(57)【要約】  本発明によれば、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを取得し、該ＤＮＡを含む形質転換体を用いてＬ−フェニルアラニン又は桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造する。また、本発明によれば、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを取得し、該ＤＮＡを含む形質転換体を用いてＬ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性又は桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ。
【請求項２】
Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有する請求項１記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ。
【請求項３】
桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有する請求項１記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ。
【請求項４】
下記の理化学的性質を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ。
（１）作用：Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する又は桂皮酸とアンモニアから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する。
（２）至適ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．５
（３）分子量：５７，０００±５,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号３で示される塩基配列を有し、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号３で示される塩基配列において、１から複数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列を有し、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項７に記載のＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項８に記載のＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項７に記載のＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項１４】
請求項８に記載のＤＮＡ又は請求項１２に記載の組換えＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項１５】
請求項１１に記載の組換えＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項１６】
宿主生物が大腸菌である請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１７】
宿主生物が大腸菌である請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１８】
宿主生物が大腸菌である請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項１乃至６いずれかに記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の形質転換体又はその処理物の存在下、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載の形質転換体又はその処理物の存在下、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の形質転換体又はその処理物の存在下、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２３】
請求項１乃至６いずれかに記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２４】
請求項１３に記載の形質転換体又はその処理物の存在下、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２５】
請求項１４に記載の形質転換体又はその処理物の存在下、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の形質転換体又はその処理物の存在下、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法。
【請求項２７】
請求項１乃至６いずれかに記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、一般式（１）
【化１】
2008129873.tif 000014
（式（１）中、Qは置換されていてもよいフェニル基、ピリジル基、チエニル基又はフリル基を表す。X、Y、Zはそれぞれ独立してQに置換する置換基を表し、水素原子、フルオロ基、クロル基、ブロム基、ニトロ基、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を表す。）で表されるＬ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法。
【請求項２８】
請求項１乃至６いずれかに記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、一般式（２）
【化２】
2008129873.tif 000015
（式（２）中、Qは置換されていてもよいフェニル基、ピリジル基、チエニル基又はフリル基を表す。X、Yはそれぞれ独立してQに置換する置換基を表し、水素原子、フルオロ基、クロル基、ブロム基、ニトロ基、水酸基、アミノ基、メチル基又はメトキシ基を表す。）で表されるＬ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法。
【請求項２９】
請求項１乃至６いずれかに記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、一般式（３）
【化３】
2008129873.tif 000016
（式（３）中、Qはフェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２、４−ジクロロフェニル基、４−ブロモフェニル基、４−ニトロフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、３−ピリジル基、２−チエニル基又は２−フリル基を表す。）で表されるＬ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ、これをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体及び（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法並びに（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、β−フェニルアラニンは、医薬中間体として有用な化合物とされている。β−フェニルアラニンは、１つの不斉炭素をもち、立体異性体を有することから、化学的な純度だけでなく、立体化学的な純度（光学純度）も高いβ−フェニルアラニンが求められている。【０００３】
従来、立体選択的にβ−フェニルアラニンを得るためには、ラセミ体のβ−フェニルアラニンを光学分割することによって目的の立体異性体を単離精製する手法がとられていた。しかしながら、この手法によれば、理論収率は５０％と低く、多工程で製法が煩雑となるため、得られるβ−フェニルアラニンも高価となってしまう。したがって、高収率化及び低価格化を実現するための立体選択的なβ−フェニルアラニンの製造方法の開発が期待される。【０００４】
（Ｒ）−β−フェニルアラニンは、抗がん剤の一種であるパクリタキセル（タキソール）の中間体である。Ｗａｌｋｅｒらは、タキサス属植物の一種であるＴａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａから抽出されるフェニルアラニンアミノムターゼが（Ｓ）−α−フェニルアラニン（Ｌ−フェニルアラニン）を（Ｒ）−β−フェニルアラニンに変換するアミノムターゼであることを明らかにした（非特許文献１）。また、Ｗａｌｋｅｒらは、Ｔａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ由来のフェニルアラニンアミノムターゼがＬ−フェニルアラニンを（Ｒ）−β−フェニルアラニンに変換し、逆反応としてＲ体およびＳ体両方のβ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンに変換することも明らかとしている（非特許文献２）。したがって、これらのタキサス属由来のフェニルアラニンアミノムターゼは、高いＲ体選択性を有するフェニルアラニンアミノムターゼであるといえる。
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc. 1998, Vol. 120, 5333-5334
【非特許文献２】J. Bio. Chem. 2004, Vol. 279, No. 52, 53947-53954
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc. 2006, Vol. 128, 10660-10661
【非特許文献４】Biochemistry 2003, Vol. 42, 12708-12718
【発明の開示】
【０００５】
一方、（Ｓ）−β−フェニルアラニンもまた、医薬品の中間体として、需要が高まっている。しかしながら、Ｓ体選択性を有するフェニルアラニンアミノムターゼは知られていない。したがって、光学純度の高い（Ｓ）−β−フェニルアラニンを得るためには、上述の煩雑な光学分割法に頼らざるをえないのが現状である。
【０００６】
Ｃｌａｒｄｙらは、（Ｓ）−β−フェニルアラニン骨格を含む抗生物質の一種であるａｎｄｒｉｍｉｄを産生する微生物からａｎｄｒｉｍｉｄ生合成遺伝子クラスターを見出し、そのＤＮＡ配列を解読し、各遺伝子産物の推定アミノ酸配列と既知酵素のアミノ酸配列との相同性を解析することにより、ａｎｄｒｉｍｉｄの生合成経路を予測した。そして、遺伝子産物のひとつであるＡｄｍＨがＳｇｃＣ４（チロシンアミノムターゼ）と相同性を有することから、α−フェニルアラニンをβ−フェニルアラニンに変換する活性を有するアミノムターゼであることを推測している（非特許文献３）。しかしながら、ＡｄｍＨ遺伝子が発現して該遺伝子産物が産生されるか否か、また、該遺伝子産物が産生されるとしても、そのＡｄｍＨがフェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するか否か等の検証は何ら行っていない。さらに、ＡｄｍＨがかりにフェニルアラニンアミノムターゼだとしても、ＡｄｍＨの相同タンパク質には高い立体選択性を有するものと低いものとが存在することから、ＡｄｍＨが産業的に有用な高立体選択性という特徴を有するか否かは全く不明である。ＡｄｍＨとアミノ酸レベルで２０％の相同性を示すタキサス属由来のフェニルアラニンアミノムターゼが、β−フェニルアラニン合成反応において高い立体選択性を有する（非特許文献２）のに対し、ＡｄｍＨとアミノ酸レベルで３６％の相同性を示すＳｇｃＣ４は、β−チロシン合成反応において低い立体選択性を有することが知られている（非特許文献４）。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ、これをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを有する形質転換体及び（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法並びに（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法を提供することにある。
【０００８】
本発明によれば、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性又は桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼが提供される。
【０００９】
本発明において、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有する上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼとすることができる。
【００１０】
また、本発明において、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有する上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼとすることができる。
【００１１】
また、本発明によれば、
下記の理化学的性質を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼが提供される。
（１）作用：Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する又は桂皮酸とアンモニアから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する。
