【手続補正書】
【提出日】平成15年6月17日(2003.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
まず、IDPc遺伝子の両側末端部位をClaIで切断した後、切断したDNAをpLNCXに挿入して大腸菌DH5αに形質転換させた。制限酵素処理を通して方向性を確認した後、前記遺伝子が各々正方向及び逆方向に挿入された組換えベクターを得た。サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターにより正方向に転写される組換えベクターは、IDPcの発現増大のために使用され、逆方向に転写される組換えベクターはIDPcの発現抑制のために使用された。対照群には遺伝子が挿入されていないレトロウイルスベクター pLNCXを使用した(図1)。得られた組換えベクターは、脂肪細胞(preadipocyte)のNIH3T3 L1 細胞に導入させた。この効率を検証するためにマーカー遺伝子にGFP(Green fluorescence protein)cDNA(Clontech Laboratories 社)を挿入したpLNCXベクターを同時に細胞に導入させた。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
<2-2>形質転換細胞株の製造
前記実施例<2-1>で製造した組換えベクターをNIH3T3 L1脂肪細胞に導入させるためにBOSC23細胞を利用したレトロウイルスパッケージングシステムを使用した。このために2×106のBOSC23細胞をまず、10%FBSを含んだDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)培地に接種し、形質転換する前に25μMクロロキン(chloroquin)、10% FBSを含むDMEM培地に接種した。形質転換はリン酸カルシウム方式(Pear, W. S.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,1993年、第90巻、P.8392-8396)にしたがい行なった。まず、10μgの組換えベクターDNAと0.25M CaCl2を混合した溶液を2X HBS(20mM NaCl, 1.5mM Na2HPO4, 50mM HEPES, pH7.1)に混合した後、BOSC23細胞が成長したプレートに均一に添加して10時間CO2培養器で培養した。10時間後、10%FBSを含んだDMEM培地に交換して24時間培養した後、培養液だけを1,200rpmで遠心分離して上澄み液を再び45μmフィルターを使用してろ過した。ろ過された溶液には、組換えレトロウイルスベクターだけが存在し、ここに4μg/mlの濃度でポリブレン(polybrene, Sigma)を添加した。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
前記組換えレトロウイルスベクターをNIH3T3 L1細胞に感染させるために、まず、5×105のNIH3T3 L1細胞を接種して10%FBSを含んだDMEM培地で培養した。細胞が50%成長した状態で培地を捨てて、BOSC23細胞からパッケージングされたレトロウイルスベクターが含まれた溶液を均一に添加した後、5時間程度培養した後、新しい培地に交換して再び2日間培養した。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
組換えされたレトロウイルスベクターに感染されたNIH3T3 L1細胞数を測定し400μg/mlのG-418(Gibco BRL)を含んだDMEM培地が入っている96ウェルプレートに 50個の細胞が入るように接種した後、再び培養した。2日に一回ずつG-418培地を交換しながら各ウェルで成長する細胞群を再び分離し再培養して1次形質転換細胞株を選別した。1次形質転換細胞株のゲノムDNAを抽出してPCRを行うことによってゲノム内にIDPc遺伝子Gが挿入されたかを確認して2次選別した。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
<実施例 3>形質転換細胞株でのIDPc及びIDPm酵素活性測定
