(57)【要約】  抑肝散について、より高い品質保証を可能とする、試験管内試験によるバイオアッセイ系を見出すことを目的とし、チアミンが欠乏した状態で培養されるアストログリア細胞に、抑肝散を含有する被検試料を添加し、培養アストログリア細胞のグルタミン酸もしくはニュートラルレッドの取り込み量から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアミンが欠乏した状態で培養されるアストログリア細胞に、抑肝散を含有する被検試料を添加し、培養アストログリア細胞のグルタミン酸もしくはニュートラルレッドの取り込み量から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法。
【請求項２】
被検試料を添加し、所定時間培養後に、グルタミン酸またはニュートラルレッドを添加することを特徴とする請求項第１項記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
【請求項３】
抑肝散を含有する被検試料と同時に、複数の既知量の抑肝散を含む試料についても抑肝散の薬理活性価を評価し、これから被検試料中の抑肝散の薬理活性を定量する請求項第１項または第２項記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
【請求項４】
チアミンが欠乏した状態で培養されるアストログリア細胞に、抑肝散を含有する被検試料を添加し、添加後の培養アストログリア細胞のミトコンドリア代謝活性から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法。
【請求項５】
抑肝散を含有する被験試料を添加したチアミン欠乏培地中で培養したアストログリア細胞のミトコンドリア代謝活性と、抑肝散非添加チアミン欠乏培地中で培養したアストログリア細胞のミトコンドリア代謝活性を比較する請求項第４項記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抑肝散のアッセイ方法に関し、更に詳細には、培養アストログリア細胞を用い、漢方製剤である抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を定量的に評価しうるアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方薬は、生薬をブレンドした医薬品であり、その活性成分が全て特定されているわけではない。また、単一の活性成分のみで効果を発揮するわけではなく、複合的に作用するものであるため、その品質を保証するには、漢方薬全体として評価をすることができる測定方法が必要であるとされている（特許文献１、特許文献２）。【０００３】
この測定方法中には、個別の成分を測定し、それらを総合的に評価する方法と、生物材料を用いて生理活性を評価するバイオアッセイがある。そしてバイオアッセイには、生体内（in  vivo）試験と、試験管内（in  vitro）試験があるが、生体内試験の系は、試験施設、試験動物、処理能力等の点で種々の制約があり、漢方薬の品質評価に用いるには困難が伴っていた。【０００４】
一方、試験管内試験の系では、特殊な施設を必要とせず、安定した試験結果が短期間に得られるため、この系でバイオアッセイ法を確立することが求められており、実際ミオスタチンについては、バイオアッセイ法が報告されている（特許文献３）。しかし、それ自身が複数の有効成分を含む生薬を組み合わせた漢方薬についは、常に適切なバイオアッセイ系が見出されているというものではなく、それらの確立が待たれている。【０００５】
例えば、漢方製剤である抑肝散は、一般的には下の組成のものであるが、このものについても適切なバイオアッセイ系は見出されておらず、より高い品質保証を行うためには、その開発が求められている。【０００６】
【表１】
2009008266.tif 000003
【特許文献１】特表２０００−５１２６２１
【特許文献２】特表２００１−５２１８７６
【特許文献３】特表２００５−５２０４８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、抑肝散について、より高い品質保証を可能とする試験管内試験によるバイオアッセイ系を見出すことが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、抑肝散の作用に関し鋭意検討を行っていたところ、このものはアストログリア細胞のチアミン欠乏によるグルタミン酸およびニュートラルレッドの取り込み低下を改善することができ、しかもその改善程度は抑肝散の用量に依存することを知った。また、上記の取り込み低下は、ミトコンドリアの代謝活性とも関連があることを知った。そして、これらの知見を応用すれば、抑肝散のバイオアッセイ法が構築できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち本発明は、チアミンが欠乏した状態で培養されるアストログリア細胞に、抑肝散を含有する被検試料を添加し、培養アストログリア細胞のグルタミン酸もしくはニュートラルレッドの取り込み量から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法である。【００１０】
