(57)【要約】【課題】本発明の目的は、従来知られているアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上を有する医薬及び機能性食品に比べて優れた医薬及び機能性食品を提供することにある。【解決手段】ホスファチジルイノシトールがアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上の作用を有することを見出し、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する医薬及び機能性食品について本発明を完成するに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルイノシトールを含有するアディポネクチン上昇剤。
【請求項２】
ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項１に記載のアディポネクチン上昇剤。
【請求項３】
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項１に記載のアディポネクチン上昇剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
【請求項４】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、アディポネクチン上昇作用を有する該機能性食品。
【請求項５】
ホスファチジルイノシトールを含有する抗肥満剤。
【請求項６】
ホスファチジルイノシトールを含有する脂肪肝改善剤。
【請求項７】
ホスファチジルイノシトールを含有するインスリン抵抗性改善剤。
【請求項８】
ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項５〜７のいずれかに記載の薬剤。
【請求項９】
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項５〜７のいずれかに記載の薬剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
【請求項１０】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、抗肥満作用を有する該機能性食品。
【請求項１１】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、脂肪肝改善作用を有する該機能性食品。
【請求項１２】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、インスリン抵抗性改善作用を有する該機能性食品。
【請求項１３】
ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項１０〜１２のいずれかに記載の機能性食品。
【請求項１４】
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項１０〜１２のいずれかに記載の機能性食品；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
【請求項１５】
請求項１、又は５〜７のいずれかに記載の薬剤製造のためのホスファチジルイノシトールの使用。
【請求項１６】
哺乳動物においてアディポネクチンを上昇させる方法であって、ホスファチジルイノシトールの有効量を該哺乳動物に摂取させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するアディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤の少なくとも1種以上の薬剤；ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上の作用を有する機能性食品；アディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上の作用を有する食品；アディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤の少なくとも1種以上の薬剤を調製するためのホスファチジルイノシトールの使用；及び、ホスファチジルイノシトール摂取することを特徴とするアディポネクチン上昇方法、抗肥満方法、脂肪肝改善方法、肝機能改善方法、又はインスリン抵抗性改善方法の少なくとも1種以上の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧等のいわゆる「生活習慣病」が増加している。その中でも肥満、特に内臓脂肪の蓄積が特徴である、「かくれ肥満」や「肥満予備軍」の増加は深刻である。
一般に肥満を解消するためには、運動療法、食事療法（摂取カロリー制限療法）などが考えられるが様々な理由で有効な効果が得られない場合が多い。
また、内臓脂肪蓄積抑制効果がある食品、例えば、褐色脂肪細胞中のミトコンドリアを活性化させる食品の摂取が提案されている（特許文献１）が、ヒトにおいて褐色脂肪細胞の量は少ないため、効果は期待されにくい。
最近、脂肪細胞から特異的に分泌されるアディポサイトカインとしてアディポネクチンが発見され、この血中濃度と内臓脂肪との関係が注目されている。アディポネクチンは、脂肪組織に特異的に発現し、しかも高発現している遺伝子に由来するタンパク質として見出された。その血液中での濃度は脂肪細胞特異的に分泌されるにもかかわらず、肥満、すなわち脂肪を蓄積すると低下し、減量すると増加する（非特許文献１）。そして、アディポネクチンを投与したマウスの体重減少が見られたという報告（非特許文献２）があり、肥満症の病態などに大きく関与すると考えられている（非特許文献３）。
また、アディポネクチンはレプチンと共に脂肪組織由来のインスリン感受性因子の候補と考えられている。脂肪萎縮性糖尿病のインスリン抵抗性・脂質代謝異常は生理的なレプチン投与によっても部分的に改善したが、アディポネクチンとレプチンの同時投与によってほぼ完全に改善した。そして、アディポネクチンを補充し、血中濃度を増加させることにより、インスリン抵抗性の原因となる組織内中性脂肪含量を低下できる（非特許文献４）。
さらに、アディポネクチンが動脈硬化巣に対して直接的に抗動脈硬化作用を示すことが報告されている。その作用機序としては、スカベンジャー受容体の発現制御を介する脂肪蓄積の低減とＴＮＦαなどの炎症に関わる分子の発現制御の作用と考えられている（非特許文献５）。
このように、アディポネクチンは、高血圧、肥満、高脂血症、糖尿病などいわゆる生活習慣病に密接にかかわり、特に、アディポネクチンの遺伝的、後天的欠乏は日本人の生活習慣病の主要な原因である。従って、アディポネクチンの血中量を上昇させることは生活習慣病の予防・治療に有効であると考えられる。
アディポネクチンの血中量を上昇させるには、脂質等の摂取を制限すること、又は発酵茶抽出物の摂取をすることが有効であるとの報告がある（特許文献２）。しかし、エネルギー源である脂質の摂取量を制限することは、生命活動の維持において好ましいものではない。
一方、ホスファチジルイノシトールはさまざまな植物、特に大豆レシチンに含まれ、細胞の情報伝達と深く関与していることが報告されている。近年、ホスファチジルイノシトールの摂取が血中のトリアシルグリセロール（ＴＧ）濃度を減少させ、ＨＤＬ−Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール）濃度を上昇させることが報告されているが（非特許文献６）、他の機能については報告されていない。
【特許文献１】特開平１０−２３１４９５号公報
【特許文献２】特開２００４−３１５３７９号公報
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Res.Commun.、1999年、257巻、p.79-83
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2001年、98巻、p.2005
【非特許文献３】Diabetes、2002年、51巻、p.2325
【非特許文献４】Nature Med.(7)941-946 (2001)
【非特許文献５】J. Biol. Chem. (278)2461-2468(2003)
【非特許文献６】Jim W. Burgessら、Journal of Lipid Research (46) 350-355(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、従来知られているアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上を有する医薬及び機能性食品に比べて優れた医薬及び機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は上記課題を解決するために、血中アディポネクチン濃度を上昇させる方法を開発するにあたり、エネルギー源の摂取量を過度に制限する必要が無い方法の開発を念頭に鋭意検討した。その結果、ホスファチジルイノシトールがアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上の作用を有することを見出した。本知見をもとに、エネルギー源の摂取量を過度に制限する必要が無い、血中アディポネクチン濃度上昇方法として、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する医薬及び機能性食品について本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に関する。
〔Ａ１〕ホスファチジルイノシトールを含有するアディポネクチン上昇剤。
