【手続補正書】
【提出日】平成14年6月7日(2002.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】非胚もしくは生後動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞。
【請求項２】ヒト細胞である、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】筋肉、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、骨髄、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織、または骨髄の群より選択される非胚組織から単離される、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】請求項１に記載の幹細胞から誘導される多能性内胚葉幹細胞。
【請求項５】請求項１に記載の幹細胞から誘導される多能性中胚葉幹細胞。
【請求項６】請求項１に記載の幹細胞から誘導される多能性外胚葉幹細胞。
【請求項７】請求項１に記載の幹細胞から誘導される内胚葉、外胚葉または中胚葉系統前駆細胞。
【請求項８】（ａ）生後動物細胞または組織から誘導され、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞；および
（ｂ）前記幹細胞の増殖を支持し得る培地、
を含む培養物。
【請求項９】増殖因子または分化決定因子をさらに含む、請求項８に記載の培養物。
【請求項１０】前記幹細胞がヒト細胞である、請求項８に記載の培養物。
【請求項１１】多能性胚様幹細胞を単離する方法であって、
（ａ）生後動物供給源から細胞を入手する工程と、
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程と、
（ｃ）前記細胞を培養する工程と、
を含む方法。
【請求項１２】クローン性多能性胚様幹細胞株を単離する方法であって、
（ａ）生後動物供給源から細胞を入手する工程と、
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程と、
（ｃ）前記細胞を培養する工程と、
（ｄ）前記培養された細胞をクローン密度に希釈する工程と、
（ｅ）前記希釈された細胞を培養する工程と、
（ｅ）単一細胞を有するそれらの培養物を増殖させる工程と、
を含む方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の方法によって発生するクローン性多能性胚様幹細胞株。
【請求項１４】目的の遺伝子またはタンパク質を発現するために遺伝子操作された請求項１に記載の幹細胞。
【請求項１５】遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を産生する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むＤＮＡ構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程と、
（ｂ）前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）において選択された幹細胞を培養する工程と、
を含む方法。
【請求項１６】請求項１５に記載の方法によって産生される遺伝子操作された多能性胚様幹細胞株。
【請求項１７】ヒト細胞である、請求項１６に記載の幹細胞。
【請求項１８】分化決定因子である作用物質の存在または活性を検出する方法であって、
Ａ．請求項１に記載の幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程と、
Ｂ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程と、を含み、
ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す、方法。
【請求項１９】作用物質、化合物または因子が分化決定されていない細胞の分化決定を変調する能力を試験する方法であって、
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において請求項１に記載の幹細胞を培養する工程と、
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程と、
を含む方法。
【請求項２０】分化決定されていない細胞の分化決定を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムであって、
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において請求項１に記載の幹細胞を培養する工程と、
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程と、
を含むアッセイシステム。
【請求項２１】増殖因子である作用物質の存在または活性を検出する方法であって、
Ａ．請求項１に記載の幹細胞と増殖因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程と、
Ｂ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程と、を含み、
ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す、方法。
【請求項２２】作用物質、化合物または因子が分化決定されていない細胞の増殖を変調する能力を試験する方法であって、
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において請求項１に記載の幹細胞を培養する工程と、
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程と、
を含む方法。
【請求項２３】分化決定されていない細胞の増殖を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムであって、
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において請求項１に記載の幹細胞を培養する工程と、
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程と、
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程と、
を含むアッセイシステム。
【請求項２４】請求項１に記載の幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に多能性胚様幹細胞を移植する方法。
【請求項２５】請求項１に記載の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に精製された多能性胚様幹細胞を提供する方法。
【請求項２６】請求項１に記載の多能性胚様幹細胞に目的のタンパク質もしくは遺伝子を発現するＤＮＡもしくはＲＮＡを含むベクターをトランスフェクトする工程を含む、目的のタンパク質または遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏ投与する方法。
【請求項２７】治療有効量の多能性胚様幹細胞またはそれから誘導される細胞もしくは組織を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全および／または他の疾患状態を予防ならびに／あるいは治療する方法。
【請求項２８】治療有効量の多能性胚様幹細胞またはそれから誘導される細胞もしくは組織を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において組織修復または移植する方法。
【請求項２９】請求項１に記載の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全および／または他の疾患状態を予防ならびに／あるいは治療する方法。
【請求項３０】請求項１に記載の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において組織修復または移植する方法。
【請求項３１】哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全を治療するための薬学的組成物であって、
Ａ．治療有効量の多能性胚葉幹細胞またはそれから誘導される細胞もしくは組織と、
Ｂ．薬学的に受容可能な媒体またはキャリアと、
を含む薬学的組成物。
【請求項３２】増殖因子または分化決定因子をさらに含む、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、一般に多能性幹細胞、詳細には胚様多能性幹細胞に関する。本発明はまた、細胞または組織移植、遺伝子治療、ならびに細胞−細胞間相互作用、分化決定、発生遺伝子および成長もしくは分化因子に関する同定、アッセイまたはスクリーニングにおける組織工学のための幹細胞の使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】
組織および器官の形成は、胎児期の発生中に自然に生じる。多細胞生物の発生は、規定された機能を有する数十億個の細胞から成る実体の形成時に最大に達する予め決定された分子および細胞経路に続いて起こる。細胞の発生は、細胞の増殖、分化決定、および分化の発達（ｌｉｎｅａｇｅ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）によって達成され、その結果、分化した細胞型が形成される。この過程は全能性接合体から始まり、個体の生涯を通して継続する。発生が全能性接合体から進行しながら、細胞が増殖し、多能性初代胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉への分化決定によって分離する。始原細胞（多能性、三能性、両能性および終局的に単能性）系統への発達性分化決定によってこれらの胚葉がさらに分離することによって、細胞の分化経路および細胞の究極的機能がさらに規定される。
【０００３】
発生は、受精卵から胞胚、次いで原腸胚へ進行する。原腸形成は、２層胚盤が３層胚盤に変換されるプロセスである。原腸形成は身体形状の形態形成または発生の開始であり、原腸形成は胚盤の原外胚葉表面上の原始線条の形成から開始する。原始線条、胚葉、および脊索の形成は、原腸形成中に生じる重要なプロセスである。３種の胚葉（外胚葉、内胚葉、および中胚葉）のそれぞれは、特定の組織および器官を生じる。
【０００４】
胚の３つの層への体制は、内部の腸、外部の表皮、およびその間の結合組織を有する成体の体制に概ね対応する。内胚葉は、呼吸通路および胃腸管の上皮裏打ちの供給源であり、咽頭、食道、胃、腸および唾液腺を含む多くの関連する腺、肝臓、膵臓ならびに肺を生じる。中胚葉は、平滑筋層、結合組織、組織および器官に関連する管を生じ、中胚葉はまた、循環器系のほとんどを形成し、血液細胞、骨髄、骨格、横紋筋、ならびに生殖および排泄器官の供給源である。外胚葉は、表皮（皮膚の表層）、感覚器官、ならびに脳、脊髄および神経系の遠位成分を含む神経系全体を形成する。
【０００５】
大多数の細胞は、一連の発生および分化を介して発達するが、少数の細胞はこの経路から離れて、連続的な維持および生物の修復を提供する幹細胞を保存する。保存された幹細胞としては、始原幹細胞および多能性幹細胞が挙げられる。始原細胞（例えば、前駆幹細胞、即時型幹細胞、および形成または芽細胞、例えば、筋芽細胞、脂肪芽細胞、軟骨芽細胞など）が分化決定される。単能性幹細胞は、単一の系統に制限された組織（筋原性、繊維形成、脂肪生成、軟骨形成、骨形成系統など）を形成する。二能性幹細胞は、２つの系統に属する組織（軟骨−骨形成、脂肪−繊維形成系統など）を形成する。三能性幹細胞は、３つの系統に属する組織（軟骨−骨−脂肪生成系統など）を形成する。多能性幹細胞は、系統（造血系統など）内の多数の細胞型を形成する。始原幹細胞は、培地に添加され得る誘導剤に係わらず、それらの系統に制限された組織を形成する。それらは静止状態を保持することができる。分化決定された始原細胞は自己複製が可能であるが、プログラムされた細胞の老化が生じる前に制限された寿命（約５０〜７０細胞倍加）を有する。それらはまた、増殖するためのさまざまな成長因子によって刺激され得る。分化するために活性化された場合、これらの細胞は、表現型の発現を刺激するための発達因子（即ち、インスリン、インスリン様成長因子−Ｉ、およびインスリン様成長因子−ＩＩ）を必要とし得る。
【０００６】
対照的に、多能性細胞は分化決定されていない。即ち、それらは、任意の特定の組織系統に決定されない。それらは静止状態を保持することができる。それらはまた、増殖するための成長因子によって刺激され得る。増殖のために活性化する場合、多能性細胞は、分化未決定を維持する限り広範な自己再生が可能である。多能性細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一のクローンからさまざまな分化決定された始原細胞を作製する能力を有する。例えば、６９０倍加を超えた後の胎児期多能性マウスクローン（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）および３００倍加を超えた後の生後多能性ラットクローン（Ｙｏｕｎｇら、１９９９）は、両方とも、長期間のデキサメタゾン暴露後に分化決定された始原細胞を形成し、続いて、特徴的な形態学的および表現型発現マーカーを示す骨格筋、脂肪、軟骨に分化するするように誘導された。この分化決定プロセスは、全般的（例えば、デキサメタゾン）または系統特異的（例えば、骨形態形成タンパク質−２、筋形態形成タンパク質など）決定誘導剤のいずれかの使用を必要とする。一旦、多能性細胞が特定の組織系統へ決定されるように誘導されると、それらは系統特異的始原細胞の特徴を有すると想定される。それらは静止状態を保持することができるか、またはそれらは特定の誘導剤の影響下で増殖することができる。それらが複製する能力は、プログラムされた細胞老化が生じる前の約５０〜７０細胞倍加に制限され、それらは表現型の発現を刺激するための発達因子の援助を必要等する。
【０００７】
胚幹細胞は、胚組織から単離された未決定の多能性細胞である。
胚に注入されると、それらはすべての体細胞系統および機能的配偶子を生じることができる。未分化状態の場合、これらの細胞はアルカリホスファターゼ陽性であり、胚性幹細胞および肺性生殖細胞に対する免疫学的マーカーを発現し、レロメラーゼ陽性であり、広範な自己再生能力を示す。分化時に、これらの細胞は、外胚葉、中胚葉、および内胚葉胚性胚葉から誘導される広範な細胞型を発現する。胚性幹（ＥＳ）細胞は、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類およびヒト胚の胚盤胞、内部細胞隗または生殖隆起から単離されている（ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｆｍａｎ、１９８１；Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら、１９９４；ＧｒａｖｅｓおよびＭｏｒｅａｄｉｔｈ、１９９３；Ｍａｒｔｉｎ、１９８１；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９１；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、１９９８）。
【０００８】
ＥＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究の両方のために使用される。ＥＳ細胞は、遺伝子操作およびクローン拡張中の多系統分化能を保持する。未決定細胞は、細胞の分化および発生を研究するためのモデルシステムを提供し、例えば、相同性組換えによってゲノム（特にマウスのゲノム）に特定の変異を運搬するためのベクターとして使用する場合に強力なツールを提供する（Ｂｒｏｗｎら、１９９２）。ＥＳ細胞は移植研究のための潜在的な供給源であるが、これらの見込みは、培養物の発達に伴う無秩序および異種の性質によって阻止されており、このため、分化している集団から系統制限された前駆体を選択するためのストラテジーに必要な開発が求められている（Ｌｉ  ｅｔら、１９９８）。動物にインプラントされたかまたは皮下に提示されたＥ細胞は、３種のすべての胚葉の誘導体を含有する様々なタイプの組織を含有する奇形腫を形成する（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９８８）。
【０００９】
中胚葉由来の始原細胞および多能性幹細胞の例としては、筋肉の単能性筋付随体筋芽細胞（Ｍａｕｒｏ、１９６１；Ｃａｍｐｉｏｎ、１９８４；Ｇｒｏｕｎｄｓら、１９９２）；脂肪組織の単能性脂肪芽細胞（Ａｉｌｈａｕｄら、１９９２）；軟骨膜および骨膜のそれぞれ単能性軟骨形成細胞および骨形成細胞（Ｃｒｕｅｓｓ、１９８２；Ｙｏｕｎｇら、１９９５）；脂肪組織の二能性脂肪繊維芽細胞（Ｖｉｅｒｃｋら、１９９６）；骨髄の二能性軟骨形成／骨形成幹細胞（Ｏｗｅｎ、１９８８；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ、１９８９；Ｒｉｃｋａｒｄ  ｇｏａｌ、１９９４；Ｃａｐｌａｎら、１９９７；Ｐｒｏｃｋｏｐ、１９９７）；骨髄の三能性軟骨形成／骨形成／脂肪生成幹細胞（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、１９９９）；骨髄の多能性幹細胞（ＰａｌｉｓおよびＳｅｇｅｌ、１９９８；ＭｃＧｕｉｒｅ、１９９８；Ｒａｔａｊｃｚａｋら、１９９８）；骨髄の多能性心臓性／造血性／内皮形成細胞（ＥｉｓｅｎｂｅｒｇおよびＭａｒｋｗａｌｄ、１９９７）；ならびに結合組織の多能性間葉幹細胞（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ａ、Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）が挙げられる。
【００１０】
多能性間葉幹細胞ならびにその単離および使用方法については、米国特許第５，８２７，７３５号（１９９８年１０月２７日出願）に記載されており、該文献はその全体が参考として本明細書に援用されている。そのような多能性間葉幹細胞は、分化決定された細胞を実質的に含まず、軟骨、筋肉、脂肪組織、脈管構造、腱、靭帯および造血を含むがそれらには限定されない中胚葉由来の多数の組織に分化することが可能である。そのような多能性間葉幹細胞のさらなる成分および軟骨修復における多能性間葉幹細胞の特定の使用については、米国特許第５，９０６，９３４号（１９９９年５月２５日出願）に記載されており、該文献はその全体が参考として本明細書に援用されている。
【００１１】
間葉系統能を有する始原細胞または多能性幹細胞集団は、例えば、トリ（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ，  １９９３，１９９５）、マウス（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｓａｉｔｏ、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）、ラット（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９８８；Ｌｕｃａｓら、１９９５，１９９６；Ｄｉｘｏｎら、１９９６；Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６）、ウサギ（Ｐａｔｅら、１９９３；Ｗａｋｉｔａｎｉら、１９９４；Ｇｒａｎｄｅら、１９９５；Ｙｏｕｎｇ，  Ｒ．  Ｇら、１９９８）、およびヒト（Ｃａｐｌａｎら、１９９３；Ｙｏｕｎｇ、１９９９ａ−ｃ）の多く動物種から単離されている。胎児期ニワトリ（Ｙｏｕｎｇら、１９９３）および胎児期マウス（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）から単離された中胚葉幹細胞の集団のクローン化分析（限界系列希釈を反復することによる個々のクローンの単離）により、２つのカテゴリーの細胞：分化決定された始原細胞および分化決定されていない多能性細胞が示された。非不死化された始原細胞は自己複製が可能であるが、プログラムされた細胞の老化が生じる前の約５０〜７０細胞倍加に制限された限定された寿命を有する。それらは静止状態を保持することができるか、または増殖、それらの系統経路に発達、および／または分化するように誘導され得る。始原細胞の１つの独特な特徴は、インスリン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦＩ）、またはインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）などの発達因子で処理することによってそれらの表現型発現を加速することができることである（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ａ，  ｂ；Ｙｏｕｎｇ、１９９９ａ；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）。
【００１２】
始原細胞は分化決定され、系統が制限されている。それらは静止状態を保持することができるか、または適切な生体活性因子による処理によって増殖、それらの系統経路に発達、および／または分化するように誘導され得る（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）。これとは対照的に、多能性間葉幹細胞であるＰＰＭＳＣは、中胚葉について分化未決定であり、系統が制限されていないことが見出された胎児期動物由来のＰＰＭＳＣは、特定の系統に対して未決定を保持する限り、広範な自己再生能を有した。一旦、ＰＰＭＳＣが特定の組織系統に決定されると、それらは該系統に対する始原細胞の特徴を有するものとみなされ、それらの複製能は、プログラムされた細胞老化が生じる前の約５０〜７０細胞倍加に制限される。ＰＰＭＳＣは静止状態を保持し得、そうでない場合は、適切な生体活性因子は増殖、分化決定、系統発達、および／または幹細胞の分化を含むことを必要とする（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）。
【００１３】
早期の正常なヒトの発生では組織および器官の形成が自然に生じるが、損傷したかまたは外傷もしくは疾患により消失したほとんどのヒト組織を再生する能力は、成体では実質的に減少する。毎年数百万人の米国人が組織の消失または終段階の器官不全を患う。これらの患者のための国民医療費の合計は、１年あたり４千億ドルを超えている。現在、米国では、これらの障害を治療するために年間８百万を超える外科手順が実施されており、４千万〜９千万の病院日数が必要である。これらの療法は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。組織移植および外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足および可能な長期の病的状態のために厳しく制限されている。実際、ドナー不足は毎年悪化し、必要な臓器の待機リストに掲載されながら死亡する患者の数が増加している（ＬａｎｇｅｒおよびＶｉｃａｎｔｉ、１９９３）。
【００１４】
組織工学は、組織の機能を保存、維持、または改善する生物学的代用物の開発に工学の原理およびライフサイエンスを適用する学際的な分野である。これらの一般的ストラテジーは、次の新たな組織の作製に適応されている：（１）．単離された細胞または組織欠損もしくは欠陥の領域に適用される細胞代用物。（２）．マトリックス上または内に配置された細胞。閉鎖系では、栄養物および水の透過を可能にする一方、インプラントの破壊から抗体または免疫細胞などの大きな実体を排除する膜によって身体から細胞が単離される。開放系では、マトリックスに付着した細胞がインプラントされ、身体に組み入れられる。（３）．組織の再生を生じる増殖の決定されたパターンに特異的な細胞を調節するための成長因子に依存する組織誘導物質、およびこれらの物質をそれらの標的に送達するための方法。
【００１５】
利用可能な証拠に基づいて、広範な移植、先天異常、選択術、疾患、および遺伝子異常は、多能性幹細胞単独かあるいは形態形成タンパク質、成長因子、遺伝子、および／または徐放送達システムとの組み合わせでの治療の能力を有する。好ましい治療は、組織消失の治療であり、ここで、目的は移植に利用可能な細胞数を増加し、それによって失われた組織（即ち、組織の消失、先天異常、胸部再構成、輸血、もしくは筋ジストロフィー）を再生するかまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のための十分な細胞数を提供する（筋ジストロフィー）ことである。多能性幹細胞を使用して期待される利益は、特定の組織系統への（形態形成タンパク質誘導性）決定前の無制限の増殖のための能力であり、次いで、一旦始原幹細胞として決定されるとプログラムされた細胞老化の前にさらに５０〜７０倍加生存することである。移植に利用できる組織の量が制限されている場合、これらの増殖属性は極めて重要である。組織消失は、ガン、外傷性組織損傷、先天異常、脈管性欠陥、選択術などに関する急性損傷および外科的介入、即ち、切断、組織の挫滅組織切除、および外科摘出術から生じ得、このため、米国では毎年３５０万の手術が行われている。
【００１６】
様々な多能性幹細胞の使用による予想される利益は、例えば、多能性間葉幹細胞の適用を考慮する場合に例示することができる。中胚葉由来の潜在的に多数の組織（即ち、骨、軟骨、筋肉、脂肪組織、脈管構造、腱、靭帯および造血）、消失した組織を再生するための特定の形態形成タンパク質および成長因子により例えばｅｘ  ｖｉｖｏで作製された前記組織の置換のために、多能性間葉幹細胞を利用することができる。次いで、再生された組織を移植して組織の消失部位を修復し得る。代替的ストラテジーは、細胞組成物として多能性幹細胞を提供するか、例えば、マトリックス、必要な領域への移植物へ取り入れられ得るべきであり、これにより、内因性形態形成タンパク質および成長因子は多能性幹細胞を誘導して、組織の失われた組織構造を再生することが可能である。このアプローチについては米国特許第５，９０３，９３４号（本明細書においてその全体が援用されている）に例示されており、該文献は、軟骨修復のための部位での軟骨および／または骨への分化を提供するための多能性間葉幹細胞のポリマーキャリアへのインプラントについて記載している。
【００１７】
（ａ）単離および分類することができる；（ｂ）多能性を保持する一方で無制限の増殖能を有する；（ｃ）多数の個別の組織系統へ決定するために操作することができる；（ｄ）現存する組織への組み入れが可能である；および（ｄ）続いてそれぞれ分化された組織型を発現することができる、移植療法のためのさらなる組織供給源の同定は、消失した、損傷を受けた、もしくは疾患のある組織の機能的能力および／または寿命を維持あるいは増加する療法に有益性であることが明らかであり得る。
【００１８】
本明細書における参考文献の引用は、本発明の先行技術であるとして承認されるものと解釈されるべきではない。
【００１９】
【発明の概要】
本発明の最も広範な態様では、本発明は、非胚動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な幹細胞にまで及ぶ。
【００２０】
特定の態様では、本発明は、生後動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞にまで及ぶ。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、成体動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞にまで及ぶ。
【００２２】
本発明の多能性胚様幹細胞は、非ヒト細胞から単離してもまたはヒト細胞から単離してもよい。
【００２３】
本発明の多能性胚様幹細胞は、筋肉、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織、または骨髄の群より選択される非胚組織から単離することができる。
【００２４】
本発明はさらに、細胞、特に、多能性胚様幹細胞から誘導される多能性または始原細胞に関する。細胞は、分化決定された細胞であり得、該細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉系統に決定され得る。例えば、中胚葉系統の分化決定された細胞、例えば、脂肪生成、筋原または軟骨形成始原細胞は、多能性胚様幹細胞から誘導され得る。
【００２５】
本発明はまた、多能性間葉幹細胞、多能性内胚葉幹細胞および多能性外胚葉幹細胞を含む多能性胚様幹細胞から誘導される多能性細胞に関する。いずれのそのような多能性細胞も自己再生および分化可能である。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞；および
（ｂ）前記幹細胞の増殖を支持し得る培地、を含む培養物。
を含む培養物に関する。
【００２７】
培養物を含有するそのような幹細胞は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。そのような培養物の幹細胞は、非ヒト細胞から単離されてもまたはヒト細胞から単離されてもよい。
【００２８】
本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）非胚動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｃ）前記細胞を培養する工程。
【００２９】
本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）生後動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｃ）前記細胞を培養する工程。
【００３０】
本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）成体動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｃ）前記細胞を培養する工程。
【００３１】
本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）非胚動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）２０μｍフィルターを介して前記細胞をろ過する工程；
（ｃ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｄ）前記細胞を培養する工程。
【００３２】
さらなる態様において、多能性肺様幹細胞を単離する方法は、それによってそのような幹細胞のクローン集団が単離される方法に関し、ここで、まず、単一の多能性肺様幹細胞が単離され、次いで、クローン集団を作製するために培養および拡張される。単一の多能性胚様幹細胞は、限界希釈かまたは当業者に公知である他の方法によって単離することができる。
【００３３】
従って、本発明はまた、そのような方法によって発生されるクローン多能性胚様幹細胞株に関する。
【００３４】
特定の態様では、本発明は多能性胚様幹細胞あるいは形質転換またはトランスフェクトされ、それによって目的の遺伝子もしくはタンパク質を含有し発現することができるそのような細胞の集団に関する。従って、本発明は、目的の遺伝子またはタンパク質を発現するように遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を含む。次いで、そのような遺伝子操作された幹細胞が分化決定されるのと同様に、本発明はさらに、遺伝子操作された多能性胚様幹細胞から誘導され、目的の遺伝子またはタンパク質を発現する分化決定された細胞を包含する。分化決定された細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞であってもよく、多能性間葉幹細胞などの多能性細胞または脂肪生成もしくは筋原細胞などの始原細胞であってもよい。
【００３５】
次いで、本発明は、遺伝子的多能性胚様幹細胞を産生する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
（ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むＤＮＡ構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程；
（ｂ）前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において選択された幹細胞を培養する工程。
【００３６】
特定の態様において、本発明は、そのような方法によって産生されたヒトおよび非ヒト細胞を含む遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を包含する。
【００３７】
本発明はさらに、分化決定因子である作用物質の存在または活性を検出する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．本発明の多能性胚様幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程；および
Ｂ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程、
ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す。
【００３８】
本発明はまた、作用物質、化合物または因子が分化決定されていない細胞の分化決定を変調する能力を試験する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
【００３９】
本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞の増殖または分化決定を変調するのに有効な潜在的作用物質、化合物または薬物のスクリーニングのためのアッセイシステムを含む。
【００４０】
さらにそのような態様では、本発明は、分化決定されていない細胞の分化決定を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
【００４１】
本発明はまた、増幅因子である作用物質の存在または活性を検出する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．本発明の多能性胚様幹細胞と増幅因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程；および
Ｂ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程、
ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、作用物質、化合物または因子が分化決定されていない細胞の増殖を変調する能力を試験する方法を含み、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
【００４３】
本発明はさらに、分化決定されていない細胞の増殖を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
【００４４】
アッセイシステムは、重要なことに、本発明の多能性胚様幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ変調することが可能な薬物もしくは他の実体を同定するために適応し得る。そのようなアッセイは、例えば、増殖または特定の系統もしくは細胞型にを決定するために多能性胚様幹細胞を変調するのに特異的であり得る作用物質、因子または薬物の開発に有用である。例えば、そのような薬物は細胞または組織の移植療法を可能にするのに使用することができる。
【００４５】
アッセイシステムは、増殖または分化決定因子をコードするかあるいはそうでなけれは細胞の分化または発生に関与するタンパク質または分子をコードする遺伝子をスクリーニングするか、同定するかあるいは特徴付けするために容易に適応することができる。例えば、特定の系統に沿った分化に関与するかまたは分化中に発現されるタンパク質をコードする遺伝子は、公知の方法（例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ディファレンシャルディスプレイなど）により同定することができる。従って、本発明の多能性胚様幹細胞は、特定の系統を生じる条件下で培養することができ、次いでここで発現された遺伝子を特徴付けすることができる。多能性胚様状態における本発明の多能性胚様幹細胞を維持するのに必要な因子およびタンパク質はまた、それらの再生能を維持する条件下で本発明の多能性胚様幹細胞を培養し、遺伝子およびそのようにして発現されるタンパク質または外因から提供される場合に自己再生能を維持するタンパク質を特徴付けることによって、同様に同定および特徴付けすることができる。
【００４６】
さらなる実施態様において、本発明は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞の活性、あるいは増殖因子および分化決定因子を含む作用物質または任意のそのような細胞もしくは組織に作用することが決定付けられた他の薬物に基づく特定の治療方法に関する。１つの例示的治療方法は、特定の系統の細胞の欠乏もしくは不全に原因として関連するかまたは該欠乏もしくは不全から生じる症状の発現の予防または変調に関連し、該方法は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞を、宿主のそれらの症状の発達または進行を予防するのに十分な量で、個々にあるいは増殖因子または分化決定因子との混合で投与することを含む。
【００４７】
さらなるかつ特定の態様において、本発明は、治療から利益が得られえる症状、疾患、障害、細胞衰弱もしくは欠損の治療または緩和における細胞の分化未決定の集団、細胞の分化決定された集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞の移植を含む治療方法を含む。これらの方法は、細胞、組織もしくは器官の置換または補充を含む。そのような置換または補充は、本発明の多能性胚洋館細胞の移植または細胞の未分化未決定の集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織もしくは器官の移植によって達成することができる。
【００４８】
従って、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に多能性胚様幹細胞を移植する方法を含む。
【００４９】
さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に精製された多能性胚様幹細胞を提供する方法を提供する。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞に目的のタンパク質もしくは遺伝子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターをトランスフェクトする工程を含む、目的のタンパク質もしくは遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ投与する方法を含む。
【００５１】
本発明は、治療有効量の多能性胚様幹細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において組織修復または移植する方法を提供する。
【００５２】
本発明は、治療有効量の多能性胚様幹細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全および／または他の疾患状態を予防ならびに／あるいは治療する方法を提供する。
【００５３】
さらなる態様では、本発明の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全および／または他の疾患状態を予防ならびに／あるいは治療する方法を提供する。
【００５４】
本明細書において一般に言及されている治療方法は、増殖因子もしくは分化決定因子を含む薬学的組成物を単独かあるいは本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞もしくは組織、あるいは他の同様な薬剤、薬物または例えば、本発明のさらなる態様に従って調製および使用される薬物スクリーニングアッセイによって同定される化合物との組み合わせで投与することによって様々な病因あるいは他の細胞機能不全および障害を治療する方法を含む。
【００５５】
本発明のさらなる目的は、細胞の分化未決定集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞を含むかまたは基づく治療方法における使用のための薬学的組成物を、受容可能なキャリアと共に提供することである。薬学的に受容可能なキャリアを伴う、本発明の多能性胚様幹細胞ならびに／またはそれから誘導される細胞、組織および器官に作用するかあるいは変調する増殖因子あるいは分化決定因子を含む薬学的組成物も考慮される。増殖因子あるいは分化決定因子の薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官をさらに含み得る。薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官を、ポリマーキャリアあるいは細胞外マトリックス中に含み得る。
【００５６】
本発明はまた、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全を治療するための薬学的組成物を提供し、該薬学的組成物は以下のものを含む。
Ａ．治療有効量の本発明の多能性胚葉幹細胞；および
Ｂ．薬学的に受容可能な媒体またはキャリア。
【００５７】
本発明の薬学的組成物はまた、本発明の多能性胚様幹細胞から誘導される内胚様、外胚様または中胚葉分化決定された細胞を含む組成物、および薬学的に受容可能な媒体もしくはキャリアを含む。そのような任意の薬学的組成物は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。
【００５８】
本発明は、間葉型の細胞へ分化することが可能な多能性幹細胞（ＰＰＭＳＣ）に関し、ここで、そのような細胞は、抗原マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０およびＭＨＣクラスＩに対して陽性であるかまたはこれらを発現する。本発明のＰＰＭＳＣは、マーカーＣＤｌａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤｌ１７、ＣＤ１２３、ＣＤｌ６６、グリコホリンＡ、ＤＲＩＩ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、アネキシン、およびＬＩＮに対して陰性である。
【００５９】
本発明はさらに、抗原マーカーＣＤｌａ、ＣＤ１０、ＣＤ４１、ＣＤ６６ｅおよびアネキシンに対して陽性であるかまたはこれらを発現し、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤｌ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤｌ１７、ＣＤ１２３、ＣＤｌ６６、グリコホリンＡ、ＤＲＩＩ、クラスＩ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、およびＬＩＮに対して陰性であるかまたはこれらを発現しない多能性幹細胞に関する。
【００６０】
本発明はまた、抗原マーカーＣＤｌａ、ＣＤ１０、ＣＤ２２およびアネキシンに対して陽性であるかまたはこれらを発現し、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤｌ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤｌ１７、ＣＤ１２３、ＣＤｌ６６、グリコホリンＡ、ＤＲＩＩ、クラスＩ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、アネキシン、およびＬＩＮに対して陰性であるかまたはこれらを発現しない多能性幹細胞を含む。
【００６１】
本発明はさらに、抗原マーカーＣＤ１０およびＣＤ２２に対して陽性であるかまたはこれらを発現し、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤｌ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤｌ１７、ＣＤ１２３、ＣＤｌ６６、グリコホリンＡ、ＤＲＩＩ、クラスＩ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、アネキシン、およびＬＩＮに対して陰性であるかまたはこれらを発現しない多能性幹細胞に関する。
【００６２】
本発明はもちろん、本発明において例示されるものを含む本発明の多能性胚様幹細胞の調製および単離のためのいくらかの手段または方法を考慮し、従って、本発明は請求の範囲内でそのような手段または方法を含むことを意図する。
【００６３】
他の目的および利点は、以下の例示的図面を参照にして、以下の説明を再考することにより当業者には明らかであろう。
【００６４】
【詳細な説明】
本発明に従えば、用いられる従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術は当業者の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  （１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  ［Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ編（１９９４）］；”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１１１  ［Ｊ．  Ｅ．  Ｃｅｌｉｓ編（１９９４））］；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１１１  ［Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ編（１９９４）］；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  （Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．  １９８４）；”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  ［Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  ［Ｂ．  Ｄ．  ＰＨａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］  ”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  ［Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）］；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  （１９８４）を参照されたい。
【００６５】
本明細書において認められる以下の用語は次のように規定されるべきである。
【００６６】
用語「胚様多能性幹細胞」（単数および複数）、「胚様幹細胞」、「多能性胚様幹細胞」、「原外胚葉様幹細胞」、「多能性原外胚葉様幹細胞」、「ＰＰＥＬＳＣ」、「ＰＰＳＣ」および「幹細胞」ならびに具体的に列挙されていない任意の変異体は、本明細書において交換可能に使用され得、本出願および請求の範囲を通して使用されるに、これらの用語は、これらの細胞（単数および複数）ならびに／あるいは非胚もしくは生後動物細胞もしくは組織から誘導される上記細胞の培養物、クローンもしくは集団に及び、自己再生可能および内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能である。胚様多能性幹細胞は、本明細書ならびに請求の範囲に記載の能力および特徴のプロフィールを有する。
【００６７】
本発明の胚様多能性幹細胞は分化未決定であり、即ち、それらはいずれの特定の胚様、例えば、内胚葉、中胚葉、外胚葉、または脊索にも決定されていない。それらは静止状態を保持することができる。それらはまた、増殖するための特定の成長因子によって刺激され得る。増殖のために活性化される場合、胚様多能性幹細胞は、分化未決定を保持する限り広範な自己再生が可能である。この決定過程には、一般的または特定の分化決定剤の使用が必要である。
【００６８】
「分化決定」は、個々の細胞が、生命体の形成を生じる発生シークエンス中の以後および特定の段階の分化を決定する。
【００６９】
用語「分化未決定」は、細胞が発生シークエンスの分化の以後のいずれの段階（例えば、胚様系統または細胞型）にも決定されていない細胞の特徴を指す。
【００７０】
用語「分化決定」は、細胞が発生シークエンスの分化の以後の特定の段階（例えば、胚様系統または細胞型）に決定されている細胞の特徴を指す。例えば、分化決定された細胞は、胚様内の単一の系統、例えば、肝臓、甲状腺（内胚葉）、筋肉、骨（中胚葉）、ニューロン、メラニン細胞、表皮（外胚葉）などに制限された子孫を生じ得るそれらの細胞を含む。
【００７１】
「多能性内胚様幹細胞」は、自己再生または内胚葉内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性内胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から内胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の内胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性胚様幹細胞は、上皮裏打ち誘導体、および／または気管の実体、気管支、肺、胃腸管、肝臓、膵臓、膀胱、咽頭、甲状腺、胸腺、上皮小体、鼓室、耳管、扁桃などを含むがこれらに限定されない内胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。
【００７２】
「多能性中胚葉幹細胞」は、自己再生または中胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性中胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から中胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の中胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性中胚葉幹細胞は、骨格筋、平滑筋、心筋、脂肪細胞、褐色細胞、結合組織中隔、疎性結合組織、繊維性器官被膜、腱、靭帯、真皮、骨、硝子軟骨、弾性軟骨繊維軟骨、関節軟骨、成長板軟骨、内皮細胞、髄膜、骨膜、軟骨膜、赤血球、リンパ球、単球、マクロファージ、小膠細胞、形質細胞、肥満細胞、樹状細胞、巨各球、破骨細胞、軟骨吸収細胞、リンパ節、扁桃、脾臓、腎臓、尿管、膀胱、心臓、精巣、卵巣、子宮などを含むがこれらに限定されない中胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。
【００７３】
「多能性外胚葉幹細胞」は、自己再生または外胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性外胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から外胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の外胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性外胚葉幹細胞は、神経外胚葉、神経堤、および／または表面外胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。
【００７４】
「多能性神経外胚葉幹細胞」は、自己再生または神経外胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性神経外胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から神経外胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の神経外胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性神経外胚葉幹細胞は、ニューロン、稀突起膠細胞、星状細胞、上衣細胞、網膜、松果体、脳下垂体後葉などを含むがこれらに限定されない神経外胚様系統内の任意の細胞型を形成することができる。
【００７５】
「多能性神経堤幹細胞」は、自己再生または神経堤内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性神経堤幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から神経堤系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の神経堤分化決定剤の使用が必要である。多能性神経堤幹細胞は、頭側神経節、知覚神経節、自律神経節、末梢神経、シュワン細胞、知覚神経終末、副腎髄質、メラニン細胞、頭部間葉の寄与、頚部間葉への寄与、胸部間葉への寄与、腰部間葉への寄与、仙骨間葉への寄与、尾骨間葉への寄与、心臓弁、心流出路（大動脈および肺動脈幹）、ＡＰＵＤ（アミン取り込みデカルボキシラーゼ）システム、傍濾胞「Ｃ」（カルシトニン）細胞、エンテロクロマフィン細胞などを含むがこれらに限定されない神経堤系統内の任意の細胞型を形成することができる。
【００７６】
「多能性表面外胚葉幹細胞」は、自己再生または表面外胚様内の任意の特定の系統への分化が可能である。多能性表面外胚葉幹細胞は、それらの寿命中の任意の時点で単一の細胞から表面外胚葉系統内で決定する能力を有する。この決定過程には、一般的または特定の表面外胚葉分化決定剤の使用が必要である。多能性表面外胚様幹細胞は、表皮、毛髪、爪、汗腺、唾液腺、脂腺、乳腺、脳下垂体前葉、歯のエナメル質、内耳、眼のレンズなどを含むがこれらに限定されない表面外胚葉系統内の任意の細胞型を形成することができる。
【００７７】
始原細胞は、分化決定されており、即ち、個々の細胞は、各胚様内の単一の系統、例えば、肝臓、甲状腺（内胚葉）、筋肉、骨（中胚葉）、ニューロン、メラニン細胞、表皮（外胚葉）などに制限された子孫を生じることができる。それらはまた、増殖するための特定の成長因子によって刺激され得る。増殖のために活性化される場合、始原細胞は、プログラム化された細胞老化および死が生じる前に５０〜７０細胞倍加に制限された寿命を有する。
【００７８】
「クローン」または「細胞のクローン集団」は、単一の細胞共通の先祖から有糸分裂によって誘導される細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代に渡るｉｎ  ｖｉｔｒｏ  での安定な増殖が可能である初代細胞のクローンである。
【００７９】
「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自律単位として機能する任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）であり、即ち、自身の制御下で複製することが可能である。
【００８０】
「ベクター」は、付着されたセグメントの複製が生じるようにもう１つのＤＮＡセグメントを付着することができるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。
【００８１】
「ＤＮＡ分子」は、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の単一形態または二重螺旋でのポリマー形態を指す。この用語は、分子の１次および２次構造のみを指し、該分子を任意の特定の３次形態に限定するものではない。従って、この用語は、特に、線状  ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、および染色体において見出される２本鎖ＤＮＡを含む。特に２本鎖ＤＮＡ分子の構造について議論する場合、配列は、転写されない鎖のＤＮＡ（即ち、該鎖はｍＲＮＡに相同な配列を有する）に沿った５’から３’方向への配列のみを示す通常的な慣例に従って本明細書に記載することができる。
【００８２】
「複製開始点」は、ＤＮＡ合成に参加するそれらのＤＮＡ配列を指す。
【００８３】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合に、転写され、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列であるコード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ型、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は、通常、コード配列の３’側に配置される。
【００８４】
転写および翻訳調節配列は、宿主細胞にコード配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。
【００８５】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向の）コード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的のために、プロモーター配列は、転写開始部位によって３’末端に結合し、上流（５’方向）に伸張し、最小数の塩基またはバックグランドよりも大きな検出可能なレベルで転写を開始するのに必要なエレメントを含む。プロモーター配列内では、転写開始部位（従来、ヌクレアーゼＳｌによるマッピングによって規定される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が認められよう。真核生物のプロモーターは、常にではないがしばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガノ配列を含有する。
【００８６】
「発現調節配列」は、もう１つのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御ならびに調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、コード配列によってタンパク質に翻訳される場合、コード配列は細胞中の転写および翻訳調節配列の「制御下」にある。
【００８７】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、宿主細胞に連絡してポリペプチドを細胞の表面に方向付けるかまたはポリペプチドを培地に分泌させるシグナルペプチド（ポリペプチドに対してＮ末端側）をコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物に天然に存在する様々なタンパク質に関連して見出すことができる。
【００８８】
本発明のプローブについて言及する際に本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ以上、好ましくは３つを超えるリボヌクレオチドから成る分子として規定される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、順に、最終的な機能およびオリゴヌクレオチドの使用に依存する。
【００８９】
本明細書において使用される用語「プライマー」は、精製された制限消化におけるような天然に存在するかまたは合成により精製されるいずれのオリゴヌクレオチドをも指し、プライマー伸長産物（核酸鎖に対して相補的である）の合成が誘導される条件（即ち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下ならびに適切な温度およびｐＨ）下に配置される場合、合成開始点として作用することが可能である。プライマーは単一鎖かまたは２本鎖のいずれか一方であり、誘導剤の存在下で所望される伸長産物の合成をプライムするのに十分な長さでなければ成らない。このプライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および方法の使用を含む多くの因子に依存する。例えば、診断アプリケーションのために、標的配列の複雑度に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に１５２５以上のヌクレオチドを含有するが、該プライマーはそれより少ないヌクレオチドを含有してもよい。
【００９０】
プライマーは、特に標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントはプライマーの５’末端に付着することができ、該プライマー配列の残りの部分は鎖に相補的である。
【００９１】
あるいは、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーに散在させることもできるが、但し、プライマー配列は、鎖の配列とハイブリダイズし、それによって伸長産物の合成のためのテンプレートを形成するのに十分な該鎖の配列との相補性を有する。
【００９２】
本明細書で使用される用語「制限ヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、特定のヌクレオチド配列またはその付近で２本鎖ＤＮＡを切断する微生物の酵素を指す。
【００９３】
外来性または異種ＤＮＡが細胞の内部に導入されている場合、該細胞は該外来性または異種ＤＮＡによって「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質転換またはトランスフェクトＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれていても組み込まれていなくてもよい。原核生物、例えば、酵母、および哺乳動物細胞では、形質転換またはトランスフェクトＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。親核細胞については、安定に形質転換またはトランスフェクトされた細胞は、形質転換またはトランスフェクトＤＮＡが、染色体の複製を介して娘細胞に遺伝するように染色体に組み込まれている細胞である。この安定性は、親核細胞が、形質転換またはトランスフェクトＤＮＡを含有する娘細胞の集団から成る細胞株あるいはクローンを樹立する能力によって決定される。
【００９４】
少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドが規定された長さのＤＮＡ配列に一致する場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」である。  実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な鎖ソフトウェアを使用して配列を比較するか、または例えば、特定の系について規定されるストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当業者の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上掲；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ＆  ＩＩ、上掲；；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上掲を参照されたい。
【００９５】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然におけるより大きな分子との関連において認められないより大きなＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。従って、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、該遺伝子は、通常、供給源生物のゲノムにおける哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接される。異種コード配列のもう１つの例は、コード配列自体が天然に認められない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンか、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含有するｃＤＮＡ）である。対立遺伝子変異体または天然に存在する変異事象は、本明細書に規定されるＤＮＡの異種領域を生じない。
【００９６】
発現調節配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御ならびに調節する場合、該ＤＮＡ配列は該発現調節配列に「作動可能に連結される」。用語「作動可能に連結される」は、発現させようとするＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有し、正確な読み枠を維持して、発現調節配列下のＤＮＡ配列の発現およびＤＮＡ配列にコードされる所望の産物の産生を可能にすることを含む。組換えＤＮＡ分子への挿入を所望する遺伝子が適切な開始シグナルを含有していない場合、そのような開始シグナルを該遺伝子の前に挿入することができる。
【００９７】
用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について５×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に等価である塩および温度条件を指す。しかし、当業者であれば、そのような「標準的なハイブリダイゼーション条件」が、緩衝液中のナトリウムおよびマンガンの濃度、ヌクレオチドの配列長および濃度、ミスマッチ％、ホルムアミド％などを含む特定の条件に依存することを理解するであろう。２つの配列のハイブリダイズがＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡであるかどうかも「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定に重要である。そのようなハイブリダイゼーション条件は、周知の公式（ここで、所望であればより高いストリンジェンシーの洗浄によりハイブリダイゼーションは予想されるかまたは決定されるＴｍよりも典型的に１０〜２０℃低い）に従って、当業者によって容易に決定される。
【００９８】
本明細書に記載のアミノ酸残基は、Ｌ異性体型であるのが好ましい。
しかし、免疫グロブリン結合の所望される機能特性がポリペプチドによって保持される限り、Ｄ−異性体型の残基を任意のＬ−アミノ酸残基の代わりに置き換えることができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ酸を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基を指す。標準的なポリペプチド命名方法Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２４３：３５５２−５９  （１９６９）を見ると、アミノ酸残基の省略記号は以下の対応表（表１）の通りである。
【００９９】
【表１】
2004504003.tif 000001
【０１００】