（２）至適ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．５
（３）分子量：５７，０００±５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
【００１２】
また、本発明によれば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼが提供される。
【００１３】
また、本発明によれば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼが提供される。
【００１４】
本発明によれば、上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡが提供される。
【００１５】
また、本発明によれば、配列番号３で示される塩基配列を有し、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
【００１６】
また、本発明によれば、配列番号３で示される塩基配列において、１から複数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列を有し、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
【００１７】
また、本発明によれば、配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
【００１８】
また、本発明によれば、上記のＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換えＤＮＡが提供される。
【００１９】
また、本発明によれば、上記のＤＮＡ又は上記の組換えＤＮＡを有する形質転換体が提供される。
【００２０】
また、本発明において、宿主生物が大腸菌である上記の形質転換体とすることができる。
【００２１】
また、本発明によれば、上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法が提供される。
【００２２】
また、本発明によれば、上記の形質転換体又はその処理物の存在下、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法が提供される。
【００２３】
また、本発明によれば、上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法が提供される。
【００２４】
また、本発明によれば、上記の形質転換体又はその処理物の存在下、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法が提供される。
【００２５】
また、本発明によれば、上記に記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、一般式（１）（式（１）中、Qは置換されていてもよいフェニル基、ピリジル基、チエニル基又はフリル基を表す。X、Y、Zはそれぞれ独立してQに置換する置換基を表し、水素原子、フルオロ基、クロル基、ブロム基、ニトロ基、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を表す。）で表されるＬ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法が提供される。
【００２６】
【化１】
2008129873.tif 000002
【００２７】
また、本発明によれば、上記に記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、一般式（２）（式（２）中、Qは置換されていてもよいフェニル基、ピリジル基、チエニル基又はフリル基を表す。X、Yはそれぞれ独立してQに置換する置換基を表し、水素原子、フルオロ基、クロル基、ブロム基、ニトロ基、水酸基、アミノ基、メチル基又はメトキシ基を表す。）で表されるＬ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法が提供される。
【００２８】
【化２】
2008129873.tif 000003
【００２９】
また、本発明によれば、上記に記載のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、一般式（３）（式（３）中、Qはフェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２、４−ジクロロフェニル基、４−ブロモフェニル基、４−ニトロフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、３−ピリジル基、２−チエニル基又は２−フリル基を表す。）で表されるＬ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造することを特徴とする（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法が提供される。
【００３０】
【化３】
2008129873.tif 000004
【００３１】
この発明によれば、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成することができる。また、桂皮酸とアンモニアから（Ｓ）−β−フェニルアラニンも合成することができる。これにより、一段階で、立体選択的に（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成することができる。また、この酵素を用いた（Ｓ）−β−フェニルアラニン合成の理論収率は１００％である。したがって、安価で、効率よく（Ｓ）−β−フェニルアラニンを入手することができる。
【００３２】
この発明によれば、一段階で、立体選択的に（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成することができる。したがって、安価で効率よく（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００３４】
【図１】各ｐＨにおけるＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの相対活性を示す図である。トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）における酵素活性を１００％とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態は、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼである。
このＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性又は／および桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有する。【００３６】
上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有する。この反応式（４）を以下に示す。【００３７】
【化４】
2008129873.tif 000005
【００３８】
また、上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、桂皮酸とアンモニアとから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する酵素活性を有する。この反応式（５）を以下に示す。【００３９】
【化５】
2008129873.tif 000006
【００４０】
また、上記のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、Ｌ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を合成する酵素活性を有する。この反応式（６）〜（８）を以下に示す。【００４１】
【化６】
2008129873.tif 000007
【００４２】
【化７】
2008129873.tif 000008
【００４３】
【化８】
2008129873.tif 000009
【００４４】
Qは置換されていてもよいフェニル基、ピリジル基、チエニル基又はフリル基を表す。X、Y、Zはそれぞれ独立してQに置換する置換基を表す。Ｘ、Ｙ、Ｚ基は、水素原子、フルオロ基、クロル基、ブロム基、ニトロ基、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を表す。【００４５】
具体的には、Ｌ−フェニルアラニン類似体には、Ｌ−モノハロゲノフェニルアラニン、Ｌ−ジハロゲノフェニルアラニン、Ｌ−トリハロゲノフェニルアラニン、Ｌ−モノニトロフェニルアラニン、Ｌ−ジニトロフェニルアラニン、Ｌ−トリニトロフェニルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−トリヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−モノアミノフェニルアラニン、Ｌ−ジアミノフェニルアラニン、Ｌ−トリアミノフェニルアラニン、Ｌ−モノアルキルフェニルアラニン、Ｌ−ジアルキルフェニルアラニン、Ｌ−トリアルキルフェニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシフェニルアラニン、Ｌ−ジアルコキシフェニルアラニン、Ｌ−トリアルコキシフェニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキルフェニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノフェニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノフェニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロフェニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノフェニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノフェニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロフェニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノフェニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロフェニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロフェニルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロフェニルアラニン、Ｌ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−ジハロゲノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノニトロ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−ジニトロ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアミノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキル−２−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアルキル−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアルコキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−ジハロゲノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノニトロ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−ジニトロ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアミノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキル−３−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアルキル−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアルコキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−ジハロゲノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノニトロ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−ジニトロ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアミノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキル−４−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアルキル−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−ジアルコキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−ジハロゲノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノニトロ−２−チエニルアラニン、Ｌ−ジニトロ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−ジアミノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキル−２−チエニルアラニン、Ｌ−ジアルキル−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−ジアルコキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−２−チエニルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−２−チエニルアラニン、Ｌ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−ジハロゲノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノニトロ−３−チエニルアラニン、Ｌ−ジニトロ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−ジアミノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキル−３−チエニルアラニン、Ｌ−ジアルキル−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−ジアルコキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−３−チエニルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−３−チエニルアラニン、Ｌ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノハロゲノ−２−フリルアラニン、Ｌ−ジハロゲノ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノニトロ−２−フリルアラニン、Ｌ−ジニトロ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノ−２−フリルアラニン、Ｌ−ジアミノ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキル−２−フリルアラニン、Ｌ−ジアルキル−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−ジアルコキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−２−フリルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−２−フリルアラニン、Ｌ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノハロゲノ−３−フリルアラニン、Ｌ−ジハロゲノ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノニトロ−３−フリルアラニン、Ｌ−ジニトロ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−ジヒドロキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノ−３−フリルアラニン、Ｌ−ジアミノ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキル−３−フリルアラニン、Ｌ−ジアルキル−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−ジアルコキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノアミノ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアルキルモノニトロ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノアミノモノニトロ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−３−フリルアラニン、Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−３−フリルアラニンなどがある。【００４６】
さらに具体的には、Ｌ−フェニルアラニン類似体には、Ｌ−２−フルオロフェニルアラニン、Ｌ−３−フルオロフェニルアラニン、Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン、Ｌ−２、４−ジフルオロフェニルアラニン、Ｌ−２−クロロフェニルアラニン、Ｌ−３−クロロフェニルアラニン、Ｌ−４−クロロフェニルアラニン、Ｌ−２、４−ジクロロフェニルアラニン、Ｌ−２−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−３−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−２、４−ジブロモフェニルアラニン、Ｌ−２−ニトロフェニルアラニン、Ｌ−３−ニトロフェニルアラニン、Ｌ−４−ニトロフェニルアラニン、Ｌ−２−ヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−３−ヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−４−ヒドロキシフェニルアラニン、Ｌ−２−メチルフェニルアラニン、Ｌ−３−メチルフェニルアラニン、Ｌ−４−メチルフェニルアラニン、Ｌ−２−エチルフェニルアラニン、Ｌ−３−エチルフェニルアラニン、Ｌ−４−エチルフェニルアラニン、Ｌ−２−プロピルフェニルアラニン、Ｌ−３−プロピルフェニルアラニン、Ｌ−４−プロピルフェニルアラニン、Ｌ−２−メトキシフェニルアラニン、Ｌ−３−メトキシフェニルアラニン、Ｌ−４−メトキシフェニルアラニン、Ｌ−２−エトキシフェニルアラニン、Ｌ−３−エトキシフェニルアラニン、Ｌ−４−エトキシフェニルアラニン、Ｌ−２−ピリジルアラニン、Ｌ−３−ピリジルアラニン、Ｌ−４−ピリジルアラニン、Ｌ−２−チエニルアラニン、Ｌ−３−チエニルアラニン、Ｌ−２−フリルアラニン、Ｌ−３−フリルアラニンなどがある。【００４７】
本実施形態のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、以下に示す反応を触媒して、Ｌ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β-フェニルアラニン類似体を合成する。
・ Ｌ−モノハロゲノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジハロゲノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−ジハロゲノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−トリハロゲノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−トリハロゲノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−ジニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−トリニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−トリニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−ジヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−トリヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−トリヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアミノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−ジアミノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−トリアミノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−トリアミノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアルキルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−ジアルキルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−トリアルキルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−トリアルキルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアルコキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−ジアルコキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−トリアルコキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−トリアルコキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノアルキルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノアルキルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノアミノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノアミノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノハロゲノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノアミノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノアミノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノハロゲノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノハロゲノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノハロゲノフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノハロゲノフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノモノニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノヒドロキシモノニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−モノヒドロキシモノニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジハロゲノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジハロゲノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノニトロ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノニトロ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジニトロ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジニトロ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジヒドロキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジヒドロキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアミノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジアミノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキル−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキル−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアルキル−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジアルキル−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアルコキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジアルコキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノアルキル−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノアミノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノハロゲノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノニトロ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノアミノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノアミノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノハロゲノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノニトロ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノニトロ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノハロゲノ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノニトロ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノニトロ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノヒドロキシ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノニトロ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノヒドロキシモノニトロ−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジハロゲノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジハロゲノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノニトロ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノニトロ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジニトロ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジニトロ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジヒドロキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジヒドロキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアミノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジアミノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキル−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキル−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアルキル−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジアルキル−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−ジアルコキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−ジアルコキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノアルキル−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノアルキル−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノアミノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノアミノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノハロゲノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノハロゲノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルコキシモノニトロ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルコキシモノニトロ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノアミノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノアミノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノハロゲノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノハロゲノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアルキルモノニトロ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアルキルモノニトロ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノハロゲノ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノハロゲノ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノアミノモノニトロ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノアミノモノニトロ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノヒドロキシ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノニトロ−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
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・ Ｌ−モノハロゲノモノヒドロキシ−３−フリルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノヒドロキシ−３−フリルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノハロゲノモノニトロ−３−フリルアラニンから（Ｓ）−β−モノハロゲノモノニトロ−３−フリルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−モノヒドロキシモノニトロ−３−フリルアラニンから（Ｓ）−β−モノヒドロキシモノニトロ−３−フリルアラニンを合成する反応。【００４８】
具体的には、本実施形態のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、以下に例示する反応を触媒して、Ｌ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β-フェニルアラニン類似体を合成する。
・ Ｌ−２−フルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−フルオロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−フルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−フルオロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−フルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−フルオロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２、４−ジフルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２、４−ジフルオロフェニルアラニンを合成する反応
・ Ｌ−２−クロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−クロロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−クロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−クロロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−クロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−クロロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２、４−ジクロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２、４−ジクロロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−ブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−ブロモフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−ブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−ブロモフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−ブロモフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２，４−ジブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２，４−ジブロモフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−ニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−ニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−ニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−ニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−ニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−ニトロフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−ヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−ヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−ヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−ヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−ヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−ヒドロキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−メチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−メチルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−メチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−メチルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−メチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−メチルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−エチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−エチルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−エチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−エチルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−エチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−エチルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−プロピルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−プロピルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−プロピルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−プロピルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−プロピルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−プロピルフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−メトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−メトキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−メトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−メトキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−メトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−メトキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−エトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−エトキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−エトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−エトキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−エトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−エトキシフェニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−２−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−３−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−４−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−４−ピリジルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−チエニルアラニンから（Ｓ）−β−２−チエニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−チエニルアラニンから（Ｓ）−β−３−チエニルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−２−フリルアラニンから（Ｓ）−β−２−フリルアラニンを合成する反応。
・ Ｌ−３−フリルアラニンから（Ｓ）−β−３−フリルアラニンを合成する反応。【００４９】
この明細書において、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼとは、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質のことをいう。また、「Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性」とは、Ｓ体選択的にβ−フェニルアラニンを合成できることをいう。また、「Ｓ体選択的」とは、β−フェニルアラニン中に含まれる（Ｓ）−β−フェニルアラニンの光学純度が５０％ｅｅ以上であることをいうが、望ましくは８０％ｅｅ以上であり、さらに望ましくは９０％ｅｅ以上であり、９９％ｅｅ以上であると最も望ましい。【００５０】
本実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、下記の理化学的性質を有する。
（１）作用：Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する又は桂皮酸とアンモニアから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを合成する。【００５１】
（２）至適ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．５
なお、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）における酵素活性を１００％とすると、ｐＨが約８．０〜９．５のとき酵素の相対活性は８０％以上であり、ｐＨが約８．２〜９．２のとき酵素の相対活性は９０％以上である。【００５２】
（３）分子量：５７，０００±５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）【００５３】
本実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。また、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。【００５４】
この明細書において、「複数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜３０個、好ましくは２〜１５個、さらに好ましくは２〜１０個である。【００５５】
また、本実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上、望ましくは８０％以上、さらに望ましくは８５％以上、最も望ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分断片であってもよい。【００５６】
タンパク質の相同性の検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベース、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ並びにＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡの塩基配列に関するデータベース及びＤＮＡの塩基配列を元に予想したアミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍなどを用いて、例えば、インターネット上で行なうことができる。【００５７】
本実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ産生生物から取得することができる。Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ産生生物として、パントエア・アグロメランス  Ｅｈ３３５株（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｅｈ３３５）を例に挙げることができる（非特許文献３）。
また、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡにより宿主細胞を形質転換して、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを発現させ、単離してもよい。この方法によれば、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを簡便かつ効率的に取得することができる。【００５８】
（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態は、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡである。このＤＮＡは、以下の（ａ）〜（ｄ）いずれかのＤＮＡである。
（ａ）第１の実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３で示される塩基配列を有し、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３で示される塩基配列において、１から複数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列を有し、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【００５９】
本実施形態に係るＤＮＡは、第１の実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼとはアミノ酸配列に若干の差異があっても、その酵素活性については大きな違いが認められないようなタンパク質をコードするＤＮＡを含んでもよい。
具体的には、ＤＮＡの多型や変異等によってアミノ酸配列に若干の差異があるが、第１の実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼとほぼ同等の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。【００６０】
Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡとしては前記したものの他に、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。また、配列番号２において塩基番号１〜１６２６、配列番号３において塩基番号２４〜１６４９に示す塩基配列又はそれらの相補配列中の少なくとも２０塩基の連続した配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。上記の塩基配列を有するＤＮＡであれば、どのような生物由来であっても構わない。【００６１】
配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡは、パントエア・アグロメランスＥｈ３３５株（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｅｈ３３５）由来ＡｄｍＨ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＹ１９２１５７）であり、配列番号３において塩基番号２４〜１６４９に示す塩基配列は、宿主細胞である大腸菌での発現効率が向上するように、ＡｄｍＨ遺伝子の塩基配列を発現させる大腸菌に適したコドンに変更したものである。宿主細胞に適したコドンへの変更に際しては、例えば、ＤＮＡ２．０社（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）のソフトウェア：Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒを利用することができる。【００６２】
Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡは、例えば化学的におよび／または遺伝子工学的に合成してもよい。合成に際しては、一般的なＤＮＡ合成の受託会社に委託することができる。また、パントエア・アグロメランスＥｈ３３５株（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｅｈ３３５）菌体から抽出することもできる（非特許文献３）。さらにＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを産生する生物から、通常のＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法の利用により、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを得ることも可能である。【００６３】
また、配列番号２において塩基番号１〜１６２６に示す塩基配列又は配列番号３において塩基番号２４〜１６４９に示す塩基配列を有するＤＮＡに、置換、欠失、挿入又は付加を含む変異を導入することにより、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることも可能である。
ＤＮＡに、置換、欠失、挿入又は付加を含む変異を導入する方法としては、部位特異的変異導入法などを用いることができる。また、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は付加を含む変異を導入する塩基数としては、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内で、かつ、コードされるタンパク質の酵素活性について大きな違いが認められない範囲内であればよい。【００６４】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いＤＮＡ、すなわち５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに望ましくは８０％以上、最も望ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。【００６５】
