【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年3月12日(2004.3.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】除草剤抵抗性植物
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えDNA技術に関し、特に(i)非トランスジェニック様植物と比較した場合に、除草剤に対して実質的な抵抗性又は実質的な耐性を示すトランスジェニック植物；及び(ii)同様にかかる非トランスジェニック様植物と比較した場合に比較的高められた濃度の脂溶性酸化防止剤を含有するトランスジェニック植物の作成に関する。本発明はまた、特に前記のトランスジェニック植物の作成に使用される場合又は該トランスジェニック植物によって産生される場合のヌクレオチド配列（及びその発現生成物）に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
除草剤に暴露された際に除草剤に実質的に“耐性”である植物は、同様に除草剤に暴露された非耐性様植物によって提供される用量／応答曲線と比べた場合に、右方向にシフトした用量／応答曲線を提供する。このような用量／応答曲線では、Ｘ軸に“用量”がプロットされ、Ｙ軸に“殺草率”、“除草効果”などがプロットされる。耐性植物は、所定の除草効果を得るためには、典型的に非耐性様植物の少なくとも２倍の除草剤を必要とするであろう。除草剤に対して実質的に“抵抗性”である植物は、農業社会によって田畑で雑草を防除するために典型的に使用される濃度及び量の除草剤に暴露された場合には、たとえあったとしても壊死、細胞溶解、白化又はその他の損傷をほとんど示さない。
【０００３】
本発明の内容の範囲内で、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（HPPD）という用語、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（4-HPPD）という用語及びp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（p-OHPP）という用語は、同意語である。
【０００４】
HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドを用いて植物材料を形質転換させることからなるHPPD除草剤抵抗性植物を提供する方法が知られている。しかし、種々のHPPD酵素が種々のHPPD阻害剤型除草剤(HPPD-inhibitor herbicide)に対して種々のレベルの耐性を提供することは、これまでに一般的に認識されていなかったことである。所定のHPPD酵素は、ある種のHPPD阻害剤型除草剤に対して有用なレベルの耐性を付与し得るが、例えば種々の範囲の雑草を防除し得るか、より安価に調製し得るか又は環境上の利点を提供し得る別のさらに望ましいHPPD阻害剤型除草剤に商業的レベルの耐性を付与することは、全く不適当なことではないのかもしれない。本発明はまた、特定のHPPD酵素及びそれをコードするポリヌクレオチドのほかに、特定のHPPD阻害剤型除草剤に対して商業上有用なレベルの耐性を付与するのに適したHPPD酵素を選択する手段も提供する。
【０００５】
商業上有用な施用量の所望のHPPD除草剤に対して耐性をもつ植物を提供するためには、所望のHPPD除草剤又は一群のHPPD除草剤による阻害に対して低下した感受性をもつHPPD酵素をコードするポリヌクレオチドを使用することが好都合であろう。この生体外でのHPPD除草剤による阻害に対する“低下した感受性”という特徴は、本明細書では“増大した抵抗性”又は“固有の耐性”とも表現される。
【０００６】
シュードモナス種(Pseudomonas sp.)のHPPDの幾つかの突然変異体は、酵素に対する阻害剤の結合の明らかに減少した割合(rate)を示すことに基づいて（すなわち、平衡Ｅ＋Ｉ←→ＥＩにおけるｋonに本質的に対応する測定値に基づいて、下記参照）かかる増大した抵抗性を示すことが要求される。しかし、かかる突然変異酵素体は、低下した触媒活性及び／又は低下した安定性を有し、この性質は恐らくはかかる突然変異酵素体を特に温暖気候作物、特にHPPD阻害剤型除草剤が一般的に最も有用な範囲の雑草防除を提供するトウモロコシ及びダイズに使用することを不適当にする。これまで種々の起源から得られる種々の突然変異していない野生型HPPD酵素が有用且つ種々の固有のレベルの耐性を同様に示すことができることや、また突然変異していない野生型酵素が、一般的に突然変異誘導体よりも相当に良い安定性と活性(kcat／Ｋm)とを示すことからトランスジェニック植物に使用することが好ましいことは、これまでに知られていなかった。
【０００７】
また、これら野生型HPPD酵素又は実際に突然変異したHPPD酵素の固有の耐性のレベルをHPPD阻害剤の具体的な種類及び構造に従って著しく変えることができることは、これまでは認識されていなかった。これらの耐性の違いが、従来使用されている検定方法によって処理されるパラメーターｋonの違いではなく、むしろパラメーターＫd及びｋoffの違いにその根拠があることはこれまで知られていなかった。また、これらの固有の耐性の違いは、例えば、異なる植物種から誘導される配列類似のHPPD酵素同士のように比較的に類似したアミノ酸配列を有するHPPD酵素同士の間でさえ著しく且つ有用であり得ることも認識されていなかった。自生作物の防除に有用な作用をもつ除草剤の種類について最も幅広い選択範囲を維持し且つ雑草に対する遺伝子流動の起こり得る影響を最小限にするためには、トランスジェニック植物に付与される除草剤耐性がHPPD阻害剤型除草剤のある種の所望のサブクラスだけに対してのみ優先的に発現されることが望ましい。これは、特定の一組のHPPD除草剤型に対して抵抗性を受け渡すのに最も適した特定のHPPD酵素を選択できるという別の利点である。
【０００８】
“特異的な”という用語が、特定のタンパク質の抵抗性に関連して、特定の除草剤又は除草剤群に対して使用される場合には、この用語はある程度の感受性、特に高濃度(非商業的施用量)の除草剤が施用される場合において ある程度の感受性を除外しないことは明らかである。
【０００９】
“トリケトン除草剤”とは、シクロヘキサン-1,3-ジオン又はビシクロ[3,2,1]オクタン-2,4-ジオンの誘導体を意味する。
【００１０】
“syncarpic acid”とは、4,4,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリオンの誘導体を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、アミノ酸配列 ＱＩＫＥＣＱ と、配列 Ｆ，(Ｄ/Ｅ)，Ｆ，(Ｍ/Ｌ)，Ｗ１，(Ｐ/Ａ)，Ｐ，Ｗ2，Ｘ，Ｘ，Ｙ，Ｙ〔式中、Ｗ1はＡ又はＰであり且つ(i)Ｗ１がＡである場合にはＷ2はＰ、Ａ、Ｑ又はＬであり；あるいは(ii)Ｗ1がＰである場合にはＷ2はＰ、Ａ、Ｑ又はＴであり、且つＸはアミノ酸である〕とを有してなるトリケトン阻害剤特異的耐性HPPD酵素が提供される。
【００１２】
また、本発明は、アミノ酸配列 ＰＰＴＰＴと、配列Ｆ，(Ｄ/Ｅ)，Ｆ，(Ｍ/Ｌ)，Ｗ1，(Ｐ/Ａ)，Ｐ，Ｗ2，Ｘ，Ｘ，Ｙ，Ｙ〔式中、Ｗ1はＡ又はＰであり且つ(i)Ｗ１がＡである場合にはＷ2はＰ、Ａ、Ｑ又はＬであり；あるいは(ii)Ｗ1がＰである場合にはＷ2はＰ、Ａ、Ｑ又はＴであり、且つＸはアミノ酸である〕とを有してなるトリケトン阻害剤特異的耐性HPPD酵素を提供する。
【００１３】
本発明の酵素の好ましい態様において、該酵素はさらに次の配列：
(i)   (Ｌ/Ｖ)，Ａ，Ｓ，Ｘ，Ｄ，Ｖ，Ｌ 
(ii)   (Ｒ/Ｑ)，Ａ，Ｒ，(Ｓ/Ｔ)，(Ｐ/Ａ)，Ｍ，Ｇ，Ｇ
(iii)  (Ｋ/Ｄ/Ｅ/Ｎ)，Ｙ，Ｙ，(Ｄ/Ｅ)，Ｇ，Ｖ，Ｒ，Ｒ
(iv)  Ｑ，Ｅ，Ｌ，Ｇ，Ｖ，Ｌ
(v)   (Ｈ/Ｙ)，(Ｈ/Ｎ)，Ｇ，Ｇ，(Ｐ/Ｓ)，Ｇ，Ｖ
(vi)  Ｅ，Ｋ，Ｄ，Ｅ，(Ｒ/Ｖ/Ｋ/Ｑ)，Ｇ，(Ｑ/Ｒ/Ｅ)，Ｅ 
（式中、Ｘはアミノ酸である）の少なくとも一つを有する。
【００１４】
本発明のHPPD阻害剤耐性HPPD酵素は、下記の構造式ＩのHPPD阻害剤と複合体を形成し得、前記複合体のpH7.0及び25℃の水における解離定数(Ｋd)は1.0〜30 nMの範囲内にあり及び／又は該複合体のpH7.0及び25℃の水における解離速度定数は４×10-5 〜 ２×10-3s-1 の範囲内にある。
【００１５】
構造式Ｉ：2-(ニトロ-4-メタンスルホニルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオン
2004528821.tif 000001
【００１６】
前記のHPPD阻害剤耐性HPPD酵素のヒドロキシフェニルピルビン酸値kcat／Ｋm はpH7.0及び25℃で0.8〜5.0 s-1μM-1の範囲内にあり得る。
【００１７】
また、本発明は、HPPD阻害剤耐性HPPD酵素(但し、トウモロコシ、コムギ及びオオムギから誘導されるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素を除く)であって、シロイヌナズナ(Arabidopsis)から誘導されたHPPD酵素と比較して、前記の耐性酵素が後記の式１及び／又は式２から選択される除草剤に対して、後記の式３及び／又は式４から選択される除草剤に対する抵抗性と比べて、少なくとも2.5倍、好ましくは４倍高められた抵抗性を示すものであることを特徴とするHPPD阻害剤耐性HPPD酵素が提供される。構造式がケト型で描かれる場合には、これらの構造はエノール型でも存在することができること及びこれらの全て及びその他の互変異性体の全ても次の式の範囲内に包含されることに注目される。
【００１８】
式１
2004528821.tif 000002
〔式中、Ar基であるＡ、Ｂ、Ｄ及びＥはそれぞれ独立して置換されていてもよいフェニル基及び置換されていてもよいヘテロアリール基から選択される。Ｒ1又はＲ2あるいはその両方はＨ原子であり、Ｒ3及びＲ4は共にＨ原子であり且つＲ5又はＲ6あるいはその両方はＨ原子である。Ｒ8及びＲ9は共にＨ原子であり且つＲ10又はＲ11あるいはその両方はＨ原子である。Ｒ12又はＲ13あるいはその両方はＨ原子であり且つＲ14又はＲ15あるいはその両方はＨ原子である。これらの定義とは別に、Ｒ1〜Ｒ17 はそれぞれ独立してＨ原子、-Ｃ1〜Ｃ4アルキル基、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル基、ハロゲン原子、基OH、SH、CN、-NH2、
-NHCOR、-CONHR、-COR、-SR、-SOR、-SO2R、NHR-SO2R、-CO2R、-NO2、-CF3、-SF5、-OR、及び-CO2H（基中、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子及びＣ1〜Ｃ4アルコキシ基からなる群から選択される１個又はそれ以上の置換基で置換されていてもよいアリール基である）からなる群から選択される〕。
【００１９】
前記の基Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥの任意の置換基としては、-Ｃ1〜Ｃ4アルキル基、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル基、ハロゲン原子、基 OH、SH、CN、-NH2、-NHCOR、-CONHR、-COR、-SR、-SOR、-S02R、NHR-S02R、-CO2R、-NO2、-CF3、-SF5、-OR、及び-CO2H（但し、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子及びＣ1〜Ｃ4アルコキシ基からなる群から選択される置換基の１個又はそれ以上で置換されていてもよいアリール基である）が挙げられる。
【００２０】
本発明の方法の好ましい態様において、Ａrは置換フェニル基であり且つＲ1〜Ｒ3、Ｒ5及びＲ6はそれぞれＨ原子であり且つＲ4はＨ原子ではない。また、さらに好ましい態様においては、Ａrは置換フェニル基であってもよく且つＲ1〜Ｒ6は全てＨ原子である。前記のフェニル基は、２位及び４位以外の全ての位置にＨ原子を有していてもよく、その場合には２位がN02基又はCl原子で置換され且つ４位がS02Me基又はCl原子で置換されることが好ましい。
【００２１】
別の好ましい態様では、Ａrは置換3-ピリジル基である。場合によっては、該ピリジル基のＮはＮ-オキシドであってもよい。前記のピリジル基は、２位及び６位以外の全ての位置にＨ原子を有していてもよく、その場合には２位が基Ｒ′で置換され且つ６位が基
CF2H、CF2Cl 又は CF3で置換されることが好ましい。Ｒ′はMe基、イソプロピル基、n-プロピル基、CH20Me基、CH20Et基、CH2CH20Me基又はCF3基である。
【００２２】
式１の除草性HPPD阻害剤は、その農学的に許容し得る塩を包含する。特定の好ましい態様によれば、(i)本発明のポリヌクレオチドはHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするために選択され且つ(ii)式１の除草剤の代表例、例えば
2-(2-ニトロ-4-トリフルオロメチルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオン 及び／又は
2-(2-クロロ-4-メタンスルホニルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオン、及び／又は
2-(ニトロ-4-メタンスルホニルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオン
に対して実質的に耐性である植物が作成される。上記の第二番目 及び第三番目の除草剤は、それぞれスルコトリオン(sulcotrion)及びメソトリオンとして知られている。
【００２３】
式２
2004528821.tif 000003
〔式中、基Ｇは置換されていてもよいフェニル基及び置換されていてもよいヘテロアリール基の中から選択される。Ｒ1〜Ｒ2はそれぞれ独立して、Ｈ原子、-Ｃ1〜Ｃ4アルキル基、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル基、ハロゲン原子、基 OH、SH、CN、-NH2、-NHCOR、-CONHR、
-COR、-SR、-SOR、-S02R、NHR-S02R、-CO2R、-NO2、-CF3、-SF5、-OR、及び -CO2H（基中、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子及びＣ1〜Ｃ4アルコキシ基からなる群から選択される置換基の１個又はそれ以上で置換されていてもよいアリール基である）からなる群から選択される〕。
【００２４】
Ｒ1及びＲ2は共にＨ原子であることが好ましい。
【００２５】
前記の基Ｇの任意の置換基としては、-Ｃ1〜Ｃ4アルキル基、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル基、ハロゲン原子、基 OH、SH、CN、-NH2、-NHCOR、-CONHR、-COR、-SR、-SOR、-S02R、
NHR-S02R、-CO2R、-NO2、-CF3、-SF5、-OR、及び -CO2H（基中、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ基及びＣ1〜Ｃ4アルコキシアルコキシ基からなる群から選択される置換基の１個又はそれ以上で置換されていてもよいアリール基である）が挙げられる。
【００２６】
式２の除草性HPPD阻害剤は、その農学的に許容し得る塩を包含する。好ましい態様において、基Arは置換3-ピリジル基であり且つＲ1及びＲ2は両方共にＨ原子である。場合によっては、前記のピリジル基のＮはＮ-オキシドであってもよい。前記のピリジル基は、２位及び６位以外の全ての位置にＨ原子を有していてもよく、その場合には２位が基Ｒ′で置換され且つ６位が基CF2H、CF2Cl 又は CF3で置換されることが好ましい。前記のＲ′はMe基、イソプロピル基、n-プロピル基、CH20Me基、CH20Et基、CH2CH20Me基 又はCF3基である。具体的な好ましい態様によれば、(i)本発明のポリヌクレオチドはHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするために選択され、また(ii)式２の除草剤の代表例、例えば：
3-[[2-メチル-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニル]-ビシクロ[3.2.1]-オクタン-2,4-ジオン、及び／又は
3-[[2-(エトキシメチル)-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニル]-ビシクロ[3.2.1]オクタン-2,4-ジオン 及び／又は
3-[[2-(メトキシエトキシメチル)-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニル]-ビシクロ[3.2.1]オクタン-2,4-ジオン
に対して実質的に耐性である植物が作成される。
【００２７】
式３
2004528821.tif 000004
Ｒ1〜Ｒ6は、それぞれ独立してＨ原子、-Ｃ1〜Ｃ4アルキル基、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル基、ハロゲン原子、基OH、SH、CN、-NH2、-NHCOR、-CONHR、-COR、-SR、-SOR、-SO2R、
NHR-SO2R、-CO2R、-NO2、-CF3、-SF5、-OR、及び-CO2H（式中、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子又はＣ1〜Ｃ4アルコキシ基からなる群から選択される置換基の１個又はそれ以上で置換されていてもよいアリール基である）からなる群から選択される。
【００２８】
式３の除草性HPPD阻害剤は、その農学的に許容し得る塩を包含する。好ましい態様において、Ｒ1はSO2Me基であり、Ｒ3はCF3基又はCl原子であり、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5はそれぞれＨ原子であり、Ｒ3がCF3基である場合には、前記化合物は除草剤イソキサフルトールの活性ジケトニトリルである。具体的な好ましい態様によれば、(i)本発明のポリヌクレオチドはHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするために選択され且つ(ii)式３の除草剤（又はこれらを生成する化合物）の代表例、例えば：
5-シクロプロピル-4-(2-メチルスルホニル-4-トリフルオロメチルベンゾイル)-イソキサゾール 及び／又は
1-[2-(メタンスルホニル)-4-(トリフルオロメチル)フェニル]-3-シクロプロピル-2-シアノ-プロパン-1,3-ジオン
（これらの化合物のうちの前者の化合物は除草剤イソキサフルトールであり、第二番目の化合物はその誘導体である）
に対して実質的に耐性である植物が作成される。
【００２９】
式４
2004528821.tif 000005
〔式中、Ar基であるＫ及びＪはそれぞれ独立して、置換されていてもよいフェニル基及び置換されていてもよいヘテロアリール基の中から選択される。Ｒ1〜Ｒ4 はそれぞれ独立して、-Ｃ1〜Ｃ4アルキル基、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル基、ハロゲン原子、基OH、SH、CN、-NH2、-NHCOR、-CONHR、-COR、-SR、-SOR、-SO2R、NHR-SO2R、-CO2R、-NO2、-CF3、
-SF5、-OR、及び-CO2Hからなる群から選択される（基中、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子又はＣ1〜Ｃ4アルコキシ基からなる群から選択される１個又はそれ以上の置換基で置換されていてもよいアリール基である）〕。基Ｋ及びＪの任意の置換基としては、-Ｃ1〜Ｃ4アルキル基、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル基、ハロゲン原子、基OH、SH、CN、-NH2、-NHCOR、-CONHR、-COR、-SR、-SOR、-SO2R、NHR-SO2R、-CO2R、-NO2、-CF3、-SF5、-OR、及び-CO2Hが挙げられる（基中、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子又はＣ1〜Ｃ4アルコキシ基からなる群から選択される置換基の１個又はそれ以上で置換されていてもよいアリール基である）。
【００３０】
式４の除草性HPPD阻害剤は、その農学的に許容し得る塩を包含する。幾つかの好ましい態様において、Arは置換フェニル基であり且つＲ1〜Ｒ4はそれぞれメチル基である。前記のフェニル基は２位及び４位以外の全ての位置にＨ原子を有していてもよく、その場合には２位がN02基、Me基、OMe基又はCl原子で置換され且つ４位がS02Me基、CN基、OR基又は
Cl原子で置換されることが好ましい（式中、Ｒ＝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基であるか、あるいはハロゲン原子及びＣ1〜Ｃ4アルコキシ基からなる群から選択される置換基の１個又はそれ以上で置換されていてもよいアリール基である）。別の好ましい態様では、Ａrは置換2-ピリジル基であり且つＲ1及びＲ2は共にＨ原子である。前記のピリジル基は３位及び５位以外の全ての位置にＨ原子を有していてもよく、その場合には３位が基Ｒ′で置換され且つ６位が基CF2H、CF2Cl 又は CF3で置換されることが好ましい。Ｒ′はMe基、イソプロピル基、n-プロピル基、CH20Me基、CH20Et基、 CH2CH20Me基 又はCF3基である。
【００３１】
また、本発明は、カラスムギ(Avena)、ボウムギ(Lolium)、クリノイガ(Cenchrus)、ウシノケグサ(Festuca)、オヒシバ(Eleusine)、パラグラス(Brachiaria)又はモロコシ植物から得られるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素を提供する。
