【手続補正書】
【提出日】平成14年11月14日(2002.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】生物剤の経口およびＣＮＳ供給を強化するためのリガンド
【特許請求の範囲】
【請求項１】少なくとも１つのペプチドを含んでなるポリペプチドまたはその誘導体であって、前記ポリペプチドまたはその誘導体は配列番号６の下記のモチーフ：
Ｙ１−Ｙ２−Ｘ−Ｙ３−Ｘ−Ｙ４−Ｘ−Ｙ５
（ここで
Ｙ１は正に帯電したアミノ酸、例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｙ２はＶａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｙ３は負に帯電したアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｙ４は負に帯電したアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｙ５はＴｈｒであり、
Ｘは任意のアミノ酸である）
を含んでなり、前記ポリペプチドは小腸または血液脳関門を横切ることができる、ポリペプチドまたはその誘導体。
【請求項２】前記ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号１のアミノ酸配列、またはそのアナローグ、誘導体、または変異型を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】前記配列番号１の誘導体が、小腸および血液脳関門を横切る生物学的因子を送出すことができる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】前記ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号２のアミノ酸配列、またはそのアナローグ、誘導体、または変異型を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】前記ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号３のアミノ酸配列、またはそのアナローグ、誘導体、または変異型を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】前記ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号４のアミノ酸配列、またはそのアナローグ、誘導体、または変異型を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】前記ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号５のアミノ酸配列、またはそのアナローグ、誘導体、または変異型を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】前記ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号４のペプチドまたはその誘導体の生物学的活性の少なくとも約２０％である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】Ｃａｃｏ２細胞を横切る輸送；血液脳関門のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを横切る輸送；ｉｎ  ｖｉｖｏ経口的生物学的利用能の分析；またはｉｎ  ｖｉｖｏ中枢神経系の生物学的利用能の分析を含んでなるｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイを使用して、生物学的活性を測定する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】前記ポリペプチドまたはその誘導体が生物学的因子をさらに含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】前記ポリペプチドまたはその誘導体が小腸および血液脳関門を横切る前記生物学的因子を送出すことができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】前記ポリペプチドまたはその誘導体が血液脳関門および胃腸関門を横切る生物学的因子を増加させることができ、前記ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号４のアミノ酸配列、またはそのアナローグ、誘導体、または変異型を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】前記ポリペプチドまたはその誘導体が担体をさらに含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】前記ポリペプチドまたはその誘導体が生物学的因子および担体をさらに含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】前記ポリペプチドまたはその誘導体が修飾された因子をさらに含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】前記ポリペプチドまたはその誘導体が治療剤をさらに含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】治療を必要とする患者に有効量の請求項１に記載の前記ポリペプチドと、薬学上許容される担体とを投与することを含んでなる、前記患者における中枢神経系の病理学に関連する疾患を治療する方法。
【請求項１８】配列番号１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはその誘導体をコードする単離された核酸。
【請求項１９】請求項１８に記載の核酸配列を含んでなる発現ベクター。
【請求項２０】請求項１８に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】配列番号１、２、３、４、５または６のアミノ酸配列をコードするポリペプチドを核酸分子がコードする、核酸分子および担体を含んでなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は治療剤の経口およびＣＮＳ生体利用効率を高めることができるペプチドまたはその類似物または誘導体（リガンド）を含む組成物に関する。さらに詳細には、本発明は生物剤と結合するリガンド、または担体を伴うリガンドの複合体から成る組成物を含む。
【０００２】
発明の背景
経口経路により投与される薬剤の最適化生体利用効率は、新製品の開発段階における医薬産業の最も重要な目的の一つである。生体利用効率は、血液中に吸収され循環される医薬組成物から吸収される生物剤すなわち活性成分の量、およびこの吸収速度の両方を表す。これは、分子が血液循環に到達する迄に一つまたはいくつかの生体膜を横断していくことを意味する。経口的に投与される薬剤の物理化学的特性がその生体利用効率を決定すると一般に考えられてきた。これらのパラメータの中には、分子量（６００Ｄより大きい分子量の治療剤に対する極めて低い透過性が知られている）、ｐＫａ、およびオクタノール／水分配係数（ＬｏｇＤ）により特徴付けられる親油性がある。
【０００３】
一般的な循環に達する薬剤の量は、腸上皮により吸収される薬剤量、および消化管中での薬剤溶解度および安定性に応じて決まる。多くのクラスの薬剤は、それらの吸収における大きな個体間の変動性および／または低い生体利用効率を示す。抗癌治療に用いられる細胞毒は、多くの場合に吸収不良を示す薬剤のいい見本である。治療用ペプチドおよびタンパク質も、それらが容易に胃および腸において代謝されてしまうので、経口経路では極めて低い生体利用効率しか有しない。分解に関する問題に加えて、こうしたペプチドおよびタンパク質の分子量は、一般的に、消化管壁を越えて循環系中への有意な輸送を可能とするには高すぎる。
【０００４】
生物工学の到来からこの方、多くのタンパク質療法が多くの潜在的な難病に対して有意な治療効果を有するとして確認されてきた。こうした疾患には、癌、心臓疾患、中枢神経系疾患、免疫系疾患、血液および循環系疾患、および多くのホルモン系疾患が挙げられる。これらの内科的疾患の多くは慢性的であり、所要治療の継続的な管理を必要とする。
【０００５】
タンパク質療法、および治療剤を配送するための多くの他のハードの幅広い利用は、管理可能および許容可能なやり方においてそれらを容易に患者に投与できる能力に応じて決まる。タンパク質またはペプチド薬剤を含む従来の治療経路は、主として消化管を通してのこうした薬剤の吸収不足のせいで、非経口投与（すなわち、注射による）を介するものである。しかし、注射は痛みを伴い、他の投与方法に比べて投与することが困難な場合がある。いくつかのこれら薬剤はおうおう年少者または老人患者への投与を必要とする場合があるので、患者の薬剤服用遵守もまた重要な検討材料である。経口投与は、明らかに、それらを長期間服用しなければならない患者にこうした化合物を投与するための最も望ましい方法である。
【０００６】
経口ワクチン接種はより便利であるが、ワクチンは一般に注射を介して与えられる。これは、特に、それらの消化管中への低吸収の故に、死菌またはペプチド系ワクチンについて当てはまる。しかし、全身性免疫に伴う問題は、粘膜免疫反応、例えば、侵入微生物に対する第一防衛障壁として重要であるＩｇＡの産生を有効に誘発しない場合があることである。この理由により、低腸吸収の問題が解決されるならば経口ワクチン接種を提供することは有益であろう。
【０００７】
経口的にポリペプチドおよびワクチンを配送しようとする最近の努力は、吸収増強剤の使用に焦点を絞ってきている。これは、過剰油中のサリチル酸ソーダ懸濁液がＧＩ管からのヒト成長ホルモンの吸収を高めることができるという発見をもたらした（ＥＰ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １７７，３４２；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．３４：３５（１９８６）を参照すること）。吸収はこの組合せにより強化されるが、一方で、タンパク質の最高の達成可能生体利用効率は、まだ極めて低くただの約１０〜２０％以下（静脈内投与に比べて）である。結果として、より多くの量のタンパク質が血漿中の必要治療レベルのタンパク質を提供するために経口的に投与されなければならない。生物工学の到来を以ってしてもなお比較的に限定された有効性であり、複合化学実在物であり、従って極めて高価であることは、タンパク質およびポリペプチドに伴う特定の問題である。上述の処方は大腸中のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの吸収をいくらか改善することが見出されてきたが、一方で、それらはまた上で説明したように固有の制限および不利を有する。
【０００８】
従って、必要であるものは、経口的に投与される生物剤の消化管から循環系中への吸収を増大させる新奇で有用な製品である。さらに必要とされるものは、血液脳関門（ＢＢＢ）を渡る治療剤の吸収を増大させ、その結果治療剤のＣＮＳ生体利用効率を増大させる新奇で有用な製品である。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ポリペプチド、またはその誘導体が小腸および血液脳関門を渡ることができる、少なくとも一つのペプチドまたはその誘導体を含むポリペプチドを提供する。こうしたポリペプチドは本明細書においてリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）と呼ばれる。
一つの実施形態において、本発明は小腸および血液脳関門を渡ることができるペプチドまたはその誘導体を提供する。
本発明のポリペプチドは、ポリペプチド、またはその誘導体が小腸および血液脳関門を渡る生物剤を配送することができる、少なくとも一つのペプチドまたはその誘導体を含む。
【００１０】
本発明の好ましいペプチドは、ペプチドが小腸および血液脳関門を渡ると共に小腸および血液脳関門を越えて生物剤を配送することができる、Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ（配列番号：４）のアミノ酸配列を提供する。
本発明は、さらに、ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号：１、２、３、４、５、６または７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
本発明の好ましいペプチド、ペプチドの変異体または誘導体は、Ｘがあらゆるアミノ酸である配列Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｘ−Ｔｈｒ（配列番号：７）（またＲＶＸＤＸＤＸＴとして単一文字アミノ酸符号に短縮される）を有する。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、モチーフ配列番号：６：Ｙ１−Ｙ２−Ｘ−Ｙ３−Ｘ−Ｙ４−Ｘ−Ｙ５を有する少なくとも一つのペプチド化合物を提供する。式中、
Ｙ１はＡｒｇまたはＬｙｓなどの正電気を帯びたアミノ酸であり、
Ｙ２はＶａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｙ３はＧｌｕまたはＡｓｐなどの負電気を帯びたアミノ酸であり、
Ｙ４はＧｌｕまたはＡｓｐのような負電気を帯びたアミノ酸であり、
Ｙ５はＴｈｒまたはＳｅｒであり、
Ｘはあらゆるアミノ酸である。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、さらに、ポリペプチドまたはその誘導体のカルボキシル末端アミノ酸がペプチドのＣ−末端カルボキシル基に結合される、ポリペプチドまたはその誘導体のカルボキシル末端での伸長を提供する。本発明の一つの実施形態は、該配列番号：２，３，または５のアラニンのカルボキシル末端がカルボキシテトラメチルローダミンに結合される、アミノ酸配列配列番号：２，３，または５を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、また、本明細書において「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）模倣体」または「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏ）模倣体」として言及する、アミノ酸以外の化合物の誘導体であるその分子構造残基中に含むことができるポリペプチドの類似物を提供する。ペプチドリガンドの他の類似物は、その鎖の変更位相構造を有する化合物、特に分子中に環または複数の環を閉じると共にその構造を拘束する化学結合を有する非直鎖型化合物である。本発明リガンドの他の類似物には、Ｌ−α−アミノ酸残基、Ｄ−α−アミノ酸残基、非α−アミノ酸残基の別の選択を含む変更配列を持つペプチドが挙げられる。
【００１４】
本発明のペプチドリガンドは、組み換え法および化学合成を含む公知の方法を用いることにより作成することができる。ペプチドを符号化する核酸を含むベクターの適する宿主細胞中への導入を通してペプチドを生産する組み換え法は、本明細書において参考のために包含するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ，Ｖｏｌｓ．１〜８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されているように公知の技術である。直鎖アミノ酸配列は、例えば、メリフィールドの固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６４））により合成される。
【００１５】
あるいは、本発明のリガンドは、技術上公知の標準溶液法を用いて合成することができる（例えば、本明細書において参考のために包含するＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８４）を参照すること）。本発明の新奇に合成されたリガンドは、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により容易に精製することができると共に、例えば、質量分析またはアミノ酸配列分析を用いて特性分析を行うことができる。合成ペプチドに対して９５％を超える純度が好ましいが、より低い純度も許容可能である。
【００１６】
従って、別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号：４の誘導体が小腸および血液脳関門を渡り、生物剤を小腸および血液脳関門を越えて配送することができるオリゴペプチド、化学誘導体またはペプチド模倣体から構成される。
本発明の別の実施形態において、リガンドは生物剤と結合する。こうした結合は、リガンドおよび生物剤の化学的、遺伝子的または物理的結合、または上述の成分の混合、またはそれらの共投与により達成することができる。
本発明のペプチド、誘導体またはペプチド模倣体は、一つ以上の以下の活性を有する：
【００１７】
本発明は、ポリペプチドまたはその誘導体が小腸および血液脳関門を渡ると共に小腸および血液脳関門を越えて生物剤を配送することができ、ポリペプチドまたはその誘導体が配列番号：４のポリペプチドまたはその誘導体の生物活性の少なくとも約２０％を有する、少なくとも一つのペプチドまたはその誘導体を含むポリペプチドを提供する。
なおさらに、本発明は、ポリペプチドまたはその誘導体が少なくとも０．０００５の経口治療効率係数、または少なくとも１の血液脳分割係数を有する、少なくとも一つのペプチドまたは誘導体を含むポリペプチドを提供する。
【００１８】
本ポリペプチドの生物活性は、Ｃａｃｏ２細胞横断輸送；血液脳関門の生体外モデル横断輸送を含む生体外バイオアッセイ、生体内経口生体利用効率分析；または生体内中枢神経系生体利用効率分析を用いることにより測定することができるがそれらに限定されない。
【００１９】
本発明は、さらに、担体に結合する１以上のリガンドを含むポリペプチドを包含する。本発明の別の実施形態において、リガンドは、リガンドの薬理学的特性を改善して血液脳関門を越えて生物剤を配送するためのリガンドの選択性および効果を増大させるためにタンパク質、ウイルス、ポリマーまたはあらゆる他の担体との結合を有する。リガンドおよび担体の結合は、リガンドおよび担体の化学的、遺伝子的または物理的結合、または上述の成分の混合、またはそれらの共投与により達成することができる。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、担体と結合したリガンドは、さらに生物剤と結合されるが、これは本発明の前の実施形態において説明したリガンド−担体組成物および生物剤の化学的、遺伝子的または物理的結合により達成される。本発明は、さらに、生物剤と結合した１以上のリガンドまたは担体を伴うそれらの複合体を含む医薬組成物を提供する。
本発明のなお別の実施形態において、リガンドは変性生物剤と結合されるが、これはリガンドをプロドラッグであり生物剤の活性を全く示さないような物である変性生物剤に化学的に結合することにより達成される。活性生物剤は身体中の化学反応または酵素反応の作用の際にこうした物から放出される。
【００２１】
本発明は、治療性化合物の経口およびＣＮＳ生体利用効率を高めることができる本発明の少なくとも一つのリガンドを含むポリペプチドにまで及ぶ。本発明は、さらに、担体と結合した本発明の１以上のリガンドを含むポリペプチドを包含する。
さらに、本発明は、こうした疾患が中枢神経系（ＣＮＳ）病理に関係する疾患の診断および治療のためのポリペプチドにまで及ぶ。
本発明は、さらに、（ａ）ペプチド模倣体に限定されないがそれを含む上述のペプチド、変異体または化学誘導体のあらゆるもの；（ｂ）リガンドと化学的に接合するかまたは物理的に結合するかいずれかの医薬的に許容可能な担体または賦形剤；および（ｃ）少なくとも一つの治療剤を含む、ＣＮＳ病理の診断および治療に有用なポリペプチドを目指す。
【００２２】
本発明は、さらに、治療剤に化学的に接合されるかまたは遺伝子的に融合されたペプチド模倣体を包含する上述のペプチド、変異体または化学誘導体のあらゆるものを含む、ＣＮＳ病理の診断および治療に有用なポリペプチドを提供する。
上述のような医薬組成物の有効量を被験者に投与することを含む、望ましくないＣＮＳに関係する疾患または病状を有する被験者におけるＣＮＳ病理抑制のための方法も、また、提供される。
【００２３】
本発明は、また、本発明の医薬組成物の有効量および医薬的に許容可能な担体を該患者に投与することを含むこうした治療の必要性がある患者におけるＣＮＳ病理に関係する疾患を治療する方法を提供する。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面および詳細説明を参照することによりさらに良く理解される。
【００２４】
本発明の詳細な説明
Ｉ．リガンド
上述の説明のように、本発明は、生物剤または調合剤の経口およびＣＮＳ生体利用効率を高めることができるリガンドを含む医薬組成物を提供する。本発明は、また、リガンドが中で治療または診断目的に用いられる生物剤の配送を改善するための標識部分として使用される医薬組成物を提供する。
本発明のリガンドの調製は、公知のペプチド合成有機化学法によるか、または組み換えＤＮＡ技術の支援により達成される。
【００２５】
ＩＩ．化学ペプチド合成
ペプチド合成有機化学法は、均一相中においてかまたは固相の助けによるかのいずれかで縮合反応によってアミノ酸残基をカップリングすることを含むと考えられる。縮合反応は以下のように遂行することができる：
ａ）縮合剤の存在下における、化合物（アミノ酸、ペプチド）の遊離カルボキシル基との、および他の保護反応基の遊離アミノ基および他の保護反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合；
ｂ）化合物（アミノ酸、ペプチド）の活性カルボキシル基との、および遊離または他の保護反応基の遊離アミノ基および遊離または他の保護反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合。
【００２６】
カルボキシル基の活性化は、特に、カルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾリドまたはＮ−ヒドロキシ−スクシニミド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールまたはｐ−ニトロフェニルエステルなどの活性エステルに転換することにより行うことができる。上記の縮合反応用の最も普通の方法には、カルボジイミド法、アジド法、混合無水物法、およびＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１〜３（Ｅｄ．Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．）１９７９，１９８０，１９８１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているような活性エステルを用いる方法がある。特に有用な方法は、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ウロニウム、または−ホスホニウムエステル、例えば、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８、１８７４）を用いるカストロタイプ法である。
【００２７】
「固相」を用いる本発明のリガンドの調製は、例えば、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９（１９６３）およびＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５，１６１〜２１４（１９９０）中に記載されている。調製しようとするペプチドのアミノ酸のカップリングは、通常、カルボキシル末端側からスタートする。この方法に対して、上に反応基があるか、または上にこうした基を導入することができる固相が必要とされる。これは、例えば、ベンゼンおよびジビニルベンゼンと反応性クロロメチル基とのコポリマー、またはヒドロキシメチルまたはアミン官能基との反応性を示す高分子固相であることができる。
