(57)【要約】  保存後の全血検体であっても、採血直後と同等の測定精度を維持することができる、ＨｂＡ１ｃの測定方法の提供である。解糖系阻害剤の存在下で全血を保存し、保存後の前記全血試料にプロテアーゼを添加して前記全血試料中のヘモグロビンを切断する。そして、得られたヘモグロビン断片の糖化部分に、フルクトシルアミンオキシダーゼを作用させ、前記糖化部分とフルクトシルアミンオキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、ＨｂＡ１ｃ糖化率を決定する。また、解糖系阻害剤存在下での全血保存に代えて、保存後の全血にＫＣｌ、Ｋ２ＳＯ４、ＫＮＯ、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＮＯ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、Ｍｇ（ＮＯ）２等の強電解質物質を添加し、前記強電解質物質存在下でプロテアーゼ処理を行う。これらの方法によれば、全血保存による、ＨｂＡ１ｃ測定値の変動を回避できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨｂＡ１ｃの測定方法に使用するヘモグロビン含有試料の製造方法であって、
下記（Ａ１）または（Ａ２）工程を含むことを特徴とする製造方法。
（Ａ１）ヘモグロビン含有物を、二酸化炭素の発生を抑制させた状態で保存する工程
（Ａ２）保存後のヘモグロビン含有物から、ヘモグロビンに結合した二酸化炭素を減少させる工程
【請求項２】
前記（Ａ１）工程において、解糖系阻害剤の存在下でヘモグロビン含有物を保存する、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項３】
前記解糖系阻害剤が、フッ化ナトリウムおよびフッ化カリウムの少なくとも一方である、請求の範囲２記載の製造方法。
【請求項４】
前記（Ａ２）工程において、前記保存後のヘモグロビン含有物に、正イオンがＫ＋、Ｎａ＋およびＭｇ２＋からなる群から選択された少なくとも一つのイオンであり且つ負イオンがＣｌ−、ＳＯ４２−およびＮＯ−からなる群から選択された少なくとも一つのイオンである強電解質物質を添加する、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項５】
前記強電解質物質が、ＫＣｌ、Ｋ２ＳＯ４、ＫＮＯ、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＮＯ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４およびＭｇ（ＮＯ）２からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲４記載の製造方法。
【請求項６】
前記ヘモグロビン含有試料が、全血試料または血球試料である、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項７】
ＨｂＡ１ｃを測定する方法であって、
下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含むことを特徴とするＨｂＡ１ｃ測定方法。
（Ａ）請求の範囲１記載の製造方法により、保存後のヘモグロビン含有試料を準備する工程
（Ｂ）保存後の前記ヘモグロビン含有試料をプロテアーゼ処理して、前記ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンを切断する工程
（Ｃ）前記（Ｂ）工程により得られたヘモグロビン断片の糖化部分に、フルクトシルアミンオキシダーゼを作用させる工程
（Ｄ）前記糖化部分とフルクトシルアミンオキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、ＨｂＡ１ｃの量を決定する工程
【請求項８】
前記（Ａ）工程が、解糖系阻害剤の存在下でヘモグロビン含有物を保存することにより、保存後の前記ヘモグロビン含有試料を準備する工程であって、
前記（Ｂ）工程において、プロテアーゼ処理の反応液における前記解糖系阻害剤の濃度が、０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌである、請求の範囲７記載のＨｂＡ１ｃ測定方法。
【請求項９】
前記（Ａ）工程が、保存後のヘモグロビン含有物に、正イオンがＫ＋、Ｎａ＋およびＭｇ２＋からなる群から選択された少なくとも一つのイオンであり且つ負イオンがＣｌ−、ＳＯ４２−およびＮＯ−からなる群から選択された少なくとも一つのイオンである強電解質物質を添加することにより、保存後の前記ヘモグロビン含有試料を準備する工程であって、
前記（Ｂ）工程において、前記強電解質物質の存在下、プロテアーゼ処理を行う、請求の範囲７記載のＨｂＡ１ｃ測定方法。
【請求項１０】
前記（Ｂ）工程において、プロテアーゼ処理の反応液中の前記強電解質物質の濃度が、１０〜３０００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求の範囲９記載のＨｂＡ１ｃ測定方法。
【請求項１１】
前記（Ｄ）工程において、前記糖化部分とフルクトシルアミンオキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、前記ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンにおけるＨｂＡ１ｃ量を算出し、さらに、前記ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビン量と前記ＨｂＡ１ｃ量から、ＨｂＡ１ｃ比率を算出する、請求の範囲７記載のＨｂＡ１ｃ測定方法。
【請求項１２】
前記ヘモグロビン含有試料が、全血試料または血球試料である、請求の範囲８記載のＨｂＡ１ｃ測定方法。
【請求項１３】
請求項１記載のヘモグロビン含有試料の製造方法に使用する、ヘモグロビン含有物を保存するための保存用試薬であって、
解糖系阻害剤を含むことを特徴とする保存用試薬。
【請求項１４】
前記解糖系阻害剤が、フッ化ナトリウムおよびフッ化カリウムの少なくとも一方である、請求の範囲１３記載の保存用試薬。
【請求項１５】
前記保存用試薬が、前記ヘモグロビン含有物の保存時における二酸化炭素の発生を抑制するための保存用試薬である、請求の範囲１３記載の保存用試薬。
【請求項１６】
前記ヘモグロビン含有試料が、全血試料または血球試料である、請求の範囲１３記載の測定方法。
【請求項１７】
請求の範囲１記載のヘモグロビン含有試料の製造方法に使用する、保存後のヘモグロビン含有物を処理するための処理用試薬であって、
正イオンがＫ＋、Ｎａ＋およびＭｇ２＋からなる群から選択された少なくとも一つのイオンであり且つ負イオンがＣｌ−、ＳＯ４２−およびＮＯ−からなる群から選択された少なくとも一つのイオンである強電解質物質を含むことを特徴とする処理用試薬。
【請求項１８】
前記強電解質物質が、ＫＣｌ、Ｋ２ＳＯ４、ＫＮＯ、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＮＯ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４およびＭｇ（ＮＯ）２からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１７記載の処理用試薬。
【請求項１９】
さらに、プロテアーゼを含む、請求の範囲１７記載の処理用試薬。
【請求項２０】
前記処理用試薬が、保存したヘモグロビン含有物中のヘモグロビンに結合している二酸化炭素を減少させるための処理用試薬である、請求の範囲１７記載の処理用試薬。
【請求項２１】
前記ヘモグロビン含有試料が、全血試料または血球試料である、請求の範囲１７記載の処理用試薬。
【請求項２２】
請求の範囲７記載のＨｂＡ１ｃ測定方法に使用する試薬キットであって、
フルクトシルアミンオキシダーゼおよび強電解物質を含む第１試薬と、プロテアーゼを含む第２試薬とを含む測定キット。
【請求項２３】
前記第１試薬が、さらに酸化酵素を含み、前記第２試薬が、さらに酸化により発色する基質を含む、請求の範囲２２記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨｂＡ１ｃ測定に使用するヘモグロビン含有試料の製造方法およびＨｂＡ１ｃ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の状態を示す指標として、各種タンパク質の糖化率が測定されている。中でも、血球中のヘモグロビン（Ｈｂ）の糖化率、特にＨｂＡ１ｃは、生体内血糖値の過去の履歴を反映していることから、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。ＨｂＡ１ｃは、ＨｂＡ（α２β２）のβ鎖Ｎ末端アミノ酸（バリン）にグルコースが結合しており、その値は、総Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ量の比（割合、％）で表される。【０００３】
