【手続補正書】
【提出日】平成17年1月27日(2005.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  高親和性のペプチド含有ナノ粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ポリマーコア構造体を有するポリマーナノ粒子であって、ここで、該ポリマーコアは、疎水性／親水性ブロックコポリマーを含み、そして、該ナノ粒子は、該ポリマーコアに共有結合された少なくとも２個のペプチド部分により機能化され、該ペプチド部分は、生体分子に対して高い親和性を有し、かつ１型ペプチド、２型ペプチド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、そして該ナノ粒子は、高い含水量を有することによって特徴付けられる、ポリマーナノ粒子。
【請求項２】  前記ブロックコポリマーが、ポリ（アミノ酸）を含む、請求項１に記載のポリマーナノ粒子。
【請求項３】  請求項２に記載のポリマーナノ粒子であって、前記ポリ（アミノ酸）が、以下：
疎水性アミノ酸、中性アミノ酸、またはこれらの任意の２種のランダムコポリマーから構成される疎水性ブロック；および
親水性アミノ酸から構成される親水性ブロック、
を含む、ポリマーナノ粒子。
【請求項４】  請求項１に記載のポリマーナノ粒子であって、ここで、前記ブロックコポリマーが、ポリ（アミノ酸）疎水性ブロックおよびポリエチレングリコール親水性ブロックを含む、ポリマーナノ粒子。
【請求項５】  請求項１に記載のポリマーナノ粒子であって、ここで、前記ブロックコポリマーが、ポリカプロラクトン疎水性ブロックおよびポリエチレングリコール親水性ブロックを含む、ポリマーナノ粒子。
【請求項６】  ポリマーコア構造体を有するポリマーナノ粒子であって、ここで、該ポリマーコアは、架橋された親水性ポリマーを含み、そして該ナノ粒子は、該ポリマーコアに共有結合された少なくとも２個のペプチド部分により機能化され、該ペプチド部分は、生体分子に対して高い親和性を有し、かつ１型ペプチド、２型ペプチド、およびそれらの混合物からなる群から選択され、そして該ナノ粒子は、高い含水量を有することによって特徴付けられる、ポリマーナノ粒子。
【請求項７】  請求項６に記載のポリマーナノ粒子であって、ここで、前記親水性ポリマーは、架橋された親水性ビルディングブロックを含み、該親水性ビルディングブロックの少なくともいくつかは、炭水化物である、ポリマーナノ粒子。
【請求項８】  請求項７に記載のポリーナノ粒子であって、ここで、前記炭水化物は、グルコース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、フルクトースまたはタロースのような単糖類；マルトース、スクロース、ラクトース、またはトレハロースのような二糖類；三糖類；セルロース、デンプン、グリコーゲン、アルギネート、イヌリン、およびデキストランのような多糖類；修飾された多糖類；ソルビタン；ソルビトール；キトサン；またはグルコサミンから誘導される、ポリーナノ粒子。
【請求項９】  請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子であって、ここで、前記ペプチド部分は、１型ペプチドである、ポリマーナノ粒子。
【請求項１０】  少なくとも１個の１型ペプチド部分および少なくとも２個の２型ペプチド部分を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１１】  前記１型ペプチド部分に非共有的に結合された治療用タンパク質をさらに含み、そして該治療用タンパク質は、該ナノ粒子内に少なくとも部分的に取り囲まれている、請求項９または１０に記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１２】  前記ペプチド部分が、２型ペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１３】  請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子であって、前記ペプチド部分の少なくとも１個が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ
Ｐｈｅ−ＬｙｓおよびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓからなる群から選択される、ペプチド配列を含む、ポリマーナノ粒子。
【請求項１４】  請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子であって、前記ナノ粒子ポリマーコア構造体に共有結合された少なくとも１種のエンハンサー分子をさらに含む、ポリマーナノ粒子。
【請求項１５】  請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子であって、前記ナノ粒子ポリマーコア構造体に共有結合された少なくとも１種のポリエチレングリコール分子をさらに含む、ポリマーナノ粒子。
【請求項１６】  前記ペプチド部分が、ポリマー分子に直接的に共有結合されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１７】  前記ペプチド部分が、リンカー分子によってポリマー分子に共有結合されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１８】  前記リンカー分子が、ポリエチレングリコール鎖である、請求項１７に記載のポリマーナノ粒子。
【請求項１９】  生体分子標的の分子認識のための方法であって、該方法は、ポリマーコア構造体を有するポリマーナノ粒子に該生体分子標的を曝露する工程を包含し、該ポリマーコアが疎水性／親水性ブロックコポリマーまたは架橋された親水性ポリマーを含み、そして該ナノ粒子は、該ナノ粒子ポリマーコア構造体に共有結合された少なくとも２種のペプチド部分によって機能化され、該ペプチド部分の少なくとも１種は、２型ペプチドであり、そして該ナノ粒子は、高い含水性を有することによって特徴付けられる、
方法。
【請求項２０】  周囲に治療用タンパク質を制御可能に放出するための方法であって、該方法は、ポリマーコア構造体を有するポリマーナノ粒子を周囲に投与する工程を包含し、該ポリマーコアは、疎水性／親水性ブロックコポリマーまたは架橋された親水性ポリマーを含み、そして該ナノ粒子は、以下：
ｉ）該ナノ粒子ポリマーコア構造体に共有結合された少なくとも２種の１型ペプチド部分であって、該治療用タンパク質に対して高い親和性を有する、ペプチド部分；および
ｉｉ）該ペプチド部分に非共有結合的に結合され、そして該ナノ粒子内に少なくも部分的に取り囲まれた治療用タンパク質、
を含み、そして該ナノ粒子は、高い含水性を有することによって特徴付けられる、方法。
【請求項２１】  標的化された細胞または組織型の近傍への治療用タンパク質の制御された送達のための方法であって、該方法は、該標的化された細胞または組織型を含む周囲に、ポリマーコア構造体を有するポリマーナノ粒子を投与する工程を包含し、ここで、該ポリマーコアは、疎水性／親水性ブロックコポリマーまたは架橋された親水性ポリマーを含み、該ナノ粒子は、以下：
ｉ）各々が該標的化された細胞または組織型に対して高い親和性を有する、該ナノ粒子ポリマーコア構造体に共有結合された少なくとも２種の２型ペプチド部分；
ｉｉ）該治療用タンパク質に対して高い親和性を有する、該ナノ粒子ポリマーコア構造体に共有結合された少なくとも１種の１型ペプチド部分；および
ｉｉｉ）該１型ペプチド部分に非共有結合的に結合され、そして該ナノ粒子内に少なくとも部分的に取り囲まれた治療用タンパク質、
を含み、そして該ナノ粒子は、高い含水性を有することによって特徴付けられる、方法。
【請求項２２】  ペプチド官能基化ポリマーナノ粒子を合成するための方法であって、該ナノ粒子は、高い含水量を有することによって特徴付けられ、該方法は、以下：
親水性ビルディングブロックを含む水相を、少なくとも１種の界面活性剤を含む有機溶媒に添加する工程であって、該ビルディングブロックは、架橋可能な基を有する疎水性モノマーを含む、工程；
該ビルディングブロックを共有結合で架橋するために、該ビルディングブロックの該架橋可能な基を反応させて、親水性ポリマーナノ粒子を生成する、工程；
界面活性剤および該有機溶媒を取り除く、工程；
該ナノ粒子を含む溶媒に２型ペプチド部分を添加する工程であって、該ペプチド部分は、該ナノ粒子に結合するための官能基を含む、工程；および
該ペプチドとナノ粒子とを共有結合させるために、該ペプチド部分と該ナノ粒子とを反応させる、工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】  請求項２２に記載の方法であって、前記水相は、治療用タンパク質および１型ペプチド部分をさらに含み、該１型ペプチド部分は、前記ビルディングブロックに結合するための官能基を含み、かつ該治療用タンパク質に対して高い親和性を有する、方法。
【請求項２４】  請求項２２または２３に記載される方法であって、前記親水性ビルディングブロックの少なくともいくつかは、炭水化物を含む、方法。
【請求項２５】  請求項２４に記載の方法であって、前記炭水化物は、グルコース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、フルクトースまたはタロースのような単糖類；マルトース、スクロース、ラクトース、またはトレハロースのような二糖類；三糖類；セルロース、デンプン、グリコーゲン、アルギネート、イヌリン、およびデキストランのような多糖類；修飾された多糖類；ソルビタン；ソルビトール；キトサン；またはグルコサミンから誘導される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療物の分野に関する。より詳細には、本発明は、所望の治療特性を有する粒子に関する。
【０００２】
（発明の背景）
特定のペプチドは、高い親和性および選択性で特定のタンパク質に結合し得、そして従って、種々の分離、診断、および治療用途において利用され得る。しかし、インビボで、ペプチドは、しばしば血流から迅速に清澄化される。従って、治療ペプチドならびに他の治療剤の循環時間を増加する方法が、所望される。１つの戦略において、ペプチド、タンパク質、および超分子複合体（例えば、リポソーム）は、その循環時間を増加するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を用いて官能基化されてきた。新しい治療構築物および送達方法が、望ましい。
【０００３】
治療物のその意図される標的への結合強度の増加もまた、望ましい。バンコマイシンの場合、これは、バンコマイシン分子がオリゴマー（すなわち、二量体）を形成するオリゴマー形成を介して達成される（Ｒａｏら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６（６）：３５３−９  １９９９）。この二量体は、結合強度における実質的な増加を示す。多価の物質が例外的な結合性能を保有し得るので、その使用が、多くの研究者によって調査されている（Ｓ．Ｂｏｒｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，２０００年１０月９日、ｐ．４８−５３）。
【０００４】
インテグリンに結合するペプチド（例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含むペプチド）は、ナノ粒子表面に物理的に吸着されるかまたはこのナノ粒子内に分散される治療分子の経口送達を増強する目的で、アルキルシアノアクリレートナノ粒子に結合される（欧州特許６８４８１４を参照のこと）。同様に、ナノ粒子は、診断用途のためにタンパク質で官能基化されている。
【０００５】
治療腫瘍学における現在の研究の重要な領域は、抗脈管形成剤の開発に集中しており、この抗脈管形成剤は、血管の増殖を阻害または抑制することによって、腫瘍の脈管構造を標的する。ＲＧＤ含有ペプチドは、インテグリンαｖβ３レセプターを遮断し、そして新生血管内皮細胞のアポトーシスを迅速に開始することが示されている。さらに、これらは、いくつかの腫瘍細胞株の転移および腫瘍誘導性脈管形成を阻害することが示されている。αｖβ３インテグリン結合に選択的な短循環ＲＧＤ含有ペプチドが、開発されてきた（Ｒ．Ｈａｕｂｎｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：７４６１−７１，１９９７）。治療剤としての小さな循環ペプチドの利点は、その容易な合成、タンパク分解に対する耐性、および低い免疫原性である。
【０００６】
ナノ粒子は、治療剤の送達のため、およびその表面に高親和性結合エレメントを提示するための両方において使用され得る。ナノ粒子は、水溶液中でのポリ（アミノ酸）成分の自発的凝集から形成される（米国特許第５９０４９３６号）。従って、形成されたこの粒子は、薬物送達の使用を示し、この薬物は、この粒子内にカプセル化されている。
【０００７】
特定のタンパク質（例えば、インターロイキン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子を含むサイトカイン）の毒性は、これらが系の広範にわたる様式で与えられる場合に、その投薬量を制限する。しかし、このタンパク質が、このタンパク質の活性が所望される組織において局所的に濃縮される場合、全身的な毒性は実質的に低減され得る。このことを達成するための１つの方法は、融合タンパク質の生成を介する方法であり、ここで、サイトカインは、腫瘍特異的抗体ドメインに融合される（Ｘｉａｎｇ  Ｊ．，Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１９９９，９，２３−２６）。この腫瘍特異的抗体は、腫瘍中の抗原に結合し、これによって系全体にわたる循環からこの融合タンパク質を除去し、そしてこれらを腫瘍内で濃縮する。治療タンパク質を特定の組織に濃縮するための他の方法は、価値がある。
【０００８】
ブロックコポリマーは、インビボ使用のためのナノ粒子を形成するために有利に使用され得る。アルミニウムポルフィリン複合体は、種々の環状エーテルおよびエステル（エポキシド、ラクトン、およびラクチドを含む）を重合し、そして酸無水物または二酸化炭素と共にエポキシドのコポリマーを生成することが公知である（Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．１９８８，Ａ２５，５７１）。これらのポリマーの多くは、一般に、低い（存在する場合）毒性および免疫原性という所望の特徴の多くを有することが認識され、そしてこれらは、身体から迅速に清澄化される。さらに、この重合系の「生きた」性質は、狭い分子量分布のブロックコポリマーの調製を可能にする。ポリ（  −カプロラクトン）ｃｏ（エチレンオキシド）ジブロックコポリマー（Ｇａｎ，Ｚ．；Ｊｉａｎｇ，Ｂ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９９６，５９，９６１）は、ナノ粒子を迅速に形成し、そして酵素分解を受けることが示されている（Ｇａｎ，Ｚ．；Ｊｉｍ，Ｔ．Ｆ．；Ｌｉ，Ｍ．；Ｙｕｅｒ，Ｚ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｗｕ，Ｃ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９９，３２，５９０）。ナノ粒子はまた、水溶液中でのポリ（アミノ酸）（ＰＡＡ）ブロックコポリマーの自発的凝集から形成される（米国特許第５９０４９３６号）。ＰＥＧ−ＰＡＡブロックコポリマー（ＰＥＧブロックは親水性であり、そしてＰＡＡブロックは、疎水性のアミノ酸またはアミノ酸誘導体（例えば、β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸）からなる）もまた、ナノ粒子を形成するために使用され、そしてさらに、低分子の送達における使用のために研究されている（Ｋｗｏｎ，Ｇ．Ｓ．；Ｎａｉｔｏ，Ｍ．；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．；Ｏｋａｎｏ，Ｔ．；Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．；Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １９９５，３２，１９２；Ｙ．Ｊｅｏｎｇ，Ｊ．Ｃｈｅｏｎ，Ｓ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｎａｈ，Ｙ．Ｌｅｅ．Ｙ．Ｓｕｎｇ，Ｔ．ＡｋａｉｋｅおよびＣ．Ｃｈｏ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８，５１，１６９）。
【０００９】
重合は、ミクロエマルジョンおよび逆ミクロエマルジョンの分散相中で実施される（総説については、Ａｎｔｏｎｉｅｔｔｉ，Ｍ．；およびＢａｓｔｅｎ，Ｒ．；Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９５，１９６，４４１を参照のこと）；逆ミクロエマルジョンの分散水相中での親水性モノマーの重合の研究については、Ｈｏｌｔｚｓｃｈｅｒｅｒ，Ｃ．；およびＣａｎｄａｕ，Ｆ．；Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ，１９８８，２９，４１１を参照のこと）。ミクロエマルジョンの重合は、５ｎｍ〜５０ｎｍのサイズ範囲の粒子を生じ得る。
【００１０】
