(57)【要約】  β−１，４結合を有するオリゴ糖を生成する酵素、該オリゴ糖の製造方法、及び該オリゴ糖の新たな機能に基づき機能性食品を提供すること。  （Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチドを提供する：（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列；または（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と５１％以上の相同性を有するアミノ酸配列。  また本発明は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする機能性食品を提供する。
2008062555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と５１％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
（Ａ）〜（Ｄ）に示される生物学的性状を有していることを特徴とするポリペプチド：（Ａ）ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来である；
（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４０〜４２ｋＤａである；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有する；
（Ｄ）少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有する。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、オリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列中の１個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、塩基配列。
【請求項５】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項６】
β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産する生産方法であって、請求項５に記載のベクターを用いることを特徴とする生産方法。
【請求項７】
β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するためのキットであって、請求項５に記載のベクターを備えていることを特徴とするキット。
【請求項８】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌であることを特徴とする請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
ルミノコッカス  アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）であることを特徴とする請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産する生産方法であって、請求項８に記載の形質転換体を用いることを特徴とする生産方法。
【請求項１２】
β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するためのキットであって、請求項８に記載の形質転換体を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１４】
β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産する生産方法であって、請求項１３に記載の抗体を用いることを特徴とする生産方法。
【請求項１５】
β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するためのキットであって、請求項１３に記載の抗体を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１６】
請求項１または２に記載のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程を包含することを特徴とするヘテロオリゴ糖を合成する方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載のポリペプチドを備えていることを特徴とするヘテロオリゴ糖を合成するための試薬キット。
【請求項１８】
β−１，４結合を有するオリゴ糖をさらに備えていることを特徴とする請求項１７に記載の試薬キット。
【請求項１９】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含んでいることを特徴とするヘテロオリゴ糖を合成するための試薬組成物。
【請求項２０】
機能性食品を製造する方法であって、
請求項１または２に記載のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程；および
反応生成物を食品に添加する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２１】
４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする腸内環境改善用機能性食品。
【請求項２２】
ビフィズス菌の増殖を促進することで腸内環境を改善するための、請求項２１に記載の機能性食品。
【請求項２３】
４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする脂質代謝改善用機能性食品。
【請求項２４】
血中コレステロール量を減少させることで脂質代謝を改善するための、請求項２３に記載の機能性食品。
【請求項２５】
４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とするミネラル吸収能促進用機能性食品。
【請求項２６】
４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする糖尿病患者用機能性食品。
【請求項２７】
４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする低カロリー性低甘味料。
【請求項２８】
４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする便秘改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリペプチドおよびその利用に関するものであり、より詳細には、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドおよびその製造方法、該ポリペプチドを用いて合成したヘテロオリゴ糖およびその合成方法、ならびにこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物は、生物の主要なエネルギー源であり、脂肪酸、トリグリセリド、およびいくつかのアミノ酸のような他の化合物の生合成における前駆体である。炭水化物はまた、結合組織、神経組織、細菌細胞壁、および核酸の構造的成分として重要な役割を担っている。このような生体における栄養成分および／または構成成分としての役割以外に、炭水化物は、糖タンパク質などが有する糖鎖として生体内の種々の情報伝達において重要な役割を担うことが近年明らかにされており、遺伝子工学および／またはタンパク質工学だけでなく糖鎖工学が注目を集めている。【０００３】
単糖が２〜１０個程度結合した炭水化物であるオリゴ糖は、例えば、根菜類の根粒部分および／または哺乳動物の乳汁に含まれており、動植物の組織中に広く分布している。また、薬理作用を持ったオリゴ糖が数多く発見されており、これらを利用した医薬品および／または健康食品の開発も盛んに行われている（例えば、特許文献１および２などを参照のこと）。【０００４】
近年、様々な生理機能を有するオリゴ糖に注目が寄せられている。機能性オリゴ糖合成を目的とした多くの研究開発が行われており、機能性オリゴ糖の研究開発として、様々なオリゴ糖が工業的規模で生産されてきた。現在では，特定保健用食品の半数以上が機能性成分としてオリゴ糖を含んでいる。【０００５】
ヘテロオリゴ糖は、２種類以上の異なる単糖が結合して形成されるオリゴ糖であり、種々の生理活性を有することが知られている。そのため、ヘテロオリゴ糖は広範な分野において利用されている。ヘテロオリゴ糖の製造方法の一例としては、セロビオースホスホリラーゼの逆反応を利用してグルコース−１−リン酸と糖類から製造する方法がある（特許文献３を参照のこと）。セロビオースホスホリラーゼは、本来セロビオースをグルコース−１−リン酸とグルコースとに加リン酸分解する酵素であるが、この反応が可逆的であることを利用して、グルコース−１−リン酸と種々の糖類とから様々なヘテロオリゴ糖が合成されている。【０００６】
しかし、上述したヘテロオリゴ糖の製造方法は、グルコース−１−リン酸が高価であるため、製造されるヘテロオリゴ糖が高価になるという欠点を有する。また、この方法は、反応時に生成されるリン酸を反応終了後に除去する必要がある。さらに、この方法を用いた場合、ヘテロオリゴ糖の収率に限界がある。また、このようなヘテロオリゴ糖の製造方法以外の方法として、安価でありかつ入手容易なスクロースに、グルコース−１−リン酸の存在下で、スクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼとを作用させることによって反応時にリン酸が副生しない方法が特許文献４に記載されている。【０００７】
偏性嫌気性ルーメン細菌であるルミノコッカス  アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ（以下、Ｒ．ａｌｂｕｓ））７株（ＡＴＣＣ２７２１０として登録されている。）がセロビオースを２−エピマー化する活性を有することは知られており、セロビオースエピメラーゼ（ＣＥ）としてその存在が示唆されていた（非特許文献１を参照のこと）。この菌の培養液に分泌されるというこの活性が単一の酵素としてのＣＥによるものであることを証明するために、多くの研究者によって酵素の分離精製が試みられてきた。しかしながら、未だに本酵素の純化および同定には至っておらず、その実体は不明である。
【特許文献１】特開平８−２５６７３０号公報（平成８年（１９９６）１０月８日公開）
【特許文献２】特開２００３−４７４０２公報（平成１５年２月１８日公開）
【特許文献３】特開平２−１６９９２号公報（平成２年１月１９日公開）
【特許文献４】特開２００１−２０４４８９号公報（平成１３年７月３１日公開
【非特許文献１】Ｔ．Ｒ．ＴｙｌｅｒとＪ．Ｍ．Ｌｅａｔｈｅｒｗｏｏｄ（１９６７）  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１９，３６３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献４に記載されるような方法を用いるヘテロオリゴ糖合成法は、以下のような不都合を有する：（１）原料が高価である；（２）合成するために複数の基質および酵素を必要とし、その結果、コストが上昇し、反応条件の設定が複雑化する；（３）スクロースを用いる反応において、反応工程は一段階であるものの、反応液中には目的のヘテロオリゴ糖以外に未反応の基質（スクロース）、スクロースの分解によって生じるフルクトース、未反応の受容体糖および複数の糖が混在しているため、目的のヘテロオリゴ糖の分離が複雑である；（４）セロビオースホスホリラーゼを用いた合成法では、非還元末端側の糖がグルコースに限定される。【０００９】
非特許文献１においてその存在が示唆された酵素ＣＥ（ＥＣ  ５．１．３．１１）の反応生成物は、４−O−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンノース（グルコシルマンノース；Ｇｌｃ−Ｍａｎ）であると推定された。しかし、本酵素が分泌酵素であるのか否かは決定されておらず、また、酵素の詳細な諸性質や、基質特異性、生成物の詳細な構造決定は未だなされていない。【００１０】
上述したようにＣＥは独特な酵素活性を有しており、酵素学的観点から非常に興味深い酵素である。よって、本酵素を用いたヘテロオリゴ糖合成に対して多くの利点および有用性を期待することができる。【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＥの精製を実現し、その酵素化学的諸性質を解明して新規オリゴ糖合成方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上述のような問題点を解決するため、ＣＥ産生菌を自然界に求め、探索してきた。その結果、牛ルーメンから分離したＲ．ａｌｂｕｓが産生する酵素の中から、優れたＣＥを見出し（実施例１を参照）、また、この微生物の産生するＣＥをコードする遺伝子を取得し（実施例２と以下の文章を参照）、本発明を完成するに至った。本発明に係るポリペプチドは、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有することを特徴としており、解決しようとする課題を克服するに至った。【００１３】
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列；または（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と５１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有することを特徴としている。【００１４】
本発明に係るポリペプチドは、（Ａ）ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来である；（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４０〜４２ｋＤａである；（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有する；および（Ｄ）少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有する、という生物学的性状を有していることを特徴としている。本発明に係るポリペプチドはさらに、（Ｅ）少なくともセロビオース、セロトリオース、セロテトラオースまたはラクトースの還元末端のグルコースを２−エピマー化する活性を有する；（Ｆ）紫外線の最大吸収が２７８〜２８０ｎｍである；（Ｇ）等電点（ｐＩ）が４．６９である；（Ｈ）（Ｄ）に示される活性が金属塩（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋，Ｚｎ２＋またはＡｇ＋）で阻害される；（Ｉ）（Ｄ）に示される活性が化学物質（例えば、Ｎ−ブロモスクシミド、ヨード酢酸またはｐ−クロロマーキュリーベンゾエート）で阻害される；（Ｊ）（Ｄ）に示される活性の最大活性が、ブリットン−ロビンソン緩衝液中でｐＨ７．７〜８．２にて示される；または（Ｋ）（Ｄ）に示される活性の最大活性が、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液中で２８〜３２℃にて示される、という性状を有していることが好ましい。上記金属塩または化学物質の好ましい濃度は１ｍＭであり、上記緩衝液の好ましい濃度は４０〜１００ｍＭである。また、上記性状（Ｅ）に示した活性は、可逆的であり、本発明に係るポリペプチドは、当該可逆的反応もまた触媒する。【００１５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。【００１６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、（Ａ）配列番号２に示される塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列中の１個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、オリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴としている。【００１７】
本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。【００１８】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを用いることを特徴としている。【００１９】
また、本発明に係るポリペプチドを生産するためのキットは、上記ベクターを備えていることを特徴としている。【００２０】
本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。本発明に係る形質転換体は、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌であることが好ましく、ルミノコッカス  アルブス（Ｒ．ａｌｂｕｓ）であることがより好ましい。【００２１】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記の形質転換体を用いることを特徴としている。【００２２】
