(57)【要約】  低増殖性でかつ低温耐性を有する細胞株の樹立方法を確立し、ライ菌の簡便で長期的なin vitro培養法を提供することを目的とする。  ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウス皮下可植性ヒト血管肉腫より得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清含有培地で培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって剥離しない細胞を選択し、得られた細胞株を前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量を低減しながら継代培養することを特徴とする低温耐性（超）低増殖性細胞株の樹立方法、この方法により得られる細胞株、及びこれを用いたライ菌の培養方法。
2009028705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウス皮下可植性ヒト血管肉腫由来の低温耐性かつ低増殖性細胞株を宿主として用いることを特徴とするライ菌の体外培養法。
【請求項２】
前記低温耐性かつ低増殖性細胞株が、２８〜３７℃の温度条件下における倍加時間が１日以上２８日以下である請求項１に記載のライ菌の体外培養法。
【請求項３】
低温耐性かつ低増殖性細胞株として、ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫ＷＢ−ＳＣＩＤより得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清含有培地で培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって剥離しない細胞を選択し、得られた細胞株を前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量を低減しながら継代培養することにより得られる低増殖性細胞株を用いる請求項１または２に記載のライ菌の体外培養法。
【請求項４】
低温耐性かつ低増殖性細胞株として、超低増殖性細胞株ＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１７年６月８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０３４９号として寄託）をＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量を低減しながら継代培養することにより得られる低増殖性細胞株を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のライ菌の体外培養法。
【請求項５】
低温耐性かつ低増殖性細胞株として、細胞株ＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８６４号として寄託）を用いる請求項４に記載のライ菌の体外培養法。
【請求項６】
前記宿主中、２８〜３２℃の範囲内で培養を行う請求項１〜５のいずれかに記載のライ菌の体外培養法。
【請求項７】
ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウス皮下可植性ヒト血管肉腫ＷＢ−ＳＣＩＤより得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清含有培地で培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって剥離しない細胞を選択し、得られた細胞株を前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量（培養上清含有濃度）を低減しながら継代培養することを特徴とする低増殖性細胞株の樹立方法。
【請求項８】
前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培養上清含有濃度を２０％以下とした時点で培養温度を２８℃まで下げる工程を含む請求項７に記載の低増殖性細胞株の樹立方法。
【請求項９】
ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫に由来し、請求項７または８に記載の方法により樹立された低増殖性細胞株。
【請求項１０】
２８〜３７℃の温度条件下における倍加時間が１日以上２８日以下である請求項９に記載の超低増殖性細胞株。
【請求項１１】
ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫ＷＢ−ＳＣＩＤに由来する超低増殖性細胞株ＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１７年６月８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０３４９号として寄託）をＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量（培養上清含有濃度）を低減しながら剥離継代培養する方法により樹立された低増殖性細胞株。
【請求項１２】
低増殖性細胞株ＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８６４号として寄託）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低増殖性細胞株の樹立方法、特に低温耐性低増殖性細胞株の樹立方法、その方法により樹立された低温耐性低増殖性細胞株及びこれを用いたライ菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハンセン病はＷＨＯ指定特定伝染病であり、全世界で約１２００万人の患者がいると推定されている。また、年間５０万人以上の患者が新たに発生しているとされる。この感染症の原因菌であるライ菌（Mycobacterium leprae）は細胞内寄生菌であり、マクロファージ、シュワン細胞、血管内皮細胞等の内部で増殖する。【０００３】
