【手続補正書】
【提出日】平成15年12月25日(2003.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
請求項１の式Iaのアミン化合物の調製方法であって、次の工程を含む前記方法：
R’4のアルデヒド若しくはR’4のケトンと、第一級アミンR’1R’2R’3CNH2及び触媒との混合物を、有機溶媒の存在下若しくは非存在下において水素化のために、30〜300℃に加熱する及び/又は0.1×106〜20×106パスカルに加圧する（このときR’1、R’2、R’3及びR’4は請求項１で定義され、第一級アミンR’1R’2R’3CNH2は請求項５に記述するように調製されることを特徴とする）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
実施例2
N-プロピル-2,3-ジメチル-2-ブチルアミン（化合物5）の調製：
氷酢酸25 mLにプロピオニトリル8.25 g(0.15 mol)を含む溶液に、反応温度を約38℃に制御しながら濃硫酸15 gを滴下し、40℃より低い温度で攪拌しながら2,3-ジメチル-2-ブタノール5.2 g(0.051 mol)を滴下した。温度を維持したまま混合物を一晩攪拌し、氷水に注ぎ、40%水酸化ナトリウム溶液を用いて塩基性にして、エーテルで抽出した。エーテル抽出物を合せて水で1回洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。エーテルを回収した後に得られた6.2 gの淡黄色液体を、無水エーテル80 mLに溶解した。得られた溶液を、無水エーテル80 mLに水素化アルミニウムリチウム3.04 g(0.08 mol)を含む懸濁液に滴下した。この混合物を10時間還流してから、冷却した。この混合物に40%水酸化ナトリウム水溶液を適量滴下し、上層のエーテルを注意深く注ぎ分けた。下層の固体をエーテルで洗った(×3)。得られた洗液とエーテル抽出液を合せて、無水炭酸カリウムで乾燥し、濾過した。冷却しながら、濾液が酸性になるまでHCl-Et2Oを加えた。これを濾過して固形物を集め、イソプロパノール及びアセトンから3回再結晶化して、3.33 g（収率46.33%）の白色層状結晶 mp 183〜185℃を得た。C9H22NClに対する元素分析(%)：計算値 C 60.15、H 12.34、N 7.79；実測値 C 60.20、H 13.80、N 7.85。1H-NMR(D2O, ppm) 0.98(d, 6H)、1.00(t, 3H)、1.24(s, 6H)、1.63(m, 2H)、2.05(m, 1H)、2.98(t, 2H)。MS(m/z) 143(M+)。
実施例3
N-(1-メチルプロピル)-2,3-ジメチル-2-ブチルアミン（化合物13）の調製：
2,3-ジメチル-2-ブチルアミンをブロモイソブタンと共に実施例1と同様に処理して、化合物13を収率17.1%で得た。塩酸塩の融点(mp)は203〜204℃である。C10H14NClに対する元素分析(%)：計算値 C 61.99、H 12.49、N 7.23；実測値 C 62.17、H 13.18、N 7.27；MS(m/z) 157(M+)；1H-NMR(D2O, ppm) 0.90(d, 6H)、1.18(t, 3H)、1.26(d, 3H)、1.28-3.43(m, 19H)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
実施例21
N-(1-メチルエチル)-N-(2,4,5-トリクロロフェノキシ-アセチル)-2,3-ジメチル-2-ブチルアミンの調製：
2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸51.3 g及びチオニルクロリド18 mLの混合物を、攪拌しながら2.5時間還流した。次に少量の無水ベンゼンを加え、過剰なチオニルクロリド及びベンゼンを真空中で蒸留除去した。その残留物を冷却して、2,4,5-トリクロロフェノキシアセチルクロリドである白色固体が晶出した。
