【手続補正書】
【提出日】平成17年2月3日(2005.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  保存されたＤｉａｐｈａｎｏｕｓ関連ホルミン自己調節ドメイン（ＤＡＤ）
【特許請求の範囲】
【請求項１】  以下のアミノ酸配列：
｛ＧＡ｝−｛ＶＡ｝−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−｛ＫＲＱ｝−ｘ−｛ＧＡ｝−｛ＳＧＡ｝−｛ＡＰ｝  （配列番号１）
を有するＤＡＤと呼ばれるペプチドを含む約１３０アミノ酸未満のペプチドまたはポリペプチドであって、ここで、１セットのブレース内のアミノ酸は交換可能であり、そしてｘは任意のアミノ酸を意味する、ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項２】  本質的に以下のアミノ酸配列：
｛ＧＡ｝−｛ＶＡ｝−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−｛ＫＲＱ｝−ｘ−｛ＧＡ｝−｛ＳＧＡ｝−｛ＡＰ｝  （配列番号１）
からなるペプチドであって、ここで、１セットのブレース内のアミノ酸は交換可能であり、そしてｘは任意のアミノ酸を意味する、ペプチド。
【請求項３】  配列番号１のＣ末端に、約５〜１２アミノ酸の塩基性モチーフをさらに有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】  以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたはポリペプチド：
（ａ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＳＧＡＡＦＲＲＫＲＧ  ｛配列番号２｝；
（ｂ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＳＧＡＡＦＲＤＲＲＫＲＩ  ｛配列番号３｝；
（ｃ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＳＧＡＡＦＲＤＲＲＫＲＴ  ｛配列番号４｝；
（ｄ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＴＧＳＡＦＧＱＲＮＲＱＡＲＲＱＲ  ｛配列番号５｝；
（ｅ）ＡＶＭＤＫＬＬＥＱＬＫＮＡＧＰＡＫＳＤＰＳＳＡＲＫＲＡ  ｛配列番号６｝；および
（ｆ）ＧＡＭＤＳＬＬＥＫＬＲＡＡＡＰＱＡＫＤＱＲＤＲＲＲＲＡ  ｛配列番号７｝。
【請求項５】  前記ペプチドまたはポリペプチドの配列が、ｍＤｉａ２タンパク質（配列番号８）に示される、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドまたはポリペプチド。
【請求項６】  Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ関連ホルミンタンパク質のＧＴＰａｓｅ結合ドメイン（ＧＢＤ）に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドまたはポリペプチド。
【請求項７】  以下を含む、融合ポリペプチド：
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の第１のペプチドまたはポリペプチド；
（ｂ）必要に応じて、リンカー領域；および
（ｃ）該第１のペプチドもしくはポリペプチドまたは該リンカー領域に連結された第２のポリペプチドであって、該第２のポリペプチドは、該第１のペプチドまたはポリペプチドにネイティブで連結されていない、第２のポリペプチド。
【請求項８】  前記第２のポリペプチドが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたは蛍光タンパク質である、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】  請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドまたはポリペプチドのモノマーが２つ以上反復する直鎖状マルチマーを含む融合ポリペプチドであって、該モノマーは、末端同士で直接的にかまたは該モノマー反復の間に存在するリンカーで連結される、融合ポリペプチド。
【請求項１０】  式（Ｐ−Ｘｍ）ｎ−Ｐを有する請求項９に記載のポリペプチドマルチマーであって、ここで、
Ｐは、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドまたはポリペプチドであり、
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキニル、９個までの酸素原子を含むＣ１〜Ｃ２０ポリエーテル、およびＧｌｙ２からなる群より選択されるスペーサーまたはリンカーであり、ここで、ｚ＝１〜１０；ｍ＝０または１、そしてｎ＝１〜１００である、ポリペプチドマルチマー。
【請求項１１】  請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドまたはポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１２】  配列番号９に示される配列を有する、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】  請求項７〜９のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１４】  融合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸は、以下：
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の第１のペプチドまたはポリペプチドをコードする第１の核酸配列；
（ｂ）必要に応じて、該第１の核酸配列とインフレームで融合された、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列；および
（ｃ）該第１の核酸配列または該リンカー核酸配列にインフレームで連結され、そして第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
を含む、核酸分子。
【請求項１５】  標準的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１１〜１４のいずれかに記載の核酸分子とハイブリダイズする、核酸。
【請求項１６】  請求項１１〜１５のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクターであって、以下：
（ａ）プロモーター、および
（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞において該核酸の発現を調節するさらなる調節配列、
に作動可能に連結された、発現ベクター。
【請求項１７】  プラスミドである、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】  ウイルスベクターである、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１９】  請求項１１〜１５のいずれかに記載の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた、細胞。
【請求項２０】  請求項１６〜１８のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞であって、該核酸が発現される、細胞。
【請求項２１】  細胞増殖を阻害するかまたはアポトーシスにより細胞を殺傷するための方法であって、該方法は、アクチン重合および／またはアクチン線維の安定化により増殖阻害または細胞死が引き起こされる細胞に、請求項１〜８のいずれかに記載のペプチドまたはポリペプチドを導入する工程を包含し、その結果、該ペプチドまたはポリペプチドが、該アクチン重合または該安定化を引き起こし、それによってアポトーシスの該増殖阻害が起こる、方法。
【請求項２２】  細胞増殖を阻害するかまたはアポトーシスにより細胞を殺傷するための方法であって、該方法は、アクチン重合および／またはアクチン線維の安定化により増殖阻害または細胞死が引き起こされる細胞において、請求項１１〜１５のいずれかに記載の核酸を発現させる工程を包含し、その結果、該核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドが発現され、そして該アクチン重合または該安定化を引き起こし、それによって該増殖阻害またはアポトーシスが起こる、方法。
【請求項２３】  細胞増殖を阻害するかまたはアポトーシスにより細胞を殺傷するための方法であって、該方法は、アクチン重合および／またはアクチン線維の安定化により増殖阻害または細胞死が引き起こされる細胞において、請求項１６〜１８のいずれかに記載のベクターを発現させる工程を包含し、その結果、該ベクターによりコードされるペプチドまたはポリペプチドが発現され、そして該アクチン重合または該安定化を引き起こし、それによって該増殖阻害またはアポトーシスが起こる、方法。
【請求項２４】  前記導入工程または前記発現工程が、生きた動物中で実施される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】  阻害または殺傷される前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】  細胞中でのＧＢＤのＤＡＤへの分子間結合を破壊または阻害する方法であって、該方法は、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドまたはペプチドを、該細胞中に導入するか、または該細胞中で発現させる工程を包含し、ここで、該ペプチドまたはポリペプチドが、該結合を破壊または阻害する、方法。
【請求項２７】  前記導入工程がマイクロインジェクションによる、請求項２１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】  前記導入工程が、前記核酸または前記ベクターを用いた前記細胞のマイクロインジェクション、トランスフェクション、形質導入、または感染による、請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】  細胞中でアクチン重合を誘導する方法であって、該方法は、請求項１〜８のいずれかに記載の有効量のペプチドまたはポリペプチドを該細胞に提供する工程を包含し、ここで、該ペプチドまたはポリペプチドが、アクチン重合を誘導する、方法。
【請求項３０】  前記提供工程が、前記ペプチドまたはポリペプチドのマイクロインジェクションにより達成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】  細胞中でアクチン重合を誘導する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１１〜１５のいずれかに記載の核酸、または
（ｂ）請求項１６〜１８のいずれかに記載の発現ベクター、
の該細胞中での発現を引き起こす工程を包含し、ここで、該核酸から発現されるペプチドまたはポリペプチドが、アクチン重合を誘導する、方法。
【請求項３２】  細胞中でＡｒｐ２／３複合体活性化を刺激する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の有効量のペプチドまたはポリペプチドを該細胞に提供する工程を包含する、方法。
【請求項３３】  前記提供工程が、前記ペプチドまたはポリペプチドのマイクロインジェクションにより達成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】  細胞中で、Ａｒｐ２／３複合体活性化を刺激する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１１〜１５のいずれかに記載の核酸、または
（ｂ）請求項１６〜１８のいずれかに記載の発現ベクター、
の該細胞での発現を引き起こす工程を包含し、その結果、該核酸から発現されるペプチドまたはポリペプチドが、Ａｒｐ２／３複合体活性化を刺激する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、分子生物学、生化学および医療の分野にあり、検索ツールとして、そして細胞増殖のインヒビター、アポトーシスの誘導因子、および抗癌療法として有用である、細胞骨格事象に関与する新規なタンパク質ドメインに関する。
【０００２】
（背景技術の説明）
近年発見されたホルミン相同性（ｆｏｒｍｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）（ＦＨ）タンパク質ファミリーは、細胞極性および形状（これには、細胞質分裂の空間的調整および時間的調整を含む）に影響する範囲のアクチン媒介プロセスに関与する。実質的な証拠によって、ＦＨタンパク質が、アクチン結合タンパク質プロフィリンならびにＡｒｐ２／３複合体およびＲｈｏファミリーのＧＴＰ結合タンパク質との、異なるドメインを通じた相互作用によってこれらの機能を満たすことが示される。
【０００３】
ＦＨタンパク質は、２つのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒタンパク質であるＤＩＡＰＨＡＮＯＵＳ（ＤＩＡ）およびＣＡＰＰＵＣＣＩＮＯ（ＣＡＰＵ）、酵母タンパク質、Ｂｎｉｌｐ、ならびにマウスタンパク質ホルミン（ｆｏｒｍｉｎ）の間の配列およびタンパク質組織化における観察に基づいて規定された。引き続き、ＦＨタンパク質をコードするさらなる遺伝子が真菌、植物、虫、および哺乳動物において見出されている；現在新しく１ダースの特徴付けられたファミリーメンバーが存在する（表１）。ＦＨタンパク質は、１０００〜２０００アミノ酸長であり、そして２つの保存された配列ドメイン（ＦＨ１およびＦＨ２と名付けられた）を含む。ＦＨ１ドメインは平均で約１００アミノ酸長であり、そしてほとんどが極端にプロリンリッチであり、連続したプロリン残基の複数のストレッチを伴う。ＦＨ２ドメインは、ＦＨタンパク質ファミリーのメンバーの間でのみ見出された約１３０残基の保存領域である。
【０００４】
全てのファミリーメンバーにおけるＦＨ１およびＦＨ２ドメインは、約１６０アミノ酸ごとに分離されるが、隣接する領域の長さはかなり異なる。これらの変りやすい大きさの領域内の配列類似性のブロックは、既知のファミリーメンバーの数が増大するにつれ、認識可能になってきた。配列保存はまた、ＦＨ２ドメインを囲む領域において検出されている。
【０００５】
ＣＡＰＵ以外の全てのＦＨタンパク質は、ＮＥＷＣＯＩＬＳおよびＰＡＩＲＣＯＩＬＳアルゴリズムによって予想されるように、１つ以上のコイルドコイル領域を含む。代表的に、１つのコイルドコイル領域は、ＦＨ１ドメインに対してＮ末端に存在し、そして１または２つがＦＨ２領域内またはＦＨ２領域に対してＣ末端に存在する。コイルドコイルドメインは、通常細胞骨格タンパク質中であり、そしてホモタイプ相互作用およびヘテロタイプ相互作用についての可能性を提供する。
【０００６】
コンセンサスＦＨ２ドメインを用いるデータベース検索によって、真核生物が複数のＦＨ遺伝子を含むことが示される（表１）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、これの完全なゲノム配列が利用可能であり、２つの認識可能ＦＨ遺伝子（ＢＮＩ１およびＢＮＲ１）が存在し、一方他の種においては少なくとも３つが存在する（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおけるＵ４０１８７、Ｕ８８３１４、およびＺ７８０１３の配列）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける２つのＦＨ遺伝子は機能的に重複するが、同じことは、ハエおよび分裂酵母において遺伝的に同定されたＦＨ遺伝子の対に対しては真ではないようである。
表１−ＦＨタンパク質ファミリーメンバー
【０００７】
【表１】
2004516006.tif 000001
ａ．列挙された組み合わせパートナーとの内因性の相互作用は、酵母ＦＨタンパク質についてのみ確認された。
ｂ．この表は、Ｗａｓｓｅｒｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１１１〜１１５，１９９８の複製した表１である；引用文献番号は、Ｗａｓｓｅｒｍａｎの刊行物において挙げられた番号である。
略語：Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ；Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ；ＣＡＰＵ、ＣＡＰＰＵＣＣＩＮＯ；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ；ＤＩＡ、ＤＩＡＰＨＡＮＯＵＳ；Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；ＦＨ、ホルミン相同性；Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ；Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；ＳＨ３、Ｓｒｃｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３。
【０００８】
Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓｒｅｌａｔｅｄホルミン（ＤＲＦ）は、小さいＧＴＰ結合タンパク質の活性化Ｒｈｏサブファミリーに結合する能力について公知のＦＨタンパク質のサブクラスを構成する（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９８，８：１１１〜１１５）。ＧＴＰ結合タンパク質のＲｈｏサブファミリーのメンバーは、ＦＨタンパク質を細胞性シグナル伝達経路に結び付ける。Ｒｈｏタンパク質であるＲａｓ−関連ＧＴＰａｓｅは、細胞の接着、運動性、出芽部位（ｂｕｄ−ｓｉｔｅ）選択、および収縮プロセスを調節する（Ｔａｋａｉ，Ｙら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０、２２７〜２３１；Ｎａｒｕｍｉｙａ，Ｓ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０，２１５〜２２８）。Ｒｈｏサブファミリーは、Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２のタンパク質を含み、ＲｈｏおよびＣｄｃ４２の両方が、細胞質分裂に必要である。それは、ＦＨファミリーのメンバーと相互作用する２つのタンパク質である。
【０００９】
ＲｉｄｌｅｙおよびＨａｌｌは、Ｒｈｏ小ＧＴＰａｓｅ活性化がアクチンストレスファイバーの形成に必要かつ十分であることを、１９９２年に初めて実証した。Ｒｉｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ  ７０，３８９〜９９（１９９２ａ）。これ以降、２つのＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅ結合タンパク質、Ｒｈｏキナーゼ、またはＲＯＣＫ、およびＤｉａｐｈａｎｏｕｓ関連Ｆｏｒｍｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（相同性）タンパク質（ＤＲＦ）は、Ｒｈｏ調節アクチン再構築において重要なエフェクターであることが示された（Ｒｉｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １，Ｅ６４〜６（１９９９））。これらの２つのエフェクターの活性化改変体の同時発現は、活性化ＲｈｏＡの発現によって生じたアクチンストレスファイバーを再利用するのに十分である（Ｋｏｈｎｏ，Ｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ
１５，６０６０〜８（１９９６）；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，１３６〜１４３（１９９９）；Ｎａｋａｎｏ，Ｋら，Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ  ５，１３〜２５（２０００）；Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｔら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５，１３〜２５（２０００））。ＲＯＣＫは、細胞骨格再構築に関与する複数の基質（例えば、ＬＩＭキナーゼおよびミオシンホスファターゼのミオシン結合サブユニット（ＭＢＳ））を有する（Ａｍａｎｏ，Ｍら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２６１、４４〜５１（２０００）に概説される）が、Ｓｒｃ、ＩＲＳｐ５３およびアクチン結合タンパク質、プロフィリン、ＥＦ１α、またはＢｕｄ６ｐ／Ａｉｐ３ｐを含む公知のＤＲＦ結合パートナーのどれもがＤＲＦ−制御アクチン再構築において直接的な役割を有さないようである（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７，２６１５〜２３（１９９７）；Ｕｍｉｋａｗａ，Ｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６，２０１１〜６（１９９８）；Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７１，６２６〜６２９（２０００）；Ｏｚａｋｉ−Ｋｕｒｏｄａ，Ｋら．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１，８２７〜３９（２００１）；Ｓｕｅｔｓｕｇｕ，Ｓら、Ｅｍｂｏ  Ｊ  １７，６５１６〜２６（１９９８））。変わりに、これらの因子は、特定の細胞性領域に対してＲｈｏ−調節ＤＲＦ複合体を標的する上で必須の役割を有するか、または細胞骨格に対するＤＲＦ効果を調節するようである。
【００１０】
出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＤＲＦは、Ｂｎｉ１およびＢｎｒ１を含む（Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，Ｍら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６，１１８〜１２２；Ｋｏｈｎｏ，Ｈら（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５，６０６０〜６０６８）。３つの哺乳動物ＤＲＦ遺伝子が、マウス／ヒトにおいて同定されている：それぞれ、ｍＤｉａ１／ａＮＡ１  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：１３６〜１４３；Ｌｙｎｃｈ，Ｅ．Ｄ．ら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１３１５〜１３１８、ｍＤｉａ２／Ｄｉａ２（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  ９２，４７５〜４８７（１９９８））、およびｍＤｉａ３／ＤＩＡ（Ｂｉｏｎｅ，Ｓ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６２，５３３〜５４１（１９９８））。ｍＤｉａｌは、活性化ＲｈｏＡ−Ｃに結合することが示されており、そしてｍＤｉａ２は、ＲｈｏＡ、ＢおよびＣｄｃ４２に結合する（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎら、前出；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，３０４４〜３０５６）。一次アミノ酸配列の相同性に基づいて、ＤＲＦファミリーは、４つの保存されたドメインを含む：アミノ末端におけるＧＴＰａｓｅ結合ドメイン（ＧＢＤ）、３つのＦＨドメインであるプロリンリッチＦＨ１、ＦＨ２、およびＦＨ３ドメイン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｊら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４１，１２１７〜１２２８（１９９８）；Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎ，Ｄ．Ｈ．ら（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０，３３６７〜３３７７）。本発明者らは、本明細書に記載されている最カルボキシ末端においてＤＲＦ自己調節性ドメイン（ＤＡＤ）と名付けられたＤＲＦに対して特有の新しい相同性ドメインを同定した。
【００１１】
出芽酵母における試験によって、ＤＲＦが、重要なＲｈｏエフェクターであることが示された（Ｋｏｈｎｏら、前出；Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａら、前出）。哺乳動物細胞において、微量注入した抗体によるＤＲＦの阻害によって、ＤＲＦは細胞質分裂、ストレスファイバー形成、および転写因子ＳＲＦの活性化に必要であることが示された（Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｔら（２０００）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  ５：１３〜２５）。調節解除されたＤＲＦまたは「活性化された」ＤＲＦの発現（それらのＧＢＤの除去によって生成された）は、細胞外刺激の非存在下においてアクチン重合および遺伝子発現を誘導するのに十分である（Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出；Ｗａｔａｎａｂｅら（１９９９）前出；Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａら、前出）。これらの活性化されたマウスＤＲＦはまた、別の小ＧＴＰａｓｅエフェクターであるＲｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫと協調して、線維芽細胞においてストレスファイバーを誘導する（Ｎａｋａｎｏ，Ｋら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０，２４８１〜２４９１（１９９９）；Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎら、前出）。
【００１２】
ＤＲＦは、細胞におけるアダプター分子として機能し、そしてプロリンリッチＦＨ１ドメインとのＳＨ３ドメインの相互作用を介していくつかのシグナル伝達キナーゼおよび足場タンパク質に結合することによってシグナル伝達経路および再構築経路を架橋する。これらは、Ｓｒｃ非レセプターチロシンキナーゼファミリー（Ｋｉｋｙｏ，Ｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８、７０４６〜７０５４（１９９９））、Ｈｏｆｌｐ（Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７１、６２６〜６２９（２９９９））、ＤＩＰ−１（Ｃｈａｎｇ、Ｆら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７，１６９〜１８２（１９９７））、およびＩＲＳｐ５３／ＢＡＩＡＰ２（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９７、前出）を含む。アクチン結合タンパク質プロフィリンはまた、ＦＨ１ドメインと相互作用する（Ｉｍａｍｕｒａ，Ｈら、Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，２７４５〜２７５５（１９９７）；Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｔら、前出；Ｎａｒｕｍｉｙａ，Ｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１０、６８〜７２（１９９７）；Ｍｉｋａｗａ，Ｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６，２０１１〜２０１６（１９９８））。他のアクチン結合因子ＥＦ１αおよびＢｕｄ６ｐ／Ａｉｐ３ｐは、他の領域によってＢｎｉ１Ｐと会合する（Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，Ｍら、前出；Ｓｕｅｔｓｕｇｕ，Ｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５７、４７０〜４７４（１９９９））。哺乳動物ＤＲＦファミリーメンバーに対するプロフィリン結合の有意性はまだ解明されていない。なぜなら、プロフィリンは、Ｒｈｏ調節アクチン再構築における重要な因子ではないようであるからである（Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｓ、Ａら、Ｃｅｌｌ  ９８、１５９〜１６９（１９９９））。しかし、プロフィリンは、ＳＲＦ調節経路においてアクチンモノマーセンサーとして働き得る（Ｋｉｋｙｏ，Ｍら、前出；Ｎａｋａｎｏ，Ｋら、前出）。