また本発明は、チアミンが欠乏した状態で培養されるアストログリア細胞に、抑肝散を含有する被検試料を添加し、培養アストログリア細胞のミトコンドリア代謝活性から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のバイオアッセイ法によれば、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、試験管内試験により、簡単かつ安定に抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を求めることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の抑肝散のバイオアッセイ法は、チアミンが欠乏した状態で培養されるアストログリア細胞を用い、これに抑肝散を含有する被検試料を添加し、添加後の培養アストログリア細胞のグルタミン酸もしくはニュートラルレッドの取り込み量またはミトコンドリア代謝活性から抑肝散の薬理活性値を評価するというものである。【００１３】
本発明において使用される、チアミンが欠乏した状態で培養されるアストログリア細胞（以下、「チアミン欠乏アストログリア細胞」または「Ｔ欠乏アストログリア」ということがある）は、例えば、Juurlink  &  Hertzの方法（Juurlink  BJH,  Hertz  L  (1992)  Astrocytes.  Boulton  BA,  Baker  GB,  Waltz  W  (eds).  In:Neuromethods,  page  269-321,  The  Humana  Press  Inc.  Totowa,  NJ）により得られたアストログリア細胞を、一定期間、例えば、７日間ないし１０日間チアミンを含有しない培地で培養することにより作製される。【００１４】
このようにして調製されたチアミン欠乏アストログリア細胞は、トランスポーター機能が低下し、また、膜機能障害が生じてしまい、正常なアストログリア細胞に比べ、グルタミン酸等の取り込み量が低下したものとなる。【００１５】
本発明のバイオアッセイ法の一つの態様は、抑肝散を含む被検試料を含有する培地中、チアミンが欠乏した状態でアストログリア細胞を培養し、その後グルタミン酸もしくはニュートラルレッドを添加し、所定時間培養した後のグルタミン酸もしくはニュートラルレッドの量を測定するものである。グルタミン酸の場合の所定時間は、１から７時間、好ましくは５時間であり、ニュートラルレッドの場合は、１から５時間、好ましくは２時間である。【００１６】
そして、これらの量から、添加した被検試料中の、一般には抑肝散の量として認識される薬理活性価を定量することが可能となる。培養後の、グルタミン酸濃度またはニュートラルレッドの量は、吸光検出によって測定することが好ましい。この場合グルタミン酸濃度は、細胞中に取り込まれた残りの培養液中のグルタミン酸量であり、また、ニュートラルレッドの量は細胞に取り込まれたニュートラルレッドの量である。【００１７】
上記測定に当たっては、一般的には、既知濃度の抑肝散を含む試料を同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被検試料中の抑肝散の薬理活性価を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、既知濃度の抑肝散を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。【００１８】
また、本発明のバイオアッセイ法の別の態様は、抑肝散を含有する被検試料を含有する培地中で、チアミンが欠乏した状態で培養されたアストログリア細胞を培養し、所定時間培養後のアストログリア細胞のミトコンドリア代謝活性を測定し、これから抑肝散の薬理活性価を評価する方法である。【００１９】
この方法の一つの態様としては、チアミン欠乏培地中に抑肝散を含有する被験試料を添加した培地で培養したアストログリア細胞のミトコンドリア代謝活性を、抑肝散を含有する試験試料を添加しない、チアミン欠乏培地で培養したアストログリア細胞のミトコンドリア代謝活性と比較し、これから試験試料中の抑肝散の薬理活性を評価する方法が挙げられる。【００２０】
これらの方法において、ミトコンドリア代謝活性は、例えば、３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）還元により測定できる。すなわち、ＭＴＴから産生されるホルマザンを測定することによりミトコンドリアの代謝活性を測定できる。もちろん、ミトコンドリア代謝活性が測定できる方法であれば他の公知方法を用いても良いことはいうまでもない。【００２１】
