外の細胞も包含される細胞集団を利用する方法であり、心筋細胞以外の細胞混入は、移植後の患者の生命に関わる重大な予期できない副作用を引き起こす可能性がある。そこで、移植治療に供する場合は、心筋細胞を精製してから使用することが必要と考えられている。
これまでに、ＥＳ細胞由来の未精製の心筋細胞を心臓へ移植後に生着させることを達成した報告がある（非特許文献６：Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００７  Ｍａｙ  １７；非特許文献７：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７  Ｍａｙ  ３１；非特許文献８：ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００７  Ａｐｒ  １３）。一方で、最近、ＥＳ細胞由来の心筋細胞を精製して心臓にインジェクションを行ったが、生着率が極めて低く、生着した（即ち、移植された臓器内に長期間生存し、臓器内に接着して留まった）心筋細胞を見出すことができなかったことが報告され、精製されたＥＳ細胞由来の心筋細胞は、個体（生体）に移植しても生着できないということが判明した（非特許文献９：Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６；２０３：２３１５−２７．）。
これらの報告によって、精製された心筋細胞の移植後の生着の難しさが表面化した。同じ報告で、このような問題点を解決するために、精製されたＥＳ細胞由来の心筋細胞の移植後の生着率を高める目的で、マウス胎児性線維芽細胞を混合して移植する方法が見出された（非特許文献９：Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６  Ｏｃｔ  ２；２０３（１０）：２３１５−２７）。これは、精製したＥＳ細胞由来の心筋細胞について、その純度を保持したまま移植して生着させることは、既知の方法では実施できないことを示している。
また、人体への治療を目的とした移植細胞の調製は、血清などの、他動物由来の因子を排除する必要がある。移植に用いる心筋細胞の作製方法においては、通常は有血清培養を行うが、無血清条件においては、ヒトＥＳ細胞が胚様体を形成でき、その中に含まれる心筋細胞の量も、通常の有血清培養と同程度であることが知られている（非特許文献１０：Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：９３１−９４１，２００６）。しかしながら、この報告を含む既知の報告では、心筋細胞を血清等の他動物由来の因子を用いずに調製して移植を行った例については何ら報告されていない。
このように、上述した様な心筋細胞を心臓に移植するためのいくつかの問題点、即ち、心筋細胞以外の細胞が包含されること、心筋細胞の生着性が低いこと、他種由来の成分を排除できないこと、などの問題点を、すべて解決しなければならない。
さらに、心臓組織への移植に際しては、所謂「細胞シート」の形態で移植することが考えられているが、細胞シートの作製については、新生仔心筋細胞を単層のシートにした後、このシートをｉｎ  ｖｉｔｒｏでは３枚まで重ね合わせることができることが知られている（非特許文献１１：ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００６  Ａｐｒ；２０（６）：７０８−１０）。しかしながら、酸素の透過性に限界が存在するため、これ以上は血管の新生なしには細胞シートに厚みをもたせることができないと記載されており、心臓の患部組織の大きさに合わせて任意の細胞シートを作製するまでには至っていない。
以上のように、移植に用いる心筋細胞の作製や心筋細胞の移植については、実用性の観点から更なる改善が求められているのが現状である。
【特許文献１】ＵＳ２００５−０２１４９３８Ａ
【非特許文献１】Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２００３，８３，１８１８−２２
【非特許文献２】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，９０（３）：ｅ−４０
【非特許文献３】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７  ２，１００：２６３−２７２
【非特許文献４】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２３５；２２００−２２０９，２００６
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６４（５１５５）：９８−１０１
【非特許文献６】Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００７  Ｍａｙ  １７（Ｆｌｋ１（＋）ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ）
【非特許文献７】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７  Ｍａｙ  ３１（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｐｏｓｔ−ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  Ｒａｔｓ）
【非特許文献８】ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００７  Ａｐｒ  １３（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）
【非特許文献９】Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００６  Ｏｃｔ  ２；２０３（１０）：２３１５−２７
【非特許文献１０】Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：９３１−９４１，２００６
【非特許文献１１】ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００６  Ａｐｒ；２０（６）：７０８−１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明者らは、培養心筋細胞を臨床に用いるための少なくとも現在想定される最低限の条件を検討し、以下の課題が明らかになった。
（１）心筋細胞の精製：  心筋細胞を生体又は多能性幹細胞から得る場合、未知の細胞が混入して存在する状態では安全性の保障が不可能であるため、いずれの場合においても心筋細胞の高度な精製は必須である。この心筋細胞の高度な精製純度を安定して維持するためには、生体又は多能性幹細胞から得られた心筋細胞をバラバラに分散（単細胞化）して、個々の細胞の種類を判別し、心筋細胞のみを選抜することが必要であると考えられる。
（２）心筋細胞の由来：  免疫拒絶の問題や、倫理的問題があるばかりではなく、心筋細胞の性質の種間における相異が臨床上の安全性及び有効性に重大な影響をもたらすため、レシピエント個体と同じ種由来のドナー細胞であることが重要である。
（３）他種の動物由来因子の排除：  免疫原性及び未知の病原体の混入を避けるため、血清に代表される他動物由来因子の混入を排除する必要がある。
（４）移植心筋細胞の生着：  移植された心筋細胞は、宿主の心筋細胞と同様に機能する必要があるが、先ずは宿主の心筋細胞に生着する（生きた状態を長期間保つこと）必要がある。
（５）次の段階では細胞が成熟（成長し、大きくなること）が必要である。
即ち、本発明は、心筋細胞以外の細胞を含まず、また他種由来の成分を含まないように精製された心筋細胞の、移植後の生着率を改善し、移植後の成熟を促すこと、を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、心筋細胞以外の細胞を含まず、また他種由来の成分を含まないように精製された生体由来又は多能性幹細胞由来の心筋細胞の生着率を改善するために、精製された心筋細胞について細胞塊が構築できるか検討を行った。その結果、多能性幹細胞である胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）から分化、誘導された心筋細胞を含む細胞塊をいったん分散させて単細胞化することにより得られる精製された心筋細胞を、無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を凝集させることを特徴とする、胚性幹細胞由来や誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞の細胞塊を作製する方法を提供することにより、上記課題を解決することができることを明らかにした。
本発明の発明者らは、先ず生体由来の心筋細胞を使用して、上記の課題を解決することができるかどうかについて検討を行った。即ち、心筋細胞以外の細胞を含まず、また他種由来の成分を含まないように精製した生体由来の心筋細胞を使用して、移植後の生着率を高めることができるかどうかを検討した。
具体的には、精製した生体由来の心筋細胞は、１０％血清を含有する培養液中にも関わらず２４時間経過後も細胞塊を形成できなかった。この結果は、未精製で行われた既知の生体心筋細胞の細胞塊形成が、非心筋細胞の補助的な作用に強く依存していたことを強く示唆した。更に、精製された生体由来の心筋細胞が無血清条件でどのような振る舞いを示すかを実験的に検討したところ、細胞塊の構築はもとより、細胞そのものが死滅してしまった。これらの事実から、「生体心臓由来の未精製心筋細胞塊の構築」は実現できない技術であり、まして無血清状況においての精製された生体心臓由来心筋細胞の振る舞いを予想することすらできないことが判明した。
次に、既知の心筋細胞凝集塊の作製方法では、使用する細胞が、新生仔や胎仔の心臓由来細胞であり、血清を含む培地を用いて培養されていた。これは、一般に血清は、細胞種によらず保護的な効果が強いという共通認識によるものである。しかし、前述したように、例えば人体に対する治療を行う場合、他種動物由来物（例えば血清）を用いることは、避ける必要がある。そこで、無血清培地にして、血清の代わりに血清代替物を含む様々な添加物を用いて、生体由来の心筋細胞における凝集能力を検討した。しかし、生体由来心筋細胞は、いずれの無血清条件でも、十分に細胞塊を構築できず、細胞の生存率も低かった。
また、既知の方法では、生体由来の心筋細胞を塊として培養することで、心筋細胞の生存が長期間維持されるという報告があることから、精製した生体由来の心筋細胞を無血清条件で細胞塊にする試みを行った。ところが、培養５日後においても、細胞塊を形成することができなかった。今回得られた実験結果により、無血清条件においては、精製した生体由来の心筋細胞は細胞塊を構築できないという新たな知見が得られた。
そこで、本発明者らは、心筋細胞を得るための供給源を変更すれば、この技術的困難を打開できるのではないかと考えた。そして、様々な供給源について同様の検討を行った結果、精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞では、無血清条件においても僅か１２時間で速やかに互いに結合し、効果的に立体的な心筋細胞塊を構築できること、そしてその時点で既に同期した収縮を開始していたことを明らかにした。
