(57)【要約】  細胞物性測定装置１０は、探触子２０と、探触子２０を保持してＸＹＺの３軸方向に移動させるためのＸＹＺ移動機構３０と、さらに、探触子２０を高さ方向、すなわちＺ方向に上下に移動させるための高さ移動機構３２と、ＸＹＺ移動機構３０と、高さ移動機構３２と、探触子２０のそれぞれに信号線を介して接続される制御部６０と、制御部６０に接続される表示部８０とを含んで構成される。制御部６０の接触検出モジュール６６は、位相シフト法を用いて、探触子２０が測定対象物８に接触することを検出し、硬さ算出モジュール６８は、探触子２０を測定対象物８に接触させて位相シフト法により硬さを求める機能を有する。
2008069250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物である生体細胞に超音波を入射する振動子と、測定対象物からの反射波を検出する振動検出センサとを有する探触子と、
測定対象物に対し、探触子をＸＹ平面内の任意の位置に相対的に移動させる平面内移動機構と、
測定対象物に対し、探触子をＸＹ平面に対する高さ方向に相対的に移動させる高さ移動機構と、
探触子に増幅器とともに直列に接続され、振動子への入力波形と振動検出センサからの出力波形に位相差が生じるときは、周波数を変化させてその位相差をゼロに補償する位相シフト回路と、
位相差をゼロに補償する周波数変化量が予め任意に設定された周波数変化閾値を超えたときに、探触子が測定対象物に接触したとして接触信号を出力する接触検出部と、
接触信号が出力されたときの高さ移動機構の高さ方向の位置を、探触子が測定対象物に接触した接触高さとして出力する接触高さ出力部と、
測定対象物に対する探触子のＸＹ平面内の移動位置と、その移動位置における接触高さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の３次元表面形状を表示する表面形状表示手段と、
を備えることを特徴とする細胞物性測定装置。
【請求項２】
請求の範囲１に記載の細胞物性測定装置において、
位相差をゼロに補償したときの周波数変化量と硬さとの関係を予め求めておき、探触子の先端を予め任意に定めた測定高さにおいて測定対象物に接触させ、位相差をゼロに補償する周波数変化量から測定対象物の硬さを出力する硬さ出力部と、
測定対象物に対する探触子のＸＹ平面内の移動位置と、その移動位置における測定対象物の硬さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の２次元的硬さ分布を表示する硬さ分布表示手段と、
を備えることを特徴とする細胞物性測定装置。
【請求項３】
請求の範囲１に記載の細胞物性測定装置において、
探触子は、
振動子と振動検出センサとを含む本体部と、
本体部に接続され細長く延び、曲率半径が５μｍ以上２０μｍ以下の先端部を有する軸状プローブ部と、
を有していることを特徴とする細胞物性測定装置。
【請求項４】
請求の範囲３に記載の細胞物性測定装置において、
平面内移動機構は、探触子の曲率半径より短い距離の測定ピッチで、測定対象物に対し探触子を移動させることを特徴とする細胞物性測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞物性測定装置に係り、特に測定対象物である生体細胞について、その物性分布を測定する細胞物性測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の形状評価も含め物性評価には、例えば顕微鏡による形態的観察法が用いられる。また、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）等のように、微小なカンチレバーを用いて細胞の表面の凹凸と、カンチレバーが接触したことによる凹凸の変化から細胞の応力・歪を測定することが行われる。また、細胞に特殊な蛍光体を配置することで細胞の輪郭等の物性を検出することが行われる。例えば、特許文献１には、一定の温度以上で紫外線によって励起され発光する蛍光体を含む代謝プローブの中に細胞を配置し、紫外線の照射による蛍光体の発光から細胞の温度を検出することが開示されている。【０００３】
なお、本願発明者は、特許文献２において開示されているように、位相シフト法を用いて対象物の硬さを精度よく測定できる方法を開発している。この技術は、振動子から測定対象物に振動を入射し、測定対象物からの反射波を振動検出センサで検出し、入射波と反射波との間に測定対象物の硬さに応じて生じる位相差を位相シフト回路によって周波数を変化させることで位相差をゼロに補償し、その位相差をゼロに補償する周波数変化量から測定物の硬さを求めるものである。この方法によれば、測定対象物に接触して振動を入力し反射波を検出する接触式によって測定対象物の硬さを測定することができる。【０００４】
【特許文献１】特開平１１−２５８１５９号公報
【特許文献２】特開平９−１４５６９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術において、ＡＦＭ、ＳＰＭ等のカンチレバー方式によれば、生体細胞の表面の凹凸と、その凹凸に基づく応力・歪を測定できるが、その測定は細胞の表面に止まり、生体細胞内部を含めた硬さ等の物性を測定するには不十分である。また、特許文献１に示されるようにマーカによって生体細胞の物性を測定する方法では、形状や温度等の測定が可能であるが、例えばガン細胞の硬さ等の物性を測定することができない。また、特許文献２の方法によれば、測定対象物の硬さを測定できるが、測定対象物の表面形状等を測定することができない。【０００６】