ライ菌は試験管内で培養することはできず、抗ライ薬の効果を調べるためにはマウス足底部でのライ菌培養が用いられている。また、ライ菌はアルマジロに感染することが発見されており、ライ腫型ライ（ＬＬ型：ライ菌が最も増殖する臨床病型）の疾患モデルとしてライ研究に利用され、これを用いてライワクチンをつくることが試みられている。【０００４】
しかし、動物を用いた培養は取扱いが不便である。マクロファージ、神経細胞などを感染細胞として用いることも検討されてきたが、培養には成功していない。このように、in vitro培養が不可能であるという事情がハンセン病研究の遅れの大きな原因となっている。また、上述の通り、ハンセン病は現在でも多数の患者を有する感染症である。ハンセン病治療薬としてはサルファ剤や各種抗生物質が用いられており、耐性菌に対しては２〜３剤併用の多剤療法が行なわれているが、これらに対しても耐性菌が発生しており、有用な抗ライ薬のスクリーニング系が望まれている。【０００５】
上記の事情に鑑み、本発明者らの一人は、血管内皮細胞から、増殖速度が低くライ菌の感染増殖に適した超低増殖性内皮系細胞（本願明細書において「ＳＬＧ細胞」という）を樹立し、これを用いたライ菌の培養方法を先に提案した（特許文献１）。しかし、このＳＬＧ細胞は低温耐性の点で未だ不十分であり、用い得る培地にも制限があった。
【特許文献１】特開２００６−３４５８１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、動物を利用することなく、ライ菌の長期的なin vitro培養を可能とするより改善された培養系の確立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の超低増殖性内皮系細胞（ＳＬＧ細胞）の継代培養を重ねた結果、上記細胞が、形態及び増殖性の点で明確に異なる低温耐性低増殖性細胞（本願明細書において「ＬＴＴ細胞」という）に変化するという予想外の結果を得た。また、このＬＴＴ細胞は、２８℃の低温までの温度により細胞増殖が制御可能であり、かつ通常の培地で培養が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下の低増殖性細胞株の樹立方法、特に超低増殖性細胞株の樹立方法、その方法により樹立された超低増殖性細胞株及びこれを用いたライ菌の培養方法を提供する。【０００９】
１．ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウス皮下可植性ヒト血管肉腫由来の低温耐性かつ低増殖性細胞株を宿主として用いることを特徴とするライ菌の体外培養法。
２．前記低温耐性かつ低増殖性細胞株が、２８〜３７℃の温度条件下における倍加時間が１日以上２８日以下である前記１に記載のライ菌の体外培養法。【００１０】
３．低温耐性かつ低増殖性細胞株として、ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫ＷＢ−ＳＣＩＤより得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清含有培地で培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって剥離しない細胞を選択し、得られた細胞株を前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量を低減しながら継代培養することにより得られる低増殖性細胞株を用いる前記１または２に記載のライ菌の体外培養法。【００１１】
４．低温耐性かつ低増殖性細胞株として、超低増殖性細胞株ＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１７年６月８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０３４９号として寄託）をＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量を低減しながら継代培養することにより得られる低増殖性細胞株を用いる前記１〜３のいずれかに記載のライ菌の体外培養法。【００１２】
５．低温耐性かつ低増殖性細胞株として、細胞株ＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８６４号として寄託）を用いる前記４に記載のライ菌の体外培養法。【００１３】
６．前記宿主中、２８〜３２℃の範囲内で培養を行う前記１〜５のいずれかに記載のライ菌の体外培養法。
７．ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウス皮下可植性ヒト血管肉腫より得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清含有培地で培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって剥離しない細胞を選択し、得られた細胞株を前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量（培養上清含有濃度）を低減しながら継代培養することを特徴とする低増殖性細胞株の樹立方法。【００１４】
８．前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培養上清含有濃度を２０％以下とした時点で培養温度を２８℃まで下げる工程を含む前記７に記載の低増殖性細胞株の樹立方法。
