(57)【要約】  本発明は、シクロスポリンＡ結合タンパク質（ＣＳＡＢＰ）を標的とした、ＣＳＡＢＰ関連疾患の診断および／または処置、ＲＮＡウイルスの増殖の制御、およびＲＮＡ代謝系の制御のための組成物および方法、ＣＳＡＢＰを標的とする成分のスクリーニング方法、ＣＳＡＢＰを利用した、ＣｓＡ、ＮＳ５ＢまたはシクロフィリンＢの検出・阻害のための組成物および方法、ならびに、ＣＳＡＢＰのプロモーター、これを利用したＣＳＡＢＰの発現を制御する物質のスクリーニング方法、およびＣＳＡＢＰ関連疾患の発症または病期を判定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患を処置するための組成物。
【請求項２】
ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分が、ＣＳＡＢＰ、ＣＳＡＢＰの機能的変異体、ＣＳＡＢＰのドミナントネガティブ変異体、ＮＳ５Ｂ、シクロフィリンＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体、抗ＣＳＡＢＰ抗体、これらをコードする核酸、およびこれらを発現するベクター、ならびにＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣＳＡＢＰをコードする核酸またはその発現産物を検出する成分を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患を診断するための組成物。
【請求項４】
ＣＳＡＢＰをコードする核酸またはその発現産物を検出する成分が、抗ＣＳＡＢＰ抗体、シクロスポリンＡおよびその誘導体、ＮＳ５Ｂ、シクロフィリンＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体、ならびにＣＳＡＢＰをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＣＳＡＢＰ関連疾患が、ＲＮＡウイルス感染症、Ｃ型肝炎、炎症性疾患、ＲＮＡウイルスの複製を促進する状態、および腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
被験物質をＣＳＡＢＰまたはその断片と共存させる工程を含む、ＣＳＡＢＰを検出および／または制御する成分のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を含む、ＲＮＡウイルスの増殖を制御するための組成物。
【請求項８】
ＣＳＡＢＰまたはその機能的変異体を含む、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＮＳ５ＢまたはシクロフィリンＢを検出および／または阻害するための組成物。
【請求項９】
１）ＣＳＡＢＰのプロモーターと、これに作動可能に連結されたレポーター配列とを含む核酸分子を有する細胞を、被験物質と共存させる工程、および
２）レポーター配列の発現産物を検出する工程
を含む、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ＣＳＡＢＰのプロモーターに結合する物質を回収する工程を含む、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法
【請求項１１】
ｉ）配列番号３７で表される塩基配列またはその部分を含む核酸分子、
ｉｉ）ｉ）の核酸分子の塩基配列に１個または２個以上の変異を有するが、なお該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）の核酸分子の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子、および
ｉｖ）ｉ）またはｉｉ）の核酸分子と７０％以上の相同性を有し、かつ、該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子、
からなる群から選択される、ＣＳＡＢＰのプロモーター。
【請求項１２】
ＣＳＡＢＰのプロモーターを有するベクター。
【請求項１３】
ＣＳＡＢＰのプロモーターと、これに作動可能に連結されたレポーター配列とを含む核酸分子を有する細胞。
【請求項１４】
ＣＳＡＢＰ遺伝子におけるメチル化を検出する工程を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患の発症または病期を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）結合タンパク質（ＣＳＡＢＰ：Cyclosporin A binding protein）を標的とした、ＣＳＡＢＰ関連疾患の診断および／または処置、ＲＮＡウイルスの増殖の制御、およびＲＮＡ代謝系の制御のための組成物および方法、ＣＳＡＢＰを標的とする成分のスクリーニング方法、ならびに、ＣＳＡＢＰを利用した、ＣｓＡ、ＮＳ５ＢまたはシクロフィリンＢ（ＣｙＰＢ）の検出・阻害のための組成物および方法に関する。また、本発明は、ＣＳＡＢＰのプロモーター、これを利用したＣＳＡＢＰの発現を制御する物質のスクリーニング方法、およびＣＳＡＢＰ遺伝子のメチル化を検出することによるＣＳＡＢＰ関連疾患の発症または病期を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の肝臓における持続的感染は、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がんなどの慢性肝疾患の主な原因であることが知られている。本邦において約１５０万人と推定されているＨＣＶ感染者からのこれら慢性肝疾患の発症は、現在大きな公衆衛生問題となっており、ＨＣＶを排除する抗ウイルス療法の開発は急務を要する課題である。
現在Ｃ型肝炎ウイルスに対する治療としては、主にインターフェロン（ＩＦＮ）の単独投与あるいはＩＦＮとリバビリンの併用療法が適用されている。しかしこれらによる著効率は平均して３〜６割というのが実状であり、これらに代わる抗ＨＣＶ療法の開発が求められている。こうした状況を受けて、現行のインターフェロン（ＩＦＮ）を主体とする治療法を至適化する試みに加え、新たな抗ＨＣＶ剤の探索がこれまで多くの研究者や製薬企業によってなされてきた。【０００３】
例えば、ウイルス性プロテアーゼであるＮＳ３およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＮＳ５ＢはＨＣＶの増殖に必須な酵素として知られているが、ＮＳ３阻害剤としてＢＩＬＮ２０６１などが、またＮＳ５Ｂ阻害剤としてＪＴＫ−００３や特許文献１に記載のシクロアルキル複素環化合物などがそれぞれ開発されている。また、ＨＣＶゲノムＲＮＡを標的とするリボザイム（Heptazymeなど）や、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ISIS-14803など）、ｓｉＲＮＡなども開発されている。さらに、近年開発されたＨＣＶサブゲノムレプリコンシステム（非特許文献１）を用いたスクリーニングにより、ＨＣＶ複製抑制能を有する様々な化合物が同定されるようになった。かかる化合物としては、例えば、ＩＦＮγ（非特許文献２）、ＩＬ−１（非特許文献３）、ＴＧＦβ（非特許文献４）等のサイトカイン、低分子化合物として三酸化ヒ素（非特許文献５）、ビンブラスチンなどの微小管重合阻害剤（非特許文献６）、ロバスタチンなどのゲラニルゲラニル化阻害剤（非特許文献７）、ＣｓＡ（非特許文献８、非特許文献９）およびその誘導体（例えば、特許文献２に記載の修飾シクロスポリン、特許文献３に記載のＣ型肝炎治療剤）などが報告されている。しかしながら、治療効果や安全性の観点から満足できる治療剤は未だ存在せず、さらなる研究努力が求められていた。【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５０５１１４号公報
【特許文献２】特表２００７−５０４２６０号公報
【特許文献３】特開２００７−１５９２６号公報
【非特許文献１】Lohmann V, Science. 1999;285(5424):110-3
【非特許文献２】Frese M et al., Hepatology. 2002;35(3):694-703
【非特許文献３】Zhu H and Liu CJ, Virol. 2003;77(9):5493-8
【非特許文献４】Murata T et al., Virology. 2005;331(2):407-17
【非特許文献５】Hwang DR et al., Antimicrob Agents Chemother. 2004;48(8):2876-82
【非特許文献６】Bost AG et al., J Virol. 2003;77(7):4401-8
【非特許文献７】Ye J et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(26):15865-70
【非特許文献８】Watashi K et al., Hepatology. 2003;38(5):1282-8
【非特許文献９】Nakagawa M et al., Biochem Biophys Res Commun. 2004;313(1):42-7
【非特許文献１０】Watashi K et al., Mol Cell. 2005;19(1):111-22
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、治療効果に優れた新しいＨＣＶ治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行う中で、ＣｓＡに結合するタンパク質（ＣＳＡＢＰ）を見出した。そして、このＣＳＡＢＰに着目してさらに研究を進める中で、同タンパク質がＨＣＶの複製に必要なＣｙＰＢおよびＮＳ５Ｂと３量体を形成すること、同タンパク質の発現抑制によりＨＣＶの複製が抑制され、発現増強により複製が促進されること、さらには、ＣＳＡＢＰが複数の腫瘍細胞で発現しているが、正常細胞ではほとんど発現していないことを見出した。また、さらなる研究により、ＣＳＡＢＰのプロモーター領域およびＣＳＡＢＰの転写に関与する転写因子を同定するとともに、前記プロモーター領域が高頻度にメチル化されうることや、抗メチル化剤の投与によりＣＳＡＢＰの発現を増強できること、炎症性サイトカインの投与により正常細胞においてＣＳＡＢＰの発現が誘導されることをさらに見出し、本発明を完成させた。
ＣｓＡがＣｙＰＢに結合し、ＨＣＶの複製に必要なＣｙＰＢとＮＳ５Ｂとの相互作用を阻害することにより、ＨＣＶの増殖を抑制することは示唆されていたが（非特許文献１０）、ＣｙＰＢとＮＳ５Ｂとの２量体に別のタンパク質が結合して３量体を形成することや、このタンパク質がＨＣＶの複製に必須であることについては全く報告がなく、かかるタンパク質の存在は当業者といえども到底予想し得ないものであった。【０００７】
すなわち、本発明は以下に関する：
（１）ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患を処置するための組成物。
（２）ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分が、ＣＳＡＢＰ、ＣＳＡＢＰの機能的変異体、ＣＳＡＢＰのドミナントネガティブ変異体、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体、抗ＣＳＡＢＰ抗体、これらをコードする核酸、および、これらを発現するベクター、ならびにＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質からなる群から選択される上記（１）の組成物。
（３）ＣＳＡＢＰまたはこれをコードする核酸を検出する成分を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患を診断するための組成物。【０００８】
（４）ＣＳＡＢＰまたはこれをコードする核酸を検出する成分が、抗ＣＳＡＢＰ抗体、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体、ならびにＣＳＡＢＰをコードする核酸もしくはそのユニークな断片に特異的にハイブリダイズする核酸からなる群から選択される上記（３）の組成物。
（５）ＣＳＡＢＰ関連疾患が、ＲＮＡウイルス感染症、Ｃ型肝炎、炎症性疾患、ＲＮＡウイルスの複製を促進する状態、および腫瘍からなる群から選択される上記（１）〜（４）の組成物。
（６）被験物質をＣＳＡＢＰまたはその断片と共存させる工程を含む、ＣＳＡＢＰを検出および／または制御する成分のスクリーニング方法。
（７）ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を含む、ＲＮＡウイルスの増殖を制御するための組成物。
（８）ＣＳＡＢＰまたはその機能的変異体を含む、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢを検出および／または阻害するための組成物。【０００９】
（９）１）ＣＳＡＢＰのプロモーターと、これに作動可能に連結されたレポーター配列とを含む核酸分子を有する細胞を、被験物質と共存させる工程、および、２）レポーター配列の発現産物を検出する工程を含む、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質をスクリーニングする方法。
（１０）ＣＳＡＢＰのプロモーターに結合する物質を回収する工程を含む、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法。
（１１）ｉ）配列番号３７で表される塩基配列またはその部分を含む核酸分子、ｉｉ）ｉ）の核酸分子の塩基配列に１個または２個以上の変異を有するが、なお該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子、ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）の核酸分子の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子、および、ｉｖ）ｉ）またはｉｉ）の核酸分子と７０％以上の相同性を有し、かつ、該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子からなる群から選択される、ＣＳＡＢＰのプロモーター。
（１２）ＣＳＡＢＰのプロモーターを有するベクター。
（１３）ＣＳＡＢＰのプロモーターと、これに作動可能に連結されたレポーター配列とを含む核酸分子を有する細胞。
（１４）ＣＳＡＢＰ遺伝子におけるメチル化を検出する工程を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患の発症または病期を判定する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、ＲＮＡウイルス感染症や腫瘍を含むＣＳＡＢＰ関連疾患、特にＨＣＶ感染症に対する新たな治療薬、診断薬および治療・診断方法を提供するものであり、ヒト医療および獣医療への多大な貢献が期待できる。特に、ＣＳＡＢＰは宿主由来のタンパク質であることから、ウイルス由来のタンパク質と異なり変異の頻度も少ないため、ＣＳＡＢＰを標的とする本発明の治療薬は、ウイルス耐性を生じにくいという利点がある。しかも、本発明の治療薬は、炎症性サイトカインの影響でウイルスが複製しやすくなった細胞を、正常の、ウイルスが複製しにくい状態に戻すことができるため、感染防御に必要な炎症自体を抑制することなく、ウイルスの増殖を特異的に抑制することが可能である。
また、本発明のスクリーニング方法により、新たな作用機序を有する治療剤を検索することが可能となる。
さらに本発明は、ＲＮＡウイルスの増殖や、ＲＮＡ代謝系の制御における新たな標的物質を提供することにより、これらの用途に利用することができる薬剤や方法の選択肢を増加させ、ヒト医学や獣医学を含むライフサイエンスの進歩に寄与することができる。
さらにまた、本発明の判定方法により、腫瘍やＲＮＡウイルス感染症などの発症や病状を新たな方向から明らかにすることができるため、より精度の高い病状把握が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】種々のサンプルにおけるＣＳＡＢＰの発現をノーザンブロット法で解析した結果を示した図である。
【図２】種々の正常組織におけるＣＳＡＢＰの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で解析した結果を示した図である。
【図３】種々の癌細胞におけるＣＳＡＢＰの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で解析した結果を示した図である。
【図４】組換えＣＳＡＢＰタンパク質（ＣＳＡＢＰ−ＦＬ）の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を示した図である。
【図５】ＣｓＡとＣＳＡＢＰ（ＣＳＡＢＰ−ＦＬ）との分子会合試験の結果を示したグラフである。横軸はＣｓＡ濃度（μＭ）、縦軸はＲＵ値をそれぞれ示す。
【図６】ＲＮＡ存在下または非存在下におけるＣＳＡＢＰ（ＣＳＡＢＰ−Ｃ）のＡＴＰａｓｅ活性の測定結果を示したグラフである。横軸は反応時間（分）、縦軸は遊離３２Ｐの放射活性（ｃｐｍ）をそれぞれ示す。また、ＲＮＡ（＋）およびＲＮＡ（−）は、ＲＮＡ存在下および非存在下での測定結果をそれぞれ示す。
【００１２】
【図７】ＣｓＡまたはＦＫ５０６によるＣＳＡＢＰ（ＣＳＡＢＰ−Ｃ）のＡＴＰａｓｅ活性への影響を評価したグラフである。横軸はＣｓＡおよびＦＫ５０６の濃度（μＭ）、縦軸は遊離３２Ｐの放射比活性をそれぞれ示す。
【図８】種々のｓｉＲＮＡによるＣＳＡＢＰの発現抑制を示したグラフである。横軸は、ＣＳＡＢＰの相対発現比（si-control導入細胞におけるＣＳＡＢＰ発現量に対するパーセンテージ）を示す。
【図９】ｓｉＲＮＡの導入によるＣＳＡＢＰ発現量への影響を示したグラフである。縦軸は、１２．５ｎｇの全ＲＮＡ中のＣＳＡＢＰの遺伝子のコピー数を示す。なお、横軸のintactは、導入試薬のみで処理した細胞、si-controlは、β−アクチン特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞、そしてsi-ＣＳＡＢＰは、ＣＳＡＢＰ特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞をそれぞれ示す。
【図１０】ｓｉＲＮＡの導入によるＨＣＶ複製量への影響を示したグラフである。縦軸は、１２．５ｎｇの全ＲＮＡ中のＨＣＶゲノムのコピー数を示す。なお、横軸のintactは、導入試薬のみで処理した細胞、si-controlは、β−アクチン特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞、そしてsi-ＣＳＡＢＰは、ＣＳＡＢＰ特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞をそれぞれ示す。
【図１１】ＣＳＡＢＰの過剰発現によるＨＣＶ複製増強効果を示したグラフである。縦軸は、ＨＣＶゲノム複製指数としてのルシフェラーゼ比活性を示す。なお、横軸のControlは、ｐｃ−ＤＮＡ３のみを導入した細胞、ＣＳＡＢＰ full 50は、５０ｎｇのＣＳＡＢＰ−ｐｃＤＮＡ３を導入した細胞、そしてＣＳＡＢＰ full 150は、１５０ｎｇのＣＳＡＢＰ−ｐｃＤＮＡ３を導入した細胞をそれぞれ示す。
【００１３】
【図１２】ＣＳＡＢＰと、ＨＣＶの複製に関与するタンパク質との会合をＧＳＴプルダウン法により解析した結果を示した図である。1/5 INPは、１／５量のin vitro合成タンパク質溶液、GSTはＧＳＴタンパク質単独、そしてGST-ＣＳＡＢＰはＧＳＴ−ＣＳＡＢＰとin vitro合成タンパク質溶液とを共培養後、グルタチオンセファロースによりＧＳＴ−ＣＳＡＢＰを回収したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥして、オートラジオグラフィーでin vitro合成した各タンパク質を検出したものである。
【図１３】ＣＳＡＢＰと、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢとの会合へのＣｓＡの影響を、ＧＳＴプルダウン法により解析した結果を示した図である。1/5 INPは、１／５量のin vitro合成タンパク質溶液、GSTはＧＳＴタンパク質単独、そしてGST-ＣＳＡＢＰはＧＳＴ−ＣＳＡＢＰとin vitro合成タンパク質溶液とを共培養後、グルタチオンセファロースによりＧＳＴ−ＣＳＡＢＰを回収したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、オートラジオグラフィーでin vitro合成した各タンパク質を検出したものである。
【図１４】ＣＳＡＢＰと、ＮＳ５Ｂの種々の断片との会合をＧＳＴプルダウン法により解析した結果を示した図である。1/5 INPは、１／５量のin vitro合成タンパク質溶液、GSTはＧＳＴタンパク質単独、そしてGST-ＣＳＡＢＰはＧＳＴ−ＣＳＡＢＰとin vitro合成タンパク質溶液とを共培養後、グルタチオンセファロースによりＧＳＴ−ＣＳＡＢＰを回収したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、オートラジオグラフィーでin vitro合成した各タンパク質を検出したものである。図中の数字は、ＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸番号を示す。
【図１５】Ｈｕｈ７細胞またはＭＨ１４細胞を、抗ＣＳＡＢＰ抗体および抗ＫＤＥＬ抗体と２重染色した結果を示した写真図である。
【００１４】
【図１６】Ｈｕｈ７細胞またはＭＨ１４細胞を、抗ＣＳＡＢＰ抗体と、ＨＣＶ由来の種々のタンパク質に対する抗体とで２重染色した結果を示した写真図である。
【図１７】ＭＨ１４細胞に含まれる物質に対するＲＮＡ結合アッセイの結果を示した図である。図中、Whole cellsはＭＨ１４細胞溶解物、Gは抗体を特異的に吸着するセファロース、pUはＲＮＡに結合した沈降物、そしてr-ＣＳＡＢＰは組換えＣＳＡＢＰタンパク質を示す。
【図１８】in vivoにおけるＣＳＡＢＰ−ＮＳ５Ｂ−ＣｙＰＢ３量体の存在をＲＮＡ結合アッセイにより検討した結果を示した図である。図中、Whole cellsはＭＨ１４細胞溶解物、Gは抗体を特異的に吸着するセファロース沈降物、そしてpUはＲＮＡに結合した沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、抗ＣＳＡＢＰ抗体、抗ＮＳ５Ｂ抗体および抗ＣｙＰＢ抗体でウエスタンブロットしたものである。
【図１９】ＣＳＡＢＰの欠損がＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢのＲＮＡとの結合に及ぼす影響をＲＮＡ結合アッセイにより検討した結果を示した図である。図中、Whole cellsはＭＨ１４細胞溶解物、Gは抗体を特異的に吸着するセファロース沈降物、そしてpUはＲＮＡに結合した沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、抗ＣＳＡＢＰ抗体、抗ＮＳ５Ｂ抗体および抗ＣｙＰＢ抗体でウエスタンブロットしたものである。
【００１５】
【図２０】ＣｓＡが、ＣＳＡＢＰ、ＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢのＲＮＡとの結合に及ぼす影響をＲＮＡ結合アッセイにより検討した結果を示した図である。図中、Whole cellはＭＨ１４細胞溶解物、Gは抗体を特異的に吸着するセファロース沈降物、そしてpUはＲＮＡに結合した沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、抗ＣＳＡＢＰ抗体、抗ＮＳ５Ｂ抗体および抗ＣｙＰＢ抗体でウエスタンブロットしたものである。
【図２１】ＣＳＡＢＰ上流領域の種々のｃＤＮＡ断片における転写活性を、ルシフェラーゼレポーターアッセイで検討した結果を示したグラフである。
【図２２】ＣＳＡＢＰプロモーター領域における転写因子結合モチーフの位置を示した図である。
【図２３】転写因子結合モチーフに種々の変異を導入したｃＤＮＡ断片における転写活性を、ルシフェラーゼレポーターアッセイで検討した結果を示したグラフである。
【図２４】ＣＳＡＢＰのプロモーター領域をCpG Island Searcherで解析した結果を示した図である。図中、縦方向のバーはＣｐＧ配列の位置を、横方向の帯はＣｐＧアイランド領域をそれぞれ示す。
【図２５】５−アザ−２’−デオキシシチジンの添加によるＣＳＡＢＰの発現量の変化を検討した結果を示した図である。図下の数字は５−アザ−２’−デオキシシチジンの濃度を示す。
【図２６】ヒト正常肝細胞に、ヒトＩＬ−１β、ＴＮＦαまたはＩＬ−６を投与した際の、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現の変化を示した図である。縦軸は対照（Control、培地のみを投与）を１００％とした場合の、ＣＳＡＢＰ遺伝子発現量の比率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患を処置するための組成物、ならびに、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分のＣＳＡＢＰ関連疾患を処置するための組成物の製造への使用に関する。
本発明においてＣＳＡＢＰとは、シクロフィリン（ＣｙＰ）、カルシニューリンおよびＰ糖タンパク質以外の、ＣｓＡに結合するヒトまたは動物に存在する物質を意味し、典型的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質または配列番号２で表される塩基配列を有する核酸がコードするタンパク質（ヒトＣＳＡＢＰ）を指す。さらに、本発明におけるＣＳＡＢＰは、ヒトＣＳＡＢＰに相同な非ヒト動物におけるＣＳＡＢＰ、例えば、チンパンジー（XP_517881）、ウシ（XP_614159）、イヌ（XP_531871）、ラット（XP_225959）、マウス（XP_915830）、Monodelphis domestica（XP_001370066）、Xenopus tropicalis（AAI21455）、ニワトリ（XP_413970）のＣＳＡＢＰをも含む（括弧内は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号である）。上記以外の動物におけるＣＳＡＢＰも、配列番号１で表されるアミノ酸配列または配列番号２で表される塩基配列に基づいて、対象動物のタンパク質または核酸データベースを検索することにより、適宜同定することができ、このように同定された各種動物のＣＳＡＢＰも、本発明に利用することができる。なお、本明細書中、ＣＳＡＢＰにおけるアミノ酸番号または塩基番号は、特に別記しない限り、前記ヒトＣＳＡＢＰにおけるものを表す。【００１７】
本明細書中、ＣＳＡＢＰは、上記タンパク質のほか、文脈によってはこれをコードする遺伝子や、ＣＳＡＢＰの変異体を意味することもある。さらに、上記タンパク質または遺伝子をより特定的に、例えば、「ＣＳＡＢＰタンパク質」、「ＣＳＡＢＰポリペプチド」、「ＣＳＡＢＰ遺伝子」、「ＣＳＡＢＰ核酸」、「ＣＳＡＢＰ  ＤＮＡ」などと呼ぶこともある。
当然のことながら、生物個体間には、タンパク質の生理学的機能を損なわない遺伝子配列やアミノ酸配列の変異が生じる可能性があるため、本発明におけるＣＳＡＢＰは、上記配列番号で表される配列と同一の配列を有するタンパク質や核酸以外にも、同配列に対し１個または２個以上、典型的には１個または数個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸または塩基が相違する配列を有するものを含む。【００１８】
本発明においてＣＳＡＢＰの存在量とは、上記ＣＳＡＢＰの生体における質量やモル数のほか、特定の臓器（例えば、肝臓、子宮、腎臓、食道、肺、大腸、乳房など）、組織（例えば、ＲＮＡウイルス標的組織、腫瘍組織など）、細胞（例えば、ＲＮＡウイルス標的細胞、腫瘍細胞など）、さらには細胞小器官（例えば、小胞体など）における質量やモル数をも意味する。また、ＣＳＡＢＰの存在量は、上記ＣＳＡＢＰのみならず、ＣＳＡＢＰと同様の機能を有する物質、例えば、ＣＳＡＢＰの機能的変異体などの存在量をも包含する。したがって、ＣＳＡＢＰの存在量を制御するとは、かかるＣＳＡＢＰの存在量を、絶対的もしくは相対的に増加させ、維持し、または減少させることをいう。
本発明においてＣＳＡＢＰの機能とは、例えば、ＣｓＡもしくはその誘導体、ＣｙＰ、特にＣｙＰＢ、ＮＳ５Ｂおよび／またはＲＮＡに結合する機能、ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ機能、ＨＣＶ複製促進機能などを包含する。したがって、ＣＳＡＢＰの機能を制御するとは、これらの機能の少なくとも１つ、好ましくはこれら全ての機能を、促進、維持または抑制することをいう。【００１９】
本発明において、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分には、かかる機能を有する任意の物質が含まれる。ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を増強する成分としては、限定することなく、例えば、ＣＳＡＢＰ、ＣＳＡＢＰの機能的変異体、これらをコードする核酸およびかかる核酸を含むベクター、ならびにＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を増強する物質等が挙げられ、低減する成分としては、限定することなく、例えば、ＣＳＡＢＰのドミナントネガティブ変異体、抗ＣＳＡＢＰ抗体、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体、これらをコードする核酸、これらを発現するベクター、ならびにＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を阻害する物質（例えば、ＣＳＡＢＰを標的とするｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドならびにこれらを発現するベクターなど）が挙げられる。【００２０】
ＣＳＡＢＰの機能的変異体としては、限定されることなく、例えば、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列に１個または２個以上、典型的には１個または数個の変異を有するが、なおＣＳＡＢＰと同等の機能を有する変異体、（２）配列番号２で表される塩基配列を有する核酸もしくは同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列に１個または２個以上、典型的には１個または数個の変異を有する核酸によりコードされ、かつＣＳＡＢＰと同等の機能を有する変異体、（３）配列番号２で表される塩基配列を有する核酸、同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸もしくは（２）のポリペプチドをコードする核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつ、ＣＳＡＢＰと同等の機能を有する変異体、（４）配列番号２で表される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸によりコードされ、かつ、ＣＳＡＢＰと同等の機能を有する変異体等が挙げられる。【００２１】
変異体は、既知の任意の手法、例えば、制限酵素による核酸の切断または挿入、部位特異的変異導入、放射線もしくは紫外線の照射などにより適宜作製することができる。
ある変異体がＣＳＡＢＰと同等の機能を有するか否かは、例えば、ＣｓＡもしくはその誘導体、ＣｙＰ、特にＣｙＰＢ、ＮＳ５Ｂおよび／またはＲＮＡとの結合性、ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ機能および／またはＨＣＶ複製促進機能などを、既知の任意の方法、例えば、結合性については、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法など、ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ機能については、Okanamiら（Okanami et al.、Nucleic Acids Res、1998、26:2638-2643）の方法など、ＨＣＶ複製については、ＨＣＶのＲＮＡもしくはタンパク質をＰＣＲ法などの種々の核酸定量法もしくはＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法などの種々のタンパク質定量法などにより解析し、適切な陰性対照や、陽性対照としてのＣＳＡＢＰと比較することによって評価することができる。例えば、ある変異体において、上記の少なくとも１つの機能が陰性対照より優れている場合、例えば、１０％以上、２５％以上、５０％以上、７５％以上、さらには１００％以上優れている場合、および／または、同機能がＣＳＡＢＰの１／１００以上、１／５０以上、１／２５以上、１／１０以上、１／５以上、さらには１／２以上である場合、この変異体をＣＳＡＢＰの機能的変異体に含める。【００２２】
本発明において、ＣＳＡＢＰのドミナントネガティブ変異体とは、ＣＳＡＢＰの機能の少なくとも１つが低減もしくは欠失したＣＳＡＢＰの変異体であって、野生型ＣＳＡＢＰの機能を阻害し得るものを意味する。かかるドミナントネガティブ変異体は、野生型ＣＳＡＢＰに変異を導入して、上記の機能的変異体と同様にＣＳＡＢＰ機能を測定し、その数値のいずれかまたは全てが野生型ＣＳＡＢＰより低いもの、より好ましくは、野生型ＣＳＡＢＰと共存させた場合に、野生型ＣＳＡＢＰの機能を低減させるものから選択することができる。変異を導入する部位としては、例えば、ＲＮＡヘリカーゼモチーフの存在する第１９１〜第３７８アミノ酸およびその近傍、ＣｓＡ結合領域である第９４０〜第９４５アミノ酸およびその近傍などを挙げることができる。【００２３】
本発明において、抗ＣＳＡＢＰ抗体は、ＣＳＡＢＰを標的とする任意の抗体、ならびにかかる抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域断片）、およびＣＤＲ含有断片などの種々の機能的断片を含む。抗ＣＳＡＢＰ抗体は、任意の既知の方法、例えば、動物（ウサギ、ヤギ、ラット、マウスなど）をＣＳＡＢＰタンパク質またはその断片などで免疫し、所定期間後に血清を採取し、ポリクローナル抗体を得る方法や、免疫動物から所定期間後にリンパ球、特にＢ細胞を採取し、これを腫瘍細胞株などの不死細胞と融合させてハイブリドーマを得、これをさらに培養してモノクローナル抗体を得る方法などにより適宜作製することができる。抗体は、投与する対象に不要な免疫反応を惹起しないように、対象の生物種に応じて種々の改変を施してあってもよい。例えば、ヒト以外の生物種の可変領域と、ヒトの定常領域とを融合することによりヒト型キメラ抗体を、ヒト以外の生物種のＣＤＲをヒト抗体の適切な位置に移植することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を、それぞれ得ることができる。このように、ヒトへの適用のために改変されたヒト化抗体、さらには、同様の手法によって種々の非ヒト動物に適応させた改変抗体も、本発明で用いる抗ＣＳＡＢＰ抗体に含まれる。【００２４】
本発明において、ＮＳ５Ｂは、ＨＣＶ由来のもの（NP_751928）のほか、豚コレラウイルス（NP_777506）、ＧＢウイルスＡ（NP_803217）、ＧＢウイルスＢ（NP_757361）、ＧＢウイルスＣ（NP_803209）、牛ウイルス性下痢ウイルス（NP_777493、NP_776271）、ボーダー病ウイルス（NP_777545）などのフラビウイルス科のウイルス、特にペスチウイルス属およびヘパシウイルス属のウイルスに由来するものを含む（括弧内は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号である）。これらのうち、処置や検出の標的となるウイルスに由来するＮＳ５Ｂが好ましい。
本発明において、ＣｙＰＢは、ヒト由来のもの（AAH32138、AAH20800、AAH08848、AAH08848）のほか、ラット（NP_071981）、マウス（NP_035279）、ウシ（NP_776577）、ニワトリ（NP_990792）等に由来するものを含む（括弧内は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号である）。これらのうち、処置や診断を受ける対象に由来するＣｙＰＢが好ましい。【００２５】
