(57)【要約】  基板(1)の主表面上に、複数の金微粒子(10)が離散的に分散されて固定されている。分子プローブ(20)の一端が金微粒子に結合し、その先端に、有機分子と特異的に結合する性質を持つ標的捕捉部(20c)が固定されている。金微粒子の分布密度を制御することにより、分子プローブの分布密度を制御することガできる。
2008126146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の主表面上に離散的に分散されて該基板に固定された複数の金微粒子と、
一端が前記金微粒子に結合し、先端には、有機分子と特異的に結合する性質を持つ標的捕捉部が固定された複数の分子プローブと
を有する有機物質検出デバイス。
【請求項２】
前記金微粒子の直径は、０．４５〜１．２ｎｍである請求項１に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項３】
前記金微粒子の半径の平均値をｒ（ｎｍ）、前記分子プローブの長さの平均値をＬ（ｎｍ）としたとき、金微粒子の分布密度（個／ｍ２）が３／（２０π２Ｌ２ｒ２×１０−１８）以下である請求項１または２に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項４】
前記分子プローブは、Ａｕ−Ｓ結合により前記金微粒子に結合している請求項１乃至３のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項５】
前記分子プローブは、ヌクレオチド鎖を含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項６】
前記基板は、その主表面に、金以外の導電性材料で形成された作用電極を含み、前記金微粒子は、該作用電極上に固定されている請求項１乃至５のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項７】
前記分子プローブの各々の先端に、さらに蛍光色素が固定されている請求項６に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項８】
さらに、
前記基板を収容すると共に、測定対象の試料溶液を収容する容器と、
前記基板に固定されている前記分子プローブに励起光を照射する光源と、
前記分子プローブの先端に固定された蛍光色素から放射される蛍光を検出する光検出器と、
前記容器に収容された試料溶液に浸漬され、前記基板上の作用電極と対をなす対向電極と、
前記容器に収容された試料溶液に基準電位を与える参照電極と、
前記参照電極に対する作用電極の電位を測定し、該作用電極の電位の符号が周期的に反転するように、前記作用電極と対向電極との間に電圧を印加する電源と
を有する請求項７に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項９】
前記電源は、前記作用電極の電位の符号が反転する周期を変化させることができる請求項８に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項１０】
支持基板の上に、金とは異なる導電材料からなる作用電極を形成する工程と、
前記作用電極の表面上に、金微粒子を分散させて固定する工程と、
有機分子と特異的に結合する性質を持つ標的捕捉部が先端部に固定され、基部には、金と結合する結合部を有する複数の分子プローブの該基部を、前記金微粒子に結合させる工程と
を有する有機物質検出デバイスの製造方法。
【請求項１１】
前記金微粒子の直径は、０．４５〜１．２ｎｍである請求項１０に記載の有機物質検出デバイスの製造方法。
【請求項１２】
前記金微粒子の半径の平均値をｒ（ｎｍ）、前記分子プローブの長さの平均値をＬ（ｎｍ）としたとき、金微粒子の分布密度（個／ｍ２）が３／（２０π２Ｌ２ｒ２×１０−１８）以下になるように該金微粒子を分散させる請求項１０または１１に記載の有機物質検出デバイスの製造方法。
【請求項１３】
前記分子プローブの基部が、チオール基またはジチオール基を有する請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイスの製造方法。
【請求項１４】
前記分子プローブがヌクレオチド鎖を含む請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイスの製造方法。
【請求項１５】
