(57)【要約】  一塩基のみが異なる、変異を含む検出対象配列と変異を含まない非検出対象配列とが共存する場合でも、前記変異を含む検出対象配列を検出可能なＪＡＫ２遺伝子変異の検出用プローブを提供する。  配列番号１の塩基配列からなるＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における８４番目のシトシン塩基（Ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって１７〜２２塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。これらのプローブを、例えば、Ｔｍ解析に使用することによって、変異が発生しているＪＡＫ２遺伝子と変異が発生していないＪＡＫ２遺伝子とが含まれる試料であっても、前者の変異を検出することができる。前記プローブは、蛍光色素で標識化されていることが好ましい。
2009011297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、
下記（Ｘ）および（Ｙ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
（Ｘ）  配列番号１の塩基配列からなるＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における８４番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって１７〜２２塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｙ）  前記（Ｘ）の相補配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ｘ）が、配列番号３〜８からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１記載のプローブ。
【請求項３】
前記塩基配列における塩基（ｋ）が、チミン（ｔ）である、請求の範囲１記載のプローブ。
【請求項４】
前記プローブが、配列番号１の塩基配列における７３番目の塩基の変異（ｇ→ｔ）を検出するためのプローブである、請求の範囲１記載のプローブ。
【請求項５】
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲１記載のプローブ。
【請求項６】
前記標識化プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブである、請求の範囲５記載のプローブ。
【請求項７】
前記標識化プローブが、蛍光色素で標識化されたプローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブである、請求の範囲５記載のプローブ。
【請求項８】
前記標識化プローブが、オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシン塩基が標識化されたプローブである、請求の範囲５記載のプローブ。
【請求項９】
前記プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求の範囲１記載のプローブ。
【請求項１０】
ＪＡＫ２遺伝子における変異の検出方法であって、
下記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とする変異の検出方法。
（Ａ）  前記変異の有無を検出する被検核酸と、請求の範囲１記載のプローブとを含む反応系を準備する工程
（Ｂ）  前記反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｃ）  温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
【請求項１１】
ＪＡＫ２遺伝子における変異が、配列番号１に示すＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における７３番目の塩基の変異（ｇ→ｔ）である、請求の範囲１０記載の検出方法。
【請求項１２】
前記（Ａ）工程における前記被検核酸が、鋳型核酸から核酸増幅法により増幅させた増幅物である、請求の範囲１０記載の検出方法。
【請求項１３】
前記（Ａ）工程が、さらに、プライマーセットを用いて、鋳型核酸から被検核酸を増幅する工程を含む、請求の範囲１２記載の検出方法。
【請求項１４】
前記プライマーセットが、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、請求の範囲１３記載の検出方法。
（Ｆ）  配列番号２の塩基配列における１９３番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２４〜４４塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ）  配列番号２の塩基配列における２５５番目のシトシン塩基（ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜４７塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記２５５番目のシトシン塩基（ｃ）に相補的なグアニン塩基（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項１５】
前記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１４記載の検出方法。
（Ｆ１）  配列番号２５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）  配列番号５１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項１６】
前記プローブが、蛍光標識で標識化されたプローブであり、前記（Ｂ）工程において、前記蛍光標識の蛍光強度を測定する、請求の範囲１０記載の検出方法。
【請求項１７】
被検核酸が、生体試料由来の核酸である、請求の範囲１０記載の検出方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、血液である、請求の範囲１７記載の検出方法。
【請求項１９】
核酸増幅法によりＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、
下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセット。
（Ｆ）  配列番号２の塩基配列における１９３番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２４〜４４塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ）  配列番号２の塩基配列における２５５番目のシトシン塩基（ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜４７塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記２５５番目のシトシン塩基（ｃ）に相補的なグアニン塩基（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項２０】
