【手続補正書】
【提出日】平成17年2月28日(2005.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
実施例１でクローニングした新規遺伝子はエクソン1a（289bp）、1b（297bp）、2（679bp）が関与する選択的スプライシングによって２種類の遺伝子転写産物をもたらす（図１）。このうちタンパク質をコードするのはエクソン1bと2から転写されたmRNAである。
実施例３：GRXL-1タンパク質の構造
実施例１でクローニングした遺伝子にコードされたタンパク質は157アミノ酸配列（配列番号２）からなる推定分子量16.6kDaのタンパク質で、チオールトランスフェラーゼの一種であるグルタレドキシン（GRX）とアミノ酸レベルで27％の相同性を有する（図２、３）。そこで、この遺伝子をGRX-like 1（GRXL-1）遺伝子と命名し、この遺伝子のコードするタンパク質をGRXL-1タンパク質と命名した。立体構造予測プログラムによる解析の結果、GRXL-1タンパク質は分子の中心を形成する４つのβシートとこの周囲を取り巻く４本のαヘリックスから構成されており、GRXと非常に類似した構造を有すことが明らかになった（図４）。またGRXL-1タンパク質にはＮ端に疎水性アミノ酸からなるシグナル配列が存在する（図３）。
実施例４：GRXL-1タンパク質の酵素化学的解析
GRXタンパク質ファミリーには、チオールトランスフェラーゼの活性中心である-Cys-X-X-Cysの配列が１本目のβシートと２本目のαヘリックスとを連結する長いループ上に存在することが知られている。しかしGRXL-1タンパク質ではこの保存された配列がGln-X-X-Cys-となっており、67番目のシスチンのみが保存されていた（図３）。GRXL-1タンパク質のグルタレドキシン活性の有無を調べるため、GRXL-1 cDNA（配列番号１）を発現ベクター(pET-42)にクローニングして組換えベクターを作製し、これを大腸菌に形質導入し、組換えGRXL-1タンパク質を調製した。グルタチオンと2-hydroxyethyl disulfideを基質とし、組換えGRXL-1タンパク質の酵素活性を測定したが、グルタレドキシン活性は検出されなかった（図５）。
実施例５：GRXL-1タンパク質の細胞内局在
GRXL-1タンパク質の細胞内局在を調べるため、GRXL-1 のＣ端に蛍光緑色タンパク質GFPが結合した融合タンパク質を発現する組換えDNA断片を作製し、これを発現ベクター(pEGFP-N1)に挿入し組換えベクター（pEF-GRXL-GFP）を作製した。これら発現ベクターをCOS細胞にトランスフェクションし、GRXL-1/GFP融合タンパク質（GRXL-GFP）を発現させた（図６）。その結果、GRXL-GFPタンパク質は主にミトコンドリアに局在した。GRXL-1タンパク質のミトコンドリア局在化シグナル配列を同定するため、GRXL-1タンパク質のＮ端から52番目までの配列をGFPに結合させた発現ベクター（pM3-GFP）を作成しこれをCOS細胞にトランスフェクションした。さらにGRXL-1タンパク質のＮ端から25番目までの配列を除いた配列をGFPに結合させた発現ベクターを作成しこれをCOS細胞にトランスフェクションした(pM1-GFP)。その結果、Ｎ端の1-24番目のアミノ酸がミトコンドリアに局在化シグナルとして働いていることが明らかになった。
実施例６：GRXL-1タンパク質の癌抑制作用
GRXL-1遺伝子の癌抑制作用を調べるため、pEF-GRXL-GFPおよびコントロールであるGFP発現ベクター(pEGFP)をHela細胞に導入し、遺伝子発現による癌細胞の増殖抑制効果をコロニー形成実験法により検討した。その結果pEF-GRX-LGFPを多量に発現する癌細胞の増殖は、コントロールであるGFP発現細胞に比べ著しく減少することが観察された（図7）。GRXL-GFPを発現する細胞の形態を観察したところ、細胞内に異常な形態を示す多数の核が存在することが明らかになった（図8）。
実施例７：GRXL-1遺伝子の発現
