(57)【要約】【課題】  腫瘍細胞にγδＴ細胞の標的分子を発現させ、γδＴ細胞が腫瘍細胞を効率よく傷害するための腫瘍細胞の標的化方法を提供するものである。また腫瘍細胞の標的化方法を利用したがん治療・予防薬を提供するものである。さらにがん治療・予防方法を提供するものである。【解決手段】  腫瘍細胞を代謝拮抗剤に曝露することにより、γδＴ細胞が腫瘍細胞を認識して攻撃するために必要な標的分子を腫瘍細胞表面に発現させることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を代謝拮抗剤に曝露し、前記腫瘍細胞にγδＴ細胞の標的分子を発現させることを特徴とする腫瘍細胞の標的化方法。
【請求項２】
前記代謝拮抗剤がゲムシタビン、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍細胞の標的化方法。
【請求項３】
前記標的分子がＦａｓ、ＭＩＣＡ及びＴＲＡＩＬ−レセプターであることを特徴とする請求項１又は２に記載の腫瘍細胞の標的化方法。
【請求項４】
前記標的分子が同時に高発現していることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の腫瘍細胞の標的化方法。
【請求項５】
γδＴ細胞と代謝拮抗剤を組み合わせてなることを特徴とするがん治療・予防薬。
【請求項６】
前記γδＴ細胞と前記代謝拮抗剤とを、別々の溶液に懸濁し、薬剤とすることを特徴とする請求項５に記載のがん治療・予防薬。
【請求項７】
前記代謝拮抗剤を含む薬剤を投与した後、前記γδＴ細胞を含む薬剤を投与することを特徴とする請求項５又は６に記載のがん治療・予防薬。
【請求項８】
前記代謝拮抗剤がゲムシタビン、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれか１項に記載のがん治療・予防薬。
【請求項９】
前記γδＴ細胞が自己由来であることを特徴とする請求項５乃至８のいずれか１項に記載のがん治療・予防薬。
【請求項１０】
γδＴ細胞を含む薬剤と代謝拮抗剤を含む薬剤を投与することを特徴とするがん治療・予防方法。
【請求項１１】
前記代謝拮抗剤を含む薬剤を投与した後、前記γδＴ細胞を含む薬剤を投与することを特徴とする請求項１０に記載のがん治療・予防方法。
【請求項１２】
前記代謝拮抗剤がゲムシタビン、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のがん治療・予防方法。
【請求項１３】
前記γδＴ細胞が自己由来であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のがん治療・予防方法。
【請求項１４】
γδＴ細胞を含む薬剤と、代謝拮抗剤を含む薬剤とからなるがん治療・予防用キット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍細胞の標的化方法に関する。また該腫瘍細胞の標的化方法を用いたがん治療・予防薬に関する。さらにがん治療・予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の最も多い死亡原因としてがんが挙げられる。がんの治療方法としては、三大療法と言われる外科療法、化学療法、放射線療法があるが、夫々治療の困難性や副作用といった問題がある。【０００３】
近年、上記三大療法のほかにがんの新しい治療方法として免疫細胞療法が行われており、免疫細胞療法は治療の困難性や副作用等の問題が少ないため注目されている。【０００４】
この免疫細胞療法の１つにγδＴ細胞を用いる方法がある。γδＴ細胞はγδ型T細胞レセプター（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＴＣＲという）を発現するＴ細胞である。γδＴ細胞はサイトカインを産生することで抗腫瘍効果を発揮するほか、ＴＣＲによりペプチド以外の抗原を認識して傷害することが知られている。また、正常細胞ががん化して腫瘍細胞となることによって発現するＦａｓ、ＭＩＣＡ、ＴＲＡＩＬ−レセプター（ＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＴＲＡＩＬ−Ｒという）等細胞膜表面たんぱく質にγδＴ細胞が有するＦａｓリガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬを介して結合し、傷害することが知られている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２）。【０００５】
しかし、この傷害活性は腫瘍細胞にＦａｓ、ＭＩＣＡ、ＴＲＡＩＬ−Ｒが発現しないと効果を発揮しづらいという問題がある。【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００７；５６（８）：１２８５−１２９７
