(57)【要約】この発明は、天然またはキメラＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムのＥ２タンパク質２の超可変領域１にエピトープタグペプチドをコードする核酸配列を含む核酸、上記核酸によってコードされるエピトープタグ化ＨＣＶ粒子、および抗エピトープタグ抗体固定化担体を利用した上記ＨＣＶ粒子の簡便かつ高純度の精製方法に関する。
2009011413.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含む核酸であって、前記（ａ）、前記（ｂ）または前記（ｃ）のＥ２タンパク質コード配列の超可変領域１（ＨＶＲ１）にエピトープタグペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸。
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＪＦＨ−１株のゲノム
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＪ６ＣＦ株の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列およびｐ７タンパク質コード配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域、を含むキメラＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム
（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＪＦＨ−１株の５’非翻訳領域、ＴＨ１株のＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列およびｐ７タンパク質コード配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域、を含むキメラＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム
【請求項２】
前記エピトープタグペプチドは、ＤＹＫＤＤＤＤＫまたはＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫからなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記エピトープタグペプチドは、リンカー配列をさらに含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記リンカー配列は、ＧＧＧ配列、ＧＧＧＧＳ配列もしくは（ＧＧＧＧＳ）３配列、または、前記ＧＧＧ配列、前記ＧＧＧＧＳ配列もしくは前記（ＧＧＧＧＳ）３配列の一部において１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むリンカー配列である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
配列番号１１、１２、３０、３１、４１または４２で示される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸（ただし核酸がＲＮＡの場合は配列表の塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」に読み替えるものとする）。
【請求項６】
前記超可変領域１（ＨＶＲ１）の最後の配列の次のアミノ酸を１番としたとき、１２２番目または１２４番目のアミノ酸であるアスパラギンをリジンに置換する変異を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号２０または２１で示される、請求項６に記載の核酸（ただし核酸がＲＮＡの場合は配列表の塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」に読み替えるものとする）。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸を含有するベクター。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸をゲノムとして含有するエピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子。
【請求項１０】
請求項９に記載のエピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を含有する細胞。
【請求項１１】
Ｈｕｈ７またはその派生株である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の細胞からエピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を生成する生成ステップと、
前記エピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を含有する液体を抗エピトープタグ抗体固定化担体に接触させ、前記エピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を前記抗エピトープタグ抗体固定化担体に吸着させる吸着ステップと、
前記エピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を前記抗エピトープタグ抗体固定化担体から遊離させて前記エピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を得る遊離ステップと、
を備える、エピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子の精製方法。
【請求項１３】
前記遊離ステップは、エピトープタグペプチド含有緩衝液、カルシウム不含緩衝液、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．０の０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の１Ｍアルギニン塩酸緩衝液または０．１ｍＭ〜１ｍＭの塩酸のいずれかを用いて、前記抗エピトープタグ抗体固定化担体から前記エピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を遊離させる、請求項１２に記載の精製方法。
【請求項１４】
請求項９に記載のエピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子を不活化して得られるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ワクチン。
【請求項１５】
抗原としての請求項９に記載のエピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）粒子に対する抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピトープタグ化Ｃ型肝炎ウイルス粒子、該ウイルスを生産するためのベクター、該ウイルス粒子を生産する細胞株に関する。また、本発明は、該ウイルス粒子を精製する方法、該ウイルス粒子を不活化して得られるワクチン、抗原としての該ウイルス粒子に対する抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ；以下、単に「ＨＣＶ」と称することもある）は非Ａ非Ｂ肝炎の主要な原因ウイルスとして発見同定され（非特許文献１）、高感度なＨＣＶの検出方法が確立されたことにより、輸血による新たなＨＣＶ感染患者は激減した。しかしながら、日本におけるウイルス保有者は肝炎の症状を示していない、いわゆるウイルスキャリアーを含めると２００万人以上、世界で１億７０００万人以上と推定されている。それはＨＣＶ感染による肝炎の慢性化率が７０〜８０％と高いことや、現在のところインターフェロン以外の有効な抗ウイルス剤がないことが大きな原因となっている。さらに、Ｃ型肝炎は予後の悪い深刻な感染症であり、Ｃ型慢性肝炎患者の半数程度は肝硬変、肝癌へと病態が確実に悪化していく。こうしたことから、キャリアーの発症予防やウイルスの排除を目的とした抗ウイルス薬やワクチンの開発が望まれている。
ＨＣＶに対する治療薬を開発するためには、感染性ＨＣＶ粒子やＨＣＶが増殖するメカニズムを研究するための細胞培養系が必要である。これまで、ＨＣＶを効率よく増殖させることのできる実験系としては、チンパンジーを用いた動物実験系のみしか存在しなかったことが、ＨＣＶ治療薬の開発の遅れの主たる原因であった。しかし、２００５年に脇田らによって、細胞培養系で感染性ウイルスを作製する技術が開発され（特許文献１および２、非特許文献２）、感染性ＨＣＶ粒子を用いて、ＨＣＶ治療薬を開発することが可能となった。
このような状況にあって、細胞培養系で産生された感染性ＨＣＶ粒子を精製するための公知の技術（特許文献２および非特許文献３）よりも、簡便かつ高純度に感染性ＨＣＶ粒子を精製する新たな技術開発の必要性がある。
細胞培養系で得られたタンパク質を簡便にかつ高純度に精製する方法としては、目的タンパク質を標識となるタンパク質との融合タンパク質として発現させ、標識となるタンパク質に対する抗体やこれに特異的に結合する分子で融合タンパク質を精製する技術が知られている。
標識となるタンパク質はエピトープタグあるいは単にタグ（Ｔａｇ）と呼称される。エピトープタグとしては、ＦＬＡＧペプチド、３ＸＦＬＡＧペプチド、ＨＡペプチド，３ＸＨＡペプチド、ｍｙｃペプチド、６ＸＨｉｓペプチド、ＧＳＴポリペプチド、ＭＢＰポリペプチド、ＰＤＺドメインポリペプチド、ＴＡＰ（Ｔａｎｄｅｍ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ペプチド、アルカリフォスファターゼ、アビジンなどが知られている。これらのペプチドまたはポリペプチドは、通常目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合されるが、場合によっては目的のタンパク質内に挿入することもできる。
しかし、タンパク質にエピトープタグを付加する際に、タンパク質の種類、エピトープタグの種類、タンパク質上のエピトープタグの付加位置などによって、タンパク質本来の生物活性や立体構造が変化しないという保証はない。そのためタンパク質毎、エピトープタグの種類毎、さらにはエピトープタグの付加位置毎にエピトープタグ化タンパク質の生物学的機能を調べる必要がある。
ＨＣＶのゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなる（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡである。このゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲまたは５’ＵＴＲとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、および３’非翻訳領域（３’ＮＴＲまたは３’ＵＴＲとも表記する）からなる。その構造領域にはＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなＨＣＶの構造タンパク質（Ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。構造タンパク質のうち、Ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１およびＥ２はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、ＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
ＨＣＶはエンベロープと呼ばれる被膜で包まれている。エンベロープは宿主細胞の膜に由来する成分とウイルスに由来するタンパク質からなる。ＨＣＶのエンベロープを構成するタンパク質は、エンベロープタンパク質１（Ｅ１と呼称する）、エンベロープタンパク質２（Ｅ２と呼称する）およびｐ７からなる。特にＥ１およびＥ２はそのＣ末端に膜貫通領域を持っており、ＨＣＶの膜にこの膜貫通領域を介してアンカーされ、ＨＣＶ粒子形成や感染に関与している（非特許文献４、非特許文献５）。
Ｅ２タンパク質のアミノ末端側にはウイルス株間で著しく配列の異なるところが２カ所存在し、超可変領域１（ＨＶＲ１と呼称する）と超可変領域２（ＨＶＲ２と呼称する）と命名されている（非特許文献６）。ＨＶＲ１はＥ２タンパク質のアミノ末端部分の２７アミノ酸からなり、Ｅ２タンパク質の表面に露出してＢ細胞エピトープになっている。ＨＶＲ１のアミノ酸配列の多様性は最大８０％を示すがアミノ酸が保存されている部分も数カ所認められることから、ウイルスの生存にはある一定の２次構造が必要であると考えられている。さらにＨＶＲ１にはシステイン残基やアスパラギン結合型糖鎖付加シグナルはほとんど存在しない。一方、ＨＲＶ２は７アミノ酸よりなり、Ｅ２タンパク質のアミノ末端より９１−９７番目に位置している。ＨＲＶ２はＨＣＶ１ｂ型のゲノムに存在するが、他の遺伝型のＨＣＶには存在しない。
ＨＣＶにおいてウイルス粒子にエピトープタグが挿入された例としては、ＪＦＨ−１株（ＨＣＶ２ａ型）のＥ２タンパク質のＨＶＲ１がＨＡペプチドに置換されたものが公知であり、感染性を有することが確かめられている（非特許文献２）。しかしながら、この感染性エピトープタグ化ＨＣＶ粒子が高純度に精製できたとの報告はない。
【特許文献１】ＷＯ０５０８０５７５Ａ１
【特許文献２】ＷＯ０６０２２４２２Ａ１
【非特許文献１】Ｃｈｏｏ，ＱＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：３５９−３６２，１９８９
【非特許文献２】Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１１：７９１−７９６，２００５