より具体的には、このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般的に用いる条件を例示できる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行なうことができ、市販のシステムとしては、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅシステム（アマルシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行なうことができる。試験すべきＤＮＡ又はＲＮＡを転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、全容量の１／２０量のキット添付のブロッキング試薬及び５×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬は例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、２％（重量／容量）ＦｉｃｏｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドン）であり、これを１／２０に希釈して使用することができる。ハイブリダイゼーションの温度は４０℃以上８０℃以下、より好ましくは５０℃以上７０℃以下の範囲であり、数時間から一昼夜のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、さらに好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ又はＲＮＡをプローブに用いた標識を利用して識別することができる。【００６６】
２つのアミノ酸配列又は塩基配列における相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列に相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基数）に対する百分率で示される。【００６７】
（第３の実施形態）
本発明の第３の実施形態は、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを持つ組換えＤＮＡである。この組換えＤＮＡは、第２の実施形態に係るＤＮＡをベクターに組み込んでなる。【００６８】
本実施形態の組換えＤＮＡは、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡをベクターに組込むことにより得ることができる。
クローニングする際のベクターとしては、宿主細胞内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主細胞とする場合にはＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１などが例示することができる。また、プラスミドとしては、例えばＥｓｃｈｅｎｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主細胞とする場合には、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）等を例示することができる。【００６９】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。更にバチルス属細菌中で発現させるためにＮｐプロモーター（特公平８−２４５８６号公報）なども用いることができる。【００７０】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
転写・翻訳を効率的に行うため、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性を有するタンパク質のＮ末端又はその一部を欠失したタンパク質と発現ベクターのコードするタンパク質のＮ末端部分を融合させたタンパク質を発現させてもよい。
目的とするタンパク質の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。【００７１】
クローニングの際、前記のようなベクターを、上述したＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクターＤＮＡ断片を得ることができるが、必ずしも該ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば該ＤＮＡ断片の付着末端とベクターＤＮＡ断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により該ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えＤＮＡを作製する。必要に応じて、アニーリングの後、微生物等の宿主に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えＤＮＡを作製することもできる。【００７２】
（第４の実施形態）
本発明の第４の実施形態は、形質転換体である。
この形質転換体は、第２の実施形態に係るＤＮＡ又は第３の実施形態に係る組換えＤＮＡを有する形質転換体である。【００７３】
形質転換体に使用する宿主生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよい。宿主生物の例として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではなく、エシェリヒア属細菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属細菌、シュードモナス属細菌などの細菌類、サッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属などの酵母類、アスペルギルス属などの糸状菌類などが使用できる。【００７４】
宿主生物に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば宿主細胞が大腸菌の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。このようにして得られた形質転換体は、培養されることにより、多量のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを安定に生産することができる。【００７５】
Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを保有する組換えＤＮＡは、形質転換体から取り出すことができ、他の微生物に移入させることも可能である。また、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを保有する組換えＤＮＡを、ＰＣＲを用いてＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素等で処理した後、他のベクターＤＮＡ断片と結合させ、宿主生物に移入することも容易に実施できる。【００７６】
培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で、振とう培養、通気攪拌培養、連続培養又は流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。【００７７】
培養条件は、培地の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを産生できる条件であれば特に制限はない。
例えば、好気条件下でｐＨは６以上８以下、温度は２５℃以上４０℃以下の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養した場合、培養に必要な時間は４８時間以内である。【００７８】
形質転換体が産生したＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは、培養物中の形質転換体を含む培養液をそのまま採取して利用することもできる。また、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼが培養液中に存在する場合は、濾過、 遠心分離などにより、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ含有溶液と形質転換体とを分離することもできる。Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼが形質転換体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過又は遠心分離などの手段により形質転換体を採取して利用することもできる。また、採取した形質転換体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてethylenediaminetetraacetic acid（ＥＤＴＡ）等のキレート剤及び又は界面活性剤を添加してＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを可溶化し、溶液として分離採取することができる。【００７９】
このようにして得られたＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウム若しくは硫酸ナトリウムなどの塩析処理、又は親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール若しくはアセトンなどによる分別沈澱法により沈澱させることができる。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤若しくはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを得ることができる。【００８０】
（第５の実施形態）
本発明の第５の実施形態は、（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法である。第１の実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ、第４の実施形態に係る形質転換体又はその処理物の存在下で、Ｌ−フェニルアラニンから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造する。【００８１】
形質転換体の処理物は、細胞の破壊を目的として、形質転換体を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、自己消化、界面活性剤処理、酵素処理したもの及びこれらの処理により得られるＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼを含む画分の固定化物、形質転換体の固定化物として得ることができる。【００８２】
反応条件は特別の制限は無いが、ｐＨと温度を適切に制御しながら反応することが好ましいが、例えば、ｐＨは６以上１０以下、望ましくは、７以上１０以下とする。また、温度は４℃以上６０℃以下の範囲内とし、反応は、振盪又は攪拌条件下で行うのが好ましい。【００８３】
形質転換体又はその形質転換体処理物の使用量は、Ｌ−フェニルアラニンとの反応が十分に進行すれば特に制限されないが、通常Ｌ−フェニルアラニン１０ｇに対して少なくても１ｕｎｉｔ、好ましくは１０ｕｎｉｔ以上のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性となる量を添加することが望ましい。形質転換体又はその形質転換体処理物の添加方法は反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。【００８４】
Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性は、１μｍｏｌの（Ｓ）−β−フェニルアラニンを１分間に合成できる能力を１ｕｎｉｔと定義する。
Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性は、２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−フェニルアラニンを含む０．１ｍｏｌ／ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に酵素液を加えて２５℃で保温し、（Ｓ）−β−フェニルアラニンの生成量を測定して算出する。【００８５】
反応液中のＬ−フェニルアラニンは、その一部が反応媒体中に溶解していればよく、必ずしも反応液の媒体に完全に溶解している必要はない。Ｌ−フェニルアラニンの添加方法については反応開始時に一括添加しても、反応の進行に伴い分割して又は連続して添加してもよい。【００８６】
反応液の媒体としては、水、水性媒体、有機溶媒又は水若しくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＣＨＥＳ［Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸］緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよい。【００８７】
反応液からの（Ｓ）−β−フェニルアラニンの分離精製法は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。【００８８】
（第６の実施形態）
本発明の第６の実施形態も（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造方法である。第１の実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ、第４の実施形態に係る形質転換体又はその処理物の存在下で、桂皮酸とアンモニアから（Ｓ）−β−フェニルアラニンを製造する。【００８９】
第５の実施形態では、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの基質となる原料としてＬ−フェニルアラニンを用いたが、本実施形態では、Ｌ−フェニルアラニンに代えて桂皮酸とアンモニアを反応させている。本実施形態では、第５の実施形態で述べた内容と異なる点についてのみ記載し、第５の実施形態を適用できる内容については説明を省略する。【００９０】
（Ｓ）−β−フェニルアラニンの製造は、ｐＨは７以上１１以下、望ましくは、８以上１０以下、温度は４℃以上６０℃以下で、振盪又は攪拌条件下で行うのが好ましい。