【００３２】
さらにまた、本発明は、配列番号８、10、12、14、16、18及び20からなる群から選択される配列、あるいはアラインメントのClustal法に基づいて及びアラインメントの所定のアミノ酸150個の長さに沿って比較した場合に、前記の配列番号８、10、12、14、16及び 18の配列又は配列番号４の酵素と少なくとも93％の同一性を有する配列、あるいはアラインメントのClustal法に基づいて及び該アラインメントの所定のアミノ酸150個の長さに沿って比較した場合に、前記の配列番号４の配列と少なくとも91％の同一性を有する配列を有するHPPD阻害剤耐性HPPD酵素を提供する。
【００３３】
当業者には、アラインメントのclustal法とは何を意味するかは周知であり、それに関して国際出願公開第WO00/32757号明細書が参照される。
【００３４】
本発明はまた、トリケトン耐性HPPD、すなわち本発明のHPPD酵素をコードする領域をもつ異種ポリヌクレオチド含有する除草剤抵抗性植物を提供する。
【００３５】
本発明はまた、トリケトン阻害剤特異的耐性HPP阻害剤酵素をコードするポリヌクレオチドの選択方法であって、一群のHPPD酵素コード配列を選別し、次いでHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする配列として、対照HPPD酵素と比較して、前記の式１から選択される除草剤に対して前記の式３から選択される除草剤に対する抵抗性と比べて、少なくとも2.5倍、好ましくは４倍抵抗性であるか、あるいは前記の式２から選択される除草剤に対して前記の式４から選択される除草剤に対する抵抗性と比べて少なくとも2.5倍、好ましくは４倍抵抗性である酵素をコードする配列を選択することからなり、前記の対照HPPD酵素が、該対照酵素がシロイヌナズナから誘導される場合に得られるポリヌクレオチドと実質的に同じ選択を示すように選択されるものであるトリケトン耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチドの選択方法を提供する。
【００３６】
さらにまた、本発明は、syncarpic acid特異的HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチドの選択方法であって、一群のHPPD酵素コード配列を選別し、次いで耐性HPPD酵素をコードする配列として、対照HPPD酵素と比較して、前記の式１及び４から選択されるHPPD阻害剤に対して前記の式１から選択されるHPPD阻害剤に対する抵抗性と比べて少なくとも2.5倍、好ましくは４倍抵抗性である酵素をコードする配列を選択することからなり、前記の対照HPPD酵素が該対照酵素がシロイヌナズナから誘導される場合に得られるポリヌクレオチドと実質的に同じ選択を示すように選択されるものであるsyncarpic acid特異的HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチドの選択方法を提供する。対照HPPDは、双子葉植物、特にシロイヌナズナ又はタバコから誘導し得、除草剤に対するHPPD酵素の耐性は、酵素／除草剤複合体の解離速度を測定することによって決定し得る。
【００３７】
選択されたポリヌクレオチドによってコードされるHPPD酵素は、pH7.0及び25℃で0.10〜５ s-1μM-1の範囲内にあるkcat／Ｋm ヒドロキシフェニルピルビン酸値を有し得る。
【００３８】
本発明はさらに、HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの選択方法であって、HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドを選別し、次いでHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域をもつポリヌクレオチドとして、前記の式１及び／又は式２から選択されるトリケトン除草性HPPD阻害剤と複合体を形成することができる酵素をコードする領域をもつポリヌクレオチドを選択することからなり、前記複合体の解離がpH7.0及び25℃の水において1.0〜30 nMの範囲内の解離定数(Ｋd)によって決定されるものであり且つ前記の複合体の解離がpH7.0及び25℃の水において４×10-5 〜 ２×10-3 s-lの範囲内の解離速度定数(ｋoff)をもつものであり且つ前記の選択された除草性HPPD阻害剤が双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の除草活性を有するものである前記のHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの選択方法を提供する。
【００３９】
本発明はまた、HPPD阻害性除草剤に耐性である植物を提供する方法であって、前記の本発明の阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域をもつポリヌクレオチド、あるいは前記の本発明の方法のいずれかに従って選択できるポリヌクレオチドを用いて植物材料を形質転換し、次いで該植物材料を形態学的に正常な稔性植物中で再生させることからなる前記の
HPPD阻害性除草剤に耐性である植物を提供する方法〔但し、前記のHPPD配列はシェワネラ・コルウェリアナ（Shewanella colwelliana）又はシュードモナス・フルオレッセンス
（Pseudomonas fluorescens）から誘導されたものではないものとする〕を提供する。
【００４０】
前記ポリヌクレオチドは、前記配列によってコードされるHPPDを細胞下の細胞小器官、例えば葉緑体又はミトコンドリアに対して標的指向化できるタンパク質をコードする領域をさらに有していてもよく、しかも前記の標的指向化タンパク質は(i)葉緑体トランジットペプチド又は(ii)葉緑体トランジットペプチド−葉緑体タンパク質のＮ末端部分−葉緑体トランジットペプチドの配列を有していてもよい。
【００４１】
前記のポリヌクレオチドは、HPPD阻害性除草剤分解性又は解毒性の酵素、及び／又は前記HPPD阻害性除草剤に特異的に結合できるタンパク質をコードする配列をさらに含有していてもよい。
【００４２】
前記のポリヌクレオチドは、(i)非HPPD阻害剤型除草剤用の標的及び／又は(ii)非HPPD阻害剤型除草剤分解又は解毒酵素をコードする領域 及び／又は 該領域を用いて形質転換させた植物材料に昆虫、菌類及び／又は線虫に対する抵抗性を付与することができるタンパク質をコードする領域をさらに有していてもよい。
【００４３】
前記の標的又は酵素は、シトクロムp450、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、グリホセートオキシダーゼ（GOX)、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT)、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ（EPSPS)、アセトラクテートシンターゼ（ALS)、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（PPGO)及びフィトエンデサチュラーゼ（PD) 又はこれらの突然変異体又は修飾体からなる群から選択し得る。
【００４４】
本発明はまた、前記の本発明の方法のいずれかの方法によって得られる形態学的に正常な稔性完全植物を提供する。
【００４５】
本発明はさらにまた、前記の本発明の方法のいずれかの方法によって選択できるポリヌクレオチドの使用であって、阻害剤耐性HPPD酵素用のトランスジェニックである植物組織及び／又は形態学的に正常な稔性全植物の作成における前記ポリヌクレオチドの使用を提供する
本発明はまた、作物植物及び雑草からなる場所の雑草の選択的防除方法であって、前記植物が前記の本発明の方法のいずれかの方法によって得られるものであり、前記方法が前記の場所に雑草防除量のHPPD阻害剤を施用することからなるものである雑草の選択的防除方法を提供する。前記のHPPD阻害剤は、前記の式１〜式４をもつ除草剤からなる群から選択し得る。殺虫剤、殺菌剤及び非HPPD阻害剤型除草剤からなる群から選択される農薬を前記の場所に施用してもよい。
【００４６】
本発明はまた、可能性のある除草剤の高処理生体外(in vitro)選別用の除草剤標的の作成における前記の本発明の態様に従って選択できるポリヌクレオチドの使用を提供し、本発明のこの選別の具体的態様において、ポリヌクレオチドの領域をコードするタンパク質は大腸菌又は酵母で異種的に(heterologously)発現させ得る。
【００４７】
一つの要旨において、本発明は、除草剤抵抗性植物において施用するのに有用なある種の除草剤に対して固有の耐性のレベルを示すHPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの選択方法に関する。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるHPPD酵素は、選択されたHPPD阻害剤に対して高レベルの固有の耐性（ｋoff、Ｋi又はＫd値）を示す他に、高安定性及び高い触媒活性（この触媒活性はパラメーターｋcat／Ｋmによって表される）を有し得ることが好ましい。
【００４８】
HPPD酵素のヒドロキシフェニルピルビン酸に関するＫm を測定する方法は、周知である。しかし、これまで、HPPDの相対不安定性は、正確な、比較的低下していないｋcat値の測定を不可能にしていた。従って、別の要旨において、本発明は、有用且つ測定された範囲内のkcat/Ｋm値を示すHPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの選択方法に関する。
【００４９】
当業者に周知の方法の多くが、微生物、植物、菌類、藻類、混合培養物などの種々様々な可能性のある供給源生物及び土壌などのDNAの環境供給源からHPPDをコードする領域をもつ選別及び選択用の適当なヌクレオチド候補を得るのに利用できることが認められるであろう。これらの方法としては、特にcDNA又はゲノムDNAライブラリーの調製、適当に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーの使用、公知の配列に基づいたプローブの使用又は相補性検定(例えば、チロシンの成長について)並びに組換え又はシャッフルHPPDコード配列を得るための突然変異誘発及びシャフリング(shuffling)の使用が挙げられる。
【００５０】
選択についてのある態様においては、候補及び対照HPPDコード配列を有するポリヌクレオチドは、酵母、細菌宿主株、藻類又は高等植物、例えばタバコ又はシロイヌナズナの中で及び種々の濃度の選択されたHPPD阻害剤の存在下で形質転換株又は植物の可視指標表現型に従って選別されるHPPDコード配列の固有の耐性の相対レベルで発現される。用量応答及びこれらの指標表現型に関連した用量応答(褐色の生成、成長阻止、除草効果など)の相対シフトは、例えば、GR50（成長を50％低下させる濃度）又はMIC(最小阻止濃度)値（値の増大は、発現されたHPPDの固有の耐性の増大に対応する）に関して表現されることが都合がよい。
【００５１】
宿主生物、指標表現型及び対照HPPDの多くの組み合わせが同様の範囲の選択を達成し、これらの組み合わせが本発明の範囲内で熟考されることが認められるであろう。例えば、大腸菌のような細菌の形質転換に基づく比較的早い検定系(system)では、それぞれのHPPDコード配列は、例えば、lacZプロモーターなどの制御可能なプロモーターの発現制御下で及び例えば合成DNAを使用することによって、できるだけ発現のレベルを比較できる種々のHPPD配列を得るためにコドンの使用のよう結果(issue)を適切に考慮に入れてDNA配列として発現させてもよい。別の候補のHPPD配列を含有するポリヌクレオチドを発現するかかる菌株は、種々の濃度の選択された除草剤上に場合によってはチロシン補足培地中で接種してもよく、また発現されるHPPD酵素の固有の耐性の相対レベルは、褐色の組織渇変症
(ochronotic)色素の生成の阻止の程度及びMICを基準として評価さしてもよい。
【００５２】
前記の方法の態様において、前記細胞は浸透性化されていてもよいし、又は特に酵母の場合には細胞の内外への種々のHPPD阻害剤の分別取り込み及び輸出の影響を最小限にするために損傷のある(disabled)ポンプを有する菌株であってもよい。前記の方法の好ましい態様においては、細菌細胞は、液体培地中でほぼ定常期まで増殖され、選択された除草剤に１時間以下の短い時間暴露され、同じ容量の新しい培地中に再懸濁され、そして色素の発生の割合が監視される。別の好ましい方法では、候補HPPDを発現する配列をシャトルベクターに移し、 上記と同様にそれぞれを比較できる濃度で発現させるが、今回は適当なシュードモナス種、例えば形質転換させることができ、唯一の炭素源としてチロシン上で増殖させることができるシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 87-89中で発現させる。宿主シュードモナス菌の内因性HPPD遺伝子は、例えば、抗生物質標識遺伝子の組換え挿入によって無力化される。別の耐性HPPD酵素を発現するために形質転換されたシュードモナス菌それぞれは、種々の濃度の選択されたHPPD阻害剤上で増殖され、それぞれのHPPD阻害剤に関して発現されたHPPD配列の固有の抵抗性が、唯一の炭素源としてチロシンを含有する培地上で増殖を阻止するのに必要な濃度を基準として評価される。
【００５３】
当業者には、これらのポリヌクレオチドの選択方法の多数の生じ得る部分改変であって、本質的に同一の選別結果を達成し且つ本発明の範囲内に入ると考えられる部分改変が存在することが理解されるであろう。
【００５４】
一般的に、かかる微生物に基づいた選択方法は、候補ポリヌクレオチドの比較的高い処理を達成するのに適しており、初期の予備選別に特に適している。しかし、識別の鋭敏さに伴って生じ得る問題が、選択された除草剤の特質的な(differential)取り込み及び代謝から生じるという理由から、及び多数の除草性HPPD阻害剤の極めて高い固有の潜在能力
(potencies)がMIC値に基づいた方法の理論的解決を制限し得るという理由から、本発明の選択方法の別の態様を使用することも好ましい。
【００５５】
阻害剤耐性HPPD酵素を優先的にコードする配列を有するポリヌクレオチドを選別し且つ選択する本発明の方法の別の特に好ましい態様においては、候補ポリヌクレオチドは植物材料中に形質転換され、形態学的に正常な稔性植物に再生され、次いでこの植物は選択されたHPPD阻害剤型除草剤に対する特質的な(differential)耐性について測定される。カナマイシンなどの適当な選択標識、例えば、アグロバクテリウム由来のベクターなどのバイナリーベクター及び例えばタバコの葉のディスクからなどの植物再生法を使用する多数の適当な形質転換法が当該技術において周知である。場合によっては、対照群の植物が、対照HPPDを発現するポリヌクレオチドを用いて同様に形質転換される。別法として、形質転換されていないシロイヌナズナ又はタバコなどの双子葉植物を、いかなる場合にもそれ自体の内因性HPPDを発現するという理由から、対照として使用できる。一連の最初の
(primary)植物形質転換体又はこれらの子孫の式１、式２、式３ 及び／又は 式４から選択される除草性HPPD阻害剤に対する除草剤耐性レベルの平均及び分布が、除草剤の一連の種々の濃度における植物、損傷、分裂白化の兆候などに基づいた標準的な方法で評価される。これらのデータは、例えば、Ｘ軸に“用量”がプロットされ且つＹ軸に“殺草率”、
“除草効果”、“生じる緑色植物の個数”などがプロットされた用量／応答曲線から誘導されるGR50値として表される。GR50値の増大は発現されたHPPDの固有の耐性レベルの増大に対応する。除草剤は発芽前又は発芽後に施用することが適当であり得る。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、植物に対するポリヌクレオチドの影響を基礎にして決定される式１又は２から選択される阻害剤に対する前記の発現されたHPPDの固有の耐性と、式３又は式４から選択されるHPPD阻害剤についての固有の耐性との比（Ｒ12／Ｒ34）が、対照HPPDについて選択された化合物の同じ対について測定される上記と同じ比よりも少なくとも約2.5倍、好ましくは４倍大きいか、あるいは少なくとも約2.5倍、好ましくは４倍小さいものとして選択される。高等又下等植物、指標表現型、形質転換法、評価方法及び対照HPPDの多数の組み合わせが同様の選択範囲を達成し、本発明の範囲内に入ると考えられることが認められるであろう。適当な青物(green)、過渡的に形質転換し得る緑色組織、例えば葉肉細胞プロトプラス又はタバコの葉における試験HPPD遺伝子の過渡的発現もまた、場合によってはより迅速な選択手段を提供するために使用される。組織のかかる過渡的形質転換に適した方法は、当該技術では周知であり、例えば葉浸入法、真空浸入法及びアグロバクテリウムを用いた感染法又はDNA被覆粒子を用いた標識組織の砲撃(ボンバードメント)法が挙げられる。
【００５７】
これらの過渡的検定方法において、処理した組織は、例えば、形質転換後約0.1〜７日後に一連の濃度の選択された除草剤を含有する培地に移植し、さらに１〜５日後に白化の可視できる兆候について評価することが適当である。過渡的な発現の相違を考慮に入れるための内部対照を提供するために、形質転換に使用する組立て体(construct)は、容易に定量可能な生成物を発現するGUSなどの遺伝子を含有していてもよい。一方、好ましい方法、すなわちポリヌクレオチドの選択用の植物の安定な形質転換に基づいた方法の制約としては、必要とされる比較的多数の（好ましくは25を超える）事象、データを好転させる(turn around)のに必要な数ヶ月の時間尺度並びにさらなる育種、分離分析及び生物学的変動性を解決するために及び異なる組立て体同士から発現される別のHPPD遺伝子の間での比較を行うために理想的には必要な別の世代についての試験が挙げられる。
【００５８】
本発明の選択方法の別の特に好ましい態様においては、HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする候補領域を有するポリヌクレオチドは、発現された候補HPPD酵素と対照HPPD酵素との相対的な固有耐性レベルの生体外測定を基準として選択される。
【００５９】
本発明で使用する生体外方法と標準(criteria)との特定の組み合わせは新規である。ここで、商業的に有用であるか又は商業的に有用である可能性をもつHPPD除草剤の有効成分は、複数のHPPD酵素同士の固有の抵抗性を比較するために有用なＫi値及びその他の力学的パラメーターがHPPD文献に一般的に記載されているような定常酵素反応速度論又はIC50型酵素検定法から誘導し得ないようなHPPD酵素の有力な阻害剤である傾向をもつことが認められる。
【００６０】
見掛けのIC50値は、一般的に任意の実験パラメーター、例えば前記の検定で使用される酸素濃度及び反応時間によって決定し得る。より適切な方法の使用があるとしても、HPPDを部分的に又は完全に精製するためにこれまでに報告されている方法が、酵素に対して動力学的パラメーターの値を変化させるような損傷を且つHPPD酵素同士の固有の耐性の間に有用な比較を混同するような程度まで生じることはこれまでは知られていなかった。特に、部分精製の結果として損なわれる高い割合の酸素分子及び触媒活性（活性部位基準当たりについて表される）の低下の影響が、阻害剤とのHPPD結合相互作用の測定される見かけの強さを低下させるはずである。
【００６１】
本明細書において好ましい生体外方法の非限定的例示として、HPPD配列は、酵母又は大腸菌中で、例えばＴ7ポリメラーゼプロモーターからの発現を使用して又は当該技術で周知のその他のかかる適当な方法を使用して都合よく発現させ得る。
【００６２】
生体外実験に適した抽出物は、例えば、細胞破砕、細胞残屑及び不溶性タンパク質の円心分離による除去並びに発現された可溶性HPPD酵素を含有する画分の適当な緩衝液への交換によって調製し得る。このようにして調製された抽出物は、 場合によっては、使用が必要とされるまで液体窒素温度で凍結ビーズ化し、保存してもよい。対照HPPD酵素も同様に調製される。HPPDの取り扱い及び部分精製は、最小限にすることが好ましい。なぜならば、前述のように、精製又は鉄イオンを用いて再構成しようと試みる大部分の方法は固有抵抗性と活性レベルの間の所望の比較をわかりにくくするかもしれない活性と阻害剤結合能の損失をもたらすことがここで認められるからである。
【００６３】
場合によっては、酵素は、安定化効果をもつが、後で除去することが困難であるほど緊密に結合しない構造式VIII（以下を参照）などの阻害剤の存在下で部分精製してもよい。生体外(in vitro)測定は、例えば、導入遺伝子から発現されるHPPDが、例えば、全可溶性タンパク質の0.25〜10％を構成している大腸菌抽出物を使用して行うことが適当である。ポリヌクレオチドの選択方法の具体的な態様においては、発現されたHPPD酵素の固有の抵抗性は、酵素／除草剤複合体の解離速度(ｋoff値)を基準として及び／又は酵素／除草剤複合体の解離定数(Ｋd)に従って生体外で評価される。
【００６４】
従って、本発明の一つの要旨において、HPPD特異的耐性HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドを選択する方法であって、一群のHPPD酵素コード配列を選別し、次いでHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする配列として、式１及び／又は式２から選択される除草性HPPD阻害剤と複合体を形成できる酵素をコードする配列を選択することからなり、pH7.0及び25℃の水において、前記複合体の解離が1.0〜30 nMの範囲内の解離定数(Ｋd)及び／又は４×10-5 〜 ２×10-3 s-l の範囲内の解離速度定数(ｋoff)によって左右されるものであり且つ前記の選択されたHPPD阻害剤が双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の除草活性をもつものであるHPPD特異的耐性HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの選択方法が提供される。双子葉植物に対する活性とは、本明細書では、農薬業界で化合物の発見に使用する選別試験において常用される一連の６種類又はそれ以上の双子葉植物雑草及び作物種について平均をとった除草活性についていう。また、双子葉植物に対する除草活性とは、本明細書では、ある種のおそらくはより除草性の阻害剤代謝産物であって、インプランタで又はその他で生成され得る代謝産物による除草活性よりもむしろある種の阻害剤それ自体による除草活性をいう。
