(57)【要約】  （１）複数の低分子化合物の各々に関して、その三次元構造情報と、標的高分子におけるリガンド結合領域の三次元構造情報とに基づいてドッキングシミュレーションを行うことにより、各低分子化合物のドッキングスコアを算出すると共に、前記結合領域内において各低分子化合物が安定的に結合する三次元位置情報を取得する工程、（２）ドッキングスコア上位群に含まれる各低分子化合物に関して、取得した前記三次元位置情報から、分子断片１種以上の三次元位置情報を全て取得する工程、（３）取得した分子断片の三次元位置情報を分子断片毎に集計する工程、（４）前記集計に基づき、局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する工程、（５）選択された特徴的分子断片から分子断片１種以上を選択し、それを満足する化合物を決定する工程を含む、標的生体高分子に結合可能なリガンドの探索方法を開示する。
2008035729.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生体高分子に結合可能なリガンドに特徴的な分子断片及びその三次元位置情報の決定方法であって、
（ａ）複数種類の低分子化合物の各々に関して、その三次元構造情報と、前記標的生体高分子におけるリガンド結合領域の三次元構造情報とに基づいてドッキングシミュレーションを実施することにより、各低分子化合物のドッキングスコアを算出すると共に、リガンド結合領域内において各低分子化合物が安定的に結合する三次元位置情報を取得する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で算出したドッキングスコアに基づく上位群に含まれる各低分子化合物に関して、前記工程（ａ）で取得したリガンド結合領域内における三次元位置情報から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する工程、並びに
（ｄ）前記工程（ｃ）の集計に基づき、リガンド結合領域内において局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する工程
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において決定された特徴的分子断片から分子断片１種類以上を選択し、それを満足する化合物を決定する工程
を含む、標的生体高分子に結合可能なリガンドの探索方法。
【請求項３】
標的生体高分子に結合可能なリガンドに特徴的な分子断片及びその三次元位置情報を決定するためのプログラムであって、
複数種類の低分子化合物について、それぞれ、局在分子断片特定用ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記原子座標から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する手順、
取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する手順、並びに
前記集計に基づき、局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する手順
をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項４】
標的生体高分子に結合可能なリガンドを探索するためのプログラムであって、
複数種類の低分子化合物について、それぞれ、局在分子断片特定用ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記局在分子断片特定用ドッキング原子座標から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する手順、
取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する手順、
前記集計に基づき、局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する手順、
生理活性候補化合物１種類又はそれ以上について、生理活性候補化合物ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記生理活性候補化合物ドッキング原子座標と、先に選択した局在分子断片の種類及び三次元位置情報とを比較して、前記生理活性候補化合物の局在分子断片充足度を見積る手順、並びに
局在分子断片充足度の高い生理活性候補化合物を選択する手順
をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項５】
標的生体高分子に結合可能なリガンドを探索するためのプログラムであって、
複数種類の低分子化合物について、それぞれ、局在分子断片特定用ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記局在分子断片特定用ドッキング原子座標から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する手順、
取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する手順、
前記集計に基づき、局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する手順、
生理活性候補化合物１種類又はそれ以上について、生理活性候補化合物三次元原子座標を発生させる手順、
前記生理活性候補化合物三次元原子座標と、先に選択した局在分子断片の種類及び三次元位置情報とを比較して、前記生理活性候補化合物の局在分子断片充足度を見積る手順、並びに
局在分子断片充足度の高い生理活性候補化合物を選択する手順
をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的生体高分子に結合可能なリガンドの探索方法、及びその前段階である、標的生体高分子に結合可能なリガンドに特徴的な分子断片及びその三次元位置情報の決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的生体高分子に結合可能なリガンドを、計算機を用いて探索する方法として、標的生体高分子のリガンド結合部位とリガンドの三次元情報を利用して、ドッキング方法により、リガンドの妥当な結合様式とドッキングスコアを計算し、この計算を複数個のリガンドに対して連続的に適用することにより、結合する可能性があるリガンドを発見する、あるいは、結合する可能性がない化合物を振るい落とす計算方法が公知である。このような計算方法は、バーチャルスクリーニング又はインシリコスクリーニングと呼ばれている。【０００３】
幾つかのドッキングプログラムが市販されており、ドッキングスコアは、それぞれのプログラムが持つ独自のスコア関数により算出される（代表的なプログラムとして、DOCK、GOLD、FlexX、AutoDOCK、DrugScore等がある）。このドッキングスコアを利用した標的生体高分子のリガンド結合部位におけるリガンドの結合様式の予測は比較的良好で、例えば、非特許文献１においては、検討した例のおよそ８０％についてＸ線結晶解析の結果が再現されることが報告されている。しかしながら、ドッキングスコアを利用した化合物の結合親和性の予測については、機能する例はあるものの、良好な予測はほとんどの場合できないことも、非特許文献１には報告されている。【０００４】