ナノ粒子それ自体が生物活性を示すようなナノ粒子の改変は、望ましくあり得る。好ましくは、このようなナノ粒子は、構築が容易であるべきであり、意図される分子標的に強力かつ特異的に結合すべきであり、生態適合性であるべきであり、身体内で非毒性物質へと代謝されるべきであり、非免疫原性であるべきであり、そして血流からの所望でないクリアランスを回避するように設計されるべきである。循環時間は、通過サイズに一部影響を受け得る。ＲＥＳ系による取り込みを避けるために、５０ｎｍ未満の粒子が好ましい。腎臓のクリアランスを避けるために、５ｎｍより大きな粒子が好ましい。また、上記のように、循環時間はまた、この粒子の表面上のＰＥＧの存在によって延長され得る。特定の治療物の標的された送達もまた、有益である。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、生体分子標的に対する高い親和性を有する２つ以上のペプチド部分で各々が官能基化されたナノ粒子である、水溶性ポリマーナノ粒子に関し、このペプチドは、ナノ粒子ポリマーマトリックス構造または核に共有結合されている。このナノ粒子は、必要に応じて、標的化および／または送達を容易にするための１つ以上のエンハンサー分子をさらに含み得るか、またはこれらは、必要に応じて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの分子を含み得る。このＰＥＧ鎖は、リンカーまたはつなぎ鎖として役立ち得、一端がナノ粒子表面に結合し、そして他端が高親和性ペプチドで官能基化されている。本発明はさらに、これらのポリマーナノ粒子を合成する方法、およびこれらが使用され得る種々の用途に関する。本明細書中に開示される本発明のナノ粒子は、ペプチド官能基化ナノ粒子（ＰＦＮ）と呼ばれる。
【００１２】
本発明の粒子は、好ましくは、直径約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ、より好ましくは約５ｎｍ〜約１００ｎｍであり、そして最も好ましくは、５〜３０ｎｍである。この粒子サイズは、生理活性物質としてのそのインビボでの使用を可能にする。
【００１３】
ナノ粒子当りの高親和性ペプチド（「ＨＡＰ」）部分の数は、２〜約１０００、好ましくは２〜１００、および最も好ましくは、２〜３０の範囲であり得る。ナノ粒子は、必要に応じて、さらに、１より多くの型の高親和性ペプチドからなり得る。本明細書中で使用される場合、ペプチドの「型」は、特定の分子構造のペプチドとして定義される。
【００１４】
高親和性ペプチドの１つの型（本明細書中で、「１型ペプチド」と呼ぶ）は、治療的に有用なタンパク質またはタンパク質フラグメント（本明細書中では、「治療タンパク質」と呼ぶ）をこのナノ粒子に結合するように働く。高親和性ペプチドの別の型（本明細書中では、「２型ペプチド」と呼ぶ）は、本発明のポリマーナノ粒子を、所定の細胞型の表面上または特定の組織型中で発現される標的タンパク質に結合するように働く。
【００１５】
ペプチド単独と比較する場合、本明細書中に開示されるペプチド官能基化ナノ粒子は、有利なことに、より長い循環時間を有し得る。さらに、ＰＦＮは、その標的により強力に結合し得、そしてより低い免疫原性を示し得る。このナノ粒子は、哺乳動物において無毒性の物質へと代謝される生物分解性成分からなる。
【００１６】
本発明のさらなる利点は、相補的な特徴を有する複数の高親和性ペプチド型が、単一のナノ粒子内に組み込まれ得るということである。これは、例えば、１つまたは１つより多くの標的化ペプチドを使用して、治療ナノ粒子が、所望の細胞型、組織、または器官に標的されること；あるいは治療タンパク質が、所望の標的部位に送達されることを可能にし得る。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、ナノ粒子コアは、疎水性／親水性ブロックコポリマーからなる。使用されるブロックコポリマーは、特定の条件下で、水性の系中でナノ粒子を自発的に形成する特性を有する。好ましくは、このブロックコポリマー鎖は、少なくとも２つの型の反復モノマーからなる。好ましいブロック形態は、ＡＢ型またはＡＢＡ型である。「Ａブロック」は、親水性であり、例えばポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシドである。「Ｂブロック」は、疎水性および中性であり、例えば、ポリカプロラクトンである。狭い分子量分布を有するブロックコポリマーが好ましい。その分解性、生体適合性、十分に実証された合成、化学的性質の目的適合性（ｔａｉｌｏｒａｂｉｌｉｔｙ）、およびその架橋の容易さのために、ポリ（アミノ酸）（「ＰＡＡ」）が、本発明における疎水性ビルディングブロックとして好ましい。これらは、同様に、親水性ブロックの形成において利用され得る。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、ナノ粒子コアは、架橋した親水性ビルディングブロックからなる。これらのナノ粒子は、最初に、ナノ粒子コアを、逆ミクロエマルジョンの分散した水相中でのこのビルディングブロックの架橋を介して形成することによって、作製される。この架橋可能な部分は、好ましくはアクリレートまたはアクリルアミドである。炭水化物誘導体は、好ましくはビルディングブロックとして使用される。
【００１９】
本発明の１つの実施形態は、生体分子標的の分子認識のための方法に関する。より詳細には、この実施形態は、特定の生体分子標的に対する高い親和性を有する２型ペプチド配列からなるナノ粒子に関し、このペプチドは、親水性ポリマーまたはブロックコポリマーナノ粒子マトリックス分子に共有結合している。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、タンパク質治療剤（親水性タンパク質を含む）は、薬物送達用途のためのナノ粒子構築物に組み込まれる。より詳細には、この実施形態は、治療タンパク質を制御可能に放出するナノ粒子医薬に関する。この実施形態において、このナノ粒子は、３つの型の分子構築物からなる：ナノ粒子マトリックス分子、治療タンパク質に対する高い親和性を有する１型ペプチド配列、および治療タンパク質。この治療タンパク質−ペプチドの親和性は、使用におけるナノ粒子中の治療タンパク質の保持を可能にし、このタンパク質の循環時間を伸張する。治療タンパク質に高親和性で結合し得る１つ以上のペプチド型が、使用され得る。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、標的された細胞または組織型の付近に治療タンパク質を制御送達する方法を提供する。この実施形態のナノ粒子は、４つの型の分子構造からなる：ナノ粒子マトリックス分子、治療タンパク質に対する高い親和性を有する１型短ペプチド配列、特定の細胞上または特定の組織中で発現されるタンパク質に対する高い親和性を有する２型短ペプチド配列、ならびに治療タンパク質。従って、治療剤として投与される場合、治療タンパク質を含むナノ粒子は、標的化されたタンパク質を発現する組織または細胞の表面に濃縮する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
用語「１つの（「ａ」および「ａｎ」）」は、本明細書中で使用される場合、「１つ以上の」を意味する。
【００２３】
「水溶性」によって、本明細書中または添付の特許請求の範囲において、水中での１０ｍｇ／ｍＬより高い溶解度、そして好ましくは５０ｍｇ／ｍＬより高い溶解度を有することが意味される。
【００２４】
高親和性分子からなるナノ粒子が提供される；このナノ粒子は、水溶性であり、そしてインビボ送達し得る。より詳細には、各ポリマーナノ粒子は、生体分子標的に対する高い親和性を有する２つ以上のペプチド部分で官能基化され、このペプチド部分は、ナノ粒子ポリマーマトリックス構造物に共有結合されている。本発明は、さらに、これらのポリマーナノ粒子を合成する方法、およびこれらが使用され得る種々の用途に関する。
【００２５】
本発明のナノ粒子は、直径が約５ｎｍ〜約１０００ｎｍのサイズ範囲、より好ましくは約５ｎｍ〜約１００ｎｍであり得、そして最も好ましくは約５ｎｍ〜約３０ｎｍである。５〜３０ｎｍのサイズ範囲のナノ粒子は、腎臓のクリアランスおよび細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みを効率的に回避し得る。さらに、小さな粒子は、所望の細胞、組織、または器官標的に到達するために、有利に血流を抜け出し得る。
【００２６】
ナノ粒子当たりのＨＡＰ部分の数は、２〜約１０００、好ましくは２〜１００、そして最も好ましくは２〜３０の範囲であり得る。このナノ粒子は、必要に応じて、さらに、１つより多くの型の高親和性ペプチドからなり得る。本明細書中で使用される場合、ペプチド「型」は、特定の分子構造として定義される。
【００２７】
本発明に従う高親和性ビルディングブロックとして使用されるペプチドは、一般に、１０−４Ｍと１０−９Ｍとの結合親和性を有する。この高親和性ペプチドは、目的のレセプターに対する公知のペプチドリガンドからなり得る。例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅのペプチドリガンド−レセプターライブラリー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｏｅｎｉｘｐｅｐｔｉｄｅ．ｃｏｍ／Ｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｙｌｉｓｔ．ｈｔｍ）は、潜在的に治療的に有用なレセプターについての数千の既知ペプチドリガンドを含む。ＨＡＰは、例えば、ラクタム、ダラージン（ｄａｌａｒｇｉｎ）および他のエンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシンＩＩ、ゴナドトロピン放出ホルモン、トロンビンレセプターフラグメント、ミエリン、および抗原性ペプチドのような天然のペプチドである。本発明において有用な高親和性ペプチドビルディングブロックは、目的のタンパク質についてのペプチドライブラリーの高スループットスクリーニングを介して発見され得る（例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはビーズ上で示される直線配列のライブラリー）。このようなスクリーニング方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ，Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ，Ｇ．Ｊ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。この高親和性ペプチドは、改変されたアミノ酸または完全な合成アミノ酸からなり得る。
【００２８】
この高親和性ペプチドの認識部分の長さは、約３〜約１００アミノ酸で変化し得る。好ましくは、このペプチドの認識部分は、約３〜約１５アミノ酸、そしてより好ましくは３〜１０アミノ酸の範囲である。より短い配列が好ましい。なぜなら、１５アミノ酸未満のペプチドは、より長いペプチド配列と比較して低免疫原性であり得るためである。小さなペプチドは、そのライブラリーが、迅速にスクリーニングされ得るというさらなる利点を有する。また、これらは、固体状態技術を使用して、より容易に合成され得る。
【００２９】
ナノ粒子を作製するための、同じ分子構造または異なる分子構造の複数の高親和性ペプチド分子の使用は、このナノ粒子の結合活性を増加し得る。本発明において使用される場合、「高親和性」は、１０−４Ｍより強い結合定数での、単一ペプチドの単一標的分子への結合を意味するが、「結合活性」は、２つ以上のこのようなペプチド単位の、細胞または分子複合体上の２つ以上の標的分子への結合を意味する。
【００３０】
いくつかの実施形態における試薬および出発物質は、商業的に得られ得る。例えば、アミノ酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、およびＣｈｅｍｄｅｘ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍｄｅｘ．ｃｏｍ）のような化学薬品卸業者から購入され得る。さらに、化学製品要覧および資源（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｑ／ｃｈｅｍｃｙ／）は、出発物質を位置付けるために使用され得る。高親和性結合剤として使用されるべきペプチドは、多くの供給業者から購入され得、その１つはＰｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｗｗｗ．ｐｅｐｔｉｄｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｃｏｍ）である。
【００３１】
ナノ粒子コアは、迅速に合成され、所望の時間スケールで身体内で分解され、無毒性であり、高親和性ペプチドでの容易な官能基化を可能にし、そして治療剤および他の治療物質のタンパク質の封入を可能にするように選択される。
【００３２】
（Ｉ．ブロックコポリマーを含むＰＦＮ）
ナノ粒子コアがブロックコポリマーを含む場合、このブロックコポリマーは、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含む。この構造を有するポリマー材料は、本発明における使用に好ましい構造を有するナノ粒子の形成に従うことが知られている。この疎水性ブロックおよび親水性ブロックは、非毒性かつ非免疫原性であることが知られている物質を含み、この物質は、身体内での分解および浄化機構によって排除され（これらの特性を有するポリマーの総説については、Ａｍａｓｓ，Ｗ．，Ａｍａｓｓ，Ａ．，Ｔｉｇｈｅ，Ｂ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９８，４７，８９を参照のこと）、そしてまた、ペプチド、タンパク質または薬学的因子で容易に官能基化されるナノ粒子の調製を可能にする。ペプチド官能基化ナノ粒子の調製のためにこれらの材料を合成することが必要である先行技術に対する利点、改良、改変が、本明細書中に記載される。
【００３３】
１実施形態において、本発明において使用される疎水性／親水性ブロックコポリマーは、大部分がＩｎｏｕｅによって開発されたアルミニウムポルフィリン化学を使用して合成され得る（Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．１９８８，Ａ２５，５７１；および本明細書中でアルミニウムポルフィリンリビング重合の総説について引用された参考文献を参照のこと）。アルミニウムポルイフィリン錯体は、種々の環式エーテルおよびエステル（エポキシド、ラクトン、およびラクチドを含む）を重合し、エポキシドと、酸無水物または二酸化炭素とのコポリマーを形成することが知られている（Ｉｎｏｕｅ，同書）。これらのポリマーの多くは、一般に、（もしあったとしても）低い毒性および免疫原性の所望の特徴の多くを有することが認識されており、身体から容易に清浄化される。この重合系の「リビング（ｌｉｖｉｎｇ）」性質に起因して、ブロックコポリマーが、調製され得る。
【００３４】
アルミニウムポルフィリン化学を使用する合成の１つの例として、ポリ（ε−カプロラクトン）−コ（エチレンオキシド）ジブロックコポリマーが、反応スキーム１に示されるように調製され得（Ｇａｎ，Ｚ．；Ｊｉａｎｇ，Ｂ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，５９，９６１）、酵素分解を引き起こすナノ粒子を容易に形成する（Ｇａｎ，Ｚ．；Ｊｉｍ，；Ｔ．Ｆ．；Ｌｉ，Ｍ．；Ｙｕｅｒ，Ｚ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｗｕ，Ｃ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９９，３２，５９０）。ＰＥＧは、ＰＥＧが付着される実体物の循環時間を増加し、免疫系成分とＰＥＧ化した実体物との相互作用を妨害するＰＥＧの能力が当該分野で周知（ｗｅｌｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ）であるため、好ましい親水性ブロックである。
【００３５】
【化１】
2004500438.tif 000001
ポリ（ε−カプロラクトン）コ（エチレンオキシド）ジブロックコポリマーの首尾一貫した合成は、ペプチド官能基化ナノ粒子の調製に使用され得る追加のコポリマーの調製のための有用なペンダントとして役立つ。ε−カプロラクトンのプロパンオキシド、１，２−ブテンオキシド、３，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ラクチド）、またはエキレンオキシドと無水コハク酸との混合物による置換は、新規な親水性／疎水性ブロックコポリマーの調製のための経路（反応スキーム２）を提供する。
【００３６】
【化２】
2004500438.tif 000002
一旦、疎水性／親水性ブロックコポリマーが合成されると、それらは、活性因子、すなわちペプチド、タンパク質、または誘導体化ペプチドおよびタンパク質構造、ならびに薬学的化合物に容易に結合する官能基を含むことが有機合成の当業者に公知の技術によって改変され得る。カップリング反応は、化学選択的連結反応を使用することによって活性因子の特異点で起こるように設計される。この反応部分は、代表的にペプチドまたはタンパク質上に見られるアミン、アルコール、およびカルボキシルのような他の部分とよりむしろ、優先的に互いに反応する。種々の化学選択的反応が同定され、最近概説されており（Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｇ．Ａ．，；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６，５０６）、これらの戦略の多くが、現在の発明に使用され得る。幾つかの可能な化学選択的連結反応のうちの１つの有用性を証明する例として、上記スキームに記載されたポリマーの第１のブロック上に位置付けされた末端クロリドは、ナトリウムスルフヒドリドとの反応によってチオールに容易に転化される（Ｍａｒｃｈ，Ｊ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，４０６〜４０７頁）（反応スキーム３）。
