(57)【要約】  本発明は、新規なキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡおよびその利用法に関する。具体的には、本発明は、カンディダ シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列を取得し、これを宿主生物に導入することにより、キシロース資化能を有する微生物を生成することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項２】
配列番号２によって示される塩基配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２によって示される塩基配列の遺伝暗号の縮重による変異配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
酵母に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
酵母がカンディダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）である、請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
酵母がカンディダ・シェハタエ ＣＢＳ５８１３（ＮＢＲＣ１９８３）である、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡと、宿主細胞において前記ＤＮＡの発現を調節することが可能な調節配列とを含んでなる、核酸構築物。
【請求項８】
前記ＤＮＡが配列番号１によって示されるアミノ酸配列をコードする、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記ＤＮＡが配列番号２によって示される塩基配列を含む、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記調節配列が宿主細胞に由来するものである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記調節配列がプロモーターである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかである、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記プロモーターが、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＤＣ、ＧＡＬ１／１０、ＴＤＨ３およびＰＧＫ１プロモーターからなる群より選択される、請求項１１または１２に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項７〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１５】
プラスミドである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物、あるいは請求項１４または１５に記載のベクターを含んでなり、それによりキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる微生物。
【請求項１７】
微生物が酵母または細菌である、請求項１６に記載の微生物。
【請求項１８】
酵母または細菌が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）またはペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）の酵母、およびチモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌からなる群から選択される、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１８に記載の微生物。
【請求項２０】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）である、請求項１８に記載の微生物。
【請求項２１】
前記ＤＮＡまたは前記核酸構築物が宿主微生物のゲノムに組み込まれている、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２２】
キシリトールデヒドロゲナーゼを製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）のステップ：
（ａ）請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の微生物を培地中で培養するステップ、および
（ｂ）キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する生成物を、前記微生物または培地から回収するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２３】
キシルロースの発酵を行うのに適した微生物を選択するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の微生物を用いる、エタノールの製造方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のＤＮＡを含むキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現カセット、キシロースレダクターゼ遺伝子発現カセット、およびキシルロキナーゼ遺伝子発現カセットを含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む核酸構築物およびベクター、該ベクターによって形質転換された該ＤＮＡを発現する微生物、ならびにキシリトールデヒドロゲナーゼを製造する方法に関する。本発明の微生物等は、エタノール製造工程、バイオマス製造工程、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+を再生利用する工程等の産業上有用な工程に利用し得る。
【背景技術】
【０００２】
キシロースは、植物のバイオマスと木材に存在する最も豊富な炭水化物の１つであり、リグノセルロース物質の約４０％を構成する。セルロース生産工程においては、キシロースは、ヘミセルロースの主成分であるキシランの加水分解物からの廃棄産物として形成される。炭素資源の有効利用のために、キシロースを発酵によりエタノールやバイオマスに変換することが望まれており、特にエタノールは、液体燃料として大量に使用されようとしている。【０００３】
キシロース、Ｄ−リボースなどのペントースなどを利用することができる酵母として、Ｃａｎｄｉｄａ（非特許文献１、２）、Ｄａｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ（非特許文献３）、Ｐｉｃｈｉａ（非特許文献４）などが知られている。【０００４】
一般的には、生物において、キシロースなどのペントースのエタノールへの変換はペントースのリン酸化を介し、生じたリン酸化ペントースがペントースリン酸経路に入ることによってエタノールに変換される。ペントースのリン酸化は、第一に、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ＋への変換を伴うペントースの還元を要し、この反応はレダクターゼにより触媒される。ペントースの還元によって生じるペンティトールは、次にＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換を伴う酸化に供される。この反応はデヒドロゲナーゼにより触媒される。これら２段階の反応を経て、Ｄ−ペンテュロースが生じ、これがリン酸化酵素によりリン酸化されるとペントースリン酸となる（非特許文献５）。【０００５】
