(57)【要約】  本発明は、持続血液濾過に好適なバイオ人工糸球体とともに人工腎臓を構成するバイオ人工尿細管を提供する。尿細管上皮細胞を用いて内面を被覆した人工膜とこれを収容する容器とからなるバイオ人工尿細管であり、該細胞は、ＭＥＫ阻害剤の適用により重層化することなくコンフルエントな単層を該人工膜上で形成している。前記尿細管上皮細胞は、ＭＥＫ阻害剤の適用により接触阻害機能を保持していることを特徴とする。ＭＥＫ阻害剤として、Ｕ０１２６が好ましい。腎臓機能の再現を可能とする細胞を付けることで効率よく、かつ２４時間連続的に透析ができ、また尿細管の有用物質の再吸収機能をも付加することができる。
2008047760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿細管上皮細胞を内面に付した人工膜とこれを収容する容器とからなるバイオ人工尿細管であり、ＭＥＫ阻害剤の適用により該細胞は重層化することなくコンフルエントな単層を形成して該人工膜上に付されていることを特徴とするバイオ人工尿細管。
【請求項２】
前記尿細管上皮細胞が、ＭＥＫ阻害剤の適用により接触阻害機能を保持していることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ人工尿細管。
【請求項３】
前記尿細管上皮細胞が、ＲＰＴＥＣその他のヒト初代尿細管上皮細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ1細胞、ＪＴＣ−１２細胞、またはＨＫ-２細胞である、請求項１または２に記載のバイオ人工尿細管。
【請求項４】
前記ＭＥＫ阻害剤が、Ｕ０１２６，ＰＤ９８０５９，ＣＩ−１０４０からなる群より少なくとも１種選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のバイオ人工尿細管。
【請求項５】
前記ＭＥＫ阻害剤がＵ０１２６である、請求項４に記載のバイオ人工尿細管。
【請求項６】
前記人工膜が、ポリスルホン、セルロース酢酸、またはポリイミドからの中空糸膜で形成されている、請求項１〜５のいずれかに記載のバイオ人工尿細管。
【請求項７】
尿細管上皮細胞にＭＥＫ阻害剤を適用して接触阻害機能を保持させ、これによって該細胞が人工膜内面にコンフルエントな単層を形成した後に、該細胞の重層化を防止することを特徴とする、バイオ人工尿細管において尿細管上皮細胞のコンルエントな単層を維持する方法。
【請求項８】
前記のＭＥＫ阻害剤の適用は、尿細管上皮細胞の維持培養液に該ＭＥＫ阻害剤を30〜50μＭの濃度となるように添加することである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ人工尿細管、すなわち尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層が内部に形成された人工尿細管および該細胞の単層を維持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工膜と尿細管上皮細胞を用いたバイオ人工尿細管は1987年にAebischerらにより初めて考案され、基礎的研究が発表された（非特許文献1〜３）。しかし、1989年にはその研究は中座している。1998年にMichigan大学のHumesらは、polysulfone hollow fiberを用いて中空糸内面に近位尿細管上皮細胞を生着させ、このバイオ人工尿細管は細胞のほぼ完全な接着によりイヌリンのリークを阻止でき、様々な代謝機能も保有することを報告した（非特許文献４）。さらに腎不全犬を用いたバイオ人工尿細管デバイスの体外循環実験を実現させ（非特許文献５）、2001年には、エンドトキシン血症を伴う急性腎不全患者に対するバイオ人工尿細管デバイスによる最初の臨床応用を行っている（非特許文献６）。2004年には、10例の急性腎不全を伴い多臓器不全を呈する患者の治療を行い、その内6名の生命予後の改善を報告している（非特許文献７）。しかし、これらの実験または臨床応用では、人工尿細管デバイスは24時間に限って用いられており、それ以上の長期治療は行われていない。【０００３】
本発明者は慢性透析患者の合併症を防止する長期機能維持可能なバイオ人工尿細管デバイスを開発するために、種々の尿細管上皮細胞種の平膜上や中空糸膜モジュールへの長期培養を行ってきた。腎臓組織から単離された尿細管上皮細胞は、組織内の他の細胞との相互関連の喪失、または培養環境下での細胞の特性の変化などから、腎臓組織内で単層の円柱状の尿細管を形成するための接触阻害を保てないことを長期培養から確認した。従来コンフルエントな単層（confluent monolayer）を形成すると接触阻害により増殖が止まると考えられてきた株化尿細管上皮細胞も、コンフルエントな単層を形成後、長期に観察するといずれも重層化することが判明した（非特許文献８，９）。細胞種にもよるが、コンフルエントな単層を形成して1〜2週間で重層化により尿細管デバイスの機能は著しく低下することも明らかになった。多数の腎不全患者に人工尿細管デバイスを用意し、供給する場合、1本の尿細管デバイスは治療の必要な状況が発生するまでの一定期間待機状態になることが必要とされる。その場合、重層化が始まることによりその間に尿細管デバイスの劣化が生じてしまう。慢性患者に対し繰り返す治療が必要な場合にも、治療間隙を培養して待つ間に重層化が進行して尿細管デバイスの機能を劣化させることになる。
＜引用文献リスト＞
【非特許文献１】Aebischer P, Ip TK, Miracoli L, Galletti PM: Renal epithelial cells grown on semipermeable processor. Trans Am Soc Artif Intern Organs 33:96-102,1987
【非特許文献２】Aebischer P, Ip TK, Galletti PM: The bioartificial kidney: Progress toward an ultrafiltration device with renal epithelial cells processing. Life Support Sys 5:159-168,1987
【非特許文献３】Ip TK, Aebischer P: Renal epithelial cell-controlled solute transport across permeable membrane as the foundation for bioartificial kidney. Artif Organs 13:58-61,1987
【非特許文献４】Humes HD, MacKay SM, Funke AJ, Buffington DA.: Tissue engineering of a bioartificial renal tubule assist device: In vitro transport and metabolic characteristics. Kidney Int 55:2502-2514,1999
【非特許文献５】Humes HD, Buffington DA, MacKay SM, Funke AJ, Weitzel WF. : Replacement of renal function in uremic animals with a tissue-engineered kidney. Nat Biotechnol 17:451-455, 1999
【非特許文献６】Weitzel WF, Fissell WH, Humes HD.: Initial clinical experience with a human proximal tubule cell renal assist device (RAD). J Am Soc Nephrol 12(Program and Abstracts issue): 279A,2001
【非特許文献７】Humes HD, Weitzel WF, Bartlett RH, Swaniker FC, Paganini EP, Luderer JR, Sobota J: Initial clinical results of the bioartificial kidney containing human cells in ICU patients with acute renal failure. Kidney Int 2004;66:1578-1588
【非特許文献８】Fujita Y, Kakuta T, Saito A, et al.: Evaluation of Na+ active transport and morphological changes for bioartificial renal tubule cell device using Madin-Darby canine kidney cells. Tissue Eng 8:13-24,2002
【非特許文献９】Ozgen N, Tarashima M, Aung T, Sato Y, Isoe C, Kakuta T, Saito a.: Evaluation of long-term transport ability of a bioartificial renal tubule device using ＬＬＣ−ＰＫ1. Nephrol Dial Transplant 2004;19:2198-2207
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、腎臓の再吸収機能の忠実な再現を可能とする尿細管上皮細胞を人工膜内面に生着させてなるバイオ人工尿細管を開発するに当たり、バイオ人工尿細管における上記の現状に鑑みて、機能低下および劣化の問題を検討し、鋭意研究を行った。その結果、尿細管上皮細胞の接触阻害作用を、ＭＥＫ阻害剤の適用により維持することにより、該細胞のコンフルエントな単層（confluent monolayer）を人工膜内面に持続的に形成させることができた。これによって長期間にわたり細胞機能の維持が可能となることを見出し、血液濾過器としてのバイオ人工糸球体とともに、より生体腎臓に近い機能を有する人工腎臓を構成するデバイスとしての本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のバイオ人工尿細管は、
尿細管上皮細胞を内面に付した人工膜とこれを収容する容器とからなるバイオ人工尿細管であり、ＭＥＫ阻害剤の適用により該細胞は重層化することなくコンフルエントな単層を形成して該人工膜上に付されていることを特徴としている。【０００６】
前記尿細管上皮細胞が、ＭＥＫ阻害剤の適用により接触阻害機能を保持していることを特徴とするバイオ人工尿細管である。【０００７】
前記尿細管上皮細胞が、ＲＰＴＥＣ、その他のヒト初代尿細管上皮細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ1細胞、ＪＴＣ−１２細胞、またはＨＫ-２細胞である。【０００８】
前記ＭＥＫ阻害剤は、Ｕ０１２６，ＰＤ９８０５９，ＣＩ−１０４０からなる群より少なくとも１種選択される。好ましくはＵ０１２６である。【０００９】
前記人工膜が、ポリスルホン、セルロース酢酸、またはポリイミドからの中空糸膜で形成されている。【００１０】
本発明のバイオ人工尿細管において尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層を維持する方法は、尿細管上皮細胞にＭＥＫ阻害剤を適用して接触阻害機能を保持させ、これによって該細胞が人工膜内面にコンフルエントな単層を形成した後に、該細胞の重層化を防止することを特徴とする。【００１１】
前記のＭＥＫ阻害剤の適用は、尿細管上皮細胞の維持培養液に該ＭＥＫ阻害剤を30〜50μＭの濃度となるように添加することである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のバイオ人工尿細管は、腎臓尿細管が有する再吸収機能の忠実な再現を目指すもので、尿細管上皮細胞を人工膜内面にコンフルエントな単層状に付けることで効率よく、かつ選択的に有用物質、電解質および水分を再吸収できるようになった人工尿細管デバイスである。【００１３】
尿細管上皮細胞の上に別の尿細管上皮細胞が重なることによる能動輸送の妨害、または上記人工膜の狭小化した内腔のために原尿の流れが滞り、その結果有用物質の再吸収を妨げる事態を招く上記尿細管上皮細胞の重層化を、ＭＥＫ阻害剤を適用して該細胞の接触阻害を保持させることによって、長期間にわたり防止することが可能となった。これにより人工膜内面に形成されたコンフルエントな単層状の尿細管上皮細胞の機能が持続して維持される。【００１４】
本発明のバイオ人工尿細管は、慢性・急性心不全や慢性・急性腎不全／多臓器不全などの過剰水分貯留や代謝物質の蓄積を呈する病態を改善すべく持続的な血液濾過を必要とする場合に、バイオ人工糸球体とともに人工腎臓を構成するデバイスとして、へパリンなどの抗血液凝固剤を持続的に用いることの弊害を防止し、安全で簡便な持続治療システムを提供することが可能とする。
[発明の詳細な説明]
血液は腎臓の糸球体で濾過され、血球およびタンパク質以外の物質は、濾過液たる「原尿」中の溶質として尿細管へ移行し、尿細管で必要なものは血液中に再吸収され、老廃物などが分泌されて、尿を形成し体外に排泄される。生体の腎臓は、代謝、血圧・電解質調節、酸塩基平衡調節、内分泌機能をも発揮しているが、それらの機能に関与する細胞種が多く複雑であることから、最も再生し難い臓器の一つと考えられる。【００１５】
現用人工腎臓およびそれを使用する治療は技術的に確立されているが、現用人工腎臓の機能は生体腎臓の機能にはるかに及ばず、体内老廃物の除去ならびに電解質調整の一部を代行するにすぎない。すなわち物質の透過選択性に乏しくグルコース、アミノ酸やホルモン、イオン類といった有用物質も除去してしまい、生体腎臓のもつ代謝・内分泌機能は代替できないために、患者は種々の合併症に苦しんでいる。このような理由ならびに後述する間欠型血液透析の不便さから、次世代型人工腎臓治療として連続的かつ高効率なシステムの開発が不可欠となっている。現在、携帯型人工腎臓治療や透析液再生型腹膜透析など、新しい人工腎臓治療システムの開発が進められている。さらに究極的には患者由来の糸球体／尿細管細胞もしくは遺伝子導入により同様な機能を強化された細胞を用いたバイオ人工腎臓システムもまた目標となる。【００１６】