【非特許文献２】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１７５：２１４４−２１５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、腫瘍細胞にＦａｓ、ＭＩＣＡ及びＴＲＡＩＬ−Ｒを発現させ、γδＴ細胞が腫瘍細胞を効率よく傷害するための腫瘍細胞の標的化方法を提供するものである。また腫瘍細胞の標的化方法を利用したがん治療・予防薬を提供するものである。さらにがん治療・予防方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行ったところ、代謝拮抗剤が腫瘍細胞にγδＴ細胞の標的分子であるＦａｓ、ＭＩＣＡ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ（以下、標的分子ともいう）を同時に強発現させる機能があることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は下記手段を提供するものである。【０００９】
（１）腫瘍細胞を代謝拮抗剤に曝露し、前記腫瘍細胞にγδＴ細胞の標的分子を発現させることを特徴とする腫瘍細胞の標的化方法、
（２）前記代謝拮抗剤がゲムシタビン、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（１）に記載の腫瘍細胞の標的化方法、
（３）前記標的分子がＦａｓ、ＭＩＣＡ及びＴＲＡＩＬ−レセプターであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の腫瘍細胞の標的化方法、
（４）前記標的分子が同時に高発現していることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれか１つに記載の腫瘍細胞の標的化方法。【００１０】
（５）γδＴ細胞と代謝拮抗剤を組み合わせてなることを特徴とするがん治療・予防薬、
（６）前記γδＴ細胞と、前記代謝拮抗剤とを、別々の溶液に懸濁し、薬剤とすることを特徴とする（５）に記載のがん治療・予防薬、
（７）前記代謝拮抗剤を含む薬剤を投与した後、前記γδＴ細胞を含む薬剤を投与することを特徴とする（５）又は（６）に記載のがん治療・予防薬、
（８）前記代謝拮抗剤がゲムシタビン、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（５）乃至（７）のいずれか１つに記載のがん治療・予防薬、
（９）前記γδＴ細胞が自己由来であることを特徴とする（５）乃至（８）のいずれか１つに記載のがん治療・予防薬。【００１１】
（１０）γδＴ細胞を含む薬剤と代謝拮抗剤を含む薬剤を投与することを特徴とするがん治療・予防方法、
（１１）前記代謝拮抗剤を含む薬剤を投与した後、前記γδＴ細胞を含む薬剤を投与することを特徴とする（１０）に記載のがん治療・予防方法、
（１２）前記代謝拮抗剤がゲムシタビン、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載のがん治療・予防方法、
（１３）前記γδＴ細胞が自己由来であることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれか１つに記載のがん治療・予防方法。【００１２】
（１４）γδＴ細胞を含む薬剤と代謝拮抗剤を含む薬剤とからなるがん治療・予防用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、腫瘍細胞を代謝拮抗剤に曝露することにより、γδＴ細胞が腫瘍細胞を認識して攻撃するために必要な標的分子であるＦａｓ、ＭＩＣＡ及びＴＲＡＩＬ−Ｒを該腫瘍細胞表面に発現させることができる。γδＴ細胞はそれら標的分子を認識して腫瘍細胞を傷害するため、従来よりも効率の良いγδＴ細胞を用いたがん治療・予防薬、がん治療・予防方法を提供することが可能となる。
しかも本発明により標的化された腫瘍細胞は上記標的分子を同時に高発現しているため、γδＴ細胞は効率よく腫瘍細胞を傷害することができる。【００１４】
更に、代謝拮抗剤とγδＴ細胞とをがん治療・予防薬、がん治療・予防方法として併用することで、代謝拮抗剤そのものが有する抗腫瘍効果と代謝拮抗剤の標的分子発現機能により腫瘍細胞の傷害を効率化されたγδＴ細胞とが相乗効果を奏し、従来のがん治療・予防薬、がん治療・予防方法と比較してより効果の高いがん治療・予防薬、がん治療・予防方法を提供することが可能となる。【００１５】
更に、本発明で用いる代謝拮抗剤は、現在のところ効果の高い抗がん剤と認識されているものの、一方で骨髄毒性（白血球減少、血小板減少、貧血）などの副作用も有しており、その副作用のため長期間の継続投与が難しくなることも少なくない。本発明のようにγδＴ細胞を用いた免疫細胞療法と併用し、患者の免疫細胞を賦活化することで、その副作用も軽減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。【００１７】
