(57)【要約】カルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有し、かつybjL遺伝子の発現が増強するように改変された微生物を培地中で培養し、該培地中にカルボキシル基を有する酸性物質を生成・蓄積せしめ、カルボキシル基を有する酸性物質を該培地から採取することにより、カルボキシル基を有する酸性物質を製造する。
2008133161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有し、かつybjL遺伝子の発現が増強するように改変された微生物。
【請求項２】
ybjL遺伝子のコピー数を高めること、又はybjL遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ybjL遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ybjL遺伝子が、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１または２に記載の微生物：
（A）配列番号２、４または８７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２、４または８７に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、微生物内でその発現を増強することにより微生物のカルボキシル基を有する酸性物質生産能を向上させるタンパク質。
【請求項４】
ybjL遺伝子が、配列番号５又は８８に記載のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
前記微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、ラウルテラ属細菌、パントエア属細菌及びクレブシエラ属細菌からなる群より選択される、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
前記微生物がルーメン細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
前記微生物が、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスである請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される１種または２種以上の有機酸である請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物を培地中で培養し、該培地中にカルボキシル基を有する酸性物質を生成・蓄積せしめ、カルボキシル基を有する酸性物質を該培地から採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
【請求項１２】
前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される１種又は２種以上の有機酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物又は該微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、カルボキシル基を有する酸性物質を生成させ、該酸性物質を採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
【請求項１５】
前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される１種又は２種以上の有機酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２または１５に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸、L-アスパラギン酸は調味料原料等として、広く用いられている。コハク酸は調味料、生分解性プラスチックの原料として広く用いられている。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝子の導入が、コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献８参照）。またコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子のエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、又はエシェリヒア属に属する腸内細菌への導入が、L-グルタミン酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている（例えば、特許文献７参照）。【０００４】
アミノ酸等の目的物質の生産能を向上させる方法として、物質の取り込み系、又は排出系を改変する方法が知られている。例えば、物質の取り込み系を改変する方法としては、目的物質の細胞内への取り込み系を欠失又は低下させることにより、目的物質の生産能を高める方法が知られている。具体的にはgluABCDオペロン又はその一部を欠失させ、Ｌ−グルタミン酸の細胞内への取り込みを欠失又は低下させることによってＬ−グルタミン酸の生産能を向上させる方法（例えば、特許文献９参照）及びプリンヌクレオチドの細胞内への取り込みを弱化することによって、プリンヌクレオチド生産能を強化する方法（例えば、特許文献１０参照）等が知られている。【０００５】
一方、排出系を改変する方法に関しては、目的物質の排出系を強化する方法、及び目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損または弱化させる方法が知られている。目的物質の排出系を強化する方法としては、例えばＬ−リジン排出遺伝子(LysE)を強化したコリネバクテリウム属細菌の菌株を用いたＬ−リジンの製造法（例えば、特許文献１１参照）や、L-グルタミン酸の排出系遺伝子（yhfK）を強化した腸内細菌を用いたL-グルタミン酸の製造法が知られている（例えば特許文献１８参照）。また、Ｌ−アミノ酸の排出に関与することが示唆されているrhtA,B,C遺伝子を用いたＬ−アミノ酸の製造法も報告されている（例えば、特許文献１２参照）。目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損等させる方法としては、目的物質がＬ−グルタミン酸の場合に２−オキソグルタレートパーミアーゼ遺伝子を変異又は破壊することにより、目的物質の中間体である２−オキソグルタル酸の排出を弱化する方法が知られている（例えば、特許文献１３参照）。【０００６】
その他にも、物質の細胞膜の透過に関与するATP結合カセット（ATP Binding cassette）スーパーファミリー（ABCトランスポーター）をコードする遺伝子をアミノ酸の細胞膜輸送が改変された微生物の育種に用いることが示唆されている（例えば、特許文献１４参照）。【０００７】
エシェリヒア属細菌においてＬ−アミノ酸の排出に関与すると予想されるyfiK等の遺伝子を発現増強することにより、Ｌ−グルタミン酸の生産効率が向上したことが報告されている（例えば、特許文献１５参照）。また、yhfK遺伝子の発現を増強することによっても、L-グルタミン酸の生産能が向上することが報告されている（例えば特許文献１８参照）。【０００８】
また、Ｌ−グルタミン酸の製造法には、微生物を酸性条件下で培養し、Ｌ−グルタミン酸を析出させながらＬ−グルタミン酸を発酵生産する方法が知られている（例えば、特許文献１６参照）。L-グルタミン酸を析出させる低ｐＨ条件下ではL-グルタミン酸は電荷を持たないフリー体の形での存在比率が高くなり、これらは容易に細胞膜を透過する。一般に、Ｌ−グルタミン酸は細胞内に取り込まれると、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってTCAサイクルの中間体である２−オキソグルタル酸に１段階で変換されるため、細胞内に取り込まれたＬ−グルタミン酸は容易に代謝されると考えられる。しかし、Ｌ−グルタミン酸の発酵生産においては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下したエンテロバクター属細菌等又はエシェリヒア属細菌が用いられるが（例えば特許文献１６、１７）、これらの微生物は、２−オキソグルタル酸を分解できないため、結果として細胞内Ｌ−グルタミン酸濃度が上昇し生育が阻害されるため培養が成立しない。そこで、上記特許文献１６においては、変異処理により、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損し、かつＬ−グルタミン酸を析出させながら生産することのできる菌株が育種され、Ｌ−グルタミン酸の製造に用いられた。【０００９】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１９及び特許文献２０、非特許文献２）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。【００１０】
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献２１及び特許文献２２）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産なども報告されていた（例えば、特許文献２３）。【００１１】
一方、通性嫌気性グラム陰性細菌であるエシェリヒア・コリでは、コリネ型細菌同様、好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、静止菌体として酸素を通気せずに嫌気的に非アミノ有機酸を生産する方法（非特許文献３）と、好気的に非アミノ有機酸を生産する方法が知られている（特許文献２４）が、グラム陰性細菌であるため浸透圧に弱く、菌体当たりの生産性などに改善の余地があった。【００１２】
ybjL遺伝子は大腸菌のゲノム上に存在する遺伝子であり（例えば、非特許文献４参照）、予想されるアミノ酸配列のモチーフやトポロジーなどから何らかのトランスポーターをコードしているとも考えられている。しかし、該遺伝子をクローニングしたり、発現させて解析した報告はなく、実際の機能は不明であった。
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献５】特開２０００−１０６８６９号公報（米国特許第６，６８２，９１２号）
【特許文献６】特開２０００−１８９１６９号公報（米国特許公開第２００１００９８３６号）
【特許文献７】特開２０００−１８９１７５号公報（米国特許第７，２４７，４５９号）
【特許文献８】特公平７−１２１２２８号公報
【特許文献９】欧州特許出願公開１０３８９７０号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開１００４６６３号明細書
【特許文献１１】国際公開第９７／２３５９７号パンフレット
【特許文献１２】特開２０００−１８９１７７号公報（米国特許公開第２００５２３９１７７号）
【特許文献１３】国際公開第９７/２３５９７号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第００/３７６４７号明細書
【特許文献１５】特開２０００−１８９１８０号（米国特許第６，９７９，５６０）
【特許文献１６】特開２００１−３３３７６９号公報（米国特許公開第２００７１３４７７３号）
【特許文献１７】特開平７−２０３９８０号（米国特許第５，５７３，９４５号）
【特許文献１８】特開２００５−２７８６４３（米国特許公開第２００５１９６８４６号）
【特許文献１９】米国特許第５，１４２，８３４号公報
【特許文献２０】米国特許第５，５０４，００４号公報
【特許文献２１】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献２２】特開平１１−１９６８８８号公報
【特許文献２３】特開平１１−１９６８８７号公報
【特許文献２４】米国特許公開第２００５０１７０４８２号
【非特許文献１】明石邦彦ら著  アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】Guettler, M.V. et al. 1999. International Journal of Systematic Bacteriology 49: 207-216
【非特許文献３】Vemuri, G.N. et al. 2002. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 28(6): 325-332
【非特許文献４】Blattner, F.R. et al. 1997. Science 277(5331):1453-74
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、カルボキシル基を有する酸性物質、特にL-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、コハク酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてカルボキシル基を有する酸性物質を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｌ−グルタミン酸耐性に関与する遺伝子としてybjLを単離し、ybjL遺伝子の発現を強化した菌株は、Ｌ−グルタミン酸の発酵収率を向上させることを見出した。さらにybjL遺伝子の発現を強化した菌株は、コハク酸等の生成速度、または収率を向上させることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）カルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有し、かつybjL遺伝子の発現が増強するように改変された微生物。
（２）ybjL遺伝子のコピー数を高めること又はybjL遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ybjL遺伝子の発現が増強するように改変された（１）に記載の微生物。
（３）ybjL遺伝子が、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子である（１）または（２）に記載の微生物：
（A）配列番号２、４または８７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（B）配列番号２、４または８７に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、微生物内でその発現を増強することにより微生物のカルボキシル基を有する酸性物質生産能を向上させるを有するタンパク質。
（４）ybjL遺伝子が、配列番号５又は８８に記載のタンパク質をコードする遺伝子である（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物。
（５）前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌である、（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物。
（６）前記微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、ラウルテラ属細菌、パントエア属細菌及びクレブシエラ属細菌からなる群より選択される、（５）に記載の微生物。
（７）前記微生物がルーメン細菌である、（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物。
（８）前記微生物が、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスである（７）に記載の微生物。
（９）前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される１種又は２種以上の有機酸である（１）〜（８）のいずれかに記載の微生物。
（１０）前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である（１）〜（）のいずれかに記載の微生物。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載の微生物を培地中で培養し、該培地中にカルボキシル基を有する酸性物質を生成・蓄積せしめ、カルボキシル基を有する酸性物質を該培地から採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
（１２）前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α-ケトグルタル酸からなる群より選択される１種又は２種以上の有機酸である、（１１）に記載の方法。
（１３）前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である、１１に記載の方法。
（１４）（１）〜（１０）のいずれかに記載の微生物又は微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、カルボキシル基を有する酸性物質を生成させ、該酸性物質を採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
（１５）前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α-ケトグルタル酸からなる群より選択される１種又は２種以上の有機酸である、（１４）に記載の方法。
（１６）（１２）又は（１５）に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構造を示す図。
【図２】ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築を示す図。
【図３】ybjL増幅株の高濃度Ｌ−グルタミン酸存在下での生育を示す図。
【図４】エシェリヒア属細菌におけるybjL増幅株のコハク酸蓄積を示す図。
【図５】エンテロバクター属細菌におけるybjL増幅株のコハク酸蓄積を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１８】
＜１＞本発明のカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有する微生物
本発明の微生物は、カルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有し、かつybjL遺伝子の発現が増強するように改変された微生物である。「カルボキシル基を有する酸性物質の生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、カルボキシル基を持つ酸性物質を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。カルボキシル基を持つ酸性物質の生産能を有する微生物としては、本来的にカルボキシル基を持つ酸性物質の生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用してカルボキシル基を持つ酸性物質の生産能を有するように改変したものや、本発明の遺伝子を導入することによってカルボキシル基を持つ酸性物質の生産能が付与又は増強された微生物であってもよい。【００１９】
本発明において、「カルボキシル基を有する酸性物質」とは、カルボキシル基を有し、塩を形成していないフリー体で酸性を示す有機化合物を意味する。具体的には、有機酸、及びカルボキシル基を２つ有するＬ−アミノ酸、すなわち酸性アミノ酸が挙げられる。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−アスパラギン酸、有機酸としては、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α-ケトグルタル酸等が挙げられる。【００２０】
