(57)【要約】本発明は、ＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体を提供し、また、当該抗体を含有する、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出薬、及び当該抗体を用いたＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出方法又は診断方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドと特異的に結合する抗体。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加された変異型アミノ酸配列を含み、かつＴＤＰ−４３活性を有するタンパク質であって、当該変異型アミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化された前記タンパク質
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、リン酸化されたアミノ酸残基を含む一部のアミノ酸配列を含む部分ペプチド
【請求項２】
少なくとも１つのアミノ酸残基が、セリン残基、トレオニン残基及びチロシン残基からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
少なくとも１つのアミノ酸残基が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３９３番目、第４０３番目、第４０４番目、第４０９番目及び第４１０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ペプチドのアミノ酸配列が配列番号５〜１１のいずれかに示されるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
リン酸化により（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）の部分ペプチドの構造が変化した部位に結合することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
リン酸化がカゼインキナーゼ１によるものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体がポリクローナル抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体。
【請求項１１】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項７、９又は１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項７又は９〜１１のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１３】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４であるハイブリドーマ。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含有する、リン酸化ＴＤＰ−４３検出薬。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含有する、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変検出薬。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含有する、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーの診断薬。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体と採取された被験試料とを反応させることを特徴とする、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出方法。
【請求項１９】
請求項１４若しくは１５に記載の検出薬、請求項１６に記載の診断薬、又は請求項１７に記載の医薬組成物の製造における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体、該抗体を含有するＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出薬及び検出方法、並びにＴＤＰ−４３プロテイノパチーの治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＤＰ−４３（ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａ）は、ＴＡＲ（ｔｒａｎｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ）ＤＮＡに結合し、転写調節や選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）に関与する核因子であることが知られている。
また、ＴＤＰ−４３は、ユビキチン陽性細胞内封入体（ＮＣＩ）や変性突起様構造物などの形態で、前頭側頭型認知症を含む前頭側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＦＴＬＤ）などの変性神経細胞に凝集、蓄積するタンパク質である（Ａｒａｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６  Ｄｅｃ  ２２；３５１（３）：６０２−１１．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  ３０、Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６  Ｏｃｔ  ６；３１４（５７９６）：１３０−３）。ＴＤＰ−４３は、ＦＴＬＤ以外にも筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）、グアム島パーキンソン認知症複合、紀伊半島パーキンソン認知症複合等の神経細胞やグリア細胞にも蓄積することが知られており、これらの疾患はＴＤＰ−４３プロテイノパチー（ＴＤＰ−４３蛋白蓄積症）と総称される。ＴＤＰ−４３の異常蓄積は、それぞれの疾患の病変部位に見られ、これらの疾患における神経変性の原因と密接な関係があると考えられる。
現在、ＴＤＰ−４３の研究やＴＤＰ−４３プロテイノパチーの病理診断には、市販されている２種類の抗体が用いられているが、これらの抗体は患者の脳又は脊髄内に異常蓄積するＴＤＰ−４３と結合するだけでなく、脳又は脊髄などに正常に存在するＴＤＰ−４３とも強く結合し、脳又は脊髄標本の免疫染色でも核に存在する正常のＴＤＰ−４３を染め出すことが知られていた。
一方、ＴＤＰ−４３は、患者の脳又は脊髄において高度にリン酸化されて蓄積していることが判明した（Ａｒａｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６  Ｄｅｃ  ２２；３５１（３）：６０２−１１．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  ３０、Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６  Ｏｃｔ  ６；３１４（５７９６）：１３０−３）。しかしながら、そのリン酸化部位やリン酸化に関わる酵素については未だ報告はない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、ＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体、および該抗体を含有するＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出薬及び検出方法、並びにＴＤＰ−４３プロテイノパチーの治療用医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、変性神経細胞に異常蓄積したＴＤＰ−４３（ユビキチン陽性封入体を構成する）において、構成アミノ酸の一部がリン酸化されていることを見出した。さらにこのリン酸化アミノ酸を含む合成ペプチドを抗原として調製した抗体は、ＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物と特異的に結合することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  以下の（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）のペプチドと特異的に結合する抗体。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加された変異型アミノ酸配列を含み、かつＴＤＰ−４３活性を有するタンパク質であって、当該変異型アミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化された前記タンパク質
