【手続補正書】
【提出日】平成16年10月8日(2004.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】            明細書
【発明の名称】        膵β細胞関連転写因子の遺伝子導入によるインスリン産生細胞の形成誘導
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵のインスリン産生細胞の形成誘導法、特に、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導することを特徴とするインスリン産生細胞の形成誘導法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病患者の膵臓では、膵島のインスリン産生細胞であるβ細胞数の絶対的減少が認められ、インスリン分泌不全をきたしている（J Am Optom Assoc 69(11), 727-32, 1998）。近年、糖尿病の移植医療の観点から、膵島移植が行われているが、移植用膵島のドナー不足や術後の拒絶反応に対する長期的な免疫抑制を要することなど、多くの問題が残されているのが現状である（Ann Med 33(3), 186-92, 2001）。
近年、生体内に存在し、必要に応じて増殖と分化を繰り返す未分化細胞、すなわち、組織幹細胞への関心が高まっている。組織幹細胞はＥＳ細胞に比べ、その分化段階がより分化した細胞に近いと考えられるため、比較的容易にインスリン産生細胞へ分化させることが可能と考えられる。
【０００３】
膵における組織幹細胞の存在については、それを示唆するいくつかの研究結果がこれまで報告されている。Ｒａｍｉｙａらは、１型糖尿病のモデル動物と考えられているＮＯＤマウス由来の膵管上皮細胞を単離培養した後、インスリン産生細胞へ分化誘導したことを報告している（Nat Med 6(3), 278-82, 2000）。また、Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒらはヒトの膵管上皮細胞を培養し、インスリン陽性細胞群を形成したことを報告している（Proc Natl Acad Sci U S A 97(14), 7999-8004, 2000）。これらはいずれも、膵幹細胞が膵管上皮近傍に存在することを示唆する報告である。更にｉｎ  ｖｉｖｏでは、Ｓｈａｒｍａらが、膵部分切除を施したラットの膵断端では再生像が認められ、同時に膵管のみならず膵島でも、膵β細胞特異的転写因子の遺伝子であるｐｄｘ−１の発現が高まっていることを報告している（Diabetes 48(3), 507-13, 1999）。Ｋｒｉｔｚｉｋらは、ＩＦＮγを膵島細胞特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、本来β細胞特異的転写因子であるべきｐｄｘ−１を発現する膵管上皮の増生と同時に、膵管内に膵島の新生が認められると報告している（Am J Physiol 269(6 PT 1), E1089-94, 1995、J Endocrinol 163(3), 523-30, 1999）。これらから、膵の組織幹細胞はｐｄｘ−１などの転写因子活性化のシグナルを受けて内分泌細胞へ分化することが示唆される。
【０００４】
一方、生体への遺伝子導入の手段として、簡便かつ効率の高いアデノウイルスベクターは多くの研究で用いられている（Nature 371(6500), 802-6, 1994、Science 265(5173), 781-4, 1994）。これまで、その投与方法としては主として静脈投与法が用いられてきたが、肝以外の臓器へは導入効率が極めて低いこと、また全身投与であるため僅かながらも他臓器での外来蛋白発現による悪影響も否定できないことなど、問題点も挙げられている。
これらの問題を解決する方法として、経総胆管投与法がある。Ｐｅｅｔｅｒｓらはラットの肝臓への遺伝子導入の方法として、経総胆管投与を用い、静脈投与に比し、高率かつ特異的で、免疫応答も低い導入が可能であることを報告している（Hum Gene Ther 7(14), 1693-9, 1996）。更に、ＲａｐｅｒとＤｅＭａｔｔｅｏは、その際、総胆管を結紮し、膵管へのみウイルスを注入することで、膵に高い特異性を持たせることに成功したと報告している（Pancreas 12(4), 401-10, 1996）。
【０００５】
しかし、これらは何れもラットにおける報告であり、マウスでは膵管や胆管の脆弱性から同様の手法は困難を極める。マウスは種々の遺伝子操作動物を作製しやすく、加えてこのような外来遺伝子の導入が可能となれば、各種研究を進める上で大変意義が深い。そこで、マウス肝管の結紮を行わないことで、注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流入が可能であれば、この方法は、ヒトにおいては非観血的で安全性の高い内視鏡的逆行性膵・胆管造影（ＥＲＣＰ）などの技術と類似点も多く、膵への効果的な遺伝子導入法として臨床応用も期待できる（Dig Dis Sci 45(2), 230-6, 2000）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、膵のインスリン産生細胞の形成誘導法、特に、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導するインスリン産生細胞の形成誘導法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記発明の課題を解決すべく、鋭意研究の結果、例えば、β細胞の分化に必要な転写因子の遺伝子を、膵の組織幹細胞へ導入し、強制的に発現させることで成熟した膵内分泌細胞へ分化誘導することができるように、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導し、インスリン産生細胞の形成を行うことができること、及び膵への遺伝子導入法として、経総胆管投与を用い、ラットの場合のような、肝管の結紮を行わずに、注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流入を行うことにより、膵への効果的な遺伝子の導入が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、総胆管を結紮することなく、経総胆管投与によって、膵の組織細胞へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導することにより、インスリン産生細胞の形成を行うことよりなる。
本発明においては、膵β細胞関連転写因子の遺伝子として、ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３等が、該膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵へ導入するためのベクターとして、アデノウイルスベクター等が用いられる。
本発明の方法により、インスリン産生細胞の形成を誘導し、インスリン産生細胞の形成を行うことにより、糖尿病の再生治療が可能となる。また、本発明の遺伝子の膵への導入方法は、ヒトにおいては非観血的で安全性の高い内視鏡的逆行性膵・胆管造影（ＥＲＣＰ）などの技術と類似点も多く、膵への効果的な遺伝子導入法として臨床応用も期待できるものである。
【０００９】
すなわち本発明は、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、経総胆管投与によって、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導することを特徴とするインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項１）や、膵β細胞関連転写因子の遺伝子が、膵β細胞の分化関連転写因子の遺伝子であり、インスリン産生細胞の形成の誘導が、膵に存在する組織幹細胞の分化誘導であることを特徴とするインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項２）や、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、総胆管を結紮することなく、経総胆管投与によって、膵へ導入することを特徴とする請求項１又は２記載のインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項３）や、膵β細胞関連転写因子の遺伝子が、ｐｄｘ−１又はｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項４）や、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、アデノウイルス発現ベクターに組込んで、膵へ導入することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項５）や、アデノウイルス発現ベクターが、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系を利用したアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項５記載のインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項６）や、アデノウイルス発現ベクターに、レポーター遺伝子ＥＧＦＰを組込んだことを特徴とする請求項５又は６記載のインスリン産生細胞の形成誘導法（請求項７）からなる。
