(57)【要約】異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換体を用いた現状の微生物変換においてみられる変換効率の低さを改善する手段の提供を目的とする。多剤排出蛋白質をコードする遺伝子を欠損した微生物を宿主として用い、これに異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換体を作製し、これを微生物変換に使用することにより、疎水性または両親媒性の基質化合物を非常に効率よくその目的化合物に変換することができる。大腸菌を宿主とする場合、欠損させる多剤排出蛋白質をコードする遺伝子としては、tolC、acrA、acrB等が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多剤排出蛋白質をコードする遺伝子のうち、いずれかの遺伝子を欠損した宿主となる微生物に、異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換体。
【請求項２】
多剤排出蛋白質をコードする遺伝子が欠損した宿主となる微生物が、大腸菌である請求項１記載の形質転換体。
【請求項３】
多剤排出蛋白質をコードする遺伝子が、tolC、acrAおよびacrBからなる群より選択されるいずれかの遺伝子である請求項１または２記載の形質転換体。
【請求項４】
異種生物由来の遺伝子が酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素および合成酵素からなる群より選択されるいずれかの酵素をコードする遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項５】
異種生物由来の遺伝子がチトクロームP-450酵素もしくはアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項６】
異種生物由来の遺伝子がチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の形質転換体を用いた微生物変換方法。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれかに記載の形質転換体を用いた微生物変換方法であって、基質化合物に一原子酸素添加することを特徴とする方法。
【請求項９】
基質化合物がビタミンＤ3、4-コレステン-3-オンおよびコンパクチンからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００７年３月１日出願の日本特願２００７−５０９３５号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、多剤排出蛋白質を欠損した宿主に異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換株およびそれらを用いた基質化合物の微生物変換方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般に化合物を製造する手段としては、化学合成法と酵素合成法が挙げられる。多くの医薬品原料となり得る化合物を製造するためには、原料化合物の位置特異的もしくは立体特異的な修飾を効率的に行うことが不可欠である。これらの反応については酵素合成法が優れていることが知られている。【０００４】
しかしながら、酵素を実用的な触媒として工業レベルで使うには、酵素の持つ本質的な限界を考慮しなければならない。それは酵素寿命が短い点と触媒作用に補酵素を必要とする点である。これまでに酵素を用いた製造プロセス設計では、如何に酵素寿命を引き伸ばして酵素活性を持続させるかに多くの注意が払われてきた。また、酵素合成法に用いられる多くの酵素は、その触媒作用に補酵素を必要としており、例えば酸化還元の酵素反応ではNADHなどのピリジンヌクレオチドを必要とする。これら補酵素は一般に高価であるため、工業レベルで酵素反応を行う場合は補酵素の添加が経済的に大きな問題となる。【０００５】
これら酵素反応の限界を克服するための解決策として、微生物、特に大腸菌の細胞を酵素反応の場として用いる戦略が立てられている。つまり、大腸菌を酵素の遺伝子で形質転換することで、細胞内で目的の酵素を多量に発現させることができる。このことは連続的に酵素を細胞内で生産することを意味し、細胞が生きている限り酵素活性を維持することができる。さらに、細胞内の様々な代謝反応によって、酵素反応に必要な補酵素が再生されることが可能である。【０００６】
このような大腸菌の形質転換体を培地中で培養し、培養物に基質化合物を接触させ、修飾された該化合物を得る「微生物変換」によって様々な医薬品原料となり得る化学物質を生産することが試みられている。特に、チトクロームP-450遺伝子によって形質転換した大腸菌を用いた、疎水性または両親媒性の化合物の微生物変換による酸化反応は、医薬品製造において重要である。【０００７】
チトクロームP-450遺伝子がコードするチトクロームP-450酵素（以下、単にP-450酵素ともいう）は、還元型で一酸化炭素を結合して450nm付近にソーレー吸収帯(soret band)を示す一群のプロトヘム含有蛋白質の総称である。P-450酵素は多くの動植物組織、カビ、酵母のミクロソーム、一部の動物組織のミトコンドリアの内膜に結合しているほか、ある種の細菌、カビでは可溶性の形で存在している。【０００８】
P-450酵素は様々な基質特異性を有する。多種多様な有機化合物を基質とし得る異常に広い基質特異性を示す酵素がある一方で、比較的限られた種類の有機化合物としか反応しない基質特異性のかなり厳密な酵素も存在する。また反応部位に対する立体特異性(stereo-specificity)や位置特異性(regio-specificity)にも優れた選択性を示す場合がある。そして、P-450酵素の具体的な機能としては、一原子酸素添加反応を触媒することによって、該P-450酵素を発現する細胞内において、生体内異物(xenobiotic)の水酸化、エポキシ化、脱アルキル化、脱窒などの様々な反応に関与することが知られている。【０００９】
特に微生物由来のP-450酵素の一部は、実際に有用化合物の工業生産に利用されている。代表的な例の一つが、放線菌ストレプトミセス・カルボフィラス(Storeptomyces carbophilus)のP-450酵素であり、基質であるコンパクチン(compactin)の6β位を水酸化し、生成物として高脂血症の治療薬であるプラバスタチンを生成する（非特許文献１参照）。さらに、放線菌シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のP-450酵素を利用してビタミンＤ3の1α位と25位を水酸化して活性型ビタミンＤ3を生産する方法も実用化されている。これら微生物由来のP-450酵素は、それに電子を供給する電子伝達系（フェレドキシンとフェレドキシン還元酵素）と共役して初めてその一原子酸素添加反応を触媒することができる。【００１０】