形質転換NIH3T3 L1細胞株でのIDPc酵素活性を測定するために、細胞から細胞質を分離した後、ブラッドフォード方法で蛋白質の濃度を測定した。まず、3×107 個の細胞を1Xリン酸塩緩衝溶液で2回洗浄した後、スクロース緩衝溶液(0.32M sucrose, 0.01 M Tris-Cl, pH 7.4)を利用して破砕した。これを1,000 x gで遠心分離して細胞カスを除去し、再び15,000 x gで遠心分離して上澄み液の細胞質と沈殿物のミトコンドリア部分を分離した。細胞質分画を含む上澄み液に溶液全体の1/10容積で0.1%トリトン(Triton)X-100を含んだリン酸塩緩衝溶液を添加してブラッドフォード方法 (Bradford assay)を用いて定量した。酵素活性測定は、25℃の緩衝溶液(50mM MOPS, pH 7.2, 35.5 mM トリエタノールアミン, pH 7.2, 2 mM NADP+, 2 mM MgCl2, 5 mM イソクエン酸, 1 μg/ml ロテノン)で反応させて行なった。 反応が終わった後、340nmで2分間、スペクトルフォトメーター(吸光測定器)で吸光度の変化を測定し、1分間に1μMのNADPHを生成する酵素の量を1 ユニットとして酵素の活性を表した。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
5) 肝（liver）中性脂質及び総コレステロール濃度測定
形質転換マウスと正常マウスの肝を一定量採取し、CIAAを2:1で混ぜた溶液1mlと混合した後、粉砕した。そのうち100μlを乾燥させ200μlの純粋エチルアルコールに溶かした後、0.5%トリトンX-100(Triton X-100)、3mMコール酸ナトリウム(sodium cholate)が含まれた500μlの前記と同じアサン製薬製品の中性脂質及びコレステロール測定キット溶液を混合した後、37℃で10分間反応させた。反応後800μlの水を混ぜた後、上の血中濃度測定法と同様にマイクロプレート分析器を使用して肝の中性脂質及び総コレステロールの濃度を測定した。中性脂質及びコレステロールの定量換算は、これらの標準物質溶液に対して前記と同じ方法を適用した後、得られた標準濃度曲線を利用して実施した。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
その結果、26週になった形質転換マウス(Tg)の体重は、正常マウス(Non-Tg)に比べて23-35%増加し(図7)、IDPc酵素活性は肝と脂肪組織で正常マウスに比べてそれぞれ1.4倍及び2.7倍増加し(図9)、IDPc酵素反応産物である[NADPH]の全体[NADPH + NADP+]に対する含量比率は、肝で1.2倍、脂肪組織で1.3倍増加した(図10)。腹部脂肪組織の重さは対照群に比べて約13.6倍増加したが(図11)肝の重さには変化が無かった(図8)。一方、血液中の中性脂質及び総コレステロールの量は、形質転換マウスで正常マウスに比べてそれぞれ1.8倍及び2.4倍増加した(図12)。肝でも中性脂質及びコレステロールの量は、それぞれ3.4倍及び2.8倍増加していることが確認できた(図13)。これと共に肥満細胞で主に生成される蛋白質であるレプチンもやはりIDPc形質転換マウスの脂肪組織で対照群に比べて約2倍多く生成されることが観察された(図14)。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
<実施例 8>イソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤による肥満抑制程度調査
<8-1>イソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤による3T3-L1細胞株の脂肪蓄積抑制程度調査
脂肪細胞に分化する細胞である3T3-L1細胞に、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるメチルイソクエン酸とオキサロマレイン酸を処理して脂肪細胞への分化抑制程度の差を分析した。イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤が脂肪酸合成に及ぼす影響は、前記の細胞株をインシュリン処理により脂肪細胞に分化させた後、脂肪を特異的に染色するオイル レッド オー(Oil-Red-O)で処理することにより確認できる。図19は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを処理していない細胞(左)、オキサロマレイン酸を処理した細胞(中間)、メチルイソクエン酸を処理した細胞(右)をオイル レッド オーで染色して後、100倍拡大(上)及び200倍拡大(下)した結果である。その結果、オキサロマレイン酸とメチルイソクエン酸を処理した細胞株が対照群に比べて脂肪の生成が減少したことを確認した(図19)。前記結果は、IDPc抑制剤が細胞内脂肪蓄積量を減少させることを示すものでありIDPcが細胞内脂肪代謝に重要な作用をしていることを示す。


【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004511256.tif 000001
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2004511256.tif 000002