(57)【要約】  透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された培養細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法、または、細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法を提供する。これにより、ＨＢＶまたはＨＣＶなどの肝炎ウイルスを生体外の培養細胞に感染させ、ウイルスを増殖させる実験系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項２】
細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項３】
前記細胞を充填した前記中空糸の内腔に圧力または遠心力を負荷することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項４】
前記細胞が肝細胞または肝臓由来の細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項５】
前記細胞がＨｕＳ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０８）であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項６】
前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項７】
以下の工程のいずれかを含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を製造する方法：
（１）透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させる工程；あるいは、
（２）細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填する工程。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の方法により製造された肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法により得られた肝炎ウイルス感染細胞培養物、肝炎ウイルス粒子または肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いることを特徴とする肝炎ワクチンの製造方法。
【請求項１０】
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスを増殖するためのキット。
【請求項１１】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの感染を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキット。
【請求項１４】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスに感染した細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法。
【請求項１７】
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すためのキット。
【請求項１８】
前記肝炎ウイルス感染細胞は、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルス感染細胞であることを特徴とする、請求の範囲第１６項に記載の肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法。
【請求項１９】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための診断または検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）等の肝炎ウイルスの増殖方法、ならびに肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸およびこれを用いた薬剤評価方法等の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界、とりわけアジアおよびアフリカ諸国において、劇症肝炎、肝硬変及び肝細胞癌のような急性および慢性の肝疾患の最も重要な原因の１つである。ＷＨＯ（世界保健機関）によるとＨＢＶに感染した患者は世界中に約３億５千万人いるといわれており、日本国内のＢ型肝炎ウイルスの持続感染者は、無症候性キャリアを含めると１５０万人に達すると推定されている。【０００３】
現在、ＨＢＶに対する治療にはラミブジンを始めとする治療薬や、インターフェロン等が用いられているが、薬剤に耐性を持つウイルスが高い割合で出現してくるという大きな問題を抱えている。このため十分な治療効果が得られていない例も多く存在し、有効な抗ウイルス薬の開発が切望されている。【０００４】
ＨＢＶは、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞などの株化細胞にトランスフェクションにより強制的に遺伝子を細胞内に導入することによって、一過性にウイルスを増殖させ得ることがわかっている（非特許文献１）。しかしながら、ヒト肝細胞にＨＢＶを接触感染させ、ウイルスを増殖させる有用な系はこれまで存在していない。このため、チンパンジーやヒト肝細胞を移植したキメラマウスを使用して基礎研究や薬剤の影響を調べる実験が行われている。しかし、これらの動物は非常に高価であり、個体差や再現性にも問題があるばかりでなく、動物愛護の点からもその利用には制限がある。このような背景から、有効な治療薬の早期開発を実現するための、ＨＢＶを安定して生体外増殖させうる有用な感染実験系が真に望まれていた。【０００５】
一方、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染患者も世界中に約３億人いるといわれており、日本国内においてもＣ型肝炎ウイルスの持続感染者は、２００万人に達すると推定されている。ＨＣＶキャリアは非常に高い確率で慢性肝炎を発症し、一部は肝硬変、肝癌に進行する深刻な感染症である。ＷＨＯからは毎年３００〜４００万人の新規感染者が報告されており、現在、その治療法としてインターフェロンおよび抗ウイルス薬のリバビリンが併用されているが、ＨＣＶの感染拡大の防止およびウイルス撲滅に向けた新規ワクチンの開発が急務となっている。【０００６】
ＨＣＶに対する治療には、インターフェロンおよびリバビリンの併用療法が主として行われるが、日本ではインターフェロンが効きにくいＨＣＶ−１ａ、ＨＣＶ−１ｂタイプの感染者が多く治癒率が低いことが問題となっている。また、インターフェロンの強い副作用も問題として挙げられる。このような背景からＨＣＶにおいても有効な抗ウイルス薬の開発が切望されている状況である。【０００７】
ＨＣＶは生体であるヒトまたはチンパンジーにしか感染しないことが知られている。１９９９年にはＨＣＶのサブゲノムを培養細胞で複製増殖させるＨＣＶサブゲノムレプリコンシステムが報告されたが、この技術はウイルスＲＮＡの複製が出来るのみであり、それが可能な株もごく少数に限られたものであった。培養細胞を用いたＨＣＶ粒子の複製は、２００５年に脇田らがクローニングしたＪＦＨ−１株を用いて世界で初めて可能となった（非特許文献２）。しかしながら、ＪＦＨ−１株はＨＣＶ感染症では極めて稀な劇症肝炎患者から分離されたものという大きな制約がある。【０００８】
その後、正常ヒト肝細胞または幾つかのヒト肝細胞株等の培養肝細胞において、ＨＢＶあるいはＨＣＶの感染、増殖が確認されているものの、それらは一過性の感染に終わるか、あるいは極めて低いレベルの感染価しか得られないものであり、例えば薬剤の有効性を評価するには何れの培養系も実用的なものであるとは言い難い。【０００９】
培養肝細胞で感染が成立しても高いウイルス感染価が得られない大きな原因のひとつは細胞の培養形態にある。培養ディッシュ等を使った単層培養法においては、細胞は生体内とは極端に異なる環境下に置かれて培養されることになる。このため、細胞が持つ多くの機能が失われる結果、たとえウイルス感染が成立しても一過性に終わってしまい長期間安定してウイルスを感染・増殖させることが出来ない。【００１０】
例えば、もしＨＢＶまたはＨＣＶ慢性肝炎患者から分離されたウイルス株を簡便かつ、高い感染価で培養することが可能となれば、有効な抗ウイルス薬をインビトロでスクリーニングできることになる。しかし、これまでそのようなウイルス培養系は存在しなかった。
【非特許文献１】Ｓｕｒｅａｕら、Ｃｅｌｌ、４７（１）：ｐｐ３７−４７（１９８６）
【非特許文献２】脇田隆字ら、ウイルス、５５（２）：ｐｐ２８７−２９６（２００５）
【発明の開示】
【００１１】
従って本発明は、上記のような問題点を解決しようとするものであり、ＨＢＶまたはＨＣＶ等の肝炎ウイルスを生体外の培養細胞に感染させ、ウイルスを増殖させる実験系を提供することを主目的とする。
【００１２】
更にＨＢＶやＨＣＶ感染患者血清由来の肝炎ウイルスを感染・増殖させる培養系を提供することによって、有効な肝炎ウイルス治療薬開発のための簡便なスクリーニングや、肝炎ウイルス感染患者に対する治療薬の効果予測を可能にするものである。
【００１３】
上記のような目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、当該肝炎ウイルスを生体外にて効率よく安定的に増殖させることを見出した。すなわち、本発明は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔において肝炎ウイルス感染細胞を培養し、肝炎ウイルスを生体外にて効率よく安定的に増殖させることができる肝炎ウイルスの増殖方法を提供する。
【００１４】
また、従来ヒト肝細胞の培養には、ディッシュやプレートなどの培養容器を用いた単層培養法が実施されていた。しかしながら、上述したように単層培養法においては、肝細胞にウイルスが感染しても一過性の感染または低い感染価しか得られない。本発明者らは、単層培養法では低い感染価しか得られなかった肝炎ウイルス感染細胞を、中空糸の内腔に充填して３次元培養を実施することによって、ウイルス感染価が著しく高くなることを見出した。
【００１５】
さらに、本発明は、上記の方法により培養した肝炎ウイルス感染細胞を使用して肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価するスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
また、本発明により、未だ不明であるＨＢＶやＨＣＶの感染宿主のレセプターを同定できる可能性が考えられる。更に本発明は、感染から複製の自然史を知る上でも重要なモデルを提供する。このため新たな宿主因子をターゲットとした薬剤開発にも応用できる可能性がある。
【００１７】
すなわち本発明は、以下のような構成からなるものである。
【００１８】
［項１］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【００１９】
［項２］
細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２０】
［項３］
前記細胞を充填した前記中空糸の内腔に圧力または遠心力を負荷することを特徴とする項１または２に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２１】
［項４］
前記細胞が肝細胞または肝臓由来の細胞であることを特徴とする項１〜３のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２２】
［項５］
前記細胞がＨｕＳ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０８）であることを特徴とする項４に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２３】
［項６］
前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする項１〜５のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２４】
［項７］
以下の工程のいずれかを含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を製造する方法：
（１）透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させる工程；あるいは、
（２）細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填する工程。
【００２５】
［項８］
項７に記載の方法により製造された肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸。
【００２６】
［項９］
項１〜６のいずれか１項に記載の方法により得られた肝炎ウイルス感染細胞培養物、肝炎ウイルス粒子または肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いることを特徴とする肝炎ワクチンの製造方法。
【００２７】
［項１０］
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスを増殖するためのキット。
【００２８】
［項１１］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【００２９】
［項１２］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの感染を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【００３０】
［項１３］
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキット。
【００３１】
［項１４］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスに感染した細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【００３２】
［項１５］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【００３３】
［項１６］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法（オーダーメイド治療の確立）。
【００３４】
［項１７］
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すためのキット。
【００３５】
［項１８］
前記肝炎ウイルス感染細胞は、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルス感染細胞であることを特徴とする、項１６に記載の肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法（オーダーメイド治療の確立）。
［項１９］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための診断または検査方法。
【００３６】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明を用いた実施例１において、患者血清由来ＨＢＶを感染増殖させた細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図２】本発明を用いた実施例１において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞中のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピー数を示すグラフである。
