【手続補正書】
【提出日】平成17年2月7日(2005.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインに媒介される炎症状態を患う患者を治療するための、
(a)サイトカインにより媒介された炎症状態を患う患者を提供する段階と、
(b)該患者に、α-ケトアルカン酸化合物を含む有効量の組成物を投与し、化合物が薬学的に許容される不活性担体物質中に溶解されたα-ケトアルカン酸、生理学的に許容されるα-ケトアルカン酸の塩、α-ケトアルカン酸のエステル、またはα-ケトアルカン酸のアミドである段階と、
を含む治療方法。
【請求項２】
サイトカインが、炎症状態における早期媒介物質である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
サイトカインが、炎症状態における遅発媒介物質である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
組成物が、炎症状態の発症後24時間に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
サイトカインにより媒介される炎症状態が腫瘍壊死因子により媒介される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
サイトカインにより媒介される炎症状態が、インターロイキン-1βにより媒介される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
サイトカインにより媒介される炎症状態が、高移動度群B-1により媒介される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
α-ケトアルカン酸化合物がC3〜C8の直鎖または分枝である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
α-ケトアルカン酸化合物が、α-ケトブチラート、α-ケトペンタノエート、α-ケト-3-メチル-ブチラート、α-ケト-4-メチル-ペンタノエートまたはα-ケトヘキサノエートからなる群から選択されてもよい、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
α-ケトアルカン酸化合物がピルビン酸である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
生理学的に許容される塩が、Na+、K+、Ca++、Mg+、およびNH4+からなる群から選択されてもよい、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
α−ケトアルカン酸化合物が、アルキル、アラルキル、アルコキシル、カルボキシアルキル、グリセリルまたはジヒドロキシアセトンからなる群から選択されてもよい、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
α−ケトアルカン酸化合物のエステルが、エチル、プロピル、ブチル、カルボキシメチル、アセトキシメチル、カルベトキシメチルおよびエトキシメチルからなる群から選択されてもよい、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
α−ケトアルカン酸化合物のエステルが、ピルビン酸エチルである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
α−ケトアルカン酸化合物のアミドが、構造式RCOCONR1R2
（式中、
Rがアルキル基であり；
R1およびR2がそれぞれ-H、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルまたは-CHR3COOHであり；
R3が天然のアミノ酸の側鎖である）
を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
α−ケトアルカン酸化合物のアミドが、ピルブアミドである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
担体物質が、生理pH値で酸のα-ケト官能基のエノール化を誘導し、安定化させるための生物学的に安全な成分をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
エステルのα-ケト官能基のエノール化を誘導し、安定化させるための成分が、無機、二価陽イオンである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
二価陽イオンが、カルシウムまたはマグネシウムである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
エステルのα-ケトアルカン酸部分が、α-ケトプロピオン酸である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
α-ケトアルカン酸エステル化合物がピルビン酸エチルであり、二価陽イオンがカルシウムであり、不活性担体物質が7〜8のpH範囲のリンガー溶液である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
不活性担体物質が、カリウムイオンを付加した等張生理食塩水のリンガー溶液である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
α-ケトアルカン酸エステル化合物が、2-ケト-酪酸エチル、2-ケトペンタン酸エチル、2-ケト-3-メチル-酪酸エチル、2-ケト-4-メチルペンタン酸エチルおよび2-ケト-ヘキサン酸エチルからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
α-ケトアルカン酸エステル化合物が、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される陽イオンを含む塩溶液に混合されている、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
炎症状態が、局所および全身性炎症、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、慢性関節リウマチ、喘息（喘息発作重積状態を含む）、敗血症または敗血症性ショックを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
炎症状態が皮膚状態である、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
皮膚状態が乾癬または湿疹である、請求項26記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
【図１】本発明の組成物中の好ましいα-ケトアルカン酸エステルおよびアミドの構造を示す図である。