このような微生物由来のチトクロームP-450酵素を用いた化合物の微生物変換は、その酵素を発現している微生物の培養液または菌体を用いて行われてきた。微生物由来のP-450酵素をコードする遺伝子を宿主として適した放線菌ストレプトミセス・リビダンス(Storeptomyces lividans)に導入してその酵素活性を発現させた培養液も用いられている。しかしながら、このような遺伝子をもつ放線菌による基質化合物の微生物変換は、放線菌特有の性質として、培養および基質化合物の目的生成物への変換にかなりの時間を要する。また、酵素によっては効果的に酵素発現量を増やすための発現誘導条件の検討が必要である。さらに、基質化合物や目的生成物を代謝あるいは分解する反応系が変換に用いる放線菌に存在する場合があり、このことが副産物の生成や基質化合物および目的生成物の減少などを引き起こし、目的生成物の生産性を低下させる一因となっている。【００１１】
これらの理由から、培養に要する時間が比較的短く、しかも基質化合物および目的生成物を代謝あるいは分解する反応系が少ないとみなせる大腸菌を宿主とした、微生物由来のチトクロームP-450遺伝子を機能的に発現できる系の構築が望まれていた。このような系として、P450camの電子伝達系をコードするcamAB遺伝子を共発現し、多様な放線菌のチトクロームP-450遺伝子を機能的に発現させる系が提案されている（特許文献１参照）。しかし、この系による微生物変換活性は非常に低く、工業生産に利用するには不十分なものであった。つまり、微生物由来のチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子を発現する大腸菌を用いた微生物変換により実際に工業生産を行うためには、さらなる活性向上が必要であった。【００１２】
そのための手法として、基質を細胞内に積極的に取り込む方法も検討されている。例えば、フラボバクテリウム・ルテセンス(Flavobacterium lutescens) IFO3084株由来のL-リジン  6-アミノトランスフェラーゼをコードするlat遺伝子を発現させた大腸菌は、L-リジンをL-ピペコリン酸に変換する能力を持つ（非特許文献２参照）が、その形質転換体を用いた微生物変換反応において、基質のL-リジンを細胞内に積極的に取り込むために、L-リジン特異的透過酵素をコードするlysP遺伝子を増幅させることにより、この微生物変換活性を向上させることが知られている（非特許文献３参照）。【００１３】
このように微生物変換においては、基質分子の細胞内への膜輸送が重要な事項であることが示唆されていたが、医薬品製造のための微生物変換においてしばしば基質化合物となる疎水性や両親媒性の化合物については、これを細胞内に積極的に膜輸送する機構は大腸菌には存在しない。また、大腸菌の薬剤排出蛋白質を破壊した株においては、与えられた化合物（哺乳類のステロイドホルモン）の細胞内存在量が上昇するという報告がなされていた（非特許文献４参照）。これは、受動的に細胞内に入り込んだ化合物が細胞外に排出されにくくなることにより、細胞内の存在量が上昇したことを示唆している。【００１４】
一方、薬剤排出蛋白質をコードするacrA、acrBまたはtolC遺伝子の少なくとも１つの遺伝子で形質転換された大腸菌は有機溶媒に対する耐性が付与され、この大腸菌を用いた二層系による微生物変換を高効率で実施することができるという主旨の特許出願も公開されている（特許文献２）。これらのことから、宿主微生物の多剤耐性蛋白質を破壊することが微生物変換にどのような影響を与えるか推測することは難しいと言える。【００１５】
［特許文献１］国際公開第2003/087381号パンフレット、その英文ファミリーUS 2006234337 A1
［特許文献２］日本出願公開平成11-221080（221080/1999A1）号公報
［非特許文献１］Cloning, characterization and expression of the gene encoding cytochrome P-450sca-2 from Streptomyces carbophilus involved in production of pravastatin, a specific HMG-CoA reductase inhibitor.Gene. 1995 Sep 22;163(1):81-85.
［非特許文献２］Biotransformation of L-lysine to L-pipecolic acid catalyzed by L-lysine 6-aminotransferase and pyrroline-5-carboxylate reductase. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 Mar;66(3):622-627.
［非特許文献３］Increase in the rate of L-pipecolic acid production using lat-expressing Escherichia coli by lysP and yeiE amplification. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 Sep;66(9):1981-1984.
［非特許文献４］Mammalian steroid hormones are substrates for the major RND- and MFS-type tripartite multidrug efflux pumps of Escherichia coli. J Bacteriol. 2006 Feb;188(3):1191-1195.
［非特許文献５］Entry into and release of solvents by Escherichia coli in an organic-aqueous two-liquid-phase system and substrate specificity of the AcrAB-TolC solvent-extruding pump. J Bacteriol. 2000 Sep;182(17):4803-10.
［非特許文献６］Production of alpha, omega-alkanediols using Escherichia coli expressing a cytochrome P450 from Acinetobacter sp. OC4. Biosci Biotechnol Biochem. 2006 Jun;70(6):1379-1385.