前記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドであり、前記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドが、下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１９記載のプライマーセット。
（Ｆ１）  配列番号２５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）  配列番号５１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２１】
前記プライマーセットが、生体試料由来のＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマーセットである、請求の範囲１９記載のプライマーセット。
【請求項２２】
請求の範囲１０記載のＪＡＫ２遺伝子における変異の検出方法に使用するための変異検出キットであって、
請求の範囲１記載のプローブを含むことを特徴とする変異検出キット。
【請求項２３】
さらに、請求の範囲１９記載のプライマーセットを含む、請求の範囲２２記載の変異検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄増殖性疾患（chronic  myeloproliferative  disorder；ＣＭＰＤ）に関連するＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。【０００３】
ＳＮＰの一般的な検出方法としては、（１）検出目的の変異が発生する領域を増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を解析するDirect  Sequencing法、（２）Pyrosequencing法、（３）前記領域を増幅させ、温度勾配カラム中でＨＰＬＣを行い、溶出される時間によって変異の有無を検出するDenaturing  ＨＰＬＣ法、（４）検出目的の変異を含む領域に蛍光プローブが結合すると蛍光を発することを利用し、蛍光強度の測定により変異を検出するInvader法、（５）３’末端領域のいずれかの塩基が検出目的の変異に相補的な塩基となるよう設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ（Allele  Specific  Primer）−ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法等があげられる。【０００４】
しかしながら、前記（１）、（２）および（４）の方法は、それぞれ、約２０％、約５％、約５％程度と感度が低く、操作に多大な手間と時間がかかる。前記（３）の方法は、感度が約１０％と低く、また、変異の有無が確認できるのみで、どの部位にどのような変異が生じているのかを解析できず、特異性にかけるという問題がある。また、前記（５）の方法は、感度は高いものの特異性が低く、偽陽性が生じ易いという問題がある。なお、感度は数値（％）が小さい程高感度である。【０００５】
このような問題から、近年、ＳＮＰの検出方法として、以下に示すＴｍ（Melting  temperature）解析が利用されている。これは、まず、検出目的のＳＮＰを含む領域に相補的なプローブを用いて、被検体の核酸と前記プローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。そして、ハイブリッド形成体に加熱処理を施して、温度上昇に伴うハイブリッドの一本鎖への解離（融解）を、吸光度等のシグナル測定により検出する。この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、ＳＮＰを判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、例えば、まず、変異型のＳＮＰを含む核酸とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておく。続いて、被検体の核酸と前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。そして、この測定値が前記評価基準値と同じであれば、パーフェクトマッチ、すなわち、被検体の核酸のＳＮＰが変異型であると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち、被検体の核酸のＳＮＰが正常型であると判断できる。しかしながら、このようなＴｍ解析を用いた検出方法は、一般的に感度が低いという問題がある。【０００６】
真性多血症（Polycythemia  vera；PV）、本態性血小板血症（essential  thrombocythemia；ＥＴ）等の慢性骨髄増殖性疾患（ＣＭＰＤ）において、ＪＡＫ２遺伝子の変異型ＳＮＰが高頻度に認められることが報告されている（非特許文献１〜４）。前記変異型ＳＮＰとは、ＪＡＫタンパク質の６１７番目のバリン（Ｖ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換する変異であり、ＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２の７３番目（成熟ｍＲＮＡ（ＣＤＳ）の１８４９番目）のグアニンがチミンに置換されている（ＪＡＫ２／Ｖ６１７Ｆ）。このようなタンパク質を発現するＪＡＫ２遺伝子の変異（ＪＡＫ２／Ｖ６１７Ｆ）の検出は、ＣＭＰＤの診断、治療に有用と考えられる。しかしながら、一人の患者の血液検体であっても、その血液検体には、変異型ＳＮＰが発生している変異ＪＡＫ２遺伝子を有する血液細胞と、正常型ＳＮＰである正常ＪＡＫ２遺伝子を有する血液細胞とが含まれている。これらの遺伝子の違いは、ＳＮＰのタイプ、すなわち、一塩基の違いにすぎない。そうすると、変異型ＳＮＰを検出するためのプローブは、変異型ＳＮＰを含む変異配列（検出対象配列）にパーフェクトマッチでハイブリダイズするが、さらに、変異型ＳＮＰではなく正常型ＳＮＰを含む正常配列（非検出対象配列）にも、一塩基はミスマッチであるものの、ハイブリダイズするという現象が起こってしまう。このような場合に、Ｔｍ解析において、シグナル強度と温度との関係を示す融解曲線を作成すると、パーフェクトマッチである変異配列の高温側ピークが、ミスマッチである正常配列の低温側のピークの存在によって、検出し難くなるという問題がある。つまり、変異配列が存在する場合であっても、正常配列の存在によって、その検出が困難となり、検出感度の低下が生じてしまう。【０００７】
【非特許文献１】Tefferi  A.  Hematology  Am  Soc  Hematol  Educ  Program.  2006;  240-245.