前記分子プローブの各々の先端に、さらに蛍光色素が固定されている請求項１４に記載の有機物質検出デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、先端に、特定の有機分子、例えば特定の蛋白質と特異的に結合する標的捕捉部、例えば抗体等が固定されている分子プローブを利用した有機物質検出デバイス及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の蛋白質と特異的に結合する抗体が先端に固定された複数の分子プローブを基板上に結合させた有機物質検出デバイスが注目されている。基板表面には、二電極法または三電極法の作用電極となる導電膜が形成されており、分子プローブの基部が、この導電膜に結合している。分子プローブには、オリゴヌクレオチド分子等が用いられる。オリゴヌクレオチド分子は、リン酸の負電荷を多数含むため、負に帯電している。【０００３】
作用電極に正電位を与えると、分子プローブは静電引力により基板上に横たわる。逆に、作用電極に負電位を与えると、静電斥力により、分子プローブが立上る。先端の抗体に蛋白質が結合している場合には、その慣性のため、分子プローブの姿勢の変化が生じにくくなる。分子プローブの姿勢の変化を、例えば光学的に検出することにより、標的となる蛋白質の濃度に関する情報を得ることができる。【０００４】
分子プローブが基板上に密に分布すると、各分子プローブの姿勢の自由な変化が、隣接する分子プローブによって妨げられる。分子プローブの姿勢の自由な変化を許容するために、分子プローブの分布密度を適切に制御することが望まれる。【０００５】
以下、分子プローブの分布密度を制御して、基板上に固定化させる方法について説明する。【０００６】
分子プローブとアルカンチオールとが一定のモル比で溶解した溶液を作製する。分子プローブの基部は、チオール基で修飾されている。この溶液中に、金表面を有する基板を浸漬させる。Ａｕ−Ｓ結合反応が生ずることにより、分子プローブ及びアルカンチオールが基板表面に結合する。【０００７】
図９Ａに、分子プローブとアルカンチオールとが基板に結合した状態を模式的に示す。分子プローブ２０の基部のＳ原子、及びアルカンチオール２２の基部のＳ原子が、基板１の表面に結合している。溶液中の分子プローブとアルカンチオールとのモル比を調節することにより、基板１の表面に結合する分子プローブ２０の分布密度を制御することができる（例えば、下記の特許文献１）。【０００８】
分子プローブ２０が基板表面上でコロニーを形成すると、局所的に分子プローブ２０の密度が高くなり、その姿勢の変化が阻害されてしまう。基板１の表面に結合したアルカンチオール２２は、分子プローブ２０のコロニーの形成を防止する機能も有する。【０００９】
図９Ａに示すように、分子プローブ２０は、分子ワイヤ２０ｂ、及びその先端に固定された抗体２０ｃ及び蛍光色素２０ｄを含む。抗体２０ｃは、特定の標的となる蛋白質等と特異的に結合する。ヌクレオチド鎖２０ｃは、負に帯電している。基板１に負電位を与えると、静電斥力により、図９Ａに示したように分子プローブ２０が立上る。逆に、基板１に正電位を与えると、静電引力により、図９Ｂに示したように分子プローブ２０が横たわる。【００１０】
分子プローブ２０が横たわった状態では、蛍光色素２０ｄに励起光を照射しても、励起エネルギの一部が基板１に移動するクエンチング効果により、発する蛍光が弱くなる。従って、この蛍光の強度を計測することにより、分子プローブ２０の姿勢を判定することができる。【００１１】
【特許文献１】特開２００６−３０８３７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
溶液中に基板を浸漬させて分子プローブとアルカンチオールとを基板表面に結合させる方法では、分子プローブ２０の分布密度が、人為的に制御困難な溶液の対流や分子の拡散の影響を受ける。このため、分布密度の再現性が十分ではない。【００１３】
また、図９Ｂに示すように、分子プローブ２０が基板１上に横たわった状態でも、蛍光色素２０ｄと基板１との間にアルカンチオール２２の層が介在する。このため、蛍光色素２０ｄが基板１の表面に十分近づけず、蛍光の強度を十分低下させることができない。【００１４】
本発明の目的は、分子プローブの分布密度の再現性を高めることが可能な有機物質検出デバイス及びその製造方法を提供することである。本発明の他の目的は、分子プローブが基板上に横たわったときの蛍光の強度を十分低下させることが可能な有機物質検出デバイス及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一観点によると、
基板の主表面上に離散的に分散されて該基板に固定された複数の金微粒子と、
一端が前記金微粒子に結合し、先端には、有機分子と特異的に結合する性質を持つ標的捕捉部が固定された複数の分子プローブと
