(57)【要約】単分散性及び構造安定性が高く、かつ細胞へのｓｉＲＮＡ送達能に優れた、ｓｉＲＮＡ内包高分子ミセル複合体（ポリイオンコンプレックス）を提供する。さらに本発明は、当該複合体を用いた核酸送達デバイス、核酸送達用キット、医薬組成物及び遺伝子治療剤を提供する。  本発明のポリイオンコンプレックスは、ポリエチレングリコール部分および末端がチオール基の側鎖を有するポリカチオン部分を構成成分とするブロックコポリマーと、ｓｉＲＮＡとを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール部分および末端がチオール基の側鎖を有するポリカチオン部分を構成成分とするブロックコポリマーと、ｓｉＲＮＡとを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
【請求項２】
ポリカチオン部分が、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドである、請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項３】
ブロックコポリマーが下記一般式（１）で示されるものである、請求項１又は２記載のポリイオンコンプレックス。
2008062909.tif 000006
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
Ｌ１は、ＮＨ、下記一般式（２）：
−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−    （２）
（式中、ｐ１は１〜５の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（３）：
−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ３ａ−    （３）
（式中、Ｌ２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ａは、ＮＨを表す。ｑ１は１〜５の整数を表す。）
で示される基を表す。
ｋは１００〜５００の整数を表し、ｍは０〜４９９の整数を表し、ｎは１〜５００の整数を表す。但し、ｍ＋ｎは１０〜５００である。
ｐは１〜１０の整数を表し、ｑは１〜１０の整数を表し、ｒは１〜１０の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ＋ｎ）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
【請求項４】
ポリカチオン部分とｓｉＲＮＡとが静電的相互作用により結合したものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項５】
ポリカチオン部分とｓｉＲＮＡとがコア部分を形成し、ポリエチレングリコール部分が当該コア部分の周囲にシェル部分を形成したものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項６】
ブロックコポリマーの分子内及び／又は分子間でジスルフィド結合が形成されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内への核酸送達デバイス。
【請求項８】
ポリエチレングリコール部分および末端がチオール基の側鎖を有するポリカチオン部分を構成成分とするブロックコポリマーを含む、細胞内への核酸送達用キット。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含む、細胞内への核酸送達用キット。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、癌治療用の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０記載の組成物を有効成分として含むことを特徴とする、癌の遺伝子治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を内包した高分子ミセル複合体、特に、ｓｉＲＮＡを内包した高分子ミセル複合体に関する。また本発明は、当該複合体を用いた核酸送達デバイス、核酸送達用キット、医薬組成物及び遺伝子治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）とは、１９〜２１塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、強力かつ特異的な遺伝子発現抑制現象として知られるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を担う主要分子である（Ｆｉｒｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９１，ｐ．７４４−７４５，１９９８）。２００１年にＴｕｓｈｌらによって哺乳類細胞におけるＲＮＡｉが報告されて以来（Ｓａｙｄａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４１１，ｐ．４９４−４９８，２００１）、あらゆる疾病治療への適用を目指した研究開発が活発に行われている。但し、先行する開発は目や呼吸器など患部への到達が容易な部位に対するものであり、適用範囲が限定的である。そもそも、ｓｉＲＮＡは生理的環境にて易分解性の不安定な化学種であり、マウスに単独で静脈投与した場合には速やかに（ｔ１／２＝数分）腎排泄されることが知られている。したがって、ｓｉＲＮＡの体内動態を改善するＤＤＳは、ｓｉＲＮＡ実用化の鍵を握るものとして切望されている。
しかし、全身性のＤＤＳは、未だ研究室レベルに留まり、実用化には程遠い。最も前衛的な成果を発表しているＡｌｎｙｌａｍ及びＰｒｏｔｉｖａ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの両社によるＳＮＡＬＰ（Ｓｔａｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の系であっても、肝臓への受動的な取り込みのため肝臓以外の組織への適用は困難である（Ｔｒａｃｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐ．１１１−１１４，２００６）。一方、血流中への長期滞留という点のみについては、協和発酵社によるＷｒａｐｐｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅの系が、一本鎖ＤＮＡを対象としながらも飛躍的な滞留性向上に成功したため（Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｙａｍａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｗｒａｐｐｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．１１４，ｐ．２６８−２７５，２００６）、今後のｓｉＲＮＡへの展開が大いに期待されているが、リポソームの場合、安定すぎて内部の薬剤を放出するのが困難な場合が多い。
前述したように、ｓｉＲＮＡの適用を拡大するにあたっては、ｓｉＲＮＡの体内動態を改善し、血流中へのｓｉＲＮＡ投与を可能とする技術が極めて重要である。
これまでに、プラスミドＤＮＡやアンチセンスＤＮＡにつき、ポリエチレングリコール−ポリリシンブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＰＬｙｓ）を用いて当該ＤＮＡを内包したナノメートルスケールの構造体（すなわち高分子ミセル）が形成され、その有用性が報告されている（Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｒｒｏｗ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｏｒｍ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｌｉｎｅ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ．２９，ｐ．８５５６−８５５７，１９９６  ；  Ｍ．Ａ．Ｗｏｆｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｈｕｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．７，ｐ．２１２３−２１３３，１９９６；Ｓ．Ｋａｔａｙｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．，Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．８，ｐ．７０２−７０７，１９９７；Ｓ．Ｋａｔａｙｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８７，ｐ．１６０−１６３，１９９８）。
