(57)【要約】肝細胞がん細胞において非肝がん細胞に比べリン酸化修飾状態が異なるタンパク質を用いて肝細胞がんを判定する方法、ならびに該タンパク質からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーを提供する。肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーは、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）であって、リン酸化修飾状態を測定することで、肝細胞がんの有無を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）を含む肝細胞がんたんぱく質マーカーであって、当該たんぱく質マーカーはリン酸化修飾されていること特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
【請求項２】
請求項１に記載の肝細胞がんタンパク質マーカーを用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記タンパク質マーカーは、外科的に採取した生体試料から抽出されることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項５】
請求項２に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記タンパク質マーカーのリン酸化修飾を検証することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記タンパク質マーカーは、外科的に採取した生体試料から抽出されることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項８】
請求項５に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記検証は、前記たんぱく質マーカーのセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基、トレオニン（ｔｙｒｅｏｎｉｎｅ）残基、及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基の内のいずれか一つの残基のリン酸化修飾の測定に基いて行われることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項９】
請求項８に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記タンパク質マーカーは、外科的に採取した生体試料から抽出されることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）のリン酸化修飾を測定し、正常値と比較することをもって陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１２】
生体試料中の請求項１に記載の肝細胞がんタンパク質マーカーであるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）のリン酸化修飾を測定するにあたり、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法から選択される方法を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の肝細胞がんの検出方法において、外科的に採取された生体試料からたんぱく質を抽出し複数回の次元の異なる電気泳動して固体担体上に固定して染色し、前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のたんぱく質スポットにおける増減を比較することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の肝細胞がんの検出方法において、質量分析装置を用いて、外科的に採取された生体試料から得られた前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６の消化産物のリン酸化修飾をポジティブイオンモード測定とネガティブイオンモード測定の比較から肝細胞がんの有無を判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記リン酸化修飾は、前記肝細胞がんタンパク質マーカーのセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）残基、及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基の内のいずれか１つに対して測定されることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の肝細胞がんの検出方法において、外科的に採取された生体試料からたんぱく質を抽出し複数回の次元の異なる電気泳動して固体担体上に固定して染色し、前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のたんぱく質スポットにおける増減を比較することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の肝細胞がんの検出方法において、質量分析装置を用いて、外科的に採取された生体試料から得られた前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６の消化産物のリン酸化修飾をポジティブイオンモード測定とネガティブイオンモード測定の比較から肝細胞がんの有無を判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のリン酸化部位を認識する抗体を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記抗体は、リン酸化セリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基、リン酸化トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）残基、およびリン酸化チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基の内のいずれかを認識するものであることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞がんの検出に用い得る新規なリン酸化修飾タンパク質マーカーおよび該タンパク質マーカーを用いた肝細胞がんの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞がんは肝臓に原発する上皮性悪性腫瘍の一つで、肝細胞に似た腫瘍細胞からなる。通常肝臓に多数の腫瘤を形成しており、肝血管内に増殖・進展する傾向が強く、しばしば門脈に腫瘍栓を形成する。日本を含むアジア、アフリカ地域に多発し、肝硬変が併存していることが多い。
