【手続補正書】
【提出日】平成17年2月7日(2005.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１〜１５２４６、
（Ｂ）（Ａ）に相補なヌクレオチド配列、又は
（Ｃ）少なくとも約５ヌクレオチド長である、（Ａ）又は（Ｂ）のクリプトウイルス特異的フラグメント、
を含む単離核酸。
【請求項２】
前記（Ｃ）のクリプトウイルス特異的フラグメントが、
（i）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８、相補配列、又は縮重コード配列、
（ii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５、相補配列、又は縮重コード配列、
（iii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、相補配列、又は縮重コード配列、
（iv）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間にさらに挿入された２つのグアニン残基を結合した（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、相補配列、又は縮重コード配列、
（v）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１、相補配列、又は縮重コード配列、
（vi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、相補配列、又は縮重コード配列、
（vii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、相補配列、又は縮重コード配列、
（viii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、相補配列、又は縮重コード配列、
（ix）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、相補配列、又は縮重コード配列、
（x）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４２７２〜６５１５、相補配列、又は縮重コード配列、
（xi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、相補配列、又は縮重コード配列、
（xii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、相補配列、又は縮重コード配列、並びに
（xiii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８、相補配列、又は縮重コード配列、
から成る群から選択される核酸セグメントを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記クリプトウイルス特異的フラグメントを含み、前記フラグメントが約７ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記フラグメントが約７ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記フラグメントが約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチド長である、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸がｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸、及びキャリアを含む、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸を含む、核酸構築物。
【請求項１０】
ワクチン製造における請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項１１】
ワクチン製造における請求項９に記載の核酸構築物の使用。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸構築物を含むクローニングベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の発現ベクター又は請求項１３に記載のクローニングベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８、又は縮重配列、
（Ｂ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５、又は縮重配列、
（Ｃ）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間にさらに挿入された２つのグアニン残基を結合した（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、又は縮重コード配列、
（Ｄ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１、又は縮重配列、
（Ｅ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｆ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｇ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、又は縮重配列、