上記特許文献１および２、非特許文献１〜６の全記載は、ここに特に開示として援用される。【００１６】
本発明の課題は、異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換体を用いた現状の微生物変換においてみられる変換効率の低さを改善する手段を提供することである。
【発明の開示】
【００１７】
本発明者らは上記課題を解決するため、いくつかある多剤排出蛋白質をコードする遺伝子のうちのいずれかの遺伝子を欠損した微生物を宿主として用い、これに異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換体を作製した。そしてこの形質転換体が、疎水性または両親媒性の基質化合物を非常に効率よくその目的化合物に変換するすること見出し、本発明を完成した。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［９］に関する。
［１］多剤排出蛋白質をコードする遺伝子のうち、いずれかの遺伝子を欠損した宿主となる微生物に、異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換体。
［２］多剤排出蛋白質をコードする遺伝子が欠損した宿主となる微生物が、大腸菌である［１］記載の形質転換体。
［３］多剤排出蛋白質をコードする遺伝子が、tolC、acrAおよびacrBからなる群より選択されるいずれかの遺伝子である［１］または［２］記載の形質転換体。
［４］異種生物由来の遺伝子が酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素および合成酵素からなる群より選択されるいずれかの酵素をコードする遺伝子である［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換体。
［５］異種生物由来の遺伝子がチトクロームP-450酵素もしくはアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子である［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換体。
［６］異種生物由来の遺伝子がチトクロームP-450酵素をコードする遺伝子である［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換体。
［７］［４］〜［６］のいずれかに記載の形質転換体を用いた微生物変換方法。
［８］［４］〜［６］のいずれかに記載の形質転換体を用いた微生物変換方法であって、基質化合物に一原子酸素添加することを特徴とする方法。
［９］基質化合物がビタミンＤ3、4-コレステン-3-オンおよびコンパクチンからなる群より選択される、［８］記載の方法。
【００１９】
以下に本願明細書において記載する用語、記号等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本願明細書において用いる「多剤排出蛋白質」とは、グラム陰性細菌が有し、主として疎水性、両親媒性の化合物を菌体内から菌体外へ排出する薬剤耐性機構を構成する蛋白質全てを包含する。限定されるものではないが、大腸菌ではTolC、AcrA、AcrB、EmrA、EmrBなどが、緑膿菌ではOprM、MexA、MexBなどがこれに該当する。
【００２１】
本願明細書において用いる「異種生物由来の遺伝子」とは、宿主となる微生物以外の生物から単離または増幅可能な遺伝子全てを包含する。限定されるものではないが、生物の染色体DNAやプラスミドDNAから単離または増幅される遺伝子、mRNAから増幅される遺伝子などがこれに該当する。
【００２２】
本願明細書において用いる「形質転換体」とは、遺伝子組換え技術を用いて特定の微生物に別の生物由来の遺伝子を発現可能な形態で導入した微生物を意味し、それに用いる遺伝子導入の手法は、プラスミド等のベクターを用いた遺伝子組換えだけでなく、相同組換え等の手法も包含する。
【００２３】
本願明細書において用いる「微生物変換方法」とは、形質転換体を培地中で培養し、培養物に基質化合物を接触させ、該化合物を修飾して目的化合物に変換し、それを取得する方法を意味する。
【００２４】
本発明にいう「基質化合物」とは、各種微生物変換反応によって修飾されることが可能な疎水性または両親媒性の化合物を意味する。例えば、異種生物由来の遺伝子がP450遺伝子の場合は、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン等のアルカン化合物、トルエン、フェノール、クメン等の芳香族化合物、コレステロール、テストステロン、4-コレステン-3-オン（4-cholesten-3-one）、デヒドロエピアンドロステロン、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3等のステロイド類、ロイシルロイシン、ロイシルバリン、ポリロイシン、ポリバリンなどの直鎖ペプチド類、プロリルフェニルアラニン、ロイシルアラニン等のジペプチドが環化縮合したジケトピペラジン類、シクロスポリン、エキノマイシン等の生理活性を有する環状ペプチド類、ピネン、カンフェン、リモネン、ゲラニオール等のモノテルペン類、アンブロサン、カリオフィラン、ドリマン等のセスキテルペン類、アビエチン酸、ジベレリン酸等のジテルペン類、ダンマラン、ホパン、ラノスタンなどのトリテルペン類、コンパクチン等のスタチン類、タイロシン、FK-506、エリスロマイシン等のマクロライド類、その他各種薬物、あるいはそれらの前駆体、代謝物、誘導体等が挙げられる。
【００２５】
本願明細書において用いる「遺伝子の類縁体」とは、元の遺伝子と実質的に同等の機能を有し、
(1) 元の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(2) 元の遺伝子の塩基配列との相同性が70％以上である塩基配列を有するポリヌクレオチド、
(3) 元の遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、または
(4) 遺伝暗号の縮重のため、元の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、(1)項から(3)項までのいずれかの項で定義されたポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と同じ配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００２６】
また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、元の遺伝子をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0Mの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２７】
本発明により、多剤排出蛋白質をコードする遺伝子を欠損した微生物を宿主とした異種生物由来の遺伝子を組み込んだ形質転換体を作製することができ、その形質転換体を用いて各種の基質化合物を効率よく目的化合物に変換することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
多剤排出蛋白質をコードする遺伝子を欠損した宿主