N-(1-メチルエチル)-2,3-ジメチル-2-ブチルアミン・ハイドロクロリド1.81 g、トリエチルアミン3.30 g、触媒量の4-ジメチルアミノピリジン及びトルエン50 mLの混合物に、トルエン20 mLに2,4,5-トリクロロフェノキシアセチルクロリド5.50 gを含む溶液を攪拌しながら滴下した。添加後、この混合物を油浴上80℃で14時間加熱してから、外界温度まで冷却し、濾過した。得られた固体をトルエンで洗った。濾液及びトルエン洗液を合せて、水50 mL、1N NaOH(50 mL×2)、水50 mL、1N HCl(50 mL×2)、水50 mLで順番に洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、褐色粘性ペーストを得た。この残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、3.30 g（収率86.8%）の化合物を淡黄色半固体として得た。1H-NMR(CDCl3, ppm) 0.865(d, J＝6.75Hz, 6H)、1.401(s, 6H)、1.448(d, J＝6.75Hz, 6H)、2.85(m, 1H)、3.98(m, 1H)、4.740(s, 2H)、6.928(s, 1H)、7.441(s, 1H)。MS(m/z) EI+：338/336(1：1,(M-i-Pr)+)、298/296(M-Me2C-Me2CH)+/294、 84(B,C6H12+)；FAB+：378.2/380.2(M＋H)+/382.2、336.2/338.2(1：1,(M-i-Pr)+)、296.1/298.1(B,M＋H-C6H12)、100.1(t-ヘキシルアミン)、85.1(C6H13+)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
この結果から、化合物1及びニモジピンは、脳卒中の比率を著しく減少させて脳卒中の発症を遅らせ、脳卒中の神経症状を著しく改善し、脳卒中の死亡率を著しく低下させて動物の生存期間を延長させ得ることが示された。
生物活性試験の方法は、次のように行った：化合物1は蒸留水で所望の濃度に調製し、一方ニモジピンは市販で入手可能なジンロング(Jinglongyu)(商標)オイルで所望の濃度に調製した。SHRspのオス30匹及びメス30匹（10週齢、120〜180 g）は、軍事医学科学院の血管疾患研究センターから購入した。全SHRspを、血圧、体重及び性別に基づいてランダムに5つの群に分けた：コントロール群（等量のジンロング(商標)オイルを与えた）、0.25 mg・kg-1d-1化合物1処理群、1.0 mg・kg-1d-1化合物1処理群、4.0 mg・kg-1d-1化合物1処理群、及び、40 mg・kg-1d-1ニモジピン処理群。各群は12匹の動物を含み、4〜5匹の動物を一つのケージで飼育した。飼料（23〜24%のタンパク質を含む）は、軍事医学科学院の実験動物センターから購入した。動物は、脳卒中の発症を促進するために、1% NaClを含む水道水を与えた。12匹の正常WKYラット（上と同じ年齢及び上と同じ性別）をコントロールとして選択し、水道水及び同じ飼料を与えた。11週齢に達した時点で、実験のための薬物を動物に与えた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
生物活性試験9.  低酸素濃度及び低グルコース濃度によって誘起された大脳皮質(cortical)神経アポトーシスに対する、化合物1の阻害効果
図６に示すように、電子顕微鏡を用いて、低酸素濃度及び低グルコース濃度によって誘起された大脳皮質神経アポトーシス、及び、それに対する化合物1の効果を観察した。染色質は正常大脳皮質神経細胞において均等に分布しており、その細胞膜も原形を保っていた。しかしながら低酸素濃度及び低グルコース濃度処理群では、細胞は小さくなり、染色質は凝縮し破裂して核膜付近に分布した。このとき幾らかの染色質は円形又は三日月形を形成し、最終段階では、細胞膜が陥入して染色質断片を包み込んでアポトーシス体を形成した。10 μmol・L-1化合物1処理群においては、上述した変化はほとんど観察されなかった。さらに、染色質凝縮が減少し、核膜及び細胞膜も原形を保っていた。従って、前記濃度の化合物1は、低酸素濃度及び低グルコース濃度によって誘起された大脳皮質神経細胞アポトーシスに対して効果を有した。