各組織におけるGRXL-1遺伝子の発現量を調べるため、GRXL-1染色体遺伝子のエクソン１ｂとエクソン２の塩基配列を基にPCR用のプライマーを設計した。各組織より調整したcDNAを鋳型としたRT-PCR法による遺伝子発現解析の結果、GRXL-1遺伝子はほとんどの正常ヒト組織で恒常的に発現していた。しかし一部の癌細胞株では発現量の著しい減少が認められた（図9）。
実施例８：GRXL-1遺伝子の一塩基多型
癌組織におけるGRXL-1遺伝子の変異を調べるため、GRXL-1染色体遺伝子の塩基配列を基にPCR用のプライマーを設計した。すなわち、エクソン１ｂ、２および各エクソンのスプライシングドナー・アクセプター配列の塩基配列を解析するためのプライマーを、プロモーター領域、イントロン領域、エクソン領域に設定した。正常組織および癌組織より抽出したDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅されたDNAの塩基配列を決定した。その結果、GRXL-1 cDNA（配列番号１）には、第479位、第644位および921位のGがそれぞれAに置換（１塩基置換）することが明らかになった（図２）。このうち第479位の塩基置換は、アミノ酸146番目のアラニンからスレオニンへの置換（A146T）を伴うものであった（この変異を有するGRXL-1遺伝子およびタンパク質をGRXL-1A146Tと呼ぶ）。このアミノ酸の置換がGRXL-1タンパク質の機能にどのような影響を与えるかを調べるため、GRXL-A146T遺伝子を発現するベクター（pEF-GRXL-A146T-GFP）を作成しこれをCOS細胞に導入し、核の異形を示す細胞数をGRXL-1と比較した。その結果pEF-GRXL-A146T-GFP発現細胞では、核の異形形成率が65％に減少していることが明らかになった（図10）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、神経芽細胞腫に係わる新規遺伝子GRXL-1と、この遺伝子の発現産物であるGRXL-1タンパク質が提供される。このGRXL-1タンパク質は、ミトコンドリアに主に存在し、癌細胞の増殖と生存を制御する機能を有する新親癌抑制タンパク質である。さらにこの出願の発明によって、GRXL-1遺伝子およびタンパク質を用いた神経芽細胞腫の診断方法および腫瘍増殖抑制剤が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
GRXL-1遺伝子のエクソン−イントロン構造を示す。
【図２】
GRXL-1 cDNAの塩基配列（配列番号１と同一）である。エクソン1bおよび2の境界を矢印で示した。括弧内塩基は一塩基多型、下線はポリAシグナルを示す。
【図３】
GRXL-1タンパク質とGRXタンパク質のアミノ酸配列の比較である。黒枠内は両者で共通するアミノ酸残基、枠で囲んだ部分はGRXL-1タンパク質Ｎ端のミトコンドリア局在化配列、＊はチオールトランスフェラーゼ活性中心の２つのシスチンを示す。
【図４】
GRXL-1タンパク質およびGRXタンパク質の立体構造予測である。
【図５】
Ａは、大腸菌で発現させ、精製したGRXL-1タンパク質およびGRXタンパク質の電気泳動像、Ｂは各タンパク質のグルタレドキシン活性の測定結果である。
【図６】
融合タンパク質GRXL-GFPと、ミトコンドリア局在マーカーDsRed-2をCOS細胞に発現させ、GRXL-1タンパク質の細胞内局在を調べた結果である。
【図７】
GRXL-GFP発現ベクター及びコントロールベクターが導入されたHela細胞のコロニー形成率を測定した結果である。GRXL-GFPの発現により癌細胞の増殖が抑制されている。
【図８】
GRXL-GFP発現ベクターを導入後7日後のCOS細胞を蛍光顕微鏡により観察した結果である。GRXL-GFPの発現により細胞分裂が抑制され、細胞内に異常な形態を示す多数の核が観察された。
【図９】
ヒトの各組織および癌細胞株におけるGRXL-1遺伝子発現をRT-PCR法により測定した結果である。
【図１０】
GRXL-1のアミノ酸146番目のアラニンからスレオニンへの置換により、核異形形成率が減少していることを示した結果である。