一方、標的生体高分子の三次元情報を利用することなく、１つ以上の既知のリガンドの三次元情報をもとに、標的生体高分子に結合可能なリガンドを計算機で探索する方法として、ファーマコフォアモデル検索と呼ばれる手法がある。これは、既存の活性のあるリガンド１分子、あるいは、２つ以上の既存の活性のあるリガンドの重ね合わせから、標的生体高分子との相互作用に必要な官能基群（例えば、水素結合性の置換基、イオン性原子、疎水性の置換基など）とそれらの相対的な立体配置を予測し、それらを満たす新規リガンドを計算機で探索する手法である（代表的なプログラムとして、Catalyst、Unity、MOE等がある）。しかしながら、このファーマコフォアモデル検索は、１つ以上の既知の活性なリガンドが存在しない限り、計算をすることが不可能であることから、限定された使用を強いられる手法と言える。また、このファーマコフォアモデル検索は、既存のリガンドと類似した性質を持つ新規のリガンドを見出す手法であり、標的生体高分子との相互作用についての情報も直接的には取り扱っていない。【０００５】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistry）」，（米国），2004年，47巻，12号，3032-47頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のとおり、従来のファーマコフォアモデル検索では、１つ以上の既知の活性なリガンドの情報が不可欠である。
また、バーチャルスクリーニング又はインシリコスクリーニング法では、ドッキングスコアと結合親和性との相関が低かった。創薬のリード化合物として有用な医薬候補化合物としては、ＩＣ５０が１μmol/L未満であることが望ましいが、従来のバーチャルスクリーニング又はインシリコスクリーニング法や、ハイスループットスクリーニング法では、このような高活性の医薬候補化合物を取得することは容易ではない。従って、本発明の課題は、標的生体高分子に対する１種又は２種以上の高活性医薬候補化合物を高確率で見出すことのできる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
［１］標的生体高分子に結合可能なリガンドに特徴的な分子断片及びその三次元位置情報の決定方法であって、
（ａ）複数種類の低分子化合物の各々に関して、その三次元構造情報と、前記標的生体高分子におけるリガンド結合領域の三次元構造情報とに基づいてドッキングシミュレーションを実施することにより、各低分子化合物のドッキングスコアを算出すると共に、リガンド結合領域内において各低分子化合物が安定的に結合する三次元位置情報を取得する工程（以下、ドッキングシミュレーション工程と称する）、
（ｂ）前記工程（ａ）で算出したドッキングスコアに基づく上位群に含まれる各低分子化合物に関して、前記工程（ａ）で取得したリガンド結合領域内における三次元位置情報から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する工程（以下、取得工程と称する）、
（ｃ）前記工程（ｂ）で取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する工程（以下、集計工程と称する）、並びに
（ｄ）前記工程（ｃ）の集計に基づき、リガンド結合領域内において局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する工程（以下、選択工程と称する）
を含むことを特徴とする、前記方法、
［２］前記［１］の方法において決定された特徴的分子断片から分子断片１種類以上を選択し、それを満足する化合物を決定する工程（以下、リガンド決定工程と称する）
を含む、標的生体高分子に結合可能なリガンドの探索方法、
［３］標的生体高分子に結合可能なリガンドに特徴的な分子断片及びその三次元位置情報を決定するためのプログラムであって、
複数種類の低分子化合物について、それぞれ、局在分子断片特定用ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記原子座標から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する手順、
取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する手順、並びに
前記集計に基づき、局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する手順
をコンピュータに実行させるためのプログラム、
［４］標的生体高分子に結合可能なリガンドを探索するためのプログラムであって、
複数種類の低分子化合物について、それぞれ、局在分子断片特定用ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記局在分子断片特定用ドッキング原子座標から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する手順、
取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する手順、
前記集計に基づき、局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する手順、
生理活性候補化合物１種類又はそれ以上について、生理活性候補化合物ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記生理活性候補化合物ドッキング原子座標と、先に選択した局在分子断片の種類及び三次元位置情報とを比較して、前記生理活性候補化合物の局在分子断片充足度を見積る手順、並びに
局在分子断片充足度の高い生理活性候補化合物を選択する手順
をコンピュータに実行させるためのプログラム、
［５］標的生体高分子に結合可能なリガンドを探索するためのプログラムであって、
複数種類の低分子化合物について、それぞれ、局在分子断片特定用ドッキング原子座標を発生させる手順、
前記局在分子断片特定用ドッキング原子座標から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する手順、
取得した分子断片の三次元位置情報を、分子断片毎に集計する手順、
前記集計に基づき、局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する手順、
生理活性候補化合物１種類又はそれ以上について、生理活性候補化合物三次元原子座標を発生させる手順、
前記生理活性候補化合物三次元原子座標と、先に選択した局在分子断片の種類及び三次元位置情報とを比較して、前記生理活性候補化合物の局在分子断片充足度を見積る手順、並びに
局在分子断片充足度の高い生理活性候補化合物を選択する手順
をコンピュータに実行させるためのプログラム
に関する。【０００８】
