(57)【要約】複数のヌクレオチド単位からなる核酸の塩基配列情報を維持したままで、化学的手段により、その核酸における複数種類の塩基を塩基種ごとに識別可能に標識する核酸塩基修飾法。この方法により提供される核酸塩基修飾体。この核酸塩基修飾体は本質的に１本鎖である。  本発明により、顕微鏡的手段で核酸のシ−ケンシングを行う新しい手段が提供される。
2009020249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドないしポリヌクレオチドである核酸における複数種類の塩基を、塩基配列を維持したままで、塩基種ごとに識別可能に修飾する核酸塩基修飾法。
【請求項２】
前記の核酸における複数種類の塩基を、下記の（１）又は（２）の手段により塩基種ごとに識別可能に修飾する請求の範囲１項に記載の核酸塩基修飾法。
（１）塩基の置換反応
（２）塩基の環構造拡張反応
【請求項３】
オリゴヌクレオチドないしポリヌクレオチドであり、塩基配列解析の対象とされる１本鎖の核酸であって、その核酸における複数種類の塩基が請求の範囲１項又は２項に記載の方法により塩基種ごとに識別可能に修飾された核酸塩基修飾体。
【請求項４】
複数のヌクレオチド単位からなる核酸における複数種類の塩基の内、特定種類の塩基を選択的に遊離させ、次いでこれらの塩基が結合していた位置に同一種の標識化合物を導入する核酸塩基修飾法。
【請求項５】
前記核酸塩基修飾法において、核酸における複数種類の塩基の一種類ごとに核酸塩基修飾法のプロセスを繰り返して行い、その際、塩基の一種類ごとに互いに識別して検出できる異種の標識化合物を導入する請求の範囲４項に記載の核酸塩基修飾法。
【請求項６】
前記核酸塩基修飾法において、複数種類の塩基が、少なくともアデニン及びグアニンを包含するプリン塩基と、少なくともシトシン、チミン及びウラシルを包含するピリミジン塩基との２種類の塩基である請求の範囲４項又は５項に記載の核酸塩基修飾法。
【請求項７】
前記核酸塩基修飾法において、特定種類の塩基を選択的に遊離させる手段が少なくとも下記のいずれか１以上の手段を含む請求の範囲４項〜６項のいずれかに記載の核酸塩基修飾法。
（１）プリン塩基の選択的遊離に関しては、Ｈ型の陽イオン交換樹脂、強酸、又はメチル化剤共存下強酸を用いることによって遊離させる方法。
（２）ピリミジン塩基の選択的遊離に関しては、ヒドラジン、又はメチルヒドラジンを用いて遊離させる方法。
（３）グアニンの選択的遊離に関しては、ルイス酸又はメチル化剤存在下強酸を用いて遊離させる方法。
（４）アデニンの選択的遊離に関しては、ＨＣＯＯＨ型、ＨＣｌ型、ＣＨ３ＣＯＯＨ型、Ｃ６Ｆ５ＯＨ型、ＣＣｌ２ＣＯＯＨ型、ＣＣｌ３ＣＯＯＨ型又は−ＳＯ３Ｈ型のいずれかのイオン交換樹脂を用いて遊離させる方法、又は０．１〜１Ｍの強酸水溶液に供する方法。この強酸には少なくとも塩酸、硫酸、硝酸が包含される。
（５）シトシンの選択的遊離に関しては、ルイス酸−強酸混合物を用いて遊離させる方法、シトシンのアミノ基をアルキル化、あるいはアシル化したのちに強酸に供する方法、ＮａＣｌ存在下ヒドラジンを作用させる方法。
（６）チミン又はウラシルの選択的遊離に関しては、４位のＣ＝Ｏ結合をアルキル化あるいはスルホニル化する方法と、５，６位のＣ＝Ｃ結合とエチレン、アセチレン化合物との協奏的環化する方法。
【請求項８】
前記核酸塩基修飾法において、標識化合物を導入する方法が、塩基遊離部位の水酸基に対する標識化アミノ化合物による還元的アミノ化反応である請求の範囲４項〜７項のいずれかに記載の核酸塩基修飾法。
【請求項９】
前記核酸塩基修飾法において、標識化アミノ化合物がモノアミノウンデカゴ−ルドである請求の範囲８項に記載の核酸塩基修飾法。
【請求項１０】
前記核酸塩基修飾法において、標識化アミノ化合物が、標識導入用のリンカ−としてのアミノエタノ−ルと標識が結合したもの、あるいは蛍光色素である１−アミノメチルピレン、カンタムドット、少なくともＴＥＭＰＯを含有するスピン標識、少なくともＴＥＴを包含する有機系色素、又は蛍光性蛋白質である請求の範囲８項に記載の核酸塩基修飾法。
【請求項１１】
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドにおいて、該アデニンが下記一般式
【化１】
2009020249.tif 000026
で表される修飾アデニンに変換され、該グアニンが下記一般式
【化２】
2009020249.tif 000027
で表される修飾グアニンに変換され、該シトシンが下記一般式
【化３】
2009020249.tif 000028
で表される修飾シトシンに変換された（上記各式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ１及びＲ２は共同して５又は６員環を形成してもよく、Ｒ３及びＲ４は共同して５又は６員環を形成してもよく、但し、Ｒ１及びＲ２はＲ３及びＲ４とは異なり、Ｙは水素原子又は水酸基を表す。）、核酸塩基修飾体。
【請求項１２】
更に、前記修飾アデニンあるいは修飾グアニンが下記一般式
【化４】
2009020249.tif 000029
（式中、Ｙは上記と同様を表す。）で表される修飾体に変換された請求の範囲１１項に記載の核酸塩基修飾体。
【請求項１３】
請求の範囲１１項に記載の核酸塩基修飾体を製造するための核酸塩基修飾法であって、水溶液中でアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドに下記一般式
ＣＨＣｌＲ１ＣＯＲ２
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ１及びＲ２は共同して５又は６員環を形成してもよい。）で表される第１のハロゲン化カルボニル化合物を反応させる段階、及び次にｐＨ２．０〜４．５に調製された水溶液中で下記一般式
ＣＨＸＲ３ＣＯＲ４
（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ３及びＲ４は共同して５又は６員環を形成してもよく、ただし、Ｒ３及びＲ４はＲ１及びＲ２とは異なり、ＸはＢｒ、Ｉ又はアルキルスルホン酸エステルを表す。）で表される第２のハロゲン化カルボニル化合物、あるいは下記化学式５の一般式で表されるベンゾキノン誘導体（Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、はそれぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ５及びＲ６は共同して５又は６員環を形成してもよい）を反応させる段階からなる核酸塩基修飾法。
【化５】
2009020249.tif 000030
【請求項１４】
請求の範囲１２項に記載の核酸塩基修飾体を製造するための前記核酸塩基修飾法であって、更にｐＨを１．０〜７．０に調整する段階を含む請求の範囲１３項に記載の核酸塩基修飾法。
【請求項１５】
前記第１のハロゲン化カルボニル化合物がクロロアセトアルデヒドであり、前記第２のハロゲン化カルボニル化合物が２−ブロモシクロヘキサノンあるいはｐ−ベンゾキノンである請求の範囲１３項又は１４項に記載の核酸塩基修飾法。
【請求項１６】
アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はウラシルを含むポリヌクレオチドに対してｐ−ベンゾキノンをｐＨ３．０より低いｐＨで処理することにより、アデニン、シトシンの各塩基にエテノ化反応を起こさせると共にエテノ化されたアデニンのみを遊離させ、下記の化学式６に示す核酸塩基修飾体を得る核酸塩基修飾法。
【化６】
2009020249.tif 000031
（上記化学式６において、式中のｋ、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ０以上の整数を表し、かつ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎの合計は２以上で３．０×１０８以下の整数である。又、ｋ、ｌ、ｍ、ｎで表されるヌクレオチド単位の配列順序は順不同である。）
【請求項１７】
アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はウラシルを含むポリヌクレオチドに対してｐ−ベンゾキノンをｐＨ４．５〜６．５で処理することにより、アデニン及びシトシンを優先的にエテノ化反応させ、下記の化学式７に示す核酸塩基修飾体を得る核酸塩基修飾法。
【化７】
2009020249.tif 000032
（上記の下記化学式７において、式中のｋ、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ０以上の整数を表し、かつ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎの合計は２以上で３．０×１０８以下の整数である。又、ｋ、ｌ、ｍ、ｎで表されるヌクレオチド単位の配列順序は順不同である。）
【請求項１８】
請求の範囲１６項に記載の化学式６又は請求の範囲１７項に記載の化学式７で示される核酸塩基修飾体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のヌクレオチド単位からなる核酸の塩基配列情報を維持したままで、化学的手段により、その核酸における複数種類の塩基を塩基種ごとに識別可能とする核酸塩基修飾法と、この方法により提供される本質的に１本鎖である核酸塩基修飾体に関する。
上記の核酸塩基修飾法には、置換修飾法と拡張修飾法とが含まれる。
置換修飾法とは、核酸における複数種類の塩基を塩基種ごとに識別可能な標識化合物に置換する方法であって、オリゴヌクレオチドないしポリヌクレオチドであるＤＮＡ又はＲＮＡにおける特定種類の塩基のみを選択的に遊離させて、その遊離部位に標識された化合物を導入することにより、当該ＤＮＡ又はＲＮＡに関する配列情報その他の核酸塩基情報を取得可能とした方法である。
拡張修飾法は、核酸における複数種類の塩基を塩基種ごとに識別可能な塩基環数に構造変換させる方法であって、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はウラシルを含むポリヌクレオチドを、４種の塩基が識別可能なように異なる塩基環数に修飾する方法である。
【背景技術】
【０００２】
従来より、多様な研究分野と産業分野において、ＤＮＡやＲＮＡであるオリゴヌクレオチドないしポリヌクレオチド（核酸）の配列情報などを簡易かつ迅速に得ることができる手段が強く求められている。
又、近年、生体内で比較的短い二本鎖ＲＮＡが強力な遺伝子サイレンス効果を示すという発見に端を発したＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる研究・技術分野が急速に拡大している。ＲＮＡｉの分野では、比較的短いオリゴヌクレオチドである上記二本鎖ＲＮＡについての配列情報等の簡易で迅速な取得手段が極めて重要な意味を持つ。
ところで、従来は、例えば周知のマクサムギルバート法のように、核酸塩基を塩基種選択的に修飾又は化学変換する方法は知られている。
又、下記の特許文献１には、還元糖末端を、２−アミノピリジンなどを還元剤と共に作用させて標識する技術が開示されている。
［文献１］特開２００７−０３８１３０
しかし、上記のマクサムギルバート法では、対象核酸鎖中の唯一つの核酸塩基を遊離させたのちに、当該部分を基点に塩基性条件下で鎖の切断を行うものであって、対象核酸鎖中の同一核酸塩基全てを置換標識するものではない。
又、上記の特許文献１では、単に還元糖末端を還元的アミノ化反応により標識する糖鎖標識技術の一種を開示するに過ぎず、要素技術としては本発明の目的と関連する部分もあるが、本質的に本発明との接点は余りない。
