(57)【要約】  パラゴムノキのビタミンEの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子群を単離し、各遺伝子の塩基配列を決定することが本発明の課題である。本発明により、ビタミンEの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子群がパラゴムノキから単離され、それらの遺伝子の塩基配列が決定された。ビタミンEは天然に存在する抗酸化物質であるので、本発明で得られた遺伝子群で植物を形質転換することにより、該植物におけるビタミンE含量が増加すること、ひいてはゴムの老化防止を得ることが期待できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−３９０で示されるアミノ酸配列。（ｂ）プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号１６０−１３２９で示される塩基配列。（ｂ）プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−１６７７で示される塩基配列。（ｂ）プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５】
請求項２乃至請求項４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項６】
請求項２乃至請求項４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸番号１−４２９で示されるアミノ酸配列。（ｂ）プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項８】
請求項７記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号１９９−１４８５で示される塩基配列。（ｂ）プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１０】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号１−１７６０で示される塩基配列。（ｂ）プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１１】
請求項８乃至請求項１０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項１２】
請求項８乃至請求項１０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号６に示す、アミノ酸番号１−４４５で示されるアミノ酸配列。（ｂ）p-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成するp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項１４】
請求項１３記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１５】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号４７−１３８１で示される塩基配列。（ｂ）p-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成するp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１６】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号１−１６３１で示される塩基配列。（ｂ）p-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成するp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１７】
請求項１４乃至請求項１６のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項１８】
請求項１４乃至請求項１６のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項１９】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸番号１−４７１で示されるアミノ酸配列。（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニルレダクターゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２０】
請求項１９記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１２−１４２４で示される塩基配列。（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニルレダクターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項２２】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１−１７９３で示される塩基配列。（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニルレダクターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項２３】
請求項２０乃至請求項２２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項２４】
請求項２０乃至請求項２２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項２５】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号１０に示す、アミノ酸番号１−４１４で示されるアミノ酸配列。（ｂ）ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として2-メチル-6-フィチルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２６】
請求項２５記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２７】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号９に示す、塩基番号９３−１３３４で示される塩基配列。（ｂ）ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として2-メチル-6-フィチルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項２８】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号９に示す、塩基番号１−１５６３で示される塩基配列。（ｂ）ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として2-メチル-6-フィチルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項２９】
請求項２６乃至請求項２８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項３０】
請求項２６乃至請求項２８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項３１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号１２に示す、アミノ酸番号１−３４１で示されるアミノ酸配列。（ｂ）2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル-1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項３２】
請求項３１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３３】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１１に示す、塩基番号１６５−１１８７で示される塩基配列。（ｂ）2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル-1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項３４】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１１に示す、塩基番号１−１４１０で示される塩基配列。（ｂ）2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル-1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項３５】
請求項３２乃至請求項３４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項３６】
