(57)【要約】【課題】  本発明は、アトピー性皮膚炎の予防及び／又は治療のための医薬組成物を提供する。【解決手段】  低分子量ヒアルロン酸を有効成分とするアトピー性皮膚炎の治療又は予防薬を提供する。低分子量ヒアルロン酸はヒアルロン酸２糖〜ヒアルロン酸６糖であり、特に、ヒアルロン酸４糖を用いることができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量ヒアルロン酸を有効成分とするアトピー性皮膚炎の治療又は予防薬。
【請求項２】
低分子量ヒアルロン酸が２糖〜６糖の低分子量ヒアルロン酸である請求項１に記載の治療又は予防薬。
【請求項３】
低分子量ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸４糖である請求項１に記載の治療又は予防薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量ヒアルロン酸を有効成分とするアトピー性皮膚炎の予防及び／又は治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は、アトピー素因と呼ばれるアレルギー体質、例えばアレルギー喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚炎の蕁麻疹を起こしやすい体質の上に、様々な刺激が加わって生じる痒みを伴う慢性の皮膚疾患である。日本皮膚科学会の診断基準では、増悪・寛解を繰り返す、痒みを伴う湿疹を主とする皮膚疾患とアトピー性皮膚炎を定義し、患者の多くはアトピー素因を持つが、アトピー素因を持つことを必要としていない。従って、広義には、接触性皮膚炎なども含めて診断上「アトピー性皮膚炎」とされる場合がある。一般には、広範囲にわたって慢性湿疹の症状を呈し、乾燥して表面が白い粉を吹いたようになり、強い痒みを伴う。患者によっては、赤い湿疹、結節などができ、激しい痒みを伴ったり、
湿潤した局面から組織液が浸出して、激しい痛みを伴う。慢性化すると、鳥肌だったようにザラザラしたものができ、皮膚が次第に厚くなったり、しこりのあるイボ状の痒疹ができることもある。【０００３】
アトピー性皮膚炎は幼児期に発症し、成人に達する前に自然寛解することが多い。しかし、成人まで持ち越す例や、成人してからの発症や再発する例が増加している。アトピー性皮膚炎のアレルギー症状を根本治療する方法はなく、基本的には、ステロイドや抗ヒスタミン剤など、かゆみ止めの薬による対症療法により症状を緩和することを目標としている。外用又は内用ステロイド剤の投与により過剰な免疫を抑制したり、ワセリンなどの保湿剤により乾燥部分を保護する治療が主流である。【０００４】
しかし、最も治療効果が高いと言われているステロイド剤は、本来の症状よりもさらに強くぶり返すリバウンドと呼ばれる現象を起こしたり、長期連続使用により効果の減弱（タキフィラキシー）を起こすこともある。また、長期に渡ってステロイド外用剤を連用すると皮膚萎縮、皮膚感染症の誘発、毛細血管拡張といった障害が出てくることが知られており、症状に応じたステロイドの投与量や投与期間などのコントロールは困難である。ステロイドに代わる副作用が少ない治療薬の開発が求められてきた。【０００５】
アトピー性皮膚炎による乾燥を防ぐため、保湿剤としてヒアルロン酸を含む治療剤が開発されている。例えば、特許文献１には、ε-ポリリジンを有効成分とし、ヒアルロン酸を保湿剤として含有するアトピー性皮膚炎の治療薬が開示されている。特許文献２には、ヒアルロン酸と加水分解シルクを絹不織布に含有せしめたシートをアトピー性皮膚炎の予防及び治療補助に使用することが記載されている。特許文献３には、ボリジ種子油と小麦胚芽から抽出された植物性セラミドを主成分とし、ヒアルロン酸を機能性成分として含む皮膚外用製剤が開示されている。特許文献４には、エイコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸と、保湿剤としてヒアルロン酸を含む皮膚外用剤が記載されている。しかし、ヒアルロン酸は、あくまで保湿剤として使用されており、アトピー性皮膚炎の治療における有効成分として含有されているものではない。また、ヒアルロン酸は、いわゆる高分子量のヒアルロン酸（例えば、重量平均分子量９００,０００程度）であり、低分子量ヒアルロン酸、特にヒアルロン酸４糖を含むものではない。
【特許文献１】特開２００５−０３５９１４号公報