バイオエタノール生産に主として使用される酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、キシロースから変換されて生じるペンテュロースであるキシルロースを利用することができるが、この酵母は、ペントース類を発酵することができない（非特許文献６）。重要なことは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにもペントース発酵タンパク質類をコードする遺伝子が含まれているが、それらは発現しないということである。【０００６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるペントースの発酵は、キシロースを代謝する微生物からのキシロース利用経路を提供することによって可能になるのではないかと考えられている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、細菌のキシロースイソメラーゼ遺伝子を発現するために、多くの試みがなされているが、恐らく外来遺伝子の発現が不十分であるために、キシロースの発酵は達成されていない（非特許文献７〜１０）。【０００７】
一方で、酵母同士の遺伝子を利用する方法として、キシロース資化能を持つＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓからキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させる試みがなされた（特許文献１、２）。また、同様のキシロース資化能を持つ酵母であるＣａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅから、キシロースレダクターゼ遺伝子の単離（非特許文献１１）やキシリトールデヒドロゲナーゼの精製（非特許文献１２）が試みられている。しかしながら、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅのキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、未だに単離された例を見ない。
【特許文献１】日本国特許第３１２２１５３号
【特許文献２】日本国特許第３１９３９１７号
【非特許文献１】Gong, C.S., Chen, L.F., Flickinger, M.C. and Tsao, G.T., Conversion of hemicellulose carbohydrate. Adv. Biochem. Eng. 20:93-118 (1981)
【非特許文献２】Jeffries, T.W., Utilization of xylose by bacteria, yeast and fungi. Adv. Biochem. Biotech. 27:1-32 (1983)
【非特許文献３】Wu,J.F., Lastick, S.M., Updegraff, D.M., Ethanol production from sugars derived from plant biomass by a novel fungus. Nature 321:887-888 (1986)
【非特許文献４】Maleszka, R. and Schneider, H., Fermentation of D-xylose, xylitol and D-xylulose by yeasts. Can. J. Microbiol. 28:360-363 (1982)
【非特許文献５】Barnett, J.A., The utilization of sugars by yeasts. In: Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry; Tipson, R.S. and Horton, D.編; New York: Academic Press.1976, pp.125-235
【非特許文献６】Jeffries, T.W., Emerging technology for fermenting D-xylose. Trends in Eiotechnology 3:208-212 (1985)
【非特許文献７】Sartny, A.V., McConaugh, B.L., Lodo, Z., Sundstrom, J.A., Furlong, C.E. and Hall, B.D., Expression of the Escherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae. Appi. Eur. Microbiol.53:1996-2000 (1987)
【非特許文献８】Amoer, R., Wilhelm, M. and Hollenberg, C.P., The fermentation of xylose - an analysis of the expression of Bacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes in yeast. Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:351-357 (1989)
【非特許文献９】Chan, E.-C., Ueng, P.P. and Chen, L.F., D-xylose fermentation to ethanol by Schizosaccharomyces pombe cloned with xylose isomerase gene. Biotech. Lett.8:231-234 (1986)
【非特許文献１０】Chan, E.-C., Ueng, P.P. and Chen, L.F., Environmental effects on D-xylose fermentation by Schizosaccharomyces cerevisiae. Appl. Biotechnol.20:221-232 (1989)
【非特許文献１１】Govinden, R., Pillay, B., van Zyl, W.H. and Pillay, D., Candida shehatae xylose reductase gene, complete cds., GenBank Direct Submission, Accession AF278715, (2000)
【非特許文献１２】Yang, V.W. and Jeffries, T.W., Purification and properties of xylitol dehydrogenase from the xylose-fermenting yeast Candida shehatae. Appl. Biochem. Biotechnol., 26:197-206 (1990)
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、キシロースをエタノールやバイオマスに効率よく変換する技術に使用し得る、新規のキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、ならびにその利用法を提供することを目的とする。
【発明の要約】
【０００９】
本発明は、以下の特徴を有する。
【００１０】
（１）下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００１１】
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
（２）配列番号２によって示される塩基配列を含む、上記（１）に記載のＤＮＡ。
【００１２】