一方、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンを含むポリ又はオリゴデオキシリボヌクレオチドやアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルを含むポリ又はオリゴリボヌクレオチドを、クロロアセトアルデヒドと反応させて、そのアデニンとシトシンを修飾することが知られている（下記の文献２）。このような修飾されたヌクレオシドは、蛍光発光性を有し、オリゴヌクレオチド自動合成装置用のモノマーに変換された後、同装置上で、オリゴヌクレオチドに導入された後、蛍光性核酸プローブ等に用いられてきた（下記の文献３）。
［文献２］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１９，３４９９−３５０６（１９７２）
［文献３］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１９，５６２６−５６３５（１９８７）
しかし、文献２の方法は、簡易かつ確実な方法であるが、アデニンとシトシンのみを修飾するに限られ、この方法だけでは、ＤＮＡやＲＮＡを構成する全ての塩基を識別することはできなかった。
本発明者らのグループは、ＤＮＡやＲＮＡを構成する塩基に標識を付して、電子顕微鏡によりＤＮＡやＲＮＡの配列を解析する検討を行っており、簡便にＤＮＡやＲＮＡを構成する各塩基を標識する方法が求められていた。
【発明の開示】
【０００３】
そこで本発明は、塩基種同士を相互に識別可能に核酸塩基を修飾し、これによって、核酸における塩基数の定量や分布情報、塩基配列情報の取得と天然修飾塩基の検出等を行うことができる修飾技術の開発と、その結果として生成する修飾核酸を提供することを課題とする。
［文献４］Ａ．Ｃｈｅｎｎｅａら，「Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐ−Ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ−２’−Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｐ−Ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ−２’−Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．８，８６５−８７４（１９９５）
［文献５］Ｌｕｂｏｗ  Ｊｏｗａら，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ−Ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ」，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＴＯＸＩＣＯＲＯＧＹ，ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，４７−５４（１９９０）
本発明者は、従来の計測技術において区別することのできなかった核酸塩基の検出を実現することを目的として化学処理を施し、核酸塩基を塩基種ごとに識別可能な標識化合物に置換することで、従来の計測技術の利用により配列情報等の取得が可能となる核酸の修飾法（置換修飾法）について発明した。
次に本発明者は、前記の文献２に記載された、クロロアセトアルデヒドによりＤＮＡを修飾する方法を詳細に検討した結果、反応条件を変更することにより、この方法では修飾することのできなかったグアニンを同様のハロゲン化カルボニル化合物あるいはベンゾキノン化合物（上記文献４及び文献５）により修飾することができることを見出し、２種のハロゲン化カルボニル化合物あるいは１種のハロゲン化カルボニル化合物を用いて、反応条件を変更した２段階あるいは特定の塩基の選択的離脱を含む３段階でポリヌクレオチドを修飾することにより、アデニンとシトシンを第１のハロゲン化カルボニル化合物で修飾し、次にグアニンを第２のハロゲン化カルボニル化合物あるいはベンゾキノン化合物で修飾することができることを見出した。その結果、ポリヌクレオチドは、修飾されたアデニン、グアニン及びシトシンと未修飾のチミン又はウラシルとから構成されることになり、構成塩基を識別することが可能になった一方、ベンゾキノン化合物は反応条件を詳細に検討することによりアデニンとシトシンを選択的に修飾し、構成塩基の識別が可能となった（拡張修飾法）。
（第１発明）
本願の第１発明は、オリゴヌクレオチドないしポリヌクレオチドである核酸における複数種類の塩基を、塩基配列を維持したままで、塩基種ごとに識別可能に修飾する、核酸塩基修飾法である。
以上の第１発明及び以下に述べる各発明において、「塩基種ごとに識別可能に修飾する」とは、例えばプリン塩基とピリミジン塩基を互いに識別可能な異なる態様で修飾することを言い、あるいは、例えばアデニン、グアニン、シトシン及びチミン（又はウラシル）を互いに識別可能な異なる態様で修飾することを言う。又、核酸に含まれる特定種類の複数の塩基の全てに対して、即ち１００％の確率でこのような修飾が行われることが、特に好ましい。但し、本発明の目的を実質的に達成するためには、９５％以上の確率で、より好ましくは９９％以上の確率で、このような修飾が行われていれば足りる。
（第２発明）
本願の第２発明は、前記第１発明に係る核酸における複数種類の塩基を、下記の（１）又は（２）の手段により塩基種ごとに識別可能に修飾する、核酸塩基修飾法である。
（１）塩基の置換反応
（２）塩基の環構造拡張反応
（第３発明）
本願の第３発明は、オリゴヌクレオチドないしポリヌクレオチドであり、塩基配列解析の対象とされる１本鎖の核酸であって、その核酸における複数種類の塩基が第１発明又は第２発明に記載の方法により塩基種ごとに識別可能に修飾された、核酸塩基修飾体である。
（第４発明）
本願の第４発明は、複数のヌクレオチド単位からなる核酸における複数種類の塩基の内、特定種類の塩基を選択的に遊離させ、次いでこれらの塩基が結合していた位置に同一種の標識化合物を導入する、核酸塩基修飾法である。
この第４発明において、特定種類の塩基の選択的な遊離や標識化合物の導入は、核酸に含まれる特定種類の複数の塩基に対して１００％の確率で行われることが特に好ましいが、発明の目的を実質的に達成するためには、９５％以上の確率で、より好ましくは９９％以上の確率で行われていれば足りる。
（第５発明）
本願の第５発明は、前記第４発明に係る核酸塩基修飾法において、核酸における複数種類の塩基の一種類ごとに核酸塩基修飾法のプロセスを繰り返して行い、その際、塩基の一種類ごとに互いに識別して検出できる異種の標識化合物を導入する、核酸塩基修飾法である。
（第６発明）
本願の第６発明は、前記第４発明又は第５発明に係る核酸塩基修飾法において、複数種類の塩基が、少なくともアデニン及びグアニンを包含するプリン塩基と、少なくともシトシン、チミン及びウラシルを包含するピリミジン塩基との２種類の塩基である、核酸塩基修飾法である。
（第７発明）
本願の第６発明は、前記第４発明〜第６発明のいずれかに係る核酸塩基修飾法において、特定種類の塩基を選択的に遊離させる手段が少なくとも下記のいずれか１以上の手段を含む、核酸塩基修飾法である。
（１）プリン塩基の選択的遊離に関しては、Ｈ型の陽イオン交換樹脂、強酸、又はメチル化剤共存下強酸を用いることによって遊離させる方法。
（２）ピリミジン塩基の選択的遊離に関しては、ヒドラジン、又はメチルヒドラジンを用いて遊離させる方法。
（３）グアニンの選択的遊離に関しては、ルイス酸又はメチル化剤存在下強酸を用いて遊離させる方法。
（４）アデニンの選択的遊離に関しては、ＨＣＯＯＨ型、ＨＣｌ型、ＣＨ３ＣＯＯＨ型、Ｃ６Ｆ５ＯＨ型、ＣＣｌ２ＣＯＯＨ型、ＣＣｌ３ＣＯＯＨ型又は−ＳＯ３Ｈ型のいずれかのイオン交換樹脂を用いて遊離させる方法、又は０．１〜１Ｍの強酸水溶液に供する方法。この強酸には少なくとも塩酸、硫酸、硝酸が包含される。
（５）シトシンの選択的遊離に関しては、ルイス酸−強酸混合物を用いて遊離させる方法、シトシンのアミノ基をアルキル化、あるいはアシル化したのちに強酸に供する方法、ＮａＣｌ存在下ヒドラジンを作用させる方法。
（６）チミン又はウラシルの選択的遊離に関しては、４位のＣ＝Ｏ結合をアルキル化あるいはスルホニル化する方法と、５，６位のＣ＝Ｃ結合とエチレン、アセチレン化合物との協奏的環化する方法。
（第８発明）
本願の第８発明は、前記第４発明〜第７発明のいずれかに係る核酸塩基修飾法において、標識化合物を導入する方法が、塩基遊離部位の水酸基に対する標識化アミノ化合物による還元的アミノ化反応である、核酸塩基修飾法である。
（第９発明）
本願の第９発明は、前記第８発明に係る核酸塩基修飾法において、標識化アミノ化合物がモノアミノウンデカゴールドである、核酸塩基修飾法である。
（第１０発明）
本願の第１０発明は、前記第８発明に係る核酸塩基修飾法において、標識化アミノ化合物が、標識導入用のリンカーとしてのアミノエタノールと標識が結合したもの、あるいは蛍光色素である１−アミノメチルピレン、カンタムドット、少なくともＴＥＭＰＯを含有するスピン標識、少なくともＴＥＴを包含する有機系色素、又は蛍光性蛋白質である、核酸塩基修飾法である。
（第１１発明）
本願の第１１発明は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドにおいて、該アデニンが下記一般式
【化１】
2009020249.tif 000003
で表される修飾アデニンに変換され、該グアニンが下記一般式
【化２】
2009020249.tif 000004
で表される修飾グアニンに変換され、該シトシンが下記一般式
【化３】
2009020249.tif 000005
で表される修飾シトシンに変換された（上記各式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ１及びＲ２は共同して５又は６員環を形成してもよく、Ｒ３及びＲ４は共同して５又は６員環を形成してもよく、但し、Ｒ１及びＲ２はＲ３及びＲ４とは異なり、Ｙは水素原子又は水酸基を表す。）、核酸塩基修飾体である。
（第１２発明）
本願の第１２発明は、更に前記第１１発明に係る修飾アデニンあるいは修飾グアニンが下記一般式
【化４】
2009020249.tif 000006
（式中、Ｙは上記と同様を表す。）で表される修飾体に変換された、核酸塩基修飾体である。
（第１３発明）
本願の第１３発明は、第１１発明に記載の核酸塩基修飾体を製造するための核酸塩基修飾法であって、水溶液中でアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドに下記一般式
ＣＨＣｌＲ１ＣＯＲ２
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ１及びＲ２は共同して５又は６員環を形成してもよい。）で表される第１のハロゲン化カルボニル化合物を反応させる段階、及び次にｐＨ２．０〜４．５に調製された水溶液中で下記一般式
ＣＨＸＲ３ＣＯＲ４
（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ３及びＲ４は共同して５又は６員環を形成してもよく、ただし、Ｒ３及びＲ４はＲ１及びＲ２とは異なり、ＸはＢｒ、Ｉ又はアルキルスルホン酸エステルを表す。）で表される第２のハロゲン化カルボニル化合物、あるいは下記化学式５の一般式で表されるｐ−ベンゾキノン誘導体（Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７はそれぞれ水素原子又は炭化水素基を表し、Ｒ５及びＲ６は共同して５又は６員環を形成してもよい）を反応させる段階からなる、核酸塩基修飾法である。