このことは、胚性幹細胞由来の心筋細胞が精製された同細胞間における細胞接着を効率的に構築できることを示しており、そして精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞が無血清条件下において高い凝集能力を有することを示すものである。この知見は、複数の種についてそれぞれの種由来の胚性幹細胞を用いたそれぞれの場合にも再現されたことから、このような特徴は、ヒト由来も含め胚性幹細胞から得られる心筋細胞に共通する性質であると考えられる。この無血清条件下における胚性幹細胞特異的な性質に基づき、本発明者らは、初めて無血清条件下で、精製された心筋細胞を細胞塊にすることができた。
更に、既知の報告からは、移植後の生着能力が低い胚性幹細胞由来の心筋細胞は、再凝集能力も低いと予測されたが（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７０：１３１０−１３１７，２０００）、一方で、精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させること自体が困難であると予測され、当該細胞を凝集させることができないと考えられていた。それにも関わらず、本発明者らは、そのような予測に反して、精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞が他の細胞の介助なしに細胞塊を構築でき、しかも、これを移植に用いることによって生着率の飛躍的向上がもたらされることを初めて示した。即ち、胚性幹細胞由来の心筋細胞が単細胞化して精製された上、更に無血清条件下でも細胞塊を構築できるという、生体心臓由来の心筋細胞とは全く異なる特性を有することを見出すことに成功した。
更に、本発明者らは、より移植に適した胚性幹細胞由来心筋細胞塊の作製方法を見出すべく、胚性幹細胞由来の心筋細胞が無血清条件下において更に効率的に細胞塊を構築できる条件として培地への添加物の検討を行った。その結果、添加物としてインスリン、トランスフェリン、セレニウム（ＩＴＳ）の添加を行ったところ、細胞塊自律拍動がＩＴＳ未添加の細胞塊に対して強いことが再現よく観察された。即ち、ＩＴＳ（特にインスリン）を添加することは、胚性幹細胞由来の精製された心筋細胞にとって望ましいことであることが示された。なお、ＩＴＳの中で最も重要な因子はインスリンであり、トランスフェリンとセレニウムは補助的な役割を担う。
次に、無血清である基礎培地（以下、基礎培地）にＩＴＳを加えたものに、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び／又はインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）の添加を行ったところ、ｂＦＧＦ単独添加時に、細胞塊形成後５日目の細胞塊の直径が有意に増大しており、当該細胞が保護されていることが分かった。これは、血清を含有する培養条件では見られず、ｂＦＧＦを単独で添加する無血清条件に特有の細胞保護・増殖効果であった。血清添加条件下にて平面培養した実験条件下で培養する心筋細胞に対するｂＦＧＦの作用として、細胞保護、細胞増殖促進などが存在することが知られていたが（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７  Ｊａｎ；４２（１）：２２２−３３，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００４；６４：５１６−２５．）、無血清条件下で心筋細胞の長期間の増殖や保護が生じることは全く知られていなかった。
また、この効果は、１０％血清添加培地を用いて細胞塊を形成させた場合の効果よりも大きいが、ｂＦＧＦを添加しても平面培養により細胞塊を形成させない場合は、１０％血清添加培地を用いて細胞塊を形成させた場合の効果よりも小さかった。この２つの実験結果から、ｂＦＧＦが１０％血清添加培地を用いて細胞塊を形成させた場合の効果を上回る細胞保護・増殖促進効果を得るためには、細胞塊の構築が必須であると考えられた。
そこで、本発明者らは、上記効果の発揮において、細胞塊の構築が必須要件であることを確認するために、精製されたマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を平面接着培養し、当該培地にｂＦＧＦを添加して、その影響を解析した。
細胞塊が形成されない平面培養において、基礎培地にＩＴＳを添加した環境では、殆ど精製された心筋細胞は生存できなかった。しかし、ｂＦＧＦを添加することによって、より多くの細胞が生存接着した状況が見られた。この作用は１０％血清添加培地を用いて細胞塊を形成させた場合の効果よりも小さいものであった。
精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を構築した場合に、無血清＋ＩＴＳ＋ｂＦＧＦの作用と１０％血清の作用を長期培養後に比較したところ、１０％血清含有培地では、細胞塊の大きさが有意に縮小していたのに対し、無血清＋ＩＴＳ＋ｂＦＧＦ群では、有意に増大していた。このことは、本発明者らが見出したｂＦＧＦの作用は、精製・無血清・細胞塊の全ての要素との相乗効果であることが分かった。
この結果から即ち、本発明は、無血清培地にＩＴＳ及び／又はｂＦＧＦを添加することによって、心筋細胞塊の状態が長期間維持されることを見出した。この知見により、心筋細胞の生存率は従来法の平面培養法での６０〜７０％に比べて、９０％以上と飛躍的に向上させることができるようになった。
以上のことから、本発明者らは、従来技術では達成できなかった無血清条件かつ高度に精製された条件での心筋細胞塊の構築を、胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いることによって達成し、更にＩＴＳ及びｂＦＧＦを添加する条件で、最も効率的に心筋細胞塊を構築できることを見出した。
即ち、本発明に係る一つの態様は、胚性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を、無血清条件下の培地を用いて培養して、当該細胞を再凝集させることを特徴とする、胚性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法も提供する。上記培養に用いる培地には、ＩＴＳのうち少なくともインスリンが添加されているものが望ましく、更にｂＦＧＦが添加されているものが望ましい。また、上記方法では、単細胞化した細胞塊を既知の方法のように単一の空間で培養せず、１０，０００個までの細胞群に分割して独立した空間において培養を行うことができる。
増殖性の非心筋細胞が混入した場合、凝集塊の大きさが極端に大きくなり、形態も変形する。更にこの指標に加えて、ミトコンドリアに蓄積する蛍光色素を用いて染色を行うことによって、増殖性の細胞を色素が蓄積しにくい細胞として同定することができる。このような非心筋細胞が混入した細胞塊は、移植治療などへの使用を却下することによって、僅かに混入した増殖性非心筋細胞を移植細胞から除外することが可能である。
また、バラバラに分散（単細胞化）された胚性幹細胞由来の精製された心筋細胞は、そのまま個体（生体）の心臓組織に移植しても生着できないことが、これまでに報告されており、本発明者らも同様の結果を得た。この問題は、従来技術においては、精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞に補助細胞を混合することで解決されたことから、生体内での非心筋細胞の保護作用が心筋細胞の生存にとって必須であることが明確に示された。しかしながら、非心筋細胞の混入は、移植後の患者の生命に関わる重大な予期できない副作用を引き起こす可能性があるため、本発明者らは、補助細胞を混合させることなく、精製された心筋細胞をそのまま高純度で個体（生体）内に移植することができれば、より安全性と治療効果が高まると考えた。
そこで、上記方法により得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊の利用を着想し、当該細胞塊を個体（生体）の心臓組織に移植することにより、移植後の生着性を飛躍的に向上させることができることを見出した。換言すると、細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を、無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を再凝集させて細胞塊を形成させることにより、精製された胚性幹細胞由来心筋細胞の移植後の生着性を飛躍的に向上させることができることを見出した。
即ち、本発明に係る別の態様は、単細胞化して精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を再凝集化して得られた細胞塊を、個体（生体）の心臓組織（特に患部）に移植して生着させることを特徴とする心疾患の治療方法に関する。本願発明において「生着」とは、移植された臓器内に長期間生存し、臓器内に接着して留まることを意味する。
更に、上述したように既知の方法では、新生仔心筋細胞を単層のシートを３枚まで重ね合わせることができることが知られていたが、それ以上の厚さを持つ心筋細胞シートは作製できなかった。
この課題を解決するため、上記方法により得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊の利用を着想した。上記方法により当該細胞塊を構築し、得られた細胞塊を回収して、壁面によって仕切られた細胞非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続ける程度に隙間なく並べて播種し、浮遊培養を行った。その結果、当該細胞塊は、時間経過に伴って細胞塊同士が接合して、５０〜３００μｍの厚みをもったシート状の細胞塊が得られ、従来技術の限界を超える厚みを有する所謂「細胞シート」を生体外で作製することができることを見出した。これにより、実際の応用形態においては、任意の大きさを有する精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を任意の数用いて、任意の大きさの細胞シートを作製することができることが明らかになった。
即ち、本発明に係る更なる態様は、精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を、同一平面状に密に並べて浮遊培養を行ない、細胞塊同士が接合して、５０〜３００μｍの間で任意の厚みを有するまで当該培養を行うことを特徴とするシート状細胞塊（細胞シート）の作製方法に関する。
本発明においては、上述したような特徴を有する精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞の細胞塊を、心臓組織に移植して生着させることができることを明らかにした。このような細胞塊は、人体を含む動物の身体に移植することができる移植用の医療機器として利用することができる。
即ち、本発明のさらなる態様においては、胚性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を得、その心筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、そして当該細胞を凝集させることにより作製された、胚性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を含む、医療機器を提供する。このような医療機器は、個体の心臓組織に移植して生着させることを目的としており、心臓移植を必要とする患者に対して使用することができるという顕著な効果を奏するものである。