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、リン酸化されたアミノ酸残基を含む一部のアミノ酸配列を含む部分ペプチド
（２）  少なくとも１つのアミノ酸残基が、セリン残基、トレオニン残基及びチロシン残基からなる群から選ばれる少なくとも１つである、（１）に記載の抗体。
（３）  少なくとも１つのアミノ酸残基が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３９３番目、第４０３番目、第４０４番目、第４０９番目及び第４１０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つである、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）ペプチドのアミノ酸配列が配列番号５〜１１のいずれかに示されるものである（１）〜（３）のいずれか１項に記載の抗体。
（５）リン酸化により（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）の部分ペプチドの構造が変化した部位に結合することができる、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体。
（６）リン酸化がカゼインキナーゼ１によるものである（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体。
（７）抗体がモノクローナル抗体である（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗体。
（８）抗体がポリクローナル抗体である（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗体。
（９）受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。上記ハイブリドーマは、２００８年７月３日付で、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
（１０）（７）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体。
（１１）抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、（７）、（９）又は（１０）のいずれか１項に記載の抗体。
（１２）（７）又は（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（１３）受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４であるハイブリドーマ。
（１４）（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体を含有する、リン酸化ＴＤＰ−４３検出薬。
（１５）（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体を含有する、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変検出薬。
（１６）（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体を含有する、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーの診断薬。
（１７）（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
（１８）（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体と採取された被験試料とを反応させることを特徴とする、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出方法。
（１９）（１４）若しくは（１５）に記載の検出薬、（１６）に記載の診断薬、又は（１７）に記載の医薬組成物の製造における、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体の使用。
本発明により、ＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体、および該抗体を含有するＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出薬及び検出方法、並びにＴＤＰ−４３プロテイノパチーの治療用医薬組成物等が提供される。
本発明の抗体は、ＦＴＬＤやＡＬＳ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチーを発症した患者で認められるＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物に特異的に結合することができるため、これらの疾患の診断や治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の抗体の特異性をウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す図である。
図２は、ＥＬＩＳＡ法による抗ｐＳｅｒ４０９リン酸化ペプチド抗体の反応性（特異性）の検討結果を示す図である。
図３は、ＥＬＩＳＡ法による抗ｐＳｅｒ４１０リン酸化ペプチド抗体の反応性（特異性）の検討結果を示す図である。
図４は、ＥＬＩＳＡ法による抗ｐＳｅｒ４０９，４１０リン酸化ペプチド抗体の反応性（特異性）の検討結果を示す図である。
図５は、市販ＴＤＰ−４３抗体及びｐＳ４０９抗体を用いたＦＴＬＤ脳組織の免疫染色結果を示す図である。
図６は、ＥＬＩＳＡ法による異常ＴＤＰ−４３の検出結果を示す図である。
図７は、ウエスタンブロッティング法による異常ＴＤＰ−４３の検出結果を示す図である。
図８は、ウエスタンブロッティング法による異常ＴＤＰ−４３の検出結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２００７年７月６日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２００７−１７８５８３号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．概要
本発明は、リン酸化ＴＤＰ−４３に特異的に結合する抗体、該抗体を含有するＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出薬及び検出方法、及びＴＤＰ−４３プロテイノパチーの治療用医薬組成物等に関する。
ＴＤＰ−４３は、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー患者の脳又は脊髄の神経細胞などにおいて異常に蓄積し、ユビキチン陽性細胞内封入体（ＮＣＩ）や変性突起様構造物などのＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物を形成する。そして、ＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物は高度にリン酸化されている。また、凝集、蓄積しているＴＤＰ−４３は線維状構造をとっており、リン酸化によってＴＤＰ−４３は本来の構造が変化してβシート構造に富むコンホメーションをとっていると考えられる。
本発明者らは、異常蓄積したＴＤＰ−４３の構成アミノ酸の一部がリン酸化されていることに着目し、さらにこのリン酸化アミノ酸を有する合成ペプチドを抗原として調製した抗体が、ＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物と特異的に結合することを見出し、本発明を完成するに至ったものである。また、本発明においては、リン酸化によりＴＤＰ−４３の構造が変化した部分にも、本発明の抗体が結合することを見出した。