本発明の目的は、新しい方法で生体細胞の表面形状を測定できる細胞物性測定装置を提供することである。また、他の目的は、生体細胞の表面形状の測定と共に細胞の硬さを測定できる細胞物性測定装置を提供することである。以下の手段は、これらの目的の少なくとも１つに貢献する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る細胞物性測定装置は、測定対象物である生体細胞に超音波を入射する振動子と、測定対象物からの反射波を検出する振動検出センサとを有する探触子と、測定対象物に対し、探触子をＸＹ平面内の任意の位置に相対的に移動させる平面内移動機構と、測定対象物に対し、探触子をＸＹ平面に対する高さ方向に相対的に移動させる高さ移動機構と、探触子に増幅器とともに直列に接続され、振動子への入力波形と振動検出センサからの出力波形に位相差が生じるときは、周波数を変化させてその位相差をゼロに補償する位相シフト回路と、位相差をゼロに補償する周波数変化量が予め任意に設定された周波数変化閾値を超えたときに、探触子が測定対象物に接触したとして接触信号を出力する接触検出部と、接触信号が出力されたときの高さ移動機構の高さ方向の位置を、探触子が測定対象物に接触した接触高さとして出力する接触高さ出力部と、測定対象物に対する探触子のＸＹ平面内の移動位置と、その移動位置における接触高さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の３次元表面形状を表示する表面形状表示手段と、を備えることを特徴とする。【０００８】
また、本発明に係る細胞物性測定装置において、位相差をゼロに補償したときの周波数変化量と硬さとの関係を予め求めておき、探触子の先端を予め任意に定めた測定高さにおいて測定対象物に接触させ、位相差をゼロに補償する周波数変化量から測定対象物の硬さを出力する硬さ出力部と、測定対象物に対する探触子のＸＹ平面内の移動位置と、その移動位置における測定対象物の硬さとに基づいて、測定対象物である生体細胞の２次元的硬さ分布を表示する硬さ分布表示手段と、を備えることが好ましい。【０００９】
また、本発明に係る細胞物性測定装置において、探触子は、振動子と振動検出センサとを含む本体部と、本体部に接続され細長く延び、曲率半径が５μｍ以上２０μｍ以下の先端部を有する軸状プローブ部と、を有していることが好ましい。【００１０】
また、本発明に係る細胞物性測定装置において、平面内移動機構は、探触子の曲率半径より短い距離の測定ピッチで、測定対象物に対し探触子を移動させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
上記構成により、細胞物性測定装置は、測定対象物に対し、探触子をＸＹ平面内の任意の位置に相対的に移動させることができ、さらにＸＹ平面に対する高さ方向にも相対的に移動させることができる。これにより、探触子を用いて測定対象物に対し２次元的に走査することができる。そして、位相シフト回路を用いて、探触子の高さを移動させて、位相差をゼロに補償する周波数変化量が予め任意に設定された周波数変化閾値を超えたときに、探触子が測定対象物に接触したとする。これにより、測定対象物の接触高さの２次元分布を得ることができる。このように、ＡＦＭ、ＳＰＭ等の従来技術とは異なる新しい方式によって、測定対象物である生体細胞の３次元的な表面形状を測定することができる。【００１２】
また、位相差をゼロに補償したときの周波数変化量と硬さとの関係を予め求めておき、探触子の先端を予め任意に定めた測定高さにおいて測定対象物に接触させ、位相差をゼロに補償する周波数変化量から測定対象物の硬さを出力する。測定高さとしては、探触子が測定対象物に接触してからの一定の深さとすることもでき、また、基準面からの一定の深さからとすることもできる。いずれにしても、測定対象物の内部を含めた硬さを測定でき、これによって、測定対象物である生体細胞の表面形状の測定と共に細胞の硬さを測定できる。【００１３】
また、探触子は、振動子と振動検出センサとを含む本体部に接続され細長く延びる軸状のプローブ部を有し、その先端部は、曲率半径が５μｍ以上２０μｍ以下であるので、測定対象物である生体細胞の微小な部分の表面形状、硬さを測定することができる。【００１４】
また、探触子の曲率半径より短い距離の測定ピッチで、測定対象物に対し探触子を移動させるので、探触子の先端部の大きさよりも細かい測定ピッチで、測定対象物である生体細胞の表面形状、硬さの分布を測定できる。これにより、測定対象物である生体細胞の微小な物性変化を測定できる。また、測定ピッチが細かいことによる測定のばらつきが、探触子の先端部の大きさによって平均化され、測定の信頼性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係る実施の形態における細胞物性測定装置の構成を示す図である。