肝細胞がん検出のためのマーカーとして、従来αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（非特許文献１、参照）、ＫＭ−２（非特許文献２、参照）、ＣＡ１２５（非特許文献３、参照）等が用いられていた。
一方、翻訳後修飾、特にリン酸化されたタンパク質が様々な器官・組織の状態を反映することが知られている。例えば、損傷を受けた筋組織の状態を把握するためのリン酸化トロポニン１タンパク質（特許文献１、参照）や種々のがんの検出に用いるためのリン酸化ウロキナーゼ（特許文献２、参照）などがある。
【非特許文献１】Ｌｉｅｂｍａｎ  ＨＡ，Ｆｕｒｉｅ  ＢＣ，Ｔｏｎｇ  ＭＪ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ＲＡ，Ｌｏ  ＫＪ，Ｌｅｅ  ＳＤ，ＣｏｌｅｍａｎＭＳ，Ｆｕｒｉｅ  Ｂ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１０，ｐｐ．１４２７−１４３１．（１９８４）
【非特許文献２】Ｋｕｍａｇａｉ  Ｙ，Ｃｈｉｂａ  Ｊ，Ｓａｔａ  Ｔ，Ｏｈｔａｋｉ  Ｓ，Ｍｉｔａｍｕｒａ  Ｋ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，ｐｐ４９８７−４９９４．（１９９２）
【非特許文献３】Ｅｌｉａｓ  Ｊ，Ｋｅｗ  ＭＣ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４６，ｐｐ８０５−８０７．（１９９０）
【特許文献１】特表２００６−５０２２０３号公報、発明の名称「筋肉損傷を監視し診断するための単離した翻訳後修飾タンパク質」
【特許文献２】特許第３１２９４３０号公報、発明の名称「リン酸化ウロキナーゼの測定方法」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、非特許文献１乃至３に示されたマーカーは陽性判定率が十分でなかった。
例えば、ＡＦＰとＰＩＶＫＡ−ＩＩの肝細胞がん判定スクリーニング率は６０〜７０％であり、さらなる信頼性をもったマーカーが求められている。
本発明の目的は、前述した特許文献１，２に開示されたたんぱく質以外のたんぱく質であって、肝細胞がん細胞において非肝がん細胞に比べリン酸化修飾状態が異なるタンパク質を用いて肝細胞がんを判定する方法を提供することにある。
また、本発明は、リン酸化修飾状態が異なるタンパク質からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）を含む肝細胞がんたんぱく質マーカーであって、当該たんぱく質マーカーはリン酸化修飾されていること特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカーが得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんタンパク質マーカーを用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記タンパク質マーカーのリン酸化修飾を検証することを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記検証は、前記たんぱく質マーカーのセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）残基、及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基の内のいずれか一つの残基のリン酸化修飾の測定に基いて行われることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記いずれか１つの肝細胞がんの検出方法において、前記タンパク質マーカーは、外科的に採取した生体試料から抽出されることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）のリン酸化修飾を測定し、正常値と比較することをもって陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、生体試料中の前記肝細胞がんタンパク質マーカーであるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）のリン酸化修飾を測定するにあたり、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より選択される方法を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記リン酸化修飾は、前記肝細胞がんタンパク質マーカーのセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）残基、及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基の内のいずれか１つに対して測定されることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記いずれか一つの肝細胞がんの検出方法において、外科的に採取された生体試料からたんぱく質を抽出し複数回の次元の異なる電気泳動して固体担体上に固定して染色し、前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のたんぱく質スポットにおける増減を比較することを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、質量分析装置を用いて、外科的に採取された生体試料から得られた前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６の消化産物のリン酸化修飾をポジティブイオンモード測定とネガティブイオンモード測定の比較から肝細胞がんの有無を判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記生体試料は、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿の内のいずれか一種であることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のリン酸化部位を認識する抗体を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記抗体は、リン酸化セリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基、リン酸化トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）残基、及びリン酸化チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基の内のいずれかを認識するものであることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
【発明の効果】
【０００５】
