(57)【要約】本発明は、発酵由来のコハク酸製造にあたり、複雑な工程を経ず、副生物が全てコハク酸製造に再利用可能なコハク酸アンモニウム溶液を効率よく製造するものであり、発酵由来のコハク酸アンモニウムを製造するに際し、  （１）コハク酸カルシウム・３水和物を微生物により製造する晶析発酵工程、  （２）コハク酸カルシウム・３水和物をコハク酸カルシウム・１水和物に転移晶析する転移工程  （３）コハク酸カルシウム・１水和物を分離する結晶分離工程  （４）分離したコハク酸カルシウム・１水和物をコハク酸アンモニウム溶液にする塩置換工程  （５）コハク酸アンモニウム溶液より炭酸カルシウム沈殿を除去する固液分離工程  からなる。
2008143015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵由来のコハク酸アンモニウムを製造するに際し、 
（１）コハク酸カルシウム・３水和物を微生物により製造する晶析発酵工程、
（２）コハク酸カルシウム・３水和物をコハク酸カルシウム・１水和物に転移晶析する転移工程、
（３）コハク酸カルシウム・１水和物を分離する結晶分離工程
（４）分離したコハク酸カルシウム・１水和物をコハク酸アンモニウム溶液にする塩置換工程、
（５）コハク酸アンモニウム溶液より炭酸カルシウム沈殿を除去する固液分離工程  からなる高純度のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項２】
発酵工程に用いるカルシウム化合物が、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸水素カルシウム、炭酸カルシウムから選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項1記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項３】
コハク酸カルシウム・３水和物を、コハク酸カルシウム・１水和物に転移する反応を、８０℃以上で行うことを特徴とする請求項1記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項４】
コハク酸カルシウム・1水和物をコハク酸アンモニウムに置換する塩置換反応を、炭酸アンモニウム又はアンモニアと炭酸ガスで行うことを特徴とする請求項１記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項５】
塩置換工程におけるコハク酸濃度が、５重量％以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項６】
請求項1〜５のいずれかに記載の方法により製造したコハク酸アンモニウム溶液よりコハク酸を取得するコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵由来のコハク酸およびコハク酸アンモニウム溶液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸およびその誘導体は食品、香粧品および医薬品などの原料として幅広く用いられている。更に、近年、コハク酸は生分解性プラスチックのモノマーとしての用途が着目されている。これらの用途に用いるコハク酸は、従来、石油化学法により製造されてきた。一方、近年では、炭水化物などの植物由来の原料を用いる、発酵法でのコハク酸製造が検討されている。【０００３】
発酵法によりコハク酸を生産する場合、微生物が必要十分な活性を示すために、一般的には培養ｐＨを中性付近に保つ必要がある。中和剤としては、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウムおよび炭酸アンモニウムなどが用いられている。これらを用いた場合、培養液中には用いた対応する塩基とのコハク酸塩が蓄積する事となる。【０００４】
コハク酸塩の中でもコハク酸カルシウムは溶解度が低く、培養液中で結晶として析出する事が知られている（特許文献１）。通常、培養液中には糖などの発酵原料、菌体の栄養源として培地に加えた種々の添加物および菌体の代謝による副生物などが混合されている。コハク酸カルシウムにおいては、析出した結晶を培養液より単離する事でこれらの混合物からの分離が可能となるため、コハク酸の精製工程を簡略化する事ができる。更に、コハク酸塩結晶析出を目的とした濃縮等の操作が不要であるため、カルシウム塩の析出はエネルギー的にも有利である。【０００５】
コハク酸塩からコハク酸を分離するには、硫酸などの酸を添加する事で遊離のコハク酸が生じる領域までｐＨを下げる方法が一般的である。コハク酸カルシウムにおいても、硫酸を用いてコハク酸を取得する方法が知られている（特許文献２）。しかしながら、本反応では副生物として多量の石膏が析出するのが難点である。【０００６】
酸を添加せずにコハク酸塩よりコハク酸を分離する方法として電気透析法が提案されている（特許文献３）。精製工程途中でコハク酸より分離された塩基は、発酵の中和剤として再利用されるため、副生物は生じない。しかしながら、本法の適用はコハク酸ナトリウム、コハク酸アンモニウムなどの１価の塩基とのコハク酸塩に限られる。カルシウム塩においては膜のスケール成分を析出させ得る事より、本法は適当ではない。【０００７】