請求項３２乃至請求項３４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項３７】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号１４に示す、アミノ酸番号１−４１１で示されるアミノ酸配列。（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項３８】
請求項３７記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３９】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１３に示す、塩基番号８２−１３１７で示される塩基配列。（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項４０】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１３に示す、塩基番号１−１８３７で示される塩基配列。（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項４１】
請求項３８乃至請求項４０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項４２】
請求項３８乃至請求項４０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項４３】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号１６に示す、アミノ酸番号１−３４０で示されるアミノ酸配列。（ｂ）2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項４４】
請求項４３記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項４５】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１５に示す、塩基番号８４−１１０６で示される塩基配列。（ｂ）2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項４６】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１５に示す、塩基番号１−１２８２で示される塩基配列。（ｂ）2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項４７】
請求項４４乃至請求項４６のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項４８】
請求項４４乃至請求項４６のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項４９】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号１８に示す、アミノ酸番号１−５０８で示されるアミノ酸配列。（ｂ）ビタミンEの前駆体であるベンゾキノン誘導体又はプラストキノン誘導体を基質としてトコトリエノール類またはトコフェロール類を生合成するトコフェロールサイクラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項５０】
請求項４９記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項５１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１７に示す、塩基番号１２３−１６４９で示される塩基配列。（ｂ）ビタミンEの前駆体であるベンゾキノン誘導体又はプラストキノン誘導体を基質としてトコトリエノール類またはトコフェロール類を生合成するトコフェロールサイクラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５２】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１７に示す、塩基番号１−２００８で示される塩基配列。（ｂ）ビタミンEの前駆体であるベンゾキノン誘導体又はプラストキノン誘導体を基質としてトコトリエノール類またはトコフェロール類を生合成するトコフェロールサイクラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５３】
請求項５０乃至請求項５２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項５４】
請求項５０乃至請求項５２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【請求項５５】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。（ａ）配列表の配列番号２０に示す、アミノ酸番号１−３４７で示されるアミノ酸配列。（ｂ）δ-トコフェロール若しくはδ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてβ-トコフェロール若しくはβ-トコトリエノールを、又はγ-トコフェロール若しくはγ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてα-トコフェロール若しくはα-トコトリエノールを生合成するγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項５６】
請求項５５記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項５７】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１９に示す、塩基番号８２−１１２５で示される塩基配列。（ｂ）δ-トコフェロール若しくはδ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてβ-トコフェロール若しくはβ-トコトリエノールを、又はγ-トコフェロール若しくはγ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてα-トコフェロール若しくはα-トコトリエノールを生合成するγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５８】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１９に示す、塩基番号１−１４０８で示される塩基配列。（ｂ）δ-トコフェロール若しくはδ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてβ-トコフェロール若しくはβ-トコトリエノールを、又はγ-トコフェロール若しくはγ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてα-トコフェロール若しくはα-トコトリエノールを生合成するγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５９】
請求項５６乃至請求項５８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させた形質転換植物。
【請求項６０】
請求項５６乃至請求項５８のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてビタミンEの生合成を増強させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパラゴムノキのビタミンE生合成に関する酵素群、および当該酵素をコードする遺伝子群に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンEは最も重要な天然の抗酸化剤である。植物におけるトコフェロールの合成経路は後に詳細に述べるが、例えばCollakovaらの文献（Collakova et al.,Plant Physial., 133 (2003) p930-940）や、Bowierらの総説（Bowier et al., Progress in Lipid Res., 44 (2005) p414-416）に記載されている。またパラゴムノキのビタミンEについては、パラゴムノキからトコトリエノールを単離、同定をしたことが、Whittleらの文献（Whittle et al., Biochem.J., 100 (1966) p138-145）やDunphyらの文献（Dunphy et al., Nature, 207 (1965) p521-522）に記載されている。【０００３】
