【手続補正書】
【提出日】平成16年6月30日(2004.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（I）：
2004137175.tif 000001
〔式中、RはキガマイシンAでは次式
2004137175.tif 000002
の糖鎖を示し、キガマイシンBでは次式
2004137175.tif 000003
の糖鎖を示し、キガマイシンCでは次式
2004137175.tif 000004
の糖鎖を示し、キガマイシンDでは次式
2004137175.tif 000005
の糖鎖を示し、またキガマイシンEでは次式
2004137175.tif 000006
の糖鎖を示す〕で表される化合物である、抗生物質キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンD、およびキガマイシンE、あるいはこれらキガマイシン類の製薬学的に許容される塩。
【請求項２】
アミコラトプシス属に属する、請求項1に記載の一般式（I）のキガマイシンA、B、C、DまたはEの少くとも１つを生産するキガマイシン生産菌を栄養培地に培養し、培養物からキガマイシンA、B、C、DまたはEの少くとも一つを採取することを特徴とする、抗生物質キガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよび（または）キガマイシンEの製造法。
【請求項３】
一般式（I）で表されるキガマイシンの生産菌として、アミコラトプシスsp. ML630−mF1株（独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM BP−10016として寄託）を用いる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
請求項1に記載の一般式（I）で表されるキガマイシンA、キガマイシンB、キガマイシンC、キガマイシンDおよびキガマイシンEの少くとも１つ、またはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、また製薬学的に許容される担体を配合されて含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項５】
抗菌剤組成物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
抗腫瘍剤組成物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の一般式（I）で表される抗生物質キガマイシンA、B、C、DおよびEを生産する特性を持つアミコラトプシスsp. ML630−mF1株（FERM BP−10016）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
（3）次式（Ic）
2004137175.tif 000007
で表される抗生物質キガマイシンCの理化学的性状は次のとおりである。
A)  外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B)  融点：210℃
C)  比旋光度：[α]D24  −154.0°（c 1.00、メタノール）
D)  HPLCでの保持時間（Retention time）値： 7.74分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E)  マススペクトル(m / z)：810.4(M＋H)＋  808.4 (M−H)−
F)  高分解能マススペクトル：実験値  832.27626(M＋Na)＋
計算値  832.27925
G)  分子式：C41H47NO16
H)  紫外線吸収スペクトル：添付図面の図９に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax  nm (ε)  217 (23400)、 236 (21800)、254 (21000)、280 (16600)、341 (10500)
(点線)  0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax  nm (ε)  217 (22700)、 236 (21800)、254 (22200)、280 (17600)、341 (9700)
(破線)  0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax  nm (ε)  280 (14200)、366 (8500)
I)  赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図10に示す。
νmax(cm−1)  2946、2877、2830、1648、1619、1583、1486、1467、1442、1363、1276、1205、1170、1103、1062、944、877、804、624、418 
J)   1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図11に示す。
K)  13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図12に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（5）次式（Ie）
2004137175.tif 000008
で表される抗生物質キガマイシンEの理化学的性状は次のとおりである。
A)  外観及び性質：黄色粉末、酸性物質
B)  融点：210℃
C)  比旋光度：[α]D24  −175.2°（c 1.00、メタノール ）
D)  HPLCでの保持時間（Retention time）値： 16.49分
カプセルパック（タイプUG120Å 5μm、4.6径×150 mm、資生堂製）の高速液体クロマトグラフィーで溶出溶媒として40％アセトニトリル−60％精製水で溶出して測定した場合である。
E)  マススペクトル(m / z)：1098.6 (M＋H)＋  1096.6 (M−H)−
F)  高分解能マススペクトル：実験値  1120.43568(M＋Na)＋
計算値  1120.43654
G)  分子式：C55H71NO22
H)  紫外線吸収スペクトル：添付図面の図1７に10μg/mlの濃度の溶液でのスペクトル図を示す。
(実線) メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax  nm (ε)  217 (38900)、 236 (35100)、254 (33100)、280 (26500)、341 (14300)