ＨｂＡ１ｃは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、酵素法、電気泳動法等によって測定されているが、近年、酵素法による簡便な測定の確立が研究されている。前記酵素法によるＨｂＡ１ｃの測定方法とは、例えば、以下のような方法である。まず、Ｈｂにプロテアーゼを作用させ、β鎖Ｎ末端バリンを含む断片を切り出す。そして、さらにフルクトシルアミンオキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を前記断片の糖化部分（すなわち、β鎖Ｎ末端バリンの糖化部分）に作用させ、過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量に対応する。この反応液に、さらにペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）と酸化により発色する発色基質とを添加し、ＰＯＤを触媒として過酸化水素と発色基質との間で酸化還元反応させる。そして、前記発色基質の発色程度を吸光度測定等により測定する。この方法において、吸光度の大きさは、発色した発色基質の量に相当し、前記発色した発色基質の量は、生成した過酸化水素の量に相当し、過酸化水素の量は、前述のように糖化量に相当する。つまり、発色程度を測定することによって、このような酸化還元反応を介して、間接的に糖化量を測定できる。そして、この糖化量と総Ｈｂ量とからＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。【０００４】
このようなＨｂＡ１ｃ（％）の測定は、検査機関によって行われることが多いが、特に健康診断等では、通常、患者から採取したＨｂ含有試料（例えば、全血試料、全血から回収した血球試料、全血から回収したＨｂ試料等）は、採取後ただちに測定に供されるのではない。一般的に、これらのＨｂ含有試料は、例えば、常温や冷蔵、冷凍状態で保存された後、測定に供される。
【発明の開示】
【０００５】
しかしながら、本発明者らが、前記酵素法について研究を進めたところ、以下のことが明らかとなった。すなわち、前述のようなＨｂ含有試料を保存した後にＨｂＡ１ｃ測定を行うと、採取のＨｂ含有試料を使用した測定値よりも低い値を示すことがわかった。このため、保存後に測定されるＨｂ含有試料については、採取直後のＨｂ含有試料を使用した場合と同等の測定精度を維持することが困難であるという問題がある。特に、ＨｂＡ１ｃは、前述のように生体内血糖値の過去の履歴を示すため、糖尿病の治療や予防においては、一回ごとの測定値よりも、経時的な変化を知ることが非常に重要である。したがって、測定値が変動する要因については、条件を統一することが望まれる。しかしながら、Ｈｂ含有試料の採取から測定までの条件（例えば、時間や温度等）を一定にコントロールすることは、効率面からも現実的ではない。
【０００６】
そこで、本発明は、保存後のＨｂ含有試料であっても、採取直後と同等の測定精度を維持できる、ＨｂＡ１ｃの測定方法の提供を目的とする。
【０００７】
本発明のＨｂ含有試料の製造方法は、ＨｂＡ１ｃを測定する方法に使用するＨｂ含有試料の製造方法であって、下記（Ａ１）または（Ａ２）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ１）Ｈｂ含有物を、二酸化炭素の発生を抑制させた状態で保存する工程
（Ａ２）保存後のＨｂ含有物から、Ｈｂに結合している二酸化炭素を減少させる工程
【０００８】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法は、ＨｂＡ１ｃを測定する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）本発明の製造方法により、保存後のＨｂ含有試料を準備する工程
（Ｂ）保存後の前記Ｈｂ含有試料をプロテアーゼ処理して、前記Ｈｂ含有試料中のヘモグロビンを切断する工程
（Ｃ）前記（Ｂ）工程により得られたヘモグロビン断片の糖化部分に、フルクトシルアミンオキシダーゼを作用させる工程
（Ｄ）前記糖化部分とフルクトシルアミンオキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、ＨｂＡ１ｃの量を決定する工程
【０００９】
本発明者らは、Ｈｂ含有試料の保存によるＨｂＡ１ｃ変動の原因について研究を行った。その結果、Ｈｂ含有試料の保存による二酸化炭素の発生と、発生した二酸化炭素によるＨｂの構造変化が、その原因であることを突き止めた。一般的に、体内から採取した試料であっても、例えば、血球細胞を含む場合、その血球細胞自体は生きているため、解糖系の作動によって、グルコースが消費され二酸化炭素が発生することが知られている。採血直後の健常者全血における酸素分圧は、通常、約８０〜１００ｍｍＨｇであり、二酸化炭素分圧は、通常、約３５〜４５ｍｍＨｇである。その他にも、全血中において炭酸イオン（ＨＣＯ３−）として存在し、前記炭酸イオン濃度は約２２〜２６ｍｍｏｌ（例えば、２４ｍｍｏｌ）であることが知られている。しかし、全血を、例えば、室温で１〜５日間放置すると、解糖系の影響により、酸素分圧は略０ｍｍＨｇ程度にまで減少し、二酸化炭素分圧は１５０ｍｍＨｇ以上となり、さらに、炭酸イオン濃度は約８〜３４ｍｍｏｌにまで増加する。この炭酸イオン濃度は、例えば、採血直後の全血におけるグルコース濃度の２倍に相当する値である。つまり、保存によって、全血における酸素濃度と二酸化炭素濃度との比率は逆転する。このように二酸化炭素の比率が増大すると、Ｈｂの立体構造は、オキシ型からデオキシ型に変化してしまう。このようなデオキシ型への変化は、全血にかかわらず、例えば、全血から回収した血球試料や全血から回収したＨｂ試料についても、二酸化炭素の存在下での保存や、二酸化炭素が発生した状態での保存によって、同様に生じる。そこで、さらに研究を重ねた結果、デオキシ型Ｈｂは、酵素法によるＨｂＡ１ｃ測定に重要なβ鎖Ｎ末端が、Ｈｂの内部に向くような立体構造になることを突き止めた。つまり、従来法では、保存時の二酸化炭素発生により、Ｈｂの立体構造は、β鎖Ｎ末端にプロテアーゼが作用し難いデオキシ型に変化し、Ｈｂを全てオキシ型にすることは困難であったため、保存に伴ってＨｂＡ１ｃ測定値が低下する結果になったと考えられる。なお、Ｈｂの立体構造として、オキシ型とデオキシ型についての報告はあるが、デオキシ型Ｈｂは、β鎖Ｎ末端が内部を向く構造であり、そのために、プロテアーゼによってβ鎖Ｎ末端バリンやそれを含むペプチドを切り出し難くなることは、本発明者らが初めて突き止めたことである。そこで、本発明者らは、第１の手段として、Ｈｂ含有物の保存時における二酸化炭素の発生を抑制することによって、保存によるＨｂＡ１ｃ変動の抑制を実現した。また、本発明者らは、第２の手段として、保存によりＨｂ含有物において二酸化炭素が発生してＨｂがデオキシ型に変化しても、Ｈｂに結合している二酸化炭素を減少させて、Ｈｂをオキシ型に再変換することによって、保存によるＨｂＡ１ｃ変動の抑制を実現した。
【００１０】
以上のように、本発明によれば、Ｈｂ含有物を保存した場合であっても、ＨｂＡ１ｃの測定値の変動を抑制できため、保存後のＨｂ含有試料について、採取直後のＨｂ含有試料と同様の精度でＨｂＡ１ｃを測定できる。このように保存によるＨｂＡ１ｃ測定値の影響を抑制できることから、前述のように、試料の採取場所とは異なる場所でＨｂＡ１ｃ測定を行う場合や、ある程度の検体数が集まってからまとめてＨｂＡ１ｃ測定を行う場合のように、試料の保存が必須である際、極めて有用な方法といえる。なお、前述したメカニズムは推測であって、本発明を何ら制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜Ｈｂ含有試料の製造方法＞
本発明の製造方法は、前述のように、ＨｂＡ１ｃを測定する方法に使用するＨｂ含有試料の製造方法であって、下記（Ａ１）または（Ａ２）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ１）Ｈｂ含有物を、二酸化炭素の発生を抑制させた状態で保存する工程
（Ａ２）保存後のＨｂ含有物から、Ｈｂに結合している二酸化炭素を減少させる工程【００１２】
このように、（Ａ１）Ｈｂ含有物を二酸化炭素の発生を抑制させた状態で保存することによって、または、（Ａ２）保存後のＨｂ含有物から、Ｈｂに結合している二酸化炭素を減少させることによって、ＨｂＡ１ｃ測定値の変動が抑制されたＨｂ含有試料を得ることができる。本発明においては、例えば、Ｈｂ含有物について、保存時における二酸化炭素の発生を抑制し、または、保存時に発生し、Ｈｂに結合した二酸化炭素を減少させればよく、二酸化炭素発生の抑制方法または発生した二酸化炭素を減少させる方法自体は、何ら制限されない。そして、このような方法により調製した保存後のＨｂ含有試料であれば、ＨｂＡ１ｃ測定において、例えば、採取直後と同様の精度でＨｂＡ１ｃを測定できる。なお、本発明により製造したＨｂ含有試料を使用するＨｂＡ１ｃの測定方法は、何ら制限されない。具体例としては、例えば、後述するような酵素の他に、免疫法、ＨＰＬＣ法等、従来公知の方法が採用できる。なお、本発明のＨｂ含有試料の製造方法に関しては、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法において詳細に説明する。【００１３】