【００６５】
本発明の別の要旨において、HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドを選択する方法であって、一群のHPPDコード配列を選別し、次いでHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする配列として、式３及び／又は式４から選択される除草性HPPD阻害剤と複合体を形成できる酵素をコードする配列を選択することからなり、pH7.0及び25℃の水において前記複合体の解離が1.0〜30 nMの範囲内の解離定数(Ｋd)及び／又は４×10-5 〜 ２×10-3 s-lの範囲内の解離速度定数(koff)によって支配されるものであり且つ前記の選択された除草性HPPD阻害剤が双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の除草活性をもつものであるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの選択方法が提供される。
【００６６】
さらに別の要旨において、HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチドを選択する方法であって、一群のHPPD酵素コード配列を選別し、次いでHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする配列として、対照HPPD酵素と比較して、式１及び／又は式２から選択されるHPPD阻害剤に対して式３及び／又は４から選択されるHPPD阻害剤と比べて、固有抵抗性において少なくとも2.5倍、好ましくは４倍を超える差を示す酵素をコードする配列を選択することからなり且つ前記の対照酵素が、該対照酵素がシロイヌナズナから誘導される野生型HPPDである場合に得られるポリヌクレオチドの選択と実質的に同じポリヌクレオチドの選択を示すように選択されるものであるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチドの選択方法が提供される。このことが何を意味するか及び本発明の生体外(in vitro)方法において使用される用語の幾つかが 何を意味するのかをさらに例示するために、以下は、前記の選択されたポリヌクレオチドがカラスムギ(Avena sativa)由来のHPPDを発現し且つ前記の対照HPPD配列がシロイヌナズナ由来のものである非限定的な例に関する。この例示に使用した選択に関する定義及び基準は、別のHPPD酵素をコードし且つ本発明の同一か又は別の生体外方法のいずれかに従って選択できる別のポリヌクレオチドの選択に同様に適用される。この例に従えば、この場合にはカラスムギ(Avena sativa)由来のHPPD酵素をコードする配列を有するポリヌクレオチドが、対照HPPD酵素、この場合にはシロイヌナズナ由来のHPPD酵素と比較して、カラスムギHPPD酵素が式１及び／又は式２から選択される除草性阻害剤に対して式３及び／又は式４から選択される除草性阻害剤と比べて2.5倍を超える抵抗性であると認められる場合に抵抗性として選択される。これは、同じ条件下で〔例えば、＜４％又は25％(v/v)のグリセロールを含有し且つ ＜２又は20〜25mMのアスコルビン酸ナトリウムを含有するpH6.5又は7.0の50mM Bis-Tris-プロパン緩衝液中、25℃で〕で検定したこと、好ましくは同じ方法を使用して、同じ日に並行して検定したことを意味する。
【００６７】
(a) 式３又は４から選択されるHPPD阻害剤は、カラスムギ(Avena)から誘導されるHPPDを用いて形成された複合体から、式１又は２から選択されるHPPD-阻害剤が解離するよりも徐々に解離し、式１又は式２から選択される化合物に関するｋoff値(下記の工程図に例示する）と、式３又は４から選択される化合物に関するｋoff値との比(ｋoff12／ｋoff34）が、（同様に得られた）シロイヌナズナ対照酵素由来の選択された阻害剤の同じ対の解離に関して認められる同様に誘導された比よりも少なくとも2.5倍、好ましくは４倍よりも大きい程度まで徐々に解離する。
2004528821.tif 000006
【００６８】
ここでは、HPPDの除草性阻害剤が、一般的に低いｋoff値(0.0003 s-1未満、場合によっては0.000001 s-1未満の範囲)をもつことが認められる。かかる低いｋoff値を測定するための当該技術において知られている適当な多数の方法が本発明の実施に適していることが認められるであろう。これらの方法としては、酵素阻害剤複合体を用いるか又はそれを用いずに、放射線標識又は他の標識で標識した阻害剤の交換速度の測定が挙げられる。例えば、酵素阻害剤複合体は、HPPD調剤を標識阻害剤又は未標識阻害剤と共にインキュベートし、次いで適当な時間後に、場合によってはこのようにして形成された酵素阻害剤複合体を過剰の阻害剤から適当な方法で、例えば限外濾過、濾紙への結合又はゲル濾過カラム下方への交換によって容易に調製し得る。次いで、このようにして調製した酵素阻害剤複合体との交換反応は、適当な場合には、過剰の標識阻害剤又は未標識阻害剤を加えることによって開始される。本発明の方法で使用するのに適したHPPD調剤は、関心事のHPPD酵素を発現させるために処理された大腸菌株のスパン(spun)粗製溶解液の約0.25〜10％の全可溶性タンパク質の濃度の比較的精製されておらず、緩衝液交換された、上清画分である。多数の方法、例えば放射線分析法、蛍光分析法、NMR、蛍光脱分極法、EPR、メスバウアー法、UV/VIS分光分析法など、あるいはフォノン共鳴を、原則として酵素／リガンド交換反応を監視するのに使用でき、特にこの場合には酵素は鉄原子をリガンド結合部位に含有している。場合によっては、監視方法は、試料を取り出し、結合及び未結合標識成分を迅速に分離し、定量する種々の時点でのデータ収集に基づいて連続的であってもよいし（例えば、シンチレーション近接／ビーズ型の方法を用いる）又は不連続的であってもよい。
【００６９】
ｋoffの値は、HPPDの活性部位濃度に関する情報と一緒に交換データの数値積分に基づいて及び以下に記載のようにして得られるｋon値に基づいてコンピューターに実装することによって適切に算出できる。例えば、シロイヌナズナHPPDの粗抽出物では、結合されたメソトリオンの約20〜30％が比較的迅速に交換し〔20〜25％(v/v)グリセロール中、25℃、pH7.0におけるメソトリオンの解離についてはｔ1/2 ＜〜30−40分〕、これに対して純粋な完全に活性な酵素のバルクに対応するとここで推測される70〜80％は徐々に交換する〔20〜25％(v/v)グリセロール中、25℃、pH7.0におけるメソトリオンの解離については
ｔ1/2 〜４日〕ことが通常的に認められる。この推測は、(1)活性のロスに関連する別の酵素処理が相対的増加を迅速な交換分率(fraction)の割合で招くという観察 及び (2)前記の分率は、一方では、複合体形成の時間(10秒〜24時間)に従って変化し、従って結合反応において動力学的に捕捉された中間体ではないという観察によって支持される。いずれにしても、ｋoff値は本発明では常に主要な緩徐型交換反応の速度から算出される。本発明の範囲内では、所望の動力学的比較を行う多数の方法がオフ速度(off rate)の明確又は厳密な決定なしに可能であるが、同じ基礎となる原理に基づいて同じ選択結果を達成することが認められるであろう。
【００７０】
あるいは、
b)  式３又は４から選択される除草性阻害剤は、基質HPPと比べて、カラスムギ(Avena)から誘導されるHPPDに対して、式１又は２から選択される除草剤に結合するよりも緊密に結合し、式１又は式２から選択される化合物に関するＫd(下記の工程図に示すＫd＝ｋoff／ｋon)の値と、式３又は４から選択される化合物に関するＫdの値との比(Ｋd12／Ｋd34)が、（同様に得られた）シロイヌナズナ対照酵素由来の同じ対の選択された阻害剤同士の結合ついて認められる同様に誘導された比よりも少なくとも2.5倍、好ましくは４倍よりも大きい程度にまで結合する。
2004528821.tif 000007
【００７１】
ｋoff値を測定する方法を下記に要約する。この方法の幾つかの態様において、Ｋdは
ｋonの値、すなわちHPPDと阻害剤との複合体の形成の速度を支配する速度定数（Ｋd＝
ｋoff／ｋon）を測定することによっても決定される。ｋonの値を得るのに適した酵素反応速度論的方法は、阻害剤と基質の一連の濃度にわたる酵素阻害の開始の速度に基づく。適当な方法は、例えば、Vivianiらによって1998年に報告されたHPPDに関するHPLC検定法
(Pestic. Biochem. Physiol., 62, 125-134)（この検定法は酵素の添加及び反応の最初の１分又はそこいらにわたって集められるデータポイントによって開始することができる）、ヒドロキシフェニルピルビン酸のKm値を測定する標準的方法 及び例えばSchloss J.V. (1989年)によってCRC Press Boca発行の“Target Sites of Herbicides Action”(Boger P.,及びSandmann G.編) に記載された動力学的分析／算定の方法を組み合わせる。
【００７２】
別法として、ｋon値の評価は、HPPDを放射線又はその他の標識で標識した除草剤阻害剤と混合し、次いで結合反応の進行を場合によっては酵素阻害剤複合体を迅速に単離することによって及び／又は多数の方法（例えば、蛍光分析法、EPR、NMR、放射線検出法など）のいずれか一つの方法によって監視することによって、より直接的に測定することができる。例えば、HPPDとの反応は、放射線標識除草剤を加えることによって開始させ、一連の種々の時間進行させ、次いで大過剰の未標識阻害剤を加えて混合することによって迅速に停止させ得る。この場合、種々の時間における結合の程度は、例えば、限外濾過を使用するか、フィルターに結合するか又はゲル濾過によって監視してHPPDに結合された放射線標識を未結合標識から分離し得、次いで画分はそれぞれシンチレーションカウンターで定量することができる。
【００７３】
かかる物理的結合の測定によってｋonを測定する場合には、大部分の化合物の幾つかのHPPD酵素に対する結合は急速に結合する部位の半分との二相と思われ、この場合に残りの結合は次いで比較的極めてゆっくり生じることを認めることが重要である。このような場合、適切な速度定数を提供する急速初期結合相（通常0.1-4×105 M-ls-lの速度定数に対応する）である。これは、酵素検定法に基づく方法を使用することにより得られる値に対応する。なぜならば、部位の半分だけが最初に結合されるが、同じ時間尺度ではHPPD触媒活性の本質的に全部が阻止されるからである。本発明の範囲内で、所望の動力学的比較を行う多くの多かれ少なかれ厳密な(rigorous)方法が可能であり、それはオフ速度(off 
rate)及びオン速度(on rate)の明確な決定を必要としないであろうが、同じ基礎とする原理に基づいて、同じ選択結果を達成し得ることが認められるであろう。
【００７４】
従って、例えば、好ましい且つ比較的高い処理法においては、相対Ｋd値（これは選択されたHPPD阻害剤のＫd値の必要とされる比を測定するのに必要とされる全てである）が公知の標準又はその他の“代用(surrogate)”リガンドの結合との競争によって間接的に評価される。かかる代用リガンドは、場合によっては最初にファージディスプレーライブラリーから選択されるペプチドを含む分子、RNAアプタマー又は抗体断片であり得る。好ましい態様においては、それは標識されたHPPD阻害剤である。それゆえ、構造式Ｉ又はIV又はＶを標識された標準として使用とし得、選択されたHPPD阻害剤の相対Ｋd値を供試HPPD又は対照HPPDに結合された認識された標準と競争できる能力に基づいて評価され且つ該標準の料を減少する実験を設定する。
【００７５】
構造式Ｉ  2-(ニトロ-4-メタンスルホニルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオン
2004528821.tif 000008
構造式II  3-[[2-メチル-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニル]-ビシクロ[3.2.1]-オクタン-2,4-ジオン
2004528821.tif 000009
構造式III  3-[[2-(エトキシメチル)-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニ
ル]-ビシクロ[3.2.1]-オクタン-2,4-ジオン
2004528821.tif 000010
構造式IV  1-[2-(メタンスルホニル)-4-(トリフルオロメチル)フェニル]-3-シクロプロピル-2-シアノ-プロパン-1,3-ジオン
2004528821.tif 000011
構造式Ｖ  2-[2-ニトロ-4-クロロベンゾイル]-4,4,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-
1,3,5-トリオン
2004528821.tif 000012
構造式VI  2-[2-メチル-4-シアノベンゾイル]-4,4,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-
1,3,5-トリオン
2004528821.tif 000013
構造式VII  3-[[2-メチル-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニル]-4,4,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリオン
2004528821.tif 000014
構造式VIII  2-[シクロプロピルカルボニル]-5-エチル-4-メタンスルホニル-4-メチルシクロヘキサン-1,3-ジオン
2004528821.tif 000015
【００７６】
理想的には、平衡Ｋd値に対する最もよい近似値を得るために、HPPDと標準阻害剤及び供試阻害剤との競争結合反応は、例えば25℃で平衡に達するできるだけ長い時間、好ましくはHPPDに結合されていない標識及び結合された標識の量のサンプリング及びゲル濾過又はニトロセルロース濾紙などへの結合による評価前の数日間放置して平衡化させるべきである。かかる反応は酵素安定性における制約によってより短い時間放置してもよいこと及び反応時間が短くなればなるほど、得られる値が純粋なＫd値よりもむしろｋon値の差を反映するようになり且つより重くなることが理解されるであろう。本発明の範囲内で、多種多様な代替技術、例えばLuminex蛍光ビーズ技術又はシンチレーション近接カウンティングに基づいた方法が、例えば結合標識を未結合標識から分離する工程の必要を回避し且つ本質的に同じ結果を与えるのにおそらくは使用し得ることが理解されるであろう。かかる方法を使用すると、相対Ｋd値の決定はマイクロタイタープレートフォーマットに転換でき、HPPD酵素をコードする領域をもつポリヌクレオチドの選択ばかりではなく、新規な化学除草剤の有用な先導として小分子阻害剤の発見にも有用である。
【００７７】
さらに別の要旨によれば、本発明は、場合によってはpH7.0、25℃で0.10〜５s-1μM-1 範囲内のｋcat/Ｋmヒドロキシフェニルピルビン酸値を意味する高い触媒活性をもつ阻害剤耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに選択する方法からなる。Ｋmの検定及び測定は、公表されている方法、例えばVivianiらの1998年報告のHPLC検定法
（Pestic. Biochem. Physiol., 62, 125-134）を使用して行われる。検定の時間経過は、急速にカーブし(curve off)、かかる停止される方法を使用して、適当に短い時間で十分な初期速度測定を行うこと及び適切に得られたデータを適合させて速度評価を得ることが重要である。大部分の酵素を完全に活性な形で保持する適当なHPPD調剤は、例えば、典型的には全可溶性タンパク質の約0.2〜10％のレベルの関心事のHPPD酵素を発現するために操作された大腸菌株の回転粗製溶解物の比較的粗製の緩衝液交換された上清画として迅速に調製される。
【００７８】
ｋcatを得るために、基質濃度を変化させた実験から得られるVmax値（生成HGAのモル数/s）が酵素活性部位の濃度によって区分される。活性部位濃度を測定する方法が多数存在する。除草剤、例えば構造Ｉ、IV又はＶの除草剤はHPPD酵素の活性部位に極めて強固に結合し、しかも場合によっては標識され、適当な活性部位プローブを活性部位濃度の測定に有用にする。従って、例えば、標識化阻害剤の固定濃度に対する未知濃度のHPPDの活性部位を含有する抽出物の力価測定から、結合された標識の量に対する抽出物希釈のグラフを描くことが可能であり、それによって阻害剤結合部位又は“活性部位”の濃度を得ることができる。多数の方法が、放射線標識、NMR、EPR、Biacore（Pharmacia製）などの使用を含めて結合反応を監視するのに適している。
【００７９】
ある種のHPPD阻害剤の結合は二相性(biphasic)であることから、結合力価測定(binding titration)を注意深く行うこと及び阻害剤及び時間を変化させることが重要である。なぜならば、ある場合には、得られた結果が活性部位濃度の完全な定量よりもむしろ“半分の部位(half site)”により近いからである。力価測定(titration)に使用される結合反応は、できる限り、酵素安定性を実際に考慮することによって修飾されるよう平衡に到達させることを必要とする。本発明の範囲内で、所望の動力学的比較を行う多数の幾分厳密な方法が可能であり、ｋcat／Ｋmの明確な測定を必要としなくてもよいが、同じ原理に基づいてHPPD酵素をコードする領域を含有するポリヌクレオチドの相対効力を位置づける
(ranking)点で同じ結果を達成し得ることが認められるであろう。例えば、ｋcat値、従ってｋcat/Ｋm値は、定量蛍光ウエスタン検定法又はELISA型検定法を使用して活性な粗抽出物中のHPPDポリペプチドの量を定量するために、SDS PAGE精製HPPDポリペプチドに対して生じさせた抗体を使用することによって取得してもよい。しかし、ポリペプチドの定量に基づいた方法は、材料が活性酵素を表すか否かには盲目的であり、このような理由で阻害剤の結合に基づいてkcatを測定する方法が好ましい。触媒反応中間体に似た阻害剤について、この強固な結合能の保持が触媒機能の保持と同義語であるからである。HPPDがさらに精製され、しかも及びより多くの活性を損失するので、損傷した酵素はさらに標識された阻害剤を結合するが、活性が減少するのにつれて、この結合の増大する割合が弱くなり、より迅速に交換する。従って、本発明の方法の好ましい態様においては、比較的迅速な交換状態である阻害剤結合部位の画分がｋcatの算出において差し引かれる。このように、例えば、シロイヌナズナHPPDの粗抽出物においては、メソトリオン(構造１)について測定された全結合容量(capacity)の約20〜30％が迅速に交換し〔25％(v/v)グリセロール中、25℃、pH7.0でのメソトリオンの解離について、t1/2 〜30−40分〕、これに対して80％（活性酵素に相当すると推測される）は徐々に交換する〔25％(v/v)グリセロール中、25℃、pH7.0でのメソトリオンの解離について、t1/2 〜４日〕ことが通常的に認められる。従って、この場合には、本出願において挙げたその値は可能性のある調整を考慮に入れていないが、Ｋcatは、測定された全結合能の〜80％と算出される活性部位測定に基づき得る。
【００８０】
本発明の一つの要旨において、トウモロコシ、コムギ及びオオムギから誘導されるものではなく且つメソトリオンと複合体を形成することができる酵素能に特徴があるトリケトン阻害剤特異的耐性HPPD酵素であって、前記複合体のpH7.0及び25℃の水における解離が
1.0〜30 nMの範囲内の値を有する解離定数(Ｋd)によって決定されるものであり及び／又は前記複合体の解離が４×10-5 〜 ２×10-3の範囲内の値を有する速度常数(ｋoff)によって決定されるものであるトリケトン阻害剤特異的耐性HPPD酵素が提供される。別の要旨において、前記のHPPD阻害剤耐性酵素は、さらに0.1〜５s-1μＭ-1の範囲内、さらに好ましくは0.8〜５s-1μM-1の範囲内のｋcat／Ｋm値を有することに特徴がある。
【００８１】
別の要旨において、HPPD阻害剤耐性HPPD酵素は、配列番号８、10、12、14、16、18及び20からなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいはアラインメントのClustal法に基づいて及びアラインメントの所定のアミノ酸150個の長さに沿って比較した場合に前記の配列番号８、10、12、14、16又は18の配列と少なくとも93％の同一性をもつ配列を有する配列；あるいは配列番号４のHPPD阻害剤耐性HPPD酵素又はアラインメントのClustal法に基づいて及び該アラインメントの所定のアミノ酸150個の長さに沿って比較した場合に、前記の配列番号４の配列と少なくとも91％の同一性をもつ配列を有する配列を有する。
【００８２】
本明細書及び本発明の好ましい態様の幾つかにおいて挙げたHPPD阻害剤の構造は、下記の通りである。構造がケト型で描かれ、これらの構造がエノール型でも存在することができること及びこれらの型の全て及び他の互変異性体の全ても、目的とすることが認められる。
【００８３】
具体的な好ましい態様によれば、(i)本発明のポリヌクレオチドはHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするために選択され且つ(ii)式４の除草剤の代表例、例えば