９．ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫に由来し、前記７または８に記載の方法により樹立された低増殖性細胞株。【００１５】
１０．２８〜３７℃の温度条件下における倍加時間が１日以上２８日以下である前記９に記載の低増殖性細胞株。
１１．ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫に由来する超低増殖性細胞株ＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１７年６月８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０３４９号として寄託）をＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量（培養上清含有濃度）を低減しながら剥離継代培養する方法により樹立された低増殖性細胞株。【００１６】
１２．低温耐性低増殖性細胞株ＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８６４号として寄託）。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ライ菌の感染増殖に適した低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）が得られる。このため、ライ菌の長期的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が可能となる。また、ライ菌の体外培養をこのＬＴＴ細胞で確立することで、いままで解明されてこなかったライ菌のクローニング、細胞内侵入経路や細胞内増殖様式、さらには治療薬のin vitro実験系など今迄不可能であったライ菌の研究が幅広く可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明による低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の形状の温度による変化を示す写真（３７℃）。
【図２】本発明による低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の形状の温度による変化を示す写真（３２℃）。
【図３】本発明による低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の形状の温度による変化を示す写真（３０℃）。
【図４】本発明による低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の形状の温度による変化を示す写真（２８℃）。
【図５】本発明によるＬＴＴ細胞の温度による増殖速度の変化を示すグラフ。
【図６】本発明によるＬＴＴ細胞のライ菌（M.leprae）への感染を示す写真（チール・ネルセン染色、４００倍）。
【図７】本発明によるライ菌（M.1eprae）感染ＬＴＴ細胞を種々の温度で２週間培養した場合におけるライ菌１６ｓｒＲＮＡ量の変化を示すグラフ。
【図８】本発明によるライ菌感染ＬＴＴ細胞を培養した場合におけるライ菌１６ｓｒＲＮＡ量と菌数の相関を示すグラフ。
【図９】本発明によるライ菌感染ＬＴＴ細胞を培養した場合におけるライ菌数の増大を示す写真（チール・ネルセン染色、シェパード法、４００倍；１日目）。
【図１０】本発明によるライ菌感染ＬＴＴ細胞を培養した場合におけるライ菌数の増大を示す写真（チール・ネルセン染色、シェパード法、４００倍；１４日目）。
【図１１】本発明によるライ菌感染ＬＴＴ細胞を培養した場合におけるライ球（各写真右下枠内参照）の形成を示す写真（チール・ネルセン染色、２００倍；左：１日目、右：１４日目）。
【図１２】本発明によるライ菌感染ＬＴＴ細胞を継代培養した場合におけるライ菌１６ｓｒＲＮＡ量を示すグラフ（３０℃、２週間後ＤＤＷ処理により新たなＬＴＴにライ菌を感染させている）。
【図１３】ヒト型ネスチン発現のＦＡＣＳ解析の結果を示す図。
【図１４】培地添加ＦＢＳ濃度によるＬＴＴ細胞増殖抑制を示す図。
【図１５】ＬＴＴ細胞増殖と細胞内感染ライ菌増殖の相関を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
Ｉ．低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の樹立方法
はじめに、本発明による低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の樹立方法について説明する。【００２０】
本発明による低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の樹立方法は、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウス皮下可植性ヒト血管肉腫ＷＢ−ＳＣＩＤより得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清含有培地で培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって剥離しない細胞を選択し、得られた（超）低増殖性細胞株を前記ＩＳＯＳ−１培養上清の培地中添加量（培養上清含有濃度）を低減しながら剥離継代培養することを特徴とする。ここで、（超）低増殖性細胞株は特開２００６−３４５８１１で開示した方法により得られる。この方法を以下の（Ａ）〜（Ｂ）で説明し、本発明のＬＴＴ細胞の樹立方法について（Ｃ）で説明する。【００２１】
（Ａ）低増殖性細胞の分離培養方法