【００１３】
Ｂｎｉ１ｐ、ｍＤｉａ１およびｍＤｉａ２は、そのＧＴＰａｓｅ結合ドメインの除去によって「活性化」または調節解除されることが示されている。線維芽細胞におけるＧＢＤ−ｍＤｉａ１および−ｍＤｉａ２の発現は、別の小ＧＴＰａｓｅエフェクターである、ＲｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫと協調することに加えて細胞外刺激の非存在下でＳＲＦを活性化して、ストレスファイバーを誘導する（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎら、１９９９、前出；Ｋｉｋｙｏら、前出；Ｚｈａｏ，Ｚ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８、２１５３〜２１６３（１９９８））。これらの切断実験によって、ＤＲＦのＧＴＰａｓｅ結合ドメインが、負の調節活性を含むことが示唆された。多くのシグナル伝達分子は、自己調節性ドメインを含む。例えば、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ１）（Ｆｒｏｓｔ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７３，２８１９１〜２８１９８（１９９８）；Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．ら．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０、２９０７１〜２９０７４（１９９５））およびＳｒｃ−ファミリーキナーゼは、分子内会合を通じてその活性を調節するドメインを保有する（Ｋｉｍ，Ａ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，１５１〜１５８（２０００））。ＰＡＫ１自己阻害性ドメインは、ＣＲＩＢドメインに隣接する（Ｗｅｌｃｈ，Ｍ．Ｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９，４２３〜４２７（１９９９））；活性化Ｃｄｃ４２に対する結合によってこの会合が調節されると仮定される。
【００１４】
同様の観察が、Ｃｄｃ４２結合ヴィスコット‐オールドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）に対してなされている（Ａｌｂｅｒｔｓら、前出）。ＷＡＳＰは、Ｒｈｏ−関連小ＧＴＰａｓｅ  Ｃｄｃ４２によって活性化される（Ｒｏｈａｔｇｉ、Ｒら、Ｃｅｌｌ  ９７、２２１〜３１（１９９９）；Ｍａ  Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１５３６２〜７（１９９８）；Ｋｉｍ，Ａ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４、１５１〜８（２０００）、この結合は、ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン（ＣＲＩＢ）（Ｂｕｒｂｅｌｏ，Ｐ．Ｄ．ら．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０，２９０７１〜４（１９９５））とＣ末端ＷＣＡドメインとの間の分子内会合を破壊する。次いで遊離のＷＣＡは、アクチンモノマーに結合し、そしてＡｒｐ２／３アクチン再構築複合体を活性化して糸状偽足、膜状仮足およびラッフル（ｒｕｆｆｌｅ）の形成を誘導する（Ｍａｃｈｅｓｋｙ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４６、２６７〜７２（１９９９）；Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｒ．Ｄ．らＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２，９１〜６（２０００））。Ａｒｐ２／３複合体は、ｐ１６、ｐ２０、ｐ２１、ｐ３４、ｐ４１、Ａｒｐ２およびＡｒｐ３（Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｒ．Ｄ．ら．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９，２４４〜９（１９９９）のように脊椎動物命名法を用いた）からなる。Ａｒｐ２／３は、新しいアクチンファイバーの核生成の促進、ならびに既存のフィラメントに対する結合および分枝の誘導の両方によって細胞の前縁でアクチンフィラメントのアセンブリを調節する。アクチン分枝は、膜状仮足の形成に重要であり（Ｐａｎｔａｌｏｎｉ，Ｄら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，３８５〜９１（２０００））、そしてｐ３４は、この活性に重要であるようである（Ｂａｉｌｌｙ，Ｍら、Ｃｕｒｒ
Ｂｉｏｌ  １１，６２０〜５（２００１））。ＷＡＳＰおよびその関連のＮ−ＷＡＳＰは、それぞれ、ＷＡＳＰ相互作用タンパク質（ＷＩＰ）、およびＷＡＳＰ相互作用ＳＨ３タンパク質（ＷＩＳＨ）のような他のタンパク質（細胞中でそれらの活性を調節する）と作用する（Ｔａｋｅｎａｗａ，Ｔら．，Ｊ  Ｃｅｌｌ
Ｓｃｉ  １１４，１８０１〜９（２００１）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｑｕｉｌｅｓ，Ｎら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，４８４〜９１（２００１）；Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｍら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５２，４７１−８２（２００１））。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、アミノ酸配列：
［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］（配列番号１）、
を有するＤＡＤと名付けられたペプチドを含む約１３０以下のアミノ酸のペプチドまたはポリペプチドに関連し、
ここでカッコのセット内のアミノ酸は、互換可能であり、そしてｘは、任意のアミノ酸を意味する。
【００１６】
１つの実施形態において、ペプチドは本質的に、アミノ酸配列：
［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］（配列番号１）、からなり、
ここでカッコのセット内のアミノ酸は、互換可能であり、そしてｘは、任意のアミノ酸を意味する。
【００１７】
上記のペプチドはさらに、配列番号１のＣ末端において、約５と１２との間のアミノ酸の基本的（ｂａｓｉｃ）モチーフを有し得る。
【００１８】
１つの実施形態において、上記のペプチドまたはポリペプチドは、以下：
（ａ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＳＧＡＡＦＲＲＫＲＧ［配列番号２］；
（ｂ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＳＧＡＡＦＲＤＲＲＫＲＩ［配列番号３］；
（ｃ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＳＧＡＡＦＲＤＲＲＫＲＩ［配列番号４］；
（ｄ）ＧＶＭＤＳＬＬＥＡＬＱＴＧＳＡＦＧＱＲＮＲＱＡＲＲＱＲ［配列番号５］；
（ｅ）ＡＶＭＤＫＬＬＥＱＬＫＮＡＧＰＡＫＳＤＰＳＳＡＲＫＲＡ［配列番号６］；および
（ｆ）ＧＡＭＤＳＬＬＥＫＬＲＡＡＡＰＱＡＫＤＱＲＤＲＲＲＲＡ［配列番号７］；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
好ましくは、上記のペプチドまたはポリペプチドは、その配列がｍＤｉａ２タンパク質（配列番号８）に存在するものである。
【００２０】
好ましい実施形態において、上記のペプチドまたはポリペプチドは、Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ関連ホルミンタンパク質のＧＴＰａｓｅ結合ドメイン（ＧＢＤ）に結合する。
【００２１】
また、以下：
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の第一のペプチドまたはポリペプチド；
（ｂ）必要に応じて、リンカー領域；および
（ｃ）この第一のペプチドもしくはポリペプチドに、またはこのリンカー領域に連結されている第二のポリペプチドであって、この第二のポリペプチドは、この第一のペプチドまたはポリペプチドに天然には連結されていない、第二のポリペプチド、
を含む融合ポリペプチドも提供される。
【００２２】
上記の融合ポリペプチドにおいて、第二のポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたは蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ，またはＢＦＰ）であり得る。
【００２３】
別の融合ポリペプチドは、直接的に、またはモノマー反復の間に存在するリンカーによって、端と端を連結された上記のペプチドまたはポリペプチドのモノマーの２つ以上の反復の線状マルチマーである。
【００２４】
このポリペプチドマルチマーは、式（Ｐ−Ｘｍ）ｎ−Ｐのマルチマーであり得、ここでＰは、請求項１〜６のいずれかのペプチドまたはポリペプチドであり、Ｘは、９つまでの酸素原子を含むＣ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ１−Ｃ２０アルケニル、Ｃ１−Ｃ２０アルキニル、Ｃ１−Ｃ２０ポリエーテル、およびＧｌｙｚ、からなる群より選択されるスペーサーまたはリンカーであり、ここでｚ＝１〜１０；ｍ＝０または１、そしてｎ＝１〜１００である。
【００２５】
本発明はまた、核酸分子、好ましくは上記のペプチドまたはポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡに関する。１つの実施形態において、核酸は、配列番号９に存在する配列を有する。
【００２６】
また上記の融合ポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。
【００２７】
融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、以下を含み得る：
（ａ）上記のような第一のペプチドまたはポリペプチドをコードする第一の核酸配列；
（ｂ）必要に応じて、第一の核酸配列とインフレームで融合された、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列；および
（ｃ）第一の核酸配列に、またはリンカー核酸配列にインフレームで連結し、そして第二のポリペプチドをコードする、第二の核酸配列。
【００２８】
また、標準的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の核酸分子のいずれかにハイブリダイズする核酸も提供される。好ましいストリンジェントな条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のインキュベーション、その後の約５０℃の温度での約０．２×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【００２９】
本発明はまた、（ａ）プロモーター、および（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞における核酸の発現を調節するさらなる調節配列に、作動可能に連結された上記の核酸を含む発現ベクターに関する。好ましい発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。
【００３０】
また、上記のような核酸分子で、または上記のような発現ベクター（ここでこの核酸は発現される）で、形質転換またはトランスフェクトされた細胞も提供される。
【００３１】
本発明はまた、多数の方法に関する。好ましい方法は、細胞増殖を阻害するための、またはアポトーシスにより細胞を殺傷するための方法であり、この方法は、上記のペプチドまたはポリペプチドが、アクチンの重合または安定化を生じるように、アクチンファイバーのアクチンの重合および／または安定化が増殖阻害または細胞死を生じる細胞に、上記のペプチドまたはポリペプチドを導入して、これによって増殖阻害またはアポトーシスを起こす工程を包含する。
【００３２】
細胞増殖を阻害するための方法またはアポトーシスによって細胞を殺傷するための方法はまた、核酸によってコードされるペプチドまたはポリペプチドが発現されて、アクチンの重合または安定化を生じるように、アクチンファイバーのアクチンの重合および／または安定化が増殖阻害または細胞死を生じる細胞において、上記の核酸を発現させて、これによって増殖阻害またはアポトーシスを起こす工程を包含する。
【００３３】
上記の方法は、ベクターによってコードされるペプチドまたはポリペプチドが発現されて、アクチンの重合または安定化を生じるように、アクチンファイバーのアクチンの重合および／または安定化が増殖阻害または細胞死を生じる細胞において、上記の発現ベクターを発現させて、これによって増殖阻害またはアポトーシスを起こす工程を包含する。
【００３４】
これらの方法における導入工程または発現工程は、インビボで生きた動物、好ましくはヒトにおいて、実行され得る。好ましくは、増殖阻害または殺傷されている細胞は、腫瘍細胞である。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、細胞においてＤＡＤに対するＧＢＤの分子内結合を破壊または阻害するための方法を提供する。この方法は、上記のポリペプチドまたはペプチドを細胞に導入する工程、または細胞において発現する工程（ここでこのペプチドまたはポリペプチドは、このＧＢＤ−ＤＡＤ結合を破壊または阻害する）を包含する。
【００３６】
ペプチドを導入するための好ましい方法はマイクロインジェクション（微量注入）による。他の実施形態において、核酸は、核酸またはベクターを用いた細胞へのマイクロインジェクション、トランスフェクション、形質導入、または感染によって発現のために導入され得る。
【００３７】
別の方法で、有効量の上記のペプチドまたはポリペプチドを細胞に提供することによって、細胞中でのアクチン重合が誘導される（ここで、このペプチドまたはポリペプチドはアクチン重合を誘導する）。このペプチドまたはポリペプチドをマイクロインジェクションすることによって、この提供は達成され得る。細胞においてアクチン重合を誘導する関連の方法は、上記の核酸または発現ベクターの１つを細胞において発現させる工程を包含する。ここで、この核酸から発現されたペプチドまたはポリペプチドは、アクチン重合を誘導する。
【００３８】
細胞においてＡｒｐ２／３複合体活性を刺激する方法も提供される。この方法には、以下：（１）例えば、マイクロインジェクションによって、上記のペプチドまたはポリペプチドの有効量を細胞に提供する工程、または（２）上記の核酸から発現されたペプチドまたはポリペプチドが、Ａｒｐ２／３複合体活性を刺激するように、この細胞において、上記の核酸または発現ベクターのいずれかを発現させる工程、を包含する。
【００３９】
図１１は、アクチンリモデリングの内因性活性化  対  アクチンリモデリングの外因性活性化を示す概略図である。この内因性モデルは、ＤＡＤペプチドおよびＷＣＡペプチドが、Ａｒｐ２／３を活性化し、ラッフル（ＷＣＡ）または細いファイバー（ＤＡＤ）のいずれかを生成するのに十分な情報を含むことを示唆する。外因性モデルは、複数の細胞シグナルが、細胞内のこれらの効果について必要とされることを示す。これらの因子（例えば、ＳｒｃおよびＰＩＰ２）は、細胞内における、ＤＲＦまたはＷＡＳＰの採用または調節に貢献する。
【００４０】
（好ましい実施形態の説明）
完全なＦＨタンパク質スーパーファミリーのアミノ酸配列アライメントは、プロリンリッチである相同性の、ＦＨ１領域およびＦＨ２領域を描写する。ＤＲＦサブファミリー（これらは、Ｒｈｏファミリーの低分子ＧＴＰａｓｅに結合する）のみのアライメントは、図１および図６（パネルは、アルファベット順の標識を与えられたそれらのパネル）に示されるＣ末端に保存されたドメインをもたらす。
【００４１】
ＤＡＤは、以下のコンセンサス配列によって記載される：
［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］（配列番号：１）
ここで、括弧の中のアミノ酸（一文字コード）は、交換可能であり、「Ｘ」は、任意のアミノ酸であることを意味する。
【００４２】
このＤＡＤドメインは、これまでに発見された３つのマウス／ヒトのＤＲＦにおいて、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ（Ｄｉａ）、発芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｂｎｉ１タンパク質およびＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＳｅｐＡタンパク質において、見出された。これは、以下の一覧ならびに図１および図６に示される。以下の一覧において、同一のアミノ酸には影が付けられている。
【００４３】
【化１】
2004516006.tif 000002
2004516006.tif 000003
このＤＡＤペプチド配列は、第四の残基（上記の殆どにおいてＧである）で始まる。第二のカラムにおける数字は、全長タンパク質において指定されたペプチドの開始残基番号である。上に列挙されるタンパク質の遺伝子産物に対するＧｅｎＢａｎｋ  ＴＭ／ＥＢＩ登録番号は、以下である：ｍＤｉａ１−Ｕ９６９６３；ｍＤｉａ２−ＡＦ０９４５１９；ＤＩＡ１５６−ＮＰ００６７２０；Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ−ＡＡＡ６７７１５；Ｂｎｉ１，Ｐ４１８３２；およびＳｅｐＡ−ＡＡＢ６３３３５。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号は、以下である：ｍＤｉａ１−Ｏ０８８０８；ｍＤｉａ２−Ｑ９Ｚ２０７。
【００４４】
ｍＤｉａ２の完全なアミノ酸を、以下に示しており、この配列は下線が引かれたＤＡＤ（上に示される）に対応し、そしてこの塩基性モチーフには、二重下線を引いている。
【００４５】
【化２】
2004516006.tif 000004
配列番号８をコードするｍＤｉａ２の核酸配列は、以下に示される：
【００４６】
【化３】
2004516006.tif 000005
2004516006.tif 000006
興味深いことに、ＤＦＮＡ１変異は、ＤＡＤドメインから８残基離れたところに生じ、ここで、フレームシフトが、アミノ酸１１９６でＤＦＮＡ１タンパク質を中断する終止コドンを誘導する（Ｌｙｎｃｈら、前出）。
【００４７】
細胞におけるＤＡＤ発現は、アクチン重合を活性化させ、この血清応答因子によって調節される微小管および転写を安定化させるのに十分である。
【００４８】
本発明者らは、ＤＡＤペプチドがアクチン重合を活性化する機構を定義づけた。ＤＡＤは、ＤＲＦタンパク質の分子内調節ドメインを表す。刺激を受けない細胞において、これは、ＤＲＦのＧＢＤに結合する。Ｒｈｏタンパク質を活性化するアゴニストで細胞を刺激する際に、Ｒｈｏは、ＧＢＤに結合し、そしてネガティブＧＢＤ−ＤＡＤ分子内相互作用を破壊する。ＤＲＦタンパク質は、細胞骨格の変化を誘引する他の細胞因子の活性化または補充のいずれかを行う。
【００４９】
本発明は、Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ関連ＦＨタンパク質サブファミリーについての調節機構を規定する。このＤＲＦは、分子内ＧＢＤ−ＤＡＤ結合によって調節される。Ｒｈｏ−ＧＴＰは、ＧＢＤ−ＤＡＤ相互作用を破壊するＤＲＦを活性化する。ＤＡＤ発現は、細胞性ＤＲＦの正常な自己調節を妨害することによってＲｈｏ−ＧＴＰ結合を模倣する。ＤＡＤ構造は、高度に保存されており、そしてその特徴付けはさらに、いくつかの以前の観察の性質を説明する：Ｂｎｉ１、ｍＤｉａ１およびｍＤｉａ２  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインの切断は、それらの活性化を生じる。ＤＡＤ−ＧＢＤ自己調節は、ＷＡＳＰのＧＢＤ（ＣＲＩＢドメイン）とＶＣＡドメインとの相互作用に類似する。しかし、ＶＣＡドメインとは違って、ＤＡＤは、「エフェクター」活性を含まない。そのかわり、ＤＡＤ発現の強力な効果は、（例えば、研究されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞において）ｍＤｉａ１の内因性の成分に依存する。
【００５０】
ＷＡＳＰ自己調節機構に類似して、ＤＲＦのＧＢＤは、活性化Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅを感知し、そしてＤＡＤとの結合を介して足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）タンパク質の活性を支配する二機能性ドメインである。Ｒｈｏのエフェクターループ変異は、ｍＤｉａ２とのＲｈｏの相互作用が複雑であることを、Ｒｈｏのエフェクターループ変異分析に基づいて示した（Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ  ８１，１１５９−１１７０（１９９５）。また、Ｒｈｏ結合タンパク質のいくつか（ＰＫＮおよびキネククチン（ｋｉｎｅｃｔｉｎ）を含む）は、活性化ＧＴＰａｓｅのための複数の結合部位を保有し、限定されたペプチドドメインに制限され得ない。
【００５１】
（マイクロインジェクションまたは他のトランスフェクション、形質導入、もしくは感染の手段による）細胞内の、ＤＡＤタンパク質の導入は、活性化Ｒｈｏと同様に優先的にＧＢＤを置き換えることによって、トランスでの（ｔｒａｎｓ）分子内のＧＢＤ−ＤＡＤ相互作用を破壊する。
【００５２】
ＧＢＤの検出は、ＤＲＦを「活性化する」。発芽酵母において、ΔＧＢＤ−Ｂｉｎ１発現は、アクチンケーブルの形成を引き起こす。細胞増殖条件、および、それによる活性化ＲｈｏおよびＲＯＣＫの活性のレベルに依存して、哺乳動物細胞における活性化ΔＧＢＤ−ｍＤｉａ１またはｍＤｉａ２の発現は、アクチンストレスファイバーの形成を引き起こす。一旦、ＧＢＤ−ＤＡＤ相互作用が確認された場合（実施例ＩＩ）、細胞におけるＤＡＤドメイン発現の効果を説明するために単純なモデルが、着想された。このモデルは、図３Ｃにおいて示され、図１１において展開される：活性化Ｒｈｏ−ＧＴＰが低レベルである細胞において、ＤＲＦは、Ｎ末端との直接的なＣ末端相互作用を有する不活性状態を想定する。グアニンヌクレオチド交換が活性化され、その後ＧＴＰを伴ったＲｈｏのロードがそれに続く細胞の導入の際に、細胞は、ＦＨ１ドメインおよびＦＨ２ドメインを介して、下流エフェクターの補充または活性化に必要なドメインを優先的に暴露する。このモデルはまた、Ｃ末端ＤＡＤドメインがまた、ＷＡＳＰのＶＣＡ領域に類似の様式でエフェクター活性を維持する可能性を説明する。
【００５３】
ＧＢＤの過剰発現は、ＤＡＤドメイン発現の効果をスケルチ（ｓｑｕｅｌｃｈ）する。これに取り組むために、ＧＢＤおよびＤＡＤドメインの両方をコードするプラスミドを、細胞にマイクロインジェクションし、そしてストレスファイバーおよびＳＲＦ活性を、モニターした（実施例を参照のこと）。
【００５４】
このモデルによってまた、ＤＡＤ発現の効果が分子内ＤＡＤ−ＧＢＤ相互作用の阻害に起因することが予測される。したがって、ＤＡＤドメイン発現は、内因性ＤＲＦタンパク質を活性化する。この可能性を、内因性ｍＤｉａ１（これは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現される（Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出））を、ＥＧＦＰ−ＤＡＤのための発現ベクターと共に抗ｍＤｉａ１抗体を同時注射することによって阻害することによって試験される（実施例ＩＩＩ）。
【００５５】
（ＤＡＤは研究ツールとしての有用性を有する）
これまで、アクチンの重合を活性化させる特異的な化合物は存在しない。ＤＡＤは、発現されたミニ遺伝子としてか、またはペプチドとして細胞に導入され得、これは、研究者に、細胞シグナル伝達、構造および生理の両方を研究するための独特なツールを提供する。ＤＡＤは、他のペプチド（例えば、ＨＩＶ  ｔａｔ由来のペプチド、ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、または炭疽致死因子複合体）にカップリングされ得、これは、この細胞への侵入を促進する。
【００５６】
従来の方法および組成物を使用して生成される、ＤＡＤ発現プラスミドまたはＤＡＤペプチドは、多数の生物および細胞型においてアクチン重合を誘導する試薬として使用され得る。ＤＡＤ誘導性細胞は、アクチン重合および細胞骨格を破壊する化合物についてのスクリーニングアッセイにおいて使用される。
【００５７】
一般に、次いで、ＤＡＤペプチドは、Ｒｈｏシグナル伝達をおよび細胞骨格調節経路を研究するための有用な生物学的ツールである。
【００５８】
（低分子ＧＴＰａｓｅの分子内活性化のためのレポーターとしてのＤＡＤ−ＧＢＤ相互作用）
ＤＡＤ−ＧＢＤ相互作用は、活性化Ｒｈｏに結合することによって破壊される。したがって、ＤＡＤおよび、独立して、ＤＲＦ  ｍＤｉａ２（またはそのヒトホモログ）由来のＧＢＤは、市販されている蛍光タンパク質（例えば、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の黄色変異体またはシアン変異体（例えば、ＥＹＦＰおよびＥＢＦＰ）に融合され、そして細胞内またはマウス内で、導入遺伝子として発現される。蛍光共鳴エネルギー移行（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を使用して、刺激されない細胞における、これらのポリペプチドの相互作用が、測定される（例えば、以下を参照のこと：Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２，２６３（４  Ｐｔ  １）：Ｃ７２３−８；Ｍａｔｙｕｓ  Ｌ．Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  Ｂ．１９９２，１２：３２３−３７；Ｍｉｔｒａ  ＲＤら、Ｇｅｎｅ．１９９６，１７３：１３−１７；Ｌａｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｌら、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｐｏｌ．１９９７，４４（３）：４７７−８９；Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８；６７：５０９−４４；Ｐｏｌｌｏｋ  ＢＡら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９，９（２）：５７−６０；Ｂａｓｔｉａｅｎｓ  ＰＩら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９，（２）：４８−５２；Ｐｅｒｉａｓａｍｙ  Ａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；５８：２９３−３１４；Ｚａｃｈａｒｉａｓ  ＤＡら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０００，１０：４１６−２１；Ｌｌｏｐｉｓ  Ｊら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００，９７：４３６３−８；Ｈｏｎｄａ  Ａら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１  ９８：２４３７−２４４２）。