【化５】
2009020249.tif 000007
（第１４発明）
本願の第１４発明は、第１２発明に記載した核酸塩基修飾体を製造するための、前記第１３発明に係る核酸塩基修飾法であって、更にｐＨを４．５〜７．０に調整する段階を含む、核酸塩基修飾法である。
（第１５発明）
本願の第１５発明は、前記第１３発明又は第１４発明に係る第１のハロゲン化カルボニル化合物がクロロアセトアルデヒドであり、第２のハロゲン化カルボニル化合物が２−ブロモシクロヘキサノンあるいはｐ−ベンゾキノンである、核酸塩基修飾法である。
（第１６発明）
本願の第１６発明は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はウラシルを含むポリヌクレオチドに対してｐ−ベンゾキノンをｐＨ３．０より低いｐＨで処理することにより、アデニン、シトシンの各塩基にエテノ化反応を起こさせると共にエテノ化されたアデニンのみを遊離させ、下記の化学式６に示す核酸塩基修飾体を得る、核酸塩基修飾法である。なお、化学式６は、後述する図１６の反応式における（２）を省略して示したものであり、化学式７に示す中間反応段階を経由してもよい。
【化６】
2009020249.tif 000008
上記化学式６において、式中のｋ、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ０以上の整数を表し、かつ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎの合計は２以上で３億以下の整数である。又、ｋ、ｌ、ｍ、ｎで表されるヌクレオチド単位の配列順序は順不同である。
なお、この明細書において、「エテノ化反応」とは、天然型の核酸塩基をエテノ塩基に拡張する反応をいう。
（第１７発明）
本願の第１７発明は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はウラシルを含むポリヌクレオチドに対してｐ−ベンゾキノンをｐＨ４．５より高いｐＨで処理することにより、アデニン及びシトシンを優先的にエテノ化反応させ、下記の化学式７に示す核酸塩基修飾体を得る、核酸塩基修飾法である。
なお、下記化学式７において、式中のｋ、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ０以上の整数を表し、かつ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎの合計は２以上で１００億以下の整数である。又、ｋ、ｌ、ｍ、ｎで表されるヌクレオチド単位の配列順序は順不同である。
【化７】
2009020249.tif 000009
（第１８発明）
本願の第１８発明は、第１６発明に記載の化学式６又は第１７発明に記載の化学式７で示される、核酸塩基修飾体である。
（発明の効果）
以上の第１発明〜第１８発明によれば、ポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドについて、簡易かつ高効率な化学的方法により、その核酸塩基を塩基種ごとに識別可能な標識化合物に置換し、あるいは核酸塩基に塩基種ごとに識別可能な構造変換を起こさせることができる。ここで、「塩基種ごとに識別可能な構造変換」とは、顕微鏡的手段等の適宜な解析手段あるいは計測手段により、塩基種ごとに、塩基部分の原子団の大きさの違いを識別できるように構造変換を起こさせることを言う。そのような構造変換の代表的な形態が、塩基種ごとに環構造の環の数が異なるように構造変換させることである。
従って、従来の計測技術を利用して配列情報等の取得が可能となる核酸塩基修飾体が提供され、そのポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドの配列情報を損なうことなく、塩基数の定量や分布情報、塩基配列情報の取得と天然修飾塩基の検出等を行うことができる。
しかも、これらの核酸塩基修飾体の各塩基は修飾により相補的な塩基対を形成する性質を失うので、自動的に二重鎖が解消して、一分子配列解析に必須である１本鎖の状態となる。即ち、従来法のように１本鎖への解離および水素結合に基づく分子内高次構造の解消のために大量の解離剤を投入するなどの面倒を要しない。更に、全塩基標識された核酸塩基修飾体は、カ−ボンナノチュ−ブを市販の分散剤よりも効率良く分散させることができるという特徴も有する。
なお、核酸塩基をプリン塩基とピリミジン塩基との２種類の塩基種選択的に置換修飾できる場合には、後述するように少なくともポリＡ配列を含むＲＮＡ等の核酸断片の各種の解析に有効であり、例えばポリＡ配列を含むＲＮＡ等の核酸断片において、少なくとも核酸の構造（例えば鎖長等の情報を含む）を維持したまま、核酸中の単一種類の全ての塩基が標識化合物によって置換された核酸塩基置換修飾体を得ることができる。このような核酸塩基置換修飾体を利用することにより、ｍＲＮＡのポリＡ配列についてその長さの同定と定量、あるいはＲＮＡのキャップ構造の検出等の新しい可能性が得られる。
更に、置換修飾法においては、標識剤（標識化合物）に対する汎用性が高く、アミノ基を持つ現存のほとんどの標識を導入できる。実際に、実施例欄で後述するように、金属クラスタ−によるオリゴヌクレオチドの多点標識に成功しているが、この金属クラスタ−標識核酸は、プログラマブルな金属ナノワイヤ−として期待される化合物でもある。
次に、拡張修飾法においては一度の処理で各塩基に塩基環数の違いを持たせることにより、各塩基間に約３０％の体積差を持たせることができ、顕微鏡やナノポア電流検出等の体積差を検出する技術に対して極めて有効である。
全ての拡張修飾法において修飾されたポリヌクレオチド中の４種類の塩基は、例えば、下記のような手段で識別することが可能である。
（１）たとえば、環の数が異なると体積に大きな差が生じ、原子間力顕微鏡のような大きさを見分ける顕微鏡において識別可能である。
（２）また、誘電率に関しても大きな差が生じ、透過型電子顕微鏡や走査型トンネル電流顕微鏡、ナノメ−トルオ−ダ−の穴の電流値変化を検出する装置等において塩基種の識別が可能である。
（３）修飾を受けた塩基は蛍光発光性を有し、エキソヌクレア−ゼや化学的手法によって末端から遊離した１単位のヌクレオチドの蛍光特性を検出することで識別が可能である。
また、識別にあたっては一本鎖への解離が必要であるが、本手法では修飾によって塩基対の形成を妨げることから、二本鎖の核酸断片に適用すれば修飾を受けて自動的に１本鎖となり、水素結合に基づく分子内高次構造の形成もなくなるため、検出感度を低下させる解離剤を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
第１図は、金クラスタ−で多点ラベルされたオリゴヌクレオチド（ｄＡ２０）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。第２図は、金クラスタ−で多点ラベルされたオリゴヌクレオチド（ｄＡ２０−１００）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。上の像と下の像では観察する視野が異なる。第３図は、金クラスタ−で多点ラベルされたオリゴヌクレオチド（ｄＡＴ９ＡＴ８Ａ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。上図は原図、下図は説明を加えた図である。第４図は、第２実施例群の実施例１で４つの基本核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが修飾される反応の概略を示す図である。数字は各段階におけるオリゴヌクレオチドの形態を表し、（１）は反応前、（２）は第１段階の修飾後、（３）は第２段階の修飾の中間状態、（４）は第２段階の修飾後を示す。第５図は、第２実施例群の実施例１で得たオリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフ図である。グラフ中の（１）〜（３）の数字は段階を表し、（１）は反応前、（２）は第１段階の修飾後、（３）は第２段階の修飾後の高速液体クロマトグラフ図を示す。第６図は、第２実施例群の実施例１の第１段階の修飾後のオリゴヌクレオチドの質量分析スペクトルを示す。第７図は、第２実施例群の実施例１の第２段階の修飾後のオリゴヌクレオチドの質量分析スペクトルを示す。第８図は、第２実施例群の実施例２の原料と修飾後のオリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフ図、吸収スペクトル（ＵＶ−Ｖｉｓ）、円二色性分散スペクトル（ＣＤ）を示す。第９図は、第２実施例群の実施例３の原料と修飾後のオリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフ図を示す。第１０図は、第２実施例群の実施例４の修飾後のＤＮＡの酵素分解後の高速液体クロマトグラフ図を示す。第１１図は、第２実施例群の実施例４における修飾ＤＮＡとカーボンナノチューブの複合体のＡＦＭ像を示す。第１１図の左側の写真は修飾ＤＮＡとカーボンナノチューブ複合体のＡＦＭ像、右側上段のグラフはＣ点−Ｄ点間のヒストグラムを表したもの、右側中段のグラフはＥ点−Ｆ点間のヒストグラムを表したもの、右側下段のグラフはＧ点−Ｈ点間のヒストグラムを表したものである。第１２図は、第２実施例群の実施例４の修飾後のＤＮＡとカ−ボンナノチュ−ブの複合体の動的光散乱測定図を示す。第１３図は、第３実施例群で４つの基本核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが修飾される反応の概略を示す図である。数字は各段階におけるオリゴヌクレオチドの形態を表し、（１）は反応前、（２）は第１段階の修飾後、（３）は第２段階の修飾後、（４）は第３段階の修飾後を示す。第１４図は、第３実施例群の第２段階の修飾後のオリゴヌクレオチドの質量分析スペクトルを示す。第１５図は、第３実施例群の第３段階の修飾後のオリゴヌクレオチドの質量分析スペクトルを示す。第１６図は、第４実施例群で４つの基本核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが修飾される反応の概略を示す図である。数字は各段階におけるオリゴヌクレオチドの形態を表し、（１）は反応前、（２）は第１段階の修飾後、（３）は第２段階の修飾後を示す。第１７図は、第４実施例群実施例１の第１段階の修飾後のオリゴヌクレオチドの質量分析スペクトルを示す。第１８図は、第４実施例群実施例１の第２段階の修飾後のオリゴヌクレオチドの質量分析スペクトルを示す。第１９図は、第４実施例群実施例２の修飾後のオリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフ図を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
次に本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。本発明の技術的範囲はこれらの実施形態によって限定されない。
（第１の置換修飾法の実施形態）
第１の置換修飾法の実施形態の概要を、下記の化学式８の一般式によって示す。まず、式中の「Ｂ」で示す天然核酸塩基又は非天然核酸塩基を適宜な塩基遊離手段を作用させて遊離させ、ヘミアセタ−ル型のリボ−ス残基を生成させた後に、還元的アミノ化などの方法により、リボ−ス環の開環を伴いながら、塩基が結合していた位置に、式中の「Ｌａｂｅｌ」の文字で示す標識化合物を導入する。