【非特許文献３】Ｚａｈｎ，Ａ．＆Ａｌｌａｉｎｌ，ＪＰ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６：６７７−６８５，２００５
【非特許文献４】Ｖｏｉｓｓｅｔ，Ｃ．＆Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，９６：４１３−４２０，２００４
【非特許文献５】Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８２：２５８９−２５９５，２００１
【非特許文献６】Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１７５：２２０−２２８，１９９１
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、ＨＣＶ粒子を簡便かつ高純度に精製可能なエピトープタグ化ＨＣＶ粒子とその精製方法、および高純度ＨＣＶ粒子を用いたワクチン等を提供することにある。
本発明者らは、ＨＣＶ粒子の細胞培養での生産性および感染性に影響しないエピトープタグの種類およびエピトープタグを付加するＨＣＶタンパク質と付加位置との組み合わせを検討し、本発明の第一の目的であるエピトープタグ化ＨＣＶ粒子の作製に成功した。さらに、このＨＣＶ粒子を高生産するクローンを作製し、産生されたエピトープタグ化ＨＣＶ粒子が抗エピトープタグ抗体カラムを用いて１ステップで高純度に精製できることを確認し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）  下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含む核酸であって、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＥ２タンパク質コード配列の超可変領域１（ＨＶＲ１）にエピトープタグペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸。
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＪＦＨ−１株のゲノム
（ｂ）ＨＣＶのＪ６ＣＦ株の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列およびｐ７タンパク質コード配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域、を含むキメラＨＣＶゲノム
（ｃ）ＨＣＶのＪＦＨ−１株の５’非翻訳領域、ＴＨ１株のＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列およびｐ７タンパク質コード配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域、を含むキメラＨＣＶゲノム
（２）  上記エピトープタグペプチドは、ＤＹＫＤＤＤＤＫまたはＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫからなるアミノ酸配列を含む、上記（１）に記載の核酸。
（３）  上記エピトープタグペプチドは、リンカー配列をさらに含む、上記（１）または（２）に記載の核酸。
（４）  上記リンカー配列は、ＧＧＧ配列、ＧＧＧＧＳ配列もしくは（ＧＧＧＧＳ）３配列、または、ＧＧＧ配列、ＧＧＧＧＳ配列もしくは（ＧＧＧＧＳ）３配列の一部において１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むリンカー配列である、上記（３）に記載の核酸。
（５）  配列番号１１、１２、３０、３１、４１または４２で示される、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸（ただし核酸がＲＮＡの場合は配列表の塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」に読み替えるものとする）。
（６）  上記超可変領域１（ＨＶＲ１）の最後の配列の次のアミノ酸を１番としたとき、１２２番目または１２４番目のアミノ酸であるアスパラギンをリジンに置換する変異を含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸。
（７）  配列番号２０または２１で示される、上記（６）に記載の核酸（ただし核酸がＲＮＡの場合は配列表の塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」に読み替えるものとする）。
（８）  上記（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸を含有するベクター。
（９）  上記（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸をゲノムとして含有するエピトープタグ化ＨＣＶ粒子。
（１０）  上記（９）に記載のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を含有する細胞。
（１１）  Ｈｕｈ７またはその派生株である、上記（１０）に記載の細胞。
（１２）  上記（１０）または上記（１１）に記載の細胞からエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を生成する生成ステップと、
上記エピトープタグ化ＨＣＶ粒子を含有する液体を抗エピトープタグ抗体固定化担体に接触させ、そのエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を抗エピトープタグ抗体固定化担体に吸着させる吸着ステップと、
上記エピトープタグ化ＨＣＶ粒子を上記抗エピトープタグ抗体固定化担体から遊離させてエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を得る遊離ステップと、
を備える、エピトープタグ化ＨＣＶ粒子の精製方法。
（１３）  上記遊離ステップは、エピトープタグペプチド含有緩衝液、カルシウム不含緩衝液、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．０の０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０の１Ｍアルギニン塩酸緩衝液または０．１ｍＭ〜１ｍＭの塩酸のいずれかを用いて、上記抗エピトープタグ抗体固定化担体から上記エピトープタグ化ＨＣＶ粒子を遊離させる、上記（１２）に記載の精製方法。
（１４）  上記（９）に記載のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を不活化して得られるＨＣＶワクチン。
（１５）  抗原としての上記（９）に記載のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子に対する抗ＨＣＶ抗体。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−１８４５８７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＨＣＶ  Ｅ２の構造図を示す。Ｎ１〜Ｎ１１は糖鎖付加部位、ＨＶＲはＨｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ、ＴＭＤはＴｒａｎｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎを示す。Ｊ６／ＪＦＨ−１のＥ２  ＨＶＲ１のアミノ酸の一部（下線）の部分を除き、そこにＦＬＡＧタグ配列（下線）を挿入した。
図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）プラスミドの構築図を示す。図２Ｂは、図２Ａの続きであり、図２Ｃは、図２Ｂの続きである。
図３は、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＲＮＡおよびＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡをＨｕｈ−７細胞に導入後の培養上清中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量の変化を示す。Ｊ６／ＪＦＨ−１ではその産生量に変化はなかったが、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ではＣｏｒｅ産生量が２２日目まで減少したが、その後、増加し３５日目でＪ６／ＪＦＨ−１とほぼ同じ産生量となった。
図４は、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＲＮＡおよびＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡをＨｕｈ−７細胞に導入後、４，１７，３０，４３日目のＨＣＶ  ＣｏｒｅおよびＥ２タンパク質の発現を示す。Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）において、３０，４３日目のＥ２タンパク質の分子量は４日目よりも低くなっていることが示された。
図５は、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡをＨｕｈ−７細胞に導入後、４，１７，３０，４３日目のＨＣＶＥ２タンパク質をエンドグリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）で処理したときの挙動を示す。エンドグリコシダーゼ処理することにより、図４で見られたような分子量の違いは見られなくなった。
図６は、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡ導入後、８日目と３９日目のＨＣＶゲノムの配列解析を示す。ＲＮＡ導入後から３９日目でＥ２領域の糖鎖付加部位であるアスパラギン（Ｎ６）がリジン（Ｋ）に置換されていた。
図７は、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルスの精製溶液中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量を示す。１ＸＦＬＡＧペプチドまたは３ＸＦＬＡＧペプチド溶出によりＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質が検出されたことから、ＨＣＶ粒子の精製が確認された。
図８は、精製したＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルス溶液中に含まれる夾雑タンパク質について示す。精製したウイルス溶液中には夾雑タンパク質はほとんど含まれていなかった。
図９は、精製したＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルスの感染性について示す。各ウイルスを感染後、４日目の細胞内のＨＣＶ  ＲＮＡを定量した。精製したウイルスは未精製のウイルスと同等の感染性を有することが確認された。
図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋ、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋプラスミドの構築図を示す。図１０Ｂは、図１０Ａの続きであり、図１０Ｃは、図１０Ｂの続きである。
図１１は、ＨＣＶ  Ｅ２の構造図を示す。Ｎ１〜Ｎ１１は糖鎖付加部位、ＨＶＲはＨｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ、ＴＭＤはＴｒａｎｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎを示す。ＪＦＨ−１のＥ２  ＨＶＲ１のアミノ酸の一部（下線）の部分を除き、そこにＦＬＡＧタグ配列（下線）を挿入した。
図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃは、ｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）プラスミドの構築図を示す。図１２Ｂは、図１２Ａの続きであり、図１２Ｃは、図１２Ｂの続きである。
図１３は、ＨＣＶ  Ｅ２の構造図を示す。Ｎ１〜Ｎ１１は糖鎖付加部位、ＨＶＲはＨｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ、ＴＭＤはＴｒａｎｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎを示す。ｐＴＨ／ＪＦＨ−１のＥ２  ＨＶＲ１のアミノ酸の一部（下線）の部分を除き、そこにＦＬＡＧタグ配列（下線）を挿入した。
図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃは、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）プラスミドの構築図を示す。図１４Ｂは、図１４Ａの続きであり、図１４Ｃは、図１４Ｂの続きである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の実施にあたっては、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学および免疫学の従来技術を利用するものとする。このような技術は、当業者には自明であり、既報において十分に説明されている（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照）。
また、本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が本明細書に参考として、援用される。