「人工尿細管」は、腎臓の濾過装置として原尿から、グルコース、アミノ酸類イオン類、水分などを吸収する尿細管の再吸収機能を模するものであり、尿細管による再吸収を人工的に実施する尿細管デバイスである。「バイオ人工尿細管」は、そうした人工尿細管に細胞、組織、生体物質などを組み込んだものである。また「バイオ人工腎臓」とは、少なくともバイオ人工糸球体（bioartificial glomerulus）、バイオ人工尿細管（bioartificial tubules）およびこれらを連結する（送液ポンプを含むこともある）抗血栓性回路から構成される系であり、腎臓機能の再現を可能とする細胞を付けることで効率よく２４時間連続的に腎臓代行治療ができ、また尿細管の有用物質の再吸収機能をも付加することができる。図１に本発明者が目指すバイオ人工腎臓の概念図を示す。現在の透析治療に使われる人工腎臓は限られた時間内で急速な透析のみを行なうものであり、その効果は限られている。
バイオ人工尿細管
本発明のバイオ人工尿細管は、
尿細管上皮細胞を内面または外面に付した人工膜とこれを収容する容器とからなるバイオ人工尿細管であり、ＭＥＫ阻害剤の適用により該細胞は重層化することなくコンフルエントな単層を形成して該人工膜上に付されていることを特徴とする。【００１７】
上記バイオ人工尿細管は、中空糸人工膜内面に尿細管上皮細胞を付すことによって、生体腎臓の尿細管が有する選択的な物質の再吸収機能を担わせている。人工膜内部（中空糸では内腔）を流れる血漿濾過液（ネフロン尿細管では原尿）からグルコース、イオン類、水などを吸収し、アンモニア、クレアチニン、薬剤、老廃物などを吸収しないという選択性は、尿細管上皮細胞による選択性によって実現できる。すなわち、糸球体の主として篩作用により血液から透析液中に濾過された低分子の有用物質は、尿細管による物質の能動輸送機能によって、今度は血液中に再流入する。【００１８】
バイオ人工臓器を作成する場合、一般に細胞とscaffoldとしての人工素材との親和性をよくする工夫とともに、本来の臓器・組織から遊離した細胞が人工素材の支えの上で体内臓器と同等の機能を発揮させるための工夫も大切である。バイオ人工尿細管において、物質移動に関して極性を有する尿細管上皮細胞が尿細管としての機能を有するためには選択・採取される細胞の機能とともに単層を形成・維持させることが重要である。尿細管上皮細胞は本来腎組織内では、正常細胞の特性である「接触阻害」（contact inhibition、細胞周囲全体が増殖した細胞と接触した状態になると、その増殖が抑制される特性）の機能を保ち、単層を形成し維持する。【００１９】
本発明者の検討から、組織から遊離させられた尿細管上皮細胞はコンフルエントな単層を形成後に重層化すること、それにともなって尿細管の代謝、輸送機能が漸減することが明らかになっている。株化細胞のＭＤＣＫ、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞なども長期培養により接触阻害を保てず、コンフルエントな単層を形成した後２週目に細胞の上に細胞が重なり、重層化することを既に報告している（非特許文献８，９）。それに伴い、水、グルコース、ナトリウムなどの輸送能が低下することも示した。さらに、初代培養ヒト近位尿細管上皮細胞であるＲＰＴＥＣにおいても長期培養により接触阻害を保てず、重層化することを確認している（図６）。このように尿細管上皮細胞が増殖してその単層上に細胞が積み重なり、重層化すると原尿の流れが悪くなり、有用物質の再吸収の効率も低下する。なお細胞密度に関して「コンフルエント（confluent）」とは、隣同士に細胞が接し、連なって集密であることをいう。
・人工膜
本発明のバイオ人工尿細管は、尿細管上皮細胞を生着させた人工膜およびこれを収容する容器から構成される。その人工膜は、多孔性物質であることが求められるが、血液透析にはこれまで中空糸膜を基本とする濾過膜が使用されてきており、本発明のバイオ人工尿細管の人工膜でもその数々の利点から中空糸人工膜が採用される。
＜中空糸＞
本発明のバイオ人工尿細管では、微細孔の分布が比較的均一であり、しかも物質の担持容量が極めて大きい中空糸繊維膜が好ましく使用される。その中空糸膜は、通常ろ過、物質の分離に広く使用されている構造のもので、内表面から外表面の間の膜側面には多数の微細孔が空いている。その微細孔は、0.001μm〜数μm、好ましくは0.03〜1μｍの径である。中空糸を使用する膜体では、その構造特性から、他の多孔性物質と比べて単位表面積当たりの物質の担持量または収容容量は極めて大きい。したがって微小な医療デバイスとする場合にも極めて大きい担持能力を有する担体として利用できる。【００２０】
中空糸材料として、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、酢酸セルロースなどが利用される。好ましい基材としては、血液透析用の中空糸膜であればいずれでもよいが、人工腎臓用の合成高分子中空糸膜が好ましく採用される。したがって前記中空糸はセルロース酢酸、ポリスルホン、ポリイミド、またはエチレン・ビニールアルコール共重合体
からの膜で形成されていることが望ましい。【００２１】
血液濾過に好適な限外濾過用中空糸として、非対称微孔性中空繊維の製造方法が特許第２９１６４４６号に開示されている。この中空繊維は、外側に向かって孔径が順次大きくなる連続多孔性スポンジ構造と微孔性バリヤー層を有する内面を有する構造を有する。このため該中空糸繊維は、人工腎臓、人工透析用フィルターなどに利用されている。そのような中空糸繊維は流体透過性、機械的強さおよび加工性にも優れているために、本発明の中空糸膜の材料として好適である。
・尿細管上皮細胞
中空糸内面にコンフルエントな単層を形成させて付している尿細管上皮細胞として、特に限定されず各種の尿細管上皮細胞が使用される。例えば解剖学的に移植不適合な腎臓から採取されたヒト尿細管の上皮細胞であってもよい。したがって、尿細管上皮細胞として、培養株化上皮細胞、遺伝子導入による代用上皮細胞、多能性幹細胞などに由来するものであってもよい。具体的には、そうした尿細管上皮細胞としてヒト尿細管上皮細胞、Madin-Darby canine kidney（ＭＤＣＫ）、ヒト近位尿細管株化細胞ＨＫ-2、ＪＴＣ−１２細胞、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞、初代培養ヒト近位尿細管（ＲＰＴＥＣ）などが例示される。実際には、細胞接着性、能動輸送能、代謝能、単層形成持続期間などの観点から好適な尿細管上皮細胞が選択されることが望ましい。【００２２】
進歩著しい細胞工学技術および遺伝子工学を適用することにより、幹細胞由来の分化尿細管上皮前駆細胞の分離・培養増殖、より分化した尿細管上皮細胞への誘導を行なうことも可能である。また遺伝子導入により同様な機能を強化された細胞を用いる態様であってよい。【００２３】
ここで、尿細管上皮細胞を人工膜の内面にコンフルエントな単層を形成させて付すとは、該細胞を植え付けて、好ましくはコンフルエントな単層状態で貼り付けて生着させることをいう。人工膜内面を該細胞で被覆する形態であってもよい。尿細管上皮細胞が膜内面に付される形態は問わず、吸着、結合、担持などであり、固定化されて液体中に遊離しなければよい。人工膜の内面は、血漿濾過液（透析液）が通過する膜内面であり、好ましい人工膜である中空糸膜では中空糸の内腔である。必要なら尿細管上皮細胞をさらに人工膜外面にも付してもよい。  中空糸膜の内面（内腔）に尿細管上皮細胞を貼り付けるのは、中空糸の内腔内面壁である。その内腔の壁面には中空糸外部に通じる多数の小孔が空いており、選択的に水、電解質、有用物質などがその小孔から外部の血液中へ出て行く。そうした小孔は、該上皮細胞の単層で覆われるため塞がってしまう状態になるが、尿細管上皮細胞の能動輸送作用によって選択的に移動を制御されることになる。体的には、次の方法による。例えば膜面積0.4ｍ2ポリスルホン膜中空糸デバイス（中空糸1600本、内径300nm）の場合、ＬＬＣ−ＰＫ1尿細管上皮細胞を106個/mLの密度で中空糸内に１時間ごとに４回播種させると、24時間以内にコンフルエントな単層が形成されることを本発明者は確認している。【００２４】
中空糸には、上記尿細管上皮細胞の他に、さらに細胞外マトリックスを適用してもよい。これにはコラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン（Laminin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、プロネクチン（Pronectin）などが例示される。これらのマトリックスを中空糸に適用することにより、中空糸内面に定着することを促進する効果が期待される。これらの細胞接着性タンパク質、接着性のポリマーなどは細胞播種前に被覆しておいて使用する。
・薬剤
本発明のバイオ人工尿細管では、ＭＥＫ阻害剤が尿細管上皮細胞に接触阻害機能を保持させるために適用され、そうしたＭＥＫ阻害剤は、Ｕ０１２６，ＰＤ９８０５９，ＣＩ−１０４０からなる群より少なくとも１種選択される。これらの薬剤単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて使用される。より好ましいＭＥＫ阻害剤はＵ０１２６であり、MAP Kinase Kinase(ＭＥＫ)活性を阻害しERK 1／ERK 2の活性化を抑制する。以下、ＭＥＫ阻害剤について詳細に説明する。【００２５】
Mitogen-activated protein kinase(MAPK)伝達経路は、成長、分化、そしてストレス反応のような細胞機能に関与している。これらの経路は、直線的なkinaseカスケードであり、その中ではMAP kinase kinase kinaseが、MAP kinaseをリン酸化して活性化するMAP kinase kinase(MAPKK)をリン酸化し、活性化する。今日までに、MEK1, MEK2，MKK3, MKK4/SEK, MEK5, MKK6, そしてMKK7の7つのMAPK kinase同族体と、ERK1/2, JNK, p38, ERK5の４つのMAPKファミリーが同定されている。これらの経路の活性化はリン酸化を通して多くの基質の活性を制御する。これらの基質には、p62TCF（Elk-1）、ｃ−Myc、ATF2およびAP-1要素であるｃ−Fosとｃ−Junが含まれる。【００２６】
Ｕ０１２６は、化学名1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis[2-aminophenylthio]     butadiene（C18H16N6S2）であり、癌領域の細胞増殖抑制の研究で開発され、その作用としてＭＥＫの発現抑制の研究がなされてきた。ERK/MEK 阻害剤であるＵ０１２６は、細胞のreporter assayにおけるAP-1 transactivationの抑制因子として同定され、また、AP-1反応分子を含む内因性プロモーター（promoter）を抑制するが、プロモーター内にAP-1反応要素を欠く遺伝子には影響しないことが示された。このＵ０１２６の作用は、MAPK kinaseファミリーのMEK-1, MEK-2の直接的阻害によりもたらされる。しかし、protein kinase C、Ab1 kinase, Raf, MEKK, ERK, JNK, MKK-3, MKK-4/SEK, MKK-6, Cdk2またはCdk4のkinase活性への影響はほとんどない(Favata MF, Horiuchi KY, Manos EJ, Daulerio AJ, Stradley DA, Feeser WS, Van Dyk DE, Pitts WJ, Earl RA, Hobbs F, Copeland RA, Magolda RL, Scherle PA, Trzaskos JM : Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. J Biol Chem, 1998;273:18623-18632)。【００２７】
上皮細胞系においては、細胞周囲全体が増殖した細胞と接触した状態になると、その増殖が抑制される特性（接触阻害）を有すると考えられているが、Liらはhepato-growth factor（ＨＧＦ）の作用によりその特性が失われた場合に、ＭＥＫ阻害剤がMadin-Darby canine kidney（ＭＤＣＫ）細胞の接触阻害を保つように作用するとしている(Li S, Gerrard ER Jr., Balkovetz DF. Evidence for ERK1/2 phosphorylation controlling contact inhibition of proliferation in Madin-Darby canine kidney epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 2004;287:C432-C439)。なお、ＭＤＣＫ細胞においてＵ０１２６およびＰＤ-９８０５９が接触阻害の回復作用があることが示されたが、増殖に伴う細胞密度の調節機構に関するものであり、単層の細胞層の維持についての言及はない。【００２８】
本発明者は、ＭＤＣＫ細胞、porcineの近位尿細管上皮ＬＬＣ-ＰＫ1細胞、ヒト近位尿細管株化細胞ＨＫ-２、ヒト初代培養近位尿細管上皮細胞であるＲＰＴＥＣについて、コンフルエントな単層形成後2週間目には細胞層上に細胞が着いて、重層化することを確認している。【００２９】
医学的に必要な時に人工尿細管デバイスを供給することを考慮すると、必要な時点でデバイスを作成するのでは遅すぎ、前もって作製し、供給するまで保存することが必要である。しかしながら、コンフルエントな単層が形成された時点から重層化が始まっており、患者治療に用いられる時点では明らかな機能低下を来たしている可能性がある。患者の治療間際までコンフルエントな単層を保った状態で維持して患者の手元に届けることが望まれる。また、間欠的なバイオ人工腎臓治療に用いる場合にも、使用してから次の使用までの間隙に単層を形成させた状態で維持する場合にもＭＥＫ阻害剤の添加が必要になる。ＭＥＫ阻害剤の添加を中止すれば速やかにERK ｍRNAの発現と細胞増殖は非添加であった以前の状態に戻ることが明らかとなり、接触阻害機能の維持による単層の長期維持が可能であることが明らかになった。したがって、作製され、待機状態にあるバイオ人工尿細管、ならびにバイオ人工糸球体デバイスの維持培養液にＭＥＫ阻害剤を適正な濃度に添加し、使用前に標準培養液に切り替えることにより本来の機能に復させることができる。【００３０】
