【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年4月16日(2004.4.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、サンプル中の型特異的ポリヌクレオチド配列の同定プロセス：
(1)サンプルからの又はサンプル由来のポリヌクレオチドを、固相支持体に関連する多数の型特異的プローブと接触させ、型特異的ハイブリダイゼーションを検出する；及び
(2)サンプル中又はサンプル由来のポリヌクレオチドを、型特異的増幅反応では検出されないが、工程１のハイブリダイゼーション工程によって検出されうる型の型特異的プライマーと接触させる。
【請求項２】
広範囲プライマーを用いてサンプルからポリヌクレオチドを増幅する第１の工程の後に、該増幅ポリヌクレオチドを工程(1)において使用することをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
広範囲プライマーによって増幅されたポリヌクレオチド配列を解析して、ハイブリダイゼーションの前に所定の一般的ポリヌクレオチド型の存在を確認する、請求項２記載のプロセス。
【請求項４】
型特異的増幅が定量的である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
型特異的プライマーがHPV16、18、31、33、45、52、58、35、56、及び59の１つに特異的なものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
疾患の危険性がある個体を同定する方法であって、請求項１〜５に記載の工程を用いた、個体から得たサンプル中の疾患関連ポリヌクレオチドの検出とタイピングを含む前記方法。
【請求項７】
少なくとも1セットの適切な広範囲プライマーを少なくとも1セットの型特異的プライマーと組み合わせて含む、請求項１〜５の工程で使用するための診断キット。
【請求項８】
HPV16及び／又はHPV18型特異的PCRプライマーを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
HPV、HIV-1、HCV、HBV、CMV、EBV、HDV、HGV、HSV、HHV、VZV、ヘリコバクターピロリ、マイコバクテリア、マイコプラズマ、ロタウイルス、又はp53遺伝子のタイピングのためのものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス、方法、又はキット。
【請求項１０】
HPVのタイピングのためのものである、請求項９に記載のプロセス、方法、又はキット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】アッセイ
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の検出及び解析方法に関する。特に、本発明は核酸の検出及びタイピング（例えば、診断）、及び疾患関連遺伝子の変異を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正確かつ網羅的な遺伝子型解析の重要性は、ヒトパピローマウイルス（HPV）のタイピングに例示される。パピローマウイルスは種特異性が高い小さなDNA腫瘍ウイルスである。これまで、100を超える個別のヒトパピローマウイルス（HPV）遺伝子型が報告されている。HPVは一般的に皮膚(例えば、HPV-1及び-2)又は粘膜表面(例えば、HPV-6及びHPV-11)に感染し、通常数ヶ月又は数年続く良性の腫瘍（瘤）を引き起こす。このような良性の腫瘍は当事者個人には悩ましいものかもしれないが、わずかな例外を除けば、生命の危険を伴うものではない。
【０００３】
しかしながら、HPVの中には癌のようなより深刻な疾患に関与しているものもある。HPV遺伝子型とヒト癌の最も強い正の関係はHPV-16及びHPV-18と子宮部癌の間にみられる。例えば、HPV16及び／又は18に感染した人は、該疾患になる危険性が高いと考えられる。子宮頸癌は開発途上国において最もよくみられる悪性腫瘍で、世界で毎年約500,000例の新しい患者が発生している。
【０００４】
現在大規模な核酸タイピングは通常プロープアレイハイブリダイゼーションによって実施されている。
【０００５】