【非特許文献２】Baxter  EJ,  Scott  LM,  Campbell  PJ,  et  al.  Lancet.  2005;  365:  1054-1061.
【非特許文献３】Kralovics  R,  Passamonti  F,  Buser  AS,  et  al.  N  Engl  J  Med.  2005;  352:  1779-1790.
【非特許文献４】Levine  RL,  Wadleigh  M,  Cools  J,  et  al.  Cancer  Cell.  2005;  7:  387-397.
【発明の開示】
【０００８】
そこで、本発明は、１塩基のみが異なる、変異を含む変異配列と変異を含まない正常配列とが共存する場合でも、優れた感度で検出目的の前記変異を検出可能なＪＡＫ２遺伝子変異の検出用プローブおよびその用途の提供を目的とする。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明のプローブは、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、下記（Ｘ）および（Ｙ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
（Ｘ）  配列番号１の塩基配列からなるＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における８４番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって１７〜２２塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｙ）  前記（Ｘ）の相補配列からなるオリゴヌクレオチド
【００１０】
本発明の変異の検出方法は、ＪＡＫ２遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とする。
（Ａ）  前記変異の有無を検出する被検核酸と、本発明のプローブとを含む反応系を準備する工程
（Ｂ）  前記反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｃ）  温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
【００１１】
本発明のプライマーセットは、核酸増幅法によりＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーを含むことを特徴とする。
（Ｆ）  配列番号２の塩基配列における１９３番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２４〜４４塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ）  配列番号２の塩基配列における２５５番目のシトシン塩基（ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜４７塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記２５５番目のシトシン塩基（Ｃ）に相補的なグアニン塩基（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
【００１２】
本発明の変異検出キットは、本発明のＪＡＫ２遺伝子の変異の検出方法に使用するためのキットであって、本発明のプローブを含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明のプローブによれば、検出目的の変異ＪＡＫ２／Ｖ６１７Ｆが発生している変異配列（変異遺伝子）と、前記変異が発生していない正常配列（正常遺伝子）とが共存している場合でも、前記変異配列の有無、すなわち、検出目的の変異の有無を検出できる。前述のように、前記Ｔｍ解析においては、一般的に、一塩基のみが異なる変異配列と正常配列の双方にプローブがハイブリダイズする。このため、前記融解曲線において、両者のシグナルが重なり、変異配列の有無を検出することが非常に困難とされている。これに対して、本発明のプローブによれば、変異配列と正常配列の双方にハイブリダイズするものの、融解曲線において、両者のシグナルを十分に分離できる。このため、本発明によれば、優れた感度で、ＪＡＫ２遺伝子の変異（ＪＡＫ２／Ｖ６１７Ｆ）を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、以下、検出目的の変異が発生しているＪＡＫ２遺伝子を、「変異遺伝子または検出対象遺伝子」、検出目的の変異が発生している配列であって、プローブがハイブリダイズ可能な領域またはこの領域を含む配列を、「変異配列または検出対象配列」という。また、検出目的の変異が発生していないＪＡＫ２遺伝子を、「正常遺伝子または非検出対象遺伝子」、検出目的の変異が発生していない配列であって、プローブがハイブリダイズ可能な領域またはこの領域を含む配列を、「正常配列または非検出対象配列」という。また、変異の検出に供される核酸を、「被検核酸または標的核酸」ともいう。【００１６】
配列番号１の塩基配列は、ＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２のｃＤＮＡ配列であり、７３番目の塩基（ｋ）が検出目的の塩基である。前記７３番目の塩基（ｋ）はＳＮＰとして知られており、例えば、正常型はｇ、変異型はｔである。配列番号２の塩基配列は、ＪＡＫ２遺伝子の完全長配列（ｅｘｏｎおよびｉｎｔｒｏｎを含む）における部分配列であり、ｅｘｏｎ１２およびその周辺領域を含む配列である。ＪＡＫ２遺伝子の完全長配列（１４２７５１ｂｐ）は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００００９に登録されている。また、ＪＡＫ２遺伝子のｍＲＮＡ（５０９７ｂｐ）は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されており、この登録されている塩基配列において、２３４３番目が、検出対象の塩基部位である。なお、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されている塩基配列において、４９５番目〜３８９３番目の領域がＣＤＳ配列であり、ＣＤＳ内の１８４９番目が、検出目的の塩基部位である。【００１７】
