(57)【要約】【課題】高純度、すなわち純度９９％以上のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を製造する方法を提供する。【解決手段】下記一般式で示されるＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法であって、ラパマイシンとアルキルトリフレートとを反応させる工程と、前記反応によって得られた反応生成物を順相クロマトグラフにより精製する工程と、前記順相クロマトグラフによって精製された精製物を逆相クロマトグラフにより精製する工程を行うことを特徴とするＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。【化１】2008065887.tif 000008（式１中、Ｒが、アルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アシロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、またはアリールである。）【選択図】なし
2008065887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で示されるＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法であって、ラパマイシンとアルキルトリフレートとを反応させる工程と、前記反応によって得られた反応生成物を順相クロマトグラフにより精製する工程と、前記順相クロマトグラフによって精製された精製物を逆相クロマトグラフにより精製する工程を行うことを特徴とするＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【化１】
2008065887.tif 000007
（式１中、Ｒが、アルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アシロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、またはアリールである。）
【請求項２】
前記逆相クロマトグラフに用いる固定相が、アルキル基、フェニル基、アルキルシリル基より選ばれる少なくとも一種で修飾された、粒径が５〜１００μｍのシリカゲルであることを特徴とする請求項１に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。  
【請求項３】
前記アルキル基が、ブチル基、オクチル基、オクタデシル基より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項２に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記シリカゲルの粒径が、１０〜５０μｍであることを特徴とする請求項２または３に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記逆相クロマトグラフに用いる溶離液が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールより選ばれる少なくとも１種の有機溶媒に対して１０〜５０ｖｏｌ％の水を混合した混合液であることを特徴とする請求項１に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記有機溶媒が、アセトニトリルあるいはメタノールであることを特徴とする請求項５に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記アセトニトリルあるいはメタノールに対する水の比率が２０〜３５ｖｏｌ％であることを特徴とする請求項６に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。  
【請求項８】
前記逆相クロマトグラフに用いる注入液が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールより選ばれる少なくとも１種の有機溶媒に対して４０〜６０ｖｏｌ％の水を混合した混合液であることを特徴とする請求項１に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記逆相クロマトグラフにおいて、カラムヘッド容積１．０Ｌあたり１〜４ｇの前記順相クロマトグラフによって精製された精製物を分離に供することを特徴とする請求項１に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの方法でＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を製造したした後、引き続き、得られた前記誘導体を少なくとも1種類以上の水と混和可能な溶媒と水とを含む混合溶媒へ投入、あるいは少なくとも1種類以上の水と混和可能な溶媒にあらかじめ溶解させ次いで水あるいは水を含む混合溶媒へ投入し、析出させる工程を行うことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記水と混和可能な溶媒をＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体に対して２から１０重量比用いる請求項１０に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項１２】
前記水をＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体に対して１０重量比以上用いる請求項１０または１１に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項１３】
前記水と混和可能な溶媒がアルコール類である請求項１０〜１２のいずれかに記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項１４】
前記アルコール類がメタノールである請求項１３に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造法。