〔Ａ２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤。
〔Ａ２−２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤。
〔Ａ３〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ３−２〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ３−３〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜３）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程。
〔Ａ３−４〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜３）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程。
〔Ａ３−５〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ３−６〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ３−７〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）ｎ−ヘキサン及びエタノールの混合溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）エタノールでホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ３−８〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１〕に記載のアディポネクチン上昇剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程；
２）ｎ−ヘキサン及びエタノールの混合溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）エタノールでホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ４〕ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、アディポネクチン上昇作用を有する該機能性食品。
〔Ａ５〕ホスファチジルイノシトールを含有する抗肥満剤。
〔Ａ６〕ホスファチジルイノシトールを含有する脂肪肝改善剤。
〔Ａ７〕ホスファチジルイノシトールを含有するインスリン抵抗性改善剤。
〔Ａ８〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤。
〔Ａ９〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ９−２〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ９−３〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜３）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程。
〔Ａ９−４〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜３）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程。
〔Ａ９−５〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ９−６〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ１０〕ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、抗肥満作用を有する該機能性食品。
〔Ａ１１〕ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、脂肪肝改善作用を有する該機能性食品。
〔Ａ１２〕ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、インスリン抵抗性改善作用を有する該機能性食品。
〔Ａ１３〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１０〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の機能性食品。
〔Ａ１４〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１０〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の機能性食品；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１４−２〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１０〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の機能性食品；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１４−３〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜３）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１０〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の機能性食品；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程。
〔Ａ１４−４〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜３）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１０〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の機能性食品；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程。
〔Ａ１４−５〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１０〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の機能性食品；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ１４−６〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記１）〜４）の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである前記〔Ａ１０〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の機能性食品；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ１５〕前記〔Ａ１〕、又は〔Ａ５〕〜〔Ａ７〕のいずれかに記載の薬剤製造のためのホスファチジルイノシトールの使用。
〔Ａ１６〕哺乳動物においてアディポネクチンを上昇させる方法であって、ホスファチジルイノシトールの有効量を該哺乳動物に摂取させる工程を含む方法。
〔Ａ１６−２〕哺乳動物において肥満を改善する方法であって、ホスファチジルイノシトールの有効量を該哺乳動物に摂取させる工程を含む方法。
〔Ａ１６−３〕哺乳動物において脂肪肝を改善する方法であって、ホスファチジルイノシトールの有効量を該哺乳動物に摂取させる工程を含む方法。
〔Ａ１６−４〕哺乳動物においてインスリン抵抗性を改善する方法であって、ホスファチジルイノシトールの有効量を該哺乳動物に摂取させる工程を含む方法。
〔Ｂ１〕ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するアディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤の少なくとも1種以上の薬剤。
〔Ｂ２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトールである前記〔Ｂ１〕記載の薬剤。
〔Ｂ３〕ホスファチジルイノシトールが、大豆由来リン脂質にホスフォリパーゼＢ活性を有するキャンディダ属由来の酵素を作用させることによって得られたものである前記〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕に記載の薬剤。
〔Ｂ４〕ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上の作用を有する機能性食品。
〔Ｂ５〕ホスファチジルイノシトールが全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトールである前記〔Ｂ４〕記載の機能性食品。
〔Ｂ６〕ホスファチジルイノシトールが、大豆由来リン脂質にホスフォリパーゼＢ活性を有するカンディダ属由来の酵素を作用させることによって得られたものである前記〔Ｂ４〕又は〔Ｂ５〕に記載の機能性食品。
〔Ｂ７〕アディポネクチン上昇作用を有する食品あるいはアディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤の少なくとも1種以上の薬剤を調製するためのホスファチジルイノシトールの使用。
