【手続補正書】
【提出日】平成16年7月1日(2004.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
【図１】図1は、AT4受容体のDEAE-Sepharoseイオン交換精製からの画分の非還元SDS-PAGE分析を示す。ゲルを銀染色し(A)、オートラジオグラフィーに付した(B)。CAHPSで可溶化したウシ副腎膜からのタンパク質をDEAE-Sepharose速流カラムで分隔した。放射性標識バンドと共に移動した(矢印頭によって示される)銀-染色タンパク質バンドを、レーン2に示すように、溶出された画分で検出された。分子量マーカーはレーン1に示し、サイズは、図面の左に示したkBaで表わす。
【図２】図2は、Mr165kDにおける図1に示した銀-染色タンパク質バンドの毛細管カラムRP-HPLC/ESI-MS/MS分析の結果を示す。
(A)トリプシン消化のMS/MS合計イオン電流(TIC)追跡。ペプチド混合物を0.2mmのIDカラムに適用し、60分の直線グラジエント(流速1.7μL/分)を、溶媒Aが0.1％v/v水性TFAであって、溶媒Bが60％アセトニトル中の0.1％v/v水性TFAである0〜100％Bから用いた。ペプチドをそれらの親イオンの衝突-誘導解離(CID)によって配列決定した。星印で標識したピークはトリプシン自動消化ペプチドとして同定した。Bos taurus CD34(TrEMBLアクセッション番号Q9XS61)から、各々、残基321〜349および208〜220としてSEQUESTアルゴリズムを用いて、ペプチドT1およびT2を同定した。
(B)トリプシンペプチドT3の二重荷電イオンの衝突-誘導解離MS/MSスペクトル(m/z1106.0)。ペプチドT3はSEQUESTを用いて同定できず、示したように、デノボ方法、すなわち、β-およびγ-型産物イオンシリーズの手動解釈を用いて解釈した(RoepstorffおよびFohlman,1984)。配列タグVQAFFEを最初に推定し、これを、Fastaプログラムを用いてTrEMBLデータベースに対してサーチした。この配列タグは、ヒトオキシトシナーゼに対して相同であることが判明した(TrEMBLアクセッション番号O00769)。ヒトオキシトシナーゼからのさらなる残基(残基番号979〜996)はMS/MSスペクトルにフィットすることが判明した。
(C)かく同定された19アミノ酸ペプチド配列を示す。それは、ヒト配列におけるスレオニンであるN-末端残基におけるのみのヒトオキシトシナーゼの相同領域とは異なる。
【図３】図3は、2つの結合実験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAを含むプラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1  Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識Ang IVによって競合的に阻害される。BoはIRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1 Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。Pci IRAPはRogiら、1996によって記載されているように調製した。
【図４】図4は、結合試験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAを含むプラスミドでトランスフェクトされたHDK 293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1  Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識LVVYPWTQRF(配列番号:2)、公知のAT4受容体リガンドによって競合的に阻害される。Boは、IRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1 Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。
【図５】図5は、結合実験からの結果をまとめ、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNA(IRAP)を含むプラスミドでトランスフェクトされたHEK293細胞から調製された膜(IRAP)への125I-Nle1 Ang IV結合の増加を示す。放射性リガンドの結合は、増大させていく濃度の未標識KYLPGPLQ(配列番号:3)、公知のAT4受容体リガンドによって競合的に阻害される。Boは、IRAPトランスフェクト細胞における125I-Nle1  Ang IV結合部位の合計数を表わし、B/Bo×100は、IRAPトランスフェクト細胞における部位の合計数のパーセンテージとして表わした、占有された結合部位の数を表わす。
【図６】図6は、合計(T)および非特異的(NS)結合を示す、対照プラスミドでトランスフェクトされたHEK 293-T細胞からの膜(対照)と比較した、IRAP cDNAでトランスフェクトされたHEK293-T細胞からの膜(IRAP)からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体/IRAPの非還元SDS-PAGE分析のオートラジオグラフィーを示す。トランスフェクトされた細胞は1％CHAPS、50mMトリス、pH6.8、5mM EDTA中に4℃にて4時間可溶化させた。膜を遠心によって除去し、100μlの合計容量中の0.1μCiの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV、20μMのベスタチン、100μMのPMSF、2.5mMのフェナントロリンと共に可溶化された受容体を37℃にて90分間インキュベートし、次いで、氷上で紫外線を365nmにおいて2時間照射した。2つの特異的放射性標識バンドが、IRAP cDNAでトランスフェクトされた細胞において目に見える；ほぼ165kDaの主要なバンドおよび≧250kDaの従たるバンド。
【図７】図7は、隣接する断面における、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学による、マウス脳断面およびIRAP mRNAでの125I-Nle Ang IV結合を用いるAT4受容体結合の分布を示す。
【図８】図8は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、125I-Nle Ang IVをおよびIRAP mRNAを用いるE15マウス胚におけるAT4受容体結合の分布を示す。
【図９】図9は、ヒトIRAP cDNA配列に由来するアンチセンスおよびセンスオリゴ塩基配列を用いる、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学におけるヒト小脳断面におけるIRAP mRNAの分布を示す(頂部パネル)。用いたアンチセンス配列は、ヒトIRAP配列のヌクレオチド1136〜1109、ヌクレオチド1407〜1377およびヌクレオチド2587-2560(Human Genbankアクセッション番号U62768)。小脳の隣接断面を125I-Nle Ang IVで標識して、AT4受容体結合を示す(底部パネル)。
【図１０】図10は、DEAE-Setharoseアニオン交換クロマトグラフィーによって精製された、ウシ副腎膜からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体/IRAPの非還元SDS-PAGEのオートラジオグラフを示す。165kDaの見掛けの分子量を持つ主なバンド、ならびに(矢印頭によって示した)3つの高分子量複合体が目に見える。
【図１１】図11は、SK-N-MC細胞(A)およびウシ副腎膜(B)からの［125I］-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV架橋AT4受容体のSDS-PAGE分析のオートラジオグラフを示す。非還元条件下(レーン1)および還元条件下(レーン2)、非還元条件下(レーン3)および還元条件下(レーン4)、10μM未標識Ang IVの存在下で、および非還元条件下(レーン5)および還元条件下(レーン6)、10μM未標識LVVYPWTQRF(配列番号:2)の存在下における、SK-N-MCおよびウシ副腎膜への合計「125I」-Nle1-BzPhe6-Gly7-Ang IV結合を示す。ほぼ250kDaの見掛けの分子量で移動する従たる高分子量放射性標識複合体は非還元下(レーン1)では明らかであるが、還元条件下(レーン2)では明らかではない。
【図１２ａ】図12aは、合成基質L-ロイシル-β-ナフチルアミドでの蛍光アッセイ法を用いる、Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)によるIRAP活性の阻害の測定の結果を示す。10mMのAng IVまたはLVVYPWTQRF(配列番号:2)(LVV-へモルフィン7)の存在下におけるIRAPによるL-ロイシル-β-ナフチルアミドの加水分解速度は、340nmの励起波長および410nmの発光波長における蛍光の変化によって検出した。
【図１２ｂ】図12bは、IRAP阻害の動的解析を示す。3つの濃度のAng IV(頂部パネル)またはジバリナールAng IV(底部パネル)の不存在または存在下におけるIRAP活性の二重-逆数(Lineweaver-Burk)プロットを示す。
【図１３】図13は、トリプシン残基に整列させたAT4受容体/IRAPに高い親和性をもって結合する3つのペプチドのアミノ酸残基を示す。最も長いペプチド：
LVVYPWTQRF(配列番号:2)
についての構造-活性実験により、残基VYPWTは依然として充分なAT4受容体/IRAP結合活性を保有することを示した。
【図１４ａ】図14aは、Barnes迷路空間学習例におけるNle Ang IVの効果のまとめを示す。上方パネルは、各々、人工脳脊髄液対照、1nmolのNle Ang IVまたは100pmolのNle Ang IVを与えた3つの処理群の平均誤差のプロットである。下方パネルは、3処理群到達学習者基準が必要とした日数のプロットである。
【図１４ｂ】図14bは、Barnes円形迷路例において学習を加速する、AT4リガンド、Nle-Ang IVおよびLVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果を示す。頂部パネルは学習者曲線を示し、これは、2つのペプチド処理のためのテストの日にわたる学習者基準に到達する動物のパーセンテージのプロットである。底部パネルは、初日の最初のトライアル5分前のいずれかのペプチドの単一容量後に学習者基準に動物が要した平均日数のプロットである。
【図１５】図15は、マウスにおける3日および6日後における、Y迷路空間学習例での0.3pmol時間の速度でのLVVYPWTQRF(配列番号:2)の慢性注入の効果をまとめる。新規なアームで費やされた増大した時間は、処理の結果として記憶の保持を改良した。
【図１６】図16は、ラットにおけるMorris水迷路例におけるスコポラミン処理の健忘症効果に対する急性脳室内(icv)の効果をまとめる。沈んだプラットフォームを見つけるにおける時間の潜伏期は、異なる処理の健忘症特性の尺度である。
【図１７】図17は、ラットにおける受動回避例でのスコポラミン処理の健忘症効果に対する急性icv用量のLVVYPWTQRF(配列番号:2)の効果をまとめる。暗いチャンバーに入る時間の潜伏期は、異なる処理の記憶-増強特性の尺度である。
【図１８】図18は、10-9〜10-6Mの各ペプチドを用いる、ラット海馬スライスからのカリウム-誘導3H-コリン放出に対するAng IV(A)およびLVVYPWTQRF(配列番号:2)(B)の効果を示す。値は各用量における6つの実験の平均±SEMであり、対照のパーセンテージとして表わす。*p＜0.05。
【図１９ａ】図19aは、aCSF中の10-8MのNle-Ang IVで30分間、aCSF単独または30mMのKClおよび5mMのフォルスコリンで30分間処理したラット海馬スライスにおけるERK1およびERK2の刺激を示す。
【図１９ｂ】図19bは、前記ペプチドで5分、30分および120分処理したヒトIRAPでトランスフェクトしたHEK293細胞でのERK1/ERK2リン酸化に対する3つの異なる濃度(0.001、1、および10μM)のNle-Ang IVの効果を示す。