また、本発明に係るポリペプチドを生産するためのキットは、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。【００２３】
本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。【００２４】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記の抗体を用いることを特徴としている。【００２５】
また、本発明に係るポリペプチドを生産するためのキットは、上記抗体を備えていることを特徴としている。【００２６】
本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成する方法は、上記のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程を包含することを特徴としている。【００２７】
本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための試薬キットは、上記のポリペプチドを備えていることを特徴としている。本発明に係る試薬キットは、β−１，４結合を有するオリゴ糖をさらに備えていることが好ましい。【００２８】
本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための試薬組成物は、上記のポリペプチドを含んでいることを特徴としている。【００２９】
本発明に係る機能性食品は、プレバイオティクスとして機能するために、上記のポリペプチドを用いて生産される化合物を含んでいることを特徴としている。本発明に係る機能性食品は、ビフィズス菌の成長促進剤および低カロリー性（難消化性）食品であることが好ましい。また、本発明に係る機能性食品は、さらなる機能性物質を含んでいてもよい。なお、本発明に係る機能性食品は、組成物の形態で単品にて提供されても、キットの形態にて提供されてもよい。【００３０】
本発明に係る機能性食品の製造方法は、上記のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程；および反応生成物を食品に添加する工程を包含することを特徴としている。本発明に係る機能性食品の製造方法は、上記食品にさらなる機能性物質を添加する工程をさらに包含してもよい。【００３１】
本発明に係る腸内環境改善用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。特に当該機能性食品は、ビフィズス菌の増殖を促進することで腸内環境を改善するためのものである。【００３２】
本発明に係る脂質代謝改善用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。特に当該機能性食品は、血中コレステロール量を減少させることで脂質代謝を改善するためのものである。【００３３】
本発明に係るミネラル吸収能促進用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。【００３４】
本発明に係る糖尿病患者用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。【００３５】
本発明に係わる低カロリー性低甘味料は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−D−マンノースを含有することを特徴とする。【００３６】
本発明に係わる便秘改善剤は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に係るポリペプチドを用いれば、セロオリゴ糖の還元末端グルコースが２−エピマー化した生成物や乳糖から４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースなどを容易にかつ大量に合成することができるだけでなく、所望のヘテロオリゴ糖を容易に合成することができる。これにより、機能性食品素材（例えば、ノンカロリーもしくは低カロリーの食品、またはミネラル（特に、Ｃａ２＋など）の吸収に優れた食品）を低価格で提供することができる。また、本発明を用いればは血中コレステロールの減少を生じさせる食品または食品添加物を開発することができる。さらに、制腸作用などを有するビフィズス菌の成長を促進することが可能である。但し、上記以外の生理活性が認めうることを否定するものではない。【００３８】
４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースは別名エピラクトース（ｅｐｉｌａｃｔｏｓｅ）とも呼ばれ、牛乳中にごく微量存在することが知られている（Ｔ．Ｒ．Ｉ．Ｃａｔａｌｄｉら，（１９９９）  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１，４９１９）。本化合物を以下エピラクトースと略記する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明に係るポリペプチドが触媒する、セロビオースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してＧｌｃ−Ｍａｎに変換する反応を示すスキームである。
【図２】図２は、本発明に係るポリペプチドが触媒する、ラクトースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してエピラクトースに変換する反応を示すスキームである。
【図３】図３は、種々のクロマトグラフィーを用いて精製した本発明に係るポリペプチドを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＣＢＢ染色写真である。Ｍ、分子量マーカー；Ｃ、粗抽出液；Ｐ、ＣＥ精製酵素標品。
【図４】図４は、本発明に係るポリペプチドを、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ａ）、ＵＤＰ−グルコース（Ｂ）、グルコース−６−リン酸（Ｃ）、グルコース（Ｄ）、マンノース（Ｅ）、フルクトース（Ｆ）、ガラクトース（Ｇ）、キシロース（Ｈ）、アラビノース（Ｉ）、ソホロース（Ｊ）、ラミナリビオース（Ｋ）、ゲンチオビオース（Ｌ）、ラクトース（Ｍ）、マルトース（Ｎ）、スクロース（Ｏ）、セロビオース（Ｐ）、セロトリオース（Ｑ）およびセロテトラオース（Ｒ）を基質として行った反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。
【図５】図５は、本発明に係るポリペプチドが生成したラクトースからの生成物（エピラクトース）の１Ｈ−ＮＭＲ（ａ）と１３Ｃ−ＮＭＲ（ｂ）のスペクトラである。
【図６】図６は、本発明に係るポリペプチドが生成したセロトリオースからの生成物（Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ）の１Ｈ−ＮＭＲ（ａ）と１３Ｃ−ＮＭＲ（ｂ）のスペクトラである。
【図７】図７は、本発明に係るポリペプチドが触媒する、セロトリオ−スの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎに変換する反応を示すスキームである。
【図８】図８は、エピラクトース（ａ）またはＤＦＡＩＩＩ（ｂ）がミネラル吸収促進作用を有することを示す結果である。
【図９】図９は、エピラクトースがミネラル吸収促進作用を有することを示す結果である。パネルＡはＣａ２＋、パネルＢはＭｇ２＋、パネルＣはＺｎ２＋の吸収をそれぞれ示す。
【図１０】図１０は、反転サック法で測定した、エピラクトースのＣａ２＋吸収促進効果を示す図である。縦軸は、サックに用いた小腸の長さ（ｃｍ）当たりのＣａ２＋吸収量を表す。
【図１１】図１１は、エピラクトース添加食を摂取したラットにおける血中総コレステロール値の変化を示すグラフである。パネルＡが絶食時、パネルＢが摂食時を表す。
【図１２】図１２は、エピラクトース添加食を摂取したラットにおける血中の中性脂質、リン脂質、コレステロール量の変化を示すグラフである。
【図１３】図１３は、エピラクトース摂食後の血糖値の変化を表したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
異性化酵素の一つに分類されるエピメラーゼは、これまでに３２種類の存在が報告されている。その多くは、ヌクレオチドやリン酸、アシル基などの修飾を受けた糖類を基質とするものであり、未修飾の糖を基質とするものはアルドース１−エピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．３．３）、マルトース１−エピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．３．２１）およびＣＥ（ＥＣ  ５．１．３．１１）の３種類だけである。【００４１】
本発明者らは、自ら見出したルミノコッカス  アルブス（Ｒ．ａｌｂｕｓ）ＮＥ１由来のＣＥを精製し、酵素化学的諸性質の解明を試みた。本酵素はセロビオースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化し、Ｇｌｃ−Ｍａｎへの相互変換を触媒した（図１）。上述した３種類のエピメラーゼのうち還元末端側の２位に作用するエピメラーゼはＣＥのみである。【００４２】
このように、ＣＥの触媒する反応は非常に独特であったので、本発明者らは、本酵素をセロビオース以外の基質に作用させるあるいは本酵素の基質特異性を改変することで、新規の生成物が得られるのではないかと考え、ＣＥによる新規オリゴ糖合成をさらに試みた。【００４３】
〔１〕ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
〔１−１〕ポリペプチド
本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
本明細書中において使用される場合、「本発明に係るポリペプチド」は、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来の、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはその変異体が意図され、より詳細には、ＣＥまたはその変異体が意図される。上記細菌は、Ｒ．ａｌｂｕｓであることが好ましく、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１系統であることがより好ましい。なお、本明細書中に記載されるＲ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０３６（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）によって提供され得る。【００４４】
本明細書中において使用される場合、「Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ（Ｒ．ａｌｂｕｓ）  ＮＥ１由来のＣＥ」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が約４１ｋＤａ（例えば、４０〜４２ｋＤａ）であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有していることを特徴としている。なお、この見かけの分子量は、用いたポリペプチド（タンパク質）における翻訳後修飾の程度や、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるゲルの濃度によって若干変動するため、実際のアミノ酸配列から計算される分子量が約３５ｋＤａ〜約４６ｋＤａであり得ることを当業者は容易に理解する。なお、本発明者らによって同定されたＣＥの配列情報に基づいて計算された分子量は４５２１７Ｄａである。また、図３のレーンＰに示される単一のバンドの位置を正確に表せば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は４３．１ｋＤａである。【００４５】
本発明に係るポリペプチドの有する活性は、オリゴ糖の還元末端側である糖の２位水酸基を異性化する活性であることが好ましい。本明細書中において使用される場合、「オリゴ糖」は、２〜１０個の単糖からなる糖が意図され、単糖の数は、２〜６個が好ましく、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースまたはラクトースであることがより好ましい。【００４６】
後述の実施例に示されるように、本発明に係るポリペプチドは、紫外線の最大吸収が２７８〜２８０ｎｍであり、等電点（ｐＩ）が４．６９である。また、本発明に係るポリペプチドにおいて、上記オリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性は、金属塩（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋，Ｚｎ２＋またはＡｇ＋）で阻害され、化学物質（例えば、Ｎ−ブロモスクシミド、ヨード酢酸またはｐ−クロロマーキュリーベンゾエート）で阻害される。なお、本発明に係るポリペプチドの有する活性を阻害するために好ましい上記金属塩または化学物質の濃度は１ｍＭである。さらに、本発明に係るポリペプチドにおいて、上記オリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性は、ブリットン−ロビンソン緩衝液中でｐＨ７．７〜８．２にてその最大活性が示され、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液中で２８〜３２℃にてその最大活性が示される。なお、上記緩衝液の好ましい濃度は４０〜１００ｍＭである。【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。【００４８】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。【００４９】
本発明に係るポリペプチドは、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１から精製されたが、本発明に係るポリペプチドとしてはこれに限定されず、他の天然の精製産物、化学合成手順の産物、または原核生物宿主から組換え技術によって産生された産物を包含する。【００５０】
本明細書の記載に基づけば、当業者は、本発明に係るポリペプチドの全アミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列（または、オープンリーディングフレームもしくはその一部）を取得することができる。例えば、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下のように取得され得る。【００５１】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの単離方法は、本発明に係るポリペプチドを発現する細胞から調製されるゲノムライブラリーを作製する工程を包含する。本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためには、ゲノムライブラリーを用いる方が好ましい。プラスミド、コスミド、ファージ、ＹＡＣなどの広範囲に入手可能なクローニングベクターを用いて、本発明に係るポリペプチドまたはその部分をコードするヌクレオチド配列を単離するのに適した遺伝子ライブラリーを作成し得る。【００５２】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を確認するために遺伝子ライブラリーをスクリーニングする方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列情報に基づくオリゴヌクレオチドプローブを調製する工程を包含する。標準トリプレット遺伝暗号を用いて、約１７塩基対またはそれより長いオリゴヌクレオチド配列が、通常のインビトロ合成技術によって調製され得る。このオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の全長または一部分に対応するように合成される。得られたオリゴヌクレオチドは、次いで、放射性核種、酵素、ビオチン、蛍光試薬などで標識され、そして遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用される。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいて設計した縮重プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってもよい。【００５３】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記遺伝子ライブラリー単離物から回収される組換えＤＮＡから得られ得る。本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、これらの組換え分子の非ベクターヌクレオチド配列の配列決定によって得られ得る。ヌクレオチド配列情報は、広く用いられているＤＮＡ配列決定プロトコル（例えば、Ｓ．Ｌ．ＢｅｒｇｅｒとＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２，３０７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）（本明細書中に参考として援用される））中に見いだされ得る配列決定法などを使用して得られ得る。いくつかの組換えＤＮＡ単離物（ｃＤＮＡからの単離物およびゲノムライブラリーからの単離物の両方を包含する）からのヌクレオチド配列情報を組み合わせて、本発明に係るポリペプチドの全アミノ酸のコード配列、ならびに上流ヌクレオチド配列および下流ヌクレオチド配列を提供し得る。【００５４】