〔Ｂ８〕ホスファチジルイノシトールを摂取することを特徴とするアディポネクチン上昇方法、肥満改善方法、脂肪肝改善方法、肝機能改善方法、又はインスリン抵抗性改善方法の少なくとも1種以上の方法。
〔Ｂ９〕ホスファチジルイノシトールが、大豆由来リン脂質にホスフォリパーゼＢ活性を有するキャンディダ属由来の酵素を作用させることによって得られたものである前記〔Ｂ８〕に記載の方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するアディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤の少なくとも1種以上の薬剤、或いはホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも1種以上の作用を有する機能性食品、さらにはアディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤の少なくとも1種以上の薬剤を調製するためのホスファチジルイノシトールの使用、そしてホスファチジルイノシトールを摂取することを特徴とするアディポネクチン上昇方法、抗肥満方法、脂肪肝改善方法、肝機能改善方法、又はインスリン抵抗性改善方法の少なくとも1種以上の方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明でいうアディポネクチン上昇剤としては、血中のアディポネクチン濃度を上昇させる作用を有する薬剤が挙げられ、投与前後の血中のアディポネクチン濃度を測定することによりその薬剤効果を知ることができる。本発明でいう抗肥満剤としては、体重を低下させる薬剤が挙げられ、投与前後の体重を測定することによりその薬剤効果を知ることができる。本発明でいう脂肪肝改善剤としては、肝臓脂質量を低下させる薬剤が挙げられ、投与前後の肝臓脂質量を測定することによりその薬剤効果を知ることができる。本発明でいう肝機能改善剤としては、肝機能を改善させる薬剤が挙げられ、投与前後の血清肝機能マーカー（ＧＯＴ、ＧＰＴ等）を測定することによりその薬剤効果を知ることができる。本発明でいうインスリン抵抗性改善剤としては、血糖値は変化させず血中インスリン濃度を低下させる薬剤が挙げられ、投与前後の血糖値及びインスリン濃度を測定することによりその薬剤効果を知ることができる。本発明のこれらの剤は、エネルギー源の摂取量を過度に制限することなく前記作用をもたらすことができる点で特徴を有する。【０００７】
また、アディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤が投与される対象としては、高血圧症、肥満症、高脂血症、糖尿病などいわゆる生活習慣病に関連する疾患の患者、または予防を期待する者である。【０００８】
本発明の薬剤の作用効果は、例えば、総コレステロール濃度低下により血中脂質代謝の改善を知ることができ、体重増加量、摂食効率及び肝臓重量低下により抗肥満効果を、肝臓のトリグリセリド濃度又は総コレステロール濃度低下により脂肪肝改善効果を、ＡＳＴ、ＡＬＴ低下により肝機能改善を、インスリン濃度減少によりインスリン抵抗性改善を知ることができる。【０００９】
本発明に用いるホスファチジルイノシトールは、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が高いものであれば特に限定されない。組成物全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率としては、下限としては５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましく、８５モル％以上であることが最も好ましく、９０モル％以上であることがこの上なく好ましい。
本発明に用いるホスファチジルイノシトールは医薬又は食品として服用又は食用可能なホスファチジルイノシトールであればその由来および製法は何ら限定されるものでは無いが、大豆リン脂質から熱エタノール法（特開２０００−３００１８６号公報）により製造したもの、またはホスホリパーゼＢ（以下、ＰＬＢと略すことがある）活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素を用いて大豆リン脂質から製造したものを用いることが望ましい。本発明において、「ホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない」又は「ホスファチジルイノシトールを実質的に分解しない」とは、同義で用いられることがあり、ホスファチジルコリンに対する活性とホスファチジルイノシトールに対する活性との比（ホスファチジルイノシトールに対する活性／ホスファチジルコリンに対する活性）が、上限としては１５％以下であることが例示され、１０％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、５％以下であることがさらに好ましく、３％以下であることが特に好ましく、１％以下であることが最も好ましく、下限としては０．０１%以上であることが例示され、０．１％以上であることが好ましい。
ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しないあるいはホスファチジルイノシトールを実質的に分解しない酵素としては、具体的には以下の（１）〜（４）のようなものがあげられる。
（１）ＰＬＢ活性を有するキャンディダ属由来の酵素であって、下記の物理化学的性質を有する酵素。
１）作用：リン脂質を２モル比の遊離脂肪酸と等モル比のグリセリルホスフォリルコリンとに加水分解する作用
２）分子量：５３，０００±３，０００（ＳＤＳ電気泳動法による）
３）等電点：ｐＨ４．２１±０．２
４）至適ｐＨ：ｐＨ５．５から６．５付近
５）ｐＨ安定性：ｐＨ５から９付近（３７℃、９０分間処理）
６）安定性：５５℃（ｐＨ５で１０分間処理）
７）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに対する活性比がホスファチジルコリンの場合の１０％以下
（２）下記工程により得られる酵素画分Ａ又は酵素画分Ｂを含有するホスフォリパーゼＢ。
１）キャンディダ・シリンドラッセ（ルゴーサ）を培養する工程
２）キャンディダ・シリンドラッセ（ルゴーサ）の培養液を濃縮する工程
３）有機溶媒により酵素を沈殿させる工程
４）３）の工程により得られる粗酵素液を疎水クロマトグラフィーで精製する工程
５）４）の工程で得られる酵素をイオン交換クロマトグラフィーで酵素画分Ａ又は酵素画分Ｂに分離精製する工程
（３）配列表配列番号１のアミノ酸配列を有するホスフォリパーゼＢ。
（４）配列表配列番号２のアミノ酸配列を有するホスフォリパーゼＢ。
上記以外にも、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素としては、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せず、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解する酵素が挙げられる。当該酵素はキャンディダ属由来の酵素であることが好ましい。【００１０】
ここで、リン脂質は細胞膜の構成成分であり重要な生理機能を担っており、そのうちでも特に、ホスファチジルイノシトールは細胞膜中の細胞内外のシグナル伝達に深く関っている。医薬・食品用途でのリン脂質の給源は主に大豆、鶏卵卵黄、魚卵等である。リン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）等複数の分子種の混合物として得られる。これらのリン脂質混合物から高純度ホスファチジルイノシトールを分離するには有機溶媒分画、シリカゲル、アルミナ等の担体でのクロマトによる分離などが知られている。比較的含量の多いＰＣやＰＥはこれらの方法でも効率良く取得できるが、含量の少ないホスファチジルイノシトールなどを取得するには極めて効率が悪い。また、前記分離方法は、クロロホルムのようなハロゲン系の有機溶媒を大量に使用する必要があり製品の用途が限定され、医薬・食品用途には向かない。ＰＣ、ＰＥ、ＰＳ、ＰＡ、ＰＩ等を含有するリン脂質から医薬・食品用に用いることのできるホスファチジルイノシトールを効率よく製造するためには、リン脂質中、ホスファチジルイノシトール以外のＰＣ、ＰＥ、ＰＡ、ＰＳ等を選択的に加水分解しホスファチジルイノシトールを残存させればよい。すなわち、以下に示すホスファチジルイノシトールの製造方法は、高純度のホスファチジルイノシトールを効率的に取得するための好ましい製造方法として例示される。【００１１】
本発明に使用されるホスファチジルイノシトールは具体的には以下の工程で製造することができる。すなわち、大豆由来のリン脂質混合物に、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素、例えば、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめることにより、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上、さらに好ましくは８５％以上とせしめることができ、本発明に使用されるホスファチジルイノシトールを取得することができる。【００１２】
より具体的には以下の工程にて製造すればよい。大豆レシチンにＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない前記酵素を作用させる工程、有機溶媒（例えばヘキサン及びエタノールの混合溶媒）を用いてホスファチジルイノシトールを抽出する工程（例えば抽出時のｐＨはｐＨ４．５〜８．５が好ましい）、抽出溶媒をｐＨ４〜６の緩衝液で洗浄する、または抽出溶媒を含水エタノールと混合した後、ｐＨを４．０〜５．０に調整する工程、ホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒（例えばアセトン又はエタノール等）で沈殿回収する工程、及び溶媒を乾燥除去する工程を含む方法が挙げられる。【００１３】