本発明において、保存するＨｂ含有物は、Ｈｂを含んでいればよい。前記Ｈｂ含有物としては、例えば、全血、血球等があげられる。前記全血としては、例えば、採取（採血）後の未処理全血、希釈した全血、溶血した全血等があげられる。また、前記血球としては、例えば、全血から回収した血球でもよいし、希釈した血球、溶血した血球等があげられる。血球は、例えば、全血から沈降や遠心分離等により回収できるが、例えば、血漿等が残存してもよい。また、採血後の全血等から回収したＨｂ（例えば、精製Ｈｂ）であってもよい。前記（Ａ１）工程は、例えば、血球を含有するＨｂ含有物の保存に適用することが好ましく、例えば、未処理全血、希釈全血、血球等があげられる。前記（Ａ２）工程は、例えば、未処理全血、希釈全血、溶血した全血、血球、精製Ｈｂ等のＨｂ含有物の保存に適用することが好ましい。また、Ｈｂ含有物は、例えば、ドライ（乾燥体）でもウェット（液体）でもよい。【００１４】
＜ＨｂＡ１ｃ測定方法＞
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法は、ＨｂＡ１ｃを測定する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）本発明の製造方法により、保存後のＨｂ含有試料を準備する工程
（Ｂ）保存後の前記全血試料をプロテアーゼ処理して、前記Ｈｂ含有試料中のヘモグロビンを切断する工程
（Ｃ）前記（Ｂ）工程により得られたヘモグロビン断片の糖化部分に、フルクトシルアミンオキシダーゼを作用させる工程
（Ｄ）前記糖化部分とフルクトシルアミンオキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、ＨｂＡ１ｃの量を決定する工程【００１５】
本発明の測定方法においては、前記（Ａ）工程において、前述のように、二酸化炭素の発生を抑制させた状態でＨｂ含有物を保存することによって、保存後のＨｂ含有試料を調製してもよいし（Ａ１）、保存後のＨｂ含有物について、Ｈｂに結合した二酸化炭素を減少させることによって、保存後のＨｂ含有試料を調製してもよい（Ａ２）。以下に、前者の具体例として、第１のＨｂＡ１ｃ測定方法、後者の具体例として、第２のＨｂＡ１ｃ測定方法を示す。なお、本発明は、これらの具体例には限定されない。【００１６】
第１のＨｂＡ１ｃ測定方法
本発明の第１のＨｂＡ１ｃ測定方法は、下記（Ａ１’）〜（Ｄ）工程を含む。
（Ａ１’）解糖系阻害剤の存在下でＨｂ含有物を保存する工程（保存後のＨｂ含有試料の製造）
（Ｂ）保存後のＨｂ含有試料をプロテアーゼ処理して、前記Ｈｂ含有試料中のヘモグロビンを切断する工程
（Ｃ）前記（Ｂ）工程により得られたヘモグロビン断片の糖化部分に、フルクトシルアミンオキシダーゼを作用させる工程
（Ｄ）前記糖化部分とフルクトシルアミンオキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、ＨｂＡ１ｃの量を決定する工程【００１７】
本発明の第１のＨｂＡ１ｃ測定方法によれば、例えば、血球を含むＨｂ含有物の場合、その保存時において、血球細胞による解糖系が抑制されるため、二酸化炭素の発生が抑制される。その結果、デオキシ型Ｈｂへの立体構造変化が防止される。このため、保存後のＨｂ含有試料であっても、採血時と同様に、Ｈｂの立体構造は、β鎖Ｎ末端にプロテアーゼが作用し易いオキシ型を維持できるため、ＨｂＡ１ｃ測定値の変動を防止できる。前記（Ａ１’）工程は、例えば、血球を含有するＨｂ含有物の保存に適用することが好ましく、例えば、未処理全血、希釈全血、血球等があげられる。【００１８】
第１のＨｂＡ１ｃ測定方法は、例えば、前記（Ａ１’）工程において、前記解糖系阻害剤の存在下でＨｂ含有物を保存すればよく、それ以外の工程における条件等は何ら制限されるものではない。また、前記（Ｂ）工程および（Ｃ）工程は、例えば、同一反応液において、同時に行ってもよい。前記（Ｄ）工程は、前記（Ｃ）工程の後に行ってもよいし、前記（Ｃ）工程（および前記（Ｂ）工程）と並行して行ってもよい。【００１９】
前記解糖系阻害剤としては、例えば、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム等があげられ、この中でも、フッ化ナトリウムが好ましい。また、解糖系阻害剤は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。【００２０】
つぎに、本発明の第１のＨｂＡ１ｃ測定方法について、Ｈｂ含有物として全血を保存する一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されず、例えば、希釈全血や血球等のＨｂ含有物についても同様に行うことができる。【００２１】
（全血の保存）
被検体から全血を採取し、ＨｂＡ１ｃの測定時まで、前記解糖系阻害剤の存在下で保存する。なお、ＨｂＡ１ｃ測定において、全血の保存は必須ではないが、本発明の目的は、保存によるＨｂＡ１ｃ値の変動を抑制することであるため、全血の保存が必要となる場合に、本発明を適用することが好ましい。【００２２】
前記解糖系阻害剤は、例えば、被検体から全血を採取した直後に添加してもよいし、予め、採血用具（例えば、採血管）内に配置させてもよい。具体例として、フッ化ナトリウムを含む採血管として、市販品である商品名ベノジェクトII真空採血管（テルモ社製）、商品名グルコセーブ（セキスイ社製）等を使用することができる。また、市販の採血管を用いる場合は、さらにヘパリン等の抗凝固剤等を含んでもよい。ヘパリン等の抗凝固剤を共存させることで、さらに、十分な抗凝固作用を確保できる。本発明においては、前記解糖系阻害剤を含む試薬を、全血の保存用試薬として使用することができる。【００２３】
前記（Ａ１’）工程において、全血に対する前記解糖系阻害剤の添加割合は、特に制限されないが、例えば、全血１ｍｌあたり０．１〜１００ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．２〜１０ｍｏｌ／Ｌである。前記（Ｂ）工程のプロテアーゼ処理の反応液において、前記解糖系阻害剤（例えば、ＮａＦ）の濃度は、例えば、０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０１〜３ｍｏｌ／Ｌである。【００２４】
前記解糖系阻害剤を添加した全血は、特に制限されないが、例えば、採血当日から１０日程度保存することが可能である。患者から採取された全血は、例えば、検査機関に送られる場合、採血当日から２日以内に分析に供されることが一般的である。また、従来法によれば、例えば、採血当日から４日を経過した段階で、ＨｂＡ１ｃの測定値の影響が顕著になる。したがって、本発明の方法によれば、採血試料を保存する場合でも、ＨｂＡ１ｃ％の変動を十分に予防して、信頼性の高いＨｂＡ１ｃ測定が可能である。【００２５】
前記解糖系阻害剤を添加した全血の保存温度は、特に制限されないが、一般的に、１〜３５℃であり、好ましくは２〜２５℃であり、より好ましくは２〜１０℃である。【００２６】
また、前述のような未処理の全血以外に、例えば、希釈全血や回収した血球を保存する際も、同様に処理することができる。解糖系阻害剤の添加割合は、特に制限されず、例えば、希釈全血や血球等を全血の量に換算して、前述のような範囲に設定することができる。以下の工程も同様である。【００２７】
（溶血処理）
保存後の全血試料を溶血処理する。全血試料の溶血方法は、特に制限されず、例えば、浸透圧差を利用する方法、超音波による方法等が使用できる。浸透圧差を利用する場合、全血（または血球）に対して、例えば、２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させればよい。また、界面活性剤を試料に添加して溶血することもできる。【００２８】
（プロテアーゼ処理）
溶血した保存後全血試料をプロテアーゼ処理する。この処理で、前記試料中のＨｂのβ鎖Ｎ末端バリンや、前記Ｎ末端バリンを含むペプチド（β鎖Ｎ末端ペプチド）を切り出すことによって、後述するＦＡＯＤを、Ｈｂの糖化部分（β鎖Ｎ末端バリン）に効率良く作用させることができる。【００２９】
前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。市販品としては、例えば、メタロプロテアーゼ（商品名、アークレイ社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（商品名、天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（商品名、天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（商品名、天野エンザイム社製）、ペプチダーゼＲ（商品名、天野エンザイム社製）、パパインＭ−４０（商品名、天野エンザイム社製）、プロテアーゼＮ（商品名、フルカ社製）、プロテアーゼＮ「アマノ」（商品名、天野製薬社製）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（商品名、トヨチーム東洋紡社製）等があげられる。【００３０】