ＳＣＩＤ（severe combined immunodeficiency disease；重症複合型免疫不全症）マウスは、遺伝子再構成能に異常があるために成熟したＢおよびＴ細胞が先天的に欠損したマウスであり、ヒト新生児でみられる遺伝性の重症複合型免疫不全症のモデル動物である。レシピエントとしてのＳＣＩＤマウスは、種々の系統が知られているが、本発明ではいずれも用いることができる。一方、ヒト血管肉腫は稀ではあるが致死性の高い腫瘍である。【００２２】
ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫ＷＢ−ＳＣＩＤは、本発明者らがヒト血管肉腫をＳＣＩＤマウスに移値して可植性腫瘍として樹立したものである（Masuzawa M.et al.,“Evaluation of recombinant interleukin-2 immunotherapy for human hemangiosarcoma in a SCID mice model（WB−ＳＣＩＤ）”，J．Dermatol. Sci.27（2）：88-94, 2001）。本発明においては、この腫瘍（ＷＢ−ＳＣＩＤ）またはこれに準じて作製したＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫を用いることができる。以下の説明では、便宜上、このようにして得られるＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫細胞をＷＢ−ＳＣＩＤ腫瘍細胞と呼ぶ。【００２３】
低増殖性細胞を得るには、まず、ＷＢ−ＳＣＩＤ腫瘍細胞を腫瘍から得た後、マウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清含有培地で培養する。マウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清を含まない培地ではＷＢ−ＳＣＩＤ腫瘍細胞は数日間で死滅するため、マウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清は培養に必須である。マウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１は本発明者らにより樹立され（Masuzawa M. et al.,“Establishment of a new murine-phenotypic angiosarcoma cell line(ISOS−1)“，J. Dermatol. Sci．，16（2）：91−98,1998）、東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターに保存されている(保存番号：TKG 0590)。【００２４】
マウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清は、上記ＩＳＯＳ−１を培養することにより得られるが、典型的には、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加したＤＭＥＭ−high glucose（ダルベッコ改変イーグル培地）を用いることができる。具体的には（ａ）培地としてＤＭＥＭ−high glucose＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを用い、ＩＳＯＳ−１細胞を１×１０６程度フラスコで培養し、コンフルエントになり細胞数約１×１０８となった状態で培地を回収し、遠心（３０００ｒｐｍ）後、上清を凍結保存し、使用時に３７℃で解凍後、濾過して使用する。ＩＳＯＳ−１培養上清の添加濃度は好ましくは５０％以下である。【００２５】
ＷＢ−ＳＣＩＤ腫瘍細胞を培養するための培地は、上記ＩＳＯＳ−１培養上清の添加を除けば通常と同様でよく、例えば、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加したＤＭＥＭ−high glucose（ダルべッコ改変イーグル培地）を用いることができる（Masuzawa M.et al.,“Establishment of a human hemangiosasarcoma cell line (ISO-HAS)”Int. J. Cancer, 81（2）：305−308,1999参照）。培養条件は後述の超低増殖性培養株を得る場合以外は通常の温度条件及び湿度条件を採用し得る。培養は接着培養にて行なう。【００２６】
次いで、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行ない、剥離した細胞を除く処理を行なう。処理時間は５〜３０分間程度、好ましくは１０〜２０分間程度、より好ましくは１５分間程度である。これにより、酵素抵抗性細胞以外の細胞が除去できる。継続培養しながらトリプシン−ＥＤＴＡ処理は通常５回以上、好ましくは１０回以上行ない、酵素抵抗性細胞のみを純化する。【００２７】
このように純化して得られたＷＢ−ＳＣＩＤ腫瘍細胞は、それ自体低増殖性であるが、このＷＢ−ＳＣＩＤ腫瘍細胞を剥離継代培養することにより、より低増殖性の細胞株を得ることができる。ここで剥離継代培養とは、細胞に対してトリプシン−ＥＤＴＡ処理を行なった後、これを機械的に剥離して培養する手法を繰り返して継代培養を行なうことである。剥離継代培養における機械的剥離操作としては接着細胞を穏やかかつ効果的に剥離するために慣用される剥離方法が利用できるが、典型的にはピペッティング操作が用いられる。剥離継代培養は通常１０代以上、好ましくは１００代以上行なう。【００２８】
得られた細胞は密度依存性であり、密度が高いほど増殖が活発化する。
（Ｂ）超低増殖性細胞株の樹立方法