【００１０】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載のインスリン産生細胞の形成誘導法を用いることを特徴とする糖尿病の再生治療方法（請求項８）からなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を、経総胆管投与によって、膵へ導入し、インスリン産生細胞の形成を誘導することにより、インスリン産生細胞の形成を行うことよりなる。本発明において、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵へ導入するに際しては、従来ラットにおいて報告されていたような、総胆管を結紮する方法ではなく、総胆管を結紮することなく、経総胆管投与によって、膵へ導入することにより、注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流入を行うことができ、膵への効果的な遺伝子の導入が可能となる。
【００１２】
本発明において用いられる膵β細胞関連転写因子の遺伝子としては、ｐｄｘ−１及びｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３（Development 127, 3533-3542, 2000）が有利に利用できる。本発明において、膵β細胞関連転写因子の遺伝子を膵へ導入するには、ベクターとしてアデノウイルス発現ベクターを用い、該膵β細胞関連転写因子の遺伝子を組込んで、膵へ導入することができる。アデノウイルス発現ベクターの構築には、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系を利用したアデノウイルスベクターの作製法（Hum Gene Ther 10(11), 1845-52, 1999）を用いることができる。アデノウイルス発現ベクターに組込む膵β細胞関連転写因子の遺伝子は、該遺伝子を発現する細胞株からＲＴ−ＰＣＲ法により全長をクローニングして取得することができる。例えばマウスｐｄｘ−１  ｃＤＮＡは、マウスインスリノーマ由来のβ細胞株であるＭＩＮ６細胞のｔｏｔａｌＲＮＡから、またマウスｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３  ｃＤＮＡはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳のｔｏｔａｌＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法により全長をクローニングして取得することができる。
【００１３】
本発明において、膵β細胞関連転写因子の遺伝子の導入を確認するためには、アデノウイルスベクターに、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）遺伝子を組込むことによって、その緑色蛍光により遺伝子が導入された細胞を判別することができる。
経総胆管投与の方法は、適宜公知の方法を用いて行うことができる（Hum Gene Ther 7(14), 1693-9, 1996）。
本発明の方法により、インスリン産生細胞の形成誘導を起こさせ、インスリン産生細胞の再生を図ることにより、糖尿病に対する再生治療を行うことができる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
Ａ．実験方法
Ａ−１．供試動物
全実施例を通して、９週齢で雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ、体重２５〜２８ｇのマウスを用いた。マウス室は、気温を一定に保ち、１２時間毎の明暗サイクルで、飲水や食餌は特に制限を加えない状態で維持した。
【００１５】
Ａ−２．アデノウイルスベクターの作製
アデノウイルスベクターに組み込むマウスｐｄｘ−１  ｃＤＮＡ（配列番号１）は、マウスインスリノーマ由来のβ細胞株であるＭＩＮ６細胞の全ＲＮＡから、またマウスｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３  ｃＤＮＡ（配列番号３）はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳の全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法にて全長をクローニングした後、全塩基配列を確認し使用した。本発明者の教室において開発したＣｒｅ−ｌｏｘＰ組み換え系を利用したアデノウイルスベクター作製法（Hum Gene Ther 10(11), 1845-52, 1999）を用いて、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１、ＡｄＶ−ｎｇｎ３、さらに特別なｃＤＮＡを組み込まないコントロールの、計３種類のアデノウイルスベクターを作製した（図１）。発現カセットには多くの細胞種で強い発現活性をもつＣＡＧ（Cytomegalovirus immediate-early enhancer-chicken β-actin hybrid）プロモーター下に（Gene 108(2), 193-9, 1991）、ｐｄｘ−１  ｃＤＮＡ、またはｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３  ｃＤＮＡを、更にその下流にＩＲＥＳ、ＥＧＦＰを組み込むことで遺伝子導入された細胞が緑色蛍光により判別可能となっている（FEBS Lett 470(3), 263-8, 2000）。尚、生体に投与するアデノウイルスベクターはセシウムクロライド勾配精製法を用いて精製した（J Virol Methods 4(6), 343-52, 1982）。
【００１６】
Ａ−３．ウェスタンブロットによるｐｄｘ−１の発現確認
ＡｄＶ−ｐｄｘ−１を感染させた２９３細胞を蛋白抽出液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ−４０，０．１％  ＳＤＳ、０．１％  sodium deoxycholate）に懸濁し、細胞破砕した。ブラッドフォードアッセイ用キット（BioRad,Hercules,CA,USA）を用い、蛋白定量を行った後、ＳＤＳサンプルバッファー（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），６％  ＳＤＳ，１５％  グリセロール，１５％  ２−メルカプトエタノール、０．０１５％  ブロモフェノールブルー）と混合し、９８℃で５分加熱した。その後、サンプルを１０％ポリアクリルアミドゲルへ電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Millipore,Bedford,MA）へエレクトロブロッティングした。蛋白の吸着した膜をウサギ抗マウスｐｄｘ−１抗血清（大阪大学第１内科・梶本先生より寄贈）とともに３時間室温で振盪し、洗浄後、更にペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体とともに１時間室温で振盪した。その後、化学発光技術によるウェスタンブロット検出キット（ECL kit;Amersham Corp.,Arlington Heights, IL, USA）およびＸ線フィルム（FUJI MEDICAL X-RAY FILM;FUJI PHOTO FILM, Kanagawa, Japan）を用いて蛋白の検出を行った。
【００１７】
Ａ−４．アデノウイルスの注入
マウスをペントバルビタールによる全身麻酔下で開腹後、総胆管の十二指腸合流部位から逆行性に２９Ｇ針を刺入し、２５０μｌの乳酸リンゲル液にて調整したアデノウイルスベクター１×１０９plaque forming unitsを、３０秒間かけてゆっくりと注入した。その際、過度の圧が膵管にかかると外傷性の膵外分泌腺炎を惹き起こす可能性があるため、膵の腫大が生じないように留意した。逆流のないことを確認した後、腹部を縫合した。静脈投与に際しては、尾静脈より同様に調製したアデノウイルス液を注入した（Nat Med 6(5), 568-72, 2000）。その後、７〜１２日で各種検討を行った。
【００１８】
Ａ−５．ＥＧＦＰ及びβガラクトシダーゼの発現確認
ＥＧＦＰの発現を確認するため、単離した肝及び膵を固定せずにスライドグラスにのせ、蛍光顕微鏡にて４６０〜４９０ｎｍバンドパスフィルター及び、５１０ｎｍロングパスフィルターを用いて観察した。βガラクトシダーゼの発現を確認するため、単離した肝及び膵をＯＴＣコンパウンド（Tissue-TEC, Miles, Elkhart, In, USA）に埋包し、液体窒素にて凍結した。その後、凍結切片作製装置にて１０μｍの切片を作製し、１％グルタルアルデヒドで固定し、5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase（Ｘ−Ｇａｌ）にて４時間の染色を行った。
【００１９】
Ａ−６．組織化学的解析
単離した膵を２０％ホルマリン液にて固定し、パラフィンに埋包した。３〜５μｍ厚の切片を作製し、脱パラフィン処理をした。乾燥させた後、ヘマトキシリン・エオジンにて染色した。また、インスリン免疫染色は以下のように行った。脱パラフィン処理後、非特異的染色を避けるため、１０％正常ブタ血清（コスモバイオ社製，東京，日本）とともに１０分間、室温放置した。その後、ブタ抗ヒト・インスリン抗体（オリエンタル酵母社製，東京，日本）とともに１６時間、低温で放置した。次に、ビオチン付加されたウサギ抗ブタＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ，京都，日本）とともに３０分間、室温で放置し、最後にＤＡＢ（２０ｍｇ（3,3'-diaminobenzidine, tetrahydrochloride）、２０μｌ（30% hydrogen peroxidase in 100ml PBS））とともに５分間、室温で放置した。水で洗浄した後、光学顕微鏡にて観察した。
【００２０】
Ａ−７．組織学的変化の評価