【請求項１５】
前記析出は、Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体を少なくとも1種類以上の水と混和する溶媒を含む溶媒にあらかじめ溶解させた後、水もしくは少なくとも1種類以上の水と混和する溶媒と水を含む混合溶媒に投入することにより行われるものである請求項１０〜１４のいずれかに記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかの製造方法で製造されたことを特徴とするＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体。
【請求項１７】
純度が９９％以上である請求項１６に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高純度のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法およびその製造方法によって製造されたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）から産生されるマクロライド系抗生物質である。ラパマイシンは免疫抑制作用を有し、さらに抗ガンおよび抗真菌性を有していることも示されている。このような有益な薬理活性を示すことよりラパマイシン誘導体の報告が数多くある（非特許文献１）。【０００３】
一方、ラパマイシン誘導体の合成法としては、例えば特許文献１に、トルエン溶媒中ルチジン存在下ラパマイシンとアルキルトリフレートを反応させＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を製造する方法が開示されている。特許文献１では、得られたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の収率あるいは純度についての記載はないが、本発明者ら追試を実施したところ、収率は２３％に留まり、また純度は９２〜９５％程度であった。【０００４】
また、本発明者らによって改良されたＯ−ラパマイシン誘導体の合成法として特許文献２がある。特許文献２には塩化メチレン溶媒中Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン存在下ラパマイシンとアルキルトリフレートを反応させ、前記反応によって得られた化合物を順相クロマトグラフにより精製する方法が開示されている。特許文献２の方法によって収率は大幅に改善されたが、得られたＯ−アルキル化ラパマイシンの純度は９５％程度であった（本明細書比較例１参照）。【０００５】
一般的に医薬品の純度は、医薬品原末としての優劣という点で非常に重要な要素となりうる。純度が低いということは、不純物が多く含まれているということを示し、薬効や安全性の面で信頼性が低いと判断される。このように低い純度のものを医薬品として用いようとする場合、不純物の同定・定量や、不純物の安全性試験などを必要とされており、開発のリスクやコストが増大することが問題となる。したがって、高純度の医薬品原末を得ることは製品開発に非常に有利となる。  【０００６】
【非特許文献１】Drugs of Future 1999,24(1):22-29
【特許文献１】ＷＯ９４／０９０１０号公報
【特許文献２】特開２００５−２８１２９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、高純度のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法およびその製造方法によって製造されたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的は、下記（１）〜（１７）の本発明により達成される。
（１）下記一般式で示されるＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法であって、ラパマイシンとアルキルトリフレートとを反応させる工程と、前記反応によって得られた反応生成物を順相クロマトグラフにより精製する工程と、前記順相クロマトグラフによって精製された精製物を逆相クロマトグラフにより精製する工程を行うことを特徴とするＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。【０００９】
【化１】
2008065887.tif 000003
（式１中、Ｒが、アルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アシロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、またはアリールである。）
（２）前記逆相クロマトグラフに用いる固定相が、アルキル基、フェニル基、アルキルシリル基より選ばれる少なくとも一種で修飾された、粒径が５〜１００μｍのシリカゲルであることを特徴とする（１）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（３）前記アルキル基が、ブチル基、オクチル基、オクタデシル基より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする（２）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（４）前記シリカゲルの粒径が、１０〜５０μｍであることを特徴とする（２）または（３）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（５）前記逆相クロマトグラフに用いる溶離液が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールより選ばれる少なくとも１種の有機溶媒に対して１０〜５０ｖｏｌ％の水を混合した混合液であることを特徴とする（１）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（６）前記有機溶媒が、アセトニトリルあるいはメタノールであることを特徴とする（５）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（７）前記アセトニトリルあるいはメタノールに対する水の比率が２０〜３５ｖｏｌ％であることを特徴とする（６）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（８）前記逆相クロマトグラフに用いる注入液が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールより選ばれる少なくとも１種の有機溶媒に対して４０〜６０ｖｏｌ％の水を混合した混合液であることを特徴とする（１）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（９）前記逆相クロマトグラフにおいて、カラムヘッド容積１．