本発明においては、まず宿主となる微生物が本来もっている多剤排出蛋白質の機能が失われた宿主を作製する。この宿主は、多剤排出蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠落しているか、その遺伝子の内部に他のDNAが挿入されて分断されているか、あるいはその遺伝子に少なくとも一つ以上の変異が入ることによって、その遺伝子にコードされる多剤排出蛋白質の機能の一部または全てが失われている（破壊されている、ということもある）ものである。このような遺伝子の機能が破壊された微生物は、限定されるものではないが、公知のP1トランスダクション法やDNAの相同組み換え法を用いて得ることができる。宿主となる微生物は、培養可能かつプラスミドやファージDNAなどのベクターと挿入遺伝子の増幅に用いることのできる微生物であれば特に限定されず、例えば、大腸菌、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物が挙げられるが、好ましい例として大腸菌を挙げることができる。【００２９】
また、多剤排出蛋白質をコードする遺伝子としては、限定されるものではないが、例えば、大腸菌由来のものとして、配列番号２２の塩基1から塩基1488までの連続した塩基配列で示される大腸菌K-12株由来の多剤排出蛋白質TolCをコードする遺伝子tolC、配列番号２３の塩基329から塩基1522までの連続した塩基配列で示される大腸菌K-12株由来の多剤排出蛋白質AcrAをコードする遺伝子acrA、配列番号２３の塩基1545から塩基4694までの連続した塩基配列で示される大腸菌K-12株由来の多剤排出蛋白質AcrBをコードする遺伝子acrBまたはそれらの類縁体を挙げることができる。【００３０】
このようにして得られた宿主微生物は、多剤排出蛋白質の機能の一部または全部が欠損しているので、微生物変換において基質化合物が微生物内に留まり易いと考えられ、その結果、変換反応の効率が上がり、目的生成物の生産効率も高まる。【００３１】
形質転換体の作製
次に得られた宿主に、異種生物由来の遺伝子またはその類縁体（以下、単に異種遺伝子等ともいう）を組み込み、微生物変換に適した形質転換体を作製する。異種遺伝子等を宿主に組み込む方法は、特に制限はなく、例えば、その異種遺伝子等を適当なベクター中に挿入してプロトプラスト法、エレクトロポレーション法により宿主に組み込むことができる。用いることのできるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよいが、発現ベクターが好ましい。発現ベクターにおいて異種遺伝子等は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。【００３２】
異種生物由来の遺伝子
宿主に組み込まれる異種遺伝子等は、基質化合物を目的化合物に変換する反応に関与するものであれば特に制限はないが、直接に変換反応を触媒する各種酵素をコードする遺伝子が好ましく、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素または合成酵素等を挙げることができる。酸化還元酵素としては、酸化還元反応を触媒する酵素であれば特に限定されるものではないが、チトクロームP-450酵素やアルデヒド還元酵素などを挙げることができる。特に好ましいものとして、チトクロームP-450酵素、中でもCYP105ファミリーおよびCYP107ファミリーに分類されるチトクロームP-450を挙げることができる。転移酵素としては、原子団（官能基など）をある分子から別の分子へ転移する酵素であれば特に限定されるものではないが、アミノトランスフェラーゼ（基質化合物のα-アミノ基を2-オキソグルタル酸に渡し、基質化合物自身は2-オキソ酸となる反応を触媒する）や糖転移酵素などを挙げることができる。【００３３】
また加水分解酵素としては、加水分解反応を触媒する酵素であれば特に限定されるものではないが、リパーゼやアミラーゼなどを挙げることができる。脱離酵素としては、原子団の結合の解離を触媒する酵素であれば特に限定されるものではないが、炭酸ヒドラターゼなどを挙げることができる。異性化酵素としては、ある異性体を基質特異的に異性化する反応を触媒する酵素であれば特に限定されるものではないが、グルコースイソメラーゼなどを挙げることができる。合成酵素とは、ATPの加水分解エネルギーを利用して、2つの分子を結合させる酵素であれば特に限定されるものではないが、DNAリガーゼなどを挙げることができる。【００３４】
形質転換体の培養
こうして作製された形質転換体は、必要により誘導物質を添加する等して、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適当な栄養培地中で培養する。このような栄養培地は、適当な炭素源、窒素源、無機塩および天然有機栄養物等より成り、炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、ソルビトール、有機酸類等を、窒素源としてはアンモニア、尿素、硫安、硝安、酢安等の化合物をそれぞれ一種または二種以上使用することができる。また無機塩としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などの塩類を使用することができる。さらに使用菌の生育促進効果を持つ天然有機栄養物としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などを用いることができ、さらにビタミン類、核酸類を少量含有させることもできる。【００３５】
形質転換体を用いた微生物変換
次いでこれらの遺伝子が発現した菌体を基質化合物と接触させ、変換反応をさせる。変換反応の温度は、形質転換体の至適温度を考慮して、適宜決定できる。また反応時間も、目的化合物への変換率（反応の進行度合い）等を考慮して適宜決定することができる。宿主が大腸菌の場合、例えば、20〜37℃で、1〜5日が好適である。さらに、反応様式は、バッチ式でも連続式でも、いずれの形式でも実施することができる。【００３６】
生成した目的生成物の単離および精製は、一般に微生物代謝産物をその培養液から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用できる。例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、トルエン等を用いた有機溶媒抽出、ダイヤイオンHP-20などの疎水性吸着樹脂を用いた吸脱着処理、セファデックスLH-20等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィー、もしくは薄層クロマトグラフィーによる吸脱着処理、あるいは逆相カラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知のあらゆる方法がこれにあたる。また、ここに示した方法に特に限定されるものではない。これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、目的化合物を単離精製することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント（％）は、培地の説明においては重量パーセント、HPLCの移動相の説明においては、容量パーセントを示す。【００３８】
