(57)【要約】  本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法等において、検出感度が高く、抗原抗体反応の未反応物の分離が容易な生体分子検出用試薬及びそれを用いた生体分子検出方法を提供する。この手段として、半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子とを無機化合物又は有機ポリマーからなるビーズに含有し、且つビーズ表面に生体検出用分子が修飾されていることを特徴とする生体分子検出用試薬を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子とを無機化合物又は有機ポリマーからなるビーズに含有し、且つビーズ表面に生体検出用分子が修飾されていることを特徴とする生体分子検出用試薬。
【請求項２】
前記半導体ナノ粒子が、粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発することができる半導体ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の生体分子検出用試薬。
【請求項３】
前記半導体ナノ粒子が、異なる波長の蛍光を発することができる少なくとも２種の半導体ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の生体分子検出用試薬。
【請求項４】
前記半導体ナノ粒子は、粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発することができる半導体ナノ粒子であり、且つ少なくとも２種が含有されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の生体分子検出用試薬。
【請求項５】
請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の生体分子検出用試薬を用いることを特徴とする生体分子検出方法。
【請求項６】
ビーズに含有する半導体ナノ粒子とは異なる粒径の半導体ナノ粒子の表面に生体検出分子を修飾した半導体ナノ粒子複合体を更に前記生体分子検出用試薬と組み合わせて用いることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の生体分子検出方法。
【請求項７】
請求の範囲第４項に記載の生体分子検出試薬を用いる生体分子検出方法であって、マイクロアレイ上で実施することを特徴とする生体分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子を利用した生体分子検出用試薬及びそれを用いた生体分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の進歩によって生体が活動するさまざまな仕組みが明らかになり脳やいろいろな臓器の病気やガンなどを分子レベルで解明する試みが行われている。その一つとして生体の機能とその異常を蛍光画像として捉える所謂バイオ・イメージング法が進展しつつある。【０００３】
この分野において、生体分子検出方法として、従来分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。しかし、当該方法で従来使用されてきた有機蛍光色素などのマーカー物質は、紫外線照射時の劣化が激しく寿命が短いことが欠点であり、また発光効率が低く、感度も十分ではなかった。【０００４】
例えば、蛍光マイクロビーズを抗原抗体反応を利用した免疫測定に用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この方法において、生体高分子間の特異的な反応のサイトとなるマイクロオーダーサイズのビーズは、有機溶媒中で染色し、蛍光顕微鏡やフローサイトメータでビーズの読み取りや識別を行っていた。しかしながら、ビーズの識別化は容易ではなく、特に数十種から数万種の多数のビーズを正確かつ容易に識別することは困難であった。【０００５】
また、蛍光標識粒子及び磁性粒子用いることにより、迅速、簡便に反応結合物と未反応物の分離を容易にした抗体の測定方法が知られているが、操作が煩雑であり、有機蛍光色素を用いているので感度が不十分であるという問題があった（例えば、特許文献２参照。）。【０００６】
ところで、ナノテクノロジーにおける最近の進歩は、ナノ粒子を、検出、診断、感知及びその他の用途に使用することの可能性を示唆している。また、生物系と相互作用するナノ粒子複合体は、最近生物及び医学の分野で広く関心を集めている。これらの複合体は、感知（例えば画像化）及び治療目的（例えば薬物送達）の両方にとって新規血管内プローブとして有望であると考えられている。【０００７】
一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す物質は「量子ドット」と称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。したがって、量子ドットの大きさまたは物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを利用することができる。【０００８】
そのため、近年、上記マーカー物質として半導体ナノ粒子を用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を半導体ナノ粒子の表面に物理的および／または化学的に吸接合した生体物質標識剤が検討されている（例えば、特許文献３参照。）。また、有機分子をＳｉ／ＳｉＯ2型半導体ナノ粒子の表面に結合した生体物質標識剤が検討されている（例えば、特許文献４参照。）。【０００９】