（Ｈ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｉ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、又は縮重配列、
（Ｊ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、又は縮重配列、あるいは
（Ｋ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８、又は縮重配列、
を含む核酸セグメントによってコードされる単離クリプトウイルスタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質が（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、又は（Ｊ）を含む核酸セグメントによってコードされるクリプトウイルスエンベロープタンパク質である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１６に記載のタンパク質、及びキャリアを含む、組成物。
【請求項１９】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８、又は縮重配列、
（Ｂ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５、又は縮重配列、
（Ｃ）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間のヌクレオチド配列中にさらに挿入された２つのグアニン残基を結合した（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、又は縮重配列、
（Ｄ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１、又は縮重配列、
（Ｅ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｆ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｇ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、又は縮重配列、
（Ｈ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｉ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、又は縮重配列、
（Ｊ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、又は縮重配列、あるいは
（Ｋ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８、又は縮重配列、
を含む核酸セグメントによってコードされるクリプトウイルスタンパク質を含むキメラタンパク質。
【請求項２０】
前記クリプトウイルスタンパク質が（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、又は（Ｊ）を含む核酸セグメントによってコードされるクリプトウイルスエンベロープタンパク質である、請求項１９に記載のキメラタンパク質。
【請求項２１】
クリプトウイルス特異抗体産生における請求項１６又は請求項１９に記載のタンパク質の使用。
【請求項２２】
ワクチン製造における請求項１６又は請求項１９に記載のタンパク質の使用。
【請求項２３】
請求項１６に記載のタンパク質に特異的に結合する単離抗体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の抗体、及びキャリアを含む、組成物
【請求項２５】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｂ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｃ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、又は縮重配列、
（Ｄ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｅ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、又は縮重配列、あるいは
（Ｆ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、又は縮重配列、
によってコードされるクリプトウイルスエンベロープタンパク質を特異的に結合する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体がポリクローナル性である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体がモノクローナル性である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体がキメラである、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２９】
クリプトウイルス感染症治療用薬剤の製造における、請求項２３に記載の抗体の使用。
【請求項３０】
請求項１に記載の核酸を含む、単離ウイルス粒子。
【請求項３１】
請求項３０に記載のビリオン、及びキャリアを含む、組成物。
【請求項３２】
請求項１７に記載のタンパク質を含む、単離ウイルス粒子。
【請求項３３】
（配列番号１）に完全相補なヌクレオチド配列を有するゲノムを含む、単離クリプトウイルス粒子。
【請求項３４】
ワクチン製造における請求項３２に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項３５】
