【手続補正書】
【提出日】平成16年5月7日(2004.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
天然のTCRの細胞外部分は、各々が膜近位定常ドメインと膜遠位可変ドメインを有する２つのポリペプチド（αβ又はγδ）からなる（図１参照）。前記定常ドメインと可変ドメインのそれぞれには、鎖内ジスルフィド結合が含まれる。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（CDR）に類似した多型性が高いループを含有する。TCRのCDR３は、ＭＨＣによって提示されるペプチドと相互作用し、CDR１とCDR２はペプチド及びＭＨＣと相互作用する。TCR配列の多様性は、連結される可変（Ｖ）、多様（Ｄ）、連結（Ｊ）、及び定常遺伝子の体細胞での再構成を通じて生成される。機能的なα鎖ポリペプチドは、再構成されたＶ−Ｊ−Ｃ領域によって形成されるのに対して、β鎖はＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃ領域からなる。細胞外定常ドメインは、膜近位領域と免疫グロブリン領域を有している。膜近位領域は、膜貫通ドメインと膜近位システイン残基の間に位置するアミノ酸からなる。定常免疫グロブリンドメインは、残りの定常ドメインアミノ酸残基からなり、膜近位システインから連結領域(joining region)の先頭にまで及び、免疫グロブリン型の折り畳み(fold)の存在を特徴とする。Ｃα１又はTRAC＊０１として知られる単一のα鎖定常ドメインと、Ｃβ１又はTRBC＊０１及びＣβ２又はTRBC２＊０１として知られる２つの異なるβ定常ドメインとが存在する。これらの異なるβ定常ドメイン間の差は、エキソン１のアミノ酸残基４、５、及び３７に存する。このため、TRBC１＊０１は、そのエキソン１の中に４Ｎ、５Ｋ、及び３７Ｆを有し、TRBC２＊０１は、そのエキソン１の中に４Ｋ、５Ｎ、及び３７Ｙを有する。各TCR細胞外ドメインの範囲は、若干変化し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
E.Coli細胞を溶解し封入体を純度約８０％に精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭトリス  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で変性し、単一パルスの変性タンパク質を５℃未満のリフォールディング緩衝液に添加することによって、３０ｍｇ／リットル重鎖、３０ｍｇ／リットルβ２ｍの濃度で、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、１００ｍＭトリス  ｐＨ８．１、３．７ｍＭ  シスタミン、６.６ｍＭ  β-システアミン、４ｍｇ／ｍＬペプチド（例えば、ｔａｘ  １１−１９）中にリフォールディングした。リフォールディングは、４℃において、１時間以上で完結させることができた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
【図１】図１は、本発明によって導入された鎖間ジスルフィド結合を有する可溶性TCRの概略図である。
【図２】図２ａ及び２ｂは、システインコドンを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのそれぞれα鎖及びβ鎖の核酸配列である。陰影付きの部分は、導入したシステインコドンである。
【図３】図３ａは、新規ジスルフィド鎖間結合を生成させるために使用したＴ４８→Ｃ突然変異（下線部）を含めたA6 TCRα鎖細胞外アミノ酸配列である。図３ｂは、新規ジスルフィド鎖間結合を生成させるために使用したＳ５７→Ｃ突然変異（下線部）を含めたA6 TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列である。
【図４】図４は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィによって得られたトレースである。
【図５】図５−Ａ．図４に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図４に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク１はジスルフィドによって連結されていないβ鎖を主として含んでいることが明らかであり、ピーク２は鎖間ジスルフィドによって連結されたTCRヘテロダイマーを含み、ショルダーは鎖間ジスルフィド連結sTCRに混入したＥ．ｃｏｌｉ汚染物質によるものであり、この複製では見え難い。
【図６】図６は、図５のピーク１からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィによって得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。
【図７】図７は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ複合体に対するジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore応答曲線である。挿入グラフは、ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答である。
【図８】図８ａは、突然変異してＢａｍＨｌ制限酵素切断部位が組み込まれた新規システイン残基を含むA6 TCRα鎖配列である。陰影付きの部分は、導入されてＢａｍＨｌ制限酵素切断部位を形成した突然変異を示す。図８ｂ及び８ｃは、突然変異して追加のシステイン残基を含み非天然(non-native)ジスルフィド結合を形成するＪＭ２２  TCRのα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。
【図９】図９ａ及び９ｂは、それぞれ図８ａ及び８ｂのＤＮＡ配列から産生されるＪＭ２２  TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性ジスルフィド連結ＪＭ２２  TCRの陰イオン交換クロマトグラフィによって得られたトレースである。
【図１１】図１１ａは、図１０に示すカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。図１１ｂは、図１０に示すカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク１が鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含んでいるのは明らかである。
【図１２】図１２は、図１０のピーク１からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィによって得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。収率は８０％である。
【図１３】図１３−Ａ．ＨＬＡ−Ｆｌｕ複合物に対するジスルフィド連結ＪＭ２２可溶性TCRの特異的結合のBIAcore応答曲線である。Ｂ．ジスルフィド連結ＪＭ２２可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答である。
【図１４】図１４ａ及び１４ｂは、突然変異して追加のシステイン残基を含み非天然ジスルフィド結合を形成したＮＹ−ＥＳＯのα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。
