(57)【要約】  耐塩性ラン藻類由来の熱ショックタンパク質をコードする核酸を有効成分とする蒸散抑制剤、更に光合成の制御に関与するタンパク質・酵素、植物体のサイズを制御するタンパク質・酵素、根の伸展を促進するタンパク質・酵素、植物体の成長を促進するタンパク質・酵素、RNAの安定性を向上させるタンパク質・酵素から選択されるタンパク質をコードする核酸又はそのアンチセンス配列からなる核酸を含む蒸散抑制剤、かかる蒸散抑制剤の光合成効率化のための使用、植物の蒸散抑制方法。
2008117537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱ショックタンパク質をコードする核酸を、有効成分として含有する蒸散抑制剤。
【請求項２】
熱ショックタンパク質が、DnaKタンパク質又はHSP70タンパク質である、請求項１記載の蒸散抑制剤。
【請求項３】
前記DnaKタンパク質が、耐塩性ラン藻のDnaKタンパク質である、請求項２に記載の蒸散抑制剤。
【請求項４】
下記(a)〜(d)のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を有効成分として含有する蒸散抑制剤。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号1〜721からなるアミノ酸配列
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号116〜721からなるアミノ酸配列
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号164〜721からなるアミノ酸配列
(d)(a)〜(c)の配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列
【請求項５】
更に光合成の制御に関与するタンパク質・酵素、植物体のサイズを制御するタンパク質・酵素、根の伸展を促進するタンパク質・酵素、植物体の成長を促進するタンパク質・酵素、RNAの安定性を向上させるタンパク質・酵素からなる群から選択される一以上のタンパク質をコードする核酸又はそのアンチセンス配列からなる核酸を含む請求項１乃至４何れか一項記載の蒸散抑制剤。
【請求項６】
核酸がデオキシリボ核酸である請求項１乃至５何れか一項記載の蒸散抑制剤。
【請求項７】
熱ショックタンパク質をコードする核酸の、蒸散抑制剤としての使用。
【請求項８】
DnaKタンパク質又はHSP70タンパク質をコードする核酸の、蒸散抑制剤としての使用。
【請求項９】
前記DnaKタンパク質が、耐塩性ラン藻のDnaKタンパク質である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
下記(a)〜(d)のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸の、蒸散抑制剤としての使用。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号1〜721からなるアミノ酸配列
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号116〜721からなるアミノ酸配列
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号164〜721からなるアミノ酸配列
(d)(a)〜(c)の配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列
【請求項１１】
請求項１乃至６記載の蒸散抑制剤の光合成効率化のための使用。
【請求項１２】
熱ショックタンパク質をコードする核酸を、植物細胞内のゲノムに導入し、前記核酸を導入したゲノムを含む植物細胞を生育させることを特徴とする植物の蒸散抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱ショックタンパク質をコードする核酸を有効成分とする蒸散抑制剤、又は該核酸の蒸散抑制剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質（Heat Shock Protein；以下「HSP」と記載する）は、高温ストレスに伴って、その発現が誘導されるタンパク質であり、分子シャペロンと呼ばれる一群のタンパク質として知られている。HSPは、原核生物から真核生物まで多くの生物種にわたって広くその存在が認められており、例えば、（１）分子量約15kDa〜約30kDaの小HSP（small HSP）、（２）分子量約60kDaのHSP60タンパク質又はGroELタンパク質（「HSP60」の名称は、真核生物における名称であり、「GroEL」の名称は、原核生物における名称である）、及び（３）分子量約70kDaのHSP70タンパク質又はDnaKタンパク質（「HSP70」の名称は、真核生物における名称であり、「DnaK」の名称は、原核生物における名称である）が知られている。【０００３】
HSPの機能に関しては、高温耐性との関連性が指摘されているものの、現在も研究途上にあり、あまり多くは解明されていない。【０００４】
植物におけるHSPの機能を研究した例としては、タバコにおいて、アンチセンス法によりHSP60タンパク質の発現を抑制すると、異常な表現型を示すことが知られており（非特許文献１）、また、シロイヌナズナにおいて、アンチセンス法によりHSP70タンパク質の発現を抑制すると、異常な表現型を示すことが知られている（非特許文献２）。また更に、シロイヌナズナにおいて、熱ショック遺伝子の転写を制御する遺伝子を抑制することにより、HSP70タンパク質の発現量が増加し、シロイヌナズナが高温耐性を獲得したことが知られている（非特許文献３）。更には、クリの木（chestnut）由来の小HSPをコードする遺伝子を大腸菌に導入し、前記タンパク質を大腸菌中で発現させると、大腸菌が高温耐性を獲得したことが知られている（非特許文献４）。【０００５】
