(57)【要約】本発明は、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用試薬を提供する。  本発明の試薬は、例えば、下記式（Ｉ）−１：2008062911.tif 000041  （式（１）−１中、式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す（但し、細胞への遺伝子導入用試薬の場合は、ｍ１及びｍ２がいずれも１５である場合は除く。）。）で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用試薬である。
2008062911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）−１：
2008062911.tif 000038
（式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す。）
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質導入用試薬。
【請求項２】
次式（Ｉ）−１：
2008062911.tif 000039
（式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す（但し、ｍ１及びｍ２がいずれも１５である場合は除く。）。）
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞への遺伝子導入用試薬。
【請求項３】
組成物が、さらにジアシルホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子からなる群から選ばれる少なくとも１つを含むものである、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
ジアシルホスファチジルコリンのアシル鎖の一部又は全部がオレオイル基である、請求項３記載の試薬。
【請求項５】
組成物が、水性媒体中に分散してなる分子集合体である、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項６】
分子集合体は、二分子膜小胞体構造を形成し、内水相にタンパク質又は遺伝子を含むものである、請求項５記載の試薬。
【請求項７】
組成物が、乾燥粉末品である、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項８】
乾燥粉末品は、水性媒体中に分散したときにタンパク質又は遺伝子を包含した二分子膜小胞体構造を形成し得るものである、請求項７記載の試薬。
【請求項９】
細胞が、生体組織の一部を構成しているもの、又は血漿、血清若しくは血液、若しくはそれらの成分の一部を含む培地にて培養された細胞である、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の試薬を含む、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用キット。
【請求項１１】
次式（Ｉ）−２：
2008062911.tif 000040
（式中、Ｍ２は、−（ＣＨ２）ｋ’又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ’−（ｋ’は１〜１４の整数である。）であり、ｐ１及びｐ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す。）
で示される、カチオン性アミノ酸型脂質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質導入用試薬及び遺伝子導入用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工の二分子膜からなる小胞体又はリポソームに有用物質を内包させる技術は、医薬品、香粧品、食品、染料などの分野で盛んに研究されている。
リポソームの膜構成脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びコレステロールなどの膜構成脂質と、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリンなどの負電荷リン脂質との混合脂質が広く用いられている。
近年では、カチオン性脂質単独またはそれを含むリポソームを用いて、遺伝子と複合体を形成することにより、細胞内に遺伝子を導入する研究が行われている（Ｈｏｎｇ  Ｓｕｎｇ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ−ｔｒａｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉａｍｉｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉｅｄ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｃｈａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００４，１５，１０９５）。既存の遺伝子導入用カチオン性脂質、例えば１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｙｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ（ＤＯＳＰＡ）、ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ（ＤＯＴＭＡ）、ｄｉｄｏｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＤＤＡＢ）、リポフェクトアミンなどは、脂質成分の親水部に正電荷を付与させるために４級アミンを有するものがほとんどである。これらカチオン性脂質を用いた遺伝子導入系においては、ポリエチレンイミンなどのカチオン性高分子を用いた遺伝子導入キャリアとは異なり、ＤＮＡとの複合体がエンドソームから離脱するプロトンスポンジ効果を有さない。そのため、既存の遺伝子導入用カチオン性脂質には通常、膜融合性脂質である１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が混合されている。カチオン性脂質によりＤＮＡを濃縮安定化させる作用を有し、ＤＯＰＥによりエンドソーム膜との融合を促すことで、このカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体がエンドソーム膜外に放出される。これにより、カチオン性脂質により濃縮安定化されたＤＮＡの核内への導入が達成される（Ｌ．Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，２７，３９１７；特表平  １１−５０４６３１号公報）。
しかし、上記遺伝子導入用カチオン性脂質の合成はその化学構造が複雑であるために容易に合成できず、これらの遺伝子導入試薬の価格が高いのが現状である。また、４級アミンを有する遺伝子導入用脂質はそのカチオン性が強力なため、血清成分との凝集を引き起こしやすく、血清存在下での遺伝子導入効率を著しく低下させる要因になる。さらに、これらのカチオン性脂質は細胞膜表面のリン脂質にも強く相互作用するため、細胞毒性も高い。
一方、タンパク質を外部から細胞内に導入する場合も運搬体が必要であり、その運搬体として、脂質系（Ｐｒｏｆｅｃｔ  Ｐ−１、ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ、ＳＡＩＮＴ−ＭＩＸ等）やペプチド系（Ｐｒｏｆｅｃｔ  Ｐ−２、Ｃｈａｒｉｏｔ等）などの試薬がすでに市販されている。しかし、これらの運搬体のほとんどは、単純にタンパク質と混合して複合体を形成させ、細胞に添加して使用するため、複合体の大きさの制御ができないことが多い。また、特に脂質系運搬体については、細胞培養液に血清タンパク質が含まれている場合には目的タンパク質の導入効率が大幅に低下するため、血清不含有培地での実験を行なう必要がある。さらに、過剰の脂質運搬体が遊離して存在すると、顕著な細胞毒性が現れることがある。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、タンパク質又は遺伝子を細胞に効率よく導入することができ、容易に且つ安価で合成可能であり、生体適合性が高い（すなわち低毒性の）、タンパク質又は遺伝子導入用試薬を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、カチオン性アミノ酸型脂質により構成される二分子膜小胞体のような分子集合体にタンパク質や遺伝子を封入し、細胞へのタンパク質導入や遺伝子導入の試験を行なうと、当該タンパク質又は遺伝子が効率よく細胞に導入され得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示すカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用試薬を提供するものである。さらに、本発明は、当該試薬を含む、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用キットを提供する。
一般式（Ｉ）：
2008062911.tif 000003
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−及び−ＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基であり、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは０〜１４の整数である。）であり、ｎは１〜４の整数である。）で示されるカチオン性アミノ酸型脂質。
カチオン性官能基としては、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基、及びこれらの誘導体からなる群から選択されるものが挙げられる。
式（Ｉ）において、Ｒ１は、式（ａ）で表されるものを例示することができる。
2008062911.tif 000004
また、式（Ｉ）において、Ａ１及びＡ２はいずれも−ＣＯＯ−であることが好ましい。さらに、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソプレノイド基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、及びメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、主鎖の炭素数が１２〜３０の飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基であることが好ましく、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、炭素数１２〜２２、好ましくは炭素数１４〜１８のアルキル鎖である。また、式（Ｉ）において、ｎは２であることが好ましい。
さらに、本発明においては、式（Ｉ）−１で表されるカチオン性アミノ酸型脂質を使用することができる。
2008062911.tif 000005
（式（Ｉ）−１中、式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４（好ましくは０〜１１）の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す（但し、細胞への遺伝子導入用試薬、及び当該試薬を含む細胞への遺伝子導入用キットを提供する場合は、ｍ１及びｍ２がいずれも１５である場合は除く。）。）
また、式（Ｉ）−１で表されるカチオン性アミノ酸型脂質としては、具体例としては、式（Ｉ）−２で表されるカチオン性アミノ酸型脂質が挙げられる。
2008062911.tif 000006
（式（Ｉ）−２中、ｍ１及びｍ２は、式（Ｉ）−１の場合と同様である。）
本発明において、カチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物には、ジアシルホスファチジルコリンを含めることができる。この場合、ジアシルホスファチジルコリンのアシル鎖の一部又は全部がオレオイル基であることが好ましい。具体的には、上記組成物には１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含めることができる。
上記組成物には、さらにコレステロールを含めることができ、また、ポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子を含めることも可能である。
上記組成物は水性媒体中に分散してなる分子集合体であっても、乾燥粉末品の形態であってもよい。分子集合体は、二分子膜小胞体構造を形成し、内水相にタンパク質又は遺伝子を含むものである。乾燥粉末品の場合は、水性媒体中に分散したときにタンパク質又は遺伝子を包含した二分子膜小胞体構造を形成し得る。ここで、タンパク質又は遺伝子導入の対象となる細胞としては、例えば血漿、血清若しくは血液、又はそれらの成分の一部を含む培地にて培養された細胞が挙げられる。
さらに、本発明は、−般式（Ｉ’）：
2008062911.tif 000007
（式（Ｉ’）中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−及び−ＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基であり、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ２は、−（ＣＨ２）ｋ’−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ’−（ここで、ｋ’は１〜１４の整数である。）であり、ｎは１〜４の整数である。）
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質である。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３並びにＡ１及びＡ２は、前記と同様である。また、ｎは２であることが好ましい。
さらに、本発明は、次式（Ｉ）−３で示されるカチオン性アミノ酸型脂質である。
2008062911.tif 000008
（式中、Ｍ２は、−（ＣＨ２）ｋ’−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ’−（ｋ’は１〜１４（好ましくは１〜１１）の整数である。）であり、ｐ１及びｐ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す。）
また、式（Ｉ）−３で表されるカチオン性アミノ酸型脂質としては、具体例としては、式（Ｉ）−４及び式（Ｉ）−５で表されるカチオン性アミノ酸型脂質が挙げられる。
2008062911.tif 000009
（式（Ｉ）−４中、ｐ１及びｐ２は、式（Ｉ）−３の場合と同様である。）
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＣＯＳ−１細胞に導入されたリポソーム／Ｄｍｃ１複合体の共焦点レーザ顕微鏡写真である。
図２は、細胞内導入Ｄｍｃ１の局在部位をウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す図である。
図３は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に導入されたリポソーム／Ｄｍｃ１複合体の共焦点レーザ顕微鏡写真である。
図４は、ＣＯＳ−１細胞に導入されたリポソーム／ｒＨＳＡ複合体の共焦点レーザ顕微鏡写真である。
図５は、ＣＯＳ−１細胞に導入されたリポソームの共焦点レーザ顕微鏡写真である。
図６は、ＣＯＳ−１細胞に導入されたリポソーム／ｒＨＳＡ複合体の共焦点レーザ顕微鏡写真である。
図７は、カチオン性リポソームの生体膜への融合度の測定結果を示すグラフである。
図８は、ｐＤＮＡ内包リポソームのＴＥＭによる観察像を示す図である。
図９は、カチオン性リポソームへのｐＤＮＡの内包をゲル電気泳動により確認した結果を示す図である。
図１０は、ｐＤＮＡ内包リポソームの遺伝子発現効率の算出結果を示すグラフである。
図１１は、カチオン性リポソームの遺伝子運搬能評価としての、ルシフェラーゼアッセイによる発現量の算出結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−３１７８４１号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質を構成成分とする分子集合体をタンパク質又は遺伝子導入用試薬として利用するものである。