本発明は、（１）ファーマコフォアモデル検索で必要な既知の活性なリガンドの情報が全く不要であり、（２）標的生体高分子との相互作用をドッキングにより取り扱う一方、信頼性にやや難のあるドッキングスコアは最終的に使わず、（３）標的生体高分子に結合可能なリガンドに特徴的な分子断片及び三次元位置情報という新しい概念でリガンドを検索する手法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、標的生体高分子に対する１種又は２種以上の高活性医薬候補化合物を高確率で見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＤＯＣＫプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド（ＴＩＢＯ）結合領域におけるベンゼン環の局在位置を、ＴＩＢＯの結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図２】ＤＯＣＫプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド（ＴＩＢＯ）結合領域におけるメチル基の局在位置を、ＴＩＢＯの結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図３】ＤＯＣＫプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド（ＴＩＢＯ）結合領域におけるチオカルボニル基の局在位置を、ＴＩＢＯの結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図４】ＧＯＬＤプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド（ＴＩＢＯ）結合領域におけるベンゼン環の局在位置を、ＴＩＢＯの結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図５】ＧＯＬＤプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド（ＴＩＢＯ）結合領域におけるメチル基の局在位置を、ＴＩＢＯの結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図６】ＧＯＬＤプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド（ＴＩＢＯ）結合領域におけるチオカルボニル基の局在位置を、ＴＩＢＯの結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図７】図１に示すベンゼン環の局在位置（ＤＯＣＫプログラムによる）に基づいて本発明方法により選抜された化合物（MayBridge社、コード番号JFD 01710）の、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド結合領域における結合状態を模式的に示す説明図である。
【図８】図１に示すベンゼン環の局在位置（ＧＯＬＤプラグラムによる）に基づいて本発明方法により選抜された化合物（MayBridge社、コード番号JFD 01710）の、ＨＩＶ−１逆転写酵素のリガンド結合領域における結合状態を模式的に示す説明図である。
【図９】本発明方法により見出された、ＨＩＶ−１逆転写酵素に対する医薬品候補化合物の構造式と活性値（ＩＣ５０値）を示す説明図である。
【図１０】ＤＯＣＫプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＣｙｓＬＴ２受容体のリガンド結合領域におけるベンゼン環の局在位置を、本発明方法により選抜された化合物（Specs社、コード番号AK-968/40708060）の結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図１１】ＧＯＬＤプログラムを用いる本発明方法により決定された、ＣｙｓＬＴ２受容体のリガンド結合領域におけるベンゼン環の局在位置を、本発明方法により選抜された化合物（Specs社、コード番号AK-968/40708060）の結合状態と共に模式的に示す説明図である。
【図１２】本発明方法により見出された、ＣｙｓＬＴ２受容体に対する医薬品候補化合物の構造式と活性値（ＩＣ５０値）を示す説明図である。
【図１３】本発明方法の手順を示すフローチャートである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明には、ドッキングシミュレーション工程、取得工程、集計工程、及び選択工程を含む、標的生体高分子に結合可能なリガンドに特徴的な分子断片及びその三次元位置情報（以下、特徴的分子断片情報と称することがある）の決定方法と、ドッキングシミュレーション工程、取得工程、集計工程、選択工程、及びリガンド決定工程を含む、標的生体高分子に結合可能なリガンドの探索方法とが含まれる。前記リガンド探索方法では、前記特徴的分子断片情報決定方法で得られた分子断片及びその三次元位置情報に基づいて、更に、前記リガンド決定工程を実施することにより、標的生体高分子に結合可能なリガンドを決定することができる。【００１２】
本発明方法では、ドッキングシミュレーション工程を実施する前に、標的生体高分子のリガンド結合領域に関する三次元構造情報と、ドッキングシミュレーションに用いる複数種類（通常、１０種類以上、好ましくは１０００種類以上）の低分子化合物に関する三次元構造情報とを用意する。【００１３】
本発明方法を適用することのできる標的生体高分子としては、医薬の標的として利用可能な高分子である限り、特に限定されるものではなく、例えば、天然のタンパク質（糖タンパク質を含む）、核酸、若しくは多糖類、又は、これらの誘導体（例えば、改変タンパク質）を挙げることができる。【００１４】
標的生体高分子のリガンド結合領域に関する三次元構造情報は、標的生体高分子におけるリガンド結合領域を含む限り、例えば、前記リガンド結合領域のみの三次元構造情報であることもできるし、標的生体高分子の全体又はその一部（但し、リガンド結合領域を含む）の三次元構造情報であることもできる。前記三次元構造情報は、ドッキングシミュレーションを実施するのに必要な情報を含む限り、特に限定されるものではなく、リガンド結合領域を構成する各原子の情報、例えば、各原子の種類、状態、及び／又は三次元位置情報等を挙げることができる。前記三次元構造情報として、例えば、公知の既存情報若しくはその改変情報、又は新たに決定した新規情報を利用することができる。【００１５】
より具体的には、標的生体高分子の結晶構造が既に決定されている場合には、例えば、データバンク［例えば、プロテインデータバンク（http://www.rcsb.org/pdb/）］から結晶構造の三次元情報を入手することができる。入手した三次元情報は、そのまま、リガンド結合領域の三次元構造情報として使用することもできるが、通常は、用いるドッキングシミュレーションプログラムに応じて、必要な加工処理を行うことが好ましい。【００１６】
例えば、Ｘ線構造解析により決定された結晶構造では、水素原子が含まれていないため、水素原子の三次元情報を付加することが好ましい。水素原子の付加は、例えば、計算化学システム［Sybyl（商品名）（バージョン6.4）；Tripos社（米国）製］を用いて実施することができる。また、リガンドとの複合体の状態でＸ線構造解析を実施して得られた結晶構造では、リガンドに関する三次元情報を除去することが必要である。また、各原子に対して、その電荷情報を付加することが好ましく、例えば、AMBER（Assisted
Model Building with Energy Refinement）［The Amber biomolecular simulation
programs. J Comput Chem. 2005;26(16):1668-88、及びForce fields for protein
simulations. Adv Protein Chem. 2003;66:27-85］の力場パラメーターを使用し、割り付けることができる。【００１７】
