(57)【要約】  脱髄病変へのドラッグデリバリーシステムを提供する。また、脱髄病変の生化学的マーカーを提供する。  コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合していることを特徴とする、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬デリバリーシステム。体液におけるコンタクチンの発現を測定することを含む、脱髄疾患の評価及び／又は鑑別方法。
2009020058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合していることを特徴とする、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬デリバリーシステム。
【請求項２】
脱髄疾患が、先天性髄鞘形成不全疾患、中枢神経系脱髄疾患、末梢神経系脱髄疾患、精神疾患、放射線照射後白質脳症及び化学療法後白質脳症からなる群より選択される請求項１記載のデリバリーシステム。
【請求項３】
コンタクチンを特異的に認識できる物質がコンタクチンに対する特異的抗体である請求項１又は２記載のデリバリーシステム。
【請求項４】
脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分が、Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質である請求項１〜３のいずれかに記載のデリバリーシステム。
【請求項５】
Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質が、Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドであって、以下の(A）、(B)および(C)のうちの少なくとも１つの作用を奏する前記リガンドである請求項４記載のデリバリーシステム。
(A)オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進する。
(B)Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化する。
(C)ミエリン塩基性蛋白の発現を促進する。
【請求項６】
Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドが、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体又はその改変体である請求項５記載のデリバリーシステム。
【請求項７】
体液におけるコンタクチンの発現を測定することを含む、脱髄疾患の評価及び／又は鑑別方法。
【請求項８】
脱髄疾患が、先天性髄鞘形成不全疾患、中枢神経系脱髄疾患、末梢神経系脱髄疾患、精神疾患、放射線照射後白質脳症及び化学療法後白質脳症からなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
体液が、脳脊髄液又は血液である請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
コンタクチンの発現をタンパク質レベルで測定する請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
コンタクチンの発現をRNAレベルで測定する請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
体液におけるコンタクチンの発現を測定することができる試薬を含む、脱髄疾患を評価及び／又は鑑別するためのキット。
【請求項１３】
脱髄疾患が、先天性髄鞘形成不全疾患、中枢神経系脱髄疾患、末梢神経系脱髄疾患、精神疾患、放射線照射後白質脳症及び化学療法後白質脳症からなる群より選択される請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
体液が、脳脊髄液又は血液である請求項１２又は１３記載のキット。
【請求項１５】
試薬が、下記(i)、(ii)又は(iii)のいずれかである請求項１２〜１４のいずれかに記載のキット。
(i)コンタクチンに対する特異的抗体
(ii)コンタクチンのmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブ
(iii)コンタクチンのmRNAを鋳型として合成されるcDNAを特異的に増幅できる少なくとも１対の核酸プライマー
【請求項１６】
コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものを含む、脱髄疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
コンタクチンを特異的に認識できる物質が脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものを有効な量で被験者に投与することを含む、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分を脱髄病変にデリバリーする方法。
【請求項１８】
コンタクチンを特異的に認識できる物質が脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものを有効な量で被験者に投与することを含む、脱髄疾患を予防及び／又は治療する方法。
【請求項１９】
脱髄疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物を製造するための、コンタクチンを特異的に認識できる物質が脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱髄病変へのドラッグデリバリーシステム及び脱髄病変の生化学的マーカーに関し、より詳細には、脱髄病変にのみ発現している分子を利用して、脱髄疾患の予防・治療薬を病変特異的に到達させたり、脱髄疾患の評価や鑑別を生化学的に行う技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症(MS)は中枢神経系の脱髄疾患であり、全世界で推定250万人が本症を患っている。典型例では、生来健康であった20〜30代の成人に特に誘発なく脳・視神経・脊髄の多箇所に脱髄が生じ、その病巣に応じた多彩な神経症状（精神障害、運動麻痺、失明、眩暈など）が出現し、後に自然消失（寛解）する。しかし、その後もまた同様に脱髄が生じ（再発）、神経症状を患う。この経過が何度も繰り返し、次第に後遺症を残すようになり、多くは自立歩行不能となる。MS発症自体は生命予後に関与しないことが多く、故に幾多の神経学的後遺症に長年苦しむこととなる。昨今は本邦でも患者数の増加傾向が認められている。【０００３】
MSの治療方法として最も望まれるのは原因療法であり、根治療法である。MSの概念が提唱されてから約150年が経過し、分子生物学等の手法も発展し、多くの遺伝解析等も行われたが、それでもMSの病因は不明であり、根治療法は開発できていない。幾多の薬剤が再発予防の目的で開発され、一部は再発率をある程度低減させる効果を示しているが、一度生じた障害（例えば、脱髄による失明や運動麻痺）を回復させる治療法は開発されていない。そこで、髄鞘再生療法の開発が特に患者数の多い欧米で注目されるようになった。【０００４】
MSは上述にように再発（脱髄）と寛解（髄鞘の自然再生）が認められる疾患であるが、次第に寛解が認められなくなり、後遺症が残存（髄鞘再生の失敗）するようになる特徴がある。故に、髄鞘形成細胞であるオリゴデンドロサイトが経過と共に消失すると考えられ、MSに対する神経幹細胞移植療法を開発しようとする試みがなされた。一方、1998年に、MS脱髄病巣において、オリゴデンドロサイトの減少は認められるが、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は多数残存していることが報告された（非特許文献１）。【０００５】