０Ｌあたり１〜４ｇの前記順相クロマトグラフによって精製された精製物を分離に供することを特徴とする（１）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれかの方法でＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を製造したした後、引き続き、得られた前記誘導体を少なくとも1種類以上の水と混和可能な溶媒と水とを含む混合溶媒へ投入、あるいは少なくとも1種類以上の水と混和可能な溶媒にあらかじめ溶解させ次いで水あるいは水を含む混合溶媒へ投入し、析出させる工程を行うことを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（１１）前記水と混和可能な溶媒をＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体に対して２から１０重量比用いる（１０）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（１２）前記水をＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体に対して１０重量比以上用いる（１０）または（１１）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（１３）前記水と混和可能な溶媒がアルコール類である（１０）〜（１２）のいずれかに記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（１４）前記アルコール類がメタノールである（１３）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造法。
（１５）前記析出は、Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体を少なくとも1種類以上の水と混和する溶媒を含む溶媒にあらかじめ溶解させた後、水もしくは少なくとも1種類以上の水と混和する溶媒と水を含む混合溶媒に投入することにより行われるものである（１０）〜（１４）のいずれかに記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法。
（１６）（１）〜（１５）のいずれかの製造方法で製造されたことを特徴とするＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体。
（１７）純度が９９％以上である（１６）に記載のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で提供される製造方法により高純度、すなわち純度９９％以上のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を製造することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１のクロマトグラムである。
【図２】図２は、比較例１のクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明をより具体的に説明する。
本発明では、ラパマイシンとアルキルトリフレートとを反応させる工程と、前記反応によって得られた反応生成物を順相クロマトグラフにより精製する工程と、前記順相クロマトグラフによって精製された精製物を逆相クロマトグラフにより精製する工程を行うことを特徴とする下記一般式１で示されるＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の製造方法を提供する。【００１３】
【化１】
2008065887.tif 000004
（式１中、Ｒが、アルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アシロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニルアミノアルキル、アシルアミノアルキル、またはアリールである。）【００１４】
上記一般式１のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体について、Ｒ=アルコキシアルキルの具体例として、下記一般式２で示されるＯ−(２−エトキシエチル)−ラパマイシンなどを例示することができる。
Ｏ−(２−エトキシエチル)−ラパマイシンは、例えば塩化メチレン溶媒中Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン存在下、ラパマイシンとアルキルトリフレートの一つである２−エトキシエチルトリフレートを反応させることにより得ることができる。【００１５】
【化２】
2008065887.tif 000005
【００１６】
また、Ｒ＝ヒドロキシアルキルの具体例としては、下記一般式３で示されるＯ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンなどを例示することができる。
Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンは、例えば塩化メチレン溶媒中Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン存在下、ラパマイシンとアルキルトリフレートの一つであるt-ブチルジメチルシリロキシエチルトリフレートを反応させ、t-ブチルジメチルシリル基を脱保護することにより得ることができる。【００１７】
【化３】
2008065887.tif 000006
【００１８】
本発明のラパマイシンとアルキルトリフレートとを反応させる工程において使用される溶媒は、原料および反応生成物に対する溶解力を有していれば特に限定されないが、好ましくはハロゲンを含む有機溶媒、より好ましくは塩素を含む有機溶媒、さらに好ましくは塩化メチレン、クロロホルムである。【００１９】
本発明では、上記の通りラパマイシンとアルキルトリフレートとを反応させた後、その反応生成物を順相クロマトグラフにより精製し、順相クロマトグラフによって精製された精製物をさらに逆相クロマトグラフにより精製する。これらの精製工程を経ることにより、高純度、すなわち純度９９％以上のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を得ることが可能である。【００２０】
本発明でいう純度とは、下記条件の液体クロマトグラフで分析して得られるＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体のピーク面積百分率を表す。すなわち、純度は（Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体ピーク面積×１００）／（全てのピーク面積の総和）という計算式で導かれ、％値で表される。
（液体クロマトグラフの条件）
・カラム：Zorbax  SB-C18、直径4.6mm×長さ25cm（Aglient  Technologies社製）
・溶離液：70vol％アセトニトリル/30vol％脱イオン水
・注入量：10uL（10mg試料を20mlアセトニトリルに溶解）
・流速：2.0ml/min        ・分析時間：１時間
・検出：ＵＶ  278nm      ・カラム温度：40℃  【００２１】
本発明の順相クロマトグラフは、分析や分取精製に一般的に用いられている順相クロマトグラフを指す。すわなち、固定相の極性が移動相の極性より高い分離系であり、固定相にはシリカゲル等を用い、シリカゲルを固定相に用いた場合は、試料分子がシラノール基に吸着し、吸―脱着の過程をへて分離精製が行われる。移動相の溶離液には極性の少ない溶媒、例えばヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム等、もしくはそれらの混合物が用いられる。【００２２】
本発明の逆相クロマトグラフは、分析や分取精製に一般的に用いられている逆相クロマトグラフを指す。すなわち、順相クロマトグラフとは逆に移動相の極性が固定相の極性より高い分離系であり、固定相にはシリカゲルのシラノール基に修飾基により修飾を行って疎水性を付与した粒子状充填材（以下、固定相粒子という）を用い、移動相の溶離液には水、あるいは水とメタノール、エタノール、アセトニトリルのような水と混和する有機溶媒の混合物など、親水性の高いものが用いられる。固定相あるいは固定相を予め充填したカラムは数々のメーカーにより市販されており容易に利用できる。なお、固定相粒子の性質は、修飾基の種類、修飾率、粒子径、比表面積、細孔容積、細孔径等により異なる。【００２３】
本発明の逆相クロマトグラフに用いる固定相（シリカゲルのシラノール基）を修飾する修飾基としては、例えばアルキル基、フェニル基、アルキルシリル基が挙げられ、アルキル基としては、例えばブチル基、オクチル基、オクタデシル基等が挙げられる。なお、アルキル基はその一部が他の官能基で置換されていれもよく、そのようなものとしては例えばシアノプロピル基、アミノプロピル基、ピレニルエチル基、ニトロフェニルエチル基等が挙げられる。また、フェニル基もその一部が他の官能基で置換されていれもよく、そのようなものとしては例えばニトロフェニル基、シアノフェニル基等が挙げられる。なお、シリカゲルのシラノール基は部分的に修飾されていてもよく、修飾されず残存したシラノール基はエンドキャッピングされていてもよい。これら修飾基の種類や修飾率の違いは固定相の性質に影響するため、分離対象化合物の性質を考慮し、溶離液などの他の因子と合わせて分離目的に適するものを選定する必要がある。なお、本発明のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を精製する場合、修飾基としてブチル基、オクチル基、オクタデシル基が特に好ましい。【００２４】
逆相クロマトグラフに用いる固定相粒子は、粒径３μｍから５００μｍ程度のものが市販されている。一般的に、粒径が小さくなるほど分離性能は向上するが、抵抗が大きくカラム圧が高くなるため流速を上げることが難しくなる。また、粒径が小さくなるほどその価格が高くなる。したがって、精製目的によって、要求される分離能、処理量と処理時間、コストパフォーマンスを考慮し、適切な粒子径を選択する必要がある。なお、なお、本発明のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を精製する場合、粒子径は１０〜５０μｍが好ましく、１０〜２５μｍがより好ましい。【００２５】
本発明に逆相クロマトグラフに用いる溶離液としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールより選ばれる少なくとも１種の有機溶媒に対して１０〜５０ｖｏｌ％の水を混合した混合液が好ましく、前記有機溶媒がアセトニトリルあるいはメタノールであることがより好ましく、前記アセトニトリルあるいはメタノールに対する水の比率が２０〜３５ｖｏｌ％であることがさらに好ましい。なお、有機溶媒の種類や水との混合比率は、固定相の種類、カラム容積、分離する量によって適切な条件を選択する必要がある。【００２６】
本発明の逆相クロマトグラフに用いる注入液としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールより選ばれる少なくとも１種の有機溶媒に対して４０〜６０ｖｏｌ％の水を混合した混合液が好ましい。なお、このような混合液に順相クロマトグラフによって精製された精製物を溶解させる。【００２７】