以上のように、本発明者らは、バラバラに分散（単細胞化）して完全に精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞の生存率を大幅に改善するための培養条件を鋭意検討した結果、動物由来血清を使用しない条件（即ち、無血清条件）下の培地、好ましくはインスリンを含有する当該培地、更に好ましくはトランスフェリン、セレニウム、及び／又は塩基性線維芽細胞増殖因子を更に含有する当該培地を用いて培養することにより、当該細胞が凝集して細胞塊を形成するという特性を新たに見出した。また、当該細胞を個体（生体）の心臓組織に移植したところ、当該組織への生着率が飛躍的に高まるという知見を新たに見出した。更に、当該細胞を用いると公知技術に比較して予想以上の厚みを有するシート状の細胞塊、並びにそのような細胞塊を含む医療機器を得られるという知見を新たに見出し、本発明を完成するに至った。
このようにして胚性幹細胞を培養することにより得られた知見は、胚性幹細胞の代わりに、他の多能性を有する幹細胞を用いても同様の結果となる。即ち、バラバラに分散（単細胞化）して完全に精製された多能性幹細胞を、動物由来血清を使用しない条件（即ち、無血清条件）下の培地、好ましくはインスリンを含有する当該培地、更に好ましくはトランスフェリン、セレニウム、及び／又は塩基性線維芽細胞増殖因子を更に含有する当該培地を用いて培養することにより、当該細胞が凝集して細胞塊を形成することができ、そして心筋細胞の生存率を大幅に改善することができる。このような多能性幹細胞としては、胚性幹細胞の他に、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、更には胚や胎児の細胞等に由来する、胚性幹細胞に類似した形質を有する全ての多能性幹細胞を用いることができ、例えば、胚性生殖幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＧＳ細胞）、及び誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。
即ち、本発明は以下の事項に関する。
（１）胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、生殖幹細胞や誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を、無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を凝集させることを特徴とする、多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法；
（２）培地がインスリンを含有する培地である上記（１）記載の方法；
（３）培地が、トランスフェリン、セレニウム、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）及びエンドセリン−１（ＥＴ−１）からなる物質群から選択される少なくとも１つの物質を含有する培地である上記（１）又は（２）記載の方法；
（４）培地における含有量が、インスリン０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン０．１〜１０μｇ／Ｌ、セレニウム０．１〜１０μｇ／Ｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、上皮細胞増殖因子１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、血小板由来成長因子１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、エンドセリン−１（ＥＴ−１）１×１０−８〜１×１０−６Ｍである上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法；
（５）単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させて得られた細胞塊を、個体の心臓組織に移植して生着させることを特徴とする心疾患の治療方法；
（６）心筋細胞塊が上記（１）〜（４）のいずれか１項の方法により得られた心筋細胞塊である上記（５）記載の方法；
（７）移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる上記（５）又は（６）記載の方法；
（８）移植がシート状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる上記（５）又は（６）記載の方法；
（９）精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞塊を、壁面によって仕切られた細胞非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続ける程度に隙間なく並べて播種し、浮遊培養を行ない、細胞塊同士が接合して５０〜３００μｍの間で任意の厚みを有するまで当該培養を行うことを特徴とするシート状細胞塊の作製方法；
（１０）心筋細胞塊が上記（１）〜（４）のいずれか１項の方法により得られた心筋細胞塊である上記（９）記載の方法；
（１１）多能性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を得、その心筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、そして当該細胞を凝集させることにより作製された、多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を含む、個体の心臓組織に移植して生着させるための医療機器；
（１２）移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる、（１１）記載の医療機器。
（１３）移植がシート状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる、（１１）記載の医療機器。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞が無血清条件下で培養した場合に、凝集する能力を有する特性が見出された。本発明の方法により、細胞塊を構築することにより、当該心筋細胞の生存率又は増殖能を高く維持しながら長期間培養する方法が得られた。また、当該細胞を個体（生体）の心臓組織に移植すると、当該組織への生着率が飛躍的に高まることが見出され、当該細胞を他の細胞と混在することなく心臓組織内に長期間生着させることができた。これにより、心臓の細胞治療において有望な治療方法、及び心筋細胞の細胞塊を含む医療機器の実用性を可能にすることができた。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）発現マウス胚性幹細胞に由来する、精製した心筋細胞を用いて心筋細胞塊を構築する方法及び、マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞１００００細胞から３１３細胞を用いた時の細胞塊を示す。
【図２】図２は、分注後２４時間後（図２Ａ）又は４８時間後（図２Ｂ）におけるマーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた心筋細胞塊の構築を示す。
【図３】図３は、マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用い、接着基質による細胞生存率の比較に基づき、平面培養における最適な接着基質の同定（図３Ａ）及び、細胞塊と平面培養の心筋細胞生存率の比較（図３Ｂ及び図３Ｃ）を示す。
【図４】図４は、マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の形成において、混在する胚性幹細胞を見出す方法（１）を示す。赤枠で示した細胞塊には細胞増殖による巨大な細胞塊が見出された。
【図５】図５は、マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の形成において、混在する胚性幹細胞を見出す方法（２）を示す。ＴＭＲＭ（ミトコンドリアを特異的に染色する試薬）由来の蛍光シグナルが弱いことを利用した混入非心筋増殖細胞の検出を示し、正常心筋細胞（図５Ａ）とは対照的に、異常心筋細胞塊では非心筋増殖細胞が混入していることが明らかになった（図５Ｂ）。
【図６】図６Ａは、細胞非接着性丸底９６ウェルディッシュで培養した場合に、新生仔ラット心臓由来精製心筋細胞では、２４時間後においても細胞塊を構築できなかったことを示し、図６Ｂは、新生仔ラット心臓由来精製心筋細胞は、無血清条件下において、５日後細胞塊を形成せず、死滅したことを示す。
【図７】図７は、ＩＴＳ及びｂＦＧＦなどの種々の添加物を添加した無血清培地中で、細胞非接着性丸底９６ウェルディッシュで培養した場合に、それらの添加物が細胞塊の直径増加に対してどのような作用を有するかを明らかにすることにより、それらの添加物による細胞保護作用及び増殖促進活性が検出されたことを示す。
【図８】図８は、フィブロネクチンでコーティングした細胞培養用ディッシュ上でマウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を平面接着培養した結果、無血清ＩＴＳ、ＩＴＳ＋ｂＦＧＦ群で有意に細胞生存率が低いことを示す。
【図９】図９は、再凝集法を適用せず、分散細胞のまま心臓に移植した場合のマウス胚性幹細胞由来の単細胞化した精製心筋細胞の移植後の組織内細胞生存率を計測した結果を示す。
【図１０】図１０は、マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を再凝集法により細胞塊に形成した後に、赤色色素（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）を用いてラベルし、心臓に移植した場合、心筋細胞は効率的に生存したことを示す。
【図１１】図１１（Ａ）及び（Ｂ）は、再凝集後に移植したＥＧＦＰ発現マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞の細胞塊の、心臓組織内での細胞数を計測し、その結果として細胞の組織内生存率の解析を行った結果を示す。図１１（Ｃ）及び（Ｄ）は、マウス心筋細胞塊が移植心臓内で長期間生着し、そして時間の経過と共に成熟することが出来ることを示す。
【図１２】図１２は、無血清（図１２Ａ）又は、無血清にＫＳＲ（図１２Ｂ）又はＩＴＳ（図１２Ｃ）を添加した条件におけるマーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊の作製を示す。
【図１３】図１３は、マーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を用いた、任意の厚みを有する任意の大きさの心筋細胞シートの作製を示す。
【図１４】図１４は、無血清条件において、精製ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞塊が作製できることを示す。
【図１５】図１５は、移植したヒト胚性幹細胞由来心筋細胞が、免疫不全マウス心臓組織内において２週間生存できることを示す。
【図１６】図１６は、移植細胞のトレースに用いた赤色色素を使用して、移植したヒト胚性幹細胞由来心筋細胞が、免疫不全マウス心臓組織内において５週間生存できることを示す。
【図１７】図１７は、移植細胞のトレースに用いた色素（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ：赤色）、Ｎｋｘ２．５（水色）及び抗サルコメアアクチニン抗体（緑色）を使用して、移植したヒト胚性幹細胞由来心筋細胞が、免疫不全マウス心臓組織内において５週間生存できることを示す。
【図１８】図１８は、Ｎｋｘ２．５（水色）及び抗ヒト抗体（緑色）を使用して、移植したヒト胚性幹細胞由来心筋細胞が、免疫不全マウス心臓組織内において５週間生存できることを示す。