（３）配列番号２によって示される塩基配列の遺伝暗号の縮重による変異配列を含む、上記（１）に記載のＤＮＡ。
【００１３】
（４）酵母に由来する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ。
【００１４】
（５）酵母がカンディダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）である、上記（４）に記載のＤＮＡ。
【００１５】
（６）酵母がカンディダ・シェハタエ ＣＢＳ５８１３（ＮＢＲＣ１９８３）である、上記（５）に記載のＤＮＡ。
【００１６】
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡと、宿主細胞において前記ＤＮＡの発現を調節することが可能な調節配列とを含んでなる、核酸構築物。
【００１７】
（８）前記ＤＮＡが配列番号１によって示されるアミノ酸配列をコードする、上記（７）に記載の核酸構築物。
【００１８】
（９）前記ＤＮＡが配列番号２によって示される塩基配列を含む、上記（８）に記載の核酸構築物。
【００１９】
（１０）前記調節配列が宿主細胞に由来するものである、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の核酸構築物。
【００２０】
（１１）前記調節配列がプロモーターである、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の核酸構築物。
【００２１】
（１２）前記プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかである、上記（１１）に記載の核酸構築物。
【００２２】
（１３）前記プロモーターが、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＤＣ、ＧＡＬ１／１０、ＴＤＨ３およびＰＧＫ１プロモーターからなる群より選択される、上記（１１）または（１２）に記載の核酸構築物。
【００２３】
（１４）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡまたは上記（７）〜（１３）のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【００２４】
（１５）プラスミドである、上記（１４）に記載のベクター。
【００２５】
（１６）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡ、上記（７）〜（１３）のいずれかに記載の核酸構築物、あるいは上記（１４）または（１５）に記載のベクターを含んでなり、それによりキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる微生物。
【００２６】
（１７）微生物が酵母または細菌である、上記（１６）に記載の微生物。
【００２７】
（１８）酵母または細菌が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）またはペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）の酵母、およびチモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌からなる群から選択される、上記（１７）に記載の微生物。
【００２８】
（１９）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、上記（１８）に記載の微生物。
【００２９】
（２０）シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）である、上記（１８）に記載の微生物。
【００３０】
（２１）前記ＤＮＡまたは前記核酸構築物が宿主微生物のゲノムに組み込まれている、上記（１６）〜（２０）のいずれか１項に記載の微生物。
【００３１】
（２２）キシリトールデヒドロゲナーゼを製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）のステップ：
（ａ）上記（１６）〜（２１）のいずれかに記載の微生物を培地中で培養するステップ、および
（ｂ）キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する生成物を、前記微生物または培地から回収するステップ
を含む、上記方法。
【００３２】
（２３）キシルロースの発酵を行うのに適した微生物を選択するステップをさらに含む、上記（２２）に記載の方法。
【００３３】
（２４）上記（１６）〜（２１）のいずれかに記載の微生物を用いる、エタノールの製造方法。
【００３４】
（２５）上記（１）に記載のＤＮＡを含むキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現カセット、キシロースレダクターゼ遺伝子発現カセット、およびキシルロキナーゼ遺伝子発現カセットを含むベクター。
【００３５】
本発明によれば、キシルロース発酵に関連するキシリトールデヒドロゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組換え的に発現する酵母等の微生物などが提供される。かかるＤＮＡおよび微生物は、バイオエタノール生産、バイオマス生産、食品産業等において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ｃａｎｄｉｄａ  Ｓｈｅｈａｔａｅ由来キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターを構築するための手順の概要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明によれば、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。【００３８】
キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．９）は、キシロースを原料とするキシルロース発酵プロセスの一部を触媒する酵素である。該プロセスの前半は、キシロースからキシリトールが還元的に生成される反応であり、この還元反応は、キシロースレダクターゼ酵素によって触媒される。また、該プロセスの後半は、キシリトールからキシルロースが酸化的に生成される反応であり、この酸化反応は、キシリトールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。キシリトールデヒドロゲナーゼ活性は、ＮＡＤ（Ｐ）＋依存性である。キシロースレダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の両方を、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞に導入することによって、エタノール生産能を向上させる試みも行われている（例えば米国特許第６，５８２，９４４号など）。【００３９】
本発明のＤＮＡは、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（ｃ）配列番号１によって示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
をコードするＤＮＡである。【００４０】
配列番号１によって示されるポリペプチドをコードするＤＮＡは、酵母に由来するものであり、具体的にはカンジダ・シェハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、特にＣａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ ＣＢＳ５８１３（ＮＢＲＣ１９８３）に由来する。【００４１】