本発明者は、細胞表面への吸着性や細胞毒性の低い成分組成からなるリポソームにタンパク質又は遺伝子を内包させて複合体を安定化させ、Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法により粒径を調製したリポソームによるタンパク質又は遺伝子運搬体システムを構築した。タンパク質又は遺伝子をリポソームに内包させて粒径が揃ったナノ粒子とすることにより、細胞への取り込み能を向上させ、細胞内のプロテアーゼによる内包タンパク質の分解やヌクレアーゼによる内包遺伝子の分解を阻害することが可能となる。
以下、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質及びそれを含む組成物について詳細に説明する。
１．カチオン性アミノ酸型脂質
１−１）カチオン性アミノ酸型脂質
本発明において使用されるカチオン性アミノ酸型脂質は、一般式（Ｉ）：
2008062911.tif 000010
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−及びＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基であり、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４の整数である。）であり、ｎは、１〜４の整数である。）
で示されることを特徴としている。
式（Ｉ）中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基である。ここで「カチオン性官能基」とは、水溶液中でカチオン性を示す基をいい、このような性質を有するものであれば特に限定されない。例えば、カチオン性官能基としては、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基、及びこれらの誘導体が挙げられる。「誘導体」としては、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾール基に含まれる水素原子が、低級（例えば炭素数１〜６）アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル等）、アミノアルキル基（アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど）や対応するオリゴアミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴオキシアルキル基（オリゴオキシメチル基、オリゴオキシエチル基、オリゴオキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物が挙げられる。
Ｒ１は、カチオン性官能基を少なくとも一つ有していればよいが、カチオン性官能基を二つ以上有していることが好ましい。特に、カチオン性官能基を二つ以上有している化合物は、タンパク質、あるいはポリアニオンであるＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸と安定な複合体を形成できる点で、あるいは細胞表面の負電荷が密集している部分に安定に結合し細胞内移行性が高まる点で好ましい。カチオン性置換基を二つ以上有している場合は、カチオン性置換基の組み合わせは特に限定されない。
これらの中でも、Ｒ１としては、次式（ａ）で表される基であることが好ましい。
2008062911.tif 000011
次に、式（Ｉ）中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基である。「鎖状炭化水素基」は、結合基Ａ１またはＡ２に共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に限定されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよいが、直鎖が好ましい。鎖状炭化水素基の主鎖の炭素数は、１２〜３０が好ましく、１２〜２２がより好ましく、１４〜１８がさらに好ましい。このような鎖状炭化水素基は飽和又は不飽和であってもよいが、鎖状炭化水素基に二重結合または三重結合などの不飽和結合がある場合、その数は１〜４であることが好ましい。鎖状炭化水素基の主鎖としては、アルキル鎖、アルケニル鎖またはアルキニル鎖が好ましく、アルキル鎖がより好ましい。
また、鎖状炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソプレノイド基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、及びメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。ここで、アルキル基としては、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。アルケニル基としては、炭素数１〜６のアルケニル基が好ましく、例えば、ビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、２−ブテニル等が挙げられる。アルキニル基としては、炭素数１〜６のアルキニル基が好ましく、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
これらの鎖状炭化水素基の中でも、Ｒ２及びＲ３としては、置換基を有していてもよい、炭素数１２〜２２のアルキル鎖が好ましい。
また、式（Ｉ）中、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、―ＣＯＮＨ−及びＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基である。Ａ１及びＡ２の組み合わせは特に限定されるものではないが、Ａ１及びＡ２が、いずれも、−ＣＯＯ−であることが好ましい。
式（Ｉ）中、ｎは、１〜４の整数である。ｎが１〜４であるときは、二分子膜中で式（Ｉ）の化合物の鎖状炭化水素基を膜平面に対して垂直に配向させることができる点で好ましい。また、ｎが１〜４であるときは、水溶液中でカチオン性アミノ酸型脂質が集合して形成する二分子膜の親−疎水界面が安定であり小胞体構造を形成しやすいため、分子集合体の構成脂質成分として用いることにより、小胞体構造ならびに分散状態を安定化させる効果が期待できる。特に、ｎが２のときは、上述の効果に加えて、グルタミン酸やその誘導体を原料にできるため、低価格や低毒性の点でより好ましい。
具体的には、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、下記式（Ｉ）−１で表される化合物であることが好ましい。
2008062911.tif 000012
（式（１）−１中、式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４（好ましくは０〜１１）の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す（但し、細胞への遺伝子導入用試薬、及び当該試薬を含む細胞への遺伝子導入用キットを提供する場合は、ｍ１及びｍ２がいずれも１５である場合は除く。）。）
（式（Ｉ）−１中、式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４（好ましくは０〜１１、より好ましくは１〜１１、さらに好ましくは３〜５））の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す（但し、細胞への遺伝子導入用試薬、及び当該試薬を含む細胞への遺伝子導入用キット（後述する）を提供する場合は、ｍ１及びｍ２がいずれも１５である場合は除く。）。）
また、式（Ｉ）−１で表されるカチオン性アミノ酸型脂質としては、具体例としては、式（Ｉ）−２で表されるカチオン性アミノ酸型脂質が挙げられる。
2008062911.tif 000013
（式（Ｉ）−２中、ｍ１及びｍ２は、式（Ｉ）−１の場合と同様である。）
本発明においては、式（Ｉ）で示される化合物のアミノ酸由来のカチオン性官能基部分にスペーサー（Ｍ及びＬ）を結合させることができる。式（Ｉ）で示される化合物をタンパク質又は遺伝子導入用試薬として使用するときは、スペーサーＭは、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−で示され、ｋは０〜１４の整数である。また、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−である。これらのスペーサーを導入することにより、ζ電位（ゼータ電位）を調整することが可能である。
本発明においては、スペーサーＭ２及び／又はＬを導入した次式（Ｉ’）で示される化合物（カチオン性アミノ酸型脂質）も提供する。
2008062911.tif 000014
（式（Ｉ’）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、Ａ１及びＡ２、Ｌ並びにｎは前記と同様であるが、Ｍ２は、−（ＣＨ２）ｋ’−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ’−（ｋ’は１〜１４の整数である。）である。）
スペーサーを導入した脂質としては、下記式（Ｉ）−３で示される化合物であることが好ましい。
2008062911.tif 000015
（式（Ｉ）−３中、Ｍ２は、−（ＣＨ２）ｋ’−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ’−（ｋ’は１〜１４（好ましくは１〜１１、より好ましくは３〜５）の整数である。）であり、ｐ１及びｐ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す。）
また、式（Ｉ）−３で表されるカチオン性アミノ酸型脂質としては、具体例としては、式（Ｉ）−４で表されるカチオン性アミノ酸型脂質が挙げられる。
2008062911.tif 000016
（式（Ｉ）−４中、ｐ１及びｐ２は、式（１）−３の場合と同様である。）
また、本発明において、スペーサーを導入した脂質としては、下記式（Ｉ）−５で示されるカチオン性アミノ酸型脂質も好ましく挙げられる。
2008062911.tif 000017
（式（Ｉ）−５中、Ｌ１は、単結合、又は−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ３は、−（ＣＨ２）ｉ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−又は、−ＣＨｉ’−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｉ−（ＣＨ２）ｉ’’−（ｉは０〜１４（好ましくは０〜１１、より好ましくは１〜１１、さらに好ましくは３〜５）の整数、ｉ’は１〜１０（好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３）の整数、ｉ’’は１〜１０（好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３）の整数である。）であり、Ｌ２は、単結合、又は−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ４は、−（ＣＨ２）ｊ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｊ−又は、−ＣＨｊ’−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｊ−（ＣＨ２）ｊ’’−（ｊは０〜１４（好ましくは０〜１１、より好ましくは１〜１１、さらに好ましくは３〜５）の整数、ｊ’は１〜１０（好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３）の整数、ｊ’’は１〜１０（好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３）の整数であり、ｐ１及びｐ２は、式（Ｉ）−３の場合と同様である。）
上記式（Ｉ）−５のカチオン性アミノ酸型脂質としては、例えば、後述する実施例中に記載の化合物９で示されるものが好ましい。
１−２）カチオン性アミノ酸型脂質の製造方法
このような本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、公知の反応を組み合わせることによって極めて簡便に製造することができる。例えば、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、次式：
2008062911.tif 000018
（式中、Ａ１１及びＡ１２は、それぞれ独立して、カルボキシル基、水酸基、またはアミノ基であり、ｎは、１〜４の整数である。）
を有する三官能性コア化合物に、鎖状炭化水素基の供給源及びカチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源を順次反応させることによって製造することができる。
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質を製造するための代表的な合成経路を示すと、以下の通りである。
まず、三官能性コア化合物のＡ１１やＡ１２部に、鎖状炭化水素基の供給源を反応させる。この際、必要に応じて、カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源と反応させる官能基を、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等の保護基で保護しておくことが好ましい。
次いで、得られた化合物のアミノ基にカチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源を反応させる。カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源は、予めアミノ基をｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などにより保護し、反応させるカルボキシル基はスクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。反応は、第三級アミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。
スペーサーを導入する場合は、鎖状炭化水素基を導入した化合物にカチオン性官能基とカルボキシル基を有する炭化水素基の供給源を反応させる。カチオン性官能基とカルボキシル基を有する炭化水素基には、片末端がｔｅｒｔ−ブトキシ基などにより保護されたアミノ基を有し、もう一方の末端にカルボキシル基を有する化合物が望ましい。炭化水素基部位はオリゴオキシエチレンとしてもよい。
上記反応はいずれも、室温で行うことができる。また、反応は、加圧、減圧または大気圧いずれの圧力下でも行うことができるが、操作が簡便であることから、大気圧雰囲気下で行うことが望ましい。
反応終了後は、トリフルオロ酢酸などの酸で処理して脱保護し、常法により精製してカチオン性アミノ酸型脂質を得ることができる。なお、反応の終点は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、質量分析装置、薄層クロマトグラフィー、核磁気共鳴スペクトル、及び赤外吸収スペクトル等によって確認できる。
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質の製造方法は、上記方法に限定されるものではない。例えば、三官能性コア化合物のアミノ基にカチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源と先に反応させ、次いで、Ａ１１やＡ１２部に鎖状炭化水素基の供給源と反応させることもできる。
以下、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質の合成に用いることができる原料化合物を例示する。
鎖状炭化水素基の供給源としては、三官能性コア化合物と共有結合し得る、アミノ基、水酸基、カルボキシル基などの反応性官能基を有するものであれば特に限定されない。
カルボキシル基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、脂肪酸が挙げられる。例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等であり、それぞれ分岐鎖体も含まれる。また、それらの酸無水物、または酸クロライドも含まれる。
アミノ基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一アミンとして、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ヘプタデシルアミン、オクタデシルアミン、ドコシルアミン、オレイルアミン等が挙げられ、それらの分岐鎖体も含まれる。さらに分岐状のイソプレノイド等のアミンも使用できる。また、アミノ基を有する脂肪族炭化水素基の供給源には、Ｎ−メチル−ドデシルアミン、Ｎ−メチル−テトラデシルアミン、Ｎ−メチル−ヘキサデシルアミン、Ｎ−エチル−ドデシルアミン、Ｎ−エチル−テトラデシルアミン、Ｎ−エチル−ヘキサデシルアミン、Ｎ−プロピル−ドデシルアミン、Ｎ−プロピル−テトラデシルアミン、Ｎ−プロピル−ヘキサデシルアミン、ジオレイルアミン等の第二アミンも含まれ、それらの分岐鎖体も用いられる。