【図１５】図１５ａ及び１５ｂは、それぞれ図１４ａ及び１４ｂのＤＮＡ配列から産生されたNY-ESO TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。
【図１６】図１６は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性ＮＹ−ＥＳＯジスルフィド連結TCRの陰イオン交換クロマトグラフィによって得られたトレースである。
【図１７】図１７−Ａ．図１６に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図１６に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク１及び２が、鎖間ジスルフィドによって連結されたTCRヘテロダイマーを含んでいることは明らかである。
【図１８】図１８  図１７のピーク１（Ａ）及びピーク２（Ｂ）からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示すグラフである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。
【図１９】図１９は、ＨＬＡ−NYESO複合体に対するジスルフィド連結ＮＹ−ＥＳＯ可溶性TCRの特異的結合のBIAcore応答曲線である。Ａ．ピーク１、Ｂ．ピーク２。
【図２０】図２０ａ及び２０ｂは、（陰影付きで示された）新規システインコドンを導入するように突然変異した可溶性NY-ESO TCRのそれぞれα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。これらの配列は、（太字のコドンで示された）天然ジスルフィド鎖間結合に関与するシステインを含む。
【図２１】図２１ａ及び２１ｂは、それぞれ図２０ａ及び２１ｂのＤＮＡ配列から産生されるNY-ESO TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。
【図２２】図２２は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRαｃｙｓβｃｙｓの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図２３】図２３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRαｃｙｓの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図２４】図２４は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRβｃｙｓの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図２５】図２５は、図２２〜２４の陰イオン交換カラム分析からのそれぞれNY-ESO TCRαｃｙｓβｃｙｓ、TCRαｃｙｓ、TCRβｃｙｓ各画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。レーン１及び７はＭＷマーカーであり、レーン２はNYESOdsTCRlg4  α-cys  βピーク（EB/084/033）であり、レーン３はNYESOdsTCRlg4  α-cys  β小ピーク（EB/084/033）であり、レーン４はNYESOdsTCRlg4  α  β-cys（EB/084/034）であり、レーン５はNYESOdsTCRlg4  α-cys  β-cys小ピーク（EB/084/035）であり、レーン６はNYESOdsTCRlg4  α-cys  β-cysピーク（EB/084/035）である。
【図２６】図２６は、図２２〜２４それぞれの陰イオン交換カラム分析からのNY-ESO TCRαｃｙｓβｃｙｓ、TCRαｃｙｓ、及びTCRβｃｙｓ各画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。レーン１及び７はＭＷマーカーであり、レーン２はNYESOdsTCRlg4  α-cys  βピーク（EB/084/033）であり、レーン３はNYESOdsTCRlg4  α-cys  β小ピーク（EB/084/033）であり、レーン４はNYESOdsTCRlg4  α  β-cys（EB/084/034）であり、レーン５はNYESOdsTCRlg4  α-cys  β-cys小ピーク（EB/084/035）であり、レーン６はNYESOdsTCRlg4  α-cys  β-cysピーク（EB/084/035）である。
【図２７】図２７は、図２２からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRαｃｙｓβｃｙｓのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。
【図２８】図２８は、図２２からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRαｃｙｓのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。
【図２９】図２９は、図２２からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRβｃｙｓのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。
【図３０】図３０は、HLA-NY-ESO複合体に対するNY-ESO TCRαｃｙｓβｃｙｓの特異的結合のBIAcore応答曲線である。
【図３１】図３１は、HLA-NY-ESO複合体に対するNY-ESO TCRαｃｙｓの特異的結合のBIAcore応答曲線である。
【図３２】図３２は、HLA-NY-ESO複合体に対するNY-ESO TCRβｃｙｓの特異的結合のBIAcore応答曲線である。
【図３３】図３３ａ及び３３ｂは、（陰影付きで示された）新規システインコドンを導入するように突然変異した可溶性ＡＨ−１．２３  TCRのそれぞれα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。これらの配列は、（太字のコドンによって示される）天然ジスルフィド鎖間結合に関与するシステインを含む。
【図３４】図３４ａ及び３４ｂは、図３３ａ及び３３ｂの各ＤＮＡ配列から産生されるＡＨ−１．２３  TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。
【図３５】図３５は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性ＡＨ−１．２３  TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図３６】図３６は、図３５における陰イオン交換カラム分析のＡＨ−１．２３  TCR画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、クーマシー染色）を示す図である。試験したタンパク質は、リフォールディング体３からのTCR  １．２３  Ｓ−Ｓの陰イオン交換画分である。レーン１はＭＷマーカーであり、レーン２はＢ４であり、レーン３はＣ２であり、レーン４はＣ３であり、レーン５はＣ４であり、レーン６はＣ５であり、レーン７はＣ６であり、レーン８はＣ７であり、レーン９はＣ８であり、レーン１０はＣ９である。