本発明において、上記ポリペプチドは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列のみからなってもよいし、あるいは該アミノ酸配列に加えて、例えば該ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端にさらなる配列を含むことができる。そのような付加的なアミノ酸配列の例は、細胞外への成熟タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチド配列である。【００４２】
あるいは、上記ポリペプチドは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体、ホモログ、アナログなども包含する。ここで「同一性」なる用語は、ギャップを導入するかまたはギャップを導入しないで、アミノ酸配列同士をアライメントした際に、完全に一致するアミノ酸数の全アミノ酸数に対する割合（％）を意味する。このようなポリペプチドは、一般に、配列番号１によって示されるアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含み、好ましくは該アミノ酸配列と９２％以上または９３％以上、より好ましくは９５％以上または９７％以上、さらに好ましくは９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものである。【００４３】
同一性が９０％以上である配列を有するタンパク質は、例えば、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬなど）にアクセスして検索することができる。検索システムとして、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを使用することができる。そのような検索のための具体的な操作方法は、例えば高木利久および金久實編「ゲノムネットのデータベース利用法」第２版（１９９８年）、共立出版（東京、日本）に記載されている。【００４４】
あるいは、上記ポリペプチドは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を含む変異体も包含する。ここで、「数個」とは、約１０以下の整数、例えば２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４または２〜３の整数を意味する。【００４５】
アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含む上記変異体が新規でありかつキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、本発明の範囲内に包含される。【００４６】
本発明のＤＮＡによってコードされる上記ポリペプチドにおけるアミノ酸の変異は、配列番号１によって示されるアミノ酸配列中、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性に関わる触媒ドメインや補酵素が作用する補酵素結合ドメインの立体構造（またはコンホメーション）に悪影響を及ぼさないような部位での突然変異であることが好ましい。しかし、酵素活性を著しく低下させることがない限り、触媒ドメインまたは補酵素結合ドメインであっても突然変異を導入することが可能である。補酵素結合ドメインを構成するアミノ酸としては、配列番号１によって示されるアミノ酸配列中、Ａｓｐ２０７、Ｉｌｅ２０８、Ｐｈｅ２０９、Ａｓｎ２１１およびＬｙｓ２１２が挙げられる。また、触媒ドメインを構成するアミノ酸としては、配列番号１によって示されるアミノ酸配列中、Ｃｙｓ４１、Ｈｉｓ６６、Ｇｌｕ６７、Ｓｅｒ９６、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０２およびＣｙｓ１１０が挙げられる。突然変異を導入することによって、例えば、野生型よりも酵素活性が高い、例えば野生型と比べて１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、または５０倍以上増大させることが可能である。あるいは、突然変異を導入することによって、酵素の熱安定性を向上させることもできる。変異の例は、例えばＷａｔａｎａｂｅ，  Ｓ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０（１１）：１０３４０−１０３４９  （２００５）に記載されるような変異を含む。【００４７】
特にアミノ酸間の置換は、構造的または化学的性質の類似したアミノ酸間の保存的置換でもよいし、あるいは、そのような性質の異なるアミノ酸間の非保存的置換でもよい。構造的または化学的性質の類似したアミノ酸は次のように分類することができる。【００４８】
疎水性アミノ酸群には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、プロリンが含まれる。【００４９】
極性アミノ酸群には、セリン、トレオニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、システインが含まれる。【００５０】
芳香族アミノ酸群には、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンが含まれる。【００５１】
酸性アミノ酸群には、グルタミン酸、アスパラギン酸が含まれる。【００５２】
塩基性アミノ酸群には、リジン、アルギニン、ヒスチジンが含まれる。【００５３】
本発明のＤＮＡは、上記のいずれかのポリペプチドをコードする塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡからなり、例えば天然ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られたＤＮＡ、これらのＤＮＡの２つ以上の組合せからなるＤＮＡなどを含む。【００５４】
具体的には、本発明のＤＮＡは、配列番号２によって示される塩基配列を含むＤＮＡである。また、本発明の別のＤＮＡは、配列番号２によって示される塩基配列の遺伝暗号の縮重による変異配列を含むＤＮＡである。該ＤＮＡには、例えば野生型の起源である生物種と異なる生物種において最適のコドンを、遺伝暗号の縮重に基づいて選択し含有させることができる。該変異配列は、塩基配列は相違しても該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列は同一となるような変異を含む配列を意味する。【００５５】
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ技術、ハイブリダイゼーション技術、クローニング技術、部位特異的突然変異誘発技術などの公知の技術を用いて作製することができる。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９８などに詳細に記載されており、本発明のＤＮＡの作製のために利用しうる。【００５６】
はじめに、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅを、例えばＹＰＤ培地、ＹＭ培地などのようにペプトン、グルコース、イーストエキスなどを含む培地中、約２５℃で振とう培養によって増殖したのち、ゲノムＤＮＡを抽出する。配列番号２に示される塩基配列などに基づいて１９〜２５塩基長の正方向プライマーおよび逆方向プライマーを設計・合成し、これらのプライマーを使用し、目的のゲノムＤＮＡを鋳型にし、耐熱性ポリメラーゼおよびＭｇ２＋の存在下でＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ条件は、例えば９４℃１分の処理ののち、９４℃３０秒（変性）、５５℃３０秒（アニーリング）および７２℃３分（伸長反応）を１サイクルとして約３５サイクルの増幅を行い、最後に７２℃７分の処理を行うことを含む。目的のＤＮＡ断片が増幅したかどうかは、アガロースゲル電気泳動によって確認することができる。【００５７】