【図２０】図20は、ネズミIRAPの細胞質テイルに対して向けられた抗体で染色されたマウス海馬の断面を示す。IRAP抗体染色は、ニューロンマーカーNeuN抗体で二重標識することによって示されたニューロン(頂部パネル-右)に対応するアンモン角のCA3領域の垂体細胞層(頂部パネル-左)で検出された。底部パネルは、IRAP(左)がGLUT4(右)と同一ニューロンで見出されたが、同一細胞下区画では見出されなかったことを示す。
【図２１】図21は、10-10〜10-6MのLVVYPWTQRF(配列番号:2)への暴露に続くNG108-15またはSK-N-MC細胞における［3H］-チミジン取込の刺激を示す。値は四極子で行ったいくつかの実験の平均±標準偏差であり、対照のパーセンテージとして表わす。*p＜0.05。
【図２２】図22は、E15鶏雛交感神経ニューロンからの神経突起成長に対するLVVYPWTQRF(配列番号:2)およびAng IVの効果をまとめる。値は対照のパーセント記号として表わす。
【図２３】図23は、胚日13.5〜17からの発生するマウス脳におけるAT4受容体/IRAP分布を示す。切片は矢じり面で切断した。
【図２４】図24は、損傷したヒツジ脊髄の切片への［125I］-Ang IV結合を示す。矢印頭は血管への結合を示し、矢印は活性化されたグリアを示す。スケールバー＝1.9mm。
【図２５】図25は、負傷していないウサギ頚動脈への「125I」-Ang IV結合を示す。左側の図面はヘマトキシリンおよびエオシン-染色断面である。右側の図は、インキュベートした切片に暴露した対応するX線フイルルと重ね合わせられたヘマトキシリンおよびエオシン-染色断面を表わす。e＝内皮細胞、m＝媒質、a＝外膜。スケールバー＝0.15mm。
【図２６】図26は、バルーン負傷から(A)1日後、(1di)、(B)1週間後(1wi)、(C)4週間後(4wi)および(D)20週間後(20wi)におけるウサギの右側頚動脈の媒体/新しい最も内側における［125I］-Ang IV結合の定量の結果を表わす。値は3〜4匹の動物の平均±標準偏差であり、対照組織(左側頚動脈)のパーセンテージとして表わす：1日未処理(1du)、1週間未処理(1wu)、4週間未処理(4wu)および20週間未処理(20wu)。*p＜0.05。
【図２７】図27は、ELISAアッセイ法によって検出されたSE56およびSK-N-MC細胞系における血清によるIRAPの細胞表面発現の刺激を示す(頂部パネル)。ウェスタンブロット分析によって検出された血清刺激後における、SK-N-MC細胞での、高密度ミクロソーム(2)、低密度ミクロソーム(3)および原形質膜(4)におけるIRAPの存在(矢印頭)。細胞質(1)および核およびミトコンドリア(5)におけるその不存在に注意されたし(底部パネル)。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine
<120>  MODULATION OF INSULIN-REGULATED AMINOPEPTIDASE (IRAP)/ANGIOTENSIN IV (AT4) RECEPTOR ACTIVITY
<130>  GF-A0401
<140>  JP   2003-516534
<141>  2002-08-02
<150>  AU   PR6772
<151>  2001-08-02
<150>  US   60/330,170
<151>  2001-10-17
<160>  23
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Val Tyr Ile His Pro Phe 
1               5       
<210>  2
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Ovis aries
<400>  2
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe 
1               5                   10  
<210>  3
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Ovis aries
<400>  3
Lys Tyr Leu Pro Gly Pro Leu Gln 
1               5               
<210>  4
<211>  6
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Nle substitution at position 1
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Nle
<400>  4
Leu Tyr Ile His Pro Phe 
1               5       
<210>  5
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Bos taurus
<400>  5
Ala His Leu Ser Glu Val Gln Ala Phe Phe Glu Asn Gln Ser Glu Ala 
1               5                   10                  15      
Thr Phe Arg 
<210>  6
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  antisense oligonucleotide from mouse IRAP cDNA sequence 
<400>  6
gaggttaggt ttggatgtag gctaagttca t                                    31
<210>  7
<211>  28
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  antisense oligonucleotide from mouse IRAP cDNA sequence 