＜プローブ＞
本発明のプローブは、前述のように、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、下記（Ｘ）および（Ｙ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプローブであることを特徴とする。なお、本発明のプローブは、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブであってもよい。本発明において、前記オリゴヌクレオチド（Ｘ）は、３’末端が、下記条件を満たしていればよい。
（Ｘ）  配列番号１の塩基配列からなるＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における８４番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって１７〜２２塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｙ）  前記（Ｘ）の相補配列からなるオリゴヌクレオチド【００１８】
本発明のプローブは、配列番号１に示すＪＡＫ２遺伝子ｅｘｏｎ１２の７３番目（ｋ）、すなわち、ＪＡＫ２遺伝子のｃＤＮＡ（成熟ｍＲＮＡに対応）の１８４９番目の塩基（ｋ）の変異（ｇ→ｔ）を検出するためのプローブである。本発明のプローブのうち、前記オリゴヌクレオチド（Ｘ）からなるプローブは、ＪＡＫ２遺伝子のアンチセンス鎖（逆鎖）に相補的であって、アンチセンス鎖における変異を確認できる。また、本発明のプローブのうち、前記オリゴヌクレオチド（Ｙ）からなるプローブは、ＪＡＫ２遺伝子のセンス鎖（順鎖）に相補的であって、センス鎖における変異を確認できる。【００１９】
本発明のプローブは、例えば、ＪＡＫ２遺伝子の７３番目が変異（ｔ）した変異配列にパーフェクトマッチするように設計してもよいし、７３番目が正常（ｇ）である正常配列にパーフェクトマッチするように設計してもよい。【００２０】
本発明のプローブにおいて、前記オリゴヌクレオチド（Ｘ）としては、例えば、配列番号３〜８で示すオリゴヌクレオチドがあげられる。下記配列において、ｋは、ｇおよびｔのいずれでもよく、変異配列とパーフェクトマッチに設計する際には「ｔ」、正常配列とパーフェクトマッチに設計する際には「ｇ」とすることが好ましい。これらの配列の中でも、配列番号５で表わされるオリゴヌクレオチドからなるプローブが好ましく、より好ましくは、配列番号５において塩基ｋがチミンであるオリゴヌクレオチドからなるプローブである。
５’−ｔａｔｇｔｋｔｃｔｇｔｇｇａｇａｃ−３’（配列番号３）
５’−ｇｔａｔｇｔｋｔｃｔｇｔｇｇａｇａｃ−３’（配列番号４）
５’−ａｇｔａｔｇｔｋｔｃｔｇｔｇｇａｇａｃ−３’（配列番号５）
５’−ｇａｇｔａｔｇｔｋｔｃｔｇｔｇｇａｇａｃ−３’（配列番号６）
５’−ｇｇａｇｔａｔｇｔｋｔｃｔｇｔｇｇａｇａｃ−３’（配列番号７）
５’−ｔｇｇａｇｔａｔｇｔｋｔｃｔｇｔｇｇａｇａｃ−３’（配列番号８）【００２１】
これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号１の塩基配列における６２、６３、６４、６５、６６または６７から８４番目の領域（７３番目はｇまたはｔ）の相補配列に結合する配列である。【００２２】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識物質は、制限されないが、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例として、例えば、前記蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。【００２３】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。【００２４】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。【００２５】
本発明のプローブは、前述のように、ＪＡＫ２遺伝子の変異の検出に使用することができる。この変異の検出方法は、何ら制限されず、被検核酸と前記プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。本発明のプローブを適用する方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した変異の検出方法について、以下に説明する。【００２６】
＜変異検出方法＞
本発明の変異検出方法は、前述のように、ＪＡＫ２遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とする。
（Ａ）  前記変異の有無を検出する被検核酸と、本発明のプローブとを含む反応系を準備する工程
（Ｂ）  前記反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｃ）  温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程【００２７】
本発明の変異検出方法によれば、配列番号１に示すＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における７３番目の塩基（ｋ）の変異（ｇ→ｔ）を検出できる。本発明の変異検出方法によれば、例えば、従来のDirect  Sequencing法やPyrosequencing法よりも、優れた感度で検出を行うことができる。【００２８】
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。【００２９】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前記試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写反応（RT-PCR：Reverse  Transcription  PCR）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。これらの増幅産物を、本発明における被検核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜２００塩基である。【００３０】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。【００３１】