すべてのアミノ酸残基配列は、左右の方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式で本明細書において表されることに注意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１以上のアミノ酸残基のさらなる配列に結合したペプチドを示すことに注意すべきである。上記の表は、３文字命名と本明細書において代替的に出現し得る１文字命名とを相関させるために示されている。
【０１０１】
同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は相互に縮重であり得ることは理解されるべきである。「縮重する」とは、異なる３文字のコドンが特定のアミノ酸を明確にするために使用されることを意味する。特定の各アミノ酸をコードするために以下のコドンを交換可能に使用することができることは当該分野において周知である。
【０１０２】
フェニルアラニン（Ｐｈｅ  または  Ｆ）  ＵＵＵ  または  ＵＵＣ
ロイシン（Ｌｅｕ  または  Ｌ）  ＵＵＡ  または  ＵＵＧ  または  ＣＵＵ  または  ＣＵＣ  または  ＣＵＡ  または  ＣＵＧ
イソロイシン（Ｉｌｅ  または  Ｉ）  ＡＵＵ  または  ＡＵＣ  または  ＡＵＡ
メチオニン（Ｍｅｔ  または  Ｍ）  ＡＵＧ
バリン（Ｖａｌ  または  Ｖ）  ＧＵＵ  または  ＧＵＣ  ｏｆ  ＧＵＡ  または  ＧＵＧ
セリン（Ｓｅｒ  または  Ｓ）  ＵＣＵ  または  ＵＣＣ  または  ＵＣＡ  または  ＵＣＧ  または  ＡＧＵ  または  ＡＧＣ
プロリン（Ｐｒｏ  または  Ｐ）  ＣＣＵ  または  ＣＣＣ  または  ＣＣＡ  または  ＣＣＧ
トレオニン（Ｔｈｒ  または  Ｔ）  ＡＣＵ  または  ＡＣＣ  または  ＡＣＡ  または  ＡＣＧ
アラニン（Ａｌａ  または  Ａ）  ＧＣＵ  または  ＧＣＧ  または  ＧＣＡ  または  ＧＣＧ
チロシン（Ｔｙｒ  または  Ｙ）  ＵＡＵ  または  ＵＡＣ
ヒスチジン（Ｈｉｓ  または  Ｈ）  ＣＡＵ  または  ＣＡＣ
グルタミン（Ｇｌｎ  または  Ｑ）  ＣＡＡ  または  ＣＡＧ
アスパラギン（Ａｓｎ  または  Ｎ）  ＡＡＵ  または  ＡＡＣ
リジン（Ｌｙｓ  または  Ｋ）  ＡＡＡ  または  ＡＡＧ
アスパラギン酸（Ａｓｐ  または  Ｄ）  ＧＡＵ  または  ＧＡＣ
グルタミン酸（Ｇｌｕ  または  Ｅ）  ＧＡＡ  または  ＧＡＧ
システイン（Ｃｙｓ  または  Ｃ）  ＵＧＵ  または  ＵＧＣ
アルギニン（Ａｒｇ  または  Ｒ）  ＣＧＵ  または  ＣＧＣ  または  ＣＧＡ  または  ＣＧＧ  または  ＡＧＡ  または  ＡＧＧ
グリシン（Ｇｌｙ  または  Ｇ）  ＧＧＵ  または  ＧＧＣ  または  ＧＧＡ  または  ＧＧＧ
トリプトファン（Ｔｒｐ  または  Ｗ）  ＵＧＧ
終止コドンＵＡＡ  （オーカー）  または  ＵＡＧ  （アンバー）  または  ＵＧＡ  （オパール）
【０１０３】
上に明記されたコドンはＲＮＡ配列に関するものであることを理解すべきである。ＤＮＡに対する対応コドンはＵの代わりにＴを有する。
【０１０４】
ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の変異または変更は、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するように作製され得る。そのような変異は、一般に、可能な限り最も少ないヌクレオチド変化を作製することによって作製され得る。この種類の置換変異を作製して、非保存的方法（即ち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸からもう１つの群に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）または保存的方法（即ち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）で得られるタンパク質のアミノ酸を変化することができる。そのような保存的変化は、一般に得られるタンパク質の構造および機能においてより少ない変化を生じる。非保存的変化は、得られるタンパク質の構造、活性または機能をより変更し易い。本発明は、得られるタンパク質の活性または結合特性を有意に変更しない保存的変化を含有する配列を含むことを考慮すべきである。
【０１０５】
以下は、様々な群のアミノ酸の１例である。
【０１０６】
非極性Ｒ基を有するアミノ酸。
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
【０１０７】
非変化極性Ｒ基を有するアミノ酸。
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
【０１０８】
変化した極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ  ６．０で陰性に荷電）。
アスパラギン酸、グルタミン酸。
【０１０９】
塩基性アミノ酸（ｐＨ  ６．０で陽性に荷電）。
リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ  ６．０において）。
【０１１０】
もう１つの群は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る。
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。
【０１１１】
【表２】
もう１つの群は、分子量に従い得る（即ち、Ｒ基のサイズ）。
2004504003.tif 000002
【０１１２】
特に好ましい置換は：
陽性荷電が維持され得るようなＡｒｇの代わりにＬｙｓおよびその逆；
陰性荷電が維持され得るようなＡｓｐの代わりにＧｌｕおよびその逆；
遊離の−ＯＨを維持することができるようなＴｈｒの代わりにＳｅｒ；および
遊離のＮＨ２を維持することができるようなＡｓｎの代わりにＧｌｎ。
【０１１３】
特定の好適な特性を有するアミノ酸を置換するためにアミノ酸置換を導入してもよい。例えば、Ｃｙｓは、もう１つのＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的部位に導入することができる。Ｈｉｓは、特定の「触媒」部位（即ち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用する、生化学触媒において最も一般的なアミノ酸である）として導入することができるＰｒｏはタンパク質の構造にβターンを導入する特定の平面構造を有するため、Ｐｒｏを導入することができる。
【０１１４】
少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のアミノ酸残基が同一であるか、または保存的置換を示す場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」である。
【０１１５】
「抗体」は、抗体および特異的エピトープに結合するそのフラグメントを含む任意の免疫グロブリンである。該用語は、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を包含し、最近では米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号により詳細に記載されている。
【０１１６】
「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖可変ならびに超可変領域から成る抗体分子の構造タンパク質である。
【０１１７】
本明細書において使用される様々な文法形態における語句「抗体分子」は、インタクトな免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を考慮する。
【０１１８】
例示的抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当該分野において公知である部分（該部分は本明細書に記載の治療方法における使用に好適である）を含むパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分である。
【０１１９】
抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２は、周知の方法により、実質的にインタクトな抗体分子に対するそれぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。例えば、米国特許第４，３４２，５６６号（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓら）を参照されたい。Ｆａｂ’抗体分子部分も周知であり、Ｆ（ａｂ’）２部分から、続いてメルカプトエタノールによる２つの重鎖部分を結合するジスルフィド結合の還元、続いてヨードアセタミドなどの試薬による得られたタンパク質メルカプタンのアルキル化により生成される。インタクトな抗体分子を含有する抗体がここでは好ましい。
【０１２０】
様々な文法形態における語句「モノクローナル抗体」は、特定の抗原と免疫反応することが可能なただ１つの腫の抗体結合部位を有する抗体を指す。従って、モノクローナル抗体は、典型的に、該抗体が免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、異なる抗原に対してそれぞれが免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二特異的（キメラ）モノクローナル抗体を含有し得る。
【０１２１】
語句「薬学的に受容可能」は、薬学的に耐性であり、ヒトに投与された場合に典型的にアレルギーまたは胃の不調、めまい感などの同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
【０１２２】
本明細書において使用される語句「治療有効量」は、標的細胞隗のＳ相活性の臨床的に有意な変化または例えば、高血圧、発熱もしくはその存在および活性に伴う白血球数などの病因の他の特徴を予防する、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％減少するのに十分な量を意味する。
【０１２３】
その初期の態様において、本発明は、非胚動物細胞または組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞の同定ならびに単離に関する。本発明は、生後または成体動物細胞もしくは組織から誘導される、自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚葉幹細胞にまで及ぶ。
【０１２４】
本発明の多能性胚様幹細胞は、非ヒト細胞から単離してもまたはヒト細胞から単離してもよい。特定の実施態様において、本発明は、任意のヒト多能性胚葉幹細胞およびそのような細胞のクローン集団を含む集団に関する。
【０１２５】
本発明の多能性胚様幹細胞は、筋肉、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織、または骨髄の群より選択される非胚生後あるいは成体組織から単離することができる。
【０１２６】
本発明はさらに、細胞、特に、多能性胚様幹細胞から誘導される多能性または始原細胞に関する。細胞は、分化決定された細胞であり得、該細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉系統に決定され得る。
【０１２７】
さらなる態様において、本発明は、以下のものを含む培養物に関する。
（ａ）自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞；および
（ｂ）前記幹細胞の増殖を支持し得る培地。
【０１２８】
培養物を含有するそのような幹細胞は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。そのような培養物の幹細胞は、非ヒト細胞から単離されてもまたはヒト細胞から単離されてもよい。
【０１２９】
本発明はさらに、多能性胚様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）非胚動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｃ）前記細胞を培養する工程。
【０１３０】
特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）生後動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｃ）前記細胞を培養する工程。
【０１３１】
特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）成体動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｃ）前記細胞を培養する工程。
【０１３２】
特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）非胚動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）前記細胞をコラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液中でインキュベートする工程；
（ｃ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記インキュベートした細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｄ）前記細胞を培養する工程。
【０１３３】
特に、本発明の多能性肺様幹細胞を単離する方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）非胚動物供給源から細胞を入手する工程；
（ｂ）２０μｍフィルターを介して前記細胞をろ過する工程；
（ｃ）−８０℃の最終温度に到達するまで、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記ろ過した細胞を緩徐に凍結する工程；および
（ｄ）前記細胞を培養する工程。
【０１３４】
さらなる態様において、多能性肺様幹細胞を単離する方法は、それによってそのような幹細胞のクローン集団が単離される方法に関し、ここで、まず、単一の多能性肺様幹細胞が単離され、次いで、クローン集団を作製するために培養および拡張される。単一の多能性胚様幹細胞は、限界希釈かまたは当業者に公知である他の方法によって単離することができる。
【０１３５】
従って、本発明はまた、そのような方法によって発生されるクローン多能性胚様幹細胞株に関する。
【０１３６】
特定の態様では、本発明は多能性胚様幹細胞あるいは形質転換またはトランスフェクトされ、それによって目的の遺伝子もしくはタンパク質を含有し発現することができるそのような細胞の集団に関する。従って、本発明は、目的の遺伝子またはタンパク質を発現するように遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を含む。次いで、そのような遺伝子操作された幹細胞が分化決定されるのと同様に、本発明はさらに、遺伝子操作された多能性胚様幹細胞から誘導され、目的の遺伝子またはタンパク質を発現する分化決定された細胞を包含する。分化決定された細胞は内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞であってもよく、多能性間葉幹細胞などの多能性細胞または脂肪生成もしくは筋原細胞などの始原細胞であってもよい。
【０１３７】
次いで、本発明は、遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を産生する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
（ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むＤＮＡ構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程；
（ｂ）前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において選択された幹細胞を培養する工程。
【０１３８】
特定の態様において、本発明は、そのような方法によって産生されたヒトおよび非ヒト細胞を含む遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を包含する。
【０１３９】
本発明の多能性幹細胞の存在および単離によって生じる診断的および治療的両方の可能性については、多能性胚葉幹細胞が非胚生後または成体動物細胞もしくは組織から単離することができ、他方で自己再生ならびに他方で内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞への分化が可能であるという事実から導かれる。従って、任意の内胚葉、外胚葉、および中胚葉系統の細胞は、動物供給源から、成体期に入るかまたは成体期中であっても該供給源から入手可能な細胞の単一な自己再生供給源から提供され得る。本明細書においてはじめに示唆され、さらに詳細に説明したように、本発明は、例えば、薬学的介入、方法および治療、細胞に基づく治療、遺伝子療法、様々な生物学的および細胞アッセイ、増殖または分化決定因子の単離および評価、ならびに発生および細胞分化に関する多様な研究におけるそれから誘導される細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞の使用を考慮する。
【０１４０】
本明細書において先に記載したように、外傷または疾患により損傷したかもしくは消失したほとんどのヒト組織を再生する能力は、成体では実質的に減少している。毎年数百万人の米国人が組織の消失または終段階の器官不全を患う。組織消失は、ガン、外傷性組織損傷、先天異常、脈管性欠陥、選択術などに関する急性損傷および外科的介入、即ち、切断、組織の挫滅組織切除、および外科摘出術から生じ得る。組織移植および外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足および可能な長期の病的状態のために厳しく制限されている。これらの一般的ストラテジーは、次の新たな組織の作製に適応されている：（１）．単離された細胞または組織欠損もしくは欠陥の領域に適用される細胞代用物。（２）．閉鎖または開放系のいずれか一方でマトリックス上もしくは内に配置された細胞。（３）．組織の再生を生じる増殖の決定されたパターンに特異的な細胞を調節するための（増殖因子または分化決定因子を含む）成長因子に依存する組織誘導物質、およびこれらの物質をそれらの標的に送達するための方法。
【０１４１】
広範な移植物、先天異常、選択術、疾患、および遺伝子異常は、それから誘導される細胞もしくは組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞単独あるいは増殖因子、分化決定因子、または目的の遺伝子もしくはタンパク質との組み合わせでの治療に対して可能性を有する。好ましい治療方法は、組織がｉｎ  ｖｉｖｏで再生され得る場所での移植のために直接細胞を提供するか、失われた組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生して次いで組織を提供するか、あるいはｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のためのトランスフェクションまたは形質転換に適切な十分な数の細胞を提供することを目的とする組織消失の治療を含む。
【０１４２】
本発明の多能性胚葉幹細胞の重要な有益性は、任意の特定の組織系統（内胚葉、外胚葉、中胚葉）への決定前に自己再生に対する能力を有し、次いで、一旦決定されたらさらに増殖することである。移植に利用できる適切な細胞および組織の量が制限されている場合、これらの増殖ならびに分化属性は極めて重要かつ有用である。
【０１４３】
（ａ）単離および分類することができる；（ｂ）多能性を保持する一方で無制限の増殖能を有する；（ｃ）多数の個別の組織系統へ決定するために操作することができる；（ｄ）現存する組織への組み入れが可能である；および（ｅ）続いてそれぞれ分化された組織型を発現することができる、移植療法のためのさらなる組織供給源としての多能性胚葉幹細胞の単離は、消失した、損傷を受けた、もしくは疾患のある組織の機能的能力および／または寿命を維持あるいは増加する療法に有益性であることが明らかであり得る。
【０１４４】
さらなる実施態様において、本発明は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞の活性、あるいは増殖因子および分化決定因子を含む作用物質または任意のそのような細胞もしくは組織に作用することが決定付けられた他の薬物に基づく特定の治療方法に関する。１つの例示的治療方法は、特定の系統の細胞の欠乏もしくは不全に原因として関連するかまたは該欠乏もしくは不全から生じる症状の発現の予防または変調に関連し、該方法は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞を、宿主のそれらの症状の発達または進行を予防するのに十分な量で、個々にあるいは増殖因子または分化決定因子との混合で投与することを含む。
【０１４５】
さらなるかつ特定の態様において、本発明は、治療から利益が得られえる症状、疾患、障害、細胞衰弱もしくは欠損の治療または緩和における細胞の分化未決定の集団、細胞の分化決定された集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞の移植を含む治療方法を含む。これらの方法は、細胞、組織もしくは器官の置換または補充を含む。そのような置換または補充は、本発明の多能性胚洋館細胞の移植または細胞の未分化未決定の集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織もしくは器官の移植によって達成することができる。
【０１４６】
従って、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に多能性胚様幹細胞を移植する方法を含む。
【０１４７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞を宿主に導入する工程を含む、宿主に精製された多能性胚様幹細胞を提供する方法を提供する。
【０１４８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の多能性胚様幹細胞に目的のタンパク質もしくは遺伝子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターをトランスフェクトする工程を含む、目的のタンパク質もしくは遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ投与する方法を含む。
【０１４９】
本発明は、治療有効量の多能性胚様幹細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全および／または他の疾患状態を予防ならびに／あるいは治療する方法を提供する。
【０１５０】
さらなる態様では、本発明の幹細胞から誘導される治療有効量の内胚葉、外胚葉または中胚葉分化決定された細胞を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全および／または他の疾患状態を予防ならびに／あるいは治療する方法を提供する。
【０１５１】
本明細書において一般に言及されている治療方法は、増殖因子もしくは分化決定因子を含む薬学的組成物を単独かあるいは本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞もしくは組織、あるいは他の同様な薬剤、薬物または例えば、本発明のさらなる態様に従って調製および使用される薬物スクリーニングアッセイによって同定される化合物との組み合わせで投与することによって様々な病因あるいは他の細胞機能不全および障害を治療する方法を含む。
【０１５２】
また、それから誘導される細胞および／または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞を認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む抗体、ならびに細胞および／もしくはそれから誘導される組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞の増殖または決定を変調する作用物質、因子あるいは薬物は、特定の診断または治療アプリケーションを有することができ、例えば、細胞衰弱、細胞欠損などの症状を補正、緩和、検出および／または測定するの利用できる。例えば、それから誘導される細胞および／または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞を使用し、例えば、マウス脾臓リンパ球と骨髄腫との融合細胞を利用するハイブリドーマ技術などの公知の技術により、様々な細胞培地においてそれらに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を生成してもよい。同様に、例えば、本発明の細胞の増殖または決定を変調する作用物質、因子または薬物を発見、同定または合成することができ、診断および／治療プロトコールに使用することができる。
【０１５３】
ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の一般的作製方法は周知である。発ガンＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン・バールウイルスによるトランフェクションなどの融合以外の技術によっても、不死の抗体産生細胞株を作製することができる。例えば、Ｍ．  Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”  （１９８０）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｔｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”  （１９８１）；  Ｋｅｎｎｅｔｔら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  （１９８０）を参照されたい。また、米国特許第４，３４１，７６１号；同第４，３９９，１２１号；同第４，４２７，７８３；同第４，４４４，８８７；同第４，４５１，５７０；同第４，４６６，９１７；同第４，４７２，５００；同第４，４９１，６３２；同第４，４９３，  ８９０を参照されたい。
【０１５４】
それから誘導される細胞もしくは組織を含む多能性胚葉幹細胞、またはそれに対して作用する増殖もしくは分化決定因子に対して産生されるモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性、即ち、イソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。増殖または分化決定因子の活性を中和するモノクローナル抗体が特に興味深い。そのようなモノクローナル物を、本明細書において考慮または記載した分化決定もしくは増殖アッセイを含む活性アッセイで容易に同定することができる。それ由来の細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞、あるいは増殖または分化決定因子の免疫親和性に基づく精製もしくは単離または同定を求める場合、高親和性抗体も有用である。
【０１５５】
好ましくは、本発明の診断または治療方法で使用される抗体は、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体である。より好ましくは、抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。さらに、本明細書に記載の抗体分子は、抗体分子全体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分の形態であるのが好ましい。
【０１５６】
はじめに示唆したように、本発明の診断方法は、例えば、抗胚葉多能性幹細胞抗体、好ましくはアフィニティー精製されたポリクローナル抗体、より好ましくはｍＡｂを含む、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の幹細胞を認識する有効量の抗体を含むアッセイによって、細胞サンプルあるいは培地を検査することを含む。さらに、本明細書に記載の抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦ（ｖ）部分または抗体分子全体の形態であるのが好ましい。先に考察したように、本方法により利益を得ることが可能な患者には、細胞衰弱、臓器不全、組織消失、組織損傷、先天異常、ガンまたは他の疾患衰弱を患う患者が含まれる。抗体を単離し、抗体が標的細胞もしくは因子の単離、精製、検査または変調を援助する能力を決定あるいは最適化する方法は、当該分野において周知である。
【０１５７】
ポリクローナル抗ポリペプチド抗体を産生させる方法は、当該分野において周知である。米国特許第４，４９３，７９５号（Ｎｅｓｔｏｒら）を参照されたい。Ｎｉｍａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０：４９４９−４９５３  （１９８３）を参照されたい。典型的に、有用な抗体分子のＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２部分を含有するモノクローナル抗体は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）（該文献は本明細書において参考として援用される）に記載のハイブリドーマ技術を使用して調製することができる。
【０１５８】
膵臓細胞は、典型的にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を使用して骨髄腫と融合される。融合したハイブリッドは、ＨＡＴに対するそれらの感受性によって選択される。本発明の１つの態様を実施するのに有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、本発明の多能性胚葉幹細胞と免疫反応するそれらの能力によって同定される。本発明のさらなる態様を実施するのに有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、それから誘導される細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞に対する因子、作用物質もしくは薬物の増殖または分化決定活性を阻害するそれらの能力によって同定される。
【０１５９】
本発明を実施するのに有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養物を開始することによって、産生させることができる。該培養物は、ハイブリドーマが培地に抗体分子を分泌するのに十分な条件下および期間の間維持される。次いで、抗体含有培地が回収される。次いで、抗体分子は、周知の技術によってさらに単離される。
【０１６０】
これらの組成物の調製に有用な培地は当該分野において周知でありかつ市販されており、それらには、合成培養培地、近交系マウスなどが含まれる。合成培地の例としては、４．５ｇｍ／ｌグルコース、２０ｍＭグルタミン、および２０％ウシ胎児血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（ＤＭＥＭ  ；  Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｖｉｒｏｌ．  ８：３９６  （１９５９））がある。近交系マウス株の例としては、Ｂａｌｂ／ｃがある。
【０１６１】
本発明はさらに、本発明の治療方法を実施するのに有用な治療組成物を考慮する。主題組成物は、混合物中に、薬学的に受容可能な賦形剤（キャリア）または媒体およびそれから誘導される細胞または組織を含む１つ以上の本発明の多能性胚葉幹細胞を単独あるいは有効成分として本明細書に記載の増殖因子または分化決定因子との組み合わせで含む
【０１６２】
単独または増殖因子または分化決定因子と組み合わされたそれから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞は、薬学的組成物中に、適切なキャリアと共に、細胞もしくは組織の消失または欠損を経験している患者に様々な手段で投与するのに有効な強度で調製することができる。
【０１６３】
本発明のさらなる目的は、細胞の分化未決定集団、細胞の分化決定集団、それから誘導される組織および器官を含む本発明の多能性胚様幹細胞を含むかまたは基づく治療方法における使用のための薬学的組成物を、受容可能なキャリアまたは媒体と共に提供することである。薬学的に受容可能なキャリアまたは媒体を伴う、本発明の多能性胚様幹細胞ならびに／またはそれから誘導される細胞、組織および器官に作用するかあるいは変調する増殖因子あるいは分化決定因子を含む薬学的組成物も考慮される。増殖因子あるいは分化決定因子の薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官をさらに含み得る。
【０１６４】
本発明の薬学的組成物は、本発明の多能性胚様幹細胞、またはそれから誘導される細胞、組織もしくは器官を、単独であるいはポリマーキャリアまたは細胞外マトリックス中に含み得る。適切なポリマーマトリックスは、合成または天然ポリマーから形成される多孔性メッシュまたはスポンジ、およびポリマー溶液を含む。マトリックスの一方の形態はメッシュまたはスポンジであり、他方の形態はポリマーヒドロゲルである。使用可能な天然のポリマーとしては、コラーゲン、アルブミン、およびフィブリンなどのタンパク質；ならびにアルギン酸およびヒアルロン酸のポリマーなどの多糖が挙げられる。合成ポリマーは生物分解性および非生物分解性ポリマーの両方を含む。生物分解性ポリマーの例としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。非生物分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレン、酢酸ビニル、およびポリビニルアルコールが挙げられる。
【０１６５】
可鍛性であるイオンまたは共有架橋されたヒドロゲルを形成することができるポリマーを使用して、細胞をカプセル化する。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が共有、イオン、または水素結合を介して架橋し、ゲルを形成するために水分子を補足する３次元の開放格子構造を作製する場合に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用することができる材料の例としては、アルギン酸などの多糖、ポリホスファゼン、ポリアクリレート（これらはイオン架橋する）、またはＰｌｕｒｏｎｉｃｓもしくはＴｅｔｒｏｎｉｃｓなどのブロックコポリマー、ポリエチレン、オキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー（これらはそれぞれ温度もしくはｐＨによって架橋する）が挙げられる。他の材料は、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンなどのポリマーを含む。
【０１６６】
一般に、これらのポリマーは、水、緩衝化塩溶液、または荷電した側鎖もしくはその１価のイオン塩を有する水溶性アルコール溶液などの水溶液に部分的に可溶である。カチオンと反応することができる酸性側鎖を有するポリマーの例としては、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーが挙げられる。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーもしくはポリマーとの反応によって形成される酸性側鎖を有するコポリマーを使用することもできる。酸性基の例としては、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基がある。アニオンと反応することができる塩基性側鎖を有するポリマーの例には、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、およびいくつかのイミノ置換ポリホスファゼンがある。ポリマーのアンモニウムまたは第四塩も主鎖の窒素またはイミノ基から形成することができる。塩基性側鎖の例には、アミノおよびイミノ基がある。
【０１６７】
本発明はまた、哺乳動物の細胞衰弱、障害および／または機能不全を治療するための薬学的組成物を提供し、該薬学的組成物は以下のものを含む。
Ａ．治療有効量の本発明の多能性胚葉幹細胞；および
Ｂ．薬学的に受容可能な媒体またはキャリア。
【０１６８】
本発明の薬学的組成物はまた、本発明の多能性胚様幹細胞から誘導される内胚様、外胚様または中胚葉分化決定された細胞を含む組成物、および薬学的に受容可能な媒体もしくはキャリアを含む。そのような任意の薬学的組成物は、増殖因子または分化決定因子をさらに含むことができる。
【０１６９】
本発明はもちろん、本発明において例示されるものを含む本発明の多能性胚様幹細胞の調製および単離のためのいくらかの手段または方法を考慮し、従って、本発明は請求の範囲内でそのような手段または方法を含むことを意図する。
【０１７０】
様々な投与技術を利用してもよく、それらのうち、皮下、静脈および腹腔内注入、カテーテル法などの非経口技術も利用される。治療因子含有組成物は、従来、例えば、単位用量の注入によって静脈投与される。幹細胞または細胞の平均量は変動し得るが、特に資格を有する医師または獣医師の推奨および処方に基づくべきである。
【０１７１】
有効成分などの細胞または組織に基づく治療組成物の調製については、当該分野において十分に理解されている。そのような組成物は、薬学的に受容可能な媒体において処方されえる。細胞は、溶液中にあってもまたはマトリックス中に埋め込まれいてもよい。
【０１７２】
有効成分として成長、増殖または分化決定因子を含む因子（例えば、ヒト成長ホルモンなど）を有する治療組成物の調製については、当該分野において十分に理解されている。有効治療成分は、しばしば、薬学的に受容可能であり有効成分に適合性である賦形剤または媒体と混合される。さらに、所望であれば、組成物は、有効成分の有効性を増強する湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。
【０１７３】
因子は、中和された薬学的に受容可能な塩の形態として、治療組成物に処方することができる。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離のアミノ機によって形成される）および例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸が挙げられる。遊離のカルボキシル基から形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄（ＩＩＩ）水酸化物などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導することができる。
【０１７４】
本発明の治療組成物を参照にして使用される場合の用語「単位用量」は、ヒトに対する単位の投与量として適切な物理的に区別される単位を指し、それぞれの単位は、要求される希釈剤、即ち、キャリア、媒体、またはビヒクルを伴って、所望の治療効果を生じるために算出された予め決定された量の活性材料を含有する。
【０１７５】
組成物は、投与処方に適合する方法および治療有効量で投与される。投与しようとする量は、例えば、治療しようとする被験体および衰弱、被験体の器官、細胞および免疫系が有効成分を利用する能力、および細胞または組織治療の性質などに依存する。投与に必要な有効成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、各個体に対して特有である。しかし、因子の適切な投与量は、１日あたり個体の体重キログラムあたり約０．１〜２０、好ましくは約０．５〜約１０、より好ましくは、１〜数ミリグラムの有効成分の範囲であり、投与経路に依存する。初回投与および２回目の投与のための適切なレジメも変動可能であるが、初回投与、それに続く１時間以上の間隔で以後注入または他の投与による反復投与を含むことができる。あるいは、１０ナノモル〜１０マイクロモルの血中濃度を維持するのに十分な連続静脈輸注が考慮される。
【０１７６】
例えば、有効成分として増殖因子または分化決定因子を有する治療組成物は、有効量の因子および１つ以上の次の有効成分：抗生物質、ステロイドをさらに含んでもよい。例示的処方は以下の通りである。
【０１７７】
【表３】
2004504003.tif 000003
【０１７８】
【表４】
2004504003.tif 000004
【０１７９】
【表５】
2004504003.tif 000005
【０１８０】
【表６】
2004504003.tif 000006
【０１８１】
本明細書で使用される「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕｌ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味する。
【０１８２】
本発明のもう１つの特徴は、本明細書に記載のものを含む目的の遺伝子またはタンパク質のＤＮＡ配列の発現である。当該分野において周知の通り、ＤＮＡ配列は、それらを、発現ベクター内の発現調節配列に作動可能に連結し、該発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主に形質転換することによって発現させることができる。ＤＮＡ配列の発現調節配列へのそのような作動可能連結は、もちろん、常にＤＮＡ配列の一部とは限らない場合、ＤＮＡ配列の上流の正確な読み枠に開始コドンＡＴＧを供給することを含む。
【０１８３】
広範な宿主／発現ベクターの組み合わせは、ＤＮＡ配列の発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体および合成ＤＮＡ配列から成り得る。適切なベクターは、ＳＶ４０の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ラムダファージの多くの誘導体、例えば、ＮＭ９８９、ならびに他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および繊維状１本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドなどの酵母プラスミドまたはその誘導体；昆虫もしくは哺乳動物細胞に有用なベクターなどの親核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡもしくは他の発現調節配列を使用するために修飾されているベクターなどのプラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されるベクターを含む。
【０１８４】
広範な発現調節配列（該発現調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）のいずれをもこれらのベクターに使用して、ＤＮＡ配列を発現させることができる。そのような有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの早期または後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ＬＴＲシステム、ラムダファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモーター、および原核もしくは親核細胞またはそれらの組織の遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせが挙げられる。
【０１８５】
広範な単細胞宿主細胞はまた、ＤＮＡ配列の発現に有用である。これらの宿主は、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母などの菌類、ならびにＣＨＯ、Ｒｌ．ｌ、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、Ａｆｒｉｃａｎ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｎｋｅｙ腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、組織培養物中のヒト細胞および植物細胞などの周知の真核および原核宿主を含み得る。
【０１８６】
すべてのベクター、発現調節配列および宿主が同等に十分機能してＤＮＡ配列を発現させるとは限らないことは理解されよう。また、すべての宿主が、同じ発現系で同等に十分機能するとは限らない。しかし、当業者であれば、過度の実験を伴うことなく、適切なベクター、発現調節配列、および宿主を選択して、本発明の範囲を逸脱することなく所望される発現を達成することが可能である。例えば、ベクターを選択する際、ベクターは宿主内で機能しなければならないため、宿主について考慮しなければならないベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる他の任意のタンパク質も考慮される。
【０１８７】
発現調節配列を選択する場合、通常、様々な因子が考慮される。例えば、これらには、システムの相対的強度、その制御能力、および特に潜在的な２次構造に関して、発現させようとする特定のＤＮＡ配列または遺伝子との適合性が含まれる。例えば、選択されたベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を正確に折り畳む能力、およびそれらの発酵用件、ならびに発現させようとするＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物の精製容易性を考慮することによって、適切な単細胞宿主が選択される。これらおよび他の因子を考慮すれば、当業者は、発酵時または大規模な動物培養物において本発明のＤＮＡ配列を発現させる様々なベクター／発現調節配列／宿主の組み合わせを構築することが可能である。
【０１８８】
ＤＮＡ配列は、クローン化よりもむしろ合成によって調製することができる。ＤＮＡ配列は、アミノ酸ハイブリダイゼーションへ津に対する適切なコドンによって設計することができる。一般に、配列を発現のために使用する場合、意図される宿主に適切なコドンが選択される。全配列は、標準的な方法によって重複するオリゴヌクレオチドから組み立てられ、全コード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９２：  ７５６  （１９８１）；  Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２３：  １２９９  （１９８４）；  Ｊａｙ  ら、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５９  ：  ６３１１  （１９８４）を参照されたい。
【０１８９】
合成ＤＮＡ配列は、類似体または「変異タンパク質」を発現する遺伝子の簡便な構築を可能にする。あるいは、変異タンパク質をコードするＤＮＡは、天然の遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的変異誘発によって作製することができ、変異タンパク質は、従来のポリペプチド合成を使用して直接作製することができる。
【０１９０】
非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み入れのための一般的方法については、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．  Ｎｏｒｅｎ，  Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．  Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：  １８２−１８８  （Ａｐｒｉｌ  １９８９）に記載されている。
本方法は、非天然アミノ酸を有する類似体を作製すために使用してもよい。
【０１９１】
本発明はまた、それから誘導される細胞もしくは組織を含む多能性胚葉幹細胞の増殖または特に分化決定因子を誘発する能力を参考にして、増殖因子または特に分化決定因子の存在を検出するための方法を含む様々な診断アプリケーションに関する。本発明の多能性胚葉幹細胞の診断有用性は、それから誘導される細胞もしくは組織を含む多能性胚葉幹細胞の増殖または特に分化決定因子を誘発する能力を参考にして、増殖因子または特に分化決定因子をスクリーニングするためのアッセイにおけるそのような細胞の使用にまで及ぶ。そのようなアッセイは、例えば、核酸および／またはタンパク質配列の単離ならびに決定によって、既知の因子を特徴付けるか、新規の因子を同定するか、または新規もしくは既知の因子をクローン化する場合に使用し得る。
【０１９２】
上で詳細に記載した通り、それから誘導される細胞または組織を含む多能性胚葉幹細胞に対する抗体は、周知のハイブリドーマ技術を含む標準的な方法によって、産生させ、単離することができる。簡便のために、本明細書では多能性胚葉幹細胞に対する抗体をＡｂ１と呼び、別の種において惹起された抗体をＡｂ２と呼ぶことにする。
【０１９３】
多能性胚葉幹細胞の存在は、そのような決定に適用可能な通常の免疫学的手順によって確認することができる。多くの有用な手順が公知である。特に有用であるそのような３つの手順は、検出可能な標識で標識された多能性胚葉幹細胞、または検出可能な標識で標識された抗体Ａｂ１、または検出可能な標識で標識された抗体Ａｂ２のいずれかを利用する。該手順は以下の式に要約され得、式中、アスタリスクは粒子が標識されることを示し、「幹細胞」は、多能性胚葉幹細胞を表す。
Ａ．幹細胞＊＋Ａｂ１＝幹細胞＊Ａｂ１
Ｂ．幹細胞＋Ａｂ１＊＝幹細胞Ａｂ１＊
Ｃ．幹細胞＋Ａｂ１＋Ａｂ２＊＝幹細胞Ａｂ１Ａｂ２＊
【０１９４】
該手順およびそれらのアプリケーションは、当業者によく知られており、従って、本発明の範囲内で利用することができる。「競合手順」、手順Ａについては、米国特許第３，６５４，０９０号および同第３，８５０，７５２号に記載されている。手順Ｃ「サンドイッチ」手順については、米国特許第ＲＥ  ３１，００６号および同第４，０１６，０４３号に記載されている。なお、「二重抗体」または「ＤＡＳＰ」手順などの他の手順についても公知である。
【０１９５】
それぞれの場合、幹細胞は、１つ以上の抗体または結合パートナーと複合体を形成し、複合体のうちの１つのメンバーが検出可能な標識で標識される。複合体が形成され、次いで所望であれば、単離することができ、または標識の検出に適用可能な既知の方法によってその量を決定することができる事実。例えば、蛍光標示式細胞分取のための手順は、当該分野において公知であり、本明細書の実施例において提供されている。予め抗体が結合するかまたは付着しているカラムへの付着によって細胞を単離することもできる。
【０１９６】
Ａｂ２の特徴的な特性がＡｂｌに反応することであることは、上記より明らかであろう。このことは、１つの哺乳動物種において惹起されたＡｂｌが、抗体Ａｂ２を惹起する抗原として別の種において使用されているからである。例えば、Ａｂ２は、抗原としてウサギ小唄を使用し、ヤギにおいて惹起され得る。従って、Ａｂ２は、ヤギにおいて惹起される抗ウサギ抗体であり得る。本説明および請求の範囲の目的のために、Ａｂｌを第１または抗幹細胞抗体と呼び、Ａｂ２を第２または抗Ａｂｌ抗体と呼ぶことにする。
【０１９７】
これらの研究にほぼ一般適に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外光に暴露された場合に蛍光発光する化学物質、および他の物質である。多くの蛍光材料が公知であり、標識として利用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＭＣＡブルーおよびＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗが含まれる。特定の検出材料は、ヤギにおいて調製される抗ウサギ抗体であり、イソチオシアネートを介してフルオレセインと結合する。
【０１９８】
幹細胞またはその結合パートナーは、放射性元素または酵素で標識することもできる。放射性標識は、任意の現在利用可能な計数手順によって検出することができる。好適なアイソトープは、３Ｈ、ｌ４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択することができる。
【０１９９】
同様に、酵素標識も有用であり、任意の現在利用されている発色、分光光度、蛍光光度、電流測定または気体定量技術によって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子と反応することによって、選択された粒子に結合される。これらの手順において使用することができる多くの酵素は公知であり、利用することができる。ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが好適である。交互標識材料および方法の開示内容の例によって、米国特許第３，６５４，０９０号；同第３，８５０，７５２号；および同第４，０１６，０４３号が参照される。
【０２００】
本発明は、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚様幹細胞の増殖または分化決定を変調するのに有効な潜在的作用物質、化合物または薬物のスクリーニングのためのアッセイシステムを含む。これらのアッセイはまた、それから誘導される細胞または組織を含む本発明の多能性胚葉幹細胞に関して活性もしくは能力が既知または推定される因子によって、因子の遺伝子またはポリペプチド配列のクローン化に利用することができる
【０２０１】
アッセイシステムは、重要なことに、本発明の多能性胚様幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ変調することが可能な薬物もしくは他の実体を同定するために適応し得る。そのようなアッセイは、例えば、増殖または特定の系統もしくは細胞型にを決定するために多能性胚様幹細胞を変調するのに特異的であり得る作用物質、因子または薬物の開発に有用である。例えば、そのような薬物は細胞または組織の移植療法を可能にするのに使用することができる。
【０２０２】
従って、本発明は、分化決定因子である作用物質の存在または活性を検出する方法を考慮し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．本発明の多能性胚様幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程；および
Ｂ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程、
ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す。
【０２０３】
本発明はまた、作用物質、化合物または因子が分化決定されていない細胞の分化決定を変調する能力を試験する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
【０２０４】
さらにそのような態様では、本発明は、分化決定されていない細胞の分化決定を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
【０２０５】
本発明はまた、増幅因子である作用物質の存在または活性を検出する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．本発明の多能性胚様幹細胞と増幅因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程；および
Ｂ．形態学、ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程、
ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す。
【０２０６】
さらなる態様において、本発明は、作用物質、化合物または因子が分化決定されていない細胞の増殖を変調する能力を試験する方法を含み、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
【０２０７】
本発明はさらに、分化決定されていない細胞の増殖を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングするためのアッセイシステムに関し、該方法は以下の工程を含む。
Ａ．分化決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程；
Ｂ．試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程；および
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
【０２０８】
本発明のさらなる実施態様では、多能性胚様幹細胞あるいは増殖因子または分化決定因子を単離するかもしくはその有無を決定するための医学専門家による使用に適切な市販の試験キットを調製することができる上記の試験技術に従って、そのようなキットの１つのクラスは、少なくとも標識された幹細胞またはその結合パートナー、例えば、該幹細胞に特異的な抗体、および指示書（該指示書はもちろん、選択された方法、例えば、「競合」、「サンドイッチ」、「ＤＡＳＰ」などに依存する）を含有する。キットはまた、緩衝液、安定剤などの周辺試薬を含有することもできる。
【０２０９】
従って、多能性胚様幹細胞の単離または該細胞の存在の実証のための試験キットを調製することができ、該試験キットは以下のものを含む。
（ａ）多能性胚様肝細胞もしくは該細胞への特異的結合パートナーの検出可能な標識への直接的または間接的付着によって得られる予め決定された量の少なくとも１つの標識された免疫組織学的反応成分；
（ｂ）他の試薬；および
（ｃ）前記キットの使用のための指示書。
【０２１０】
より具体的には、試験キットは以下のものを含んでもよい。
（ａ）一般に固相に結合して免疫吸着剤を形成するか、あるいはその代わりに安定なタグ、または複数のそのような終産物など（もしくはそれらの結合パートナー）にそれぞれに１つ結合する上記のような既知の量の多能性胚様肝細胞；
（ｂ）必要であれば、他の試薬；および
（ｃ）前記試験キットの使用のための指示書。
【０２１１】
さらなる改変において、試験キットは、上記の目的のために調製および使用することができ、該試験キットは予め決定されたプロトコール（例えば、「競合」、「サンドイッチ」、「二重抗体」など）に従って作動し、以下のものを含む。（ａ）多能性胚様肝細胞を検出可能な標識を結合することによって得られている標識された成分；
（ｂ）少なくとも１つの試薬がリガンドである１つ以上のさらなる免疫科学的試薬であって、該リガンドは以下のものからなる群より選択される；
（ｉ）標識された成分に結合可能なリガンド；
（ｉｉ）標識された成分の結合パートナーに結合可能なリガンド；
（ｉｉｉ）決定しようとする少なくとも１つの成分に結合可能なリガンド；および
（ｉｖ）決定しようとする少なくとも１つの成分の少なくとも１つの結合パートナーに結合可能なリガンド；ならびに
（ｃ）多能性胚葉幹細胞と該細胞に対する特異的結合パートナーとの間の免疫組織反応の１つ以上の成分の検出および／または決定のためのプロトコールの実施のための指示書。
【０２１２】
本発明は、本発明の例示として提供される以下の非制限的実施例を参考にすることによってさらに理解され得る。以下の実施例は、本発明の好適な実施態様をより十分に例示するために提示されるものであって、決して本発明の広範な範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０２１３】
【予備的考慮】
提唱された研究は、組織構造および組織機能、例えば、幹細胞、生体活性因子、および生体マトリックスの回復に必要な３部システムならびに組織再生および移植療法のための使用の特定の同定を確かめるように指令された長期間の調査努力の一部である。これらの努力の目的は、ヒト多能性幹細胞を単離し、特定の分化決定に特異的な分子機構を同定することである。この目的は、細胞表面マーカーに対する抗体を使用し、次いで、抗体結合に基づく単離プロトコールを考案することでこれらの細胞を特徴付けることによって達成されるであろう。
【０２１４】
本発明者らは、先の研究で次のことを示した：（ａ）多能性間葉幹細胞のクローン集団は、中胚葉器官の様々な器官および組織から誘導することができる；（ｂ）多能性間葉幹細胞は、分化能の消失を伴わない実質的に無制限の倍加能を有する；および（ｃ）特定の生体活性因子は、細胞速度論、増殖および分化決定、ならびに多能性間葉幹細胞の様々な中胚葉系統、即ち、筋肉、軟骨、骨、脂肪および繊維結合組織への決定を調節することができる。
【０２１５】
【実施例１】
系統発生的分布
現在までに、少なくとも５つの種が試験され、間葉幹細胞の系統発生的分布が決定されている（表７）。試験されたすべての種、例えば、胎児期トリ（Ｙｏｕｎｇら、１９９１、１９９２ａ，ｂ、１９９３、１９９５、１９９８ａ；Ｂｏｗｅｒｍａｎら、１９９１）、胎児期マウス（Ｋｌａｕｓｍｅｙｅｒら、１９９４；Ｒｏｇｅｒｓ  Ｖａｌ、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）、胎児期および生後ラット（Ｌｕｃａｓら、１９９４、１９９５；Ｄａｖｉｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６）、生後ウサギ（Ｐａｔｅら、１９９３）、ならびに胎児期および生後ヒト（Ｙｏｕｎｇら、１９９９）は、間葉幹細胞の常在性集団を有する。これらの幹細胞は、デキサメタゾンおよび／またはインスリンの存在下でインキュベートする場合、多数の中胚葉表現型を形成する能力を有する。これまで、１６種の個別かつ容易に同定可能な細胞／組織表現型が得られている。これらは即ち、骨格筋、平滑筋、心筋、関節軟骨、成長平板軟骨、硝子軟骨、弾性軟骨、繊維軟骨、軟骨内骨化、膜性骨化、瘢痕組織、真皮、脂肪細胞、腱／靭帯、骨膜／軟骨膜、および内皮細胞である。
【０２１６】
ドナーの年齢
移植療法の始原および多能性幹細胞を回収する至適年齢を決定するための研究が行われている。これまで、種あたりに存在する（多能性）幹細胞の数、増殖能力、または分化能については、ドナーの年齢および性別（ヒトのみ）と比較すると差異が認められていない（表７）（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９５，１９９８（ａ），  １９９８（ｂ），１９９９、観察結果は公開されていない；Ｐａｔｅら、１９９３；Ｔｒｏｕｍら、１９９３；Ｌｕｃａｓら、１９９４，１９９５；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６；Ｃａｌｃｕｔｔら、１９９８）。試験した５つのすべての種（ニワトリ、マウス、ラット、ウサギおよびヒト）では、種あたりの多能性幹細胞数について年齢に関する差異は認められていない。増殖能または分化能に対する年齢の影響は認められていない。生後では、老年（ヒト）幹細胞において差異は認められていない。
【０２１７】
幹細胞の局在位置
５つの動物種由来のドナー部位の分析は、うっ血もしくは修復を経験し、結合組織画分を有する任意の組織または器官は、間葉幹細胞の常在性集団を有する。これまでにアッセイされた器官、組織およびそれらの関連結合組織画分は、胚全体、胎児全体、骨格筋、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織および骨髄（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９５；Ｐａｔｅら、１９９３；Ｔｒｏｕｍら、１９９３；Ｌｕｃａｓら、１９９４，１９９５；Ｄａｖｉｓら、１９９５；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６；Ｃａｌｃｕｔｔら、１９９８；観察結果は公開されていない）を含む。
【０２１８】
特定の組織型の関連結合組織が繊維細胞の必要な補体、組織特異的分化決定された始原幹細胞、および多能性幹細胞を有する一方、該組織は他の組織系統の始原幹細胞も含有することは興味深い（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９５、観察結果は公開されていない）。例えば、（硝子）軟骨周囲の軟骨膜は、幹細胞組成物に基づく３つの区域に区別されることが明らかにされた。内部１／３（または骨形成層）は、主に軟骨形成始原細胞および少数の多能性細胞を含有し；中間  １／３は主に多能性細胞、しかし少数の軟骨形成始原細胞および少数の非軟骨形成始原細胞を含有し；外部１／３は主に非軟骨形成始原細胞（例えば、筋原性、脂肪生成、繊維形成、および骨形成始原細胞）、繊維細胞、および少数の多能性細胞を含有した。本発明者らは、骨格筋結合組織（例えば、筋内膜、筋周膜、筋外膜）、骨膜、心内膜、ならびに心外膜における多能性細胞、組織特異的始原細胞、および非組織特異的始原細胞について、局所幹細胞分布の同様の型を見出した。
【０２１９】
クローン化可能分析
間葉幹細胞の同定された集団内の細胞の組成を決定するために、連続限界希釈によるクローン化可能分析を行った。トリ（Ｙｏｕｎｇら、１９９３）およびマウス（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）由来の間葉幹細胞のクローン化可能分析は、一貫して幹細胞の２つのカテゴリー、例えば、分化決定された始原幹細胞および分化未決定の多能性幹細胞を明らかにしている。５つの組織系統が、胎児期および生後多能性幹細胞クローン（例えば、筋原性、軟骨形成、脂肪生成、繊維形成および骨形成）において、全般および系統特異的誘導剤により誘導され、その後、分化された表現型が発現されている（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９８８；Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ｂ、本研究；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）。
【０２２０】
幹細胞の特徴
幹細胞、始原細胞および多能性細胞の各カテゴリーは、共通の特徴と自己特有の特徴とを有している。始原および多能性間葉幹細胞の両方は、付着のためのＩ型コラーゲン下層を選好し、凍結保存法および１０％血清および７．５％ＤＭＳＯを含有する培地（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）での−７０〜−８０℃での保存を選好する。
【０２２１】
始原幹細胞（即ち、前駆幹細胞、即時型幹細胞、および形成（−芽）細胞）は分化決定されている。それらは、培地中に存在する他の任意の系統に対する誘導剤に係わらず、それぞれの系統内の組織を形成するのみである（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）。それらは静止状態を保持することができるか、または増殖および／または分化するように活性化され得る。それらは密集時に接触阻止を示す。増殖のために活性化される場合、始原幹細胞は、老化前に５０〜７０倍加寿命を有する（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ｂ）。分化のために活性化される場合、発達因子は表現型発現を刺激する必要がある（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）。