本発明に係るポリペプチドに特異的な遺伝子ライブラリー単離物から得られたヌクレオチド配列は、本発明に係るポリペプチド遺伝子の重要な領域を同定するために分析に供される。これらの重要な領域には、オープンリーディングフレーム、プロモーター配列、終止配列などが包含される。ヌクレオチド配列情報の分析は、好ましくは、コンピューターで行われる。重要な領域についてヌクレオチド配列を分析するのに適したソフトウェアは市販されており、これには、例えば、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などが包含される。本発明に係るポリヌクレオチド配列情報を分析する際に、精製された本発明に係るポリペプチドのＮ末端配列決定から得られたアミノ酸配列情報を使用してそのヌクレオチド配列分析の精度を向上させることも重要である。【００５５】
本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列がベクター中に機能的に挿入される場合、組換え技術によって発現され得る。本明細書中において使用される場合、「機能的に挿入される」は、適切なオープンリーディングフレームおよび方向に従って発現ベクター中に挿入されることが意図される。【００５６】
このように、本明細書を読んだ当業者は、本発明によって、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドだけでなく、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供されることを、容易に理解する。本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについては、本明細書中下記にて詳述する。本発明に係るポリペプチドの完全なオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物を作製する場合、好ましい出発物質は本発明に係るポリペプチドをコードするゲノムライブラリー単離物である。より好ましくは、上述した方法によって取得したポリヌクレオチドである。【００５７】
典型的には、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターの下流に挿入され、それに停止コドンが続くが、所望であればハイブリッドタンパク質としての生産とそれに続く開裂が、使用され得る。一般的には、本発明に係るポリペプチドの生産収率を向上させる宿主細胞に特異的な配列が使用され、そして適切な制御配列（エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、およびリボソーム結合部位など）が発現ベクターに付加される。いったん適切なコード配列が単離されると、これは、種々の異なる発現系；例えば、細菌、酵母、バキュロウイルスまたは哺乳動物細胞を用いて発現され得る。本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。【００５８】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。【００５９】
例えば、本発明に係るポリペプチドは、天然の細菌からの抽出物、または本発明に係るポリペプチドを産生するように遺伝的に改変された形質転換体（例えば、原核生物細胞および真核生物細胞）から、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合し得る抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、容易に精製され得る。抗体アフィニティークロマトグラフィーの使用に加えて、本発明に係るポリペプチドおよび本発明に係るポリペプチド由来のポリペプチドは、他の広範な公知のタンパク質精製技術（例えば、硫安分画、溶媒沈殿、免疫沈降法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点沈殿、エレクトロフォーカシング、電気泳動法など）を単独または組み合わせて用いて精製され得る。【００６０】
精製の過程で単離された画分は、本発明に係るポリペプチド特異的抗体を用いたイムノアッセイ、または本発明に係るポリペプチド特異的バイオアッセイ（例えば、ラクトースまたはセロオリゴ糖を基質として用いる酵素反応およびその生成物の解析）を用いて分析されることによって、本発明に係るポリペプチドの存在を分析され得る。【００６１】
本発明に係るポリペプチドに特異的な抗体は、適切な脊椎動物宿主（例えば、ウサギ）を、精製された本発明に係るポリペプチドを単独でまたは通常のアジュバントと組み合わせて免疫することによって産生される。普通、２つかそれ以上の免疫感作が含まれ、そして血液または脾臓が、最後の注射の数日後に採取される。ポリクローナル抗血清については、免疫グロブリンは、種々の標準的技法により、沈降、単離、および精製され得る。これには、アフィニティーカラム中のゲルまたはビーズのような固体表面に結合した本発明に係るポリペプチドを用いるアフィニティー精製が含まれる。モノクローナル抗体については、脾臓細胞が、通常、不死化リンパ球、例えば骨髄細胞株とハイブリドーマ形成のための選択的条件下で融合される。次いでハイブリドーマは、限定的希釈条件下でクローニングされ得、そしてそれらの上清が、所望の特異性を有する抗体についてスクリーニングされ得る。抗体を産生する技法は文献に公知であり、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）」（本明細書中に参考として援用される）に例示される。【００６２】
このように、本明細書を読んだ当業者は、本発明によって、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドだけでなく、該ポリペプチドと特異的に結合する抗体もまた提供されることを、容易に理解する。本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体については、本明細書中下記にて詳述する。【００６３】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、本発明に係るポリペプチドの有するβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を保持するポリペプチドが意図される。【００６４】
本明細書中において使用される場合、変異体の一例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１由来のＣＥのアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、欠失、逆位、転座、反復およびタイプ置換されたアミノ酸配列を含む変異体が挙げられる。【００６５】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。【００６６】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、ランダム変異によっても目的は達成される。さらに、本明細書中に記載される活性測定方法を用いれば、作製した変異体が所望のβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するか否かを容易に決定し得る。【００６７】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を変化させない。【００６８】
代表的な保存性置換としては、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシルアミノ酸ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド型アミノ酸ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性アミノ酸ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香属アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換などが挙げられる。【００６９】
本明細書中において使用される場合、変異体の他の例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１由来のＣＥをコードする塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。【００７０】
本明細書中において使用される場合、変異体の別の例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１由来のＣＥをコードする塩基配列の相補配列の１個もしくは数個の塩基が置換、付加、欠失もしくは挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。【００７１】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋとＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。【００７２】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。【００７３】
本明細書中において使用される場合、変異体の別の例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１由来のＣＥをコードする塩基配列と少なくとも５０％同一、より好ましくは少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７２％、７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％，９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。また、ＮＥ１株由来のＣＥとアミノ酸レベルで相同性を示す天然の配列は、最高でも５１％の相同性を示すに過ぎない。なお、この配列は、クロストリディウム  ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＮ−アシルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉタンパク質（登録番号Ｑ１ＦＫＶ５）である。【００７４】
例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一であるということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。【００７５】
任意の特定の核酸分子が、例えば、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対して、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７２％、７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％，９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ｔ．Ｆ．ＳｍｉｔｈとＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（本明細書中に参考として援用される））を用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す。最も相同性が高い（Ｂｅｓｔｆｉｔ）または任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。【００７６】
特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｄ．Ｌ．Ｂｒｕｔｌａｇら（１９９０）のアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６，２３７（本明細書中に参考として援用される））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ，ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１，Ｊｏｉｎｉｎｇ，  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０，Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１，Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５，Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５，Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。【００７７】
以上のように、本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは、セロビオースに対する２−エピメラーゼ活性を有するが、ラクトースまたはセロビオース以外のセロオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性をも有する。このような性質を併せ持つ本発明に係るポリペプチドは、新規オリゴ糖の合成に非常に有用である。【００７８】
なお、本発明に係るポリペプチドを用いてヘテロオリゴ糖を合成する方法は、特許文献４に記載されるような合成法と比較して、以下のような利点を有する：（１）１基質−１酵素の反応であるので、反応系が簡便かつ安価である；（２）反応副生物が無いため目的の生成物の精製が容易であり、大量生産に好適である；（３）非還元末端糖についての基質特異性が厳密ではないので、上述した合成法では合成し得ないヘテロオリゴ糖を合成することができる。【００７９】
〔１−２〕ポリヌクレオチド
上述したように、本発明はまた、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。【００８１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。【００８２】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド、トリヌクレオチドといわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドはより長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。【００８３】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。【００８４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。【００８５】
なお、本発明のＣＥの全塩基配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号１）にはそれぞれシグナル配列およびシグナルペプチドは存在しないので、ＣＥが菌体内酵素であることは明白である。但し、このことは、未だ未発見の分泌機構がＣＥに存在することを完全に否定するものではないことを付記しておく。【００８６】
本発明の目的は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、およびβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、およびβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意すべきである。【００８７】
〔２〕抗体
上述したように、本発明はまた、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。【００８８】
ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Ｍ．Ｃｈｏｗら、（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，９１０、およびＦ．Ｊ．Ｂｉｔｔｌｅら、（１９８５）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２３４７（これらはいずれも本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。【００８９】