１．エピトープタグ化ＨＣＶ粒子
本発明にかかる「エピトープタグ化ＨＣＶ粒子」とは、ＨＣＶの構造タンパク質内にエピトープタグペプチドが付加されたＨＣＶ粒子を意味する。このエピトープタグ化ＨＣＶ粒子は、細胞培養系で生産でき、好ましくは感染性を保有している。
細胞培養系でＨＣＶ粒子を生産するためには、ＪＦＨ−１株由来の全長遺伝子、またはＪＦＨ−１株と他のＨＣＶ株とのキメラ遺伝子を用いる必要があり、その基本技術は、ＷＯ０４１０４１９８Ａ１、ＷＯ０６０２２４２２Ａ１、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９１−７９６，２００５、およびＬｉｎｄｅｎｂａｃｈ，ＢＤ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：６２３−６２６，２００５に記載されている。
すなわち、ＨＣＶ粒子を生成できる遺伝子の１つの形態は、ＪＦＨ−１株のウイルスゲノムＲＮＡであって、５’側から３’側に順番に、５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域からなるＲＮＡである。
ＨＣＶ粒子を生成できる遺伝子の別な形態は、２種類以上のＨＣＶ株のウイルスゲノムＲＮＡからなるキメラ遺伝子であって、たとえば、５’側から３’側に順番に、ＪＦＨ−１株以外のＨＣＶ株の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列およびＮＳ２タンパク質コード配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域からなるＲＮＡである。
具体的には、ＨＣＶ粒子を生成できる遺伝子としては、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の核酸、すなわち、
（ａ）５’側から３’側に順番に、ＪＦＨ１株のゲノム（すなわちＪＦＨ−１株由来の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域を含む核酸：（配列番号３０：ｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、配列番号３１：ｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）参照））
（ｂ）５’側から３’側に順番に、Ｊ６ＣＦ株の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列およびｐ７タンパク質コード配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域を含むキメラＨＣＶゲノム（好ましくは、５’側から３’側に順番に、Ｊ６ＣＦ株由来の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、およびＮＳ２タンパク質コード領域のＮ末端１６アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード領域のＮ末端１７アミノ酸残基からＣ末端までコードする配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域からなるキメラＨＣＶゲノム：配列番号１０：ｐＪ６／ＪＦＨ−１、配列番号１１：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、配列番号１２：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）参照）
（ｃ）５’側から３’側に順番に、ＪＦＨ１株の５’非翻訳領域、ＴＨ１株のＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列およびｐ７タンパク質コード配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域を含むキメラＨＣＶゲノム（好ましくは、５’側から３’側に順番に、ＪＦＨ−１株由来の５’非翻訳領域、ＴＨ株のＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、およびＮＳ２タンパク質コード領域のＮ末端３３アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質コード領域のＮ末端３４アミノ酸残基からＣ末端までコードする配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列および３’非翻訳領域からなるキメラＨＣＶゲノム：配列番号４０：ｐＴＨ／ＪＦＨ１、配列番号４１：ｐＴＨ／ＪＦＨ１（１ＸＦＬＡＧ）、配列番号４２：ｐＴＨ／ＪＦＨ１（３ＸＦＬＡＧ）参照）、を挙げることができる。
本発明では、上記ＨＣＶゲノムに対し、そのＥ２タンパク質コード配列の超可変領域１（ＨＶＲ１）中にエピトープタグペプチドであるＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧ（配列番号４９）またはＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧ（配列番号５０）をコードする核酸配列をインフレームで挿入するか、または当該領域の一部を上記エピトープタグペプチドで置換し、エピトープタグ化ＨＣＶゲノムＤＮＡを作製する。そして、このＤＮＡを用いて「エピトープタグ化ＨＣＶ粒子」を培養細胞系で産生させ、高純度で精製されたエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を取得する。
２．エピトープタグ化ＨＣＶ粒子の作製
（１）ＨＣＶ構造タンパク質内にエピトープタグを持つＨＣＶゲノムＤＮＡの作製
本明細書で用いられる「エピトープタグ（あるいは単にタグ（Ｔａｇ）と呼称する）」は、ＨＣＶの標識に使用可能のものであれば特に限定されるものではないが、たとえば、ＦＬＡＧペプチド（ｆｌａｇペプチド、Ｆｌａｇペプチドとも呼称する）、３ＸＦＬＡＧペプチド（３ｘＦＬＡＧペプチド、３ｘＦｌａｇペプチド、３Ｘｆｌａｇペプチドとも呼称する）、ＨＡペプチド、３ＸＨＡペプチド、ｍｙｃペプチド、６ＸＨｉｓペプチド、ＧＳＴポリペプチド、ＭＢＰポリペプチド、ＰＤＺドメインポリペプチド、ＴＡＰ（Ｔａｎｄｅｍ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ペプチド、アルカリフォスファターゼ、アビジン等を挙げることができる。本発明においては、エピトープタグペプチドとしてＦＬＡＧペプチド（アミノ酸配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号５１））または３ＸＦＬＡＦＧペプチド（アミノ酸配列：ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号５２））を用いるが、なかでも３ＸＦＬＡＧペプチドがより好適である。
上記エピトープタグを付加する場所はＨＣＶ粒子のＥ２タンパク質のＨＶＲ１領域である。エピトープタグは、ＨＶＲ１領域内において各ＨＣＶ株間での相同性が低いＥ２タンパク質のＮ末端から数えて、８〜１９番目アミノ酸の間にインフレームで（読み枠がズレないように）挿入するか、あるいは上記Ｎ末端の１１〜１７番目のアミノ酸を除去して、ここにエピトープタグペプチドを挿入するのがより好適である。
上記エピトープタグのＣ末端には、必要に応じて適当なリンカーを付加する。リンカーとして、アミノ酸配列ＧＧＧ（配列番号５３）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、または（ＧＧＧＧＳ）×３（（ＧＧＧＧＳ）３ともいう）、あるいは、これらのアミノ酸配列の一部に、１〜１０個程度、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含むペプチドが使用され、好適な例としてＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、（ＧＧＧＧＳ）×３が挙げられるが、ＧＧＧがより好適である。
上記エピトープタグをコードする核酸をＨＣＶゲノムに導入する方法としては、エピトープタグをコードする核酸配列を含む合成プライマーでＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られたＰＣＲ産物を適宜制限酵素処理、ライゲーション処理によりＨＣＶゲノムのｃＤＮＡに組み換える方法が挙げられる。これらの手法の例は、後述の実施例に示されている。
使用するＨＣＶ株は限定されるものではなく、ＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法によって分類される遺伝子型１ａ（例えばＨ７７株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ０１１７５１））、遺伝子型１ｂ（例えばＪ１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ８９８１５）、Ｃｏｎ１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＪ２３８７９９、Ｃｏｎ−１株、ｃｏｎ１株と称することもある）、ＴＨ株（Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４２０５−１４２１０，１９９４、特開２００４−１７９））、遺伝子型２ａ（例えばＪＦＨ−１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６３９、ＪＦＨ１株と称することもある）、Ｊ６ＣＦ株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ１７７０３６）、ＪＣＨ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４０）、ＪＣＨ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４１）、ＪＣＨ−３（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４２）、ＪＣＨ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４３）、ＪＣＨ−５（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４４）、ＪＣＨ−６（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４５））、遺伝子型２ｂ（例えばＨＣ−Ｊ８株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ０１２２１））、遺伝子型３ａ（例えばＮＺＬ１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ１７７６３））、遺伝子型３ｂ（例えばＴｒ−Ｋｊ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ４９３７４））の６タイプのいずれに属する株を使用することができる。本明細書の実施例においては、本発明の好ましい例として、非構造タンパク質コード配列および３’非翻訳領域はＪＦＨ−１株由来のもので、５’非翻訳領域および構造タンパク質コード配列がＴＨ１株、ＪＦＨ−１株またはＪ６ＣＦ株由来の核酸配列を使用した。
ＨＣＶのＨＶＲに所望のエピトープタグペプチドを挿入するには、ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型にして、エピトープタグペプチドをコードした合成ＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲを行う。これにより、エピトープタグが目的の場所に付加／挿入されたエンベロープタンパク質をコードするｃＤＮＡを得ることができる。
さらに、エピトープタグを持つエンベロープタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を適切な制限酵素で消化して単離し、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターの下流に完全長のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを上記と同じ制限酵素で消化し、同じ位置に単離したエピトープタグ配列を持ったエンベロープタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を挿入することでエピトープタグを有する完全長ＨＣＶ  ｃＤＮＡを得ることができる。
ここで使用する完全長のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターは、このベクターから転写されたＲＮＡをＨｕｈ７細胞などのＨＣＶ許容性細胞に導入すると、ＨＣＶ粒子を産生可能なものであり、その構造や作製の詳細はＷＯ０４１０４１９８Ａ１、ＷＯ０６０２２４２２Ａ１、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９１−７９６，２００５、Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，ＢＤ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：６２３−６２６，２００５に記載されている。
（２）細胞培養系によるエピトープタグ化ＨＣＶ粒子の産生