【０２２２】
多能性細胞は分化決定されていない。即ち、それらは、任意の特定の中胚葉組織系統に決定されない。それらは静止状態を保持することができるか、または増殖および／または特定の組織系統に決定するように活性化され得る。それらは、それらの寿命の任意の時点で中胚葉株内の任意の組織系統について始原幹細胞を形成するように（全般または系統特異的誘導剤によって）誘導される能力を有する（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ａ，ｂ、本研究；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）。増殖のために活性化する場合、それらは、分化未決定を維持する限り広範な自己再生が可能である。例えば、胎児期多能性マウス幹細胞クローンは、６９０細胞倍加を経験した後、多能性を保持した（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）。一旦、多能性細胞が、特定の系統を決定するように誘導されると、それらは、系統特異的始原細胞の特徴、即ち、老化前の制限された（約５０〜７０）倍加寿命、密集時での接触阻止、および表現型発現を刺激するための発達因子の援助を有するとみなされる。例えば、６９０＋細胞倍加した胎児期多能性マウス幹細胞クローン（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）は、骨格筋、脂肪、軟骨、および骨の表現型発現マーカーを示す形態学を形成する系統特異的始原細胞を形成するように誘導された。
【０２２３】
発現されたｍＲＮＡのノーザン分析
本発明者らは、これまでに、多能性細胞におけるＭＭＰ誘導性筋形成を試験するための研究においてノーザンブロット分析を使用している。ＭＭＰは、胎児期マウス多能性幹細胞（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）においてミオゲニンおよびＭｙｏＤ１遺伝子発現のｍＲＮＡの転写を誘導した。
【０２２４】
要約すると、始原および多能性間葉幹細胞は、胎児期および生後動物の両方に存在する。間葉幹細胞は、結合組織成分を有する任意の組織または器官において認めることができる。任意の年齢または性由来の間葉幹細胞において差異は認められない。間葉幹細胞は、分化決定始原幹細胞および分化未決定多能性幹細胞の両方から成る。多能性間葉幹細胞は、多能性を消失することなく、広範に増殖し得る。一旦、特定の組織系統に決定されると、これらの幹細胞はより原始的な分化状態には戻らない。始原幹細胞は、プログラムされた細胞老化前に有限の５０〜７０倍加寿命を有する。特定の生体活性因子（内因性または外来から供給される）は、増殖、分化決定、および系統発達を遺伝子的に調節することができる。
【０２２５】
これらの研究から、本発明者らは、特に、大量の細胞が必要で、供給される移植組織が不足している場合に、中胚葉組織移植、再生、および遺伝子療法のために自家移植多能性間葉幹細胞をＨＬＡ一致ドナー組織として使用することができることを提唱する。
【０２２６】
【表７】
2004504003.tif 000007
【０２２７】
【材料および方法】
細胞の回収および培養
ラットの細胞について、ＣＯ２吸入を使用して、１日齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット児を屠殺した。ラットを２分間、７０％エタノールに浸漬し、滅菌フードに入れ、皮を剥ぎ、大殿筋、中殿筋、大腿二頭筋、半膜様筋、半腱様筋、縫工筋、大腿四頭筋、ヒラメ筋、および腓腹筋の新鮮筋腹を取り出した。注意深く腱、大きな血管、および神経を除去した。関連する筋内膜、筋周膜、および筋外膜結合組織画分を含む筋組織を１０  ｍｌの完全培地中に置き、注意深く細かく切り刻んだ。完全培地は、１０％の予め選択されたウマ血清（ｌｏｔ  ＃’ｓ  １７Ｆ−０２１８  ｏｒ  ４９Ｆ−００８２，  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、１％抗生物質溶液（１０，０００単位／ｍｌペニシリンおよび１０，０００  ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、ＧＩＢＣＯ）を補充したＥａｒｌｅ塩を有する８９％（ｖ／ｖ）Ｅａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ｐＨ  ７．４  （２２）（ＧＩＢＣＯ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）から成った。細かく切り刻んだ後、組織懸濁液を５０×ｇで２０分間、遠心分離した。．  上清を捨て、細胞ペレットの容積を見積もった。細胞ペレットを７容積のＥＭＥＭ、ｐＨ  ７．４および２容積のコラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液に再懸濁し、酵素反応により細胞を遊離させた（Ｌｕｃａｓら、１９９５）。コラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液は、１００  ｍｌディスパーゼ溶液（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）に添加された５０  ｍｌのＥＭＥＭ中３７，５００単位のコラゲナーゼ（ＣＬＳ−Ｉ，  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，  ＮＪ）から成った。最終濃度は２５０単位／ｍｌコラゲナーゼおよび３３．３単位／ｍｌディスパーゼであった（Ｙｏｕｎｇら、１９９５）。得られた懸濁液を３７℃で１時間撹拌し、細胞を分散させて３００×ｇで２０分間、遠心分離した。上清を捨て、組織ペレットを２０  ｍｌのＭＳＣ−１培地に再懸濁した。細胞を９０  ｍｍおよび２０  ｍｍ  Ｎｉｔｅｘフィルター（Ｔｅｔｃｏ  Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，  Ｎ．  Ｙ）で篩い分けし、単一の細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を１５０×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを１０  ｍｌの完全培地に再懸濁した。Ｔｒｙｐａｎブルー排除（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）により細胞生存度を決定した。１％ゼラチン化（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，  ＮＪ）１００  ｍｍ培養皿（Ｆａｌｃｏｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）あたり１０５細胞で細胞を播種した。細胞培養物を９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境、３７℃で密集状態まで増殖させた。密集時に、細胞をトリプシンで遊離させ、凍結保存した。細胞を、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）を含有する完全培地中で、−８０℃の温度が達成されるまで緩徐に凍結（１分間あたり１℃の温度低下）した（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。種によって起源材料は異なるものの、ヒト、ウサギ、トリおよびマウスの単離についても同様の手順を使用した。
【０２２８】
クローン化可能分析
凍結した細胞のアリコートを融解し、完全培地に再懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを完全培地中に再懸濁した。細胞の生存度をＴｒｙｐａｎブルー排除によって決定した。次いで、細胞を、ゼラチン化１００  ｍｍ皿あたり１０５細胞で播種し、密集状態まで増殖させた。細胞をトリプシンで遊離させ、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ  ；  Ｍｏｒｔｏｎ  Ｔｈｉｏｋｏｌ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）を含有する完全倍地中で−８０℃まで凍結保存した。
【０２２９】
前馴化培地
胎児期ニワトリ（Ｙｏｕｎｇら、１９９３）および胎児期マウス（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）による先のクローン化研究は、個々の細胞が、同じ親株の高度増殖細胞による「前馴化された」培地中で増殖した場合、より高いクローン化効率が達成されることを示した。従って、幹細胞が密集状態（対数増殖期）で回収されるごとに、培養培地をプールし、０．２  ｍｍフィルターで２回ろ過し、アリコートに分けて、４℃で保存した。本研究のクローン化部分の間は、得られた「前馴化培地」を使用した。
【０２３０】
５０細胞倍加後の増殖
胎児期マウス（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇ  ら、、１９９８ｂ）における先の研究は、クローン化前に、細胞を５０細胞倍加後に増殖させる場合、より高いクローン化効率が達成されることを示した。そのような幹細胞をインスリンと共にインキュベートすると、１％未満の細胞が、様々な間葉系統の分化された細胞の表現型マーカーを示した。これらの観察は、クローン化前に５０を超える細胞倍加で細胞を増殖させることによって、大部分の細胞は集団から取り出されることを示唆した。おそらく、５０細胞倍加（Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界）後の細胞の増殖により、分化決定された細胞をプログラムされた細胞老化および死を経験した（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，１９６３，１９６５；  Ｙｏｕｎｇ，１９９９ａ）。
【０２３１】
凍結保存された細胞を融解し、密集度まで培養し、対数増殖期の前馴化培地を回収し、トリプシンで細胞を遊離し、それらを凍結保存に供する標準プロトコールは、幹細胞集団が最低でも５０細胞倍加を経験するまで反復した。本研究では、４０〜５０細胞倍加のアポトーシスを経験するために（高い細胞質対核比を有する）より大きなサイズの細胞を観察した。５０細胞倍加後に保持する細胞の大部分は同様のサイズであり、細胞質対核比が小さい。５０倍加を超えて増殖させた細胞のアリコートをクローン化のために凍結保存した。
【０２３２】
クローン化
５０倍加を超えて増殖させた細胞の凍結アリコートを融解し、密集状態まで増殖させ、トリプシンで遊離させ、遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、細胞の生存度を決定した。細胞を、クローン化培地でクローン密度（５ｍｌあたり１ｍｌ）にまで希釈した（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ｂ；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）。等容量の完全培地と前馴化培地とを混合することによってクローン化培地を調製した。５ミリリットルの細胞懸濁液を、ゼラチン化した９６ウェルの平板（Ｃｕｒｔａｉｎ−Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ）の各ウェルの中心に置き、３７℃でインキュベートした。６時間後、２００  ｍｌのクローン化培地を各ウェルに添加した。最初の播種の１８時間後、ウェルあたりの細胞数を決定した。単一の細胞を有するウェルのみをさらに増殖させた。培地を他のすべてのウェルから取り出した。これらのウェルを７０％（ｖ／ｖ）エタノールと共に５分間インキュベートし、室内の空気中で乾燥させた。０．０３％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する２００  ｍｌの滅菌Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ，  ＧＩＢＣＯ），  ｐＨ  ７．４を添加して、混入菌の増殖を阻止した（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）。
【０２３３】
これらのウェルでさらに増殖させるために、１０個以上の細胞がウェル内に出現した後に最初のクローン化培地を新鮮クローン化培地と置き換えた。その後のクローン化培地の置き換えは、培養物の密集度の百分率に依存し、給餌間を最大５日間経過させた。培養物を密集状態後も増殖させた。各培養物をトリプシンで遊離させ、ゼラチン化した６ウェルの平板（Ｆａｌｃｏｎ）のウェル内に置き、１日おきに完全培地を与え、密集状態後も増殖させた。培養物をトリプシンで遊離し、最低２４時間で凍結保存した。クローン化培地の９６ウェルの平板においてクローン密度での播種、密集状態を介する増殖、トリプシン遊離、完全培地における６ウェル中の密集度を介する増殖、培養物の選択、トリプシン遊離、および凍結保存の過程を、各単離されたクローンを単一の細胞から誘導することを確実にするために、最初のクローン化後３回反復した。得られたクローンを増幅させ、トリプシンで遊離し、アリコートに分け、凍結保存した（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ｂ；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）。
【０２３４】
表現型発現のためのインスリン−デキサメタゾン分析
インスリンおよびデキサメタゾンを使用して、クローンを検査し、それらの同一性、即ち、分化決定された始原細胞かまたは分化未決定の多能性細胞であるかを決定した。インスリンなどの発達因子は始原細胞において表現型発現を加速するが、多能性幹細胞の表現型発現の誘導に対しては効果を示さない。対照的に、デキサメタゾンなどの系統誘導剤は、多能性細胞において分化決定および発現を誘導するが、始原細胞における表現型発現を変更しない。従って、始原細胞のみが培養物中に存在する場合、インスリン中でインキュベートされた培養物について発現された表現型の質または量は、デキサメタゾンと共にインキュベートした培養物と比較して差異は認められない。始原細胞および多能性細胞の療法を含有する培養物を混合する場合、デキサメタゾンで処理した培養物において発現された表現型の質および／または量は、インスリンで処理した培養物と比較してより大きい。培養物が多能性細胞のみを含有する場合、インスリンで処理した培養物において表現型の発現は認められない。デキサメタゾンで処理した同様の培養物は、多数の発現された表現型を示す。このように、デキサメタゾンおよびインスリンによる処理の効果を比較することにより、不明な細胞群内の始原および多能性細胞の特定の型を同定することができる（Ｙｏｕｎｇら、１９９２，１９９３，１９９５，１９９８ａ，ｂ，１９９９ａ−ｃ；Ｌｕｃａｓら、１９９３，１９９５；Ｐａｔｅら、１９９３；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６）。
【０２３５】
凍結保存されたクローンを融解し、完全培地においてゼラチン化２４ウェルの平板のウェルあたり５、１０、もしくは２０×１０３細胞かまたは標準的なプロトコールに従って９６ウェルの平板のウェルあたり０．５もしくは１．０×１０３細胞で平板固定した。最初の平板固定の２４時間後、培地を試験培地（ＴＭ）１〜４（ＴＭ−１、ＴＭ−２、ＴＭ−３、ＴＭ−４）または５（ＴＭ−５）に変更した。ＴＭ−１〜ＴＭ−４は、Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ  （カタログ番号１２−７２５Ｂ，ｌｏｔ．  ｎｏｓ．  ＯＭ０４５５  ［ＴＭ−１］，  １Ｍ１７２４  ［ＴＭ−２］，  ２Ｍ０４２０  ［ＴＭ−３］、または２Ｍ０２７４  ［ＴＭ−４］，  Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、ＥＭＥＭ１、ならびに１％（ｖ／ｖ）抗生物質溶液（１０，０００単位／ｍｌのペニシリン、および１０，０００  ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ＧＩＢＣＯ）、ｐＨ  ７．４から成った。ＴＭ−５は、９８％（ｖ／ｖ）  ＥＭＥＭ、１％、３％、５％または１０％（ｖ／ｖ）  ＨＳ  （ＨＳ４、ＨＳ７、またはＨＳ９）、および１％（ｖ／ｖ）抗生物質溶液、ｐＨ  ７．４から成った。トリ始原細胞および多能性細胞の両方を「定常状態」の条件で培養物中において最低３０日間およ培養物中において１２０もの長期間維持するＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ：ＥＭＥＭ：抗生物質の比を含有する試験培地。それぞれ様々な濃度のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅを含有する４つの試験培地（ＴＭ＃’ｓ  １−４）を、実験手順に記載の通りに使用した。それぞれの試験培地中に存在するＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ対ＥＭＥＭ対抗生物質の比を、トリ始原細胞および多能性細胞の両方におけるの定常状態の培養条件を維持する能力に基づいて、それぞれのロットのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅについて経験的に決定した。４つのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅに基づく試験培地は：ＴＭ＃  １  ＝  １５％  （ｖ／ｖ）  Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ  （ロット番号ＯＭ０４５５）  ：  ８４％  （ｖ／ｖ）  ＥＭＥＭ：  １％  （ｖ／ｖ）抗生物質；ＴＭ＃  ２  ＝  １５％  （ｖ／ｖ）  Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ  （ロット番号１Ｍ１７２４）  ：  ８４％  （ｖ／ｖ）  ＥＭＥＭ  ：  １％  （ｖ／ｖ）抗生物質；ＴＭ＃  ３  ＝  ５０％  （ｖ／ｖ）  Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ  （ロット番号２Ｍ０４２０）  ：  ４９％  （ｖ／ｖ）  ＥＭＥＭ：  １％  （ｖ／ｖ抗生物質；およびＴＭ＃  ４  ＝  ７５％  （ｖ／ｖ）  Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ  （ロット番号２Ｍ０２７４）  ：  ２４％  （ｖ／ｖ）  ＥＭＥＭ：  １％  （ｖ／ｖ）抗生物質である。
【０２３６】
試験培地のみで２４時間プレインキュベーションしたものを使用して、完全倍地中の任意の潜在的な相乗的成分を洗浄した。２４時間後の試験培地は、以下のうちの１つに変化した。対照については、試験倍のみを使用した。始原細胞のクローンを同定するために、培地を、２μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ）、始原細胞において表現型発現マーカーの出現を加速する薬剤を含有する試験培地（ＴＭ−１〜ＴＭ−５）に置き換えた（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）．。始原細胞のクローンを同定するために、培地を、１０−１０〜１０−６Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、全般的非特異的系統誘導剤を含有する試験培地（ＴＭ−１〜ＴＭ−５）に置き換えた（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ａ）．。対照および処理した培養物を、１日おきに培地を交換しながらさらに３０〜４５日間増殖させた。１つの濃度ごと、１回の実験ごとに４つの培養物を使用した。０〜４５日間の期間に、培養物を（主観的に）１日単位で調査した。表現型発現の変化（以下を参照されたい）は、処理時間に相関し、インシュリンまたはデキサメタゾン濃度に関連した。次いで、３つのパラメータを利用して実験を繰り返し、確立された免疫化学的および組織化学的手順（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ，ｂ，１９９３，１９９５，１９９８ａ，ｂ，１９９９）を使用して、表現型発現マーカーを（客観的に）確認した。Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ倒立位相差／光度領域顕微鏡を使用して、細胞を写真撮影した。
【０２３７】
推定骨格筋細胞内の筋節ミオシンの存在を確認するためのミオシン酵素連結免疫培養物アッセイ（ミオシン−ＥＬＩＣＡ）を使用して、多核系統および自発的に収縮する分岐構造を示す培養物をさらに評価した（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ，  ｂ，  １９９９）。推定脂肪細胞内の中性脂肪の存在を確認するためのＳｕｄａｎブラックＢ（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｃ．）染色を使用して、多数の屈折性小胞を示す培養物をさらに評価した（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９５；Ｙｏｕｎｇ、１９９９ａ）。推定軟骨細胞周辺の細胞周辺および／または細胞外マトリックスに局在するコンドロイチン硫酸／ケラタン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するためのコンドロイチナーゼ−ＡＣ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）／ケラタナーゼ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）消化にｐＨ  １．０で結合したＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ  （Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌａｕ  ８ＧＳ，  Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用して、細胞周辺マトリックスハローを含有する丸型細胞の凝集を示す培養物をさらに評価した（Ｙｏｕｎｇら、１９８９ａ，  １９９３，１９９５；Ｙｏｕｎｇ，  １９９９）。推定鉱化骨スピクラ内のリン酸カルシウムの存在を確認するためのＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−  ［ｂ−アミノエチルエーテル］  Ｎ，  Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ’−テトラ酢酸、Ｓｉｇｍａ）前処理に結合したｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ  （Ｓｉｌｂｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）染色を使用して、３次元マトリックス内に埋め込まれたおよび／または重層した細胞を示す培養物をさらに評価した（Ｙｏｕｎｇら、１９８９ａ，  １９９３，１９９５）。推定繊維芽細胞周囲の細胞外コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するためのコンドロイチナーゼ−ＡＢＣ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）消化に結合したＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ｐＨ  １．０染色を使用して、顆粒状または繊維状のいずれかの細胞外マトリックス内に埋め込まれた細胞の密集層を示す培養物をさらに評価した（Ｙｏｕｎｇら、１９８９ａ，  １９９３，１９９５；Ｙｏｕｎｇ、１９９９）。
【０２３８】
【実施例２】
生体ラット骨髄由来の多能性間葉幹細胞の集団の単離
骨髄支質は、骨芽細胞および軟骨細胞に分化し得る細胞を含有することが知られている。骨髄支質はまた、他の表現型を形成し得る多能性細胞を含有することが仮定されている。本発明者らは、多くの間葉表現型に分化可能である細胞（本発明者らはこれを間葉幹細胞（ＭＳＣ）と呼んでいる）がラット骨格筋細胞から単離することができることを明らかにした。本発明者らは、こららの同じ技術を応用して、ＭＳＣが生体ラット骨髄の支質組織に存在するかどうかを決定した。７週齢雄性ラット由来の骨髄を回収し、付着細胞を、ＥＭＥＭ＋１０％プレ選択されたウマ血清中で密集状態まで培養し、次いで、トリプシン処理、ろ過し、７．５％ＤＭＳＯ中で−８０℃まで緩徐に凍結した。細胞を融解し、上記の培地中で平板固定し、１０−１０〜１０−６Ｍの範囲の濃度のデキサメタゾンで５週間まで処理した。観察された表現型は骨格筋管（抗ミオシン）、平滑筋（抗平滑筋αアクチン）、骨（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色）、軟骨（Ａｌｃｅｃブルー、ｐＨ  １．０）および脂肪（ＳｕｄａｎブラックＢ）を含んだ。骨髄は骨始原細胞以外の幹細胞を含有する。
【０２３９】
Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎは骨髄支質中に骨形成幹細胞を発見した（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，  １９７６）最初の人物である。多くの研究室による以後の研究により、骨髄中の決定された骨形成前駆細胞の存在（Ｕｒｉｓｔ，  １９８９；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，  １９８９；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら、１９９４；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９８；Ｂａｂら、１９８４）および正常位欠損の修復におけるそれらの使用（Ｏｈｇｕｓｈｉら、１９８９；Ｐａｌｅｙら、１９８６；Ｇｒｕｎｄｅｌら、１９９１）が確認された。しかし、後にＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎは、骨髄支質における２つの集団の骨形成幹細胞について記載した（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，  １９９５）。１つの集団については、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎが決定型骨形成前駆細胞（ＤＯＰＣ）と呼んでおり、第２に集団は誘導型骨形成前駆細胞（ＩＯＰＣ）である。ＤＯＰＣは骨芽細胞になることが決定されているが、ＩＯＰＣはそのようには決定されておらず、骨芽細胞に分化するためのいくつかの外因性シグナルによって誘導されなければならない。骨形成シグナルを供給するための鉱物質除去された骨マトリックスを使用する実験は、骨髄中のＩＯＰＣの存在を支持した（Ｂｌｅｉｂｅｒｇ，  １９８５；  Ｂｕｒｗｅｌｌ，  １９８５；  Ｌｉｎｄｈｏｌｄら、１９８２；  Ｌｉｎｄｈｏｌｍ，  １９８０；  Ｇｒｅｅｎら、１９８６；  Ｐａｌｅｙら、１９８６；  Ｇｒｕｎｄｅｌら、１９９１；  ｓｔｒａｔｅｓら、１９８９；  Ｋａｔａｏｋａら、１９９３；  Ｔｈｅｉｓら、１９９２）。
【０２４０】
Ｏｗｅｎらによる骨髄支質細胞の以後のクローン化実験（Ａｓｈｔｏｎら、１９８４；  Ｏｗｅｎら、１９８７；  Ｖｉｔａｍｉｔｊａｎａら、１９９３；  Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、１９９４）により、骨髄支質中に繊維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞に分化可能な細胞が存在することが発見された。次いで、Ｏｗｅｎは、骨髄が多能性間葉幹細胞を含有することを提供した（Ｌｏｃｋｌｉｎら、１９９５；Ｏｗｅｎら、１９８８；Ｏｗｅｎ，  １９８８）。
【０２４１】
本発明者らは、ニワトリ胚骨格筋（Ｙｏｕｎｇら、１９９１；  Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ）、新生ラット骨格筋（Ｌｕｃａｓら、１９９５）、新生ラット心臓および培養物中でいくらかの中胚葉表現型に分化し得る生体ウサギ骨格筋から細胞の集団を単離している：骨格筋、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞。本発明者らは、これらの細胞を多能性間葉幹細胞と呼んでいる。本研究は、類似の集団の細胞が生体ラット骨髄に存在するかどうかを決定するために行った。
【０２４２】
【材料および方法】
細胞培養
骨髄全体から細胞を単離するために使用した手順は、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎが最初に記載した手順（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，  １９７６）と本質的に同一である。６〜８週齢のラットから長い骨を取り出し、末端を切断し、Ｅａｒｌｅ塩を有する１０％予め選択されたウマ血清および１％抗生物質（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ，  ＧＩＢＣＯ）を補充されたＥａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ）  （ＧＩＢＣＯ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）を１８ゲージ針を介してフラッシュした。骨髄細胞は、連続的に小さな針（最終的に２２ゲージ針）に通して粉砕を反復することによって解離した。解離した細胞を２０μＭＮｉｔｅｘフィルターを介してろ過し、単一細胞の調製物を得た。血球計で細胞数を決定し、造血および支質細胞を含む細胞を、１００  ｍｍ培養皿あたり１０７細胞で平板固定した。皿は、予め１％ウシゼラチンで被覆しておいた（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌｓ  ＮＪ）。
【０２４３】
培養２４時間後、非付着細胞を取り出し、培地を上記の培養培地に取り換えた。ここから先の手順は先に記載の単離およびアッセイと同一である。簡単に説明すると、付着骨髄細胞を密集状態まで培養した。培養物注の細胞を、０．０１％エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）中０．０２５％トリプシンで皿から遊離させ、２０μｍフィルターでろ過した。次いでこれらの細胞を、ＥＭＥＭ＋１０％ウシ血清および７．５％ＤＭＳＯ  （Ｓｉｇｍａ）中に１０細胞を含有する１ｍｌのアリコートで凍結した。凍結チャンバ内（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）で凍結保存を実施し、緩徐に−８０℃まで細胞を凍結した。
【０２４４】
２４時間の凍結後、凍結した細胞のアリコートを融解し、ＥＭＥＭ＋１０％ウシ血清および抗生物質における２４ウェルゼラチン被覆平板培養（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）中の１６  ｍｍウェルあたり２０，０００細胞の密度で平板固定した。これらの細胞を２次培養物とした。いくつかのウェルには同じ培地を維持して対照群のために取っておき、実験用ウェルは、培養開始１日目から１０−１０〜１０−６Ｍの範囲の濃度のデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）で補充した培地で処理した。培養中は１週間の間隔で培養物を固定化し、以下に記載のようにして表現型についてアッセイした。
【０２４５】
表現型のアッセイ
１．鉱化組織。本質的にＨｕｍａｓｏｎ（Ｈｕｍａｓｏｎ，  １９７２）に記載の通り、リン酸カルシウムのＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをＤＰＢＳで２回濯いだ。細胞を０．５  ｍｌの１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）で３〜５分間固定化し、次いで、蒸留水で４回濯いだ。次いで、０．５  ｍｌの新たに調製した２％硝酸銀（Ｓｉｇｍａ）溶液を添加し、細胞を暗所で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を５回濯いだ。約０．５  ｍｌの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい光に１５分間暴露した（光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた）。プレートを再度５回蒸留水で濯ぎ、次いで、１００％エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない緩衝液中に１％ｗ／ｖ  ［エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）  （Ｓｉｇｍａ）（カルシウム特異的キレーター）を有する選択された培養物を１時間前処理することによって実施した。
【０２４６】
２．  軟骨。培養物をＡｌｃｉａｎブルー（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、ｐＨ  １．０で染色した。固定化されたウェルを０．５  ｍｌ  Ａｌｃｉａｎｂｌｕｅ、ｐＨ  １．  ０で３０分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で７回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。
【０２４７】
３．  脂肪。以下の方法で、飽和中性脂肪のＳｕｄａｎブラックＢ（Ａｓｂｅｙ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ）染色を（Ｈｕｍａｓｏｎ，  １９７２）実施した。培養ウェルからすべての培地をアスピレーと吸引し、それぞれのウェルを１ｍｌのＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、０．５  ｍｌの７０％ＥＴＯＨを添加して細胞膜を破壊した。１分間後、アルコールをアスピレーと吸引し、ウェルをＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を１００％プロピレン中で５分間、２回インキュベートした。次に、細胞を、１ウェルあたり０．５  ｍｌのＳｕｄａｎブラックＢで１０分間、２回インキュベートした。各溶液が澄明になるまで以下の溶液を各０．５  ｍｌで繰り返し細胞を濯ぐことによって、染色を区別した。プロピレン：水９０：１０、８５：１５、および７０：３０。蒸留水を用いて細胞を２回、１分間洗浄し、次いで、グリセリンゼリーで永久保存化した。
【０２４８】
４．  筋肉。Ｙｏｕｎｇら（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ｂ）の手順を改変して使用し、骨格筋ミオシンに対するＭＦ−２０抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，  Ａｍｅｓ，  ＩＡ）で細胞を染色した。断りがない限り、各工程の前にＤＰＢＳで２回濯いだ。もう１度濯いだ後、０．５  ｍｌの冷エタノール（−２０℃）を５分間適用し、細胞を固定化した。この後、０．５  ｍｌのＤＰＢＳ中１％ｖ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ１００／０．０５％ｗ／ｖアジ化ナトリウムと共に５分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。２０％ヤギ血清の１次ブロッカーを３０分間、３７℃インキュベーター中で適用する。次いで、ＭＦ−２０の１：  ２００希釈の１次ＩｇＧ（０．４  ｍｌ／ウェル）を１時間インキュベートする。０．５  ｍｌの２０％ヤギ血清の２次ブロッカーを３０分間適用し、続いて、１：  ７５００  希釈のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｅｉｎｃｏ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を０．４  ｍｌ加え、また３７℃で３０分間インキュベートした。２０％ヤギ血清から成る３次ブロッカーを３０分間適用し、取り出し、次いで、１：  ３７５０  希釈のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｌｅｉｎｃｏ）を０．４  ｍｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。この時点で細胞を濯ぎ、０．５  ｍｌのＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を添加して、周囲温度、暗所で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、２００μｌのＡＢＴＳ溶液を細胞から取り出し、１０μｌの０．０３％アジ化ナトリウムを含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ）のウェルで平板固定した。４０５  ｎｍフィルターを使用するＴｉｔｅｒ  Ｔｅｋ分光光度計プレートリーダー上で該ＥＬＩＳＡプレートを読み取った。
【０２４９】
ＡＢＴＳ溶液のアリコートを取り出した後、０．５  ｍｌのＤＰＢＳで２回細胞を濯ぎ、次いで０．５  ｍｌの蒸留水で２階濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにＣｈｒｏｍａｇｅｎ  （Ｓｉｇｍａ）を添加した。一旦発色したら、２５μｌの０．０５％アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。
【０２５０】
残りのウェルからＡＢＴＳを取り出し、先に記載のように、Ｊｏｈｎｓｏｎ−ＷｉｎｔおよびＨｏｌｌｉｓのｉｎ  ｓｉｔｕジアミノ安息香酸（ＤＡＢＡ）手順（Ｊｏｈｎｓｏｎ−ＷｉｎｔおよびＨｏｌｌｉｓ，  １９８２）を使用してＤＮＡ含有量を分析した。従って、同じウェル上で、ミオシン含有量およびＤＮＡ含有量に対する吸光度を得た。
【０２５１】
６．  平滑筋。Ｓｉｇｍａ社製キットを使用し、平滑筋ａ−アクチンに対する抗体による染色によって、平滑筋をアッセイした。
【０２５２】
７．  内皮細胞。Ｖｏｙｔａら（Ｖｏｙｔａら、１９８４）が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（高グルコース）（ＤＭＥＭ）  （ＧＩＢＣＯ）で細胞を５回洗浄した。細胞を、１ｍｌあたり１０μｇの１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸（ＤｉＩ−Ａｃｙｌ−ＬＤＬ）  （Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，  ＭＡ）と共に３７℃で４時間インキュベートした。次いで、ウェルをＥＭＥＭ＋１０％ウマ血清で６回洗浄し、蛍光付着を有するＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ上で観察した。
【０２５３】
【結果】
骨髄全体から単離された細胞のほとんどは、培養皿に付着しない造血細胞であった。培地を交換したときの培養１日目に、これらの細胞を取り出した。６日目までの培養物は、星形を伴うほとんどの付着細胞から成った（図１ＡおよびＢ）。小さな丸型で極めて収縮性の細胞が星状細胞胃付着し、この星状細胞がさらに培養皿に付着しているを思われる場合、しばしば細胞の凝集隗が認められる。しかし、培養物の最も際立った特徴は、細胞が直線状に配列することである。このラインの長さの測定値は６０  ｍｍを超え、１００  ｍｍ培養皿にほとんどまたがっている。コラーゲンは、ブラシで円形状に適用されたため、細胞が乾燥コラーゲンのラインの後を追っているとは考えにくい。直線ライン上にある細胞は、それらに付着する他の細胞を有すると思われた。初代骨髄細胞の培養物の培地では、浮遊細胞が連続的に供給されていることが認められた。これは、最初の付着後では浮遊細胞が認められなかった骨格筋および心臓由来の培養物とは対照的である。
【０２５４】
トリプシン遊離、ろ過、凍結、融解、および２次培養物への最植え込み後、細胞のラインはもはや認められなかった。平均で８０％の細胞が、凍結融解で生存したが、これは、骨格筋および心臓から単離された細胞から得られたデータ（Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｅｃｋａら、１９９６）と一致する。デキサメタゾンを添加しなかった２次培養物の細胞は、ほぼ均一な星形細胞である（図２Ａ）。これらの細胞は、２次培養物中で５週間後でも任意の表現型を示さず、すべての表現型アッセイで陰性であった。
【０２５５】
しかしながら、デキサメタゾンによる処理により、多くの表現型の発現が引き起こされる。骨格筋および心臓から単離された培養物では、時期に応じて様々なデキサメタゾン濃度で限られたオーダーの表現型の出現が認められる。培養時に自発的に収縮した多核細胞も、１０−９〜１０−６Ｍの範囲のデキサメタゾン濃度での培養で１〜２週間で出現した。多核細胞をミオシンに対する抗体で染色することにより、該多核細胞は筋管と同一であることが確認された（図２Ｂ）。デキサメタゾン処理の４週間までに、繊維を含有するほぼ平行四辺形型の細胞が認められた。これらの細胞は、１０−７および１０−６Ｍデキサメタゾンで最も多く認められた。繊維を平滑筋αアクチンに対する抗体で染色したところ、平滑筋細胞と同定された（図２Ｃ）。培養３週間後、１０−９〜１０−６Ｍデキサメタゾンで処理したウェルでは、収縮性細胞外マトリックスを有する、すべて類似のサイズの極めて丸型の細胞の小集合が出現した。Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色されたこれらの凝集物は、軟骨細胞と同定された（図３Ａ〜Ｃ）。いくつかの軟骨節は、位相差下で観察すると極めて暗い領域を示す。これらの暗領域をＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ’ｓで染色したところ、好物の存在が示された。これらの節は、石灰化軟骨を示し得る。
【０２５６】
約２週間から、１０−８〜１０−６Ｍデキサメタゾンで処理した培養物は、様々なサイズを有する大きな小胞を伴う細胞を含有し、これらの細胞は、位相差顕微鏡下で収縮型の外見が認められた。これらの細胞をＳｕｄａｎブラックＢで染色したところ、飽和型中性脂肪の存在が示され、従って該細胞は脂肪細胞と同定された（図４Ａ）。これらの細胞は、ミオシンまたは平滑筋αアクチンに対する抗体では染色されなかった。しかし、一般に骨髄培養物の脂肪細胞の数は、骨格筋から単離された培養物よりも少なかった。多角形細胞の細胞凝集物は、培養４週間後に出現した。それらは、１０−９〜１０−１０Ｍデキサメタゾンで処理されたウェルで最も一般的に認められたが、すべてのデキサメタゾン濃度では、少数しか出現しなかった。これらの細胞は、位相差顕微鏡下で相当な暗部を示した稠密な細胞外マトリックスを有し、マトリックスはＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で染色された（図４Ｂ）。染色はＥＧＴＡによる前処理で防止され得る（図４Ｃ）。これはすべて石灰化細胞外マトリックスを示した。従って、これらの細胞は、骨芽細胞と同定された。また、デキサメタゾンによる処理の４週間までに、１０−７および１０−６Ｍデキサメタゾン培養物で多角形であるが細胞外マトリックスが認められない細胞が出現した。これらの細胞は、細胞質小胞にＤｉＩ−Ａｃｙｌ−ＬＤＬを取り込み（図５ＡおよびＢ）、従って、内皮細胞と同定された。ＤｉＩ−Ａｃｙｌ−ＬＤＬとのインキュベーション期間を４時間に制限したところ、平滑筋細胞は、染色されなかった。最後に、らせん状に増殖し、Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で軽度に染色された滑面マトリックスを有する星形細胞の領域は、１０−１０〜１０−８Ｍデキサメタゾン処理で出現した。（データ示さず）形態学および染色パターンに基づいて、細胞は仮定的に繊維芽細胞と同定された。
【０２５７】
【考察】
本発明者らは、骨格筋および心臓から得られる細胞とほぼ同一の方法で、多くの表現型に分化することによってデキサメタゾン処理に応答する骨髄から細胞集団を単離することができた。しかし、初代培養物は、筋および心臓から得られる初代培養物とは同一ではなかった。これは、驚くべきことではない。何故なら、各組織は分化された細胞およびそれらの即時型前駆体の独特な補体を含有するからである。骨格筋由来の初代培養物は分化された多核筋管を含有すし、心臓由来の初代培養物は心筋細胞を含有する（Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｅｃｋａら、１９９６）。これらの表現型は両方とも初代骨髄培養物には存在しなかった（図１）。しかし、初代骨髄培養物は、長い直線ラインで細胞が並ぶ独特な特徴を有した。このことは以前に文献で報告されておらず、本発明者らは、これらの培養物の性状についてはあまり説明していない。しかし、それらは、いくらかの独立した調製物において再現性が認められた。プレートには予めコラーゲンが被覆してあるため、乾燥コラーゲンのラインに沿って細胞が配列した可能性もある。しかし、コラーゲンが、円運動で使用されるブラシで適用されたならば、この可能性は低いと思われる。コラーゲンアプリケーションの変化は、細胞の直線ラインの形成に影響を及ぼさない（データ示さず）。もう１つの可能性は、ラインが、培養物において造血環境を形成しようとする分化された支質細胞を示すことである。培養条件および予め選択されたウマ血清の使用は、この状況を引き起こし易い。本発明者らは既に、ほとんどのロットの血清が細胞に繊維芽細胞への分化を引き起こさせ、デキサメタゾン処理には感応しないことを明らかにしている（Ｌｕｃａｓら、１９９５）。おそらく、繊維芽細胞分化を防止することにより、より容易に観察するために分化された支質細胞をより明白にそれらの表現型を発現させることが可能である。培地において繰り返し生じる浮遊細胞の再生もまた骨格筋および心臓由来の初代培養物とは異なるが、分化した造血組織とは一致する。ライン内の細胞および浮遊細胞の性質についてはさらに検討する必要がある。
【０２５８】
初代培養物は骨格筋および心臓から得られる培養物とは異なるが、２次培養物は、他の組織から得られる培養物と同一であるようであり、デキサメタゾンに対して同一に挙動した。対照の２次培養物は、５週間の培養の間、何ら分化を示さない星状細胞から成るデキサメタゾンによる処理により、典型的な時間系列および典型的なデキサメタゾン濃度範囲において十分に分化した表現型が出現する。認識された最初１の十分に分化した表現型は、培養１〜２週間で出現する多核筋管であり、続いて、培養３週間で脂肪細胞、次いで４週間で軟骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞であった。異なる濃度のデキサメタゾンにより、異なる表現型の分化が生じた。平滑筋細胞および内皮細胞は１０−７および１０−６Ｍデキサメタゾンで最も多く、脂肪細胞はｌ０−８〜１０−６Ｍの範囲の濃度のデキサメタゾンで存在し、軟骨細胞および骨格筋管は１０−９〜１０−６Ｍデキサメタゾンで存在する一方、骨芽細胞はすべての濃度のデキサメタゾンで少量存在した。このことから、１つの培養物にいくらかの表現型が存在することが明らかであり、実際、１０−７Ｍデキサメタゾンで処理された培養物ではすべての表現型が認められるのが普通である。異なる表現型の出現時間および表現型を誘導するために使用されるデキサメタゾンの濃度は両方とも、ラット骨格筋および心臓から単離される２次培養物で得られる結果に対応する。
【０２５９】
しかし、骨髄細胞の２次培養物に対するデキサメタゾンの効果は先に報告したものとは異なる。ほとんどの場合、骨髄支質細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデキサメタゾン処理によって、骨芽細胞が分化する（Ｖｉｌａｍｉｔｊａｎａ−Ａｍｅｄｅｅら、１９９３；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら、１９９４；Ｋｌｅｉｎら、１９９４；Ｇｒｏｎｔｏｓら、１９９４；Ｏｗｅｎら、１９８７）が、いくつかの研究でも、脂肪細胞の分化が報告されている（Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら、１９９４；Ｋｌｅｉｎら、１９９４；Ｇｒｏｎｔｏｓら、１９９４；Ｏｗｅｎら、１９８７）。しかし、骨格金筋管、軟骨細胞、または内皮細胞の分化については何も報告されていない。分散チャンバにおける骨髄支質細胞のいくらかのｉｎ  ｖｉｖｏ研究で該チャンバにおける軟骨の出現が報告されている（Ｂａｂら、１９８４；Ｂａｂら、１９８８；Ｚｉｐｏｒｉ、１９８９）ことをみれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞の分化が認められないのは異例である。先の研究でも決定された先駆細胞の分化能が認められていたかもしれないが、実際には骨形成および脂肪生成に関する研究に当てはまる。しかし、培養条件が差異の原因であるかもしれない。第１に、ここで使用される単離手順は、初代培養で前駆細胞を分化させることによって、該前駆細胞を排除するように設計されている。次いで、好ましくは、分化した細胞は凍結融解中に死滅し（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）、これは、対照培養物において分化した表現型がまったく認められないことからも実証される。第２に、先の研究では例外なく培養培地にウシ胎児血清が使用されていたことである。本発明者らの経験では、ウシ退治血清は、２次培養物中で未決定細胞を繊維芽細胞に分化させ、デキサメタゾンに対する応答を排除してしまう（Ｌｕｃａｓら、１９９５）。デキサメタゾンの正確な機序については知られていないが、デキサメタゾンは細胞のすべての可能な経路の分化を刺激することは明らかである（Ｌｕｃａｓら、１９９５）。決定された前駆細胞の場合、これは、表現型の最終分化を生じるが、多能性細胞の場合、デキサメタゾンはそれぞれの可能な表現型の決定および分化を誘導する（Ｌｕｃａｓら、１９９５）。従って、先の研究では、決定された始原細胞（即ち、前骨芽細胞）を排除しようとせず、培養物中の三毛って衣細胞は血清によって繊維形成系統に決定されたため、骨芽細胞の分化が検出された
【０２６０】
【実施例３】
肉芽組織は、多数の中胚葉表現型に分化し得る細胞を含有する
以前に、本発明者らは、新生ラット骨格筋から、デキサメタゾンなどの非特異的分化作用物質で処理すると多くの間葉表現型に分化可能な細胞を単離した。本発明者らは、これらの細胞を間葉幹細胞と呼び、それらは肉芽組織に存在すると仮定している。この仮説を試験するために、肉芽組織から細胞を単離し、それらが多数の中胚葉表現型を形成する能力についてアッセイした。７週齢雄性ラットの皮下にステンレス製創傷チャンバをインプラントした。インプラント７または１４日後に該チャンバを取り出し、付着している組織を掻き取った。コラゲナーゼ／ディスパーゼによる消化で細胞を単離し、予め選択されたウマ血清を有する培地においてゼラチン被覆皿中で密集状態まで培養した。細胞をトリプシンで遊離させ、７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中−８０℃で凍結し、次いで、融解し、１０−６〜１０−１０Ｍデキサメタゾンを補充した同培地中で培養した。両時点での細胞は、培養中同様に挙動した。対照培養は星状形態を有する細胞を含有し、骨格筋から単離された細胞と外観は同様であった。しかし、デキサメタゾンによる処理では、以下のような表現型が観察された。培養時に自発的に収縮し、ミオシンに対する抗体で染色された長型多核細胞（骨格筋管）、細胞外マトリックスがＡｌｃｉａｎブルー、ｐＨ  １．０で染色された丸型細胞の小節（軟骨）、細胞外マトリックスが鉱物に対するＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で染色された丸型細胞（骨）、ＳｕｄａｎブラックＢで染色された大きな小胞を有する丸型細胞（脂肪細胞）、平滑筋αアクチンに対する抗体で染色された細胞内繊維を有する大細胞（平滑筋）、アセチル化低（ｏｗ）密度リポタンパク質を取り入れた丸型細胞（内皮細胞）、および顆粒化されたおよび原繊維の細胞（結合組織）。これらの結果は、、肉芽組織内における、単なる繊維結合組織瘢痕ではなく多数の中胚葉組織を形成し得る間葉幹細胞の存在を示唆する。これらの細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで適切に操作した場合、瘢痕組織の形成とは異なる実際の組織再生を達成することができる。
【０２６１】
皮膚創傷の治癒に伴う細胞事象については、広範に研究されている（最近の研究については、Ｃｌａｒｋ、１９９３；Ｂｅｎｎｅｔｔ、１９９３ａ，  １９９３ｂ；ＨｕｎｔおよびＬａＶａｎ、１９８９；Ｆａｌａｎｇａ、１９９３；ＯｒｇｉｌｌおよびＤｅｍｌｉｎｇ、１９８８；Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、１９９３）。第１に、外傷は、毛細血管床の裂傷を生じ、血管周囲組織空間へ血液が放出され、凝固して血腫を形成する。血腫形成の間、血小板が凝集し、脱顆粒し、血塊に多くの成長因子が放出される。血塊の成分および放出された成長因子はマクロファージを引き寄せ、マクロファージは血塊に移動してこれを分解する。マクロファージも多くの成長因子を合成および放出し、これらの因子は損傷を受けていない組織周辺の毛細血管内皮細胞および繊維芽細胞に作用する。いくつかの成長因子、特に、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、内皮細胞の増殖および移動を引き起こす（ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、１９８７；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、１９８７）。これらの細胞はマクロファージの直ぐ後ろで新たな毛細血管ループを形成し、創傷への循環を回復する。その間、繊維芽細胞は増殖し、これもマクロファージに続いて創傷に移動する。繊維芽細胞は、原則としてＩ型コラーゲン、プロテオグリカン、およびフィブロネクチンから成る細胞外マトリックスを分泌し始めるこれは結局は極めて稠密なマトリックスとなり、コラーゲン分子が架橋を経験するようなかなり強度なマトリックスとなる。このような繊維芽細胞と関連細胞外マトリックスとの組み合わせは、瘢痕組織を構成する。
【０２６２】
瘢痕組織は、必然的に、外因性作用物質の非存在下で外傷後の皮下組織で形成するが、鉱物質除去された骨マトリックスおよび外マトリックスから精製されたタンパク質を使用する研究では、皮下部位における軟骨および骨のｄｅ  ｎｏｖｏ誘導が明らかにされている（Ｕｒｉｓｔ、１９８９；ＲｅｄｄｉおよびＨｕｇｇｉｎｓ、１９７２；ＷｅｉｓｓおよびＲｅｄｄｉ、１９８１；Ｒｅｄｄｉ、１９８１；Ｌｕｃａｓら、１９９０；ＷｅｉｓｓおよびＲｅｄｄｉ、１９８０；ＲｅｄｄｉおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９７６；ならびにＷａｎｇら、１９９０）。この誘導の細胞事象については研究されており、血腫の形成、マクロファージ、続いて「間葉細胞」の浸潤、および新たな毛細血管を生じる組織外傷から成る。間葉細胞は軟骨細胞へ分化し、次いで肥大を生じる。肥大性軟骨細胞は、古典的な軟骨内骨形成によって骨に置き換わる（Ｒｅｄｄｉ、１９８１；ＲｅｄｄｉおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９７６）。この一連の早期細胞事象は、繊維芽細胞の代わりに間葉細胞が出現することを除いて、創傷の治癒と同一である。このデータは、創傷内に、繊維形成性瘢痕以外の組織へ分化する能力を有する細胞が存在することを意味する。
【０２６３】
先の研究では、デキサメタゾン、非特異的分化作用物質によって骨格筋（Ｌｕｃａｓら、１９９５）周辺の結合組織内に局在する細胞集団の存在が明らかにされており、これらの細胞は繊維芽細胞だけではなく、骨格筋、平滑筋、内皮細胞、軟骨、骨および脂肪などの他の中胚葉表現型に分化する。従って、これらの細胞を「間葉幹細胞」（ＭＳＣ）と命名された。さらなる研究により、ＭＳＣは様々な期間の結合組織画分内に存在することが明らかにされた（Ｙｏｕｎｇら、１９９５）。これらの細胞は、通常、様々な期間の結合組織内に存在し、従って、組織外傷後の創傷治癒応答に寄与し得るため、本発明者らは、これらの細胞も創傷治癒に関する肉芽組織中に存在するかどうかを決定するための以下の実験を行った。
【０２６４】
【材料および方法】
細胞培養
Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  （Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、１９５９，１９６９）により記載され、Ｇｏｏｄｓｏｎ  （Ｇｏｏｄｓｏｎら、１９７６）によって改変されたように、長さ３．５  ｃｍのシリンダーに形成されたステンレス製メッシュから創傷チャンバを構築した。ベンゼン、次いでエタノールに浸漬することによって創傷チャンバを清浄し、石鹸水中で洗浄し、次いで徹底的に濯いだ。それらをオートクレイブ中で滅菌した。
【０２６５】
腹腔内ペントバルビタールにより、７週齢ラットを麻酔した。腹部を剃毛し、ポビドン・ヨウ素（ｐｒｏｖｉｄｏｎｅ−ｉｏｄｉｎｅ）溶液で清浄した。Ｈｕｎｔら、（Ｈｕｎｔら、１９６６）の方法により、創傷チャンバを腹部層に挿入し、ステンレス製創傷クリップで創傷を閉じた。
【０２６６】
インプラント後７または１４日目のいずれかに創傷チャンバを取り出し、間葉幹細胞の単離のための先に記載された２工程手順（Ｌｕｃａｓら、１９９５）を使用して、推定幹細胞を単離した。まず、滅菌条件下で、付着しているすべての組織を創傷チャンバから取り出した。次いで、チャンバを開放し、チャンバ内の組織の容積を目視で見積もり、電磁撹拌棒を含有する１００  ｍｌ培地ボトルにチャンバを移した。７容積の２５０単位／ｍｌコラゲナーゼ（ＣＬＳ−Ｉ  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，  ＮＪ）、３３．３単位／ｍｌディスパーゼ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を含有するＥａｒｌｅ塩を有するＥａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）を添加し、創傷チャンバ中の組織が消化されるまで、混合物を３７℃で１時間半撹拌した。混合物を遠心分離管に移し、３００×ｇで２０分間、遠心分離した。上清を捨て、１０％予め選択されたウマ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＥＭＥＭ、ｐＨ  ７．４を２０  ｍｌ添加し、細胞を、２０μｍのフィルターを介してろ過し、単一細胞懸濁液を得た。さらに、細胞を１５０×ｇで１０分間、遠心分離し、上清を捨て、１０  ｍｌのＥＭＥＭ＋１０％ウマ血清を添加した。血球計で細胞を計数し、１％ウシゼラチンで被覆した１００  ｍｍ培養皿（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＪ）あたり１００，０００細胞で平板固定した。培養物を、１０％予め選択されたウマ血清および抗生物質を補充したＥＭＥＭ中に維持した。
【０２６７】
約８日後、細胞は密集状態に達し、培養物は少数の多核筋管を伴う単核細胞から成った。０．０５％トリプシンで細胞を遊離させ、筋管を除去し、単核細胞を残す２０μｍフィルターを介して細胞をろ過した。次いで、細胞を、ＥＭＥＭ＋１０％ウマ血清＋７．５％ＤＭＳＯ中−８０℃で凍結した。．  細胞のアリコートを融解し、２４ウェルゼラチン被覆培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）中１６  ｍｍウェルあたり５，０００細胞の密度で平板固定した。対照では同じ培地で培養物を維持したが、実験用皿は１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍの範囲の濃度でデキサメタゾンを含有する培地で処理した。４または５週間目に、培養物を固定化し、以下に記載のようにして表現型についてアッセイした。
【０２６８】
表現型のアッセイ：
１．  筋肉。骨格筋筋管を、培養物中で自発的に収縮した多核線状および分岐構造として形態学的に観察した（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ）。Ｙｏｕｎｇら（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２ｂ）の手順を改変して使用し、支質ミオシンに対するＭＦ−２０抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，  Ａｍｅｓ，  ＩＡ）で細胞を染色することによって、組織化学的に骨格筋表現型を確認した。断りがない限り、各工程の前にＤＰＢＳで２回濯いだ。ＤＰＢＳで細胞層を濯いだ後、０．５  ｍｌの冷エタノール（−２０℃）を５分間適用し、細胞を固定化した。この後、０．５  ｍｌのＤＰＢＳ中１％ｖ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ１００／０．０５％ｗ／ｖアジ化ナトリウムと共に５分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。２０％ヤギ血清の１次ブロッカーを３０分間、３７℃インキュベーター中で適用する。次いで、ＭＦ−２０の１：  ２００希釈の１次ＩｇＧ（０．４  ｍｌ／ウェル）を１時間インキュベートする。０．５  ｍｌの２０％ヤギ血清の２次ブロッカーを３０分間適用し、続いて、１：  ７５００  希釈のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｅｉｎｃｏ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を０．４  ｍｌ加え、また３７℃で３０分間インキュベートした。２０％ヤギ血清から成る３次ブロッカーを３０分間適用し、取り出し、次いで、１：  ３７５０  希釈のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｌｅｉｎｃｏ）を０．４  ｍｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。この時点で、細胞を０．５  ｍｌ  ＤＰＢＳで２回、次いで、０．５  ｍｌの蒸留水で２濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにＣｈｒｏｍａｇｅｎ  （Ｓｉｇｍａ）を添加した。一旦発色したら、２５μｌの０．０５％アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。
【０２６９】
２．  軟骨。培養物をＡｌｃｉａｎブルー（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、ｐＨ  １．０で染色した。細胞を１０％ホルマリン中で固定化し、次いで０．５  ｍｌ  Ａｌｃｉａｎブルー、ｐＨ  １．０で３０分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で７回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。
【０２７０】
３．  鉱化組織。鉱化可能な組織は、極めて稠密な多角形細胞の凝集物として区別されうる。Ｈｕｍａｓｏｎ  （Ｈｕｍａｓｏｎ、１９７２）により記載のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ手順を使用するリン酸カルシウムに対する組織化学的染色によって、細胞外マトリックスの石灰化性質の確認を行った。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをＤＰＢＳで２回濯いだ。細胞を５  ｍｌの１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）で３〜５分間固定化し、次いで、蒸留水で４回濯いだ。次いで、０．５  ｍｌの新たに調製した２％硝酸銀（Ｓｉｇｍａ）溶液を添加し、細胞を暗所で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を５回濯いだ。約０．５  ｍｌの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい白色白熱光に１５分間暴露した（光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた）。プレートを再度５回蒸留水で濯ぎ、次いで、１００％エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない緩衝液中に１％ｗ／ｖ  ［エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）  （Ｓｉｇｍａ）（カルシウム特異的キレーター）を有する選択された培養物を１時間前処理することによって実施した（Ｈｕｍａｓｏｎ，  １９７２）。
【０２７１】
４．  脂肪。以下の方法で、飽和中性脂肪のＳｕｄａｎブラックＢ（Ａｓｂｅｙ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ）染色を（Ｈｕｍａｓｏｎ，  １９７２）実施した。培養ウェルからすべての培地をアスピレーと吸引し、それぞれのウェルを１ｍｌのＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、０．５  ｍｌの７０％エタノールを添加して細胞膜を破壊した。１分間後、アルコールをアスピレーと吸引し、ウェルをＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を１００％プロピレン中で５分間、２回インキュベートした。次に、細胞を、１ウェルあたり０．５  ｍｌのＳｕｄａｎブラックＢで１０分間、２回インキュベートした。各溶液が澄明になるまで以下の溶液を各０．５  ｍｌで繰り返し細胞を濯ぐことによって、染色を区別した。プロピレン：水９０：１０、８５：１５、および７０：３０。蒸留水を用いて細胞を２回、１分間洗浄し、次いで、グリセリンゼリーで永久保存化した。
【０２７２】
５．  平滑筋。Ｓｉｇｍａ社製キットを使用し、平滑筋ａ−アクチンに対する抗体による染色によって、平滑筋をアッセイした。
【０２７３】