特に、β鎖Ｎ末端に特異的に作用してＮ末端ペプチドの切断を触媒するプロテアーゼ（例えば、特開２０００−３００２９４号公報、特開２００４−３４４０５２号公報等）が好ましい。また、β鎖Ｎ末端バリンの切断を触媒するプロテアーゼとしては、例えば、国際公開第２０００／５０５７９号パンフレット（日本国特許３６６８８０１）、国際公開第２０００／６１７３２号パンフレット、特開２００２−３１５６００号公報等に開示されているプロテアーゼがあげられる。【００３１】
この反応液におけるプロテアーゼの添加割合は、例えば、０．００１〜３００,０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０.０１〜３０,０００ＫＵ／Ｌであり、特に好ましくは０.１〜１０００ＫＵ／Ｌである。前記反応液中のＨｂ濃度が０.００５ｍＭの場合、プロテアーゼの添加割合は、例えば、０.０１〜３００,０００ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.０５〜３０,０００ＫＵ／Ｌであり、特に好ましくは０.１〜１０,０００ＫＵ／Ｌである。プロテアーゼの活性「Ｕ」は、１分間に１マイクロモルのチロシンに相当する２７５ｎｍの吸光度の増加を与える酵素量を１Ｕとする。【００３２】
前記プロテアーゼ処理は、例えば、緩衝液中で行うことが好ましく、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が使用できる。また、プロテアーゼ反応液のｐＨは、例えば、４〜１０の範囲であり、好ましくは６〜９である。【００３３】
プロテアーゼ処理の条件は特に制限されないが、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間は、例えば、１〜１００分程度であり、好ましくは１〜１０分である。【００３４】
また、このプロテアーゼ処理は、例えば、以下に示すような促進化合物の存在下で行ってもよい。このような促進化合物の存在下で、Ｈｂをプロテアーゼ処理すれば、プロテアーゼ処理の効率化・短縮化が可能になる。また、効率良いプロテアーゼ処理が可能であるため、例えば、処理に使用するプロテアーゼの増量も不要となる。【００３５】
前記促進化合物としては、例えば、下記式（Ｉ）で表される化合物があげられる。
Ｒ−Ｘ      ・・・（Ｉ）【００３６】
前記式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基、置換アルキル基、アシル基または置換アシル基である。具体例としては、炭素数９〜１６の直鎖アルキル基もしくは直鎖アシル基、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキル基もしくは分枝鎖アシル基、または、シクロアルキルで置換された直鎖アルキル基（例えば、シクロアルキルの炭素数が３〜８であり、シクロアルキルを除く直鎖の炭素数が４〜１３）等があげられる。前記シクロアルキルは、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロブチル等があげられる。前記式（Ｉ）において、Ｘは、糖残基であり、例えば、単糖または二糖の残基であることが好ましい。前記単糖としては、例えば、マンノシド、グルコシド、チオグルコシド等、二糖としては、マルトシド、フルクトピラノシル-グルコピラノシド、チオマルトシド等があげられる。これらの糖の構造は、α、β、Ｄ、Ｌのいずれでもよい。また、糖の環式構造に結合する水素や、ＯＨ基の水素は、例えば、Ｎａ、Ｋ、ハロゲン等で置換されてもよい。なお、本発明において、Ｒと糖残基の環式構造との結合を介している原子（例えば、−Ｏ−、−Ｓ−等）は、糖残基の構成要素とする。【００３７】
前記式（Ｉ）の促進化合物の具体例としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、６−シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ-マルトシド、スクロースモノラウレート（β−Ｄ−フルクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノドデカノエート）、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド（ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド）、５−シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ-マルトシド、ｎ−ドデシル−αβ−Ｄ−マルトシド、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、および、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド等があげられる。これらの中でも、前記式（Ｉ）におけるＲ（アルキル鎖）の炭素数が１２以上である、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド等が好ましい。また、Ｒの炭素数が同じ場合（例えば、炭素数が同じアルキル基とアシル基）、より好ましくはアシル基であり、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）が好ましい。【００３８】
プロテアーゼ処理の反応液における前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．０１〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは０．４〜１００ｍＭである。前記反応液中のＨｂ濃度が０．００５ｍＭの場合、前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．４〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍＭである。なお、前記促進化合物とプロテアーゼの添加順序は何ら制限されず、同時でもよいし、それぞれを順不同で添加することもできる。【００３９】
プロテアーゼ処理の条件は、前述のように特に制限されないが、促進化合物を共存させる場合、その処理時間は制限されず、特に上限は制限されず、例えば、０.１〜６０分程度でプロテアーゼ処理を行うことが可能である。処理時間は、好ましくは０．１〜４５分、より好ましくは０.２〜２０分であり、特に好ましくは０.２〜５分である。前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行う場合、より迅速にアミノ酸やペプチドの切り出しを行えるため、前述のような処理時間であっても十分に切断処理が可能である。【００４０】
また、前記促進化合物としては、例えば、前記式（Ｉ）の化合物の他に、例えば、ニトロ化合物があげられる。これらはいずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。ニトロ化合物としては、例えば、亜硝酸やその塩があげられる。亜硝酸塩としては、特に制限されないが、例えば、亜硝酸カリウム、亜硝酸アミル、亜硝酸ブチル、ニトログリセリン、亜硝酸ナトリウム、パラニトロクロルベンゼン、トリニトロトルエン、ニトロベンゼン等があげられる。プロテアーゼ処理の反応液における前記ニトロ化合物の添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記反応液中のＨｂ濃度が０．００５ｍＭの場合、前記ニトロ化合物の添加割合は、例えば、０．００５ｍＭ以上が好ましく、より好ましくは０．０５〜２ｍＭである。【００４１】
また、次工程のＦＡＯＤ処理に先立って、試料にテトラゾリウム化合物を添加することが好ましい。血液試料のようにアスコルビン酸等の還元物質を含む試料の場合、例えば、これによる測定への影響を、テトラゾリウム化合物の添加によって回避することができる。この場合、テトラゾリウム化合物の添加は、例えば、プロテアーゼ処理の前後いずれでもよい。また、プロテアーゼ処理の際、テトラゾリウム化合物を共存させれば、例えば、プロテアーゼによる消化を促進することができる。