ビタミンEの生合成に関連する植物由来の酵素の遺伝子については、これまでシロイヌナズナ由来のゲラニルゲラニルリダクターゼを単離した例(Keller et al., Eur.J.Biochem, 251 (1998) p413-417)、トコフェロールサイクラーゼ遺伝子の変異により前駆体の2,3-ジメチル-5-フィチル-1,4-ベンゾキノンが葉や種子中に蓄積された例（Sattler et al., Plant Physiology, 132 (2003) p2184-2195およびSchledz et al., FEBS letter, 499 (2001) p15-20）、オオムギ由来のホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ遺伝子をアラビドプシスやトウモロコシに導入しビタミンE含量、組成を制御することに成功した例（Cahoon et al., Nature Biotechnology, 21 (2003) p1082-1087）、シロイヌナズナ由来のγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼ遺伝子をシロイヌナズナに導入しビタミンE組成を制御することに成功した例(Shintani et al., Science, 282 (1998) p2098-2100)、シロイヌナズナ由来のγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼ遺伝子と2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼ遺伝子をダイズに導入しビタミンE含量、組成を制御することに成功した例（Eenennaam et al., The Plant Cell, 15 (2003) p3007-3019）などが報告されている。またα-トコフェロ−ルの含有量が高められた形質転換ダイズについて、特許出願も行なわれている（特開２００６−０７５１０６号公報）。しかしパラゴムノキにおいては、ビタミンEの生合成に関連する酵素の遺伝子はこれまで全く取得されていなかった。そのために、パラゴムノキにおいてビタミンEの生合成を制御する手段はこれまでなかった。【０００４】
なおこれまでに判っている植物のビタミンEの生合成経路を図１に示す。プレフェン酸を基質として、プレフェン酸デヒドラターゼの作用によりp-ヒドロキシフェニルピルビン酸が生成する。そしてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの作用により、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸が生成する。また非メバロン酸経路も作用しており、ゲラニルゲラニル二リン酸から、ゲラニルゲラニルレダクターゼによりフィチル二リン酸が生成する。【０００５】
これらの生成物から、ビタミンEの前駆体であるベンゾキノン誘導体やプラストキノン誘導体が生成する。すなわち、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸から、ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの作用により、2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンが生成する。またフィチル二リン酸とホモゲンチジン酸から、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの作用により、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンが生成する。更に2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンから、2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの作用により、2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル1,4-ベンゾキノンが生成する。また、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンから、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの作用により、2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンが生成する。【０００６】
それらを原料としてトコトリエノール類が生成する。すなわち、2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル1,4-ベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりγ-トコトリエノールが生成し、更にγ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンから、γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりα-トコトリエノールが生成する。また2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりδ-トコトリエノールが生成し、更にδ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンから、γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりβ-トコトリエノールが生成する。【０００７】
更にトコフェロール類も生成する。すなわち、2,3-ジメチル-5-フィチル-1,4-ベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりγ-トコフェロールが生成し、更にδ-トコフェロールとS-アデノシル-L-メチオニンから、γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりα-トコフェロールが生成する。また2-メチル-6-フィチルベンゾキノンから、トコフェロールサイクラーゼの作用によりδ-トコフェロールが生成し、更にδ-トコフェロールとS-アデノシル-L-メチオニンから、γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼの作用によりβ-トコフェロールが生成する。
【発明の開示】
【０００８】
しかしこれまで、パラゴムノキにおけるビタミンEの生合成に関与する酵素の遺伝子群に関する解析はまだ不十分であった。よってパラゴムノキのビタミンEの生合成に関与する酵素の遺伝子群を単離し、当該遺伝子群を構成する各遺伝子の塩基配列を解析することが、本発明の課題である。
【０００９】
パラゴムノキのEST（Expression Sequence Tags）解析により得た遺伝子断片情報と既知遺伝子データベースとの統合解析により、ビタミンEの生合成に関与する酵素の遺伝子群と思われる配列を特定し、全長cDNAクローニングにより、当該遺伝子ホモログを取得した。そして取得した各遺伝子についてその塩基配列を決定した。
【００１０】
上記で述べたようにビタミンEは良く知られた抗酸化物質であり、ビタミンEがゴム製品においても酸化防止剤、すなわち老化防止剤として作用していることが確認されている（Malaika et al., Polymer & Composites, 8 (2000) p537）。よって本発明で得られたビタミンE生合成に関与している酵素の遺伝子群で植物、特にゴム産生植物を形質転換することにより、ビタミンE含量が高められた実用植物を作製することが可能である。より具体的には、本発明の遺伝子を導入して得られた形質転換したパラゴムノキを作製することにより、ビタミンEの生合成の増強、ひいては老化防止効果が高められることが期待できる。なお本願明細書において「ビタミンEの生合成を増強」とは、本発明のビタミンEの生合成に関与している遺伝子をパラゴムノキなどの植物に導入することにより、天然の植物と比較してビタミンEの生合成が増加することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は植物のビタミンE生合成の経路を示した図である。
【図２】図２はプレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列を示す図である。
【図３】図３はプレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列を示す図である。
【図５】図５は他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６はp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの塩基配列を示す図である。
【図７】図７はp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】図８はゲラニルゲラニルレダクターゼの塩基配列を示す図である。
【図９】図９はゲラニルゲラニルレダクターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】図１０はホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１１】図１１はホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】図１２は2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１３】図１３は2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】図１４はホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１５】図１５はホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１６】図１６は2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１７】図１７は2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１８】図１８はトコフェロールサイクラーゼの塩基配列を示す図である。