一例として、HPV分野において、最近Sahliは、HPV DNAのPCR増幅後、プローブアレイハイブリダイゼーションとDNAシークエンシングを行うことによる、HPV感染の診断方法を報告している（R. Sahli, WHO meeting Heidelberg, Germany, 6-7 March 2001.“HPVワクチン研究と開発に関わる実験診断手法の評価とハーモナイゼーション”）。この方法は、HPV全般には特異的であるが、特定のHPV型には特異的でない広範囲プライマーを用いて、サンプル内のHPV DNAを増幅する第１のPCR工程を含む。この後、得られたPCRフラグメントは、固相支持体に結合した多数の型特異的オリゴヌクレオチドプローブとリバースブロットハイブリダイゼーションを行う。PCRフラグメントと型特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、サンプル中の特定のHPV型の検出が可能になる。このようなハイブリダイゼーション技術を利用することで、1回のPCR後に、多数のHPVプローブに対するサンプルのスクリーニングが可能になり、複数の個々の特異的PCR反応が不要となる。
【０００６】
最初のPCR反応でHPV陽性と同定されたが、HPV特異的プローブとは陽性ハイブリダイゼーション反応が認められなかったサンプルについては、DNAのダイレクトシークエンスを行ってHPV型を同定するか、又は新しい型の存在を確認する。Sahliは、HPV陽性だがハイブリダイゼーション陰性であるアンプリコンは、ハイブリダイゼーション特異的アレイにはないHPV型か亜型（サブタイプ）に全て対応し、それをシークエンシングにより確定したと報告している
同じハイブリダイゼーション検出系を含むスクリーニングは、癌に関わる、p53等の遺伝子のタイピングに加えて、多数のバクテリアやウイルス遺伝子（例えば、HIV-1、HCV、HBV、ヘリコバクターピロリ、及びマイコバクテリア、マイコプラズマ由来の遺伝子等）の同定やタイピングについて公知である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は核酸検出及びタイピングのための改善された方法を提供する。
【０００８】
第１の形態において、本発明は、以下の工程を含むサンプル中の型特異的ポリヌクレオチド配列の同定プロセスに関する：
(1)サンプルからの又はサンプル由来のポリヌクレオチドを、固相支持体に関連する多数の型特異的プローブと接触させ、型特異的ハイブリダイゼーションを検出する；及び
(2)サンプル中又はサンプル由来のポリヌクレオチドを、型特異的増幅反応では検出されないが、工程１のハイブリダイゼーション工程によって検出されうる型の型特異的プライマーと接触させる。
【０００９】
好ましい形態において、本発明は、以下の工程を含む型特異的ポリヌクレオチドの同定プロセスに関する。
【００１０】
(1)広範囲プライマーを用いてサンプルからポリヌクレオチドを増幅する；
(2)(1)で得られたポリヌクレオチドを、固相支持体に関連する多数の型特異的プローブと接触させ、型特異的ハイブリダイゼーションを検出する;及び
(3)サンプル中又はサンプル由来のポリヌクレオチドを、型特異的増幅反応では検出されないが、工程2のハイブリダイゼーション工程によって検出されうる型のための型特異的プライマーと接触させる。
【００１１】
好ましくは、前記プロセスは、広範囲プライマーによって増幅されたポリヌクレオチド配列を解析して、ハイブリダイゼーションの前に所定の一般的ポリヌクレオチド型の存在を確認する工程1bをさらに含む。所定の一般的ポリヌクレオチド型が陽性のサンプルだけが工程2でスクリーニングされる。アンプリマーは、好ましくはK leterら（Am. J. Pathology (1998), 153: 1731-1739）に概説されるようなマイクロタイタープレートフォーマット中で、好ましくは広範囲の型を認識し得る一般的プローブ（general probes）の混合物と接触させる。
【００１２】
必要であれば、前記プロセスは型特異的ではない検出シグナル増幅工程を含む。
【００１３】
本発明は特にサンプル中のウイルス型、より具体的にはHPV型を同定するためのプロセスに関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の方法を用いた、個体から得たサンプル中の疾患関連ポリヌクレオチドの検出とタイピングを含む、疾患の危険性がある個体を同定する方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、少なくとも1セットの適切な広範囲プライマーを少なくとも1セットの型特異的プライマーと組み合わせて含む診断キット、必要であれば、型特異的ハイブリダイゼーション反応を実施するための適切な手段と組み合わせて含む診断キットに関する。
【００１６】