インスリン陽性細胞の新生など組織学的変化を定量的に検討するため、各々のアデノウイルスベクターについて、４匹以上のマウスの膵から、各４以上の非連続切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色及びインスリン免疫染色を行った。インスリン陽性細胞群を、インスリン陽性細胞数が５以上の正常膵島、４以下の正常膵島、細胞数が４以上の新生膵島様の集塊、３以下の新生インスリン陽性細胞の４つのグループに分けて観察し、各アデノウイルス投与群間で比較検討した。
【００２１】
Ａ−８．ＲＴ−ＰＣＲ
２９３細胞内でのアデノウイルスベクターの発現を確かめるため、感染後３日目の２９３細胞から、Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform法を用いて全ＲＮＡを抽出した。これを鋳型に一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅα；東洋紡社製．，東京，日本）を用いて、逆転写反応を行った。生成物をＡｄＶ−ｐｄｘ−１検出用プライマー（forward primer：ACCATGAACAGTGAGGAGCAG：配列番号５）、（backward primer：TCCTCTTGTTTTCCTCGGGTTC：配列番号６），ＡｄＶ−ｎｇｎ３（forward primer：TGGCACTCAGCAAACAGCGA：配列番号７）、（backward primer：ACCCAGAGCCAGACAGGTCT：配列番号８）検出用プライマーを用いてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ；和光社製，大阪，日本）によるＰＣＲ反応で増幅した。また、各々のテンプレートに加えられる全ｃＤＮＡ量の差を補正するため、ＨＰＲＴ検出用プライマー（forward primer：CTCGAAGTGTTGGATACAGG：配列番号９）、（backward primer：TGGCCTATAGGCTCATAGTG：配列番号：１０）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【００２２】
また、アデノウイルスベクター投与１週間後のマウスより単離した膵から、同様に全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行った。膵における内因性のｐｄｘ−１（forward primer：TGGATAAGGGAACTTAACCT：配列番号１１）、（backward primer：TTGGAACGCTCAAGTTTGTA：配列番号：１２）、ＣＫ１９（forward primer：AAGACCATCGAGGACTTGCG：配列番号１３）、（backward primer：CTATGTCGGCACGCACGTCG：配列番号：１４）、ｎｅｓｔｉｎ（forward primer：GGAGAGTCGCTTAGAGGTGC：配列番号１５）、（backward primer：GTCAGGAAAGCCAAGAGAAG：配列番号：１６）の発現を定量化するため、各々のプライマーを用いてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ，和光社製，大阪，日本）によるＰＣＲ反応を行った。更に２％アガロースゲルによる電気泳動を行った後、エチヂウムブロマイドにて染色したゲルをＦｌｕｏｒ−Ｃｈｅｍ（Alpha Innotech,san Leandro,CA）にて撮影し、ＰＣＲ産物の定量をAlphaEase FC software（Alpha Innotech）を用いて行った。この方法を用いて、ｍＲＮＡの発現レベルを、それぞれＨＰＲＴの発現量に対する比として定量化し、比較検討した。
【００２３】
Ａ−９．統計学的検討
統計学的手法を用いての検定では、全てにおいて、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定を用い、いずれも、ｐ＜０．０５で有意とした。
【００２４】
Ｂ．実験結果
Ｂ−１．ＨＥＫ２９３細胞での発現確認
本発明者は作製したアデノウイルスベクターが、目的の遺伝子を発現することができるかを、ヒト胎児腎細胞株である２９３細胞を用いて検討した。２９３細胞へＡｄＶ−ｐｄｘ−１、ＡｄＶ−ｎｇｎ３、コントロールのアデノウイルスベクターを１０ｍｏｉで感染後、３日目にＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認した。その後、細胞を回収し、ＲＴ−ＰＣＲを施行した。その結果、導入遺伝子のｍＲＮＡの発現が確認された（図２Ａ）。更に、２９３細胞から抽出した蛋白を用いて、ｐｄｘ−１のウェスタンブロットを施行した。ＡｄＶ−ｐｄｘ−１を感染させた２９３細胞ではマウスのβ細胞株であるＭＩＮ６細胞から抽出した蛋白をコントロールとして、ｐｄｘ−１の４６ｋＤのバンドが確認できた（図２Ｂ）。同様のバンドは、コントロールでは認められなかった。以上の結果から、今回作製したアデノウイルスベクターにより目的の遺伝子と蛋白を細胞内で発現することが確認された。
【００２５】
Ｂ−２．肝・膵におけるＥＧＦＰの発現確認
本実施例で作製したアデノウイルスベクターではＣＡＧプロモーター下に目的遺伝子を、更にその下流にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを組み込むことで遺伝子導入された細胞がＥＧＦＰの緑色蛍光により判別可能となっている。アデノウイルスベクター投与後、１０日目の肝及び膵の外観を蛍光顕微鏡下で観察した（図３；参考写真１参照）。励起されたＥＧＦＰの発現は、肝では経静脈投与に比し明らかに経総胆管投与において強いことがわかる（図３Ａ、Ｂ；参考写真１参照）。また膵において、ＥＧＦＰの発現は経静脈投与ではまったく認められなかったが、経総胆管投与では広範囲に認められた（図３Ｃ、Ｄ；参考写真１参照）。また、どちらの場合も脾臓や胃にはＥＧＦＰの発現は認めなかった。乳酸リンゲルのみを投与したコントロールマウスでは、ＥＧＦＰの発現は認められなかった。
【００２６】
Ｂ−３．肝・膵におけるβガラクトシダーゼ遺伝子の発現確認
アデノウイルスベクターの組織レベルでの導入効率を更に検討するため、本発明者は、ＣＡＧプロモーター下に（Gene, 108(2), 193-9, 1991）、βガラクトシダーゼ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターであるＡｄＶ−ＬａｃＺを経静脈投与及び経総胆管投与法にて投与し、肝及び膵の凍結切片を作製してＸ−ｇａｌ染色を行った（図３Ｅ、Ｆ；参考写真１参照）。膵においては、経静脈投与ではまったく発現を確認できなかったが、経総胆管投与では膵管を中心に広範な発現を確認した（図３Ｆ；参考写真１参照）。また、組織学的に明らかな炎症像や、破壊像を認めなかった。以上の結果から、膵への本発明者のアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入において、経総胆管投与は経静脈投与に比し非常に有効性が高くかつ安全であることが示された。以下の膵への遺伝子導入の実験に際しては、経総胆管投与法にて投与した。
【００２７】
Ｂ−４．アデノウイルスベクター投与後の膵の組織化学的解析
次に、膵でβ細胞分化に関連する転写因子を高発現させ、その影響を組織学的に検討した。投与後７〜１２日で膵を単離し、パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及び抗ヒト・インスリン抗体を用いたインスリン免疫染色を行った。ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群では、１２日目の膵組織像のヘマトキシリン・エオジン染色において、膵実質内に多数の膵管増殖領域が認められた（図４Ａ；参考写真２参照）。その領域ではインスリン陽性細胞が単独であるいは膵島様の集塊として散在しており、インスリン産生細胞の新生と考えられた（図４Ｂ；参考写真２参照）。こうした新生像は、コントロールのアデノウイルスベクター投与群においては認められなかった。ＡｄＶ−ｎｇｎ３投与群では、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１と同様の変化が僅かに認められた。こうした変化を定量的に検討するため、各々のアデノウイルスベクターを投与した複数のマウスの膵を採取し、複数の非連続切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色及びインスリン免疫染色を行い、各グループ間で統計学的検討を行った。その結果、正常な膵島の総数は、各グループ間で変わりはなかったが、新生したと考えられるインスリン陽性細胞やその集塊の数はＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群で有意に高かった（図５）（ｐ＜０．０５）。以上の結果から、膵管より投与されたアデノウイルスベクターにより遺伝子導入を受けた膵細胞は膵管の増殖をきたし、一部はインスリン産生細胞へ分化したと考えられた。
【００２８】
Ｂ−５．アデノウイルスベクター投与後の膵におけるＲＴ−ＰＣＲによる各種マーカーの検討
こうして示された組織学的変化の原因を、検討する目的で、投与７日目における膵組織の全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、デンシトメトリーによりその発現の強弱を定量的に比較検討した。その結果、投与７日目では、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群において内因性ｐｄｘ−１の活性化が認められた（ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。これまでｐｄｘ−１遺伝子はｐｄｘ−１蛋白自身による自己調節能が報告されている（Proc Natl Acad Sci U S A, 98(3), 1065-70, 2001、Mol Cell Biol 20(20), 7583-90, 2000）ことから、アデノウイルスベクター由来のｐｄｘ−１による内因性ｐｄｘ−１遺伝子の活性化が示唆された。また、ＡｄＶ−ｐｄｘ１投与群においては、膵管のマーカーであるＣＫ１９の発現がコントロールの２．６倍を示し、膵管の増殖を裏付ける結果となった（図６Ｂ）。ＡｄＶ−ｎｇｎ３については、組織像での僅かな変化を反映するデータは得られなかった。また、膵内分泌前駆細胞のマーカーとして近年報告されているｎｅｓｔｉｎ（Diabetes 50(3), 521-33, 2001）の発現は、ｐｄｘ−１投与群で高い傾向が認められたが、有意な差は認められなかった（図６Ｃ）。しかし、これは膵全体でのｍＲＮＡの発現をみているため、膵管増生領域における局所でのｎｅｓｔｉｎの発現など、今後更なる検討が必要と考えられる。以上の結果より、アデノウイルスベクターにより転写因子遺伝子の導入された膵において、内因性ｐｄｘ−１の発現が惹起され、直接あるいは間接的に膵管の増殖をきたし、また、内分泌前駆細胞に於は、内分泌細胞への分化が誘導されたと考えられる。