標的生体高分子の結晶構造が決定されていない場合には、例えば、類似の立体構造を有することが予想される別の生体高分子の結晶構造が既に決定されていれば、その結晶構造に基づいてホモロジーモデリングを実施することにより、標的生体高分子の推定結晶構造を得ることができる。例えば、類似生体高分子の結晶構造を鋳型として、計算化学システム［例えば、MOE（商品名）（バージョン2002.03）；Chemical Computing Group社（カナダ）製］を用いて、ホモロジーモデリングを行うことにより、標的生体高分子の推定結晶構造を得ることができる。得られた推定結晶構造について、所望により、前記加工処理、例えば、水素原子の付加、リガンドの除去、電荷の付加を行うことができる。【００１８】
本明細書における用語「低分子化合物」とは、標的生体高分子の分子量よりも小さい分子量を有する化合物を意味し、好ましくは、後述のドッキングシミュレーションプログラムにおいて、ドッキングパートナーの一方（すなわち、リガンド）として利用可能な化合物、例えば、標的生体高分子のリガンド結合領域に、分子全体、あるいは、少なくともその一部が存在可能な化合物である。【００１９】
本発明方法では、低分子化合物の三次元構造情報を、通常、１０種類以上、好ましくは１０００種類以上、用意する。低分子化合物の選択方法は、特に限定されるものではないが、例えば、標的生体高分子のリガンド結合領域の形状及び大きさに応じて、低分子化合物の分子量の閾値（上限）を予め設定し、その閾値を超えない化合物を低分子化合物として選択することができる。なお、本発明においては、低分子化合物が標的生体高分子のリガンドであるか否かについて、予め考慮する必要はない。すなわち、本発明方法では、標的生体高分子のリガンドであるか否かを問わず、任意の低分子化合物を使用することができ、従って、これまでリガンドが全く知られていない標的生体高分子であっても、本発明方法を適用することが可能である。【００２０】
用意する三次元構造情報は、ドッキングシミュレーションを実施するのに必要な情報を含む限り、特に限定されるものではなく、低分子化合物を構成する各原子の情報、例えば、各原子の種類、状態、及び／又は三次元位置情報等を挙げることができる。前記三次元構造情報として、例えば、公知の既存情報若しくはその改変情報、若しくは新たに決定した新規情報、又はそれらの組合せを利用することができる。【００２１】
より具体的には、例えば、各種データベース、或いは、市販化合物のカタログから平面構造式情報を入手し、立体構造生成プログラム［例えば、Concord（商品名）（バージョン4.0.2）；Tripos社（米国）製］を用いて三次元構造化することにより、低分子化合物の各々の三次元構造情報を得ることができる。所望により、更に、回転可能な一重結合をランダムに回転させるなどして、エネルギー最小化計算を行うことにより、コンホメーションがよりランダマイズされた三次元構造情報を得ることができる。【００２２】
本発明方法におけるドッキングシミュレーション工程では、三次元構造情報を用意した各低分子化合物に関して、その三次元構造情報と、前記標的生体高分子におけるリガンド結合領域の三次元構造情報とに基づいてドッキングシミュレーションを実施することにより、各低分子化合物のドッキングスコアを算出すると共に、リガンド結合領域内において各低分子化合物が安定的に結合する三次元位置情報を取得する。【００２３】
ドッキングシミュレーション用のプログラムとしては、各種プログラムが公知である。本工程で用いることのできるドッキングシミュレーションプログラムとしては、例えば、標的生体高分子のリガンド結合領域の三次元構造情報と、低分子化合物の三次元構造情報とを入力することにより、前記低分子化合物のドッキングスコアと、リガンド結合領域における前記低分子化合物の三次元位置情報（より具体的には、低分子化合物を構成する各原子の三次元位置情報）とを出力可能なドッキングシミュレーションプログラムを挙げることができる。【００２４】
前記ドッキングシミュレーションプログラムとしては、例えば、（１）力場ベースのスコア関数を利用するプログラム、（２）経験的なスコア関数を利用するプログラム、（３）知識ベースのスコア関数を利用するプログラム等を挙げることができる［Assessing Scoring Functions for Protein-Ligand Interactions. J. Med.
Chem. 2004;47(12):3032-47］。【００２５】
前記プログラム（１）では、古典的なモレキュラーメカニックスのエネルギー関数を利用しており、ファンデルワールス及び静電相互作用の和を用いる。具体的なプログラムとしては、例えば、ＣＨＡＲＭｍ（Momany, F. A.; Rone, R. Validation of the general-purpose QUANTA.
3.2/CHARMm force-field. J. Comput. Chem. 1992, 13, 888-900）、ＤＯＣＫのchemical score（Ewing,
T. J. A.; Kuntz, I. D. Critical evaluation of search algorithms for automated
molecular docking and database screening. J. Comput. Chem. 1997, 18, 1175-1189）が公知である。【００２６】
前記プログラム（２）では、水素結合、イオン相互作用、リポフィリックな相互作用等をパラメーター化し、重み付けをして合計する。具体的なプログラムとしては、例えば、ＣｈｅｍＳｃｏｒｅ（Eldridge, M. D.; Murray, C. W.; Auton, T. R.; Paolini, G. V.; Mee,
R. P. Empirical scoring functions. I: The development of a fast empirical
scoring function to estimate the binding affinity of ligands in receptor
complexes. J. Comput.-Aided Mol. Des. 1997, 11, 425-445）、ＧＯＬＤ（Jones, G;
Willett, P.; Glen, R. C. Molecular recognition of receptor sites using genetic
algorithm with a description of desolvation. J. Mol. Biol. 1995, 245, 43-53、Jones,
G; Willett, P.; Glen, R. C.; Leach, A. R.; Taylor, R. Development and
validation of a genetic algorithm for flexible docking. J. Mol. Biol. 1997,
267, 727-748）、ＡｕｔｏＤｏｃｋ（Morris, G. M.; Goodsell, D. S.; Halliday, R. S.; Huey,
R.; Hart, W. E.; Belew, R. K.; Olson, A. J. Automated docking using a
Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. J. Comput.
Chem. 1998, 19, 1639-1662、Goodsell, D.S.; Olson, A. J. Automated docking of
substrates to proteins by simulated annealing. Proteins: Struc., Funct., Genet.