結局、本発明者の研究により本発明にとり有用な以下の知見が収集された。
(1)哺乳類、とくにイヌ、ブタ、ヒトなどの尿細管上皮細胞は、株化細胞のみならず、初代培養細胞においても、人工膜上でコンフルエントな単層を形成した後2週間目で単層上に細胞が積み上がり、重層化する。(2)ＭＥＫ阻害剤を、好ましくは30μＭから50μＭの濃度となるようにメディウム中に添加することにより、上皮細胞の接触阻害を保ち、単層を維持する作用をもつ。(3)添加しないことにより、その作用は失われ、細胞増殖は元の活性に復する。さらに本発明者は未公表データであるが、初代培養のヒトの近位尿細管上皮細胞においても、コンフルエントな単層形成後、引き続く培養により多層化する事実も確認した。
＜尿細管上皮細胞の重層化防止の方法＞
次に本発明者は、上記のような多層化が生起する状況を克服して、重層化を防止した状態で尿細管デバイスを必要なタイミングで供給できるための条件を検討した。この問題は、物質輸送に関して極性をもたない内皮細胞を中空糸など人工膜面に生着させた持続血液濾過器（バイオ人工糸球体とも言える）の機能維持についても、物質の能動輸送はないものの、その機能維持に単層形成の長期維持を要する点では同様である。【００３１】
バイオ人工尿細管デバイスに必要な細胞を得るためには、尿細管上皮細胞の大量培養を行なう。得られた培養細胞懸濁液を中空糸モジュールに播種する。尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成した後には、over-confluentになることにより代謝性物質の能動輸送能が低下してしまう（非特許文献８，９）。これは該細胞の増殖重層化が進むと、方向性を持つ能動輸送が阻害されるとともに、細胞が膨隆して中空糸内腔が狭小化するためである。細胞塊により中空糸内腔が部分的に閉塞することすら起きる。【００３２】
尿細管上皮細胞に播種時点から接触阻害を保たせて細胞増殖を抑制するために、該細胞の培養液中にextracellular-signal regulated kinase kinase (MAPK kinase)(ＭＥＫ)の阻害剤、例えばＵ０１２６を添加することが必要である。ＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６は、MAPK kinaseが関与するスレオニンとチロシンのリン酸化を抑制してERKの１つであるMAPK(mitogen-activated protein kinase)がMAP（mitogen-activated protein）のcell cycleへの作用を抑制する。しかし、Ｕ０１２６はMAPK経路以外の細胞の活動（protein kinase C, Ab1 kinase, Raf, JNK, MKK, Cdk）には影響がないので安全であるとされている（Favata MF, Horiuchi KY, Manos EJ, Daulerio AJ, Stradley DA, Feeser WS, Van Dyk DE, Pitts WJ, Earl RA, Hobbs F, Copeland RA, Magolda RL, Scherle PA, Trzaskos JM : Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. J Biol Chem 1998;273:18623-18632：Dudley DT, Pang L，Decker SJ, Bridges AJ, Saltiel AR. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:7868-7889）。本発明者は、後述するようにPorcineの近位尿細管上皮細胞であるＬＬＣ-ＰＫ1細胞を用いて培養液中にＵ０１２６を添加し、細胞増殖の抑制とコンフルエントな単層形成・維持効果を評価し、また、添加中止後の細胞増殖への影響についても評価した。【００３３】
よって本発明のバイオ人工尿細管において尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層を維持する方法は、尿細管上皮細胞にＭＥＫ阻害剤を適用して接触阻害機能を保持させ、これによって該細胞が人工膜内面にコンフルエントな単層を形成した後に、該細胞の重層化を防止することを特徴とする方法である。本発明の方法により、そうしたコンフルエントな単層は、形成後少なくとも２週間以上、好ましくは３週間、より好ましくは４週間、持続して維持される。【００３４】
上記の方法においてＭＥＫ阻害剤の適用は、予め作製されて待機状態にあるバイオ人工尿細管およびバイオ人工糸球体デバイスの維持培養液に、ＭＥＫ阻害剤を適正な濃度、20〜100μＭ、好ましくは30〜50μＭの濃度となるように添加して細胞の重層化を防止し、使用前に標準培養液に切り替えることにより本来の機能に復させることができる。【００３５】
また現行の間欠的血液透析(濾過)にバイオ尿細管デバイスを合わせて用いるような場合には、各治療後次の治療までの間MEK阻害剤を用いて培養することにより重層化を防止することもできる。
・尿細管容器
現行の血液濾過装置も、中空糸濾過膜を濾過器内部に収めたカートリッジタイプとして使用されているが、本発明のバイオ人工尿細管も、好ましくはそうしたカートリッジタイプのデバイスである。したがって上記中空糸膜を収める尿細管デバイスは、従来のカートリッジと同じ材質、材料で作製されてよい。持続血液濾過のために装着型または埋め込み型とする場合には、その目的に好適な形態をとり、より小型化させて生体適応性の材料で製造されるのが望ましい。なお、該容器には、上記人工膜を収める単なる容器としてだけでなく、人工膜を内部に固定化、支持する構造、血液、透析液などの液体の流入口、流出口の構造などの必要な構成部品なども含まれる。結局、該容器は本発明であるバイオ人工尿細管の中空糸人工膜を除くすべての部分であることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１はバイオ人工腎臓の模式図を表す。図中のＡ、Ｖはそれぞれ動脈、静脈を意味する。
【図２】図２はＬＬＣ-ＰＫ1細胞を、(1)DMEM-high glucose(DMEM-HG)メディウムにより培養した場合(2)１％DMSO含有DMEM-HGメディウムで培養した場合(3)50μM Ｕ０１２６を含む１％DMSOを含有したDMEM-HGメディウムで培養した場合の0日（Ｄａｙ０）から6日（Ｄａｙ６）の細胞数（Cell Number）の推移を示す。
【図３】図３は、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞を、(1)〜(3)Ｕ０１２６をそれぞれ10μM、30μM、50μM加えた1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウムで培養した群、(4)DMEM‐HG単独で培養した群、(5)1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウムで培養した群によるＬＬＣ-ＰＫ1細胞数の0〜3日目までの推移を示す。
【図４】ＬＬＣ-ＰＫ1細胞がコンフルエントな単層を形成した（0日目）後の総ERK1/2（上段）と活性ERK1/2（下段）をWestern blot analysisのbandとして図４に示した。1，2，3，6、日目とも左側よりDMEM-HGメディウム単独培養（C）、１％DMSO含有DMEM-HGメディウムによる培養（D）、50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウム（U）による培養における各ERK1/2のタンパク質量を示している。
【図５】ＬＬＣ−ＰＫ1細胞をethylene vinyl alcohol copolymer (EVAL)膜ミニモジュール内腔に2.2×108細胞/mlの密度で播種しDMEMメディウムで2週間培養するグループ（3例）と、DMEDメディウム内に50μg/mlのU0126を添加して2週間培養するグループ（3例）を縦断してScanning electron microscopyで検索した。DMEMメディウムで培養したグループでは細胞が重層化して内腔が狭小化している（上段）が、U0126添加DMEMで培養したグループではほぼコンフルエントな単層が保たれている（下段）。
【図６】図６は、ヒト初代近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを１×107/mlでEVAL中空糸モジュールに播種後DMEM-HGメディウムによる培養6日(上段)と14日後（下段）の中空糸断面SEM像を表す。6日でも既に単層上に細胞が積み重なり始めている（上段矢頭が示す部分）。14日後には細胞塊により中空糸腔が狭小化、壊死が起こり、部分的に閉塞している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
現行の人工腎臓としての透析療法は、糸球体の濾過機能を間欠的に、しかも不完全に代行しているに過ぎない。1週間168時間中の12時間（約７％）を透析治療に充てるに過ぎず、生体の腎臓に比してその水分や代謝物排泄能は著しく低い。したがって維持血液透析患者は水分や食事摂取に著しい制限を受け、なおかつ、そうした不完全さから生じる様々な合併症に苦しめられている。また、それらの合併症のための入院や手術などの治療費は年々膨大化してり、わが国の医療費増大の一因となっている。【００３８】
現行の血液透析治療をより効率の高いものにするためには、週12時間という強い制限因子を取り除くことが不可避的に必要となる。しかし一方で、患者は通院や治療のために隔日に日中の大切な時間を奪われており、現状の透析技術でそれ以上の治療時間を費やすことは事実上不可能である。腎機能に近づける治療効率を確保するための長い治療時間の必要性と患者の自由度確保との間の矛盾を解決するためには、治療システムにおける技術的飛躍が必要である。【００３９】
本発明のバイオ人工尿細管は、本発明者が作製したバイオ人工糸球体（Saito A: Research in the development of a wearable bioartificial kidney with a continuous hemofilter and a bioartificial tubule device using tubular epithelial cells. Artif Organs 2004; 28：58-6）と併せて、完全な人工腎臓（図１）開発の先駆けにもなり得るものと考える。すなわち本発明のバイオ人工尿細管は、抗血栓性回路を形成することによりバイオ人工糸球体とセットとして使用される。これにより携帯型人工腎臓治療や透析液再生型腹膜透析などの次世代型人工腎臓治療として、持続的な血液濾過、選択的な有用物質の再吸収を可能となる。【００４０】
高い血液適合性と抗血栓性を有しながら、なおかつ高い濾過性能を用いうるバイオ人工糸球体の開発には、患者自身の血管内皮細胞を用いて血液濾過器の濾過膜内面をコンフルエントな細胞単層を形成させ、大きなフェネストラを形成させることが必要である。本発明者によるバイオ人工糸球体は、糸球体内皮細胞の細胞膜にあるフェネストラという穴（窓)の数と径の拡大および持続時間の延長を、Cytochalasin Bなどのアクチンフィラメント妨害薬を添加することで可能としたバイオ人工糸球体である。バイオ人工腎臓の透析効率を長期間維持する上で重要である。【００４１】
このようなバイオ人工糸球体の別々の出口からそれぞれ出てくる２種類の液体は、図１に示すごとく次のデバイス、バイオ人工尿細管に通される。濾過された血液は、本発明のバイオ人工尿細管の側面から流入させ、該尿細管内部に収められた中空糸の外側を通って流れ、中空糸内腔から再吸収された物質が加わってくる。この血液は該側面の別の位置から流出して、患者の静脈血流内に戻される。他方、バイオ人工糸球体の側面から排出される血漿濾過液（透析液）は限外濾過液であり、中空糸濾過膜を通過した各種の低分子物質、電解質などを含む。この液は、バイオ人工尿細管の底面から中空糸内部（内腔）を通るように流される。他方の底面から流出する該血清濾過液は、「尿」として廃棄される。バイオ人工尿細管の内部を通過する際に、有用物質、水分、電解質などが再吸収され、中空糸繊維外側を流れる血液中に入る。【００４２】
システム全体として１つの態様は、上記人工糸球体および人工尿細管を、抗血栓性回路を介してロータポンプにより連動させて、長期間、持続的に機能する持続装着型のバイオ人工腎臓である。既に本発明者はこのようなタイプの人工腎臓を作製し、1日10リットル（L）の持続血液濾過を行なうことにより現行の血液透析に比して、尿素、クレアチニン、尿酸などの低分子量物質から透析アミロイドーシスの原因タンパク質であるβ2-microglobulinまでを著しく低値に維持できることを明らかにした（Saito A, Takagi T, Sugiura S, Ono M, Minakuchi K, Teraoka S, Ota K.: Maintaining low concentration of plasma β2-microglobulin through continuous slow haemodialysis. Nephrol Dial Transplant 10(Suppl. 3): 52-56, 1995）。1日10Lの持続血液濾過は、約7 ml/minの濾過液を持続的に血液中から除去することであり、一般に使われる膜面積1.8 ｍ2程度の中空糸モジュールは必要なく、膜面積0.2〜0.3 m2の胸ポケットに収納可能な濾過モジュールでよいために装着にともなう煩わしさも最小限にできる（Saito A: Research in the development of a wearable bioartificial kidney with a continuous hemofilter and a bioartificial tubule device using tubular epithelial cells. Artif Organs 2004; 28：58-6）。飲食した水分や生じた代謝産物を、日を越えて体内に蓄積させるのではなく、腎臓同様に直ちに濾過し除去できるので身体への負担も少なく、合併症も生じにくい。ただし、そのような装着持続的濾過が可能となるためには、全身的抗凝固療法を最小限にしても１本の中空糸濾過器（バイオ人工糸球体）が少なくとも1週間以上、ならびにバイオ人工尿細管が約１ヶ月間、機能することが必要になる。人工素材を用いた現行の持続血液濾過器は、全身性抗凝固療法を行なった上で1本の濾過器が最大24時間機能することが求められているに過ぎない。【００４３】