【００２９】
Ｃ．考察
本発明においては、膵への効果的な転写因子遺伝子の導入による膵内分泌細胞の再生に重点をおいて実験を進めた。
これまで、生体への簡便且つ高率な遺伝子導入手段として、アデノウイルスベクターは、多くの研究で用いられてきた。しかし、静脈投与では肝以外の臓器へは導入効率が極めて低く、一方で全身への投与であるため、他臓器での悪影響の可能性も否定できない。また、膵への特異的遺伝子導入法としてＭｃＣｌａｎｅらは、マウスの膵実質へ直接に針を刺入する方法を提唱しているが、局所的であると同時に、ある程度の侵襲は避けられない（Hum Gene Ther 8(18), 2207-16, 1997、Pancreas 15(3), 236-45, 1997、Hum Gene Ther 8(6), 739-46, 1997）。こうした理由から、今回本発明者は、膵への特異的遺伝子導入法として、マウスの総胆管から逆行性にアデノウイルスベクターを注入する方法、すなわち、経総胆管投与法を用いた。Ｐｅｅｔｅｒｓらはラットの肝臓への遺伝子導入の方法として、経総胆管投与を用い、静脈投与に比し、高率かつ特異的で、免疫応答も低い導入が可能であることを報告している（Hum Gene Ther 7(14), 1693-9, 1996）。
【００３０】
一方、ＲａｐｅｒとＤｅＭａｔｔｅｏは、その際、総胆管を結紮し、膵管へのみウイルスを注入することで、膵に高い特異性を持たせることに成功したと報告している（Pancreas 12(4), 401-10, 1996）。しかし、これらは何れもラットにおける報告であり、マウスでは膵管や肝管の脆弱性から同様の手法は困難を極める。マウスは種々の遺伝子改変動物を作製しやすく、加えてこのような外来遺伝子の導入が可能となれば、各種研究を進める上で大変意義が深い。そこで、本発明者は、肝管の結紮は行わず、あえて肝へのウイルスの流入によるウイルス量の損失は甘受した。そのため、流入時に過度に膵管に圧がかかることなく適度な注入が可能となったと考えている。膵へのウイルスの感染及び発現の確認は、今回、目的の転写因子に加えて、ＥＧＦＰを同時に発現するように設計された発現カセットを用いているため、蛍光顕微鏡下で確認が可能となった。結果的に、経総胆管投与法を用いて、肝・膵への選択的で、かつ高率な導入ができた。
【００３１】
次に、β細胞の分化関連転写因子について考察する。
ｐｄｘ−１はインスリン、グルコキナーゼ、ＧＬＵＴ２などの転写調節を通して血糖値の恒常性維持に働く膵β細胞特異的転写因子であるが、膵の発生にも大きく関与している。ｐｄｘ−１は胎生期に膵芽発生部位周辺の前腸に発現し、その後発生後期では膵島及び小腸に限局し、生後は膵β細胞に特異的に発現する。変異ｐｄｘ−１のヘテロ接合体をもつヒトやマウスでは膵β細胞の減少に伴う糖尿病を惹き起こす。ホモのマウスでは膵の無形成が認められる（Mol Cell Biol 20(20), 7583-90, 2000、Development 122(5), 1409-16, 1996、EMBO J 13(5), 1145-56, 1994）。
【００３２】
同様にβ細胞の分化関連転写因子であるｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は膵の発生過程で膵前駆細胞が膵島の内外分泌細胞へ分化する際、Ｎｏｔｃｈシグナルを介した系で内分泌細胞への分化の方向を決定する重要な因子である。ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３はＥ１５．５で膵内分泌前駆細胞に発現のピークを呈し、生後消失する。ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子のホモ欠損マウスでは発生過程において膵島細胞は形成されず、糖尿病にて生後１〜３日で死亡する。またこのマウスでは、膵でのｐａｘ４、ｐａｘ６、ｎｅｕｄｏＤ／ＢＥＴＡ２の発現を認めないことがわかっている（Genes Dev 15(4), 444-54, 2001、Mol Cell Biol 20(9), 3292-307, 2000、Diabetes 49(2), 163-76, 2000、Diabetes 50(5), 928-36, 2001、Nature 400(6747), 877-81, 1999、Proc Natl Acad Sci USA 97(4), 1607-11, 2000、Mol Cell Neurosci 8(4), 221-41, 1996）。以上のことから、ｐｄｘ−１及びｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は、その下流に多くの転写因子が存在しており、膵幹細胞の内分泌細胞へ向けた最終分化はｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、またそれらにより制御されるの多くの転写因子により制御されていると思われる。
【００３３】
近年、そうした転写因子を外来性に導入して非β細胞を類β細胞化しようという試みが多く行われている。Ｗａｔａｄａらはα細胞由来の細胞株であるαＴＣ１細胞にｐｄｘ−１遺伝子を導入すると、βセルリン存在下でインスリン、グルコキナーゼなどのβ細胞特異的蛋白の発現が誘導されることを報告している（Diabetes 45(12), 1826-31, 1996）。また、最近、Ｆｅｒｂｅｒらは、ｐｄｘ−１遺伝子を発現するアデノウイルスを静脈投与することで肝へ高発現させると、一部の細胞はインスリン産生細胞となり、さらにこの方法でＳＴＺ誘発糖尿病のマウスの血糖値を改善することに成功したと報告している（Nat Med 6(5), 568-72, 2000）。多くの細胞では単一遺伝子の導入で分化や分化転換が誘導されるわけではなく、α細胞株や肝細胞など、β細胞に発生学的に近い細胞であるため、このような結果が導かれると考えられる。膵に存在する組織幹細胞もやはり、膵内外分泌細胞にある程度方向付けられた細胞群のひとつと考えられる。そこで本発明者は、β細胞の分化に必要な転写因子ｐｄｘ−１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３を膵の組織幹細胞へ遺伝子導入することで分化誘導ができれば、膵内分泌細胞の再生医療に向けた新たな可能性が広がると考えた。
【００３４】
これまで、膵幹細胞の局在については、多くの報告から、膵管上皮近傍、膵島内などの可能性が示唆されているが、いまだ不明な点が多い（Nat Med 6(3), 278-82, 2000、J Virol Methods 4(6), 343-52, 1982）。そのため、本実施例においては、膵管上皮及びその近傍の膵実質組織を標的として遺伝子導入を試みた。その結果、膵管上皮そのものの増殖像と、その領域中に、インスリン陽性細胞の新生を確認した。こうした変化が生じた原因について検討するため施行したＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群で膵での内因性のｐｄｘ−１の発現が高まっていることが判明した。ｐｄｘ−１遺伝子のプロモーター領域には、ｐｄｘ−１蛋白自身の結合領域があり、自己調節を行っており、そのことがβ細胞の特異性に関わっていると考えられている（Proc Natl Acad Sci USA 98(3), 1065-70, 2001、Mol Cell Biol 20(20), 7583-90, 2000）。そこから類推されるに、今回認められた内因性のｐｄｘ−１の活性化はアデノウイルスベクターによる外来性のｐｄｘ−１により惹き起こされたためと考えられる。
また、膵管のマーカーであるＣＫ１９は、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１投与群で有意に高い発現を認めたが、これは組織像で確認された膵管上皮の活発な増生を反映していると考えられた。
【００３５】
以上から、本発明者は組織学的変化の生じた機序を次のように推測する。すなわち、膵管上皮細胞内では、生体内の他の細胞同様、種々の蛋白が発現し、活性化と抑制の均衡の上に恒常性を維持していると考えられる。ｐｄｘ−１は膵管上皮細胞では発生時期にのみ発現しているが、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１により外来性に高発現したｐｄｘ−１により、内因性ｐｄｘ−１を含めた種々の遺伝子の活性化が生じ一時的に発生時期の未成熟な性格を取り戻し膵管の増殖に至ったのではないだろうか。Ｓｈａｒｍａらの膵部分切除モデルにおいても、膵管上皮にみられる脱分化や再分化の像は内因性ｐｄｘ−１活性化を伴う転写因子の不均衡による影響ではないかと考察されている（Diabetes 48(3), 507-13, 1999）が、推測の域を出ない。また、インスリン陽性細胞の由来としては、ＡｄＶ−ｐｄｘ−１により遺伝子導入を受けた膵管近傍の組織幹細胞がｐｄｘ−１の発現、及びそれにより活性化された転写因子の影響により、インスリン産生細胞への最終分化を果したという可能性が考えられる。
【００３６】