【特許文献２】特開２００３−２１２７１５号公報
【特許文献３】特開２００２−０５３４２８号公報
【特許文献４】特開２０００−０９５６８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アトピー性皮膚炎の予防及び／又は治療に際し、ステロイド剤に代替できる治療効果の高い治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、低分子量ヒアルロン酸、特にヒアルロン酸４糖にアトピー性皮膚炎による炎症を抑える効果があり、投与によりアトピー性皮膚炎の症状を軽減することができることを見いだした。【０００８】
すなわち、本発明は、低分子量ヒアルロン酸を有効成分とするアトピー性皮膚炎の治療又は予防薬を提供する。【０００９】
さらに、本発明では、低分子量ヒアルロン酸は２糖（分子量約４００）、３糖（分子量約６００）、４糖（分子量約８００）、５糖（分子量約１０００）又は６糖（分子量１２００）であってもよい。また、低分子量ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸４糖（分子量約８００）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アトピー性皮膚炎の予防及び／又は治療に際し、副作用が少ない又は副作用がない、治療効果の高い治療薬が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるアトピー性皮膚炎モデルマウスの左耳介厚を測定した結果を示すグラフである。
【図２】実施例１におけるアトピー性皮膚炎モデルマウスの患部を撮影したカラー写真である。
【図３】実施例１におけるアトピー性皮膚炎モデルマウスの掻痒行動を観察（回／１５分間）した結果を示すグラフである。
【図４】実施例２における患者の患部を撮影したカラー写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの２糖繰り返し単位から構成されている高分子の長鎖の多糖であり、一方、オリゴ糖も知られている。
本発明の低分子量ヒアルロン酸とは、ヒアルロン酸２糖、３糖、４糖、５糖又は６糖（分子量約４００〜約１２００）のヒアルロン酸であり、とりわけ、ヒアルロン酸４糖が望ましい。【００１３】
本発明に係る薬剤に含まれる低分子量ヒアルロン酸としては、基本的にはβ-Ｄ-グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ-アセチル-グルコサミン−の３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ-Ｄ-グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル-グルコサミン−とから基本的に構成されるものであれば、２糖単位が１個または複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４,５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。【００１４】
本発明で使用する低分子量ヒアルロン酸としては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。またストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。【００１５】
本発明においては、上記２糖単位１個からなる２糖およびその誘導体のような低分子量のヒアルロン酸を使用することができる。好ましくは２〜２０糖程度の低分子量ヒアルロン酸を挙げることができ、より好ましくは、２〜６糖の低分子量ヒアルロン酸であり（分子量約４００〜約１２００）、最も好ましくはヒアルロン酸４糖である。【００１６】
低分子量ヒアルロン酸は、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法(Biochem., 33(1994)p6503−6507)等の公知の方法によってヒアルロン酸を低分子化する方法、化学的もしくは酵素的に合成する方法(Glycoconjugate J.,(1993)p435−439、WO93/20827)などで製造することが好ましい。例えば酵素分解法としては、ヒアルロン酸分解酵素(ヒアルロニダーゼ(睾丸由来)、ヒアルロニダーゼ(Streptomyces由来)、ヒアルロニダーゼＳＤなど)、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法(新生化学実験講座「糖質ＩＩ−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244−248、1991年発行、東京化学同人参照)などが挙げられる。【００１７】