プロモーターの制御下にエピトープタグコード配列を持つＨＣＶ  ｃＤＮＡからＲＮＡを合成し、このＲＮＡを細胞に導入することでエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を含有する細胞が得られ、上記細胞を培養することでエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を作製することができる。プロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターが挙げられるが、Ｔ７プロモーターが特に好ましい。
Ｔ７プロモーターの制御下にＨＣＶ  ｃＤＮＡを導入し、クローン化した核酸を鋳型として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを作製するためには、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）などのキットを用いることができる。
ＲＮＡを導入する細胞は、ＨＣＶ粒子形成を許容する細胞で有れば良く、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、あるいはＨｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞または２９３細胞にＣＤ８１遺伝子および／またはＣｌａｕｄｉｎ１遺伝子を発現させた細胞が挙げられる。なかでもＨｕｈ７細胞またはＨｕｈ７細胞の派生株が好適に使用される。Ｈｕｈ７細胞の派生株としては、Ｈｕｈ７．５細胞、Ｈｕｈ７．５．１細胞を挙げることができる。
ＲＮＡを細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられるが、リポフェクション法およびエレクトロポレーション法が好ましく、エレクトロポレーション法がより好適である。
ＲＮＡの代わりにｃＤＮＡを細胞に導入してもよく、この場合、エピトープタグコード配列を付加したＨＣＶ  ｃＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターとターミネーターとからなるベクター（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０２：４７７−４７９，１９９４、ＷＯ２００７／０３７４２８Ａ１）に機能しうる態様で挿入して、ＲＮＡと同じ方法で細胞に導入し、発現させる。
細胞のウイルス粒子産生能は、培養液中に放出されたＨＣＶウイルス粒子を構成する、例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、またはＥ２タンパク質に対する抗体を用いて評価することができる。また、培養液中のＨＣＶウイルス粒子が含有するＨＣＶゲノムＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶウイルス粒子の産生能を間接的に評価することもできる。
作製されたウイルスが感染能を有しているか否かは、ＨＣＶ  ＲＮＡを導入した細胞を培養して得られた上清でＨＣＶ許容性細胞（たとえばＨｕｈ７）を処理して、たとえば４８時間後に上記細胞を抗コア抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、上記細胞の抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ウエスタンブロットにて、コアタンパク質を検出することで評価できる。
（３）エピトープタグ化ＨＣＶ粒子産生細胞株の取得
ＨＣＶゲノムの効率的な複製には、ゲノムの塩基配列に変異が起こることが必要であることが示されており（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１４３７−１４４９，２００１）、複製を向上させる変異は適合変異（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）と呼ばれている。上記（２）により作製したＨＣＶゲノムＲＮＡが導入された細胞を継代培養することで、ＨＣＶ粒子を持続的に生産する細胞株を得ることができる。このように培養を続けることで、ＨＣＶゲノムに適合変異が起こり、ＨＣＶ粒子生産が著しく向上することがある。
上記（ａ）から（ｃ）の核酸において、ＨＶＲ１配列（Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：３５２１−３５３３，１９９８）の最後の配列の次のアミノ酸を１番としたとき、１２２番目または１２４番目のアミノ酸であるアスパラギンがリジンに置換するような変異は、エピトープタグ化ＨＣＶ粒子の産生する際の変異として好適である。中でも（ａ）または（ｂ）の核酸では１２４番目のアミノ酸がアスパラギンからリジンに置換するように変異することがより好適であり、（ｃ）の核酸では１２２番目のアミノ酸がアスパラギンからリジンに置換するように変異することがより好適である。この位置のアスパラギンは糖鎖の修飾を受ける領域であると考えられ、糖鎖が付加されないことが、ＨＣＶ粒子の高生産性と関係があることが示唆される。
本発明での適合変異は、前述の通り継代培養によって得ることもできるが、人為的に導入することもできる。適合変異を人為的に導入する場合、変異導入用プライマーを設計し、これを用いたＰＣＲを行なうことにより変異が導入されたＤＮＡを合成することができる。また、突然変異体作製キットとして市販されているＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｒｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて変異体を作製してもよい。
本発明での適合変異は、ハイブリダイゼーション技術では１アミノ酸が変異するのに必要な核酸の変異を検出することは困難であるが、ＨＣＶの遺伝子配列をシークエンスすることで確認することができる。
（４）エピトープタグ化ＨＣＶ粒子の精製
エピトープタグ化ＨＣＶ粒子の精製には、そのエピトープタグに結合することの出来るタンパク質を結合させた担体が用いられる。タンパク質としてはエピトープタグペプチドに対する抗体がもっとも一般的である。本発明においては、好適なエピトープタグがＦＬＡＧペプチドまたは３ＸＦＬＡＧペプチドであり、これらのペプチドに結合することの出来る抗ＦＬＡＧ抗体であるＭ２抗体やＭ５抗体を結合（固定化）させた担体（いずれもシグマ社より入手できる）等が使用できる。
ＦＬＡＧエピトープタグ化ＨＣＶ粒子産生細胞または３ＸＦＬＡＧエピトープタグ化ＨＣＶ粒子産生細胞の培養上清、あるいは該ＨＣＶ粒子含有液体、を抗ＦＬＡＧ抗体結合担体カラムにかけ、カラムをリン酸緩衝液で洗浄し、ＦＬＡＧペプチドまたは３ＸＦＬＡＧペプチドを含む緩衝液で、抗ＦＬＡＧ抗体結合担体に結合したＨＣＶ粒子を溶出することができる。カルシウム依存的にＦＬＡＧペプチドに結合する抗体であるＭ５抗体を結合させた担体を使用する場合は、カルシウムを含有する緩衝液でＨＣＶ粒子を結合させ、カルシウム不含の緩衝液でＨＣＶ粒子を担体から溶出させることができる。
その他の溶出方法としては、抗体結合担体からのタンパク質を溶出する一般的な方法を使用することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。たとえば溶出溶液として、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５〜ｐＨ４．０）または１Ｍのアルギニン塩酸緩衝液（ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０）が使用できる（Ｅｊｉｍａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４５：２５０−２５７，２００５）。さらに０．１ｍＭ〜１ｍＭの塩酸を使用することができる。また、溶出されたＨＣＶ粒子が変性しないように、溶出後の緩衝液のｐＨを中性付近（ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０）にするのが望ましい。
このようにして精製されたＨＣＶ粒子をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、ＨＣＶ由来タンパク質を検出することでＨＣＶ粒子が精製できたか否かを判断できる。
３．エピトープタグ化ＨＣＶ粒子の利用
（１）ワクチン
純度の高いエピトープタグ化ＨＣＶ粒子はワクチンとしての用途、抗ＨＣＶ抗体作製のための抗原としての用途に好適である。
具体的には、作製されたエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を当該分野で既知の方法により不活化して用いることができる。ウイルスの不活化は、ホルマリン，β−プロピオラクトン，グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させることにより達成することができる（Ａｐｐａｉａｈｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２２：３６６９−３６７５，２００４）。
さらに、紫外線で照射することによりウイルスの感染性を失わせ、迅速に不活化することもできる。紫外線照射は、ウイルスを構成するタンパク質などへの影響が少なく、ウイルスの不活化を行うことができる。不活化するための紫外線の線源としては一般に市販されている殺菌灯、特に１５Ｗ殺菌灯を用いて行うことができるが、それに限るものではない。また、本発明においては、ＨＣＶ粒子は上記に記載した方法により精製したものを用いているが、不活化方法は精製・未精製などの状態により限られるものではない。好ましくはエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を含む溶液を２０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線で室温にて５分以上照射することにより、エピトープタグ化ＨＣＶ粒子を不活化することができる。
本発明のワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかの形態で、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分（ウイルス粒子またはその一部分）を含有し、投与可能に調製される。液体中の溶解または懸濁に適した固形物の形態で調製することができる。調製物は乳濁され、またはリポソームにカプセル化してもよい。
ＨＣＶ粒子などの活性免疫原性成分は、薬学的に受容可能であって、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物が挙げられる。さらに、所望に応じて、ワクチンは、少量の補助剤（例えば加湿剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、たとえば、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）、およびＲＩＢＩを包含する。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に含有している。アジュバントの効能は、ＨＣＶ粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じる、抗体の量を測定することにより決定され得る。
本発明のワクチンは、通常非経口的に、例えば皮下注射または筋内注射のような、注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、およびある場合には経口処方薬が挙げられる。
所望により、アジュバント活性を有する１以上の化合物をＨＣＶワクチンに加えることができる。アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、ＨＣＶワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油およびＣａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）またはコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素（ＣＴ）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Ｂａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標）のもの）、サポニンまたはビタミンＥソリュビリゼートが挙げられる。したがって、好ましい形態においては、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、本発明のワクチンと医薬上許容される担体または希釈剤の他の具体例には、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清または脱脂乳などのタンパク質含有物質、およびバッファー（例えば、リン酸バッファー）などともに投与することができる。
本発明のワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防および／または治療効果があるような量で投与される。投与されるべき量は、通常投与当たり抗原を０．０１μｇから１００，０００μｇまでの範囲であり、これは、処置される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、および所望の防御の程度に依存し、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。
本発明のワクチンは、単独投与スケジュールで、または好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に１〜１０の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持するおよびまたは強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。
また本発明のワクチンは、他の免疫制御剤（例えば、免疫グロブリン）と共に投与してもよい。