さらに、本発明者は、ＴＤＰ−４３がカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）の基質になることを見出し、その基質結合部位の多くが患者脳でもリン酸化されていることを見出した。したがって、ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の中でＣＫ１のリン酸化コンセンサス配列（ｐＳ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｓ／Ｔ，ｐＳ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ）に合う部位、すなわちＴＤＰ−４３のアミノ酸配列部位のうちＣＫ１が結合しリン酸化する部位は、本発明の抗体がよく結合する部位であると考えられる。
本発明の抗体は、リン酸化されていないＴＤＰ−４３には結合しないのに対し、リン酸化ＴＤＰ−４３及びその一部を有するペプチドと特異的に結合することができる。従って、本発明の抗体は、ＦＴＬＤやＡＬＳ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチーの診断や治療に有用である。
２．リン酸化ＴＤＰ−４３に特異的に結合する抗体
本発明の「抗体」は、上記リン酸化ＴＤＰ−４３と特異的に結合する抗体又はその断片を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本明細書においては、リン酸化ＴＤＰ−４３又はリン酸化ＴＤＰ−４３部分ペプチドと特異的に結合する抗体又はその断片を「抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体」と称する。
本発明の抗体には、本発明の抗体が結合する抗原決定基（エピトープ）と結合する抗体も含まれる。抗原決定基はリン酸化ＴＤＰ−４３の全部又は一部の領域であり、例えば上記ＣＫ１のリン酸化コンセンサス配列（ｐＳ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｓ／Ｔ，ｐＳ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ）に合う部位、すなわちＴＤＰ−４３のアミノ酸配列部位のうちＣＫ１が結合しリン酸化する部位が挙げられる。
本発明において、「特異的に結合する」とは、リン酸化されたＴＤＰ−４３タンパク質若しくはＴＤＰ−４３ペプチド（リン酸化により構造が変化した部位を含む）には結合する（反応する）が、リン酸化されていないタンパク質又はペプチドには結合しない（反応しない）ことを意味する。結合が特異的か否かであることの確認は、免疫学的手法、例えばＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、又は免疫組織学的染色等によって確認することができる。
本発明の抗体には、抗体断片が含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、線状抗体、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を少なくとも一部に含むペプチド等などが挙げられる。抗体のアミノ酸配列が改変されたとしても、上記リン酸化ＴＤＰ−４３又はリン酸化ＴＤＰ−４３部分ペプチドと特異的に結合することができる限り、そのような抗体は本発明の範囲内に含まれる。
また、本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体が含まれる。
３．抗体の製造
以下、抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体の調製方法について説明する。
（１）抗原の調製
（１−１）全長ＴＤＰ−４３
リン酸化ＴＤＰ−４３は、本発明の抗体を作製するための免疫源として使用される。また、抗原には、上記リン酸化ＴＤＰ−４３の全長配列のうち一部のアミノ酸配列を含むペプチドを使用することも可能である。
ここで、リン酸化ＴＤＰ−４３としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加された変異型アミノ酸配列を含み、かつＴＤＰ−４３活性を有するタンパク質であって、当該変異型アミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化された前記タンパク質
すなわち、本発明において、抗原として用いるリン酸化ＴＤＰ−４３において、アミノ酸配列部分は配列番号１に示されるが、これ以外に、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の変異型アミノ酸配列を有するリン酸化ＴＤＰ−４３を使用することも可能である。
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個）の他のアミノ酸が付加又は挿入されたアミノ酸配列
本発明においては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＤＰ−４３活性と同様の作用を有する変異型のＴＤＰ−４３を使用することもできる。
ここで、「ＴＤＰ−４３活性」とは、ＴＧ（チミン−グアニン）あるいはＵＧ（ウラシル−グアニン）の繰り返しを有する核酸との結合活性を意味する。このような結合活性は、ＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇとその競合阻害試験を行うことにより、あるいは公知のＥＭＳＡ法により測定することができる。
また、本発明で用いられるＴＤＰ−４３は、ＴＤＰ−４３活性を有する限り、上記アミノ酸配列とホモロジーを有するタンパク質でもよい。そのようなタンパク質としては、配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
このような配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ＴＤＰ−４３をコードするＤＮＡの塩基配列を用いて、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、ＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
その後、通常の遺伝子工学的手法を用いた宿主−発現系により、目的とするＴＤＰ−４３タンパク質を得ることができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。
リン酸化の対象となるアミノ酸残基は、特に限定されるものではないが、セリン（Ｓｅｒ）残基、トレオニン（Ｔｈｒ）残基及びチロシン（Ｔｙｒ）残基からなる群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
また、上記リン酸化コンセンサス配列（ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（配列番号１２）又はｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ（配列番号１３））（Ｘは任意のアミノ酸配列を表し、ｐＳｅｒ／Ｔｈｒはその配列中でリン酸化されるセリン若しくはトレオニンを表す）を含む部位としては、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち以下のものが挙げられる。
Ｔｈｒ２５（第２５番目のＴｈｒを指す。以下同様。）、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ１４１、Ｔｈｒ１５３、Ｓｅｒ１８０、Ｓｅｒ２５４、Ｓｅｒ３４７、Ｓｅｒ３６９、Ｓｅｒ３７３、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８９、Ｓｅｒ４０３、Ｓｅｒ４０４、Ｓｅｒ４０７。
本発明においては、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第３９３番目、第４０３番目、第４０４番目、第４０９番目及び第４１０番目のアミノ酸配列（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）の１つ又は複数のアミノ酸残基をリン酸化することが好ましい。上記変異型アミノ酸配列の場合も、配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置、すなわち、変異前のアミノ酸残基が上記第３９３番目、第４０３番目、第４０４番目、第４０９番目及び第４１０番目のアミノ酸配列（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）の１つ又は複数のアミノ酸残基をリン酸化したものを抗原とすることができる。