例えば、特許文献５には、粒径の違いにより異なる励起波長及び蛍光を持つ半導体ナノ粒子を利用して、ＤＮＡやタンパク質等の生体高分子を容易に検出する技術が開示されている。【００１０】
しかしながら、上記のような生体物質標識剤を抗原抗体反応原理の免疫測定法等に用いた方法においては、未だ検出感度が不十分、又は検出感度はあっても未反応物の分離が煩雑であるという問題等があり、検出と分離の両方を一つの生体物質検出剤でできる技術の開発が望まれていた。また、遺伝子診断等多量の情報を１度に標識できるようなシステムが望まれていた。
【特許文献１】特開２００４−２２６２３４号公報
【特許文献２】特開平７−１５１７５６号公報
【特許文献３】特開２００３−３２９６８６号公報
【特許文献４】特開２００５−１７２４２９号公報
【特許文献５】特開２００３−３２２６５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、その目的は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法等において、検出感度が高く、抗原抗体反応の未反応物の分離が容易な生体分子検出用試薬及びそれを用いた生体分子検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る上記課題は、下記の手段により解決される。【００１３】
１．半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子とを無機化合物又は有機ポリマーからなるビーズに含有し、且つビーズ表面に生体検出用分子が修飾されていることを特徴とする生体分子検出用試薬。【００１４】
２．前記半導体ナノ粒子が、粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発することができる半導体ナノ粒子であることを特徴とする前記１に記載の生体分子検出用試薬。【００１５】
３．前記半導体ナノ粒子が異なる波長の蛍光を発することができる少なくとも２種の半導体ナノ粒子であることを特徴とする前記１に記載の生体分子検出用試薬。【００１６】
４．前記半導体ナノ粒子は、粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発することができる半導体ナノ粒子であり、且つ少なくとも２種が含有されていることを特徴とする前記１に記載の生体分子検出用試薬。
５．前記１〜４のいずれか一項に記載の生体分子検出用試薬を用いることを特徴とする生体分子検出方法。
６．ビーズに含有する半導体ナノ粒子とは異なる粒径の半導体ナノ粒子の表面に生体検出分子を修飾した半導体ナノ粒子複合体を更に前記生体分子検出用試薬と組み合わせて用いることを特徴とする前記５に記載の生体分子検出方法。
７．前記４項に記載の生体分子検出試薬を用いる生体分子検出方法であって、マイクロアレイ上で実施することを特徴とする生体分子検出方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の上記手段により、抗原抗体反応を利用した免疫測定法等において、検出感度が高く、抗原抗体反応の未反応物の分離が容易な生体分子検出用試薬及びそれを用いた生体分子検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の生体分子検出用試薬は、半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子とを無機化合物又は有機ポリマーからなるビーズに含有してなり、且つビーズ表面に生体検出用分子が修飾されていることを特徴とする。【００１９】
なお、「無機化合物又は有機ポリマーに、半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子とを含有してなるビーズ」とは、コアに半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子を主に含むコアシェル構造のビーズや、無機化合物又は有機ポリマーからなるマトリックス内に分散含有された半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子を含有してなるビーズを代表例として示すことができる。【００２０】
ここで、「ビーズ」とは、半導体ナノ粒子又は磁性体ナノ粒子を含有している微小粒子をいう。当該ビーズの粒径は１０ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。更に、５０ｎｍ〜５００ｎｍであることが好ましい。【００２１】
以下、本発明とその構成要素等について詳細な説明をする。【００２２】
（無機化合物）
本発明で用いられる無機化合物としては、半導体ナノ粒子と磁性体ナノ粒子の安定性を確保できるものであれば、特に限定されない。また、特にナノ粒子材料として希土類金属を用いる場合には、水分子の配位を防ぐことができるものが好ましい。具体的には、ガラス、シリカ、酸化イットリウム等の金属酸化物、リン酸カルシウム、リン酸ストロンチウム等の金属リン酸化合物、硫化亜鉛等の金属硫黄化合物等が挙げられる。これらのうち、光の吸収性の点でガラスが好ましい。【００２３】
（有機ポリマー）