1990, 8, 195-202、Morris G. M.; Goodsell D. S.; Huey R.; Olson A.J. Distributed
automated docking of flexible ligands to proteins: parallel applications of AutoDock
2.4., J. Comput.-Aided Mol. Des. 1996 Aug, 10(4), 293-304）が公知である。【００２７】
前記プログラム（３）では、標的タンパク質とリガンドの原子ペアの相互作用を合計する。相互作用のポテンシャルは、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）に登録されている既存の複合体結晶構造情報を用いる。具体的なプログラムとしては、例えば、ＤｒｕｇＳｃｏｒｅ（Gohlke, H.; Hendlich, M.; Llebe, G. Knowledge-based scoring function
to predict protein-ligand interactions. J. Mol. Biol. 2000, 295, 337-356）、ＰＭＦ（Muegge,
I.; Martin, Y. C. A general and fast scoring function for protein-ligand
interactions: A simplified potential approach. J. Med. Chem. 1999, 42, 791-804）が公知である。【００２８】
これらのドッキングシミュレーションプログラムでは、シミュレーション対象の低分子化合物（リガンド）に対してドッキングスコアを算出することができる。前記ドッキングスコアの評価基準は、そのプログラムで用いられるアプローチ方法によって異なるが、本明細書における用語「ドッキングスコア」とは、結合の強度的安定性を示す指標である。【００２９】
また、これらのドッキングシミュレーションプログラムでは、標的生体高分子のリガンド結合領域の三次元構造情報と、低分子化合物の三次元構造情報とを入力すると、前記低分子化合物に関して、そのドッキングスコアが算出されると同時に、低分子化合物とリガンド結合領域との安定的な結合が期待される結合様式、つまり、リガンド結合領域における低分子化合物の三次元位置情報が得られる。ここで、「リガンド結合領域における低分子化合物の三次元位置情報」とは、より具体的には、前記低分子化合物を構成する全原子の三次元位置情報である。【００３０】
１つの低分子化合物のドッキングシミュレーションが終了したところで、次の低分子化合物のドッキングシミュレーションを行い、以下、三次元構造情報を用意した低分子化合物の内、所望の低分子化合物の全てについて、順次、ドッキングシミュレーションを実施することができる。【００３１】
本発明方法における取得工程では、前記ドッキングシミュレーション工程で算出されたドッキングスコアに基づく上位群に関して、前記ドッキングシミュレーション工程で取得したリガンド結合領域内における三次元位置情報から、所定の分子断片１種類又はそれ以上の三次元位置情報を全て取得する。本工程における前記上位群は、各種条件、例えば、標的生体高分子の種類、ドッキングシミュレーションを行う低分子化合物の数、得られたドッキングスコアの傾向などに応じて適宜決定することができるが、通常、上位１０％以内、好ましくは上位３０％以上、より好ましくは上位５０％以上である。より多くの上位群で行うことで、より正確な分子断片の三次元位置情報を取得することができる。【００３２】
本明細書における用語「分子断片」とは、化合物（特には低分子化合物）を構成することのできる原子又は原子団を意味し、例えば、各種の基本骨格［例えば、非環式（例えば、直鎖又は分岐）炭化水素骨格（基）、環式（例えば、単環式、縮合多環式、架橋環状、スピロ、又は環集合）炭化水素骨格、又はヘテロ環式骨格］若しくは特性原子団（例えば、ベンゼン環、アミン、カルボニル基、アミド、ウレア、チオウレア、水酸基、チオール基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホ基、ハロホルミル基、カルバモイル基、アミジノ基、シアノ基、ホルミル基、チオカルボニル基、アミノ基、イミノ基等）又はそれらの組合せを挙げることができる。【００３３】
集計工程では、前記取得工程で取得した三次元位置情報を、各分子断片毎に集計する。また、選択工程では、前記集計工程の結果に基づき、リガンド結合領域内において局在傾向が認められた分子断片の種類及びその三次元位置情報を選択する。前記集計処理は、各分子断片毎に、有意な局在化を示す三次元位置を特定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、以下の手順に従って実施することができる。【００３４】
まず、計算対象となる空間領域、すなわち、標的生体高分子のリガンド結合領域を複数の区域に分割する［例えば、８０００（＝２０３）区域〜１２５０００（＝５０３）区域］。三次元位置情報が得られた分子断片の中から１つの分子断片を選択し、その分子断片に関して、前記上位群に出現する全ての三次元位置情報を前記分割区域毎に集計する。集計後、全分割区域の中で、有意な局在傾向が認められる区域が存在するか否かを判定し、有意な局在傾向が認められた区域の三次元位置情報を、その分子断片の特徴的な三次元位置情報として記録する。なお、１つの分子断片について、局在傾向が認められる区域は１つに限定されず、複数の区域が特定される場合もあり得るし、局在傾向が全く認められない場合もあり得る。１つの分子断片に関する前記集計、判定、及び記録が終了したところで、次の分子断片に関して、同様に、集計、判定、及び記録を実施し、その分子断片に特徴的な三次元位置情報を特定する。所望の分子断片について、順次、前記手順を繰り返すことにより、前記リガンド結合領域に特徴的な分子断片の種類及びその三次元位置情報を決定することができる。なお、分子断片の選択については、例えば、創薬において重要性が報告又は示唆されている分子断片を優先的に選択することもできるし、あるいは、経験的に、又はランダムに選択することもできる。【００３５】
本発明方法におけるリガンド決定工程では、前記選択工程で選択された特徴的分子断片（以下、局在分子断片とも称する）から、分子断片１種類以上（好ましくは、種類及び／又は三次元位置情報に関して異なる分子断片２種類以上）を選択し、それらの種類及び三次元位置情報を同時に満足する化合物を決定する。前記決定方法としては、例えば、化合物データベースのスクリーニングなどを挙げることができる。【００３６】