【図３７】図３７は、図３５における陰イオン交換カラム分析のＡＨ−１．２３  TCR画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、クーマシー染色）を示す図である。試験したタンパク質は、リフォールディング体３からのTCR  １．２３  Ｓ−Ｓの陰イオン交換画分である。レーン１はＭＷマーカーであり、レーン２はＢ４であり、レーン３はＣ２であり、レーン４はＣ３であり、レーン５はＣ４であり、レーン６はＣ５であり、レーン７はＣ６であり、レーン８はＣ７であり、レーン９はＣ８であり、レーン１０はＣ９である。
【図３８】図３８は、図３５からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性ＡＨ−１．２３  TCRのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。
【図３９】図３９ａ及び３９ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基４８に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４０】図４０ａ及び４０ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基４５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４１】図４１ａ及び４１ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基６１に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４２】図４２ａ及び４２ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基５０に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４３】図４３ａ及び４３ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基１０に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４４】図４４ａ及び４４ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基１５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４５】図４５ａ及び４５ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基１２に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４６】図４６ａ及び４６ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基２２に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、陰影付きのアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４７】図４７ａ及び４７ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基５２に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４８】図４８ａ及び４８ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基４３に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図４９】図４９ａ及び４９ｂは、TRAC＊０１のエキソン１中の残基５７に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５０】図５０ａ及び５０ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基７７に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５１】図５１ａ及び５１ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基１７に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５２】図５２ａ及び５２ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基１３に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５３】図５３ａ及び５３ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基５９に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５４】図５４ａ及び５４ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基７９に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５５】図５５ａ及び５５ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基１４に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５６】図５６ａ及び５６ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基５５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５７】図５７ａ及び５７ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基６３に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５８】図５８ａ及び５８Ｂは、TRBC２＊０１のエキソン１中の残基１５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。
【図５９】図５９は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ  ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図６０】図６０は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ  ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図６１】図６１は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ  ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図６２】図６２は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ  ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図６３】図６３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ  ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図６４】図６４は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ  ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。