増幅した目的のＤＮＡ断片を、必要に応じて適切な制限酵素部位を導入したのち、プラスミドなどのベクターに挿入し、適当な宿主細胞に導入し、ＤＮＡ断片のクローニングを行う。ベクターには、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位またはシャイン-ダルガルノ配列、ターミネーター、マルチクローニングサイト、ポリアデニル化シグナルなどを適宜含有させることができる。ベクターは、細菌などの原核生物用ベクター、酵母、菌類などの真核生物用ベクターを使用することができる。種々のベクターが市販されているので、適切なものを選択して使用できる。また、宿主細胞の例は、大腸菌などの細菌、酵母などを含む。【００５８】
部位特異的突然変異誘発技術は、変異部位を含むプライマーを合成し、これを用いたＰＣＲを目的ＤＮＡを含むベクターを鋳型にして行うことを含む。この技術を用いることによって、配列番号２によって示される塩基配列を含むＤＮＡの変異体を作製することができる。【００５９】
本発明はさらに、上記ＤＮＡと、該ＤＮＡの発現を調節することが可能な調節配列とを含んでなる核酸構築物を提供する。【００６０】
本発明において、調節配列は、本発明のＤＮＡの発現を調節することが可能な塩基配列であり、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、リボソーム結合部位またはシャイン-ダルガルノ配列、ターミネーター等を含み、好ましい調節配列はプロモーターを含む配列やターミネーターを含む配列である。【００６１】
本発明の実施形態によれば、該調節配列は宿主細胞に由来するものである。特に宿主としての酵母が本来もつキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の５'側および３'側の調節配列を含むゲノム配列を、本発明の異種ＤＮＡ配列にフランキングしたベクターを作製するときには、酵母細胞のゲノムに、相同組換えによって本発明の異種ＤＮＡを組み込むことができる。【００６２】
上記プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかであってもよい。該プロモーターは、特に限定されないが、例えばＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＤＣ、ＧＡＬ１／１０、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１からなる群より選択されうる。強力プロモーターの選択などプロモーターの選択次第では、それらの元の宿主微生物における本発明のＤＮＡの自然の発現のレベルを越える発現レベルを得ることが可能な場合がある。【００６３】
本発明はさらに、上記ＤＮＡのいずれかまたは上記核酸構築物のいずれかを含むベクターを提供する。【００６４】
ベクターとしては、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ウイルス等が挙げられる。好ましい実施形態では、該ベクターはプラスミドである。該ベクターは、望ましい宿主微生物における複製に適切であり、したがって、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、リボソーム結合部位またはシャイン-ダルガルノ配列、ターミネーター等を適宜選択してベクターに含有させることができる。また、ベクターには、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを導入することができる。【００６５】
本発明は、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現カセットのみならず、これに加えてキシルロキナーゼ遺伝子発現カセット、および／またはキシロースレダクターゼ遺伝子発現カセットを任意で含むベクターも包含する。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えば配列番号１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または上記のような該ポリペプチドの変異体、ホモログもしくはアナログをコードするＤＮＡ配列でありうる。キシルロキナーゼ遺伝子は、例えば配列番号２６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または上記のような該ポリペプチドの変異体、ホモログもしくはアナログをコードするＤＮＡ配列でありうる。キシロースレダクターゼ遺伝子は、例えば配列番号２４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または上記のような該ポリペプチドの変異体、ホモログもしくはアナログをコードするＤＮＡ配列でありうる。【００６６】
本発明において「発現カセット」とは、プロモーターおよびターミネーターその他の、宿主における遺伝子発現に必要とされる調節配列を、目的の遺伝子配列と機能的に連結することにより作製される核酸構築物である。該構築物を宿主に導入することにより、該宿主において目的の遺伝子が発現される。本発明において「機能的に連結された」とは、目的遺伝子に連結された調節配列が、所望の様式で目的遺伝子の発現に作用しうるように連結されていることを意味する。各遺伝子の発現は、連続的であってもよいし、あるいは同時であってもよい。本発明のこのようなベクターの構築例は図１に示されており、キシロース等を原料としてエタノールを生産するために有効に使用できる。【００６７】
本発明はさらに、上記ＤＮＡのいずれか、上記核酸構築物のいずれか、または上記ベクターのいずれかを含んでなり、それによりキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる微生物を提供する。【００６８】
ベクターを微生物細胞内に導入するときには、形質転換、形質導入などの慣用の手法を利用する。そのような手法には、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法などが含まれる。【００６９】
該微生物の例は、限定されないが、酵母、菌類または細菌である。好ましくは、該微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属またはＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属の酵母、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ属の細菌からなる群から選択される。好ましくは、該微生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅである。【００７０】
上記微生物においては、前記ＤＮＡまたは前記核酸構築物が、宿主微生物のゲノムに組み込まれることが可能である。ゲノムへの組み込みは、前記ＤＮＡまたは核酸構築物の上流および下流に、当該宿主微生物のゲノム由来の配列を連結することにより実現することができる。宿主細胞ゲノムへの塩基配列の組み込みに適した方法は当業者に公知である。前記ベクターを宿主細胞のゲノムとは別に細胞内に存在させることもできる。この場合、ベクターは自律的に複製可能であるべきである。【００７１】