ワクチン製造における請求項３３に記載のクリプトウイルス粒子の使用。
【請求項３６】
前記ウイルス粒子が弱毒ビリオンである、請求項３４又は３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記ウイルス粒子が、死菌ビリオンである、請求項３４又は３５に記載の使用。
【請求項３８】
前記クリプトウイルスがＢＢＲ株である、単離クリプトウイルス粒子。
【請求項３９】
請求項３に記載の核酸を含む、プローブ。
【請求項４０】
請求項５に記載の核酸を含む、プライマー。
【請求項４１】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルスタンパク質の存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
生物材料サンプルを、請求項２３に記載の抗体に接触する工程、及び
前記サンプルの構成要素に対する前記抗体の特異的結合を検出する工程であって、特異的結合の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルスタンパク質の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項４２】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異的ＲＮＡの存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
ＲＮＡを含む生物材料サンプルを得る工程、
少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記サンプルを請求項３９に記載のプローブに接触させる工程であって、検出可能なハイブリダイゼーション産物の形成が、前記サンプル中に前記クリプトウイルス特異的ＲＮＡが存在することを示す工程、
を含む方法。
【請求項４３】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異的ＲＮＡの存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
ＲＮＡを含む生物材料サンプルを得る工程、
増幅反応混合物中で、請求項４０に記載のプライマーを少なくとも一つ使用して、前記サンプル中のクリプトウイルス特異的ＲＮＡを増幅する工程、
次に、前記増幅反応混合物中におけるクリプトウイルス特異的増幅産物の存在の有無を検出する工程であって、前記反応混合物中の前記増幅産物の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルスＲＮＡの存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項４４】
前記生物材料が細胞材料である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記生物材料が血液又は血清である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記生物材料が脳脊髄液である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記生物材料がリンパ組織である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記生物材料が神経組織である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記神経組織が脳組織である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
前記サンプルを請求項１６に記載のタンパク質に接触する工程、
特異的タンパク質−抗体複合体の形成させる工程、
前記特異的タンパク質―抗体複合体の存在を検出する工程であって、該特異的タンパク質―抗体複合体の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルス特異抗体の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項５１】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
前記サンプルを請求項１９に記載のタンパク質に接触する工程、
特異的タンパク質−抗体複合体の形成させる工程、及び
前記特異的タンパク質―抗体複合体の存在を検出する工程であって、該特異的タンパク質―抗体複合体の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルス特異抗体の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項５２】
ヒト由来の抗体を含有する生物材料サンプル中におけるクリプトウイルスを選択的に結合する抗体の存在の有無を検出するためのアッセイ法であって、前記アッセイ法が、
クリプトウイルス感染症を罹患していると疑われる個体に由来するサンプルである、前記サンプルを、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体が存在しているならば、抗体が結合したエンベロープタンパク質複合体を形成するように、請求項１７のエンベロープタンパク質に接触させる工程、
形成された任意の抗体結合エンベロープタンパク質複合体を、抗ヒト抗体を結合する抗体に接触して、前記抗体と前記抗体結合エンベロープタンパク質複合体との複合体を形成させる工程、及び