超低増殖性細胞株の樹立方法は、基本的には上記の低増殖性細胞の分離培養方法と同様であるが、初代培養時のマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清の添加濃度は好ましくは５〜２０％程度、特に好ましくは20％程度とする。【００２９】
このようにして得られる（超）低増殖性細胞株は、マウスＣＤ３１、ＧＳＡ−１陽性であり、マウス内皮系細胞である。また、染色体はすべてマウス型で、最頻数は７７である。しかし、ヒト／マウス両クラスＩ抗原を同時発現している。また、ここで得られる（超）低増殖性細胞株のうちほとんどはマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清の添加濃度５％以下では成育せず死滅する。【００３０】
得られた細胞株の１つがＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤであり、平成１７年６月８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０３４９号として寄託されている。【００３１】
（Ｃ）低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株
上述のように、前記ＳＬＧ細胞はマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清の添加濃度５％以下では成育せず死滅する。しかし、継代培養しながら徐々に添加濃度を下げることにより添加濃度０％の培地（例えば、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ−high glucose培地）で培養が可能な細胞が得られることが明らかになった。【００３２】
本発明の低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株の樹立方法では、上記（Ｂ）の手順により新たに（超）低増殖性細胞株を得、これを以下の操作に供してもよいが、平成１７年６月８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０３４９号として寄託したＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤを用いてもよい。【００３３】
前記培養上清の添加濃度の低減は、任意の方法で行い得る。例えば、一定の割合（例えば、継代するごとに３０％〜９９％）で添加濃度を逓減してもよいし、一定の値（例えば、継代するごとに１％〜１０％）添加濃度を低減してもよい。また、添加濃度の低減に際して、低温処理を行ってもよい。例えば、添加濃度を２０％以下とし
た時点で培養温度を低下させる。但し、２８℃以下では成育しないので低温処理は２８℃以上で行うことが好ましい。好ましくは、添加濃度を２０％にした時点で２８℃までの低温処理を行う。【００３４】
このようにして得られた低温耐性低増殖性細胞株としては、例えば、ＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤ（平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８６４号として寄託）がある。【００３５】
得られる細胞は２８℃までの低温耐性となり、また、温度を下げることで小型化するなど形態上の変化も見られる（図１〜４）。
ＩＩ．ライ菌の培養
本発明による、低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株は倍加時間が１日以上２８日以下であり、しかも、適応温度が２８℃までである。また、低温により細胞増殖が制御可能であり、ライ菌の培養に適している。【００３６】
後述の実施例に示すように、本発明による低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株はライ菌に容易に感染させることができる。例えば、低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）を、例えば、マウス足蹠のライ腫より分離した粗なライ菌浮遊液と混合培養するだけでよい。ライ菌の培養は好ましくは２８〜３２℃、より好ましくは３０℃前後にて行う。【００３７】
また、本発明の低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）株によれば、ライ菌の継代培養を容易に行うことができる。具体的には、ライ菌感染ＬＴＴ細胞を２度蒸留水（ＤＤＷ）で処理することでＬＴＴ細胞を破壊して、細胞内のライ菌を遊出させ、新たにＬＴＴ細胞に感染させる。【００３８】
また、ＬＴＴ細胞内感染ライ菌の長期培養において、ライ菌障害や処理過程におけるライ菌の損失などを避けるために、例えば、牛胎児血清(FBS)の添加濃度を2.5％まで低下させ、1％程度の脂肪カクテルを混合した培地を用いることができる。これにより、ライ菌増殖を保持しつつＬＴＴ細胞増殖をさらに抑えることができ、従って、ＬＴＴ細胞を破壊処理することなく、ライ菌を感染したままでＬＴＴ細胞を適時分割しながら長期培養することが可能である。【００３９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を制限するものではない。なお、下記の手技はすべて無菌操作で行なった。また、ライ菌はＴｈａｉ５３株ライ菌（国立感染症研究所ハンセン病研究センターより入手）を用いたが、この株がライ菌であることは、ライ菌の特異的プライマーを用いたＰＣＲ（Cox RA， Kempsell K, Fairclough L, Colston MJ． The 16s ribosomal RNA of Mycobacterium leprae contains a unique sequence which can be used for identification by the polymerase chain reaction. J. Med. Microbiol.,35：284−290,1991．参照）を用いて事前に確認した。