【００２８】
所期のアミノ酸配列の合成後、樹脂からのペプチドの分離が続く。例えば、トリフルオロ酢酸中に溶解したトリフルオロメタンスルホン酸またはメタンスルホン酸を用いて樹脂をフッ化水素と接触させることは、ペプチドを樹脂から分離させる。ペプチドは、また、低級アルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールとのエステル交換により担体から除去することができるが、この場合にペプチドの低級アルキルエステルが直接形成される。同様に、アンモニアの支援による分割は本発明によるペプチドのアミドを生成する。
【００２９】
特に適する固相は、例えば、Ｒｉｎｋ（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２８，３７８７により記載されているリンクアミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）である。合成後、ペプチドはトリフルオロ酢酸を用いる穏やかな条件下でカルボキシアミド誘導体を生成しながら固相から分離することができる。
【００３０】
縮合反応に参画しない場合がある反応基は、前述のように、酸、塩基または還元の支援による加水分解により極めて容易に再度除去することができる基によって効果的に保護される。こうして、カルボキシル基は、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノール、ベンジルアルコールまたはｐ−ニトロベンジルアルコールおよび固形支持体に結合されたアミンとのエステル化により効果的に保護することができる。
【００３１】
アミノ基を有効に保護することができる基には、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシ−カルボニル（ｔ−ｂｏｃ）またはｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル基、またはベンゼン−スルホニルまたはｐ−トルエンスルホニル基などのスルホン酸から誘導される酸基がある。置換または非置換アリールまたはアリールアルキル基、例えば、ベンジルおよびトリフェニルメチル、またはオルトニトロフェニル−スルフェニルおよび２−ベンゾイル−１−メチルービニルなどの基のような他の基も用いることができる。特に適するα−アミノ−保護基は、例えば、塩基感受性９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基（Ｃａｒｐｉｎｏ ＆ Ｈａｎ（１９７０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２，５７４８）である。可能な保護基のさらに広範囲な評価は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１〜９（Ｅｄｓ．Ｇｒｏｓｓ，Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）１９７９〜１９８７（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）中に見出すことができる。
【００３２】
また、リジンのα−アミノ基を保護することは必要であり、アルギニンのグアニジン基にとっても望ましいことである。この点についての通例の保護基はリジンに対してＢｏｃ基、アルギニンに対してＰｍｃ、Ｐｍｓ、Ｍｂｓ、またはＭｔｒ基である。
保護基は、特定基の性質に応じて種々の従来の方法、例えば、トリフルオロ酢酸の支援により、または、例えば、水素およびパラジウムなどの触媒、または氷酢酸中のＨＢｒによる穏やかな還元により分離することができる。
【００３３】
ＩＩＩ．リガンドの生合成
本発明のリガンドは、公知の組み換え技術によることを含めてあらゆる技術により調製することができる。上述の技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．，１９９４；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，ＶｏｌｕｍｅｓＩ〜ＩＩＩ，Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．，１９９４；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ，Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．，１９９４；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．，１９８５；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，１９８４．などの実験室マニュアルにさらに詳しく記載されている。
【００３４】
本発明のリガンドを符号化するＤＮＡは技術上知られる多様な方法により調製することができる。これらの方法には、その全体の開示を本明細書において参考のために包含するＥｎｇｅｌｓ ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６〜７３４（１９８９）に記載されている、トリエステル、亜リン酸塩、ホスホラミダイトおよびＨ−ホスホン酸塩法などのあらゆる方法による化学合成が挙げられるがそれらに限定されない。一つの実施形態において、発現宿主細胞により選択されたコドンが本発明のリガンドを符号化する設計ＤＮＡ中に用いられる。
【００３５】
組み換えＤＮＡ技術を用いてリガンドを生産する方法の１例は、（１）リガンド、充当されたリンカーおよび拘束部位コード配列を符号化するＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成的に生成し、（２）ＤＮＡが作動可能にプロモーターと結合されるように発現ベクターなどの適切なベクター中にＤＮＡを挿入し、（３）ＤＮＡを発現できる微生物または他の発現系中にベクターを挿入し、および（４）組み換え的にリガンドを単離する段階を伴う。
【００３６】
当業者は、本発明のリガンドが原核および真核両方の種々の細胞系においても生産されることができ、これらはすべて本発明の範囲内にあることを認識するであろう。適切なベクターには、ウイルス性、細菌性および真核性発現ベクターが挙げられる。ＤＮＡなどの核酸分子は、それが転写および翻訳制御情報を含有するヌクレオチド配列を含む場合に本発明のリガンドを「発現できる」と言われ、こうした配列はポリペプチドを符号化するヌクレオチド配列に「作動可能なように結合」される。遺伝子配列発現に必要とされる制御領域の正確な性質は、微生物から微生物へと変化することが可能であるが、しかし、一般に、原核生物においてプロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指図する）およびＲＮＡ中に転写される時に合成開始の信号を送るＤＮＡ配列の両方を含有するプロモーター領域を含む。こうした領域は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、およびＣＡＡＴ配列などの転写および翻訳の開始と関連した５’−非コード配列を含む。
【００３７】
例えば、本発明のリガンドを符号化するＤＮＡ分子の全コード配列は、適切な発現ベクター中で以下の１以上と組合せてこうした発現を可能とすることができる：（１）外因性プロモーター配列（２）リボソーム結合部位（３）担体タンパク質（４）ポリアデニル化信号（４）分泌信号。修正は原核または真核中の発現を改善するために細胞５’−未翻訳および３’−未翻訳配列中になされることができる；または、コドンはそれらが同一のアミノ酸を符号化する一方でそのコドンが選択された発現系の中で好ましいコドンであることが可能であるように修正することが可能である。
【００３８】
こうした好ましいコドンの使用は、例えば、本明細書において参考のためにそれらの全体を包含するＧｒａｎｔｈａｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：４３〜７４（１９８１）、およびＬａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１〜１２（１９８５）中に記載されている。さらに、いったん適切なベクター中にクローン化されると、ＤＮＡは前述のように様々な方法で変化して、それら自体が本発明のリガンドであるアミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドの類似物、誘導体または変異体を生産することができる。
【００３９】
別の実施形態において、本発明のリガンドは、リガンドが中でそのＮ−末端またはそのＣ−末端、または両方の末端で１以上のペプチド複製品に融合される融合タンパク質として発現することができる。特定の実施形態において、融合タンパク質は、少なくともリガンドの実質的な部分が融合タンパク質からタンパク質分解的に裂かれてリガンドを生成することができるように、特定的に裂けることが可能である。こうした融合タンパク質は化学的または酵素的プロテアーゼによって認識される裂け目部位により設計することができる。
【００４０】
一つの実施形態において、融合タンパク質はリガンド配列の除去に対する独特な裂け目部位（または複数の部位）により設計される、すなわち、融合タンパク質は所定のプロテアーゼ（または複数のプロテアーゼ）がリガンドから裂け出すが、しかし、リガンド内のいかなる部位においても裂かれないように設計され、その結果リガンドの分裂を避ける。別の実施形態において、融合接合部（または複数の接合部）での裂け目部位（または複数の部位）は所定の酵素による融合タンパク質の開裂が融合タンパク質配列の残分から真正で無傷のリガンド配列を遊離する。ｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（インビトロジェン）および他の類似のベクターは、大腸菌における本発明のリガンドを含む融合タンパク質の増強翻訳効率のためのｔｒｃプロモーターからの高レベルの規制された転写を得るために用いることができる。
【００４１】
本発明のリガンドは、また、金属親和性樹脂を用いる１段階精製用にＮ−末端のニッケル結合性ポリヒスチジン後部に融合されて発現することができる。融合タンパク質中のエンテロキナーゼ開裂認識部位は、精製リガンドからＮ−末端ヒスチジン融合タンパク質の次の除去を可能とする。リガンド融合タンパク質は適切な担体タンパク質、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、デヒドロフォレート・レダクターゼ、チレオドキシン、タンパク質Ａブドウ球菌アウレウスおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを用いて生産することができる。これらの例は、勿論、限定用ではなく説明用に意図されている。
【００４２】
本発明のリガンドは、また、ウイルスコートタンパク質により融合タンパク質として合成され、例えば、バクテリオファージＭ１３、Ｔ７、Ｔ４およびラムダ、ガンマｇｔ１０、ガンマｇｔ１１など；アデノウイルス、レトロウイルスおよびｐＭＡＭ−ネオ、およびｐＫＲＣなどのウイルス粒子の表面上に発現することができる。
【００４３】
一般に、原核生物発現ベクターは、宿主細胞と適合する種から誘導される複製および制御配列を含有する。ベクターは、通常、複製部位、および形質転換細胞における形質選択を提供することができるタンパク質を符号化する配列を担持する。例えば、ベクターは、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣＮｏ．３７，０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣＮｏ．４０，０１１）、ｐＢＯ４７５、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０またはｐＲＩＴ３０シリーズ中のあらゆるベクター（Ｎｉｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：１４４〜１６１（１９９０））、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＤＲ５４０、ｐＲＬ−ラムダ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン）、ｐＢＳ，ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐブルースクリプトＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン）；ｐＴＲＣ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア）を含む。真核：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン）ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア）は、原核宿主中の発現に適する。
【００４４】
こうしたプラスミドは、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）を参照すること）によって開示されている。バシラスプラスミドはｐＣ１９４、ｐＣ２２１、およびｐＴ１２７などを含む。こうしたプラスミドはグリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ）（Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２），ｐｐ．３０７〜３２９）によって開示されている。
【００４５】
適するストレプトマイセスプラスミドには、ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７〜４１８３（１９８７））、および．ｐｈｉ．Ｃ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎ：Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ（１９８６），ｐｐ．４５〜５４）などのストレプトマイセスバクテリオファージが挙げられる。シュードモナスプラスミドは、ジョンら（Ｊｏｈｎ ｅｔ．ａｌ．）（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３〜７０４（１９８６））、およびイザキ（Ｉｚａｋｉ）（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９〜７４２（１９７８））により概説されている。
【００４６】
本発明のリガンドに対して符号化する発現ベクターを含有する原核宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ＮＯ．３１４４６）、大腸菌株ＪＭ１０１（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１））、大腸菌株Ｂ、大腸菌株．ｓｕｂ．．ｃｈｉ．１７７６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１５３７）、大腸菌ｃ６００株（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９：４４０（１９５４））、大腸菌Ｗ３１１０株（Ｆ−、ガンマ−、原栄養菌株、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７３２５）、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１０，ｔｏｎＡ，ｐｈｏＡ Ｅ１５，（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９，ｐｔｒ３，ｄｅｇＰ４１，ｏｍｐＴ，ｋａｎ．ｓｕｐ．ｒ）（米国特許第５，２８８，９３１号、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５５，２４４）、バシラスサブチリス、サルモネラチフィムリウム、セラチアマルセサンおよびシュードモナス種が挙げられる。例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ ＮＯ．３１４４６）は特に有用である。用いることが可能である他の微生物菌株には、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１，５３７）などの大腸菌株が挙げられる。これらの例は、勿論、限定用ではなく説明用に意図されている。
【００４７】
原核細胞中に本発明のリガンドを発現するために、リガンド符号化ＤＮＡを作動可能なように機能的原核プロモーターに結合させることが必要である。こうしたプロモーターは、構造性かまたはさらに好ましくは調節可能（すなわち、誘導可能かまたは抑制解除可能）のいずれかであり得る。構造性プロモーターの例には、バクテリオファージ．ラムダ．のｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーターおよびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーターなどが挙げられる。
【００４８】
誘導可能原核プロモーターの例には、バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、λａｃＺ、λａｃＩ、およびｇａｌプロモーター、アルファ．−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６〜１８２（１９８５））およびＢ．サブチリスのζ−２８−特定プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ３２：１１〜２０（１９８４））、バシラスバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））、およびストレプトマイセスプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８〜４７８（１９８６）を参照すること）が挙げられる。
【００４９】
組み換え型ＤＮＡ構築プロモーターにおいて最も普通に用いられているものには、Ｐ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３７５，６１５（１９７８）；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８，１０５６（１９７７）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１，５４４（１９７９）を参照すること）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４０５７（１９８０）；ＥＰＯ Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．００３６，７７６を参照すること）が挙げられる。これらが最も普通に用いられている一方で、他の微生物プロモーターが発見され利用されてきており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されてきて、熟練工によりプラスミドベクターを用いてそれらを機能的にくくることが可能となってきた（例えば、Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０，２６９（１９８０）を参照すること）。
【００５０】
原核細胞における適正な発現は、また、遺伝子配列−符号化配列の上流にリボソーム結合性部位の存在を必要とする。こうしたリボソーム結合性部位は、例えば、ゴールドら（Ｇｏｌｄ ｅｔ．ａｌ．，）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５〜４０４（１９８１）により開示されている。リボソーム結合性部位および翻訳開始に必要とされる他の配列は、作動可能なように本発明のペプチドを符号化する核酸分子に結合される。バクテリア系における翻訳は、第一メチオニンを符号化するコドンで開始される。この理由により、ペプチド配列中にＡＴＧコドンを含み、プロモーターとペプチドを符号化するＤＮＡ配列間の結合がメチオニンを符号化することができるいかなる干渉性コドンも含まないことを確認することは好ましい。
【００５１】
原核生物に加えて、酵母、または多細胞性微生物から誘導される細胞などの真核微生物は宿主細胞として用いることができる。数多くの他の菌株が一般に使用可能であるが、サッカロマイセス・セレヴィシエまたは通常のパン酵母が、真核細胞の中では最も普通に用いられている。サッカロマイセス中の発現のために、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８２，３９，１９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７，１４１（１９７９）；Ｔｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０：１５７（１９８０）を参照すること）が一般に用いられる。このプラスミドは、すでに、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異菌株に対する選択標識を提供するｔｒｐ１遺伝子、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４，０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５，１２，１９７７）を含む。
【００５２】
酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、次に、トリプトファンの不在下における形質転換の成長を検出するための効果的な環境を提供する。酵母ベクター中の適する促進性配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，２０７３（１９８０））またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−フォスフェイトデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−フォスフェイトイソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）、Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００（１９７８）を参照すること）が挙げられる。
【００５３】
適する発現プラスミドを構築することにおいて、これらの遺伝子に関係する終結（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）配列も、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供するために発現するように期待されている発現ベクター３’配列中にくくられる。成長条件により支配される転写の付加的利点を有する他のプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２に対するプロモーター部位、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解系酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−フォスフェイトデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース活用を担う酵素がある。酵母適合プロモーター、複製源および終結配列を含有するあらゆるプラスミドベクターが適する。
【００５４】