ＡｄＶ−ｎｇｎ３の投与では、内因性ｐｄｘ−１の活性化及び組織変化は僅かであったが、発生過程で、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３は一度強く発現するもののやがて消失し、その後成熟した膵島細胞が出現する。そこで、アデノウイルスベクターによるｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３の一過性高発現消失後に、インスリン陽性細胞が出現する可能性をＡｄＶ−ｎｇｎ３投与１ヵ月後の膵を用いて検討したが、明らかな変化は認められなかった。この結果から、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３単独の遺伝子導入では、ｐｄｘ−１と同等の効果は得られないと考えられた。今回、本発明者は、アデノウイルスベクターを経総胆管投与法を用いることで、高率にかつ安全にマウス膵への遺伝子導入に成功した。ｐｄｘ−１遺伝子の導入では、膵実質内に膵管の増殖像が認められ、その領域において、新生インスリン陽性細胞の出現を認めた。ＲＴ−ＰＣＲによる解析から、そうした変化は、内因性のｐｄｘ−１やＣＫ１９の活性化との関連が示唆された。このような、生体における膵組織幹細胞の転写因子による分化誘導の試みはこれまで初めてであり、遺伝子導入による糖尿病の治療に道を開くものである。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によって、膵β細胞関連転写因子ｐｄｘ−１遺伝子をアデノウイルスベクターへ組み込み、これをマウスの総胆管へ投与すると膵臓の組織細胞へ効率よく遺伝子が導入され、インスリン産生細胞の形成誘導がなされるので、インスリン産生細胞が再生され、糖尿病に対する再生医療が可能となる。特に、本発明の方法は、１型糖尿病の根本的治療への道を開くものである。
本発明の方法は、総胆管遺伝子導入法を用いて、肝管の結紮を行わないで、注入時に過度に膵管に圧をかけることなく適度な流入が可能であり、ヒトにおいては非観血的で安全性の高い内視鏡的逆行性膵・胆管造影（ＥＲＣＰ）などの技術と類似点も多いので、膵への効果的な遺伝子導入法として臨床応用も期待できる。また、本発明の方法は、膵管や胆管の脆弱なマウスにも適用することができ、本発明の方法をマウスに適用すると、マウスは種々の遺伝子操作動物を作製しやすいという利点を有するので、実験動物として各種研究を進める上で大変意義深い。
更に、本発明の方法では、アデノウイルスベクターを経総胆管投与法を用いることで、高率にかつ安全に膵への遺伝子導入を可能とし、該遺伝子の導入によりインスリン産生細胞の形成誘導に成功している。このような生体における膵組織幹細胞の転写因子による分化誘導の試みはこれまで初めてであり、本発明の方法は、遺伝子導入による糖尿病のような病気の治療に大きな展望を開くものである。
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の実施例で使用したアデノウイルスベクターの構造を示す図である。
【図２】
本発明の実施例において、作製したアデノウイルスベクターが、目的の遺伝子を発現することができるかを、ヒト胎児腎細胞株である２９３細胞を用いて検討した結果をＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロットにて確認した図である。
【図３】
本発明の実施例において、ＣＡＧプロモーター下に目的遺伝子を，更にその下流にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを組み込んで作製したアデノウイルスベクターを投与後、１０日目の肝及び膵の外観を実体顕微鏡で観察した写真を示す図である（Ａ−Ｄ）。Ｂ，ＤはＡ，Ｂの同部位を蛍光下で観察している図である。更に、ＣＡＧプロモーター下に２ａｃＺ遺伝子を組み込んで作製したアデノウイルスベクターを投与後１０日目の肝及び膵の凍結切片をＸ−ｇａｌ染色及びエオジン染色後、光学顕微鏡で観察した写真を示す図である（Ｅ，Ｆ）。
【図４】
本発明の実施例において、膵でβ細胞分化に関連する転写因子を高発現させ、その影響を組織学的に検討するために、投与後７〜１２日で膵を単離し、パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及び抗ヒト・インスリン抗体を用いたインスリン免疫染色を行って観察した結果を示す図である。
【図５】
本発明の実施例において、膵でβ細胞分化に関連する転写因子を高発現させ、膵島及びインスリン産生細胞の数を定量的に検討するために、各々のアデノウイルスベクターを投与した複数のマウスの膵を採取し、複数の非連続切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色及びインスリン免疫染色を行い、各グループ間で統計学的検討を行った結果を示す図である。
【図６】
本発明の実施例において、アデノウイルスベクターにより遺伝子導入を受けた膵の遺伝子発現の変化を検討するために、投与７日目における膵組織の全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、デンシトメトリーによりその発現の強弱を定量的に比較検討した結果を示す図である。
【００３９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING                               
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
<120> Induction of differentiation of insulin-producing cells
by introducing genes of deffrentiation-related
transcription factors
<130> P005P01
<140>
<141>
<160> 16                            
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1463
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220> 
<221> CDS
<222> (280)..(1134)
<400> 1
aaaattgaaa caagtgcagg tgttcgcggg cacctaagcc tccttcttaa ggcagtcctc 60    
caggccaatg atggctccag ggtaaaccac gtggggtgcc ccagagccta tggcacggcg 120   
gccggcttgt ccccagccag cctctggttc cccaggagag cagtggagaa ctgtcaaagc 180   
gatctggggt ggcgtagaga gtccgcgagc cacccagcgc ctaaggcctg gcttgtagct 240   
ccgacccggg gctgctggcc ccaagtgccg gctgccacc atg aac agt gag gag    294   
Met Asn Ser Glu Glu
1               5
cag tac tac gcg gcc aca cag ctc tac aag gac ccg tgc gca ttc cag   342   
Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp Pro Cys Ala Phe Gln
10                  15                  20    
agg ggc ccg gtg cca gag ttc agc gct aac ccc cct gcg tgc ctg tac   390   
Arg Gly Pro Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro Pro Ala Cys Leu Tyr
25                  30                  35        
atg ggc cgc cag ccc cca cct ccg ccg cca ccc cag ttt aca agc tcg   438   
Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Phe Thr Ser Ser
40                  45                  50            
ctg gga tca ctg gag cag gga agt cct ccg gac atc tcc cca tac gaa   486   
Leu Gly Ser Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp Ile Ser Pro Tyr Glu
55                  60                  65                
gtg ccc ccg ctc gcc tcc gac gac ccg gct ggc gct cac ctc cac cac   534   
Val Pro Pro Leu Ala Ser Asp Asp Pro Ala Gly Ala His Leu His His
70                  75                  80                  85
cac ctt cca gct cag ctc ggg ctc gcc cat cca cct ccc gga cct ttc   582   
His Leu Pro Ala Gln Leu Gly Leu Ala His Pro Pro Pro Gly Pro Phe
90                  95                 100    