<400>  7
attgatcagg ttggctcggt ctttgtca                                        28
<210>  8
<211>  28
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for both splice variants
<400>  8
ccaagtaagt gctcatcttc acactctc                                        28
<210>  9
<211>  31
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for both splice variants of  AT4 receptor/IRAP
<400>  9
gtgttactgt catacagaag tgtctcctct c                                    31
<210>  10
<211>  28
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for both splice variants
<400>  10
cagtttcatg gcagtagtag agcagttc                                        28
<210>  11
<211>  33
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  11
cattggtgaa gggctccatt tccttacagc cgg                                  33
<210>  12
<211>  37
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe specific for splice variant of AT4 receptor/IRAP 
<400>  12
cttccctcaa acatgctgtt ttcaatcata ttcctgg                              37
<210>  13
<211>  24
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe specific for splice variant of AT4 receptor/IRAP 
<400>  13
tggaggagga tgaagaggat tatg                                            24
<210>  14
<211>  26
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  14
ctacgctatg aactcagcct acaccc                                          26
<210>  15
<211>  27
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  15
gcctacaccc gaacctaacc tcgatga                                         27
<210>  16
<211>  24
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  16
cacaggtcat aatatttcaa gagt                                            24
<210>  17
<211>  26
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  17
aagccaagaa aaacaagctg agatcc                                          26
<210>  18
<211>  18
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  18
ataagggatg agcaatac                                                   18
<210>  19
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  19
caccgcttta tcaaatatgc ctaag                                           25
<210>  20
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  20
atatgcctaa gaagtcatca gtcgt                                           25
<210>  21
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  21
ctactttgaa attcagtacc cactt                                           25
<210>  22
<211>  26
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  22
ttcagtaccc acttaagaaa ttggat                                          26
<210>  23
<211>  25
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Probe for AT4 receptor/IRAP 
<400>  23
tcaccttccg agaggagaca cttct                                           25