【図２】本発明に係る実施の形態において、探触子と特性算出部の構成について示す図である。
【図３】本発明に係る実施の形態において、位相シフト回路の機能を説明する図である。
【図４】本発明に係る実施の形態において、予め求められた周波数変化量Δｆと硬さとの対応関係の１例を示す図である。
【図５】本発明に係る実施の形態において、測定対象物であるガン細胞を実体顕微鏡で観察した様子を示す図である。
【図６】本発明に係る実施の形態において、測定対象物であるガン細胞におけるアクチンの局在について免疫蛍光抗体法を用い、共焦点レーザ顕微鏡にて観察した様子を示す図である。
【図７】本発明に係る実施の形態において、測定対象物であるガン細胞について２次元凹凸分布を測定して表示した例を示す図である。
【図８】本発明に係る実施の形態において、測定対象物であるガン細胞について２次元硬さ分布を測定して表示した例を示す図である。
【符号の説明】
【００１６】
６  透明シリコンシート、８  測定対象物、１０  細胞物性測定装置、２０  探触子、２２  軸状プローブ部、２４  探触子本体部、２６  振動子、２８  振動検出センサ、３０  ＸＹＺ移動機構、３２  高さ移動機構、３４  測定軌跡、４０  特性算出部、４２，４４，４６，４８  端子、５０  増幅器、５２  位相シフト回路、５４  周波数変化量算出部、５６  接触検出部、５８  硬さ算出部、６０  制御部、６２  平面内移動モジュール、６４  高さ方向移動モジュール、６６  接触検出モジュール、６８  硬さ算出モジュール、７０  分布表示モジュール、８０  表示部。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に図面を用いて本発明に係る実施の形態につき詳細に説明する。以下では、探触子を生体細胞に対し移動させて、ＸＹＺ方向に走査するものとして説明するが、走査は相対的なものであればよく、例えば、測定対象物である生体細胞を試料台に固定し、試料台をＸＹＺ方向に移動するものとしてもよい。また、試料台をＸＹ方向に走査するものとし、探触子をＺ方向に移動させるものとしてもよい。また、以下において探触子は、振動子と振動検出センサとを積層したものとして説明するが、それ以外の配置方法であってもよい。例えば振動子と振動検出センサとを同心状に配置してもよく、また、振動子と振動検出センサとを並列に別個に配置するものとしてもよい。【００１８】
図１は、細胞物性測定装置１０の構成を示す図である。図１には、細胞物性測定装置１０の構成要素ではないが、測定対象物８の生体細胞として、コラーゲンシートを貼り付けた透明シリコンシート６の上に培養して付着させたガン細胞が示されている。測定対象物８であるガン細胞の詳細については後述する。細胞物性測定装置１０は、探触子２０と、探触子２０を保持してＸＹＺの３軸方向に移動させるためのＸＹＺ移動機構３０と、さらに、探触子２０を高さ方向、すなわちＺ方向に上下に移動させるための高さ移動機構３２と、ＸＹＺ移動機構３０と、高さ移動機構３２と、探触子２０のそれぞれに信号線を介して接続される制御部６０と、制御部６０に接続される表示部８０とを含んで構成される。【００１９】
ＸＹＺ移動機構３０は、測定対象物８である生体細胞に対し、探触子２０を図１に示したＸＹＺの３軸方向に任意に移動させる機能を有する。ここで、ＸＹ平面は、測定対象物８である生体細胞が固定される試料台の表面に平行な平面である。ＸＹＺ移動機構３０のうち、Ｚ方向の移動機能は、測定対象物８である生体細胞が試料台の上に固定される高さがばらつく際に、その中心的な高さに探触子２０を移動するためのもので、一旦測定対象物８である生体細胞に対して中心的位置の位置決めがなされると、そこでＸＹＺ移動機構３０のＺ移動機能は完了する。したがって、その後は、ＸＹＺ移動機構３０は、実質的に、測定対象物８である生体細胞に対し、探触子２０をＸＹ平面内の任意の位置に移動させる機能を有することになる。【００２０】
かかるＸＹＺ移動機構３０は、いわゆるＸＹＺテーブルと、精密なステッピングモータをＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸駆動用としてそれぞれ備えるものとして構成することができる。例えば、Ｘ軸ステッピングモータは、固定台に対しＸ軸方向に移動可能なＸテーブルを駆動し、Ｙ軸ステッピングモータはＸテーブルの上に搭載されＹ軸方向に移動可能なＹ軸テーブルを駆動し、Ｚ軸ステッピングモータはＹテーブルの上に搭載されＺ軸方向に移動可能なＺ軸テーブルを駆動するものとして構成することができる。この例では、Ｚ軸テーブル上に探触子２０が取り付けられる。固定台は、測定対象物８である生体細胞が固定される試料台と一定の位置関係で相互に固定されている。なお、ＸＹＺ移動機構３０の制御信号線は、制御部６０と接続される。【００２１】
ＸＹＺ移動機構３０は、そのＺ軸方向の移動は、測定対象物８である生体細胞の厚み程度の移動を精密に行う必要があり、そのＸ軸方向及びＹ軸方向の移動は、測定対象物８である生体細胞の大きさに対し、十分多数の測定位置を設定できる程度の移動を精密に行う必要がある。これらの精密な移動の必要性から、ＸＹＺ移動機構３０は、移動分解能として、Ｘ軸方向で１０ｎｍ、Ｙ軸方向で２０ｎｍ、Ｚ軸方向で１０ｎｍ程度を確保できる仕様のものが用いられる。【００２２】
高さ移動機構３２は、ＸＹＺ移動機構３２に取り付けられ、探触子２０をＸＹ平面に対し高さ方向、すなわちＺ方向に上下移動させる機能を有する。上記のＸＹＺテーブル方式のＸＹＺ移動機構３０の場合では、Ｚテーブルに高さ移動機構３２が取り付けられ、Ｚテーブルに対して、探触子２０をＺ方向に上下移動させる機能を有する。上記のように、ＸＹＺ移動機構３０は、初期にＺ方向の高さ設定を行った後は、実質上ＸＹ移動機構、すなわちＸＹ平面内の走査機構として働くが、高さ移動機構３２は、このＸＹ走査の間に、各測定点において、高さ方向に探触子２０を移動させる。高さ移動機構３２の制御信号線は制御部６０に接続される。【００２３】
かかる高さ移動機構３２は、ＸＹＺ移動機構３０とは独立のＺ軸ステッピングモータで構成することができる。Ｚ軸方向の上下移動は、測定対象物８である生体細胞の厚み方向に対して、十分な分解能の精度で行う必要があることから、１０ｎｍ程度の移動分解能を有するものが用いられる。【００２４】
探触子２０は、振動子２６と振動検出センサ２８が積層された探触子本体部２４と、探触子本体部２４から先端に向けて細くなって延びる軸状プローブ部２２を含んで構成される。振動子２６と振動検出センサ２８にそれぞれ一端側が接続される各信号線は、他端側で制御部６０に接続される。【００２５】
探触子２０は、その根元の部分で高さ移動機構３２に接続される。そして、高さ移動機構３２は、ＸＹＺ移動機構３０のＺテーブルに取り付けられ、ＸＹＺ移動機構３０は固定台に対しＸＹＺ方向に移動可能であり、固定台は、測定対象物８である生体細胞が固定される試料台と一定の位置関係にある。したがって、ＸＹＺ移動機構３０をＸＹ方向に移動させ、適当な測定位置で高さ移動機構３２によって探触子２０を上下させることで、測定対象物８である生体細胞に対し、２次元的に走査しながら、適当な測定位置で探触子２０を生体細胞に接触させることができる。このように、ＸＹＺ移動機構３０と高さ移動機構３２とは、測定対象物８である生体細胞に対し、２次元的に走査しながら、各測定位置で探触子２０の先端を生体細胞に接触させる機能を有する測定走査機構である。図１には、測定対象物８である生体細胞に対し、探触子２０の先端が２次元的に走査する測定軌跡３４が示されている。【００２６】
制御部６０は、ＸＹＺ移動機構３０を制御して、Ｚ方向の初期位置を設定し、ＸＹ平面内で探触子２０を任意の位置に移動させる平面内移動モジュール６２と、高さ移動機構３２を制御して、探触子２０をＸＹ平面に対する高さ方向に移動させる高さ方向移動モジュール６４と、探触子２０が測定対象物８に接触することを検出する接触検出モジュール６６と、探触子２０を測定対象物８に接触させてその硬さを求める硬さ算出モジュール６８と、接触検出モジュール６６の接触高さ検出機能と、硬さ算出モジュール６８の硬さ検出機能とを用いて、測定対象物８の表面形状と硬さ分布とを表示部８０に表示する分布表示モジュール７０とを含んで構成される。【００２７】
かかる制御部６０は、信号処理を行う電子回路と、データ処理等を実行するコンピュータとを組み合わせて構成できる。データ処理等の機能は、ソフトウェアを用いて実行でき、具体的には、例えば細胞物性表示プログラムを実行することで実現できる。【００２８】
図２は、探触子２０と、制御部６０の接触検出モジュール６６、高さ算出モジュール６８の機能を実現する電子回路である特性算出部４０の構成について抜き出して示す図である。【００２９】
探触子２０は、上記のように、先端に向けて細くなって延びる軸状プローブ部２２の根元に、振動子２６と振動検出センサ２８が積層された探触子本体部２４を備える。振動子２６は、軸状プローブ部２２を介してその先端に接触する測定対象物８である生体細胞に超音波を入射する機能を有し、振動検出センサ２８は、測定対象物８である生体細胞からの反射波を軸状プローブ部２２を介して受け取り検出する機能を有する。図２の例では、振動子２６と振動検出センサ２８とが直列に積層されて接続され、接続点を接地して用いられている。具体的には、円板状の圧電素子の両面にそれぞれ電極を設けたものを２つ用いて積み重ね、中間の電極２つを一体化して接地電極とし、積み重ねた上面側電極と下面側電極の一方側を振動子２６の入力電極とし、他方側を振動検出センサ２８の出力電極とする。そして、図２の例では、振動子２６の入力電極側の面を軸状プローブ部２２の平坦な裏面に接着して固定される。圧電素子としては、市販のＰＺＴ素子を用いることができる。【００３０】
軸状プローブ部２２は、探触子本体部２４から放射される超音波について、小さな測定対象物８である生体細胞上に位置決めして接触できるように、また、小さな生体細胞上のその接触したところからの反射波を探触子本体部２４に伝える機能を有する素子である。例えば、探触子２０に用いられる振動子２６と振動検出センサ２８が円板状として、その直径を数ｍｍとすれば、その大きさのままでは、例えば、１ｍｍ以下あるいは０．１ｍｍ程度の小さな測定対象物８である生体細胞に位置決めして接触することが困難である。そこで、探触子本体部２４の外径をできるだけ小さくすると共に、軸状プローブ部２２の形状として、探触子本体部２４から先端に向けて細くなって延びるものを用いる。【００３１】