【図６５】図６５ａ及び６５ｂは、TRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図５９の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図６６】図６６ａ及び６６ｂは、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６０の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図６７】図６７ａ及び６７ｂは、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６１の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図６８】図６８ａ及び６８ｂは、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６２の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図６９】図６９ａ及び６９ｂは、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６３の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７０】図７０ａ及び７０ｂは、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６４の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７１】図７１は、Superdex  ２００  ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図５９の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７２】図７２は、Superdex  ２００  ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６０の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７３】図７３は、Superdex  ２００  ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６１の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７４】図７４は、Superdex  ２００  ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６２の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７５】図７５は、Superdex  ２００  ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６３の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７６】図７６は、Superdex  ２００  ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６４の陰イオン交換カラム分析から収集した。
【図７７】図７７は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ  ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。
【図７８】図７８は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ  ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。
【図７９】図７９は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ  ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。
【図８０】図８０は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ  ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。
【図８１】図８１は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ及びＨＬＡ−Ａ２−ＮＹ−ＥＳＯ  ｐＭＨＣに対する、TRAC＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２＊０１のエキソン１の残基５５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの非特異的結合を示すBIAcoreトレースである。
【図８２】図８２は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ  ｐＭＨＣに対する、TRAC＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。
【図８３】図８３ａは、１ＢＤ２配列を含むモデルの周囲の電子密度地図である（鎖Ａ  Ｔｈｒ１６４、鎖Ｂ  Ｓｅｒ  １７４）。地図には、１．０、２．０及び３．０σの等高線が記されている。図８３ｂは、２つの位置Ａ１６４及びＢ１７４においてＣｙｓで改良（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）した後の電子密度地図である。この地図も、図８３ａと同じσレベルで等高線が記されている。
【図８４】図８４は、１ＢＤ２  TCRの構造を本発明のNY-ESO TCRの構造と、リボン表示及びコイル表示で前記各構造を重ね合わせることによって比較した図である。
【図８５】図８５ａ及び８５ｂは、ビオチン認識部位が導入されたNY-ESO TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。ビオチン認識部位を強調して示す。
【図８６】図８６ａ及び８６ｂは、ヘキサ−ヒスチジンタグを導入したNY-ESO TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。ヘキサ−ヒスチジンタグを強調して示す。
【図８７】図８７は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムからの新規ジスルフィド結合及びビオチン認識配列を含む可溶性NY-ESO TCRの溶出を示すグラフである。
【図８８】図８８は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムからの新規ジスルフィド結合及びヘキサ−ヒスチジンタグを含む可溶性NY-ESO TCRの溶出を示すグラフである。
【図８９】図８９は、図８７に示したＮＹ−ＥＳＯ−ビオチンタグ付き陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のゲルろ過クロマトグラフィによるタンパク質溶出プロファイルである。