(点線)  0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax  nm (ε)  217 (37300)、 236 (35100)、254 (35300)、280 (16700)、341 (15600)
(破線)  0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したUV吸収スペクトル。主なピークは次のとおりである。
λmax  nm (ε)  280 (22500)、366 (13700)
I)  赤外線吸収スペクトル（KBr 錠剤法）：添付図面の図18に示す。
νmax(cm−1)    2975、2935、2834、1650、1619、1583、1469、1442、1376、1311、1276、1203、1162、1105、1062、989、944、877、804、620
J)   1H−NMR スペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図19に示す。
K)  13C−NMRスペクトル(CDCl3／TMS)：添付図面の図20に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
さらに、キガマイシン類は膵臓癌細胞PANC−1細胞に対する殺細胞効果について、通常の細胞培養の条件下より栄養飢餓状態で細胞死を惹起する作用が強い。キガマイシンA、B、C、DおよびEで得た試験の結果を図21に示した。キガマイシンCとDの場合、通常の培地を使用した場合は10μg/mlで100％の細胞死を来たしたが、栄養飢餓状態では0.1g/mlで100％の細胞死を惹起した。固形がんでは、血管新生が追い付かずに栄養飢餓状態にあると考えられ、栄養条件のいい正常部位と比べてキガマイシンは選択的な制癌活性を示すと考えられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
以上の結果より、ML630−mF1株はアミコラトプシス（Amycolatopsis、文献、International Journal of Systematic Bacteriology、36巻、29−37頁、1986年）属に属するものと考えられる。そこで、ML630−mF1株をアミコラトプシス・エスピー（Amycolatopsis sp.）ML630−mF1とする。
なお、ML630−mF1株は、独立行政法人  産業技術総合研究所に寄託申請し、平成14年６月７日、FERM  P−18875として受託された。
また、アミコラトプシスsp.ML630−mF1株は、独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約の規約下にFERM BP−10016の受託番号で寄託されてある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
さらに、第3の本発明に係る医薬組成物は抗菌剤組成物、あるいは抗腫瘍剤組成物であることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
また、第4の本発明では、新規な微生物として、上記の一般式（I）のキガマイシン類を生産する特性をもつアミコラトプシス sp. ML630−mF1株（FERM BP−10016）が提供される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【実施例１】
抗生物質キガマイシンA、B、C、DおよびEの製造
ポテトスターチ2％、グルコース2％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.25％、トーストソーヤミール2％、炭酸カリウム0.32％、硫酸銅0.0005％、塩化マンガン0.0005％、硫酸亜鉛0.005％を含む液体培地（pH7.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110mlずつ分注し、常法により120℃で20分滅菌した。この滅菌した培地に寒天斜面培地に培養したアミコラトプシスML630−mF1株（FERM BP−10016）を接種し、その後30℃で5日間回転振とう培養した。これにより種母培養液を得た。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
上記の二つの酢酸ブチル層を合わせ減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣（約4.1 g）をクロロホルム100 mlと水100 mlで撹拌し、クロロホルム層を濃縮乾固して1.51 g、不溶物として528 mgを得た。それぞれシリカゲル60N（フラッシュクロマトグラフィー用、関東化学）のカラムクロマトグラフィーを行った。クロロホルム層から得た1.51 gは、210 gのシリカゲル60Nを充填したカラム（径5.5 cm）に、不溶物の528 mgは70 gのシリカゲル60Nを充填したカラム（径3.5 cm）にチャージした。それぞれクロロホルム−メタノール混液で展開し、薄層クロマトグラフィーで分析して同一成分を溶出する２活性画分を得た。フラクション186−250を濃縮乾固し、934.9 mg、フラクション186−250を濃縮乾固し、107 mgの固形物を得た。前者の一部の294.8 mgを９分割して、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
シリカゲルクロマトグラフィーのフラクション186−250を濃縮乾固して得た107 mgの固体物質を４分割して、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した。その分画26−30を集め減圧下に濃縮乾固して36.1 mgのキガマイシンAを得た。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
培地３リットルを用いた別の培養からは、同様な精製法を行い、高速液体クロマトグラフィー（Pegasil ODS、径30×250 mm）で40％アセトニトリル−水で溶出した時、分画35−36を集め減圧下に濃縮乾固して1.9 mgのキガマイシンCを得た。分画39−41を集め1.9 mgのキガマイシンBを得た。また分画51−56を集め46.6 mgのキガマイシンD、および分画82−86を集め12.9 mgのキガマイシンEを得た。