【手続補正書】
【提出日】平成16年1月9日(2004.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸配列を切断する方法であって、少なくとも一つのカッタープローブと前記標的核酸配列をハイブリダイゼーション及び標的／プローブ複合体の形成が可能な条件下で結合させる工程、ここで、前記少なくとも一つのカッタープローブは前記標的核酸配列に相補的であり、前記少なくとも一つのカッタープローブはその中に少なくとも一つのヌクレオチドを置換している少なくとも一つの反応性基を有しており、前記少なくとも一つの反応性基は核酸鎖のリン酸糖骨格を切断するに十分なフリーラジカルを生成する少なくとも一つの分子を含み、前記少なくとも一つの反応性基を活性化させて、前記標的／プローブ複合体を前記カッタープローブの中の少なくとも一つの反応性基の位置および前記標的核酸配列の中の前記相補的位置で切断する工程、を含む切断方法。
【請求項２】
前記少なくとも一つの反応性基はハロゲン化ヌクレオチドである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記少なくとも一つの反応性基はプリンまたはピリミジン類似体である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つの反応性基はブロモウラシルであり、前記活性化法は照射である、請求項３の方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つのカッタープローブはさらに捕獲分子を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
カッタープローブの中の少なくとも一つのヌクレオチドが置換されており、核酸鎖のリン酸糖骨格を切断するに十分なフリーラジカルを生成する少なくとも一つの分子を含む少なくとも一つの反応性基を有している、カッタープローブを含む、サンプル中の標的核酸配列を検出するための組成物。
【請求項７】
更にリポーター分子を含む、請求項６の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも一つの反応性基はブロモウラシルであり、前記標的／プローブ複合体はブロモウラシルとキレート形成ダイの結合により、高周波照射で切断される、請求項３の方法。
【請求項９】
少なくとも二つのヌクレオチドで置換した少なくとも二つの反応性基をその中に有する少なくとも一つのカッタープローブと前記標的核酸配列を結合し、前記少なくとも二つの反応性基の活性化により前記標的／プローブ複合体を実質的に切り取る工程を更に含む、請求項１記載の方法
【請求項１０】
前記少なくとも一つのカッタープローブが更に少なくとも一つのリポータープローブを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも一つのカッタープローブが更に少なくとも一つの捕獲分子を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記標的核酸配列が長さ１ｋｉｌｏｂａｓｅより大きい、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも二つのカッタープローブが用いられ、前記少なくとも二つのカッタープローブのうちの一つが前記標的核酸配列の一部分に結合するリポーター分子を有し、前記少なくとも二つのカッタープローブのうちのもう一つが前記標的核酸配列の異なった部分に結合する捕獲分子を有する、請求項１記載の方法
【請求項１４】
前記少なくとも一つのカッタープローブが複数の反応性基を有し、前記複数の反応性基の活性化により前記標的核酸配列を破壊する、請求項１記載の方法
【請求項１５】
標的核酸配列を検出する方法であって、ａ）標的核酸配列を含むと推定されるサンプルから核酸を得る工程、ｂ）前記標的核酸配列を切出す工程、ｃ）前記核酸が二本鎖ならば変性させる工程、ｄ）その一部が前記標的核酸配列に特異的に結合する少なくとも一つの一次プローブを、部分二本鎖標的／プローブ複合体（ＰＤＴＰ）を形成するために十分なハイブリダイズ条件下で接触させる工程、ｅ）少なくとも一つの一本鎖一次プローブの非結合部分に結合させるために少なくとも１つの二次プローブを接触させる工程、および、ｆ）前記ＰＤＴＰを検出する工程、を含む検出方法。
【請求項１６】
少なくとも二つの一次プローブを前記ｃ）工程で変性された標的核酸配列の両方の鎖に結合する為に使用する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも一つの二次プローブは一本鎖である、請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの一次プローブ、又は前記少なくとも一つの二次プローブはリポーター分子を有していることを更に含む、請求項１５の方法。
【請求項１９】
前記ｄ）工程のＰＤＴＰの核酸の少なくとも一つの端がヌクレアーゼ耐性のためにキャップされた、請求項１５の方法。
【請求項２０】
前記ｅ）工程のＰＤＴＰがエキソヌクレアーゼで処理されている、請求項１５の方法。
【請求項２１】
前記キャップされたＰＤＴＰがエキソヌクレアーゼで処理されている、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの一次プローブが前記標的核酸配列にハイブリダイズする時に少なくとも一つのヘアピンループを形成する、請求項１５の方法。
【請求項２３】
標的核酸配列を検出する方法であって、ａ）標的核酸配列を含むと推定されるサンプルから一本鎖核酸を得る工程、ｂ）その一部が前記標的核酸配列に特異的に結合するＤＮＡ二重標的保護分子を、前記工程ａ）の核酸配列と、保護標的核酸配列（ＰＮＡＳ）を形成するために十分なハイブリダイズ条件下で接触させる工程、前記ＤＮＡ二重標的保護分子はペアピン構造を有する、ｃ）ｂ）工程の一以上のＰＮＡＳを含む前記単離した核酸を少なくとも一つの５'一本鎖領域を有するＰＮＡＳ構造を形成するために酵素で分解する工程、ｄ）前記ＰＮＡＳに結合する少なくとも一つのリポータープローブと接触する工程、ｅ）ＰＮＡＳを検出する工程、を含む検出方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ二重標的保護分子は更に捕獲分子を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記リポータープローブはポリｄＴラベルプローブである、請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記ヘアピン構造の両端は酵素分解に耐性である、請求項２３の方法。
【請求項２７】
標的核酸配列を検出する方法であって、ａ）標的核酸配列を含むと推定されるサンプルから一本鎖核酸を得る工程、ｂ）その一部が前記標的核酸配列に特異的に結合するＤＮＡ二重標的保護分子を、前記工程ａ）の核酸配列と、保護標的核酸配列（ＰＮＡＳ）を形成するために十分なハイブリダイズ条件下で接触させる工程、前記Ｄ
ＮＡ二重標的保護分子はペアピン構造をとり、リポータープローブを有している、ｃ）ＰＮＡＳを検出する工程、を含む検出方法。
【請求項２８】
標的核酸配列を検出する方法であって、一つ以上のラベルしたリポータープローブをハイブリダイゼーションの助けになる条件下で一以上のリポータープローブを結合可能な前記標的核酸配列に接触させる工程、及び前記標的核酸配列に結合した前記ラベルしたリポータープローブを検出する工程、を含む検出方法。
【請求項２９】
前記標的核酸配列が少なくとも一つのポリＡ領域を含み、及び前記一以上のラベルしたリポータープローブはポリｄＴ配列である、請求項２８の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、１９９７年１１月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／０６５,３７８、１９９８年２月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／０７５,８１２、および１９９８年３月５日出願の米国仮特許出願番号６０／０７６,８７２の優先権を主張する。
＜技術分野＞ 本発明は核酸配列を検出するための方法および組成物を含む。より具体的には、本発明は、異なる核酸標的保護および回復戦略を使用した特異的遺伝子配列の検出のための方法および組成物を含む。さらに、本発明は核酸開裂のための新規な方法を含む。
＜発明の背景＞ 分子生物学的技術により、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の決定、同定または検出のための多くの正確で迅速な試験が提供されてきた。残念なことに、これらの試験のほとんどは、試験に関与する１または数個の段階を、ＤＮＡのＰＣＲ増幅に依存する。ＰＣＲを用いた標的核酸の増幅は、所望の標的核酸配列以外の核酸配列の増幅をもたらし得る。
【０００１】
多くの標的およびシグナル増幅法が文献に記載されてきたが、高い特異性、簡易性、およびスピードの組合せられたものを提供すると信じられるものはない。近年、核酸検出技術が、２１世紀の診断技術の開発のために研究中である。核酸配列を基本とした増幅（NASBA Organon Teknika）、鎖−置換増幅（Becton Dickinson）、転写を基本とした増幅システム（TAS）、転写を仲介した増幅（Genprobe）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR、F.Hoffmann la Roche）およびインサイツＰＣＲの標的増幅法などの、多くの異なる増幅を基本とする技術が開発されてきた。
【０００２】
他の増幅を基本とした技術は、シグナル（プローブ）増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（LCR/Abbott）、ｑ−ベータバクテリオファージレプリカーゼ（Genetrak systems）、サイクリングプローブ技術（ID Biomedical of Vancouer）、ｂ−ＤＮＡ（Chiron）、インサイツハイブリダイゼーション、リガーゼハイブリダイゼーション、および転写シークエンシングを用いたゲノム増幅（GAWTS）などを含む。
【０００３】
上記の技術は全て、不満足な態様を有する。標的増幅法は、単位複製配列および他の形のサンプル汚染並びに特異性に関連した問題に難点がある。かかる問題は、その技術基礎の限界に存し、適切な実験（キット）設計がないことに一致し、その結果、特異性および感度は高くない。さらに、これらの技術は特異的ＲＮＡ標的を直接スクリーニングする能力に欠けており、これにより、これらの技術が、ＲＮＡウイルス性、癌、および他の感染性疾患診断および治療管理の向上を支持することが厳しく制限される。
【０００４】
さらに、特殊な標的におけるマイクログラム量以上の核酸をスクリーニングできないことにより、さらに、これらの方法の特異性および感度は減少する。実際、感染性疾患診断における１つの真実は、検出の必要が感染時間経過の初期であればあるほど、解析に必要な宿主ＤＮＡ（ミリグラム量）のサンプルは多い。
【０００５】
シグナル増幅技術は同様に、固有な問題を有する。標的を定量できないことと併せて、標的から単一コロニーまで全体的に認識できないことによる、非特異的な高いバックグラウンドシグナルおよび不適切な感度レベルにより、診断の進展の機会はほとんどない。
【０００６】
単一遺伝子コピー検出における現在最も感度の高いアッセイである生物発光のみが、最低数１０万の保護標的を検出できる。必要なのは、単一の遺伝子を検出するための標的検出の感度を増加させる方法である。
【０００７】
現在利用可能な核酸増幅法でも、小サンプル中に存在する比較的少量の標的核酸分子（マイクログラム量のＤＮＡ）を検出できるが、より短時間でより少ないバックグラウンド妨害で標的核酸分子を検出する能力もまた必要とされる。ＰＣＲおよび他の増幅技術に固有な問題は、回収方法の間のサンプル汚染およびＤＮＡ種を汚染し偽陽性結果を与える単位複製配列（増幅ＤＮＡ）の存在を含む。関連性の高い配列により仲介される非特異的標的増幅およびプライマーダイマーの生成の問題がある。また特異性を良好に調節できない結果、偽陽性反応が生じ、感度を良好に調節できない結果、偽陰性反応が生じる。ＰＣＲ結果はしばしば、ＤＮＡ−サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティングおよびプローブハイブリダイゼーション、またはインサイツハイブリダイゼーションなどの他の技術により確証および確認しなければならない。さらに、ＰＣＲおよび増幅技術は、最大１マイクログラムの範囲の、非常に少量の開始サンプルＤＮＡを用いてのみ使用できる。これにより、大量の全／非特異的核酸におけるコピー数の少ない核酸標的の検出に、並びに初期感染時間経過診断にＰＣＲ技術を使用できない。
【０００８】
直接的ＲＮＡ解析を提供する技術は、ノーザンブロットおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイを含む。ノーザンブロットは最初にＲＮＡ分子を変性させ、線形で折り畳まれていないことを確かめる。次いで、ＲＮＡをゲル電気泳動にかけ、膜に移行し、標識プローブとハイブリダイズさせ、可視化法にかける。この方法は定性および定量の両方である。この長い時間と高い費用のかかる方法は、その設計における全ての不利な面のためにＲＮＡ診断においてほとんどまたは全く適当ではなく、これはＤＮＡ診断でのサザンブロットの使用の問題と類似している。これらは、時間の消費、高い費用／材料および労働、比較的少ない標的の検出における感度の欠失、および単一の標的コピーまで感知できないこと、従って後期の伝染性時間経過アッセイを含む。
【０００９】
リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ambion）は、プローブのＲＮＡ分子への結合、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して非特異的ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ領域を除去、電気泳動ゲル上での解析を含む。この方法は定性のみであり、アッセイにおいて可視化に必要なＲＮＡの量のために、診断技術には感度が足りない。
【００１０】
ＲＮＡ診断に可能性のある現在利用可能な唯一のプロセスである、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、間接的ＲＮＡ解析のみ達成できる。ＲＮＡをＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）に変換し、定量的ＰＣＲを実施する。ＲＴ−ＰＣＲは高価であり、特異性および感度が低く、再現可能な結果を得るために全段階を極度に標準化する必要があり、極めて手間を要する。また、ＲＴ−ＰＣＲは初期の伝染性時間経過核酸診断に使用できない。
【００１１】
従って、特異的核酸配列を検出できる方法および組成物が必要である。特に必要なのは、所望レベルの特異性を使用して核酸配列の単離が可能となる柔軟性を与える方法および組成物である。また、核酸増幅技術を使用しないが、任意の量、特に大量のサンプル核酸から、特異的標的配列の単離が可能であり、所望の特異性のレベルに応じて、数レベルの特異性で単離を行える柔軟性を有する方法も必要である。特に必要なのは、ＲＮＡ（核酸標的配列の源としてｍＲＮＡを含むがこれに限定されない）を使用して標的配列を検出できる方法および組成物である。
＜本発明の要約＞ 様々な細胞および／または組織源から単離した標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列の、検出並びに定性および定量の両方の解析のための方法および組成物を記載する。方法は、安価であり、複数のレベルの特異性に特異的であり、感度が高く、広範囲の量の核酸をアッセイでき、再現可能な結果を生じ、最小限の手間が必要とされる。本発明の方法および組成物は、診断および治療に、例えば、ウイルスなどの微生物および他の微生物およびヒト、動物および植物の病原体の検出；ヒト、動物および植物における感染性疾患、癌および転移の診断、血液製剤のアッセイ、および腫瘍の早期検出、法医学、親子鑑定、組織または器官の移植および遺伝子疾患決定などの領域において使用する遺伝子解析に使用できる。これらのアッセイはまた、食物、土壌、水、血液製剤および空気品質試験の汚染検出に使用できる。