我々は、現在の解析プロセスは与えられたサンプルと関連した疾患危険性の不完全な予測（picture）しか提供しないと判断した。例えば、ハイブリダイゼーション工程がそのような型の検出に特異的なプローブを有していても、ハイブリダイゼーション工程では検出されない疾患と高い関連性を有するウイルス型を含むサンプルもある。
【００１７】
例えばHPVの場合、高危険性型のために設計された特異的プローブが存在するにも関わらず、ハイブリダイゼーション解析では疾患と低い関連性しか有しない型のみ含むように見えるサンプルも、高危険性型を含むことを確認した。現在のお決まりの試験はそのような高危険性型があっても同定せず、そのような型はいくつかのサンプルにおいて同定されないかもしれない。
【００１８】
すなわち、好適には、本発明は複数のポリヌクレオチド型を含むあるいは含むかもしれないサンプルのタイピングに関する。
【００１９】
所定の型がハイブリダイゼーションによって陽性でなくても、サンプルにそのような型が存在しないと仮定することはできないことが確認された。これは、所定の型のための特定のプローブがハイブリダイゼーション段階で用いられている場合であってもあてはまる。それゆえ、本発明においては、ハイブリダイゼーションスクリーニングによって同定されない特異的高危険性型の検出のために、選択的、型特異的増幅工程が、ハイブリダイゼーション工程を含む全てのタイピングプロセスの後に導入される。そのような特異的増幅工程の利用によって、これまで利用可能なものよりも完全な存在する型の検出、例えば、HPV感染のより完全な検出が可能になる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションに基づく検出系については、ダイレクトシークエンス法も同様の欠点を有する；多重感染の場合、低濃度型が検出されない可能性がある。すなわち、感受性の限界から、シークエンシングのみではサンプル中に存在する型の決定的な回答を得ることができない。さらなる型特異的増幅段階も必要となる。
【００２１】
理論に制約されたくなければ、サンプル内のポリヌクレオチド間の競合によって検出されないポリヌクレオチドもあると考えられる。競合はプロセス中の多くの異なった段階で起こる。一例として、広範囲PCRプライマーを用いたHPVタイピングの場合、もし１つのHPV型が他の型よりもはるかに高モルで存在すると、マイナーな型は競合に負け、アッセイの検出限界より下になる可能性が高い。さらに、異なるHPV遺伝子型は、プライマー標的領域において若干異なった塩基配列を含むため、各遺伝子型は利用可能な広範囲プライマープールから得られるPCRプライマーサブセットによって優先的に増幅される。さらに、サンプル中に複数の型が存在する場合、シグナル検出レベルにおいて、型特異的プローブとその対応する型特異的ポリヌクレオチドターゲットとのハイブリダイゼーションの検出も影響を受ける可能性がある。
【００２２】
好適には本発明はハイブリダイゼーション／検出工程を含み、その結果はサンプル中のポリヌクレオチド型間の競合、例えば、検出プローブ又は増幅プライマーをめぐる競合に敏感である。
【００２３】
好適には、本発明のハイブリダイゼーション／検出工程は、雑多なポリヌクレオチド型を含むサンプルの解析に用いられる場合、擬陰性の結果を与えうる。
【００２４】
本発明の型特異的ポリヌクレオチド配列は関連配列の広いクラスの特定のサブセットを表すものである。特に、所定の型は配列及び／又はハイブリダイゼーション特性に基づいて好適に特徴づけられ、これらのパラメーターに基づいて広いクラスのメンバーと区別されうる。
【００２５】
ウイルスの場合、「型」とは好適には遺伝子型であり、サンプル中の型特異的ポリヌクレオチド配列の同定とは、好適には遺伝子型の同定である。例えば、HPVの場合、L1遺伝子において既知のどの型とも10%を越える配列の相違を示すウイルス分離株は異なった遺伝子型として分類される(Chan et al, Journal of Virology (1995) 69:3074-3083)。しかしながら、分離株はさらに分類され、2から10%相違するHPV分離株は亜型として分類され、一方もし変異が2%未満の場合は分離株は変異株として分類される。したがって、本明細書中においてタイピングという記載は、必要に応じて、型、亜型、及び変異型の解析の全てを含む。
【００２６】
例えば、単一遺伝子の変異の場合、型は疾患に関連した遺伝子の特異的変異である。p53遺伝子のクラスの場合、遺伝子中の異なる変異は、異なるp53型である。
【００２７】
したがって、型特異的ポリヌクレオチド配列は特異的遺伝子配列、あるいは型、亜型、又は変異型のような密接に関連した一群の配列の１つである。
【００２８】