形成された任意の抗体結合エンベロープタンパク質複合体の存在の有無を検出する工程であって、前記複合体の存在が、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体がサンプル中に存在することを示す工程、
を含むアッセイ法。
【請求項５３】
ヒト由来の抗体を含有する生物材料サンプル中においてクリプトウイルス抗原を選択的に結合する抗体の存在の有無を検出するためのアッセイ法であって、前記アッセイ法が、
クリプトウイルス感染症を罹患していると疑われる個体に由来するサンプルである、前記サンプルを、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体が存在しているならば、抗体が結合したウイルス複合体を形成するように、請求項３２に記載のウイルス粒子に接触させる工程、
かくして形成された任意の抗体結合ウイルス複合体を、抗ヒト抗体を結合する抗体に接触して、前記抗ヒト抗体結合抗体と前記抗体結合ウイルス複合体との複合体を形成させる工程、及び
形成された任意の複合体の存在の有無を検出する工程であって、前記複合体の存在が、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体がサンプル中に存在することを示す工程、
を含むアッセイ法。
【請求項５４】
哺乳類におけるクリプトウイルス感染の検出法であって、前記方法が、
前記哺乳類から生物材料サンプルを得る工程、及び
前記サンプルを用いて請求項４１，４２、４３、５０、５１、５２、又は５３のいずれかの方法を行い、これにより、前記哺乳類におけるクリプトウイルス感染を示す前記サンプル中にあるクリプトウイルスタンパク質、クリプトウイルス特異的ＲＮＡ、及び／又はクリプトウイルス特異抗体の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項５５】
前記哺乳類がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヒトが神経学的、神経変性、及び／又は神経精神医学的疾患を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒトが、原発性気道及び／又はリンパ節腫脹関連疾患を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
培養哺乳類羊膜細胞であって、前記細胞が、クリプトウイルスに非増殖的に急性感染しており、細胞株ＡＶ3／ＳＳＰＥの特徴を有する細胞。
【請求項５９】
クリプトウイルスビリオン単離方法であって、前記方法が、
（ａ）クリプトウイルス感染を有するヒトから得られた複数の末梢血単核細胞を、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む人工水性培地中で培養する工程、
（ｂ）複数の末梢血単核細胞を複数の哺乳類羊膜細胞と共に、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む新鮮人工水性培地中で共培養する工程、
（ｃ）前記末梢血単核細胞を前記哺乳類羊膜細胞と共に共培養基中で継代培養する工程、
（ｄ）複数の哺乳類上皮細胞を前記末梢血単核細胞及び前記哺乳類羊膜細胞と共に、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む新鮮人工水性培地中で共培養する工程、並びに
（ｅ）上清中にあるクリプトウイルスビリオンを得るために、前記水性培地の前記上清を、前記細胞から分離する工程、
を含む方法。
【請求項６０】
クリプトウイルスの増殖方法であって、前記方法が、
（ａ）複数の哺乳類上皮細胞を、請求項５９に記載の方法によって単離された複数の無細胞クリプトウイルスビリオンに曝露する工程、及び
（ｂ）ビリオンに曝露された、前記哺乳類上皮細胞を、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む人工水性培地中でさらに培養する工程、
を含む方法。
【請求項６１】
クリプトウイルスで非増殖型感染された哺乳類細胞株の産生方法であって、前記方法が、
（ａ）前記哺乳類羊膜細胞がクリプトウイルスによって非増殖型感染されるように、クリプトウイルスに感染しているヒトから得られた末梢血単核細胞を、哺乳類羊膜細胞と共に、細胞グアニリルシクラーゼを増加する薬剤を含む人工水性培地中で共培養する工程、
（ｂ）前記非増殖型感染哺乳類羊膜細胞を、前記末梢血単核細胞と共に継代培養して、前記共培養物が非増殖型感染された哺乳類羊膜細胞の単培養とする工程、
を含む方法。
【請求項６２】
前記哺乳類羊膜細胞がヒト羊膜細胞である、請求項５９又は請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ヒト羊膜細胞がＡＶ3細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳類上皮細胞が、Ｖｅｒｏ又はＣＶ-１細胞から成る群から選択されるシミアン上皮細胞である、請求項５９又は請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣＶ-１細胞がＣＶ-１細胞亜株である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する前記薬剤が、サイクリックＧＭＰ、インスリン、亜鉛ジカチオン、又はこれらのいずれかの組み合わせである、請求項５９、６０、又は６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記人工水性培地中で前記サイクリックＧＭＰ濃度が約０.０５〜約５ｍＭである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤が、一酸化窒素又は、有機硝酸塩化合物、ニトロシル鉄化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯエート化合物から成る群から選択される一酸化窒素ドナーである、請求項５９、６０、又は６１に記載の方法。
