【手続補正書】
【提出日】平成15年8月20日(2003.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５３】
細胞系統が、ジャーカット、ＭＯＬＴ−４、ＨＳ−６０２、Ｕ９３７、ＴＦ−１、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１、ＭＬ−２及びＨＵＴ−７８から成るグループの中から選択されている、請求項５２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８０】
前記小型ペプチドが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ及びＫＡＫ−Ｔａｇから成るグループの中から選択されている、請求項７９に記載の組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８１】
前記タグが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＫＡＫ−Ｔａｇから成るグループの中から選択されている、請求項１、３１、３４及び３７のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８５】
前記抗癌剤が、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、ｃｉｓ−プラチナ、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項８２に記載の組成物。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２５】
抗癌剤が、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項１２２に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７１】
標的細胞上又はその中の実質的に露呈されかつ／又は過剰発現された結合部位に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、標的細胞に対する結合が、その上又は中で結合部位が実質的に利用可能でないかつ／又は発現されていないその他の細胞に有利なように発生し、結合選択性又は特異性が、主として第１の超可変領域によって決定され、第１の超可変領域が、配列番号８又は２０から成るＣＤＲ３領域であり、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有するペプチド又はポリペプチド。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７３】
その他の細胞に有利なように標的細胞に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、Ｆｖ分子が、第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第１の鎖及び第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第２の鎖を含んで成り、第１鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号８又は２０の配列を含み、第２鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択された１つの配列を有し、第１、第２及び第３の超可変領域は、それぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域であり、ＦｖはｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチド。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９１】
細胞系統が、ジャーカット、ＭＯＬＴ−４、ＨＳ−６０２、Ｕ９３７、ＴＦ−１、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１及びＨＵＴ−７８から成るグループの中から選択されている、請求項１９０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１１】
前記小型ペプチドが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇから成るグループの中から選択されている、請求項２１０に記載の組成物。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１２】
タグが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇから成るグループの中から選択されている、請求項１３７、１７０、１７２及び１７５のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１６】
前記抗癌剤が、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、ｃｉｓ−プラチナ、トキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項２１２に記載の組成物。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