６．  内皮細胞。Ｖｏｙｔａら（Ｖｏｙｔａ、１９８４）が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（高グルコース）（ＤＭＥＭ）  （ＧＩＢＣＯ）で細胞を５回洗浄した。細胞を、１ｍｌあたり１０μｇの１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸（ＤｉＩ−Ａｃｙｌ−ＬＤＬ）  （Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，  ＭＡ）と共に３７℃で４時間インキュベートした。次いで、ウェルをＥＭＥＭ＋１０％ウマ血清で６回洗浄し、蛍光付着を有するＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ上で観察した。
【０２７４】
【結果】
初代培養物により、密集状態に達するまで単核星形細胞が増殖した（図６ＡおよびＢ）。トリプシンで細胞を遊離させ、ろ過し、凍結保存した後も平板固定時には細胞は星形を保持した。４週間目に、対照培養部は星形細胞から成った（図７Ａ）。しかし、デキサメタゾンで処理した培養物は、７種の形態を示した。約１週間の培養を始めたところ、自発的に収縮した線状および分岐した両方の多核細胞がすべてのデキサメタゾン濃度で出現したが、１０−８および１０−７Ｍデキサメタゾンの方がより多く出現した（図７Ｂ）。これらの細胞を骨格支質ミオシンに対する抗体で染色した（図７Ｃ）ところ、骨格筋筋管と同定された。
【０２７５】
１０−９〜１０−６  Ｍデキサメタゾンで処理した培養物は、位相差顕微鏡での観察では収縮性細胞周辺マトリックスを有する丸型細胞の小節を含有していた。これらの小節の２種の形態を同定した。１つの形態は、明白な境界を伴わない膨れ上がった細胞凝集物を有し、該細胞凝集物は星形細胞層と合流していた（図８Ａ）。第２の形態は、星形細胞層との鮮明な境界を含有する盛り上がった細胞凝集物から成った（図８Ｂ）。両小節の形態の細胞周辺マトリックスはＡｌｃｉａｎブルー、ｐＨ  １．０によって染色され、硫酸化グリコサミノグリカンの存在を示す。特定の細胞形態学および組織学的染色パターンに基づき、これらの細胞を軟骨小節中の軟骨細胞と同定した。
【０２７６】
培養４週間後に多角形細胞の細胞凝集物が出現した。それらは、１０−９〜１０−１０Ｍデキサメタゾンで処理されたウェルで最も一般的に認められたが、すべてのデキサメタゾン濃度では、少数しか出現しなかった。これらの細胞は、位相差顕微鏡下で相当な暗部を示した稠密な細胞外マトリックスを有し、マトリックスはＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で染色された（図８Ｃ）。染色はＥＧＴＡによる前処理で防止され得ることが見出された（データ示さず）。これはすべて石灰化細胞外マトリックスを示した。従って、これらの細胞は、仮に骨芽細胞と同定された。
【０２７７】
１０−８〜１０−６Ｍデキサメタゾンで処理した培養物は、２週間の培養で最初に出現した細胞内小胞を含んだ。細胞内小胞は、ＳｕｄａｎブラックＢで染色され、中性脂肪の存在を示した（図９Ａ）。特定の形態学および組織化学染色パターンに基づいて、これらの細胞は脂肪細胞と同定された。図９Ａでは、軟骨小節付近に特徴的な細胞内小胞／脂質小滴を有する脂肪細胞を認めることができる。このことは、培養系の２つの特徴を強調している：１）デキサメタゾンは非特異的に多数の中胚葉表現型を誘導することができ、２）タスの表現型は、それぞれの培養ウェルにおいてぞれぞれのデキサメタゾン濃度で出現した。
【０２７８】
１０−７および１０−６Ｍのデキサメタゾン濃度および培養３週間後、極めて大きな星状または四辺形の形状である細胞が出現し、区別可能な細胞内繊維を含有した。これらの細胞は平滑筋αアクチンに対する抗体で染色された（図９Ｂ）。染色は細胞内繊維で特に強度に認められた。従って、本発明者らは、これらの細胞を平滑筋細胞と同定した。同じデキサメタゾン濃度（１０−７および１０−６Ｍ）およびまた培養３ヵ月後に、個々の非凝集性多角形から丸型の単核細胞が出現した。これらの細胞は、蛍光標識アシル低密度リポタンパク質を細胞質内に取り入れた（図１０ＡおよびＢ）。染色は核周辺に認められ、いくらかの細胞では核で顕著であった。従って、本発明者らは、これらの細胞を内皮細胞と同定した。
【０２７９】
１０−９〜１０−７Ｍ濃度のデキサメタゾンで、非収縮性粒状細胞外マトリックスを有する螺旋パターンの密集な紡錘状細胞の凝集を３週間後に認識した。これらの細胞のこれらの細胞外マトリックスは、繊維芽細胞を示唆するパターンで、Ａｌｃｉａｎブルー、ｐＨ  １．０で染色された。従って、本発明者らは、これらの細胞を仮定的に繊維芽細胞と同定した。
【０２８０】
インプラント後７日目に取り出した創傷チャンバとインプラント後１４日目に取り出した創傷チャンバとの間には、ごく僅かな差異しか認められなかった。両時点から得られた培養物から、同じデキサメタゾン濃度で同じ表現型が明らかにされた。
【０２８１】
【考察】
本発明者らの研究室の先の研究では、いくらかの中胚葉表現型に分化可能なニワトリ、ラットおよびウサギの骨格筋において単離された細胞集団の存在が明らかにされている（Ｌｕｃａｓら、１９９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ；Ｐａｔｅら、１９９３）。ニワトリ胚（Ｙｏｕｎｇら、１９９５）および新生ラット心臓（Ｗａｒｅｊｃｋａ、１９９６）のいくらかの結合組織において同様の細胞集団が見出されている。Ｏｗｅｎの用語（Ｏｗｅｎ、１９８７）に従って、本発明者らは、明らかな非制限的増殖能（Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９３）および中胚葉（間葉）発生系統の細胞へ分化する能力について、これらの細胞を間葉幹細胞と命名した。本研究において、本発明者らは、７週齢ラットの皮下に７または１４日間インプラントされたＨｕｎｔ  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ創傷チャンバから得られる肉芽組織に同じ単離および試験手順を適用した。
【０２８２】
本研究における細胞の単離手順は、ラット筋肉および心臓で使用される手順と同一であった（Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａ、１９９６）。チャンバのメッシュまたは内部のいずれかに増殖した肉芽組織のみを使用するために、創傷チャンバから注意深く、付着している組織を掻き取った。任意の混入始原細胞を表現型で認識可能な形態まで分化させるために、単離した細胞を初代培養物で密集状態まで培養させた。これらの初代培養物では、僅かな筋管のみが出現し、他の分化した表現型は認められなかった。次いで、初代培養物をトリプシンで遊離させ、７．５％ＤＭＳＯ中で−８０℃まで緩徐に凍結し、融解し、２次培養物中においた。凍結融解工程は分化した表現型を排除し、間葉幹細胞の生存を可能にするために設計される。
【０２８３】
培地のみで増殖させる場合、２次培養物は星状形態を維持し、分化しない（図７Ａ）。分化は、外因性作用物質で刺激されなければならず、デキサメタゾンを使用すればこれが達成される。この系では、デキサメタゾンは非特異的分化剤として作用する。その正確な作用機序については不明であるが、デキサメタゾンは幹細胞の分化を刺激するための多くの培養系で使用されている（ＢａｌｌおよびＳａｎｗａｌ、１９８０；ＯｗｅｎおよびＪｏｙｎｅｒ、１９８７；Ｂｅｌｌｏｗｓら、１９９０；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ、１９７９；Ｈｏｕｎｅｒら、１９８７；ＳｃｈｉｗｅｋおよびＬｏｆｆｌｅｒ、１９８７；ＢｅｒｎｉｅｒおよびＧｏｌｔｚｍａｎ、１９９３；ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＣｒｉｓｔａｅ、１９９３；Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９８９；ならびにＧｕｅｒｒｉｅｒｏおよびＦｌｏｒｉｎ、１９８０）。
【０２８４】
デキサメタゾンで処理した２次培養物中の細胞は、骨格筋筋管、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、および繊維芽細胞を示すいくらかの形態へ分化した。特に分化された細胞について特に表現型発現マーカーを同定するために設計された免疫組織学、組織化学、または機能的ＬＤＬ取り込み技術によって表現型を確認した。本研究においてこれらの応答を誘発するのに使用される特定の表現型の出現のタイミングおよびデキサメタゾンの特定の濃度は、ニワトリ胚（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ）、ラット胚骨膜（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９８８）、新生期ラット骨格筋（Ｌｕｃａｓら、１９９５）、新生期ラット心臓（Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６）、および生体ウサギ骨格筋（Ｐａｔｅら、１９９３）から単離される間葉幹細胞の条件に同一である。本研究においてラット肉芽鎖組織から単離された細胞は、培養物において他の結合組織に存在するＭＳＣの集団と同一に挙動するようである。従って、本発明における細胞は、ＭＳＣの集団であるようである。
【０２８５】
理論的に、ＭＳＣのこの集団は、２つのサブ集団：１）観察された表現型のそれぞれの始原幹細胞および／または２）分化決定多能性幹細胞から成り得る。分化決定された始原幹細胞集団の存在に関する先の例は、骨格筋の単能性始原筋付随体幹細胞（Ｍａｕｒｏ、１９６１；Ｓｎｏｗ、１９７８；Ｇｒｏｕｎｄｓ、１９９０，  １９９１）、それぞれ軟骨膜および骨膜の単能性始原軟骨形成および骨形成幹細胞（ＢｌｏｏｍおよびＦａｗｃｅｔｔ、１９９４）、ならびに骨髄の二能性始原軟骨形成、骨形成幹細胞（Ｏｗｅｎ、１９８８；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ、１９８９）を含む。分化未決定多能性ＭＳＣの存在は、クローン単離された幹細胞の結果に基づく。ラット胚骨膜（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ，  １９８８）およびニワトリ胚骨格筋、真皮、および心臓（Ｙｏｕｎｇら、１９９３）から誘導される個々のクローン細胞株は、デキサメタゾンで処理した場合、多数の表現型を示しており、このことから、これらの組織における分化未決定の多能性幹細胞の存在が示唆されている。さらに、新生期ラット骨格筋から単離された細胞から作製されるクローン細胞株の予備データはまた、多数の中胚葉表現型に分化することができる個々のクローンを明らかにしており（Ｄａｖｉｓら、１９９５）、このことから、多能性幹細胞の分娩後生存への存続が示唆される。
【０２８６】
本研究では、培養培地は、初代培養物における分化決定された始原細胞の分化を可能にし、ここで、骨格筋筋管が認められた。しかし、同じ培地で培養された第２の細胞は、アッセイされた中胚葉表現型への分化を示さなかった（図８Ａ）。表皮は、軟骨細胞または骨芽細胞のための分化決定された始原細胞を含有しないようである。従って、肉芽組織から得られる２次培養物中の少なくともいくつかの細胞は分化未決定の多能性ＭＳＣであるか能性があるようである。
【０２８７】
さらに、創傷チャンバから単離したＭＳＣの潜在的起源および試験した動物の年齢は、本研究について興味深い。方法のセクションに記載のように、創傷チャンバ内のみの細胞を分析に使用した。このことは、間葉幹細胞の移動能力を示唆し、それらが創傷チャンバ周辺の組織に由来することを示唆する。ＭＳＣは、明らかに創傷に移動し、同時に創傷治癒に記載の他の細胞型、繊維芽細胞および脈管細胞を伴う。本研究において使用した動物は創傷チャンバインプラント時で７週齢であった。肉芽組織におけるＭＳＣの存在は、ＭＳＣが成体期生存まで存続することを示す（Ｐａｔｅら、１９９３）。
【０２８８】
７または１４日間インプラントされていた創傷チャンバから単離される間葉幹細胞は、デキサメタゾン処理に対して同一の応答を示した。先の研究は、肉芽組織が７日目に創傷チャンバに存在し、１４日目に最大に達することを示している（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、１９６９）。１４日後、肉芽組織は徐々に改造され、結合組織瘢痕を形成する。現在の結果は、間葉幹細胞が創傷治癒の肉芽相全体に存在し、従って、創傷治癒応答に参加し得ることを示す。しかし、創傷チャンバに存在する間葉幹細胞の絶対数を予測することは不可能である。初代培養物の単離手順、それに続く凍結融解および２次培養物での増殖は、本来の組織に存在する間葉幹細胞の数を比較することはできない。さらに、幹細胞の両サブ集団（分化決定および多能性）の増殖能は、そのような算出を困難にしている。先の研究は、分化決定された始原細胞がプログラムされた細胞老化の前に約５０細胞倍加の寿命を有する（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，  １９６５）が、多能性ＭＳＣは、それらが特定の系統に未決定であり続ける限り、本質的に不死的に増殖する（Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９３）ことを示している。肉芽細胞内の比較的多量のＭＳＣを比較することは、間葉幹細胞のマーカーが利用できるまで待たなければならない。
【０２８９】
肉芽組織における間葉細胞の存在は創傷治癒に対する現在の捕らえ方に異論を提示している。この見方は、創傷に移動する細胞は脈幹細胞（平滑筋および内皮細胞）ならびに繊維芽細胞であると述べている。繊維結合組織瘢痕の形成は必然であるという考えも認められる。我々らの研究に基づいて、本研究者らは創傷部位に移動する細胞の少なくとも一部は、多数の中胚葉表現型を形成する能力を有する間葉幹細胞である。示されているように、ＭＳＣは周辺の結合組織に存在し、「肉芽組織」に寄与している他の細胞と共同して移動することができ、繊維芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞を含む多くの中胚葉表現型に分化する能力を有する先の研究では、全層関節軟骨欠損に配置されたＭＳＣは、局所内因性因子の影響下で軟骨および骨に分化することが明らかにされている。従って、本発明者らは、創傷部位に存在する１つ以上の局所因子は決定および以後のＭＳＣの結合組織瘢痕、即ち、繊維芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞において観察された表現型への分化に影響する能力を有する血小板、マクロファージ、リンパ球を脱顆粒することによって放出され、創傷治癒中に全身の循環に存在する多くの成長因子は同定されており、分化決定された始原細胞に関するそれらの機能は特徴付けされている（Ｃｌａｒｋ、１９９３；Ｂｅｎｎｅｔｔ、１９９３ａ，  １９９３ｂ；ＨｕｎｔおよびＬａＶａｎ、１９８９；Ｆａｌａｎｇａ、１９９３；ＯｒｇｉｌｌおよびＤｅｍｌｉｎｇ、１９８８；Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、１９９３；Ａｄｏｌｐｈら、１９９３）。しかし、多くの未知因子は、同定、特徴付け、ならびに始原幹細胞および多能性間葉幹細胞の両方に対するそれらの影響についての機能分析が行われていない。この見解は、螺旋パターンを形成する紡錘形細胞（繊維芽細胞）へのＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化を引き起こす活性がほとんどのロットの血清に存在する（Ｌｕｃａｓら、１９９５）ことからも支持される。
【０２９０】
本発明者らは、局所環境が変化する場合、創傷部位に存在する常在性ＭＳＣは繊維結合組織瘢痕以外の組織を形成し得ると仮定している。この見解は、骨形態が骨外性皮下創傷部位に配置される研究によって支持される。これにより、最初に軟骨が出現し、その後該軟骨が軟骨内骨化を生じて骨を形成する（Ｕｒｉｓｔ、１９８９；Ｒｅｄｄｉ  およびＨｕｇｇｉｎｓ、１９７２；Ｒｅｄｄｉ、１９８１；Ｗａｎｇら、１９９０）。別の研究で、応答性細胞がインプラント部位に存在することが示されている（Ｗｅｉｎｔｒｏｕｂら、１９９０）。皮下部位に別の形態形成タンパク質、筋形態形成タンパク質をインプラントすると、皮膚組織の骨格筋管の分化が生じる（Ｌｕｃａｓら、１９９６）。最終的に、皮膚創傷を治癒するためのＴＧＦ−β１に対する抗体の添加、または外来性ＴＧＦ−β３の添加によっても、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）のレベルが調製されている（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、１９９４；Ｓｈａｈら、１９９２，１９９４，１９９５）。これらの研究により、ＴＧＦ−β１に対する抗体または外来性ＴＧＦ−β３は瘢痕形成を抑制し、それにより正常な表皮が出現することが示された。本発明者らは、創傷部位でＴＧＦ−βイソ型のレベルが変化すると、瘢痕繊維芽細胞から正常繊維芽細胞へＭＳＣの分化が偏り、正常な表皮が出現すると推測している。
【０２９１】
肉芽組織に間葉幹細胞の集団が存在すると、瘢痕組織の形成に対して真の組織再生の可能性が生じる再生には、間葉幹細胞が適切かつ特異的に操作されて所望の組織に分化することが必要である。本発明者らは、現在、１）繊維形成を阻害し、２）特異的表現型を刺激する能力について生体活性因子を試験している。
【０２９２】
【実施例４】
生体ヒト骨格筋から単離された間葉幹細胞
創傷の治癒は損傷に対する応答であるが、非機能的瘢痕組織を生じる。より好ましい結果は組織の再生であろう。本発明者らは、肢骨、筋肉、脂肪、表皮などに正常に認められる組織へ分化可能な間葉幹細胞の存在を仮定し、胎児および成体ラット骨格筋においてそのような細胞集団を見出した。成体ヒト組織からこれらの細胞を単離するために、これらの実験を設計した。７５歳糖尿病雌および３５歳雄の切断された脚から骨格筋を回収した。単核細胞を酵素的に単離し、１０％予め選択されたウマ血清を補充したＥａｒｌｅ塩を有する最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。この調製物は、筋管へ分化される決定された筋原細胞を含有する。次いで、培養物をトリプシン処理し、ろ過し、７．５％ＤＭＳＯ中、−８０℃で凍結し、融解し、平板固定し、ここで、２〜６週間の間、１０−１０〜１０−６Ｍデキサメタゾン（非特異的分化因子）を補充した上記の同じ培地でそれらを培養した。対照培養は、間葉幹細胞に典型的な正常形態を示した。デキサメタゾンで処理された培養物は、以下の表現型を含有した：ミオシンに対する抗体で染色された長形単核細胞（骨格筋）、ＳｕｄａｎブラックＢで染色された脂質小滴を有する丸型細胞（脂肪細胞）、Ａｌｃｉａｎブルー、ｐＨ  １．０で染色された細胞外マトリックスを有する丸型細胞（軟骨）、平滑筋ａ−アクチンに対する抗体で染色された細胞（平滑筋）、アセチル化低密度リポタンパク質を取り入れた細胞（内皮細胞）、および鉱物に対するＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で染色された細胞外マトリックス（骨芽細胞）。実験により、間葉表現型に分化する能力を有するヒト間葉幹細胞の存在が確立される。これにより、細胞を操作して、損傷を受けた患者の間葉組織の適切な再生を達成する可能性が生じる。間葉細胞は、結合組織、筋肉、骨、脂肪、軟骨、および血液細胞を含む多くの異なる組織を生じる。間葉から誘導された身体の組織に対する損傷は珍しいことではない。しばしば、組織に対する損傷は外傷、「磨耗および断裂」と呼ばれる病因学的破損、または先天的欠損によって生じる。骨折、変形性関節症、または骨格筋損傷に関与する病因学的過程ではこれは特に正しい。身体は、損傷を受けたまたは消失した間葉組織の修復の機序を有するが、正常な機能を有する組織の再生は不十分であるかまたは不適切であるようである。その代わり、治癒は、通常、主に非機能的繊維瘢痕組織から成る領域を残す。
【０２９３】
損傷が生じると、創傷治癒の過程が開始する。第１の段階は血腫の形成、続いて、炎症応答および以後の肉芽組織の損傷による欠損への移動に関与する。創傷が治癒すると、リモデリングおよび繊維瘢痕が生じる。これは、通常、細胞の空隙を修復するのに適切であるが、成体の身体が同一に一致する機能的至適細胞を再生する能力は制限されている。タンパク質および成長因子の流入は細胞が損傷の視域に移動するためのシグナルである（Ｐｏｓｔｅｌｔｈｗａｉｔｅら、１９７６，１９７８，  １９８１；Ｓｅｐｐａら、１９８２；Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔら、１９８２；Ｄｕｅｕｌら、１９８２）。このことは正しいかもしれないが、広範囲の損傷の再生は、細胞の創傷への移動のみでは簡単に説明することができない。従って、結合組織マトリックスに存在する多能性細胞の常在性集団が存在するという仮説が提案された。成長因子は、これらの常在性間葉幹細胞による可能な再生について、開始および複製のための重要なシグナルであるようである。これらの間葉幹細胞の多能性特性に関する分化の方向は、特定のシグナルによって変化することができるが、再生を開始させて、非機能的瘢痕組織を回避することができる。
【０２９４】
瘢痕形成は損傷を安定化しようとするが、それは機能的には最適ではない。治癒される損傷の視域が瘢痕を伴い得るという多くの問題がある。腱、筋肉および軟骨損傷などの間葉組織の領域における瘢痕組織は、特に弾力性、収縮、伸張性および剪断力に関する機能性が顕著に減少する。例えば、非機能的瘢痕形成による問題は、骨折後の骨の癒着不能または骨折変形治癒、瘢痕視域における再損傷素因を有する腱、関節軟骨表面の変化による関節炎、および皮膚結合組織における過形成性瘢痕による問題である。間葉細胞は、治癒過程において極めて重要であり、創傷に存在する多くの間葉組織に分化する特性についてその特徴が知られている。
【０２９５】
幹細胞は、無制限の増殖能を有する細胞と規定されており、従って、細胞倍加数が制限されるＨａｙｆｌｉｃｋ理論には結びつかない（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、１９６５）。これらの細胞は、身体において多数の組織型を構成している細胞系統へ分化することができる娘細胞子孫を産生することができる（Ｈａｌｌ  ＆  Ｗａｔｔ、１９８９）。発生中の哺乳動物胚には、娘細胞が生物の骨格組織を生じる多能性細胞である間葉幹細胞が存在する（Ｇｉｌｂｅｒｔ、１９９７）。これらの細胞から誘導される骨格組織は、骨、筋肉、軟骨、結合組織、および骨髄支質を含む。
【０２９６】
成体では、胚の間葉幹細胞に類似の多能性を有する細胞は、表皮、胃腸管上皮、および骨髄の造血画分においても同定されているという証拠も存在する。多能性細胞は、成体組織の修復および維持に重要であると思われる。造血画分から誘導される幹細胞についてはほとんど研究されている。造血幹細胞と呼ばれる細胞は、多くの様々な表現型に分化する能力を有することに注目した（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａら、１９８６；Ｓａｃｈｓなど）。もう１つの類似ではあるがまったく異なる細胞集団が仮定され、その後、間葉幹細胞（ＭＳＣ）と呼ばれる成体骨髄において見出された。ＭＳＣについても広範に研究されたが、これは、骨および軟骨（Ｏｗｅｎ、Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ、Ｃａｐｌａｎ）、腱（Ｃａｐｌａｎ）、筋肉（Ｗａｋａｔａｎｉ，  Ｓａｉｔｏ）、脂肪（Ｄｅｎｎｉｓ）ならびに造血を支持し得る骨髄支質結合組織などの様々な組織表現型を生じることが明らかにされている。これらの特性も、鉱物質除去された骨マトリックスインプラントに関与する研究中に観察されている。インプラント、またはそれから誘導されるタンパク質は、異所性視域、即ち筋肉において軟骨および骨形成のｄｅ  ｎｏｖｏ誘導を示した（Ｕｒｉｓｔ、１９６５；ＲｅｄｄｉおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９７６；Ｗａｎｇら、１９９０；Ｕｒｉｓｔら、１９７８；Ｌｕｃａｓら、１９８８）。これは、骨髄マトリックス内のタンパク質シグナルに応答する成体ヒトにおける結合組織マトリックス内の多能性細胞の集団が存在し得る。
【０２９７】
最近の研究では、トリ胚骨格筋周囲の結合組織には多くの間葉表現型に分化することができる細胞集団が存在することが先に明らかにされている（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ）。異なる濃度のデキサメタゾンでインキュベートする場合、ＭＳＣは、骨、軟骨、骨格筋、脂肪、および内皮組織を含む様々な表現型に分化することが明らかにされている（Ｙｏｕｎｇら、１９９５）。これらの細胞の集団も、最近、成体ラットの心筋（Ｌｕｃａｓら、１９９５）、新生ラット、成体ラットの骨格筋（Ｗａｒｅｊｅｃｋａら、１９９６）、および成体ウサギ（Ｐａｔｅら、１９９３）に存在することが明らかにされている。これらの単離された細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）と呼ばれている。現在の目的は、上記の間葉幹細胞に類似の細胞集団が存在し、ヒト成体の骨格筋から単離することができるかどうかを決定することである。
【０２９８】
【材料および方法】
表現型のアッセイ：
１．  鉱化組織。本質的にＨｕｍａｓｏｎ（Ｈｕｍａｓｏｎ，  １９７２）に記載の通り、リン酸カルシウムのＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをＤＰＢＳで２回濯いだ。細胞を０．５  ｍｌの１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）で３〜５分間固定化し、次いで、蒸留水で４回濯いだ。次いで、０．５  ｍｌの新たに調製した２％硝酸銀（Ｓｉｇｍａ）溶液を添加し、細胞を暗所で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を５回濯いだ。約０．５  ｍｌの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい光に１５分間暴露した（光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた）。プレートを再度５回蒸留水で濯ぎ、次いで、１００％エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない緩衝液中に１％ｗ／ｖ  ［エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）  （Ｓｉｇｍａ）（カルシウム特異的キレーター）を有する選択された培養物を１時間前処理することによって実施した（Ｈｕｍａｓｏｎ，  １９７２）。
【０２９９】
２．  軟骨。培養物をＡｌｃｉａｎブルー（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ），  ｐＨ  １．０で染色した。
固定化されたウェルを０．５  ｍｌ  Ａｌｃｉａｎブルー、ｐＨ  １．  ０で３０分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で７回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。
【０３００】
３．  脂肪。以下の方法で、飽和中性脂肪のＳｕｄａｎブラックＢ（Ａｓｂｅｙ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ）染色を（Ｈｕｍａｓｏｎ，  １９７２）実施した。培養ウェルからすべての培地をアスピレーと吸引し、それぞれのウェルを１ｍｌのＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、０．５  ｍｌの７０％ＥＴＯＨを添加して細胞膜を破壊した。１分間後、アルコールをアスピレーと吸引し、ウェルをＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を１００％プロピレン中で５分間、２回インキュベートした。次に、細胞を、１ウェルあたり０．５  ｍｌのＳｕｄａｎブラックＢで１０分間、２回インキュベートした。各溶液が澄明になるまで以下の溶液を各０．５  ｍｌで繰り返し細胞を濯ぐことによって、染色を区別した。プロピレン：水９０：１０、８５：１５、および７０：３０。蒸留水を用いて細胞を２回、１分間洗浄し、次いで、グリセリンゼリーで永久保存化した。
【０３０１】
４．  筋肉。Ｙｏｕｎｇら（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ｂ）の手順を改変して使用し、支質ミオシンに対するＭＦ−２０抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，  Ａｍｅｓ，  ＩＡ）で細胞を染色した。断りがない限り、各工程の前にＤＰＢＳで２回濯いだ。もう１度濯いだ後、０．５  ｍｌの冷エタノール（−２０℃）を５分間適用し、細胞を固定化した。この後、０．５  ｍｌのＤＰＢＳ中１％ｖ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ１００／０．０５％ｗ／ｖアジ化ナトリウムと共に５分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。２０％ヤギ血清の１次ブロッカーを３０分間、３７℃インキュベーター中で適用する。次いで、ＭＦ−２０の１：  ２００希釈の１次ＩｇＧ（０．４  ｍｌ／ウェル）を１時間インキュベートする。０．５  ｍｌの２０％ヤギ血清の２次ブロッカーを３０分間適用し、続いて、１：  ７５００  希釈のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｅｉｎｃｏ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を０．４  ｍｌ加え、また３７℃で３０分間インキュベートした。２０％ヤギ血清から成る３次ブロッカーを３０分間適用し、取り出し、次いで、１：  ３７５０  希釈のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｌｅｉｎｃｏ）を０．４  ｍｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。この時点で細胞を濯ぎ、０．５  ｍｌのＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を添加して、周囲温度、暗所で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、２００μｌのＡＢＴＳ溶液を細胞から取り出し、１０μｌの０．  ０３％アジ化ナトリウムを含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ）のウェルで平板固定した。４０５  ｎｍフィルターを使用するＴｉｔｅｒ  Ｔｅｋ分光光度計プレートリーダー上で該ＥＬＩＳＡプレートを読み取った。
【０３０２】
ＡＢＴＳ溶液のアリコートを取り出した後、０．５  ｍｌのＤＰＢＳで２回細胞を濯ぎ、次いで０．５  ｍｌの蒸留水で２階濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにＣｈｒｏｍａｇｅｎ  （Ｓｉｇｍａ）を添加した。一旦発色したら、２５μｌの０．０５％アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。
【０３０３】
残りのウェルからＡＢＴＳを取り出し、先に記載のように、Ｊｏｈｎｓｏｎ−ＷｉｎｔおよびＨｏｌｌｉｓのｉｎ  ｓｉｔｕジアミノ安息香酸（ＤＡＢＡ）手順（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｉｎｔら、１９８２）を使用してＤＮＡ含有量を分析した。従って、同じウェル上で、ミオシン含有量およびＤＮＡ含有量に対する吸光度を得た。
【０３０４】
５．  平滑筋。  Ｓｉｇｍａ社製キットを使用し、平滑筋ａ−アクチンに対する抗体による染色によって、平滑筋をアッセイした。
【０３０５】
６．  内皮細胞。  Ｖｏｙｔａら（Ｙｏｙｔａら、１９８４）が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（高グルコース）（ＤＭＥＭ）  （ＧＩＢＣＯ）で細胞を５回洗浄した。細胞を、１ｍｌあたり１０μｇの１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸（ＤｉＩ−Ａｃｙｌ−ＬＤＬ）（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，  ＭＡ）と共に３７℃で４時間インキュベートした。次いで、ウェルをＥＭＥＭ＋１０％ウマ血清で６回洗浄し、蛍光付着を有するＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ上で観察した。
【０３０６】
７．  造血細胞。ＣＤ−３４に対するマーカーの存在によって造血細胞を同定した。培養皿中の細胞をＤＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇで２回洗浄した。次に、ＤＰＢＳ−Ｃａ２＋Ｍｇ２＋およびＥＤＴＡ溶液を添加した。４０分後、サンプルを緩徐に粉砕して細胞を取り出した。次いで、外れた細胞を取り出し、１５  ｍｌ遠心分離管に移した。次いで、ＥＭＥＭ  １０％  ＨＳ−３  を培養さらに添加し、サンプルを再インキュベートした。細胞懸濁物を１５０ｇで１２分間、遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、ペレットを１．９５  ｍｌのＤＰＢＳ−Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋培地に再懸濁した。次いで、細胞を血球計を使用して計数した。次に、細胞をＤＰＢＳ−Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋で洗浄した。次いで、本発明者らは、５ｍｌの１次ＩｇＧをＥＭＥＭ１０％ＨＳ−３中４℃でインキュベートした。ＩｇＧは４０μｌ／１０６細胞ＣＤ−３４  Ａアイソトープであった。２本のマイクロ遠心管中、２０μｌ／１０６細胞ＣＤ−３４  Ｂアイソトープであった。次いで、サンプルをマイクロ遠心管中、４分間、１５０  ｇで遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、ペレットを再懸濁し、ＤＰＢＳで洗浄した。次いで、サンプルを再度遠心分離し、１％ＢＳＡ、０．５％ＴＷ中で２０分間ブロックした。次いで、サンプルを再度遠心分離した。次いで、２次ＩｇＧを添加し、２０分間インキュベートした。次いで、サンプルをスピード３で４分間、遠心分離した。上清をアスピレーター吸引し、ペレットを０．５  ｍｌ培地で洗浄した。溶液を再度遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引した。１００  ｍｌの媒体ＰＢＳをペレットに添加し、次いで、スライドあたり１０μｌを利用してサンプルを平板固定した。サンプルをアセトン、ＥＴＯＨ、加熱およびホルマリンで固定化した。次いで、サンプルを、ブルーフィルターを有する蛍光顕微鏡下で観察した。
【０３０７】
【結果および考察】
７７歳雌および３７歳雄の外科サンプルから得られた骨格筋から間葉幹細胞を単離した。初代培養物は、単核星形細胞（推定多能性間葉幹細胞）および筋芽細胞を示した（図１１Ａ、１１Ｂ）。トリプシンで細胞を遊離させ、ろ過し、凍結保存した後も平板固定時には２次培養物中の細胞は星形を保持した（図１１Ｃ）。
【０３０８】
デキサメタゾンで処理した２次培養物は、脂肪細胞、軟骨および骨を含むいくらかの形態を示した（１３Ｂ〜Ｄ；図１４Ａ〜Ｃ）。これらの培養物中の細胞をミオシンに対する抗体で染色した（図１２Ａ〜Ｂ）ところ、骨格筋筋管と同定された。他の細胞は、それらの形態学および蛍光標識アシル低密度リポタンパク質を細胞質に取り入れるそれらの能力によって内皮細胞と同定された（図１５Ａ〜Ｂ）。平滑筋αアクチンに対する抗体による細胞染色も同定された（図１４）。２次培養物も、ＣＤ３４の発現について評価し、固定化された細胞はＣＤ３４に対する抗体で陽性染色であることが明らかにされた（図１６Ａ〜Ｂ）。
【０３０９】
これらの結果は、培養物において、平滑筋、脂肪細胞、軟骨、骨および内皮細胞に分化可能である多能性間葉幹細胞を、成体、（老齢（７７歳）でもよい）ヒト骨格筋から単離することができることを示す。
【０３１０】
【実施例５】
３Ｔ３細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性表現型に分化する
結合組織は、繊維芽細胞のみから成ると考えられる。３Ｔ３細胞は、繊維芽細胞を出現させると思われるマウス胚組織から誘導される細胞株である。本発明者らは、プロトコールに従って３Ｔ３細胞を培養した。本発明者らは、ラット組織から多数の表現型に分化することができる細胞を単離することを開発した。Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、Ｅａｒｌｅ塩を有する最小必須培地（ＥＭＥＭ）＋１０％予め選択されたウマ血清中で培養した。細胞を、非特異的分化剤、１０−ｌ０〜１０−６Ｍの範囲の濃度のデキサメタゾンで、４〜８週間処理した。対照にはデキサメタゾンを添加しなかった。いくらかの間葉表現型は培養物中で発生した：脂肪細胞（ＳｕｄａｎブラックＢ染色）；軟骨細胞（Ａｌｃｉａｎブルー染色、ｐＨ  １．０）、骨芽細胞（鉱物質に対するＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色）、平滑筋細胞（ａ−平滑筋アクチンに対する抗体）、内皮細胞（アシル低密度リポタンパク質の取り込み）、および骨格筋筋管（線状多核細胞および支質ミオシンに対する抗体）。いくつかの細胞はまた、イソプロテレノール処理で拍動数が増加し、プロプラノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）処理で減少する２核拍動細胞を示した。本発明者らは、この細胞を仮定的に心筋細胞と同定した。３Ｔ３は、幹細胞の特徴を有するが、繊維芽細胞の特徴を有さない多数の間葉から誘導された表現型に分化することが可能である。従って、それらは、幹細胞の細胞生物学を診査し、成長および分化因子によって方向付けられる特定の組織型を研究するための簡単、簡便なアッセイを提供するのに極めて貴重な道具であり得る。特異的に細胞分化を指令する能力は、組織の修復において非常に大きな可能性を付与する。
【０３１１】
Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞は、本来、Ｓｗｉｓｓマウス胚から、長期培養方法を使用して、Ｔｏｄａｒｏら（ＴｏｄａｒｏおよびＧｒｅｅｎ、１９６３；Ｔｏｄａｒａら、１９６４）により作製された細胞株は、培養物中明らかな不死後、密集上での細胞増殖の接触阻害を対象に選択された。これは、約５０細胞倍加後の細胞老化について、Ｈａｙｆｌｉｃｋ数（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、１９６５）への一致が失われることによる。細胞株は繊維芽細胞様細胞を出現させ、これはＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞と命名された。それらの由来３Ｔ３細胞およびその誘導体は、１３，０００以上の研究において使用され、ウイルス形質転換（Ｄｅｎｈａｒｄｔら、１９９１；ＧｒｅｅｎおよびＯｌａｎｉｙｉ、１９７４）、細胞表面レポーター（Ｅｌｄａｒら、１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、１９９０；Ｍａｈｅｒ、１９９３；Ｓａｔｏｈら、１９９０）成長因子調節（ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９３；ＣｏｒｐｓおよびＢｒｏｗｎ、１９９１；Ｐｏｗｉｓら、１９９０；Ｓａｔｏｈら、１９９０；Ｙａｔｅｓら、１９９３）細胞生理学（ＣｏｒｐｓおよびＢｒｏｗｎ、１９９２；ＤｏｍｉｎおよびＲｏｚｅｎｇｕｒｔ、１９９３；Ｐａｎｇら、１９９３）、ならびに因子調節分化（Ｅｖａｎｓら、１９９３；Ｓｐａｒｋｓら、１９９３）を含む細胞制御の態様に関する様々な態様が検討されている。分子生物学技術の出現に伴い、Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞は、遺伝子調節機構を研究するために利用されている（Ｂａｔｔｅｙら、１９９１；Ｌｉｎｄｅｒら、１９９１；Ｍｉｙａｚａｗａら、１９９３；ｙａｎおよびＨｕｎｇ、１９９３；Ｙａｎｇら、１９９３）。
【０３１２】
３Ｔ３細胞のサブ集団は、培養中にグルココルチコイドで処理すると脂肪細胞に分化することが明らかにされている（ＧｒｅｅｎおよびＭｅｕｔｈ、１９７４；Ｋｕｒｉ−Ｈａｒｃｕｃｈ、１９７８；ＮｉｘｏｎおよびＧｒｅｅｎ、１９８４；Ｍｏｒｉｋａｕａら、１９８２；Ｒｉｎｇｏｌｄら、１９９１；ＷｉｅｒおよびＳｃｏｔｔ、１９８６）。３Ｔ３のクローンである３Ｔ３−１０  Ｔｌ／２細胞は、５’−アザシチジンで処理すると脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および筋管に分化することが明らかにされている（ＴａｙｌｏｒおよびＪｏｎｅｓ、１９７９）。
【０３１３】
最近（Ｙｏｕｎｇら、１９９５）、分化決定された始原間葉幹細胞および分化未決定の多能性間葉幹細胞の両方は、多数の器官およびニワトリ胚における器官系に関連する結合組織画分内に局在することが見出された。Ｌｕｃａｓら（Ｌｕｃａｓら、１９９５）は、胎児および新生児ラット骨格筋から間葉幹細胞を単離した。これらの細胞は、骨格筋、軟骨、骨、平滑筋、内皮細胞、および繊維芽細胞に分化することが可能であった。Ｗａｒｅｊｃｋａら（Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６）は、３〜５日齢ラット心臓から幹細胞集団を単離した。デキサメタゾンによる処理後、これらもまた、骨格筋、平滑筋、脂肪細胞、骨および軟骨に発生することが認められた。
【０３１４】
本研究では、本発明者らは、Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞が培養物中において多数の表現型を形成する能力を評価した。
【０３１５】
【材料および方法】
細胞培養
１２５継代時のＳｗｉｓｓ−３Ｔ３細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ’Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）より入手した。到着時、細胞を融解し、最初に、Ｅａｒｌ塩を有する８９％Ｅａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ  ＧＩＢＣＯ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）、１０％予め選択されたウマ血清、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００μペニシリン／１０，  ０００マイクログラムのストレプトマイシン硫酸、ＧＩＢＣＯ）を含有する培地（ｐＨ  ７．４）において皿あたり１００，  ０００細胞で、予めウシゼラチン（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＪ）を被覆した１００  ｍｍ皿に播種した。培養物を、湿潤９５％空気／５％Ｃ０２を含有するインキュベーター、３７℃中に、細胞が密集状態になるまで配置した。
【０３１６】
細胞は、約８日目に密集状態に達し、０．０２５％トリプシンおよびＣａ、Ｍｇを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液でプレートから遊離させ、２０μｍのＮｉｔｅｘフィルターを介して、７．５％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ，  Ｓａｌｏｍ，  ＭＯ）を含有するＥＭＥＭ＋１０％ウマ血清中１×１０６細胞／ｍｌに希釈し、凍結チャンバ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）内で−８０℃まで緩徐に凍結した。
【０３１７】
次いで、凍結した３Ｔ３細胞を融解し、ＰＢＳ中０．４％トリパンブルーを使用し、血球計（Ｄｅｎｈａｒｄｔら、１９９１；ＤｏｍｉｎおよびＲｏｚｅｎｇｕｒｔ、１９９３）で細胞生存度を決定し、細胞を、１％ゼラチンで予め被覆した２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓｗｏｒｋｓ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｎ．  Ｙ．）中に、５０００細胞／ウェルの密度で配置した。細胞を、１０％ウマ血清および様々な濃度のデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ，  Ｓａｌｏｍ，  ＭＯ）を含有するＥＭＥＭ中で培養した。４つのウェルを対照とし、デキサメタゾンを添加しなかった。４つのウェルは、それぞれ、１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ、１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、１０−６Ｍデキサメタゾンを含有する培地を添加した。培地を１日おきにチャージし、培養物を、異なる表現型の出現について、位相差顕微鏡下で試験した。
【０３１８】
表現型のアッセイ：
骨−Ｈｕｍａｓｏｎに記載の通り、リン酸カルシウムのＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをＤＰＢＳで２回濯いだ。細胞を０．５  ｍｌの１０％ホルマリンで３〜５分間固定化し、次いで、蒸留水で４回濯いだ。次いで、１．５  ｍｌの新たに調製した２％硝酸銀溶液を添加し、細胞を暗所で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を５回濯いだ。約０．５  ｍｌの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを明るい光に、光を反射させるための白色背景に対して１５分間暴露した。プレートを再度５回蒸留水で濯ぎ、１００％エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ｃａ、Ｍｇを含まない緩衝液中に１％重量／容積［エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）］−テトラ酢酸（カルシウム特異的キレーター）を有する選択された培養物を１時間前処理することによって実施した。
【０３１９】
筋肉−Ｙｏｕｎｇら、１９９２ｂの手順を改変して、支質ミオシンに対するＭＦ−２０抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，  Ａｍｅｓ  Ｉｏｗａ）で細胞を染色した。断りがない限り、各工程の前にＤＰＢＳで２回濯いだ。もう１度濯いだ後、０．５  ｍｌの冷エタノール（−２０℃）を５分間適用し、細胞を固定化した。この手順の後、０．５  ｍｌのＤＰＢＳ中１％ｖ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ１００／０．０５％ｗ／ｖアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）と共に５分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。２０％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ）の１次ブロッカーを３０分間、３７℃インキュベーター中で適用する。次いで、ＭＦ−２０の１：  ２００希釈の１次ＩｇＧ（０．４  ｍｌ／ウェル）を１時間インキュベートする。０．５  ｍｌの２０％ヤギ血清の２次ブロッカーを３０分間適用し、続いて、１：  ７５００  希釈のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｅｉｎｃｏ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を０．４  ｍｌ加え、また３７℃で３０分間インキュベートした。これを３０分間、３７℃でインキュベートした。２０％ヤギ血清から成る３次ブロッカーを３０分間適用し、取り出した。次に、１：  ３７５０  希釈のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｌｅｉｎｃｏ）を０．４  ｍｌ添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。細胞を０．５  ｍｌの蒸留水で２階濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにＣｈｒｏｍａｇｅｎ  （Ｓｉｇｍａ）を添加した。一旦発色したら、２５マイクロリットルの０．０５％アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。
【０３２０】
軟骨−培養物をＡｌｃｉａｎブルー（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、ｐＨ  １．０で染色した。固定化されたウェルを０．５  ｍｌ  Ａｌｃｉａｎブルー溶液、ｐＨ  １．  ０で３０分間染色し、次いで、ウェルから取り出した。ウェルを水道水または蒸留水で７回濯ぐことによって、非結合染色物を取り出した。培養物は、グリセリンゼリー化で保存した。
【０３２１】
平滑筋−平滑筋αアクチンに対する抗体で染色することによって、細胞を同定し（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）。
【０３２２】
内皮細胞−Ｖｏｙｔａら（Ｖｏｙｔａら、１９８４）が記載のように、低密度リポタンパク質を取り込む能力によって内皮細胞を同定した。抗生物質を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（高グルコース）（ＧＩＢＣＯ）で細胞を５回洗浄した。細胞を、１ｍｌあたり１０μｇの１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸（ＤｉＩ−Ａｃｙｌ−ＬＤＬ）  （Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，  ＭＡ）と共に３７℃で４時間インキュベートした。次いで、ウェルをＥＭＥＭ＋１０％ウマ血清で６回洗浄し、蛍光付着を有するＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ上で観察した。
【０３２３】
心筋−大型２核化された核ならびに変力薬および変時性薬に対する反応に基づいて、心筋細胞を同定した。
【０３２４】
【結果】
３Ｔ３細胞をＡＴＣＣより入手し、解凍し、培養したところ、ほとんどが正常または３角形形態を有した。約１週間〜１０日間の培養で密集状態に達した。細胞を凍結し、融解し、記載のように反復した。デキサメタゾンを伴わない対照培養物は、培養期間中を通して、継続して均一な星状形態を示した（図１７Ａ）。
【０３２５】
デキサメタゾンで処理した培養物は、多数の表現型を示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化について試験するために、デキサメタゾンを非特異的誘導剤として使用した（Ｇｒｉｇ．，  ａｕｂｉｎ，  Ｈｅｅｒｓｃｈｅ）。デキサメタゾン処理の２週間後に出現した１つの表現型は、位相差で収縮性であった丸型小滴を有する細胞を含有した（図１７Ｂ）。これらの細胞をＳｕｄａｎブラックＢで染色したところ（図１７Ｃ）、脂肪細胞と同定された。これらの脂肪細胞のほとんどは、１０−８〜１０−６デキサメタゾン濃度で出現した。
【０３２６】
１４日目に、１０−９〜１０−６Ｍデキサメタゾンの濃度で、いくらかの核を含有する細長い細胞が出現した（図１８Ａ）。これらの細胞は培養物中で自発的に収縮し、支質ミオシンに対するモノクローナル抗体で染色された（図１８Ｂ）。従って、これらの細胞は、筋管と同定された。
【０３２７】
培養４週間目に、１０−７〜１０−６Ｍデキサメタゾンの濃度で、若干の２核細胞が出現した。これらの細胞は、１分間に約６５拍動で、培地中で規則的に拍動した（表８）。細胞を１０−６Ｍのイソプロテノールで処理した場合、拍動数は１分間あたり８５拍動まで増加した。イソプロテレノールは、心筋に対する陽性の変力および変時性効果を有する強力な選択的βアドレナリン作用アゴニストである（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、１９９６）。対照的に、プロプラノロールは心拍数を遅くするβアドレナリン作用アンタゴニストである。細胞を１０−６Ｍプロプラノロールで前処理し、次いで、イソプロテノールに暴露した場合、細胞は拍動数を維持する。これらの基準、イソプロテノールに対する陽性変時性反応およびプロプラノロールに対する陰性反応に基づいて、本発明者らは、仮定的にこれらの細胞を心筋細胞と同定した。
【０３２８】
【表８】
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表８．心筋および対照細胞のイソプロテノールおよびプロプラノロールへの暴露ならびに拍動数の変化の比較
【０３２９】
培養３５日目に、１０−７〜１０−９Ｍデキサメタゾンの濃度で、小節中で増殖し、収縮性細胞外マトリックスを有する丸型細胞が出現した（図１９ＡおよびＢ）。細胞外マトリックスをＡｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色した。これらの小節は軟骨と同定された。２つの異なる形態が観察された。一方では、軟骨小節は不規則な境界を有し、ここで、該細胞は周辺星状細胞に結合していた（図１９Ｃ）。他方は、背景の星状細胞とは極めて明確に規定される境界を有する小節から成った（図１９Ｂ）。
【０３３０】
培養２８日後、すべてのデキサメタゾン濃度で、少数の多角形細胞が出現した（図１９）。これらの細胞は、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色で染色された稠密な細胞外マトリックスを形成した（図１９）。ＥＧＴＡで培養物を前処理した場合、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色による染色が防止された（データ示さず）。石灰化マトリックスを作製する細胞の能力に基づき、これらの細胞は骨芽細胞と同定された。
【０３３１】
デキサメタゾン処理の３５日目に、繊維を含有する平行四辺形型の細胞が認められた。これらの細胞は、１０−７および１０−６Ｍデキサメタゾン濃度で最も多く認められた。これらの繊維は平滑筋αアクチンに対する抗体で染色された。従って、細胞は平滑筋細胞と同定された（図２０）。
【０３３２】
認識可能な細胞外マトリックスを伴わない多角形細胞は、３５日目に１０−７および１０−６Ｍデキサメタゾン濃度で出現した。細胞はＤｉｌ−Ａｃｙｌ  ＬＤＬを細胞質小胞に取り入れ、内皮細胞と同定された（図２１）。
【０３３３】
【考察】
培養物における組織の増殖は、後にｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のための生物学的組織の開発に転換することができる細胞生物学を理解するための非常に重要な有望性を有している。一般にＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞は、文献上繊維芽細胞と呼ばれている（Ｅｌｄａｒら、１９９０；Ｌｉｎｄｅｒら、１９９１）。しかし、３Ｔ３を、間葉幹細胞を単離するために開発されたプロトコールに従って培養した場合、３Ｔ３細胞は、デキサメタゾンで処理するといくらかの中胚葉表現型に発生する。
【０３３４】
本研究では、１０−８Ｍデキサメタゾンの濃度で、処理２週間の培養物は、位相差で収縮性である丸型小滴を有する細胞を示した。これらの細胞をＳｕｄａｎブラックＢで染色したところ、脂肪細胞と同定された。１４日目に、１０−９〜１０８Ｍデキサメタゾンの濃度で、培養中に自発的に収縮した細長い多核細胞が出現した。これらは、支質ミオシンに対するモノクローナル抗体による染色に基づき、筋管と同定された。１０−７〜１０−６Ｍデキサメタゾン濃度で、２８日目に、培養物中で規則的に拍動する２核細胞が認められた。これらの細胞は、選択的βアゴニストおよびアンタゴニストに暴露される場合、心筋細胞として挙動する。培養３５日目、１０−９〜１０−７Ｍデキサメタゾン濃度で、２つの異なる形態で軟骨細胞が出現し、一方は不規則な境界を有し、他方は背景の星状細胞から明確に規定される境界を有した。培養２８日後、すべてのデキサメタゾン濃度において、多角形細胞が出現した。石灰化マトリックスを作製する細胞の能力に基づき、これらの細胞は骨芽細胞と同定された。デキサメタゾン処理の３５日目、１０−６Ｍデキサメタゾン濃度で平行四辺形型細胞が観察された。これらの細胞は、平滑筋αアクチンに対する抗体によるそれらの染色に基づき、平滑筋細胞と同定された。３５日目、１０−７Ｍデキサメタゾンの濃度で、Ｄｉｌ−Ａｃｙｌ−ＬＤＬを細胞質小胞に取り入れる細胞外マトリックスを伴わない多角形細胞が内皮細胞と同定された。
【０３３５】
３Ｔ３が分化する能力について考察している報告はほとんどないが、文献的にいくらかの研究では、該細胞が他の表現型に分化することが示されている。マウス繊維芽間葉細胞Ｃ３Ｈ１０  Ｔ１／２（３Ｔ３のクローン）は、ＢＭＰ  ２および４による永久トランスフェクション後に本来の繊維芽細胞の性質を消失した（Ａｈｅｒｎｓら、１９９３）。これらの細胞は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、および脂肪細胞に類似の３種の異なる表現型に分化することが明らかにされた。ＴａｙｌｏｒおよびＪｏｎｅｓ（ＴａｙｌｏｒおよびＪｏｎｅｓ、１９７９）は、５’−アザシチジン（５−ＡＺＡ−ＣＲ）がマウス胚細胞株において生化学的に分化された機能的横紋筋、脂肪細胞および軟骨細胞の形成を誘導することを示した。１９８２年において、同グループは、初期Ｓ期中に細胞が処理されると、筋肉および脂肪細胞表現型は最大であることを示した（ＴａｙｌｏｒおよびＪｏｎｅｓ、１９８２）。
【０３３６】
幹細胞の２つの異なる特徴は、無制限な分可能、およびそれらの休止状態である能力である。本研究における３Ｔ３細胞は、１２５形態または６２５細胞倍加でＡＴＣＣより入手した。これは、決定化された細胞の５０細胞倍加のＨａｙｆｌｉｃｋ限界を超えている（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，  １９６５）。研究中に、本発明者らは、少なくとも５を超える細胞倍加を観察した。対照研究では、３Ｔ３細胞が静止状態であり、刺激を受けるまで未分化であることが明らかにされている。
【０３３７】
ＳｐａｒｋｓおよびＳｃｏｔｔ（Ｓｐａｒｋｓら、１９９１）は、３Ｔ３細胞に対するＴＧＦＢの効果について検討した。彼らは、ＴＧＦＢが３Ｔ３細胞の脂肪細胞への分化の特異的阻害剤であることを認めた。しかし、増殖は影響を受けなかった。従って、分化した脂肪細胞表現型の発現前は、３Ｔ３幹細胞は、まず、細胞周期の異なる段階で増殖を停止する。さらに、分化は、増殖停止を防止する高度の分裂促進剤によって非特異的に開始することができる。幹細胞の分化に関するもう１つの研究（ＳｃｏｔｔおよびＭａｅｒｃｋｌｅｉｎ  １９８４）では、低線量のＵＶ照射は、成長因子の欠損または栄養欠損培養条件における細胞増殖を調節する能力を変更することなく、前脂肪細胞の分化を安定かつ選択的に阻害することが見出された。この効果は、発ガン阻害の初期の事象であり得る。照射された細胞はまた、非照射細胞よりも形質転換しやすい。
【０３３８】
ＴｏｄａｒｏおよびＧｒｅｅｎによる本来の単離は、意図的な形質転換に関与しない。しばしば、３Ｔ３細胞は、自発的に形質転換されることが主張されており、これは該細胞の無制限増殖能の原因である。しかし、Ｓｃｏｔｔらの研究では、ＵＶ照射への暴露にもかかわらず細胞増殖が生じないことが示されている。
【０３３９】
さらに、ウイルストランスフェクションによって３Ｔ３を形質転換する研究では、トランスフェクトされていない細胞は腫瘍を形成しない（Ｓｐａｒｋｓら、１９９１）。従って、３Ｔ３細胞にＨａｙｆｌｉｃｋ数を超える能力があるのは、それらが幹細胞であるのがその理由である可能性がある。
【０３４０】
中胚葉（胚由来の組織）は、体肢骨格および筋（背側中胚葉（ｄｏｓｒａｌ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ））、結合組織ならびに血管および心臓の内皮（臓側板）、ならびに他の器官（中間中胚葉）を生じる。本研究で観察される表現型は、背側中胚葉および臓側板から誘導される。将来の研究では、中間中胚葉由来の表現型が注目されるであろう。
【０３４１】
ＢＭＰおよびＣＤＭＰは、これらの様々な組織の分化を指令することが認められている作用物質である。ＢＭＰは、アザシチジンの存在下で、Ｃ３ＨｌＯＴｌ／２の脂肪細胞、軟骨細胞および骨芽細胞への分化を誘導した（Ａｈｅｒｎｓら、１９９３）。関節細胞由来の抽出物は、ラットの皮下にインプラントされる場合、軟骨および骨形成を誘導することが見出されている（Ｃｈａｎｇら、１９９４）。これらの軟骨誘導性形態学的タンパク質（ＣＤＭＰ）は、軟骨細胞の分化および長骨の成長に役割を果たしていると考えられる。
【０３４２】
従って、３Ｔ３細胞は多能性分化能を示し、幹細胞として挙動している。このことにより、３Ｔ３細胞は、分化の遺伝的段階を研究するための潜在的アッセイ系になる。
【０３４３】
【実施例６】
造血サイトカインは、ヒト多能性幹細胞における造血発現を誘導する
ヒト多能性幹細胞（老齢、回収後１５０細胞倍加でのＰＡＬ＃３細胞株）を、１０％ＨＳおよび１％抗生物質／抗カビ剤を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ中１％ゼラチン化Ｔ−２５フラスコあたり７５×１０３細胞で播種した。２４時間後、培地を、（対照）同培地または（実験）造血サイトカイン：２．５  Ｕ／ｍｌエリトロポイエチン、１０  ｎｇ／ｍｌ顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、１０  ｎｇ／ｍｌ顆粒球コロニー刺激因子、１０  ｎｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子、５０  ｎｇ／ｍｌインターロイキン−３、５０  ｎｇ／ｍｌインターロイキン−６、５０  ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子、および２μｇ／ｍｌインスリンを含有する同培地で置き換えた。培養物は、それぞれの培地において２週間ごとに給餌した。対照と比較して、３週間の実験処理により、ノーザンＲＮＡ／ｃＤＮＡ分析により示されるように、ＧＭ−ＣＳＦレポーターの発現が誘導された。
【０３４４】
【実施例７】
ヒト間葉幹細胞は、細胞表面クラスター分化マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６およびＭＨＣクラスＩを提示する
毎年数百万人の人が組織の消失または終段階の器官不全を患う。同種療法は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。これらの療法は、深刻なドナーの不足、長期罹患率、および死亡率によって制限される。広範な移植、先天異常、選択術、および遺伝子異常は、ＨＬＡが一致したドナー組織の供給源として、自己由来の幹細胞による治療の能力を有する。本発明者らの現在の調査は、ヒト始原および多能性間葉幹細胞における細胞表面クラスター分化（ＣＤ）マーカーを特徴付けて、これらの細胞の比較的精製された集団の単離に役立てることをることを目的としている。本研究では、１５  ＣＤマーカーが存在するか能性について、胎児、成熟、および老齢個体から単離されたヒト多能性および始原細胞を試験した。インスリンおよびデキサメタゾンに対する応答は、細胞単離物が分化決定された始原細胞および分化未決定の多能性細胞から成ることを示した。フローサイトメトリーは、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６、およびＭＨＣクラスＩマーカーに対して陽性ならびにＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、およびＣＤ６５マーカーに対して陰性である細胞集団を示した。ノーザン分析は、細胞回収時のＣＤ１３およびＣＤ５６が有効に転写されたことを示す。本発明者らは、まず、これらのヒト間葉幹細胞上のＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６、およびＭＨＣクラスＩ表面抗原の同定について報告する。
【０３４５】
多くの研究により、多くの動物の結合組織画分に広範に分布する間葉幹細胞の存在が示されている。これらの細胞は、個体の生涯を通して、組織の継続的な維持および修復を提供している。これらの細胞の例としては、筋肉の単能性始原筋付随体幹細胞（Ｍａｕｒｏ、１９６１；Ｃａｍｐｉｏｎ、１９８４；Ｇｒｏｕｎｄｓら、１９９２）；脂肪組織の単能性脂肪芽細胞（Ａｉｈａｕｄら、１９９２）；それぞれ軟骨膜および骨膜の単能性軟骨形成および骨形成幹細胞（Ｃｒｕｅｓｓ、１９８２；Ｙｏｕｎｇら、１９９５）；脂肪組織の二能性脂肪繊維芽細胞（Ｖｉｅｒｃｋら、１９９６）；骨髄の軟骨形成／骨形成幹細胞（Ｏｗｅｎ、１９８８；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ、１９８９；  Ｃａｐｌａｎら、１９９７）；ならびに骨髄および末梢血の多能性造血幹細胞（ＰａｌｉｓおよびＳｅｇｅｌ、１９９８；ＭｃＧｕｉｒｅ、１９９８；Ｒａｔａｊｃｚａｋら、１９９８）が挙げられる。
【０３４６】
連続希釈クローン可能分析（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，  １９９８ａ，  ｂ；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）は、間葉幹細胞が２つの特有に異なるカテゴリーの細胞：様々な系統に決定された始原細胞（上記を参照されたい）、および何ら特定の系統に決定されていない多能性細胞から成ることを示している。さらなる分析（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９５）は、多能性系統特異的始原細胞および多能性細胞は、様々な組織の結合組織画分にも存在することを示した。例えば、骨格筋の結合組織は、筋付随体細胞（骨格筋の前駆細胞）および繊維芽細胞（結合組織の前駆細胞）だけではなく、脂肪芽細胞（脂肪の前駆細胞）、軟骨形成始原細胞（軟骨の前駆細胞）、骨形成細胞（骨の前駆細胞）、および分化未決定の多能性幹細胞を含有する。
【０３４７】
分化決定された始原細胞は、Ｈａｙｆｌｉｃｋ限界（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，  １９６５）に順応し、プログラム化された細胞老化および死が生じる前に５０〜７０細胞倍加に制限された寿命を有する。始原細胞は、それらが決定されている系統に制限された細胞型に分化する（上記を参照されたい）。対照的に、多能性幹細胞は、該細胞が分化未決定を保持する限り、Ｈａｙｆｌｉｃｋ限界を超えて広範な自己再生のための能力を有する多能性幹細胞は、胚性中胚葉株内の任意の組織系統に決定することができる。
一旦、特定の系統に決定されれば、これらの細胞は始原細胞のすべての帰属物であるとみなされる。
【０３４８】