＜腫瘍細胞の標的化方法＞
まず腫瘍細胞の標的化方法について説明する。
本発明は腫瘍細胞を代謝拮抗剤に曝露することにより、腫瘍細胞にγδＴ細胞の標的分子を発現させる腫瘍細胞の標的化方法である。【００１８】
ここで、標的分子とはＦａｓ、ＭＩＣＡ及びＴＲＡＩＬ−Ｒをいう。【００１９】
γδＴ細胞はＦａｓリガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬを細胞膜表面に発現しており、それぞれＦａｓ、ＭＩＣＡ、ＴＲＡＩＬ−Ｒと結合し、それらの分子を発現する細胞を傷害することができる。【００２０】
ここで、代謝拮抗剤とはＤＮＡを構成する物質に類似する物質で、細胞内に取り込まれることで、ＤＮＡを構成する物質と拮抗して代謝を阻害したり、ＤＮＡ鎖に組み込まれて正常なＤＮＡ合成を阻害する物質をいう。例えば、ゲムシタビン、フルオロウラシル、Ｓ−１、テガフール・ウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、シタラビン、エノシタビン、メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン等が挙げられる。【００２１】
ここで、ゲムシタビンとはシチジンの２´部分がフッ素で置換されたヌクレオシドである。ゲムシタビンは細胞内でリン酸化されて活性型ヌクレオチドになる。活性型ヌクレオチドはＤＮＡ鎖に取り込まれて、細胞死を誘発する。【００２２】
ゲムシタビンは例えば塩酸ゲムシタビン（商品名：ジェムザール、日本イーライリリー）を生理食塩水などに溶解して調製する。【００２３】
本発明によれば、代謝拮抗剤に曝露された腫瘍細胞ではＦａｓ、ＭＩＣＡ、及びＴＲＡＩＬ−Ｒが同時に高発現し、発現した標的分子にγδＴ細胞が結合し、腫瘍細胞を傷害するため、代謝拮抗剤及びγδＴ細胞が夫々発揮するよりも高い腫瘍細胞殺傷効果を発揮することができる。【００２４】
標的分子が同時に高発現しているとは、Ｆａｓ、ＭＩＣＡ及びＴＲＡＩＬ−Ｒの発現量が無処理状態と比較して、３種ともに増加している状態をいう。【００２５】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏにおいて腫瘍細胞を標的化する場合、シャーレ等に腫瘍細胞を播種し、例えばゲムシタビンの最終濃度が０．１μＭ〜１０μＭとなるように培地に添加し、４８時間ゲムシタビンに曝露したまま腫瘍細胞を培養すれば、標的分子を発現させ、γδＴ細胞の標的化することができる。
しかしながら、ゲムシタビンの濃度を高くして曝露する時間を短縮することや、ゲムシタビンの濃度を低くして曝露する時間を長くすることも可能である。【００２６】
次いで、γδＴ細胞と代謝拮抗剤からなるがん治療・予防薬について説明する。【００２７】
＜がん治療・予防薬＞
本発明のがん治療・予防薬は、担がん患者に投与する治療薬として用いることができる。また代謝拮抗剤及びγδＴ細胞は、肉眼では見えない腫瘍細胞を傷害することができるため、手術後の再発予防薬としての利用が可能である。【００２８】
本発明のがん治療・予防薬はγδＴ細胞を含む薬剤と代謝拮抗剤を含む薬剤からなる。このような構成にすることにより、代謝拮抗剤を先に投与することができ、腫瘍細胞がγδＴ細胞の標的分子を発現する時間を与えることができる。【００２９】
次いで、γδＴ細胞を含む薬剤及び代謝拮抗剤を含む薬剤の調製方法について説明する。【００３０】
＜γδＴ細胞の調製＞
採血により末梢血を得る。採血する方法としては、真空採血管等による全血採取を利用することができる。採血量は患者の末梢血に含まれるγδＴ細胞の割合、γδＴ細胞の培養可能期間、投与数などを考慮し、患者の負担とならない程度に設定することが好ましい。例えば、１４日間の培養期間で、投与するγδＴ細胞として１０９個程度のγδＴ細胞を得たい場合には、培養開始時のγδＴ細胞数を３×１０５〜１×１０６個程度確保できるように採血量を設定することが好ましい。
また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接末梢血単核球を取得することが可能である。【００３１】
例えば密度勾配遠心法により末梢血単核球を得る。末梢血単核球を培養液ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン）中に懸濁する。ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液という。なお、ここで示した培養液以外にも、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下ＤＭＥＭという）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下ＩＭＥＭという）等の細胞の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。【００３２】