理想的にはシステム全体として、自己血圧によりPumplessで長期間、持続的に機能する埋め込み型のバイオ人工腎臓が想定される。
[実施例]
本明細書に記載される使用材料はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。また、以下の実施例中で用いる装置名および、使用材料の濃度、使用量、処理時間、処理温度等の数値的条件、処理方法等はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。また、以下の説明をいくつかの図を参照して行なうが、これらの図はこの発明を理解できる程度に概略的に示してあるにすぎない。【００４４】
本研究において、近位尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層の形成およびその維持に対するＭＥＫ阻害剤、Ｕ０１２６投与の効果について調べるために、以下の５種類の検索がなされた。
【実施例１】
【００４５】
方法
凍結保存されたブタの近位尿細管株化細胞であるLewis-lung cancer porcine kidney 1（ＬＬＣ-ＰＫ1）細胞、2×106個をtranswellフィルターユニットに播種し、(1)高ブドウ糖（high glucose）-DMEM（DMEM-HG）単独で培養、(2)1％ dimethylsulfoxide（DMSO）を含有するDMEM-HGメディウムで培養、(3)さらに50μＭのＵ０１２６を含む１％ DMSO含有DMEM-HGメディウムをインサート外腔のみに入れて培養（内腔にはDMEM-HGのみ）を行なった。播種後の０、１、２、３、６日目にそれぞれの群の細胞数を、trypan blue染色した後に測定した。ＬＬＣ−ＰＫ1細胞はマグネシウム、カルシウム非添加滅菌PBS液で静かに洗浄し、1mlのトリプシン−EDTA液で37℃、15分間トリプシン処理した。処理後の細胞(1ml)は４mlのDMEMに加え、トリパン・ブルー染色後にHemocytometerを用いて細胞数を計測した。計測は各3回づつ行った。
結果
ＬＬＣ-ＰＫ1細胞を、(1)DMEM-HGメディウムにおいて培養した場合、(2)１％DMSO含有DMEM-HGメディウムで培養した場合、(3)50μＭ Ｕ０１２６を含む１％DMSO含有DMEM-HGメディウムで培養した場合、それぞれの0日から6日の細胞数の推移を図２に示した。図から明らかなようにいずれも経日的に細胞数は増加したが、Ｕ０１２６を添加したメディウムにより培養された群では、著しく細胞数が抑制された。
【実施例２】
【００４６】
方法
ＬＬＣ-ＰＫ1細胞をそれぞれ５×105個、６−well-plateに播種し、24時間後に培養液を次の３種類のものに分けて切り替えた。すなわち、(1)10μＭのＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６を含有する１％DMSO含有高ブドウ糖DMEM（DMEM-HG）、(2) 30μＭのＵ０１２６を含有する１％DMSO含有DMEM-HG、(3)50μＭのＵ０１２６を含有する１％DMSO含有DMEM-HGの３種類の培養液に切り替えた。さらに(4)DMEM‐HG単独で培養した群、(5)1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウムで培養した群についても調べた。播種後0日、１日、２日、３日に培養細胞はtrypan blue染色を行った上でその細胞数を算出した。
結果
上記(1)〜(5)におけるＬＬＣ-ＰＫ1細胞の増殖結果を、その細胞数の０〜３日目までの推移を図３に示した。MDEM−HG単独群に比して、1％DMSO含有群では一定の抑制を示したものの、経日的に明らかな増加を示した。10μＭ Ｕ０１２６添加群でも経日的増加を抑制しきれず、30および50μＭ Ｕ０１２６では明らかな増殖抑制が認められた。
【実施例３】
【００４７】
方法
６-well platesにそれぞれ５×105個のＬＬＣ-ＰＫ1細胞を播種し、翌日に3種類のメディウムの３グループに分類した（0日目）。すなわち、(1)対照としてDMEM-HGメディウム単独（Ｃ）、(2)1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウム（Ｄ）、(3)50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSOを含有したDMEM-HGメディウム（Ｕ）で３日間培養し、その後（Ｄ）（Ｕ）グループのメディウムをDMEM-HGメディウムに変更して、各グループをさらに３日間培養した。0、１、２、３、６日目にERK1/2のWestern blot分析を行なった。【００４８】
培養ＬＬＣ−ＰＫ1細胞はWestern blot分析のための細胞溶解液として用いられた。それぞれの細胞サンプルは氷冷したPBSでリンスして、４℃で1500rpmの遠心分離5分間を行なった後に採集し、-80℃に保った。【００４９】
20mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate、1ｍM Na3VO4 sodium orthovanadate, および1μg/ｍL leupeptinを含有する50 μLの氷冷細胞溶解液からタンパク質を採取し、４℃、15分15000×gで遠心し可溶性タンパク質を抽出した。各細胞溶解液のタンパク質濃度は、 protein assay kit (Protein Assay Rapid Kit; Wako, Osaka, Japan)を用いて測定し、mercaptoethanolを含有するLaemmli bufferを加えて同一濃度にし、100℃で5分間加熱した。ＬＬＣ−ＰＫ1細胞溶解液のタンパク質(20μg)は12.5% polyacrylamide gel (e-PAGEL; ATTO, Tokyo, Japan)を用いたSDS-PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）により分析した。タンパク質はpolyvinylidene difluoride (PVDF) 膜(BIO-RAD, Hercules, CA)上に移し、非特異的抗体を減らすために非脂肪skim milk、0.1% sodium azide, および 0.1% Tween-20含有PBSで60分間処理した。総ERK1/2と活性ERK1/2は、上記膜を p44/42 (ERK1/2) MAPK抗体、またはphospho-p44/42 MAPK 抗体(1:1,000; Cell Signaling Technology)で処理したのち1:2,000希釈horseradish peroxidase (HRP)-linked anti-rabbit IgGをプローブとし、enhanced chemiluminescence HRP Western blot detection system (LumiGLO reagent, Cell Signaling Technology)を用いて検出した。
結果
図４には、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞がコンフルエントな単層を形成した（0日目）後のERK 1/2のWestern blot analysisの培養条件と培養日数による経過を示した。図の上段には総ERK１/2を、また下段には活性ERK1/2の発現を示し、右側に向かうにしたがって１、２、３、６日目の各3本ずつのWestern blotを示した。１、２、３、６日目とも左側より順にDMEM-HGメディウム単独培養（C）、１％DMSO含有DMEM-HGメディウムによる培養（D）、ならびに50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSO含有DMEM-HGメディウムによる培養（U）におけるERK1/2タンパク質の発現を示している。0、６日目の各サンプルと１、２、３日目の対照（C）はDMEM-HGメディウム単独による培養結果である。上段の総ERK1/2の量はDMSO処理(D)とＵ０１２６処理(U)でほとんど変化がないが、活性ERK1/2は１日目から３日目のＵ０１２６処理サンプル(U)では抑制されている（下段）。他方、DMSO処理サンプル(D)ではその発現は抑制されていないか、むしろ亢進している。６日目には、Ｕ０１２６処理サンプル(U)の活性ERK1/2発現は戻ってきており、Ｕ０１２６の作用は可逆的であると考えられた。
【実施例４】
【００５０】
方法
Ｕ０１２６の添加により中空糸モジュール内面でＬＬＣ-ＰＫ1細胞のコンフルエントな単層を維持できるかを明らかにするために、膜面積65cm2のエチレンビニルアルコール (Ethylene vinyl alcohol；EVAL)共重合体製の中空糸モジュール（クラレ社（東京）製）内にそれぞれＬＬＣ-ＰＫ1細胞、2.2×108個を播種してDMEM-HGメディウムで培養し、コンフルエントな単層を形成した次の日に、50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSO含有メディウムに切り替えて培養継続した群と、含有しない同一メディウムで培養を継続した群との２つのモジュール群に分け、それぞれのメディウムをモジュールの中空糸外側に閉鎖回路で循環させた。３日目には両群のメディウムをＵ０１２６とDMSOを含まないものに交換した。培養後の４日目に、両モジュール群はそれぞれ３本についてglutaraldehydeで固定し、走査型電子顕微鏡（scanning electron microscopy；SEM）で、縦断面像を観察した。
結果
両群の典型例を図５に比較して示した。Ｕ０１２６添加培養液群は下段に示す如く、ほぼコンフルエントな単層を維持したが、非添加群では上段に示す如く、重層化が進み、膨隆して中空糸内腔が狭小化している。
【実施例５】
【００５１】
方法
ブタの近位尿細管上皮株化細胞であるLewis-lung cancer porcine kidney 1 (ＬＬＣ-ＰＫ1)細胞２×108を、Ethylene vinylalcohol copolymer (EVAL)膜中空糸ミニモジュール（膜面積：65cm2）中空糸内腔に播種し、中空糸内側と外側にそれぞれDMEM-HGメディウムを0.25ml/minで循環し、培養した。その際、transmembrane pressureは０に保った。播種1日後より実験群（4本）の外側は50μＭ Ｕ０１２６と１％DMSOを含んだDMEM-HGメディウムに変更した。対照群（4本）にはＵ０１２６およびDMSOを含まないDMEM-HGメディウムを流した。播種３日後において、中空糸内側には50mg/dl尿素窒素（ＵＮ）と5mg/dlのクレアチニン（creatinine；Ｃｒ）を含んだDMEM-HG培養液を0.25ml/minで流し、外側には尿素、クレアチニンを含まないDMEM-HG培養液を同速度で流した。24時間の尿素窒素、クレアチニンのリーク率とグルコース、Na+の再吸収量を測定した。
再吸収率とリーク率の測定法：再吸収率とリーク率は、以下の計算式によって計算される。
Ｃ0×Ｖ0−Ｃ1×（Ｖ1-ＶR）
再吸収率（リーク率）＝    ──────────────  
C2V2
CO =外液排出液中の物質濃度、  VO = 外液総排出液量
CI =外液送液中の物質濃度、  VI =外液総送液量
VR = 実験終了時に中空糸外側に残留する外液の量
C2＝内液送液中の物質濃度、      V2＝内液総送液量
結果
表１に示す結果を得た。すなわち、Ｕ０１２６群において尿素窒素（ＵＮ）のリーク率は、対照群に比して有意に低く、Na+再吸収量は有意に高値を示した。Creatinine（Ｃｒ）のリーク率は有意差が表れないまでも対照群に比べて低値を、またグルコース再吸収量においても有意の差は出ないまでも高値を示した。【００５２】
これらの結果より、Ｕ０１２６の添加により近位尿細管上皮細胞の接触阻害がよく保たれ、細胞間の接着を増してリークを減らすとともに、細胞の上に細胞が層をなすことを防止することにより、グルコースやNa+の能動輸送がよく保たれたものと考えられる。【００５３】
またEVAL中空糸内のヒト初代近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣ層のSEM像が図６に示されている。ヒト初代近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを１×107/mlでEVAL中空糸モジュールに播種後、メディウムにて培養した。培養6日(上段)と14日後（下段）における中空糸断面SEM像である。6日でも既に単層上に細胞が積み重なり始めている（上段矢頭が示す部分）。14日後には細胞塊により中空糸腔が狭小化、部分的に閉塞している。【００５４】
【表１】
2008047760.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のバイオ人工尿細管は、慢性・急性心不全や慢性・急性腎不全／多臓器不全などの過剰水分貯留や代謝物質の蓄積を呈する病態を改善すべく持続的な血液濾過を必要とする場合に、バイオ人工糸球体とともに人工腎臓を構成するデバイスとして、へパリンなどの抗血液凝固剤を持続的に用いることの弊害を防止し、安全で簡便な持続治療システムを提供することができる。