本発明において、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢのＣＳＡＢＰ結合性変異体とは、上記ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢに対し１個または２個以上のアミノ酸変異を有するが、ＣＳＡＢＰとの結合性を保っている変異体を意味する。例えば、ＣＳＡＢＰは、ＨＣＶのＮＳ５Ｂの第１〜第２００アミノ酸からなる部分、および、第４０１〜第５２０アミノ酸からなる部分に結合することから（実施例７（１）参照）、これらの部分の少なくとも一方を含むＮＳ５Ｂの断片は、ＣＳＡＢＰ結合性変異体に含まれる。上記変異体のうち、ＣＳＡＢＰの機能を阻害し得るものが好ましく、かかる変異体としては、例えば、ＣＳＡＢＰ結合部位を含むが、ＣｙＰＢ結合部位（ＨＣＶの場合は、第５２１〜第５９１アミノ酸）は含まないＮＳ５Ｂ変異体、ＣＳＡＢＰ結合部位を含むが、ＲＮＡポリメラーゼ領域（ＨＣＶの場合は、第１１６〜第３９８アミノ酸）を含まないＮＳ５Ｂ変異体などが挙げられる。【００２６】
本発明における核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ等の種々の高分子を含む。
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータであり、標準的なプロトコル集、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)や、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)等に記載されている。
本発明におけるストリンジェントな条件は、例えば、６５℃での、３．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ExpressHyb（登録商標）Hybridization Solution（Clontech社）等の市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。
同程度のストリンジェンシーを生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬等が存在するが、当業者はかかる条件に通じていると思われるため、これらについては、本明細書中に特段記載はしていない。しかしながら、ＣＳＡＢＰの変異体をコードしている核酸またはＣＳＡＢＰプロモーターの相同体または対立遺伝子の明確な同定ができるよう、条件を操作することが可能である。【００２７】
ＣＳＡＢＰを標的とするｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドとしては、既知の任意の手法により作製されるものを用いることができる。
ｓｉＲＮＡの例としては、配列番号９〜１４に記載のものを挙げることができるが、本発明に用いることのできるｓｉＲＮＡはこれらに限定されず、配列番号２の任意の部分に対するものを包含する。
また、特開2003-219893号公報には、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡとＲＮＡとからなる２本鎖ポリヌクレオチドが記載されている。このポリヌクレオチドは、２本鎖の一方がＤＮＡで、他方がＲＮＡであるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであっても、同じ鎖の一部がＤＮＡで、他の部分がＲＮＡであるＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。かかるポリヌクレオチドは、好ましくは１９〜２５、より好ましくは１９〜２３、さらに好ましくは１９〜２１ヌクレオチドからなり、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの場合は、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるものが好ましく、また、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラの場合は、２本鎖ポリヌクレオチドの上流側の一部がＲＮＡであるものが好ましい。かかるポリヌクレオチドは、自体公知の化学合成法により定法に従って、任意の配列を有するものを作製することが可能である。【００２８】
上記核酸は、裸の核酸としてそのまま利用することもできるが、種々のベクターに担持させることもできる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。ベクターは、担持する核酸の発現を増強するプロモーターを少なくとも含んでいることが好ましく、この場合、該核酸は、かかるプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。核酸がプロモーターに作動可能に連結されているとは、プロモーターの作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生されるように、該核酸とプロモーターとが配置されていることを意味する。ベクターは、宿主細胞内で複製可能であってもなくてもよく、また、遺伝子の転写は宿主細胞の核外で行われても、核内で行われてもよい。後者の場合、核酸は宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。【００２９】
本発明においてＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質には、かかる機能を有する任意の物質が含まれる。
本明細書中で、遺伝子またはタンパク質の「発現」とは、遺伝子の転写、スプライシング、翻訳、翻訳後修飾等の、遺伝子からポリペプチドが合成される種々の段階を包含し、したがって、「発現を制御する」とは、遺伝子の転写、スプライシング、翻訳、翻訳後修飾等の諸過程の少なくとも１つを制御すること、すなわち、増強もしくは低減することをいう。
ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を増強する物質としては、限定することなく、例えば、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β等のＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦα等のＴＮＦなど）、ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーもしくはＧＡＴＡファミリーに属する転写因子（ＣＲＥＢ、ＡＴＦ１〜６およびＧＡＴＡ１〜６など）または転写因子ＡＰ−１およびこれらの機能的等価物や、該転写因子の存在量および／または機能を増強する物質（ＰＫＡ、ｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ、ｐ９０ＲＳＫ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＳＫ−１、ＣａＭＫ、カルシウムイオン、Ａｋｔ／ＰＫＢ、ＪＮＫ、ＦＲＫ（Fos-related kinase）、ＲＳＫ（ribosomal S6 kinase）、カゼインキナーゼＩＩ、ＧＳＫ−３βおよびこれらの機能的等価物など）等が挙げられる。【００３０】
一方、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を低減する成分としては、限定することなく、ＣＳＡＢＰを標的とするｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドならびにこれらを発現するベクター、ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーもしくはＧＡＴＡファミリーに属する転写因子または転写因子ＡＰ−１の阻害剤、例えば、ＣＳＡＢＰ遺伝子のプロモーター領域（同遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを＋１塩基として、ＡＴＧの１塩基上流（５’側）の塩基を−１塩基とした場合の−４６３〜−１塩基（配列番号３７）、好ましくは−４６３〜−４４塩基（配列番号３０）、特にその転写因子結合部位（−２２０〜−２１３塩基：（ＣＲＥＢ結合部位：ＴＧＡＣＧＴＣＡ）、−１８８〜−１７９塩基（ＧＡＴＡ結合部位：ＣＧＴＧＡＴＡＴＣＡ）および−１５０〜−１４０塩基（ＡＰ−１結合モチーフ：ＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ）を少なくとも１つ含むＤＮＡの部分）に、好ましくは特異的に、結合する物質（例えば、同部分にハイブリダイズする核酸等）、前記転写因子のドミナントネガティブ変異体（例えば、ＣＲＥＢＭ１（Gonzalez, G. A., and Montminy, M. R. (1989) Cell 59, 675-680）、ＫＣＲＥＢ（Reusch, J. E. et al. (2000). Mol. Cell. Biol. 20, 1008-1020.）、ＤＮ  ＣＲＥＢ（Nguyen, L. Q. et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14, 1448-1461）、Ａ−ＣＲＥＢ（Ahn S. et al. (1998) Mol Cell Biol 18:967-977））、該転写因子に対する抗体、これらをコードする核酸および該核酸を含むベクター、該転写因子の活性化を阻害する物質（例えば、ＰＫＡ、ｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ、ｐ９０ＲＳＫ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＳＫ−１、ＣａＭＫ、カルシウムイオン、Ａｋｔ／ＰＫＢ、ＪＮＫ、ＦＲＫ、ＲＳＫ、カゼインキナーゼＩＩ、ＧＳＫ−３β等の阻害剤、例えば、これらの物質に対する抗体、Ｈ８９、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ等のＰＫＡ阻害剤、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＦＲ１８０２０４などのＥＲＫ経路阻害剤、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２３９０６３などのｐ３８阻害剤、ＫＮ−９３、ＫＮ−６２、ＡＩＰ、CaM Kinase II Inhibitor 281-301、lavendustin C、Ｋ２５２ａ、rottlerin、ＭＬ−７、ＭＬ−９、ＳＴＯ−６０９、Ｗ−７、Ｗ−５等のＣａＭＫ阻害剤、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、Ａ２３１８７、イオノマイシン等の細胞内カルシウム動態阻害剤等）などが挙げられる。
また、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質として、後述のＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質をスクリーニングする方法によって同定した物質を用いてもよい。【００３１】
本発明におけるＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質として好ましいのは、ＣＳＡＢＰを標的とするｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸およびＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドならびにこれらを発現するベクター、ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーに属する転写因子（ＣＲＥＢ、ＡＴＦ１〜６およびこれらの機能的等価物、特にＣＲＥＢ）、および該転写因子の存在量および／または機能を増強する物質（例えば、ＰＫＡ、ｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ、ｐ９０ＲＳＫ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＳＫ−１、ＣａＭＫ、カルシウムイオン、Ａｋｔ／ＰＫＢおよびこれらの機能的等価物等）などのＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を増強する物質、ならびに、ＣＳＡＢＰ遺伝子のプロモーター領域（−４６３〜−１塩基（配列番号３７）、好ましくは−４６３〜−４４塩基（配列番号３０）、特にＣＲＥＢ結合部位（−２２０〜−２１３塩基：ＴＧＡＣＧＴＣＡ）を含むＤＮＡの部分に、好ましくは特異的に、結合する物質（例えば、同部分にハイブリダイズする核酸等）、前記転写因子のドミナントネガティブ変異体（例えば、ＣＲＥＢＭ１、ＫＣＲＥＢ、ＤＮ  ＣＲＥＢ、Ａ−ＣＲＥＢ）、該転写因子に対する抗体、これらをコードする核酸および該核酸を含むベクター、該転写因子の活性化を阻害する物質（例えば、ＰＫＡ、ｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ、ｐ９０ＲＳＫ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＳＫ−１、ＣａＭＫ、カルシウムイオン、Ａｋｔ／ＰＫＢ等の阻害剤、例えば、これらの物質に対する抗体、Ｈ８９、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ等のＰＫＡ阻害剤、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＦＲ１８０２０４などのＥＲＫ経路阻害剤、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２３９０６３などのｐ３８阻害剤、ＫＮ−９３、ＫＮ−６２、ＡＩＰ、CaM Kinase II Inhibitor 281-301、lavendustin C、Ｋ２５２ａ、rottlerin、ＭＬ−７、ＭＬ−９、ＳＴＯ−６０９、Ｗ−７、Ｗ−５等のＣａＭＫ阻害剤、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、Ａ２３１８７、イオノマイシン等の細胞内カルシウム動態阻害剤等）を包含するＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーに属する転写因子の阻害剤などのＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を抑制する物質である。
なお、上記のＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のうち、ポリペプチドであるものは、これをコードする核酸分子およびこれを含むベクターを、ポリヌクレオチドであるものは、これを含むベクターをそれぞれ包含するものとする。【００３２】
本発明において、ＣＳＡＢＰ関連疾患とは、ＣＳＡＢＰが発症、進行、寛解、治癒等に関与している疾患や、ＣＳＡＢＰの発現を特徴とする疾患等を含む。ＣＳＡＢＰが発症、進行、寛解、治癒等に関与している疾患としては、例えば、ＲＮＡウイルス感染症、典型的にはプラス鎖ＲＮＡウイルス感染症、より典型的にはフラビウイルス科ウイルス感染症を挙げることができる。したがって、かかる疾患には、レオウイルス感染症、ＳＡＲＳ、トロウイルス感染症、黄熱病、日本脳炎、デング熱、西ナイル熱、牛ウイルス性下痢・粘膜病、豚コレラ、ボーダー病、Ｃ型肝炎、口蹄疫、ポリオ（急性灰白髄炎）、Ａ型肝炎、風邪、風疹、シンドビスウイルス感染症、馬ウイルス性動脈炎、サル出血熱、ノロウイルス感染症、サポウイルス感染症、ウサギ出血熱、猫カリシウイルス病、豚水疱疹、Ｅ型肝炎、マールブルグ病、エボラ出血熱、狂犬病、水胞性口炎、麻疹、小反芻獣疫、犬ジステンパー、牛疫、流行性耳下腺炎、メナングルウイルス感染症、ニューカッスル病、ＲＳウイルス感染症、ヒト・メタニューモウイルス感染症、ニパウイルス感染症、インフルエンザ、アカバネ病、ハンタウイルス肺症候群、腎症候群性出血熱、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱、ＡＩＤＳ、成人Ｔ細胞白血病等、より典型的には、黄熱病、日本脳炎、デング熱、西ナイル熱、牛ウイルス性下痢・粘膜病、豚コレラ、ボーダー病、Ｃ型肝炎等、特に牛ウイルス性下痢・粘膜病、豚コレラ、ボーダー病、Ｃ型肝炎等が含まれる。
また、ＲＮＡウイルス感染症のうち、炎症を伴うもの、および／または炎症に続発するものや、炎症性サイトカインの放出を伴うもの、および／または炎症性サイトカインの放出に続発するものも好適である。【００３３】
ＣＳＡＢＰの発現を特徴とする疾患としては、上記ＲＮＡウイルス感染症のほか、腫瘍性疾患、例えば、肝臓、子宮、腎臓、食道、肺、大腸および乳房などの腫瘍、典型的には、肝癌、子宮癌、腎癌、食道癌、肺癌、大腸癌および乳癌など、さらには、炎症性疾患、特に炎症性サイトカインの放出を伴う疾患、例えば、脳炎、結膜炎、角膜炎、ぶどう膜炎、網膜炎、鼻炎、副鼻腔炎、耳炎、口内炎、歯肉炎、食道炎、胃炎、腸炎、肝炎、咽頭炎、喉頭炎、気管炎、気管支炎、肺炎、膀胱炎、尿管炎、尿道炎、腎炎、膣炎、子宮炎、卵巣炎、精巣炎、血管炎、心膜炎、神経炎、筋炎、骨炎、骨膜炎、骨髄炎、軟骨炎、髄膜炎、関節炎、皮膚炎などが挙げられる。
ＣＳＡＢＰの発現を特徴とする疾患としてはまた、ＲＮＡウイルスの複製を促進する状態が含まれる。かかる状態は、例えば、正常細胞にＴＮＦαなどの炎症性サイトカインが作用し、同細胞におけるＣＳＡＢＰの発現を誘導することにより生じる。この状態を放置すると、こうしたＣＳＡＢＰの発現が誘導された細胞のうち、ＲＮＡウイルスに未だ感染していない細胞にＲＮＡウイルスが感染した場合や、ＲＮＡウイルスに既に感染した細胞において、同ウイルスが複製しやすい環境を提供することになり、ＲＮＡウイルス感染症の発症や重篤化がもたらされることになる。したがって、本発明の組成物を投与して、かかる状態にある細胞におけるＣＳＡＢＰの発現を阻害することにより、ＲＮＡウイルス感染症の発症や重篤化を予防または抑制することが可能となる。
ＣＳＡＢＰの発現の有無は、後述のＣＳＡＢＰをコードする核酸またはその発現産物を検出する成分を用いて、当業者に知られた適切な検出手法により適宜確認することができる。
また、ＣＳＡＢＰ関連疾患には、上記疾患に続発する種々の疾患、例えば、Ｃ型肝炎、特に慢性Ｃ型肝炎に続発する肝線維症や肝硬変、肝癌なども含まれる。
本発明の組成物は、所望の臓器や細胞への到達を効率化するために、これらに対して標的化されていてもよい。標的化には、任意の既知の手法を用いることができ、これには、例えば、所望の臓器や細胞に特異的に発現する分子に対するリガンドや抗体による修飾などが挙げられる。特に、本組成物の有効成分を、WO2006/068232に記載の担体に担持させることにより、肝臓に特異的に送達させることができる。