2-[2-ニトロ-4-クロロベンゾイル]-4,4,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリオン及び／又は2-[2-メチル-4-シアノベンゾイル]-4,4,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリオン及び／又は3-[[2-メチル-6-(トリフルオロメチル)-3-ピリジニル]カルボニル]-4,4,6,6テトラメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリオンに対して実質的に抵抗性である植物が作成される。
【００８４】
構造Ｉ〜VIIIとして挙げた特定のHPPD阻害剤の構造は、既に説明してある。具体的な好ましい態様によれば、(i)本発明のポリヌクレオチドはHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするために選択され且つ(ii)前記の構造の一つ又はそれ以上に対して実質的に耐性である植物が作成される。構造がケト型で描かれ、これらの構造がエノール型でも存在することができること及びこれらの型の全て及び全ての他の互変異性体も目的とすることが認められる。
【００８５】
本発明の形質転換植物及びこのようにして形質転換された植物材料は、式１、２、３及び４で示されるHPPD阻害剤の群の中の多数の除草剤に対して並びにこれらの群以外のHPPD阻害性除草剤、例えば 5-メチル-2-(2-クロロ-3-エトキシ-4-メタンスルホニルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオンに対して耐性又は抵抗性であることが認められるであろう。
【００８６】
式１及び２の中から選択されるHPPD阻害剤に耐性であるこれらの態様は、式３及び４例えば構造Ｖの代表である除草剤には一般的にあまり耐性又は抵抗性ではないことも認められるであろう。反対に、式３及び４の中から選択されるHPPD阻害剤に耐性であるこれらの態様は、一般的に式１及び２例えば構造Ｉ代表である除草剤(メソトリオン)には一般的にあまり耐性又は抵抗性ではない。前記の態様がランスジェニック植物である場合には、除草剤は通常の除草剤散布方法に従って出芽前又は出芽後に散布し得る。
【００８７】
さらにまた、本発明によれば、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質が提供され、またrubiscoの小さなサブユニットをコードする遺伝子から誘導されるプロモーター、ケストルム(cestrum)ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ポリユビキチンプロモーター、FMV35Sプロモーター、プラストシアニンプロモーター、ヒストンプロモーター、CaMV35Sプロモーター 及び GST1プロモーターの発現制御下のHPPPD配列を有する前記ポリヌクレオチドを有するベクターが提供される。さらに別の好ましい態様においては、前記の植物が単子葉植物である場合には、前記のHPPD配列は、トウモロコシポリユビキチンプロモーター又はケストルムウイルスプロモーターの発現制御下にある。さらに別の好ましい態様においては、前記の植物が双子葉植物である場合には、HPPD配列は、シロイヌナズナのrubiscoプロモーターの小さなサブユニット、シロイヌナズナのアクチンプロモーター又はケストルムウイルスプロモーターの発現制御下にある。
【００８８】
本発明の形質転換植物材料は、最初にトリケトン除草剤などのHPPD阻害剤に暴露され、次いで前記の除草剤に暴露された際に形質転換材料と非形質転換材料との間の色の違いを基準として肉眼で見て選択し得る。非形質転換材料は、選択操作に供された場合には白くなり且つ白い状態のままであり得るが、これに対して形質転換材料は、上記と同様に選択操作に供された場合には白くなり得るが、その後に緑に変り得るか又は緑のままであり得る。植物の形質転換、選択及び再生方法（これは個々の植物、種に関して常用の改変を必要とするかもしれない）は、当業者には周知である。前記の選択方法の好ましい態様においては、前記のDNA（これは形質転換植物を非形質転換植物と区別する）は配列番号３、７、９、11、13、15、17及び19からなる群から選択される領域を含有するか、又はHPPDをコードする領域を含有し、その領域は0.1％SDSを含有する0.3濃度(strength)のクエン酸塩緩衝食塩水中で60〜65℃の温度でインキュベートし、次いで0.1％SDSを含有する0.3濃度(strength)のクエン酸塩緩衝食塩水を用いて上記と同じ温度で洗浄し、さらに配列番号３、７、９、11、13、15、17及び19からなる群から選択される配列とハイブリダイズする一つの領域に対して相補的である。
【００８９】
供試配列及び本発明の配列が二重鎖である場合には、供試配列を構成する核酸は、配列番号３、７、９、11、13、15、17及び19からなる群から選択される配列のＴMの10℃以内のＴMを有することが好ましい。供試配列及び配列番号３、７、９、11、13、15、17 及び19からなる群から選択される配列を一緒に混合し、同時に変性させた場合には、上記二つの配列のＴM値は互いに５℃以内であることが好ましい。ハイブリダイゼーションは比較的に厳しい条件下で行うことがさらに好ましく、供試配列及び本発明の配列は支持されることが好ましい。従って、変性された、供試配列又は本発明の配列は最初に支持体に固定されることが好ましく、ハイブリダイゼーションは0.3濃度(strength)クエン酸塩緩衝食塩水中で60〜65℃の温度で所定の時間行い、次いで支持体を 上記と同じ温度で、0.1濃度(strength)クエン酸塩緩衝食塩水を用いて洗浄することによって行う。ハイブリダイゼーションが配列番号３、７、９、11、13、15、17及び19からなる群から選択される配列を必要とする場合には、ハイブリダイゼーション条件は当業者には自明であるように余り厳しくないものであり得る。
【００９０】
ポリヌクレオチドが２種以上のタンパク質をコードする場合には、それぞれのタンパク質をコードする領域は植物の操作可能なプロモーター及びターミネーターの転写制御下にあり得る。ポリヌクレオチドの翻訳生成物を植物細胞内の特定の細胞下のコンパートメントに標的指向化させることが望ましいものであり得、その場合には該ポリヌクレオチドは葉緑体トランジットペプチドをコードする配列、細胞壁標的指向化配列などを、前記の成熟翻訳生成物をコードする領域の５´のすぐ近くに含有する。
【００９１】
前記のDNA配列内に含まれるタンパク質コード配列の翻訳発現は、前記のタンパク質コード配列の公知の翻訳可能な翻訳増強配列５´を含有することによって比較的増強し得る。当業者はかかる翻訳増強配列について非常に熟知しており、該配列としてはオメガ及びオメガプライムとして知られているTMV-由来の配列、並びに他のウイルスコートタンパク質コード配列の５´領域から誘導可能なその他の配列、例えばタバコEtchウイルスのタンパク質コード配列が挙げられる。さらに好ましい５´未翻訳領域としては、例えば
rubisco又はグルカナーゼをコードする遺伝子から誘導される領域が挙げられる。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチドは、コードされたmRNA不安定性モチーフ及び／又は偶然のスプライス領域を除去することにおいて修飾し得るし、あるいは例えば、双子葉植物でのこのように修飾された配列の発現が、非修飾配列のタンパク質コード領域が内因性のものである生物中で非修飾配列を発現させることによって得られる活性／機能と実質的に類似した活性／機能をもつ実質的に類似のタンパク質を生じるように、双子葉植物の好ましいコドンが使用される。修飾された配列の別の態様において、修飾配列と、前記の双子葉植物中に内在的に含まれ且つ上記と同じタンパク質を実質的にコードする配列との間の同一性の程度は、約70％よりも小さい。
【００９３】
本発明はまた、形態学的に正常な稔性完全植物であって、DNA配列についてトランスジェニックであり、トウモロコシ、コムギ又はオオムギから誘導されるものではなく且つ本発明の方法に従って好ましくは高安定性であり且つ0.10〜5.0 s-1mM-1の範囲、さらに好ましくは0.8〜5.0 s-1mM-1の範囲内のｋcat/Ｋm値を有するHPPD阻害剤耐性HPPD酵素であり、シロイヌナズナから誘導される対照HPPD酵素と比べて、式１又は式２から選択される除草剤に対して式３又は式４から選択される除草剤に対する抵抗性よりも少なくとも2.5倍、好ましくは４倍を越える抵抗性であるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域を含有するような形態学的に正常な稔性完全植物を提供する。また、前記植物は、式１及び／又は式２から選択される除草性HPPD阻害剤と複合体を形成することができるHPPD-阻害剤耐性HPPD酵素をコードする領域を含有するという基準に基づいて選択される配列についてトランスジェニックであり、pH7.0及び25℃の水において、前記複合体の解離は１〜30nMの範囲の解離定数(Ｋd)及び／又は４×10-5 〜 ２×10-3 s-1の範囲内の解離速度定数
(ｋoff)によって左右されるものであり且つ前記の選択されたHPPD阻害剤は双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の除草活性を有するものである。別の態様においては、前記の植物は、植物、好ましくは単子葉植物、さらに好ましくはイネ、パラグラス(Brachiara)、クリノイガ(Cenchrus)、ボウムギ(Lolium)、ウシノケグサ
(Festuca)、オヒシバ(Eleusine)、モロコシ(Sorghum)又はカラスムギ(Avena)種から誘導されるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするDNA配列を含有するポリヌクレオチドに関してトランスジェニックである。さらにまた別の態様においては、前記のDNAは、配列番号３、７、９、11、13、15、17及び19からなる群から選択される配列を含有する。
【００９４】
本発明の方法に従って形質転換される植物としては、圃場作物、果物及び野菜、例えばアブラナ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、飼料トウチシャ(mangelworzel)、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい遺伝子修飾植物は、まだ明確に挙げられていない限りにおいて、ダイズ類、サトウキビ、エンドウマメ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライムギ、カラスムギ、芝生及び飼い葉、アマ及びセイヨウアブラナ、並びに木の実生産植物である。本発明の方法の特に好ましい態様において、前記の植物は双子葉植物であり、好ましくはアブラナ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、ダイズ、ワタ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ からなる群から選択される双子葉植物であり、しかもダイズが特に好ましい。さらに好ましい態様においては、前記の植物はトウモロコシ又はイネである。本発明の植物はダイズ、イネ又はトウモロコシであることが好ましい。本発明はまた、前記の植物の子孫並びにかかる植物及び子孫の種子又はその他の繁殖材料を包含する。
【００９５】
本発明はまた、植物組織及び／又は形態学的に正常な稔性完全植物の生産における前記に挙げたDNA配列の使用であって、i)除草性HPPD阻害剤に対する植物の抵抗性が増大しており、前記の増大が式１又は２から選択されるHPPD阻害剤に対して式３又は４から選択されるHPPD阻害剤に対するよりも大きいか、あるいは前記の増大が式３又は４から選択されるHPPD阻害剤に対して式１又は２から選択されるHPPD阻害剤に対するよりも大きいものであり及び／又は(ii)非トランスジェニックのかかる組織又は植物と比べた場合に脂溶性抗酸化剤を比較的高められた濃度で含有する植物組織及び／又は形態学的に正常な稔性完全植物の生産における前記に挙げたDNA配列の使用も包含する。“脂溶性抗酸化剤”としては、適当なプラストキノン類、α-トコフェノール類及びカロテノイド類例えばビタミンＡの先駆物質が挙げられる。
【００９６】
本発明はさらにまた、転写エンハンサー及びHPPD阻害剤耐性HPPD酵素を、そのオートロガスプロモーターであって酵素を本明細書に記載の方法に従って同定できるオートロガスプロモーターの発現制御下に含有するポリヌクレオチドを提供する。前記のHPPD酵素は配列番号４に挙げた配列を有することが好ましい。また、本発明は、HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチド配列を用いて形質転換されている植物細胞であって、前記のHPPDコード配列が本明細書に記載の方法に従って選択できるものであること及び／又は該配列がシェベネラ・コルベリナ(Shewenella Colwellina)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス(Streptomyces 
avermitilis)及びコクシジオデス・イミツス(Coccidiodes immitus)からなる群から選択される生物から誘導されるものであることを特徴とする植物細胞を包含する。前記細胞が双子葉植物細胞である場合には、HPPDコード配列の発現を制御するのに使用されるプロモーター領域はrubiscoの小さいサブユニットから誘導されるものであり、また前記細胞が単子葉植物細胞である場合には、前記プロモーター領域はトウモロコシポリユビキチン遺伝子から誘導されるものである。
【００９７】
本発明は、関連する配列表と一緒に、下記の記載からさらに明らかであろう。
【００９８】
配列表
配列番号１  シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）株87-79由来のHPPD DNA配列
2004528821.tif 000016
【００９９】
配列番号２  シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）株87-79由来のHPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000017
【０１００】
配列番号３  カラスムギ(Avena sativa)由来のHPPD DNA配列
2004528821.tif 000018
【０１０１】
配列番号４  カラスムギ(Avena sativa)由来のHPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000019
【０１０２】
配列番号５  コムギ由来のHPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000020
【０１０３】
配列番号６  コムギ由来のHPPD cDNA配列
2004528821.tif 000021
【０１０４】
配列番号７  メリケンニクキビ(Brachiaria platyphylla)由来の部分HPPD DNA配列
2004528821.tif 000022
【０１０５】
配列番号８  メリケンニクキビ(Brachiaria platyphylla)由来の部分HPPD a/a 配列
2004528821.tif 000023
【０１０６】
配列番号９  シンクリノイガ(Cenchrus echinatus)由来の部分HPPD DNA配列
2004528821.tif 000024
【０１０７】
配列番号10  シンクリノイガ(Cenchrus echinatus)由来の部分HPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000025
【０１０８】
配列番号11  ボウムギ(Lolium rigidum)由来の部分HPPD DNA配列
2004528821.tif 000026
【０１０９】
配列番号12  ボウムギ(Lolium rigidum)由来の部分HPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000027
【０１１０】
配列番号13  オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)由来の部分HPPD DNA配列
2004528821.tif 000028
【０１１１】
配列番号14  オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)由来の部分HPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000029
【０１１２】
配列番号15  アキノエノコログサ(Setaria faberi)由来の部分HPPD DNA配列
2004528821.tif 000030
【０１１３】
配列番号16  アキノエノコログサ(Setaria faberi)由来の部分HPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000031
【０１１４】
配列番号17  オヒシバ(Eleusine indica)由来の部分HPPD DNA配列
2004528821.tif 000032
【０１１５】
配列番号18  オヒシバ(Eleusine indica)由来の部分HPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000033
【０１１６】
配列番号19  モロコシ(Sorghum)由来の部分HPPD DNA配列
2004528821.tif 000034
【０１１７】
配列番号20  モロコシ(Sorghum)由来の部分HPPDアミノ酸配列
2004528821.tif 000035
【０１１８】
プライマー配列
配列番号21  HPPD RT2
cgcaccagarctcsacgtggtggaa
配列番号22  HPPDRT4
cgacgtcgccgtagagctcgacctc
配列番号23  DT30
gagagaggatcctcgagtttttttttttttttttttttttttttttt
配列番号24  HPPD3
aayttctccgagctgttcaagtcc
配列番号25  DTR
aggttttaacgagagaggatcctcgag
【０１１９】
配列番号26  ５´Avesa I
acttgacatatgccgcccacccccgccaccgccaccg
配列番号27  ３´Avesa
ttacgtggatccctaggatttctgagctacaacagattg
配列番号28  TAHPPDNde
aacacaccatatgccgcccaccc
配列番号29  TAHPPDSph
aacacacagcatgccgcccaccccc
配列番号30  TAHPPDBam
ggatcctatgatccctgaactgcagcagattg
【０１２０】
配列番号31  HPPD4R
ggacttgaacagctssgagaa
配列番号32  HPPD5
gagccggtgcacggcaccaag
【０１２１】
実施例１  カラスムギ(Avena)種及びその他の単子葉植物種由来の完全及び部分長の
4-HPPD配列のクローニング
５日齢のカラスムギ(Avena sativa)、メリケンニクキビ(Brachiaria platyphylla)、シンクリノイガ(Cenchrus echinatus)、ボウムギ(Lolium rigidum)、オニウシノケグサ
(Festuca arundinacea)、アキノエノコログサ(Setaria faberi)、オヒシバ(Eleusine 
indica)及びモロコシ(Sorghum)種の苗から、Tri-Zol抽出法(Life Technologies)を使用して全RNAを調製した。得られたそれぞれのRNA試料について、プライマーHPPD5（配列番号 32）及びHPPD4R（配列番号31）と共にワンステップRTPCRキット(Invitrogen製)を使用してRT-PCRを行った。得られた生成物をベクター pCR2.1TOPO(Invitrogen製)にクローン化し、得られたクローン化生成物を、標準Ｍ13フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して配列決定した。得られた配列(又はその中に含まれるもの)、例えば配列番号３、７、９、11、13、15、17及び19を示す。例えば、カラスムギ(Avena sativa)から
Oligotex mRNA精製装置(Qiagen製)を使用してメッセンジャーRNAが得られた。例えば、カラスムギ(Avena sativa)HPPD遺伝子の５′末端を５′RACEを使用して同定し、遺伝子特異的プライマー(GSP)HPPD RT2（配列番号21）及びHPPD RT4（配列番号22）と共にGene 
Racer kit（Invitrogen製）を使用して行った。前記遺伝子の３′末端を３′RACEで同定し、Themoscript RT（Life Technologies）を使用してオリゴdTプライマーDT30（配列番号23）を用いて行い、次いでGSP HPPD3（配列番号24）及びプライマーDTR(配列番号25）を用いてPCRにより行った。方法は全て種々の製造業者によって提供された方法に従って行った。５′RACE反応及び３′RACE反応から得られた生成物を、pCR2.1 TOPO(invitrogen製）にクローン化し、得られたクローン化生成物をユニバーサルＭ13前進プライマー及び逆進プライマーを使用して自動ABI377 DNAシークエンサーにより配列決定した。プライマー５′Avesal（配列番号26）及び３′Avesa（配列番号27）を、HPPD遺伝子(配列番号３）の翻訳開始及び終結コドンそれぞれにデザインした。二つのプライマーをワンステップRTPCRキット(Qiagen製)と一緒に使用して全長コード配列を得た。得られた生成物をpCR 2.1TOPO中にクローン化し、配列決定し、当該技術で公知の配列との比較によって4-HPPDとして同定した。
【０１２２】