このような高分子ミセルは、上記ブロックコポリマー中のポリカチオン部分（ＰＥＧ−ＰＬｙｓではポリリシン部分）と、ポリアニオンである核酸分子（ＤＮＡ等）との静電相互作用による自己組織化によって形成される。形成された高分子ミセルは、ポリカチオンとポリアニオンとのポリイオンコンプレックス部分が内核様部分となり、その表層がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で覆われたような、コア−シェル型の構造となる。そのため、当該高分子ミセルは、生体内異物認識機構や腎排泄を回避し得ることが期待される。
本発明者は、上記プラスミドＤＮＡやアンチセンスＤＮＡがｓｉＲＮＡの類縁体であることに鑑み、ｓｉＲＮＡの体内動態を改善する方策として、ＰＥＧ−ＰＬｙｓを用いてｓｉＲＮＡを内包する高分子ミセルの形成を試みた。しかしながら、実際に得られたものは、構造安定性が低く、目的のコア−シェル型のミセル構造を十分に備えるものではなく、培養細胞へのｓｉＲＮＡ送達能に極めて乏しいものであった。そのため、ＰＥＧ−ＰＬｙｓを、ｓｉＲＮＡのキャリアとして利用することは極めて困難であった。
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、単分散性及び構造安定性が高く、かつ細胞へのｓｉＲＮＡ送達能に優れた、ｓｉＲＮＡ内包高分子ミセル複合体（ポリイオンコンプレックス）を提供することにある。さらに本発明は、当該複合体を用いた核酸送達デバイス、核酸送達用キット、医薬組成物及び遺伝子治療剤を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ポリイオンコンプレックスの単分散性及び構造安定性が低い要因は、ｓｉＲＮＡがプラスミドＤＮＡ等と比較して塩基長が極めて短い分子であることにあると考えた。そこで、この要因を解消し得るため、ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロックコポリマーについて種々検討した結果、該コポリマーのポリカチオン部分の側鎖末端に塩基性の高い官能基とチオール基を導入したものを用いれば、前述した課題を解消し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ポリエチレングリコール部分および末端がチオール基の側鎖を有するポリカチオン部分を構成成分とするブロックコポリマーと、ｓｉＲＮＡとを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
本発明のポリイオンコンプレックスにおいて、ポリカチオン部分として、例えば、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドが挙げられる。また、ブロックコポリマーとして、例えば、下記一般式（１）で示されるものが挙げられる。
2008062909.tif 000002
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
Ｌ１は、ＮＨ、下記一般式（２）：
−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−    （２）
（式中、ｐ１は１〜５の整数を表す。）
で示される基、又は下記一般式（３）：
−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ３ａ−    （３）
（式中、Ｌ２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ａは、ＮＨを表す。ｑ１は１〜５の整数を表す。）
で示される基を表す。
ｋは１００〜５００の整数を表し、ｍは０〜４９９の整数を表し、ｎは１〜５００の整数を表す。但し、ｍ＋ｎは１０〜５００である。
ｐは１〜１０の整数を表し、ｑは１〜１０の整数を表し、ｒは１〜１０の整数を表す。
「／」の表記は、その左右に示された（ｍ＋ｎ）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを表す。〕
本発明のポリイオンコンプレックスとしては、例えば、ポリカチオン部分とｓｉＲＮＡとが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。また、ポリカチオン部分とｓｉＲＮＡとがコア部分を形成し、ポリエチレングリコール部分が当該コア部分の周囲にシェル部分を形成したものが挙げられる。さらに、ブロックコポリマーの分子内及び／又は分子間でジスルフィド結合が形成されたものが挙げられる。
（２）上記（１）のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内への核酸送達デバイス。
（３）ポリエチレングリコール部分および末端がチオール基の側鎖を有するポリカチオン部分を構成成分とするブロックコポリマーを含む、細胞内への核酸送達用キット。
本発明のキットとしては、例えば、上記（１）のポリイオンコンプレックスを含むものが挙げられる。
（４）上記（１）のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、癌治療用の医薬組成物。
（５）上記（４）の医薬組成物を有効成分として含むことを特徴とする、癌の遺伝子治療剤。
（６）上記（４）の医薬組成物又は上記（５）の治療剤を患者に投与することを含む、癌の治療方法。
（７）癌の治療用の（好ましくは、癌の遺伝子治療用の）上記（１）のポリイオンコンプレックス。
（８）癌を治療するための医薬の製造のための上記（１）のポリイオンコンプレックスの使用。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明のポリイオンコンプレックスの構造を示す概略図である。
図２は、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）の化学構造式およびＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）のその１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。構造式中の「／」の表記は、その左右に示された合計（ｍ＋ｎ）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを意味する。
図３は、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルに関し、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）及びｓｉＲＮＡの混合比（Ｎ／Ｐ）と、散乱光強度との関係を示すグラフである。
図４は、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
図５は、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの粒度分布を示す図である。
図６は、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルのζ−電位を示す図である。
図７は、イオン強度変化（ＮａＣｌ濃度変化）に対する、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの構造安定性を示すグラフである。
図８は、Ｈｕｈ７細胞へのｓｉＲＮＡトランスフェクション効率に対する、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）の影響を示すグラフである。
