【手続補正書】
【提出日】平成16年8月19日(2004.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
次の工程：
ａ）１０以下のＤＥを有するマルトデキストリンを水中に溶解し、
ｂ）ｐＨを調製し、溶液を脱分枝化酵素の活性に最適温度に冷却し、
ｃ）酵素を加え、混合物をインキュベートし、
ｄ）酵素を不活性化し、
ｅ）混合物を噴霧乾燥し、
ｆ）レジスタントでんぷんを集め、場合により細く砕く
ことを有する請求項１０記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ヨーロッパ特許第６８８９７２号明細書には、増加された量のレジスタントでんぷんを得る方法が開示されている。そこには最大量のＲＳが酵素による消化後、老化を延長された時間及び比較的に低い温度で行った場合に得られることが例示されている。ここで得られたＲＳの最大量は５１．８％である（上記明細書例３）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明は多量のレジスタントでんぷんを含有することを特徴とする、でんぷんを主体とする調製物に関する。この調製物は、老化処理され、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）パンクレアチンレジスタントでんぷんを含有する、部分的に分解したでんぷんから成る。レジスタントでんぷんの量は少なくとも６０％であるのが好ましい。レジスタントでんぷん画分は、主に１０〜３５の重合度及び１１５℃以下、好ましくは９０〜１１４℃のＤＳＣピーク温度を有するα- グルカンを含有することを特徴とする。部分的に分解したでんぷんは、でんぷんをアミロリテック又は酸分解し、次いで酵素によって脱分枝化して得ることができる。好ましい部分的に分解したでんぷんは、一部α- アミラーゼ分解によって得られ、脱分枝化酵素で処理されたマルトデキストリンである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
試験をタピオカマルトデキストリンを用いかつ大規模でくり返す。４２００ｋｇタピオカマルトデキストリンを用いて出発して、約３５００ｋｇ噴霧乾燥生成物が得られる。これは１１２℃のＤＳＣ融解温度を有するレジスタントでんぷん６６％及びＤＰ１０〜３５を有する材料６５％を含有する。
例２に、本発明のＩＲＰのレジスタントでんぷんに関する化学及び物理学的データを Euresta- ＲＳ及び Novelose TM（ナショナルスターチ＆ケミカル社）と比較して示す。この例から、ＩＲＰが他の２の生成物に比してＤＰ１０〜３５のサッカライドの著しく多い含量及びＲＳ残留物のはるかに低い融解温度を有することが示される。  
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
【数１】
1998191931.tif 000001
乾燥生成物から出発することはなく、湿った生成物を同一処理に直接使用してもよいことが明らかである。酵素脱分枝化条件はほとんど全部脱分枝化するための補助剤によって生じる条件に対応し、約５９単位の酵素活性／ｇでんぷんを使用する。  
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
次表中に、ＩＲＰ、ノベロース（Novelose) 及び Euresta  ＲＳのＲＳ含量、鎖長分布及びＤＳＣ融解ピーク温度に示す。
サンプル  RS- 含量** DSC* -Tピーク  DP<10 ***  DP10-35***  DP>35*** 
（％）      （℃）        （％）      （％）      （％）
ＩＲＰ      56         105           7.0         58.7        34.3 
ノベロ
ース    57         128           4.4         35.0        60.6 
Euresta     36         141           5.1         26.1        68.8 