具体的な寸法の例を挙げると、探触子本体部２４は、軸方向の長さが約１５ｍｍで、外径が約２ｍｍから約５ｍｍの円筒部分と、円筒部分に取り付けられ、あるいは一体となって、先端に向けて次第に細くなるテーパ部分とを有する。テーパ部分の先端部の直径は、約０．２ｍｍから約０．５ｍｍである。軸状プローブ部２２は、長さが約３０ｍｍで、直径が約５０μｍから約３０μｍで、先端は、直径ｄが約１μｍから約２０μｍの半球状に仕上げられる。かかる軸状プローブ部２２は、例えば、ガラス棒を加熱溶融し、細長く延ばし、先端を半球状にして成形したものを用いることができる。軸状プローブ部２２は、適当な接合材を用いて、探触子本体部２４のテーパ部分の先端に取り付けられる。【００３２】
図２には、特性算出部４０の構成が示されている。特性算出部４０は、振動検出センサ２８からの反射波に相当する出力信号を受け取る端子４２と、振動子２６への入射波に相当する入力信号を出す端子４４と、図１に示す制御部６０に接続される端子４６，４８とを有する。特性算出部４０の内部は、次のように構成される。【００３３】
振動検出センサ２８に接続される端子４２は、適当なＤＣカットコンデンサを介して増幅器５０に接続される。増幅器５０は、振動検出センサ２８によって検出された反射波信号を適当に増幅する電子回路で、周知の増幅回路を用いることができる。【００３４】
増幅器５０の出力は、位相シフト回路５２に入力され、位相シフト回路５２の出力は、端子４４を介して振動子２６に接続される。したがって、振動子２６−軸状プローブ部２２−測定対象物８である生体細胞−軸状プローブ部２２−振動検出センサ２８−増幅器５０−位相シフト回路５２−振動子２６の閉ループが構成される。したがって、位相シフト回路５２の内容を適当に設定することで、この閉ループにおいて自励発振を生じさせることができる。【００３５】
位相シフト回路５２の機能は、この閉ループにおいて、位相シフト回路５２に入力される入力信号の位相θ1と、位相シフト回路５２から出力される出力信号の位相θ2との間に位相差が生じるときは、閉ループの発振周波数を変更して、位相差をゼロに補償する機能を有する。そして、位相差をゼロに補償したときの周波数を周波数変化量算出部５４に出力する。【００３６】
図３は、位相シフト回路５２の機能を説明する図である。図３の横軸は周波数で、縦軸は位相である。ここで、軸状プローブ部２２が測定対象物８である生体細胞に接触していないときに、振動検出センサ２８からの反射波の位相をθ1とし、軸状プローブ部２２が測定対象物８である生体細胞に接触したときにしていないときの位相をθ2とする。そして、振動検出センサ２８からの位相θ1を有する反射波が入力されると、位相シフト回路５２は、閉ループの自励発振を持続するために位相θ1と位相θ2の差がゼロとなるように働く。【００３７】
図３において、θ1として示されている位相−周波数特性は、軸状プローブ部２２が測定対象物８である生体細胞に接触したときにおける特性で、位相シフト回路５２を除いたとしたとき、つまり位相シフト回路５２を用いないときの閉ループの特性である。そして、θ2として示されているのが、位相シフト回路５２の位相−周波数特性である。したがって、位相シフト回路５２を閉ループ内に設けたときの閉ループの発振周波数ｆ1は、図３においてθ1として示されている位相−周波数特性と、θ2として示されている位相−周波数特性との交点となる。この交点において、位相シフト回路５２の入力信号の位相θ1と出力信号の位相θ2との差である位相差がゼロに補償され、閉ループは周波数ｆ1において発振を持続することができる。【００３８】
次に、軸状プローブ部２２が測定対象物８である生体細胞に接触すると、空気と生体細胞との振動特性の相違により、振動子２６から入射された周波数ｆ1の信号は、周波数も位相も変化を受ける。位相シフト回路５２が閉ループ中にない場合には、一般的には周波数の変化は小さい。これに対し位相の変化はかなりあることが知られている。しかしながら、位相の変化を検出する位相検出器はあまり高精度のものがないのが実情である。位相シフト回路５２は、この位相の変化を周波数変化に変換する機能を有する。【００３９】
図３において、（θ1＋Δθ）として示されている位相−周波数特性は、軸状プローブ部２２が測定対象物８である生体細胞に接触したときにおける特性で、θ1として示されている特性と同様に、位相シフト回路５２を除いたとしたとき、つまり位相シフト回路５２を用いないときの閉ループの特性である。したがって、位相シフト回路５２を閉ループ内に設けたときの閉ループの発振周波数ｆ2は、図３において（θ1＋Δθ）として示されている位相−周波数特性と、θ2として示されている位相−周波数特性との交点となる。この交点において、位相シフト回路５２の入力信号の位相（θ1＋Δθ）と出力信号の位相θ2との差である位相差Δθがゼロに補償され、閉ループは周波数ｆ2において発振を持続することができる。【００４０】
したがって、軸状プローブ部２２が測定対象物８である生体細胞に接触していない状態と、接触した状態との間における位相差Δθは、θ2として示されている位相シフト回路５２の位相−周波数特性によって、周波数変化量Δｆ＝ｆ2−ｆ1に変換される。この変換定数＝（Δｆ／Δθ）は、図３から分かるように、位相シフト回路５２の特性の設定によって加減できる。このように、位相シフト回路５２は、振動子への入力波形と振動検出センサからの出力波形に位相差が生じるときは、周波数を変化させてその位相差をゼロに補償する機能を有する。なお、位相シフト回路５２のさらに詳細な内容は、上記特許文献２において開示されている。【００４１】