また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロン酸の溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量ヒアルロン酸を得る方法などが挙げられる。本発明で用いるヒアルロン酸は、薬理学的に許容可能な塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ(ｎ−ブチル)アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであることができる。【００１８】
本発明の薬剤は、特定の分子量のヒアルロン酸単独又は異なる分子量のヒアルロン酸を混合物など特に限定することなく使用できる。本発明のアトピー性皮膚炎の治療剤はヒアルロン酸を有効成分とするものであり、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって、生体に悪影響を与えることなくアトピー性皮膚炎の症状を改善又は予防することができる。【００１９】
本発明の薬剤は、低分子量ヒアルロン酸又はその塩を、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に患部及びその周囲の皮膚に塗布することができる。あるいは、任意の剤形に製剤化して、組織内投与（注射）、経口投与又は経腸投与することができる。【００２０】
皮膚に塗布する薬剤の剤形としては、軟膏、ローション剤、クリーム剤が例示できる。これらの皮膚外用剤の基剤としては、一般に外用製剤中に均一に融解、配合又は分散し得る基剤であれば特に限定は無い。例えば、ワセリン、ひまし油、シリコン、スクワラン、アクリル酸ナトリウム、ベヘニルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、ステアリルアルコール、エタノール、バチルアルコール、フェノキシエタノール、１，３−ブチレングリコール、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸、レシチン、精製水等が例示できるが、これらに限定されない。【００２１】
また、本発明の薬剤は、必要に応じて、抗酸化剤、防腐剤、湿潤剤、粘稠剤、緩衝剤、吸着剤、溶剤、乳化剤、安定化剤、界面活性剤等の添加剤を加えることができる。【００２２】
投与量は、低分子ヒアルロン酸を０．０５〜５％程度含有する軟膏剤の適量を、患部及びその周辺部に１日数回塗布することができる。例えば、ヒアルロン酸４糖として１％濃度で患部に塗布することができる。アトピー性皮膚炎の予防に用いる場合には、アトピー性皮膚炎の発症しやすい個所に同様に塗布する。【００２３】
本発明の薬剤は、患部に塗布することによりアトピー性皮膚炎の症状の進行を抑えたり、症状を緩和したりするための治療薬として使用することができ、また、患部の周辺に塗布したり、アトピー素因を持つが発症していない者、アトピー性皮膚炎の患者が家族にいる者などアトピー性皮膚炎が発症する可能性が高い者に塗布したり、アトピー性皮膚炎の再発防止などのために予防薬として使用することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１：アトピー性皮膚炎モデルマウスを用いたＨＡ４の治療効果の確認］
ＮＣマウスにＰｉＣｌによる感作、誘導により左耳介の炎症を作製し、これに対するＨＡ４配合塗布剤の影響を検討した。その結果、炎症に伴う皮膚の乾燥、痂皮形成・出血、脱毛、掻痒行動ならびに耳介厚等の炎症スコアが低減することが認められた。【００２５】
＜皮膚炎モデルマウスの作成＞