実施例１：大腸菌tolC破壊株の構築
E.coli Genetic Stock Center（Yale大学）から入手した大腸菌CAG12184 (tolC::Tn10)株からP1トランスダクション法により、tolC::Tn10をBL21star(DE3)株に移した。すなわち、大腸菌CAG12184株を塩化カルシウム2.5mMを含むL-培地（1％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.5％塩化ナトリウム、ｐH7.2）で培養し、この培養液0.2mLにP1ファージを添加して37℃で10分間培養した。この反応液を45℃で温めておいた軟寒天（1％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.5％塩化ナトリウ、0.3％寒天、塩化カルシウム2.5mM、ｐH7.2）に添加し、塩化カルシウム2.5mMを含むL-寒天培地（1％ポリペプトン、0.5％酵母エキス、0.5％塩化ナトリウム、1.8％寒天、ｐH7.2）に蒔いた。これを37℃で18時間培養後、L-培地3mLを加え、軟寒天を砕き、上清を回収してtolC-ファージ液とした。次に、大腸菌BL21star(DE3)株（インビトロジェン社）を塩化カルシウム2.5mMを含むL-培地で培養し、この培養液0.1mLにtolC-ファージ液を添加して37℃で10分間培養した。その後菌体を遠心して回収し、これにL-培地1mLを加え、37℃で1時間培養後、テトラサイクリン10μg/mLを含むL-寒天培地に蒔いた。37℃で18時間培養して出現したコロニーをBLstarTolC株とした。BLstarTolC株は、TolC機能が欠損したtolC破壊株である。【００３９】
実施例２：大腸菌acrAB破壊株の構築
同様に非特許文献５に記載されている大腸菌JA300A(acrAB::cat)を有する大腸菌JA300A株からP1トランスダクション法により、acrAB::catをBL21star(DE3)株に移し、クロラムフェニコール5μg/mLを含むL-寒天培地で選択した株をBLstarAcrAB株とした。また、BLstarTolC株にもacrAB::catを移し、この株をBLstarTolCAcrAB株とした。BLstarAcrAB株は、AcrA機能およびAcrB機能が欠損したacrAB破壊株である。BLstarTolCAcrAB株は、さらにTolC機能も欠損したTolC、acrAB破壊株である。【００４０】
実施例３：各種プラスミドの構築
（１）pETAciBC-SD vector
以下、全てのPCR反応はKOD#PLUS-DNA polymerase（東洋紡社）を用いて行った。プラスミドpDolABC（非特許文献６参照）を制限酵素NcoIおよびBamHIで処理し、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.) OC4株由来のフェレドキシンをコードする遺伝子aciB（配列番号３の塩基1から塩基321参照）を含むDNA断片を得た。この断片を大腸菌プラスミドベクター pETduet-1（Novagen社）のNcoIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドAとした。さらに、pDolABCを鋳型とし、プライマーA（配列番号６参照）とプライマーB（配列番号７参照）を用いてPCRを行い、アシネトバクター・エスピー OC4株由来のフェレドキシン還元酵素をコードする遺伝子aciC（配列番号３の塩基1978から塩基3192参照）を含むDNA断片を増幅し、制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理した。この断片をプラスミドAのBamHIおよびHindIII部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドBとした。次に、プラスミドBの二つのT7 プロモーターのうち後ろ側の一つを取り除く為に、プラスミドBを制限酵素EcoRVおよびNotIで処理し、BKL Kit（宝酒造社）を用いて平滑化後、T4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをプラスミドCとした。一方、シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーC（配列番号８参照）とプライマーD（配列番号９参照）を用いてPCRを行い、スペーサーDNA配列となるDNA断片を増幅し、制限酵素BglIIおよびBamHIで処理した。この断片をプラスミドCのBglIIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-SD vectorとした。【００４１】
（２）プラスミドpETAciBC-50AABP195
アシネトバクター・エスピー OC4株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーE（配列番号１０参照）とプライマーF（配列番号１１参照）を用いてPCRを行い、アシネトバクター・エスピー OC4株由来のアルカン酸化性P-450酵素AciAのN末端部分をコードするDNA断片（配列番号３の塩基398から塩基541までのDNA断片）を増幅し、制限酵素NdeIおよびSpeIで処理した。一方、ダクチロスポランギウム・バリエスポラム(Dactylosporangium variesporum) IFO14104株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーBP195F（配列番号１２参照）とプライマーBP195R（配列番号１３参照）を用いてPCRを行い、P-450酵素をコードするBP195遺伝子（配列番号２の塩基1から塩基1203参照）を増幅し、制限酵素SpeIおよびBamHIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-SD vectorのNdeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-50AABP195とした。【００４２】
（３）プラスミドpETAciBC-50AAvdh
シュードノカルディア・オートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーvdhF（配列番号１４参照）とプライマーvdhR（配列番号１５参照）を用いてPCRを行い、P-450酵素をコードするvdh遺伝子（配列番号１の塩基320から塩基1531参照）を増幅し、制限酵素SpeIおよびBglIIで処理した。これらのDNA断片をpETAciBC-50AABP195のSpeIおよびBamHI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETAciBC-50AAvdhとした。【００４３】
（４）プラスミドpETduet-boxA
