(57)【要約】  １−（２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシルは抗ＥＢウイルス活性を発揮し、ＥＢウイルス関連疾患の予防もしくは治療剤として有効である。ＴＫ欠損細胞に、ＥＢウイルス−ＴＫとヒトＴＫを発現するプラスミドをそれぞれ導入し、それぞれのプラスミドが導入された２種類の細胞を用いて、ＥＢウイルス−ＴＫを発現するプラスミドを導入した細胞では細胞毒性を示し、ヒトＴＫを導入した細胞では毒性を示さない薬剤をスクリーニングすることにより、抗ＥＢウイルス活性を特異的に発揮する薬剤をスクリーニングすることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−（２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル、その塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する抗エプスタイン・バール（ＥＢ）ウイルス剤。
【請求項２】
１−（２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル、その塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する、ＥＢウイルス関連疾患の予防もしくは治療剤。
【請求項３】
ＥＢウイルス関連疾患が、ＥＢウイルスによって引き起こされる腫瘍または急性もしくは慢性ＥＢウイルス感染症である請求項２の予防もしくは治療剤。
【請求項４】
チミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損細胞に、ＥＢウイルス−ＴＫとヒトＴＫを発現するプラスミドをそれぞれ導入し、それぞれのプラスミドが導入された２種類の細胞を用いて、ＥＢウイルス−ＴＫを発現するプラスミドを導入した細胞では細胞毒性を示し、ヒトＴＫを発現するプラスミドを導入した細胞では毒性を示さない薬剤をスクリーニングする、抗ＥＢウイルス活性を発揮する薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗エプスタイン・バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）剤及びＥＢウイルス関連疾患に対する薬剤並びに該薬剤の効果的なスクリーニング法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高率ではないものの、ＥＢウイルスは、Ｂリンパ腫、上咽頭がん、胃がん等さまざまな腫瘍を引き起こすと考えられている。このような腫瘍に対し、手術適応とならない場合の治療法としては、一般的な抗がん剤の投与が行われているが、必ずしも効果的な治療法とはなっていない。また、抗ウイルス剤であるガンシクロビルが治療薬の候補として報告されているが（非特許文献１）、効果が弱く実用には至っていない。
さらに、近縁ウイルスである単純ヘルペスウイルスのチミジンリン酸化酵素（チミジンキナーゼ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＴＫ）を用いた実験室内遺伝子治療法も試みられているが、患者への応用には至っていない。【０００３】
他方、１−（２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシルは、ヘルペスウイルス等に弱い抗ウイルス活性を有する化合物として知られているが（非特許文献２、特許文献１および特許文献２）、当該化合物のＥＢウイルスに対する抗ウイルス活性や、ＥＢウイルスによって引き起こされる腫瘍に対する効果については全く知られていない。
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２００１；４５（７）：２０８２−９１
【非特許文献２】Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  １９９８；３９（２）：１２９−３７
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ９１／０４９８２
【特許文献２】特開平１０−８７６８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明は、抗ＥＢウイルス剤及びＥＢウイルス関連疾患に対して顕著な効果を有する薬剤を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来、ＥＢウイルス関連疾患に対する薬剤を見出す効果的なスクリーニングする方法は報告されていない。したがって、本発明者らは、最初に、効果的なスクリーニング法を確立し、当該スクリーニング法を用いてＥＢウイルス関連疾患に対して顕著な効果を有する薬剤を見出すことを試みた。その結果、腫瘍細胞中に存在するＥＢウイルス由来のＴＫを利用し、当該ＴＫによって特異的にリン酸化されて細胞に対し毒性を示す薬剤のスクリーニング法を確立し、当該スクリーニング法を用いて種々の化合物をスクリーニングした結果、１−（２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシルが、抗ＥＢウイルス活性及びＥＢウイルス関連疾患に対して顕著な効果を示すことを見出した。【０００６】
したがって、本発明は、このような知見を基に完成したものであり、以下の〔１〕から〔４〕の通りである。
［１］  １−（２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル、その塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する抗エプスタイン・バール（ＥＢ）ウイルス剤。