1998年の時点では、OPCが分化する際には、Fynチロシンキナーゼ(Fyn)を介する信号伝達が重要であることが解明されていた(非特許文献２)。また、1999年には、FynがOPCの形態学的分化にも必須であることが報告された(非特許文献３)。さらに、中原らは、OPCに免疫グロブリンFc受容体γ鎖(FcRγ)が発現しており（分化が終わると発現が消失する）、in vitroにおいてIgGを利用してOPC上のFcRγを間接的に架橋あるいはFcRγそのものを架橋すると、Fynの発現上昇及びFcRγ-ITAM（Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs）のFynによる強いリン酸化が生じ、OPCが形態学的・生化学的分化を起こすことを明らかにした(非特許文献４及び特許文献１)。【０００６】
MSの他にも老年性認知症、アルツハイマー病、脊髄損傷、ひいては統合失調症や躁鬱病に至るまで、数多くの神経疾患及び精神疾患において髄鞘崩壊が関与していることが指摘されており、髄鞘再生療法はMSのみならず、極めて汎用性のある治療法として確立しえる。【０００７】
また、これまで、脱髄巣（即ち、髄鞘が剥がれた神経軸策の集団のこと）を生存中の人間において生化学的に評価する方法はなく、MRIによる間接的な評価のみであった。主要な脱髄疾患である多発性硬化症は再発・寛解を繰り返す特徴的な疾患であるが、長期罹病期間を経た患者においては、再発に関わらず臨床症状が緩徐に増悪する二次進行型多発性硬化症という病型が存在し、診察所見における神経学的増悪或いは自己申告による症状悪化が必ずしも再発を意味するものと確証を得られないことがしばしばある（MRIはその検出限界から再発病変を必ずしも描出できない）。現在はそれら増悪を示唆する患者に対し、加療（本邦では主にステロイド静脈点滴）を行うかどうかは個々の主治医の判断に委ねられている。【０００８】
【非特許文献１】Wolswijk G, J Neurosci 18:601-609, 1998
【非特許文献２】Umemori H, et al. Nature 367:572-576, 1994
【非特許文献３】Osterhout D J, et al., J Cell Biol 145:1209-1218, 1999
【非特許文献４】Nakahara J, et al., Developmental Cell 4:841-852, 2003
【特許文献１】国際公開WO03/011337パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、脱髄病変へのドラッグデリバリーシステムを提供することを目的とする。
また、本発明は、脱髄病変の生化学的マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
中枢神経系（脳・脊髄・視神経）ないし末梢神経系において、多くの神経軸索には脂質絶縁体である髄鞘が巻かれており、これにより神経軸索における電気的信号の伝導速度は最大で100倍まで加速することが知られている。多発性硬化症等の脱髄疾患においては、この髄鞘が未だ解明されていない原因により崩壊し、神経伝導の阻害や神経軸索の損傷を引き起こすことで、神経学的障害を来たす。
脱髄を生じた軸索周囲では病態に応じた様々な反応（炎症、貪食、細胞増殖、細胞死等）が生じており、脱髄疾患の治療においてはこれら局所的な反応を制御ないし活性化することが肝要となる。脱髄病変以外の正常脳やその他臓器に副作用や副反応を及ぼさないようなドラッグデリバリーの技法が開発されれば、治療薬の投与量の減量、副作用・副反応の抑制、効果の増強が得られるものと考えられる。【００１１】
脱髄病変にのみある種の治療薬を限局化させる一つの方策としては、脱髄病変にのみ高発現している分子を特定し、この分子に対して特異的に結合する分子を担体として治療薬を病変特異的に到達させることが考えられる。ある分子に対して特異的に結合する分子の例としては、その分子に対する特異的抗体、その分子そのもの（homophilicな結合が認められる分子の場合）、 その分子の受容体、或いは親和性を有する人工化合物等が考えられる。
本発明者らは、ヒト脱髄病変にコンタクチン（Contactin）分子が特異的に高発現することを確認し、抗コンタクチン抗体がヒト脱髄病変に集積することを確認した。【００１２】
また、臨床現場において、脱髄の有無は中枢神経系においてはMRI検査、末梢神経系においては電気生理学的検査によって判断されている。MRI検査においてはそもそも髄鞘に富んだ組織（白質）における高度脱髄においてのみ画像的評価ができる。しかしながら髄鞘が少ないながら重要な働きをしている例えば灰白質の脱髄は画像的評価が不能であり、また脱髄部位の神経軸索の生死（脱髄と同時に神経軸索が損傷され壊死している可能性）については情報が乏しい。電気生理学的検査では脱髄の空間的定量性に欠き、また体表からアクセス可能な神経にしか検査を適応できない等の欠点がある。脱髄疾患の病勢の定量的ないし定性的評価や、脱髄が画像上確認できない症例における脱髄病変有無の判定、或いは臨床治験等において脱髄病変の増減を定量的に解析するには、脱髄病変の神経軸索において特異的に高発現し（神経軸索が発現する分子であれば、壊死した神経軸索からは分泌されず定性評価が可能となる）、かつ体液中に分泌される分子を同定し、その体液中濃度を測定することが簡便かつ定量定性性に富む方法となる。【００１３】
臨床医学においては、脳を浸漬している液（脳脊髄液）を腰椎間より穿刺し採取・検査する手法は一般的にかつ安全に行われており、よって脱髄巣より特異的に脳脊髄液中へ遊離する蛋白を発見できれば、脳脊髄液による脱髄巣の評価を生化学的に行うことができるものと考えられる。
本発明者らは、コンタクチン分子が脱髄病変に特異的に高発現し、かつ体液中に分泌され、濃度測定が可能であることを確認した。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
本発明の要旨は以下の通りである。【００１４】
（１）コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合していることを特徴とする、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬デリバリーシステム。
（２）脱髄疾患が、先天性髄鞘形成不全疾患、中枢神経系脱髄疾患、末梢神経系脱髄疾患、精神疾患、放射線照射後白質脳症及び化学療法後白質脳症からなる群より選択される（１）記載のデリバリーシステム。
（３）コンタクチンを特異的に認識できる物質がコンタクチンに対する特異的抗体である（１）又は（２）記載のデリバリーシステム。
（４）脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分が、Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質である（１）〜（３）のいずれかに記載のデリバリーシステム。【００１５】
（５）Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質が、Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドであって、以下の(A）、(B)および(C)のうちの少なくとも１つの作用を奏する前記リガンドである（４）記載のデリバリーシステム。
(A)オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進する。
(B)Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化する。
(C)ミエリン塩基性蛋白の発現を促進する。【００１６】