［６.］  ＡＭＬは、通常の条件下で骨髄性系列の末端分化した細胞（赤血球、顆粒球、単球及び血小板）を発生させる始原細胞を伴う新生物の異種起原のグループである。その他の形態の新形成の場合と同様、ＡＭＬは、単数又は複数のタイプの早期骨髄様分化を示す。比較的未分化の芽細胞での正常に分化した骨髄様細胞の置換を結果としてもたらす後天的遺伝的改変と結びつけられる。ＡＭＬは一般に、骨髄中で進行し、それより低い程度であるが、二次的造血器官の中で進行する。ＡＭＬは、主として成人が罹患し、１５〜４０歳で出現率がピークに達するが、小児と同時により高齢の成人も罹患することもわかっている。ＡＭＬ患者のほぼ全てが、未分化芽細胞の異常な循環レベルの証拠が全く無い臨床的緩解に達するために、診断の直後の治療を必要とする。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
［８.］  いくつかのその他のヒト化及びキメラ抗体が開発中であるか又は臨床試験中である。さらに、正常な骨髄様細胞ならびに大部分のタイプの骨髄性白血病細胞の両方の上で発現されたＣＤ３３抗原と特異的に反応するヒト化Ｉｇが、抗癌薬カリケマイシン、ＣＭＡ−６７６（Sievers et al., Blood, ９０（１０Suppl.１ Part１）、５０４Ａ（１９９７））に接合された。薬物ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）として知られているこの接合体は、最近承認された（Caron et al., Cancer Supplement, ７３、１０４９−１０５６（１９９４））。その細胞溶解活性を考慮して、現在臨床試験中の付加的な抗−ＣＤ３３抗体（ＨｕＭ１９５）が、ゲロニン毒素（McGraw et al., Cancer Immunol, Immunother, ３９、３６７−３７４（１９９４））及び放射性同位元素131Ｉ（Caron et al., Blood８３、１７６０−１７６８（１９９４））、90Ｙ（Jurci et al., Blood, ９２、（１０ Suppl, Part１〜２）、６１３Ａ（１９９８））及び213Ｂｉ（Sgouras et al., J. Nucl, Med., ３８（５Suppl.）２３１Ｐ（１９９７）を含めた複数の細胞毒性作用物質に接合された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
［５６.］  保存的アミノ酸置換というのは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質又はそのフラグメントの１つ又は２個のアミノ酸を変更することによるアミノ酸組成物内の変化として定義づけされる。置換は、置換が主要な形でペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の特徴（例えば電荷、等電点、親和性、結合力、立体配座、可溶性）又は活性を実質的に改変しないように一般に類似の特性（例えば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負の帯電、非極性）をもつアミノ酸に関するものである。かかる保存的アミノ酸置換のために実施可能な標準的置換は、以下のようなアミノ酸の基の間でのものでありうる：
（ｉ）  グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）、
（ｉｉ）  アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）
（ｉｉｉ）  アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）
（ｉｖ）  ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）、
（ｖ）  アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）
（ｖｉ）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
［８７.］  Ｍ１３又はｆｄといったような繊維状ファージからの複製起点を含むように設計されたプラスミドベクターである。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
［１０８.］
本発明の１実施形態においては、タグは、Ｆｖペプチド又はポリペプチドに挿入又は付着されており、その調製及び同定及び診断の一助となる。タグはその後分子から除去できる。タグは、以下のタグであり得るがこれらに制限されるわけではない：ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Gｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ（Jarvik and Telmer, Ann. Rev.Gen., ３２，６０１−６１８（１９９８））及びＫＡＫ（リジン−アラニン−リジン）。タグは好ましくはｃ−ｍｙｃ又はＫＡＫである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
［１４３.］  好ましい実施形態においては、細胞系統は、制限的意味なく、ジャーカット、ＭＯＬＴ−４、ＨＳ−６０２、Ｕ９３７、ＴＦ−１、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１、ＭＬ−２及びＨＵＴ−７８細胞系統といったような造血細胞系統である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
［１６８.］  本発明のＦｖｓのＣＤＲ３領域は、ＡＭＬ細胞に特異的に結合するコア配列Ａｒｇ/Gly/Lys Ｐｈｅ Ｐｒｏを含有し得る。かかるＣＤＲ３領域の８つの例が表２に提示されている。モチーフは、各ケースにおいてＣＤＲ３領域の３つのＮ末端アミノ酸残基と一致するが、これをＣＤＲ３領域内の他の場所に位置設定することも可能である。代替的には、モチーフは、より大きな結合又はターゲティング又は認識分子の一部分のアンカー又は結合領域を構築する又は構成するために用いられるか又は単独で標的ビヒクルとして使用される結合モチーフである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