【図３】本発明を用いた実施例２において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図４】本発明を用いた実施例２において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞中のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピー数を示すグラフである。
【図５】本発明を用いた実施例３において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞培養液にＬａｍｉｖｕｄｉｎｅを加えた場合の、細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図６】本発明を用いた実施例４において、患者血清由来ＨＣＶを感染させた各条件の培養細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図７】本発明を用いた実施例５において、患者血清由来ＨＣＶを感染させた細胞培養液にインターフェロンまたはＮＩＭ８１１を加えた場合の、培養細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図８】本発明を用いた実施例６において、ＨＢＶを感染増殖させた各条件の細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図９】本発明を用いた実施例６において、ＨＢＶを感染増殖させた各条件の細胞中のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピー数を示すグラフである。
【図１０】本発明を用いた実施例７において、患者血清由来ＨＣＶを感染させた培養細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図１１】本発明を用いた実施例７において、患者結成由来ＨＣＶを感染させた細胞の培養上清中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に本発明の具体的な実施の形態を説明するが、本発明はこれに限定されない。【００３９】
〔肝炎ウイルスの増殖方法およびキット〕
本発明は、肝炎ウイルスの増殖方法を提供する。本増殖方法は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含んでいる。また、本増殖方法は、細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含んでいる。いずれの方法においても、中空糸の内腔において肝炎ウイルスに感染した細胞を培養することを特徴としている。【００４０】
（中空糸）
本発明において用いられる中空糸は、肝炎ウイルス感染細胞を保持する内腔を備え、一端が封止され、他端が開口しており、細胞は通過させないが水、塩類、タンパク質等の培養液成分を通過させる通孔を有する透過性の膜からなるものを好適に使用可能である。したがって、中空糸の材料は、細胞を中空糸内腔に保持でき、溶液や低分子の物質を透過させるような構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、セルロース系材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン等が好適に利用できる。【００４１】
中空糸の大きさについても特に制限はないが、その内径は好ましくは２０〜１０００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍ程度のものが利用される。膜厚についても、特に制限はなく、中空糸が適度の強度を保ち、かつ物質の透過性も良好な範囲で設定すればよいが、例えば１０〜２００μｍ程度が好ましい。また、多孔性膜中空糸を使用する場合、細胞の培養を考慮すると、その平均孔径は物質交換効率のよい孔径の大きいものが好ましく、０．１〜５μｍ程度のものが好適に選択されるが、特にこの範囲に限定されるものではない。【００４２】
また、中空糸は、（１）着脱可能に連結された流入側流通管と流出側流通管とからなる、一端が開口した細胞懸濁液流通管と、（２）細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部とを備えた器具に取り付けられた状態で本発明に係る肝炎ウイルスの増殖方法に用いてもよい。このとき中空糸は、一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が（１）の細胞懸濁液流通管と連通し、（２）の中空糸固定部に液体が漏れない状態で貫通するように、上記器具に１本または複数本取り付けられている。【００４３】
上述したような本発明において用いられる中空糸および中空糸付きの器具は、特開２００５−１１０６９５号公報に記載されたものを好適に使用することが可能であり、本願発明においては、本特許文献の記載を適宜援用することができる。【００４４】
（細胞の充填）
本増殖方法においては、上述した中空糸の内腔に、肝炎ウイルスを感染させるべき細胞、または肝炎ウイルスに感染した細胞を充填する。中空糸は、細胞を充填する前に親水化処理および滅菌処理されていることが好ましい。中空糸の親水化処理および滅菌処理は従来公知の方法により行われ得る。また、細胞を充填する前に、中空糸の内腔に細胞培養用液体培地等の細胞保存用液または適当なバッファー等を満たしておくことが好ましい。【００４５】
中空糸の内腔に充填される細胞を、細胞培養用液体培地、細胞保存用液または適当なバッファー等に懸濁した細胞懸濁液を、中空糸の開口部から内腔に注入する。好ましくは、中空糸の内腔に予め満たされた細胞培養用液体培地、細胞保存用液、または適当なバッファーを用いて細胞懸濁液を調製すればよく、特に同一組成の液体培地を用いることが好ましい。【００４６】
中空糸の他端が封止されているため、中空糸の開口部から内腔に注入された細胞懸濁液中の液体培地等の液体成分が中空糸の通孔から流出し、細胞が中空糸内腔に堆積する。中空糸内腔に堆積する細胞の密度は特に限定されないが、細胞が充填され堆積した中空糸に圧力または遠心力を付加することによって、細胞が凝集体化していることが好ましい。【００４７】
中空糸の内腔に充填された細胞の凝集体化は、細胞を充填した中空糸内腔の圧力を陽圧にする、または中空糸外部の圧力を陰圧にする、あるいは細胞を充填した中空糸を遠心機にかけることにより実現することができる。中空糸に圧力または遠心力を付加して細胞を凝集体化する方法は、特開２００４−１６６７１７号公報および特開２００４−２８３０１０号公報に記載された方法を好適に使用することが可能であり、本願発明においては、本特許文献の記載を適宜援用することができる。【００４８】
（細胞）
本増殖方法において用いられる細胞としては、肝炎ウイルスが感染し得る細胞であれば特に限定されず、肝細胞または肝臓由来細胞が好適に使用可能であり、特にヒト肝細胞であることが好ましい。また、ヒト肝臓由来の不死化ヒト肝細胞Ｈｕｓ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０８）を用いれば、特に効率よく肝炎ウイルスを増殖させることができるので、最も好ましい。なお、本明細書中においては、上記肝炎ウイルスを感染させる細胞を、培養細胞または宿主細胞と称することもある。【００４９】
（肝炎ウイルス）
本発明において、上述したような培養細胞に感染させて、感染状態を維持させる、または増殖させる肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＥ型肝炎ウイルスのいずれかであり、特にＨＢＶまたはＨＣＶを用いた場合に顕著な効果を奏する。本発明において使用される肝炎ウイルスの形態は特に限定されず、肝炎ウイルスのポリヌクレオチド、肝炎ウイルス粒子、肝炎ウイルス粒子を含む血清、または培養細胞に一過性にウイルス遺伝子を導入させて得た培養上清を好適に利用可能である。【００５０】
本発明において使用される肝炎ウイルスのポリヌクレオチドは、肝炎ウイルスのゲノム核酸であり、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの形態で存在し得る。肝炎ウイルス粒子は、肝炎ウイルス粒子構成タンパク質により構成されるウイルス殻中に肝炎ウイルスのゲノム核酸を含有するものであり、細胞に対する感染能を有するものであり、単に肝炎ウイルスと称することもある。肝炎ウイルス粒子は、細胞に肝炎ウイルス遺伝子を導入して一過性に感染させることによって得られる。そして、肝炎ウイルスに一過性に感染した細胞を培養して得た培養上清には、一過性に増殖した肝炎ウイルス粒子が含まれる。肝炎ウイルス粒子を含む血清は、肝炎ウイルスに感染した肝炎ウイルス感染者から採取した血液から得られ、肝炎ウイルス感染者の肝炎ウイルスを含むものである。【００５１】
特に、肝炎ウイルス粒子、肝炎ウイルスに一過性に感染した細胞を培養して得た培養上清、または肝炎ウイルス粒子を含む血清を用いれば、接触感染により容易に細胞を感染させることができるため、好ましい。また、本発明においては、肝炎ウイルス粒子を含む血清を特に好適に使用可能である。【００５２】
（肝炎ウイルス感染細胞）
本増殖方法においては、肝炎ウイルスに感染した細胞を中空糸の内腔において培養するが、中空糸の内腔に充填する前に細胞を肝炎ウイルスに感染させていてもよく、中空糸の内腔に充填した後に細胞を肝炎ウイルスに感染させてもよい。【００５３】
細胞を肝炎ウイルスに感染させる方法は、特に限定されず、肝炎ウイルス遺伝子をエレクトロポレーション等により細胞に導入する方法、または細胞に肝炎ウイルス粒子を一定時間接触させて接触感染させる方法を好適に使用することができる。細胞に肝炎ウイルス粒子を接触感染させる方法は、より容易にウイルス感染細胞を得ることができるので好ましい。また、肝炎ウイルス粒子を含む培養上清または血清を細胞に接触させることによってもウイルス感染細胞を得ることが可能である。特に、本発明においては、肝炎ウイルス感染者から得た血清を接触感染させることによって得られた肝炎ウイルス感染細胞も好適に使用可能である。【００５４】
中空糸の内腔に充填する前に、細胞を肝炎ウイルスに接触感染させる場合、細胞は液体培地等に分散した懸濁状態であるため肝炎ウイルスに対する接触機会が増加し感染効率がよい。また、中空糸の内腔に充填し、圧力または遠心力を付加することによって細胞を凝集体化した後に、細胞を肝炎ウイルスに接触感染させる場合、感染力が高く、安定して感染させることが可能である。肝炎ウイルス粒子よりも十分に大きい平均孔径の通孔を有する透過性の膜により構成される中空糸を用いることによって、肝炎ウイルスを中空糸の膜にある通孔を通過して細胞表面に到達させることができる。【００５５】
ここで肝炎ウイルスによる細胞の感染は、細胞内に肝炎ウイルスが進入し、肝炎ウイルス粒子が安定的に増殖している状態を意図している。したがって、細胞内または細胞の培養上清中における肝炎ウイルスの核酸の量、または肝炎ウイルス構成タンパク質の量を定量することによって、肝炎ウイルスによる感染を確認することができる。特にＢ型肝炎ウイルスによる感染を確認する場合、細胞中のｃｃｃＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ：中間複製体ＤＮＡ）を定量することによって感染を確認することができる。【００５６】
（培養）
本増殖方法において培養に供する中空糸は、肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸であり、上述したように、中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させる、または細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、中空糸の内腔に当該細胞を充填することによって製造することができる。【００５７】
このようにして得られた中空糸を従来公知の方法により培養する。例えば、肝炎ウイルス感染細胞を含む中空糸を培養容器に移し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養する。このとき、振とう機等により培養容器を振とうさせながら培養することにより、中空糸内腔の細胞に対して効率よく栄養や酸素を供給することができる。【００５８】
上述したように肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、培養細胞内において肝炎ウイルスを増殖させる。細胞内における肝炎ウイルスの増殖は、細胞内または細胞の培養上清における肝炎ウイルスの核酸または肝炎ウイルス粒子構成タンパク質の量を定量することによって確認することができる。特にＢ型肝炎ウイルスの増殖を確認する場合、細胞中のｃｃｃＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ：中間複製体ＤＮＡ）を定量することによって確認することができる。【００５９】
本増殖方法において、上記中空糸を用いて肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、生体外において肝炎ウイルスを増殖させることが可能である。また、本発明によれば、肝炎ウイルスによる細胞の感染を長期間持続させることが可能であり、かつ肝炎ウイルスの増殖も長期間持続させることが可能である。さらに、本発明においては、肝炎ウイルスの遺伝子を細胞に導入して強制的に感染させなくても、細胞に肝炎ウイルスを接触させて自然に接触感染させた感染細胞を用いて容易かつ効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能である。また、本発明においては、簡易な構造の中空糸を用いているので、大掛かりで特殊な装置を必要とせず、簡単な装置を用いて簡便な操作により肝炎ウイルスを感染および増殖させることができる。【００６０】
以上のように、本発明によれば効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるので、本発明により増殖させた肝炎ウイルスを用いて、肝炎ウイルスの感染または増殖を抑制する薬剤の評価、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤の評価、当該薬剤の評価による肝炎ウイルス感染者の治療等を好適に行うことが可能である。さらに、本発明においては、肝炎ウイルス感染者から得た血清を用いて感染させた細胞においても効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるため、このように増殖させた肝炎ウイルスを、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または治療に利用することが可能である。特に、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に治療薬を評価する場合に有用である。【００６１】
本発明は、肝炎ウイルスを増殖するためのキットをさらに提供する。本キットは、透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を少なくとも備えている。すなわち、本発明に係る肝炎ウイルスを増殖するためのキットは、上記肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を少なくとも備えていればよい。中空糸の内腔において肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることができる。また本キットは、肝炎ウイルスに感染した細胞を備えていてもよい。【００６２】
〔肝炎ワクチンの製造方法〕
