(57)【要約】  本発明者らは、血管新生に関与するタンパク質の1つとして知られているVEGFR-2由来のペプチドを、ヒトのHLA-A*0201を発現するモデルマウス（A2/Kbトランスジェニックマウス）に投与し、該ペプチドがワクチン効果を有するか否かの検討を試みた。その結果、本発明者らは、該ペプチドを抗原としたワクチンが、脈絡膜における血管新生の阻害に対して有効であることを見出すことに成功し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、VEGFR-2由来のペプチドを有効成分として含有する脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド。
【請求項２】
脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチン；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド。
【請求項４】
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチン；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド。
【請求項５】
HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与される、請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与される、請求項４に記載のワクチン。
【請求項７】
脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、請求項５又は６に記載のワクチン。
【請求項８】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生を阻害するための薬剤；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド。
【請求項９】
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生を阻害するためのワクチン；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド。
【請求項１０】
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生を阻害するためのワクチン；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド。
【請求項１１】
HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与される、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与される、請求項１０に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤に関する。また本発明は、脈絡膜における血管新生の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脈絡膜血管新生（CNV）に起因する滲出型加齢黄斑変性（AMD）は、先進国における高度な視力障害の主な原因の一つである。これまでに得られた証拠から、血管内皮増殖因子（VEGF）がCNVの発生に中心的な役割を果たすことが示唆されている。例えば、VEGFの産生を阻害する化合物やVEGFのシグナル伝達経路を阻害する化合物によって、CNVが抑制されることが報告されている。また、抗VEGF抗体が、光線力学療法を含む従来の治療法と比べて高い治療的有効性を示すことが報告されている。このため近年、抗VEGF薬は、CNVに対する薬物療法の主な選択肢となっている。【０００３】
VEGFシグナル伝達は、2種類の受容体チロシンキナーゼ、すなわちVEGFR-1およびVEGFR-2によって媒介される。どちらの受容体も、ヒトCNV膜や実験マウスCNV膜上に発現する。しかしながら、CNVにおけるVEGFR-1のシグナル伝達経路の役割については、依然として議論がある。例えばある研究では、抗体の経口投与、遺伝子ノックダウン、siRNAによりVEGFR-1のシグナル伝達を阻害することによって、CNVが阻害されると報告されている。また別の研究では、眼内において、VEGFや、VEGFR-2のリガンドである胎盤増殖因子1（PIGF1）によってVEGFR-1が活性化されることにより、SPARCによるVEGFR-2が活性化され、結果、CNVが活性化されると報告されている。
一方VEGFR-2については、VEGFR-2シグナル伝達の活性化がCNV増殖を促進するという知見が一般に受け入れられている。即ち、抗VEGFR-2薬やVEGFR-2抗体の全身投与や局所投与、硝子体内siRNA投与など、VEGFR-2を標的とする血管新生抑制アプローチによって、VEGFR-2のシグナル伝達が阻害され、CNV増殖も阻害されると考えられている。【０００４】
しかしながら現在利用可能な抗VEGF薬には、4週〜6週間隔での反復注射が必要という課題がある。また、眼内炎や網膜剥離等の重篤な合併症のリスクも大きい。このため、現在利用されている抗VEGF薬に代わる、新たな治療方法の確立が求められる。【０００５】
腫瘍組織において、ヒトVEGF受容体2に由来するペプチドを用いたワクチンが、VEGFR-2を発現する内皮細胞に対して強力な細胞障害性を及ぼす細胞障害性Tリンパ球（CTL）を誘導することが知られている（特許文献１）。しかしながら脈絡膜においては、細胞障害性Tリンパ球（CTL）を誘導するワクチンの存在は知られていない。またその他の組織と同様、脈絡膜においても血管新生のメカニズムには不明な点が多い。
本発明の先行技術文献を下記に示す。
【特許文献１】WO/2004/024766