本発明者らは、始原および多能性細胞が、ドナー組織の供給が不足している移植および／または遺伝子療法に価値があり得ることを提唱する。実際、Ｇｒａｎｄｅら（１９９５）は、ウサギ全層軟骨欠損モデルにおいてウサギ多能性細胞を使用した。関節軟骨の再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）ならびに隣接する肋軟骨下骨および海面質（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｂｏｎｅ）の再構築において劇的な結果が報告された。
【０３４９】
先の研究（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）では、始原および多能性細胞を、限界連続希釈クローン可能分析（１８〜２４箇月）またはＨａｙｆｌｉｃｋ限界超増殖（５〜９箇月）によって始原細胞および多能性細胞を単離および区別するためには、長期間が必要である。これらの細胞が臨床施設で有用であるためには、単離の容易性および分化決定の誘導を改善しなければ成らない。しかし、本発明者らの現在の調査は、単離および区別に必要な時間を短縮するために、ヒト始原および多能性細胞のヒト表面抗原を特徴付けることを目的としている。
【０３５０】
造血細胞上の細胞表面抗原を特徴付けるために、フローサイトメトリーと組み合わせて、細胞表面クラスター分化（ＣＤ）に対する抗体が使用されている。現在までに、造血細胞系統の「特徴を識別する」ために、１８０を超えるＣＤマーカーが使用されている（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。本文献において報告された実験は、胎児、成体、および老齢ドナーから単離されたヒト雄性ならびに雌性始原および多能性幹細胞上の１５種の細胞表面ＣＤマーカーを特徴付けることに関与した。本発明者らは、まず、ヒト始原および多能性間葉幹細胞上のＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６、およびＭＨＣクラスＩ表面抗原の同定について報告する。ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤｌｌｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、およびＣＤ６５抗原については陰性の結果が得られた。細胞からＲＮＡを抽出し、電気泳動し、ノーザン分析を使用して、ＣＤ１０、ＣＤ１３およびＣＤ５６に対する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡをプローブとして検出した。細胞回収時のＣＤ１３およびＣＤ５６が有効に転写されていた。
【０３５１】
【材料および方法】
（材料および方法は、以下に記載のものは例外として、上記の実施例１に記載のとおりである。）
【０３５２】
ヒト間葉幹細胞
成体（雌性）、胎児（雄性および雌性）、および老齢（雄性および雌性）の５種のヒト細胞集団を、本研究に使用した。成体雌性細胞を、２５歳ヒト皮膚繊維芽細胞［ＮＨＤＦ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＣＣ−０２５２，  ｌｏｔ  ＃  ６Ｆ０６００，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ］のサブ密集培養物として購入した。胎児雄性細胞を、大腿筋から誘導した２２歳胎児骨格筋細胞［ＣＭ−ＳｋＭ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＣＣ−０２３１，  ｌｏｔ  ＃６Ｆ０６０４，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ］のサブ密集培養物として購入した。胎児雌性細胞を、三頭筋から誘導した２５週齢胎児骨格筋細胞［ＣＦ−ＳｋＭ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＣＣ−２５６１，  ｌｏｔ  ＃  １４７２２，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ］のサブ密集培養物として購入した。到着時に、細胞を平板培地−Ａ（ＰＭ−Ａ）に移した。ＰＭ−Ａは、Ｅａｒｌｅ塩、１０％（ｖ／ｖ）予め選択されたウマ血清［ロット番号  １７Ｆ−０２１８  （ＨＳ７）  ｏｒ  ４９Ｆ−００８２  （ＨＳ４），  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ］、および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン［１０，０００単位／ｍｌペニシリンおよび１０，０００  ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、ＧＩＢＣＯ］を有する８９％（ｖ／ｖ）Ｅａｇｌｅ最小必須培地［ＥＭＥＭ，  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ］、ｐＨ  ７．４から成った。細胞を３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境でインキュベートした。増殖後、０．０７４４％（ｗ／ｖ）エチレンジアミンテトラ酢酸［ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ］を含有するＣａ＋２、Ｍｇ＋２を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水［ＧＩＢＣＯ］中０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン［ＤＩＦＣＯ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ］で細胞を遊離させ、１００×ｇで２０分間、遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引した。細胞ペレットをＰＭ−Ａに再懸濁し、細胞懸濁物を、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ，  Ｍｏｒｔｏｎ  Ｔｈｉｏｋｏｌ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ］を含有するＰＭ−Ａ中で−７０〜８０℃で緩徐に凍結保存した（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。
【０３５３】
間葉幹細胞の単離のための標準プロトコール（Ｙｏｕｎｇら、１９９５；Ｌｕｃａｓら、１９９５）に従って、６７歳雄性患者および７７歳雌性患者から得た骨格筋の標本から老齢細胞を単離した。雄性細胞を「ＰＡＬ＃３」と呼び、雌性細胞を「ＰＡＬ＃２」と呼んだ。簡単に説明すると、コラゲナーゼ［ＣＬＳ−１，  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，  ＮＪ］およびディスパーゼ［ｃａｔａｌｏｇ  ＃４０２３５，  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ］で骨格筋の結合組織画分から細胞を遊離させた。９０  ｍｍおよび２０  ｍｍ  Ｎｉｔｅｘ  ［Ｔｅｔｃｏ  Ｉｎｃ．，  Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，  ＮＹ］を介する．連続ろ過によって、単一の細胞懸濁液を得た。細胞を１０５細胞／１％（ｗ／ｖ）ゼラチン被覆［ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，  ＮＪ］  Ｔ−７５フラスコ［Ｆａｌｃｏｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ］でＰＭ−Ａに播種し、凍結保存前に増殖および分化させた。細胞を３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境でインキュベートした。増殖後、トリプシンで細胞を遊離させ、上記のように篩い分けして分化した表現型（即ち、多核筋管、脂肪細胞コロニー、軟骨小節、骨小節）から単核細胞を区別し、７．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有するＰＭ−Ａ中、−７０〜−８０℃で凍結保存した。上記で該述した手順を使用して、それぞれの以後の工程では、幹細胞調製物から９８％を超える混入繊維芽細胞および分化した表現型を除去する（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。
【０３５４】
平板培地−Ｂ（ＰＭ−Ｂ）を有する１％ゼラチン被覆フラスコを利用する多数の増殖および凍結保存工程によって、始原および多能性細胞をさらに精製した。ＰＭ−Ｂは、０．０１  ｍＭ  Ｗβ−メルカプトエタノール［Ｓｉｇｍａ］、１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清［ＨＳ３，  ロット番号３Ｍ０３３８，  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ］、および１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗カビ剤溶液［ＧＩＢＣＯ］を含有する８９％（ｖ／ｖ）  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに基づく培地［ｃａｔａｌｏｇ  ＃２２６００−０５０，  ＧＩＢＣＯ］から成った。次いで、細胞を３０倍加まで増殖させ、トリプシンで遊離させ、インスリン／デキサメタゾン分析、フローサイトメトリーおよび分子分析のためにアリコートに分けた。
【０３５５】
始原および多能性細胞を同定するためのインスリン／デキサメタゾン分析
ＣＭ−ＳｋＭ、ＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、ＰＡＬ＃３、およびＰＡＬ＃２細胞のアリコートを融解し、ＰＭ−Ｂを利用する１％ゼラチン被覆２４ウェルの平板［Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ］中ウェルあたり１０，０００細胞で個別に平板固定した。２４時間後、ＰＭ−Ｂを取り出し、対照培地、インシュリン試験培地、またはデキサメタゾン試験培地のいずれかと置き換えた。対照培地は、０．０１  ｍＭβメルカプトエタノール、１％（ｖ／ｖ）  ＨＳ３、および１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗カビ剤溶液を含有する９８％（ｖ／ｖ）  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭから成った。インスリン試験培地は、２μｇ／ｍｌインスリン［Ｓｉｇｍａ］を含有する対照培地から成った。デキサメタゾン試験培地は、９８％Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、０．０１  ｍＭβメルカプトエタノール、１％血清［ＨＳ３，  ＨＳ９  （ウマ血清、ロット番号  ９０Ｈ−０７０１，  Ｓｉｇｍａ）またはＦＢＳ  （ウシ胎児血清、ロット番号  ３０００Ｌ，  Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）］、および１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗カビ剤溶液から成った。この溶液では、デキサメタゾン［Ｓｉｇｍａ］を１０−１０、１０−９、１０−８、１０−７Ｍとした（Ｙｏｕｎｇら、１９９５；Ｙｏｕｎｇ、１９９９；Ｙｏｕｎｇら、１９９８）。６週間の間に、培地を１週間あたり３回交換した。表現型の変化について１週間あたり２回培地を観察し、写真撮影した。
【０３５６】
細胞の表現型発現の明白な変化について形態学的にアッセイした。これらの形態学的組織細胞型は、インスリンまたはデキサメタゾンと共にインキュベートされたトリおよびマウス間葉幹細胞において先に認められ、組織化学的および免疫科学的手順によって広範に分析された（Ｙｏｕｎｇら、１９９５；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９３；Ｙｏｕｎｇ、１９９９；Ｙｏｕｎｇら、１９９８）細胞型と同一であった。１週間目に細長い多核構造が出現し、筋原構造を同定した（図２２Ａ）。２週間目には、脂肪生成細胞を多数の細胞な収縮性小胞を含有する多核細胞と同定した（図２２Ｂ）。  ４週間目には、軟骨形成細胞を丸型細胞の凝集物として（シート状または離散した小節として）同定した（図２２Ｃ）。６週目に、骨形成細胞を、細胞凝集物の重層する３次元の細胞外マトリックスとして同定した（図２２Ｄ）。
【０３５７】
フローサイトメトリー
ＣＭ−ＳｋＭ、ＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、ＰＡＬ＃３、およびＰＡＬ＃２細胞のアリコートを融解し、１０５細胞／１％ゼラチン被覆Ｔ−７５フラスコでＰＭ−Ｂに播種し、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境で増殖させた。増殖後、トリプシンで細胞を遊離させ、ＰＭ−Ｂに再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で洗浄緩衝液に再懸諾した。洗浄緩衝液は、１％（ｗ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ＮａＮ３  ［Ｓｉｇｍａ］を補充したリン酸緩衝液から成った。トリパンブルー［ＧＩＢＣＯ］染料除外技術（Ｙｏｎｇら、１９９３；Ｙｏｎｇら、１９９１）により細胞生存度は＞９５％であった。１００マイクロリットルの細胞調製物（１×１０５細胞）を、飽和濃度のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、またはペルジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）結合ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６５、ＭＨＣクラスＩまたはイソタイプ一致対照［Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ］で染色した。簡単に説明すると、細胞を暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメトリー上での分析のために０．５  ｍｌの洗浄緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳｃａｎ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上でフローサイトメトリーを実施した。光散乱によって細胞を同定した。１０，０００ゲート制御事象における蛍光の対数を評価した（４十進計、１０２４チャンネルスケール）。ＬＹＳＹＳ  ＩＩ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析を実施し、適切なイソタイプ対照と比較してそれぞれの抗原の有無を決定した。蛍光がイソタイプ対照よりも２５％を超えて大きい場合は抗原事象をゲート制御した。５種の間葉幹細胞株から得られたプールされたフローサイトメトリーデータについて、統計解析を実施した。従って、それぞれのＣＤマーカーに対して５種のサンプルサイズを使用した。１０，０００ゲート制御事象あたりの細胞の絶対数を表１０に示す。平均値が１０００細胞を超えたら任意のＣＤマーカーについて陽性とみなした。
【０３５８】
分子分析
ＣＭ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、およびＰＡＬ＃３細胞のアリコートを融解し、１０５細胞／１％ゼラチン被覆Ｔ−７５フラスコでＰＭ−Ｂに播種し、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境で増殖させた。培養後、細胞をトリプシンで遊離させ、凍結保存した。得られた上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットを凍結し、−８０℃で保存した。細胞ペレットを氷上で融解し、製造者の取扱説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡシュレッダー  ［ｃａｔａｌｏｇ  ＃７９６５４，  Ｑｉａｇｅｎ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ］およびＲＮｅａｓｙ総ＲＮＡキット［ｃａｔａｌｏｇ  ＃７４１０４，  Ｑｉａｇｅｎ］を使用して、総ＲＮＡをＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、およびＰＡＬ＃３細胞から抽出した。．  ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６およびβアクチン（それぞれＩ．  Ｍ．  Ａ．  Ｇ．  Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ  ：  ７０１６０６、７１３９６１、４６８８８５、および５８６７３６、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  Ａｌ）のＩ．  Ｍ．  Ａ．  Ｇ．  Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  （ＬＬＮＬ）  ｃＤＮＡクローン（Ｌｅｎｎｏｎら、１９９６）を得た。制限消化によって、プラスミドからｃＤＮＡ挿入物を切り出し、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従ってアガロースゲル電気泳動により分離した。製造者の取扱説明書に従い、Ｑｉａｅｘ  ＩＩゲル抽出キット［ｃａｔａｌｏｇ  ＃２００２１，  Ｑｉａｇｅｎ］を使用して、ｃＤＮＡのバンドを使用した。Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔランダムプライマー標識キットＫｉｔ  ［ｃａｔａｌｏｇ  ＃３００３８５，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ］を使用して、３，０００  Ｃｉ／ｍＭα［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ［ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡ０００５，  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ］の取り込みによりｃＤＮＡを標識した。
【０３５９】
ノーザン分析：ホルムアルデヒド／アガロースゲル［ホルムアミド、ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｆ７９−５００、およびアガロース、ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＢＰ１６４−１００，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ］を介して総ＲＮＡ（３０μｇ／レーン／細胞株）を電気泳動し、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従ってナイロン膜［ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＮＪ０ＨＹＢ００１０  Ｍａｇｎａｇｒａｐｈ，  Ｆｉｓｈｅｒ］に移した。ローラーボトルにおいて、６８℃で１晩、ＱｕｉｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液［ｃａｔａｌｏｇ  ＃２０１２２０，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ］中でハイブリダイゼーションを行った。洗浄は製造者の取扱説明書に従って行った。増感スクリーンを使用して、−７０℃〜−８０℃でオートラジオグラフィー［Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃０４−４４１−９５，  Ｆｉｓｈｅｒ］を行った。
【０３６０】
【結果】
細胞の同定
分析にインスリンおよびデキサメタゾンを使用して、ヒト胎児、成熟、および老齢細胞集団内に存在する細胞の正体を試験した。５種すべてのヒト細胞集団において、骨格筋筋管、脂肪細胞、軟骨小節、および骨小節に一致する形態学がインスリンまたはデキサメタゾンによる処理で生成された。しかし、インスリンよりもデキサメタゾンの方が、誘導される形態の百分率が高かった（表９、図２２Ａ〜Ｄ）。データは、始原細胞（インスリンにより加速された形態）および多能性細胞（デキサメタゾンにより加速された形態）の両方が２５歳雌性表皮、２２週齢胎児雄性および２５週齢胎児雌性（生前）骨格筋結合組織、ならびに６７歳雄性および７７歳雌性骨格筋結合組織に存在することを示唆する。
【０３６１】
【表９】
2004504003.tif 000009
【０３６２】
フローサイトメトリー分析
ヒト始原細胞および多能性細胞によって発現される細胞表面抗原については不明であるため、本発明者らは、フローサイトメトリーと組み合わせた免疫化学によりＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６５、およびＭＨＣクラスＩの存在について５種の細胞集団を分析した。この強力な技術により、本発明者らは多量の細胞を比較的迅速かつ容易に試験することができた。試験したすべてのヒト細胞集団は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６、およびＭＨＣクラスＩの細胞表面発現について陽性であり、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、およびＣＤ６５については陰性であった（表１０、図２３および２４）。データは、ＣＤ１０（中性脂肪）、ＣＤ１３（アミノペプチダーゼ）、ＣＤ５６（神経細胞接着分子、１４０ｋＤａイソ型）、ならびに胎児（雄および雌）、成体（雌）、および老齢（雄および雌）年齢におけるこれらのヒト細胞の細胞表面に位置する腫瘍組織適合性クラスＩ抗原を示した。
【０３６３】
【表１０】
2004504003.tif 000010
【０３６４】
ＣＤ１０、ＣＤ１３、およびＣＤ５６の分子分析
ＣＤ１０（中性脂肪）、ＣＤ１３（アミノペプチダーゼ）、およびＣＤ５６（神経細胞接着分子、１４０ｋＤａイソ型）が回収時の細胞によって転写されるかどうかを決定するために、ＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、およびＰＡＬ＃３サンプル由来の総ＲＮＡを、ヒトＣＤ１０、ＣＤ１３、およびＣＤ５６３２Ｐ標識ｃＤＮＡをプローブとして使用するノーザンブロット技術によって分析した。細胞回収時のＣＤマーカーの転写において様々なパターンが観察された（表１０、図２８）。３種のすべての細胞株においてＣＤ５６−ｍＲＮＡへの強力なｃＤＮＡ結合が観察され、３種のすべての細胞株において神経細胞接着分子イソ型の有効な転写が示唆された。ＣＤ１３−ｍＲＮＡへのｃＤＮＡは弱い（ＣＦ−ＳｋＭ）、強い（ＮＨＤＦ）、または存在しない（ＰＡＬ＃３）かのいずれかであり、異なる細胞株内のアミノペプチダーゼの転写にばらつきがあることが示唆された。ＣＤ  １０  ｍＲＮＡへのｃＤＮＡ結合は、試験した３種のいずれの細胞株においても認められなかった。この所見は、２つの可能性を示唆している：ＣＤ１０のｍＲＮＡは、細胞回収時に転写されなかったか、またはＣＤ１０のｍＲＮＡの量がアッセイの検出限界未満であったかのいずれかである。
【０３６５】
【考察】
毎年数百万人の人々が組織の消失または終段階の器官不全を患う（ＬａｎｇｅｒおよびＶａｃａｎｔｉ、１９９３）。これらの患者のための米国の国民医療費の合計は、１年あたり４千億ドルを超えている。現在、米国では、これらの障害を治療するために年間８百万を超える外科手順が実施されており、４千万〜９千万の病院日数が必要である。これらの外科手順は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。組織移植および外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足および長期の病的状態、および死亡のために厳しく制限されている。ドナー不足は毎年悪化し、必要な臓器の待機リストに掲載されながら死亡する患者の数が増加している。広範な移植、先天異常、選択術、疾患、および遺伝子異常は、ドナー組織の供給源として、自己由来の幹細胞単独または他の薬剤との組み合わせでの治療の能力を有する。好ましい治療は、組織消失の治療であり、ここで、目的は移植に利用可能な細胞数を増加し、それによって失われた組織を置換するかまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のための十分な細胞数を提供することである。自己由来の細胞を使用すれば、同一のＨＬＡ一致が得られ、同種異系移植および免疫抑制治療に伴う病態および死亡が妨げられるはずである。
【０３６６】
先の研究では、ヒト（Ｙｏｕｎｇら、１９９２ａ；Ｙｏｕｎｇら、１９９５；Ｌｕｃａｓら、１９９３；Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｐａｔｅ  ｅｔら、１９９３；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６）を含む多くの動物種の結合組織マトリックス内に位置する中胚葉幹細胞の存在が明らかにされている。これらの細胞には２つのカテゴリーが存在することが、連続制限希釈クローン可能分析によって明らかにされている（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９８６；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５）；Ｙｏｕｎｇ、１９９９）。分化決定された始原細胞は、（筋原、繊維形成、脂肪生成、軟骨形成または骨形成系統などの単一の系統の組織を形成する）単能性、（軟骨−骨形成または脂肪繊維系統などの２つの系統の組織を形成する）二能性、または（造血系統などの同じ系統内で多数の組織もしくは細胞を形成する）多能性のいずれかである。分化決定された始原細胞は自己複製が可能であるが、プログラムされた細胞の老化が生じる前に約５０〜７０細胞倍加までの制限された寿命を有する。始原細胞の個々のクローンは、個別の系統の子孫（例えば、筋原、繊維形成、脂肪生成、軟骨形成、および骨形成）を生じることによって、系統制限を示す。始原細胞の１つの独特な特徴は、インスリン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、またはインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）などの発達因子で処理することによってそれらの表現型発現を加速することができることである（Ｙｏｕｎｇ、１９９９；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）。対照的に、多能性細胞は広範な自己再生が可能であり、単一の細胞から様々な分化決定された始原細胞を作製する能力を有する。例えば、生後多能性マウスクローンは、長期間のデキサメタゾン処理によって、６９０を超える細胞倍加後に骨格筋、脂肪、軟骨、および骨の特徴を有する形態学的かつ表現型発現を示す分化決定された始原細胞を形成するように誘導される（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）。デキサメタゾン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、筋形態形成タンパク質（ＭＭＰ）などの分化誘導因子で分化決定を誘導する必要がある（Ｙｏｕｎｇ、１９９９；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）。インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＦ−ＩＩなどの発達因子は、多能性細胞に影響を及ぼさない（Ｙｏｕｎｇ、１９９９）。一旦、ＰＰＭＳＣが特定の組織系統に決定される（即ち、分化決定された始原細胞になる）と、理論的に、それらの複製能は、プログラムされた細胞老化が生じる前の約５０〜７０細胞倍加に制限される。これらの新たに作製された始原幹細胞は、（血小板誘導性成長因子などの増幅因子の影響下で）最大で５０〜７０細胞倍加で増幅することができる。それらはまた、（発達因子の影響下で）個別の中胚葉株に沿ってさらに分化することもできる（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９３，  １９９８ａ，  １９９８ｂ）。
【０３６７】
これらの細胞には増殖および分化能の両方があるため、本発明者らは、それらが、ドナー組織の供給が不足している様々な移植および／または遺伝子療法において重要な価値があり得ることを提唱する。実際に、哺乳動物多能性細胞を単離するための本発明者らのプロトコール（Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｐａｔｅら、１９９３）を利用して、Ｇｒａｎｄｅら（Ｇｒａｎｄｅら、（１９９５））は関節軟骨ならびにラットの全層関節軟骨欠損の治療における肋軟骨下骨および海面質（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｂｏｎｅ）の再構築において劇的な結果を示している。
【０３６８】
多能性細胞の単離、発達、および分化決定の誘導に必要な時間は、細胞が取り出され、処理され、患者の身体に再導入される多くの臨床状況で使用されるべきこれらの細胞にしては相対的に短い。哺乳動物多能性細胞の単離は、代替的方法によって達成することができる。多能性細胞は、先に記載（Ｙｏｕｎｇら、１９９１；Ｙｏｕｎｇら、１９９５；Ｌｕｃａｓら、１９９５）のように７．５％（ｖ／Ｖ）  ＤＭＳＯを含有する培地における−７０〜−８０℃での冷凍保存の手段によって得ることができる。あるいは、精製された多能性細胞集団は、Ｈａｙｆｌｉｃｋ限界（５０〜７０細胞倍加）（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、１９６５）を超えた１次回収物から単離された細胞を発達させることによって、得ることができる。この手順は５〜９箇月を要する。さらなる手順は、連続希釈クローン可能分析によって多能性および始原細胞の個々のクローンを単離することである。この手順は１８〜２４箇月を要する。本発明者らは、これらの細胞を単離するための時間を最小限にしたいと考えている。本発明者らの現在の調査の１つの態様は、ヒト始原および多能性細胞上の細胞表面抗原を特徴付けすることを目的とする。この知識は、より高度に精製されたこれらの細胞集団を単離するのに必要な時間および操作を減少することを意図する。
【０３６９】
これは、ヒト始原および多能性間葉幹細胞についての中性エンドペプチダーゼ（ＣＤ１０）、アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）、神経細胞接着分子、１４０  ｋＤａ、イソ型（ＣＤ５６）、およびＭＨＣクラスＩの細胞表面局在化を実証するための最初の研究である。本発明者らは、これらの細胞表面ＣＤ抗体は、最初の細胞回収物からより精製されたヒトの細胞集団を単離するための最初の工程として、フローサイトメトリーおよび蛍光標示式細胞分取または磁気ビーズ技術と共同で使用することができることを示唆する。これらの自家細胞で富化された集団で開始することは、培養時間ならびに様々な移植および／または遺伝子治療のための適切な数の始原および多能性細胞を得るために必要な費用を有意に減少する。
【０３７０】
ヒト中胚葉細胞におけるＣＤマーカーの陽性染色
本研究において利用されるヒト胎児、成体、および老齢細胞によって発現される特定の細胞表面部分ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６、およびＭＨＣクラスＩの機能的重要性については、現在のところまだ不明である。しかし、ＣＤ１０、ＣＤ１３、およびＣＤ５６は、造血系内の分化された細胞および早期幹細胞の両方において発現されることは既知である（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。細胞表面中性エンドペプチダーゼ（ＣＤ１０）は、汎急性リンパ性白血病（ＣＡＬＬＡ）細胞、早期リンパ球始原細胞、成熟顆粒球、および好中球を同定する方法としてクラスター分化（ＣＤ）マーカーに対する抗体およびフローサイトメトリーと共に利用されている（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。この膜関連亜鉛金属ペプチダーゼは、エンケファリン、化学走性ペプチド、サブスタンスＰ、ニューロテンシン、オキシトシン、ブラジキニン、ならびにアンジオテンシンＩおよびＩＩを含む広範な調節ペプチドホルモンを不活化することが明らかにされている（Ｓｈｉｐｐら、１９８９；Ｓｈｉｐｐら、１９９１ａ；Ｌｌｏｒｅｎｓ−Ｃｏｒｔｅｓら、１９９２；Ｃａｓａｌｅら、１９９４）。
【０３７１】
細胞表面アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）は、顆粒球および単球（ＣＦＵ−ＧＭ）の早期決定された始原細胞を同定するためにフローサイトメトリーと共に利用されている。これらの系統のすべての細胞は成熟しているので、ＣＤ１３は、それらによって発現される（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。ＣＤ１３はまた大きな顆粒リンパ球の小部分上で発現されるが、他のリンパ球では発現されない（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。ＣＤ１３は、アミノペプチダーゼＮ（ＥＣ  ３．４．１１．２）、膜結合性亜鉛結合金属プロテアーゼに構造上同一である（Ｌｏｏｋら、１９８９；Ｌａｒｓｅｎら、１９９６）。この酵素は、多様な細胞型によって産生される調節ペプチドからのＮＨ２末端アミノ酸の除去を触媒する（Ｌａｒｓｅｎら、１９９６；Ｗｅｂｅｒら、１９９６）。
【０３７２】
これらの幹細胞における細胞表面酵素、中性エンドペプチダーゼ（ＣＤ１０）およびアミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）の１つの可能な機能は、それらが、好ましくはオートクリン、パラクリン、および／またはエンドクリン調節ペプチド（例えば、分化決定作用物質、発達因子、および増殖作用物質）を分解することによって、分化過程を調節する役割をし得ることである。Ｙｏｕｎｇら（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）は、様々なパラクリンおよびエンドクリン調節ペプチドが増殖、分化決定、および始原および多能性幹細胞における系統発達を変更する能力を実証した。．  これらの化合物は、増殖（血小板誘導性成長因子−ＡＡおよび−ＢＢ）、系統誘導（デキサメタゾン、ＢＭＰおよびＭＭＰ）、ならびに発達（インスリン、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）に影響する化合物を含んだ。それらの研究は、分化は、分化未決定の多能性幹細胞から分化決定された始原幹細胞へ促進するため、幹細胞が特定の調節ペプチドに応答する能力がより厳密に制御されることを示唆した。
【０３７３】
神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ，  ＣＤ５６）の１４０  ｋＤａイソ型は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）Ｔ細胞を同定するための始原型マーカーとしてフローサイトメトリーと共に利用されている（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  ら、．，  １９９７）。その機能は、造血細胞によっては納得できるほどには明らかにされていないが、Ｃ２−ｓｅｔ  Ｉｇ領域ならびに細胞外ドメイン内のフィブロネクチン領域のために、ＮＫおよびＴ細胞へのホモフィリックな接着に関与することが示唆されている（Ｌａｎｉｅｒら、１９８９；Ｌａｎｉｅｒら、１９９１）。ＮＣＡＭによる非造血組織、ホモフィリックおよびヘテロフィリックな接着について、細胞−細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用の両方を調節することが提唱されている。このことは、一部、細胞外マトリックス（細胞の接着および移動に重要なエレメントである）に関連するＩ型コラーゲンと相互作用する能力に原因があり得る（Ｍｅｙｅｒら、１９９５）。ＮＣＡＭは、早期胚細胞に出現し、細胞集合体および形態形成部位の境界の形成に重要である（Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、１９９２）。発生の後半では、様々な分化組織においてＮＣＡＭが認められる。
【０３７４】
先の研究（Ｙｏｕｎｇら、１９９５；Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９３；Ｙｏｕｎｇ、１９９９）で、間葉幹細胞が、骨格筋、心筋、平滑筋、および骨（骨芽細胞）などの中胚葉由来の組織を形成する能力が明らかにされた。これらの特定の分化された細胞型は、分化を生じる細胞−細胞間および細胞−マトリックス間相互作用のためにＮＣＡＭを利用することを明らかにしている（Ｋｎｕｄｓｅｎら、１９９０；ＰｅｃｋおよびＷａｌｓｈ、１９９３；Ｂｙｅｏｎら、１９９４；Ｌｙｏｎｓら、１９９２；Ｒｏｍａｎｓｋａら、１９９６；ＬｅｅおよびＣｈｕｏｎｇ、１９９２）。ＣＤ５６を示している５種の細胞株内の間葉幹細胞の百分率が特に興味深い（表１０）。ＣＤ５６を示す細胞数の差異は、暦年齢または回収時の細胞の機能能力を反映し得る。また、各細胞株におけるＣＤ５６を示す細胞の百分率は、それぞれの集団内の始原対多能性幹細胞の絶対数を反映し得る。細胞表面ＮＣＡＭは、正常な胚発達中に、それぞれの組織系統経路に沿った間葉幹細胞のさらなる分化のための調製に必要な細胞−細胞間および細胞−マトリックス間相互作用を調節するように機能する。それはまた、成体においても同様の機能を有する。
【０３７５】
細胞表面主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、すべての脊椎動物種に存在し、身体内のほとんどすべての有核細胞上で発現されることが示されている（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、１９９６）。ＭＨＣクラスＩ分子は、抗原のプロセシングおよび提示の現象に中心的な役割を果たし（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、１９９６；Ａｂｂａｓら、１９９７）、それらはまた、自己および非自己を区別する免疫応答の機序を理解するために広範に研究されている。間葉幹細胞は、組織工学のための細胞の供給源として、移植のためのドナーまたは遺伝子治療のための送達ビヒクルのいずれかとして提唱されている（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ，  ｂ）。示されているように（表１０）、胎児、成体、および老齢個体から単離された幹細胞の集団内の８０％を超える細胞は、ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する。このことは、それらの特定のクラスＩ抗原発現細胞が、ＭＨＣミスマッチ免疫応答性個体において外来として認識されるため、従って、それらは自己または同系移植にのみ使用すべきであることを示す。対照的に、約５％の胎児性および成体幹細胞ならびに１５％の老齢幹細胞がＭＨＣクラスＩ抗原を発現しないことが認められている。このようにＭＨＣクラスＩ抗原発現が明らかに減少するのは、細胞表面クラスＩ抗原の量が、利用される免疫組織学的／フローサイトメトリー手順による検出限界を下回ること、または幹細胞の特定の部分集合由来のこれらの分子がまったく存在しないことによるようである。この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。これらの幹細胞上の細胞表面クラスＩ分子の有無は、特定の細胞の「分化」状態、即ち、ＭＨＣクラスＩ抗原を示すより分化した（始原）幹細胞およびこれらの特定の細胞表面抗原を発現しないより原始的な（多能性）幹細胞を表し得る。あるいは、特定の幹細胞の「分化」状態は、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ抗原の発現に関係し得ない。この例では、免疫系から本質的に隠れているＭＨＣクラスＩ抗原を有さない幹細胞の部分集合が存在し得、従って、普遍的組織移植物の候補であり得る。そのような特定の部分集合の細胞は、同系異種移植手順に有用であり得る。この領域は、現在研究中である。
【０３７６】
ヒト間葉幹細胞におけるＣＤマーカーの陰性染色
上記の４種の陽性染色細胞表面抗原とは対照的に、以下の１１種の抗原は、胎児、成体、および老齢ヒト間葉幹細胞の細胞表面上には存在しないことが認められた。これらのマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ  １６、ＣＤ  １９、ＣＤ２５、ＣＤ４５、およびＣＤ６５であった。．この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。しかし、これらの特定の細胞表面抗原は、造血系（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）、即ち、Ｔ細胞（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ４５）、Ｂ細胞（ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５）、胸腺細胞（ＣＤ７）、顆粒球（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ４５、ＣＤ６５）、単球（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ４５）、濾胞樹状細胞（ＣＤ  １９）、および成熟赤血球（ＣＤ４５）にのみ存在するとされている。
【０３７７】
結論として、これは、ヒト間葉幹細胞についての中性エンドペプチダーゼ（ＣＤ１０）、アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）、神経細胞接着分子イソ型（ＣＤ５６）、およびＭＨＣクラスＩの細胞表面局在化を実証するための最初の研究である。それ自体で、本発明者らは、これらの細胞表面ＣＤマーカーは、最初の細胞回収物由来のヒト始原および多能性細胞のより精製された団を単離するための最初の工程として、フローサイトメトリー、蛍光標示式細胞分取、磁気ビーズ分離、または抗体精製カラムと共同で使用することができることを示唆する。これらの中胚葉細胞で富化された集団で開始することは、培養時間および供給費用の両方を有意に減少し、様々な移植および／または遺伝子治療に必要な始原および多能性細胞の収量を改善する。
【０３７８】
【実施例８】
ヒト間葉幹細胞は造血細胞表面クラスター分化マーカーＣＤ３４およびＣＤ９０を示す
ここでは、ヒト間葉幹細胞上の１３種の細胞表面クラスター分化マーカーのプロフィールについて詳細に報告する。間葉幹細胞の単離、冷凍保存、および発達のための以下の標準的なプロトコールに従い、胎児、および老齢個体から細胞を単離した。それぞれの個体由来の間葉幹細胞集団は、始原および多能性幹細胞の両方から成った。３０細胞倍加での間葉幹細胞の結果は、ＣＤ３４およびＣＤ９０については陽性染色、ならびにＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、グリコホリンＡ、およびＨＬＡ−ＩＩ（ＤＲ）については陰性染色を示した。各細胞株からＲＮＡを抽出し、電気泳動し、ノーザン分析を使用して、ＣＤ３４およびＣＤ９０に対する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡをプローブとして検出した。結果は、細胞回収時にＣＤ９０が有効に転写されたことを示す。本発明者らは、ヒト間葉幹細胞上でのＣＤ３４およびＣＤ９０細胞表面抗原の最初の同定について報告する。
【０３７９】
幹細胞を臨床的に有用であるようにするためには、単離、発達、およびそれらを患者身体に再導入する前の幹細胞の分化決定の誘導に必要な期間は、比較的短くなければならない。従って、本発明者らの調査は、ヒト間葉幹細胞上の細胞表面抗原を特徴付けてこれらの細胞のより精製された集団の単離を容易にすることに焦点を置く。幹細胞に対する独特な細胞表面抗原を同定することにより、幹細胞の単離を促進するためにこれらの抗原に対する抗体を使用することが可能である。現在検討中の１つの技術では、蛍光標識した抗体および蛍光標示式細胞分取と組み合わせたフローサイトメトリーを使用する。この技術は、細胞表面抗原のプロフィールに基づく造血細胞を特徴付け、単離するために、クラスター分化（ＣＤ）マーカーと共に使用されている。実際に、様々なリンパ球産生および赤血球生成系統内の個々の細胞型を特徴付けおよび単離するために、１８０を超える個々のＣＤマーカーが使用されている（Ｋｉｓｉｈｍｏｔｏら、１９９７）。
【０３８０】
本文献において報告された実験は、胎児、成熟、および老齢ドナーから単離されたヒト雄性ならびに雌性幹細胞の細胞表面ＣＤマーカーを特徴付けることに関与する。間葉幹細胞の単離、冷凍保存、および増殖のための標準的なプロトコールに従って細胞を得た（Ｙｏｕｎｇら、１９９５、Ｌｕｃａｓら、１９９５、Ｙｏｕｎｇら、１９９３、Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。各個体由来の細胞集団は、始原細胞および多能性細胞の両方の混合物を含有し、これは、デキサメタゾンおよびインスリンを使用する比較／対比分析によって決定された（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ）。免疫化学的蛍光標示フローサイトメトリーを使用して、個々の細胞集団における１３腫のＣＤマーカーを試験した。陽性染色はＣＤ３４およびＣＤ９０について得られた。陰性染色はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、グリコホリンＡ、およびＨＬＡ−ＩＩ（ＤＲ）について得られた。細胞集団からＲＮＡを抽出し、電気泳動に供し、ノーザン分析を使用して、ＣＤ３４およびＣＤ９０に対する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡをプローブとして検出した。結果は、細胞回収時にＣＤ９０が有効に転写されていることを示した。本発明者らは、ヒト始原および多能性細胞上の造血幹細胞表面マーカーＣＤ３４およびＣＤ９０存在のの最初の同定について報告する。
【０３８１】
【材料および方法】
ヒト間葉幹細胞
本研究では、６種の幹細胞集団を使用した。２種は胎児ドナー（１つの雌および１つの雄）、２種は成熟ドナー（両方とも雌）、および２種は老齢ドナー（１つの雌および１つの雄）から採取した。細胞は、２つの異なる結合組織画分（真皮および骨格筋関連の結合組織）から誘導した。ヒト組織を回収するためのプロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｇｅｏｒｇｉａ，  Ｍａｃｏｎ，  ＧＡにより承認されたものである。
【０３８２】
胎児雌性細胞を、三頭筋に関連する結合組織から誘導した２５週齢胎児骨格筋細胞［ＣＦ−ＳｋＭｌ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＣＣ−２５６１，  ｌｏｔ  ＃  １４７２２，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ］のサブ密集培養物として購入した。胎児雄性細胞を、大腿筋に関連する結合組織から誘導した２２歳胎児骨格筋細胞［ＣＭ  ＳｋＭｌ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＣＣ−０２３１，  ｌｏｔ  ＃  ６Ｆ０６０４，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ］のサブ密集培養物として購入した。成体雌性細胞を、２５歳ヒト皮膚細胞［ＮＨＤＦ  １，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＣＣ−０２５２，  ｌｏｔ  ＃  ６Ｆ０６００，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ］のサブ密集培養物および３６歳ヒト皮膚細胞［ＮＨＤＦ２，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＣＣ−０２５２，  ｌｏｔ  ＃  １６２８０，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ］のサブ密集培養物として購入した。到着時に、細胞を平板培地−Ａ（ＰＭ−Ａ）に移した。ＰＭ−Ａは、Ｅａｒｌｅ塩、１０％の予め選択されたウマ血清（［ｌｏｔ  ｎｏ．  １７Ｆ−０２１８  （ＨＳ７）もしくは４９Ｆ−００８２  （ＨＳ４），  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ］または［ｌｏｔ  ｎｏ．  ３Ｍ０３３８  （ＨＳ３），  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ］）、および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液［１０，０００単位／ｍｌペニシリンおよび１０，０００  μｇ／ｍｌストレプトマイシン、ＧＩＢＣＯ］を有する８９％（ｖ／ｖ）Ｅａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ｐＨ  ７．４［ＥＭＥＭ，  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ］から成った。細胞を３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境でインキュベートした。増殖後、０．０７４４％（ｗ／ｖ）エチレンジアミンテトラ酢酸［ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ］を含有するＣａ＋２、Ｍｇ＋２を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水［ＧＩＢＣＯ］中０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン［ＤＩＦＣＯ，  Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ］で細胞を遊離させ、１００×ｇで２０分間、遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットをＰＭ−Ａに再懸濁し、細胞懸濁物を、７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ，  Ｍｏｒｔｏｎ  Ｔｈｉｏｋｏｌ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ］を含有する平板培地−Ａ中で−７０〜−８０℃で緩徐に凍結保存した（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。
【０３８３】
老齢幹細胞はＤｒ．  Ｐａｕｌ  Ｌｕｃａｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，  Ｖａｌｈａｌｌａ，  ＮＹ）より入手した。間葉幹細胞の単離のための標準プロトコール（Ｌｕｃａｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９９）に従って、７７歳雌性患者および６７歳雄性患者から得た骨格筋の病因学的標本に関連する筋内膜、筋周膜、および筋外膜結合組織画分から老齢細胞を単離した。これらの細胞をそれぞれ「ＰＡＬ２」および「ＰＡＬ３」と命名した。簡単に説明すると、コラゲナーゼ［ＣＬＳ−１，  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，  ＮＪ］およびディスパーゼ［ｃａｔａｌｏｇ  ＃４０２３５，  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ］で幹細胞を遊離させた。９０  μｍおよび２０μｍ  Ｎｉｔｅｘ  ［Ｔｅｔｃｏ  Ｉｎｃ．，  Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，  ＮＹ］を介する．連続ろ過によって、単一の細胞懸濁液を得た。細胞を１０５細胞／１％（ｗ／ｖ）ゼラチン化［ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，  ＮＪ］１００ｍｍ皿［Ｆａｌｃｏｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ］でＰＭ−Ａに播種し、凍結保存前に増殖および分化させた。細胞を３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境でインキュベートした。増殖後、トリプシンで細胞を遊離させ、上記のように篩い分けして繊維芽細胞および分化した表現型（即ち、多核筋管、脂肪細胞コロニー、軟骨小節、骨小節）から単核幹細胞を区別し、７．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）  （Ｌｕｃａｓら、１９９５）を含有するＰＭ−Ａ中、−７０〜−８０℃で凍結保存した。
【０３８４】
さらなる細胞の増殖は、発達および凍結保存工程を反復し、但し篩い分けはせず、１％ゼラチン化Ｔ−７５フラスコ［Ｆａｌｃｏｎ］および平板培地−Ｂ（ＰＭ−Ｂ）を利用することによって得た。ＰＭ−Ｂは、８９％（ｖ／ｖ）  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに基づく培地（Ｋａｗａｍｏｔｏら、１９８３）［ｃａｔａｌｏｇ  ＃２２６００−０５０，  ＧＩＢＣＯ］、１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清［ＨＳ３］、および１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗カビ剤溶液［１０，０００単位／ｍｌペニシリン、１０，  ０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（フンジゾンとして）ＧＩＢＣＯ］、ｐＨ  ７．４から成った。次いで、細胞をインスリン／デキサメタゾンバイオアッセイおよびフローサイトメトリーのためにアリコートに分けた。
【０３８５】
始原および多能性幹細胞を同定するためのインスリン／デキサメタゾンバイオアッセイ
始原および／または多能性幹細胞の存在を決定するために、インスリンおよびデキサメタゾンを使用して、発達した細胞を試験した（Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）。本バイオアッセイでは、インスリンは始原幹細胞において表現型発現を加速するが、多能性幹細胞の表現型発現の誘導に対しては効果を示さない。対照的に、デキサメタゾンは、多能性幹細胞において分化決定および発現を誘導するが、始原幹細胞における表現型発現を変更しない。従って、始原細胞のみが培養物中に存在する場合、インスリン中でインキュベートされた培養物について発現された表現型は、デキサメタゾンと共にインキュベートした培養物と比較して差異は認められない。始原細胞および多能性細胞の療法を含有する培養物を混合する場合、デキサメタゾンで処理した培養物において発現された表現型の量は、インスリンで処理した培養物と比較してより大きい。さらに、発現された表現型の数の増加が観察され得る。培養物が多能性細胞のみを含有する場合、インスリンで処理した培養物において表現型の発現は認められない。デキサメタゾンで処理した同様の培養物は、多数の発現された表現型を示す。このように、インスリンおよびデキサメタゾンによる処理の効果を比較することにより、不明な細胞群内の始原および多能性幹細胞の特定の型を同定することができる（Ｙｏｕｎｇら、１９９２，  １９９３，１９９５，１９９８ａ，  ｂ，  １９９９；Ｌｕｃａｓら、１９９３，１９９５；Ｐａｔｅら、１９９３；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａら、１９９６）。
【０３８６】
ＣＭ−ＳｋＭ１、ＣＦ−ＳｋＭ１、ＮＨＤＦ２、ＰＡＬ３およびＰＡＬ２細胞のアリコートを融解し、ＰＭ−Ｂを利用して、１％ゼラチン被覆２４ウェルの平板［Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ］中ウェルあたり１０，０００細胞かまたは１％ゼラチン被覆９６ウェルの平板［Ｆａｌｃｏｎ］中ウェルあたり１，０００細胞で個別に平板固定した。デキサメタゾン試験培地は、９８％、９４％、もしくは８９％Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ；またはそれぞれ１、５、または１０％血清［ＨＳ３、ＨＳ９  （ウマ血清、ロット番号  ９０Ｈ−０７０１，  Ｓｉｇｍａ）、または１％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、ロット番号  ３０００Ｌ，  Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）、１％抗生物質−抗カビ剤溶液および１０−１０、１０−９、１０−８、１０−７、もしくは１０−６Ｍデキサメタゾン［Ｓｉｇｍａ］（Ｙｏｕｎｇら、１９９５，  １９９８ｂ）から成った。８週間の間に、培地を１週間あたり３回交換した。表現型の変化について１週間あたり２回培地を観察し、写真撮影した。
【０３８７】
推定間葉幹細胞の表現型発現の明白な変化について形態学的基準を使用して決定した。形態学的表現型は、インスリンまたはデキサメタゾンと共にインキュベートしたトリおよびマウス間葉幹細胞で先に認められた表現型に同一であった（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，  １９９８ａ）。骨格筋原構造は、それらの細長い多核性状、交差線紋、および自発的収縮によって同定された（Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９５）。骨格筋筋管は、ミオゲニン（Ｆ５Ｄ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，  ＤＳＨＢ：  Ｗｒｉｇｈｔら、１９９１）、支質ミオシン（ＭＦ−２０，  ＤＳＨＢ：  Ｂａｄｅｒら、１９８２）、速骨格筋ミオシン（ＭＹ−３２，  Ｓｉｇｍａ：  ＮａｕｍａｎｎおよびＰｅｔｔｅ、１９９４）、ミオシン重鎖（ＡＬＤ−５８：  Ｓｈａｆｉｑら、１９８４）、ならびにヒト速ミオシン繊維（Ａ４．７４：  Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９８８）に対する抗体を使用して免疫化学染色によって確認した。平滑筋細胞は、細胞内ストレス（ｓｔｒｅｓｓ）フィラメントを含有する大きな多角形細胞と同定した。平滑筋表現型は、平滑筋αアクチンに対する抗体で免疫化学的に確認された（１Ａ４，  Ｓｉｇｍａ  Ｓｋａｌｌｉら、１９８６）。心筋は二核細胞として確認された。心筋の表現型は、平滑筋αアクチン（１Ａ４）および支質ミオシン（ＭＦ−２０）（ＥｉｓｅｎｂｅｒｇおよびＭａｒｋｗａｌｄ、１９９７）に対する抗体の同時標識で免疫化学的に確認された。脂肪生成細胞を多数の細胞な収縮性小胞を含有する多核細胞と同定した。脂肪細胞は、ＳｕｄａｎブラックＢ（Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ：  Ｙｏｕｎｇら、１９９３）およびＯｉｌ  Ｒｅｄ−Ｏ（Ｓｉｇｍａ：  Ｈｕｍａｓｏｎ、１９７２）による組織化学染色によって、飽和中性脂肪を含有する細胞内小胞の存在で確認した。軟骨形成構造は、収縮性細胞周辺マトリックスハローを有する丸型細胞凝集物として（シート状または離散した小節として）同定された。軟骨表現型は、プロＩＩ型コラーゲン（Ｃｌ  ＩＣＩｍ  ＤＳＨＢ：  Ｈｏｌｍｄａｈｌら、１９８６；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、１９９８）；ヒト特異的ＩＩ型コラーゲン（ＩＩ−４ＣＩＩ，  ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ａｕｒｏｒａ，  ＯＨ：  ＢｕｒｇｅｓｏｎおよびＨｏｌｌｉｓｔｅｒ、１９７９；Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４）；およびＩＸ型コラーゲン（Ｄｌ−９，  ＤＳＨＢ：  Ｙｅら、１９９１）のための免疫化学染色、ならびにコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸を含有するグリコサミノグリカンに対するＡｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）による組織化学染色（Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ：  Ｙｏｕｎｇら、１９９３；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ａ，  ｂ）、ならびに硫酸部分を含有するグリコサミノグリカンに対するＰｅｒｆｉｘ／Ａｌｃｅｃブルー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ／Ａｌｒｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ：  Ｌｕｃａｓら、１９９１）により確認した。骨形成構造は、細胞の凝集物に重層する３次元細胞外マトリックスと同定された。骨形成表現型は、骨シアロプロテイン（ＷＶ１Ｄ１，  ＤＳＨＢ：  Ｋａｓｕｇａｉら、１９９２）およびオステオポンチン（ＭＰｌ  ｌ  ｌ，  ＤＳＨＢ  ：  Ｇｏｒｓｋｉら、１９９０）に対する免疫化学、ならびにｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ（Ｓｉｌｂｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃｈｒｏｍａ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ：  Ｙｏｕｎｇら、１９９３，１９９８ａ，  ｂ）を使用するリン酸カルシウムに対する組織化学染色によって確認した。繊維芽細胞を、形態学的外観により多角形または星形細胞と同定した。繊維形成表現型を、ヒト繊維芽細胞表面タンパク質に対する抗体で免疫細胞化学的に確認した（１Ｂ１０，  Ｓｉｇｍａ：  Ｒｏｎｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎら、１９９２）。内皮細胞を、個々にまたはシート状で生じる丸石型細胞と同定した。内皮表現型を、ヒト特異的内皮細胞表面マーカー（Ｐ１Ｈ１２，  Ａｃｃｕｒａｔｅ，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  ＮＹ：  Ｓｏｌｏｖｅｙら、１９９７）、末梢内皮細胞接着分子、ＰＥＣＡＭ（Ｐ２Ｂ  １，  ＤＳＨＢ）、脈幹細胞接着分子、ＶＣＡＭ（Ｐ８Ｂ１，  ＤＳＨＢ：  Ｄｉｔｔｅｌら、１９９３）、およびＥセレクチンに対する免疫学的染色により確認した。２次抗体はビオチン化抗ヒツジＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）、またはＶｅｃｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）に含有される抗体から成る。３次プローブは、Ｖｅｃｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）に含有されるアビジン−ＨＲＰから成る。以下の不溶性西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質を使用して、抗体の結合を可視化した：ペルオキシダーゼのＶＩＰ基質キット（青、Ｖｅｃｔｏｒ）、ペルオキシダーゼのＤＡＢ基質（黒、Ｖｅｃｔｏｒ）、およびＡＥＣ染色キット（赤、Ｓｉｇｍａ）。異なる発色基質を利用して、同じ培養ウェルの多数の連続染色を可能にした。
【０３８８】
フローサイトメトリー
回収後、３０細胞倍加時のＣＭ−ＳｋＭ、ＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ１、ＮＨＤＦ２、ＰＡＬ＃３および細胞ＰＡＬ＃２  のアリコートを融解し、１０５細胞／１％ゼラチン被覆Ｔ−７５フラスコでプレー化培地−Ｂ、（ＰＭ−Ｂ）に播種し、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境で増殖させた。培養後、細胞をトリプシンで遊離させ、ＰＭ−Ｂに再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、洗浄緩衝液（１％ＦＢＳ  ［ＨｙＣｌｏｎｅ］  および１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ＮａＮ３  ［Ｓｉｇｍａ］を補充したＣａ＋２，  Ｍｇ＋２  ［Ｃｅｌｌｇｒｏ，  ＭｅｄｉａＴｅｃｈ］  を含有しないＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水）に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。Ｔｒｙｐａｎブルー染料［ＧＩＢＣＯ］排除技術（Ｙｏｕｎｇら、１９９３、Ｙｏｕｎｇら、１９９１）により細胞生存度は＞  ９５％であった。１００マイクロリットルの細胞調製物（１×１０５細胞）を、飽和濃度のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、またはペルジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）結合ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、グリコホリン−ＡおよびＨＬＡ−ＩＩ（ＤＲ）、またはイソタイプ一致対照［Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ］で染色した。簡単に説明すると、細胞を暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄し、０．５  ｍｌの洗浄緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳｃａｎ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーター上でフローサイトメトリーを実施した。光散乱によって細胞を同定した（図２９）。１０，０００ゲート制御事象における蛍光の対数を評価した（４十進計、１０２４チャンネルスケール）。ＬＹＳＹＳ  ＩＩ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析を実施した。適切なイソタイプ対照と比較して染色の有無を決定した。２５％を超える染色がイソタイプ対照を超えている場合、ゲート制御事象はＣＤマーカーに対する染色の存在があると評価した。５種の間葉幹細胞株から得られたプールされたフローサイトメトリーデータについて、統計解析を実施した。１０，０００ゲート制御事象あたりの細胞の絶対数を表１１に示す。平均値が１，０００ゲート制御細胞を超えたら任意の所定のＣＤマーカーについて陽性とみなした。