本明細書中で使用される場合、本発明に係る「抗体」は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｒ．Ｌ．Ｗａｈｌら、（１９８３）  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４，３１６（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。【００９０】
さらに、本発明に係るポリペプチドのペプチド抗原と結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力が本発明に係るポリペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなる本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。【００９１】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、本発明に係るポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。【００９２】
本発明に係る抗体は、キメラモノクローナル抗体であり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。既報については、Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，１２０２；Ｖ．Ｔ．Ｏｉら、（１９８６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４，２１４；Ｓ．ＣａｂｉｌｌｙおよびＨ．Ｌ．Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍ．ＴａｎｉｇｕｃｈｉおよびＭ．Ｋｕｒｏｓａｗａ、ＥＰ  １７１４９６；Ｓ．Ｌ．ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、ＥＰ  １７３４９４；Ｍ．Ｓ．ＮｅｕｂｅｒｇｅｒおよびＴ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒ．Ｒ．ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＡ．Ｙ．Ｌｉｕ、ＷＯ  ８７０２６７１；Ｇ．Ｌ．Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６４３；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ，３１４，２６８（これらはいずれも本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。【００９３】
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係るポリペプチドを認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。【００９４】
このように、本発明に係る抗体を用いれば、本発明に係るポリペプチドであるβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを容易に取得し得、アフィニティークロマトグラフィー等と組み合わせることにより、本発明に係るポリペプチドを生産することができる。すなわち、本発明は、上記抗体を用いるポリペプチドの生産方法、上記抗体を備えているポリペプチド生産用キットもまた提供し、ポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【００９５】
〔３〕ベクター
本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。【００９６】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。【００９７】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。【００９８】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。【００９９】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子などが挙げられる。【０１００】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。【０１０１】
本発明に係るベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを合成することができる。【０１０２】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０１０３】
このように、本発明に係るベクターを用いれば、本発明に係るポリペプチドを容易に生産することができる。すなわち、本発明は、上記ベクターを用いるポリペプチドの生産方法、上記ベクターを備えているポリペプチド生産用キットもまた提供し、ポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【０１０４】
〔４〕形質転換体
本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明に係るポリペプチドを容易にかつ大量に生成することができる。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図されるが、細胞（特に、原核生物細胞、菌類（例えば、糸状菌など）であることが好ましい。【０１０５】
本発明に係る形質転換体は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現していてもよい。【０１０６】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが発現され得るように生物中に導入することによって取得される。【０１０７】
このように、本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明に係るポリペプチドを容易に生産することができる。すなわち、本発明は、上記形質転換体を用いるポリペプチドの生産方法、上記形質転換体を備えているポリペプチド生産用キットもまた提供し、ポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【０１０８】
〔５〕ヘテロオリゴ糖を合成するためのキット、試薬組成物および方法
本発明は、ヘテロオリゴ糖を合成するためのキット、試薬組成物および方法を提供する。本発明を用いれば、Ｇｌｃ−Ｍａｎを従来法よりもはるかに簡便に合成することができるだけでなく、新規オリゴ糖を容易に取得することができる。【０１０９】
本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するためのキットは、本発明に係るポリペプチドを備えている。本発明に係るキットは、本発明に係るポリペプチド以外に、該ポリペプチドの酵素反応を促進するための試薬、または該酵素反応を適切に行うための試薬を一緒に備えていてもよく、これらの試薬は酵素反応に応じて適宜選択され得る。本発明に係るキットを適用する際に使用される炭素源としては、特に限定されないが、セロオリゴ糖（２糖、３糖、４糖、５糖、６糖など）およびラクトースが挙げられる。これらの炭素源を得るためのバルク資材としては、セロオリゴ糖については、セルロースを含む未利用資源または低利用資源（例えば、パルプなど）が挙げられるがこれらに限定されず、β−１，４結合多糖を含むヘミセルロースもまたバルク資材として挙げられる。また、ラクトースについては、バルク資材として、ウシ、ヤギやヒツジなどの生乳、粉ミルク、乳清（ホエイ）等が挙げられる。これらのバルク資材は、直接用いられても、分解酵素（例えば、セルラーゼおよびキシラナーゼなど）を添加して予め分解させておいてもよい。【０１１０】
本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための試薬組成物は、本発明に係るポリペプチドを含む。本発明に係る試薬組成物は、本発明に係るポリペプチド以外に、上述した該ポリペプチドの酵素反応を促進するための試薬、または該酵素反応を適切に行うための試薬を一緒に含んでもよい。本発明に係る試薬組成物を適用する際に使用される炭素源としては、特に限定されないが、セロオリゴ糖（２糖、３糖、４糖、５糖、６糖など）およびラクトースが挙げられる。これらの炭素源を得るためのバルク資材としては、上述した通りである。【０１１１】
本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための方法は、本発明に係るポリペプチドを用いる。一実施形態において、本発明に係る方法は、本発明に係るポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖とともにインキュベートする工程を包含する。上記オリゴ糖は、ラクトースまたはセロオリゴ糖であることが好ましい。本発明に係る方法を適用する際に使用される炭素源としては、特に限定されないが、セロオリゴ糖（２糖、３糖、４糖、５糖、６糖など）およびラクトースが挙げられる。これらの炭素源を得るためのバルク資材としては、上述した通りである。なお、ＨＰＬＣ、シリカゲル、活性炭カラムクロマトグラフィーなどを用いれば、合成したヘテロオリゴ糖を大量生産レベルで精製することができる。【０１１２】
〔６〕機能性食品
「プレバイオティクス」は、Ｇ．Ｒ．ＧｉｂｓｏｎとＭ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ（１９９５）（Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５，１４０１）による定義では，「腸内フローラ（消化管内に生息している微生物群（主に嫌気性菌））のバランスを改善することによって宿主の健康に好影響を与える、食品。」とされており、本明細書中で使用される場合、「動物（ヒトを含む）の腸内環境において有用な微生物（例えば、乳酸菌、ビフィズス菌などのプロバイオティクス）を増殖させて、腸内環境の改善を促進する物質」が意図され、有用微生物増殖因子ともいう。代表的なプレバイオティクスとしては、オリゴ糖などの難消化性物質、プロピオン酸菌による乳清発酵物、および食物繊維などが挙げられ、オリゴ糖は、プロバイオティクスのエサとなり、食物繊維は腸内細菌を貯留させてその増殖を補助する。【０１１３】
プレバイオティクスの効果としては、ミネラル分吸収促進効果、血中コレステロールや中性脂肪値の抑制、動脈硬化の予防、血糖値の抑制、糖尿病の改善、肥満の改善、腸の運動の活性化、便秘の改善、免疫能の活性化、感染症の予防、癌の予防、血中アンモニア値の抑制、肝機能低下による肝性脳症の改善、腸内細菌によるビタミン類合成の促進、各種ミネラルの吸収の促進、潰瘍性大腸炎の症状の改善などが挙げられるが、これらに限定されない。また、プレバイオティクスの摂取によってミネラル（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋など）の吸収が改善されることが、最近の研究によって明らかにされており、特にＣａ２＋の吸収促進効果が注目されている。オリゴ糖は、ミネラル分吸収促進効果を有する場合がある。この作用機序は、オリゴ糖が小腸または大腸の内面の細胞と細胞との間の細胞相互結合組織の隙間（いわゆる、タイトジャンクション（ＴＪ））を広げることによって各種ミネラルの吸収が促進されるためであると考えられている。【０１１４】
以下の実施例に示すように、本発明に係るポリペプチドを用いてβ−１，４結合を有するラクトースから合成したヘテロオリゴ糖であるエピラクトースを合成する方法を用いればプレバイオティクスとしての機能性食品が提供され得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。【０１１５】
例えば、実施例５に示されるように、ビフィズス菌は、エピラクトースを資化することができる（表６）。また、実施例９に示されるように、エピラクトースはラットの盲腸内ビフィズス菌の増殖を促進させ、ｐＨの低下（表９）と盲腸内の短鎖脂肪酸量と有機酸量を増加させることができるので(表１０)、腸内環境を改善することができ、腸内環境改善用機能性食品として利用することができる。【０１１６】
また、実施例７と８に示されるように、エピラクトースはミネラル吸収能促進能を有しており（図８、９と１０）、従ってミネラル吸収能促進剤又はミネラル吸収促進用機能性食品として利用することができる。【０１１７】
さらに、実施例９に示されるように、エピラクトースは盲腸内容物を増加させるので（表９）、便秘改善剤として利用することができる。【０１１８】
さらに、実施例１０に示されるように、エピラクトースは血中コレステロール量を減少させることができ（図１１と１２）、従って脂質代謝改善剤又は脂質代謝改善用機能性食品として利用することができる。【０１１９】
また、エピラクトースは胃や腸で消化吸収されにくく(表７)、低カロリーであると共に、実施例１１に示されるように、摂食後の血糖値の上昇も見られないことから（図１３）、血糖値の上昇を避ける必要のある糖尿病患者用機能性食品として利用することができる。【０１２０】
また、エピラクトースは甘味が弱いので、低カロリー性低甘味剤として利用することができる。【０１２１】
すなわち、本発明は機能性食品およびその製造方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る機能性食品は、β−１，４結合を有するオリゴ糖であるエピラクトースを含んでいることを特徴としており、ビフィズス菌の成長促進剤、便秘改善剤、脂質代謝改善剤、低カロリー性食品またはミネラル吸収能促進剤であることが好ましい。なお、本発明に係る機能性食品は、エピラクトース以外のさらなる機能性物質を含んでもよい。【０１２２】
他の実施形態において、本発明に係る機能性食品は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを用いて生産される化合物を含んでいることを特徴としている。【０１２３】
本実施形態に係る機能性食品を製造するためには、上記のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させ、反応産物を食品に添加すればよい。例えば、上記のポリペプチドをラクトースと反応させることでエピラクトースを反応産物として製造することができるが、この反応産物は前述の通り、腸内環境改善作用、ミネラル吸収能促進作用、脂質代謝改善作用、低カロリー性、さらには血糖値の上昇をもたらさない等の機能を有していることから、前記反応産物を他の食品に添加することで、前記反応産物が有する機能が付加された機能性食品を製造することができる。さらに反応産物であるエピラクトースは、スクロースより低甘味であるので、甘みを抑えつつ、低カロリーの飲食品を製造するための低カロリー性低甘味料として利用することができる。【０１２４】
反応産物であるエピラクトースは、ラクトースを含む天然原料である乳、特にウシ、ヤギあるいはヒツジなどの家畜乳を生乳のまま、あるいは脱脂してから、上記のポリペプチドと反応させることで製造することができる。また、家畜乳から回収されるホエイ（乳精）画分や、低脂肪乳、低タンパク乳、脱脂・脱タンパク乳あるいは低乳糖乳などの加工乳を上記のポリペプチドと反応させることでも、エピラクトースを製造することができる。【０１２５】
なお、本発明は、プロバイオティクスとプレバイオティクスとを組み合わせたシンバイオティクスおよびその製造方法として提供されてもよい。【０１２６】
以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２７】
〔実施例１：ＮＥ１株の分離法と菌学的性質〕
［１．菌株の分離法］
カニューレ付きの牛からルーメン内容物を採取し、嫌気性希釈液（Ｍ．Ｐ．ＢｒｙａｎｔとＬ．Ａ．Ｂｕｒｋｅｙ（１９５３）  Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．３６，２０５）を用いて１０５倍に希釈した。希釈液をイノキュラムとしＲＧＣＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に記載））培地のロールチューブを作製した。ロールチューブ内寒天表層に出現したコロニーをＲＭ−濾紙培地に接種し、濾紙を崩壊させた株を選択した。ＲＭ培地の組成を表１に示した。【０１２８】
【表１】
2008062555.tif 000003
【０１２９】
［２．ＣＥ活性測定］
定性的測定法として、共存すると考えられるβ−グルコシダーゼ活性を阻害する目的で、Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．８）１０μＬ、１００ｍＭ  セロビオース５μＬ、酵素液１０μＬ）を精製過程に用いた。３０℃で反応させ、酵素活性の強弱によって反応時間を調整し、５分間煮沸することにより反応を停止させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて反応生成物を同定した。反応液２．５μＬを０．５ｍｍ厚ガラスプレートＳｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）にスポットした後、展開液［２−プロパノール／１−ブタノール／Ｈ２Ｏ＝７：１：２、ｖ／ｖ］で展開した。乾燥後、ｐ−アニスアルデヒド溶液を噴霧し、ホットプレートまたはオーブンで加熱して発色させた。【０１３０】