実施例２  大腸菌中でのシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens）、シロイヌナズナ(Arabidonsis)及びコムギの4-HPPD遺伝子の異種発現
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）株 87-79の配列決定（国際出願公開第98/20144号明細書参照)、シロイヌナズナ(Arabidonsis)(国際出願公開第97/2728号明細書参照)及びコムギ4-HPPD(国際出願公開第00/32757号明細書参照)の遺伝子の配列決定は、当該技術では全て知られている。これら３種類の遺伝子は全て、プライマーを使用してRT-PCRにより、適当な制限酵素部位を組み込み、それらを適当な大腸菌過剰発現ベクター、例えばpET系（Novagen）に且つ例えば実施例３に記載のようにしてクローンニングした。大腸菌中でのシュードモナスHPPD遺伝子の異種発現もまた国際出願公開第98/20144号明細書参照に記載されており、その内容は本明細書に参照文献として参照される。大腸菌中でのシロイヌナズナHPPDの異種発現もまたGarciaらの Plant Physiol, 
(1999) 119, 1507-1516に記載されており、その内容は本明細書において参照される。
【０１２３】
実施例３  大腸菌中でのカラスムギ(Avena sativa)4-HPPD遺伝子の異種発現
完全な長さのカラスムギ（Avena sativa）HPPD遺伝子を、実施例１に記載のpCR2.1 
TOPOベクターから、Nde１及びBamHIを使用して切り出し、同様に制限したpET-24a 
(Novagen製)に連結した。次いで、このベクターを大腸菌BL21（DE3）コドン+RP細胞
（Stratagene製）に形質転換した。前記のベクターを係留している適当な宿主株、例えばBL21(DE3)又は別のDE3溶原菌は、別の4-HPPD阻害剤を同定するための高速多量処理選別においてその使用を提供するのに十分なHPPD酵素の量を発現する。形質転換系の信頼性は、PCR、プラスミド回収及び制限分析により確認した。前記の形質転換宿主株から（例えば、SDSゲル電気泳動及びバンドの切り出しによって）精製されたHPPDは、4-HPPDをコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換した植物の分析用の抗血清の提供に使用し得る。
【０１２４】
実施例４  タバコにおけるシュードモナス4-HPPDの異種発現
菌株87-79(配列番号１)由来のシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas 
fluorescens）遺伝子をPCRで編集して５´Nco1及び３´Kpn１制限部位に含有させた。次いで、この生成物をpMJB1に連結した。pMJB1はpUC19誘導プラスミドであり、植物操作可能な二倍増強CaMV35Sプロモーター；TMVオメガ(omega)エンハンサー及びNOS転写ターミネーターを含有する。得られたプラスミドの概略図は国際出願公開第98/20144号明細書の図２に示されている。二重増強35Sプロモーター、TMVオメガリーダー、4-HPPD遺伝子及び
nosターミネーターを含有する発現カセットをHindIII／EcoR１(部分EcoR1消化)を使用して切除し、同様に消化したpBIN19にクローン化し、次いで大腸菌TOP10感応細胞に形質転換した。
DNAを大腸菌から回収し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium 
tumefaciens) LBA4404を形質転換するのに使用し、次いでリファンピシリンとカナマイシンとを含有する培地から選択した細菌を形質転換した。当該技術で周知の方法、場合によっては本明細書のほかの箇所に記載の方法を使用してタバコ組織をアグロバクテリウム媒介形質転換に供した。 形質転換された新芽を、カナマイシン抵抗性カルスから再生させた。新芽を、カナマイシンを含有するMS寒天上に植えた。生存している根付いた外植片を再度植えつけてカナマイシン耐性形質転換植物約50本を得た。
【０１２５】
実施例５  タバコにおけるコムギHPPD配列の異種発現
コムギHPPD遺伝子は、翻訳開始コドンにNde1制限部位を含有するプライマーTAHPPDNde（配列番号28）又は翻訳開始コドンにTAHPPDSph（配列番号29）を含有するSph１制限部位及び翻訳停止コドンにTAHPPDBam（配列番号30）を含有するBamHI制限部位を使用して
RT-PCRによって得られた。得られたPCR生成物をpCR2.1にクローン化し、配列決定して信頼性を確認した。Nde１：BamH1 生成物をベクターpMCJA〔これはpMJB1(国際出願公開第98/20144号明細書)の誘導体であり且つ翻訳開始コドンにNco1よりもむしろNde1制限部位を含有する〕に連結した。Sphl：BamHI 生成物をベクターATSSU1（rubiscoプロモーターのシロイヌナズナ小サブユニットとnosターミネーターとを含有するpUC誘導ベクター）又はATSSU2（rubiscoプロモーターのシロイヌナズナ小サブユニットと、最適化トランジットペプチドと、nosターミネーターとを含有するpUC誘導ベクター）に連結した。次いで、これらの遺伝子発現カセットを全て、BIN19のような適当なバイナリーベクター(及び関連ベクター)に移し、TAHPPD１(図１)、TAHPPD2（図２）及びTAHPPD3（図３）とそれぞれ命名した。これらの組立て体を全てアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株LBA4404に形質転換し、前記の方法を使用して順次タバコを形質転換するのに使用した。
外植片(すなわち、葉と、補助的な芽を含有する茎の短い節)を、0.02〜２ppmの種々の濃度のメソトリオン(前記参照)を含有するMS寒天(＋３％スクロース)に置いた。タバコでは、例えば、未形質変換外植片は0.02ppmで完全に白化した。未形質変換外植片は、除草剤に長期暴露した後に回収しなかった。これらの具体的な実験では、芽から成長する新芽だけが白化し、移植組織上の葉は緑色のままであった。
多数のPCR+ve形質転換植物は、メソトリオン0.1ppm(例えば、野生型タバコに症状を生じる濃度の５倍の濃度)に耐え、白化を示さなかった。これらの植物は正常に根付き、未形質転換植物と表現型上は区別がつかなかった。この形質転換体の一部は＞0.2ppmの濃度に耐性があり、除草剤の存在下で正常に見える植物を生じ、よく根付いた。形質転換植物のあるものは前記の除草剤濃度よりも高い濃度で除草剤に供した際に最初に白化し得るが、長期間暴露すると徐々に“緑色に変化し”、“回復した”。
前記の除草剤抵抗性トランスジェニック植物の一部を、公知の除草剤イソキサフルトール[5-シクロプロピル-4-(2-メチルスルホニル-4-トリフルオロメチルベンゾイル)-イソキサゾール] 又は別法として構造式VIのsyncarpic acidで処理した。前記の植物は、非形質転換の対照と比べて、前記の除草剤全てに抵抗性であるが、しかしイソキサフルトール
〔その有効成分はジケトニトリル(構造式IV)(式３の除草剤）〕又は構造式VI(式４の除草剤）に対してはメソトリオン(式１の除草剤）に対するよりも抵抗性が実質的に小さく、従って前記植物が同じ作用様式をもつが異なる種類の構造をもつ4-HPPD阻害剤の多数の種類に対しては完全に交差抵抗性ではないことを明確に示している。
【０１２６】
実施例６  タバコにおけるカラスムギ(Avena sativa)4-HPPD遺伝子の異種発現
pCR 2.1TOPOベクター(実施例１)内部に含まれるカラスムギ（Avena sativa) 4-HPPD遺伝子を、Ndel及びBamH1を使用してベクターから切り出し、同様に消化したpMCJAに連結した。得られたベクターの構造を図４に図示する。
次いで、4-HPPD植物発現カセットを、HindIII及びEcoRlで制限したバイナリーベクター pBin19に連結し、大腸菌TOP10細胞(Invitrogen製)に形質転換した。次いで、このバイナリーベクターを当該技術で周知の方法及び例えば本明細書に記載の方法を使用してタバコに形質転換した。
前記の除草剤抵抗性トランスジェニック植物の一部を、公知の除草剤イソキサフルトール[5-シクロプロピル-4-(2-メチルスルホニル-4-トリフルオロメチルベンゾイル)-イソキサゾール]又は別法として構造式VIのsyncarpic acidで処理した。前記の植物は、未形質転換対照と比べて、前記の除草剤全てに抵抗性であるが、しかしイソキサフルトール〔その有効成分はジケトニトリル(構造式IV)(式３の除草剤）〕又は構造式VI(式４の除草剤）に対してはメソトリオン(式１の除草剤）に対するよりも抵抗性が実質的に小さく、従って前記植物が同じ作用様式をもつが異なる種類の構造をもつ4-HPPD阻害剤の多数の種類に対しては完全に交差抵抗性ではないことを明確に示している。
【０１２７】
実施例７  植物形質転換用のDNAの作成
植物発現カセットを含有するベクターを適当な制限酵素(１種又は複数)で消化して前記カセットを切り出すことによって、ボンバードメント法植物形質転換に使用するのに適した線状DNAを得て作成し、次いでアガロース寒天上で精製し、Biotrap（Schleicher及び
Schuell）を使用して単離した。
ダイズ又はトウモロコシのアグロバクテリウム 形質転換については、植物発現カセットを実施例12又は13に記載のようにしてバイナリーベクターにサブクローン化した。
【０１２８】
実施例８  HPPD阻害剤耐性HPPDをコードする領域をもつポリヌクレオチドの植物内
(in planta)選別及び選択
植物は、1)内因性タバコ(対照)HPPD遺伝子を発現する非形質転換タバコ植物、品種
Samsun、2)本明細書に記載の実施例に従ってシュードモナスHPPDを発現するために形質転換されたタバコ植物 及び 3)本明細書に記載の実施例に従ってコムギHPPDを発現するために形質転換されたタバコ植物である。
多数の植物を、温室内で小さな鉢で種子から５〜７葉の苗の段階まで成長させ、式１、２、３及び４の化合物から選択される種々のHPPD阻害剤型除草剤を一連の用量で、適当には0.0〜2000 g/haの用量で噴霧した。処理は、例えば例えば、脱イオン水＋0.5％
TurbochargeTM界面活性剤で製剤化するか又は50％アセトン/水で製剤化し、それぞれの系統(line)の１ダース又はそれ以上の複製に且つそれぞれの噴霧量〔植物がＴ1植物（一次形質転換体の自己子孫）であり及びさらに通常は１：２：１で分離する場合〕又は同系の３〜６植物の場合に200 l/haで施用した。未噴霧対照に対して分裂組織及び葉の白化、最終的壊死及び発育抑制の点で目に見える被害の程度を、処理後１未満及び３週間で評価した。感受性の分離体(segregants)から得たデータは分析から除外した。要約すれば、得られた結果は下記の通りである。
対照(未形質転換)植物は、メソトリオン（構造式１）についてよりもイソキサフルトールについて 〜１-２倍感受性であり、構造式VI、構造式VII又は構造式Ｖについては 〜２-４倍感受性である。構造式IIはイソキサフルトールに対して同様の効能をもつ。コムギHPPDを発現する植物は、構造式VI又は構造式Vについてよりもメソトリオンについて10〜40倍感受性が低く、しかもまたイソキサフルトールについてよりもメソトリオンについて４〜10倍感受性が低い。コムギHPPDを発現する植物は、構造式Ｖ、構造式VI 又は 構造VIIについてよりも構造IIについて４〜15倍感受性が小さい。シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)HPPDを発現する植物は、メソトリオン又は構造式IIについてよりもイソキサフルトール、構造式Ｖ、構造式VI又は構造VIIについて２〜６倍耐性である。
【０１２９】
得られた結果は、特に、コムギHPPDをコードする領域を有する試験ポリヌクレオチドを含有する植物が、例えば、構造Ｉ、メソトリオン、式１から選択される化合物について、例えば、構造VI、式４から選択される化合物についての耐性よりも＞16Ｘよりもい耐性であり、これに対して非形質転換対照植物については、上記と同じ化合物についてのそれぞれの耐性の違いは＜４であることを実証している。従って、試験植物と対照植物についての２つの式１／式２の比は、少なくとも16/４これは＞2.5であり且つ４＞である。従って、本発明の方法によれば、コムギHPPDをコードする領域をもつポリヌクレオチドは形質転換、再生、育種及びタバコの噴霧試験によって選別され、しかもこれらの結果に従って
HPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするものとして選択される。また、得られた結果は、シュードモナス菌HPPDをコードする領域を有する試験ポリヌクレオチドを含有する植物が、例えば、構造Ｖ、構造VI又は構造VII、（式４から選択される化合物）について、例えば、構造I、メソトリオン、式１から選択される化合物についてよりも＞２〜４倍耐性であり、これに対して未形質転換対照植物については、上記と同じ化合物についてのそれぞれの耐性の違いは＜0.3〜0.5であることを実証している。従って、試験植物と対照植物についての２つの式４／式１の耐性の比は、少なくとも＞２/0.5、これは＞2.5であり且つ４＞である。従って、本発明の方法によれば、シュードモナスHPPDをコードする領域をもつポリヌクレオチドは形質転換、再生、育種及びタバコの噴霧試験によって選別され、それによってHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするものとして選択される。
【０１３０】
実施例９  0.10〜５/μM/sの範囲のkcat/Ｋm値をもつHPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの生体外選別及び選択
例えば、シロイヌナズナ、コムギ、カラスムギ、シュードモナスなど及び本実施例の他の個所に記載のものからの種々の試験HPPD配列を発現する組換え大腸菌株の粗製抽出物を調製した。この組換えクローンを、Stratageneから供給される大腸菌コドン最適化PR株BL21(DE3)に導入した。培養槽培地(例えば、カナマイシン100μg/mlを補足したLB培地)に１mM IPTGを添加した後にHPPDタンパク質がこの菌株内で発現された。正確に予測された量の組換えタンパク質が、(i)細胞抽出物のSDSゲルのクーマシー染色に基づき且つ並行して空のpET24aベクターを用いて形質転換された同様の大腸菌細胞のクーマシー染色ゲルと比較し、次いで(ii)SDS PAGEゲルから切り出し且つ溶出されたHPPDポリペプチドに対して前記のポリクロナール抗体を使用してウエスタン分析することによって同定された。典型的には、湿潤重量25gの細胞をpH7.5の0.1M Hepes/KOH緩衝液50ml中で洗浄した。低速円心分離を行った後に、得られた細胞ペレットを上記と同じ緩衝液50ml中に再懸濁した。細胞を、ガラス製ホモジナイザーを使用して均一に懸濁し、次いでConstant Systems 
(Budbrooke Rd、 Warwick、 U. K.) Basic Z 細胞粉砕装置を使用して10000 psiで粉砕した。粗製抽出物を２時間以内に40,000g以下で遠心分離し、ペレットを捨てた。次いで、透明な上清画分をSephadex G25の下方に同じ緩衝液に交換し、このようにして調製した抽出液を新規に使用するか又は液体窒素中にビーズ化し、使用するまで −80℃で保存にした。典型的には、クーマシー色素染色したSDS PAGEゲルから判断すると、抽出物はHPPDとして可溶性タンパク質を１〜４％含有していた。典型的には、タンパク質濃度は15〜30mg/mlの範囲内にあり、25℃及び基質濃度100μM HPPでのHPLC検定法を使用することに基づいた比活性は、生成HGA50〜300nmol/min/タンパク質の範囲であった。
【０１３１】
それぞれの酵素製剤の酵素阻害剤結合部位の力価は、下記の通りに測定した。一組の反応をエッペンドルフ遠心分離管中で、氷温で行った。一連の容量、典型的には０〜50μlの抽出物を反応緩衝液に最終容量250μlまで希釈し、それぞれの管の反応を一定量の放射線標識阻害剤を加えることによって開始させた。反応緩衝液は、25mMアスコルビン酸ナトリウム(新たに調製した)と２〜3.8 mg/lの高純度カタラーゼ(Sigma C3155 〜50,000単位/タンパク質mg)とを含有するpH7.0の50mMのBis-Tris-プロパン緩衝液であることが適当である。場合によっては、反応緩衝液は、25％(v/v)グリセロールも含有する。放射線標識HPPD阻害剤は、14Ｃを用いて0.5〜３GBq/mmolで標識するのが適当であり、阻害剤はメソトリオン、イソキサフルトールから誘導したジケトニトリル又は5-メチル-2-(2-クロロ-3-エトキシ-4-メタンスルホニルベンゾイル)シクロヘキサン-1,3-ジオンから選択するの適当である。それぞれの管の放射線標識の一定濃度は、0.1〜0.4μM HPPD阻害剤に設定するのが適当である。幾つかの阻害剤/HPPD酵素の対の場合には、反応は、i)25℃で比較的短い時間、適当には５〜15分か又はii)長時間、４℃で一夜、次いで25℃で３〜５時間行ない、i)前記部位の半分又は ii)部位の実質的に全部の占有部分それぞれを達成する。当業者には、これが実験の内容であることが認められるであろう。時間の最後に、反応の試料、典型的には0.2mlを採取し、２mlのPharmacia“NAP5”ゲル濾過カラムを下方に迅速にクロマトグラフィー分離し、タンパク質含有画分(0.8ml)とタンパク質を含有していない画分(３ml)とに分離した。得られた２つの画分をシンチレーションバイアル管に分け、シンチレーション液を加え、次いでそれぞれの画分のカウント数を合計した。これらのタンパク質含有画分のカウントはタンパク質に結合された放射線標識阻害剤に相当し且つタンパク質を含有していない画分のカウントは結合されなかった阻害剤に相当する。放射線標識阻害剤の純度及び放射線特異活性は公知である。従って、阻害剤がHPPDに触媒部位/タンパク質モノマー当り約１個又は0.5個の割合で結合すると仮定すると、抽出物中の阻害剤結合部位の濃度、従って触媒部位の濃度を算出することができる。かかる化学量論量は、活性部位を指向し且つ模擬触媒中間体である阻害剤について期待されるであろう。別の例として、幾つかの代表的な実験の結果を以下に示す。
【０１３２】
20mgタンパク質/mlシロイヌナズナHPPD抽出物の試料のアリコート０、２、５、10、20、40及び60μlをそれぞれ14Ｃメソトリオン(〜12 GBq/mmolで最終濃度〜17μM) 10μl
(196 Bq)と共に、25mMアスコルビン酸ナトリウムと２〜3.8mg/lの高純度カタラーゼ 
(Sigma C3155〜50,000単位/mgタンパク質)とを含有するpH7.0及び25℃の50mMのBis-Trisプロパン緩衝液の最終容量240μl中で、氷温で24時間インキュベートし、次いで25℃で〜3.5時間インキュベートした。パイロット実験は、かかる条件下ではメソトリオンの結合はほぼ完全であり、結合の最初の〜50％が急速に生じ、残りの50％がさらに遅いことを示した。それぞれの反応の試料200μlを採取し、NAP5カラムに沿ってクロマトグフィー分離してタンパク質結合放射線標識を未結合放射線標識から分離し、２つの画分を数えた。得られた結果を表１に示し且つ図１に示したが、適当な補正の後に、結合されたdpsを元の反応における結合標識の濃度μMに変換した。TLC及びNMRの試験に一致して、表１は、放射線標識の95％がメソトリオン(そのHPPDに対する結合によって規定される)であり、〜４−５％は放射線標識混濁物に対応し、該放射線標識混濁物はメソトリオンではなく且つHPPDに対する緊密な結合を示さない。希釈されていないシロイヌナズナ抽出物中のメソトリオン結合部位の濃度は〜12.2μMである。シロイヌナズナHPPDのポリペプチドＭrは〜50kDである；従ってHPPDは最初の粗製シロイヌナズナHPPD抽出物のタンパク質の３％を構成している。
【０１３３】
表１ 14Ｃメソトリオンに対するシロイヌナズナHPPDの力価測定
2004528821.tif 000036
【０１３４】
当業者には、本質的に同じ方法をその他のHPPD酵素の抽出物における阻害剤結合部位の力価(titre)を測定するのに使用できることは明らかであろう。従って、例えば、コムギからの24 mgタンパク質/mlでのHPPDの抽出物が、14Ｃ標識ジケトニトリル又は14Ｃ標識5-メチル-2-(2-クロロ-3-エトキシ-4-メタンスルホニルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオンについて〜20±〜４μMの結合部位を含有することが測定される。コムギについては、最初の阻害剤分子はより迅速に結合し、第二の阻害剤分子はそれよりも遅く結合し、誤差範囲はシロイヌナズナ HPPDに関する誤差範囲よりも高い。その理由は、コムギ酵素は幾分安定性が低く、しかもその結合能をより早く失うからである。コムギHPPD(事実、全ての HPPD酵素)は阻害剤によって安定化され、それに対して最も緊密に結合する阻害剤によってほとんど安定化される。かかる阻害剤が、阻害剤結合部位の力価を測定するのに最もよい選択である。
【０１３５】
HPPD活性についてのHPLC検定及びkcat及びＫmの測定は、次の通りに行う。検定緩衝液は105μM(又は適当なものとして)であり、ヒドロキシフェニルピルビン酸(HPP)は、pH7.0の50mM Bis-Tris-プロパン緩衝液中で新たに調製する。希釈緩衝液は、25mMアスコルビン酸ナトリウムと3.8mg/lのウシのカタラーゼ(Sigma C3155 〜50,000単位/mg)とを含有するpH7.0の50mM Bis-Tris-プロパン緩衝液である。HPPD酵素(貯蔵物からの新鮮な未凍結物）を氷温で保持し、使用する前に氷温で希釈緩衝液中で適当な濃度(典型的には２〜８μM)まで希釈する。検定は、希釈酵素５μlをエッペンドルフ遠心分離機中で25℃の検定緩衝液100μlに加えることによって開始し、０〜90秒の一連の時間で25％過塩素酸20μlを加え、回転混合することによって停止させる。それぞれのエッペンドルフ管の内容物80〜