形質転換体又はその形質転換体処理物の使用量は、桂皮酸とアンモニアとの反応が十分に進行すれば特に制限されないが、通常、桂皮酸１０ｇに対して少なくても１ｕｎｉｔ、好ましくは１０ｕｎｉｔ以上のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性となる量を添加することが望ましい。【００９１】
反応液に添加するアンモニア源としては、気体のアンモニア、アンモニアの水溶液もしくはアルコール溶液、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は水酸化アンモニウムなどが挙げられる。反応液中の桂皮酸又はアンモニアは、その一部が反応媒体中に溶解していればよく、必ずしも反応液の媒体に完全に溶解している必要はない。桂皮酸又はアンモニアの添加方法については反応開始時に一括添加しても、反応の進行に伴い分割して又は連続して添加してもよい。【００９２】
反応液の媒体としては、第５の実施形態で述べたものと同様な媒体を用いることができる。【００９３】
（第７の実施形態）
本発明の第７の実施形態は（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法である。本実施形態の方法によれば、第１の実施形態に係るＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの存在下、Ｌ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体を製造する。また、（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体は、第４の実施形態に係る形質転換体又はその処理物の存在下、Ｌ−フェニルアラニン類似体から製造することもできる。【００９４】
具体的には、本実施形態は以下一般式（１）〜（３）で表される（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造方法である。【００９５】
【化９】
2008129873.tif 000010
【００９６】
式（１）中、Qは置換されていてもよいフェニル基、ピリジル基、チエニル基又はフリル基を表す。X、Y、Zはそれぞれ独立してQに置換する置換基を表し、水素原子、フルオロ基、クロル基、ブロム基、ニトロ基、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を表す。【００９７】
【化１０】
2008129873.tif 000011
【００９８】
式（２）中、Qは置換されていてもよいフェニル基、ピリジル基、チエニル基又はフリル基を表す。X、Yはそれぞれ独立してQに置換する置換基を表し、水素原子、フルオロ基、クロル基、ブロム基、ニトロ基、水酸基、アミノ基、メチル基又はメトキシ基を表す。【００９９】
【化１１】
2008129873.tif 000012
【０１００】
式（３）中、Qはフェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２、４−ジクロロフェニル基、４−ブロモフェニル基、４−ニトロフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、３−ピリジル基、２−チエニル基又は２−フリル基を表す。【０１０１】
具体的には、本実施形態の製造方法として、以下の方法が例示される。
・Ｌ−２−フルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−フルオロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−フルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−フルオロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−フルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−フルオロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２、４−ジフルオロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２、４−ジフルオロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−クロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−クロロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−クロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−クロロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−クロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−クロロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２、４−ジクロロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２、４−ジクロロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−ブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−ブロモフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−ブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−ブロモフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−ブロモフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２、４−ジブロモフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２、４−ジブロモフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−ニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−ニトロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−ニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−ニトロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−ニトロフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−ニトロフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−ヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−ヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−ヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−ヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−ヒドロキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−ヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−メチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−メチルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−メチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−メチルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−メチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−メチルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−エチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−エチルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−エチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−エチルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−エチルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−エチルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−プロピルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−プロピルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−プロピルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−プロピルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−プロピルフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−プロピルフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−メトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−メトキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−メトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−メトキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−メトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−メトキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−エトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−２−エトキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−エトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−３−エトキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−エトキシフェニルアラニンから（Ｓ）−β−４−エトキシフェニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−２−ピリジルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−３−ピリジルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−４−ピリジルアラニンから（Ｓ）−β−４−ピリジルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−チエニルアラニンから（Ｓ）−β−２−チエニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−チエニルアラニンから（Ｓ）−β−３−チエニルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−２−フリルアラニンから（Ｓ）−β−２−フリルアラニンを製造する方法。
・Ｌ−３−フリルアラニンから（Ｓ）−β−３−フリルアラニンを製造する方法。【０１０２】
第５の実施形態では、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの基質となる原料としてＬ−フェニルアラニンを用いたが、本実施形態では、Ｌ−フェニルアラニンに代えてＬ−フェニルアラニン類似体を反応させている。本実施形態では、第５の実施形態で述べた内容と異なる点についてのみ記載し、第５の実施形態を適用できる内容については説明を省略する。【０１０３】
（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の製造は、ｐＨは６以上１０以下、望ましくは、７以上１０以下、温度は４℃以上６０℃以下で、振盪又は攪拌条件下で行うのが好ましい。形質転換体又はその形質転換体処理物の使用量は、Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼがＬ−フェニルアラニン類似体に対して十分に作用すれば特に制限されないが、通常、Ｌ−フェニルアラニン類似体１０ｇに対して少なくても１ｕｎｉｔ、好ましくは１０ｕｎｉｔ以上のＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼ活性となる量を添加することが望ましい。【０１０４】
反応液中のＬ−フェニルアラニン類似体は、その一部が反応媒体中に溶解していればよく、必ずしも反応液の媒体に完全に溶解している必要はない。Ｌ−フェニルアラニン類似体の添加方法については反応開始時に一括添加しても、反応の進行に伴い分割して又は連続して添加してもよい。【０１０５】