加えて、植物細胞も宿主として利用可能であり、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ、およびノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化信号配列などの植物細胞と適合する制御配列は利用可能である。別の好ましい宿主は昆虫細胞、例えばショウジョウバエ幼虫である。昆虫細胞を宿主として用いて、ショウジョウバエ・アルコールデヒドロゲナーゼ・プロモーターを用いることができる。Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４５３〜１４５９（１９８８）を参照すること。
【００５５】
本発明のリガンドは脊椎動物宿主細胞中で生産することができる。培養中（組織培養）の脊椎動物細胞の増殖は、近年での決まりの手順になってきた（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）を参照すること）。有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）により形質転換されるモンキー腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（浮遊培養における増殖用にサブクローン化された２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；胎児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３〜２５１（１９８０））；モンキー腎細胞（ＣＶ１，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカグリーンモンキー腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅ．Ｓｃｉ．，３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
【００５６】
哺乳類の宿主細胞中の発現のために、有用なベクターには、ＳＶ４０から誘導されるベクター、ｐＲＫ５およびｐＲＫ７を含むｐＲＫベクターなどのサイトメガロウイルスから誘導されるベクター（Ｓｕｖａ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３７：８９３〜８９６（１９８７），ＥＰ３０７，２４７（Ｍａｒ．１５，１９８９），ＥＰ２７８，７７６（Ａｕｇ．１７，１９８８））ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルスから誘導されるベクター、およびモロニーのマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）から誘導されるベクターなどのレトロウイルスベクターが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５７】
本発明ペプチドの真核宿主における本発明発現のリガンドの生産は、真核の制御領域の使用を必要とする。こうした領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を方向付けるために十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核プロモーターには、例えば、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３〜２８８（１９８２））；ヘルペス・ウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ３１：３５５〜３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４〜３１０（１９８１））；酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１〜６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１〜５９５５（１９８４）を参照すること）が挙げられる。
【００５８】
複製源は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、腺、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源から誘導することが可能であるように、外因性起源を含むようなベクターの構築により提供され得るか、または宿主細胞染色体の複製機構により提供され得るかのいずれかである。ベクターが宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者は多くの場合に十分である。十分な量のタンパク質は細胞培養により生産されるが、しかし、第二コード配列を用いる精製は生産レベルをなお一層高めることに役立つ。一つの第二コード配列はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、これはメトトレキサート（ＭＴＸ）などの外部制御パラメータにより影響を受け、その結果メトトレキサート濃度の制御により発現の制御が可能となる（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４２１６（１９８０））を含む。
【００５９】
場合により、本発明のリガンドは作動可能なように分泌リーダー配列に結合されて、培地中への宿主細胞による発現産物の分泌をもたらす。分泌リーダー配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、１ｐｐ、アルカリホスファターゼ、転化酵素、およびアルファ係数が挙げられる。また本明細書において使用に適するものにタンパク質Ａの３６アミノ酸リーダー配列がある（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：３９０１（１９８５））。
【００６０】
いったん構築物（複数を含む）を含有するベクターまたは核酸分子が発現用に調製されると、ＤＮＡ構築物（複数を含む）は、多様な適する手段、すなわち、形質転換、トランスフェクション、接合、原形質融合、電気穿孔法、粒子銃技術、リポフェクチン、リン酸カルシウム析出、直接微量注入法、およびＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクションなどのいずれによっても適切な宿主細胞中に導入することが可能である。プラスミドＤＮＡによる真核細胞株のトランスフェクションに対する最も有効な方法は所定の細胞タイプによって変わる。
【００６１】
ベクター導入後、受容細胞はベクター含有細胞の増殖に対して選択する選択性培地中で増殖する。クローン化遺伝子分子（複数を含む）の発現は、本発明のリガンドの産生をもたらす。これは形質転換細胞中に、またはこれらの細胞を識別するための誘導後（例えば、ブロモデオキシウラシルを神経芽腫細胞などに投与することにより）に起こり得る。培養条件の変化は本発明のリガンドを形成するために用いることができる。最も好ましい条件は生理学上の条件を模倣したものである。
【００６２】
トランスフェクションは、いかなるコード配列が実際に発現されるかどうかに関係なく、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。トランスフェクションの多くの方法、例えば、ＣａＰＯ４析出および電気穿孔法が等業者に知られている。良好なトランスフェクションは、一般に、このベクター作動のいかなる兆候でも宿主細胞内に起こる場合に認識される。
【００６３】
形質転換は、ＤＮＡが染色体外の要素または染色体の成分のいずれかとして複製可能なように微生物中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、形質転換はこうした細胞に適切な標準技術を用いて行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）のセクション１．８２に記載されているように、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、一般に、実質的に細胞壁バリアを含有する原核または他の細胞用に用いられる。アグロバクテリア・チュームフェイシエン（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による感染は、Ｓｈａｗ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）および１９８９年６月２９日公告のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換用に用いられる。
【００６４】
こうした細胞壁のない哺乳類細胞に対しては、上述のサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．）のセクション１６．３０〜１６．３７に記載されているリン酸カルシウム析出法が好ましい。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的な態様は、１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号中にアキセル（Ａｘｅｌ）により記載されている。酵母菌中への形質転換は、一般に、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行われる。しかし、核注入、電気穿孔法、または原形質融合によるなどのＤＮＡを細胞中に導入するための他の方法も用いることが可能である。
【００６５】
本発明のリガンドを生産するために用いられる宿主細胞は、一般的にサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．）に記載されているように多様な培地中で培養することができる。多種多様の転写および翻訳の制御配列を、発現を制御する宿主の性質に応じて用いることが可能である。制止または活性化を可能とする転写開始制御信号は、遺伝子配列の発現が調節できるように選択することが可能である。興味あるものは、温度を変更することにより発現が制止されたり開始されたりすることが可能である温度感性のあるものか、または化学（代謝など）制御を受けやすい制御信号である。
【００６６】
細胞内発現系またはペリプラスム空間分泌系において、本発明の組み換え的に生産されるリガンドは、宿主細胞膜／細胞壁を分裂させることにより（例えば、浸透圧衝撃または界面活性剤中で宿主細胞膜の溶解度を高めることにより）培養細胞から回収することができる。あるいは、細胞外の分泌系において、組み換え的に生産される本発明のリガンドは培養培地から回収することができる。第一段階として、培養培地または溶解物を遠心分離してあらゆる粒子状の細胞破片を除去する。
【００６７】
次に、膜および可溶性タンパク質留分を分離する。次に、リガンドは可溶性タンパク質留分から精製することができる。リガンドが膜結合種として発現する場合は、膜結合ペプチドは界面活性剤での可溶化により膜留分から回収することができる。次に、粗ペプチド抽出物は、さらに、免疫親和性上の分画化またはイオン交換カラム；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー；クロマト集束；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を用いるゲル濾過；疎水親和性樹脂およびマトリックス上に固定されたＩｇＧリガンドを用いるリガンド親和力などの適する手段によって精製することができる。
【００６８】
生体外転写／翻訳系も、また、アミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドを符号化するＤＮＡ分子から誘導されるＲＮＡｓを用いて本発明のリガンドを生産するために用いることができる。細胞なしの翻訳系はタンパク質およびペプチドの生合成において用いられ、タンパク質生産用の分子生物学上の標準手段になってきた（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ｊ．Ｔｙｍｍｓ，１９９５，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｍｅｒｒｉｃｋ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：３８（１９８３）を参照すること）。
【００６９】
Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．ａｎｄ Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｓ．，「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１０：１６６〜１６８（１９９１）、Ｂａｒａｎｏｖ ｅｔ．ａｌ．，「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｓｃａｌｅ」Ｇｅｎｅ ８４：４６３〜４６６（１９８９）、Ｋａｗａｒａｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，「Ａｌｏｎｇ ｌｉｖｅｄ ｂａｔｃｈ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６：３２０〜３２４（１９９５）を参照すること。
【００７０】
真核および原核両方の細胞なしシステムが本発明のリガンドの生体外合成用に用いることができる。ウサギの網状赤血球（Ｐｅｌｈａｍ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２４７〜２５６（１９７６））および小麦麦芽溶解物（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７０：２３３０〜２３３４（１９７３））法が、真核生体外翻訳系に一般的に用いられる。スピリンら（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，）「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（４８８２）：１１６２〜１１６４（Ｎｏｖ．２５，１９８８）、ツバイ（Ｚｕｂａｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，７：２６７（１９７３）により考え出された大腸菌Ｓ３０抽出物法、およびゴールドおよびシュバイガー（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０：５３７（１９７１）の分画法が、原核生体外翻訳系に広く用いられる。
【００７１】
生体外合成のための発現単位は５’未翻訳領域を含み、さらに、３’領域を含むことが可能である。発現単位の５’未翻訳領域は、プロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合性配列、および翻訳開始信号を含有する。５’未翻訳領域（「頭」）は、また、便利な制限酵素認識部位および翻訳エンハンサーまたは「活性体」配列（複数を含む）を含有することが可能である。３’領域は便利な制限酵素認識部位および選択配列の３’後部を含有することが可能である。発現単位は等業者には公知のプロトコルにより化学的に合成することが可能である。あるいは、これらの要素は、１以上のプラスミド中に組み込まれ、微生物中に増幅され、標準手順により精製され、発現単位中への組み立て前に制限酵素により適切な断片に切り刻むことが可能である。
【００７２】
５’未翻訳領域は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ用などのプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼ結合性配列を含有する。リボソーム結合性部位に対して符号化するＤＮＡ配列は、プロモーター領域の下流または内部に位置する。リボソーム結合性部位は、原核翻訳手順が用いられる場合に原核リボソーム複合体（リボソームＲＮＡｓを含む）に対して特定的であることが可能である。
【００７３】
しかし、本発明の特定の実施形態は、真核配列およびウサギ網状赤血球系（Ｋｒａｗｅｔｚ ｅｔ．ａｌ．， Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６１：２７４〜２８６，１９８３：Ｍｅｒｉｃｋ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：３８，１９８３を参照すること）などの生体外真核翻訳系を用いる。合意の翻訳開始配列、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ、および他の機能的に関連する配列は、脊椎ｍＲＮＡｓに対して確立されてきた。この配列または関連配列は、生体外でのタンパク質合成を方向付けるＤＮＡ構築において用いることが可能である。この開始配列におけるＡＴＧトリプレットはメチオニンに対する翻訳開始コドンである；生体外タンパク質合成はこの点から始まると期待される。
【００７４】
プロモーターと翻訳開始部位の間に、翻訳エンハンサーまたは「活性体」配列などの他の知られた配列を置くことは望ましくあり得る。例えば、ジョブリングら（Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ．ａｌ．，）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：４４８３〜４４９８（１９８８））は、タバコモザイクウイルスからの未翻訳「リーダー配列」がＳＰ６−生成ｍＲＮＡｓにおいて「有意に翻訳を刺激した」ことを示した。
【００７５】
彼らは、また、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４の３６−ヌクレオチド５’未翻訳領域が大麦のアミラーゼおよびヒトインターロイキンｍＲＮＡｓの翻訳効率を増加させることを報告している（Ｊｏｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２〜６２５（１９８７））。ゴキブリウイルス（ノダウイルス）ＲＮＡ２（Ｆｒｉｅｓｅｎ ａｎｄ Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：８７６〜８８６（１９８１））、カブモザイクウイルスおよびブロムモザイクウイルス塗布タンパク質ｍＲＮＡｓ（Ｚａｇｏｒｓｋｉ ｅｔ．ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６５：１２７〜１３３（１９８３））も、また、高効率で翻訳する。対照的にいくつかの未翻訳リーダーはＳＰ６ＲＮＡｓの発現を厳しく低減させる（前述のＪｏｂｌｉｎｇ ｅｔ．ａｌ．，（１９８８））。
【００７６】
加えて、本発明のリガンドを符号化するＤＮＡ分子は、生体外発現単位中に組み込むことが可能である。一つの実施形態の中で、発現ポリペプチドは担体ポリペプチド／ペプチドおよびリガンドアミノ酸配列の両方を含有する。担体ペプチドは融合ポリペプチド量の定量化および精製に有用であろう（担体ポリペプチドに対する抗体が利用可能であるかまたは生産することができるとして）。一つの例は、融合ペプチドとして本発明のペプチドに付着することができる１１アミノ酸物質Ｐである。抗−物質Ｐ抗体は、物質Ｐを含有する融合タンパク質の検出用および定量化用に市販されている。別の例は８アミノ酸標識ペプチド、「フラッグ」（Ｈｏｐｐ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４〜１２１０（１９８８）である。担体のポリペプチドの好ましい形態は、簡単な化学的または酵素的手段により新奇なポリペプチドから裂けることが可能であるものである。
【００７７】
ＩＶ．アミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドの類似物、誘導体、または変異体であるリガンド
上述のように、本発明における用途を有するリガンドはアミノ酸配列配列番号：４を含むペプチド、およびこうしたペプチドの類似物、誘導体、または変異体を含む。本明細書において用いられる用語「アミノ酸」および特定のアミノ酸へのあらゆる言及は、自然に起こるタンパク新生アミノ酸およびアミノ酸類似物などの非自然的発生アミノ酸を包含することを意図している。
【００７８】
当業者は、この定義が特に指示のない限り自然に起こるタンパク新生（Ｄ）または（Ｌ）アミノ酸、ペニシラミン（３−メルカプト−Ｄ−バリン）などのアミノ酸類似物を含む化学的に変性されたアミノ酸、ノルロイシンなどの自然に起こる非−タンパク新生アミノ酸、およびアミノ酸の特徴である技術上知られた特性を有する化学的に合成された化合物を包含することを知るであろう。本明細書において用いられる用語「タンパク新生の」は、アミノ酸が公知の代謝経路を通して細胞の中のタンパク質中に組み込まれることができることを示す。
【００７９】
本発明のリガンド中に（Ｌ）−または（Ｄ）−アミノ酸を含むことの選択は、部分的にペプチドの所期の特徴に応じて決まる。例えば、１以上の（Ｄ）−アミノ酸の組み込みは、生体外または生体内におけるペプチドの安定性の増大を与える。また、１以上の（Ｄ）−アミノ酸の組み込みは、例えば、本明細書において記載されている結合アッセイ、または技術上公知の他の方法を用いて測定されるペプチドの結合活性を増大させるかまたは減少させることができる。いくつかのケースの場合に、例えば、ペプチドを被験者に投与することを設計する場合に、活性を短期間に保持するペプチドを設計することが望ましい。これらのケースにおいて、１以上の（Ｌ）−アミノ酸のペプチド中への組み込みは、被験者中の内生ペプチダーゼが生体内でペプチドを消化することを可能として、それによって被験者の活性ペプチドへの暴露を制限している。
【００８０】
本明細書において用いられる用語「アミノ酸同等物」は、自然発生アミノ酸の構造から離れるが、しかし、それらが生物活性を保持しているペプチド内で置換することができるようなアミノ酸構造を実質的に有する化合物を意味する。従って、例えば、アミノ酸同等物は側鎖修正または置換を有するアミノ酸を含むと共に、関連有機酸、またはアミドなども含むことができる。用語「アミノ酸」はアミノ酸同等物を含むように意図されている。用語「残基」はアミノ酸およびアミノ酸同等物の両方を意味する。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「ペプチド」はその最も広い意味において用いられ、アミノ酸同等物またはなお所期のペプチド機能活性を保持している間の他の非アミノ基を含有する化合物を指す。ペプチド同等物は１以上のアミノ酸を関連有機酸（ＰＡＢＡなど）またはアミノ酸などと置き換えること、あるいは側鎖または官能基の置換または修正により従来のペプチドとは異なることができる。その生物学的機能を破壊しないように限定された修正がペプチドになされることは理解される。この結果、完全にはペプチドの活性を破壊しないでアミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドの修正物が本発明のリガンドである。こうした修正には、例えば、添加、欠失、またはアミノ酸残基の置換、アミノ酸構造または機能を模倣する化合物との置換、およびアミノ基またはアセチル基などの化学部分の添加を含むことができる。修正は意図的または偶然的であることができると共に、組成物または構造の修正であることができる。
【００８２】
本発明のリガンドは、それらが拘束された第二構造中に維持される場合にも有用である。本明細書において用いられる用語「拘束された第二構造」「安定した」および「構造的に安定な」はリガンドを含むペプチド結合が自由に回転できないが、しかし、代わりに比較的固定された構造中に維持されることを示す。
【００８３】