*ＤＳＣ測定：でんぷん２０〜３０ｍｇをステンレススチール製ＤＳＣ- 平なべ中に入れ、水を加えて、２０％（ｗ／ｗ）系となす。閉じられた平なべを３℃／分の速度で２０〜１６０℃でＳＥＴＡＲＡＭ  ＤＳＣ１１１中で加熱する。エンタルピー変化を連続的に記録し、特有の転移温度を記入する。
**ＲＳ測定のために、次の処理を行う：
老化したでんぷん生成物の５％（ｗ／ｗ）懸濁液を、酢酸塩緩衝液中で十分に均質化する。安息香酸の飽和水溶液２５０ｍｌ中に無水酢酸ナトリウム８．２ｇを溶解し、１Ｍ塩化カルシウム４ｍｌを加え、酢酸でｐＨを５．２に調整する前に蒸留水で８００ｍｌにすることによって上記酢酸塩緩衝液を調製する。懸濁液２５ｍｌを、振とうする水浴中で３７℃で１６時間１ｍｌパンクレアチン溶液と共にインキュベートする。次いでインキュベートした懸濁液を９５％エタノール１１９ｍｌ中に入れ、攪拌し、濾過し、濾過ケーキを８０％エタノールで２回洗滌し、１０５℃でオーブン中で乾燥する。ＲＳ含量を次の様に算出する：  
残留物のでんぷん含量
ＲＳ（％）＝─────────────────×１００％  
インキュベーション前（乾燥状態で）
の懸濁液のでんぷん含量
パンクレアチン溶液を１０分間蒸留水１２ｍｌと共にパンクレアチン２ｇを攪拌し、遠心分離し、上澄液をパンクレアチン溶液として使用する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
試験管内醗酵のためのＲＳの精製を、パンクレアチンα- アミラーゼ(Sigma, A-３１７６）ででんぷんを大規模に消化して行う。ＩＲＰ４２．５ｇ、Euresta ７２．７ｇ又はノベロース３０．７ｇを滅菌リン酸塩緩衝液ｐＨ６．９（夫々
３００ｍｌ、４００ｍｌ及び７００ｍｌ）中に懸濁し、透析管中に入れ、α- アミラーゼ（サンプル１０ｍｇ／ｇ）を加える。次いで管を３７℃で水１ｌ中にし沈め、一晩放置する。次の日α- アミラーゼ活性の同一量を再び添加し、第二消化を一晩行う。サンプルを遠心分離し（１０分、３０００ｒｐｍ）、数回洗滌する。沈降物（ＲＳ）を、凍結乾燥する。
Ｃ．試験管内醗酵に使用される方法
この方法は他の文献に広範に記載されている（Barry 等、Estimation of   
fermentability of dietary fibre in vitro : a European interlaboratory 
study. Br. J. Nutr. (1995), 74, 303-322)。
Ｃ１．基本スケジュール
すべての試験を試験管内バッチ系中で行う。醗酵を健康な若いボランティアから集められた新鮮を大便から成る接種物を使用してバイアル中で行う。ボランティアは常に通常の食物を摂取し、非消化疾患を示さず、少なくとも３ケ月間抗生物質をとらない。醗酵変化を、醗酵が種々の時間で停止するバイアル中で測定する。
Ｃ２．接種物
２人の非メタン産生ボランディアからの大便を約５分間熱い水道水（約６５℃）で前もって温められた、絶縁ビン中に集める。Ｏ2 を除くために、ビンに１００ｍｌ／ｓの流れでＣＯ2 を５分間さっと流し、次いで大便を集める。絶縁ビンを実験室で受け取り、ＣＯ2 を内部に流す。大便の重さを測る。温めた（３７℃）栄養緩衝液５部を大便（ｖ／ｗ）１部に加えることによって絶縁ビン中で接種物を産生する。栄養培地は、添加された微量元素（最終溶液１ｌあたり次の溶液（ｍｇ／ｌ）１０ｍｌ：ＦｅＳＯ4.７Ｈ2 Ｏ３６８０、ＭｎＳＯ4.７Ｈ2 Ｏ１９００、ＺｎＳＯ4.７Ｈ2 Ｏ４４０、ＣｏＣｌ2.６Ｈ2 Ｏ  １２０、ＣｕＳＯ4.５Ｈ2 Ｏ  ９８、Ｍｏ7(ＮＨ4)6 Ｏ24４Ｈ2 Ｏ  １７．４）と共にＮａＨＣＯ3 
９．２４、Ｎａ2 ＨＰＯ4.１２Ｈ2 Ｏ  ７．１２５、ＮａＣｌ  ０．４７０、
ＫＣｌ０．４５０、Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１００、ＣａＣｌ2 （無水）０．０５５、ＭｇＣｌ2 （無水）０．０４７、尿素０．４００、を含有する炭酸塩- リン酸塩緩衝液から調製される。使用前、そして接種物の調製の間ＣＯ2 の連続的泡立ては、嫌気生活を保ち、一定のｐＨを保証する。スラリーを Stomacher (LaboratoryBlended, Seward Medical,ロンドン）装置を用いて２分間混合し、次いで６層の外科用カーゼを通して濾過する。接種物を３７℃で水浴中で保ち、ＣＯ2 で連続的に泡立てる。