を有する有機物質検出デバイスが提供される。【００１６】
分子プローブの先端に、さらに、蛍光色素を固定することが好ましい。【００１７】
本発明の他の観点によると、
支持基板の上に、金とは異なる導電材料からなる作用電極を形成する工程と、
前記作用電極の表面上に、金微粒子を分散させて固定する工程と、
有機分子と特異的に結合する性質を持つ標的捕捉部が先端部に固定され、基部には、金と結合する結合部を有する複数の分子プローブの該基部を、前記金微粒子に結合させる工程と
を有する有機物質検出デバイスの製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
金微粒子に分子プローブが結合するため、金微粒子の分布密度を制御することにより、分子プローブの分布密度を制御することが可能になる。分子プローブが結合していない領域にアルカンチオール等を結合させておく必要がないため、分子プローブが横たわったときに、その先端が基板表面に、より近接する。このため、分子プローブの先端に蛍光色素が固定されている場合には、クエンチング効果により、蛍光の強度をより低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、実施例による有機物質検出デバイスに用いられる電圧駆動型プロテインチップの概略斜視図であり、図１Ｂは、１つの金粒子及びそれに結合した分子プローブを模式的に示す図である。
【図２】図２は、１つの金粒子と、それに結合する硫黄原子との位置関係を模式的に示す平面図である。
【図３】図３は、微粒子堆積装置の概略図である。
【図４】図４は、微粒子堆積装置に用いられる分級装置の概略図である。
【図５】図５は、実施例による有機物質検出デバイスの全体構成を示す概略図である。
【図６】図６Ａは、作用電極の電位の時間変化を示すグラフであり、図６Ｂは、蛍光色素から発する蛍光の強度の時間変化を示すグラフである。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ分子プローブが立上った状態及び横たわった状態の電圧駆動型プロテインチップの概略斜視図であり、図７Ｃは、横たわった状態の分子プローブを模式的に示す図である。
【図８】図８は、蛍光の時間変化の実際の測定結果を示すグラフである。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ、従来の電圧駆動型プロテインチップの、分子プローブが立上った状態及び横たわった状態を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００２０】
１  基板
１ａ  下地基板
１ｂ  密着層
１ｃ  作用電極
１０  金微粒子
１０ａ  金原子
２０  分子プローブ
２０ａ  結合部
２０ｂ  分子ワイヤ
２０ｃ  標的捕捉部
２０ｄ  蛍光色素
２２  アルカンチオール
２５  標的蛋白質
３０  容器
３１  対向電極
３２  参照電極
３３  電源
４０  光源
４１  光ファイバ
４５  光検出器
４６  光ファイバ
５０  試料溶液
６０  堆積チャンバ
６１  ステージ
６５  収束部
６５ａ  静電レンズ
６６  高真空部
６７  真空部
７０  ノズル
７３  分級装置
７４  荷電装置
７５  微粒子発生装置
７６  キャリアガス供給装置
８０、８１  真空ポンプ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１Ａに、実施例による有機物質検出デバイスに用いられる電圧駆動型プロテインチップの概略斜視図を示す。基盤１の、金とは異なる材料が露出した主表面上に、金微粒子１０が離散的に分散されて固定されている。分子プローブ２０の基部が、金微粒子１０に結合している。金微粒子１つ当たり４本程度の分子プローブ２０が結合する。【００２２】
図１Ｂに、１つの金微粒子１０、及びそれに結合した分子プローブ２０を模式的に示す。基板１は、サファイア等の下地基板１ａの上に、密着層１ｂを介して作用電極１ｃが形成された積層構造を有する。下地基板１ａの厚さは、例えば約３５０μｍである。密着層１ｂは、例えばＴｉで形成されており、その厚さは約５ｎｍである。作用電極１ｃは、例えばＰｔで形成されており、その厚さは約４０ｎｍである。作用電極１ｃの表面に、金微粒子１０が固定されている。金微粒子１０の寸法（球体と仮定した場合の直径に相当）は、例えば０．９ｎｍ程度である。【００２３】