定量的測定法を、以下の方法に従って行った。反応液の組成を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３．２ｍＬ、１００ｍＭ  ラクトースを６．２ｍＬ（２１２ｍｇ）、酵素液１．６ｍＬ（１０．９μｇ）とし、３０℃で２０分間または４０分間反応させた。サンプルを５分間煮沸することによって反応を停止させた後、イオン交換樹脂（ＡＧ５０１−Ｘ８レジン、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに供し、遠心分離により非吸着性画分を得た。このうちの１０μＬを高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０  （Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：水、流速：０．６ｍＬ／分、カラム温度：８０℃、検出器：気化光散乱検出器（オルテック））に供し、おおよそ１７分の保持時間で溶出されるエピラクトースに由来するピークの面積から反応液中のエピラクトース濃度を計算した。検量線は試薬のエピラクトース（Ｓｉｇｍａ）を用いて作成した。酵素反応速度は、反応が直線的に進行する反応開始２０分後から４０分後の間に生成するエピラクトースにより計算し、１分間に１μｍｏｌのエピラクトースを生成する反応速度を１ユニット（Ｕ）と定義した。酵素の比活性は牛血清アルブミンを標準タンパク質として計算し、Ｕ／ｍｇとして表示した。【０１３１】
［３．ＮＥ１株の菌学的性質］
得られた分離菌の中で、高いＣＥ活性を有する菌を選択しＮＥ１株と命名した。本菌は絶対嫌気性菌であり、生育条件により、単独、二連鎖または短連鎖で存在し、球状または卵形（０．３〜１．５×０．７〜１．８μｍ）であった。また、本菌は、グラム陽性であり、セルロース、セロビオース、キシラン、ラクトース、グルコースを資化した。【０１３２】
［４．ＮＥ１株染色体ＤＮＡの調製］
ＲＭ−Ｃ培地を用いてＲ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１を培養した後、遠心分離により培養上清を除去した。得られた沈殿を５．６７ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）（ＴＥ）に懸濁し、０．３ｍＬの１０％  ＳＤＳと９μＬの２０ｍｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ（ＴａＫａＲａ）を添加し、混合した後に３７℃で１時間保温した。反応液に１．２５ｍＬの４Ｍ  ＮａＣｌを添加して穏やかに混合し、塩濃度を０．７Ｍに調製した後、０．８ｍＬの１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）／０．７Ｍ  ＮａＣｌを添加して６５℃で１０分間保温した。８ｍＬのクロロホルムを加え、室温で３０分間かけてゆっくり混合した。６，０００ｒｐｍで２０分間、室温による遠心分離によって水層、中間層、フェノール層に分け、水層を回収した。回収した水層に等量のフェノール／クロロホルムを加え、室温でゆっくりと混合した。再び、６，０００ｒｐｍで２０分間、室温による遠心分離によって水層、中間層、フェノール層に分け、水層を回収した。回収した水層に等量の２−プロパノールを加えてゆっくりと混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を回収し、７０％エタノールでリンスした後、４℃で１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心した。得られた染色体ＤＮＡを、適量のＴＥに溶解し、−２０℃で保存した。【０１３３】
［５．ＮＥ１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の決定］
上述の染色体ＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして用い、２７ｆプライマーおよび１４９２ｒプライマーを用いて１６Ｓ  ｒＤＮＡをコードする領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲを、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅを用いて行い、ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑを使用した。増幅断片をアガロースゲル電気泳動によって分離後ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。精製断片をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。これをアンピシリン濃度が５０μｇ／ｍＬのＬＢ寒天培地に塗布し、シングルコロニーを形成させた。形成したコロニーを拾い、アンピシリン濃度が５０μｇ／ｍＬのＬＢ液体培地で培養した。培養液を遠心により集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いプラスミドの回収を行なった。調製したプラスミドをテンプレートとし、ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｍｉｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてシーケンス反応を行い、シーケンス解析にはＣＥＱ８０００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した。反応溶液の組成はマニュアルに従い、反応時間および温度は、目的断片のサイズあるいは反応に用いたプライマーに応じて決定した。なおシーケンス反応およびＰＣＲに使用したプライマー（配列番号５〜１１）の一覧を表２に示した。得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列が配列番号３である。配列番号３に示した塩基配列は、標準菌株（ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＡＴＣＣ２７２１０のものと９９％の相同性を示した。上述の菌学的性質に鑑みて、ＮＥ１株はＲ．ａｌｂｕｓであると同定された。【０１３４】
【表２】
2008062555.tif 000004
【０１３５】
〔実施例２：Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１のＣＥの調製〕
［１．培養方法］
実施例１にて得られたＲ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１株を使用した。前培養用液体培地としてＲＭ培地に１％セロビオースを添加した。ＡＴＣＣマニュアルに記載されているＲＧＣＡ培地を改良したＲＧＣ培地、Ｔｙｌｅｒら（非特許文献１）が報告した培地なども使用可能であるが、我々の培地はより簡便に調製し得る。
前培養の場合、加圧培養試験管（三紳工業）に上述の培地２０ｍＬを入れ、嫌気性菌培養装置ＡＧ−２（三紳工業）を用いて試験管内を二酸化炭素ガスで置換した後、滅菌した。凍結保存状態にある菌体を氷上で融解した後、１ｍＬを接種し、３５℃で２４時間静置培養した。【０１３６】
本培養の場合、１Ｌまたは５００ｍＬの広口メジュームビン（ＩＷＡＫＩ）にそれぞれ７５０ｍＬ、３７５ｍＬの上述の培地を入れ、嫌気性菌培養装置ＡＧ−２を用いてメジュームビン内を二酸化炭素ガスで置換した後、滅菌した。本培地にそれぞれ２０ｍＬ、１０ｍＬの前培養液を接種し、３５℃で１週間静置培養した。なお、接種する際も嫌気性菌培養装置ＡＧ−２により、二酸化炭素置換を行った。通常、炭素源としては、セロビオースまたは濾紙を適宜用いればＣＥが効率よく菌体内に発現される。前培養で得られた培養液を、加圧培養試験管に入れたまま−８０℃で保存した。【０１３７】
［２：粗酵素液の調製］
上述の培地を用いてＲ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１を１週間培養した後、遠心分離により菌体を回収した。１５ｍＬの１ｍＭ  フェニルメタンスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液Ａ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール）に懸濁後，フレンチプレスにより菌体を破砕した。菌体破砕後、１２，０００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とした。得られた培養上清に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩穏やかに撹拌した後、１２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した。得られた沈殿を、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール）に懸濁した後、緩衝液Ａで透析したものを粗酵素液とした。なお、培養後の操作を全て４℃で行った。【０１３８】
［３．ＣＥの精製］
（１）陰イオン交換クロマトグラフィー
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる場合、サンプルを緩衝液Ａで透析した後、予め同緩衝液で平衡化した担体に供した。ＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．６Ｍへ増加させる直線濃度勾配によって溶出を行い、４ｍＬずつ１００画分を回収した。【０１３９】
ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる場合は、ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、上記と同様の操作を行った。ただし、ＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．５Ｍへ増加させる直線濃度勾配によって溶出を行い、０．５ｍＬずつ１００画分を回収した（流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ）。【０１４０】
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で得られた活性画分に硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和とした後、ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＲＥＳＯＵＲＳＥ  ＥＴＨ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。担体を、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０％飽和硫酸アンモニウム）で予め平衡化しておいた。硫酸アンモニウム濃度を５０％飽和から０％飽和へ減少させる直線濃度勾配によって溶出を行い、１．５ｍＬずつ１００画分を回収した（流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ）。溶出画分を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩した後、活性測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。【０１４１】
（３）吸着クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィーで得られた活性画分を緩衝液Ｃ（５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール）で透析した後、同緩衝液で予め平衡化しておいたヒドロキシアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；和光純薬工業）に供した。吸着後の洗浄を、緩衝液Ｄ（５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５Ｍ  ＫＣｌ）を用いて行った。リン酸濃度を５ｍＭから２００ｍＭへ増加させる直線濃度勾配によって溶出を行い、４ｍＬずつ１００画分を回収した。【０１４２】
（４）ゲルろ過クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ）で得られた活性画分４．５ｍＬを０．９ｍＬずつ５つに分画した。各画分を、ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、緩衝液Ｅ（２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）で予め平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。同緩衝液にて溶出を行い、２５０μＬずつ５０画分を回収した（流速：０．５  ｍＬ／ｍｉｎ、溶出開始２０分後から回収）。【０１４３】
［４．ＣＥ活性測定］
実施例１に記載の手順に従い、ＣＥ活性を定性的および定量的に測定した。【０１４４】
［５．タンパク質の定量］
ブラドフォード法（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８）に従って、タンパク質を定量した。検量線は牛血清アルブミンを用いて作製した。【０１４５】
［６．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０）に従って行った。４．８％濃縮ゲル、１０％分離ゲルを使用し、泳動装置にはＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて２０ｍＡの定電流で泳動した。泳動後のゲルを、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＳｉｌ−Ｂｅｓｔ  Ｓｔａｉｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＰＡＧＥ（ナカライテスク）を用いて染色した。【０１４６】
［７．Ｎ末端アミノ酸配列と塩基配列の解析］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲル中に含まれるタンパク質を、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  ＳＤ  ＳＥＭＩ−ＤＲＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写にはブロッティング緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  グリシン、０．１％  ＳＤＳ、２０％メタノール）を使用し、メンブレン１ｃｍ２あたり０．８ｍＡの定電流で１時間行った。転写後のメンブレンをポンソーＳで染色後、目的バンドを切り出し、プロテインシーケンサーを用いてＮ末端アミノ酸配列を解析した。【０１４７】
アガロースゲル電気泳動装置には、サブマリン型電気泳動漕Ｍｕｐｉｄ−２（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ）を使用し、電気泳動用アガロースには、Ａｇａｒｏｓｅ  Ｌ  ０３（ＴａＫａＲａ）を使用した。試料溶液には、泳動用色素（０．２５％  ブロモフェノールブルー、０．２５％  キシレンシアノール、３０％  グリセロール）を１／１０倍容加え、泳動用緩衝液に１×ＴＡＥ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０））を用いた。泳動後のゲルを、エチジウムブロマイドを加えた１×ＴＡＥ中に浸し染色した。ＤＮＡ分子量マーカーには、１Ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。電気泳動によって分離した各種ＤＮＡ断片のアガロースゲルからの回収を，ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を使用して、製造業者の指示書に従って行った。【０１４８】
［８．クローンの塩基配列およびアミノ酸配列の相同性解析］
Ｒ．ａｌｂｕｓ  ８株のゲノム情報をＴＩＧＲ（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）より得た。本遺伝子は未同定遺伝子として記載されている。ＤＲＡＷ３２（ＡｃａＣｌｏｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて塩基配列の解析を、ＢＬＡＳＴ（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）を用いて相同性検索を行った。塩基配列およびアミノ酸配列の多重整列（アラインメント）にはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３）を使用した。【０１４９】
Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定を、以下の方法に従って行った。なお、以下に述べる手法は一例であって、本発明を限定するものではない。【０１５０】