【請求項６９】
前記水性培地がさらにグルタミンを含む、請求項５９、６０、又は６１に記載の方法。
【請求項７０】
請求項６０に記載の方法を含む、クリプトウイルスで急性感染された哺乳類上皮細胞株を産生する方法。
【請求項７１】
クリプトウイルスで急性感染された哺乳類上皮細胞であって、前記細胞が請求項６０の方法によって産生される、哺乳類上皮細胞。
【請求項７２】
クリプトウイルスで非増殖型感染された細胞であって、前記細胞が請求項６１に記載の方法に従って産生される、細胞。
【請求項７３】
抗ウイルス治療薬候補のインビトロスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項７１に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞を前記抗ウイルス治療薬候補に曝露する工程、並びに
（ｃ）クリプトウイルス複製及び／又はクリプトウイルスビリオンのアセンブリに対する前記薬剤の有効性を測定する工程であって、コントロールに比較してクリプトウイルス複製及び／又はクリプトウイルスビリオンのアセンブリが阻害されることが、前記治療薬候補の抗ウイルス活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項７４】
抗ウイルス治療薬候補のインビトロスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項５８又は７２に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞を前記抗ウイルス治療薬候補に曝露する工程、並びに
（ｃ）クリプトウイルス複製、クリプトウイルスゲノム複製、及び／又はクリプトウイルス特異的転写に対する前記薬剤の有効性を測定する工程であって、コントロールに比較してクリプトウイルス複製、クリプトウイルスゲノム複製、及び／又はクリプトウイルス特異的転写が阻害されることが、前記治療薬候補の抗ウイルス活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項７５】
ヒト疾患研究のための動物モデルであって、前記モデルが、非ヒト哺乳類を含み、前記非ヒト哺乳類が、（配列番号１）に相補である一本鎖ＲＮＡを含むゲノムを有する感染性無細胞クリプトウイルスを人工的に接種されるか、あるいは前記クリプトウイルスで非増殖型感染された細胞を接種されており、これによって前記非ヒト哺乳類が、接種された後、以前に前記非ヒト哺乳類によって呈示されていなかった症状である、ヒト疾患に特徴的な症状を少なくとも一つ呈示する動物モデル。
【請求項７６】
前記非ヒト哺乳類が齧歯類又はウサギ類である、請求項７５に記載の動物モデル。
【請求項７７】
前記非ヒト哺乳類が非ヒト霊長類である、請求項７５に記載の動物モデル。
【請求項７８】
前記ヒト疾患が、神経学的、神経変性、及び／又は神経精神医学的疾患である、請求項７５に記載の動物モデル。
【請求項７９】
治療薬候補のインビボスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項７５に記載の動物モデルに前記スクリーンされる治療薬候補を投与する工程であって、前記非ヒト哺乳類が、前記治療薬候補の投与前に、ヒト疾患に特徴的な症状を少なくとも一つ呈示している工程、及び
（ｂ）前記治療薬候補の有益な抗ウイルス効果の有無を検出する工程であって、有益な抗ウイルス効果の存在が前記治療薬候補の活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項８０】
予防薬候補のインビボスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）前記スクリーニングされる予防薬候補を、以前にヒト疾患症状を有していない非ヒト哺乳類に投与する工程、
（ｂ）（配列番号１）に相補である一本鎖ＲＮＡを含むゲノムを有する感染性無細胞クリプトウイルス、あるいは前記クリプトウイルスで非増殖型感染された哺乳類細胞で、前記非ヒト哺乳類を接種する工程、並びに
（ｃ）前記非ヒト哺乳類において、その後の有益な抗ウイルス効果の有無を検出する工程であって、前記接種された非ヒト哺乳類における有益な抗ウイルス効果の存在が前記予防薬候補の活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項８１】
前記予防薬候補が免疫予防薬である、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記非ヒト哺乳類が齧歯類又はウサギ類である、請求項７９請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記非ヒト哺乳類が非ヒト霊長類である、請求項７９又は請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記ヒト疾患が神経学的、神経変性、及び／又は神経精神医学的疾患である、請求項７９又は請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
抗クリプトウイルス抗体検出キットであって、前記キットが、
請求項３３に記載のクリプトウイルス粒子、及び
標識抗ヒト抗体結合抗体、
を含むキット。
【請求項８６】
前記クリプトウイルス粒子を支持するための固体マトリックスをさらに含む、請求項８５に記載の抗クリプトウイルス抗体検出キット。
【請求項８７】