前記テトラゾリウム化合物としては、特に制限されないが、例えば、2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  salt、2-(4-iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  salt、2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  salt、2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium  salt、3,3’-(1,1’-biphenyl-4,4’-diyl)-bis(2,5-diphenyl)-2H-tetrazolium  salt、3,3’-[3,3’-dimethoxy-(1,1’-biphenyl)-4,4’-diyl]-bis[2-(4-nitropenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium  salt]、2,3-diphenyl-5-(4-chlorophenyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(p-diphenyl)tetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-(p-diphenyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(4-styrylphenyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(m-tolyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(p-tolyl)tetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-(2-thienyl)tetrazolium  salt、2-benzothiazoyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium  salt、 2,2’-dibenzothiazolyl-5,5’-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3’-(3,3’-dimethoxy-4,4’-biphenylene)ditetrazolium  salt、3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-cyanotetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-carboxytetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-methyltetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-ethyltetrazolium  salt等があげられ、特に好ましくは、2-(4-iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  saltである。【００４２】
前記テトラゾリウム化合物の添加量は、特に制限されないが、例えば、試料１μＬ当たり、０．００１〜１００μｍｏｌになるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜１０μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０１〜１μｍｏｌの範囲である。【００４３】
（ＦＡＯＤ処理工程）
つぎに、前記プロテアーゼ処理後の反応液にＦＡＯＤを添加する。これによって、Ｈｂ断片におけるＮ末端バリンの糖化部分にＦＡＯＤを作用させ、酸化還元反応を行う。このＦＡＯＤ処理によって、例えば、以下に示すように、Ｎ末端バリンに結合した糖が遊離し、過酸化水素が生成される。【００４４】
前記ＦＡＯＤは、特に制限されないが、α-アミノ基が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して、過酸化水素およびα−ケトアルデヒドを発生する反応を触媒する酵素（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）が好ましい。このような触媒反応は、例えば、下記式（１）で表すことができる。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  Ｏ２
→  Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ２−Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ２      …（１）【００４５】
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−[ＣＨ（ＯＨ）]ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。【００４６】
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４              …（２）【００４７】
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ                …（３）【００４８】
このようなＦＡＯＤ−αとしては、例えば、国際公開第２００４／０２９２５１号パンフレットに記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、特開２００４−２７５０１３号公報や特開２００４−２７５０６３号公報記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、ペニシリウム属由来のＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６号公報）等が使用できる。このようなＦＡＯＤを使用すれば、例えば、β鎖Ｎ末端バリン以外が糖化されていても、バリンの糖化部分以外には作用し難いため、より精度の高いＨｂＡ１ｃの測定が可能となる。【００４９】
なお、ＦＡＯＤは、前記（１）以外の基質特異性をさらに有していてもよい。このようなＦＡＯＤとしては、例えば、前記糖化されたα−アミノ基と糖化されたアミノ酸側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）があげられる。具体例としては、例えば、商品名ＦＰＯＸ-ＣＥ（キッコーマン社製）、商品名ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９）等があげられる。このようなＦＡＯＤの場合、例えば、プロテアーゼの種類を適宜選択し、β鎖Ｎ末端のアミノ酸やペプチドを特異的に切断するプロテアーゼと組み合わせることによって、他の糖化部位への作用を抑制することが可能である。【００５０】
ＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。ＦＡＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、６〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜３８℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０.１〜６０分、好ましくは０.１〜５分である。【００５１】
ＦＡＯＤ処理の反応液におけるＦＡＯＤの添加割合は、例えば、０.０１〜５０ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.５〜１０ＫＵ／Ｌである。ＦＡＯＤの活性「Ｕ」は、フルクトシルバリンを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとする。【００５２】
（酸化還元反応の測定）
つぎに、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応の測定を行う。この測定は、例えば、前記反応により生じる過酸化水素量の測定や、前記反応で消費される酸素量の測定があげられる。前記過酸化水素量は、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と酸化により発色する基質とを用いて、これらと過酸化水素との反応により前記基質を発色させ、この発色程度を測定することにより行うことができる。また、過酸化水素量は、ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、電気的手法等によって測定することもできる。【００５３】
前記酸化により発色する基質（発色基質）としては、特に制限されず、例えば、Ｎ-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（商品名ＤＡ−６４、和光純薬工業社製）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）-３，７-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩（例えば、商品名ＤＡ−６７、和光純薬社製）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）-４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタンヘキサナトリウム塩（例えば、商品名ＴＰＭ−ＰＳ、同仁化学社製）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合わせた基質等があげられる。トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。【００５４】