［２］  １−（２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル、その塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する、ＥＢウイルス関連疾患の予防もしくは治療剤。
［３］  ＥＢウイルス関連疾患が、ＥＢウイルスによって引き起こされる腫瘍または急性もしくは慢性ＥＢウイルス感染症である上記［２］の予防もしくは治療剤。
［４］  チミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損細胞に、ＥＢウイルス−ＴＫとヒトＴＫを発現するプラスミドをそれぞれ導入し、それぞれのプラスミドが導入された２種類の細胞を用いて、ＥＢウイルス−ＴＫを発現するプラスミドを導入した細胞では細胞毒性を示し、ヒトＴＫを発現するプラスミドを導入した細胞では毒性を示さない薬剤をスクリーニングする、抗ＥＢウイルス活性を発揮する薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の薬剤は、ＥＢウイルス−ＴＫが発現している細胞のみに細胞毒性を示し、ヒトＴＫが発現している細胞には毒性を示さないことから、抗ＥＢウイルス効果及びＥＢウイルス関連疾患に対する予防および治療効果と副作用の低減が期待でき、ＥＢウイルスによって引き起こされる疾患、例えばＥＢウイルスの急性又は慢性感染症、ＥＢウイルスによって引き起こされる悪性腫瘍等の予防・治療薬として有用である。【０００８】
また、本発明のスクリーニング方法は、ＥＢウイルス由来のＴＫを利用し、当該ＴＫによって特異的にリン酸化されて細胞に対し毒性を示す薬剤をスクリーニングすることが可能であることから、抗ＥＢウイルス活性を発揮する薬剤をスクリーニングする方法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、最初に本発明のスクリーニング方法を説明し、次ぎに当該スクリーニング方法により選択された本発明の薬剤を説明する。【００１０】
（１）本発明のスクリーニング方法
本発明の方法は、前述したように、ＴＫ欠損細胞に、ＥＢウイルス−ＴＫとヒトＴＫを発現するプラスミドをそれぞれ導入し、それぞれのプラスミドが導入された２種類の細胞を用いて、ＥＢウイルス−ＴＫを発現するプラスミドを導入した細胞では細胞毒性を示し、ヒトＴＫを発現するプラスミドを導入した細胞では毒性を示さない薬剤をスクリーニングする方法に関する。【００１１】
ＴＫ欠損細胞としては、ＴＫ欠損ヒト腫瘍細胞が好ましく、例えばＴＫ欠損ヒト骨肉腫細胞（１４３Ｂ）等を例示することができる。このような細胞は、ＡＴＣＣ等から購入することができ、例示した１４３Ｂ細胞はＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８３０３として登録されている。【００１２】
ＥＢウイルス−ＴＫ又はヒトＴＫを発現するプラスミドベクターとしては、図１に示すように、セレクションのための適当な抗生物質耐性を有し、プロモーターの下流にＥＢウイルス−ＴＫ又はヒトＴＫをコードする遺伝子を発現可能な状態で連結したプラスミドを例示することができる。【００１３】
ＥＢウイルス−ＴＫ及びヒトＴＫをコードする遺伝子は、既にクローニングされており、その塩基配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースを用いて検索可能である。このため、ＮＣＢＩのデータベース情報を基にＥＢウイルス−ＴＫ及びヒトＴＫをコードする遺伝子を常法により調製することができる。【００１４】
次ぎに、上記調製したＴＫ遺伝子を、適当な抗生物質耐性を有し、たとえばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターとターミネーターを有するプラスミド、具体的には、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のプラスミド、ｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒのプロモーターの下流のマルチクローニングリージョンに、ＥＢウイルス−ＴＫ又はヒトＴＫをコードする遺伝子を発現可能な状態になるように、常法により連結する。【００１５】
調製したプラスミドベクターを、上記ＴＫ欠損細胞に遺伝子導入する。遺伝子導入は、常法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８７  Ｎｏｖ；８４（２１）：７４１３−７）に従って行うことが可能である。【００１６】
このようにして調製したＥＢウイルス−ＴＫとヒトＴＫのそれぞれの遺伝子が導入された２種類の細胞を用いて、ＥＢウイルス−ＴＫを導入した細胞では細胞毒性を示し、ヒトＴＫを導入した細胞では毒性を示さない薬剤をスクリーニングすることで、抗ＥＢウイルス活性を発揮する薬剤をスクリーニングすることが可能である。特に、被検薬剤の細胞生存率を５０％に抑制するそれぞれの濃度（ＣＣ５０）を出し、その比を選択係数（ＳＩ）として求めることで、薬剤の選択的毒性を数値で表すことが可能である。【００１７】
（２）本発明薬剤
本発明薬剤の有効成分は、１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（別名：１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）チミン）である。この化合物は、公知化合物であり、文献公知の方法あるいはそれを応用した方法で調製可能である（非特許文献２、特許文献１または特許文献２など参照）。この化合物は、塩、水和物または溶媒和物の形態であってもよい。そのような塩としては、塩酸塩または硫酸塩などの酸付加物が例示される。また、水和物または溶媒和物としては、上記化合物またはその塩１分子に対し、０．１〜３．０分子の水または溶媒が付着したものを例示することができる。さらに、互変異性体などの各種異性体も上記化合物に包含されうる。【００１８】