【図２】IFN-γ(1000U/ml)、IL-1β(1nM)およびTNF-α(10ng/ml)を含むサイトカインのカクテル（「サイトミックス(cytomix)」）（「サイト(Cyto)」）で48時間インキュベートしたCaco-2単層の透過性に対するピルビン酸エチルの効果を示した棒グラフである。REPSはサイトカインにより誘発された腸上皮の高透過性をブロックする。
【図３】インビボでTNFおよびHMGB-1放出を減少させることにより内毒素致死性を防ぐ場合のピルビン酸エチル前処理の効果を示した図である。(a)EPによる前処理後（1回のEP用量が40mg/kg、腹腔内、t=-30分にて）、致死用量の内毒素(5mg LPS/kg、腹腔内、時間=0hrにて)に曝露したマウスのカプラン・メイア（Kaplan-Meier）プロット。EPは致死性に対してかなりの防護を付与した（P＜0.05）。(b) ピルビン酸エチル前処理によりLPS後2時間で血清TNFの放出が著しく減衰される。(c)ピルビン酸エチルはLPS後20時間で、血清HMGB-1レベルを著しく阻害する。ビヒクル処理した内毒素血症動物に比べ、EPのTNFおよびHMGB-1に対してはP＜0.05；2度繰り返した実験ではn=5。
【図４】内毒素血症および敗血症HMGB-1の致死率を減衰させる場合のピルビン酸エチルの遅延投与の効果を示したものである。(a)致死用量のLPS(3.75mg LPS/kg；腹腔内)およびピルビン酸エチルの遅延投与（40 mg/kg；腹腔内）を受けた、すなわちLPS注入後4時間で開始し、8時間、12時間、24時間および30時間に繰り返し投与されたマウスのカプラン・メイアプロット。(b)HMGB-1放出を20時間で収集した血清のウエスタンブロットにより分析した。LPSはインビボでHMGB-1の放出を誘発し（レーン4、5、6）、ピルビン酸エチル（レーン7、8、9）による遅延処理により血清HMGB-1の放出が著しく妨害される。(c)時間=0時間で盲腸せん孔により誘発された腹膜炎の発症後24時間に開始したピルビン酸エチル（40mg/kg、腹腔内）による処理を行った盲腸せん孔を有する敗血症マウスのカプラン・メイアプロット。内毒素血症およびCLPモデルの両方で、ピルビン酸エチルの遅延投与により生存率が著しく増加したことに注意すべきである。
【図５】ピルビン酸エチルがTNF転写および合成を阻害することが示されている。(a)LPSにより刺激されたマクロファージ培養物によるTNF放出に対するピルビン酸エチルの影響を、50ng/mlまたは100ng/mlのLPSにより刺激したマクロファージ条件培地上でELISAにより測定した。マクロファージ培養物からのTNF応答の50%を阻害したピルビン酸エチルの濃度（ピルビン酸エチルEC50）は3.4mMであり、臨床的に達成可能な濃度であることに注意すべきである。(b)ピルビン酸エチルはTNF遺伝子の転写を妨害する。TNF転写に対するピルビン酸エチルの効果をリボヌクレアーゼ防護アッセイ法(RPA III（登録商標）、アンビオン(Ambion)、テキサス州オースチン)により分析した。ピルビン酸エチルは、ピルビン酸エチル濃度依存様式でTNFのLPSにより誘発される転写を妨害する。
【図６】マクロファージ培養物におけるNF-κBおよびp38MAPK経路の、LPSにより誘発される活性化がピルビン酸エチルにより妨害されることが示されている。(a)示した濃度のピルビン酸エチルの存在下、LPSによりRAW264.7細胞を刺激した。NF-κBの活性化を、32P標識したNF-κBプローブを用いて15分および4時間にEMSAにより分析した。ピルビン酸エチルはピルビン酸エチル濃度依存様式でNF-κBの活性化を抑制した。実験を3度繰り返した。(b)スーパーシフトおよび競合試験。LPSにより刺激し、p65-Relに対する抗体と共にインキュベートしNF-κB複合体の特定のスーパーシフトを誘発したマクロファージの核抽出物。競合分析のために、核抽出物を100倍モル過剰の未標識（非放射性）NF-κBまたはHIF-1プローブと共にインキュベートした。(c)RAW264.7細胞を、指示した濃度のピルビン酸エチルの存在下、LPSにより刺激した。製造業者（マサチューセッツ州ベヴァリーCat.＃9210、New England Biolabs）に従いリン酸化(thr180/tyr182)p38MAPKに対する抗体を用い、ウエスタンブロットによりP38MAPKのリン酸化を分析した。(d)p38 MAPKの総量をウエスタンブロットにより視覚化する。ピルビン酸エチルは総p38MPKの細胞内レベルに影響を与えずにマクロファージ培養物中のp38MAPKのリン酸化を妨害する。
【図７】ピルビン酸エチルがHMGB-1の放出を阻害することが示されている。(a)LPS添加後24時間の条件培地のウエスタンブロットから証明されるように、ピルビン酸エチルはマクロファージ培養物からのHMGB-1の放出を阻害する。(b)HMGB-1の総細胞関連レベルに対するピルビン酸エチルの効果の分析。ピルビン酸エチルは処理後10時間または20時間のいずれにおいてもHMGB-1の細胞内安定性およびレベルに影響しなかったことに注意すべきである。ピルビン酸エチルがHMGB-1の放出を特異的に妨害することが示唆される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  UNIVERSITY OF PITTSBURGH OF THE COMMONWEALTH SYSTEM OF 
HIGHER EDUCATION
NORTH SHORE LONG ISLAND JEWISH RESEARCH INSTITUTE
<120>  METHOD OF USING PYRUVATE AND/OR ITS DERIVATIVES FOR THE 
TREATMENT OF CYTOKINE-MEDIATED INFLAMMATORY CONDITIONS
<130>  HB-A0301
<140>  JP   2002-573009
<141>  2002-03-15
<150>  US   60/276,279
<151>  2001-03-15
<160>  2     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  An artificially synthesized oligonucleotide sequence
<400>  1
agttgagggg actttcccag gc                                              22
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  An artificially synthesized oligonucleotide sequence
<400>  2
tcaactcccc tgaaagggtc cg                                              22