(57)【要約】  抗原とＦｃレセプターの両者に対する抗体の結合活性を評価できる簡便な方法を提供する。  蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープと、前記ドナー又はアクセプターの他方で標識されたＦｃレセプター又はその断片と、抗体とを混合する工程、前記ドナーを励起できる波長の光を前記混合物に照射する工程、前記混合物の蛍光量を測定する工程を含む、抗原又は抗原エピトープとＦｃレセプター又はその断片の両者に対する抗体の結合活性を測定する方法。抗体のADCC活性を推定する方法、抗体の品質管理方法、抗体の製造方法、抗体のスクリーニング方法及びこれらの方法に用いるキットも提供される。
2008156083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープと、前記ドナー又はアクセプターの他方で標識されたＦｃレセプター又はその断片と、抗体とを混合する工程、前記ドナーを励起できる波長の光を前記混合物に照射する工程、前記混合物の蛍光量を測定する工程を含む、抗原又は抗原エピトープとＦｃレセプター又はその断片の両者に対する抗体の結合活性を測定する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法で測定された結合活性に基づき、抗体の抗体依存性細胞障害活性を推定する方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法を利用して、抗体の品質を管理する方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法で抗体の品質を管理する工程を含む、抗体の製造方法。
【請求項５】
請求項４記載の製造方法で製造した抗体を含有する医薬品の製造方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載の方法を利用して、所望の結合活性又は抗体依存性細胞障害活性を有する抗体をスクリーニングする方法。
【請求項７】
請求項１〜３又は６のいずれかの方法に用いるためのキットであって、下記(a)、(b)及び(c)を含む前記キット。
(a)蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプター
(b)抗原又は抗原エピトープ
(c)Ｆｃレセプター又はその断片
【請求項８】
蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープと、前記ドナー又はアクセプターの他方で標識された抗体結合分子又はその断片と、抗体とを混合する工程、前記ドナーを励起できる波長の光を前記混合物に照射する工程、前記混合物の蛍光量を測定する工程を含む、抗原又は抗原エピトープと抗体結合分子又はその断片の両者に対する抗体の結合活性を測定する方法。
【請求項９】
抗体結合分子が、Fcレセプター、補体分子及び抗原又は抗原エピトープからなる群から選ばれるが、但し前記抗原又は抗原エピトープは蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープとは異なるものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の方法を利用して、所望の抗原又は抗原エピトープと抗体結合分子又はその断片の両者に結合して生じる生物活性を有する抗体をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、下記(a)、(b)及び(d)を含む前記キット。
(a)蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプター
(b)抗原又は抗原エピトープ
(d)抗体結合分子又はその断片
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原とＦｃレセプターの両者に対する抗体の結合活性を測定する方法に関し、より詳細には、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移を利用して、抗原とＦｃレセプターの両者に対する抗体の結合活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトには免疫と呼ばれる体を守る防御システムが備わっている。細菌やウイルスなどの異物（抗原）が体内に侵入すると、抗体と呼ばれるタンパク質が作られ、これが抗原を攻撃して生体を防御する。抗体の働きを利用して医薬品としたものが抗体医薬であり、その作用メカニズムとして、抗体依存性細胞障害活性（ADCC）、補体依存性細胞障害活性(CDC)、中和活性、アポトーシス誘導活性などが重要であることが報告されている。特に、ハーセプチン（転移性乳癌治療薬）やリツキサン（非ホジキンリンパ腫治療薬）では、Fcレセプターを介するADCC活性が最も重要な抗腫瘍メカニズムであると報告されている（非特許文献１）。【０００３】
ADCC作用は、標的細胞（target cell）上に発現している抗原に抗体が結合し、作動細胞（effecter cell）に発現しているFcレセプター（Fc-receptor）に抗体のFc部分が結合して標的細胞を傷害する。この作用の発現には、抗原抗体結合活性とFc/Fc-receptor結合活性の２つの結合活性が必要と考えられる。抗原抗体結合活性はcompetitive ELISA（cELISA）で従来評価が可能であった（非特許文献２）（図１）が、Fc-receptor結合活性を測定する方法は知られておらず、いわんや、抗原抗体結合活性とFc/Fc-receptor結合活性の２つの結合活性を一度に評価できる方法は知られていない。【０００４】
【非特許文献１】Clybes, R. A., et al., 2000. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Natl. Med. 6: 443
【非特許文献２】Human monoclonal antibody stability and activity at vaginal pH, Journal of Reproductive3 Immunology56, 61-76(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗原とＦｃレセプターの両者に対する抗体の結合活性を評価できる簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、抗原とFcレセプターの両者に抗体が結合して作用するADCC作用機序を考えると、抗原抗体結合活性とFc/Fc-receptor結合活性を個別に評価するよりも両者を同時に評価できる試験系が最適と考えた。そこで、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）の原理を利用して、抗体の、抗原への結合とFcレセプターへの結合の両方が同時に起こる時のみ、蛍光が検出できる新規評価法を確立した。本評価法は抗体のCDC活性の評価や、Bi-specific抗体の結合活性の評価等にも応用可能である。
本発明の要旨は以下の通りである。【０００７】