配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）のリン酸化を測定することで、肝細胞がんの判別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、１８人の患者から得られた（ａ）非がん部位抽出タンパク質サンプルと（ｂ）がん部位抽出タンパク質サンプルを二次元電気泳動により展開し、リン酸化タンパク質染色溶液で染色したゲルを比較したものを示す図である。
図２は、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６の全アミノ酸配列を示す図である。
図３は、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のトリプシン消化産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルを示す図で、（ａ）はポジティブイオンモード測定、（ｂ）はネガティブイオンモード測定の結果を夫々示している図である。
図４は、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のトリプシン消化産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルを示す図で、質量範囲２０５０Ｄａから２８００Ｄａまでの範囲の（ａ）はポジティブイオンモード測定、（ｂ）はネガティブイオンモード測定の結果の比較を示す図である。
【符号の説明】
【０００７】
１    非がん部位サンプルのチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６スポット
２    がん部位サンプルのチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６スポット
４１    ポジティブイオンモードで測定されるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲペプチド由来のピーク
４２    ネガティブイオンモードで測定されるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲペプチド由来のピーク
４３    ネガティブイオンモードで測定されるリン酸化されたチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲペプチド由来のピーク
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について更に具体的に説明する。
本発明者は、肝細胞がん組織において、非がん細胞に比べてリン酸化が亢進するタンパク質を探索した結果、特定のタンパク質のリン酸化修飾量を測定することで肝細胞がん細胞と非がん細胞を判別することが可能であることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
即ち、本発明は、被験者から得られた生体試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）のリン酸化修飾の変動を測定することで肝細胞がんの判定を行う方法である。
具体的に、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ９６）のリン酸化を、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法により測定する方法を提供すものである。
ここで、本発明に用いられる生体試料としては、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、及び尿などがある。
このような生体試料中から上記タンパク質リン酸化修飾の変動を測定する方法としては、生体試料を等電点電気泳動およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を組み合わせた二次元電気泳動法と、分離されたタンパク質のリン酸化状態を可視化できる染色法を組み合わせて用いる方法、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせた多次元クロマトグラフィー法と分離されたタンパク質のリン酸化修飾を質量分析により定量する方法、タンパク質のリン酸化部位を認識する特定の抗体を用いる方法などがある。
また、本発明における特定の抗体とは、リン酸化セリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基、リン酸化トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、及びリン酸化チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基を認識するものなどを呼ぶ。これらの抗体を単独もしくは複数用い、公知の方法である酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング法、放射免疫測定法、免疫沈降法などにより試料中のタンパク質リン酸化を検出することができる。
【実施例】
【０００９】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（実施例１）
本発明の実施例１では、肝細胞がん患者由来のがん細胞抽出タンパク質および非がん細胞抽出タンパク質の二次元電気泳動解析について説明する。
１８人の肝細胞がん患者から外科的に切除された組織より、病理学的に診断された、がん部位組織および非がん部位組織を、それぞれ細胞溶解液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５）、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）中でガラスホモジェナイザーを用いて破砕後、３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを遠心（１３，０００ｒｐｍ、２０分）した後、上清を採取した。上清中のタンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッド社）を用い、ブラッドフォード法により測定した。それぞれの患者から採取した、２５μｇのがん部位抽出タンパク質と２５μｇの非がん部位抽出タンパク質を混合し、がん部位抽出タンパク質サンプル（合計４５０μｇ）と非がん部位抽出タンパク質サンプル（合計４５０μｇ）を作製した。がん部位抽出タンパク質サンプルと非がん部位抽出タンパク質サンプルを、固定化ｐＨグラジェントゲル（ＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅＤｒｙＳｔｒｉｐ、ｐＨ３−１０、２４ｃｍ：ＧＥヘルスケア社）を用いて７１，５００Ｖｏｌｔ・時間の等電点電気泳動を行った（一次元電気泳動）。