【００５９】
ＤＡＤ−ＧＢＤ  ＦＲＥＴ技術は、ＤＡＤ−ＧＢＤ相互作用における効果について低分子ＧＴＰａｓｅの生物学的活性を試験するための新規のインビボモデルを表す。このアプローチは、インビボで潜在的に特異的な場合、他のＧＴＰａｓｅ結合タンパク質に適用され得る。
【００６０】
（ＤＡＤは、アポトーシスの誘導因子および抗癌剤としての役割を担う）
ＤＲＦは、哺乳動物細胞において安定な微小管の形成における役割を有する。本発明は、微小管運動の調節において、ＦＨタンパク質ための役割を補助する。ＤＡＤまたはＤＡＤ誘導ペプチドは、別の重要な用途を有し得る、つまり、拡大されたＤＡＤ発現は、プログラムされた細胞死を誘導する。同様の観察が、細胞を、また微小管を安定させる化合物である、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル）を用いた処理を使用してなされた（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，Ｖ．ら  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １１，１８３−１８８（１９９６））。アポトーシスを誘引するＴａｘｏｌおよびＤＡＤの能力は、正常な細胞運動の破壊によって媒介されると考えられる。細胞骨格破壊は、アポトーシスを誘引する、シグナル伝達および遺伝子発現の変更に直接的に結びつき得る。Ｔａｘｏｌ（Ｄｕｍｏｎｔｅｔ，Ｃ．ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７，１０６１−１０７０（１９９９）と同様に、ＤＡＤの誘導体は、抗腫瘍剤として有用である。
【００６１】
本明細書中に記載される組成物および方法は、インビトロまたはインビボで、任意の型の細胞の増殖を阻害するためそしてアポトーシスによって殺傷するために有用であり、ここで、細胞におけるアクチン重合およびアクチン繊維の安定化は、増殖阻害および／または細胞死を生じる。従って、本発明は、動物における腫瘍の処置のために特に有用である。
【００６２】
ＤＮＡまたはＤＮＡを含むベクターもしくは他のビヒクルの投与は、本明細書中に記載される遺伝子治療の実施形態におけるように、標的化される細胞の位置に依存して、多数の経路のいずれかを使用して行なわれる。従って、投与は、筋肉内、皮下または経皮、静脈内（門脈循環中を含む）、くも膜下腔内、腹腔内、胃内、および肺への吸入または滴下を含むがこれらに限定されない、任意の非経口経路によるものであり得る。本明細書中に開示される特定の送達ビヒクルの経口投与もまた、当該分野で公知である。
【００６３】
細胞の増殖を阻害するかまたは細胞の死を誘導するための有効量または有効用量の（ａ）ＤＡＤペプチドまたは機能的誘導体は、１細胞当り約０．０１フェムトグラム〜約１ピコグラムの範囲である。有効用量は、本明細書中に記載される種々の方法を使用して最適な用量範囲を同定するために、好ましくはインビトロで細胞を注入することによって、決定され得る。投与される投薬量は、レシピエントの健康および体重、他の同時処置の存在、存在する場合、処置の頻度、ならびに所望の効果の性質（例えば、腫瘍の根絶または自己免疫の処置）に部分的に依存する。
【００６４】
（ＤＡＤのアミノ酸置換および付加改変体）
少なくとも１つのアミノ酸残基および好ましくは唯一のアミノ酸残基が除去され、そして異なる残基がその位置に挿入されたＤＡＤペプチドもまた、本発明に含まれる。好ましくは、このような置換および付加は、所望の生物学的効果または生化学的効果を有意に減少させることなく、改善された生物学的活性または改善された臨床特性を生じる。１つ以上の残基の提案された置換または付加が、ペプチドに所望の影響を与えるか否かを評価することは、当業者の範囲内である。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９，およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８４（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。本発明のペプチド分子において作製され得る置換の型は、保存的置換であり、そして以下の群のうちの１つ中の変化として定義される：
１．小さく脂肪性の非極性またはわずかに極性の残基：例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ；
２．極性の負電荷残基およびこれらのアミド：例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の正電荷残基：例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ。
Ｐｒｏは、その異常な構造のために、密接に鎖を束縛する。機能的な特性における実質的な変化は、例えば、上の基（または上に示されない２つの他のアミノ酸基）中ではなく、これらの間で、より保存的でない置換を選択することによって作製され、これらの変化は、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）大量の側鎖、を維持することに対するこれらの影響においてより有意に異なる。本発明に従うほとんどの置換は、ペプチド分子の特徴において極端な変化を生じない置換である。そうする前に置換の正確な効果を推定することが困難である場合でさえ、当業者は、効果が、本明細書中に記載される慣例的なスクリーニングアッセイ、好ましくは生物学的アッセイおよび生化学的アッセイによって評価され得ることを理解する。酸化還元安定性または熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、あるいはキャリアと共に凝集する傾向、またはマルチマーへと凝集する傾向を含む、ペプチド特性の改変は、当業者に周知である方法によって評価される。
【００６５】
（ＤＡＤの化学的誘導体）
ＤＡＤの「化学的誘導体」は、通常ペプチドの一部ではないさらなる化学的部分を含む。ペプチドの共有結合的改変は、本発明の範囲に含まれる。このような改変は、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と、ペプチドの標的化アミノ酸残基を反応させることによって、分子に導入され得る。
【００６６】
以下に考察されるキャップペプチドは、「天然の」未キャップのペプチドの好ましい化学的誘導体の例である。置換または付加改変体の現在の組み合わせのいずれかは、本明細書中に開示されるキャップ基のいずれかでキャップされ得る。
【００６７】
ペプチドの化学的誘導体の他の例は、以下の通りである。
【００６８】
リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物で誘導体化される。環状のカルボン酸無水物での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬としては、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４ペンタンジオン；およびグリオキル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【００６９】
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボキシイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ−Ｒ’）と反応することによって選択的に改変され得る。さらに、アルパルチル残基およびグルタミル残基はまた、アンモニアとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換され得る。
【００７０】
他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジンのアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出、ｐｐ７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００７１】
本明細書中に開示される全てのペプチド配列について、本発明は、対応するレトロ−インベルソ（ｉｎｖｅｒｓｏ）配列を含み、ここで、ペプチド鎖の方向は逆であり、そして全てのアミノ酸は、Ｄ−シリーズに属する。Ｌ−シリーズペプチドについて特定されたＮ末端キャップ基の完全な範囲およびＣ末端キャップ基の完全な範囲はまた、Ｄシリーズペプチドについて意図される。
【００７２】
１つ以上のＤ−アミノ酸が１つ以上のＬ−アミノ酸と置換されたペプチドもまた含まれる。さらに、改変されたアミノ酸またはアミノ酸の化学的誘導体は、ペプチドが、通常天然タンパク質の一部分ではなく、さらなる化学的部分または改変されたアミノ酸を含むように、提供され得る。このような誘導された部分は、可溶性、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。このような効果を媒介し得る部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）において開示される。
【００７３】
（マルチマーペプチド）
本発明はまた、ＤＡＤの塩基性ペプチド配列が、介在するスペーサーまたはリンカーを用いてかまたは用いずに、約２〜約１００回繰り返されるより長いペプチドを含む。ペプチド配列番号１のマルチマー（ＤＡＤとしてこの節において記号的に称され、ここで、Ｄ、ＡおよびＤは、単一のアミノ酸を示さない）は、以下の式
（ＤＡＤ−Ｘｍ）ｎ−ＤＡＤ（ここで、ｍ＝０または１、ｎ＝１〜１００。Ｘは、スペーサー基、好ましくは、９個までの酸素原子またはＧｌｙｚ（ｚ＝１〜１０）を含む、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ２０ポリエーテル）によって示される。
【００７４】
このようなマルチマーは、本明細書中に記載されるペプチド改変体のいずれかから構築され得ることが理解される。さらに、ペプチドマルチマーは、ペプチドモノマーおよび開示されたその置換改変体の異なる組み合わせを含み得る。こののようなオリゴマーまたはマルチマーペプチドは、本明細書中に考察されるような、化学合成または組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。化学的に生成される場合、オリゴマーは、好ましくは、塩基性ペプチド配列の２〜８の反復を有する。組換え的に生成される場合、マルチマーは、発現系が許容する限り多数の反復（例えば、２〜約１００の反復）を有し得る。
【００７５】
（ペプチド模倣物）
この点において有用である別のクラスの化合物は、ＤＡＤとＧＢＤとの間の相互作用に影響する低分子量のペプチド模倣化合物（この用語はまたペプチド模倣物を含む）である。このようなペプチド模倣物は、候補ペプチド模倣物の存在下または非存在下で、ＤＡＤおよびＧＢＤの共同結晶化を比較する構造的研究によって同定され得る。
【００７６】
ＤＡＤのペプチド模倣物は、
［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］
の生物学的効果を模倣する。
【００７７】
ペプチド模倣因子は、これがペプチドの結合活性または生物学的活性を有するように、非天然ペプチドまたは
［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］
の立体化学的特性を有する非ペプチド因子であり得る。従って、本発明は、ペプチド模倣化合物が別のペプチドに結合される化合物を含む。
【００７８】
ペプチド模倣因子は、これがＤＡＤの結合活性または生物学的活性を有するように、非天然ペプチドまたはＤＡＤの結合エレメントの立体空間的特性を再生成する非ペプチド因子であり得る。ＤＡＤに対応する直鎖状ペプチドと同様に、ペプチド模倣物は、結合表面（これは、ＧＢＤと相互作用する）および非結合表面を有する。さらに、ＤＡＤの直鎖状ペプチドと同様に、ペプチド模倣物の非結合表面は、ペプチド模倣物の結合表面を改変することなく、種々の治療的部分によって改変され得る官能基を含む。ペプチド模倣物の好ましい実施形態は、分子の非結合表面上にアニリンを含む。アニリンのＮＨ２基は、約４．５のｐＫａを有し、従って、ペプチド模倣物の結合表面上の任意のＮＨ２官能基を改変することなく、任意のＮＨ２選択的試薬によって改変され得る。他のペプチド模倣物は、これらの結合表面上にいずれのＮＨ２官能基も有さずともよく、従って、任意のＮＨ２は、ｐＫａに関係せず、結合体化のための部位として非結合表面上に提示され得る。さらなる他の改変可能な官能基において、例えば、−ＳＨおよび−ＣＯＯＨは、結合体化部位としてペプチド模倣物の非結合表面に組み込まれ得る。治療部分はまた、ペプチド模倣物の合成の間に直接的に組み込まれ得、そして分子の非結合表面上に優先的に提示され得る。
【００７９】
本発明はまた、部分的なペプチド特徴を保持する化合物を含む。例えば、本発明のペプチド内の任意のタンパク質分解的に不安定な結合は、アイソスター（Ｎ−メチル化；Ｓ１部位におけるＤ−アミノ酸）のような非ペプチドエレメント、または還元されたペプチド結合によって選択的に置換され得るが、分子の残りは、そのペプチド性質を保持する。
【００８０】
オピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼなどのような多数の生物活性ペプチドについてのペプチド模倣化合物（アゴニスト、基質、またはインヒビターのいずれか）が、記載されている。ペプチド模倣化合物を設計および調製するための方法は、当該分野で公知である（Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３−１０８２（１９９３）；Ｗｉｌｅｙ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７−３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３：９１−１４１（１９９５）；Ｇｉａｎｎｉｓら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１−７８（１９９７）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される））。これらの方法は、環状ペプチドの少なくとも結合能力および結合特異性を保有し、そして好ましくは生物学的活性をも保有するペプチド模倣物を作製するために使用される。当業者に利用可能なペプチド化学および一般的な有機化学の知識は、このような化合物の設計および合成のために、本発明の開示を考慮して十分である。
【００８１】
例えば、このようなペプチド模倣物は、遊離しているかまたはＧＢＤとの複合体中で結合しているかのいずれかの本発明のペプチドの結晶学的に誘導された三次元構造の検査によって同定され得る。あるいは、ＧＢＤに結合した本発明のペプチドの構造は、核磁気共鳴質量分光学を使用して得られ得る。ペプチドのその結合パートナーとの相互作用の立体化学のよりよい知識により、このようなペプチド模倣因子の合理的な設計が可能となる。
【００８２】
（ペプトイド）
ペプトイドは、Ｎ置換グリシンのオリゴマーである（Ｓｉｍｏｎ  ＲＪら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９２  ８９：９３６７−９３７１）。非ペプチド、低分子アゴニストおよびアンタゴニストの設計に対する「ペプトイド」アプローチはまた、Ｈｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９５，１３：１３２−１３４によって記載される。ＤＡＤのペプトイドは、１つ以上のこのようなＮ置換グリシンでの置換、または付加を含む。置換基は、４−アミノフェノール、イソブチルアミン、ブチルアミン（ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ２）、シクロヘキサンメチルアミン、アミノメチルシクロプロパン、ベンジルアミン、メチルアミン、イソプロピルアミン、Ｒ（＋）−（Ｌ−メチルベンジルアミン）、５−（−１−α−メチルベンジルアミン、Ｎ−３−グアニジノプロピルなどであり得る。このような置換は、Ｎｇｕｙｅｎ．Ｊ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２：２０８８−２０９２によってＳＨ３結合ペプトイドの増加した生物活性を生じることが以前に示されている。しかし、置換基は、Ｎグリシン産物がペプトイド中でさらに結合され得る限り、グリシン中のＮ位置で置換され得る実質上任意の置換基であり得る。
【００８３】
（キャップペプチド）
ペプチド［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］、またはその活性フラグメントは、好ましくは、それぞれアミノ末端Ｎに結合したアセチル（「Ａｃ」）およびアミド（Ｃ末端のカルボキシル基に結合した−ＮＨ２（「Ａｍ」））を用いて、そのアミノ末端およびカルボキシル末端においてブロックされ得るかまたはキャップされ得る。このペプチドは、Ａｃ基およびＡｍ基としてブロック基を示す１文字コードで参照され得る：
Ａｃ−［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］−Ａｍ
Ｎ末端キャップ官能基は、好ましくは、末端アミノ官能基に結合され、そして以下からなる群より選択され得る：
ホルミル；１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル（例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル）；１〜１０個の炭素原子を有するアルケノイル（例えば、ｈｅｘ−３−エノイル）；１〜１０個の炭素原子を有するアルキノイル（例えば、ｈｅｘ−５−ｙｎｏｙｌ；アロイル（例えば、ベンゾイルまたは１−ナフトイル）；ヘテロアロイル（例えば、３−ピロイルまたは４−キノロイル）；アルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル）；アリールスルホニル（例えば、ベンゼンスルホニルまたはスルファニリル）；ヘテロアリールスルホニル（例えば、ピリジン−４−スルホニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルカノイル（例えば、４−アミノブチリル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケノイル（例えば、６−ヒドロキシ−ｈｅｘ−３−エノイル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキノイル（例えば、３−ヒドロキシ−ｈｅｘ−５−ｙｎｏｙｌ）；
置換アロイル（例えば、４−クロロベンゾイルまたは８−ヒドロキシ−ｎａｐｈｔｈ−２−ｏｙｌ）
置換へテロアロイル（例えば、２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−メチル−キナゾリン−６−ｏｙｌ）；
置換アルキルスルホニル（例えば、２−アミノエタンスルホニル）；
置換アリールスルホニル（例えば、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル）；
置換へテロアリールスルホニル（例えば、１−メトキシ−６−イソキノリンスルホニル）；カルバモイルまたはチオカルバモイル；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）であって、ここで、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリール、または置換へテロアリールである；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）であって、ここで、Ｒ’は、全て上に定義されるように、アルカノイル、アルケノイル、アルキノイル、アロイル、ヘテロアロイル、置換アルカノイル、置換アルケノイル、置換アルキノイル、置換アロイル、または置換へテロアロイルである。
【００８４】
Ｃ末端キャップ官能基は、末端カルボキシルとのアミド結合でか、または末端カルボキシルとのエステル結合でのいずれかで、存在し得る。アミド結合を提供するキャップ官能基は、ＮＲ１Ｒ２として命名され、ここで、Ｒ１およびＲ２は、以下の基より独立して引き出され得る：
水素；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル）；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルケニル（例えば、ｐｒｏｐ−２−ｅｎｙｌ）；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキニル（例えば、ｐｒｏｐ−２−ｙｎｙｌ）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキル（例えば、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、ハロゲノアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルカノイルアルキル、カルボキシアルキル、カルバモイルアルキル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケニル（例えば、ヒドロキシアルケニル、アルコキシアルケニル、メルカプトアルケニル、アルキルチオアルケニル、ハロゲノアルケニル、シアノアルケニル、アミノアルケニル、アルキルアミノアルケニル、ジアルキルアミノアルケニル、アルカノイルアルケニル、カルボキシアルケニル、カルバモイルアルケニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキニル（例えば、ヒドロキシアルキニル、アルコキシアルキニル、メルカプトアルキニル、アルキルチオアルキニル、ハロゲノアルキニル、シアノアルキニル、アミノアルキニル、アルキルアミノアルキニル、ジアルキルアミノアルキニル、アルカノイルアルキニル、カルボキシアルキニル、カルバモイルアルキニル）；
１０個までの炭素原子を有するアロイルアルキル（例えば、フェナシルまたは２−ベンゾイルエチル）；
アリール（例えば、フェニルまたは１−ナフチル）
ヘテロアリール（例えば、４−キノリル）；
１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル（例えば、アセチルまたはブチリル）
アロイル（例えば、ベンゾイル）；
ヘテロアロイル（例えば、３−キノロイル）；
ＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’’であって、ここで、Ｒ’およびＲ’’は、独立してハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アロイル、スルホニル、スルフィニル、またはＳＯ２−Ｒ’’’もしくはＳＯ−Ｒ’’’であり、ここで、Ｒ’’’は、置換または未置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはアルキニルである。
【００８５】
ペプチド模倣物およびマルチマーペプチドおよびペプトイドを含む、全ての前述のペプチド、ペプトイド、改変体および化学的誘導体は、以下の通りに［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］の生物学的または生化学的活性（例えば、結合、ＤＡＤ−ＧＢＤ相互作用の破壊など）を有さなければならない：細胞生存率またはアポトーシスのインビトロアッセイにおけるこのペプチドの活性の少なくとも約２０％。あるいはまたはさらに、改変体、化学的誘導体またはペプトイドは、細胞全体、細胞画分、単離されたＧＢＤ含有タンパク質もしくはペプチド、または任意の他の結合分子を用いる結合アッセイで試験される場合、リガンドまたは結合パートナー（好ましくは、ＧＢＤ）に結合について標識された［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］と競合するはずである。
【００８６】
（ペプチドおよび誘導体の生成）
（一般的な化学的合成手順）
本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。しかし、これらの長さを考えると、これらは、好ましくは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−５４（１９６３）によって一般に記載されるような固相合成を使用して調製され得るが、当該分野で公知の他の等価な化学合成もまた、有用である。固相ペプチド合成は、保護αアミノ酸を適切な樹脂に結合することによってペプチドのＣ末端から開始され得る。このような開始物質は、クロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂へのエステル結合によってか、またはＢＨＡ樹脂もしくはＭＢＨＡ樹脂へのアミド結合によって、α−アミノ−保護アミノ酸を結合することによって調製され得る。
【００８７】
ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄａｎｓｋｙら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．，３８：１５９７−９８（１９６６）によって記載される。クロロメチル化樹脂は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．およびＬａｂ．Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販される。このような樹脂の調製は、Ｓｔｅｗａｒｔら、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  １９６９）第１章、１−６によって記載されている。ＢＨＡ樹脂およびＭＢＨＡ樹脂の支持体は、市販されており、そして合成される所望のポリペプチドがＣ末端に未置換アミドを有する場合のみ、一般に使用される。
【００８８】
アミノ酸は、ペプチド結合の形成について、当該分野で周知の技術を使用して、伸長するペプチド鎖に結合され得る。例えば、１つの方法は、アミノ酸のカルボキシル基を、伸長するペプチド鎖の遊離Ｎ末端アミノ基との反応により感受性にする誘導体にアミノ酸を変換する工程を包含する。具体的には、保護アミノ酸のＣ末端は、クロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸ｓｅｃ−ブチル、クロロギ酸イソブチル、もしくは塩化ピバロイルまたは酸塩化物などとのＣ末端の反応によって混合無水物に変換され得る。あるいは、アミノ酸のＣ末端は、活性エステル（例えば、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールから形成されるエステル）に変換され得る。別の結合方法は、適切な結合剤（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）の使用を包含する。当業者に明らかな他の適切な結合剤は、Ｇｒｏｓｓら、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻；「Ｍａｊｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９７９）において開示される。
【００８９】
ペプチド合成において使用される各アミノ酸のα−アミノ基は、これらの活性α−アミノ官能基を含む副反応を防ぐために、結合反応の間に保護されなければならない。特定のアミノ酸は、反応性の側鎖官能基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、およびヒドロキシル）を含み、そしてこのような官能基はまた、最初および引き続く結合工程の両方の間、（１）α−アミノ基部位または（２）反応性側鎖部位のいずれかにおいて生じる化学的反応を防ぐための適切な保護基で保護されなければならない。
【００９０】