以上のような理由により安価で経済的な中和剤であるにも関わらず、カルシウム化合物を中和剤として用いる検討は近年なされていない。【０００８】
一方で、コハク酸アンモニウムからコハク酸を取得する場合、硫酸を用いる方法では硫酸アンモニウムが副生する。この副生した硫酸アンモニウムを３００℃で熱分解させる事で硫酸水素アンモニウムとアンモニアを生じさせ、それぞれを工程内で再利用して最終的には副生塩を発生させない方法が提唱されている（特許文献４）。【０００９】
またコハク酸アンモニウムからコハク酸の取得に酢酸を用いる方法も提唱されている（特許文献５）。副生する酢酸アンモニウムは熱分解により酢酸とアンモニアを生じさせ、それぞれを工程内で再利用する事で副生塩は発生しない。このようにコハク酸精製工程の出発原料としてはコハク酸アンモニウムである事が好ましい。【００１０】
コハク酸アンモニウムは発酵工程の中和剤としてアンモニアなどを用いる事で培養液中に蓄積させる事ができる。しかしながら、効率よくコハク酸を生産する中和剤としてアンモニアは好ましくなく、発酵生産性および収率の観点から、マグネシウム化合物が有効である事が示されている（特許文献６）。【００１１】
このような発酵工程で好ましい形態であるマグネシウム塩を精製工程で、多様な精製法が適用可能であり、特許文献４、５の方法を用いれば副生塩を発生させないという観点から、より好ましい形態であるアンモニウム塩へと変換する方法として塩置換法が提案されている（特許文献７）。塩置換工程で生成したマグネシウム化合物は発酵工程の中和剤として再利用される。発酵工程で生成するコハク酸マグネシウムは培養液中に溶解しており、通常、結晶として析出しない。そのため培養液に炭酸アンモニウム等を投入することで塩置換工程が行われている。従って、コハク酸マグネシウム以外の培養液中の混合物が、精製工程の出発原料であるコハク酸アンモニウム溶液に持ち込まれることとなる。そのため、塩置換工程の前あるいは後に複雑な混合物淘汰工程が必要となる問題があった。【００１２】
【特許文献１】特開昭６２−２９４０９０号公報
【特許文献２】特開平３−３０６８５号公報
【特許文献３】特開平２−２８３２８９号公報
【特許文献４】特表２００１−５１４９００号公報
【特許文献５】特開２００４−１９６７６８号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／０２６３４９号パンフレット
【特許文献７】特開２００５−２９５９９８号公報
【００１３】
本発明は、発酵由来のコハク酸製造のため、コハク酸アンモニウム溶液を効率よく製造する方法を提供することを目的としている。
【発明の開示】
【００１４】
本発明者は、発酵工程において中和剤であるカルシウム化合物を添加する事で効率よくコハク酸カルシウムを生成することに成功した。更に、生成したコハク酸カルシウムを単離してアンモニア化合物で塩置換することにより、コハク酸アンモニウム溶液を高純度で製造できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の工程を包含するものである。
１、発酵由来のコハク酸アンモニウムを製造するに際し、
（１）コハク酸カルシウム・３水和物を微生物により製造する晶析発酵工程、
（２）コハク酸カルシウム・３水和物をコハク酸カルシウム・１水和物に転移晶析する転移工程
（３）コハク酸カルシウム・１水和物を分離する結晶分離工程
（４）分離したコハク酸カルシウム・１水和物をコハク酸アンモニウム溶液にする塩置換工程
（５）コハク酸アンモニウム溶液より炭酸カルシウム沈殿を除去する固液分離工程  からなる高純度のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
２、発酵工程に用いるカルシウム化合物が、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸水素カルシウム、炭酸カルシウムから選ばれる１種以上であることを特徴とする1項記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
３、コハク酸カルシウム・３水和物を、コハク酸カルシウム・１水和物に転移する反応を、８０℃以上で行うことを特徴とする１項記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
４、コハク酸カルシウム・１水和物をコハク酸アンモニウムに置換する塩置換反応を、炭酸アンモニウム又はアンモニアと炭酸ガスで行うことを特徴とする１項記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
５、塩置換工程におけるコハク酸濃度が、５重量％以上であることを特徴とする１〜４項記載のコハク酸アンモニウム溶液の製造方法。
６、１〜５項のいずれかに記載の方法により製造したコハク酸アンモニウム溶液よりコハク酸を取得するコハク酸の製造方法。