一次元電気泳動後のゲルに対し還元アルキル化を行った後、二次元目のＳＤＳ電気泳動を、１２．５％のポリアクリルアミドゲル（２４ｃｍ×２０ｃｍ）を用いて行った。以上のように分離したゲルをリン酸化タンパク質染色溶液（Ｐｒｏ−Ｑ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ：インビトロジェン社）を用いて染色した。染色したゲルをイメージアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００：ＧＥヘルスケア社）を用いてタンパク質スポットを検出した。
非がん部位に比べがん部位で、リン酸化タンパク質染色溶液による染色が変動しているタンパク質スポットを特定した。特定したスポットをゲルから切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行い、ペプチド化した。ゲル内消化したペプチドをイオンスプレー型質量分析装置（ＥＳＩ−ＭＳ，ＬＣＱ−Ｄｅｃａ：Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で測定し、Ｍａｓｃｏｔソフトウェア（ＭＡＴＲＩＸ  ＳＣＩＥＮＣＥ社）を用いたペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ法）により、スポットのタンパク質同定を行った。
その結果、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のタンパク質スポットのリン酸化タンパク質染色溶液による染色が、非がん部位に比べがん部位で変動していることが明らかとなった。
図１は、がん部位抽出タンパク質サンプルと非がん部位抽出タンパク質サンプルを二次元電気泳動により展開し、リン酸化タンパク質染色溶液で染色したゲルを比較したものを示している。図１の符号１は、非がん部位サンプルのチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６スポットで、符号２は、がん部位サンプルのチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６スポットである。各符号１と２のスポットは、リン酸化タンパク質染色溶液での染色が非がん部位サンプル（１）とがん部位サンプル（２）とで異なっている。図１の符号２のスポットを切り出して、トリプシンによるゲル内消化後、ＰＭＦ法によりタンパク質の同定を行った。その結果、図２の下線に示すように、タンパク質スポットゲルからトリプシン消化により得られたペプチドとして、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６の部分ペプチドに相当する質量のペプチドが観測された。
（実施例２）
本発明の実施例２では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定によるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６リン酸化の検証について説明する。
チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のトリプシン消化産物を、１０μｌの０．１％ＴＦＡ、５０％メタノール水溶液に溶解させ、サンプル溶液とした。サンプル溶液１μｌを質量分析装置用ターゲットプレートに滴下し、室温で乾燥させた。乾燥させたサンプルスポットにマトリックス溶液（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、７０％メタノール、４ｍＭモノアンモニウムホスフェイト（ｍｏｎｏ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液に飽和濃度になるようにα−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（α−ＣＨＣＡ）を溶解させたもの）を０．７μｌ滴下し、室温で乾燥させた。ターゲットプレートを飛行時間測定型の質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ，Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＳＴＲ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）のリニアモードで測定し、測定イオン極性をポジティブイオンモードとネガティブイオンモードの２通りで測定した。スペクトルの質量校正は標準ペプチドよる外部標準法を用いた。
図３は、質量範囲６９９ダルトン（Ｄａ）から３００１Ｄａのポジティブイオンモード測定とネガティブイオンモード測定結果を比較したものを示した。ネガティブイオンモードではポジティブイオンモードでは測定しづらいリン酸化修飾ペプチドの質量スペクトルを測定することが可能である。
図４は、質量範囲２０５０Ｄａから２８００Ｄａまでの範囲の質量スペクトルの比較を示す図である。図４において、符号４１は、ポジティブイオンモードで測定されるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲペプチド由来のピークを示す。また、符号４２は、ネガティブイオンモードで測定されるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲペプチド由来のピークを示す。また、４３はネガティブイオンモードで測定されるリン酸化されたチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲペプチド由来のピークを示している。図４を見るとポジティブイオンモード測定とネガティブイオンモード測定に共通に観測されるピーク（図４の４１、図４の４２）と質量差＋８０Ｄａでネガティブイオンモード測定にのみ観測されるピーク（図４の４３）があることがわかる。ポジティブイオンモード測定とネガティブイオンモード測定に共通に観測されるピーク（図４の４１、図４の４２）の質量は、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６の５１２−５３０残基（ＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲ）のペプチドと質量が一致しており、ＦＱＳＳＨＨＰＴＤＩＴＳＬＤＱＹＶＥＲ中のセリン残基（Ｓ）、トレオニン残基（Ｔ）、チロシン残基（Ｙ）のいずれかがリン酸化修飾されていると考えられる。
したがって、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６のリン酸化を測定することは肝細胞がんの診断に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明においては、肝細胞がんたんぱく質マーカーとそれを用いた肝がん細胞を検出する方法とを提供することができる。
なお、本出願は、２００７年６月２０日に出願された日本国特許出願第２００７−１６２８５７号からの優先権を基礎として、その利益を主張するものであり、その開示の全てをここに取り込む。
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【国際調査報告】
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