さらに本発明のワクチンは、健常人に投与し、健常人にＨＣＶに対する免疫応答を誘導し、新たなＨＣＶ感染に対し、予防的に使用してもよい。さらにまた、ＨＣＶに感染した患者に投与し、生体内にＨＣＶに対する強い免疫反応を誘導することにより、ＨＣＶを排除する治療的ワクチンとして使用してもよい。
（２）エピトープタグ化ＨＣＶ粒子を抗原として誘発される抗ＨＣＶ抗体
本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子は簡便に精製でき、高純度であるため、抗体作製のための抗原として有用である。
すなわち、動物の血清には不純物に対する抗体が含まれているため、動物の免疫に用いるＨＣＶ粒子サンプルに不純物が存在する場合、この不純物に対する抗体を除くために血清をＨＣＶ抗原カラムなどで精製する必要がある。しかしながら、本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子は高純度なＨＣＶとして得られるため、このような精製工程は不要である。
抗ＨＣＶ抗体は、本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を哺乳類または鳥類に投与することで作製することができる。哺乳類動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、モルモット、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマなどを挙げることができる。ヒトコブラクダ、フタコブラクダおよびラマはＨ鎖のみからなる抗体を作製するには好適である。鳥類動物としては、ニワトリ、ガチョウ、ダチョウなどを挙げることができる。本発明の粒子を投与された動物の血清を採取して、既知の方法に従って抗体を取得することができる。
本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子で免疫した動物の細胞を用いてモノクローナル抗体産生細胞を産生するハイブリドーマを作製することができる。ハイブリドーマを製造する方法は周知であり、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に記載された方法を用いることができる。
モノクローナル抗体産生細胞は、細胞融合により作製してもよく、また癌遺伝子ＤＮＡの導入やＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスの感染によりＢリンパ球を不死化させるような他の方法で作製してもよい。
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体やポリクローナル抗体はＨＣＶの診断や治療、予防に有用である。
本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を用いて作製された抗体は、Ｃ型肝炎の治療、予防を目的として使用される。さらに臓器移植によるドナー臓器からのＨＣＶの感染予防にも使用される。さらに上記抗体は、既存の抗ウイルス剤たとえば、インターフェロン、リバビリンなどとの併用でも使用できる。
抗ＨＣＶ抗体の有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を用いて作製された抗ＨＣＶ抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
上記治療剤の投与経路は特に限定されないが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与である。なお、治療剤の投与時期は、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わない。
本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を用いて作製された抗ＨＣＶ抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｔｅｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて、たとえば上記の中から単独でまたは適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたエピトープタグ化ＨＣＶ粒子を用いて作製された抗ＨＣＶ抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０００６】
実施例１：ＨＣＶ  Ｅ２  ＨＶＲ１領域にＦＬＡＧタグ配列を挿入したＪ６／ＪＦＨ−１プラスミドの構築
ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡとして、５’ＵＴＲからＮＳ２のＮ末端１６アミノ酸残基までが遺伝子型２ａのＪ６ＣＦ株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ１７７０３６、Ｙａｎａｇｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６２（１９９９）ｐ２５０−２６３）、ＮＳ２のＮ末端１７アミノ酸残基から３’ＵＴＲまでが同じく遺伝子型２ａ株のＪＦＨ−１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６３９、Ｋａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２５（２００３）ｐ１８０８−１８１７）であるＪ６／ＪＦＨ−１キメラのｃＤＮＡを使用した。挿入するＦＬＡＧタグとしてはＦＬＡＧ配列を１回または３回繰り返したｃＤＮＡを挿入した。作製されたこれらのプラスミドをそれぞれｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）と呼ぶ。
これらの遺伝子から翻訳されるＦＬＡＧタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列をＥ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸から図１に示した。Ｊ６／ＪＦＨ１のコードするＥ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を配列番号１、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を配列番号２、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を配列番号３に記載した。また、これらのプラスミドの作製方法を図２（Ａ）−（Ｃ）に示す。
具体的には、ＪＦＨ１株由来ゲノムＲＮＡ全領域に対応するｃＤＮＡをｐＵＣ１９プラスミド中にクローニングすることにより構築されたプラスミドＤＮＡであるｐＪＦＨ１（Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１１（２００５）ｐ７９１−７９６、国際公開ＷＯ２００４／１０４１９８）をＥｃｏＲＩで消化後、さらにＢｃｌＩで部分消化し、ＥｃｏＲＩ部位から最初のＢｃｌＩ部位までの断片（約２８４０ｂｐ）が除去されたプラスミドＤＮＡ断片を精製した。一方、ｐＵＣ１９プラスミド中にクローニングされたＪ６ＣＦ株由来ゲノムｃＤＮＡ、ｐＪ６ＣＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ１７７０３６、Ｙａｎａｇｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６２：２５０−２６３，１９９９）をＥｃｏＲＩとＢｃｌＩで部分消化して得られる約２８４０ｂｐの断片を上記の断片に連結し、Ｊ６／ＪＦＨ１を得た。
次に、Ｊ６／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＥ２−Ｆ（配列番号４）および１Ｆ−Ｒ（配列番号５）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１とした。
次に、Ｊ６／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＥ２−Ｒ（配列番号６）および１Ｆ−Ｆ（配列番号７）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２とした。
次にＪ６／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＥ２−Ｆ（配列番号４）および３Ｆ−Ｒ（配列番号８）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．３とした。
次に、Ｊ６／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＥ２−Ｒ（配列番号６）および３Ｆ−Ｆ（配列番号９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．４とした。
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μｌのＨ２Ｏに溶かした。ＰＣＲ産物ｎｏ．１とＰＣＲ産物ｎｏ．２のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＥ２−Ｆ（配列番号４）およびＥ２−Ｒ（配列番号６）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．５とした。
次にＰＣＲ産物ｎｏ．３とＰＣＲ産物ｎｏ．４のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＥ２−Ｆ（配列番号４）およびＥ２−Ｒ（配列番号６）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．６とした。それぞれのＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのＨ２Ｏに溶かした。
Ｊ６／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡおよび精製したＰＣＲ産物ｎｏ．５を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）と名付けた。このｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）は、５’側から３’側に順番に、Ｊ６ＣＦ株由来の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、およびＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１６アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１７アミノ酸残基からＣ末端間でコードする配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質領域および３’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記Ｅ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列をコードする塩基配列を含む。
次いで、Ｊ６／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡおよび精製したＰＣＲ産物ｎｏ．６を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）と名付けた。このｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）は、５’側から３’側に順番に、Ｊ６ＣＦ株由来の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列およびＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１６アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１７アミノ酸残基からＣ末端までコードする配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質領域および３’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記Ｅ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列を３回繰り返した塩基配列を含む。
ｐＪ６／ＪＦＨ−１を配列番号１０、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）を配列番号１１、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）を配列番号１２としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
実施例２：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ合成と細胞内への導入
ｐＪ６／ＪＦＨ−１，ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）をＸｂａ  Ｉで切断し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。この切断したプラスミドを鋳型として、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて各ＨＣＶ  ＲＮＡの合成を行った。