参考例１：低増殖性細胞株の樹立
（１）マウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清の作成
培地としてＤＭＥＭ−high glucose＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを用い、ＩＳＯＳ−１（Masuzawa M. et al.,”Establishment of a new murine-phenotypic angiosarcoma cell line (ISOS-1)”，J.Dermatol. Sci.,16（２）：91−98,1998）を１×１０６を１７５ｃｍ２フラスコで上記培地５０ｍｌ中１週間培養した。フラスコがコンフルエントになり細胞数約１×１０８となった状態で培地を回収し、遠心（３０００ｒｐｍで１０分間）後、上清を−２０℃凍結保存した。これを使用時３７℃で解凍後、０．４５μｍフィルターで濾過して用いる。【００４０】
（２）ＷＢ−ＳＣＩＤ細胞
ＳＣＩＤマウス皮下可植性ヒト血管肉腫ＷＢ−ＳＣＩＤ（Masuzawa M. et al.,“Evaluation of recombinant interleukin-2 immunotherapy for human hemangiosarcoma in a SCID mice model (WB-SCID)”， J. Dermatol. Sci．27（２）：88−94,2001
）の腫瘍を摘出した。【００４１】
摘出腫瘍をシャーレに移し、生理食塩水内にて半割し、腫瘍中心半壊死組織より円刃を用いて擦過するようにして非酵素処理にて細胞遊出させた。遊出した細胞を遠心チューブに移し、遠心器にて４℃、１０００ｒｐｍで遠心し、細胞を沈下させ上清を除去し、沈下した細胞層を分離した。【００４２】
細胞層を上記（１）のマウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清５０％添加し、ヒト血管肉腫細胞用培地（ＤＭＥＭ−high glucose＋１０％ＦＢＳ＋マウス血管肉腫細胞株ＩＳＯＳ−１培養上清５０％添加）（以後培地と略す）にて再浮遊させて通常の培養皿に移し、ＣＯ２インキュベータ内にて３７℃、５％ＣＯ２の通常の培養環境で培養を開始した（初代培養）。【００４３】
以後週に２回培地を交換し、培養開始１週間後、培地を除去し、生理食塩水で１回培養皿底を洗い、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ製）（以後、トリプシン−ＥＤＴＡと略す）を適量加え１０分間放置した。放置後、剥離した細胞を除去し、培養皿底に残存した細胞のみを生理食塩水で１回洗い、新たに新鮮な培地を加え継続培養した。上記の操作を週２回、計１０回繰り返し、トリプシン−ＥＤＴＡ処理にて剥離する細胞がないことを確認し、トリプシン−ＥＤＴＡで剥離しなかった細胞のみ培養を続けた。【００４４】
（３）低増殖細胞株の選択
１カ月後、培養皿底に観察される細胞コロニーをトリプシン−ＥＤＴＡで１時間処理し、その後トランスファーピペットで約１０分間ピペッティングして機械的に細胞を剥離した。剥離細胞を新たな培養皿に移し、培養を継続した。【００４５】
培養皿内で増殖した細胞について上記と同様にピペッティングして機械的に細胞を剥離、剥離継代培養を繰り返した。
２ケ月後、紐状に長い細胞群が単層敷石状に安定して培養された。この細胞は密度依存性（細胞密度が高いほど増殖は活発化）に増殖した。【００４６】
径３５ｍｍ培養皿（９．６ｃｍ２）で培地２ｍｌ、培地交換週２回の培養条件で、１０５個の細胞を培養すると最も増殖する７日目から１０日目でも、倍加時間は約７０時間であり、低増殖性であった。【００４７】
上記の培養条件で１０日目以降に細胞は培養皿をほぼ覆い、唐草模様状に単層に増殖した。コンフルエントの状態に近づくと、細胞の剥離が起こった。
細胞数を減らして培養を繰り返すことで細胞は性状を変化せず、ゆっくり増殖を続けた。【００４８】
得られた細胞は紐状で長い形態（長さ：約１００〜２５０μｍ）である。また、得られた細胞を自動細胞分析装置（ＦＡＣＳｃａｎ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いＣＥＬＬＱｕｅｓｔ解析ソフトでＦＡＣＳ解析したところ、マウスＣＤ３１、ＧＳＡ−１陽性でマウス内皮系細胞であることが確認された。染色体はすべてマウス型で、７１〜７９に及び、最頻数は７７であった。また、ヒト／マウス両クラスＩ抗原を同時発現しており、電顕的には高密度顆粒が多く、きわめて細胞小器官に富んでいた。この細胞はＤＭＳＯ１０％添加培地で凍結保存が可能であった。【００４９】
参考例２：超低増殖性細胞株の樹立
参考例１と同様にしてＷＢ−ＳＣＩＤ細胞を得た。（１）培地に添加するＩＳＯＳ−１培養上清の添加比率を５０％から２０％に低下させ、（２）ＣＯ２インキュベータの温度設定を３７℃から３４℃に低下させた他は参考例１と同様の培養条件でこれを培養した。【００５０】
この結果、変更前の条件でコンフルエントに達した細胞密度の約５０％まで増殖した時点で細胞は超低増殖性となり、この時点での倍加時間は１５００時間以上であった。
細胞の形状等は参考例１と同様であった。単一株をＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤとして、平成１７年６月８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０３４９号）。
【実施例１】
【００５１】
低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）の樹立