【図１９】図１９はトコフェロールサイクラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】図２０はγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼの塩基配列を示す図である。
【図２１】図２１はγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】図２２は、パラゴムノキの葉中に含まれるトコフェロールの含量を示すグラフである。
【図２３】図２３は、パラゴムノキの成葉と乳液中に含まれるトコフェロールおよびトコトリエノールの含量を示すグラフである。
【図２４】図２４は、パラゴムノキの各組織における本発明の各遺伝子の発現量解析の結果を示す図である。
【図２５】図２５は、本発明の遺伝子を導入したペリプロカ形質転換体からビタミンEを抽出した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
パラゴムノキ標準木の乳液（Latex）および当年枝の木部組織（Xylem）について、total RNAを抽出し、cDNAライブラリを作製した。これらについて網羅的なワンパスシークエンス解析を行った。乳液、木部組織由来のcDNAライブラリについて、それぞれ16407、16035の精度の高いEST配列が得られた（合計32442）。得られた部分配列について、配列の類似性に基づいたクラスタリング解析と、既知遺伝子との比較に基づいたアノテーション解析を行い、パラゴムノキESTデータベースを構築した。【００１３】
得られたESTデータベースにおいて、プレフェン酸デヒドラターゼ、他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼ、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ、2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼ、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードすると推定されるEST配列を見出した。これらの配列について3'-RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）により3’末端側の配列を決定し、完全長のcDNAを取得した。【００１４】
また、ビタミンE生合成経路の諸酵素のうちESTデータベースにおいて見出されなかったホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、トコフェロールサイクラーゼ、γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼについて、他の植物の既知アミノ酸配列のアライメントにより保存性の高い領域から縮重プライマー（Degenerate Primer）を設計し、PCRにより読み枠（ORF）の部分配列を取得した。さらに得られた各部分配列情報を元にして、3'-RACEにより3'末端側の配列を、5'-RACEにより5'末端側の配列を決定し、完全長のcDNAを取得した。【００１５】
プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図２および配列表の配列番号１の塩基番号１から１６７７に示す。配列表の配列番号１の塩基配列において塩基番号１６０から１３２９に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たプレフェン酸デヒドラターゼの推定アミノ酸配列を、図３および配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から３９０に示す。なおプレフェン酸デヒドラターゼは、プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。【００１６】
他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図４および配列表の配列番号３の塩基番号１から１７６０に示す。配列表の配列番号３の塩基配列において塩基番号１９９から１４８５に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たプレフェン酸デヒドラターゼの推定アミノ酸配列を、図５および配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４２９に示す。なお上記で述べたように、プレフェン酸デヒドラターゼは、プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。【００１７】
p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図６および配列表の配列番号５の塩基番号１から１６３１および図６に示す。配表の配列番号５の塩基配列において塩基番号４７から１３８１に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列からp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの推定アミノ酸配列を、図７および配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から４４５に示す。なおp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼは、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。【００１８】
ゲラニルゲラニルレダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図８および配列表の配列番号７の塩基番号１から１７９３に示す。配列表の配列番号７の塩基配列において塩基番号１２から１４２４に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たゲラニルゲラニルレダクターゼの推定アミノ酸配列を、図９および配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から４７１に示す。なおゲラニルゲラニルレダクターゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。【００１９】
ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１０および配列表の配列番号９の塩基番号１から１５６３に示す。配列表の配列番号９の塩基配列において塩基番号９３から１３３４に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１１および配列表の配列番号１０のアミノ酸番号１から４１４に示す。なおホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼは、ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として2-メチル-6-フィチルベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。【００２０】
2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１２および配列表の配列番号１１の塩基番号１から１４１０に示す。配列表の配列番号１１の塩基配列において塩基番号１６５から１１８７に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得た2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１３および配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１から３４１に示す。なお2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼは、2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル-1,4-ベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。【００２１】
ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１４および配列表の配列番号１３の塩基番号１から１８３７に示す。配列表の配列番号１３の塩基配列において塩基番号８２から１３１７に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１５および配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から４１１に示す。なおホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼは、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。【００２２】