標識化合物に関しては、一級あるいは二級アミノ基を有する化合物を導入することが可能であり、現存する標識化合物のほとんどを導入できる。また、核酸塩基を標識化合物で置換することにより、塩基対形成に基づく分子内多次構造や二重鎖の形成を阻害して、分子内に多次構造を有しない一本鎖とする、あるいは塩基対形成とは異なる鎖間の相互作用や結合の付与によって分子内多次構造の構築や二重鎖を高度に安定化することができる。
この方法によって、例えばポリＡ配列を含むＲＮＡ等の核酸断片において、少なくとも核酸の構造（例えば鎖長等の情報を含む）を維持したまま、核酸中の単一種類の全ての塩基が標識化合物によって置換された核酸塩基修飾体を得ることができる。このような核酸塩基修飾体を利用することにより、ｍＲＮＡのポリＡ配列についてその長さの同定と定量、あるいはＲＮＡのキャップ構造の検出等の新しい可能性が得られる。
【化８】
2009020249.tif 000010
置換修飾法の概要
次に、本実施形態の置換修飾法の概要を説明する。上記の化学式８の一般式に示すヌクレオチド単位が複数ないし多数繰り返されるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを考えるとき、ポリＡ配列のような特殊な場合を除き、その核酸における塩基「Ｂ」としては、通常、ヌクレオチド単位ごとに４種類の塩基のいずれかがランダムな順序で結合している。
これらの塩基の内、例えばアデニンのみを選択的に遊離させ得る選択的遊離手段を作用させると、核酸における塩基「Ｂ」がアデニンであるヌクレオチド単位においてのみ、一斉に、化学式８の一般式で示す塩基の遊離が起こる。従って、これらのヌクレオチド単位においてのみ、一斉に、上記の標識化合物の導入を行うことができる。
上記のプロセスを完了した核酸に対して、次に、例えばグアニンのみを選択的に遊離させ得る選択的遊離手段を作用させて、核酸における塩基「Ｂ」がグアニンであるヌクレオチド単位においてのみ、一斉に、標識化合物の導入を行うことができる。その際、アデニンの場合とグアニンの場合とで、互いに識別して検出できる異種の標識化合物を導入することができる。
このようなプロセスの繰り返しにより、核酸中の４種類の塩基を全て、塩基種ごとに異なる標識化合物に置換することができる。核酸中に４種類の塩基の全てが含まれてはいない場合も同様である。その他にも、例えばプリン塩基とピリミジン塩基とを選択的に遊離させ得る選択的遊離手段を作用させることにより、これら２種類の塩基を全て、２種類の塩基種ごとに異なる標識化合物に置換することもできる。
この方法によって、核酸の構造（例えば鎖長、配列情報、塩基の種別含量等の豊富な情報を含む）を維持したままで、核酸中の４種類の塩基が全て、その塩基種に対応した特定の標識化合物によって置換された核酸塩基修飾体を得ることができる。
核酸塩基修飾体の利用
このような核酸塩基修飾体を利用することにより、例えば以下のことが可能となる。
１）各塩基間で大きさの異なる標識化合物を導入した場合、大きさを見分ける計測技術、たとえば原子間力顕微鏡によって核酸の一分子配列解析技術が実現する。
２）各塩基間で誘電率の異なる標識化合物を導入した場合、誘電率を見分ける計測技術、たとえば走査型トンネル電流顕微鏡や、微細穴（ナノポア）の電流値を計測する装置等によって核酸の一分子配列解析技術が実現する。
３）各塩基間で蛍光発光特性の異なる標識化合物を導入した場合、核酸末端分解酵素と電気泳動、蛍光検出によって核酸の一分子配列解析技術が実現する。
４）各塩基間で異なる金属種のクラスタ−を導入した場合、導電率を核酸配列によって制御する１ｎｍ以下の線幅の導電体が実現し、また、枝分かれＲＮＡを原料とし、半導体性の金属を標識剤として用いた場合、電子回路となる。
本発明において「核酸」とは、複数のヌクレオチド単位からなるオリゴヌクレオチドないしはポリヌクレオチドをいう。「複数」とは２以上の数値をいう。核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが包含され、かつ１本鎖及び２本鎖以上のものが包含される。特に１本鎖のものが好ましい。
塩基を選択的に遊離させる手段
核酸中の特定種類の塩基を選択的に遊離させる手段としては、少なくとも下記のいずれかの手段、あるいはこれらの手段の２以上の組み合わせが特に好ましく含まれる。
（１）プリン塩基の選択的遊離に関しては、Ｈ型の陽イオン交換樹脂、強酸、又はメチル化剤共存下強酸を用いることによって遊離させる方法。
（２）ピリミジン塩基の選択的遊離に関しては、ヒドラジン、又はメチルヒドラジンを用いて遊離させる方法。
（３）グアニンの選択的遊離に関しては、塩化アルミニウム又は塩化スズ、トリメチルシリルトリフリック酸等のルイス酸、又はヨウ化メチルやジメチル硫酸と塩酸、ジメチル硫酸とジメチル硫酸緩衝液、硫酸や硝酸の希薄水溶液を用いて遊離させる方法。希薄水溶液とは０．０５Ｍ以下の濃度を指す。
（４）アデニンの選択的遊離に関しては、ＨＣＯＯＨ型、ＨＣｌ型、ＣＨ３ＣＯＯＨ型、Ｃ６Ｆ５ＯＨ型、ＣＣｌ２ＣＯＯＨ型、ＣＣｌ３ＣＯＯＨ型又は−ＳＯ３Ｈ型のいずれかのイオン交換樹脂を用いて遊離させる方法、又は０．１〜１Ｍの強酸水溶液に供する方法。この強酸には少なくとも塩酸、硫酸、硝酸が包含される。
（５）シトシンの選択的遊離に関しては、ルイス酸−強酸混合物を用いて遊離させる方法、シトシンのアミノ基をアルキル化、あるいはアシル化したのちに強酸に供する方法、ＮａＣｌ存在下ヒドラジンを作用させる方法。
（６）チミン又はウラシルの選択的遊離に関しては、４位のＣ＝Ｏ結合をアルキル化あるいはスルホニル化する方法と、５，６位のＣ＝Ｃ結合とエチレン、アセチレン化合物との協奏的環化する方法。
標識化合物の種類及び導入方法
この実施形態で用いる標識化合物としては、公知の任意の手段により測定あるいは検出が可能な標識部（ラベリングされた部分）と、核酸における塩基遊離部位に対して結合が可能な官能基部分とを備える限りにおいて、限定されない。
好ましい標識化合物の種類及び導入方法の一例として、塩基遊離部位の水酸基に対する標識化アミノ化合物による還元的アミノ化反応を挙げることができる。
標識化アミノ化合物としては、標識導入用のリンカ−としてのアミノエタノ−ルと標識が結合したもの、あるいは、蛍光色素である１−アミノメチルピレン、カンタムドット、少なくともＴＥＴを包含する有機系色素、少なくともＴＥＭＰＯを含有するスピン標識、又は蛍光性蛋白質などが好ましく例示される。
又、標識化アミノ化合物として公知のモノアミノウンデカゴ−ルドを用いると、標識化の様子をＴＥＭ観察することができる。この場合の概略的な反応式を以下の化学式９に示す。化学式９において、「Ａｕ」は，金属クラスタ−ラベル即ちアミノ末端化ウンデカゴ−ルドを示す。
【化９】
2009020249.tif 000011
標識化合物の種類及び導入方法の他の例として、以下のものを列挙することができる。
ケトンおよびアルデヒド類は適切な還元剤存在下で一級あるいは二級アミンと還元的に反応して二級アミンあるいは三級アミンを生成する（還元的アミノ化反応）。還元糖末端やリボ−スをはじめとする糖類はヘミアセタ−ル型の閉環構造とアルデヒド型の開環構造の平衡関係にあり、アルデヒド型は同様の還元的アミノ化反応が進行する。
（第１の拡張修飾法の実施形態）
本実施形態に於いては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドを次の２段階の反応により修飾する。
第１段階：
この段階においては、アデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）を修飾する。
修飾に用いる第１のハロゲン化カルボニル化合物は下式で表される。
ＣＨＣｌＲ１ＣＯＲ２
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ水素原子又は炭化水素基、好ましくは水素原子を表す。この炭化水素基としては、アルキル基やアリ−ル基、好ましくはアルキル基が挙げられる。アルキル基としては、炭素数が６以下の直鎖アルキル基、アリ−ル基としてはフェニル基が挙げられる。またＲ１及びＲ２は共同して５又は６員環、好ましくは６員環を形成してもよい。この５又は６員環は脂肪環又は芳香環であってもよいが、脂肪環が好ましい。
この段階においては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドにこの第１のハロゲン化カルボニル化合物を反応させる。修飾されるポリヌクレオチドの長さは２〜３×１０８塩基、好ましくは２０〜３０００塩基対である。
第１のハロゲン化カルボニル化合物のこのポリヌクレオチドに対する反応性は、後述の第２のハロゲン化カルボニル化合物よりも低いため、第１のハロゲン化カルボニル化合物はアデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）とは反応し修飾するが、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）とは反応しない（文献１）。
反応条件は下記のとおりである。
反応溶媒：  水、水溶性有機溶媒、又は水と水溶性有機溶媒の混合物。水溶性有機溶媒はメタノ−ル又は、エタノ−ル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルカ−ボネ−ト、エチレンカ−ボネ−ト、エチレングリコ−ル、ジエチレングリコ−ルが好ましい。
ポリヌクレオチドの濃度：１μＭ〜１００ｍＭ（特に好ましくは、核酸塩基を濃度換算して０．１ｍＭ）
第１のハロゲン化カルボニル化合物の濃度：０．１Ｍ〜２．０Ｍ（特に好ましくは、０．１Ｍ）
ｐＨ：４〜７（特に好ましくは、ｐＨ５．５）
反応温度：２０〜４５℃（特に好ましくは、３７℃）
反応時間：１〜１４４時間（特に好ましくは、７２時間）
このｐＨ調整はトリエチルアミンをはじめとする各種アミンと酢酸、ギ酸をはじめとするカルボン酸の緩衝液やリン酸緩衝液などの各種緩衝液により行なう。特に好ましくは、酢酸ナトリウム緩衝液である。
この反応により、ポリヌクレオチド中のアデニン（Ａ）は下式に示すように修飾される。
【化１０】
2009020249.tif 000012
また、ポリヌクレオチド中のシトシン（Ｃ）は下式に示すように修飾される。
【化１１】
2009020249.tif 000013
第２段階：
この段階においては、グアニン（Ｇ）を修飾する。
修飾に用いる第２のハロゲン化カルボニル化合物は下式で表される。
ＣＨＸＲ３ＣＯＲ４
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ水素原子又は炭化水素基を表す。この炭化水素基としては、アルキル基やアリ−ル基、好ましくはアルキル基が挙げられる。アルキル基としては、炭素数が６以下の直鎖アルキル基、アリ−ル基としてはフェニル基が挙げられる。またＲ３及びＲ４は共同して５又は６員環、好ましくは６員環を形成してもよい。この５又は６員環は脂肪環又は芳香環であってもよいが、脂肪環が好ましい。ＸはＢｒ、Ｉ又はアルキルスルホン酸エステルを表す。アルキルスルホン酸のアルキル基はメチル基、エチル基、トリフルオロメチル基、フェニル基、メシチル基などである。
ただし、Ｒ３及びＲ４はＲ１及びＲ２とは異なる。即ち、Ｒ３がＲ１でありかつＲ４がＲ２である場合とＲ３がＲ２でありかつＲ４がＲ１である場合は除かれる。
この段階においては、第１段階でアデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）が修飾されたポリヌクレオチドに、この第２のハロゲン化カルボニル化合物を反応させる。第２のハロゲン化カルボニル化合物のこのポリヌクレオチドに対する反応性は、上記第１のハロゲン化カルボニル化合物よりも高いため、第１段階で修飾されなかったグアニン（Ｇ）は、第２のハロゲン化カルボニル化合物と反応し、修飾される。しかし、この第２のハロゲン化カルボニル化合物も第１のハロゲン化カルボニル化合物と同様に、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）とは反応しない。