ペプチドの第二構造を拘束するための種々の方法が技術上公知であり、本発明のリガンドにおける用途を有している。例えば、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−配列を含有するようなペプチドはβ−ターン、公知の第二構造を形成する。例えば、本発明のリガンドは、それを、例えば、Ｄｅｄｈａｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：５８５（１９８７）；Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ．ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ １７：３４４２（１９７８）；およびＣａｒｂｏｎｅ ｅｔ．ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３８：１８３８（１９８７）により記載されている方法に従って、アルファ螺旋または三重螺旋などの螺旋を形成する配列中に組み込むことにより安定化させることができる。これらはそれぞれ本明細書において参考のために包含する。加えて、本発明のリガンドは、その活性が保持される限りにおいて、より大きな直鎖、環式または分岐ペプチド中に組み込むことができる。
【００８４】
新奇に合成された直鎖ペプチドの第二構造を拘束するための特定の方法は、技術上公知の種々の方法のどれかを用いてペプチドを環化することである。例えば、本発明の環化リガンドは、例えば、本明細書において参考のために包含するＳｃｈｉｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．２５：１７１（１９８５）により記載されているように、非隣接アミノ酸残基間のペプチド結合を形成することにより調製することができる。リガンドは、Ｂｏｃおよびｔ−ブチル側鎖保護を有するＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸を用いて直鎖ペプチド鎖を組み立てることによりメリフィールド樹脂上に合成することができる。樹脂からのリガンドの放出後、ペプチド結合をリガンドのアミノおよびカルボキシル末端間に形成することができる。
【００８５】
本発明の新奇に合成される直鎖リガンドは、また、反応性アミノ酸側鎖間の結合形成により環化することができる。例えば、システイン対を含むリガンドは合成することができ、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］でペプチドの希釈水溶液を酸化することにより二硫化物ブリッジを形成することができる。あるいは、ε（γ−グルタミル）−リジン結合などのラクタムはリジンおよびグルタミン酸残基間に形成することができ、リジノノルロイシン結合はリジンおよびロイシン残基間に形成することができ、またはジチロシン結合は２チロシン残基間に形成することができる。本発明の環状リガンドは、例えば、デスモシンのヘテロ環式構造を形成することができる４リジン残基を含有するように構築することができる（例えば、本明細書において参考のために包含する、Ｄｅｖｌｉｎ， Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ ｅｄ．（１９９２）を参照すること）。
【００８６】
これらおよび他の結合を形成するための方法は技術上公知であり、化学反応性の公知の規則に基づく（本明細書において参考のために包含する、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｂｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ Ｅｄ．（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，１９９２）を参照すること）。
【００８７】
Ｖ．ペプチド模倣体
本発明のリガンドは、また、アミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドのペプチド模倣体を含むことができる。ペプチド類似物は、通常、医薬産業においてテンプレートペプチドのそれらに類似の特性を持つ非ペプチド薬剤として用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５） ＴＩＮＳ ｐ．３９２；およびＥｖａｎｓ ｅｔ．ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３０：１２２９を参照すること、これらは本明細書において参考のために包含する）、例えば、コンピュータ化された分子モデルの助けにより開発することができる。
【００８８】
構造的に治療的に有用なペプチドに類似しているペプチド模倣体は、同等の治療または予防効果を生み出すために用いることが可能である。一般に、ペプチド模倣体は構造的にパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学特性または薬学的活性を有するポリペプチド）に類似しており、こうしたペプチドはアミノ酸配列配列番号：１を含むが、しかし−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される連鎖により技術上知られた方法およびさらに以下の参考文献に記載される方法によって任意に置換される１以上のペプチド連鎖を有する：
【００８９】
Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３〜４６８（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ． ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ（１９７９）１４：１７７〜１８５（−ＣＨ２ＮＨ−，−ＣＨ２−ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ（１９８６）３８：１２４３〜１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ（１９８２）３０７〜３１４（−ＣＨ＝ＣＨ−，シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｇ． ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９８０）２３：１３９２〜１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９８２）２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ．ＥＰ４５６６５（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９８３）２４：４４０１〜４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ（１９８２）３１：１８９〜１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）；これらはそれぞれ本明細書において参考のために包含する。
【００９０】
特に好ましい非ペプチド連鎖は−ＣＨ２ＮＨ−である。こうしたペプチド模倣体は、ポリペプチドに対して、例えば、より経済的な生産、より大きな化学的安定性、強化された薬理学的特性（半減期、吸収、有効性、効き目、など）、改造された特異性（例えば、生物活性の広範なスペクトル）、および低減した抗原性などを含む有利な利点を有することが可能である。
【００９１】
ペプチド模倣体の標識化は、通常、１以上のラベルを、直接またはスペーサ（例えば、アミド基）を通して、定量的な構造−活性データおよび／または分子モデルにより予測されるペプチド模倣体上の非妨害位置（複数を含む）に共有結合的に付着させることを含む。こうした非妨害位置は、一般に、ペプチド模倣体がそれらに対し相互作用を起こして治療効果を生み出す巨大分子（複数を含む）または細胞との直接接触を形成しない位置である。ペプチド模倣体の誘導体化（例えば、標識化）は、実質的に、所期のペプチド模倣体の生物学的または薬理学的活性を妨害するべきではない。
【００９２】
ペプチド模倣体に対する多様な設計が可能である。例えば、結合用の必要な構造が中で非ペプチドにより安定化させられる環状ペプチドは、特に熟考される。ロブ（Ｌｏｂ）らへの米国特許第５，１９２，７４６号、バークジュニア（Ｂｕｒｋｅ，Ｊｒ）らへの米国特許第５，１６９，８６２号、ビショッフ（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）らへの米国特許第５，５３９，０８５号、アバーサ（Ａｖｅｒｓａ）らへの米国特許第５，５７６，４２３号、シャショウア（Ｓｈａｓｈｏｕａ）への米国特許第５，０５１，４４８号、およびゲータ（Ｇａｅｔａ）らへの米国特許第５，５５９，１０３号には、こうした化合物を生み出すための多様な方法が記載されている。これらの特許はすべて本明細書において参考として包含する。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物の合成も、また、技術上知られる。エルドレド（Ｅｌｄｒｅｄ）ら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：３８８２（１９９４））はペプチド配列を模倣する非ペプチド拮抗薬を論じている。同様に、クー（Ｋｕ）ら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：９（１９９５））は一連のこうした化合物の合成のさらなる解明を提供している。
【００９３】
本発明のリガンドであるアミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドの誘導体は、組み換え核酸分子技術を用いて生産することができる。特定のペプチドに対する修正は、生合成の間の特定部位突然変異誘発およびアミノ酸置換を通してのことであるので意図的であり得るか、またはペプチドを産生する宿主における突然変異を通してのことなので偶然的であり得る。誘導体を含むペプチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているものなどの標準突然変異誘発技術を用いて獲得することができる。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の第１５章にはクローン化ＤＮＡの特定部位突然変異誘発に対する手順が記載されている。
【００９４】
アミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドの誘導体には、例えば、リン酸化反応、グリコシル化、架橋化、アシル化、タンパク質分解開裂、治療用タンパク質、抗体分子、膜分子または他のリガンドに対する連鎖による、翻訳の間または後での修正が含まれるがそれには確かに限定されない（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２８５〜３２０を参照すること）。
【００９５】
遺伝子的に生産された誘導体の特定のタイプは、また、欠失、置換、添加、およびアミノ酸修正などのアミノ酸変更を含むがそれらに限定されない。「欠失」は関連ペプチド中に１以上のアミノ酸残基（複数を含む）がないことを意味する。「添加」は関連ペプチド中での１以上のアミノ酸残基（複数を含む）の存在を意味する。ペプチドに対する添加および欠失は、アミノ末端、カルボキシル末端、および／または内部において可能であり、アミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドを符号化するＤＮＡ分子を変異することにより、および／またはペプチドの翻訳後修正により生産することができる。
【００９６】
アミノ酸「修正」は自然発生アミノ酸を変更して非自然的発生アミノ酸を生産することを指す。非自然的アミノ酸を持つアミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドの類似物は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２〜１８８（Ａｐｒｉｌ １９８９）に記載されているように、生合成の間に非自然的アミノ酸をポリペプチド中に部位特異的に組み込みことにより生み出すことができる。
【００９７】
「置換」はペプチド中において１以上のアミノ酸残基（複数を含む）を別のアミノ酸残基（複数を含む）により置き換えることを指す。突然変異は、特定のコドンが次に別のアミノ酸を符号化する別のコドンに変わるようにアミノ酸配列配列番号：１を含むペプチドを符号化するＤＮＡ分子において行うことができる。こうした突然変異は、一般に、可能な限り最も少ないヌクレオチド変化をなすことにより行われる。この種類の置換突然変異は、得られるペプチド中のアミノ酸を非伝統的なやり方（すなわち、コドンを特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の集団に属するアミノ酸から別の集団に属するアミノ酸に変更することによる）または伝統的なやり方（すなわち、コドンを特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の集団に属するアミノ酸から同じ集団に属するアミノ酸に変更することによる）において変更することを行うことができる。
【００９８】
こうした伝統的変更は、一般に、得られるペプチドの構造および機能のより少ない変化をもたらす。以下の基はある程度まで交換できるアミノ酸を含有する：塩基性アミノ酸リジン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性アミノ酸アスパラギンおよびグルタミン酸；中性極性アミノ酸セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギンおよびより少ない程度にメチオニン；非極性脂肪族アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン（しかし、サイズにより、グリシンおよびアラニンはより近い関係にあり、バリン、イソロイシン、およびロイシンはより近い関係にある）；および芳香族アミノ酸フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。
【００９９】
加えて、異なる範疇に区分けされるけれども、アラニン、グリシン、およびセリンは、ある程度までは互換性があると思われ、システインは追加的にこのグループに適合するか、または極性中性アミノ酸で分類することが可能である。プロリンは非極性中性アミノ酸であるが、その置換はその構造上の影響のせいで困難であることを示す。従って、プロリンによるまたはプロリンのための置換は、同じかまたは類似の構造結果が得られうる場合を除いて、好ましくない。プロリン残基の特性を与える構造は、これらの１以上がヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）により置換される場合に得ることが可能である。誘導体は１より大きい変更を含む変更の組合せおよび異なるタイプの変更を含む。
【０１００】
アミノ酸配列配列番号：４を含むペプチドの「誘導体」は、類似のアミノ酸配列を有し、ある程度までアミノ酸配列配列番号：４を含むペプチドの活性を保持する機能的に等価なものである。「機能的に等価」とは、誘導体がアミノ酸配列配列番号：４を含むペプチドの活性に置き換えることができる活性を有することを意味する。好ましい機能等価物は、当業者に知られる、および／または下に記載されるアッセイにより測定される時にＩＢおよびＢＢＢを通しての輸送有効性の十分なレベルを保持する。
【０１０１】
好ましい機能等価物は、アミノ酸配列配列番号：４を含むペプチド活性の１％〜１０，０００％内、さらに好ましくは１０％〜１０００％の間、さらに好ましくは５０％〜２００％内にある活性を有する。さらに特定の実施形態において、誘導体は、アミノ酸配列配列番号：４を含むペプチドに対して、少なくとも５０％の配列類似性、好ましくは７０％、さらに好ましくは９０％、なおさらに好ましくは９５％の配列類似性を有する。「配列類似性」は、ポリペプチド源には無関係で二つの異なるポリペプチド中のアミノ酸配列間に見られる「相同性」を指す。
【０１０２】
ＶＩ．生物剤
多様な生物剤が本発明における使用に適する。これらは、限定なしに、タンパク質、サイトカインおよびホルモン（インシュリンなど）などを含むペプチド（例えば、オリゴペプチドおよびポリペプチド）、組み換え型可溶性受容体、モノクローナル抗体、ヒト成長ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、凝固因子、ワクチン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、酵素、およびジムスターゼを含む。
【０１０３】
好ましいクラスの生物剤（化学療法薬を含む）には、抗新生物薬、抗菌剤、駆虫剤、抗真菌薬、ＣＮＳ薬、免疫調整剤およびサイトカイン、毒素および神経ペプチドが挙げられる。標的細胞がそれらに向けて抵抗機構を開発してくる傾向にある生物剤も好ましい。特に好ましい生物剤には、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンまたはカルミノマイシン、ビンカ・アルカロイド、マイトマイシン型抗生物質、ブレオマイシン型抗生物質、フルコナゾールなどのアゾール抗真菌薬、アンフォテリシンＢなどのポリエン抗真菌薬、パクリタクセルなどのタキサン関連抗新生物薬、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターフェロンおよびサイトカインなどの免疫調整剤が挙げられる。
【０１０４】
好ましい生物剤には、限定なしに、アンフォテリシン−Ｂなどの追加の抗真菌薬、フルシトシン、ケトコナゾール、ミコナゾール、イタコナゾール、グリセオフルビン、クロトリマゾール、エコナゾール、ターコナゾール、ブトコナゾール、シクロピロックス・オラミン、ハロプロジン、トインアフテート、ナフチフィン、ナイスタチン、ナタマイシン、ウンデシレン酸、安息香酸、サリチル酸、プロピオン酸およびカプリル酸が挙げられる。こうした薬剤には、さらに限定なしに、ジドブジンなどの抗ウイルス剤、アシクロビル、ガンチクロビル、ビダラジン、イドクスウリジン、トリフルリジン、フォックスカルネ、アマンタジン、リマンタジンおよびリバビリンが挙げられる。
【０１０５】
こうした薬剤には、さらに限定なしに、９−ラクタム抗生物質を含むペニシリン関連化合物などの抗菌剤、広域ペニシリンおよびペニシリナーゼ−抵抗性ペニシリン（メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム、アゾシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、シクラシリン、メズロシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、チカルシリン、イミペネムおよびアズトレオナムなど）、セファロスポリン（セファロスポリンはセファピリン、セファキソリン、セファレキシン、セフラジンおよびセファドロキシルなどの第一世代セファロスポリン；セファマンドール、セフォキシチン、セファクロール、セフロキシム、セフロキシムアクセチル、セフォニシド、セフォテタンおよびセフォラニドなどの第二世代セファロスポリン；
【０１０６】
セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾンおよびセフタジジムなどの第三世代セファロスポリンを包含する）、テトラサイクリン（デメクロサイテトラサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリンおよびオキシテトラサイクリンなど）、ベータ−ラクタマーゼ抑制剤（クラブラン酸など）、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシンＣ、カナマイシンＡ、ネオマイシンＢ、ネチルマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンなど）、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、バンコマイシン、バシトラシン、イソニアジド、リファンピン、エタムブトール、アミノサリチル酸、ピラジンアミド、エチオンアミド、シクロセリン、ダプソーン、スルホキソン・ナトリウム、クロファジミン、スルホンアミド（スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、およびスルフィソキサザールなど）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、キノロン（ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシンおよびシプロフロキサシンなど）、メテンアミン、ニトロフラントインおよびフェナゾピリジンが挙げられる。
【０１０７】
多様な中枢神経系生物剤が本発明における使用に適する。これらには、フェノチアジン（コンパジン、ソラジン、プロマジン、クロルプロマジン、アセプロマジン、アミノプロマジン、ペラジン、プロクロルペラジン、トリフルオペラジン、およびチオプロペラジンなど）、ジャボクアルカロイド（レセルピンおよびデセルピンなど）、チオキサンテン（クロルプロチキセンおよびチオチキセンなど）、ブチロフェノン（ハロペリドール、モペロン、トリフルオペリドール、チミペロン、およびドロペリドールなど）、ジフェニルブチルピペリジン（ピモジドなど）、およびベンズアミド（スルピリドおよびチアプリドなど）などの神経安定薬；
【０１０８】
グリセロール誘導体（メフェネシンおよびメトカルバモールなど）、プロパンジオール（メプロバメートなど）、ジフェニルメタン誘導体（オルフェナドリン、ベンゾトラピン、およびヒドロキシジンなど）、およびベンゾジアゼピン（クロルジアゼポキシドおよびジアズパムなど）などのトランキライザー；睡眠薬（ゾルプデムおよびブトクタミドなど）；９−遮断薬（プロプラノロル、アセブトノール、メトプロロール、およびピンドロールなど）；ジベンザゼピン（イミプラミンなど）、ジベンゾシクロヘプテン（アミトリプチリンなど）、およびテトラシクリック（ミアンセリンなど）などの抗欝薬；ＭＡＯ抑制剤（フェネルジン、イプロニアジド、およびセレゲリンなど）；
【０１０９】
フェニルエチルアミン誘導体（アンフェタミン、デキサンフェタミン、フェンプロポレックス、フェンテルミン、アンフェプラモン、およびペムリンなど）およびジメチルアミノエタノール（クロフェンシクラン、シプロデナート、アミノレックス、およびマジンドールなど）などの精神刺激薬；ＧＡＢＡ−模倣体（プロガビドなど）、アルカロイド（コ−ダーゴクライン、ジヒドロエルゴクリスチン、およびビンカミンなど）；コリン作用薬（シチコリンおよびフィゾシグミンなど）；血管拡張剤（ペントキシフィリンなど）；および脳活性剤（ピリチノールおよびメクロフェノキセートなど）；およびいくつかのこうした薬剤の混合物が挙げられる。
【０１１０】
特に興味のあるものは、ベンゾジアゼピンなどの鎮痛剤−睡眠薬、フェノチアジン、チオキサンテン、ブチロフェノン、およびジベンゾキサゼピンなどの精神薬理学薬剤、および中枢神経系刺激剤である。本発明の脳処理実施形態が生物剤の活性を改善する組成物を目指しているので、本発明のこの実施形態は、本明細書において記載される原理および手順を適用することにより、広範な中枢神経系薬剤に適用することができる。
【０１１１】
当然、本発明に従って被験者に投与される生物剤は、また、抗体などの多様なポリペプチド、ジフテリア毒素などの毒素、コロニー刺激因子および腫瘍壊死因子などのペプチドホルモン、神経ペプチド、成長ホルモン、エリスロポエチン、およびチロイドホルモン、α−リポタンパク質などのリポタンパク質、ヒアルロン酸などのプロテオグリカン、ゴナドトロピンホルモンなどのグリコタンパク質、インターフェロンまたはインターロイキンなどの免疫調整剤またはサイトカイン、エストロジェン受容体などのホルモン受容体を含むことができる。特定の実施形態において、こうしたポリペプチドは、少なくとも約５００、さらに好ましくは少なくとも約５，０００、最も好ましくは少なくとも約１０，０００の分子量を持つものである。
【０１１２】