上記のＳＬＧ／ＷＢ−ＳＣＩＤ細胞株を７５ｃｍ２培養フラスコを用いて３４℃インキュベータでＩＳＯＳ−１培養上清２０％添加の培地にて培養しさらに２℃ずつ培養温度を下げ、２８℃までの低温度に達した時点からＩＳＯＳ−１培養上清の添加濃度を下げ、最終的に無添加条件で培養が可能となった。【００５２】
細胞の形状は実施例１〜２とは異なり、短縮して小型化する。
この単一株をＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤとして、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８６４号）。
【実施例２】
【００５３】
ＬＴＴ細胞のヒト型ネスチン発現
本実施例においてＬＴＴ細胞 (ＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤ)が神経幹細胞マーカーであるヒト型ネスチン(nestin)発現陽性であることを確認した。
１．Nestin  FACS解析
LTT細胞のヒト型ネスチンおよびマウス型ネスチンの発現の有無をFACSで解析した。ヒト型ネスチン発現解析のため、第一抗体として神経幹細胞マーカーヒト型ネスチン抗体(Rabbit anti-human nestin polyclonal antibody, 反応特異性：ヒト型ネスチンのみ陽性、Chemicon International Inc.)、第二抗体としてビオチン標識anti-rabbit IgGで反応させたのち、FITC標識avidinで発色し、FACS解析した。マウス型ネスチン発現解析のために、第一抗体としてマウス型ネスチン抗体（Mouse anti-nestin monoclonal antibody, 反応特異性：ラットおよびマウス型ネスチンのみ陽性、Chemicon International Inc.）、第二抗体FITC標識抗マウス抗体IgGで発色しFACS解析した。
2.結果
LTT細胞はヒト型ネスチンが陽性で（図13）、マウス型ネスチンは陰性であった（データ示さず）。同時に解析した正常血管内皮細胞（HUVEC）、血管肉腫細胞（ISO-HAS）、悪性組織球腫細胞（FEM）、悪性外毛根鞘腫細胞（TL-1）はいずれも明らかな陽性所見を認めなかった（図13）。【００５４】
ＬＴＴ細胞はヒト/マウス両クラス I抗原を発現するマウス内皮系細胞であるが、ヒト型ネスチンを発現していることで神経幹細胞としての性状も保持していることが明らかになった。ライ菌は生体内で神経組織に極めて親和性が高いことが知られており、ＬＴＴ細胞が神経幹細胞の性状をも発現していることは、ライ菌にとってＬＴＴ細胞は感染宿主として親和性があると考えられる。
【実施例３】
【００５５】
低温耐性低増殖性細胞（ＬＴＴ細胞）の生育における温度依存性
実施例１で得たＬＴＴ／ＷＢ−ＳＣＩＤを３７、３２、３０及び２８℃の温度条件下１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地の培地にて培養し、０、７、１４及び２１日目の細胞数を計測した。結果を図５に示す。増殖力は温度の低下とともに低下し、培養開始から１４日目までの倍加時間は３７℃で７５．７時間（３．１日）、３２℃で１０５．８時間（４．４日）、３０℃で２３７時間（９．９日）、２８℃で５００時間(２０．８日)であった。
【実施例４】
【００５６】
ＬＴＴ細胞とライ菌の親和性(易感染性）
マウス足蹠のライ腫より分離した粗なライ菌浮遊液をＬＴＴ細胞と混合培養した。１週間後チール・ネルセン染色した結果、細胞内ライ菌の存在を確認した（図６）。
【実施例５】
【００５７】
細胞内ライ菌増殖の最適温度条件の確定
下記の方法により細胞内ライ菌増殖の最適温度条件を検討した。
Ａ．ＬＴＴ細胞内感染ライ菌の数量の判定
１）リアルタイムＰＣＲによるライ菌１６ｓ  ｒＲＮＡの相対定量
Yang Z, Habib M, Shuai J, Fang W. Detection of PCV2 DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR.J. Zhejiang Univ.Sci. B,8：162−169,2007に準じて、以下の手順によりライ菌１６ｓ ｒＲＮＡの相対定量を行う。【００５８】
すなわち、実施例４のライ菌感染細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、マイクロチューブに移し、遠心（５６０Ｇ、５分）して上清を除く。得られたペレットに溶解バッファ（キアゲン社  lysis buffer; Buffer RLT, Rneasy Mini Kit）３００μｌを加え細胞を溶解した。直ちに２回蒸留水（ＤＤＷ）１ｍｌを加え、溶解バッファを希釈する。遠心（４６００Ｇ、５分）して上清を除き、ペレットに前記バッファ（Buffer RLT）１ｍｌを加え、ピペッティングにて混和する。Lysing Matrix B tubeに移し、ボールミル型ホモジナイザー（トミー精工製Micro Smash）にて５０００ｒｐｍで１分間遠心する。Rneasy Mini Kitにて全ＲＮＡを抽出し、QuantiTect（登録商標、キアゲン社）SYBR Green PCRキットにてｃＤＮＡ合成した。下記のライ菌16s rRNA遺伝子特異的プライマーＰ２×Ｐ３で、SYBER Green Real-time PCRを行い、ライ菌特異的16s rRNAを相対定量する。
Ｐ２：5’ AGTCGAACGGAAAGGTCTTAAAAAATCTT 3’（配列番号１）
Ｐ３：5’ CATCCTGCACCGCAAAAAGCTT 3’（配列番号２）
２）Shepard法rapid methodによる菌数のカウント定量法