分子プローブ２０は、分子ワイヤ２０ｂ、その基部の結合部２０ａ、その先端に固定された標的捕捉部２０ｃ及び蛍光色素２０ｄにより構成される。分子ワイヤ２０ｂの長さは、例えば１５ｎｍ程度である。結合部２０ａはＳ原子を含む。このＳ原子と、金微粒子１０のＡｕ原子とのＡｕ−Ｓ結合により、分子プローブ２０が金微粒子１０に結合している。【００２４】
分子ワイヤ２０ｂは、例えば、ヌクレオチド鎖で構成される。ヌクレオチド鎖の分子中には、負電荷が一定間隔で分布している。なお、分子ワイヤ２０ｂとして、その他のイオン性ポリマを用いてもよい。正に帯電したイオン性ポリマの例として、ポリグアニジン等が挙げられる。負に帯電したイオン性ポリマとして、ポリリン酸等が挙げられる。分子ワイヤ２０ｂは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、二本鎖の一部が一本鎖になったものでもよい。【００２５】
標的捕捉部２０ｃは、測定対象である有機分子（標的有機分子）２５と特異的に結合することにより、有機分子２５を捕捉する。【００２６】
標的有機分子２５として、例えば蛋白質、血漿蛋白、腫瘍マーカ、アポ蛋白、ウイルス、自己抗体、凝固因子、線溶因子、ホルモン、血中薬物、核酸、ＨＬＡ抗原、リポ蛋白、糖蛋白、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類等が挙げられる。【００２７】
標的捕捉部２０ｃは、標的に対する抗体、抗原、酵素、補酵素等で構成される。また、抗体を例えば蛋白質分解酵素で限定分解して得られる当該抗体の断片（フラグメント）、または測定対象蛋白質に対して親和性を有する有機化合物や生体高分子等で構成してもよい。抗体の例として、例えば、モノクローナルな免疫グロブリンＩｇＧ抗体が挙げられる。また、ＩｇＧ抗体に由来する断片の例として、例えばＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントが挙げられる。さらに、Ｆａｂフラグメントに由来する断片等を使用することもできる。測定対象蛋白質に対して親和性を有する有機化合物の例として、ブタン酸、ピルビン酸、チロシン等の酵素基質またはそのアナログ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）等の補酵素、ジエチルスチルベストロール、酒石酸ブリモニジン、９−ｃｉｓレチン酸等の作動剤（アゴニスト）、テトロドトキシン、ナロキソン、６−メルカプトプリン等の拮抗剤（アンタゴニスト）等が挙げられる。上述の化合物が分子ワイヤ２０ｂに直接連結して固定することができない場合には、連結部分（一般には二価の原子団）を介在させることで固定するようにしてもよい。【００２８】
蛍光色素２０ｄは、光の作用で励起されて蛍光を発する。蛍光色素２０ｄとして、例えばフルオレセインマレイミドＣｙ３（商標）等を用いることができる。【００２９】
図２を参照して、１つの金微粒子１０に結合できる分子プローブ２０の本数について説明する。金微粒子１０を、直径０．９ｎｍの球体と仮定する。その表面のうち基板側を向く領域は、基板に接触するか、または基板表面と非常に近接している。このため、基板側を向く領域には、立体障害により分子プローブ２０が結合できない。分子プローブ２０が結合できる領域は、実質的に、球体表面の半分の領域である。この領域には、約１２個のＡｕ原子が露出している。【００３０】
図２は、１つの金微粒子１０を構成するＡｕ原子１０ａ、及び金微粒子１０に結合したＳ原子２０ａの相対位置関係を示す。単純化のために、金微粒子１０の表面を、（１１１）面が露出した直径０．９ｎｍの円形であると仮定する。Ａｕ原子１０ａは、六角格子１０ｈの格子点及び各六角形の中心に位置し、相互に隣り合うＡｕ原子１０ａの中心間の距離は０．２９ｎｍである。Ｓ原子２０ａは、相互に近接した３個のＡｕ原子１０ａの中心であって、かつ、Ａｕ原子の六角格子１０ｈを縦横に３１／２倍して３０度回転させて得られる六角格子２０ｈの格子点、及び各六角形の中心に位置する。【００３１】
単純化すると、1２個のＡｕ原子に対して約４個のＳ原子が結合することになる。つまり、１つの金微粒子１０に４本程度の分子プローブ２０が結合すると考えられる。【００３２】
図３に、金微粒子２０を基板１の表面に分散させて固定するための微粒子堆積装置の概略図を示す。この微粒子堆積装置は、例えば特開２００６−１１７５２７号公報に開示されている。【００３３】