また、本発明の組成物は、有効成分の細胞内への送達を促進するために、同成分をリポソーム、特にカチオン性リポソームなどの細胞内送達担体中に包含させたり、同担体に結合させたり、さらに、例えばＴＡＴペプチドなどの細胞内送達を促進する物質と結合させることもできる。【００３４】
本発明のＣＳＡＢＰ関連疾患処置用組成物は、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分のほか、ＣＳＡＢＰ関連疾患の処置に有効な他の成分を含んでもよく、また、ＣＳＡＢＰ関連疾患の処置に有効な他の薬剤と併用することができる。
具体的には、ＲＮＡウイルス感染症の処置が企図される場合には、例えば、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、リマンタジン、アジドチミジン、ジダノシン、ザルシタビン、サニルブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、エムトリシタビン、ラミブジン、テノホビル、エムトリシタビン、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、インジナビル、サキナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、エンフュヴィルタイド、アデフォビル、エンテカビルなどの抗ウイルス剤を利用することができる。
また、ＲＮＡウイルス感染症が炎症を伴うもの、および／または炎症に続発するものや、炎症性サイトカインの放出を伴うもの、および／または炎症性サイトカインの放出に続発するものである場合には、炎症および／または炎症性サイトカインの放出を抑制する薬物、例えば、種々のステロイド系抗炎症剤や非ステロイド系抗炎症剤、炎症性サイトカインの発現を抑制するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸などの物質、および／または炎症性サイトカインの作用を抑制する薬物、例えば、炎症性サイトカインに対する抗体や、炎症性サイトカインの受容体拮抗剤などを本発明の組成物中に含んでもよく、またこれと併用してもよい。  【００３５】
特に、Ｃ型肝炎の処置が企図される場合には、例えば、インターフェロン類（IFNα、IFNβ、IFNβ-1a（Rebif）、IFNγ、IFNω、Infergen、アルブフェロン、Multiferon、ロクテロン、Belerofonなど）、ペグ化インターフェロン類（PegIFNα-2a（ペガシス）、PegIFNα-2b（PegIntron））、リバビリン、ＣｓＡおよびその誘導体（例えば、ＮＩＭ８１１、特許文献２に記載の修飾シクロスポリンなど）、アマンタジン、Medivir HCV Protease、ＡＢ６８、ＰＹＮ１７、ＩＴＭＮ−１９１、Ａ−８３１、Oglufanide、Ｒ７１２８、ニトラゾキサニド、Bavituximab、ＮＯＶ−２０５、ＸＴＬ−２１２５、ＡＶＩ−４０６５、ＡＮＡ９７５、ＨＣＶ−７９６、ミトキノン（MitoQ）、ＡＣＨ−０１３７１７１、ＸＴＬ−６８６５、ＤＥＢＩＯ−０２５、ＵＴ−２３１Ｂ、Ｒ１６２６、Ｇ１２６２７０、ＳＣＨ５０３０３４（Boceprevir）、ＶＸ９５０（Telaprevir）、ＰＦ−０３４９１３９０、Civacir、メチレンブルー（Suvus）、セルゴシビル、ＶＧＸ−４１０Ｃ、ヴァロピシタビン、ＪＢＫ−１２２、タリバビリン（Viramidine）、ＥＭＺ７０２、ChronVac-C、ＴＧ４０４０、PeviPROTM、ＧＧＩ−５００５、ＨＣＶ／ＭＦ５９、ＩＣ４１、ＩＮＮＯ０１０１（Ｅ１）、ＮＡ２５５、ロバスタチン、特許文献１に記載のシクロアルキル複素環化合物等を利用することができる。  【００３６】
Ｃ型肝炎に伴う肝線維症や肝硬変の処置が企図される場合には、例えば、切断型ＴＧＦβＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦβＩＩ型受容体等のＴＧＦβ活性阻害剤、ＨＧＦ等の成長因子製剤、ＭＭＰ遺伝子含有アデノウイルスベクター等のＭＭＰ産生促進剤、ＰＰＡＲγリガンド、アンギオテンシンＩＩのＩ型受容体アンタゴニスト、ＰＤＧＦチロシンキナーゼ阻害剤、およびアミロライド等のナトリウムチャンネル阻害剤を含む肝星細胞活性化／増殖抑制剤、compound 861やgliotoxin等のアポトーシス誘導剤、コラーゲン、プロテオグリカン、テナスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、オステオネクチン、エラスチン等の細胞外マトリクス成分の産生を抑制するための、これらの成分を標的としたｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）等の標的分子の発現を抑制する効果を有する物質、もしくはこれらの成分のドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクター、さらには、コルチコステロイド、ペニシラミン、コルヒチン、インターフェロンγ、プロスタグランジン誘導体等のコラーゲン生成を抑制する薬物等を利用することができる。【００３７】
また、腫瘍の処置が企図される場合には、例えば、イホスファミド、塩酸ニムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、塩酸ゲムシタビン、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、塩酸イダルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ミトキサントロン、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、塩酸イリノテカン、酒石酸ビノレルビン、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン等のアルカロイド、アナストロゾール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、リン酸エストラムスチン等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼ等を利用することができる。【００３８】
本発明において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、疾患がＣ型肝炎の場合、「処置」の用語は、Ｃ型肝炎の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、Ｃ型肝炎発症の予防または再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
また、本発明における用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、ＣＳＡＢＰ関連疾患の処置が企図される場合には、対象は典型的には、該疾患に罹患しているか、罹患するリスクの高い対象、例えばニワトリ、マウス、ラット、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ヒトなどを意味する。【００３９】
上記ＣＳＡＢＰ関連疾患処置用組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年等を参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤等が挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等の注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。具体的には、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、適切な単位投与形態に製剤化することができる。これら製剤における有効成分量は、処置に有効な用量を想定された投与回数で対象に供給できるように適宜設定することができる。【００４０】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプル、バイアル、チューブ、ボトル、パック等の容器に充填する。【００４１】
本組成物の対象の体内への投与は上記いずれの経路によってもよいが、好ましくは非経口投与、より好ましくは局所投与または静脈内投与、特に好ましくは門脈内もしくは腫瘍内投与である。投与回数は１回が好ましいが、状況に応じて複数回投与することもできる。また、投与時間は短時間でも長時間持続投与でもよい。本発明の組成物は、より具体的には、注射によりまたは経皮的に投与することができる。注射による投与の例としては、例えば、局所注射、静脈内注射、動脈内注射、選択的動脈内注入、門脈内注入、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、腫瘍内注射、髄腔内注射、関節内注射、脳室内注射等によるものが挙げられるが、これらに限られない。静脈内注射等の場合、通常の輸血の要領での投与が可能となり、対象を手術する必要がなく、さらに局所麻酔も必要ないため、対象および術者双方の負担を軽減することができる。また手術室以外での投与操作が可能である点で有利である。【００４２】
さらに本発明は、対象へ本発明のＣＳＡＢＰ関連疾患処置用組成物の有効量を投与することを含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患の処置方法に関する。本発明の処置方法において、本発明の処置用組成物の対象への投与は、例えば、上述の投与方法に従って好適に実施することができる。また、医師または獣医師においては、上記投与方法を適宜改変して、本発明の剤を対象へ投与することが可能である。ここで、有効量とは、ＣＳＡＢＰ関連疾患の発症を低減し、症状を軽減し、または進行を防止する量であり、好ましくは、ＣＳＡＢＰ関連疾患の発症を予防し、またはＣＳＡＢＰ関連疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞等を用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタ等のモデル動物における試験により適宜決定することができる。【００４３】
本発明の処置方法において投与するＣＳＡＢＰ関連疾患処置用組成物の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンス等を考慮して決定され得るため、一般的な有効量と異なることもあるが、かかる場合であっても、これらの方法はなお本発明の範囲に含まれる。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、髄腔内、関節内、脳室内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎等）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎等）であってもよい。
また、本発明の処置法においては、本発明のＣＳＡＢＰ関連疾患処置用組成物のほか、上述のＣＳＡＢＰ関連疾患の処置に有効な他の薬剤を併用することができる。【００４４】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰをコードする核酸またはその発現産物を検出する成分を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患を診断するための組成物に関する。
本発明において、ＣＳＡＢＰをコードする核酸またはその発現産物を検出する成分としては、ＣＳＡＢＰをコードする核酸またはその発現産物に結合する任意の物質を用いることができる。かかる物質としては、例えば、抗ＣＳＡＢＰ抗体、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体等のＣＳＡＢＰ結合性物質、ならびにＣＳＡＢＰをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物などに特異的にハイブリダイズする核酸などが挙げられる。ＣＳＡＢＰをコードする核酸のユニーク断片とは、ゲノム中、ＣＳＡＢＰをコードする核酸にしか存在しない断片を意味し、典型的には、１２〜３２塩基長（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２塩基長）以上の長さの断片である。ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢのＣＳＡＢＰ結合性変異体としては、ＣＳＡＢＰに結合するが、その他の生理学的活性を欠く変異体が好ましい。かかる変異体としては、例えば、ＣＳＡＢＰ結合部位を含むが、ＣｙＰＢ結合部位（ＨＣＶの場合は、第５２１〜第５９１アミノ酸）は含まないＮＳ５Ｂ変異体、ＣＳＡＢＰ結合部位を含むが、ＲＮＡポリメラーゼ領域（ＨＣＶの場合は、第１１６〜第３９８アミノ酸）を含まないＮＳ５Ｂ変異体などが挙げられる。【００４５】
前記検出する成分には、検出の便宜のために、種々の標識を付すことができる。標識は、既知の任意のもの、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、前記成分に結合する物質（例えば抗体）、ビオチン、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、および酵素などから選択することができる。
検出には、既知の任意の方法を用いることができる。かかる方法の例としては、限定することなく、例えば、抗ＣＳＡＢＰ抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、標識したＣＳＡＢＰ結合性物質（ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体など）を利用した、酵素発色法、蛍光検出法、放射活性測定法、オートラジオグラフィー法、フローサイトメトリー法、組織染色法、細胞染色法、ＣＳＡＢＰをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などを挙げることができる。【００４６】
上記検出に用いる検体は、ＣＳＡＢＰタンパク質の検出であれば、例えば、血液、粘膜擦過物、手術やバイオプシー等により採取した種々の細胞、臓器等を含む。検体は、そのまま検出操作に供してもよいが、例えば細胞を超音波処理等により破砕し、その遠心上清から細胞抽出液を調製するなどしておくと、検出操作が容易になる。また、ＣＳＡＢＰをコードする核酸の検出であれば、例えば、血液、唾液、口腔粘膜、水疱内容物、水疱を含む皮膚片、糞便、尿、手術やバイオプシー等により採取した種々の細胞、体液、臓器等を検体として利用することができる。これらの検体は、そのまま検出に供してもよいが、事前にＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出・精製することが好ましい。ＤＮＡやＲＮＡの抽出法は当該技術分野で既知の任意のものを選択することができるが、ＤＮＡの抽出であれば、例えば、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法等の手法を、ＲＮＡの抽出であれば、例えば、グアニジン・酸性フェノール（ＡＧＰＣ）法、ＳＤＳ−フェノール法等の手法をそれぞれ用いることができる。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、検出に先立ち増幅してもよい。増幅には、ＰＣＲ法を始めとする任意の既知の方法を用いることができる。ＤＮＡやＲＮＡを増幅しておくことにより、検出操作が容易になる。【００４７】
本発明においては、ＣＳＡＢＰもしくはこれをコードする核酸の存否または存在量に基づいてＣＳＡＢＰ関連疾患を診断する。例えば、ＣＳＡＢＰの発現を特徴とする疾患は、ＣＳＡＢＰもしくはこれをコードする核酸の発現を検出することにより、当該疾患への罹患を診断することができる。また、進行もしくは消退に伴ってＣＳＡＢＰの発現が増減する疾患は、ＣＳＡＢＰもしくはこれをコードする核酸の発現量の変化をモニターすることにより、その進行もしくは消退、さらには寛解や治癒を診断することができる。
したがって、本発明はまた、対象から採取した検体中のＣＳＡＢＰもしくはこれをコードする核酸の存在を検出する工程または存在量を測定する工程を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患の診断方法にも関する。本方法における対象、検体および測定方法は上述したとおりである。【００４８】
本発明はまた、被験物質とＣＳＡＢＰまたはその断片とを共存させる工程を含む、ＣＳＡＢＰを検出および／または制御する成分のスクリーニング方法に関する。ここで、ＣＳＡＢＰを制御する成分とは、典型的には、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を意味する。
本発明の方法で用いる被験物質は特に限定されず、タンパク質などの高分子や、低分子量の種々の化合物を包含する。被験物質は、既知の物質であっても、リコンビナトリアルケミストリーなどの任意の既知の方法で合成された新規物質であってもよい。
本発明の方法におけるＣＳＡＢＰの断片は、ＣＳＡＢＰの任意の部分であってもよいが、ＣＳＡＢＰの機能に関与する部分、例えば、ＲＮＡヘリカーゼ活性に関与するＤＥｘＤｃドメイン（第１９１〜第３７８アミノ酸）の全体またはその一部を含む部分であることが好ましい。かかる断片は、ＣＳＡＢＰタンパク質のタンパク質分解酵素、例えば、トリプシン、パパインなどによる消化、ＣＳＡＢＰ遺伝子の制限酵素での消化、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法などによるＣＳＡＢＰ遺伝子の所定部分の増幅などの既知の任意の手法により得ることができる。
被験物質またはＣＳＡＢＰは、任意の固体支持体に固定化されていてもよい。支持体の例としては、限定することなく、例えば、ガラス、ニトロセルロース、ナイロン、プラスチックなどの材質の、プレート、ビーズ、チップなどが挙げられる。複数種の被験物質をチップなどに固定し、これに標識されたもしくはされていないＣＳＡＢＰを接触させたり、または、複数のＣＳＡＢＰを固相化し、これに複数種の被験物質を接触させることにより、一度に複数種の被験物質を試験することができる。【００４９】