前述のように、被検核酸が、鋳型核酸から核酸増幅法により増幅させた増幅産物である場合、前記（Ａ）工程は、さらに、プライマーを用いて鋳型核酸から被検核酸を増幅する工程を含んでもよい。【００３２】
前記プライマーとしては、ＪＡＫ２遺伝子において本発明のプローブがハイブリダイズ可能な領域が増幅されればよく、特に制限されない。前記増幅領域は、例えば、前記プローブがハイブリダイズする領域のみでもよいし、前記ハイブリダイズ領域を含む領域であってもよい。プライマーとしては、例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか一方でもよいが、両者を一対として併用することが好ましい。プライマーとしては、後述するものが使用できるが、これには制限されない。【００３３】
本発明において、本発明のプローブの添加割合は、制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、本発明のプローブの被検核酸に対するモル比は、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。この際、被検核酸とは、例えば、検出目的の変異が発生している変異配列（検出対象配列）と前記変異が発生していない正常配列（非検出対象配列）との合計でもよいし、前記変異配列を含む増幅産物と前記正常配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、被検核酸を含む試料中における変異配列の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、変異配列またはそれを含む増幅産物に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに、好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。【００３４】
前記被検核酸に対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。【００３５】
Ｔｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。【００３６】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりである。【００３７】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、本発明のプローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。【００３８】
まず、全血からゲノムＤＮＡを単離する。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができ、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX  Genomic  Blood  DNA  Purification  kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。【００３９】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識化プローブを添加する。前記標識化プローブとしては、例えば、ＱＰｒｏｂｅが好ましい。このＱＰｒｏｂｅとは、一般に、プローブ末端のシトシン塩基を蛍光色素で標識化したプローブであり、これが検出対象配列にハイブリダイズすることで、前記蛍光色素と検出対象配列のグアニン塩基とが相互作用し、その結果、蛍光が減少（または消光）するものである。【００４０】
前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述する増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。中でも、増幅反応と、前記（Ｂ）工程とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。【００４１】
前記プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。【００４２】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。前記核酸増幅法は、制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  acid  sequence  based  amplification）法、ＴＭＡ（Transcription−mediated  amplification）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。なお、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。【００４３】
ＰＣＲのプライマーの配列は、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅できるものであれば特に制限されず、前述のように、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜３０ｍｅｒ）に設定できる。【００４４】
本発明の検出方法に使用するプライマーセットとしては、例えば、後述する本発明のプライマーセットがあげられる。なお、本発明のプライマーセットの用途は、本発明の検出方法には制限されず、また、本発明の検出方法に使用するプライマーセットも、本発明のプライマーセットには限定されない。【００４５】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。【００４６】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。【００４７】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。【００４８】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜１μｍｏｌ／Ｌである。【００４９】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。【００５０】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。【００５１】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、例えば、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、変化量を（ｄ蛍光強度増加量／ｔ）とする場合は、例えば、最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。【００５２】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもできる。【００５３】