なお、配列番号１に示すアミノ酸配列とその位置を表示するために、本明細書においてはその位置の次にアミノ酸の３文字表記又は１文字表記をすることがある。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第３９３番目のアミノ酸がセリンのときは、「Ｓｅｒ３９３」又は「Ｓ３９３」のように表示する。これと同様に、第４０３番目アミノ酸残基がセリンのときは、「Ｓｅｒ４０３」、「Ｓ４０３」のように表示する。他のアミノ酸残基と位置についても、この表記に準じて表示する。
アミノ酸残基へのリン酸化の方法は、ＴＤＰ−４３を含む基質溶液にカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）、その他のリン酸化酵素、あるいはそれらを含む粗酵素液とＡＴＰを混合し、数分から数十時間インキュベートすることによってＴＤＰ−４３をリン酸化することができる。ＴＤＰ−４３を含む基質溶液は大腸菌や培養細胞内にＴＤＰ−４３を挿入したプラスミドを導入した細胞を増殖させる方法がある。この他、試験管内で合成したり、生体材料から調製することも可能である。また全長のＴＤＰ−４３だけでなく、部分分解物や部分ペプチドを基質とし、上記のような酵素を用いてリン酸化することも可能である。
（１−２）リン酸化ＴＤＰ−４３の部分ペプチド
本発明においては、リン酸化ＴＤＰ−４３の全長のみならず、リン酸化部位（リン酸化されたアミノ酸残基）を含む限り、一部の長さの部分断片を抗原として使用することが可能である。本発明においては、この一部の長さの部分断片を「部分ペプチド」と呼ぶ。ペプチドにはポリペプチドも含まれるが、本発明においては、アミノ酸配列の長さに関係なく、リン酸化ＴＤＰ−４３の一部の配列を有し、かつ、少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されている限り「部分ペプチド」と総称する。
本発明において、抗原として使用するのに好ましい部分ペプチドのアミノ酸配列は、上記（１−１）の項に記載の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、リン酸化されたアミノ酸残基を含む一部のアミノ酸配列であり、好ましくは連続する４個以上のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、部分ペプチドの長さは配列番号１に示すアミノ酸配列の８〜１５個の配列であり、さらに好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列の１０〜１１個の配列である。神経病理学、及び生化学的解析結果によると、部分ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端側の部分配列を有することが好ましい。そのような部分配列としては、以下の配列番号２〜４に示されるものを例示することができる。
2009008529.tif 000002
配列番号２、３、４に示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１で示されるアミノ酸配列における３８８〜３９７番目、３９８〜４０８番目、４０５〜４１４番目のアミノ酸配列である。但し、本発明においては、上記部分配列を一部改変して用いることができる。例えば、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）又はＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎなどの担体蛋白質を架橋させるために、上記配列番号２〜４に示すアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側に、システイン（Ｃｙｓ）残基を付加することができる。
また、前記の通り、ＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の中でＣＫ１のリン酸化コンセンサス配列（ｐＳ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｓ／Ｔ，ｐＳ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ）でＣＫ１が結合しリン酸化する部位のアミノ酸配列も、本発明における部分ペプチドとして使用することが可能である。
さらに、上記タンパク質及び部分ペプチドは、マウス、ヒト等の脳や脊髄などの組織や細胞から精製された天然型のＴＤＰ−４３及びその部分ペプチドでもよいし、遺伝子工学的に生産されたＴＤＰ−４３又はその部分ペプチドでもよい。また、そのアミノ酸配列を指定することにより、固相法などの公知のタンパク質合成法又は市販のタンパク質合成装置を用いて合成することもできる。
ここで、リン酸化されるアミノ酸残基としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ残基が挙げられるが、好ましくはＳｅｒ及びＴｈｒ残基である。置換による変異処理が施された変異型アミノ酸配列において、置換後のアミノ酸残基がＳｅｒ、Ｔｈｒ又はＴｙｒのときは、これらのアミノ酸残基もリン酸化の対象となる。
より具体的には、リン酸化部分ペプチドは例えば以下の配列番号５〜１１に示すものが挙げられる。
2009008529.tif 000003
上記アミノ酸配列において「（ＰＯ３Ｈ２）」はその前に記載のアミノ酸残基がリン酸化されたことを意味する。例えば、上記アミノ酸配列において、「Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）」は、Ｓｅｒがリン酸化されていることを意味する。
配列番号５に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の第６番目のＳｅｒ残基をリン酸化し、かつ、Ｎ末端にＣｙｓを付加したものである。
配列番号６に示すアミノ酸配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６番目のＳｅｒ残基をリン酸化し、かつ、Ｎ末端にＣｙｓを付加したものである。
配列番号７に示すアミノ酸配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列の第７番目のＳｅｒ残基をリン酸化し、かつ、Ｎ末端にＣｙｓを付加したものである。
配列番号８に示すアミノ酸配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６番目及び第７番目のＳｅｒ残基をリン酸化し、かつ、Ｎ末端にＣｙｓを付加したものである。
配列番号９に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５番目のＳｅｒ残基をリン酸化し、かつ、Ｎ末端にＣｙｓを付加したものである。
配列番号１０に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６番目のＳｅｒ残基をリン酸化し、かつ、Ｎ末端にＣｙｓを付加したものである。
配列番号１１に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５番目及び第６番目のＳｅｒ残基をリン酸化し、かつ、Ｎ末端にＣｙｓを付加したものである。
これらのリン酸化ＴＤＰ−４３又は部分ペプチドは、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変が認められるマウス、ヒト等の脳や脊髄などの組織又は細胞から精製された天然型のリン酸化ＴＤＰ−４３でもよいし、遺伝子工学的に生産されたリン酸化ＴＤＰ−４３でもよい。例えば、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変が認められる脳や脊髄などの組織を各種界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりリン酸化ＴＤＰ−４３を得ることができる。また、抗原として用いるリン酸化ＴＤＰ−４３は、そのアミノ酸配列を指定することにより、固相法などの公知のタンパク質合成法又は市販のタンパク質合成装置を用いて合成することもできる。合成したペプチドは、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）又はＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎなどの担体蛋白質と結合させ、免疫原として用いることができる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したリン酸化ＴＤＰ−４３又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に温血動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは１〜１０ｍｇであり、アジュバントを用いるときは５〜５００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１〜２週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜５回免疫を行う。免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。３回〜４回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。例えば、目的の抗体を含有する血清を、リン酸化されていないＴＤＰ−４３又はリン酸化されていない合成ペプチド（以下、「非リン酸化ＴＤＰ−４３」という）を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、リン酸化ＴＤＰ−４３に対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