（１）蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープと、前記ドナー又はアクセプターの他方で標識されたＦｃレセプター又はその断片と、抗体とを混合する工程、前記ドナーを励起できる波長の光を前記混合物に照射する工程、前記混合物の蛍光量を測定する工程を含む、抗原又は抗原エピトープとＦｃレセプター又はその断片の両者に対する抗体の結合活性を測定する方法。
（２）（１）記載の方法で測定された結合活性に基づき、抗体の抗体依存性細胞障害活性を推定する方法。
（３）（１）又は（２）記載の方法を利用して、抗体の品質を管理する方法。
（４）（３）記載の方法で抗体の品質を管理する工程を含む、抗体の製造方法。
（５）（４）記載の製造方法で製造した抗体を含有する医薬品の製造方法。
（６）（１）又は（２）記載の方法を利用して、所望の結合活性又は抗体依存性細胞障害活性を有する抗体をスクリーニングする方法。
（７）（１）〜（３）又は（６）のいずれかの方法に用いるためのキットであって、下記(a)、(b)及び(c)を含む前記キット。
(a)蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプター
(b)抗原又は抗原エピトープ
(c)Ｆｃレセプター又はその断片
（８）蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープと、前記ドナー又はアクセプターの他方で標識された抗体結合分子又はその断片と、抗体とを混合する工程、前記ドナーを励起できる波長の光を前記混合物に照射する工程、前記混合物の蛍光量を測定する工程を含む、抗原又は抗原エピトープと抗体結合分子又はその断片の両者に対する抗体の結合活性を測定する方法。
（９）抗体結合分子が、Fcレセプター、補体分子及び抗原又は抗原エピトープからなる群から選ばれるが、但し前記抗原又は抗原エピトープは蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープとは異なるものである（８）記載の方法。
（１０）（８）又は（９）記載の方法を利用して、所望の抗原又は抗原エピトープと抗体結合分子又はその断片の両者に対する結合活性を有する抗体をスクリーニングする方法。
（１１）（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、下記(a)、(b)及び(d)を含む前記キット。
(a)蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプター
(b)抗原又は抗原エピトープ
(d)抗原結合分子又はその断片
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ADCC作用機序に則った結合活性評価が可能となった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、すなわち特願2007‐160007の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、抗体のADCC作用機序を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の抗体結合活性(Total結合活性)測定法の原理を示す模式図である。
【図３】図3は、抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)原液のTotal結合活性の用量反応曲線（Total binding Non-competitive Dose response curve）を示す。
【図４】図４は、aFuc含量が異なるサンプルのTotal結合活性の用量反応曲線（Total binding Non-competitive Dose response curve）を示す。
【図５】図５は、ON0305J01、A5-3、J1-2及びN2-3の暫定直線域のTotal結合活性Non-competitive 反応の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明の方法は、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移(TR-FRET)を利用する。蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）は、ドナーとアクセプターが互いに近接することにより起こる現象である。すなわち、ドナーを励起すると、その励起エネルギーが共鳴エネルギー転移により近距離にあるアクセプターにエネルギー転移され、励起光よりも長波長の蛍光が観察される。長寿命（ミリ秒オーダー）の励起状態を示す蛍光ランタニドキレートをドナーとして用いれば、アクセプターへのエネルギー転移に数百マイクロ秒の時間を要するので、時間分解測定法(TR)で適当な遅延時間経過後に蛍光強度を測定することによって、バックグランド蛍光（例えば、ドナーとアクセプターの非特異的近接による蛍光など）を抑制することができる。さらに、ランタニドキレートはストークスシフトが非常に広い（例えば、ユーロピウムキレートの場合、励起波長340 nm、蛍光波長615 nm）という特性を有するためにバックグランドの影響を最小限に抑えることができるという利点もある。【００１１】
従来、抗原と抗体の結合活性の測定はELISA法で行われてきた。また、抗原と結合することにより、抗体の定常領域のコンフォメーションが変化することをBIACOREで検出したという報告がなされている（International Immunology, Vol.15, No.3, pp.417-426 (2003)）。しかし、この報告では、抗体のコンフォメーション変化により、Fcレセプターに対する親和性が上昇することまでは確認されていない。後述の実施例に示す通り、本発明者らは、アクセプターで標識した抗原、ドナーで標識したFcレセプター及び抗体の３者の混合物がFRETを生じることを観察した。このことは、ADCCの作用機序に則った抗体の立体構造変化と新たな結合様式の生成を実証するものである。従って、本発明者らは、抗体のADCC活性に相当すると考えられる抗体の結合活性の測定法を確立したと言える。
また、同様に抗原分子に結合した抗体の特定部位に補体（C1）分子が結合することによって活性化されるCDC活性の測定法においても、抗原と補体（例えばC1q,C1r,C1sなどのC1、C2、C3、C4などが挙げられ、好ましくはC1である）をアクセプター又はドナーで標識することにより、ADCC活性と同様に測定可能となる。
さらには、抗体がBi-specific抗体である場合、それぞれの抗原分子をアクセプター又はドナーで標識することにより、Bi-specific抗体の結合活性の測定法にも応用可能となる。