本発明に使用できる微生物の親株は、特に限定されないが、細菌が好ましい。細菌としては、腸内細菌科に属する細菌、ルーメン細菌に分類される細菌、及びコリネ型細菌が好ましい。【００２１】
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、ラウルテラ、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。中でも、エシェリヒア属、エンテロバクター属、ラウルテラ属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属に属する細菌が特に好ましい。【００２２】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられるが、これに限定されない。【００２３】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。【００２４】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  12301 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。【００２５】
パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345)。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。【００２６】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacteragglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株やエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC 12010株（Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27;98(2):340-348）、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637 (FERM ABP-10955)株等が挙げられる。なお、AJ110637株は、2006年3月に静岡県牧之原市須々木海岸側の土壌から、グリセリンを炭素源とした液体集積培養にて取得された。その後16ＳｒＤＮＡの全長配列を決定したところ、エンテロバクター・アエロゲネスNCTC10006株と99.9％の相同率を示した。また、ＡＰＩキットによる生理学的試験結果においてもエンテロバクター・アエロゲネスの基準種と同じ結果を得た事により、単離取得株はエンテロバクター・アエロゲネスと同定された。同株は、2007年8月22日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-21348として寄託され、2008年3月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM ABP-10955の受領番号が付与されている。【００２７】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。【００２８】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。【００２９】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられ、ラウルテラ属細菌としては、ラウルテラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。【００３０】
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
ラウルテラ・プランティコーラ  ATCC33531株
尚、AJ13399株及びAJ13410株は、寄託当時はクレブシエラ・プランティコーラとして分類されていたが、現在ではクレブシエラ・プランティコーラはラウルテラ・プランティコーラに分類されている（Drancourt, M. 2001. Int J Syst Evol Microbiol. 51:925-32）。【００３１】
ルーメン細菌としては、マンヘイミア属細菌、アクチノバチルス属細菌、アンアエロバイオスピリルム属細菌、パイロバクテリム属細菌、セラモノナス属細菌が挙げられ、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）、セラノモナス・ルミナンティアム（Selenomonas ruminantium）、ベイロネラ・パルビューラ（Veillonella parvula）、ウォルネラ・サクシノゲネス(Wolnella succinogenes)、アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス(Anaerobiospirillum succiniciproducens)等の細菌を用いることが出来、特にマンヘイミア・サクシニシプロデューセンスを使用することが望ましい。具体的な菌株としては、マンヘイミア sp. 55E株（KCTC0769BP株）（米国特許出願公開2003/0113885号公報、国際公開2005/052135号パンフレット）が挙げられる。【００３２】
＜１−１＞カルボキシル基を有する酸性物質の生産能の付与
以下、細菌にカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を付与する方法、またはこれらの微生物のカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を増強する方法について述べる。【００３３】
カルボキシル基を有する酸性物質を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、カルボキシル基を有する酸性物質の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、発酵による物質生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100ページ参照）。ここでカルボキシル基を有する酸性物質生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、2種又は3種以上であってもよい。また発現が増強されるカルボキシル基を有する酸性物質の生合成系酵素も単独であっても、2種または3種以上であってもよい。さらに栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。【００３４】
カルボキシル基を有する酸性物質を有する栄養要求性変異株、カルボキシル基を有する酸性物質のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
以下、具体的に微生物にアミノ酸又は有機酸生産能を付与する方法と、アミノ酸又は有機酸生産菌について例示する。【００３５】
＜Ｌ−グルタミン酸生産菌＞
上述したような微生物にＬ−グルタミン酸生産能を付与するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（以下「ＰＲＰＣ」ともいう）（prpC）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA,pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などをが挙げられる。酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である。これらの酵素の中では、ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。【００３６】
以下に目的遺伝子の発現が増強するように微生物を改変する方法について説明する。【００３７】
１つ目の方法は、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子としてＣＳをコードする遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）、およびＧＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈＡ遺伝子）を用いる場合、これらの遺伝子はエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされていることから（Ner, S. et al. 1983. Biochemistry 22: 5243-5249; Fujita, N. et al. 1984. J. Biochem. 95:909-916; Valle, F. et al. 1984. Gene 27: 193-199; Microbiology 140: 1817-1828, 1994; Eikmanns, B.J. et al. 1989. Mol. Gen. Genet. 218: 330-339; Bormann, E.R. et al. 1992. Molecular Microbiology 6: 317-326）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。【００３８】
形質転換に用いるプラスミドとしては、腸内細菌群に属する細菌の中で自律複製可能なプラスミド、例えばpUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。上記ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの活性を同時に増強するためのプラスミドとして、gltA遺伝子、ppc遺伝子及びgdhA遺伝子が組み込まれたRSFCPG（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）、及びRSFCPGのgltA遺伝子をprpCに置き換えたRSFPPGが挙げられる。【００３９】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M.and Higa,A.,J. 1970. Mol. Biol. 53: 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C.H. et al. 1977. Gene, 1: 153）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N. 1979. Molec. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M.J. et al.1978. Nature 274: 398; Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。【００４０】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。【００４１】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変すること、及び、SD配列を改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Goldstein, M. A., and Doi, R.H. 1995. Biotechnol. Annu. Rev. 1: 105-128）等に記載されている。【００４２】
発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した方法（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12): 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。【００４３】
尚、Redドリブンインテグレーションには、参考例１に示すように、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株、例えばパントエア・アナナティスSC17(0)株を好適に用いることができる。同株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。【００４４】
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、メチルクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、特開平2001-333769号公報、特開2000-106869号公報、特開2000-189169号公報、特開2000-333769、特開2006-129840、国際公開2006/051660号パンフレット等に記載された微生物が例示できる。【００４５】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。【００４６】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ(sucA)、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)、酢酸キナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセト乳酸シンターゼ(ilvI)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl)、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ(putA)などが挙げられる。酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。【００４７】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、後述の乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の活性を低下又は欠損させるのと同様の方法を用いることができる。【００４８】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（Reed, L.J. and Mukherjee, B.B. 1969. Methods in Enzymology 13: 55-61）に従って測定することができる。【００４９】
エシェリヒア属細菌において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されている。また、コリネ型細菌において２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、エンテロバクター属細菌については、特開2001-333769号公報に開示されている。【００５０】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌としては、以下の菌株が挙げられる（米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号）。
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr
エシェリヒア・コリAJ12624 (FERM BP-3853)
エシェリヒア・コリAJ12628 (FERM BP-3854)
エシェリヒア・コリAJ12949 (FERM BP-4881)
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr は、エシェリヒア・コリW3110の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（sucA遺伝子）を破壊することにより得られた株である。この株は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを完全に欠損している。【００５１】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した他の細菌としては、具体的には次のような株が挙げられる。【００５２】
パントエア・アナナティスAJ13601（FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989）
パントエア・アナナティスAJ13356（FERM BP-6615 米国特許6.331,419号）
パントエア・アナナティスSC17sucA（FERM BP-8646 国際公開パンフレットWO2005/085419号）
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410（FERM BP-6617 米国特許6,197,559号）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム  ΔS株  （国際公開95/34672号パンフレット参照）【００５３】
尚、SC17sucA株は、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として自然界より単離されたAJ13355株から、粘液質低生産変異株（SC17）を取得し、同株の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（sucA）を破壊することによって得られた株である。AJ13601は、このSC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のgltA、ppc、gdhAの各遺伝子を含むプラスミドRSFCPG、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から、さらに、低pHにおける高濃度Ｌ−グルタミン酸耐性株の選択、及び増殖度及びＬ−グルタミン酸生産能が高い株の選択によって、取得された菌株である（欧州特許出願公開0952221号明細書）。AJ13356は、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させた株である。
SC17sucA株は、プライベートナンバーAJ417が付与され、平成１６年２月２６日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
AJ13410株は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  産業技術総合研究所特許生物寄託センター、郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号及びFERM P-16647として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6617が付与されている。【００５４】
上記パントエア・アナナティスAJ13355株、AJ13356株、AJ13601株、及び前述のクレブシエラ・プランティコーラAJ13399株は、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する。【００５５】
また、腸内細菌科のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるためには、arcA遺伝子を欠損させる方法（米国特許7,090,998号公報）、グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子を増幅させる方法（WO2005/085419パンフレット）も用いることが出来る。【００５６】