【００１２】
本発明の２つの実施形態は、制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）および標的保護アッセイ（ＴＰＡ）を含む。本発明はまた、核酸の部位特異的切断のための新規な技術を含み、これはハロゲン化ヌクレオチド誘導体、好ましくはピリミジンまたはプリン類似体などの反応性基を有するカッタープローブ（ＣＰ）を用いて核酸を切断することを含む。ＲＦＴＡは、特殊なプローブを使用した核酸の選択的な制限開裂および検出を含む。ＴＰＡは、特殊プローブを用いた標的配列の保護および検出を含む。
[カッタープローブ（ＣＰ）およびカッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）]
カッタープローブは、核酸を切断するための新規な方法および組成物を含み、核酸の開裂を必要とする任意の公知のアッセイに使用できる。好ましい方法は、切断する標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含み、これには、ハロゲン化ヌクレオチド誘導体などの反応性基が、標的の開裂部位に並置する位置のプローブに組込まれている。例えば、置換ブロモウリジン（ＢＵ）が、チミジンの代わりにプローブに組込まれると、相補的アデニンが標的核酸（反対の鎖）の開裂部位となる。カッタープローブは特異的部位でＤＮＡまたはＲＮＡを開裂するだけである。いくつかのチミジンがＢＵで置換されている場合、他の３つの塩基と共にカッタープローブに存在する他のチミジン塩基は、配置および塩基カッタープローブによる切断の特異性の基礎になる。カッタープローブは、標的鎖に逆平衡な配列を有する。これらの新規なカッタープローブは、標的核酸の存在を検出するためにカッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）において、または核酸の開裂が所望である任意の他のアッセイにおいて使用できる。カッタープローブの他の使用は、標的核酸の特異的部分の破壊および既知の点突然変異の検出を含む。ＣＰの反応性基であるＢＵは、適当な形の特異的エネルギー、光エネルギーまたは化学試薬により活性化され、標的配列が開裂する。
【００１３】
ＣＰは、本発明の新規なアッセイに使用し得る。さらに、標的配列が一旦、カッタープローブと結合すれば、標的／プローブ複合体は、特異的ヌクレアーゼ分解に耐性となり、ＴＰＡにおいてＰＮＡＳ、保護標的核酸構造（protected target nucleic acid structure）（ＰＮＡＳ）およびＲＦＴＡにおいて部分的二本鎖標的プローブ複合体（ＰＤＴＰ）を形成する。
【００１４】
カッタープローブは、１９９８年２月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／０７５,８１２、１９９８年５月５日出願の６０／０７６,８７２に開示され、その両方をそれぞれの全体を本明細書に取り込む。
[制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）]
制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）は、１９９７年１１月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／０６５,３７８、および１９９８年２月２４日出願の６０／０７５,８１２に開示され、その両方についてそれぞれの全体を本明細書に取り込む。
【００１５】
一般に、ＲＦＴＡは、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ標的の検出に使用し得る。好ましくは、ＲＦＴＡ法および組成物は、少なくとも１つの一次プローブおよび少なくとも１つの第二プローブを含む。プローブは好ましくは一本鎖である。一次プローブは少なくとも２つの部分を有し得る。一次プローブの少なくとも１つの部分は、標的に相補的であり、一次プローブの少なくとも１つの他の部分は第二プローブに相補的である。第二プローブは標的に相補的ではなく、第二プローブに相補的な一次プローブの部分にのみ相補的である。追加の部分をプローブに添加してもよい。
【００１６】
ＤＮＡおよびＲＮＡの両方へ適用される本発明のＲＦＴＡ法は、電気泳動分離後に標的核酸を移行した後に膜ハイブリダイゼーションを利用する従来のＤＮＡまたはＲＮＡブロッティング法に優る利点がいくつかある。ＲＦＴＡは、膜ハイブリダイゼーションよりもかなり迅速で実施が簡便であり、技術的熟練および電気または真空移行システム、ＵＶ架橋剤または真空オーブン、およびハイブリダイゼーションオーブンおよび水浴などの特殊装置の必要が少ない。ＲＦＴＡはまた、膜ハイブリダイゼーションで利用した比較的大量で、比例的に遅いハイブリダイゼーション速度を有するハイブリダイゼーションとは対照的に、はるかに少ないプローブが、電気泳動前に少量でハイブリダイゼーションに利用される点で、標準的ＲＦＬＰ解析よりも実施がかなり安価である。ＲＦＴＡには追加の特殊電気泳動システムは全く必要でなく、利用可能な検出システムは全て、膜に作用させる固定または乾燥ゲル上でより良好とはいわないまでも同等に作用する。さらに、ＲＦＴＡは膜ハイブリダイゼーションよりもより感度が高くあり得る。なぜなら、核酸転写または膜架橋が必要でなく、これは両方共、傷害または不十分な転写による特異的シグナルの欠失をもたらし得るからである。ＲＦＴＡはＤＮＡ増幅を利用しないので、ＲＦＴＡはＰＣＲを基本とした試験でしばしば見られる高い割合の非特異的シグナルの傾向がない。最後に、ＲＦＴＡは、数個のプローブを単一のサンプルを用いて同時に任意の電気泳動ゲル上で試験できる点で多重性の利点を有し、数個のゲルの泳動および／または続く再プローブのためにすでにハイブリダイズした膜を剥離するなどの（この両方共費用と時間のかかる方法である）、複製単離段階を実施する必要がなくなる。
【００１７】
本発明の好ましいＲＦＴＡ法の１つの例は、以下の段階を使用する：１）標的核酸を有するサンプル核酸の分離および精製；２）サンプル核酸の開裂による標的核酸の切出し；３）二本鎖核酸サンプルの一本鎖への変性；４）所望の標的配列の少なくとも一部に相補的な、少なくとも１つの標識された標的特異的一次プローブと精製核酸サンプルの結合。プローブの標的核酸への自発的ハイブリダイゼーションの可能な条件下で、プローブを過剰のモル量で加える。５）標的核酸−プローブ複合体の単離；および６）標的核酸−プローブ複合体の検出。
[標的保護アッセイ（ＴＰＡ）]
ＴＰＡ実施形態を含む方法および組成物は、二本鎖ヘアピンＤＮＡプローブと一緒に一本鎖ＲＮＡの検出に用いることができる。ＴＰＡ実施形態の方法および組成物は、分子生物学技術で一般的に使用されている成分および方法と一緒に使用できる。さらに、ＴＰＡ実施形態は、ＣＰなどの新規核酸開裂技術と一緒に使用できる。
【００１８】
中心で折り畳まれ二本鎖ＤＮＡ構造を形成するポリプリンまたはポリピリミジンに富む配列を、好ましくは有する長さが可変の二本鎖ヘアピンＤＮＡプローブのインビトロ構成の好ましい、ＴＰＡ、ＲＮＡ−ＴＰＡの実施形態。
[ｍＲＮＡ ＴＰＡにおけるＴＦＯヘアピン捕獲プローブ]
ｍＲＮＡにおいてポリピリミジンに富む領域を同定しなければならない。これは三重らせん形成のピリミジン・プリン・ピリミジンモチーフに要求されるため必要である。二本鎖ＤＮＡヘアピン捕獲プローブは２つの部分を有することを特徴とする：３'末端はポリプリンに富む領域であり、５'末端はポリピリミジンに富む領域であり、両方の領域がヘアピンループを形成した伸縮により中間で接続される。ヘアピン捕獲プローブはそれ自体が折り返され、ヘアピンを形成する。また、３'末端は、３'末端に近いが３'末端ではない生化学的フック（ジゴキシゲニンまたはＤＩＧ）と複合体を形成する。
１．当業者に公知の任意の方法によるｍＲＮＡの単離および工程１の二本鎖ＤＮＡヘアピンプローブによる特異的ｍＲＮＡ分子の結合。プローブ／標的配列は、現段階で保護核酸配列（ＰＮＡＳ）である。独特なＲＮＡ標的部位は、ｍＲＮＡの３'ポリＡと５'ｍＲＮＡ末端（５'末端に近い）の間に位置する。これは第一レベルの特異性である。
２．標的ｍＲＮＡ分子の存在により三重らせんＰＮＡＳにならない任意の二本鎖ＤＮＡプローブ分子を分解する、ExoIIIなどのヌクレアーゼの添加などによる、二本鎖構造の除去。
３．次いで、ＰＮＡＳを単離する。好ましい方法として、ＰＮＡＳは、当業者に公知の方法を使用して固体基質に付着させる。かかる方法は、生化学的フックまたは特異的結合対、例えばＤＩＧ（ジゴキシゲニン）およびビオチンおよび抗ＤＩＧの使用によりプローブ／標的複合体を磁気ビーズおよびストレプトアビジン覆膜磁気ビーズに付着させることを含むがこれに限定されない。標的の長さは、可変であり得、好ましくは８から２５ヌクレオチド塩基の間の範囲からキロベース長さのセグメントである。
４．標的の存在は、３'アデニンｍＲＮＡ分子にハイブリダイズする、好ましくは約２５ヌクレオチドの、リポータープローブ分子、好ましくはポリ（ｄｔ）オリゴにより同定する。各レポータープローブ分子は、リポータープローブ分子に会合した、少なくとも１つのメンバーの結合基を有する。
【００１９】
コピー数の少ないＲＮＡ標的の存在を正確に決定する能力は、治療適用の助けとなり、間接的な方法による標的とする一本鎖ＤＮＡの存在の決定を可能にする。
【００２０】
ＣＰ、ＲＦＴＡおよびＴＰＡの実施形態を含む、本発明の組成物は、本明細書で教示する方法を実践するに必要な組成物を含む。例えば、ＲＦＴＡの方法に使用する組成物は、標的配列に相補的な１つ以上のヌクレオチド部分および二次プローブ配列に相補的な１つ以上のヌクレオチド部分を有する一次プローブ、および標識二次プローブを含み得る。ヌクレアーゼおよび緩衝液と共に、選択した一次および二次プローブを含む組成物またはキットが、本発明に含まれる。個々の分子、プローブおよび成分はまた個々に提供できるものと理解されるべきである。
【００２１】
従って、本発明の目的は、好ましくは様々なレベルの特異性で、ヒト、植物および動物において特異的遺伝子配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
【００２２】
さらに別の本発明の目的は、カッタープローブを含む特異的な核酸開裂のための新規な方法および組成物を提供することである。
さらに別の本発明の目的は、一次および二次プローブを含む、特別に設計されたプローブを含むＤＮＡ配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、一次および二次プローブを含む、特別に設計されたプローブを含むＲＮＡ配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
別の本発明の目的は、三重らせん構造の形成を含む核酸配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
【００２４】
さらに別の本発明の目的は、様々なレベルの特異性で、ヒト、植物および動物において、特異的な遺伝子配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
【００２５】
さらに別の本発明の目的は、ヒト、植物および動物における微生物または病原体の同定の決定のために核酸配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
【００２６】
別の本発明の目的は、親子または種同定などの遺伝子関係の決定のために、または器官または組織のドナー可能性を決定するために、核酸配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
【００２７】
別の本発明の目的は、法医学決定に使用するために、または血液供給を保護するために、核酸配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
さらに別の本発明の目的は、ヒト、植物および動物における遺伝子疾患の解析のために、核酸配列を検出するための方法および組成物を提供することである。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の開示した実施例および添付の請求の範囲の詳細な記載の参照後に明らかとなるであろう。
＜詳細な説明＞
本発明は、標的を含むと推定されるサンプルにおける標的核酸配列の検出のための方法および組成物を含む。この方法および組成物は、ＲＮＡおよびＤＮＡ配列の両方の直接的検出に必要な組成物および方法を含む。この方法および組成物は、核酸量、好ましくはナノグラムからミリグラム量の範囲の核酸で、標的配列を検出できる。アッセイの特異性を向上させる段階が、実施する順番に記載され、これを特異性レベルと呼ぶ。本発明の方法および組成物は、診断および治療に、例えば、ウイルスなどの微生物および他の微生物およびヒト、動物および植物の病原体の検出；ヒト、動物および植物における感染性疾患の診断、血液製剤のアッセイ、および腫瘍の早期検出、法医学、親子鑑定、組織または器官の移植および遺伝子疾患決定などの領域において使用する遺伝子解析に使用できる。これらのアッセイはまた、食物、土壌、水、血液製剤および空気品質試験の汚染検出に使用できる。
【００２９】
特異性は現在、ＤＮＡ診断において発達中の概念である。本明細書に使用したように、特異性レベルは、予期される最終結果を可視化するために起こらなければならない単一事象として認識される。核酸診断において、これらの事象は以下を含み得る：特異的核酸制限反応；
特異的核酸プローブハイブリダイゼーション反応；
ＰＮＡＳの固定基質への特異的結合；または シグナル可視化反応。
【００３０】
ＤＮＡ診断技術を再指向し向上する目標に向けて、追加の特異性レベルが前に追加される。追加の特異性レベルは、プローブハイブリダイゼーションの結果とした、標的のサイズを再度調節することにより標的のサイズを効率的に増加することを含む。かかるレベルは、ゲルフォーマットを使用して、ＲＦＴＡの好ましい実施形態に見られる。標的核酸のＣＰ部位特異的非酵素的開裂を含む本発明の方法および組成物は、アッセイに２つのレベルの特異性を提供する利点がある。
【００３１】
本出願は、１９９７年１１月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／０６５,３７８、１９９８年２月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／０７５,８１２、および１９９８年３月５日出願の米国仮特許出願番号６０／０７６,８７２の優先権を主張し、これら全てについてその全体を本明細書に取り込む。
【００３２】
本発明は、公知の分子生物学的技術である方法および組成物を使用する。本発明は、ヌクレアーゼ、プローブ、ハイブリダイゼーションスキーム、捕獲溶出法、種々のサイズ検出法または検出付き溶出の組合せに関する。例えば、本明細書に使用した核酸の単離は、当業者に公知の任意の技術により実施できる。単離および精製法は、公知のSambrookらによる、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1989)（これは本明細書に引用により取り込む）の実験マニュアルに見られる。
【００３３】
他の公知の技術は、核酸の標識付けおよび検出のためのかかる標識の可視化を含む。かかる標識は、レポーター分子と呼ばれ、標識を含むプローブのいくつかはレポータープローブと呼ばれる。使用した標識は、現在入手可能な種類のいずれかであってもよく、直接的な、例えば放射活性、または蛍光分子；間接的な、例えばビオチン／アビジンまたはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）；酵素、例えば熱量測定および／または蛍光基質と結合したアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ；生物発光分子、または１つ以上のシステムの組合せであり得る。これらの例は、唯一の検出法として限定するものではない。核酸またはプローブの任意の標識法を本発明に使用できる。検出法は、標識システムに依存し、これは各個々の試験の設計において選択する。
【００３４】