（３）モノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製したリン酸化ＴＤＰ−４３又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に温血動物に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは１〜１０ｍｇであり、アジュバントを用いるときは５〜５００μｇである。用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から１〜３０日後、好ましくは２〜５日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰＭＩ、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳＯ／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０８〜５×１０８個の抗体産生細胞と２×１０７〜１０×１０７個のミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比１：１〜１：１０）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば１０〜２０％のウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に５×１０７個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルにＨＡＴ培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、９６ウエルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に３７℃で１時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧを３７℃で１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４９０ｎｍの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、リン酸化ＴＤＰ−４３に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内にハイブリドーマを約２×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
なお、ヒト型化抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。ヒト型化抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト型化抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公知である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：１３−２１（１９９４）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）等）。
（４）微生物の寄託
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（識別のための表示：ＴＤＰ４３−ｐＳ４０９／４１０）は、２００８年７月３日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（５）遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植）と呼ばれる手法を採用することができる。ＣＤＲグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特許第２８２８３４０号公報等を参照）。
ヒト化抗体（完全ヒト抗体）は、一般にＶ領域の抗原結合部位である超過変領域（Ｈｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト化抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
また、本発明においては、本発明のハイブリドーマ（例えば受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４のハイブリドーマ）又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
（６）抗体断片の作製
本発明の抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、線状抗体、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を少なくとも一部に含むペプチド等などが挙げられる。
Ｆａｂは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合で結合した抗体断片である。Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂをチオエーテル結合又はジスルフィド結合させて作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した抗体断片である。Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを、発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）と１本のＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結したポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片であり、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。ｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。ｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造することができる。ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することができる。
本発明においては、本発明のハイブリドーマ（例えば受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４のハイブリドーマ）又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じて抗体断片を作製することができる。
４．検出薬及び検出方法、並びに診断薬および診断方法
本発明の抗体は、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変を検出するための試薬として用いることができる。ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変は、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーの患者の脳、脊髄などで認められ、ユビキチン陽性封入体（ＮＣＩ）などのＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物の発生などを呈する。さらに、ＴＤＰ−４３の蓄積、不溶化、漏出、あるいはこれに伴う細胞や組織の形態的又は生化学的変化などが生じる。