好ましくは、本発明の方法は、HIV-1、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン‐バーウイルス(EBV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、G型肝炎ウイルス(HGV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒトヘルペスウイルス(HHV)、水痘‐帯状疱疹ウイルス(VZV)、ヘリコバクターピロリ、マイコバクテリア、マイコプラズマ、ロタウイルスのタイピング、及びp53のような疾患に関連した遺伝子のタイピングに用いられる。他の好適なタイピングのターゲットとしては、疾患の進行及び／又は重症度に関連した様々な型のウイルスや遺伝子が挙げられる。最も好ましくは、本発明はHPVのタイピングで用いられる。しかしながら、本発明は技術的には核酸の起源に限定されず、必要に応じて、任意の遺伝子又はウイルスからの核酸のタイピングに用いられる。
【００２９】
本発明の方法はサンプル、好適には、感染及び／又は疾患の危険性を検査する個体から得た組織サンプルのような生物学的試料を用いる。血液や尿のような体液も本発明のプロセスで使用しうる。一般にDNAタイピングのために侵襲的な外科的プロセスでサンプルを取得する必要はなく、例えば、サンプルの取得にはスワブが用いられる。サンプルの取得は非侵襲的、非外科的方法が好ましい。タイピングのために個体からサンプルを取得する他の適切な方法は当該技術分野で周知である。
【００３０】
本発明のプロセスでは、ポリヌクレオチド／核酸とプローブを特異的ハイブリダイゼーションが（もし起こるなら）起こるように接触させる。
【００３１】
解析対象ポリヌクレオチドはサンプルから直接用いてもよいが、より好ましくは、核酸増幅（例えば、PCR）工程の後に用いられる。場合によっては、増幅前にRNAをDNAに転写することが必要となる。後者のいずれの場合も、増幅ポリヌクレオチドはサンプルに由来する。
【００３２】
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは任意の適切なハイブリダイゼーション法や検出系を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション系の例としては、例えば、従来のドットブロットやサザンブロットが挙げられる。好適なものは、型特異的プローブが固相支持体上に固定化され、増幅核酸がハイブリッド形成を検出するためにラベルされているリバースハイブリダイゼーションアプローチである。もっとも好適なものは、WO99/14377及びKleterら（Journal of Clinical Microbiology (1999), 37(8):2508-2517）に記載されているLiPA系であり、その内容の全てを参照として本明細書中に組み入れるものとする。この系では、オリゴヌクレオチドプローブは平行線状に固相支持体上に固定化されている。しかしながら、例えば、Gravittら（Journal of Clinical Microbiology (1998)36(10): 3020-3027）に記載されているような、他のリバースハイブリダイゼーション系を用いてもよく、その内容の全てを参照として本明細書中に組み入れるものとする。
【００３３】
好ましくは、ポリヌクレオチドサンプルは複数のプローブに対して同じハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で同時にスクリーニングされる。
【００３４】
本発明の型特異的プローブは、所定の型の核酸（例えば、ウイルスの遺伝子型）にハイブリダイズするように設計された、サンプル中の型の同定が可能な1本鎖オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３５】
型特異的プローブ配列は当該技術分野で周知であり、本発明においては任意の適切な配列を用いることができる。HPVの場合、例えば、適切な型特異的プローブはWO9914377に記載されている。本発明は、本発明のハイブリダイゼーション工程で用いられる型特異的プローブの性質や由来に限定されるものではない。
【００３６】
型特異的プローブは、マイクロタイターディッシュ、マイクロスフェア、チップ等の任意の適切な固相支持体に付着していてもよい。他の好適な支持体は当該技術分野で周知である。型特異的プローブは、固定できるように、あるいはハイブリダイゼーション効率を改善するために修飾されていてもよい。そのようなプローブは固相支持体に関連して上述のように用いられ、本発明のプロセス中で所定のポリヌクレオチドと接触する。