例えば、標識核酸は、蛍光を使用し得、核酸上に複数のＦＩＴＣ分子（フルオレセインイソシアネート）、または当業者に公知の任意の他の蛍光分子を配置することにより達成できる。さらに、化学発光、生物発光、または化学蛍光（全て酵素仲介）、放射活性または当業者に公知の他の標識は、シグナル増幅が検出の特異性を増加するために必要とされる場合に使用し得る。ゲル可視化は、オートラジオグラフィー可視化のための放射活性、または化学蛍光または当業者に公知のその他を利用し得る。ある方法は、走行後にゲルを、ＡＴＴＯＰＨＯＳＴＭ溶液（Boehringer Mannheim）に配置することを必要とする。核酸上の標識であるアルカリホスファターゼは、ＡＴＴＯＰＨＯＳＴＭ溶液と反応して蛍光を発生する。特異的配列を直接的に検出する別の方法は、エクオリン生物発光（SeaLite Sciences,Inc.）を用いるものである。本発明は、１００ものシグナル増幅分子を、当業者に公知の単一の標的にのせる能力を主張する技術に関する。
【００３５】
さらに、標的配列は、アッセイからの標的の単離により決定し得る。２つの公知の技術が、サイズ分離技術または捕獲分子への結合による標的の取り出しを含む。これらの２つの技術は、それぞれ、本明細書でゲルフォーマットおよび試験管（テストチューブ）フォーマットと呼ぶ。
【００３６】
ゲルフォーマットは、サイズ分離による単離を含み、試験管フォーマットの捕獲法のような、生化学的フックおよび固体基質を使用しない。代わりに、標的／プローブ複合体を、任意の実行可能な方法で、標的／プローブ複合体をサイズ分類することにより単離する。好ましい方法は、ゲル電気泳動であるが、他のサイズ分類技術、例えばクロマトグラフィーまたは分画遠心分離も本発明において考慮する。
【００３７】
一般に、標的／プローブ複合体は、これに限定するものではないが、通常、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動、またはキャピラリーゲル電気泳動により、ハイブリダイズしていないプローブからサイズ分離する。特異的標的／プローブ分子は、特異的核酸プローブ上に配置した標的により同定する。
【００３８】
標的／プローブ複合体の期待されるフラグメントサイズ、従ってゲル上でそれが移動する位置を計算できる。計算の記載は、Sambrook らなどの多くの標準的な文献に見られる。一定時間後の既知サイズのフラグメントの期待される移動距離は、ゲルの型およびゲルの走行に使用した電流量を考慮することにより計算できる。この移動は、所望の標識部分の遅延係数（Ｒｆ）を反映する。Ｒｆは、、添加点から、所望の複合体のゲル上での移動点までの距離を、ゲルにより遅延されない小分子の移動（通常ダイ前端）で割ったものとして定義される。別の言葉でいえば、プローブ／標的複合体のＲｆは、ダイ前端の移動距離で、プローブ／標的複合体の移動距離を割ったものと定義される。ダイ前端は同一条件下で同様に移動する事実から、Ｒｆは一般に定数であるので、複合体のＲｆは標的／プローブ複合体の移動距離に比例する。
【００３９】
独特（決定的）なゲル位置への移動により、プローブ／標識複合体のサイズだけではなく、標識の存在のために、１つの追加の特異性レベルが追加される。標識プローブを有する標的配列は、類似のサイズであり、ゲル上の同位置で走行する、他の非標識、非標的核酸配列により検出が妨害されることなく、特異的サイズで検出できる。標識／プローブ複合体は、当分野で公知の方法によりゲルで可視化する。
【００４０】
試験管フォーマットは、ＤＩＧまたはビオチン／ストレプトアビジン、酵素／基質、または抗体／抗原などの特異的結合対を使用する。これらの結合対もまた、生化学的フックと呼ばれる。結合対の一方は、他のプローブまたは標的配列に結合する通常捕獲プローブと呼ばれるプローブ、またはプローブの一部に結合する。他方の結合対のメンバーは、固体支持体表面、または捕獲分子を溶液から分離するために使用できる表面、例えば磁気ビーズに付着する。固体支持体は、プラスチックプレート、シリコン化プレート、およびプラスチックビーズを含むがこれに限定されず、それらから標的をさらに解析するために開裂または溶出できる。これにより単一のアッセイで１つ以上の標的の解析が可能となる。
【００４１】
本発明の２つの好ましい実施形態は、制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）および標的保護アッセイ（ＴＰＡ）を含む。さらに、本発明において、各実施形態は、ハロゲン化ヌクレオチドなどの反応性基を有するカッタープローブ（ＣＰ）を用いて核酸を開裂する新規な方法および組成物と共に使用し得ると考えられる。ＣＰの方法および組成物はまた、核酸の開裂を所望する任意のアッセイで使用できる。
[核酸配列を切断するためのＣＰの方法および組成物]
本明細書に使用したように、ＣＰは、活性化時にフリーラジカルを形成する反応性基を有する核酸プローブを意味する。好ましくは、反応性基は、ハロゲン置換ヌクレオチド誘導体、好ましくは臭素または塩素、最も好ましくはハロゲン置換ピリミジン誘導体であるが、任意のヌクレオチドをハロゲン置換し得る。しかし、機能的等価分子、すなわち、高い効率で核酸鎖の糖−リン酸骨格を開裂する後エネルギーを付与する２つのフリーラジカルの産生により特徴づけられるものは、用語ＣＰに含まれると考える。本発明はまた、複数鎖の複合体において、ヌクレオチドのリン酸糖骨格を開裂するに十分なフリーラジカルを生成する分子を含む。用語ＢＵ（ブロモウラシル）は、理解し易くするために本明細書において使用し、プローブ分子において使用できる化合物として限定するものではない。用語ＢＵまたはＣＰにより考えられる他の可能な反応性基は、クロロウラシル、ブロモシトシンおよびクロロシトシンを含み、これは活性化時にフリーラジカルを生成することが知られている。
【００４２】
かかるプローブの使用例は、エネルギー付与５'ブロモウラシル（ＢＵ）含有プローブを付与することを含む。ウラシルフリーラジカルが形成され、高頻度で、ＢＵに並置する核酸鎖を制限するであろう。
【００４３】
臭素フリーラジカルは、低頻度で反対の核酸鎖を制限する。これらの方法において、キレート形成ダイ（intercalating dye）の添加により、ブロモウラシル活性化が引き起こされ、臭素フリーラジカルが生成し、高頻度で反対の鎖を開裂する。
【００４４】
本発明の方法および組成物は、カッタープローブを用いた標的核酸の開裂を含む。標的核酸は、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であり得る。好ましくは、ＣＰは一本鎖であるが、他の形または会合構造も本発明に考慮する。新規なカッタープローブを、カッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）において使用して、標的核酸の存在を検出できる。カッタープローブの他の使用は、標的核酸の特異的部分の破壊および既知の点変異の検出を含む。
【００４５】
核酸標的の制限は、以前、これは、制限エンドヌクレアーゼを用いて達成され、使用した酵素に特異的な配列でおよび制限部位がゲノムに存在する場所でのみ核酸を切断する。このように核酸を制限することは、制限配列が、常に、保存された核酸標的領域の所望の位置に見られないため限られる。さらに、多くの制限酵素が、例えば開裂用に塩基のメチル化を要求するなど、独特な要求を有する。本発明の方法にはかかる拘束がない。
【００４６】
本発明は、反応性基を含むように変化した、新規ヌクレオチドの使用を含み、これは活性化時に、例えば、特異的エネルギーまたは化学試薬が作用することにより、核酸鎖に特異的な破壊が引き起こされる。本発明は、二本鎖破壊を引き起こせる任意のＵＶエネルギーまたは他の周波数の使用に関する。さらに、本発明は、核酸配列に組込めるか、または複合体を形成でき、光または他の刺激の曝露時に核酸の一方または両方の鎖に破壊を引き起こせる、任意の光反応性化合物（臭素および塩素を含むがこれに限定されない）の使用を考える。
【００４７】
ＣＰの方法および組成物は、切断する標的配列に相補的なプローブ配列を使用する。カッタープローブにおいて、反応性基、例えばハロゲン化ヌクレオチド誘導体を、標的の開裂部位に並置する位置のプローブに組込まれている。例えば、ブロモウリジンが、チミジンの代わりにＣＰに組込まれると、相補的アデニンが標的で開裂する。カッタープローブは所望の部位でＤＮＡまたはＲＮＡを開裂するだけである。いくつかのチミジンがＢＵで置換されている場合、プローブ分子の相補配列は、標的上の配置の特異性およびカッタープローブによる特異的部位開裂の基礎を形成する。
【００４８】
好ましい実施形態はブロモウリジンを使用する。ＢＵを有するＣＰの活性は、ブロモウラシル置換ＤＮＡの光感受性に基づく。ＢＵ置換ＤＮＡは、短波長ＵＶ２５４ｎｍから長波長ＵＶ３１３ｎｍおよびさらには３１３ｎｍ以上の高強度の可視光領域およびＸ線およびγ放射を含む範囲の光により開裂できる。特定の理論と関連づける意図はないが、上記の型のエネルギーはハロゲン化ピリミジン（ＢＵ）を２つのフリーラジカル（臭素フリーラジカルおよびウラシリルフリーラジカル）に変換すると考えられる。ウラシリルラジカルは、ＢＵが取込まれた鎖上の糖リン酸骨格および上流および下流の２つの隣接する塩基を破壊し、並びに、臭素フリーラジカルは、標的鎖の糖リン酸骨格を破壊する。ブロモウリジン塩基での二本鎖破壊効果は、２５４ｎｍで顕著である。しかし、インビボでは、チミンダイマーは補助反応を形成する傾向がある。本発明のインビボ法において、チミンダイマーを所望でない場合、好ましい実施形態は、３１３ｎｍのＵＶ光波長を使用する。インビトロシステムにおいて、チミンダイマーが適用に全く損傷を与えない場合、約２５４ｎｍのＵＶ曝露が好ましい。
【００４９】
塩基カッタープローブを使用する利点は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子上の所望の部位で、標的を制限することである。これにより、標的を含むことが疑われるサンプル核酸の、標的の正確なサイズでの切断が可能となり、標的の端を決定できる。かかる切断により、５'または３'突出のない平滑末端標的が得られる。
【００５０】
ＣＰの方法および組成物の実施形態は、図１に示す。ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖標的（５０）は、少なくとも１つの一本鎖カッタープローブ（５４、５６）とのハイブリダイゼーションにより開裂する。ＢＵは、プローブ（５４、５６）のチミンを置換し、これは標的における開裂されるアデニンに並置する。活性化時に、ＢＵは標的（５０）のアデニンと相互作用する。ＢＵ含有プローブ（５４、５６）が標的核酸鎖（５０）上の特異的領域にハイブリダイズした後、標的／カッタープローブ複合体を、ＵＶ光に曝露する。光曝露により、プローブ（５４、５６）上のＢＵ挿入部位、および反対の標的核酸鎖（５０）上の並置部位の両方で鎖破壊が生じる。
【００５１】
プローブのＢＵ分子は、互いに隣に位置しているか、または任意の位置でプローブ中に分散して得る。この技術を使用して、選択的に任意の部位で核酸を切断できる。切断は、特異的配列でのみ切断する制限エンドヌクレアーゼにより認識される部位に限定されない。この新規な方法を用いて、非酵素的であるが、配列特異的な核酸切断が、標的の両端において可能である。別に、ＣＰは標的に相補的でもよく、ＣＰの活性化により二本鎖標的／プローブ複合体が切出される。本発明は１つまたは２つのＢＵ部位の使用に限定されず、完全切断は、２つ以上の隣接するＢＵ分子を含み得る。
[核酸のＫｂ長セグメントの制限]
本発明の別の実施形態において、図２に示されるように、標的核酸配列（５０）を含むことが疑われる二本鎖ＤＮＡサンプル（６４）を、ＣＰ（５４、５６）と使用できる。サンプル配列（６４）は変性、次いでＣＰ（５４、５６）とのハイブリダイゼーションにより分離する。ＣＰの活性化により、制限部位１および制限部位２での全標的の制限が生じる。Ｄ段階において、ＣＰは標的の一方の側上にあり、切出し一本鎖標的を生じる。
[一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ標的でのＣＰの好ましい実施形態]
カッタープローブアッセイ（ＣＰＡ）は自動化および小型化が可能であり、高い特異性および高い感度を有する結果を提供する。なぜなら、最低３の特異性レベルがこのフォーマットで可能であるからである。この技術は、広範囲の量の核酸を処理でき、しかも非常に高い感度を保証する。さらに、所望であれば、ＣＰＡにより創製された標的／プローブ複合体を、ＰＣＲ、前記した他の増幅技術、およびＤＮＡ−チップアレイなどの他のＤＮＡ解析技術と共に使用できる。
【００５２】
好ましいＣＰＡ３段階法は以下である：
１）サンプル一本鎖核酸を単離し；
２）カッタープローブとハイブリダイズし、制限し、プローブ／標的複合体を形成し；
３）標的を単離および検出する。
【００５３】
標的の単離は、任意の公知の技術により、好ましくは試験管フォーマットまたはサイズ分離により達成され得る。
標的／プローブ複合体の単離のための試験管フォーマットを使用するＣＰＡは、図３に示し、ＲＮＡまたはＤＮＡに使用できる。１つ以上の配列特異的ＣＰを任意のアッセイで使用できる。図３のＡにおいて、試験するサンプル核酸（６４）を、単離および精製する。図３に示した例において、サンプルはＤＮＡ（６４）である。サンプルは、ＲＮＡでもよく、これは通常一本鎖である。
【００５４】
図３、段階Ｂにおいて、ＣＰオリゴ（５４、５６）を、設計し、標的配列および所望の開裂部位（群）に基づいて製造した。ＣＰ−アンカー（５６）は、任意の位置で複合体を形成した生化学的フックを有する。ＣＰ−リポーター（５４）は、任意の位置で複合体を形成したリポーター分子を有し、標的／プローブ複合体可視化を助ける。
【００５５】
段階Ｃにおいて、標的を含むと推定されるサンプル核酸を、それが二本鎖である場合、変性させる。
段階Ｄにおいて、以下の成分をハイブリダイゼーションの可能な条件下で混合する：変性サンプル核酸；カッタープローブ対；およびＣＰアンカー／標的複合体の結合のための固定基質、例えば抗ＤＩＧ（８８）で覆膜した磁気ビーズ（７２）。ＣＰリポーター（５４）上の標識は、アステリスクで示す。約３１３ｎｍでのインビトロでのＵＶ照射は標的（５０）を制限する。
【００５６】
図３の段階Ｅは、複合体の固体基質（７２）へのアンカリングを示す。一旦結合すると、制限された標的／プローブ複合体は、高分子量ゲノムＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ（変性）またはＲＮＡ標的から容易に分離する。例えば、アンカー捕獲分子（８８）を介して付着した標的／プローブ複合体を有する磁気ビーズ（８）を、十分に洗浄した。２つのプローブ（５４、５６）を有する標的（５０）はＰＮＡＳ（９０）である。
【００５７】
段階Ｆにおいて、ＣＰ−リポーター（５４）からのシグナルを増幅する。
好ましい実施形態において、各アッセイは、カッタープローブアンカー対（ＣＰ−アンカー対、ＣＰ１）と呼ばれる２つのカッタープローブ、および、カッタープローブリポーター対（ＣＰ−リポーター対、ＣＰ２）と呼ばれる２つのリポータープローブを使用する。
【００５８】
カッタープローブアンカー対は、標的配列の一部のみに結合できることを特徴とする。図３に示したＤＮＡアンカープローブ（５６）は末端にブロモウラシル塩基およびプローブの他の塩基と複合体を形成しているジゴキシゲニン（ＤＩＧ）（７０）またはアンカー分子を有する。アンカー捕獲分子（８８）は抗ＤＩＧである。
【００５９】
カッタープローブリポーター対（５４）は、ＣＰ−アンカー対が結合できない配列である、一本鎖ＤＮＡ標的の残りの一部に結合できることを特徴とする。
どちらかのＣＰ対が、相補的一本鎖ＤＮＡ標的または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の変性鎖またはＲＮＡ標的に結合する。
【００６０】
示した特異的成分を例えば使用し、本発明はかかる特定の例には限定されないと理解する。上記のプローブは、長さが可変である。また、図１Ｂおよび１Ｃに示すように、追加の特異性レベルがＣＰＡアッセイにおいて必要である場合、より多くのカッタープローブ（５８、６０、６２）を追加でき、各プローブは追加の特異性レベルに寄与している。
【００６１】
ＣＰＡは、その中に構築された複数の特異性レベルを有し、以下を含む： １．ＢＵＣＰ−アンカー対（ＢＵＣＰ１）（５６）の結合 ２．ＢＵＣＰ−リポーター対（ＢＵＣＰ２）（５４）の結合３．標的／プローブ複合体の捕獲（標的−制限および保護される）：ＤＩＧ／抗ＤＩＧ磁気ビーズ相互作用。
【００６２】
さらに、ＢＵＣＰ−アンカープローブ（５６）およびＢＵＣＰ−リポータープローブ（５４）は非相補的であり、標的配列（５０）それ自体は、これらのプローブの両方に連結する核酸セグメントであるという事実は、低バックグラウンドの高特異的アッセイを提供する。