反応条件は下記のとおりである。
反応溶媒：  水、水溶性有機溶媒、又は水と水溶性有機溶媒の混合物。水溶性有機溶媒はメタノ−ル又は、エタノ−ル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルカ−ボネ−ト、エチレンカ−ボネ−ト、エチレングリコ−ル、ジエチレングリコ−ルが好ましい。
ポリヌクレオチドの濃度：  １μＭ〜１００ｍＭ
第２のハロゲン化カルボニル化合物の濃度：０．１Ｍ〜２．０Ｍ
ｐＨ：４〜７
反応温度：０〜６５℃
反応時間：１〜１４４時間
このｐＨ調整はトリエチルアミンをはじめとする各種アミンと酢酸、ギ酸をはじめとするカルボン酸の緩衝液やリン酸緩衝液などの各種緩衝液により行なう。
この反応により、ポリヌクレオチド中のグアニン（Ｇ）は第２のハロゲン化カルボニル化合物により一旦修飾されるが、比較的不安定であり、通常の条件（例えば、ｐＨ：４以下、温度：２５℃など）では塩基が離脱する。
この段階では、ポリヌクレオチド中のグアニン（Ｇ）は下式に示すように修飾される。
【化１２】
2009020249.tif 000014
上記２段階の修飾反応の結果、アデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）は修飾され、グアニン（Ｇ）は一旦修飾され、その後塩基が離脱する。一方、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は修飾されない。その結果、ポリヌクレオチド中の４種類の塩基はそれぞれ識別可能な形態に修飾される。例えば、後述の実施例では第２図に示すように、ポリヌクレオチドは第４図の（３）と（４）に示すように修飾され、これらの塩基は配列を維持したままそれを構成する環の数が異なる。従って、例えば、その環の数を適当な手段により検出することが可能である。
（第２の拡張修飾法の実施形態）
本実施形態においては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドを次の２段階あるいは３段階の反応により修飾する。
第１段階：
第１の拡張修飾法の実施形態と同様の処理を行う。
第２段階：
この段階においては、次の化学式１３のようにグアニン（Ｇ）を修飾する。
【化１３】
2009020249.tif 000015
即ち、下記の化学式１４の一般式で表されるｐ−ベンゾキノン誘導体を反応させる段階から成る、核酸塩基修飾法である。
【化１４】
2009020249.tif 000016
上記の化学式１４において、Ｒ５及びＲ６及びＲ７はそれぞれ水素原子又は炭化水素基を表すが、この炭化水素基としては、アルキル基やアリ−ル基、好ましくはアルキル基が挙げられる。アルキル基としては、炭素数が１８以下の直鎖アルキル基、アリ−ル基としてはフェニル基が挙げられる。また、Ｒ５及びＲ６は共同して５又は６員環を形成してもよい。この５又は６員環は脂肪環又は芳香環であってもよい。
ベンゾキノン化合物のこのポリヌクレオチドに対する反応性は、条件を制御することにより向上し、第１段階で修飾されなかったグアニン（Ｇ）をベンゾキノン化合物の付加物へと変換する。しかし、このベンゾキノン化合物もハロゲン化カルボニル化合物と同様に、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）とは反応しない。
反応条件は下記のとおりである。
反応溶媒：  水、水溶性有機溶媒、又は水と水溶性有機溶媒の混合物。水溶性有機溶媒はメタノ−ル又は、エタノ−ル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルカ−ボネ−ト、エチレンカ−ボネ−ト、エチレングリコ−ル、ジエチレングリコ−ルが好ましい。
ポリヌクレオチドの濃度：  １μＭ〜１００ｍＭ（特に好ましくは、核酸塩基の濃度が３．０ｍＭ）
ベンゾキノン化合物の濃度：０．１Ｍ〜２．０Ｍ（特に好ましくは０．１Ｍ）
ｐＨ：７〜９（特に好ましくは、ｐＨ７．２）
反応温度：０〜６５℃（特に好ましくは、５０℃）
反応時間：１〜１４４時間（特に好ましくは、１２時間）
このｐＨ調整はトリエチルアミンをはじめとする各種アミンと酢酸、ギ酸をはじめとするカルボン酸の緩衝液やリン酸緩衝液などの各種緩衝液により行なう。特に好ましくは、酢酸ナトリウム緩衝液である。
上記２段階の修飾反応の結果、アデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）は修飾され、グアニン（Ｇ）は別の形で修飾される。一方、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は修飾されない。その結果、ポリヌクレオチド中の４種類の塩基はそれぞれ識別可能な形態に修飾される。例えば、後述の実施例では、第１３図の（３）に示すようにポリヌクレオチドは修飾され、これらの塩基は配列を維持したまま、それを構成する環の数が異なる。従って、例えば、その環の数を適当な手段により検出することが可能である。
第３段階：
修飾されたＡは比較的不安定であり、酸性条件下（例えば、ｐＨ：４以下、温度：３７℃など）において、下記の化学式１５に示すよう選択的に塩基が離脱する。
【化１５】
2009020249.tif 000017
上記した修飾反応によってアデニン（Ａ）を選択的に離脱させることができる。一方、修飾グアニン（Ｇ）、修飾シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は修飾されない。その結果、ポリヌクレオチド中の４種類の塩基はそれぞれ識別可能な形態に修飾される。例えば、後述の実施例では、第１３図の（４）に示すように、ポリヌクレオチドは修飾され、これらの塩基は配列を維持したまま、それを構成する環の数が異なる。従って、例えば、その環の数を適当な手段により検出することが可能である。
（第３の拡張修飾法の実施形態）
本実施形態に於ては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドを次の１段階あるいは２段階の反応により修飾する。
第１段階：
この段階においては、アデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）を修飾する。即ち、前記の化学式１４に示すベンゾキノン化合物を反応させる段階から成る、核酸塩基修飾法である。
この段階においては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）を含むポリヌクレオチドにこのベンゾキノン化合物を反応させる。この修飾されるポリヌクレオチドの長さは２〜３×１０８億塩基対、好ましくは２０〜３０００塩基対である。
ベンゾキノン誘導体は、ｐＨ４．５で、２４時間反応を行うと、下記の表１に示すように、アデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）は修飾されるが、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）は修飾されない。「０．１％未満」は検出限界領域を示すものである。
【表１】
2009020249.tif 000018
反応条件は下記のとおりである。
反応溶媒：  水、水溶性有機溶媒、又は水と水溶性有機溶媒の混合物。水溶性有機溶媒はメタノ−ル又は、エタノ−ル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルカ−ボネ−ト、エチレンカ−ボネ−ト、エチレングリコ−ル、ジエチレングリコ−ルが好ましい。
ポリヌクレオチドの濃度：  １μＭ〜１００ｍＭ（特に好ましくは、核酸塩基を濃度換算して２．０ｍＭ）
ベンゾキノン化合物の濃度：０．１Ｍ〜２．０Ｍ（特に好ましくは６０ｍＭ）
ｐＨ：４．５〜６．５（特に好ましくは、ｐＨ４．５）
反応温度：２０〜４５℃（特に好ましくは、３７℃）
反応時間：１〜１４４時間（特に好ましくは、２１時間）
このｐＨ調整はトリエチルアミンをはじめとする各種アミンと酢酸、ギ酸をはじめとするカルボン酸の緩衝液やリン酸緩衝液などの各種緩衝液により行なう。特に好ましくは、酢酸ナトリウム緩衝液である。
この反応により、ポリヌクレオチド中のアデニン（Ａ）は下記の化学式１６に示すように修飾される。
【化１６】
2009020249.tif 000019
また、ポリヌクレオチド中のシトシン（Ｃ）は下記の化学式１７に示すように修飾される。
【化１７】
2009020249.tif 000020
上記修飾反応の結果、アデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）は修飾され、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は修飾されない。その結果、ポリヌクレオチド中の４種類の塩基はそれぞれ識別可能な形態に修飾される。例えば、後述の実施例では第１３図に示すように、ポリヌクレオチドは第１３図の（３）と（４）に示すように修飾され、これらの塩基は配列を維持したままそれを構成する環の数が異なる。従って、例えば、その環の数を適当な手段により検出することが可能である。
第２段階：
この反応により、ポリヌクレオチド中のアデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）は、ベンゾキノン化合物により修飾される。修飾された塩基のうちアデニン（Ａ）は比較的不安定であり、酸性条件下（例えば、ｐＨ：４以下、温度：２５℃など）において下記の化学式１８に示すように塩基が離脱する。
【化１８】
2009020249.tif 000021
上記１段階あるいは２段階の修飾反応の結果、アデニン（Ａ）が選択的に離脱し、ポリヌクレオチド中の４種類の塩基はそれぞれ識別可能な形態に修飾される。例えば後述の実施例では第１６図に示すように、ポリヌクレオチドは第１６図の（２）と（３）に示すように修飾され、これらの塩基は配列を維持したままそれを構成する環の数が異なる。従って、例えば、その環の数を適当な手段により検出することが可能である。なお、第一段階をｐＨ３．０以下でおこなうと修飾されたアデニン（Ａ）が遊離した修飾オリゴヌクレオチドが直接生成する。
【実施例】
【０００６】
次に本願発明の実施例を説明する。本願発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されない。
〔第１実施例群：第１の置換修飾法〕
（実施例１：核酸塩基の選択的遊離）
まず、各核酸塩基の遊離について２’−デオキシアデノシン（ｄＡ、ヤマサ醤油社製）、２’−デオキシシチジン（ｄＣ、ヤマサ醤油社製）、２’−デオキシグアノシン（ｄＧ、ヤマサ醤油社製）、およびチミジン（Ｔ、ヤマサ醤油社製）を用いて調査した。
（１）ｄＡとｄＧについては、それらの０．０３Ｍ水溶液それぞれに対して陽イオン交換樹脂であるＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８−２００  ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅｓｉｎ（Ｈ＋）を約３０当量加えて室温で２時間放置した後、生成した２’−デオキシリボ−スを定量した。この定量値に基づき、ｄＡあるいはｄＧからの２’−デオキシリボ−スの回収率を算定することができる。そしてこの回収率は、ｄＡあるいはｄＧから２’−デオキシリボ−スへの変換率と考えることができる。表２に示すように、ｄＡの場合もｄＧの場合も１００％に近い極めて高い回収率であった。遊離したＡｄｅ及びＧｕａは溶液中に確認できないことから、樹脂に吸着したものと考えられる。