反応液における前記発色基質の添加割合は、例えば、０.００１〜１０ｍＭの範囲であり、好ましくは０.００４〜２ｍＭである。【００５５】
ＰＯＤ反応は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行われることが好ましく、前述のような緩衝液が使用できる。ＰＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、５〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０.１〜５分である。【００５６】
ＰＯＤ反応液におけるＰＯＤの添加割合は、例えば、０.０１〜３００ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.５〜４０ＫＵ／Ｌである。また、前記反応液における発色基質の添加割合は、例えば、０.００１〜１０ｍＭの範囲であり、好ましくは０.００４〜２ｍＭである。ＰＯＤの活性「Ｕ」は、１分間に１マイクロモルのグアイヤコールを酸化できる量を１Ｕとする【００５７】
このように発色基質を用いた場合、例えば、その発色（例えば、反応液の吸光度）を分光光度計で測定すればよい。過酸化水素量は、ＨｂにおけるＮ末端バリンの糖化量（すなわち、ＨｂＡ１ｃ量、ＨｂＡ１ｃ濃度、糖化濃度ともいう）に対応するため、測定した吸光度からＮ末端バリンの糖化量を算出できる。このようにして、ＨｂＡ１ｃ量が測定できる。【００５８】
さらに、下記式に示すように、このＨｂのＮ末端バリンの糖化量（ＨｂＡ１ｃ量）と試料中の全Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）との比（１００分率）を算出することによって、ＨｂＡ１ｃ％（ＨｂＡ１ｃ比率）を求めることができる。なお、Ｈｂ量は、従来公知の方法や、市販の試薬キットによって測定できる。
ＨｂＡ１ｃ％＝（β鎖Ｎ末端バリンの糖化量/Ｈｂ量）×１００【００５９】
吸光度からのＮ末端バリン糖化量の算出は、例えば、ＨｂにおけるＮ末端バリンの既知糖化量と吸光度との関係をプロットした検量線を用いることによって行える。例えば、Ｎ末端バリンの糖化量が既知であるＨｂ標準液について、前述と同様にして吸光度測定を行い、この標準液の測定値と既知糖化量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、この検量線に前述のように測定した吸光度を代入することによって、Ｎ末端バリンの糖化量（ＨｂＡ１ｃ量）が算出できる。【００６０】
また、前記発色基質は、前述のように、特に制限されないが、例えば、前記ＤＡ−６７のような、過酸化水素との反応によりメチレンブルーを生成する基質が好ましい。このような発色基質から生成されるメチレンブルーは、比較的長波長側（約６６６ｎｍ）に極大吸収を持つため、例えば、全血試料中に５００ｎｍ付近やそれ以下の波長領域に吸収を持つ成分が存在する場合でも、それらによる吸光度の変動を回避してより高い信頼性で測定を行うことができるからである。また、このような発色基質を使用する際は、前記反応液に対して、さらに後述する色素物質を添加した後、吸光度測定を行うことが好ましい。このように色素物質を共存させることによって、メカニズムは不明であるが、メチレンブルーをさらに高波長側（６６０ｎｍ以上）で検出することも可能である。このため、例えば、全血試料中に６６０ｎｍに吸収を示す成分が含まれる場合であっても、それによる影響を回避してより高い信頼性で測定を行うことができる。なお、前記色素物質の添加時期は、吸光度測定前であれば、何ら制限されず、例えば、メチレンブルーの生成の前後いずれであってもよいし、前記発色基質や酸化酵素の添加と同時であってもよい。【００６１】
前記色素物質としては、例えば、５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）−３−ピラゾールカルボン酸またはその塩（例えば、三ナトリウム塩）、６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸またはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸またはその塩（例えば、三ナトリウム塩）、７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸もしくはその塩（例えば、三ナトリウム塩）または水和物（例えば、１１／２水和物）等があげられ、これらの塩や水和物としては、例えば、市販品であるタートラジン、食用黄色５号、食用赤色２号、食用赤色１０２号等があげられる。また、３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン］−３−オンもしくはその塩（例えば、二ナトリウム塩）または水和物（例えば、一水和物）、３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−４，５，６，７，−テトラクロロスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、４，５，６，７−テトラクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）等があげられ、これらの塩や水和物としては、例えば、食用赤色３号、食用赤色１０４号、食用赤色１０５号等が使用できる。また、アントシアニン重合体（例えば、市販のカカオ色素（Ｃａｃａｏ  ｃｏｌｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｏｂｔｏｍａ  ｃａｃａｏ  ＬＩＮＮＥ））や、カキ色素（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ    ｃｏｌｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｐｏｓｐｙｒｏｓ  ｋａｋｉ  ＴＨＵＮＢ．）等も使用できる。前記色素物質の添加割合は、特に制限されないが、発色基質１モルに対して、例えば、０．１〜１０００モル、好ましくは１〜５００モルであり、より好ましくは２〜１００モルであり、また、反応液における最終濃度は、例えば、１０−６〜０．１ｍｏｌ/Ｌであり、好ましくは１０−５〜０．０５ｍｏｌ/Ｌ、より好ましくは０．００００５〜０．０３ｍｏｌ/Ｌである。【００６２】
ＨｂＡ１ｃ量ならびにＨｂＡ１ｃ％の測定において、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで各処理を同時に行ってもよい。また、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤ、発色基質の添加順序も特に制限されない。
１  ：  溶血処理＋プロテアーゼ処理
２  ：  溶血処理＋プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３  ：  溶血処理＋プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
４  ：  プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
５  ：  プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
６  ：  ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理【００６３】
このような第１のＨｂＡ１ｃ測定方法は、例えば、以下のような試薬キットにより行ってもよい。前記試薬キットは、前記本発明の第１のＨｂＡ１ｃ測定方法を実施できるものであれば、どのような構成であってもよいが、例えば、第１試薬としてＦＡＯＤおよび酸化酵素を含む試薬、第２試薬として、プロテアーゼおよび発色基質を含む試薬があげられる。このような試薬キットの場合、例えば、ヘモグロビン含有試料と第１試薬とを混合した後に、さらに第２試薬を添加することで、プロテアーゼ処理、ＦＡＯＤ処理、発色反応の全てを開始することができる。【００６４】
前記第１試薬は、例えば、ＦＡＯＤおよび酸化酵素（例えば、ＰＯＤ）の他に、さらに、緩衝剤、前記促進化合物、前記色素物質等を含んでもよい。また、第２試薬は、例えば、プロテアーゼおよび発色基質の他に、さらに、緩衝剤や前記色素物質を含んでもよい。各試薬において、各成分の含有割合は、特に制限されないが、反応液における濃度が前述のような範囲となるように調製することが好ましい。【００６５】
第２のＨｂＡ１ｃ測定方法
本発明の第２のＨｂＡ１ｃ測定方法は、下記（Ａ２’）〜（Ｄ）工程を含む。
（Ａ２’）保存後の全血に、正イオンがＫ＋、Ｎａ＋およびＭｇ２＋からなる群から選択された少なくとも一つのイオンであり且つ負イオンがＣｌ−、ＳＯ４２−およびＮＯ−からなる群から選択された少なくとも一つのイオンである強電解質物質を添加する工程（保存後の全血試料の製造）
（Ｂ）保存後の前記ヘモグロビン含有試料をプロテアーゼ処理して、前記ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンを切断する工程