３×１０６個のＨｕｈ−７細胞と５μｇのＨＣＶ  ＲＮＡをＣｙｔｏｍｉｘ溶液（１２０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４，２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  ＡＴＰ，５０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）４００μｌで懸濁し、４ｍｍキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて２６０Ｖ、９５０μＦでエレクトロポレーションを行った。その後、ＨＣＶ  ＲＮＡ導入細胞を１０ｃｍ２ディッシュに播種し、継代培養を行った。
実施例３：Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡ導入細胞によるＨＣＶ粒子の産生
Ｊ６／ＪＦＨ−１，Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡを導入した各細胞の継代時に、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いて培養上清中に含まれるＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質を定量し、ＨＣＶ粒子産生の確認を行った。その結果、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＲＮＡ導入ではその産生量に変化は見られずほぼ一定だった。しかしながら、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡ導入では培養上清中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅ量は導入２１日目までは経時的に減少していったが、導入から２２日を経過した時点でＣｏｒｅ量が上昇し始め、３５日経過時点でＪ６／ＪＦＨ−１と同程度のＣｏｒｅ産生量を示した（図３）。このことから、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡは、Ｈｕｈ−７細胞導入当所は高いウイルス産生能を有していないが、後にウイルスゲノム内にウイルス産生に必要な適合変異が導入され、Ｊ６／ＪＦＨ−１  ＲＮＡと同様のウイルス産生能を有するようになると考えられた。
実施例４：Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡ導入細胞によるＨＣＶタンパク質の発現
Ｊ６／ＪＦＨ−１，Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡ導入から４，１７，３０，４３日目の細胞内のＨＣＶタンパク質発現をウェスタンブロッティングにより確認した。解析にあたって、ＲＮＡを導入していないＨｕｈ−７細胞から得られた細胞抽出試料を陰性対象とした。それぞれの細胞からの抽出試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にブロッティングした。その後、抗Ｃｏｒｅモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２抗体、シグマ社）および抗Ｅ２モノクローナル抗体と、これらの抗体を認識するＨＲＰ標識２次抗体を用いて、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて細胞内で翻訳されたＣｏｒｅタンパク質およびＥ２タンパク質を検出した。
その結果、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）導入において、３０，４３日目でのＥ２タンパク質はＲＮＡ導入時のＥ２タンパク質より分子量が軽くなっていることが示された（図４）。Ｃｏｒｅタンパク質においてはそのような変化は見られなかった。そこで、これらのＥ２タンパク質を脱糖鎖酵素であるＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理したところ、そのような分子量の違いはみられなくなっていた（図５）。このことから、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡゲノムのＥ２領域は細胞の継代を重ねることによって、そのゲノム内に変異を生じ、その部位は糖鎖結合部位である可能性が示唆された。
実施例５：継代を重ねたＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルス感染細胞内のＨＣＶゲノム配列解析
Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルスが高い感染性を有するために必要な適合変異を調べるために、ＲＮＡ導入から８日目と３９日目の感染細胞内のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、この中に含まれるＨＣＶゲノムの配列解析を行った。
その結果、Ｅ２領域の糖鎖付加部位の一つであるアスパラギンＡＡＵ（Ｎ）がリジンＡＡＡ（Ｋ）に置換されており、この部位の糖鎖修飾が無くなることにより、ＲＮＡ導入時のＥ２タンパク質よりも分子量が軽くなることが示された（図６）。なお、本アスパラギンはＪ６ＣＦ株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ１７７０３６、Ｙａｎａｇｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６２（１９９９）ｐ２５０−２６３）のＣｏｒｅタンパク質のＮ末端配列であるメチオニンを１として数えて５３４番目のアミノ酸に対応する。
実施例６：Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルス粒子の精製
Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルス粒子を精製するために、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ＲＮＡ導入から５６日目の培養上清を用いた。この培養上清６００μｌに、０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で前処理したＭ２抗体ａｇａｒｏｓｅ（シグマ社）５００μｌを加え、４℃で２時間転倒混和を行った。フロースルーを回収し、Ｍ２抗体ａｇａｒｏｓｅをＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、２００μｌの１ＸＦＬＡＧペプチド（シグマ社）溶液または３ＸＦＬＡＧペプチド（シグマ社）溶液を用いて３回溶出操作を行った。これらの溶出サンプルのＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量をＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）により定量したところ、どちらのＦＬＡＧペプチドでも溶出でき、その精製効率は約５％であった（図７）。
これらの溶出サンプルの純度を調べるために、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  ０．１ｆｍｏｌ相当の溶出サンプルおよび未精製の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、銀染色を行い各溶液中に含まれる夾雑タンパク質を確認したところ、溶出サンプルではほとんど夾雑タンパク質は確認されなかった（図８）。以上から、溶出サンプルはＨＣＶ粒子が高純度に精製されていることが確かめられた。
実施例７：精製したＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルスの感染性の評価
実施例６で精製したＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルスの感染性を評価するために、培養細胞を用いての感染実験を行った。Ｈｕｈ−７細胞を８ｗｅｌｌガラスチャンバーに１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養後、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  １ｆｍｏｌ相当のウイルス液を３時間感染させた。感染後、ＤＭＥＭ（シグマ社）で２回洗浄し、そこから４日間培養を行った。４日後の細胞内のｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の添付マニュアルに従って抽出した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中のＨＣＶ  ＲＮＡ量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。使用するプライマーおよびプローブはＨＣＶ  ＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域を標的としたセンスプライマーＳ−１７（配列番号１３）、アンチセンスプライマーＲ−１９（配列番号１４）およびタックマンプローブ（配列番号１５）を用いた。このプライマーおよびプローブと抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを混合し、ＴａｑＭａｎ  ＥＺ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＣＯＲＥ  ＲＥＡＧＥＮＴＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の添付マニュアルに従いＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を調製し、７５００Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による検出を行った。その結果、精製したＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルス溶液はＨｕｈ−７細胞に対して感染性を有することが示された（図９）。このことから、ＨＣＶ  Ｅ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧタグ配列を挿入したウイルスは高純度に精製することが可能であり、その精製ウイルスは感染性を有することが示された。
実施例８：Ｊ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｅ２  Ｎ→ＫおよびＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｅ２  Ｎ→Ｋ変異プラスミドの構築
実施例５で示した、Ｊ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）ウイルスが高い感染性を有するために必要な適合変異（Ｅ２領域の糖鎖付加部位のアスパラギンＡＡＴ（Ｎ６）からリジンＡＡＡ（Ｋ）への置換）を持つプラスミドｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｎ→ＫおよびｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋの構築を行った。プラスミドの作製方法を図１０（Ａ）−（Ｃ）に示す。
具体的には、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）を鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー１１４１Ｓ−２ａ（配列番号１６）およびＪ６Ｅ２−Ｋ−Ｒ（配列番号１７）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．７とした。
次に、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）を鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー１１４１Ｓ−２ａ（配列番号１６）およびＪ６Ｅ２−Ｋ−Ｒ（配列番号１７）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．８とした。
次に、ｐＪ６／ＪＦＨ−１を鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＪ６Ｅ２−Ｋ−Ｆ（配列番号１８）および３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．９とした。
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、５０μｌのＨ２Ｏに溶かした。ＰＣＲ産物ｎｏ．７とＰＣＲ産物ｎｏ９のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー１１４１Ｓ−２ａ（配列番号１６）および３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１０とした。
次に、ＰＣＲ産物ｎｏ．８とＰＣＲ産物ｎｏ．９のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー１１４１Ｓ−２ａ（配列番号１６）および３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１１とした。それぞれのＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのＨ２Ｏに溶かした。