本発明薬剤は、抗ＥＢウイルス剤、ＥＢウイルス関連疾患の予防もしくは治療剤として有効である。ＥＢウイルス関連疾患としては、ＥＢウイルスによって引き起こされる腫瘍または急性もしくは慢性ＥＢウイルス感染症が挙げられ、ＥＢウイルスによって引き起こされる腫瘍としては、例えば、Ｂリンパ腫、上咽頭がん、胃がん等が挙げられる。
本発明薬剤の投与量は、患者の年齢、体重、疾病、患者の重篤度、薬物による忍容性、投与方法などにより異なり、これらの条件を総合した上で適宜決定されるものであるが、通常１日当たり０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内から選ばれ、一回または複数回に分けて投与される。投与方法は、経口、非経口、経腸、局所投与などのいずれの経路によっても投与することができる。【００１９】
製剤化に際しては、通常使用される製剤用担体、賦形剤、その他の添加剤を使用することができる。担体としては、乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、塩化ナトリウムなどの個体状担体、グリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、水などの液状担体を例示することができる。剤型としては任意の形態を採ることができ、たとえば個体状担体を使用する場合には錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル化剤、座剤、トローチ剤などを、液状担体を使用する場合にはシロップ、乳液、軟ゼラチンカプセル、クリーム、ゲル、ペースト、スプレー、注射などをそれぞれ例示することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。【００２１】
実施例
（１）細胞株の樹立
ＥＢウイルス−ＴＫにより特異的にリン酸化を受け細胞に毒性を示す薬剤のスクリーニング法の概要を図１に示す。
最初に、ＮＣＢＩのデータベース情報を基にプライマーを設計し、Ｂ９５ａ細胞（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９０；６４（２）：７００−５）からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にてＥＢウイルスのＴＫ遺伝子を増幅し、発現プラスミドベクターｐＣＩ−ｎｅｏのマルチクローニングリージョンにクローニングした（ｐＣＩ−ＥＢ−ＴＫｎｅｏ）。同様にヒトＴＫ遺伝子もＰＣＲ法にて増幅し、クローニングした（ｐＣＩ−ｈｕＴＫｎｅｏ）。クローニングされた遺伝子断片が目的した遺伝子であるか、塩基配列を決定し確定した。
次ぎに、ＴＫ欠損ヒト骨肉腫細胞（１４３Ｂ）にＥＢウイルス−ＴＫまたはヒトＴＫを発現するプラスミドベクター、それぞれｐＣｌ−ＥＢ−ＴＫｎｅｏまたはｐＣＩ−ｈｕＴＫｎｅｏをリポフェクション法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８７  Ｎｏｖ；８４（２１）：７４１３−７）により遺伝子導入し、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）によってプラスミドが導入された細胞を選択した。【００２２】
ＥＢウイルス−ＴＫを導入した細胞（１４３Ｂ／ＥＢウイルス−ＴＫ）とヒトＴＫを導入した細胞（１４３Ｂ／ｈｕ−ＴＫ）の２種類の細胞を用いて、ＥＢウイルス−ＴＫを導入した細胞で毒性を示し、ヒトＴＫを導入した細胞で毒性を示さない薬剤のスクリーニングを行った。【００２３】
（２）薬剤感受性の決定
１４３Ｂ／ＥＢウイルス−ＴＫ、１４３Ｂ／ｈｕ−ＴＫ、１４３Ｂ  ＴＫ（−）細胞および各ＥＢＶ持続感染細胞の薬剤に対する感受性は、薬剤の細胞毒性によって決定した。すなわち、種々の濃度の各薬剤１００μｌが入った９６穴平底培養プレートに細胞（１４３Ｂ／ＥＢウイルス−ＴＫ、１４３Ｂ／ｈｕ−ＴＫ、１４３Ｂ  ＴＫ（−）細胞：５×１０４細胞／１００μｌ、ＥＢウイルス持続感染細胞：２０×１０４細胞／１００μｌ）を加えた。５日間培養した後、生存細胞数をＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ］アッセイにて決定した。なお、テストした薬剤の細胞毒性は、細胞生存率を５０％に抑制する濃度（ＣＣ５０）で示した。【００２４】
（３）薬剤の効果
ＥＢウイルス−ＴＫによってリン酸化が起こると過去に報告されている核酸誘導体（アジドチミジン（ＡＺＴ），５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（５ＦｄＵ），アシクロビル（ＡＣＶ），１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ブロモビニルウラシル（ＢＶａｒａＵ），ガンシクロビル（ＧＣＶ），５−ブロモビニル−２’−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ））が、ＥＢウイルス−ＴＫを発現している１４３Ｂ／ＥＢウイルス−ＴＫに選択的毒性を示すかどうか、ＭＴＴアッセイにて検討した。また、本発明の化合物と構造が類似している核酸誘導体である１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル（ＦＭＡＵ），１−（Ｃ−シアノ−２−デオキシ−リボブラノシル）チミン（１’−ＣＮ−ｄＴ），β−Ｄ−２−メチレン−４−チオ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）チミン（４’−Ｓ−ＤＭＤＴ），１−（２−デオキシ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）チミン（４’−Ｓ−ａｒａＴ），１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン（４’−Ｓ−ＦＭＡＣ）についても同様に検討した。【００２５】