本発明で用いられる有機ポリマーとしては特に限定されないが、例えば、（不）飽和炭化水素、芳香族炭化水素、（不）飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、（不）飽和脂ケトン、芳香族ケトン、（不）飽和アルコール、芳香族アルコール、（不）飽和アミン、芳香族アミン、（不）飽和チオール、芳香族チオール、有機珪素化合物、これらの１種以上の化合物からなる縮合体、これらの１種以上の化合物からなる重合体等が挙げられる。なお、上記「（不）飽和」とは、飽和及び不飽和の両方を意味するものである。上記縮合体及び重合体としては、例えば、ポリエチレン、ポリブタジエン等のポリオレフィン；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテル；ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルエステル、フェノール樹脂、メラミン樹脂、アリル樹脂、フラン樹脂、ポリエステル、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリウレタン、テフロン（登録商標）、アクリロニトリル／スチレン樹脂、スチレン／ブタジエン樹脂、ビニル樹脂、ポリアミド樹脂、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンオキシド、糖、澱粉、セルロース、ポリペプチド等が挙げられる。これらの有機化合物は単独で用いられても、２種以上が併用されてもよい。【００２４】
（半導体ナノ粒子）
〈半導体ナノ粒子の形成材料〉
本発明に係る半導体ナノ粒子は種々の半導体材料を用いて形成することができる。例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−Ｖ族の半導体化合物を用いることができる。【００２５】
なお、半導体材料としては、半導体ナノ粒子が粒径の違いにより、量子サイズ効果を発現し、所望の異なる波長の蛍光を発する材料を用いることが好ましい。また、蛍光色の異なる少なくとも２種類以上の半導体ナノ粒子を用いることも好ましい態様である。【００２６】
II−VI族の半導体の中では、特に、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ及びＨｇＴｅを挙げることができる。【００２７】
III−Ｖ族の半導体の中では、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ及びＡｌＳが好ましい。【００２８】
VI族の半導体の中では、Ｇｅ、Ｐｂ及びＳｉは特に適している。【００２９】
本発明においては、半導体ナノ粒子がコア／シェル構造を有する粒子であることが好ましい。この場合、半導体ナノ粒子は半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部を被覆するシェル部とで構成されるいわゆるコア／シェル構造を有する半導体ナノ粒子であって、該コア部とシェル部の化学組成が相異するものであることが好ましい。【００３０】
以下、コア粒子とシェル層について説明する。【００３１】
〈コア粒子〉
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、Ｓｉ、及びＣｄＳｅである。【００３２】
なお、必要があればＧａなどのドープ材料を極微量含んでもよい。【００３３】
上記コア部の平均粒径に関しては、発明の効果発現のために、１ｎｍ〜１０ｎｍであることが好ましい。なお、平均粒径を１ｎｍ〜１０ｎｍとすることにより小粒径の生体分子の標識及び検知が可能となり、更に、１ｎｍ〜５ｎｍであれば、十分に生体１分子に対する標識並びに動態イメージングが可能となる。従って、特に好ましいのは１ｎｍ〜５ｎｍである。【００３４】
なお、シェル部を加えたコア／シェル型半導体粒子の平均粒径としては、３ｎｍ〜５０ｎｍにすることが好ましい。更には、３ｎｍ〜１０ｎｍにすることが好ましい。【００３５】
本発明において、「平均粒径」とは、累積５０％体積粒径をいう。この測定は、例えば、一般的に用いられるＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）にて、粒子を１００個観察し、その分布の値を用いて算出することができる。【００３６】
〈シェル層〉
シェルに用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＧａＳ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＡｓ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＡｓ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、又はこれらの混合物等が挙げられる。【００３７】
なお、好ましいシェル層の材料としては、半導体ナノ結晶粒子コアより高いバンドギャップエネルギーを有する半導性材料が挙げられる。【００３８】
半導体ナノ結晶粒子コアより高いバンドギャップエネルギーを有することに加えて、シェルに適切な材料は、コア半導性ナノ粒子粒子に関して、良好な伝導性および原子価バンドオフセットを有するべきである。従って、伝導性バンドは、コア半導性ナノ結晶粒子の伝導性バンドよりも望ましくは高く、そして原子価バンドは、コア半導性ナノ結晶の原子価バンドよりも望ましくは低い。可視で（例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＰ、）または近赤外で（例えば、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ）エネルギーを放出する半導性ナノ結晶粒子コアについて、紫外線領域でバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。具体例としては、例えば、ＺｎＳ、ＧａＮおよびマグネシウムカルコゲニド（例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅおよびＭｇＴｅ）が挙げられる。【００３９】