水酸基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一飽和アルコールとしてラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等が挙げられる。その他、１，１−ドデセノール、１−オレイアルコール、リノレニルアルコール等の直鎖第一飽和アルコール、分岐第一飽和アルコール、分岐第一不飽和アルコール、第二飽和アルコールあるいは第二不飽和アルコールが挙げられる。また、これらアルコール類をグリセリンの１，３−位あるいは１，２−位に結合したジアルキルグリセロール、第一飽和アルコール及び第一不飽和アルコールで構成されたジアルキルグリセロールが挙げられる。
その他、鎖状炭化水素基の供給源としては、ステロール類が挙げられる。例えば、コレステロール、コレスタノール、シトステロール及びエルゴステロール等である。
カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源としては、アミノ酸またはその誘導体を使用できる。中でも、リジンまたはこれらの誘導体が好ましい。ここで、アミノ酸の誘導体には、アミノ酸に含まれる水素原子が、低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル等）、アミノアルキル基（アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど）や対応するオリゴアミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴオキシアルキル基（オリゴオキシメチル基、オリゴオキシエチル基、オリゴオキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物が含まれる。
本発明においては、上記脂質単独のほか、さらに１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を混合して脂質との複合体を形成させることができる。これにより、脂質とエンドソーム膜との融合を促すことで、高効率にタンパク質を導入することができる。脂質とＤＯＰＣとの複合体を形成する場合、脂質とＤＯＰＣとの混合比は、例えば１：１〜１０：１、好ましくは３：１〜５：１である。
２．組成物
次に、本発明の試薬として使用される組成物について説明する。本発明において、組成物は水性媒体中に分散してなる分子集合体の形態であってもよく、凍結乾燥や噴霧乾燥等により乾燥させた乾燥品の形態であってもよい。
２−１）分子集合体
本発明において分子集合体は、構成脂質として、上述した本発明のカチオン性アミノ酸型脂質を含むものであれば特に限定されない。そのような分子集合体としては、例えば、高分子集合体、高分子ミセル、エマルジョン、リピドマイクロスフィア、二分子膜小胞体（リポソーム）、ヘキサゴナル構造を有する集合体およびその他のチューブ状やキュービック状の集合体などが挙げられるが、本発明においては、タンパク質又は遺伝子を内包させるためにリポソームなどの小胞体構造を有するものであることが好ましい。本発明のカチオン性アミノ酸型脂質の含有量は特に制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、２０〜１００モル％であることが好ましく、５０〜１００モル％であることがより好ましい。
本発明においては、組成物は、ポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子を含むものであることが好ましい。ポリエチレングリコールの分子量は１，０００〜２０，０００であり、好ましくは２，０００〜６，０００である。
本発明の分子集合体に含まれるその他の構成脂質は、本発明のカチオン性アミノ酸型脂質と分子集合体を形成することができ、分子集合体の構成脂質として一般に使用されるものであれば特に限定されない。例えば、リン脂質、脂肪酸、ステロール類、多種の糖脂質などが挙げられる。
リン脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。本発明において、ジアシルホスファチジルコリンやジアシルホスファチジルエタノールアミンのアシル鎖の一部又は全部がオレオイル基であることが好ましい。これらのリン脂質は、エン（二重結合）、イン（三重結合）、ジエン、ジイン、トリエンなどの不飽和部を含有しても良いし、ビニル基などの重合性基、例えばスチリル基を含有しても良い。リン脂質の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、０〜７０モル％であることが好ましく、０〜５０モル％であることがより好ましい。
リン脂質のアシル鎖を構成する脂肪酸としては、炭素数１２〜２２の飽和または不飽和脂肪酸が用いられる。例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、オクタデカ−２，４−ジエン酸などがある。更には、グリセロール骨格ではなく、３官能性アミノ酸、例えばグルタミン酸やリジン骨格を持つ両イオン性などのアミノ酸型脂質も使用することができる。脂肪酸の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、１〜７０モル％であることが好ましく、５〜３０モル％であることがより好ましい。
また、分子集合体には、脂質小胞体の膜成分としてステロール類を安定化剤として添加してもよい。そのようなステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレン骨格を有する全てのステロイドが挙げられるが、好ましくはコレステロールである。ステロール類の含有量に特に制限はないが、小胞体膜の安定性を考慮すれば、分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、５〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは１５〜４０モル％である。
分子集合体の製造方法は、特に限定されるものではなく、一般に公知の方法を用いることができる。例えば、リポソームの製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などで製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールやエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはラウリルエーテルなどの界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。
分子集合体の粒子径は、上記製造方法の組み合わせによって自在に制御することが可能であるが、分子集合体の粒子径として５０〜２，０００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１００〜５００ｎｍである。
２−２）乾燥品
本発明において使用される乾燥品は、上記脂質又は分子集合体を乾燥させることにより得ることができる。乾燥処理は特に限定されるものではないが、凍結乾燥又は噴霧乾燥であることが好ましい。
凍結乾燥処理は、例えば、上記脂質又は分子集合体を滅菌後、所定量をバイアルに入れて純水、生理食塩水、緩衝液等に分散させ、液体窒素等で脂質分散液を凍結させた後に１５〜３０℃で減圧下に乾燥を行なう。凍結乾燥保護剤としてすくロースやトレハロースなどを脂質分散液に予め溶解させておいても良い。最期にバイアル内部を窒素ガスで置換することにより凍結乾燥品を得ることができる。
噴霧乾燥処理は、例えば溶液又は微粒子懸濁液を熱気流中に一気に噴霧すればよい。これにより、微小粒状乾燥品を得ることができる。噴霧乾燥は、公知のスプレードライヤーを用いて実施することができる。
本発明の乾燥品を使用するには、任意の再溶解液を添加することによって、用時調製すればよい。再溶解液としては、例えば純水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が挙げられる。
３．タンパク質又は遺伝子導入用の試薬及びキット
本発明において、式（Ｉ）で表される化合物を含む組成物は、タンパク質導入試薬として用いることができる。
本発明において細胞内へのタンパク質導入の対象となる「タンパク質」は、任意のペプチド又はポリペプチドを意味し、分子量やアミノ酸配列の長さに限定されるものではない。また、上記タンパク質は単量体であっても多量体であってもよく、さらに、１種類のタンパク質に限定されず複数種類のタンパク質の混合物でもよい。組成物に内包するタンパク質の量は、細胞内に導入するタンパク質の種類や量により適宜設定できるが、タンパク質の変性を防ぎ、あるいはタンパク質を内包した分子集合体の構造、特に、二分子膜小胞体の構造、粒子径、膜安定性や分散安定性に影響を及ぼさないように設定することが好ましい。
また、本発明において細胞内への遺伝子導入の対象となる「遺伝子」は、タンパク質の発現の有無を問わず、任意の核酸又はポリヌクレオチドを意味し、例えばＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またペプチド核酸（ＰＮＡ）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）のような核酸誘導体であってもよい。さらに、当該遺伝子には、適当なプラスミドに組み込んだ組み換えベクターも含まれる。組成物に内包する遺伝子の量は、細胞内に導入する遺伝子の種類や量により適宜設定できるが、核酸の塩基（対）数が小さく、さらに高濃度となるように設定することが好ましい。
このような分子集合体にタンパク質又は遺伝子を内包させる方法は、タンパク質又は遺伝子の種類等に応じて適宜選択すればよい。
内包させるタンパク質の水溶性が高い場合にはこのタンパク質水溶液に凍結乾燥した混合脂質粉末に分散させ、充分に水和後、例えばエクストルージョン法によって内包することができる。更に凍結乾燥法を組み合わせることによって内包効率を高めることができる。内包させるタンパク質の水溶性が低い場合には、ラウリルエーテルなどの界面活性剤の水溶液に、タンパク質と混合脂質を分散させて混合ミセル状態とし、透析や限外濾過によって界面活性剤を除去することによって内包させることができる。内包されなかったタンパク質は、ゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離することができる。
また、内包させる遺伝子がプラスミドなどの高分子量核酸の場合には、例えば、公知の方法により数十μｍサイズの巨大な分子集合体内に内包させたり、又はカチオン性高分子に被覆させて電荷を中和することにより調製することができる。内包させる物質がデコイＤＮＡ（二重鎖ＤＮＡ）やｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどの低分子量核酸の場合には、上記の方法に加え、例えば、分子集合体の形成後に核酸水溶液中で撹拌分散することにより調製することができる。内包されなかったＤＮＡ又はＲＮＡは、ゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離することができる。
本発明のタンパク質導入用試薬の使用量は、細胞１×１０４個あたり０．１〜２００ｐｍｏｌ、好ましくは０．１〜１０ｐｍｏｌ程度の量であるが、従来のタンパク質導入試薬として用いられてきたＰｒｏｆｅｃｔ  １、ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ等の使用量を参考にして適宜設定することができる。この用量により、効率よくタンパク質を導入することができる。
また、本発明の遺伝子導入用試薬の使用量は、細胞１×１０４個あたり０．００１〜２００ｐｍｏｌ、好ましくは０．００１〜１００ｐｍｏｌ、より好ましくは０．１〜１０ｐｍｏｌ程度の量であるが、従来の遺伝子導入試薬として用いられてきたリポフェクトアミン、トランソーム、ＤＯＴＡＰおよびＤＭＲＩＥなどのカチオン性脂質を構成脂質にしたリポソーム試薬等の使用量を参考にして適宜設定することができる。この用量により、従来の遺伝子導入試薬（リポフェクトアミン）に比べて細胞毒性を伴うことなく同程度の導入効率が得られる。
一般的にタンパク質又は遺伝子導入に使用する分子集合体の粒子径は、様々なサイズを用いることが可能であり特に制限はないが、分子集合体試薬の粒子径は、タンパク質又は遺伝子の導入効果や細胞毒性の面から、５０〜２，０００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１００〜５００ｎｍである。
また本発明は、上記試薬を含むタンパク質又は遺伝子導入用キットを提供する。キットには、緩衝液、ｐＨ調整剤、細胞保護液などを単独で、又は適宜組み合わせて含めることができる。必要に応じて、対照として用いられる標準タンパク質や、トランスフェクションの対照として用いられる標準核酸を含んでもよい。このような標準タンパク質としては、例えば、レポーター又はマーカータンパク質（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等）等が挙げられる。また、標準核酸としては、例えば、レポーター又はマーカータンパク質（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等）をコードする核酸が挙げられ、当該核酸は、プラスミドベクターの形態であってもよい。さらに、本発明のキットには、必要に応じて、例えばＤＥＡＥデキストラン等のトランスフェクション増強試薬、及び他の添加剤を含めることが可能である。さらに、本発明のキットには、細胞へのタンパク質又は遺伝子を導入するための使用説明書を含めることができる。キットに含まれる各成分は、例えば、各成分を容器中に封入した包装形態としてもよい。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
カチオン性アミノ酸型脂質の合成
（Ａ）ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４．５６ｇ、２ｓ４ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１００ｍＬ）を８５℃にて沸点還流し、ジンスタークを用いて反応前に水を除去した。反応液にグルタミン酸（２．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）とヘキサデシルアルコール（１０．７ｇ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、１０時間生成水を除去しながら沸点還流した。反応の進行に伴い、懸濁液は徐々に溶解し透明に変化した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃にて再結晶し、ジアシルグルタミン酸誘導体（１）（収率８３％）を白色粉末で得た。
2008062911.tif 000019
ジアシルグルタミン酸誘導体（１）の分析結果は、以下の通りであった。
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝０，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８９（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６２（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．８４（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；２．０８（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；２．４５（ｔ，２Ｈ，ｇｌｕ  γ−ＣＨ２）；３．４５（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ）；４．０６，４．１０（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）．
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：５９５．９；Ｆｏｕｎｄ：５９７．３（ＭＨ）＋．