Shepard C.C. Acid-fast bacilli in nasal excretions in leprosy,and results of inoculation of mice, Am． J. Hyg.,71：147−157,1960に準じて、以下の手順によりライ菌数のカウントを行う。【００５９】
細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、マイクロチューブに移し、遠心（５６０Ｇ、５分）して上清を除く。得られたペレットに溶解バッファ（キアゲン社1ysis buffer;Buffer RLT,Rneasy Mini Kit）３００μｌを加え、細胞を溶解する。２回蒸留水（ＤＤＷ）１ｍｌを加え、ピペッティング後、遠心（４６００Ｇ、５分）し、上清を完全に除去した後、血清入り培地１０ｍｌを加え、ピペッティングを十分に行い、平均台上のスライドグラス上に径１０ｍｍの円形状に塗り広げて空気乾燥させる。３回火炎固定し、チール・ネルセン染色を行った後、円の直径線に沿って、４００倍の連続視野で視野内の菌数をカウントし合計し、下記の計算式から検体内の菌数を算出する。【００６０】
総菌数＝視野数×カウント合計菌数／１．２７
Ｂ．ＬＴＴ細胞内ライ菌増殖の最適温度条件の確定
粗なライ菌浮遊液（１×１０８）を７５ｃｍ２フラスコにプレコンフルエントになったＬＴＴ細胞に添加して１週間培養した。フラスコをＰＢＳ−−（Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅ）で洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、１０ｃｍ２の培養皿に１×１０４／ｃｍ２を分注し、３７℃、３２℃、３０℃、２８℃の各温度で２週間培養した。Ａの１）の手順で、ＲＮＡを相対定量し、３０℃がライ菌増殖の最適温度であることを確認した（図７）。【００６１】
Ｃ．最適温度条件における増殖を評価する菌数とｒＲＮＡ相対定量の相関性の確認
最適温度にて培養したライ菌感染ＬＴＴ細胞を培養１日目と２週間目とに採取した。Ａの１）と２）の各手法によりそれぞれ、ＲＮＡの相対定量と菌数のカウントを行い、両者の相関を確認した（図８）。培養１日目と２週目の間の倍加時間〔generation (doubling) time〕は４．４日であった。Ｓｈｅｐａｒｄ法での顕微鏡視野内の比較でも明らかに菌数の増加が確認された（図９、１０）。ＬＴＴ細胞感染ライ菌は培養１日目に比べて２週間目ではライ球（ｇｌｏｂｉ；ライ腫型ライの良好な増殖形態とされる）状に菌塊増殖が目立っており（図１１）、ライ菌の良好な増殖が確認できた。
【実施例６】
【００６２】
ライ菌の継代培養
Ａ．滅菌蒸留水（ＤＤＷ）処理を用いる方法
２週間培養したライ菌感染ＬＴＴ細胞の培養皿の培養上清を除去し、培養皿を１度ＤＤＷで洗浄した。新たにＤＤＷを適量加え、５分間静置した。ホールピペット（transfer pipette）でピペッティングを行い、さらに５分間静置した。ホールピペットで再度ピペッティングを行った。一方、非感染の新しいＬＴＴ細胞の浮遊液を作成し、５×１０４／ｃｍ２の細胞密度になるようにＬＴＴ細胞の浮遊液をＤＤＷ処理した培養皿に４倍量添加し、１週間培養した。【００６３】
培養２週目とＤＤＷ処理後１週間目のＬＴＴ細胞を回収し、実施例５Ａ１）の手順でＲＮＡを相対定量した。この結果、培養２週目のＲＮＡ量よりＤＤＷ処理後１週間目のＲＮＡの増量が確認された。すなわち、ライ菌の継代増殖培養が可能であることが確認された（図１２）。【００６４】
Ｂ．牛胎児血清(FBS)の添加濃度を低下させた培地を用いる培養方法
B-1 培地添加FBS濃度によるLTT細胞増殖抑制
方法：5% CO2 インキュベーターでライ菌最適温度条件30℃において、LTT細胞を〜1 x 105 / cm2密度で培養を開始し、DMEM-high-glucose（HDMEM）培地添加FBS濃度を0%から10%までの各濃度で増殖抑制を検討した。
結果：LTT細胞はライ菌至適温度30℃でFBS濃度を低下させると増殖が抑制された。2.5%濃度は細胞障害なく増殖が抑制される最低濃度で、2週間培養における倍加時間（DT）は372時間（15.5日）であった（図１４）。これは10％ FBS添加条件の237時間(9.9日)よりさらに延長している。
B-2 ライ菌感染ＬＴＴ細胞の培養
方法：上記の結果より、FBS 2.5%添加HDMEMにライ菌の栄養源として１％脂質カクテル(Lipid concentrate, Invitrogen Co.)を混和した培地を用い、ライ菌感染LTT細胞を培養した。なお、ライ菌増殖はライ菌特異的プライマーを用いたリアルタイム PCR による16s rRNAの相対定量により判定した。
結果：28日間培養でライ菌感染LTT細胞は2.5倍に増殖し、倍加時間(DT)は504時間(21日)であった。この間に細胞内ライ菌は6.3倍に増加し、DTは252時間（10.5日）であった（図１５）。【００６５】
ライ菌の増殖率がLTT細胞の増殖率を上回ったことにより、ライ菌を感染したままでＬＴＴ細胞を適時分割培養することで、ライ菌の増殖を維持することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、ＬＴＴ細胞はライ菌の増殖速度よりも低増殖性であり、適応温度もライ菌の至適温度に類以しており、ライ菌の感染増殖に適している宿主細胞が得られ、細胞内増殖ライ菌の長期培養のための継代増殖培養法が確立された。この結果、ライ菌のin vitroでの培養が可能になった。また、本発明による細胞株は低温耐性を有し、温度による増殖制御が容易であり、ライ菌の研究及び抗ライ薬のスクリーニング等に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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