【００３７】
【化３】
2004500438.tif 000003
単離後、チオール含有ポリマーは、チオールのα−ブロモカルボニル官能基との高選択的反応によってペプチドに結合され（反応スキーム４）（例えば、Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｗ．Ｈ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，７７０１を参照のこと）、官能基が容易にリシン含有ペプチドに導入される（例えば、Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，７２６３を参照のこと）。
【００３８】
【化４】
2004500438.tif 000004
さらに、粒子形成後に架橋され得る官能基が、含まれ得る。好ましくは、架橋可能な部分は、粒子間架橋の発生を減少させるために疎水性ブロック内に含まれる。例えば、疎水性ブロックの形成の間における重合溶液中の少量の１，２−エポキシ−４−ペンタノンエチレンケタールの封入は、疎水性ブロック中に幾つかの環式ケタールを組み込む。次いで、これらのケタールは、酸性水に対する曝露の際に切断され得、ケトン官能基を再生する。次いで、このケトン官能基は、エチレンジアミンから形成される化合物のようなジ（アミノ−オキシ）含有化合物との反応によって架橋され得る（スキーム５）。
【００３９】
【化５】
2004500438.tif 000005
糖質「ブロック」由来のエポキシドまたは環式エステルのアルミニウムポルフィリンリビング重合（反応スキーム６）から作製された新規ポリマーが、使用され得る。これらのブロックコポリマーは、デキストラン／スチレンまたはデキストラン／アクリレートブロックコポリマーと同様の特性を有し、この合成は、Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．；Ｏｈｎｏ，Ｋ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００，１，１５２で議論されている。しかし、このデキストラン／エポキシドまたはデキストラン／環式エステルは、非毒性であるとして一般に受容され、身体から排除される非毒性分解産物に分解され得るポリマーセグメントからなるというさらなる利点を有する。
【００４０】
【化６】
2004500438.tif 000006
上記デキストランコポリマーは、この点でナノ粒子を形成し得、本発明における使用のために、それらは、高親和性ペプチドまたはＰＥＧリンカーに対する化学選択的連結を引き起こすか、またはブロックコポリマー鎖の架橋を容易にするために、最初に改変されなければならない。これを達成する１つの方法は、反応スキーム７に概略化した一連の反応を介する。このコポリマーは、まず、１，１’−カルボニルジイミダゾールと反応され、次いで、エチレンジアミンの添加によってデキストランブロックにアミン官能基が導入される。ブロモ無水酢酸によるさらなる改変は、デキストラン上のα−ブロモカルボニル基を脱離する。以前のように、この基は、ペプチドのシステイン残基またはチオール末端ＰＥＧの側鎖のようなチオールに化学選択的に連結され得る。有機合成、ペプチド合成、または生化学の当業者は、追加の官能基が、連結工程（例えば、ヒドラジド、アミノオキシ、チオセミカルバジド、α−アミノチオール、ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、ハロゲン、トシレート、およびカルボジイミドで補助したエステルおよびアミド形成が挙げられるが、これらに限定されない）のために使用され得ることを理解する。
【００４１】
【化７】
2004500438.tif 000007
改変したブロックコポリマーは、反応スキーム４に示されるようなチオール含有分子と反応する。
【００４２】
ＰＥＧ−ポリカプロラクトンブロックの場合、粒子形成後に架橋され得る官能基が含まれ得る。好ましくは、この架橋可能な部分は、粒子間架橋の発生を減少させるために、疎水性ブロック内に含まれる。これは、例えば、重合混合物中の１，２−エポキシ−４−ペンタノンエチレンケタールの封入、脱保護、および上記のようなジ（アミノ−オキシ）含有化合物との架橋によって達成され得る。
【００４３】
それらの分解性、生体適合性、周知の合成、化学的性質の変更性、それらが架橋され得る容易さのために、ポリ（アミノ酸）（「ＰＡＡ」）は、本発明において、疎水性構築ブロックとして好ましい。さらに、それらは、さらに親水性ブロックを形成する際に使用され得る。
【００４４】
ＰＡＡコアは、例えば、米国特許第５，９０４，９３６号において議論される標準的なアミノ酸連結方法を使用して合成され得る。しかし、’９３６で使用される重合方法は、広い分子量分布およびあまり理解されていない構造を生じ得る（Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３９０，３８６〜３８９；Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，２７５９〜２７６０；およびそれらの文献に引かれている参考文献）。例えば、’９３６で議論されるように、ブロック構造は、それがより低い分子量のコロイド粒子形成するため、所望され得る。理論に束縛されることを望まないが、’９３６で使用される重合方法は、このような十分に規定されたブロック構造を有さず、むしろポリマー種の複合混合物を有する鎖を生成し得、このような構造は、安定なコロイド粒子を形成しない。従って、別個の構造を有する十分に特徴づけされたＰＡＡを単離するために、Ｄｅｍｉｎｇ（前出Ｄｅｍｉｎｇ；Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９９，３２，４５００〜４５０２）によって最近開発されたリビング重合方法を使用する制御された重合スキームを介して、ＰＡＡ鎖を合成することが有利であり得る。
【００４５】
ＰＡＡ疎水性ブロックおよびＰＥＧ親水性ブロック：この実施形態において、ＰＡＡブロックは、疎水性アミノ酸およびそれらの誘導体（例えば、Ｌｅｕ、ｌｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびβ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸）を含む。ＰＥＧは、幾つかの方法を使用して、ブロックに結合され得る。例えば、ＰＥＧは、ペプチド合成の当業者に公知であるカルボジイミドカップリング反応（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６）を介して、ＰＡＡ（カルボン酸またはアミン末端のいずれか）に結合され得る。このＰＥＧは、それが固相ペプチド合成に使用される樹脂上にある間、またはＰＡＡがこの樹脂から切断された後に、ＰＡＡに結合され得る。あるいは、α−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）の遷移金属媒介重合の使用は、それらの合成の間のＰＡＡの末端基官能基化を可能にする（Ｃｕｒｔｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，７４２７〜７４２８）。この技術は、遷移金属錯体上でのＰＥＧ官能基化開始リガンドを使用することによってＰＡＡ−ＰＥＧ化合物の合成の際に補助するために適応され得る。このＰＥＧ官能基化開始リガンドは、ＮＣＡの重合を開始し、ＰＡＡ鎖に共有結合されたままであり、所望のブロック構築物を与える。
【００４６】
ＰＡＡ疎水性ブロックおよびＰＡＡ親水性ブロック：この実施形態において、ポリ（アミノ酸）鎖（「ＰＡＡ」）は、疎水性アミノ酸および中性アミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）と、親水性アミノ酸（例えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）のブロックからなる。好ましくは、イオン性アミノ酸は、カルボキシル官能基を有する側鎖を有する（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）。各ブロックのアミノ酸の型を、１つまたは２つのペプチドに限定することが望ましくあり得る。例えば、疎水性ブロックは、全体として、ロイシンからなり得るか、またはロイシンとバリンのランダムコポリマーであり得る。最も好ましくは、親水性ブロックは、全体としてＧｌｕからなるが、一方で、疎水性ブロックは、ＬｅｕとＶａｌとのコポリマーである。これらのＰＡＡは、好ましくは、例えば、ＡＢまたはＡＢＡ型のブロックの形態である。
【００４７】
ＰＡＡ架橋：自発的な形成の後、ナノ粒子構造は、さらに、ブロックコポリマー鎖を架橋することによって安定化され得る。このような架橋は、ポリマー分野の当業者に一般に公知のいくつかの方法によって達成され得る。１つの方法は、鎖構造にアミン残基（例えば、ＰＡＡ構造におけるリジン）を含むことである。アミン残基の割合は、ナノ粒子を形成する能力が、許容可能な程度を越えて減少しないように十分に低くあるべきである。次いで、これらのアミン残基は、例えば、試薬Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドアクリレートを使用することによって、アクリレート部分で官能化され得る。自発的なナノ粒子形成に続いて、同じナノ粒子内の異なる鎖からのアクリレート官能基を、標準的なフリーラジカル重合技術を使用して、一緒に連結され得る。あるいは、グルタルアルデヒドまたは当該分野で周知の他の試薬（例えば、Ｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６を参照のこと）がまた、鎖に含まれるアミン残基を架橋するために使用され得る。ＨＡＰをブロックコポリマー連結する場合のように、ブロックコポリマーに鎖の互いの架橋がまた、化学選択的結合対を使用して達成され得る（Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｇ．Ａ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６，５０６）。これらの試薬が、ＨＡＰの部分またはタンパク質に対して低い反応性のみを有するか、または反応性を有さない、化学選択的反応対が、好ましい。
【００４８】
好ましくは、架橋は、粒子間反応を減少するために、ナノ粒子の表面から離れた、疎水性ブロックにおいて実施される。化学選択的反応対が使用される場合、ブロックコポリマー鎖は、レブリン酸官能化アミン末端またはリジン残基（この目的のために、合成の間疎水性ブロックに分散される）、およびアミノオキシ基を介してブロックコポリマーに含まれるケトン基を通して架橋され得る。
【００４９】
ペプチド結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）：２型高親和性ペチチドは、最も高い程度の生物学的活性のために、得られたナノ粒子の表面かまたはその近傍に位置すべきである。このペプチドを粒子の表面の近傍に配置するために、ＨＡＰは、好ましくは、ブロックコポリマー鎖の一方の末端または両方の末端に結合され得る。あるいは、ＨＡＰは、ＨＡＰ分子を、ブロックコポリマー鎖に沿う１つ以上の残基に結合することによって組み込まれ得る。１つの実施形態において、構築物は、ＡＢＡ型のものであり得、このＢブロックは、疎水性ポリマーからなり、Ａブロックは、親水性ブロックからなり、そしてこの高い親和性ペプチドは、親水性ポリマーブロックの末端に結合される。あるいは、高密度のペプチドが、ブロックコポリマー鎖に沿う複数の残基または中程度の分子への結合によって組み込まれ得る。好ましくは、これらのＨＡＰは、親水性ブロックの自由末端に結合される。
【００５０】
ＨＡＰ分子は、ナノ粒子形成の前か、ナノ粒子が形成された後、ブロックコポリマー分子に直接結合され得るか、またはＰＥＧ−ブロックコポリマー分子を介して結合され得る。理論に束縛されることを望まないが、ＨＡＰが、ナノ粒子形成の前に、コポリマー鎖に結合される場合、コポリマーのコロイド分散系の自発的な、熱力学的に駆動された形成を乱す可能性を減少されるために、３〜１０アミノ酸の短いＨＡＰ配列が、より長い配列とは反対に好ましい。このナノ粒子が、ＰＥＧ鎖からなる場合、これらのペプチドは、粒子形成の前、その間、またはその後に、ＰＥＧ分子の自由端に結合され得る。
【００５１】
さらに、ＨＡＰのブロックコポリマーへの結合は、ペプチド合成の当業者に公知の標準的なカップリング技術を使用してコポリマー側鎖への結合を介して達成され得る（Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．，前出；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ，Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．，前出）、例えば、これは、ＨＡＰのアミノ末端を、ＰＡＡのＧｌｕまたはＡｓｐのカルボン酸側鎖に結合することによって達成され得る。逆に、ＨＡＰのカルボン酸末端は、ＰＡＡ中の、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＨｉｓの窒素含有官能基に共有結合され得る。ここで、ＰＡＡまたは高親和性ペプチドのいずれかのカルボン酸末端は、活性化エステルに転換され（ＤＣＣまたは他の試薬を用いて）、そして反応パートナーのアミン官能基を用いて縮合される。
【００５２】
これらのブロックコポリマーはまた、化学選択的連結反応を可能にする官能基を含むように、有機合成の当業者に公知の技術によって改変され得る  （Ｌｅｍｉｅｕｘ，同書）。反応部分は、優先的に、ペプチドまたはタンパク質上に代表的に見出されるアミン、アルコールおよびカルボキシルのような他の部分よりはむしろ互いに反応する。いくつかの可能な化学選択的連結反応の１つの有用性を実証する例として、ＰＡＡ上のチオール含有官能基（これは、システイン残基の組み込みによって含まれ得る）またはチオール末端ＰＥＧが、チオールとα−ブロモカルボニル官能基（例えば、Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｗ．Ｈ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，７７０１を参照のこと）、官能基（これは、リジン含有ペプチドまたはタンパク質に容易に導入される）（例えば、Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３，１１５，７２６３を参照のこと）との高度に選択的な反応によってペプチドに結合される。
【００５３】
ＰＥＧは、ナノ粒子を生成するために使用されるブロックコポリマー中の親水性ブロックとして使用され得る。あるいは、これらのナノ粒子を生成するために使用されるブロックコポリマーは、他のポリマーからなり、例えば、親水性ＰＡＡブロックが使用され得る。後者の場合において、ナノ粒子形成の後、文献に十分に記載されるＰＥＧ化の利点のために、ナノ粒子表面をＰＥＧ鎖で官能化することが有益であり得る。以下に議論されるように、二官能性ＰＥＧ鎖が、高親和性ペプチドをこの表面に連結するために使用され得るか、または一官能性ＰＥＧ鎖が、表面を改変するために使用され得る。
【００５４】
ＰＥＧは、優先的にヘテロ二官能性またはホモ二官能性であり、約１，０００と約２０，０００との間の平均分子量である分子量を有する。
【００５５】
この用途のために、両方の末端が同じ反応性部分を有して終結する二官能性ＰＥＧまたは２つの異なる反応性部分を有して終結するヘテロ二官能性ＰＥＧが、使用され得る。ＰＥＧの末端として使用され得る代表的な反応性基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミン、アルデヒド、−ハロ、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジド、チオール、ケトン、ハライド、およびエポキシド。二官能性ＰＥＧの場合において、２つの同一な基が、ＰＥＧの各末端に位置する。ヘテロ二官能性ＰＥＧは、ＰＥＧの各末端に位置する１つの固有な基を有する。次いで、ＰＥＧのナノ粒子への結合が、例えば、ＥＤＣのようなカルボジイミドを使用して、コポリマー鎖のカルボキシ末端をＰＥＧ鎖のアミノ末端に連結することによって達成され得る（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６）。ＰＥＧがナノ粒子に結合された後、ＰＥＧ鎖の一部分の反応性自由端が、ＨＰＡ分子と反応し得る。
【００５６】