［１８４.］  Ｙ１二量体と（ＣＯＮＹ１とも呼ばれる）ｓｃＦｖ単量体の結合を比較するため、ＫＧ−１細胞についてin vitroで結合競合実験が行なわれた。さらに、これらの実験は、全ＹＩＩｇＧのｓｃＦｖＹ１単量体に対する結合を比較した。この研究を実施するために、Ｙ１ ＩｇＧ Ｙ１ ＩｇＧはビオチンで標識づけされた。この研究は、Ｙ１ＩｇＧがＩＧＹコービオチンと競合したことを明らかにした。関連性のないヒトＩｇＧは、標識づけされたＹ１ ＩｇＧと競合しなかった。Ｙ１ｓｃＦｖｓ（５μｇ及び１０μｇ）は、Ｙ１ ＩｇＧ−Biotin（５０ng）と部分的に競合した。研究は同様に、１ｎｇのＩｇＧ Ｙ１−ＦＩＴＣが、１μｇのｓｃＦｖ ＦＩＴＣと同じ程度までＫＧ−１細胞に（血清無しで）結合したが、血清が存在する場合、大部分のＹ１ ＩｇＧ結合は「遮断される」ということをも示した。これらの研究は同様に、ラジオレセプタアッセイ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって分析されるように、Ｙ１二量体の結合が少なくともｓｃＦｖ単量体のものより少なくとも２０倍高いことも示した。
［１８５.］  さらにもう１つの実施形態においては、（ＹＩ−ｃｙｓ−ＫＡＫ ｓｃＦｖと呼ばれる）カルボキシ末端におけるシステインに加えて、リジン−アラニン−リジンが加えられた。このｓｃＦｖ構成体のアミノ酸配列は以下に再現されている。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
［１８６.］  Ｙ１−ｃｙｓ−ＫＡＫは、細菌中のλ−ｐＬベクター内で産生された。４２℃まで温度を上昇させることよってλ−ｐＬベクター内の発現が誘発された。誘発された培養から封入体が得られ、望まれない可溶性タンパク質を除去するべく水溶液により半精製された。この封入体はグアニジンの中で可溶化され、ＤＴＴにより還元され、アルギニン／酸化−グルタチオンに基づく溶液中でin vitroで再度折畳まれた。再折畳み後、タンパク質は透析され、尿素／リン酸緩衝液を含む緩衝液に対して接線方向流でのろ過により濃縮された。タンパク質は、ＳＰ−カラム中のイオンクロマトグラフィにより再精製され濃縮された。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
［１８７.］  ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ中ならびにＹ１−ｃｙｓ−ＫＡＫ ｓｃＦｖ中でより高レベルの発現を得るために、我々は、ｓｃＦｖ構成体のＮ末端配列の位置２に、アラニン残基についてコードするアミノ酸を導入した。この新たに修飾された構成体で、４倍の発現レベルが得られた。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
［１８８.］  血小板から誘導された抗原ＧＰＩｂ（グリコカリシン）について、単量体（Ｙ１−ＫＡＫとしても知られているＣＯＮＹｓｃＦｖ）と二量体Ｙ１−ｃｙｓ ＫＡＫ（システイン二量体）の間の結合の差を確認するべく、ＥＬＩＳＡ検定が実施された。ＧＰＩｂに対する結合を検出するために、ポリクローナル抗１本鎖抗体及び／又は新規のポリクローナル抗−ＶL（ウサギ由来）及び抗ウサギＨＲＰが使用された。二量体は、単量体より２〜１００倍高い活性を示した。例えば、０．８ ＯＤ単位を達成するために、わずか０．１mg／mlの二量体に比べて、１２．８mg／mlの単量体が使用された。図１２を参照のこと。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
［２１３.］  対象の発明のもう１つの特定の実施形態においては、抗癌剤は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、ｃｉｓ−プラチナ、トキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体を含むグループの中から選択される。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
［２２３.］  さらにもう１つの実施形態においては、ペプチドと薬学的作用物質の間のリンクは、リンカー化合物により作用される。本明細書及びクレーム中で使用されているリンカー化合物は、２つ以上の部分を互いにつなぐ化合物として定義づけされる。リンカーは、直鎖又は有枝鎖リンカーでありうる。有枝鎖リンカーは、２重分岐、３重分岐又は４重以上の有枝化合物から成り得る。リンカー化合物は、ジカルボン酸、マレミドヒドラジド、ＰＤＰＨ、カルボン酸ヒドラジド、及び小型ペプチドであり得るが、これらに制限されるわけではない。その他のリンカー化合物の例としては、コハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸といったジカルボン酸；Ｎ−〔ε−マレイミドカプロン酸〕ヒドラジド、４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕ジクロヘキサン−１−カルボキシヒドラジド及び〔Ｎ−〔６−マレイミドウンデカン酸〕ヒドラジド〕といったようなマレイミドヒドラジド；サルファヒドリル反応性タンパク質に接合された（３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオニルヒドラジド）といったＰＤＰＨリンカー；２〜５個の炭素から選択されたカルボン酸ヒドラジド；及び例えば抗癌医薬品ドクソルビシンの遊離糖とｓｃＦｖの間の小型ペプチドリンカを用いた直接的カップリングが含まれる。小型ペプチドには、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Gｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＫＡＫ Ｔａｇが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