【図１】
2008047760.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月15日(2009.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿細管上皮細胞を内面または外面に付した人工膜とこれを収容する容器とからなるバイオ人工尿細管であり、ＭＥＫ阻害剤の適用により該細胞は重層化することなくコンフルエントな単層を形成して該人工膜上に付されていることを特徴とするバイオ人工尿細管。
【請求項２】
前記尿細管上皮細胞が、ＭＥＫ阻害剤の適用により接触阻害機能を保持していることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ人工尿細管。
【請求項３】
前記尿細管上皮細胞が、ＲＰＴＥＣその他のヒト初代尿細管上皮細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ1細胞、ＪＴＣ−１２細胞、またはＨＫ-２細胞である、請求項１または２に記載のバイオ人工尿細管。
【請求項４】
前記ＭＥＫ阻害剤が、Ｕ０１２６，ＰＤ９８０５９，ＣＩ−１０４０からなる群より少なくとも１種選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のバイオ人工尿細管。
【請求項５】
前記ＭＥＫ阻害剤がＵ０１２６である、請求項４に記載のバイオ人工尿細管。
【請求項６】
前記人工膜が、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリイミド、またはエチレン・ビニールアルコール共重合体からの膜で形成された中空糸膜で形成されている、請求項１〜５のいずれかに記載のバイオ人工尿細管。
【請求項７】
尿細管上皮細胞にＭＥＫ阻害剤を適用して接触阻害機能を保持させ、これによって該細胞が人工膜内面にコンフルエントな単層を形成した後に、該細胞の重層化を防止することを特徴とする、バイオ人工尿細管において尿細管上皮細胞のコンルエントな単層を維持する方法。
【請求項８】
前記のＭＥＫ阻害剤の適用は、尿細管上皮細胞の維持培養液に該ＭＥＫ阻害剤を30〜50μＭの濃度となるように添加することである、請求項７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ人工尿細管、すなわち尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層が内部に形成された人工尿細管および該細胞の単層を維持する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工膜と尿細管上皮細胞を用いたバイオ人工尿細管は1987年にAebischerらにより初め
て考案され、基礎的研究が発表された（非特許文献1〜３）。しかし、1989年にはその研
究は中座している。1998年にMichigan大学のHumesらは、polysulfone hollow fiberを用
いて中空糸内面に近位尿細管上皮細胞を生着させ、このバイオ人工尿細管は細胞のほぼ完全な接着によりイヌリンのリークを阻止でき、様々な代謝機能も保有することを報告した（非特許文献４）。さらに腎不全犬を用いたバイオ人工尿細管デバイスの体外循環実験を実現させ（非特許文献５）、2001年には、エンドトキシン血症を伴う急性腎不全患者に対するバイオ人工尿細管デバイスによる最初の臨床応用を行っている（非特許文献６）。2004年には、10例の急性腎不全を伴い多臓器不全を呈する患者の治療を行い、その内6名の
生命予後の改善を報告している（非特許文献７）。しかし、これらの実験または臨床応用では、人工尿細管デバイスは24時間に限って用いられており、それ以上の長期治療は行われていない。
【０００３】
本発明者は慢性透析患者の合併症を防止する長期機能維持可能なバイオ人工尿細管デバイスを開発するために、種々の尿細管上皮細胞種の平膜上や中空糸膜モジュールへの長期培養を行ってきた。腎臓組織から単離された尿細管上皮細胞は、組織内の他の細胞との相互関連の喪失、または培養環境下での細胞の特性の変化などから、腎臓組織内で単層の円柱状の尿細管を形成するための接触阻害を保てないことを長期培養から確認した。従来コンフルエントな単層（confluent monolayer）を形成すると接触阻害により増殖が止まる
と考えられてきた株化尿細管上皮細胞も、コンフルエントな単層を形成後、長期に観察するといずれも重層化することが判明した（非特許文献８，９）。細胞種にもよるが、コンフルエントな単層を形成して1〜2週間で重層化により尿細管デバイスの機能は著しく低下することも明らかになった。多数の腎不全患者に人工尿細管デバイスを用意し、供給する場合、1本の尿細管デバイスは治療の必要な状況が発生するまでの一定期間待機状態にな
ることが必要とされる。その場合、重層化が始まることによりその間に尿細管デバイスの劣化が生じてしまう。慢性患者に対し繰り返す治療が必要な場合にも、治療間隙を培養して待つ間に重層化が進行して尿細管デバイスの機能を劣化させることになる。
＜引用文献リスト＞
【非特許文献１】Aebischer P, Ip TK, Miracoli L, Galletti PM: Renal epithelial cells grown on semipermeable processor. Trans Am Soc Artif Intern Organs 33:96-102,1987
【非特許文献２】Aebischer P, Ip TK, Galletti PM: The bioartificial kidney: Progress toward an ultrafiltration device with renal epithelial cells processing. Life Support Sys 5:159-168,1987
【非特許文献３】Ip TK, Aebischer P: Renal epithelial cell-controlled solute transport across permeable membrane as the foundation for bioartificial kidney. Artif Organs 13:58-61,1987
【非特許文献４】Humes HD, MacKay SM, Funke AJ, Buffington DA.: Tissue engineering of a bioartificial renal tubule assist device: In vitro transport and metabolic characteristics. Kidney Int 55:2502-2514,1999
【非特許文献５】Humes HD, Buffington DA, MacKay SM, Funke AJ, Weitzel WF. : Replacement of renal function in uremic animals with a tissue-engineered kidney. Nat Biotechnol 17:451-455, 1999
【非特許文献６】Weitzel WF, Fissell WH, Humes HD.: Initial clinical experience with a human proximal tubule cell renal assist device (RAD). J Am Soc Nephrol 12(Program and Abstracts issue): 279A,2001
【非特許文献７】Humes HD, Weitzel WF, Bartlett RH, Swaniker FC, Paganini EP, Luderer JR, Sobota J: Initial clinical results of the bioartificial kidney containing human cells in ICU patients with acute renal failure. Kidney Int 2004;66:1578-1588
【非特許文献８】Fujita Y, Kakuta T, Saito A, et al.: Evaluation of Na+ active transport and morphological changes for bioartificial renal tubule cell device using Madin-Darby canine kidney cells. Tissue Eng 8:13-24,2002
【非特許文献９】Ozgen N, Tarashima M, Aung T, Sato Y, Isoe C, Kakuta T, Saito a.: Evaluation of long-term transport ability of a bioartificial renal tubule device using ＬＬＣ−ＰＫ1. Nephrol Dial Transplant 2004;19:2198-2207
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、腎臓の再吸収機能の忠実な再現を可能とする尿細管上皮細胞を人工膜内面に生着させてなるバイオ人工尿細管を開発するに当たり、バイオ人工尿細管における上記の現状に鑑みて、機能低下および劣化の問題を検討し、鋭意研究を行った。その結果、尿細管上皮細胞の接触阻害作用を、ＭＥＫ阻害剤の適用により維持することにより、該細胞のコンフルエントな単層（confluent monolayer）を人工膜内面に持続的に形成させるこ
とができた。これによって長期間にわたり細胞機能の維持が可能となることを見出し、血液濾過器としてのバイオ人工糸球体とともに、より生体腎臓に近い機能を有する人工腎臓を構成するデバイスとしての本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のバイオ人工尿細管は、
尿細管上皮細胞を内面または外面に付した人工膜とこれを収容する容器とからなるバイオ人工尿細管であり、ＭＥＫ阻害剤の適用により該細胞は重層化することなくコンフルエントな単層を形成して該人工膜上に付されていることを特徴としている。
【０００６】
前記尿細管上皮細胞が、ＭＥＫ阻害剤の適用により接触阻害機能を保持していることを特徴とするバイオ人工尿細管である。
【０００７】
前記尿細管上皮細胞が、ＲＰＴＥＣ、その他のヒト初代尿細管上皮細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ1細胞、ＪＴＣ−１２細胞、またはＨＫ-２細胞である。
【０００８】
前記ＭＥＫ阻害剤は、Ｕ０１２６，ＰＤ９８０５９，ＣＩ−１０４０からなる群より少なくとも１種選択される。好ましくはＵ０１２６である。
【０００９】
前記人工膜が、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリイミド、またはエチレン・ビニールアルコール共重合体からの膜で形成された中空糸膜で形成されている。
【００１０】
本発明のバイオ人工尿細管において尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層を維持する方法は、尿細管上皮細胞にＭＥＫ阻害剤を適用して接触阻害機能を保持させ、これによって該細胞が人工膜内面または外面にコンフルエントな単層を形成した後に、該細胞の重層
化を防止することを特徴とする。
【００１１】
前記のＭＥＫ阻害剤の適用は、尿細管上皮細胞の維持培養液に該ＭＥＫ阻害剤を30〜50μＭの濃度となるように添加することである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のバイオ人工尿細管は、腎臓尿細管が有する再吸収機能の忠実な再現を目指すもので、尿細管上皮細胞を人工膜内面または外面にコンフルエントな単層状に付けることで効率よく、かつ選択的に有用物質、電解質および水分を再吸収できるようになった人工尿細管デバイスである。
【００１３】
尿細管上皮細胞の上に別の尿細管上皮細胞が重なることによる能動輸送の妨害、または上記人工膜の狭小化した内腔のために原尿の流れが滞り、その結果有用物質の再吸収を妨げる事態を招く上記尿細管上皮細胞の重層化を、ＭＥＫ阻害剤を適用して該細胞の接触阻害を保持させることによって、長期間にわたり防止することが可能となった。これにより人工膜内面または外面に形成されたコンフルエントな単層状の尿細管上皮細胞の機能が持続して維持される。
【００１４】
本発明のバイオ人工尿細管は、慢性・急性心不全や慢性・急性腎不全／多臓器不全などの過剰水分貯留や代謝物質の蓄積を呈する病態を改善すべく持続的な血液濾過を必要とする場合に、バイオ人工糸球体とともに人工腎臓を構成するデバイスとして、へパリンなどの抗血液凝固剤を持続的に用いることの弊害を防止し、安全で簡便な持続治療システムを提供することが可能とする。
[発明の詳細な説明]
血液は腎臓の糸球体で濾過され、血球およびタンパク質以外の物質は、濾過液たる「原尿」中の溶質として尿細管へ移行し、尿細管で必要なものは血液中に再吸収され、老廃物などが分泌されて、尿を形成し体外に排泄される。生体の腎臓は、代謝、血圧・電解質調節、酸塩基平衡調節、内分泌機能をも発揮しているが、それらの機能に関与する細胞種が多く複雑であることから、最も再生し難い臓器の一つと考えられる。
【００１５】
現用人工腎臓およびそれを使用する治療は技術的に確立されているが、現用人工腎臓の機能は生体腎臓の機能にはるかに及ばず、体内老廃物の除去ならびに電解質調整の一部を代行するにすぎない。すなわち物質の透過選択性に乏しくグルコース、アミノ酸やホルモン、イオン類といった有用物質も除去してしまい、生体腎臓のもつ代謝・内分泌機能は代替できないために、患者は種々の合併症に苦しんでいる。このような理由ならびに後述する間欠型血液透析の不便さから、次世代型人工腎臓治療として連続的かつ高効率なシステムの開発が不可欠となっている。現在、携帯型人工腎臓治療や透析液再生型腹膜透析など、新しい人工腎臓治療システムの開発が進められている。さらに究極的には患者由来の糸球体／尿細管細胞もしくは遺伝子導入により同様な機能を強化された細胞を用いたバイオ人工腎臓システムもまた目標となる。