ＨＡＰペプチドは、１つのポリペプチドのＰＥＧ末端に結合され得、引き続いてＨＡＰ−ＰＥＧ分子が、ＰＡＡまたは他のＰＥＧ末端を介してナノ粒子に結合され得る。このＨＡＰは、ＰＥＧへの結合の前に、その全体が形成され得るか、またはそれは、ＰＥＧ末端への１つのアミノ酸の連続的な結合によって形成され得る。後者の方法を使用して、ナノ粒子に結合されるＰＥＧ末端は、固相ペプチド合成のために使用される樹脂に結合され得る。例えば、ジアミノＰＥＧが出発物質として使用され得る。このポリマーは、この手順のために適切であることが見出され得る種々の樹脂（例えば、ＰＥＧＡ樹脂）に結合され得る（例えば、ＰＥＧ−ペプチド結合体の例については、Ａｕｚａｎｎｅａｕ，Ｆ．Ｉ．；Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．；Ｂｏｃｋ，Ｋ．；Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１９９１，１，３１を参照のこと）。次いで、このＨＡＰは、固相ペプチド合成に使用される標準的な試薬および手順を使用して、未反応のＰＥＧ末端から生長される。好ましくは、これらの手順は、ペプチドのポリアミド骨格の調製のために、ＦＭＯＣベースまたはＢＯＣベースの保護基ストラテジーを使用し、そしてＤＣＣを使用するか、またはＴのカルボン酸活性化試薬を使用する。配列の完成の際に、このＰＥＧは、基質樹脂から切断され、ＰＥＧを樹脂に結合するために使用されたＰＥＧ末端を再生する。切断剤の正確な性質が、ペプチドに存在する他の官能基および基質樹脂の同定によって決定される。トリチル官能化樹脂が使用される上に概略された好ましい例において、切断は、塩化メチレン中のＴＦＡを使用して達成される。一旦自由になると、この末端は、必要ならば、ナノ粒子への結合を補助する所望の官能基への引き続く改変を受け得る。例えば、ＢＯＣ−アミノオキシ酢酸への結合は、ＢＯＣ保護基のＴＦＡでの除去の後に、アミノオキシ官能化ＰＥＧ末端を生じる。次いで、このアミノオキシ部分は、ブロックポリマー鎖またはナノ粒子上に存在するアルデヒドまたはケトン基と反応され得る。ペプチドの合成の間に助剤として使用される保護基は、合成の間のいくつかの段階で除去され得、それの除去の正確な手順位置が、使用される全体的な合成ストラテジーによって指示される。同様に、ペプチド側鎖基改変がまた、合成の間のいくつかの点で起こり得る。
【００５７】
一旦所望のＰＥＧ−ペプチド種が、存在する末端官能基と共に合成されると、これは、ナノ粒子に結合される。このカップリング手順を補助するために、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）反応対が、予め選択される（１つは、ＰＥＧ−ペプチドのＰＥＧ末端として、他方は官能化ビルディングブロックとして（これは、ナノ粒子処方物に含まれる））。例えば、アミノオキシ基は、ＰＥＧ末端に配置され得、そしてケトンまたはアルデヒドビルディングブロック、あるいはケトンまたはアルデヒドビルディングブロックを用いて合成されたアミノ酸が、ナノ粒子構造に組み込まれ得る。これらの２つの官能基は、互いと優先的に高収率で反応することが知られており（Ｌｅｍｉｅｕｘ、同書）、従ってＰＥＧ−ペプチド複合体をナノ粒子にカップリングする。議論されたものよりもあまり選択的ではない、他の既知の反応対がまた、使用され得、正確な選択が、合成的考察、毒物学的考察、経済的考察または他の考に基づく。
【００５８】
循環を増加するためのＰＥＧ官能化：本発明の１つの実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）が、ノナ粒子形成の前または後に、ブロックコポリマー鎖に結合され、その結果、それらは、ナノ粒子の表面に位置する。ＰＥＧがナノ粒子形成の前に結合される場合、それらの存在は、自発的なナノ粒子形成を干渉してはならない。このような干渉は、ＰＥＧの結合が、ＰＥＧ−ブロックコポリマー分子を親水性にしすぎる場合に生じ得る。従って、ＰＥＧ鎖がナノ粒子形成の前に結合される場合、ＰＥＧ鎖および親水性コポリマーの分子量は、ノナ粒子形成が、適切な水溶液条件下で自発的に起こるように、十分低く維持されなくてはならない。このＰＥＧ鎖が、ナノ粒子形成の後に結合される場合、このような結合が、ナノ粒子構造の破壊を生じないように、注意しなければならない。このことが起こらないことを確実にするために使用され得る１つの方法は、ＰＥＧ分子結合の前に、ナノ粒子構造内のコポリマー鎖を架橋することである。
【００５９】
循環時間を増加させる目的のために使用されるＰＥＧは、その末端にＨＡＰを提供することを必要としない。従って、これらのＰＥＧ鎖は、単官能性であり得る；すなわち、１つの末端は、アミンのような反応性基で官能化され得、ＰＥＧ鎖がこの部分を介して表面または分子に結合されることを可能にするが、他方の末端は、一般に生理学的条件に不活性であり、例えば、メトキシ基である。あるいは、二官能性ＰＥＧ（これは、ブロックコポリマー鎖またはナノ粒子表面に一方の末端で結合され得る）は、循環時間を増加するために使用され得る。この場合、自由端（すなわち、コポリマーまたはナノ粒子に結合されない末端）は、当該分野で慣用的な方法を使用して、メトキシ基で「キャップされるか」または本質的に非反応性とされる。
【００６０】
本発明において実施されるように、ＰＥＧは、リンカーとしてまたは循環時間を増加させるために使用される場合、ＰＥＧは線状であり、個々のＰＥＧ鎖の好ましい分子量は、１０００〜５０，０００Ｄａの分子量の範囲である。
【００６１】
ブロックコポリマーからのナノ粒子の形成：一旦ペプチド官能化ブロックコポリマーが合成されると、標的化送達のためのナノ粒子が、以下のように形成され得る。ブロックコポリマー（このコポリマーのある割合は、２型ペプチド−官能化ブロックコポリマーで官能化され得る）は、水性緩衝液に添加される。例えば、２型ペプチド／ブロックコポリマーの希釈溶液は、水可溶性有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦなど）を含む水溶液中で調製される。次いで、水溶性有機溶媒が、透析または減圧下での蒸留のような方法によって水から除去される。
【００６２】
（ＩＩ．架橋された親水性ポリマーからなるＰＦＮ）
１つの実施形態において、重合可能な基を有する親水性ビルディングブロックが、安定なナノ粒子コアを形成するために使用される。これらのビルディングブロックは、逆マイクロエマルジョンの分散水相中で架橋される。１つの単一のビルディングブロックに結合された重合可能基の数は、例えば、１個〜３個の低分子量ビルディングブロックから、１０個以上のポリマービルディングブロックの範囲であり得る。１より多い重合可能基を含むビルディングブロックは、架橋剤として機能し得、そしてゲル網目構造を可能にする。１、２またはそれより多い重合可能な基を有するビルディングブロックのセットから、異なる量および比率のビルディングブロックを使用することは、重合の際に、異なる可撓性（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｙ）のポリマー網目構造の形成を可能にする。
【００６３】
例示的な架橋可能基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクリレート、アクリルアミド、ビニルエーテル、スチリル、エポキシド、マレイン酸誘導体、ジエン、置換ジエン、チオール、アルコール、アミン、ヒドロキシアミン、カルボン酸、無水カルボン酸、カルボン酸ハライド、アルデヒド、ケトン、イソシアネート、スクシンイミド、カルボン酸ヒドラジド、グリシジルエーテル、シロキサン、アルコキシシラン、アルキン、アジド、２’−ピリジルジチオール、フェニルグリオキサール、ヨード、マレイミド、イミドエステル、ジブロモプロピオネート、およびヨードアセチル。
【００６４】
フリーラジカル重合：好ましい重合可能官能基は、アクリレート部分およびアクリルアミド部分である。このような部分は、フリーラジカル重合に対して反応性である。フリーラジカル重合は、ＵＶ光と光開始剤との組み合わせ、酸化還元対フリーラジカル開始剤、または熱および熱活性化開始剤によって容易に達成され得る。
【００６５】
ナノ粒子コアを形成するために使用される例示的なモノマービルディングブロックとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクリルアミド、アクリル酸ナトリウム、メチレンビスアクリルアミド、２，２−ビスアクリルアミド酢酸アンモニウム、２−アクリルアミドグリコール酸、メタクリル酸２−アミノエチル、オルニチンモノアクリルアミド、オルニチンジアクリルアミドナトリウム塩、Ｎ−アクリロイル（ヒドロキシメチル）−メチルアミン、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−アクリルアミド、２−スルホエチルメタクリレート、２−メタクリロイルエチルグルコシド、グルコースモノアクリレート、グルコール−１−（Ｎ−メチル）−アクリルアミド、グルコース−２−アクリルアミド、グルコース−１，２−ジアクリルアミド、マルトース−１−アクリルアミド、ソルビトールモノアクリレート、ソルビトールジアクリレート、スクロースジアクリレート、スクロースモノ（エチレンジアミンアクリルアミド）、スクロースジ（エチレンジアミンアクリルアミド）、スクロースジ（ジエチレントリアミンアクリルアミド）、カナマイシンテトラアクリルアミド、カナマイシンジアクリルアミド、デキストランマルチアクリルアミド（ｄｅｘｔｒａｎ  ｍｕｌｔｉａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、スクロースモノ（エチレンジアミンアクリルアミド）モノ（ジエチレントリアミンアクリルアミド）モノ（フェニルアラニン）ナトリウム塩、ならびに他のアクリレートまたはアクリルアミド誘導体化糖。
【００６６】
好ましい実施形態において、ビルディングブロックの少なくともいくつかは、炭水化物である。炭水化物ビルディングブロックの場合、炭水化物領域は、通常、複数のヒドロキシル基から構成され、ここで少なくとも１つのヒドロキシル基は、少なくとも１つの重合可能基を含むように修飾される。
【００６７】
炭水化物ビルディングブロックの炭水化物領域は、炭水化物または炭水化物誘導体を含み得る。例えば、この炭水化物領域は、以下から誘導され得る：単糖類（例えば、グルコース、リボース、アラビノース、キシロース、アロース、アルトロース、マンノース、グルコース、イドース、ガラクトース、フルクトースまたはタロース）；二糖類（例えば、マルトース、スクロース、ラクトースまたはトレハロース）；三糖類；多糖類（例えば、セルロース、デンプン、グリコーゲン、アルギネート、イヌリン、およびデキストラン）；または修飾多糖類。他の代表的な炭水化物としては、ソルビタン、ソルビトール、キトサンおよびグルコサミンが挙げられる。炭水化物は、ヒドロキシル基に加えてアミン基を含み得、そしてこのアミン基またはヒドロキシル基は、架橋基、他の官能基またはそれらの組み合わせを含むように修飾または置換され得る。
【００６８】
炭水化物ベースのビルディングブロックは、生物有機化学の分野で公知の標準的なカップリング技術によって、炭水化物前駆体（例えば、スクロース、ソルビタール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、デキストランなど）から調製され得る（例えば、Ｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６，ｐｐ２７−４０，１５５，１８３−１８５，６１５−６１７；およびＳ．Ｈａｎｅｓｉａｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７を参照のこと）。例えば、架橋可能基は、アクリロイルクロリドをアミン官能化糖に滴下することによって、炭水化物に容易に結合される。アミン官能化糖は、エチレンジアミン（または他のアミン）と１，１’−カルボニルジイミダゾール活性化糖との反応によって調製され得る。アミンを炭水化物に導入する他の反応もまた、使用され得、この多くは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（前出）において概説される。
【００６９】
炭水化物ベースのビルディングブロックはまた、フリーラジカル条件下において重合することが知られている部分で、炭水化物を部分的に（または完全に）官能化することによって調製され得る。例えば、メタクリルエステルは、炭水化物と無水メタクリル酸またはグリシジルメタクリレートとの反応によって、様々な置換レベルにおいて炭水化物上で置換され得る（Ｖｅｒｖｏｏｒｔ，Ｌ．；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｍｏｏｔｅｒ，Ｇ．；Ａｕｇｕｓｔｉｊｉｎｓ，Ｐ．；Ｋｉｎｇｅｔ，Ｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１９９８，１７２，１２７−１３５）。
【００７０】
炭水化物ベースのビルディングブロックはまた、化学酵素的方法（Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９２，２５，７０８１）によって調製され得、例えばここで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａは、ピリジン中におけるビニルアクリレートとの単糖類のエステル交換反応を触媒するか、またはアクリレートの直接付加による単糖類のエステル交換反応を触媒する（Ｐｉｌｅｔｓｋｙ，Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９９，３２，６３３−６３３）。多数の誘導体化炭水化物は、炭水化物化学の分野の当業者に公知であるため、他の官能基が存在し得る。
【００７１】
炭水化物ベースのビルディングブロックに加えて、アクリレート誘導体化ポリマービルディングブロックまたはアクリルアミド誘導体化ポリマービルディングブロックの他の例としては、ポリエチレングリコールベースの分子（例えば、ポリエチレングリコールジアクリレート）が挙げられる。
【００７２】
ポリアミドの形成：オリゴマーカチオン性ビルディングブロック（例えば、キトサンまたはポリリジン）は、多官能性アニオン（例えば、ポリ（アスパラギン酸））と架橋されて、本発明における使用のためのナノ粒子を形成し得る。
【００７３】
化学選択的重合：化学選択的ビルディングブロックはまた、ナノ粒子を形成するために使用され得る。このストラテジーの代表的な例は、部分的に酸化されて、逆マイクロエマルジョン内に多数のアルデヒドを含む多糖類の使用であり得る。ジ（アミノ−オキシ）含有化合物（例えば、エチレンジアミンから作製される化合物（反応スキーム８））は、次いで、架橋剤として使用され得、酸化された糖のアルデヒドは、このアミノ−オキシ官能基と反応する。
（反応スキーム８）
【００７４】
【化８】
2004500438.tif 000008
逆マイクロエマルジョン中におけるナノ粒子コアの製造：ナノ粒子が親水性ビルディングブロックから構成される場合、ＰＦＮは、最初に、逆マイクロエマルジョンの分散された水相に可溶化された親水性モノマービルディングブロックの架橋によりナノ粒子コアを形成することによって、製造される。ナノ粒子コアの製造のための逆マイクロエマルジョンは、水性緩衝液または水、ビルディングブロック、有機溶媒、界面活性剤および開始剤を適切な割合で合わせることにより形成され、連続した油相に分散した界面活性剤安定化水性ナノ液滴（ｎａｎｏｄｒｏｐｌｅｔ）の安定な相を生成する。安定な逆マイクロエマルジョンの組成は、当業者によって、公知の方法を使用して見出され得る。これらは、例えば、Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈ．Ｌ．ＲｏｓａｎｏおよびＭ．Ｃｌａｕｓｓｅ編、ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９８７，およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐ．ＫｕｍａｒおよびＫ．Ｌ．Ｍｉｔｔｅｌ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９９９において考察される。本発明において、可溶化された親水性ビルディングブロックを含む水相は、１つ以上の可溶化界面活性剤を含む有機溶媒に添加されて、逆マイクロエマルジョンを形成する。
【００７５】
分散した水相は、約５〜約６５重量％、好ましくは約５〜約２５重量％、最も好ましくは５〜１５重量％可溶化された親水性ビルディングブロックを含む。最も好ましい組成物では、重合の後、得られるナノ粒子は、より高級なポリマーを含有するナノ粒子と比較してより親水性でありかつより可溶性であり、そして分解生成物の量は、より高級なポリマーを含有するナノ粒子と比較して少ない。理論に縛られることは望まないが、高い含水量のコアの使用はまた、最終用途における免疫原性を減少し得る。なぜなら、認識する免疫系成分の異種表面が少ないからである。高い含水量はまた、より可撓性のポリマーネットワークにわたって伸展性（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｙ）を提供する。従って、細胞表面レセプターに結合する場合、このナノ粒子は、細胞表面に適合し、より多くの表面レセプターを結合させ得る。より多くのレセプターの結合により、このナノ粒子はアンタゴニストとしてより良好に機能し得る。さらに、理論に縛られることを望まないが、ＰＦＮ細胞表面範囲は、他の細胞シグナル伝達経路を阻害し得ると考えられる。
【００７６】
逆マイクロエマルジョンの分散した水相のナノ液滴中のビルディングブロックの重合は、当業者に周知の標準的な手順に従う（例えば、Ｏｄｉａｎ  Ｇ．Ｇ．；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第３版、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｌ．Ｈ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，１−２１頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６；およびＲ．Ｂ．ＳｅｙｍｏｕｒおよびＣ．Ｅ．Ｃａｒｒａｈｅｒ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ７−１１，１９３−３５６頁，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１を参照のこと）。好ましくは、ビルディングブロックは、官能性／架橋可能基（例えば、アクリレートおよびアクリルアミド）を有し、フリーラジカル重合に対して感受性であり、そして重合は、ＵＶ開始剤とＵＶ光の組み合わせ、酸化還元対フリーラジカル開始剤、または熱開始剤および熱によって誘導され得る。有機溶媒および非反応性界面活性剤は、重合後に除去され、架橋した水溶性のナノ粒子を生じる。