その他、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌として、以下のものを例示することができる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573(FERM P-5492) 特開昭56-151495公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12210(FERM P-8123) 特開昭61-202694公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212(FERM P-8123) 特開昭61-202694公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418(FERM-BP2205) 特開平2-186994公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムDH18(FERM P-11116) 特開平3-232497公報参照
コリネバクテリウム・メラセコラDH344(FERM P-11117) 特開平3-232497公報参照
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11574(FERM P-5493) 特開昭56-151495公報参照    【００５７】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物には、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029株（FERM BP-5189、WO96/06180号参照）も含まれる。さらに、Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質に耐性のアリサイクロバチルス属微生物（特開平11-262398号公報）も含まれる。【００５８】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物は、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下した性質や、マレートシンターゼ（ａｃｅＢ）・イソシトレートリアーゼ（ａｃｅＡ）・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペロン（以下、ａｃｅオペロンと略す）の発現が構成的になった性質を持ったものでもよい。このような性質を有する微生物としては、例えば、次のものが挙げられる。
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭＢＰ−３８５４）
エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭＢＰ−３８５３）
前者は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下し、ａｃｅオペロンの発現が構成的になった性質を併せ持つ変異株であり、後者は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下した変異株である（仏国特許２６８０１７８号明細書参照）。【００５９】
また、パントエア属細菌を用いる場合、糖を含有する培地で培養したときに菌体外に生成する粘液質が野生株よりも少ない変異を有していることが好ましい。菌体外に生成する粘液質が野生株よりも少ない変異は、特開2001-333769に記載の固体培地上で粘性物質を生産しない菌株をスクリーニングする方法、多糖合成に関与するamsオペロンを破壊する方法、いずれも利用できる。配列番号66に多糖合成に関与するamsオペロンの塩基配列を、同オペロンがコードするAmsH,I,A,C,Bのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号67,68,69,70,71に示す。【００６０】
＜コハク酸生産菌＞
コハク酸生産菌としては、酢酸、乳酸、エタノール、及び蟻酸の形成能を欠損した株を使用することが出来、具体的には、エシェリヒア・コリSS373株（国際公開99/06532号パンフレット）が挙げられる。
酢酸、乳酸、エタノール、及び蟻酸の形成能を欠損した株は、最小培地で酢酸、及び乳酸を資化できない株を取得すること、または、以下の乳酸の生合成系遺伝子、及び酢酸の生合成系酵素の活性を低下することによって取得することが可能である。（国際公開2005/052135号パンフレット）。
また、上記のような株は、モノフルオロ酢酸耐性（US5,521,075）を付与することによっても取得することができる。
その他にコハク酸生成能が向上した株を取得する方法として、蟻酸リアーゼと乳酸デヒドロゲナーゼの両方を欠損し、ピルビン酸を資化できない株を、嫌気条件下でグルコース富化培地で培養し、ピルビン酸資化能を有する変異株を単離する方法が挙げられる（国際公開1997/16528号パンフレット）。【００６１】
コハク酸生産能は、以下のコハク酸生合成系に関与する酵素の遺伝子の増幅や、同生合成系から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の遺伝子の欠損によっても取得することが可能である。
コハク酸生産能は、乳酸の生合成系酵素である、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH 以下カッコ内は酵素名）の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することができる（国際公開2005/052135号パンフレット、国際公開2005/116227号パンフレット、米国特許5,770,435号公報、米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開99/53035号公報、Alam, K. Y.and Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217）微生物によってはＬ型の乳酸デヒドロゲナーゼとＤ型の乳酸デヒドロゲナーゼを有するものがあるが、いずれか一方を低下させるように改変すればよいが、両方とも低下させることが好ましい。【００６２】
また、コハク酸生産能は、ギ酸の生合成系酵素である、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ(PFL)の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することができる（米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開2005/116227号パンフレット、国際公開2005/52135号パンフレット、Donnelly, M.I. et al. 1998. Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72: 187-198）。【００６３】
コハク酸生産能は、酢酸の生合成系酵素である、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（PTA）、酢酸キナーゼ（ACK）、ピルビン酸オキシダーゼ (POXB) 、アセチルCoA合成酵素（ACS）、アセチルCoAハイドロラーゼ（ACH）の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することが出来る（米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開2005/052135号公報、国際公開第99/53035号公報、国際公開2006/031424号公報、国際公開2005/113745号パンフレット、国際公開2005/113744号パンフレット）。【００６４】
また、コハク酸生産能は、エタノールの生合成系酵素である、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）の酵素活性が低下するように改変することによっても高めることができる（国際公開2006/031424号パンフレット参照）。【００６５】
また、ピルビン酸キナーゼ、グルコースPTS(ptsG)、ArcAタンパク質、IclRタンパク質（iclR）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdh）及び/又はグルタミンシンセターゼ（glnA）、グルタミン酸シンターゼ（gltBD）活性を低下することによっても、コハク酸生産能を高めることが出来る（国際公開第2006/107127号、第2007007933号、特開2005-168401）。酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である。【００６６】
コハク酸生産能は、コハク酸生産に関与する生合成系酵素の増強によっても付与することが出来る。
コハク酸生産能は、ピルビン酸カルボキシラーゼ、マリックエンザイム、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、フマラーゼ、フマル酸リダクターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増強することによっても高めることが出来る（特開平11-196888号公報、国際公開第99/53035号パンフレット、Hong, S. H., and S. Y. Lee. 2001. Biotechnol. Bioeng. 74: 89-95、Millard, C. S. et al. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1808-1810、国際公開2005/021770号パンフレット特開2006-320208、Kim, P. et al. 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1238-1241）。これらの目的酵素の酵素活性増強は、前述したＬ−グルタミン酸生産菌について記載した目的遺伝子の発現の増強方法、及び下述するybjL遺伝子の発現の増強方法を参照にして行うことが出来る。【００６７】
具体的には、腸内細菌科に属するコハク酸生産菌として以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ SS373株（国際公開99/06532号パンフレット）
エシェリヒア・コリ AFP111株（国際公開9716528号パンフレット）
エシェリヒア・コリ  NZN111株（米国特許6,159,738号公報）
エシェリヒア・コリ  AFP184株（国際公開2005/116227号パンフレット）
エシェリヒア・コリ  SBS100MG株、SBS110MG株、SBS440MG株、SBS550MG株、SBS660MG株（国際公開2006/031424号公報）【００６８】
コリネ型細菌に属するコハク酸生産菌として以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムＡＢ−４１株（特開平11−113588号公報）
ブレビバクテリウム・フラバムＡＢ−４１株/PC増幅株（特開平11−196888号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ110655株（FERM BP-10951）
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Δldh(国際公開第2005/021770号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）2256Δ(ldh, ach, pta, ack)（国際公開第2005/113744号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)（国際公開第2005/113745号パンフレット）
コリネバクテリウム・グルタミカムＲldh-/pCRB-1 PC株（国際公開2005/010182号パンフレット）【００６９】
ルーメン細菌に属するコハク酸生産菌としては以下の菌株が挙げられる。
マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス LPK,LPK7,LPK4(国際公開2005/052135号パンフレット)
アクチノバチルス・サクシノゲネス 130Z(米国特許5,504,004号公報)
アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス FZ10(米国特許5,521,075号公報)
アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス FZ53(米国特許5,573,931号公報)【００７０】
＜１−２＞ybjL遺伝子の発現の増強
本発明の微生物は、上述したようなカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有する微生物を、ybjL遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、先にybjL遺伝子の発現が増強するように改変を行った後に、カルボキシル基を有する酸性物質生産能を付与してもよい。また、ybjL遺伝子の増幅により、カルボキシル基を有する酸性物質の生産能が付与又は増強された微生物でもよい。【００７１】
本発明による「ybjL遺伝子」とは、エシェリヒア・コリのybjL遺伝子、及びそのホモログ、パントエア・アナナティスのybjL遺伝子、及びそのホモログ、エンテロバクター・アエロゲネスのybjL遺伝子、及びそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのybjL遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号３の101位から1783位の塩基配列を含む遺伝子を例示することができる。また、パントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号１の298位から1986位を含むDNAを例示することができる。また、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株由来のybjL遺伝子としては、配列番号87に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号86の19位から1704位を含むDNAを例示することが出来る。さらに、Salmonella typhimurium由来のybjL遺伝子としては、配列番号２５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２４）、Yersinia pestis由来のybjL遺伝子としては、配列番号２７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２６）、Erwinia carotovora由来のybjL遺伝子としては、配列番号２９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２８）、Vibrio cholerae由来のybjL遺伝子としては、配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号３０）、Aeromonas hydrophila由来のybjL遺伝子としては、配列番号３３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号３２）、Photobacterium profundum由来のybjL遺伝子としては、配列番号３５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号３４）などを例示することができる。上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。なお、上記Salmonella typhimurium、Yersinia pestis、Erwinia carotovora、Vibrio cholerae、Aeromonas hydrophila、Photobacterium profundumのybjL遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列と、それぞれ、９６％、９０％、８８％、６４％、６０％、６８％相同であり、配列番号２のアミノ酸配列とはそれぞれ８６％、９０％、８４％、６３％、６０％、６７％相同である。さらに、配列番号２と４のアミノ酸配列の間の相同性は８６％である。配列番号２、４間の共通配列を、配列番号５に示す。配列番号４と87のアミノ酸配列の間の相同性は92％であり、配列番号２と87のアミノ酸配列の間の相同性は83％である。なお、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株由来のybjL遺伝子の配列（配列番号86）及び同アミノ酸配列（配列番号87）は、本発明者らにより新規に見出されたものである。配列番号２、４、87間のアミノ酸配列の間の共通配列を配列番号88に示す。【００７２】
ybjL遺伝子ホモログとは、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス及びエンテロバクター・アエロゲネス以外の微生物由来で、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス又はエンテロバクター・アエロゲネスのybjL遺伝子構造と高い類似性を示し、かつ微生物内でその発現を増強することにより微生物のカルボキシル基を有する酸性物質生産能を向上させるタンパク質をコードする遺伝子をいう。ybjL遺伝子ホモログとしては、配列番号２、４または87のアミノ酸配列全体、または配列番号２、４または87のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、かつ、微生物内で発現を増強することにより微生物の物質生産能を向上させるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。さらに、上記いずれかに記載のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するybjL遺伝子ホモログは、配列番号５又は88、好ましくは配列番号５記載の共通配列を有していても良い。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている(http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。【００７３】
ybjL遺伝子は、その発現を増強することにより微生物の目的物質生産能を向上させることができる限り、人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子であってもよい。すわなち、既存のタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号2、4、25、27、29、31、33、35または配列番号87のアミノ酸配列において、保存的変異、具体的には１若しくは数個の位置で１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。さらに、ybjL遺伝子は、配列番号2、4、25、27、29、31、33、35または配列番号87のアミノ酸配列全体に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、かつ、微生物内で発現を増強することにより微生物の物質生産能を向上させるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。【００７４】