【００１６】
「人工尿細管」は、腎臓の濾過装置として原尿から、グルコース、アミノ酸類イオン類、水分などを吸収する尿細管の再吸収機能を模するものであり、尿細管による再吸収を人工的に実施する尿細管デバイスである。「バイオ人工尿細管」は、そうした人工尿細管に細胞、組織、生体物質などを組み込んだものである。また「バイオ人工腎臓」とは、少なくともバイオ人工糸球体（bioartificial glomerulus）、バイオ人工尿細管（bioartificial tubules）およびこれらを連結する（送液ポンプを含むこともある）抗血栓性回路か
ら構成される系であり、腎臓機能の再現を可能とする細胞を付けることで効率よく２４時間連続的に腎臓代行治療ができ、また尿細管の有用物質の再吸収機能をも付加することができる。図１に本発明者が目指すバイオ人工腎臓の概念図を示す。現在の透析治療に使わ
れる人工腎臓は限られた時間内で急速な透析のみを行なうものであり、その効果は限られている。
バイオ人工尿細管
本発明のバイオ人工尿細管は、尿細管上皮細胞を内面または外面に付した人工膜とこれを収容する容器とからなるバイオ人工尿細管であり、ＭＥＫ阻害剤の適用により該細胞は重層化することなくコンフルエントな単層を形成して該人工膜上に付されていることを特徴とする。
【００１７】
上記バイオ人工尿細管は、中空糸人工膜内面または外面に尿細管上皮細胞を付すことによって、生体腎臓の尿細管が有する選択的な物質の再吸収機能を担わせている。人工膜内部（中空糸では内腔）を流れる血漿濾過液（ネフロン尿細管では原尿）からグルコース、イオン類、水などを吸収し、アンモニア、クレアチニン、薬剤、老廃物などを吸収しないという選択性は、尿細管上皮細胞による選択性によって実現できる。すなわち、糸球体の主として篩作用により血液から透析液中に濾過された低分子の有用物質は、尿細管による物質の能動輸送機能によって、今度は血液中に再流入する。
【００１８】
バイオ人工臓器を作成する場合、一般に細胞とscaffoldとしての人工素材との親和性をよくする工夫とともに、本来の臓器・組織から遊離した細胞が人工素材の支えの上で体内臓器と同等の機能を発揮させるための工夫も大切である。バイオ人工尿細管において、物質移動に関して極性を有する尿細管上皮細胞が尿細管としての機能を有するためには選択・採取される細胞の機能とともに単層を形成・維持させることが重要である。尿細管上皮細胞は本来腎組織内では、正常細胞の特性である「接触阻害」（contact inhibition、細胞周囲全体が増殖した細胞と接触した状態になると、その増殖が抑制される特性）の機能を保ち、単層を形成し維持する。
【００１９】
本発明者の検討から、組織から遊離させられた尿細管上皮細胞はコンフルエントな単層を形成後に重層化すること、それにともなって尿細管の代謝、輸送機能が漸減することが明らかになっている。株化細胞のＭＤＣＫ、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞なども長期培養により接触阻害を保てず、コンフルエントな単層を形成した後２週目に細胞の上に細胞が重なり、重層化することを既に報告している（非特許文献８，９）。それに伴い、水、グルコース、ナトリウムなどの輸送能が低下することも示した。さらに、初代培養ヒト近位尿細管上皮細胞であるＲＰＴＥＣにおいても長期培養により接触阻害を保てず、重層化することを確認している（図６）。このように尿細管上皮細胞が増殖してその単層上に細胞が積み重なり、重層化すると原尿の流れが悪くなり、有用物質の再吸収の効率も低下する。なお細胞密度に関して「コンフルエント（confluent）」とは、隣同士に細胞が接し、連なって集
密であることをいう。
・人工膜
本発明のバイオ人工尿細管は、尿細管上皮細胞を生着させた人工膜およびこれを収容する容器から構成される。その人工膜は、多孔性物質であることが求められるが、血液透析にはこれまで中空糸膜を基本とする濾過膜が使用されてきており、本発明のバイオ人工尿細管の人工膜でもその数々の利点から中空糸人工膜が採用される。
＜中空糸＞
本発明のバイオ人工尿細管では、微細孔の分布が比較的均一であり、しかも物質の担持容量が極めて大きい中空糸繊維膜が好ましく使用される。その中空糸膜は、通常ろ過、物質の分離に広く使用されている構造のもので、内表面から外表面の間の膜側面には多数の微細孔が空いている。その微細孔は、0.001μm〜数μm、好ましくは0.03〜1μｍの径である。中空糸を使用する膜体では、その構造特性から、他の多孔性物質と比べて単位表面積当たりの物質の担持量または収容容量は極めて大きい。したがって微小な医療デバイスとする場合にも極めて大きい担持能力を有する担体として利用できる。
【００２０】
中空糸材料として、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、酢酸セルロースなどが利用される。好ましい基材としては、血液透析用の中空糸膜であればいずれでもよいが、人工腎臓用の合成高分子中空糸膜が好ましく採用される。したがって前記中空糸は酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリイミド、またはエチレン・ビニールアルコール共重合体からの膜で形成されていることが望ましい。
【００２１】
血液濾過に好適な限外濾過用中空糸として、非対称微孔性中空繊維の製造方法が特許第２９１６４４６号に開示されている。この中空繊維は、外側に向かって孔径が順次大きくなる連続多孔性スポンジ構造と微孔性バリヤー層を有する内面を有する構造を有する。このため該中空糸繊維は、人工腎臓、人工透析用フィルターなどに利用されている。そのような中空糸繊維は流体透過性、機械的強さおよび加工性にも優れているために、本発明の中空糸膜の材料として好適である。
・尿細管上皮細胞
中空糸内面または外面にコンフルエントな単層を形成させて付している尿細管上皮細胞として、特に限定されず各種の尿細管上皮細胞が使用される。例えば解剖学的に移植不適合な腎臓から採取されたヒト尿細管の上皮細胞であってもよい。したがって、尿細管上皮細胞として、培養株化上皮細胞、遺伝子導入による代用上皮細胞、多能性幹細胞などに由来するものであってもよい。具体的には、そうした尿細管上皮細胞としてヒト尿細管上皮細胞、Madin-Darby canine kidney（ＭＤＣＫ）、ヒト近位尿細管株化細胞ＨＫ-2、ＪＴ
Ｃ−１２細胞、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞、初代培養ヒト近位尿細管（ＲＰＴＥＣ）などが例示される。実際には、細胞接着性、能動輸送能、代謝能、単層形成持続期間などの観点から好適な尿細管上皮細胞が選択されることが望ましい。
【００２２】
進歩著しい細胞工学技術および遺伝子工学を適用することにより、幹細胞由来の分化尿細管上皮前駆細胞の分離・培養増殖、より分化した尿細管上皮細胞への誘導を行なうことも可能である。また遺伝子導入により同様な機能を強化された細胞を用いる態様であってよい。
【００２３】
ここで、尿細管上皮細胞を人工膜の内面または外面にコンフルエントな単層を形成させて付すとは、該細胞を植え付けて、好ましくはコンフルエントな単層状態で貼り付けて生着させることをいう。人工膜内面または外面を該細胞で被覆する形態であってもよい。尿細管上皮細胞が膜内面または外面に付される形態は問わず、吸着、結合、担持などであり、固定化されて液体中に遊離しなければよい。人工膜の内面は、血漿濾過液（透析液）が通過する膜内面であり、好ましい人工膜である中空糸膜では中空糸の内腔である。必要なら尿細管上皮細胞をさらに人工膜外面にも付してもよい。中空糸膜の内面（内腔）に尿細管上皮細胞を貼り付けるのは、中空糸の内腔内面壁である。その内腔の壁面には中空糸外部に通じる多数の小孔が空いており、選択的に水、電解質、有用物質などがその小孔から外部の血液中へ出て行く。そうした小孔は、該上皮細胞の単層で覆われるため塞がってしまう状態になるが、尿細管上皮細胞の能動輸送作用によって選択的に移動を制御されることになる。体的には、次の方法による。例えば膜面積0.4ｍ2ポリスルホン膜中空糸デバイス（中空糸1600本、内径300nm）の場合、ＬＬＣ−ＰＫ1尿細管上皮細胞を106個/mLの密度で中空糸内に１時間ごとに４回播種させると、24時間以内にコンフルエントな単層が形成されることを本発明者は確認している。
【００２４】
中空糸には、上記尿細管上皮細胞の他に、さらに細胞外マトリックスを適用してもよい。これにはコラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン（Laminin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、プロネクチン（Pronectin）などが例示される。これらのマトリックスを中空糸に適用することにより、中空糸内面に定着することを促進する効果が期待される。これらの細胞接着性タンパク質、接着性のポリマーなどは細胞播種前に被覆しておいて使用する。
・薬剤
本発明のバイオ人工尿細管では、ＭＥＫ阻害剤が尿細管上皮細胞に接触阻害機能を保持させるために適用され、そうしたＭＥＫ阻害剤は、Ｕ０１２６，ＰＤ９８０５９，ＣＩ−１０４０からなる群より少なくとも１種選択される。これらの薬剤単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて使用される。より好ましいＭＥＫ阻害剤はＵ０１２６であり、MAP Kinase Kinase(ＭＥＫ)活性を阻害しERK 1／ERK 2の活性化を抑制する。以下
、ＭＥＫ阻害剤について詳細に説明する。
【００２５】
Mitogen-activated protein kinase(MAPK)伝達経路は、成長、分化、そしてストレス反応のような細胞機能に関与している。これらの経路は、直線的なkinaseカスケードであり、その中ではMAP kinase kinase kinaseが、MAP kinaseをリン酸化して活性化するMAP kinase kinase(MAPKK)をリン酸化し、活性化する。今日までに、MEK1, MEK2，MKK3, MKK4/SEK, MEK5, MKK6, そしてMKK7の7つのMAPK kinase同族体と、ERK1/2, JNK, p38, ERK5の４つのMAPKファミリーが同定されている。これらの経路の活性化はリン酸化を通して多くの基質の活性を制御する。これらの基質には、p62TCF（Elk-1）、ｃ−Myc、ATF2およびAP-1要素であるｃ−Fosとｃ−Junが含まれる。
【００２６】
Ｕ０１２６は、化学名1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis[2-aminophenylthio]butadiene（C18H16N6S2）であり、癌領域の細胞増殖抑制の研究で開発され、その作用としてＭＥ
Ｋの発現抑制の研究がなされてきた。ERK/MEK 阻害剤であるＵ０１２６は、細胞のreporter assayにおけるAP-1 transactivationの抑制因子として同定され、また、AP-1反応分子を含む内因性プロモーター（promoter）を抑制するが、プロモーター内にAP-1反応要素を欠く遺伝子には影響しないことが示された。このＵ０１２６の作用は、MAPK kinaseファ
ミリーのMEK-1, MEK-2の直接的阻害によりもたらされる。しかし、protein kinase C、Ab1 kinase, Raf, MEKK, ERK, JNK, MKK-3, MKK-4/SEK, MKK-6, Cdk2またはCdk4のkinase活性への影響はほとんどない(Favata MF, Horiuchi KY, Manos EJ, Daulerio AJ, Stradley
DA, Feeser WS, Van Dyk DE, Pitts WJ, Earl RA, Hobbs F, Copeland RA, Magolda RL,
Scherle PA, Trzaskos JM : Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. J Biol Chem, 1998;273:18623-18632)。
【００２７】
上皮細胞系においては、細胞周囲全体が増殖した細胞と接触した状態になると、その増殖が抑制される特性（接触阻害）を有すると考えられているが、Liらはhepato-growth factor（ＨＧＦ）の作用によりその特性が失われた場合に、ＭＥＫ阻害剤がMadin-Darby canine kidney（ＭＤＣＫ）細胞の接触阻害を保つように作用するとしている(Li S, Gerrard ER Jr., Balkovetz DF. Evidence for ERK1/2 phosphorylation controlling contact inhibition of proliferation in Madin-Darby canine kidney epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 2004;287:C432-C439)。なお、ＭＤＣＫ細胞においてＵ０１２６およびＰＤ-９８０５９が接触阻害の回復作用があることが示されたが、増殖に伴う細胞密
度の調節機構に関するものであり、単層の細胞層の維持についての言及はない。
【００２８】
本発明者は、ＭＤＣＫ細胞、porcineの近位尿細管上皮ＬＬＣ-ＰＫ1細胞、ヒト近位尿
細管株化細胞ＨＫ-２、ヒト初代培養近位尿細管上皮細胞であるＲＰＴＥＣについて、コ
ンフルエントな単層形成後2週間目には細胞層上に細胞が着いて、重層化することを確認
している。
【００２９】
医学的に必要な時に人工尿細管デバイスを供給することを考慮すると、必要な時点でデバイスを作成するのでは遅すぎ、前もって作製し、供給するまで保存することが必要である。しかしながら、コンフルエントな単層が形成された時点から重層化が始まっており、患者治療に用いられる時点では明らかな機能低下を来たしている可能性がある。患者の治療間際までコンフルエントな単層を保った状態で維持して患者の手元に届けることが望ま