図９は、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡを内包したジスルフィド架橋高分子ミセルのマウス血中滞留性評価の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０００５】
１    ブロックコポリマー
２    ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分
３    ポリカチオン部分
４    ｓｉＲＮＡ
５    ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−３１５７５３号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
本発明者は、ｓｉＲＮＡを内包した高分子ミセル複合体（ポリイオンコンプレックス）を形成するにあたり、該ポリイオンコンプレックスの単分散性及び構造安定性を改善するためには、ｓｉＲＮＡのキャリアとなる高分子ブロックコポリマー（ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロックコポリマー）の改良が必要であると考え、種々の検討を行った。
そこで本発明者は、ポリカチオン部分の側鎖末端にチオール基（−ＳＨ基）が導入されたブロックコポリマーを用いて、ｓｉＲＮＡ内包ポリイオンコンプレックスを調製した。具体的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリリシン（ＰＬｙｓ）からなる高分子ブロックコポリマーの一級アミンに、−ＳＨ基を含有する１−イミノ−４−メルカプトブチル基を導入したブロックコポリマー（以下、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋））を用いて、ｓｉＲＮＡ内包ポリイオンコンプレックスを調製した。
その結果、ポリアニオンであるｓｉＲＮＡを安定に内包したナノメートルスケールの構造体で、単分散性及び構造安定性に非常に優れた、コア−シェル型の構造を有するミセル状のポリイオンコンプレックスの形成に成功した（図１参照）。
また、得られたｓｉＲＮＡ内包ポリイオンコンプレックスは、ポリカチオン部分の側鎖末端のチオール基（−ＳＨ基）が互いに反応することで、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合による架橋構造を形成することができる。この結合により、ポリイオンコンプレックスを構成する前記ブロックコポリマー同士の会合性が強められ、ｓｉＲＮＡのような塩基長の短い分子であっても安定した内包状態を保つことができ、結果としてミセル構造の安定化を効果的に図ることができる。しかも、ジスルフィド結合による架橋構造は、細胞内外の環境変化に応じて安定性が変化するため、これを利用して細胞への高いｓｉＲＮＡ送達能を達成することができる。つまり、ジスルフィド結合は、還元的環境下において容易に開裂する結合であるが、細胞外と細胞内とではグルタチオンの濃度差による酸化還元環境の違いがある。具体的には、細胞外では非還元的環境であり（約１０μＭ）、細胞内では還元的環境である（約１０ｍＭ）。そのため、本発明のポリイオンコンプレックスは、標的細胞に取り込まれた後、架橋構造による安定化が解かれることで、内包物であるｓｉＲＮＡを標的細胞内にスムーズかつ効率的に放出することができ、ＲＮＡｉによる遺伝子発現の抑制効率（ノックダウン効率）等を飛躍的に向上させ得る。
以上のように、本発明のポリイオンコンプレックスは、生理的環境にて易分解性の不安定な化学種であるｓｉＲＮＡを、標的細胞内に導入するまで極めて安定な状態で保持することができ、しかも、細胞外から細胞内への環境変化に応答して効率的にｓｉＲＮＡを放出する（細胞内に導入する）ことができるインテリジェントベクターとして、極めて有用性の高いものである。
本発明のポリイオンコンプレックスに用いるブロックコポリマーは、本発明者らによる既報の文献（Ｍｉｙａｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．２３５５−２３６１，２００４）に開示されたものである（例えば、ｐ．２３５６スキーム１中の“ＰＥＧ−ＰＬＬ−ＩＭ”で示されるポリマー）。しかし、当該文献は、ｐＤＮＡのキャリアとして有用なブロックコポリマーの報告を目的としたものであり、当該ブロックコポリマーをｓｉＲＮＡのキャリアとして用いることについては開示されていない。すなわち、この文献は、ｐＤＮＡのキャリアとしての有用性を示さない比較対照のポリマーとして、本発明に用いるブロックコポリマーを開示している。また、ｐＤＮＡとｓｉＲＮＡとはいずれも核酸の一種として分類されるものであるが、前述したように、ｐＤＮＡ等のキャリアとして有用な既存のブロックコポリマーを、ｓｉＲＮＡの有用なキャリアとして用いることは困難であった。このような状況の下、本発明者は、当該文献に比較対照として開示されていたブロックコポリマーをｓｉＲＮＡのキャリアとして用いることにより、安定に内包することが極めて困難であったｓｉＲＮＡを十分に実用化が可能なレベルで、ミセル状のポリイオンコンプレックスに内包できることを見出した。しかも、このｓｉＲＮＡ内包ポリイオンコンプレックスが、標的細胞へのｓｉＲＮＡ導入効率が非常に高いものであるなど、ｓｉＲＮＡ送達デバイスとして当業者が予想し得ない格段の効果を有することも見出した。
２．ポリイオンコンプレックス
本発明のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）は、末端にチオール基が導入された側鎖を有するポリカチオン部分を含む特定のブロックコポリマーと、ｓｉＲＮＡとを含むことを特徴とする、ミセル状のｓｉＲＮＡ内包高分子複合体である。
（１）ブロックコポリマー
本発明のＰＩＣを構成するブロックコポリマーは、ＰＥＧ部分及びポリカチオン部分を構成成分として含むブロックコポリマーであって、ポリカチオン部分が、末端にチオール基（−ＳＨ基）が導入された側鎖を有することを特徴とするものである。
ポリカチオン部分において、側鎖の末端に導入された−ＳＨ基は、ポリカチオン部分が有する側鎖のうちの少なくとも一部の側鎖に導入されていればよい。導入率として、例えば、ポリカチオン部分が有する全側鎖のうち、０．２〜１００％の側鎖が末端−ＳＨ基を有するものであることが好ましく、より好ましくは５〜７０％、さらに好ましくは３０〜６５％である。
ＰＥＧ部分及びポリカチオン部分は、上述した末端−ＳＨ基の点を除き、その構造（例えば重合度）は限定されず、任意の構造のものを選択できるが、特に、ポリカチオン部分は、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドであることが好ましい。ここで言うカチオン性基とは、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含む意味である。このようなカチオン性基としては、公知のものが全て含まれる。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、結合後その側鎖がカチオン性基を有するように置換されたものも含む。
本発明において使用し得るブロックコポリマーとしては、例えば、下記一般式（１）で示されるブロックコポリマーが好ましく挙げられる。
2008062909.tif 000003
ここで、一般式（１）の構造式中、繰り返し単位数（重合度）がｋのブロック部分がＰＥＧ部分であり、繰り返し単位数がｍの部分とｎの部分とを合わせたブロック部分（一般式（１）中、［  ］内に示された部分）がポリカチオン部分である。また、ポリカチオン部分における「／」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の配列順序が任意であることを意味する。例えば、Ａ及びＢというモノマー単位から構成されるブロック部分が、［−（Ａ）ａ―／―（Ｂ）ｂ−］と表記されている場合は、ａ個のＡとｂ個のＢとからなる合計（ａ＋ｂ）個の各モノマー単位が、ランダムにどのような並び順で連結していてもよいことを意味する。但し、すべてのＡ及びＢは、直鎖状に連結していることが必要である。
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、同一又は異なって、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。