このように、本発明の方法は、抗体が抗原に結合するのと同時に他の抗原結合分子に結合することによって特異的に生じる生物活性（ADCC活性、CDC活性、Bi-specific抗体の結合活性など）を測定するのに極めて優れた方法である。【００１２】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープと、前記ドナー又はアクセプターの他方で標識されたＦｃレセプター又はその断片と、抗体とを混合する工程、前記ドナーを励起できる波長の光を前記混合物に照射する工程、前記混合物の蛍光量を測定する工程を含む、抗原又は抗原エピトープとＦｃレセプター又はその断片の両者に対する抗体の結合活性（Total結合活性）を測定する方法を提供する。混合物の蛍光量の測定はバックグランドの蛍光が消光した後に行うとよい。
また、本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープと、前記ドナー又はアクセプターの他方で標識された抗体結合分子又はその断片と、抗体とを混合する工程、前記ドナーを励起できる波長の光を前記混合物に照射する工程、前記混合物の蛍光量を測定する工程を含む、抗原又は抗原エピトープと抗体結合分子又はその断片の両者に対する抗体の結合活性を測定する方法を提供する。抗体結合分子としては、Fcレセプター、補体分子、抗原又は抗原エピトープ（蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方で標識された抗原又は抗原エピトープとは異なる）などを例示することができる。【００１３】
本発明の方法でTotal結合活性を測定できる抗体としては、抗体のADCC活性を測定する場合、抗原結合活性とFcレセプター結合活性の両方を有するものであればいかなるものでもよい。抗体のCDC活性を測定する場合、抗原結合活性と補体（C1）結合活性の両方を有するものであればいかなるものでもよい。Bi-specific抗体の結合活性を測定する場合、異なる2つの抗原結合領域を有する抗体であればいかなるものでもよい。
本発明の方法で用いる抗体がWholeの抗体の場合、その抗体クラスは特に限定されず、IgG、IgM、IgE、IgAクラスなどいかなるクラスの抗体でもよく、好ましくはIgG、IgMクラスの抗体である。上記の抗体は、モノクロ-ナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などのいずれであってもよい。また、抗原結合領域とFcレセプター結合領域を有する低分子化抗体、抗原結合領域と補体（C1）結合領域を有する低分子化抗体、Bi-specificな低分子化抗体も本発明の方法に用いる抗体に含まれる。【００１４】
蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナーとしては、ランタニドキレート（リガンド（2,2’,2’’,2’’’-[(4’-4-aminophenyl)-2,2’:6’,2’’-terpypyridine-6,6’’-diyl)bis(methylenenitrilo)]tetrakis(acetic acid)）とランタニド（ユーロピウム（Eu）、テルビウム（Tb）、サマリウム（Sa）、ジスプロシウム（Dy））とが配位結合したもの）などを挙げることができる。ランタニドキレートは、長寿命（ミリ秒オーダー）の励起状態を示し、かつストークスシフトが長いので、好ましい。
蛍光共鳴エネルギー転移が可能なアクセプターとしては、アロフィコシアニン、ULight、Alexa、HiLyteFluor、HyCY-5、B-PE(B-phycoerythrin)、R-PE(R-phycoerythrin)などを挙げることができる。これらのアクセプターは全てユーロピウムキレートをはじめとするランタニドキレートの励起エネルギーをエネルギー転移することが可能である。【００１５】
抗原は特に限定されるものではなく、抗原活性を有するいかなる抗原を用いてもよい。例えば、Glypican3、HER2、CD20、CD3,TNF,CD25,RSV,CD33,CD53,VEGF,IL6-R,TNFなどを挙げることができる。また、抗原は、全長でなく、そのエピトープ領域を用いてもよい。例えば、Glypican3のエピトープ領域としては、配列番号１のアミノ酸配列からなる領域を挙げることができる。VEGFepitopeのエピトープ領域としては、DVSTAVSFYSYTTP（配列番号４）を挙げることができる（High-affinty human antibodies from Phage-displayed synthetic Fab libralies with a single framework scaffold, J Mol. Biol. 340 p1073-1093(2004)）。
Ｆｃレセプター(FcR)は、免疫グロブリン(Ig)のＦｃ領域に対する受容体であり、マクロファージ、好中球、肥満細胞、免疫担当細胞のほとんどが発現している。IgG、IgE、IgAクラスの免疫グロブリンに対するFcRは、それぞれ、FcγR、FcεR、FcαRと呼ばれている。FcγRは、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIという３つのグループに大別される。NK細胞表面に発現しているFcγRIIIはADCCを媒介していると考えられている。【００１６】
Ｆｃレセプター断片は、Ｆｃレセプターの生物学的活性を保持している限り、どのような断片であってもよい。例えば、FcγRIII断片としては、配列番号２のアミノ酸配列からなる断片、配列番号３のアミノ酸からなる断片などを挙げることができる。他のＦｃレセプター断片は、Betty D. Louis B. and Barbara K.”Site of Binding of IgG2b and IgG2a by Mouse Macropharge Fc receptors by using Cyanogen bromide fragments”The Journal of Immunology. Vol.134 No.2(1985) p1080-1083などに記載されている。【００１７】
抗原又は抗原エピトープ及びＦｃレセプター又はその断片を直接又は間接的に蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターにより標識したものが使用される。
例えば、ユーロピウムキレートで標識された抗6XHis抗体が市販されているので、抗原（又は抗原エピトープ）あるいはＦｃレセプター（又はその断片）の適当な部位に6XHisを付加しておけば、抗6XHis抗体と複合体を形成させる（抗原抗体反応）ことによって、抗原（又は抗原エピトープ）あるいはＦｃレセプター（又はその断片）をドナーで標識することができる。他にも、ユーロピウムキレートで標識されたProteinG、抗humanIgG抗体、抗mouseIgG抗体、抗rabbitIgG抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ユビキチン、抗GST抗体、抗DNP抗体、抗c-Myc抗体、抗FLAG抗体、抗HA抗体などが市販されており、本発明で使用することができる。【００１８】
また、ストレプトアビジン結合アロフィコシアニンが市販されているので、抗原（又は抗原エピトープ）あるいはＦｃレセプター（又はその断片）の適当な部位にビオチンを結合しておけば、アビジンと複合体を形成させることによって、抗原（又は抗原エピトープ）あるいはＦｃレセプター（又はその断片）をアクセプターで標識することができる。他にも、アロフィコシアニンに結合した抗c-Myc抗体、抗FLAG抗体、抗GST抗体、抗mouseIgG抗体、抗rabbitIgG抗体、wheat germ agglutinin、抗DNP抗体、抗6XHis抗体、抗HA抗体、ビオチン、ProteinA、WGA、Concanavalin Aなどが市販されており、本発明で使用することができる。【００１９】