また、高温耐性以外の環境ストレス（例えば、高塩、乾燥、又は強光）耐性と、分子シャペロンとの関連性については、たとえばDnaK及びHSP70が、耐塩性、耐乾燥性などに関与していることが報告されている（特許文献１）。【０００６】
また更に、特段のストレスを植物体に対して与えない環境下において、HSP70が重要な働きをしている旨が特許文献２に記載されている。しかし、HSP70が植物による水の蒸散を抑制する作用を有すること、更に光合成を大幅に促進させるにもかかわらず、水の蒸散作用は促進させないことは記載されておらず、また示唆もされていない。【０００７】
【特許文献１】特開2001-78603号公報
【非特許文献１】Plant J., 6, 425-432(1994)
【非特許文献２】Mol. Gen. Genet., 252, 11-19(1996)
【非特許文献３】Plant J., 8, 603-612(1995)
【非特許文献４】Plant Physiol., 120, 521-528(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
植物の生育に際しても、水が必須であるが、水の消費効率を向上させる方策が、特に緑化事業などの現場では望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題の解決をするために、鋭意検討を行った結果、驚くべきことにHSPを導入した組換植物は、組換を行っていない植物と比して、大幅に光合成作用が促進されるにもかかわらず蒸散作用の亢進が押さえられていることを見いだし、HSPを蒸散抑制剤とすることにより本発明を完成させた。【００１０】
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
１．熱ショックタンパク質をコードする核酸を、有効成分として含有する蒸散抑制剤。
２．熱ショックタンパク質が、DnaKタンパク質又はHSP70タンパク質であることを特徴とする、１記載の蒸散抑制剤。
３．前記DnaKタンパク質が、耐塩性ラン藻のDnaKタンパク質であることを特徴とする、２に記載の蒸散抑制剤。
４．下記(a)〜(d)のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を有効成分として含有する蒸散抑制剤。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号1〜721からなるアミノ酸配列
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号116〜721からなるアミノ酸配列
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号164〜721からなるアミノ酸配列
(d)(a)〜(c)の配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列
５．更に光合成の制御に関与するタンパク質・酵素、植物体のサイズを制御するタンパク質・酵素、根の伸展を促進するタンパク質・酵素、植物体の成長を促進するタンパク質・酵素、RNAの安定性を向上させるタンパク質・酵素からなる群から選択される一以上のタンパク質をコードする核酸又はそのアンチセンス配列からなる核酸を含むことを特徴とする１乃至４何れかに記載の蒸散抑制剤。
６．核酸がデオキシリボ核酸であることを特徴とする１乃至５何れかに記載の蒸散抑制剤。
７．熱ショックタンパク質をコードする核酸の、蒸散抑制剤としての使用。
８．DnaKタンパク質又はHSP70タンパク質をコードする核酸の、蒸散抑制剤としての使用。
９．前記DnaKタンパク質が、耐塩性ラン藻のDnaKタンパク質であることを特徴とする、８に記載の使用。
１０．下記(a)〜(d)のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸の、蒸散抑制剤としての使用。
(a)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号1〜721からなるアミノ酸配列
(b)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号116〜721からなるアミノ酸配列
(c)配列番号２記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号164〜721からなるアミノ酸配列
(d)(a)〜(c)の配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列
１１．１乃至６記載の蒸散抑制剤の光合成効率化のための使用。
１２．熱ショックタンパク質をコードする核酸を、植物細胞内のゲノムに導入し、前記核酸を導入したゲノムを含む植物細胞を生育させることを特徴とする植物の蒸散抑制方法。【００１１】
なお、本明細書において、「植物」とは、生物を微生物、植物、及び動物の３つに分類した場合の前記植物を意味し、植物体（すなわち、植物全体）及びその一部（例えば、花、葉、茎、根、若しくは種子、又は組織）が含まれる。また、「植物細胞」には、既に分化した植物の細胞・組織の他、例えば、未分化な植物の細胞又は未分化な植物の組織培養物、或いはプロトプラスト、カルス（細胞集塊）、不定胚、不定芽が含まれる。