ペプチドの合成において使用される特定の保護基の選択において、以下の一般的なルールが、代表的に伴う。具体的には、α−アミノ保護基は、（１）結合反応において使用される条件下で、α−アミノ官能基を不活性にするべきである、（２）側鎖保護基を除去せずそしてペプチドフラグメントの構造を変更しない条件下での結合反応後、容易に利用可能であるべきである、そして（３）結合の直前に、活性化の際のラセミ化の可能性を実質的に減少させるべきである。他方、側鎖保護基は、（１）結合反応において使用される条件下で、側鎖官能基を不活性にするべきである、（２）α−アミノ保護基を除去する際に使用される条件下で安定であるべきである、そして（３）ペプチド鎖の構造を変更しない反応条件下で所望の十分に構築されたペプチドから容易に除去可能であるべきである。
【００９１】
ペプチド合成に有用であることが公知の保護基が、それらの除去に使用される因子で反応性が変化することは、当業者に明らかである。例えば、特定の保護基（例えば、トリフェニルメチルイソプロピルオキシカルボニルおよび２−（ｐ−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニル）は、非常に不安定であり、そして温和な酸条件下で切断し得る。他の保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチル−オキシカルボニルおよびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）は、あまり不安定ではなく、それらの除去には中程度に強い酸（例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸、または酢酸中の三フッ化ホウ素）を必要とする。さらに他の保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺまたはＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、およびイソプロピルベンジルオキシカルボニル）は、さらにあまり不安定ではなく、それらの除去にはさらにより強い酸（例えば、フッ化水素、臭化水素、またはトリフルオロ酢酸中のトリフルオロ酢酸ホウ素）が必要とされる。当該分野で公知の適切な保護基は、Ｇｒｏｓｓら，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｙａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８１）に記載される。
【００９２】
好ましいα―アミノ保護基は、ＢＯＣおよびＦＭＯＣである。Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基について、保護は、上記の（１）に言及される基のうちのいずれか（例えば、ＢＯＣ、２−クロロベンジルオキシカルボニルなど）であり得る。Ａｒｇのグアニジノ基について、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（２，２，５，７，８−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−６−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）、２，３，６−トリメチル−４−メトキシフェニルスルホニル、またはＢＯＣ基によって提供され得る。ＳｅｒまたはＴｈｒのヒドロキシル基について、保護は、例えば、ｔ−ブチル；ベンジル（ＢＺＬ）；または置換ＢＺＬ（例えば、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｏ−クロロベンジル、および２，６−ジクロロベンジルによる保護であり得る。ＡｓｐまたはＧｌｕのカルボキシル基について、保護は、例えば、ＢＺＬ、ｔ−ブチル、シクロヘキシルなどの基を用いるエステル化によるものであり得る。Ｈｉｓのイミダゾール窒素について、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）またはトシル部分が、保護基として適切に使用される。Ｔｙｒのフェノールヒドロキシル基について、保護基（例えば、テトラヒドロプラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４−ブロモベンジル、および２、６−ジクロロベンジル）が、適切に使用される。好ましい保護基は、ブロモベンジルオキシカルボニルである。ＡｓｎまたはＧｌｕの側鎖アミノ基について、キサンチル（Ｘａｎ）が、好ましく使用される。Ｍｅｔについて、アミノ酸は、好ましくは保護されないままである。Ｃｙｓのチオ基について、ｐ−メトキシベンジルが、代表的に使用される。
【００９３】
他の標準的なα−アミノ基脱保護試薬（例えば、ジオキサン中のＨＣＬ）、および特定のα−アミノ保護基の除去についての条件は、当業者の範囲内である（例えば、Ｌｕｂｋｅら，Ｃｈｅｍｉｅ  ｕｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ａｍｉｎｏｓａｕｒｅｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｕｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｅ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ＩＩ−１，１０２−１１７（Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９７５）に記載されるようなα−アミノ基脱保護試薬および条件）。アミノ保護基の除去後、保護されていないα−アミノ基（一般的に、なお側鎖は保護されている）が、意図された配列と段階的な様式でカップリングされ得る。
【００９４】
段階的な手段と代替的であるのは、フラグメントの縮合方法であり、ここで、短い長さの予め形成したペプチド（各々が、所望の配列の一部を表す）が、固相支持体に結合したアミノ酸の成長する鎖にカップリングされる。この段階的手段について、特に適切なカップリング試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドである。さらに、フラグメント手段について、カップリング試薬の選択ならびに所望の性質およびサイズのフラグメントをカップリングするために必要とされる断片化パターンの選択は、成功するために重要であり、そして当業者に公知である。
【００９５】
各保護されたアミノ酸またはアミノ酸配列は、通常、過剰量の化学量論的量で固相反応器に導入され、そしてカップリングは、有機溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＣＨ２Ｃｌ２、またはこれらの混合物）中で適切に実行される。不完全なカップリングが生じる場合、カップリング手順は、次のアミノ酸に対するカップリングに備えて、Ｎ−アミノ保護基の除去前に慣例的に繰り返される。α−アミノ保護基の除去後、残存するα−アミノ酸および側鎖が保護されたアミノ酸は、意図された配列に段階的様式でカップリングされ得る。合成の各段階におけるカップリング反応の成功は、モニターされ得る。合成をモニタリングする好ましい方法は、ニンヒドリン反応（例えば、Ｋａｉｓｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４：５９５（１９７０）によって記載される）による方法である。カップリング反応はまた、周知の市販の方法およびデバイス（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ９９０  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて自動で実行され得る。
【００９６】
所望のペプチド配列の完了の際、保護されたペプチドは、樹脂支持体から切断されなけらればならず、そして全ての保護基が除去されなければならない。保護基の切断反応および除去は、脱保護反応と同時または連続して適切に達成される。ペプチドを樹脂に固着させる結合がエステル結合である場合、これは、エステル連結を破壊し得、かつ樹脂マトリックスを透過し得る任意の試薬によって切断され得る。１つの特に有用な方法は、無水フッ化水素水溶液を用いた処理によるものである。この試薬は、通常、樹脂からペプチドを切断するだけではなく、全ての酸不安定保護基も除去し、ゆえに、完全に脱保護されたペプチドを直接的に提供する。酸不安定性であるさらなる保護基が存在する場合、さらなる脱保護工程が実行されなければならない。これらの工程は、特定の必要性および状況に応じて、上記のフッ化水素処理の前または後のいずれかに実行され得る。
【００９７】
保護基を除去することなくペプチドを切断することが望ましい場合、保護されたペプチド−樹脂は、メタノール分解（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）に供され得、このようにしてＣ末端カルボキシル基がメチル化された保護されたペプチドを生じる。このメチルエステルは、引き続いて温和なアルカリ条件下で加水分解され、遊離のＣ末端カルボキシル基を生じ得る。次いで、ペプチド鎖上の保護基は、強酸（例えば、フッ化水素液）を用いた処理によって除去され得る。メタノール分解に特に有用な技術は、Ｍｏｏｒｅら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｆｉｆｔｈ  Ａｍｅｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，５１８−５２１（Ｇｏｏｄｍａｎら，編，１９７７）（ここで、保護されたペプチド−樹脂は、クラウンエーテルの存在下でメタノールおよびシアン化カリウムを用いて処理される）の技術である。
【００９８】
クロロメチル化された樹脂が使用される場合に、樹脂から保護されたペプチドを切断するための他の方法としては、（１）アンモニア分解および（２）ヒドラジン分解が挙げられる。所望される場合、生じるＣ末端アミドまたはヒドラジドは、遊離のＣ末端カルボキシル部分に加水分解され得、そして保護基は慣例に従って除去され得る。Ｎ末端α−アミノ基上に存在する保護基は、保護されたペプチドが支持体から除去される前または後のいずれかに除去され得る。本発明のペプチドの精製は、代表的に、クロマトグラフィー技術（例えば、調製ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（モノクローナル抗体カラムを含む）など）または他の従来の技術（例えば、逆流分配など）を用いて達成される。
【００９９】
（遺伝子「治療」）
Ｄｉａタンパク質が細胞周期進行の正常な制御（例えば、細胞分裂の完了）において役割を果たすので、これらの遺伝子は、腫瘍抑制因子（これらの変異または欠失が、増殖制御からの逸脱および腫瘍形成を導き得る）としてはたらくと考えられている。Ｄｉａ機能の崩壊は、細胞分裂の調節不全を導き得る。例えば、変異し機能的でないｍＤｉａ２遺伝子を欠損しているかまたは変異している細胞（またはこのような細胞を有する被験体）は、処理され得、そして調節不全が機能的遺伝子またはその残物の導入によって補正される。本発明に従って、外因性に細胞へ導入されるか、または細胞の遺伝子改変後に細胞中で発現されるＤＡＤまたはＤＡＤ様ペプチドが、このような条件を補正または処理するために使用される。同様に、ｍＤｉａ２欠損は、特定の型の腫瘍において、「自然の」腫瘍進行の一部として生じ得る。従って、この機能の回復（ＤＡＤを用いるか、またはＤＡＤを発現させることによってこのような細胞中でアポトーシスを誘導する）は、ｍＤｉａ２機能またはＤＡＤペプチドをコードする別の遺伝子の機能の欠損が病原性プロセスの一部である進行している腫瘍を有する被験体の処置に対して好ましい手段である。ＤＡＤの導入は、総称して「遺伝子移入」または「遺伝子治療」（以下に議論される）として公知である種々の方法によって達成され得る。
【０１００】
本発明の別の使用は、ｍＤｉａ遺伝子（例えば、ｍＤｉａ２）またはそのヒトホモログの発現について細胞をスクリーニングすることである。ＤＡＤは、タキソールと同様の様式で微小管を安定化し、細胞の殺傷を引起す。従って、腫瘍がｍＤｉａの発現の選択的な欠失（本明細書中に開示されるようにＤＡＤ発現によって修正可能である）を有するか否かを知ることが有用である。従って、本明細書中に記載される治療実施形態と組み合わせて、腫瘍がＤＡＤに基づく治療を比較的受けやすいかまたはこの治療に耐性であるかどうかを決定するために、従来の方法を用いて、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかにおけるｍＤｉａ遺伝子発現について、細胞をスクリーニングする方法が、提供される。抗ｍＤｉａ抗体が、これに関して有用である。さらに、ｍＤｉａ遺伝子発現の測定としてＤＡＤペプチドを直接スクリーニングすることが可能である。
【０１０１】
遺伝子治療または遺伝子移入としては、細胞および最終的に生きた動物への「外来」遺伝子の導入が挙げられる。遺伝子治療についてのいくつかの一般的な戦略が、研究され、そして広範囲で概説されている（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−３５６（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（補遺６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）；Ｚｗｉｅｂｅｌ，Ｊ．Ａ．ら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６１８：３９４−４０４（１９９１）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３８：９１−１３５（１９９０）；Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．７：１７９−１９２（１９８９）（これらの参考文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。
【０１０２】
１つの手段は、培養中の初代細胞への遺伝子移入、その後のエキソビボでの形質転換された細胞の宿主への自家移植（全身または特定の器官もしくは組織のいずれか）を含む。
【０１０３】
本発明の目的を達成するために、遺伝子治療は、機能的に活性なＤＮＡの哺乳動物体組織または器官へのインビボでの直接的な移入、より好ましくは機能的に活性なＤＮＡの増殖を休止している細胞への直接的な移入によって達成される。ＤＮＡ移入は、以下に記載の多数の手段を用いて達成されえる。これらの系は、最初に、そのＤＮＡを発現するトランスフェクトされたクローンを選択するための選択マーカー（例えば、Ｇ４１８耐性）の使用によってインビトロにおいて好首尾な発現について試験され得、続いて、インデューサーを用いた処理の後の所望の遺伝子産物の存在が、適切な免疫アッセイにおいてその産物に対する抗体を用いて検出され得る。手順の効率（ＤＮＡ取り込み、プラスミドの組み込みおよび組込まれたプラスミドの安定性を含む）は、公知の方法を用いるプラスミドＤＮＡの直線化、および「キャリア」として高分子量の哺乳動物ＤＮＡを用いての同時トランスフェクションによって、改善され得る。
【０１０４】
当該分野で公知の遺伝子の好首尾な移入の例としては、以下が挙げられる：（ａ）マウス筋組織へのプラスミドＤＮＡの直接的な注射（これは、不定の期間にわたってマーカー遺伝子の発現を導く）（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）；Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ら，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ
Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３：７１（１９９１））；（ｂ）レトロウイルスベクターは、血管組織のインビボおよびインサイチュ感染に有効である；（ｃ）肝臓へのレトロウイルス調製物の門脈注射および直接的な注射は、遺伝子移入およびインビボにおける発現をもたらす（Ｈｏｒｚａｇｌｏｕ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７２８５（１９９０）；Ｋｏｌｅｋｏ，Ｍ．ら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２７（１９９１）；Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３８７（１９９１））；（ｄ）肺組織への組換えアデノウイルスの気管内注入は、肺気道上皮におけるインビボ移入および外来遺伝子の延長した発現に有効であった（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１（１９９１）；（ｅ）単純疱疹ウイルスベクターは、脳組織へのインビボ遺伝子移入を達成した（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ら編，Ｍｉａｍｉ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ−Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ１，Ｂｏｅｒｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ，１９９１）。
【０１０５】
レトロウイルス媒介ヒト遺伝子治療は、両栄養性複製欠損レトロウイルス系を利用する（Ｔｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１１１（１９９０）；Ｔｅｍｉｎら，米国特許第４，９８０，２８９号；Ｔｅｍｉｎら，米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら，米国特許第５，１２４，２６３号；Ｗｉｌｌｓ，Ｊ．Ｗ．，米国特許第５，１７５，０９９号；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，米国特許第４，８６１，７１９号）。このようなベクターは、機能的ＤＮＡをヒト細胞またはヒト組織に導入するために使用されている（例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子のリンパ球への導入、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子および腫瘍壊子因子の遺伝子の腫瘍浸潤リンパ球への導入）。レトロウイルス媒介遺伝子送達は、一般的に、遺伝子移入のために標的細胞の増殖を必要とする（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０））。この条件は、本発明のＤＮＡ分子に対して好ましい標的細胞（すなわち、活発に増殖している腫瘍細胞）によって満たされる。多数の方法のうちのいずれかを使用するプラスミドによっておよびレトロウイルスベクターによるトランスフェクションを使用する嚢胞性線維症の遺伝子治療は、Ｃｏｌｌｉｎｓら、米国特許第５，２４０，８４６号に記載される。
【０１０６】
増殖阻害ＤＡＤ配列をコードするＤＮＡ分子は、当該分野で周知であるように、複製欠損レトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を用いてレトロウイルスベクターにパッケージングされ得る（例えば、Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９−６３５３（１９８４）；Ｍａｎｎ，Ｒ．Ｆ．ら，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−１５９（１９８３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７（１９８５）；Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｈｏｃｋ，Ｒ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：２５７（１９８６）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２（１９８６）を参照のこと。遺伝子移入に効率的で安全であるより新しいパッケージング細胞株が、より最近に記載されている（Ｂａｎｋら，米国特許第５，２７８，０５６号；）。
【０１０７】
遺伝子治療手段は、部位特異的様式で利用され、レトロウイルスベクターを選択した組織または器官に送達し得る。従って、例えば、カテーテル送達系が使用され得る（Ｎａｂｅｌ，Ｅ．Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１３４２（１９８９））。このような方法（レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターのいずれか）は、血管壁への遺伝子の送達または腫瘍の血液循環への遺伝子の送達に特に有用である。他のウイルスベクター（例えば、組換えアデノウイルスベクター（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．：ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，１６７９頁；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６  ９１９１９８８、Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｓ．Ｅ．：ＴＨＥ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＥＳ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．編．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４，第１１章）、ニューロン特異的送達および持続のための単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）を含む）もまた、使用され得る。ヒト遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの利点としては、組換えが稀であるという事実、このようなウイルスと関連するヒトの悪性腫瘍が公知ではないこと、アデノウイルスゲノムが二本鎖ＤＮＡ（これは、７．５ｋｂｋまでのサイズの外来遺伝子を受け入れるために操作され得る）であり、そして生アデノウイルスが安全なヒトワクチン生物であることである。アデノ随伴ウイルスもまた、本発明の方法に従って、ヒト遺伝子治療に有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９４１（１９９１））。
【０１０８】
本発明のＤＮＡ分子を発現し得、かつ遺伝子治療（特にヒトにおいて）に有用な別のベクターは、非複製性にされ得るワクシニアウイルスである（米国特許第５，２２５，３３６号；同第５，２０４，２４３号；同第５，１５５，０２０号；同第４，７６９，３３０；Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０８４７−１０８５１；Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：２５４９−２５５３；Ｆａｌｋｎｅｒ  Ｆ．Ｇ．ら．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：７１９２；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３４０３−３４０９）。異種ＤＮＡを含む組換えワクシニアウイルスおよび他のウイルス、ならびに免疫および遺伝子治療におけるこれらの使用は、Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（１９９３）３：８６−９０；Ｍｏｓｓ，Ｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）２０：３４５−３６２；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ
Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：２５−３８；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６６２−１６６７；Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａら．，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）３４：４３−６４；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら．，Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆ  Ａｎａｌ（１９８３）３：２０１−２１３に概説される。
【０１０９】
インビボにおけるウイルス媒介遺伝子移入に加えて、当該分野で周知の物理的な手段が、直接的な遺伝子移入に使用され得、これらとしては、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆら，１９９０，前出）および粒子ボンバードメント媒介遺伝子移入（Ｙａｎｇ，Ｎ．−Ｓ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２７２６（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８０：９４（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４４：６５（１９８９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１１（１９９１））が挙げられる。さらに、エレクトロポレーション（インビトロにおける細胞への遺伝子移入のための周知の手段）を使用して、インビボの組織に、本発明に従うＤＮＡ分子を移入させ得る（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，Ａ．Ｖ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：１３１（（１９９１））。
【０１１０】
遺伝子移入はまた、「キャリア媒介遺伝子移入」（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）；Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７１２８（１９８３）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：７８５１（１９８２）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２））。好ましいキャリアは、標的化リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：１０６８（１９８３）；Ｓｏｒｉａｎｏら，前出）、例えば、免疫リポソーム（これは、アシル化モノクローナル抗体を脂質二重層に組み込み得る（Ｗａｎｇら、前出）である。種々の型の腫瘍に特異的なポリクローナル抗体およびｍＡｂは、当該分野で周知である。アシアロ糖タンパク質／ポリリジン（Ｗｕら，１９８９，前出）のようなポリカチオンが使用され得、ここで、この結合体は、標的組織を認識する分子（例えば、肝臓に対するアシアロオロソムコイド）およびトランスフェクションされるＤＮＡに結合するＤＮＡ結合化合物を含む。ポリリジンは、ＤＮＡに損傷を与えることなくＤＮＡに結合するＤＮＡ結合分子の例である。次いで、この結合体は、移入のために本発明に従うプラスミドＤＮＡと複合体化する。
【０１１１】
プラスミドベクターは、増殖抑制ＤＡＤペプチドの細胞中での発現のために、インビトロまたはインビボでその細胞に微量注入され得る。あるいは、インビボで細胞を感染し得、それによって本発明のＤＮＡ分子を送達し得るレトロウイルスまたはアデノウイルスのようなベクター中に、ＤＮＡ分子が配置され得る（以下を参照のこと）。トランスフェクションまたはマイクロインジェクションに使用されるプラスミドＤＮＡは、当該分野で周知の方法（例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ手順（Ｑｕｉａｇｅｎ）、続く、公知の方法（例えば、本発明の例示される方法）を用いたＤＮＡ精製）を用いて調製され得る。