【０３８９】
統計解析
唯一生物学的に有意な結果はマーカーＣＤ３４およびＣＤ９０であった。これらを、胎児期ヒト組織から誘導される標本および生後ヒト組織から誘導される標本の２つに分けた。ＡＢＳＴＡＴコンピュータプログラム（Ａｎｄｅｒｓｏｎ−Ｂｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ａｒｖａｄａ，  ＣＯ）を使用して、一方向分散分析により２つのグループを解析した。
【０３９０】
分子分析
回収後３０細胞倍加のＣＭ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、およびＰＡＬ＃３細胞のアリコートを融解し、１０５細胞／１％ゼラチン化Ｔ−７５フラスコで平板培地−Ｂに播種し、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２湿潤環境で増殖させた。増殖後、トリプシンで細胞を遊離し、遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットを凍結し、−８０℃で保存した。細胞ペレットを氷上で融解し、製造者の取扱説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡシュレッダー  ［ｃａｔａｌｏｇ  ＃７９６５４，  Ｑｉａｇｅｎ，  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ］およびＲＮｅａｓｙ総ＲＮＡキット［ｃａｔａｌｏｇ  ＃７４１０４，  Ｑｉａｇｅｎ］を使用して、総ＲＮＡをＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、およびＰＡＬ＃３細胞から抽出した。．  ＣＤ３４、ＣＤ９０およびβアクチン（それぞれＩ．  Ｍ．  Ａ．  Ｇ．  Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ  ：  ７７０８５８、７１４０６０、および５８６７３６、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  Ａｌ）のＩ．  Ｍ．  Ａ．  Ｇ．  Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  （ＬＬＮＬ）  ｃＤＮＡクローン（Ｌｅｎｎｏｎら、１９９６）を得た。制限消化によって、それぞれのプラスミドからｃＤＮＡ挿入物を切り出し、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従ってアガロースゲル電気泳動により分離した。製造者の取扱説明書に従い、Ｑｉａｅｘ  ＩＩゲル抽出キット［ｃａｔａｌｏｇ  ＃２００２１，  Ｑｉａｇｅｎ］を使用して、それぞれのｃＤＮＡのバンドを使用した。Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔランダムプライマー標識キットＫｉｔ  ［ｃａｔａｌｏｇ  ＃３００３８５，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ］を使用して、３，  ０００  Ｃｉ／ｍＭα［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ［ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡ０００５，  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ］の取り込みによりｃＤＮＡを標識した。
【０３９１】
ノーザン分析：ホルムアルデヒド／アガロースゲル［ホルムアミド、ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｆ７９−５００、Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ  ；  アガロース、ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＢＰ１６４−１００，  Ｆｉｓｈｅｒ］を介して総ＲＮＡ（３０μｇ／レーン／細胞株）を電気泳動し、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従ってキャピラリー転移によりナイロン膜［ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＮＪ０ＨＹＢ００１０  Ｍａｇｎａｇｒａｐｈ，  Ｆｉｓｈｅｒ］に移した。ローラーボトルにおいて、６８℃で１晩、ＱｕｉｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液［ｃａｔａｌｏｇ  ＃２０１２２０，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ］中でハイブリダイゼーションを行った。洗浄は製造者の取扱説明書に従って実施した。増感スクリーンを使用して、−７０℃〜−８０℃でオートラジオグラフィー［Ｆｕｊｉ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃０４−４４１−９５，  Ｆｉｓｈｅｒ］を行った。
【０３９２】
【結果】
幹細胞の同定
インスリン及びデキサメタゾンを使用しする比較／対比分析によって、雄性及び雌性ヒト胎児、成熟、、及び老齢細胞集団内に存在する推定細胞の正体を試験した。骨格筋筋管、脂肪細胞、軟骨小節、及び骨小節に一致する形態学的外観における少数の表現型の変化は、インスリンによって生じた。多量の類似の表現型変化は、デキサメタゾンによる処理によって生じた。デキサメタゾンは、筋肉、脂肪、軟骨、骨、結合組織、及び内皮細胞に関する表現型発現を誘導した。骨格筋、平滑筋、及び心筋表現型は、抗体染色に基づいて認識された。これらの細胞も、骨格筋、筋幹、脂肪細胞、軟骨小節、及び骨小節に類似した。これらの形態学的変化は、３０細胞倍加の６つのすべてのヒト幹細胞集団において生じた。８０細胞倍加では、インスリンは細胞に影響を及ぼさないが、デキサメタゾンは細胞の表現型発現を変化した（図２６Ａ〜Ｄ）。データは、始原細胞（インスリンにより加速された形態）及び多能性細胞（デキサメタゾンにより加速された形態）の両方が２２週齢胎児（生前）雄性及び２５週齢胎児雌性（生前）骨格筋結合組織、２５歳雌性表皮、６７歳雄性及び７７歳雌性骨格筋結合組織から単離される推定ヒト幹細胞の３０細胞倍加後の集団に存在したという仮説を支持する。
【０３９３】
フローサイトメトリー分析
ヒト間葉幹細胞集団によって発現されるクラスター分化細胞表面については不明であるため、本発明者らは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ  １１７、グリコホリンＡ、及びＨＬＡ−ＩＩ（ＤＲ）の存在について、フローサイトメトリーと組み合わせた免疫化学によって、５種の細胞集団を分析した。この強力な技術により、本発明者らは多量の細胞を比較的迅速かつ容易に試験することができた。すべてのヒト幹細胞は、ＣＤ９０について陽性染色を示した。ＣＤ３４に対する陽性染色は、ＮＨＤＦ（成体ヒト雌性ＮＨＤＦ１及びＮＨＤＦ２）、ＰＡＬ＃３（老齢ヒト雄性）、及びＰＡＬ＃２（老齢ヒト雌性）由来の生後幹細胞によって示された。ＣＤ３４に対する陰性染色は、ＣＭ−ＳｋＭ（胎児ヒト雄）及びＣＦ−ＳｋＭ（胎児ヒト雌）由来の胎児期幹細胞によって示された。生後成体ＮＨＤＦ１及びＮＨＤＦ２及び老齢（ＰＡＬ＃３及びＰＡＬ＃２）細胞集団は、二重ＣＤ３４／ＣＤ９０染色を発現したが、胎児（ＣＭ−ＳｋＭ及びＣＦ−ＳｋＭ）集団はＣＤ９０のみを発現した。ＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に対する抗体について分析すると、ＮＨＤＦｌ  集団はＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性な２５２０細胞ならびにＣＤ９０のみに陽性な６９７９細胞を発現した。ＮＨＤＦ２はＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性な７３２０細胞ならびにＣＤ９０のみに陽性な１５３９細胞を発現した。同じ技術を使用したところ、ＰＡＬ＃３はＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性な３４３０細胞ならびにＣＤ９０のみに陽性な６０６９細胞を含有した。ＰＡＬ＃２はＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性な１８８０細胞ならびにＣＤ９０のみに陽性な６３６０細胞を含有した。ＣＭ−ＳｋＭはＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性な１細胞ならびにＣＤ９０のみに陽性な９５４９細胞を含有した。ＣＦ−ＳｋＭはＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性な１８０細胞を発現したが、ＣＤ９０のみに陽性な８６８０細胞を発現した。ＣＤ３４には陽性であるがＣＤ９には陰性であるような細胞は試験した集団では認められなかった。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、グリコホリンＡ、及びＨＬＡ−ＩＩ（ＤＲ）（表１１、図２７〜２９）については試験したすべての集団が陰性であった。
【０３９４】
【表１１】
2004504003.tif 000011
【０３９５】
ＣＤ３４及びＣＤ９０の分子分析
ＣＤ３４及びＣＤ９０が回収時に細胞によって有効に転写されたかどうかを決定するために、プローブとしてヒトＣＤ３４及びＣＤ９０  ｃＤＮＡを使用するノーザンブロット技術によって、ＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、及びＰＡＬ＃３サンプル由来の総ＲＮＡを分析した。細胞回収時のＣＤマーカーの転写において様々なパターンが観察された（表１１、図３０）。試験した３種の細胞株のいずれにおいてもＣＤ３４−ｍＲＮＡに結合するｃＤＮＡは認められず、回収時に有効な転写が生じないか、又はＣＤ３４のｍＲＮＡの量がアッセイの検出限界未満であることが示唆された。ＣＤ９０−ｍＲＮＡに結合するｃＤＮＡは、強力（ＣＦ−ＳｋＭ及びＮＨＤＦ）か又は弱い（ＰＡＬ＃３）のいずれかであったことから、それぞれの細胞株内ではＣＤ９０に対する転写パターンが同様であることが示唆された。
【０３９６】
【考察】
ヒト間葉幹細胞におけるＣＤマーカーの陽性染色
ヒト胎児、成体、及び老齢間葉幹細胞によって発現される細胞表面クラスターマーカーＣＤ３４及びＣＤ９０の機能的重要性については、現在のところまだ不明である。
【０３９７】
しかし、ＣＤ３４は決定及び未決定の造血前駆細胞、小脈管内皮細胞及び神経組織のいくらかの細胞を発現することが知られている（Ｌｉｎら、１９９５）。ｃＤＮＡを扱った１つの研究グループが、ＣＤ３４をシアロムチンとして特徴づけた（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９２）。ＣＤ３４の提案された細胞機能は、血液細胞前駆体の分化の調節であると考えられ、それは細胞接着分子であると示唆されている（Ｌｉｎら、１９９５）。臨床専門家はＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を広範に利用して、自家骨髄移植での使用のために造血幹細胞及び始原細胞を精製している。さらに、ＣＤ３４を発現する細胞の選択を使用して、造血遺伝子療法のための臨床アプリケーションにおいて細胞を単離することができる（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、１９９３）。
【０３９８】
Ｔｈｙ−１としても知られるＣＤ９０は造血細胞（Ｃｒａｉｇら、１９９３）、ニューロン組織（Ｔｉｖｅｒｏｎら、１９９２；Ｍｏｒｒｉｓ、１９８５）及びいくつかの結合組織（Ｍｏｒｒｉｓ及びＢｅｅｃｈ，  １９８４）で発現される。Ｃｒａｉｇらは、ＣＤ９０が相当数の造血細胞上でＣＤ３４と同時発現すると決定した。ＣＤ９０及びＣＤ３４の両方に陽性であるヒト末梢血細胞は、免疫不全マウスにおいて多数の造血系統を産生することが可能な造血幹細胞を含むことが見出された（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、１９９４）。ＣＤ９０に当てはまる機能はまだ不明であるが、ＣＤ９０はＴリンパ球のシグナル伝達の役割を果たし、これはチロシンのリン酸化に関与する経路に関係する（Ｌａｎｃｋｉら、１９９５）該タンパク質は免疫グロブリンといくつか相同性を有するため、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であると考えられている。興味深いことに、Ｔｈｙ−１は脳組織及びＴリンパ球上で発現されるため、このタンパク質は失調の発達に役割を果たし得る。この障害は、神経学的及び免疫学的機能の両方に病巣があるのが特徴である（Ｇａｔｔｉ、１９９１；Ｔｅｐｌｉｔｚ、１９７８）。
【０３９９】
成体雌性（ＮＨＤＦ）、老齢雄性（ＰＡＬ＃３）、及び老齢雌性（ＰＡＬ＃２）幹細胞集団は、（フローサイトメトリーの分析により）細胞表面上にＣＤ３４及びＣＤ９０の両方を発現したが、胎児雄性（ＣＭ−ＳｋＭ）及び胎児雌性（ＣＦ−ＳｋＭ）集団はＣＤ９０のみを発現した。これらの所見は２つの理由で重要であり得る。
【０４００】
第１は、ＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性である先に記載の細胞集団のみが造血幹細胞系統に属することである。多数の中胚葉系統から表現型マーカーを発現させる能力があるため、本発明者らはこれらの細胞は造血系統にのみ属するとは考えていない。むしろ、本発明者らのデータは、我々が造血幹細胞と共通の表現型特徴を有する独特な集団を見出したことを示唆する。
【０４０１】
第２に、ＣＤ３４マーカーは、成体雌性（ＮＨＤＦ）、老齢雄性（ＰＡＬ＃３）、及び老齢雌性（ＰＡＬ＃２）の細胞表面上で検出され得るが、胎児雄性（ＣＭ−ＳｋＭ）及び胎児雌性（ＣＦ−ＳｋＭ）細胞上では検出されない。さらに、試験した細胞株でノーザンブロット分析によってＣＤ３４  ｍＲＮＡを発現した細胞株は認められない。ＣＤ３４  ｍＲＮＡの発現が認められないことについて２つの説明が可能である。存在するｍＲＮＡの量はアッセイの検出限界を下回っているかもしれないこと。あるいは、マーカーはなお生後細胞の細胞表面上存在してもＣＤ３４の有効な転写が停止してしまっていたかもしれない。この所見はなぜＣＤ３４がＣＤ９０より少数の細胞で発現されるかを説明するのに役立ち得る。胎児（ＣＭ−ＳｋＭ及びＣＦ−ＳｋＭ）細胞でＣＤ３４の発現が比較的認められないことは特に注目すべきである。しかし、この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。
【０４０２】
幹細胞集団において観察されたＣＤ３４又はＣＤ９０のいずれかに陽性な細胞は、培養物中に生存したニューロン又は結合組織始原細胞から誘導される。フローサイトメトリーに使用された幹細胞集団は、組織回収後３０細胞倍加であった。Ｈａｙｆｌｉｃｋ限界（５０〜７０細胞倍加）後にプログラムされた細胞老化が達成されている（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、１９６３，１９６５）。本研究において使用される幹細胞集団はＨａｙｆｌｉｃｋ限界よりも少ない回数（即ち３０細胞倍加であった）だけ複製したため、それらはなお始原及び分化した細胞を含有し得るしかし、ＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性である細胞は、ニューロン又は結合組織細胞から誘導されにくく、これらの組織由来の細胞はこれらの２つのタンパク質を同時発現することは知られていない。ＣＤ３４及びＣＤ９０の両方に陽性である細胞の特徴についてはまだ十分に調べられていない。
【０４０３】
ヒト間葉幹細胞におけるＣＤマーカーの陰性染色
ＣＤ３４及びＣＤ９０に関する所見とは対照的に、１１種の抗原が、胎児、成体、及び老齢ヒト間葉幹細胞の細胞表面上には存在しないことが認められた。これらのマーカーはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、グリコホリンＡ、及びＨＬＡ−ＩＩ（ＤＲ）であった。この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。しかし、これらの特定の細胞表面ＣＤ抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、及びＣＤ１１７の存在が原因であるとされている（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。単球／マクロファージはＣＤ１１ｃ、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、及びＨＬＡ  ＤＲ−ＩＩを示している（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。ナチュラルキラー細胞はＣＤ１１ｃ、ＣＤ３８、ＣＤ４５、及びＣＤ１１７を示している（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。顆粒球はＣＤ１１ｃ、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、及びＣＤ１１７を示している（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。骨髄性始原細胞はＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、及びＣＤ１１７を示している（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。赤血球はグリコホリンＡを示している（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７）。いくつかのニューロン細胞はＣＤ３８及びＨＬＡ  ＤＲ−ＩＩを示している（Ｍｉｚｇｕｃｈｉら、１９９５；Ｒｏｈｎら、１９９６）。
【０４０４】
造血細胞の特徴を有するこれらの１１種の表面マーカーが本研究で使用した雄性及び雌性胎児、成体、及び老齢幹細胞上に認められないことについては、２つの説明が可能である。試験した幹細胞は正常な環境下で造血系統に沿った分化能を持たない可能性がある。この仮説が正しければ、これらのマーカーはこれらの細胞の分化した系統上には決して出現し得ない。あるいは、これらの幹細胞が造血株に沿った分化能を有する場合、１１種の分化マーカーが認められないことは間接的に研究された細胞がより原始的な幹細胞であることを示す。
【０４０５】
組織工学の可能性
毎年数百万人の人々が組織の消失又は終段階の器官不全を患う（Ｌａｎｇｅｒ及びＶａｃａｎｔｉ、１９９３）。これらの患者のための米国の国民医療費の合計は、１年あたり４千億ドルを超えている。現在、米国では、これらの障害を治療するために年間８百万を超える外科手順が実施されている。これらの治療には４千万〜９千万の病院日数が必要である。これらの療法は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。組織移植及び外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足及び可能な長期の病的状態のために厳しく制限されている。ドナー不足は毎年悪化し、必要な臓器の待機リストに掲載されながら死亡する患者の数が増加している。広範な外傷、先天異常、疾患、及び遺伝子異常は、ドナー組織の供給源として、自己由来の間葉幹細胞によって治療される可能性がある。組織消失を治療する場合、消失した組織を置き換えるための移植に利用できる細胞数を増やすことが所望される。ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のための細胞数を増加させるための手順も所望される。自己由来の幹細胞を使用する１つの有益性は、それらが同一のＨＬＡ一致を提供することができ、病態及び死亡に関連する免疫抑制療法の必要性が防止されることである。第２の有益性は、多能性細胞に関連する広範な細胞増殖の可能性である。多能性幹細胞は、分化決定誘導前の細胞数を顕著に増加することができる。分化決定誘導後、得られる始原幹細胞は、次いで、プログラムされた細胞老化が生じる前にさらに５０〜７０細胞倍加増殖することができる。移植及び／又は遺伝子治療に利用できる組織数に限りがある場合、これらの２つの幹細胞集団の増殖特性は極めて重要である。
【０４０６】
これまで、始原幹細胞は、骨の部位特異的修復（Ｋａｄｉｙａｌａら、１９９７）に使用され、多能性間葉幹細胞は軟骨及び骨の部位特異的修復（Ｇｒａｎｄｅら、１９９５）に使用されている。自己由来幹細胞療法が臨床的妥当性を有するためには、単離、発達、及び（必要であれば）細胞の個体への再導入の前の系統誘導にかかる時間が相対的に短いことが必要である。本発明者らの研究室の以前の研究ではＨａｙｆｌｉｃｋ限界（５０〜７０細胞倍加）を超える発達か又は始原又は多能性細胞の個々の集団を単離するための限界連続希釈によるクローン化（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９５；Ｙｏｕｎｇら、１９９３；Ｙｏｕｎｇら、１９９８ｂ）を使用した。これらの技術は、単離ならびに／又は始原及び多能性細胞集団の完全分離に９箇月〜２年を必要とする。本発明者らの現在の調査は、自己由来の始原及び多能性細胞の精製に必要な時間を減少することを目的とする。この目的のために、本発明者らは、男女の胎児、成体、及び老齢ヒトドナーからこれらの細胞を単離し、それらの細胞表面クラスター分化の特徴づけを始めた。本発明者らは今回、ＣＤ９０の発現の実証ならびにヒト始原及び多能性間葉幹細胞における多様な量のＣＤ３４について初めて報告する。本発明者らは、これらの細胞表面ＣＤマーカーは、最初の幹細胞回収物からより精製されたこれらの細胞の精製された集団を単離するための最初の工程として、フローサイトメトリー及び蛍光標示式細胞分取と共同で使用することができることを示唆する。
【０４０７】
本発明者らが想定した臨床アプリケーションは以下の通りである。組織欠損をしゅうふくするための選択術又は遺伝子療法の候補者を待機している患者が診療室にやってくる。少量の皮膚生検（約５ｍｍ３）を局所麻酔下で取り出し、輸送液中に置き、研究室に搬送する。そこで、組織を酵素的消化して幹細胞を遊離させ、細胞懸濁液を培養する。細胞が密集状態に達したら、それらを遊離させ、好ましい始原細胞及び多能性細胞を、それらの独特な細胞表面抗原プロフィールに対する抗体を使用して単離する。多能性細胞を発達させて細胞数を増加させ、好みの組織系統に決定するように誘導する。３０日未満に、患者の自己由来幹細胞、本来の始原細胞及び多能性細胞（所望の系統へ決定するように誘導される）が患者に移植される。遺伝子療法のためには、多能性細胞には、細胞発達の前に所望の遺伝子がトランスフェクトされる。このプロトコールは培養時間及び費用の両方を顕著に減少させる。また、特定の移植及び遺伝子両方に必要な幹細胞の収量が改善される。
【０４０８】
【実施例９】
生後の哺乳類における多能性胚様幹細胞（ＥＳ様細胞）の保持
分離した多能性幹細胞の中胚葉への分化能のキャラクタリゼーションを行う過程で、全く異なる非中胚葉性表現型の存在さえ示唆する異種形態を観察し、それに注目した。Ｙｏｕｎｇら、１９９１，１９９２ａ；  Ｌｕｃａｓら、１９９５  の記載に従って、凍結保存で単離したヒト細胞を１０−７Ｍもしくは１０−８Ｍのデキサメタゾン中で増殖させ、培養１８日間後に、破骨細胞様細胞（造血系列）（図３１Ａ）及び神経細胞（図３１Ｂ及びＣ）を観察した。同様に１０−６Ｍのデキサメタゾン中で増殖させたマウス３Ｔ３細胞の場合は、マクロファージに似た大型細胞を培養９日後に観察した。ラット細胞は１０−７Ｍのデキサメタゾン中で増殖させ、大型細胞を確認した。
【０４０９】
異種形態や性質や程度を評価するために、ヒトから分離した多能性幹細胞（ＣＦ−ＮＨＤＦ２及びＰＡＬ３細胞）をインスリンとデキサメタゾン中で最長４５日間培養し、形態学的、免疫化学的、組織化学的解析を行った。
【０４１０】
本研究の本来の目的は、多能性の間葉幹細胞が出生後ヒトに存在するかを決定することである。３６年齢雌性真皮と６７年齢雄の骨格筋結合組織由来の成体ヒト細胞を、上記に記載の方法で分離した。前記細胞についての初期の形態学的研究から、上記細胞は小型細胞で、細胞質に対する細胞核の比率（核／胞体比）が大きいことがわかる（図３４Ａ）。上記の形態的な発現は、胚性幹細胞の形態と一致する。次に行われた免疫染色法から、個々の細胞が、段階特異的胚抗原（ＥＳ抗原）−１（ＳＳＥＡ−１）（図３４Ｂ）、ＳＳＥＡ−３（図３４Ｃ）、ＳＳＥＡ−４（図３４Ｄ）、及びヒト特異的癌胎児性抗原（ＨＣＥＡ及びＣＤ６６）（データ非表示）を発現することが示された。前記の結果は、２つの細胞系には細胞表面に胚性抗原を持つ細胞が存在することを示唆している。
【０４１１】
インスリン及びデキサメタゾンを用いた比較バイオアッセイ又は対照バイオアッセイを行い、前記細胞を同定した。前記細胞をインスリンと培養した場合には、形態学的変化も抗原染色における変化も見られなかった。つまり、依然としてＳＳＥＡ―１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＨＣＥＡ，ＣＤ６６（データ非表示）を発現する細胞が存在した。前記結果から、前記細胞は系統への分化決定済みの前駆細胞でないことが示唆された。
【０４１２】
デキサメタゾンによる培養では、胚性抗原染色の消失とともに外胚葉、中胚葉、内胚葉起源の細胞に対する表現型発現マーカーが出現した。このことは、前記細胞が系統非制限的幹細胞であることを示唆する。ネスチン（図３４Ｅ）ニューロン（図３４Ｆ）、ニューロフィラメント（図３４Ｈ）、神経膠（図３４Ｉ）などの神経系外胚葉発現マーカー及びケラチノサイトなどの外胚葉発現マーカー（図３４Ｊ）の導入によって、外胚葉系列マーカーを発現する細胞を同定した。ミオゲニン（図３４Ｋ）、サルコメアミオシン、速筋型骨格筋ミオシン、ミオチン重鎖（データ非表示）骨格筋管（図３４Ｌ）、平滑筋α―アクチン（データ非表示）などの筋、中性飽和脂質、（３４Ｍ）などの脂肪、１１型コラーゲン（図３４Ｎ）、ＩＸ型コラーゲン、コンドロイチン・スルフェート、ケラタン・サルフェイト・プロテオグリカン含有小節（データ非表示）などの軟骨、骨サイアロン・プロテイン−１１（図３４Ｏ）、オステオポンチン、リン酸カルシウム含有小節（データ非表示）などの骨、線維芽細胞（データ非表示）、ＰＥＣＡＭ（図３４Ｐ）、ＶＣＡ、Ｅ−セレクチン、ヒト特異的内皮細胞表面マーカー、ＣＤ３４（データ非表示）などの内皮細胞の発現マーカーを導入することにより、中胚葉系マーカー発現細胞を同定した。α−フェトプロテイン（図３４Ｑ）及び胃腸内上皮（図３４Ｒ）の発現マーカーの導入により内胚葉系列マーカー発現細胞を同定した。
【０４１３】
ヘイフリック（Ｈａｙｆｌｉｃｋ）は、２倍体線維芽細胞（線維芽細胞系統への分化決定済みの前駆細胞）が、プログラム細胞老化及びプログラム細胞死を起こすまでに、約５０回の細胞倍加を限度とする有限寿命を有すことを明らかにした。ゆえに５０回の細胞倍加は、ヘイフリック限界（Ｈａｙｆｌｉｃｋ’ｓ  Ｌｉｍｉｔ）と呼ばれる。系統への分化が決定されていない胚性細胞を使用している研究者らは、前記細胞が、ヘイフリック限界をはるかに超えて細胞分裂した後も、自己再生能力を維持することを明らかにした。上記の理由で、前記細胞系の増殖能力を調べた。上記の実験で、前記の細胞を多能性状態に保った。細胞の増殖と放出を行い、継代１７代目（ＮＨＤＦ２）及び３９代目（ＰＡＬ３）を低温保存した。倍加時間は、平均１２〜２４時間で、１継代につき約４倍加とした。ゆえに、ＮＨＤＦ２細胞は７０回を超える細胞倍加を、ＰＡＬ３細胞は２００回を超える細胞倍加を経たことになる。実験群のうち一群は、細胞をクロラムフェニコール（ＣＭ）中のみで培養し、細胞を多能性状態に保った。上記実験において、細胞を３０〜５６日間培養した。形態学的、免疫化学的、組織化学的解析により、前記の細胞が、胚性抗原に対する抗体で染色されることがわかる。第２実験群においては、細胞をインスリン含有のＣＭ中で、３０〜５６日間培養し、増殖させ続けることが、前記細胞の分化決定を誘導するか否かを判定した。これらの細胞が胚性抗原に対する抗体に同様の染色パターンを示すということが、形態学的、免疫化学的、及び組織化学的解析により示された。第３実験群では、細胞をデキサメタゾンＣＭ中で３０〜５６日間培養し、前記細胞を分化させた。分化誘導後、前記細胞は、外胚葉性細胞系、中胚葉性細胞系、及び内胚葉性細胞系の細胞特有の抗原を発現することが形態学的、免疫化学的、組織化学的解析により解明された。ヘイフリックの限界（Ｈａｙｆｌｉｃｋ’ｓ  Ｌｉｍｉｔ）を超えて増殖した後も、前記細胞系は、胚性幹細胞と類似した特性を損失しないことがこれらの結果からはっきりとわかる。細胞は、上記のような処理後も、多能性特性（異種胚性細胞に属する細胞に分化する能力）を消失しなかった。
【０４１４】
細胞質に対して核の比率が大きいこと、肺性細胞表面抗原の発現、自己再生能力の維持、誘導分化と同時に胚性抗原の消失、外胚葉性、中胚葉性、内胚葉性の細胞系の表現型発現マーカーを現す分化細胞種の誘導、以上を根拠として考えると、これらの細胞系は多能性幹細胞の基準を満たす。これらの細胞の胚性抗原発現及び分化能は、マウス、霊長類、ヒトの内部細胞塊に由来する胚性細胞の属性と極めて類似している。上記の結果は、胚性細胞の特性と類似した特性を有する予備多能性幹細胞が成体ヒト内に存在することを示唆している。
【０４１５】
多核系を現す培養条件及び自然に収縮する分岐構造を、平板培養の日から表現型が発現するまで、酵素結合免疫培養検定法（ＥＬＩＣＡ）を用いて検定し、推定上の骨格筋細胞内に筋原性多能性マーカー、すなわち、サルコメア・ミオシン（ＭＦ−２０）（図３２Ｄ）、抗骨格速筋型ミオシン（ＭＹ−３０）（図３２Ｅ、３２Ｆ）、ミオシン重鎖の存在を確認した（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９２ａ，ｂ；  Ｙｏｕｎｇ，  １９９９）。細胞内線維を有する二核多角形細胞と単核多角形細胞が出現する培養物を、平滑筋α―アクチン（ＩＡ４）染色法でさらに評価した。二核多角形細胞（図３２Ｋ）のα―アクチン染色法では、心起源の表現型が示唆されるが、単核多角形細胞（図３２Ｌ）のα―アクチン染色法では、平滑筋細胞が暗示される（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈｌａｎｄ，１９９７）。複合屈折小胞を現す培養物は、スダンブラックＢ（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ―Ｂ）  （図３２Ｍ）及びオイルレッドーＯ（  Ｏｉｌ  Ｒｅｄ―Ｏ）  染色法でさらに評価し、推定上の肥満細胞内に中性飽和脂質の存在を確認した（Ｈｕｍａｎ  ｓｏｎ，１９７２  Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，１９９５；Ｙｏｕｎｇ，  １９９９）。細胞周囲のマトリックス・ハロー（暈）を有する円形細胞の集合体を発現する培養物を、免疫化学染色と組織化学染色の両方を用いてさらに調べた。推定上の軟骨形成性系統への分化決定済み細胞を、ＩＸ型コラーゲン（Ｄ１９）（図３２Ｐ）、１１型コラーゲン（ＨＣＩＩ）（図３２Ｏ）に対する抗体、及びコンドロイチン・サルフェイト・プロテオグリカンとケラタン・サルフェイト・プロテオグリカンの組織化学的染色、すなわち、ｐＨ１．０のアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｂｌｕｅ，  ｐＨ  １．０）  （図  ３２Ｑ）  及び  ｐＨ１．０のサフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ，ｐＨ  １．０）で確認した。ｐＨ１．０のアルシアンブルー及びｐＨ１．０のサフラニンＯを、さらに  （コンドロイチナーゼ−ＡＣ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，クリブランド，  オハイオ州）などのコンドロイチン・サルフェイト・プロテオグリカン特異的分解酵素とケラタン・サルフェイト・プロテオグリカン（ケラタナス、ＩＣＮ）特異的分解酵素を組み合わせて、推定上の軟骨細胞小節を取り囲む細胞外マトリック内で前記の特殊なプロテオグリカンの存在を確認した（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８９ａ，  １９９２ｂ，  １９９３，１９９５；  Ｙｏｕｎｇ，１９９９）。３次元マトリックス内もしくは３次元マトリックス上面、又は３次元マトリックス内とその上面の両方に包埋された細胞については、免疫化学的手法と組織化学的手法の両方を用いてさらに評価した。推定上の骨形成原細胞系統への分化決定済み細胞を、骨サイアロン・プロテイン（ＷＶ１Ｄ１）（図３２Ｓ）とオステポンチン（ＭＰ１１１）（図３２Ｔ）に対する抗体に前処理試薬としてＥＧＴＡ（エチレングリコール・ビス・［β―アミノエチル・エーテル］Ｎ，  Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ’−テトラ酢酸、  シグマ）を添加して、フォン・コッサ染色（Ｓｉｌｂｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）（図３２Ｕ）で検定して、推定上の石灰化したスピクラ内にリン酸カルシウ���の存在を確認した（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９ａ，１９９２ｂ，１９９３，１９９５）。
【０４１６】
網目状の細胞過程を有する円形細胞群をつくる培養条件を、神経系前駆体細胞（ＦＯＲＳＥ−１）（図３３Ｃ）、前記神経系前駆体幹細胞マーカーネスチン（ＭＡＢ３５３）（図３３Ｃ）、神経フィラメント（ＲＴ−９７）（図３３Ｄ）、ニューロン（８Ａ２）（図３３Ｅ）などのニューロン表現型に対する抗体を用いてさらに評価した。前記ヒト幹細胞が（神経）外胚葉起源の細胞を形成可能であることが、これらの抗体染色結果によって示された。α−フェトプロテイン（ＨＡＦＰ）（図３３Ｌ、３３Ｍ）に対するヒト特異的の抗体を用いて、肝臓（内胚葉）の分化決定を示唆する細胞内非屈折性細胞質小包を有する単核細胞及び二核細胞をさらに調べた。陽性染色は、多能性ヒト幹細胞が内胚葉起源の細胞を形成する潜在能力を有していることを示唆した。
【０４１７】
細胞質に対する核の比率の大きいこと、アルカリ性ホスファターゼの陽性染色、自己再生能力の維持、高いテロメラーゼ活性、及び骨格筋、平滑筋、心筋、脂肪細胞、軟骨、骨、内皮細胞、神経幹細胞、ニューロン、内胚葉に対する表現型表示マーカーを現す分化細胞種の誘導を根拠にして考慮すると、前期細胞は、多能性幹細胞の基準を満たす。さらに、マウス、霊長類、ヒトから採取した胎児性細胞の特性と非常に似ている。この結果から、ヒトをはじめとする出世後の動物が多能性胎児様細胞を維持していることが明らかになった。
【０４１８】
さらに、一連のヒト細胞系を用いて免疫化学的及び組織化学的に研究をした。３６年齢雌性真皮由来のヒト細胞ＣＦ−ＮＨＤＦ２を（１２回から４７回までの）様々な回数の細胞倍加で増殖させ、上記記載のような、多誘導性中胚葉、外胚葉、内胚葉、胚性系統について評価した。ヒト細胞ＣＭ−ＳｋＭ２及びＣＦ−ＳｋＮ２を、１２回の細胞倍加まで増殖させた後、同様に評価した。結果を表１２−１６にまとめた。表１２に、実験に用いた様々な免疫細胞化学及び免疫組織学のマーカーのリストを示す。表１３〜１５に、様々な培養条件下で細胞倍加を行ったヒト細胞ＣＦ−ＮＨＤＦ２の実験結果を示す。表１６に、異なる増殖条件下で細胞倍加を行ったヒト細胞ＣＭ−ＳｋＭ２及びＣＦ−ＳｋＭ２の実験結果を示す。
【０４１９】
ヒト細胞における内胚葉性、外胚葉性、及び中胚葉性系統マーカーについての要約を表１７に示す。
【０４２０】
上記の結果は、出生後の動物、特にヒトを起源とした（肺性組織以外の）多能性胚様細胞の存在と分離、内胚葉性、外胚葉性、中胚葉性の系統細胞への分化能を示す。
【０４２１】
【表１２】
2004504003.tif 000012
【０４２２】
【表１３】
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【０４２３】
【表１４】
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【０４２４】
【表１５】
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【０４２５】
【表１６】
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【０４２６】
【表１７】
2004504003.tif 000017
【０４２７】
【実験対象及び方法】
分離及び増殖  老人男性細胞は、ＰＡＬ３と命名し、間葉幹細胞１６，１８を分離及び培養するための基準プロトコルに従って、６７歳の被験者から採取した骨格筋標本から分離した。
【０４２８】
成体雌細胞は、３６年齢ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ２，ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＣＣ―０２５２，  ｌｏｔ  ＃１６２８０，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，サンディエゴ、カリフォルニア）の亜密集的な混合培養物として購入した。到着後直ぐに、前記細胞を、１０％ＨＳ９（ウマ血清、ｌｏｔ  ＃９０Ｈ―０７０１，Ｓｉｇｍａ）及び２  Ｕ／ｍｌ  ＡＤＦ  （抗分化因子、ＭｏｒｐｈｏＧｅｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク、ニューヨーク州）を含有する調整培地（ＣＭ）に移した。ＣＭは、８９％の（ｖ／ｖ）  Ｏｐｔｉ―ＭＥＭ  （ＧＩＢＣＯ―ＢＲＬ）、０．０１  ｍＭのβ―メルカプトエタノール  （Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズリー州）、１％  （ｖ／ｖ）の抗真菌性の抗生物質溶液（ペニシリン１０，０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０，０００  ｍｇ／ｍｌ、ファンギソン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）としてアンホテリシンＢ  ２５  ｍｇ／ｍｌ、  ＧＩＢＣＯ―ＢＲＬ）の組成からなり、ｐＨ７．４とした。細胞を、空気９５％、二酸化炭素５％の給湿環境において増殖させて、トリプシン１６で放出し、９０ｍｍと２０ｍｍのＮｉｔｅｘ  フィルター１９を通して篩分けした後、７．５％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｔｈｉｏｋｏｌ，デンバーズ、マサチューセッツ州）２０を含有する培地中で凍結保存した。さらに間葉幹細胞１６、１８の基準プロトコルに従って、両細胞群を増殖した。
【０４２９】
表現型の解析
凍結保存した細胞を融解し、１ウェルにつき１×１０３細胞を１％ゼラチン含有９６穴ウェルの平板（Ｃｏｒｎｉｇ、コーニング、ニューヨーク州）１５，１６に撒いた。前記細胞系を非誘導ＣＭのみか、又はインスリンとデキサメタゾンの両方もしくはそのどちらか一方を添加したＣＭを使用して、比較又は対照分析システムで培養し、誘導された表現型発現７、１５を確かめた。この測定法において、インスリンは、分化決定済み前駆細胞の表現型発現を促進するが、多能性幹細胞での分化決定やその後の表現型発現の誘導には影響がない。対照的に、デキサメタゾンは、多能性幹細胞での分化決定や表現型発現を誘導するが、前駆幹細胞の表現型発現を変えない。
【０４３０】
細胞はＣＭのみ、ＣＭ＋２ｍｇ／ｍｌインスリン、ＣＭ＋１０−６Ｍデキサメタゾン、ＣＭ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋インスリンに、それぞれ１％、５％、１０％のウマ血清を加えた培地で３０〜５６日間培養した。培地交換は、１週間に３度行った。表現型発現における変化を視覚的にとらえて１週間に２度検証した。これらの変化を、免疫化学及び組織化学的に解析した。
【０４３１】
免疫化学的解析
製品の指示書又は記載に従って培養した。２１  胚性細胞、神経組織の外胚葉マーカー、表皮、筋肉の中胚葉マーカー、軟骨、骨、線維芽細胞、内皮性細胞、内胚葉性マーカーに特異的な下記の一次抗体で染色した。１）胚性細胞：段階特異的胚性抗原―１［ＭＣ―４８０、発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンク（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、アオイワシティ、アイオワ州、ＤＳＨＢ］、段階特異的胚性抗原―３［ＭＣ―６３１，  ＤＳＨＢ］、段階特異的胚性抗原―４［ＭＣ―８１３−７０，  ＤＳＨＢ］、ヒト癌胎児性抗原［ＨＣＥＡ，  Ｓｉｇｍａ］、癌胎児性抗原［ＣＤ６６，  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．  バーリンゲーム、カリフォルニア州］；２）神経組織の外胚葉マーカー：神経前駆細胞［ＦＯＲＳＥ―１，  ＤＳＨＢ］、ネスチン−１［ＨＮＥＳ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、カリフォルニア州］、ネスチン−２［Ｒａｔ―４０１，  ＤＳＨＢ］、ネスチン−３［ＭＡＢ３５３，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ］、ニューロン［８Ａ２，  ＤＳＨＢ］、ニューロン・マーカー［Ｓ―１００，Ｓｉｇｍａ］、神経膠［ＣＮＰａｓｅ，  Ｓｉｇｍａ］、  ニューロフィラメント［ＲＴ９７，  ＤＳＨＢ］、ニューロフィラメント−２００［Ｎ―２００，  Ｓｉｇｍａ］、表皮：ケラチノサイト［ＶＭ―１，ＤＳＨＢ］；３）  筋の中胚葉マーカー：ミオゲニン  ［Ｆ５Ｄ，  ＤＳＨＢ］、サルコメアミオシン［ＭＦ―２０，  ＤＳＨＢ］、速筋型骨格筋ミオシン  ［ＭＹ―３２，  Ｓｉｇｍａ］、ミオチン重鎖［ＡＬＤ５８，  ＤＳＨＢ］、ミオシン強鎖［Ａ４．７４，  ＤＳＨＢ］、  平滑筋αアクチン［１Ａ４，Ｓｉｇｍａ］、軟骨：１１型コラーゲン［ＣＩＩＣＩ，ＤＳＨＢ］、１１型コラーゲン［ＩＩ―４ＣＩＩ，  ＩＣＮ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＩｎｃ、オーロラ、オハイオ州］、ＩＸ型コラーゲン［Ｄ１―９，ＤＳＨＢ］、骨：  骨サイアロン・プロテイン−１１［ＷＶ１Ｄ１，ＤＳＨＢ］、オステポンチン［ＭＰ１１１，ＤＳＨＢ］、線維芽細胞：ヒト線維芽細胞特異的タンパク質  ［１Ｂ１０，  Ｓｉｇｍａ］、内皮細胞：内皮細胞表面マーカー［Ｐ  １  Ｈ  １２，  Ａｃｃｕｒａｔｅ、ウェストベリー、ニューヨーク州］、ＰＥＣＡＭ  ［Ｐ２Ｂ１，ＤＳＨＢ］、ＶＣＡＭ  ［Ｐ８Ｂ１，ＤＳＨＢ］、Ｅ−セレクチン  ［Ｐ２Ｈ３，ＤＳＨＢ］、ヒト特異的ＣＤ３４シアロムチン［ＨＣＤ３４］；  ３）  内胚葉マーカー：ヒト特異的α−フェトプロテイン［ＨＡＦＰ，Ｖｅｃｔｏｒ］、ヒト特異的胃腸フェイステル上皮特異的抗原［ＨＥＳＡ，Ｓｉｇｍａ］  。二次抗体は、ビオチン抗羊ＩｇＧ抗体  ［Ｖｅｃｔｏｒ］、もしくはビオチン抗マウスＩｇＧ  抗体［Ｖｅｃｔｏｒ］からなるか、又はＶｅｃｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ  ［Ｖｅｃｔｏｒ］に含まれる。第三プローブは、Ｖｅｃｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ  ［Ｖｅｃｔｏｒ］に含まれるアビジン−ＨＲＰからなる。ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）  ［ｂｌｕｅ，Ｖｅｃｔｏｒ］用の不溶性ＨＲＰ培養基であるＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ、ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、  及び  ＡＥＣ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ［ｒｅｄ，Ｓｉｇｍａ］を用いて、抗体結合を視覚化した。様々な色の培養基を使い、同じ培養ウェルで多種多様な染色を連続して実施可能にした。
【０４３２】
組織化学的解析
上記に記載のように培養を続けた。１５、２２  ｐＨ１．０のアルシアンブルー６，１６，２３を用い、軟骨の特性であるコンドロイチン・サルフェイト及びケラタン・サルフェイト・プロテオグリカンを同定した。スダンブラックＢ及びオイルレッドーＯ染色法６、１６，２２，２３を用い、脂肪細胞の特性である中性飽和脂質を同定した。フォン・コッサ染色法６，１６，２３を用い、骨の特性であるリン酸カルシウムを同定した。
【０４３３】
拡大自己再生能力
細胞は、継代１７代目  （ＮＨＤＦ２）  及び３９代目  （ＰＡＬ３）を各々経て、進行性の増殖１６，２０をした。ＮＨＤＦ２は７０回を超える細胞倍加、ＰＡＬ３は２００回を超える細胞倍加をし、その平均倍加時間は１２〜２４時間で、１世代あたり４〜６倍加をした。上記のように、細胞を調べた。結果を前記に記載したように評価した。前記細胞系は、ヘイフリックの限界（Ｈａｙｆｌｉｃｋ’ｓ  Ｌｉｍｉｔ）を超えて増殖後も、胚様細胞の同一性も、また誘導能力も消失しなかったことがこれらの結果から示唆される。
【０４３４】
以下の抗体は（米国）分子遺伝学研究室（ＮＩＣＨＤ）の支援による発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンク（ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）から入手し、アイオワ大学生物科学部（Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ  ５２２４２で保有している。：ＭＣ―４８０（Ｄ．  Ｓｏｌｔｅｒにより開発）、ＭＣ―６３１（Ｄ．  Ｓｏｌｔｅｒにより開発）、  ＭＣ―８１３―７０（Ｄ．  Ｓｏｌｔｅｒにより開発）、ＦＯＲＳＥ―１（  Ｐ．  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎにより開発）、  ＲＡＴ−４０１  （Ｓ．Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄにより開発）、  ８Ａ２  （Ｖ．  Ｌｅｍｍｏｎにより開発）、  ＲＴ９７  （Ｊ．  Ｗｏｏｄにより開発）、  ＶＭ―１  （Ｖ．  Ｂ．Ｍｏｒｈｅｎｎにより開発）、Ｆ５Ｄ  （Ｗ．Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔにより開発）、ＭＦ―２０（  Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｍａｎにより開発）、ＡＬＤ５８（Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｍａｎにより開発）、Ａ４．７４（Ｈ．  Ｂｌａｕにより開発）、  ＣＩＩＣ１  （Ｒ．  ＨｏｌｍｄａｈｌとＫ．  Ｒｕｂｉｎにより開発）、  Ｄ１―９（Ｘ．―Ｊ．ＹｅとＫ．Ｔｅｒａｔｏにより開発）、  ＷＶ１Ｄ１  （Ｍ．ＳｏｌｕｒｓｈとＡ．Ｆｒａｚｅｎにより開発）、  ＭＰ  １１１  （Ｍ．  ＳｏｌｕｒｓｈとＡ．  Ｆｒａｚｅｎにより開発）、  Ｐ２Ｂ  １  （Ｅ．Ａ．  ＷａｙｎｅｒとＧ．Ｖｅｒｃｅｌｌｏｔｔｉにより開発）、  Ｐ８Ｂ１  （Ｅ．Ａ．  ＷａｙｎｅｒとＴ．ＬｅＢｉｅｎにより開発）、Ｐ２Ｈ３（Ｅ．  Ａ．  ＷａｙｎｅｒとＧ．Ｖｅｒｃｅｌｌｏｔｔｉにより開発）
【０４３５】
細胞の収集及び培養
３６年齢ヒト真皮線維芽細胞（ＣＦ―ＮＨＤＦ２，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＣＣ―２５１１，ｌｏｔ  ＃１６２８０，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，サンディエゴ、カリフォルニア）を亜密集的な培養物として女性成体真皮細胞を獲得した。到着後直ぐに、前記細胞を、平板培養Ｃ（ＰＭ―Ｃ）に移した。ＰＭ―Ｃは、８９％  （ｖ／ｖ）  のＯｐｔｉ―ＭＥＭ  基底培養（ｃａｔａｌｏｇ  ＃２２６００―０５０，  ＧＩＢＣＯ）からなり、その成分は０．０１  ｍＭの  β―メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）  、１０％  （ｖ／ｖ）ウマ血清（ＨＳ９，ｌｏｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ９０Ｈ―０７０１，Ｓｉｇｍａ）、  １％の抗真菌性抗生物質溶液（ＧＩＢＣＯ）、２Ｕ／ｍｌ  ＡＤＦ  （抗分化因子、  ＭｏｒｐｈｏＧｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク、ニューヨーク州）で、ｐＨ  ７．４とした。細胞を、空気９５％／二酸化炭素５％、３７℃の給湿性の部屋におき、１週間に３回培地を交換して、増殖させて融合状態にした。細胞をトリプシンで放出し、基準プロトコルに従って凍結保存した。凍結した細胞を融解し、ＰＭ−Ｃ培地内に播き、融合状態まで増殖させ、トリプシンで放出し、再び培地に置き、融合段階まで増殖させた。細胞を採取した。インスリンーデキサメタゾン分析及びフローサイトメトリ（流動細胞光度測定法）用に、細胞に継代番号を付けて収集した。
【０４３６】
形態学的解析
以下の形態について、細胞を分析したのち培養物をスクリーニングした。：細胞質に対する細胞核の比率が大きい小星状細胞（潜在的幹細胞）、双極細胞（潜在的筋芽細胞）、紡錘細胞（潜在的線維芽細胞）、多核性直線細胞及び多核性分岐細胞（潜在的骨格筋管）、細胞内フィラメントを有する単核多角形細胞（潜在的平滑筋細胞）、細胞内フィラメントを有する二核多角形細胞（潜在心筋細胞）、屈折細胞内小疱を有する単核細胞（潜在的脂肪細胞）、細胞内小疱を持たない単核細胞（潜在的内肺葉細胞）、丸石型様表現型の単核シート状細胞（潜在的内肺葉細胞）、細胞周囲のマトリックス・ハロー（暈）を有する円形細胞（潜在軟骨細胞、細胞周囲のマトリックス・ハロー（暈）を有する円形細胞の集合体（潜在的軟骨小節）、３次元マトリックス・ハロー（暈）を胞埋する円形集合細胞（潜在骨小節）、網目状の細胞過程を有する単核細胞（潜在的ニューロン細胞）
【０４３７】
組織化学的解析
各製品の指示書もしくは（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８ｂ）の記載に従って培養を行った。培養物は、胚マーカー（アルカリ性ホスファターゼ）で以下のように染色した。軟骨（コンドロイチン・サルフェイト・プリテオグリカン及びケラタン・サルフェイト・プリテオグリカン）には、コンドロイチナーゼＡＣ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，クリブランド、オハイオ州）又はケラタナーゼ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）の分解と共にアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌａｕ  ８ＧＳ，Ｃｈｒｏｍａ―Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．）とサフラニンＯ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）をｐＨ１．０として用い、細胞周囲と細胞外の両方又はそのどちらか一方のマトリックスにあるコンドロイチン・サルフェイト・グリコサミノグリカン又はケラタン・サルフェイト・グリコサミノグリカンの産生を検証した。脂肪細胞（中性飽和脂質）には、スダンブラックＢ（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．ワシントン市．）及びオイル・レッドＯ（Ｓｉｇｍａ）  を用い、骨（リン酸カルシウム）に対しては、前処理としてのＥＧＴＡ（エチレングリコール・ビス・  ［β―アミノエチルエーテル］  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、Ｓｉｇｍａ）と混合して、フォン・コッサ染色（Ｓｉｌｂｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃｈｒｏｍａ―Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）  を用い、推定上の石灰化した骨のスピクラ内にリン酸カルシウムの産生を検証した。純アルシアンブルー（Ｐｅｒｆ―ＡＢ）は  Ｆｉｓｈｅｒ―Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｐＨ１．０の  アルシアンブルー（ＡＢ  １．  ０）と  サフラニンＯ（ＳＯ  １．  ０）とスダンブラックＢ（ＳＢＢ）と  フォン・コッサ（ｖＫ）  は、Ｃｈｒｏｍａ―Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  （Ｒｏｂｏｚ）から購入した。
【０４３８】
免疫化学的分析
（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２ｂ）の記載もしくは各製品の指示書に従って培養を行った。筋、軟骨、骨、内皮細胞の指標となる中胚葉マーカー、外胚葉マーカー、及び内胚葉マーカーのそれぞれに特異的抗体で培養物を以下のように染色した。中胚葉マーカー：筋（ミオゲニン  ［Ｆ５Ｄ，発生生物学研究室ハイブリドーマバンク，ＤＳＨＢ］、サルコメアミオシン［ＭＦ―２０，ＤＳＨＢ］、速筋型骨格筋ミオシン［ＭＹ―３２，  Ｓｉｇｍａ］、ミオチン重鎖［ＡＬＤ―５８，  ＤＳＨＢ］、ミオシン強鎖［Ａ４．７４，ＤＳＨＢ］、平滑筋  （平滑筋αアクチン［１Ａ４，  Ｓｉｇｍａ］）、軟骨（１１型コラーゲン［ＣＩＩＣ１，  ＤＳＨＢ］  とＩＸ  ［Ｄ１―９，  ＤＳＨＢ］）、骨（骨サイアロン・プロテイン  ［ＷＶ１Ｄ１，  ＤＳＨＢ］、オステオポンチン［ＭＰ１１１，ＤＳＨＢ］）、内皮細胞（内皮細胞表面マーカー［Ｈ  Ｅｎｄｏ，Ａｃｃｕｒａｔｅ］）；外胚葉マーカー：  （内皮細胞［１５１―Ｉｇ，  ＤＳＨＢ］、神経前駆細胞［ＦＯＲＳＥ―１，  ＤＳＨＢ］、ネスチン［ＲＡＴ―４０１，ＤＳＨＢ］、ニューロフィラメント［ＲＴ９７，  ＤＳＨＢ］、ニューロン［８Ａ二，ＤＳＨＢ］）；内胚葉マーカー：（α−フェトプロテイン  ［ＨＡＦＰ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ］、上皮細胞［ＨＡ４ｃｌ９，  ＤＳＨＢ］）
【０４３９】
抗体
抗体  ＧＡＬ―１３、１Ａ４、ＭＹ３２、ＤＥ―Ｕ―１０、ＨＣＥＡ、ＨＥＳＡ、ＨＦＳＰ、ＣＮＰａｓｅ、Ｓ―１００、Ｎ―２００、ＯＲＯは、Ｓｉｇｍａから購入した。Ｈ―Ｅｎｄｏは、ＡｃｃｕｒａｔｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＨＮＥＳとＭＡＢ３５３はＣｈｅｍｉｃｏｎから購入した。ＨＣ―ＩＩはＩＣＮから購入した。Ｈ―ＡＦＰ、Ｈ―ＣＤ３４、Ｈ―ＣＤ６６、ＡＬＫ―ＰＨＯＳは、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＭＦ―２０はＤ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｍａｎによって、Ｆ５ＤはＷ．Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔによって、  ＷＶ１Ｄ１はＭ．  ＳｏｌｕｒｓｈとＡ．Ｆｒａｚｅｎによって、ＭＰ１１１はＭ．ＳｏｌｕｒｓｈとＡ．Ｆｒａｚｅｎによって、ＣＩＩＣ１はＲ．ＨｏｌｍｄａｈｌとＫ．Ｒｕｂｉｎによって、Ｄ１―９はＸ．―Ｊ．ＹｅとＫ．Ｔｅｒａｔｏによって、ＦＯＲＳＥ―１はＰ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎによって、ＲＴ９７はＪ．Ｗｏｏｄによって、８Ａ２はＶ．Ｌｅｍｍｏｎによって、ＲＡＴ―４０１は、Ｓ．Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄによってそれぞれ開発され、（米国）分子遺伝学研究室（ＮＩＣＨＤ）の支援で開発された発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンクからすべて入手し、アイオワ市のアイオワ大学生物科学部（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ  ５２２４２）で保有し、ＭＣ―４８０、ＭＣ―６３１、ＭＣ―８１３−７０はすべて認識胚性抗原であり、またすべて発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンクから入手した。ＡＬＤ―５８、Ａ４．７４、Ｐ２Ｂ１、Ｐ８Ｂ１、Ｐ２Ｈ３、  ＶＭ―１もまた発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンクから入手した。
【０４４０】
【実施例１０】
分化特異的因子を伴う多能性細胞の刺激、検定及び分析
拡大自己更新及び多系列分化の能力をもつ多能性幹細胞は、細胞分化、増殖及び分化に対する細胞の応答、又は細胞分化決定因子の研究のため及び、因子、作用物質又は化合物を同定し特徴づけする検定システム又は方法において及びいずれかのかかる因子、作用物質、化合物などをコードする遺伝子又は細胞の増殖、分化及び分化決定に関与する遺伝子を同定する上で、独特かつ有用な細胞供給源である。
【０４４１】
生物活性因子の効果
始原幹細胞、始原幹細胞クローン及び多能性幹細胞クローンの混合個体群にアクセスできれば、これらの幹細胞の成長特性及び表現型発現に対するさまざまな生物活性因子（例えば組換え型成長因子、精製化合物及び新規誘発因子）の影響に取組むことが可能である。初期の研究では、我々は、これらの細胞を用いて１４の生物活性因子を単独で及び組合わせた形でテストした（表１８）。３つの一般的な活性カテゴリ（増殖、分化決定及び分化発達）が示された。ＢＦは、刺激物質又は阻害物質効果のいずれかを生み出すことができた。効果は、全ての系列全体にわたり一般的であるか又は単数又は複数の特異的組織系列に制限されているかのいずれかであり得るものであった。
【０４４２】
内皮細胞成長因子は、使用された検定条件下で始原細胞又は多能性幹細胞のいずれかに対し測定可能な効果を全く示さなかった。血小板由来の成長因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）及び血小板由来の成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）は、多能性幹細胞において及び多能性幹細胞の全ての系列において増殖を刺激した。血小板由来の内皮細胞成長因子（ＰＤＥＣＧＦ）は、使用された検定条件下で、始原細胞又は多能性幹細胞のいずれに対しても測定可能な効果を全く示さなかった。塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＣＦ）及び形質転換成長因子−β−（ＴＧＦ−β）は、線維形成性始原細胞内で分化発達を刺激し、その他の全ての始原細胞内で分化発達を阻害し、多能性細胞内では全く効果がなかった。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、多能性幹細胞内で増殖を抑制し、多能性細胞内で一般的分化決定を刺激し、全ての始原細胞内で分化発達の弱い刺激物質として作用した。筋形態形成タンパク質（ＭＭＰ）は、多能性細胞内では特異的筋原性分化決定作用物質として、筋原性始原細胞内では分化発達の弱い刺激物質として作用し、その他の系列に決定された始原細胞に対しては全く効果をもたなかった。骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）は、多能性細胞内では特異的軟骨形成分化決定作用物質として、又軟骨形成始原細胞内では分化発達の弱い刺激物質として作用し、その他の系列に決定された始原細胞に対しては全く効果をもたなかった。（ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、  ロット３０００Ｌ）内に存在し我々が同定した）線維芽細胞形態形成タンパク質（ＦＭＰ）は、多能性細胞内では特異的線維形成分化決定作用物質として、線維形成始原細胞内では分化発達の刺激物質として作用し、その他の系列に決定された始原細胞に対しては全く効果をもたなかった。瘢痕阻害因子（ＳＩＦ）は、多能性細胞に対するＦＭＰの分化決定活性の特異的阻害物質として、又線維形成始原細胞内では進行に対するＦＭＰの分化発達活性の特異的阻害物質として作用し、その他の系列についての系列誘発又は分化発達に対しては全く効果をもたなかった。抗分化因子（ＡＤＦ）は、多能性細胞に対する分化決定活性の一般的阻害物質及びＰＣに対する分化発達活性の一般的阻害物質として作用した。インシュリン、インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）及びインシュリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）は、全ての始原細胞内で分化発達を刺激したが、多能性細胞に対する測定可能な効果は全くなかった。成長因子−β及び塩基性線維芽成長因子は、線維形成始原細胞内で分化発達を刺激し、その他の全ての始原細胞内で分化発達を阻害し、多能性細胞に対しては全く効果をもたない。
【０４４３】
発現されたｍＲＮＡのノーザン分析
我々は、マウス多能性幹細胞クローン内でのＭＭＰによる筋形成の誘発を検査するためにノーザンブロット分析を使用した。我々は同様に、ヒト間葉幹細胞内でのＣＤマーカー転写を検査するためにもこの技術を使用した。ＭＭＰは、出生前マウス多能性幹細胞クローンであるＳｗｉｓｓ−ＸＹＰ−７内でのマイオジェニン及びＭｙｏＤ１遺伝子の発現のためｍＲＮＡの転写を誘発した（Ｒｏｇｅｒｓ  ら、  １９９５；Ｙｏｕｎｇ  ら、  １９９８ａ）。ノーザンブロット分析は同様に、アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）、神経細胞付着分子（ＣＤ５６）、及びＴｈｙ−１（ＣＤ９０）が、出生前及び出生後の両方のヒト間葉幹細胞内で細胞収獲時点で活発に転写されていることを示した（先行例を参照のこと）。
【０４４４】
既知の又は未知の遺伝子の発現を検査するため（ＭＲＮＡなどを通して）、又は、多能性幹細胞、それに由来する細胞又は既知の又は未知の生物活性因子に対する露呈後のいずれかのかかる細胞の中で発現された遺伝子のｃＤＮＡライブラリ又は示差的表示を生成するために、類似のかかる研究を利用することも可能である。
【０４４５】
細胞又は系列の特徴づけ
特定の細胞型を特徴づけし同定する上で、組織学的、機能的、免疫学的及び発現（例えばｍＲＮＡ発現など）分析の組合せを利用することができる。例えば、特定の増殖、分化決定又は分化発達能力に関する既知の又は未知の生物活性因子を特徴づけするにあたっては、多能性胚種様幹細胞の固有の能力を特徴づけする上での先行例に示された特徴づけと同様に、これらの分析を利用することができる。表１９は、細胞型を特徴づけする上で利用可能と思われる組織学的、免疫学的及びｃＤＮＡプローブのマーカーの一覧表を提供している。
【０４４６】
【料及び方法】
（材料及び方法は、以下に記す場合を除き、上述の通りである）。
【０４４７】
幹細胞の分離、クローニング及び発現
始原細胞及び多能性幹細胞を分離するため、結合組織を含む標本を無菌状態で収獲し、付加的な２倍の抗生物質−抗真菌性溶液を含む間葉幹細胞−１内で無菌フードまで輸送した（Ｌｕｃａｓ  ら、  １９９５）。間葉幹細胞培地は、８９％（ｖ／ｖ）の培地〔Ｅａｒｌｅ  の塩を伴うイーグル最小必須培養液、ＥＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）（Ｙｏｕｎｇ  ら、  １９９１）又は、０．０１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．，  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）（Ｙｏｕｎｇ  ら、  １９９８ｃ，ｅ）〕とそれに追加された１０％の血清〔ＨＳ７（ロット番号１７Ｆ−０２１８、Ｓｉｇｍａ）、ＨＳ４（ロット番号  ４９Ｆ−００８２、Ｓｉｇｍａ）、ＨＳ３（ロット＃３Ｍ０３３８、Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）（Ｙｏｕｎｇ  ら、  １９９８ｅ）といったような予備選択されたウマ血清、又は２Ｕ／ｍｌの抗分化因子を含む任意の非選択血清（ＡＤＦ，Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）（Ｙｏｕｎｇ  ら、  １９９８ｃ，ｅ）〕、１％の抗生物質−抗真菌性溶液〔１０，０００単位／ｍｌのペニシリン、１０，０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及びＦｕｎｇｉｚｏｎ、  ＧＩＢＣＯといったような２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ〕（Ｌｕｃａｓ  ら、  １９９５）、ｐＨ７．４から成る。組織標本を１０ｍｌの間葉幹細胞−１中に置き、入念に細かく切り刻む。切り刻んだ後、組織懸濁液を２０分間５０×ｇで遠心分離に付す。上清を廃棄し、細胞ペレットの体積について見積りを行なう。細胞ペレットを、７ペレット体積のＥＭＥＭ（又はＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．０１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）及び２ペレット体積のコラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液の中で再懸濁させて、酵素作用により細胞を放出させる（Ｌｕｃａｓ  ら、  １９９５）。コラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液は、１００ｍｌのディスパーゼ溶液（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）に添加した５０ｍｌのＥＭＥＭ（又はＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．０１ｍＭのβメルカプトエタノール）中の３７，５００単位のコラゼナーゼ（ＣＬＳ−１、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，  ＮＪ）から成る。最終的に得られた濃度は、２５０単位／ｍｌのコラゲナーゼと、３３．３単位／ｍｌのディスパーゼであった（Ｙｏｕｎｇ  ら、  １９９２）。結果として得られた懸濁液を３７℃で１時間撹拌して細胞を分散させ、３００×ｇで２０分間遠心分離させる。上清を廃棄し、組織ペレットを２０ｍｌの間葉幹細胞−１内で再懸濁させる（Ｌｕｃａｓら、１９９５）。細胞を９０μｍ及び２０μｍのＮｉｔｅｘ  を通してふるいがけし、単一の細胞懸濁液を得る（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。細胞懸濁液を１０分間１５０×ｇで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍｌの間葉幹細胞−１内で再懸濁させる（Ｌｕｃａｓら、１９９５）。細胞生存度をトリパンブルー排除検定により決定する（Ｙｏｕｎｇら、１９９１）。細胞を、１％のゼラチンで被覆された（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，  ＮＪ）１００ｍｍ培養皿（Ｆａｌｃｏｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）又はＴ−７５培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）あたり細胞１０５個の割合で播種する。９５％空気／５％ＣＯ２の加湿された環境の中で３７℃で密集性に至るまで、細胞培養を増殖させる。密集状態になった時点で、細胞をトリプシンで放出させ、凍結保存する。−７０℃〜−８０℃の最終温度が達成されるまで７．５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｔｈｉｏｋｏｌ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）を含有する間葉幹細胞−１中で細胞低速凍結させる（毎分１度の温度降下）（Ｙｏｕｎｇ  ら、  １９９１）。