プラスミドpETAciBC-SD vectorを制限酵素BamHIおよびHindIIIで処理し、フェレドキシン還元酵素に相同性を有する蛋白をコードする遺伝子aciCを含むDNA断片をT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETduetaciCとした。次に、プライマーboxBNcoF（配列番号１６参照）、boxBBamR（配列番号１７参照）とストレプトマイセス・エスピー  (Streptomyces sp.) TM-7株のゲノムDNAとを用いて、コンパクチン酸化性P-450酵素に付随するフェレドキシンをコードするboxB遺伝子（配列番号４の塩基1782から塩基1973参照）を含むDNA断片を増幅し、制限酵素NcoIおよびBamHIで処理した。このDNA断片を、制限酵素NcoIおよびBamHIで処理したpETduetaciCとT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETduetboxBとした。さらに、プライマーboxANdeF（配列番号１８参照）、boxAXhoR（配列番号１９参照）とストレプトマイセス・エスピー TM-7株のゲノムDNAとを用いて、コンパクチン酸化性P-450酵素をコードするboxA遺伝子（配列番号４の塩基544から塩基1761参照）を含むDNA断片を増幅し、制限酵素NdeIおよびXhoIで処理した。このDNA断片を、制限酵素NdeIおよびXhoIで処理したpETduetboxBとT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpETduet-boxAとした。【００４４】
（５）プラスミドpTrcRat
バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)895-3株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーExratF（配列番号２０参照）とプライマーExratR（配列番号２１参照）を用いてPCRを行い、(R)-α-メチルトリプタミンアミノトランスフェラーゼをコードするratA遺伝子（配列番号５の塩基230から塩基1330参照）を増幅し、制限酵素PstIおよびEcoRIで処理した。このDNA断片をpTrcHisA（インビトロジェン社）のPstIおよびEcoRI部位にT4 DNAリガーゼにより連結したプラスミドをpTrcRatとした。【００４５】
（６）プラスミドpHSG-ZAR
フラボバクテリウム・ルテセンス(Flavobacterium lutescens)IFO3084株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーlatSacF（配列番号２４参照）とプライマーlatXhoR（配列番号２５参照）を用いてPCRを行い、リジンアミノトランスフェラーゼをコードするlat遺伝子（配列番号３０参照）を増幅し、制限酵素SacIおよびXhoIで処理した。また、フラボバクテリウム・ルテセンス(Flavobacterium lutescens)IFO3084株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーZARXhoF（配列番号２６参照）とプライマーZARBamR（配列番号２７参照）を用いてPCRを行い、N-ベンジルオキシカルボニル-L-アミノアジピン酸-デルタ-セミアルデヒド還元酵素をコードするzar遺伝子（配列番号３１参照）を増幅し、制限酵素XhoIおよびBamHIで処理した。さらにバチルス・サチルス(Bacillus subtilis) str.168 ATCC23857株のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーrocGBamF（配列番号２８参照）とプライマーrocGXbaR（配列番号２９参照）を用いてPCRを行い、rocG遺伝子（配列番号３２参照）を増幅し、制限酵素SacIおよびXbaIで処理した。これら３つのDNA断片をpHSG298（タカラバイオ社）のSacIおよびXbaI部位にT4 DNAリガーゼにより連結し、lat、zar、rocGの順に組み込んだプラスミドpHSG-ZARを得た。【００４６】
実施例４：ビタミンＤ3から25-ヒドロキシビタミンＤ3への微生物変換
プラスミドpETAciBC-50AAvdhを用いて大腸菌BLstarTolCAcrAB株、BLstarTolC株、BLstarAcrAB株およびBL21star(DE3)を形質転換した株をそれぞれBlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AAvdh株、BLstarTolC/pETAciBC-50AAvdh株、BLstarAcrAB/pETAciBC-50AAvdh株およびBL21star/pETAciBC-50AAvdh株とした。同様に、プラスミドpETAciBC-50AABP195を用いて大腸菌BLstarTolCAcrAB株、BLstarTolC株、BLstarAcrAB株およびBL21star(DE3)株を形質転換した株をそれぞれBlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195株、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP195株、BLstarAcrAB/pETAciBC-50AABP195株およびBL21star/pETAciBC-50AABP195株とした。これらの株をカルベニシリンナトリウム(100μg/mL)を含むＭ9SEED液体培地（3.39％ Na2HPO4、1.5％ KH2PO4、0.25％塩化カルシウム、0.5％塩化アンムニウム、1％ カザミノ酸、0.002％ チミン、0.1mM塩化カルシウム、0.1mM硫酸鉄、0.4％ グルコース、0.001mM 塩化マグネシウム）に接種し、25℃で24時間220rpmで振とう培養した。この培養液200μLをカルベニシリンナトリウム(100μg/mL)とOvernight Express Autoinduction Systems（Novagen社）を含むＭ9Main液体培地（3.39％ Na2HPO4、1.5％ KH2PO4、0.25％ 塩化ナトリウム、0.5％ 塩化アンムニウム、1％ カザミノ酸、0.002％ チミン、0.1mM 塩化カルシウム、0.1mM 硫酸鉄、80μg/mL 5-アミノレブリン酸）25mLに添加した後、25℃で24時間220rpmで振とう培養した。遠心により菌体を回収し、5mLのCV2緩衝液（50mM リン酸カリウム緩衝液、2％グリセリン、50μg/mLカルベニシリン、0.1M IPTG）に懸濁し、培養液に対して5倍濃縮した菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液1mLに1％ ビタミンＤ3DMSO溶液を25μL（終濃度250μg/mL）および部分メチル化シクロデキストリン（終濃度0.75％）を添加し、28℃で24時間220rpmで振とう培養した。その後、この反応液にメタノール2mLを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で15,000rpmで10分間遠心することにより得られた上清をHPLCで分析し、基質のビタミンＤ3が水酸化されることにより生成した25-ヒドロキシビタミンＤ3を検出した。この結果を表１に示した。【００４７】
【表１】
2008105513.tif 000002
【００４８】
なお、HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：J' sphere ODS-H80 (YMC, Inc.), 75mm x 4.6mmI.D.