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたジアシルグルタミン酸誘導体１（１．０ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（２０２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基で保護し、スクシンイミドにより活性化されたリジン（６１７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加し、さらに６時間室温で撹拌した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過して、アミノ基を保護したリジン誘導体をそれぞれ得た。
得られた誘導体にフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を加え、４℃で、２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で４回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、ろ過し、乾燥して、カチオン性アミノ酸型脂質２（収率８０％）を白色粉末として得た。
2008062911.tif 000020
カチオン性アミノ酸型脂質２の分析結果は、以下の通りであった。
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝０，ｅｓｔｅｒ）；１６７３（νＣ＝０，ａｍｉｄｅ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５−１．２９（ｂｒ，４４Ｈ，−ＣＨ２−）；４．５１（ｄ，１Ｈ，−ＣＯ−Ｎ−ＣＨ−）；７．８，８．２（ｂｒ，２Ｈ，−Ｃ−ＮＨ２）．
【実施例２】
【０００７】
Ｄｍｃ１内包カチオン性リポソームを用いたＤｍｃ１細胞核内導入確認
本発明者は、減数分裂期におけるＤＮＡの相同組換え機構に重要な役割を担うＤｍｃ１タンパク質に着目した。ヒト由来のＤｍｃ１は、ｐＩ＝５．６，３７ｋＤａのタンパク質であり、８量体からなるリング構造を取ることが明らかにされている（Ｔ．Ｋｉｎｅｂｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２００４，１４，３６３−３７４．）。減数分裂期以外でも、相同組換えは、二重鎖切断などの重篤な損傷を受けたＤＮＡの修復にも用いられる機構である。このようなＤＮＡ損傷の修復時のエラーなどにより、ＤＮＡに変異が引き起こされ、そのことがガンや遺伝病の原因となることが知られている。本発明者は、減数分裂期細胞においてのみ発現しているＤｍｃ１を、体細胞へ外部から導入することにより、損傷もしくは変異を受けたＤＮＡをＤｍｃ１依存的な相同組換えにより正確に修復して、ガンなどの細胞治療に応用できるものと考えた。そこで本実施例では、Ｄｍｃ１内包カチオン性リポソームを用いて、Ｄｍｃ１が細胞核内に導入されるかどうかの確認試験を行なった。
２．１．  Ｄｍｃ１内包リポソーム調製
２．１．１．  凍結乾燥脂質の調製
混合脂質（リポソーム）として、ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝２．５／２．５／５／０．０３（モル比）を用いた。
まず、混合脂質の各混合比における全成分に、それらが完全に溶ける程度のｔｅｒｔ−ブチルアルコールを加え、６０℃で加熱融解させた。これらを凍結乾燥させ、得られた粉末を混合脂質とした。
リポソームを構成する脂質分子を以下に示す。
2008062911.tif 000021
２．１．２．  リポソーム調製
まず、Ｄｍｃ１を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）にて１８μＭに希釈した。このＤｍｃ１溶液（１８μＭ）中、上記２．１．１．項において調製した混合脂質を、常法である水和法により、室温で３時間攪拌した。脂質とＤｍｃ１との比は７５：１である。撹拌後、エクストルージョン（ＰＶＤＦ  ｆｉｌｔｅｒ：孔径５，０．６５，０．４５×２，０．２２×２μｍ）にて、リポソームの粒径をある程度揃えた。最後に、超遠心分離（１００，０００  ｘ  ｇ，３０分×２）を行い、未内包Ｄｍｃ１を除去後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）にて、分散しＤｍｃ１内包リポソームを調製した。
物性評価として脂質の定量はコリン型リン脂質定量より、内包タンパク質の定量はＨＰＬＣ（２２０ｎｍ）にて行った。また、動的光散乱法（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ、Ｎ４ＰＬＵＳ）にて粒径、ζ電位を測定した。
２．２．  結果
調製したリポソームは粒径３００ｎｍ前後であり、ζ電位が＋２９ｍＶであった。少なくとも１カ月程度は、粒径はそれ程変化せずに安定であった（粒径＜５００ｎｍ）。また、Ｄｍｃ１内包率（リポソーム調製後でのＤｍｃ１量／仕込みのＤｍｃ１量）は２０〜４０％程度、脂質収率（リポソーム調製後での脂質量／仕込みの脂質量）は４０〜５０％程度であった。
【表１】
2008062911.tif 000022
また、表１に示したように、分散媒としてＰＢＳ（−）を用いた場合では、時間の経過と共に粒径の増大が見られ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒを用いることで粒径がある程度制御できることが確認された。表１で示した２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒで調製したＤｍｃ１内包リポソームの粒径は、１ヶ月経過後も４４７±２００ｎｍであり、粒径の増大を抑えることができた。
【実施例３】
【０００８】
細胞取込み評価
実験前日に細胞を培養ディッシュに播種し、当日細胞密度８０％となるようにした。細胞はＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル由来株腎細胞）を用い、血清存在下でインキュベーションした。細胞培養液には血清含有、または血清不含有のものを使用した。Ｄｍｃ１内包リポソームをディッシュに添加後（［脂質］＝１２０μｇ／φ３５ｍｍディッシュ）、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄しＨｏｅｃｈｓｔにて核染色（室温、１５ｍｉｎ）を行った。細胞をＰＢＳ（−）にて再度洗浄し、リソソーム染色色素であるＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒにて染色し、共焦点顕微鏡にて観察した。また、Ｄｍｃ１にはＣｙ３標識し共焦点顕微鏡により細胞内動態を観察した。
Ｄｍｃ１へのＣｙ３標識方法は次の通りである。Ｃｙ３−マレイミド（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｙｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ））を用いて、２バイアル（３００ｎｍｏｌ／ｖｉａｌ）を２０μｌのＤＭＳＯに溶解し、ｂｕｆｆｅｒで１／５に希釈した。そこに９００ｍＬ  Ｄｍｃ１溶液（２０ｍｇ／９００ｍＬ）を加え、１０分撹拌し、ゲルろ過により未結合のＣｙ３を除去することで、Ｃｙ３標識Ｄｍｃ１を得た。
＜結果＞
図１に、ＣＯＳ−１細胞に導入されたリポソーム／Ｄｍｃ１複合体の共焦点レーザー顕微鏡像（［Ｄｍｃ１］＝１．３ｍＭ）を示す。中央はｘｙ平面像、右と下はｘｙ平面像上の赤線で垂直に切ったｚ軸断面像である。
血清存在下、非存在下どちらにおいても、Ｃｙ３−Ｄｍｃ１（赤の輝点）が細胞内に見られ、またエンドソーム（緑の輝点）と局在がずれていることから、Ｄｍｃ１内包リポソーム（Ｃｙ３−Ｄｍｃ１）が細胞に効率的に取り込まれることが示された。
赤：リポソーム／Ｃｙ３−Ｄｍｃ１複合体
青：細胞核（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）
緑：エンドソーム（ＦＭ−１  ４３）
スケールバー：２０μｍ
Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅによりリポソームの細胞毒性を評価したところ（ミトコンドリアの酸化還元酵素活性を測定）、インキュベーション時間が４時間ではほとんど毒性は見られず、またインキュベーション時間を２４時間に伸ばしても約８０％の細胞が生存していた。この結果から、Ｄｍｃ１内包リポソームは、細胞毒性が低い特長を有することも強く示唆された。
【実施例４】
【０００９】
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによる核内移行の確認
Ｄｍｃ１は核内タンパク質であり、ＤＮＡ修復に応用し得るためには、外部から導入したＤｍｃ１が核に移行する必要がある。そこで、導入したＤｍｃ１が細胞質、細胞核のいずれに存在するのかをウェスタンブロット法により解析した。
４．１．  細胞の調製
実施例３の細胞取り込み実験と同じ条件で実験を行い、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により、細胞（ＣＯＳ−１）をペレットとして回収した。回収した細胞は直ちに−８０℃にて凍結保存した。
４．２．  細胞質と核の分離
２種類の界面活性剤（ＮＰ−４０とＳＤＳ）により、細胞質成分と細胞核成分を分離した。その後、ＲＣ−ＤＣプロテインアッセイキットによりそれぞれのサンプルの総タンパク質を定量した。
細胞のペレットをＰＢＳで洗浄し、０．６％  ＮＰ−４０を含有するＢｕｆｆｅｒ  Ｎに細胞を懸濁した。この細胞懸濁液を遠心し（４，７００ｒｐｍ，５分）、上清を細胞質画分とした。一方、遠心後のペレットをＢｕｆｆｅｒ  Ｎで洗浄し、２×ＳＤＳサンプルバッファーに懸濁した。懸濁液を１００℃で１０分加熱した後遠心し（１，５００ｒｐｍ，５分）、上清を核画分とした。
４．３．  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ
細胞質画分、核画分及びＤｍｃ１標品（対照）のそれぞれのサンプルの総タンパク質量を一定として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（２００Ｖ，１時間）、及びＰＶＤＦ膜への転写（１５０ｍＡ，１ｈｒ）を行なった。その後、Ｄｍｃ１抗体と共に、核、細胞質分離の確認として、それぞれヒストン抗体、チューブリン抗体も用いた。最後に、２次抗体（抗ウサギＨＲＰ抗体）のＨＲＰ基を利用した化学発光法によりＤｍｃ１、チューブリン、ヒストンのバンドを検出した。
４．４．  結果
図２ａにおいて、細胞質及び核は、共にＤｍｃ１の位置にバンドが見られることから、Ｄｍｃ１内包リポソームにおいてＤｍｃ１の核内導入が確認された。また、チューブリンは細胞質成分のみ、ヒストンは細胞核成分のみにバンドが現れたことから、細胞質、細胞核成分が正確に分離できていることが確認された。
さらに、図２ｂにおいてリポソームのみ（空リポソーム）、リポソーム未導入のインタクトな細胞のみでは核成分のＤｍｃ１の位置にバンドが現れないことから、Ｄｍｃ１内包リポソームにおけるバンドがＤｍｃ１由来であることを確認した。この結果より、リポソームにより導入されたＤｍｃ１は核に移行していることが示された。以上の結果は、Ｄｍｃ１内包リポソームはＤｍｃ１を細胞内の適切な部位（ここでは核）まで運搬する機能を有することを示すものであった。
【実施例５】
【００１０】
ＣＯＳ−１以外の細胞でのＤｍｃ１内包リポソームの細胞導入の確認
Ｄｍｃ１内包リポソームがＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル腎由来株化細胞）以外の細胞でも取り込まれるのを確認するため、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（マウス胎児由来繊維芽細胞）で細胞取り込み実験を行った。
Ｄｍｃ１内包リポソームは実施例２で調製したものと同じものを用いた。また、細胞をＮＩＨ−３Ｔ３に変えたこと以外は、実施例３と同様の方法で細胞取込み評価を行った。
＜結果＞
図３に示す通り、Ｃｙ３−Ｄｍｃ１（赤の輝点）がＮＩＨ−３Ｔ３細胞内に見られ、またエンドソーム（緑の輝点）と局在がずれていることから、Ｃｙ３−Ｄｍｃ１のＮＩＨ−３Ｔ３細胞質への取り込みが確認された。よって、Ｃｙ３−Ｄｍｃ１内包リポソームによってＣＯＳ−１細胞以外の細胞においてもＤｍｃ１が細胞質に取り込まれることが確認された。
導入：Ｃｙ３−Ｄｍｃ１内包リポソーム
細胞：ＮＩＨ−３Ｔ３
赤：Ｃｙ３−Ｄｍｃ１
青：核
緑：エンドソーム
【実施例６】
【００１１】
Ｄｍｃ１以外のタンパク質でのリポソームによる細胞導入の確認
用いたリポソーム（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝２．５／２．５／５／０．０３（モル比）が他のタンパク質においても細胞導入能があることを確かめるため、ＴＲＩＴＣ（ローダミン）標識アルブミン（ｒＨＳＡ）内包リポソームによるアルブミンの細胞取込みを評価した。
６．１．  ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ内包リポソームの調製
６．１．１．  ｒＨＳＡへのＴＲＩＴＣ標識
まず、ＴＲＩＴＣ（２ｍｇ）を０．１Ｎ  ＮａＯＨ（２００μｌ）中でボルテックスし、さらにＰＢＳ（−，６００μｌ）を加えボルテックスしＴＲＩＴＣ溶液（５．６４ｍＭ）を調製した。ｒＨＳＡにこのＴＲＩＴＣ溶液を加え攪拌後、カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にてフリーのＴＲＩＴＣを除去しＴＲＩＴＣ標識ｒＨＳＡ（ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ）とした。カラムを通した際のｂｕｆｆｅｒには、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒを用いた。調製したＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡは、ビウレット法にてｒＨＳＡの定量を行った。
６．１．２．  ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ内包リポソームの調製
調製方法はＤｍｃ１内包リポソームの調製においてＤｍｃ１をＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡに変えたこと以外は、実施例２と同様である。まず、調製したＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）にて１８μＭに希釈した。このＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ溶液（１８μＭ）中で、実施例２の２．１．１．項により調製した混合脂質を室温で３時間攪拌し、エクストルージョン（ＰＶＤＦ  ｆｉｌｔｅｒ：孔径５，０．６５，０．４５×２，０．２２×２μｍ）にて、粒径を揃えた。最後に、超遠心分離１００，０００  ｘ  ｇ，３０分×２）を行い、未内包ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡを除去後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に分散させてＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ内包リポソームを調製した。
物性評価として脂質の定量はコリン型リン脂質定量より、内包タンパク質の定量はＨＰＬＣ（２２０ｎｍ）にて行った。また、動的光散乱法にて粒径を測定した。
＜結果＞
調製したＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡリポソームは粒径３００ｎｍ前後であり、少なくとも１週間程度までは粒径はそれ程変化せず（＜５００ｎｍ）安定であることを確認した。
６．２．  ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ内包リポソームの細胞取込み評価
リポソーム組成は実施例２と同様に、ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝２．５／２．５／５／０．０３（モル比）である。細胞取り込み評価方法は実施例３で示した方法と同様である。
実験前日に細胞をディッシュに播種しておき、当日、細胞密度が８０％となるように調整した。細胞はＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル腎由来株化細胞）を用い、血清存在下でインキュベーションした。
