【手続補正書】
【提出日】平成16年8月26日(2004.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の機能性を有する細胞に進化させる方法であって、
a)細胞のコンポジションを入手し、ここで、前記コンポジションの少なくとも１つの各細胞が
a1)１０〜１０００個の範囲の異種の発現可能なヌクレオチド配列、ここで、前記配列の少なくとも１つが細胞内の人工染色体に組み込まれている、及び／又は
a2)以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]
（ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは個々にスペーサーを表し、
PRは、最初の細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表す）
の少なくとも２つの発現カセット、
を含んで成る、
b)少なくとも１つのスクリーニングの機能性を決定し、
c)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に関して当該コンポジションの細胞をスクリーニングし、
d)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択し、
e)選択した細胞の発現カセットの発現可能な配列を互いに、そして／あるいはそれらと別の細胞のコンポジションに由来する発現可能な配列とを組み合わせ、そして
f)少なくとも１つの細胞が所望の機能性を獲得するまで、必要に応じて段階b)〜e)を繰り返す、
段階を含んで成る、方法。
【請求項２】
段階c)が、既定のスクリーニング機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択する前に、少なくとも２つの異なるスクリーニング基準に関してスクリーニングすること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階a)が、更に修飾されたコンポジションを入手する前の組み合わせの１つの段階を含んで成る、請求項１又は2に記載の方法。
【請求項４】
スクリーニング基準が、培地を基にした基準、例えば異常な培地の基質の使用、毒素を含んで成る培地上での細胞の増殖、阻害剤を含んで成る培地上での細胞の増殖、生存の基準で選択される細胞への到達、より優れた増殖、形態の逸脱、粘着性、スペクトル特性、酵素活性（の調節）、である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
スクリーニング基準が、少なくとも１つの物理的基準、例えば温度、モル浸透圧濃度、光、及び電気、生存の基準で選択される細胞への到達、より優れた増殖、形態の逸脱、粘着性、スペクトル特性、酵素活性（の調節）、である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が、少なくとも２つの異なる種から派生する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記の少なくとも１つの細胞が、少なくとも１０個の種に由来する発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１又は複数のスクリーニング基準の強度が各繰り返しにつき増大し、そして/あるいは、１又は複数のスクリーニング基準の型が各繰り返しにつき変化する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
発現可能な配列の組み合わせが、細胞内の染色体の組み合わせである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
発現可能な配列の組み合わせが、少なくとも２つの異なる細胞から発現可能な配列を除去し、個々の発現可能な配列をin vitroで組み合わせ、そして少なくとも２つの組み合わされた発現可能な配列を少なくとも２つの細胞内に導入すること、によって実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
所望の機能性が、非天然の二次代謝物を産生する細胞の能力である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
コンポジションの少なくとも１つの細胞が、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも１つのコンカテマーを含んで成り、各コンカテマーが５’→３’方向に以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、rs1とrs2は共に機能的制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、当該方法において機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が異なる発現状態に由来する）のオリゴヌクレオチドを含んで成る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
全てのrs1-rs2配列が同一の制限酵素によって認識される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、パン酵母, クルイベロマイセス・マリキシャヌス(Kluyveromyces marxianus), K.ラクチス(K. lactis), カンジダ・ウチリス(Candida utilis), ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma), サッカロマイセス・ボウラジイ(Saccharomyces boulardii), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・パラフィニカ(Candida paraffinica), シュワニオマイセス・カステリイ(Schwanniomyces castellii), ピキア・スチピチス(Pichia stipitis), カンジダ・シェハタエ(Candida shehatae), ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis), リポマイセス・リポフェル(Lipomyces lipofer), クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcos curvatus), カンジダ種(Candida spp)(例えば、C.パルミオレオフィリア(C. palmioleophila)),  ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii), カンジダ属(Candida), ロドトルラ種(Rhodotorula spp), サッカロマイセス種(Saccharomycopsis spp)., アウレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans), カンジダ・ブルンプチイ(Candida brumptii), カンジダ・ハイドロカーボフマリカ(Candida hydrocarbofumarica), トルロプシス属(Torulopsis), カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis), サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae),  ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra), カンジダ・フラベリ(Candida flaveri), エレモテシウム・アシュビイ(Eremothecium ashbyii), ピキア種(Pichia spp.), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), クルイベロマイセス属(Kluyveromyces), ハンセヌラ属(Hansenula), クロエケラ属(Kloeckera), ピキア属(Pichia), パチソレン種(Pachysolen spp.), 又はトルロプシス・ボンビコラ(Torulopsis bombicola)を含んで成る群から選択される酵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の別の観点において、細胞は、所望の機能性を有する細胞に進化させる方法であって、
a)細胞のコンポジションを入手し、ここで、前記コンポジションの各細胞が、以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]
（ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、最初の細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表す）
の少なくとも２つの発現カセットを含んで成る、そして
b)少なくとも１つのスクリーニングの機能性を決定し、
c)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に関して細胞の当該コンポジションをスクリーニングし、
d)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択し、
e)選択した細胞の発現カセットの発現可能な配列と、別の細胞のコンポジションに由来する発現可能な配列とを組み合わせ、そして
f)少なくとも１つの細胞が所望の機能性を獲得するまで、必要に応じて段階b)〜e)を任意に繰り返す、
段階を含んで成る、方法、に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
言い換えると、本発明は、所望の機能性を有する細胞に進化させる方法であって、
a)細胞のコンポジションを入手し、ここで、前記コンポジションの少なくとも１つの細胞が
a1)少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列、ここで、前記配列の少なくとも１つが細胞内の人工染色体に組み込まれている、及び／又は
a2)以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]
（ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、最初の細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表す）
の少なくとも２つの発現カセット、及び／又は
a3)少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列、ここで、前記配列は当該細胞にとって異種である、
を含んで成る、
b)少なくとも１つのスクリーニングの機能性を決定し、
c)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に関して細胞の当該コンポジションをスクリーニングし、
d)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択し、
e)選択した細胞の発現カセットの発現可能な配列と、別の細胞のコンポジションに由来する発現可能な配列とを組み合わせ、但し、発現可能な配列の組み合わせは、細胞がa3)だけに記載のようなものである場合、完全長の遺伝子の変化、及び／又は発現カセットの変化、及び／又は染色体の変化となる、
f)少なくとも１つの細胞が所望の機能性を獲得するまで、必要に応じて段階b)〜e)を任意に繰り返す、
段階を含んで成る、方法に関する。