［２５０.］  本発明のさらにもう１つの実施形態においては、抗癌剤は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン（ＭＤＯＸ）、アドリアマイシン、ｃｉｓ−プラチナ、トキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
［２７０.］  １．５  ＡＭＬ細胞からの膜調製。１０8個の洗浄された細胞を含有するペレットに対し１mlの低温溶解溶液（０．３Ｍのスクロース、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）を添加し、その後４℃で１１０００×ｇで２０分間スピンさせた。上清流体を廃棄し、ペレットをＴＥ（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ中で再懸濁させ、上述のとおりスピンさせた。最終的ペレットを０．４のＡ280で６mlのＰＢＳ中で再懸濁させ、２時間３７℃で、３本のMaxiSorpimmuno-管（ＮＵＮＣ）をコーティングするために使用した。コーティングの後、管をＰＢＳで３回洗い流し、次に２時間ＲＴでＭＰＢＳ（ＰＢＳ中の２％の脱脂粉乳）で遮断させた。バイオパンニングの前に、管をさらに３回ＰＢＳで洗い流した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
［３２９.］  コア配列 Ａrg/Gly Ｐhe Ｐro に基づいて、ＡＭＬ細胞に結合するための高い親和性をもつその他のＣＤＲ３領域を構築することができる。これらは、Ａrg/Gly Ｐhe Ｐroコア配列を維持する一方で、添加、欠失又は突然変異により上述の５−１２−mersのいずれかを変動させることによって構築することができる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２１】
［３３０.］  本発明のＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列 Ｒ１−Ａrg/Gly Ｐhe Ｐro−Ｒ２を有し、ここでＲ１は０〜１５個のアミノ酸、好ましくは０〜９個、最も好ましくは０〜１個のアミノ酸を含み、Ｒ２は、１〜１５個、最も好ましくは１〜９個のアミノ酸を含む。Ｒ１及びＲ２は、ＡＭＬ細胞に対するＡrg/Gly Ｐhe Ｐro 配列の特異的結合に不利な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７５】
［３７４.］  ９．５  Ｙ１−ｃｙｓ−ＫＡＫ（システイン二量体）の産生
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７６】
［３７５.］  λｐＬ−ｙｌ−ｃｙｓ−ＫＡＫ細菌培養１リットルを２〜３時間４２℃で誘発させた。この培養を３０分間５０００ＲＰＭで遠心分離した。１８０mlのＴＥ中でペレットを再懸濁させた（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＥＤＴＡ）。８mlのリゾチーム（５mg／mlのストックからのもの）を添加し、１時間インキュベートした。５ＭのＮａＣｌ及び２５mlの２５％トリトンを添加し、さらに１時間インキュベートした。この混合物を４℃で６０分間１３０００ＲＰＭで遠心分離に付した。上清を廃棄した。テッシュマイザ（又はホモジナイザ）を用いてＴＥ中にペレットを再懸濁させた。このプロセスを、封入体（ペレット）の色が灰色／明褐色となるまで、３〜４回くり返した。封入体を、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、０．１ＭのトリスｐＨ７．４、２ｍＭのＥＤＴＡ中で可溶化させた（１０mlの可溶化緩衝液中の１．５グラムの封入体は〜１０mg／mlの可溶性タンパク質を提供した）。これを少なくとも４時間インキュベートした。タンパク質濃度を測定し、１０mg／mlの濃度にした。ＤＴＴを６５ｍＭの最終濃度まで添加し、室温で一晩インキュベートした。０．５Ｍのアルギニン、０．１ＭのトリスｐＨ８、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．９ｍＭのＧＳＳＧを含有する溶液に対し１０mlのタンパク質を希釈させる（滴下による）ことにより再折畳みを開始した。再折畳み用溶液を４８時間〜１０℃でインキュベートした。タンパク質を含有する再折畳み用溶液を、２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６、１００ｍＭの尿素を含む緩衝液中で透析し、５００mlsに濃縮した。濃縮／透析済み溶液をＳＰ−セファロースカラムに結合させ、ＮａＣｌ勾配により（最高１Ｍまで）溶出した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８７】
［３８６.］  以下の配列、ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥを、ＰＣＲ及びＩＰＴＧ誘発可能発現系へのクローニングによりＹ１のＣ末端で添加した。クローンをＹ１−biotagと命名した。この配列は、遊離ビオチンの不在下で、酵素がビオチンをリシン（Ｋ）残基に共有結合により連結させることのできる、酵素BirＡのための基質である（抗原特異的Ｔリンパ球の表現型分析。Science, １９９６．１０月４；２７４（５２８４）：９４−６，Altman JD et al）。この構成体は、ＢＬ２１細菌細胞中で封入体として産生された。前述の通りに再折畳みを行なった。封入体をグアニジン−ＤＴＴ内で可溶化させた。再折畳みは、アルギニン−トリス−ＥＤＴＡを含有する緩衝液中での希釈によって行なった。透析及び濃縮を実施し、その後HiTrapＱイオン交換精製を行なった。