炭素数１〜１２の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。
またアルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基（各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数１〜６である）等が挙げられる。
置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；−ＣＨＯ）に転化することができる。また置換基（特にＲ１における置換基）がホルミル基、カルボキシル基又はアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体若しくはその断片又はその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質等を結合させることができる。
一般式（１）中、Ｌ１は、ＰＥＧ部分とポリカチオン部分とのリンカー部分であり、ＮＨ、下記一般式（２）：
−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−    （２）
〔式（２）中、ｐ１は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基、又は下記一般式（３）：
−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ３ａ−    （３）
〔式（３）中、Ｌ２ａは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ａは、ＮＨを表す。ｑ１は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基を表す。
一般式（１）中、ｋは、ＰＥＧ部分の繰り返し単位の数（重合度）を表し、具体的には、１００〜５００（好ましくは２００〜３００）の整数を表す。
また、ポリカチオン部分を構成する各モノマー単位の重合度については、ｍが０〜４９９（好ましくは０〜１００、より好ましくは２０〜１００、さらに好ましくは３０〜１００、特に好ましくは３０〜７０）の整数を表し、ｎが１〜５００（好ましくは１〜１００、より好ましくは５〜１００、さらに好ましくは５〜５０、特に好ましくは１０〜５０）の整数を表す。但し、ｍ＋ｎは、１０〜５００（好ましくは１０〜２００、より好ましくは２０〜１５０、さらに好ましくは３０〜１２０、さらに好ましくは３０〜１００、さらにより好ましくは４０〜１００、特に好ましくは４０〜７０）である。
さらに、ポリカチオン部分の側鎖中のメチレン基（−ＣＨ２−）の繰り返し単位数については、ｐは１〜１０（好ましくは３〜４）の整数を表し、ｑは１〜１０（好ましくは３〜４）の整数を表し、ｒは１〜１０（好ましくは２〜４）の整数を表す。
以上より、一般式（１）で示されるポリマーは、以下の２つのブロック部分を必須構成要素とするポリマーであると言える。
・親水性であり生体適合性に優れたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖からなるブロック部分（重合度ｋのブロック部分：ＰＥＧ部分）
・ｓｉＲＮＡと静電結合する側鎖、及び側鎖同士でジスルフィド結合による架橋構造を形成し得る側鎖を有するブロック部分（側鎖にカチオン性基と末端チオール基とを有する重合度ｍ＋ｎのブロック部分：ポリカチオン部分）
一般式（１）で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、１０，０００〜１５０，０００であることが好ましく、より好ましくは１０，０００〜４０，０００である。また、個々のブロック部分については、ＰＥＧ部分の分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、４，４００〜２２，０００であることが好ましく、より好ましくは８，０００〜１５，０００であり、さらに好ましくは１０，０００〜１３，０００、特に好ましくは１０，０００〜１２，０００であり、ポリカチオン部分の分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、２，５００〜１２５，０００であることが好ましく、より好ましくは２，５００〜２５，０００である。
一般式（１）で示されるポリマーの製造方法は、限定はされないが、概略を述べると、例えば、（ａ）Ｒ１とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、（ｂ１）このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ１と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖がカチオン性基を含むように置換若しくは変換するか、又は（ｂ２）上記ＰＥＧセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成してこれらを互いに連結し、その後、（ｃ）カチオン性基を含む側鎖に−ＳＨ基含有化合物を反応させて、側鎖の末端に−ＳＨ基を導入する方法が挙げられる。当該製法において、各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。当該製造方法の具体例としては、後述する実施例に記載の合成スキームを参照することができる。
上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ  ９６／３２４３４号公報、ＷＯ  ９６／３３２３３号公報又はＷＯ  ９７／０６２０２号公報に記載のブロックコポリマーのＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。ＰＥＧセグメントのうち−Ｒ１基と反対側の末端は、一般式（１）において「−Ｌ１」となる部分であり、−ＮＨ２、下記一般式（４）：
−（ＣＨ２）ｐ２−ＮＨ２    （４）
〔式（４）中、ｐ２は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基、又は一般式（５）：
−Ｌ２ｂ−（ＣＨ２）ｑ２−Ｌ３ｂ    （５）
〔式（５）中、Ｌ２ｂは、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｌ３ｂは、ＮＨ２を表す。ｑ２は１〜５（好ましくは２〜３）の整数を表す。〕
で示される基であることが好ましい。
（２）内包する核酸
本発明のＰＩＣにおいて、コア部分の構成成分として内包する核酸は、１つの態様ではｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）利用して目的の遺伝子の発現を抑制し得るものであればよく、例えば、目的遺伝子としては、癌（腫瘍）遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましく挙げられる。また、ｓｉＲＮＡの塩基長は、通常、３０塩基未満（好ましくは１９〜２１塩基）であればよく、限定はされない。
但し、本発明においては、内包する核酸はｓｉＲＮＡのみには限定されず、必要に応じて、他の核酸、例えばプラスミドＤＮＡ及びアンチセンスオリゴＤＮＡ、デコイ核酸（二重鎖ＤＮＡ）、各種ＲＮＡ、並びに化学修飾核酸及び非天然型核酸類縁体（例えばＰＮＡ（ペプチド核酸））を内包することもできる。
ｓｉＲＮＡ等の核酸分子はポリアニオンとなるため、前記ブロックコポリマーのポリカチオン部分の側鎖と、静電的相互作用により結合（会合）することができる。
本発明では、必要に応じて、上記ｓｉＲＮＡ等と共に、生理活性タンパク質や各種ペプチドなど、細胞内で機能発現する様々な物質をコア部分に含有させることもできる。
また、本発明のＰＩＣの他の一態様においては、コア部分の構成成分として、さらに高分子量又は低分子量の「アニオン性物質」を用いることができ、例えば、ウイルス粒子、ペプチドホルモン、タンパク質、酵素等の高分子物質、あるいは分子内に荷電性官能基を有する低分子物質（水溶性化合物）等が挙げられる。当該アニオン性物質としては、複数の異なる帯電状態の官能基（アニオン性基及びカチオン性基）を有する分子について、ｐＨを変化させることにより分子全体としての帯電状態をアニオン性に変化させることができるものも含まれる。これらアニオン性物質は、１種のみ用いてもよいし２種以上を併用してもよく、限定はされない。