【００６３】
一本鎖標的ＤＮＡ（変性一本鎖ＤＮＡ）またはＲＮＡ標的の検出感度は、現段階の二本鎖標的／プローブ複合体および他の一本鎖ＤＮＡ／ゲノムＤＮＡを、Ｓ１またはヤエナリ・ヌクレアーゼなどの酵素、または一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡを３'−５'の方向に分解する、類似の機能をもつ任意の他の酵素での処理により向上できる。一旦、プローブが標的に結合すれば、標的／プローブ複合体は保護核酸構造（ＰＮＡＳ）となり、これらの酵素による分解に対して耐性となる。このヌクレアーゼ処理は任意であるが、その使用は本発明に考慮され、必要時にアッセイの感度を増加させ、実施するアッセイに依存する。
[サイズ分離を使用したＣＰＡ]
ゲルアッセイフォーマットのこの好ましい実施形態は、図３の段階Ｆでの試験管フォーマットと異なる。ゲルアッセイフォーマットは、以下のレベルの特異性で形成される。
１．ＣＰ−１、アンカー分子、ＤＩＧ等の結合は必要ないが、プローブ（５６）は標的（５０）を保護および制限する。
２．ＣＰ−２、リポーター分子の結合は必要ないが、プローブ（５４）は標的（５０）を保護および制限する。
３．ゲルの泳動、制限標的（５０）は予測可能な距離Ｒｆに移動する。または上記で議論した任意のサイズ分離技術を使用する。追加の特異性レベルが必要であれば、２つのＣＰを、縦にハイブリダイズして標的を保護および制限する３つのプローブに断片化することにより導入できる。図１はこのプローブ断片化（５８、６０、６２）を示す。
[三重らせんが形成されるＣＰＡの実施形態−ＴＦＯ（図４）]
この実施形態において、標的配列（５０）は二本鎖であり、プローブ（６８）は一本鎖である。プローブ（６８）が標的配列にハイブリダイズした場合、プローブ（６８）は三重らせん構造を形成する。かかるプローブは三重らせん形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）と呼ばれ、特異的二本鎖遺伝子セグメントの切出しに使用できる。プローブは、（非共有結合的に）二本鎖標的のいずれかの鎖と会合できる。この実施形態はインビボおよびインビトロで遺伝子の切出しに使用できる。
【００６４】
特異的二本鎖遺伝子セグメント（二本鎖ＤＮＡ）の切出しは、遺伝子療法および生物工学の分野の出現により幅広い関心を集めている。これらの方法におけるＤＮＡの非酵素的制限は、ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ制限の使用以上に、新規かつ有益である。エンドヌクレアーゼ制限は、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）による４−８の塩基の制限／認識部位を必要とし、これは配列を切断したい場所に位置していないかもしれない。ブレオマイシン、ＥＤＴＡおよびその他などの大きな電気的に陰性の分子が、核酸に付着し、ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドへの付着により特異的な微量塩基カッターを生成する方法を提供するために使用し、ブレオマイシンまたはＥＤＴＡが一本鎖ＤＮＡに近接していることからＤＮＡ鎖の切断が生じる。
【００６５】
電気的陰性形のＤＮＡ切断に関する問題は、遺伝子セグメントを切出すために、二本鎖ＤＮＡを変性、切断、および再生する必要性および高度に電気的に陰性な切断分子の調節不可能な反応性から、複数である。これらの分子は、特異的部位へのプローブハイブリダイゼーションの前に、それ自体および非特異的ＤＮＡ部位と反応し得る。
【００６６】
例えば、インビボおよびインビトロでの遺伝子切出しのための、本発明の新規な方法および組成物は、ＣＰの形である、ＴＦＯの使用により達成される。インビトロで、独特な二本鎖ＤＮＡセグメントに特異的なＴＦＯを、数倍過剰に加えてＤＮＡとハイブリダイズさせる。ＴＦＯは、ヘリックスの大きな溝に存在し、ここでフッグステイン結合（弱い水素型結合）により結合している。本発明の１つの実施形態において、ＴＦＯはＢＵ−ＴＦＯと呼ばれるＢＵで置換された２つの末端チミン塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
【００６７】
ＢＵ−ＴＦＯ保護標的／プローブ複合体の、約３１３ｎｍのＵＶ、または臭素原子を励起しフリーラジカルを生成する任意の波長での処理は、短い二本鎖切出しのためにＴＦＯの両端で二本鎖ＤＮＡを切断する。
【００６８】
図４Ｂで示した第二の実施形態において、大きい二本鎖ＤＮＡセグメントは２つのＢＵ−ＴＦＯの使用により切出すことができる。ＤＮＡの大きな部分のフランキング領域を、ＣＰまたはＴＦＯにハイブリダイズさせる場合、全ＤＮＡ区分は、ＤＮＡのＫｂ区分であり得、本区分は核酸分解から保護される。
【００６９】
ＢＵ−ＴＦＯカッタープローブのインビボへの適用には、変更された塩基からなるＢＵ−ＴＦＯを用いて細胞をトランスフェクションすることが必要であり、細胞膜結合ＤＮＡヌクレアーゼにより認識されない。インビボで２つの形のＢＵ−ＴＦＯが染色体部位に結合した後、より透過型のエネルギー、例えばＢＵ増感効果にも関与することが示された低用量のＸ線で放射を行う。
【００７０】
これらの制限法およびカッタープローブ組成物はまた、インビボおよびインビトロにお
ける遺伝子破壊にも使用され、ＴＦＯの結合形は遺伝子切出しプロセスにおける結合と類似している。この実施形態は図５に示す。多くのおよび近い空間配置をとる反応性基、例えばＢＵが、ＴＦＯを通じて存在し、照射後、目的物でない核酸配列が消去され、通常細胞破壊がもたらされる。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、ＢＵ置換分子を用いて、細胞性ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡを標的化することである。これにより、ＢＵ−カッタープローブは、部位選択的開裂のために特異的ＲＮＡ分子に結合する。臭素および他のフリーラジカルの生成により、ｍＲＮＡ翻訳機能が破壊され、細胞は生存し続けるが、破壊された特異的ｍＲＮＡ集合は存在しない。ＢＵ−ＣＰは、ＢＵ−ＣＰプローブを用いると、ＲＮＡが削除され、一方、アンチセンスＤＮＡを用いると、ＲＮＡは依然として存在し、ＤＮＡにほとんど結合しないという点から、アンチセンスＤＮＡよりも利点がある。結合条件は変化し得、ＲＮＡは依然として、翻訳または他の機能に関しては存在する。
[ＴＦＯを用いた点突然変異の検出]
カッタープローブの組成物および方法の別の実施形態は、文書化された点変異の検出である。点突然変異を検出するためにＣＰを使用する例を表１に示す。この方法の１つの実施形態は、標的配列を得るために、点変異を含むと推定されるサンプルＤＮＡの変性および制限を含む。この制限は、任意の公知の制限法、またはより好ましくは、２つのＣＰを使用して達成され、点変異部位を含むと推定されるＤＮＡの小セグメントを単離する。第三ＣＰを使用して標的配列をハイブリダイズする。表１に示されるように、点変異が存在する場合、第三ＣＰの照射により、標的配列およびＣＰ複合体に開裂が引き起こされる。点変異が全く存在しない場合、開裂は全く生じない。次いで、サンプルをゲル上で走行させ、可視化して、複合体が開裂したかを決定する。点変異の有無を可視化する１つの方法は、標識配列に結合するＣＰを標識することである。
【００７２】
【表１】
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[制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）]
本発明の制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）は、直接的にＲＮＡまたはＤＮＡ標的を検出する。標的は一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＦＴＡ法は、少なくとも１つの一次プローブおよび少なくとも１つの二次プローブを使用する。全プローブは一本鎖である。一次プローブは少なくとも２つの区分を有する。一次プローブの少なくとも１つの区分は標的に相補的であり、一次プローブの少なくとも１つの区分は第二プローブに相補的である。二次プローブは標的に相補的ではなく、二次プローブに相補的であるように設計された第一プローブの区分にのみ相補的である。追加の区分を一次プローブに追加してもよい。追加の区分は標的または第二プローブのいずれかに相補的であり得る。
【００７３】
一旦プローブ／標的複合体が形成されると、サイズ分離または生化学的フックによりおよび、試験管フォーマットの固体支持体への結合により単離できる。両方の単離法を上記する。
【００７４】
ＴＰＡおよびＲＦＴＡなどの技術は、ミリグラム量の核酸から、ナノグラム、ピコグラムおよびさらに少量の標的（フェムトモルまで）を解析できる。本発明の実施形態はまた、非常に小さいサンプルにおけるコピー数の少ない核酸または他の標的を同定する。大量の核酸を処理する能力は、現在のマイクログラムの解析技術からの急進的な逸脱であり、従ってＤＮＡ技術は非常に向上する。
[ＤＮＡ ＲＦＴＡ適用]
ＲＦＴＡは、感染性物質の同定のためのＤＮＡ配列の簡単な検出から、組織適合性抗原の遺伝子型、ウイルス株型、または遺伝子疾患試験などの細かいＤＮＡ配列解析が所望である、より複雑な適用までの様々なＤＮＡ診断適用に使用できる。細かいＤＮＡ配列差異は、配列特異的プローブ自体を使用して、または最初の消化段階で使用した制限エンドヌクレアーゼの選択において、またはその両方の組合せで決定でき、後者の方法ではハイブリダイズした制限フラグメントのサイズが変化する。ＲＦＴＡはまた、可変数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）の差異、並びに制限フラグメント多形（ＲＦＬＰ）法のこの修飾を使用してサンプル間での小タンデム反復（ＳＴＲ）マーカーを決定するために使用できる。ＲＦＬＰ法は現在、ハイブリダイゼーション用膜を使用して、法医学および親子鑑定を実施、並びに骨髄移植の成功も評価する。下記の開示は、ＤＮＡ用の方法および組成物の適用を指向するものであるが、ＲＮＡもまた考えられ、ＲＮＡ適用の修飾は下記に示す。
【００７５】
ＤＮＡ ＲＦＴＡ実施形態の例は、図６および７に示す。図６は、段階Ａ−Ｇを示す：段階Ａ、サンプルＤＮＡの単離および精製；段階Ｂ、サンプルＤＮＡからの標的配列５０の放出、段階Ｃ、二本鎖核酸サンプル配列の変性；段階Ｄ、標識一次プローブ７４を用いた標的配列５０のハイブリダイゼーション；段階Ｅ、二次プローブ７６を用いたハイブリダイゼーション；段階Ｆ、別の二次プローブ７８を用いたハイブリダイゼーション；および段階Ｇ、サイズ分離による単離。次いで、得られた構造を、好ましくはゲル電気泳動を使用して、解析ゲルに適用し、標識バンドのＲｆを決定する。
【００７６】
標的／プローブ複合体をゲル電気泳動により単離する場合、ＲＦＴＡに記載した特異性レベルは：１）５'標識切出し機構、２）３'標識切出し機構（最初の標識切出し機構と異なる場合、追加の特異性レベル）；３）標識を有する一次プローブ（７４）；４）二次プローブ（７６）；５）二次プローブ（７８）；および６）予測可能な移動（複合体のＲｆ）である。追加のプローブは、断片化でき、特異的配列に追加して特異性レベルをさらに増加できる。
[ＤＮＡ ＲＦＴＡの段階および考察は図６に記載：]
段階Ａ：サンプルＤＮＡ源：ＤＮＡの単離および精製本発明の制限フラグメント標的アッセイ（ＲＦＴＡ）は、サンプルに存在する標的ＤＮＡ配列を検出する。方法は、標的を含むことが疑われる源からのＤＮＡサンプルの精製を使用する。源は、細胞、組織、細胞小器官、血清、水および他の液体を含むが、これに限定されない。宿主またはサンプルＤＮＡは、高分子量ゲノムＤＮＡの形であり得る。精製は、当業者に公知の多くの方法のいずれか１つであり得るか、またはかかる目的のために意図された増幅ＤＮＡを使用し得る。
段階Ｂ：ＤＮＡ ＲＦＴＡの標的核酸の切出し次いで、精製サンプルを開裂して、標的核酸配列（サンプル中に存在する場合）を切出す。標的核酸の切出しは、ＲＦＴＡ法の第一の特異性レベルである。
【００７７】
切出しは、いくつかの異なる方法のいずれか１つで達成できる。１つの方法は、１つ以上の配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる消化を含み、その制限部位は標的核酸の境界をなすことが知られている。追加の特異性レベルは、最初の制限エンドヌクレアーゼとは異なる部位で標的を切出す第二エンドヌクレアーゼの使用により添加できる。
【００７８】
他の型のヌクレアーゼ、例えば非特異的エンドヌクレアーゼも使用し得る。例えば、核酸はリボザイム、リボヌクレアーゼを使用する方法、または他の方法を使用して開裂し、核酸を開裂できる。１つ以上のエンドヌクレアーゼまたは他の型のヌクレアーゼの選択は、標的配列および実施する個々の試験設計に依存する。
【００７９】
他の方法を、ＤＮＡのヌクレアーゼ切断の代わりに利用可能である。本発明の新規な試みは、任意の部位でＤＮＡおよびＲＮＡを選択的に切断するための前記したカッタープローブ（ＣＰ）である。切断は、特異的配列でのみ切断するエンドヌクレアーゼにより認識される部位に限定されない。
段階Ｃ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける変性一旦サンプル核酸が標的核酸の切出しを受けると、全サンプルＤＮＡを、熱、イオンまたは塩条件、水酸化物、またはｐＨ条件などの公知の方法を使用して、個々の相補鎖に変性する。
段階Ｄ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける一次プローブのハイブリダイゼーション図６に示すように、変性後、サンプルＤＮＡをハイブリダイゼーションの可能な条件下でプローブと結合させる。好ましい実施形態において、３つのプローブ、一次プローブおよび２つの二次プローブを、ＲＦＴＡ法で使用する。一次プローブは、標的に排他的に結合するように特別に設計されているので、標的がサンプルに存在する場合にのみ、一次プローブは結合する。本発明は標的およびプローブサイズは可変であると考える。
【００８０】
ａ）一次プローブの設計一次プローブ（７４）の設計の考察は、一方のサンプル鎖（ワトソンまたはクリック鎖として知られ、図ではＷまたはＣと略す）または両方のサンプル鎖を、本発明において標的鎖（５０）として使用し得る。両方の鎖の使用により、シグナルは２倍増幅する。後者の実施形態は、特定の標的核酸鎖（５０）に特異的な鎖特異的一次プローブ（７４）の使用を必要とする。
【００８１】
一次プローブ（７４）は、１つ以上の部分を有し得る。好ましい実施形態において、一次プローブは３つの部分を有する。第一部分（８０）は、配列相同性または他の手段により、二次プローブ（７６）（標識していてもしていなくてもよい）に結合できる。一次プローブ（７４）のこの第一部分（８０）は、配列相同性または他の手段により、標的核酸配列（５０）に結合できず、最初の二次プローブ（７４）に結合する。一般に一次プローブ（７４）の中間付近にある第二部分（８２）は、配列相同性または他の手段により、標的配列（５０）に結合できる。この実施形態において、一次プローブ（７４）の第三部分（８４）は、配列相同性または他の手段により、別の二次プローブ（７８）（標識していてもしていなくてもよい）に結合できる。二次プローブは標的配列に結合できない。
【００８２】
あるフォーマットにおいて、一次プローブ（７４）の第一（８０）および第三（８４）部分の一方または両方は、付着した、標識などのリポーター分子を有する。リポーターはシグナル増幅を向上させるために伸長または短縮し得る。
【００８３】
１つ以上の配列同定が所望である解析において、異なる標的領域への結合のために異なる配列を有する複数の一次プローブを、同時に、反応混合物に使用する（多重）。これらのプローブは、互いに相補的ではない。使用したプローブの数は、当業者には公知である、捕獲−検出、分離および検出の可能な方法により制限される。
【００８４】
一次プローブは、ＲＦＴＡ法において、第三の特異性レベルである。
ｂ）標識プローブプローブは、放射活性、蛍光、または当業者に公知の任意の他の検出法を使用して検出分子を用いて標識し得る。１つの実施形態において、一次プローブを、その全長に沿って、どれだけ多くの異なる部分が一次プローブを含むかにかかわらず、標識する。