（Ｃ）前記（Ｂ）工程により得られたヘモグロビン断片の糖化部分に、フルクトシルアミンオキシダーゼを作用させる工程
（Ｄ）前記糖化部分とフルクトシルアミンオキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、ＨｂＡ１ｃの量を決定する工程【００６６】
本発明の第２のＨｂＡ１ｃ測定方法によれば、ヘモグロビン含有物の保存により二酸化炭素が発生してＨｂの立体構造がデオキシ型に変化した場合でも、前記強電解質物質を添加することで、保存が原因であるＨｂＡ１ｃ測定値の変動を防止できる。これは、保存により二酸化炭素が発生してＨｂがデオキシ型に変化した場合でも、強電解質物質によりＨｂに結合した二酸化炭素を、例えば、乖離（除去）することで、Ｈｂの立体構造をオキシ型に再変化できるためと考えられる。【００６７】
第２のＨｂＡ１ｃ測定方法では、保存後のヘモグロビン含有物に前記強電解質物質を添加することが特徴であって、それ以外の工程における条件等は何ら制限されない。前記保存後のヘモグロビン含有物に前記強電解質物質を添加することで、通常、前記（Ｂ）工程において、前記強電解質物質の存在下、プロテアーゼ処理が行われる。また、前記（Ｂ）工程および（Ｃ）工程は、例えば、同一反応液において、同時に行ってもよい。前記（Ｄ）工程は、例えば、前記（Ｃ）工程（および前記（Ｂ）工程）と並行して行ってもよい。【００６８】
つぎに、本発明の第２のＨｂＡ１ｃ測定方法について、Ｈｂ含有物として全血を保存する一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されず、例えば、希釈全血、溶血した全血、血球、精製Ｈｂ等のＨｂ含有物についても同様に行うことができる。また、第２のＨｂＡ１ｃ測定方法は、例えば、前記（Ａ２’）工程において、本発明の製造方法により保存後のＨｂ含有試料を製造する以外は、何ら制限されない。第２のＨｂＡ１ｃ測定方法は、特に示さない限り、前記第１のＨｂＡ１ｃ測定方法と同様にして行うことができる。なお、前記第２のＨｂＡ１ｃ測定方法の（Ｂ）〜（Ｄ）工程は、それぞれ前記第１のＨｂＡ１ｃ測定方法の（Ｂ）〜（Ｄ）工程に対応し、特に示さない限りは同じ工程である。【００６９】
（全血の保存）
まず、被検体から全血を採取して、ＨｂＡ１ｃの測定時まで、これを保存する。なお、ＨｂＡ１ｃの測定において、全血の保存は必須ではないが、本発明の目的は、保存によるＨｂＡ１ｃ値の変動を抑制することであるため、全血の保存が必要となる場合に、本発明を適用することが好ましい。【００７０】
この実施形態においては、前記第１のＨｂＡ１ｃ測定方法とは異なり、前記解糖系阻害剤の存在下で全血を保存することは必須ではない。したがって、例えば、採血管の種類は何ら制限されず、例えば、解糖系阻害剤を含有しない採血管等が使用できる。【００７１】
（溶血処理）
保存後の全血を溶血処理する。溶血処理の条件は、例えば、前記第１のＨｂＡ１ｃ測定方法と同様である。なお、前記強電解質物質は、溶血処理の前後いずれに添加してもよい。【００７２】
（強電解質物質の添加）
前記溶血した全血に、前記強電解質物質を添加する。これによってＨｂＡ１ｃ測定に供する保存後の全血試料を調製できる。【００７３】
前記強電解質物質としては、例えば、ＫＣｌ、Ｋ２ＳＯ４、ＫＮＯ、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＮＯ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４およびＭｇ（ＮＯ）２があげられる。この他にも、例えば、Ｃａ（ＮＯ）２等が使用できる。中でも、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４が好ましい。また、強電解質物質は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。二種類以上を併用する際の組み合わせは、何ら制限されないが、例えば、ＫＣｌとＭｇＳＯ４との組み合わせ、ＮａＣｌとＭｇＳＯ４との組み合わせ、Ｋ２ＳＯ４とＭｇＳＯ４との組み合わせがあげられる。本発明においては、前記強電解質物質を含む試薬を、保存した全血中のＨｂに結合した二酸化炭素を減少するための処理試薬として使用できる。この処理試薬は、例えば、さらにプロテアーゼを含んでもよい。【００７４】
全血に対する強電解質物質の添加割合は、例えば、全血１ｍｌあたり５〜３０００ｍｏｌであり、好ましくは８〜１０００ｍｏｌである。また、次工程のプロテアーゼ処理の反応液における強電解質物質の濃度は、例えば、１０〜３０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、好ましくは４０〜１０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、特に好ましくは４０〜３５０ｍｍｏｌ/Ｌである。前記反応液中のＨｂ濃度が０.００５ｍＭの場合、前記強電解質物質の添加割合は、例えば、１０〜３０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、好ましくは４０〜１０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、特に好ましくは４０〜３５０ｍｍｏｌ/Ｌである。【００７５】
また、前述のような未処理の全血以外に、例えば、希釈全血、溶血した全血、血球、精製Ｈｂ等を保存した場合も、強電解質物質により同様に処理することができる。強電解物質の添加割合は、特に制限されず、例えば、希釈全血、溶血した全血、血球、精製Ｈｂ等を全血の量に換算して、前述のような範囲に設定することができる。その他の工程も同様である。【００７６】
（プロテアーゼ処理）
前記溶血した全血試料について、前記強電解質物質の存在下、プロテアーゼ処理を行う。【００７７】
また、プロテアーゼ処理においては、前記反応液に、さらに、ＮａＯＨおよびＴｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）の少なくとも一方を含有させることが好ましい。これらを添加することによって、特に、全血試料を凍結保存した場合のＨｂＡ１ｃ変動をより効果的に抑制することができる。なお、前記第１のＨｂＡ１ｃ測定方法においても同様である。凍結保存の温度は、例えば、−１５〜−８０℃であり、通常、−８０℃である。【００７８】
前記反応液におけるＮａＯＨの添加割合は、例えば、５〜３０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、好ましくは３０〜１０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、特に好ましくは４０〜３５０ｍｍｏｌ/Ｌである。また、Ｔｒｉｓの添加割合は、例えば、５〜３０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、好ましくは３０〜１０００ｍｍｏｌ/Ｌであり、特に好ましくは４０〜３５０ｍｍｏｌ/Ｌである。【００７９】
そして、プロテアーゼ処理後、前記第１のＨｂＡ１ｃ測定方法と同様にして、ＦＡＯＤ処理や酸化還元反応の測定を行うことによって、ＨｂＡ１ｃを算出すればよい。【００８０】
このような第２のＨｂＡ１ｃ測定方法は、例えば、以下のような試薬キットにより行ってもよい。前記試薬キットは、前記本発明の第２のＨｂＡ１ｃ測定方法を実施できるものであれば、どのような構成であってもよいが、例えば、第１試薬としてＦＡＯＤ、酸化酵素および前記強電解質物質を含む試薬、第２試薬として、プロテアーゼおよび発色基質を含む試薬があげられる。このような試薬キットの場合、例えば、全血と第１試薬とを混合した後に、さらに第２試薬を添加することで、プロテアーゼ処理、ＦＡＯＤ処理、発色反応の全てを開始することができる。【００８１】
前記第１試薬は、例えば、ＦＡＯＤ、酸化酵素（例えば、ＰＯＤ）および前記強電解質物質の他に、さらに、前述のようなＮａＯＨやＴｒｉｓ、この他にも、緩衝剤、前記促進化合物、前記色素物質等を含んでもよい。また、第２試薬は、例えば、プロテアーゼおよび発色基質の他に、さらに、緩衝剤や色素物質を含んでもよい。各試薬において、各成分の含有割合は、特に制限されないが、反応液における濃度が前述のような範囲となるように調製することが好ましい。【００８２】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８３】
各種採血管を用いて採取した全血を保存した後、ＨｂＡ１ｃ％を測定して、ＨｂＡ１ｃ％の変動の有無を確認した。【００８４】
下記採血管を用いて健常人から全血を採取し、前記全血を前記採血管に入れたまま密閉保存した。前記採血管を４℃で１５日間放置した後、全血のＨｂおよびＨｂＡ１ｃを測定した。【００８５】
（採血管）
Ｈ管  ：ヘパリンナトリウム採血管（テルモ社製）
ＤＫ管：ＥＤＴＡ−Ｋ採血管（テルモ社製）
ＦＨ管：フッ化ナトリウム＋ヘパリンナトリウム採血管（テルモ社製）【００８６】
【表１】
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【００８７】