【０１１２】
同様に、ＤＡＤ配列を含むペプチドまたはポリペプチドは、標的細胞に微量注入され得る。十分な間隔の後、細胞は、免疫蛍光によってかまたはトランスフェクトされている増殖阻害ＤＮＡの発現のための他の手段によって、試験され得る。増殖阻害は、特異的抗体を用いて、組込まれたＢｒｄＵを提供することによって試験され得る。
【０１１３】
一旦標的細胞にトランスフェクトされると、細胞増殖を阻害する本発明のＤＮＡ分子の能力は、当該分野で公知の任意の細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）アッセイまたは細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）アッセイを用いて試験され得る。コロニー形成効率のアッセイは、標的細胞の特定のクラスについて使用され得る。放射性標識前駆体（例えば、３Ｈ−チミジン）の取り込みを測定することもまた、有用である。なお別のアッセイとしては、色素生成染料（例えば、テトラゾリウム塩ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６５：５５−６３（１９８３））（これは、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素によって改変されて、青色のホルマザン生成物を形成し、この吸光度は、５７０ｎｍにおいて分光光度計によって測定され得る）の取り込みが挙げられる。特定の範囲の細胞数にわたって、この基質は、細胞数と形成される色との間に線形の関係を生じる。
【０１１４】
（プラスミド）
本発明のＤＮＡ分子および誘導体は、当該分野で周知のように、任意の適切な発現ベクターを用いて発現され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。１つの有用な発現ベクターは、ｐＧＥＸ−ＫＧである。
【０１１５】
好ましい発現プラスミドは、以下の実施例１および図面の説明に記載される。
【０１１６】
より一般的には、ＤＡＤをコードするＤＮＡ分子またはその誘導体は、従来方法（連結のための平滑末端もしくはスタッガー末端（ｓｔｕｇｇｅｒｅｄ−ｅｎｄｅｄ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、粘着末端の充填（適切な場合）、所望されない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、適切なリガーゼとの連結、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるフラグメントの合成を含む）に従って、ベクターＤＮＡと組み換えられ得る。このような操作についての技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）によって開示され、そして当該分野で周知である。
【０１１７】
特定の細胞型（例えば、インビボで増殖している腫瘍細胞）を標的化するために、本発明のＤＡＤをコードするＤＮＡ配列を含む多数の代替ベクターのうちのいずれかが、選択され得る。第１に、標的細胞の細胞型に組織特異性を有する制御配列が、使用され得る。このような特別な作用様式を有するプロモーターの例としては、膵臓における選択的な発現のためのインスリン遺伝子プロモーターまたはＭＭＴＶまたはラクトアルブミンプロモーター（例えば、胸部組織における発現のため）が挙げられる。
【０１１８】
標的細胞におけるＤＡＤまたはプラスミド由来の機能的誘導体の発現について、内因性翻訳終止コドンが、利用され得る。Ｃ末端短縮を有する構築物（内因性終止コドンを欠く）が使用される場合、終止コドンは、ベクター中のクローニング部位の直ぐ下流に挿入される。
【０１１９】
本発明に従うインビトロにおける細胞のトランスフェクションに関して、選択マーカー遺伝子（例えば、Ｇ４１８耐性）が、同じプラスミド上か、またはｐＳＶ２ｎｅｏプラスミド（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ
Ｇｅｎｅｔ（１９８２）１：３２７−３４１）またはｐｌＰＢ１プラスミド（Ｂｉａｍｏｎｔｉ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ（１９８５）１３：５５４７−５５６１）のような第２のプラスミドを用いる同時トランスフェクションによってかのいずれかで添加され得る。インビボにおけるＤＡＤ  ＤＮＡを用いた細胞のトランスフェクションについて、インビボにおいて有用な選択マーカー（例えば、ＨＳＶのｔｋ遺伝子）が好ましくあり得る。
【０１２０】
（プロモーターおよびエンハンサー）
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして「作動可能に連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書中に使用される場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡまたはＲＮＡの鎖の上に見出されるプロモーターの配列である。核酸分子の２つの配列（例えば、プロモーター配列およびコード配列）は、転写される両方の配列を同じＲＮＡ転写物上に転写することを可能にするか、または第２の配列に伸びる１つ目の配列で始まるＲＮＡ転写物を可能にするかのいずれかの様式で、これら２つの配列が互いに連結している場合、「作動可能に連結している」。従って、２つの配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのプロモーター配列およびコード配列）は、プロモーター配列で始まる転写がコード配列に作動に可能に連結されたＲＮＡ転写物を生成する場合、作動可能に連結されている。「作動可能」であるために、２つの配列が互いに直ぐに隣接している必要はない。
【０１２１】
本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳動物細胞において、作動可能でなければならず、真核生物プロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかであり得る。適切なプロモーターは、誘導性、抑制性または恒常性であり得る。恒常性プロモーターの例は、ウイルスプロモーターＭＳＶ−ＬＴＲであり、これは、様々な細胞型において、効率的かつ活性であり、そして他のほとんどのプロモーターと対照的には、静止した細胞および増殖している細胞において、同じ促進活性を有することである。他の好ましいウイルスプロモーターには、以下の中に存在するものが挙げられる：ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルス由来）（Ｂａｓｈａｒｔ、Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５））またはＲＳＶ−ＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルス由来）（Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２）。以下もまた有用である：マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ、Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｓ．、Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｓ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ、Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））。プロモーター領域との転写因子会合ならびに転写因子の個別の活性化およびＤＮＡ結合についての他の例示的な説明は、以下に挙げられる：Ｋｅｅｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）２３１：６９９；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４０：２４５；Ｊｏｎｅｓ、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：９；  Ｌｅｗｉｎ、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：１１６１；Ｐｔａｓｈｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：３２９；Ａｄａｍｓら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：３０６。上記に挙げられる全ての参考文献は、本明細書において参照として援用される。
【０１２２】
プロモーター領域はさらに、特定の組織に見られる特定のタンパク質と相互作用することによって、組織特異的エンハンサーとしても機能し得るオクタマー領域を含み得る。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトされた標的細胞に対して特異的であり得るか、またはこのような標的細胞の細胞性因子によって非常に活性化されるものである。ベクター（プラスミドまたはレトロウイルス）の例は、（Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎら、米国特許第５，１１２，７６７号）おいて開示される。転写におけるエンハンサーおよびこれらの作用についての一般的な議論については、Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．Ｍ．、Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、（１９９０）、５５２−５７６頁を参照のこと。レトロウイルスエンハンサー（例えば、ウイルスＬＴＲ）は、特に有用である。このエンハンサーは好ましくは、プロモーターの上流に位置して、プロモーターと相互作用して、遺伝子発現を促す。レトロウイルスベクターとの使用のために、内因性のウイルスＬＴＲは、エンハンサー欠損にされ、他の所望されるエンハンサー配列で置換され得、このエンハンサーは、組織特異性または他の所望の特性（例えば、本発明のＤＡＤコードＤＮＡ分子における転写効率）を与える。
【０１２３】
（薬学的組成物および治療組成物ならびにこれらの投与）
本発明の薬学的組成物に用いられ得る化合物としては、上記の化合物の全ておよびこれらの化合物の薬学的に受容可能な塩が挙げられる。塩基性基を含む本発明の化合物の薬学的に受容可能な酸付加塩は、適切な場合には、強いもしくは中程度強い無毒性の有機酸または無機性である酸で、当該分野で公知の方法により形成される。本発明において挙げられる酸付加塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩である。
【０１２４】
酸性基を含む本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩基付加塩は、公知の方法により、有機塩基および無機塩基から調製され、そして例として、以下が挙げられる：無毒性のアルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム）ならびに水酸化アンモニウム；無毒性の有機塩基（例えば、トリエチルアミン、ブチルアミン、ピペラジンおよびトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミン。
【０１２５】
上記のように、本発明の化合物は、細胞増殖を阻害する能力またはアポトーシスを誘導する能力を有し、癌の処置（特に、転移性癌）において活用される特性を有する。本発明の組成物は、それ自体で活性であり得るか、または「プロドラッグ」として、インビボで活性体に変換されて作用し得る。
【０１２６】
本発明の化合物およびこれらの薬学的に受容可能な塩は、従来の投与形態（例えば、カプセル剤、浸透させたオブラート、錠剤または注射用調製物）に取りこまれ得る。薬学的に受容可能な固体または液体のキャリアを用い得る。
【０１２７】
好ましくは、本発明の化合物は、全身投与（例えば、注射によって）される。注射は、使用する場合、任意の公知の経路（好ましくは静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内または腹腔内）によるものであり得る。注射可能物質は、従来形態で（溶液または懸濁物のいずれかとして）、注射する前の液体中の溶液もしくは懸濁物に適切な固体形態（または乳剤として）に調製され得る。
【０１２８】
固体キャリアとしては、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、石膏、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸が挙げられる。液体キャリアとしては、シロップ、落花生油、オリーブ油、食塩水、水、ブドウ糖、グリセロールなどが挙げられる。同様に、キャリアまたは希釈剤は、任意の持続性放出物質（例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン）を単独または蝋と共に含み得る。液体キャリアを使用する場合、処方物を、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤、滅菌注射用液（例えば、溶液）の形態（例えば、アンプルまたは水性もしくは非水性の液体懸濁物）であり得る。このような薬学的組成物の要約は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｇｅｎｎａｒｏ  第１８版  １９９０）において、見出され得る。
【０１２９】
薬学的処方物は、錠剤形態が必要な場合には、混合、顆粒化および圧縮のような工程を含む薬学的化学の従来技術に従って作られ、または経口、非経口、局所的、経皮的、膣内、陰茎内、鼻腔内、気管支内、頭蓋内、眼内、耳内および直腸投与のために所望される製品を提供するのに適切であるように成分の混合、充填および溶解する工程を含む薬学的化学の従来技術に従って作られる。薬学的組成物はまた、少量の無毒の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）を含み得る。
【０１３０】
本発明は、多くの属および種の動物のいずれかの診断または処置に使用され得、ヒトの医学または獣医学の実施に等しく適用可能である。従って、この薬学的組成物を用いて、家畜および商業的動物（鳥およびより好ましくは哺乳動物ならびにヒトを含む）を処置し得る。
【０１３１】
投与のための好ましい経路は、全身であるが、薬学的組成物は、局所的もしくは経皮的（例えば、軟膏剤、クリームまたはゲル）；経口的；直腸（例えば、座剤など）、非経口的、注射または持続的注入；膣内；陰茎内；鼻腔内；気管支内；頭蓋内；耳内；または眼内に投与され得る。
【０１３２】
局所的適用のために、この化合物は、局所的に適用されるビヒクル（例えば、軟膏剤（ｓａｌｖｅまたはｏｉｎｔｍｅｎｔ）中に取りこまれ得る。活性成分のためのキャリアは、噴霧可能な形態中または噴霧可能でない形態中のいずれかにあり得る。噴霧可能でない形態は、局所的適用に対し固有のキャリアを含み、かつ好ましくは、水より大きい動的粘度を有する半固体または固体形態であり得る。適切な処方物としては、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、リニメント剤、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。必要な場合、これらは、滅菌され得るか、助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、または浸透圧に影響を与える塩など）と混合され得る。噴霧可能でない局所処方物のための好ましいビヒクルとしては、軟膏基剤（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）；従来のクリーム剤（例えば、ＨＥＢクリーム）；ゲル；およびワセリンなどが挙げられる。
【０１３３】
噴霧可能なエアロゾル処方物もまた、局所的適用に適切であり、ここで、固体または液体である不活性なキャリア物質と好ましく合わされる化合物は、圧縮ビン中につめられるか、加圧された揮発性の（通常はガス状の）噴霧剤に混合される。エアロゾル処方物は、液剤、緩衝剤、界面活性剤、芳香剤および／または抗酸化剤を、本発明の化合物に加えて含み得る。
【０１３４】
特にヒトに対する、好ましい局所的適用のために、感染部位（例えば、皮膚表面、粘膜、眼など）に有効量の化合物を投与することが好ましい。この量は一般に、一回の適用につき約０．００１ｍｇ〜約１ｇの範囲にあり、これは、処置する部位、症状の重篤度および使用する局所用ビヒクルの状態に依存する。
【０１３５】
本発明の治療的組成物は、ＤＡＤペプチドに加えて、１つ以上のさらなる抗腫瘍剤（例えば、分裂阻害剤（例えば、ビンブラスチン）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）；葉酸阻害剤（例えば、メトトレキサート、ピリトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）またはトリメトレキサート）；代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシド）；インターカレーター抗生物質（例えば、アドリアマイシンおよびブレオマイシン）；酵素または酵素阻害剤（例えば、アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド））；または生物学的応答改変剤（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン））を含み得る。事実、任意の既知の癌治療剤を、本明細書で開示されるペプチドと合わせて含む薬学的組成物は、本発明の範囲内にある。この薬学的組成物もまた、さらなる症状の危険にある対象の患者を処置するための１つ以上の他の医薬（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤および抗コクシジウム剤を含む抗感染剤）を含み得る。
【０１３６】
ここで本発明について一般的に記載してきたが、同じことが、以下の実施例に対する参照を通してより容易に理解され、これらの実施例は、例示のために提供されて、特に記載のない限り、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１３７】
（実施例Ｉ）
（実施例ＩＩ〜Ｖの方法）
（Ａｌｂｅｒｔ，ＡＳ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６．２８２４−２８３０（２００１）もまた参照のこと）
（細胞培養、マイクロインジェクションおよび蛍光顕微鏡）
ガラスカバーガラス上で増殖させたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変必須培地（Ｇｉｂｃｏ；ＢＲＬ）（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含む）中でマイクロインジェクションの２４時間前まで維持し、細胞を０．１％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む培地に移した。ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＳＲＥ−Ｆｏｓ  ＨＡレポーター細胞株であるＨＡ１３をＳＲＥ遺伝子発現実験全てで用いた（Ｓａｈａｉ，Ｅ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ  １７，１３５０−１３６１（１９９８））。細胞を、吸引ガラスキャピラリーで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５１７１半自動化インジェクションシステムを用いて、以前の記載（Ｋｉｋｙｏら、前出）のようにマイクロインジェクションした。精製したプラスミドＤＮＡ発現ベクターを、他に指示のない限り、ＰＢＳ：ｄＨ２Ｏ（１：１）緩衝液中でそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロインジェクションし、必要な場合には、空ベクター（ｐＥＦｍ）を、ＤＮＡ注入濃度を基準化する実験において含んだ。蛍光検出実験のために、細胞を、マイクロインジェクション後２時間で、ＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒドで固定して、染色前に０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）で浸透化した。ＳＲＥ調節ＦｏｓＨＡ染色を、最初のウサギ抗ＨＡ抗血清（Ｙ−１１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に続いて、ＡＭＣＡ結合抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて間接免疫蛍光により検出した。糸状のアクチンを、細胞内において、ＴＲＩＴＣ標識ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で染色することによってモニターした。染色後、カバーガラスをゲルバトール（ｇｅｌｖａｔｏｌ）にマウントした。蛍光画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ４００蛍光顕微鏡上に取り付けられたデジタルカメラ（ＳＰＯＴ  Ｒ１００；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、示した４０倍または１００倍（１．４ＮＡ）のいずれかで、固定した露光時間で取りこんだ。画像は、ＴＩＦＦファイルで保存されて、ＣｌａｒｉｓＤｒａｗを用いて図中に構築した。
【０１３８】
（プラスミドおよびＧｅｎｂａｎｋＴＭ寄託番号）
ｍＤｉａ１、ｍＤｉａ２および種々のドメイン発現構築物を、ＰＣＲ産物から、ｐＥＦｍ（Ｒ．Ｍａｒａｉｓからの無償提供）、ｐＥＦＨＡ、ｐＥＦｍＥＧＦＰ、ｐＴ７−ｐｌｉｎｋ、ｐＧＥＸ−ＫＧおよびｐＧＡＤ１０中において、標準的方法を用いて作製して、直接の配列決定により確認した。完全な詳細は、要求に応じて入手可能である。インビトロ翻訳プラスミドをｐＴ７−ｐｌｉｎｋを用いて作製した（Ａｋａｄａ、Ｒ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５４、２６７−２７４（１９９７）。議論される遺伝子産物の寄託番号：ｍＤｉａ１、Ｕ９６９６３；ｍＤｉａ２、ＡＦ０９４５１９；ＤＩＡ１５６、ＮＰ＿００６７２０；Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ、ＡＡＡ６７７１５；Ｂｎｉ１、Ｐ４１８３２；ＳｅｐＡ、ＡＡＢ６３３３５。ほとんどの実験について、プラスミドは、他に記載のない限り、ｍＤｉａ２に対する以下のアミノ酸をコードした：ＧＢＤ、１０１−２１６；ＦＨ１、５２１−６３０；ＦＨ２、８０１−９１０；ＤＡＤ、１０３１−１１７１。
【０１３９】
（インビトロＧＳＴ−「プルダウン」および２−ハイブリッドアッセイ）
２−ハイブリッドアッセイおよびインビトロ翻訳／ＧＳＴ−プルダウンは、以前に記載されるように実施した（Ｋｉｋｙｏら、前出；Ｈｉｌｌ、Ｃ．Ｓ．ら、前出）。要約すると、示した「バイト」タンパク質を、示されるｃＤＮＡをｐＧＢＴ９  Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインプラスミド中にサブクローニングすることによって作った；「プレイ」は、ｐＧＡＤ１０またはｐＳＥ１１０７のいずれかにおいて生成されたＧａｌ４活性化ドメイン融合タンパク質であった。ＨＦ７ｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）レポーター酵母株を、示したプラスミドと同時形質転換して、適切なプレート上でバイトおよびプレイの栄養素要求マーカーについて選択し、次いでＨｉｓプレート上で再画線して、Ｇａｌ４調節ＨＩＳレポーター発現について選択した。レポーター活性のレベルを、漸増濃度（０〜６４ｍＭ）の３−アミノトリアゾールを伴うＴｒｐ／Ｌｅｕ／Ｈｉｓプレート上に再現画線によりモニターした。
【０１４０】
インビトロ翻訳およびプルダウンのため、プラスミドを、ｍＤｉａ２に対する示されたコード配列（Ｋｉｋｙｏら、前出）を含むｐＴ７−ｐｌｉｎｋまたはｐＣＡＮ（Ａｋａｄａら、前出）を用いて構築して、ＧＢＤまたはＦＨ１を、ＴＮＴキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、３５Ｓ標識メチオニンを用いてインビトロ翻訳した。４μｌの標識化ＩＶＴ産物を、１００μｇのＧＳＴ、ＧＳＴ−ＤＡＤまたはＧＳＴ−ＳｒｃＳＨ３と共にインキュベートし、示したようにグルタチオンビーズに結合した。ビーズを、４℃で、２時間２５ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ７．２、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で揺らしながらインキュベートした。結合反応物を、組換えＲｈｏＡ−Ｖ１４（Ｓａｈａｉら、前出）を添加する前に３０℃まで温めた。ビーズを、遠心分離により回収し；ビーズを３回、総容積の５倍容量の結合緩衝液中で洗浄した後、ビーズを、ＳＤＳサンプル緩衝液中に懸濁して、電気泳動し、次いでクマシーブルーＲ２５０で染色して、オートラジオグラフィする前に乾燥させた。
【０１４１】
（実施例ＩＩ）
（ＤＡＤの同定）
成長ＦＨタンパク質スーパーファミリーのアミノ酸配列の整列は、プロリンリッチＦＨ１領域およびプロリンリッチＦＨ２領域の相同性を描写する（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、前出；Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎら、前出）。ＤＲＦサブファミリーのみの比較整列は、図１に示される、Ｃ末端における保存ドメインを与えた。コンセンサス配列：
［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］
を、ＤＲＦ−ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ、すなわちＤＡＤと称した。塩基性残基のいくつかの残基の保存領域が、Ｃ末端近くに下線で示されて存在した。ＤＡＤドメインは、３つ全てのマウス／ヒトＤＲＦ中に見出された（Ｂｉｏｎｅら、前出；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、前出；Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ（Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎら、前出）、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｂｎｉ１ｐ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９、１５６７−１５６９（１９９５））およびＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＳｅｐＡタンパク質（Ｈａｒｒｉｓら、前出）；Ｂｎｒ１ｐは、例外であるようであった。
【０１４２】
（実施例ＩＩＩ）
（ＤＡＤ発現は、アクチンリモデリングおよびＳＲＦを活性化する）