抗クリプトウイルス抗体検出キットであって、前記キットが、
請求項１６又は請求項１９に記載のタンパク質、及び
標識抗ヒト抗体結合抗体、
を含むキット。
【請求項８８】
前記タンパク質を支持するための固体マトリックスをさらに含む、請求項８７に記載の抗クリプトウイルス抗体検出キット。
【請求項８９】
（Ｃ）の前記クリプトウイルス特異的フラグメントが、（配列番号３４）、（配列番号３５）、（配列番号３６）、（配列番号３７）、（配列番号３８）、（配列番号３９）、（配列番号４０）、（配列番号４１）、（配列番号４２）、（配列番号４３）、（配列番号４４）、（配列番号４５）、（配列番号４６）、（配列番号４７）、又は（配列番号４８）を含むか、あるいはこれらのいずれかの相補ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ルブラウイルス（ＲＵＢＵＬＡＶＩＲＵＳ）属に属するニューロビルレントウイルス（ＮＥＵＲＯＶＩＲＵＬＥＮＴ）（クリプトウイルス（ＣＲＹＰＴＯＶＩＲＵＳ））とその使用
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明に従って、人工水性培地は、必須ではないが、さらに約０．５〜約５ｍＭの好ましい濃度のグルタミンを含むことが好ましい。培地中のさらに好ましいグルタミン濃度は、約１〜約３ｍＭである。
本発明によるクリプトウイルスビリオンの単離とクリプトウイルスで非増殖型感染された哺乳類細胞株の産生の方法において、ＰＢＭＮＣは、前述のように人工水性培地中で哺乳類羊膜細胞と共培養される。
有用な哺乳類細胞の例は、限定はされないが、齧歯類、ウサギ、霊長類、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコまたはブタ細胞を含む。
本発明に従って、一つの好ましい実施形態は、霊長類細胞、即ち、霊長類を源とする細胞である。霊長類は、哺乳類目のメンバーで、キツネザル、メガネザル、サル（例えば、アフリカミドリザル、コロブスモンキー、及びバブーン）、類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びギボン）、並びにヒトを含む。
羊膜細胞は、羊膜または羊膜腔を起源とする培養細胞である。
好ましい霊長類羊膜細胞は、ヒト羊膜細胞、例えばＡＶ3である。
本方法によって非増殖型感染された本発明の細胞の例は、ＡＴＣＣ受託番号（）として寄託されている、ＡＶ3／ＳＳＰＥである。
これらの発明の方法では、ＰＢＭＮＣと哺乳類羊膜細胞共培養物の継代培養は１回以上行われる。培養細胞の新鮮培地（前述の培地）への継代培養は、典型的には一週間あたり２回行われる。本方法に従って、少なくとも約２〜約１２継代培養を行うことが好ましい。典型的には共培養を８〜１２継代すると、実質的に全ての哺乳類羊膜細胞がクリプトウイルスによって非増殖型感染される。一般的には、約２〜約３継代のうちに、ＰＢＭＮＣは培養基から消失して、哺乳類羊膜細胞のみが残る。
本発明に従って、哺乳類上皮細胞は、哺乳類上皮組織に起源を発する培養細胞である。一つの好ましい実施形態では、哺乳類上皮細胞は、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞のような、齧歯類上皮細胞である。他の好ましい実施形態では、哺乳類上皮細胞は、例えば、ＶｅｒｏまたはＣＶ−１細胞のようなサル上皮細胞である。最も好ましくは、ＣＶ−１細胞は、亜株ＣＶ−１c細胞である。
本発明のクリプトウイルス粒子を同定するために本願に提供された配列情報に加えて、本発明のクリプトウイルスとそのウイルスサブコンポーネントは、以下に例示するものを含む、数々のウイルス学的、生化学的、及び分子技術によって特徴づけすることが可能であり、これが実行されてきた。
プラーク滴定アッセイ：単層の哺乳類上皮細胞（例えば、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、またはＣＶ-１c）上に肉眼で可視なプラーク形成を使って、感染性クリプトウイルスの調製物を定量することができる（Ｒｏｂｂｉｎｓら， “Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ” １４３：３９６〜４０３， １９８１）。
中和滴定アッセイ：プラーク形成は、臨床血清検体及びウサギで産生したクリプトウイルス特異的抗血清の段階希釈で阻害され得る（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら， “Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ” １４３：３９６〜４０３， １９８１）。中和滴定アッセイは、所定の患者がある特定のウイルスに対する中和抗体を有することを実証するために医学ウイルス学研究において日常的に使用される。中和アッセイは、クリプトウイルスに対する中和抗体の有無についての診断に使用することができる。中和アッセイの典型例では、検査対象の血清またはＣＳＦサンプルのような生物材料の段階希釈は、一般的には、最終プレーティング濃度が最終希釈液（希釈血清またはＣＳＦを含む）０．２ｍＬあたり約１００〜２００プラーク形成単位のウイルスとなるように、十分に感染性のあるウイルスを加えて４℃で約１時間インキュベートする。インキュベーション後、約０．２ｍＬの希釈ウイルス−血清（またはＣＳＦ）混合物を、典型的には単層の感受性細胞（例えば、ＶｅｒｏまたはＣＶ−１）に播種して、細胞を部分的ＣＯ2大気（例えば５％（容積／容積））中３７℃でインキュベートする（典型的には１５分ごとに接種物を撹拌する）。