先ず、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ８株の染色体由来の未同定遺伝子の配列をもとにプライマー（５’−ＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＴＡ−３’（配列番号１３））を構築し、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った．９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。得られた反応生成物に基づいて、完全に一致するプライマー（５’−ＣＧＣＴＴＡＴＡＴＧＡＣＡＣＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１４）および５’−ＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１５））を構築し、ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＭＩＸ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて同様のサイクルでＰＣＲを行うことで，ＤＩＧで標識されたプローブを作製した。【０１５１】
単離したＲ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素（ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌＩＩ）を用いて消化した。３μｇの染色体ＤＮＡ当り１０Ｕの制限酵素を用いて３７℃で１２時間反応させた後，さらに１０Ｕの制限酵素を添加して１２時間反応させた。反応液を、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動に供した。３０Ｖの定電圧で４時間電気泳動して、ＤＮＡを分離した。分離したＤＮＡを、常法に従いナイロン膜であるＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に毛細管現象を利用して転写し，ＵＶ照射によりＤＮＡをナイロン膜に固定した。【０１５２】
ハイブリダイゼーションおよび検出には、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。上記の手順で調製した標識プローブならびにナイロン膜を使用して、ハイブリダイゼーションを６０℃で１６時間行った。プローブを、ハイブリダイゼーション溶液１ｍＬ当り１０ｎｇにて使用した。膜の洗浄を、０．１％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ溶液中にて６８℃で１５分間振盪させることで行い，同様の操作を合計３回行った。検出を、製造業者の指示書に従って行い、発光基質にはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。Ｘ線フィルムには、ＦＵＪＩ  ＭＥＤＩＣＡＬ  Ｘ−ＲＡＹ  ＦＩＬＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を使用し、１分間感光させた。【０１５３】
Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１の染色体ＤＮＡ３μｇを１０ＵのＥｃｏＲＩで消化し，フェノール／クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製した。精製後、エタノール沈殿を行い４μＬのＴＥに溶解し，４℃で一晩セルフライゲーションを行った。セルフライゲーション後の反応液を鋳型とし，プローブの配列をもとに設計したプライマー（５’−ＣＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＴＡＴＡＣＴＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１７））を用いてｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間の反応を３０サイクル行った。ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を鋳型としてシークエンス反応を行うことにより、ＣＥ遺伝子を含む近傍の塩基配列情報を取得した。得られた配列情報に基づいてＣＥ遺伝子全長を含む配列の取得を目的としたプライマー（５’−ＣＴＣＴＴＡＴＡＧＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１８）および５’−ＴＴＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧ−３’（配列番号１９））を作製し、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１の染色体ＤＮＡを鋳型に増幅したＤＮＡ断片をｐＴ７  Ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。【０１５４】
塩基配列を、Ｓａｎｇｅｒらのｄｉｄｅｏｘｙ法により決定した（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら、（１９７７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７４，５４６３）。ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片またはその増幅断片をｐＴ７  Ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトにサブクローニングし、精製したプラスミドを鋳型として，シークエンス反応を行った。シークエンス反応には、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。解析には、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  を用いた。【０１５５】
［９．基質特異性］
ＣＥの基質特異性を、ＴＬＣを用いて定性的に解析した。反応液の組成を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）１５μＬ、１００ｍＭ  各種基質５μＬ、精製酵素５μＬ（３４ｎｇ）とし、２５℃で一晩反応させた。サンプルを、５分間煮沸することによって反応を停止させた後、ＴＬＣに供した（展開溶媒系；２−プロパノール／１−ブタノール／Ｈ２Ｏ＝７：１：２）。【０１５６】
［１０．反応生成物の解析］
（１）ラクトースを基質とした場合
反応液の組成を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３．２ｍＬ、１００ｍＭ  ラクトースを６．２ｍＬ（２１２ｍｇ）、酵素液を１．６ｍＬ（１０．９μｇ）とし、２５℃で一晩反応させた。サンプルを５分間煮沸することによって反応を停止させ、全量をＴＬＣに供した。ＴＬＣプレートの一部を発色させ、反応生成物の移動度を測定した後にシリカゲルを削り取ることによって、生成物を単離した。得られた生成物を、シリカゲルの２倍量の脱塩水で抽出した後、ロータリーエバポレーター（東京理化機械）で濃縮した。本生成物は來雑物として微量のラクトースを含むので、全量を再びＴＬＣに供し、同様の操作を行うことで反応生成物を精製した。精製後の反応生成物５０μＬ（２６２μｇ）に８Ｍ  トリフルオロ酢酸を５０μＬ加え、３時間１００℃に放置することによって完全に加水分解させた。遠心濃縮器を用いて本反応液の溶媒を脱塩水に置換した後、反応性生物をＴＬＣに供することによって分解産物を定性的に同定した。【０１５７】
（２）セロトリオースを基質とした場合
反応液の組成を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）を４．１ｍＬ、１００ｍＭ  セロトリオースを２．７ｍＬ（１３６ｍｇ）、酵素液を１．８ｍＬ（１２．２μｇ）とし、上記と同様の操作を行うことによって反応生成物を分離精製した後、高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置（ＢＲＵＫＥＲ  ＡＭＸ−５００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（５００ＭＨｚ））に供し、１Ｈおよび１３Ｃのスペクトラを測定した（１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ）。【０１５８】
〔Ｂ．結果〕
［１．ＣＥの精製］
５段階のクロマトグラフィーにより、電気泳動的に単一のタンパク質を得た（図３）。収率は約０．２％（１０２μｇ）であった。各種緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）でＣＥ活性を測定したところ、グリシルグリシン−ＮａＯＨにおいて最も高い活性を示した。この緩衝溶液中での酵素の比活性は３．６Ｕ／ｍｇであった。【０１５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上から推定される精製酵素の分子量は約４３．１ｋＤａであった。精製酵素の分子吸光係数（Ｅ値、１％酵素溶液で２８０ｎｍにおける吸光度）は約１８であった（牛血清アルブミンを標準タンパク質とした場合）。また、酵素活性の最大活性はｐＨ７．７〜８．２にある（４０ｍＭ  ブリットン−ロビンソン緩衝液中）であり、酵素活性の最大活性は２８〜３２℃（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液中）であった。酵素活性は、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋，Ａｇ＋、Ｎ−ブロモスクシミド、ヨード酢酸、ｐ−クロロマーキュリーベンゾエート（各々１ｍＭ）で阻害された（酵素を３０℃で３０分前処理した場合）。【０１６０】
（表３：ＣＥ精製の工程）【０１６１】
【表３】
2008062555.tif 000005
【０１６２】
［２．Ｎ末端アミノ酸配列の解析および基質特異性］
精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、目的バンドを切り出した。目的のタンパク質のＮ末端配列を解読した。得られたＮ末端配列はＭＭＩＳＥＩＲＱＥＬＴＤＨＩＩＰＦＷＮＫＬＲＤ（配列番号４）であった。類似性を有するアミノ酸配列をＢＬＡＳＴにて検索したが、高い相同性を示すアミノ酸配列は得られなかった（データは示さない）。【０１６３】
そこで、一部ゲノム配列が明らかとなっているＲ．ａｌｂｕｓ  ８株のゲノムデータベースＴＩＧＲで、本配列と類似性を持つアミノ酸配列を検索した結果、２３残基のうち１８残基が一致する配列ＭＭＫＥＥＶＫＱＥＬＴＳＨＩＩＰＦＷＮＫＬＲＤ（配列番号２０）を見出した。Ｒ．ａｌｂｕｓ  ８株のゲノムデータベースに掲載されているこのタンパク質は、バクテロイデス  フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＹＣＨ４６、ミクロブルビファー  デグラダンス（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）２−４０由来のＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉとそれぞれ４０％、３７％の割合でアミノ酸配列が一致していた。ＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉは、アセチルグルコサミンの２位の水酸基を異性化し、Ｎ−アセチルマンノサミンを生成する酵素である。【０１６４】
そこで、本発明の酵素を、ＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉの基質であるアセチルグルコサミンを基質とするＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉ活性について薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認したところ、反応生成物は得られなかった。また、これまでに報告のあるエピメラーゼの活性を有するか否かを検討するために、本発明の酵素を、ＵＤＰ−グルコース、グルコース−６−リン酸および種々の単糖を基質とした反応に供したが、いずれの反応においても反応生成物は得られなかった。【０１６５】
本発明の酵素を、代表的な２糖であるマルトース（α−１，４）、スクロース、ソホロース（β−１，２）、ラミナリビオース（β−１，３）およびゲンチオビオース（β−１，６）を基質とした酵素反応に供した場合も、反応生成物は得られなかった。しかし、驚くことに、本発明の酵素を、ラクトース（β−１，４）を基質とした反応に供したところ、基質以外のスポットが反応生成物として検出された。これまでに、ラクトースを基質としてヘテロオリゴ糖を生成するエピメラーゼは知られていない。また、本発明の酵素を、少なくともセロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースとともに反応に供した場合も、基質以外のスポットが反応生成物として検出された（図４）。【０１６６】
以上の結果、ならびにセロペンタオースおよびセロヘキサオースを基質とした場合の結果を表４にまとめた。これらの結果から、本酵素がこれまでに報告されたエピメラーゼとは全く異なる基質特異性を有する新規エピメラーゼ酵素であることが明らかとなった。また各種糖の反応性から、本酵素がβ−１，４結合を有するオリゴ糖のみに作用する可能性が示唆された。【０１６７】
また、エピラクトースまたはＧｌｃ−Ｍａｎを基質として反応させた際の生成物が、それぞれラクトースまたはセロビオースであることを、ＴＬＣで確認した（図は示さず）。この結果は、本発明に係るＣＥが可逆的触媒反応を行なうことを示している。【０１６８】
（表４：精製タンパク質の基質特異性）【０１６９】
【表４】
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【０１７０】
［３．反応生成物の同定］
上述の基質特異性の解析から、セロビオース以外に、少なくともセロオリゴ糖およびラクトースが上記の新規酵素の基質になり得ることが明らかとなった。このことは、これまでに報告のない新規オリゴ糖が合成されたことを示唆する。【０１７１】
そこで、この生成オリゴ糖の構造を解析した。具体的には、ラクトースを基質として酵素反応を行い、反応生成物をＴＬＣにより分離した後、シリカゲルを削り取ることで生成物を単離した。この生成物を、トリフルオロ酢酸を用いて酸加水分解し、分解産物をＴＬＣにて検出したところ、ガラクトースおよびマンノースであることが観察された。このことから、この酵素はセロビオースと同様にβ−１，４結合を有するラクトースを基質とし、還元末端グルコースをマンノースに変換することで、新規オリゴ糖β−１，４ガラクトシルマンノース（エピラクトース）を生成したと考えられた。【０１７２】
〔実施例３：ＮＭＲによる反応生成物の構造解析〕
実施例２に記載の手順に従い、ラクトースからの生成物を精製した。抽出後のサンプルを濃縮し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を重水に置換した後、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲに供し、１Ｈおよび１３Ｃのスペクトラを測定した。なお、外部標準としてＴＳＰ（［２，２，３，３−Ｄ４］ｓｏｄｉｕｍ  ３−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）  ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）を用いた。得られたスペクトラは、市販のエピラクトース（Ｓｉｇｍａ）と完全に一致するものであった（図５）。【０１７３】
セロトリオースを基質とした場合の反応液の組成を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）を４．１ｍＬ、１００ｍＭ  セロトリオースを２．７ｍＬ（１３６ｍｇ）、酵素液を１．８ｍＬ（１２μｇ）とし、２５℃で一晩反応させた。５分間の煮沸で反応を停止し、全量をＴＬＣに供した。ＴＬＣプレートの一部を発色させ反応生成物の生成を確認後、シリカゲルを削り取りその生成物を単離した。シリカゲルの２倍量の脱塩水で抽出した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。本サンプルは夾雑物として微量のセロトリオースを含むため、再び全量をＴＬＣに供し、同様の操作を行うことで精製した。抽出後のサンプルを濃縮し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を重水に置換した後、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲに供した。なお、外部標準としてＴＳＰを用いた。得られたスペクトルは、過去に報告された細胞壁多糖由来グルコピラノシル−１，４−O−β−Ｄ−グルコピラノシル１，４−O−β−Ｄ−マンノース（Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ）のスペクトラと完全に一致した（Ｒ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、（１９９１）  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２１０，２６３）（図６、図７））。【０１７４】
