【手続補正書】
【提出日】平成17年5月20日(2005.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
コラゲナーゼ酵素調製物に含まれていないヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のプロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分と、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分とからなり、組織解離を行うには、解離を開始する前に、Ａ成分をＢ成分に、それぞれ必要な量で添加する生成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
中性プロテアーゼ（ＮＰ）とコラゲナーゼとからなる生成物の製造方法であって、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらず、かつ組換え生産によって製造されたものではない、含量が明確なヒストリチクス菌由来の中性プロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分を、精製もしくは部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分に、組織解離の開始に先立って、両成分の量比を個別に調整して混合することを特徴とする方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
ＤＥ  ４４  ４５  ８９１  Ａ１には、ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の組換えプロテアーゼ（中性プロテアーゼ，ＮＰ）ならびに細胞および細胞集合体を単離するためのその使用が記載されている。これは、中性プロテアーゼを使って、より多くの細胞および細胞集合体を単離するには、その中性プロテアーゼを再現性のある品質で、大量に入手できるようにする必要があり、それは組換え生産法によって可能になるという事実がきっかけとなっている。しかし、中性プロテアーゼのクローニングは、容易にできるわけではない。というのも、ヒストリチクス菌の配列はほとんど分かっていないからである（クロストリパイン、２つのコラゲナーゼならびに１つのリボソームＲＮＡ配列）。そのため、コドン使用頻度を推断することができず、それゆえに、使用できるオリゴヌクレオチドの縮重度を制限することもできない。したがって、ヒストリチクス菌由来の中性プロテアーゼのＤＮＡ配列ならびにその組換え生産を利用できるようにしなけらばならない。すなわち、ヒストリチクス菌由来の中性プロテアーゼ活性を持つタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもって、それらを利用できるようにしなければならず、そのＤＮＡ配列は、
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すＤＮＡ配列またはそれに相補的なＤＮＡ配列、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）に記載の配列の１つとハイブリダイズするであろう、遺伝コードが縮重していない核酸配列、
という群から選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
細胞組織を解離させ、そこに含まれている細胞または細胞集合体を遊離させる方法は、細胞または細胞集合体が望ましい程度に遊離して、細胞または細胞集合体が細胞組織部分から分離されるまで、細胞組織を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または同じアミノ酸配列の遺伝コードの縮重の範囲内でコードされる配列からなり、かつ外来ＤＮＡの原核細胞または真核細胞での発現産物であるヒストリチクス菌由来の組換え中性プロテアーゼと共にインキュベートすることを特徴とする。そのようにして得られる酵素の使用は実証されていない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の生成物は、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれていないヒストリチクス菌由来のプロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分(a separate A component)と、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分とから構成され、組織解離を行うには、解離を開始する前に、Ａ成分をＢ成分に、それぞれ必要な量で添加する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の方法は、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらず、かつ組換え生産によって製造されたものではない、含量が明確なヒストリチクス菌由来の中性プロテアーゼ（ＮＰ）からなる独立したＡ成分を、精製もしくは部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したＢ成分に、組織解離の開始に先立って、両成分の量比を個別に調整（an individual dosage）して混合することを特徴とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の生成物ならびに本発明による組織解離への中性プロテアーゼの使用では、組織の細胞または細胞集合体を単離するために、中性プロテアーゼをコラゲナーゼ酵素調製物に個別に添加するか、またはコラゲナーゼもしくはコラゲナーゼＩおよびＩＩに個別に添加することにより、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれていないヒストリチクス菌の中性プロテアーゼ（ＮＰ）を個別に使用するので、細胞の収量、生存性および完全性に関して単離結果の改善が達成される。