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、脈絡膜における血管新生に関与するタンパク質の1つとして知られているVEGFR-2を標的とした、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤を提供することである。また本発明の課題は、脈絡膜における血管新生の阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するにあたり、脈絡膜における血管新生に関与するタンパク質の1つとして知られているVEGFR-2に注目した。具体的には、本発明者らは、VEGFR-2由来のペプチドを抗原としたワクチンを、ヒトのHLA-A*0201を発現するモデルマウス（A2/Kbトランスジェニックマウス）に投与し、そのワクチン効果を確認することを試みた。その結果、本発明者らは、該ペプチドを抗原としたワクチンが、脈絡膜における血管新生を阻害することを見出した。【０００８】
脈絡膜における血管新生とVEGFとの関連については、多数の報告がある。しかしながら、その他の組織と同様脈絡膜においても、血管新生のメカニズムには不明な点が多く、VEGFR-1やVEGFR-2が血管新生においてどのような役割を果たしているのかは、未だ明らかではない。特に、VEGFR-1やVEGFR-2を腫瘍に対するワクチン療法に適用したという報告があるにもかかわらず、脈絡膜新生血管に対してワクチン療法を適用したという報告はない。このことは、VEGFR-1やVEGFR-2由来のペプチドワクチンが脈絡膜以外の新生血管を阻害することが既知であっても、脈絡膜においても当然に同様の効果を示すとは限らないと、当業者の間で考えられていたことを示す。そのような中、本発明者らは、数多くの候補の中からVEGFR-2を標的として選択し、実験を試みた。その結果、VEGFR-2由来のペプチドを抗原としたワクチンが、脈絡膜における新生血管を阻害することが可能であることを見出した。さらに、VEGFR-2由来のぺプチドを抗原としたワクチンが、症状が重篤な患者のみならず視力が比較的良好な初期の症例に対する患者に対しても有効であることを見出した。すなわち本発明は、以下の〔１〕〜〔３６〕を提供する。
〔１〕下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔２〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチン；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔４〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチン；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔５〕HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与される、〔３〕に記載のワクチン、
〔６〕HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与される、〔４〕に記載のワクチン、
〔７〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔５〕又は〔６〕に記載のワクチン、
〔８〕下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生を阻害するための薬剤；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔９〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生を阻害するためのワクチン；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔１０〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生を阻害するためのワクチン；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔１１〕HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与される、〔９〕に記載のワクチン、
〔１２〕HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与される、〔１０〕に記載のワクチン、
〔１３〕下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する薬剤を被検者に投与する工程を含む、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための方法；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔１４〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔１３〕に記載の方法、
〔１５〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有するワクチンを被検者に投与する工程を含む、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための方法；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔１６〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有するワクチンを被検者に投与する工程を含む、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための方法；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔１７〕HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与される、〔１５〕に記載の方法、
〔１８〕HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与される、〔１６〕に記載の方法、
〔１９〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔１７〕又は〔１８〕に記載の方法、