また、本発明の抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体は、リン酸化ＴＤＰ−４３の検出及び定量ができるので、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーの診断薬に用いることができる。
ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変検出には、検出感度の点から、Ｓｅｒ４０９及び／又はＳｅｒ４１０がリン酸化されたタンパク質又はペプチドと結合する抗体を用いることが好ましい。
抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体を用いてＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出又はＴＤＰ−４３プロテイノパチーの診断をする方法は、例えば、
（ａ）本発明の抗体またはその断片と試料とを反応させる工程、及び
（ｂ）工程（ａ）で形成した抗原抗体複合体と、検出のための標識抗体とを反応させる工程
を含む。反応後、標識抗体から発するシグナルを検出する。
本発明の検出又は診断薬を用いる検出方法又は診断方法は、抗体を用いるアッセイ、即ち免疫アッセイであれば、いずれの方法でもよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウエスタンブロット法等が挙げられる。
本発明の検出及び／又は定量法、あるいは診断法に供される試料としては、脳又は脊髄などの神経組織（例えば脳の組織切片）及び神経細胞、脳脊髄液、血液等の体液試料等、リン酸化ＴＤＰ−４３が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定されるものではない。
本発明の検出及び／又は定量法、あるいは診断法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫測定法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法により行うこともでき、サンドイッチ法の場合には固相化抗体及び標識抗体のうち少なくとも１種が本発明の抗体であればよい。
標識抗体とは、標識物質で標識された抗体を意味し、これらの標識抗体は、試料（例えば、脳、脊髄などの神経組織及び神経細胞、脳脊髄液、血液等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原を検出または定量するために用いることができる。
本発明で用いることができる標識物質は、抗体に物理的結合又は化学的結合等により結合させることによりそれらの存在を検出可能にするものであれば特に限定されない。標識物質の具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等が挙げられ、より具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、カタラーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または化学発光物質が挙げられる。標識物質と抗体との結合法は、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすことができるが、酵素、化学発光物質、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルを生じる。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。また、ビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
固定化抗体は、試料（例えば、脳、脊髄などの神経組織及び神経細胞、脳脊髄液、血液等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原を検出、定量、分離または精製するために用いることができる。
抗体を固定化するために使用できる不溶性担体としては、例えば、（ｉ）ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂又はナイロン樹脂等、（ｉｉ）ガラス、（ｉｉｉ）セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等が挙げられる。これらの担体は、ビーズ、フィルター又はメンブレン等の形態で、あるいはアフィニティークロマトグラフィー用の担体として使用することができる。
５．検出用又は診断用キット
本発明のＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変検出用キット又はＴＤＰ−４３プロテイノパチー診断用キットは、本発明の抗体を含むものである。ここで用いる抗体は、上記した固定化抗体や標識抗体でもよい。例えば、本発明の抗体を一次抗体として使用する場合、本発明のキットには、抗原抗体結合反応により形成された複合体を検出するための二次抗体を含めてもよい。本発明のキットには、該キットを効率的かつ簡便に利用できるようにするために、これら抗体以外に種々の補助剤を含めてもよい。補助剤としては、例えば固体状の二次抗体を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗浄するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵素を使用した場合に酵素活性を測定するための基質、その反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常使用されるものが挙げられる。
６．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を有効成分として含有するものであり、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、運動ニューロン疾患などの関連の神経変性疾患等の疾患の予防、治療に有効である。用いられる抗体としては、例えば、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体が挙げられる。さらに、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させるために、ペプチド化した抗体又はこれらのペプチドとＢＢＢ透過性運搬体との結合体が挙げられる。
本発明の抗体は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体または希釈剤等と共に投与することができ、またその投与は１回または数回に分けて行うことができる。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口又は非経口的に投与することができる。
経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用することができる。崩壊剤としては、澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸複塩などが挙げられ、結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムなどが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤は錠剤形成に非常に有効である。経口投与用として水性懸濁液又はエリキシルにする場合は、必要により乳化剤、懸濁化剤を併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。
注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に０．１μｇ抗体／ｍｌ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１０μｇ〜５０ｍｇの割合で、好ましくは１００μｇ〜２ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。但し、この範囲に限定されるものではなく、患者の体重および症状や個々の投与経路によって変動し得る。治療する患者の薬物に対する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間および投与間隔によっても投与量に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当なこともある。
投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
抗体の調製