【０４４８】
表現型発現のためのインシュリン−デキサメタゾン分析
凍結保存した細胞を融解し、標準的プロトコルに従ってゼラチンで被覆された２４ウェルの平板のウェル１個あたり５、１０又は２０×１０３個の細胞の割合で、間葉幹細胞−１内で平板固定する。初期平板固定から２４時間後に、培地をテスト用培地（ＴＭ）１〜６（ＴＭ−１、ＴＭ−２、ＴＭ−３、ＴＭ−４、ＴＭ−５又はＴＭ−６）へと変更する。ＴＭ−１〜ＴＭ−４は、Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（カタログ番号１２〜７２５Ｂ、ロット番号、ＯＭＯ  ４５５〔ＴＭ−１〕、１Ｍ１７２４〔ＴＭ−２〕、２Ｍ０４２０〔ＴＭ−３〕又は２Ｍ０２７４〔ＴＭ−４〕、Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、培地（ＥＭＥＭ又はＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．０１ｍＭβ−メルカプトエタノール）及び１％の（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌物質、ｐＨ７．４から成る。ＴＭ−５は、９８％（ｖ／ｖ）の培地、１％（ｖ／ｖ）ＨＳ及び１％（ｖ／ｖ）抗生物質−抗真菌物質、ｐＨ７．４から成る。ＴＭ−６は、９８．５％（ｖ／ｖ）の培地、０．５％（ｖ／ｖ）のＨＳ及び１％（ｖ／ｖ）の抗生物質−抗真菌物質、ｐＨ７．４から成る。Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ：  培地（ＥＭＥＭ又はＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．０１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）：抗生物質（＋抗真菌物質）を複数の比率で含むテスト用培地は、最低３０日最高１２０日の培養期間について「定常状態」条件下で始原細胞及び多能性細胞の両方を維持した。さまざまな濃度のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅを各々含む４つのテスト用培地（ＴＭ＃’ｓ１〜４）を使用した。各テスト用培地中に存在するＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ対培地対抗生物質の比率は、鳥の始原細胞及び多能性細胞の両方の個体群の中で定常状態条件を維持するその能力に基づいて、各々のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅロットについて経験的に決定された。４つのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅベースのテスト用培地は、以下の通りであった：ＴＭ−１＝１５％（ｖ／ｖ）Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号ＯＭＯ４５５）；８４％（ｖ／ｖ）培地；１％（ｖ／ｖ）抗生物質；ＴＭ−２＝１５％（ｖ／ｖ）Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号１Ｍ１７２４）；８４％（ｖ／ｖ）培地；１％（ｖ／ｖ）抗生物質；ＴＭ−３＝５０％（ｖ／ｖ）Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号．２Ｍ０４２０）；４９％（ｖ／ｖ）培地；１％（ｖ／ｖ）抗生物質；及びＴＭ−４＝７５％（ｖ／ｖ）Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号２Ｍ０２７４）；２４％（ｖ／ｖ）培地；１％（ｖ／ｖ）抗生物質。間葉幹細胞−１培地中のあらゆる潜在的共力成分を洗い出すために、テスト用培地単独の中での２４時間の予備インキュベーションを使用する。２４時間後に、テスト用培地を次のもののうちの１つに変更する。対照として、ＴＭ−１〜ＴＭ−６が単独で用いられる。始原細胞のクローンを同定するためには、始原細胞内の表現型発現マーカーの出現を加速する作用物質である２μｇ／ｍｌのインシュリン（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＭ−１〜ＴＭ−６で培地を置換する（表１８）。多能性細胞のクローンを同定するためには、一般的な非特異的系列誘発作用物質である１０−１０〜１０−６Ｍのテキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＭ−１〜ＴＭ−６で培地を置換する（表１９）��対照及び処理対象培地は、一日置きに培地を変更して、さらに３０〜４５日間増殖させる。実験一回、濃度１つあたり４つの培養ウェルを使用する。０〜４５日の期間中、培養を毎日のベースで形態的特徴の変化について主観的に検査する。表現型発現の改変は処理日数及び付随するインシュリン又はデキサメタゾン濃度と相関される。その後、立証された組織学的、機能的／組織化学的、ＥＬＩＣＡ／フローサイトメトリ、及び分子検定を用いて表現型発現マーカーを客観的に確認するためこれらのパラメータを利用して、実験を反復する（表１９）。
【０４４９】
【表１８】
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【０４５０】
【表１９】
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【０４５１】
以下に記すのは、上述の実施例１〜１０中で言及されている参考文献のアルファベット順のリストである。リストアップされた参考文献ならびにその他の出版物の開示、本書で挙げた特許開示又は文書は全て、本書中にその全体が参考として内含されている。
【０４５２】
【参考文献】
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【０４５３】
【実施例１１】
クローン原生分析が、出生後の動物中の予備多能性原外胚葉様幹細胞を明らかにする
【概要】
階段希釈クローン原生分析を用いた以前の研究が、出生後のラット骨格筋に付随する結合組織から分離された予備多能性間葉幹細胞（ＰＰＭＳＣ）のクローン個体群の存在を報告した。同様に階段希釈クローン原生分析を用いる現行の研究は、多能性幹細胞のもう１つのクローン個体群の存在を報告している。これら２つのクローン細胞系統間の比較分析は、類似性と差異を実証している。インシュリン／デキサメタゾン生物検定によって見極められるように、両方のクローン細胞系統共、系列が決定されていない。両方のクローン細胞系統共、外因性作用物質によって活性化されないかぎり血清を含まない培地内で静止状態にとどまる。そして両方のクローン細胞系統共、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界を超えて拡大自己更新能力をもつ。ＰＰＭＳＣクローンは、密集状態で接触阻害される。これとは対照的に、本書に報告されているクローンは接触制限されておらず、密集状態を超えて増殖し続けることになる。両方のクローン細胞系統は共に中胚葉由来の細胞（すなわち骨格筋、平滑筋、脂肪、軟骨、骨）を形成することになるが、一方本書で報告されるクローンは同様に、外胚葉由来（すなわち神経幹細胞、神経細胞）及び内胚葉由来（すなわち肝細胞）の細胞をも形成する。３つの一次胚葉から細胞を形成するその潜在能のため、我々はこの出生後ラットクローンを多能性原外胚葉様予備幹細胞と呼称した。この研究は、出生後の哺乳動物の体内の胚様予備幹細胞の保持及び、身体組織の正常な維持、修復及び再生におけるそれらの潜在的関与を示唆している。
【０４５４】
【序】
胚幹細胞は、ヒトを含む霊長類とげっ歯類の尾胞、内部細胞塊及び生殖腺隆線内で同定された（Ｅｖａｎｓ  ら、１９８１；Ｍａｒｔｉｎ，  １９８１；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ら、１９９５，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ら、１９９８；Ｇｅａｒｈａｒｔ  ら、１９９９）。分離の後、これらの未分化細胞は、胚幹細胞抗原、陽性アルカリホスファターゼ染色、拡大自己更新能力及びテロメラーゼ活性についての免疫学的マーカーを発現する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現が許された時点で、これらの細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉由来の組織についての免疫学的マーカーを発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ら、１９９５，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ら、１９９８；Ｇｅａｒｈａｒｔ  ら、，  １９９９）。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植された時点で、胚幹細胞は、自然発生的奇形腫を形成する（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ら、１９９８；Ｇｒｅａｒｈａｒｔ  ら、１９９９）。これらの独特の性質のため、胚幹細胞は、組織移植のためのドナー細胞の供給源として提案されてきた（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ら、１９９５，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ら、１９９８；Ｇｅａｒｈａｒｔ  ら、１９９９）。
【０４５５】
現行のクローン原生研究は、多能性幹細胞のクローン個体群が出生後の哺乳動物の結合組織内に存在するか否かを見極めるため、そしてそれらの機能的能力を検査するために着手された。我々は以前に、出生後のラットの骨格筋に付随する結合組織から分離された多能性間葉幹細胞（ＰＰＭＳＣ）クローン個体群すなわちＣｌｏｎｅ−Ａ２Ａ２の存在について報告した（Ｙｏｕｎｇ  ら、２０００ａ）。ＰＰＭＳＣクローン系統は、分化決定されず、外因性作用物質により活性化されないかぎり無血清培地内で静止状態にとどまり、自己更新のための拡大した能力を有し、密集状態で接触阻害され、中胚葉系列すなわち筋肉、脂肪、軟骨及び骨からの組織のみを形成した。現行の研究は、出生後ラット結合組織由来の多能性幹細胞の第２のクローン個体群の存在を報告している。このクローン細胞系統は同様に分化決定されておらず、無血清培地内で静止状態にとどまるはずであり、アルカリホスファターゼ及びテロメラーゼ活性の両方を発現し、拡大した自己更新能力を有し、独自の分化能力を有する。
【０４５６】
【材料及び方法】
出生後ラット結合組織由来の幹細胞
出生後Ｓｐｒａｇｎｅ−Ｄａｗｌｅｙラットからの骨格筋を、単核細胞の分離、平板固定、密集状態までの増殖、トリプシン放出及び凍結保存のために処理した（Ｙｏｕｎｇ  ら、．２０００ａ）。細胞を反復的に融解し、５０の細胞倍加に達するまで膨張させた（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９１，１９９３，１９９８ｂ；Ｙｏｕｎｇ  ２０００）。個々のクローンは、階段希釈クローン原生分析によって生成された（Ｙｏｕｎｇ  ら、２０００ａ）。各回のクローニングは、約２０の細胞倍加という結果をもたらした。かくして、４回のクローニングは、結果として得られたクローンの中で約８０の細胞倍加をもたらした。結果としてのクローンを増殖させ、トリプシンで放出させ、アリコートにし、凍結保存した（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３，１９９８ａ，２０００ａ；Ｒｏｇｅｒｓ  ら、１９９５）。本書で報告したクローンをラット−Ａ２Ｂ２と呼称し、１３０の細胞倍加の後、多能性について徹底的に検査した。
【０４５７】
分化能力についてのインシュリン−デキサメタゾン分析
分化決定された始原幹細胞又は分化決定されていない多能性幹細胞のいずれかとしてのその同一性を見極めるために、無血清培地及びインシュリン及びデキサメタゾンを含有する無血清培地を用いて、ラット−Ａ２Ｂ２を検査した。インシュリン、インシュリン様成長因子−Ｉ及びインシュリン様成長因子−ＩＩといったような進行因子は、始原細胞内で表現型発現を加速するが、多能性幹細胞内の表現型発現の誘発に対しいかなる効果をもたない。（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３，１９９８ｂ；Ｙｏｕｎｇ，２０００）。これとは対照的に、デキサメタゾン、骨形態形成タンパク質−２及び筋形態形成タンパク質といったような系列誘発作用物質は、分化決定及び多能性細胞内での発現を誘発するが、始原細胞内での表現型発現は改変させない（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３，１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ；Ｙｏｕｎｇ  ２０００）。従って、培養中に始原細胞が単独で存在する場合、デキサメタゾンでインキュベートされたものに比べて、インシュリン内でインキュベートされた培養について、発現された表現型の差異は全く存在しないことになる。培養が始原細胞及び多能性細胞の両方を含んで混合された場合には、インシュリンで処理されたものに比べデキサメタゾンで処理された培養中には、発現された表現型により大きな変動が存在することになる。培養が多能性細胞を単独で含有する場合、インシュリン処理された培養中には、発現された表現型が全く存在しなくなる。デキサメタゾンで処理された類似の培養は、多数の表現型の発現を示すことになる。かくして、デキサメタゾンとインシュリンの処理の効果を比較することによって、未知の細胞個体群の中の特定のタイプの始原細胞及び多能性細胞同定することができる（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２，１９９５；Ｌｕｃａｓ  ら、１９９３，１９９５；Ｐａｔｅ  ら、１９９３；Ｒｏｇｅｒｓ  ら、１９９５；Ｗａｒｅｊｃｋａ  ら、１９９６）。
【０４５８】
ラット−Ａ２Ｂ２クローン細胞系統を、完全培地内で平板固定し（Ｙｏｕｎｇ  ら、  ２０００ａ），２４時間付着させ、２４時間無血清テスト用培地に移して完全培地内の何らかの潜在的共力成分を洗い出し、その後、テスト用培地を単独で使用した。始原幹細胞を同定するため、テトス用培地に２ｍｇ／ｍｌのインシュリン（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を添加した。多能性幹細胞を同定するため、テスト用培地に対し１０−１０から１０−６Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を添加した。多能性幹細胞をさらに同定するため、２ｍｇ／ｍｌのインシュリン及び１０−６Ｍのデキサメタゾンを含むテスト用培地に対し、多数の誘発作用物質を含有するものとして知られている選択された血清（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９８ａ，ｂ）を添加した。使用した選択された血清はＨＳ９（９０Ｈ−０７０１，Ｓｉｇｍａ）及びＨＳ１０（ＭｏｒｐｈｏＧｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）であった。対照及び処理済み培養を、一日おきに培地を変更して、さらに３０〜４５日間増殖させた。１回の実験、濃度１つにつき３〜６個の培養ウェルを使用した。３０〜４５日の期間中、細胞の形態の主観的分析を用いて、培養を毎日検査した。この研究で指摘された形態的変化は、以前の研究からの徹底的な検査に基づくものであった（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９１，１９９２ａ，ｂ，１９９３，１９９５，１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ，ｂ；Ｙｏｕｎｇ，  ２０００）。表現型発現の改変（以下参照）を、処理日数及び利用された外因性作用物質の濃度と相関させた。
【０４５９】
その後、以前に実証された組織化学及び免疫化学的手順を用いて、表現型発現についてさまざまな立証済みマーカーの存在を客観的に確認するため、これらのパラメータを用いて実験をくり返した（精査、Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２ｂ，１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ，Ｙｏｕｎｇ，  ２０００）。培養をメーカーの指示に従ってか又は記述通りに処理した（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２ｂ，２０００ａ）。細胞は、Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ、倒立位相差／明視野顕微鏡を用いて撮影した。
【０４６０】
形態学的、組織化学的及び免疫細胞化学的分析
中胚葉表現型についての我々の標準的な形態学的生物検定（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ；Ｙｏｕｎｇ，  ２０００）は、外胚葉及び内胚葉系列に属する潜在的な分化した細胞型を内含するように増強された。検定全体を通して以下の形態について、培養をスクリーニングした。
【０４６１】
推定上の胚様幹細胞を、その相対的に小さいサイズ及びその大きい核対細胞質比により試験的に同定した。アルカリホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）組織化学を用いて、確認を達成した。
【０４６２】
多数の細かい「クモ状」細胞プロセスを用いて単核細胞として、推定上の神経細胞を試験的に同定した。神経外胚葉系列の表現型マーカーに特定的な抗体を用いて、免疫化学的染色により、神経細胞関連細胞型を確認した。これらの抗体は、神経細胞前駆体細胞［ＦＯＲＳＥ−１、ＤＳＨＢ（Ｔｏｌｅ  ら、１９９５ａ，ｂ）］ネスチン［ＲＡＴ−４０１、ＤＳＨＢ（Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ  及び  Ｍｃｋａｙ，１９８５）］、神経フィラメント［ＲＴ９７，ＤＳＨＢ（Ｗｏｏｄ及びＡｎｄｅｒｔｏｎ，  １９８１）］、神経細胞［８Ａ２，ＤＳＨＢ（Ｄｒａｚｂａ  ら、１９９１）］、及び乏突起膠細胞（Ｒｉｐ，  ＤＳＨＢ（  ）］に特徴的なエピトープを染色した。上皮関連細胞型を、上皮成長因子レセプタ〔１５１−Ｉｇ，ＤＳＨＢ〕について免疫化学的に染色することによって確認した。
【０４６３】
推定上の筋芽細胞を、単核双極形状細胞として試験的に同定した。筋芽細胞表現型を、マイオジェニンについての抗体を用いて確認した〔Ｆ５Ｄ、ＤＳＨＢ（Ｗｒｉｇｈｔ  ら、，  １９９１）〕。
【０４６４】
推定上の骨格筋管を、多核性線状及び有枝細胞として試験的に同定した。骨格筋表現型は、筋節ミオシン［ＭＦ−２０、ＤＳＨＢ（Ｂａｄｅｒ  ら、１９８２）］、速−骨格筋ミオシン［ＭＹ−３２，Ｓｉｇｍａ  （Ｎａｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｅ，  １９９４）］、ミオシン重鎖［ＡＬＤ−５８、ＤＳＨＢ（Ｓｈａｆｉｑ  ら、１９８４）］、及びミオシン高速鎖［Ａ４、７４、ＤＳＨＢ（Ｗｅｂｓｔｅｒ  ら、１９８８）］についての抗体染色により確認した。
【０４６５】
細胞内フィラメントを伴う単核多角形細胞として、推定上の平滑筋細胞を試験的に同定した。平滑筋アルファアクチンについての抗体染色により、平滑筋表現型を確認した［１Ａ４、Ｓｉｇｍａ  （Ｓｋａｌｌｉ  ら、１９８６）］．
【０４６６】
推定上の脂肪細胞を、細胞内屈折小胞を伴う単核細胞として、試験的に同定した。脂肪細胞は、スーダンブラック−Ｂ（Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ）及びオイルレッド−Ｏ（Ｓｉｇｍａ）（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ；Ｙｏｕｎｇ  ２０００）での組織化学的染色を介して飽和した中性脂質含有細胞内小胞の存在によって確認された。
【０４６７】
細胞周囲のマトリクスのカサを含む丸くなった細胞の凝塊として、推定上の軟骨小結節を試験的に同定した。軟骨小結節は、組織化学染色及び免疫化学染色の両方によって確認された。組織化学的には、細胞周囲及び／又は細胞外マトリクス内のコンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸を伴うグリコサミノグリカン側を含むプロテオグリカンを染色することによって、軟骨小結節を視覚化した。これは、ｐＨ１．０でアルシアンブルー  （Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌａｕ  ８ＧＳ，Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．）  又はサフラニン−Ｏ  （Ｃｈｒｏｍａ  −Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）を用いて達成された。細胞外マトリクス内にある軟骨に特異的なグリコサミノグリカンの検証は、コンドロイチナーゼ−ＡＣ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）及びケラチナーゼ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）  での材料の消化の後の染色の喪失によって確かめられた（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９８９ａ，ｂ，１９９３，１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ；Ｙｏｕｎｇ  ２０００）。免疫化学的には、軟骨形成表現型は、ＩＩ型コラーゲン［ＣＩＩＣ１，ＤＳＨＢ（Ｈｏｌｍｄａｈｌ  ら、（１９８６）］及びＩＸ型コラーゲン［Ｄ１−９，ＤＳＨＢ（Ｙｅ  ら、１９９１）］に対する抗体についての、まずは細胞内そしてそれに続いて細胞外の染色によって確認された。
【０４６８】
密な３次元マトリクスが重ね合わされた丸くなった細胞の凝塊として、推定上の骨小結節を試験的に同定した。骨小結節は、組織化学的及び免疫化学的染色の両方により確認された。組織化学的には、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ  （Ｓｉｌｂｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）手順を用いてリン酸カルシウムについての細胞外マトリクスの陽性染色により、骨形成原表現型を検証した。細胞外マトリクス内のリン酸カルシウムの存在の検証は、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−［ｂ−アミノエチルエーテル〕Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、Ｓｉｇｍａ）、特異的カルシウムキレート化剤（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ；Ｙｏｕｎｇ，  ２０００）での予備処理後のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ  手順による陽性染色の消滅により確認された。免疫細胞化学的には、骨形成原表現型は、骨シャロタンパク［ＷＶ１Ｄ１，ＤＳＨＢ（Ｋａｓｕｇａｉ  ら、１９９２）］及びオステオポンテン［ＭＰ１１１，ＤＳＨＢ（Ｇｏｒｓｋｉ  ら、１９９０）］に対する抗体にについての、まずは細胞内そしてその後細胞外の染色により確認された。
【０４６９】
非屈折材料を含む細胞内小胞を伴う単核細胞として、推定上の肝細胞を試験的に同定した。アルファフェトプロテイン［ＲＡＦＰ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  （Ｍｕｊｏｏ  ら、１９８３）］についての抗体染色により、肝細胞表現型を確認した。
【０４７０】
最後に、分化されたラット細胞の特徴であるラット特異的主要組織適合性複合体−ＩＬＲＭＨＣ−Ｉ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  （Ｒｕｂｉｎ  ら、１９８４；Ｐｒａｂｈａｌａ  ａｎｄ  Ｗｉｒａ，１９９５）］についても、培養を染色した。
【０４７１】
２次抗体は、Ｖｅｃｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）  内に収納されたビオチニル化抗ヒツジＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）、  ビオチニル化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｉｔｙ，  Ｓｔａｔｅ）で構成されていた。三次プローブは、Ｖｅｃｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）  内に収納されたアビジン−ＨＲＰで構成されていた。抗体結合を視覚化するために、ペルオキシダーゼのための不溶性ＨＲＰ基質ＶＩＰ基質キット（青、Ｖｅｃｔｏｒ）、ペルオキシダーゼのためのＤＡＢ基質（黒、Ｖｅｃｔｏｒ）及びＡＥＣ染色キット（赤、Ｓｉｇｍａ）を使用した。同じ培養ウェルの多数の逐次的染色を可能にするため、異なる色のついた基質を利用した。
【０４７２】
抗体
Ｐ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎにより開発されたＦＯＲＳＥ−１，Ｓ．Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ  により開発されたＲＡＴ−４０１，Ｊ．Ｗｏｏｄ    により開発されたＲＴ−９７，Ｖ．  Ｌｅｍｍｏｎ  により開発された８Ａ２，Ｓ．Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ  により開発されたＲｉｐ，  Ａ．Ｈｕｂｂａｒｄにより開発された１５１−Ｉｇ，Ｗ．Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔにより開発されたＦ５Ｄ，Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｍａｎにより開発されたＭＦ−２０，Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｈｍａｎ  により開発されたＡＬＤ−５８，Ｈ．Ｍ．Ｂｌａｕにより開発されたＡ．４．７４，Ｒ．Ｈｏｌｍｄａｈｌ及びＫ．Ｒｕｂｉｎ  により開発されたＣＩＩＣ１，Ｘ．−Ｊ．  Ｙｅ及びＫ．Ｔｅｒａｔｏにより開発されたＤ１−９，Ｍ．Ｓｏｌｕｒｓｈ  及びＡ．Ｆｒａｚｅｎにより開発されたＷＶＩＤ１及びＭ．Ｓｏｏｕｒｓｈ及びＡ．Ｆｒａｚｅｎにより開発されたＭＰ１１１といった抗体を、ＮＩＣＨＤの賛助の下で開発されたＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから入手し、アイオワ大学生物学部、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，  ＩＡ５２２４２により維持した。
【０４７３】
拡大自己更新能力
１３０の細胞倍加から出発して、ラット−Ａ２Ｂ２クローンを融解し、ゼラチンで被覆されたＴ−２５フラスコ１本あたり１００×１０３細胞の割合で平板固定した。細胞を、密集後状態（７〜８日）まで増殖させ、トリプシンで放出させた（Ｙｏｕｎｇ  ら、．  １９９９，２０００ａ）。細胞数は、フラスコ１本につき５〜６．５×１０６細胞又は一継代あたり５〜６細胞倍加の範囲内にあった。倍加時間は平均１８〜２４時間であった。細胞を約１〜１１×１０６細胞／ｍｌでアリコートにし、凍結保存した。密集を超えた増殖、トリプシンでの放出及び凍結保存の手順をさらに１２継代、つまりクローニング後６８の細胞倍加全体を通して反復した。こうして１３０の細胞倍加開始数と合わさって、１９８の細胞倍加を受けた細胞クローンが結果としてもたらされた。１３０〜１９８細胞倍加の各継代間隔で、細胞アリコートを、インシュリン及びデキサメタゾンと共に３０〜４５日間インキュベートし、形態学的、組織化学的及び免疫化学的に検査した。
【０４７４】
テロメラーゼ検定。１９８の細胞倍加でラット−Ａ２Ｂ２をテロメラーゼ活性について検定した。細胞を融解し、ゼラチンで被覆されたＴ−７５フラスコ１本あたり１００〜１０３細胞の割合で平板固定し、密集状態を超えて成長させた。トリプシリ放出により細胞を収獲し（Ｙｏｕｎｇ  ら、，  １９９９），Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ検出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔ）内にメーカーが記述したとおりに、テロメラーゼ活性のため細胞を処理した。
【０４７５】
【結果】
分化能力
当初の（１３０細胞倍加）及び膨張した（１３０〜１９８の細胞倍加）比較／対比分析システムの両方において、インシュリン、テキサメタゾン及び／又は選択された血清でのインキュベーションの前後に、ラット−Ａ２Ｂ２クローン細胞系統を分析した。平板固定から２４時間後の培養の観察は、クローンＡ２Ａ２（ＰＰＭＳＣ）細胞系統の細胞サイズの約１／４〜１／２の非常に小さな細胞を明らかにした。これらのさらに小さな細胞は、大きい核対細胞質比を表わした。６週間の無血清テスト用培地内でのラット−Ａ２Ｂ２クローンのインキュベーションは、細胞数の顕著な増大を結果としてもたらさず、平板固定から２４時間後の細胞と同等の形態をもたらした。ラット−Ａ２Ｂ２クローンを６週間インシュリンを伴うテスト用培地内でインキュベートした結果、接触阻害の喪失を実証する特徴の無い細胞の多重層がもたらされた。この多重細胞層は、アルカリホスファターゼ活性についての陽性の染色を実証した（表２０）。これとは対照的に、デキサメタゾンを伴うテスト用培地、デキサメタゾン＋インシュリンを伴うテスト用培地又はデキサメタゾン＋インシュリン＋選択された血清を伴うテスト用培地内でのラット−Ａ２Ｂ２のインキュベーションは、アルカリホスファターゼ染色の喪失、ただし分化した表現型の発現、を結果としてもたらした。外胚葉、中胚葉及び内胚葉系列のためのマーカーを示す細胞が観察された。例えば、外胚葉系列マーカーを表示する細胞は、神経前駆体細胞、ネスチン、神経フィラメント、神経細胞、乏突起膠細胞及び上皮成長因子レセプタについての抗体を用いて同定された。中胚葉系列マーカーを表示する細胞は、筋原性系列についてはマイオジェニン、筋節ミオシン、速骨格筋ミオシン、ミオシン重鎖、ミオシン高速鎖及び平滑筋アクチン；脂肪細胞については飽和中性脂質；軟骨形成系列については硫酸化プロテオグリカンを含むＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン及び軟質小結節；及び骨形性原系列については骨シャロタンパク、オステオポンチン及びリン酸カルシウムを含有する骨小結節についての抗体又は組織化学染色を用いて、同定された。内胚葉系列マーカーを表示する細胞は、肝細胞についての抗体を用いて同定された。外胚葉、中胚葉及び内胚葉系列細胞型を惹起する全ての処理は、分化された細胞としてそれらを識別するラット特異的主要組織適合性複合体−Ｉ（ＲＭＨＣ−Ｉ）エピトープを誘発した（表７）。
【０４７６】
拡大自己更新
その多能性状態を維持しながらの拡大自己更新のための能力を決定するべく、１３０の細胞倍加後の１２の継代の各々において、ラット−Ａ２Ｂ２を検定した。各継代の後、ラット−Ａ２Ｂ２クローンを、インシュリン／デキサメタゾン生物検定において、上述のとおり処理した。結果は、検定した全ての継代レベルにおいて同等で識別不能であった。
【０４７７】
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性の有無について１９８の細胞倍加でラット−Ａ２Ｂ２を検定した。図２に示されているように、テロメラーゼ活性は、この１９８の細胞倍加数で、幹細胞内に比較的高レベルで存在していた。
【０４７８】
【考察】
出生後の多能性幹細胞
出生後のラットの骨格筋に付随する結合組織から分離された細胞の段階希釈クローン原生分析は、多数のクローンを生成した。この研究では、ラット−Ａ２Ｂ２と呼称された１つのクローンが検査された。ラット−Ａ２Ｂ２は、インシュリンを伴う又は伴わない長期インキュベーションに続く星状形態の改変を示さなかった（表２０）。無血清培地又はインシュリンのいずれに対しても応答が欠如していたことは、このクローンが分化決定された始原幹細胞でないことを示唆していた（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ；Ｙｏｕｎｇ，２０００）。これとは対照的に、これらの細胞によるアルカリホスファターゼ活性の発現は、これらの細胞が、胚幹細胞と一部の属性を共有していることを示唆していた（Ｔｈｏｍａｓ  ら、１９９８；Ｇｅａｒｈａｒｔ  ら、１９９９）。実際、インシュリン及び選択された血清を伴う又は伴わない状態でのデキサメタゾンとのインキュベーションは、表現型発現の改変を惹起した（表２０）。これらの結果は、このクローンが、或る形の分化決定されていない多能性幹細胞であることを示唆していた。中胚葉分化細胞型のみを実証したＰＰＭＳＣクローン−Ａ２Ａ２（Ｙｏｕｎｇ  ら、２０００ａ）とは対照的に、ラット−Ａ２Ｂ２で指摘された表現型改変は３つの一次胚葉全て、すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉について示された（表２０）。指摘された表現型改変には、神経前駆体細胞、ネスチン、神経フィラメント、神経細胞、乏突起膠細胞、上皮成長因子レセプタ、筋芽細胞、骨格筋、平滑筋、脂肪細胞、軟骨、骨及び肝細胞の出現が含まれていた。外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系列細胞型を惹起する全ての処理は、同様に、分化された細胞を同定するラット特異的主要組織適合性複合体−Ｉ（ＲＭＨＣ−Ｉ）エピトープをも誘発した（表２０）。拡大自己更新についてクローンテストした時点で、我々は、その分化潜在能力の偏差を全く認識しなかった。最後に、１９８の細胞倍加で、ラット−Ａ２Ｂ２はテロメラーゼ活性を実証した。
【０４７９】
そのアルカリホスファターゼ活性の発現、拡大自己更新潜在能力、テロメラーゼ活性の発現及び３つの一次胚葉全てから分化された細胞を形成する潜在能力のため、この出生後ラットクローンラット−Ａ２Ｂ２を多能性原外胚葉様幹細胞（ＰＰＥＬＳＣ）と呼称した。
【０４８０】
前述の通り、胚幹細胞は、アルカリホスファターゼ活性、拡大自己更新能力、テロメラーゼ活性、自然発生的分化及び外胚葉、中胚葉及び内胚葉由来の細胞に分化する能力を実証している（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ら、１９９５，１９９８；Ｇｅａｒｈａｒｔ  ら、１９９９）。胚幹細胞のその他の側面については、この研究では直接取組まれなかった。これらの側面としては、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植された場合の自然発生的奇形腫の形成又は胚幹細胞抗原についての免疫学的マーカーが含まれていた（Ｔｈｏｍａｓ  ら、１９９５，１９９８；Ｇｅａｒｈａｒｔ  ら、１９９９）。しかしながら、この研究からのデータ（アルカリホスファターゼ活性、自己更新のための拡大された能力、テロメラーゼ活性及び三つの一次胚葉全てから細胞を形成する能力）は、「胚」様予備幹細胞すなわち多能性原外胚葉様幹細胞が出生後の哺乳動物の結合組織区画内に保持される可能性を示唆している。
【０４８１】
出生後の種の中の予備幹細胞
以前のクローン原性分析（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３，１９９８ａ，２０００ａ）と本研究を合わせると、予備幹細胞、分化決定された始原細胞及び分化決定されていない多能性細胞の少なくとも２つの一般的カテゴリが示唆されている。予備幹細胞の各々の一般的カテゴリの中には、幹細胞のサブカテゴリもあるように思われる。我々も、そして他の人々も、多くのタイプの分化決定された始原幹細胞すなわち単能性幹細胞（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３；Ｇｒｏｕｎｄｓ，１９９９；Ｙｏｔｓｕｙａｎａｇｉ  ら、１９９９；Ｇｏｒｄｏｎ  ら、２０００）、二能性幹細胞（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３；Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｉｅｒ  ら、２０００；Ｒａｍｉｙａ  ら、２０００）、三能性幹細胞（Ｐｒｏｋｏｐ，  １９９７；Ｙｏｏ  ら、１９９８；  Ｐｉｒｔｅｎｇｅｒ  ら、１９９９）、及び多能性幹細胞（Ｐａｌｉｓ  ａｎｄ  Ｓｅｇｅｌ，１９９８；ＭｃＧｕｉｒｅ，１９９８；Ｒａｔａｊｃｚａｋ  ら、１９９８）の存在を指摘してきた。これらの例では、始原幹細胞は、特定の系列に特異的な細胞型を形成し、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界に適合し（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，  １９６５）、その後、プログラミングされた細胞の老化及び死枯を受ける。我々は同様に、分化決定されていない多能性間葉幹細胞（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３，１９９８ａ，２０００ａ，Ｙｏｕｎｇ，２０００；Ｒｏｇｅｒｓ  ら、１９９５）及び分化決定を受けていない多能性原外胚葉幹細胞（本研究）をも分離しクローニングした。これらの多能性幹細胞は、分化決定されていない。これらの細胞は、それが分化決定を受けない状態にとどまるかぎり、自己更新のための拡大された能力をもつ。多能性幹細胞は、外因性作用物質による作用を受けないかぎり、静止状態にとどまる。これらの幹細胞は、それらをいずれかの特定の組織系列に決定するために誘発性作用物質を必要とする。多能性幹細胞がひとたび特定の組織系列に決定されたならば、これらは、分化決定された始原幹細胞の特性の全てを呈する、すなわち系列制約のある表現型を形成しＨａｌｆｂａｃｋの限界に適合することになる。この研究は、出生後の哺乳動物の体内の胚様予備幹細胞の保持、及び身体組織の正常な維持、修復及び再生におけるそれらの潜在的関与を示唆している。
【０４８２】
現行の及び先行する研究（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９１，１９９２ａ，ｂ，１９９３，１９９５，１９９８ａ，ｂ，１９９９，２０００ａ，ｂ，Ｙｏｕｎｇ，  ２０００；Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ  ら、１９８８；Ｃａｐｌａｎ  ら、１９９３；  Ｐａｔｅ  ら、１９９３；Ｌｕｃａｓ  ら、１９９５，１９９６；Ｒｏｇｅｒｓ  ら、１９９５；Ｓａｉｔｏ  ら、，１９９５；Ｄｉｘｏｎ  ら、１９９６；Ｗａｒｅｊｃｋａ  ら、１９９６；Ｃｌａｒｋ  ら、２０００）に基づき、我々は、ヒトを含めた出生後の動物の体内には少なくとも１０のカテゴリーの予備幹細胞が存在することを提案することになる。提案されるカテゴリは、多能性原外胚葉様幹細胞、多能性外胚葉幹細胞、多能性間葉（中胚葉）幹細胞、多能性内胚葉幹細胞、多能性神経幹細胞、多能性表皮幹細胞、多能性始原幹細胞、三能性始原幹細胞、二能性始原幹細胞及び単能性始原幹細胞である。我々は同様に、これらの予備幹細胞カテゴリのうちの単数又は複数のものを移植療法のために使用でき、使用すべきであるということをも提案することになる。実際、移植療法のための予備出生後幹細胞の使用に関する報告は、数多く存在してきた。例えば、Ｇｒａｎｄｅ  ら、（１９９５）は、全層関節軟骨欠損モデルにおける軟骨及び骨の修復のための成人多能性間葉幹細胞の移植について報告している。Ｅｇｌｉｔｉｓ  及び  Ｍｅｚｅｙは、造血細胞が、成体マウスの脳内で神経支持細胞へと分化することを報告した。Ｃａｐｌａｎ  ら、．（１９９７；Ｗａｋｉｔａｎｉ  ら、１９９４）は、軟骨再生のための骨髄間質由来の間葉幹細胞の使用について報告している。Ｙｏｕｎｇ  ら、．（ＲＧ  Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９８）は、アキレス腱の修復のためのコラーゲンマトリクス内に埋込まれた骨髄間質由来の出生後間葉幹細胞の使用について報告している。Ａｓａｈａｒａ  ら、．（１９９９；Ｋａｌｋａ  ら、２０００）は、新血管新生のための内皮始原細胞の使用について報告している。Ｂｊｏｒｓｏｎ  ら、．（１９９９）は、血球を形成するために成人の神経幹細胞を用いることを報告した。Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ  ら、．（２０００）及びＲａｍｉｙａ  ら、．（２０００）は、膵臓インシュリン分泌ベータ細胞を形成するために管前性幹細胞を使用することを報告している。Ｇｒｏｕｎｄｓ（１９９９）は、筋肉修復のための幹細胞の使用を再考した。Ｇｕｓｓｏｎｉ  ら、．（１９９９）は、幹細胞移植によるｍｄｘマウス内のジストロフィ発現の回復について報告している。Ｊａｃｋｓｏｎ  及びＧｏｏｄｅｌｌ（１９９９）は、骨格筋から分離した幹細胞の造血潜在能力について報告した。Ｎｉｋｌａｓｏｎ（１９９９；ら、１９９９）は、始原幹細胞を用いたｅｘ  ｖｉｖｏの血管の生成について報告した。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ら、（１９９９）は、肝卵形細胞の供給源としての骨髄幹細胞の使用について報告している。Ｙｏｔｓｕｙａｎａｇｉ  ら、．（１９９９）は、軟骨膜からの幹細胞を用いた軟骨の再構築について報告した。Ｇｏｒｄｏｎ  ら、，（２０００）は、未変性非活性化幹細胞を用いた肝の再生について報告した。
【０４８３】
【表２０】
2004504003.tif 000057
【０４８４】
＊  テスト用培地であるＴＭは、Ｏｐｔｉ＋ＭＥＭ＋ベータメルカブトエタノール＋抗生物質／抗真菌剤、ｐＨ７．４で構成されていた。
＊＊  テスト用培地＋インシュリンであるＴＭ＋Ｉｎｓ  は、２ｍｇ／ｍｌのインシュリンを含有するテスト用培地で構成されていた。
＊＊＊  テスト用培地＋誘発性作用物質であるＴＭ＋Ｉｎｄｕｃｔｉｎｅ  Ａｇｅｎｔｓは、以下の組合せのうちの１つを含有するテスト用培地で構成されていた；
２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋０．５％のＨＳ９；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１％のＨＳ９；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋５％のＨＳ９；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１０％のＨＳ９；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１％のＨＳ１０；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋５％のＨＳ１０；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１０％のＨＳ１０；２ｍｇ／ｍｌ  インシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１％のＭＦＣＳ１；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋５％のＭＦＣＳ１；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１０％のＭＦＣＳ１；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１５％のＭＦＣＳ１；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１％のＨＳ９＋３％のＨＳ７；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋５％のＨＳ９＋３％のＨＳ７；２ｍｇ／ｍｌのインシュリン＋１０−６Ｍのデキサメタゾン＋１０％のＨＳ９＋３％のＨＳ７；１％のＨＳ７、３％のＨＳ７、及び３％のＨＳ７．
【０４８５】
【参考文献】
2004504003.tif 000058
2004504003.tif 000059
【０４８６】
【実施例１２】
非近交系ＳＤラット内へのラット多能性原外胚葉様幹細胞クローンＡ２Ｂ２−ｓｃｌ−４０の移植は、対宿主移植片病を誘発しない
同種異系ドナーを用いたこれまでの移植研究は、宿主組織内の炎症反応の誘発を実証している。対宿主移植片病と呼ばれるこの反応は、ドナーと宿主組織の間のＨＬＡ不整合に起因して発生する。本研究の目的は、出生後の非近交系ＳＤラット由来のラット多能性原外胚葉様幹細胞クローンが、成体の非近交系ＳＤラット内の対宿主移植片反応を誘発することになるか否かを見極めることにあった。
【０４８７】
Ａ２Ｂ２−ｓｃｌ−４０と呼ばれる出生後多能性原外胚葉様幹細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏと同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同時培養実験で幹細胞を追跡するべく、ベータガラクトシダーゼ発現のためのＬａｃ−Ｚ遺伝子である安定したゲノミックマーカーで予め形質移入した。Ａ２Ｂ２＝ｓｃｌ−４０幹細胞を密集状態まで成長させ、収穫し、移植のため処理した。幹細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で徹底的に洗浄し、１×１０６の幹細胞を含む１００ｍｌの緩衝液（実験）又は１００ｍｌの緩衝液のみ（対照）を、９５％の空気／５％のＣＯ２の加湿された環境内で３７℃で２４時間無菌ゲルフォームの５ｍｍ３片と共にインキュベートした。
【０４８８】
次に実験用ゲルフォーム（ゲノム標識付けされた幹細胞を含む）及び対照ゲルフォーム（緩衝液のみ）を、成体雄非近交系ＳＤラットの首（耳下腺と胸鎖乳突筋の間）の左右領域内に無作為に移植した。大きな炎症反応について確かめるため動物を剖検し、付着組織と共にゲルフォーム移植片を除去し、３分の１ずつにカットし組織学（３分の２）及び細胞培養（３分の１）のために処理した。剖検結果は、検査対象のいずれの動物にも大きな炎症反応を指摘しなかった。組織学結果は、対照又は実験用のゲルフォーム片のいずれの中にも炎症細胞の大きな浸潤を指摘しなかった。組織培養結果は、対照ゲルフォーム内への多能性幹細胞の内殖及び実験用ゲルフォーム内の移植されたＬａｃ−Ｚ標識付け済み幹細胞による多能性の該研究全体を通しての保持を指摘した。
【０４８９】
【実施例１３】
ラット多能性幹細胞の分離及び神経マーカーの培養発現
ＰＰＭＳＣの分離のために用いられたものと同じプロトコルに従ってＲＯＳＡ２６ＬａｃＺ標識付け済みマウス（ＲＯＳＡ２６  ＰＰＳＣと記されている）及びラット骨格筋（ＲｍＳＣ−１と記されている）からＰＰＳＣを分離し、同じ選択されたウマ血清を含むＰＰＭＳＣのために用いられたのと同じ培地内でこれを培養した（Ｌｕｃａｓ  ら、  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．  Ｒｅｇ．  ３；４５７−４６８）。ＲＯＳＡ２６マウスは、Ｂ−ガラクトシダーゼを発現する遺伝子導入マウスであり、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られた。ＲｍＳＣ−１細胞を、Ｌｕｃａｓ  ら、  （Ｌｕｃａｓ  ら、  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．  Ｒｅｇ．３；４５７−４６８）に記述されているように、雄及び雌のラット新生児の骨格筋から分離した。デキサメタゾンで処理されたＲＯＳＡ２６ＰＰＳＣ及びＲｍＳＣ−１ＰＰＳＣの培養中で、神経細胞−脂肪細胞、骨格筋管、軟骨細胞、骨芽細胞などと並んで培養内で中胚葉表現型が分化した。ＰＰＭＳＣのために使用された分離手順は同様に、神経ならびに中胚葉表現型へと分化できる細胞を分離する能力をもっている。
【０４９０】
ＲＯＳＡ２６ＰＰＳＣ及びＲｍＳＣ−１  ＰＰＳＣを、誘発デキサメタゾン条件内で培養させ、星状膠細胞と同時培養させ、星状膠細胞からの調整培地で培養させ、結果として得られた細胞を、抗体染色により神経細胞表現型について評価した。細胞を２４ウェルの培養皿内で平板固定し、上述の方法及び材料を用いて抗体染色により評価した。ＲＯＳＡ  β−ガラクトシダーゼ発現細胞を染色するためには、Ｘ−ｇａｌ  を利用した。神経細胞抗体マーカーは、ＤＨＳＢから得られたＧＦＡＰ（星状膠細胞）、ＣＮＰａｓｅ（神経用の神経細胞マーカー）、ＩＡ４及びＲＴ−９７（神経フィラメント）であり、上述の実施例（実施例９及び１０）でさらに特徴づけされていた。神経細胞抗体は一次抗体として使用され、ＨＲＰで標識付けされたヤギ抗マウス抗体は二次抗体として使用された。免疫染色のためのカラー試薬は、ＨＲＰのためのクロマジェンであるＴｒｕｅｂｌｕｅ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ）であった。
【０４９１】
ＲＯＳＡ２６ＰＰＳＣを２１日間ラット星状膠細胞と同時培養し、神経細胞マーカーＧＦＡＰ及び（ＬａｃＺ遺伝子の産物を認識し、従ってＲＯＳＡ細胞を認識する）Ｘ−ｇａｌに対する抗体で染色した。図３５は、Ｘ−ｇａｌ及びＧＦＡＰで染色した２１日間のラット星状膠細胞とＲＯＳＡ２６ＰＰＳの同時培養を示す。Ｘ−ｇａｌでのみ染色し、Ｘｇａｌ及びＧＦＡＰの両方について２重染色した細胞が発見された。黒色矢印は、２重染色された細胞を指し、白色矢印はＧＦＡＰについて染色されなかったＲＯＳＡ  ＰＰＳＣを指している。図３６は、Ｘ−ｇａｌ及びＧＦＡＰで染色された２１日間のラット星状膠細胞とＲＯＳＡ２６ＰＰＳＣの同時培養を示す。ＧＦＡＰでのみ染色された星状膠細胞が記され（白色矢印）、同様にＸ−ｇａｌ及びＧＦＡＰについて２重染色されたＲＯＳＡ由来の細胞（黒色矢印）も記されている。図３７には、Ｘ−ｇａｌ及びＧＦＡＰで染色された２１日間のＲＯＳＡ２６ＰＰＳＣとラット星状膠細胞の同時培養も示されている。白色矢印はＸ−ｇａｌについて染色されたＲＯＳＡ２６ＰＰＳＣ（未分化）を指し、一方黒色矢印は、Ｘ−ｇａｌ及びＧＦＡＰについて２重染色されたＲＯＳＡ細胞（分化）を指す。
【０４９２】
ラット骨格筋から分離したＰＰＳＣ（ＲｍＳＣ−１）を２１日間１０〜７Ｍのデキサメタゾンで処理して分化を誘発し、次にさまざまな神経細胞特異的抗体で染色した。図３８は、２１日間１０〜７Ｍのデキサメタゾンで処理され、その後抗−ＣＮＰａｓｅで染色されたラット骨格筋（ＲｍＳＣ−１）から分離されたＰＰＳＣを、ＣＮＰａｓｅ、抗ＣＮＰａｓｅについて陽性の細胞が黒色矢印で示された状態で描かれている。ＩＡ４に対する抗体で染色されたデキサメタゾン処理済みＲｍＳＣ−１細胞が、図３９に示されている。
【０４９３】
図４０は、２１日間ラット星状膠細胞からの調整培地で処理されかつ抗体ＲＴ−９７で染色されたＲｍＳＣ−１を示す。陽性染色細胞が矢印で記されている。ＣＮＰａｓｅ及びＧＦＡＰについて陽性の細胞は同様に、２１日間のラット星状膠細胞からの調整培地内でのＲｍＳＣ−１細胞の成長後に染色時点でも観察された。
【０４９４】
【実施例１４】
ヒト成体から分離された多数の幹細胞個体群
上述のプロトコルを用いて、Ｃ３ＴＦ細胞と呼称された１７才の女性の真皮から、幹細胞が分離され、Ｙｏｕｎｇ  ら、  により提供された（Ｙｏｕｎｇ，  Ｈ．Ｅ．  ら、（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３：２７５−２８４；Ｙｏｕｎｇ，  Ｈ．Ｅ．  ら、  （１９９２ａ）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：８５−９２）。Ｃ３ＴＦ細胞は、核型分析され、４６，ＸＸの正常な雌であることが証明された（図４１）。この核型は、Ｃ３ｔＦ細胞が３７の細胞倍加にあるときに実施された。３７の細胞倍加後、ＣＴ３Ｆ細胞は半分に分割され、１０％の選択された血清ＨＳ１０の存在下及び１５％の選択された血清ＭＦＣＳ１の存在下という２つの異なる培養条件下に置かれた。幹細胞、多能性間葉幹細胞及び多能性胚様幹細胞のＰＰＭＳＣ及びＰＰＥＬＳＣと呼ばれる２つの個体群が、それぞれこれらの血清条件下で分離された。ＰＰＭＳＣ細胞は、いずれか及び全ての間葉細胞型を形成する能力を有する。ＰＰＥＬＳＣ細胞は、中胚葉、外胚葉及び内胚葉系列内の細胞型を形成する能力をもつ。ＣＤマーカーフロー分析がこれら２つの細胞個体群について実施された。ＰＰＭＳＣと呼ばれる個体群は、７２の細胞倍加にあり、一方  ＰＰＥＬＳＣと呼ばれる個体群は、ＣＤマーカー分析が実施されたとき７０の細胞倍加があった。分析においては、５８のＣＤマーカーが利用された。
【０４９５】
ＰＰＥＬＳＣは、テストされた５８のＣＤマーカ抗体全てについて、つまり特定的には、ＣＤｌａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１６６、グリコホリン−Ａ、ＤＲΠ、クラス−Ｉ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、アネキシン、  及びＬＩＮについて陰性であった。ＰＰＥＬＳＣは、テストされたいずれのＣＤマーカーについても陽性染色を全く示さなかった。
【０４９６】
ＰＰＭＳＣは、ＣＤマーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ５６、ＣＤ９０及びＭＨＣクラス−Ｉについて陽性染色を実証した。この結果は、実施例７及び８において以上でＰＰＭＳＣについて紹介したＣＤマーカー研究と相関している。ＰＰＭＳＣは、５２の抗体すなわち、ＣＤｌａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５５、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６５、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１６６、グリコホリン−Ａ、ＤＲΠ、ＦＬＴ３、ＦＭＣ−７、アネキシン  及びＬＩＮについて陰性であった。
【０４９７】
独特のＣＤマーカープロフィールに基づく成人の予備幹細胞の付加的個体群をＣ３ＴＦ細胞から分離した。これらの個体群は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１０、ＣＤ４１、ＣＤ６６ｅ及びアネキシン  について陽性であり、その他全てのマーカーについて陰性である。ＣＤ６６ｅは胚抗原マーカーである。第２の個体群は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１０、ＣＤ２２及びアネキシン  について陽性であり、その他全てについて陰性である。第３の個体群はＣＤ１０及びＣＤ２２について陽性であり、その他全てのマーカーについて陰性である。これらの結果は、場合によって全く異なる増殖及び分化能力をもつ付加的な幹細胞個体群の存在を表わしている。
【０４９８】
【実施例１５】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内のｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト多能性幹細胞による造血再形成
【プロトコルの概要】
本研究の目的は、ヒトの幹細胞療法のために生来の出生後多能性幹細胞又は出生後多能性幹細胞で誘発された造血幹細胞を使用することの実行可能性を見極めることにある。６７才の男性及び１７才の女性に由来する出生後ヒト多能性幹細胞を、生来の及び造血誘発された幹細胞として個別に、亜致死の照射を受けた免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤの中に、マウス造血幹細胞と同時移植される。マウス内へのヒトの細胞の取込みを同定するためには、マウスの血液及び骨髄中の細胞上のヒト特異的ＣＤ４５抗原発現が使用されることになる。ヒト幹細胞の造血再増殖活性に同定するためには、Ｂ細胞、顆粒球、巨核球及び赤血球についてのＣＤマーカープロフィールが使用される。マウス細胞と混合されたヒト特異的ＣＤ４５抗原を発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒトの幹細胞がマウス内に取込まれたことを表わす。骨髄球及びリンパ球の両方の系列のヒト造血ＣＤマーカーが発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞が造血系を再生しつつあることを表わす。
【０４９９】
【プロトコルの詳述】
使用された動物は全て、Ｔ細胞の漏出性の徴候について予備テストされた免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤである（ｎ＝各グループにつき６）。動物は、表２１内で以下で示されているとおりにグループ分けされ処理される。
【０５００】
【表２１】
2004504003.tif 000060
【０５０１】
ヒト細胞の植付けのための検定パラメータ；
移植されたマウス及び対照のマウスからの血液（１）及び骨髄（２ａ、ｂ、ｃ）を、輸注から８週（マウス３匹）及び１２週（マウス３匹）後に分析する。ＦＡＣＳｃａｎを用いたマルチパラメータフローサイトメトリ分析でヒト造血ＣＤマーカーについて細胞（１、２ａ）を染色する。Ｂ細胞、顆粒球及び赤血球についてのＣＤマーカープロフィールを用いて、マウス組織内のヒト細胞の取込みを同定する。各実験において、移植を受けていないマウスからの細胞を負の対照として同じ抗体で染色する。マウスの細胞と混合された造血マーカーを発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞が骨髄様及びリンパ様の両方の区画内で造血系を再生しつつあることを表わす。
【０５０２】
全てのマウスからの骨髄（２ｂ）を、免疫細胞化学によりヒト特異的ＭＨＣ−Ｉ及びＨＬＡ−ＤＲ−ＩＩ抗原について染色する。マウスの細胞と混合されたヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞がマウス内に取込まれ造血系を再生しつつあることを表わしている。
【０５０３】
マウスの骨髄内へのヒトの細胞の取込みのさらなる分析には、ひと造血細胞のコロニー形成を刺激するものとして知られているヒト成長因子で分離された骨髄細胞を刺激することが関与している。かくして、移植されたマウス（２Ｃ）からの骨髄細胞は、メチルセルロース培養及びヒト血漿及びｈｕ−ＩＬ−３（１０Ｕ／ｍｌ）、ｈｕ−ＧＭ−ＣＳＦ（１Ｕ／ｍｌ）、ｈｕ−ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びｈｕ−ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）で刺激された培養内で平板固定される。顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）及び顆粒球−赤血球−巨核球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の始原細胞に由来するヒトコロニーを同定するために、形態学的基準及び組織学的染色が使用される。検定の特異性は、個々のコロニー内でヒトジストロフィンＲＮＡを増幅するためＰＣＲを使用することによって確認される。
【０５０４】
【結果】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、亜致死の照射（３００ｃＧｙ）を受け、尾静脈を経由して、マウス一匹あたり４．８×１０（Ｍｏ＃１−３）又は１．２×１０６（Ｍｏ＃４−６）の割合で、ＣＴ３Ｆ  ＰＰＥＬＳＣ細胞の注射を受けた。さらに高い細胞濃度では、マウスは生き延びなかった。最近の実験では、注射溶液（０．２％のＢＳＡ及び２０Ｕ／ｍｌのヘパリンを伴うＩＭＤＭ）の中に２０Ｕ／ｍｌのヘパリンを内含し、マウス１匹あたり３×１０６（ｎ＝１）を注入することができた。
【０５０５】
移植から８週間後に、６匹のマウスを屠殺し、クラス  Ｉ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ１１７といったマーカーでヒト細胞について骨髄、脾臓及び末梢血を分析した。骨髄中のクラスＩを除き、すべてのマーカーは陰性であった。骨髄の約０．５％が、ヒトクラスＩ陽性細胞を含有していた。脾臓及び末梢血中、以上に列挙したマーカーを用いていかなるヒト細胞も検出されなかった。
【０５０６】
【実施例６】
ラット幹細胞は、ゲノム標識付け及びレトロウイルス遺伝子移入後に多能性を保持する
【概要】
出生後のラット骨格筋を収獲し、間葉幹細胞を分離した。クローン原生分析は、多能性幹細胞がまさに実際出生後の哺乳動物の体内に存在していること、そしてそれらがクローニング後少なくとも４つの間葉系列組織（例えば骨格筋、脂肪、軟骨及び骨）を形成するその能力を保持することを明らかにした。その後クローンを、ゲノム標識付け後の多能性保持及び拡大自己更新について検査した。この能力は、β−ガラクトシダーゼでのゲノム標識付けの後及び拡大自己更新すなわち、クローニング後の２００＋の細胞倍加の後も保持された。結合組織基質内の多能性幹細胞の存在及び、クローニング、遺伝子トランスフェクション及び拡大自己更新後のその多能性保持は、これらの幹細胞が遺伝子療法及び／又は出生後の動物内の組織の修復及び再生にとって重要な貢献を果たす可能性があるということを示唆している。
【０５０７】
【材料と方法】
ゲノム標識付け
１０％のウマ血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン−５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）及び５０Ｕ／ｍｌの組換え型ヒト抗分化因子（ＡＤＦ、Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ）を伴う、修正イーグル培地（ＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）の中で、クローン（ラット−Ａ２Ｂ２）（以上の実施例１１で記述）を成長させた。核ターゲティングされたＬａｃＺ遺伝子を発現する安定したラット−Ａ２Ｂ２細胞系統（ｎｌｓ−ＬａｃＺ）を、プラスミドｐＵＴ６５１（選択可能な報告された遺伝子Ｓｈ  ｂｌｅ：：ｌａｃＺ）を用いて構築した。血清を含有する培地内で６ウェルのプラスチック皿（Ｆａｌｃｏｎ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｌｅ  ｐｏｎｔ−ｄｅ  ｃｌａｉｘ，  Ｆｒａｎｃｅ）  上で５×１０３細胞／ｃｍ２の割合で細胞を平板固定し、一晩付着させた。次に、無血清培地（Ｏｐｔｉ−ｍｅｍ，  ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）内で１６時間リポフェクチン試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて２ｍｇのＰＵＴ６５１と共に細胞を一晩インキュベートした、トランスフェクションを受けた細胞を、２５０ｍｇのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が追加された選択培地内へ１：１０に分割した。最高レベルのβ−Ｇａｌを発現する１２の耐性クローンのうちの１つのクローンをサブクローニングし使用した。組織化学的及び免疫化学的技術により、β−Ｇａｌ発現を評価した。室温で１０分間２％のパラホルムアルデヒド内で固定するか又は氷冷メタノール内で５分間固定した後、ＰＢＳ内で洗い流し、色素産生基板Ｘ−Ｇａｌでの組織化学染色及びポリクローナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ）抗β−Ｇａｌ抗体（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ  ら、１９９７）での免疫染色により、細胞内でＬａｃＺ発現を評価した。ラット免疫グロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ）に予め吸着されたビオチン化抗マウスＩｇＧと共にＶｅｃｔｏｒ−ＨＲＰ−ＤＡＢ発現系（Ｖｅｃｔｏｒ−Ｌａｂｓ）を用いて抗体結合を視覚化した。
【０５０８】
表現型発現のためのインシュリン−デキサメタゾン分析