被験物質とＣＳＡＢＰまたはその断片との接触は、任意の手法で達成してもよいが、典型的には、不活性媒体、好ましくは液状の不活性媒体中で行う。不活性媒体には、被験物質やＣＳＡＢＰに対して反応を起こさない既知の任意の媒体、例えば、蒸留水、生理食塩水、ＰＢＳなどを用いることができる。
本発明の方法の一態様においては、被験物質とＣＳＡＢＰまたはその断片との結合性（親和性）をスクリーニングの指標とする。結合性（解離定数、結合定数など）の測定は、既知の任意の方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、平衡透析法、原子間力顕微鏡法（Florin EL et al., Science. 1994;264 (5157):415-7）、放射性同位体、酵素、蛍光色素などで標識した既知のＣＳＡＢＰ結合性物質（ＣｓＡ、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢ、抗ＣＳＡＢＰ抗体など）と被験物質とを競合させる種々の競合結合アッセイなどにより行うことができる。本発明において好ましい解離定数（Ｋｄ）としては、例えば、１０−６Ｍ以下、好ましくは１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１０−９Ｍ以下であり、好ましい結合定数（Ｋａ）としては、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、さらに好ましくは１０９Ｍ−１以上である。結合性の高い被験物質は、ＣＳＡＢＰを検出および／または阻害する成分として好ましく用いることができる。【００５０】
本発明の方法の別の態様においては、被験物質の共存によるＣＳＡＢＰの機能の促進または抑制をスクリーニングの指標とする。ＣＳＡＢＰの機能としては、上述のＣｓＡもしくはその誘導体、ＣｙＰ、特にＣｙＰＢ、ＮＳ５Ｂおよび／またはＲＮＡとの結合性、ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ機能および／またはＨＣＶ複製促進機能などが挙げられ、被験物質の存在下で、ＣＳＡＢＰのこれらの機能がどのように変化するかを、既知の任意の方法、例えば、結合性については、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法など、ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ機能については、前記Okanamiらの方法など、ＨＣＶ複製促進機能については、ＨＣＶのＲＮＡもしくはタンパク質をＰＣＲ法などの種々の核酸定量法もしくはＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法などの種々のタンパク質定量法などにより解析する。こうして同定したＣＳＡＢＰの機能を促進する物質は、ＣＳＡＢＰの機能を促進する成分として、また、ＣＳＡＢＰの機能を抑制する物質は、ＣＳＡＢＰを阻害する成分として、本発明の組成物の製造や処置方法などに好ましく用いることができる。
本発明の方法のさらなる態様においては、被験物質の共存によるＣＳＡＢＰの存在量の増減をスクリーニングの指標とすることができ、これにより、ＣＳＡＢＰの存在量を制御する成分を同定することができる。ＣＳＡＢＰの存在量の増減を測定する具体的な手法は上述のとおりである。【００５１】
したがって、本発明はまた、ＣＳＡＢＰまたはその断片を含む、ＣＳＡＢＰを検出および／または制御する成分のスクリーニングキットに関する。同キットは、任意の容器に充填されたＣＳＡＢＰまたはその断片を少なくとも含む。容器としては、例えば、ガラスまたはプラスチック等の材質のアンプル、バイアル、ボトルなどが挙げられ、これらは好ましくは密封されている。ＣＳＡＢＰまたはその断片は、結晶形態で存在していても、凍結乾燥された状態で存在していても、あるいは、適切な媒体、例えば、蒸留水、生理食塩水、ＰＢＳなどの中に存在していてもよい。キットが結晶形態の、または凍結乾燥されたＣＳＡＢＰまたはその断片を含む場合は、同キットは適切な溶解液もしくは再構成液（例えば、蒸留水、生理食塩水、ＰＢＳなど）をさらに含んでいてもよい。本発明のキットはまた、上記のほか、被験物質のＣＳＡＢＰまたはその断片への結合性の測定やＣＳＡＢＰの機能の評価に用いる種々の試薬、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光色素などで標識した既知のＣＳＡＢＰ結合性物質（ＣｓＡ、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢ、抗ＣＳＡＢＰ抗体など）、ＣＳＡＢＰ核酸検出用プローブ、ＣＳＡＢＰ核酸増幅用プライマー、ＨＣＶサブゲノムレプリコンシステム、ＨＣＶ核酸検出用プローブ、ＨＣＶ核酸増幅用プライマー、抗ＨＣＶ抗体などを含んでもよい。上記キットはさらに、同キットの使用法に関する説明や指示を含む種々の媒体、例えば、使用説明書、ＣＤ、ＤＶＤなどを含んでもよい。【００５２】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を含む、ＲＮＡウイルスの増殖を制御するための組成物、ならびに、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分の、ＲＮＡウイルスの増殖を制御するための組成物の製造への使用に関する。
本組成物の対象となるＲＮＡウイルスとしては、既知の任意のもの、例えば、限定することなく、アレクシウイルス属、アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アストロウイルス科、アブサンウイロイド科、バルナウイルス科、ベニウイルス属、ビルナウイルス科、ボルナウイルス属、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス属、カーラウイルス属、クロステロウイルス科、コモウイルス科、コロナウイルス科、コオロギ麻痺病ウイルス属、シストウイルス科、デルタウイルス属、エナモウイルス属、フィロウイルス科、フラビウイルス科、フォベアウイルス属、フロウイルス属、Ｅ型肝炎様ウイルス属、ホルデイウイルス属、ハイポウイルス科、イダエオウイルス属、レビウイルス科、ルテオウイルス科、マラフィウイルス属、メタウイルス科、ナルナウイルス科、ノダウイルス科、オフィオウイルス属、オルトミクソウイルス科、ウルミアウイルス属、パラミクソウイルス科、パーティティウイルス科、ペクルウイルス属、ピコルナウイルス科、ポモウイルス属、ポスピウイロイド科、ポテクスウイルス属、ポティウイルス科、シュウドウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、セキウイルス科、ソベモウイルス属、テヌイウイルス属、テトラウイルス科、トバモウイルス属、トブラウイルス属、トガウイルス科、トンブスウイルス科、トティウイルス科、トリコウイルス属、ティモウイルス属、アンブラウイルス属、ヴァリコサウイルス属、ヴィティウイルス属などのウイルスが挙げられる。【００５３】
上記組成物において好ましいのは、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、限定することなく、アレクシウイルス属、アルテリウイルス科、アストロウイルス科、バルナウイルス科、ベニウイルス属、ブロモウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス属、カーラウイルス属、クロステロウイルス科、コモウイルス科、コロナウイルス科、コオロギ麻痺病ウイルス属、シストウイルス科、デルタウイルス属、エナモウイルス属、フラビウイルス科、フォベアウイルス属、フロウイルス属、Ｅ型肝炎様ウイルス属、ホルデイウイルス属、イダエオウイルス属、レビウイルス科、ルテオウイルス科、マラフィウイルス属、メタウイルス科、ノダウイルス科、オルトミクソウイルス科、ウルミアウイルス属、ペクルウイルス属、ピコルナウイルス科、ポモウイルス属、ポテクスウイルス属、ポティウイルス科、レトロウイルス科、セキウイルス科、ソベモウイルス属、テトラウイルス科、トバモウイルス属、トブラウイルス属、トガウイルス科、トンブスウイルス科、トリコウイルス属、ティモウイルス属、アンブラウイルス属、ヴィティウイルス属などのウイルスである。【００５４】
また、上記組成物においてより好ましいのは、フラビウイルス科のウイルス、例えば、限定することなく、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルスなどのフラビウイルス属のウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス１型および２型、豚コレラウイルス、ボーダー病ウイルスなどのペスチウイルス属のウイルス、ＨＣＶなどのヘパシウイルス属のウイルスなどであり、特に好ましいのは牛ウイルス性下痢ウイルス１型および２型、豚コレラウイルス、ボーダー病ウイルスなどのペスチウイルス属のウイルス、およびＨＣＶなどのヘパシウイルス属のウイルスであり、最も好ましいのは、ＨＣＶなどのヘパシウイルス属のウイルスである。
上記組成物は、生体内の細胞に用いてもよいが、生体外で培養している細胞に用いることもできる。したがって、本組成物は、上記ＲＮＡウイルスの増殖を制御する工程を含む種々の試験や実験に用いることができる。【００５５】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分をＲＮＡウイルス感染細胞内に送達する工程を含む、ＲＮＡウイルスの増殖を制御するための方法に関する。上記成分の送達は、既知の任意の方法、例えば、感染細胞を含む組織もしくは媒体への上記成分の注入もしくは添加、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法などを利用することができる。また、上記有効成分の細胞内への送達を促進するために、同成分をリポソーム、特にカチオン性リポソームなどの細胞内送達担体中に含むことや、同担体に結合させること、さらに、例えばＴＡＴペプチドなどの細胞内送達を促進する物質と結合させることもできる。【００５６】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰまたはその機能的変異体を含む、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢを検出および／または阻害するための組成物、ならびに、ＣＳＡＢＰまたはその機能的変異体の、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢを検出および／または阻害するための組成物の製造への使用に関する。
上記組成物におけるＣＳＡＢＰの機能的変異体は、典型的にはＣｓＡ、その誘導体、ＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢの少なくとも１つに結合性を有する変異体を意味する。好ましい変異体は、上記結合性を有するが、その他のＣＳＡＢＰ機能、例えば、ＡＴＰａｓｅ活性や、ＨＣＶ複製促進機能を有しないか、その程度が極めて低いものである。検出用の組成物において、ＣＳＡＢＰまたはその機能的変異体には、検出の便宜のために、種々の標識を付すことができる。標識は、既知の任意のもの、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、ＣＳＡＢＰまたはその機能的変異体に結合する物質（例えば抗体）、ビオチン、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、および酵素などから選択することができる。
上記検出用組成物は、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢの体内分布、細胞内分布、存在量などの調査に用いることができ、一方、阻害用組成物は、ＣｓＡおよびその誘導体の過量投与による有害症状の処置や、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢが関与する疾患、例えば、ＲＮＡウイルス感染症の処置などに用いることができる。【００５７】
また、本発明は、対象に上記組成物の有効量を投与する工程を含む、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢを検出および／または阻害するための方法に関する。本方法において、上記組成物の対象への投与は、例えば、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で好適に行うことができる。また、医師または獣医師においては、上記投与方法を適宜改変して、本発明の剤を対象へ投与することが可能である。ここで、有効量とは、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢの検出を目的とする場合は、上記組成物に含まれる標識を適切な検出機器などにより検出できる量であり、ＣｓＡおよびその誘導体の過量投与による有害症状の処置を目的とする場合は、同症状を軽減し、または進行を抑制する量、好ましくは、同症状を消失させる量であり、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢが関与する疾患の処置を目的とする場合は、同疾患の発症を低減し、症状を軽減し、または進行を防止する量であり、好ましくは、同疾患の発症を予防し、または同疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞等を用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタ等のモデル動物における試験により適宜決定することができる。【００５８】
上記方法において投与する組成物の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、検出機器の検出感度、標識の種類、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンス等を考慮して決定され得るため、一般的な有効量と異なることもあるが、かかる場合であっても、これらの方法はなお本発明の範囲に含まれる。
投与頻度は、用いる組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎等）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎等）であってもよい。【００５９】
また、本発明は、上記検出用組成物と、対象から採取した検体とを接触させる工程を含む、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢの検出方法にも関する。
検出には、既知の任意の方法を用いることができる。かかる方法の例としては、限定することなく、例えば、抗ＣＳＡＢＰ抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、標識を含む前記組成物を利用した、酵素発色法、蛍光検出法、放射活性測定法、オートラジオグラフィー法、フローサイトメトリー法、組織染色法、細胞染色法などを挙げることができる。
上記検出に用いる検体としては、例えば、血液、粘膜擦過物、手術やバイオプシー等により採取した種々の細胞や臓器、培養細胞、細胞培養物等を挙げることができる。検体は、そのまま検出操作に供してもよいが、例えば細胞を超音波処理等により破砕し、その遠心上清から細胞抽出液を調製するなどしておくと、検出操作が容易になる。【００６０】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分を含む、ＲＮＡ代謝系を制御するための組成物、ならびに、ＣＳＡＢＰの存在量および／または機能を制御する成分の、ＲＮＡ代謝系を制御するための組成物の製造への使用に関する。ＣＳＡＢＰは、ＤＥｘＤｃドメイン（第１９１〜第３７８アミノ酸）を有することから、ＲＮＡヘリカーゼ活性を有すると考えられる。ＲＮＡヘリカーゼは、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を一本鎖に解離することができ、ｍＲＮＡの成熟、リボソームの結合、翻訳などのＲＮＡ代謝系に関与している。ＣＳＡＢＰも同様にＲＮＡ代謝系に関与していると考えられるため、ＣＳＡＢＰの存在量や機能を制御することにより、ＲＮＡ代謝系を制御することができるものとみられる。本明細書中の実施例５では、ＣＳＡＢＰの発現量を低下させることでＨＣＶのＲＮＡ量が減少し、実施例６では、ＣＳＡＢＰを過剰発現させることでＨＣＶのＲＮＡ量が増加することが示されているが、これは、ＣＳＡＢＰを制御することにより、ＲＮＡ代謝系を制御できることを示すものである。【００６１】
したがって、上記組成物は、ＣＳＡＢＰが関与するＲＮＡ代謝系の異常に起因する疾患や、同代謝系を制御することにより改善する疾患を含むＲＮＡ代謝系関連疾患、例えば、複製にＲＮＡを利用する病原体、例えば、ＲＮＡウイルスなどによる感染症や、腫瘍、精巣における増殖性疾患、精巣が産生する生理活性物質、例えば、テストステロンなどの性ホルモンの異常に起因する疾患（前立腺癌や前立腺肥大等の前立腺疾患、男性更年期障害、精巣機能低下症）などの処置に用いることができるほか、ＲＮＡ代謝系の制御を要する試験や実験などにも利用することができる。
また、本発明は、対象に上記組成物の有効量を投与する工程を含む、ＲＮＡ代謝系関連疾患を処置するための方法に関する。なお、本方法のその他の詳細は、上記ＣＳＡＢＰ関連疾患の処置方法に準ずる。さらに、本発明は、ＲＮＡ代謝系の制御を要する試料に、上記組成物を添加する工程を含む、ＲＮＡ代謝系を制御するための方法にも関する。上記組成物は、好ましくは有効量で添加する。ここで有効量とは、上記成分がＲＮＡ代謝系を促進、維持、または抑制するのに有効な量を意味し、かかる量は当業者が適宜設定することができる。また、本方法における試料としては、例えば、培養細胞や培養組織、摘出細胞や摘出組織などが挙げられる。【００６２】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰに結合する物質を含む、ＣＳＡＢＰ発現部位特異的薬物送達システム、ならびに、ＣＳＡＢＰに結合する物質の、ＣＳＡＢＰ発現部位特異的薬物送達システムの製造への使用に関する。ＣＳＡＢＰは、特定の細胞（例えば、精巣や腫瘍細胞など）の特定の部位（例えば、小胞体など）に局在していることから（例えば、本明細書中の実施例７（２）参照）、ＣＳＡＢＰに結合する物質は、ＣＳＡＢＰ発現部位に対する標的化分子として利用することができる。かかる物質としては、例えば、抗ＣＳＡＢＰ抗体、ＣｓＡおよびその誘導体、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢおよびこれらのＣＳＡＢＰ結合性変異体等が挙げられる。ＮＳ５ＢまたはＣｙＰＢのＣＳＡＢＰ結合性変異体としては、ＣＳＡＢＰに結合するが、その他の生理学的活性を欠く変異体が好ましい。かかる変異体としては、例えば、ＣＳＡＢＰ結合部位を含むが、ＣｙＰＢ結合部位（ＨＣＶの場合は、第５２１〜第５９１アミノ酸）は含まないＮＳ５Ｂ変異体、ＣＳＡＢＰ結合部位を含むが、ＲＮＡポリメラーゼ領域（ＨＣＶの場合は、第１１６〜第３９８アミノ酸）を含まないＮＳ５Ｂ変異体などが挙げられる。ＣＳＡＢＰに結合する物質は、既知の任意の方法で送達される薬物に結合される。例えば、ＣＳＡＢＰに結合する物質と送達される薬物のいずれもがタンパク質である場合は、両者をコードする核酸を遺伝子工学的に結合し、融合タンパク質とすることができる。細胞内への取り込みを容易にするために、ＣＳＡＢＰ結合性物質と薬物の複合体を、リポソーム、好ましくはカチオン性リポソームに組み込むか、これとのエマルジョンとすることができる。【００６３】