また、「育種」とは、生育させること、培養することなど、植物細胞を増殖、分化、肥大化、伸長等、成長させる行為を指称して使用する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、HSPの蒸散抑制剤としての新たな用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明蒸散抑制剤を作用させたイネと対照のイネの、光合成活性を二酸化炭素固定量により比較した図である。「Sample」は本発明蒸散抑制剤を作用させたイネを示し、「Control」は対象を示す。縦軸は、二酸化炭素固定量（単位面積、時間あたりの固定した二酸化炭素の量）を示す。
【図２】本発明蒸散抑制剤を作用させたイネと対照のイネの蒸散速度を比較した図である。「Sample」は本発明蒸散抑制剤を作用させたイネを示し、「Control」は対象を示す。縦軸は、蒸散速度（単位面積、時間あたりの大気中に放出された水分子のモル数）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、発明を実施するための最良の形態により、本発明を詳説する。
１．本発明蒸散抑制剤
本発明蒸散抑制剤は、HSPをコードする核酸を有効成分として含有する。
本発明蒸散抑制剤における「HSP」とは、小HSP（例えばMol. Gen. Genet., 219, 365-372(1989)記載のHSP17.4タンパク質やHSP18.2タンパク質など）、HSP60タンパク質（例えばPlant Mol. Biol., 18, 873-885記載のHSP60タンパク質など）、GroELタンパク質（例えばPlant J., 10, 1119-1125(1996)記載のCPN10タンパク質など）、HSP70タンパク質（例えばPlant Mol. Biol., 25, 577-583(1994)記載のHSC70タンパク質、Plant Physilo., 88, 731-740(1988)記載のHSP70-1タンパク質、HSP70-2タンパク質、HSP70-3タンパク質、Plant Cell Physiol., 37, 862-865(1996)記載のBiPタンパク質など）DnaKタンパク質、HSP90（Plant Physiol., 99, 383-390(1992)記載のHSP81-1タンパク質、HSP81-2タンパク質、HSP81-3タンパク質、Plant Mol. Biol., 35, 955-961(1997)記載のHSP81-4タンパク質、HSP88.1タンパク質、HSP89.1タンパク質など）、HSP100（Plant Cell, 6, 1899-1909 (1994)記載のHSP101タンパク質など）のいずれも使用することが可能であるが、DnaKタンパク質及びHSP70タンパク質であることが好ましい。DnaKタンパク質であることが好ましく、特に耐塩性ラン藻又はバクテリアのDnaKタンパク質が好適である。
HSP70タンパク質としては、真核生物のHSP70タンパク質を用いることができ、例えば、動物、植物、又は真菌（例えば、カビ、酵母、又はキノコなど）のHSP70タンパク質が例示される。【００１５】
これらのタンパク質の中でも耐塩性ラン藻類のDnaKタンパク質が特に好ましい。前記耐塩性ラン藻としては、耐塩性を有するラン藻である限り、特に限定されるものではないが、例えば、NaCl濃度が0.25 mol/L〜3 mol/Lの条件下での生育可能な高塩耐性ラン藻、例えば、アファノティーキ・ハロフィチカを挙げることができる。耐塩性ラン藻の１種であるアファノティーキ・ハロフィチカのDnaKタンパク質は、全体として721個のアミノ酸残基からなり、耐塩性ラン藻以外の原核生物（例えば、大腸菌又は淡水性ラン藻）のDnaKタンパク質、あるいは、真核生物のHSP70タンパク質と異なり、カルボキシル基末端（C末端）に約100個のアミノ酸残基からなる余分のアミノ酸配列を有する。アファノティーキ・ハロフィチカのDnaKタンパク質は、高塩濃度においても、他のタンパク質が正しくアッセンブリーするのを介在する特性を有することが知られている。アファノティーキ・ハロフィチカのDnaKタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。このようなDnaKタンパク質をコードする核酸を植物細胞のゲノムに導入すると、後述の蒸散抑制効果の確認方法によって評価した蒸散抑制効果が、本発明蒸散抑制剤を用いない植物と比して20%以上増加する。本発明蒸散抑制剤に有効成分として使用する核酸は、50%以上、好ましくは65%以上、最も好ましくは80%以上の蒸散抑制効果を有する核酸であることが好ましい。【００１６】
ところで天然に存在するタンパク質には、それをコードするDNAの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうる。この様な変異にもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、本発明蒸散抑制剤の有効成分である核酸がコードするアミノ酸配列に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン2（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがIL-2活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するタンパク質である。【００１７】
同様に、DnaKタンパク質及びHSP70タンパク質には、天然体のDnaKタンパク質及びHSP70タンパク質が含まれることは勿論のこと、変異体、遺伝子工学的に得られるリコンビナントタンパク質、あるいは、アミノ酸配列が、DnaKタンパク質又はHSP70タンパク質のアミノ酸配列において１又はそれ以上（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列である変異タンパク質も含まれる。なお、本明細書における「数個」とは、アミノ酸配列全体のアミノ酸数の7%の整数個、好ましくは5%の整数個、より好ましくは3%の整数個を指称する。例えば721個のアミノ酸からなるアミノ酸配列の場合においては50個、好ましくは36個、より好ましくは21個を示す。【００１８】