本明細書における用途を有する生物剤は、また、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、アンギオテンシン変換酵素、および５α−レダクターゼなどの酵素阻害剤を含むことができる。これら薬剤の特色は、フィナステリド、キナプリル、ラミプリル、リシノプリル、サキナビール（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、リトナビール、インジナビール、ネルフィナビール、ジドブジン、ザルシタビン、アロフェニルノルスタチン、キノスタチン、デラビリジン、ビス−テトラヒドロフランリガンド（例えば、Ｇｈｏｓｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９（１７）：３２７８〜９０ １９６６を参照すること）、およびジダノシンなどのペプチドおよび非ペプチド構造である。こうした薬剤は単独または組合せ治療において投与することができる；例えば、組合せ治療では、サキナビール、ザルシタビン、およびジダノシンまたはサキナビール、ザルシタビン、およびジドブジンを利用する。例えば、Ｃｏｌｌｉｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１９６６ Ｊａｎ．２９（１）：９９を参照すること。
【０１１３】
同様に、多様なヒトおよび動物のサイトカインが本組成物中の生物剤としての使用に適する。これらには、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦｓ）、および免疫系の機能を制御する多くの他のタンパク質およびペプチド因子が挙げられる。これがいくつかのこうした薬剤の混合物にまで及びことは理解されよう。本発明は、サイトカイン自体の特異活性を強調することを目指すのではなく、むしろ組成物そのものを目指している。
【０１１４】
ＶＩＩ．担体
溶液（単分子系）、分散液（超分子系）、またはナノ粒子、ミクロスフェア、マトリックス、およびゲルなどのあらゆる特定系を形成する、ポリペプチド、脂質、炭水化物、ポリアミン、合成ポリマーなどの合成、半合成および自然の化合物に限定されないが、それらを含む多様な担体が本発明のリガンドと結びつくことができる。
以下のクラスの担体を例として取り上げる。しかし、種々の他の担体が本発明において用いることができることは理解される。
【０１１５】
高分子担体は、非イオン水溶解性、非イオン疎水性または水不良溶解性、カチオン性、アニオン性またはポリペプチドのようにポリペプチド両性電解質であることができる。これらポリマー担体の重合度は、約３〜約５００，０００、さらに好ましくは約５〜約５０００、なおさらに好ましくは約２０〜約５００であることが好ましい。
【０１１６】
好ましい親水性担体は、水に可溶性である非毒性、非免疫原性ポリマーである。こうしたセグメントには、ポリエーテル（例えば、ポリエチレン・オキシド）、多糖類（例えば、デキストラン）、ポリグリセロール、ビニルモノマー（例えば、ポリアクリルアミド）のホモポリマーおよびコポリマー、ポリアクリル酸エステル（例えば、ポリアクリロイル  モルホリン）、ポリメタクリルアミド、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルトリアゾール、ポリビニルピリジンのＮ−オキシド、ビニルピリジンおよびビニルピリジンＮ−オキシドのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリアミノ酸、ポリグリセロール（例えば、ポリ−２−メチル−２−オキサゾリン、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン）およびそれらのコポリマーおよび誘導体が挙げられるが確かにそれらに限定されない。
【０１１７】
好ましい非イオン疎水性および水不良溶解性セグメントには、ポリプロピレン・オキシド、ポリエチレン・オキシドとポリエチレン・オキシドのコポリマー、ポリエチレン・オキシドおよびポリプロピレン・オキシド以外のポリアルキレン・オキシド、スチレンのホモポリマーおよびコポリマー（例えば、ポリスチレン）、イソプレンのホモポリマーおよびコポリマー（例えば、ポリイソプレン）、ブタジエンのホモポリマーおよびコポリマー（例えば、ポリブタジエン）、プロピレンのホモポリマーおよびコポリマー（例えば、ポリプロピレン）、エチレンのホモポリマーおよびコポリマー（例えば、ポリエチレン）、疎水性アミノ酸およびアミノ酸の誘導体のホモポリマーおよびコポリマー（例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、セリン、グルタミン、アスパラギン）、核酸のホモポリマーおよびコポリマーおよびそれらの誘導体が挙げられる。
【０１１８】
好ましいポリアニオン担体には、ポリメタクリル酸およびその塩、ポリアクリル酸およびその塩、メタクリル酸およびその塩のコポリマー、アクリル酸およびその塩のコポリマー、ヘパリン、ポリリン酸塩、アニオン性アミノ酸のホモポリマーおよびコポリマー（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）、ポリリンゴ酸、ポリ乳酸、ポリヌクレオチド、およびカルボキシル化デキストランなどが挙げられる。
【０１１９】
好ましいポリカチオン担体には、ポリリジン、ポリアスパラギン、カチオン性アミノ酸のホモポリマーおよびコポリマー（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、ポリメタクリル酸のアルカノールアミンエステル（例えば、ポリ−（メタクリル酸ジメチルアンモニオエチル））、ポリアミン（例えば、スペルミン、ポリスペルミン、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミン、ポリペンチレンイミン、ポリヘキシレンイミンおよびそれらのコポリマー）、第３アミンと第２アミンのコポリマー、部分的または完全な第４化アミン、ポリビニルピリジンおよびポリカチオンセグメントの第４アンモニウム塩が挙げられる。
【０１２０】
これらの好ましいポリカチオンセグメントには、また、脂肪族、ヘテロ環式または芳香族アイオネン（Ｒｅｍｂａｕｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ，１９６８，６：１５９；Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｔ．，Ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ−２，Ｗｉｌｓｏｎ Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｐｒｏｓｓｅｒ，Ｈ．Ｊ．（ｅｄｓ．）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１６７〜１８７，１９８６を参照すること）が挙げられる。
加えて、デンドリマー、例えば、種々世代のポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９０，２９，１３８）も用いることができる。
【０１２１】
特に好ましいものは、以下のポリマー群から選択されるコポリマーである：
（ａ）少なくとも一つの親水性非イオンポリマーおよび少なくとも一つの疎水性非イオンセグメントを有する分割化コポリマー（「親水性−疎水性コポリマー」）；
（ｂ）少なくとも一つのカチオン性セグメントおよび少なくとも一つの非イオン性セグメントを有する分割化コポリマー（「カチオン性コポリマー」）；
（ｃ）少なくとも一つのアニオン性セグメントおよび少なくとも一つの非イオン性セグメントを有する分割化コポリマー（「アニオン性コポリマー」）；
（ｄ）少なくとも一つのポリペプチドセグメントおよび少なくとも一つの非ペプチドセグメントを有する分割化コポリマー（「ポリペプチドコポリマー」）；
（ｅ）少なくとも一つのポリヌクレオチドセグメントおよび核酸でない少なくとも一つのセグメントを有する分割化コポリマー（「ポリペプチドコポリマー」）；
親水性−疎水性コポリマーの典型的な代表物は、以下の式を有するエチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリマーである。
【０１２２】
Ａ．エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー
一つの好ましい実施形態において、分割化コポリマーは以下の式を有するエチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリマーである：
【化１】
2004514410.tif 000001
【化２】
2004514410.tif 000002
【０１２３】
式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｉおよびｊは約２〜約８００、好ましくは約５〜約２００、さらに好ましくは約５〜約８０の値を有すると共に、式中の各Ｒ１、Ｒ２対に対して一つは水素であり、他はメチル基である。
【０１２４】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）は、実際にはＢブロック内のイソプロピレン基の方向がランダムであることを、単純化し過ぎている。このランダムな方向はより完全である式（ＩＶ）において示されている。こうしたポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）化合物は、Ｓａｎｔｏｎ，Ａｍ．Ｐｅｒｆｕｍｅｒ Ｃｏｓｍｅｔ．，７２（４）：５４〜５８（１９５８）；Ｓｃｈｍｏｌｋａ，Ｌｏｃ．ｃｉｔ．８２（７）：２５（１９６７）；Ｓｃｈｉｃｋ，Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，ｐｐ．３００〜３７１（Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９６７）により記載されている。多くのこうした化合物は、「ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ）」、「プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）」および「シンペロニック（ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ）」などの無印商標名で市販されている。Ｂ−Ａ−Ｂ式内のプルロニックポリマーは、多くの場合、「逆（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）」プルロニック、「プルロニック−Ｒ」または「メロキサポール（ｍｅｒｏｘａｐｏｌ）」と呼ばれる。
【０１２５】
式（ＸＶＩＩ）の「ポリオキサミン（ｐｏｌｙｏｘａｍｉｎｅ）」は、商標名テトロニック（ＴｅｔｒｏｎｉｃＴＭ）でミシガン州ワイアンドットのＢＡＳＦから市販されている。式（ＸＶＩＩ）に示されるポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックの順序は逆転することができ、テトロニック−Ｒ（商標）を創り出す。これもＢＡＳＦから市販されている。Ｓｃｈｍｏｌｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｓｏｃ．，５９：１１０（１９７９）を参照すること。ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン・ブロックコポリマーは、また、エチレンオキシドとプロピレンオキシドの反復単位のランダム混合物を含む親水性ブロックにより設計することができる。ブロックの親水性特徴を維持するために、エチレンオキシドが優位である。同様に、疎水性ブロックはエチレンオキシドとプロピレンオキシドの反復単位の混合物であることができる。こうしたブロックコポリマーは商標名プルラドット（ＰｌｕｒａｄｏｔＴＭ）でＢＡＳＦから市販されている。
【０１２６】
式（ＩＶ）のジアミン結合プルロニックは、また、以下の式のジアミン結合ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマー族の一員であることができる。
【化３】
2004514410.tif 000003
【０１２７】
式中、点線は第二窒素から伸びているポリエーテルの対称コピーであることを示し、Ｒ＊は２〜６個炭素数のアルキレン、５〜８個炭素数のシクロアルキレンまたはフェニレンであり、Ｒ１およびＲ２に対して、（ａ）両方とも水素であるか、または（ｂ）一つが水素であり他がメチル基であるかのいずれかであり、Ｒ３およびＲ４に対して、（ａ）両方とも水素であるか、または（ｂ）一つが水素であり他がメチル基であるかのいずれかであり、Ｒ３およびＲ４の両方が水素である場合にＲ５およびＲ６の一つが水素で他がメチル基であり、Ｒ３およびＲ４の一つがメチル基である場合にＲ５およびＲ６の両方が水素である。
【０１２８】
当業者は、本明細書における検討に照らして、本発明の実行が例えばポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）化合物に限定される場合でさえ、上述の代表的な式は余りにも限定的であることを認識するであろう。このようにして、第一ブロックを作製する単位はエチレンオキシド単独で成り立つ必要はない。同様に、すべてのＢ型ブロックがプロピレンオキシド単位単独で成り立つ必要があるとは限らない。代わりに、ブロックは第一実施形態のパラメータが維持される限り式（Ｉ）〜（Ｖ）に規定されるもの以外のモノマーを組み込むことができる。
【０１２９】
従って、最も単純な実施例において、ブロックＡ中の少なくとも一つのモノマーは前に説明したように側鎖基により置換することが可能である。本発明において用いることができる親水性−疎水性ブロックコポリマーの多様な他の例が合成されてきた。これらのコポリマーは一般式ＡｎＢｍを有し、式中、Ａは親水性ホモポリマーまたはコポリマーセグメントであり、Ｂは疎水性ホモポリマーまたはコポリマーセグメントである；ｎはブロックＡ中の単位の数であり、ｍはブロックｂ中の単位の数である。ＡおよびＢセグメントは、それぞれ、直鎖または分岐鎖のいずれかであり得る。
【０１３０】
本発明において特に有用であるブロックコポリマーの例には、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（イソプレン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）トリブロックコポリマー（Ｍｏｒｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１８：１０２１，１９９０）、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（スチレン）ブロックコポリマー（Ｄｕｎｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１１：１０１６，１９９４）、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ジブロックコポリマー（Ｈａｒａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ １２：２１５３，１９９６）、およびポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（−ベンジルＬ−アスパラギン酸塩）ジブロックコポリマー（Ｋｗｏｎ，ｅｔ．ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ １２：９４５，１９９３）が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３１】
本発明において用いることができる親水性−疎水性ブロックコポリマー中の親水性ホモポリマーまたはコポリマーＡセグメントは、それぞれが同じかまたは異なる垂れ下がり基を有する少なくとも３モノマー単位を含む。各垂れ下がり基は酸素および窒素からなる群から選択される少なくとも一つの原子を含む。代表的な親水性ホモポリマーまたはコポリマーには、ポリエチレンオキシド、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー、多糖類、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンＮ−オキシド、ビニルピリジンＮ−オキシドとビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、およびポリアクロイルモルホリンが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３２】
好ましくは、親水性Ａセグメントは以下の式である：
【化４】
2004514410.tif 000004
【０１３３】
コポリマー：
【化５】
2004514410.tif 000005
【化６】
2004514410.tif 000006
式中ｍおよびｊはそれぞれ３〜５０００の値を有する。
【０１３４】
本発明において有用である疎水性Ｂセグメントは、また、フルオロアルキルセグメントに限定されないがそれを含むフルオロカーボン部分を含むことができ、コポリマーはフルオロカーボンおよび炭化水素の両方を含むことができる。一つのこうした例は以下の式を有する分割化ブロックポリマーである：
Ｒ１−Ｌ１−｛Ｒ２−Ｌ２−Ａ｝ｗ−Ｌ４−Ｒ４−Ｌ３−Ｒ３
（ＶＩ）
【０１３５】
式中、
（ｉ）Ｒ１は炭素原子数２〜５０個の一価のフッ素化炭化水素でありＲ２は炭素原子数２〜５０個の二価の炭化水素であるか、または（ｉｉ）Ｒ１は炭素原子数２〜５０個の一価の炭化水素でありＲ２は炭素原子数２〜５０個の二価のフッ素化炭化水素であるかのいずれかであり；Ｒ３は（ｉ）水素、（ｉｉ）炭素原子数２〜５０個の一価のフッ素化炭化水素、または（ｉｉｉ）炭素原子数２〜５０個の一価の炭化水素であり；Ｒ４は（ｉ）Ｒ３が水素の場合、化学結合；
（ｉｉ）Ｒ３がフッ素化炭化水素の場合、炭素原子数２〜５０個の二価の炭化水素、または（ｉｉｉ）Ｒ３が炭化水素の場合、炭素原子数２〜５０個の二価のフッ素化炭化水素であり；Ｌ１およびＬ２はそれぞれ他とは独立に結合基であり；Ｌ３およびＬ４はＲ４と一緒にまとめて、Ｒ３が水素の場合化学結合であり、Ｒ３が水素以外の場合Ｌ３およびＬ４はそれぞれ独立に考えられて結合基である；
【０１３６】
Ａは、それぞれが酸素および窒素からなる群から選択される少なくとも一つの原子を含む同じかまたは異なる垂れ下がり基を有する少なくとも３モノマー単位を含む親水性ホモポリマーまたはコポリマーであり；ｗは１〜１００の値を有する。
【０１３７】
親水性ホモポリマーまたはコポリマーＡは、それぞれの単位が同じかまたは異なる垂れ下がり基を有する少なくとも３単量体単位を含む。それぞれの垂れ下がり基は、酸素および窒素からなる群から選択される少なくとも一つの原子を含む。代表的な親水性ホモポリマーまたはコポリマーには、ポリエチレンオキシド、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー、多糖類、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンＮ−オキシド、ビニルピリジンＮ−オキシドとビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、およびポリアクロイルモルホリンが挙げられる。
【０１３８】
Ｂ．カチオン性コポリマー
有用な分割化コポリマーは中で少なくとも一つのセグメントがポリカチオンであるクラスのコポリマーを含む。これらの構造の１例は複数の共有結合ポリマーセグメントを含むコポリマーの基礎であり、該セグメントは（ａ）少なくとも３個のアミノアルキレンモノマーを含むカチオン性ホモポリマー、コポリマー、またはブロックコポリマーである少なくとも一つのポリカチオンセグメントを有し、該モノマーは少なくとも以下の一つからなる群から選択される：
（ｉ）以下の式で表される少なくとも一つの第３アミノモノマー：
【化７】
2004514410.tif 000007
【０１３９】
および第３アミノモノマーの４組の塩、または（ｉｉ）以下の式で表される少なくとも一つの第２アミノモノマー：
【化８】
2004514410.tif 000008
および酸添加および第２アミノモノマーの４組の塩、式中、
Ｒ１は水素、炭素原子数２〜８個のアルキル、Ａモノマー、またはＢモノマーであり；各Ｒ２およびＲ３は他から独立に捉えて以下の式の同じかまたは異なる直鎖または分岐鎖アルカンジイル基であり、
【化９】
2004514410.tif 000009
【０１４０】
式中、ｚは２〜８の値を有し；Ｒ４は対になって表現される結合炭素原子の一つの結合を充足させる水素であり；Ｒ５は水素、炭素原子数２〜８個のアルキル、Ａモノマー、またはＢモノマーであり；Ｒ６は水素、炭素原子数２〜８個のアルキル、Ａモノマー、またはＢモノマーであり；Ｒ７は以下の式の直鎖または分岐鎖アルカンジイル基であり、
【０１４１】
【化１０】
2004514410.tif 000010
【０１４２】
式中、ｚは２〜８の値を有し；Ｒ８は水素、炭素原子数２〜８個のアルキル、Ａモノマー、またはＢモノマーであり；および上に定義される少なくとも一つの直鎖または分岐鎖非イオン親水性セグメントＡは約５〜約１０００の単量体単位を有する。
本発明のコポリマー中のポリカチオン性セグメントは分岐できる。例えば、ポリスペルミン系コポリマーは分岐される。これらコポリマーのカチオン性セグメントは、１，４−ジブロモブタンとＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンの縮合により合成された。この反応は第１、第２、および第３アミンを伴う高度に分岐したポリマー生成物を生成する。
【０１４３】
分岐ポリカチオンの例は、少なくとも２個の窒素原子を含有するポリアミンと少なくとも２個のハロゲン原子（臭化物または塩化物を含む）を含有するハロゲン化アルキル間の縮合反応の生成物である。特に、分岐ポリカチオンは多縮合の結果として生成される。この反応の１例はＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンと１，４−ジブロモブタン間の反応であり、ポリスペルミンを生成する。
【０１４４】
分岐ポリカチオンの別の例は以下の式により表されるポリエチレンイミンである：
（ＮＨＣＨ２ＣＨ２）Ｘ［Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）ＣＨ２ＣＨ２］Ｙ
（ＶＩ）
有用なポリアミン系コポリマーの１例は以下の式で表されるポリマーである：
Ｋ１−Ｌ１−［Ｇ−Ｌ２−Ｆ−Ｌ３］１−Ｋ２
（ＶＩＩ）
【０１４５】
式中、
Ｆは複数の式−ＮＨ−Ｒ０で表される反復単位を含むポリアミンセグメントであり、該Ｒ０は置換可能である炭素原子数２〜６個の脂肪族基である；
Ｇはポリエチレンオキシドまたはエチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーであり上に定義した直鎖または分岐鎖非イオン性セグメントである；
Ｋ１およびＫ２は他から独立に水素、ヒドロキシル基、アミノ基、ＧまたはＦポリマーセグメントであり；各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は他から独立に結合基または化学結合である。
【０１４６】
ポリカチオン性セグメントのアミノ基は４級化されてアンモニウム塩を生成することができる。実施例は、ハロゲン化アルキルにより修正されて第３および第４ポリアミンを生成するポリスペルミンおよびポリアミンを含む。別の有用なタイプのカチオン性セグメントの明確な化学構造は、脂肪族、ヘテロ環式または芳香族であり得るアイオネン（ｉｏｎｅｎｅｓ）である（Ｒｅｍｂａｕｍ ｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９６８，６：１５９；Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｔ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ−２．Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｐｒｏｓｓｅｒ，Ｈ．Ｊ．（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１６３〜１８７，１９８６を参照すること）。