【００３７】
型特異的ハイブリダイゼーション反応を検出するために用いられる検出系には何らの限定もない。プローブ又は核酸はラベルしてもよい。好ましくは、スクリーニングする核酸をラベルする。好適な検出系としては、放射活性検出系（例えば32P及び35S）や非アイソトープ的検出系（例えば、蛍光体を用いる）が挙げられる。好適な非放射活性検出方法はEP-A-667918に記載されている。
【００３８】
サンプル中の核酸型の存在は陽性ハイブリダイゼーション反応によって確認される。しかしながら、本発明は陽性の結果が存在しないことがウイルス型が存在しないことを示すものとはいえないことを実証する。したがって、本発明のプロセスは、ハイブリダイゼーションスクリーニング工程に続く、型特異的プライマーを用いた型特異的増幅工程を提供する。
【００３９】
プライマーは、好適には、複写される核酸鎖に（100%又は部分的に）相補的なプライマー伸長産物の開始のスタートポイントとして機能する1本鎖オリゴヌクレオチド配列である。特定のDNA型を増幅するための好適なプライマーは当該分野の標準的技術を用いて設計されうる。さらに、多数のウイルス型や遺伝子型のための特異的プライマーについては十分な報告がある。
【００４０】
HPV型増幅のための好ましい型特異的プライマーはBaayら（Journal of Clinical Microbiology, March (1996), 745-747）、Karlsenら（Journal of Clinical Microbiology September 1996, vol 34, no 9, 2095-2100）、及びYoshinouchiら（Journal of Clinical Microbiology. Nov1999, Vol37, No11, p 3514-3517.）に記載されており、その配列は参照として本明細書中に組み入れるものとする。好適なものは、子宮頸癌の高い危険性と関連した遺伝子型（限定するものではないが、例えば、HPV16、18、31、33、45、52、58、35、56、及び59等）に特異的な全てのHPVプライマーである。
【００４１】
型特異的増幅は好ましくはPCRプロセスによって実施される。PCRプロセスは当該分野で周知であり、報告も多い。増幅は、加熱変性、増幅対象DNA配列に隣接した配列へのプライマーのアニーリング、アニールしたプライマーの伸長を含む。プライマーは標的配列の反対側の鎖にハイブリダイズし、DNAポリメラーゼによるDNA合成がプライマーの間の領域を進行するように配向される。PCR反応によるDNAの増幅は米国特許第4683202号及び第4683195号に記載されており、その内容を参照として組み入れる。さらに、PCR産物の解析技術（例えば、配列解析や制限解析）は当該技術分野の標準的技術である。
【００４２】
しかしながら、核酸増幅はPCRに限定されず、他の適切な方法、例えばNASBA(Compton,J (1991) Nature 350:91-92)やLCR(Backman K et al (1989) EP-A0320308)を用いてもよい。他の適切な増幅方法は当該技術分野で周知である。
【００４３】
好適には、型特異的増幅の後、アンプリマーの存在又は非存在を確認するための検出工程を実施する。
【００４４】
好適には、本発明の型特異的増幅は定量的プロセスである。例えば、定量的PCRにより、ウイルスの遺伝子型のような所定の核酸型レベルの測定や、疾患の可能性や疾患の予防との関連付けができる。例えば、ウイルス量が特定の閾値を越えると疾患の危険性が増加する場合、これは診断的に重要である。ウイルス量と疾患の進行の関係は、定量的PCR技術とともにSwanら（Journal of Clinical Microbiology, April 1999,37(4):, 1030-1034）及びJosefssonら（The Lancet, June  2000. 355:2189-2193）に記載されており、これらをそのような技術に関する参照として本明細書に組み入れる。
【００４５】
型特異的増幅のための核酸は、好ましくはオリジナルサンプルから直接得られる。増幅はサンプル由来の核酸を用いて実施してもよい。例えば、オリジナルサンプルがRNAの場合は、RNAのcDNAへの逆転写後に増幅が実施される。あるいは、増幅は、例えば広範囲プライマーセットによってオリジナルサンプルから増幅した核酸を用いて実施してもよい。
【００４６】
好ましくは、ハイブリダイゼーションスクリーニングの前にサンプル核酸の増幅を行う。そのような増幅は、前述したように、PCRや関連した方法を用いて実施することができる。
【００４７】