９週齢のＮＣ/Ｎｇａ Ｓｌｃマウスの雄１２匹を日本エスエルシー株式会社より入手し、受入時に外観の検査を行い全例に異常のないことを確認した後、飼育室へ搬入した。飼育は、温度２２±２℃、相対湿度５５±１５％、換気回数１２回／時、明暗時間１２時間に設定した飼育室にて、プラスチック製ケージ（１４．５×２６．０×１２．５ｃｍ）を用いて１匹ずつ飼育した。飼料は固型飼料ローデンラボダイエットＥＱ（日本エスルシー株式会社、ＬｏｔＮｏ. ＡＵＧ２４０６２）を、飲料水は公共水道水をそれぞれ毎日自由摂取させた。９日間の馴化後、馴化期間中の体重増加、一般状態および操作部位の良好な動物を１０匹選び、無作為に５匹ずつの２群に分けた。【００２６】
全例について、ディスポーザブルツベルクリン用シリンジを用いて５％ＰｉＣｌ／エタノール４：アセトン１溶液を、予めバリカンで除毛したマウスの腹部に一匹当たり０．０５ｍＬ塗布し、四肢に一肢当たり０．０２ｍＬ塗布した。さらに、ディスポーザブルツベルクリン用シリンジを用いて、感作４日後より、１％ＰｉＣｌオリーブオイル溶液を、マウスの左耳介部に０．０２ｍＬ、１週間間隔で３回、左耳介の炎症を確認するまで塗布誘導して、皮膚の炎症モデルを作成した。【００２７】
＜被験物質の調製＞
被験物質であるＨＡ４は具体的には、Tawadaらの方法（Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology. 2002; 12(7):421-6.）により調製した。また、被験物質であるＨＡ４配合塗布剤は、表１に記載のとおりに配合したものを使用した。対照物質として、ＨＡ４を含まない基剤のみの塗布剤を使用した。この薬剤に含まれる成分のうちＨＡ４以外は、一般的な基材であり、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患に効果があることは知られていない。【００２８】
【表１】
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【００２９】
＜被験物質の投与＞
１群には、誘導３回目の誘導１時間前に表１に記載の被験物質であるＨＡ４配合塗布剤（株式会社糖質科学研究所製：ＬｏｔＮｏ.０６０６０７、ＨＡ配合量１ｍｇ／ｍｌ）を１日１回左耳介にディスポーザブルツベルクリン用シリンジを用いて０．０２ｍＬ塗布投与した。ＨＡ４配合塗布剤の投与は、誘導３回目以降５週間にわたって行った。残りの１群は陰性対照として、表１に記載の対照物質（株式会社糖質科学研究所製：Ｌｏｔ  Ｎｏ．０６０６０７）を投与した（表２）。【００３０】
【表２】
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【００３１】
＜評価＞
各マウスの一般状態を１日１回以上観察し、感作日、試験終了日およびその他週１回以上体重測定した。さらに、体重及び下記の評価項目のスコアについて、Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を行った。【００３２】
（１）耳介厚計測
感作前、各誘導塗布前ならびに被験物質投与開始日より週１回の各投与前に、マイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社製）を用いて、マウスの左耳介の厚さを計測した。なお、参考のため右耳介についても計測した。
（２）皮膚症状の観察
各誘導塗布の直前ならびに被験物質投与開始日より週１回、投与直前に、マウスの左耳
介について、以下の項目を観察・評価した。
観察項目：発赤、浮腫、脱毛、乾燥、痂皮形成・出血、潰瘍・組織欠損等
評価スコア：無症状（スコア０）、軽度（スコア１）、中等度（スコア２）、重度（スコア３）
（３）掻痒行動の観察
各誘導塗布後１時間ならびに被験物質投与開始日より週１回各投与後１時間から、それぞれ約１５分間、塗布部の掻痒行動を観察し、引っ掻き回数をカウントした。試験終了日に全例のマウスの耳介を写真撮影した。【００３３】
＜試験結果及び考察＞
体重は、対照群に対して被験物質群に有意な差はみられず、対照群及び被験物質群ともにアトピー性皮膚炎症状を示したこと以外に異常は見られなかった。【００３４】
１．耳介厚計測（図１）
左耳介は、対照群及び被験物質群ともに感作後、誘導開始の１週間後には上昇し、２週間後には感作時の厚さに対して両群ともに約２．１倍に達し、アトピー性皮膚炎の症状を呈していた。
ＨＡ４の５週間にわたる投与の翌日（投与第３６日）には、対照群が同１．４８倍、被験物質群同１．３９倍となり、被験物質群の左耳介厚は対照群と比べて有意に減少した。なお、投与開始後９、１６、２３、３０日の各測定時点で対照群に比較して被験物質群の左耳介厚は低値を示したが、有意な差はみられなかった。参考として測定した右耳介厚は、投与第３５日の翌日に対照群に対して５％水準で被験物質群が低値を示した。【００３５】