ところで、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼは、フレーム内に2つのATGコドンを含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988) J.Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaperらは、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼは、2箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いものとの両方の形態が合成されることを示している。このように自然界に存在するアミノ酸には、同一遺伝子由来であっても異なる大きさのタンパク質が存在することが知られている。同様に、例えばDnaKについても、複数のATGコドンが開始コドンとして機能する可能性はある。しかし、いずれのATGコドンが開始コドンであっても、上記のDnaKタンパク質をコードする点では同じであり、第２番目、第３番目のATGコドンから始まる塩基配列を有する核酸も本発明蒸散抑制剤に使用することができる。従って、DnaKタンパク質は配列番号２記載のアファノティーキ・ハロフィチカのアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜721からなるアミノ酸配列の他、アミノ酸番号116〜721からなるアミノ酸配列や、アミノ酸番号164〜721からなるアミノ酸配列も包含する。【００１９】
本発明蒸散抑制剤における「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA)及びリボ核酸（RNA)が例示されるが、本発明蒸散抑制剤の保存安定性及び使用時の安定性が優れるためDNAであることが好ましい。また、これらの核酸は1本鎖（例えばDNAは、前記HSPのセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れか一方）であると2本鎖（前記センス鎖及びアンチセンス鎖の対合体）であることを問わないが、核酸の安定性が優れるため2本鎖であることが好ましい。例えば上記アファノティーキ・ハロフィチカのアミノ酸配列（配列番号２記載）をコードするDNAの塩基配列としては、配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号1〜2166からなる塩基配列が挙げられる。また、配列番号２のアミノ酸番号116〜721からなるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列としては、配列番号１記載の塩基配列のうち塩基番号345〜2166からなる塩基配列が挙げられる。さらに、配列番号２のアミノ酸番号164〜721からなるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列としては、配列番号１記載の塩基配列のうち塩基番号490〜2166からなる塩基配列が挙げられる。なお、1つのアミノ酸に対応するコドン（アミノ酸に対応する塩基配列）は複数存在することは、当業者にとっては周知である。したがって、例えば配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列に限定して解釈されないことは、当業者にとっては容易に理解しうることである。【００２０】
また、このような塩基配列からなる核酸（例えばDNA）は、それを構成する塩基配列に１又は複数の塩基の置換、欠失、挿入又は転位を有していても良い。かかる変異が起こっていても、それがコードするアミノ酸配列に与える変異の影響は小さく、本発明蒸散抑制剤の蒸散抑制効果が保持される限り（湿潤重量の測定による成長度が30%以上保持されることが好ましい）においてアミノ酸配列に変異を与えても良いからである。かかる塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸（DNA又はRNA）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が例示される。【００２１】
なお、「ストリンジェントな条件」とは、例えば50%ホルムアミド、5×SSPE（20×SSPE：2.97 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaH2PO4・H2O、0.025 mol/L EDTA（エチレンジアミン四酢酸）を含むpH7.4の水溶液）、5×デンハルト溶液（100×デンハルト液：1 gのフィコール400（ファルマシア社製）、1 gのポリビニルピロリドン（PVP-360：シグマ社製）、1 gのBSAフラクションV（牛血清アルブミン：シグマ社製）を50 mlの水に溶解した水溶液）、0.5%SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下、42℃で16時間のインキュベート、更にその後の0.1%SDSを含む1×SSPE、0.1%SDSを含む0.1×SSPEによる55℃での順次洗浄を行う条件又はこれと核酸のハイブリダイズにおいて同等の機能の条件を指称する。このような条件下で、あるDNAにハイブリダイズする塩基配列からなるDNAは、あるDNAに対して少なくとも70%以上の相同性を有すると考えられ、たとえば2166塩基からなるDNAにおいては1527塩基以上の塩基配列が共通していることになる。
かかる核酸は、蒸散抑制剤として使用することができる（このような使用を「本発明使用」という）。【００２２】