2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１６および配列表の配列番号１５の塩基番号１から１２８２に示す。配列表の配列番号１５の塩基配列において塩基番号８４から１１０６に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得た2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図１７および配列表の配列番号１６のアミノ酸番号１から３４０に示す。なお2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼは、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンを生合成する反応を触媒する酵素である。【００２３】
トコフェロールサイクラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図１８および配列表の配列番号１７の塩基番号１から２００８に示す。配列表の配列番号１７の塩基配列において塩基番号１２３から１６４９に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たトコフェロールサイクラーゼの推定アミノ酸配列を、図１９および配列表の配列番号１８のアミノ酸番号１から５０８に示す。なお、トコフェロールサイクラーゼは、ビタミンEの前駆体であるベンゾキノン誘導体又はプラストキノン誘導体を基質としてトコトリエノール類またはトコフェロール類を生合成する反応を触媒する酵素である。【００２４】
γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、図２０および配列表の配列番号１９の塩基番号１から１４０８示す。配列表の配列番号１９の塩基配列において塩基番号８２から１１２５に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得たγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、図２１および配列表の配列番号２０のアミノ酸番号１から３４７に示す。なおγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼは、δ-トコフェロール若しくはδ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてβ-トコフェロール若しくはβ-トコトリエノールを、又はγ-トコフェロール若しくはγ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてα-トコフェロール若しくはα-トコトリエノールを生合成する反応を触媒する酵素である。【００２５】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるDNAの特定の部位に、当該DNAの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。【００２６】
即ち、配列表の配列番号１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成する反応を触媒するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００２７】
同様に、配列表の配列番号３に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号３に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号３に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００２８】
同様に、配列表の配列番号５に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号５に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成するp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号５に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００２９】
同様に、配列表の配列番号７に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号７に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号７に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニルレダクターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号７に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００３０】
同様に、配列表の配列番号９に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号９に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号９に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として2-メチル-6-フィチルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号９に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００３１】
同様に、配列表の配列番号１１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１１に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１１に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル-1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００３２】
同様に、配列表の配列番号１３に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１３に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１３に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１３に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００３３】
同様に、配列表の配列番号１５に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１５に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１５に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１５に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００３４】
同様に、配列表の配列番号１７に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１７に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１７に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、ビタミンEの前駆体であるベンゾキノン誘導体又はプラストキノン誘導体を基質としてトコトリエノール類またはトコフェロール類を生合成するトコフェロールサイクラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１７に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００３５】
同様に、配列表の配列番号１９に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１９に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１９に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、δ-トコフェロール若しくはδ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてβ-トコフェロール若しくはβ-トコトリエノールを、又はγ-トコフェロール若しくはγ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてα-トコフェロール若しくはα-トコトリエノールを生合成するγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１９に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。【００３６】