図７は、低酸素濃度及び低グルコース濃度によって誘起された大脳皮質神経アポトーシスの割合を示す（フローサイトメトリーの使用による）。細胞をPI染色して、フローサイトメトリーによって異なる段階における細胞のDNA量を測定した。コントロール群では、大部分の神経細胞はG1期にあり、そのアポトーシスの割合は約2.3%であった。低酸素濃度及び低グルコース濃度処理した細胞では、8時間、16時間及び24時間でG1サブ-ピークが起り、そのアポトーシスの割合は13.6±5.8%、23.8±7.4%及び20.3±7.1%であった。アポトーシスは16時間において、最も顕著であった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【表１４】
2005519974.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
この結果から、化合物1は低酸素濃度及び低グルコース濃度によって誘起された大脳皮質神経アポトーシスを用量依存的な様式で阻害できたことが示された。
生物活性試験9の方法は、次のように行った：大脳皮質神経は、生後12時間のウィスターラットから調製して培養した（G.Y. Yang, A.L. Bentz. Reperfusion-induced injure to the blood-brain after middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke,1994,25：1658-1665を参照）。無血清のDMEM培地を12日後に用いた。この組織標本は、低酸素濃度タンク（95% N2＋5% CO2）でそれぞれ8時間、16時間及び24時間インキュベートしてから、酸素を通常濃度に戻してさらに24時間インキュベートした。五つの群に行った実験は、次のようである：コントロール群は、標準培地を用いて14日間培養した；低酸素濃度及び低グルコース濃度処理群は標準培地を用いて12日間培養してから、低濃度酸素及び低濃度グルコースを含む無血清培地で16時間培養し、標準酸素濃度でさらに24時間培養した；化合物1処理群は、低濃度酸素及び低濃度グルコースを含む無血清培地中で16時間培養し、標準酸素濃度でさらに24時間培養してから、それぞれ異なる濃度の化合物1（0.1 μmol・L-1、1.0 μmol・L-1及び10 μmol・L-1）を加えた。電子顕微鏡及びフローサイトメトリーによってアポトーシスを検出する方法は、C.Du、R.Hu、C.A.Csernanskyらの文献（Very delayed infarction after mild focal cerebral ischemia：a role for apoptosis. J.Cereb.Flow Metab., 1996,16:195-201）、M.Chopp, Y.Li, N.Jiangらの文献（Antibodies against adhesion molecules reduced apoptosis after transient middle artery occlusion in rat brain. J.Cereb.Flow Metab., 1996,16：578-584）を参照とする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【図１】P1075、ピナシジル、生物活性試験1における化合物（以降は化合物1と呼ぶ）及びグリベンクラミドと、[3H]P1075標識したラット大動脈片における結合部位との相互作用を示す。
【図２】ラット(n＝8)に由来する動脈平滑筋細胞のカリウム電流に対する、化合物1の効果を示す。
【図３】ラットに由来する動脈平滑筋細胞のカリウム電流に対する、化合物1の効果を示す（X±SE、n＝8、コントロールに対して**P<0.01）。
【図４】脳虚血によって引き起こされたスナネズミ海馬CA1領域の正常錐体神経死に対する、化合物1の効果を示す。
【図５】脳虚血によって引き起こされたスナネズミ海馬CA1領域の正常錐体神経アポトーシスに対する、化合物1の効果を示す。
【図６】脳卒中後の神経における症状のグレード値に対する、化合物1の効果を示す。
【図７】低酸素濃度及び低グルコース濃度によって誘起された大脳皮質神経アポトーシス、及び、化合物1の効果を示す（電子顕微鏡の使用による）。
【図８】低酸素濃度及び低グルコース濃度によって誘起された大脳皮質神経アポトーシスの割合を示す（フローサイトメトリーの使用による）。