固定相の量と分離に供する原料（本発明の場合は順相クロマトグラフによって精製された精製物）の量は、目的とする精製物の純度と回収率に影響する。例えば、固定相にブチル基、オクチル基、オクタデシル基より選ばれる少なくとも一種で修飾され粒径が１０〜２５μｍのシリカゲルを、溶離液にアセトニトリルあるいはメタノールに対する水の比率が２０〜３５ｖｏｌ％である混合物を用いる場合、カラムヘッド容積１．０Ｌあたり１〜４ｇの原料が分離に供される。例えば、内径５ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムでは０．５〜２ｇ、内径２０ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムでは、９．５〜３８ｇの原料を分離に供することによって、目的の高純度のＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体を許容可能な範囲の回収率で得ることができる。【００２８】
上記逆相クロマトグラフによって精製されたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の粉末化は、前記Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体を水と混和可能な溶媒に溶解させ、この溶液を水中に投入して析出させて行うことができる。また、前記Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体を少なくとも1種類以上の水と混和する溶媒と水を含む混合溶媒にあらかじめ溶解させた後、放置して析出させることによっても粉末化することができる。このように粉末化することによって、医薬品原末としての取扱性が向上し、なおかつ品質安定性や保存安定性も向上する。これらの長所は、後述のステントへのコーティング時の製造上の安定性に貢献する。【００２９】
また、本発明の製造方法によって得られたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の粉末化に使用される水と混和可能な溶媒は、好ましくはアルコールであり、さらに好ましくはメタノールである。【００３０】
また、本発明の製造方法によって得られたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の粉末化に使用される水と混和可能な溶媒は、Ｏ−アルキル化ラパマイシンに対して２から１０重量比用いるのが好ましい。【００３１】
また、本発明の製造方法によって得られたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体の粉末化に使用される水は、Ｏ−アルキル化ラパマイシンに対して１０重量比以上用いるのが好ましい。【００３２】
本発明の製造方法によって得られたＯ−アルキル化ラパマイシン誘導体は、例えばステント等の医療器具にコーティングされる。前記Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体でコーティングされたステントを血管等の病変部に留置することにより、前記O-アルキル化ラパマイシン誘導体が病変部に取り込まれて再狭窄が予防される。
【実施例】
【００３３】
次に実施例によって本発明を説明する。
（実施例１）
（１）２−エトキシエチルトリフレートの製造
エトキシエタノール25gを攪拌子入りの丸底フラスコに取り、窒素バブラーに接続して内部を乾燥窒素で置換した。塩化メチレン141mLを加えて、さらに2,6-ルチジン33mlを加え、-10〜0℃に冷却下、トリフルオロメタンスルフォン酸無水物57mLを1時間かけて滴下し、冷却下1時間攪拌を続けた。反応溶液に100ｍL蒸留水を加えて、有機相を分離し、有機相をさらに100ｍLの蒸留水で洗浄した後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、硫酸ナトリウムを濾過して除いた後、減圧下に溶媒を留去した。残渣を150Pa、30℃で減圧蒸留を行い、2-エトキシエチルトリフレート画分57ｇを得た。【００３４】
（２）Ｏ−(２-エトキシエチル)−ラパマイシンの製造
ラパマイシン25gを攪拌子入りの丸底フラスコに取り、上部にコンデンサーを接続した後、窒素バブラーに接続して内部を乾燥窒素で置換した。塩化メチレン88mLを加えて溶解させ、さらにN,N-ジイソプロピルエチルアミン250 mLを加え、激しく攪拌しながら上記（１）で合成した2-エトキシエチルトリフレート49gを加え、さらに60℃の油浴中で1時間20分攪拌を続けた。混合物を1.6Lの酢酸エチルで希釈し、2Lの1N 塩酸、2Lの脱イオン水、1.6Lの飽和食塩水で順次洗浄した。酢酸エチル相を分離し、無水硫酸ナトリウム150gを加えて20分間攪拌した。硫酸ナトリウムを濾過して除いた後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、残渣を直径10cm、高さ100 cmのシリカゲルベッドを有する、カラムクロマトグラフにて精製（順相クロマトグラフ）を行った。溶離液として、酢酸エチル／n-ヘキサン (1:1, v/v)、酢酸エチル／n-ヘキサン (3:2, v/v)、酢酸エチル／n-ヘキサン (7:3, v/v)を順次流し、主生成物の分画を集めて濃縮し、さらにデシケーター内で真空乾燥した。15.5gのアモルファス状の精製物（Ｏ−(２-エトキシエチル)−ラパマイシン）を得た。
次に上記アモルファス状の精製物3gを、1gずつ３回に分けて下記条件の逆相クロマトグラフにて精製した。
（逆相クロマトグラフの条件）
・カラムサイズ： 直径5cm×長さ25cm
・固定相： YMC GEL ODS-A、粒径20μm、細孔径12nm (YMC社製)  固定相を修飾する修飾基はオクタデシル基  
・注入液： 原料1gを100mL 50ｖｏｌ％アセトニトリル/50ｖｏｌ％ 脱イオン水に溶解
・溶離液： 75ｖｏｌ％ アセトニトリル / 25ｖｏｌ％ 脱イオン水
・流速： 100mL/min      ・検出： UV 278nm        ・カラム温度： 室温