【図１９】図１９は、無血清又は、無血清にＩＴＳ又はＫＳＲを添加した条件において、マウスｉＰＳ細胞由来精製心筋細胞塊を作製した結果を示す。
【図２０】図２０は、ヒトＥＳ細胞由来精製心筋細胞の、無血清条件におけるｂＦＧＦ及び他の増殖因子を添加した場合の細胞保護及び増殖活性化作用において、ｂＦＧＦが優位性を有することを示す。
【図２１】図２１は、マウス心筋細胞塊が移植心臓内で長期生着する際の成熟機構に関して、宿主心臓内におけるｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＴ−１についての遺伝子発現を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の実施において、分子生物学や組換えＤＮＡ技術等の遺伝子工学の方法及び一般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な書籍を参照し得る。このような書籍としては、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＆  Ｓｔｒｉｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００３）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第３版」（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．＆  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７）等が挙げられる。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＳｉｇｍａ社やＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社等の市販業者から入手可能である。
（１）多能性幹細胞
多能性幹細胞を用いた細胞培養、及び発生・細胞生物学実験の一般的方法について、実施者は、当該分野の標準的な書籍を参照し得る。これらには、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）が含まれる。本明細書において参照される細胞培養、発生・細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社やＳｉｇｍａ社等の市販業者から入手可能である。
マウスやヒトの多能性幹細胞の作製、継代、保存法については、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、前項で挙げた参考書籍に加えて、複数の参考文献等を参照することにより、これらの多能性幹細胞を使用し得る。当該文献としては、以下の文献等が挙げられる：Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号。また、その他の動物種に関しても、例えばサル（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７８４４，１９９６）やラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：２８８，１９９４；Ｌｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開番号第９９／２７０７６号）、ニワトリ（Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：２３３９，１９９６；米国特許第５，３４０，７４０号；米国特許第５，６５６，４７９号）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５６３，１９９４；Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１０８９，１９９７）等に関して胚性幹細胞や胚性幹細胞様細胞等の多能性幹細胞の樹立方法が知られており、各記載の方法に従って、本発明に用いることができる多能性幹細胞を作製又は使用することができる。
本発明の方法は、いずれの哺乳動物由来の多能性幹細胞に対しても適用することができる。例えば、マウス、ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ、マーモセット、アカゲザル、ヒト由来の多能性幹細胞に対して使用することができるが、これらの動物種由来の多能性幹細胞だけには限定されない。例えば、本発明に用いられる多能性幹細胞としては、既に培養細胞として広く使用されているマウス、サル、ヒト等の哺乳動物由来胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を挙げることができる。
マウス由来胚性幹細胞の具体例としては、ＥＢ３細胞、Ｅ１４細胞、Ｄ３細胞、ＣＣＥ細胞、Ｒ１細胞、１２９ＳＶ細胞、Ｊ１細胞等が挙げられる。本願発明に係るマウス由来胚性幹細胞は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）やＣｈｅｍｉｃｏｎ社、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社等から入手することができる。
サル由来胚性幹細胞としては、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ：Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５；９２：７８４４）やカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ：Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２００１；２２２：２７３−２７９）、コモンマーモセット（ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｒｍｏｓｅｔ：Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００５；２３：１３０４−１３１３）からの樹立が報告されており、使用可能である。例えば、マーモセット胚性幹細胞は、財団法人・実験動物中央研究所からも入手することができる。
ヒト由来胚性幹細胞は、現在、全世界で数１０種以上が樹立されており、例えば、米国・国立衛生研究所のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には多数の株が登録されて使用可能であるとともに、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社やＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ等から購入することも可能である。また、日本の場合、国立大学法人・京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターからも入手することができる（Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６；３４５：９２６−９３２）。
更に、ウシ（Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２００１；３：５９−６７，）、トリ（Ｐｅｔｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．２００４；１２１：１１５９−１１６８）、ゼブラフィッシュ（Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１；２９４：１２９０−１２９１）についても胚性幹細胞の樹立が報告されている。
一般に胚性幹細胞は初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からも胚性幹細胞を作製することが可能である（Ｍｕｎｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：９８９，２０００；Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：７４０，２００１；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１６６９，２００４）。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこから胚性幹細胞を作製する試み（米国特許公開第０２／１６８７６３号；Ｖｒａｎａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１９１１−６）や、胚性幹細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有した胚性幹細胞を作る方法も報告されている（国際公開番号第００／４９１３７号；Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１５５３，２００１）。本発明で使用することができる胚性幹細胞には、この様な方法により作製された胚性幹細胞又は胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。
また、本発明に係る方法に使用できる多能性幹細胞には、胚性幹細胞のみに限らず、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、更には胚や胎児の細胞等に由来する、胚性幹細胞に類似した形質を有する全ての多能性幹細胞が含まれる。この場合、胚性幹細胞と類似の形質とは、胚性幹細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在や胚性幹細胞特異的な遺伝子の発現、又はテラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）形成能やキメラマウス形成能といった、胚性幹細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。その具体例としては、始原生殖細胞より作製される胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、精巣の生殖細胞より作製される生殖幹細胞（ＧＳ細胞）、及び線維芽細胞等の体細胞から特殊な遺伝子操作により作製される誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。誘導多能性幹細胞としては、体細胞に特定の因子を導入することにより作製することができる誘導多能性幹細胞が挙げられ、当該細胞は京都大学山中伸弥教授のグループに係る文献（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ”Ｃｅｌｌ  ２００７  １３１：８６１−８７２）や、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学のＴｈｏｍｓｏｎのグループに係る文献（Ｊ．Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７３１８：１９１７−１９２０）に記載された方法に従って作製することができる。具体的には、任意の体細胞に対してＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８の内、少なくとも一つ以上の遺伝子を導入すし、多能性幹細胞に特異的な遺伝子やタンパク質の発現を検出、これらを選別することによって作製することができる。この様にして作製した誘導多能性幹細胞は、胚性幹細胞と同様に、増殖不活性化したマウス線維芽細胞やこれを代替出来る細胞存在下で、塩基性線維芽細胞増殖因子と共に培養することができ、胚性幹細胞と同様に多能性幹細胞として利用することができる。