前記スクリーニングの対象となる化合物群又はデータベースとしては、必要な三次元構造情報を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、各種データベース又は市販化合物のカタログを対象とすることができる。より具体的には、例えば、前記ドッキングシミュレーションで用いた三次元構造情報を含む低分子化合物データベース、好ましくは、前記ドッキングシミュレーションで得られた、リガンド結合領域における三次元位置情報を含む低分子化合物データベース（特に好ましくは、上位群に分類された低分子化合物のデータベース）を挙げることができる。【００３７】
リガンド結合領域に対する相対的位置関係が特定された分子断片が提示された場合、その条件を満足する化合物を検索する方法としては、各種プログラムが公知であり、例えば、（１）「局在分子断片（分子断片の種類と相対的空間位置）」と「ドッキング結果である各低分子化合物の三次元位置情報」とを利用する検索方法、（２）「局在分子断片」のみを利用する分子構造の３Ｄ検索方法などを挙げることができる。【００３８】
前記検索方法（１）では、選択工程で選択された特徴的分子断片の局在分子断片の種類と三次元位置情報と、スクリーニング対象の各低分子化合物における、ドッキングシミュレーションにより得られる各三次元位置情報とを比較し、両者の一致度（以下、局在分子断片充足度と称する）が高いものを優先的に選択することができる。各低分子化合物の前記三次元位置情報を取得するために用いるドッキングシミュレーションプログラムとしては、例えば、前記ドッキングシミュレーション工程で例示した各種プログラムを使用することができる。また、各低分子化合物の前記三次元位置情報は、前記ドッキングシミュレーション工程で用いたのと同じドッキングシミュレーションプログラムを用いて取得することもできるし、それとは別のドッキングシミュレーションプログラムを用いて取得することもできる。局在分子断片充足度は計算により算出することもできるし、あるいは、コンピューターグラフィックス（ＣＧ）により視覚化し、それらの視察により決定することもできる。ＣＧに基づく視察では、標的生体高分子との全体的な結合の様子も同時に判断することができるため、好ましい。【００３９】
前記検索方法（２）では、三次元構造情報を用意した各低分子化合物に対して、局在分子断片に基づくスクリーニングを実施する。各低分子化合物の三次元構造情報は、例えば、各種データベース、或いは、市販化合物のカタログから平面構造式情報を入手し、立体構造生成プログラム［例えば、Concord（商品名）（バージョン4.0.2）；Tripos社（米国）製］を用いて三次元構造化することにより、取得することができる。【００４０】
前記検索方法（１）又は（２）に利用することのできる公知プログラムとしては、例えば、ＵＮＩＴＹ（Tripos社）、ＣＡＴＡＬＹＳＴ（Accelrys社）、ＭＯＥ（CCG社）を挙げることができる。【００４１】
本発明の具体的な態様を、図１３に示すフローチャートに基づいて、更に説明する。
図１３に示すフローチャートには、ドッキングシミュレーション工程が記載されていないが、各低分子化合物の三次元構造情報と標的生体高分子のリガンド結合領域の三次元構造情報とに基づいてドッキングシミュレーション工程を実施した後、図１３に示す各工程を実施する。【００４２】
先ず、ドッキングシミュレーション工程で得られたドッキングスコアに基づいて上位群に含まれる低分子化合物を選択し、その各々について、局在分子断片特定用ドッキング原子座標を発生させる（Ｓ１）。前記原子座標は、ドッキングシミュレーション工程で得られた、リガンド結合領域内において各低分子化合物が安定的に結合する三次元位置情報を、以下の工程で使用可能な原子座標に変換したものである。所望の分子断片の種類を入力し（Ｓ２）、各局在分子断片特定用ドッキング原子座標に関して、入力した分子断片が有意に局在する空間位置を算出するため、前記分子断片の三次元位置情報を全て取得する（Ｓ３）。取得した分子断片の三次元位置情報を、リガンド結合領域内の分割区域毎に集計し、局在する空間位置があるか否かを判定する（Ｓ４）。Ｓ４において、局在する空間位置が認められない場合（Ｎｏ）、Ｓ２に戻り、別の分子断片を入力する（Ｓ２）。Ｓ４において、局在する空間位置が認められた場合（Ｙｅｓ）、Ｓ５に進み、局在化が認められた分子断片の種類とその局在化空間位置を局在化分子断片として記録する（Ｓ５）。所望の分子断片候補の全てを調べたか否かを検討し（Ｓ６）、分子断片候補が残っている場合（Ｎｏ）にはＳ２に戻り、候補全てを調べ終わった場合（Ｙｅｓ）にはＳ７に進む。【００４３】
生理活性候補化合物の各々についてドッキングシミュレーションを行うことにより、生理活性候補化合物ドッキング原子座標を発生させる（Ｓ７）。生理活性候補化合物の三次元位置情報と、Ｓ５で得られた局在化分子断片の種類と局在化位置情報とを比較することにより、局在分子断片充足度を見積る（Ｓ８）。生理活性候補化合物の全てについて、ドッキングシミュレーション及び局在分子断片充足度見積りが終了したか否かを検討する（Ｓ９）。Ｓ９において候補が残っている場合（Ｎｏ）にはＳ７に戻り、Ｓ９において候補全てが終了していた場合（Ｙｅｓ）にはＳ１０に進む。得られた局在分子断片充足度に基づいて、高充足度化合物のリストを作成し（Ｓ１０）、終了する。【００４４】
なお、図１３に示すフローチャートでは、リガンド決定工程において前記検索方法（１）を使用する場合の各工程（特にＳ７）を示している。リガンド決定工程において前記検索方法（２）を使用する場合には、図１３に示す工程Ｓ７に代えて、生理活性候補化合物三次元原子座標を発生させる。
【実施例】
【００４５】
本発明の有効性を示すために、創薬標的タンパク質の三次元構造から医薬品候補化合物の探索が可能であることを確認した。以下、ＨＩＶ−１逆転写酵素及びＣｙｓＬＴ２受容体を例にとって手順を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００４６】
《実施例１：ＨＩＶ−１逆転写酵素に対する医薬品候補化合物の探索》
（１）生体高分子情報の準備
本実施例では、ＨＩＶ−１逆転写酵素に関する医薬品候補化合物を探索した。
HIV-1逆転写酵素の結晶構造は、プロテインデータバンク（http://www.rcsb.org/pdb/）から入手した［HIV-1逆転写酵素（エントリー1HNV）］。この結晶構造は、低分子リガンドＴＩＢＯ［5-CHLORO-8-METHYL-7-(3-METHYL-BUT-2-ENYL)-