また、ホスファチジルイノシトールの製造中での酸化を防止する目的でビタミンＥ（トコフェロール）等の酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程において添加しても良い。酸化防止剤としては、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸エステル、ＢＨＡ、ＢＨＴ、没食子酸プロピル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム（結晶、無水）、又はビタミンＥ（トコフェロール）が例示され、ビタミンＥ（トコフェロール）が好ましい。ビタミンＥとしてはトコフェロールであれば特に限定されないが、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、又はこれらの混合物が挙げられ、α−トコフェロールが好ましい。また、γ−トコフェロールが好ましい場合もある。添加量はホスファチジルエタノールの酸化が防止できる量であれば良く、好ましくは０．０００１％〜１０％、より好ましくは０．００１％〜１％である。【００１４】
ＰＬＢ活性を有する酵素であって実質的にホスファチジルイノシトールに作用しない酵素をリン脂質混合物に作用させることにより、リン脂質混合物のうちホスファチジルイノシトールのみを選択的に残存させ、効率良くホスファチジルイノシトールを取得することができる。リン脂質混合物は予めホモジナイザー等を使用して水に分散させてもいいし強制的な攪拌によって均一な水溶液を調製することもできる。リン脂質濃度は、水に分散したリン脂質混合物に前記酵素が作用しうる濃度であれば良いが、１〜２０％の範囲、好ましくは５〜１０％、特に好ましくは６〜８％である。【００１５】
反応のｐＨは前記酵素がリン脂質混合物に作用しうるｐＨであれば良いが、ｐＨ３〜１０、前記酵素の活性が最大になるｐＨ５．５〜６．５付近に調整することが好ましい。特に好ましくはｐＨ６付近である。反応のｐＨを一定に保つために緩衝液を使用することも好ましく、ｐＨ５．５〜６．５の範囲で緩衝能を有する緩衝液であればその種類は特に限定されないが、食品用途の観点からは酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又はリン酸緩衝液の使用が特に好ましい。【００１６】
また、反応中にアルカリ溶液を適宜添加して反応液のｐＨを好ましい範囲にコントロールすることもできる。酵素反応を活性化、又は酵素の安定化のために塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム等のカルシウム塩やマグネシウム塩を添加しても良い。【００１７】
酵素反応時の撹拌速度は酵素反応が良好に進む速度であれば何ら問題はない。
水に対する溶解性が低い基質を乳化させる目的で界面活性剤を添加することもできる。【００１８】
本発明において使用される、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素の使用濃度は、リン脂質１ｋｇあたり１０００〜１００００００００単位の範囲で使用することができるが２０００〜５００００００単位の範囲が好ましい。使用するＰＬＢの形態は水溶性の形で添加してもよく、セライト又はイオン交換樹脂等の不溶性担体に固定化された形態でもよい。【００１９】
酵素反応の温度は前記酵素が失活しない範囲で使用することができるが、上限としては６０℃以下であることが好ましく、４５℃以下であることがより好ましく、また下限としては１０℃以上であることが好ましく、３０℃以上であることがより好ましい。【００２０】
反応時間は上記の酵素反応条件によって異なり、通常１〜１５０時間であるが、基質の残存量を定性的に把握して反応を止めればよい。反応終了後、熱処理、ｐＨ処理などにより前記酵素を失活させても何ら問題は無い。加水分解反応の状態を確認するにはシリカゲル薄層クロマト（ＴＬＣ）法が最も簡便である。ＴＬＣを用い、ヨウ素発色して基質の残存量を定性的に確認する場合、ホスファチジルイノシトール以外のリン脂質を示すスポットがＴＬＣ上でほぼ確認できなくなった時点で反応を止めるのが好ましい。反応後の生成物中には遊離の脂肪酸、グリセリルホスフォリルコリン（ＧＰＣ）、グリセリルホスフォリルエタノールアミン（ＧＰＥ）、グリセロリン酸（ＧＰ）と反応せずに残ったホスファチジルイノシトールおよび糖脂質等が混合して存在している。【００２１】
該混合物からホスファチジルイノシトールを簡便に回収する方法として、ホスファチジルイノシトールが溶解し、水と分離し得る有機溶剤を含有する溶剤を添加し分液して得た有機層からホスファチジルイノシトールを取得する方法が良い。分液操作の工程では酵素と接触せしめた混合物をそのまま用いても良いし、あらかじめ混合物を濃縮又は乾燥などの操作を行ってから分液操作の工程を行っても良い。【００２２】
ホスファチジルイノシトールを抽出する溶媒としてはクロロホルム、エーテル、又はヘキサン等の有機溶媒を使用することができるが、食品用途の観点からは水と分離し得る有機溶剤を含有する溶剤が好ましい。具体的には、ｎ−ヘキサンと親水性溶媒の混合物が好ましい例として挙げられる。また当該親水性溶媒としてはエタノールのような低級アルコールである事が特に好ましい。低級アルコールとしてはメタノール、エタノール、１−プロパノール、又は２−プロパノールが例示され、エタノールが好ましい。【００２３】
親水性溶媒の量は、水と分離しうる有機溶剤１００容量部に対して下限としては通常１０容量部以上、好ましくは２０容量部以上、更に好ましくは３０容量部以上、上限としては特に限定されないが、通常は４００容量部以下、好ましくは３００容量部以下、更に好ましくは２００容量部以下、特に好ましくは１００容量部以下が例示される。【００２４】
また、抽出工程後の分液操作においては遠心分離等の機械的な分離操作の他に自然放置により水層と有機層を分離させることも可能である。自然放置による分離の場合には、水層とホスファチジルイノシトールを含む有機溶媒層の分離を良好にする目的で抽出前に反応液のｐＨを変化させることもできる。このためのｐＨとしては、好ましくはｐＨ６．０〜１１、更に好ましくはｐＨは６．５〜８．０付近である。【００２５】
遊離脂肪酸とホスファチジルイノシトールは有機溶媒に可溶でありＧＰＣ、ＧＰＥ、ＧＰなどはヘキサン等の有機溶媒に不溶であり水に可溶である。
抽出操作およびその後の静置の温度は有機溶媒層と水層の分離が良好となる温度であれば良いが２０℃以上、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃で行えば有機溶媒層と水層の分離が良好となる。【００２６】
ホスファチジルイノシトールの抽出操作を行った後、ｐＨ５．０以下の適当な緩衝液とエタノールの混合液と有機溶媒を混合し、混合液のｐＨを５．０以下にする（ｐＨの低下が不十分のときは酢酸又はリン酸などの適当な酸を用いてｐＨを５以下にする）ことが遊離の脂肪酸を効率的に除去する点で好ましい。また、有機溶媒層を減圧濃縮して、溶媒を留去した後に、上記と同じ方法でｐＨを５以下としても良い。【００２７】
有機溶媒層に回収されたホスファチジルイノシトールと遊離脂肪酸は減圧濃縮等の操作により溶媒を留去する。ホスファチジルイノシトールは水溶性アルキルカルボニル溶剤又は水混和性アルキルカルボニル溶剤、または低級アルコール溶剤に不溶性であり、遊離脂肪酸はこれらの溶剤に可溶性であるので、これらの溶剤を用いればホスファチジルイノシトールは沈殿物として回収することができる。水溶性アルキルカルボニル溶剤又は水混和性アルキルカルボニル溶剤としては、アセトン又はメチルエチルケトン等、低級アルコール溶剤としてはエタノール、メタノール又はプロパノール等が例示されるが、アセトンまたはエタノールが好ましい。遊離の脂肪酸の除去と、未反応の原料もしくは不純物の除去（酵素反応由来のホスファチジルイノシトール以外の不純物、例えば糖脂質等）を同時に行うためにはエタノールが最も好ましい。【００２８】
エタノールによる、原料もしくは不純物の除去操作時の温度は、これらの除去が良好に行われる温度であれば問題無いが、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃が良い。濃縮液または濃縮物に５０℃のエタノールを添加し、よく撹拌した後、そのまま又は温度を室温まで低下させた後に沈殿物を回収すれば良い。ホスファチジルイノシトールの回収は遠心分離法でも濾過法の固液分離操作いずれの方法をとってもよい。【００２９】
また、酵素反応終了後の混合物から有機溶媒でホスファチジルイノシトールを抽出した後、水層と有機層を分離し、更に有機溶媒を濃縮させた後、ホスファチジルイノシトールが吸着し、ホスファチジルイノシトール以外の糖脂質等の不純物は吸着しないシリカゲルを用いてホスファチジルイノシトール以外の糖脂質等の不純物を除去しても良い。また、濃縮液をアセトン洗浄した後、エタノール洗浄し、このエタノール洗浄液を濃縮乾燥させることにより、原料もしくは不純物を分離取得することも可能である。【００３０】