ハイブリダイゼーションの条件については当業者が適宜選択をすることができるが、具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。試験すべきDNAまたはRNA分子を転写した膜と標識したプローブを、適用なハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、例えば、5×SSC、0.1質量%N-ラウロイルサルコシン、0.02質量%のSDS、2質量%の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬及び50%フォルムアミドから成る。核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬としては、一例として、0.1Mマレイン酸と0.15M塩化ナトリウムからなる緩衝液(pH7.5)に市販の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬を10% になるように溶解したものを使用することができる。20×SSCは、３Ｍ塩化ナトリウム、0.3Ｍクエン酸溶液であり、SSCは、より好ましくは、３〜６×SSC、更に好ましくは４〜５×SSCの濃度で使用する。【００３７】
ハイブリダイゼーションの温度は、40〜80℃、より好ましくは50〜70℃、更に好ましくは55〜65℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×SSC＋0.1質量％SDS溶液、より好ましくは４×SSC＋0.1質量％SDS溶液、更に好ましくは２×SSC＋0.1質量％SDS溶液、更に好ましくは１×SSC＋0.1質量％SDS溶液、最も好ましくは0.1×SSC＋0.1質量％SDS溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたDNA分子またはRNA分子をプローブに用いた標識を利用して識別することができる。【００３８】
更に本願明細書において、配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と配列番号２に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する限り、本発明の範囲内である。【００３９】
同様に、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号４に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、プレフェン酸を基質としてp-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生合成するプレフェン酸デヒドラターゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４０】
同様に、配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号６に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号６に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてホモゲンチジン酸を生合成するp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４１】
同様に、配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号８に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号８に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、ゲラニルゲラニル二リン酸を基質としてフィチル二リン酸を生合成するゲラニルゲラニルレダクターゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４２】
同様に、配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１０に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸を基質として2-メチル-6-フィチルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４３】
同様に、配列表の配列番号１２に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１２に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-ゲラニルゲラニル-1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４４】
同様に、配列表の配列番号１４に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１４に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１４に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、ゲラニルゲラニル二リン酸とホモゲンチジン酸を基質として2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンを生合成するホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４５】
同様に、配列表の配列番号１６に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１６に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１６に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンを生合成する2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４６】
同様に、配列表の配列番号１８に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１８に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１８に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、ビタミンEの前駆体であるベンゾキノン誘導体又はプラストキノン誘導体を基質としてトコトリエノール類またはトコフェロール類を生合成するトコフェロールサイクラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４７】
同様に、配列表の配列番号２０に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号２０に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号２０に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、δ-トコフェロール若しくはδ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてβ-トコフェロール若しくはβ-トコトリエノールを、又はγ-トコフェロール若しくはγ-トコトリエノールとS-アデノシル-L-メチオニンを基質としてα-トコフェロール若しくはα-トコトリエノールを生合成するγ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。【００４８】
ビタミンEの生合成に関与する酵素をコードする本発明の遺伝子群を、ゴムノキなどの植物に遺伝子導入してその発現を増強することにより、該酵素の発現量を該植物において増加させることができる。すなわち本発明で得られたビタミンEの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換したゴムノキを作製することにより、特に乳液（Latex）中のビタミンE含量を増加させることができる。そしてひいてはビタミンEの抗酸化作用により、ゴムの老化防止効果を高められることを期待することができる。【００４９】
なお本発明の遺伝子を導入する植物の例としては、パラゴムノキの他、ペリプロカ、グアユール、キャッサバ、ヒマワリ、レタス、インドゴムノキなどを挙げることができるが、形質転換を行う対象の植物はそれらの植物に限定されるものではなく、種々の植物において本発明の遺伝子を導入した形質転換体を作成することができる。中でもパラゴムノキなどのゴム産出植物を用いて形質転換を行い、特にゴム産出植物の乳管にて本発明の遺伝子の発現を増強させて本発明のビタミンEの生合成に関与する酵素の発現量を増加させ、それによって乳管から産出される乳液（Latex）中のビタミンE含量を増加させ該ゴム産出植物から得られるゴムのビタミンE含量を増加させることは、本発明において好適な態様である。なおゴム産出植物は、キク科、クワ科、トウダイグサ科、ガガイモ科、キョウチクトウ科、アカテツ科など多くの2-メチル-6-フィチルベンゾキノンとS-アデノシル-L-メチオニンを基質として2,3-ジメチル-5-フィチル1,4-ベンゾキノンを生合成する科に渡ることが知られている。【００５０】