【００１５】
コハク酸アンモニウム溶液からは公知の方法（特許文献４、５など）により、コハク酸を製造することができる。また、塩置換により生じた炭酸カルシウムは発酵中和剤として再利用可能である。あるいは公知の方法（非特許文献１）により炭酸カルシウムを焼成して生じた酸化カルシウムを水和した水酸化カルシウムで中和する事も可能である。更に焼成により発生する二酸化炭素は発酵および塩置換工程で有効利用する事ができる。
【００１６】
【非特許文献１】「石膏石灰ハンドブック」石膏石灰学会、１９７２年、ｐ１２６−１４４、技報堂出版株式会社発行
【００１７】
本発明により、コハク酸アンモニウム溶液が効率良く、しかも複雑な工程を経ずに製造することが可能となり、コハク酸アンモニウム溶液からは、公知の方法によりコハク酸が製造され、また、再利用可能の副生物のみが産生される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】純度の高い原料（試薬レベル）を用いて取得したコハク酸カルシウム・３水和物（Ａ）と発酵液に蓄積したコハク酸カルシウム・３水和物（Ｂ）の結晶形の比較した写真である。
【図２】発酵液に蓄積したコハク酸カルシウム・３水和物（Ａ）と（Ａ）を転移して得られたコハク酸カルシウム・１水和物（Ｂ）の結晶形の比較した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、上述の通り、５段階の工程を構成要件とする発明であり、以下、順に内容を記載する。
（1）発酵工程  
本発明は、先ず発酵により、培養液中にコハク酸を生産することに始まる。培養によるコハク酸の製造は、従来から知られているコハク酸生産能を有する菌株をカルシウム化合物で中和しつつコハク酸を得る方法が適用される。本発明に使用できる微生物は、特に限定されないが、好気性細菌又は通性嫌気性細菌が好ましく、具体的にはコリネ型細菌（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌、又はエシェリヒア属細菌が好ましく、中でも、コリネ型細菌がより好ましい。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。【００２０】
上記細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233（FERM BP-1497）、同MJ-233の変異株であるMJ-233 AB-41（FERM BP-1498）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ATCC6872、コリネバクテリウム・グルタミカム
ATCC31831、ATCC13032及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（非特許文献２）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233株、及びその変異株MJ-233  AB-41株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムMJ-233株及びMJ-233  AB-41株と呼称することができる。
【非特許文献２】Lielbl, W.,Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of  SystematicBacteriology, 1991, vol. 41, p255-260
【００２１】
使用菌株は従来から用いられている上述の菌株はもちろんのこと、それらを親株として変異処理、遺伝子操作により、コハク酸生産能を高めた菌株であっても良い。例えば乳酸脱水素酵素を欠失した変異株コリネバクテリウム・グルタミカムMJ233/Δldhを用いる事ができる。尚、本改変株は、特許文献８に記載の方法により構築できる。発酵工程は更に生産性を高める事を目的として菌体培養工程とコハク酸発酵工程とに分ける事もできる。【００２２】
【特許文献８】国際公開第２００５／０２１７７０号パンフレット
【００２３】
a) 菌体培養工程
上記微生物を培養するにあたっては、通気、攪拌をしながら好気的な雰囲気下で行うことが望ましい。【００２４】
ここでいう好気的雰囲気下とは菌体が酸素を消費しながら増殖が行われている条件の事である。溶存酸素濃度は特に限定されないが、効率的な増殖には溶存酸素飽和度として、４％以上、より好ましくは２０％以上である。【００２５】
培養に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。【００２６】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いる事もできる。【００２７】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。【００２８】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、代謝又は生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。【００２９】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。【００３０】