その結果、表１に示すように、本発明の薬剤以外に、１４３Ｂ／ＥＢウイルス−ＴＫ細胞に選択的な毒性を示す薬剤を見出すことはできなかった。また、上記以外の１３０種の核酸誘導体を同様にスクリーニングしたが、顕著な効果を示すものを見出すことはできなかった。【００２６】
（４）本発明薬剤の効果
上記（３）と同様に、１４３Ｂ／ＥＢウイルス−ＴＫ細胞および１４３Ｂ／ｈｕ−ＴＫ（ヒトＴＫ）細胞に対する細胞毒性をＭＴＴアッセイによって調べたところ、表１に示すように、本発明薬剤は１４３Ｂ／ＥＢウイルス−ＴＫ細胞に対して最も高い選択係数（ＳＩ：２７００倍以上）を示し、３００μＭにおいても１４３Ｂ／ｈｕ−ＴＫ細胞には全く毒性を示さなかった。【００２７】
【表１】
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【００２８】
（５）本発明薬剤のＥＢウイルス感染がん細胞に対する効果
ＥＢウイルス感染がん細胞であるＮＣ３７細胞などに対する本発明薬剤の細胞毒性効果をＭＴＴアッセイで調べた。その結果、表２に示すように、ＥＢウイルス−ＴＫが発現しているＮＣ３７細胞では本発明薬剤は既存のＧＣＶよりも１０倍以上の効果を示した。しかしながらＥＢウイルス−ＴＫを発現していない細胞ではどちらも効果が認められなかった。【００２９】
【表２】
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【００３０】
（６）急性感染に対する効果
健常人血液からＢリンパ球を分離した。このＢリンパ球に本発明薬剤の存在下でＥＢウイルスを感染させ、２週間培養を行った後、感染Ｂ細胞を回収、洗浄し、ＤＮＡを抽出した。このＢリンパ球中のＥＢウイルスＤＮＡ量を、リアルタイムＰＣＲで定量し、ウイルスコピー数とした。代表的な２例（ＰＢＭＣ＃１２８７及びＰＢＭＣ＃５９２６）の結果を図２に示す。図２に示すように、本発明薬剤は、Ｂリンパ球中におけるＥＢウイルスＤＮＡ量が低下させ、新規感染も阻害されたことが明らかとなった。【００３１】
（７）慢性活動性ＥＢウイルス感染症細胞に対する効果
慢性活動性ＥＢウイルス感染症はＥＢウイルスがＢ細胞ではなく、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）に感染する予後不良の感染症である。この慢性感染細胞株、ＫＡＩ３細胞（Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９  Ｍａｒ；１１５（３）：３８５−９２）をヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入し、本発明薬剤の効果をＭＴＴアッセイで検討した。なお、コントロール薬剤としてＧＣＶを用いた。その結果、表３に示すように、本発明薬剤はＧＣＶと比べ、明らかに高い効果を示した。【００３２】
このように、本発明薬剤は、その効果において、今まで報告のあるＧＣＶと比べて１０倍以上優れた効果を有することが明らかとなり、ＥＢウイルス−ＴＫが発現している細胞のみに細胞毒性を示し、ＥＢＶ感染細胞を急性、慢性問わず排除しうると考えられる。【００３３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の薬剤は、ＥＢウイルスによって引き起こされる疾患、例えばＥＢウイルスの急性又は慢性感染症、ＥＢウイルスによって引き起こされる悪性腫瘍等に対する、副作用の低減した予防・治療薬として有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、抗ＥＢウイルス活性を特異的に発揮する薬剤をスクリーニングする方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明のスクリーニング法の概要を模式的に示したものである。
【図２】Ｂリンパ球中におけるＥＢウイルスＤＮＡ量に対する本発明薬剤の効果を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月28日(2009.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）５−メチルウラシル、その塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する抗エプスタイン・バール（ＥＢ）ウイルス剤。
【請求項２】
１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）５−メチルウラシル、その塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含有する、ＥＢウイルス関連疾患の予防もしくは治療剤。
【請求項３】
ＥＢウイルス関連疾患が、ＥＢウイルスによって引き起こされる腫瘍または急性もしくは慢性ＥＢウイルス感染症である請求項２の予防もしくは治療剤。
【国際調査報告】
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