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。【００７５】
このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１の298位から1986位からなる塩基配列、配列番号３の101位から1783位からなる塩基配列、配列番号８６の19位から1704位からなる塩基配列、または配列番号２４、２６、２８、３０、３２、もしくは３４に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。また、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、上記のいずれかの塩基配列を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ybjL 遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。【００７６】
ybjL遺伝子は、さらに、配列番号１の298位から1986位からなる塩基配列を有するDNA、配列番号３の101位から1783位からなる塩基配列を有するDNA、配列番号86の19位から1704位からなる塩基配列を有するDNA、配列番号1、3、24、26、28、30、32、34もしくは86の塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖と、またはこれらの塩基配列を有するDNAから調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ微生物内で発現を増強することにより微生物の物質生産能を向上させるタンパク質をコードするDNAであってもよい。【００７７】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましく９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC, 0.1%SDS、好ましくは0.1×SSC, 0.1%SDS、より好ましくは65℃、0.1×SSC, 0.1%SDS、さらに好ましくは68℃、0.1×SSC, 0.1%SDSに相当する温度、塩濃度で、1回より好ましくは２〜３回の洗いの条件が挙げられる。【００７８】
プローブは、ybjL遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC, 0.1%SDSが挙げられる。【００７９】
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の酵素遺伝子についても同様に適用される。【００８０】
ybjL遺伝子の発現の増強は、上述したようなＬ−グルタミン酸生産菌について記載した目的遺伝子の発現の増強方法と同様の方法により、形質転換や相同組み換えによってybjL遺伝子のコピー数を高めたり、ybjL遺伝子の発現調節配列を改変したりすることすることや、ybjLの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、ybjLの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによって達成出来る。【００８１】
本発明の微生物は、ybjL遺伝子の発現が増強することにより、カルボキシル基を有する酸性物質の排出活性が向上していることが好ましい。「カルボキシル基を有する酸性物質の排出活性が向上した」ことは、本発明の微生物を培養したときに培地中に排出される目的物質の量を、ybjL遺伝子の発現が増強されていない対照の微生物を培養したときに培地中に排出される目的物質の量と比較することによって確認することができる。すなわち、「カルボキシル基を有する酸性物質の排出活性の向上」は、対照の微生物に比べて、本発明の微生物を培養したときに培地中に蓄積するカルボキシル基を有する酸性物質が高くなることによって観察される。また、「カルボキシル基を有する酸性物質の排出活性の向上」は、本発明の微生物の細胞内においてカルボキシル基を有する酸性物質の濃度が低下することによっても観察され得る。「カルボキシル基を有する酸性物質の排出活性」は、ybjL遺伝子の発現が増強されていない株に比べて、細胞内のカルボキシル基を有する酸性物質の濃度が、10％以上、好ましくは20％以上、特に好ましくは、30％以上減少していることが好ましい。微生物の絶対的な「カルボキシル基を有する酸性物質の排出活性」は、微生物の細胞内のカルボキシル基を有する酸性物質の濃度と細胞外のカルボキシル基を有する酸性物質の濃度の差を測定することによって検出できる。さらに、「カルボキシル基を有する酸性物質の排出活性」は、反転膜を利用して、ラジオアイソトープにて細胞内のアミノ酸の取り込み活性を測定することによっても検出出来る（J.Biol.Chem 2002 Vol277.No.51 p49841-49849）。例えば、ybjL遺伝子を発現させた菌体より反転膜小胞を作製し、ATPあるいはその他駆動力となる基質を添加し、RIラベルしたグルタミン酸の取り込み活性を測定することによって測定可能である。また生菌を使用して、ラベル化されたカルボキシル基を有する酸性物質と非ラベル化のカルボキシル基を有する酸性物質の交換反応の速度を検出することによっても測定できる。【００８２】
本発明の微生物は、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物であってもよい。このような微生物は、ybjL遺伝子の発現が増強することによって、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有するようになったものであってもよいし、本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有するものであってもよい。【００８３】
酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、前述のパントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、及びAJ13601株（FERM BP-7207）（以上、特開2001-333769号公報参照）などが挙げられる。パントエア・アナナティスAJ13355及びAJ13356株は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所、住所 郵便番号305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644、及びFERM P-16645として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614、及びFERM BP-6615が付与されている。AJ13601は、１９９９年８月１８日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-17156として寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。尚、これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355、AJ13356、及びAJ13601株として寄託されたが、近年１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。【００８４】
本方法において、有機酸、特にコハク酸を生産する際には、ybjL遺伝子の発現上昇に加えて、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、及びピルビン酸−ギ酸リアーゼ（PFL）の１又は２以上の酵素の活性が低下するように改変された微生物株を用いるとより有効である。
ここで、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された」とは、乳酸デヒドロゲナーゼ非改変株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。乳酸デヒドロゲナーゼ活性は、乳酸デヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。また、乳酸デヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下されたことは、公知の方法（Kanarek, L. and Hill, R.L. 1964. J. Biol. Chem. 239: 4202）により乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。エシェリヒア・コリの乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下した変異株の具体的な製造方法としては、Alam, K. Y., and Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217に記載されている方法等が挙げられる。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下され、かつ、ybjL遺伝子の発現が増強された微生物は、例えば後述の実施例1のようにして、LDH遺伝子が破壊された微生物を作製し、該微生物をybjL遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低下のための改変操作とybjLの発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。ここで、エシェリヒア・コリではLDHはldhA遺伝子、lldD遺伝子がコードしており、ldhA遺伝子のDNA配列を配列番号36、アミノ酸配列を配列番号37に、lldD遺伝子のDNA配列を配列番号38、アミノ酸配列を配列番号39に示す。【００８５】
LDHの活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上のLDH遺伝子に、細胞中のLDH活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上のLDHをコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上のLDHをコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Qiu Z. and Goodman M.F. 1997. J. Biol. Chem. 272:8611-8617）。また、遺伝子破壊、例えばコード領域が欠失したような変異型LDHをコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、染色体上の正常型LDH遺伝子を置換すること、又は、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても、LDH活性を低下または欠損させることができる。【００８６】
例えば、LDH活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。LDH遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型LDH遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでエシェリヒア・コリを形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のLDH遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、DatsenkoとWannerによって開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12): p6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報、WO2005/010175号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。【００８７】
また、「アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された」とは、アルコールデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、アルコールデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。また、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下されたことは、公知の方法（Lutstorf, U.M. et al.1970. Eur. J. Biochem. 17: 497-508）によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。エシェリヒア・コリのアルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下した変異株の具体的な製造方法としては、Sanchez, A. M. et al. 2005. Biotechnol. Prog. 21: 358-365)に記載されている方法等が挙げられる。本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下され、かつ、ybjL遺伝子の発現が増強された微生物は、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)をコードする遺伝子が破壊された微生物を作製し、該微生物をybjL遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、ADH活性低下のための改変操作とybjL遺伝子発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下は上述の乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下と同様の方法で行うことが出来る。また、エンテロバクター・アエロゲネスのADH遺伝子（adhE）として、エンテロバクター・アエロゲネスAJ 110637 (FERM ABP-10955)株のADH遺伝子の塩基配列（部分配列）を配列番号７４に示す。同遺伝子の全塩基配列は、例えば、これらの部分配列に基づいて、エンテロバクター・アエロゲネスの染色体ＤＮＡからADH遺伝子（adhE）を単離することによって、決定することができる。【００８８】
また、「ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下するように改変された」とは、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ非改変株と比較してピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下していることをいう。ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性は、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。また、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下されたことは、公知の方法（Knappe, J. and Blaschkowski, H. P. 1975. Meth. Enzymol. 41: 508-518）によりピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性を測定することによって確認することができる。本発明のピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下され、かつ、ybjL遺伝子の発現が増強された微生物は、例えばPFL遺伝子が破壊された微生物を作製し、該微生物をybjL遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、PFL活性低下のための改変操作とybjL遺伝子発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。PFL活性の低下は、上述の乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下と同様の方法で行うことができる。【００８９】
本方法において、有機酸、特にコハク酸を生産する際には、ybjL遺伝子の発現増強に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼ(ＰＣ)の活性が増強するように改変された微生物を用いてもよい。ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、及び／又はピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性の低下と組合わせてもよい。「ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された」とは、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ピルビン酸カルボキシラーゼの活性は例えば、後述するようなNADHの減少を測定する方法により測定することができる。【００９０】
本発明の方法に使用されるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。【００９１】
ＰＣ遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム由来のPC遺伝子を用いることができる（Peters-Wendisch, P.G. et al. 1998. Microbiology, 144: 915-927）。また、ＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよい。【００９２】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト  ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
なお、PC遺伝子発現の増強は、上述した前述したＬ−グルタミン酸生産菌について記載した目的遺伝子の発現の増強、及びybjL遺伝子の発現増強と同様にして行うことができる。【００９３】
＜２＞本発明のカルボキシル基を有する酸性物質の製造方法
本発明の微生物を培地に培養し、培地中にカルボキシル基を有する酸性物質を生成蓄積せしめ、カルボキシル基を有する酸性物質を該培地から採取することにより、カルボキシル基を有する酸性物質を製造することが出来る。また、本発明の微生物又は該微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、カルボキシル基を有する酸性物質を生成させ、該酸性物質を採取することによっても、カルボキシル基を有する酸性物質を製造することができる。前者の方法は、カルボキシル基を有する酸性物質が酸性アミノ酸である場合に好適である。また、後者の方法は、カルボキシル基を有する酸性物質が有機酸である場合に好適である。以下、カルボキシル基を有する酸性物質として、酸性アミノ酸及び有機酸の製造について、好適な態様を例示する。【００９４】