本発明は、上記の増殖方法により得られた肝炎ウイルス感染細胞培養物、肝炎ウイルス粒子または肝炎ウイルス構成タンパク質（以下、肝炎ウイルス粒子等）を用いて、肝炎ワクチンを製造する方法をさらに提供する。ここで、肝炎ウイルス感染細胞培養物には、肝炎ウイルスに感染した細胞、当該細胞を培養して得た培養上清等が含まれる。本製造方法においては、上記肝炎ウイルス粒子等またはその一部を抗原として用いて、従来公知の方法により肝炎ワクチンを製造することが可能である。例えば、肝炎ウイルス粒子等をそのまま肝炎ワクチンとすることが可能であり、従来公知の方法により肝炎ウイルス粒子等を弱毒化または不活化して肝炎ワクチンを製造することも可能である。【００６３】
本発明によって製造された肝炎ワクチンは、液体中に溶解または懸濁させること等によって、投与可能に調整させる。また、調製された肝炎ワクチンは、投与に適した形態とされていてもよく、医薬上許容される成分を添加してもよい。このように調製された肝炎ワクチンの投与経路、投与量、投与回数等は、従来の肝炎ワクチンまたは他のワクチンにおいて通常行われているのと同様に決定すればよい。【００６４】
本発明によれば、簡単な装置を用いて簡便な操作により、生体外において肝炎ウイルスを長期的に増殖させることが可能であり、このようにして得られた肝炎ウイルス粒子等を用いて、効率よく肝炎ワクチンを製造することが可能である。本発明により製造された肝炎ワクチンを肝炎ウイルスに感染していない生体に投与して、生体内において肝炎ウイルスに対する免疫反応を誘導することによって、肝炎ウイルス感染を予防することが可能である。また、上記肝炎ワクチンを肝炎ウイルスに感染した生体に投与して、生体内において肝炎ウイスに対する強い免疫反応を誘導することによって、肝炎ウイルスを排除する治療に用いることも可能である。【００６５】
〔薬剤をスクリーニングする方法およびキット〕
さらに、本発明は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔において培養した上記肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価する方法を提供する。具体的には、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を包む、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。また、本発明は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの感染を抑制する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。【００６６】
上記の培養工程において、評価すべき薬剤候補物質の存在下または非存在下において、肝炎ウイルスの感染状態、肝炎ウイルスの増殖状態、または肝炎ウイルスタンパク質の発現量が変化した場合、すなわち、評価すべき薬剤候補物質の存在により肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現が抑制された場合、当該薬剤候補物質を肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤であると判定することができる。【００６７】
ここで、肝炎ウイルスの感染状態、増殖状態等に対する薬剤候補物質の影響は、肝炎ウイルス感染細胞を培養する培養液中、あるいは肝炎ウイルスに感染可能な細胞と肝炎ウイルスとを共に培養する培養液中に評価すべき薬剤を添加して培養し、培養上清中または細胞内に含まれる肝炎ウイルス核酸、肝炎ウイルス粒子構成タンパク質等を量的または質的に解析することによって、評価することができる。これにより、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするだけでなく、肝炎ウイルスの薬剤耐性評価やそのメカニズムの解明も可能となる。【００６８】
本発明によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングすることができるので、様々な薬剤の評価を効率よく行うことが可能である。また、本発明によれば、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞であっても、効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるので、肝炎ウイルス感染者個別に薬剤候補物質を評価することができる。【００６９】
本発明は、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキットをさらに提供する。本キットは、透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を少なくとも備えている。すなわち、本キットは、上記肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を少なくとも備えていればよい。【００７０】
中空糸の内腔に充填された細胞を肝炎ウイルスに感染させて培養することによって、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、様々な薬剤候補物質の評価を効率よく行うことが可能である。このとき、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた肝炎ウイルス感染細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に薬剤候補物質を評価することが可能である。また本キットは、肝炎ウイルスに感染した細胞を中空糸の内腔に備えていてもよい。これにより当該中空糸を用いて培養した細胞を用いて様々な薬剤の評価を効率よく行うことが可能である。【００７１】
〔治療薬をスクリーニングする方法およびキット〕
上記スクリーニングする方法においては、肝炎ウイルスの感染または増殖を抑制する薬剤をスクリーニングする方法について説明したが、本発明はこれに限定されず、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法もまた提供する。本方法におけるスクリーニング工程は、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法と同様であり、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程、または透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含んでいる。本方法によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングすることができるので、肝炎ウイルス感染者の治療に適した薬剤のスクリーニングを効率よく行うことが可能である。【００７２】
特に、本方法において、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対する治療に適した薬剤を、個別にスクリーニングすることができる。したがって、本方法は、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または治療に好適に利用することができる。【００７３】
また、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングするためのキットを提供する。本キットも、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキットと同様に構成されている。本キットを用いれば、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤を効率よくスクリーニングすることが可能である。特に、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた肝炎ウイルス感染細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に治療薬をスクリーニングすることが可能である。【００７４】
〔治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法およびキット〕
さらに、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法もまた提供する。本方法におけるスクリーニング工程は、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法と同様であり、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき複数の薬剤と共に培養する工程、または透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含んでいる。本方法によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すことができるので、肝炎ウイルス感染者の治療に適した薬剤のスクリーニングを効率よく行うことが可能であり、オーダーメイド治療の確立を実現することができる。【００７５】
特に、本方法において、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対する治療に適した薬剤の組み合わせを、個別に見出すことができる。したがって、本方法は、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または治療に好適に利用することができる。【００７６】
また、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すためのキットを提供する。本キットも、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキットと同様に構成されている。本キットを用いれば、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを効率よく見出すことが可能である。特に、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた肝炎ウイルス感染細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に最適な治療薬の組み合わせを見出すことが可能である。【００７７】
〔診断または検査方法〕
さらに、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するための診断または検査方法を提供する。本発明に係る診断または検査方法は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含み、当該培養工程において薬剤を評価することによって肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤を決定し、これを投与する工程をさらに含んでいる。具体的には、上記培養工程において、評価すべき薬剤の存在下または非存在下において、肝炎ウイルスの感染状態または増殖状態が変化した場合、すなわち、評価すべき薬剤の存在により肝炎ウイルスの感染または増殖が抑制された場合、当該薬剤を肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤であると判定することができる。このようにして評価した薬剤を、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤として投与し、肝炎ウイルス感染者を治療する。【００７８】
ここで、肝炎ウイルスの感染状態、増殖状態等に対する薬剤の影響は、肝炎ウイルス感染細胞を培養する培養液中、あるいは肝炎ウイルスに感染可能な細胞と肝炎ウイルスとを共に培養する培養液中に評価すべき薬剤を添加して培養し、培養上清中または細胞内に含まれる肝炎ウイルス核酸、肝炎ウイルス粒子構成タンパク質等を量的または質的に解析することによって、評価することができる。これにより、肝炎ウイルス感染者に対する治療薬の効果を予測することが可能である。【００７９】
本発明によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングすることができるので、肝炎ウイルス感染者に対する様々な治療薬の効果を効率よく評価することが可能である。また、本発明によれば、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞であっても、効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるので、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に治療薬を評価することができる。したがって、本治療方法は、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または検査に好適に利用することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８１】
〔実施例１〕
凍結ヒト肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，Ｃｏｄｅ：Ｈ１０００．Ｈ１５，ｌｏｔ．４２８）を融解し、培養液にヒト肝細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度に懸濁した１ｍｌ細胞懸濁液を準備し、ここにＨＢＶを高濃度に含むＨＢＶ感染者の血清１００μｌを添加し３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下に６０分間静置した。前記同様にヒト肝細胞の懸濁液を調製し、ここにＨＢＶ感染者血清の替わりにＨｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ｃ−２２株をトランスフェクションし、一過性に増殖させて得たウイルス粒子を含む培養上清を添加し３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下に６０分間静置した。この後、それぞれのヒト肝細胞懸濁液をセルローストリアセテート製中空糸モジュールを用い（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）中空糸内腔に注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。【００８２】
感染・培養開始から２日後に中空糸を培養液にて４回洗浄し、その後２日毎に培養液を交換しながら、３５日目まで培養を継続した。細胞培養上清から市販のＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ、キアゲン）を使用して培養液中のＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ  ＤＮＡの定量を経時的に行った。また、培養３５日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。【００８３】
その結果、培養１０日目から培養３５日目までの間、感染者血清を感染させた細胞では培養上清中には７．０×１０３〜５．０×１０４コピー／ｍｌ、培養液より得たウイルス液を感染させた細胞では６．５×１０６〜１．７×１０８コピー／ｍｌのＨＢＶ粒子に相当するＨＢＶ  ＤＮＡが出ていることを確認した。
また、培養３５日目の細胞中には、血清を感染させた細胞では７．３×１０３コピー、培養液より得たウイルス液を感染させた細胞では４．０×１０８コピーに相当するｃｃｃＤＮＡを確認した。このことより、ＨＢＶが長期間にわたって感染し細胞内で増殖していることが確認できた。【００８４】
〔実施例２〕