まず、細胞の培養液を血清あり、または血清なしのものと交換し、ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ内包リポソーム添加後（［脂質］＝１２０ｍｇ，／φ３５ｍｍディッシュ）４時間インキュベーションした。その後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄しＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２にて核染色（室温、１５ｍｉｎ）、再びＰＢＳ（−）にて洗浄しＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒにてエンドソーム染色（３７℃，５％ＣＯ２，６０ｍｉｎ）を行い、共焦点顕微鏡にて観察した。
＜結果＞
血清存在下、非存在下どちらにおいても、ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ（赤の輝点）が細胞内に見られ、またエンドソーム（緑の輝点）と局在がずれていることから、ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡの細胞質への取り込みが確認された（図４）。よって、Ｄｍｃ１以外のタンパク質であってもリポソームに内包させることにより細胞内の細胞質にまで運搬されていることが確認された。
導入：ＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡ内包リポソーム
細胞：ＣＯＳ−１
〔比較例１〕
ＤＯＰＣがない場合
リポソーム組成：Ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝２．５／５／０．０３（モル比）
実施例２で示したＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝２．５／２．５／５／０．０３（モル比）でのＤｍｃ１内包リポソームと全て同様の手順で、Ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝２．５／５／０．０３（モル比）でのＤｍｃ１内包リポソームを調製した。調製後３日程度は粒径３００ｎｍ前後で安定であったが、１週間以内には完全に凝集、沈殿してしまった。
ポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子がない場合
リポソーム組成：ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２＝２．５／２．５／５（モル比）ｒＨＳＡを用いてポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子としてＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８の影響を調べた。まず、２５ｗｔ％  ｒＨＳＡ溶液をＰＢＳにより希釈し０．４ｗｔ％  ｒＨＳＡ溶液を調製した。０．４ｗｔ％  ｒＨＳＡ溶液に、前記２．１．項と同様の手順で調製した表２の組成の混合脂質を加えて水和及び撹拌し、エクストリューダー（ＰＶＤＦ  ｆｉｌｔｅｒ：孔径５，０．６５，０．４５ｘ  ２，０．２２  ｘ  ２μｍ）にて、粒径をある程度揃えた。最後に、超遠心分離（１００，０００  ｘ  ｇ，３０ｍｉｎ  ｘ  ２）を行い、分散媒（ＰＢＳ）にて再分散させることでｒＨＳＡ内包リポソームを得た。
【表２】
2008062911.tif 000023
表２より、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を用いないリポソームは用いたリポソームに比べ、粒径の増大が見られた。カチオン性リポソームはアニオン性のｒＨＳＡを介して凝集し易く、ＰＥＧ鎖にて表面修飾することで分散安定性はかなり向上した。また、このｒＨＳＡを用いた系ではＰＥＧを用いることでｒＨＳＡ内包率も向上した。アニオン性タンパク質の内包には粒径制御のためＰＥＧが有用であることが確認された。
【実施例７】
【００１２】
リポソーム表面電荷の違いによる細胞取込みへの影響
本実施例では、ローダミン標識したカチオン性、両イオン性、アニオン性の空リポソームを用いて、細胞内取り込みにおけるリポソーム膜成分の最適化を行った。
７．１．  リポソーム調製
リポソームの調製方法は実施例２の２．１．項と同様である。表３に示したそれぞれの混合比での脂質成分にそれらが完全に溶ける程度のｔｅｒｔ−ブチルアルコールを加え、加熱融解させた。これらを凍結乾燥させて得られた粉末を混合脂質とした。
【表３】
2008062911.tif 000024
次に、ＰＢＳ（−）中で、調製した混合脂質を、室温で３時間攪拌し、エクストルージョン（ＰＶＤＦ  ｆｉｌｔｅｒ：孔径５，０．６５，０．４５  ｘ  ２，０．２２  ｘ  ２μｍ）にて、粒径をある程度揃えた。最後に、超遠心分離（１００，０００  ｘ  ｇ，３０ｍｉｎ  ｘ  ２）を行い、ＰＢＳにて分散しリポソームを調製した。ここで用いたＤＨＳＧはアニオン性脂質である。
７．２．  細胞取込み評価
エンドソーム染色を行っていないこと以外は実施例３で示した方法と同様である。実験前日細胞を播種し、当日細胞密度８０％となるようにした。細胞はＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル腎由来株化細胞）を用い、血清存在下でインキュベーションした。まず、細胞の培養液を血清あり、または血清なしのものと交換し、Ｄｍｃ１内包リポソーム添加後（［脂質］＝１２０ｍｇ，／φ３５ｍｍディッシュ）４時間インキュベーションした。その後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄しＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２にて核染色（室温、１５ｍｉｎ）、再びＰＢＳ（−）にて洗浄した後、共焦点顕微鏡にて観察した。
＜結果＞
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した核を指標にして、ローダミン標識リポソームの細胞内局在を調べた結果、カチオン性、アニオン性、両イオン性のリポソームの順に細胞内への取り込みが多かった（図５）。アニオン性、両イオン性リポソームでは細胞内取込みはわずかであり、細胞膜への吸着も見られた。取り込まれたリポソームでは核移行は見られなかったが、リポソームが核と同じ面上に存在し、細胞内に取り込まれていることが確認できた。
〔比較例２〕
市販のタンパク質導入試薬との比較
本比較例では、下記３種類の市販されているタンパク質導入試薬とＣｙ３−Ｄｍｃ１内包リポソームにより細胞内へのＤｍｃ１導入に関する比較を行った。
・Ｐｒｏｆｅｃｔ  Ｐ−１（Ｌｉｐｉｄ系）及びＰ−２（非Ｌｉｐｉｄ系）（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）：タンパク質溶液と混合することにより複合体形成
・ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｌｉｐｉｄ系）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）：フィルムを形成させた後にタンパク質溶液と水和させ複合体形成
導入方法はそれぞれの試薬キットのプロトコールに従った。Ｄｍｃ１添加量を０．１、１、５μｇ／ｍＬとし、インキュベーション時間を４、２０時間として、タンパク質導入試薬によるＤｍｃ１導入効率の最適化、及び共焦点顕微鏡観察を用いたＤｍｃ１の細胞内挙動の比較を行い、カチオン性リポソームを用いた場合と比較した。ただし、インキュベーション時は全て血清非存在下で行った。また、インキュベーション後の細胞核、エンドソーム染色に関しては、実施例３と同様の手順で行った。
タンパク質導入試薬Ｐｒｏｆｅｃｔ  Ｐ−１、Ｐ−２ではどれも細胞表面にＤｍｃ１（赤の輝点）が吸着してしまっているように見え、細胞内に効率よく導入されているようには見えなかった。ＢｉｏＰＯＲＴＥＲでは、細胞内でＤｍｃ１がエンドソーム（緑の輝点）の位置に観察されカチオン性リポソームの場合と似たような挙動が確認できた。また、インキュベーション時間が２０時間では、どの試薬を用いても細胞表面に吸着してしまっているように見られるものが多かった。
そこで、ＢｉｏＰＯＲＴＥＲの場合について、インキュベーション時間４時間とし、試薬量とＤｍｃ１の比を今回と同じように変えるが、１ディッシュあたりのＤｍｃ１量を揃えることで最適比を確定し、リポソームの場合と比較した。ただし、１ディッシュあたりのＤｍｃ１の量を０．１μｇとして比較した。
細胞内においてエンドソーム（緑の輝点）とＤｍｃ１（赤の輝点）の局在がずれて見られ、Ｄｍｃ１が細胞質に取り込まれたのが確認できるのは、（０．１μｇ  Ｄｍｃ１＋１μｌ  ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ）の比の場合のみであり、この比をＢｉｏＰＯＲＴＥＲのＤｍｃ１導入のための最適比とした。
また、先の実験においてＢｉｏＰＯＲＴＥＲ、Ｄｍｃ１内包リポソーム共に最適なＤｍｃ１のアプライ量は１ｄｉｓｈあたり１μｇであったため、本実験でのＢｉｏＰＯＲＴＥＲの最適化された比を用いて、この１μｇ／ｄｉｓｈの濃度において再びＤｍｃ１内包リポソームの場合と比較した。
どちらの場合においても、細胞内でＤｍｃ１（赤の輝点）がエンドソーム（緑の輝点）とずれて存在しており、Ｄｍｃ１が細胞質に取り込まれたのが確認された。
次に、血清存在下でこれら２つを比較した。
どちらの場合についてもＤｍｃ１が細胞質に取り込まれているのが確認された。Ｄｍｃ１が細胞質に取り込まれた細胞の数としては、Ｃｙ３−Ｄｍｃ１内包リポソームの方が多少多く観察された。
【実施例８】
【００１３】
スペーサー導入カチオン性アミノ酸型脂質の合成
リン脂質等との混合系では従来のカチオン性脂質２では親水部が小さいためＤＯＰＣの親水部に埋没してしまう。そこでカチオン性脂質の親水部と疎水部間にスペーサーを導入したカチオン性脂質脂質５（Ｌｙｓ−Ｃ５−Ｇｌｕ２Ｃ１６）の検討を行った。
（Ａ）ジアシルグルタミン酸誘導体１は、実施例１で作製したものを使用した。
（Ｂ）ジアシルグルタミン酸誘導体１（１．０ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２０２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し１時間室温撹拌した。その後アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基で保護しスクシンイミドにより活性化された６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（３２３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加しさらに６時間室温撹拌した。反応終了後、溶媒を除去、炭酸ナトリウム飽和水／クロロホルムにて分液（各３回）後、硫酸マグネシウムにて脱水、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過し、スペーサー導入ジアシルグルタミン酸誘導体を得た。得られた誘導体にフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を加え４℃、２時間撹拌する。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水／クロロホルムにて分液（×４）後、硫酸マグネシウムにて脱水、メタノール４℃にて再結晶を行いろ過、乾燥後スペーサー導入アミノ酸型脂質４（化合物４）（収率６３％）を白色粉末として得た。
2008062911.tif 000025
スペーサー導入ジアシルグルタミン酸誘導体４の分析結果は、以下の通りであった。
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１２（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝０，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８７（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．７３（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）；１．９４（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；２．１４（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；２．２５（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）；２．４１（ｔ，２Ｈ，ｇｌｕ  γ−ＣＨ２）；２．９８（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−）；４．０４，４．１１（ｔ−４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；４．５０（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ）；７．０２（ｄ，１Ｈ，−ＣＯ−ＮＨ−）；８．０７（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ２）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：７０９．１；Ｆｏｕｎｄ：７０９．８（ＭＨ）＋．
（Ｃ）ジアシルグルタミン酸誘導体４（１．０ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１７１ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し１時間室温撹拌した。その後アミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基で保護しスクシンイミドにより活性化されたリシン（７４３ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を添加しさらに６時間室温撹拌した。反応終了後、溶媒を除去、炭酸ナトリウム飽和水／クロロホルムにて分液（各２回）後、硫酸マグネシウムにて脱水、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過しアミノ基を保護したリジン誘導体をそれぞれ得た。得られた誘導体にフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を加え４℃、２時間撹拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水／クロロホルムにて分液（×４）後、硫酸マグネシウムにて脱水、メタノール４℃にて再結晶を行いろ過、乾燥後スペーサー導入カチオン性アミノ酸型脂質５（化合物５）（収率３８％）を白色粉末として得た。
2008062911.tif 000026
スペーサー導入カチオン性アミノ酸型脂質５の分析結果は、以下の通りであった。
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（８／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０５（モノスポット））。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８７（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｓ，５２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２）；１．８０（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；１．９８（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２）；２．３８（ｔ，２Ｈ，ｇｌｕ  γ−ＣＨ２）；２．９３（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ・・−ＣＨ２−ＮＨ２）；３．１８（ｍ，２Ｈ，−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；３．８３（ｔ，１Ｈ，Ｇｌｕ  α−ＣＨ）；４．０６，４．１１（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２）；４．５５（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ・・−ＣＨ）；７．０８（ｄ，１Ｈ，−ＣＯ−ＮＨ−）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：８３６；Ｆｏｕｎｄ：８３７．８（ＭＨ）＋．
【実施例９】
【００１４】
カチオン性リポソームの調製