上記のように蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー又はアクセプターの一方により標識された抗原（又は抗原エピトープ）と他方により標識されたＦｃレセプター（又はその断片）を抗体と混合し、適当な時間インキュベートする。ドナーとアクセプターの濃度は、ドナーとアクセプター間のFRETによるアクセプターからの蛍光量が100counts以上となる濃度が適当であり、好ましくは前記蛍光量が500counts以上となる濃度であり、より好ましくは前記蛍光量が1000counts以上となる濃度である。また、ドナーとアクセプター間のFRETによるアクセプターからの蛍光量の上限は、特に限定されるわけではないが、2500000countsが適当であり、好ましくは2000000countsであり、より好ましくは1800000countsである。その結果、まず、抗原（又は抗原エピトープ）と抗体の複合体が形成され、抗体のコンフォメーションが変化して、Ｆｃレセプター（又はその断片）に対する親和性が上昇することにより、抗原又はFcレセプター上のドナーとアクセプターの距離が接近すると考えられる。この３者の複合体に励起光を照射すると、前記ドナーとアクセプターの間で蛍光共鳴エネルギー転移が起こり、励起光よりも長波長の蛍光が観察される（FRET）（図２）。蛍光量を一定時間内積算し（TR）、観察する時間を遅らせることによりドナーとアクセプターの非特異的近接によるバックグランドを抑えた蛍光シグナル検出が可能となる。【００２０】
抗原（又は抗原エピトープ）とＦｃレセプター（又はその断片）と抗体の混合物をインキュベートする時間は、特に限定されるわけではないが、通常、３０〜１８０分が適当であり、４５〜１２０分が好ましい。
抗体を抗原（又は抗原エピトープ）及びＦｃレセプター（又はその断片）と混合するときには、抗体をバッファー（例えば、Tris-HCl, EDTA, NaCl, TritonX, DTTなどを含有するバッファー）などで希釈してもよい。
励起光の波長は、ドナーを励起させることができる波長であればよく、例えば、ドナーがユーロピウムキレートである場合には、320nmの光学フィルターを用いて励起光を照射すればよい。励起光の照射は、例えばFlash回数300回で320nm（バンド幅75nm）の光学フィルターを用いて行うとよい。【００２１】
蛍光シグナル検出はバックグランドを抑えた条件で行えばよく、その条件は測定対象により適宜選択することができる。
例えば、ドナーがユーロピウムキレートで、アクセプターがアロフィコシアニンである場合、Flash回数300回で320nm（バンド幅75nm）の光学フィルターを通して励起光を照射し、70usのDelay timeの後、400usのWindow time（測定時間）で665nm(バンド幅7.5nm)及び615nm(バンド幅8.5nm)の光学フィルターでシグナルを測定する。
TR-FRETの測定条件は、ドナーとアクセプターの種類により、適宜、変更するとよい。【００２２】
蛍光の測定は、ドナーとアクセプター間のFRETによるアクセプターからの蛍光量を測定すればよいが、ドナー又はアクセプターが直接励起により蛍光を発する場合には、それらの蛍光量も測定するとよい。ドナー又はアクセプターの直接励起による蛍光は内部標準として利用できる。例えば、ドナーがユーロピウムキレートで、アクセプターがアロフィコシアニンである場合、直接励起によるドナーからの蛍光量(波長615 nmの蛍光量)に対するFRETによるアクセプターからの蛍光量（波長665 nmの蛍光量）の比率（百分率、千分率など）でSignal強度を補正でき、Total結合活性を表現することができる。本発明の抗体結合活性測定法は、ADCC作用機序に則った結合様式を評価するものであるから、本発明の方法で測定された抗体結合活性（Total結合活性）はADCC活性との相関性が高いと考えられ、Total結合活性からADCC活性を推定することができる。例えば、Total結合活性とADCC活性の相関性を示す検量線を作成しておけば、Total結合活性からADCC活性を容易に推定することができる。同様に抗体のCDC活性やBi-specific抗体の結合活性測定方法においても本発明の、Total結合活性からこれらの生物活性を容易に推定することができる。
このTotal結合活性は、抗体の品質管理、抗体の最適化のためのスクリーニング方法や抗体の生物活性の評価方法などに利用することができる。【００２３】
抗体の品質管理は、抗体の製造工程の一つとして行うことができる。本発明は、このような抗体の品質管理工程を含む、抗体の製造方法も包含する。また、本発明は、この方法で製造した抗体を含有する医薬品の製造方法も包含する。
抗体は、慣用のプロトコ-ルを用いて、抗原又は抗原エピト-プを動物に投与することにより製造することができる。抗体は、ポリクロ-ナル抗体、モノクロ-ナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。【００２４】
ポリクロ-ナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原を動物に投与（免疫）し、該免疫動物から免疫抗原に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約２〜１０回程度行なわれる。ポリクロ-ナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。ポリクロ-ナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコ-ル沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。【００２５】
モノクロ-ナル抗体は、Nature (1975) 256: 495、Science (1980) 208: 692-に記載されている、G. Koehler及びC. Milsteinのハイブリド-マ法により作製することができる。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞と融合させることによりモノクロ-ナル抗体産生細胞を調製する。さらに、抗原又は抗原エピト-プと特異的に反応するが、他の抗原タンパク質とは実質的に交差反応しない抗体を産生する細胞系を単離するとよい。この細胞系を培養し、培養物から所望のモノクロ-ナル抗体を取得することができる。モノクロ-ナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。【００２６】
ヒト化抗体を作製する技法は、Biotechnology 10, 1121-, 1992; Biotechnology 10, 169-, 1992に記載されている。
本発明の方法により製造された抗体を医薬的に許容される担体又は添加剤と混合して製剤化することにより、医薬品を製造することができる。【００２７】