【０１４７】
Ｃ．アニオン性コポリマー
アニオン性コポリマーは水性環境の中でポリアニオンを生成する少なくとも一つの高分子電解質セグメントを含有する。これは広範囲ｐＨにおいて、高イオン化度を有する強多塩基酸、およびｐＨ依存のイオン化度により特徴付けられる弱塩基酸の両方を含む。アニオン性セグメントは、通常、カルボキシル基、サルフェート基、スルホン酸基、およびホスフェート基などの複数の垂れ下がりアミノ基を有する。アニオン性コポリマーの例には、ポリオキシエチレン−ｂ−ポリメタクリル酸（Ｗａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ Ａ：Ｐｏｌｍ．Ｃｈｅｍ．，３０：２２５１（１９９２）、ポリスチレン−ｂ−ポリアクリル酸（Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２５：７１６０，１９９２）、ポリオキシエチレン−ｂ−ポリオキシプロピレン−ｂ−ポリオキシエチレンによりグラフト化されたポリアクリル酸（Ｂｒｏｍｂｅｒｇ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．１７：１６９（１９９６））が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４８】
Ｄ．ポリペプチドコポリマー
ポリペプチドコポリマーは、セグメントが少なくとも一つのポリペプチドセグメントおよび少なくとも一つの非ペプチドポリマーセグメントを有する、複数の共有結合ポリマーセグメントを有する。ポリペプチドセグメントは複数のアミノ酸単位またはそれらの誘導体を有する。
ポリペプチドを含有する有用な分割化コポリマーの例には、以下の式で表されるポリ（オキシエチレン）−ポリ（Ｌ−リジン）ジブロックコポリマーが挙げられる：
【０１４９】
【化１１】
2004514410.tif 000011
【０１５０】
式中、ｉは約２〜約５００の整数であり、ｊは約４〜約５００の整数である。第２例は以下の式で表されるポリ（オキシエチレン）−ポリ（Ｌ−アラニン−Ｌ−リジン）ジブロックコポリマーである：
【化１２】
2004514410.tif 000012
式中、ｉは約２〜約５００の整数であり、ｊは約２〜約５００の整数である。
【０１５１】
本発明におけるポリペプチドコポリマーの使用は、固相および溶液相化学を用いることによるポリペプチドセグメントの長さのより良い制御を可能とする。明確な化学構造を有するポリペプチドに基づく分割化コポリマーについて、ポリ（アミノ酸）−ｂ−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）−ｂ−ポリ（アミノ酸）（Ｂｒｏｍｂｅｒｇ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９：４０（１９９８））などが文献に記載されてきた。さらに、ポリペプチド中の単位組成物および配列は、疎水性、親水性、イオン性、水素および化学結合形成性アミノ酸およびそれらの誘導体を含んで変性されて、分割化コポリマーの基礎の中でのより広い可変性を作り出すことができる。
【０１５２】
Ｅ．ポリヌクレオチドコポリマー
ポリヌクレオチドコポリマーは、セグメントが少なくとも３個の核酸単位またはそれらの誘導体を含有する少なくとも一つのセグメントを持つ、複数の共有結合ポリマーセグメントを有する。ポリペプチドコポリマーに類似に、ポリヌクレオチドコポリマーは固相および溶液相化学を用いることによるセグメント長および配列に対するより良い制御を提供する。
【０１５３】
明確な化学構造を有するポリヌクレオチドに基づく分割化コポリマーは、ポリオキシエチレン−ｂ−ポリヌクレオチドコポリマーおよびポリカチオン−ｂ−ポリヌクレオチドコポリマー（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７：３（１９９６）；米国特許第５，６５６，６１１号）を含んで記載されてきた。ポリペプチドコポリマーと同様に、ポリヌクレオチドコポリマーは、本発明に従って適切な生物剤組成物を選択することにおいて特に有用である、ポリヌクレオチドセグメントにおける単位組成物および配列の変化を可能とする。
【０１５４】
ＶＩＩＩ．生物剤および／または担体をリガンドで結合すること
Ａ．リガンドの接合
別の実施形態において、本発明は、生物剤に接合された本発明のリガンドを提供する。本明細書における用途を有する特定の生物剤は上に記載されている。
なお別の実施形態において、本発明は薬剤担体系に接合されたリガンドを提供すると共に、こうした担体系はポリマー分子、ブロックコポリマー分子、または前記ポリマーの誘導体である。担体系はタンパク質分子も含むことが可能である。特定の担体系は上に記載されている。
【０１５５】
Ｂ．化学接合の方法
本発明リガンドの生物剤、または担体への共役体の調製は、化学連結反応に対する知られた有機化学法の一つによって達成される。リガンドと巨大分子間の構造的連結、およびそれらが接合される化学的方法は、共役体に接合される時にリガンドの結合力およびリガンドの生物活性が最小限に妥協されるように選択されるべきである。当業者により理解されるように、多くの適する化学接合法がある。適切な接合法の選択は、接合分子中に存在する化学基の検査、およびそれらにいくつかの新規な化学基を導入してこれら分子の可能な修正を評価することにより理論的に正当化することができる。多くの化学基が接合反応を受けることができる。
【０１５６】
以下の基を例として本明細書において記載する：ヒドロキシル基（−ＯＨ）、第１および第２アミノ基（−ＮＨ２および−ＮＨ−）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メルカプト基（−ＳＨ）、芳香族環、糖残基、アルデヒド（−ＣＨＯ）、脂肪族および芳香族ハロゲン化物など。これら基の反応性は技術上公知である（本明細書において参考のために包含する、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｂｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ Ｅｄ．（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，１９９２）、Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｗｉｌｅｙ １９９２）を参照すること）。接合法および技術のさらに広範囲にわたる記載は、Ｇ．Ｔ．Ｈａｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５、およびＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１中に見出すことができ、これらは本明細書において参考のために包含する。
【０１５７】
Ｃ．ヒドロキシル基による接合
ヒドロキシル基（−ＯＨ）は、セリン、トレオニン、およびチロシン残基の側鎖中、および糖類および糖タンパク質中の糖残基中のペプチドおよびタンパク質に存在する。ヒドロキシル基は、また、パクリタクセルなどの生物剤を含む多くの化合物中、および多糖類およびポロキサマーなどの高分子化合物中に存在する。ヒドロキシル基は求核特性を示し、例えばアルキル化（エーテル化）、ならびにアシル化（エステル化）などの置換反応を受けやすい。以下の反応性化学物質はヒドロキシル基と接合するために好ましい：ハロゲン化アルキル（Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ）、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、アシル無水物、ハロゲン化アシル、アルデヒド（−ＣＨＯ）、およびヒドラジド（Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２）など。特に好ましいものはアシル無水物（（Ｒ−ＣＯ）２Ｏ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（本明細書において参考のために包含するＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．ａｎｄ Ｐａｕｌ，Ｒ．，（１９５８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８０，４４２３を参照すること）である。
【０１５８】
Ｄ．アミノ基による接合
アミノ基（−ＮＨ２）は、これらがアシル化されない場合、ペプチドおよびタンパク質中においてそれらのＮ−末端で、およびリジン残基の側鎖中に存在する。アミノ基は、また、ドキソルビシンなどの治療剤を含む多くの化合物中に存在する。化学的および遺伝子的方法は、アミノ基をペプチド、タンパク質、小有機分子および高分子を含む多くの他の分子中に導入することを可能とする。アミノ基は求核特性を示し、例えば、アルキル化、アシル化、およびアルデヒドとの縮合などの置換反応を受けやすい。
【０１５９】
以下の反応性化学物質はアミノと接合するために好ましい：ハロゲン化アルキル（Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ）、アリールアジド、アシル無水物、ハロゲン化アシル、アシルエステル、カルボジイミドで活性化したカルボン酸塩、およびアルデヒド（−ＣＨＯ）など。特に好ましいものは、アシル無水物（（Ｒ−ＣＯ）２Ｏ）、塩化アシル（Ｒ−ＣＯ−Ｃｌ）、ｐ−ニトロフェニルエステル（Ｒ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル・エステル（ＮＨＳエステル、Ｒ−ＣＯ−Ｏ−Ｎ（ＣＯ−ＣＨ２）２）、イミドエステル（Ｒ−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｏ−ＣＨ３）、およびカルボジイミドで活性化したカルボン酸（Ｒ−ＣＯ−ＯＨ＋Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’’）である。
【０１６０】
Ｅ．メルカプト基による接合
メルカプト基（−ＳＨ）は、システイン残基を含むペプチドおよびタンパク質中に存在する。メルカプト基は、また、多くの化合物中に存在し、他の化合物中に導入することができる（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．，Ｄｒｅｖｉｎ，Ｈ．ａｎｄ Ａｘｅｎ，Ｒ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３を参照すること）。メルカプト基は求電子置換反応、例えば、アルキル化および酸化反応を受けやすい。−ＳＨ基と接合するために有用であり好ましいものは以下の反応性化学物質である：ヨウ化アルキル、α−不飽和アシル、および酸化剤。特に好ましいものは以下の誘導体である：ヨードアセトアミドＲ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｉ、マレイミド（Ｒ−Ｎ（ＣＯ−ＣＨ）２）、ビニルスルホン（Ｒ−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｍａｓｒｉ Ｍ．Ｓ．（１９８８）．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．７：４９〜５４、これは本明細書において参考のために包含する）。
【０１６１】
Ｆ．カルボキシル基による接合
カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）は、ペプチドおよびタンパク質中においてそれらのＣ−末端に（アミド化されない場合）、およびアスパラギン酸およびグルタミン酸残基の側鎖中に存在する。カルボキシル基は、また、メトトレキサートなどの治療剤を含む多くの化合物中に存在する。化学的および遺伝子的方法は、カルボキシル基をペプチド、タンパク質、小有機分子および高分子を含む多くの他の分子中に導入することを可能とする。カルボキシル基はアミンおよびヒドロキシル基などの求核基をアシル化することができる。カルボキシル基は接合の前に活性化を必要とする。好ましい活性化法は、ハロゲン化有機または無機酸（例えば、塩化ピバロイル、エチル・クロロホルメート、塩化チオニル、ＰＣｌ５）との反応、カルボジイミドとの反応（Ｒ−ＣＯ−ＯＨ＋Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ、例えばＥＤＣ、ＤＣＣ）、ベンゾトリアゾリル・ウロニウムまたはホスホニウム塩（ＴＢＴＵ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ）との反応である。
【０１６２】
Ｇ．架橋剤による接合
好ましい実施形態において、治療剤または薬剤担体分子いずれかの他分子に対するリガンド受容体の接合は、架橋剤の支持により達成される。特に好ましいものはヘテロ二官能価架橋剤である。多様な架橋剤が等業者に知られている（例えば、本明細書において参考のために包含するＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１を参照すること）。
【０１６３】
ヘテロ二官能価架橋剤は、それらの内一つがアミノ基を有し、他がメルカプト基を有する２分子を結合するために特に有用である。好ましい実施形態において、リガンドはメルカプト基を有し、従って、アミノ基を担持する多様な化合物と接合することに利用することが可能である。以下のヘテロ二官能価架橋剤は、例えば、アミノ基をメルカプト基に接合する：ＧＭＢＳ（Ｎ−［●−マレイミドブチリルオキシ］スクシニミドエステル、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．（１９８８）．Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１２，７７〜８３）、ＳＰＤＰ（Ｎ−サクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．（１９７８）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３〜７３７）、ＳＩＡ（Ｎ−スクシニミジルヨードアセテート、Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．（１９８４）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １４０，６３〜７１）、ＳＮＳＢ（Ｎ−スクシニミジル−［４−ビニルスルホニル］ベンゾエート）。
【０１６４】
特に好ましいヘテロ二官能価リンカーは２反応基の間にポリオキシエチレン鎖を有する。こうしたリンカーによる接合は２接合分子間に親水性接合部を有する生成物を生み出し、その結果、それは生成物の水性媒体中での溶解度を増大させる。本明細書においてポリオキシエチレンを有する以下のリンカーを例として記載する：Ｎ−マレイミド−ポリオキシエチレン−スクシニミド・エステル（Ｓｈａｒｅｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２Ｄ２Ｚ０Ｆ０２）、ビニルスルホン−ポリオキシエチレン−スクシニミド・エステル（Ｓｈａｒｅｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ａｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２Ｚ５Ｂ０Ｆ０２）
【０１６５】
前記生物剤は本発明において生物学的に活性な物質として用いることが可能である。それらは、生物剤の不活性化化学誘導体、すなわち、それらの構造がある生物学的条件において化学的または酵素的に修正されることによって活性物質に転換していくプロドラッグとして用いる方がよい。例えば、２’または７−ヒドロキシル基が中でカルボン酸のエステルに転換されるパクリタクセル誘導体はプロドラッグを形成する（Ｄｅｕｔｃｈ ｅｔ．ａｌ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｒｕｇ．３．Ｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３２：７８８〜７９２，１９８９を参照すること）。
【０１６６】
例えば、そのアミノ基が中でアミノ酸誘導体のカルボキシル基によりアシル化されるドキソルビシン誘導体はプロドラッグを形成する（Ｂｒｅｉｓｔｏｌ Ｋ，ｅｔ．ａｌ．「Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｊ Ｎ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｖｅｒｓｕｓ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｕｍｏｕｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｒｅｅ ｄｒｕｇ．」Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９９ Ｊｕｌ；３５（７）：１１４３〜９；ＤｅＦｅｏ−Ｊｏｎｅｓ Ｄ，ｅｔ．ａｌ．「Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ‘ｐｒｏｄｒｕｇ’ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｋｉｌｌｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．」Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０００ Ｎｏｖ；６（１１）：１２４８〜５２を参照すること）。
【０１６７】
Ｈ．治療ポリペプチドによるリガンドの遺伝子融合
本発明の別の実施形態において、リガンドを符号化する自然の、修正された、または組み換え型の核酸配列は、融合タンパク質を符号化するために生物活性ポリペプチド配列に縛ることが可能である。治療タンパク質によるリガンド融合物の構築および発現に適する一般的な方法は、リガンドの組み換え製造に対して本明細書において上述したのと同じものである。キメラ・リガンド−ポリペプチドは、本発明のリガンドを符号化するＤＮＡ配列をフレーム単位で対象のポリペプチドを符号化するｃＤＮＡ配列に融合することにより最も幸便に構築することが可能である。
【０１６８】
しかし、治療ポリペプチドのゲノム断片への融合も用いることができる。あるいは、ＰＣＲ技術は適切なベクターによりフレーム単位で２部の分子を接合するために用いることができる。種々の長さおよび構造のスペーサは、付加的な可撓性を有する融合タンパク質を提供しタンパク折り畳みを維持するために、リガンド配列と治療タンパク質の間に挿入することができる。本発明のリガンドの融合は、アフィニティークロマトグラフィーおよび固定化金属キレートクロマトグラフィーを含む種々の公知の方法により精製することができる（Ａｌ−Ｍａｓｈｉｋｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７１：１７５６〜１７６３（１９８８））。適する融合パートナーは「生物剤」の項で記載した通りである。
【０１６９】
Ｉ．ウイルスタンパク質中へのリガンドの導入
本発明のリガンドはウイルスの屈性を変更するためにウイルス粒子中に導入することができる。各種ウイルスは遺伝子の生体内移送および発現用のベクターとして用いることができる。一例として、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳおよびＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスなどを挙げることが可能である。
【０１７０】
例えば、アデノウイルスの標的化は、構造的に拘束するやり方においてリガンドアミノ酸配列の導入により野生型外皮タンパク質から区別されるキメラアデノウイルス繊維タンパク質の構築によって提供することができる。こうしたキメラアデノウイルス繊維タンパク質は、キメラアデノウイルス繊維タンパク質よりもむしろ野生型アデノウイルス繊維タンパク質を含む場合を除いて同一であるベクターの細胞中への参入よりもさらに効果的であるキメラ繊維タンパク質を含むベクターの細胞中への参入を導くことができる。
【０１７１】
望ましくは、配列を符号化するリガンドは遺伝子発現のレベルで繊維タンパク質中に導入される。こうしたリガンドアミノ酸配列はアデノウイルス配列の代わりか、またはアデノウイルス配列に加えるかのいずれかで導入される。導入の性質には関係なく、ＤＮＡまたはタンパク質いずれかのレベルでのアデノウイルス繊維タンパク質中へのその組込みは、キメラ繊維タンパク質中での配列番号：６モチーフの生成をもたらす。
【０１７２】
ウイルス性ベクターをＣＮＳに再指向することおよび生物障壁を通しての輸送の増進は、例えば、抗アデノウイルス抗体に対して記載したように、抗ウイルス抗体の本発明のリガンドへの化学結合により生成される二重特異性共役を用いることにより達成することができる（Ｈａｉｓｍａ ＨＪ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０００，Ａｌｖａｒｅｚ ＲＤ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０００を参照すること）。化学接合の制限を避けるために、抗繊維ノブＡＢ（または細胞アデノウイルス受容体、ＣＡＲ）およびリガンドから成る遺伝子融合タンパク質を生成することができる（Ｄｍｉｔｒｉｅｖ Ｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００）。
以下の実施例は本発明を実施することに対して今知られる最善の形態を単に説明するために意図されている。
【０１７３】
ＩＸ．用途および治療上の使用
本発明のリガンドを含む組成物、生物剤、および／または担体は、経口的に、局所的に、直腸に、膣に、エアロゾール使用による肺経路により、非経口的に、すなわち、筋肉内、皮下、腹膜内、または静脈内に投与することができる。リガンド組成物は単独で投与することができるし、またはそれは標準薬務に従って医薬的に許容可能な担体または賦形剤と混合することができる。投与の経口形態に対して、リガンド組成物は、錠剤、カプセル、飴剤、トローチ剤、粉末、シロップ、エリキシル剤、水溶液および懸濁液などの形状で用いることができる。
【０１７４】
錠剤の場合において、用いることができる担体にはラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸塩が挙げられる。でんぷんなどの種々の崩壊剤、およびステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの潤滑剤は、通常、錠剤で用いられる。カプセル形状での経口投与に対して、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用に必要とされる場合、ポリヌクレオチド組成物は乳化剤および懸濁剤と混ぜることができる。必要ならば、ある種の甘味剤および／または調味剤は添加することができる。
【０１７５】
非経口投与に対して、共役の滅菌溶液が通常準備され、溶液のｐＨは適して調整され、緩衝される。静脈使用に対して、溶質の全濃度は調合物を等張とするように制御すべきである。眼の投与に対して、軟膏または落下性液は塗布具または点眼器などの技術上知られた眼配送システムにより適用することが可能である。こうした組成物は、ヒアルロン酸などの粘液模倣体、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピル・メチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール）、ソルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロムなどの保存剤、および通常の量の希釈剤および／または担体を含むことができる。肺投与に対して、希釈剤および／または担体はエアロゾール形成を可能とするように適切に選択される。
