【手続補正書】
【提出日】平成17年4月8日(2005.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質及びそれらを構造の中に含む化学種を原料として、二酸化炭素などの超臨界流体、高圧ガス、液体ならびにそれらと他の溶媒、ガスなどの化学種の混合流体中において、高分子などの支持体を用いて、ペプチド、タンパク質ならびにそれらを含む化合物を合成する方法。
【請求項２】
ペプチド、タンパク質及びそれらを含む化合物を合成するにあたり、使用圧力、温度及び組成のうち少なくとも１つを制御することにより、前記混合流体の合成するペプチド、タンパク質ならびにそれらを含む化合物の性質を制御することを特徴とする請求項１の合成方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環境に悪影響を及ぼす有機溶媒中の高分子の支持体上で行われていたペプチド、タンパク質及びそれらを含む化合物の合成反応を、環境に悪影響を及ぼさない二酸化炭素などの超臨界流体、高圧ガス、液体ならびにそれらと他の溶媒、ガスなどの化学種の混合流体中で行い、ペプチド、タンパク質及びそれらを含む化合物を取得する方法を提供することを目的とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
また本発明の要旨は、上記方法において、前記混合流体の使用圧力、温度及び組成のうち少なくとも１つを制御することにより、合成するペプチド、タンパク質ならびにそれらを含む化合物の性質を制御するところにもある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
昇圧部は、超臨界流体等としての二酸化炭素用と添加溶媒用の２つの昇圧用ポンプ４Ａ、４Ｂを有する。ボンベ１は、液体二酸化炭素を昇圧用ポンプ４Ａへ送るため、サイフォン式の二酸化炭素ボンベを用いた。ボンベから送られる液体二酸化炭素中の水分を除去するために、ボンベとポンプの間に乾燥管２を置いた。乾燥管の仕様は、材質SUS316、最高使用圧力２０ＭＰａ、内径３５．５ｍｍ、長さ３１０ｍｍである。また、乾燥剤には、ＧＬサイエンス(株)製のモレキュラーシーブ5A(1/16inch Pellet)を使用した。乾燥管により水分を除去された液体二酸化炭素は、冷却ユニット５（ヤマト科学製BL-22）によって約−５℃に保たれたエチレングリコールにより冷却され、昇圧用ポンプ４Ａに送られる。なおこの装置においては、液体二酸化炭素を溶媒として用いるようになっているが、所望の物質のボンベをボンベ１と付け替えることによって、溶媒として用いる物質を適宜変更することが可能である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
合成カラム１０は、装置内の空気恒温槽１６内に設置されている。空気恒温槽の内容積は、２０リットルあり、チノー（株）製温度制御器DB1000により、温度を測定温度±０．１Ｋで制御できる。温度測定部には、チノー製の白金抵抗測温体1TPF483を用いた。昇圧部から供給される液体二酸化炭素と溶離液は、予熱管８へ送られる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
予熱管８は、溶媒（二酸化炭素等）を平衡温度まで加熱し超臨界流体にするためのものであり、１／１６ｉｎｃｈステンレス管(長さ約４ｍ)を直径５５ｍｍ、長さ１４０ｍｍのスパイラル状に変形して、恒温槽内に設置した。予熱管８により超臨界流体とした二酸化炭素は添加溶媒と共に、六方バルブ７及び９（レオダイン製インジェクタ7125:最大使用圧力490kgf・cm2）を通過し、合成カラム１０（日本分光（株）製ステンレスカラム954R）に導入される。なお、カラム１０は、六方バルブ９に設置され、合成カラム１０による合成操作のとき以外には、六方バルブ９を切り替えることによって配管の洗浄が行えるようにした。また、カラム内の圧力を排出するために、ストップバルブＶ５、Ｖ６を設置した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
合成カラムにガラスビーズを充填し、スチレン樹脂に９−フルオロメトキシカルボニルを担持させた９−フルオロメトキシカルボニル−フェニルアラニン−アルコ樹脂（Fmoc-Phe-Alko Resin、渡辺化学（株）製）を１ｇ加え、Ｖ２を開けて合成カラム内に二酸化炭素を導入し、合成カラム内圧力を２０ＭＰａとした。このとき、上限圧力を膨張弁１２で調整した。このとき、空気恒温槽１６を３５℃に、膨張弁１２を８０℃に温度調整した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
その後、９−フルオロメトキシカルボニルの脱保護を行うために、ポンプ４Ｂを用いて２０％ピペリジン／ジメチルフォルムアミド溶液６ｍｌを合成カラムに導入した。さらにロイシンをフェニルアラニンとカップリング反応させるために、ポンプ４Ｂを用いて５％ロイシン／ジメチルフォルムアミド溶液を合成カラム内に導入した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
［実施例２］