医薬的に許容される担体及び添加剤の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。【００２８】
実際の添加物は、医薬品の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。【００２９】
抗体の有効投与量は、抗体の種類、治療や予防の対象とする疾患の種類、患者の年齢、疾患の重篤度などにより適宜選択される。例えば、抗体が抗グリピカン抗体であり、これを抗癌剤として使用する場合、抗グリピカン抗体の有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、これらの投与量に制限されるものではない。
抗体の投与方法は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによる全身又は局所投与）、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。【００３０】
また、本発明のTotal結合活性の測定法は、試料となる抗体の所望の抗原結合活性と抗体依存性細胞障害活性を同時に測定できることから、高い抗原結合活性と優れた抗体依存性細胞障害活性を併せ持つ抗体を選抜する手法として利用することができる。
Total結合活性の測定法の操作例としては、例えば以下のような手順が考えられる。【００３１】
１）ドナーまたはアクセプターを抗原ペプチドまたはその断片に、標識キット等を用いて直接結合（-NH2基や-SH基との共有結合）させるか、或いは、公知の方法で、抗6XHis抗体などの抗体、ProteinG、抗humanIgG抗体、抗mouseIgG抗体、抗rabbitIgG抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ユビキチン、抗GST抗体、抗DNP抗体、抗c-Myc抗体、抗FLAG抗体、抗HA抗体などを介して間接的に結合させた溶液を調整する。
２）同様にして1)に対応するドナーまたはアクセプターをFcレセプターまたはその断片に標識キット等を用いて直接結合（-NH2基や-SH基との共有結合）させるか、或いは、公知の方法で、抗6XHis抗体などの抗体、ProteinG、抗humanIgG抗体、抗mouseIgG抗体、抗rabbitIgG抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ユビキチン、抗GST抗体、抗DNP抗体、抗c-Myc抗体、抗FLAG抗体、抗HA抗体などを介して間接的に結合させた溶液を調整する。【００３２】
３）試料となる抗体溶液を緩衝液で段階的に希釈する。
４）１）、２）及び３）の溶液を適切な比率で混合する。
５）４）で調製した溶液を、例えば、プレートリーダーなどを用いて公知の方法で、ドナーを励起することができる波長の光（例えば、ドナーがユーロピウムキレートである場合は、約320nmの波長の光）を照射し、出てくる蛍光シグナル（例えば、ドナーがユーロピウムキレートであり、アクセプターがアロフィコシアニンである場合は、約665nm(FRETによるアクセプターからの蛍光)と約615nm（直接励起によるドナーからの蛍光）の蛍光シグナル）を測定する。【００３３】
具体的には、例えば以下の条件で測定できる。
[測定条件]
Excitation; 320nm， Emission; 665nm / 2nd Emission; 615nm
Flash回数200〜400回、好ましくは300回で320nm（バンド幅75nm）の光学フィルターを通して励起光を照射し、50〜100us、好ましくは70usのDelay timeの後、300〜500us、好ましくは400usのWindow time（測定時間）で665nm(バンド幅7.5nm)及び615nm(バンド幅8.5nm)の光学フィルターで蛍光シグナルを測定する。
本測定法で用いる緩衝液は特に制限はないが、代表としてリン酸、酢酸、トリス−塩酸、クエン酸などの緩衝液を用いることができる。反応の際のｐHは特に制限はないが、ｐH3〜9.5、好ましくはｐH5〜8.5であればよい。【００３４】
また、本発明は、下記(a)、(b)及び(c)を含むキットも提供する。
(a)蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプター
(b)抗原又は抗原エピトープ
(c)Ｆｃレセプター又はその断片
蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプターは前記の通りであるが、抗6XHis抗体などの抗体、ProteinG、抗humanIgG抗体、抗mouseIgG抗体、抗rabbitIgG抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ユビキチン、抗GST抗体、抗DNP抗体、抗c-Myc抗体、抗FLAG抗体、抗HA抗体などに結合していてもよい。その場合、キットには、Hisタグを抗原又はFcレセプターに付加するための試薬、ビオチンを抗原又はFcレセプターに結合するための試薬などを含めてもよい。抗原又は抗原エピトープ並びにＦｃレセプター又はその断片は前記の通りである。このキットは、Total結合活性の測定、抗体の品質管理、抗体のスクリーニングなどに利用することができる。
さらに、このキットには、Tris-HCl, EDTA, NaCl, TritonX, DTTなどを含有するバッファー、マイクロプレートのような反応容器、取扱説明書などを含めてもよい。
さらにまた、本発明は、下記(a)、(b)及び(d)を含むキットも提供する。
(a)蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプター
(b)抗原又は抗原エピトープ
(d)抗体結合分子又はその断片
蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー及びアクセプターは前記の通りであるが、抗6XHis抗体などの抗体、ProteinG、抗humanIgG抗体、抗mouseIgG抗体、抗rabbitIgG抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ユビキチン、抗GST抗体、抗DNP抗体、抗c-Myc抗体、抗FLAG抗体、抗HA抗体などに結合していてもよい。その場合、キットには、Hisタグを抗原又はFcレセプターに付加するための試薬、ビオチンを抗原又はFcレセプターに結合するための試薬などを含めてもよい。抗体結合分子又はその断片は前記の通りである。このキットは、抗原又は抗原エピトープと抗体結合分子又はその断片の両者に対する抗体の結合活性の測定、抗原又は抗原エピトープと抗体結合分子又はその断片の両者に抗体が結合して生じる生物活性を有する抗体のスクリーングなどに利用することができる。
さらに、このキットには、Tris-HCl, EDTA, NaCl, TritonX, DTTなどを含有するバッファー、マイクロプレートのような反応容器、取扱説明書などを含めてもよい。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。【００３６】