微粒子発生装置７５が、レーザアブレーションや蒸発凝縮法等により、金微粒子を生成する。例えば、圧力３×１０３Ｐａ程度にされた微粒子発生チャンバ内にＡｕターゲットを配置し、繰返し周波数２０ＨｚのＮｄ：ＹＡＧレーザの２倍高調波を入射させることにより、金の蒸気を発生させる。この蒸気が、キャリアガス供給装置７６から供給されたキャリアガスによって冷却され、核凝縮により金微粒子が生成される。キャリアガスとして、例えば純度９９．９９９９５％、流量１ＳＬＭのヘリウムガスが用いられる。生成された金微粒子は、キャリアガスによって荷電装置７４まで輸送される。【００３４】
荷電装置７４は、放射線照射、紫外線照射等の方法により、金微粒子を帯電させる。例えば、金微粒子をチューブ型の電気炉で８００℃程度まで加熱し、アメリシウム２４１（２４１Ａｍ）の放射線源からの放射線により帯電させる。帯電した金微粒子は、分級装置７３まで輸送される。分級装置７３は、微分式移動度測定器（ＤＭＡ）等を利用して、所望の寸法の金微粒子を抽出する。【００３５】
図４に、分級装置７３の概略図を示す。分級装置７３は、外側の円筒（外筒）９０と内側の円筒（内筒）９１とを含む二重円筒構造を有する。例えば内筒９１の外径は１１ｍｍであり、外筒９０の内径は１８ｍｍである。外筒９０と内筒９１との間に、直流電圧が印加されている。外筒９０の上端近傍に形成されたシースガス導入口９２から、外筒９０と内筒９１との間の空間にシースガスが導入される。シースガスは、フィルタ９４を通過して、外筒９０と内筒９１との間の空間を経由し、外筒９０の下端に設けられた排出口９３から外部に排出される。【００３６】
外筒９０に上部スリット９５が設けられ、内筒９１に下部スリット９６が設けられている。下部スリット９６は、上部スリット９５よりも、シースガス流の下流側に配置されている。上部スリット９５と下部スリット９６との、軸方向に関する距離は例えば２１０ｍｍである。上部スリット９５から、金微粒子が、キャリアガスと共に、外筒９０と内筒９１との間の空間内に導入される。金微粒子は、外筒９０と内筒９１との間に発生している電場によって内筒９１に引き寄せられる。引き寄せられる速さは、金微粒子の寸法に依存する。このため、ある一定の寸法の金微粒子のみが下部スリット９６を通過する。【００３７】
下部スリット９６を通過した金微粒子が、内筒９１内の流路９７を通って、図３に示したノズル７０に輸送される。シースガスの流量、及び外筒９０と内筒９１との間の電圧を制御することにより、所望の寸法の金微粒子を抽出（分級）することができる。【００３８】
図３に戻って説明を続ける。分級された金微粒子を含むキャリアガスが、ノズル７０を通って、堆積チャンバ６０の真空部６７に導入される。ノズル７０は、オリフィスまたはキャピラリを有する。堆積チャンバ６０内は、真空ポンプ８０及び８１により差動排気されている。真空部６７に導入された金微粒子及びキャリアガスは、差動排気により高真空とされた高真空部６６に輸送される。【００３９】
高真空部６６に輸送された金微粒子は、静電レンズ６５ａを含む収束部６５により、パーティクルビームとされる。このパーティクルビームは、可動ステージ６１上に載置された基板１に照射される。これにより、基板１上に金微粒子がほぼ一様に分布して、固定される。この方法により得られる金微粒子の粒径は、その平均粒径の±１０％の範囲内に分布する。基板１上に堆積する金微粒子の面密度は、微粒子発生装置７５のレーザ出力及びレーザ照射時間を変化させることによって、再現性よく制御することができる。【００４０】
なお、他の方法で金微粒子１０を形成してもよい。例えば、基板１上に０〜３原子層程度の金膜を蒸着し、約５００℃で１時間の熱処理を行ってもよい。金膜の膜厚のばらつきにより、熱処理時に粒径０．９ｎｍ程度のアイランド、すなわち金微粒子が形成される。【００４１】
次に、金微粒子１０に分子プローブ２０を結合させる方法について説明する。一端がアルカンチオール基、例えばメルカプトヘキサノール（ＭＣＨ）の誘導体、５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６（商標）で修飾され、先端に標的捕捉部２０ｃ及び蛍光色素２０ｄが固定された分子プローブ２０を準備する。分子プローブ２０の合成は、化学合成法、発酵生産法等により行うことができる。また、市販品を用いてもよい。【００４２】
分子プローブ２０を、溶媒中に分散または溶解させる。溶媒として、水、アルコール、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤を含有する液等を用いることができる。表面に金微粒子１０が固定された基板１を、この溶液中に浸漬させる。チオール基のＳ原子が、金微粒子１０のＡｕ原子に結合することにより、分子プローブ２０が金微粒子１０に結合する。Ｐｔ、Ｗ、Ｉｒ、またはＲｈからなる作用電極１ｃには分子プローブ２０が結合し難い。【００４３】