ccg aat gga acc gag cct ggg ggc ctg gaa gag ccc aac cgc gtc cag   630   
Pro Asn Gly Thr Glu Pro Gly Gly Leu Glu Glu Pro Asn Arg Val Gln
105                 110                 115        
ctc cct ttc ccg tgg atg aaa tcc acc aaa gct cac gcg tgg aaa ggc   678   
Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Trp Lys Gly
120                 125                 130            
cag tgg gca gga ggt gct tac aca gcg gaa ccc gag gaa aac aag agg   726   
Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Thr Ala Glu Pro Glu Glu Asn Lys Arg
135                 140                 145                
acc cgt act gcc tac acc cgg gcg cag ctg ctg gag ctg gag aag gaa   774   
Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu Leu Glu Lys Glu
150                 155                 160                 165
ttc tta ttt aac aaa tac atc tcc cgg ccc cgc cgg gtg gag ctg gca   822   
Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg Val Glu Leu Ala
170                 175                 180    
gtg atg ttg aac ttg acc gag aga cac atc aaa atc tgg ttc caa aac   870   
Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn
185                 190                 195        
cgt cgc atg aag tgg aaa aaa gag gaa gat aag aaa cgt agt agc ggg   918   
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys Arg Ser Ser Gly
200                 205                 210            
acc ccg agt ggg ggc ggt ggg ggc gaa gag ccg gag caa gat tgt gcg   966   
Thr Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro Glu Gln Asp Cys Ala
215                 220                 225                
gtg acc tcg ggc gag gag ctg ctg gca gtg cca ccg ctg cca cct ccc   1014  
Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Val Pro Pro Leu Pro Pro Pro
230                 235                 240                 245
gga ggt gcc gtg ccc cca ggc gtc cca gct gca gtc cgg gag ggc cta   1062  
Gly Gly Ala Val Pro Pro Gly Val Pro Ala Ala Val Arg Glu Gly Leu
250                 255                 260    
ctg cct tcg ggc ctt agc gtg tcg cca cag ccc tcc agc atc gcg cca   1110  
Leu Pro Ser Gly Leu Ser Val Ser Pro Gln Pro Ser Ser Ile Ala Pro
265                 270                 275        
ctg cga ccg cag gaa ccc cgg tga ggacagcagt ctgagggtga gcgggtctgg  1164  
Leu Arg Pro Gln Glu Pro Arg                                     
280                 285                                 
gacccagagt gtggacgtgg gagcgggcag ctggataagg gaacttaacc taggcgtcgc 1224  
acaagaagaa aattcttgag ggcacgagag ccagttggat agccggagag atgctgcgag 1284  
cttctggaaa aacagccctg agcttctgaa aactttgagg ctgcttctga tgccaagcta 1344  
atggccagat ctgcctctga ggactctttc ctgggaccaa tttagacaac ctgggctcca 1404  
aactgaggac aataaaaagg gtacaaactt gagcgttcca atacggacca gcaggcgag  1463  
<210> 2
<211> 284        
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Asn Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp  
1               5                  10                  15      
Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro  
20                  25                  30          
Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro  
35                  40                  45              
Gln Phe Thr Ser Ser Leu Gly Ser Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp  
50                  55                  60                  
Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Ser Asp Asp Pro Ala Gly  
65                  70                  75                  80  
Ala His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Gly Leu Ala His Pro  
85                  90                  95      
Pro Pro Gly Pro Phe Pro Asn Gly Thr Glu Pro Gly Gly Leu Glu Glu  
100                 105                 110          
Pro Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala  
115                 120                 125              
His Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Thr Ala Glu Pro  
130                 135                 140                  
Glu Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu  
145                 150                 155                 160  
Glu Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg  
165                 170                 175      
Arg Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys  
180                 185                 190          
Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys  