近赤外で放出する半導性ナノ結晶粒子コアについて、可視でバンドギャップエネルギーを有する材料もまた使用され得る。【００４０】
本発明において、特に好ましい半導体材料は、ＳｉＯ2、ＺｎＳである。【００４１】
なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。【００４２】
〈半導体ナノ粒子の製造方法〉
本発明に係る半導体ナノ粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いることができる。【００４３】
液相法の製造方法としては、沈殿法である、共沈法、ゾル−ゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である（例えば、特開２００２−３２２４６８号、特開２００５−２３９７７５号、特開平１０−３１０７７０号、特開２０００−１０４０５８号公報等を参照。）。【００４４】
気相法の製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照。）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照。）、レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照。）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。【００４５】
本発明の半導体ナノ粒子の製造方法としては、特に液相法による製造方法が好ましい。【００４６】
なお、本発明に係る半導体ナノ粒子の粒径や発光強度の均一性を実現するために、原材料の純度、合成濃度、合成温度と時間、粒子形成後のアニール温度・時間等の条件を最適化して、格子欠陥が少なく結晶性の高い半導体ナノ粒子とすることを要する。【００４７】
（磁性体ナノ粒子）
本発明に係る磁性体ナノ粒子は、平均粒子径が１〜５０ｎｍの磁性を有するナノ粒子であることが好ましい。平均粒子径が１ｎｍ以上であるので安定可能に作製可能であり、５０ｎｍ以下であるので、例えば細胞内の物質を標的とした場合であっても細胞内まで侵入して標的物質を捉えることができる。また、磁性体ナノ粒子の表面が大きいため反応効率が高く、極微量の標的物質も迅速に捕集することができる。磁性体ナノ粒子の平均粒子径は、結晶の安定性および磁力応答性の観点から３〜４０ｎｍが好ましく、５〜２０ｎｍが特に好ましい。【００４８】
このような磁性体ナノ粒子は、例えば特表２００２−５１７０８５号等に記載された方法に従って製造することができる。例えば鉄（II）化合物、または鉄（II）化合物および金属（II）化合物を含有する水溶液を、磁性酸化物の形成のために必要な酸化状態下に置き、溶液のｐＨを７以上の範囲に維持して、酸化鉄またはフェライト磁性体ナノ粒子を形成することができる。また、金属（II）化合物含有の水溶液と鉄（III）含有の水溶液をアルカリ性条件下で混合することによっても、本発明の磁性体ナノ粒子を得ることができる。さらに、バイオカタリシス（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁に記載の方法を用いることもできる。【００４９】
本発明で好ましい磁性体ナノ粒子は、金属酸化物、特に、酸化鉄およびフェライト（Ｆｅ，Ｍ）3Ｏ4からなる群から選択されるものである。ここで酸化鉄には、とりわけマグネタイト、マグヘマイト、またはそれらの混合物が含まれる。また、表面と内部が異なるコアシェル型構造であっても良い。前記式中Ｍは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはＺｎ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｎｉ2+、Ｍｇ2+などであり、Ｍ／Ｆｅのモル比は選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でまたは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好ましい。これらのうち、安全性の観点から酸化鉄が好ましい。【００５０】
例えばマグネタイトを形成するためには、溶液中に鉄が２種類の異なる酸化状態、Ｆｅ2+およびＦｅ3+で存在することが好ましい。２つの酸化状態は、鉄（II）塩および鉄（III）塩の混合物を、好ましくは所望の磁性酸化物の組成に対してＦｅ（II）塩をＦｅ（III）塩より少し多いモル量で添加すること、または鉄（II）塩もしくは鉄（III）塩を添加して、必要に応じてＦｅ2+またはＦｅ3+の一部を他方の酸化状態に、好ましくは酸化または場合により還元によって変換することにより、溶液中に存在できるようになる。【００５１】
この磁性金属酸化物は、３０〜１００℃の温度、好ましくは５０〜９０℃の間の温度で熟成することが好ましい。【００５２】