本発明蒸散抑制剤は、更にHSP以外のタンパク質をコードする核酸を含んでいることが好ましい。すなわち、本発明蒸散抑制剤は遺伝子組換植物における成長性の不良を改善するための発明であるため、HSP以外のタンパク質をコードする核酸を同時にゲノムに導入する際の使用が想定されるからである。かかる「HSP以外のタンパク質」としては、例えば光合成の促進に働く酵素等の遺伝子（例えばホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開平10-248419号公報）等）、不稔性を付与するアンチセンス配列（Bgpl（国際公開公報WO9413809）、MS2（米国特許第5932784号公報）等）、植物体のサイズを制御する遺伝子（BON1（米国公開2002/0194639号公報）、BAP1（米国公開2002/0194639号公報）等）、根の伸展に関連する遺伝子（プロリン輸送因子の遺伝子（ProT:例えばPlant Cell Physiol., 42(11), 1282-1289(2001)記載）、フルクトース1,6二リン酸アルドラーゼ遺伝子（米国特許第6441277号公報）等）、植物体の成長を促進する遺伝子（サイクリン遺伝子（米国特許第6166293号公報）等）、RNA（mRNA）の安定性を向上させるタンパク質の遺伝子（HVD1遺伝子（特開2002-34576号）等）等が例示されいずれも使用することが可能である。このような「HSP以外のタンパク質」はHSPとの融合タンパク質として発現する様に構築されていても良く、また別個のタンパク質として発現するように構築されていても良い。【００２３】
かかる本発明蒸散抑制剤に含まれる上記核酸は、核酸単体の状態で存在していても良いが、核酸の安定性を高めるために、例えば本発明蒸散抑制剤の使用に際して用いられる組換ベクターに導入した状態で存在することが好ましい。このような組換ベクターの例としては、例えばバイナリーベクターpBI121（Methods Enzymol., 118, 6270640(1986)記載）、pCIAMBIA、pE21-Ω-MCS等が挙げられ、既存の組換ベクターを使用することが可能である。かかる組換ベクターは、本発明蒸散抑制剤により成長を促進する、対象植物のゲノムへの導入効率を考慮して適当な組換ベクターを当業者であれば適宜選択して使用することが可能である。【００２４】
組換ベクターに核酸を導入する場合には、導入する核酸の上流及び下流に、それぞれ、対象とする植物細胞内で機能するプロモーター及びターミネーターを挿入することが好ましく、また、形質転換体を得る際に有効な選択マーカーとして適当なDNAを挿入することが好ましい。【００２５】
前記プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターを挙げることができる。前記ターミネーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素（NOS）由来のターミネーターを挙げることができる。前記選択マーカーとしては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子（NPTII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（HPT遺伝子）等を挙げることができる。【００２６】
本発明蒸散抑制剤の剤型は、液状、微粉状、ペースト状等が例示されるが、本発明蒸散抑制剤に含まれる核酸の安定性を害せず、また後述する使用例に使用できる限りにおいて他の剤型も採用しうる。【００２７】
２．本発明蒸散抑制方法
本発明蒸散抑制方法は、HSPをコードする核酸を、植物細胞内のゲノムに導入し、前記核酸を導入したゲノムを含む植物細胞を生育させることを特徴とする。
本発明蒸散抑制方法における、「HSP」及び「核酸」は前記「１．本発明蒸散抑制剤」で記載したものと同様である。【００２８】
本発明蒸散抑制方法における「植物細胞」は、被子植物又は裸子植物の細胞のいずれでもよく、双子葉植物又は単子葉植物の細胞のいずれでもよく、また、草本生殖物又は木本生殖物のいずれでもよい。草本性植物としては、例えば、穀類植物、芝草類、又は野菜類を挙げることができ、木本性植物としては、例えば、常緑広葉樹、落葉広葉樹等を挙げることができる。【００２９】
前記芝草類としては、例えば、イネ科芝草［例えば、スズメガヤ亜科（例えば、シバ類又はバーミューダーグラス類）、ウシノケグサ亜科（例えば、ベントグラス類、ブルーグラス類、フェスク類、又はライグラス類）、又はキビ亜科］、カヤツリグサ科芝草、及びキク科芝草を挙げることができる。前記穀類植物としては、例えば、イネ科植物、例えば、イネ、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、モロコシ、サトウキビ、トウモロコシ・ポップコーン、又はハトムギを挙げることができる。前記野菜類としては、例えば、ナス科植物（例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、若しくはトウガラシ）、アカザ科植物（例えば、ホウレンソウ、サトウダイコン等）、マメ科植物（例えば大豆、小豆、エンドウ等）、アブラナ科（例えば、アブラナ、ルッコラ等）又はゴマ科植物（例えば、ゴマ）を挙げることができる。【００３０】
前記常緑広葉樹としては、例えば、ユーカリ、アカシア、又はコーヒーを挙げることができる。前記落葉広葉樹としては、例えば、ポプラ、クヌギ、ヤナギ、シラカバ、又はコナラを挙げることができる。【００３１】
また一般に観葉植物と知られている植物（例えばリュウゼツラン科、サトイモ科、ヤシ科、ウコギ科、クワ科、ガガイモ科、キツネノマゴ科、キョウチクトウ科、クズウコン科、ヒノキ科、ミカン科、パンヤ科、タコノキ科、バショウ科、トウダイグサ科、モクセイ科、ツユクサ科、パイナップル科、ベンケイソウ科、リュウケツジュ科、ヤナギ科等の植物、シダ植物等）に対しても本発明促進方法は有用である。【００３２】