ＤＡＤドメインのＤＲＦ機能における役割を試験するために、ｍＤｉａ２ＤＡＤドメインを、ＥＧＦＰと、哺乳動物の発現プラスミド中で融合（ｐＥＦｍＥＧＦＰ−ＤＡＤ）し、低血清（０．１％ＦＣＳ）中で２４時間維持されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中にマイクロインジェクションした。インジェクション後３時間で、アクチン再構築における効果およびＳＲＦの活性化を評価した。アクチン重合化を、蛍光ＴＲＩＴＣ−ファロイジンで細胞を染色することにより観察し、ＳＲＦ調節遺伝子発現を、ＨＡ１３細胞を染色することにより観察し、安定に形質転換された、ＨＡタグを含むＳＲＥ調節Ｆｏｓレポーター遺伝子の誘導について、間接的免疫蛍光によりモニターした（Ｓａｈａｉら、前出）。ＥＧＦＰ−ＤＡＤの効果を、他のｍＤｉａ２ドメイン（ＧＢＤ配列、ＦＨ１配列およびＦＨ２配列を含む）を含む同様のＥＧＦＰ融合タンパク質と比較した。他の相同性ドメインのどれも、アクチン活性またはＳＲＦ活性に影響を持っておらず、ＥＧＦＰ−ＤＡＤ発現は、アクチンフィラメントの形成を、図２Ａに示すように、細胞内で強く誘導した。アクチンリモデリングは、非ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現が同様の効果を有する場合、ＥＧＦＰに依存しなかった。アクチン線維の形成の増加に加えて、細胞もまた、伸長し、限局的な接着の数が増加する。ＥＧＦＰ−ＤＡＤは、図２Ｂに要約するように、ＳＲＦを強く誘導し、ここでバーは、ＦｏｓＨＡ陽性ＧＦＰ融合発現細胞の数を表す。
【０１４３】
アクチン線維の形成およびＳＲＦの活性化は以前に、ＧＢＤを欠損しているかまたは「活性化」したｍＤｉａ１およびｍＤｉａ２の発現後に、観察された。張線維形成が、細胞をＲＯＣＫインヒビターＹ−２７６３２で処理することでブロックされるので、構築された張線維形成は、協調的なＤＲＦおよびＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）活性に依存する（Ｗａｔａｎｂｅら、１９９９、前出；Ｋｉｋｙｏら、前出；Ｚｈａｏら、前出）。活性化ＤＲＦと同様に、構築されたアクチンフィラメントのＤＡＤ誘導は、発現プラスミドをインジェクションする前の、Ｙ−２７６３２処理によって、阻害された。ＲＯＣＫ阻害は、ＳＲＦのＤＡＤ活性化にどのような影響も与えなかったが、同様の結果が、活性化されたｍＤｉａ１およびｍＤｉａ２で、以前に観察された。
【０１４４】
（実施例ＩＶ）
（自己会合：ＤＡＤのＧＢＤとの相互作用）
Ｗａｔａｎａｂｅおよびその同僚（１９９９、前出）は以前に、ｍＤｉａ１のＮ末端が、そのＣ末端に結合し得ることを報告した。同様の分子内相互作用もまた、Ｃｄｃ４２結合ＷＡＳＰについて報告された（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９８、前出）。
【０１４５】
同様の相互作用がｍＤｉａ２で生じるか否かについて試験するため、ＤＡＤドメインを、ＧＢＤとの結合について、２−ハイブリッドアッセイおよびＧＳＴ−「プルダウン」アッセイの両方で、図３ＡおよびＢのそれぞれに示すように試験した。インビトロで、ｍＤｉａ２および単離されたＧＢＤは、ＤＡＤドメインに特異的に結合した。ＤＡＤ−ＧＢＤまたはＤＡＤ−ｍＤｉａ２相互作用を、活性化Ｒｈｏによる調節について試験した。インビトロ翻訳された３５Ｓ−メチオニン標識化ＧＢＤおよびｍＤｉａ２の両方を、漸増する濃度の、活性化された組換えＲｈｏＡ−Ｖ１４（これは、ＧＳＴ融合タンパク質として細菌内で産生された）と共にインキュベートした。活性化Ｒｈｏは、ＧＢＤおよびｍＤｉａ２の両方の会合を、図３Ｂに示すように、破壊したが、ＦＨ１−ＳｒｃＳＨ３結合にどのような影響も持たなかった。
【０１４６】
これらの観察に基づいたモデルを図３Ｃに示す。活性化Ｒｈｏ−ＧＴＰが低レベルの細胞において、ＤＲＦは、Ｃ末端ＤＡＤが直接、Ｎ末端ＧＢＤと相互作用する不活性状態と考えられる。Ｒｈｏ活性化およびＧＢＤ結合は、ＤＡＤの放出を誘導し、次いでエフェクターをＦＨ１ドメインおよびＦＨ２ドメインを介して補充する。Ｃ末端ＤＡＤ（ＷＡＳＰのＶＣＡドメインなど）は、二機能性のレギュレーターであり得る。この事象において、ＤＡＤはまた、ＧＢＤと会合するのみならず、「エフェクター」（例えば、ＡＲＰ２／３複合体）を、ＷＡＳＰ−ＶＣＡドメインに類似した様式で補充する（Ａｌｂｅｒｔら、前出）。
【０１４７】
（実施例Ｖ）
（細胞における自己調節モデルの試験）
自己調節モデルは、ＧＢＤの過剰発現が、ＤＡＤドメイン発現の影響を、直接の結合を介して中和することを予測する。このことを試験するために、ＧＢＤ（ｐＥＦｍ−ＧＢＤ）およびＤＡＤ（ｐＥＦｍＥＧＦＰ−ＤＡＤ）の両方をコードするプラスミドを細胞にマイクロインジェクションした；アクチンおよびＳＲＦ活性を、以前のようにモニターした。図４Ａに示すように、ＧＢＤ発現は、ＤＡＤ誘導アクチンリモデリングをブロックした。ＦＨ１またはＦＨ２ドメインの同時インジェクションは、影響しなかった。同様の結果を、ＳＲＦ活性をアッセイした場合に得た（図４Ｂ）。これらの結果は、ＧＢＤ発現がＤＡＤドメインをトランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）阻害し、要するに、ＤＡＤドメインを抑圧することを示した。
【０１４８】
ＧＢＤはまた、ＤＡＤがＲｈｏを活性化している場合に、ＳＲＦおよびアクチンリモデリングをブロックし得た。他のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ結合ドメインの発現は、Ｒｈｏシグナル伝達をブロックすることを示した（Ｓａｈａｉら、前出）。ＲｈｏのＤＡＤ活性化を、ＤＲＦがＲｈｏシグナル伝達の下流のエフェクターであるとの推定にもかかわらず、試験した。ＤＡＤを、Ｒｈｏシグナル伝達を阻害するが、ＤＲＦ活性化を阻害しないＰＫＮのＮ末端（ＰＫＮ．Ｎ）またはＣ３トランスフェラーゼのいずれかと同時発現させた（Ｓａｈａｉら、前出；Ｍａｅｓａｋｉ、Ｒ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４、７９３−８０３（１９９９））。Ｃ３もＰＫＮ．Ｎのどちらも、ＳＲＦのＤＡＤ活性化を阻害しなかった（図４Ｂ）が、各々は、以前に報告されたように、ＳＲＦの血清活性化を阻害した。この特異的なＤＡＤ阻害のため、ＤＡＤがＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの下流でシグナルを誘発することを結論づけた。
【０１４９】
ＤＡＤがＷＡＳＰ−ＶＣＡドメインに類似したエフェクタードメインであった場合、ＤＡＤ活性のＧＢＤ中和が予想された。ＤＡＤ活性に対する代替的な説明は、以下の通りである：ＤＡＤは、ネガティブな分子内ＤＡＤ−ＧＢＤ会合を阻害する。この場合、ＤＡＤドメイン発現は、内因性ＤＲＦタンパク質をＧＢＤ−ＤＡＤ自己調節機構を開放することにより活性化している。この可能性を、アフィニティー精製した抗ペプチド抗体をＥＧＦＰ−ＤＡＤ発現ベクターと共に同時インジェクションすることにより、ＤＡＤを発現し、同時に内因性ｍＤｉａ１を阻害することにより試験した（Ｋｉｋｙｏら）。この抗体は、ｍＤｉａ１のアミノ末端のアミノ酸６６〜７７（ＹＧＤＤＰＴＡＱＳＬＱＤ）を認識する。抗ｍＤｉａ１は、アクチンリモデリングおよびＳＲＦに影響するので、効果的にＤＡＤ活性をブロックした（図４ＣおよびＤ）。抗ｍＤｉａ１は、ＳＲＦ誘導をΔＧＢＤ−ｍＤｉａ２（図４Ｄ）またはΔＧＢＤ−ｍＤｉａ１欠失変異体によっては、これらが抗ｍＤｉａ１抗体により認識されるペプチド配列を欠くので、阻害しなかった。Ｓｒｃ干渉（図４Ａ、右パネル）および抗Ｓｒｃ（Ａｌｂｅｒｔｓ、Ａ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３、８６１６−８６２２（１９９８））もまた、ＤＡＤ誘導張線維形成およびＳＲＦをブロックした（図４ＣおよびＤ）。従って、ＤＡＤドメインの影響は、内因性ＤＲＦに依存する。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞について、ＤＲＦは、ｍＤｉａ１である。これらのインヒビターは、ＤＡＤドメインが、Ｒｈｏシグナル伝達におけるＤＲＦの下流標的を補充する「エフェクター」活性を有する場合、影響を有しない。
【０１５０】
ＤＡＤ−ＤＲＦ結合をＤＡＤの生物学的活性と相関させるために、アラニンスキャニング変異誘発を、ＤＡＤコンセンサス領域に沿って実施した。変異体を、ツーハイブリッド分析によって結合について試験し、次いで細胞中で発現させた。結合実験の結果を、図５Ａに示す。ｍＤｉａ２−ＤＡＤ相互作用を破壊した変異を、塗りつぶした矢頭で示す；ｍＤｉａ２相互作用に影響を有さなかった変異を、白抜きの矢頭で示す。保存されたＤＡＤ残基のＭ１０４１Ａ、Ｌ１０４４Ａ、Ｌ１０４８Ａ（アミノ酸位置は、ｍＤｉａ２ペプチド配列に由来する；可変の残基は灰色の四角であり、同一残基／保存された残基は黒の四角である）置換は、図５Ｂに示されるように、結合を破壊し、そしてＳＲＦおよびアクチン繊維の形成の両方における活性の欠如を生じた。Ｌ１０４４Ａ変異体の局在はまた、有意に変更された。野生型ＤＡＤの散在性の膜局在の代わりに、Ｌ１０４４Ａは、膜および細胞端での点状の局在を有し、「虫食い」の様相の細胞を生じる。これはまた、この融合タンパク質が核に現れるのを可能にする。Ｌ１０４４Ａ発現はまた、いくつかのプロテインキナーゼ（Ｖａｖ、ＰＡＫ１およびＳｒｃ）と複合体形成するＨＩＶ−１  Ｎｅｆ発現から生じる伸長の形成を連想させる伸長の形成を引き起こした。しかし、このＤＡＤ変異体は、Ｎｅｆ誘導されたｔｒｉｃｈｏｐｏｄｉａにおいて見られる繊維状アクチンを欠いた。非保存的残基のアラニン置換（Ｓ１０４３ＡおよびＱ１０４９Ａ）は、結合に影響を有さず、そして両方とも繊維形成およびＳＲＦを誘導し得た。興味深いことに、保存されたグルタミン酸残基のＥ１０４６Ａ置換もまた、影響を有さず、このことは、結合ＤＡＤ−ｍＤｉａ２が、疎水性相互作用によって主に媒介されることを示唆した。この相互作用はまた、「コア」ＤＡＤ配列に隣接する塩基性残基の長さに強力に依存する。１０５０位での終止コドンの導入は、ツーハイブリッドアッセイによって決定されるように、この相互作用を弱めたが、排除せず、そしてまた、細胞中の明らかな繊維の数および密度を減少させた（図５Ｂ、右下パネル）。
【０１５１】
本発明者らは、その生物学的活性におけるこれらの残基およびＤＡＤコアからの可変性の距離の重要性を試験している。総合して、これらのＤＡＤ変異実験の結果は、ＤＡＤ活性が、全長ＤＲＦに結合するＤＡＤの能力に依存することを示す。
【０１５２】
（実施例ＶＩ）
（実施例ＶＩＩ〜ＶＩＩＩのための材料および方法）
細胞培養、マイクロインジェクションおよび蛍光顕微鏡。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変必須培地（Ｇｉｂｃｏ；ＢＲＬ）中で維持し、そしてガラスのカバーガラスにプレートした；マイクロインジェクションの２４時間前に、細胞を０．１％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを含む培地に交換した。細胞を、以前に記載されたようにマイクロインジェクションした（Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出）。精製されたプラスミドＤＮＡ発現ベクターを、他に示されない限り、ＰＢＳ：ｄＨ２Ｏ（１：１）の緩衝液中に各々１０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロインジェクションした；空のベクター（ｐＥＦｍ）を、必要な場合に、インジェクションされたＤＮＡ濃度を正規化するための実験に含めた。繊維状アクチンの蛍光検出のために、細胞を、マイクロインジェクション後に、ＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで３時間固定し、そしてＴＲＩＴＣ標識されたファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた周辺室温での６０分の染色の前に、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を用いて透過化処理した。ｐ３４ＡｒｃおよびＡｒｐ３の検出のために、ホルムアルデヒド固定の後、細胞を、−２０℃のメタノールで２０分間抽出した。ＰＢＳ中での２時間の大規模な再水和の後、カバーガラスを、ＰＢＳ／５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ）中に希釈された示されるウサギポリクローナル抗血清と共に、加湿チャンバ内で４℃で一晩インキュベートした。一次血清を、ＰＢＳでの洗浄後に、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ標識したロバ抗ウサギを用いて検出した。次いで、カバーガラスをゲルバトール（ｇｅｌｖａｔｏｌ）中に備え付けた。蛍光画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ４００エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡に備え付けられたデジタルカメラ（ＳＰＯＴ  Ｒ１００；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、固定された露出時間および１００×（１．４ＮＡ）対物レンズを使用して捕らえた。画像を、ＣｌａｒｉｓＤｒａｗを使用して図に組み立てた。
【０１５３】
プラスミドおよびＧｅｎｂａｎｋＴＭ登録番号。ｍＤｉａ２および種々のドメイン発現構築物を、標準的な方法を使用して、ＰＣＲ産物からｐＥＦｍ（Ｒ．Ｍａｒａｉｓの厚意）、ｐＥＦｍＥＧＦＰおよびｐＧＥＸ−ＫＧ中に作製し、そして直接の配列決定によって確認した；完全な詳細は、要求に応じて入手可能である。ｍＤｉａ２についての登録番号は、ＡＦ０９４５１９である。ほとんどの実験について、プラスミドは、ｍＤｉａ２  ＤＡＤについての以下のアミノ酸（他に示さない限り示されたアミノ酸置換を有する１０３１〜１１７１）をコードした；全てのプラスミドを、変異誘発を確認するために配列決定した。
【０１５４】
組換えタンパク質精製、インビトロのＧＳＴ−「プルダウン（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ）」およびツーハイブリッドアッセイ。ツーハイブリッドアッセイおよびインビトロの翻訳／ＧＳＴプルダウンを、以前に記載されたように実行した（Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出；Ｓａｈａｉ，Ｅ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ  １７、１３５０−６１（１９９８））。ＧＳＴ−ＤＡＤ融合タンパク質を、標準的な方法を使用して生成し、そしてタンパク質濃度をクマシーＲ２５０染色したゲル上で既知の標準と比較することによって、またはＢｉｏＲａｄキットの色素結合アッセイによって決定した。Ａｒｐ２／３およびアクチン結合実験のために、１μｇ／μｌのＢＳＡで飽和したグルタチオンビーズ上に固定化されたＧＳＴまたはＧＳＴタグ化ＤＡＤ（２０μｇ）を、精製されたＡｒｐ２／３複合体１μｇまたは０．１μｇ／μｌのＢＳＡで補充された１×ＰＢＳ中のＧアクチン１μｇのいずれかと混合し、そして回転ホイールで４℃で１時間インキュベートした。ビーズを、０．１μｇ／μｌのＢＳＡで補充した１×ＰＢＳで３回リンスし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてＡｒｐ３、ｐ３４またはアクチンのいずれかを認識する精製された抗体を用いてイムノブロットした。細胞抽出物からのプルダウンのために、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、Ｍａｃｈｅｓｋｙ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ
Ｂｉｏｌ  ８、１３４７−５６（１９８８）のように溶解および抽出し、そして徹底的な洗浄、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、転写およびイムノブロッティングの前に、グルタチオンビーズに結合した精製されたＧＳＴ融合タンパク質と共にインキュベートした。
【０１５５】
ピレン−アクチン重合アッセイ。ウサギ骨格筋アクチン（Ｓｐｕｄｉｃｈ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４６、４８６６−７１（１９７１））、ピレン標識されたアクチン（Ｋｏｕｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１４、３３−８（１９８１）；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ  ４、２５３−６２（１９８３））およびＷＡＳＰ−ＰＷＣＡ（Ｙａｒａｒ，Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９、５５５−８（１９９９））を、別の場所に記載のように調製した。ピレン−アクチン重合アッセイを、以下の改変しながら、Ｗｅｌｃｈ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９、４２３−７（１９９９）に以前に記載されたように実行した。ピレン−アクチンおよび未標識アクチンを、Ｇ緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＤＴＴ）中で混合して、２０％未満のピレン−アクチンを有する２．５μＭのＧアクチン溶液を生成した。ＷＡＳＰ−ＰＷＣＡまたはＧＳＴ−ＤＡＤまたはＧＳＴとのＡｒｐ２／３複合体の６μｌを、１０×開始緩衝液（２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＡＴＰ）の６μｌと共に混合した。この１２μｌの溶液を４８μｌのＧアクチン溶液と混合して、重合を開始した。集合反応速度を、２５℃の温度に維持したＦｌｕｏｒｏｌｏｇ３蛍光測定機（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｓ．Ａ．；励起波長３６５ｎｍ、発光波長４０７ｎｍ）を使用してモニターした。
【０１５６】
抗体。Ａｒｐ３およびｐ３４を認識する親和性精製された抗体は、以前に記載された（Ｗｅｌｃｈ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５、２６５−９（１９９７））。マウスモノクローナル抗アクチン（Ｃｌｏｎｅ／Ｃ４）抗体を、製造業者（ＩＣＮ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって提供されるプロトコールに従って使用した。
【０１５７】
（実施例ＶＩＩ）
（ＤＡＤは、ＷＡＳＰ  ＷＣＡドメインに類似する）
ＤＡＤは、真菌、昆虫および哺乳動物のＤＲＦのアミノ酸配列の比較の間に、以前に同定され（Ａｌｂｅｒｔｓら、２００１、前出）、そして図６ａに示される。次いで、本発明者らは、ＤＲＦが、ＷＡＳＰに全く類似した様式で、小ＧＴＰａｓｅ調節された分子内結合によって自己調節されるという仮説を立てた。ＷＡＳＰと類似の挙動を示すＤＡＤについて、本発明者らは、ＤＡＤが、以前に示されていなかったアクチンに対する本質的な（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）作用を有するか否かを調査した。本発明者らは、最初に、ＤＡＤ機能に関する手掛かりについて、ＷＡＳＰとＤＡＤとの間の配列類似性を試験した。
【０１５８】
図６ｂに示すものは、既知のアクチン結合タンパク質およびＡｒｐ２／３結合タンパク質とコフィリンとのアラインメントである。ＤＲＦが、Ａｒｐ２／３のＷＡＳＰ活性化に関与することが公知の酸性Ｃ末端を有さないことは、容易に明らかであった（Ｔａｋｅｎａｗａら、前出）。アラインメントのより綿密な試験によって、最も有意な類似性がＷＨ２ドメインとＤＡＤの保存されたロイシンリッチの「コア」との間であったが、ＷＨ２とＤＡＤとの間には、いくつかの有意な差異が存在することが明らかになった：ＷＨ２は、、Ｌｅｕ−Ｌｅｕモチーフに対して３位Ｎ末端にＡｒｇを含み（ＤＡＤにおいては、重要なＭｅｔ残基である）（上記；Ａｌｂｅｒｔｓら、２００１、前出を参照のこと）、そしてＬｅｕ−Ｌｅｕモチーフから３残基進むとＷＨ２はＩｌｅ、そしてＤＡＤはＬｅｕを含む。このＷＨ２ドメインはまた、塩基性残基が隣接する保存されたＬｅｕを有し、一方でＤＡＤは、ＷＡＳＰ、ＡｃｔＡおよびコフィリンの他の領域において見出される残基に類似した３〜４個の塩基性残基を有する（図６ｂの右側）。ＡｃｔＡ由来の塩基性領域は、詳細に研究されており（Ｐｉｓｔｏｒ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１３、３２７７−８７（２０００）；Ｓｋｏｂｌｅ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０、５２７−３８（２０００））、そして細菌のＡｒｐ２／３標的化において、明らかに役割を有する。
【０１５９】
（実施例ＶＩＩＩ）
（Ａｒｐ２／３複合体およびＧアクチンとのＤＡＤの相互作用）
（１．ＤＡＤは、Ａｒｐ２／３複合体およびＧアクチンと直接結合する。）
ＷＡＳＰ−ＷＣＡドメインとの類似性、特にＷＨ２領域との相同性に起因して、本発明者らは、ＤＡＤがＡｒｐ２／３およびＧアクチンと相互作用することを予測した。この仮説を試験するために、グルタチオン−セファロースビーズに結合した精製されたＧＳＴ−ＤＡＤを、精製されたＧアクチンまたは血小板から精製されたＡｒｐ２／３と共にインキュベートした（Ｗｅｌｃｈ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２９８、５２−６１（１９９８））。インキュベーション後、この複合体を徹底的に洗浄し、そして得られたタンパク質複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、膜に転写し、そしてアクチン、Ａｒｐ３およびｐ３４  Ａｒｃに対する抗体を使用してウェスタンブロットによって分析した（Ｗｅｌｃｈ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５、２６５−９（１９９７））。図７ａおよび７ｂに示すように、ＤＡＤは、Ｇアクチンおよび精製されたＡｒｐ２／３複合体にそれぞれ結合する。ＧＳＴ−ＤＡＤを、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞から作製された細胞溶解物由来のＡｒｐ２／３に対する結合について試験した（図７ｃ）。精製された複合体と同様に、本発明者らは、Ａｒｐ２／３に対する結合を検出し得た。細胞抽出物由来のＡｒｐ２／３結合もまた、ｍＤｉａ２由来の他のドメイン（ＧＢＤ、ＦＨ１およびＦＨ２を含む）を使用してアッセイした（上記；Ａｌｂｅｒｔｓら、２００１、前出を参照のこと）。これらの他のＧＳＴ融合タンパク質は、いずれもＡｒｐ２／３と会合しなかった。ＤＡＤ−Ａｒｐ２／３会合もまた、ツーハイブリッド分析によって試験した（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９８、前出）。ｐ２１との相互作用のみが観察された。
【０１６０】
（２．ＤＡＤは、インビトロでＡｒｐ２／３を活性化する。）
ＤＡＤは、Ａｒｐ２／３複合体およびＧアクチンに結合し、そして細胞中のアクチン繊維の集合を活性化するので、本発明者らは、ピレン−アクチン重合アッセイを使用して、ＤＡＤがＡｒｐ２／３複合体のアクチン凝集活性を活性化し得るか否かを決定することを考えた。ＧＳＴ−ＤＡＤ単独では、試験された濃度でアクチン重合の反応速度に影響を有さなかったが、有意なＡｒｐ２／３刺激活性を示した（図８）。しかし、ＧＳＴ−ＤＡＤの活性は、Ａｒｐ２／３複合体の潜在的な刺激因子であるＷＡＳＰのＰＷＣＡフラグメント（プロリンリッチ領域、ＷＨ２領域、コネクター領域および酸性領域からなる）の活性と比較して弱かった（図８）。これらの結果は、ＤＡＤが、ＧアクチンをＡｒｐ２／３と会合させ、そしてアクチン重合を活性化することを実証する。
【０１６１】
（３．ＤＡＤの塩基性領域の、Ａｒｐ２／３に対する活性および結合）
ＡｃｔＡ、ＳＣＡＲおよびＷＡＳＰタンパク質は、Ａｒｐ２／３活性化に関与または寄与する、塩基性または「コフィリン」相同ドメインを有する（Ｐｉｓｔｏｒら、前出；Ｓｋｏｂｌｅら、前出；Ｂｉ，Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９、Ｒ１６０−３（１９９９））。ＤＡＤ中の保存された塩基性残基（図６ｂを参照のこと）の重要性を試験するために、本発明者らは、ＤＡＤ塩基性領域の役割を分析することによって、以前の変異分析（前出）を拡張した。図９ａは、ｍＤｉａ２  ＤＡＤ領域に作製されたアミノ酸置換の要約を示す。これらを、ＥＧＦＰ融合タンパク質として発現させ、そして代表的な画像を図９ｂに示す。アミノ酸１０５７と１０６０との間の各々の代表的な塩基性残基の単一Ａｌａ置換は、１０５５位および１０５６位での二重置換のような効果を有さなかった。次いで、本発明者らは、１０５７位および１０５８位、１０５９位および１０６０位、または１０６３位および１０６５位で、Ｇｌｕを二重置換させた。ＤＡＤ二重変異体の両方のセット（ＤＡＤ  Ｒ１０５７Ｅ／Ｒ１０５８ＥおよびＤＡＤ  Ｋ１０５９Ｅ／Ｒ１０６０Ｅ）は、細い繊維を誘導する能力を喪失し；ＤＡＤ変異体Ｒ１０５７Ｅ／Ｒ１０５８Ｅはまた、元々存在したアクチン網様構造が破壊されたようであった。次いで、本発明者らは、これらのＤＡＤ改変体のＧＳＴ融合タンパク質を精製し、そして図７ａ〜７ｃのように、Ａｒｐ２／３と複合体形成する能力についてこれらを試験した。図９ｃに示されるように、本発明者らは、二重のＧｌｕ置換が、Ａｒｐ２／３と会合するＤＡＤの能力を破壊したことを見出した。ＡｃｔＡの塩基性領域と同様に、ＤＡＤは、Ａｒｐ２／３結合および細胞中の細い繊維の誘導の両方のために、インタクトな塩基性領域を必要とする。
【０１６２】
（４．ＤＡＤおよび全長のｍＤｉａ２は、細胞の別個の領域でＡｒｐ２／３成分と同時局在する。）
本発明者らは、ウサギポリクローナル抗体を使用する間接的免疫蛍光によって、Ａｒｐ３およびｐ３４  Ａｒｃの局在を分析した。細胞を、ＥＧＦＰ−ＤＡＤ発現プラスミドのインジェクション後、３時間試験した。図１０ａおよび挿入画に示されるように、ＥＧＦＰ−ＤＡＤは、張線維であると推測された縞状のパターンを取った（本発明者らは、これらの実験において使用された固定条件に起因して、標識されたファロイジンを用いて、同時染色できなかった）。本発明者らはまた、矢印によって示されるような、細胞辺縁近くの融合タンパク質の分離したパッチを見出した。ウサギ抗Ａｒｐ３での同時染色は、ＥＧＦＰ−ＤＡＤおよびＡｒｐ３が、両方ともこれらの領域に標的化されたことを明らかにした。Ａｒｐ３（図１０ａ）およびｐ３４  Ａｒｃ（図１０ｂ）の両方は、点描の四角によって示されるように、ＤＡＤの縞に沿って整列した。本発明者らはまた、細胞の縁でＥＧＦＰ−ＤＡＤに沿ってｐ３４  Ａｒｃを見出した。これらの結果は、ＤＡＤが、図６ａ〜６ｃに示されるような新規のアクチン重合に関連する細胞の領域において、Ａｒｐ２／３と同時局在することを示す。
【０１６３】
次いで、本発明者らは、Ａｒｐ２／３が、Ｒｈｏ小ＧＴＰａｓｅの既知の活性化因子（この場合、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ））によって刺激された細胞において、全長ｍＤｉａ２と共に見出され得るか否かを試験した。細胞に、ｐＥＦｍｙｃ−ｍＤｉａ２をインジェクションし、そしてインジェクションの２時間後に１０μＭのＬＰＡで処理した。ｍｙｃ−ｍＤｉａ２の局在を、抗Ａｒｐ２／３抗体に加えて９Ｅ１０（ｍｙｃ）ｍＡｂを使用する間接的免疫蛍光によって検出した。未刺激細胞において、ｍｙｃ−ｍＤｉａ２は、エンドソーム内に見出され、そして他の小胞は、以前に記載されたとおりであった（Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出）。ＬＰＡ処理は、ホスホチロシンおよび他の局所的接着成分を有する構造への、ｍｙｃ−ｍＤｉａ２の標的化を誘導する（図１１）。いくつかの細胞はまた、その先端でｍＤｉａ２を含む伸長を生成した。挿入画において見られるように、Ａｒｐ３およびｐ３４  Ａｒｃの両方もまた、これらの伸長中に濃縮された。図６ｃの本発明者らのアクチン同時インジェクション実験と組み合わせて、これらの結果は、ＤＲＦが、アクチン繊維の生成の前またはその間に、細胞周辺にＡｒｐ２／３を標的化することを示唆する。
【０１６４】
（５．考察）