リン脂質混合物の由来は特に限定されない。鶏卵卵黄由来のリン脂質、イクラ等の魚卵由来リン脂質、又は大豆由来のリン脂質等を使用することができるが、原料リン脂質の安定供給の面で鶏卵卵黄由来のリン脂質又は大豆由来のリン脂質が好ましく、大豆由来のリン脂質が特に好ましい。本発明において使用される、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素はＰＬＢ活性の他に強いリパーゼ活性を有することが好ましいが、リパーゼ活性を有することは大豆リン脂質からホスファチジルイノシトールやグロセリルホスフォリルコリンを製造する上では全く問題はない。大豆リン脂質はトリグリセリドとの混合物でも供給されており、該混合物を原料とした場合に、トリグリセリドとリン脂質を同時に加水分解することができる点で、リパーゼ活性とＰＬＢ活性を併せ持つことは有意である。なお、ＰＬＢ活性は高いが、リパーゼ活性が低い、あるいは有さない場合には、別途リパーゼを添加することでトリグリセリドとリン脂質を同時に分解することができる。【００３１】
本発明の上記方法により、高純度のホスファチジルイノシトールが提供される。ホスファチジルイノシトールの含有率は高純度であれば特に限定されないが、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が、下限としては５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましく、８５モル％以上であることが最も好ましく、９０モル％以上であることがこの上なく好ましく、高純度のホスファチジルイノシトールは機能性リン脂質として有用である。ホスファチジルイノシトールは分子中に水酸基を豊富に含むイノシトールを有するため、ＰＣ又はＰＥ等の他のリン脂質と比較して水への分散又は溶解が良好であったり、他の脂質成分の溶解性等が極端に異なりリン脂質としての応用範囲が広げられるという利点が考えられる。ホスファチジルイノシトール濃度の測定法としては、通常、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ法）又は高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）が挙げられるが、ＨＰＬＣ法が好ましい例として挙げられる。ＨＰＬＣ法としては、後述する参考例８に記載の基準油脂分析試験法（日本油化学会制定、基準油脂分析試験法2003年版）が挙げられる。【００３２】
ホスファチジルイノシトールの医薬及び食品中の含有量は、アディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも１種以上の作用が得られる量であれば何ら限定されるものではないが、ホスファチジルイノシトールの1日摂取量の下限としては、１ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ以上がより好ましく、５０ｍｇ以上がさらに好ましい。また、ホスファチジルイノシトールの1日摂取量の上限としては、５００００ｍｇ以下が好ましく、１００００ｍｇ以下がより好ましく、１０００ｍｇ以下がさらに好ましい。【００３３】
また、本発明に用いるホスファチジルイノシトールは、全リン脂質中の含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールであることが好ましく、さらに好ましくは、８０モル％以上であることが好ましい。ホスファチジルイノシトールの含有率は、後述する参考例７に記載の基準油脂分析試験法（日本油化学会制定、1996年）により測定することができる。【００３４】
摂取には経口、非経口いずれも含まれ、非経口には、注射、点滴、経鼻、皮膚または頭皮への塗布などによるものがある。経口としては、例えば、ホスファチジルイノシトールを含む食品及び／又はホスファチジルイノシトールを含む製剤により摂取すればよい。単独の食品／薬剤からの摂取でもよく、同時或いは時間差をおいて複数の食品／薬剤から摂取してもよい。これらはヒトを含む哺乳動物に摂取させることができる。【００３５】
該成分を摂取することを特徴とするアディポネクチン上昇方法、抗肥満方法、脂肪肝改善方法、肝機能改善方法、又はインスリン抵抗性改善方法も本発明の範囲内である。
本発明のアディポネクチン上昇方法としては、血中のアディポネクチン濃度を上昇させる方法が好ましく、例えば、本発明の薬剤／機能性食品の摂取前後の比較において、摂取後の値が摂取前の値に比して有意に上昇する方法が挙げられる。【００３６】
また、本発明のホスファチジルイノシトールの使用は、本発明のアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも１種以上の作用を有する食品、アディポネクチン上昇剤、抗肥満剤、脂肪肝改善剤、肝機能改善剤、又はインスリン抵抗性改善剤の少なくとも１種以上の薬剤を調製するための使用であれば特に限定されない。【００３７】
本発明のホスファチジルイノシトールを含有する食品としては、これらを含有するものであれば何ら限定されるものでは無く、例えばホスファチジルイノシトール含有サプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、ホスファチジルイノシトール含有飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、ホスファチジルイノシトール含有菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、ホスファチジルイノシトール含有油、ホスファチジルイノシトール含有油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、ホスファチジルイノシトール含有ケチャップ、ホスファチジルイノシトール含有ソース、ホスファチジルイノシトール含有流動食、ホスファチジルイノシトール含有乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、ホスファチジルイノシトール含有パン類、ホスファチジルイノシトール含有麺類（うどん、そば、ラーメン、パスタ、やきそば、きしめん、そーめん、ひやむぎ、ビーフン等）、ホスファチジルイノシトール含有スープ類（味噌汁、コーンスープ、コンソメスープ等）、ホスファチジルイノシトール含有ふりかけ等が挙げられる。【００３８】
本発明に用いられるホスファチジルイノシトールを含有する食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン、酸化チタニウム等）、食物繊維、各種糖類（セルロース、デキストリン、キチン等）、各種多価不飽和脂肪酸（アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸等）、各種共役脂肪酸類（共役リノール酸、共役リノレン酸、共役アラキドン酸、共役ＤＨＡ、共役ＥＰＡ、共役ＤＰＡ等）、各種リン脂質（レシチン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルＤＨＡ等）、各種糖脂質類（セレブロシド等）、各種カロチノイド類（β-カロチン、リコピン、アスタキサンチン、β−クリプトキサンチン、カプサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン等）、各種フラボノイド類（ケルセチン、ルテオリン、イソフラボン等）、各種アミノ酸類（グリシン、セリン、アラニン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、プロリン、メチオニン、システイン等）、その他の各種栄養素（還元型コエンザイムＱ１０、カルニチン、セサミン、α−リポ酸、イノシトール、Ｄ−カイロイノシトール、ピニトール、タウリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、クルクミン、γ−オリザノール、グルタチオン、γ−アミノ酪酸、シネフリン、ピロロキノリンキノン、カテキン、カプサイシン等）、各種分散剤、各種乳化剤等の安定化剤、各種甘味料（ソルビトール、ショ糖等）、各種呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、蜂蜜、蜜ロウ、プロポリス、アガリクス、高麗人参、バイオペリン等を配合することができる。また、ペパーミント、ベルガモット、カモンミール、ラベンダーなどのハーブ類を配合してもよい。また、テアニン、デヒドロエピアンドステロン、メラトニンなどの素材を配合してもよい。
なお、本発明でいう機能性食品とは、保健機能食品のことであり、健康食品のうち、国が安全性や有効性などを考慮して設定した規格基準などを満たした食品である。保健機能や栄養機能を表示することを認められ、食品の目的や機能等の違いにより、「特定保健用食品」と「栄養機能食品」に分けられる。【００３９】
本発明のホスファチジルイノシトールを含有する医薬としては、ホスファチジルイノシトールを含有するものであれば何ら限定されない。該医薬の剤型としては、散在、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、ホスファチジルイノシトールは水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いてもよい。更に、ホスファチジルイノシトールの吸収性を高めるために、賦型剤（アラビアガム、デキストリン、カゼイン等）の存在化又は非存在化、平均粒子系を１ミクロン程度まで微粉砕して用いることも可能である。【００４０】
製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、マルトース、レシチン、アラビアガム、デキストリン、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料などをあげることができる。尚、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。【００４１】
注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ポーラス投与のいずれであってもよい。
【実施例】
【００４２】