この誘導多能性幹細胞は、種々の組織への分化の特徴や細胞内での遺伝子発現の特徴に関して、胚性幹細胞と同様の性状を有していることがこれまでに明らかになっており（Ｐａｒｋ  Ｉ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５１，１４１−１４７）、胚性幹細胞から種々の組織への分化誘導条件を、誘導多能性幹細胞に対してそのまま適用することができる（高橋及び山中、細胞工学，Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．３，２５２−２５３，２００８）。
（２）多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法
以下においては、多能性幹細胞として胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を例にとって記載する。心筋細胞への分化能を有する胚性幹細胞に対して、適切な心筋細胞分化誘導処理を行うと、心筋細胞への分化が生じる。即ち、例えばマウス胚性幹細胞を、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を培養液中から取り除いて浮遊培養させて、細胞塊（胚様体）を形成させるハンギングドロップ法により、胚性幹細胞から心筋細胞への分化誘導を行うことができる。又はマーモセット胚性幹細胞やヒト胚性幹細胞を使用して、同様に胚性幹細胞から心筋細胞への分化誘導を行うこともできる。胚性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法としては、公知の方法を用いることができ、特に特定されるものではない。例えば、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質の存在下で分化誘導を行う方法（ＷＯ２００５／０３３２９８）や、カノニカルＷｎｔシグナル経路の活性化を促す物質の存在下で分化誘導を行う方法（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／５９２４２、ＷＯ２００７／１２６０７７として公開）を用いて胚性幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。
（３）心筋細胞の精製
上記（２）の方法により胚性幹細胞から分化誘導された心筋細胞を精製（選択）する方法としては、酵素の作用により心筋細胞をバラバラに分散（単細胞化）して、個々の心筋細胞として精製することができる方法であれば、特に特定されるものではない。例えば、心筋細胞内のミトコンドリアを指標として選択する方法（ＷＯ２００６／０２２３７７）、低栄養条件で生存することができる細胞を選抜する方法（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５１５６３、ＷＯ２００７／０８８８７４として公開）を用いて心筋細胞のみを精製（選択）することができる。
（４）心筋細胞塊の作製
上記（３）の方法により単細胞化して得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を無血清条件下で培養することにより、当該細胞を凝集させて、胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を作製することができる。好ましくは、当該培養に用いる培地にインスリン（０．１〜１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（０．１〜１０μｇ／Ｌ）、セレニウム（０．１〜１０μｇ／Ｌ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）、上皮細胞増殖因子（１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、血小板由来成長因子（１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）、およびエンドセリン−１（ＥＴ−１）（１×１０−８〜１×１０−６Ｍ）からなる物質群から選択される少なくとも１つの物質が含まれていることが望ましい。
更に、上記の方法により得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊に僅かに混在する増殖性細胞を検出して、移植用細胞から除外することによって、さらなる安全性を確保することができる。現在、心筋細胞を精製する方法としては、予め幹細胞のゲノムに何らかのマーカー遺伝子の導入を行う方法が知られている（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０００；１４：２５４０−２５４８）。しかし、これら全ての方法では９９％純度は提供できても１００±０％の純度は保証できない。例えば、ヒト心筋梗塞を治療するために１０の１１乗の心筋細胞が必要であるとするならば、純度９９％では、１０の９乗の非心筋細胞が混入することを意味する。このように、既知の技術水準からすれば完全に近い精製と言える方法であっても完全な心筋細胞の精製が可能となってはいないことから、更なる精製方法との組み合わせや、他の安全性を担保する方法の適用が必要とされる。
そこで、上記の方法に対して、あえて未分化胚性幹細胞を混入させてみた。すると、増殖能力が心筋細胞に比べて高い未分化胚性幹細胞は、心筋細胞塊の外側に大きく別の細胞塊を構築した。この混入した胚性幹細胞が存在する心筋細胞塊は、細胞塊全体の大きさを判定することによって、自動的に判別可能である。更に、当該細胞塊に対してミトコンドリア指示薬（例えば、ＴＭＲＭ）を添加したところ、ミトコンドリアを多く持つ心筋細胞は明るく、ミトコンドリアを多く持たない胚性幹細胞やその他の増殖性の細胞は暗く見出すことができた。この細胞塊内の蛍光強度の差異が大きい細胞塊を除外することは、Ａｒｒａｙｓｃａｎ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、Ｉｎｃｅｌｌ  １０００（ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）、Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｃａｎａｌｙｚｅｒ  ＬｅｍｎａＴｅｃ，Ａａｃｈｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）及び“ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  ＭＩＣＲＯ”（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）、“Ｐａｔｈｗａｙ  ＨＴ”（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、“Ｓｃａｎ＾Ｒ”（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などを利用して自動的に行い得る。このようにして、上記の方法は簡単に且つ自動的に未分化胚性幹細胞の混入を識別することができる。即ち、無血清条件で培養して凝集した胚性幹細胞由来の精製された心筋細胞塊に僅かに混在する増殖性細胞を、当該細胞塊の大きさや形状を指標として、更に当該指標に加えてミトコンドリア指示薬により染色を行い、蛍光強度と細胞塊内の蛍光強度分布などを指標として識別することができる。このようにして、心筋細胞以外の細胞が混入した細胞塊を移植用細胞から除外することによって、安全性を高めることができる。
（５）心筋細胞塊の心臓組織への移植及び生着
上記方法により凝集して得られた細胞塊、即ち、精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を用いて、心筋細胞のみを個体（生体）の心臓組織に移植することができる。例えば、注射により心筋細胞を心臓組織中に直接注入することもでき、この場合、２９、３０ゲージという細く低侵襲性の注射針による注入にも適用可能である。当該方法により移植された心筋細胞の生着率は、既知の方法に比べて、飛躍的に向上されている。ここで「生着」とは、移植された臓器内に長期間生存し、臓器内に接着し留まることを意味する。
（６）心筋細胞塊の移植用シート
既知の方法では新生仔心筋細胞を用いた場合でも、一度に３細胞以上の厚さを持つ心筋細胞シートは作製できない。しかしながら、本発明では、精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞の細胞塊を構築した後、得られた細胞塊を回収して、壁面によって仕切られた細胞非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続ける程度に隙間なく並べて播種して、浮遊培養を行なうことにより、当該浮遊培養において、心筋細胞塊は、時間経過に伴って細胞塊同士が接合して５０〜３００μｍの厚みをもったシート状の細胞塊（細胞シート）を形成することができる。したがって、任意の厚みを形成するまで培養を行う。これにより、実際の応用形態においては、任意の大きさを有する精製胚性幹細胞由来心筋細胞塊を任意の数用いて、任意の大きさの細胞シートを構築することができる。
【実施例】
【０００８】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１：マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞の作製及び、ミトコンドリア法を用いた心筋細胞の精製
本実施例においては、マウス胚性幹細胞から心筋細胞を作製すること、そしてミトコンドリア指示薬を使用して心筋細胞を精製することができるかどうかについて検討を行うことを目的として行った。
胚性幹細胞として、ＥＢ３細胞株（Ｎｉｗａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；２４：３７２−３７６）を用いて、この細胞にＥＧＦＰ発現ユニットをプラスミドを用いてＥＢ３株に導入し、ＥＧＦＰを発現する細胞を取得・株化した。このようにして取得したＥＧＦＰ発現−胚性幹細胞（ＥＢ３細胞）を、最終濃度１０％の非動化（５５℃、３０分）ウシ胎児血清を加えたα−ＭＥＭ培養液（シグマ社製）で、胚性幹細胞数が７５個／３５μＬの濃度となるように希釈した。次いで、市販品である細胞培養用３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製、型式７８８１６１；開口部内径３．０ｍｍ）に上記で調製したマウス胚性幹細胞を分注し、以下の方法に従って胚様体を作製した。
使用した３８４ウェルプレートにおける公称の溶液許容量は１ウェルあたり２５μＬであるが、液面を盛り上げるために、１ウェルあたり３５μＬを分注した。これにより、１ウェルあたり胚性幹細胞７５個を分注した。この時、開口部水平面までに要した溶液量は２８μＬであり、盛り上げに要した溶液量は７μＬであった。分注には、Ｔｈｅｒｅｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製のマルチチャンネルピペット（製品番号４６１００７０）、又はバイオテック株式会社製の分注機械（型式ＬＤ−０１）を用いた。