195                 200                 205              
Lys Arg Ser Ser Gly Thr Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro  
210                 215                 220                  
Glu Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Val Pro  
225                 230                 235                 240  
Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Pro Gly Val Pro Ala Ala  
245                 250                 255      
Val Arg Glu Gly Leu Leu Pro Ser Gly Leu Ser Val Ser Pro Gln Pro  
260                 265                 270          
Ser Ser Ile Ala Pro Leu Arg Pro Gln Glu Pro Arg                  
275                 280                                  
<210> 3
<211> 1861
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220> 
<221> CDS
<222> (1093)..(1737)
<400> 3
ggatcccaag gtgatattga acctggccaa gcaatagttt ctgagtagaa aggacttgag 60    
cagggaccgt ctctggtcac tctgtcctct ttcccaggat ggagtcagtc tgtgaaacat 120   
ggttgcacac acatttcctg acccaaccca tagtggcgga gagctggata gcactttgaa 180   
ctaatgggcg ctcctcccag ctgccagcca agaagacact tgactccttg atcgctggtt 240   
catttagaca agccgtttcc ctctctgagc caaaagaccc catgtgtaat actcaaagaa 300   
gaggccttcc ttatatatat ataggcaccc ccaaacctcc ttcatgctac caagaaaggg 360   
tctggacaca tgccaaaaag aaagaggaaa aggcaaagct ctccccagcg gccggacggg 420   
actcttctgg ctgggcgagg ctctttgagg aaccgagagt tgctgggact gagcccgcga 480   
cgggggaggc gtggagtggg ggaacaaaca gagtgctgct cccctccccc gacccctgcc 540   
ctttgtccgg aatccagctg tgctctgcgg gtgggggttg tggggggagg agcgggctcg 600   
cgtggcgcag cccctgggcc ccctccgctg attggcccgt ggtgcaggca gcagcccggc 660   
aggcacgctc ctggccgggg gcagagcaga taaagcgtgc caggggacac acgacttgca 720   
tgcagctcag aaatccctct gggtctcatc actgcagcag tggtcgagta cctcctcgga 780   
gcttttctac gacttccaga cgcaatttac tccaggcgag ggcgcctgca gtttagcaga 840   
acttcagagg gagcagagag gctcagctat ccactgctgc ttgacactga ccctatccac 900   
tgctgcttgt cactgactga cctgctgctc tctattcttt tgagtcggga gaactaggta 960   
acaattcgga aactccaaag ggtggatgag gggcgcgcgg ggtgtgtgtg ggggatactc 1020  
tggtcccccg tgcagtgacc tctaagtcag aggctggcac acacacacct tccatttttt 1080  
cccaaccgca gg atg gcg cct cat ccc ttg gat gcg ctc acc atc caa gtg 1131  
Met Ala Pro His Pro Leu Asp Ala Leu Thr Ile Gln Val
1               5                  10            
tcc cca gag aca caa caa cct ttt ccc gga gcc tcg gac cac gaa gtg   1179  
Ser Pro Glu Thr Gln Gln Pro Phe Pro Gly Ala Ser Asp His Glu Val
15                  20                  25                
ctc agt tcc aat tcc acc cca cct agc ccc act ctc ata cct agg gac   1227  
Leu Ser Ser Asn Ser Thr Pro Pro Ser Pro Thr Leu Ile Pro Arg Asp
30                  35                  40                  45
tgc tcc gaa gca gaa gtg ggt gac tgc cga ggg acc tcg agg aag ctc   1275  
Cys Ser Glu Ala Glu Val Gly Asp Cys Arg Gly Thr Ser Arg Lys Leu
50                  55                  60    
cgc gcc cga cgc gga ggg cgc aac agg ccc aag agc gag ttg gca ctc   1323  
Arg Ala Arg Arg Gly Gly Arg Asn Arg Pro Lys Ser Glu Leu Ala Leu
65                  70                  75        
agc aaa cag cga aga agc cgg cgc aag aag gcc aat gat cgg gag cgc   1371  
Ser Lys Gln Arg Arg Ser Arg Arg Lys Lys Ala Asn Asp Arg Glu Arg
80                  85                  90            
aat cgc atg cac aac ctc aac tcg gcg ctg gat gcg ctg cgc ggt gtc   1419  
Asn Arg Met His Asn Leu Asn Ser Ala Leu Asp Ala Leu Arg Gly Val
95                 100                 105                
ctg ccc acc ttc ccg gat gac gcc aaa ctt aca aag atc gag acc ctg   1467  
Leu Pro Thr Phe Pro Asp Asp Ala Lys Leu Thr Lys Ile Glu Thr Leu
110                 115                 120                 125
cgc ttc gcc cac aac tac atc tgg gca ctg act cag acg ctg cgc ata   1515  
Arg Phe Ala His Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Thr Gln Thr Leu Arg Ile
130                 135                 140    
gcg gac cac agc ttc tat ggc ccg gag ccc cct gtg ccc tgt gga gag   1563  
Ala Asp His Ser Phe Tyr Gly Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Gly Glu
145                 150                 155        
ctg ggg agc ccc gga ggt ggc tcc aac ggg gac tgg ggc tct atc tac   1611  
Leu Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Asn Gly Asp Trp Gly Ser Ile Tyr
160                 165                 170            
tcc cca gtc tcc caa gcg ggt aac ctg agc ccc acg gcc tca ttg gag   1659  
Ser Pro Val Ser Gln Ala Gly Asn Leu Ser Pro Thr Ala Ser Leu Glu