再び図２に戻り、周波数変化量算出部５４は、位相シフト回路５２から出力される周波数ｆ1とｆ2とから周波数変化量を算出する機能を有する。具体的には、閉ループにおいて測定対象物８が含まれないときに位相シフト回路５２の作用により自励発振が生じるときの閉ループの発振周波数ｆ1と、閉ループにおいて測定対象物８が含まれるときに位相シフト回路５２の作用により自励発振が生じるときの閉ループの発振周波数ｆ2とを受け取って、これらの間の周波数変化量であるΔｆ＝ｆ2−ｆ1を算出する機能を有する。すなわち、周波数変化量算出部５４の機能は、測定対象物８が閉ループに含まれないときの発振周波数ｆ1を閉ループから検出してこれを一旦記憶し、次に測定対象物が閉ループに含まれるときの発振周波数ｆ2を閉ループから検出してこれも一旦記憶し、記憶された２つの周波数ｆ1とｆ2とを読み出して、その差である周波数変化量を演算するという一連の処理を行うものである。【００４２】
算出された周波数変化量Δｆは、目的に応じ、接触検出部５６、硬さ算出部５８に出力される。【００４３】
接触検出部５６は、位相差をゼロに補償する周波数変化量Δｆが予め任意に設定された周波数変化閾値Δｆ0を超えたときに、探触子２０が測定対象物８である生体細胞に接触したとして接触信号を端子４６に出力する機能を有する。ここで、特性算出部４０の中で、硬さ算出部５８を除いた部分が、図１における制御部の接触検出モジュール６６の機能に対応する。【００４４】
周波数変化閾値Δｆ0は、周波数変化量算出部５４における周波数測定の分解能によって定めることができる。例えば、周波数測定の分解能が、測定誤差等を含めて、±１Ｈｚ程度であれば、Δｆ0を数Ｈｚ程度に設定することができる。【００４５】
接触検出の手順の１例を、図１、図２を用いて以下に説明する。ここでは、ＸＹＺ移動機構３０と測定対象物８との間の位置が適切に初期設定されているとする。その状態の後に、高さ移動機構３２によって、探触子２０を測定対象物８である生体細胞に接触しないように十分高い位置とする。この機能は、制御部６０の高さ方向移動モジュール６４の機能によって実行される。そして、ＸＹＺ移動機構３０によって、探触子２０を任意の測定位置に移動させる。この機能は、制御部６０の平面内移動モジュール６２の機能によって実行される。その測定位置において位相シフト回路５２から出力される周波数を周波数変化量算出部５４で測定し、ｆ1として一旦記憶する。つぎに、高さ移動機構３２によって、探触子２０を下降させながら、位相シフト回路５２からの周波数ｆ2を周波数変化量算出部５４で測定し、周波数変化量Δｆ＝ｆ2−ｆ1を求める。周波数変化量Δｆは、接触検出部５６に出力され、ここで、これを予め設定されている周波数変化閾値Δｆ0と比較される。ΔｆがΔｆ0以上となると、探触子２０の先端が測定対象物８である生体細胞に接触したと判断し、接触検出部５６は、接触信号を端子４６に出力する。これらの機能は、制御部６０の接触検出モジュール６６の機能によって実行される。【００４６】
探触子２０の先端が測定対象物８である生体細胞に接触したと判断されて接触信号が端子４６に出力されると、制御部６０は、そのときにおける高さ移動機構３２の高さ方向の位置である接触高さ位置を記憶する。この接触高さ位置は、高さ方向移動モジュール６４の移動指令の状態等から得ることができる。もちろん、別途に高さ方向移動量検出センサを用いて、接触信号に同期して、探触子２０の高さ方向の位置を検出し、これを接触高さ位置としてもよい。接触高さ位置は、相対的なものでもよく、測定対象物８が固定される試料台の表面の高さを基準としたものでもよい。このようにして、測定位置において、測定対象物である生体細胞に接触したときの接触高さ位置を求めることができる。【００４７】
図２に戻り、硬さ算出部５８は、探触子２０の先端を予め任意に定めた測定高さ位置において測定対象物８に接触させて、周波数変化量Δｆから測定対象物８の硬さを算出する機能を有する。上記の接触検出部５６によって出力させる接触信号は、測定分解能を適当に上回る程度の周波数変化閾値ｆ0に基づいているので、探触子２０が測定対象物８である生体細胞の表面に接触したことを知らせることができるが、生体細胞の内部の硬さを知らせることができない。そこで、測定対象物８である生体細胞の内部の硬さを求めるために、探触子２０は、接触高さ位置よりも深い測定高さ位置まで、測定対象物８の内部に向けて押し付けられる。【００４８】
測定高さ位置は、基準高さ位置からの所定の高さとすることができる。例えば、測定対象物８である生体細胞が固定される試料台の表面高さ位置を基準として、任意に設定された高さだけ高い位置を測定高さ位置とすることができる。ここで、測定対象物８である生体細胞は、図１に示されるように、試料台の上に透明シリコンシート６が貼り付けられ、その上のコラーゲンシートの上に付着している。透明シリコンシート６の厚さ、コラーゲンシートの厚さ、生体細胞の厚さ等は、対象とする測定対象物８のそれぞれに対応して異なり、またＸＹ平面内で一様ではない。したがって、好ましくは、測定高さ位置は、各測定位置ごとに、接触高さ位置から所定の深さ分だけ沈ませた高さ位置とすることが好ましい。例えば、接触高さ位置から、さらに1μｍだけ、生体細胞の内部に向かって探触子２０の先端を沈み込ませた高さ位置を測定高さ位置とすることができる。もちろん、1μｍの値は例示であるので、これを別の値、例えば、２μｍ、３μｍ等の値に設定してもよい。このように測定高さ位置の高さに探触子２０の先端を移動させる機能は、端子４６からの接触信号に基づき、高さ移動機構３２に指令を出すことで実行できる。すなわち、接触検出モジュール６６と高さ方向移動モジュール６４の協働によって実現される。【００４９】