実施例１において、ロイシン−フェニルアラニンの合成を圧力０．１〜１９．８ＭＰａの範囲で行った。図３に圧力０．１〜１９．８ＭＰａの範囲にて合成したジペプチドであるロイシン−フェニルアラニンの収率と圧力の関係を示す。この図より、合成時の圧力を増加させるほど、高収率が得られ、経済効率の点からも好ましい。また本実施例では、二酸化炭素の臨界圧力をまたがって合成を行ったが、二酸化炭素の臨界圧力であるおよそ７．４ＭＰａ（７３ａｔｍ）以下の高圧ガスの状態においてもロイシン−フェニルアラニンを合成できることが確認できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
［実施例３］
実施例１において、ロイシン−フェニルアラニンの合成をジメチルフォルムアミド濃度２０〜８０ｗｔ．％の範囲の超臨界二酸化炭素とジメチルフォルムアミドの混合流体中で行った。図４にジメチルフォルムアミド濃度２０〜８０ｗｔ．％の範囲にて合成したジペプチドであるロイシン−フェニルアラニンの収率と濃度の関係を示す。この図より、超臨界二酸化炭素にジメチルフォルムアミドを添加した方が高反応率を得られることが示された。また、ジメチルフォルムアミド濃度を５０ｗｔ．％に設定するのが経済効率の点から好ましい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
［実施例４］
実施例１において、超臨界二酸化炭素の代りに、超臨界エタン及び超臨界アンモニアを用いてロイシン−フェニルアラニンの合成を行った。超臨界エタン及び超臨界アンモニアを用いて合成した反応物を高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した。その結果、超臨界二酸化炭素を用いて合成した場合と同様のピークが得られ、ロイシン−フェニルアラニンが合成できたことが示された。なお、超臨界エタン及びアンモニアには、ジメチルフォルムアミド濃度が５０ｗｔ．％に設定するのが経済効率の点から好ましい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
合成カラムにガラスビーズを充填し、スチレン樹脂に９−フルオロメトキシカルボニルを担持させた９−フルオロメトキシカルボニル−フェニルアラニン−アルコ樹脂（Fmoc-Phe-Alko Resin渡辺化学（株）製）を１ｇ加え、Ｖ２を開けて合成カラム内に二酸化炭素を導入し、合成カラム内圧力を２０ＭＰａとした。このとき、上限圧力を膨張弁１２で調整した。このとき、空気恒温槽を３５℃に、膨張弁１２を８０℃に温度調整した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
その後、９−フルオロメトキシカルボニルの脱保護を行うために、ポンプ４Ｂを用いて２０％ピペリジン／ジメチルフォルムアミド溶液６ｍｌを合成カラムに導入した。さらにロイシンをフェニルアラニンとカップリング反応させるために、ポンプ４Ｂを用いて５％水酸化９−フルオロメトキシカルボニル-ロイシン／ジメチルフォルムアミド溶液を合成カラム内に導入した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
さらに、この時合成カラム内の樹脂上で生成されたロイシン−フェニルアラニンに、ロイシンをカップリングさせるために、９−フルオロメトキシカルボニル−ロイシンの脱保護を行うことを目的として、ポンプ４Ｂを用いて２０％ピペリジン／ジメチルフォルムアミド溶液６ｍｌを合成カラムに導入した。その後、ポンプ４Ｂを用いて５％水酸化９−フルオロメトキシカルボニル−ロイシン／ジメチルフォルムアミド溶液を合成カラム内に導入し、カップリング反応を行った。同様の操作を数回行うことにより、スチレン樹脂上でトリロイシン−フェニルアラニンを合成した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
合成カラムにガラスビーズを充填し、スチレン樹脂に９−フルオロメトキシカルボニルを担持させた９−フルオロメトキシカルボニル−グリシン−フェニルアラニン−アルコ樹脂（Fmoc-Gly-Phe-Alko Resin、渡辺化学（株）製）を１ｇ加え、Ｖ２を開けて合成カラム内に二酸化炭素を導入し、合成カラム内圧力を２０ＭＰａとした。このとき、上限圧力を膨張弁１２で調整した。このとき、空気恒温槽を３５℃に、膨張弁１２を８０℃に温度調整した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
その後、９−フルオロメトキシカルボニルの脱保護を行うために、ポンプ４Ｂを用いて２０％ピペリジン／ジメチルフォルムアミド溶液６ｍｌを合成カラムに導入した。さらにアラニン（Ala）をグリシン−フェニルアラニン（Gly-Phe）とカップリング反応させるために、ポンプ４Ｂを用いて５％ロイシン／ジメチルフォルムアミド溶液を合成カラム内に導入した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】符号の説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【符号の説明】
１：ボンベ
２：乾燥管
３：フィルタ
４Ａ、４Ｂ：送液ポンプ
５：冷却ユニット
６：安全弁
７：六方バルブ
８：余熱管
９：六方バルブ
１０：合成カラム
１１：紫外線検出器
１２：膨張弁
１３：圧力計
１４：トラップ
１５：流量計
１６：空気恒温槽
１７：サンプル瓶
Ｖ１〜Ｖ６：ストップバルブ