また、必要に応じて血清を０．１〜２０％添加してもよい。血清として、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、以下ＦＣＳという）、ＡＢ血清又は自己血漿等を使用してもよい。【００３３】
得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグ又はプレートに播種する。【００３４】
フラスコ、バッグ又はプレート中に播種された末梢血単核球に濃度が０．０５〜１００μＭ、好ましくは０．１〜３０μＭとなるようにビスホスホネートを添加する。ここで、使用されるビスホスホネートとしては、例えばパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物が挙げられる。例えば、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物では０．１〜１０μＭにすることが好ましい。【００３５】
更に、上記培養液にＩＬ−２を濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加する。【００３６】
ＩＬ−２を添加した後３４〜３８℃、より好ましくは３７℃で、２〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ２存在下で培養する。この際、培養する細胞数に応じ、培養液を適宜添加する。更に、培養液の増加に伴い、ＩＬ−２の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜添加する。【００３７】
培養期間としては７日間以上であれば高純度でγδＴ細胞を含む細胞群が得られるが、γδＴ細胞の細胞数を増やすには、１４日間程度培養することが好ましい。【００３８】
以上の方法により、γδＴ細胞を効率よく増殖させることができる。【００３９】
次に、本発明の培養方法によって得られた活性化γδＴ細胞を含む薬剤について説明する。【００４０】
＜γδＴ細胞を含む薬剤＞
得られた細胞を遠心分離等により回収する。【００４１】
回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）等を利用することが好ましい。【００４２】
洗浄後に得られたγδＴ細胞を遠心分離法等を用いて回収し、医薬品として可能な液体、例えば、生理食塩水等に懸濁して本発明の薬剤を調製することができる。この際、懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方法に応じて適宜調整される。【００４３】
本発明の薬剤に用いるγδＴ細胞数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０８〜１０１２個／回／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／回／人以上である。【００４４】
このようにして得られたγδＴ細胞を、生理食塩水に懸濁してγδＴ細胞を含む薬剤を得る。【００４５】
本薬剤を投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下、リンパ節等へ注射することも、病変部に直接注入しても、また点滴として全身投与してもよい。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよい。【００４６】
γδＴ細胞は自己由来であれば、投与した際に患者の免疫系に排除されることなく、その機能を発揮することが可能である。【００４７】
次に代謝拮抗剤を含む薬剤について説明する。代謝拮抗剤としては様々なものを用いることができるが、ここではゲムシタビンを例として説明する。【００４８】
＜代謝拮抗剤を含む薬剤の調製＞
ゲムシタビンは例えば塩酸ゲムシタビン（商品名ジェムザール（登録商標）、日本イーライリリー）を生理的に許容可能な溶液（例えば生理食塩水等）に溶解して調製する。【００４９】
投与方法としては１０００ｍｇ／ｍ２を３０分かけて点滴静注することが好ましいが、患者の症状に応じて適宜調整される。【００５０】
投与頻度としては、例えば週１回投与を３週繰り返し、４週目は休薬する方法や、隔週で１回投与する方法等が挙げられる。【００５１】
γδＴ細胞を含む薬剤とゲムシタビンを含む薬剤を投与するタイミングとしては、ゲムシタビンを含む薬剤を投与した後、γδＴ細胞を含む薬剤を投与することが好ましい。
特にゲムシタビンを含む薬剤を投与して４８時間以降であれば、腫瘍細胞がゲムシタビンと接触し、腫瘍細胞がγδＴ細胞の標的分子を発現するため、投与したγδＴ細胞が腫瘍細胞を認識し、腫瘍細胞を効率よく傷害することができる。