ｐＪ６／ＪＦＨ１および精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１０を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋと名付けた。このｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋは、５’側から３’側に順番に、Ｊ６ＣＦ株由来の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列およびＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１６アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１７アミノ酸残基からＣ末端間でコードする配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質領域および３’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記ＮＳ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列をコードする塩基配列を含み、かつＣｏｒｅタンパク質のＮ末端配列であるメチオニンを１として数えて５３２番目のアミノ酸がリジンとなるような塩基配列を含む。
次いで、ｐＪ６／ＪＦＨ１および精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１１を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋと名付けた。このｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋは、５’側から３’側に順番に、Ｊ６ＣＦ株由来の５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列およびＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１６アミノ酸残基までコードする配列、ならびに、ＪＦＨ−１株のＮＳ２タンパク質領域のＮ末端１７アミノ酸残基からＣ末端までコードする配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質領域および３’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列であり、上記ＮＳ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列を３回繰り返した塩基配列を含み、かつＣｏｒｅタンパク質のＮ末端配列であるメチオニンを１として数えて５３２番目のアミノ酸がリジンとなるような塩基配列を含む。
ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋを配列番号２０、ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋを配列番号２１としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
実施例９：Ｊ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｅ２  Ｎ→ＫおよびＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｅ２  Ｎ→Ｋウイルスの作製
実施例８で作製したプラスミドをそれぞれＸｂａＩで切断し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。この切断したプラスミドを鋳型にＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて各ＨＣＶ  ＲＮＡの合成を行った。
３×１０６個のＨｕｈ−７細胞と５μｇのＨＣＶ  ＲＮＡをＣｙｔｏｍｉｘ溶液（１２０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４，２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  ＡＴＰ，５０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）４００μｌで懸濁し、４ｍｍキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて２６０Ｖ、９５０μＦでエレクトロポレーションを行った。その後、ＨＣＶ  ＲＮＡ導入細胞を１０ｃｍ２ディッシュに播種し、継代培養を行った。
Ｊ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）Ｅ２  Ｎ→ＫおよびＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）Ｅ２  Ｎ→Ｋ  ＲＮＡを導入した各細胞の継代時に、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いて培養上清中に含まれるＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質を定量し、ＨＣＶ粒子産生の確認を行った。培養初期から後期にわたって、変異を導入しないＲＮＡを導入した細胞の培養上清中に含まれるＨＣＶ  Ｃｏｒｅ量と変異を導入したＲＮＡを導入した細胞の培養上清に含まれるＨＣＶ  Ｃｏｒｅ量とを比較すると後者の方が高いことが示された。
実施例１０：ＨＣＶ  Ｅ２  ＨＶＲ１領域にＦＬＡＧタグ配列を挿入したＪＦＨ−１プラスミドの構築
実施例１と同様な方法で、遺伝子型２ａ株のＪＦＨ−１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６３９、Ｋａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２５（２００３）ｐ１８０８−１８１７）のＨＶＲ１内にエピトープタグ配列を導入した。エピトープタグとしてはＦＬＡＧ配列を１回または３回繰り返したｃＤＮＡを挿入した。これらのプラスミドをそれぞれＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）と呼ぶ。
これらの遺伝子から翻訳されるＦＬＡＧタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列をＥ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸から図１１に示した。
ｐＪＦＨ−１（ｐＪＦＨ１と呼称されることもある）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列を配列番号２２、ｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列を配列番号２３、ｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列を配列番号２４に記載した。また、これらのプラスミドの作製方法を図１２（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
具体的には、ｐＪＦＨ−１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＪＦＨ１−Ｆ（配列番号２５）およびＪＦＨ１−１Ｆ−Ｒ（配列番号２６）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１２とした。
次に、ｐＪＦＨ−１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）およびＪＦＨ１−１Ｆ−Ｆ（配列番号２７）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１３とした。
次にＪＦＨ１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＪＦＨ１−Ｆ（配列番号２５）およびＪＦＨ１−３Ｆ−Ｒ（配列番号２８）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１４とした。
次に、ｐＪＦＨ−１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）およびＪＦＨ１−３Ｆ−Ｆ（配列番号２９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１５とした。
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μｌのＨ２Ｏに溶かした。ＰＣＲ産物ｎｏ．１２とＰＣＲ産物ｎｏ．１３のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＪＦＨ１−Ｆ（配列番号２５）および３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１６とした。
次にＰＣＲ産物ｎｏ．１４とＰＣＲ産物ｎｏ．１５のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＪＦＨ１−Ｆ（配列番号２５）および３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１７とした。それぞれのＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのＨ２Ｏに溶かした。
ｐＪＦＨ−１  ｃＤＮＡおよび精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１６を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）と名付けた。このｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）は、ＪＦＨ１株の遺伝子をコードする塩基配列で、Ｅ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列をコードする塩基配列を含む。次いで、ｐＪＦＨ１  ｃＤＮＡおよび精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１７を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）と名付けた。このｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）は、ＪＦＨ１株の遺伝子をコードする塩基配列で、Ｅ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列を３回繰り返した塩基配列を含む。
ｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）を配列番号３０、ｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）を配列番号３１としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
実施例１１：ＨＣＶ  Ｅ２  ＨＶＲ１領域にＦＬＡＧタグ配列を挿入したＴＨ／ＪＦＨ１プラスミドの構築
ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡとして、５’ＵＴＲからＮＳ２のＮ末端１６アミノ酸残基までが遺伝子型１ｂのＴＨ１株（（Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４２０５−１４２１０，１９９４、特開２００４−１７９）、ＮＳ２のＮ末端１７アミノ酸残基から３’ＵＴＲまでが同じく遺伝子型２ａ株のＪＦＨ−１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６３９、Ｋａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２５（２００３）ｐ１８０８−１８１７）であるＴＨ／ＪＦＨ−１キメラのｃＤＮＡを使用し、ＴＨ／ＪＦＨ１のＨＶＲ１内にエピトープタグ配列を導入した。挿入するエピトープタグとしてはＦＬＡＧ配列を１回または３回繰り返したｃＤＮＡを挿入した。これらのプラスミドをそれぞれｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）と呼ぶ。
これらの遺伝子から翻訳されるＦＬＡＧタグの挿入部位近傍のアミノ酸配列を、Ｅ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列由来ものとして図１３に示した。
ｐＴＨ／ＪＦＨ−１のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列を配列番号３２、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列を配列番号３３、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列を配列番号３４に記載した。また、これらのプラスミドの作製方法を図１４に示す。
まず、ＴＨ／ＪＦＨ−１を作製した。ｐＪＦＨ−１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＪＦＨ１−Ａ（配列番号４３）およびＪＦＨ１−Ｂ（配列番号４４）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行い、ＪＦＨ−１の５’非翻訳領域とプライマーＪＦＨ１−Ｂに含まれるＴＨのＣｏｒｅの一部の増幅を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１８とした。