これらの結果は、Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓに関連するホルミンに見出される保存された領域であるＤｉａ自己調節ドメイン（ＤＡＤ）が、Ａｒｐ２／３複合体に結合し、そしてこれを活性化することを示す。ＤＡＤが、アクチン重合を制御する細胞成分へ直接Ｒｈｏを連結させるからだけでなく、Ａｒｐ２／３へシグナル伝達する新規タンパク質境界面を示すので、これらの観察は、重要である。ＷＣＡドメイン同様、ＤＡＤは、アクチンモノマーおよびＡｒｐ２／３に直接結合する。ＤＡＤは、アクチンをインビトロで凝集させ、そして細胞におけるアクチン重合の引き金を引くが、アクチン凝集の速度は、インビトロのＷＡＳＰ−ＰＷＣＡとは大きく異なる。細胞において、ＤＡＤは、波うちもラメリポディウムも誘導しないが、細い繊維を誘導する。本発明者らの観察は、Ｒｈｏ小ＧＴＰａｓｅエフェクターが、いかにしてＡｒｐ２／３と連絡し、そしてこれらの特異的なアクチンベースの構造の形成を活性化するかについての２つのモデルを導く。このモデルは、アクチンリモデリングに関するＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅにおける、ＤＡＤとＷＡＳＰとの間の重要な類似性および差異を強調する試みにおいて、本発明者ら自身のデータに加えて、以前に公開されたデータを取り込む。これらのモデルは、「本質的（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）」モデルまたは「付帯的（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）」モデルのいずれかとして図６に示され、それぞれ、左側および右側に示される。
【０１６５】
（ａ．本質的  対  付帯的）
本質的モデルは、Ａｒｐ２／３またはアクチンモノマーと接触するＷＡＳＰおよびＤＲＦのドメインが、複合体が生成する構造の型を指示するために十分な情報を伝達することを示唆する。精製された試薬を使用して本明細書中で示される最初の生物学的な証拠は、ＷＡＳＰとＤＡＤとが元来異なることを示す：ＷＡＳＰは、最小の遅滞期でアクチン重合の引き金を引くが、一方、ＤＡＤは、ゆっくりと重合を誘導する。現在当研究室で研究中のものは、本発明者らが、アクチン繊維の網様構造を破壊し、そして細胞の前突（ｐｒｏｔｕｓｉｏｎ）および波うちを誘導することを以前に示した、ｍＤｉａ２  Ｌ１０４４Ａ置換ＤＡＤ改変体である（Ａｌｂｅｒｔｓら、２００１、前出）。これは、ＤＡＤにおける特定の変更が、その本質的活性を変更するのに十分であり、そしてアクチンまたはＡｒｐ２／３のいずれかに結合するようにし、そして細い繊維のかわりに波うちを引き起こすことを示唆する。しかし、これは、ＤＡＤ  Ｌ１０４４Ａが、ｍＤｉａ２のＧＢＤに結合できないことによって複雑にされ、従って、自己阻害を破壊し、そして活性なＲｈｏを模倣することによって細胞ＤＲＦを活性化する（Ａｌｂｅｒｔｓら、２００１、前出）。本発明者らは、ＤＡＤ  Ｌ１０４４ＡがなおＡｒｐ２／３を活性化し、そのデフォルト活性は、波うちを引き起こし、ＧＢＤに対するＲｈｏまたはＤＡＤのいずれかの結合に際して生じる他のＤＲＦ制御された事象を特異的に引き起こさないので、繊維を生じないということを前提とする。
【０１６６】
これら複数のシグナル伝達事象は、付帯的モデルにおいて見出され、このモデルは、特定のアクチン構造の形成を協力して生じるシグナルの組み合わせを含む。これらのシグナルは、他のＤＲＦまたはＷＡＳＰドメイン（例えば、Ｓｒｃ（Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出；Ｂａｎｉｎ，Ｓ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６、９８１−８（１９９６）；Ｕｅｔｚ，Ｐ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１、３３５２５−３０（１９９６））およびＩＲＳｐ５３（Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｓｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７１、６２６−６２９（２０００）；Ｔａｋｅｎａｗａら、前出；Ｍｉｋｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８、７３２−５（２０００））と相互作用するタンパク質または低分子によって送達される。これらの相互作用は、細胞内のＷＡまたはＤＡＤのいずれかと結合した活性なＡｒｐ２／３リモデリング機構を標的化または調節する。ＤＡＤは、本明細書中で、アクチン繊維生成に関連する細胞の特定の領域に対して標的化されたことが示され、一方、ＬＰＡ処理後、全長のｍＤｉａ２は、伸長の先端で細胞辺縁に優勢に局在した。ＬＰＡは、ＤＡＤの亜細胞性局在を変更しない。これらの結果は、ＤＲＦの他のドメインが、細胞内の標的化に寄与することを示唆する。これらの相互作用の正味の効果は、所定の小ＧＴＰａｓｅの活性化に応答して生じるアクチンリモデリングの型を指示する。
【０１６７】
ＤＲＦおよびＷＡＳＰは、（図１１の右側に示される）多くの共通の結合パートナーを共有するので、この段階でこの付帯的モデルに折り合いをつけることは、困難である。全てのＷＡＳＰ結合因子（ＷＩＰおよびＰＩＰ２を除く）は、ＤＲＦと相互作用することが公知である。これは、本発明者らがツーハイブリッドスクリーニングによってｍＤｉａ１結合タンパク質およびｍＤｉａ２結合タンパク質として同定したＷＩＳＨを含む。ＰＩＰ２は、アクチン繊維の形成に重要な役割を有するようであり、そしてＰＩＰ５キナーゼの発現は、細胞中の張線維の形成を誘導することが示されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ  １５２、：８６７−８７６（２００１））。
【０１６８】
特異性についての説明は、ＧＴＰａｓｅの活性化に起因し得る。従って、細胞中で生成される構造の型は、それぞれのＧＴＰａｓｅによって標的化されるエフェクターの数および型によって制御される。例えば、活性化されたＲｈｏＡは、ＲｈｏエフェクターＲＯＣＫ、ホスホリパーゼ（Ｄ  Ｋａｍ，Ｙ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１、４０５５−６６（２００１））およびＤＲＦの活性化後に張線維の形成を誘導する。このＧＴＰａｓｅ特異的な説明は、エフェクター間を識別するＧＴＰａｓｅを必要とする。しかし、ＤＲＦが選択的であるかは明らかでない。例えば、Ｂｎｉ１ｐは、Ｒｈｏ１およびＣｄｃ４２ｐの両方に結合し；後者は、出芽の先端でＢｎｉ１ｐを標的化することにおいて、重要な役割を有する（Ｏｚａｋｉ−Ｋｕｒｏｄａら、前出；Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａら、前出）。Ｃｄｃ４２Ｈもまた、哺乳動物ＤＲＦ  ｍＤｉａ２に結合するが（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９９８、前出）、これが細胞中で実際に生じるか否かは、いまだ実証されていない。
【０１６９】
ＤＲＦは、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２に結合するだけでなく、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣおよび構成的にＧＴＰａｓｅに結合したＲｈｏファミリーのメンバーであるＲｎｄ１−３にも結合する。本発明者らは、特異性が、小ＧＴＰａｓｅの領域的活性化を次第で定まり得るという仮設を立てた。例えば、ＤＲＦのｂｏｎｅ  ｆｉｄｅ活性化因子は、実際に、エンドソームへもまた標的化されるＲｈｏＢであり得る（哺乳動物ＤＲＦ（Ｔｏｍｉｎａｇａら、前出）と共に、Ｍｅｌｌｏｒ，Ｈ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３、４８１１−４（１９９８））。
【０１７０】
（ｂ．旧  対  新）
上記の結果は、ＤＡＤが、細胞中で新規のアクチン重合を誘導することを示唆する。標識されたアクチンを同時インジェクションする同じ方法を使用して、Ｍａｃｈｅｓｋｙ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３８、９１３−２６（１９９７）は、活性化されたＲｈｏＡが、本明細書中で使用されるような短い期間内で新規アクチン重合を刺激しなかったと結論付けたが、その代わり、存在する繊維の認識を示唆した。ＲｈｏＡが、アクチン重合を活性化しない場合、ＤＲＦの活性化およびＡｒｐ２／３のＤＡＤに対するリクルートメントにＲｈｏＡを組み込むモデルは、不適切である。これについては、複数の説明が存在し、先行の研究において、ＲｈｏＡ  Ｑ６３Ｌは、翻訳後の修飾（ＣａａＸモチーフのゲラニル−ゲラニル化）を有さない組換えタンパク質として細菌中で生成された、という説明の可能性が最も高い（Ａｄａｍｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７、２００３３−８（１９９２））。従って、活性化されたＧＴＰａｓｅは、インジェクション後の遅滞期間（ｌａｇ  ｐｅｒｉｏｄ）の原因となるエフェクターの細胞プールを正確に標的化しなかった。ＤＲＦが、既存の繊維を利用するという考えは、ＤＡＤがＡｒｐ２／３と共に細胞中で繊維を修飾するので、無視できない。さらに、ＤＡＤの誘導性形態を用いて細胞株を分析する種々の生化学的アプローチを使用して、本発明者らは、ＤＡＤが活性化される場合に、ＤＡＤおよびＡｒｐ２／３の両方が、アクチン繊維の網様構造に移動することを見出した。この効果を説明する機構は、現在調査中であるが、一緒に考えると、これらの結果は、ＤＡＤが、繊維生成の間に、既存のフィラメントを結合または使用し得ることを示唆する。
【０１７１】
最後に、本明細書中に示される結果は、ＤＡＤが、Ａｒｐ２／３を刺激する能力を有することを実証する。この発見は、Ｒｈｏがいかにしてアクチンリモデリング機構と連絡するかについての数年来の推測を解決する。いくつかのアクチン結合タンパク質は、Ｂｎｉ１ｐおよび哺乳動物ＤＲＦ（プロフィリンおよびＢｕｄ６ｐ／Ａｉｐ３を含む）と相互作用することが示されたが（Ｏｚａｋｉ−Ｋｕｒｏｄａら、前出；Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａら、前出；Ｗａｔａｎａｂｅら、前出；Ｓｈｅｕ，Ｙ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８、４０５３−６９（１９９８））、Ｒｈｏ−ＤＲＦ制御されたアクチンリモデリングにおけるこれらの特定の役割は、同定されていない。本発明者らは、これらが、Ａｒｐ２／３とのＤＡＤの相互作用によって引き起こされる最初のアクチン凝集事象の調節に関与することを予測する。あるいは、これらはまた、アクチン重合を調節する因子に対する小ＧＴＰａｓｅまたはＤＲＦである。このような役割は、Ａｒｐ２／３のＷＡＳＰ活性化におけるプロフィリンについて示唆されている（Ｙａｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０、１００１−１２（２０００））。
【０１７２】
上記で引用される参考文献は、具体的に援用されてもされなくても、全て本明細書中で参考として援用される。
【０１７３】
ここで、本発明を完全に記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験を要さずに、広範囲の等価なパラメーター、濃度および条件内で同じ発明が実行され得ることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ関連ＦＨタンパク質サブファミリーおける保存されたＣ末端ドメインを示す。マウスのＤＲＦである、ｍＤｉａ１、ｍＤｉａ３、およびｍＤｉａ２と、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｂｎｉ１ｐおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＳｅｐＡとの比較アライメントである。第二列における数字は、それぞれの配列（登録番号が、方法の節で提供される）の各々に示された第一の残基に対応する。同一な残基は、青であり、類似アミノ酸は、緑であり、コンセンサス配列は、［ＧＡ］−［ＶＡ］−Ｍ−Ｄ−ｘ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−ｘ−Ｌ−［ＫＲＱ］−ｘ−［ＧＡ］−［ＳＧＡ］−［ＡＰ］によって記載され、ここで、ｘは、任意の残基を示し；下線は塩基性残基の保存された領域を示す。
【図２】
図２は、単離されたＤＡＤの発現が、アクチンリモデリングおよびＳＲＦを活性化することを示す。図２Ａは、ＥＧＦＰ−ＤＡＤ融合タンパク質の発現後の、アクチン細胞骨格変化を示す。上端のパネルは、ＥＧＦＰ融合タンパク質を示し、そして下端のパネルは対応するＴＲＩＴＣ−ファロイジン染色を示す。プラスミドは、各々（ｐＥＦｍＥＧＦＰ−ＦＨ２（ｍＤｉａ２  ＡＡ８０１−９１０）およびｐＥＦｍＥＧＦＰ−ＤＡＤ（ｍＤｉａ２  ＡＡ１０３１−１１７１））、１０ｎｇ／μｌで注射され；そして、３時間後に固定された。図２Ｂは、ＤＡＤの発現が、ＳＲＦ調節性遺伝子発現を活性化することを示す。ＨＡ１３  ＳＲＥ−ＦｏｓＨＡレポーター細胞は、指示された発現プラスミドを微量注入された。３時間後に、これらを固定して、そして間接的免疫蛍光によってＦｏｓＨＡレポーターについて染色した。バーは、ＦｏｓＨＡに対してポジティブに染色するＥＧＦ０Ｐ発現細胞の平均の割合を表現し、エラーバーは、２〜３の実験からの標準偏差を表現し、ここで、４０〜１００のＥＧＦＰポジティブ細胞が、各々において計数された。
【図３】
図３は、Ｎ末端ＧＢＤとのＤＡＤの相互作用を示す。
図３Ａは、ツーハイブリッド分析の結果を示す。酵母レポーター株ＨＦ７ｃは、ＨＩＳレポーター遺伝子の発現と相関することについて選択する３−アミノトリアゾールの濃度を上昇しつつ（０ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭ、１６ｍＭ、３２ｍＭ、および６４ｍＭ）、選択プレート（Ｈｉｓ）上で再ストリークする前に、指定された「ｂａｉｔ」（Ｔｒｐ−）プラスミドおよび「ｐｒｅｙ」（Ｌｅｕ−）プラスミドで形質転換された。この指定された数は、３日後の増殖が存在する、３−ＡＴの最も高い濃度に対応する。活性化されたＲｈｏＡ−Ｖ１４Ｓ１９０（脂質改変を阻止するＧＴＰａｓｅ欠損およびＣＡＡＸ変異）およびＤＡＤの両方は、ｍＤｉａ２およびＧＢＤの両方と相互作用したが、他のＦＨドメインとは相互作用しなかった。ＳｒｃＳＨ３ドメインに対するＦＨ１の結合を、結合についてのポジティブコントロールとして使用した。このｍＤｉａ２プラスミドは、アミノ酸４７〜８００をコードする。
図３Ｂは、インビトロで翻訳された、ＧＢＤおよびｍＤｉａ２が、ＧＳＴ−ＤＡＤに結合することを示す。ｐＴ７−ｐｌｉｎｋプラスミドを使用して、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）によって３５Ｓ−メチオニンで標識した、ＧＢＤ、ＦＨ１およびｍＤｉａ２を生成した。ＩＶＴ材料を、アガロースビーズに結合したＧＳＴ融合タンパク質と共に、４℃で、２時間インキュベートし、活性化されたＲｈｏの添加前に３０℃まで、暖めた。ビーズは、ＳＤＳサンプル緩衝液中に再懸濁する前に冷結合緩衝液３×で洗浄した。組換えＲｈｏＡ−Ｖ１４は、２倍過剰なモル濃度、１０倍過剰なモル濃度、２０倍過剰なモル濃度で導入された。
図３Ｃは、ＧＢＤとＤＡＤとの間の分子内相互作用に基づく、ＤＲＦに対する自己調節機構を記述するモデルを提供する。活性化Ｒｈｏ−ＧＴＰの結合は、ＦＨ１ドメインまたはＦＨ２ドメインのいずれかに対する、エフェクタータンパク質の採用または活性化のいずれかを可能にするＧＢＤ−ＤＡＤ相互作用を破壊する。ＧＢＤの同時発現は、ＤＡＤが、アクチンリモデリングおよびＳＲＦ活性化に十分なエフェクタードメインであった場合、ＤＡＤ発現の効果をブロックする。Ｓｒｃまたは抗ｍＤｉａ１の妨害はまた、効果を有さない。これらがブロックする場合、ＤＡＤ効果は、内因性のＤＲＦに依存し、そしてＤＡＤは、そのＧＢＤを、それの分子内ＤＡＤ相互作用から裂き、従って、分子の残りを活性化させる。
【図４】
図４は、ＧＢＤスケルチング（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）および内因性ＤＲＦ（ｍＤｉａ１）の阻害によるＤＡＤ効果の破壊を示す。
図４Ａは、ＤＡＤ誘導性アクチン再配列が、ＧＢＤ発現およびＳｒｃ  Ｋ２９８Ｍ／Ｙ５３０Ｆの妨害によってブロックされることを示す。ｐＥＦｍＥＧＦＰ−ＤＡＤは、指定されるように、空のベクター（ｐＥＦｍＥＧＦＰ）またはｐＥＦｍ−ＧＢＤ、ｐＥＦｍ−ＦＨ２またはｐＳＧＴ−Ｓｒｃ  Ｋ２９８Ｍ／Ｙ５３０Ｆ（これら各々は１０ｎｇ／μｌである）と共に注射される。細胞は、固定され、そしてＴＲＩＴＣ−ファロイジンで染色される（下端のパネル；ＥＧＦＰ融合が、上端のパネルに示される）。ＧＢＤおよびＳｒｃの妨害の両方が、アクチンファイバーの長期的な誘導をブロックする。
図４Ｂは、ＧＢＤ同時発現が、ＳＲＦのＤＡＤ活性化を特異的にブロックすることを示す。ｐＥＦｍＥＧＦＰ−ＤＡＤは、示されるように、ｐＥＦｍ−ＧＢＤ、ＦＨ１、ＦＨ２、ＰＫＮ．ＮまたはＣ３と結合される。細胞は、ＦｏｓＨＡ発現について３時間後に固定された；バーは、ＦｏｓＨＡポジティブＥＧＦＰを発現する細胞の割合の平均を表現する。エラーバーは、２〜３の実験からの標準偏差を表現する。
図４Ｃは、抗ｍＤｉａ１、Ｓｒｃおよび抗Ｓｒｃの妨害によるＤＡＤ阻害を示す。抗ｍＤｉａ１、Ｃｓｔ．１抗Ｓｒｃまたは非特異的ウサギＩｇＧ（各々は、１  ｍｇ／ｍｌである）を、ｐＥＦｍＥＧＦＰ−ΔＧＢＤ−ｍＤｉａ２またはｐＥＦｍＥＧＦＰ−ＤＡＤのいずれかと共に微量注入した。３時間後の細胞は、固定され、そしてＦｏｓＨＡ発現について染色された。これらの実験（Ｃ）において、各細胞が２回注射され、核への発現ベクターの送達および細胞質への抗体の送達が確実にされた。
図４Ｄは、注入された細胞の代表的なフィールドを示す。ＳＲＥ−ＦｏｓＨＡレポーターは、第２のＡＭＣＡカップリングロバ抗ウサギＩｇＧ抗体によってモニターされるウサギＹ−１１抗ＨＡによって検出され、緑色は、ＥＧＦＰである。
【図５】
図５は、ＤＲＦ結合を破壊するＤＡＤの変異が生物学的活性を阻害することを示す。
図５Ａは、ツーハイブリッドアッセイによる、ＤＡＤ−ｍＤｉａ２相互作用の変異分析を示す。アラニン置換または終止コドンが、ＤＡＤコア領域においてか、およびｍＤｉａ２塩基性ストレッチ（ＲＲＫＲ）の後の、いくつかの保存された残基について生成された。結合を与えた変異は、黒矢印によって、示され、効果がない変異は、白矢印によって示される。
図５Ｂは、細胞におけるＤＡＤ変異体の発現を示す。０．１％ＦＣＳ中にて、ガラスカバースリップ（ｇｌａｓｓ  ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ）上で、２４時間維持されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞が、指定されたｐＥＧＦＰ−ＤＡＤ改変体またはＤＡＤ改変体（１０ｎｇ／μｌ）と共に微量注入され、３時間後、細胞は、固定され、そしてＴＲＩＴＣ−ファロイジンで染色された（右のパネルに示される）。保存された残基の変異は、常に活性であるＤＡＤ−Ｅ１０４６Ａを除いて生物学的効果を破壊した。
【図６】
ＤＡＤは、アクチン重合を活性化し、そしてこれは、ＷＡＳＰ−ＷＨ２に相同である。図６ａは、配列比較を示す。Ｄｉａ自己調節性ドメイン（ＤＡＤ）；黒の影付けは、同一な残基を示し、そしてこの保存された残基は、灰色で強調される。図６ｂは、ＷＡＳＰ−ＷＨ２配列およびＤＡＤ配列の比較を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ解析は、ＷＨ２ドメイン由来の指定されたペプチド配列に基づいて実行された：黒のボックスは、同一の残基を示し、黒い文字で灰色のボックスは、保存された残基を示し、そして灰色のボックスで白文字は、類似の残基を示す。同様の影付けが、塩基性領域の比較において使用される。図６ｃは、ＤＡＤが新たな（デノボ；ｄｅ  ｎｏｖｏ）アクチン重合を誘導することを示す一連の顕微鏡写真である。細胞に、Ａｌｅｘａ５６８標識アクチンに加え、精製された組換えＧＳＴ−ＤＡＤ、ＧＳＴ−ＤＡＤ  Ｍ１０４１Ａ、またはＧＳＴ単独を注射し、そして、指定された時間においてホルムアルデヒドで固定した。次いで、カバースリップを、ゲルバトール中でのせて、１００倍の対物レンズで視覚化し、そして画像を、実施例ＶＩで記載のようにＣＣＤカメラを用いて得た。
【図７】
図７は、ＤＡＤが、Ｇ−アクチンおよびＡｒｐ２／３に結合することを示す。図７ａは、精製したＧ−アクチンとのＧＳＴタグ化ＤＡＤの相互作用を示す。グルタチオン−セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズに結合された組換えＧＳＴタグ化ＤＡＤおよびＧＳＴ（２０μｇ）を、１μｇのＧ−アクチンと共にインキュベートした。この得られたタンパク質複合体は、沈澱され、洗浄され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗アクチン抗体との免疫ブロッティングに先だってメンブレンに移された。図７ｂは、精製Ａｒｐ２／３複合体との組換えＤＡＤタンパク質の相互作用を示す。組換えＧＳＴタグ化ＤＡＤおよびＧＳＴ（２０μｇ）を、１μｇの精製されたＡｒｐ２／３複合体と共にインキュベートした。この得られたタンパク質複合体を、グルタチオン−セファロースと共に沈澱し、そして抗Ａｒｐ３抗体および抗−ｐ３４抗体と共に免疫ブロットした。図７ｃは、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞溶解物からのＡｒｐ２／３とのＤＡＤ複合体の存在を示す。１０％  ＦＣＳ中で増殖するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝溶液中で溶解し、得られた抽出物を、示した、セファロースビーズに複合体化されたＧＳＴ融合タンパク質と共にインキュベートした。複合体を、図７ａおよび図７ｂにあるように分析した。
【図８】
図８は、Ａｒｐ２／３複合体を用いたアクチン核生成におけるＧＳＴ−ＤＡＤの効果を示す。実施例ＶＩに記載されたように、ピレン−アクチン重合アッセイにおける、蛍光強度  対  ２．５μＭアクチンの重合開始後の時間のグラフが、示される。２０ｎＭのＡｒｐ２／３複合体は、３０ｎＭのＷＡＳＰ−ＰＷＡまたは７５０ｎＭのＧＳＴ−ＤＡＤのいずれかで活性化される。７５０ｎＭのＧＳＴは、コントロールとして使用された。
【図９】
図９は、塩基性領域が、細いファイバーの形成およびＡｒｐ２／３との会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎ）に必要とされることを示す。図９ａは、ｍＤｉａ２ＤＡＤ塩基領域の変異分析を示し、白抜きの文字は、アクチンラッフル（ａｃｔｉｎ
ｒｕｆｆｌｅ）の形成を誘導するＤＡＤ  Ｌ１０４４Ａを除いた、ＤＡＤ活性を阻害したアミノ酸置換を示す（実施例を参照のこと）。置換の位置は、右に示される。塩基性領域中のグルタメート置換は、細いファイバーのＤＡＤ誘導を破壊した。図９ｂは、ＥＧＦＰ−ＤＡＤ、ＥＧＦＰ−ＤＡＤ  Ｒ１０５７Ａ、およびＥＧＦＰ−ＤＡＤ  Ｒ１０５７Ｅ／Ｒ１０５８Ｅの各々の発現プラスミドが注射された３時間後に、各々を発現する細胞の代表的な画像を示す。図９ｃは、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞溶解物からの、ＧＳＴ−「プルダウン（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ）」実験の結果を示す。１５μｇの指定された融合タンパク質を、図７ａ〜図７ｃにあるような溶解物と共にインキュベートした。結合した物質は、広範な洗浄および抗ｐ３４  Ａｒｃとの免疫ブロット後に検出される。
【図１０】
図１０は、リゾフォスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ；ＬＰＡ）で細胞を刺激した後に、ＤＡＤおよびｍＤｉａ２とのＡｒｐ３およびｐ３４  Ａｒｃの同時局在化を示す一連の顕微鏡写真である。図１０ａにおいて、ＥＧＦＰ−ＤＡＤは、３時間、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞で発現され、次いで、実施例ＶＩで記載されるように、メタノールでの抽出の前にホルムアルデヒドで固定された。次いで、細胞を、ウサギ抗Ａｒｐ３（図１０ａ）または抗ｐ３４
Ａｒｃ（図１０ｂ）で染色した。ＥＧＦＰ−ＤＡＤは、アクチンフィラメントネットワークに対応する条線で見出された。Ａｒｐ３およびｐ３４  Ａｒｃの両方はまた、合成した画像のインセットにおける点描された長方形によって示されるのと同じパターンで見出される。Ａｒｐ２／３成分の両方はまた、細胞の縁にて別個のパッチで見出される。ＥＧＦＰ−ＤＡＤとのＡｒｐ３同時局在化は、矢印によって示される。図１０ｃおよび図１０ｄ：ＬＰＡ（１０μＭ）で処理された細胞中の、Ａｒｐ３およびｐ３４  Ａｒｃ、それぞれとの全長ｍＤｉａ２の同時局在化；細胞に、全長ｍＤｉａ２（ｐＥＦｍＤｉａ２）についての発現ベクターを注射した。２時間後、細胞を、ＬＰＡで１０分間、刺激した。次いで、細胞を固定し、そして９Ｅ１０抗体ならびにウサギの抗Ａｒｐ３（図１０ｃ）またはｐ３４  Ａｒｃ（図１０ｄ）で染色した。細胞の周辺での、条線における両方の同時局在は、ｍＤｉａ２を用いて細胞展開物（ｃｅｌｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の末端に濃縮された。
【０１７４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  VAN ANDEL INSTITUTE
<120>  CONSERVED DIAPHANOUS-RELATED FORMINAUTOREGULATORY DOMAIN (DAD)
<130>  F102H92X62
<140>  JP P2002-504298
<141>  2001-06-22
<150>  US 60/213,275
<151>  2000-06-22
<160>  9
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa can be Gly or Ala
<220>
<221>  MISC_FEATURE
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<223>  Xaa can be Val or  Ala
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa can be any amino acid
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa can be any amino acid
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa can be Lys, Arg or Gln
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa can be any amino acid
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa can be Glu or Ala
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa can be Ser, Glu or Ala
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa can be  Ala or Pro
<400>  1
Xaa Xaa Met Asp Xaa Leu Leu Glu Xaa Leu XaaXaa Xaa Xaa Xaa
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<211>  21
<212>  PRT
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<212>  PRT
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<212>  PRT
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<400>  5
Gly Val Met Asp Ser Leu Leu Glu Ala Leu GlnThr Gly Ser Ala Phe
1              5                  10                 15
Gly Gln Arg Asn Arg Gln Ala Arg Arg Gln Arg
20                 25
<210>  6
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  6