好適には、広範囲プライマーは全てのプレハイブリダイゼーション工程で用いられ、HPV DNAのような所定のクラスの複数の核酸メンバーを増幅する。広範囲プライマーは、関連配列のクラスから核酸の複数の型を増幅できる任意のプライマー、又はプライマー群である。かくして、広範囲プライマーは、例えば１つの種内の型、１つの型内の亜型、及び１つの亜型内の変異型を増幅するプライマーを含む。
【００４８】
HPV解析の好適な例において、好適な広範囲プライマーは少なくとも30タイプ、好ましくは40タイプ、より好ましくは50タイプ以上のHPV型からDNAを増幅することができる。好適なプライマーの例は、Kleterら（American Journal of Pathology (1998)153(6):1731-1738）に記載されており、その全ての内容とプライマー配列を参照として組み入れる。特に、好ましいものはKleterら(前掲)に記載されているようなSPF1及びSPF2プライマーセットである。他の方法やHPV DNAの広範囲増幅用プライマーはWO99/14377に記載されており、その内容の全てを参照として組み入れる。
【００４９】
本発明はまた、核酸プレハイブリダイゼーションの増幅及び／又はハイブリダイゼーション後のシグナル増幅を行うプロセスに関する。
【００５０】
本発明はまた上記タイピングプロセスで用いられる適当なキットにも関する。本発明のキットは、好適にはウイルス又は遺伝子タイピング（好適にはHPVタイピング）のための構成要素を含む。好適なキットは広範囲プライマーと少なくとも1セットの型特異的なプライマーを含む。より好ましくは、キットはHPV16及び／又はHPV18型特異的PCRプライマを含む。好ましくは、キットはまたHPV型特異的プローブが付着した固相支持体を含む。キットは任意のハイブリダイゼーション、洗浄、及び検出液を含んでいてもよい。
【００５１】
個々の刊行物は完全に記載されているように参照として本明細書に組み入れることを具体的かつ個別に指摘したが、疑念を避けるために、本明細書中で引用した特許及び特許出願（これらに限定するものではないが）を含む全ての刊行物は、参照として本明細書中に組み入れることを指摘する。
【００５２】
以下、本発明を下記の非限定的実施例を参照して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
実施例１：HPV遺伝子型の検出
患者
SPF10 PCR及びLiPA（Quint WGV et al., Journal of Pathology (2001), 194:154-158）によって決定されたHPV16、18、31、33、35、51、52又は58等の複数HPV遺伝子型の存在に基づき、11名の患者を大きな群より選択した。サンプルの選択は、信頼性のある型特異的PCRプライマーが利用可能な（Baay MF et al. Journal of Clinical Microbiology (1996), 34:745-747; Walboomers JM et al, Journal of Pathology(1999), 189:12-19）遺伝子型の検出に基づいて行った。これらの型特異的PCRのそれぞれの特異性は、HPV16、18、31、33、35、39、51、52、56、59、58、59、66、及び68を含む、13の異なる遺伝子型から得た完全なゲノムDNAを含む組換えプラスミドを用いた解析によって確認した。
【００５４】
DNAの単離、PCR、及びジェノタイピング
各患者より、子宮頸部の生検標本を取得した。グアニジンイソチオシアネート処理によりDNAを単離し、シリカ粒子上に補足した（Boom R et al, Journal of. Clinical Microbiology (1990), 28:495-503）。HPV DNAはSPF10 PCRにより増幅し、アンプリマーを（Kleter B et al Journal of Clinical Microbiology (1999), 37:2508-2517）にしたがってHPV-LiPAを用いて解析した。次いで、同じDNA単離物をLiPAで陽性と判明した型の型特異的プライマーセットにより試験した。
【００５５】
結果
生検標本SPF10-LiPAと型特異的PCRの結果を表１にまとめる。
【００５６】
患者9では、生検標本中HPV16と31が型特異的PCRによって検出されたが、これらの型はSPF10-LiPAでは同定されなかった。同様に、患者11では、SPF10-LiPAでは生検標本中HPV16のみ同定されたが、型特異的PCRではさらなる型としてHPV51と52が検出された。
【表１】
2004538010.tif 000001