【００７７】
分散した水相のナノ液滴のサイズは、用いられる水、界面活性剤および油相の相対量によって決定される。界面活性剤は、逆マイクロエマルジョンを安定化するために使用される。これらの界面活性剤は、架橋可能部分を含まず、これらはビルディングブロックではない。使用され得る界面活性剤としては、市販の界面活性剤、例えば、Ａｅｒｏｓｏｌ  ＯＴ（ＡＯＴ）、ポリエチレンオキシ（ｎ）ノニルフェノール（ＩｇｅｐａｌＴＭ，Ｒｈｏｄｉａ  Ｉｎｃ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｃｒａｎｄｂｒｏｏｋ，ＮＪ）、ソルビタンエステル（モノオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、モノラウリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）２０）、モノパルミチン酸ソルビン酸（Ｓｐａｎ（登録商標）４０）、モノステアリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）６０）、トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）、およびトリステアリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）６５）（これらは、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である）を含む）が挙げられる。セスキオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）８３）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能である。使用され得る他の界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））化合物が挙げられる。共界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）としては、以下が挙げられる：モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２１）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０Ｒ）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）６１）、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）、およびトリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）（これらは、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である）。他の代表的な市販の界面活性剤としては、ポリオキシエチレンオキシ（４０）−ソルビトールヘキサオレイン酸エステル（Ａｔｌａｓ  Ｇ−１０８６，ＩＣＩ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ，Ａｌｄｒｉｃｈ）、および直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ，Ａｓｈｌａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）が挙げられる。
【００７８】
他の例示的な界面活性剤としては、以下が挙げられる：脂肪酸セッケン、アルキルホスフェートおよびジアルキルホスフェート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩、４級アミン塩、ｎ−アルキルキサンタン、ｎ−アルキルエトキシル化スルフェート、ジアルキルスルホコハク酸塩、ｎ−アルキルジメチルベタイン、ｎ−アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ｎ−アルキルポリオキシエチレンエーテル、ソルビタンエステル、ポリエチレンオキシソルビタンエステル、ソルビトールエステルおよびポリエチレンオキシソルビトールエステル。
【００７９】
他の界面活性剤としては、脂質（例えば、リン脂質、糖脂質、コレステロールおよびコレステロール誘導体）が挙げられる。例示的な脂質としては、脂肪酸または脂肪酸を含む分子が挙げられ、ここでこの脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、パルミトイル酸、リノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸、ならびにそれらの塩（例えば、ナトリウム塩）が挙げられる。この脂肪酸は、例えば、酸官能性部分を含む小分子へのカップリング反応によってこの酸官能基をスルホネートに変換することによって、または当業者に公知の他の官能基の変換によって、修飾され得る。
【００８０】
さらに、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デンプンおよびそれらの誘導体は、本発明において、界面活性剤としての使用を見出し得る。
【００８１】
カチオン性脂質（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド／クロリド（ＣＴＡＢ／ＣＴＡＣ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド／クロリド（ＤＯＤＡＢ／ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、および［Ｎ−（ｎ’−Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］クオレステロール、ジオール（Ｄｃ−Ｃｈｏｌ））は、共界面活性剤として使用され得る。アルコール（例えば、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールおよびオクタノール）もまた、共界面活性剤として使用され得る。より長い炭素鎖を有する他のアルコールもまた使用され得る。
【００８２】
ナノ粒子コアの官能化：構成可能なビルディングブロックは、ナノ粒子を形成するために架橋され、このナノ粒子の表面は、２型高親和性ペプチドで官能化される。ＨＡＰは、ブロックコポリマーナノ粒子に関して本明細書中で先に考察されたように、直接かまたはリンカー分子を介してのいずれかで、ナノ粒子の表面に結合され得る。リンカーの配置において、高親和性ペプチドの一部または全ては、テザーの末端で「表示」される。従って、本発明の１つの適用において、ＰＦＮは、本明細書中で前述される様な生分解性なの粒子コアの表面で表示される高親和性ペプチドを構成する。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、ＰＦＮは、前述のナノ粒子コアの表面に、リンカー分子（このリンカーは、好ましくは、ＰＥＧを含む）を介して結合した高親和性ペプチドを構成する。
【００８４】
これらの実施形態の各々について、ナノ粒子をいくつかのカップリングストラテジーを使用して官能化し、カップリングのために使用される異なる成分および反応性化学部分の両方の付加の順序を変えることが可能である。
【００８５】
これらの成分が互いに結合する順序に関して、例えば、ＰＥＧを含むリンカー分子によって親水性ポリマーナノ粒子に結合した高親和性ペプチドを構成するＰＦＮは、以下の様式で合成され得る：このナノ粒子コアは、初めに、二官能性ＰＥＧ含有テザーと反応され、続いて、このＰＥＧの一部の自由端が高親和性ペプチドで官能化される。あるいは、この高親和性ペプチドは、初めに、ＰＥＧ含有テザーに結合され、続いて、他のＰＥＧ末端がこのナノ粒子コアに結合される。最後に、本発明の一実施形態において、高親和性ペプチドに結合したＰＥＧ含有テザーは、ポリアミノ酸のステップバイステップ型の固体支持体合成から誘導される。
【００８６】
カップリング方法（単数または複数）に関して、高親和性ペプチドをナノ粒子コアにグラフト化し、そしてこのテザーとナノ粒子とを反応させるために、反応性部分のいくつかの組み合わせが選択され得る。一連の直交性の反応セットを使用して、いくつかのコアビルディングブロックおよび／またはテザーアームを変更する際、異なるペプチドを同じナノ粒子コアにグラフト化し、そして／または異なるエンハンサーをこのナノ粒子コアに十分に制御された割合でグラフト化することもまた可能である。直交反応性の対を使用する反応は、同時にかまたは連続的に行われ得る。
【００８７】
反応条件が考慮される限り、水系でナノ粒子を官能化することが好ましい。ナノ粒子コアの合成の残留物である界面活性剤および油相は、溶媒洗浄（例えば、エタノールを使用して界面活性剤および油を可溶化し、同時にポリマーナノ粒子を沈殿させる）；界面活性剤吸着ビーズ；透析を使用することによって、または水系（例えば、４Ｍ尿素）を使用することによって（別々にまたは組み合わせて）除去され得る。界面活性剤の除去のための方法は、当該分野で公知である。
【００８８】
高親和性ペプチドは、ナノ粒子表面への結合を可能にする官能基を含まなければならない。好ましくは、必ずしも必要ではないが、この官能基は、カップリング反応を助けるために選択された化学選択性試薬の対の１つのメンバーである。（Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｇ．，Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６，５０６−５１３）。例えば、ナノ粒子表面（および／またはその表面にグラフト化したリンカー）が、α−カルボニル官能基を表す場合、このペプチドはスルフヒドリル部分を介して結合され得る。ペプチド構造中のスルフヒドリル部分は、システイン残基の含有によって達成され得る。
【００８９】
カップリングはまた、ナノ粒子上の１級アミンまたはリンカー末端とペプチド上のカルボン酸との間で可能である。ペプチド構造中のカルボン酸は、直鎖ペプチドについて、その末端アミノ酸のいずれかで見出され得るか、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸の含有によって見出され得る。カルボン酸がナノ粒子上にあり、かつ１級アミンがペプチドに属している反対の構成もまた、容易にアクセス可能である。多くの重合可能ビルディングブロックは、酸性部分を含み、この酸性部分は、それらの重合後に、ビーズの表面においてアクセス可能である。高親和性ペプチドについて、１級アミン官能基は、そのＮ末端（このペプチドが直鎖である場合）のいずれかで見出され得、そして／またはリジン残基の導入によって見出され得る。
【００９０】
反応性化学対の別の例は、スルフヒドリルとマレイミド部分とのカップリングを含む。このマレイミド官能基は、当業者に公知の方法（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄ．，１９９６に記載される方法）を用いて、他の通常の官能基（例えば、カルボン酸、アミン、チオールまたはアルコール）と（好ましくは市販の）短いリンカーとを反応させることによって、ペプチド、リンカーまたはナノ粒子の表面のいずれかに容易に導入され得る。高親和性ペプチドはまた、アミノ−オキシ官能基とアルデヒドまたはケトン部分との間の反応を用いて、ナノ粒子および／またはテザーに結合され得る。このアミノ−オキシ部分（ナノ粒子上にあるかまたはペプチド内にあるかのいずれかである）は、当業者に公知の一連の形質転換によって、他の通常の官能基（例えば、アミン）から初めて導入され得る。同じ様式で、アルデヒドまたはケトン含有粒子およびアルデヒド含有ペプチドは、公知の方法によって容易に合成される。
【００９１】
この得られるペプチド官能化ナノ粒子は、直ちに使用され得るか、溶液として保存され得るか、または長期間の貯蔵のために凍結乾燥され得る。
【００９２】
（ＩＩＩ．エンハンサー分子の使用）
必要に応じて、ナノ粒子表面はまた、ペプチド以外の分子によって官能化され得る。「エンハンサー」と本明細書中で称されるこのような分子は、好ましくは、以下のカテゴリーの１つ以上に属する小分子から構成される：特定の細胞による取込みを増大する分子（例えば、特定の癌細胞による取込みを促進するために使用される葉酸）、特異的標的化に対する認識を提供する分子（例えば、単鎖多糖類）、ＰＦＮが蓄積する動物組織または植物組織におけるＰＦＮの追跡を可能にする分子（例えば、色素、蛍光分子または放射性分子）、または有用な治療効果を提供する高親和性ペプチド以外の任意の分子。高親和性ペプチドと同様に、これらのエンハンサーは、ＰＦＮの表面に直接結合され得るか、またはリンカー分子の末端で表され得る。
【００９３】
一般的に、ポリマーコア、ＰＥＧ、エンハンサーおよびＨＡＰ成分の結合は、標準的な生体結合技術によって達成され得る。例えば、ペプチドのカルボキシ末端をコアのアミン末端に（またはその逆）結合するために、カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）が使用され得る。コア上のアミノ基をペプチド上のアミノ機に結合するために、グルタルアルデヒドが使用され得る。これらの例は、限定的ではなく、当業者は、複数のカップリング試薬または方法から選択し得る（例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．，ＴｈｅＰｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６を参照のこと）。あるいは、化学選択性カップリング試薬の相補対が用いられ得、この対の一方のメンバーはＰＡＡに組み込まれ、そしてこの対の他方のメンバーは、ＨＡＰに組み込まれる。実際に、このストラテジーが使用され、大きなポリペプチド配列の調製において成功している（Ｌｅｍｉｅｕｘ、同書）。また、末端官能化ポリペプチドの調製における新たな進歩（Ｃｕｒｔｉｎ，Ｓ．Ａ．Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，７４２７−７４２８）により、上記のカップリング化学の必要性を回避し、ＨＡＰ末端コポリマー構造の直接合成が可能となり得る。
【００９４】
（ＩＶ、タンパク質制御放出）
特定の実施形態において、本発明のナノ粒子は、治療ペプチドまたはタンパク質の制御放出に有用である。本発明のナノ粒子は、とりわけ、神経系、内分泌系、心臓血管系、血液循環系、呼吸器系、細網内皮細胞系、骨格系、骨格筋、平滑筋、免疫系、生殖系、および癌組織に作用するタンパク質またはタンパク質フラグメントから構成され得る。
【００９５】
本発明において有意に使用され得るタンパク質は、限定しないが、ヒト身体によって天然に産生されるタンパク質、このようなタンパク質の組換え体、およびこのようなタンパク質の誘導体およびアナログ、ならびにレセプターの可溶性部分が挙げられる。例えば、サイトカイン（例えば、インターロイキンおよびインターフェロン）、ならびに成長因子、およびサイトカインおよび成長因子レセプターの可溶性画分が使用され得る。サイトカインはしばしば、低分子量糖タンパク質である。糖タンパク質は、一般的に、性質において親水性であるので、これらは、本発明における使用に特に受け入れられる。親水性タンパク質は、現在当該分野で公知のブロックコポリマーナノ粒子に望ましくない程度に組み込まれると予期される。なぜなら、親水性タンパク質は、ナノ粒子の外側の溶液中に残ることが熱力学的に好ましいからである。しかし、本発明において、高い親和性のペプチドは、親水性のタンパク質をブロックコポリマーに、続いてナノ粒子にまたはナノ粒子内に結合するのに役立つ。
【００９６】
ＰＡＡブロックから形成される治療剤含有粒子：ブロックコポリマー（その少なくともいくらかが、１型ペプチド官能基化ブロックコポリマーである）が水溶液に添加される。ＤＭＦは、溶解を促進するために使用され得る。第２に、治療タンパク質は、水溶液中で溶解される。１型ペプチドは、溶液中でのナノ粒子の形成の前、その間、またはその後に治療タンパク質に非共有結合的に結合し得る。次いで、ブロックコポリマーは、ＤＭＦの除去とともにナノ粒子に自発的に合体する。最後の結果は、治療的価値のタンパク質の部分またはタンパク質のフラグメント（これらは、ナノ粒子によって少なくとも部分的に含まれるかまたは取り囲まれる）に構成されるナノ粒子の形成である。
【００９７】
ＨＡＰで官能基化され、そして治療タンパク質で複合体化されたブロックコポリマー−ペプチドは、親和性ペプチドで官能基化されていないブロックコポリマーとは異なる構造を有し、異なって作用する。例えば、比較的親水性のタンパク質を用いて、ブロックコポリマー−タンパク質複合体は、ブロックコポリマー単独よりも大きく、親水性である。従って、１型ペプチドで官能基化されたブロックコポリマーに対する親水性ブロックのサイズを減少するかまたは全体的にその親水性ブロックを除去することが有利であり得る。
【００９８】