磁性金属酸化物を形成するために各種の金属イオン間の相互作用を起こさせるには溶液のｐＨが７以上である必要がある。ｐＨは、適切なバッファー溶液を最初の金属塩の添加時の水溶液として用いるか、または必要な酸化状態にした後に溶液に塩基を添加することによって所望の範囲に維持される。ひとたびｐＨ値としてその７以上の範囲にある特定の値を選択した後は、最終産物の大きさの分布が実質的に均一となることを確保するために、そのｐＨ値を磁性ナノ粒子の調製工程の全体にわたって維持することが好ましい。【００５３】
また磁性ナノ粒子の粒子サイズを制御する目的で、追加の金属塩を溶液に添加する工程を設けてもよい。この場合、次の２つの異なる操作様式にて行うことができる。１つの操作様式は段階的増加によるもので、以後段階的様式の操作と呼ぶが、その操作様式では各成分（金属塩、酸化剤および塩基）を数回に分けて、好ましくは毎回等量で、定めた順序で溶液に連続的に添加し、それらの工程を所望のナノ粒子のサイズが得られるまで必要な回数繰り返し、その各回の添加量は溶液中（すなわち粒子の表面上以外）での金属イオンの重合を実質的に避けることのできる量とする。【００５４】
他方は、連続した操作様式であり、各成分（金属塩、酸化剤、および塩基）を定められた順序で、粒子表面以外の部位での金属イオンの重合を避けるために各成分毎に実質的に均一な流速で、連続的に溶液中に添加する。この段階的又は連続的操作様式を用いることによって、大きさの分布が狭い粒子を形成することができる。【００５５】
〈検出用分子によるビーズの表面修飾〉
本発明に係るビーズ表面が、疎水性である場合には、そのままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題が生じる場合がある。従って、ナノ粒子の表面（コア／シェル型半導体ナノ粒子の場合は、シェル部の表面）を親水化処理することが好ましい。【００５６】
親水化処理の方法としては、例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に粒子表面に表面修飾剤を化学的および／または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基として、カルボキシル基・アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどがあげられる。【００５７】
本発明に係る検出用分子としては、生体高分子の特異的検出のために使用し得るものであれば特に限定するものではないが、例えばアビジン若しくはストレプトアビジンまたはビオチン、抗原または抗体、ＤＮＡまたはＲＮＡ等のオリゴ若しくはポリヌクレオチド等が挙げられる。【００５８】
例えば、アビジン若しくはストレプトアビジンを検出用分子として結合させる場合には、例えば置換アルキルチオールとしてカルボキシル基を有するアルキルチオール化合物（以下、チオールカルボン酸という場合もある。）を用い、カルボキシル基が表面に露出した半導体ナノ粒子を調製し、これを更に例えばＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド等を用いて誘導体化した後、アビジンまたはストレプトアビジン（例えばシグマアルドリッチジャパン株式会社等から入手可能。）と反応させて結合することができる。【００５９】
また、ビオチンを検出用分子として結合させる場合には、例えば置換アルキルチオールとしてアミノ基を有するアルキルチオール化合物（以下、アミノチオールという場合もある）を用い、アミノ基が表面に露出した半導体ナノ粒子を調製し、これを、例えばＢｉｏｔｉｎ−Ｓｕｌｆｏ−Ｏｓｕ（スルホスクシンイミジルＤ−ビオチン）（株式会社同仁科学研究所）等の誘導体化したビオチンと反応させて結合することができる。【００６０】
当業者であれば、ビーズ上の官能基と目的の検出用分子の種類等に応じて、置換反応による結合に適した反応条件及び試薬を適宜選択することができる。【００６１】
本発明においては、検出用分子がアビジン、ストレプトアビジン、又はビオチンであることが好ましい。【００６２】
（生体分子検出方法）
本発明の生体分子検出用試薬を用いた生体高分子等の生体分子の検出は、生体分子、例えば予め検出用分子と特異的に反応し得る分子によって標識されたポリヌクレオチドやタンパク質を含有するサンプルに本発明の生体分子検出用試薬を添加し、特異的結合が生じた半導体ナノ粒子を単離してその蛍光を検出することによって行うことができ、溶液中で結合反応及び検出を行うこともできる。【００６３】
検出は、生体分子を含有する細胞中で行っても良く、また、ＤＮＡチップやタンパク質チップ等のマイクロアレイ上で反応させても良い。【００６４】
本発明の方法の一実施形態として、例えば、ＤＮＡチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとビオチンにより標識されたオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。尚、本明細書中において、「オリゴヌクレオチド」とは、特に限定するものではないが、１００塩基長以下の長さのＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドをいい、天然起源のものでも合成したものでも良い。【００６５】
また、ＤＮＡチップ上に固定されたｃＤＮＡとビオチンにより標識されたｃＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。【００６６】