凍結ヒト肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，Ｃｏｄｅ：Ｈ１０００．Ｈ１５，ｌｏｔ．４２８）を融解し、培養液に細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度に懸濁した１ｍｌ細胞懸濁液を準備した。この後、セルローストリアセテート製中空糸モジュールを用い（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）中空糸内腔にこのヒト肝細胞懸濁液を注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、ここにＦｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ｃ−２２株をトランスフェクションし一過性に増殖させて得たウイルス粒子を含む培養上清を添加して、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。【００８５】
感染・培養開始から２日後に中空糸を培養液にて４回洗浄し、更に２日毎に培養液を交換しながら、３５日目まで培養を継続した。細胞培養上清から市販のＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ、キアゲン）を使用して培養液中のＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ  ＤＮＡの定量を経日的に行った。また、培養３５日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。【００８６】
その結果、培養１０日目から培養３５日目までの間、細胞培養上清中には６．０×１０５〜５．０×１０７コピー／ｍｌのＨＢＶ粒子に相当するＨＢＶ  ＤＮＡが出ていることを確認した。また、培養３５日目の細胞中には、４．１×１０７コピーに相当するｃｃｃＤＮＡを確認した。このことより、ＨＢＶが長期間にわたって感染し細胞内で増殖していることが確認できた。【００８７】
〔実施例３〕
凍結ヒト肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，Ｃｏｄｅ：Ｈ１０００．Ｈ１５，ｌｏｔ．４２８）を融解し、培養液に細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度に細胞懸濁液を準備し、この後、セルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）の中空糸内腔にこのヒト肝細胞懸濁液を注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。１日おきに培地交換を実施し８日間培養を行った時点で培養液にＨＢＶのウイルス液を添加し、細胞に感染させた。ＨＢＶウイルス液は、Ｈｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ａｅ株をトランスフェクションし、一過性に感染させ培養して得た培養上清を濃縮して調製した。感染と同時に、細胞培養液にＢ型慢性肝炎治療薬として臨床適用されているＬａｍｉｖｕｄｉｎｅを最終０．２ｍＭまたは１．０ｍＭとなるように添加し培養を行った。薬剤添加後の細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量を経時的にＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量した。【００８８】
その結果、Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ添加群では溶媒対照群に比べ細胞培養上清中に出てくるＨＢＶ  ＤＮＡの増加が著明に抑制され、薬剤の抗ウイルス効果を確認できた。【００８９】
〔実施例４〕
ヒト肝臓に由来する不死化ヒト肝細胞ＨｕＳ−Ｅ／２細胞を実験に使用した。ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は以下に述べるような方法で樹立した。なお、不死化ヒト肝細胞ＨｕＳ−Ｅ／２は、２００７年９月７日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託された（受託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０８）。【００９０】
ヒト肝組織から分離した正常ヒト肝細胞に、プラスミドに挿入したヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ遺伝子）およびヒトパピローマＥ６Ｅ７遺伝子（ＨＰＶ１８／Ｅ６Ｅ７）を常法に従いトランスフェクションにより細胞内に導入した。遺伝子導入後、増殖能を獲得し不死化した細胞コロニーから肝細胞機能発現の高いものを選別し、ＨｕＳ−Ｅ／２クローンを得た。【００９１】
（実施例４−１：単層培養法で感染、培養）
ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は１２ｗｅｌｌコラーゲンコートプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でまいた。２４時間後に培養液を２×１０５ゲノムコピー／ｍｌのＨＣＶを含む１ｍｌのヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に交換した。ＨＣＶはＨＣＶ感染患者血清由来のものを用いた。さらに２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。この後、２日毎に培地交換をおこなった。血清由来のＨＣＶを感染させてから３日、５日、７日後に細胞を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＳｅｐａｓｏｌＩ（ナカライテスク）を用いて回収した。このＲＮＡ中のＨＣＶ  ＲＮＡをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によって定量をおこなった。【００９２】
（実施例４−２：単層培養法で感染、その後中空糸培養）
ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は実施例４−１と同様の条件で培養し、同じく血清由来ＨＣＶに感染させた。感染４８時間後に６つのｗｅｌｌからトリプシンを用いて細胞を回収してこれをセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、中空糸内腔に細胞を充填した。各モジュールは１２ｗｅｌｌプレートのｗｅｌｌで震盪培養し、培養液は２日ごとに新しいものに交換した。モジュール中の細胞からのｔｏｔａｌＲＮＡは実施例４−１と同じ感染後の日数で常法により回収し、ＨＣＶ  ＲＮＡは実施例４−１と同様に定量した。【００９３】
（実施例４−３：中空糸培養法で感染、培養）
１×１０５細胞のＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュールの中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して細胞を充填し、１２ｗｅｌｌプレートを用いて振盪培養した。２４時間後、培養液を２×１０５ゲノムコピー／ｍｌの血清由来ＨＣＶを含む０．８ｍｌの培養液に交換した。さらに２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。培養液は２日ごとに新しいものに交換した。モジュール中の細胞からのｔｏｔａｌＲＮＡは実施例４−１と同じ感染後の日数で常法により回収し、ＨＣＶ  ＲＮＡは実施例４−１と同様に定量した。【００９４】
この結果、ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は、単層培養法においても非常に低いレベルで一時的に血清由来のＨＣＶが感染、増殖していることがわかったが、そのレベルは低く、例えばその培養系を使って薬剤の効果を判定できるものでは無かった。しかし、中空糸内にＨｕＳ−Ｅ／２細胞を充填して培養することにより、著しく高いウイルス感染価を示した。更に、単層培養においてウイルスを感染させた後に、この細胞をトリプシン消化して回収し中空糸内に充填して培養した結果は、単層培養法での感染、培養した場合とあまり変わらないものであった。【００９５】
実施例４の結果により、中空糸内に細胞を充填し３次元的に培養することにより、ＨＣＶ感染患者血清由来のウイルスを培養細胞に感染、増殖させ高いウイルス感染価を得ることができた。また、ＨＣＶを細胞に感染させる際に、中空糸内で細胞が３次元構造をとっていることが重要であることが示唆された。このことは、例えば肝細胞においては、血管側あるいは胆管側といった極性を付与することで本来細胞が持つ機能を発現させ、その結果として、ＨＣＶ感染が生体内に近似した状態で起きていることが推測された。【００９６】
〔実施例５〕
１×１０５細胞のＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）の中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、細胞を充填し、１２ｗｅｌｌプレートを用いて振盪培養した。２４時間後、ヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）を用いて、２×１０５ゲノムコピー／ｍｌの血清由来ＨＣＶを含む０．８ｍｌの培養液に交換した。感染２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。この新しい培養液にはＩＦＮ  ａｌｐｈａ（１００ＩＵ／ｍｌ）あるいはＮＩＭ８１１（１μｇ／ｍｌ）を含むものと何も含まないものの３種類を用いた。培養液は２日ごとに新しいものに交換した。血清由来のＨＣＶを感染させてから３日、５日、７日後に細胞を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＳｅｐａｓｏｌＩ（ナカライテスク）を用いて回収した。このＲＮＡ中のＨＣＶ  ＲＮＡをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によって定量をおこなった。【００９７】
この結果、ＩＦＮ  ａｌｐｈａおよびＮＩＭ８１１といったＨＣＶに対する薬剤を細胞培養液に添加することによって、患者血清由来ＨＣＶの細胞中での増殖が著しく抑制されることが確認できた。薬剤を添加しない群では、高いウイルス感染価を示した。なお、ＮＩＭ８１１はシクロスポリン誘導体でＨＣＶゲノム複製を阻害することが既に報告されている。【００９８】
〔実施例６〕
ＨｕＳ−Ｅ／２細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度になるよう細胞懸濁液を準備し、ＨＢＶのウイルス液を添加し、３７℃で１時間、細胞に感染させた。ＨＢＶウイルス液は、Ｈｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ｃ−ＡＴ株をトランスフェクションし、一過性に感染させ培養して得た培養上清を濃縮して調製した。【００９９】
（実施例６−１）
ＨＢＶに感染させたＨｕＳ−Ｅ／２細胞は１２ｗｅｌｌコラーゲンコートプレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でまいた。その後、ヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）を用いて３日間おきに培地交換を行いながら培養を続けた。細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量を経時的にＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量した。また、培養２４日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。【０１００】
（実施例６−２）
ＨＢＶに感染させたＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）の中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、１．５×１０５の細胞を充填した。細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、実施例６−１と同じ培養液を用いて振とう培養を行った。３日おきに培地交換を実施し細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量を経時的にＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量した。また、培養２４日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。【０１０１】
この結果、中空糸培養においては単層培養に比べ、長期間に渡りかつ高いＨＢＶ感染価を維持した。また、ｃｃｃＤＮＡのコピー数も、中空糸培養では単層培養法に比べ著しく高いものであった。【０１０２】
〔実施例７〕
１×１０５細胞のＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュールの中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して細胞を充填し、１２ｗｅｌｌプレートを用いて振盪培養した。２４時間後、培養液を２×１０５ゲノムコピー／ｍｌの血清由来ＨＣＶを含む０．８ｍｌの培養液に交換した。さらに２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。その後、２日ごとに培養液を新しいものに交換しながら３０日まで培養を続けた。この間、モジュール中の細胞および細胞培養上清から常法によりｔｏｔａｌＲＮＡを経時的に回収し、それぞれのＨＣＶ  ＲＮＡ数の推移を調べた。【０１０３】
細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡ数推移を調べた結果、増減を繰り返しながら３０日間以上の長期間にわたり感染が持続していることがわかった。また、培養上清中にも３０日間以上、ＨＣＶ  ＲＮＡが検出された。【０１０４】
この結果、中空糸内に充填した細胞にＨＣＶ感染患者血清由来のウイルスを感染させて長期間にわたり高いレベルで感染を持続することが確認された。【０１０５】
上述したように、本発明によれば、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、肝炎ウイルスを生体外にて効率よく長期間安定的に増殖させることが可能となった。さらに、本発明によれば、上記の方法により培養した肝炎ウイルス感染細胞を使用して肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価することが可能となった。【０１０６】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によって、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された培養細胞に肝炎ウイルスを感染させ、当該肝炎ウイルスを生体外にて効率よく長期間安定的に高い感染価で増殖させることが可能となった。さらに、本発明は、上記の方法により培養した肝炎ウイルス感染細胞を使用して肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価する薬剤評価方法を実施することが可能となった。【０１０８】
これまで正常培養ヒト肝細胞に肝炎ウイルスを感染させ、生体外において安定的に肝炎ウイルスの感染・増殖を可能とする培養系は無く、本発明は肝炎ウイルスの感染メカニズム解明や優れた抗ウイルス薬の開発に非常に有用となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月27日(2009.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項２】