送達する薬物は、ＣＳＡＢＰ発現部位にてその作用を発揮するか、作用が高まる任意の既知の薬物を含む。例えば、精巣の小胞体は、テストステロン等の性ホルモンの合成に関与する種々の酵素、例えば、１７α−ヒドロキシラーゼ、１７，２０リアーゼ、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼなどが存在するため、上記薬物の一例として、これらの酵素自体や、これらの酵素の活性を促進もしくは抑制する薬物、例えば、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤であるトリロスタン、特開平１０−２５９１８２などに記載の１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤などを挙げることができる。また、腫瘍細胞への送達を企図する場合には、腫瘍の処置を目的とする種々の薬剤を送達することができる。かかる薬剤の非限定例については、上記のとおりである。送達する薬物のさらなる例としては、種々の標識物質、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、および酵素などを挙げることができる。
本発明はまた、上記ＣＳＡＢＰ発現部位特異的薬物送達システムを用いたＣＳＡＢＰ発現部位特異的薬物送達方法にも関する。本方法は、上記薬物送達システムの有効量を対象に投与する工程を含んでもよく、その場合の他の詳細は、上記ＣＳＡＢＰ関連疾患の処置方法に準ずる。本方法はまた、上記薬物送達システムを、in vitroで、培養細胞や培養組織、摘出細胞や摘出組織などの試料に添加する工程を含んでもよい。【００６４】
本発明はまた、１）ＣＳＡＢＰのプロモーターと、これに作動可能に連結されたレポーター配列とを含む核酸分子を有する細胞を、被験物質と共存させる工程、および２）レポーター配列の発現産物を検出する工程を含む、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
ここで、ＣＳＡＢＰのプロモーターとは、ＣＳＡＢＰ遺伝子コード領域の上流（５’側）に位置し、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御するための遺伝子の部分であり、典型的には転写因子結合配列を有している。ヒトＣＳＡＢＰのプロモーターを含むプロモーター領域は、−４６３〜−１塩基（配列番号３７）、好ましくは−４６３〜−４４塩基（配列番号３０）、特に転写因子結合部位（−２２０〜−２１３塩基：（ＣＲＥＢ結合部位：ＴＧＡＣＧＴＣＡ）、−１８８〜−１７９塩基（ＧＡＴＡ結合部位：ＣＧＴＧＡＴＡＴＣＡ）および−１５０〜−１４０塩基（ＡＰ−１結合モチーフ：ＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ））を少なくとも１つ含む部分に存する。ヒト以外のＣＳＡＢＰのプロモーター領域は、例えば実施例８と同様に、ＣＳＡＢＰのコード領域の上流配列を含む種々の長さのｃＤＮＡ断片と、これに作動可能に連結されたレポーター配列とを含む核酸分子を細胞、好ましくは同種細胞に導入し、レポーター配列の発現を検出することにより適宜決定することができる。【００６５】
レポーター配列としては、その発現産物が検出可能である任意の塩基配列を用いることができる。検出の便宜から、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（βgal）、βグルクロニダーゼ（βglu）、βラクタマーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、種々のルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼ）等の遺伝子を用いることができるが、これらに限定されない。すなわち、発現産物がタンパク質である場合は、特異的な抗体を用いて検出することが可能であるし、発現産物がｍＲＮＡである場合は、特異的な核酸プローブを用いて検出することが可能である。したがって、レポーター配列としてＣＳＡＢＰ遺伝子を採用することもできる。
本方法に用いる細胞は特に限定されないが、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくは対象ＣＳＡＢＰと同種の細胞、例えばヒト細胞である。細胞は、前記核酸分子を本来的に含んでいても、前記核酸分子を人為的に導入したものであってもよい。核酸分子の導入には、既知の任意の方法、例えば、限定することなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法などを用いることができる。したがって、本方法の一態様は、細胞に前記核酸分子を導入する工程を含んでもよい。【００６６】
本方法における被験物質は特に限定されず、タンパク質などの高分子や、低分子量の種々の化合物を包含する。被験物質は、既知の物質であっても、リコンビナトリアルケミストリーなどの任意の既知の方法で合成された新規物質であってもよい。被験物質の非限定例として、転写の制御に関連する物質、特に転写因子ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡおよびＡＰ−１に関連する物質、例えば、ＰＫＡ、ｃＡＭＰ、アデニル酸シクラーゼ、ｐ９０ＲＳＫ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＭＡＰＫＡＰＫ−２、ＭＳＫ−１、ＣａＭＫ、カルシウムイオン、Ａｋｔ／ＰＫＢ、ＪＮＫ、ＦＲＫ、ＲＳＫ、カゼインキナーゼＩＩ、ＧＳＫ−３βおよびこれらに関連する物質を挙げることができる。また、今回、ＣＲＥＢ結合モチーフを含むＣＳＡＢＰのプロモーター領域が、ＣｐＧアイランドを形成しており、これによりメチル化され得ることが明らかとなったが、プロモーターのメチル化の程度が転写活性に影響を与えることが考えられるため（例えば、Bernstein BE et al., Cell. 2007;128(4):669-81参照）、メチル化を制御する物質、例えば、抗メチル化剤なども被験物質として例示することができる。また、本方法の被験物質として、下記のＣＳＡＢＰのプロモーターに結合する物質を回収する工程を含む、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法によって同定された物質を用いることもできる。したがって、本方法は、ＣＳＡＢＰのプロモーターに結合する物質を回収する工程を１）の工程の前にさらに含んでもよい。また、後述のとおり、前記ＣＳＡＢＰプロモーター結合物質を回収する工程は、回収されたＣＳＡＢＰプロモーター結合物質を精製する工程、および／または回収されたＣＳＡＢＰプロモーター結合物質（もしくは精製されたＣＳＡＢＰプロモーター結合物質）を同定する工程をさらに含んでもよい。【００６７】
被験物質との共存は、既知の任意の方法、例えば、限定することなく、細胞を含む培養系への被験物質の添加や、被験物質をコードする核酸の導入による細胞における該物質の発現などにより適宜達成することができる。
レポーター配列の発現産物は、種々の形態のもの、例えば、限定することなく、転写産物、スプライシング産物、翻訳産物、翻訳後修飾産物などを含み、各形態に適した検出方法で検出することができる。すなわち、発現産物が核酸、例えばｍＲＮＡである場合は、限定することなく、例えば、該核酸に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、種々のＰＣＲ法などを挙げることができ、発現産物がポリペプチドの場合は、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、酵素発色法、蛍光検出法、放射活性測定法、オートラジオグラフィー法、フローサイトメトリー法、組織染色法、細胞染色法などを挙げることができる。【００６８】
本方法において、レポーター配列の発現量を増加させる物質はＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を増強する物質と判定され、レポーター配列の発現量を減少させる物質はＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を低減する物質と判定される。ここで、発現量の増加または減少は、典型的には、被験物質の非共存下における発現量と比較しての増加または減少を意味する。そして、本方法によって同定されるＣＳＡＢＰの発現制御物質もまた、本発明の範囲に含まれる。
本方法においては、検出の精度および比較可能性を担保するために、陽性対照および／または陰性対照を適宜設けることができる。具体的な陽性対照および／または陰性対照の設定は、当業者の能力の範囲内である。【００６９】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰのプロモーターに結合する物質を回収する工程を含む、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
本方法における、ＣＳＡＢＰのプロモーターに結合する物質の回収手法としては、例えば、ビオチン化したＣＳＡＢＰプロモーターと、被験物質、例えば、細胞破砕物や細胞溶解物などと、固相（例えば、ビーズ、プレート、チップ、カラムなど）に固定したアビジンやストレプトアビジンとを接触させ、被験物質をプルダウンする方法や、固相に結合したＣＳＡＢＰプロモーターに被験物質を接触させた後、固相を洗浄することにより、プロモーターと、これに結合した物質との複合体を回収する方法などが挙げられる。ビオチンとアビジンの代わりに、他の既知の結合担体、好ましくは、核酸に適用可能な結合担体、例えば、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体などを用いてもよい。また、ビオチン化ＣＳＡＢＰプロモーターと、被験物質と、固相化アビジン等との接触は、３者を同時に混合して行ってもよく、また、ビオチン化ＣＳＡＢＰプロモーターと他の２者のいずれかを先に混合し、その後残りの１者を添加することで達成してもよい。
ＣＳＡＢＰのプロモーターに結合した物質は、例えば、ＭＳ（質量分析法）などにより同定することができる。ＭＳを行う前に、回収された被験物質を１次元または２次元ゲル電気泳動法や、液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法などにより精製してもよい。したがって、本方法は、回収されたＣＳＡＢＰプロモーター結合物質を精製する工程、および／または回収されたＣＳＡＢＰプロモーター結合物質（もしくは精製されたＣＳＡＢＰプロモーター結合物質）を同定する工程をさらに含んでもよい。【００７０】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰのプロモーターに関する。該プロモーターは、ＣＳＡＢＰ遺伝子コード領域の上流（５’側）に位置する、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御するための遺伝子の部分であり、典型的には転写因子結合配列を有している。ヒトＣＳＡＢＰのプロモーターは、ｉ）配列番号３７で表される塩基配列またはその部分を含む核酸分子、ｉｉ）ｉ）の核酸分子の塩基配列に１個または２個以上、好ましくは１個または数個の変異を有するが、なお該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子、ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）の核酸分子の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子、およびｉｖ）ｉ）またはｉｉ）の核酸分子と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、該核酸分子と同等の機能を有する核酸分子からなる群から選択される。【００７１】
したがって、ヒトＣＳＡＢＰプロモーターは、−４６３〜−１塩基（配列番号３７）からなる塩基配列またはその部分、好ましくは−４６３〜−４４塩基（配列番号３０）からなる塩基配列またはその部分、特に転写因子結合部位（−２２０〜−２１３塩基：（ＣＲＥＢ結合部位：ＴＧＡＣＧＴＣＡ）、−１８８〜−１７９塩基（ＧＡＴＡ結合部位：ＣＧＴＧＡＴＡＴＣＡ）および−１５０〜−１４０塩基（ＡＰ−１結合モチーフ：ＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ））を少なくとも１つ含むＣＳＡＢＰ遺伝子の部分を含む。
ここで、前記塩基配列の部分は、機能的であることが好ましい。ある遺伝子の部分が機能的であるか否かは、例えば、同部分を上記のレポーター配列と作動可能に連結し、これを所定の細胞に導入し、レポーター配列の発現を検出することにより適宜決定することができる（例えば実施例８参照）。
また、ヒト以外のＣＳＡＢＰのプロモーターは、例えば実施例８と同様に、ＣＳＡＢＰのコード領域の上流配列を含む種々の長さのｃＤＮＡ断片と、これに作動可能に連結されたレポーター配列とを含む核酸分子を、細胞、好ましくは同種細胞に導入し、レポーター配列の発現を検出することにより適宜決定することができるが、こうして得られた非ヒトＣＳＡＢＰプロモーターも、本発明に含まれる。
本発明のＣＳＡＢＰプロモーターは、前記ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法や、下記のＣＳＡＢＰ関連疾患の発症または病期を判定する方法等に用いることができる。【００７２】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰのプロモーターを有するベクターおよび細胞に関する。当該ベクターおよび細胞において、ＣＳＡＢＰプロモーターは、レポーター配列と作動可能に連結されていてもよい。ＣＳＡＢＰプロモーター、レポーター配列、ベクターおよび細胞は、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質をスクリーニングする方法について上記した任意のものを利用することができる。本発明の細胞は人為的な改変を受けていてもいなくともよいが、典型的には遺伝子導入などの人為的な改変を受けたものである。これらのベクターおよび細胞は、前記ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法等に用いることができる。【００７３】
本発明はまた、ＣＳＡＢＰ遺伝子、例えばそのプロモーター領域などの非コード領域やコード領域などにおけるメチル化を検出する工程を含む、ＣＳＡＢＰ関連疾患の発症または病期を判定する方法に関する。
前記のとおり、ＣＲＥＢ結合モチーフを含むＣＳＡＢＰのプロモーター領域が、ＣｐＧアイランド形成しており、これによりメチル化され得ることが明らかとなり、また、抗メチル化剤を細胞に投与することにより、ＣＳＡＢＰの発現を増強できることが判明した（実施例９参照）。下記実施例２に示すとおり、ＣＳＡＢＰの発現は正常組織で極めて低く、がん細胞において顕著に高いことを考慮すると、ＣＳＡＢＰ遺伝子におけるメチル化の解除と、細胞のがん化との間に高い関連性があるものと推測される。したがって、ＣＳＡＢＰ遺伝子におけるメチル化を検出することにより、ＣＳＡＢＰ関連疾患、例えば腫瘍性疾患の発症や病期を判定することが可能となる。【００７４】
本方法における、ＣＳＡＢＰのプロモーター領域およびＣＳＡＢＰ関連疾患はすでに上記したとおりである。本方法において、メチル化は既知の任意の方法、例えば、限定することなく、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳ−ＰＣＲ）、Combined bisulfite restriction assay（ＣＯＢＲＡ）、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、bisulfite−ＳＳＣＰ、ＤＭＨ（differential methylation hybridization）法、MethyLight法、Pyrosequencing法等により検出することができる。
本方法においては、例えば、血液、唾液、口腔粘膜、水疱内容物、水疱を含む皮膚片、糞便、尿、手術やバイオプシー等により採取した種々の細胞、体液、臓器等を検体として利用することができる。これらの検体は、そのまま検出に供してもよいが、事前にＤＮＡを抽出・精製することが好ましい。ＤＮＡの抽出法は当該技術分野で既知の任意のものを選択することができるが、例えば、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法等の手法を適宜用いることができる。
本方法により、例えば、ＣＳＡＢＰの発現を特徴とするＣＳＡＢＰ関連疾患については、例えば、被験対象由来の検体のメチル化の程度が健常対象由来の検体より低い場合には、被験対象がＣＳＡＢＰ関連疾患を発症していると判定され、ある時点の被験対象由来の検体のメチル化の程度が、それより前の時点の被験対象由来の検体より低い場合には、被験対象におけるＣＳＡＢＰ関連疾患が進行していると判定され、ある時点の被験対象由来の検体のメチル化の程度が、それより前の時点の被験対象由来の検体より高い場合には、被験対象におけるＣＳＡＢＰ関連疾患が寛解していると判定される。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１  ＣＳＡＢＰのクローニング