【図９０】図９０は、図８８に示したＮＹ−ＥＳＯ−ヘキサ−ヒスチジンタグ付き陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のゲルろ過クロマトグラフィによるタンパク質溶出プロファイルである。
【図９１−１】図９１ａ〜ｈは、それぞれ以下の濃度のＮＹ−ＥＳＯペプチド及び蛍光NY-ESO TCR四量体と共にインキュベートしたＨＬＡ−Ａ２陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＰＰ  ＬＣＬ）を２５，０００回測定して得られた染色強度を示すＦＡＣＳヒストグラムである。NYESO  ０  TCR  ５μｇ、NYESO  １０−４Ｍ  TCR  ５μｇ、NYESO  １０−５Ｍ  TCR  ５μｇ、NYESO  １０−６Ｍ  TCR  ５μｇ、NYESO  ０  TCR  １０μｇ、NYESO  １０−４Ｍ  TCR  １０μｇ、NYESO  １０−５Ｍ  TCR  １０μｇ、NYESO  １０−６Ｍ  TCR  １０μｇ。
【図９１−２】図９１−１の説明に同じ。
【図９１−３】図９１−１の説明に同じ。
【図９２】図９２は、TRBC１＊０１定常領域が組み込まれたA6 TCRのベータ鎖のＤＮＡ配列である。
【図９３】図９３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示した、TRBC１＊０１定常領域が組み込まれた可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィのトレースである。
【図９４】図９４−Ａ．図９３に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図９３に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。
【図９５】図９５は、図９３のピーク２からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示すグラフである。ピーク１は、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含む。
【図９６】図９６−Ａ．ＨＬＡ−Ｆｌｕ複合体に対するジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示すグラフである。Ｂ．ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答を示すグラフである。
【図９７】図９７は、「フリーの」システインが組み込まれたA6 TCRの突然変異ベータ鎖の核酸配列である。
【図９８】図９８は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、「フリーの」システインが組み込まれた可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィを示すグラフである。
【図９９】図９９−Ａ．図９８に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図９８に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。
【図１００】図１００は、図９８のピーク２からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示す図である。ピーク１は、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含む。
【図１０１】図１０１−Ａ．ＨＬＡ−Ｆｌｕ複合体に「フリーの」システインが組み込まれたジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示すグラフである。Ｂ．ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答を示すグラフである。
【図１０２】図１０２は、「フリーの」システインが突然変異したセリン残基が組み込まれたA6 TCRの突然変異ベータ鎖の核酸配列である。
【図１０３】図１０３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、「フリーの」システインが突然変異したセリン残基が組み込まれた可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィを示すグラフである。
【図１０４】図１０４−Ａ．図１０３に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図１０３に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク２が、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含んでいることは明らかである。
【図１０５】図１０５は、図１０３のピーク２からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示すグラフである。ピーク１は、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含む。
【図１０６】図１０６−Ａ．「フリーの」システインが突然変異したセリン残基が組み込まれたジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRのＨＬＡ−Ｆｌｕ複合体に対する特異的結合のBIAcore分析結果を示すグラフである。Ｂ．ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答を示すグラフである。
【図１０７−１】図１０７は、ｐＹＸ１１２のヌクレオチド配列である。
【図１０７−２】図１０７−１の説明に同じ。
【図１０８−１】図１０８は、ｐＹＸ１２２のヌクレオチド配列である。
【図１０８−２】図１０７−１の説明に同じ。
【図１０９】図１０９は、TCRα鎖に融合したプレプロα接合因子のＤＮＡ配列及びタンパク質配列である。
【図１１０】図１１０は、TCRβ鎖に融合したプレプロα接合因子のＤＮＡ配列及びタンパク質配列である。
【図１１１】図１１１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＳＥＹ６２１０において発現される可溶性TCRのウェスタンブロットの写真である。レーンＣは、対照として精製可溶性NY-ESO TCR  ６０ｎｇを含む。レーン１及び２は、２つの別個のTCR形質転換酵母培養物から収集したタンパク質を含む。
【図１１２】図１１２は、ｐＥＸ１７２プラスミドのＫｐｎＩ〜ＥｃｏＲＩ挿入断片の核酸配列である。プラスミドの残部は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ−である。
【図１１３】図１１３は、バキュロウイルスにクローニングするためのTCR鎖の概略図である。
【図１１４】図１１４は、ｐＡｃＡＢ３発現プラスミドに挿入するためのＢａｍＨＩ挿入断片としてのジスルフィドＡ６  α  TCR構築物の核酸配列である。
【図１１５】図１１５は、ｐＡｃＡＢ３発現プラスミドに挿入するためのＢａｍＨＩ挿入断片としてのジスルフィドＡ６  β  TCR構築物を示す図である。
【図１１６】図１１６は、細菌によって産生されたジスルフィドA6 TCR及び昆虫ジスルフィドA6 TCRに対するクーマシー染色ゲル及びウェスタンブロットを示す写真である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５８】
2005514006.tif 000001