〔実施例４：組換え酵素の調製〕
ＮＥ１株の成熟型ＣＥ酵素のアミノ酸配列および塩基配列は、配列番号１および配列番号２に示される配列であることが判明した。予め行なった実験により得られたＮ末端のアミノ酸配列（配列番号４）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のものと完全に一致していた。配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づけば、ＣＥの分子量は４５，２１７Ｄａであった。【０１７５】
ＣＥ酵素（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２に示される塩基配列を有する。）を以下の方法で発現させた。【０１７６】
［１．発現プラスミドの構築］
ゲノムＤＮＡを鋳型とし，ＣＥ遺伝子の全長をＰＣＲにより増幅した．９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。反応液からＤＮＡ断片を回収し、サブクローニングした増幅断片に変異が導入されていないことを確認した後、大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）ベクターに挿入した。【０１７７】
［２．酵素の誘導］
宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、発現プラスミドで形質転換した後、最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ寒天培地上で選抜し、同様の液体培地４ｍＬ中にて３７℃で一晩前培養した。５００ｍＬ容三角フラスコに入れた同液体培地２００ｍＬに前培養液４ｍＬを接種し（合計４００ｍＬ）、３７℃で２００ｒｐｍにて振盪培養を行った。６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。なお、培養後の操作を全て４℃で行った。【０１７８】
［３．菌体の破砕］
６，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、大腸菌の培養液４００ｍＬから菌体を回収した。この菌体を、１５ｍＬの１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ  ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール）に懸濁した後に、フレンチプレスにより破砕した。菌体破砕後、１２，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とした。【０１７９】
［４．組換え酵素の精製］
１）陰イオン交換クロマトグラフィー
上述の実施例において得られた粗酵素液を、予め緩衝液Ａで平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。溶出を、０Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配で行い、４ｍＬずつ１００画分に分けて回収した。【０１８０】
２）吸着クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた活性画分を緩衝液Ｂ（５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール）で透析した後、予め同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（和光純薬工業）に供した．吸着後の洗浄は緩衝液Ｃ（５ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５Ｍ  ＫＣｌ）を用いた。溶出を、５ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸直線濃度勾配で行い、４ｍＬずつ１００画分に分けて回収した。【０１８１】
３）組換え酵素の精製度
精製して得られた組換え酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一なバンドを与えた。収率が約７０％で、比活性が約１０Ｕ／ｍｇの精製標品２０ｍｇを得た。【０１８２】
４）組換え酵素の酵素化学的性質
上述の酵素化学的性質の実験手法を用いて試験したところ、本組換えＣＥは、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１由来のＣＥとほぼ同じ性質であった。【０１８３】
〔実施例５：ビフィズス菌によるエピラクトースの資化性〕
以下の手順に従って、ビフィズス菌を、エピラクトースを含む培地（表５）中で培養し、生育試験を行った。なお、供試したビフィズス菌株は、ビフィデバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）  ＪＣＭ１２５５、ビフィデバクテリウム  ブレベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）  ＪＣＭ１１９２、ビフィデバクテリウム  ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）  ＪＣＭ１２１７、ビフィデバクテリウム  アドレセンチス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）  ＪＣＭ１２７５、ビフィデバクテリウム  インファンチス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）  ＪＣＭ１２２２、ビフィデバクテリウム  カテヌラタム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）  ＪＣＭ１１９４である。
１．供試糖溶液を添加することにより培地が希釈されることを考慮して、培地の濃度を数倍の濃度で調製した。
２．供試糖溶液を、濾過滅菌した後に培地に添加した（最終濃度１％）。
３．１％グルコース含有培地中にて前培養した供試菌株の菌液を培地量の１％接種した。４．培養を、アネロパックケンキ（Ａｎｅｒｏｐａｃｋ  Ｋｅｎｋｉ；三菱ガス化学）を用いたガスパック法によって行った。嫌気条件下にて３７℃で１〜３日間培養し、供試菌株の資化性について検討した。【０１８４】
（表５．エピラクトース資化性試験培地の組成）【０１８５】
【表５】
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【０１８６】
エピラクトースの生育度を表６に示した。何れのビフィズス菌もエピラクトースを利用することができることが判明した。【０１８７】
（表６．ビフィズス菌のエピラクトース資化性）【０１８８】
【表６】
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【０１８９】
〔実施例６：エピラクトースの難消化性〕
エピラクトースの胃内および腸内での消化耐性を、以下の方法により調べた。【０１９０】
日本薬局方崩壊試験第１液（人工胃液）を用いて胃内での消化耐性を調べた。すなわち、１００ｍＭエピラクトース水溶液２５μＬに２倍濃度の人工胃液（０．４％塩化ナトリウム、１．４％濃塩酸）２５μＬを添加した後、３７℃で２時間静置した。１００ｍＭ  水酸化ナトリウムを添加して上記溶液を中和した後、ＡＧ５０１−ＸＢレジンに供し、遠心分離により非吸着性画分を得た。ＣＥ活性の定量的測定法と同様の方法で残存するエピラクトースを定量した。エピラクトースと同様にラクトース、スクロースについても消化耐性を調べた。【０１９１】
腸内での消化耐性を、Ｔ．Ｍｉｓｈｉｍａらの方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５３、７２５７（２００５））に従って調製したラット小腸粗酵素液を用いて調べた。すなわち、１００ｍＭ  エピラクトース水溶液２５μＬにラット小腸粗酵素液２５μＬを添加した後、３７℃で３時間静置した。上記溶液を５分間煮沸して含まれる酵素を失活させた後、ＡＧ５０１−ＸＢレジンに供し、遠心分離により非吸着性画分を得た。ＣＥ活性の定量的測定法と同様の方法で残存するエピラクトースを定量した。エピラクトースと同様にラクトース、スクロースについても消化耐性を調べた。【０１９２】
胃内および腸内でのエピラクトース、ラクトース、スクロースの消化耐性を表７に示す。エピラクトースは胃内および腸内において消化液に対して高い安定性を有していることが確認された。【０１９３】
【表７】
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【０１９４】
〔実施例７：エピラクトースのミネラル吸収促進作用〕
Ｃａｃｏ−２細胞は、ヒト大腸ガン組織から樹立された上皮細胞株であり、フラスコや透過性膜上に培養すると、極性を有する単層を形成する。また、Ｃａｃｏ−２細胞は、１０〜１５％ウシ胎児血清添加培地による２〜３週間程度の培養によって、分化誘導剤を使用することなく小腸上皮細胞様に分化する。細胞間にはＴＪが形成され、細胞の刷子縁膜側には微絨毛が形成される。そして、一部のミネラルはこのＴＪを介して吸収される。ラットを用いたｉｎ  ｖｉｖｏの実験にてＣａ２＋吸収促進作用の認められた難消化性糖類をＣａｃｏ−２に添加すると、Ｃａ２＋吸収が増加した。このＣａ吸収促進作用はＴＪを介した作用であることが示唆されている（Ｔ．ＳｕｚｕｋｉとＨ．Ｈａｒａ，(２００４)  Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３４、１９３５）。【０１９５】
そこで、Ｃａ２＋吸収促進作用を有する難消化性糖類の一種であるジフラクトースアンヒドリド（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏ−ｆｕｒａｎｏｓｅ  １，２’：２，３’  ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ；  ＤＦＡＩＩＩ）を対照として、エピラクトースのＴＪへの影響を検討した。【０１９６】
ヒト大腸ガン由来細胞株Ｃａｃｏ−２（ＨＴＢ３７、継代数１９）をＡＴＣＣから購入した。１００ｍＬ／Ｌのウシ胎児血清（非働化処理を実施、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ）、４４ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＭ  Ｎａ−ピルビン酸、５０，０００  ＩＵ／Ｌ  ペニシリン、および５０ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン硫酸を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に使用した。Ｃａｃｏ−２細胞を、７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、５％二酸化炭素および９５％空気の存在下にて３７℃で培養した。本実験では、継代数３９のＣａｃｏ−２細胞を使用した。【０１９７】
刷子縁膜側へ添加した難消化性糖類による細胞間透過性へ影響の評価には、試薬として、（１）Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ｐＨ  ７．４））、ならびに（２）１ＭのＤＦＡＩＩＩまたはエピラクトース（ＨＢＳＳに溶解）溶液を使用した。【０１９８】
トランズウェル・システム（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ；直径１２ｍｍ、ポアサイズ０．４μｍ、培養面積１．０ｃｍ２；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用した。細胞間の透過性の評価を、経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ）の測定により、以下の方法に従って実施した。
１．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに、０．６３×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播いたＣａｃｏ−２細胞を、２５−２６日間培養した。
２．Ｃａｃｏ−２細胞を培養したＴｒａｎｓｗｅｌｌの刷子縁膜側および基底膜側を、ＨＢＳＳで２回リンスした後、各々０．５ｍＬおよび１．０ｍＬのＨＢＳＳを充填した。
３．ＣＯ２インキュベーター内（５％二酸化炭素および９５％空気の存在下にて３７℃）で３０分間静置後、０ｍｉｎの測定値としてＴＥＲを測定した。
４．刷子縁膜側からの難消化性糖類の添加の影響を評価する場合は、最終濃度として、各難消化性糖類が０、２０、４０、８０ｍＭとなるように、刷子縁膜側の溶液に添加した。【０１９９】
その結果、図８に示すように、エピラクトースまたはＤＦＡＩＩＩのＣａｃｏ−２への添加によって、その濃度に依存してＴＥＲが低下し、８０ｍＭ添加の３時間後では、エピラクトースまたはＤＦＡＩＩＩのいずれを添加した場合においても、ＴＥＲが５００Ω・ｃｍ２付近まで低下した。【０２００】
また、難消化性糖類の添加３時間後のＴＥＲを測定した後、各難消化性糖類を除去、培養培地に交換した。培地交換２４時間後のＴＥＲは、エピラクトース、ＤＦＡＩＩＩともに初期値である１２００〜１４００Ω・ｃｍ２に戻っていた。【０２０１】
このように、エピラクトースは、ＴＪについてのミネラル吸収促進作用を有するＤＦＡＩＩＩと同様の作用を示した。これらの結果は、エピラクトースがＣａ２＋を含むミネラル吸収促進作用を有する可能性を示すものである。【０２０２】
［実施例８：ラットに対するミネラル吸収促進作用］
ラットにおけるエピラクトースのミネラル吸収促進作用を検討した。【０２０３】
（１）４週令のＷｉｓｔａｒ−ＳＴ系雄ラット（日本ＳＬＣ）をステンレスケージに個別に入れて飼育し、飼料および水（イオン交換水）を自由に摂取させた。毎朝同一時刻に体重および摂食量を計測した。動物個体の状態は、脱毛および／または下痢などを指標にして判定した。試験飼料は毎日、飲水は３日毎に交換した。なお、飼育室を、室温２３±１℃、温度６０％前後、明暗周期を１２時間（明期８：００〜２０：００、暗期２０：００〜８：００）に設定した。ＡＩＮ９３Ｇ標準精製飼料（基本食）で５日間飼育した後、表８に示す試験飼料（エピラクトース添加食、ラクトース添加食）またはコントロール食にて１５日間飼育した。【０２０４】
【表８】
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【０２０５】
飼育１２日目から４日間の糞を採集して凍結乾燥し、粉砕後、約１ｇを乾式灰化（５５０℃、１８時間）し、３％塩酸溶液に溶解後、原子吸光度法（偏光ゼーマン原子吸光度計、ＨＩＴＡＣＨＩ）により、ミネラルの測定を行った。飼料１ｇも同様の操作をおこなった。得られたミネラル量より、４日間のミネラルの吸収率を求めた。【０２０６】
結果は、図９に示すとおり、エピラクトース摂取により、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋の吸収率が増加することが確認された。【０２０７】
（２）１５日間の飼育終了後にラットを解剖して小腸を取り出し、生理食塩水で小腸内容物を洗い流した後、空腸と回腸にわけてそれぞれから約３ｃｍのセグメントを３つ作り、裏表を反転させた。反転したセグメントの片端を縫合絹糸（スペシャル縫合絹糸４号、ハシモト）で結紫した。他端は、内液（１２５ｍM  ＮａＣｌ、４ｍM  ＫＣｌ、１．２５ｍM  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３０ｍM  Ｔｒｉｓ、１０ｍM  Ｄ−グルコース、 ｐＨ７．４）０．７ｍＬをシリンジにより注入後、同様に結紫し、小腸反転サックを作成した。【０２０８】
作成した反転サックをＣａ２＋及びエピラクトースをそれぞれ０、５０、１００  ｍＭ含む外液（１２５ｍM  ＮａＣｌ、４ｍM  ＫＣｌ、１０ｍM  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、 ３０ｍM  Ｔｒｉｓ、１０ｍM  Ｄ−グルコース、 ｐＨ７．４、浸透圧はＮａＣｌ量で調整した）１５ｍＬの入った５０ｍＬ遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ウオーターバスにて３７℃、１１０  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ／ｍｉｎで振とうした。３０分間の振とう後、反転サック内の内液を回収し、Ｃａ２＋濃度を市販の測定キット（カルシウムＣテストワコー、和光純薬工業）にて測定した。また、小腸反転サックの長さを定規により測定した。その結果を図１０に示す。【０２０９】