＜２−１＞酸性アミノ酸の製造
本発明の微生物を培地に培養し、培地中に酸性アミノ酸を生成蓄積せしめ、酸性アミノ酸を該培地から採取することにより、酸性アミノ酸を製造することができる。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。【００９５】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。また、酢酸、クエン酸等の有機酸も、これらが目的物質でない場合には、使用することができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。【００９６】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に酸性アミノ酸が蓄積される。【００９７】
また、酸性アミノ酸がＬ−グルタミン酸である場合、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。【００９８】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。【００９９】
＜２−２＞有機酸の製造
本発明の微生物又は該微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することによって、有機酸を製造することができる。【０１００】
第一の形態では、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む培地で微生物を培養することにより、微生物の増殖と有機酸の生成が同時に行なわれる。この形態では、培地が前記反応液に相当する。尚、微生物の増殖と有機酸の生成が並行して行われてもよく、また、主として微生物が増殖する培養期と、主として有機酸が生成する培養期があってもよい。【０１０１】
また、第二の形態では、培地で培養して増殖させた菌体を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液と共存させ、該反応液中で微生物を有機原料に作用させることによって有機酸を生成させる。この形態では、微生物の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。【０１０２】
培養に用いる細菌は、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものであっても良いが、予め液体培地で培養（種培養）したものが好ましい。【０１０３】
培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
前記第一の形態では、培地に添加する炭素源は、有機酸生成のための有機原料でもある。
前記第二の形態では、培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、有機酸生成反応に用いられる。【０１０４】
本発明の方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。また、有機酸がコハク酸の場合、特開平５−６８５７６のように効率よくコハク酸を製造するためにフマル酸などを添加してもよく、フマル酸の変わりにリンゴ酸を添加してもよい。【０１０５】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、微生物の培養又は有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、前記第一の形態では、有機原料の培地中の濃度は５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内である。また、前記第二の形態では、反応液中の有機原料の濃度は５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内である。また、培養又は反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。【０１０６】
上記炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。【０１０７】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ5〜10、好ましくはｐＨ6〜9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。【０１０８】
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ましい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。【０１０９】
本反応に用いる微生物の生育至適温度は、通常、２５℃〜４０℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応液中の菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。また、反応は、バッチ式でもよく、カラム式でもよい。【０１１０】
細菌の培養時は、好気条件で行うことが好ましい。一方、有機酸の生成反応は、好気条件で行ってもよいが、微好気条件または嫌気条件下で行ってもよい。微好気条件または嫌気条件下での反応には、例えば反応容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを反応液に供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを反応液に通気する等の方法を用いることができる。【０１１１】
反応液（培養液）中に蓄積した有機酸は、常法に従って、反応液より分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。【０１１２】
さらに本発明において目的とする有機酸がコハク酸である場合には、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る（特開平4-189822）。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。また、本発明の製造法により得られるコハク酸もしくはコハク酸含有ポリマー、又はこれらを含有する組成物は、食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
【実施例】
【０１１３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。【０１１４】
〔参考例１〕λ Red遺伝子産物に耐性なパントエア・アナナティス菌株の構築
パントエア・アナナティスにおいてsdhA遺伝子破壊を行うために、「Red-driven integration」あるいは「Red-mediated integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）を高効率で行うための受容菌を構築した。【０１１５】
まず、λのgam、bet及びexoの各遺伝子（以下、「λ Red遺伝子」）を発現する新規なヘルパープラスミドRSF-Red-TERを構築した（図１）。詳細は、参考例２に記載する。【０１１６】
このプラスミドは、異なる遺伝子背景を持つ広い範囲の宿主に使用できる。その理由は、１）これは、多くのグラム陰性菌及びグラム陽性菌、並びに植物においてさえも安定に維持され得るRSF1010広宿主域プラスミドのレプリコンを有しており（Scholz, et al., 1989. Gene 75: 271-288; Buchanan-Wollaston et al. 1987. Nature 328:172-175）、２）λ Red遺伝子、gam、bet及びexo遺伝子は、多くの細菌のRNAポリメラーゼによって認識される、PlacUV5プロモーターの調節化にあり（例えば、Brunschwig, E. and Darzins, A. 111. Gene 1: 35-41; Dehio, M. et al 1998. Gene 215: 223-229）、３）自己調節因子PlacUV5-lacI、及びエシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ非依存性転写ターミネーター（TrrnB）は、λ Red遺伝子の基底発現レベルを低くする（Skorokhodova, A. Y. et al. 2004. Biotekhnologiya (Rus) 5: 3-21）からである。さらに、RSF-Red-TERプラスミドは、レバンスクラーゼ（levansucrase）遺伝子（sacB）を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを回収することができる。【０１１７】
エシェリヒア・コリでは、RSF-Red-TERプラスミドにより提供される短いフランキング領域と共に、PCRで生成したDNA断片がインテグレートする頻度は、pKD46ヘルパープラスミド（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. 97: 6640-6645)）を用いた場合と同程度に高い。しかし、λ Red遺伝子の発現は、パントエア・アナナティスにとって毒性を示す。RSF-Red-TERヘルパープラスミドで形質転換された細胞は、IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイド、1mM)及び適当な抗生物質（クロラムフェニコール25μg/ml又はカナマイシン40μg/ml）を含むLB培地で非常に低い生育速度を示し、λ Red介在組換え（λ Red-mediated recombination）の効率は、観察されたとしても極端に低い（10-8）。【０１１８】
λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべての発現に耐性なパントエア・アナナティスの変異株を選択した。そのために、パントエア・アナナティスSC17株（米国特許第6,596,517号）に、RSF-Red-TERプラスミドをエレクトロポレーションにより導入した。１８時間培養後、約106個の形質転換株が得られ、１０クローンまではコロニーが大きいサイズであり、残りはすべて非常に小さかった。１８時間培養後、大きいコロニーは約2mmであり、小さいコロニーは約0.2mmであった。培養を24時間まで延長しても、小さいコロニーはそれ以上生育しなかったが、大きいコロニーは生育を続けた。λ Red遺伝子の３つの遺伝子すべて（gam、bet及びexo）の発現に耐性な、大きいコロニーのパントエア・アナナティス変異株の一つを、更なる解析に用いた。【０１１９】
RSF-Red-TERプラスミドDNAを、大きいコロニーのクローン１つ、及びいくつかの小さいコロニーのクローンから単離し、エシェリヒア・コリMG1655を再形質転換して、Red遺伝子の活性な産物を合成するプラスミドの能力を調べた。得られた形質転換体におけるRed依存的インテグレーションのコントロール実験により、大きいコロニーのクローンから単離されたプラスミドのみが、Red依存的インテグレーションに必要なλ Red遺伝子の発現をもたらすことが示された。選択された大きいコロニーのクローンにおいて、Red媒介インテグレーションが起るかを調べるために、KmRマーカー及びhisD遺伝子に相同な40bpのフランキング領域を含み、パントエア・アナナティスのhisD遺伝子のSmaI認識部位にインテグレートするようにデザインされた、PCRで生成した直鎖状のDNA断片を用いて、エレクトロポレーションを行った。２個の小さいコロニーのクローンをコントロールとして用いた。パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列を配列番号４０に示す。PCRには、配列番号４１及び４２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、pMW118-(λatt-Kmr-λatt)プラスミドを鋳型として使用した。λ Red遺伝子に耐性ではない２個の小さなコロニーのクローンをコントロールとして使用した。pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドの構築は、参考例３で詳述する。【０１２０】
RSF-Red-TERプラスミドは、同プラスミド上にあるlacI遺伝子によって、Red遺伝子の発現を誘導することができる。２つの誘導条件について調べた。第１のグループでは、IPTG(1mM)をエレクトロポレーションの１時間前に添加し、第２のグループでは、IPTGはエレクトロポレーション可能な細胞の調製のための培養開始時に添加した。大きいコロニーのクローンから単離したRSF-Red-TERを保持するSC17の後代の生育速度は、RSF-RedTERプラスミドを持たない菌株よりも有意に低くはなかった。IPTGの添加により、これらの培養物の生育速度はわずかに低下しただけであった。一方、小さいコロニーのクローンの後代から単離したRSF-Red-TERを導入したSC17株は、IPTG非添加で非常にゆっくり生育し、誘導すると生育は事実上停止した。大きいコロニーのクローンの後代の細胞から単離したRSF-Red-TERをエレクトロポレーションした後、たくさんのKmRクローン（短い誘導時間で１８クローン、誘導時間を延長すると約１００クローン）が生育した。調べた100クローンの全ては、His-表現型を有し、20クローンについてPCRで確認したところ、これらの細胞の染色体の構造が期待どおりであることが確認された。一方、小さいコロニーのクローンの後代の細胞から単離したRSF-Red-TERをエレクトロポレーションしても、インテグレーションされた株は得られなかった。【０１２１】
得られた大きいコロニーのクローンを、7%スクロースを含むプレートで生育させてプラスミドを脱落させ、RSF-Red-TERで再形質転換した。プラスミドを持たない株をSC17(0)と命名した。同株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。【０１２２】
上記再形質転換の後に生育した全てのクローンは、親株クローンSC17(0)と同様に大きなコロニーサイズを有していた。RSF-Red-TERプラスミドで再形質転換したSC17(0)株におけるRed媒介インテグレーションの実験を行った。得られた３つの独立した形質転換株について、前の実験に用いたのと同じDNA断片を用いて調べた。短い誘導時間（エレクトロポレーション１時間前）を採用した。各々の実験で、１０個を超えるKmＲクローンが生育した。試験した全てのクローンは、His-表現型を有していた。こうして、λ Red遺伝子の発現に耐性なSC17(0)と名付けた変異株が選択された。この菌株は、パントエア・アナナティス染色体へのRed依存的インテグレーションのための好適な受容菌として使用できる。【０１２３】
〔参考例２〕ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図２に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号４３、４４、４５、４６のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載（Skorokhodova, A.Y. et al. 2004. Biotekhnologiya (Rus) 5: 3-21）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代りにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。【０１２４】
次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たpMW-PlaclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-PlaclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-PlaclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMWPlaclacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstI、及びSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むLB培地にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBPlacMCSベクターを構築するために、配列番号４７及び４８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-PlaclacIプラスミドを鋳型として用いて、PlacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号４９及び５０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L. 2000. Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 97: 6640-6645）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBPlacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。【０１２５】
Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とPlacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号５１及び４８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、PlacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号４８及び５２のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、PlacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSF-RedベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TERと命名した。【０１２６】
〔参考例３〕pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドの構築
pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175)プラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-HindIII大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の２つの断片に連結した。基本となるpMW118-attL-Tc-attRは、以下の４つの断片を連結することによって得た。【０１２７】
１）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattLに相当する領域から、プライマーP1（配列番号５３）及びP2（配列番号５４）を用いたPCR増幅により得たattL（配列番号５５）を持つBglII-EcoRI断片(114bp)。これらのプライマーは、BglII及びEcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１２８】