形質転換体の作製方法としては、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。導入された遺伝子を活性化するために有用なプロモーターとして、例えば、本技術分野で汎用されているカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを用いて、形質導入するべき本発明の遺伝子の上流に配置することができる。導入された外来遺伝子を十分に発現させるためには、多くの場合には何らかのプロモーターが必要とされるが、好適なプロモーターはカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに限定されるものではなく、本技術分野において汎用されている種々のプロモーターを用いることも可能である。なおゴムの増産には乳管特異的なプロモーターを使用することが好適である。【００５１】
また、本発明において使用可能なベクターとして、例えば、pIG121-Hm、pBI12、pBI221、pBIN19、pCC22、pGA482、pPCV001、pCGN1547、pJJ1881、pPZP111、pGreen0029、pBI101、pBI121、pYLTAC7などを挙げることができる。しかし使用できるベクターはそれらに限定されるものではない。そのようなベクターを、例えばアグロバクテリウム菌に導入して、カルス又は幼植物に感染させることにより、形質転換植物を作製する事が可能であり、更に、そのような形質転換植物に由来する種子を得る事が可能である。また、本発明の植物遺伝子を植物に導入する形質転換法は、アグロバクテリウム法に限定されるものではなく、パーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いる事も可能である。なおゴムノキにおいて外来遺伝子を導入して形質転換を行った例が、特開平８−１１６９７７号公報において開示されている。よって本技術分野の当業者は、例えば特開平８−１１６９７７号公報の記載を参考にして適宜工夫をして、本発明の遺伝子を導入した形質転換植物を作製することができる。
【実施例】
【００５２】
（材料）
植物体試料として、Indonesia Cikampekで栽培されているパラゴムノキHevea brasiliensis RRIM600標準木より採取した乳液および、当年枝の木部組織を用いた。乳液は採取後、直ちに等量の2×Sampling Buffer（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁した。ペリプロカ（Periploca sepium Bunge）は、日立造船（株）の中澤慶久氏から分与していただいた。【００５３】
（パラゴムノキからのRNA抽出）
乳液および木部組織からそれぞれ下記の手順でRNAを抽出した。採取後、直ちに等量の2×Sampling Buffer（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁した乳液を遠心分離し、上層のゴム層を取り除いた。さらに1.5倍量の2×CTAB solution (2% hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), 1% 2-mercaptoethanol, 0.1 M Tris-HCl (pH9.5), 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA )を加え、65℃で10 min インキュベートした。さらに、等量のクロロホルム/イソアミルアルコールを加え、濁後、遠心分離により水層を回収した。再度、等量のクロロホルム/イソアミルアルコールを加え、懸濁後、遠心分離により水層を回収した。1/4量の10 M LiClを加え混合し、−20℃で2時間インキュベートした(RNAの選択的沈殿)。これを遠心分離し、沈殿を適量のTEに溶解、遠心し上清を回収した (多糖類を排除)。これについて、フェノール処理、フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム/イソアミルアルコール処理後、再度LiClによるRNAの選択的沈殿を行った。沈殿を70%エタノールで洗浄、減圧乾燥後、DEPC処理水に溶解し、乳液由来total RNAを得た。【００５４】
また、当年枝からメスを用いて師部組織を剥離して得られた木部組織約1gを液体窒素で冷却しつつ乳鉢・乳棒で破砕し、RNeasy（登録商標） Plant Mini Kit（QIAGEN社）を使用して、木部組織由来total RNAを得た。得られたRNA溶液について吸光度測定による定量と電気泳動による確認を行った。乳液25mlから450μg、木部組織1gから110μgのRNAが得られた。【００５５】
（パラゴムノキcDNAライブラリの作製）
パラゴムノキ乳液および木部組織由来RNA試料について、日立計測器サービス (株)にてV-キャッピング法によりcDNAライブラリを作製した。V-キャッピング法はcDNA完全長率の高い手法である。【００５６】
乳液由来のcDNAライブラリのライブラリサイズは、1.7×105、インサート率は71%(24サンプル/アガロースゲル電気泳動)、完全長率はインサートのあるクローンに対して82%であった。木部組織由来のcDNAライブラリのライブラリサイズは2.9×105、インサート率は80%（24サンプル/アガロースゲル電気泳動）、完全長率はインサートのあるクローンに対して87%であった。【００５７】
（EST配列のシークエンス解析とクラスタリング解析およびアノテーション解析）北里大学北里生命科学研究所ゲノム情報学研究室にて、パラゴムノキ乳液および木部組織由来cDNAライブラリそれぞれ約2万クローンについて網羅的なワンパスシークエンス解析を行った。シークエンス解析により得られた配列情報からインサートを保持しないクローン、シークエンスが読めていないものを除去し、精度の高い配列情報を得た。乳液と木部組織のライブラリについてそれぞれ16407個と16035個の精度の高いEST配列が合計32442個得られた。【００５８】
得られた部分配列について、配列の類似性に基づいたクラスタリング解析と、既知遺伝子との比較に基づいたアノテーション解析を行い、パラゴムノキESTデータベースを構築した。クラスタリング解析には、NTTソフトウェアのVISUALBIO clusteringを使用した。アノテーション解析は、NCBI BLAST を使用した相同性検索により行った。検索の際に使用したデータベースはnr(All non-redundant GenBank CDS translations + PDB +SwissProt + PIR (Peptide Sequence Database))である。【００５９】
得られたESTデータベースにおいて、ビタミンE生合成経路の諸酵素、すなわち、プレフェン酸デヒドラターゼ、他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼ、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼ、2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼ、2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼをコードすると推定されるEST配列を見出した。【００６０】
（3'-RACEによる3'末端側の配列決定）
上記の解析により得られた各配列について3'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)により3'末端側の配列を決定し、完全長のcDNAを取得した。3'-RACEには3’-Full RACE Core Set（タカラバイオ (株)）を使用した。逆転写反応にはoligo-dT primerを使用した。PCR による増幅にはoligo-dT primerと既知配列の一部と同じ配列のsense primerを使用した。逆転写反応、PCRにより得られた増幅断片をpT7Blue vectorにTAクローニングした後シークエンス解析を行った。【００６１】
（Degenerate PCRによるクローニング）
他の植物の既知アミノ酸配列のアライメントにより保存性の高い領域から宿重プライマー（Degenerate Primer）を設計し、PCRにより読み枠（ORF）の部分配列を取得した。さらに得られた各部分配列情報を元にして、3'-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)により3'末端側の配列を、5'-RACEにより5'末端側の配列を決定し、完全長のcDNAを取得した。【００６２】