6,7,8,9-TETRAHYDRO-2H-2,7,9A-TRIAZA-BENZO[CD]AZULENE- 1-THIONE］との複合体結晶構造であり、結合している低分子リガンドは計算には不要なので、ＴＩＢＯに関する三次元構造情報を除去した。また、前記結晶構造は、Ｘ線により決定されたものなので、水素原子が含まれていない。計算化学システム［Sybyl（商品名）（バージョン6.4）；Tripos社（米国）製］を用いて、水素原子を付加した後、全原子の電荷を、カリフォルニア大コールマン教授らのグループによって開発されたAMBER（Assisted
Model Building with Energy Refinement）［The Amber biomolecular simulation
programs. J Comput Chem. 2005;26(16):1668-88、及びForce fields for protein
simulations. Adv Protein Chem. 2003;66:27-85］の力場パラメーターを使用し、割り付けた。【００４７】
（２）低分子化合物情報の準備
医薬品候補化合物の探索は、市販されている化合物を対象として計算を行った。ハイスループットスクリーニング用化合物カタログ［MayBridge社（英国）：1999年8月版、50,361化合物；Specs社（オランダ）：1999年4月版、71,162化合物］にｓｄファイル形式で登録されている化合物（以下、カタログ化合物と称する）を、立体構造生成プログラム［Concord（商品名）（バージョン4.0.2）；Tripos社（米国）製］を用いて三次元構造化した後、回転可能な一重結合をランダムに回転させ、エネルギー最小化計算を行った。以上の手順により得られたカタログ化合物の三次元構造の中から、医薬品候補化合物の探索を行った。【００４８】
（３）ドッキングシミュレーション
ＨＩＶ−１逆転写酵素のＴＩＢＯが結合する部位は、この酵素のアロステリック部位として知られており、この領域に結合するいくつかの医薬品が知られている。このアロステリック部位に対し、カリフォルニア大学サンフランシスコ校クンツ教授らのグループによって開発されたドッキングシミュレーションプログラム［DOCK（商品名）（バージョン4.0）；Ewing, T. J. A.; Kuntz, I. D. Critical
evaluation of search algorithms for automated molecular docking and database
screening. J. Comput. Chem. 1997, 18, 1175-1189］、あるいは、ドッキングシミュレーションプログラム［GOLD（商品名）（バージョン1.0）；ケンブリッジ結晶学データセンター（英国）製］を用いて、前記工程（２）で三次元構造化したカタログ化合物のドッキングシミュレーションを行った。ＤＯＣＫ及びＧＯＬＤのそれぞれのシミュレーションにおいて、全カタログ化合物について、ドッキングスコア及び各種分子断片の三次元位置情報を取得した。なお、ＤＯＣＫは複数のスコアを取り扱うことができ、本実施例及び後述の実施例２では、ＤＯＣＫのchemical
scoreを使用した。【００４９】
（４）分子断片情報の集計
ＤＯＣＫ及びＧＯＬＤのそれぞれのシミュレーションで得られたドッキングの結果から、ドッキングスコアが上位から数えて約半分の化合物（約50,000個）を抽出し、代表的な分子断片、例えば、ベンゼン環、アミン、カルボニル基、アミド、ウレア、チオウレア、メチル基、水酸基、チオール基等の三次元位置情報を集計した。その結果、少なくとも３種類の分子断片、すなわち、ベンゼン環、メチル基、及びチオカルボニル基が、ＨＩＶ−１逆転写酵素のアロステリック部位のポケット内において、局在して存在することが見出された。また、この結果は、使用したドッキングプログラムに依存せず、ＤＯＣＫのシミュレーション結果を用いても、ＧＯＬＤのシミュレーション結果を用いても、計算結果は同じであった。【００５０】
結果を図１〜図６に示す。図１〜図３は、ドッキングシミュレーションプログラムとしてＤＯＣＫを用いた場合の結果であり、図４〜図６は、ＧＯＬＤを用いた場合の結果である。また、図１及び図４はベンゼン環に関する結果であり、図２及び図５はメチル基に関する結果であり、図３及び図６はチオカルボニル基に関する結果である。図１〜図６において、分子断片（ベンゼン環、メチル基、又はチオカルボニル基）を球体で表わし、Ｘ線結晶解析により結合様式が明らかにされたＴＩＢＯも併せて表記した。
例えば、図１を例にとると、図１に示す球体（合計１２個）は、分割区域毎に集計し、局在化している度合いを統計的に調べた結果、局在傾向が認められた区域の内、上位１２番目までの分割区域を表示したものである。【００５１】
図１〜図６に示すように、ＴＩＢＯのベンゼン環、メチル基、又はチオカルボニル基が、本発明方法により明らかにされたベンゼン環、メチル基、又はチオカルボニル基の局在領域と非常によく一致していることがわかる。これらの官能基（分子断片）は、ＨＩＶ−１逆転写酵素のアロステリック部位に対するＴＩＢＯの結合能に重要であることが知られており、本発明方法により決定される分子断片を満たす化合物が創薬標的タンパク質に対する結合能を有すると期待できること、すなわち、本発明方法が医薬品候補化合物の探索に有効であることが確認された。【００５２】
（５）リガンドの決定
得られた局在化した分子断片の位置情報を元に、これを満たした様式で結合している化合物を、ＤＯＣＫ又はＧＯＬＤのシミュレーションから得られた結合状態の三次元座標から抽出した。分子断片としてベンゼン環の位置情報を用いて抽出した化合物の１つ（MayBridge社、コード番号JFD 01710）について、その結合状態を図７及び図８に示す。図７は、ＤＯＣＫを用いたシミュレーションから抽出した結果であり、図８は、ＧＯＬＤを用いたシミュレーションから抽出した結果であり、同じような抽出が可能であった。最終的に、ベンゼン環以外の分子断片も用いて、MayBridge社及びSpecs社のカタログ化合物から３６化合物を選抜した。【００５３】
選抜した３６化合物について実際に評価を行ったところ、ＩＣ５０が１μmol/L未満の化合物が２個見出された。得られた医薬品候補化合物を図９に示す。【００５４】
《実施例２：ＣｙｓＬＴ２受容体に対する医薬品候補化合物の探索》
（１）生体高分子情報の準備