反応液の媒体としては、第５の実施形態で述べたものと同様な媒体を用いることができる。
【実施例】
【０１０６】
（分析条件）
（Ｓ）−β−フェニルアラニン、（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体、（Ｒ）−β−フェニルアラニン、（Ｒ）−β−フェニルアラニン類似体、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン類似体及び桂皮酸は高速液体クロマトグラフィーにより定量した。これらの分析条件は次の通りである。【０１０７】
（１）（Ｓ）−β−フェニルアラニン、（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体、（Ｒ）−β−フェニルアラニン及び（Ｒ）−β−フェニルアラニン類似体の分析条件
（１） の分析は主に、β−フェニルアラニン及びβ−フェニルアラニン類似体の光学純度の測定を目的とする。
カラム；ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＷＨ  ４．６×２５０（ダイセル化学工業株式会社）
カラム温度；５０℃
ポンプ流速；１．５ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液；２ｍｍｏｌ／ｌ  硫酸銅
検出；ＵＶ２５４ｎｍ【０１０８】
（２）β−フェニルアラニン、β−フェニルアラニン類似体、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン類似体及び桂皮酸の分析条件
（２） の分析は主に、酵素活性又は反応収率の測定を目的とする。
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＴＭＳ−ＵＧ−５  ４．６×２５０（野村化学株式会社）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液；５ｍｍｏｌ／ｌ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）：メタノール＝８：２（ｖ／ｖ）
検出；ＵＶ２５４ｎｍ【０１０９】
（評価法）
（Ｓ）−β−フェニルアラニン及び（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の光学純度は、上記（１）に示す分析条件下で得られたクロマトグラムのピーク面積値から算出した。
また、（Ｓ）−β−フェニルアラニン及び（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の反応収率は、上記（２）に示す分析条件下で得られたクロマトグラムのピーク面積値から算出した。【０１１０】
（実施例１）
＜Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡの合成＞
配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡをＤＮＡ２．０社に委託して合成した。該合成ＤＮＡは、５'末端及び３'末端付近に、それぞれＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIの制限酵素認識配列を有するようにした。【０１１１】
（実施例２）
＜組換えＤＮＡの作製＞
組換えＤＮＡとして組換えプラスミドを作成した。
実施例１で合成したＤＮＡ及びプラスミドｐＵＣ１８をＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡績社製）を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（Ａｍ）１００μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性でかつ白色コロニーとなった形質転換体を得た。このようにして得られた形質転換体よりプラスミドを抽出した。
通常の塩基配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列が配列番号３に示す塩基配列であることを確認した。
得られたＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼをコードするＤＮＡを持つプラスミドをｐＳＰＡＭと命名した。【０１１２】
（実施例３）
＜形質転換体の作製及び発現＞
ｐＳＰＡＭを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを通常の方法で形質転換し、得られた形質転換体をＭＴ−１１０４６と命名した。
該形質転換体を５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のＡｍ１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にてＯＤ（６６０ｎｍ）が０．５になるまで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド）が１ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、さらに１６時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた菌体を０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。【０１１３】
（実施例４）
＜ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による発現の確認＞
実施例３で作製した形質転換体の懸濁液１．０ｍｌをバイオラピュター（オリンパス社製）を用いて、氷水中で５分間破砕した。得られた形質転換体の処理物を遠心分離し、得た上清液を可溶性画分とした。また、沈殿物に０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１．０ｍｌ加えたものを不溶性画分とした。可溶性画分及び不溶性画分をそれぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン社製）、泳動バッファーにＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  ランニングバッファー（インビトロジェン社製）、分子量マーカーにＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（インビトロジェン社製）を用いた。Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼのバンドは、可溶性画分のレーンで分子量マーカーの分子量５１，０００と６４，０００との間の位置に確認され、分子量約５５，０００であると推定された。したがって、作製した形質転換体が産生するＳ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼは分子量５７，０００±５０００の範囲にあることが示された。一方、このバンドは不溶性画分のレーンでは確認されなかった。【０１１４】
（実施例５）
＜Ｓ体選択性フェニルアラニンアミノムターゼの精製＞
実施例３と同様の方法で得た菌体を２０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器機社製）を用いて０℃で３分３０秒間破砕した。破砕液を遠心分離し、得た上清をＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（メルク社製）処理し、粗酵素液を調製した。粗酵素液を陰イオン交換樹脂（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＸＬ、アマシャム社製）に吸着させ、２０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）へのリニアーグラジエントで溶出させた。活性画分を集め、緩衝液を１ｍｏｌ／ｌ硫酸アンモニウムを含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に交換した後、疎水クロマト樹脂（ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ、アマシャム社製）に吸着させ、１ｍｏｌ／ｌ硫酸アンモニウムを含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）から５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）へのリニアーグラジエントで溶出させた。活性画分を集め、緩衝液を２０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に交換した後、陰イオン交換樹脂（ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ、アマシャム社製）に吸着させ、２０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）から１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）へのリニアーグラジエントで溶出させた。活性画分をゲルろ過樹脂（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）を用いて０．２ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で分画した。活性画分を集め、緩衝液を０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に交換し、精製酵素標品とした。なお、以上の操作は約４℃で実施した。【０１１５】
（実施例６）
＜至適ｐＨ＞
各ｐＨにおける酵素活性を測定した。反応液（１．０ｍｌ）は、２５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−フェニルアラニン、０．１ｍｏｌ／ｌの各種緩衝液および実施例５で調製した精製酵素標品（適当量）を含み、２５℃で３０分間反応させた。結果は図１の通りで、至適ｐＨは８．０〜９．５であった。測定に用いた各種緩衝液を以下に示す。図１は、横軸にｐＨを示し、縦軸に相対活性（％）を示す。相対活性は、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）における酵素活性を１００％とし、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）における酵素活性に対する百分率を算出することによって求めた。
リン酸緩衝液    ：ｐＨ６．０〜８．０
トリス塩酸緩衝液：ｐＨ７．５〜９．０
ＣＨＥＳ緩衝液  ：ｐＨ９．０〜１０．０【０１１６】
（実施例７）
＜Ｌ―フェニルアラニンを基質とした（Ｓ）−β−フェニルアラニンの合成＞
反応液（１．０ｍｌ）は、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−フェニルアラニン、０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び実施例３と同様の方法で調製したＭＴ−１１０４６の上清液（適当量）を含み、３０℃で２４時間反応させた。（Ｓ）−β−フェニルアラニンの反応収率は３６％で、光学純度は１００％ｅｅであった。【０１１７】
（実施例８）
＜桂皮酸とアンモニアを基質とした（Ｓ）−β−フェニルアラニンの合成＞
反応液（１．０ｍｌ）は、５ｍｍｏｌ／ｌ桂皮酸、１０％炭酸アンモニウム（ｐＨ９．２）及び実施例３と同様の方法で調整したＭＴ−１１０４６の上清液（適当量）を含み、３０℃で７２時間反応させた。（Ｓ）−β−フェニルアラニンの桂皮酸に対する反応収率は５％で、光学純度は１００％ｅｅであった。【０１１８】
（実施例９）
＜Ｌ−フェニルアラニン類似体から対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の合成＞
反応液（１．０ｍｌ）は、１０ｍｍｏｌ／ｌの表１に示すＬ−フェニルアラニン類似体（Ｐｅｐｔｅｃｈ社製）、０．１ｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び実施例３と同様の方法で調製したＭＴ−１１０４６の上清液（適当量）を含み、３０℃で２４時間反応させた。対応する（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の反応収率は表１に示す通りで、光学純度は１００％ｅｅであった。（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の反応収率は（分析条件）の（２）に示す分析条件下で、光学純度は（分析条件）の（１）に示す分析条件下で、得られたクロマトグラムのピーク面積値から算出した。（Ｓ）−β−フェニルアラニン類似体の標品にはＰｅｐｔｅｃｈ社製の試薬を用いた。【０１１９】
【表１】
2008129873.tif 000013
【０１２０】
以上のように、本発明によれば、（Ｓ）−β−フェニルアラニンを１段階で、立体選択的に製造することができる。したがって、（Ｓ）−β−フェニルアラニンを安価で効率良く製造することが可能となる。【０１２１】
以上、本発明の構成について説明したが、本発明は、これに限られず様々な態様を含む。
【図１】
2008129873.tif 000017
【配列表】
2008129873000001.app
【国際調査報告】
2008129873.tif 000018
2008129873.tif 000019
2008129873.tif 000020
2008129873.tif 000021