（６）Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドが、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体又はその改変体である（５）記載のデリバリーシステム。
（７）体液におけるコンタクチンの発現を測定することを含む、脱髄疾患の評価及び／又は鑑別方法。
（８）脱髄疾患が、先天性髄鞘形成不全疾患、中枢神経系脱髄疾患、末梢神経系脱髄疾患、精神疾患、放射線照射後白質脳症及び化学療法後白質脳症からなる群より選択される（７）記載の方法。
（９）体液が、脳脊髄液又は血液である（７）又は（８）記載の方法。【００１７】
（１０）コンタクチンの発現をタンパク質レベルで測定する（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）コンタクチンの発現をRNAレベルで測定する（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）体液におけるコンタクチンの発現を測定することができる試薬を含む、脱髄疾患を評価及び／又は鑑別するためのキット。
（１３）脱髄疾患が、先天性髄鞘形成不全疾患、中枢神経系脱髄疾患、末梢神経系脱髄疾患、精神疾患、放射線照射後白質脳症及び化学療法後白質脳症からなる群より選択される（１２）記載のキット。【００１８】
（１４）体液が、脳脊髄液又は血液である（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）試薬が、下記(i)、(ii)又は(iii)のいずれかである（１２）〜（１４）のいずれかに記載のキット。
(i)コンタクチンに対する特異的抗体
(ii)コンタクチンのmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブ
(iii)コンタクチンのmRNAを鋳型として合成されるcDNAを特異的に増幅できる少なくとも１対の核酸プライマー【００１９】
（１６）コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものを含む、脱髄疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
（１７）コンタクチンを特異的に認識できる物質が脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものを有効な量で被験者に投与することを含む、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分を脱髄病変にデリバリーする方法。
（１８）コンタクチンを特異的に認識できる物質が脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものを有効な量で被験者に投与することを含む、脱髄疾患を予防及び／又は治療する方法。
（１９）脱髄疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物を製造するための、コンタクチンを特異的に認識できる物質が脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合したものの使用。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、脱髄疾患の予防及び/又は治療薬を病変特異的に到達させることが可能となった。
また、本発明により、脱髄疾患の評価や鑑別を生化学的に行うことが可能となった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2007‐202776の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】多発性硬化症患者脳の一例である。図Aはluxol fast blue染色により白く抜けた脱髄病変（矢印）を検出している。図Bは図Aの隣接領域であり、抗コンタクチン抗体が脱髄病変に集積するかを見たものであるが、図Bを図Aと比較して容易に分かる通り、抗コンタクチン抗体は脱髄巣に特異的に集積することが分かる。抗コンタクチンの局在を確認するために蛍光プローブ（FITC）を付加した二次抗体を用いている。
【図２】多発性硬化症患者脳9例（図A〜R）及び健常脳1例（図S及びT）である。図AとB、図CとDは同一患者の隣接領域であり、図E〜Tにおいても同様に1症例に対し2枚1セットの図示となっている。それぞれ図1と同様に、luxol fast blue染色による脱髄病変の検出（白く抜けた部位）と、抗コンタクチン抗体の脱髄病変への集積を見ている。写真のポジネガの関係のように、図A〜Rの多発性硬化症患者脳ではいずれも抗コンタクチン抗体が脱髄病変に特異的に集積することが分かる。対照的に図S及びTの健常脳には脱髄病巣は認めらずまた抗コンタクチン抗体の集積も認められない。以上のことは、コンタクチンを目標とするドラッグデリバリーにより脱髄巣に選択的に薬剤を集積させることができることを示している。
【図３】虚血性脳疾患患者脳1例である。図1、2同様に、luxol fast blue染色による脱髄病変の検出（白く抜けた部位：矢印）と、抗コンタクチン抗体の脱髄病変への集積を見ている。図1、2と同様に、本患者脳においても抗コンタクチン抗体は虚血性に生じた脱髄病変に集積することが分かる。虚血性脳疾患による脱髄は非特異的な反応の産物である。従って、コンタクチンを目標とするドラッグデリバリーは、多発性硬化症に限らず、脱髄を有する広く一般的な疾患に応用できることを示している。
【図４】多発性硬化症患者脳2例（図A〜C、図D〜F）である。いずれも脱髄病巣である。コンタクチンが脱髄病巣の神経軸索表面に表出していることを確認するため、図1〜3で示したのと同様に抗コンタクチン抗体の脱髄病巣への局在をFITCで標識した二次抗体で検出すると同時に、同じ標本において神経軸索のマーカーであるNeurofilamentを認識する抗Neurofilament抗体で標識しそれをCy3でラベルした二次抗体で二重に検出した。図A、Dは抗コンタクチン抗体の局在を、図B、Eは抗Neurofilament抗体の局在を見ているが、図C、Fはそれらの写真を重ね合わせている。結果、抗コンタクチン抗体の局在は抗Neurofilament抗体と一致しており（図A〜C）、また神経軸索表面に局在していること（図D〜F）が確認される。よってコンタクチンを目標としたドラッグデリバリーにより、脱髄病巣の軸索周囲に薬剤を選択的に運搬できることが示された。
【図５】再発寛解型（再発期及び寛解期）及び二次進行型の多発性硬化症患者及び虚血性脳疾患の脳脊髄液検体のコンタクチン濃度の定量検査の実施例である。定量化するために使用したpositive control及びnegative controlは図に示している位置において検定した。それ以外は上述のいずれかの疾患患者の脳脊髄液であり、矢印において示したものは特に陽性反応が強く、肉眼的にもその陽性が確認できたものを示している（陽性検体は緑色に着色するように色素を入れている）。写真の器具をELISAプレートリーダーにかけ精密に定量化した結果は図6に示す。
【図６】図5の結果をELISAプレートリーダーにより定量化し、それぞれの疾患群における平均値（脳脊髄液中濃度：ng/ml）をグラフ化したものである。「多発性硬化症」群は、その右3列に示した「再発寛解型多発性硬化症（寛解期）」、「再発寛解型多発性硬化症（再発期）」、「二次進行型多発性硬化症」の全ての群のデータを平均化したものである。図示したように、正常検体からはコンタクチンはほぼ検出されず、多発性硬化症や虚血性脳疾患といった脱髄を伴う検体においては検出されることが分かり、コンタクチンの濃度検定によって脱髄の有無を診断できることが分かる。また多発性硬化症の中でも特に再発寛解型多発性硬化症寛解期に高く、再発期に低く、二次進行型においてはその中間に類していることから、病型診断にコンタクチンの定量が有用であることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合していることを特徴とする、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬デリバリーシステムを提供する。【００２３】