そして、これらのＴｍ値から、目的の塩基部位における遺伝子型（変異型、正常型等）を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補的であるハイブリッド（パーフェクトマッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、目的の塩基部位における遺伝子型を決定することができる。例えば、目的の塩基部位の塩基を変異型と仮定し、その変異型塩基を含む検出目的配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、目的塩基は、変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、目的塩基は、正常型と判断できる。【００５４】
また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて（ハイブリッド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。【００５５】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。【００５６】
＜プライマーセット＞
本発明のプライマーセットは、核酸増幅法によりＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーを含むことを特徴とする。
（Ｆ）  配列番号２の塩基配列における１９３番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２４〜４４塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ）  配列番号２の塩基配列における２５５番目のシトシン塩基（ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜４７塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記２５５番目のシトシン塩基（ｃ）に相補的なグアニン塩基（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド【００５７】
本発明において、各プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。【００５８】
このように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、その３’末端の塩基が固定されていればよいことから、各プライマーの長さ自体は特に制限されず、一般的な長さに適宜調整することができる。プライマーの長さの一例としては、例えば、１３〜５０ｍｅｒの範囲であり、好ましくは１４〜４５ｍｅｒであり、より好ましくは１５〜４０ｍｅｒである。具体例として、前記フォワードプライマーは、配列番号２の塩基配列における１９３番目のシトシン塩基（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２４〜４７塩基目（好ましくは、２５〜３５塩基目、より好ましくは２７〜３２塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記リバースプライマーは、配列番号２の塩基配列における２５５番目のシトシン塩基（ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜４７塩基目（好ましくは、２５〜３８塩基目、より好ましくは２６〜３１塩基目）までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、フォワードプライマーとリバースプライマーの３’末端が固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、配列番号２における１９４番目〜２５４番目の領域であるが、得られる増幅産物の全体の長さは使用するプライマーの長さに応じて変化する。【００５９】
また、リバースプライマーは、配列番号２に示す塩基配列に対して、フォワードプライマーは、前記塩基配列の相補鎖の塩基配列に対して、それぞれ完全に相補的なオリゴヌクレオチドでなくともよい。すなわち、各プライマーにおける３’末端の塩基を除く部分において、例えば、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。【００６０】
以下に、本発明におけるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。中でもフォワードプライマーとしては、配列番号２５、リバースプライマーとしては、配列番号５１が好ましい。【００６１】
【表１】
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【００６２】
【表２】
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【００６３】
本発明のプライマーセットにおけるフォワードプライマーおよびリバースプライマーのモル比は、特に制限されない。また、核酸増幅反応時における前記両者のモル比も、特に制限されないが、例えば、フォワードプライマーと（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）とのモル比（Ｆ：Ｒ）は、１：０．０１〜１００であることが好ましく、より好ましくは１：０．１〜１０であり、特に好ましくは１：０．５〜２である。【００６４】