〔２０〕下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する薬剤を被検者に投与する工程を含む、脈絡膜における血管新生を阻害するための方法；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔２１〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有するワクチンを被検者に投与する工程を含む、脈絡膜における血管新生を阻害するための方法；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔２２〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドのうち少なくとも1種類を有効成分として含有するワクチンを被検者に投与する工程を含む、脈絡膜における血管新生を阻害するための方法；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔２３〕HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与される、〔２１〕に記載の方法、
〔２４〕HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与される、〔２２〕に記載の方法、
〔２５〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤の製造における、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドの使用；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン及び／又は、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔２６〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔２５〕に記載の使用、
〔２７〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチンの製造における、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドの使用；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔２８〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチンの製造における、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドの使用；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔２９〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与されるためのものである、〔２７〕に記載の使用、
〔３０〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与されるためのものである、〔２８〕に記載の使用、
〔３１〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔２９〕又は〔３０〕に記載の使用、
〔３２〕脈絡膜における血管新生を阻害するための薬剤の製造における、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチドの使用；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔３３〕脈絡膜における血管新生を阻害するためのワクチンの製造における、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドの使用；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔３４〕脈絡膜における血管新生を阻害するためのワクチンの製造における、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチドの使用；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔３５〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与されるためのものである、〔３３〕に記載の使用、
〔３６〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与されるためのものである、〔３４〕に記載の使用。
〔３７〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチド；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン及び／又は、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔３８〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔３７〕に記載のペプチド、
〔３９〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチド；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔４０〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチド；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔４１〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与されるためのものである、〔３９〕に記載のペプチド、
〔４２〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与されるためのものである、〔４０〕に記載のペプチド、
〔４３〕脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）が滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫から選択される、〔４１〕又は〔４２〕に記載のペプチド、