れる。また、間欠的なバイオ人工腎臓治療に用いる場合にも、使用してから次の使用までの間隙に単層を形成させた状態で維持する場合にもＭＥＫ阻害剤の添加が必要になる。ＭＥＫ阻害剤の添加を中止すれば速やかにERK ｍRNAの発現と細胞増殖は非添加であった以
前の状態に戻ることが明らかとなり、接触阻害機能の維持による単層の長期維持が可能であることが明らかになった。したがって、作製され、待機状態にあるバイオ人工尿細管、ならびにバイオ人工糸球体デバイスの維持培養液にＭＥＫ阻害剤を適正な濃度に添加し、使用前に標準培養液に切り替えることにより本来の機能に復させることができる。
【００３０】
結局、本発明者の研究により本発明にとり有用な以下の知見が収集された。
(1)哺乳類、とくにイヌ、ブタ、ヒトなどの尿細管上皮細胞は、株化細胞のみならず、初
代培養細胞においても、人工膜上でコンフルエントな単層を形成した後2週間目で単層上
に細胞が積み上がり、重層化する。(2)ＭＥＫ阻害剤を、好ましくは30μＭから50μＭの
濃度となるようにメディウム中に添加することにより、上皮細胞の接触阻害を保ち、単層を維持する作用をもつ。(3)添加しないことにより、その作用は失われ、細胞増殖は元の
活性に復する。さらに本発明者は未公表データであるが、初代培養のヒトの近位尿細管上皮細胞においても、コンフルエントな単層形成後、引き続く培養により多層化する事実も確認した。
＜尿細管上皮細胞の重層化防止の方法＞
次に本発明者は、上記のような多層化が生起する状況を克服して、重層化を防止した状態で尿細管デバイスを必要なタイミングで供給できるための条件を検討した。この問題は、物質輸送に関して極性をもたない内皮細胞を中空糸など人工膜面に生着させた持続血液濾過器（バイオ人工糸球体とも言える）の機能維持についても、物質の能動輸送はないものの、その機能維持に単層形成の長期維持を要する点では同様である。
【００３１】
バイオ人工尿細管デバイスに必要な細胞を得るためには、尿細管上皮細胞の大量培養を行なう。得られた培養細胞懸濁液を中空糸モジュールに播種する。尿細管上皮細胞がコンフルエントな単層を形成した後には、over-confluentになることにより代謝性物質の能動輸送能が低下してしまう（非特許文献８，９）。これは該細胞の増殖重層化が進むと、方向性を持つ能動輸送が阻害されるとともに、細胞が膨隆して中空糸内腔が狭小化するためである。細胞塊により中空糸内腔が部分的に閉塞することすら起きる。
【００３２】
尿細管上皮細胞に播種時点から接触阻害を保たせて細胞増殖を抑制するために、該細胞の培養液中にextracellular-signal regulated kinase kinase (MAPK kinase)(ＭＥＫ)の阻害剤、例えばＵ０１２６を添加することが必要である。ＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６は、MAPK kinaseが関与するスレオニンとチロシンのリン酸化を抑制してERKの１つであるMAPK(mitogen-activated protein kinase)がMAP（mitogen-activated protein）のcell cycleへの作用を抑制する。しかし、Ｕ０１２６はMAPK経路以外の細胞の活動（protein kinase C, Ab1 kinase, Raf, JNK, MKK, Cdk）には影響がないので安全であるとされている（Favata MF, Horiuchi KY, Manos EJ, Daulerio AJ, Stradley DA, Feeser WS, Van Dyk
DE, Pitts WJ, Earl RA, Hobbs F, Copeland RA, Magolda RL, Scherle PA, Trzaskos JM : Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. J Biol Chem 1998;273:18623-18632：Dudley DT, Pang L，Decker SJ, Bridges AJ, Saltiel AR. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:7868-7889）。本発明者は、後述するようにPorcineの近位尿細管上皮細胞であるＬＬＣ-ＰＫ1細胞を用いて培養液中にＵ０１２６
を添加し、細胞増殖の抑制とコンフルエントな単層形成・維持効果を評価し、また、添加中止後の細胞増殖への影響についても評価した。
【００３３】
よって本発明のバイオ人工尿細管において尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層を維持する方法は、尿細管上皮細胞にＭＥＫ阻害剤を適用して接触阻害機能を保持させ、これによって該細胞が人工膜内面にコンフルエントな単層を形成した後に、該細胞の重層化を
防止することを特徴とする方法である。本発明の方法により、そうしたコンフルエントな単層は、形成後少なくとも２週間以上、好ましくは３週間、より好ましくは４週間、持続して維持される。
【００３４】
上記の方法においてＭＥＫ阻害剤の適用は、予め作製されて待機状態にあるバイオ人工尿細管およびバイオ人工糸球体デバイスの維持培養液に、ＭＥＫ阻害剤を適正な濃度、20〜100μＭ、好ましくは30〜50μＭの濃度となるように添加して細胞の重層化を防止し、
使用前に標準培養液に切り替えることにより本来の機能に復させることができる。
【００３５】
また現行の間欠的血液透析(濾過)にバイオ尿細管デバイスを合わせて用いるような場合には、各治療後次の治療までの間MEK阻害剤を用いて培養することにより重層化を防止
することもできる。
・尿細管容器
現行の血液濾過装置も、中空糸濾過膜を濾過器内部に収めたカートリッジタイプとして使用されているが、本発明のバイオ人工尿細管も、好ましくはそうしたカートリッジタイプのデバイスである。したがって上記中空糸膜を収める尿細管デバイスは、従来のカートリッジと同じ材質、材料で作製されてよい。持続血液濾過のために装着型または埋め込み型とする場合には、その目的に好適な形態をとり、より小型化させて生体適応性の材料で製造されるのが望ましい。なお、該容器には、上記人工膜を収める単なる容器としてだけでなく、人工膜を内部に固定化、支持する構造、血液、透析液などの液体の流入口、流出口の構造などの必要な構成部品なども含まれる。結局、該容器は本発明であるバイオ人工尿細管の中空糸人工膜を除くすべての部分であることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１はバイオ人工腎臓の模式図を表す。図中のＡ、Ｖはそれぞれ動脈、静脈を意味する。
【図２】図２はＬＬＣ-ＰＫ1細胞を、(1)DMEM-high glucose(DMEM-HG)メディウムにより培養した場合(2)１％DMSO含有DMEM-HGメディウムで培養した場合(3)50μM Ｕ０１２６を含む１％DMSOを含有したDMEM-HGメディウムで培養した場合の0日（Ｄａｙ０）から6日（Ｄａｙ６）の細胞数（Cell Number）の推移を示す。
【図３】図３は、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞を、(1)〜(3)Ｕ０１２６をそれぞれ10μM、30μM、50μM加えた1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウムで培養した群、(4)DMEM‐HG単独で培養した群、(5)1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウムで培養した群によるＬＬＣ-ＰＫ1細胞数の0〜3日目までの推移を示す。
【図４】ＬＬＣ-ＰＫ1細胞がコンフルエントな単層を形成した（0日目）後の総ERK1/2（上段）と活性ERK1/2（下段）をWestern blot analysisのbandとして図４に示した。1，2，3，6、日目とも左側よりDMEM-HGメディウム単独培養（C）、１％DMSO含有DMEM-HGメディウムによる培養（D）、50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウム（U）による培養における各ERK1/2のタンパク質量を示している。
【図５】ＬＬＣ−ＰＫ1細胞をethylene vinyl alcohol copolymer (EVAL)膜ミニモジュール内腔に2.2×108細胞/mlの密度で播種しDMEMメディウムで2週間培養するグループ（3例）と、DMEDメディウム内に50μg/mlのU0126を添加して2週間培養するグループ（3例）を縦断してScanning electron microscopyで検索した。DMEMメディウムで培養したグループでは細胞が重層化して内腔が狭小化している（上段）が、U0126添加DMEMで培養したグループではほぼコンフルエントな単層が保たれている（下段）。
【図６】図６は、ヒト初代近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを１×107/mlでEVAL中空糸モジュールに播種後DMEM-HGメディウムによる培養6日(上段)と14日後（下段）の中空糸断面SEM像を表す。6日でも既に単層上に細胞が積み重なり始めている（上段矢頭が示す部分）。14日後には細胞塊により中空糸腔が狭小化、壊死が起こり、部分的に閉塞している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
現行の人工腎臓としての透析療法は、糸球体の濾過機能を間欠的に、しかも不完全に代行しているに過ぎない。1週間168時間中の12時間（約７％）を透析治療に充てるに過ぎず、生体の腎臓に比してその水分や代謝物排泄能は著しく低い。したがって維持血液透析患者は水分や食事摂取に著しい制限を受け、なおかつ、そうした不完全さから生じる様々な合併症に苦しめられている。また、それらの合併症のための入院や手術などの治療費は年々膨大化してり、わが国の医療費増大の一因となっている。
【００３８】
現行の血液透析治療をより効率の高いものにするためには、週12時間という強い制限因子を取り除くことが不可避的に必要となる。しかし一方で、患者は通院や治療のために隔日に日中の大切な時間を奪われており、現状の透析技術でそれ以上の治療時間を費やすことは事実上不可能である。腎機能に近づける治療効率を確保するための長い治療時間の必要性と患者の自由度確保との間の矛盾を解決するためには、治療システムにおける技術的飛躍が必要である。
【００３９】
本発明のバイオ人工尿細管は、本発明者が作製したバイオ人工糸球体（Saito A: Research in the development of a wearable bioartificial kidney with a continuous hemofilter and a bioartificial tubule device using tubular epithelial cells. Artif Organs 2004; 28：58-6）と併せて、完全な人工腎臓（図１）開発の先駆けにもなり得るものと考える。すなわち本発明のバイオ人工尿細管は、抗血栓性回路を形成することによりバイオ人工糸球体とセットとして使用される。これにより携帯型人工腎臓治療や透析液再生型腹膜透析などの次世代型人工腎臓治療として、持続的な血液濾過、選択的な有用物質の再吸収を可能となる。
【００４０】
高い血液適合性と抗血栓性を有しながら、なおかつ高い濾過性能を用いうるバイオ人工糸球体の開発には、患者自身の血管内皮細胞を用いて血液濾過器の濾過膜内面をコンフルエントな細胞単層を形成させ、大きなフェネストラを形成させることが必要である。本発明者によるバイオ人工糸球体は、糸球体内皮細胞の細胞膜にあるフェネストラという穴（窓)の数と径の拡大および持続時間の延長を、Cytochalasin Bなどのアクチンフィラメン
ト妨害薬を添加することで可能としたバイオ人工糸球体である。バイオ人工腎臓の透析効率を長期間維持する上で重要である。
【００４１】
このようなバイオ人工糸球体の別々の出口からそれぞれ出てくる２種類の液体は、図１に示すごとく次のデバイス、バイオ人工尿細管に通される。濾過された血液は、本発明のバイオ人工尿細管の側面から流入させ、該尿細管内部に収められた中空糸の外側を通って流れ、中空糸内腔から再吸収された物質が加わってくる。この血液は該側面の別の位置から流出して、患者の静脈血流内に戻される。他方、バイオ人工糸球体の側面から排出される血漿濾過液（透析液）は限外濾過液であり、中空糸濾過膜を通過した各種の低分子物質、電解質などを含む。この液は、バイオ人工尿細管の底面から中空糸内部（内腔）を通るように流される。他方の底面から流出する該血清濾過液は、「尿」として廃棄される。バイオ人工尿細管の内部を通過する際に、有用物質、水分、電解質などが再吸収され、中空糸繊維外側を流れる血液中に入る。
【００４２】
システム全体として１つの態様は、上記人工糸球体および人工尿細管を、抗血栓性回路を介してロータポンプにより連動させて、長期間、持続的に機能する持続装着型のバイオ人工腎臓である。既に本発明者はこのようなタイプの人工腎臓を作製し、1日10リットル
（L）の持続血液濾過を行なうことにより現行の血液透析に比して、尿素、クレアチニン
、尿酸などの低分子量物質から透析アミロイドーシスの原因タンパク質であるβ2-microglobulinまでを著しく低値に維持できることを明らかにした（Saito A, Takagi T, Sugiura S, Ono M, Minakuchi K, Teraoka S, Ota K.: Maintaining low concentration of pla
sma β2-microglobulin through continuous slow haemodialysis. Nephrol Dial Transplant 10(Suppl. 3): 52-56, 1995）。1日10Lの持続血液濾過は、約7 ml/minの濾過液を持続的に血液中から除去することであり、一般に使われる膜面積1.8 ｍ2程度の中空糸モジ
ュールは必要なく、膜面積0.2〜0.3 m2の胸ポケットに収納可能な濾過モジュールでよい