（１）抗原の調製
本発明の抗体を得るための抗原ペプチドとして、ヒトＴＤＰ−４３（配列番号１）におけるアミノ酸配列番号３８８−３９７、３９８−４０８、又は４０５−４１４のアミノ酸配列のＮ末端にシステインを付加した配列（ＣＡＳＮＡＧＳＧＳＧＦ、ＣＮＧＧＦＧＳＳＭＤＳＫ、ＣＭＤＳＫＳＳＧＷＧＭ）を有し、且つリン酸化セリン残基を有する以下のペプチドを固相法により合成した（シグマジェノシス、又はサーモクエスト）［Ｓ（ＰＯ３Ｈ２）はリン酸化セリンを表す］。また、カラム作製、コントロール等に使用するため、配列番号２〜４に示されるアミノ酸配列を有する非リン酸化ペプチドも合成した。
2009008529.tif 000004
（２）免疫
前記合成ペプチドをＴｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ又はＫＬＨと定法に従ってコンジュゲートし、抗原として用いた。抗原ペプチドを含有する１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩水溶液と１ｍｌのフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）を合わせ、超音波処理によってエマルジョン化し、ウサギ（ニュージーランドホワイト、体重２．５ｋｇ、雌）の背中数カ所以上に分けて免疫した。初回免疫から２週間後に０．５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド生理食塩溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを合わせ、超音波処理によりエマルジョン化したものを追加免疫した。免疫した１週間後に採血を行い、採取した血液は室温で１時間静置後、４℃で一晩静置し、５０００ｘｇ、１０分間の遠心分離を行い、抗血清を得た。
（３）抗体の精製
抗体を精製するため、ホルミルセルロファイン（生化学工業）、あるいはトヨパールＡＦトレシル６５０Ｍ（東ソー）約２ｍｌに対し、ＴＤＰ−４３におけるアミノ酸配列番号３８８−３９７、３９８−４０８又は４０５−４１４のアミノ酸配列を有する非リン酸化合成ペプチド約２ｍｇを反応させたカラムを作製した。抗血清２ｍｌをこのカラムにおいて１０−２０時間循環させ、カラムに吸着されなかった抗体を抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体とした。
抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体のうち、Ｓｅｒ４０９及びＳｅｒ４１０がリン酸化されたペプチドに対するポリクローナル抗体を、ｐＳｅｒ４０９／４１０ポリクローナル抗体と名づけた。
【実施例２】
【０００７】
モノクローナル抗体の調製
（１）ハイブリドーマの作製
上記「実施例１（２）免疫」の方法に準じて初回免疫及び追加免疫を行なった。最終免疫の３日後に、免疫したマウスから脾臓を採取した。採取した脾臓細胞とミエローマ細胞株とを５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール法により細胞融合を行った。ＨＡＴ（アミノプテリン、ヒポキサンチン、チミジン）を含む選択培地を用い、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。７〜１４日間培養し、増殖してきたハイブリドーマに対しさらにスクリーニングを行った。
スクリーニングは、ＦＴＬＤ患者脳のＴｒｉｔｏｎ不溶性画分をＰＬＬコートしたスライドグラス上に塗布し、それにハイブリドーマの培養上清を反応させ、異常構造物と反応する（異常構造物を染める）抗体を産生するクローンを選択することにより行った。その後、限界希釈法により、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを得た。
（２）モノクローナル抗体の調製
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法で作製したハイブリドーマのクローンをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与して腹水を採取するか、高濃度培養上清を作製することにより得た。
具体的には、上記方法で作製したハイブリドーマのクローンを、予め（１０日前）２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン）を投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１×１０７個投与し、２週間後の腹水を採取した。
このようにして得られたモノクローナル抗体をｐＳｅｒ４０９／４１０モノクローナル抗体と名づけた。
（３）ハイブリドーマの寄託
上記方法により得られたハイブリドーマのうち、ｐＳｅｒ４０９／４１０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、「ＴＤＰ４３−ｐＳ４０９／４１０」と称して、２００８年７月３日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託した（受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９８４）。
【実施例３】
【０００８】
ウエスタンブロッティング法及びＥＬＩＳＡ法による抗体の特異性の検討
実施例１において調製した抗体が、それぞれリン酸化した抗原ペプチドと特異的に反応するか否かをウエスタンブロッティング法及びＥＬＩＳＡ法により確認した。
ウエスタンブロッティング法による検討においては、抗原ペプチドとして、２種類のリン酸化リコンビナントヒトＴＤＰ−４３及び非リン酸化ＴＤＰ−４３（コントロール）を用い、抗体としては、Ｓｅｒ４０９がリン酸化されたペプチド（ｐＳｅｒ４０９（ｐＳ４０９））に対する抗体、Ｓｅｒ４１０がリン酸化されたペプチド（ｐＳｅｒ４１０）に対する抗体並びにＳｅｒ４０９及びＳｅｒ４１０がリン酸化されたペプチド（ｐＳｅｒ４０９，４１０）に対する抗体を用いた。また、アミノ酸配列番号４０５−４１４のアミノ酸配列を有する非リン酸化ＴＤＰ−４３ペプチドに対する抗体をコントロールとして用いた。
上記抗原ペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、転写したペプチドと上記抗体との反応性を調べた。その結果、これらの抗体は、ＣＫ１によりリン酸化したリコンビナントヒトＴＤＰ−４３とは強く反応したが、ＣＫ１によりリン酸化しないＴＤＰ−４３とは反応が見られなかった（図１）。図１において、「ＣＫ１」はカゼインキナーゼ１、「ＣＫ２」はカゼインキナーゼ２を表し、それぞれ、ＣＫ１、ＣＫ２を用いてリン酸化させたものである。
ＥＬＩＳＡ法による検討では、定法に従って９６ウエルプレート（住友ベークライト）に５μｇ／ｗｅｌｌの非リン酸化ペプチド、あるいは抗原ペプチドを底面に吸着させた後、実施例１で調製した抗体を５００−１０００倍希釈して反応させ、定法を用いて発色させた。その結果、非リン酸化ペプチドとは反応しなかったが、抗原ペプチドとは強い反応性を示した（図２〜４）。
【実施例４】
【０００９】
抗体の免疫組織染色
ＦＴＬＤ患者から採取された脳大脳皮質をホルマリン固定後、５０ミクロン厚に薄切し、市販されている抗ヒトＴＤＰ４３抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ社）（図５、「リン酸化非依存性抗ＴＤＰ−４３抗体」）、及び本発明の抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体（図５、「リン酸化依存性抗ＴＤＰ−４３抗体（ｐＳ４０９）」）を用い、アビジン・ビオチン複合体法により免疫染色し、ジアミノベンチジンを用いて発色させた。
その結果、本発明の抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体を用いた場合は、大脳皮質において強い陽性反応（褐色）が認められ、変性神経突起様、球状、あるいはドット状のＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変が認められた。これに対し、細胞核に局在する正常のＴＤＰ−４３とはほとんど反応が見られなかった（図５右パネル）。一方、市販の抗ヒトＴＤＰ４３抗体を用いた場合は、細胞核に局在する正常のＴＤＰ−４３との反応が認められた（図５左パネル）。また、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者に出現するｓｋｅｉｎ様封入体も本発明の抗体に対して強い陽性反応を示した。さらに、本発明の抗体は市販の抗ＴＤＰ−４３抗体よりも広汎なＴＤＰ−４３の異常を高感度に検出した。