培養の形態は特に限定されないが、より高濃度の菌体を得るためには基質を逐次添加し、菌体収量を増加できるフェドバッチ培養、連続培養等が好ましい。【００３１】
培養温度、ｐＨは増殖可能であれば特に限定されないが、通常、温度に関し２０〜４０℃、ｐＨに関し６．０〜８．０の範囲である。【００３２】
培養は所望の菌体量が得られるまで行う事ができる。好ましくは乾燥菌体重に換算して３０〜１２０g/Lの範囲である。【００３３】
b)コハク酸カルシウム・3水和物晶析発酵工程
コハク酸発酵は嫌気的雰囲気下において上記で培養した菌体を炭素源と反応させ、生成したコハク酸をカルシウム化合物で中和する事で行う。培養した菌体に適した条件で反応させる事で培地中にコハク酸カルシウム・３水和物を析出させながら生成蓄積させる事ができる。【００３４】
嫌気的雰囲気下とは溶存酸素濃度として０．１ppm以下、好ましくは０．０１ppm以下である。嫌気的雰囲気下とするために酸素供給量を制限する。そのための方法として、通気量を少なくする、攪拌を緩やかにする、窒素ガスや炭酸ガス等の不活性ガスと混合し酸素分圧を低減したガスを通気する等の方法を用いる事ができる。また酸素を完全に除去した完全嫌気条件下とする事もできる。そのための方法として、通気をしない、不活性ガスだけを通気する等の方法を用いる事ができる。【００３５】
反応に用いる、上記で培養した菌体の量は特に限定されないが、通常１〜１２０g/L、好ましくは１０〜８０g/Lである。菌体培養液をそのまま所望量添加して用いる事ができる。あるいは遠心等の操作により培養液中の混合物を除去した後、反応に用いる事もできる。【００３６】
コハク酸発酵に用いる炭素源は微生物が資化してコハク酸を生成する事ができれば特に限定されず、菌体培養と同様の炭素源を用いる事ができる。【００３７】
炭素源の添加方法も特に限定されないが、例えば所望するコハク酸量に対して、必要とする量の炭素源を全量反応開始時に予め加えておく事ができる。また反応進行に伴う炭素源の消費に合わせて逐次炭素源を添加しても良い。更には炭素源の全量を逐次添加とする事もできる。【００３８】
コハク酸の中和に用いる事のできるカルシウム化合物は、炭酸カルシウム（CaCO3）、酸化カルシウム（CaO）、水酸化カルシウム（Ca(OH)2）、炭酸水素カルシウム（Ca(HCO3)2）などが挙げられ、特に限定されないが、ｐＨを容易に制御できる観点から、水酸化カルシウムの使用が好ましい。また、これらを２種類以上混合して用いる事もできる。【００３９】
カルシウム化合物の添加方法に関し、ｐＨを適正な値に制御できる範囲においては特に限定されないが、例えばスラリーの形態として、ｐＨに応じて添加する事が出来る。また粉末で添加してもよい。【００４０】
反応温度、ｐＨはコハク酸生成が行われる範囲において、特に限定されないが、通常温度に関して２０〜４０℃、ｐＨに関しては４．０〜８．０の範囲である。【００４１】
反応に用いる培地に関し、コハク酸生成反応を阻害しない範囲において特に限定されないが、例えば炭素源のみとしても良い。また上記菌体培養工程と同様の炭素源以外の添加物を用いる事も出来る。例えば正リン酸等のリン酸化合物を反応促進成分として添加する事が出来る。これら炭素源以外の添加物の添加方法は特に限定されないが、例えば反応開始時に全量を添加する事ができる。あるいは反応途中に逐次添加する方式でも良い。【００４２】
また培地中には炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させる事が好ましい。これらの供給方法は特に限定されないが、例えば炭酸ガスを通気する事ができる。通気する炭酸ガスの濃度は通常５％以上である事が好ましい。また炭酸カルシウムを中和剤として用いる事により、炭酸イオン、重炭酸イオンを供給する事も出来る。【００４３】
本反応に用いる発酵槽の形態に関し、特に制限はなく、アミノ酸発酵等に使用する通常の機械攪拌型発酵槽を用いる事が出来る。また気泡塔型培養装置（例えば特許文献９）を用いる事もできる。
【特許文献９】特開平１１-０９２５０２号公報
【００４４】
反応進行に従い、コハク酸カルシウム・３水和物結晶が析出する。所望量のコハク酸カルシウムが反応液中に得られるまで反応を続ける。通常コハク酸換算で３０g/L以上であり、好ましくは５０g/L以上蓄積するまで反応を続行する。反応時間に関しては通常１０〜４８時間である。また析出する結晶を発酵槽外に引き抜きながら、更に反応を継続させても良い。【００４５】
（２）転移工程
反応液中に析出したコハク酸カルシウム・３水和物結晶は、遠心分離、又はろ過によって採取する事ができる。しかしながら、図１に示したように、発酵により得られるコハク酸カルシウム・３水和物結晶は、純度の高い条件下、例えば、和光純薬製特級コハク酸と水酸化カルシウムを反応させることで得られるコハク酸カルシウム・３水和物と比較してかなり微細な針状結晶である。結晶をより分離しやすいコハク酸カルシウム・１水和物へと転移する事で、菌体や反応副生物などの混合物が含まれる反応液とコハク酸カルシウム結晶との分離を容易にする事ができる。【００４６】