ファージディスプレイ法を用いて、ＣｓＡに結合するヒト細胞内タンパク質をクローニングした。まず、ＰＥＧビーズ樹脂にＣｓＡを光化学的に共有結合させた（ＣｓＡビーズ）。１×１０１１ｐｆｕの１２ランダムペプチドファージライブラリー（T7Select（登録商標）10-3 OrientExpress cDNA Cloning System、Oligo(dT)（Novagen社）を用いて作製）に０．５ｍｇＣｓＡビーズを加え、４℃で一晩インキュベートした。１ｍｌの１×ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）でビーズを計１０回洗浄したのち１００μｌの感染可能な大腸菌を加え、ビーズから直接ファージを回収した。回収したファージ、１×１０１１ｐｆｕに再び０．５ｍｇのビーズを加え、一連の操作を計４回繰り返した。４回目の回収ファージから５種類の独立したファージを個別に増幅させ、約１×１０１０ｐｆｕのファージを０．５ｍｇのビーズとともに４℃で一晩インキュベートし、１％ＳＤＳを加えてファージを溶出させた。ＣｓＡを結合させていないビーズをもとにファージの溶出比を算出した。【００７６】
最も溶出比の高かったファージクローン番号１３をクローニングした。このファージは、ＬＶＦＧＴＬＬＧＱＬＲＡのアミノ酸配列を有するペプチドを提示する。このペプチドをコードする遺伝子をＮＣＢＩのデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で照会したところ、同配列と相同性を有するヒト由来のタンパク質を見出した（遺伝子ＩＤ：ＮＭ＿０２２８２８）。このタンパク質は全長１４３０アミノ酸からなり、その中ほどにＬＬＧＱＬＲＡなる配列を含んでいた。このタンパク質がＣＳＡＢＰである。【００７７】
実施例２  ＣＳＡＢＰの発現解析
種々の組織および細胞株におけるＣＳＡＢＰの発現状況を、ノーザンブロット法およびＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した。
（１）ノーザンブロット解析
ノーザンブロットは定法に基づき行った。使用した全ＲＮＡは、ヒト正常肝組織（Human Liver Total RNA、Clontech社）、ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３、ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ−７およびＨＣＶゲノムレプリコン細胞株ＭＨ１４からのもので、各細胞株からの全ＲＮＡの抽出は、RNeasy kit（Invitrogen）を用いて行った。２０μｇのＲＮＡサンプルをホルムアルデヒド変性ゲルで電気泳動した。泳動終了後のゲルをナイロンメンブラン（Hybond-N+）に一晩トランスファーし、ＵＶクロスリンクで架橋させ、乾燥させた。ランダムプライマー法（Rediprime II、GE healthcare社）により３２ＰでラベルしたＣＳＡＢＰ遺伝子をプローブ（5'-acgaagtgatgggtgggagcgagcc-3'（配列番号３）および5'-cccataactggagcaactgttcacc-3'（配列番号４））としてハイブリダイゼーションを行い、Ｘ線フィルム（BioMax（Kodak社）、FUJI MEDICAL X-RAY FILM（富士フィルム社））を用い、ＣＳＡＢＰプローブと結合する各サンプル中のＣＳＡＢＰのＲＮＡを検出した（図１）。この結果、調査した３種類の癌細胞において、いずれも４３００ベース付近にシングルバンドが確認できた。しかしながら、正常肝細胞では、このようなバンドは観察できなかった【００７８】
（２）ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析
テンプレートには、１４種の臓器における正常組織からの第１鎖ｃＤＮＡライブラリー（Clonteck社）、および１１種の癌細胞から回収した全ＲＮＡを用いた。癌細胞からの全ＲＮＡの回収はRNeasy kit（Qiagen社）を、得られた全ＲＮＡの逆転写反応はTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche社）をそれぞれ用い、定法に従い行った。プライマーは、フォワードプライマーにＣＳＡＢＰ  791〜810（5'-gacgggaaaggattggtcaa-3'、配列番号５）を、リバースプライマーにＣＳＡＢＰ  2723〜2742（5'-cccatcacttcgtgcttttt-3'、配列番号６）をそれぞれ用い、Gotaq（登録商標）PCR system（Promega社）を用い、９５℃、５分×１サイクル、９５℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、２．５分×３５サイクル、７２℃、７分×１サイクルでＰＣＲ反応を行った。結果を図２および３に示す。
ＣＳＡＢＰの発現は、精巣を除くほとんどの正常組織で非常に低かった（図２）が、調査した全ての癌細胞において顕著であった（図３）。これは、ＣＳＡＢＰを精巣マーカーまたは癌マーカーとして利用できることを示すものである。【００７９】
実施例３  ＣＳＡＢＰ組換えタンパク質の合成
ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３のｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー（フォワードプライマー:5'-CCGAATTCATGTCCAGGCCGAGCAGCGTCTCC-3'（配列番号７）、リバースプライマー:5'-CCCTCGAGTCAATCAGTTGTGTTTTTTTCTCCC-3'（配列番号８）（下線は制限酵素認識配列））を用いたＰＣＲによりＣＳＡＢＰ遺伝子を増幅させ、ｐＥＴベクター（Invitrogen社）にクローニングした。ｐＥＴ−ＣＳＡＢＰ−ＦＬ、ｐＥＴ−ＣＳＡＢＰ−Ｃ（ＦＬ＝全長、Ｃ＝Ｃ末端部分領域（ＣＳＡＢＰ ORF：第１９３〜第１４３０アミノ酸））を大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下、２０℃で一晩培養してタンパク質を発現させた。ＣＳＡＢＰを発現誘導させた大腸菌を回収し、可溶性画分をＨｉｓＴｒａｐ（アマシャム社）を用いて精製した後、精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分子量（クマシー染色）を確認した（図４）。精製タンパク質のバンドは、分子量１５０ｋＤａ付近に認められ、これは、ＮＣＢＩのデータベースに記載された情報と一致するものであった。したがって、上記手法により、組換えＣＳＡＢＰタンパク質を十分な量で作製できることが明らかとなった。【００８０】
実施例４  ＣＳＡＢＰの機能の評価
ＣＳＡＢＰのＣｓＡへの結合能およびＡＴＰａｓｅ活性を以下のようにして評価した。
（１）ＣｓＡとの分子会合
組換え全長ＣＳＡＢＰタンパク質（ＣＳＡＢＰ-FL）とＣｓＡとの分子会合を、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）法により評価した。ＳＰＲ測定にはBiacore 3000（Biacore社）を用いた。精製組換えＣＳＡＢＰタンパク質をBiacoreチップＣＭ５にアミンカップリング法で固定化した（固定化量約１００００）。ＰＢＳ−８％ＤＭＳＯに溶解したＣｓＡをアナライトとして用いた。様々なＣｓＡ濃度に対するＣＳＡＢＰのＲＵ値を測定し、Biacore付属のアプリケーションを用いてＫＤ値を算出した。この結果、ＣｓＡとＣＳＡＢＰとの解離定数はＫＤ＝１．２×１０-７Ｍと算出され、両物質が特異的に結合することが明らかとなった（図５）。【００８１】
（２）ＡＴＰａｓｅ活性の測定
ＡＴＰａｓｅ活性の測定には、前記Okanamiらの方法を用いた。すなわち、精製したＣＳＡＢＰ−Ｃを４０倍濃縮し、ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０）に置換した。精製ＣＳＡＢＰ−Ｃ（５００ｎｇ）を５０μｌのヘリカーゼバッファー（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ＤＴＴ）に加え、３０ｎＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）１μｌおよび１００ｎｇの全ＲＮＡ（肝臓由来）存在下、３０℃で反応させた。過剰量のリン酸の添加により反応を停止させ、ＡＴＰを活性炭に吸着後、分解されて遊離した３２Ｐの量をシンチレーションカウンターで測定することでＡＴＰａｓｅ活性を求めた。また、比較のため、ＲＮＡが存在しない条件でも同様の測定を行った。結果を図６に示す。同図より、ＣＳＡＢＰがＲＮＡ依存性のＡＴＰａｓｅ活性を有することが分かる。
ＣＳＡＢＰのＡＴＰａｓｅ活性がＣｓＡの存在によりどのように変化するかを検討するため、種々の濃度のＣｓＡまたはＦＫ５０６の存在下で上記と同様の測定を行い、ＡＴＰａｓｅ活性を算出した（図７）。これによると、ＣＳＡＢＰのＡＴＰａｓｅ活性が、ＣｓＡの結合によって機能阻害を受けることが明らかとなった。なお、ＦＫ５０６とＣＳＡＢＰとの解離定数はＫＤ＝２．５×１０-６Ｍであった。【００８２】
実施例５  ＣＳＡＢＰの発現抑制によるＨＣＶ複製への影響
ＣＳＡＢＰの発現をｓｉＲＮＡにより抑制し、これがＨＣＶ複製に及ぼす影響について、ＭＨ１４細胞の系を用いて検討した。ＭＨ１４細胞は、感染性を除いたＨＣＶサブゲノムをヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ−７に導入したものであり（Miyanari Y et al., J Biol Chem. 2003 Dec 12;278(50):50301-8）、ＭＨ１４細胞にはＨＣＶサブゲノムが発現し、その複製機構は野生型のものと同じであることが知られている。
（１）ｓｉＲＮＡの作製とＭＨ１４細胞への導入
ＣＳＡＢＰ遺伝子上の６種類の異なる領域を標的にしたｓｉＲＮＡを定法により化学合成した（下表参照）。また、コントロール（si-control）として、β−アクチン特異的ｓｉＲＮＡ（Ambion社）を用いた。【００８３】
【表１】
2009028418.tif 000002
ｓｉＲＮＡのＭＨ１４細胞への導入は、以下のようにして行った。２×１０５細胞／ウェルの濃度のＭＨ１４細胞を６ウェルプレート中で一晩培養し（３７℃、５％ＣＯ２）、各ｓｉＲＮＡを５％siLentFect（BIORAD社）溶液に最終濃度３０ｎＭで懸濁したものをＭＨ１４細胞に添加し、４時間培養したのち、培地の半量を１５ｎＭのｓｉＲＮＡを含む新鮮な培地に交換し、１８時間後、培地の全量を新鮮な培地に交換して、さらに５日間培養した。【００８４】
（２）遺伝子発現の定量
培養後細胞を回収し、RNeasy kit（Qiagen社）で全ＲＮＡを精製し、定法に従って逆転写反応を行い、第１鎖ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡを用いて、Ｇ６ＰＤＨ、ＣＳＡＢＰ、ＨＣＶの各遺伝子をリアルタイムＰＣＲを用いて定量した。Ｇ６ＰＤＨは内部対照として、細胞間のＲＮＡ量を補正するために用いた。Ｇ６ＰＤＨおよびＨＣＶ遺伝子はリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ法により、ＣＳＡＢＰ遺伝子はサイバーグリーン法により、下表に示すプライマーおよび／またはプローブを用いて定量した。Ｇ６ＰＤＨの定量には、２重プローブ法を用いた。なお、ＣＳＡＢＰに関してはｓｉＲＮＡ＃３０３１１の導入細胞用のプライマーを示した。
【表２】
2009028418.tif 000003
この結果、ＣＳＡＢＰを標的とする６種類のｓｉＲＮＡ−ＣＳＡＢＰ（ｓｉ−ＣＳＡＢＰ）がいずれもＣＳＡＢＰの転写をｍＲＮＡレベルで抑制可能であり、このうち＃３０３１１が最も優れた抑制効率を示すことが明らかとなった（図８）。また、ｓｉ−ＣＳＡＢＰ（＃３０３１１）の導入により、ＣＳＡＢＰの発現量が１／７以下に、ＨＣＶゲノムの複製量が１／４以下にそれぞれ顕著に減少した（図９および１０）。【００８５】
実施例６  ＣＳＡＢＰの過剰発現によるＨＣＶ複製への影響
ＣＳＡＢＰ遺伝子を外来性に導入し、これがＨＣＶ複製に及ぼす影響について検討した。
まず、実施例３で得たＣＳＡＢＰタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位に導入して、ＣＳＡＢＰ−ｐｃＤＮＡを作製した。同ベクターをLipofectamin 2000（Invitrogen社）に５０または１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、ＨＣＶサブゲノムレプリコン配列中、ネオマイシン耐性遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置換したＲＮＡをＬＭＨ１４細胞（非特許文献４参照）に導入した。導入後４日目に、ルシフェラーゼ遺伝子の発現に伴う発光を測定し、ＨＣＶ複製を定量した。結果を図１１に示す。同図から明らかなように、ＣＳＡＢＰ−ｐｃＤＮＡはＨＣＶゲノムの複製を用量依存的に増強した。【００８６】
実施例７  ＣＳＡＢＰによるＨＣＶゲノム複製機構の解析
ＣＳＡＢＰがどうような機構でＨＣＶゲノムの複製に関与しているかを明らかにするために、ＣＳＡＢＰの細胞内の標的分子の検索をin vitroおよびin vivoで行った。
（１）in vitroにおける分子会合
まず、ＣＳＡＢＰ−ＧＳＴ融合タンパク質を作製するため、実施例３で得たＣＳＡＢＰ−ｃＤＮＡをｐＧＥＸ−６Ｐ−１（GE healthcare社）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに組み込み、大腸菌Rosetta（DE3）（Novagen社）に導入した。ＣＳＡＢＰ−ｐＧＥＸ形質転換株を、定法に基づきクローニングし、ＣＳＡＢＰタンパク質発現のために培養した。所定の時間培養後、ＩＰＴＧを添加し、ＣＳＡＢＰ−ＧＳＴ融合タンパク質の発現誘導を行い、それらの形質転換株を回収した。ＣＳＡＢＰ−ＧＳＴ融合タンパク質の精製はGE healthcare社のプロトコルに沿って行い、ＣＳＡＢＰ−ＧＳＴ融合タンパク質を得た。【００８７】
次に、ＣＳＡＢＰ−ＧＳＴ融合タンパク質を、in vitroで３５Ｓ標識タンパク質合成したＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＡおよびＣｙＰＢの各タンパク質と混合し、２時間培養後、ＧＳＴカラムで回収した。対照区には結合実験に供した１／５量のタンパク質溶液を用いた。これらのサンプルをイメージングアナライザーBAS5000にて解析し、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＡおよびＣｙＰＢの各タンパク質を検出した。また、別の実験では前記in vitro合成タンパク質溶液とＣＳＡＢＰ−ＧＳＴタンパク質との共培養中にＣｓＡを０、０．１、１、１０および３０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、所定時間培養後、グルタチオンセファロースによってＧＳＴ−ＣＳＡＢＰと共沈してきたサンプルを同様に検出した。結果を図１２および１３にそれぞれ示す。
ＧＳＴ−ＣＳＡＢＰとin vitro合成タンパク質溶液とを共培養後、グルタチオンセファロースによりＧＳＴ−ＣＳＡＢＰを回収したサンプルにおいて、ＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢが検出されたことから（図１２中、矢印で示した部分）、ＣＳＡＢＰがＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢと会合することが明らかとなった。これは、ＣＳＡＢＰがＣｙＰＢおよびＮＳ５Ｂと３量体を形成していることを示すものである。一方、ＣｓＡの添加によって、ＧＳＴ−ＣＳＡＢＰ／ＮＳ５Ｂの会合は維持されていたが、ＣｙＰＢはこれらの分子とは解離した（図１３）。
さらに別の実験において、ＮＳ５Ｂの種々の断片を用いて、ＣＳＡＢＰが、ＮＳ５Ｂのどの部分に結合するのかを調査した。その結果、ＣＳＡＢＰは、ＮＳ５Ｂの第１〜第２００アミノ酸からなる部分、および、第４０１〜第５２０アミノ酸からなる部分に結合することが明らかとなった（図１４）。これは、ＣｙＰＢがＮＳ５ＢのＣ末端（第５２１〜第５９１アミノ酸）に結合するのと対照的である（非特許文献１０参照）。【００８８】
（２）in vivoにおける分子会合
１）ＣＳＡＢＰの細胞内局在
ＣＳＡＢＰが実際に細胞内に存在するか否かを検討するために、抗ＣＳＡＢＰ抗血清（ポリクローナル抗体）を作製し、Ｈｕｈ７細胞およびＭＨ１４細胞内のＣＳＡＢＰの局在を免疫染色により観察した。また、前記抗ＣＳＡＢＰ抗血清を用いて、ＣＳＡＢＰがＨＣＶの複製に関与している分子と共局在しているかどうかも調査した。
まず、ＣＳＡＢＰ遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部のペプチド（ILHPKRGTEDRSDQ、配列番号１の第１２３７〜第１２５０アミノ酸に相当）を合成し、これを定法に従ってウサギに４回免疫し、所定期間後ウサギ血清を回収、濃縮し、免疫で用いたペプチドのペプチドカラムを作製し、それに特異的に吸着する抗体を回収し、精製抗ＣＳＡＢＰ抗血清を得た。Ｈｕｈ７細胞およびＭＨ１４細胞を冷アセトンで固定した後、前記抗ＣＳＡＢＰ抗体と、細胞質内に存在する小胞体膜タンパク質ＫＤＥＬに対する抗体とで２重染色を行った。染色には、ＣＳＡＢＰ抗体に対しては、抗ウサギIgG-Alexa 488標識２次抗体を、ＫＤＥＬ抗体に対しては、抗ウサギIgG-Alexa 594標識２次抗体（いずれもMolecular Probes社）をそれぞれ用いた。また、別の実験では、抗ＫＤＥＬ抗体の代わりに、ＨＣＶ由来の種々のタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）に対する抗体を用いて２重染色を行い、ＨＣＶの複製部位におけるＣＳＡＢＰの共局在についても検討した。染色には、ＣＳＡＢＰ抗体に対しては、抗ウサギIgG-Alexa 488標識２次抗体を、抗ＮＳ３、ＮＳ４ＡまたはＮＳ４Ｂ抗体に対しては、抗ウサギIgG-Alexa 594標識２次抗体を、そして、抗ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂ抗体に対しては抗マウスIgG-Alexa 594標識２次抗体（いずれもMolecular Probes社）をそれぞれ用いた。染色後、細胞はコンフォーカル顕微鏡で観察した。結果を図１５および１６にそれぞれ示す。【００８９】