〔４４〕脈絡膜における血管新生を阻害するための、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のペプチド；
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔４５〕脈絡膜における血管新生を阻害するための、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチド；
（ａ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔４６〕脈絡膜における血管新生を阻害するための、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のペプチド；
（ａ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
〔４７〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A02である被検者に対して投与されるためのものである、〔４５〕に記載のペプチド、
〔４８〕ワクチンが、HLA抗原がHLA-A24である被検者に対して投与されるためのものである、〔４６〕に記載のペプチド。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】第7日における、PBS投与群、IFA単独投与群、ペプチドワクチン接種群それぞれの蛍光眼底造影における、脈絡膜新生血管からの蛍光の漏出指数を示すグラフである。
【図２】第7日における、PBS投与群、IFA単独投与群、ペプチドワクチン接種群それぞれの蛍光眼底造影の一例を示す写真である。
【図３】第7日における、PBS投与群、IFA単独投与群、ペプチドワクチン接種群それぞれの蛍光眼底造影における、脈絡膜新生血管断面積を示すグラフである。
【図４】第7日における、PBS投与群、IFA単独投与群、ペプチドワクチン接種群それぞれの脈絡膜伸展標本の一例を示す写真である。
【００１０】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、VEGFR-2由来のペプチドを有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤（以下、「本発明の薬剤」と称する場合がある）に関する。本発明は上述のとおり、本発明者らによって、VEGFR-2由来のペプチドを抗原とするワクチンが、脈絡膜における血管新生の阻害に有効であることが見出されたことに基づく。【００１１】
ヒトVEGFR-2のアミノ酸配列は公知であり、例えば米国特許第5,861,301号に記載されている。該特許文献に記載の情報に接した当業者であれば、ヒトVEGFR-2を容易に入手することが可能である。
本発明の薬剤に含有されるVEGFR-2由来のペプチドは、9量体又は10量体の部分ペプチドであることが好ましい。このようなペプチドとして、より具体的には、
（ａ）配列番号：１から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
が挙げられる。【００１２】
本発明のペプチドは、VEGFR-2発現細胞に対してCTLを誘導する活性を有する限り、なんら制限されるものではない。すなわち本発明のペプチドには、
（ｂ）配列番号：１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン又はメチオニン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
も含まれる。更に、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に１〜２個のアミノ酸が付加していてもよい。
また本発明のペプチドには、
（ｃ）配列番号：７から１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたペプチドであって、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファン、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである、細胞障害性Ｔ細胞の誘導活性を有するペプチド、
も含まれる。【００１３】
アミノ酸残基を改変する場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異させることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ基（R、K、H）、及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc Natl Acad Sci USA (1984)81:5662-6； Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc Natl Acad Sci USA (1982)79:6409-13）。変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、７個以内であり、好ましくは５個以内であり、さらに好ましくは３個以内（例えば、２個以内）である。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 5873-7）によって決定することができる。
なお本発明においては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが、特に好ましい。【００１４】
また本発明のペプチドは、アミノ酸配列に基づいて、任意の位置からペプチドを合成して得ることができる。ペプチドの合成は、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことが可能である。通常用いられる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; ペプチド合成、丸善（株）、1975; ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985; 医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店、1991等の文献や、国際公開WO99/67288号等の公報に記載されている。【００１５】