２．皮膚症状観察
（発赤）
対照群は、左耳介皮膚に第２回誘導時に２／５例、第３回誘導時に全例、投与第９日に対照群の２／５例、軽度の発赤が認められた。
被験物質群は、第２回誘導時に３／５例、第３回誘導時に全例に、軽度の発赤が認められた。投与第９日に被験物質群の１／５例に軽度の発赤が認められ、投与第２３日に被験物質群１／５例のそれぞれに軽度の発赤が認められた。【００３６】
（浮腫）
第３回誘導・投与第１日、投与第９日、投与第１６日に両群とも全例、軽度の浮腫が認められた。
（乾燥）
対照群は、第２回ならびに第３回誘導時に全例に軽度の乾燥が認められ、投与第９日に２／５例、投与第１６日、２３日に１／５例、軽度の乾燥が認められた。
被験物質群は、第２回誘導時に４／５例、第３回誘導時に全例、投与第９日に１／５例、軽度の乾燥が認められた。【００３７】
（痂皮形成・出血）
第２回誘導時に対照群の全例に軽度、第３回誘導時に１／５例に中等度、３／５例に軽度、投与第９日に４／５例、投与第１６日に１／５例、投与第２３日に２／５例の軽度の痂皮形成・出血を認めた。
第２回誘導時に被験物質群の全例、第３回誘導時に３／５例、投与第９日に２／５例、投与第１６日に１／５例の軽度痂皮形成・出血を認めた。
全例に皮膚の潰瘍・組織の欠損はみられなかった。【００３８】
（脱毛）
第３回誘導時ならびに投与第９日の両群全例に脱毛を認めた。投与第１６日の対照群は４／５例、被験物質群は２／５例の脱毛を認め、被験物質群が対照群に対して５％水準で有意に低値を示した。投与第３０日における対照群及び被験物質群の典型的な個体の左耳介の写真を図２に示す。【００３９】
このように、発赤、浮腫、脱毛、乾燥、痂皮形成・出血の各項目で対照群に対して被験物質群が低値を示す例があり、投与第１６日の脱毛では有意に低値を示した。なお、全例の炎症部位に潰瘍・組織の欠損はみられなかった。【００４０】
３．掻痒行動の観察
対照群及び被験物質群について掻痒行動の観察結果をまとめたグラフを図３に示す。第１回誘導時の掻痒回数に対して両群とも第２回誘導時には高値を示し、第３回誘導時には被験物質群のみがさらに高値を示した。
投与第９日以降投与第３５日までは、投与第３０日の対照群の高値を除き、両群ともに掻痒回数は漸次低減した。投与第２３日、３０日、３５日の翌日（３６日）の被験物質群は、対照群に対して低値を示したが、有意な差はみられなかった。【００４１】
以上、ＮＣマウスにＰｉＣｌ感作・誘導により作製した炎症に対して被験物質を投与することによって脱毛、掻痒行動ならびに耳介厚等の炎症スコアが低減した。これらの結果は、ＨＡ４の投与により、アトピー性皮膚炎モデルマウスにおける症状が緩和されることを意味し、ＨＡ４はアトピー性皮膚炎の治療に有効であることを強く示唆するものである。【００４２】
また、被験物質を塗布した反対側である右耳介厚において、対照群と比較して有意に耳介厚が増加したことは、塗布したＨＡ４が皮膚から血中に移行し、全身を巡って反対側へ作用したことを示唆する。このことから、全身症状を呈するアトピー性皮膚炎においての治療に奏功を示すことを強く示唆するものである。【００４３】
［実施例２：アトピー性皮膚炎患者におけるＨＡ４の治療効果の確認］
本発明の薬剤として、表１に記載のＨＡ４配合塗布剤を使用した。【００４４】
１６歳女性（身長１６９ｃｍ、体重５０ｋｇ）のアトピー性皮膚炎に罹っている患者をボランティアとして、上記クリーム剤を塗布した。この患者は、幼少時にアトピー性皮膚炎と診断されており、完治していない。浸潤性紅斑、痒疹、痂皮、掻破、丘疹、掻痒など軽度慢性病変を呈している。患者に上記クリーム剤を朝と夜の入浴後に肘の内側に１週間塗布した。投与後一週間で、慢性病変及び掻痒が消失した（図４）。ヒアルロン酸４糖以外は一般的な基材であり、アトピー性皮膚炎の治療に効果があることは知られていない。したがって、この効果は、ヒアルロン酸４糖の作用であると考えられ、ヒアルロン酸４糖はアトピー性皮膚炎の治療に有効であることが示唆された。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【国際調査報告】
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