ＤＯＰＣ、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８の混合脂質にカチオン性リシン型脂質２またはスペーサー導入カチオン性アミノ酸型脂質（５）をそれぞれ混合し５ｍＬ  ｔ−ブチルアルコールに溶解後、凍結乾燥した。その後、脂質濃度が２ｗｔ％になるようにＨＥＰＥＳ緩衝液２０ｍＭに水和後（室温、１２ｈｒ）、ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法にて最終孔径０．２２μｍまで透過させた。超遠心分離にて外水相を洗浄後、リン脂質定量で濃度を調整し、粒径が２５０ｎｍ程度のリポソームを調製した（表４）。
【表４】
2008062911.tif 000027
【実施例１０】
【００１５】
アルブミン内包リポソームの調製
Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ）２ｍｇを０．１Ｎ−ＮａＯＨ  ａｑに溶解させ、ｐＨを７．４に調製した。その水溶液を２５ｇ／ｄＬ  ｒＨＳＡ  １ｍＬと混合し６時間撹拌後、ゲルカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）にて未結合ローダミンを除去し、ローダミン標識アルブミンを調製した。３種類の混合脂質（表５）をそれぞれ３０ｍｇに１ｍＬの３ｇ／ｄＬのローダミン標識アルブミンを混合し６時間水和後、高圧押出法（最終孔径０．２２μｍ）にて粒径を制御した。その後超遠心分離（１００，０００  ｘ  ｇ，３０ｍｉｎ）にて未内包ＴＲＩＴＣ標識アルブミンを除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液にて再分散しＴＲＩＴＣ標識アルブミン内包リポソームを調製した。
調製したＴＲＩＴＣ標識アルブミン内包リポソーム物性を測定した。調製したリポソーム（脂質濃度１ｍｇ／ｍＬ）のｐＨ７．４でのζ電位を測定した（表５）。スペーサー導入カチオン性脂質５を導入したリポソームｃが最もζ電位が高く、スペーサーによってカチオン部がより外側に位置していることが示された。また、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＫＷ−８０３，溶離液：ＰＢ（ｐＨ７．０）／ｍｅｔｈａｎｏｌ  １０／１（Ｖ／Ｖ），検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ）にて内包ｒＨＳＡの濃度を測定し、リポソームのｒＨＳＡ内包効率及び内包率を算出した。
【表５】
2008062911.tif 000028
調製したリポソームのｒＨＳＡ内包効率及び内包率を表５に示した。ｒＨＳＡは表面がアニオン性のタンパク質であるため、リポソームのζ電位が大きくなるほど、多くのｒＨＳＡを内包できたものと考察される。
【実施例１１】
【００１６】
アルブミン内包リポソームの細胞内導入
ＣＯＳ−１（サル腎臓由来株化細胞）を２×１０４ｃｅｌｌｓガラスボトムディッシュに播種し、２４時間後にリポソームを脂質濃度２μｇ／ｍＬで１ｍＬ添加した。４時間培養後、ＰＢＳにて２回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２にて核、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（１５０ｎＭ）にてエンドソームをそれぞれ染色し細胞導入動態を共焦点顕微鏡にて観察した。
コントロールリポソームａ（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）に関しては細胞内にＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡがほとんど観察されなかった（図６、左パネル）。細胞に取込まれるリポソーム量が少なかったためと考察される。
次に、カチオン性脂質２を膜成分としたリポソームｂ（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／カチオン性脂質２／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）では、細胞内に多くのＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡが観察された（図６、中央パネル）。しかしエンドソームとの局在が一致するものも多く観察された。
リポソームｃ（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ／カチオン性脂質５／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）では、リポソームｂよりもＴＲＩＴＣ−ｒＨＳＡがより多く導入された様に考えられた（図６、右パネル）。これは、リポソームｂ及びｃにおいては、ＨＥＰＥＳ分散媒中ではζ電位はそれほど変わらないが、細胞添加中ではカチオン性脂質５の親水部が細胞表面に吸着しやすく細胞内導入量が増したことを示すものであると考えられた。
【実施例１２】
【００１７】
スペーサー導入カチオン性脂質の合成
2008062911.tif 000029
上記スキームに示すように、Ｌｙｓ−（ＣＨ２）３−Ｇｌｕ２Ｃ１６（６）、Ｌｙｓ−（ＣＨ２）５−Ｇｌｕ２Ｃ１６（５）、Ｌｙｓ−（ＣＨ２）７−Ｇｌｕ２Ｃ１６（７）、及びＬｙｓ−（ＣＨ２）１１−Ｇｌｕ２Ｃ１６（８）の合成を行った。以下に、これら各脂質の合成方法を具体的に説明する。
（Ａ）Ｌｙｓ−（ＣＨ２）３−Ｇｌｕ２Ｃ１６（６）の合成法
ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ（５．００ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）と（ＢＯＣ）２Ｏ（１１．６ｇ、５３．４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（５．３９ｇ、５３．４ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍＬに溶解し、６０℃にて１２時間攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧除去し、酢酸エチル１００ｍＬに再溶解させ、０．２ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌで２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、ヘキサン４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収し、Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ（６．９８ｇ、３４．４ｍｍｏｌ、収率７１％）を得た。
Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ（０．７５１ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（１．９６ｇ、４．０７ｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解し１時間室温にて攪拌後、ジアシルグルタミン酸誘導体（１、２．００ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３７３ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を添加しさらに１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌する。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ＮＨ２−（ＣＨ２）３−Ｇｌｕ２Ｃ１６を得た（１．３３ｇ、１．９５ｍｍｏｌ、収率５８％）。
ＮＨ２−（ＣＨ２）３−Ｇｌｕ２Ｃ１６（１．００ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＳｕ（７１９ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１６４ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解後、室温にて１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、カチオン性脂質６を得た（６８０ｍｇ、０．８３８ｍｍｏｌ、収率５７％）。
カチオン性脂質６の分析結果は、以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３）；１．２０−１．３４（ｂｒ，５４Ｈ，ＣＨ２），１．４２−１．５２（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ），１．５４−１．７１（ｍ，６Ｈ，ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２，ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２）１．７６−１．８６（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＯ）ＣＨ２），１．９８−２．１３（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨＣＨ２），２．２８（ｔ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２），２．３５−２．４７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯＯ），２．９２（ｔ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），３．２５−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２），３．４３−３．４７（ｍ，１Ｈ，ＮＨ２ＣＨ），４．０５−４．１２（ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＣＨ２），４．５０−４．５７（ｍ，１Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ），７．３６（ｄ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），７．８２（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ４７Ｈ９２Ｎ４Ｏ６，８０９．７；ｆｏｕｎｄ，８０９．９．
（Ｂ）Ｌｙｓ−（ＣＨ２）５−Ｇｌｕ２Ｃ１６（５）の合成法
ＮＨ２−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ（５．００ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）と（ＢＯＣ）２Ｏ（９．１６ｇ、４２．０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４．２４ｇ、４２．０ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍＬに溶解し、６０℃にて１２時間攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧除去し、酢酸エチル１００ｍＬに再溶解させ、０．２ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌで２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、ヘキサン４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収し、Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ（６．３５ｇ、２７．５ｍｍｏｌ、収率７２％）を得た。
Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ（０．８５５ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（１．９６ｇ、４．０７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解し１時間室温にて攪拌後、ジアシルグルタミン酸誘導体（１、２．００ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３７３ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を添加しさらに１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌する。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ＮＨ２−（ＣＨ２）５−Ｇｌｕ２Ｃ１６を得た（１．１３ｇ、１．６１ｍｍｏｌ、収率４８％）。
ＮＨ２−（ＣＨ２）５−Ｇｌｕ２Ｃ１６（１ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＳｕ（６９３ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１５８ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解後、室温にて１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、カチオン性脂質５を得た（４１９ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ、収率３５％）。
カチオン性脂質５の分析結果は、以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３）；１．２０−１．３５（ｂｒ，５８Ｈ，ＣＨ２），１．４０−１．５１（ｂｒ，４Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２，ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２）１．５２−１．６８（ｍ，６Ｈ，ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２，ＮＨ２ＣＨ（ＣＯ）ＣＨ２），１．８１−１．９９（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨＣＨ２），２．１３−２．２５（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２），２．３３−２．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯＯ），２．９０−２．９８（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），３．１６−３．２５（ｂｒ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２），３．７５−３．９０（ｍ，１Ｈ，ＮＨ２ＣＨ），４．０２−４．１３（ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＣＨ２），４．５３−４．５６（ｍ，１Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ），７．０９（ｄ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），８．１９（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ４９Ｈ９６Ｎ４Ｏ６，８３７．７；ｆｏｕｎｄ，８３７．８．
（Ｃ）Ｌｙｓ−（ＣＨ２）７−Ｇｌｕ２Ｃ１６（７）の合成法
ＮＨ２−（ＣＨ２）７−ＣＯＯＨ（５．０  ０ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）と（ＢＯＣ）２Ｏ（７．５２ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３．４８ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍＬに溶解し、６０℃にて１２時間攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧除去し、酢酸エチル１００ｍＬに再溶解させ、０．２ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌで２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、ヘキサン４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収し、Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯＯＨ（５．９３ｇ、２２．９ｍｍｏｌ、収率７３％）を得た。
Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）７−ＣＯＯＨ（０．９５８ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（１．９６ｇ、４．０７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解し１時間室温にて攪拌後、ジアシルグルタミン酸誘導体（１、２．００ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３７３ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を添加しさらに１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌する。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ＮＨ２−（ＣＨ２）７−Ｇｌｕ２Ｃ１６を得た（１．３７ｇ、１．８８ｍｍｏｌ、収率５６％）。
ＮＨ２−（ＣＨ２）７−Ｇｌｕ２Ｃ１６（１ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＳｕ（６７０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１５３ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解後、室温にて１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、カチオン性脂質７を得た（５３４ｍｇ、０．６１７ｍｍｏｌ、収率４５％）。
カチオン性脂質７の分析結果は、以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３）；１．１４−１．３４（ｂｒ，６０Ｈ，ＣＨ２），１．４０−１．５２（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２）１．５４−１．７０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２，ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２，ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２），１．７５−１．８２（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＯ）ＣＨ２），１．９２−２．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨＣＨ２），２．２１（ｔ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２），２．３０−２．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯＯ），２．８５（ｔ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），３．１６−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２），３．３４−３．７６（ｍ，１Ｈ，ＮＨ２ＣＨ），４．０２−４．１５（ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＣＨ２），４．５７−４．６１（ｍ，１Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ），６．４７（ｄ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），７．５２（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ５１Ｈ１００Ｎ４Ｏ６，８６５．８；ｆｏｕｎｄ，８６６．１．
（Ｄ）Ｌｙｓ−（ＣＨ２）１１−Ｇｌｕ２Ｃ１６（８）の合成法
ＮＨ２−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ（５．０  ０ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）と（ＢＯＣ）２Ｏ（５．５８ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．５９ｇ、２５．６１ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍＬに溶解し、６０℃にて１２時間攪拌した。反応終了後、メタノールを減圧除去し、酢酸エチル１００ｍＬに再溶解させ、０．２ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌで２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、ヘキサン４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収し、Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ（６．１７ｇ、１９．６ｍｍｏｌ、収率８４％）を得た。
Ｂｏｃ−ＮＨ（ＣＨ２）１１−ＣＯＯＨ（１．１７ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（１．９６ｇ、４．０７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解し１時間室温にて攪拌後、ジアシルグルタミン酸誘導体（１、２．００ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３７３ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を添加しさらに１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌する。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ＮＨ２−（ＣＨ２）１１−Ｇｌｕ２Ｃ１６を得た（１．０９ｇ、１．４１ｍｍｏｌ、収率４２％）。
ＮＨ２−（ＣＨ２）１１−Ｇｌｕ２Ｃ１６（１．００ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＳｕ（６３０ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１４３ｍｇ、１．４２ｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解後、室温にて１２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。その後、メタノール４℃にて再結晶を行い、グラスフィルター（Ｇ６）で回収した。精製物を回収し、溶媒を除去後、トリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌した。反応終了後、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回、水で２回分液し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、カチオン性脂質８を得た（６１７ｍｇ、０．６７０ｍｏｌ、収率５４％）。
カチオン性脂質８の分析結果は、以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３）；１．１４−１．３４（ｂｒ，６８Ｈ，ＣＨ２），１．４０−１．５２（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２）１．５２−１．７１（ｍ，８Ｈ，ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２，ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２，ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２），１．７８−１．８６（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＯ）ＣＨ２），１．９４−２．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨＣＨ２），２．２１（ｔ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２），２．３０−２．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯＯ），２．８０（ｔ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），３．１０−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２），３．３３−３．４０（ｍ，１Ｈ，ＮＨ２ＣＨ），４．０２−４．１４（ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＣＨ２），４．５８−４．６２（ｍ，１Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ），７．６０（ｄ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），８．２１（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ５５Ｈ１０８Ｎ４Ｏ６，１０２６．８；ｆｏｕｎｄ，１０２６．９．
【実施例１３】
【００１８】
Ｌｙｓ−ＰＥＧ−ＤＨＳＧ（化合物９）の合成法
2008062911.tif 000030
上記スキームに示すように、化合物９の合成を行った。以下に、これら各脂質の合成方法を具体的に説明する。
ジアシルグルタミン酸誘導体（３．５ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（０．８８ｇ、８．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２５ｍＬ、テトラヒドロフラン２５ｍＬに溶解し１２時間室温にて攪拌後。反応終了後、反応溶液を３００ｍＬのアセトンに滴下して４℃で再結晶し、濾過後乾燥してＤＨＳＧを得た（３．４７ｇ、４．９９ｍｍｏｌ、収率８５％）。
ＤＨＳＧ（１．６６ｇ、２．３９ｍｍｏｌ）及びＢＯＰ（１．１２ｇ、２．８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１００ｍＬに溶解し、１時間室温にて攪拌後、Ｔｒｔ−（ＰＥＧ）２−ＮＨ２（１．０ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２４ｍｇ、２．３７ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１２時間攪拌した。反応終了後、カラム（クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製した。得られた精製物にトリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、カラム（クロロホルム／メタノール＝５／１）で精製し、ＮＨ２−（ＰＥＧ）２−ＤＨＳＧを得た（０．６６ｇ、０．７３ｍｍｏｌ、収率３４％）。
ＮＨ２−（ＰＥＧ）２−ＤＨＳＧ（０．５０ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）とＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＳｕ（０．２８ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．０６３ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５０ｍＬに溶解後、室温にて１２時間攪拌した。反応終了後、カラム（クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製した。さらに、得られた精製物にトリフルオロ酢酸５ｍＬ加えて、４℃にて２時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを加え、沈殿した結晶をグラスフィルター（Ｇ６）にて回収した。回収した結晶を、ＮａＯＨを敷き詰めたデシケーター内に５時間静置し、化合物９（Ｌｙｓ−ＰＥＧ−ＤＨＳＧ）（０．２３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、収率３９％）を得た。
化合物９の分析結果は、以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＭｅＯＤ＝４／１，５００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３）；１．１４−１．３４（ｂｒ，５２Ｈ，ＣＨ２），１．４６−１．５２（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨＣＨ２ＣＨ２）１．５８−１．６６（ｍ，４Ｈ，ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２），１．６９−１．８１（ｍ，６Ｈ，ＮＨ２ＣＨ（ＣＯ）ＣＨ２，ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２），１．８２−１．８９（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２），１．９３−２．１９（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨＣＨ２），２．３３−２．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯＯ），２．４５−２．５５（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２），２．９６（ｔ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），３．２５−３．３４（ｍ，４Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２），３．５０−３．６５（ｂｒ，１２Ｈ，ＯＣＨ２），３．８８−３．９２（ｍ，１Ｈ，ＮＨ２ＣＨ），４．０２−４．１５（ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＣＨ２），４．４６−４．５１（ｍ，１Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ），６．２７（ｄ，１Ｈ，ＣＨＮＨ），７．３５（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ５１Ｈ１００Ｎ４Ｏ６，９２２．１；ｆｏｕｎｄ，９２１．８．
【実施例１４】
【００１９】
リポソームの調製
実施例１２及び１３において合成した各カチオン性脂質等と、Ｄｉｏｌｅｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ）、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ｃｈｏｌ）及びＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８とを、下記表６に記載のモル比で混合した後、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールに溶解し、凍結乾燥して混合脂質を調製した。調製した混合脂質３０ｍｇを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）１．５ｍＬに６時間水和し、Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法（最終孔径０．２２μｍ）により粒子径約２５０ｎｍのリポソームを調製した。
【表６】
2008062911.tif 000031
2008062911.tif 000032
リポソーム物性