胚性幹細胞を含む培養液を分注し、培養液が盛り上がった状態のプレートを裏返して、下側開口端に培養液の突出部分を作った。この状態を保ったまま、蓋をしてインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養し、前記下端側開口端の突出部分中で胚性幹細胞を増殖させた。培養開始後１日後に、突出した培養液面が下になっている状態のプレートを清潔なピンセットなどで保持し、別の大型容器中に満たされた最終濃度１０％の非動化（５５℃、３０分）ウシ胎児血清を加えたα−ＭＥＭ培養液（シグマ社）の表面に培養液の突出部分を接触させ、細胞塊を自重で大型容器中の培養液内へ沈降させることにより、胚性幹細胞由来の細胞塊である胚様体を回収した。
回収した胚様体を更に２日から３日、非細胞接着ディッシュ（Ａｓａｈｉ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｇｌａｓｓ：滅菌シャーレ＃ＳＨ９０−１５、又は栄研器材株式会社：滅菌角型シャーレ２型）を用いて胚様体を培養した。この胚様体を遠沈管に回収し、溶液を無血清培地（α−ＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社  ＃Ｍ０６４４にＩＴＳ溶液（ＧＩＢＣＯ  ＃４１４００−０４５）（ここで、本発明において使用したＩＴＳ溶液中には、インスリンが１ｇ／Ｌ、トランスフェリンが０．５５ｇ／Ｌ、そして塩化セレニウムが０．６７ｍｇ／Ｌ、それぞれ含まれる）を１／１００希釈で加えた）に変換すると同時に、細胞接着性の滅菌培養ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ  ＃３５３００３）において培養した。
分化培養開始１５日目まで、一日おきに培地を交換した。１５日目のサンプルに対し、ミトコンドリア指示薬ＴＭＲＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｔ６６８）を終濃度１０ｎＭで加え２時間培養した後、コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ  Ｔｙｐｅ  ３）を終濃度０．１％、トリプシン（ＤＩＦＣＯ  ＃２１５２４０）を終濃度０．１％でそれぞれ加えた生理的バッファー（１１６ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭグルコース、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．３５）を用い、スターラーを用いて溶液を攪拌しながら、細胞を単細胞化した。この単細胞化したサンプルを蛍光活性化細胞ソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）に供し、高蛍光細胞群を回収した（ＷＯ２００６／０２２３７７）。精製した細胞の生細胞数及び死細胞数を血算盤にて計測した。その結果、生細胞の割合は、約７５％であった。
実施例２：マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、実施例１において作製したマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いて、その後細胞塊を作製することができるかどうかを明らかにすることを目的として行った。
実施例１において作製した胚性幹細胞由来の精製心筋細胞を、１００００、５０００、２５００、１２５０、６２５及び３１３個の細胞が細胞非接着性丸底９６ウェルプレート（住友ベークライト：セルフェクタイトスフェロイド）の１ウエルに存在するように分注した。培養培地は、１０％牛胎仔血清を含むα−ＭＥＭである。分注した細胞を経時的に観察したところ、１０時間後には、細胞塊を形成し、同期して自律拍動した。２４時間後には、ほぼ完全な球形をなし、１０日後においては、リズミカルな同期した自律拍動を示した（図１）。
この結果から、マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を単細胞化した後に、心筋細胞が再凝集して、細胞塊を形成する能力を有することが明らかになった。
実施例３：マーモセット胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、実施例１の方法に準じて作製したマーモセット胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いて、その後細胞塊を作製することができるかどうかを明らかにすることを目的として行った。
マーモセット胚性幹細胞は、実験動物中央研究所から入手した（Ｓａｓａｋｉ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００５；２３（９）：１３０４−１３）。このマーモセット胚性幹細胞を、マイトマイシンＣ処理により増殖不活性化したマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）を用いて未分化維持培養を行った。培養液［ＫＯ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．２ｍＭ  β−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び８ｎｇ／ｍｌ組換えヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）］を用いた。植え継ぎに際しては、０．１％ＩＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ）、３７℃１０分にて胚性幹細胞コロニーを分離した。
続いて、ＭＥＦと胚性幹細胞を分離するために、ポアサイズ１００μｍのメッシュの通過液を取得し、これをポアサイズ４０μｍのメッシュの非通過細胞塊を取得した。この細胞塊が即ち純粋な胚性幹細胞塊である。分化にあたり、ＥＢあたり５０〜１０００個の胚性幹細胞塊を細胞非接着性バクテリアディッシュ（アサヒテクノグラス：滅菌シャーレ）上で胚様体として合計１５〜３０日間培養し、心筋細胞を含む胚様体へと分化させた。この際に使用した培養液は、本実施例において上述した培養液から、ｂＦＧＦを除いたもの［ＫＯ−ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．２ｍＭ  β−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び８ｎｇ／ｍｌ組換えヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）］であった。
胚様体作製後１〜２ヶ月経過した胚様体を用いて、ＷＯ２００６／０２２３７７に記載の方法を用いて心筋細胞を精製した。即ち、胚様体をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、バラバラの単細胞を得た。細胞が分散された培養液に対し、ミトコンドリア指示薬ＴＭＲＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｔ６６）を終濃度１０ｎＭで加え、３７℃、１５分間暴露し、３回洗浄した後、直ちにＦＡＣＳ解析を行った。主細胞集団に比べて高蛍光を示す細胞（心筋細胞）を分離回収した。
この分離した心筋細胞を実施例２と同様の方法を用いて心筋細胞塊を作製した。即ち、マーモセット胚性幹細胞由来の精製心筋細胞２０００細胞が細胞非接着性丸底９６ウェルプレート（住友ベークライト：セルフェクタイトスフェロイド）の１ウエルに存在するように分注した。分注した細胞を経時的に観察したところ、２４時間後（図２Ａ）には、細胞塊を形成し、同期して自律拍動した。４８時間後（図２Ｂ）には、ほぼ完全な球形をなし、１０日後においては、リズミカルな同期した自律拍動をしめした（図２）。
この結果から、マーモセット胚性幹細胞由来の心筋細胞を単細胞化した後に、心筋細胞が再凝集して、細胞塊を形成する能力を有することが明らかになった。
実施例４：マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊形成時の細胞生存率の測定及び接着法との比較
本実施例では、平面培養条件における保護作用の強さを指標とした接着基質の検討、及び平面接着培養と細胞塊培養における胚性幹細胞由来精製心筋細胞の生存率の比較を、細胞保護作用の強い血清を用いた平面接着条件と、有血清条件及び無血清条件における細胞生存率を比較検討し、細胞塊培養方法の無血清条件における優れた細胞保護作用を示す目的で実施した。
本実施例においては、実施例１に従い、マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を精製した。
精製した心筋細胞を、（１）ゼラチン、（２）フィブロネクチンコートしたプラスチック製培養皿（ＢＤ社）に有血清条件で播種した（図３Ａ）。同時に、細胞塊を形成する目的で、実施例２に従い（３）細胞非接着性丸底９６ウェルプレートに１，０００細胞毎分注し、１２０ｇで５分遠心操作を行った。また、（４）細胞塊構築において無血清条件を用いる点を除いて実施例２に従い細胞非接着性丸底９６ウェルプレートに１，０００細胞毎分注し、１２０ｇで５分遠心操作を行った。（１）〜（４）を同一のインキュベーター内で１２時間及び４日間培養を行った。４日後、各ディッシュに接着する細胞数（生細胞数と、接着せず浮遊する細胞数（死細胞数）とを計測した。その結果を図示する（（１）及び（２）について図３Ａ、（３）及び（４）についてそれぞれ図３Ｂ及び図３Ｃを参照）。
この結果、細胞塊無血清培養条件における細胞生存率は、平面接着血清含有条件における最大の細胞生存率（（２）の場合の約６０％の生存率）と比べても明らかに高いことが明らかになった（（３）の場合について９９．２％の生存率、（４）の場合について９０．４％の生存率）。
実施例５：精製したマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊の作製と、混在する胚性幹細胞の検出
本実施例は、精製したマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊の中に混在する非心筋細胞を検出することを目的として行った。
実施例１、２の方法を用いて精製した心筋細胞塊を作製した。但し、この最終的に９６ウェルプレートに播種を行う前段階で、心筋細胞懸濁液に、２％の未分化胚性幹細胞を加えた。細胞塊は、無血清＋１ｍｇ／ｍｌのＩｎｓｕｌｉｎ、及び１０ｎＭ  ＴＭＲＭを含むα−ＭＥＭ溶液で培養し、１４日後に全てのウエルの蛍光像及び位相差像を取得した。
この結果、約２％のウエルである２ウエルにおいて、大型（正常な細胞塊の２倍以上の大きさ）の細胞塊が観察され（図４）、この非球形細胞塊の一部が、弱いＴＭＲＭ由来の蛍光シグナルを有する細胞集団（即ち、非心筋細胞）であり、異常心筋細胞であることが判明した（図５Ｂ）。なお、正常の心筋細胞塊は、細胞塊全体がＴＥＲＭ由来の蛍光シグナルを発していた（図５Ａ）。
このように、本実施例において提供する方法は、高感度に、非心筋細胞の混入を識別することが出来た。
実施例６：新生仔ラット心臓由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、新生仔ラットの心臓由来の、精製した心筋細胞を用いた細胞塊を作製することができるかどうかを明らかにすることを目的として行った。
生後０〜２日の新生仔ラットをエーテル麻酔した。心臓を摘出し、０．１％コラゲナーゼ（ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ）を用いて細胞をバラバラに分散した。これを１０ｎＭ  ＴＭＲＭを用いて染色した後、ＦＡＣＳを用いて心筋細胞を精製した。
精製した心筋細胞の細胞数を計測し、３０００細胞づつ細胞非接着性９６ウェルディッシュ（住友ベークライト）にて培養した。培養培地は１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）を含有するＤＭＥＭ−高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