脱髄疾患としては、先天性髄鞘形成不全疾患（例えば、副腎白質ジストロフィ、異染性白質ジストロフィ、グロボイド細胞白質ジストロフィ、海綿状硬化症、Pelizaeus-Merzbacher病、Alexander病、脳性麻痺等）、中枢神経系脱髄疾患（例えば、多発性硬化症（視神経脊髄炎、同心円硬化症を含む）、急性散在性脳脊髄炎、炎症性広汎性硬化症、亜急性硬化性全脳炎、進行性多巣性白質脳症、低酸素脳症、橋中心髄鞘破壊症、ビタミンB12欠乏症、Binswanger病、脳梗塞、脊髄梗塞、加齢変化に伴う脱髄病変、脊髄損傷等）、末梢神経系脱髄疾患（例えば、ギランバレー症候群、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎、脱髄を伴うニューロパチー等）、精神疾患（例えば、アルツハイマー病、統合失調症、躁鬱病、加齢性認知症等）、放射線照射後白質脳症、化学療法後白質脳症などを例示することができるが、これらに限定されることはない。【００２４】
コンタクチンは、6つのIgドメインと4つのFNIIIドメインからなるimmunoglobulin superfamily細胞接着因子（Ig-CAMs）であり（アミノ酸配列（NCBI accession number: AAH36569）、mRNA/cDNA配列（NCBI accession number: BC036569）、遺伝子情報（NCBI gene ID: 1272）他）、その他のIg-CAMsや細胞接着因子等と共役して、神経突起の成長や分岐を制御しており、また有髄神経においては他の細胞接着因子やチャネル等と共役して、ランビエ絞輪の構成を担っていること等がその機能として報告されている（Falk J, et al. Bio Cell 94:327-334, 2002）。【００２５】
コンタクチンを特異的に認識できる物質としては、コンタクチンに対する特異的抗体、コンタクチンそのもの、コンタクチンの受容体、コンタクチンに対して親和性を有する人工化合物などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
コンタクチンに対する特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよく、例えば、goat polyclonal 抗Contactin抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）、goat polyclonal抗Contactin抗体（R&D Systems社製）、mouse monoclonal 抗Contactin抗体（R&D Systems社製）、mouse monoclonal抗Contactin抗体（BD Biosciences社製）、mouse monoclonal 抗Contactin抗体（UC Davis/NINDS/NIMH NeuroMab Facility製）、rabbit polyclonal 抗Contactin抗体（Chemicon社製）などが入手可能であり、本発明において利用できる。また、常法により作製したものを利用してもよい。【００２６】
コンタクチンとしては、recombinant human Contactin（R&D Systems社製）などが入手可能であり、本発明において利用できる。また、公開されているアミノ酸配列（NCBI accession number: AAH36569）、mRNA/cDNA配列（NCBI accession number: BC036569）、遺伝子情報（NCBI gene ID: 1272）等から常法により組換蛋白としてあるいは合成ペプチドとして作製したものを利用してもよい。
コンタクチンの受容体としては、Neurofascin-155、Caspr/Paranodin、Nr-CAM、Neurofascin-186、Tenascinファミリー（Tenascin-Rを含む）、Phosphacan、Naチャネル、RPTPb（Falk J, et al. Bio Cell 94:327-334, 2002）、Notch（Hu QD et al. Cell 115:163-175, 2003）などが知られており、本発明において利用できる。【００２７】
コンタクチンに対して親和性を有する人工化合物としては、Contactinの遺伝子の一部のアミノ酸のみを発現させた或いは改変させた組換蛋白、Contactinの受容体として上記に列挙した群等の遺伝子より一部のアミノ酸のみを発現させた或いは改変させた組換蛋白、Contactinのアミノ酸配列や立体構造から結合性が推定される合成ペプチドなどを例示することができる。【００２８】
脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分としては、Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質を挙げることができる。このような物質は、OPCにFcRγシグナルを入れることによって、ミエリン形成を始動すると考えられる（国際公開WO03/011337パンフレット参照）。しかし、FcRγは免疫系細胞にも発現を認めることから、FcRγ刺激により髄鞘再生を誘導する医薬の実用化に際し、副作用が懸念される。従って、この副作用軽減のためには、脱髄病変にのみ選択的に同医薬品を届けるシステムの構築が必要であると考えられるが、本発明のドラッグデリバリーシステムを用いれば、脱髄巣にのみ同医薬品を届けることが可能となり、副作用の軽減が期待され、また臨床効果発現に必要な医薬投与量の減量が期待できる。Ｆｃ受容体γ鎖を活性化することができる物質は、Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドであって、以下の(A）、(B)および(C)のうちの少なくとも１つの作用を奏する前記リガンドであるとよい。【００２９】
(A)オリゴデンドログリア前駆細胞の分化を促進する。
(B)Ｆｙｎチロシンキナーゼを活性化する。
(C)ミエリン塩基性蛋白の発現を促進する。
あるいは、(A)〜(C)のいずれの作用を持たなくても、FcRγに特異的に結合して、ミエリン形成を促進する物質であればよい。Ｆｃ受容体γ鎖に対するリガンドとしては、抗Ｆｃ受容体γ鎖抗体（以下、「抗ＦｃＲγ抗体」と記す）、その改変体などを例示することができる。抗ＦｃＲγ抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。【００３０】
抗ＦｃＲγ抗体は、rabbit polyclonal抗ＦｃＲγ抗体（Upstate Biotechnology社製）などの市販のものを利用してもよいし、常法に従って調製したものを利用してもよい。
例えば、ポリクローナル抗体を調製するには、免疫抗原のＦｃＲγを動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から抗ＦｃＲγ抗体含有物を採取し、抗体を分離精製すればよい。あるいは、FcRγの部分ペプチドを使用することも可能である。また、FcRγの塩基配列（GenBank M33195(ヒトの場合)）より予測され、合成された人工ペプチドで免疫することも可能である。この際は、短いペプチド（一般に6〜18アミノ酸残基）を免疫原として用いるならば、Keyhole limpet haemocyaninなどのキャリア蛋白との複合体にするとよい。蛋白投与の場合は通常、50〜100μgで免疫する。【００３１】