転移反応は反応液を加温する事により行う。３水和物から１水和物への転移点は、純薬では６０℃付近、培養液ではそれ以上８０℃付近までの間になる。そこで、最適な本操作条件は反応液組成により異なるが、通常８０℃以上に加温して行う。反応時間に関しては温度に依存するが、反応温度８０℃の場合は、通常２〜２４時間である。これらの条件は、当業者であれば結晶状態を観察しながら容易に適正範囲を決めることができる。【００４７】
図2に示したように、本転移工程により結晶の形状は、反応液中の針状結晶（コハク酸カルシウム・３水和物）から、楕円球状結晶（コハク酸カルシウム・１水和物）へと変化する。この１水和物は比較的安定であり、温度が低下しても３水和物にはなかなか戻らない。
（３）結晶分離工程
本工程では、転移晶析させた反応液より、コハク酸カルシウム・1水和物結晶を、例えば６０℃前後で分離する。反応液中にはコハク酸カルシウム・１水和物結晶以外には菌体や反応副生物等が含まれている。これらよりコハク酸カルシウム・１水和物結晶を分離する方法は特に限定されないが、効率よく分離する観点においては、比重差を利用した分離が好ましい。【００４８】
分離には一般的に用いられるスクリューデカンター、スーパーデカンター等が利用できる。【００４９】
分離されたコハク酸カルシウム・１水和物結晶は次工程へと送られるが、結晶は菌体や不純物の除去、洗浄を目的に再度スラリー化しても良い。洗浄に用いる液体は水でも良いが、コハク酸カルシウムの溶液好ましくは飽和溶液を用いれば、洗浄によるコハク酸のロスを抑制する事が出来る。こうして得られたスラリーを分離する事で再びコハク酸カルシウム・１水和物の結晶を得る事ができる。【００５０】
またコハク酸カルシウム・１水和物はコハク酸換算で１０〜２０g/L反応液中に溶解しているため、これら溶解分は分離により母液側に移行する。コハク酸カルシウム・１水和物結晶の回収率を高める目的においては、例えば分離された母液を濃縮して更に結晶を析出させる事ができる。また分離工程の前に反応液を濃縮して、析出する結晶量を高めても良い。あるいは母液を発酵工程へと戻し、全体としてコハク酸カルシウム・１水和物結晶の回収率を高める事もできる。【００５１】
（４）塩置換工程
本工程は、コハク酸カルシウム・１水和物をコハク酸アンモニウムへと塩置換を行うとともに炭酸カルシウムを生成析出する工程である。本反応により発酵工程でカルシウム塩結晶として得られたコハク酸を、アンモニウム塩溶液へと転換する事ができる。【００５２】
コハク酸カルシウム・１水和物と炭酸アンモニウムを混合して反応する事により、塩置換は行われる。また塩置換反応はアンモニアと炭酸ガスを添加しても良い。これらの条件は、当業者であれば適宜変更する事ができる。【００５３】
反応液中のコハク酸濃度に関し、塩置換により得られるコハク酸アンモニウムが結晶として析出しない範囲である事が好ましく、通常はコハク酸重量濃度５〜４０％である。コハク酸濃度に関しては、塩置換反応時にコハク酸カルシウム・１水和物結晶に加える水の量を調節する事で容易に調整する事が出来る。【００５４】
塩置換に炭酸アンモニウムを用いる場合、反応液中のカルシウムに対し、通常炭酸が０．５〜５倍モル、好ましくは０．５〜２倍モル添加する。尚、ここで言う反応液中のカルシウムとはコハク酸カルシウムおよびカルシウム化合物に含まれるカルシウムの総量を意味する。反応液中のカルシウムは炭酸イオンと反応する事で炭酸カルシウムとして沈殿析出する。【００５５】
アンモニアと炭酸ガスにより反応を行う場合、炭酸ガスは反応液中のカルシウムに対し、通常０．５〜５倍モル、好ましくは０．５〜２倍モル添加する。アンモニアの添加はアンモニア水、アンモニアガスの何れの形態でも良い。アンモニアの添加量は、反応液のｐＨが炭酸カルシウムの沈殿しうる範囲となるようにする。ｐＨの範囲は通常５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０である。【００５６】
反応は攪拌しながら行う事が好ましい。反応時間は特に規制は無く、通常０．５〜５時間で反応は終了する。【００５７】
（５）炭酸カルシウム除去のための固液分離工程
本工程により、塩置換工程で生じたコハク酸アンモニウム溶液と炭酸カルシウム沈殿の混合スラリーより炭酸カルシウムを除去し、コハク酸アンモニウム溶液を得ることが出来る。【００５８】
炭酸カルシウムの分離方法はろ別、比重分離のいずれも用いる事が出来る。【００５９】
本工程により、コハク酸とアンモニアの合計が全固形分の９０％以上を占める高純度のコハク酸アンモニウム溶液を得る事が出来る。【００６０】
分離された炭酸カルシウムは、発酵工程で再利用する事が出来る。また公知の方法で焼成、水和する事によって、発酵工程でより好ましい中和剤である水酸化カルシウムを得ることも出来る。【００６１】