次に、ｐＴＨ（Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４２０５−１４２１０，１９９４およびＭｏｒａｄｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４６：９２０−９２４，１９９８）を鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＴＨ−Ｃ（配列番号４５）およびＴＨ−Ｄ（配列番号４６）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行い、ＴＨのＣｏｒｅからＮＳ２の一部分とプライマーＴＨ−Ｃに含まれるＪＦＨ−１の５’非翻訳領域の一部分およびプライマーＹＨ−Ｄに含まれるＪＦＨ−１のＮＳ２の一部分の増幅を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１９とした。
ｐＪＦＨ−１を鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＪＦＨ１−Ｅ（配列番号４７）およびＪＦＨ１−Ｆ（配列番号４８）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行い、ＪＦＨ−１のＮＳ２、ＮＳ３の一部とプライマーＪＦＨ１−Ｅに含まれるＴＨのＮＳ２の一部の増幅を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２０とした。
上記ＰＣＲ産物ｎｏ．１８，ｎｏ．１９，ｎｏ．２０とプライマーＪＦＨ−ＡおよびＪＦＨ−Ｅを用いてＰＣＲを行い、ＪＦＨ−１の５’翻訳領域からＴＨ株のＣｏｒｅからＮＳ２の一部、ＪＦＨ−１のＮＳ２からＮＳ３の一部のフラグメントを得た（ＰＣＲ産物ｎｏ．２１）。
次に、ｐＪＦＨ−１およびＰＣＲ産物ｎｏ．２１をそれぞれＥｃｏＲ  Ｉ、ＳｐｅＩで制限酵素処理を行い、ライゲーションし、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１を得た。このプラスミドを用いて、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）を作製する方法を図１４（Ａ）−（Ｃ）に示す。
具体的には、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＴＨ−Ｆ（配列番号３５）およびＴＨ−１Ｆ−Ｒ（配列番号３６）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２２とした。
次に、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）およびＴＨ−１Ｆ−Ｆ（配列番号３７）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２３とした。
次にｐＴＨ／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＴＨ−Ｆ（配列番号３５）およびＴＨ−３Ｆ−Ｒ（配列番号３８）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２４とした。
次に、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１  ｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマー３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）およびＴＨ−３Ｆ−Ｆ（配列番号３９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  １分３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２５とした。
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μｌのＨ２Ｏに溶かした。ＰＣＲ産物ｎｏ．２２とＰＣＲ産物ｎｏ．２３のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＴＨ−Ｆ（配列番号３５）および３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２６とした。
次にＰＣＲ産物ｎｏ．２４とＰＣＲ産物ｎｏ．２５のＤＮＡを各１μｌずつ混合した。これを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付されていた、１０×緩衝液を１０μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、１０μＭのプライマーＴＨ−Ｆ（配列番号３５）および３１８９Ｒ−ＩＨ（配列番号１９）をそれぞれ１μｌ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μｌとした。その後Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μｌ加えてから、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ２分からなる工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２７とした。それぞれのＰＣＲ産物を精製し、３０μｌのＨ２Ｏに溶かした。
ｐＴＨ／ＪＦＨ−１  ｃＤＮＡおよび精製したＰＣＲ産物ｎｏ．２６を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）と名付けた。このｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）は、ＴＨ１株の遺伝子をコードする塩基配列で、Ｅ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列をコードする塩基配列を含む。
次いで、ｐＴＨ／ＪＦＨ１  ｃＤＮＡおよび精製したＰＣＲ産物ｎｏ．２７を制限酵素ＫｐｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、日本）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。このベクターをｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）と名付けた。このｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）は、ＴＨ１株の遺伝子をコードする塩基配列で、Ｅ２のＨＶＲ１領域にＦＬＡＧペプチド配列を３回繰り返した塩基配列を含む。
ｐＴＨ／ＪＦＨ１を配列番号４０、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）を配列番号４１、ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）を配列番号４２としてこれらの塩基配列を配列表に示した。
上記実施例で作製されたベクター類から合成されたＲＮＡはいずれも、培養ＨＣＶ許容性細胞（Ｈｕｈ７等）に導入すると、エピトープタグ化ＨＣＶ粒子を生成した。そして、エピトープタグ化ＨＣＶ粒子含有培養上清を、抗エピトープタグ抗体を固定した担体を充填したカラムに通すことによって、エピトープタグ化ＨＣＶ粒子を特異的に吸着し、その後の溶離処理により、該ＨＣＶ粒子を精製することができた。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によれば、ＨＣＶ粒子を培養細胞系で生産し、精製するための方法において、従来の方法よりも、簡便かつ高純度にＨＣＶ粒子を精製できる。本発明の方法によって提供されるＨＣＶ粒子は高純度であるため、ＨＣＶの予防または治療用ワクチンとして好適である。さらに、本発明のエピトープタグ化ＨＣＶ粒子はＨＣＶに対する抗体を誘導するツールとしても利用できる。
本発明の方法によって提供されるＨＣＶ粒子は高純度であるため、ＨＣＶの予防または治療用ワクチンとして好適に利用できる。さらに、本発明にかかるエピトープタグ化ＨＣＶ粒子はＨＣＶに対する抗体を誘導するツールとしても利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１：Ｊ６／ＪＦＨ１のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号２：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号３：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号４：プライマー（Ｅ２−Ｆ）
配列番号５：プライマー（１Ｆ−Ｒ）
配列番号６：プライマー（Ｅ２−Ｒ）
配列番号７：プライマー（１Ｆ−Ｆ）
配列番号８：プライマー（Ｅ２−Ｆ）
配列番号９：プライマー（３Ｆ−Ｒ）
配列番号１０：ｐＪ６／ＪＦＨ−１
配列番号１１：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）
配列番号１２：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）
配列番号１３：プライマー（Ｓ−１７）
配列番号１４：プライマー（Ｒ−１９）
配列番号１５：プローブ
配列番号１６：プライマー（１１４１Ｓ−２ａ）
配列番号１７：プライマー（Ｊ６Ｅ２−Ｋ−Ｒ）
配列番号１８：プライマー（Ｊ６Ｅ２−Ｋ−Ｆ）
配列番号１９：プライマー（３１８９Ｒ−１Ｈ）
配列番号２０：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（１×ＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋ
配列番号２１：ｐＪ６／ＪＦＨ−１（３×ＦＬＡＧ）Ｎ→Ｋ
配列番号２２：ｐＪＦＨ−１のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号２３：ｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号２４：ｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号２５：プライマー（ＪＦＨ１−Ｆ）
配列番号２６：プライマー（ＪＦＨ１−１Ｆ−Ｒ）
配列番号２７：プライマー（ＪＦＨ１−１Ｆ−Ｆ）
配列番号２８：プライマー（ＪＦＨ１−３Ｆ−Ｒ）
配列番号２９：プライマー（ＪＦＨ１−３Ｆ−Ｆ）
配列番号３０：ｐＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）
配列番号３１：ｐＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）
配列番号３２：ｐＴＨ／ＪＦＨ１のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号３３：ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（１ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号３４：ｐＴＨ／ＪＦＨ−１（３ＸＦＬＡＧ）のコードするＥ２タンパク質のＮ末端の配列
配列番号３５：プライマー（ＴＨ−Ｆ）
配列番号３６：プライマー（ＴＨ−１Ｆ−Ｒ）
配列番号３７：プライマー（ＴＨ−１Ｆ−Ｆ）
配列番号３８：プライマー（ＴＨ−３Ｆ−Ｒ）
配列番号３９：プライマー（ＴＨ−３Ｆ−Ｆ）
配列番号４０：ｐＴＨ／ＪＦＨ１
配列番号４１：ｐＴＨ／ＪＦＨ１（１ＸＦＬＡＧ）
配列番号４２：ｐＴＨ／ＪＦＨ１（３ＸＦＬＡＧ）
配列番号４３：プライマー（ＪＦＨ１−Ａ）
配列番号４４：プライマー（ＪＦＨ１−Ｂ）
配列番号４５：プライマー（ＴＨ−Ｃ）
配列番号４６：プライマー（ＴＨ−Ｄ）
配列番号４７：プライマー（ＪＦＨ１−Ｅ）
配列番号４８：プライマー（ＪＦＨ１−Ｆ）
配列番号４９：エピトープタグペプチド（１ＸＦＬＡＧ＋Ｌｉｎｋｅｒ）
配列番号５０：エピトープタグペプチド（３ＸＦＬＡＧ＋Ｌｉｎｋｅｒ）
配列番号５１：エピトープタグペプチド（１ＸＦＬＡＧ）
配列番号５２：エピトープタグペプチド（３ＸＦＬＡＧ）
配列番号５３：リンカー
配列番号５４：リンカー
［配列表］
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2009011413.tif 000093
【図２Ｃ】
2009011413.tif 000094
【図３】
2009011413.tif 000095
【図６】
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【図９】
2009011413.tif 000097
【図１０Ａ】
2009011413.tif 000098
【図１０Ｂ】
2009011413.tif 000099
【図１０Ｃ】
2009011413.tif 000100
【図１１】
2009011413.tif 000101
【図１２Ａ】
2009011413.tif 000102
【図１２Ｂ】
2009011413.tif 000103
【図１２Ｃ】
2009011413.tif 000104
【図１３】
2009011413.tif 000105
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2009011413.tif 000107
【図１４Ｃ】
2009011413.tif 000108
【図４】
2009011413.tif 000109
【図５】
2009011413.tif 000110
【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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