〔実施例１〕抗体の調製
[抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)調製方法]
抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)発現CHO細胞（WO2006/06693の実施例４）を拡大培養していき、培養液をフィルターろ過による細胞除去を行なった（CM画分）。CM画分をrProteinA Sepharose工程に供し、溶出画分を中和・ろ過後、TFF膜で濃縮・緩衝液交換を行った。この方法で、Lot No.ON0305J01(aFuc4.5%,定量値28.5mg/mL)、A5-3(aFuc4.7%,定量値6.88mg/mL)、J1-2(aFuc3.3%,定量値6.54mg/mL)、N2-3(aFuc6.7%,定量値5.54mg/mL)及びMo0305125(aFuc3.0％%,定量値8.18mg/mL)のサンプルを得た。
また、上記の５サンプルとはアフコシル(aFuc)含量の異なるサンプルであるLot No.Mo03FTP-050725(aFuc96.8%, 定量値1mg/mL)は、W02006/46751に記載の方法で得た。
[アフコシル抗GPC3抗体産生細胞]
アフコシル抗GPC3抗体産生細胞はWO2006/46751に記載された方法で作製し、その細胞を用いた。
[アフコシル抗GPC3抗体の調製]
アフコシル抗GPC3抗体はアフコシル抗GPC3抗体発現CHO細胞を培養して得られた培養上清からProtein Aアフィニティカラムクロマトグラフィーとイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて調製した。
培養上清をrProtein A Sepharose FFカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)に添加し、カラムを洗浄した後、酸でカラムに吸着した蛋白を溶出した。溶出した画分のpH を中性付近に調整し、アフコシルGC33を含む画分を20 mM 酢酸緩衝液、pH6.0で平衡化したSP Sepharose FFカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、200 mM NaClを含む同緩衝液でカラムに吸着した蛋白を溶出した。
得られた画分をSDS-PAGEで分析し、アフコシル抗GPC3抗体を含む画分を集め、これを最終調製品とした。
両ロットを同一濃度に希釈して（今回は1mg/mL）、以下のように混合した。
aFuc含量
100%（実際：96.8%）    Mo03FTP-050725 100%
50%(50.7%）           Mo03FTP-050725 50%：ON0305J01 50%で混合→(1)
25%(27.6%)            (1) 50%:ON0305J01 50%で混合
5%(4.5%)              ON0305J01 100%【００３７】
〔実施例２〕FcレセプターV-type（FcγRIIIaV-6 × His）の調製
FcγRIIIaV断片＋6xHis tag発現CHO細胞を以下のようにして作製した。ヒトCD16細胞外領域をコードする可溶型CD16 cDNAはMultiple Tissue cDNA panels :Fetal spleen cDNA library (Clontech社)を鋳型にPCR反応で増幅した。プライマーは、5‘端の合成オリゴとしてEcoRI認識配列、コザック配列を付加したCD16F1(TAA GAA TTC CCA CCA TGT GGC AGC TGC TCC TCC C)（配列番号５）、3’端の合成オリゴとしてHisタグ、終止コドン、NotI認識配列を付加したCD16R1 (TAA GCG GCC GCT TAT CAA TGA TGA TGA TGA TGA TGA CCT TGA GTG ATG GTG ATG TTC) （配列番号６）とした。得られたPCR産物をpGEM T-Easy vectorにクローニングした。クローニングされたCD16の塩基配列をシークエンスにより確認した結果、158位がフェニルアラニンである158F型であることが確認された。得られた158F型遺伝子を鋳型としてQuick Change(QIAGEN社)を用いた点変異導入法によりF(TTT)→V(GTT)の点変異を導入し、158V型遺伝子を取得した。取得した158V型遺伝子をEcoRI、NotIで切断後、pCXND3へクローニングした。本ベクターpCXND3の構築の流れについて、以下に述べる。DHFR-ΔE-rvH-PM1-f（WO92/19759参照）の抗体Ｈ鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素EcoRI/SmaI部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、EcoRI-NotI-BamHI adaptor（宝酒造社製）をクローニングした。このベクターをpCHOIと命名した。pCHOIのDHFR遺伝子発現部位をpCXN（Niwaら、Gene 1991;108:193-200）の制限酵素HindIII部位にクローニングしたベクターをpCXND3と命名した。エレクトロポレーション法によりCHO細胞に各発現プラスミドを導入し、Geneticinによる選抜で可溶型CD16定常発現CHO細胞（158V型）を取得した。
この細胞を0.5 mg/mL Geneticin（Invitrogen社）、1% Penicillin-Streptomycin （Invitrogen社）を含むCHO-S-SFMII（Invitrogen社）を用い、37°C、8% CO2の条件で培養した。
得られた培養上清から陽イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィーを用いて可溶型CD16V（158V型）を調製した。
20 mM 酢酸緩衝液、pH5.0で平衡化したSP Sepharose FFカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)に同緩衝液で3倍希釈した培養上清を添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、500 mM NaClを含む同緩衝液で、カラムに吸着した蛋白を溶出した。得られた画分をHisタグに特異的な抗体を用いたWestern Blotで分析し、可溶型CD16（158V型）を含む画分を集めた。
陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで得られた可溶型CD16（158V型）画分を1 M TrisでpHを7.0に調整し、300 mM NaClを含む20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH8.0で平衡化したTalon Metal Affinity Resinカラム（Clontech社）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中0 mMから150 mMまでのイミダゾールの直線濃度勾配で、カラムに吸着した蛋白を溶出した。得られた画分をSDS-PAGEで分析し、可溶型CD16（158V型）が含まれる画分を集めた。
Hisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィーで得られた各画分を限外ろ過膜（Amicon Ultra-15、分離サイズ10kDa、Millipore社）で濃縮およびPBSへの緩衝液置換し、これを最終調製品とした。【００３８】
〔実施例３〕FcレセプターF-type（FcγRIIIaF-6 × His）の調製
FcγRIIIaF断片＋6xHis tag発現CHO細胞を以下のようにして作製した。ヒトCD16細胞外領域をコードする可溶型CD16 cDNAはMultiple Tissue cDNA panels :Fetal spleen cDNA library (Clontech社)を鋳型にPCR反応で増幅した。プライマーは、5‘端の合成オリゴとしてEcoRI認識配列、コザック配列を付加したCD16F1(TAA GAA TTC CCA CCA TGT GGC AGC TGC TCC TCC C)（配列番号５）、3’端の合成オリゴとしてHisタグ、終止コドン、NotI認識配列を付加したCD16R1 (TAA GCG GCC GCT TAT CAA TGA TGA TGA TGA TGA TGA CCT TGA GTG ATG GTG ATG TTC) （配列番号６）とした。得られたPCR産物をpGEM T-Easy vectorにクローニングした。クローニングされたCD16の塩基配列をシークエンスにより確認した結果、158位がフェニルアラニンである158F型であることが確認された。取得した158F型遺伝子をEcoRI、NotIで切断後、pCXND3へクローニングした。本ベクターpCXND3の構築の流れについて、以下に述べる。DHFR-ΔE-rvH-PM1-f（WO92/19759参照）の抗体Ｈ鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素EcoRI/SmaI部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、EcoRI-NotI-BamHI adaptor（宝酒造社製）をクローニングした。このベクターをpCHOIと命名した。pCHOIのDHFR遺伝子発現部位をpCXN（Niwaら、Gene 1991;108:193-200）の制限酵素HindIII部位にクローニングしたベクターをpCXND3と命名した。エレクトロポレーション法によりCHO細胞に各発現プラスミドを導入し、Geneticinによる選抜で可溶型CD16定常発現CHO細胞（158F型）を取得した。
この細胞を0.5 mg/mL Geneticin（Invitrogen社）、1% Penicillin-Streptomycin （Invitrogen社）を含むCHO-S-SFMII（Invitrogen社）を用い、37°C、8% CO2の条件で培養した。
得られた培養上清を300 mM NaClを含む20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH8.0で平衡化したTalon Metal Affinity Resinカラム（Clontech社）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中0 mMから500 mMまでのイミダゾールの直線濃度勾配で、カラムに吸着した蛋白を溶出した。得られた画分をSDS-PAGEで分析し、可溶型CD16（158F型）が含まれる画分を集めた。
精製で得られた画分を透析法でPBSに緩衝液置換し、これを最終調製品とした。【００３９】
〔実施例４〕抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)のTR-FRETによる抗原及びFcR結合活性（Total結合活性）試験法
1.1 試薬及び試液
Eu-W1024 labeled anti-6 × His antibody（Eu-anti 6 × His）(PerkinElmer)
Streptavidin conjugated to SureLight（登録商標）-Allophycocyanin for kinase assays（StAv-APC）(PerkinElmer)
Biotinylated GPC3 epitope peptide（B-GPC3epi：アミノ酸配列Biotin-SQQATPKDNEISTFNHLGNV（配列番号１））(SIGMA GENOSYS)
FcレセプターV-type（FcγRIIIaV-6 × His）（実施例２で調製）
FcレセプターF-type（FcγRIIIaF-6 × His）（実施例３で調製）
2-アミノ-2-ヒドロキシルメチル1,3-プロパンジオール（Tris）（試薬特級）（和光純薬工業）
EDTA・2Na（和光純薬工業）
塩化ナトリウム（試薬特級）（和光純薬工業）
Triton X-100（Promega）
ジチオトレイトール（DTT）（試薬特級）（和光純薬工業）
5 mol/L 塩酸（容量分析用）（和光純薬工業）
1.2 機器及び装置
調製用プレート：Optical 96-well Reaction plate（アプライドバイオシステム）
384 白色マイクロプレート：OptiPlate384（PerkinElmer）
マイクロプレートリーダー：EnVision2102（PerkinElmer）
コントロールソフト：Wallac EnVision Manager ver.1.07（PerkinElmer）
天秤：PG503-SDR（METTLER TOLEDO）
pHメーター：HM-50G（東亜ディーケーケー）
超純水製造装置：AutopureER600G（ヤマト科学）【００４０】
1.3 試験方法
StAv-APC溶液*1をbinding buffer*2で希釈して400 pmol/mL（APC濃度）とした[Solution A]。
B-GPC3epi溶液*3をbinding buffer*2で希釈して800 pmol/mLとした[Solution B]。
FcγRIIIaV-6 × Hisをbinding buffer*2で希釈して400 pmol/mLとした[Solution C]。
Eu-anti 6 × HisをBinding buffer*2で希釈して5 pmol/mLとした[Solution D]。
Solution A及びSolution Bを1：1混合[Mixture-1]して暗所・室温で30分静置した。
Solution C及びSolution Dを1：1混合[Mixture-2]して暗所・室温で30分静置した。
抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)原液（実施例１で調製）をBinding buffer*2で段階的に希釈した[Solution E]。
調製用プレートでMixture-1 20 μL，Mixture-2 20 μL及び段階希釈したSolution E 10 μLを混合し，384 白色マイクロプレートに40 μLずつ移してプレートリーダーで測定した。【００４１】