かかる植物細胞の中でも、イネ科植物、アカザ科植物、マメ科植物、アブラナ科植物や、ユーカリ、アカシア、ポプラの細胞が好ましく、特にサトウキビ、サトウダイコン、大豆、アブラナ、ゴマ、ユーカリ、ポプラの細胞が好ましいが、成長を促す限りにおいてこれらの植物に特に限定はされない。【００３３】
かかる植物細胞内のゲノムへの核酸導入方法は、公知の発現ベクター（pBI121など）を用いることで、例えば目的の遺伝子を含むベクターを有するアグロバクテリウムを、植物組織に感染させる方法、ポリエチレングリコール処理法、プロトプラストに電気パルス処理して前記ベクターを導入するエレクトロポレーション法、あるいは、金粒子に前記ベクターを乗せて植物組織に導入するパーティクルガン法などの常法を用いることができる。【００３４】
前記方法により形質転換された植物細胞を、適当な培地［例えば、ムラシゲ・スクーグ（Murashige and Skoog）培地；Plant Physiol., 15, 473-497(1962)］で生育させ、再生することにより、形質転換植物を得ることができる。この際、選択マーカーに対応する適当な抗生物質（例えば、カナマイシン）を培地に加えておくと、形質転換体を選択することができる。【００３５】
例えば、イネ科芝草（例えば、ノシバ又はベントグラス）に、DnaKタンパク質又はHSP70タンパク質をコードするDNAを導入する場合には、以下に示す手順により実施することができる。【００３６】
前記ポリエチレングリコール処理法による導入は、例えば、以下のようにして行うことができる。1〜100 μg/mLのベクターと、105〜106個/mlのプロトプラストとを、浸透圧調節剤として0.4〜0.6 mol/Lのマンニトール等を含む緩衝液等の液体媒体中に懸濁する。これにポリエチレングリコール溶液を最終濃度10〜30%になるように加え、室温で5〜30分間放置した後、ポリエチレングリコールを希釈することにより、遺伝子をプロトプラスト中に導入する。【００３７】
前記エレクトロポレーション法による導入は、例えば、以下のようにして行うことができる。1〜100 μg/mLのベクターと、105〜106個/mLのプロトプラストとを、浸透圧調節剤として0.4〜0.6 mol/Lのマンニトール等を含むバッファー等の液体媒体中に懸濁する。これに電界強度300〜600 V/cm時定数10〜50 msからなる電気パルスを印加して電気的刺激を加え、遺伝子をプロトプラスト中に導入する。【００３８】
前記パーティクルガン法による導入は、例えば、以下のようにして行うことができる。細胞集塊（0.3〜0.5 ml程度）を、ろ紙上に均一に展開・吸着させる。そしてベクターを塩化カルシウムとスペルミジンとを用いて吸着させた直径0.1〜5 μmの金属粒子を用意し、パーティクルガンで800〜1500 PSIの空気圧あるいは火薬の爆発時の圧力により細胞集塊に打ち込み導入する。金属粒子には、タングステン又は金などを用いることができる。【００３９】
遺伝子導入処理後のプロトプラストは、植物の組織培養培地、例えば、N6培地、R2培地、K8p培地、又はAA培地等に植物生育調節物質、例えば、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類及びカイネチン等のサイトカイニン類を添加した液体又は固形培地により培養する。培養は暗所で行い、温度としては20〜30℃が好ましい。前記培養により、遺伝子が導入されたプロトプラストから細胞集塊が形成される。【００４０】
遺伝子導入処理後の脱分化状態の細胞集塊を、植物の組織培養培地、例えば、N6培地、R2培地、K8p培地、又はAA培地等に植物生育調節物質、例えば、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類及びカイネチン等のサイトカイニン類を添加した液体又は固形培地により培養する。培養は暗所で行い、温度としては20〜30℃が好ましい。更に、14〜40日間隔で新鮮培地に継代し、培養を継続する。培養は明所で行うのが好ましい。培養開始24〜48日で不定胚又は不定芽が得られる。【００４１】
前記不定胚又は不定芽を、植物体再生培地、例えば、N6培地、R2培地、MS培地、又はLS培地等に植物生育調節物質、例えば、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類及びカイネチン等のサイトカイニン類を添加した培地により培養する。14〜40日間隔で新鮮培地に継代し、培養を継続する。培養は明所で行うのが好適である。培養開始24〜48日で形質転換植物体が得られる。【００４２】
このようにして得られた植物体は、通常の生育条件下において、本発明蒸散抑制方法を用いないで生育させた植物体と、下記の方法により生育度を比較した場合に、蒸散抑制効果が観察される。【００４３】
本発明蒸散抑制方法の効果の確認は、例えば下記の手法によって行うことができる。
すなわち、HSPを含まないベクターを組み込んだ陰性対象植物と蒸散抑制対象の植物とを、生育させ、同一の生育期間が経過した植物体の吸水量を測定する方法、又は植物体全部又はその一部を採取して気体中に放出される水蒸気量を測定して対比する方法が挙げられる。
本発明蒸散抑制方法によると、陰性対象と検体を同一条件下で光合成を行わせると光合成活性が10%以上（好ましくは15%以上、最も好ましくは20%以上）亢進し、しかも蒸散作用の亢進は10%未満（好ましくは5%未満、もっとも好ましくは3%未満）に抑制される。
これらの測定は、実施例に記載した方法によるとより正確な測定が可能である。【００４４】
３．本発明蒸散抑制剤の使用方法
本発明蒸散抑制剤は、これを植物細胞のゲノムに公知の手法により導入し、導入後のゲノムを有する植物体を培養又は生育させることにより使用することができる。