高い親和性のペプチドは、ペプチド合成または有機化学の当業者によく知られた種々の方法によってＰＡＡに接続され得る。例えば、ＨＡＰのカルボン酸末端は、ペプチド合成においてしばしば使用される活性化エステルまたはカルボジイミドカップリング化学の使用によってＰＡＡのアミン末端に結合され得る。あるいは、化学選択的カップリング試薬の相補的な対が使用され得、対の１つのメンバーがＰＡＡに組み込まれ、そして対の他のメンバーがＨＡＰに組み込まれる。実際、この戦略は、大きなペプチド配列の調製において首尾良く使用されている。（Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｇ．，Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６，５０６−５１３およびそこに引用される参考文献）。Ｄｅｍｉｎｇらの方法はＨＡＰからＰＡＡブロックを成長するために使用され得る（Ｃｕｒｔｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，７４２７−７４２８）（反応スキーム９）。この方法において、ＨＡＰは、ＮＣＡの重合のために開始リガンドとして作用してＨＡＰ−ＰＡＡ材料を生じるように適切に官能基化される（ＨＡＰの反応性官能基の保護は、ＮＣＡ重合の引き続く防止を妨げるのに必要であり得る）。ＨＡＰまたはＰＡＡが保護状態で使用されて保護される場合、ＨＡＰ−ＮＣＡ材料の脱保護は、活性種を生成するために必要であり得る。
【００９９】
（反応スキーム９）：
【０１００】
【化９】
2004500438.tif 000009
ナノ粒子内の治療タンパク質の保持は、ペプチド親和性およびペプチド濃度によって制御され得る。ペプチド親和性／ペプチド濃度における最適は、おそらくある。ナノ粒子がタンパク質に非常に弱く結合する場合、タンパク質は、非常に迅速に放出される。結合が強すぎる場合、タンパク質は、所望されるよりも長くナノ粒子に隔離され得る。
【０１０１】
ポリカプロラクトンブロックから形成される治療剤含有粒子：類似の様式で、ＨＡＰをポリカプロラクトンに結合することが望ましくあり得る。これは、ペプチド合成または有機化学の当業者により多くの方法で達成され得る。例えば、ポリカプロラクトンの末端ヒドロキシルは、脱離基（例えば、アルコールとｐ−トルエンスルホニルクロライドとの反応から生じるもの）に変換され得る。得られるスルホンエステルは、ＨＡＰのアミンによって置換され得、ＨＡＰとポリカプロラクトンとの間に共有結合を生じる（反応スキーム１０）。
【０１０２】
（反応スキーム１０）：
【０１０３】
【化１０】
2004500438.tif 000010
あるいは、ポリカプロラクトンブロックは、アルミニウムポルフィリンの使用により、適切に保護され官能基化されたＨＡＰから成長され得る。この例は、ＨＡＰがその図に示される多糖類の代わりをすることを除いて、スキーム１０に示されるスキームと類似のスキームを有する。保護基が除去された後、活性なＨＡＰ−ポリカプロラクトン物質が単離され得る。
【０１０４】
逆マイクロエマルジョンにおいて形成される治療剤含有粒子：タンパク質はまた、逆マイクロエマルジョン方法を使用して形成されるナノ粒子のコアに隔離され得る。この実施形態について、ナノ粒子が、タンパク質の活性を弱めることなしに、活性治療タンパク質の周りに形成されることが重要である。これは、本開示において先に議論されたように、逆マイクロエマルジョンの分散水相におけるナノ粒子の形成において化学選択的試薬を使用することによって達成され得る。この戦略の代表的な例は、逆エマルジョン内に多数のアルデヒドを含むように部分的に酸化された多糖類の使用である。ケトン官能基との高い親和性のペプチドはまた、溶液中に含まれる。ペプチドを含むケトンは、レブリン酸を用いたアミン末端（またはリジン残基側鎖）の官能基化によって形成され得る。ＨＡＰが結合する治療タンパク質もマイクロエマルジョンに含まれる。次いで、ジ（アミノ−オキシ）含有化合物（例えば、エチレンジアミンから形成される化合物（反応スキーム１１））は、ＨＡＰを多糖類に結合することおよび多糖類コアを架橋することの両方のために使用される。従って、治療タンパク質を取り囲む架橋ネットワークが形成される。
【０１０５】
（反応スキーム１１）：
【０１０６】
【化１１】
2004500438.tif 000011
ＨＡＰの使用は、ナノ粒子コアにおけるタンパク質の保持を増加するために役立つ。このように、ナノ粒子内の治療タンパク質の保持は、ペプチド親和性、ペプチド濃度、およびネットワーク架橋密度によって制御される。
【０１０７】
（Ｖ．治療タンパク質の標的送達）
本発明の別の実施形態は、治療タンパク質を標的細胞または組織型の近位に制御送達するための方法を提供する。この実施形態のナノ粒子は、４つの型の分子構造（ナノ粒子マトリクス分子、治療タンパク質に対する高い親和性を有する１型ペプチド、特定の細胞または特定の組織で発現されるタンパク質に対する高い親和性を有する２型ペプチド、および治療タンパク質）から構成される。従って、治療剤として投与される場合、治療タンパク質を含むナノ粒子は、標的タンパク質を発現する組織または細胞表面に濃縮する。治療タンパク質−ペプチド親和性はまた、使用においてナノ粒子中の治療タンパク質の保持を可能にし、タンパク質の循環時間を延ばす。治療タンパク質に高い親和性であり得る１つ以上のペプチドが使用され得る。
【０１０８】
タンパク質は、ブロックコポリマー構造から製造されたナノ粒子および本明細中において先に議論されたような逆エマルジョンの分散相に形成されるナノ粒子の両方に含まれ得る。ブロックコポリマーナノ粒子構造および逆マイクロエマルジョンの分散相に形成されるナノ粒子の両方のための２型ペプチドを用いたナノ粒子表面官能化もまた、本開示において示される。
【０１０９】
（ＶＩ．ＰＦＮ特質）
本発明において実施されるように、水溶性ペプチド官能基化ナノ粒子（ＰＦＮ）は、それらを優れた治療候補にするいくつかの特質を有する。それらの小さなサイズのため、ナノ粒子は、生物活性な実在物としてインビボで（例えば、哺乳動物の体内において）使用され得る。インビボ適用において、ペプチド単独と比較して、本明細書中に開示されるＰＦＮは、増加した親和性およびより長い循環時間を有利に有する。ナノ粒子は、体内において非毒性物質に代謝される。
【０１１０】
本発明のナノ粒子は、高い水含有量を有する。「高い水含有量」とは、ブロックコポリマーを含むＰＦＮに関して、コアが、８５重量％〜９５重量％より多くの水を含み得、残りがポリマー材料であることを意味する。逆マイクロエマルジョンの分散水相において架橋される親水性ポリマーを含むＰＦＮは、約３５〜約９５重量％の水、好ましくは約７５〜約９５重量％の水、そして最も好ましくは、８５〜９５重量％の水のコアを有する。従って、分解産物の量は、より高いポリマー濃度を有する粒子よりも少ない。高い水含有量のコアはまた、免疫原性を減少し得る。なぜなら、免疫系成分が相互作用する表面がより小さいからである。高い水含有量はまた、コンプライアンズを提供する。従って、細胞表面レセプターに付着する場合、ナノ粒子は、細胞表面に適合し得、より多くの表面レセプターが結合し得る。より多くのレセプターを結合することによって、ナノ粒子はアンタゴニストとしてより良く機能し得る。さらに、理論によって束縛されることは望まないが、ＰＦＮ細胞表面範囲が他の細胞シグナル伝達経路を阻害し得ると考えられる。
【０１１１】
増加した治療性能は、ＰＦＮの多価構造から生じ得る。「多価」とは、ナノ粒子当たり２つ以上の高い親和性認識エレメントがあることを意味する。多価によって、ナノ粒子が同時に複数の点で結合し得る。多価はまた、標的分子の近位にペプチドの高い局所濃度を提供する。理論によって束縛されることは望まないが、この高い局所濃度は、結合した標的の割合を増加し得ると考えられる。
【０１１２】
さらに、本明細書中に概説されるＰＦＮ製造戦略は、表面の組成が所望の特性に従ってあつらえられ得る、多数の細かく調整されたヘテロ官能基化実体の製造を可能にする。コアビルディングブロックおよび／またはテザーアームのいくらかを変えることによって、異なるペプチドおよび／またはエンハンサー分子（例えば、ＰＥＧ鎖、送達可能物（例えば、葉酸塩）または小さな治療分子）を一連のオルソゴナルな反応セット（アミン−酸、アミノオキシ−ケトンおよびブロモアセトアミド−スルフヒドリル）を利用することによって十分制御される比率においてナノ粒子につなげることが可能である。エンハンサーとしてのＰＥＧの使用は、例えば、消化性酵素を結合されたペプチドから切断することを妨げるための立体的障害物を提供するか、またはＰＦＮの表面近くに水和相を提供するか、またはＰＦＮの免疫原性応答を最小化し、それらをステルス（ｓｔｅａｌｔｈｙ）にする。
【０１１３】
本出願のさらなる利点は、１つより多くの型のペプチド分子が単一のナノ粒子に組み込まれ得ることである。これによって、例えば、治療ペプチドが、標的ペプチドを使用して、所望の細胞型、組織または器官に標的化され得る。
【０１１４】
本発明において開示されるナノ粒子の別の利点は、癌治療剤としてのそれらの有用性である。腫瘍において見出される漏出性の脈管構造によって、これらのナノ粒子は、腫瘍内の血流および濃縮物に残され得る。この効果（巨大分子因子について増加した透過性および保持（ＥＰＲ）として記載される）は、固形腫瘍において普遍的に観測された（Ｈ．Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０００，Ｖ６５，ｐ．２７１−２８４）。巨大分子についてのＥＰＲ効果に関する重要な機構は、保持であるが、低分子量の物質は、保持されないで、拡散によって循環する血液に戻される。従って、５〜１００ｎｍの直径のＰＦＮは、固形腫瘍内に蓄積し得る。従って、本発明のナノ粒子は、標的に結合する前でさえ腫瘍内に自然に濃縮し、より高い効力およびより低い全身毒性を提供する。
【０１１５】
本発明のナノ粒子および分解産物は、非毒性であり、身体から排除されるように設計される。これらは、分解性の、好ましくは、炭水化物に基づくか、ＰＡＡに基づくか、またはＰＥＧに基づくコアを有し得、分解の速度が糖の個性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、架橋密度、および他の特徴によって制御される。従って、ナノ粒子は、体内で代謝され得、体内での望ましくない蓄積を妨げる。ナノ粒子は、注射（皮下、静脈、筋内、皮内、腹腔内、脳内、または非経口的）によって投与され得る。ナノ粒子はまた、鼻、肺、膣、眼への送達および経口摂取に適し得る。ナノ粒子は、投与のために薬学的に受容可能なキャリアに懸濁され得る。
【０１１６】
本発明のナノ粒子はまた、標的細胞または組織型の生物学的認識能力が理由で、その標的細胞または組織型を含む環境において分離および診断適用に有用である。
【０１１７】
（ＶＩＩＩ．治療標的および治療適用）
特に本発明のナノ粒子が有利に使用され得る１つの領域は、癌の処置である。腫瘍は、タンパク質およびより大きな実体（例えば、ナノ粒子）が腫瘍内で濃縮し得る漏出性の脈管構造を有することが公知である。このようなタンパク質およびタンパク質フラグメントを使用する本発明のナノ粒子は、抗癌治療剤としての用途を見出し得る。例えば、上皮増殖因子レセプター（ＥＦＧｒ）の可溶性部分および脈管内皮増殖因子レセプター（ＶＥＧＦｒ）の可溶性部分が使用され得る。腫瘍内のＥＧＦｒおよびＶＥＧＦｒのようなレセプターの可溶性部分の放出は、ＥＧＦおよびＶＥＧＦが細胞表面のそれらのレセプターに結合し得る前に、増殖因子ＥＧＲおよびＶＥＧＦに結合することに役立ち得る。このような使用は、腫瘍の増殖を遅くし、腫瘍内の新脈管形成を遅くするのに役立ち得る。
【０１１８】
この技術の別の例示的な適用において、ＶＥＧＦ−２を心臓組織に送達するナノ粒子は、新たな心臓動脈の増殖を刺激するために使用され得、従って、心臓疾患の処置における治療剤として作用し得る。
【０１１９】
本発明において利用され得るさらなる活性剤は、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２）およびコロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を含み、これらの両者は、免疫系、および腫瘍壊死因子を刺激するといわれている。
【０１２０】
いくつかの実施形態における試薬および開始物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ  ａｎｄ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、Ｆｉｓｈｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）およびＣａｒｂｏｍｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）、Ｒａｄｃｕｒｅ（Ｓｍｙｒｎａ，ＧＡ）、およびＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｉｌｅｓ，ＩＬ）のような化学物質販売業者から商業的に得られ得る。ＰＥＧ分子は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入され得る。さらに、化学製品ディレクトリおよびリソース（例えば、＜ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｃｈｅｍｃｙ／＞を使用して開始物質を探し出し得る。
【０１２１】
高い親和性の結合剤として使用されるペプチドは、多くの供給源から購入され得、１つは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｗｗｗ．ｐｅｐｔｉｄｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｃｏｍ）である。
【０１２２】
（実施例）
（実施例１）
ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ε−カプロラクトン）（ＭＷ＝１．５×１０４、総重量の１５〜２５％のポリ（エチレンオキシド）ブロック）を、Ｇａｎ，Ｚ；Ｊｉａｎｇ，Ｂ．；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９９６，５９，９６１の方法によって調製する。単離後、この生成物をＴＨＦ中に溶解して、ＮａＳＨの水溶液に添加する。一旦、ＮａＳＨとの反応が完了すれば、この溶液を、ＨＣｌの添加によってヒュームフード中で中性のｐＨに酸性化し、そして全ての揮発性化合物を真空下で除去し、わずかに減少した容積のみの水溶液を残した。窒素の保護ブランケット下で、この生成物をＴＨＦ中に再度溶解すして、遠心分離して塩を除去した。ＴＨＦの容積を真空下で低減させ、そして得られた溶液を、迅速に攪拌しているビーカーの脱気した水（これに添加されているＴＨＦよりも１０〜１０００倍多い水を含む）に滴下して添加する。得られた溶液を真空下において、ＴＨＦを除く。次いで、修飾したバージョンのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（末端リジン上にブロモアセトアミド官能基を有する）を（水相中でのこのペプチドの分散を補助するために最小量のＤＭＦ中に溶解して）、この水溶液中に添加する。ナノ粒子溶液を真空下で濃縮して、大きいリザーバの水に対して透析して、未反応のペプチドおよび塩副産物を除く。透析された溶液の凍結乾燥（炭水化物の凍結防止剤の添加後）によって、ペプチド−官能化ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ε−カプロラクトン）ナノ粒子を生じる。
【０１２３】
代替的な処方物において、１〜５％のεカプロラクトンブロックが１，２−エポキシ−４−ペンタノンエチレンケタールで置換され得る。ポリマーの合成および末端へのチオールの付加後、このポリマーをマイルドな酸性の水溶液に曝露することによって環状ケタールを除去する。次いでこのミセルを上記に概説したようにペプチドを用いて作製して官能基化する。ペプチドの添加後、ジアミノ−オキシ官能基化ＰＥＧ（ＭＷ＝５０００）のような架橋剤を水溶液に添加して、ナノ粒子の内部を架橋する。次いで、この粒子を前と同様に精製および単離する。
【０１２４】
（実施例２）
Ｈａｄｄｌｅｔｏｎの手順（Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．：Ｏｈｎｏ，Ｋ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０００，１，１５２）に従って、β−シクロデキストランを、環開口し、そして修飾して保護ポリサッカライド（多糖類）（これは、未保護のまま残っている末端アノマーヒドロキシル基のみを有する）を得る。この化合物を、わずかに高い温度で真空下で乾燥した後、（５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィナート）アルムニウムエチルと反応させられて、活性な重合化開始種を得る。この種を用いてＥｎｄｏの方法（Ｅｎｄｏ，Ｍ．；Ａｉｄａ，Ｔ．；Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９８７，２０，２９８２）によってε−カプロラクトンを重合化する。ポリサッカライド上の保護基の単離および加水分解後、このポリマーを、１，１’−カルボニルジイミダゾール含有ＤＭＦと３日間反応させる。次いで、エチレンジアミンを添加し、そしてこの反応をさらに２日間進行させる。次いで、この生成物を無水ブロモ酢酸と反応させる。この生成物を単離し、ＤＭＦ中に溶解し、そして水溶液中に滴下して添加する。ミセル形成後、ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓを、ＤＭＦ中の溶液として水溶液に添加する。ナノ粒子溶液を真空下で濃縮して、大きいリザーバの水に対して透析して、未反応のペプチドおよび塩副産物を除去する。炭水化物の凍結防止剤の添加後、透析した溶液を凍結乾燥することによって、ペプチド官能基化したナノ粒子を得る。