【００８５】
ｃ）一次プローブのハイブリダイゼーション一次プローブ（７４）を、自発的反応を確かにするために、モル過剰量で変性サンプルＤＮＡを配置させる。次いで、一本鎖サンプルＤＮＡおよびプローブをハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、遅延冷却、イオン調整、またはｐＨ中和などの公知の方法により行い得る。これはアッセイの第三の特異性レベルである。
段階Ｅ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける最初の第二プローブのハイブリダイゼーション図６、段階Ｅで示すように、次いで、最初の第二プローブを一次プローブにハイブリダイズさせる。第二プローブ（７６）は、標的を知らせるために使用し、従って、標識され、これはリポータープローブである。二次プローブは、オリゴヌクレオチド（一本鎖ＤＮＡ）配列、通常、しかし限定的ではないが、１０−２５ｍｅｒプローブからなる。ゲルフォーマットにおいて、二次プローブを十分に標識し得る。各二次プローブは、ＲＦＴＡ法に別のレベルの特異性を追加する。好ましい実施形態において、２つの二次プローブを使用し、それぞれ、第四および第五の特異性レベルである。
【００８６】
二次プローブ（７６）および一次プローブは同時に加えることができ、モル過剰量で変性サンプルＤＮＡとハイブリダイズさせる。別に、二次プローブは、一次プローブがハイブリダイズした後に、加え得る。ハイブリダイゼーションは公知の方法により行い得る。これはアッセイの第四の特異性レベルである。
段階Ｆ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける別の二次プローブのハイブリダイゼーション図６に示すように、別の二次プローブ（７８）を使用する場合、次いでそれを標識し、一次プローブにハイブリダイズさせる。標識の型は、選択した検出法により決定する。全ての一次および二次プローブ（７６、７８）を、同時に、累積的な特異性レベルでハイブリダイズし得る。２番目の二次プローブの追加は５の特異性レベルである。
段階Ｇ：ＤＮＡ ＲＦＴＡにおける単離および検出標的（５０）がサンプル中に存在する場合、付着した二次プローブまたはプローブ群を有する一次プローブと標的配列の得られた複合体は、二本鎖構造である（図６の段階Ｆに示す）。次いで、複合体をサンプルＤＮＡの残りから単離し、検出する。単離の２つの実施形態（ａ）図６に示すサイズ分離および（ｂ）図７に示す捕獲プローブが示される。ゲル電気泳動後、期待したゲル位置（Ｒｆ）での標識バンドの検出により、６つの特異性レベルを有する核酸標的の存在が示される。
【００８７】
ある場合、標的は、一次プローブおよび二次プローブ濃度よりも少ない数で存在し得る。この場合、一次プローブおよび二次プローブは、標的に結合することなく、共にハイブリダイズし得、ゲル上に偽陽性を与える。標的にハイブリダイズしていないプローブを識別するために、一次プローブの第二部分（標的に相補的な区分）に配列特異性を有するカッタープローブ、例えばＢＵ塩基カッターを、一次および二次プローブのハイブリダイゼーション後に、標的／プローブ複合体にハイブリダイズさせ得る。その後、ハイブリダイズしたサンプル複合体をＵＶ（約３１３ｎｍ）で処理すると、プローブ／標的複合体が２つの小複合体に開裂する。２つの小複合体は、サイズ分類ゲル上でのそのＲｆの算定により、標的を含まないプローブ複合体から、容易に識別される。
【００８８】
一次プローブの結合が非特異的である場合、次いで、標識バンドは、計算した標的／プローブ複合体（通常小バンドを与える）のＲｆとは別のサイズ位置に現れるか、またはゲルまたは膜上に観察されるＤＮＡバンドは全く標識を有さない。それ故、一次プローブの僅かな非特異的結合は、ＲＦＴＡ試験において診断解釈の結果を混乱させない。
【００８９】
標的／プローブ複合体の３'末端は、３'末端を除去および標的および二次プローブ配列をギャップがその間に存在しないように設計することにより３'末端の遊離デオキシリボースヒドロキシル基（すなわち、別のヌクレオチドに結合していないヒドロキシル）にキャップをすることによりヌクレアーゼ耐性となり得る。同様に、５'末端でのキャップは、遊離５'ヒドロキシルまたはホスフェートの除去により達成される。ヌクレアーゼ耐性（ＲＦＴＡでは不必要であるが）は、特異的適用のためのアッセイの感度の増加の助けとなり得る。
【００９０】
図８−Ｉは、ＲＦＴＡの実施形態を示し、ここでは３つの異なるプローブを使用する。長いプローブ、一次プローブ（７４）は、結合していない一本鎖領域を両端（７４）に残しながら、標的配列（５０）の少なくとも一部に結合する。二次プローブ（７６）および（７８）が結合し、複合体を形成し、次いでゲル電気泳動により単離するのは一次プローブのこれらの末端である。複合体に結合してない末端があり、所望であればエキソヌクレアーゼで処理し得る。１つ以上のプローブを、標識し得る。いずれかの鎖、ワトソンまたはクリックを、対応する結合能を有するプローブの使用と共に、標的配列として使用し得る。この図は５つの特異性レベルを提供する。
【００９１】
図８−ＩＩは、その末端の両方でヘアピンループを形成するプローブ（７４）を使用し、ヘアピンの内部に標的配列（５０）と結合している、別の実施形態を示す。このプローブ／標的複合体はエキソヌクレアーゼ消化に耐性である。このプローブ／標的複合体の形成後、エキソヌクレアーゼをサンプルに加え得、全ての結合していない標的およびプローブ、および存在する任意の他の核酸は消化除去する。ヘアピンプローブは前記した方法で標識し得る。この図は４つの特異性レベルを提供する。
【００９２】
図８−IIIは、２つの一次プローブ（７４）および（８６）（各々、一方の末端上では１つのヘアピンループを形成でき、他方の末端は標的配列（５０）の一部と結合できる）を使用する好ましい実施形態を示す。好ましい実施形態において、プローブ（７４、８６）は、２つのプローブ（７４、８６）の末端の間にヌクレアーゼ消化が可能となる有意なギャップがないように設計されている。ヘアピンループは、任意のサイズであり得、末端が同鎖の内部配列に結合している構造である、ヘアピンの効果を有する任意の型を形成し得る。かかる構造は、ヘアピン、クローバー葉、分枝構造および当業者に公知のその他を含む。２つの異なるプローブの使用（各々、標的配列の異なる部分に結合でき、各々ヘアピンループを形成する）により、標的／プローブ複合体はエキソヌクレアーゼ消化に耐性になる。それ故、任意の結合していないまたは不完全に結合したプローブ（７４、８６）または標的（５０）は、エキソヌクレアーゼ処理により消化される。
【００９３】
図８−IIIの実施形態において、２つのプローブ（７４、８６）は、互いに結合せず、標的（５０）が２つのプローブ（７４、８６）に接続した場合にのみゲルにおいて可視化され、従って大きくバックグラウンドシグナルは大きく減少する。さらに、目的でない複合体は、予期したＲｆに移動せず、従って、所望の標的から識別可能となる。従って、所望の標的を含まない複合体は、期待したＲｆでゲル上にバンドを生成しない。
ＲＦＴＡ発明の別の実施形態（ここで標的／プローブ複合体は捕捉により単離される）は、図７に示す。プローブ／標的複合体は、一方または両方の核酸鎖に結合することが示されたことに注意されたい。本発明は、標的配列の検出のためのシグナル増幅を提供するための、かかるプローブのセットの使用に関する。
[捕獲プローブ／試験−チューブフォーマットおよび検出]
本発明により考えられる別の方法は、サイズ分離の代わりにプローブ／標的複合体を単離するための、チューブアッセイおよび捕獲プローブの使用である（図７）。
【００９４】
以下は、１５ヌクレオチドの標的配列が、同核酸から標的／プローブ複合体の単離のための捕獲プローブの使用を（変化できる）ための、ＲＦＴＡ法の好ましい実施形態の例である。標的配列を有することが疑われるサンプルを、３つのプローブとハイブリダイズさせる。これらのプローブの２つは、プローブ／標的複合体を単離するためにサイズ分離を使用したＲＦＴＡ法で前記したプローブから修飾する。
[プローブ図：]
１）試験管（テストチューブ）フォーマットの１つの実施形態において、一次プローブは、約５５ヌクレオチド塩基を有し得、ここで約１５ヌクレオチド塩基の部分が標的配列と相補的である。かかる部分は一次プローブの中心または付近に、別の約１５ヌクレオチド塩基の部分は、二次プローブに結合するために一方の末端上に、三番目の約２５ヌクレオチドの塩基の部分は、別の二次プローブに結合するために他方の末端上に配置し得る。
【００９５】
２）最初の二次プローブは、少なくとも１５ヌクレオチド塩基であり、標的配列と相補的ではないが、一次プローブの部分に相補的である。
３）二番目の二次プローブは、少なくとも２５ヌクレオチド塩基であり、最初の二次プローブと結合せず、標的配列と相補的ではなく、一次プローブの末端と相補的である。
【００９６】
ゲル適用による前記したプローブ／標的複合体の単離において、二次プローブは標識する必要がなく；一次プローブのみ標識する必要がある。しかし、これらの試験管またはチューブを基本とした適用において、唯１つの二次プローブを当分野で公知の任意の標識で標識する。
【００９７】
ＲＦＴＡの試験管フォーマットは、１つの二次プローブを捕獲プローブとして使用し（ＤＩＧまたは当分野で公知の任意の他の生化学的「フック」に複合体を形成させる（コンジュゲート））、標的／一次プローブ複合体を固体支持体に付着させる。
【００９８】
図７は、この方法の好ましい実施形態を示す：サンプルＤＮＡの単離、および長サンプルＤＮＡ鎖からの標的配列の制限ヌクレアーゼ放出。標的配列、１を変性し、一次プローブ、プローブ２とハイブリダイズする。二次プローブ、４、捕獲プローブ、はそれに付着した捕獲分子を有する。図７において、捕獲分枝はジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、３であると示されている。しかし、これは類似の機能を有する任意の他の分子でもよい。磁気ビーズ、５、をＤＩＧ（８８）に対する抗体と共に、試験−チューブに加え、標的／プローブ複合体を捕獲する。図７の段階Ｇは、３番目のプローブ、リポータープローブ６、好ましくは標識されたものを、上記標的／プローブ複合体に加える実施形態を示す。かかる標識プローブを結合することにより、全構造が、試験−チューブ容器内において容易に検出（可視化）できる。捕獲およびリポータープローブ、両方共二次プローブ、を任意の順番で加えることができる。
【００９９】
標識およびプローブサイズは可変であり、リポータープローブは最適のシグナルを発生するために伸長または短縮し得る。二次リポータープローブは、試験管アッセイで標識された唯一のものであり、当業者に公知の任意の方法を使用して標識できるが；しかし、別の標識も必要な場合には使用し得る。試験管適用において、リポータープローブシグナルは検出に重要である。例えば、試験フォーマットにおいて、リポーターシグナルは、標的が捕獲ないしリポータープローブのギャップをつなぐために存在する場合、固体基質に付着するのみである。
【０１００】
図９は、チューブ適用および標的プローブ複合体（ＰＤＴＰ−部分二本鎖標的／プローブ複合体）の変動を示す。
チューブを基本としたアッセイは、予備処理手段として、例えば、ミリグラム量からマイクログラム量までの核酸からの全標的を濃縮するために、ＤＮＡチップ、ＰＣＲ、および他の核酸またはシグナル増幅技術のために使用できる。シグナル増幅は当分野で公知の任意の方法であり得る。
【０１０１】
標的／一次プローブ／捕獲プローブ／リポータープローブ複合体の存在は、全プローブを共に付着させるための標的配列の存在に直接的に依存している。標的配列がなければ、実質的に非特異的シグナル（バックグラウンド）は全くない。
【０１０２】
ＲＦＴＡ試験管アッセイフォーマットで使用するための標的／プローブ（ＰＤＴＰ）構築物のいくつかの他の実施形態を図９に示す。核酸の一方または両方の鎖、ワトソンまたはクリック鎖の使用が、これらの図式で考えられる。ヘアピン構造は図９に例としてのみ示し、形成された構造の型に限定するものではない。
【０１０３】
図９−Ｉは、一次プローブ２に結合した標的配列１を示し、これは捕獲プローブ４に直接付着した捕獲分子３を有する。標識リポータープローブ５は、構造の検出のために加える。この実施形態は、末端がヒンジ／ループ領域の付加または他の方法によりキャップされていない場合、５の特異性レベルを有し、エキソヌクレアーゼ耐性ではない。
【０１０４】
図９−ＩＩは、二次プローブがヘアピンまたは他の類似の構造を形成する実施形態を示す。標的配列１は一次プローブ２と結合する。リポータープローブ５は、当業者に公知の方法を使用して標識する。捕獲分子３が付着した捕獲プローブ４はまた、標的／プローブ構造に結合する。この実施形態は５の特異性レベルを有し、エキソヌクレアーゼ耐性である。
【０１０５】
図９−IIIは、ヘアピンループを形成する２つのプローブ、捕獲一次プローブ２およびリポータープローブ４の使用を示す。各プローブの一部は、標的配列１に結合している。一次プローブ２は、それに付着した捕獲分子３を有し、標的／プローブ複合体の捕獲を提供する。この実施形態は４の特異性レベルを有し、エキソヌクレアーゼ消化に耐性である。
【０１０６】
図９−ＩＶは、ヘアピンループを形成するリポータープローブ４の使用を示す。標的配列１は、一次プローブ２に結合する。一次プローブ２はまた、リポータープローブ４に結合し、これはヘアピン構造を形成する。一次プローブ２はまた、付着した捕獲分子３を有する捕獲プローブ５に結合する。この実施形態は５の特異性のレベルを有し、末端がキャップされていない場合、エキソヌクレアーゼ消化に一部のみ耐性である。
【０１０７】
ＲＦＴＡのこの実施形態により、シグナルが標的配列の非存在下でも生成可能となり得る。この場合、リポーターおよび捕獲領域をはずすには注意をしなければならない。これは多くの方法により達成できる：
ｉ）ハイブリダイゼーション段階、後一次および二次ハイブリダイゼーションを加える。この時点で、標的領域の一部に相同的で一次プローブに相補的なカッタープローブを、プローブ複合体にハイブリダイズし；このハイブリダイゼーション後のＵＶ処理（約３１３ｎｍ）により、（標的領域の非存在下）捕獲およびリポータープローブを分離する。
ii）一次プローブを２つのプローブ（各々、標的の異なる領域に結合）に断片化できる。
iii）標的のヌクレアーゼ耐性を使用するリポーターおよび捕獲領域をはずす任意の他の方法により、標的／プローブ複合体は安定化する。
【０１０８】
図９−Ｖは、標的配列１に結合した一次プローブ２の使用を示す。リポータープローブ５および捕獲分子３を有する捕獲プローブ４は、一次プローブ２に結合する。この実施形態は５の特異性レベルを有し、キャップ法を使用しない場合、エキソヌクレアーゼにより消化できる。
【０１０９】
追加の特異性レベルは、複数の標識をプローブに加えることにより、または１つ以上のリポータープローブを創製することにより達成できる。
【０１１０】
追加のプローブは、断片化でき、特別な順序で加えてさらに特異性レベルを増加できる。例えば、標的／プローブ構築物の別の実施形態は、３から２にプローブの数を減少させるためのヘアピンループの使用を含む。
【０１１１】
配列をヌクレアーゼに耐性にすることは、必要ではないが、バックグラウンドの減少または特定のアッセイ状況での感度の増加のために使用し得る。プローブないし標的配列にギャップが全く形成されないようにプローブを設計することにより、保護標的配列、または保護標的核酸配列（ＰＮＡＳ）はExoIIIなどのヌクレアーゼに対して耐性となる。さらに、３'プローブ末端は、ヌクレアーゼから保護するために、当業者に公知の方法で、キャップ、またはデヒドロキシル化または修飾する必要がある。他の公知の修飾法は、ＤＩＧ、ビオチン、アビジン、またはヒドロキシラーゼ反応の存在を含むがこれに限定されない。かかる修飾は任意の上記構築物を用いて使用できる。
【０１１２】
伸長ヘアピンリポータープローブの使用により、より多くのリポーター分子の付加が可能となり、標的の可視化を増強する。
[ＲＮＡ検出修飾]
ＲＮＡ標的配列の検出のために、上記のＤＮＡ方法および組成物と類似した方法および組成物を、ＲＮＡ配列を修飾して使用できる。
【０１１３】
ＤＮＡサンプルでは、最初の段階は、当業者に公知の様々な方法のいずれかによる、サンプルＲＮＡの精製である。最も単純な形において、特異的ＲＮＡ配列の検出および特徴づけが、特異的標識核酸プローブのハイブリダイゼーションを使用し、次いでサイズ分離および前章で記載した特異的標的の検出により達成される。