（３）ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）
本発明のＰＩＣは、ｓｉＲＮＡと前記ブロックコポリマー中の一部（ポリカチオン部分）とが相互作用してイオンコンプレックスとなるコア部分を形成し、当該ブロックコポリマー中の他の部分（ＰＥＧ部分を含む部分）がコア部分の周囲にシェル部分を形成した状態の、コア−シェル型のミセル状複合体ということができる（図１参照）。
本発明のＰＩＣは、例えば、ｓｉＲＮＡとブロックコポリマーとを任意のバッファー（例えばＴｒｉｓバッファー等）中で混合することにより容易に調製することができるが、ブロックコポリマーとｓｉＲＮＡとの静電結合の前に、ブロックコポリマーのみがジスルフィド結合をして凝集等しないよう、十分な還元条件下で行うことが好ましい。還元条件は、例えばＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等を添加することにより調整することができる。
さらに、本発明のＰＩＣは、ブロックコポリマーとｓｉＲＮＡとの静電結合後（ミセル構造の形成後）、ＤＭＳＯ等の添加により酸化条件下とすることで、ブロックコポリマー中の−ＳＨ基どうしを反応させ、ブロックコポリマーの分子内及び／又は分子間においてジスルフィド架橋構造を形成することができる。この架橋構造により、ｓｉＲＮＡの内包状態及びミセル構造の一層の安定化を図ることができる。
ブロックコポリマーとｓｉＲＮＡとの混合比は、限定はされないが、例えば、ブロックコポリマー中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（Ｎ）と、ｓｉＲＮＡ中のリン酸基の総数（Ｐ）との比（Ｎ／Ｐ比）が、０．５〜１００であることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０、さらに好ましくは１〜１０、さらにより好ましくは１〜４、特に好ましくは１〜２である。ブロックコポリマーが一般式（１）のコポリマーである場合のＮ／Ｐ比も、上記と同様に０．５〜１０であることが好ましく、より好ましくは０．５〜４、さらに好ましくは１〜２である（この場合のＮは、ポリカチオン部分の側鎖に含まれる１級アミンと２級アミンの合計数である。）。Ｎ／Ｐ比が上記範囲のときは、遊離のポリマーが存在せず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高い発現効率が得られる等の点で好ましい。なお、上記カチオン性基（Ｎ）は、内包する核酸中のリン酸基と静電的に相互作用してイオン結合を形成することができる基を意味する。
本発明のＰＩＣの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法（ＤＬＳ）による粒径が３０〜１５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは５０〜１００ｎｍである。
３．核酸送達デバイス
本発明においては、上述したポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を含む核酸送達デバイスが提供される。本発明の送達デバイスは、標的細胞内へ安定したまま送達することが困難であったｓｉＲＮＡを、容易に安定化状態にすることができるため、少ないｓｉＲＮＡ使用量であっても十分にＲＮＡｉ等の効果を得ることができる。また、細胞内外の酸化還元環境の変化を利用し、ＰＩＣのコア部分に内包した所望のｓｉＲＮＡを標的細胞内に効率的に導入する手段としても使用できる。
例えば、所望のｓｉＲＮＡを内包したＰＩＣを含む溶液を被験動物に投与して、体内の標的細胞に取り込ませる。その後、細胞内に取り込まれたＰＩＣがエンドソームから細胞質に移行する。ブロックコポリマー間でジスルフィド結合が形成されていた場合は、細胞質内の還元的環境に応答して、当該結合が開裂し、その結果、ＰＩＣに内包されているｓｉＲＮＡと細胞内に存在するポリアニオンとの置換が促進され、ＰＩＣが解離することにより、所望のｓｉＲＮＡを細胞質内に放出することができる。
本発明の送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。
本発明の送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望のｓｉＲＮＡを導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。よって本発明は、前述したＰＩＣを含む各種疾患の治療用の医薬組成物、当該医薬組成物を有効成分として含む各種疾患用の遺伝子治療剤、及び、前述したＰＩＣを用いる各種疾患の治療方法（特に遺伝子治療方法）を提供することもできる。投与の方法及び条件は前記と同様である。また、各種疾患としては、例えば、癌（例えば、肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞腫及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患、及び中枢系疾患等が挙げられる。
上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
４．核酸送達用キット
本発明の核酸送達用キットは、前記特定のブロックコポリマー又は本発明のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば癌細胞等の各種標的細胞に対してｓｉＲＮＡを導入する、ＲＮＡｉを利用した遺伝子治療に好ましく用いることができる。
本発明のキットにおいて、ブロックコポリマーの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のキットは、前記特定のブロックコポリマー以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、細胞内に導入するｓｉＲＮＡ、溶解用又は希釈用等の各種バッファー、溶解用バッファー、各種タンパク質、及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができる。
本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望のｓｉＲＮＡをコア部分としたポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を調製するために使用され、調製したＰＩＣは、標的細胞へのｓｉＲＮＡ送達デバイスとして有効に用いることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
＜材料＞
以下に、本実施例で用いた化合物及び装置等の名称及び略称並びに入手元等を記載した。
ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン（Ｌｙｓ（Ｚ））（シグマ−アルドリッチ）
ｎ−ヘキサンテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（和光純薬工業）
トリホスゲン（東京化成工業）
α−メトキシ−ω−アミノ−ポリエチレングリコール（分子量１２，０００）（日本油脂）
クロロホルム（和光純薬工業）
ジエチルエーテル（昭和エーテル）
ベンゼン（和光純薬工業）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（和光純薬工業）
トリフルオロ酢酸（和光純薬工業）
３０％ＨＢｒ／ＣＨ３ＣＯＯＨ（東京化成工業）
塩化リチウム（和光純薬工業）
Ｎ−メチルピロリジドン（ＮＭＰ）（シグマ−アルドリッチ）
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（和光純薬工業）
２−イミノチオラン（和光純薬工業）
０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬工業）
ＩＲ−Ｒｅｐｏｒｔ  １００（日本分光）
ＮＭＲ  ＥＸ４００ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（日本電子）
ＨＬＣ−８８２０  ＧＰＣ（東ソー）