＜ＨｂＡ１ｃ％測定方法＞
１５日放置した全血を精製水で２６倍希釈し、この希釈液６．５μＬに精製水６．５μＬを添加したものをサンプルとした。このサンプル１３μＬに前記第１試薬７８μＬを混合して３７℃で５分間インキュベートした。ここで、この反応液について、波長５７１ｎｍ／７５１ｎｍにおける吸光度測定（Ｂ１）、および、波長６９４ｎｍ／７５１ｎｍにおける吸光度測定（Ａ１）を行った。次に、前記反応液に、さらに前記第２試薬１９．５μＬを添加して３７℃で５分間インキュベートした後、前記反応液について、再度、波長６９４ｎｍ／７５１ｎｍにおける吸光度測定（Ａ２）を行った。そして、下記式に示すように、２回目の吸光度（Ａ２）から、１回目の吸光度（Ａ１）に容量変化を補正する値［（１３＋７８）／（１３＋７８＋１９．５）］を乗じた値を差し引き、この値を、全血試料のＨｂＡ１ｃ濃度に相当する吸光度（ＨｂＡ１ｃ吸光度）とした。なお、１回目の波長５７１ｎｍ／７５１ｎｍにおける吸光度（Ｂ１）は、試料中のＨｂ濃度に相当する（Ｈｂ吸光度）。測定は、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）を用いて行った。また、コントロールとして、採血直後の全血、ならびに、全血に代えて精製水を使用し、同様にして吸光度測定を行った。また、この吸光度を、予め作成した検量線に代入して、ＨｂＡ１ｃ％を求めた。前記検量線は、ＨｂＡ１ｃ％が既知である標準試料を用いて同様に吸光度測定を行い、前記吸光度とＨｂＡ１ｃ％の値とのプロットから作成した。これらの結果を下記表２に示す。
ＨｂＡ１ｃ吸光度＝Ａ２−［Ａ１×（１３＋７８）／（１３＋７８＋１９．５）］【００８８】
【表２】
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【００８９】
前記表２に示すように、ヘパリンＮａのみを含有する採血管やＥＤＴＡ−Ｋを含有する採血管で採取した全血は、放置によって吸光度の減少が見られ、結果としてＨｂＡ１ｃ％が減少した。これは、放置している間に、全血中から二酸化炭素が発生し、これによってオキシ型Ｈｂがデオキシ型Ｈｂに変化したため、プロテアーゼがＨｂのβ鎖Ｎ末端側に作用し難くなったことが原因と考えられる。これに対して、フッ化ナトリウムを含有する採血管を使用した場合、摂取した全血を１５日間放置しても、ＨｂＡ１ｃ％の結果に変動はほとんど見られなかった。すなわち、患者から採取した全血を保存した場合であっても、フッ化ナトリウムの存在下であることによって、採取直後と保存後におけるＨｂＡ１ｃ％を変動させることなく、高い精度で測定することが可能であることがわかる。【００９０】
なお、保存中にＨｂＡ１ｃ％が変動していないことも、ＨＰＬＣ法により確認済みである。すなわち、上述と同様の条件で、前記ヘパリンナトリウム採血菅で採血した全血を、前記採血菅にいれたまま放置した。そして、この全血について、ＨＰＬＣ法によりＨｂＡ１ｃ％の測定を行った。測定には、ＡＤＡＭＳ‐Ａ１ｃ  ＨＡ‐８１６０（アークレイ社製）を使用した。その結果を下記表に示す。下記表に示すように、ＨｂＡ１ｃ％は、保存によって変動していないことがＨＰＬＣ法により確認できた。【００９１】
ＨｂＡ１ｃ％      
採血直後      ５．４５
１日後          ５．３５
５日後          ５．６１
７日後          ５．５０
９日後          ５．５６
１２日後          ５．５１        
【実施例２】
【００９２】
保存した全血に各種添加剤を添加してＨｂＡ１ｃ％を測定し、ＨｂＡ１ｃ％の変動を確認した。【００９３】
ヘパリンナトリウム採血管（Ｈ管）を用いて健常人から全血を採取し、この全血を冷蔵庫で２週間保存した後、全血のＨｂおよびＨｂＡ１ｃを測定した。なお、ＨｂＡ１ｃ％の測定方法は、第１試薬に代えて下記第１−２試薬を使用した以外は、前記実施例１と同様に行った。下記第１−２試薬においてＰＩＰＥＳ／ＫＯＨは、３０ｍｍｏｌのＰＩＰＥＳにＫＯＨを添加してｐＨ７に調整した後、水を加えて１Ｌとして調製した。【００９４】
【表３】
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【００９５】
また、下記表４に示す添加剤（Ｎｏ．１〜２２）を使用した系の評価基準として、実施例１と同様のフッ化ナトリウム＋ヘパリンナトリウム採血管（ＦＨ管）により採取した全血についても、同様にして保存後にＨｂＡ１ｃ％の測定を行った。ＦＨ管により採取した全血を保存した場合、ＨｂＡ１ｃ％の低下が十分に抑制されることは、実施例１において証明済みである。したがって、Ｈ管で採取した全血について、各添加剤を使用した系を用いてＨｂＡ１ｃ測定を行った場合、その測定値と、ＦＨ管で採血した全血についての測定値とが近似していれば、前記添加剤を使用した系により、ＨｂＡ１ｃ値の減少を防止できたといえる。これらの結果を、下記表５および表６に示す。【００９６】
【表４】
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【００９７】
【表５】
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【表６】
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【００９８】
同図に示すように、ＫＣｌ等を加えていない添加剤１を使用した系では、実施例１に示すようなＦＨ管により採取した全血と比較して、Ｈ管により採取した全血は、保存によってＨｂＡ１ｃ％が大きく減少した。これに対して、Ｈ管により採取した全血を保存し、測定時にＫＣｌ等を含む添加剤を加えた系（添加剤Ｎｏ．２〜２２）においては、保存後の全血であっても、ＦＨ管を使用した際と同等のＨｂＡ１ｃ％値が得られ、前記添加剤によってＨｂＡ１ｃ％の減少を抑制することができた。
【実施例３】
【００９９】
ヘパリン管で採取した全血を、速やかに−８０℃で保存した（６０日間）。そして、室温で解凍した後、全血についてＨｂＡ１ｃ％を測定し、その変動を確認した。なお、全血を冷凍保存し、第１−２試薬における添加剤として下記表７の添加剤を使用し、前記第１−２試薬における緩衝液としてＰＩＰＥＳ／ＫＯＨに代えてＰＩＰＥＳ／ＴｒｉｓまたはＰＩＰＥＳ／ＮａＯＨを使用した以外は、前記実施例２と同様にしてＨｂＡ１ｃ％の測定を行った。これらの結果を下記表８に示す。【０１００】
【表７】
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【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
前記表８に示すように、ＫＣｌ等を加えていない添加剤１を使用した系では、実施例１に示すようなＦＨ管により採取した全血と比較して、−８０℃での凍結保存を行うことによって、ＨｂＡ１ｃ％が大きく減少した。これに対して、Ｈ管により採取した全血を保存した場合であっても、添加剤２３〜３１の系においては、ＦＨ管を使用した際と同等のＨｂＡ１ｃ％値が得られ、ＨｂＡ１ｃ％の減少を抑制することができた。
【実施例４】
【０１０３】
保存した全血に添加剤（Ｋ２ＳＯ４およびＭｇＳＯ４）を添加してＨｂＡ１ｃ％を測定し、ＨｂＡ１ｃ％の変動を確認した。【０１０４】
前記実施例３の第１−２試薬において、添加剤として、Ｋ２ＳＯ４（６０ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＫ２ＳＯ４（４０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加した。これを第１−２試薬とした。そして、ヘパリンナトリウム採血管（Ｈ管）およびＥＤＴＡ‐２Ｋ採血菅を用いて健常人から全血を採取し、前記採血菅にいれたままで全血を冷蔵庫で所定期間（０、１、４、６、１１日間）保存した後、全血のＨｂおよびＨｂＡ１ｃを測定した。ＨｂＡ１ｃ％の測定方法は、第１試薬に代えて前記第１−２試薬を使用した以外は、前記実施例１と同様に行った。なお、対照として、Ｋ２ＳＯ４およびＭｇＳＯ４に代えて精製水を添加した第１−２試薬を使用した。これらの結果を下記表９に示す。【０１０５】
【表９】
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【０１０６】
前記表９に示すように、いずれの採血菅で採取した全血も、対照は、経時的に測定値が低下した。これに対して、実施例は、Ｋ２ＳＯ４およびＭｇＳＯ４存在下で測定することにより、ＨｂＡ１ｃ％値の変動は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
以上のように、本発明によれば、全血試料を保存した場合であっても、ＨｂＡ１ｃの測定値の変動を防止することができるため、全血の採取直後と同様の精度でＨｂＡ１ｃを測定することができる。このように保存によるＨｂＡ１ｃ測定値の影響を排除できることから、例えば、全血を採取した場所と異なる場所において測定を行う場合のように、全血の保存が必須である場合に、極めて有用な方法といえる。
【国際調査報告】
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