探触子２０を測定高さ位置まで移動させて、その状態で位相シフト回路５２から出力される周波数Ｆ2を測定すると、このときの周波数Ｆ2は、接触検出の際の周波数ｆ2と一般的には異なった値となる。この周波数Ｆ2と、探触子２０が測定対象物８と接触していないときの周波数ｆ1との差である周波数変化量Δｆ＝Ｆ2−ｆ1は、測定対象物８の硬さ等の物性を反映している。そこで、周波数変化量Δｆと硬さとの対応関係を予め求めておくことで、周波数変化量Δｆから、その測定位置における測定対象物８である生体細胞の硬さを算出できる。【００５０】
図４は、予め求められた周波数変化量Δｆと硬さとの対応関係の１例を示す図である。図４の横軸は、硬さを表すヤング率で、縦軸は位相シフト法による周波数変化量である。ここで、縦軸の周波数変化量は、接触高さ位置から測定高さ位置の間の高さ変化量で規格化してある。図４は、ヤング率がわかっている数種類の試料を予め作成し、図1で説明した細胞物性測定装置１０を用い、各試料について、その試料に探触子２０が接触していないときの周波数ｆ1と、その試料に探触子２０が接触してからさらに1μｍ沈ませたときの周波数Ｆ2をそれぞれ測定し、そのときの周波数変化量Δｆを求めて、作成されたものである。異なるヤング率の試料としては、透明シリコン、適当な媒体に６０％から１００％のシリコンを混ぜたもの、適当な媒体に２％から１０％のゼラチンを混ぜたものを用いた。【００５１】
図４から分かるように、ヤング率と周波数変化量Δｆとの間には一定の相関関係がある。したがって、図４のような対応関係を予めメモリ等に記憶しておくことで、周波数変化量Δｆから、その測定位置における測定対象物８である生体細胞の硬さを算出できる。「Δｆ−硬さ」の対応関係は、Δｆを入力することで硬さが出力される型式で記憶される。具体的には、ルックアップテーブルのような換算テーブルの型式で記憶されてもよく、計算式の形式で記憶されていてもよい。【００５２】
硬さ算出の手順の１例を、図１、図２を用いて以下に説明する。ここでは、接触検出の手順で述べたように、すでに、測定対象物８である生体細胞の任意の測定位置に探触子２０が移動され、その測定位置で、接触が検出され、そのときの接触高さ位置が求められているものとする。その測定位置における生体細胞の硬さを求めるには、まず、接触高さ位置から所定の測定高さ位置に探触子２０を下降させる。上記の例では、接触高さ位置から１μｍさらに下降させる。この機能は、上記のように、制御部６０の接触検出モジュール６６と高さ方向移動モジュール６４の協働によって実行される。そして、その測定高さ位置において、位相シフト回路５２からの周波数Ｆ2を周波数変化量算出部５４で測定し、周波数変化量Δｆ＝Ｆ2−ｆ1を求める。周波数変化量Δｆは、硬さ算出部５８に出力され、ここで、これを予め求められている「周波数変化量Δｆ−硬さ」の対応関係がメモリ等から読み出され、これを用いて、測定高さ位置における周波数変化量Δｆに対応する硬さが算出される。算出された硬さデータは、端子４８に出力される。このように、硬さ算出には、図２における特性算出部４０の全部の要素が用いられ、その意味で、制御部６０の硬さ算出モジュール６８は、図２における特性算出部４０の全部の要素が対応するとともに、接触検出モジュール６６の機能を一部含む。【００５３】
なお、生体細胞のような測定対象物８は、一般的に粘弾性を有する。したがって、同じ測定高さ位置であっても、高い位置から低い位置に探触子２０を沈ませて低い位置を測定高さ位置とする場合と、一旦探触子２０を低い位置に沈めた後、低い位置から高い位置に探触子２０を戻して高い位置を測定高さ位置とする場合とで、測定対象物８の硬さ特性が異なることがある。そこで、測定高さ位置における硬さ測定について、この２種類を区別するものとしてもよい。この場合には、例えば、測定対象物８に接触しない高さから、接触を検知し、そこから１μｍ沈ませて、沈み状態での硬さを測定し、さらに適当な量沈ませてその後再び測定高さ位置を１μｍの位置に戻して、戻し状態での硬さを測定するものとできる。【００５４】
このように、平面内移動モジュール６２の機能によってＸＹＺ移動機構３０の動作を制御することで、測定対象物８である生体細胞に対し、ＸＹ平面内で探触子２０を走査させることができ、高さ方向移動モジュール６４の機能によって高さ移動機構３２の動作を制御することで、測定対象物８について、ＸＹ平面に対する高さ方向に探触子２０を移動させることができる。そして、さらに、接触検出モジュール６６の機能により、走査における各測定位置において探触子２０を下降させて、探触子２０が測定対象物８の表面に接触した接触高さを検出することができる。ここで、走査における各測定位置のデータと、各測定位置における接触高さのデータとを対応付けることで、測定対象物８である生体細胞の表面の２次元的凹凸、すなわち２次元的表面形状のデータを得ることができる。そして、表示のための適当な画像処理を行うことで、これを表示部８０に画像として出力することができる。この機能は、制御部６０の分布表示モジュール７０の機能によって実行される。【００５５】