本実施例では、Ｇタンパク質共役型受容体（GPCR）であるＣｙｓＬＴ２受容体に関する医薬品候補化合物を探索した。
ＣｙｓＬＴ２受容体は、Ｘ線結晶解析の報告例がないため、ホモロジーモデリング（Homology Modeling）により三次元構造を構築した。プロテインデータバンク（http://www.rcsb.org/pdb/）に登録されている結晶構造のうち、ウシロドプシン（エントリー1F88）を入手した。ウシロドプシンは、Ｘ線結晶構造解析が行われた唯一のＧＰＣＲであり、同じＧＰＣＲであるＣｙｓＬＴ２受容体に三次元構造が最も類似している唯一の結晶構造と推定される。前記結晶構造は、レチナールとの複合体結晶構造であり、結合している低分子リガンドは計算には不要なので、レチナールに関する三次元構造情報を除去した。また、第４ヘリックスと第５ヘリックスとの間のループ（Trp175〜Asn199のアミノ酸）は、結晶構造中においてレチナールを上から被うようにポケットにふたをしており、ドッキング計算の妨げとなるので、このループ部分のアミノ酸も除去した。このようにして得たウシロドプシンの三次元構造を鋳型として、計算化学システム［MOE（商品名）（バージョン2002.03）；Chemical
Computing Group社（カナダ）製］を用いて、ホモロジーモデリングを行い、ＣｙｓＬＴ２受容体の三次元構造を得た。【００５５】
得られた三次元構造に、計算化学システム［Sybyl（商品名）（バージョン6.4）；Tripos社（米国）製］を用いて、水素原子を付加した後、全原子の電荷を、カリフォルニア大コールマン教授らのグループによって開発されたAMBER（Assisted
Model Building with Energy Refinement）［The Amber biomolecular simulation
programs. J Comput Chem. 2005;26(16):1668-88、及びForce fields for protein
simulations. Adv Protein Chem. 2003;66:27-85］の力場パラメーターを使用し、割り付けた。【００５６】
（２）低分子化合物情報の準備
医薬品候補化合物の探索は、市販されている化合物を対象として計算を行った。ハイスループットスクリーニング用化合物カタログ［MayBridge社（英国）：1999年8月版、50,361化合物；Specs社（オランダ）：2003年6月版、174,245化合物］にｓｄファイル形式で登録されている化合物（以下、カタログ化合物と称する）を、立体構造生成プログラム［Concord（商品名）（バージョン4.0.2）；Tripos社（米国）製］を用いて三次元構造化した後、回転可能な一重結合をランダムに回転させ、エネルギー最小化計算を行った。以上の手順により得られたカタログ化合物の三次元構造の中から、医薬品候補化合物の探索を行った。【００５７】
（３）ドッキングシミュレーション
ホモロジーモデリングにより得られたＣｙｓＬＴ２受容体の結合ポケット（ウシロドプシンの結晶構造において、レチナールが結合していた領域に相当する領域）に対し、カリフォルニア大学サンフランシスコ校クンツ教授らのグループによって開発されたドッキングシミュレーションプログラム［DOCK（商品名）（バージョン4.0）；Ewing, T. J. A.; Kuntz, I. D. Critical
evaluation of search algorithms for automated molecular docking and database
screening. J. Comput. Chem. 1997, 18, 1175-1189］、あるいは、ドッキングシミュレーションプログラム［GOLD（商品名）（バージョン1.0）；ケンブリッジ結晶学データセンター（英国）製］を用いて、前記工程（２）で三次元構造化したカタログ化合物のドッキングシミュレーションを行った。ＤＯＣＫ及びＧＯＬＤのそれぞれのシミュレーションにおいて、全カタログ化合物について、ドッキングスコア及び各種分子断片の三次元位置情報を取得した。【００５８】
（４）分子断片情報の集計
ＤＯＣＫ及びＧＯＬＤのそれぞれのシミュレーションで得られたドッキングの結果から、ドッキングスコアが上位から数えて約３割の化合物（約50,000個）を抽出し、代表的な分子断片、例えば、ベンゼン環、アミン、カルボニル基、アミド、ウレア、チオウレア、メチル基、水酸基、チオール基等の三次元位置情報を集計した。その結果、少なくともベンゼン環がＣｙｓＬＴ２受容体の結合ポケット内に局在して存在することが見出された。【００５９】
（５）リガンドの決定
得られた局在化した分子断片の位置情報を元に、これを満たした様式で結合している化合物を、ＤＯＣＫ又はＧＯＬＤのシミュレーションから得られた結合状態の三次元座標から抽出した。分子断片としてベンゼン環の位置情報を用いて抽出した化合物の１つ（Specs社、コード番号AK-968/40708060）について、その結合状態を図１０及び図１１に示す。図１０は、ＤＯＣＫを用いたシミュレーションから抽出した結果であり、図１１は、ＧＯＬＤを用いたシミュレーションから抽出した結果であり、同じような抽出が可能であった。最終的に、ベンゼン環以外の分子断片も用いて、MayBridge社及びSpecs社のカタログ化合物から７８０化合物を選抜した。【００６０】
選抜した７８０化合物について実際に評価を行ったところ、ＩＣ５０が１μmol/L未満
の化合物が３個見出された。得られた医薬品候補化合物を図１２に示す。【００６１】
以上、本発明方法によれば、有用な医薬品候補化合物を見出すことが可能であることを示すことができた。また、本発明方法では、使用するドッキングプログラムに依存することなく、化合物の探索が可能であることを示すことができた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、医薬候補化合物の探索の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008035729.tif 000012
【図８】
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【図１０】
2008035729.tif 000014
【図１１】
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【国際調査報告】
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