モノクローナル抗体を調製するには、上記免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓あるいはリンパ節を採取、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定的に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択する。該ハイブリドーマを動物の腹腔内で増殖させ、腹水からモノクローナル抗体を精製してもよいし、動物の血清等からモノクローナル抗体を精製してもよい。あるいはまた、ハイブリドーマを培地で培養して、モノクローナル抗体を生成させた後、該モノクローナル抗体を培養上清などから精製してもよい。モノクローナル抗体作成法は、P. N. Nelson et al., J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol. 53, 111-117 (2000)に記載されているので、これを参考として本明細書に引用する。【００３２】
免疫抗原のＦｃＲγの調製方法は、Takaiらの論文(T. Takai, M. Li, D. Sylvestre, R. Clynes, J. V. Ravetch, Cell 76, 519 (1994))か、その論文内の引用文献にて記載されているので、これらを参考として本明細書に引用する。ヒトの場合は、公開されているヒトFcRγの配列（GenBank M33195(ヒトの場合)）を元に合成ペプチドを作ることは容易である。
動物の免疫にあたっては、免疫抗原であるＦｃＲγを動物（例えば、哺乳動物）に対して投与による抗体産生が可能な部位に単独であるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与は、皮下注射による投与が好ましい。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１週間毎に１回ずつ、モノクローナルならば１〜２回、ポリクローナルならば３〜４回行うとよい。【００３３】
免疫する動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられる。
抗体は上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取される。抗体価の測定で最も多く使われるのはELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）法である。更に細かく検討するには、免疫細胞化学やWestern Blotを行うとよい。詳細については、Nelsonらの論文（P. N. Nelson et al., J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol. 53, 111-117 (2000)）を参照するとよい。【００３４】
抗体の分離精製は免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合物あるいはプロテイン−Ａ等の活性吸着剤により特異抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行うことができる。【００３５】
このようにして作製された抗体は、IgGを主たる成分とし、IgM,IgA等、他の免疫グロブリンも含む。この抗体はＦｃＲγと特異的に結合する。【００３６】
上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫された動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の１週間以内に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗ＦｃＲγ抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495（1975））に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどを使用することができるが、好ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、Sp2/0、NS1、NSO、X63Ag8等があげられるが、特にSp2等が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜１：２程度であり、PEG（好ましくはPEG1000〜PEG6000）が50％程度の濃度で添加され、37度で20〜30分インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。【００３７】
抗ＦｃＲγモノクローナル抗体の分離精製は上記のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。
抗ＦｃＲγ抗体は、ＦｃＲγに特異的に結合して、所望の効果を奏するものであれば、IgG、IgA、IgMのいかなるクラスのものでもあってもよく、またそれらからFcあるいはFc領域を除去したFab'あるいはFab画分あるいはその重合体でもよい。また、抗ＦｃＲγ抗体の可変遺伝子部と、ヒトイムノグロブリン定常遺伝子とを融合させ、組み換え体として発現させたキメラ抗体を用いることもできる。【００３８】
また、抗ＦｃＲγ抗体は、脳内に存在する酵素で壊れるような糖鎖で修飾されていてもよい。
抗ＦｃＲγ抗体以外のＦｃＲγを活性化することができる物質としては、以下のものを例示することができる。【００３９】
１）抗FcγRI抗体
２）抗FcγRIII抗体
３）FcγRIIのアンタゴニスト
４）FcRγの構造よりＦｃＲγとの結合能が推測される人工化合物
５）IgGの中でもFcγRIに結合性が高いIgGのサブクラス
６）抗ＦｃεＲＩ抗体【００４０】
１）の抗FcγRI抗体および２）の抗FcγRIII抗体は、それぞれ、免疫抗原として、FcγRIおよびFcγRIIIを用い、前述の抗ＦｃＲγ抗体の調製方法に順じて調製することができる。
３）のFcγRIIのアンタゴニストは、FcRγに対して抑制的（負に）働く機能を抑制する作用を持つ物質であればよい。
FcγRII（II型Fc受容体）はＦｃＲγの活性に対して抑制的に働くので、これをアンタゴニスト（antagonist）でブロックした上で、ＦｃＲγを刺激をしてやると効果が高まると考えらる。【００４１】
４）のFcRγの構造よりＦｃＲγとの結合能が推測される人工化合物は、ＦｃＲγを活性化することができる物質であればよく、ＦｃＲγとの結合能は、IP-Westernなどにより推測することができる。例えば、その化合物をオリゴデンドログリアと反応させてやり、FcRγ抗体で免疫沈降反応（IP：immunoprecipitation）をして、釣った物質が人工化合物であれば、結合能があると推定される。上記のようにしてＦｃＲγとの結合能が推測された人工化合物は、市販されているものを購入してもよいし、化学合成してもよい。【００４２】
５）のIgGの中でもFcγRIに結合性が高いIgGのサブクラスとしては、ヒトの場合、IgG3、IgG1、IgG4、IgG2などを例示することができ、マウスの場合、IgG2a、IgG1、IgG2b、IgG3などを例示することができる。FcγRIは高親和性IgG受容体、FcγRIIIは低親和性IgG受容体である。そこでFcγRIを活性化するには、FcγRIに結合能が高いIgGサブクラス、ヒトの場合は例えばIgG3を選択的に投与するとよい。関連する総説としては、J. E. Gessner et al., Ann. Hematol. 76, 231-248 (1998)を参照されたい。これらのIgGのサブクラスは、サブクラスが特定されたmonoclonal hybridomaより得られたIgGをpolyclonalとなるように混合するか、或いは、反応性の無いhybridomaの抗体を得ることにより調製することができる。【００４３】
６）の抗ＦｃεＲＩ抗体は、免疫抗原として、ＦｃεＲＩを用い、前述の抗ＦｃＲγ抗体の調製方法に順じて調製することができる。
脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分は、１種類のみ用いてもよいし、複数種を組み合わせて使用してもよい。【００４４】
また、脱髄疾患がウイルス性脱髄疾患（JCウイルスによる進行性多巣性白質脳症（致死的）等）である場合には、本発明のドラッグデリバリーシステムは抗ウイルス薬の脱髄領域への選択的デリバリー等に応用可能と考えられ、上記例示の他に、一般的なドラッグデリバリーシステムとして展開可能と考える。この場合には、脱髄疾患の予防及び/又は治療薬の有効成分として、抗ウイルス薬の有効成分（例えば、HARRT、アジドチミジン、インターフェロンα、インターフェロンβ、リバビリン、抗ウイルス抗体等）を挙げることができる。【００４５】
本発明のドラッグデリバリーシステムにおいては、コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合している。コンタクチンを特異的に認識できる物質を脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合させるには、以下のようにするとよい。例えば、抗コンタクチン抗体と、髄鞘再生を促す抗FcRγ抗体を結合させるには、双方の抗体又はF(ab)フラグメントを用意し、N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)-propionate（SPDP）やSuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate（SMPB）により化学的に架橋しても良いし、或いは、双方の抗体の元となったハイブリドーマを融合させ、遺伝子組換による融合抗体を作成する等しても良い（Segal DM et al. Curr Prot Immunol 2.13.1-2.13.16, 1995）。抗コンタクチン抗体以外のコンタクチンを特異的に認識できる物質、抗FcRγ抗体以外の脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分の場合も同様に、化学的架橋や遺伝子工学的手法を用いて、コンタクチンを特異的に認識できる物質を脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合させることができる。【００４６】
本発明のドラッグデリバリーシステムを用いて、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬を哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）などの被験者に対して経口的または非経口的に投与する際には、コンタクチンを特異的に認識できる物質が、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分に結合しているものを単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の医薬組成物として製剤化して投与するとよい。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症）の予防・治療のために使用する場合には、抗ＦｃＲγ抗体又はその改変体（コンタクチンを特異的に認識できる物質が結合している）を１回量として通常150〜500 mg/kg体重程度、好ましくは400〜500 mg/kg体重程度を、１か月に１〜２回程度、好ましくは治療開始時に同量を2〜3日連続して、静脈注射により投与するとよい。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量してもよい。【００４７】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。【００４８】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわち脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート80、HCO−50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。脱髄疾患の予防及び／又は治療薬の非経口投与としては、髄液に薬剤を直接注入する例が行われており（Science. 1981 Nov 27;214(4524):1026-8）、本予防及び／又は治療薬もそのような方法で脱髄患部に到達しうる。【００４９】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。有効成分の含有量は、製剤の種類により異なるが、通常１〜100重量％であり、好ましくは50〜100重量％である。
また、本発明は、体液におけるコンタクチンの発現を測定することを含む、脱髄疾患の評価及び／又は鑑別方法を提供する。【００５０】
脱髄疾患は前述の通りである。
体液としては、脳脊髄液、血液などを例示することができる。
脱髄疾患の評価とは、脱髄疾患の病勢の定量的ないし定性的評価、脱髄病変有無の判定、臨床治験等における脱髄病変の増減を定量的に解析することを含む概念である。
脱髄疾患の鑑別とは、多発性硬化症の再発・寛解・二次進行型の鑑別を含む概念である。
また、本発明の方法は、脳虚血病変（脳梗塞や加齢性に生じる虚血性白質病変（認知症の原因ともなる）を含む）の評価や鑑別に用いることができる可能性がある。【００５１】
本発明の方法において、体液サンプル中のコンタクチンの発現を測定してもよいし、その遺伝子発現を測定してもよい。例えば、ノーザンブロット法、RT-PCR法、ウェスタンブロット法、免疫組織化学分析法などで測定することができる。あるいはまた、cDNAマイクロアレイ、ELISA法などを利用して測定してもよい。
コンタクチンの発現をタンパク質レベルで測定するためには、コンタクチンに対する特異的抗体を用いるとよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体は公知の方法で製造することができる。ウェスタンブロット法で測定する場合には、抗体は、125I標識プロテインＡ、ペルオキシダーゼ結合IgGなどを用いて二次的に検出される。免疫組織化学分析法で測定する場合には、抗体は、蛍光色素、フェリチン、酵素などで標識するとよい。【００５２】
コンタクチンの遺伝子発現をRNAレベルで測定するためには、コンタクチンのmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを用いるとよい（ノーザンブロット法で測定する場合）。あるいはまた、コンタクチンのmRNAを鋳型として合成されるcDNAを特異的に増幅できる少なくとも１対の核酸プライマーを用いてもよい（RT-PCR法で測定する場合）。核酸プローブ及び核酸プライマーは、コンタクチンの遺伝子情報（mRNA/cDNA配列（NCBI accession number: BC036569）、遺伝子情報（NCBI gene ID: 1272）等））に基づいて設計することができる。核酸プローブは、通常、約１５〜１５００塩基のものが適当である。核酸プローブは、放射性元素、蛍光色素、酵素などで標識するとよい。核酸プライマーは、通常、約１５〜３０塩基のものが適当である。【００５３】
ELISA法を利用する場合には、例えば、ポリクローナル抗コンタクチン抗体（capture抗体）を吸着させた固相（例えば、マイクロタイタープレートなどの基板）に被験者の体液（例えば、脳脊髄液）サンプルを滴下し、capture抗体と結合したコンタクチンをモノクローナル抗コンタクチン抗体(detector抗体)と反応させた後、酵素標識抗IgG抗体（二次抗体）と反応させ、酵素の基質（通常、発色又は発光試薬）を添加して、酵素反応の生成物を検出する。