【実施例５】
【００１０】
ＥＬＩＳＡ法、及びウエスタンブロッティング法による異常ＴＤＰ−４３の検出
（１）試料の調製
ＦＴＬＤ、ＡＬＳ、プログラニュリン変異を有するＦＴＬＤ（ｍＰＧＲＮ）、ＴＤＰ−４３蓄積が認められたアルツハイマー病（ＡＤ）及びレビー小体型認知症（ＤＬＢ）の患者から採取した大脳皮質（０．５ｇ）並びにこれらの疾患に罹患していない患者又は正常人（Ｃｏｎｔｒｏｌ又はＣｏｎ）から採取した大脳皮質（０．５ｇ）をそれぞれ５ｍＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７，５，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．８Ｍ  ＮａＣｌ，１０％ｓｕｃｒｏｓｅ）にてホモジナイズし、３５０００ｒｐｍ，２０分遠心した。その後、沈殿を１％Ｔｒｉｔｏｎを含む５ｍＬの同緩衝液Ａにてホモジナイズし、３５０００ｒｐｍ，２０分遠心し、得られた沈殿をさらに１％Ｓａｒｋｏｓｙｌを含む５ｍＬの同緩衝液Ａにてホモジナイズして３５０００ｒｐｍ，２０分の遠心を行った。得られた沈殿を１ｍＬの８Ｍ尿素溶液、あるいは１％ＳＤＳ溶液に溶かし、ＥＬＩＳＡあるいはウエスタンブロットの検出に供した。脱リン酸化は８Ｍ尿素画分を透析後、λＰｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（λＰＰａｓｅ）にて３０℃で２時間処理した。
（２）ＥＬＩＳＡ法による検出
ＴＤＰ−４３蓄積のない正常脳（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、及びＴＤＰ−４３蓄積のあるＦＴＬＤ脳（ＦＴＬＤ）の不溶性画分を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）により４μｇから倍々希釈して９６ウエルプレートに４℃で一晩コーティングした。その後、一次抗体として市販ＴＤＰ−４３抗体、本発明のｐＳｅｒ４０９／４１０ポリクローナル抗体（実施例１）、及びｐＳｅｒ４０９／４１０モノクローナル抗体（実施例２）を２時間反応させ、さらにペルオキシダーゼ標識した二次抗体を２時間反応させた後、オルトフェニレンジアミンを基質として発色させて検出した。
市販抗体では正常（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とＦＴＬＤの間に違いは検出されなかった（図６パネルＡ）のに対し、本発明の抗リン酸化ＴＤＰ−４３抗体を用いた場合、ｐＳｅｒ４０９／４１０モノクローナル抗体（図６パネルＢ）、及びｐＳｅｒ４０９／４１０ポリクローナル抗体（図６パネルＣ）のいずれにおいても、ＦＴＬＤ患者由来の試料に対し強い陽性反応が認められ、その反応は量依存的であった。
（３）ウエスタンブロッティングによる検出（１）
ＴＤＰ−４３蓄積のない正常脳（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＴＤＰ−４３蓄積のあるＦＴＬＤ脳（ＦＴＬＤ）、及びＡＬＳ患者の脳の不溶性画分を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、市販抗体、あるいは本発明のｐＳｅｒ４０９／４１０モノクローナル抗体と反応させた。ウエスタンブロッティングは、上記と同様アビジン・ビオチン複合体法を用い、ジアミノベンチジンにより発色させた。
その結果、市販抗体では４３ｋＤａの位置に泳動される正常ＴＤＰ−４３のバンドが強く認識され、正常ＴＤＰ−４３と異常ＴＤＰ−４３の区別が困難であるのに対し（図７パネルＡ）、本発明のｐＳｅｒ４０９／４１０モノクローナル抗体は正常ＴＤＰ−４３バンドとは反応せず、ＦＴＬＤ、あるいはＡＬＳ患者にみられる４５ｋＤａバンド，１８〜２６ｋＤａバンド，レーン全体がスメア状に染まる反応（図中「ｓｍｅａｒ」）など、異常なＴＤＰ−４３バンドを特異的に検出した（図７パネルＢ）。またこの反応はλＰｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（図中「λＰＰａｓｅ」）による脱リン酸化処理（図７の「＋」のパネル）によって消失することから、抗体が患者脳に蓄積するリン酸化ＴＤＰ−４３を特異的に認識していることが確認された。
（４）ウエスタンブロッティングによるＴＤＰ−４３断片の検出（２）
ＴＤＰ−４３の蓄積病変は疾患によって異なる病変を示すことが知られている。突起内封入体が主な病変である１型、円形の細胞内封入体が多い２型、さらにはその両者が混在する３型に分類され、孤発性ＦＴＬＤは１型、ＦＴＬＤ−ＭＮＤ及びＡＬＳは２型、ＰＧＲＮ変異を有する家族性ＦＴＬＤ（ｍＰＧＲＮ）は３型に分類される（図８パネルＡ）。
また、最近ＴＤＰ−４３蓄積が認められるアルツハイマー病（ＡＤ）及びレビー小体病（ＤＬＢ）の症例が報告されたが、これらは３型の病変を示していた（図８パネルＡ）。これらの患者脳から上記のように調製した不溶性画分を１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、本発明のｐＳｅｒ４０９／４１０抗体と反応させ、その違いについて検討した。
その結果、孤発性ＦＴＬＤ症例（１型）は、２３及び２４ｋＤａの二本の主要バンド（断片Ａ群）並びに１８及び１９ｋＤａの２本の弱いバンド（断片Ｂ群）が検出された。これに対し、ＦＴＬＤ−ＭＮＤ及びＡＬＳ症例（２型）では、２３、２４及び２６ｋＤａの３本の主要バンド（断片Ａ群）並びに１８及び１９ｋＤａの二本の弱いバンド（断片Ｂ群）が検出された。２３ｋＤａバンドは孤発性ＦＴＬＤ例で最も強いのに対し、２４ｋＤａバンドはＦＴＬＤ−ＭＮＤあるいはＡＬＳで最も強かった。さらにｍＰＧＲＮ症例並びにＴＤＰ−４３蓄積のあるＡＤ及びＤＬＢ（３型）は、孤発性ＦＴＬＤとＦＴＬＤ−ＭＮＤ／ＡＬＳ症例の中間型を示した（図８パネルＢ，Ｃ）。
本実施例により、本発明の抗体がリン酸化ＴＤＰ−４３を特異的に認識できることが示された。また、本発明の抗体を用いることにより、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変を特異的に検出することができ、さらにＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の種類を判別できることが示された。
以上より、本発明の抗体は、リン酸化ＴＤＰ−４３検出薬、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー病変の検出薬及びＴＤＰ−４３プロテイノパチーの診断薬として有用である。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明により、生体内で検出されるユビキチン陽性封入体等のＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体の提供が可能となる。本発明の抗体は、ＴＤＰ−４３プロテイノパチー患者で認められるＴＤＰ−４３蛋白異常凝集物を構成するリン酸化ＴＤＰ−４３及びその一部を有するペプチドと特異的に結合することができる。従って、本発明の抗体は、ＦＴＬＤやＡＬＳ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチーの診断や治療に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：リン酸化合成ペプチド
配列番号６：リン酸化合成ペプチド
配列番号７：リン酸化合成ペプチド
配列番号８：リン酸化合成ペプチド
配列番号９：リン酸化合成ペプチド
配列番号１０：リン酸化合成ペプチド
配列番号１１：リン酸化合成ペプチド
配列番号１２：リン酸化コンセンサス配列
配列番号１３：リン酸化コンセンサス配列
［配列表］
2009008529.tif 000005
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【図２】
2009008529.tif 000013
【図３】
2009008529.tif 000014
【図４】
2009008529.tif 000015
【図６】
2009008529.tif 000016
【図１】
2009008529.tif 000017
【図５】
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【図７】
2009008529.tif 000019
【図８】
2009008529.tif 000020
【国際調査報告】
2009008529.tif 000021
2009008529.tif 000022
2009008529.tif 000023
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