【０１１４】
一般に、多くのＲＮＡ標的配列が、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの別々なサイズのＲＮＡ分子として見られるので、サンプルＲＮＡからの標的切出しは必要ではない。しかし、必要な場合、標的ＲＮＡは本発明において切出すことができる。例えば、ｍＲＮＡ分子は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても、正しいサイズの相補プローブに結合させ、一本鎖領域を除去するために一本鎖ヌクレアーゼを使用することにより、標的配列の単離のための所望のサイズに切断できる。他の酵素やＲＮＡ操作の公知の方法は、リボザイムやＣＰカッタープローブのいうようなＲＮＡ分子の大きさにするため、用いることができる。
【０１１５】
特異的ＲＮＡ標的配列の検出は、遺伝子発現解析、ＲＮＡウイルス（例えばＨＣＶ、Ｃ型肝炎ウイルス）、活性対潜在ウイルス感染（すなわちＣＭＶ、サイトメガロウイルス）の区別などの適用に有用である。本発明はまた、これらの適用に定量的であるように設計され得る。
【０１１６】
ＲＮＡ適用におけるＲＦＴＡの可転性を増加させるために、逆転写段階を最初に実施し、一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡを生成し得る。これにより、ＤＮＡ適用で記載したものと全く同じように、ＲＦＴＡと結合させた制限フラグメント解析の使用が可能となる。この型の解析は、ＲＮＡウイルス遺伝子型（ＨＣＶ）、並びにある感染性物質における高い変異率の結果として発達し得る薬剤耐性または免疫回避準種（例えばＨＩＶおよびＨＣＶ）の検出に適用可能である。追加の配列特異性レベルは、ｃＤＮＡを、比較的非特異的プライマーではなく配列特異的プライマー、例えばランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを用いて合成することにより、ＲＦＴＡに加え得、一定のサイズの逆転写物が生じ、これをＲＦＴＡ解析にかけ得る。これらの２つの特異性レベル、配列特異的ＲＦＴＡと結合した配列特異的ｃＤＮＡ合成は、偽陽性シグナルの可能性を減少させ、従って試験の全体の特異性を上昇させる。
[ＲＦＴＡはＲＮＡ標的の解析指向]
ほとんどのＲＮＡ標的、例えばｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびその他は、ゲルおよび試験−チューブフォーマットの両方においてＲＦＴＡにより直接指向され得る。それ故、その後の検出のためにＲＮＡをｃＤＮＡに変換するために、逆転写反応を実施する必要がない。
【０１１７】
本ＲＮＡ ＲＦＴＡ発明の好ましい実施形態は、図１０（ｍＲＮＡＲＦＴＡゲルアッセイ）に示す。また、サイズ分離は、プローブ上の捕獲分子または他の適当な分子を使用して、試験チューブ法により達成できると考えられる。さらに、ＤＮＡＲＦＴＡで示したヘアピン構造は、適当な場合、使用できる。
【０１１８】
この方法の例は図１０に示す。単離した全ｍＲＮＡ（そのいくつかは標的配列を含む）はサンプル中に存在する。ＢＵカッター部位を含むプローブ（２）は標的配列（１）に結合する。単離されたｍＲＮＡ分子は特異的な標的ｍＲＮＡ領域（１）、非特異的ｍＲＮＡ領域（９２）、３'ポリＡテール（９４）及び、５'ｃａｐ（９６）を含む。標的はＵＶ光を用いて切断する。標的配列の一本鎖部分に結合する標識プローブ３を加える。
【０１１９】
追加の実施形態において、標識プローブ３に結合する三番目のプローブを加える。プローブ／標的（ＰＤＴＰ）の全体の二本鎖構造を、特異的Ｒｆまでゲル上を走行させる。
【０１２０】
ここでは一次プローブのフラグメントを示す、塩基カッタープローブ２を用いた標的のハイブリダイゼーションによるＲＮＡの切断は、前記したように全ての場合で必要なわけではない。
【０１２１】
塩基カッタープローブを使用しない場合、標的は、ＲＮＡ標的にハイブリダイズする２つの領域および標的にハイブリダイズしない５'末端または３'末端をもつ第三区分を有する、一次プローブ３を用いてハイブリダイズし得る。このプローブの全長を前記で議論したように標識する。ＲＮＡ実施形態における１つの変動は、完全に標識されているかまたは標識されていない、塩基カッタープローブ２として作用する、２番目の一次プローブを加えることにより、特異性が増加することであり、最初の一次プローブにタンデムで近接して結合する。
【０１２２】
ＲＮＡ標的にハイブリダイズする核酸プローブの一部を断片化できる。従って、生成した各追加のプローブ片について、別の特異性レベルを加える。断片化プローブは、本明細書に記載の全ＲＦＴＡフォーマットを通じて議論したように、容易に塩基カッタープローブ分子で置換されるオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１２３】
一次プローブの第三区分と結合する非標識二次プローブとハイブリダイズさせる。
Ｓ１ヌクレアーゼ処理または当業者に公知の任意のものは、塩基カッタープローブが存在する方法において任意の段階であり、カッタープローブが存在しなければ必要である。非ハイブリダイズｍＲＮＡの除去により、期待される標的／プローブ複合体について予期されるＲｆ値が生じる。一本鎖ＲＮＡが除去されない場合、尾／標的／プローブ複合体の絶対Ｒｆ値は僅かに修飾されて、異なる、しかし予期可能なＲｆ値となる。最終複合体のサイズは、重要ではない。標的検出能は、複合体のＲｆ移動度の予測性および再現性に依拠する。
ｍＲＮＡ ＲＦＴＡゲルアッセイの他の実施形態は以下の段階を含む：
段階Ｉ：ｍＲＮＡを単離する
段階II：ｍＲＮＡ（ポリピリミジン）上の標的部位を選択し、一次プローブを設計する
段階III：ｍＲＮＡ標的への一次プローブのハイブリダイゼーション
段階ＩＶ：エキソリボヌクレアーゼでの処理（Ｓ１およびヤエナリヌクレアーゼ）
段階Ｖ：標的プローブ複合体の生成（ＰＤＴＰ複合体）
段階ＶＩ：三重体のポリＡ３'末端にハイブリダイズする二次リポータープローブポリｄＴ（ビオチニル化）を加えることによりシグナル増幅を開始
段階VII：アビジン−酵素複合体を、コンジュゲートビオチン分子を有する複合体に添加
段階VIII：予測されるＲｆへの電気泳動
段階ＩＸ：色素産生基質溶液中へのゲルの配置
このアッセイは４つの特異性レベルを提供する。
ＢＵカッタープローブを使用するｍＲＮＡ ＲＦＴＡゲルを基本とした他のアッセイの実施形態は、以下の段階を含む：
段階Ｉ：ｍＲＮＡの単離
段階II：ＢＵカッタープローブとのハイブリダイズ
段階III：ＵＶ光を照射して制限を完了
段階ＩＶ：一次プローブとハイブリダイズ
段階Ｖ：二次リポータープローブとハイブリダイズ
段階ＶＩ：予測されるＲｆまでゲル上で複合体を走行
これは４つの特異性レベルを有する。
【０１２４】
非ハイブリダイズ一本鎖ＲＮＡ尾を開裂するために、本発明により考えられる他の可能な実施形態は、ＥＤＴＡ分子またはブレオマイシンを一本鎖ＲＮＡ尾に隣接するプローブの末端にコンジュゲートすることを含む。ＲＮＡと共に、当業者に公知の任意の他の類似の分子を有するプローブのハイブリダイゼーションにより、標的ＲＮＡは開裂され、一本鎖ＲＮＡ尾は除去される。
【０１２５】
非ハイブリダイズ一本鎖ＲＮＡ尾を開裂するための別の試みは、ｍＲＮＡ尾に隣接するプローブを１つ以上のチミン塩基で終らせることである。これらがＢＵで置換される場合、ハイブリダイズした複合体をＵＶ、好ましくは長波長、約３１３ｎｍに曝露すると、ｍＲＮＡ尾が非酵素的に切出される。前記したＣＰの他の実施形態もまた使用し得る。
【０１２６】
標的／プローブ複合体をポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上で走行させる場合、二本鎖標的／プローブ複合体を可視化し、Ｒｆを、核酸サイズ基準のＲｆとの比較により計算する。標的／プローブ複合体における期待されたＲｆ値を得ることにより、４つの特異性のレベルで、所望のＲＮＡ標的がサンプル中に存在することが確認される。
【０１２７】
ＲＦＴＡ／ＲＮＡゲルアッセイ：特異性レベル（４）
１．一次プローブの結合
２．バックグラウンドシグナルを減少させることによる、感度／特異性を増加させるためのエキソヌクレアーゼ処理（非特異的ＲＮＡは破壊される）
３．二次プローブの結合４．標的／プローブ（Ｒｆ、遅延係数）のゲル中の固定点までの移動エキソヌクレアーゼ処理の省略により、特異性のレベルが３に変化する。しかし、塩基カッタープローブをエキソリボヌクレアーゼで置換すると、２レベル特異性レベルが増加し、全部で５の特異性レベルとなる。
[ＲＮＡ標的のＲＦＴＡ直接解析：試験−チューブフォーマット]
標的複合体はまた、捕獲分子のプローブへの付着に関与するゲルフォーマットにより検出し得る。
[ＤＮＡおよびＲＮＡ検出における本発明の利点]
ＤＮＡ ＲＦＴＡの利点：
複数の特異的レベル 捕獲およびリポータープローブは、それ自体接続されておらず、共通の標的にのみ接続している。図１１Ｉ．は一次プローブ（２）とＵＶ照射の組み合わせを用いたＲＮＡの標的領域（１）の一箇所の内部切断（ＲＮＡの切断点、９８）を図示している。又二次プローブ（３）も示されている。図１１ＩＩ．は一次プローブ（２）とＵＶ照射の組み合わせを用いた標的領域（１）の二箇所の内部切断を図示している。
【０１２８】
ＰＣＲはＤＮＡプローブ上で実施できる。
ＤＮＡ−チップ技術は標的／プローブ複合体も検出できる。
（ｗ）または（ｃ）のいずれかの鎖が、独立してまたは共に検出され得る。
【０１２９】
ＲＮＡ ＲＦＴＡの利点：複数の特異性レベル 捕獲およびリポータープローブは、それ自体接続されておらず（互いに直接的に結合していない）、共通の標的にのみ接続している。
【０１３０】
約２００−２５０ｍｅｒの５'ポリＡ領域は、シグナル増幅に使用できる（ポリｄＴ標識プローブを使用）。
ＲＮＡは、逆転写（ＲＴ）段階を受けて、直接解析できる。
【０１３１】
ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の適用における、ＲＦＴＡ実施形態を含む、本発明は、電気泳動分離後に標的核酸を移行した後に膜ハイブリダイゼーションを利用する従来のＤＮＡまたはＲＮＡブロッティング法に優る利点がいくつかある。ＲＦＴＡは、膜ハイブリダイゼーションよりもかなり速く実施がより簡便であり、技術的熟練および電気または真空移行システム、ＵＶ架橋剤または真空オーブン、およびハイブリダイゼーションオーブンおよび水浴槽などの特殊装置の必要が少ない。ＲＦＴＡはまた、膜ハイブリダイゼーションで利用した比較的大量で、比例的に遅いハイブリダイゼーション動態を有するハイブリダイゼーションとは対照的に、はるかに少ないプローブが、電気泳動前に少量でハイブリダイゼーションに利用される点で、標準的ＲＦＬＰ解析よりも実施がかなり安価である。
【０１３２】
ＲＦＴＡには追加の特殊電気泳動システムは全く必要でなく、利用可能な検出システムは全て、ゲルを走行させて解析するインサイツまたは天然ゲル上で、または、膜に作用させる固定または乾燥ゲル上でより良好とはいわないまでも同等に作用する。さらに、ＲＦＴＡは膜ハイブリダイゼーションよりもより感度が高くあり得る。なぜなら、核酸移行または膜架橋が必要でなく、これは両方共、傷害または不十分な移行による特異的シグナルの欠失をもたらし得るからである。ＲＦＴＡはＤＮＡ増幅を利用しないので、ＲＦＴＡはＰＣＲを基本とした試験でしばしば見られる高い割合の非特異的シグナルの傾向がない。最後に、ＲＦＴＡは、いくつかのプローブを、一度に複製サンプル上で、またはいくつかのプローブを同サンプル中で任意の電気泳動レーンまたはゲル上で利用できる利点を有し、複製ゲルを走行させる必要および／またはすでにハイブリダイズした膜をその後の再プローブ用に剥離する必要（この両方共費用が高く時間を消費する方法である）がなくなる。
【０１３３】
以前のＤＮＡ解析、特に診断の領域における主要な問題は、全ての診断技術が、１回の試験でミリグラム量の核酸を処理できないことであった。これは、感染時間経過の早期に、少量の標的の存在を診断するために、全ＤＮＡ解析法に必要である。この高い感度は、以前の技術では利用できなかった。本発明の方法は、増幅（ＰＣＲ等）または非増幅を基本とするもの、さらにはチップを基本とするものであれ、全ＤＮＡ解析および診断技術に使用できる。
【０１３４】
ｍＲＮＡ ＲＦＴＡ試験−チューブアッセイの実施形態を提示する。
段階Ｉ      ：ｍＲＮＡの単離。
段階ＩＩ    ：ｍＲＮＡ（ポリピリミジン）上の標的部位を選択し、一次プローブを設計する。
段階ＩＩＩ  ：一次プローブのｍＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーション。
段階ＩＶ    ：二次捕獲プローブとのハイブリダイズ。
段階Ｖ      ：エキソリボヌクレアーゼ（ＳＩおよびヤエナリヌクレアーゼ）での処理。
段階ＶＩ    ：得られたＰＤＴＰ複合体の生成。
段階ＶＩＩ  ：二次リポータービオチニル化増幅プローブの添加。
段階ＶＩＩＩ：コンジュゲート添加。
段階ＩＸ    ：固体基質にＰＤＴＰを結合。
段階Ｘ      ：固体基質にＰＤＴＰを結合。
段階Ｘ      ：洗浄。
段階ＸＩ    ：発色性基質を加え、色発生を調査。
【０１３５】
これは４つの特異性レベルを有する。
ｍＲＮＡ ＲＦＴＡ、チューブを基本としたフォーマットの別の実施形態。
段階Ｉ    ：ｍＲＮＡの単離。
段階ＩＩ  ：ｍＲＮＡ標的の選択および一次プローブ（ＢＵＣＰ）の設計。
段階ＩＩＩ：ＢＵＣＰをｍＲＮＡ標的領域（ＢＵＣＰ−１、捕獲）とハイブリダイズ。
段階ＩＶ  ：一次プローブとハイブリダイズ。
段階Ｖ    ：ＰＤＴＰ複合体を捕獲。
段階ＶＩ  ：洗浄。
段階ＶＩＩ：二次リポータープローブとのハイブリダイズおよび標識の存在を決定。
【０１３６】
これは３の特異性レベルを有する。
本発明の方法および組成物の使用は、単一のチューブで解析できる核酸サンプルのサイズに制限がなく、また大量の非特異的な汚染もないという事実により、ＤＮＡチップおよびＰＣＲ技術を高い感度および特異性で機能させる。
【０１３７】
以前から既知のＤＮＡ解析技術の多くの方法は、感度を上げるために、十分量の核酸を試験できない。本発明の方法は、ゲノムまたは他の大量のＤＮＡ（ミリグラム量の非特異的核酸からサンプルに存在する標的に富むμｇ量まで）を予備処理でき、よって、以前から既知のＤＮＡ解析技術は、選択した標的核酸配列の存在を特異的および正確に決定できる。
標的保護アッセイ（ＴＰＡ）
核酸標的配列検出のための本発明の別の実施形態は、標的保護アッセイ（ＴＰＡ）と呼ばれる。ＴＰＡは、１９９６年１０月２６日出願の米国特許出願番号０８／７３９,０６９、現在米国特許第５，９６２，２２５号および１９９８年２月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／０７５,８１２および１９９８年３月５日出願の６０／０７６,８７２に開示され、その各々についてその全体を本明細書に取り込む。
【０１３８】
ＴＰＡ技術は、単一のＤＮＡ（遺伝子）コピーを検出するのに十分な感度の、特異的ＤＮＡおよびＲＮＡ標的の直接解析の方法である。ＴＰＡ発明はまた、二本鎖および一本鎖両方のＤＮＡを検出する。
ｍＲＮＡ／ＴＰＡ 本発明の方法および組成物は、広範囲の量のＲＮＡを処理できる能力を有し、これは、前記で議論し以前から存在する技術により達成できる適用の開発のために必要な感度を付与する。これにより、ＴＰＡプロセスは初期の感染時間経過診断技術としての使用が可能となる。感染時間経過の初期でＲＮＡ標的を検出する重要性は、ＲＮＡウイルスの複製、腫瘍発達および感染性疾患進行は、全て、宿主におけるタンパク質合成、しかしより重要には、特異的ｍＲＮＡ種の産生を必要とするという事実に基づく。
【０１３９】
本発明により考えられる１つの実施形態は、間接的単一遺伝子コピー検出に関する。各活性化遺伝子について、数万のｍＲＮＡ分子が産生される。単一の遺伝子を活性化する場合、２０,０００の特異的ｍＲＮＡ標的が、細胞および組織に存在し、同定が可能である。
【０１４０】
本発明の好ましい実施形態は、図１２に示された段階を含む。
段階Ｉ、ｍＲＮＡ（９１）の単離；
段階ＩＩ、単離されたｍＲＮＡ分子（１０６）への捕獲プローブ（２）のハイブリダイゼーション；
段階ＩＩＩ、エキソヌクレアーゼ処理；
そして、段階ＩＶ、固体支持体へのＰＮＡＳ構造の付着。又、図１２にＤＩＧ（７０）、抗ＤＩＧ（４）及び、試験管壁（１００）が示されている。捕獲プローブは長さがおよそ１５−２５ヌクレオチドであるのが好ましい。
