(57)【要約】  本発明の課題は、神経障害に基づく機能不全の改善の有効成分となり得る物質を提供することである。その解決手段としての本発明の神経障害に基づく機能不全の改善剤は、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とする。本発明改善剤を投与することにより、治療対象の運動神経機能不全や、アロデニアや痛覚過敏反応に基づく疼痛に代表される神経因性疼痛等の知覚神経機能不全において臨床的な改善が得られる。
2009005033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とする神経障害に基づく機能不全の改善剤。
【請求項２】
神経障害が脊髄損傷に伴うものであることを特徴とする請求項１記載の改善剤。
【請求項３】
神経障害が筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする請求項１記載の改善剤。
【請求項４】
神経障害に基づく機能不全が運動神経機能不全であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の改善剤。
【請求項５】
神経障害に基づく機能不全が知覚神経機能不全であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の改善剤。
【請求項６】
知覚神経機能不全が神経因性疼痛であることを特徴とする請求項５記載の改善剤。
【請求項７】
神経因性疼痛がアロデニア又は痛覚過敏反応に基づく疼痛であることを特徴とする請求項６記載の改善剤。
【請求項８】
ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とする神経因性疼痛の改善剤。
【請求項９】
ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とするＲｈｏキナーゼ活性化抑制剤。
【請求項１０】
ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を、ヒト成人、一日当たり、０．３ミリユニット（ｍＵ）〜１５０００ ｍＵの用量で、神経障害部位に持続投与するための、該酵素を有効成分として含む神経障害適用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経障害に基づく機能不全の改善剤およびＲｈｏキナーゼ活性化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの中枢神経系（ＣＮＳ）において、脊髄損傷、脳血管障害、脳外傷などによっていったん損傷を受けた神経軸索を再生することは極めて困難であり、一度運動機能や知覚機能の脱落症状が起こってしまうとその回復は難しく、生涯にわたって後遺症に苦しまなければならない。このことは当業者にはもちろんのこと、一般にもよく知られた事実であるが、近年、その理由が次第に明らかにされつつある。神経機能の回復のためには、損傷によって離断した神経軸索が損傷部を超えて伸長し、二次ニューロンにシナプス形成を行うことによる神経回路の再生が必要である。しかしながら、中枢神経系を取り巻く環境には、無秩序なシナプス形成を防ぐための複数の神経軸索の再生抑制因子を介した再生阻害機構が備わっており、この機構が神経回路の再生の邪魔をする。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、神経軸索の再生抑制因子の一つとして知られ、損傷部位における神経軸索の伸長を阻害することが報告されている（例えば非特許文献１）。また、特許文献１では、神経軸索の伸長を阻害するグリア性瘢痕の形成にケラタン硫酸が重要な働きを示すことが、脳におけるケラタン硫酸の生合成に必要なＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素１（ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−１）遺伝子をノックアウトしたマウスを用いた脳損傷モデルによる実験により明らかにされている。そして、同文献では、損傷部位においてケラタン硫酸が発現しないことがグリア性瘢痕の形成の抑制をもたらすという実験結果から、ケラタン硫酸の合成や生理活性を阻害する物質は神経障害の予防や治療に有効であると提唱されている。【０００３】
また、知覚神経機能不全のうち、ＱＯＬ（Quality of Life）を著しく低下させる症状として、神経因性疼痛の発現が挙げられる。神経因性疼痛とは、中枢神経、または末梢神経が障害されることに起因する痛みで、自発痛、侵害性刺激に対する閾値が低下する痛覚過敏反応、通常痛みを引き起こさない非侵害性の機械刺激や触覚刺激を激痛として誤認識するメカニカル・アロデニア等の症状からなる。神経因性疼痛を発現する疾患としては、中枢性として脳障害、多発性硬化症、脊髄損傷などが、末梢性の疾患としては糖尿病、帯状疱疹などが挙げられる。神経因性疼痛の中でもアロデニア（Ａｌｌｏｄｙｎｉａ）は、難治性の燃えるような痛み、刺すような痛みが長期間、持続的に続くことを特徴とし、痛みによるリハビリテーションの効果低減などの原因にもなっている。神経因性疼痛に対する薬物療法は、未だに満足するものはほとんどないといってよく、薬効、安全性の両者を満足する薬物の開発が望まれている。しかしながら、薬剤の開発は思うようには進んでいない。その原因としては、発症機序が複雑に絡み合って、ひとつではないと思われることが挙げられる。アロデニアの発症メカニズムの詳細は今なお不明であるが、近年、痛み物質として知られているＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に関する知見が報告され始めている。ＡＴＰは脊髄ミクログリアを強力に活性化し、異常神経回路形成を助長する種々のメディエーターの産生増強、細胞骨格の再構築に伴うシナプス輸送や神経伝達物質の放出を引き起こし、神経因性疼痛に関与することが分かってきたが、そのＡＴＰは、ＲｈｏファミリーのひとつであるＲａｃをも活性化する（非特許文献２）。
また、神経損傷により脊髄後角の脊髄ミクログリアが活性化し、そこに強度に発現したＰ２Ｘ４受容体の刺激が、神経因性疼痛を引き起こすことが明らかとなり、これら活性化のカスケードの一つの経路として、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の関与が提唱されている（非特許文献２）。
【特許文献１】特開２００６−２９０８４２号公報
【非特許文献１】Niederost,B.P., Zimmermann,D.R., Schwab,M.E. & Bandtlow,C.E. Bovine CNS myelin contains neurite growth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfate proteoglycans. J. Neurosci. 19, 8979-8989 (1999).