【０１２５】
代替的な処方物において、１〜５％のε−カプロノラクトンブロックは、１，２−エポキシ−４−ペンタノンエチレンケタールによって置換され得る。ポリマーの合成後、このポリマーをマイルドな酸性水溶液に曝露して環状ケタールを除去し、そして上記のようにポリサッカライドを修飾する。次いでこのミセルを上記に概説したようにペプチドを用いて作製して官能基化する。ペプチドの添加後、ジアミノ−オキシ官能基化ＰＥＧ（ＭＷ＝５０００）のような架橋剤を水溶液に添加して、ナノ粒子の内部を架橋する。次いで、この粒子を前と同様に精製および単離する。
【０１２６】
（実施例３）
二官能性のＰＥＧ（ＭＷ＝５０００，ブロモアセトアミド−官能基化）を、Ｄｅｍｉｎｇの方法（Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３９０，３８６〜３８９；Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，２７５９〜２７６０）によって合成したポリ（γ−ベンジルグルタメート１１−コ−システイン１）ブロックコポリマーと反応させる。単離後、このポリマーを、ＤＭＦに溶解して、水溶液中に滴下して添加する。ミセル形成後、ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓを、最少量のＤＭＦ中に溶解して、水相中のこのペプチドの分散を補助し、次いでこれを水溶液に加える。ナノ粒子溶液を真空下で濃縮し、そして大きいリザーバの水に対して透析して、未反応のペプチドおよび塩副産物を除去する。炭水化物の凍結防止剤の添加後、透析した溶液を凍結乾燥することによって、ペプチド官能基化したナノ粒子を得る。
【０１２７】
代替的な処方物において、１０〜２０％のγ−ベンジルグルタメートのポリ（γ−ベンジルグルタメート１１−コ−システイン１）ブロックは、リジンによって置換され得る。ポリマーの合成後、このリジン残基をγベンジルグルタメートの存在下で選択的に脱保護する。次いでこのミセルを上記に概説したようにペプチドを用いて作製して官能基化する。ペプチドの添加後、１，３−ブタジエンジエポキシドをＤＭＦ中に溶解し、水溶液に加えて、ナノ粒子内部を架橋する。次いで、この粒子を前と同様に精製および単離する。
【０１２８】
（実施例４）
Ｄｅｍｉｎｇの方法（Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３９０，３８６〜３８９；Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，２７５９〜２７６０）を用いて、ポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート８０−コ−ロイシン２０）のコポリマーを、Ｎ−カルボキシアンヒドリドの重合化から調製する。ＨＢｒ／酢酸でのグルタメートブロックの脱保護後、このブロックコポリマーを、ＤＭＦに溶解して、これを水溶液中に緩徐に添加してナノ粒子形成を誘導する。このグルタメートブロックのアミン末端は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−水酸化エチルカルボジイミドの作用によって、ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓのカルボキシル基末端（ここで側鎖アミンが光不安定性保護基によって保護される）に結合される。一旦カップリング反応が完了すれば、このペプチドを脱保護し、そしてこの反応混合物を大きいリザーバの水に対して透析して、未反応のペプチドおよび塩副産物を除去する。炭水化物の凍結防止剤の添加後、透析した溶液を凍結乾燥することによって、ペプチド官能基化したナノ粒子を得る。
【０１２９】
代替的な処方物において、１０〜２０％のロイシンのポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート８０−コ−ロイシン２０）ブロックは、リジンによって置換され得る。ポリマーの合成後、このリジンおよびグルタミン酸の残基を、ＨＢｒ／酢酸およびトリフルオロ酢酸で脱保護する。次いでミセルを、ペプチド上の光不安定性基が架橋後に除去されること（次の工程で記載）以外は、上記に概説したようにペプチドを用いて作製して官能基化する。ペプチドの添加後、１，３−ブタジエンジエポキシドをＤＭＦ中に溶解し、水溶液に加えて、ナノ粒子内部を架橋し、そして光不安定性基を除去する。次いで、この粒子を前と同様に精製および単離する。
【０１３０】
（実施例５）
ＡＢ構造を有するＰＡＡブロックコポリマー鎖は、分子量１０００〜１０，０００Ｄａを有するＬｅｕおよびＶａｌ（Ｌｅｕ−Ｖａｌ）のランダムコポリマーの疎水性ブロック、ならびに分子量５，０００〜２０，０００のＧｌｕからなる親水性ブロックからなる。従って、制御された重合化機構（例えば、Ｄｅｍｉｎｇ（前出）の手順に従う）を通じて、約６，０００〜３０，０００Ｄａの総分子量が形成される。Ｇｌｕ残基の酸性基は、メチル化を保たれ、そしてカルボキシル基末端は、次の工程における高い親和性のペプチドの付着を助けるように保護される。
【０１３１】
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙからなるペプチドは販売されている。この配列を含むペプチドは、１０−４Ｍ程度の結合定数でストレプトアビジンに結合することが示されている。このペプチドのカルボキシル基末端は、ＥＤＣカップリング（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６）を介してＰＡＡ鎖のアミノ末端に結合され、ＰＡＡ−ＨＡＰを生じる。
【０１３２】
ナノ粒子を形成するために、ＰＡＡ鎖およびＰＡＡ−ＨＡＰ鎖の両方を水溶液に添加する。ＰＡＡ−ＨＡＰ鎖対ＰＡＡ鎖の重量比は、１：１〜１：１００の間である。１ｍＬの水溶液（５〜７のｐＨを有し、そして１０〜５００ｍＭのＮａＣｌを含有する）に対する１〜５０ｍｇのポリマー混合物の添加によって、自然なナノ粒子形成が生じる。
【０１３３】
（実施例６）
ブロックコポリマーが、酸性または塩基性の残基からなる親水性ブロックを有するＰＡＡである場合、反応のｐＨは、親水性イオン化可能モノマーの少なくとも一部がイオン化されるように選択される。例えば、Ｌｅｕ／Ｇｌｕ鎖のアセンブリのために、水溶液は、３〜１３のｐＨの範囲であり得、そして塩化ナトリウムが、溶液中に０．０１〜０．５Ｍの濃度で含まれる。次いでこのブロックコポリマーは、自発的にナノ粒子に融合する。
【０１３４】
（実施例７）
実施例５または６のようなＡＢ構造を有するＰＡＡブロックコポリマー鎖を、制御された重合化機構（Ｄｅｍｉｎｇ、前出）によって形成する。Ｇｌｕ残基の酸性基は、メチル化を保たれ、そしてカルボキシル基末端は、次の工程における高い親和性のペプチドの付着を助けるように保護される。
【０１３５】
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列からなるペプチドは販売されている。この配列を含むペプチドは、ナノモル程度の結合定数で特定のインテグリンに結合することが示されている。このペプチドのカルボキシル基末端は、ＥＤＣカップリング（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６）を介してＰＡＡ鎖のアミノ末端に結合され、ＰＡＡ−ＨＡＰを生じる。
【０１３６】
粒子を形成するために、ＰＡＡ鎖およびＰＡＡ−ＨＡＰ鎖の両方を水溶液に添加する。ＰＡＡ−ＨＡＰ鎖対ＰＡＡ鎖の重量比は、１：１〜１：１００の間である。１ｍＬの水溶液（５〜７のｐＨを有し、そして１０〜５００ｍＭのＮａＣｌを含有する）に対する１〜５０ｍｇのポリマー混合物の添加によって、自然なナノ粒子形成が生じる。
【０１３７】
（実施例８）
８５重量％の緩衝液（１０ｍＭ  ＰＢＳ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）、８重量％  ＩＭＡ（イヌリン  マルチ−アクリルアミド）、６重量％ＡＭ（アクリルアミド）、および１重量％ＮＯＢＡ（ナトリウムオルニチンブロモアセトアミドアクリルアミド）からなる水相を調製する。イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）  ＣＯ−２１０、イゲパル  ＣＯ−７２０およびシクロヘキサンを１．０：１．３：９．０の重量比で混合することによって、オイル＋界面活性剤相を調製する。３グラム（３ｇ）の水相を３０ｇのオイル＋界面活性剤相と混合し、逆相マイクロエマルジョン（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）の形成を行う。この逆相マイクロエマルジョンは、シクロヘキサンの連続相中に分散した、水相の界面活性剤安定化ナノ小滴を含む。次いで、光開始剤（例えば、イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）およびＤａｒｏｃｕｒ（Ｃｈｉｂａ））を、構築ブロックの重量１００部に対して０．０１部〜１部の重量の光開始剤で添加する。次いでこの逆相マイクロエマルジョンを脱気し、Ｎ２で再充填し、そして２０分〜１時間ＵＶランプを用いて照射し、この構築ブロックを重合化する（ＩＭＡ、ＡＭ、ＮＯＢＡ）。一旦重合化が完了すれば、この逆相マイクロエマルジョンにエタノールを添加することによってナノ粒子を沈殿させる。残りの界面活性剤および溶媒を、透析およびクロマトグラフィーのような標準的な技術によって除去する。この時点で、ナノ粒子の水溶液を凍結乾燥し、水に容易に溶ける綿状の固体としてナノ粒子を残す。次いで、このナノ粒子を適切な水溶液中に組み込み得る。
【０１３８】
（実施例９）
８１〜８５重量％の緩衝液（１０ｍＭ  ＰＢＳ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）、８重量％  ＩＭＭＡ（イヌリン  マルチ−メタクリレート）、６重量％ＡＭ（アクリルアミド）、および１〜５重量％のＤＡＡ（ジアセトンアクリルアミド）からなる水相を調製する。イゲパル  ＣＯ−２１０、イゲパル  ＣＯ−７２０およびシクロヘキサンを１．０：１．３：９．０の重量比で混合することによって、オイル＋界面活性剤相を調製する。３グラム（３ｇ）の水相を３０ｇのオイル＋界面活性剤相と混合し、逆相マイクロエマルジョンの形成を行う。この逆相マイクロエマルジョンは、シクロヘキサンの連続相中に分散した、水相の界面活性剤安定化ナノ小滴を含む。この逆相マイクロエマルジョンに、１０μＬのＵＶ光開始剤ストック溶液（９５重量％トルエン、２．５重量％イルガキュア、および２．５重量％Ｄａｒｏｃｕｒ）を、添加する。この逆相マイクロエマルジョンを１００ｍＬのＳｃｈｌｅｎｋチューブに移す。このチューブの内容物を水流吸引器で脱気する。このチューブの内容物を５分間吸引し、続いてこのチューブにＮ２ガスを１分再充填する。この吸引／充填工程を全部で３サイクル繰り返す。Ｓｃｈｌｅｎｋチューブの内容物を攪拌して、ＵＶランプを用いて１時間照射し、構築ブロックを重合化する（ＩＭＭＡ、ＡＭ、ＤＡＡ）。重合化が完了した後、この溶液に９ｍＬの純エタノールを直接添加することによってナノ粒子を沈殿させる。ナノ粒子含有ペレットを脱イオン水に再懸濁する。残りの界面活性剤および溶媒を、標準的技術（透析、クロマトグラフィーなど）によって除去する。この時点で、ナノ粒子の水溶液を凍結乾燥し得る。
【０１３９】
（実施例１０）
８１〜８５重量％の水、１４重量％のＩＭＭＡ（イヌリン  マルチ−メタクリレート）、および１〜５重量％のＤＡＡ（ジアセトンアクリルアミド）からなる水相を調製する。イゲパル  ＣＯ−２１０、イゲパル  ＣＯ−７２０およびシクロヘキサンを１．０：１．３：９．０の重量比で混合することによって、オイル＋界面活性剤相を調製する。３グラム（３ｇ）の水相を３０ｇのオイル＋界面活性剤相と混合し、逆相マイクロエマルジョンの形成を行う。この逆相マイクロエマルジョンは、シクロヘキサンの連続相中に分散した、水相の界面活性剤安定化ナノ小滴を含む。この逆相マイクロエマルジョンに、Ｅｏｓｉｎ  Ｙを含有する水溶液（ここで、光開始剤は０．００１〜０．１重量％の単量体質量を示す）を添加する。この逆相マイクロエマルジョンを１００ｍＬのＳｃｈｌｅｎｋチューブに移し、３サイクルの凍結融解、続いてこのチューブへの１分間のＮ２ガス再充填によって脱気する。Ｓｃｈｌｅｎｋチューブの内容物を攪拌して、少なくとも１００Ｗの可視光源を用いて、２０分〜２時間照射し、この構築ブロックを重合化する。一旦重合化が完了すれば、この溶液に９ｍＬの純エタノールを直接添加することによってナノ粒子を沈殿させる。ナノ粒子含有ペレットを脱イオン水に再懸濁する。残りの界面活性剤および溶媒を、標準的技術（透析、クロマトグラフィーなど）によって除去する。この時点で、ナノ粒子の水溶液を凍結乾燥し得る。
【０１４０】
（実施例１１）
ポリエチレンイミン（平均分子量８００ｋＤａ；「ＰＥＩ」）を０．０３ｇ．ｍｌで含有する塩基性緩衝液（ｐＨの値が８〜１０にわたる）の溶液を、ポリアクリル酸（平均分子量１．８ｋＤａ）を６．５ｍｇ／ｍＬで含有する溶液に滴下して添加した。１５分後、この系は平衡に達した。１つの酸性基（ポリアクリル酸由来）あたり１０のアミノ基（ＰＥＩ由来）の比によって、平均１０ｎＭの半径の、安定で狭い単分散のナノ粒子を得た。
【０１４１】
（実施例１２）
８５重量％の水および１５重量％のイヌリンからなる水相を調製する。油＋界面活性剤の相を、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０およびシクロヘキサンを１．０：１．３：９．０の重量比で混合することによって、調製する。３ｇの水相を４０ｇの油＋界面活性剤の相と混合し、逆ミクロエマルジョンの形成を生じる。１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をこの混合物に添加し、その結果、１のグルコースモノマーユニット（イヌリン由来）あたり最大１の過ヨウ素酸当量が存在する。インサイチュ酸化を約１０分間進行させ、その後、カプセル化のためのタンパク質（例えば、インターロイキン−２）を添加する。ビス［（２−アミノ−オキシ）エチルアミド］−（１，３）−プロパンの、水性メタノール混合物（５０／５０容量）中の濃厚溶液（少なくとも１ｇ／ｍＬ）を、このミクロエマルジョンに添加し、そして一晩反応させた（時間を最適化していない）。イヌリンのインサイチュ還元によって生成したアルデヒド官能基との、ビス［（２−アミノ−オキシ）エチルアミド］−（１，３）−プロパンの架橋によって得られるナノ粒子は、トラップされたインターロイキン−２を含む。これらを、エタノールの存在下での沈殿および遠心分離によって精製し、そして透析によって、過剰の未反応試薬から精製する。
【０１４２】
（実施例１３）
先行の実施例に従って、８５重量％の緩衝液（１０ｍＭ  ＰＢＳ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）、８重量％のＩＭＭＡ（イヌリンマルチメタクリレート（ｉｎｕｌｉｎ  ｍｕｌｔｉ−ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、６重量％のＡＭ（アクリルアミド）、０．３〜３．０重量％のＮＯＢＡ（オルニチンブロモアセトアミドアクリルアミドナトリウム）、および０．３〜３．０重量％のＤＡＡ（ジアセトンアクリルアミド）からなる水相を用いて合成したナノ粒子を、水溶液に溶解する。１つの代表的な手順は、１〜５ｇ／Ｌのナノ粒子を、１〜１０容量％のメタノールを含む０．０５Ｍ  ２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール緩衝液（ｐＨ８）に溶解することからなる。適切な量のチオ−およびＮ−ヒドロキシ−アミノ官能基化ポリエチレングリコール（平均分子量は代表的に２，０００と２０，０００との間）を、この反応混合物に添加し、そしてこの反応物を一晩撹拌する（反応時間は最適化されていない）。ペプチドを、ＰＥＧと同時に、このナノ粒子に直接グラフトし得る。
【０１４３】
どの官能部分をペプチドに付着させたいかに依存して、異なるリンカーが使用され得る。２セットの反応が直交する限り、表面にグラフトされる２つの異なるペプチドの相対量を選択的に制御することが可能である。エチレン−ジアミンブロモアセトアミドまたは３−ブロモアクリルアミドプロパナールを、リンカー分子として選択し得る。これらのリンカー分子は、理想的には反応媒体中に存在する１当量のチオール反応性官能基に対して少なくとも１当量で、反応混合物に添加される。ペプチドがＦＰＬＣカラムの後にグラフトされる場合には、代表的な手順は、ペプチドをナノ粒子中１ｍｇ／ｍＬの濃度で反応させることからなる。
【０１４４】
ペプチドＨ２Ｎ−ＷＬＷＨＰＱＦＳＳＣ−ＣＯ２Ｈをジチオール−ＰＥＧ鎖の末端に、システイン残基のチオールとブロモアセトアミド部分との反応を介してグラフトすることにより、高い結合能力を有するナノ粒子が導かれる：等温滴定熱量測定は、ストレプトアビジンに対して遊離ペプチドに関して３×１０−４Ｍの親和性結合を与え、一方でナノ粒子は、２つの型の結合部位を有することが見出された（１つの型は１．６（±０．９）×１０−６Ｍの結合定数を有し、そして第２の型は、５．９（±４）×１０−７Ｍの結合定数を有する）。従って、このナノ粒子は、未結合ペプチドと比較して、結合において実質的な改善を示す。
【０１４５】
（実施例１４）