２）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattRに相当する領域から、プライマーP3（配列番号５６）及びP4（配列番号５７）を用いたPCR増幅により得たattR（配列番号５８）を持つPstI-HindIII断片(182bp)。これらのプライマーは、PstI及びHindIIIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１２９】
３）pMW118-ter_rrnBのBglII-HindIII大断片(3916 bp)。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、次の３つのDNA断片を連結することによって得た。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性（ApＲ）の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6（配列番号５９及び６０）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8（配列番号６１及び６２）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１３０】
４）テトラサイクリン耐性遺伝子及びter_thrL転写ターミネーターを持つpML-Tc-ter_thrLのEcoRI-PstI小断片(1388bp)（配列番号６３）。pML-Tc-ter_thrLプラスミドは、次の２工程で得た。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al. 2001. Biotekhnologiya (in Russian) no.5, 3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10（配列番号６４及び６５）を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理した。【０１３１】
〔実施例１〕Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の探索
Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子の探索は以下のようにして行った。Ｌ−グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってトリカルボン酸サイクルの中間体である２−オキソグルタル酸に、1段階で変換されるため、グルタミン酸デヒドロゲナーゼやトリカルボン酸サイクルを持つ多くの微生物では、Ｌ−グルタミン酸は容易に代謝されることが予想される。しかし、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損させた株はグルタミン酸を分解できないため、高濃度のグルタミン酸存在下では生育が阻害される。ここでは、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株としてパントエア・アナナティスSC17sucA株（特開平2001-333769号公報参照）から誘導した菌体外多糖生合成系欠損株SC17sucAamsを用い、高濃度のＬ−グルタミン酸耐性を指標にＬ−グルタミン酸排出系遺伝子の取得を試みた。【０１３２】
SC17sucA株は糖源を含む寒天培地上で生育させた場合著量の菌体外多糖を生成するため、取り扱いが非常に困難であった。そこで菌体外多糖の生合成系遺伝子をコードするamsオペロンを欠損させることにより、菌体外多糖の生成を抑えることとした。pMW118-(λattL-Kmr-λattR）を鋳型として、配列番号６と配列番号７のオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子の両端にそれぞれλphageのattL及びattRの配列、更にその外側にそれぞれamsI遺伝子の上流50bp、amsC遺伝子下流50bpの配列を付加した遺伝子断片を増幅した。この断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した。【０１３３】
次にSC17(0)をRSF-Red-TERで形質転換し、SC17(0)/RSF-Red-TER株を得た。同株を25mg/Lクロラムフェニコールを含有するL培地（バクトトリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl 5gを純水1Lに含む培地、pH7.0）で終夜培養を行い、この終夜培養液を25mg/Lクロラムフェニコールと1mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイドを含有するL培地100mLに1/100量接種し、3時間34℃で培養を行った。こうして作製した菌体を集菌し、氷冷した10%グリセロールで３回洗菌した後、最終的に0.5mLの10%グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとし、上項で調製したPCR断片100ngを、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて、電場強度18kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたSOC培地（バクトトリプトン20g/L、イーストエキストラクト5g/L、NaCl 0.5g/L、グルコース10g/L）を添加し34℃で2時間振盪培養を行い、L培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最少培地成分（1L当り、グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g）と40mg/Lのカナマイシンを加えた培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRによりams遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と置換していることを確認した。【０１３４】
このams遺伝子欠損株より、Edge Biosystems社製 Bacterial Genomic DNA Purification Kitを用いて染色体を抽出した。一方、SC17sucA株を、L培地に前記最少培地成分を添加した寒天培地にて終夜培養した。菌体をエーゼで掻き取り、氷冷しておいた10%グリセロールで3回洗菌し、菌体に10%グリセロールを最終500μLとなるように加えて懸濁したものをコンピテントセルとした。このコンピセントセルに、前述の染色体DNA 600ngを、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて電場強度17.5kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたSOC培地を添加し、34℃で2時間振盪培養を行った後に、L培地に前記最少培地成分と40mg/Lのカナマイシンを添加した寒天培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRによりams遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子と置換していることを確認し、この株をSC17sucAams株とした。【０１３５】
パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株より染色体DNAを、制限酵素Sau3AIで部分分解後、約10kbの断片を回収し、pSTV28（タカラバイオ社）のBamHIサイトに導入した、プラスミドライブラリーを作製した。このプラスミドライブラリーを、定法に従い調製したSC17sucAams株のコンピテントセルに、エレクトロポレーションにより導入した。【０１３６】
プラスミドライブラリーを導入したSC17sucAams株を、クロラムフェニコール耐性を指標にL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、最少培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6gを純水1Lに含む培地）を加えたプレートにて選択し、形質転換体を取得した。この形質転換体を、SC17sucAamsがコロニーを形成できない、高濃度のＬ−グルタミン酸を含むグルコース最少培地（グルコース最少培地に最終濃度0.2MのＬ−グルタミン酸ナトリウム, リジン, メチオニン, ジアミノピメリン酸各100mg/Lを混合した培地）に塗布した。【０１３７】
34℃で3日間培養し、出現したコロニーのうち６４クローンについて再度同じプレートにて単一コロニーを形成させたところ、そのうち１１クローンについては４８時間後にコロニーを形成し、残りのクローンは７２時間でコロニーを形成することが判明した。【０１３８】
次に、各形質転換体に導入されているベクターに挿入された遺伝子について解析した。それぞれの形質転換体からプラスミドを抽出して塩基配列を決定したところ、４８時間でコロニーを形成した１１クローンの内、１０クローンまでが同じ遺伝子座を含み、いずれもEsherichia coliの機能未知遺伝子であるybjLと相同性を示す遺伝子を含むことが判明した。尚、WO2005/085419に記載のグルタミン酸排出系遺伝子であるyhfKを取得した条件ではこのybjL遺伝子は取得されず、逆に、今回選択した条件ではyhfK遺伝子は取得できなかった。【０１３９】
このグルタミン酸耐性を付与する因子がybjLであることを確認するため、ybjL遺伝子のクローニングを行った。AJ13355株の染色体DNAを鋳型に配列番号８と配列番号９に示されるオリゴヌクレオチドybjL-F1, ybjL-R2 を用いてPCRを行い、P. ananatisのybjL遺伝子を含む約1.8kbの断片を増幅した。この断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した後、制限酵素KpnIとSphIで処理し、同酵素で処理したpSTV28（宝酒造株式会社製）と連結することでpSTV-PanybjLを得た。このpSTV-PanybjLプラスミドと比較対照用のプラスミドpSTV28(宝酒造株式会社製)でSC17sucA株を形質転換し、SC17sucA/pSTV-PanybjL株、SC17sucA/pSTV28株を構築した。【０１４０】
SC17sucA/pSTV-ybjLをグルタミン酸含有最少培地（グルコース0.5g又はシュークロース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g、リン酸2ナトリウム6g、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム0.2M、リジン, メチオニン, ジアミノピメリン酸各100mg、寒天15gを純水1Lに含む培地）に塗布した。2日間34℃にて培養したところ、対照株であるベクター導入株SC17sucA/pSTV28株がコロニーを形成出来ないのに対し、SC17sucA/pSTV-ybjLは最少培地上でコロニーを形成することが確認された。【０１４１】
次にSC17sucA/pSTV-PanybjL株をグルタミン酸含有液体最少培地（グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g、L-グルタミン酸ナトリウム0.2M、リジン, メチオニン, ジアミノピメリン酸各100mg/L を純水1Lに含む培地）で培養し、高濃度Ｌ−グルタミン酸存在下での生育を調べた。【０１４２】
結果を図３に示す。対照株として用いたSC17sucA/pSTV28株と比べ、ybjL遺伝子が増強されたSC17sucA/pSTV-PanybjLは、高濃度Ｌ−グルタミン酸存在下での生育が大幅に向上することが分かった。従ってybjLがＬ−グルタミン酸に対して耐性を示す因子であることが確認された。【０１４３】
〔実施例２〕＜ybjL遺伝子増幅の中性pH下でのＬ−グルタミン酸生産に対する効果＞
次に、この遺伝子がＬ−グルタミン酸生産に与える影響を検討するため、ybjL増幅用プラスミドpSTV-PanybjLを、配列番号１０に示すＬ−グルタミン酸生産用プラスミドRSFCPGを有するＬ−グルタミン酸生産菌SC17sucA/RSFCPG（特開平2001-333769号公報参照）に導入して、Ｌ−グルタミン酸生産性を調べた。【０１４４】
SC17sucA/RSFCPGに、pSTV-PanybjL、比較対照用のpSTV28(宝酒造株式会社製)をエレクトロポレーションによりそれぞれ導入し、クロラムフェニコール耐性を指標にして、形質転換体を取得した。プラスミドを確認後、ybjL増幅用プラスミド導入株をSC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjLと、pSTV28導入株をSC17sucA/RSFCPG+pSTV28と名付けた。【０１４５】
次にSC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjLと、対照株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV28を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。培地は以下の組成で行った。
〔培養培地組成〕
〔Ａ区〕
シュークロース              30g/L
MgSO4・7H2O                   0.5g/L
〔Ｂ区〕
KH2PO4                       2.0g/L
酵母エキス                   2.0g/L
FeSO4・7H2O                   0.02g/L
MnSO4・5H2O                   0.02g/L
Ｌ−リジン塩酸塩             0.2g/L
DL-メチオニン                0.2g/L
ジアミノピメリン酸           0.2g/L
（KOHにてpH7.0に調整）
〔Ｃ区〕
CaCO3                        20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、テトラサイクリン塩酸塩・クロラムフェニコールをそれぞれ12.5mg/L 25mg/Lとなるように添加した。【０１４６】
SC17sucA/RSFCPG+pSTV29と、SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjLを、L寒天培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最少培地成分（グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g、リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）と25mg/Lのクロラムフェニコール, 12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地で前培養し、前述の培地5mLを張り込んだ試験管に適量植菌した。【０１４７】
17.5時間培養した後、培養液中の菌体濃度、Ｌ−グルタミン酸濃度、及び残糖を測定した。菌体濃度は５１倍に水で希釈した培養液を用い、620nmの濁度を分光光度計（U-2000A日立製作所）で測定することにより調べた。Ｌ−グルタミン酸濃度は、培養液上清を適当倍率に水で希釈した後に、バイオテックアナライザー（AS-210  サクラエスアイ(株)）により測定した。  結果を表１に示す。対照のSC17sucA/RSFCPG+pSTV28と比べ、ybjL増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjLは、Ｌ−グルタミン酸蓄積が約3g/L 上昇し、対糖収率で約9％上昇した。【０１４８】
【表１】
2008133161.tif 000003
【０１４９】
〔実施例３〕＜エシェリヒア・コリのybjL遺伝子の増幅効果＞
次にエシェリヒア・コリのybjL遺伝子をパントエア・アナナティスSC17sucA/RSFCPG株に導入してGlu生産能に対する効果を調べた。【０１５０】
GeneBank  AP009048 に登録されているエシェリヒア・コリのybjLの配列（配列番号3）を基に、配列番号11、12に示したオリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ  W3110株（ATCC 27325） の染色体を鋳型にPCR反応を行い、ybjL遺伝子を含む約1.7ｋｂの断片を得た。この断片をKpnI、SphI処理し、pSTV28（宝酒造株式会社製）の同サイトに連結した。得られたエシェリヒア・コリのybjL増幅用プラスミドをybjL増幅用プラスミドpSTV-EcoybjLとした。【０１５１】
得られたエシェリヒア・コリybjL遺伝子増幅用プラスミドpSTV-EcoybjLをエレクトロポレーションにより上記のSC17sucA/RSFCPG株に導入し、クロラムフェニコール耐性を指標として形質転換体を得た。得られた株をエシェリヒア・コリybjL遺伝子増幅株 SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjLと名付けた。【０１５２】
次にSC17sucA/ RSFCPG+pSTV-EcoybjLと、対照株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV28を用いて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。培地は以下の組成で行った。
〔培養培地組成〕
〔Ａ区〕
シュークロース              30g/L
MgSO4・7H2O                   0.5g/L
〔Ｂ区〕
KH2PO4                    2.0g/L
酵母エキス 2.0g/L
FeSO4・7H2O                0.02g/L
MnSO4・5H2O                0.02g/L
Ｌ−リジン塩酸塩           0.2g/L
DL-メチオニン              0.2g/L
ジアミノピメリン酸         0.2g/L
（KOHにてpH7.0に調整）
〔Ｃ区〕
CaCO3                        20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、テトラサイクリン塩酸塩・クロラムフェニコールをそれぞれ12.5mg/L 25mg/Lとなるように添加した。【０１５３】
SC17sucA/ RSFCPG+pSTV28と、SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjLをL寒天培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最少培地成分（ グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g、リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）と25mg/Lのクロラムフェニコール, 12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地で前培養し、前述の培地5mLを張り込んだ試験管に適量植菌した。【０１５４】
17.5時間培養後、実施例２と同様にして培養液中の菌体濃度及びＬ−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表2に示す。対照のSC17sucA/RSFCPG+pSTV28と比べ、ybjL増幅株であるSC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjLは、Ｌ−グルタミン酸蓄積が約2g/L 上昇し、対糖収率で約7％上昇した。【０１５５】
