【手続補正書】
【提出日】平成16年6月4日(2004.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の実質的に精製されたポリペプチド：
a)  配列番号８と実質的に同一であるが、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、またはこれらの任意の組合せから選択される１以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を有し、かつフィターゼ活性を有するポリペプチド；
b)  配列番号８と少なくとも80、85、90、95、または99％同一であるが、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277D、またはこれらの任意の組合せから選択される１以上のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列を有し、かつフィターゼ活性を有するポリペプチド；
c)  a)またはb)のアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも60℃、少なくとも70℃、または少なくとも80℃の温度に対して耐性であるポリペプチド；
d)  a)、b)またはc)のアミノ酸配列を有し、かつ胃液中での半減期が対応する野生型ポリペプチドより少なくとも約２倍長いポリペプチド；
e)  配列番号10に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド；
f)  a)〜e)のいずれか１つのアミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸を有し、かつ活性を保持するポリペプチド；または
g)  f)のアミノ酸配列を有するが、a)のアミノ酸改変の少なくとも１つを含むポリペプチド。
【請求項２】
下記の単離されたポリヌクレオチド：
a)  請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
b)  配列番号７のヌクレオチド配列と実質的に同一であるが、ヌクレオチド389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; 1016がGである少なくとも１つのヌクレオチド改変またはこれらの任意の組合せを含む核酸配列を有するポリヌクレオチド；
c)  配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも80、85、90、95、または99％同一であるが、ヌクレオチド389がG; 390がA; 437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; 1016がGである少なくとも１つのヌクレオチド改変またはこれらの任意の組合せを含む核酸配列を有するポリヌクレオチド；
d)  配列番号７のヌクレオチド配列と実質的に同一の核酸配列を有し、かつヌクレオチド389がG、および390がA; ヌクレオチド437がT、438がG、および439がG; ヌクレオチド470がC、および472がT; ヌクレオチド476がT、477がG、および478がT; ヌクレオチド689がG、690がA、および691がG; ヌクレオチド728がT、729がA、および730がT; ヌクレオチド863がT、および864がG; ヌクレオチド1016がG; またはこれらの任意の組合せから選択される改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
e)  配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも80、85、90、95、または99％同一である核酸配列を有し、かつヌクレオチド389がG、および390がA; ヌクレオチド437がT、438がG、および439がG; ヌクレオチド470がC、および472がT; ヌクレオチド476がT、477がG、および478がT; ヌクレオチド689がG、690がA、および691がG; ヌクレオチド728がT、729がA、および730がT; ヌクレオチド863がT、および864がG; ヌクレオチド1016がG; またはこれらの任意の組合せから選択される改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；
f)  配列番号９に示す核酸配列を有するポリヌクレオチド；
g)  配列番号９と少なくとも90、95、または99％同一の核酸配列を有し、かつフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
h)  a)〜g)のいずれか１つの核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド；または
i)  ポリヌクレオチドa)〜h)のいずれか１つの核酸配列と実質的に同一の少なくとも10ヌクレオチドの核酸配列を有するポリヌクレオチド、ただし、h)のポリヌクレオチドはb)またはd)のヌクレオチド改変を含む。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸または請求項２に記載のポリヌクレオチドを含み、さらに、宿主細胞内で作動しうる転写制御配列、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、またはシグナルペプチドをコードする核酸のうちの少なくとも１つを含む発現系。
【請求項４】
前記シグナルペプチドがタバコ由来のPRタンパク質PR-Sシグナルペプチドである、請求項３に記載の発現系。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３もしくは４に記載の発現系を含むベクター。
【請求項６】
ウイルス、細菌、または真菌のベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のベクターまたは発現系を含む宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が原核細胞、真核細胞、植物細胞、または前記ベクターもしくは発現系を含むように改変された原核、真核、または植物細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が大腸菌(E. coli)、P. パストリス(P. pastoris)、またはS. ポンベ(S. pombe)である、請求項７または８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
変異体の作製方法であって、
a)  i) 配列番号１または７；
ii) それと実質的に同一の配列；
iii) i)もしくはii)と相補的な配列；
iv) 請求項２に記載のポリヌクレオチド；または
v) i)〜iv)のいずれか１つの少なくとも30個連続したヌクレオチドを含む断片；
を含む核酸を取得し、
b)  前記配列中の１個以上のヌクレオチドを別のヌクレオチドに改変するか、前記配列中の１個以上のヌクレオチドを欠失させるか、または前記配列に１個以上のヌクレオチドを付加する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１１】
前記改変が、誤りがちのPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、アセンブリPCR、有性PCR突然変異誘発、in vivo突然変異誘発、カセット突然変異誘発、回帰的集合突然変異誘発、指数的集合突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、連結リアセンブリ、GSSM、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される方法により導入される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
フィチン酸含有食品の栄養価を改善する方法であって、
フィチン酸含有食品を、配列番号２のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチド、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項10に記載の方法により作製された変異体と接触させることを含んでなり、その結果として、前記ポリペプチドが、フィチン酸含有食品中のフィチン酸からの無機リン酸の遊離を触媒する、上記方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが
a)  i) 配列番号１、
ii) 請求項２に記載のポリヌクレオチド、または
iii) TがUであってもよい、i)もしくはii)のポリヌクレオチド、
の配列を有するフィターゼコード化核酸を含む組換え発現系、
b)  請求項３または４に記載の発現系、
c)  請求項５または６に記載のベクター、または
d)  請求項７〜９のいずれか１項に記載の宿主細胞、
により産生され、該ポリペプチドの発現がフィターゼ活性を有するポリペプチドの産生をもたらす、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
フィチン酸含有食品中のフィチン酸からの無機リン酸の遊離が、受容生物によるフィチン酸含有食品の摂取前、摂取後、または一部は摂取前で、一部は摂取後に起こる、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
a)  i) 配列番号１、
ii) 請求項２に記載のポリヌクレオチド、
iii) 請求項10に記載の方法により作製された変異体、または
iv) TがUであってもよい、i)〜iii)のいずれかのポリヌクレオチド、
の配列を有するフィターゼコード化核酸を含む組換え発現系、
b)  請求項３または４に記載の発現系、または
c)  請求項５または６に記載のベクター、
を含むように改変された植物細胞、植物部分または植物。
【請求項１６】
微生物フィターゼを含む食品を製造する方法であって、
a)  請求項15に記載の植物細胞、植物部分または植物を培養し、
b)  該植物細胞、植物部分または植物を、食品に適した組成物に変換する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
前記植物細胞、植物部分または植物がフィチン酸含有食品と混合される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記食品が動物飼料である、請求項12、13、16、または17に記載の方法。
【請求項１９】
トランスジェニック非ヒト生物であって、そのゲノムがフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、該トランスジーンがフィターゼポリペプチドの発現をもたらす、上記生物。
【請求項２０】
配列番号１もしくは７に示す核酸配列およびそれと実質的に同一の配列、または配列番号２に示すポリペプチド配列およびそれと実質的に同一の配列が保存されているコンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項２１】
配列番号１もしくは７に示す核酸配列およびそれと実質的に同一の配列、または配列番号２に示すポリペプチド配列およびそれと実質的に同一の配列が保存されているデータ記憶装置、ならびに、次の構成部品：プロセッサ、配列比較アルゴリズム、少なくとも１つの基準配列が保存されているデータ記憶装置、多型を示すコンピュータプログラム、および前記配列の特徴を識別するアイデンティファイアのうちの少なくとも１以上を含むコンピュータシステム。
【請求項２２】
第１の配列を基準配列または配列のデータベースと比較する方法であって、ここにおいて、第１の配列は配列番号１もしくは７に示す核酸配列およびそれと実質的に同一の配列、または配列番号２に示すポリペプチド配列およびそれと実質的に同一の配列であり、
第１の配列および基準配列または配列のデータベースを、配列同士を比較するコンピュータプログラムを使って読み取ること、および
第１の配列と基準配列または配列のデータベースとの差異を該コンピュータプログラムにより判定すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項２３】
第１の配列と基準配列との差異を判定することが、多型を同定することを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドを含む食品。
【請求項２５】
前記食品が動物飼料である、請求項24に記載の食品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明はまた、配列番号７と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、かつ、ヌクレオチド389がG; 390がA; ヌクレオチド437がT; 438がG; 439がG; 470がC; 472がT; 476がT; 477がG; 478がT; 689がG; 690がA; 691がG; 728がT; 729がA; 730がT; 863がT; 864がG; 1016がGであるか、またはこれらの任意の組合せから選択された改変ヌクレオチド配列を有する、フィターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、配列番号７と実質的に同一のヌクレオチド配列を有し、かつ、ヌクレオチド389がGで、390がA; ヌクレオチド437がTで、438がGで、439がG; 470がCで、472がT; 476がTで、477がGで、478がT; 689がGで、690がAで、691がG; 728がTで、729がAで、730がT; 863がTで、864がG; 1016がGであるか、またはこれらの任意の組合せから選択された改変ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。後者の配列は配列番号９で例示され、対応するアミノ酸配列は配列番号10である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
図７aおよび７bは、大腸菌appAフィターゼのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
変異体フィターゼポリヌクレオチド配列の例としては、実質的に配列番号７に記載した配列が挙げられ、その際、該ヌクレオチドは、a）配列番号９；b）すべてのTがUである配列番号９（RNA）（ただし、フィターゼコード化核酸の発現により、実質的に純粋なフィターゼ酵素が産生されるもの）；およびｃ）配列番号７（ただし、389はGであり；390はAであり；ヌクレオチド437はTであり；438はGであり；439はGであり；470はCであり；472はTであり；476はTであり；477はGであり；478はTであり；689はGであり；690はAであり；691はGであり；728はTであり；729はAであり；730はTであり；863はTであり；864はGであり；1016はGであり、またはこれらの任意の組合せである）に記載されたヌクレオチド配列を有する。さらに特定すると、パートc)に関して、本発明は、配列番号７と実質的に同一であり、かつ、ヌクレオチド389がG、および390がAであり；ヌクレオチド437がT、438がG、および439がGであり；470がC、および472がTであり；476がT、477がG、および478がTであり；689がG、690がA、および691がGであり；728がT、729がA、および730がTであり；863がT、および864がGであり；1016がGである；またはこれらの任意の組合せから選択される改変ヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
また、本発明の変異体フィターゼポリヌクレオチドの例としては、実質的に配列番号８に記載した配列を有するが、W68E、Q84W、A95P、K97C、S168E、R181Y、N226C、Y277Dまたはこれらの任意の組合せを有するポリペプチドをコードし、かつフィターゼ活性をそのまま保持するポリヌクレオチドも含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、フィターゼポリヌクレオチドの一部を含んでいてもよく、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド389がGであり；390がAであり；ヌクレオチド437がTであり；438がGであり；439がGであり；470がCであり；472がTであり；476がTであり；477がGであり；478がTであり；689がGであり；690がAであり；691がGであり；728がTであり；729がAであり；730がTであり；863がTであり；864がGであり；1016がGであること；または、オリゴヌクレオチドが配列番号７に関して上記置換の組合せを含むこと以外は、配列番号７の配列と実質的に同じ配列が含まれる。従って、本明細書に開示するように、オリゴヌクレオチドはどんな長さでもよく、１以上の上記突然変異を含むことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2003534009.tif 000001