【０１７６】
Ｘ．投与量
とりわけ本発明のリガンドを含む組成物中の生物剤の投与量は、患者の年齢、体重および病状および薬剤の薬物動力学を含む多くの因子を考慮して処方医療専門家により設定される。多くの場合、有効な処置に必要な薬剤の本発明組成物の量は、自由な生物剤を用いて必要とされる量よりも少なくてすむことが可能である。
【０１７７】
一般に、本発明において用いられる生物剤は有効な量で動物に投与される。組成物において用いられるリガンドの効果に対する影響は実効量を決定する際に考慮されねばならない。一般に、実効量は、（１）治療を追求している疾患の兆候を減少させるか、または（２）治療を追求している疾患の処置に関連して薬理学上の変化を誘発するかのいずれかに対する有効な量である。癌に対して、実効量は、腫瘍のサイズを減少させる；腫瘍の成長を抑える；転移を予防または抑制する；または癌に冒された動物の平均余命を増大させるために有効な量を含む。
【０１７８】
多くの場合において、種々の生物剤の代謝産物は薬剤の投与から生じる望ましくない影響を作り出すかまたは増幅する。例えば、これは代謝産物が心臓毒性に至ると信じられているアントラサイクリン系薬剤に対して確かにそのケースに当たる。Ｍｕｓｈｌｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１０：９７５〜９８２（１９９３）を参照すること。本発明のリガンド組成物は生物剤に対する代謝速度を減少させることができ、それによって有害な副作用に対する可能性を減少させる。
【０１７９】
生物剤による小腸または血液脳関門の浸透は、当業者により認識されるような多くの技術によって測定することができる。こうした方法には、同位元素標識化、生物剤の効果に対する動物挙動の評価、および脳で起こる毒作用を伴う薬剤に対する致死投与量の測定が挙げられる。こうした方法は、さらに、適切な生体反応を引き出すために必要とされる投与量の減少を測定することを含む。
【０１８０】
種々の抗真菌剤がヒト真菌感染症を良好に治療している。しかし、治療投与量は、多くの場合、有効な薬剤レベルを達成することと毒性副作用を避けることとの間の妥協によるものである。近年、カンジダ・アルビカンスなどの元来敏感な種の間での薬剤耐性の出現、およびカンジダ・クルセットなどの元来からの薬剤耐性種の発生増加がより新しい抗真菌剤の追求を促してきている。
【０１８１】
フルコナゾールは副作用の発生は低いが、耐性の発生はますます高まってくる問題である。化学療法活性を高めること、およびこうした薬剤に対する耐性を逆転させることにおいて有効である配送付形剤は、従って、この薬剤および他の抗菌薬に対しても望ましい。
本発明は、本発明を代表するものとして提供される以下の非限定実施例を参照することにより、さらに理解することが可能である。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をさらに十分に説明するために提示される。しかし、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１８２】
実施例
実施例１．ペプチドの固相ペプチド合成：Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号１）、ｔａｍｒａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）、ｔａｍｒａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号３）
合成の出発物質は、０．６６ｍＥｑ／ｇの樹脂のレベルで置換された０．６ｇ（０．４ｍｍｏｌ）のＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂）であった（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、カリフォルニア州）。
【０１８３】
アミノ酸の各々は、Ｃ末端グリシンで出発し、下記の工程を含んでなる合成サイクルにおいて順次に添加された：ピペリジンの脱保護（工程１）、カップリング（工程２）およびニンヒドリン試験（工程３）。配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチドの合成は、追加のＦｍｏｃ脱保護（工程１）、およびアセチル化 （工程４）、および引き続くトリフルオロ酢酸切断（工程５）および精製（工程６）を使用して完結された。すべての操作は溶媒を排出するためのガラスフリットを有するガラス反応器内で実行された。反応器を１８０度で回転させる震蘯機を使用して、樹脂を溶媒およびそれぞれの溶液とともに攪拌した。
【０１８４】
１．Ｆｍｏｃ脱保護
樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍｌ）中の２０％の樹脂をピペリジンで２回処理することによって、出発樹脂から、または樹脂に前に結合したアミノ酸のα−アミノ窒素からＦｍｏｃ保護基を除去した。次いで樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄し、各洗浄は１分間実施した。
【０１８５】
２．カップリング
適当なＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（７ｍｌのＤＭＦ中に溶解した２．４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（３ｍｌのＤＭＦ中に溶解した１．２５ｇ）、およびジイソプロピルエチルアミン（０．８４ｍｌ）を樹脂に添加し、この混合物を９０分間攪拌した。樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで４回洗浄した。使用したアミノ酸誘導体を表１に示す。
【０１８６】
【表１】
2004514410.tif 000013
【０１８７】
３．ニンヒドリン試験
樹脂の小さい試料（ほぼ３０ビーズ）を試験管に移した。１滴のエタノール中の１％のニンヒドリン溶液、１滴の８０％の水性フェノール、および１滴のピリジン中の０．００１％のＫＣＮを樹脂の試料に添加し、この混合物を１２０℃に５０分間加熱した。ビーズの青色は不完全なカップリングを示した。この場合において、カップリング工程２を反復した。完結した場合、合成を次のサイクルに進行させた。
【０１８８】
４．ペプチド配列番号１のアシル化
Ｃｙｓを使用する最後のサイクル、およびＦｍｏｃ脱保護が完結した後、樹脂を５ｍｌのＤＭＦ中の無水酢酸（０．２２ｍｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．８４ｍｌ）とともに室温において９０分間攪拌した。
【０１８９】
５．テトラメチルローダミンを使用するペプチド配列番号２、および配列番号３の標識化
ペプチド鎖合成の最後のサイクル、およびＦｍｏｃ脱保護が完結した後、樹脂を５（および６）−テトラメチルローダミン（５ｍｌのＤＭＦ中に溶解した０．９ｇ）、ＰｙＢＯＰ（３ｍｌのＤＭＦ中に溶解した１．２５ｇ）、およびジイソプロピルエチルアミン（０．８４ｍｌ）とともに１２０分間攪拌した。
【０１９０】
６．トリフルオロ酢酸を使用する切断
樹脂をＤＭＦで６回、ＤＭＦ／メタノール（１：１ｖ／ｖ）で２回、そしてメタノールで３回洗浄し、真空中で１時間乾燥した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、８．５ｍｌ）、水（０．５ｍｌ）、フェノール（０．５ｍｌ）およびチオアニソール（０．５ｍｌ）の混合物を乾燥樹脂に添加し、５時間攪拌した。液体を排出し、樹脂を２ｍｌのＴＦＡで洗浄した。合体させた液体を乾燥窒素流中で蒸発させた。残留物を２０ｍｌの無水エーテルで２回洗浄し、生成物を水（２０ｍｌ）中に溶解し、凍結乾燥した。
【０１９１】
７．精製
凍結乾燥した粉末を水中に溶解し（２ｍｌの１０ｍｇの粗製ペプチド）、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８調製用カラム（２５×２．２５ｃｍ）上に負荷した。２成分の溶離液勾配０．５％／分で、溶液Ａ中の１０％の溶液Ｂから出発して流速５ｍｌ／分において、カラムを溶離した。溶液ＡはＨ２Ｏ中の０．１％のＴＦＡであり、そして溶液ＢはＣＨ３ＣＮ中の０．１％のＴＦＡであった。ボイド体積後の画分６０〜８０ｍｌを一緒にプールし、凍結乾燥した。次いで生成物をＣＨ３ＣＯＯＨ・Ｈ２Ｏ中に溶解し（１：９、ｖ／ｖ、１ｍｌ／ｇの生成物）、凍結乾燥した。
【０１９２】
【表２】
2004514410.tif 000014
【０１９３】
実施例２．Ｃａｃｏ単層を横切るペプチド配列番号２、および配列番号３の輸送
１０％の胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ変性イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下に、Ｃａｃｏ−２細胞を培養した。所望の数のトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（直径６．５ｍｍ、孔サイズ０．４μｍ）を組織培養プレートのウェルの中に入れた。フィルターを培地（トランスウェルの先端（ａｐｉｃａｌ）側面に０．６ｍｌおよび基部横（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）側面に０．６ｍｌ）でＣＯ２インキュベーター中において３０分間湿潤させた後、フラスコから細胞を収集した。細胞を培地の中に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させ、０．２ｍｌの細胞懸濁培地をトランスウェルの先端側面に添加し、ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培地を２日毎に８〜１２日間交換して、輸送実験に適当な十分に分化した単層を得た。
【０１９４】
先端および基部横のインサートフィルター上の細胞単層を各側面においてＰＢＳでリンスし、前もって加温したＤ−ＭＥＭと３０分間前インキュベートした。先端チャンバー中の培地をおだやかに除去した。新鮮な前もって加温したＤ−ＭＥＭ（１．２ｍｌ）を新しい基部横チャンバー（“ＦＡＬＣＯＮ”３５０４組織培養プレート）に移した。インサートを新しいチャンバーに移した。フルオレセイン標識化デキストラン（分子量３０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を濃度５０μｍｏｌ／ｌにおいてプローブとして使用して、Ｃａｃｏ−２単層漏出性をモニターした。ペプチド配列番号２、または配列番号３を先端側面に濃度５０μｍｏｌ／ｌに添加した。０．５、１、１．５および２時間インキュベートした後、チャンバーの先端側面および基部横側面からの培地を収集し、Ｃａｃｏ−２単層を横切るペプチドおよびデキストランを測定した。Ｃａｃｏ−２を通る化合物の相対輸送率（％）を次のようにして計算した：
【０１９５】
Ｐ＝Ｃｂ／（Ｃａ＋Ｃｂ）×Ｖｂ／Ｖａ
ここでＣｂは基部横チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｃａは先端チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｖｂは基部横チャンバー中の培地の体積であり、そしてＶａは先端チャンバー中の培地の体積である。励起５３０ｎｍ、放射５９０ｎｍを使用する試料の蛍光により、試料中のペプチドの濃度を測定した。励起４８０ｎｍ、放射５３０ｎｍを使用する試料の蛍光により、試料中のデキストランの濃度を測定した。
【０１９６】
【表３】
2004514410.tif 000015
【０１９７】
ＨＰＬＣを使用して先端チャンバー中のペプチド配列番号２の消化を測定した。試料を培地で１００倍に希釈し、０．２００ｍｌの各々をカラムＲＰ−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４上に注入し、５アセトニトリル／水（１０ｍＭのリン酸）と流速１ｍｌ／分において前もって平衡化した。試料を２成分勾配１％／分のアセトニトリル（１０ｍＭのリン酸）／水（１０ｍＭのリン酸）で流速１ｍｌ／分において溶離した。励起波長５５５ｎｍおよび放射波長５８０ｎｍを使用して、蛍光を検出した。ペプチド配列番号２は２２．３分において鋭いピークとして溶離された。残留するペプチドの百分率を次のようにして計算した：
Ｔ＝Ａ／ＳＵＭ（Ａｉ）
ここでＡは２２．３分におけるピーク下の面積であり、ＳＵＭ（Ａｉ）は１３〜２６分間のすべてのピークの面積の合計である。
【０１９８】
【表４】
2004514410.tif 000016
【０１９９】
実施例３．配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージの構築
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）バクテリオファージＭ１３の少量タンパク質ＩＩＩとの融合タンパク質として発現された。１００μｇのファージベクターｆＵＳＥ５はＰＩＩＩのＮ末端におけるＳｆｉＩ制限部位を含有し、これをＳｆｉＩレストリカーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）で供給会社が推奨する条件下に消化し、フェノール：クロロホルム抽出により精製し、氷上の２０分間のイソプロパノールを使用する沈殿により１４ｂｐのスタッファーフラグメントから単離した。線状化ベクターは非相補的ＳｆｉＩ末端を含有し、自己結合することができず、適当な付着末端を有するオリゴヌクレオチドの配向された結合を可能とした。
【０２００】
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドインサートを自動固相オリゴヌクレオチド合成により合成し、逆相クロマトグラフィーにより精製した。配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの配列、オリゴ番号１は次の通りである：ＧＧＧＣＣＧＧＴＡＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴＧ
オリゴ番号１のＤＮＡ配列を含んでなるオリゴヌクレオチドの２つの５’末端および３’末端を「半部位」フラグメント、オリゴ番号２およびオリゴ番号３にアニールして、ベクター中のＳｆｉＩ部位１および２に対して相補的な付着末端を形成した。
【０２０１】
オリゴヌクレオチドをＴ４キナーゼでリン酸化し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ中で、１．５μｇのオリゴ番号２、１．２μｇのオリゴ番号３、および０．５μｇのオリゴ番号１を混合し、６５℃に５分間加熱し、そして混合物を温室にゆっくり冷却することによってアニールした。この混合物は５：１００：１００（オリゴ番号１：オリゴ番号２：オリゴ番号３）の概算比率を表した。次いでアニールしたオリゴヌクレオチドのインサート（２００ｎｇ）を２０μｇのＳｆｉＩ切断ｆＵＳＥ５  ＲＦ  ＤＮＡ（モル比１：５）に結合して、小さい一本鎖ギャップを有する二本鎖環状分子を生成させた。アニールしたＤＮＡを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ中で２０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの添加により結合し、１５℃において一夜インキュベートした。
【０２０２】
結合したＤＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下にエタノール沈降させ、水の中に再懸濁させ、１．８ｋＶ／ｃｍ、２００Ω、２５ｍＦにおいてジーン・パルサー（Ｇｅｅｎ  Ｐｕｌｓｅｒ）エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を使用して、コンピテント大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１細胞の中に形質転換した。エレクトロポレーション後、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）を３７℃において１時間２ｍｌのＳＯＣ培地（２％のバクト（Ｂａｃｔｏ）トリプトン、０．５％のバクト酵母エキス、１０ｍＭのＮａＣｌ，２．５ｍＭのＫＣｌ，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，１０ｍＭのＭｇＳＯ４，２０ｍＭのグルコース、０．２ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリン）中で修復させ、１００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンおよび４０ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するルリア・ベルタニ（ＬＢ）寒天を有するペトリ皿上に配置した。
【０２０３】
プレートを３７℃において一夜インキュベートした。単一のコロニーからのファージをＬＢ培地中で増幅し、下記の文献に記載されているように、ポリエチレングリコールを使用する二重沈降法により精製した：Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、編者Ｂ．  Ｋａｙ他、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６。組換えファージのクローンの構造はジデオキシＤＮＡ配列決定により確証された。
【０２０４】
オリゴヌクレオチド配列のリスト
オリゴ番号１
１） 長さ：５４ヌクレオチド
２） 型：ヌクレオチド
2004514410.tif 000017
【０２０５】
オリゴ番号２（ＯＮ１０）
１） 長さ：１０ヌクレオチド
２） 型：ヌクレオチド
ＡＡＧＣＧＣＣＡＣＣ
オリゴ番号２（ＯＮ１１）
１） 長さ：１１ヌクレオチド
２） 型：ヌクレオチド
ＡＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴ
【０２０６】
実施例４．Ｃａｃｏ−２単層を横切る配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージの輸送
治療用化合物の経口的生物学的利用能の初期予測を得るために、Ｃａｃｏ−２細胞単層を横切るｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物輸送速度はしばしば使用される。この細胞系統は、１９７７年においてＦｏｇｈ（Ｆｏｇｈ  Ｊ．他、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５９（１９７７）２２１−２２６）によりヒト結腸癌腫に由来する永久分裂能化細胞系統として確立された。Ｃａｃｏ−２細胞は多孔質支持体上で極性化単層として増殖し、腸上皮の形態学的特性を示す（典型的な小腸ヒドロラーゼおよびマーカーを発現する頂端面上の十分に規定された刷子縁、および細胞間の十分に形成されたタイト結合）。
【０２０７】
１０％の胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ変性イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下に、Ｃａｃｏ−２細胞を培養した。所望の数のトランスウェル（直径６．５ｍｍ、孔サイズ０．４μｍ）を組織培養プレートのウェルの中に入れた。フィルターを培地（トランスウェルの先端側面に０．６ｍｌおよび基部横側面に０．６ｍｌ）でＣＯ２インキュベーター中において３０分間湿潤させた後、フラスコから細胞を収集した。細胞を培地の中に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させ、０．２ｍｌの細胞懸濁培地をトランスウェルの先端側面に添加し、ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培地を２日毎に８〜１２日間交換して、輸送実験に適当な十分に分化した単層を得た。
【０２０８】
先端および基部横のインサートフィルター上の細胞単層を各側面においてＰＢＳでリンスし、前もって加温したＤ−ＭＥＭと３０分間前インキュベートした。先端チャンバー中の培地をおだやかに動かした。新鮮な前もって加温したＤ−ＭＥＭ（１．２ｍｌ）を新しい基部横チャンバー（“ＦＡＬＣＯＮ”３５０４組織培養プレート）に移した。インサートを新しいチャンバーに移した。３Ｈ−マンニトールをプローブとして使用してＣａｃｏ−２単層漏出性をモニターした。
【０２０９】
アイソトープ標識化化合物、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージ（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）または野生型ファージ（対照ファージ１、５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）、またはランダムペプチドファージ展示ライブラリー（対照ファージ２、５×１０９ｃｆｕ／ ｍｌ）を含有する培地を先端側面に添加した。２時間インキュベートした後、チャンバーの先端側面および基部横側面からの培地を収集し、Ｃａｃｏ−２単層を横切るファージおよび３Ｈ−マンニトールの輸送を測定した。Ｃａｃｏ−２を通る化合物の相対輸送率（％）を次のようにして計算した：
【０２１０】
Ｐ＝Ｃｂ／（Ｃａ＋Ｃｂ）×Ｖｂ／Ｖａ
ここでＣｂは基部横チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｃａは先端チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｖｂは基部横チャンバー中の培地の体積であり、そしてＶａは先端チャンバー中の培地の体積である。配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージは、両方の対照ファージ試料よりも、１０，０００倍高いＣａｃｏ−２単層の透過率を示した（表５）。
【０２１１】
【表５】
2004514410.tif 000018
【０２１２】
実施例５．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト血液脳関門を横切る配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージの透過率
ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＣＥＣ）単層を用いる ２チャンバーモデルを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージの輸送の評価を実施した。
【０２１３】
特発性癲癇について治療を受けている患者から外科的に切除した側頭葉の小さい試料から、ＨＣＥＣ培養物を誘導し、日常的に単離し、培養において維持した。ＨＣＥＣは、多角形の、「丸石の」形態、内皮細胞マーカー、因子ＶＩＩＩに関係する抗原およびアンギオテンシン変換酵素に対する免疫反応性、および高いレベルのＢＢＢ特異的マーカー、酵素ＧＧＴＰおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコーストランスポーター−１（ＧＬＵＴ−１）、ＨＴ７抗原（２６、２７）を示し、そしてＭＤＲ表現型（ｍｄｒ−１）、ＢＢＢの重要な特徴を発現する。
【０２１４】
区画化されるＢＢＢモデルは、２つの分離された区画間に位置する半透過性膜上で増殖したＨＣＥＣの単層を含んでなる。インサートアセンブリーの下部チャンバーは、１：１（ｖ／ｖ）比で胎児ヒト星状膠細胞（ＦＨＡＳ）コンディショニングされた培地を補充した増殖培地を含有する。ＦＨＡＳコンディショニングされた培地は無血清Ｍ１９９中でコンフルエントＦＨＡＳを７２時間インキュベートすることによって調製され、ＨＣＥＣ中でＢＢＢ表現型のマーカーを誘導することが示された。ＭｉｌｌｉｃｅｌＲ  ＥＲＳシステムを使用する経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の変化を測定し、そしてＨＣＥＣ単層を横切る３Ｈ−スクロースおよび１４Ｃ−イヌリンのパラ細胞（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）通過を測定することによって、区画化ＢＢＢモデルの機能的性能の評価を日常的に実行する。