図１０の縦軸は、サックに用いた小腸の長さ（ｃｍ）当たりのＣａ２＋吸収量で表した。エピラクトースの添加量に依存して、空腸、回腸ともに回収した内液中のＣａ２＋濃度が増加した。このことから、エピラクトースが大腸のみならず空腸および回腸においてもＣａ２＋吸収能を促進する機能を有していることが確認された。【０２１０】
〔実施例９：エピラクトースの腸内環境改善作用〕【０２１１】
実施例８の条件下でラットを１５日間飼育した後、エーテル麻酔下に開腹した。盲腸の両端を縫合糸で結紫して内容物を含む盲腸を摘出し、総盲腸重量を測定した。盲腸内容物を取り出した後、盲腸壁重量を測定した。総盲腸重量から盲腸壁重量を減じた値を盲腸内容物重量とした。盲腸内容物の一部に４倍量の脱イオン水を加えて（５倍希釈）、氷冷下でホモジナイズした。ホモジネートの一部を遠心分離し、上清のｐＨを測定した。さらにホモジネートに内部標準としてクロトン酸を加え、遠心分離後、上層を採取、同量のクロロホルムを加え、混合、遠心分離し、再び上層を集め、フィルターを通したものを有機酸分析用のサンプルとし、島津高速液体クロマトグラフ有機酸分析システムを用い、下記の分離条件及び検出条件で分析を行った。【０２１２】
分離条件
カラム：Ｓｈｉｍｐａｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈ（８ｍｍ Ｉ．Ｄ. × ３００ｍｍ）
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸水溶液
流量  ：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
温度  ：４０℃
検出条件
試薬  ：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸水溶液及び１００μＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ水溶液
流量  ：０．８ｍL／ｍｉｎ
検出器：ＣＤＤ−６Ａ
温度  ：４５℃【０２１３】
また、盲腸内容物の一部を嫌気性希釈バッファー（２０ｇ／Ｌ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｐｅｐｔｏｎｅ ｗａｔｅｒ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５ｇ／Ｌ―システイン（和光純薬工業）、１ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ  ８０（和光純薬工業）、１ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ （Ｄｉｆｃｏ））に懸濁し、さらにこれを希釈バッファーで希釈した。総嫌気性菌数の計数には５０ｍＬ／Ｌのウマ脱繊維血（日本バイオテスト）を添加したＢＬ寒天培地（栄研化学）を、乳酸菌数の計数には８ｇ／ＬのＬａｂ ｌｅｍｃｏ ｐｏｗｄｅｒ（Ｏｘｏｉｄ）および１．３ｍＬ／Ｌの酢酸を添加したＬＢＳ ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を用いた。盲腸内容物希釈液を塗布したプレートをアネロパックケンキ（三菱瓦斯化学）中、３７℃、２４時間培養した後に、コロニー数をカウントした。【０２１４】
Ｆｅｃａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Kｉｔ（ＭＯ Ｂｉｏ）を用いて盲腸内容物の一部からＤＮＡを抽出した。Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）を用いてビフィズス菌数をｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ法によって以下に示す条件で計数した。反応液の組成は２００ｎＭ ｇＢｉｆｉｆ−Ｆ、２００ｎＭ ｇＢｉｆｉｆ−Ｒ、1×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）とし、初期変性９５℃、３０秒間の後、９５℃で５秒間、６４℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の反応を４３サイクル行った。【０２１５】
なお、統計解析には、Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを行い、Ｐ値が０．０５以下の場合に、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒａｎｇｅ  Ｔｅｓｔを用いて平均値間の有意差を判定した。  【０２１６】
総盲腸重量、盲腸壁重量、盲腸内容物重量と盲腸内容物のｐＨを表９に、盲腸内容物中の有機酸含有量を表１０に示す。【０２１７】
【表９】
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【０２１８】
【表１０】
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【０２１９】
表９に示すように、エピラクトース添加飼料の摂取によって盲腸内容物重量、盲腸壁重量がコントロール食を摂取した群と比較して有意に増加した。盲腸内内容物の増加は排便回数の増加を意味しているので、エピラクトースは便秘の改善作用を有するものと期待される。【０２２０】
また、表１０に示されるように、盲腸内容物中の有機酸量については、エピラクトース摂取群で短鎖脂肪酸量が有意に増加し、総短鎖脂肪酸量はコントロール群の3.2倍となった。さらに、コハク酸量はコントロール群の１２０倍となった。また有機酸量の増加に伴い、盲腸内容物中のｐＨはエピラクトース摂取群で低下した。【０２２１】
盲腸内総嫌気性菌数（ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ内容物）は、コントロール食群９．４±０．２に対して、エピラクトース添加食群で１０．２±０．２と増加傾向を示した。乳酸菌数（ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ内容物）は、コントロール食群７．５±０．４に対して、エピラクトース添加食群で９．１±０．１となり、エピラクトース添加飼料摂取により１０倍程度増加した。さらに、ビフィズス菌数(ｌｏｇ１０ コピー数／ｇ内容物)は、コントロール食群５．６±０．３に対して、エピラクトース添加食群で７．８±０．３となり、エピラクトース添加飼料摂取により１５０倍程度増加した。【０２２２】
このように、ビフィズス菌や乳酸菌といった善玉菌がエピラクトース添加飼料により増加し、これらの菌によってエピラクトースの発酵が進んだものと結論され、エピラクトースのプレバイオティクスとしての有効性が示された。【０２２３】
［実施例１０：エピラクトースの脂質代謝改善作用］
4週令のＷｉｓｔａｒ−ＳＴ系雄ラット（日本ＳＬＣ）をステンレスケージに個別に入れて飼育し、飼料および水（イオン交換水）を自由に摂取させた。毎朝同一時刻に体重および摂食量を計測した。動物個体の状態は、脱毛および／または下痢などを指標にして判定した。試験飼料は毎日、飲水は３日毎に交換した。なお、飼育室を、室温２３±１℃、温度６０％前後、明暗周期を１２時間（明期８：００〜２０：００、暗期２０：００〜８：００）に設定した。ＡＩＮ９３Ｇ標準精製飼料（基本食）で５日間飼育した後、前記表８に示す試験飼料（エピラクトース添加食、ラクトース添加食）またはコントロール食にて１５日間飼育した。【０２２４】
飼育開始日と７日後、１４日後に９時（摂食時）と２０時（絶食時）に尾静脈より採血を行い、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、血漿を回収し、中性脂質、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、コリン型リン脂質を、それぞれＴＧ-ＥＮカイノス（（株）カイノス）、コレステロールＥテストワコー（和光純薬工業）、ＨＤＬ、コレステロールテストワコー（和光純薬工業、ＰＬ−ＥＮカイノス（（株）カイノス）を使用して測定した（図１１）。ＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロールは、総コレステロール値よりＨＤＬコレステロール値を減算して求めた。また、１５日間の飼育終了後にラットを解剖して腹部大動脈血を採取し、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、同様にして血漿中の中性脂質、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、コリン型リン脂質を測定した（図１２）。なお統計解析には、Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを行い、Ｐ値が０．０５以下の場合に、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒａｎｇｅ  Ｔｅｓｔを用いて平均値間の有意差を判定した。【０２２５】
その結果、中性指質とリン脂質の濃度変化は確認されなかったが、総コレステロール値とＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロール値は、エピラクトース添加食群においてコントロール群に比べ低下していることが確認された。【０２２６】
［実施例１１：エピラクトース摂食時の血糖値変化］
７週齢の雌性ｄｄＹマウス（日本ＳＬＣ、１群６匹）を一晩絶食後、ラクトースあるいはエピラクトース（各０．１ｍｍｏｌ／匹）を経口投与し、投与０、３０、６０、１２０分後に尾静脈より採血し、血糖値をグルコースＣＩＩテストワコーを用いて測定した。結果を図１３に示す。
図１３に示されるように、ラクトース投与群では投与後血糖値が有意に上昇し、投与３０分後に最高値を示す一方、エピラクトース投与群では血糖値の増加は認められなかった。本結果は、表７に示した消化性結果と合わせて、エピラクトースが低カロリー性を有することを示している。【０２２７】
ＣＥは、セロビオースの還元末端側グルコースの２位炭素原子に結合した水酸基の立体配置を転位し、グルコシルマンノースを導く反応を触媒するという点でアルドース１−エピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．３．３）およびマルトース１−エピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．３．２１）とは異なる。ＣＥは非常に独特な酵素活性を有しているため、酵素学的観点から非常に興味深い。しかしながら、ＣＥの酵素化学的諸性質の解明、ＣＥをコードする遺伝子（ＣＥ遺伝子）の取得、およびアミノ酸配列の解析は、これまで全くなされていなかった。【０２２８】
本発明者らは、Ｒ．ａｌｂｕｓ  ＮＥ１由来のＣＥを用いると、セロビオースを基質としてＧｌｃ−Ｍａｎを生成するが（図１）、さらにセロトリオースおよびセロテトラオースを２−エピマー化することを見出した（図４、図７）。さらに、特徴的なことにＣＥがラクトースを基質とした場合、エピラクトースを生成することも見出した（図２および５）。【０２２９】
多くのオリゴ糖が生理活性機能を有することから、ＣＥの反応生成物であるエピラクトースにおいてもその機能性が期待される。しかしながら、現在のところ、その物理化学的特性や生理活性などは明らかにされておらず、産業的な利用には至っていない。エピラクトースの特性を明らかにするためには、実用的な大量合成法を確立する必要がある。【０２３０】
これまでに、高温、高圧条件下においてラクトースの異性化を誘導し、エピラクトースを合成することができることが報告されているが，夾雑物の混在が多いこともあり有効な製法ではない（Ｊ．Ｆ．Ｍｏｒｅｎｏら，（２００３）  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５１，１８９４）。【０２３１】
また，ｐ−ニトロフェニルガラクトースおよびマンノースを基質に用いる、β−ガラクトシダーゼによる酵素的合成法によってもエピラクトースの生成は可能である（Ｍ．ＭｉｙａｍｏｔｏとＫ．Ａｊｉｓａｋａ（２００４）  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８，２０８６）。この製法は、結合位の異なるガラクトシルマンノースの生成も可能であり、その後の酵素処理によって目的生成物の単離を容易に行える点から、前述の製法よりも実用性は高い。しかしながら、基質にｐ−ニトロフェニルガラクトースを用いるために原価が高価となり、工業的製法としては不向きである。【０２３２】
これらの製法に比べて、ＣＥによるエピラクトースの酵素的合成法は、基質が安価であること、反応条件が単純であることおよび夾雑物が少ないことから、実用性に富んだ合成法といえる。しかしながら、難培養性細菌であるＲ．ａｌｂｕｓを用いて本酵素を大量調製することは現実的に困難である。この点からも、ＣＥ遺伝子を単離し、組換え酵素を大量に取得することは非常に有効であると考えられる。さらに，Ｒ．ａｌｂｕｓにおけるＣＥの生理学的意義および代謝メカニズムなどが明らかとなっていないので、学術的にも多大な貢献をする。
【産業上の利用可能性】
【０２３３】
本発明を用いれば、Ｇｌｃ−Ｍａｎ以外にも新規オリゴ糖を合成することができるので、食品分野において、機能性食材（例えば、ノンカロリーもしくは低カロリーの食品、またはミネラル（特にＣａ２＋など）吸収に優れた食品）を低価格で提供することができる。本発明を用いれば、血中コレステロールの減少を生じさせる食品または食品添加物などを開発することができるので、医薬／製薬の分野においても有用である。【０２３４】
本発明を用いれば、Ｇｌｃ−Ｍａｎなど新規オリゴ糖を合成するので、特にエピラクトースの場合は、食品分野において、機能性食材（例えば、腸内環境改善作用を有する食品、ノンカロリーもしくは低カロリーの食品、またはミネラル（特にＣａ２＋など）吸収に優れた食品）を低価格で提供することができる。また、本発明を用いれば、血中コレステロールの減少を生じさせる食品または食品添加物などを開発することができるので、医薬／製薬の分野においても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月8日(2008.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
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【請求項３】
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【請求項４】
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【請求項５】
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【請求項６】
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【請求項７】
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【請求項８】
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【請求項９】
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【請求項１０】
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【請求項１１】
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【請求項１２】
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【請求項１３】
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【請求項１４】
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【請求項１５】
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【請求項１６】
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【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースのプレバイオティクスとしての使用。
【請求項２２】
ビフィズス菌の増殖を促進することで腸内環境を改善するための、請求項２１に記載のプレバイオティクスとしての使用。
【請求項２３】
脂質代謝を改善するための、請求項２１に記載のプレバイオティクスとしての使用。
【請求項２４】
血中コレステロール量を減少させることで脂質代謝を改善するための、請求項２３に記載のプレバイオティクスとしての使用。
【請求項２５】
ミネラル吸収能を促進するための、請求項２１に記載のプレバイオティクスとしての使用。
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
便秘を改善するための、請求項２１に記載のプレバイオティクスとしての使用。
【国際調査報告】
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