本発明を製剤例、食品製造例、化粧料製造例、及び試験例に基づいて説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
［参考例１］ホスファチジルイノシトールの製造に用いるホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）の製造方法
３０リットル容積のジャーファメンターに、３％脱脂綿実粉、０．３％食塩、０．２％リン酸２カリウム、０．２％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、消泡剤０．３％から成る滅菌した培地２０リットルを入れ、同一培地で前培養（２８℃、４日間）したキャンディダ・シリンドラッセＡＴＣＣ１４８３０株の培養液１００ｍｌを無菌的に植菌した。植菌した培地に、１分間２０リットルの無菌空気を通気し、１分間３００回転で攪拌しながら２８℃で培養を行った。５０時間後、ＰＬＢ活性は最大値（０．２Ｕ／ｍｌ）を示した。得られた培養液を５０００回転、１０分間遠心分離を行い、１６リットルの上清を得た。この上清を限外濾過法により濃縮を行った。得られた濃縮液３リットルに９リットルの冷アセトンを添加し生じた沈殿物について、５０００回転、１０分間遠心分離を行って沈殿物を回収し、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと略す）（ｐＨ７．５）２リットルに溶解した。不溶物を遠心分離により除去し、予めカラムに充填したオクチルセファロース（ベッド容積；３００ｍｌ）に通しＰＬＢを吸着させた。次いで、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した。カラムに吸着されたＰＬＢは２％アデカトールＳＯ１２０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出された（疎水クロマトによる精製）。次いで、溶出液（1リットル）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（ベッド容積；２００ｍｌ）に通してＰＬＢを吸着させ、前記の緩衝液でカラムを洗浄後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配をかけてＰＬＢを溶出した。塩化ナトリウムが約０．１Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ａ、塩化ナトリウムが約０．２５Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ｂを得た（イオン交換クロマトによる分離精製）。
酵素画分Ａ及び酵素画分ＢのＮ末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサーにより特定したところ、酵素画分Ａのアミノ酸配列は配列番号１に示す配列であることが、また、酵素画分Ｂのアミノ酸配列は配列番号２に示す配列であることがわかった。さらに、GENETEX WIN 5.2（ソフトウエア株式会社製）による相同性解析により、酵素画分Ｂの酵素画分Ａに対する相同性を解析したところ、８８．５％であることがわかった。【００４３】
［参考例２］ＰＬＢ活性の測定法
ＰＬＢ活性は、レシチンから生成されるＧＰＣを酵素法により測定した。すなわち、１Ｍ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、ＭＥＳ−ＮａＯＨと略す）（ｐＨ６）０．０５ｍｌ、３％トリトンＸ１００に溶解した１０ｍＭ卵黄ホスファチジルコリン０．０５ｍｌ、１Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．２％ＴＯＤＢ０．０５ｍｌ、０．２％  ４−アミノアンチピリン０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌモノグリセリドリパーゼ０．１ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌグリセロリン酸オキシダーゼ０．１ｍｌ、６Ｕ／ｍｌ  ＧＰＣホスフォジエステラーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０５ｍｌからなる反応液０．５ｍｌを３７℃で２〜３分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し同一緩衝液で希釈したＰＬＢ溶液（０．０３〜０．１５Ｕ／ｍｌ）２５μｌを添加して反応を始め、正確に１０分後に０．５％ＳＤＳ１ｍｌを加えて反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
なお、ＰＬＢ活性１単位は、１分間に１μＭｏｌのＧＰＣを遊離する活性とした。【００４４】
［参考例３］リパーゼ（ＬＰ）活性の測定法
ＬＰ活性は、ジグリセリドを基質にして生成されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼでグリセリンに変換後、酵素法により測定した。すなわち１Ｍ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、３％トリトンＸ１００に溶解した１０ｍＭ  １，２ジグリセリド０．０５ｍｌ、０．０５Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．０５Ｍ塩化マグネシウム０．０２５ｍｌ、０．０５ＭＡＴＰ０．０５ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌモノグリセリドリパーゼ０．０５ｍｌ、５Ｕ／ｍｌグリセロキナーゼ０．０５ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌグリセロリン酸オキシダーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０２５ｍｌ、０．３％ＴＯＯＳ０．０２５ｍｌ、０．３％４−アミノアンチピリン０．０２５ｍｌから成る反応液０．５ｍｌに、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで希釈した酵素液（０．０３〜０．１５Ｕ／ｍｌ）２５μｌを添加し、反応を３７℃で１０分間行った後、０．５％ＳＤＳで反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、ＬＰ活性１単位は、１分間に１μＭｏｌのグリセリンを遊離する活性とした。【００４５】
［参考例４］ＰＬＢ酵素画分Ａのゲル濾過クロマトによる精製
参考例１で得たＰＬＢ酵素画分Ａを遠心型の限外濾過装置にかけ濃縮を行った。濃縮した液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で予め平衡化したゲル濾過クロマト（スーパーデックス７５）にかけ1分間あたり０．５ｍｌの流速で分離を行い活性画分を得た。
各分画において、参考例２及び３の方法によりＰＬＢ活性及びＬＰ活性をそれぞれ求め、さらに２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白濃度を測定した。各分画におけるＰＬＢ活性、ＬＰ活性、及び蛋白濃度の結果を図１に示した。
その結果、２８０ｎｍで測定した蛋白濃度（図中、Ａ２８０ｎｍで示す）とＬＰ活性及びＰＬＢ活性は、一致した溶出パターンを示し、ＬＰ活性とＰＬＢ活性を有する蛋白は同一酵素蛋白であることがわかった。【００４６】
［参考例５］ＰＬＢの諸性質
５−１（反応の至適ｐＨ）
参考例２に示した反応液組成のうち、緩衝液として酢酸緩衝液（以下、Ａｃｅｔａｔｅと略す）、ホスファチジルイノシトールＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨと略す）、又はＭＥＳ−ＮａＯＨを用いて各ｐＨにおけるＰＬＢ酵素画分ＡのＰＬＢ酵素活性を測定し、ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６．０を使用したときの活性に対する各緩衝液での相対活性を求めた。その結果を図２に示した。
図２に示したように、ＭＥＳ−ＮａＯＨについてはｐＨ６付近で最大の酵素活性を示し、またＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ及びＡｃｅｔａｔｅについてもｐＨ６付近で最大の酵素活性を示すことが予想された。【００４７】
５−２（ｐＨ安定性）
Ａｃｅｔａｔｅ、ＭＥＳ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨと略す）の１０ｍＭの各種緩衝液に、５Ｕ／ｍｌになるようにＰＬＢ酵素画分Ａを溶解して３７℃に９０分間静置した後、参考例２の方法に基づきＰＬＢ活性を測定し、Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ５を使用したときの活性に対する各種ｐＨでの相対残存活性を求めた。その結果を図３に示した。
図３に示したように、ｐＨ５からｐＨ８の広い範囲で安定であることがわかった。【００４８】
５−３（熱安定性）
５Ｕ／ｍｌになるように１０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）に酵素画分Ａを溶解し、参考例２の方法により０〜７０℃の温度範囲で１０分間加温した後ＰＬＢ活性を測定した。その結果を図４に示した。冷蔵保存した酵素画分ＡのＰＬＢ活性を１００％とした時の相対残存活性は、５５℃までの処理で９０％以上であり、熱に対して安定な酵素であることがわかった。【００４９】
５−４（基質特異性）