[測定条件]
Excitation; 320nm， Emission; 665nm / 2nd Emission; 615nm
Flash回数300回で320nm（バンド幅75nm）の光学フィルターを通して励起光を照射し、70usのDelay timeの後、400usのWindow time（測定時間）で665nm(バンド幅7.5nm)及び615nm(バンド幅8.5nm)の光学フィルターで蛍光シグナルを測定した。【００４２】
*1 StAv-APC溶液：Streptavidin conjugated to SureLight（登録商標）-Allophycocyanin for kinase assays（PerkinElmer製）1バイアルに蒸留水を1 mL加えてon iceで20〜30分静置した。使用前にvortex又はピペッティングにより攪拌した。
*2 Binding buffer：50 mmol/L Tris-HCl pH7.4，1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，0.1% TritonX-100，1 mmol/L DTT
*3 Biotinylated GPC3 epitope peptide（合成ペプチド，SIGMA GENOSYS製）1バイアルにPBS（Phosphate-buffered Saline，Invitrogen製）を加えて濃度1mg/mLに調製した。【００４３】
2. 試験結果
抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)原液の非競合反応によるTotal結合活性の用量反応曲線（Total binding Non-competitive Dose response curve）（FcレセプターV-typeを用い、aFuc含量ON0305J01:4.5％、A5-3：4.7%、J1-2：3.3%、N2-3:6.7%のもの）を図３に示す。ON0305J01、A5-3、J1-2及びN2-3は、抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)原液のロット名である。Total結合活性試験において、わずかなアフコシル含量が異なる試料について、ロット間差が確認できると考え得る良好な用量反応曲線が確認できた。また、直線域より直線モデル解析（Pallarel Line Method）を行なったところ、比結合活性が算出できたことから、定量的な評価が可能であると考えられる。【００４４】
アフコシル(aFuc)含量が異なる抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)（FcγRIIIaV-6 × His及びFcγRIIIaF-6 × Hisのそれぞれに結合するもの）の非競合反応によるTotal結合活性の用量反応曲線（Total binding Non-competitive Dose response curve）を図４に示す。aFuc含量が異なるサンプルについて、Non-competitiveな系を測定したところ、aFuc含量と相関がある用量反応曲線が確認できた。aFuc含量と結合活性とに相関有りと考えられ、評価法として設定可能と考えられる。ADCC試験でも同様にaFuc含量と相関のある用量反応曲線を示しているので（データは示さず）、TR-FRETはADCC試験にLinkしていると考えられた。図3と異なり、本測定サンプルは抗原結合のアフィニティーが同一であると考えられ、Total結合活性の内、Fcレセプター結合の違いが確認できた。また、一般的にFcレセプターのF-typeはV-typeよりアフィニティーが弱いといわれているが、用量反応曲線よりV又はF-typeのアフィニティーの違いの程度が分かると考えられる。【００４５】
ON0305J01、A5-3、J1-2及びN2-3の暫定直線域（図５）より、3+3 Parallel Line Methodで比活性を算出した。算出手順は、European Pharmacopoeia 5.3 Statistical analysis記載の算出方法に従った。用量反応曲線の直線域を用い、Pallarel-Line Model解析より結合活性比を算出した。Mo03050125は、ON0305J01より前に製造された抗グリピカン３抗体(抗GPC3抗体)である。製造順序はMo03050125、A5-3等、ON0305J01の順番である。ADCCではロット分析で持ちいられた。Mo03050125は製造量が少ないため、TR-FRETではON0305J01を用いた。結果を表１に示す。
【表１】
2008156083.tif 000003
ADCC試験ではロット間差が無いが、TR-FRETではロット間差有りと認められる。TR-FRETがADCCとLinkしている（仮定）ならば、生物活性試験（ADCC）では差が確認できないが、結合活性試験（TR-FRET）ではその差が確認できるのではないかと推定する。【００４６】
本発明の抗体結合活性試験法のメリットは以下の通りである。
・試験操作が簡単であり（試薬調製後、混合及びインキュベーションするだけ）、頑健性が良い。
・384プレートの使用が可能であるから、一回の測定で多くのサンプルを測定でき、ハイスループット化が容易である。
本発明の抗体結合活性試験法は、抗体の品質評価に使用できるだけでなく、ハイスループットスクリーニング法に応用可能なことから、ADCC活性を有する抗体のスクリーニング法への応用も可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、抗体の品質評価、ADCC活性を有する抗体のスクリーニング法への応用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
＜配列番号１＞
配列番号１は、GPC3 エピトープ（ヒト由来）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、FcγRIIIaV（ヒト由来）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、FcγRIIIaF（ヒト由来）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、VEGFepitopeのエピトープ領域（ヒト由来）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、プライマーCD16F1のDNA配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、プライマーCD16R1のDNA配列を示す。
【図１】
2008156083.tif 000004
【図２】
2008156083.tif 000005
【図３】
2008156083.tif 000006
【図４】
2008156083.tif 000007
【図５】
2008156083.tif 000008
【配列表】
2008156083000001.app
【国際調査報告】
2008156083.tif 000009
2008156083.tif 000010
2008156083.tif 000011
2008156083.tif 000012