cDNAマイクロアレイを利用する場合には、例えば、被験者の体液（例えば、脳脊髄液）サンプルから抽出したmRNAを逆転写酵素でcDNAに変換したものをビオチンなどで標識し、基板（例えば、ガラス基板）上に固定化した核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、蛍光強度を測定する。【００５４】
本発明において、被験者の脳骨髄液サンプル中のコンタクチンの発現及び／又はその遺伝子発現の有無を検出してもよいし、発現量を測定してもよい。コンタクチン及び／又はそのmRNAの発現の有無は所定の位置におけるスポットやバンドの出現の有無により確認できる。コンタクチン及び／又はそのmRNAの発現量はスポットやバンドの染色強度により測定できる。あるいはまた、コンタクチン及び／又はそのmRNAを定量してもよい。
被験者は、脱髄疾患への罹患が疑われる患者であるが、発病危険性が考えられるすべてのヒトを対象としてもよい。
脳脊髄液は、脳を浸漬している液であり、腰椎間より穿刺し、採取することができる。この採取方法は一般的にかつ安全に行われている。
血液は、静脈ないし動脈の穿刺により採取することができ、一般的かつ安全に行われている。【００５５】
本発明の一つの例として、脱髄疾患の評価及び/又は鑑別は、以下のような基準で行うことができる。何らかの脳疾患を疑い、症状が安定している患者において脳脊髄液中のコンタクチンの濃度を定量評価した際に、その濃度が検出限界以下の陰性値であった場合（〜0.1ng/ml）、その患者は脱髄を有さない疾患ないし正常と判断される。0.1ng/ml以上であれば、脱髄疾患であると判断される。その数値として高ければ高い程、脱髄の領域は広範囲に渡る（重症である）と判断される。或いは既に脱髄疾患と判定された患者において（例えば再発寛解型多発性硬化症において）、症状の増悪が自他覚的に疑われたが画像等諸検査で病状の変化が検出できない場合、脳脊髄液中のコンタクチン濃度が前値より有意に変動した際には病状の変化があったものと判断される。或いは脳梗塞等の疾患を患う患者において、脳脊髄液中のコンタクチン濃度が有意に高い患者の場合、その患者の脳には脱髄軸索が残存していることを意味しており、長期的な回復が期待できると判断される。【００５６】
本発明は、体液におけるコンタクチンの発現を測定することができる試薬を含む、脱髄疾患を評価及び／又は鑑別するためのキットも提供する。
脱髄疾患及び体液は前述の通りである。【００５７】
一つの例として、本発明のキットは、コンタクチンに対する特異的抗体を試薬として含む。抗体は基板に固定されていてもよい。キットには、さらに、体液を採取するための器具、コンタクチンを免疫化学的に検出するための試薬及び検定器具一式、取扱説明書などが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、脱髄疾患の評価及び/鑑定基準なども記載しておくとよい。
別の一例として、本発明のキットは、コンタクチンのmRNAと特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを試薬として含む。核酸プローブは基板に固定されていてもよい。キットには、さらに、体液を採取するための器具、体液サンプルからRNAを抽出するための試薬類、RNAをノーザンブロット法で分析するための試薬及び検定器具類、取扱説明書などが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、脱髄疾患の評価及び/鑑定基準なども記載しておくとよい。【００５８】
さらに別の一例として、本発明のキットはコンタクチンのmRNAを鋳型として合成されるcDNAを特異的に増幅できる少なくとも１対の核酸プライマーを試薬として含む。キットには、さらに、体液を採取するための器具、脳脊髄液サンプルからRNAを抽出するための試薬類、RNAをRT-PCR法で分析するための試薬及び検定器具類、取扱説明書などが含まれるとよい。取扱説明書には、キットの使用方法の他、脱髄疾患の評価及び/鑑定基準なども記載しておくとよい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６０】
〔実施例１〕脱髄病変へのドラッグデリバリーシステム
方法
脳疾患を有さない患者の死後脳4例、多発性硬化症による脱髄病変を有する患者の死後脳10例及び虚血性変化に伴う脱髄病変を有する患者の死後脳1例（全て新鮮無固定凍結標本で脳白質、死後経過時間9〜58時間）を、米国カルフォルニア州ロサンゼルス市のHuman Brain and Spinal Fluid Resource Centerより供与を受けた。同Centerよりドライアイス冷凍下で空輸された脳標本は慶應義塾大学医学部解剖学研究室へ到着後直ちに-80℃冷凍庫に保管した。個々の脳標本のサンプリング部位を凍結状態で切離し、得られた小標本を冷蔵下で4% paraformaldehyde phosphate-buffer solution（和光純薬工業株式会社製）に20時間浸漬し固定を行った。固定終了後、phosphate-buffer saline pH 7.4 (PBS：Ambion社製)に室温にて計3回各3分間浸漬し固定液を除去した。次に冷蔵下で20% sucrose（和光純薬工業株式会社製）in PBSに浸漬し、脳標本が標本瓶の底部に沈んだところで、再度新しく調整した20% sucrose in PBSに浸漬し、同様に標本瓶の底部に沈むまで静置した。脳標本より一回り大きい容器をアルミホイルで作成し、そこに満たしたTissue-Tek O.C.T. Compound（Sakura Finetechnical社製）内に脳標本を入れ、液体窒素に浸漬し凍結させた。凍結脳標本ブロックはCryostatミクロトーム（Leica社製）を用いて10μm厚に薄切し、アミノシランコートを施したプレパラート（松浪ガラス社製）上に回収した。プレパラートは使用まで-80℃冷凍庫内にて凍結保管した。凍結保管したプレパラートを使用する際には室温で30分間復温した後に、PBSに室温で10分間浸漬させてから使用した。【００６１】
正常部位と脱髄部位を区別する為には、luxol fast blue染色液（0.1% luxol fast blue（Acros Organics社製） in 95% ethanol（和光純薬株式会社製）containing 0.05% acetic acid（和光純薬株式会社製））に60℃で一晩浸漬し、水洗後0.05% lithium carbonate水溶液（和光純薬工業株式会社製）にて脱色を行った。この際、nuclear fast red（Vector Laboratories社製）にて核染色を行った。染色後の標本は定位的光学顕微鏡（オリンパス社製）にて検鏡、撮像を行った。【００６２】
上記にて確認された脱髄部位に対して、その隣接標本を選択し、死後変化に伴う抗原の変性に対して抗原性の賦活化を行う為に煮沸直後の0.01M citrate buffer solution（武藤化学株式会社製）に10分間浸漬し、再度PBSに浸漬した。【００６３】
Contactin分子が脱髄部位に特異的に高発現していることを確認し、かつ抗Contactin抗体が同部位へ特異的に集積することを確認する為、得られた脳標本に10μg/mlのmouse monoclonal抗Contactin抗体（BD Biosciences社製）in PBS containing 0.5% skim milk（Difco社製）を投与し、4℃冷蔵下で2日間湿潤箱内に静置した。2日間経過後にPBSにて計3回各3分間浸漬し洗浄を行った。洗浄後にも残留する抗Contactin抗体の局在を可視化する為、10μg/mlのfluorescein（FITC）標識goat polyclonal抗mouse IgG抗体（Jackson Laboratories社製） in PBS containing 0.5% skim milkを室温で2時間反応させ、再びPBSにて計3回各3分間浸漬し洗浄した。この際、TO-PRO-3（Molecular Probes社製）にて核染色を行った。洗浄後標本はVectashield（Vector Laboratories社製）にて封入し、共焦点レーザー走査顕微鏡（ニコン株式会社製）にて検鏡、撮像を行った。【００６４】