逆相クロマトグラフにより、保持時間20〜30分に溶出される主ピーク画分を集めた。本精製３回分の主ピーク画分を全て合わせて溶媒を除去し、アモルファス状のＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシン（40-O-[(2’-エトキシ)エチル]ラパマイシン）2.2gを得た。【００３５】
（３）純度の測定
次に、逆相クロマトグラフにより得られたＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンについて、下記の条件にて液体クロマトグラフィーで分析し純度を算出した。クロマトグラムを図１に示す。
（液体クロマトグラフの条件）
・カラム：Zorbax  SB-C18、直径4.6mm×長さ25cm（Agilent  Technologies社製）
・溶離液：70vol％アセトニトリル/30vol％脱イオン水
・注入量：10uL（10mg試料を20mlアセトニトリルに溶解）
・流速：2.0ml/min      ・分析時間：１時間
・検出：ＵＶ  278nm    ・カラム温度：40℃
・純度計算法(％)： (Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンのピーク面積×100)／(全てのピークの面積の総和)
算出の結果、Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンの純度は、９９．７％であった。【００３６】
（実施例２）
逆相クロマトグラフの条件を下記に変更した以外は、実施例１と同じ方法でＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンを製造した。
（逆相クロマトグラフの条件）
・カラムサイズ： 直径5cm×長さ25cm
・固定相： YMC GEL ODS-A、粒径20μm、細孔径12nm (YMC社製)  固定相を修飾する修飾基はオクタデシル基
・注入液： 原料1gを100mL 50ｖｏｌ％ メタノール/50ｖｏｌ％ 脱イオン水に溶解
・溶離液： 75ｖｏｌ％ メタノール / 25ｖｏｌ％ 脱イオン水
・流速： 100mL/min      ・検出： UV 278nm    ・カラム温度： 室温
保持時間20〜30分に溶出される主ピーク画分を集めた。本精製３回分の主ピーク画分を全て合わせて溶媒を除去し、アモルファス状のＯ−（２−エトキシエチル)−ラパマイシン1.8gを得た。そして、得られたＯ−（２−エトキシエチル)−ラパマイシンについて、実施例１に記載された条件にて液体クロマトグラフィーで分析し純度を算出した結果、Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンの純度は、９９．５％であった。【００３７】
（実施例３）
逆相クロマトグラフの条件を下記に変更した以外は、実施例１と同じ方法でＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンを製造した。
（逆相クロマトグラフの条件）
・カラムサイズ： 直径5cm×長さ25cm
・固定相： YMC GEL C4、粒径20μm、細孔径12nm (YMC社製)   固定相を修飾する修飾基はブチル基
・注入液： 原料1gを100mL 50vol%アセトニトリル/50vol% 脱イオン水に溶解
・溶離液： 75vol% アセトニトリル / 25vol% 脱イオン水
・流速： 100mL/min    ・検出： UV 278nm    ・カラム温度： 室温
保持時間27〜40分に溶出される主ピーク画分を集めた。本精製３回分の主ピーク画分を全て合わせて溶媒を除去し、アモルファス状のＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシン1.9gを得た。そして、得られたＯ−（２−エトキシエチル)−ラパマイシンについて、実施例１に記載された条件にて液体クロマトグラフィーで分析し純度を算出した結果、Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンの純度は、９９．４％であった。【００３８】
（実施例４）
実施例１で得たＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシン2.2gを10 mLのメタノールに溶解し、攪拌した脱イオン水80 mL中に滴下した。析出した固体を濾過し、少量の水で洗浄した後、減圧下、室温で15時間乾燥した。2.0gの白色粉末を得た。そして、得られた白色粉末について、実施例１に記載された条件にて液体クロマトグラフィーで分析し純度を算出した結果、Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンの純度は、９９．８％であった。【００３９】
（比較例１）
逆相クロマトグラフにて精製しなかったこと以外は、実施例１と同じ方法でＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンを製造し、15.5gのアモルファス状の精製物（Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシン）を得た。そして、得られたＯ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンについて、実施例１に記載された条件にて液体クロマトグラフィーで分析し純度を算出した結果、Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシンの純度は、９５．２％であった。
なお、比較例１のクロマトグラムを図２に示す。保持時間17分付近のピークが目的物、19.5分付近のピークは目的物の異性体であり、これらの合計面積を目的物由来として計算した。その他のピークは全て不純物に由来するものである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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