本発明の微生物は、キシロースからエタノールへの変換プロセスを仲介する別の酵素をコードするさらなるＤＮＡを含むことができる。別の酵素は、例えばキシロースレダクターゼ、キシルロキナーゼ等であり、好ましくはキシロースレダクターゼである。このような酵素類は、本発明に関わるキシリトールデヒドロゲナーゼ酵素と同じ起源の微生物に由来してもよいし、あるいは異なる起源の微生物に由来してもよい。また、酵素活性や熱安定性を高めるための突然変異処理（微生物に対して紫外線、ガンマ線、電子イオンビームなどの高エネルギー線照射、ニトロソグアニジン、ニトロソウレア、亜硝酸などの化学変異原による処理などを実施する）を施したものであってもよい。【００７２】
本発明はさらに、キシリトールデヒドロゲナーゼを製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）上記の微生物のいずれかを培地中で培養するステップと、（ｂ）キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する生成物を、前記微生物または培地から回収するステップとを含む。微生物からのかかる生成物の回収は、例えば超音波により微生物細胞を破砕することにより行うことができる。かかる生成物を培地から回収するためには、上記ポリペプチドが微生物細胞内で翻訳された後、これが細胞外へと分泌されるようにすることが必要である。このために、例えば該ペプチドのアミノ末端に分泌シグナルが連結された状態でポリペプチドを発現することができる。【００７３】
微生物の培養条件は、微生物の種類に応じて好適な条件を任意に選択することができる。培地は、一般に、炭素源、窒素源および無機塩を含有し、炭素源の例は、グルコース、マルトース、スクロース、ラクトース、デンプンをはじめとする糖類などであり、窒素源の例は、硫酸アンモニウム、硝酸塩などの含窒素無機塩、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキスなどであり、無機塩の例は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、鉄族金属塩などである。培養の様式は、静置培養、振盪培養、通気培養、連続培養などを含む。培養温度は約１５〜６０℃、通常約２５〜４０℃であるが、この範囲に限定されないものとする。【００７４】
生成した酵素の活性は、例えば３５℃、３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）＋の還元を測定することによって行うことができる（Ｒｉｚｚｉ，  Ｍ．ら，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６７：２０−２４  （１９８９））。標準アッセイ混合物は、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および３００ｍＭキシリトールを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に溶解した溶液である。反応は、最終容量１．０ｍｌとなるように２０ｍＭ  ＮＡＤ（Ｐ）＋を１００μｌ添加することによって開始される。酵素活性は、例えば１分間あたりにＮＡＤ（Ｐ）Ｈを１μｍｏｌ生成する酵素活性を１単位として表すことができる。【００７５】
キシリトールデヒドロゲナーゼ酵素の精製は、タンパク質化学の一般的な手法を組み合わせて行うことができる。そのような手法の例は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、等電点電気泳動、塩析、硫安分画、透析、限外濾過などを含むが、これらに限定されない。【００７６】
本発明の実施形態によれば、上記方法は、キシルロースの効率的発酵を行うのに適した微生物を選択するステップをさらに含むことができる。これにより、キシルロースの発酵をより効率的に触媒するポリペプチドを得ることができる。キシルロースの発酵効率を評価するためには、例えば、キシロースまたはキシリトールを含む培地中で微生物を一定時間培養し、その後、培地中に含まれるキシロース濃度を測定する。【００７７】
本発明はさらに、上記微生物のいずれかを用いるエタノールの製造方法を提供する。該微生物は、微生物の増殖を可能にするような固相に固定化されていてもよい。このような固相の例は、ポリウレタンおよびその誘導体などのポリマー、アルギン酸塩やカラギーナンなどの多糖類などであるが、これらに限定されない。【００７８】
エタノール生産におけるより好ましい炭水化物は、キシロースである。したがって、キシロースを発酵することができるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよび／またはＺｙｍｏｍｏｎａｓの菌株は、エタノールの製造に非常に有利である。本発明の酵母菌株は、濃厚炭水化物溶液を発酵する能力があり、高度のエタノール耐性をもち、高められた濃度のエタノールを製造する能力がある。それらは、繰返し再利用のための高い細胞生存性をもち、ｐＨと温度耐性を示す。キシロースの製造の工程において、キシロースは、キシランの加水分解からの廃棄物質として形成される。キシランは、ヘミセルロースの主要成分である。したがって、エタノール、および／またはバイオマスの製造にキシロースを使用することは、大いに有利である。さらに、本発明の微生物に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性キシロースレダクターゼ遺伝子を導入することによって、キシロースからキシルロースへの変換が容易となる。この場合、還元反応のために、このキシロースレダクターゼ酵素は、例えばアミノ酸の製造のためのバイオリアクターにおいて、特に相当する補酵素を運搬するか、再生利用する（ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ＋へ）のに適している。
【実施例】
【００７９】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、本発明の範囲は実施例によって制限されないものとする。【００８０】
実施例１：Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅ由来キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の単離および配列決定
染色体ＤＮＡの単離
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅのＮＢＲＣ１９８３（ＣＢＳ５８１３）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部より購入した。また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＴＣＣ６０７１５は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した。これらの酵母を２５℃で、ＹＰＤ培地（ペプトン２％、イーストエキス１％、グルコース２％）による振とう培養で静止期まで生育させ、Ｇｅｎとるくん（タカラバイオ株式会社・大津）を用い、その添付されたプロトコールに従って染色体ＤＮＡ単離を行った。【００８１】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子塩基配列の決定