細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項３】
前記細胞を充填した前記中空糸の内腔に圧力または遠心力を負荷することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項４】
前記細胞が肝細胞または肝臓由来の細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項５】
前記細胞がＨｕＳ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９０８）であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項６】
前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【請求項７】
以下の工程のいずれかを含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を製造する方法：
（１）透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させる工程；あるいは、
（２）細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填する工程。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の方法により製造された肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方法により得られた肝炎ウイルス感染細胞培養物、肝炎ウイルス粒子または肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いることを特徴とする肝炎ワクチンの製造方法。
【請求項１０】
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスを増殖するためのキット。
【請求項１１】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの感染を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキット。
【請求項１４】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスに感染した細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法。
【請求項１７】
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すためのキット。
【請求項１８】
前記肝炎ウイルス感染細胞は、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルス感染細胞であることを特徴とする、請求の範囲第１６項に記載の肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法。
【請求項１９】
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための診断または検査方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）等の肝炎ウイルスの増殖方法、ならびに肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸およびこれを用いた薬剤評価方法等の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界、とりわけアジアおよびアフリカ諸国において、劇症肝炎、肝硬変及び肝細胞癌のような急性および慢性の肝疾患の最も重要な原因の１つである。ＷＨＯ（世界保健機関）によるとＨＢＶに感染した患者は世界中に約３億５千万人いるといわれており、日本国内のＢ型肝炎ウイルスの持続感染者は、無症候性キャリアを含めると１５０万人に達すると推定されている。
【０００３】
現在、ＨＢＶに対する治療にはラミブジンを始めとする治療薬や、インターフェロン等が用いられているが、薬剤に耐性を持つウイルスが高い割合で出現してくるという大きな問題を抱えている。このため十分な治療効果が得られていない例も多く存在し、有効な抗ウイルス薬の開発が切望されている。
【０００４】
ＨＢＶは、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞などの株化細胞にトランスフェクションにより強制的に遺伝子を細胞内に導入することによって、一過性にウイルスを増殖させ得ることがわかっている（非特許文献１）。しかしながら、ヒト肝細胞にＨＢＶを接触感染させ、ウイルスを増殖させる有用な系はこれまで存在していない。このため、チンパンジーやヒト肝細胞を移植したキメラマウスを使用して基礎研究や薬剤の影響を調べる実験が行われている。しかし、これらの動物は非常に高価であり、個体差や再現性にも問題があるばかりでなく、動物愛護の点からもその利用には制限がある。このような背景から、有効な治療薬の早期開発を実現するための、ＨＢＶを安定して生体外増殖させうる有用な感染実験系が真に望まれていた。
【０００５】
一方、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染患者も世界中に約３億人いるといわれており、日本国内においてもＣ型肝炎ウイルスの持続感染者は、２００万人に達すると推定されている。ＨＣＶキャリアは非常に高い確率で慢性肝炎を発症し、一部は肝硬変、肝癌に進行する深刻な感染症である。ＷＨＯからは毎年３００〜４００万人の新規感染者が報告されており、現在、その治療法としてインターフェロンおよび抗ウイルス薬のリバビリンが併用されているが、ＨＣＶの感染拡大の防止およびウイルス撲滅に向けた新規ワクチンの開発が急務となっている。
【０００６】
ＨＣＶに対する治療には、インターフェロンおよびリバビリンの併用療法が主として行われるが、日本ではインターフェロンが効きにくいＨＣＶ−１ａ、ＨＣＶ−１ｂタイプの感染者が多く治癒率が低いことが問題となっている。また、インターフェロンの強い副作用も問題として挙げられる。このような背景からＨＣＶにおいても有効な抗ウイルス薬の開発が切望されている状況である。
【０００７】
ＨＣＶは生体であるヒトまたはチンパンジーにしか感染しないことが知られている。１９９９年にはＨＣＶのサブゲノムを培養細胞で複製増殖させるＨＣＶサブゲノムレプリコンシステムが報告されたが、この技術はウイルスＲＮＡの複製が出来るのみであり、それが可能な株もごく少数に限られたものであった。培養細胞を用いたＨＣＶ粒子の複製は、２００５年に脇田らがクローニングしたＪＦＨ−１株を用いて世界で初めて可能となった（非特許文献２）。しかしながら、ＪＦＨ−１株はＨＣＶ感染症では極めて稀な劇症肝炎患者から分離されたものという大きな制約がある。
【０００８】
その後、正常ヒト肝細胞または幾つかのヒト肝細胞株等の培養肝細胞において、ＨＢＶあるいはＨＣＶの感染、増殖が確認されているものの、それらは一過性の感染に終わるか、あるいは極めて低いレベルの感染価しか得られないものであり、例えば薬剤の有効性を評価するには何れの培養系も実用的なものであるとは言い難い。
【０００９】
培養肝細胞で感染が成立しても高いウイルス感染価が得られない大きな原因のひとつは細胞の培養形態にある。培養ディッシュ等を使った単層培養法においては、細胞は生体内とは極端に異なる環境下に置かれて培養されることになる。このため、細胞が持つ多くの機能が失われる結果、たとえウイルス感染が成立しても一過性に終わってしまい長期間安定してウイルスを感染・増殖させることが出来ない。
【００１０】
例えば、もしＨＢＶまたはＨＣＶ慢性肝炎患者から分離されたウイルス株を簡便かつ、高い感染価で培養することが可能となれば、有効な抗ウイルス薬をインビトロでスクリーニングできることになる。しかし、これまでそのようなウイルス培養系は存在しなかった。
【非特許文献１】Ｓｕｒｅａｕら、Ｃｅｌｌ、４７（１）：ｐｐ３７−４７（１９８６）
【非特許文献２】脇田隆字ら、ウイルス、５５（２）：ｐｐ２８７−２９６（２００５）
【発明の開示】
【００１１】
従って本発明は、上記のような問題点を解決しようとするものであり、ＨＢＶまたはＨＣＶ等の肝炎ウイルスを生体外の培養細胞に感染させ、ウイルスを増殖させる実験系を提供することを主目的とする。
【００１２】
更にＨＢＶやＨＣＶ感染患者血清由来の肝炎ウイルスを感染・増殖させる培養系を提供することによって、有効な肝炎ウイルス治療薬開発のための簡便なスクリーニングや、肝炎ウイルス感染患者に対する治療薬の効果予測を可能にするものである。
【００１３】
上記のような目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、当該肝炎ウイルスを生体外にて効率よく安定的に増殖させることを見出した。すなわち、本発明は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔において肝炎ウイルス感染細胞を培養し、肝炎ウイルスを生体外にて効率よく安定的に増殖させることができる肝炎ウイルスの増殖方法を提供する。
【００１４】
また、従来ヒト肝細胞の培養には、ディッシュやプレートなどの培養容器を用いた単層培養法が実施されていた。しかしながら、上述したように単層培養法においては、肝細胞にウイルスが感染しても一過性の感染または低い感染価しか得られない。本発明者らは、単層培養法では低い感染価しか得られなかった肝炎ウイルス感染細胞を、中空糸の内腔に充填して３次元培養を実施することによって、ウイルス感染価が著しく高くなることを見出した。
【００１５】
さらに、本発明は、上記の方法により培養した肝炎ウイルス感染細胞を使用して肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価するスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
また、本発明により、未だ不明であるＨＢＶやＨＣＶの感染宿主のレセプターを同定できる可能性が考えられる。更に本発明は、感染から複製の自然史を知る上でも重要なモデルを提供する。このため新たな宿主因子をターゲットとした薬剤開発にも応用できる可能性がある。
【００１７】
すなわち本発明は、以下のような構成からなるものである。
【００１８】
［項１］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【００１９】
［項２］
細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２０】
［項３］
前記細胞を充填した前記中空糸の内腔に圧力または遠心力を負荷することを特徴とする項１または２に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２１】
［項４］
前記細胞が肝細胞または肝臓由来の細胞であることを特徴とする項１〜３のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２２】
［項５］
前記細胞がＨｕＳ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９０８）であることを特徴とする項４に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２３】
［項６］
前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする項１〜５のいずれか１項に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
【００２４】
［項７］
以下の工程のいずれかを含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を製造する方法：
（１）透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させる工程；あるいは、
（２）細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填する工程。
【００２５】
［項８］
項７に記載の方法により製造された肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸。
【００２６】
［項９］
項１〜６のいずれか１項に記載の方法により得られた肝炎ウイルス感染細胞培養物、肝炎ウイルス粒子または肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いることを特徴とする肝炎ワクチンの製造方法。
【００２７】
［項１０］
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスを増殖するためのキット。
【００２８】
［項１１］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【００２９】
［項１２］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの感染を抑制する薬剤をスクリーニングする方法。
【００３０】
［項１３］
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキット。
【００３１】
［項１４］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスに感染した細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【００３２】
［項１５］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法。
【００３３】
［項１６］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法（オーダーメイド治療の確立）。
【００３４】
［項１７］
透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を備えていることを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すためのキット。
【００３５】
［項１８］
前記肝炎ウイルス感染細胞は、肝炎ウイルス感染者の血清由来の肝炎ウイルス感染細胞であることを特徴とする、項１６に記載の肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法（オーダーメイド治療の確立）。
【００３６】
［項１９］
透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルス感染者を治療するための診断または検査方法。
【００３７】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に本発明の具体的な実施の形態を説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００３９】
〔肝炎ウイルスの増殖方法およびキット〕
本発明は、肝炎ウイルスの増殖方法を提供する。本増殖方法は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させて培養する工程を含んでいる。また、本増殖方法は、細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に当該細胞を充填して培養する工程を含んでいる。いずれの方法においても、中空糸の内腔において肝炎ウイルスに感染した細胞を培養することを特徴としている。