調製したカチオン性リポソームの粒子径及びζ電位の測定を行った。粒子径測定は、脂質濃度３０μＭの粒子径を動的光散乱法により測定した。ζ電位は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）でリポソーム分散液を希釈し、３０μＭ時のζ電位を測定した。これらの結果を表７に示した。
【表７】
2008062911.tif 000033
スペーサーが無いカチオン性脂質２をリポソーム膜成分とした場合（Ｉ）、ζ電位は＋２．４ｍＶであったのに対し、スペーサーとしてアルキル基を導入するとζ電位が増加した（ＩＩ〜Ｖ）。アルキルの鎖長が０→３→５と増加するとζ電位は増加したが、５→７→１１と増加した場合は減少した。次に、ポリオキシエチレン型のスペーサーを導入した場合には、ζ電位が最も高くなった（ＶＩ）。比較として、遺伝子運搬体として汎用されているＤＯＴＭＡを利用した場合、そのリポソームのζ電位は１４．６ｍＶであった（ＶＩＩ）。スペーサーの導入によってζ電位が変化し、また、スペーサーの長さや種類にも関係することが明らかとなった。
次に、調製したカチオン性リポソームの生体膜への融合度を測定した。生体膜モデルとしてＤＯＰＣ／ＤＯＰＳ／ｃｈｏｌ（モル比：３／０．３／１）からなるリポソームに、蛍光脂質ＮＢＤ−ＰＥ及びＲｈｏ−ＰＥを導入し、ＦＲＥＴの解消度から融合率を算出した。１００ｍＭの生体膜モデルリポソームと１００ｍＭカチオン性リポソームとを３７℃で混合し、５分後の蛍光強度（励起：４６０ｎｍ、蛍光：５３４ｎｍ）と０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを添加したときの蛍光強度とから融合率を算出した。この結果を図７に示した。
図７に示すように、スペーサーが炭素数７のアルキル型であるカチオン性脂質で、最も融合度が高くなった（ＩＶ）。一方、ポリオキシエチレン型のスペーサーを導入したカチオン性脂質からなるリポソームは、ζ電位が大きかったものの融合度は低かった（ＶＩ）。
【実施例１５】
【００２０】
ｐＤＮＡ内包リポソームの調製
実施例１２及び１３において調製したカチオン性リポソーム等にｐＤＮＡ（４０４５ｂｐ）の内包を試みた（下記スキームＡ参照）。９０ｖｏｌ％エタノール（１ｍＬ）に混合脂質を溶解し、同量の２０ｍＭ  ＰＢ緩衝液（ｐＨ５）に、分散させたｐＤＮＡを混合した。次いで、攪拌しながら、２ｍＬの３００ｍＭ  ＮａＣｌを滴下し、さらに１時間攪拌混合した。その後、アニオン交換クロマトグラフィーにより、リポソーム表面に静電結合するｐＤＮＡを除去した。超遠心分離（１，６００，０００  ｘ  ｇ）で遠心し、その後ＰＢＳにて再分散した。調製したｐＤＮＡ内包リポソームの物性を、表８に示した。
スキームＡ
2008062911.tif 000034
【表８】
2008062911.tif 000035
ＴＥＭによる観察
調製したｐＤＮＡ内包リポソームをＴＥＭにより観察した。脂質濃度７００μＭのリポソーム分散液３μＬを銅グリッド上に置き、３分間静置した。その後に余分な水分をフィルター紙で吸い取り、３μＬリンタングステン酸ナトリウム水溶液を滴下した。３分間静置後、フィルター紙で水分を吸い取り、測定用サンプルとした。このＴＥＭによる観察結果を、図８に示した。
図８に示すように、リポソームＶＩを除くすべてのリポソームで、小胞体構造を有する集合体が観察された。一方、リポソームＶＩでは、小胞体構造以外にチューブ状の構造も見られた。
ゲル電気泳動によるｐＤＮＡの内包の確認
カチオン性リポソームへのｐＤＮＡの内包を、ゲル電気泳動により確認した。ｐＤＮＡ内包リポソームにＤＮａｓｅを混合し、３７℃で１時間インキュベーションし、その後、ｐＤＮＡをクロロホルム抽出して、１％アガロースゲルで１時間電気泳動を行った。その結果を図９に示した。
ｐＤＮＡ単独又はカチオン性リポソームとｐＤＮＡとのコンプレックスは、ＤＮａｓｅによる分解が認められた。一方、ｐＤＮＡ内包リポソームでは、ＤＮａｓｅ添加時においてもｐＤＮＡのバンドが見られたことから、ｐＤＮＡが内包されていることが確認された。
遺伝子発現効率
ｐＤＮＡ内包リポソームの遺伝子発現効率を算出した。ＣＯＳ−１細胞を１  ｘ  １０４個９６ウェルプレートに播種し、１２間後にｐＤＮＡ内包リポソームをｐＤＮＡ濃度で２μｇ／ｍＬ添加した。７２時間後に２回ＰＢＳで洗浄し、細胞を可溶化した。可溶化液２０μＬにルシフェリンを１００μＬ添加し、発光強度（ＲＬＵ）を測定した。さらに、細胞可溶化液の５μＬのタンパク質濃度を測定し、遺伝子発現効率（ＲＬＵ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。この結果を、図１０に示した。
図１０に示すように、遺伝子発現効率は、リポソームＩＶで最大の値となった。アルキルスペーサーの鎖長が０から７となると遺伝子発現が高くなった。しかし、アルキル鎖長が１１となると著しく遺伝子発現効率が低下した。ポリオキシエチレン型のスペーサーを用いた場合（リポソームＶＩ）、ζ電位は大きいものの、遺伝子発現はそれほど大きくならなかった。遺伝子発現は、細胞膜への融合率と導入効率に関与しているものと考えられた。
【実施例１６】
【００２１】
カチオン性脂質の遺伝子導入用試薬への使用の検討
遺伝子導入用試薬としてのカチオン性脂質としての使用を検討した。膜融合性脂質であるＤＯＰＥとカチオン性脂質との混合膜からなるカチオン性リポソームを調製した。混合膜のカチオン性脂質膜導入量を２０，３０，４０，５０ｍｏｌ％とした混合脂質１５ｍｇを１．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に分散させ、プローブ型超音波装置にて粒子径約１００ｎｍのリポソームを調製した。動的光散乱法によって粒子径を測定した。その結果を表９に示した。なお、表中、Ａはカチオン性脂質２、カチオン性脂質６、Ｂはカチオン性脂質５、Ｃはカチオン性脂質７、Ｄはカチオン性脂質８である。
【表９】
2008062911.tif 000036
次に、調製したカチオン性リポソームのζ電位測定を行った。その結果を表１０に示した。表中のＡ〜Ｄは、表９と同様である。
【表１０】
2008062911.tif 000037
スペーサーが長くなるにしたがってゼータ電位が大きくなる傾向があり、しかしスペーサー含有脂質８では７と比較してややゼータ電位が小さくなった。それぞれの膜含有量を比較すると、含有量が多くなるにつれて、ゼータ電位も大きくなる傾向があった。
遺伝子発現量の定量
調製したカチオン性リポソームの遺伝子運搬能評価として、ルシフェラーゼ発現プラスミドベクター（ｐｈＲＬ−ＴＫ）を用いてルシフェラーゼアッセイにより発現量を算出した（ｎ＝３）。
実験プロトコールは以下の通り行った。トランスフェクションしたＤＮＡ量はすべて２００ｎｇとした。培地１００μＬ中１  ｘ  １０４個／ｗｅｌｌのＣＯＳ−１細胞を９６穴プレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター内で１２時間培養した。脂質とプラスミドＤＮＡとの複合体（脂質／ｐＤＮＡ複合体）を１０分間静置し、培地で希釈して細胞に添加した。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。培地を除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ＭｉｌｌｉＱ水で５倍希釈した溶解バッファーを培地に加え（２５μｌ／ｗｅｌｌ）、細胞を可溶化した。軽く撹拌し、室温で１５分間静置した。細胞溶液２０μＬにセレンテラジン溶液１００μＬを添加し、ルミノメーターで発光強度を測定した。この結果を、図１１に示した。
図１１に示すように、スペーサー含有脂質６を膜成分とした際に、高い発現効率が得られた（図中Ｂ）。最も高い発現効率が得られた条件は、ＤＯＰＥ／脂質６＝６／４（ｍｏｌ  ｒａｔｉｏ）から成るカチオン性リポソームで、プラスミドＤＮＡとの混合比が１０／１（ｗ／ｗ）の時であった。スペーサーを導入していない脂質２あるいはスペーサー含有脂質ｄを膜成分とした際では、膜含有量、混合比等を変化させても遺伝子発現レベルは低い（図中Ａ，Ｄ）。スペーサー含有脂質５では、遺伝子発現に至ったもののスペーサー含有脂質６には劣る。つまりＤＯＰＥとの混合膜からなるリポソームにおけるスペーサー脂質の構造は６であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明により、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用試薬が提供される。
タンパク質や遺伝子を外部から細胞内に導入し細胞の形質転換をする技術は、バイオテクノロジーや細胞治療などへの応用が期待され注目されている。タンパク質導入の場合、導入されたタンパク質は継続的に複製されることはないが、一過性の発現でも十分な機能が発揮されるタンパク質を対象とすれば本発明は極めて有用な技術となる。
本発明において使用されるカチオン性アミノ酸型脂質は、原料の調達及び合成が容易であるため、安価で且つ大量に合成が可能である。本発明において使用されるカチオン性脂質は、単独あるいは複数の化合物から構成される組成物として用いられる。組成物は相溶した状態の無定形でもよい。本発明の好ましい態様によれば、これらの組成物は、ミセル、リピッドマイクロスフェア、リポソーム等の水性媒体に分散している分子集合体の構成成分に用いてもよいし、当該分子集合体の分散液を乾燥させたものでもよい。この態様によって、細胞に対する親和性を高め、極めて細胞内移行性の高い試薬として使用することができる。
また、本発明において使用されるカチオン性アミノ酸型脂質の中でも、リジン型脂質（アミノ酸型脂質）は、リポソーム形成能が高いためタンパク質又は遺伝子を安定に内包させることができる。
リジン型脂質はエンドソーム内の低ｐＨ環境下でリジン残基の側鎖にあるアミノ基がより正電荷を帯びるため、エンドソーム内でのプロトンスポンジ効果や、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と同様にアニオン性に帯電するエンドソーム膜と融合が生じている可能性がある。遺伝子導入の場合、実際、ＤＯＰＥを混合しなくてもリジン型脂質単独でプラスミドＤＮＡを複合体化させるだけで高効率に遺伝子発現を示すことが明らかとなっており、また、このリジン型脂質を用いた遺伝子導入系では、血清中での遺伝子発現効率の低減が見られないのも特徴である。
さらに、前記アミノ酸型脂質は生分解性が高く、分解物はアミノ酸又はその誘導体あるいは長鎖アルコール等であるため、低毒性である。
従って、本発明の試薬は、タンパク質又は遺伝子の細胞内導入用として極めて有用なものである。
【図７】
2008062911.tif 000042
【図１０】
2008062911.tif 000043
【図１１】
2008062911.tif 000044
【図１】
2008062911.tif 000045
【図２】
2008062911.tif 000046
【図３】
2008062911.tif 000047
【図４】
2008062911.tif 000048
【図５】
2008062911.tif 000049
【図６】
2008062911.tif 000050
【図８】
2008062911.tif 000051
【図９】
2008062911.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月19日(2008.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）−１：
2008062911.tif 000053
（式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す。）
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質導入用試薬。
【請求項２】
次式（Ｉ）−１：
2008062911.tif 000054
（式中、Ｌは、単結合、又は−ＣＯＮＨ−若しくは−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは０〜１４の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す（但し、ｍ１及びｍ２がいずれも１５である場合は除く。）。）
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞への遺伝子導入用試薬。
【請求項３】
組成物が、さらにジアシルホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子からなる群から選ばれる少なくとも１つを含むものである、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
ジアシルホスファチジルコリンのアシル鎖の一部又は全部がオレオイル基である、請求項３記載の試薬。
【請求項５】
組成物が、水性媒体中に分散してなる分子集合体である、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項６】
分子集合体は、二分子膜小胞体構造を形成し、内水相にタンパク質又は遺伝子を含むものである、請求項５記載の試薬。
【請求項７】
組成物が、乾燥粉末品である、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項８】
乾燥粉末品は、水性媒体中に分散したときにタンパク質又は遺伝子を包含した二分子膜小胞体構造を形成し得るものである、請求項７記載の試薬。
【請求項９】
細胞が、生体組織の一部を構成しているもの、又は血漿、血清若しくは血液、若しくはそれらの成分の一部を含む培地にて培養された細胞である、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の試薬を含む、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用キット。
【請求項１１】
次式（Ｉ）−３：
2008062911.tif 000055
（式中、Ｍ２は、−（ＣＨ２）ｋ’−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ’−（ｋ’は１〜１４の整数である。）であり、ｐ１及びｐ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す。）
で示される、カチオン性アミノ酸型脂質。
【請求項１２】
次式（Ｉ）−１：
2008062911.tif 000056
（式中、Ｌは、−ＣＯＮＨ−又は−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは２〜１４の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す。）
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質導入用試薬。
【請求項１３】
次式（Ｉ）−１：
2008062911.tif 000057
（式中、Ｌは、−ＣＯＮＨ−又は−Ｓ−Ｓ−であり、Ｍ１は、−（ＣＨ２）ｋ−又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−（ｋは２〜１４の整数である。）であり、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立して、１１〜２１の整数を表す（但し、ｍ１及びｍ２がいずれも１５である場合は除く。）。）
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞への遺伝子導入用試薬。
【請求項１４】
組成物が、さらにジアシルホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子からなる群から選ばれる少なくとも１つを含むものである、請求項１２又は１３に記載の試薬。
【請求項１５】
ジアシルホスファチジルコリンのアシル鎖の一部又は全部がオレオイル基である、請求項１４記載の試薬。
【請求項１６】
組成物が、水性媒体中に分散してなる分子集合体である、請求項１２又は１３に記載の試薬。
【請求項１７】
分子集合体は、二分子膜小胞体構造を形成し、内水相にタンパク質又は遺伝子を含むものである、請求項１６記載の試薬。
【請求項１８】
組成物が、乾燥粉末品である、請求項１２又は１３に記載の試薬。
【請求項１９】
乾燥粉末品は、水性媒体中に分散したときにタンパク質又は遺伝子を包含した二分子膜小胞体構造を形成し得るものである、請求項１８記載の試薬。
【請求項２０】
細胞が、生体組織の一部を構成しているもの、又は血漿、血清若しくは血液、若しくはそれらの成分の一部を含む培地にて培養された細胞である、請求項１２又は１３に記載の試薬。
【請求項２１】
請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の試薬を含む、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用キット。
【国際調査報告】
2008062911.tif 000058
2008062911.tif 000059