インキュベーション期間の終わりに、接種された単層は、典型的には、十分量の２％（重量／容量）カルボキシメチルセルローズ溶液を含有する人工水性細胞培養基（例えば、一般的にはウシ胎児血清及び約２００ユニット  ペニシリン／ｍＬ及び／または１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍＬのような適量の抗生物質を含み、ｐＨ約６．８〜約７．４に緩衝された、ＩＭＥＭＺＯ培地）で、１０〜１２日間存続するようにオーバーレイされる（即ち、単層が乾燥しないために十分な量）。至適には、インキュベーション期間中はプレートを移動してはならない。１０〜１２日後、オーバーレイを吸引除去して、細胞をホルマリン固定液で固定して、タンパク質染色（例えば、ギムザ）を行う。各プレート上に形成されたプラーク数を次に列挙して、ＰＲＤ50を計算する（ＰＲＤ50＝プラーク減少希釈度、コントロール［ウイルスと生理食塩水のみを含む試験管］上に形成されたプラーク数を５０％減少する血清またはＣＳＦの希釈）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
クリプトウイルス特異抗体は、血清陽性個体の血清中に発見され、現在あるいは過去のクリプトウイルス感染を指摘するが、これらの抗体は必ずしもテンカン様または脳疾患の兆候ではない。クリプトウイルスは、必ずしも脳疾患を起因することなく、かなりの割合の個体のＰＢＭＮＣ中に感染または存在していると思われる。これらの個体は、明白に無症候性であると考えられる。ウイルスの神経病理学的（例えば、テンカン様、脳性、及びその他の神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患）潜在能力は、ウイルスが神経系組織を感染した個体においてのみ顕在化するように思われる。結局、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に発見されたクリプトウイルス特異抗体のみ（即ち、ウイルスの主要エンベロープタンパク質、ＦとＨＮに対して誘導されたもの）が、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患の完全な兆候であり、したがって、それらは実質的に常に兆候である。さらなる例として、顕著な短期記憶喪失を伴う慢性疲労症候群であることが過去に診断され、ＣＳＦサンプルを得ることのできた１０人のヒト患者は、その全員がＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体、並びに欠神テンカン（即ち小発作性テンカン）の診断と一貫する脳波プロファイルを有することが見いだされている。
本発明はまた、特に抗体を含有する生物材料において、生物サンプルの検査またはアッセイに有用である、抗クリプトウイルス抗体検出キットに関する。したがって、本発明のキットは、ヒト血液、血清、血小板、血漿、組織及び臓器である臨床用サプライを、輸血または移植目的でその安全性を判定するためのスクリーニングに有益である。本発明のキットの診断への適用もまた有用である。
本発明のキットは、クリプトウイルス及びその抗原を選択的に結合する抗体を検出するための本発明のアッセイ法及びクリプトウイルス特異抗体の存在の有無についての本発明による検出方法を実施するために特に有用である。いくつかの好ましい実施形態では、このキットは、（配列番号１）と完全相補なヌクレオチド配列を有するゲノムを含む、単離クリプトウイルス粒子を含む。キットは、標識抗ヒト抗体を結合する抗体、好ましくは抗ヒト免疫グロブリン、または、Ｆａｂ及び／またはＦ（ａｂ’）2のような、標識抗ヒト抗体を結合する抗体フラグメントを含む。キットの好ましい実施形態は、さらにクリプトウイルス粒子（複数でもよい）を支持するための固体マトリックスを含む。好ましい実施形態では、抗クリプトウイルス抗体検出キットにおけるクリプトウイルス粒子は、クリプトウイルスビリオンであり、好ましい実施形態では、クリプトウイルスビリオンは、急性感染仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞由来細胞株、Ｖｅｒｏ由来細胞株、またはＣＶ−１−由来細胞株（例えば、ＣＶ−１c由来細胞株、以下に説明）のような急性クリプトウイルス感染細胞株から産生される。
一方、クリプトウイルス粒子を含まない本発明の抗クリプトウイルス抗体検出キットの最も好ましい実施形態では、キットは、前述のように、複数の一つ以上の種類の単離クリプトウイルスタンパク質及び／またはクリプトウイルスタンパク質成分を含むキメラタンパク質を含む。いくつかの好ましい実施形態では、クリプトウイルスタンパク質またはタンパク質成分は、本願に説明するように、エンベロープタンパク質である。係る実施形態はまた、抗ヒト免疫グロブリンのような、標識抗ヒト抗体を結合する抗体または、Ｆａｂ及び／またはＦ（ａｂ’）2フラグメントのような、標識抗ヒト抗体を結合する抗体フラグメントを含む。係るキットの好ましい実施形態は、さらにクリプトウイルスタンパク質を支持するための固体マトリックスを含む。
固体マトリックス、または支持体、並びに固体マトリックスにウイルス粒子及びタンパク質を付着または吸収する方法は当該分野で公知である。本発明のキットに従って、「固体マトリックス」という用語は、ウイルス粒子またはタンパク質が固定または接着することができる任意の固体または半流動体支持体または表面を含む。適切な支持体は、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲルなどを含み、ビーズ、ウェル（単一、複数ウェル血清プレート）スライド、ディップスティック、膜などの形態をとる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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