さらに、ＤＮＡチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとビオチンにより標識されたｃＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。【００６７】
あるいはまた、ＤＮＡチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。上記と同様に、ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。【００６８】
また、ＤＮＡチップ上に固定されたｃＤＮＡとアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたｃＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる、ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。【００６９】
また、ＤＮＡチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたｃＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。【００７０】
一方、タンパク質の検出の場合には、例えば、タンパク質チップ上に固定されたタンパク質とビオチンにより標識されたタンパク質とを結合させた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってタンパク質間の結合の有無を検出することができる。【００７１】
また、タンパク質チップ上に固定されたタンパク質とアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたタンパク質とを結合させた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってタンパク質間の結合の有無を検出することができる。【００７２】
本発明に係る生体分子検出方法としては、半導体ナノ粒子をアビジン又はストレプトアビジンと結合させ、ビオチンにより標識された生体分子を該半導体ナノ粒子の蛍光により検出する態様の方法が好ましい。【００７３】
本発明の方法においては、粒径または化学組成の異なる複数種類の半導体ナノ粒子を用いて複数種類の生体高分子を検出することができる。用いる半導体ナノ粒子の蛍光スペクトルの各ピークが識別可能であれば複数種類の生体高分子を同時に検出することができ、ピークの鋭さにも依存するが、例えば１００ｎｍ程度離れた２本のピークは十分識別可能である。尚、検出可能範囲は４００〜７００ｎｍである。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００７５】
以下の実験において使用した洗浄液および分散液の組成は、５０ｍＭトリス（トリス(2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1, 3-ジオール)、０．９％ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ９．０からなる。【００７６】
（比較例）
平均粒径０．７μｍの磁性体（Ｆｅ2Ｏ3）含有ポリスチレンラテックス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社）に、抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）をカルボジイミドを用いて、化学結合法により固定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理することにより粒子を安定化させ緩衝液に０．０５％の濃度で懸濁させＭｇラテックス試薬を作製した。【００７７】
希土類キレートのＥｕ−ＮＴＡ（β−ナフトイルトリフルオロアセトン）化合物（自製）３×１０-4モルとＴＯＰＯ（トリオクチルホスフィンオキシド）（同仁化学）６×１０-4モルをアセトン４０ｇに溶解した後、平均粒径０．４５９μｍのポリスチレンラテックス（日本合成ゴム社）３ｇを水４０ｍｌに懸濁させたものを混合し、エバポレーターによりアセトンを除去することによりラテックス粒子中にＥｕキレートを含有させ、Ｅｕ標識ラテックス（以下、Ｅｕラテックスとする。）を作製した。【００７８】
Ｅｕラテックスに、カルボジイミドを用いて、遺伝子組換え法により産生したＢ型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）（化学及血清療法研究所）を化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理し、緩衝液に０．００３％の濃度で懸濁させ、Ｅｕラテックス試薬を作製した。ＲＩＡ法にて、ＩｇＭ型抗ＨＢｃＡｇ抗体を測定済みの、陰性検体９８検体、陽性検体９３検体を用いて特異性を調べた。【００７９】
検体３μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液３００μＬ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μＬを加えた後撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。次に、磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、上清を除いた後、緩衝液２５０μＬ、上記Ｅｕラテックス試薬４０μＬを加えて撹拌し、１０分間免疫反応を行わせた。【００８０】
磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を３００μＬ加える。この分離、洗浄工程を３回繰返した後、分離したＭｇラテックスに最終分散液３００μＬを加え、撹拌して分散させた後、蛍光強度を計測した。【００８１】
結合サンプルに含まれるＥｕラテックスの量から蛍光を測定した。抗原量が少量の陰性検体では、ＥｕラテックスとＭｇラテックスの結合により蛍光強度が観察された。一方、陽性検体では、殆どＥｕラッテクスとＭｇラッテクスの結合が少なく、陰性検体より低い蛍光強度が観測されたが、明確な差は無く、２０回行った検体検査によっては陽性・陰性の判断に迷い、検出精度が乏しかった。【００８２】
（実施例１）
１０ｎｍのＦｅ2Ｏ3磁性体ナノ粒子と６ｎｍのＣｄＳｅ半導体ナノ粒子を１：１の比率（質量比）で混ぜた存在下で乳化重合を行い、平均粒径０．７μｍのポリスチレンラテックス（以下、複合ラテックス１とする）を合成した。【００８３】
複合ラテックス１に、抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）をカルボジイミドを用いて、化学結合法により固定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理することにより粒子を安定化させ緩衝液に０．０５％の濃度で懸濁させた複合ラテックス試薬を作製した。【００８４】
検体３μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液３００μＬ、上記複合ラテックス試薬４０μＬを加えた後撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。更に抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体を表面に固定化させた４．５ｎｍのＣｄＳｅ半導体ナノ粒子を添加して５分間免疫反応することにより検体中の抗原を抗体のサンドイッチ型構造で接合させた。
次に、磁石を用いて反応液から分離し、上清を除いた後、洗浄液を３００μＬ加える。この分離、洗浄工程を３回繰返した後、分離した複合ラテックス１の複合体に最終分散液３００μＬを加え、撹拌して分散させた後、蛍光強度を計測する。【００８５】
結合サンプルに含まれる複合ラテックス１の６ｎｍの半導体粒子と抗原をサンドイッチした抗体の４．５ｎｍ半導体粒子を測定試料として蛍光を測定した。６ｎｍの半導体ナノ粒子の蛍光では陽性検体で、高い蛍光強度、陰性検体では、低い蛍光強度が観測された。更に４．５ｎｍの半導体ナノ粒子の蛍光測定により高い精度で陽性の検出が可能となった。これは２０回繰り返しの検出においても陽性、陰性の区別が明確であり、再現性精度も高いことを証明した。【００８６】
（実施例２）
１０ｎｍのＦｅ2Ｏ3磁性体ナノ粒子と３ｎｍと６ｎｍのＣｄＳｅ半導体ナノ粒子を１：０．５：０．５の比率（質量比）で混ぜた存在下で乳化重合を行い、平均粒径０．７μｍのポリスチレンラテックス（以下、複合ラテックス２とする）を合成した。【００８７】
複合ラテックス２に、抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）をカルボジイミドを用いて、化学結合法により固定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理することにより粒子を安定化させ緩衝液に０．０５％の濃度で懸濁させた複合ラテックス試薬２を作製した。【００８８】
検体３μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液３００μＬ、上記複合ラテックス試薬１及び２をそれぞれ２０μＬ加えた後撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。更に抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体を表面に固定化させた４．５ｎｍのＣｄＳｅ半導体ナノ粒子を添加して５分間免疫反応することにより検体中の抗原を抗体のサンドイッチ型構造で接合させた。次に、磁石を用いて反応液から分離し、上清を除いた後、洗浄液を３００μＬ加える。この分離、洗浄工程を３回繰返した後、分離した複合ラテックスに最終分散液３００μＬを加え、撹拌して分散させた後、実施例１と同様に蛍光強度を計測する。【００８９】
結合サンプルに含まれる複合ラテックス１および２の残量を測定試料として、それぞれ半導体３ｎｍ、６ｎｍ粒子の蛍光を測定した。陽性検体では、高い蛍光強度、陰性検体では、低い蛍光強度が観測された。更に４．５ｎｍ粒子の発光も検出することにより、より高い精度での検出が可能となった。【００９０】
（実施例３）
ポリスチレンラテックスをガラスに変更した複合ガラスビーズにすること以外は実施例２に示される上記操作を実施して、結合サンプルに含まれる複合ガラスビーズ１および２の残量を測定試料としてそれぞれの蛍光を測定した。【００９１】
本発明の生体分子検出試薬を用いることにより比較例と比較して、有機蛍光色素の溶解・反応等のための操作が必要なく、簡便な方法で検出できることが確認された。また高い発光強度を得て、特異性が高く高精度で検出も可能となった。
【国際調査報告】
2008035569.tif 000002
2008035569.tif 000003
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