更に焼成により発生する炭酸ガスは回収する事で発酵工程あるいは塩置換工程に再利用する事が出来る。【００６２】
本発明により得られたコハク酸アンモニウム溶液を用いて、公知の方法によりコハク酸を得る事が出来る。コハク酸を取得する方法は特に限定されないが、例えば酢酸を用いる方法（特許文献５）を採用する事が出来る。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
[実施例１]【００６４】
コリネバクテリウム・グルタミカムMJ233/Δldh株を用い、水酸化カルシウムで中和しながらコハク酸カルシウム・３水和物を製造する晶析発酵工程、培養液を加熱する事によりコハク酸カルシウム・１水和物を得る転移工程、反応液より結晶を分離する結晶分離工程、カルシウム塩からアンモニウム塩へと置換する塩置換工程、及びアンモニウム塩溶液から析出した炭酸カルシウムを得る固液分離工程について、以下に示す。【００６５】
＜発酵工程＞
＜種培養＞
グルコース ３０g/L、硫酸マグネシウム・７水和物 ０．４g/L、リン酸二水素カリウム  １．０g/L、尿素  １２g/L、ＤＬ−メチオニン  ０．５g/L、硫酸第一鉄・７水和物
１０mg/L、硫酸マンガン・５水和物 １０mg/L、Ｄ−ビオチン ０．３mg/L、塩酸チアミン  ０．２mg/L、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５g/L）
２８．６mL/L、酵母エキス  １０g/Lを含む培地１００mLが入った５０mL容坂口フラスコを１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷却後、コリネバクテリウム・グルタミカムMJ233/Δldh株を接種して３１．５℃に保温し、２２時間振とう培養した。【００６６】
＜菌体培養＞
グルコース  ２０g/L、塩化マグネシウム・６水和物：２．０g/L、正リン酸  ２．０g/L、クエン酸一水和物  １．０g/L、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量３５g/Ｌ）
１４．３mL/L、塩化アンモニウム ０．８g/L、ＤＬ−メチオニン  １．０g/L、硫酸第一鉄・７水和物  ２００mg/L、硫酸マンガン・５水和物 ２００mg/L、Ｄ−ビオチン
３mg/L、塩酸チアミン １mg/L及び消泡剤０．２５mL/Lを含む培地を１５００mL作成し、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷却後、５L容反応槽に入れ、前述の種培養液を９mL加えて、３１．５℃に保温した。毎分１．５L通気し、ｐＨをアンモニアガスにて６．６に調整しながら攪拌培養を行った。培養８．０時間目より予め滅菌したグルコース溶液（５００g/L）を毎時約２５mLずつ培養終了時まで連続的に供給した。グルコース溶液を３４０mL投入した時点で培養を終了し、菌体約５０g/Lを含む菌体培養液を得た。【００６７】
＜コハク酸晶析発酵＞
グルコース  １００g/L、正リン酸２.０g/L及び消泡剤
０．０５mL/Lを含む培地（濃度は菌体培養液を接種した後の濃度）を作成し、５L容反応槽に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを３４℃に保温し、前述の菌体培養液８４０mLを加え、全容を２.1Lとして撹拌培養を行った。空気：窒素ガス：炭酸ガス  ＝  １０：７０：２０の割合で混合したガスを毎分２１０mL通気し、ｐＨを水酸化カルシウムスラリー（２６０g/L）により、ｐＨ６．６の中性領域に保ちながら、攪拌培養を行った。【００６８】
こうして２４時間反応を続けた結果、投入したグルコースは完全に消費され、コハク酸蓄積５７．０g/Lの反応液を２．８９kg（２．６５L）得た。グルコースのコハク酸転換収率は７２%であった。また反応液遠心上清中のコハク酸濃度は１３．３g/Lであり、反応液中コハク酸は７７%がカルシウム塩結晶として存在していると算出された。  同様にして合計４基で培養を行い、合計１１．１７kg（１０．７５L）の反応液よりコハク酸５８９gをカルシウム塩として得た。【００６９】
＜転移工程＞
上記反応液９．７０kgを全容３０Ｌのステンレス製容器に入れ、ウォーターバス中で８０℃に加温した。撹拌しながら約１８時間保温を続けた。本操作により結晶形の変化が観察され、Ｘ線回析の結果、コハク酸カルシウム・３水和物結晶からコハク酸カルシウム・１水和物結晶へと転移している事が判明した。転移反応前後で、加熱による水分蒸発は見られたがコハク酸量に変化は増減はなく、９．２８kgの反応液が得られ、コハク酸は５７１gであった。また反応液遠心上清中のコハク酸濃度は１５.４ｇ/Ｌであり、コハク酸溶解度に関し転移反応前後で大きな変化は生じなかった。【００７０】
＜結晶分離工程＞