Ｃ３．醗酵試験
醗酵をポリプロピレンバイアル５０ｍｌ（Falcon, Biolock)を用いて二通り行う。ブランク（Ｂ）以外に、十分に均質化された試験基質１００ｍｇ（乾燥状態で）を、秤量して夫々のバイアル中に入れ、接種物１０ｍｌを加える。空気をＯ2 不含Ｎ2 の流れによって置き代える。キャップをねじで締めた後、バイアルを振とう浴中で水平（時間０）に置く。次いで醗酵を３７℃で行い、その結果を０、４、８及び２４時間で調べる。２つのブランクを夫々の試験時間で使用する。夫々の試験時間で対応するバイアル中の醗酵を即座の凍結（ドライアイス）によって停止する。
Ｃ４．サンプル調製
ｐＨを直ちに測り、蒸留水１０ｍｌを加える。次いでサンプルを１０分３０００ｇで遠心分離する。上澄み１ｍｌのサンプル２個をＳＣＦＡ測定のために取る。サンプルをＨｇＣｌ2-Ｈ3 ＰＯ4 （１％／５％）溶液１００μｌと共に混合する。ＳＣＦＡ測定用サンプル及びでんぷん測定用ペレットを分析まで２０℃で保つ。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
残存するでんぷんを Faisant  等 (Resistant starch determination adaptedto products containing high resistant starch. Sci. Alim.,(1995), 15, 83-89) の方法によって定量する。
Ｃ５．スラリー中の短鎖脂肪酸の算出
各ＳＣＦＡの産生Ｐｉを、各試験時間に対して次の様に算出する：
Ｐｉ＝（Ｓｉ−Ｓｏ）−（Ｂｉ−Ｂｏ）
式中、Ｓｉ及びＳｏは、時間ｉ及び０夫々で基質を含有するバイアル中でのＳＣＦＡ濃度であり、Ｂｉ及びＢｏは時間ｉ及び０夫々でブランクに対するＳＣＦＡ濃度である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
各試験時間で、ＳＣＦＡ産生全体を酢酸、プロピオン酸及びｎ- 酪酸の個々の産生合計として算出する。  
試験管内醗酵の結果及び結論
醗酵の動力学を二通り、ｐＨ及びＳＣＦＡ産生の測定によって決定する。すべてのパラメーター及び各生成物に関して、醗酵の同一パターンを二重の測定値として比較しながら観察する。
Ａ）ｐＨ- 評価
３つのＲＳ生成物間の醗酵培地のｐＨは醗酵の４時間後で異なる。ｐＨ減少はEuresta 及びノベロース生成物に対するよりもＩＲＰに対する方がはるかに顕著である。僅かな差異は醗酵の８時間後持続する。醗酵の２４時間後、ｐＨ値は同一である（図２参照）。
Ｂ）ＳＣＦＡ及びｎ- ブチラート産生
図３及び４に、ＳＣＦＡ及びｎ- ブチラートの量が３つのサンプルの醗酵の間に生成することを示す。ＩＲＰ含有大便が最大量のＳＣＦＡ及びｎ- ブチラートを生じることが明らかである。ＩＲＰは図４によればｎ- ブチラートの急速な産生を生じせしめ、１０ｍＭｏｌ／ｌより多くが４時間以内に産生する。図３に、他のＳＣＦＡの量も増加することを示す。
〔例４〕
レジスタントでんぷんを用いてＵＨＴミルク飲料の調製
この例で、ＵＨＴバニラミルク飲料中に例１の脱分枝化され、老化したマルトデキストリンを使用する。ミルク飲料の調製に使用される基準レシピを以下に示す。                  基準レシピ
ミルク  全量    １０００ｍｌ
Satro ミックス* １２ｇ
ショ糖          ２０ｇ
デキストロース  ２０ｇ
＊カラギーナン、バニラ、着色料
１つのケース；ＩＲＰ３０ｇ／ｌ、第二ケース：ＩＲＰ６０ｇ／ｌで（例１参照）この基準形態に加える。
成分を混合し、５０バールで均質化する。ＵＨＴ処理を１３７℃、５秒間加熱したプレートを用いて行う。生成物を２５０ｍｌのビン中に無菌状態で詰める。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
図５は、スタンダードミルク及びＩＲＰ添加されたミルクに関してパンクレアチン消化後に得られたミルク飲料残留物のＤＳＣ曲線を示す。