比較試験として、ｄＣ、Ｔについても、同じ条件で上記の陽イオン交換樹脂による同様の処理を行ったところ、遊離した２’−デオキシリボ−スは１．０％未満であることを確認した。「１．０％未満」という回収率は検出限界領域であるため、この（１）の手段では、ｄＣやＴについては塩基の遊離が全く起こっていないと考えることができる。１．０Ｍ塩酸溶液中（ヌクレオシドの濃度は０．０３Ｍ）、室温で２４時間放置しても同様の結果が得られる。
従って、上記（１）の方法は、プリン塩基を選択的に遊離させる手段として実質的に有効であることが分かる。
（２）次にｄＣとＴについて、それらの０．１３Ｍ水溶液それぞれに対してヒドラジン（７．９Ｍ）を加えて、それぞれ表２に示す時間（ｈｏｕｒ）放置した後に上記（１）で用いたのと同じ陽イオン交換樹脂で処理した。この場合の陽イオン交換樹脂は分解遊離した塩基を捕捉するために用いており、塩基の選択的遊離手段を構成していない。以上のように処理して、上記（１）の場合と同様に生成した２’−デオキシリボ−スを定量して、その回収率を算定した。表２に示すように、ＣｙｔもＴｈｙも、それぞれ１００％に近い極めて高い率で遊離して、２’−デオキシリボ−スが定量的に生成することを確認した。ＣｙｔやＴｈｙは加ヒドラジン分解と呼ばれる分解反応を伴って遊離するが、それらの分解生成物が反応溶液中に確認できないことから、分解生成物は樹脂に吸着したものと考えられる。
比較試験として、ｄＡとｄＧについても、上記と同じ条件で上記の加ヒドラジン分解を行い、生成した２’−デオキシリボ−スを定量したところ、遊離した２’−デオキシリボ−スはそれぞれ１．０％未満という検出限界領域の値であることを確認した
従って、上記（２）の方法は、ピリミジン塩基を選択的に遊離させる手段として実質的に有効であることが分かる。
【表２】
2009020249.tif 000022
（３）ｄＡとｄＧについては、それらの１．０Ｍジメチル硫酸緩衝液それぞれに対してジメチル硫酸（１０ｍＭ）を加えて２４時間放置した後、（１）と同様に、生成した２’−デオキシリボ−スを定量した。表３に示すようにＧｕａがＡｄｅに優先して離脱することが分かる。
比較試験として、ｄＣ、Ｔについても、同じ条件で同様の処理を行ったところ、遊離した２’−デオキシリボ−スは検出限界である１．０％未満であることを確認した。「１．０％未満」という回収率は検出限界領域であるため、この（３）の手段では、ｄＣやＴについては塩基の遊離が全く起こっていないと考えることができる。１．０Ｍ塩酸溶液中（ヌクレオシドの濃度は０．０３Ｍ）室温で２４時間放置しても同様の結果が得られる
（４）次にｄＣとＴについて、それらの０．１３Ｍ水溶液それぞれに対してヒドラジン（７．９Ｍ）および食塩（０．１Ｍ）を加えて、それぞれ２４時間（ｈｏｕｒ）放置した後に上記（１）で用いたのと同じ陽イオン交換樹脂で処理した。この場合の陽イオン交換樹脂は分解遊離した塩基、および未反応のヌクレオシドを捕捉するために用いており、塩基の選択的遊離手段を構成していない。以上のように処理して、上記（１）の場合と同様に生成した２’−デオキシリボ−スを定量して、その回収率を算定した。表３に示すように、ＣｙｔがＴｈｙよりも優先して離脱することを確認した。ＣｙｔやＴｈｙは加ヒドラジン分解と呼ばれる分解反応を伴って遊離するが、食塩を加えることでＴｈｙの同反応の進行が阻害されることが分かったＴおよびＴｈｙは樹脂に吸着されないため、この系においては２’−デオキシリボ−スではなくＴの回収率を変換率とした。
比較試験として、ｄＡとｄＧについても、上記と同じ条件で上記の加ヒドラジン分解を行い、生成した２’−デオキシリボ−スを定量したところ、遊離した２’−デオキシリボ−スはそれぞれ１．０％未満という検出限界領域の値であることを確認した
従って、上記（２）の方法は、シトシン塩基を選択的に遊離させる手段として実質的に有効であることが分かる。
【表３】
2009020249.tif 000023
（実施例２：核酸塩基結合部位への置換基導入）
核酸塩基が遊離して生成した２’−デオキシリボ−スに対する還元的アミノ化による置換基導入を検討した。
２’−デオキシリボ−スの溶媒−酢酸溶液（１：２、０．０５Ｍ）に対してシアノ水素化ホウ素ナトリウム（東京化成社製、０．５Ｍ）を加えて室温で２時間放置すると、対応する２級アミンが高い反応効率で生成することをＴＬＣで確認した。また、上記の溶媒に代わるいくつかの種類の溶媒を調査したが、いずれの場合も高い反応効率を維持した。これらの結果を下記の表４に示す。
【表４】
2009020249.tif 000024
（実施例１、２の評価）
実施例１、２はヌクレオシドレベルではあるが、後述の実施例３においては、これらの手段がオリゴヌクレオチド、長鎖の核酸に対しても十分に有効であることが証明される。現時点ではプリン型塩基（Ａｄｅ及びＧｕａ）とピリミジン型塩基（Ｃｙｔ及びＴｈｙ）を選択的に遊離させる方法が実現したが、更に条件を詰めることによって４種の塩基を選択的に遊離させることができるであろう、
又、修飾するアミンを適切に選択することで、塩基ごとに構造や性質が大きく異なった置換基を導入できるであろう。即ち、核酸における複数種類の塩基の一種類ごとに核酸塩基選択的置換修飾法のプロセスを繰り返して行い、その際に、塩基の一種類ごとに互いに識別して検出できる異種の標識化合物を導入することができる。
（実施例３：オリゴヌクレオチドにおける核酸塩基置換修飾）
本実施例においては、核酸塩基置換修飾法をオリゴヌクレオチドに適用した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察を行うため、置換に用いるアミンとして、ＴＥＭ観察において十分なコントラストが得られる、アミノ末端化ウンデカゴ−ルド（アミノ末端化ＵＧ）を用いた。
オリゴヌクレオチドからアデニンを遊離し、アデニンが結合していた位置に金属クラスタ−ラベル即ちアミノ末端化ＵＧを導入するスキ−ムは、「化学式９」において前記した通りである。
化学式９に示すとおり、ｄＡ２０（０．１ｕＭ，３ｕＬ，０．０３×１０−７ｐｍｏｌ、インビトロジェン製）にＭｉｌｌｉＱ水（１０ｕＬ）及びＤＯＷＥＸ−５０ＷＸ８−２００  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅｓｉｎ（１ｍｇ）を加えて室温で２時間放置した。上清を１０ｕＬ取り出し、これを１００００倍に希釈した。希釈液を１．５ｍＬエッペンに移し、アミノ末端化ＵＧ（ｎａｎｏｐｒｏｂｅ社製、１．２ｎｍｏｌ）及びＮａＣＮＢＨ３（８．２ｍｇ）をＣＨ３ＣＯＯＨ（８０ｕＬ）及びＭｉｌｌｉＱ水（１８０ｕＬ）で希釈し、先の希釈液と混合し、室温で２時間放置後、ＴＥＭ（日本電子社製ＥＭ−１２００ＥＸ、ポジティブモ−ド）で観察し、第１図に示すＴＥＭ像を得た。第１図の下部に示すサイズバ−は「５０ｎｍ」である。ＵＧの直径（２．１ｎｍ）が塩基間距離（０．７５ｎｍ）を大きく上回るために全塩基が置換されるには至らないが、多くのＡｄｅがＵＧで置換されることが明らかとなった。
同条件下でｄＡ２０−１００（０．１ｕＭ，３ｕＬ，０．０３×１０−７ｐｍｏｌ、インビトロジェン製）を処理したところ、ＴＥＭ（日本電子社製ＥＭ−２２００、スキャニングＴＥＭ、ネガティブモ−ド）で観察し、第２図に示すＴＥＭ像を得た。第２図の下部に示すサイズバ−は「２０ｎｍ」である。
また、ｄＡＴ９ＡＴ８Ａ（１８８ｕＭ，３５４ｕＬ，６６．７ｎｍｏｌ、ジ−ンデザイン製）に１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（３．５ｕＬ）を加えて５５℃で１４時間放置した。５０ｕＬ取り出し、これをゲル濾過カラム（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨ  ＣＡＲＥ製ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＧ−２５）に供して濾液を凍結乾燥した。残渣を乾燥ＤＭＦ２８２ｍＬで溶解しアミノ末端化ＵＧのＤＭＦ溶液（２００ｕＭ，１０ｕＬ，２．０ｎｍｏｌ、ｎａｎｏｐｒｏｂｅ社製）及びＮａＣＮＢＨ３のＤＭＦ溶液（２．０Ｍ，１０ｕＬ，２０ｕｍｏｌ、ＴＣＩ社製）をＣＨ３ＣＯＯＨ（１０ｕＬ）と混合し、室温で２時間放置後、ＴＥＭ（日本電子社製ＥＭ−２２００、スキャニングＴＥＭ、ネガティブモ−ド）で観察し、第３図に示すＴＥＭ像を得た。第３図の下部に示すサイズバ−は「１０ｎｍ」である。強い信号を発する３点はＵＧのものでありそれぞれＡの位置に対応する。それぞれ点間の距離に関しては見積もり通り１０ｎｍ程度であり、ｄＡＴ９ＡＴ８Ａ中の全てのＡがＵＧに置換したものと同定できる。
（実施例１：ｄＡＧＣＴの修飾）
下記実施例において、高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）分析は下記の装置及び条件により行った。
低圧グラジエントポンプ：日本分光社製ＰＵ−２０８９  Ｐｌｕｓ
サンプリングユニット：ＡＳ−９５０−１０
多波長ＵＶ検出器：ＭＤ−２０１５  Ｐｌｕｓ
カラムオ−ブン：日本分光社製８６０−ＣＯ
カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ
溶出液：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／ＣＨ３ＣＮ（ＣＨ３ＣＮ  ３％→３０％，３０分）
溶出速度：０．５ｍＬ／分
分析温度：４０℃
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
また、質量分析は下記の装置と条件により行った。
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ製イオンスプレ−式四重極−飛行時間計測型質量分析装置：Ｑ−Ｔｏｆ  Ｐｒｅｍｉｅｒ
ダイレクトインジェクション
ネガティブモ−ド
キャピラリ−電圧：２．６ｋＶ
コ−ン電圧：６０Ｖ
コリジョンエネルギ−：ＭＳ測定  ４ｅＶ
イオン源温度：１００℃
デソルベ−ション温度：２５０℃
デソルベ−ションガス：７５０Ｌ／ｈｒ
合成例１
３００ｍＬのナスフラスコに酢酸エチル２００ｍＬを入れ、シクロヘキサノン（シグマアルドリッチ社製、ＧＣ純度９９．８％、２．１ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）とＮ−ブロモコハク酸イミド（和光純薬社製、滴定純度９８％以上、３．９ｇ、２２ｍｍｏｌ）を加え溶解した後、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５（Ｒ）（シグマアルドリッチ社製触媒、乾燥品、１５ｇ）を添加し、室温で３５分攪拌した。この溶液をろ過することによりＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５（Ｒ）を除去し、硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮した後、中圧分取精製装置（モリテックス社製Ｐｕｒｉｆ  ｃｏｍｐａｃｔ、カラム：モリテックス社製Ｐｕｒｉｆ−Ｐａｃｋ，１５μｍシリカゲル３０ｇ）を用いて精製し、２−ブロモシクロヘキサノンを得た。
中圧分取条件は下記のとおりであった：
溶出液：ヘキサン／酢酸エチル（酢酸エチル０％→２５％，２０分）
溶出速度：２０ｍＬ／分
ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ
生成した２−ブロモシクロヘキサノンの構造は、ＮＭＲ測定により確認した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １．６９−２．０３（ｍ，３Ｈ），２．１７−２．３４（ｍ，３Ｈ）２．９３−２．９９（ｍ，２Ｈ），４．４０−４．４３（ｍ，１Ｈ）．
反応例１
まず、４つの基本核酸塩基を全て含むオリゴヌクレオチド（第４図（１））、ｄＡＧＣＴ、ジ−ンデザイン社製）を用意した。ＨＰＬＣ純度は８５％以上（Ａ２６０ｎｍ）であった（第５図（１））。
（第１段階）
このオリゴヌクレオチドの水溶液（０．１１ｍＭ、４．４ｍＬ、０．５０μｍｏｌ）とクロロアセトアルデヒド（東京化成製、４０％水溶液、６．４９ｍＬ、４０ｍμｏｌ）の混合物を３０ｍＬのナスフラスコに移し、メタノ−ルを加えて全量を２０ｍＬとした（最終的にメタノ−ル：水＝１：１）。トリエチルアミン（キシダ化学社製、ＧＣ純度９９％以上）を用いてｐＨを５．０に調整した後、３７℃で２４時間処理した。反応液を分液漏斗に移し塩化メチレン（４０ｍＬ）を加えて３０分放置した後に有機層を除去する一連の操作を３度おこない、水層を濃縮乾燥して目的の標識四量体を得た（第４図（２））。
生成物の質量分析スペクトルを第６図に示す。質量分析において、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ４３Ｈ４９Ｎ１５Ｏ２２Ｐ３）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  １２２０．２）に近似するｍ／ｚ  １２２０．２（Ｍ−１）に主ピ−クが観測され、化２の構造が証明された。
（第２段階）
上記で得られた修飾されたオリゴヌクレオチドを再度蒸留水に溶解し（０．１ｍＭ、０．５０ｍＬ、０．２１μｍｏｌ）、その１０ｍＬのサンプル瓶に移し、合成例１で得た２−ブロモシクロヘキサノン（ＮＭＲ純度９５％、０．４９ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）のメタノ−ル水溶液（１．６ｍＬ、最終的にメタノ−ル：水＝２：１）を加えて全量を２．１ｍＬとした。酢酸を用いてｐＨを５．０に調整した後、３７℃で２４時間処理した。塩化メチレン（３．１ｍＬ）を加え３０分放置した後に有機層を除去する一連の操作を３度おこない、水層を濃縮乾燥して目的の標識四量体を得た（第４図（４））。
生成物の質量分析スペクトルを第７図に示す。質量分析において、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ３８Ｈ４６Ｎ１０Ｏ２２Ｐ３Ｎａ）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  １１１０．２）に近似するｍ／ｚ  １１０９．３（Ｍ−１）に主ピ−クが観測された。
この構造（第４図（４））から、反応の中間体としてグアニン（Ｇ）が一旦２−ブロモシクロヘキサノンと反応し修飾された形態（第４図（３））を経由したものと推測される。
（実施例２：ｄＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴの修飾）
下記実施例のＨＰＬＣ分析は下記条件でおこなった。
低圧グラジエントユニット：日本分光社製ＬＧ−１５８０−０２
ポンプ：日本分光社製ＰＵ−９８０
サンプリングユニット：日本分光社製ＡＳ−９５０−１０
ＣＤ−ＵＶ検出器：日本分光社製ＣＤ−１５９５
カラムオ−ブン：日本分光社製８６０−ＣＯ
カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ
溶出液：溶出液０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／ＣＨ３ＣＮ（ＣＨ３ＣＮ  ８％→
３０％，３０ｍｉｎ）
溶出速度  ０．５ｍＬ／分
分析温度：４０℃
ＵＶ検出波長ＵＶ：２５４ｎｍ
質量分析は下記条件でおこなった。
装置：ブルカーダルトニクス社製ＲＥＦＬＥＸ  ＩＩＩ
イオン化方式：マトリクス支援レ−ザ−励起イオン化法（ＭＡＬＤＩ）
検出方法：飛行時間計測
レ−ザ−種：Ｎ２レ−ザ−
測定方法：リニア−
マトリクス：３−ヒドロキシピコリン酸
検出モ−ド：ネガティブ
本発明者らは、自己で二重鎖を形成するデオキシリボヌクレオチド２０量体、ｄＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴの水溶液（０．１ｍＭ）に対して、同量のクロロアセトアルデヒド水溶液（東京化成製、２．０Ｍ）を加え、トリエチルアミンを用いてｐＨを５．０に調整した後、３７℃で４８時間処理した。塩化メチレン（反応溶液の２倍量）を加えた後有機相を除去する操作を２度繰り返して得られた反応液のＨＰＬＣチャ−トを第８図に示す。細線が原料のＨＰＬＣチャ−ト、太線が反応溶液のチャ−トで、第８図ではそれらを重ねて表示している。第８図より原料のオリゴヌクレオチドが修飾されたことを示す、ピ−ク移動と吸収スペクトルにおける新たな吸収の出現が確認された。質量分析において、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ１２０Ｈ２５１Ｎ７０Ｏ１１８Ｐ１９）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  ６３５２．３）に近似するｍ／ｚ  ６３５２．４（Ｍ−１）が主ピ−クとして観測され、原料のオリゴヌクレオチドに含まれる１０個のアデニン（Ａ）全てが修飾されたことも示された。
二重鎖核酸の取り扱いに関する考察
分析対象となる核酸は多くの場合、相補的塩基対形成に基づく二重鎖を形成する、あるいは分子内で高次構造を形成するため、配列情報の取得には、分子内高次構造を形成しない完全な一本鎖構造を必要とし、通常、大量の解離剤等が用いられるが、それでも不十分であり、長鎖の核酸断片や、分子内多次構造を形成しやすいある種の配列においては、未だ問題を残す。本発明においては二組の相補的塩基対、即ちアデニン−チミン塩基対（Ａｄｅ−Ｔｈｙ）、グアニン−シトシン塩基対（Ｇｕａ−Ｃｙｔ）を形成する片方の塩基、Ａｄｅ及びＣｙｔがハロゲン化カルボニル化合物あるいはベンゾキノン化合物によって、またはＡｄｅ、Ｃｙｔ、及びＧｕａがハロゲン化カルボニル化合物あるいはベンゾキノン化合物によって修飾を受けて、塩基対を形成できない構造へ変換されることから、修飾核酸が塩基対形成に基づく二重鎖や分子内高次構造を形成することは不可能であり、よって本発明の修飾核酸は完全な一本鎖状態で存在し、配列情報取得を目的とする各種計測装置において非常に扱いやすい状態にあるといえる。本発明が各核酸塩基間の差違の増幅のみならず、核酸の完全一本鎖化にも大きく貢献することが示唆される。本現象は第８図のとおり、二重鎖を形成する原料において円二色性分光で観測された二重鎖の形成を表す正負反転波形（コットン効果）が、修飾オリゴヌクレオチドで観測されないことからも支持される。
（実施例３：ｄＡＣ１４ＡＣ９ＡＣ４ＡＣＡＣの修飾）
下記実施例のＨＰＬＣ分析は下記条件でおこなった。
低圧グラジエントユニット：日本分光社製ＬＧ−１５８０−０２
ポンプ：日本分光社製ＰＵ−９８０
サンプリングユニット：日本分光社製ＡＳ−９５０−１０
ＣＤ−ＵＶ検出器：日本分光社製ＣＤ−１５９５
カラムオ−ブン：日本分光社製８６０−ＣＯ
カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ
溶出液：溶出液０．１ＭＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／ＣＨ３ＣＮ（ＣＨ３ＣＮ  ８％→
３０％，３０ｍｉｎ）
溶出速度  ０．５ｍＬ／分
分析温度：４０℃
ＵＶ検出波長ＵＶ：２５４ｎｍ
質量分析は下記条件でおこなった。
装置：ブルカーダルトニクス社製ＲＥＦＬＥＸ  ＩＩＩ
イオン化方式：マトリクス支援レ−ザ−励起イオン化法（ＭＡＬＤＩ）
検出方法：飛行時間計測
レ−ザ−種：Ｎ２レ−ザ−
測定方法：リニア
マトリクス：３−ヒドロキシピコリン酸
検出モ−ド：ネガティブ
また、本発明者らは、全ての核酸塩基が修飾の対象となるオリゴヌクレオチドｄＡＣ１４ＡＣ９ＡＣ４ＡＣＡＣの水溶液（０．１ｍＭ）に対して、同量のクロロアセトアルデヒド水溶液（東京化成製、２．０Ｍ）を加え、トリエチルアミンを用いてｐＨを５．０に調整した後３７℃で４８時間処理した。塩化メチレン（反応溶液の２倍量）を加えた後有機相を除去する操作を２度繰り返して得られた反応液のＨＰＬＣ図を第９図に示す。原料のオリゴヌクレオチドに含まれるアデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）３４個全てがエテノ化塩基、ＡｄｅｅとＣｙｔｅに修飾されたオリゴヌクレオチドが生成したことを示すピ−ク移動が確認された。また、質量分析において、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ３７９Ｈ５２５Ｎ１１２Ｏ１９７Ｐ３３）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  １０７０７．３）に近似するｍ／ｚ  １０７０７．１（Ｍ−１）が主ピ−クとして観測された。
塩基連続的修飾に関する考察
核酸の化学修飾に関する本発明が、修飾の対象となる核酸塩基が連続して導入されていても問題なく全核酸塩基が修飾を受けることが証明された。本実施例では質量分析により、被修飾の証明が可能なオリゴヌクレオチドのみを提示したが、本発明が、どのような長さ、配列の核酸であっても実施可能であることを示しており、本質的な事象であるといえる。
（実施例４：サケ精子ＤＮＡの修飾）
下記実施例のＨＰＬＣ分析は下記条件でおこなった。
低圧グラジエントポンプ：日本分光社製ＰＵ−２０８９  Ｐｌｕｓ
サンプリングユニット：ＡＳ−９５０−１０
多波長ＵＶ検出器：ＭＤ−２０１５  Ｐｌｕｓ
カラムオ−ブン：日本分光社製８６０−ＣＯ
カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ
溶出液：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／ＣＨ３ＣＮ（ＣＨ３ＣＮ  ５％→
３０％，３０ｍｉｎ）
溶出速度  ０．５ｍＬ／分
分析温度：４０℃
ＵＶ検出波長ＵＶ：２５４ｎｍ
さらにサケ精子ＤＮＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ製、０．６８ｍｇ）をクロロアセトアルデヒド（東京化成製、０．１Ｍ）の２０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．５、１．０ｍＬ）に溶解し、３７℃で７２時間放置した（ＴＡＩＴＥＣ製ＤｅｅｐＷｅｌｌＭａｘｉｍｉｚｅｒ）。塩化メチレン（反応溶液の２倍量）を加え１５秒振とう（ＩＷＡＫＩ製ＴＭ−２５２）、３０秒簡易遠心（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣＨＩＢＩＴＡＮ−ＩＩ、１０ｋｒｐｍ）、有機層除去する洗浄操作を２度おこない、修飾ＤＮＡを得た。
まず、修飾ＤＮＡの酵素分解により得られる修飾・未修飾ヌクレオシド混合物を定量することで修飾反応の進行度を確認した。