100μlをHPLCバイアル管に移した後に、逆相HPLCによって分離する。HPLCについては、HP 1100 HPLC装置を使用して5.5％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸(緩衝液Ａ)を用いて平衡化させたAqua Ｃ18 ５μ 75×4.6mmカラム(silicaは末端封鎖される)に、40μlを1.5ml/minの流量で装填した。このカラムを、緩衝液Ａによる２分間洗浄、次いで緩衝液Ａ/100％アセトニトリルの30/70混合物による２分間洗浄、次いでさらに緩衝液Ａによる3.5分間洗浄(使用の間、カラムは65％アセトニトリル/水中に保存した)を使用して1.5 ml/分の流量で溶出する。HGA（ホモゲンチジン酸)及びHPP（ヒドロキシフェニルピルビン酸）の溶出は、UVフローセルを使用して監視し、292nmのピーク吸光度の積分値によって定量した。HGAは約２分で溶出し、HPPはその後に溶出する。HGAの種々の濃度の標準の一組を使用して標準曲線を得て、HGA濃度に対するHGAピークのUV吸光度を較正する。
【０１３６】
前記検定法を使用して、典型的なHPPD調剤のＫm値及びＶmax値の評価を得た。Ｋmの測定については、停止した検定について、より低い基質濃度でより重要になる近初期速度データを得ることが重要である。従って、それぞれの基質濃度について多数の時間位置を採用すること及び低い基質濃度で早い時間位置(time point)を使用することが重要である。コムギHPPDについてＫm値及びＶmax値を測定する実験の一例を表２に示す。
【０１３７】
表２  種々の時間及びHPP濃度で検定したコムギHPPD
データは生成したHGAの量(pmol)である。保存コムギHPPD抽出物(18μM)は30倍に希釈した。検定、最終容量105μlは希釈されたHPPDを５μ含有していた。
2004528821.tif 000037
【０１３８】
基質HPPに関してコムギHPPDのＫm値は約10.1±1.5μMである。Ｖmaxは33.5±４pmol/sである。活性部位の力価測定から、検定におけるコムギHPPDの濃度は、105μl中の酵素部位3.1pmolに相当する31.5μMであると算出される。従って、コムギHPPDのkcat値及びkcat/Ｋm値は、それぞれ〜11/s及び〜1.1/s/μMと算出することができる。同様に、シロイヌナズナHPPDのkcat値、Ｋm値及びkcat/Ｋm値は、それぞれ〜4.65/s、3.5μM及び1.3/s/μMであると測定され、またシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens）HPPDのkcat値、Ｋm値及びkcat/Ｋm値はそれぞれ〜5.04/s、32μM 及び0.16/s/μMであると測定される。336位にトリプトファンを有するシュードモナス・フルオレッセンス
（Pseudomonas fluorescens）HPPDの突然変異体は、野生型のkcat/Ｋm値（ｋcat/Ｋm ＜〜0.05/s/μM)に比べて少なくとも３倍低いkcat/Ｋm値を有することが認められた。25℃及び飽和基質をもつ純粋な野生型シュードモナス酵素（サブユニットＭr 〜40223)、シロイヌナズナ酵素(サブユニットＭr 〜46486)及びコムギ酵素(サブユニットＭr48923)の特異活性は、少なくとも7.13、5.7及び〜13.5 μmol/min/mgタンパク質であり、HPPD酵素について既に知られている値よりも極めて高いことがさらに算出でき；これらの値は、損傷した酵素に対する結合を表すと思われる部位(下記参照)、又は触媒活性に関係しない部位の“早い交換”画分に対する結合の20〜30％をさらに考慮に入れた場合にはさらに20〜30％まで増大する。
【０１３９】
従って、この実施例によれば、例えば、コムギHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドは、細菌中での異種発現、発現されたHPPDを活性形で含有する抽出物の調製、緊密な結合活性部位指向化阻害剤に対する力価測定による活性部位濃度の測定及び一連の基質濃度での酵素検定の実施からなる方法によって選別される。そのようにして得られたデータから算出できるkcat/Ｋmの値がpH7.0、25℃で〜1.0/s/μMであり、これは0.1〜５s-1μM-1の特許請求した範囲及び0.8〜５s-1μM-1の好ましい範囲内にあることから、該ポリヌクレオチドは、本発明に有用で且つ適切な耐性HPPD酵素をコードするポリヌクレオチドとして選択される。
【０１４０】
実施例10  酵素／阻害剤複合体の解離を左右する速度定数の相対値及び絶対値の測定に基づいた、HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの生体外選別及び選択
ある場合には、対照HPPD（シロイヌナズナ由来のもの）を発現し且つ別の場合には１種又はそれ以上の供試HPPD配列を発現する組換え大腸菌株の粗抽出物を、上記の実施例に記載のようにして調製した。活性部位及び酵素活性の力価もまた、上記の実施例に記載のようにして規定し、測定した。
式１及び／又は２ 及び／又は３ 及び／又は４から選択される阻害剤の、該阻害剤と供試HPPD酵素又は対照HPPD酵素とから形成される複合体からの解離速度〔オフ速度(off 
rate)〕は、多数の方法で適切に測定される。すなわち、例えば、メソトリオン（式１から選択される化合物）及びイソキサフルトールのジケトニトリル（式３から選択される化合物）のこれらの供試HPPD、コムギHPPD又は対照シロイヌナズナHPPDとの複合体それぞれからの解離の速度が比較される。その方法及び典型的な試験から得られた結果は、次の通りである。
14Ｃメソトリオンは、特異活性1.12 GBq/mmolを有する。これはTLCにより及びHPPDに緊密に結合する物質(material)の割合を基準として放射線化学的に〜95％の純度である。シロイヌナズナ及び(供試)コムギHPPDのそれぞれを、25％グリセロール、25mMアスコルビン酸ナトリウム及び14Ｃメソトリオン0.46mM含有ウシカタラーゼ３mg/l（Sigma C3155 
〜50,000単位/mg）を含有するpH7.0の50mM Bis-Trisプロパン緩衝液1.6mlに、〜0.45及び0.54μMそれぞれの濃度に希釈し、次いで25℃で2.5〜３時間反応させた。この最初の結合反応に続いて、冷メソトリオンを最終濃度60μMまで加えることによって交換反応を開始させ、種々の時間でアリコート200μlを取り出し、迅速にクロマトグラフィーにかけて
0.1M KClを含有するpH７の50mM BTP中で平衡化したNAP5ゲル濾過カラムに通し、放射線標識を結合しているか又は結合していないタンパク質を含有する画分に分離し、次いで液体シンチレーションカウントした。その結果を図１に要約する。図１において、冷メソトリオンを加えない対照実験では、阻害剤は実質的に結合されたままである。
【０１４１】
図１において時間(〜0.35μM)における結合されたメソトリオンの濃度(縦軸)は、シロイヌナズナ酵素の濃度（〜＞0.43μM) 又は過剰量であった小麦の場合には阻害剤の濃度（〜0.46μM)よりも幾分低い。これは、25℃で2.5〜３時間後には結合が十分に完結していないこと(〜0.5当量のメソトリオンが急速に結合し、残部が徐々に結合する)及びその速度が25％(v/v)グリセロールの存在によって幾分遅くなるという理由からである。シロイヌナズナHPPDに結合されたメソトリオンの〜25％は比較的早く交換し、これに対してその残りは徐々に交換することもまた明らかである。シロイヌナズナHPPD酵素及びその他のHPPD酵素の粗製抽出物においては、結合されたメソトリオンの約20〜30％は比較的迅速に交換し〔20〜25％(v/v)グリセロール中、25℃、pH7.0におけるシロイヌナズナHPPDからのメソトリオンの解離についてはt1/2 〜30-40分〕、これに対して70〜80％（正真正銘の完全に活性な活性酵素のバルクに相当すると推測される）は徐々に交換する〔20〜25％(v/v)グリセロール中、25℃、pH 7.0におけるメソトリオンの解離についてはt1/2 〜4日〕。これは、1)活性ロスに関連した別の酵素処理は迅速交換画分の割合で相対的増大をもたらすという観察及び 2)迅速交換画分の相対割合は、一方では、結合反応の時間(10秒〜24時間）に従って変化し、従って結合反応において動力学的に捕捉された中間体ではないという予備的観察によって裏付けられる。また、迅速交換画分は単に損傷した酵素に相当するという見解は、過剰量のHPPDを用いて実験を行った場合には迅速交換画分の割合が減少するか又は認められないという観察によって裏付けられる。迅速交換画分の起源は、完全に明らかではなく、推測を受け入れやすいままである。それにもかかわらず、ここでは、実用上、ｋoff値は常に主要な緩徐型交換反応の速度から算出される。かかるｋoff値はコンピューターモデル化によって算出され、４種類の速度定数(しかし、二つのｋon値が互いに同一であると仮定される場合には、二つのｋoff値である)によって且つ別の実施例において独立して決定されるようなｋon値（ｋon値の精度は、いずれにせよ、一般的にはかかる適合については臨界的ではない）を使用することによって左右される交換反応ＥＩ＋Ｉ＊ ←→ＥＩ＊＋Ｉの計算された進行に対する最もよい適合が得られる。メソトリオンが供試コムギHPPDから迅速に解離するが、対照のシロイヌナズナHPPDからはそれよりもはるかに遅く解離することは明らかである。得られたデータは、メソトリオンについてのコムギHPPDからの〜3.8×10-4/sのｋoff値及びシロイヌナズナHPPDからの2.0×10-6/sのｋoff値（上記二つの場合のｋon値は、グリセロールの存在下で、それぞれ７×104/s/M及び1.1×105/s/Mである)に最もよく適合する。
【０１４２】
全ての供試阻害剤が、必ずしも放射標識した形で容易に利用できるものではない。オフ速度(off rate)を測定するもっと一般的な方法は、最初に未標識供試阻害剤との複合体を形成し、該複合体を過剰量の未標識阻害剤なしで迅速に交換し、次いで過剰量の標準の標識阻害剤を加えることによって交換反応を開始させることである。その動力学的性質は既に知られている。次いで、反応を監視し、結合された標識と結合されなかった標識の相対量を種々の時間で測定する。このようにしてHPPDに結合する標識された阻害剤の交換の進行速度を監視することから得られたｋoff値は、期待されるように、一般的に逆進(reverse)(これはHPPDとの複合体からの標識された阻害剤の交換である）を監視することにより得られる値に極めて近いことが認められる。後者の方法は、交換速度が速い場合(t1/2＜３時間)に選択される方法である。
【０１４３】
14Ｃメソトリオン(構造式Ｉ)(ここで使用したように特異活性1.12 GBq/mmol)とは別に、14Ｃ構造III(ここで使用したように特異活性1.036 GBq/mmol)及び14Ｃ 5-メチル-2-(2-クロロ-3-エトキシ-4-メタンスルホニルベンゾイル)-シクロヘキサン-1,3-ジオン(ここで使用したように1.81 GBq/mmol)が、標準的な阻害剤として適切に使用される。所定のHPPDに対して最も緊密に結合する（最も低いＫd値を有する）ことが認められる標準的阻害剤はどれでも、未標識阻害剤のＫd値及びkoff値の評価用のHPPDについて標準的な阻害剤として使用することが好ましい。
【０１４４】
下記の方法及び結果は、非標識阻害剤のｋoff値を測定する方法を例証する。シロイヌナズナHPPDを、25mMアスコルビン酸ナトリウム、２mg/lのウシカタラーゼ(Sigma Ｃ3155 〜50,000単位/mg)及び20μMの供試阻害剤（この場合にはメソトリオン又は構造II）を含有するpH7.0の50mM Bis-Trisプロパン緩衝液に2.76μMまで希釈した。この非標識阻害剤を用いる最初の結合反応は、氷温で一夜、次いで25℃で２〜３時間放置した。次いで、200μlをPharmacia NAP5カラムに通してゲル濾過により未結合阻害剤が存在しない状態に迅速に交換し、次いで25mMアスコルビン酸ナトリウム及び２mg/lのウシカタラーゼ(Sigma Ｃ3155 〜50,000単位/mg)を含有するpH7.0の50mM Bis-Trisプロパン緩衝液に希釈した。交換反応を、14Ｃメソトリオン80μlを最終濃度1.75μMまで加えることによって開始させ、0.1M KClを含有するpH７の50mM BTP中で平衡化させたNAP5カラムを通す急速ゲル濾過用に種々の時間でアリコートを取り出し、タンパク質結合画分とタンパク質なしの画分とに分離し、次いで液体シンチレーションカウントした。結果を図２に要約する。図中、三角形は非標識メソトリオンから得られたデータを表し、円形は構造IIから得られたデータを表す。対照実験においては、酵素が非標識阻害剤を用いずに、又は好ましくは構造VIIIにおけるような弱い阻害剤を用いてプレインキュベートされる場合には、放射線標識阻害剤は５〜６時間以内に（図２に示す実験の具体例では0.385μMの濃度まで）完全に結合され、長期の日数、実質的に完全に結合されたままであった(結合された量はシロイヌナズナHPPD酵素の段階的な劣化に対応して５〜７％／日まで減少する)。縦軸の結合の濃度は、この段階的な結合能の損失を考量に入れるために対照値について標準化される。得られたグラフは図１に示した形の逆である。また、得られたデータは、最初に生じるより早い結合の所期段階と比較的早い交換中状態にあるHPPD結合部位の〜20％と一致する。さらに、対照においては、結合平衡は４〜６時間までは十分に確立されない。ｋoff値は、本明細書では、この期間の後に生じる主要な遅い交換反応から常に算
出される。かかるｋoff値は、４種類の独立した速度定数によって左右される交換反応ＥＩ＋Ｊ←→ＥＪ＋Ｉの算出される進行に対するデータの最もよい適合を得るためにコンピューターモデルによって及び別の実施例で独立して測定されるようなｋon値を使用することによって算出される。従って、例えば、図２のデータから、構造IIがシロイヌナズナHPPDからメソトリオンが解離するよりも早く解離することが明らかである。そのデータは、シロイヌナズナHPPDからの〜1.16×10-5/s（ｋon＝0.8/s/μM）及び3.3×10-6/s（ｋon＝1.9/s/μM）のｋoff値に対する最もよい適合である〔この場合には25％(v/v)グリセロールを存在下させることなく得られる〕。
【０１４５】
前記の方法の変法においては、オフ速度(off rate)は 〜25％(v/v)グリセロールの存在下又は不存在下で測定される。グリセロールの存在下では、得られる値は、グリセロールの不存在下における場合よりも一般に〜1.5−３倍遅い。しかし、ある場合には、この変化はこの範囲外にあるか、又は別の向きで平坦である。得られたデータの別の例を下記の表３に示す。
【０１４６】
表３
種々のHPPD酵素との複合体からの種々の阻害剤の解離を左右する解離速度定数
(ｋoff値)。それぞれの列は別々の単一の実験の組から得られたデータを表す。
2004528821.tif 000038
【０１４７】
このように、特に、本発明の方法に従って、HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドが、HPPD酵素／HPPD阻害剤の解離速度(ｋoff値)について生体外(in vitro)での発現及び試験方法によって選別されることを理解することができる。コムギHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが、阻害剤耐性HPPDをコードするヌクレオチドとして選択されることが前記の例からさらに理解することができる。なぜならば、発現されたコムギHPPDの構造Ｉ(式１から選択される化合物)との複合体についてのｋoffの値と、構造IV（式３から選択される化合物)を用いて形成される複合体についてのｋoffの値との比(ｋoff１/ｋoff３)が22.9又は16.13であり、これはシロイヌナズナ対照酵素由来の同じ対の阻害剤の解離について認められる同様に誘導される比 1.25又は0.38よりも2.5倍以上も大きいことが認められるからである。認められるように、さらに同様にできる前記の選別及び比較は、例えば、構造II(式２から選択される化合物)及び構造VII(式４から選択される化合物)について、コムギHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが選択されるという同じ結果を伴ってなされている。この場合、コムギHPPDについての比 ｋoff２/ｋoff４は30又は42であり、これもまたシロイヌナズナ対照酵素についての同様の比11又は8.6よりも2.5倍を越えて大きい。別法として、コムギHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチドがpH7.0及び25℃の水において除草性HPPD阻害剤、この場合には構造Ｉ又は構造IIの除草性HPPD阻害剤と複合体を形成できるHPPD-阻害剤耐性HPPD酵素をコードするという基準で選別され、選択される。この場合、前記の複合体の解離は、４×10-5 〜 ２×10-3 s-1-の範囲の速度定数(ｋoff)(この場合には、それぞれ3.8×10-4 又は1.0×10-3及び2.5×10-4/s又は3.5×10-4)によって左右され且つ選択されたHPPD阻害剤は双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の活性を有する(これはメソトリオンそれ自体について明らかなように構造IIについてその通りである)。
【０１４８】
また、この実施例は、本発明の方法に従って、シュードモナスHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが阻害剤耐性HPPDをコードするヌクレオチドとして選択されることをを例証する。なぜならば、発現されたシュードモナスHPPDの構造VI(式４から選択される化合物)との複合体についてのｋoffの値と、構造Ｉ（式１から選択される化合物)を用いて形成される複合体についてのｋoffの値との比(ｋoff４/ｋoff１)が ＞21.7 又は ＞100であり、これはシロイヌナズナ対照酵素由来の同じ対の阻害剤の解離について認められる同様に誘導される比0.6よりも2.5倍以上も大きいことが認められるからである。認められるように、さらに同様にできる前記の選別及び比較が、例えば、構造IV(式３から選択される化合物)及び構造Ｉ(式１から選択される化合物)について、シュードモナスHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが選択されるという同じ結果を伴ってなされている。この場合、シュードモナスHPPDについての比ｋoff３/ｋoff１は5.25又は90であり、これもまたシロイヌナズナ対照酵素についての同様の比0.8又は2.54よりも2.5倍を越えて大きい。別法として、シュードモナスHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチドがpH7.0及び25℃の水において除草性HPPD阻害剤、この場合には構造IV又は構造VIの除草性HPPD阻害剤と複合体を形成できるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードするという基準で選別され、選択される。この場合に、前記の複合体の解離は、
４×10-5 〜２×10-3 s-1-の範囲の速度定数(ｋoff)(この場合には、それぞれ4.2×10-5又は1.8×10-4及び＞2.0×10-4/s)によって左右され且つ選択されたHPPD阻害剤は双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の活性を有する(これは構造IV及びVIについてその通りである)。
【０１４９】
実施例11  酵素／阻害剤の複合体の解離定数(Ｋd値)の相対値及び絶対値の測定に基づいた、HPPD酵素をコードする領域を有するポリヌクレオチドの生体外選別及び選択
種々のHPPD阻害剤に関するＫd値の差の定性測定値は、酵素を阻害剤と共にプレインキュベートし、次いで阻害率％を測定することによって得られる。例えば、HPPDは、トウモロコシの苗から単離され、部分精製され、1993年にSchulzらによって報告された方法
(FEBS LETS. 318, 162-166)及びSecorによって Plant Physiol., 106, 1429-1433(1994)に報告された方法方法と同様の方法で検定される。検定は、30分間行われ、放射線標識したヒドロキシフェニルピルビン酸(最終濃度〜0.1−0.2mM)を加えて開始され、次いで20〜30分間にわたって阻害剤が前記の部分精製酵素と共にインキュベートされる。下記の阻害レベル(対照に対して)が、トウモロコシHPPDに対して除草剤を下記の用量で用いて観察された。
メソトリオン    スルコトリオン    構造IV
1 nM        ＜17％            −              44％
10 nM         44％             8％            78％
100 nM        51％            51％            92％
1000 nM     ＞75％            83％            93％
【０１５０】
シロイヌナズナ(Arabidopis)由来のHPPD〔シロイヌナズナHPPDを発現するために形質転換された大腸菌細胞から得られ且つGarciaらによってPlant, Physiol (1999) 119, 1507-1516に報告された方法と同様の大腸菌抽出物として調製される〕を使用した以外は上記と同じ検定方法を使用して、下記の阻害レベル(対照に対して)が、シロイヌナズナHPPDに対して除草剤を下記の用量で用いて観察された。
メソトリオン    スルコトリオン    構造IV
1 nM         42％             57％            20％
10 nM        95％             96％            90％
100 nM      100％            100％            95％
1000 nM     100％            100％            95％
【０１５１】