＜変異検出キット＞
本発明の変異検出キットは、本発明のＪＡＫ２遺伝子における変異の検出方法に使用するための変異検出キットであって、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明は、前述の本発明のプローブを使用することが特徴であって、その他の構成等は何ら制限されない。また、本発明の使用方法は、本発明の変異検出方法にしたがって行うことができる。【００６５】
本発明の変異検出キットは、さらに、本発明のプライマーセットを構成するフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか一方を含んでもよいし、両方を含んでもよい。また、本発明の変異検出キットは、例えば、さらに、核酸増幅に必要な試薬、使用説明書等を含んでもよい。【００６６】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００６７】
ＪＡＫ２遺伝子ｅｘｏｎ１２の７３番目の塩基の点突然変異（ｇ→ｔ）の検出
本発明のプローブを使用して、配列番号１に示すＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における７９番目の塩基の点突然変異（ｇ→ｔ）についてのＴｍ解析を行った。【００６８】
（検体）
ＪＡＫ２／Ｖ６１７Ｆ陽性白血病細胞株であるＨＥＬと、ＪＡＫ２野生型白血病株であるＭＹＬとを使用した。各細胞の培養液を、細胞数が以下の割合となるように混合し、この培養混合液１０μｌを９５℃で５分間処理した試料を、ＰＣＲ用試料とした。【００６９】
【表３】
2009011297.tif 000005
【００７０】
（プローブおよびプライマーセット）
検出用プローブ  （配列番号３）
５’−ａｇｔａｔｇｔＴｔｃｔｇｔｇｇａｇａｃ−（TAMRA）−３’
フォワードプライマー  （配列番号２５）
５’−ｇｃａｇｃａａｇｔａｔｇａｔｇａｇｃａａｇｃｔｔｔｃｔｃ−３’
リバースプライマー  （配列番号５１）
５’−ｇｃｔｃｔｇａｇａａａｇｇｃａｔｔａｇａａａｇｃｃｔｇ−３’【００７１】
（Ｔｍ解析）
前記ＰＣＲ用試料５μｌに、下記Ｐ−ｍｉｘ  ２０μｌと下記Ｅ−ｍｉｘ  ２５μｌとの混合液を添加し、ＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で６０秒処理した後、９５℃５秒および５８℃３０秒を１サイクルとして３５−５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７０℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（波長５８５〜７００ｎｍ）。【００７２】
【表４】
2009011297.tif 000006
【００７３】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。同図において、（Ｗ）は、ｗｉｌｄ（正常型）ＤＮＡ（１００％）、（Ｍ）は、ｍｔ（変異型）ＤＮＡ（１００％）、（Ｍ１）は、ｍｔＤＮＡ：ｗｉｌｄＤＮＡが１：９９の混合物、（Ｍ１０）は、ｍｔＤＮＡ：ｗｉｌｄＤＮＡが１０：９０の混合物の結果をそれぞれ示す。同図（Ｗ）に示すように、ｗｉｌｄＤＮＡ（１００％）のピークは、５２℃であり、（Ｍ）に示すように、ｍｔＤＮＡ（１００％）のピークは、５８℃であった。これらのピーク温度（Ｔｍ値）を評価基準として、ｗｉｌｄＤＮＡとｍｔＤＮＡとの混合物におけるピークを評価した。その結果、同図における（Ｍ１）および(Ｍ１０)に示すように、前記検出用プローブを使用した結果、それぞれ、前記評価基準と同等の温度で、ｗｉｌｄＤＮＡのピークおよびｍｔＤＮＡのピークが検出された。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｉｌｄＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を十分に確保できることがわかった。また、一般的なDirect  Sequencing法やPyrosequencing法の場合、検出感度は、約５〜２０％、つまり、ｍｔＤＮＡが５〜２０％存在しなければ検出することが困難であるが、前記検出用プローブを用いたＴｍ解析によれば、ｍｔＤＮＡが約１％であっても十分に検出可能であり、極めて高感度であることがわかった。【００７４】
さらに、慢性骨髄増殖性疾患（ＣＭＰＤ）の患者から採血し、ゲノムＤＮＡの抽出を行い、同様にして、ＪＡＫ２遺伝子の変異についてＴｍ解析を行った。その結果、複数の患者のうち、全ての真正多血症例（ＰＶ症例：１０例）および本態性血小板血症例(ＥＴ症例：４例)で、ＪＡＫ２−Ｖ６１７Ｆが検出された。なお、ＥＴ症例については、Direct  Sequencing法では、検出限界以下であったことから、本実施例における方法が、極めて優れた検出感度であり、非常に有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
以上のように、本発明のプローブによれば、検出目的の変異が発生しているＪＡＫ２遺伝子（変異遺伝子）と変異が発生していないＪＡＫ２遺伝子（正常遺伝子）とが共存している場合でも、検出目的の変異を有する変異遺伝子を検出できる。例えば、前記Ｔｍ解析においては、従来のプローブであると、前述のように、プローブが一塩基のみ異なる変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするため、前記融解曲線において、両者のシグナルが重なり、変異遺伝子の存在を検出することが非常に困難であった。これに対して、本発明のプローブによれば、変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするものの、融解曲線において、両者のシグナルを分離できる。また、本発明のプローブを用いた方法によれば、既知の方法であるDirect  Sequencing法やPyrosequencing法よりも検出感度にも優れている。このため、本発明によれば、例えば、Ｔｍ解析によっても、変異遺伝子の検出が優れた感度で実現可能である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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