このため、金微粒子１０の分布密度によって、分子プローブ２０の分布密度が決定される。金微粒子１０の分布密度を再現性よく制御することが可能であるため、分子プローブ２０の分布密度の制御性も高まる。【００４４】
図５に、有機物質検出デバイスの全体構成の概略図を示す。容器３０内に試料溶液５０が収容されている。試料溶液５０は、測定対象の蛋白質等が溶解した緩衝溶液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌである。試料溶液５０内に、図１に示した電圧駆動型プロテインチップが浸漬されている。【００４５】
励起用光源４０が励起光を出射する。出射された励起光は、光ファイバ４１を経由して電圧駆動型プロテインチップの蛍光色素２０ｄに照射される。励起用光源４０として、例えば発振波長５１４．５ｎｍ、出力５００μＷのＡｒレーザを用いることができる。【００４６】
蛍光色素２０ｄで発生した蛍光が、他の光ファイバ４６を経由して、光検出器４５まで導かれる。蛍光色素２０ｄにＣｙ３（商標）を用いた場合、蛍光のスペクトルは、波長５２０〜７５０ｎｍの範囲の広がりを持つ。光検出器４５は、蛍光色素２０ｄからの蛍光のうち特定の波長、例えば波長５６５ｎｍの光の強度を測定する。【００４７】
対向電極３１及び参照電極３２が、試料溶液５０に浸漬されている。対向電極３１は、例えばＰｔで形成される。参照電極３２は、三電極法に用いられる一般的なものであり、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）である。電圧駆動型プロテインチップの作用電極１ｃ、対向電極３１、及び参照電極３２が、測定用電源３３に接続されている。【００４８】
測定用電源３３は、参照電極３２を基準としたときの作用電極１ｃの電位が所定の大きさになるように、作用電極１ｃと対向電極３１との間に電圧を印加する。【００４９】
図６Ａに、作用電極１ｃの電位の時間変化の一例を示す。横軸は経過時間を単位「秒」で表し、縦軸は作用電極１ｃの電位を表す。作用電極１ｃの電位の絶対値がＶｗになり、その極性が２秒ごとに反転する。すなわち、作用電極１ｃの電位の変動は、周期が４秒、周波数が０．２５Ｈｚの方形波になる。電位の絶対値Ｖｗは、例えば２００ｍＶである。【００５０】
図７Ａ及び図７Ｃに、それぞれ作用電極１ｃの電位が負及び正になっているときの分子プローブ２０の状態を示す。分子プローブ２０を構成する分子ワイヤ２０ｂが負に帯電しているため、作用電極１ｃの電位が負のとき、図７Ａに示すように分子プローブ２０が立上り、作用電極１ｃの電位が正のとき、図７Ｂに示すように分子プローブ２０が横たわる。【００５１】
図６Ｂに、光検出器４５で測定される光強度の時間変動を示す。横軸は経過時間を単位「秒」で表し、縦軸は光強度を表す。作用電極１ｃの電位が負の期間は、分子プローブ２０が立上っているため、作用電極の金属膜によりクエンチング効果が発現せず、光強度が相対的に高くなる。作用電極１ｃの電位が正の期間は、分子プローブ２０が横たわっているため、クエンチング効果の影響により、光強度が相対的に低くなる。【００５２】
作用電極１ｃの電位の極性が反転する周波数（以下、「測定周波数」という。）が０．２Ｈｚ程度の低い周波数であれば、分子プローブ２０は、電位の変化に追随してその姿勢を変化させる。ところが、測定周波数を高く（例えば、１ｋＨｚ）すると、分子プローブ２０の姿勢の変化が、電位の変化に追随できなくなる。このため、光検出器４５で測定される光強度の振幅が低下する。標的捕捉部２０ｃに標的有機分子２５が捕捉された状態では、その質量の影響を受けて、分子プローブ２０の姿勢変化が電位の変化に追随できる最高周波数が低下する（周波数応答性が低下する）。【００５３】
蛍光の光強度の振幅の減少、または分子プローブ２０の姿勢変化の周波数応答性の低下から、試料溶液５０内の標的有機分子の濃度を、高感度に、かつ迅速に計測することができる。【００５４】
また、分子プローブ２０に捕捉された測定対象蛋白質と蛍光色素との距離が短い（例えば、数〜１００ｎｍ）ために、捕捉された蛋白質が蛍光を吸収（消光）する。すなわち、測定対象蛋白質が分子プローブ２０に捕捉されると、光検出器４５で検出される光強度が低下する。この光強度の低下を検出することにより、測定対象蛋白質の濃度を計測することも可能である。【００５５】
図７Ｃに、基板上に横たわっている状態の分子プローブ２０を模式的に示す。図９Ｂに示した従来例では、分子プローブ２０が横たわっているとき、蛍光色素２０ｄと基板１の表面（すなわち作用電極）との間にアルカンチオール２２からなる層が介在していた。これに対し、実施例の場合には、作用電極１ｃの表面がアルカンチオール等で被覆されておらず、露出している。このため、蛍光色素２０ｄが作用電極１ｃにより近接する。このため、大きなクエンチング効果が発現する。これにより、作用電極１ｃの電位が正の期間の光強度が、より弱くなる。すなわち、作用電極１ｃの極性が異なっている２つの期間における光強度の高低差が大きくなる。【００５６】