【００４０】
（中空糸）
本発明において用いられる中空糸は、肝炎ウイルス感染細胞を保持する内腔を備え、一端が封止され、他端が開口しており、細胞は通過させないが水、塩類、タンパク質等の培養液成分を通過させる通孔を有する透過性の膜からなるものを好適に使用可能である。したがって、中空糸の材料は、細胞を中空糸内腔に保持でき、溶液や低分子の物質を透過させるような構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、セルロース系材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン等が好適に利用できる。
【００４１】
中空糸の大きさについても特に制限はないが、その内径は好ましくは２０〜１０００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍ程度のものが利用される。膜厚についても、特に制限はなく、中空糸が適度の強度を保ち、かつ物質の透過性も良好な範囲で設定すればよいが、例えば１０〜２００μｍ程度が好ましい。また、多孔性膜中空糸を使用する場合、細胞の培養を考慮すると、その平均孔径は物質交換効率のよい孔径の大きいものが好ましく、０．１〜５μｍ程度のものが好適に選択されるが、特にこの範囲に限定されるものではない。
【００４２】
また、中空糸は、（１）着脱可能に連結された流入側流通管と流出側流通管とからなる、一端が開口した細胞懸濁液流通管と、（２）細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部とを備えた器具に取り付けられた状態で本発明に係る肝炎ウイルスの増殖方法に用いてもよい。このとき中空糸は、一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が（１）の細胞懸濁液流通管と連通し、（２）の中空糸固定部に液体が漏れない状態で貫通するように、上記器具に１本または複数本取り付けられている。
【００４３】
上述したような本発明において用いられる中空糸および中空糸付きの器具は、特開２００５−１１０６９５号公報に記載されたものを好適に使用することが可能であり、本願発明においては、本特許文献の記載を適宜援用することができる。
【００４４】
（細胞の充填）
本増殖方法においては、上述した中空糸の内腔に、肝炎ウイルスを感染させるべき細胞、または肝炎ウイルスに感染した細胞を充填する。中空糸は、細胞を充填する前に親水化処理および滅菌処理されていることが好ましい。中空糸の親水化処理および滅菌処理は従来公知の方法により行われ得る。また、細胞を充填する前に、中空糸の内腔に細胞培養用液体培地等の細胞保存用液または適当なバッファー等を満たしておくことが好ましい。
【００４５】
中空糸の内腔に充填される細胞を、細胞培養用液体培地、細胞保存用液または適当なバッファー等に懸濁した細胞懸濁液を、中空糸の開口部から内腔に注入する。好ましくは、中空糸の内腔に予め満たされた細胞培養用液体培地、細胞保存用液、または適当なバッファーを用いて細胞懸濁液を調製すればよく、特に同一組成の液体培地を用いることが好ましい。
【００４６】
中空糸の他端が封止されているため、中空糸の開口部から内腔に注入された細胞懸濁液中の液体培地等の液体成分が中空糸の通孔から流出し、細胞が中空糸内腔に堆積する。中空糸内腔に堆積する細胞の密度は特に限定されないが、細胞が充填され堆積した中空糸に圧力または遠心力を付加することによって、細胞が凝集体化していることが好ましい。
【００４７】
中空糸の内腔に充填された細胞の凝集体化は、細胞を充填した中空糸内腔の圧力を陽圧にする、または中空糸外部の圧力を陰圧にする、あるいは細胞を充填した中空糸を遠心機にかけることにより実現することができる。中空糸に圧力または遠心力を付加して細胞を凝集体化する方法は、特開２００４−１６６７１７号公報および特開２００４−２８３０１０号公報に記載された方法を好適に使用することが可能であり、本願発明においては、本特許文献の記載を適宜援用することができる。
【００４８】
（細胞）
本増殖方法において用いられる細胞としては、肝炎ウイルスが感染し得る細胞であれば特に限定されず、肝細胞または肝臓由来細胞が好適に使用可能であり、特にヒト肝細胞であることが好ましい。また、ヒト肝臓由来の不死化ヒト肝細胞Ｈｕｓ−Ｅ／２細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９０８）を用いれば、特に効率よく肝炎ウイルスを増殖させることができるので、最も好ましい。なお、本明細書中においては、上記肝炎ウイルスを感染させる細胞を、培養細胞または宿主細胞と称することもある。
【００４９】
（肝炎ウイルス）
本発明において、上述したような培養細胞に感染させて、感染状態を維持させる、または増殖させる肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＥ型肝炎ウイルスのいずれかであり、特にＨＢＶまたはＨＣＶを用いた場合に顕著な効果を奏する。本発明において使用される肝炎ウイルスの形態は特に限定されず、肝炎ウイルスのポリヌクレオチド、肝炎ウイルス粒子、肝炎ウイルス粒子を含む血清、または培養細胞に一過性にウイルス遺伝子を導入させて得た培養上清を好適に利用可能である。
【００５０】
本発明において使用される肝炎ウイルスのポリヌクレオチドは、肝炎ウイルスのゲノム核酸であり、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの形態で存在し得る。肝炎ウイルス粒子は、肝炎ウイルス粒子構成タンパク質により構成されるウイルス殻中に肝炎ウイルスのゲノム核酸を含有するものであり、細胞に対する感染能を有するものであり、単に肝炎ウイルスと称することもある。肝炎ウイルス粒子は、細胞に肝炎ウイルス遺伝子を導入して一過性に感染させることによって得られる。そして、肝炎ウイルスに一過性に感染した細胞を培養して得た培養上清には、一過性に増殖した肝炎ウイルス粒子が含まれる。肝炎ウイルス粒子を含む血清は、肝炎ウイルスに感染した肝炎ウイルス感染者から採取した血液から得られ、肝炎ウイルス感染者の肝炎ウイルスを含むものである。
【００５１】
特に、肝炎ウイルス粒子、肝炎ウイルスに一過性に感染した細胞を培養して得た培養上清、または肝炎ウイルス粒子を含む血清を用いれば、接触感染により容易に細胞を感染させることができるため、好ましい。また、本発明においては、肝炎ウイルス粒子を含む血清を特に好適に使用可能である。
【００５２】
（肝炎ウイルス感染細胞）
本増殖方法においては、肝炎ウイルスに感染した細胞を中空糸の内腔において培養するが、中空糸の内腔に充填する前に細胞を肝炎ウイルスに感染させていてもよく、中空糸の内腔に充填した後に細胞を肝炎ウイルスに感染させてもよい。
【００５３】
細胞を肝炎ウイルスに感染させる方法は、特に限定されず、肝炎ウイルス遺伝子をエレクトロポレーション等により細胞に導入する方法、または細胞に肝炎ウイルス粒子を一定時間接触させて接触感染させる方法を好適に使用することができる。細胞に肝炎ウイルス粒子を接触感染させる方法は、より容易にウイルス感染細胞を得ることができるので好ましい。また、肝炎ウイルス粒子を含む培養上清または血清を細胞に接触させることによってもウイルス感染細胞を得ることが可能である。特に、本発明においては、肝炎ウイルス感染者から得た血清を接触感染させることによって得られた肝炎ウイルス感染細胞も好適に使用可能である。
【００５４】
中空糸の内腔に充填する前に、細胞を肝炎ウイルスに接触感染させる場合、細胞は液体培地等に分散した懸濁状態であるため肝炎ウイルスに対する接触機会が増加し感染効率がよい。また、中空糸の内腔に充填し、圧力または遠心力を付加することによって細胞を凝集体化した後に、細胞を肝炎ウイルスに接触感染させる場合、感染力が高く、安定して感染させることが可能である。肝炎ウイルス粒子よりも十分に大きい平均孔径の通孔を有する透過性の膜により構成される中空糸を用いることによって、肝炎ウイルスを中空糸の膜にある通孔を通過して細胞表面に到達させることができる。
【００５５】
ここで肝炎ウイルスによる細胞の感染は、細胞内に肝炎ウイルスが進入し、肝炎ウイルス粒子が安定的に増殖している状態を意図している。したがって、細胞内または細胞の培養上清中における肝炎ウイルスの核酸の量、または肝炎ウイルス構成タンパク質の量を定量することによって、肝炎ウイルスによる感染を確認することができる。特にＢ型肝炎ウイルスによる感染を確認する場合、細胞中のｃｃｃＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ：中間複製体ＤＮＡ）を定量することによって感染を確認することができる。
【００５６】
（培養）
本増殖方法において培養に供する中空糸は、肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸であり、上述したように、中空糸の内腔に充填された細胞に、肝炎ウイルスを感染させる、または細胞に肝炎ウイルスを感染させた後、中空糸の内腔に当該細胞を充填することによって製造することができる。
【００５７】
このようにして得られた中空糸を従来公知の方法により培養する。例えば、肝炎ウイルス感染細胞を含む中空糸を培養容器に移し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養する。このとき、振とう機等により培養容器を振とうさせながら培養することにより、中空糸内腔の細胞に対して効率よく栄養や酸素を供給することができる。
【００５８】
上述したように肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、培養細胞内において肝炎ウイルスを増殖させる。細胞内における肝炎ウイルスの増殖は、細胞内または細胞の培養上清における肝炎ウイルスの核酸または肝炎ウイルス粒子構成タンパク質の量を定量することによって確認することができる。特にＢ型肝炎ウイルスの増殖を確認する場合、細胞中のｃｃｃＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ：中間複製体ＤＮＡ）を定量することによって確認することができる。
【００５９】
本増殖方法において、上記中空糸を用いて肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、生体外において肝炎ウイルスを増殖させることが可能である。また、本発明によれば、肝炎ウイルスによる細胞の感染を長期間持続させることが可能であり、かつ肝炎ウイルスの増殖も長期間持続させることが可能である。さらに、本発明においては、肝炎ウイルスの遺伝子を細胞に導入して強制的に感染させなくても、細胞に肝炎ウイルスを接触させて自然に接触感染させた感染細胞を用いて容易かつ効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能である。また、本発明においては、簡易な構造の中空糸を用いているので、大掛かりで特殊な装置を必要とせず、簡単な装置を用いて簡便な操作により肝炎ウイルスを感染および増殖させることができる。
【００６０】
以上のように、本発明によれば効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるので、本発明により増殖させた肝炎ウイルスを用いて、肝炎ウイルスの感染または増殖を抑制する薬剤の評価、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤の評価、当該薬剤の評価による肝炎ウイルス感染者の治療等を好適に行うことが可能である。さらに、本発明においては、肝炎ウイルス感染者から得た血清を用いて感染させた細胞においても効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるため、このように増殖させた肝炎ウイルスを、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または治療に利用することが可能である。特に、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に治療薬を評価する場合に有用である。
【００６１】
本発明は、肝炎ウイルスを増殖するためのキットをさらに提供する。本キットは、透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を少なくとも備えている。すなわち、本発明に係る肝炎ウイルスを増殖するためのキットは、上記肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を少なくとも備えていればよい。中空糸の内腔において肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることができる。また本キットは、肝炎ウイルスに感染した細胞を備えていてもよい。
【００６２】
〔肝炎ワクチンの製造方法〕
本発明は、上記の増殖方法により得られた肝炎ウイルス感染細胞培養物、肝炎ウイルス粒子または肝炎ウイルス構成タンパク質（以下、肝炎ウイルス粒子等）を用いて、肝炎ワクチンを製造する方法をさらに提供する。ここで、肝炎ウイルス感染細胞培養物には、肝炎ウイルスに感染した細胞、当該細胞を培養して得た培養上清等が含まれる。本製造方法においては、上記肝炎ウイルス粒子等またはその一部を抗原として用いて、従来公知の方法により肝炎ワクチンを製造することが可能である。例えば、肝炎ウイルス粒子等をそのまま肝炎ワクチンとすることが可能であり、従来公知の方法により肝炎ウイルス粒子等を弱毒化または不活化して肝炎ワクチンを製造することも可能である。
【００６３】
本発明によって製造された肝炎ワクチンは、液体中に溶解または懸濁させること等によって、投与可能に調整させる。また、調製された肝炎ワクチンは、投与に適した形態とされていてもよく、医薬上許容される成分を添加してもよい。このように調製された肝炎ワクチンの投与経路、投与量、投与回数等は、従来の肝炎ワクチンまたは他のワクチンにおいて通常行われているのと同様に決定すればよい。
【００６４】
本発明によれば、簡単な装置を用いて簡便な操作により、生体外において肝炎ウイルスを長期的に増殖させることが可能であり、このようにして得られた肝炎ウイルス粒子等を用いて、効率よく肝炎ワクチンを製造することが可能である。本発明により製造された肝炎ワクチンを肝炎ウイルスに感染していない生体に投与して、生体内において肝炎ウイルスに対する免疫反応を誘導することによって、肝炎ウイルス感染を予防することが可能である。また、上記肝炎ワクチンを肝炎ウイルスに感染した生体に投与して、生体内において肝炎ウイスに対する強い免疫反応を誘導することによって、肝炎ウイルスを排除する治療に用いることも可能である。
【００６５】
〔薬剤をスクリーニングする方法およびキット〕
さらに、本発明は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔において培養した上記肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価する方法を提供する。具体的には、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を包む、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。また、本発明は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの感染を抑制する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００６６】
上記の培養工程において、評価すべき薬剤候補物質の存在下または非存在下において、肝炎ウイルスの感染状態、肝炎ウイルスの増殖状態、または肝炎ウイルスタンパク質の発現量が変化した場合、すなわち、評価すべき薬剤候補物質の存在により肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現が抑制された場合、当該薬剤候補物質を肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤であると判定することができる。
【００６７】
ここで、肝炎ウイルスの感染状態、増殖状態等に対する薬剤候補物質の影響は、肝炎ウイルス感染細胞を培養する培養液中、あるいは肝炎ウイルスに感染可能な細胞と肝炎ウイルスとを共に培養する培養液中に評価すべき薬剤を添加して培養し、培養上清中または細胞内に含まれる肝炎ウイルス核酸、肝炎ウイルス粒子構成タンパク質等を量的または質的に解析することによって、評価することができる。これにより、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするだけでなく、肝炎ウイルスの薬剤耐性評価やそのメカニズムの解明も可能となる。
【００６８】
本発明によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングすることができるので、様々な薬剤の評価を効率よく行うことが可能である。また、本発明によれば、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞であっても、効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるので、肝炎ウイルス感染者個別に薬剤候補物質を評価することができる。
【００６９】
本発明は、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキットをさらに提供する。本キットは、透過性を有する膜からなり、肝炎ウイルスが感染可能な細胞が内腔に充填された中空糸を少なくとも備えている。すなわち、本キットは、上記肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸を少なくとも備えていればよい。
【００７０】
中空糸の内腔に充填された細胞を肝炎ウイルスに感染させて培養することによって、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、様々な薬剤候補物質の評価を効率よく行うことが可能である。このとき、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた肝炎ウイルス感染細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に薬剤候補物質を評価することが可能である。また本キットは、肝炎ウイルスに感染した細胞を中空糸の内腔に備えていてもよい。これにより当該中空糸を用いて培養した細胞を用いて様々な薬剤の評価を効率よく行うことが可能である。
【００７１】
〔治療薬をスクリーニングする方法およびキット〕
上記スクリーニングする方法においては、肝炎ウイルスの感染または増殖を抑制する薬剤をスクリーニングする方法について説明したが、本発明はこれに限定されず、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングする方法もまた提供する。本方法におけるスクリーニング工程は、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法と同様であり、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程、または透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含んでいる。本方法によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングすることができるので、肝炎ウイルス感染者の治療に適した薬剤のスクリーニングを効率よく行うことが可能である。
【００７２】
特に、本方法において、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対する治療に適した薬剤を、個別にスクリーニングすることができる。したがって、本方法は、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または治療に好適に利用することができる。
【００７３】
また、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤をスクリーニングするためのキットを提供する。本キットも、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキットと同様に構成されている。本キットを用いれば、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤を効率よくスクリーニングすることが可能である。特に、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた肝炎ウイルス感染細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に治療薬をスクリーニングすることが可能である。
【００７４】
〔治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法およびキット〕
さらに、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出す方法もまた提供する。本方法におけるスクリーニング工程は、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングする方法と同様であり、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき複数の薬剤と共に培養する工程、または透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルスに感染可能な細胞を、肝炎ウイルスおよび評価すべき薬剤候補物質と共に培養する工程を含んでいる。本方法によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すことができるので、肝炎ウイルス感染者の治療に適した薬剤のスクリーニングを効率よく行うことが可能であり、オーダーメイド治療の確立を実現することができる。
【００７５】
特に、本方法において、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対する治療に適した薬剤の組み合わせを、個別に見出すことができる。したがって、本方法は、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または治療に好適に利用することができる。
【００７６】
また、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを見出すためのキットを提供する。本キットも、上記肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキットと同様に構成されている。本キットを用いれば、肝炎ウイルスを効率よく増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルス感染者を治療するために最適な薬剤の組み合わせを効率よく見出すことが可能である。特に、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた肝炎ウイルス感染細胞を用いれば、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に最適な治療薬の組み合わせを見出すことが可能である。
【００７７】
〔診断または検査方法〕
さらに、本発明は、肝炎ウイルス感染者を治療するための診断または検査方法を提供する。本発明に係る診断または検査方法は、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を、評価すべき薬剤と共に培養する工程を含み、当該培養工程において薬剤を評価することによって肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤を決定し、これを投与する工程をさらに含んでいる。具体的には、上記培養工程において、評価すべき薬剤の存在下または非存在下において、肝炎ウイルスの感染状態または増殖状態が変化した場合、すなわち、評価すべき薬剤の存在により肝炎ウイルスの感染または増殖が抑制された場合、当該薬剤を肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤であると判定することができる。このようにして評価した薬剤を、肝炎ウイルス感染者を治療するための薬剤として投与し、肝炎ウイルス感染者を治療する。
【００７８】
ここで、肝炎ウイルスの感染状態、増殖状態等に対する薬剤の影響は、肝炎ウイルス感染細胞を培養する培養液中、あるいは肝炎ウイルスに感染可能な細胞と肝炎ウイルスとを共に培養する培養液中に評価すべき薬剤を添加して培養し、培養上清中または細胞内に含まれる肝炎ウイルス核酸、肝炎ウイルス粒子構成タンパク質等を量的または質的に解析することによって、評価することができる。これにより、肝炎ウイルス感染者に対する治療薬の効果を予測することが可能である。
【００７９】
本発明によれば、培養細胞において効率よく長期的に肝炎ウイルスを感染および増殖させることが可能であり、このような肝炎ウイルス感染細胞を用いて、肝炎ウイルスの感染、肝炎ウイルスの増殖または肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングすることができるので、肝炎ウイルス感染者に対する様々な治療薬の効果を効率よく評価することが可能である。また、本発明によれば、肝炎ウイルス感染者由来の血清を用いて肝炎ウイルスに接触感染させた細胞であっても、効率よく肝炎ウイルスを増殖させることが可能であるので、肝炎ウイルス感染者に対して、個別に治療薬を評価することができる。したがって、本治療方法は、肝炎ウイルス感染者を個別に診断または治療するテーラーメードの診断または検査に好適に利用することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８１】
〔実施例１〕
凍結ヒト肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，Ｃｏｄｅ：Ｈ１０００．Ｈ１５，ｌｏｔ．４２８）を融解し、培養液にヒト肝細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度に懸濁した１ｍｌ細胞懸濁液を準備し、ここにＨＢＶを高濃度に含むＨＢＶ感染者の血清１００μｌを添加し３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下に６０分間静置した。前記同様にヒト肝細胞の懸濁液を調製し、ここにＨＢＶ感染者血清の替わりにＨｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ｃ−２２株をトランスフェクションし、一過性に増殖させて得たウイルス粒子を含む培養上清を添加し３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下に６０分間静置した。この後、それぞれのヒト肝細胞懸濁液をセルローストリアセテート製中空糸モジュールを用い（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）中空糸内腔に注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。
【００８２】
感染・培養開始から２日後に中空糸を培養液にて４回洗浄し、その後２日毎に培養液を交換しながら、３５日目まで培養を継続した。細胞培養上清から市販のＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ、キアゲン）を使用して培養液中のＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ  ＤＮＡの定量を経時的に行った。また、培養３５日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。
【００８３】
その結果、培養１０日目から培養３５日目までの間、感染者血清を感染させた細胞では培養上清中には７．０×１０３〜５．０×１０４コピー／ｍｌ、培養液より得たウイルス液を感染させた細胞では６．５×１０６〜１．７×１０８コピー／ｍｌのＨＢＶ粒子に相当するＨＢＶ  ＤＮＡが出ていることを確認した。
また、培養３５日目の細胞中には、血清を感染させた細胞では７．３×１０３コピー、培養液より得たウイルス液を感染させた細胞では４．０×１０８コピーに相当するｃｃｃＤＮＡを確認した。このことより、ＨＢＶが長期間にわたって感染し細胞内で増殖していることが確認できた。
【００８４】
〔実施例２〕
凍結ヒト肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，Ｃｏｄｅ：Ｈ１０００．Ｈ１５，ｌｏｔ．４２８）を融解し、培養液に細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度に懸濁した１ｍｌ細胞懸濁液を準備した。この後、セルローストリアセテート製中空糸モジュールを用い（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）中空糸内腔にこのヒト肝細胞懸濁液を注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、ここにＦｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ｃ−２２株をトランスフェクションし一過性に増殖させて得たウイルス粒子を含む培養上清を添加して、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。
【００８５】
感染・培養開始から２日後に中空糸を培養液にて４回洗浄し、更に２日毎に培養液を交換しながら、３５日目まで培養を継続した。細胞培養上清から市販のＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ、キアゲン）を使用して培養液中のＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ  ＤＮＡの定量を経日的に行った。また、培養３５日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。
【００８６】
その結果、培養１０日目から培養３５日目までの間、細胞培養上清中には６．０×１０５〜５．０×１０７コピー／ｍｌのＨＢＶ粒子に相当するＨＢＶ  ＤＮＡが出ていることを確認した。また、培養３５日目の細胞中には、４．１×１０７コピーに相当するｃｃｃＤＮＡを確認した。このことより、ＨＢＶが長期間にわたって感染し細胞内で増殖していることが確認できた。
【００８７】
〔実施例３〕
凍結ヒト肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ，Ｃｏｄｅ：Ｈ１０００．Ｈ１５，ｌｏｔ．４２８）を融解し、培養液に細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度に細胞懸濁液を準備し、この後、セルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）の中空糸内腔にこのヒト肝細胞懸濁液を注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。１日おきに培地交換を実施し８日間培養を行った時点で培養液にＨＢＶのウイルス液を添加し、細胞に感染させた。ＨＢＶウイルス液は、Ｈｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ａｅ株をトランスフェクションし、一過性に感染させ培養して得た培養上清を濃縮して調製した。感染と同時に、細胞培養液にＢ型慢性肝炎治療薬として臨床適用されているＬａｍｉｖｕｄｉｎｅを最終０．２ｍＭまたは１．０ｍＭとなるように添加し培養を行った。薬剤添加後の細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量を経時的にＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量した。