本発明蒸散抑制剤の植物細胞のゲノムへの導入は、それ自体公知の方法により行うことができる。かかる方法としては、「２．本発明蒸散抑制方法」に記載したアグロバクテリウムを植物組織に感染させる方法、ポリエチレングリコール処理法、エレクトロポレーション法、及びパーティクルガン法などが挙げられ、いずれも組換ベクターを用いる方法である。【００４５】
コードする核酸が組換ベクターに挿入されているHSPを本発明蒸散抑制剤に使用する場合は、かかる核酸が組み込まれた組換ベクター又は成長促進対象の植物に併せて調製したベクター（「HSPをコードする核酸」を公知の方法で切り出して単離し、成長促進対象の植物に併せて選択した組換ベクターに公知の手法により導入して構築することができる）を用いることができる。
本発明蒸散抑制剤の使用対象となる植物は、「２．本発明蒸散抑制方法」に記載した植物と共通である。【００４６】
植物細胞への組換ベクターの導入は、予め組み換えベクターに組み込んでおいたマーカー遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子（NPTII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（HPT遺伝子）等の表現系を用いて確認することができる。例えば、NPTII等の抗生物質耐性遺伝子をマーカー遺伝子として利用した場合には、組み換え後に耐性遺伝子に対応する抗生物質を含む培地で植物細胞を培養し、かかる培地で生育する植物細胞を選択することでゲノムへの遺伝子の導入がなされた株を得ることができる。
かかる選択された株の育成は、当業者であれば適宜好適な条件下で行うことができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
測定例１：
１．糖・デンプンの抽出
糖の抽出は、Ruftyらの方法に従って行った（Rufty, T.W. and Huber, S.C. 1983. Plant Physiol. 72 : 474-480）。
すなわち、糖分画を、新鮮重（0.2 g）の葉を液体窒素で粉末させて、5 mlの80% (v/v)エタノールにより100℃で1時間煮沸して抽出した。3000×gで5分間遠心して上清を回収した。更に残渣に2.5 mlの80% (v/v) エタノールを加えて懸濁し、3000×gで5分間遠心して上清を回収する操作を2回繰り返した。この80% (v/v) エタノールで抽出された糖の分画は、スクロース、ヘキソース、ペントースや可溶性のオリゴ糖が含まれている。
澱粉分画の抽出は、その沈殿物に0.2 mol/Lの水酸化カリウムを1 ml加え、100℃で1時間処理した後、1 mol/Lの酢酸緩衝液(pH 5.5)を0.2 mL加えて中和した。さらに、10 mlのアミノグルコシダーゼ (Bacillus subtilis由来：和光純薬工業製, 35 U/mL in 50 mmol/L酢酸緩衝液,pH 5.5)で37℃・16時間消化した。その可溶化された糖を澱粉分画とした。【００４８】
２．糖の定量
糖の定量はアンスロン法を用いて行った（Roe, J.H. 1955,J. Biol. Chem. 212 : 335-343）。すなわち、アンスロン試薬(0.05% anthrone in 66% H2SO4)1 mlに１で得られた糖の抽出液を20-100 μl加え100℃で15分間反応させた。そして、グルコースを標準として吸光度620 nmを測定した。【００４９】
測定例２：光合成活性の測定
二酸化炭素の固定と蒸散速度はCO2が350 ppm、温度が25℃、湿度が60%の条件下でphotosynthesis system HCM-1000 (Heinz Walz GmbH, Germany)を用いて行った。これらの測定は、午前１１時から午後１時の間に行った。【００５０】
実施例１：本発明蒸散抑制剤の製造
アファノティーキ・ハロフィチカのDnaK遺伝子を有するプラスミドpEADK1［Plant Mol. Biol., 35, 763-775(1997)］から、DnaK遺伝子を含むXbaI/BamHI断片（すなわち、制限酵素XbaI及びBamHIによる消化で得られるDNA断片）を切り出し、バイナリーベクターpBI121のXbaI／BamHI認識部位に導入した。この操作により、バイナリーベクターにおけるカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターとノパリン合成酵素（NOS）由来のターミネーターとの間に、アファノティーキ・ハロフィチカのDnaK遺伝子が導入されたpBI121-ADKが得られた。このプラスミドpBI121-ADKは、前記バイナリーベクターpBI121に由来するカナマイシン耐性遺伝子（NPTII）を選択マーカーとして有している。
このようにして得られたpBI121-ADKを凍結乾燥製剤の本発明蒸散抑制剤１とした。【００５１】
pBI121-ADKはイネ、ムギ等のイネ科植物、タバコ等のナス科植物、ノシバ等の芝植物、その他様々な植物（観葉植物等に対しても）に広く汎用的な本発明蒸散抑制剤に利用することができる。【００５２】
また、上記pBI121に挿入する前のDnaK遺伝子の上流にXbaIの粘着末端を連結したHVD1遺伝子を常法に従って連結させ、pBI121に導入して得られるpBI121-ADKHDを凍結乾燥して本発明蒸散抑制剤２を得ることができる。また、同様の手法を用いて、ProT遺伝子を用いた本発明蒸散抑制剤３（得られた組換ベクターは、pBI121-ADKPT）を得ることができる。【００５３】
同様にかずさDNA研究所から入手したシアノバクテリア由来の小HSP sHSPを組み込んだpBI121-SHを含む本発明蒸散抑制剤２を、同様にHSP60を組み込んだpBI121-H6を含む本発明蒸散抑制剤３を調製することができる。【００５４】