最初に、ＲＮＡ上の配列特異的領域を選択する。標的配列を有すると疑われるＲＮＡサンプルを、当業者に公知の任意の方法で単離すると、変性および線形ＲＮＡが獲得される。サンプルＲＮＡは生存可能な源から、またはかかる目的のための増幅ＤＮＡを使用して精製する。サンプル核酸からの標的の切出しは、ｍＲＮＡはすでに推定的にサイズ分類されているという事実から必要ではない。
【０１４１】
図１２の第二段階において、特異的一本鎖ＲＮＡ標的（１）を、二本鎖ＤＮＡ構造（２）とのハイブリダイゼーションで保護し、保護標的核酸構造（ＰＮＡＳ）（９０）と呼ばれる部分的三重らせん分子を形成する。この実施形態において、リポータープローブはＤＮＡであり、二本鎖ＤＮＡ捕獲分子長は可変であり；生化学的フックは、この目的において当業者に公知の任意の分子、例えばＤＩＧ（７０）である。このＤＮＡ捕獲分子（２）は、図１２の二本鎖構造をとして機能する二本鎖分子を形成するヘアピン構造であり得る。ＰＮＡＳ（９０）は配列特異性を決定するための標的である。
ｍＲＮＡ ＴＰＡにおけるＴＦＯヘアピン捕獲プローブ
ポリピリミジンに富むｍＲＮＡ中の領域を同定しなければならない。これは、三重体形成にピリミジン−プリン−ピリミジンモチーフが要求されるため必要である。二本鎖ＤＮＡヘアピン捕獲プローブは２つの区分を有することを特徴とする：・３'末端は可変長のポリプリンに富む領域である・５'末端は可変長のポリピリミジンに富む領域である・ 両領域はヘアピンループを形成する６塩基の伸縮により中間で結合している。
【０１４２】
従って、ヘアピン捕獲プローブは、それ自体が折り畳まれてヘアピンを形成するＤＮＡ分子である。また、３'末端は、３'末端に近接するが３'末端ではない、生化学的フックとコンジュゲートする。標的は、ＲＮＡ鎖配向をもつ二本鎖ＤＮＡヘアピンプローブにハイブリダイズする。
【０１４３】
本発明の追加の実施形態は、ポリｄＴ標識プローブ（５）の捕獲ｍＲＮＡ分子（１０６）への添加を含む。これは指示シグナルを増強する。図１３は、シグナル増幅リポータープローブのハイブリダイゼーションを示している。ｍＲＮＡサンプルに示される任意の反復配列、例えばポリＡ区分（９４）は、この新規なシグナル増幅に使用できることが本発明により考えられる。
図１４はｍＲＮＡ ＴＰＡゲルを基本としたアッセイは以下のいくつかの段階を含む旨を図示している：
段階Ｉ      ：ｍＲＮＡの単離。
段階ＩＩ    ：標的領域の選択およびＤＮＡ捕獲プローブ（２）の設計。
段階ＩＩＩ  ：ｍＲＮＡ標的（１）および二本鎖ＤＮＡプローブ（２）のハイブリダイゼーション。
段階ＩＶ    ：アッセイ特異性を増加させるために、任意の非ｍＲＮＡ複合体形成二本鎖ＤＮＡプローブを破壊するエキソヌクレアーゼ処理。
段階Ｖ      ：固体支持体へのＰＮＡＳの付着。
段階ＶＩ    ：洗浄。
段階ＶＩＩ  ：ＰＮＡＳをポリｄＴリポータープローブ（５）（ビオチニル化（１０４）２５ｍｅｒ分子）とのハイブリダイズによるシグナル増幅が図１３に示されている。又、図１３の実施形態として、１０プローブが直列にハイブリダイズしている。５‘ｃａｐ（９６），ＤＩＧ（７０）、抗ＤＩＧ（８８）及び、試験管壁（１００）も示されている。段階ＶＩＩＩ：洗浄。
段階ＩＸ    ：アビジン−酵素コンジュゲートを、コンジュゲートポリｄＴ増幅プローブ上でビオチン分子に結合している標的溶液に添加。
段階Ｘ      ：洗浄。
段階ＸＩ    ：ＰＮＡＳ構造完全性を傷害することなく、ＰＮＡＳを磁気ビーズから解離。
段階ＸＩＩ  ：予測されるＲｆまで電気泳動ゲル上で可溶性ＰＮＡＳを走行。
段階ＸＩＩＩ：ゲルを発色性基質溶液に配置し、発色するまでインキュベート。
【０１４４】
これは５の特異性レベルを有する。
この実施形態は、限定的なものではなく、他の等価体または類似の変例も使用できる。標的領域サイズおよびプローブ長は、短いものから長いものまでサイズが変化し、アッセイが呈する標的およびフォーマットの型にのみ依存する。ハイブリダイゼーションは、異なって設計されたプローブを用いて前記したＲＦＴＡ法と同じ方法で達成される。ここで使用するＤＮＡプローブ（２）は二本鎖構造を形成するヘアピンまたは任意の他の構造であり得る。ヘアピン構造は好ましい実施形態である。
【０１４５】
ＰＮＡＳの形成（４）は、本発明の方法および組成物の第一の特異性レベルである。この特異性レベルは、ＤＮＡ二本鎖保護分子（２）のポリプリンまたはポリピリミジンに富む領域で働く必要がなるために低く、非特異的ＲＮＡ種は二本鎖ＤＮＡ保護分子（２）に結合し得る。この問題を回避する１つの方法は、ポリに富む領域の２つの塩基ではなく４つの正常な塩基に及び変化する標的保護分子（二本鎖ＤＮＡ）の使用を可能とするｒｅｃＡタンパク質の添加である。
【０１４６】
上記の好ましい実施形態の例は、１８ヌクレオチド塩基長配列を有する標的配列を有し、ｍＲＮＡＴＰＡゲルアッセイである。
【０１４７】
ｍＲＮＡ ＴＰＡ試験チューブまたは捕獲アッセイの実施形態は図１５に示す。
段階Ｉ      ：ｍＲＮＡの単離（９１）。
段階ＩＩ    ：標的部位（１）の選択および捕獲プローブ（２）の設計。
段階ＩＩＩ  ：三重の保護されたｍＲＮＡ及びｄｓＤＮＡ（ＰＮＡＳ）（９０）の形成のために単離されたｍＲＮＡ分子（１０６）の標的（１）に対する捕獲プローブ（２）のハイブリダイゼーション。注釈：ＲＮＡＴＰＡでは標的がプローブを保護し、ＤＮＡ ＴＰＡではプローブが標的を保護する。
段階ＩＶ    ：標的により保護されていない任意の二本鎖ＤＮＡ捕獲プローブを除去するためのExoIII処理。ＰＮＡＳ（９０）は配列特異性を決定するための標的である。
段階Ｖ      ：固体支持体へのＰＮＡＳの付着。（７２，４）
段階ＶＩ    ：洗浄。
段階ＶＩＩ  ：リポータープローブ（ポリｄＴ、ビオチニル化（１０４）および２５ｍｅｒ）とのハイブリダイズ。
段階ＶＩＩＩ：洗浄。
段階ＩＸ    ：アビジン−酵素コンジュゲート（１０８）をポリＡテール（９４）に結合するポリｄＴリポータープローブ（５）に添加。
段階Ｘ      ：洗浄。
段階ＸＩ    ：ＰＮＡＳ構造を解離することなく磁気ビーズからのＰＮＡＳ解離。
段階ＸＩＩ  ：特異的、予測可能なＲｆへの水溶性ＰＮＡＳのゲル電気泳動（相対的移動距離を見るため）。
段階ＸＩＩＩ：ゲルを発色性基質に配置し、ゲル上のバンドを可視化（Ｒｆを計算）
このアッセイは、６の特異性レベルを有する。ここで使用したＤＮＡプローブは、二本鎖構造を形成するヘアピンまたは任意の他の構造であり得る。ヘアピン構造が好ましい実施形態である。
【０１４８】
ＴＰＡ法のＲＮＡ／ＴＰＡ ＰＮＡＳ（標的／プローブ複合体）は、単離並びに両方の試験−チューブおよびゲルアッセイフォーマットにおいて検出できる。ＴＦＯをハイブリダイゼーションしてＰＮＡＳを形成した後、続く段階は検出法により決定する。
【０１４９】
ＲＮＡ／ＴＰＡ試験−チューブ適用は、非常に高い特異性を与える。なぜなら、アッセイは少なくとも５の特異性レベルにより仲介されるからである。アッセイにより大量のＲＮＡの解析が可能となる。
【０１５０】
ExoIII処理が、捕獲プローブによりハイブリダイズする非特異的ＤＮＡを削除するために必要である。
ＤＮＡヘアピン構造を使用したｍＲＮＡ ＴＰＡチューブを基本としたアッセイの例を記載する。
段階Ｉ      ：ｍＲＮＡの単離。
段階ＩＩ    ：標的部位の選択およびヘアピン捕獲プローブの設計。
段階ＩＩＩ  ：標的およびヘアピンプローブのハイブリダイゼーション。
段階ＩＶ    ：標的により保護されていない任意の二本鎖ＤＮＡヘアピン捕獲プローブを除去するためのエキソヌクレアーゼIII処理。
段階Ｖ      ：固体支持体へのＰＮＡＳの付着。
段階ＶＩ    ：洗浄。
段階ＶＩＩ  ：リポータープローブ（ポリｄＴ、ビオチニル化および２５ｍｅｒ）とのハイブリダイゼーション。
段階ＶＩＩＩ：洗浄。
段階ＩＸ    ：アビジン−酵素コンジュゲートの添加。
段階Ｘ      ：洗浄。
段階ＸＩ    ：発色のための発色性基質の添加。
【０１５１】
これは５の特異性レベルを有する。
ｍＲＮＡ ＣＰＡゲルフォーマットアッセイの他の実施形態は以下の段階を含む。
段階Ｉ    ：ｍＲＮＡの単離。
段階ＩＩ  ：２つのＢＵカッタープローブのハイブリダイズおよび標的の制限。
段階ＩＩＩ：固定基質へのＰＮＡＳのアンカー。
段階ＩＶ  ：ゲルの走行およびバンドシグナル可視化によるＲｆの決定。
【０１５２】
このアッセイは３の特異性のレベルを有する。
ｍＲＮＡ ＣＰＡ試験管フォーマットアッセイの他の実施形態は以下の段階を含む。
段階Ｉ    ：ｍＲＮＡの単離。
段階ＩＩ  ：ＢＵカッタープローブのハイブリダイズおよび標的の制限。
段階ＩＩＩ：固定基質へのＰＮＡＳのアンカー。
段階ＩＶ  ：洗浄。
段階Ｖ    ：シグナル増幅によるＰＮＡＳ検出。
【０１５３】
三重らせん形成で使用できる別の実施形態は、三重らせんロックである。ある条件下で、二本鎖ＤＮＡセグメントのＥＸＯIII（エキソヌクレアーゼ）への曝露により、３'→５'の方向にＷおよびＣ鎖上でＤＮＡは分解し得る。三重体形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のＤＮＡ二本鎖への結合により、三重体は短時間でのＥＸＯIIIによる分解から保護される。
【０１５４】
三重らせんの安定化を達成するために、三重らせんロックの実施形態を図１６に示す。図１６は、ヘアピン構造であり、ｍＲＮＡに大きな溝が作成されるように設計した、ｄｓＤＮＡ捕獲プローブと三重体を形成しているｍＲＮＡ分子を示す。このヘアピンはまた、３'ＤＮＡ二本鎖末端のひとつに、ExoIII攻撃の部位がない。
【０１５５】
また、ExoIII分解に対して、残りの３'プローブ末端のみを保護する必要がある。これは、一連の塩基（７）（ここではポリｄＴを使用する）により閉じた末端上で接続した、互いに折り畳まれているポリプリン（３'末端）（１１４）およびポリピリミジン（５'末端）（１１６）に富む鎖である、ヘアピンＤＮＡ捕獲プローブを有することを特徴とする、三重体ロックの発明により達成された。ヘアピンプローブのポリプリン（３'末端）（１１４）に結合するｍＲＮＡ標的の部位はポリピリミジン領域である。
【０１５６】
存在するｍＲＮＡに通常の水素結合（１０８）を介してハイブリダイズする１２−１５塩基のＤＮＡ（１１０）により、捕獲プローブの３'末端を伸長することにより、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド生成によりExoIII分解に耐性な３'プローブ末端が創製される。ＤＮＡ（１１０）は４つの塩基バリエーションを介してｍＲＮＡに相補的であり、強力な水素結合により標的に結合する。平滑末端および３'曝露末端にExoIIIが要求されることにより、プローブの３'末端の保護の目標が達成可能となる（一本鎖ｍＲＮＡ３'末端は、ExoIIIが分解できない突出を創製し、同時に３'プローブ末端（１５塩基（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）多い伸縮）は、３'−５'分解に特異的に耐性な末端を送り出すｍＲＮＡと水素結合を形成する）。
[ＲＮＡ／ＴＰＡの利点]
ＲＮＡ／ＴＰＡの使用の主要な利点は、本発明の方法および組成物の使用により、単一の遺伝子コピー検出と同じ感度の高さで、全てのシグナル増幅技術並びにチップ上ＤＮＡおよびＰＣＲが標的検出を達成できるようになることである。これは、保護、濃縮、および患者の標本のミリグラム量の核酸から、１マイクログラムの核酸（すなわち元のサンプルに全標的も含む）への減少を提供する。
【０１５７】
ＨＩＶ療法におけるウイルス負荷問題は、以前は成功裡に取り組まれなかった。現在、ＰＣＲは、終点（ＡＺＴ＋カクテル療法では、ＨＩＶウイルスの個々の全徴候が除去される）を同定することを試み、非検出レベルまでウイルス負荷の損失を測定し、ＰＣＲに固有の限界、ＲＴ−ＰＣＲの性能の低さおよび組合せて使用したＲＴ（逆転写）およびＰＣＲプロセスの両方で生じる複雑さのために、ほとんどまたは全く成功していない。
【０１５８】
本発明の方法および組成物は、ＨＩＶ処置法期間を通じてｍＲＮＡレベルを追随させることにより、ウイルス負荷診断に使用される。例えば、プロテアーゼ阻害剤療法は、ＰＣＲが、療法を停止する必要のある時点（ウイルス負荷が減少する時点）を決定することが困難であるという問題がある。ＰＣＲは、その感度および特異性に影響を及ぼす固有の欠点を有し、その最も重要なことは、非常に過剰のゲノムＤＮＡにおいてコピー数の低い標的（ＤＮＡ）の同定を妨げ、直接ＲＮＡ標的を解析する能力が全体的に欠失していることである。本発明は、単一遺伝子またはＲＮＡ標的コピーまで直接解析することにより、非常に過剰のＤＮＡ／ＲＮＡにおける少量の標的を同定して、かかる問題を解決する。従って、ＴＰＡがウイルス負荷の解析について送達できるパラメーターは、以下の核酸形の数の監視を含む：１．単一遺伝子コピーに感度があるＨＩＶウイルスの二本鎖ＲＮＡ２．ＨＩＶプロウイルス（組込み形）の二本鎖ＤＮＡ−単一遺伝子コピーに感度がある３．ウイルスタンパク質に特異的なｍＲＮＡ−単一遺伝子コピーと考えられる１０,０００−２０,０００ｍＲＮＡ分子に感度がある 現在、生物発光を介したシグナル増幅は、間接的なｍＲＮＡ解析の評価により、単一遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡ標的に感度がある。生物発光および他のシグナル増幅技術が向上するので、ｍＲＮＡ標的は、直接、単一のメッセンジャーコピーレベルで、大量の非特異的核酸中で評価され得る。
【０１５９】
本発明の別の使用は、直接的ｍＲＮＡ解析である。直接的ｍＲＮＡ解析の特定の使用は、核酸を基本とした癌転移アッセイである。単一の腫瘍細胞を有するリンパ節はそれ自体、腫瘍細胞表面マーカー、レセプタータンパク質に特異的なｍＲＮＡ標的を最小で１０,０００−２０,０００提示し、これは、全リンパ節の全ＲＮＡの単離（ミリグラム量）および１回の解析で検出できる。
【０１６０】
本発明の別の使用は、Ｃ型肝炎ＲＮＡおよびｍＲＮＡの直接的同定である。この直接的検出により、感染性ウイルスの早期検出が可能となり、血液および血漿の世界的供給の安全性を確保することが容易になる。
【０１６１】
本発明の別の使用は、多くの治療様相を、処理する異常性に特異的なｍＲＮＡ標的解析により監視できることである。ホルモン異常（低または高状態）の診断は、類似ｍＲＮＡ解析により監視できる。成長因子療法もまた、遺伝子調節問題の場合と同様、直接的ｍＲＮＡ検査により監視できる。最後に、無数のヒト医学適用と共に、同等なまたはさらにより印象的な農学および獣医学適用の一覧がある。
【０１６２】
本発明の組成物は、本明細書に教示した方法を実践するために必要な成分を有する組成物を含む。例えば、組成物は、特異的標的配列に相補的なヌクレオチド区分を有する一次プローブおよび１つ以上の二次プローブ配列、および標識二次プローブを含む。ヌクレアーゼ、リボザイムおよび緩衝液と共に選択した一次および二次プローブを含む組成物またはキットは、本発明に含まれる。個々の分子、プローブおよび成分もまた個々にまたは組合せて提供され得ると理解される。
【０１６３】
本発明は、包含された実施例により説明され、これはいかなる場合にもその範囲を限定するものではない。対照的に、手段は、様々な他の実施形態、修飾、およびその等価体を含み得ることは明らかに理解され、本明細書を読んだ後、当業者に、本発明および／または後の包含される請求の範囲の範囲から逸脱することなく示唆され得る。
[実施例]
＜実施例１＞
三重らせん形成ＤＮＡ ＴＰＡにより仲介されるＰＮＡＳと共に二本鎖ＤＮＡ標的配列を使用した標的保護アッセイの一般フォーマットＤＮＡの単離 以下のプロトコールは、大量の全血から迅速にＤＮＡを単離する代表的な方法である：静脈穿刺チューブに収集した１５０ｍｌの血液（ヘパリン、ＡＣＤまたはＥＤＴＡ）を共にプールし、５００ｍｌの遠心ボトル中、１５０ｍｌのイソトンＩＩ（Coulter Diagnostics）で希釈した。３０ｍｌの１０％トライトンＸ−１００を加え、３秒間激しく混合した。細胞核を最大速度（１２,０００×ｇ）