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ＤＯＪＩＮＤＯ）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬工業）
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業）
ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマ−アルドリッチ）
ｓｉＲＮＡ（２１ｂｐ（二本鎖）：配列番号１，２）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）
センス鎖：５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）
Ｍｉｎｉ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｋｉｔ（分画分子量（ＭＷＣＯ）＝１，０００）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）
＜方法＞
１．Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｎ−カルボキシ無水物（Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡ）の合成
Ｌｙｓ（Ｚ）２５ｇを一晩減圧乾燥させ、アルゴン雰囲気下でＴＨＦ２００ｍＬを加え、Ｌｙｓ（Ｚ）を懸濁した。Ｌｙｓ（Ｚ）に対し１．３倍当量のホスゲンとなるようにトリホスゲン／ＴＨＦ溶液を加え、５０℃で溶液が無色透明になるまで反応を行った。反応終了後、貧溶媒であるｎ−ヘキサン７５０ｍＬに、Ａｒ下でこの溶液を滴下して再沈し、−２０℃で静置した。その後、上澄みは除去し、減圧乾燥した。Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡは再度ＴＨＦに溶解させ、ヘキサンを少量の結晶が析出するまで加え、−２０℃で一晩静置した。結晶と上澄みは分離し、Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡの結晶は再び再結晶させた後、減圧乾燥して回収した。上澄みに関しては、同様に再結晶操作を繰り返した後、Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡの結晶を得た。
２．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の精製
片末端に一級アミノ基を有するα−メトキシ−ω−アミノ−ポリエチレングリコール（分子量１２，０００）に、その３倍量に相当するクロロホルムを加えて溶解させた。次いで、この溶解物を、貧溶媒である０℃のジエチルエーテル（クロロホルムに対し２０倍量）に滴下して、再沈を行い、吸引濾過により沈殿物を回収した。その後、回収した沈殿物にベンゼンを加えて溶解させ、凍結乾燥を行い、ＰＥＧを回収した。
３．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）の合成
アルゴン雰囲気下で精製したＰＥＧと合成したＬｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡにそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＦを加えて溶解させ、ＰＥＧ溶液をＬｙｓ（Ｚ）−ＮＣＡ溶液に加え、４０℃で反応させた。ＩＲ測定により、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）の酸無水環に由来する９１０ｃｍ−１（Ｃ−Ｏ伸縮）、１，７８０ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ伸縮）、１，８５０ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ伸縮）の吸収ピークの消失を確認し、反応を終了した。反応終了後、エバポレーターにより４０℃でＤＭＦを蒸発させた。蒸発後の残存物にクロロホルムを加えて溶解させ、０℃のジエチルエーテルにより再沈を行い、吸引濾過により沈殿物を回収した。その後、回収した沈殿物を減圧乾燥し、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）を回収した。得られたＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）のポリマー構造は、１Ｈ−ＮＭＲ及びゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）の測定により確認した。
４．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）の脱保護
合成したＰＥＧ−ＰＬｙｓ（Ｚ）にトリフルオロ酢酸を加えて溶解させた後、３０％ＨＢｒ／ＣＨ３ＣＯＯＨを加え、４時間反応させた。反応終了後、０℃のジエチルエーテルにより、再沈及び洗浄を２回行った。ジエチルエーテルを除去し、得られたポリマーに純水を加えて溶解させ、２００倍量の純水に対して透析（ＭＷＣＯ＝１，０００の透析膜を使用）を行い、塩を除去した。透析終了後、凍結乾燥し、ポリマーを回収した。１Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、保護基であるＺ基に由来するピークの消失により、脱保護の終了を確認した。
５．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）の合成
アルゴン雰囲気下で塩化リチウム５ｇにＮＭＰを１００ｍＬ加えて、塩化リチウムを溶解させた。脱保護したＰＥＧ−ＰＬｙｓにこのＮＭＰを加えて溶解させ、ＤＩＥＡを加えてＰＥＧ−ＰＬｙｓを脱プロトン化し、２−イミノチオランを加えてから遮光し、４８時間反応させた。アルゴンバブリングにより酸素を除去したジエチルエーテルにより、再沈及び洗浄を２回行った。ジエチルエーテルを除去し、得られたポリマーに０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加えて溶解させ、１００倍量の純水に対して透析（ＭＷＣＯ＝２，０００の透析膜を使用）を行い、塩を除去した。透析終了後、凍結乾燥し、ポリマーを回収した。１Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、新たに生じた導入基由来のピークからチオール基の導入率を算出した。
６．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡ混合溶液の散乱光強度測定
ｓｉＲＮＡ（配列番号１，２）を１５μＭとなるよう１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．４に溶解した。使用したｓｉＲＮＡは、ルシフェラーゼ（Ｐｐ−Ｌｕｃ）の遺伝子発現をＲＮＡｉにより抑制し得るものである。同じくＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）も１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．４に溶解した。続いて、ｓｉＲＮＡ溶液に１／２体積のＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）溶液を目的とするＮ／Ｐ比（＋／−  ｃｈａｒｇｅ  ｒａｔｉｏ）となる濃度にて混合し、２５℃に２４時間静置した後、ゼータサイザーにより散乱光強度測定を行った。
７．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡ混合物のポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｎ／Ｐ比を変えて形成したＰＥＧ／ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡ混合物について２０％ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ（非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ染色及びＵＶトランスイルミネーターにより、遊離のｓｉＲＮＡを検出した。