参考例２に記載のＰＬＢ活性測定法により、参考例１のイオン交換クロマトで得られた２種類のＰＬＢ（酵素画分Ａ及び酵素画分Ｂ）の、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対する各種リン脂質についての相対活性を測定した。その結果を表１に示した。
その結果、酵素画分Ａ及び酵素画分ＢともにＰＣに対するホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の相対活性は他のリン脂質に比べて特に低く、ＰＬＢ酵素画分Ａ及び酵素画分Ｂは、リン脂質の中でもＰＩに対する活性が低いという基質特異性があることがわかった。また、表１の結果より、いずれの画分もＰＬＢ活性を有することからＰＬＢとしては両画分の混合物を用いることもできることがわかる。【００５０】
【表１】
2008093826.tif 000002
【００５１】
５−５（分子量）
参考例１に記載した方法によって得られた精製酵素画分ＡはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で単一のバンドが得られた。分子量既知の蛋白をマーカーにして得られた分子量は５３キロダルトンであった。【００５２】
５−６（等電点）
参考例１に記載した方法によって得られた精製酵素画分Ａについて、キャリアアンフォライトを用いたｐＨ勾配を作製して行う等電点電気泳動法により酵素画分Ａについての等電点を測定し、さらに２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白濃度を測定した。酵素画分Ａの等電点と蛋白濃度、ＰＬ活性及びＰＬＢ活性との関係を図５に示した。その結果、２８０ｎｍの吸光度で測定した蛋白濃度が最大値を示すｐＨとＬＰ活性及びＰＬＢ活性の最高値を示すｐＨは完全に一致し、そのｐＨ値（等電点）は４．２１であった。図５からわかるようにＰＬＢ活性、ＬＰ活性と蛋白濃度（図５中のＡ２８０ｎｍで示すピーク）は全く同じピークを示したことから精製酵素画分Ａは、ホスフォリパーゼＢ(ＰＬＢ)であり、またリパーゼ(ＬＰ)であることが明らかとなった。【００５３】
［参考例６］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の定量法
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）０．１ｍｌ、１０ｍＭ  ＮＡＤ  ０．０５ｍｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム０．０５ｍｌ、２％トリトンＸ１００  ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌ  ホスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣ  ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌイノシトールデヒドロゲナーゼ０．０５ｍｌ、５％ニトロテトラゾリウムブルー０．０５ｍｌ、精製水０．１５ｍｌから構成される発色液０．５ｍｌに、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含有する被検体（１〜３ｍｇ／ｍｌ）を２％トリトンＸ１００に溶解してできたＰＩ溶液０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間反応を行い、０．５％ＳＤＳ  ０．５ｍｌで反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度のイノシトール水溶液をキャリブレーターに用いてＰＩ量を定量した。【００５４】
［参考例７］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の製造方法
４０グラムの大豆由来リン脂質を４００ｍｌの１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）に攪拌し懸濁させた後１４００ＵのＰＬＢ（参考例１で得た酵素画分Ａ）を添加して４５℃で反応を開始した。２０時間後に反応を止めエタノール２００ｍｌ、ヘキサン４００ｍｌを加え、５０℃、１時間攪拌した。ヘキサン層と水層とを遠心分離により分離して有機溶媒層を回収した。回収した有機溶媒を減圧下で濃縮を行った後、濃縮物にアセトン１５０ｍｌを加え、生じた沈殿物を集め乾燥させ、８．２グラムのＰＩを高濃度に含有する粉末を得た。得られたリン脂質の純度を基準油脂分析試験法（日本油化学会制定、1996年）により測定した結果、全リン脂質中８６．８モル％であった。
［参考例８］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の製造方法
１）４０グラムの大豆由来リン脂質を４００ｍｌの１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）に攪拌し懸濁させた後１４００ＵのＰＬＢ（参考例１で得た酵素画分Ａ）を添加して４５℃で反応を開始した。反応終了後、固形物が生成し、液の流動性が悪いので、ＮａＯＨを添加して、ｐＨを７．５に調整する。
２）２０時間後に反応を止めエタノール２００ｍｌ、ヘキサン４００ｍｌを加え、５０℃、１時間攪拌した。ヘキサン層と水層とを分離して有機溶媒層を回収した。
３）この有機層に１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）３００ｍｌとエタノール３００ｍｌの混合液を添加し、ｐＨを酢酸を用いてｐＨ５．０に調整し、５０℃で、１時間撹拌させ、１時間静置し、ヘキサン層と水層を分離した。
４）回収した有機溶媒を減圧下で濃縮を行った後、濃縮物にエタノール４００ｍｌを加え、５０℃で１時間撹拌させた後、沈殿物をろ過回収し、更に４００ｍｌのエタノールを添加して、同様の操作を行い、生じた沈殿物を集め乾燥させ、ホスファチジルイノシトールを高濃度に含有する粉末６．２グラムを得た。得られたリン脂質の純度を基準油脂分析試験法（日本油化学会制定、基準油脂分析試験法2003年版）により測定した結果、全リン脂質中８８．９モル％であった。【００５５】
［製剤例１］
＜錠剤＞
ホスファチジルイノシトール        １２０ｇ
結晶セルロース                    ３３０ｇ
カルメロース−カルシウム            １５ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース        １０ｇ
精製水                              ６０ｍｌ
上記の組成となるようにこれらを通常の方法にて配合、乾燥した後、１０ｇのステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠を行い、１錠あたりホスファチジルイノシトールを２０ｍｇ含有する１００ｍｇの錠剤を得ることができる。【００５６】
［製剤例２］
＜ソフトカプセル＞
ホスファチジルイノシトール２００ｇをオリーブオイル２００ｇに添加して、約６０℃で溶解、均一に撹拌した後に冷却し、ホスファチジルイノシトール含有素材を得る。ゼラチン７０％、グリセリン３０％を混和、膨潤させ、溶解ゼラチンシートを作成する。このゼラチンシートに内溶液としてホスファチジルイノシトール含有素材を１カプセルあたり３００ｍｇの内容量になるように充填し、乾燥させ、１カプセルあたりホスファチジルイノシトールを１００ｍｇ含有するソフトカプセルを得ることができる。【００５７】
［食品製造例１］
＜飲料＞
ホスファチジルイノシトール２５００ｇを６０℃に加温したグリセリン脂肪酸エステル１０ｇ及びグリセリン３０ｇに溶解させる。混合液に水を加えて１００ｍｌとし、乳化機（加圧ホモジナイザー）を用いて乳化処理して乳化組成物を得る。この乳化組成物１ｇに水を加えて１００ｍｌとし、撹拌してホスファチジルイノシトール（２５０ｍｇ／１００ｍｌ）含有飲料を得ることができる。【００５８】
［食品製造例２］
＜パン＞
ホスファチジルイノシトール１ｇ、砂糖１５ｇ、食塩２ｇ、脂肪粉乳５ｇを湯７０ｇに溶かし、鶏卵２個を添加してよく混ぜる。これを小麦粉１３０ｇとドライイースト２ｇを混合した混合物に加え、手でこねた後、バター約３０ｇを加えて更にこね、３０個のロールパン生地を作る。ついで、発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で１５分間焼き、ロールパンを得ることができる。【００５９】
［食品製造例３］
＜うどん＞
小麦粉４００ｇに対して、水２００ｇにホスファチジルイノシトールを２ｇ及び食塩２０ｇを添加して、よくこねて寝かす。この後、生地を延伸し、幅約６ｍｍで切断してうどんを製造することができる。【００６０】
［試験例１］食事におけるリン脂質がＺｕｃｋｅｒラットの体重、摂食量、摂食効率、肝臓重量に及ぼす影響
肥満・糖尿病モデルラットであるＺｕｃｋｅｒラット（6週齢、日本エスエルシー株式会社より購入）に、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有食を4週間摂取させ（ＰＩ摂取群）、病態発症に及ぼす影響を検討した。対照としてＰＩを含まないものをトリグリセリド（ＴＧ）含有食として摂取させた（ＴＧ摂取群）。各群の４週間摂食量は表３に示されるが群間で差は見られなかった。各群の摂食量はＰＩ群が599±5ｇ、ＴＧ群が600±6ｇであった。ＰＩ含有食とＴＧ含有食の組成を表２に示した。なお、ＰＩとして参考例７で製造したものを用い、ＴＧとしては大豆油を用いた。これら２群を４週間飼育し、９時間の絶食後、エーテル麻酔化で腹部大動脈採血により屠殺し、肝臓を摘出し、血液から血清を得た。これらの肝臓及び血清を以下の試験に用いた。生育状態を表３に示す。  その結果、４週間の飼育において、初体重、終体重、摂食量は群間で差は見られなかったが、体重増加量、摂食効率及び肝臓重量はＴＧ摂取群に比較して、ＰＩ摂取群において有意に低下が認められ、ホスファチジルイノシトール抗肥満効果が示唆された。