で５分間ペレット化した。上清を除去した後、ペレットを１０ｍｌのＰＫ混合物（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭＥＤＴＡ、０.５％Ｔｗｅｅｎ２０、０.５％ＮＰ−４０、および２.５ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫ）に再懸濁し、５５℃で１５分間、９５℃で１０分間インキュベートし（プロテアーゼＫを不活性化する）、次いで室温までゆっくりと冷却する。次いで、サンプルを遠心チューブに移し、１２,０００×ｇで１０分間回転させる。上清を回収し、ＤＮＡを、０.２容量の１０Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量のエタノールを加えてペレット化する。沈殿したＤＮＡを５,０００×ｇで１０分間ペレット化し、２回７０％エタノールで洗浄し、次いで０.５ｍｌ滅菌水に再懸濁する。緩和な超音波またはせん断がペレットを完全に溶かすために必要であり得る。約１ｍｇの全ゲノムＤＮＡが、１５０ｍｌの全血（約１億５千万の核の細胞）から回収される。ＲＮＡ調製技術もまた適用できる。
[三重らせん形成により仲介されるＰＮＡＳの形成]
水中の０.５ｍｌのＤＮＡサンプルに、５０μｌの１０×ＴＦＯ緩衝液（０.２５Ｍトリス−アセテート、ｐＨ７.０、０.５ＭＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ−メルカプトエタノール、０.１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および４０ｍＭスペルミン−ＨＣｌ）を、次いで、１０ｎｍｏｌの特異的ＴＦＯを加える。安定なＰＮＡＳの形成に十分な時間および温度で、例えば３７℃で１０分間、次の段階の前にインキュベートする。
[酵素的消化]
５００単位の各制限酵素（ほとんどの場合５０μｌ）および４,０００単位のExoIII（４０μｌの１００,０００μ／ｍｌストック）を加える。反応物を３７℃でさらに５０分間インキュベートし、次いで、生化学的または生物物理学的方法により酵素を不活性化する。現時点でサンプルは方法の次の段階の準備がされている。
[捕獲システム]
消化ＤＮＡ混合物に、１０ｎｍｏｌのＤＩＧ標識捕獲プローブおよび０.５ｍｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液（５.０Ｍ ＮａＣｌ、０.５ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４.５）を加える。混合物を最適のハイブリダイゼーション温度で、安定なハイブリダイゼーション複合体が形成されるために十分な時間、例えば１時間インキュベートし、次いで、１００μｌの抗ＤＩＧ覆膜磁気ビーズを加え、洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁する。さらに１時間インキュベートした後、磁気粒子濃縮器を使用してビーズを単離し、８回０.５ｍｌハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄する。現時点でサンプルはＤＮＡ三重らせんＴＰＡ法の最終段階の準備がされている。
【０１６４】
ＦＩＴＣ標識リポータープローブを使用し、蛍光異方性を使用して検出する。ハイブリダイゼーション緩衝液中１０ｎｍｏｌのリポータープローブを含む１.０ｍＬ溶液の初期異方性を測定した後、洗浄した磁気ビーズに加える。混合物を１時間５０℃で穏やかに振りながらインキュベートし、全内容物（ビーズを含む）をアボットＴＤＭサンプルバイアルに移す。次いで、異方性を、解析するために初期の値と比較して再測定する。結合した画分は、ｆｂ＝（ｒｏｂｓ−ｒｉｎ）/（ｒｂ−ｒｉｎ）で示すことができ、ここでｆｂは結合した画分であり、ｒｉｎは初期異方性であり、ｒｏｂｓはハイブリダイゼーション後に観察された異方性であり、ｒｂは全結合である（過剰の結合剤で、低濃度のプローブを滴定することにより決定）。
＜実施例２ ＨＩＶ＞
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、ＡＩＤＳの２つの病因物質の１つである。現在、抗ＨＩＶ抗体の存在を検出する血清学的アッセイを使用して、血液および血液製剤をスクリーニングする。一般に信頼性があるが、これらの試験は、時折、交差反応性抗体のために偽陽性結果を、または感染が測定可能な免疫応答を発現する前の初期段階にある場合、偽陰性結果を生じる。ＴＰＡなどの別の方法が特に有用であり得るのは後者の場合である。なぜなら、大量のサンプルＤＮＡが、単一のアッセイチューブで処理および試験され得るからである。感受性細胞系との共培養を使用したウイルスの直接的アッセイは存在しないが、この方法は手間がかかり、完了に数日間を要する。以下の例は、低いレベルの感染ＣＤ４陽性細胞をもつ最近感染した個体の最も悪い症例の多くのの血液の引用を記載する。
１．実施例１で上記した１５０ｍｌの全血（１億５千万の白血球）ＤＮＡの抽出。０.５ｍｌの水に精製したＤＮＡを再懸濁。
２．５０μｌの１０×ＴＦＯ緩衝液および１０ｎｍｏｌＴＦＯを添加。
ＨＩＶ−１ ＴＦＯ：            （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
５'−ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＣＣ ＣＣＣ Ｔ−３'
３．１０分間３７℃でインキュベート。
４．５００単位のＳａｕ３Ａおよび４,０００単位のExoIIIを添加。
５．５０分間３７℃で、次いで２０分間６０℃でインキュベート。
６．０.５ｍｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液および１０ｎｍｏｌのＤＩＧ標識捕獲プローブを添加。
ＨＩＶ−１捕獲プローブ：        （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
５'−ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＴＴ ＴＧＴ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＴ−ＤＩＧ−３'７．５０℃で１時間インキュベート。
８．１００μｌの洗浄ＤＩＧ覆膜磁気ビーズを添加。
９．５０℃で１時間振りながらインキュベート。
１０．チューブを磁気濃縮器に配置し、液体を除去。
１１．０.５ｍｌハイブリダイゼーション緩衝液で８回洗浄。
１２．蛍光異方性で以前に測定した１０ｎｍｏｌのリポータープローブを含む１.０ｍｌハイブリダイゼーション緩衝液にビーズを再懸濁：
ＨＩＶ−１リポータープローブ：  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
５'−ＧＡＡ ＴＡＧ ＴＡＧ ＡＣＡ ＴＡＡ ＴＡＧ ＴＡ−ＦＩＴＣ−３'
１３．５０℃で１時間インキュベート。
１４．異方性を再測定し、上記の式により結合プローブ（ｆｂ）の画分を解析。
【０１６５】
別に、段階１３の後、ビーズを磁気粒子濃縮器で再精製し、ハイブリダイゼーション緩衝液で８回洗浄し、直接的蛍光測定（励起＝４９０ｎｍ、発光＝５２０ｎｍ）のために蛍光計に配置し、またはビーズを蛍光顕微鏡上で観察するためにスライド上に配置できる。
＜実施例３＞
[ＢＵＣＰを用いた一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージＤＮＡの切断]
糸状バクテリオファージの複製は、宿主細菌を含む大腸菌繊毛と協調して生じ、感染細胞は溶解しないが、上清に放出された、１世代１細胞あたり数百のウイルス粒子を産生する。感染細菌の培養物におけるバクテリオファージの力価はミリメーターあたり１０12ｐｆｕに到達できる。細胞外感染鎖は、Ｍ１３（＋）鎖、一本鎖環状ＤＮＡ分子（約７.２ｋｂ長）である。
【０１６６】
ＢＵカッタープローブＤＮＡ制限を実証するために使用したシステムは、ＢＵカッタープローブが環状Ｍ１３ｍｐｌ８バクテリオファージ上の特異的配列にハイブリダイズする能力を利用する。以下は塩基数が２５００から２５２５の配列である
【０１６７】
【化１】
2001522588.tif 000002
２．栄養ブイヨンで生育した大腸菌の培養後半の培養物を、１２,０００ｇで１０分間遠心し、得られた上清をチューブにデカントし、これにクロロホルムを２滴加え、バクテリオファージストックを滅菌する。
【０１６８】
様々な濃度のＭ１３ＤＮＡを、次に、制限するＭ１３分子の数に対して１０倍過剰のカッタープローブのインキュベートにより以前に提示されたＢＵカッタープローブ配列とハイブリダイズさせ、よって完全なハイブリダイゼーションを確実にする（プローブＭ１３相互作用のＴｍは、塩基含量調査により４４℃であると計算される）。ハイブリダイゼーション温度は１Ｍの塩ハイブリダイゼーション緩衝液中３７℃付近である。
【０１６９】
高ストリンジェンシー洗浄液を、３７℃で低塩濃度で加え、非特異的領域に結合するＢＵＣＰプローブを除去する。
次いで、プローブの付着した環状ＤＮＡを、ぺトリ皿中で、長波長ＵＶ（３１３ｎｍ）で、線量率１４.６Ｗｍ-2で照射する。しかし、照射前に、ヘキストダイ３３２５８番を、標的の臭素フリーラジカルによる高頻度の切断を確かにするために加えなければならない（Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージの反対の鎖の糖−リン酸骨格）。
【０１７０】
バクテリオファージＤＮＡの制限は、アガロース（１％）ゲル電気泳動により可視化され、これはＭ１３ＤＮＡ鎖と同様にプローブ鎖に誘導された破壊が示される。ＢＵカッタープローブは少なくとも１つの類似の蛍光分子をＢＵ分子の両方の側に有する。Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージＤＮＡは、最初のとは異なる波長で蛍光を発する別の蛍光ダイを有し、これはゲル解析時に環状（制限されていない標的）および線形（標的制限）のＲｆが確認される。
【０１７１】
これらの蛍光ダイは、実験的バックグラウンドを最小限にするために赤外スペクトルの近くである。分子動態蛍光解析器におけるゲルの解析によりプロファイルが得られる。
【０１７２】
標的が制限されていない場合、Ｍ１３は、特異的Ｒｆでゲル中に移動しているＤＮＡの環状無傷片のままである。標的の制限は、ゲルＲｆを別の位置にシフトさせ、これは切断および線形バクテリオファージの生成の証明となる。反応条件は、（２）カッタープローブ開裂を提示する他の小バンドの変性ゲルを使用して検査することにより質を調節できる（実験条件が合っていない場合、無傷カッタープローブバンドが観察される）。
＜実施例４＞
[独特な標的／プローブ複合体（ＰＤＴＰ）と一本鎖ＤＮＡ標的配列を使用したＤＮＡＲＦＴＡの一般フォーマット]
選択した標的は、Bacillus Anthracisの毒素産生遺伝子のセンス鎖（ｗ）配列である。ＤＮＡサンプル中の標的の存在は、細菌および感染の存在を示す。
[血清標本における細菌標的の単離]
１．大量の血清サンプル５０−１００ｍｌを、１２,０００×ｇで４℃で遠心する。
２．ペレットを、５６７μｌのＴＥ緩衝液中で繰り返しピペッティングすることにより再懸濁する。３０μｌの１０％ＳＤＳおよび３μｌの２０ｍｇ/ｍｌプロテインキナーゼＫを加え、混合し、１時間３７℃でインキュベートする。
３．１００μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、激しく混合する。８０μｌのＣＴＡＢ/ＮａＣｌ溶液を加え、混合し、１０分間６５℃でインキュベートする。
４．等容量のクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、混合し、４−５分間微量遠心する。上清を新しいチューブに移す。上清の取り出しが困難である場合、爪楊枝で最初に界面を取り出す。
５．等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加え、混合し、５分間微量遠心する。上清を新しいチューブに移す。
【０１７３】
ある細菌株では、クロロホルム抽出後に形成された界面は上清を用意に取り出せるほど密ではない。このような場合、ほとんどの界面は、上清を取り出す前に滅菌爪楊枝で取り出し得る。次いで残りのＣＴＡＢ沈殿物はフェノール−クロロホルム抽出で取り出す。
６．０．６容量のイソプロパノールを加え、ＤＮＡが沈殿するまで穏やかに混合する。沈殿物をシールドパスツールピペットで１ｍｌの７０％エタノールに移し洗浄する。
【０１７４】
別に、沈殿物を簡潔に微量遠心し、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄する。
７．５分間微量遠心にかけ、上清を廃棄し、凍結乾燥器で簡潔に乾燥させる。
[ＤＮＡ ＲＦＴＡ]
Bacillus Anthracisの毒素遺伝子の同定 一旦ＤＮＡを単離すれば、１または２つの制限エンドヌクレアーゼが、選択した標的領域（可変長）に隣接する部位を有する箇所で制限しなければならない。
[酵素消化]
各制限酵素５００単位（ほとんどの場合５０μｌ）を加える。反応物を３７℃でさらに５０分間インキュベートし、次いで生化学的または生物物理学的方法により酵素を不活性化する。現時点でサンプルは方法の次の段階に準備されている。
【０１７５】
以下はＲＦＴＡを含む全プローブおよび構造の配列である。
塩基５４１−６６０ B.Anthracis毒素産生遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
【０１７６】
【化２】
2001522588.tif 000003
一旦ＤＮＡを制限すれば、一本鎖ＤＮＡ標的を放出するためにＤＮＡを変性しなければならない。
[ＤＮＡの変性]
制限後、ＤＮＡを、最小１分間（９４℃で）９４℃まで加熱することにより、またはアルカリ処理（０.４Ｎ ＮａＯＨと２５ｍＭＥＤＴＡ）により変性しなければならない。
【０１７７】
次に、一次プローブを標的配列の一部とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション条件が類似である場合、捕獲プローブは同時に混合物（１０ｎｍｏｌのＤＩＧ標識プローブ）に加えてもよく、標的領域の他の部分に結合する。ハイブリダイゼーション温度は通常、二本鎖核酸の融解温度以下の２０℃である。通常のハイブリダイゼーション条件は、１０倍少ない各プローブ、５０℃で２０−６０分間のインキュベート、および中性ＯＨで高塩（５×５５ＰＥ）の緩衝液を必要とする。
[捕獲システム]
ＤＮＡ混合物に、１０ｎｍｏｌのＤｉｇ標識捕獲プローブおよび０.５ｍｌの２.５×ハイブリダイゼーション緩衝液（５.０Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４.５）を加える。混合物を最適のハイブリダイゼーション温度で、安定なハイブリダイゼーション複合体の形成に十分な時間、例えば１時間インキュベートし、次いで１００μｌの抗Ｄｉｇ覆膜磁気ビーズを加え、洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁する。さらに１時間インキュベートした後、磁気粒子濃縮器を使用してビーズを単離し、０.５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（１×ＳＳＰＥ）（鉱物ストリンジェント用に低塩）で８回洗浄する。洗浄後の磁気ビーズは、各塩基上でビオチンで置換したリポータープローブのハイブリダイゼーションに準備されている。リポータープローブ（２５ｍｅｒ）を、５０℃で５×ＳＳＰＥ中、２０−６０分間インキュベートし、ストリンジェント洗浄を導入して、４５℃で１×ＳＳＰＥ緩衝液を用いて洗浄することにより非結合プローブを除去する。磁気ビーズを含む全チューブ洗浄は、ビーズ／標的損失を防ぐために磁気チューブホールダーで実施する。
【０１７８】
次の段階は、アビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体の添加によるシグナル発生の開始である。複合体を１０倍過剰に、標的捕獲ビーズを含むチューブに加える。ビーズは同様に洗浄して非結合複合体を除去し、発色性基質テトラメチルベンジジンを加え、ペルオキシダーゼとの接触時に可溶性色を出す。
【０１７９】
色の強度は存在する標的の数に比例する。
本明細書に記載した全特許および刊行物の開示は、本発明が関連する従来技術をより完全に記載するために、その全体を引用によりここに援用する。
【０１８０】
本プロセスは、ある実施形態について特別に詳細に記載したが、かかる詳細な記載は、それらが添付の請求の範囲に含まれることを除きおよびその程度まで、本発明を限定するものではない。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2001522588000001.app