本発明のペプチドは、公知の遺伝子工学的手法により合成することも可能である。遺伝子工学的な合成手法の一例としては、以下の方法が挙げられる。すなわち、目的のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換細胞を作製する。この形質転換細胞から産生されるペプチドを回収することにより、本発明のペプチドを得ることが可能である。【００１６】
また本発明のペプチドは、一度融合タンパク質として作製し、それを適切なプロテアーゼで分解することにより得ることも可能である。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと他のペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のペプチドとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また本発明のペプチドは、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等との融合タンパク質とすることも可能である。このようにして作製された融合タンパク質を適切なプロテアーゼで処理し、目的のペプチドを回収することにより、本発明のペプチドを得ることが出来る。ペプチドの回収は当業者に公知の方法、例えばアフィニティークロマトグラフィー等によって行うことが可能である。【００１７】
また本発明のペプチドは、抗原提示能を有する細胞にin vitroまたはin vivoで接触させることによって細胞障害性T細胞を誘導する活性（細胞性T細胞の誘導活性）を有する。特に本発明のペプチドは、日本人において多く発現しているといわれるA-02又はA-24型等のHLA抗原との高い親和性を有することが好ましい。A-02又はA-24型等のHLA抗原としては、それぞれ、A-0201やA-2402等のサブタイプが挙げられる。HLA-A*0201に対して高い結合親和性を有するペプチドとしては、配列番号：１から６のペプチドが挙げられる（WO/2004/024766）。
また本発明のペプチドには、HLA-A*0201に対して高い結合親和性を有するペプチドのみならず、他の種類のHLA抗原（例えばHLA-A*2402）に対して高い結合親和性を有するペプチドも含まれる。このようなペプチドのうち、例えばHLA-A*2402と高い結合親和性を有するペプチドとしては、例えば配列番号：７から１２のペプチドを挙げることが出来る。
いったんあるタンパク質由来のペプチドのワクチンとしての有効性が確認されれば、当業者であれば、容易に、同じタンパク質からHLA抗原との結合親和性の高い他のペプチドを探索し、ワクチンとしての効果を確認することが出来る。また当業者であれば、容易に、同じタンパク質からHLA-A*0201以外のHLA抗原と高い結合親和性を有するペプチドを探索し、多様な人種に適用可能なワクチンを開発することが出来る。あるタンパク質由来のペプチドが同タンパク質に対する免疫反応を賦活する場合、同タンパク質に対してCTL誘導活性を有する限り、他のHLA抗原と高い親和性を示す同タンパク質由来のペプチドもまた同タンパク質に対する免疫反応を賦活することは、当業者の間でよく知られている。すなわち、VEGFR-2由来のペプチド（例えば配列番号：2など）が、VEGFR-2に対する免疫反応を賦活し新生血管を阻害する場合、VEGFR-2に対してCTL誘導活性を有する限り、他のHLA抗原と高い親和性を示すVEGFR-2由来のペプチド（例えば、HLA-A24に高い親和性を示すペプチド）もVEGFR-2に対する免疫反応を賦活し新生血管を阻害することは、当業者の間でよく知られている。【００１８】
本発明のペプチドとHLA抗原との結合は、細胞表面にHLA抗原を有する細胞、例えば樹状細胞を単離して、細胞へのペプチドの結合を通常行われる手法を用いて測定することができる。
あるいはまた、インターネット上で利用可能となっているソフトウェア、例えばParker K. C., J. Immunol. 152, 163-75 (1994)に記載されているもの等を用いて、種々のペプチドとHLA抗原との結合親和性をin silicoで計算することもできる。尚、HLA抗原との結合親和性は、例えばParker, K.C., J. Immunol., 152, 163-75 (1994); Nukaya, I., Int. J. Cancer, 80, 92-7 (1999)等に記載の方法に従って測定することができる。【００１９】
臨床においては、治療を必要とする患者のHLA抗原の型を予め調べることにより、これとの結合親和性、あるいは抗原提示による細胞障害性T細胞（CTL）誘導活性の高いペプチドを適宜選択することが可能である。本発明のペプチドには、このような方法によって選択されるペプチドも含まれる。【００２０】
また本発明において治療とは、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）に特有な症状を現実に発症している患者において、該症状を低減させることを言う。本発明においては、低減の程度は特に限定されるものではなく、ごくわずかであっても症状を低減させることが出来る限り、本発明の治療の意に含まれる。
また本発明において予防とは、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）に特有な症状の進行を、あらかじめ抑制することを意味する。本発明においては、進行の抑制の程度は何ら限定されるものではなく、ごくわずかでも進行を抑制することが出来る限り、本発明の予防の意に含まれる。
脈絡膜における新生血管により引き起こされる疾患（新生血管黄斑症）の症状としては、視力低下がある。この症状が低減したか否かの判断は、視力検査により判定可能である。さらに、蛍光眼底造影検査、光干渉断層装置による検査によって、脈絡膜新生血管の活動性を評価することが可能である。【００２１】
本発明のペプチドは、それ単独で治療及び予防のいずれか又は両方のために使用することが出来る。もしくは、通常用いられる製剤学的方法によって製剤化されたものであっても良い。その場合、本発明のペプチドの他に、通常医薬に用いられる担体、賦形剤等を適宜含むことができる。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。【００２２】