図８に、光強度の測定結果の一例を示す。横軸は経過時間を単位「秒」で表し、縦軸は検出された光子数を単位「個/秒」で表す。実線が、実施例による有機物質検出デバイスにより測定された光強度を示し、破線が、図９Ｂに示したプロテインチップを用いた比較例の光強度を示す。光子数を計数する単位時間を２００ｍｓとした。このため、図８において、横軸の経過時間は、２００ｍｓごとの単位時間に区分されている。なお、図８は、１５分間に亘る測定結果を積分したものである。【００５７】
実施例による有機物質検出デバイスで検出された光強度の振幅が、比較例の有機物質検出デバイスで測定された光強度の振幅よりも大きくなっていることがわかる。特に、実施例の場合には、作用電極１ｃに正電位を与えた時の蛍光の強度が低くなっている。このように、光強度の振幅が大きくなるため、雑音の影響を排除して信頼性の高い測定を高感度で行うことが可能になる。【００５８】
上記実施例では、長さ１５ｎｍ程度の分子プローブ２０を用いたが、分子プローブ２０の長さを２〜１００ｎｍとしてもよい。分子プローブ２０が短すぎると、分子プローブ２０が立ち上がっても作用電極によるクエンチングが解けないため、光強度の振幅が低下する。このため、検出感度を高めることが困難である。逆に、分子プローブ２０が長すぎると、分子プローブ２０の姿勢の自由な変化を許容するために、分子プローブ２０の分布密度を低くしなければならない。分子プローブ２０の分布密度が低いと、蛍光の強度が低下する。特に、分子プローブ２０の長さが１００ｎｍを超えると、分布密度を低くせざるを得ないため、分子プローブ２０が立ち上がった状態でも、蛍光強度が光検出器４５のノイズレベルと同程度になってしまう。【００５９】
また、上記実施例では、金微粒子の直径を０．９ｎｍ程度としたが、０．４５〜１．２ｎｍとしてもよい。金微粒子が小さすぎると、Ｓ原子が安定して金微粒子に結合できなくなる。少なくとも１個のＳ原子が安定して結合できるために、金微粒子の直径を０．４５ｎｍ以上とすることが好ましい。また、金微粒子が大きくなりすぎると、１個の金微粒子に結合するＳ原子が多くなり、分子プローブが局所的に密集することになる。分子プローブが密集すると、その姿勢変化が生じにくくなる。このため、金微粒子の直径を１．２ｎｍ以下とすることが好ましい。直径１．２ｎｍの金微粒子には、約７本の分子プローブが結合する。【００６０】
基板上における分子プローブ２０の分布密度が高すぎると、分子プローブ２０が、それに隣接する分子プローブ２０と接触して、基板上に横たわり難くなる。逆に、分子プローブ２０の分布密度が低すぎると、検出感度が低下する。長さ１５ｎｍ程度の分子プローブ２０が基板上に容易に横たわるようにするために、基板表面における分子プローブ２０の分布密度の好適範囲の上限は１．４×１０１５本／ｍ２程度である。１つの金微粒子１０に４本程度の分子プローブ２０が結合するため、金微粒子１０の分布密度の好適範囲の上限は、３．５×１０１４個／ｍ２程度っである。【００６１】
また、十分な検出感度を確保するために、分子プローブ２０が立ち上がったときの蛍光強度が、光検出器４５のノイズレベルから一桁程度大きくなるように、分子プローブ２０の分布密度を設定することが好ましい。一例として、分子プローブ２０の分布密度を３×１０１３本／ｍ２以上にすることが好ましい。なお、蛍光強度の測定系のノイズレベルが低い場合には、分子プローブ２０の分布密度を低くしてもよい。【００６２】
分子プローブ２０の長さをＬ（ｎｍ）、金微粒子１０の半径をｒ（ｎｍ）とすると、金微粒子１０の分布密度の好適範囲の上限Ａｍａｘ（個／ｍ２）は、
Ａｍａｘ＝３／（２０π２Ｌ２ｒ２×１０−１８）
と算出される。以下、上式の導出課程を示す。【００６３】
長さＬの分子プローブ２０が互いに干渉することなく横たわることができる最大表面密度Ｐｍａｘ（本／ｍ２）は、
Ｐｍａｘ＝１／（πＬ２×１０−１８）
と表すことができるである。半径ｒの金微粒子１０の表面に露出しているＡｕ原子に安定して結合できる分子プローブ２０の本数Ｎ（本／個）は、
Ｎ＝２０πｒ２／３
となる。ここで、金微粒子表面に露出しているＡｕ原子の排除面積が０．１ｎｍ２であること、Ａｕ原子３個あたり１個のＳ原子が結合すること、及び作用電極表面による立体障害を受けることなく安定にＳ原子が結合できる領域は、球体表面の半分であることを仮定した。金微粒子１０の分布密度の好適範囲の上限Ａｍａｘ（本／ｍ２）は、