【０２１５】
ＴＥＥＲ値（３００〜３５０Ω／ｃｍ２）、ならびに３Ｈ−スクロースおよび１４Ｃ−イヌリンについての透過係数Ｐｅは、それぞれ、０．２８×１０−３および０．１４×１０−３であった。２組の内部対照を各「被験化合物」について実行する。第１に、被験化合物の非存在下に３Ｈ−スクロース（２μＣｉ／ｍｌ）および１４Ｃ−イヌリン（０．５μＣｉ／ｍｌ）の輸送を使用してパラ細胞輸送を評価したが、被験化合物の存在下に同一の放射線標識化マーカーをまた使用して化合物それ自体が不活性でありかつ単層透過性を変化させないことを保証した。
【０２１６】
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージおよび対照ファージを、先端チャンバーに１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの濃度に添加した。４時間インキュベートした後、チャンバーの先端側面および基部横側面からの培地を収集し、ファージ力価を測定するために使用した。化合物の相対輸送を実施例３に記載されているように計算した。配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージは、対照ファージよりも１０００倍高い効能でＨＣＥＣ単層を横切ることができた。
【０２１７】
【表６】
2004514410.tif 000019
【０２１８】
実施例６．配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチドと担体との結合
腸関門を横切ってタンパク質を輸送する本発明の化合物の能力について試験した。その目的で、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを担体タンパク質に化学的に結合させた。
担体タンパク質、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＩＣＮ、２５０ｕ／ｍｇ）をリン酸塩緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよびｐＨ８．５）の中に最終濃度３ｍｇ／ｍｌで溶解した。Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、０．２３４ｍｇのＳＰＤＰ＝３９μｌのＤＭＦＡの比率で、１３３μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）中に溶解した。
【０２１９】
ＳＰＤＰの溶液をペルオキシダーゼ溶液に添加し、室温において攪拌しながら３０分間インキュベートした。修飾後、活性化されたタンパク質をゲル濾過により精製した。ペルオキシダーゼ溶液をセファデックスＧ−２５カラム（Ｆｉｓｈｅｒ、２０ｍｌ）に適用し、５０ｍｌのリン酸塩緩衝液で溶離した。５０の感度および０．００５Ａｕのランプ強度で２８０ｎｍにおいて検出する。画分コレクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、画分（１ｍｌ）を収集した。修飾されたペルオキシダーゼを含有する画分を収集し、組合わせた（総体積５〜７ｍｌ）。対照のために１ｍｌのアリコートを保持した。活性化されたタンパク質のアリコートを１ｍｇ／ｍｌのＬ−システインメチルエステル塩酸塩（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で処理することによって、活性化されたグループの数を評価した。
【０２２０】
回収された２−ピリジルジサルファイドの量を３４３ｎｍにおける紫外線吸収により測定した。対照試料を室温において１５時間システインで処理し、ゲル濾過により精製し、レセプター結合アッセイにおいて参照として使用した。１ｍｇの配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを２００μｌのリン酸塩緩衝液中に溶解した。活性化されたペルオキシダーゼをペプチドと混合し、室温において攪拌しながら２４時間インキュベートした。反応を３４３ｎｍにおける紫外線検出（２−ピリジルジサルファイドの検出）によりコントロールした。セファデックスＧ−２５を使用するゲル濾過により、複合体を精製した。
【０２２１】
複合体の画分を収集し、組合わせ、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（クーマッシーブルー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質濃度を測定した。配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチドの複合体はＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動により確証された。複合体のアリコートをＡＢＴＳ溶液（０．２２ｇの２’ ２’−アジノ−ビス−９３’−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩、０．０５Ｍのクエン酸、ｐＨ４．０、０．０５％のＨ２Ｏ２）と室温において３０分間インキュベートし、４０５ｎｍにおける吸収を検出することによって、複合体のペルオキシダーゼ活性／ｍｇのタンパク質を測定した。
【０２２２】
実施例７．配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを含んでなる複合体のＣａｃｏ−２単層を横切る輸送
２チャンバーのＣａｃｏ−２モデルを使用して、ペルオキシダーゼと配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチドとを含んでなる複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて腸関門（ＩＢ）を横切る輸送を評価した。上記実施例４に記載されているように、Ｃａｃｏ−２細胞単層を調製した。アイソトープ標識化化合物、配列番号１−ペルオキシダーゼ複合体（２５ｇ／ｍｌ）または対照ペルオキシダーゼ複合体（２５ｇ／ｍｌ）を含有する培地を、培養したＣａｃｏ−２単層の先端側面に添加した。２および４時間インキュベートした後、それぞれチャンバーの先端側面および基部横側面からの培地を収集し、ペルオキシダーゼ活性およびＣａｃｏ−２単層を横切る３Ｈ−マンニトールの輸送を測定するために使用した。Ｃａｃｏ−２を通る化合物の相対輸送率（％）を次のようにして計算した：
【０２２３】
Ｐ＝Ｃｂ／（Ｃａ＋Ｃｂ）×Ｖｂ／Ｖａ
ここでＣｂは基部横チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｃａは先端チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｖｂは基部横チャンバー中の培地の体積であり、そしてＶａは先端チャンバー中の培地の体積である。配列番号１−ペルオキシダーゼ複合体は、両方の対照ペルオキシダーゼ試料よりも、２．５倍高いＣａｃｏ−２単層の透過率を示した（表７）。
【０２２４】
【表７】
2004514410.tif 000020
【０２２５】
実施例８．腸投与後の配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージのｉｎ ｖｉｖｏ生物学的利用能
動物：雌のスプレイグ・ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット、体重１５０〜１７５ｇをチャールス・リバー・カナダ・インコーポレーテッド（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．）（カナダ国ケベック州セント・コンスタント）から受け取とった。動物を光（１２時間の明／暗のサイクル、０６時００において照明）および温度（２２°±１℃）制御下に３匹／カゴで保持し、このカゴは空気フィルターのカバーを有した。動物を使用するすべての操作は滅菌した層状フード下に実行された。動物はプリナ（Ｐｕｒｉｎａ）マウス食事（商標Ｐｒｏ  Ｌａｂ  ＰＭＨ  ４０１８、Ａｇｗａｙ、ニューヨーク州シラクース）、および水に任意にアクセスした。動物の研究は「実験動物のケアーおよび使用についてのガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ）」に従い実施した。
【０２２６】
動物をランダムに２つの下記のグループに分割し（対照ファージおよび配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージ）、“ＫＥＴＡＳＥＴ”（Ｗｙｅｔｈ−Ａｖｅｒｓｔ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．、オンタリオ州）で麻酔した。小腸を外科的計器で露出させ、ファージ試料溶液（２００ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．５中の１×１０１１ｃｆｕ）をおだやかに小腸の中に注入した。小腸の内部にファージを投与した後、５、３０、６０および１２０分に血液試料を収集した。血漿を直ちに調製し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ９１Ｋａｎコンピテント細胞を使用してファージ力価（細胞トランスデューシング単位／ｍｌの血漿）を測定した。表５に表す結果が示すように、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージは対照ファージよりも１０，０００高い効能を有する血流に到達することができた。
【０２２７】
【表８】
2004514410.tif 000021
【０２２８】
実施例９．配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージのラットの血液中の薬物速度論および静脈内注射後の器官中の分布
雌のスプレイグ・ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット、体重１５０〜１７５ｇのラット（３匹／グループ）に、１０１２ｃｆｕ／１００リットルの配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージまたは対照ファージを静脈内注射した。注射後５分、３０分、１時間および２時間に血液試料を収集した。血液試料中のファージ力価を検出した（表５）。２４時間後、動物を犠牲にし、動物の脳、心臓、肝臓、肺および腎臓を収集した。Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６（１９９６）に記載されているように、各動物からの器官の均質化し、そして器官中のファージの力価（細胞のトランスデューシング単位／ｇの組織）を測定した。
【０２２９】
ファージの器官生物分布を表６に表す。配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージの高い蓄積は、分析した動物の脳、腎臓、肺および心臓において検出された。脳において検出された対照ファージのレベルに比較して、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージの８０倍高い蓄積が脳において検出された。リガンドを発現するファージを注射したラットにおけるファージの最大蓄積は脳において測定された（脳：肝臓の比＝１８．１）。対照ファージは器官においていっそう等しく分布し、脳中に蓄積しなかった（脳：肝臓の比＝０．３１）。
【０２３０】
【表９】
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【０２３１】
【表１０】
2004514410.tif 000023
【０２３２】
実施例１０．配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージのＣａｃｏ−２単層を横切る輸送の配列番号１−ペルオキシダーゼ複合体による阻害
実施例４に記載されているように、１０％の胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ変性イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下に３７℃において、Ｃａｃｏ−２細胞を培養し、増殖させた。
先端および基部横のインサートフィルター上の細胞単層を各側面においてＰＢＳでリンスし、前もって加温したＤ−ＭＥＭと３０分間前インキュベートした。先端チャンバー中の培地をおだやかに動かした。新鮮な前もって加温したＤ−ＭＥＭ（１．２ｍｌ）を新しい基部横チャンバー（“ＦＡＬＣＯＮ”３５０４組織培養プレート）に移した。
【０２３３】
インサートを新しいチャンバーに移した。３Ｈ−マンニトールをプローブとして使用して、Ｃａｃｏ−２単層漏出性をモニターした。５０μｇ／ｍｌの配列番号１−ペルオキシダーゼ複合体の存在および非存在下にアイソトープ標識化化合物、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージ（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）または野生型ファージ（対照ファージ１、５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を含有する培地を先端側面に添加した。３時間インキュベートした後、チャンバーの先端側面および基部横側面からの培地を収集し、Ｃａｃｏ−２単層を横切るファージおよび３Ｈ−マンニトールの輸送を測定した。Ｃａｃｏ−２を通る化合物の相対輸送率（％）を次のようにして計算した：
【０２３４】
Ｐ＝Ｃｂ／（Ｃａ＋Ｃｂ）×Ｖｂ／Ｖａ
ここでＣｂは基部横チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｃａは先端チャンバー中の化合物の濃度であり、Ｖｂは基部横チャンバー中の培地の体積であり、そしてＶａは先端チャンバー中の培地の体積である。配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージの輸送はペプチド配列番号１−ペルオキシダーゼ複合体により完全に阻害され、本発明のリガンドがリガンド依存的レセプター仲介メカニズムによりＣａｃｏ−２単層を横切ってファージを輸送することが示唆される。配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるペプチドを発現するファージ、またはペプチド配列番号１−ペルオキシダーゼ複合体の存在下における３Ｈ−マンニトールのパラ細胞の輸送に対する効果は検出されなかった。
【０２３５】
【表１１】
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【０２３６】
実施例１１．アラニン置換突然変異
配列番号４のアミノ酸配列をコードするファージインサートにおける単一点突然変異を、下記の文献に記載されているように生成させた：Ｈｏｅｓｓ  Ｒ．他、Ｇｅｎｅ  １２８：４３−４９（１９９３）。簡単に述べると、特定のアミノ酸コーディングトリップレットをＧＣＴ（アラニントリップレット）に変化させた１連の配列番号４をコードするオリゴヌクレオチドを合成した。実施例３に記載されているように、突然変異したオリゴヌクレオチドをｆＵＳＥ５ファージベクターの中にクローニングした。すべての突然変異体を精製し、ＤＮＡ配列決定により確認した。
実施例４に記載されているように、Ｃａｃｏ−２細胞単層を通る突然変異したファージクローンの輸送を分析した。
【０２３７】
【表１２】
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【０２３８】
実施例１２．配列番号４とエリトロポイエチンとのアソシエーション
ＲＴ／ＰＣＲを使用して、ネズミエリトロポイエチン（ｍＥＰＯ）をｐｃＤＮＡ／Ａｍｐｌ．１発現ベクターの中にクローニングした。フェニルヒドラジンで３日間処理したマウスの腎臓から抽出したｍＲＮＡの逆転写により、ｃＤＮＡコード化ｍＥＰＯを得た（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ＣＢ他、Ｍｅｔｈ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８６））。センス５’−ＡＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧおよびアンチセンス５’ ＡＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＣプライマーを使用して、ＤＮＡの増幅を実施した。増幅したｍＥＰＯ遺伝子をｐｃＤＮＡ／Ａｍｐｌ．１のＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の中に挿入し、配列をＤＮＡ配列決定により確認した。Ｃｏｓ−７細胞をｐＣＭＶ／ＥＰＯプラスミドでトランスフェクトし、そして組換えｍＥＰＯの発現をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤエリトロポイエチンＥＬＩＳＡキットにより評価した。組換えｍＥＰＯの生理学的活性をｉｎ  ｖｉｖｏにおいてヘマトクリットの測定により評価した。
【０２３９】
制限部位およびＳｅｒＧｌｙＡｌａＧｌｙリンカーでフランクしたペプチド配列番号４をコードする合成オリゴヌクレオチドを合成した（５’ＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＧＧＴＡＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡ）。ＤＮＡエクステンション反応および短い相補的オリゴを使用することによって、二本鎖ＤＮＡフラグメントを合成した。さらに、配列番号４をコードするＤＮＡをＸｂａＩにより制限し、ｍＥＰＯのオープンリーディングフレームでｐＣＭＶ／ＥＰＯベクターの中にクローニングした。配列番号４−ＥＰＯ融合タンパク質の構造をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２４０】
実施例１３．ペプチド配列番号１とのパクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）プロドラッグの複合化
マレイミドプロピオン酸を使用してパクリタクセルをエステル化し、パクリタクセル−２’マレイミドプロピオネートを生成した（工程１）。次いでパクリタクセル−２’マレイミドプロピオネートをペプチド（配列番号１）と複合化させ、生成物パクリタクセル（Ｓ−マレイミドプロピオネート）−ペプチド（配列番号１）を生成した。この生成物をＨＰＬＣにより精製した。
０．１ｍｌのジメチルホルムアミド中のパクリタクセル（６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液を０．１ｍｌのジメチルホルムアミド中のマレイミドプロピオン酸（２．５ｍｇ）溶液、およびジシクロヘキシルカーボジイミド（ジメチルホルムアミド中の３ｍｇの溶液）と混合した。この混合物を６０分間攪拌した。
【０２４１】
この混合物を水−アセトニトリル勾配（１％／分、１０％のアセトニトリルから出発する）の逆相ＨＰＬＣにより分画した。生成物パクリタクセル−２’マレイミドプロピオネートを含有する画分がＭＳ（ｍ／ｚ  １００．３）により同定された。
パクリタクセル−２’マレイミドプロピオネート（０．１ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解した１ｍｇ）をペプチド配列番号１（０．０２ｍｌのＤＭＦ中に溶解した２ｍｇ）と混合し、１８時間攪拌した。次いでこの混合物を２ｍｌの水で希釈し、凍結乾燥した。残留する物質を水−アセトニトリル勾配（１％／分、１０％のアセトニトリルから出発する）の逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物パクリタクセル（Ｓ−マレイミドプロピオネート）−ペプチド（配列番号１）を含有する画分がＭＳ（ｍ／ｚ  １２４０二重装入）により同定された。
【０２４２】
実施例１４．デオキシルビシンプロドラッグとペプチド配列番号１との複合化
ロイシル−デオキシルビシンをヘテロ二機能性リンカーマレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで修飾し、生成したマレイミドプロピオニルロイシル−デオキシルビシンを得た（工程１）。次いで、マレイミドプロピオニルロイシル−デオキシルビシンをペプチド配列番号２と反応させることによって、複合体ペプチド（配列番号１）−（Ｓ−マレイミドプロピオニルロイシル−デオキシルビシン）を製造した（工程２）。
【０２４３】
０．１ｍｌのジメチルホルムアミド中のＬ−ロイシル−デオキシルビシン（６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液を、０．１ｍｌのジメチルホルムアミド中のマレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３ｍｇ）溶液、およびジイソプロピルエチルアミン（０．０１５ｍｌのジメチルホルムアミド中の１０％の溶液）と混合した。この混合物を２０分間攪拌した。この混合物を水−アセトニトリル勾配（１％／分、１０％のアセトニトリルから出発する）の逆相ＨＰＬＣにより分画した。生成物マレイミドプロピオニルロイシル−デオキシルビシンを含有する画分がＭＳ（ｍ／ｚ  ８０７．３）により同定された。
【０２４４】
マレイミドプロピオニルロイシル−デオキシルビシン（０．１ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解した１ｍｇ）をペプチド配列番号１（０．０２ｍｌのＤＭＦ中に溶解した２ｍｇ）と混合し、１８時間攪拌した。次いでこの混合物を２ｍｌの水で希釈し、凍結乾燥した。残留する物質を水−アセトニトリル勾配（１％／分、１０％のアセトニトリルから出発する）の逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物（ペプチド（配列番号１）−ロイシル−デオキシルビシン）を含有する画分がＭＳ（ｍ／ｚ  １１４１．５二重装入）により同定された。
【０２４５】
【表１３】
2004514410.tif 000026
【０２４６】
略号
Ａｃ−アセチル
Ｆａｍ−フルオレセイン−５−カルボニル
Ｔａｍｒａ−カルボキシテトラメチルローダミン
Ｙ１は正に帯電したアミノ酸、例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｙ２はＶａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔであり、
Ｙ３は負に帯電したアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｙ４は負に帯電したアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｙ５はＴｈｒまたはＳｅｒであり、
Ｘは任意のアミノ酸である。
【０２４７】
本発明は、本明細書に記載されている特定の態様により範囲を限定されない。事実、本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の変更は、前述の説明および添付図面から当業者にとって明らかであろう。このような変更は添付された特許請求の範囲に入ることを意図する。
さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、またはすべての分子量または分子質量の値は概算であり、説明のために提供されている。
種々の刊行物が引用されており、それらの開示は引用することによって本明細書の一部とされる。