【００８８】
その結果、Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ添加群では溶媒対照群に比べ細胞培養上清中に出てくるＨＢＶ  ＤＮＡの増加が著明に抑制され、薬剤の抗ウイルス効果を確認できた。
【００８９】
〔実施例４〕
ヒト肝臓に由来する不死化ヒト肝細胞ＨｕＳ−Ｅ／２細胞を実験に使用した。ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は以下に述べるような方法で樹立した。なお、不死化ヒト肝細胞ＨｕＳ−Ｅ／２は、２００７年９月７日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託された（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９０８）。
【００９０】
ヒト肝組織から分離した正常ヒト肝細胞に、プラスミドに挿入したヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ遺伝子）およびヒトパピローマＥ６Ｅ７遺伝子（ＨＰＶ１８／Ｅ６Ｅ７）を常法に従いトランスフェクションにより細胞内に導入した。遺伝子導入後、増殖能を獲得し不死化した細胞コロニーから肝細胞機能発現の高いものを選別し、ＨｕＳ−Ｅ／２クローンを得た。
【００９１】
（実施例４−１：単層培養法で感染、培養）
ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は１２ｗｅｌｌコラーゲンコートプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でまいた。２４時間後に培養液を２×１０５ゲノムコピー／ｍｌのＨＣＶを含む１ｍｌのヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に交換した。ＨＣＶはＨＣＶ感染患者血清由来のものを用いた。さらに２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。この後、２日毎に培地交換をおこなった。血清由来のＨＣＶを感染させてから３日、５日、７日後に細胞を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＳｅｐａｓｏｌＩ（ナカライテスク）を用いて回収した。このＲＮＡ中のＨＣＶ  ＲＮＡをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によって定量をおこなった。
【００９２】
（実施例４−２：単層培養法で感染、その後中空糸培養）
ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は実施例４−１と同様の条件で培養し、同じく血清由来ＨＣＶに感染させた。感染４８時間後に６つのｗｅｌｌからトリプシンを用いて細胞を回収してこれをセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、中空糸内腔に細胞を充填した。各モジュールは１２ｗｅｌｌプレートのｗｅｌｌで震盪培養し、培養液は２日ごとに新しいものに交換した。モジュール中の細胞からのｔｏｔａｌＲＮＡは実施例４−１と同じ感染後の日数で常法により回収し、ＨＣＶ  ＲＮＡは実施例４−１と同様に定量した。
【００９３】
（実施例４−３：中空糸培養法で感染、培養）
１×１０５細胞のＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュールの中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して細胞を充填し、１２ｗｅｌｌプレートを用いて振盪培養した。２４時間後、培養液を２×１０５ゲノムコピー／ｍｌの血清由来ＨＣＶを含む０．８ｍｌの培養液に交換した。さらに２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。培養液は２日ごとに新しいものに交換した。モジュール中の細胞からのｔｏｔａｌＲＮＡは実施例４−１と同じ感染後の日数で常法により回収し、ＨＣＶ  ＲＮＡは実施例４−１と同様に定量した。
【００９４】
この結果、ＨｕＳ−Ｅ／２細胞は、単層培養法においても非常に低いレベルで一時的に血清由来のＨＣＶが感染、増殖していることがわかったが、そのレベルは低く、例えばその培養系を使って薬剤の効果を判定できるものでは無かった。しかし、中空糸内にＨｕＳ−Ｅ／２細胞を充填して培養することにより、著しく高いウイルス感染価を示した。更に、単層培養においてウイルスを感染させた後に、この細胞をトリプシン消化して回収し中空糸内に充填して培養した結果は、単層培養法での感染、培養した場合とあまり変わらないものであった。
【００９５】
実施例４の結果により、中空糸内に細胞を充填し３次元的に培養することにより、ＨＣＶ感染患者血清由来のウイルスを培養細胞に感染、増殖させ高いウイルス感染価を得ることができた。また、ＨＣＶを細胞に感染させる際に、中空糸内で細胞が３次元構造をとっていることが重要であることが示唆された。このことは、例えば肝細胞においては、血管側あるいは胆管側といった極性を付与することで本来細胞が持つ機能を発現させ、その結果として、ＨＣＶ感染が生体内に近似した状態で起きていることが推測された。
【００９６】
〔実施例５〕
１×１０５細胞のＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）の中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、細胞を充填し、１２ｗｅｌｌプレートを用いて振盪培養した。２４時間後、ヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）を用いて、２×１０５ゲノムコピー／ｍｌの血清由来ＨＣＶを含む０．８ｍｌの培養液に交換した。感染２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。この新しい培養液にはＩＦＮ  ａｌｐｈａ（１００ＩＵ／ｍｌ）あるいはシクロスポリン誘導体（１μｇ／ｍｌ）を含むものと何も含まないものの３種類を用いた。培養液は２日ごとに新しいものに交換した。血清由来のＨＣＶを感染させてから３日、５日、７日後に細胞を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＳｅｐａｓｏｌＩ（ナカライテスク）を用いて回収した。このＲＮＡ中のＨＣＶ  ＲＮＡをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によって定量をおこなった。
【００９７】
この結果、ＩＦＮ  ａｌｐｈａおよびシクロスポリン誘導体といったＨＣＶに対する薬剤を細胞培養液に添加することによって、患者血清由来ＨＣＶの細胞中での増殖が著しく抑制されることが確認できた。薬剤を添加しない群では、高いウイルス感染価を示した。
【００９８】
〔実施例６〕
ＨｕＳ−Ｅ／２細胞が約２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度になるよう細胞懸濁液を準備し、ＨＢＶのウイルス液を添加し、３７℃で１時間、細胞に感染させた。ＨＢＶウイルス液は、Ｈｕｈ７細胞にＨＢＶ  Ｃ−ＡＴ株をトランスフェクションし、一過性に感染させ培養して得た培養上清を濃縮して調製した。
【００９９】
（実施例６−１）
ＨＢＶに感染させたＨｕＳ−Ｅ／２細胞は１２ｗｅｌｌコラーゲンコートプレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でまいた。その後、ヒト肝細胞無血清培養液（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）を用いて３日間おきに培地交換を行いながら培養を続けた。細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量を経時的にＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量した。また、培養２４日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。
【０１００】
（実施例６−２）
ＨＢＶに感染させたＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１）の中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷し、１．５×１０５の細胞を充填した。細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、実施例６−１と同じ培養液を用いて振とう培養を行った。３日おきに培地交換を実施し細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量を経時的にＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにて定量した。また、培養２４日目の細胞を回収してホモジナイズした細胞溶解液より、細胞内ＤＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてＨＢＶ特異的なｃｃｃＤＮＡ（中間複製体ＤＮＡ）の定量を行った。
【０１０１】
この結果、中空糸培養においては単層培養に比べ、長期間に渡りかつ高いＨＢＶ感染価を維持した。また、ｃｃｃＤＮＡのコピー数も、中空糸培養では単層培養法に比べ著しく高いものであった。
【０１０２】
〔実施例７〕
１×１０５細胞のＨｕＳ−Ｅ／２細胞をセルローストリアセテート製中空糸モジュールの中空糸内腔に８０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して細胞を充填し、１２ｗｅｌｌプレートを用いて振盪培養した。２４時間後、培養液を２×１０５ゲノムコピー／ｍｌの血清由来ＨＣＶを含む０．８ｍｌの培養液に交換した。さらに２４時間後にこの培養液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新しい培養液を加えた。その後、２日ごとに培養液を新しいものに交換しながら３０日まで培養を続けた。この間、モジュール中の細胞および細胞培養上清から常法によりｔｏｔａｌＲＮＡを経時的に回収し、それぞれのＨＣＶ  ＲＮＡ数の推移を調べた。
【０１０３】
細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡ数推移を調べた結果、増減を繰り返しながら３０日間以上の長期間にわたり感染が持続していることがわかった。また、培養上清中にも３０日間以上、ＨＣＶ  ＲＮＡが検出された。
【０１０４】
この結果、中空糸内に充填した細胞にＨＣＶ感染患者血清由来のウイルスを感染させて長期間にわたり高いレベルで感染を持続することが確認された。
【０１０５】
上述したように、本発明によれば、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝炎ウイルス感染細胞を培養することによって、肝炎ウイルスを生体外にて効率よく長期間安定的に増殖させることが可能となった。さらに、本発明によれば、上記の方法により培養した肝炎ウイルス感染細胞を使用して肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価することが可能となった。
【０１０６】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によって、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された培養細胞に肝炎ウイルスを感染させ、当該肝炎ウイルスを生体外にて効率よく長期間安定的に高い感染価で増殖させることが可能となった。さらに、本発明は、上記の方法により培養した肝炎ウイルス感染細胞を使用して肝炎ウイルスに対する薬剤の影響を評価する薬剤評価方法を実施することが可能となった。
【０１０８】
これまで正常培養ヒト肝細胞に肝炎ウイルスを感染させ、生体外において安定的に肝炎ウイルスの感染・増殖を可能とする培養系は無く、本発明は肝炎ウイルスの感染メカニズム解明や優れた抗ウイルス薬の開発に非常に有用となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明を用いた実施例１において、患者血清由来ＨＢＶを感染増殖させた細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図２】本発明を用いた実施例１において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞中のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピー数を示すグラフである。
【図３】本発明を用いた実施例２において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図４】本発明を用いた実施例２において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞中のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピー数を示すグラフである。
【図５】本発明を用いた実施例３において、ＨＢＶを感染増殖させた細胞培養液にＬａｍｉｖｕｄｉｎｅを加えた場合の、細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図６】本発明を用いた実施例４において、患者血清由来ＨＣＶを感染させた各条件の培養細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図７】本発明を用いた実施例５において、患者血清由来ＨＣＶを感染させた細胞培養液にインターフェロンまたはシクロスポリン誘導体を加えた場合の、培養細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図８】本発明を用いた実施例６において、ＨＢＶを感染増殖させた各条件の細胞培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図９】本発明を用いた実施例６において、ＨＢＶを感染増殖させた各条件の細胞中のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピー数を示すグラフである。
【図１０】本発明を用いた実施例７において、患者血清由来ＨＣＶを感染させた培養細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【図１１】本発明を用いた実施例７において、患者結成由来ＨＣＶを感染させた細胞の培養上清中のＨＣＶ  ＲＮＡコピー数の推移を示すグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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【国際調査報告】
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