凍結保存したクローンを融解し、標準的プロトコルに従いゼラチンで被覆された２４ウェルの平板の１ウェルにつき５、１０又は２０×１０３細胞の割合で間葉幹細胞−１培地中で平板固定した。最初の平板固定から２４時間後に、培地をテスト用培地（ＴＭ）１〜４（ＴＭ−１、ＴＭ−２、ＴＭ−３、ＴＭ−４）又は５（ＴＭ−５）に変更した。テスト用培地（ＴＭ）は、最低培養中で３０日、最長培養中で１２０日間鳥類の始原細胞及び多能性細胞の両方を「定常状態」条件下で維持するＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ：ＥＭＥＭ：抗生物質を複数の比率で含んでいた。各々さまざまな濃度のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅを含む４つのテスト用培地（ＴＭ＃ｓ１〜４）を使用した。各テスト用培地内に存在するＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ対ＥＭＥＭ対抗生物質の比率は、鳥類の始原細胞及び多能性細胞の両方の個体群において定常状態の培養条件を維持するその能力に基づき、各々のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅロットについて経験的に決定された。４つのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅベースのテスト用培地は以下のとおりであった：  ＴＭ＃１＝１５％（ｖ／ｖ）のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号ＯＭＯ４５５）；８４％の（ｖ／ｖ）ＥＭＥＭ：１％（ｖ／ｖ）の抗生物質；ＴＭ＃２＝１５％（ｖ／ｖ）のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号１Ｍ１７２４）：８４％（ｖ／ｖ）のＥＭＥＭ：１％（ｖ／ｖ）の抗生物質；ＴＭ＃３＝５０％（ｖ／ｖ）のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号２Ｍ０４２０）；４９％（ｖ／ｖ）のＥＭＥＭ：１％（ｖ／ｖ）抗生物質；及びＴＭ＃４＝７５％（ｖ／ｖ）のＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ロット番号２Ｍ０２７４）；２４％（ｖ／ｖ）ＥＭＥＭ：１％（ｖ／ｖ）の抗生物質；ＴＭ−１〜ＴＭ−４は、Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（カタログ番号１２−７２５Ｂ、ロット番号ＯＭＯ４５５［ＴＭ−１］、１Ｍ１７２４［ＴＭ−２］、２Ｍ０４２０［ＴＭ−３］、又は２Ｍ０２７４［ＴＭ−４］、Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ；ＭＤ）、ＥＭＥＭ１、及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ｐＨ７．４  で構成されていた。ＴＭ−５は、９８％（ｖ／ｖ）のＥＭＥＭ、１％（ｖ／ｖ）ＨＳ、及び１％（ｖ／ｖ）のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ，ｐＨ７．４で構成されていた。
【０５０９】
テスト用培地のみの中での２４時間の予備インキュベーションを用いて、ＭＳＣ−１培地内のあらゆる潜在的共力成分を洗い出した。２４時間後、テスト用培地を、テスト培地のみ（対照）、又は始原細胞のクローンを同定するため始原細胞内の表現型発現マーカーの出現を加速する作用物質である２μｇ／ｍｌのインシュリン（Ｓｉｇｍａ）（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９８ａ）又は多能性細胞のクローンを同定するための一般的非特異的系列誘発作用物質である１０−１０〜１０−６Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ  ら、１９８８；Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９３，１９９８ａ）のいずれかを含むテスト用培地（ＴＭ−１〜ＴＭ−５）に変更した。一日おきに培地を変更しながら、さらに３０〜４５日間、対照及び処理済み培養を増殖させた。実験一回一濃度あたり４つの培養ウェルを用いた。３０〜４５日の期間中、培養を毎日のベースで、表現型発現の改変（以下参照）、処理日数及び付随するインシュリン又はデキサメタゾン濃度について、（主観的に）検査した。その後、実証済みの免疫化学及び組織化学手順（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２ｂ，１９９３，１９９５，１９９８ａ，ｂ；Ｒｏｇｅｒｓ  ら、１９９５）を用いて表現型発現マーカーを（客観的に）確認するべくこれらのパラメータを利用して実験を反復し、Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ倒立位相差顕微鏡を用いて結果を写真撮影した。
【０５１０】
推定上の骨格筋細胞内の筋節ミオシンの存在を確認するため、ミオシン−酵素連鎖免疫−培養検定（ｍｙｏｓｉｎ−ＥＬＩＣＡ）を用いて、自然発生的に収縮した多核性線状及び有枝構造を示した培養を、さらに評価した（Ｂａｄｅｒ  ら、１９８２；Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２ａ，ｂ，１９９３，１９９５）。推定上の脂肪細胞内の飽和中性脂質の存在を確認するため、多重屈折小胞を示す培養を、Ｓｕｄａｎ  ｂｌａｃｋ−Ｂ（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）を用いてさらに評価した（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２ａ，１９９３，１９９５）。推定上の軟骨細胞をとり囲む細胞周囲の及び／又は細胞外の基質にあるコンドロイチン硫酸／ケラチン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するため、コンドロイチナーゼ−ＡＣ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）／ケラタナーゼ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）消化と結合させたｐＨ１．０のアルシアンブルー  （Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌａｕ  ８ＧＳ．Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，  Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて、細胞周囲マトリクスのカサ含む丸くなった細胞の凝塊を表示した培養を、さらに評価した（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９８９，１９９２ａ，１９９３，１９９５）。推定上の無機化された骨片内のリン酸カルシウムの存在を確認するため、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸、Ｓｉｇｍａ）と結合させたｖｏｎ  ｋｏｓｓａ（Ｓｉｌｂｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）染色を用いて、３次元マトリクス内に埋込まれかつ／又はそれと重ね合された細胞を示した培養をさらに評価した（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９９２ａ，１９９３，１９９５）。推定上の線維芽細胞をとり囲む細胞外コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸グリコサミノグリカンの存在を確認するため、コンドロイチナーゼ−ＡＢＣ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）と結合させたアルシアンブルーｐＨ１．０染色を用いて、粒状の又は線維性の細胞外マトリクス内に埋込まれた細胞の密集層（単複）を示す培養を、さらに評価した（Ｙｏｕｎｇ  ら、１９８９，１９９２ａ、１９９３、１９９５）。
【０５１１】
【結果】
「ＲＡＴ−Ａ２Ｂ２」と呼ばれるクローン（実施例１１に記述）を、β−ガラクトシダーゼレトロウイルストランスフェクションによりゲノム標識付けの後に評価した。全ての評価を通して、Ａ２Ｂ２細胞は、インシュリンでのインキュベーションの間、表現型発現内のいかなる変化も示さなかった。しかしながら、Ａ２Ｂ２細胞は、ゲノム標識付けの後一定の濃度範囲のデキサメタゾンでインキュベートした時点で多数の形態を示した。認められた表現型発現の変化は、筋原性、脂肪形成、軟骨形成及び骨形成形態学的なものであった。Ａ２Ｂ２細胞は、星状形態の保持及び接触阻害の喪失についてのクローン原性分析中に特定的に選択された。しかし、ひとたび特定の系列に決定するすなわち系列特異的始原細胞となるように誘発された時点で、ＲＡＴ−Ａ２Ｂ２は、密集状態で接触阻害を呈する。
【０５１２】
【考察】
毎年何百人ものアメリカ人が組織喪失又は末期器官不全に悩まされている。これらの患者に対する国レベルの合計健康管理費は年間４０００億ドルを超えている。現在、これらの障害を治療するため米国では年間８００万件以下の外科手術が実施され、４０００〜９０００万日の入院日数が必要とされている。同種異系間療法は無数の生命を救い改善したが、それでも不完全な解決法であるにとどまっている。同種異系間組織移植及び外科的介入は、決定的なドナー不足、長期罹病率及び死亡率によって著しく制限されている（Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｖａｃａｎｔｉ，１９９３）。この調査の長期的目的は、再生及び修復のためのＨＬＡ整合ドナー組織として及び遺伝子療法のための潜在的送達ビヒクルとして使用するための自己由来の多能性幹細胞の有用性を見極めることにある。自己由来のドナー組織として多能性幹細胞が利用されるためには、生体内部にそれらが存在していること、分離が容易であること、その表現型発現を操作できること、適応力があること、既存の組織内に取込まれること、生存能力があることそして機能性があることが必要である。
【０５１３】
本報告書中の研究は、多能性幹細胞，特にＲａｔＡ２Ｂ２（以上の実施例１１でより詳細に記述されている）が、トランスフェクションを受けた遺伝子の活性を保持しながら多能性を喪失することなくレトロウイルストランスフェクションを受けることができるということを示した。これらの研究から、我々は、特に数多くの細胞が必要とされ移植組織の供給が不足している場合において、組織の移植、再生及び遺伝子療法のためのＨＬＡ整合されたドナー組織として自己由来の多能性幹細胞を使用できるという仮説を提案することになる。
【０５１４】
【実施例１７】
多能性幹細胞に対するレトロウイルスを媒体とする遺伝子移入
研究目的
１）レトロウイルスベクターを用いてＰＰＳＣに遺伝子を送達し、感染したＰＰＳＣがその多能性を維持する能力をテストすること。２）萎縮した筋肉に移植した時点で分散し筋線維と融合する能力をＰＰＳＣに発現するｍｙｏＤと対照間で比較すること。
【０５１５】
研究の概要
１つの長期的最終目的は、出生後骨格筋の成長を増強させるため細胞による方法及び／又は薬理学的方法を使用することにある。ＰＰＳＣは、神経筋疾患、不使用、宇宙飛行、長期ベッド療養及び老化において発生する萎縮した骨格筋の治療のための１つの潜在的戦略を表わしている。出生後骨格筋の成長という最終目的を達成しようとして、次の４つの異なるやり方で細胞に遺伝子を送達するためにレトロウイルスが利用されてきた：すなわち１）移植後に筋原性細胞を追跡するべくｂ−ガラクトシダーゼといったようなマーカーを送達するため；２）細胞生理学における特定的なシグナリング経路の関与を研究するべくリポータ構成体を送達するため；３）転写因子を過剰発現するため；４）特定のシグナリング経路の遺伝子阻害物質を送達するため。場合によっては、筋肉消耗のための細胞療法としてＰＰＳＣを使用する目的で、まず最初にＰＰＳＣ内にマーカー遺伝子を安定した形で導入し、細胞の多能性が維持されることを見極めることが必要である。さらに、正常な及び萎縮した骨格筋の中での移植されたＰＰＳＣの挙動を見極めることが必要である。ＭｙｏＤは、非筋細胞が筋原性となるように誘発すると同時に幹細胞内での筋形成を誘発することのできる筋肉特異的転写因子である。我々は、次にＰＰＳＣの動員及び萎縮した筋線維内への取込みの効果を増大させるｍｙｏＤの強制発現の能力をテストすることになる。
【０５１６】
動物
免疫不全  ｓｃｉｄ／ｂｇマウスがＰＰＳＣ移植の受容体として使用されることになる。Ｓｃｉｄ／ｂｇマウスは、機能的Ｔ及びＢ細胞が欠損しており、低い天然キラー活性しかもたない。ｓｃｉｄ／ｂｇマウスは、より安定したＳＣＩＤ表現型を示し、一般に異系移植片移植のためのより優れた受容体である。
【０５１７】
プロトコルの詳細
Ｉ．ＰＰＭＳＣ（多能性間葉幹細胞）及びＰＰＥＬＳＣ（多能性胚様幹細胞）に対するｌａｃＺ遺伝子のレトロウイルスを媒体とした遺伝子移入の効率を見極める。
ａ）確立された技術を用いて２種類の幹細胞をレトロウイルスにより感染させる。
ｂ）感染から４８時間後に、単一の細胞内のｂ−ガラクトシダーゼ発現について酵素検定を実施する。感染を受けた細胞は青色となる。
ｃ）青色細胞の％を評定する。
ｄ）青色細胞の百分率が低い場合、レトロウイルス感染プロトコルを反復するが、６〜８時間離して２回の感染を使用する。
ｅ）ｂ〜ｃまでを反復する。
ｆ）方法の再現性を決定するため最高の百分率の青色細胞を与えるプロトコルを用いて実験を２回反復する。
【０５１８】
ＩＩ．レトロウイルス感染を受けた２種類のＳＣの感染後多能性を維持する能力をテストする。
ａ）最高の百分率の青色細胞を与えるプロトコルで細胞を感染させる。
ｂ）感染から２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、ＥＬＩＣＡ検定で使用するため９６ウェル平板内に細胞を平板固定する。対照として、９６ウェルの平板内に未感染細胞も据え付ける。同じく、細胞の形態を観察するべく１２ウェルの平板内に細胞を据え付ける。
ｃ）感染から４８時間後に、培地を誘発性培地に変更する。
ｄ）感染から２〜６週間後に、前述したデキサメタゾン方法を用いて９６ウェルの平板内で特定的細胞表現型（±レトロウイルス感染）の誘発をテストする。
ｅ）１２ウェルの平板上でｂ−ガラクトシダーゼ酵素検定を実施し、表現型誘発の形態学的徴候が青色細胞内で発生するか否かを観察する。
ｆ）対照とレトロウイルス感染を受けた細胞の間で特定の表現型の誘発を比較する。
【０５１９】
ＩＩＩ．萎縮した骨格筋及び対照の中に移植されたＰＰＭＳＣ及びＰＰＥＬＳＣを発現するｍｙｏＤと対照の挙動を比較する。
ａ）移植の２週間前に、脛側前筋の脱神経萎縮を誘発するため  ｓｃｉｄ／ｂｇマウス内の坐骨神経の一側性横断切開を実施する。
ｂ）レトロウイルスを発現するｍｙｏＤ又は対照のいずれかでＰＰＳＣを感染させる。感染から４８時間後、平行な平板内で免疫組織化学を用いてｍｙｏＤ発現についてテストする。
ｃ）下表２２に記すとおり、各々の脛側前筋内に細胞を移植する：
【０５２０】
【表２２】
2004504003.tif 000061
【０５２１】
ｄ）移植の６週間後、移植された筋肉を収集し、逐次切開し、筋肉切片上のｂ−ガラクトシダーゼについての酵素検定を実施する。
１）  筋線維の内側の青色核の数を評定する。これらは、筋原性系列に転換し宿主の内因性筋線維と融合したＰＰＳＣを表わしている。
２）  注入部位との関係において青色核の分布を比較する。
３）  筋原性系列に転換し筋線維と融合する、ＰＰＭＳＣを発現するｍｙｏＤ及び対照とＰＰＥＬＳＣを発現するｍｙｏＤ及び対照の能力を比較する。
４）  萎縮した筋肉対正常な筋肉の一関数として上述の３）で得られたデータを分析する。
【０５２２】
定義づけされたエンドポイント
エンドポイントというのは、マーカー遺伝子でレトロウイルス感染させられた多能性幹細胞がその多能性を維持し移植時点で筋肉の広い部域全体にわたり分散し、宿主の内因性筋線維と高効率で融合する能力である。成功は、ＰＰＭＳＣ及びＰＰＥＬＳＣをＬａｃＺ遺伝子で高効率まで感染させそれらにその多能性を維持させる能力により決定されることになる。移植実験は、移植細胞が筋肉の幅及び長さ全体にわたり分散し萎縮した筋線維に高効率で融合した場合に、成功したものとみなされる。
【０５２３】
【実施例１８】
内皮細胞分化に関与するシグナルプロセス
その造血内皮細胞能力及び共通の造血内皮前駆体細胞からの内皮細胞分化に関与するシグナルプロセスを査定するために、（以上の実施例１６で記述された）Ｂ−ｇａｌでのトランスフェクションを受けたラットＡ２Ｂ２細胞及びＲＯＳＡ２６ＰＰＳＣ細胞を利用した。
【０５２４】
Ａ２Ｂ２  Ｂ−ｇａｌ  ＰＰＳＣを、さまざまな成長因子の存在下で１％の選択されたＨＳ１０血清内で成長させ、内皮細胞系列に対するそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ決定誘発を査定した。細胞を、２日間、１％のＨＳ１０単独、１％のＨＳ１０とそれに加えた成長因子ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，ＥＧＦ及びＩＧＦ−１のカクテル；１％のＨＳ１０とそれに加えたｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），１％のＨＳ１０とそれに加えたＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ），１％のＨＳ１０とそれに加えたＴ細胞刺激性調整培地及び１％のＨＳ１０とそれに加えたｂＦＧＦ内で成長させ、その後ＶＥＧＦを添加した。培養皿を、ゼラチン、コラーゲンＩＶ型、ラットビトロネクチン及びラットビトロネクチンと組合わされたゼラチンでコーティングした。最大の分化は、ラットビトロネクチンでコーティングされた皿上で観察された。かくして成長させられた細胞を、形態学的査定；ＭＴＳ検定内の生物活性；Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に細胞を再播種した後管形成（毛細管形成）を検出するＭａｔｒｉｇｅｌ検定（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＭａｔｒｉｇｅｌは、基底膜成分ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、ニドゲン及びヘパリン硫酸プロテオグリカンを含む培養／成長皿をコーティングするための基底膜製品である）；及びさまざまな内皮細胞抗原マーカー（ＣＤ３１（ｐｅｃａｍ），ＢＳ−Ｂ（ＢＳ−Ｂ４イソ型レクチン染色），ＳＭａ−アクチン（平滑筋周細胞マーカー））での免疫染色によって評価した。
【０５２５】
ＰＰＳＣは、組合された成長因子ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＩＧＦ−１の存在下及びｂＦＧＦ又はＶＥＧＦの存在下で、内皮細胞マーカーＣＤ３１，ＢＳ−Ｂ  ａｂｄＳＭアクチンについて増強された染色を示した。
【０５２６】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ検定では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で播種されたＰＰＳＣは、管形成及び毛細管様の構造（図４２）、を特に成長因子の存在下で（図４３）発達させた。
【０５２７】
Ａ２Ｂ２  Ｂ−ｇａｌ  ＰＰＳＣを、ラットＳＣＩＤ動物内の後脚虚血性モデル内に投与しｉｎ  ｖｉｖｏでテストした。虚血性モデルを生成するため大腿動脈を縛って血行を止めた。後脚虚血が生成される前又は後で後脚に対し局所的に筋内注射（ＩＭ）によってか又はラットの尾静脈内に静脈内注射（ＩＶ）によってＰＰＳＣ細胞を投与した。Ｂ−ｇａｌ標識付け細胞の存在及び性質を査定するためＰＰＳＣの注射から１週間後に組織学検査を行なった。ＰＰＳＣ（Ｂ−ｇａｌ陽性細胞）は、ＩＭ又はＩＶで投与された場合、虚血部位で後脚内に取込まれた。肉眼解剖学的精査時点で、これらの細胞は、後脚内の脈管構造を追跡し、Ｂ−ｇａｌ発現の平行線パターンを示しているように思われた。さらに、虚血動物の体内へのＩＶ注射時点で、骨髄内には著しいＢ−ｇａｌ陽性細胞の取込みが観察された（図４４）。
【０５２８】
本発明は、その精神又は基本的特徴から逸脱することなくその他の形態で又はその他の要領で実施することができる。当該開示は、従って、あらゆる面で添付のクレームに示されている本発明の範囲を例示するものであって、制限的意味をもたないとみなされるべきであり、等価の意味及び範囲に入る全ての変更をその中に包含させることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】単離６日後の生体ラット骨髄の初代培養物から単離した細胞を示す。位相差１００×。直線状の細胞に注意されたい。
【図１Ｂ】単離６日後の生体ラット骨髄の初代培養物から単離した細胞を示す。位相差２００×。直線状の細胞に注意されたい。
【図２Ａ】成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。対照α−ミオシンに対する抗体で染色した。位相差１００×。
【図２Ｂ】１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。α−ミオシンに対する抗体で染色した。位相差２００×。矢印は多核筋管を示す。
【図２Ｃ】１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。α−平滑筋アクチンに対する抗体で染色した。輝度領域２００×。ｓｍ＝平滑筋。
【図３Ａ】１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色した。輝度領域１００×。矢印は軟骨小節を示す。
【図３Ｂ】１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色した。輝度領域２００×。ｃ＝軟骨。軟骨小節の直ぐ下に小さな筋管を認めることができる。
【図３Ｃ】１０−９Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色した。輝度領域２００×。矢印は軟骨小節中の無機質を示す。
【図４Ａ】１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｂで染色した。輝度領域２００×。ａ＝脂肪細胞。
【図４Ｂ】１０−１０Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色した。輝度領域２００×。ｂ＝骨。
【図４Ｃ】１０−９Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色、但し予めＥＤＴＡで処理した。輝度領域２００×。ｂ＝骨。
【図５Ａ】１０−６Ｍデキサメタゾンで処理した成体ラット骨髄２次培養物（培養３５日）から単離された細胞を示す。ローダミン標識アセチル化低密度リポタンパク質と共にインキュベーとした細胞を示す。位相差１００×。矢印はＢにおいて染色された細胞を示す。
【図５Ｂ】蛍光下で撮影したＡと同じ細胞を示す。
【図６Ａ】７日目の創傷チャンバから単離された細胞の初代培養物の位相差顕微鏡写真を示す。本来の倍率＝２００×。培養４日後の細胞を示す。矢印は星形細胞を示す。
【図６Ｂ】７日目の創傷チャンバから単離された細胞の初代培養物の位相差顕微鏡写真を示す。本来の倍率＝２００×。培養８日後の細胞を示す。矢印は星形細胞を示す。
【図７Ａ】培養４週間後の細胞の２時培養物。Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色された７日目の創傷チャンバ由来の対照培養物の位相差顕微鏡写真を示す。本来の倍率＝２００×。
【図７Ｂ】培養４週間後の細胞の２時培養物。多核細胞を示す１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した７日目の創傷チャンバ由来の未染色培養物の位相差顕微鏡写真を示す。矢印は核のクラスターを示す。本来の倍率＝１００×。
【図７Ｃ】培養４週間後の細胞の２時培養物。１０−７Ｍデキサメタゾンで処理し、筋節ミオシンに対する抗体で染色した１４日目の創傷チャンバ由来の培養物の光学顕微鏡写真。矢印は核を示す。本来の倍率＝２００×。
【図８Ａ】培養５週間後の細胞の２次培養物を示す。本来の倍率＝２００×。１０−７Ｍデキサメタゾンで処理し、Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色した１４日目の創傷チャンバ由来の培養物の位相差顕微鏡写真を示す。ｃ＝軟骨。
【図８Ｂ】培養５週間後の細胞の２次培養物を示す。本来の倍率＝２００×。１０−７Ｍデキサメタゾンで処理し、Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色した７日目の創傷チャンバ由来の培養物の位相差顕微鏡写真を示す。ｃ＝軟骨；ａ＝脂肪細胞。
【図８Ｃ】培養５週間後の細胞の２次培養物を示す。本来の倍率＝２００×。１０−６Ｍデキサメタゾンで処理し、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色した７日目の創傷チャンバ由来の培養物の光学顕微鏡写真を示す。ｂ＝骨。
【図９Ａ】培養５週間後の細胞の２次培養物を示す。１０−９Ｍデキサメタゾンで処理し、ＳｕｄａｎブラックＢ（ｐＨ  １．０）で染色した７日目の創傷チャンバ由来の培養物の位相差顕微鏡写真を示す。ａ＝脂肪細胞。本来の倍率＝２００×。
【図９Ｂ】培養５週間後の細胞の２次培養物を示す。１０−６Ｍデキサメタゾンで処理し、平滑筋αアクチンに対する抗体で染色した１４日目の創傷チャンバ由来の培養物の光学顕微鏡写真を示す。ｓｍ＝平滑筋。本来の倍率＝１００×を示す。
【図１０Ａ】１０−６Ｍデキサメタゾンで処理し、アセチル化低密度リポタンパク質と共にインキュベートした７日目の創傷チャンバから培養５週後の細胞の２次培養物を示す。本来の倍率＝２００×を示す。位相差顕微鏡。矢印はＢにおいて染色された細胞を示す。
【図１０Ｂ】１０−６Ｍデキサメタゾンで処理し、アセチル化低密度リポタンパク質と共にインキュベートした７日目の創傷チャンバから培養５週後の細胞の２次培養物を示す。本来の倍率＝２００×を示す。Ａにおいて示された視野の蛍光顕微鏡写真。矢印はＡと同じ細胞を示す。
【図１１Ａ】７７歳雌由来の初代培養物（培養５日）を示す。位相差１００×を示す。ｓ＝星形細胞。ｍ＝筋芽細胞を示す。
【図１１Ｂ】７７歳雌由来の初代培養物（培養５日）を示す。７７歳雌由来の初代培養物（培養１４日）。位相差１００×。ミオシンに対する抗体で染色した。ｓ＝星形（推定ＰＰＭＳＣ）、ｍ＝筋管。
【図１１Ｃ】７７歳雌由来の初代培養物（培養５日）を示す。７７歳雌由来の２次培養物（ＰＰＭＳＣ）（培養３５日）を示す。位相差２００×を示す。
【図１２Ａ】３７歳雄から誘導された２次培養物（培養３５日）を示す。輝度領域２００×を示す。ミオシンに対する抗体で染色した。
【図１２Ｂ】１０−１０Ｍデキサメタゾンで処理した３７歳雄から誘導された細胞の２次培養物（培養３５日）。ミオシンに対する抗体で染色した輝度領域２００×。矢印は核を示す。
【図１２Ｃ】１０−１０Ｍデキサメタゾンで処理した３７歳雄から誘導された細胞の２次培養物（培養３５日）。
【図１３Ａ】７７歳雌性から誘導され、１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した２次培養物を示す。位相差２００×を示す。螺旋パターンの紡錘状細胞を示す。
【図１３Ｂ】３７歳雄から誘導され、１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した細胞の２次培養物（培養３５日）を示す。輝度領域２００×を示す。Ａｌｃｉａｎブルー（ｐＨ  １．０）で染色した。ｃ＝軟骨。
【図１３Ｃ】３７歳雄から誘導され、１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した細胞の２次培養物（培養３５日）を示す。輝度領域２００×を示す。Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染料で染色した。ｂ＝骨。  Ａｒｒｏｗｓ  ｐｏｉｎｔ  ｔｏ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ．
【図１３Ｄ】３７歳雄から誘導され、１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した細胞の２次培養物（培養３５日）を示す。輝度領域２００×。Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染料で染色、但し予めＥＤＴＡで処理した。ｂ＝骨。
【図１４Ａ】３７歳雄から誘導され、１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した細胞の２次培養物（培養３５日）。輝度領域１００×。Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｂで染色した。矢印は脂肪細胞を示す。
【図１４Ｂ】３７歳雄から誘導され、１０−６Ｍデキサメタゾンで処理した細胞の２次培養物（培養３５日）を示す。輝度領域１００×及び平滑筋αアクチンに対する抗体で染色した。ｓｍ＝平滑筋。
【図１４Ｃ】Ｂと同じであるが、２００×を示す。
【図１５Ａ】３７歳雄から誘導され、１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した細胞の２次培養物（培養３５日）を示す。位相差２００×。但し、アセチル化ＬＤＬと共にインキュベートした。矢印はＢにおいて蛍光発光する細胞を示す。
【図１５Ｂ】Ａと同じ細胞を示す。但し、蛍光下。矢印は内皮細胞を示す。
【図１６Ａ】３７歳雄から誘導され、デキサメタゾンで処理しなかった細胞の２次培養物（培養２日）（対照）。輝度領域２００×を示す。懸濁状態でエタノールで固定化され、ＣＤ３４に対する抗体で染色されている細胞。矢印はＢにおける細胞を示す。
【図１６Ｂ】Ａと同じ細胞を示す。但し、蛍光下。矢印はＣＤ３４陽性である細胞を示す。
【図１７Ａ】培養３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。対照培養物、位相差。
【図１７Ｂ】培養３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−１０Ｍデキサメタゾンで処理した培養物、位相差を示す。ａ＝脂肪細胞。矢印は脂肪滴を示す。
【図１７Ｃ】培養３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−７Ｍデキサメタゾンで処理し、ＳｕｄａｎブラックＢで染色した培養物、輝度領域を示す。ａ＝脂肪細胞。本来の倍率＝２００×を示す。
【図１８Ａ】２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−８Ｍデキサメタゾンで１４日間処理した培養物、位相差。筋管、矢印は核を示す。
【図１８Ｂ】２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−７Ｍデキサメタゾンで１４日間処理し、筋節ミオシンに対するモノクローナル抗体で染色した培養物、輝度領域。矢印は筋管を示す。
【図１８Ｃ】２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−７Ｍデキサメタゾンで１４日間処理した培養物、位相差、ｃｍ＝心筋細胞を示す。
【図１９Ａ】培養３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−７Ｍデキサメタゾンで処理し、Ａｌｃｉａｎブルーで染色した培養物、輝度領域を示す。ｃ＝軟骨小節。本来の倍率＝１００×を示す。
【図１９Ｂ】培養３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−９Ｍデキサメタゾンで処理し、Ａｌｃｉａｎブルーで染色した培養物、輝度領域を示す。ｃ＝軟骨小節。本来の倍率＝２００×。
【図１９Ｃ】培養３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−７Ｍデキサメタゾンで処理し、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓ染料で染色した培養物、輝度領域を示す。ｂ＝骨。本来の倍率＝２００×を示す。
【図２０Ａ】平滑筋αアクチンに対するモノクローナル抗体で染色した３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。対照培養物、デキサメタゾンなし。
【図２０Ｂ】平滑筋αアクチンに対するモノクローナル抗体で染色した３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−６Ｍデキサメタゾンで処理した培養物、輝度領域を示す。ｓｍ＝平滑筋。本来の倍率＝２００×を示す。
【図２１Ａ】アセチル化ＬＤＬと共にインキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。対照培養物、デキサメタゾンなし。本来の倍率＝１００×。
【図２１Ｂ】アセチル化ＬＤＬと共にインキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−６Ｍデキサメタゾンで処理した培養物を示す。本来の倍率＝１００×を示す。
【図２１Ｃ】アセチル化ＬＤＬと共にインキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した３５日後の２次培養物における３Ｔ３細胞である。１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した培養物を示す。本来の倍率＝２００×を示す。
【図２２Ａ】３０細胞倍加まで増殖させ、インスリン又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＣＦ−ＳｋＭ。観察された形態学。２μｇ／ｍｌインスリンで１週間処理した細胞を示す。多核筋管（ＭＴ）を示す線状構造内の４つの核（矢印）の存在に注意されたい。本来の倍率、１０×を示す。
【図２２Ｂ】３０細胞倍加まで増殖させ、インスリン又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＣＦ−ＳｋＭ。観察された形態学。１０−６Ｍデキサメタゾンで２週間処理した細胞。脂肪生成細胞を示す細胞内屈折性小胞を含有する細胞（矢印）のクラスターの存在に注意されたい。本来の倍率、１０×。
【図２２Ｃ】３０細胞倍加まで増殖させ、インスリン又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＣＦ−ＳｋＭ。観察された形態学。１０−６Ｍデキサメタゾンで４週間処理した細胞を示す。筋管（ＭＴ）の存在を示す複数の多核線状構造に重層する軟骨小節（ＣＮ）を示す周辺細胞のマトリックスハローを伴う細胞の結節隗の存在に注意されたい。本来の倍率、１０×を示す。
【図２２Ｄ】３０細胞倍加まで増殖させ、インスリン又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＣＦ−ＳｋＭ。観察された形態学。２μｇ／ｍｌインスリンで６週間処理した細胞を示す。骨小節（ＢＮ）を示す細胞クラスターに重層する３次元マトリックス（矢印で示す）の存在に注意されたい。本来の倍率、１０×を示す。
【図２３】クラスター分化マーカーのフローサイトメトリーを示す。図中に「Ｘ」軸及び「Ｙ」軸を示す。３０細胞倍加まで増殖させ、細胞表面クラスター分化マーカーに対する抗体で分析したＮＨＤＦを示す。
【図２４】クラスター分化マーカーのフローサイトメトリーを示す。図中に「Ｘ」軸及び「Ｙ」軸を示す。３０細胞倍加まで増殖させ、細胞表面クラスター分化マーカーに対する抗体で分析したＮＨＤＦを示す。
【図２５】細胞株ＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、及びＰＡＬ＃３に対するクラスター分化マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、及びＣＤ５６のノーザン分析。細胞を３０細胞倍加まで増殖させ、回収し、総ＲＮＡを抽出し、電気泳動し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ５６及びβアクチン（対照）に対する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡをプローブとして検出した。示されるように、ＣＤ１３、ＣＤ５６、及びβアクチンのｍＲＮＡは、細胞回収時に有効に転写されていた。
【図２６Ａ】認められるように増殖され、インスリン又は１０−１０〜１０−６Ｍデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＮＨＤＦを示す。  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ  ａｓ  ｎｏｔｅｄ．回収後３０細胞倍加時の細胞を２ｍｇ／ｍｌのインスリンで１週間処理した細胞。多核筋管（ＭＴ）を示す線状構造を伴う５つの核（矢印）の存在に注意されたい。倍率１２５×を示す。
【図２６Ｂ】認められるように増殖され、インスリン又は１０−１０〜１０−６Ｍデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＮＨＤＦを示す。  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ  ａｓ  ｎｏｔｅｄ．回収後８０細胞倍加時の細胞を１０−６Ｍデキサメタゾンで２週間処理した細胞。脂肪生成細胞を示す細胞内屈折性小胞を含有する細胞（矢印）の存在に注意されたい。倍率、１２５×を示す。
【図２６Ｃ】認められるように増殖され、インスリン又は１０−１０〜１０−６Ｍデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＮＨＤＦを示す。  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ  ａｓ  ｎｏｔｅｄ．回収後８０細胞倍加時の細胞を１０−６Ｍデキサメタゾンで４週間処理した細胞。軟骨小節（ＣＮ）を示す周辺細胞マトリックスハローを伴う細胞の結節隗の存在に注意されたい。倍率、２５×を示す。
【図２６Ｄ】認められるように増殖され、インスリン又は１０−１０〜１０−６Ｍデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたＮＨＤＦを示す。  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ  ａｓ  ｎｏｔｅｄ．回収後８０細胞倍加時の細胞を１０−６Ｍデキサメタゾンで６週間処理した細胞。骨小節（ＢＮ）を示す細胞クラスターに重層する３次元マトリックス（矢印で示す）の存在に注意されたい。倍率、４０×を示す。
【図２７】分析のために使用したＮＨＤＦのＲＩゲートされた細胞集団を示すＦＳＣ×ＳＳＣのフローサイトメトリーを示す。同様のＲ１ゲートを使用して、ＣＭ−ＳｋＭ、ＣＦ−ＳｋＭ、ＰＡＬ  ＃２、ＰＡＬ  ＃３を分析した。
【図２８】クラスター分化マーカーのフローサイトメトリーを示す。「Ｘ」軸は前方散乱（０〜１０００直線スケール）を示し、「Ｙ」軸は側方散乱（０〜１０００直線スケール）を示す。回収後、３０細胞倍加まで増殖させ、細胞表面クラスター分化マーカーＣＤ４対ＣＤ３、ＣＤ８対ＣＤ３、ＣＤ４対ＣＤ８、ＣＤ３４対ＣＤ３３、ＣＤ４５対ＣＤ３３、ＣＤ３４対ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃ対グリコホリンＡ、ＨＬＡ−ＩＩ  （ＤＲ）対グリコホリンＡ、及びＣＤ１１ｃ対ＨＬＡ−ＩＩ  （ＤＲ）に対する抗体で分析したＮＨＤＦを示す。
【図２９】クラスター分化マーカーのフローサイトメトリーを示す。「Ｘ」軸は前方散乱（０〜１０００直線スケール）を示し、「Ｙ」軸は側方散乱（０〜１０００直線スケール）を示す。回収後、３０細胞倍加まで増殖され、細胞表面クラスター分化マーカーＣＤ１１７対ＣＤ３６、ＣＤ４５対ＣＤ３６、ＣＤ１１７対ＣＤ４５、ＣＤ３４対ＣＤ９０、ＣＤ４５対ＣＤ９０、ＣＤ３４対ＣＤ４５、ＣＤ３４対ＣＤ３８、ＣＤ４５対ＣＤ３８、及びＣＤ３４対ＣＤ４５に対する抗体で分析したＮＨＤＦを示す。
【図３０】細胞株ＣＦ−ＳｋＭ、ＮＨＤＦ、及びＰＡＬ＃３に対するクラスター分化マーカーＣＤ３４及びＣＤ９０のノーザン分析。組織回収後、細胞を３０細胞倍加まで増殖され、トリプシンで遊離させた細胞を示す。総ＲＮＡを抽出し、電気泳動し、ＣＤ３４、ＣＤ９０及びβアクチン（対照）に対する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡをプローブとして検出した。示されるように、ＣＤ９０及びβアクチンのｍＲＮＡは、細胞回収時に有効に転写されていた。
【図３１Ａ】３７歳雄から単離され、１０−８Ｍデキサメタゾンで処理した間葉幹細胞（培養３５日）。単一の核を有する大細胞を示す。培養中のマクロファージに関する記録。位相差２００×。
【図３１Ｂ】３７歳雄から単離され、１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した間葉幹細胞（培養３５日）を示す。小細胞体及び薄い広範な細胞プロセスを伴う細胞。培養中のニューロンに類似する。位相差２００×を示す。
【図３１Ｃ】新生ラットから単離され、１０−７Ｍデキサメタゾンで処理した間葉幹細胞（培養３５日）。Ｂにおいて認められる細胞に極めて類似する細胞を示す。これも培養中のニューロンに類似する。位相差２００×を示す。
【図３２Ａ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。２４時間対照細胞中で処理したＣＦ−ＮＨＤＦ２。大きな核対細胞質比を伴う星形単核細胞の存在に注意されたい。位相差、２００×を示す。
【図３２Ｂ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで１週間処理し、次いで、ミオゲニン（Ｆ５Ｄ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。筋（中胚葉）系統を示す細胞内細胞質染色による星形細胞に注意されたい。輝度領域、１００×。
【図３２Ｃ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ミオゲニン（Ｆ５Ｄ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。筋（中胚葉）系統を示す細胞内細胞質染色による２核及び単核細胞に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｄ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、筋節ミオシン（ＭＦ−２０）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。筋（中胚葉）表現型を示す細胞内細胞質染色による単核細胞に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｅ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、抗骨格筋速ミオシン（ＭＹ−３２）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。骨格筋（中胚葉）表現型を示す細胞内細胞質染色による単核細胞に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｆ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで３週間処理し、次いで、抗骨格筋速ミオシン（ＭＹ−３２）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。骨格筋（間葉）表現型を示す細胞内細胞質染色を実証する多核構造に注意されたい。輝度領域、２００×を示す。
【図３２Ｇ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ミオシン重鎖（ＡＬＤ−５８）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。骨格筋（間葉）表現型を示す細胞内細胞質染色を実証する星形構造に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｈ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ミオシン速鎖（Ａ４．７４）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。骨格筋（間葉）表現型を示す細胞内細胞質染色を実証する星形構造に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｉ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで３週間処理したＣＦ−ＮＨＤＦ２。骨格筋（間葉）表現型を示す線状多核構造に注意されたい。位相差、１００×を示す。
【図３２Ｊ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで６週間処理したＣＦ−ＮＨＤＦ２。骨格筋（中胚葉）表現型を示す大線状及び分岐多核構造に注意されたい。位相差、１００×を示す。
【図３２Ｋ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、平滑筋αアクチン（１Ａ４）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による２核星形細胞（２核星形のαアクチン細胞内染色は心筋表現型を示唆する）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｌ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、平滑筋αアクチン（１Ａ４）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形の平滑筋αアクチン細胞内染色は平滑筋（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。位相差、１００×を示す。
【図３２Ｍ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％、５％、又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、飽和中性脂質に対するＳｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ−Ｂ染色したＰＡＬ３。脂肪生成（中胚葉）表現型を示す細胞内染色小胞を含有する単核細胞に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｎ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンで３週間処理し、次いで、ＩＩ型プロコラーゲン（ＣＩＩＣ１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のＩＩ型プロコラーゲン細胞内染色は軟骨形成（中胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、２００×を示す。
【図３２Ｏ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンで３週間処理し、次いで、ＩＩ型コラーゲン（ＨＣ−ＩＩ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のＩＩ型コラーゲン細胞内染色は軟骨形成（中胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×。
【図３２Ｐ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンで３週間処理し、次いで、ＩＩ型コラーゲン（Ｄ１９）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形のＩＩ型コラーゲン細胞内染色は軟骨形成（中胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｑ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンで６週間処理し、次いで、コンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸プロテオグリカン（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ、ｐＨ  １．０）について組織学的に染色したＰＡＬ３であって、暗染色された小節は軟骨形成（中胚葉）表現型を示す。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｒ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンで６週間処理し、次いで、コンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸プロテオグリカン（Ｐｅｒｆｉｘ／Ａｌｃｅｃ  Ｂｌｕｅ）について組織学的に染色したＰＡＬ３であって、暗染色された小節は軟骨形成（中胚葉）表現型を示す。輝度領域、５０×。
【図３２Ｓ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、骨シアロプロテイン（ＷＶ１Ｄ１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞の骨シアロプロテイン細胞内染色は骨形成（中胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×。
【図３２Ｔ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、オステオポンチン（ＭＰ１１１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のオステオポンチン細胞内染色は骨形成（中胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｕ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。６週間、５％又は１０％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び２μｇ／ｍｌインスリンと共にＰＡＬ３処理、次いで、リン酸カルシウムに対して組織化学染色した（ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）。黒染色小節（多小節の３次元マトリックスのｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ陽性染色は骨形成（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、５０×を示す。
【図３２Ｖ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ヒト特異的線維芽細胞特異的タンパク質（ＨＦＳＰ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形の線維芽細胞は線維形成誘導性（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３２Ｗ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、末梢内皮細胞接着分子、ＰＥＣＡＭ（Ｐ２Ｂ１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形のＰＥＣＡＭ染色は内皮（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、２００×を示す。
【図３２Ｘ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ヒト特異的内皮細胞表面マーカー（ＨＥｎｄｏ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形のＨＥｎｄｏ染色は内皮（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、４０×。
【図３２Ｙ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株ＣＦ−ＮＨＤＦ２ならびにＰＡＬ３を示す。観察された形態学。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、血管内皮細胞接着分子、ＶＣＡＭ（Ｐ８Ｂ１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形のＶＣＡＭ染色は内皮（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、４０×を示す。
【図３３Ａ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、セレクチンＥ（Ｐ２Ｈ３）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形のセレクチンＥ染色は内皮（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｂ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ＣＤ３４シアロムチン（ＣＤ３４）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形のセレクチンＥ染色は内皮（中胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形のＣＤ３４シアロムチン染色は内皮又は造血（中胚葉）系統のいずれかを示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｃ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ニューロン前駆細胞（ＦＯＲＳＥ−１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のＦＯＲＳＥ−１細胞内染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｄ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ニューロフィラメント（ＲＴ−９７）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のニューロフィラメント細胞内染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｅ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ニューロン（８Ａ２）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のニューロン細胞内染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｆ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、神経膠細胞（ＣＮＰａｓｅ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞の神経膠染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｇ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ニューロン（Ｓ−１００）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のニューロン染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域１００×を示す。
【図３３Ｈ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ニューロンフィラメント−２００（Ｎ−２００）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内ニューロフラグメント染色による単核星形細胞（単核星形細胞のニューロフィラメント染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｉ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ヒト特異的ネスチン、ニューロン前駆細胞マーカー（ＨＮＥＳ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のネスチン細胞内染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。位相差、１００×を示す。
【図３３Ｊ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ネスチン、ニューロン前駆細胞マーカー（ＭＡＢ−３５３）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形細胞のネスチン細胞内染色はニューロン（間葉）系統への決定を示す）に注意されたい。位相差、１００×。
【図３３Ｋ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン及び＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、角化細胞（ＶＭ−１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質染色による単核星形細胞（単核星形の角化細胞染色は表皮（外胚葉）表現型を示す）に注意されたい。輝度領域、４０×を示す。
【図３３Ｌ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ヒト特異的αフェトプロテイン（ＨＡＦＰ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２を示す。細胞内細胞質小胞染色による単核星形細胞（単核星形細胞のαフェトプロテイン細胞内小胞染色は肝（内胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×。
【図３３Ｍ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで４週間処理し、次いで、ヒト特異的αフェトプロテイン（ＨＡＦＰ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質小胞染色による２核細胞（２核細胞のαフェトプロテイン細胞内小胞染色は肝（内胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×。
【図３３Ｎ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１％又は５％ＨＳ＋１０−６Ｍデキサメタゾン＋２μｇ／ｍｌインスリンで２週間処理し、次いで、ヒト特異的上皮特異的抗原（ＨＦＳＰ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質小胞染色による単核星形細胞（単核星形細胞の上皮特異的細胞内小胞染色は上皮（内胚葉）系統への決定を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×。
【図３３Ｏ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。１週間対照培地で処理し、次いで、段階特異的胚抗原−１（ＭＣ−４８０）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質小胞染色による単核星形細胞（単核星形細胞のＳＳＥＡ−１染色は胚幹細胞を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｐ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。２週間対照培地で処理し、次いで、段階特異的胚抗原−３  ＳＳＥＡ−３（ＭＣ−６３１）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質小胞染色による単核星形細胞（単核星形細胞のＳＳＥＡ−３染色は胚幹細胞を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×。
【図３３Ｑ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。４週間対照培地で処理し、次いで、段階特異的胚抗原−４  ＳＳＥＡ−４（ＭＣ−８１３−７０）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質小胞染色による単核星形細胞（単核星形細胞のＳＳＥＡ−４染色は胚幹細胞を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３３Ｒ】インスリン及び／又はデキサメタゾンと共に０〜６週間インキュベートしたヒト細胞株を示す。観察された形態学を示す。６週間対照培地で処理し、次いで、ヒトガン胎児性抗原（ＨＣＥＡ）に対する抗体で染色したＣＦ−ＮＨＤＦ２。細胞内細胞質小胞染色による単核星形細胞（単核星形細胞のヒトガン胎児性抗原染色は胚幹細胞を示す）に注意されたい。輝度領域、１００×を示す。
【図３４Ａ】２４時間、ＣＭ中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。位相差の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。高い核対細胞質比を有する８個の極めて小さな細胞を示す。
【図３４Ｂ】５６日間、ＣＭ中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。段階特異的胚抗原−１（ＭＣ４８０）に対する抗体で強度に染色した２つの極めて小さな細胞。
【図３４Ｃ】５６日間、ＣＭ中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。段階特異的胚抗原−３（ＭＣ６３１）に対する抗体で染色した２つの極めて小さな細胞（矢印）を示す。
【図３４Ｄ】５６日間、ＣＭ中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。段階特異的胚抗原−４（ＭＣ８１３−７０）に対する抗体で染色した単一の極めて小さな細胞（矢印）を示す。
【図３４Ｅ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ネスチン（ＭＡＢ３５３）に対する抗体で染色した４個の細胞（矢印）を示す。
【図３４Ｆ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ニューロン（Ｓ−１００）に対する抗体で染色した４個の細胞を示す。
【図３４Ｇ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ニューロフィラメント（ＲＴ−９７）に対する抗体で染色した多数の細胞を示す。
【図３４Ｈ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ニューロフィラメント（Ｎ−２００）に対する抗体で染色した長い細胞プロセスを有する単一の細胞を示す。
【図３４Ｉ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。神経膠細胞（ＣＮＰａｓｅ）に対する抗体で染色した単一の細胞を示す。
【図３４Ｊ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。角化細胞（ＶＭ−１）に対する抗体で染色した２個の細胞（矢印）を示す。
【図３４Ｋ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ミオゲニン（Ｆ５Ｄ）に対する抗体で染色した２個の細胞（矢印）を示す。
【図３４Ｌ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。位相差の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。多数の線状に配列した角を含有する２個の構造（矢印）を示す。
【図３４Ｍ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ−Ｏ染色された細胞内小胞を含有する多数の細胞を示す。
【図３４Ｎ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩＣ１）に対する抗体で染色した単一の細胞を示す。
【図３４Ｏ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。骨シアロプロテイン−１１（ＷＶ１Ｄ１）に対する抗体で細胞内染色した４個の細胞（矢印）を示す。
【図３４Ｐ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。末梢細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ，  Ｐ２Ｂ１）に対する抗体で染色した多数の細胞を示す。
【図３４Ｑ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ヒト特異的αフェトプロテイン（ＨＡＦＰ）に対する抗体で染色した細胞内小胞を有する３個の細胞（矢印）を示す。
【図３４Ｒ】５６日間、ＣＭ＋デキサメタゾン中でインキュベートしたＮＨＤＦ−２細胞。輝度領域の顕微鏡において同じ本来の倍率（１００×）で撮影した細胞を示す。ヒト特異的胃腸上皮特異的抗原（ＨＥＳＡ）に対する抗体で強度に染色された単一の細胞（矢印）を示す。
【図３５】Ｘ−ｇａｌならびにＧＦＡＰで染色した２１日間のＲＯＳＡ２６  ＰＰＳＣ及びラット星状膠細胞の同時培養。１００×。抗体発色試薬の暗青色及びＸ−ｇａｌの青緑の両方で染色された細胞。黒色矢印は二重染色された細胞を示し、白色矢印はＧＦＡＰで染色されなかったＲＯＳＡ  ＰＰＳＣを示す。
【図３６】Ｘ−ｇａｌならびにＧＦＡＰで染色した２１日間のＲＯＳＡ２６  ＰＰＳＣ及びラット星状膠細胞の同時培養。４０×。染色された星状膠細胞（白色矢印）、次いで、二重染色された細胞（黒色矢印）が認められる。
【図３７】Ｘ−ｇａｌならびにＧＦＡＰで染色した２１日間のＲＯＳＡ２６  ＰＰＳＣ及びラット星状膠細胞の同時培養。４０×。白色矢印はＸ−ｇａｌで単一染色されたＲＯＳＡ２６  ＰＰＳＣ（未分化）を示し、黒色矢印はＸ−ｇａｌ及びＧＦＡＰで二重染色されたＲＯＳＡ細胞（分化）を示す。
【図３８】２１日間１０−７Ｍデキサメタゾンで処理したラット骨格筋（ＲｍＳＣ−１）から単離し、次いで、抗ＣＮＰａｓｅで染色したＰＰＳＣ。１００×。白色矢印は人工産物を示す。黒色矢印はＣＮＰａｓｅに陽性な細胞を示す。
【図３９】２１日間１０−７Ｍデキサメタゾンで処理したラット骨格筋（ＲｍＳＣ−１）から単離し、次いで、ＩＡ４に対する抗体で染色したＰＰＳＣ。位相差１００×。黒色矢印は染色された細胞を示す。
【図４０】２１日間ラット星状細胞由来の馴化培地で処理したラット骨格筋（ＲｍＳＣ−１）から単離し、抗体ＲＴ−９７に対する抗体で染色したＰＰＳＣ。位相差１００×を示す。
【図４１】１７歳雌性皮膚生検から単離された３７細胞倍加時のＣＴ３Ｆ細胞の角化細胞４６，ＸＸを示す。
【図４２】１％ＨＳ１０存在下におけるＭａｔｒｉｇｅｌ上ＰＰＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化。管形成が認められる。
【図４３】１％ＨＳ１０及びＶＥＧＦ存在下におけるＭａｔｒｉｇｅｌ上ＰＰＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化。管形成が認められる。
【図４４】虚血動物への静脈注入１週間後の骨髄中のＰＰＳＣの局在位置を示す。