２４時間後の細胞の様子を図に示した。新生仔ラット由来精製心筋細胞は、細胞塊を形成せず、丸底に沿って存在していた（図６Ａ）。培養５日目の新生仔ラット心臓由来精製心筋細胞は、無血清条件下（基礎培地であるα−ＭＥＭのみ（図６Ｂ左）、もしくはα−ＭＥＭ＋ＩＴＳ（図６Ｂ右））では、細胞がほぼ死滅していた（図６Ｂ）。
実施例７：マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊形成に最適な培地組成
本実施例では、新生仔ラット初代心筋細胞、及びマウス胚性幹細胞由来心筋細胞の諸性質を解析し、胚性幹細胞由来心筋細胞に対して最も適した培養培地を見出すことを目的とした。
マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞及び、新生仔ラット精製心筋細胞は、前述のように調製した。これを、α−ＭＥＭのみ、α−ＭＥＭ＋ＩＴＳ、α−ＭＥＭ＋ＩＴＳ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、α−ＭＥＭ＋ＩＴＳ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（Ｗａｋｏ）、α−ＭＥＭ＋ＩＴＳ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１、α−ＭＥＭ＋５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、α−ＭＥＭ＋１０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、α−ＭＥＭ＋１％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ）、α−ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ、α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの計１０種類の培養培地を用いて解析を行った。
この結果、マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を細胞非接着性丸底９６ウェルディッシュで培養したところ、僅か１２時間で、全ての培養培地において細胞塊を形成した（図７Ａ）。しかし、新生仔ラット心筋細胞は、２４時間後、全ての培養条件で、細胞塊を形成することが出来なかった。１０％血清を含有する培地を例示する。４日後、新生仔ラット心筋細胞は、５％ＦＢＳ、及び１０％ＦＢＳを含有する培地においてのみ、心筋細胞塊を形成した。
一方、細胞非接着性丸底９６ウェルディッシュで培養した６日後のマウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を観察したところ（図７Ｂ）、α−ＭＥＭ＋ＩＴＳ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦのみにおいて、細胞塊形成時に比べて有意な細胞塊の直径増加が見られた（図７Ｃ、＊を付したカラムを参照）。血清を含有する培地においても、細胞塊の直径は、初期の１／２程度となった（図７Ｃ）。
このことから、無血清条件下で、ＩＴＳ及び、ｂＦＧＦを添加した培地は、非常に細胞保護作用が強く、心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮すると考えられる。
実施例８：マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊形成に最適な培地組成
実施例７において、無血清条件下で、ＩＴＳ及び、ｂＦＧＦを添加した培地が、非常に細胞保護作用が強く、心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮することが明らかになったことから、本実施例では、ｂＦＧＦやＩＴＳ溶液を構成する成分の一つであるインスリンが、細胞塊の直径増加に対してどのような作用を有するかを明らかにすることを目的として行った。
基本的には、培養培地として、α−ＭＥＭのみ、α−ＭＥＭ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、α−ＭＥＭ＋１０μｇ／ｍｌインスリン＋５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、α−ＭＥＭ＋１μｇ／ｍｌインスリン＋１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを使用した以外は、実施例７と同様に実験を行った。
この結果、６日後のマウス胚性幹細胞由来心筋細胞塊を観察したところ、α−ＭＥＭ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、α−ＭＥＭ＋１０μｇ／ｍｌインスリン＋５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、α−ＭＥＭ＋１μｇ／ｍｌインスリン＋１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦのいずれにおいても、α−ＭＥＭのみの場合の細胞塊と比べて有意な細胞塊の直径増加が見られた（図７Ｂ）。また、心筋細胞の収縮活性も強く、実施例７においてＩＴＳを添加した場合と同様の収縮活性に対する効果が見いだされた。
このことから、無血清条件下で、ｂＦＧＦ、又はインスリン＋ｂＦＧＦを添加した培地は、非常に細胞保護作用が強く、心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮すると考えられる。
実施例９：マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞の、平面接着培養系における無血清及びｂＦＧＦの作用
実施例１に従って、マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を精製した。この精製した心筋細胞をフィブロネクチンでコーティングした細胞培養用ディッシュに同数の細胞を播種し、種々の培養培地を用いて平面接着培養を行った。種々の培養培地とは、全て基礎培地にα−ＭＥＭを用い、１０％ＦＢＳ、１０％ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳ、ＩＴＳ＋５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加したものである。これらの条件に播種した細胞を合計５日間培養した後、それぞれ写真撮影を行った（図８Ａ）。この結果、無血清ＩＴＳ、ＩＴＳ＋ｂＦＧＦ群では、１０％ＦＢＳ添加群もしくは、１０％ＫＳＲ添加群に比べて有意に細胞生存率が低かった（図８Ｂ）。
実施例１０：マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞の、免疫不全マウス心筋組織内に対する移植と生着率の計測
先ず、再凝集法を適用しない場合のマウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞の生存率を計測するために、以下の実験を行った。
合計２×１０５細胞を免疫不全マウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）の左室自由壁内に移植した。マウスをエーテルにて麻酔導入し、２％フォーレンを含む空気を人工呼吸器を通じて持続的に処置した。マウスを深い麻酔下で開胸（第３肋間）し、心嚢をピンセットで破り、心臓を露出した。３０Ｇ針付きシリンジを用い、心筋細胞塊を含む生理食塩水３０μｌを吸入した。注射針を心尖部から心臓自由壁内を心基部に向かって３ｍｍ程進め注入した。移植後速やかに閉胸し、自律拍動の回復を待って、ケージに戻した。
移植３週間後、心臓を灌流固定し、凍結切片に供した。切片を抗サルコメアアクチニン抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡像を得た（図９Ａ）。この結果、生存する移植細胞は殆ど見出すことが出来ず、辛うじてトレーサーである赤色色素の反応を見出した（図９Ａ、図９Ｄ）。
次に、実施例７に記載の無血清条件で構築した２０００個の細胞からなる心筋細胞塊、合計２×１０５細胞を免疫不全マウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）の左室自由壁内に移植した。上記実験と同様に、移植を実施し、移植３週間後、心臓を灌流固定し、凍結切片に供した。切片を抗サルコメアアクチニン抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡像を得た（図１０）。蛍光顕微鏡像を元に、ひとつの細胞塊に含まれる宿主心臓組織に生着した細胞数をカウントした。
その結果、移植した細胞塊が正確に２０００個の心筋細胞からなるとした場合、９２．０５±１１．１％の心筋細胞が生着したことが判明した（ｎ＝４）（図１１（Ａ）及び（Ｂ））。これに対して、バラバラに分散した精製細胞をそのまま注入した場合は、生着細胞を見出すことができなかった。この結果は、移植後生着率が０％から９２％までの劇的な向上が得られたことを意味する。
さらに長期移植における心筋細胞変化を確認する目的で、移植後３週、８週の心臓の免疫染色的な調査を行った。この結果、移植前の心筋細胞（図１１（Ｃ）の“Ｐｒｅ”）と比べて、移植後３週、８週では、心筋細胞細胞質体積が顕著に増加し、しかも、移植心筋細胞は宿主の心筋細胞と同一の方向に並んで存在していた（図１１（Ｃ）及び（Ｄ））。これは、移植した心筋細胞塊が、移植された心臓組織内で成熟したことを表している。
実施例１１：マーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、無血清又は、無血清にＩＴＳ又はＫＳＲを添加した条件におけるマーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を作製することを目的として行った。
即ち、無血清メディウム（図１２Ａ）又は、無血清メディウムに１０％  ＫＳＲ（図１２Ｂ）又はＩＴＳ（図１２Ｃ）を用いたことを除き、実施例３に従って、マーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を作製した。培養開始後１２時間又は３日後に構築された細胞塊を図１２に示す。
実施例１２：マーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を用いた、厚みを持った細胞シートの構築
実施例１１において作製したマーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を、同一平面状にて浮遊培養した。この浮遊培養した心筋細胞塊は、０〜１２時間にかけて時間経過に伴って細胞塊同士が接合し、あたかも、厚みをもった細胞シートを構築した。この実施例は、方法の実証を目指したモデル実験であって、実際の応用形態では、任意の大きさを有する精製胚性幹細胞由来心筋細胞塊を任意の数用いて、任意の大きさの細胞シートを構築できる（図１３）。また、用いる細胞塊の大きさを変えれば、任意の厚さの細胞シートを形成することができる。
実施例１３：ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞の、免疫不全マウス心臓への移植
本実施例においては、ヒト胚性幹細胞から心筋細胞を分化させ、そしてその様にして作製した心筋細胞塊が心臓組織内で生着する能力を有するかどうかを調べることを目的として実験を行った。