１０重量％のＩＭＭＡ（イヌリンマルチメタクリレート）、４重量％のＤＡＡ（ジアセトンアクリルアミド）および１重量％のＮＯＢＡ（オルニチンブロモアセトアミドアクリルアミドナトリウム）の重合によって作製されるナノ粒子を、平均分子量６０００の過剰のポリエチレングリコールジアミン（Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ６０００−ＮＨ２）と反応させる。未反応Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ６０００−ＮＨ２を、沈殿または他の任意の当該分野において公知の方法（例えば、ＦＰＬＣのＳＣＣ）によって除去する。重炭酸緩衝液中の葉酸の溶液（１ｇ／ｍｌ、ｐＨ６．６）を、水に懸濁させたアミノＰＥＧ−官能基化ナノ粒子に添加し（１０ｍｇナノ粒子／ｍＬ水溶液）、そして１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドとカップリングさせる。ナノ粒子を、当該分野において公知の任意の方法（例えば、透析、遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーであるが、これらに限定されない）によって、精製し得る。
【０１４６】
（実施例１５）
Ｄｅｍｉｎｇ（Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３９０，３８６−３８９；Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，２７５９−２７６０）の方法に従って、ポリ（ロイシン）（Ｍｗ＝２２００）を、ロイシンＮ−カルボキシ無水物の重合から調製する。この場合には、ニッケル重合触媒が、エリスロポエチンに対するＨＡＰを用いて調製され、Ｃｕｒｔｉｎ（Ｃｕｒｔｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，７４２７−７４２８）の方法に従って開始リガンドとして働く。この場合には、エリスロポエチンに対するＨＡＰのアミン末端が、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）保護基によって保護され、一方でエリスロポエチンに対するＨＡＰの残りの部分は、ペプチド合成において通常使用される他の保護基を用いて保護される。ポリマーが単離された後に、エリスロポエチンに対するＨＡＰを、側鎖の脱保護によって活性化形態に転換し、そしてＤＭＦに溶解する。このＤＭＦ溶液を、エリスロポエチンの水溶液にゆっくりと添加する。得られる水溶液を透析して、ＤＭＦを除去する。
【０１４７】
代替の処方において、ポリ（ロイシン）ブロックの１０〜２０％のロイシンを、ランダムコポリマーとしてリジンで置換し得る。このポリマーの合成後、リジン残基をトリフルオロ酢酸で脱保護する。次いで、ＰＡＡブロックのリジン残基を、レブリン酸を用いて官能基化し、ケトンをＰＡＡブロックに含める。次いで、エリスロポエチンに対するＨＡＰを脱保護する。次いで、上に概説したように、エリスロポエチンの存在下でミセルを形成し、そしてＤＭＦに溶解したジ−アミノ−オキシ官能基化ＰＥＧ（Ｍｗ＝５０００）をこの水溶液に添加して、ナノ粒子の内部を架橋させる。次いで、前述のようにこの粒子を精製し、そして単離する。
【０１４８】
（実施例１６）
ＡＢ構造を有し、そして各ブロックが、約１０，０００〜２０，０００Ｄａであり、従って、２０，０００〜４０，０００Ｄａの総分子量を有する、ＬＥＵ／ＧＬＵブロックコポリマー鎖（ＰＡＡ鎖）を、制御された重合機構（前出のＤｅｍｉｎｇ）を介して形成する。また、ＡＢ構造を有し、ＬＥＵブロックが、約１０，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａであり、そしてＧＬＵブロックが、１０００Ｄａと２０００Ｄａとの間であり、従って、１１，０００〜２２，０００Ｄａの総分子量を有する、ＬＥＵ／ＧＬＵブロックコポリマー鎖（ＰＡＡ鎖）を、制御された重合機構（前出のＤｅｍｉｎｇ）を介して形成する。この第２の「短」鎖構造は、ペプチドカップリングのために使用される。ＧＬＵ残基の酸基はメチル化されて維持され、そしてカルボキシ末端は保護されて、次の工程において高親和性のペプチドの付着を補助する。
【０１４９】
マイクロモル濃度〜ナノモル濃度の範囲の親和性定数でＥＰＯに結合するヘキサマーペプチドを購入する。このペプチドのカルボキシル末端を、ＥＤＣカップリングを介して「短」ＬＥＵ／ＧＬＵ  ＰＡＡ鎖のアミン末端に結合させ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６）、ＰＡＡ−ＨＡＰ鎖を生成する。
【０１５０】
次いで、１００  ｇと５０００  ｇとの間のブロックコポリマーを、１０μｇのＥＰＯを含む１００μＬの水溶液に添加する。ＰＡＡ−ＨＡＰ対ＰＡＡ鎖の重量比は、１：１と１：１００との間である。ＥＰＯを、ＰＡＡ−ＨＡＰ鎖のペプチドに結合させる。この水溶液は、５と７との間のｐＨを有し、そして１０ｍＭと２００ｍＭとの間のＮａＣｌを含む。ナノ粒子形成は、自発的である。
【０１５１】
（実施例１７）
８５重量％の水および１５重量％のＩＭＭＡ（イヌリンマルチメタクリレート）からなる水相を調製する。３ｇの水相を、シクロヘキサン中の８．５重量％のＩｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０からなる３０ｇの油＋界面活性剤の相と混合する。１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をこの混合物に添加し、その結果、１のグルコースモノマーユニット（ＩＭＭＡ由来）あたり最大１の過ヨウ素酸当量が存在する。インサイチュ酸化を約１０分間進行させ、その後、アルデヒド含有ペプチドを添加する。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（これは、レブリン酸を末端リジンに含む）の改変バージョンを、ペプチドとして使用した。ビス−［２−（（２−アミノ−オキシ）エチルアミド）エチル］アミンの濃厚水溶液（少なくとも１ｇ／ｍＬ）を、このミクロエマルジョンに添加し、そして１時間反応させ、アルデヒド官能基とアミノ−オキシ部分とを架橋させる。
【０１５２】
Ｅｏｓｉｎ  Ｙの水溶液（ここで、光開始剤は、ＩＭＭＡ質量の０．００１〜０．１重量％を占める）を、この逆ミクロエマルジョンに添加する。このミクロエマルジョンを撹拌し、そして少なくとも１００Ｗの可視光源で２０分間〜２時間照射して、重合したナノ粒子を形成する。
【０１５３】
（実施例１８）
８５重量％の水および１５重量％のイヌリンからなる水相を調製する。２ｇの水相を、シクロヘキサン中８．５重量％のＩｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０からなる３０ｇの油＋界面活性剤の相と混合する。１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をこの混合物に添加し、その結果、１のグルコースモノマーユニット（イヌリン由来）あたり最大１の過ヨウ素酸当量が存在する。インサイチュ酸化を約１０分間進行させる。このミクロエマルジョンに、インターロイキン−２（０．１〜５μｇ）の１ｇの水溶液を、十分な量のヘキサマーペプチド（レブリン酸（これは、アルデヒド官能基を含む）によって終結し、マイクロモル濃度〜ナノモル濃度の親和性定数でインターロイキン−２と結合する）の存在下で添加する。
【０１５４】
ビス−［２−（（２−アミノ−オキシ）エチルアミド）エチル］アミンの水溶液を、このミクロエマルジョンに添加し、そして３時間反応させて、アルデヒド官能基とアミノ−オキシ部分とを架橋させる。インターロイキン−２／ＨＡＰ複合体を含むナノ粒子を、当該分野において公知の方法によって精製する。
【０１５５】
（実施例１９）
Ｄｅｍｉｎｇ（Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３９０，３８６−３８９；Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，２７５９−２７６０）の方法に従って、ポリ（ロイシン）（Ｍｗ＝２２００）を、ロイシンＮ−カルボキシ無水物の重合から調製する。この場合には、ニッケル重合触媒が、インターロイキン−２に対するＨＡＰを用いて調製され、Ｃｕｒｔｉｎ（Ｃｕｒｔｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，７４２７−７４２８）の方法に従って開始リガンドとして働く。この場合には、インターロイキン−２のアミン末端が、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）保護基によって保護され、一方でインターロイキン−２に対するＨＡＰの残りの部分は、ペプチド合成において通常使用される他の保護基を用いて保護される。次いで、このＨＡＰ／ポリ（ロイシン）複合体を、保護されたペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓのカルボン酸末端に、ＤＭＦ中の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドの作用によってカップリングさせる。このＤＭＦを減圧下で除去し、そして得られる固体を多量のクロロホルムで洗浄して、尿素副生成物を除去する。インターロイキン−２に対するＨａｐおよびペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓの脱保護の後に、インターロイキン−２に対するＨＡＰ／ポリ（ロイシン）／ペプチドブロックコポリマーを、ＤＭＦに溶解し、そしてインターロイキン−２の水溶液に滴下する。得られる水溶液を透析して、ＤＭＦを除去する。
【０１５６】
代替の処方において、ポリ（ロイシン）ブロックの１０〜２０％のロイシンを、ランダムコポリマーとしてリジンで置換し得る。上記のような、このポリマーの合成後、リジン残基を脱保護する。次いで、ＰＡＡブロックのリジン残基を、レブリン酸を用いて官能基化し、ケトンをＰＡＡブロックに含める。次いで、インターロイキン−２に対するＨＡＰおよびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓペプチドを脱保護する。次いで、上に概説したように、インターロイキン−２の存在下でミセルを形成し、そしてＤＭＦに溶解したジ−アミノ−オキシ官能基化ＰＥＧ（Ｍｗ＝５０００）をこの水溶液に添加して、ナノ粒子の内部を架橋させる。次いで、前述のようにこの粒子を精製し、そして単離する。
【０１５７】
（実施例２０）
ＡＢ構造を有し、そしてＬｅｕおよびＶａｌのランダムコポリマーからなる１，０００〜１０，０００Ｄａの間の分子量を有する疎水性ブロックを有し、そしてＧｌｕからなる約５，０００と２０，０００との間の分子量を有する親水性ブロックを有し、従って、６，０００〜３０，０００Ｄａの総分子量を有する、（Ｌｅｕ−Ｖａｌ）／Ｇｌｕブロックコポリマー鎖（ＰＡＡ鎖）を、制御された重合機構（前出のＤｅｍｉｎｇ）を介して形成する。また、ＡＢ構造を有し、そしてＬｅｕおよびＶａｌのランダムコポリマーからなる約１，０００〜１０，０００Ｄａの間の分子量を有する疎水性ブロックを有し、そしてＧｌｕからなる１，０００Ｄａと１０，０００Ｄａとの間の分子量を有する親水性ブロックを有し、従って、２，０００〜２０，０００Ｄａの総分子量を有する、（Ｌｅｕ−Ｖａｌ）／Ｇｌｕブロックコポリマー鎖（ＰＡＡ鎖）を、制御された重合機構（前出のＤｅｍｉｎｇ）を介して形成する。この第２の「短」鎖構造は、ペプチドカップリングのために使用される。Ｇｌｕ残基の酸基はメチル化されて維持され、そしてカルボキシ末端は保護されて、次の工程において高親和性のペプチドの付着を補助する。
【０１５８】
ＥＧＦｒの可溶性部分（本明細書中において「ｓＥＧＦｒ」と定義される）に、好ましくはマイクロモル濃度〜ナノモル濃度の範囲の親和性定数で結合するペプチドを、購入する。購入するべき特定のペプチドは、例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを介して見出される。使用されるペプチド配列は、ＥＧＦｒに対してアゴニストではない。このペプチドのカルボキシル末端は、「短い」（Ｌｅｕ−Ｖａｌ）／Ｇｌｕ  ＰＡＡ鎖のアミン末端に、ＥＤＣカップリングを介して結合し（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６）、ＰＡＡ高親和性ペプチド鎖を生成する。
【０１５９】
次いで、１００μｇと５０００μｇとの間のブロックコポリマーを、１０μｇのｓＥＧＦｒを含む１００μＬの水溶液に添加する。ＰＡＡ−ペプチド対ＰＡＡ鎖の重量比は、１：１と１：１００との間である。ｓＥＧＦｒを、ＰＡＡ−ペプチド鎖のペプチドに結合させる。この水溶液は、５と７との間のｐＨを有し、そして１０ｍＭと２００ｍＭとの間のＮａＣｌを含む。ナノ粒子形成は、自発的である。
【０１６０】
本実施例において、ＥＧＦｒに結合するペプチドは、１型ペプチドと２型ペプチドとの両方として働く。１型ペプチドとして、このペプチドは、ｓＥＧＦｒに結合するよう働き、このｓＥＧＦｒをナノ粒子に組み込む。２型ペプチドとして作用する場合に、このペプチドは、ｓＥＧＦｒレセプターを過剰発現する腫瘍組織を標的化するよう働く。次いで、治療剤（すなわち、ｓＥＧＦｒ）の放出が、腫瘍に集中された様式で起こる。そこで、ｓＥＧＦｒはＥＧＦに結合し得る。このことは、ＥＧＦの腫瘍細胞表面ＥＧＦｒへの結合を減少させ得、従って、腫瘍細胞の増殖を減少させ得る。
【０１６１】
（実施例２１）
８５重量％の水および１５重量％のイヌリンからなる水相を調製する。２ｇの水相を、シクロヘキサン中８．５重量％のＩｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０からなる３０ｇの油＋界面活性剤の相と混合する。１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をこの混合物に添加し、その結果、１のグルコースモノマーユニット（イヌリン由来）あたり最大１の過ヨウ素酸当量が存在する。インサイチュ酸化を約１０分間進行させる。エリスロポエチン（０．０５〜２μｇ）を、十分な量のヘプタマーペプチド（レブリン酸（これは、アルデヒド官能基を含む）によって終結し、マイクロモル濃度〜ナノモル濃度の親和性定数でＥＰＯと結合する）の存在下で添加する。
【０１６２】
ビス−［２−（（２−アミノ−オキシ）エチルアミド）エチル］アミンの水溶液を、このミクロエマルジョンに添加し、そして３時間反応させて、アルデヒド官能基とアミノ−オキシ部分とを架橋させる。ＥＰＯ／ＨＡＰ複合体を含むナノ粒子を、当該分野において公知の方法によって精製し、そして過剰のジアミノ−オキシ−ポリエチレングリコールの存在下で、水溶液に再懸濁させる。ジアミノ−オキシ−ポリエチレングリコールの（ナノ粒子上の残りのアルデヒドとの）反応を、１２時間進行させる。このナノ粒子を未反応ジアミノ−オキシ−ポリエチレングリコールからＦＰＬＣによって分離し、「標的」ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−レブリン酸のアルデヒド末端とカップリングさせ、そして透析によって精製する。
【０１６３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  ALNIS BIOSCIENCES, INC.
<120>  High Affinity Peptide-Containing Nanoparticles
<130>  F102F92P03
<140>  JP 2001-576085
<141>  2001-04-13
<150>  US 60/197,765
<151>  2000-04-14
<150>  US 60/220,061
<151>  2000-07-21
<150>  US 60/220,530
<151>  2000-07-24
<150>  US 60/236,448
<151>  2000-09-29
<150>  US 60/256,819
<151>  2000-12-18
<150>  US 60/256,894
<151>  2000-12-18
<150>  US 60/256,985
<151>  2000-12-18
<150>  US 60/261,520
<151>  2001-01-12
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Synthetic peptide in example 1, 4, 17, 19 and 21
<400>  1
Arg Gly Asp Phe Lys
1               5
<210>  2
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Synthetic peptide in example 2 and 3
<400>  2
Arg Gly Asp Phe Lys Cys
1               5
<210>  3
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Synthetic peptide in example 5
<400>  3
Leu Ser Trp His Pro Gly
1               5
<210>  4
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Synthetic peptide in example 13
<220>
<221>  NON_TER
<222>  (1)..(1)
<223>  There is an amino group before Trp
<220>
<221>  NON_TER
<222>  (10)..(10)
<223>  There is a carboxyl group after Cys
<400>  4
Trp Leu Trp His Pro Gln Phe Ser Ser Cys
1               5                   10