また、γδＴ細胞を含む薬剤を後から投与することで、ゲムシタビンの細胞傷害効果がγδＴ細胞に影響することを防ぐこともできる。【００５２】
以下に治療及び／又は予防薬投与のスケジュールを例示する。【００５３】
ゲムシタビン治療前又はゲムシタビン治療３日以上後にγδＴ細胞を含む薬剤を調製するための採血又は成分採血を行い、γδＴ細胞の培養を開始する。成分採血等で大量に調製する細胞を採取した場合は、採取した細胞を凍結し、必要時に解凍して培養を開始する。
第１週１日にゲムシタビンを含む薬剤を投与する。
第１週３日に培養し調製したγδＴ細胞を含む薬剤を投与する。
第３週１日にゲムシタビンを含む薬剤を投与する。
第３週３日に培養し調製したγδＴ細胞を含む薬剤を投与する。
以降この繰り返しとなる。【００５４】
このようなスケジュールで行うことで、ゲムシタビンを含む薬剤の投与によりγδＴ細胞の標的分子を発現した腫瘍細胞を、γδＴ細胞を含む薬剤の投与により効率よく腫瘍細胞を傷害することが可能となる。しかしながら、本発明はこの例に制限されるものではなく、患者の状態によってスケジュールを変更することが可能である。【００５５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００５６】
＜γδＴ細胞の調製＞
健常人ドナーから末梢血を４０ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
得られた末梢血単核球を、ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）に懸濁した。
２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、１×１０６／１ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ−２を７００Ｕ／ｍＬ、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標、ノバルティスファーマ）を１０μＭ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養を開始した。
培養を開始してから０、５、７、９、１１日後にＩＬ−２を濃度が７００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。更に、細胞の増殖に応じて培養液ＡＩＭ−Ｖを添加し、１４日間培養を行った。
【実施例２】
【００５７】
＜ゲムシタビン処理による膵癌細胞株表面のＭＩＣＡ発現変化＞
膵癌細胞株であるＫＰ−１Ｎ、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）から購入）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ）に懸濁した。【００５８】
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、２×１０５／４ｍＬの膵癌細胞株を播種した。【００５９】
一晩、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養し細胞を接着させた。【００６０】
培地を破棄し、ゲムシタビン（ジェムザール、日本イーライリリー）の濃度が０．００１μＭ、０．１μＭ、１０μＭとなるように調製したＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ）または、コントロールとしてゲムシタビン無添加の培地を添加した。【００６１】
４８時間培養後、０．５ｍＭのＥＤＴＡにより細胞をウェルからはがし、細胞を回収しＭＩＣＡの発現をＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ−ＭＣＬ  ＡＤＣ、ベックマン・コールター、以下ＦＣＭという）を用いて測定した。【００６２】
この結果、表１に示すように、０．１μＭ以上の濃度でゲムシタビン処理した膵癌細胞株は、無処理と比較しＭＩＣＡの発現が高くなることが明らかとなった。【００６３】
【表１】
2008129874.tif 000002
【実施例３】
【００６４】
＜ゲムシタビン処理による膵癌細胞株表面のＦａｓ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ発現変化＞
膵癌細胞株（ＫＰ−１Ｎ、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ）に懸濁した。【００６５】
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、２×１０５／４ｍＬの膵癌細胞株を播種した。【００６６】
一晩、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養し細胞を接着させた。【００６７】