８．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの調製
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）およびｓｉＲＮＡともに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）に溶解してストック溶液とした。続いて、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）に大過剰量のＤＴＴを加えてチオール基を還元状態とし、電荷的に中性付近となる混合比（Ｎ／Ｐ＝１〜２）にてｓｉＲＮＡと混合した。２５℃にて２４時間静置した後、Ｍｉｎｉ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｋｉｔを用いて透析を行いてＤＴＴを除くとともに、酸化剤として外液に０．５％ＤＭＳＯを添加することでジスルフィド架橋形成処理を施した。ジスルフィド架橋の形成は、遊離のチオール基の定量法であるＥｌｌｍａｎ法により確認した。
９．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの粒度分布の測定
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加し、３７℃にてゼータサイザーにより動的光散乱測定を行った。
１０．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルのζ−電位測定
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加し、３７℃にてゼータサイザーによりζ−電位測定を行った。
１１．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの安定性評価
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルに０〜６００ｍＭ  ＮａＣｌを添加して、３７℃で２４時間静置し、ゼータサイザーを用いて散乱光強度測定を行った。
１２．培養細胞へのｓｉＲＮＡトランスフェクション
Ｈｕｈ７細胞（ヒト肝癌由来細胞）を１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ、５％ＣＯ２、３７℃にて培養し、播種から２０時間後にｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（ホタルルシフェラーゼ発現ベクター）及びｐＲＬ−ＣＭＶ（ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＴＭにより導入した。続いて、当該導入から４時間後に培地交換を行い、ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを内包したＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルを培地に添加した。ミセルの添加から４８時間後にＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ及びプレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０）により、ルシフェラーゼの定量を行った。
＜結果・考察＞
１．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）の合成
下記の合成スキームに則り、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）を合成した。ＰＥＧ−ＰＬｙｓのリシン残基の重合度は３７であり、ＰＥＧ−ＰＬｙｓと２−イミノチオランの反応比を変化させることで、１−イミノ−４−メルカプトブチル基の導入率が異なる複数のＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）を得た。ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）中のＰＬｙｓ（ＳＨ＋）部分（すなわちポリカチオン部分）を構成するモノマー単位の組成は、図２に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積分比より算出された。
以下、本明細書及び図面では、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）の組成を、一般に１２−（ｍ＋ｎ）−（ｎ）と示す。ここで、１２は、ＰＥＧ部分の存在を表しており分子量１２，０００のＰＥＧ（ＰＥＧ１２，０００）の略記である。ｍは、ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）部分におけるＬｙｓ残基（−ＳＨ基の導入無し）の重合度を表し、ｎは、ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）部分における１−イミノ−４−メルカプトブチル基（−ＳＨ基含有）が導入されたＬｙｓ残基の重合度を表す。なお、下記の合成スキームに示す化学構造式中の「／」の表記は、その左右に示された合計（ｍ＋ｎ）個の各モノマー単位の配列順序が任意であることを意味する。
2008062909.tif 000004
２．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）とｓｉＲＮＡの混合比の検討
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）とｓｉＲＮＡとによる高分子ミセル形成条件を検討するべく、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）とｓｉＲＮＡとの混合比を変えて形成したＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡ溶液の散乱光強度測定を行った。
その結果、電荷的に中性付近となるＮ／Ｐ＝１〜２において分子量の大きな会合体の存在を示す強い散乱光が得られた（図３）。この会合体はｓｉＲＮＡを内包した高分子ミセルであると考えられた。
３．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）とｓｉＲＮＡの混合比を変えて形成した複合体についてＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥを行った。
その結果、Ｎ／Ｐを上げるにつれて遊離のｓｉＲＮＡは検出されなくなった（図４）。この結果は、図３の結果から推定された分子量の大きな会合体には、ｓｉＲＮＡが含まれることを示すものである。
４．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの粒度分布
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）とｓｉＲＮＡとが会合体を形成する条件にてジスルフィド架橋形成処理を施し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加して動的光散乱測定を行った。
ＰＥＧ−ＰＬｙｓから形成される会合体は単分散とはならなかったが、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）では粒径が９０ｎｍ以下の単分散な粒度分布が観測された（図５）。
５．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルのζ−電位測定
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）とｓｉＲＮＡとから形成される会合体に１５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加してζ−電位測定を行った。
その結果、各々の会合体のζ−電位はほぼ０ｍＶであった（図６）。通常、総電荷が中性となるように形成されたポリイオンコンプレックスは、静電反発を失い凝集体を形成すると考えられている。しかし、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡ会合体は、ζ−電位が中性であるにも関わらず、長時間静置しても凝集体が形成されなかった。