3'-RACE、5’-RACEには、それぞれ3’-Full RACE Core Set、5'-Full RACE Core Set（タカラバイオ (株)）を使用した。逆転写反応にはoligo-dT primerを使用した。PCRによる増幅にはoligo-dT primerと既知配列の一部と同じ配列のsense primerを使用した。逆転写反応、PCRにより得られた増幅断片をpT7Blue vectorにTAクローニングした後シークエンス解析を行った。対象としたビタミンE生合成経路の諸酵素は、ESTデータベースにおいて見出されなかったホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、トコフェロールサイクラーゼ、γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼである。【００６３】
上記のようにして得られた配列が、(1)プレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列（配列表の配列番号１）、(2)他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼの塩基配列（配列表の配列番号３）、(3)p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの塩基配列（配列表の配列番号５）、(4)ゲラニルゲラニルレダクターゼの塩基配列（配列表の配列番号７）、(5)ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼの塩基配列（配列表の配列番号９）、(6)2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの塩基配列（配列表の配列番号１１）、(7)ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼの塩基配列（配列表の配列番号１３）、(8)2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼの塩基配列（配列表の配列番号１５）、(9)トコフェロールサイクラーゼの塩基配列（配列表の配列番号１７）、(10)γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼの塩基配列（配列表の配列番号１９）である。【００６４】
そしてそれらの読み枠から得られた蛋白質の推定アミノ酸配列が、(1)プレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号２）、(2)他のクローンから得られたプレフェン酸デヒドラターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号４）、(3)p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号６）、(4)ゲラニルゲラニルレダクターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号８）、(5)ホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１０）、(6)2-メチル-6-ゲラニルゲラニルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１２）、(7)ホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１４）、(8)2-メチル-6-フィチルベンゾキノンメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１６）、(9)トコフェロールサイクラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１８）、(10)γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号２０）である。【００６５】
（ビタミンE解析）
パラゴムノキの若葉、成葉、新鮮乳液中に含まれる4種のトコトリエノールおよび4種のトコフェロールの計8種について、HPLCで含有量を定量した。【００６６】
新鮮乳液から、減圧乾燥により固形ゴムを得た。細断した固形ゴムを秤量後、アセトンによるソックスレー抽出を行った。溶媒を留去後、抽出物をヘキサンに溶解し、分析用試料とした。葉を秤量後、1%（w/v）塩化ナトリウム溶液、3%ピロガロール-エタノール溶液、60%（w/v）水酸化カリウムを加え、70℃で30分間鹸化した。ヘキサン:2-プロパノール:酢酸エチル（18:3:2）を加え遠心分離を行った。溶媒を留去後、ヘキサンに溶解し、分析用試料とした。【００６７】
HPLCの分析条件は次のとおりである。
カラム          YMC-Pack SIL-06
カラム温度      40℃
流量            1.5ml/min
移動層          ヘキサン + 2-プロパノール + 酢酸（1000:6:5）
検出器          蛍光測定（励起波長 298nm,  測定波長 325nm）【００６８】
HPLCで分析を行った結果を図２２及び２３に示す。図２２は、葉中に含まれるトコフェロールの含量を示すグラフであり、図２３は、パラゴムノキの成葉と乳液中に含まれるトコフェロールおよびトコトリエノールの含量を示すグラフである。図２２及び２３に示すように、葉にはトコフェロールが、一方で乾燥ゴムにはトコトリエノールが多く含まれていた。また、葉の成熟に伴い、葉中のトコフェロール量は増加した（図２２）。葉中のトコフェロールの組成は、αが最も多く、γ、δ、βの順に含まれていた（図２２）。一方でLatex中のトコトリエノールの組成は、γが最も多く、α、β、δの順に含まれていた（図２３）。【００６９】
（各遺伝子の発現量解析）
パラゴムノキの各組織より調製したcDNAを鋳型に、特異的なプライマーを用いて、GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) によるRealtime PCRにより各遺伝子の発現量を解析した。結果を図２４に示す。図２４より、トコフェロールの生合成に重要なゲラニルゲラニルリダクターゼとホモゲンチジン酸フィチルトランスフェラーゼが葉において多く発現し、トコトリエノールの生合成に重要なホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼが乳液において発現していることが明らかになった。つまり、これらの遺伝子の発現をコントロールすることで、トコトリエノールとトコフェロールの含量をコントロールできる可能性が示唆された。また、γ-トコフェロールメチルトランスフェラーゼは、葉においてより多く発現していることが明らかとなった。つまり、この遺伝子の発現をコントロールすることにより、αおよびγ、δおよびβの組成をコントロールできる可能性が示唆された。【００７０】
（モデル植物を用いた機能確認例）
ゴム産出植物のモデル植物であるペリプロカ（Periploca sepium Bunge）は、パラゴムノキより成長が早く（半年から一年で成木に成長）、そのためパラゴムノキより早く遺伝子導入を確認することができる。さらに、ペリプロカはパラゴムノキと乳管の構造及び機能が類似しており、パラゴムノキと同様のビタミンE生合成経路の酵素が機能していることが考えられることから、本発明のビタミンE生合成に関与する遺伝子がペリプロカにおいて機能する場合には、パラゴムノキにおいても当該遺伝子が機能することが予想される。また、ペリプロカは本来トコフェロールのみしか含まれていないことが分析により確認されており、遺伝子組み換えにより、ビタミンEの組成や含量が変化することが予想される。したがって、本実施例では、本発明の遺伝子の導入の対象としてペリプロカを用いた。【００７１】
上記の手順で得られた完全長のパラゴムノキのビタミンE生合成関連遺伝子のうち、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼについて、ペリプロカに遺伝子導入し、遺伝子組み換え植物を作製し、それらのビタミンEの組成、含量を測定することにより機能を確認した。適当な制限酵素サイトを付加したsense primerとantisense primerを用いたPCRにより、パラゴムノキの目的遺伝子の翻訳領域の配列を増幅した。増幅断片をsGFP遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を保持したpMSIsGFP vectorにクローニングした。当vectorをアグロバクテリウムに導入し、ペリプロカの植物体に感染させた。形質転換体の選抜は、マーカーであるsGFPの蛍光による観察により行った。さらに形質転換体からGenomic DNAを抽出し、目的遺伝子の導入の有無をPCRにより確認した。結果を図２５に示す。図２５より、得られたペリプロカ形質転換体からビタミンEを抽出した結果、有意な含量の増加が認められた。その結果、ペリプロカの形質転換体を用いた機能解析により遺伝子の機能を特定できた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、パラゴムノキのビタミンE生合成に関与する一連の酵素をコードする遺伝子群が採取され、それらの遺伝子の塩基配列が決定された。ビタミンEは天然に存在する抗酸化物質であるので、本発明で得られた遺伝子群で植物を形質転換することにより、該植物におけるビタミンE含量が増加すること、ひいてはゴムの老化防止を得ることが期待できる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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