前記の実験は、構造IVがメソトリオン及びスルコトリオン(これらはトウモロコシ酵素に対しては構造IVよりも〜10及び100倍活性が劣ると思われる)と同等であるか又はこれらよりも幾分劣る有力な阻害剤であることを示している。これらのデータは、ある種の置換-1,3-シクロヘキサンジオン系除草剤、例えばスルコトリオン及びメソトリオンが、少なくともこれらの観察された選択性の基準の一部分として、単子葉植物由来のHPPDを双子葉植物由来のHPPDよりも少し弱く(less strongly)阻害する傾向をもつことをことを例証している。絶対及び相対Ｋd値の定性測定値を得るために、以下に記載のように種々の方法が使用される。
【０１５２】
ある場合に対照HPPD（シロイヌナズナ由来のもの)を発現し、また別の場合には１種又はそれ以上の供試HPPD配列を発現する組換え大腸菌株の粗抽出物は、上記の実施例に記載のようにして調製される。活性部位及び酵素活性の力価もまた、上記の実施例に記載のようにして規定され、測定される。式１及び／又は２及び／又は３及び／又は４から選択される阻害剤の、これらが供試HPPD酵素又は対照HPPD酵素と形成する複合体からの解離速度〔オフ速度(off rate)〕は、上記の実施例に記載のようにして適切に測定される。Ｋd値は、比ｋoff/ｋonから適切に算出される。該方法の変法においては、オン速度(on rate)及びオフ速度(off rate)は共に 〜25％(v/v)グリセロールの存在下で測定されるか又は両者はグリセロールの不存在下で測定される。一般に、グリセロールはオン及びオフ速度をほぼ同じ程度まで遅くすると思われ、従ってＫd値はグリセロールにより変化するとは思われない場合が多い。ある場合には、それにもかかわらずＫdはグリセロール依存性である。PPD酵素に対する阻害剤の結合を左右する速度定数(ｋon値)は多数の方法で適切に測定される。
【０１５３】
第一に、HGAの形成を種々の時間で監視するHPLC検定法は、先の実施例９に記載のようにして操作される。添加される阻害剤が存在しない場合でも、進行曲線は、検定条件下で酵素の不活性化の進行を反映する直線ではない。阻害剤の増大する濃度では、曲線の湾曲がよりいっそう著しくなる。対照曲線及び阻害された曲線の両方を開始濃度から最終ゼロの濃度の方向への活性酵素の量の単純な指数減衰(すなわち、Ｅ(t)＝Ｅ(o).e-ktのプロセスによって左右される活性酵素の濃度の減少）に適合すること可能である。このように、阻害剤の一連の種々の濃度における見かけの(apparent)速度定数(ｋ´)は、阻害剤の不存在下の進行曲線に適合した対照速度定数を観察された速度から差し引くことによって得られる。次いで、真の速度定数(kon)の推定値は、見かけの速度定数に１/(１＋Ｓ/Ｋm)（式中、Ｓは検定におけるHPPの濃度である)を乗じることによって得られる。曲線の差し引きの必要性及び及びＫmの値を知るための必要性を仮定すると、これはおそらくはｋonの種々の決定方法のうちで最も誤差の少ないものであると思われる。それにもかかわらず、迅速に解離し得る酵素阻害剤複合体であって次いでより緊密に阻害された形に徐々に異性化する酵素阻害剤複合体の最初の急速形成を必要とするより複雑なスキーム(scheme)よりもむしろ単純な結合プロセスＥ＋Ｉ←→ＥＩにより適切に説明できることは、算出における暗黙の推定の直接的試験を提供するという理由から、価値がある。後者の場合においては、ほぼゼロ時間におけるゼロの阻害よりもむしろ、顕著なレベルの最初の阻害が認められる〔Schloss, J. V. (1989) in “Target sites of Herbicide Action”
(Boger, P. and Sandmann G. eds) CRC Press Boca〕。実験例を図３に例示する。
【０１５４】
図３において、100μMのHPP基質を含有する検定は、コムギHPPDを 〜19 nMの最終濃度まで加えることにより開始し、次いで図に示される時間で停止した。上部の進行曲線は阻害剤を存在させていないものであり、中間部の進行曲線は構造IIの化合物を2.5μM存在させたものであり且つ下部の進行曲線は構造IIの化合物を10μM存在させたものである；これらの曲線は、0.35μM/sの初期速度（すなわち、顕著な初期阻害が存在しない）に適合し、一次減衰速度定数 0.016、0.029及び0.06/s それぞれをが観察された。10μMのＫm値を仮定すると、従ってｋonの値は48000〜57200 s-1M-1と推定される。
【０１５５】
より直接的な検定法に基づいたｋonの測定方法は、供試HPPD酵素を阻害剤と一連の時間範囲で反応させ、次いで高濃度の(競争)基質HPを加えることによって阻害反応を効果的に停止させる。別の阻害を効果的に凍結するのと同じ時間で、これはまた、HPPを添加する前の時間の間に阻害がどのように進行したかを示す検定も開始する。次の例は、上記の方法を例証するものである。コムギHPPDを、25mMアスコルビン酸ナトリウム及び3.9 mg/lのウシカタラーゼ(Sigma Ｃ3155 〜50,000単位/mg)を含有するpH7.0の50mM Bis-Trisプロパン緩衝液中で0.465μMの濃度に希釈する。希釈されたHPPD５μlを、pH7.0の50mM BTP緩衝液(対照)10μl、構造VIの化合物0.5μMを含有するpH7.0の50mM BTP緩衝液10μl、構造VIの化合物2.0μMを含有するpH7.0の50mM BTP緩衝液10μlに加える。この反応を、25℃で０(“予備停止”検定)、10、30、50 又は70秒間行い、その後に150μMのHPP 100μlを加える。HPPの添加後に、検定を40秒間行い、その後に25％過塩素酸20μlを加えて停止させ、HPLCで分析する、酵素と阻害剤との間の前記の時間の“予備反応”において、酵素の濃度は0.155μMであり、また阻害剤の濃度は0.0.33μM及び1.33μMである。活性の完全な失活をもたらす阻害剤とHPPDとの初期の、早い、反応は化学量論量を結びつけることによっ最終的に測定できる部位の半分だけを用いるものであるということから、速度定数のシミュレーション及び算出に最適な酵素濃度は、前記の長期力価測定結合研究におて測定されるような酵素濃度の半分であることに注目される。40秒間の検定では、阻害剤の最大最終濃度は0.174μMである。特に130μMのHPPの存在下では、これは40秒検定それ自体の経過中に検定可能な進行性の阻害を生じるのに余りにも少ないこと、従って、観察される阻害の全ては基質の不存在下での前記の時間の予備反応中に生じる酵素に結合する阻害剤によるものであることが、図について説明したような実験により確認される。得られたデータはモデルのＥ＋Ｉ→ＥＩの反応に適合し、この場合に“活性”は“活性酵素”に相当し且つ活性の減少は、阻害剤の添
加後の化学種“Ｅ”の減少を反映している。オフ速度が相対的に非常に低いことを考えると、前記の阻害反応は反応条件下では事実上不可逆的であると推測できる〔それは、反応を可逆反応としてモデル化し且つ既知の低いオフ速度を前記の適合に含めるならば、著しい相違を生じない〕。前記の実験及びデータに対する適合
(fit)から得られた結果を、図４に示す。上側のグラフは構造式VIの化合物0.33μMでの活性化における酵素の割合(rate)を表し、下側のグラフは1.33μMでの酵素の割合を表す。二つの曲線は速度定数(kon)70,000 M-ls-1に適合する。
【０１５６】
koffの測定値は、アッセイに基づいた測定値よりもむしろ物理的測定値に基づく。同様に、kon速度もまた直接的物理方法によって測定できる。この場合には、放射線標識した阻害剤を使用し且つ結合されたタンパク質を遊離の阻害剤から物理的に分離することによって測定できる。例えば、特に物理的結合が最初に“部位の半分”の結合のみを示す場合には、これはそれにもかかわらず酵素活性の全部の失活と同時に生じることを表すことができることから、物理的結合に基づく方法とアッセイに基づく方法との間の相関関係を得るのに有用である。反応の種々の時間後に結合された放射線標識化阻害剤の量の測定に基づいて決定される結合の割合(rate)は、酵素活性の低下の速度のアッセイに基づく測定に基づいた測定値と非常によく相関があることが認められる。また、本明細書に記載したような交換研究に基づくkoffの測定は、酵素阻害剤複合体を形成する初期結合反応が10秒(反応が極く部分的に完結するような時間）後に停止するか又は10時間後に停止するか否かに関係なく、測定されるオン速度とオフ速度が上記と同じ種類の酵素／阻害剤複合体（むしろ、例えば、本発明者らがオン速度を測定する初期の弱い阻害された複合体であって、本発明者らがオフ速度を測定するより緊密に結合された複合体に徐々に異性化する複合体である）に関係することを確認する同様の結果を生じ、このようにして上記の二つの値が有効に組み合わされてＫdの値を生じ得ることも認められる。
【０１５７】
シロイヌナズナHPPDに結合するメソトリオンのオン速度を測定するための実験を説明する例は次の通りである。25mMアスコルビン酸ナトリウム、25％(v/v)グリセロール及び3.0 mg/lのウシカタラーゼ(Sigma Ｃ3155 〜50,000単位/mg)を含有する50mM Bis-Trisプロパン緩衝液(pH7.0)に溶解した14Ｃメソトリオンを入れた一連のエッペンドルフ円心分離管を、25℃でセットする。反応を、シロイヌナズナBPPDと14Ｃメソトリオンの最終濃度がそれぞれ〜0.30μM及び0.347μMであるようにシロイヌナズナHPPDを加え、混合することによって開始させ、次いで種々の時間間隔の後に大過剰の未標識メソトリオンを最終濃度170μMまで加えることによって停止させる。反応の停止に、試料を、急速ゲル濾過により0.1M KClを含有するpH７の50mM BTP中で平衡化させたNAP5ファルマシアカラムを通してタンパク質結合画分と、タンパク質を含有していない画分とに分離し、次いで得られた２つの画分の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。得られた結果及びデータのすり合わせ(fitting)を図５に例示する。
【０１５８】
図５のデータは、速度定数、メソトリオンを結合するシロイヌナズナ部位の半分だけを有する125000 M-1s-1のkon値に適合する。続いて起こる子図示されていないさらに遅い反応（〜1000 M-1s-1の速度定数に適合する)であり、そこではメソトリオンが残りの阻害剤部位に結合する。阻害剤／BPPDの組み合わせは、前記の部位の半分だけが最初に結合されるか否かにおいて変化することが認められた。いずれの場合でも、それはkonの値であるみなされる図５に示したような初期速度のみである。グリセロールが存在しない以外は図５と同様の実験では、konの値は190000 M-1s-1であることが認められる。この値は、活性の失活の速度の測定についてアッセイに基づく測定値を使用して認められた〜250000 M-1s-1の値と区別できない。同様の結合実験は、例えば、グリセロールの存在下での構造IVの化合物とシロイヌナズナHPPDとの会合を支配する速度定数、konについて100000 M-1s-1の値を示した。前記のkon値及びkoff値の測定方法は、Ｋd値の算出を可能にし、その値の幾つかを表４に例示する。
【０１５９】
表４
種々のHPPD酵素との複合体からの種々の阻害剤の解離を支配する解離定数(Ｋd値）
2004528821.tif 000039
【０１６０】
このように、特に本発明の方法によれば、HPPD酵素をコードする領域を含有するポリヌクレオチドがHPPD酵素／HPPD阻害剤の解離定数(Ｋd値）に関して生体外での発現及び試験の方法によって選別されることが認められる。さらに、上記の例から、コムギHPPDをコードする領域を含有するポリヌクレオチドが阻害剤耐性HPPDをコードするポリヌクレオチドとして選択されることを認めることができる。その理由は、発現されたコムギHPPDと構造Ｉ(式４から選択される化合物)との複合体についてのＫd値と、構造IV（式３から選択される化合物)を用いて形成される複合体についてのＫd値との比（Ｋd１/Ｋd３）が83.7又は又は14.3であり、これは上記と同一の条件下でのシロイヌナズナ対照酵素由来の同じ対の阻害剤の解離について認められる同様に誘導される比0.3又は1.1よりも2.5倍以上も大きいことが認められるからである。前記の選別及び比較は、例えば構造II（式２から選択される化合物）及び構造VII（式４から選択される化合物）について同様に行われており、その結果としてコムギHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが選択される。この場合には、コムギHPPDについての前記の比 Ｋd２/Ｋd４は38であり、これもまたシロイヌナズナ対照酵素についての同様の比3.4よりも2.5倍を超えて大きい。別法として、コムギHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドがpH7.0及び25℃の水の中で除草性HPPD阻害剤、この場合には構造Ｉ又は構造IIの除草性HPPD阻害剤と複合体を形成できるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードすることを基準として選別され、選択される。この場合に、前記複合体の解離は、1.0〜30 nMの範囲の解離定数(Ｋd)(この場合には、〜6.5 − 7.5nM)によって支配され且つ選択されたHPPD阻害剤は双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の活性を有する(これは、明らかにメソトリオンそれ自体についてのように構造IIについてまさにその通りである)。
【０１６１】
また、この実施例は、本発明の方法に従って、シュードモナスHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが阻害剤耐性HPPDをコードするポリヌクレオチドとして選択されることを例証する。なぜならば、発現されたシュードモナスHPPDと構造IV（式３から選択される化合物）との複合体についてのＫdの値と、構造Ｉ（式１から選択される化合物)を用いて形成される複合体についてのＫdの値との比（Ｋd３/Ｋd１）が107であり、これはシロイヌナズナ対照酵素由来の同じ対の阻害剤の解離について認められる同様に誘導される比3.3よりも2.5倍以上も大きいことが認められるからである。認められるように、前記の選別及び比較は、例えば構造Ｖ（式４から選択される化合物）及び構造Ｉ（式１から選択される化合物）について同様に行われており、その結果としてシュードモナスHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが選択される。この場合には、シュードモナスHPPDについての比Ｋd４/Ｋd１は ＞4.3であり、これもまたシロイヌナズナ対照酵素についての同様の比0.28よりも2.5倍を越えて大きい。別法として、シュードモナスHPPDをコードする領域を有するポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドがpH7.0及び25℃の水の中で除草性HPPD阻害剤、この場合には構造IV又は構造VIの除草性HPPD阻害剤と複合体を形成できるHPPD阻害剤耐性HPPD酵素をコードすることを基準として選別され、選択される。この場合には、前記の複合体の解離は、１〜30nMの範囲(この場合には、例えば12.2nM)の解離定数(Ｋd)によって支配され且つ選択されたHPPD阻害剤は双子葉植物に対してメソトリオンの除草活性の少なくとも４分の１の活性を有する(これは構造IV及びVIの両方についてまさにその通りである)。
【０１６２】
実施例12  カラスムギHPPD酵素をコードするDNA領域を有し且つHPPD阻害剤型除草剤に対して抵抗性である安定に形質転換された形態学的に正常な稔性ダイズ植物の産生
植物形質転換に適したポリヌクレオチドであって、カラスムギHPPDの発現用遺伝子を含有するポリヌクレオチドは、例えば、前記の実施例に記載されている。場合によっては、HPPD遺伝子それ自体は、形質的転換組織の選択及び同定によって提供できる。場合によっては、カラスムギHPPDの発現用遺伝子は、例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン又はグリフォセートに対する抵抗性を付与する遺伝子を含む形質転換組織の選択／同定の別の手段を提供する別の配列に沿って前記ポリヌクレオチド中に存在させることができる。また、これらの選択可能な標識配列は、別のポリヌクレオチド上に存在させてもよく、例えば同時ボンバードメント及び同時選択法が使用される。別法として、選択可能な標識遺伝子よりもむしろ、GUSなどの評価できる(scorable)標識遺伝子を使用して形質転換組織を同定してもよい。ダイズ植物材料を当業者に周知の多数の方法で適切に形質転換し、稔性植物を再生できる。例えば、稔性の形態学的に正常な形質転換ダイズ植物は、1) 例えば未成熟子葉、胚軸又は他の適当な組織からの体細胞性胚形成組織の産生、2) 微粒子銃法によるか又はアグロバクテリウムを用いた感染法による形質転換 及び 3) 植物の再生によって得てもよい。
【０１６３】
別法として、かかるダイズ植物は、芽及び／又は花組織のアグロバクテリウムを用いた真空浸潤による感染並びに形質転換種子及び／又は救済された胚から育てた植物の選択によって得てもよい。米国特許第5024944号明細書に記載のような一つの例においては、子葉組織を、ダイズ未成熟胚から、好ましくは取り出された胚軸を用いて切除し、次いで細胞体胚形成植物材料を形成するようにホルモン含有培地上で培養する。この植物材料を、例えば、直接DNA法、DNA被覆プロジェクタイル・ボンバードメント法又はアグロバクテリウム感染法を使用して形質転換し移入し、適当な選択培地上で培養し、次いで場合よっては選択剤の持続的存在下で、稔性形質転換ダイズ植物に再生させる。選択剤は、カナマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物質又はホスフィノスリシン又はグリフォセートなどの除草剤であってもよいし、あるいは選択はGUSなどの資格化し得る標識遺伝子の発現に基づいてもよい。形質転換用の別の標的組織は、体細胞性よりもむしろ繁殖系の胚形成組織からなるか、あるいは場合によっては花又は花形成組織である。
【０１６４】
一つの例においては、組立て体を、微粒子銃型アプローチ〔例えば、Santarem ER, 
Finer, J.J (1999)“Transformation of soyabean (Glycine max (L.) Merrill) using 
proliferative embryogenic tissue maintained on a semi-solid medium” In vitro 
Cellular and Developmental Biology-Plant, 35, 451-455；米国特許第5,503,998号明細書、米国特許第5830728号明細書〕又はアグロバクテリウム感染法（例えば、米国特許第
5,024,944号明細書、米国特許第5,959,179号明細書）を使用して再生可能な胚形成ダイズ組織に形質転換する。再生可能な胚形成ダイズ組織は、例えば、双子葉植物の未成熟胚から誘導される。
【０１６５】
増殖性胚形成組織は、例えば、半固形培地上に維持される。かかる組織は、例えば下記の方法で得られる。３〜４mmの長さの未成熟接合子胚を、例えば、ダイズ〔Glycine 
max (L.) Merrill〕の花形成後２〜３週間目の鞘から単離する。鞘は、“バックライティング”によって正確な長さの胚の存在と成熟度について調べることができる。次いで、鞘を殺菌消毒する。未成熟胚を取り出し、それぞれの胚から軸を取り除いた。次いで未成熟胚を、ビタミンＢ5、３％スクロース及び40mg/lの2,4-Ｄを含有するpH7.0の“D40-Lite”半固形(0.2％gelrite)ＭＳ塩培地に３〜４週間移植した。次いで、胚の増殖について、前記の材料をビタミンＢ5、３％スクロース、20mg/lの2,4-Ｄ 及び0.2％Gelriteを含有するpH5.7の“D20”ＭＳ塩培地に移した。明るい緑色の球状増殖胚を有する材料を選択し、２〜３週毎に継代培養した。
【０１６６】
ボンバードメントについては、組織の小集塊０〜25個／プレートを選択し(ボンバードメントに先立って４〜５日継代培養し)、次いでＤ20培地を入れたペトリ皿の中心に配置した。この組織を殺菌フード下に15分間覆いを取ることによって15分間乾燥した。DNA組立て体を金粒子で被覆し(例えば、前記の参考文献に記載の方法を使用して被覆した)、入手し得る銃のいずれか一つを使用してＤ20培地上で前記組織中に２回砲撃した。別の例としては、PDS 1000粒子銃を使用する。粒子は、Klein et al 1987, Nature, 327, 70-73に記載の方法と同様の方法で調製し、DNAで被覆してもよい。
【０１６７】
別法として、微量遠心分離管中で金又はタングステン粒子(〜1.0μm) 60mgをHPLCグレードのエタノールで反復して洗浄し、次いで滅菌水で反復して洗浄した。この粒子を滅菌水１mlに再懸濁し、微量円心分離管のアリコート50μlに分配した。金粒子は４℃で貯蔵し、タングステン粒子は−20℃で貯蔵した。粒子のそれぞれの(霜取りした)アリコートにDNA３mgを加え、この遠心分離管を最高速度で回転させた。連続回転を維持しながら、2.5M CaCl2 50μl及び0.1Mスペルミジン20μlを加えた。さらに10分間回転させた後に、試料をエッペンドルフ微量遠心分離機中で５秒間遠心分離し、上清を抜き取り、粒子をHPLCグレードのエタノールを連続して加えて洗浄した。この粒子をエタノール60μlに十分に再懸濁し、次いでPDS 1000粒子銃に使用すべき高分子担体の表面にアリコート10μlを分配した。PDS 1000粒子銃の構成要素を、70％エタノールに浸すことによって表面を殺菌消毒し、風乾した。2.5cm以下の円盤に配置した組織を用いて上記のようにして調製した標的プレートを、ストッピングスクリーンから６cmの位置に置いた。次いで、適切に選択された破裂板をに使用した。
【０１６８】