核酸配列データベース、ＧｅｎＢａｎｋより、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ｔｏｒｏｐｉｃａｌｉｓのキシリトールデヒドロゲナーゼのＤＮＡ配列（登録番号はそれぞれ、ＤＤ２７８６４２およびＤＱ２０１６３７）を取得し、遺伝子解析ソフトであるＧｅｎｅｔｙｘ（株式会社ゼネティックス・東京）を用いて配列比較を行い、類似性の高い領域から配列番号３および配列番号４で示した配列を取得した。これら２つの配列番号で示した配列をプライマーとして用い、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅのＮＢＲＣ１９８３の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）およびＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオ株式会社）を用いてＰＣＲを行った。反応のプログラムは、以下のとおりである：９４℃・１分間、（９４℃・３０秒間、５５℃・３０秒間、７２℃・３分間）×３５サイクル、７２℃・７分間。得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルにより電気泳動したところ、約９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅されていることが観察された。【００８２】
ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社・東京）を用いて上記で得られた断片のクローニングを行った。得られた形質転換体よりプラスミドを回収し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社・東京）を用いてシーケンシング反応を行い、ＤＮＡジェネティックアナライザー３１００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社・東京）を用いて塩基配列決定を行った。得られた塩基配列より、配列番号５および配列番号６で示した配列を取得した。【００８３】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅのＮＢＲＣ１９８３の染色体ＤＮＡを様々な制限酵素で切断し、セルフライゲーションさせたものをエタノール沈殿によって回収した。これを鋳型として、配列番号５および配列番号６で示した配列をプライマーとして用い、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲを行った。反応のプログラムは以下のとおりである：９４℃・１分間、（９８℃・２０秒間、６８℃・１０分間）×３０サイクル、７２℃・７分間。得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルにより電気泳動したところ、約２３００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅されていることが観察された。【００８４】
ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社・東京）を用いて上記で得られた断片のクローニングを行った。得られた形質転換体よりプラスミドを回収し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社・東京）を用いてシーケンシング反応を行い、ＤＮＡジェネティックアナライザー３１００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社・東京）を用いて塩基配列決定を行った。【００８５】
得られた塩基配列を、先に得られた約９００ｂｐのキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子部分長の塩基配列とアッセンブルし、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅのキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子コード領域の塩基配列を得た。その結果を、配列番号２に示す。【００８６】
実施例２：キシリトールデヒドロゲナーゼ発現ベクターの構築および酵母への導入
キシリトールデヒドロゲナーゼ発現ベクターの構築は、図１に示した手順に従い実施した。以下に詳細を述べる。なお、以下に記載するＰＣＲの条件は、以下のとおりである：９４℃・１分間、（９４℃・３０秒間、５５℃・３０秒間、７２℃・３分間）×３５サイクル、７２℃・７分間。【００８７】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（ストラタジーン社）をＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化し、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ  ＴＥ１００（インビトロジェン社）を用いて短い方の断片を除去した。一方、配列番号７および配列番号８のオリゴＤＮＡを、９５℃で５分間加熱することにより変性させた後、室温に放置して自然にアニーリングさせた。これを前述のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位にクローニングすることにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位との間にＮｈｅＩ部位およびＳｐｅＩが挿入されたベクターであるｐＢＳＮＳを構築した。【００８８】
配列番号２に示した配列に基づき、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅するためのプライマー（配列番号１７および配列番号１８）を作製した。また、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓのゲノム配列に基づき、配列番号６〜１６、配列番号１９および配列番号２０のオリゴＤＮＡを作製した。【００８９】
ＴＤＨ３プロモーター断片（ＰｓＴＤＨ３ｐ）は、以下のように取得した。配列番号９および配列番号１０のオリゴＤＮＡの組み合わせ、ならびに配列番号１１および配列番号１２のオリゴＤＮＡの組み合わせをそれぞれプライマーとして用い、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ゲル濾過カラムを用いて、得られたそれぞれの産物からプライマーを除去した。該２種類の産物を混合して鋳型とし、配列番号９および配列番号１２のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ＴＤＨ３プロモーター断片を得た。得られたプロモーター断片は、５’末端にＮｈｅＩを有し、３’末端にＢａｍＨＩ部位とＡｐａＩ部位をこの順序で有し、さらにプロモーター配列内部のＮｈｅＩが除去されている。【００９０】
ＴＤＨ３ターミネーター断片（ＰｓＴＤＨ３ｔ）は、配列番号１３および配列番号１４のオリゴＤＮＡの組み合わせをプライマーとして用いて、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得した。得られたターミネーター断片は、５’末端にＢａｍＨＩ部位とＡｐａＩ部位をこの順序で有し、且つ３’末端にＳｐｅＩ部位を有する。【００９１】
これらの断片は、ＴＤＨ３プロモーター断片の３’末端とＴＤＨ３ターミネーターの５’末端とが対応するように設計されている。これら２種類の断片を混合して鋳型とし、配列番号９および配列番号１４のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行って、ＴＤＨ３プロモーターとＴＤＨ３ターミネーターとがＢａｍＨＩ部位およびＡｐａＩ部位を間にはさんで連結された断片を作製した。得られた断片を、５’末端のＮｈｅＩ部位および３’末端のＳｐｅＩ部位を用いて上記ｐＢＳＮＳのＮｈｅＩ−ＳｐｅＩ部位に挿入し、ｐＰｓＥｘｐＢＳを構築した。【００９２】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７および配列番号１８のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片（ＣｓＸＹＬ２）を得た。また、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５および配列番号１６のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓキシロースレダクターゼ遺伝子断片（ＰｓＸＹＬ１；配列番号２３）を得た。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を翻訳したキシロースレダクターゼタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２４に示す。【００９３】