【表２】
2008133161.tif 000004
【０１５６】
〔実施例４〕＜エシェリヒア・コリでのybjL遺伝子増幅のL-アミノ酸生産能に対する効果＞
次にパントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子、エシェリヒア・コリ由来のybjL遺伝子をエシェリヒア・コリに導入して増幅効果を検討した。【０１５７】
上述のパントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子増幅用ベクターpSTV-PanybjLと、エシェリヒア・コリ由来のybjL遺伝子増幅用ベクターpSTV-EcoybjL、更に対照用プラスミドpSTV28をエレクトロポレーションによりエシェリヒア・コリの野生株であるW3110株に導入し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。パントエア・アナナティス由来のybjL増幅株をW3110/pSTV-PanybjL、エシェリヒア・コリ由来のybjL増幅株をW3110/pSTV-EcoybjL、対照のpSTV28導入株をW3110/pSTV28と名付けた。【０１５８】
次にybjL増幅株であるW3110/pSTV-PanybjL、W3110/pSTV-EcoybjLと、対照のW3110/pSTV28を用い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。W3110/pSTV-PanybjL、W3110/pSTV-EcoybjLと対照のW3110/pSTV28とをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、クロラムフェニコールを加えた培地で前培養し、Nunc社製1mL容エーゼ1かきを、以下の組成の培地5mLを張り込んだ試験管に植菌し、37℃にて11.5時間振とう培養した。実施例２と同様にして、培養液中の菌体濃度及びＬ−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表３に示す。【０１５９】
〔培養培地組成〕
〔Ａ区〕
グルコース       30g/L
MgSO4・7H2O      0.5g/L
〔Ｂ区〕
(NH4)2SO4                  20g/L
KH2PO4                 2.0g/L
酵母エキス             2.0g/L
FeSO4・7H2O            20mg/L
MnSO4・5H2O            20mg/L
（KOHにてpH7.0に調整）
〔Ｃ区〕
炭酸カルシウム          20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、クロラムフェニコールを25mg/Lとなるように添加した。【０１６０】
【表３】
2008133161.tif 000005
【０１６１】
パントエア・アナナティスのybjL遺伝子増幅株であるエシェリヒア・コリ  W3110 /pSTV-ybjLは、対照のベクター導入株W3110/pSTV29株と比べて、大幅にＬ−グルタミン酸の生産能が向上することが明らかとなった。【０１６２】
次に、ybjL増幅株の他のＬ−アミノ酸の生産能について検討した。W3110/pSTV-PanybjLと対照のW3110/pSTV28とをL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、クロラムフェニコールを加えた培地で前培養し、Nunc社製5mL容エーゼ1かきを以下の組成の培地で5mL張り込みの試験管に植菌し37℃にて7時間振とう培養した。実施例２と同様にして、培養液中の菌体濃度及び各Ｌ−アミノ酸濃度を測定した。結果を表４に示す。【０１６３】
〔培養培地組成〕
〔Ａ区〕
グルコース      40g/L
MgSO4・7H2O      0.5g/L
〔Ｂ区〕
（NH4）2SO4               20g/L
KH2PO4                  2.0g/L
酵母エキス             2.0g/L
FeSO4・7H2O            20mg/L
MnSO4・5H2O            20mg/L
（KOHにてpH7.0に調整）
〔Ｃ区〕炭酸カルシウム          30g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、クロラムフェニコールを25mg/Lとなるように添加した。【０１６４】
【表４】
2008133161.tif 000006
【０１６５】
ybjL遺伝子増幅株であるエシェリヒア・コリW3110/pSTV-PanybjLは、対照のベクター導入株W3110/pSTV28株と比べて、Ｌ−グルタミン酸だけではなく、Ｌ−アスパラギン酸の蓄積量も向上することが明らかとなった。【０１６６】
〔実施例５〕＜クレブシエラ・プランティコーラでのybjL遺伝子増幅のL-グルタミン酸生産能に対する効果＞
パントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子をクレブシエラ・プランティコーラに導入して増幅効果を検討した。【０１６７】
上述のパントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子増幅用ベクターpSTV-PanybjLと対照用プラスミドpSTV28をエレクトロポレーションによりクレブシエラ・プランティコーラのL-グルタミン酸生産菌AJ13410株（特願平11-68324）に導入し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。パントエア・アナナティス由来のybjL増幅株をAJ13410/pSTV-PanybjL、対照のpSTV28導入株をAJ13410/pSTV28と名付けた。【０１６８】
次にybjL増幅株であるAJ13410/pSTV-PanybjLと、対照のAJ13410/pSTV28を用い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討した。AJ13410/pSTV-PanybjLとAJ13410/pSTV28をL培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地、pH7.0）に、クロラムフェニコールを加えた培地で前培養し、Nunc社製1mL容エーゼ1かきを以下の組成の培地で5mL張り込みの試験管に植菌し37℃にて17時間振とう培養した。実施例２と同様にして、培養液中の菌体濃度及びＬ−グルタミン酸濃度を測定した。結果を表５に示す。【０１６９】
〔培養培地組成〕
〔Ａ区〕
シュークロース              30g/L
MgSO4・7H2O                   0.5g/L
〔Ｂ区〕
KH2PO4                    2.0g/L
酵母エキス 2.0g/L
FeSO4・7H2O                0.02g/L
MnSO4・5H2O                0.02g/L
Ｌ−リジン塩酸塩           0.2g/L
DL-メチオニン 0.2g/L
ジアミノピメリン酸       0.2g/L
（KOHにてpH7.0に調整）
〔Ｃ区〕
CaCO3                        20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、クロラムフェニコールを25mg/Lとなるように添加した。【０１７０】
【表５】
2008133161.tif 000007
【０１７１】
パントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子増幅株であるクレブシエラ・プランティコーラAJ13410/pSTV-PanybjLは、対照のベクター導入株AJ13410/pSTV28株と比べて、大幅にＬ−グルタミン酸の生産能が向上することが明らかとなった。【０１７２】
〔参考例４〕＜エシェリヒア・コリ L,D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の構築＞
本遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）によって実施した。本手法により目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。【０１７３】
＜１−１＞D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子欠損株の構築
WO2005/010175の記載に従って、ldhA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に、λファージのattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、それぞれ有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてプラスミドpMW118-attL-Cm-attRを鋳型としてPCRを行った。pMW118-attL-Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-cat-attRの順で挿入されている。プライマーに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を配列番号１３、１４に示す。増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655株にエレクトロポレーションにより導入した。次に、プラスミドpKD46が脱落したアンピシリン感受性株を取得し、ldhA遺伝子の欠失をPCRによって確認した。PCRは配列番号１５，１６に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行った。親株のPCR産物が約1.2kbであるのに対し、欠損株は約1.9kbにバンドが認められる。【０１７４】
さらに、ldhA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、アンピシリン耐性株を選択した。尚、前記pMW-intxis-tsは、λファージ由来のインテグラーゼ（Int）遺伝子と切出し酵素（excisionase、Xis）遺伝子を有し、複製が温度感受性のプラスミドである。その後、アンピシリン感受性、かつクロラムフェニコール感受性により、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落している株をPCRにて確認した。PCRは配列番号１５，１６に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行い、att-catが残存している株のPCR産物が約1.9kbであるのに対し、att-catが脱落した株は約0.3kbにバンドが認められる。このようにして取得したldhA欠損株をMG1655ΔldhA株と名付けた。【０１７５】
＜１−２＞L-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするlldD遺伝子欠損株の構築
ldhA遺伝子欠損株の構築と同様の方法にて構築した。lldD遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に、λファージのattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、それぞれ有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてプラスミドpMW118-attL-Cm-attRを鋳型としてPCRを行った。プライマーに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を配列番号１７、１８に示す。増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655ΔldhA株にエレクトロポレーションにより導入した。次に、プラスミドpKD46が脱落したアンピシリン感受性株を取得し、lldD遺伝子の欠失をPCRによって確認した。PCRは配列番号１９，２０に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行った。親株のPCR産物が約1.4kbであるのに対し、欠損株は約1.9kbにバンドが認められる。【０１７６】
さらに、lldD遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、アンピシリン耐性株を選択した。その後、アンピシリン感受性、かつクロラムフェニコール感受性により、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落している株を取得し、PCRによって確認した。PCRは配列番号１９，２０に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行った。att-catが残存している株のPCR産物が約1.9kbであるのに対し、att-catが脱落している株は約0.3kbにバンドが認められる。このようにして取得したlldD破壊株をMG1655ΔldhAΔlldD株と名付けた。【０１７７】
〔実施例６〕＜コハク酸生産菌ybjL遺伝子増強株の構築＞
＜6-1＞遺伝子増幅用プラスミドの構築
ybjL遺伝子の増幅を行うためにプラスミドpMW219::Pthrを用いた。本プラスミドは、ベクターpMW219 （日本ジーン社製）のHindIIIサイトとBamHIサイトに配列番号２１に示したエシェリヒア・コリのゲノム上のスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域を有しており。このプロモーターの下流に遺伝子をクローニングすることによって遺伝子の増幅が可能なプラスミドである。【０１７８】
＜6-2＞ybjL増強用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリのゲノム配列のybjL遺伝子の塩基配列（GenBank Accession No.U00096）に基づいて、5’プライマーとしてBamHIサイトを有する配列番号２２に示す合成オリゴヌクレオチド、配列番号２３に示す3'側プライマーとしてBamHIサイトを有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、制限酵素BamHIにて処理し、ybjL遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したPCR産物を、BamHIで処理したベクターpMW219::Pthrに連結してybjL増幅用プラスミドpMW219::Pthr::ybjLを構築した。【０１７９】
＜6-3＞ybjL増幅株の作製
上記（6-2）で得られたpMW219::Pthr::ybjLおよびpMW219を用いて、エシェリヒア・コリMG1655ΔldhAΔlldD株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれMG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::ybjL、MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219と名づけた。また、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637をpMW219::Pthr::ybjLおよびpMW219を用いて電気パルス法にて形質転換を行い、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれAJ110637/pMW219::Pthr::ybjL、AJ110637/pMW219と名づけた。【０１８０】
〔実施例７〕エシェリヒア属細菌コハク酸生産株でのybjL増幅の効果
MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::ybjL、MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219を25μg/ml のカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、該プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社）を用いて嫌気条件下、37℃で、16時間培養を行った。得られたプレートの菌体を、0.8%の食塩水で洗浄後、51倍希釈でOD=1.0（600nm）になる様に調製した。この菌体懸濁液100μlと予め窒素ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を窒素ガスにて置換した生産培地（グルコース10g/l、リンゴ酸2Na 10g/l、TES 45.88g/l、Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NH4Cl 1g/l、KOHでpH7.3に調整後フィルターろ過）1.3mlを1.5ml容のマイクロチューブに分注し、マイクロチューブ用攪拌機を用いて31.5℃で10時間培養した。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
10時間目のコハク酸蓄積を表６、コハク酸蓄積の経時変化を図４に示す。
ybjL遺伝子増幅株MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::ybjLは対照のMG1655ΔldhAΔlldD/pMW219と比べて、顕著にコハク酸蓄積が上昇した。【０１８１】
【表６】
2008133161.tif 000008
【０１８２】
〔実施例８〕エンテロバクター属細菌コハク酸生産株でのybjL増幅の効果
AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL、AJ110637/pMW219を50μg/mlのカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、該プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社）を用いて嫌気条件下、37℃で、16時間培養を行った。得られたプレートの菌体を、0.8%の食塩水で洗浄後、51倍希釈でOD=1.0（600nm）になる様に調製した。この菌体懸濁液100μlと予め窒素ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を窒素ガスにて置換した生産培地（グルコース10g/l、リンゴ酸2Na 10g/l、TES 45.88g/l、Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NH4Cl 1g/l、KOHでpH7.3に調整後フィルターろ過）1.3mlを1.5ml容のマイクロチューブに分注し、マイクロチューブ用攪拌機を用いて31.5℃で6時間培養した。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
6時間目のコハク酸蓄積を表７、コハク酸蓄積の経時変化を図５に示す。
ybjL遺伝子増幅株AJ110637/pMW219::Pthr::ybjLは対照のAJ110637/pMW219と比べて、顕著にコハク酸蓄積が上昇した。【０１８３】