培地を破棄し、ゲムシタビンの濃度が０．１μＭとなるように調製したＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ）または、コントロールとしてゲムシタビン無添加の培地を添加した。【００６８】
４８時間培養後、０．５ｍＭのＥＤＴＡにより細胞をウェルからはがし、細胞を回収しＦａｓ、ＴＲＡＩＬ−Ｒの発現をＦＣＭを用いて測定した。【００６９】
この結果、表２ａ及びｂに示すように、０．１μＭの濃度でゲムシタビン処理した膵癌細胞株は、無処理と比較しＦａｓ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現が高くなることが明らかとなった。また、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２では、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１の発現も高くなることが明らかとなった。【００７０】
【表２】
2008129874.tif 000003
【実施例４】
【００７１】
＜γδＴ細胞によるゲムシタビン処理した膵癌細胞株への傷害活性＞
膵癌細胞株（ＫＰ−１Ｎ、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ）に懸濁した。【００７２】
組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に、膵癌細胞株を播種した。【００７３】
一晩、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養し細胞を接着させた。【００７４】
培地を破棄し、ゲムシタビンの濃度が０．１μＭとなるように調製したＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ）または、コントロールとしてゲムシタビン無添加の培地を添加した。【００７５】
４８時間培養後、０．５ｍＭのＥＤＴＡにより細胞をウェルからはがし、細胞を回収し、膵癌細胞株とγδＴ細胞を区別するために、膵癌細胞株をＰＫＨ−２６（ＰＫＨ２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ、ＳＩＧＭＡ）で染色した。【００７６】
ゲムシタビンを処理していない膵癌細胞株ではＥ／Ｔ比が０：１（膵癌細胞株のみの対照群）、１０：１（γδＴ細胞単独での傷害活性）となるように２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。【００７７】
ゲムシタビンを処理した膵癌細胞株ではＥ／Ｔ比が０：１（ゲムシタビン処理単独での傷害活性）、１０：１（ゲムシタビンとγδＴ細胞併用での傷害活性）となるように２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。【００７８】
３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で４時間共培養を行った。【００７９】
次に、共培養した細胞を回収し、アポトーシスの初期段階を同定するＡｎｎｅｘｉｎＶとアポトーシス後期およびネクローシスを同定する７−ＡＡＤ（ＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖ−ＦＩＴＣ／７−ＡＡＤ  ＫＩＴ、ベックマン・コールター）により染色し、膵癌細胞株に対する細胞傷害活性をＦＣＭにより測定した。
なお、細胞傷害活性の値は下記の数式１により算出した。【００８０】
【数１】
2008129874.tif 000004
【００８１】
Ａｎｎ＋細胞数はＡｎｎｅｘｉｎＶの蛍光を発色していた細胞数を示す。Ａｎｎ＋である細胞はアポトーシスを起こしていることを示している。【００８２】
この結果、図１に示すように、ゲムシタビン処理後にγδＴ細胞を併用した場合の傷害活性は、それぞれ単独の場合と比較し相乗効果が期待できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
以上説明したように、本発明の腫瘍細胞の標的化方法は腫瘍細胞をγδＴ細胞の標的化することにより、腫瘍細胞を効率よく傷害することができる。したがって、本発明はがん治療のための薬剤等の医薬製剤分野や、免疫細胞療法等の医療分野等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、膵臓がん由来細胞株をゲムシタビン単独（ＧＥＭ）、γδＴ細胞単独（γδＴ−ＬＡＫ）、ゲムシタビンで腫瘍細胞を標的化した後γδＴ細胞を添加した場合（ＧＥＭ＋γδＴ−ＬＡＫ）の、それぞれの細胞傷害活性を示したものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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