ために装着にともなう煩わしさも最小限にできる（Saito A: Research in the development of a wearable bioartificial kidney with a continuous hemofilter and a bioartificial tubule device using tubular epithelial cells. Artif Organs 2004; 28：58-6）。飲食した水分や生じた代謝産物を、日を越えて体内に蓄積させるのではなく、腎臓同様に直ちに濾過し除去できるので身体への負担も少なく、合併症も生じにくい。ただし、そのような装着持続的濾過が可能となるためには、全身的抗凝固療法を最小限にしても１本の中空糸濾過器（バイオ人工糸球体）が少なくとも1週間以上、ならびにバイオ人工尿
細管が約１ヶ月間、機能することが必要になる。人工素材を用いた現行の持続血液濾過器は、全身性抗凝固療法を行なった上で1本の濾過器が最大24時間機能することが求められ
ているに過ぎない。
【００４３】
理想的にはシステム全体として、自己血圧によりPumplessで長期間、持続的に機能する埋め込み型のバイオ人工腎臓が想定される。
[実施例]
本明細書に記載される使用材料はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。また、以下の実施例中で用いる装置名および、使用材料の濃度、使用量、処理時間、処理温度等の数値的条件、処理方法等はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。また、以下の説明をいくつかの図を参照して行なうが、これらの図はこの発明を理解できる程度に概略的に示してあるにすぎない。
【００４４】
本研究において、近位尿細管上皮細胞のコンフルエントな単層の形成およびその維持に対するＭＥＫ阻害剤、Ｕ０１２６投与の効果について調べるために、以下の５種類の検索がなされた。
【実施例１】
【００４５】
方法
凍結保存されたブタの近位尿細管株化細胞であるLewis-lung cancer porcine kidney 1（ＬＬＣ-ＰＫ1）細胞、2×106個をtranswellフィルターユニットに播種し、(1)高ブドウ糖（high glucose）-DMEM（DMEM-HG）単独で培養、(2)1％ dimethylsulfoxide（DMSO）を含有するDMEM-HGメディウムで培養、(3)さらに50μＭのＵ０１２６を含む１％ DMSO含有DMEM-HGメディウムをインサート外腔のみに入れて培養（内腔にはDMEM-HGのみ）を行なっ
た。播種後の０、１、２、３、６日目にそれぞれの群の細胞数を、trypan blue染色した
後に測定した。ＬＬＣ−ＰＫ1細胞はマグネシウム、カルシウム非添加滅菌PBS液で静かに洗浄し、1mlのトリプシン−EDTA液で37℃、15分間トリプシン処理した。処理後の細胞(1ml)は４mlのDMEMに加え、トリパン・ブルー染色後にHemocytometerを用いて細胞数を計測
した。計測は各3回づつ行った。
結果
ＬＬＣ-ＰＫ1細胞を、(1)DMEM-HGメディウムにおいて培養した場合、(2)１％DMSO含有DMEM-HGメディウムで培養した場合、(3)50μＭ Ｕ０１２６を含む１％DMSO含有DMEM-HGメ
ディウムで培養した場合、それぞれの0日から6日の細胞数の推移を図２に示した。図から明らかなようにいずれも経日的に細胞数は増加したが、Ｕ０１２６を添加したメディウムにより培養された群では、著しく細胞数が抑制された。
【実施例２】
【００４６】
方法
ＬＬＣ-ＰＫ1細胞をそれぞれ５×105個、６−well-plateに播種し、24時間後に培養液
を次の３種類のものに分けて切り替えた。すなわち、(1)10μＭのＭＥＫ阻害剤であるＵ
０１２６を含有する１％DMSO含有高ブドウ糖DMEM（DMEM-HG）、(2) 30μＭのＵ０１２６
を含有する１％DMSO含有DMEM-HG、(3)50μＭのＵ０１２６を含有する１％DMSO含有DMEM-HGの３種類の培養液に切り替えた。さらに(4)DMEM‐HG単独で培養した群、(5)1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウムで培養した群についても調べた。播種後0日、１日、２日、３日に培養細胞はtrypan blue染色を行った上でその細胞数を算出した。
結果
上記(1)〜(5)におけるＬＬＣ-ＰＫ1細胞の増殖結果を、その細胞数の０〜３日目までの推移を図３に示した。MDEM−HG単独群に比して、1％DMSO含有群では一定の抑制を示した
ものの、経日的に明らかな増加を示した。10μＭ Ｕ０１２６添加群でも経日的増加を抑
制しきれず、30および50μＭ Ｕ０１２６では明らかな増殖抑制が認められた。
【実施例３】
【００４７】
方法
６-well platesにそれぞれ５×105個のＬＬＣ-ＰＫ1細胞を播種し、翌日に3種類のメディウムの３グループに分類した（0日目）。すなわち、(1)対照としてDMEM-HGメディウム
単独（Ｃ）、(2)1％DMSOを含有するDMEM-HGメディウム（Ｄ）、(3)50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSOを含有したDMEM-HGメディウム（Ｕ）で３日間培養し、その後（Ｄ）（Ｕ）グループのメディウムをDMEM-HGメディウムに変更して、各グループをさらに３日間培養し
た。0、１、２、３、６日目にERK1/2のWestern blot分析を行なった。
【００４８】
培養ＬＬＣ−ＰＫ1細胞はWestern blot分析のための細胞溶解液として用いられた。そ
れぞれの細胞サンプルは氷冷したPBSでリンスして、４℃で1500rpmの遠心分離5分間を行
なった後に採集し、-80℃に保った。
【００４９】
20mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM
sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate、1ｍM Na3VO4 sodium orthovanadate, および1μg/ｍL leupeptinを含有する50 μLの氷冷細胞溶解液からタンパク質を採取
し、４℃、15分15000×gで遠心し可溶性タンパク質を抽出した。各細胞溶解液のタンパク質濃度は、 protein assay kit (Protein Assay Rapid Kit; Wako, Osaka, Japan)を用いて測定し、mercaptoethanolを含有するLaemmli bufferを加えて同一濃度にし、100℃で5
分間加熱した。ＬＬＣ−ＰＫ1細胞溶解液のタンパク質(20μg)は12.5% polyacrylamide gel (e-PAGEL; ATTO, Tokyo, Japan)を用いたSDS-PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）により分析した。タンパク質はpolyvinylidene difluoride (PVDF) 膜(BIO-RAD, Hercules, CA)上に移し、非特異的抗体を減らすために非脂肪skim milk、0.1% sodium azide, および 0.1% Tween-20含有PBSで60分間処理した。総ERK1/2と活性ERK1/2は、上記膜
を p44/42 (ERK1/2) MAPK抗体、またはphospho-p44/42 MAPK 抗体(1:1,000; Cell Signaling Technology)で処理したのち1:2,000希釈horseradish peroxidase (HRP)-linked anti-rabbit IgGをプローブとし、enhanced chemiluminescence HRP Western blot detection
system (LumiGLO reagent, Cell Signaling Technology)を用いて検出した。
結果
図４には、ＬＬＣ-ＰＫ1細胞がコンフルエントな単層を形成した（0日目）後のERK 1/2のWestern blot analysisの培養条件と培養日数による経過を示した。図の上段には総ERK１/2を、また下段には活性ERK1/2の発現を示し、右側に向かうにしたがって１、２、３、６日目の各3本ずつのWestern blotを示した。１、２、３、６日目とも左側より順にDMEM-HGメディウム単独培養（C）、１％DMSO含有DMEM-HGメディウムによる培養（D）、ならび
に50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSO含有DMEM-HGメディウムによる培養（U）におけるERK1/2タンパク質の発現を示している。0、６日目の各サンプルと１、２、３日目の対照（C
）はDMEM-HGメディウム単独による培養結果である。上段の総ERK1/2の量はDMSO処理(D)とＵ０１２６処理(U)でほとんど変化がないが、活性ERK1/2は１日目から３日目のＵ０１２
６処理サンプル(U)では抑制されている（下段）。他方、DMSO処理サンプル(D)ではその発現は抑制されていないか、むしろ亢進している。６日目には、Ｕ０１２６処理サンプル(U)の活性ERK1/2発現は戻ってきており、Ｕ０１２６の作用は可逆的であると考えられた。
【実施例４】
【００５０】
方法
Ｕ０１２６の添加により中空糸モジュール内面でＬＬＣ-ＰＫ1細胞のコンフルエントな単層を維持できるかを明らかにするために、膜面積65cm2のエチレンビニルアルコール (Ethylene vinyl alcohol；EVAL)共重合体製の中空糸モジュール（クラレ社（東京）製）内にそれぞれＬＬＣ-ＰＫ1細胞、2.2×108個を播種してDMEM-HGメディウムで培養し、コン
フルエントな単層を形成した次の日に、50μＭのＵ０１２６を含む1％DMSO含有メディウ
ムに切り替えて培養継続した群と、含有しない同一メディウムで培養を継続した群との２つのモジュール群に分け、それぞれのメディウムをモジュールの中空糸外側に閉鎖回路で循環させた。３日目には両群のメディウムをＵ０１２６とDMSOを含まないものに交換した。培養後の４日目に、両モジュール群はそれぞれ３本についてglutaraldehydeで固定し、走査型電子顕微鏡（scanning electron microscopy；SEM）で、縦断面像を観察した。
結果
両群の典型例を図５に比較して示した。Ｕ０１２６添加培養液群は下段に示す如く、ほぼコンフルエントな単層を維持したが、非添加群では上段に示す如く、重層化が進み、膨隆して中空糸内腔が狭小化している。
【実施例５】
【００５１】
方法
ブタの近位尿細管上皮株化細胞であるLewis-lung cancer porcine kidney 1 (ＬＬＣ-
ＰＫ1)細胞２×108を、Ethylene vinylalcohol copolymer (EVAL)膜中空糸ミニモジュー
ル（膜面積：65cm2）中空糸内腔に播種し、中空糸内側と外側にそれぞれDMEM-HGメディウムを0.25ml/minで循環し、培養した。その際、transmembrane pressureは０に保った。播種1日後より実験群（4本）の外側は50μＭ Ｕ０１２６と１％DMSOを含んだDMEM-HGメディウムに変更した。対照群（4本）にはＵ０１２６およびDMSOを含まないDMEM-HGメディウムを流した。播種３日後において、中空糸内側には50mg/dl尿素窒素（ＵＮ）と5mg/dlのク
レアチニン（creatinine；Ｃｒ）を含んだDMEM-HG培養液を0.25ml/minで流し、外側には
尿素、クレアチニンを含まないDMEM-HG培養液を同速度で流した。24時間の尿素窒素、ク
レアチニンのリーク率とグルコース、Na+の再吸収量を測定した。
再吸収率とリーク率の測定法：再吸収率とリーク率は、以下の計算式によって計算される。
Ｃ0×Ｖ0−Ｃ1×（Ｖ1-ＶR）
再吸収率（リーク率）＝   ──────────────
Ｃ2Ｖ2
CO =外液排出液中の物質濃度、  VO = 外液総排出液量
CI =外液送液中の物質濃度、    VI =外液総送液量
VR = 実験終了時に中空糸外側に残留する外液の量
C2＝内液送液中の物質濃度、    V2＝内液総送液量
結果
表１に示す結果を得た。すなわち、Ｕ０１２６群において尿素窒素（ＵＮ）のリーク率は、対照群に比して有意に低く、Na+再吸収量は有意に高値を示した。Creatinine（Ｃｒ
）のリーク率は有意差が表れないまでも対照群に比べて低値を、またグルコース再吸収量においても有意の差は出ないまでも高値を示した。
【００５２】
これらの結果より、Ｕ０１２６の添加により近位尿細管上皮細胞の接触阻害がよく保たれ、細胞間の接着を増してリークを減らすとともに、細胞の上に細胞が層をなすことを防
止することにより、グルコースやNa+の能動輸送がよく保たれたものと考えられる。
【００５３】
またEVAL中空糸内のヒト初代近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣ層のSEM像が図６に示され
ている。ヒト初代近位尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを１×107/mlでEVAL中空糸モジュールに播種後、メディウムにて培養した。培養6日(上段)と14日後（下段）における中空糸断面SEM像である。6日でも既に単層上に細胞が積み重なり始めている（上段矢頭が示す部分）
。14日後には細胞塊により中空糸腔が狭小化、部分的に閉塞している。
【００５４】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のバイオ人工尿細管は、慢性・急性心不全や慢性・急性腎不全／多臓器不全などの過剰水分貯留や代謝物質の蓄積を呈する病態を改善すべく持続的な血液濾過を必要とする場合に、バイオ人工糸球体とともに人工腎臓を構成するデバイスとして、へパリンなどの抗血液凝固剤を持続的に用いることの弊害を防止し、安全で簡便な持続治療システムを提供することができる。
【国際調査報告】
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