【表７】
2008133161.tif 000009
【０１８４】
〔実施例９〕
＜9-1＞エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637におけるadhE欠損株の構築
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637は、嫌気条件下において糖源を含む培地で生育させた場合、著量のエタノールを生成するため、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするadhEを欠損させることにより、エタノールの生成を抑えることとした。【０１８５】
adhE欠損用遺伝子断片は、WO2005/010175に記載のプラスミドpMW-attL-Tc-attRを鋳型として、配列番号７２と配列番号７３のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより調製した。pMW118-attL-Tc-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるTc遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-Tc-attRの順で挿入されている。前記PCRにより、テトラサイクリン耐性遺伝子の両端にそれぞれλphageのattL及びattRの配列、更にその外側にそれぞれadhE遺伝子の上流60bp、下流59bpの配列を付加した遺伝子断片を増幅した。この断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した。【０１８６】
次にエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637をRSF-Red-TERで形質転換し、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637/RSF-Red-TER株を得た。同株を40μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地で終夜培養を行い、この培養液を40μg/ml クロラムフェニコールと0.4mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイドを含有するLB培地50mLに1/100量接種し、4時間31℃で培養を行った。菌体を集菌し、氷冷した10%グリセロールで３回洗菌した後、最終的に0.5mLの10%グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとし、上項で調製したPCR断片を、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたLB培地を添加し、31℃で2時間振盪培養を行った後、LB培地に25μg/mlのテトラサイクリンを加えた培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRによりadhE遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と置換していることを確認した。【０１８７】
＜9-2＞AJ110637ΔadhE株におけるピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子増強株の構築
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔadhE株において、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpycを増幅することにより、コハク酸の生成能を付与することとした。【０１８８】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のpycをAJ110637ΔadhE株で発現させるために、エシェリヒア・コリ MG1655株のスレオニンオペロンプロモーター断片の取得を試みた。エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列（Genbank Accession No. U00096）は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1474 (1997)）。本配列を基にスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'プライマーとしてSacIサイトを有する配列番号75に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番号76に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片（A）（配列番号77）を得た。【０１８９】
更に、コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC13869）由来のpyc遺伝子断片の取得を行った。5'プライマーとして配列番号78に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとしてSacIサイトを有する配列番号79に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC13869）由来のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、pyc遺伝子断片（B）（配列番号80）を得た。【０１９０】
上記、断片（A）と（B）を鋳型にし、配列番号75と配列番号79のプライマーを用いてPCR反応を行い、断片（A）と（B）が結合された遺伝子断片（C）を得た。この遺伝子断片（C）を制限酵素SacIにて処理、精製した産物を、制限酵素SacIで消化したプラスミドベクターpSTV28（宝バイオ社製）に結合して、pyc増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pycを構築した。【０１９１】
上述のエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhE株に、pyc増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pycをエレクトロポレーションにより導入し、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhEのpyc増幅株をAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pycと名付けた。【０１９２】
＜9-3＞AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pycにおけるエンテロバクター・アエロゲネス由来ybjL遺伝子増強株の構築
上述と同様にエシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'プライマーとして配列番号81に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番82に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片（A）（配列番号83）を得た。【０１９３】
次にエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株のybjL遺伝子のクローニングを行う為に、5'プライマーとして配列番号84に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番号85に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、ybjL遺伝子断片（B）（配列番号86）を得た。【０１９４】
上記、断片（A）と（B）を鋳型にし、配列番号81と配列番号85のプライマーを用いてPCR反応を行い、断片（A）と（B）が結合された遺伝子断片（C）を得た。この遺伝子断片（C）をTaKaRa BKL Kit（宝バイオ社製）にて平滑末端化し、さらに5'末端のリン酸化を行った。その後、制限酵素SmaIで消化し、Alkaline Phosphataseで脱リン酸化処理されたプラスミドベクターpMW218に結合して、ybjL増幅用プラスミドpMW218::Pthr::Ent-ybjLを構築した。【０１９５】
上述のエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637由来のybjL遺伝子増幅用ベクターpMW218::Pthr::Ent-ybjLと、対照用プラスミドpMW218をエレクトロポレーションによりエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc株に各々導入し、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、及びカナマイシン耐性を示す形質転換体を得た。エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc株由来のybjL増幅株をAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL、対照のpMW218導入株をAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218と名付けた。【０１９６】
＜9-4＞エンテロバクター属細菌でのエンテロバクター・アエロゲネス由来ybjL増幅の効果
AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL、AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218を、各々50μg/mlのカナマイシン、25μg/mlのテトラサイクリン、及び40μg/mlのクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、31.5℃にて16時間培養した。その後、シード培地（バクトトリプトン 20g/l、イーストエキストラクト 10g/l NaCl 20g/L）3mlが分注された試験管に植菌し、31.5℃で16時間、振とう培養を行った。得られた培養液にコハク酸生産培地（グルコース100g/l、3時間以上、乾熱滅菌をした炭酸カルシウム50g/L）3mlを添加後、シリコン栓にて密閉し、31.5℃で24時間振とう培養を行った。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simadzu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simadzu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
24時間目のコハク酸蓄積を表８に示す。
ybjL遺伝子増幅株AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjLでは、対照のAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218と比べて、顕著にコハク酸蓄積、及びコハク酸対消費糖収率が上昇した。【０１９７】
【表８】
2008133161.tif 000010
【０１９８】
〔配列表の説明〕
配列番号１：Pantoea ananatisのybjL遺伝子
配列番号２：Pantoea ananatisのYbjL
配列番号３：Esherichia coliのybjL遺伝子
配列番号４：Escherichia coliのYbjL
配列番号５：Pantoea ananatisとEscherichia coliのYbjLの共通配列
配列番号６：ams遺伝子破壊用プライマー
配列番号７：ams遺伝子破壊用プライマー
配列番号８：P. ananatisのybjL増幅用プライマー
配列番号９：P. ananatisのybjL増幅用プライマー
配列番号10：RSFCPGプラスミド配列
配列番号11：E. coli W3110のybjL増幅用プライマー
配列番号12：E. coli W3110のybjL増幅用プライマー
配列番号13：ldhA欠損用プライマー
配列番号14：ldhA欠損用プライマー
配列番号15：ldhA欠損確認用プライマー
配列番号16：ldhA欠損確認用プライマー
配列番号17：lldD欠損用プライマー
配列番号18：lldD欠損用プライマー
配列番号19：lldD欠損確認用プライマー
配列番号20：lldD欠損確認用プライマー
配列番号21：スレオニンプロモーター配列
配列番号22：E. coli MG1655のybjL増幅用プライマー
配列番号23: E. coli MG1655のybjL増幅用プライマー
配列番号24：Salmonella typhimuriumのybjL遺伝子
配列番号25：Salmonella typhimuriumのYbjL
配列番号26：Yersinia pestisのybjL遺伝子
配列番号27：Yersinia pestisのYbjL
配列番号28：Erwinia carotovoraのybjL遺伝子
配列番号29：Erwinia carotovoraのYbjL
配列番号30：Vibrio choleraeのybjL遺伝子
配列番号31：Vibrio choleraeのYbjL
配列番号32：Aeromonas hydrophiaのybjL遺伝子
配列番号33：Aeromonas hydrophiaのYbjL
配列番号34：Photobacterium profundumのybjL遺伝子
配列番号35：Photobacterium profundumのYbjL
配列番号36：Eshcerichia coliのldhA遺伝子
配列番号37：Eshcerichia coliのLdhA
配列番号38：Eshcerichia coliのlldD遺伝子
配列番号39：Eshcerichia coliのLldD
配列番号40：パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列
配列番号41：Kmr遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号42：Kmr遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号43：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号44：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号45：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号46：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号47：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号48：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号49：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号50：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号51：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号52：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号53：attL増幅用プライマー
配列番号54：attL増幅用プライマー
配列番号55：attLの塩基配列
配列番号56：attR増幅用プライマー
配列番号57：attR増幅用プライマー
配列番号58：attRの塩基配列
配列番号59：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号60：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号61：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号62：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号63：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号64：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号65：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号66：Pantoea ananatisのamsオペロン
配列番号67：Pantoea ananatisのAmsH
配列番号68：Pantoea ananatisのAmsI
配列番号69：Pantoea ananatisのAmsA
配列番号70：Pantoea ananatisのAmsC
配列番号71：Pantoea ananatisのAmsB
配列番号72：adhE欠損用プライマー塩基配列
配列番号73：adhE欠損用プライマー塩基配列
配列番号74: Enterobacter aerogenes AJ110637 adhE塩基配列（部分配列）
配列番号75：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号76：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号77：スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号78 :ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子増幅用プライマー
配列番号79 :ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子増幅用プライマー
配列番号80 :ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子断片
配列番号81：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号82：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号83：スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号84：Enterobacter aerogenes AJ110637 ybjL増幅用プライマー塩基配列
配列番号85：Enterobacter aerogenes AJ110637 ybjL増幅用プライマー塩基配列
配列番号86：Enterobacter aerogenes AJ110637 ybjLの塩基配列
配列番号87：Enterobacter aerogenes AJ110637 YbjLのアミノ酸配列
配列番号88：EscherichiaとPantoeaとEnterobacterのYbjLの共通配列
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
本発明の微生物を用いることにより、カルボキシル基を有する酸性物質の生産効率を向上させることが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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