この測定においても、一般的には、既知濃度の抑肝散を含む試料を同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被検試料中の抑肝散の薬理活性価を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、既知濃度の抑肝散を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。【００２２】
以上のようにして、被検試料中の抑肝散の薬理活性価を評価することができるが、この作用機序は、直接抑肝散の作用に基づくものである。すなわち、本発明者らの研究により、抑肝散は、アストログリア細胞の膜およびグルタミン酸トランスポーター機能を改善することが見出された。そして、このように抑肝散が膜およびトランスポーター機能を改善することから逆に、膜やトランスポーター機能が低下しているチアミン欠乏アストログリア細胞を利用することにより、抑肝散の薬理活性価を評価することが可能となったのである。【００２３】
また、ミトコンドリアの代謝活性は、グルタミン酸やニュートラルレッドの取り込みのメカニズムに関連するものと解されており、これを用いても抑肝散の薬理活性価を評価することが可能となる。すなわち、アストログリア細胞がグルタミン酸等を取り込む際には、エネルギーが必要であり、そのエネルギーはミトコンドリアが産生するため、ミトコンドリアの活性が下がるとグルタミン酸等の取り込み能も低下するという関係にあるのである。【００２４】
更に、本発明のバイオアッセイ法で、抑肝散として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を、同一条件で薬理活性価を評価し、基準製剤と被検製剤を比較することにより、製剤の品質同等性を評価することができる。【００２５】
更にまた、複数の製剤ロットについて本発明のバイオアッセイ法で薬理活性価の評価を行いその平均等から導き出される上下限の範囲に対し、被検試料の薬理活性価がその範囲に該当するかどうかにより品質同等性を評価することもできる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。【００２７】
実  施  例  １
グルタミン酸の取り込み試験：
（１）アストログリア細胞の培養
アストログリア細胞は、Juurlink  &  Hertzの方法に従って培養した。すなわち、新生仔ラット（生後１日目）から大脳皮質を摘出し、１００μｍのメッシュを用い、機械的に細胞を解離した。解離した細胞を、レンズクリーニングペーパーでろ過し、残渣を取り除いた。得られた細胞を１,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心で３回洗浄し、１０％馬血清を含むＤＭＥＭ培地（増殖培地）に浮遊させ、５０,０００細胞／ｃｍ２（培養面積比）でフラスコに播種した。増殖培地で１日間培養した後に、１０％透析ウマ血清を含むソルビトール含有（グルコース不含）ＤＭＥＭ培地で２週間選択培養した。これを増殖培地に戻し、培養アストログリア細胞を得た。【００２８】
（２）上記のようにして得た培養アストログリア細胞を、９６穴プレートのそれぞれの穴に、２０,０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１週間の前培養を行った。その後、チアミン欠乏ＤＭＥＭ培地で７日間培養し、チアミン欠乏培養アストログリア細胞を得た。また、チアミン含有ＤＭＥＭ培地で７日間培養し、正常培養アストログリア細胞を得た。いずれの細胞も培養に際し５％の馬血清を添加し、試験前日に無血清培地に置換した。なお、抑肝散（ＴＪ−５４；株式会社ツムラ製）（以下、「ＴＪ−５４」という）を添加しチアミン欠乏ＤＭＥＭ培地で７日間培養した細胞をＴＪ−５４添加チアミン欠乏培養アストログリア細胞とした。【００２９】
（３）グルタミン酸の取り込み能は、以下のようにして試験した。まず、（２）で得た正常アストログリア細胞、チアミン欠乏培養アストログリア細胞およびＴＪ−５４添加チアミン欠乏培養アストログリア細胞に、それぞれ、グルタミン酸１００μＭ加無血清培地を添加し、正常コントロール群、チアミン欠乏群およびＴＪ−５４群とした。【００３０】
上記各群から、グルタミン酸添加５時間後に培養上清を回収し、その上清中のグルタミン酸濃度を測定することでグルタミン酸の取り込み能を評価した。培地中のグルタミン酸濃度は、Abe  Kらの方法（Abe  K,  Abe  Y,Saito  H.  (2000)  Evaluation  of  L-glutamate  clearance  capacity  of  cultured  rat  cortical  astrocytes.  Biol  Pharm  Bull.  23:  204-207）に従い、測定する培養上製５０μｌに反応溶液５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、停止液１００μｌで反応を停止させ、測定波長５４０ｎｍ（参照波長６９０ｎｍ）で吸光度を測定することにより行った。この結果を図１に示す。なおこの図には、グルタミン酸トランスポーター阻害剤であるＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパルチックアシッド（DL-threo-β-Hydroxyaspartic  acid；ＴＢＨＡ）を１００μＭと、ＴＪ−５４を５００μｇ／ｍｌとをグルタミン酸１００μＭ加無血清培地に加えて調製した培地を用いて、チアミン欠乏培養アストログリア細胞のグルタミン酸の取り込み能を測定した結果（比較群）も併せて示した。【００３１】