ＣＳＡＢＰ（緑色）と、Ｈｕｈ７細胞およびＭＨ１４細胞内のＫＤＥＬ分子（赤色）との共局在部位は、両染色像を重ね合わせたＭｅｒｇｅ画像においては黄色で表されるが、図１５から明らかなように、かかる黄色部位は細胞質に限局しており、ＣＳＡＢＰが、ＫＤＥＬの存在する小胞体に共局在することが示された。一方、ＨＣＶ由来のタンパク質との共局在については、ＨＣＶゲノムが導入されているＭＨ１４細胞のみにＮＳ３以下のＨＣＶ由来のタンパク質分子が染色され、ＣＳＡＢＰはそれらのいずれとも共局在していることが明らかとなった（図１６）。ＨＣＶは小胞体内で複製されることが知られているため、この結果は、先の小胞体における局在と併せて、ＣＳＡＢＰがＨＣＶゲノムの複製の場所に局在していることを示すものである。【００９０】
２）ＣＳＡＢＰの細胞内でのＲＮＡ結合性 
ＣＳＡＢＰはデータベース上での機能解析では、ＲＮＡヘリカーゼ活性を有すると報告されているＤＥｘＤｃドメイン（第１９１〜第３７８アミノ酸）に存在することから、ＲＮＡとの結合性をはじめとした深い繋がりが予測される。そこで、実際にＣＳＡＢＰが細胞内でＲＮＡに結合していることを検証するためにWatashiら（非特許文献１０）の方法に従いＲＮＡ結合アッセイを行った。
まず、ＭＨ１４細胞をジギトニンで処理し、細胞溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ＮＰ−４０、および Protease inhibitor tablet（Roche社））に浸して細胞を溶解した。得られた細胞溶解物を遠心して、不可溶性分画を取り除いた細胞抽出液（Whole cells）にポリＵセファロース（ウラシルが連なっているセファロース）を添加し、ＲＮＡに結合している分子を回収した（pU）。コントロールとして、イムノグロブリンに特異的に結合するProtein Gセファロースを用いた（G）。これらのサンプル中のＣＳＡＢＰ分子を、前記抗ＣＳＡＢＰ抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した。細胞抽出液中のＣＳＡＢＰを抗ＣＳＡＢＰ抗体にて検出する際、抗体による非特異的なバンドを区別するために、ＣＳＡＢＰ検出のための標準物質として実施例３で作製した組換えＣＳＡＢＰも同時に泳動し、検出した。【００９１】
その結果、Whole cellsのレーンの約１５０ｋＤ付近にバンドが検出され、これが前記組換えＣＳＡＢＰタンパク質（r-ＣＳＡＢＰ）と同等の分子量であることから、同バンドがＣＳＡＢＰタンパク質であることが示された。そしてポリＵ沈降物、すなわちＲＮＡに結合して沈降したＭＨ１４細胞由来の物質群の中に、ＣＳＡＢＰ分子が検出された（図１７）。なお、Protein Gセファロースのレーンにバンドが認められなかったことから、使用した抗ＣＳＡＢＰ抗体のセファロースへの非特異的吸着は除外されている。したがって、pUレーンにおけるバンドは、同抗体による特異的結合によって生じたものであり、この結果は、ＣＳＡＢＰがin vivoにおいてＲＮＡと結合していることを示すものである。【００９２】
３）in vivoにおけるＣＳＡＢＰの標的分子
上記（１）に記載したin vitroにおける分子会合実験により、in vitroにおいて、ＣＳＡＢＰ分子が、ＨＣＶ由来のＮＳ５Ｂと細胞質由来のＣｙＰＢとの３量体の分子会合をすることが明らかとなったが、これが実際に細胞内でも起きていることを確認すべく、ＭＨ１４細胞溶解物についてポリＵセファロースで沈降反応を行い、各タンパク質の存否をウエスタンブロット法で解析した。
具体的には、Whole cells、pUおよびGの各サンプルを上記２）と同様に調製し、サンプル中のＣＳＡＢＰ、ＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢの各分子を、抗ＣＳＡＢＰポリクローナル抗体、抗ＮＳ５Ｂ抗体および抗ＣｙＰＢ抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した。
その結果、Whole cells中に、抗ＣＳＡＢＰ抗体、抗ＮＳ５Ｂ抗体および抗ＣｙＰＢ抗体によって各分子が検出された。そして、ポリＵセファロース沈降物中においても同様に、調査したすべての分子が検出された。一方Protein Gセファロース沈降物には、いずれのバンドも検出されなかった（図１８）。これらの結果からＣＳＡＢＰがin vivoにおいてもＮＳ５Ｂ、ＣｙＰＢと３量体を形成しており、この３量体がＲＮＡと結合していることが示された。【００９３】
４）ＣＳＡＢＰ発現消失がＨＣＶ由来タンパク質の分子会合に及ぼす影響
ＣＳＡＢＰ−ｓｉＲＮＡでの処理によって、ＣＳＡＢＰとＨＣＶ由来のタンパク質ならびにＣｙＰＢ分子とのＲＮＡを介した結合がどのように変化するかを調査した。
ＭＨ１４細胞へのｓｉＲＮＡ処理は、実施例５（１）と同様に行った。sｉＲＮＡ導入後３日目に、細胞を回収し、上記２）と同様にＲＮＡ結合アッセイを行った。結果を図１９に示す。si-control（β−アクチン特異的ｓｉＲＮＡ処理）細胞においては、上記３）と同様の結果が再現された。これに対し、ＣＳＡＢＰ−ｓｉＲＮＡで処理した細胞（si-ＣＳＡＢＰ）では、ＣｙＰＢのバンドがほとんど確認できなかった。これは、ＣＳＡＢＰの欠損によって、ＣｙＰＢがＲＮＡと結合できなくなったことを示している。ＣｙＰＢとＮＳ５Ｂとの結合はＨＣＶ複製に必須であることから、ＣＳＡＢＰの欠損によるＣｙＰＢのＲＮＡからの解離が、実施例６に記載したＣＳＡＢＰの欠損によるＨＣＶの複製阻害の一因になっていると考えられる。【００９４】
５）ＣｓＡの添加による、ＣＳＡＢＰ、ＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢの分子会合への影響
ＣｓＡ処理により、ＣＳＡＢＰ、ＮＳ５ＢおよびＣｙＰＢの分子会合がどのように変化するかを調査した。
まず、０または２μｇ／ｍｌのＣｓＡをＭＨ１４細胞に添加し２４時間培養した。培養後細胞を回収し、上記２）と同様にしてＲＮＡ結合アッセイを行った。結果を図２０に示す。ＣｓＡ処理により、ＣＳＡＢＰのＲＮＡへの結合が著しく減少するとともに、ＣｙＰＢのＲＮＡからの解離が認められた。これらの結果は、ＣｓＡによるＨＣＶの複製抑制、および、ＣＳＡＢＰの発現抑制によるＨＣＶの複製抑制のいずれにおいても、ＣＳＡＢＰおよびＣｙＰＢのＲＮＡからの解離が共通の現象として生じていることを示すものである。【００９５】
実施例８  ＣＳＡＢＰ遺伝子のプロモーター領域の決定および同遺伝子の転写に関与する転写因子の同定
ＣＳＡＢＰ遺伝子の上流にあるプロモーター領域の決定およびＣＳＡＢＰ遺伝子の転写に関与する転写因子の同定をプロモーターアッセイを用いて行った。
（１）ＣＳＡＢＰ遺伝子の転写領域の決定
ＮＣＢＩデータベース上で同定した、第５番染色体上にコードされているＣＳＡＢＰ遺伝子を含むゲノムクローン、BAC clone number RP11-64F7をChildren's Hospital Oakland Research Instituteから購入した。プロモーター領域決定のため、ＰＣＲによってＣＳＡＢＰ上流領域の数種類のｃＤＮＡをサブクローニングし、これらのｃＤＮＡをルシフェラーゼベクター（Promega社）に組み込んだ。まず、ＣＳＡＢＰ遺伝子の−４２９２〜＋２４１４塩基（ここで、同遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡを＋１塩基として、ＡＴＧの１塩基上流（５’側）の塩基を−１塩基とする）の領域を増幅するために、ＣＳＡＢＰ -4292フォワードプライマー:5'-GTCCCAGGAGACAACTCCAT-3'（配列番号２４）、ＣＳＡＢＰ +2414リバースプライマー：5'-CATCAGATCCTTGACTTGGTAGG-3'（配列番号２５）を合成し、上記ＢＡＣをテンプレートにしてＰＣＲを行った。この断片をTOPO TA Cloning（登録商標）キット（Invitrogen社）によりpCRII-TOPOベクター（Invitrogen社）に挿入した。このベクターをＮｈｅＩで切断することでＣＳＡＢＰ  −１５１９〜−４４塩基、ＳａｃＩとＮｈｅＩとで切断することでＣＳＡＢＰ  −４２９２〜−１５１６塩基をそれぞれ切り出し、ｐＧＬ４．１０ルシフェラーゼベクター（Promega社）に挿入した。【００９６】
また、ＣＳＡＢＰの−９２６〜−４４塩基、−９２６〜−４６４塩基、および−４６３〜−４４塩基の各領域を増幅するために、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したプライマー（ＣＳＡＢＰ -926フォワードプライマー:5'-TTTGAGCTCAATATTCCGCCCCCTTCTTA-3'（配列番号２６）、ＣＳＡＢＰ -44リバースプライマー:5'-TTTAAGCTTGCTAGCTGACAGCCAATGAC-3'（配列番号２７）、ＣＳＡＢＰ -464リバースプライマー:5'-TTTAAGCTTAGGTTCCTACCTTCATGGAGTT-3'（配列番号２８）およびＣＳＡＢＰ -463フォワードプライマー:5'-TTTGAGCTCTGGCTCTCTGGTTCTCCAAT-3'（配列番号２９）（下線は制限酵素認識配列））をそれぞれ合成し、上記断片（ＣＳＡＢＰ  −１５１９〜−４４塩基）をテンプレートにしてＰＣＲを行った。増幅した各断片をｐＧＬ４．１０ルシフェラーゼベクター（Promega社）に挿入した。これらのベクターを、ｐＧＬ４．７４ルシフェラーゼベクター（Promega社）と共に肝癌細胞株、Ｈｕｈ−７にＬＦ２０００（Invitrogen社）によって導入し、２４時間後に細胞を回収した。回収した細胞におけるルシフェラーゼの発光をDual-Luciferase（登録商標）Reporter Assay System（Cat.E1910、Promega社）のプロトコルに従い、ルミネッセンサーPSN（アトー株式会社）で測定した。なお、陽性対照としてSV40 early enhancer/promoterが導入されたｐＧＬ４．１３ルシフェラーゼベクター（Promega社）を、陰性対照として何も導入していないｐＧＬ４．１０ルシフェラーゼベクターをそれぞれ用いた。その結果、−４６３〜−４４塩基（配列番号３０）の領域で発光活性が認められ（図２１）、その領域がプロモーター領域であることが明らかとなった（図２２）。【００９７】
（２）転写因子の同定
上記プロモーター領域についてTFSEARCHデータベース上で検索を行った結果、転写因子ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡおよびＡＰ−１の結合モチーフ（それぞれ、TGACGTCA（−２２０〜−２１３塩基）、CGTGATATCA（−１８８〜−１７９塩基）およびGGTGACTGAGG（−１５０〜−１４０塩基））が存在することが分かった。これらの転写因子の中でＣＳＡＢＰの発現に重要なものを明らかにするために、前記領域内に存在する３つの転写因子結合モチーフに、下表に示すプライマーを用いて変異を導入し、変異型ＣＲＥＢ結合モチーフｃＤＮＡ（ｍ−ＣＲＥＢ）、変異型ＧＡＴＡ結合モチーフｃＤＮＡ（ｍ−ＧＡＴＡ）、および変異型ＡＰ−１結合モチーフｃＤＮＡ（ｍ−ＡＰ−１）をそれぞれ作製した。
【表３】
2009028418.tif 000004
【００９８】
上記変異型ｃＤＮＡの変異箇所を下表に示す。表中、変異導入前の野生型はｗ−ＣＲＥＢ、ｗ−ＧＡＴＡおよびｗ−ＡＰ−１とそれぞれ表す。
【表４】
2009028418.tif 000005
得られた変異型ｃＤＮＡを上記（１）と同様にＨｕｈ−７に導入し、発光を測定した。その結果、その結果、ｍ−ＣＲＥＢ  ｃＤＮＡを導入した場合のみに、ルシフェラーゼ活性の著しい低下が認められた（図２３）。これは、ＣＲＥモチーフ（TGACGTCA）に結合するＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーに属する転写因子がＣＳＡＢＰの転写に関与していることを示すものである。【００９９】
実施例９  抗メチル化剤によるＣＳＡＢＰの発現制御
（１）ＣＳＡＢＰ遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化
実施例８で同定したＣＳＡＢＰ遺伝子のプロモーター領域（−４６３〜−４４塩基（配列番号３０））をＣｐＧアイランド解析ツール（CpG Island Searcher、http://cpgislands.usc.edu/）により解析した結果、この領域がＣｐＧアイランドであることが示された（図２４）。ＣｐＧ配列はＤＮＡのメチル化を受ける配列であり、プロモーター領域のＣｐＧアイランドがＤＮＡのメチル化を受けると、その遺伝子の発現は抑制されるとされている（上記Bernstein et al., 2007参照）。そこでＣＳＡＢＰ遺伝子の発現とＤＮＡのメチル化との関連を解析するため、ＤＮＡメチル化阻害剤である５−アザ−２’−デオキシシチジン投与後のＣＳＡＢＰ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。【０１００】
（２）抗メチル化剤のＣＳＡＢＰ発現への影響
１０５細胞／ウェルのＭＨ１４細胞（肝癌細胞株）を、６ウェルプレート中、ＭＨ１４細胞培養培地にて２４時間前培養後、５−アザ−２’−デオキシシチジン（Sigma社）を添加した。その後、２４時間ごとに前記メチル化阻害剤を添加した培地で培地交換を行い、４日後に細胞を回収した。５−アザ−２’−デオキシシチジンの添加量は、０、０．１、０．５または１．０μＭとした。回収した細胞から、全ＲＮＡをRNeasy kit（Qiagen社、Cat. 74104）を用いて定法に従い回収した。この全ＲＮＡの逆転写反応をTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche社、Cat. 04379012001）を用いて定法に従って行い、得られたｃＤＮＡをテンプレートとした。プライマーは、上述のＣＳＡＢＰプライマー（配列番号５および６）を用い、Gotaq（登録商標）PCR system（Promega社）にて、９５℃、５分×１サイクル、９５℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、２．５分×３５サイクル、７２℃、７分×１サイクルでＰＣＲ反応を行った。陽性対照として、Cui X et al., Hum Pathol. 2006;37(3):298-311において、プロモーター領域のＤＮＡのメチル化と発現との関連が示されている遺伝子であるＲＡＳＳＦ１Ａのプライマー、RASSF1A transcript variant D 391〜415フォワードプライマー：5'-CAGATTGCAAGTTCACCTGCCACTA-3'（配列番号３８）およびRASSF1A transcript variant D 635〜660リバースプライマー：5'-GATGAAGCCTGTGTAAGAACCGTCCT-3'（配列番号３９）を用いて同様の反応を行った。内部対照として前述のＧ６ＰＤＨのプライマー（配列番号２０および２１）を用いて同様の反応を行った。結果を図２５に示す。【０１０１】
Ｇ６ＰＤＨの発現量は試験区内で均一であり、今回使用した濃度の薬剤添加による細胞毒性は見られなかった。そして、陽性対照であるＲＡＳＳＦ１Ａの発現が５−アザ−２’−デオキシシチジンの添加によって増加したことから、同薬剤が有効に作用していることが確認された。ＣＳＡＢＰ遺伝子は、５−アザ−２’−デオキシシチジンの添加により濃度依存的にその発現量が増加した。これは、ＤＮＡのメチル化の程度が低下すると、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現が増大すること、すなわち、ＣＳＡＢＰ遺伝子の発現が、ＤＮＡのメチル化と高い関連性を有することを示すものである。【０１０２】
実施例１０  炎症性サイトカインによるＣＳＡＢＰの発現誘導
ヒト正常肝細胞（Primary Human Liver Hepatocyte Cells、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社、Cat. No. ABI-3716）を、２×１０５細胞／ウェルの密度にて６ウェルプレートで培養し、ヒトＩＬ−１β、ＴＮＦαまたはＩＬ−６（いずれもBioSource社製）を、ウェル中の最終濃度がそれぞれ１ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。添加の８時間後に細胞を回収し、細胞内のＣＳＡＢＰの発現を、実施例５（２）と同様にリアルタイムＰＣＲで定量した。結果を図２６に示す。
１００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの正常肝細胞への添加によって、ＣＳＡＢＰの発現量が対照区に比べて約１．８倍に増加した。また、他の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）についても多少の増加が見られた。上記実施例２の結果は、正常細胞におけるＣＳＡＢＰの発現が検出できないか、または非常に低いものであることを示しているが、炎症性サイトカインの作用により、こうした正常細胞においてＣＳＡＢＰの発現が誘導されることは全く驚くべきことである。
上記結果は、ＨＣＶ感染時に肝組織内のＴＮＦ−αの分泌が高まっているとの報告（例えば、Tilg H et al. Gastroenterol 103(1): 264-274, 1992およびGonzalez-Amaro R et al. J Exp Med 179(3): 841-848, 1994参照）を考慮すれば、ＨＣＶの感染初期において肝組織内で炎症が惹起され、免疫担当細胞からのＴＮＦ−αによってＣＳＡＢＰの発現が誘導されることにより、ＨＣＶが、発現誘導されたＣＳＡＢＰを利用して複製を優位に進めていく可能性を示唆するものである。また、上記結果は、炎症の発生により、炎症部位の細胞においてＣＳＡＢＰの発現が誘導され、ウイルス、特に複製にＣＳＡＢＰが関与するＨＣＶなどのＲＮＡウイルスが複製しやすい環境が醸成されることを示すものであり、かかる状況下でＣＳＡＢＰの発現を抑制することにより特に有効にウイルスの増殖を阻止し得ること、および、炎症の初期段階にある対象、さらには炎症が発生するリスクのある対象にＣＳＡＢＰの発現を抑制する薬剤等を投与することにより、上記のウイルスが複製しやすい環境の醸成を阻止し、ウイルス性疾患を効果的に予防できることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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