175                 180                 185                
gaa ttc cct ggc ctg cag gtg ccc agc tcc cca tcc tat ctg ctc ccg   1707  
Glu Phe Pro Gly Leu Gln Val Pro Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Leu Pro
190                 195                 200                 205
gga gca ctg gtg ttc tca gac ttc ttg tga agagacctgt ctggctctgg     1757  
Gly Ala Leu Val Phe Ser Asp Phe Leu                          
210                 215                      
gtggtgggtg ctagtggaaa gggaggggac cagagccgtc tggagtggga ggtagtggag 1817  
gctctcaagc atctcgcctc ttctggcttt cactacttgg atcc                  1861  
<210> 4
<211> 214        
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Met Ala Pro His Pro Leu Asp Ala Leu Thr Ile Gln Val Ser Pro Glu  
1               5                  10                  15      
Thr Gln Gln Pro Phe Pro Gly Ala Ser Asp His Glu Val Leu Ser Ser  
20                  25                  30          
Asn Ser Thr Pro Pro Ser Pro Thr Leu Ile Pro Arg Asp Cys Ser Glu  
35                  40                  45              
Ala Glu Val Gly Asp Cys Arg Gly Thr Ser Arg Lys Leu Arg Ala Arg  
50                  55                  60                  
Arg Gly Gly Arg Asn Arg Pro Lys Ser Glu Leu Ala Leu Ser Lys Gln  
65                  70                  75                  80  
Arg Arg Ser Arg Arg Lys Lys Ala Asn Asp Arg Glu Arg Asn Arg Met  
85                  90                  95      
His Asn Leu Asn Ser Ala Leu Asp Ala Leu Arg Gly Val Leu Pro Thr  
100                 105                 110          
Phe Pro Asp Asp Ala Lys Leu Thr Lys Ile Glu Thr Leu Arg Phe Ala  
115                 120                 125              
His Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Thr Gln Thr Leu Arg Ile Ala Asp His  
130                 135                 140                  
Ser Phe Tyr Gly Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Gly Glu Leu Gly Ser  
145                 150                 155                 160  
Pro Gly Gly Gly Ser Asn Gly Asp Trp Gly Ser Ile Tyr Ser Pro Val  
165                 170                 175      
Ser Gln Ala Gly Asn Leu Ser Pro Thr Ala Ser Leu Glu Glu Phe Pro  
180                 185                 190          
Gly Leu Gln Val Pro Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Leu Pro Gly Ala Leu  
195                 200                 205              
Val Phe Ser Asp Phe Leu                                          
210                                                          
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-pdx-1
forward primer
<400> 5
accatgaaca gtgaggagca g                                           21    
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-pdx-1
backward primer
<400> 6
tcctcttgtt ttcctcgggt tc                                          22    
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-ngn3
forward primer
<400> 7
tggcactcag caaacagcga                                             20    
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:AdV-ngn3
backward primer
<400> 8
acccagagcc agacaggtct                                             20    
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:HPRT forward
primer
<400> 9
ctcgaagtgt tggatacagg                                             20    
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:HPRT backward
primer
<400> 10
tggcctatag gctcatagtg                                             20    
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:endogenous
ｐｄｘ-1 forward primer
<400> 11
tggataaggg aacttaacct                                             20    
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:endogenous
ｐｄｘ-1 backward primer
<400> 12
ttggaacgct caagtttgta                                             20    
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:CK19 forward
primer
<400> 13
aagaccatcg aggacttgcg                                             20    
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:CK19 backward
primer
<400> 14
ctatgtcggc acgcacgtcg                                             20    
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:nestin forward
primer
<400> 15
ggagagtcgc ttagaggtgc                                             20    
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:nestin backward
primer
<400> 16
gtcaggaaag ccaagagaag                                             20