ヒト胚性幹細胞は、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター（ナショナルバイオリソースプロジェクトによる胚性幹細胞センター）から入手した。
このヒト胚性幹細胞を、マイトマイシンＣ処理により増殖不活性化したマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）を用いて未分化維持培養を行った。培養液としては、Ｆ１２／ＤＭＥＭ（１：１）（ＳＩＧＭＡ、製品番号Ｄ６４２１）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の組成の培養液を用いた。植え継ぎに際しては、０．１％ＩＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｉｎｇｔｏｎ）、３７℃、１０分にて胚性幹細胞コロニーを分離した。
続いて、ＭＥＦと胚性幹細胞を分離するために、ポアサイズ４０μｍのメッシュの非通過細胞塊を取得した。この細胞塊が、即ち純粋な胚性幹細胞塊である。分化にあたり、ＥＢあたり５０〜１０００個の胚性幹細胞塊を細胞非接着性バクテリアディッシュ（アサヒテクノグラス：滅菌シャーレ）上で胚様体として合計１５〜３０日間培養し心筋細胞を含む胚様体へと分化させた。この際に使用した培養液は、本実施例において上述した培養液から、ｂＦＧＦを除いたもの（即ち、Ｆ１２／ＤＭＥＭ（１：１）（ＳＩＧＭＡ、製品番号Ｄ６４２１）、２０％ＫＯ−ＳＥＲＵＭ（ＧＩＢＣＯ）、１．６ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）であった。
実施例１に従い、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を精製した。続いて、実施例８の結果に従い、インシュリン１μｇ／ｍｌ及びｂＦＧＦ１ｎｇ／ｍｌを含むが血清を含まないα−ＭＥＭ溶液を用いて、精製心筋細胞１０００個を含む細胞塊を作製した（図１４を参照）。
さらに、実施例１０に従い、免疫不全マウス心臓組織内への移植を行った。移植２週間後、実施例１０に従い、凍結切片を作製した。このようにして作製した切片をＮｋｘ２．５及び抗サルコメアアクチニン抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡像を得た。
移植細胞のトレースに用いた赤色色素に染まる細胞塊を見出した。切片に対し、Ｎｋｘ２．５及び抗サルコメアアクチニン抗体の免疫検出を行った。結果を図１５に示す。移植細胞は、トレーサー色素に染まり、全体的に赤色が強いことが示された。さらに、アクチニンの免疫染色によって、横紋が染め出されていることも示された。さらに、心筋細胞マーカーであるＮｋｘ２．５は、移植心筋細胞の核内に強く見出されることもまた示された。これは、幼弱な心筋細胞に特有の現象である。また、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞の核は、周囲のマウス心筋細胞に比べて大型で、区別できる（図１５）。
さらに、移植５週間後、実施例１０に従い、凍結切片を作製した。移植細胞のトレースに用いた赤色色素に染まる細胞塊を見出した（図１６）。このようにして作製した切片をＮｋｘ２．５（水色）及び抗サルコメアアクチニン抗体（緑色）もしくはＮｋｘ２．５（水色）及び抗ヒト核抗原（緑色：マウス核内には存在しない、霊長類にのみ存在する抗原と結合）を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡像を得た。結果を図１７、１８に示す。移植細胞のミトコンドリアは、トレーサー色素に染まり、点状に赤色色素が検出された。アクチニンの免疫染色によって、横紋が染め出されていることも示された（図１７）。また、この同一の領域を構成する細胞集団がヒト細胞由来であることを示すために、抗ヒト抗体を用いて検出を行った結果、やはり、移植された細胞は、ヒト細胞でありかつ、Ｎｋｘ２．５に共染する心筋細胞であることが証明された（図１８）。
実施例１４：マウス誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、無血清条件又は、無血清条件下でＩＴＳ又はＫＳＲを添加した条件において、マウスｉＰＳ細胞由来の精製心筋細胞塊を作製することを目的として行った。
マウスｉＰＳ細胞は、京都大学再生医科学研究所より譲渡された。マウスｉＰＳ細胞の心筋細胞分化は、実施例１と同様に行った。この際、ひとつの胚様体を構成する初期細胞数は１０００個が最適であった。
図１９（Ａ）において精製を目的として、ミトコンドリア指示薬であるＴＭＲＭを用いたＦＡＣＳ解析結果を示した。図中の四角は、心筋細胞の領域を示す。このようにして精製した心筋細胞を接着培養し、免疫染色（アクチニン、Ｎｋｘ２．５）を行った結果を、図１９（Ｂ）に示した。これによって、マウスｉＰＳ−誘導心筋細胞の凝集塊が形成されることが示されたことから、ＦＡＣＳによって分取した細胞画分中にはほぼ１００％心筋細胞が含まれることが示された。さらに図１９（Ｃ）には、精製した心筋細胞を細胞非接着性の９６ｗｅｌｌ培養ディッシュに播種した２４時間後の様子を示した。この場合に無血清メディウムを用いた。この結果、マウスｉＰＳ細胞由来精製心筋細胞でも、本方法で細胞塊の構築が可能であることが分かった。
実施例１５：ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊形成に最適な培地組成
実施例７において、無血清条件下で、ＩＴＳ及び、ｂＦＧＦを添加した培地が、マウス由来細胞に対する保護作用が強く、心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮することが明らかになったことから、本実施例では、ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞におけるｂＦＧＦの有効性を示すことを目的として、そしてその有効性をさらに詳細に他の増殖因子と比較することを目的として、実施した。
基本的には、培養培地として、α−ＭＥＭ＋ＩＴＳを用いた。この基礎メディウムに対し、２５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）、２５ｎｇ／ｍｌ酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−４、２０ｎｇ／ｍｌケラチノサイト成長因子（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＫＧＦ）、１００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）、１００ｎｇ／ｍｌ血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）、１００ｎｇ／ｍｌグリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；ＧＤＮＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−１、１００ｎｇ／ｍｌ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、１×１０−７Ｍエンドセリン−１（ＥＴ−１）、１０ｎｇ／ｍｌ血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−ＡＡ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（上記に入手先の記載が無いものは全てＲ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓより購入した）を添加し、培養を行い、凝集塊を作製した。
凝集塊作製後３日、８日、２５日、４０日後の細胞塊の直径を計測した。この結果、いずれの日程においても、ｂＦＧＦを添加した細胞塊の大きさが最も大きいことが判明した（図２０Ａ）。しかも、この保護作用は、４０日間という長期に渡って継続されることが分かった。また、ｂＦＧＦの代わりに培養液中に上述した様々な物質のいずれかを添加してその細胞塊形成に対する効果を調べたところ、ｂＦＧＦには劣るものの、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＴ−１が有効性を有することが判明した（図２０Ｂ）。
このことから、ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の分化においても、ｂＦＧＦは、無血清条件下で細胞保護・増殖促進活性を有し、しかも他の増殖因子に比べてこの作用が強いことが判明した。
さらに、移植後宿主心臓内で、移植した心筋細胞が成熟できる機構を解明するために、本実施例において示した、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＴ−１について、宿主心臓内における遺伝子発現の有無をリアルタイムＰＣＲ（Ａｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって行った。それぞれのプライマープローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）より購入し、詳しくはｂＦＧＦ（Ｍｍ０１２８７１５＿ｍ１）、ＥＧＦ（Ｍｍ０１３１６９６７＿ｍ１）、ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｍｍ０１２９８５７７＿ｍ１）、ＥＴ−１（Ｍｍ０１３５１８４０＿ｇ１）を用いた。解析試薬、操作方法は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの使用説明書に従った。この結果、宿主心臓において、上記の遺伝子が発現されていることが判明した（図２１）。
本実施例の結果から、心臓内に移植した心筋細胞塊が生存し、成熟するために必要な増殖因子群は、宿主の心臓から供給されることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明により、単細胞化により精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞が、無血清条件下で培養した場合に、凝集する能力を有する特性が見出された。本発明の方法により細胞塊を構築することにより、当該心筋細胞の生存率又は増殖能を高く維持しながら、長期間培養する方法が得られた。更に、当該細胞を個体（生体）の心臓組織に移植すると、心臓組織への生着率が飛躍的に高まることが見出され、心筋細胞を、非心筋細胞と混在することなく、心臓組織内に長期間生着させることができた。即ち、本発明により、移植用の心筋細胞の提供や、心臓移植以外の治療方法として、体外で作製した心筋細胞を移植することにより心疾患を治療する方法である心臓の細胞治療方法、並びに心筋細胞の細胞塊を含む医療機器を提供する実現性を高めることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ＡＢ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ＡＢ】
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【図１１ＣＤ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ＡＢ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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