配列内部に存在するＸｂａＩ部位が除去されたＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓキシルロキナーゼ遺伝子断片（ＰｓＸＹＬ３；配列番号２５）は、以下のように取得した。Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９および配列番号２０のオリゴＤＮＡの組み合わせ、ならびに配列番号２１および配列番号２２のオリゴＤＮＡの組み合わせをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。ゲル濾過カラムによって、得られたそれぞれの産物からプライマーを除去した。該２種類の産物を混合して鋳型とし、配列番号１９および配列番号２２のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓキシルロキナーゼ遺伝子断片（ＰｓＸＹＬ３；配列番号２５）を得た。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を翻訳したキシルロキナーゼタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２６に示す。【００９４】
得られたＣｓＸＹＬ２、ＰｓＸＹＬ１およびＰｓＸＹＬ３の各遺伝子断片は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を、３’末端にＡｐａＩ部位をそれぞれ有する。これらの制限部位を利用して、各遺伝子断片を上記のベクターｐＰｓＥｘｐＢＳのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ部位に挿入した。得られたベクターは、それぞれＣｓＸＹＬ２ＥｘｐＢＳ、ＰｓＸＹＬ１ＥｘｐＢＳ、ＰｓＸＹＬ３ＥｘｐＢＳと命名した。【００９５】
ＣｓＸＹＬ２ＥｘｐＢＳをＳｐｅＩで消化し、続いて脱リン酸化反応に供した。ＰｓＸＹＬ３ＥｘｐＢＳより得たＰｓＸＹＬ３発現カセットを含むＮｈｅＩ−ＳｐｅＩ断片を、上記の消化済みＣｓＸＹＬ２ＥｘｐＢＳのＳｐｅＩ部位にライゲーションし、ＣｓＸＹＬ２発現カセットの３’側にＰｓＸＹＬ３発現カセットが同じ向きで挿入されたプラスミドＣＰｘＢＳを得た。次に、ＣＰｘＢＳをＳｐｅＩで消化し、続いて脱リン酸化反応に供した。ＰｓＸＹＬ１ＥｘｐＢＳより得たＰｓＸＹＬ１発現カセットを含むＮｈｅＩ−ＳｐｅＩ断片を、上記の消化済みＣＰｘＢＳのＳｐｅＩ部位にライゲーションし、ＣｓＸＹＬ２発現カセット、ＰｓＸＹＬ３発現カセット、ＰｓＸＹＬ１発現カセットがこの順序で、同じ向きで挿入されたプラスミドＣＰＰｘＢＳを得た。【００９６】
ＣＰＰｘＢＳをＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化し、ＣｓＸＹＬ２発現カセット、ＰｓＸＹＬ３発現カセット、ＰｓＸＹＬ１発現カセットを含むＮｈｅＩ−ＳｐｅＩ断片を精製し、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社）のＳｐｅＩ部位に挿入し、ＣＰＰｘＹＥＳを得た。【００９７】
ブドウ酒用きょうかい３号酵母（（財）日本醸造協会）より定法に従ってｕｒａ３変異株ＫＹ１０９４を取得した。リチウム法によって、ＫＹ１０９４にＣＰＰｘＹＥＳまたはｐＹＥＳ２を導入した。これにより、ＣｓＸＹＬ２発現カセット、ＰｓＸＹＬ３発現カセット、ＰｓＸＹＬ１発現カセットがこの順序で、同じ向きで挿入されたベクター（ＣＰＰｘＹＥＳ）を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体と、これらの発現カセットが挿入されていないベクター（ｐＹＥＳ２）を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体（対照）を得た。【００９８】
実施例３：キシリトールデヒドロゲナーゼ活性の測定
以下に示すとおり、得られたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体のキシリトールデヒドロゲナーゼ活性測定を実施した。【００９９】
前培養としてＳＤ−ｕｒａ（２％グルコース）２ｍＬ／試験管に菌株を接種し、２５℃で２４時間振盪培養した。前培養液２００μＬをＳＤ−ｕｒａ（２％グルコース）５ｍＬ／試験管に菌株を接種し、１２０ｒｐｍ、２５℃で２４時間の本培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を回収し、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノールで洗浄した後、再度１ｍＬの同緩衝液で懸濁した。この菌体懸濁液に１ｇのＧＬＡＳＳ  ＢＥＡＤＳ  ２１２−３００ｍｉｃｒｏｎｓ（ＳＩＧＭＡ）を添加し、ＭＩＸ−ＴＯＷＥＲ  Ａ１４（ＴＡＩＹＯ）を用いて、４℃で１５分間、菌体の破砕を行った。１２０ｒｐｍ、４℃、５分間遠心を行い、上清を回収して粗酵素液とした。粗酵素液はブラッドフォード法でタンパク質濃度を測定した。標準タンパク質にはウシ血清アルブミンを用いた。【０１００】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣl（ｐＨ８．０）、５mＭ  塩化マグネシウム、３ｍＭ  ＮＡＤ＋、１００ｍＭキシリトール、５％（ｖ／ｖ）粗酵素液の反応系で３０℃、１０分間反応を行い、３４０ｎｍの波長での吸光度を測定した。ＮＡＤＨを用いて検量線を作成し、酵素活性１単位を１ｍｇのタンパク質あたり１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを産生する酵素量（比活性）として算出した。結果を以下に示す。なお、数値は９ロットの平均値±標準偏差として表示した。
【表１】
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【０１０１】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅのキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現カセットを担持するベクターで形質転換された菌株のみで、酵素活性が検出された。このことから、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅのキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子から発現したタンパク質が目的の活性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明のＤＮＡおよび微生物は、バイオエタノール生産、バイオマス生産、食品産業等において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号３、４、７〜２２：プライマー
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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