そして、さらに、硬さ算出モジュール６８の機能により、走査における各測定位置において探触子２０を測定高さ位置に移動させて、測定高さ位置における測定対象物８の内部の硬さを検出することができる。ここで、走査における各測定位置のデータと、各測定位置における硬さのデータとを対応付けることで、測定対象物８である生体細胞の硬さの２次元的分布のデータを得ることができる。そして、表示のための適当な画像処理を行うことで、これを表示部８０に画像として出力することができる。この機能は、制御部６０の分布表示モジュール７０の機能によって実行される。【００５６】
以下に、上記の構成の細胞物性測定装置１０について、測定対象物８の生体細胞としてガン細胞を用いて、その表面形状と硬さ分布を求めた結果を説明する。以下では、図１、図２の符号を用いて説明する。【００５７】
測定対象物８としては、コラーゲンシートを貼り付けた透明シリコンシート６を、血清１％のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培養液に入れ、マウス由来黒色腫瘍Ｂ１６−Ｆ１株胆ガンを、３７℃、ＣＯ2５％の雰囲気の培養器にて２日間培養し、透明シリコン上に付着したガン細胞を用いた。このガン細胞は培養基の上にあり、生きている細胞である。図５に、測定対象物８であるガン細胞を実体顕微鏡で観察した様子を示す。また、図６は、同じガン細胞におけるアクチンの局在について免疫蛍光抗体法を用い、共焦点レーザ顕微鏡にて観察した様子を示す図である。ここでは、細胞の核の周りにアクチンが存在していることが分かる。図５からわかるように、測定対象物８であるガン細胞の大きさは、平面寸法が長手方向で約１００μｍ以下の小さなものである。【００５８】
このガン細胞が付着した透明シートを細胞物性測定装置１０の試料台に固定し、ＸＹＺ移動機構３０によって、高さ位置を適当に調整し、その後、ＸＹＺ移動機構３０を制御して、測定対象物８である生体細胞について、探触子２０をＸＹ平面内で走査した。【００５９】
ここでは、探触子２０の先端の直径ｄが約２０μｍの半球状であり、ガン細胞の大きさが長手方向でも約１００μｍ以下であることを考慮し、測定領域を約６０μｍ×約６０μｍに設定し、その領域内で走査し、Ｘ方向で２μｍ、Ｙ方向で２μｍのピッチで測定位置を定めた。つまり、場合によっては探触子２０の曲率半径より短い距離の測定ピッチで、測定対象物８に対し探触子２０を移動させて走査した。そして、各測定位置において、上記の位相シフト法を用いる方法によって、接触高さを求めた。また、各測定位置において、接触高さからさらに1μｍだけ生体細胞の内部に向かって探触子２０を押し付け、その接触高さ位置において、上記のように、位相シフト法を用いる方法によって、硬さを求めた。【００６０】
６０μｍ×６０μｍの測定領域において、２μｍ×２μｍのメッシュで測定位置を設定し、各測定位置における接触高さのデータを測定位置データと関連付け、２次元凹凸分布として表示した例を図７に示す。図７から、ガン細胞のテクスチャである表面の凹凸は、中央部が高く隆起し、周辺部が低く平面的になっていることが分かる。測定データによれば、中央部の高さは約＋４μｍ、周辺部の高さは−１μｍであった。【００６１】
図８は、同じ測定領域において、各測定位置における硬さのデータを測定位置データに関連付け、２次元的硬さ分布として表示した例である。図の中で、Ｓとあるのは相対的に硬さ値が低く、柔らかいことを示し、Ｈとあるのは相対的に硬さ値が高く、硬いことを示す。図８から分かるように、硬さ分布は、中央部の柔らかい部位、その外側の硬い部位、周辺部の柔らかい部位に分けることができる。測定データによれば、中央部の柔らかい部位のヤング率は、約１５０ｋＰａ、その外側の硬い部位のヤング率は、約３００ｋＰａ、周辺の柔らかい部位のヤング率は、約５０ｋＰａであった。【００６２】
図７と図８とを参照すると、このガン細胞は、中央の隆起している部分が柔らかく、その周辺に硬い部分があることが分かる。図５の実体顕微鏡の観察結果も参照すると、中央部の柔らかい部位がガン細胞に対応するものと考えられる。また、図６の組織画像を算用すると、ヤング率の高い部位と低い部位とは、細胞の核とアクチンにそれぞれ対応するものと考えられる。【００６３】
このように、図１の細胞物性測定装置１０によれば、位相シフト法を用いることで、測定対象物である微小な生体細胞について、表面凹凸、及び、細胞内部の硬さ分布を測定することができた。上記のように、実験に使用した生体細胞は、培養基の上の生きたガン細胞である。このように、生きた生体細胞について、表面凹凸、及び、細胞内部の硬さ分布を測定することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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