以上、図３〜図６に示される結果は、ｓｉＲＮＡを内包しその表層がＰＥＧに覆われた高分子ミセルの形成を示している。
６．ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの安定性評価
ジスルフィド架橋による安定化効果を検証するために、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルの分散媒イオン強度を変化させて、散乱光強度を測定した。通常、ポリイオンコンプレックスはイオン強度の増大に伴い解離して散乱光強度は減少する。
本実施例においても、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ／ｓｉＲＮＡ会合体は、分散媒のイオン強度に伴い会合体の解離が観察された（図７）。しかし、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／ｓｉＲＮＡミセルは極めて安定であり、特に、生理的条件である１５０ｍＭ  ＮａＣｌ程度までは、会合体にはほとんど変化が無く高い構造安定性を有し、極めて実用性に優れたものであることが示された（図７）。
７．培養細胞へのｓｉＲＮＡトランスフェクション
２種類のルシフェラーゼ（Ｐｐ−Ｌｕｃ及びＲｒ−Ｌｕｃ）を発現するＨｕｈ７細胞（ヒト肝癌由来細胞）に、一方のルシフェラーゼ（Ｐｐ−Ｌｕｃ）に対するｓｉＲＮＡを内包した高分子ミセルを与えて遺伝子発現抑制効果を評価した。
その結果、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）への１−イミノ−４−メルカプトブチル基導入率を上げるに伴い、遺伝子発現抑制効果、すなわちｓｉＲＮＡ送達能が顕著に向上した（図８）。５０％ノックダウンを達成するｓｉＲＮＡ濃度で比較した場合、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）（具体的には１２−６８−４４）を用いたときのｓｉＲＮＡ送達能は、最大でＰＥＧ−ＰＬｙｓ（具体的には１２−３７−０）を用いたときの約１０００倍であった（図８）。
【実施例２】
【０００８】
「ｓｉＲＮＡ内包ジスルフィド架橋高分子ミセルの血中滞留性の評価」
蛍光標識ｓｉＲＮＡ（Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）を内包したジスルフィド架橋高分子ミセルを調製し、マウス尾静脈より投与して、その血中滞留性（血中安定性）を評価した。
＜方法＞
実施例１で用いたｓｉＲＮＡ（二本鎖；配列番号１及び２）と同様のｓｉＲＮＡを、常法により、Ｃｙ３で蛍光標識した（Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）。次いで、このＣｙ３−ｓｉＲＮＡを内包したジスルフィド架橋高分子ミセル（ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡミセル）を調製した。ここで、当該ミセルの調製は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。なお、本実施例では、当該ミセルの調製に用いるＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）として、１−イミノ−４−メルカプトブチル基の導入率（置換基導入率；％ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が、１４％、４９％、６８％及び９７％のものをそれぞれ使用し、架橋度の異なる４種類のミセルを調製した。なお、対照として、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（Ｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡ：ミセルに内包されていないもの）、及び上記置換基導入率が０％のＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）（すなわちＰＥＧ−ＰＬｙｓ）を用いたＣｙ３−ｓｉＲＮＡ内包高分子ミセルも調製した。
ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡミセルのマウスへの投与は、マウスの体重に対するｓｉＲＮＡ量が１ｍｇ／ｋｇとなるように、マウス（Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、８〜１０週齢、メス）の尾静脈より投与した。前記対照についても同様に投与を行った。
投与から７．５分後に、マウスの下大静脈から全血を回収し、遠心（２０００ｇ、１０分、４℃）により血漿を分離した。分離した血漿に、１０ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ及び０．００２ｗ／ｖ％ポリビニル硫酸を添加して、当該ジスルフィド架橋ミセルを破壊し、その後、蛍光プレートリーダーによりＣｙ３の蛍光（励起波長：５４４ｎｍ、蛍光波長：５９０ｎｍ）を測定した。
＜結果・考察＞
図９に示すように、Ｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡは、尾静脈投与後わずか７．５分にして、投与量の９５％が血流中から失われた。また、ジスルフィド架橋無しのミセル（前記置換基導入率：０％）を用いてｓｉＲＮＡを投与した場合も、血中滞留性の向上効果は特に認められなかった。これらに対し、ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）を用いてジスルフィド架橋高分子ミセルに内包したｓｉＲＮＡは、置換基導入率の上昇に伴い、血中滞留性の向上が認められた。特に、置換基導入率が９７％のＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）を用いたＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＳＨ＋）／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡミセルを投与した場合は、血流中からの消失量が５０％以下にまで抑制された。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、単分散性及び構造安定性が高く、かつ細胞へのｓｉＲＮＡ送達能に優れた、ｓｉＲＮＡ内包高分子ミセル複合体（ポリイオンコンプレックス）を提供することができる。さらに本発明によれば、当該ポリイオンコンプレックスを用いた核酸送達デバイス、核酸送達用キット、医薬組成物及び遺伝子治療剤を提供することができる。
本発明のポリイオンコンプレックスは、生理的環境下で易分解性の不安定な化学種であるｓｉＲＮＡを、標的細胞に到達するまでの間、極めて安定な状態で保持することができる。そのため、本発明のポリイオンコンプレックスは、例えばノックアウト動物の作製や各種疾患の遺伝子治療など、研究及び臨床のいずれの分野においても極めて実用性の高いものである。
また、本発明のポリイオンコンプレックスは、ポリカチオン部分の側鎖末端のチオール基が互いに反応してジスルフィド結合を形成し、ポリイオンコンプレックスの構造をより一層安定化することができるものである。このジスルフィド結合は、ポリイオンコンプレックスが細胞内に導入（送達）された後、グルタチオン濃度の上昇に応じて開裂し得る。そのため、本発明のポリイオンコンプレックスは、環境応答的にｓｉＲＮＡを細胞内に放出するｓｉＲＮＡ送達デバイスとして、極めて有用性の高いものである。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号１：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号２：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図４】
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【国際調査報告】
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