本発明のペプチドは、１種又は２種以上の組み合わせとして、生体内でCTLを誘導し得るワクチンとして使用することが可能である。すなわち本発明は、VEGFR-2由来のペプチドを有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のためのワクチンに関する。本発明のペプチドの投与により、抗原提示細胞のHLA抗原に該ペプチドが高密度に提示され、提示されたペプチドとHLA抗原との複合体に対して特異的に反応するCTLが誘導され、脈絡膜における血管内皮細胞に対する攻撃力が高まる。あるいは、患者から樹状細胞を取り出して本発明のペプチドで刺激することにより、細胞表面に本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が得られ、これを再度患者に投与することで患者においてCTLを誘導し、標的細胞に対する攻撃力を高めることができる。【００２３】
本発明のペプチドをワクチンとして使用する場合、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントと共に投与したり、他の抗癌剤等の有効成分と共に投与したり、また粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Johnson AG., Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994）に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。【００２４】
当業者であれば、本発明のワクチンの投与を必要とする患者（被検者）の症状に応じて、本発明のワクチンの投与方法、投与量、投与期間を適宜設計することが可能である。本発明のワクチンは全身投与、局所投与のいずれの投与も可能である。全身投与としては、例えば、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射が挙げられる。また局所投与としては、脈絡膜の近傍への投与が挙げられる。
また投与量は、これに限定されるものではないが、例えば0.001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜10mgを挙げることが出来る。またワクチンは、これに限定されるものではないが、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。【００２５】
本発明の薬剤は、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）に対して有効である。本発明の薬剤の対象となる疾患は、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）であれば何ら限定されるものではないが、好ましくは滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫等の疾患に伴う新生血管黄斑症が挙げられる。また特に好ましくは、滲出型加齢黄斑変性が挙げられる。
本発明の薬剤は、従来の治療法において問題であった、治療施行後の急激な視力低下や重篤な合併症が生じるリスクが小さい。従って本発明の薬剤は、症状が重篤な患者のみならず、視力が比較的良好な初期の症例に対する患者に対しても、適用することが可能である。視力が比較的良好な初期の症例では、網膜の障害も軽度であるため、治療による視力予後が、従来の進行例に対する治療後よりも、はるかに良好であることが期待できる。【００２６】
本発明は、VEGFR-2由来のペプチドを抗原としたワクチンが、細胞障害性Ｔリンパ球活性（CTL）を誘導することにより血管内皮細胞を障害することが見出されたことに基づく。したがって本発明は、VEGFR-2由来のペプチドを有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生の阻害剤を提供する。VEGFR-2由来のペプチドの具体的な説明は、上述の通りである。なお本発明においては、阻害の程度はなんら限定されるものではなく、ごくわずかであっても血管新生を阻害することが出来る限り、阻害の意に含まれる。【００２７】
本発明の阻害剤は、ワクチンの形態で使用することが可能である。即ち本発明は、VEGFR-2由来のペプチドを有効成分として含有する、脈絡膜における血管新生を阻害するためのワクチンを提供する。ワクチンの投与部位、投与方法、投与量など、ワクチンに関する具体的な説明も上述の通りである。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔方法〕
動物
体重20g〜25gのC57bl/6マウスをCLEA Japan（東京、日本）から入手した。実験はすべて、動物の管理および使用に関する委員会、ならびに視覚および眼科に関する研究会議の眼および視覚の研究における使用に関する声明に準拠して実施した。実験に使用したマウスは、ヒトのHLA−A*0201を発現する。【００２９】
抗原ペプチド
マウス３群に分け、PBS、免疫アジュバント（Incomplete Freund Adjuvant; IFA)、もしくは、ヒトVEGF受容体２由来抗原ペプチドとIFAを懸濁したものを腋窩皮下にday 0及びday 10の２度接種した。ペプチドはヒトVEGFR-2の773番目から9つのアミノ酸VIAMFFWLL（配列番号：２）からなるペプチドで、腫瘍モデルにて抗血管新生作用が認められたものである。その後、day 20にφ200μm、200mW、0.02secで両眼３箇所ずつ半導体レーザーでCNVを誘導した。【００３０】
実験的CNV
実験的CNVは、別に記載されているものに若干の変更を加えて作製した。手短に述べると、塩酸ケタミン（Ketalar（登録商標）、三共、東京、日本）および塩酸キシラジン（Celactal（登録商標）、バイエル、東京、日本）の混合物（1：1）の腹腔内注射（1ml／kg）によって全身麻酔を導入した。光凝固のために、0.5％トロピカミド（Mydrin（登録商標）M、参天製薬、大阪、日本）を1滴用いて瞳孔を散大させた。それぞれの眼に対して、視神経乳頭周囲の主な網膜血管の間に、ダイオードレーザー光凝固装置（DC-3000（登録商標）、NIDEK、大阪、日本）および細隙灯発生システム（SL15O、Topcon、東京、日本）を用いて、照射径200mm、持続時間0.02秒および強度200mWのレーザー光凝固を6回ずつ行った。【００３１】