Ala Val Met Asp Lys Leu Leu Glu Gln Leu LysAsn Ala Gly Pro Ala
1              5                  10                 15
Lys Ser Asp Pro Ser Ser Ala Arg Lys Arg Ala
20                 25
<210>  7
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  7
Gly Ala Met Asp Ser Leu Leu Glu Lys Leu ArgAla Ala Ala Pro Gln
1              5                  10                 15
Ala Lys Asp Gln Arg Asp Arg Arg Arg Arg Ala
20                 25
<210>  8
<211>  1171
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  8
Met Glu Arg His Arg Ala Arg Ala Leu Gly ArgAsp Ser Lys Ser Ser
1              5                  10                 15
Arg Arg Lys Gly Leu Gln Ser Ala Pro Pro AlaGly Pro Tyr Glu Pro
20                 25                 30
Gly Glu Lys Arg Pro Lys Leu His Leu Asn IleArg Thr Leu Thr Asp
35                 40                 45
Asp Met Leu Asp Lys Phe Ala Ser Ile Arg IlePro Gly Ser Lys Lys
50                 55                 60
Glu Arg Pro Pro Leu Pro His Leu Lys Thr ValSer Gly Ile Ser Asp
65                 70                 75                 80
Ser Ser Ser Leu Ser Ser Glu Thr Met Glu AsnAsn Pro Lys Ala Leu
85                 90                 95
Pro Glu Ser Glu Val Leu Lys Leu Phe Glu LysMet Met Glu Asp Met
100                105                110
Asn Leu Asn Glu Asp Lys Lys Ala Pro Leu ArgGlu Lys Asp Phe Gly
115                120                125
Ile Lys Lys Glu Met Val Met Gln Tyr Ile AsnThr Ala Ser Lys Thr
130                135                140
Gly Ser Leu Arg Ser Ser Arg Gln Ile Ser ProGln Glu Phe Leu His
145                150                155                160
Glu Leu Lys Met Gly Tyr Thr Asp Glu Arg LeuPhe Thr Tyr Leu Glu
165                170                175
Ser Leu Arg Val Ser Leu Thr Ser His Pro ValSer Trp Val Gln Ser
180                185                190
Phe Gly His Glu Gly Leu Gly Leu Leu Leu AspIle Leu Glu Lys Leu
195                200                205
Ile Asn Gly Gln Ile Gln Glu Lys Val Val LysLys Thr Gln His Lys
210                215                220
Val Ile Gln Cys Leu Arg Ala Leu Met Asn ThrGln Tyr Gly Leu Glu
225                230                235                240
Arg Ile Met Ser Asp Lys Arg Ser Leu Ser LeuLeu Ala Lys Ala Met
245                250                255
Asp Pro Arg Gln Pro Ala Met Met Ala Asp ValVal Lys Leu Leu Ser
260                265                270
Ala Val Cys Ile Val Gly Glu Glu Ser Ile LeuGlu Glu Val Leu Glu
275                280                285
Ala Leu Thr Ser Ala Gly Glu Glu Arg Lys IleAsp Arg Phe Phe Ser
290                295                300
Ile Val Glu Gly Leu Arg His Asn Ser Val AsnLeu Gln Val Ala Cys
305                310                315                320
Met Gln Leu Ile Asn Ala Leu Val Thr Ser ProAsp Asp Leu Asp Phe
325                330                335
Arg Leu His Leu Arg Asn Glu Phe Met Arg CysGly Leu Lys Glu Ile
340                345                350
Leu Pro Asn Leu Lys Gly Ile Lys Asn Asp GlyLeu Asp Ile Gln Leu
355                360                365
Lys Val Phe Asp Glu His Lys Glu Glu Asp LeuSer Glu Phe Phe His
370                375                380
Arg Leu Glu Asp Ile Arg Ala Glu Leu Asp GluAla Ser Asp Val Tyr
385                390                395                400
Ser Met Leu Trp Asp Thr Val Lys Glu Thr ArgAla Glu Gly His Phe
405                410                415
Leu Ser Ile Leu Gln His Leu Leu Leu Ile ArgAsn Asp Arg Phe Ile
420                425                430
Arg Glu Gln Tyr Phe Lys Leu Ile Asp Glu CysVal Ser Gln Ile Val
435                440                445
Leu His Arg Asp Gly Thr Asp Pro Asp Phe ThrTyr Arg Lys Arg Leu
450                455                460
Asp Leu Asp Leu Ser Gln Phe Val Asp Val CysIle Asp Gln Ala Lys
465                470                475                480
Leu Asp Glu Trp Glu Glu Lys Ala Ser Glu HisCys Lys Lys Phe Glu
485                490                495
Lys Glu Cys Thr Asp His Gln Glu Thr Gln AlaGln Leu Gln Lys Arg
500                505                510
Glu Ala Lys Ile Asn Glu Leu Gln Ala Glu LeuGln Ala Phe Lys Ser
515                520                525
Gln Phe Gly Ala Leu Pro Pro Gly Thr Lys IlePro Leu Gln Pro Ser
530                535                540
Val Glu Gly Glu Ala Gly Pro Ser Ala Leu ProPro Ala Pro Pro Ala
545                550                555                560
Leu Ser Gly Gly Val Pro Pro Pro Pro Pro ProPro Pro Pro Pro Pro
565                570                575
Pro Pro Leu Pro Gly Met Pro Met Pro Phe GlyGly Pro Val Pro Pro
580                585                590
Pro Pro Pro Leu Gly Phe Leu Gly Gly Gln SerSer Ile Pro Leu Asn
595                600                605
Leu Pro Phe Gly Leu Lys Pro Lys Lys Glu PheLys Pro Glu Ile Ser
610                615                620
Met Arg Arg Leu Asn Trp Leu Lys Ile Gly ProAsn Glu Met Ser Glu
625                630                635                640
Asn Cys Phe Trp Ile Lys Val Asn Glu Asn LysTyr Glu Asn Arg Asp
645                650                655
Leu Leu Cys Lys Leu Glu Asn Thr Phe Cys CysGln Glu Lys Glu Lys
660                665                670
Arg Asn Thr Asn Asp Phe Asp Glu Lys Lys ValIle Lys Lys Arg Met
675                680                685
Lys Glu Leu Lys Phe Leu Asp Pro Lys Ile AlaGln Asn Leu Ser Ile
690                695                700
Phe Leu Ser Ser Phe Arg Val Pro Tyr Glu LysIle Arg Thr Met Ile
705                710                715                720
Leu Glu Val Asp Glu Thr Gln Leu Ser Glu SerMet Ile Gln Asn Leu
725                730                735
Ile Lys His Leu Pro Asp Glu Glu Gln Leu LysSer Leu Ser Gln Phe
740                745                750
Arg Ser Asp Tyr Asn Ser Leu Cys Glu Pro GluGln Phe Ala Val Val
755                760                765
Met Ser Asn Val Lys Arg Leu Arg Pro Arg LeuSer Ala Ile Leu Phe
770                775                780
Lys Leu Gln Phe Glu Glu Gln Val Asn Asn IleLys Pro Asp Ile Met
785                790                795                800
Ala Val Ser Thr Ala Cys Glu Glu Ile Lys LysSer Lys Gly Phe Ser
805                810                815
Lys Leu Leu Glu Leu Val Leu Leu Met Gly AsnTyr Met Asn Ala Gly
820                825                830
Ser Arg Asn Ala Gln Thr Phe Gly Phe Asp LeuSer Ser Leu Cys Lys
835                840                845
Leu Lys Asp Thr Lys Ser Ala Asp Gln Lys ThrThr Leu Leu His Phe
850                855                860
Leu Val Asp Val Cys Glu Glu Lys His Ala AspIle Leu His Phe Val
865                870                875                880
Asp Asp Leu Ala His Leu Asp Lys Ala Ser ArgVal Ser Val Glu Met
885                890                895
Leu Glu Lys Asn Val Lys Gln Met Gly Arg GlnLeu Gln Gln Leu Glu
900                905                910
Lys Asn Leu Glu Thr Phe Pro Pro Pro Glu AspLeu His Asp Lys Phe
915                920                925
Val Ile Lys Met Ser Ser Phe Val Ile Ser AlaAsn Glu Gln Tyr Glu
930                935                940
Lys Leu Ser Thr Leu Leu Gly Ser Met Thr GlnLeu Tyr Gln Ser Ile
945                950                 955                960
Met Gly Tyr Tyr Ala Val Asp Met Lys Lys ValSer Val Glu Glu Phe
965                970                975
Phe Asn Asp Leu Asn Asn Phe Arg Thr Ser PheMet Leu Ala Leu Lys
980                985                990
Glu Asn Ile Lys Lys Arg Glu Ala  Ala Glu Lys Glu Lys  Arg Ala Arg
995                1000                1005
Ile Ala  Lys Glu Arg Ala Glu  Lys Glu Arg Leu Glu  Arg Gln Gln
1010                1015                1020
Glu Lys  Lys Arg Leu Leu Glu  Met Lys Thr Glu Gly  Asp Glu Thr
1025                1030                1035
Gly Val  Met Asp Ser Leu Leu  Glu Ala Leu Gln Ser  Gly Ala Ala
1040                1045                1050
Phe Arg  Asp Arg Arg Lys Arg  Thr Pro Lys Leu Lys  Asp Ile Arg
1055                1060                1065
Gln Ser  Leu Ser Pro Met Ser  Gln Arg Pro Val Leu  Lys Val Cys
1070                1075                1080
Asn His  Glu Asn Gln Lys Met  Gln Leu Thr Glu Gly  Ser Arg Pro
1085                1090                1095
His His  Ser Ile Asn Cys Asn  Ser Thr Arg Thr Pro  Val Ala Lys
1100                1105                1110
Glu Leu  Asn Tyr Asn Leu Asp  Thr His Ala Ser Thr  Gly Arg Ile
1115                1120                1125
Lys Ala  Val Glu Lys Glu Ala  Cys Asn Ala Glu Ser  Asn Lys Lys
1130                1135                1140
Lys Glu  Met Glu Leu Leu Gly  Ser Val Ala Lys Ser  Glu Ser Val
1145                 1150                1155
Pro Glu  Val Glu Ala Leu Leu  Ala Arg Leu Arg Ala  Leu
1160                1165                1170
<210>  9
<211>  3516
<212>  DNA
<213>  Mus musculus
<400>  9
atggagaggc accgggcgcg cgctctcggc cgggacagcaagtcgtcgcg gaggaagggc    60
ttgcagtccg cgccgcccgc tggcccctac gagcccggggagaagcgacc caagttgcat   120
ttaaatatta gaacactgac agatgatatg ctggacaaatttgccagtat aagaattcca   180
gggagcaaga aagagagacc tccccttccc cacctgaagactgtgtctgg gatcagtgac   240
agctcatcac tgtcctcaga gacaatggaa aacaacccaaaggcgctgcc agagagtgaa   300
gtcttgaagc tttttgagaa gatgatggaa gatatgaatttaaatgaaga taaaaaggca   360
ccattgcggg aaaaagactt cggtatcaaa aaagaaatggtgatgcagta cattaatact    420
gcttctaaga caggaagtct tagaagtagc cgacagatctcacctcagga atttctccat   480
gagctgaaaa tgggttacac agacgagaga cttttcacgtatctggagtc actccgagta   540
tcattgacca gtcatcctgt gagttgggtg caaagctttggacacgaggg actcggatta   600
ttgctggaca ttttggaaaa actaattaat gggcaaatccaagaaaaagt tgtgaagaag   660
actcagcaca aagtcatcca gtgtctgaga gccctgatgaacacacagta tggcttagaa   720
aggattatga gtgacaagag gagtctttcc ttgttggcaaaagccatgga tcccaggcag   780
cccgctatga tggcagacgt ggtgaagctt ctgtctgcagtgtgcattgt cggcgaggaa   840
agcatccttg aagaagtgtt agaagccttg acttcagctggagaagaaag aaagattgac   900
agattttttt ccattgtgga aggcctccgg cataactcagtgaacctgca agttgcttgt   960
atgcagctca taaatgctct cgttacatct cctgatgatttggacttcag gcttcacctc   1020
agaaatgaat ttatgcgttg tggattgaaa gagatattgccaaacttaaa gggcattaag   1080
aatgatggcc tggatataca acttaaagtc tttgatgagcacaaagaaga agatttgagt   1140
gagtttttcc atcgccttga agacattaga gctgaacttgatgaagcatc tgatgtttac   1200
agcatgttat gggacacagt taaggaaact cgagcagagggacattttct ttctattctt   1260
cagcatctcc tgctcattcg caatgatcgt tttataagagagcagtattt caaattaatt   1320
gatgagtgtg tgtcacagat tgtattacat agagatggaacggaccctga cttcacatac   1380
agaaaaagac tagatttgga cttaagtcag tttgtagatgtttgcataga tcaggccaaa   1440
ctagatgagt gggaagagaa agcatccgaa cattgcaagaaatttgaaaa agagtgtact   1500
gaccaccaag aaacccaggc tcaattgcag aaaagagaggcaaagattaa tgagcttcaa   1560
gcagagttac aagcttttaa atcccagttt ggtgccttgccacctggtac aaaaattcct   1620
ttgcaacctt cagtagaagg tgaagctggc ccttcagcccttcctcctgc cccaccagca   1680
ctcagtggag gagtgccgcc tcccccaccg ccccctcctccaccaccccc accactccca   1740
ggaatgccaa tgccatttgg tggccctgta ccaccaccacctcctctggg attcctgggt   1800
gggcaaagct ctattccatt aaacctgcca tttggtttgaaaccaaagaa agaatttaag   1860
cctgaaatca gcatgagaag attgaattgg ttaaagatcggaccaaatga aatgtctgag   1920
aactgcttct ggatcaaagt aaatgaaaat aagtatgaaaatagggattt gctttgtaaa   1980
cttgagaaca ctttttgttg ccaagaaaaa gagaaaaggaatacaaatga ctttgatgag   2040
aagaaagtta ttaagaagag aatgaaggaa cttaaatttctagatcctaa aattgctcag   2100
aacctttcaa tcttcctgag ctccttccgg gtgccatatgagaaaatcag gacgatgata   2160
ttggaagtgg atgaaacaca gttgtcagag tccatgattcagaacttaat aaagcacctt   2220
cctgatgagg agcagttgaa gtcattgtcc cagtttagaagtgactataa cagtttgtgt   2280
gagcctgagc agttcgctgt tgtgatgagc aatgtgaagagactccggcc acggctcagt   2340
gctattctct ttaagcttca atttgaagag caggtgaacaacatcaaacc tgacatcatg   2400
gctgtcagta ctgcctgcga ggagatcaag aagagcaaaggctttagcaa gttgctggaa   2460
cttgtgttgc taatgggaaa ctacatgaat gctggctcccggaatgctca aaccttcgga   2520
tttgacctta gctctctctg taaactgaag gatacaaaatctgcagatca gaaaaccaca   2580
ctcctccatt tcctggtaga tgtatgtgaa gaaaagcatgctgacatcct tcactttgtg   2640
gacgatttgg cacatttaga caaagctagc agagtctctgtagaaatgct ggaaaagaac   2700
gtgaagcaga tgggaaggca gcttcaacag cttgagaagaatttggaaac ctttccccct   2760
cctgaggact tgcatgacaa gtttgtgata aagatgtccagcttcgttat cagtgcgaac   2820
gagcagtatg aaaaactctc cacactactg ggcagcatgacacaattgta ccagagtata   2880
atgggctact atgctgtcga catgaagaag gtttccgtggaagagttttt taatgatctg   2940
aacaacttca gaacttcatt tatgctagca ttaaaggaaaacatcaaaaa acgagaagca   3000
gcagaaaagg agaaacgtgc caggatagcg aaagagcgagcagagaaaga gcgacttgaa   3060
cgccagcaag agaaaaagcg cttactagaa atgaaaactgagggagatga gacaggagtg   3120
atggatagtc tgctggaggc cttgcagtca ggggctgccttccgcgacag aagaaaaagg   3180
acaccaaagc tgaaagatat tcggcagagt ctcagcccgatgtctcagag gcctgttctc   3240
aaagtttgta accatgaaaa tcagaaaatg cagttgacagaagggtcacg tccacaccac   3300
agtatcaatt gcaactccac caggactcca gtcgccaaggagcttaatta taatctagac   3360
actcatgcgt ctacagggag gatcaaggca gttgagaaggaagcctgtaa tgcagaaagc   3420
aacaaaaaaa aggaaatgga acttcttggc tctgttgctaaaagcgaatc agttcctgaa   3480
gttgaagccc tgctggcaag attacgagctttataa                            3516