加熱転移した反応液９．２８kgを約６０℃まで冷却後、スクリューデカンターにより固液分離を行った。デカンターは巴工業製Ｐ−４００Ｙを用い、内筒１３３４rpm、外筒３０００rpmに設定した。反応液は毎時３０Lの流速で投入した。約２０分で分離は終了し、筒内に付着した分を掻きとって分離ケーキに合わせた。分離後の母液は８．０７kg、ケーキは０．９９kgであった。分離前後の分析結果を表１に示す。反応液中のコハク酸は６７．２%が回収された。分離ケーキ中３８．４%がコハク酸であった。更にケーキを乾固させて重量を測定した結果、コハク酸とカルシウムで全固形分の８１．９%を占めている事がわかった。また、菌体についても仕込み量の７０%以上が分離母液側に除去できていることが確認された。【００７１】
【表１】
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【００７２】
＜塩置換工程＞
上記分離工程にて回収したケーキ６３０g（内コハク酸２４２g）を塩置換工程に用いた。ケーキを５,０００mL容ビーカーに採り、１．５８kgの水を添加し、常温で撹拌しながら懸濁させてスラリー溶液を作成した。次に、スラリー中のカルシウムに対し、０．８倍モルの炭酸アンモニウム（和光純薬製試薬特級）１７５gを投入し、常温で２時間撹拌しながら反応させた。塩置換反応液は２．２４kgが得られ、溶液はスラリー状であった。【００７３】
＜固液分離工程＞
上記塩置換反応で得られたスラリー液２.２４kgをヌッチェろ過によりろ液と沈殿へと分離した。最終的に１．８２kgの溶液と０．４２kgの沈殿とが得られた。溶液中のコハク酸は、アンモニアとのモル比およびカルシウムとのモル比はそれぞれ１．９２および０．１３であった。カルシウムの９１%は塩置換反応により沈殿として除去され、コハク酸アンモニウム溶液を得る事が出来た事がわかった。  除去された沈殿に関し、カルシウムは全固形分の３２．２%であり、コハク酸は８．０%未満であった。【００７４】
塩置換および固液分離工程により得られた溶液の分析結果を表２に示す。コハク酸の全固形分に占める割合は７２．７％であった。またコハク酸とアンモニアで全固形分の９３．１％を占めており、高純度のコハク酸アンモニウム溶液が得られた事がわかった。【００７５】
【表２】
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[実施例２]【００７６】
塩置換工程における炭酸アンモニウム量の影響を検討した。コハク酸カルシウム・１水和物（純正化学製、特級）８０gに水１８８gを加え、コハク酸２０重量%濃度のスラリー溶液を作成した。本溶液に炭酸アンモニウム量を変えて添加した。撹拌しながら２時間反応させた後、遠心して沈殿を除去してコハク酸アンモニウム溶液を得た。【００７７】
得られたアンモニウム塩溶液の分析結果を表３に示す。スラリー中のカルシウムと等モルの炭酸アンモニウムを加える事で９７．７%のカルシウムが溶液中より除去され、コハク酸はアンモニウム塩溶液として回収された事が示された。炭酸アンモニウムをカルシウムに対し、１.５倍モルと若干過剰とする事でほぼ１００%カルシウムは除去され、コハク酸は完全にアンモニウム塩となっている事が判明した。【００７８】
【表３】
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[実施例３]【００７９】
実施例１と同様にして反応液より得られたコハク酸カルシウム・１水和物結晶を用いて実施例２と同様に炭酸アンモニウム量を変化させた実験を行った。コハク酸カルシウム結晶５０g（コハク酸１９．２g）に水１５３gを添加し、撹拌しながら懸濁してコハク酸１０重量%スラリーを作成した。炭酸アンモニウムを添加し、常温で２時間撹拌しながら反応させた。反応後、遠心して沈殿を除去し、コハク酸アンモニウム溶液を得た。【００８０】
得られたアンモニウム塩溶液の分析結果を表４に示す。スラリー中のカルシウムに対し、炭酸アンモニウムを０．５倍モル以上添加することで、スラリー中のカルシウムを９２%以上沈殿として除去できることが示された。また、炭酸アンモニウムを１．５倍モル以上添加することで、スラリー中のカルシウムの９９％以上を沈殿として除去できることが示された。【００８１】
【表４】
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[実施例４]【００８２】
実施例１と同様にして得られた結晶に関して塩置換を行うが、塩置換工程の仕込みスラリー濃度を変化させて実験を行った。炭酸アンモニウムの投入量はスラリー中のカルシウムに対し、等モルとした。塩置換反応後は遠心して沈殿を除去し、コハク酸アンモニウム溶液を得た。【００８３】
得られたアンモニウム塩溶液の分析結果を表５に示す。実験Ｎｏ１，２，３のすべてにおいて、塩交換を行うことで仕込んだカルシウムを９９％以上沈殿として除去できることが示された。また、実験Ｎｏ．３において、置換後溶液のコハク酸濃度は２８重量％に達しており、コハク酸カルシウムを塩交換することで、濃縮することなく高濃度のコハク酸アンモニウム溶液を取得できることが示された。【００８４】
【表５】
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[実施例５]【００８５】
＜コハク酸結晶の取上げ＞