フルオレセイン血管造影法によるCNVのグレード評価
CNV作成３日後（day 23）および7日後(day27)に、合計169匹の動物を用いて、CNV病変からの漏出に対する効果を調べた（第3日は対照群、低用量群および高用量群の動物がそれぞれn＝41匹、34匹および18匹、第7日は対照群、低用量群および高用量群の動物がそれぞれn＝51匹、15匹および10匹）。第3日および第7日に、観察者には投与に関して知らせずに、別のものに記載された通りにフルオレセイン蛍光眼底造影法を用いて病変を検査した。【００３２】
脈絡膜フラットマウントによるCNVサイズの測定
合計36匹のマウスを、脈絡膜フラットマウント分析（第3日および第7日の各群のマウス数はそれぞれn＝4匹および8匹）に用いた。レーザー処置から3日後および7日後に、以前に記載された通りに脈絡膜フラットマウントを用いてCNV病変のサイズを測定した。マウスに麻酔を施し、50mg／mlのFITC結合デキストラン（4.4kDa、50mg／kg体重；Sigma）を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）1mlを用いて灌流した後に眼球を摘出し、続いて角膜および水晶体を除去し、網膜全体を眼杯から注意深く切離した。赤道部の端から放射状の切れ込みを加え、強膜が下向きになるように眼杯をスライドグラス上にフラットマウントした。フラットマウントしたものを蛍光顕微鏡（Olympus DPSO）で観察し、CCDカメラを用いることによって画像を撮影した。ソフトウエアシステム（Studio lite）を用いてデータをコンピュータにインポートし、コンピュータマウスでCNV領域の輪郭を指定し、NIHの公開画像処理プログラムを用いて測定した。統計分析に関しては、病変サイズを平均して各個体に1つの値を与えた。データは平均±標準誤差によって表している。【００３３】
統計分析
フルオレセイン蛍光眼底造影スコアをMann-Whitney U検定によって評価した。CNV病変のサイズは、ANOVAに続いてDunnetのpost hoc検定を行うことによって評価した。用いたすべての形式の統計分析に関して、P＜0.05の値を統計学的に有意とみなした。【００３４】
倫理面への配慮
東京大学動物実験実施マニュアルに従いマウスの苦痛軽減に努めたが、免疫をより強く賦活するためにフロインドのアジュバンドを使用したため、Scientists Center for Animal Welfareの苦痛分類でカテゴリーCである。【００３５】
〔結果〕
CNV漏出に対する効果
第3日には、フルオレセイン漏出の程度に関して、対照群、低用量投与群および高用量投与群の間に差はみられなかった。第7日には、非投与群のCNV病変からのフルオレセイン漏出が第3日と比べて増加した。高用量群におけるCNV病変からのフルオレセイン漏出は対照と比べて少なかった（図1、2）。統計学的に有意ではなかったが、低用量群の動物のCNV病変が示した漏出は対照群よりも少なかった。【００３６】
CNV病変サイズに対する効果
第3日のCNV病変サイズに関して対照群、低用量群および高用量群の間に差はみられず、CNV平均病変サイズは非投与群では第7日の方が第3日と比べて大きかった。低用量群および高用量群におけるCNV病変のサイズは対照群におけるそれと比べて有意に低下した（図3、4）。【００３７】
本発明者らは、ペプチドVIAMFFWLL(9)（配列番号：２）がVEGFのアップレギュレーションを抑制し、CNV増殖を阻害することを示した。VIAMFFWLL（配列番号：２）は免疫反応を調節することが知られている。CNVの活性が炎症過程によって媒介されること、および、インビボでのCNV増殖に対するVIAMFFWLL（配列番号：２）の阻害効果が第7日のみに認められ、第3日には認められなかったことを考慮すると、VIAMFFWLL（配列番号：２）は、血管新生それ自体を阻害し、それを通してCNVを阻害するのではなく、白血球浸潤などの免疫反応に影響を及ぼし、それによって血管新生過程を調節している可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、脈絡膜における血管新生に起因する疾患（新生血管黄斑症）の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤（ワクチン）が提供された。
従来、脈絡膜における新生血管に起因する疾患（新生血管黄斑症）を治療する方法として、レーザー治療、光線力学療法、手術療法、薬物治療等が行われてきた。しかし、レーザー治療は中心視力の低下を招き、光線力学療法は視力良好例には施行後に急激な視力低下をきたす例が存在し、手術療法も外科的侵襲に伴う術後合併症のリスクがあり、薬物療法も眼内に注射するため眼内炎や網膜剥離など重篤な合併症を生じうるリスクがあった。このように従来の治療には、治療に伴う副作用および合併症により、却って視力の低下をきたすというリスクが少なからず存在した。そのため、視力が比較的良好な初期の症例に治療を行うことが困難であった。
一方本発明の薬剤（ワクチン）では、少なくとも眼局所の合併症は生じないため、上記リスクは皆無と考えられる。従って、視力が比較的良好な初期の症例に対する治療が可能である。さらに、視力が比較的良好な初期の症例では、網膜の障害が軽度であるため、治療による視力予後が、従来の進行例に対する治療後よりも、はるかに良好であることが期待できる。
また本発明の疾患の対側眼では、高率に同様の新生血管を発症することが知られている。しかし、対側眼における新生血管の予防法として確立したものはない。本発明のワクチン療法では、対側眼の予防的治療についても効果が期待しうる。
【図１】
2008099908.tif 000002
【図２】
2008099908.tif 000003
【図３】
2008099908.tif 000004
【図４】
2008099908.tif 000005
【配列表】
2008099908000001.app
【国際調査報告】
2008099908.tif 000006
2008099908.tif 000007
2008099908.tif 000008
2008099908.tif 000009
2008099908.tif 000010