ヒストリチクス菌の中性プロテアーゼが使用される。組織のタイプおよび／または状態に依存する個別性が、広く存在する。本方法では、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼの添加が、組織の量に応じて、別々に行われる。中性プロテアーゼはコラゲナーゼ調製物中に含まれていないので、より高度な酵素安定性が達成される。これに加えて、製造者によって製造され、保存または貯蔵された、中性プロテアーゼとコラゲナーゼとの混合物は、使用されない。中性プロテアーゼとコラゲナーゼは、組織解離を開始する直前に混合される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の好ましい実施態様は、従属クレームの対象である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
不足しているヒト臓器資源をできる限り節約するために、ブタで予備試験を行う。なかでも、我々は特に、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼの限界濃度の滴定法を見いだし、これを、まず成体（＞２４ヶ月）で評価する。最初はＮＢ−１コラゲナーゼを限られた量しか利用できないので、ブタ膵島の単離はＮＢ−８コラゲナーゼを使って行う。中性プロテアーゼ含量およびトリプシン含量が最も小さく、クロストリパイン含量も可能な限り低いことを特徴とするロットだけを使用する。ここでは、消化時間および可消化組織量が中性プロテアーゼの濃度と明確に相関することが、予備試験によって示される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
新しい酵素調製物を使って評価した膵島単離における中性プロテアーゼの役割
目的：
膵島単離には数種類の酵素調製物を利用することができる。そのうちの一つは、成分（コラゲナーゼと中性プロテアーゼ）が別々になっていて、膵島単離用に中性プロテアーゼ濃度を調節することができる、高度に精製された生成物である。この研究では、膵島単離における中性プロテアーゼの役割を評価する。
方法：
酵素タイプに応じて、規格化された膵島単離を行うために、スプレイグ・ドーリーラットを７群（各群１８匹）に分割した。Ｉ群では２ｍｇ／ｍｌのＸＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用し、ＩＩ群では０．６ｍｇ／ｍｌのリベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ＩＩＩ群からＶＩＩ群では０．６ｍｇ／ｍｌのＮＢ１コラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅ）を使用した。ＩＩＩ群には純粋なＮＢ１コラゲナーゼを使用した。ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩ群には、７．５、１５、２２および／または３０μｇ／ｍｌの濃度の中性プロテアーゼ（ＮＰ）を加えた。結果を、膵島収量、アポトーシス（細胞死検出ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）およびＴＵＮＥＬ染色）、サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）分泌（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、インスリン分泌（静的インキュベーション）、および膵島の形態（組織構造および免疫組織構造）に関して評価した。
結果：
Ｉ群およびＩＩ群の場合、酵素溶液のエンドトキシン含量は、１７３＋１２２ＥＵ／ｍｌおよび１２０＋１１ＥＵ／ｍｌだった。ＩＩＩ群からＶＩＩ群の場合、エンドトキシン含量は、ＮＰ濃度と共に、０．４ＥＵ／ｍｌから５８ＥＵ／ｍｌまで徐々に増加した（ｐ＜０．０５）。ラット１匹あたりの膵島換算（ＩＥ）収量は、Ｉ群および／またはＩＩ群の場合、１３６７＋５２２および１７５５＋１１０だった。ＩＩＩ群からＶＩＩ群の場合、ラット１匹あたりのＩＥ収量は、ＮＰ濃度に応じて、ガウス分布に従い、Ｖ群では１７１２＋２４５と収量が高く、ＩＩＩ群（５９７＋２７７）およびＶＩＩ群（９０５＋２９７）では収量が低かった（ｐ＝０．０５）。ＩＩＩ群からＶＩＩ群の場合、膵島の形態はＮＰ濃度による影響を受け、ＮＰ含量が増加するにつれて、捕獲された膵島の数は減少し、断片化した膵島の数が増加した。ＮＰ濃度の増加は、膵島のα細胞リングの漸進的劣化を伴い、ＶＩＩ群ではＩ群およびＩＩ群に見られる劣化と同等だった。ＩＩＩ群からＶＩＩ群では、サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）の放出量は、Ｉ群およびＩＩ群よりも低かったが、ＮＰ濃度による影響は受けなかった。島細胞の壊死およびアポトーシスは、Ｉ群およびＩＩ群よりもＩＩＩ群からＶＩＩ群の方が、統計的に有意に少なかったが、ＮＰ濃度による影響は受けなかった。インスリン分泌の平均刺激指数は、Ｉ群の場合は２．９６、ＩＩ群の場合は５．１７で、ＩＩＩ群からＶＩＩ群では５．２５から５．４３だった。
結論：
中性プロテアーゼは、膵島単離において、膵島収量を左右する決定的なコラゲナーゼへの添加物である。適切な中性プロテアーゼ濃度を持つＳｅｒｖａコラゲナーゼは、膵島収量および膵島機能については、リベラーゼと同等であるが、細胞形態の改善をもたらす低い島細胞サイトカイン放出量およびアポトーシスと関係している。