ボンバードメントの１週間後に、全ての組織小塊を、適切な選択濃度の選択剤（例えば、グリフォセートを選択に使用する場合 及び耐性EPSPS又はGOXコード化遺伝子をカラスムギHPPDを発現する遺伝子と同じ形質転換性DNA上に存在させるかあるいは同時砲撃DNA中に存在させる場合には、0.05〜10mMのグリフォセート）を含有するpH5.7に緩衝したＤ20培地に移した。さらに３〜４週間後に、組織全部を、適切に濃度を上げた選択剤を含有する新しいＤ20培地に移した。さらに３〜４週間後に、生存組織を選択し、選択剤を含有する同様のＤ20培地に３〜４週毎に継体培養した。グリフォセートよりもむしろ幾つかの別の選択可能な標識を存在させる場合には、選択は適切に行い得る(例えば、濃度を高めたハイグロマシシンを使用して)。別法として、全ての選択はHPPD阻害剤型除草剤を使用して行う。このようにして生長部分を維持し、十分な組織を得て、PCRによって分析してこれらの生長部分が所定のDNAに関して形質転換していることが確認した。
【０１６９】
胚を生育し、成熟させるために、組織小塊を、ビタミンＢ5、６％マルトース及び0.2％gelriteを含有するpH5.7のＭＳ塩上に置いた。小塊６〜９個を23℃のトールディッシュに置いた。３〜４週間後に、胚が伸張し、分離し且つＭ6培地上での別の回数のインキュベーションに移すことができる。４〜６週間後には、胚が乳白色に着色し、乾燥の準備が整った。かかる乳白色に着色した胚９個を乾燥ペトリ皿に置き、パラフィルムでシールし、棚の上に２〜３日間置いた。胚は幾分ぐにゃぐにゃしているべきであり、“もろくてパリパリしている”べきではない。
【０１７０】
乾燥した胚をOMS(生長調節剤を含有していないMS培地)上に移植することによって発芽させることができる。１週間以内に正常な生じた発芽の後に、植物をより大きい箱に移し、十分な根及び新芽の形成があったら土壌に移植する。細菌の混入を防止するために、蒸留水を用いてOMSを根から洗浄することが得策である。植物は高湿度及び最初に24時間照明下に保持し、生長させ得る。植物は24時間照明下で約２フィートの高さまで生長させ、次いで花まで発育を促し、次いで16時間照明にシフトすることによって鞘を形成し得る。種子を回収し、その子孫を生えさせ、交配し、戻し交配して、普通の品種改良法を使用して導入遺伝子を所定の植物生育環境に移した。植物を、導入遺伝子の存在及び発現について、分子生物学の標準的な方法、例えばPCR法、サザン法、ウエスタン法、ELISA法及び酵素検定法を使用して、通常に分析した。
【０１７１】
実施例13  カラスムギHPPD酵素をコードするDNA領域を有し且つHPPD阻害剤型除草剤に対して抵抗性である安定に形質転換された形態学的に正常な稔性トウモロコシ植物の産生
トウモロコシの形質転換用の組立て体は、トウモロコシポリユビキチンプロモーターの操作可能な発現制御下でカラスムギ(Avena sativa)HPPDをコードするDNA配列を有し、しかも適当なターミネーター配列、例えばNos遺伝子の３´末端由来のターミネーター配列を含有することが好ましい。場合によっては、このDNA配列は、例えば、カナマイシン、ブタフェナシル、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン、グリフォセート又はポジティブマンノース選択に対して抵抗性を付与する遺伝子を含んでいる形質転換組織の選択／同定のさらなる手段を提供する配列も含有する。また、これらの選択可能な標識配列は、別のポリヌクレオチド上に存在させてもよく、例えば同時ボンバードメント及び同時選択法が使用される。別法として、選択可能な標識遺伝子よりもむしろ、GUSなどの評価できる (scorable)標識遺伝子を使用して形質転換組織を同定してもよい。DNAは、当業者に周知の多数の方法、例えば(i)T-DNA配列の左側領域及び右側領域内の置換及びアグロバクテリウム感染による方法、(ii)微粒子銃及びボンバードメントによるDNA被覆のような方法、
(iii)炭化ケイ素ウィスカーによる被覆のような方法又は(iv)直接DNA送達法による方法を使用してトウモロコシ標的組織に送達し得る。
【０１７２】
実施例14  アグロバクテリウムを使用するトウモロコシの形質転換
例えば、HPPD配列を含有するDNAを、同様に制限したpSB11の右側T-DNA領域と左側T-DNA領域との間に配置されたクローニング部位内の位置に連結する。プラスミドpSB11の組立て及びその親pSB21の組立ては、Komariらによって報告されている(1996, Plant, J. 10: 165-174)。次いで、HPPD配列を含有するT-DNAをスパーバイナリーpSB１ベクター（Saitoらの欧州特許出願公開第672 752A1号明細書）に相同的組換え法によって組み込んだ。これを達成するために、HPPD配列を含有するpSB11を大腸菌株HB101に移入し、次いでこれをDittaらの三重交差法（1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351）に従ってアグロバクテリウムLBA4404係留pSB１と結合させてアグロバクテリウムの形質転換株
LBA4404（pSB１-HPPD）を作成し、その中のコインテグレートプラスミドpSB１-HPPDの存在をスペクチノマイシンに対する抵抗性を基準に選択した。また、pSB１-HPPDの同一性はさらにSal１制限分析に基づいて確認した。
【０１７３】
別法として、前記と同様の方法を使用して、HPPD配列の同様の断片をスーパーバイナリーベクターpTOK162（米国特許第5591616号明細書の図１）の右側領域と左側領域との間の位置に相同的に組み換えて、アグロバクテリウムにおいてカナマイシンとスペクチノマイシンとに対する組み合わせ抵抗性に基づいて選択された同様の一組のコインテグレートプラスミドを生成させた。
【０１７４】
ヘルパープラスミドPAL4404（完全なvir領域をもつ）を有するアグロバクテリウム株
LBA4404は、American Type Culture Collectionから入手できる(ATCC 37349)。別の有用な菌株はアグロバクテリウムEHA101〔1986, Hood et al, J. Bacteriol., 168 (3): 
1283-129〕であり、これは強い病原性株 アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)A281由来のvir領域をもつヘルパープラスミドを有する。
【０１７５】
アグロバクテリウム株LBA4404（pSB１-HPPD）などは、それぞれプレート上に、例えば“PHI-L”固形培地を入れたプレート上に画線され、暗中28℃で３〜10日間培養される。 PHI-L培地は、国際出願公開第WO98/32326号明細書の第26頁（実施例４）に記載されているような培地である。別法として、上記アグロバクテリウムは、ＹＰ培地(酵母エキス
５g/l、ペプトン10g/l、NaCl５g/l、寒天15g/l、pH6.8)を入れたプレート上で、石田ら
（1996, Nature Biotechnology, 14, 745-750）によって報告されているようにして 又はHeiらによって米国特許第5591616号明細書〔AB medium (Drlica and Kado, 1974; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 3677-3681)〕に記載のようにして３〜10日間培養される。しかし、上記のいずれの場合にも、適当な抗生物質選択を提供するために変性される〔例えば、アグロバクテリウム株LBA4404（pSB１-MPD）などの場合には50μg/mlのスペクチノマイシンを含有し、pTOK 162誘導スーパーバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウムを使用する場合には50μg/mlのスペクチノマイシンと50μg/mlのカナマイシンの両方を含有する〕。
【０１７６】
前記のようにして調製したアグロバクテリウムのプレートを、４℃で貯蔵し、調製の１ヶ月以内に使用した。植物材料の形質転換用のアグロバクテリウム懸濁物は、米国特許第5591616号明細書に記載の方法と同様にして調製される。(無菌培養物の混入を回避するために良好な微生物学的方法を使用して) ３×５mmのループ一杯(loopful)のアグロバクテリウムをプレートから取り出し、14ml容Falcon管に入れた滅菌AA液体培地５mlに移し、懸濁した。別法として、植物材料の形質転換用のアグロバクテリウム懸濁物は、国際出願公開第WO98/32326号明細書に記載の方法と同様にして調製される。３×５mmのループ一杯のアグロバクテリウムをプレートから取り出し、国際出願公開第WO98/32326号明細書の第26頁の実施例４に記載の滅菌PHI-A基本培地５mlに移し、懸濁するか、又は国際出願公開第WO98/32326号明細書の第26頁の実施例４に記載の滅菌PHI-A混合培地５mlに懸濁する。別法として、植物材料の形質転換用のアグロバクテリウム懸濁物は、石田らによって
Nature Biotechnology, 14, 745-750(1996) に報告されたような方法と同様にして調製される。しかし、製造されたアグロバクテリウム懸濁物は、回転混合され、細胞集団を0.5×109 〜 ２×109 cfu/ml(好ましくはもっと低く)に調整される。１×109 cfu/mlは、
550nmで0.72以下のOD(１cm)に相当する。アグロバクテリウム懸濁物は滅菌２ml微量円心分離管に１mlずつ分別し、できるだけ早く使用する。
【０１７７】
形質転換に適したトウモロコシ系統としては、A188、F1 P3732、F1 (A188 x B73Ht)、 F1(B73Ht x A188)、F1(A188 x BMS) が挙げられるが、これらに限定されない。また、適当なトウモロコシ系統としては、種々のA188 x 近交系交配系（例えば、国際出願公開第 WO98/32326号明細書の表８に記載のPHJ90 x A188、PHN46 x A188、PHPP8 x A188）及び種々の雑種強勢群由来の近交系（例えば、国際出願公開第WO98/32326号明細書の表９に記載の PHN46、PHP28及びPHJ90)もまた挙げられる。
【０１７８】
具体例では、未成熟胚は“Hi-II”トウモロコシから作成される。“Hi-II”は、米国イリノイ州アーバナシャンペーン所在のイリノイ大学のMaize Genetic Cooperation Stock Centerから入手できるHi-IIペアレントＡとHi-IIペアレントＢとの間の相互交配によって作成された近交系同士(A188 x B73)のハイブリッドである。 これらの交配から得られる“Hi-II”種子と呼ばれる種子は、温室又は圃場に蒔かれる。得られるHi-II植物は自家受粉させるか又は姉妹植物と他家受粉させる。
【０１７９】
トウモロコシの未成熟胚の形質転換は、該未成熟胚と前記のアグロバクテリウムの適当な組換え株と接触さえることによって行った。未成熟胚とは、次の受粉の成熟の段階にある未成熟種子の胚を意味する。未成熟胚は、細胞分裂してカルス細胞を生じることができ、次いでカルス細胞が分化して完全植物の組織及び器官を生成できる無傷の組織である。また、形質転換に好ましい材料はとしては、初期に形質転換されている正常な稔性植物を再生できる能力をもつ脱分化カルスを誘導することもできる胚の胚盤が挙げられる。このように形質転換に好ましい材料としては、かかる脱分化未成熟接合胚又は胚盤から誘導されるカルスも挙げられる。
【０１８０】
未成熟トウモロコシ胚は、GreenとPhillips（1976, Crop. Sci., 15: 417-421）によって報告されたようにして又は別法としてNeufferらの方法（1982,“Growing Maize for 
genetic purposes”in Maize for biological research, W. F. Sheridan ed., 
University Press, University of North Dakota, Grand Forks, North Dakota, USA）によって発育中の穂から無菌単離される。例えば、長さ１〜２mm（好ましくは１〜1.2mm）の未成熟トウモロコシ胚は、受粉後９〜12日（好ましくは11日）目の雌性穂状花序から滅菌スパチュラを使用して無菌単離される。典型的には、穂は2.63％次亜塩素酸ナトリウムで20分間表面殺菌消毒した後に、滅菌脱イオン水で洗浄し、次いで未成熟胚が無菌除去される。未成熟胚（好ましくは 〜100個) を、アグロバクテリウム (その代替物は前記に記載されている)の懸濁物を調製するのに使用した培地と同じ培地約２mlを入れた微量遠心分離管に直接に落とす。この微量遠心分離管の蓋を閉め、内容物を数秒間回転させることによって混合する。培地をデンカントして除き、新しい培地２mlを加え、回転を繰り返した。次いで、培地全部を流し出して微量遠心分離管の底に洗浄された未成熟胚を残す。
【０１８１】
未成熟トウモロコシ胚を調製したら、この方法の次の工程、すなわち感染工程は、これらの未成熟トウモロコシ胚をアグロバクテリウムの形質転換株と接触させる工程である。この方法の一つの例では、上記感染工程は、国際出願公開第WO98/32326号明細書の実施例４に記載のようにして、Ｎ6培地（1987, Chu C. C. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking. Pp 43-50）の無機塩類及びビタミン類を含んでいる液体培地で行う。例えば、国際出願公開第WO98/32326号明細書に記載のようにして、PHI-A培地で前記のようにして調製したアグロバクテリウム懸濁液1.0mlを、前記の微量遠心分離管の胚に加え、約30秒間回転させた。別法として、PHI-I培地又はLS-inf培地中で前記のようにして調製したアグロバクテリウム懸濁液1.0mlを加える。５分間放置した後に、アグロバクテリウムと胚の懸濁物を、元のアグロバクテリウム懸濁物がPHI-A培地、PHI-I培地又はLS-inf培地それぞれにおいて調製されたか否かに応じて、1) PHI-B培地か 又は 2) PHI-J培地か あるいは 3) LS-AS培地のいずれかを入れたペトリ皿に注ぐ。前記アグロバクテリウム懸濁物をパスツールピペットを使用して抜き取り、胚をこれらが培地上に軸側を下向きにしてあるように操作し、前記ペトリ皿をパラフィルムで密封し、次いで暗中23〜25℃で同時培養の３日間インキュベートした。
【０１８２】
未成熟胚の調製に続いて、形質転換を行う別の方法は、米国特許第5591616号明細書に記載の脱分化の期間中に又はその後に未成熟胚を感染させることである。未成熟胚を、LS無機塩及びビタミンをカザミノ酸100mg/ml、L-プロリン700mg/l、ミオイノシトール100mg/l、2,4-D 1.5mg/ml、スクロース20g/l及びgelrite2.3g/lと一緒に含有するLSD 1.5固形培地上に置いた。25℃で３週間後に、胚盤から生じたカルスを２ml微量遠心分離管に採集集し、AA培地中の前記のようにして調製したアグロバクテリウム懸濁物１mlに浸す。５分間放置した後に、前記培地は場合によっては選択剤を含有するか又は連続陽性マンノース選択を提供するために調整される。
【０１８３】
次いで、カルスを発根/再生用培地に移し、25℃で昼光16時間(270 mEm-2s-1)及び暗中８時間のスケジュール下か又は連続照明(〜250 mEm-2s-1)の下で新芽及び根が発生するような時間まで生長させる。適した発根/再生培地は、LSZ培地（場合によっては、連続選択を含むか又は含まない)である。別法として、選択されたカルスは、KOHを用いてpH5.8に調整され且つLS主要及び微量無機塩類(Linsmaier and Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127)、ニコチン酸0.5mg/ml、ピリドキシンHCl塩0.5mg/ml、チアミンHCl塩1.0mg/ml、L-プロリン700mg/l、ミオイノシトール100mg/l、ゼアチン５mg/ml、スクロース20g/l、MES 0.5g/l、セフォタキシム250mg/l、精製寒天(Sigma A-7049)８g/lを含有してなるか又は場合によっては連続した選択を提供するために適切に調整された(例えば、マンノースを用いて、あるいはHPPD阻害剤型除草剤又はグリフォセートなどを含有する)LSZ再生培地に直接に移される。暗中で一定期間インキュベートした後に、プレートを照明(前記の連続照明又は光/日)に供し、小植物(plantlet)を再生させた。
【０１８４】
少量の小植物を、例えば、PHI-F培地を入れた個々のガラス管か又は半分の濃度(half 
strength)のLS主要塩類(Linsmaier and Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127)、
LS微量塩類、ニコチン酸0.5mg/ml、ピリドキシンHCl塩0.5mg/ml、チアミンHCl塩1.0mg/ml、ミオイノシトール100mg/l、スクロース20g/l、MES 0.5g/l、精製寒天(Sigma A-7049)８g/lを含有するpH5.8の半分の濃度の(half strength)のLSF培地を入れた個々のガラス管に移し、さらに約１週間育てた。次いで、小植物を、土壌を入れた鉢に移し、生育室で育て(相対湿度85％、CO2濃度600 ppm及び250 mE M-2s-l) 且つ温室で土壌混合物中で成熟期まで育てた。
【０１８５】
上記のようにして得られた第一(To)世代の植物を自家受精受粉させて第二世代(T1)の種子を得た。別法として(及び好ましくは)、第一世代の植物を、別の非形質転換トウモロコシ近交系と相互に交配して第二世代の種子を得た。次いで、これらの交配の子孫(T1)は、除草剤抵抗性特性について１：１に分離することが予測される。T1種子をまき、温室又は圃場で生育し、次いでこの世代及びそれに続く世代を通して選択されたHPPD阻害剤型除草剤に対する抵抗性の程度、抵抗性の遺伝及び抵抗性の分離を、適切に製剤化したHPPD阻害剤型除草剤、例えば構造式VI、イソキサフルトール及び構造式IIを用いて５〜2000 g/haの施用量範囲で且つ例えばV2〜V8の成長期の範囲(又は、別法として発芽後７〜21日目)で噴霧処理した後の分化(differential)植物生存率及び漂白及び白化の兆候の評価し易さを観察することによって評価した。これらの評価は、感受性の分離固体に対して及びグリフォセートに対する抵抗性を付与できる本発明又は同様の発明の遺伝子を含有していないトウモロコシの同様の非形質転換系に大して行った。HPPD阻害剤型除草剤に対して高水準の抵抗性を示す形質転換系を選択し、再度自己交配又は非形質転換近交系に戻し交配した。  前記の方法の工程全てにおいて、形質転換カルス、小植物、T0及びT1植物材料の組織試料は、場合によっては1) 導入遺伝子の存在、コピー数及び完全性を示すためにサザン法及びPCR法、2) 導入遺伝子由来のmRNAの発現を調べるためにノーザン(又は同様の)分析、3) EPSPSの発現レベルを調べるためにSDSゲルの定量ウエスタン分析 及び 4) HPPD酵素活性の測定法によって採取され且つ分析される。かかる分析方法は、当該技術においては周知である。導入遺伝子の存在、完全性及び発現について試験するのに適した方法としてはPCR法、サザン分析法及びウエスタン分析法が挙げられる。
【０１８６】
トウモロコシの別の形質転換方法
別の態様において、トウモロコシA188 X B73の未成熟胚から誘導したもろい胚形成カルスを固体媒体上で開始させ、微粒子銃で形質転換させた。適当な方法は、例えば国際出願公開第WO98/44140号明細書及び米国特許第5550318号明細書に記載されている。DNAは環状プラスミドDNAとして提供されるか、又は酵素で制限して線状EPSPS発現カセット含有断片を得、次いでアガロースゲル電気泳動及び電気溶出で精製した後に使用した。別の例では、トウモロコシ系統、例えば遺伝子型A188 X B73をもつハイブリッド系を細胞懸濁物として調製し、次いで本質的にFrameらによって報告された方法(1994, Plant, J. 6, 941-948)を使用して該細胞を、DNAで被覆された炭化ケイ素ホイスカート接触させることによって形質転換させた。
【０１８７】
実施例15  カラスムギ(Avena)HPPDの生体外(in vitro)測定
前記の実施例に記載の方法に従って、カラスムギ(Avena)HPPDが、HPPについて〜2.5μMのKm値をもち且つ〜２±0.6/s/μモルのkcat/Km値をもつことが認められる。
25℃で且つグリセロールの不存在下で、Ｉ、II、IV及びＶとの複合体の解離を支配する速度定数が、コムギ酵素を用いて観察された速度定数と同様であり、＞〜８×10-4/s、〜４×10-4/s、〜2.5×10-5/s 及び＜４×10-6/sであると評価された。対応するKi値は＞11500pM、11400pM、710pM 及び＜30pMであると評価された。
【０１８８】
本発明は、特にカラスムギ(Avena)遺伝子のダイズ、トウモロコシ及びタバコへの導入に関して説明したが、当業者には、付属の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく具体的に説明される態様に対する種々の部分改変が可能であることが認められるであろう。例えば、適当な植物形質転換法、例えば微量注入法、パーティクル媒介ボンバードメント法、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換法、電気穿孔法、プロトプラスト法又は植物細胞音波粉砕法などを、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを任意の単子葉植物又は双子葉植物材料に導入するのに使用し得、次いで該植物材料を公知の方法で再生し得る。特に、syncarpic acids（式４）に対して抵抗性の植物を再生するには、シェベネラ・コルベリナ(Shewenella Colwellina)由来のHPPDコード配列が特に好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】14Cメソトリオンの交換を示す図である。
【図２】メソトリオンと構造IIの変換を示す図である。
【図３】構造IIによる小麦HPPDの進行性抑制を示す図である。
【図４】構造VIによる小麦HPPDの進行性抑制を示す図である。
【図５】シロイヌナズナHPPDへの14Cメソトリオンの結合を示す図である。
【配列表】
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