実施例２：本発明蒸散抑制剤のイネへの使用
実施例１で得られた本発明蒸散抑制剤１を、エレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）EHA101株に保持させた。この際、バイナリーベクターとしては、pCAMBIA［Nucleic Acid Res., 12, 8711-8721(1984)］を使用した。続いて、イネ（Oryza sativa L. Notohikari）の種子の胚由来の不定胚様カルス)に対して、本発明蒸散抑制剤含有アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて形質転換処理を行った。3%スクロース及び50 μg/mLハイグロマイシンを含有するムラシゲ・スクーグ寒天培地［Plant Physiol., 15, 473-497(1962)］上で無菌的に生長させ、合計250個の植物個体が得られた。この中から15種類の独立した形質転換体（F0）を選び、種子を採取した。15種類のF1の中から、DnaK-mRNAの発現量が多い４種類を選択し、種子を採取した。得られた4種類の形質転換体（F2）は、いずれも、基本的に同じ表現型を示した。以下、この内の1種類のイネを解析に使用した。
なお、対照としてpBI121のみを導入し5週間生育させた後のイネを用いた（図１）。【００５５】
その結果、本発明蒸散抑制剤１を適用したイネは、測定例に従って光合成活性を確認すると、対象の20%以上の亢進を示すことが明らかとなった。
一方、蒸散作用を測定例に従って測定すると、いずれも亢進は3%未満であることが明らかとなった（図２）。【００５６】
実施例３：本発明蒸散抑制剤のたばこへの使用
実施例１で得られた本発明蒸散抑制剤１を、エレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株に保持させた。この際、バイナリーベクターとしては、pCAMBIA［Nucleic Acid Res., 12, 8711-8721(1984)］を使用した。【００５７】
続いて、タバコ（Nicotiana tabacum PetitHavaba SR1）の葉から切り出した円形葉片に、前述の本発明蒸散抑制剤１を保持したアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて処理した。3%スクロース及び50 μg/mLカナマイシンを含有するムラシゲ・スクーグ寒天培地上で無菌的に生長させ、合計250個の植物個体が得られた。この中から15種類の独立した形質転換体（F0）を選び、種子を採取した。15種類のF1の中から、DnaK-mRNAの発現量が多い4種類を選択し、種子を採取した。得られた4種類の形質転換体（F2）は、いずれも、基本的に同じ表現型を示した。
このタバコと本発明成長促進剤１を作用させないタバコ（野生型タバコ）とを比較し、タバコにおける蒸散抑制効果を確認することができる。【００５８】
実施例４：本発明蒸散抑制剤のノシバへの使用
ノシバ（Zoysia japonica）のプロトプラストに、前記実施例１で調製した本発明蒸散抑制剤１を使用し、処理後のノシバを生育させ、このノシバと、本発明蒸散抑制剤１を作用させていないノシバ（野生型ノシバ）とを比較し、ノシバにおける蒸散抑制効果を確認することができる。【００５９】
実施例５：本発明蒸散抑制剤のベントグラスへの使用
クリーピングベントグラス（Agrostis stolonifera）のプロトプラストを、前記実施例１で調製した本発明蒸散抑制剤２を用いて処理し、このクリーピングベントグラスを生育させる。このクリーピングベントグラスの成長と、HVD1遺伝子のみを組み込んだ発現ベクターpBI121を導入したクリーピングベントグラスの成長とを比較することで、本発明蒸散抑制剤２の蒸散抑制効果を確認することができる。【００６０】
実施例６：本発明蒸散抑制剤のポプラへの使用
実施例１で得られた本発明蒸散抑制剤２を、エレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株に保持させた。この際、バイナリーベクターとしては、pE2113-Ω［Nucleic Acid Res., 12, 8711-8721(1984)］を使用した。【００６１】
続いて、ポプラ（Populus tremula）の苗から無菌条件下で取り出した胚軸を、前述の本発明蒸散抑制剤２を保持したアグロバクテリウム・ツメファシエンスの溶液に7分間浸漬した。その後、LS培地に置床し、2日間暗条件で生育させた。その後胚軸を取り出し、CIM培地（callus induction medium：LS培地に0.1 μmol/Lの4PPU、50 μg/mLのカナマイシン、300 μg/mlのカルベシリン、0.3%のゲルライトを含む）で育成させた。シュートが形成した後、シュートを切り出し、RIM培地（root induction medium：LS培地に4 μmol/Lのインドール酢酸、50 μg/mlのカナマイシン、300 μg/mlのカルベシリン、0.3%のゲルライトを含む）に移して育成させる。根が分化し、植物がある程度成長した後に、順化させて鉢に移して生育させて植物個体が得られた。この中から７種類の独立した形質転換体（F0）を選び、種子を採取した。5種類のF1の中から、DnaK-mRNAの発現量が多い4種類を選択したところ、得られた4種類の形質転換体（F2）は、いずれも、基本的に同じ表現型を示した。
このポプラと本発明蒸散抑制剤２を作用させないポプラ（野生型ポプラ）とを比較し、ポプラにおける蒸散抑制効果を確認できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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