修飾ＤＮＡ溶液（１９．１μＬ）にＭｉｌｌｉＱ水（４２．８μＬ）を加え希釈し、混合緩衝液（３０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ５．３、５μＬ）を加え、さらに塩化マグネシウム水溶液（５０ｍＭ、５μＬ）を添加した。溶液のｐＨが５．０であることを確認し、酵素混合液０．５μＬ［ＮｕｃｌｅａｓｅＰ１（０．５ｕｎｉｔ、ＷＡＫＯ製）、ＤＮａｓｅＩ（０．０５ｕｎｉｔ、ＴａｋａｒａＢｉｏ製）］、続いて５００ｍＭＴｒｉｓ−１０ｍＭＭｇＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、８μＬ、ＴＯＹＯＢＯ製）を混合し、ｐＨ８．０を確認した後Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（０．５ｕｎｉｔ、０．９μＬ）を加えて３７℃で３時間振とうした（ＴＡＩＴＥＣ製ＤｅｅｐＷｅｌｌＭａｘｉｍｉｚｅｒ）。反応液に３．０Ｍ酢酸ナトリウム水溶液８．１μＬ、エタノ−ル（２２４μＬ）を加えた。−８０℃で１０分間冷却し遠心（１５３００ｒｐｍ、１０分、ＫＵＢＯＴＡ製マイクロミニ冷却遠心機３６１５）して、上澄みを回収した。さらにエタノ−ル（６５０μＬ）を加え、再度−８０℃で１０分間冷却し遠心（１５３００ｒｐｍ、１０分）をおこない、得られた上澄みを凍結乾燥して目的の修飾・未修飾ヌクレオシド混合物を得た（第１０図）。未消化フラグメントや反応中間体が存在するため、反応効率の正確な算出はできないが、高い効率で修飾反応が進行していることが示された。
また、修飾ＤＮＡは単層カ−ボンナノチュ−ブ（ＳＷＣＮＴ、ＨｉＰｃｏ合成品、住友商事より購入、０．１ｍｇ）と混同し、超音波処理（ＳＨＡＲＰ製ＵＴ−２０５Ｓ、５℃、３０分）することでＳＷＣＮＴ上に分散性よく吸着した（第１１図）。第１１図の通り、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定によって直線上物体の存在（左側の写真）、及び右中段のＥ点−Ｆ点間のヒストグラムより算出される基盤からの最小高低差が０．８ｎｍであることから、ＳＷＣＮＴが１本に分散している様子が観察され、また、右上段のＣ点−Ｄ点間において観測される基盤との高低差１．６ｎｍあるいは右下段のＧ点−Ｈ点間において観測される基盤との高低差１．７ｎｍから、１本のＳＷＣＮＴ表面に修飾ＤＮＡが吸着していることも確認された。また、このＳＷＣＮＴと修飾ＤＮＡの複合体を動的光散乱測定（Ｓｙｓｍｅｘ社ゼータサイザ−ナノ）に供し、平均粒径が７００ｎｍであることが明らかとなった。未修飾ＤＮＡではこのような高い分散性は得られないことから拡張修飾法によって得られた修飾核酸はカ−ボンナノチュ−ブの分散剤としての利用も期待される。
〔第３実施例群：第２の拡張修飾法〕
下記実施例の質量分析は下記条件でおこなった。
装置：アプライドバイオ社製ＤＥ−ＳＴＲ
イオン化方式：マトリクス支援レ−ザ−励起イオン化法（ＭＡＬＤＩ）
検出方法：飛行時間計測
レ−ザ−種：Ｎ２レ−ザ−
測定方法：リニア
マトリクス：２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン
検出モ−ド：ネガティブ
４つの基本核酸塩基を全て含むオリゴヌクレオチド（第１３図（１））、ｄＡＧＣＴ、ジ−ンデザイン社製）を第２実施例群（１）の第一段階と全く同じ操作をおこない得られた修飾オリゴヌクレオチド（１．１μｍｏｌ、第１３図（２））を３．４ｍＭ  Ｐ−ベンゾキノン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、純度９８％）リン酸緩衝溶液（０．５Ｍ、ｐＨ７．２、３００μＬ）に溶解し、３７℃で２４時間振とう（ＴＡＩＴＥＣ製ＤｅｅｐＷｅｌｌＭａｘｉｍｉｚｅｒ）した。塩化メチレン（６００ｍＬ）を加え１５秒振とう（ＩＷＡＫＩ製ＴＭ−２５２）、３０秒簡易遠心（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣＨＩＢＩＴＡＮ−ＩＩ、１０ｋｒｐｍ）、有機層を除去する洗浄操作を２度おこない、水層を濃縮乾燥して下記の化学式に示す目的の修飾オリゴヌクレオチド（第１３図（３））を得た。
生成物の質量分析スペクトルを第１４図に示す。質量分析において、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ４９Ｈ５２Ｎ１５Ｏ２３Ｐ３）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  １３１１．２６）に近似するｍ／ｚ  １３１１．３２（Ｍ−１）に主ピ−クが観測された（１１５４．３７のピ−クは内部標準のｄＡＧＣＴ）。
（第３段階）
上記第２段階で得られた修飾オリゴヌクレオチドを塩酸−酢酸緩衝液（０．５Ｍ、２０μＬ）に溶解した。ｐＨが２．０であることを確認した後、３７℃で３時間放置した。水層をゲル濾過カラム（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨ  ＣＡＲＥ製ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＧ−２５）に供して目的の修飾オリゴヌクレオチド（第１３図（４））を得た。生成物の質量分析スペクトルを第１５図に示す。質量分析において、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ４９Ｈ５２Ｎ１５Ｏ２３Ｐ３）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  １１７０．２１）に近似するｍ／ｚ  １１７０．１４（Ｍ−１）に主ピ−クが観測された（１３１１．７９のピ−クは未反応物）。
〔第４実施例群：第３の拡張修飾法〕
（実施例１：ｄＡＧＣＴの修飾）
下記実施例の質量分析は下記条件でおこなった。
装置：アプライドバイオ社製ＤＥ−ＳＴＲ
イオン化方式：マトリクス支援レ−ザ−励起イオン化法（ＭＡＬＤＩ）
検出方法：飛行時間計測
レ−ザ−種：Ｎ２レ−ザ−
測定方法：リニア
マトリクス：２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン
検出モ−ド：ネガティブ
４つの基本核酸塩基を全て含むオリゴヌクレオチド（第１６図（１）、ｄＡＧＣＴ、ジ−ンデザイン社製）を用いて修飾反応をおこなった。
（第１段階）
オリゴヌクレオチド（２．０ｍＭ、２０μＬ）を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、１６４μＬ）に溶解し、ｐ−ベンゾキノン（０．６ｍｇ、５．５μｍｏｌ）を加えた。ｐＨを４．５に調整した後、３７℃で２１時間処理した。塩化メチレン（３２８μＬ）を加え１５秒振とう（ＩＷＡＫＩ製ＴＭ−２５２）した後に簡易遠心を３０秒（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣＨＩＢＩＴＡＮ−ＩＩ、１０ｋｒｐｍ）、有機層除去する洗浄操作を２度おこない、水層を濃縮乾燥して下記の化学式に示す目的の修飾オリゴヌクレオチド（第１６図（２））を得た。
生成物の質量分析スペクトルを第１７図に示す。質量分析において、理論値（
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るｍ／ｚ  １３５３．４９（Ｍ−１）に主ピ−クが観測された。
（第２段階）
上記第２段階で得られた修飾オリゴヌクレオチドを塩酸−酢酸緩衝液（０．５Ｍ、２０μＬ）に溶解した。ｐＨが１．０であることを確認した後、３７℃で３時間放置した。水層をゲル濾過カラム（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨ  ＣＡＲＥ製ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＧ−２５）に供して下記の化学式に示す目的の修飾オリゴヌクレオチドを得た（第１６図（３））。生成物の質量分析スペクトルを第１８図に示す。
質量分析において、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ４９Ｈ５２Ｎ１５Ｏ２３Ｐ３）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  １３１１．２６）に近似するｍ／ｚ  １３１１．３２（Ｍ−１）に主ピ−クが観測された。
なお、第１段階をｐＨ３．０以下でおこなうと修飾されたアデニンが遊離した修飾オリゴヌクレオチド（第１６図（３））が直接生成する。
（実施例２：ｄＡＴ４ＧＴ４ＣＴ４ＧＴ４の修飾）
下記実施例のＨＰＬＣ分析は下記条件でおこなった。
低圧グラジエントポンプ：日本分光社製ＰＵ−２０８９  Ｐｌｕｓ
サンプリングユニット：ＡＳ−９５０−１０
多波長ＵＶ検出器：ＭＤ−２０１５  Ｐｌｕｓ
カラムオ−ブン：日本分光社製８６０−ＣＯ
カラム：ナカライテスク社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ
溶出液：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／ＣＨ３ＣＮ（ＣＨ３ＣＮ  ５％→３０％，３０ｍｉｎ）
溶出速度  ０．５ｍＬ／分
分析温度：４０℃
ＵＶ検出波長ＵＶ：２５４ｎｍ
質量分析は下記条件でおこなった。
装置：アプライドバイオ社製ＤＥ−ＳＴＲ
イオン化方式：マトリクス支援レ−ザ−励起イオン化法（ＭＡＬＤＩ）
検出方法：飛行時間計測
レ−ザ−種：Ｎ２レ−ザ−
測定方法：リニア
マトリクス：２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン
検出モ−ド：ネガティブ
４つの基本核酸塩基を全て含むオリゴヌクレオチド（第２図（１）、ｄＡＴ４ＧＴ４ＣＴ４ＧＴ４、ジ−ンデザイン社製）を用いて第１段階のみおこなった。
オリゴヌクレオチド（核酸塩基数８０ｎｍｏｌ）を６０ｍＭのｐ−ベンゾキノン酢酸緩衝液（ｐＨ４．５、０．１Ｍ、８０ｍＬ）に溶解し、３７℃で４０時間振とうした。塩化メチレン（１６０ｍＬ）を加え１５秒振とう（ＩＷＡＫＩ製ＴＭ−２５２）、３０秒簡易遠心（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣＨＩＢＩＴＡＮ−ＩＩ、１０ｋｒｐｍ）、有機層除去する洗浄操作を２度おこない、水層を濃縮乾燥して原料オリゴヌクレオチド中のアデニン（Ａ）とシトシン（Ｃ）が全て修飾された目的の修飾オリゴヌクレオチドを得た。生成物のＨＰＬＣ分析（第１９図）において単一のピ−クが観測され、質量分析においても、理論値（Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（Ｃ２１１Ｈ２６１Ｎ５０Ｏ１３５Ｐ１９）（Ｍ−１）：ｍ／ｚ  ６２４３．０１）に近似するｍ／ｚ  ６２４３．５９（Ｍ−１）に主ピ−クが観測された。
なお、本反応ををｐＨ３．０以下でおこなうと修飾されたアデニンが離脱した修飾オリゴヌクレオチドが優先して得られる。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の核酸塩基修飾法及び核酸塩基修飾体は、核酸塩基に関する配列情報等の取得において検出感度増幅に関わる直接的な手法であり、透過型電子顕微鏡やトンネル電流走査顕微鏡、原子間力顕微鏡といった核酸塩基の大きさ以下の解像度を有する各種顕微鏡や微少電流変化を検出する計測機器を利用する核酸配列解析技術への展開が期待される。
また、核酸塩基を本手法のように蛍光性を示す標識化合物へ変換することによって、光学顕微鏡や蛍光プレ−トリ−ダ−による核酸や核酸塩基数の定量、疾病の検査法としての利用も考えられる。修飾剤の選択によって核酸の極性（水溶性、脂溶性）及び、アミノ基の有無や新たな官能基の追加など、物理的、化学的性質をコントロ−ルすることも可能で、塩基配列によってプログラムされた、機能性物質としての側面も有する。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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