移動相：A; アセトニトリル
B; イオン交換水
グラジエント時間設定：0分 移動相A/B =30:70
13.00分 移動相A/B =30:70
14.00分 移動相A/B =100:0
21.00分 移動相A/B =100:0
22.00分 移動相A/B =70:30
25.00分 移動相A/B =70:30【００４９】
流速：1.0mL/分
検出：UV  265nm
インジェクション容量：10μL
カラム温度：40℃
分析時間：25分
保持時間：25-ヒドロキシビタミンＤ3       8.8分
ビタミンＤ3                   21.0分【００５０】
P-450酵素であるVdhをコードするvdh遺伝子と電子伝達系をコードする遺伝子aciABを発現させた大腸菌を用いたビタミンＤ3の微生物変換反応において、発現ホストとして従来法である野生型大腸菌を用いた場合と比較し、acrAB破壊株を用いた場合で2.9倍、tolC破壊株を用いた場合で4.0倍、tolCacrAB破壊株を用いた場合で4.6倍の25-ヒドロキシビタミンＤ3が蓄積した。【００５１】
また、P-450酵素であるBP195をコードする遺伝子と電子伝達系をコードする遺伝子aciABを発現させた大腸菌を用いたビタミンＤ3の微生物変換反応においても、発現ホストとして従来法である野生型大腸菌を用いた場合と比較し、acrAB破壊株を用いた場合で1.8倍、tolC破壊株を用いた場合で2.3倍、tolCacrAB破壊株を用いた場合で3.0倍の25-ヒドロキシビタミンＤ3が蓄積した。【００５２】
実施例５：4-コレステン-3-オン(4-cholesten-3-one)から25-ヒドロキシ4-コレステン-3-オン(4-cholesten-3-one)への微生物変換
前述の大腸菌BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195株、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP195株、BLstarAcrAB/pETAciBC-50AABP195株およびBL21star/pETAciBC-50AABP195株を用い、実施例４と同様に菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液1mLに1％ 4-cholesten-3-one メタノール溶液を25μL（終濃度250μg/mL）および部分メチル化シクロデキストリン（終濃度0.75％）を添加し、28℃で24時間220rpmで振とう培養した。その後、この反応液にメタノール2mLを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で15,000rpmで10分間遠心することにより得られた上清をHPLCで分析し、基質の4-cholesten-3-oneが水酸化されることにより生成した25-hydroxy-4-cholesten-3-oneを検出した。この結果を表２に示した。【００５３】
【表２】
2008105513.tif 000003
【００５４】
なお、HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：Inertsil ODS/3 50mm x 4.6mmI.D.
移動相：A; アセトニトリル
B; 0.85％ リン酸水溶液
グラジエント時間設定：0分 移動相A/B =40:60
5.00分 移動相A/B =100:0
8.00分 移動相A/B =100:0
8.30分 移動相A/B =40:60
11.00分 移動相A/B =40:60【００５５】
流速：1.2mL/分
検出：UV  235nm
インジェクション容量：40μL
カラム温度：40℃
分析時間：11分
保持時間：25-hydroxy-4-cholesten-3-one       4.97分
4-cholesten-3-one                  7.45分【００５６】
4-コレステン-3-オン(4-cholesten-3-one)の微生物変換反応においても、発現ホストとして従来法である野生型大腸菌を用いた場合と比較し、acrAB破壊株を用いた場合で1.4倍、tolC破壊株を用いた場合で10.5倍、tolCacrAB破壊株を用いた場合で11.0倍の25-ヒドロキシ4-コレステン-3-オンが蓄積した。【００５７】
実施例６：コンパクチンからプラバスタチンへの微生物変換
前述のプラスミドpETduet-boxAを用いて大腸菌BLstarTolCAcrAB株およびBL21star(DE3)を形質転換した株をそれぞれBlstarTolCAcrAB/pETduet-boxA株およびBL21star/pETduet-boxA株とした。これらの菌株を用い、実施例４と同様に菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液1mLに25mg/mL コンパクチンを30μL（終濃度750μg/mL）を添加し、28℃で8時間220rpmで振とう培養した。さらに25mg/mL コンパクチンを30μL追加添加し（終濃度1500μg/mL）、28℃で16時間220rpmで振とう培養した。その後、この反応液にメタノール1mLとアセトニトリル1mLとを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で15,000rpmで10分間遠心することにより得られた上清をHPLCで分析し、基質のコンパクチンが水酸化されることにより生成したプラバスタチンの生産を検出した。この結果を表３に示した。【００５８】
【表３】
2008105513.tif 000004
【００５９】
HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：Chromolith Performance RP-18e 100mm x 4.6mmI.D.
移動相：A; メタノール：トリエチルアミン：酢酸 = 100:0.1:0.1
B; 水：トリエチルアミン：酢酸 = 100:0.1:0.1
グラジエント時間設定：0分 移動相A/B =50:50
3.00分 移動相A/B =90:10
3.50分 移動相A/B =90:10
3.51分 移動相A/B =50:50
5.00分 移動相A/B =50:50【００６０】
流速：2.0mL/分
検出：UV  238nm
インジェクション容量：15μL
カラム温度：40℃
分析時間：6分
保持時間：プラバスタチン   1.77分
コンパクチン     3.23分【００６１】
P-450酵素であるBoxAをコードする遺伝子とその電子伝達系をコードする遺伝子boxBおよびaciCを発現させた大腸菌を用いたコンパクチンの微生物変換反応においても、発現ホストとして従来法である野生型大腸菌を用いた場合と比較し、tolCacrAB破壊株を用いた場合で33.1倍のプラバスタチンが蓄積した【００６２】
実施例７：(R)-α-メチルトリプタミンからインドール-3-アセトンへの微生物変換
前述のプラスミドpTrcRatを用いて大腸菌BLstarTolCAcrAB株およびBL21star(DE3)株を形質転換した株をそれぞれBlstarTolCAcrAB/pTrcRat株およびBL21star/pTrcRat株とした。これらの株をカルベニシリンナトリウム(100μg/mL)を含むL液体培地（1.0％ ポリペプトン、0.5％ イーストイクストラクト、0.5％塩化ナトリウム、pH7.2）に接種し、37℃で8時間220rpmで振とう培養した。この培養液50μLをカルベニシリンナトリウム(100μg/mL)とOvernight Express Autoinduction Systems（Novagen社）を含むL液体培地25mLに添加した後、30℃で20時間220rpmで振とう培養した。遠心により菌体を回収し、2.5mLのほう酸緩衝液(200mM、pH9.0)に懸濁し、培養液に対して10倍濃縮した菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液0.5mLにL液体培地を0.5mL、50％ グリセロール溶液を25μL、50mg/mL カルベニシリンナトリウムを1.25μL、100mM IPTGを10μL、および25mM (R)-α-メチルトリプタミン）を250μL添加し、30℃で18時間220rpmで振とう培養した。その後、この反応液に5N水酸化ナトリウム溶液を50μLと酢酸エチル2mLを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で15,000rpmで10分間遠心することにより得られた上清を、濃縮乾燥し、メタノール300μLに溶解した。これをHPLCで分析し、基質の(R)-α-メチルトリプタミン(R-MT)からアミノ基が遊離することにより生成したインドール-3-アセトンの生産を検出した。この結果を表４に示した。【００６３】
【表４】
2008105513.tif 000005
【００６４】
HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：CHILALPAK AS-H (DAICEL) 250mm x 4.6mmI.D.