この結果から明らかなように、チアミン欠乏培養アストログリア細胞においてＴＪ−５４が１００〜７００μｇ／ｍｌの範囲で容量依存的にグルタミン酸の取り込みを増加させることが示された。また、ＴＪ−５４（５００μｇ）の作用はＴＢＨＡにより拮抗したことから、ＴＪ−５４のグルタミン酸取り込み改善作用はグルタミン酸トランスポーターによって行われていることが示唆された。ＴＪ−５４の取り込み増加（改善）作用を図２に検量線として示す。【００３２】
実  施  例  ２
ニュートラルレッドの取り込み試験：
実施例１の（１）および（２）で調製した正常培養アストログリア細胞、チアミンＴ欠乏培養アストログリア細胞およびＴＪ−５４添加チアミンＴ欠乏培養アストログリア細胞を用い、ニュートラルレッドの取り込み試験を行った。なお試験前日の無血清培地への置換は行わなかった。【００３３】
具体的には、９６穴プレート中の培地１００μｌに対し、１５０μｇ／ｍｌニュートラルレッド溶液１００μｌを加え２時間培養する。次いで、培養液を除き、洗浄・固定液２００μｌを加え１分間放置する。更に、洗浄・固定液を除き、抽出溶媒１００μｌを加え２０分間放置し、細胞中に取り込まれたニュートラルレッドを抽出する。その後、プレートを攪拌し、５４０ｎｍで吸光度を測定することにより、ニュートラルレッドの取り込み量を定量した。この結果を図３に示す。【００３４】
この結果から明らかなように、ＴＪ−５４が１０〜５００μｇ／ｍｌの範囲で容量依存的にニュートラルレッドの取り込みが多くなることが示された。これを図４に検量線として示す。【００３５】
実  施  例  ３
ミトコンドリアの代謝活性測定試験：
（１）実施例１の（１）および（２）で調製した正常培養アストログリア細胞、チアミンＴ欠乏培養アストログリア細胞およびＴＪ−５４添加チアミンＴ欠乏培養アストログリア細胞を用い、ミトコンドリアの代謝活性を測定した。なお試験前日の無血清培地への置換は行わなかった。【００３６】
ＴＪ−５４添加後７日目に、ＭＴＴを用いたミトコンドリア代謝活性を、下記方法により測定した。この結果を図５に示す。【００３７】
（  ＭＴＴによるミトコンドリアの代謝活性測定法  ）
９６穴プレート中の培地１００μＬに対し、２０μＬのＭＴＴ液（リン酸緩衝溶液中、５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で５時間培養した。１００μｌの停止液（１０％ＳＤＳの０．０１Ｎ塩酸溶液）を添加し、反応を停止させた。反応によりMTTから生成されたホルマザンの量は翌日（一晩放置後）、吸光光度計（測定波長：５７０ｎｍ、参照波長：６９０ｎｍ）を用いて測定した。【００３８】
図５に示すように、アストログリア細胞のＭＴＴ活性は、チアミン不含培地により有意に低下した。これに対し、ＴＪ−５４は、２５０μｇ／ｍｌ以上の濃度で、容量依存的にチアミン不含培地によるＭＴＴ活性の低下を有意に改善した。これを図６に検量線として示す。【００３９】
これらの結果から、ＴＪ−５４を含有する試料を、チアミン不含培地で培養されているアストログリア細胞に作用させ、そのミトコンドリア代謝活性の改善作用を調べることにより、ＴＪ−５４の薬理活性価が測定できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、試験管内試験により、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、簡単かつ安定に抑肝散の薬理活性価を求めることが可能である。【００４１】
従って、従来の含有される一定成分を分析する方法に比べ、抑肝散をより高い程度で品質保証することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】グルタミン酸の取り込み能を評価した結果を示す図面である。図中、Ｔ（＋）は、正常な培養アストログリア細胞を、Ｔ（−）は、チアミン欠乏培養アストログリア細胞を意味する。
【図２】上記図１の結果から作成した検量線である。
【図３】ニュートラルレッドの取り込み能を評価した結果を示す図面である。図中、Ｔ（＋）およびＴ（−）は、図１と同じである。
【図４】上記図３の結果から作成した検量線である。
【図５】ミトコンドリア代謝活性を評価した結果を示す図面である。図中、Ｔ（＋）およびＴ（−）は、図１と同じである。
【図６】上記図５の結果から作成した検量線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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