Ａｍａｘ＝Ｐｍａｘ／Ｎ＝３／（２０π２Ｌ２ｒ２×１０−１８）
と算出される。一般的には、金微粒子の半径の平均値をｒ（ｎｍ）、分子プローブ２０の長さの平均値をＬ（ｎｍ）としたとき、金微粒子の分布密度（個／ｍ２）を、
３／（２０π２Ｌ２ｒ２×１０−１８）
以下とすることが好ましい。【００６４】
以上実施例に沿って本発明を説明したが、本発明はこれらに制限されるものではない。例えば、種々の変更、改良、組み合わせ等が可能なことは当業者に自明であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月24日(2009.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の主表面上に離散的に分散されて該基板に固定された複数の金微粒子と、
一端が前記金微粒子に結合し、先端には、有機分子と特異的に結合する性質を持つ標的捕捉部が固定された複数の分子プローブと
を有する有機物質検出デバイス。
【請求項２】
前記金微粒子の直径は、０．４５〜１．２ｎｍである請求項１に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項３】
前記金微粒子の半径の平均値をｒ（ｎｍ）、前記分子プローブの長さの平均値をＬ（ｎｍ）としたとき、金微粒子の分布密度（個／ｍ２）が３／（２０π２Ｌ２ｒ２×１０−１８）以下である請求項１または２に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項４】
前記分子プローブは、Ａｕ−Ｓ結合により前記金微粒子に結合している請求項１乃至３のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項５】
前記分子プローブは、ヌクレオチド鎖を含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項６】
前記基板は、その主表面に、金以外の導電性材料で形成された作用電極を含み、前記金微粒子は、該作用電極上に固定されている請求項１乃至５のいずれか１項に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項７】
前記分子プローブの各々の先端に、さらに蛍光色素が固定されている請求項６に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項８】
さらに、
前記基板を収容すると共に、測定対象の試料溶液を収容する容器と、
前記基板に固定されている前記分子プローブに励起光を照射する光源と、
前記分子プローブの先端に固定された蛍光色素から放射される蛍光を検出する光検出器と、
前記容器に収容された試料溶液に浸漬され、前記基板上の作用電極と対をなす対向電極と、
前記容器に収容された試料溶液に基準電位を与える参照電極と、
前記参照電極に対する作用電極の電位を測定し、該作用電極の電位の符号が周期的に反転するように、前記作用電極と対向電極との間に電圧を印加する電源と
を有する請求項７に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項９】
前記電源は、前記作用電極の電位の符号が反転する周期を変化させることができる請求項８に記載の有機物質検出デバイス。
【請求項１０】
支持基板の上に、金とは異なる導電材料からなる作用電極を形成する工程と、
前記作用電極の表面上に、金微粒子を分散させて固定する工程と、
有機分子と特異的に結合する性質を持つ標的捕捉部が先端部に固定され、基部には、金と結合する結合部を有する複数の分子プローブの該基部を、前記金微粒子に結合させる工程と
を有する有機物質検出デバイスの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
基板上における分子プローブ２０の分布密度が高すぎると、分子プローブ２０が、それに隣接する分子プローブ２０と接触して、基板上に横たわり難くなる。逆に、分子プローブ２０の分布密度が低すぎると、検出感度が低下する。長さ１５ｎｍ程度の分子プローブ２０が基板上に容易に横たわるようにするために、基板表面における分子プローブ２０の分布密度の好適範囲の上限は１．４×１０１５本／ｍ２程度である。１つの金微粒子１０に４本程度の分子プローブ２０が結合するため、金微粒子１０の分布密度の好適範囲の上限は、３．５×１０１４個／ｍ２程度である。
【国際調査報告】
2008126146.tif 000012
2008126146.tif 000013