なお、本試験以下の各試験において、参考例８の方法に準じて製造したＰＩについても同様にその効果を確認することができる。【００６１】
【表２】
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【００６２】
【表３】
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【００６３】
［試験例２］肝臓脂質濃度に及ぼす影響
肝臓脂質濃度は、Ｆｏｌｃｋらの方法（J. Biol. Chem., 226, 497-509 (1957)）により肝臓脂質を抽出・濃縮し、肝臓のトリグリセリド濃度は、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ法（Clin. Chim. Acta, 22, 393-397 (1968)）で定量した。肝臓総コレステロール濃度は、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬社製）を用いてコレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法により測定した。その結果、表４に示す通り、肝臓のトリグリセリド濃度、総コレステロール濃度はＰＩ摂取群においてＴＧ摂取群に比較して有意に低下しており、ＰＩの脂肪肝改善効果が示された。【００６４】
【表４】
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【００６５】
［試験例３］肝機能マーカーに及ぼす影響
肝機能障害マーカーとしてはグルタミン酸オキザロ酢酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ（ＧＯＴ））及びグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ（ＧＰＴ））はトランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（ＰＯＰ・ＴＯＯＳ法、和光純薬社製）を用いて測定した。
その結果、表５に示す通りＡＳＴ、ＡＬＴ共にＰＩ摂取群においてＴＧ摂取群に比較して有意に低下し、肝機能が改善していることが示唆された。【００６６】
【表５】
2008093826.tif 000006
【００６７】
［試験例４］血清パラメーターに及ぼす影響
血糖値はグルコースＣＩＩ−テストワコー（ＧＯＤ・ＤＡＯＳ法、和光純薬社製）を用いて測定した。
血清インスリン濃度はレビス・ラットインスリンキット（シバヤギ社製）、アディポネクチンはマウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（大塚製薬社製）を用いて測定した。
その結果、表６に示す通り、ＴＧ摂取群に比較して、ＰＩ摂取群の血中グルコース濃度は変化せず、インスリン濃度が減少傾向となり、インスリン抵抗性が改善された。さらに、ＴＧ摂取群に比較して、ＰＩ摂取群のアディポネクチン濃度は有意に上昇した。【００６８】
【表６】
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【００６９】
［試験例５］肝臓脂質代謝関連酵素活性の検討
肝臓の各細胞画分の調整は、以下の通り行った。肝臓約２ｇを氷冷下で６倍溶の０．２５Ｍのシュークロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）でホモジナイズ後、７００×ｇで１０分間遠心分離した上清を、さらに１０，０００×ｇで１０分間超遠心分離することにより、ミトコンドリア画分を沈殿させた。その上清を１２５，０００×ｇで６０分間遠心分離し、上清の細胞質画分と沈殿したミクロソーム画分を得た。各画分の蛋白質量はＬｏｗｒｙ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５−２７５，１９５１）により測定した。脂肪酸合成系にＮＡＤＰＨを供給するグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）の活性はＫｅｌｌｙらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１７，５４３−５４９，１９８４）に従い、細胞質画分を用いて測定を行った。脂肪酸β酸化系の律速酵素であるカルニチンパルミトイル転移酵素（ＣＰＴ）活性は、Ｍａｒｋｗｅｌｌらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８，３４３３−３４４０，１９７３）に従い、ミトコンドリア画分を用いて行った。
その結果、表７に示す通り、脂肪酸合成系の酵素であるＧ６ＰＤＨ活性はＰＩ摂取群においてＴＧ摂取群と比較して有意に低下することが認められた。また、脂肪酸β酸化系の律速酵素であるＣＰＴ活性は、ＰＩ摂取群において、ＴＧ摂取群に比較して有意に上昇することが判明した。これらの結果により、ＰＩ摂取により脂質代謝改善効果または、抗肥満効果が示唆された。【００７０】
【表７】
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【００７１】
［試験例６］
公知文献（Biochemical and Biophysical Research Communications 366(2008) 219-225）に記載のアディポネクチン産生量を評価する試験方法を参考に、ホスファチジルイノシトール以外の他のリン脂質に比して、本発明が有するアディポネクチン産生上昇作用の優位な効果を確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のアディポネクチン上昇作用、抗肥満作用、脂肪肝改善作用、肝機能改善作用、又はインスリン抵抗性改善作用の少なくとも１種以上の作用を有する医薬及び／又は機能性食品は、医薬及び／又は食品の分野で好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】参考例４に基づく本発明のＰＬＢのゲル濾過クロマトによるクロマトパターンを示す。
【図２】参考例５に基づく本発明のＰＬＢの最適ｐＨを示す。
【図３】参考例５に基づく本発明のＰＬＢのｐＨ安定性の結果を示す。
【図４】参考例５に基づく本発明のＰＬＢの熱安定性の結果を示す。
【図５】参考例５に基づく本発明のＰＬＢの等電点電気泳動の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月2日(2009.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルイノシトールを含有するアディポネクチン上昇剤。
【請求項２】
ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項１に記載のアディポネクチン上昇剤。
【請求項３】
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項１に記載のアディポネクチン上昇剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
【請求項４】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、アディポネクチン上昇作用を有する該機能性食品。
【請求項５】
ホスファチジルイノシトールを含有する抗肥満剤。
【請求項６】
ホスファチジルイノシトールを含有する脂肪肝改善剤。
【請求項７】
ホスファチジルイノシトールを含有するインスリン抵抗性改善剤。
【請求項８】
ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項５〜７のいずれかに記載の薬剤。
【請求項９】
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項５〜７のいずれかに記載の薬剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
【請求項１０】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、抗肥満作用を有する該機能性食品。
【請求項１１】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、脂肪肝改善作用を有する該機能性食品。
【請求項１２】
ホスファチジルイノシトールを含有する機能性食品であって、インスリン抵抗性改善作用を有する該機能性食品。
【請求項１３】
ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項１０〜１２のいずれかに記載の機能性食品。
【請求項１４】
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項１０〜１２のいずれかに記載の機能性食品；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
【請求項１５】
請求項１、又は５〜７のいずれかに記載の薬剤製造のためのホスファチジルイノシトールの使用。
【請求項１６】
少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造された有効量のホスファチジルイノシトールを含有する糖尿病予備群又は糖尿病併発患者におけるインスリン抵抗性改善剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程。
【国際調査報告】
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