尚、Contactin分子が脱髄神経軸索の表面に局在していることを確認する際には、上記の10μg/mlのmouse monoclonal抗Contactin抗体in PBS containing 0.5% skim milkに代えて、10μg/mlのmouse monoclonal抗Contactin抗体＋10μg/mlのrabbit polyclonal 抗Neurofilament抗体（Serotec社製） in PBS containing 0.5% skim milkを投与し、それらの可視化には、10μg/mlのFITC標識goat polyclonal抗mouse IgG抗体＋10μg/mlのindocarbocyanine（Cy3）標識goat polyclonal 抗rabbit IgG抗体（Jackson Laboratories社製） in PBS containing 0.5% skim milkにて反応を行った。【００６５】
結果
図1-Aの多発性硬化症患者脳の染色例で示すように、luxol fast blue染色及びnuclear fast red核染色により髄鞘は青色に、核は赤く染色される。図1-Aで白く脱色されている部位は脱髄病変である。この隣接標本において、抗Contactin抗体を投与し可視化したのが図1-Bである。抗Contactin抗体は図1-Aにおける脱髄病変に一致する領域に集積し緑色の蛍光として検出される。図2においては多発性硬化症患者脳9例（A〜P）及び脳疾患を有さない患者脳1例（S及びT）における同様の結果を示す（A/B、C/D、E/F、G/H、I/J、K/L、M/N、O/P、Q/R、S/Tはそれぞれ同一患者脳における隣接標本である）。図2-A〜Pで明らかなように、抗Contactin抗体は脱髄病変に限局しており、一方、図2-S, Tで明らかなように、脱髄を有さない患者脳においては同抗体は限局しない。他の脳疾患を有さない患者脳3例においても同様の結果であった。図3A, Bに示すように虚血性脳病変における二次的な脱髄病変（図3-A）においても、多発性硬化症例と同様に抗Contactin抗体は脱髄病変に局在を示した（図3-B）。図4に示すように、抗Contactin抗体（図4-A, D）は抗Neurofilament抗体が局在する神経軸索（図4-B, E：Neurofilamentは神経軸索の正常構成分子であり、正常或いは脱髄を問わず神経軸索に発現する分子である）において局在している（図4-C, F）。【００６６】
以上の結果から、Contactinは脱髄の原因を問わず、脱髄軸索に特異的に高発現しており、またContactinを分子標的とした化合物（例：抗Contactin抗体）は同部位へ特異的に集積・局在することが示された。従って、Contactinを分子標的とする化合物を担体とすることで、治療薬等を脱髄病変へ特異的に到達させることができると示唆される。【００６７】
〔実施例２〕脱髄病変の生化学的マーカー
方法
再発寛解型（再発期）多発性硬化症患者の脳脊髄液30例、再発寛解型（寛解期）多発性硬化症患者の脳脊髄液30例、二次進行型多発性硬化症患者の脳脊髄液30例、その他患者（脳疾患を有さない患者、虚血性脳疾患患者等を含む）の脳脊髄液30例の合計120検体を、米国カルフォルニア州ロサンゼルス市のHuman Brain and Spinal Fluid Resource Centerより供与を受けた。同Centerよりドライアイス冷凍下で空輸された検体は慶應義塾大学医学部解剖学研究室へ到着後直ちに-80℃冷凍庫に保管した。【００６８】
脳脊髄液中のContactin定量にはSandwich ELISA法を用いた。まずcapture抗体として、goat polyclonal抗Contactin抗体（R&D Systems社製）in coating buffer solution（KPL社製）を2μg/mlとなるように調整し、ELISA用96穴プレート（BD Falcon社製）の各穴に100μlずつ投与し室温で2時間反応させた。ELISAプレート洗浄器（BIO-RAD社製）を用いて全穴のcapture抗体を除去し、bovine serum albumin (BSA) blocking solution（KPL社製）を各穴に200μlずつ投与し室温で10分間反応させ、再びELISAプレート洗浄器で全穴のblocking solutionを除去した。次に、各穴に脳脊髄液標本100μlずつ、或いは、定量曲線用のコントロール抗原としてrecombinant human Contactin（R&D Systems社製）in BSA diluent solution（KPL社製）に様々な濃度で投与し、室温で4時間反応させた。反応後、1X wash solution（KPL社製）を用いてELISAプレート洗浄器で全穴を充分に洗浄し、洗浄液の除去後に引き続きdetector抗体として、mouse monoclonal抗Contactin抗体（BD Biosciences社製）in BSA diluent solutionを1μg/mlとなるように調整し、各穴へ100μlずつ投与し、室温で2時間反応させた。反応終了後、前段と同様に全穴を充分に洗浄し、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗mouse IgG抗体（KPL社製）を製造会社指示通り投与し、室温で1時間反応させた。反応終了後、前段と同様に全穴を充分に洗浄し、ABTS peroxidate substrate solution（KPL社製）を各穴に100μlずつ投与し、室温で30分間反応させた後に、peroxidase stop solution（KPL社製）を各100μlずつ更に投与し、最後にELISAプレートリーダー（BIO-RAD社製）を用いて405nmの吸収波長で吸光度を計測した。得られた生データはMicrosoft Excel上にて定量曲線との比例計算から、Contactinの濃度に変換した。但し、元の検体に不備があったもの（着色例や出血例等）は検定から除外した。【００６９】
結果
ABTS反応後、図5に示すようなプレートとなった。吸光度を測定し、標準曲線より濃度を算定し、それぞれの群に分けて平均値を求めたところ、図6のような結果となった。即ち、健常脳を有する患者脳脊髄液（“正常”）では、Contactinの脳脊髄液中平均含有濃度は0.029ng/mlであり、本検査の誤差を踏まえると、ほとんど検出できていない水準となる。他方、脱髄疾患の代表である多発性硬化症の患者脳脊髄液（“多発性硬化症”）では1.011ng/ml、虚血性脳疾患の患者脳脊髄液（“虚血性脳疾患”）では5.361ng/mlと正常に比して高濃度のContactinが脳脊髄液中に検出された。更に多発性硬化症の中で病勢毎に分類すると、再発寛解型多発性硬化症の寛解期に高く、再発期に低く、二次進行型ではその中等度の濃度となることが分かり、病勢による脳脊髄液中のContactin濃度が変化することが示された。【００７０】
以上の結果から、Contactinは正常脳では脳脊髄液中に遊離しないが、脱髄時には脳脊髄液中に遊離しており、また病勢によってその濃度が異なることから、体液中（脳脊髄液等）のContactin濃度の定量化によって脱髄疾患等の定量定性評価、診断等が可能になることが示唆された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、脱髄疾患の予防及び/治療に利用できる。
また、本発明は、脱髄疾患の評価や鑑別に利用できる。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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