実施例１にて取得したコハク酸アンモニウム溶液より酢酸添加法（特開２００５−１３９１３７）によるコハク酸結晶の取上げを実施した。コハク酸アンモニウム溶液１．７２kgをロータリーエバポレーターで減圧下、７０℃で濃縮し、コハク酸３８．４重量%溶液を４００g得た。濃縮溶液をビーカーに採り、撹拌しながら酢酸をコハク酸に対し２．４倍モルの１９３g添加した。更にメタノールを反応液に対し２０重量%の１２０g添加し、スラリー溶液を得た。【００８６】
スラリー溶液はろ過し、１１３．６gの結晶を得た。結晶中コハク酸は６１．４%、アンモニアは８．７%であった。コハク酸とアンモニアのモル比は０．９７であり、コハク酸１アンモニウム結晶が得られた事がわかった。【００８７】
上記で得られた結晶に、酢酸を１９４g加え撹拌しながら反応させた。反応させたスラリー液はろ過し、５８．２gの結晶を得た。結晶中のコハク酸含量、酢酸含量およびアンモニア含量はそれぞれ６１．１%、３５．６%および１．２%であった。【００８８】
上記で得られた結晶に対し、５倍量の水で洗浄、ろ過を二回繰り返した後、得られた結晶を乾燥させた。得られた結晶のコハク酸の純度は９６．７%であった。アンモニアおよびカルシウムのコハク酸に対する重量比はそれぞれ０．０３％および０．０４％であり、コハク酸の結晶が得られた事が確認された。【００８９】
［比較例１］
比較として発酵工程でアンモニア中和を行った。反応液を除菌する事によりコハク酸アンモニウム溶液を取得する。
＜発酵工程＞
菌株はコリネバクテリウム・グルタミカムMJ233/Δldh株を用いた。実施例１と同様にして菌体培養およびコハク酸発酵を行うが、水酸化カルシウムの代わりに１２０g/Lのアンモニア水溶液を用いて反応液の中和を行った。
培養２４時間ではグルコースが約３０g/L残存していたため、更に４８時間目まで反応を続けた結果、グルコースは完全に消費され、コハク酸蓄積３２．２g/Lの培養液が２．３４ｋｇ（２．１８L）得られた。グルコースからのコハク酸転換収率は３３%であった。【００９０】
＜除菌工程＞
上記発酵工程で得られた培養液を遠心分離により除菌し、コハク酸アンモニウム溶液を得た。コハク酸濃度は３．１７重量%であり、アンモニアとコハク酸のモル比は２．０８であった。溶液を乾固させて測定したコハク酸の全固形分に占める割合は４４．２％であり、コハク酸＋アンモニアの全固形分に占める割合は５７．５％であった。【００９１】
［比較例２］
比較として発酵工程でマグネシウム中和を行った。反応液を除菌してマグネシウム塩溶液を取得し、更に炭酸アンモニウムで塩置換を行う事によりコハク酸アンモニウム溶液を取得する。【００９２】
＜発酵工程＞
菌株はコリネバクテリウム・グルタミカムMJ233/Δldh株を用いた。実施例１と同様にして菌体培養およびコハク酸発酵を行うが、水酸化カルシウムの代わりに２０５g/Lの水酸化マグネシウムスラリーを用いて反応液の中和を行った。
培養２４時間ではグルコースが約３０g/L残存していたため、更に４８時間目まで反応を続けたが、グルコースは約１０g/L残存していた。コハク酸蓄積４１.４g/Lの培養液が２．５７ｋｇ（２．４０L）得られた。消費したグルコースからのコハク酸転換収率は５６%であった。【００９３】
＜除菌工程＞
上記発酵工程で得られた培養液を遠心分離により除菌し、コハク酸マグネシウム溶液を得た。溶液中のコハク酸濃度は４．５２重量%、マグネシウム濃度は０．８重量%であった。【００９４】
＜塩置換工程＞
除菌して得られたコハク酸マグネシウム溶液４１７gに炭酸アンモニウムを１６．３g投入して撹拌しながら反応させた。２時間反応を続けた結果溶液はスラリー状となった。【００９５】
＜固液分離工程＞
上記で得られたスラリー反応液を遠心して沈殿を分離し、コハク酸アンモニウム溶液を得た。溶液中のコハク酸濃度は４．５２重量%であった。アンモニアとコハク酸のモル比は１．５７であった。溶液を乾固させて測定したコハク酸の全固形分に占める割合は５４．０％であり、コハク酸＋アンモニアの全固形分に占める割合は６６．２％であった。【００９６】
表６に実施例１、比較例１および比較例２における発酵成績を比較した。カルシウム中和によって良好な発酵成績が得られる事が分かった。【００９７】
【表６】
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【００９８】
表７に実施例１、比較例１および比較例２より得られたアンモニウム塩溶液の分析結果をまとめて示す。カルシウム塩発酵より塩置換を経て得られたコハク酸アンモニウム溶液の純度が極めて高い事が分かった。【００９９】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の実施により、コハク酸アンモニウム溶液が効率良く、しかも複雑な工程を経ずに製造することが可能となり、コハク酸アンモニウム溶液からは、公知の方法によりコハク酸が製造され、また、コハク酸製造に再利用可能の副生物のみが産生される。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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