移動相：ヘキサン：イソプロピルアルコール：ジエチルアミン = 75:25:0.6
流速：0.7mL/分
検出：UV  238nm
インジェクション容量：15μL
カラム温度：25℃
分析時間：15分
保持時間：(R)-α-メチルトリプタミン  6.5分
インドール-3-アセトン     11.4分【００６５】
(R)-α-メチルトリプタミンアミノトランスフェラーゼであるRatAをコードする遺伝子を発現させた大腸菌を用いた(R)-α-メチルトリプタミンの微生物変換反応において、発現ホストとして従来法である野生型大腸菌を用いた場合と比較し、tolCacrAB破壊株を用いた場合で1.2倍のインドール-3-アセトンが蓄積した。【００６６】
実施例８：N-ベンジルオキシカルボニル-L-リジン(Z-Lys)からN-ベンジルオキシカルボニル-6-ヒドロキシ-L-ノルロイシン(Z-HNL)への微生物変換
プラスミドpHSG-ZARにあるlat遺伝子がコードするリジンアミノトランスフェラーゼによりZ-LysがN-ベンジルオキシカルボニル-L-アミノアジピン酸-デルタ-セミアルデヒド(Z-ASA)に変換され、zar遺伝子がコードするZ-ASA還元酵素によりZ-ASAがZ-HNLに変換され、さらにrocG遺伝子がコードするグルタミン酸デヒドロゲナーゼにより補酵素であるNADPHが再生される。このようなプラスミドpHSG-ZARを用いて大腸菌BLstarTolCAcrAB株およびBL21star(DE3)株を形質転換した株をそれぞれBlstarTolCAcrAB/pHSG-ZAR株およびBL21star/pHSG-ZAR株とした。これらの株をカナマイシン硫酸塩（25μg/mL）を含むＭ９SEED液体培地（3.39％Na2HPO4、1.5％KH2PO4、0.25％塩化カルシウム、0.5％塩化アンムニウム、1％カザミノ酸、0.002％チミン、0.1mM塩化カルシウム、0.1mM硫酸鉄、0.4％グルコース、0.001mM塩化マグネシウム）に接種し、25℃で24時間220rpmで振とう培養した。この培養液200μLをカナマイシン硫酸塩（80μg/mL）とOvernight Express Autoinduction Systems(Novagen社)を含むＭ９ZAR液体培地（3.39％Na2HPO4、1.5％KH2PO4、0.25％塩化ナトリウム、0.5％ 塩化アンムニウム、1％カザミノ酸、0.002％チミン、0.1mM塩化カルシウム）25mLに添加した後、30℃で7時間220rpmで振とう培養した後、25℃で17時間140rpmで振とう培養した。遠心により菌体を回収し、5mLのCV3 緩衝液(50mM リン酸カリウム緩衝液、2％グリセリン、20μg/mLカナマイシン硫酸塩、0.1M IPTG)に懸濁し、培養液に対して5倍濃縮した菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液1 mLに25 mg/mL Z-Lys溶液を40μL（終濃度1000μg/mL）およびγ-シクロデキストリン（終濃度2％）を添加し、28℃で24時間220rpmで振とう培養した。その後、この反応液にメタノール2mLを加えて、10分間室温でボルテックスした後、エッペンドルフ遠心機で15,000rpmで10分間遠心することにより得られた上清をHPLCで分析し、基質のZ-Lysから変換されたZ-HNLを検出した。この結果を表５に示した。
【表５】
2008105513.tif 000006
HPLCの測定条件は以下のとおりである。
分析装置：Agilent 100 series
カラム：J' sphere ODS-H80 (YMC, Inc.), 75 mm x 4.6 mmI.D.
移動相：A; アセトニトリル
B; 0.85％ リン酸水溶液
グラジエント時間設定：0分 移動相A/B =20:80
6.00分 移動相A/B =20:80
8.00分 移動相A/B =60:40
10.00分 移動相A/B =20:80
流速：1.5 mL/分
検出：UV  220nm
インジェクション容量：10μl
カラム温度：40
分析時間：10分
保持時間：Z-HNL       3.1分
リジンアミノトランスフェラーゼ、N-ベンジルオキシカルボニル-L-アミノアジピン酸-デルタ-セミアルデヒド還元酵素およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼをそれぞれコードする遺伝子を発現させた大腸菌を用いたZ-Lysの微生物変換反応において、発現ホストとして従来法である野生型大腸菌を用いた場合と比較し、tolCacrAB破壊株を用いた場合、1.5倍のZ-HNLが蓄積した。
【産業上の利用の可能性】
【００６７】
本発明は、微生物変換法を利用する化合物の製造分野に有用である。
【配列表】
2008105513000001.app
【国際調査報告】
2008105513.tif 000007
2008105513.tif 000008
2008105513.tif 000009
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