【非特許文献２】Honda, S. et al., 2001. Extracellular ATP or ADP Induce Chemotaxis of Cultured Microglia through Gi/o-Coupled P2Y Receptors. J. Neurosci. 21(6), 1975-1982.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上のように、神経障害の予防や治療のための研究開発は日々、精力的に行われているところであるが、残念ながら現状においては必ずしも満足できる成果が得られているわけではない。事実、上記のように特許文献１においてはケラタン硫酸の合成や生理活性を阻害する物質が神経障害の予防や治療に有効であると提唱されているものの、具体的な物質が実際に有効であるとの結果を得るまでには至っていない。
そこで本発明は、神経障害に基づく機能不全の改善の有効成分となり得る物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を行った結果、ケラタン硫酸分解酵素の１つであるケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素が、運動神経機能不全や知覚神経機能不全（アロデニアや痛覚過敏反応に基づく疼痛に代表される神経因性疼痛等）といった神経障害に基づく機能不全を改善すること、この作用はケラタン硫酸によるＲｈｏキナーゼ活性化の抑制を介していることを見出した。
そして、本発明者らは、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素（以下、「エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素」ということもある。）を、神経障害、例えば脊髄損傷の直後から、持続的に個体の損傷部位に投与し、ケラタン硫酸プロテオグリカンのケラタン硫酸鎖を除去することが、プロテオグリカンによる神経細胞やグリア細胞等の非神経細胞の持続的な異常活性化を解除し、これがプロテオグリカンによる神経軸索ガイダンス機能の解除につながり、ひいては神経因性疼痛の治療効果につながるとの発想を得た。該発想に基づき、本発明者らは、ラット脊髄損傷モデル髄腔内の損傷部位に、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素を持続投与することにより、運動神経機能及び知覚神経機能の改善を促し、特に後者の改善により、神経因性疼痛、特にアロデニアを改善しうることを初めて見出した。【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の神経障害に基づく機能不全の改善剤（以下、本発明改善剤ともいう。）は、請求項１記載の通り、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項２記載の改善剤は、請求項１記載の改善剤において、神経障害が脊髄損傷に伴うものであることを特徴とする。
また、請求項３記載の改善剤は、請求項１記載の改善剤において、神経障害が筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする。
また、請求項４記載の改善剤は、請求項１乃至３のいずれかに記載の改善剤において、神経障害に基づく機能不全が運動神経機能不全であることを特徴とする。
また、請求項５記載の改善剤は、請求項１乃至３のいずれかに記載の改善剤において、神経障害に基づく機能不全が知覚神経機能不全であることを特徴とする。
また、請求項６記載の改善剤は、請求項５記載の改善剤において、知覚神経機能不全が神経因性疼痛であることを特徴とする。
また、請求項７記載の改善剤は、請求項６記載の改善剤において、神経因性疼痛がアロデニア又は痛覚過敏反応に基づく疼痛であることを特徴とする。
また、本発明の神経因性疼痛の改善剤は、請求項８記載の通り、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＲｈｏキナーゼ活性化抑制剤（以下、本発明抑制剤ともいう。）は、請求項９記載の通り、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明の神経障害適用剤は、請求項１０記載の通り、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を、ヒト成人、一日当たり、０．３ミリユニット（ｍＵ）〜１５０００ ｍＵの用量で、神経障害部位に持続投与するための、該酵素を有効成分として含む。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素が、脊髄損傷等の神経障害に基づく運動神経や知覚神経の機能不全の改善剤、具体的には例えば、神経因性疼痛の改善剤のための有効成分として提供される。また、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素の特定量を含む、神経障害部位に持続投与するための神経障害適用剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１の実験結果その１：ＢｃケラタナーゼIIの後肢運動神経機能評価（ＢＢＢテスト）における治療効果の用量反応を示すグラフである。
【図２】同、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIの治療効果の用量反応を示すグラフである。
【図３】同、投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合のＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの治療効果の比較を示すグラフである。
【図４】同、投与濃度が０．００００２５ Ｕ／２００ μＬの場合のＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの治療効果の比較を示すグラフである。
【図５】同、投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合におけるＢｃケラタナーゼII、不活性化ＢｃケラタナーゼII、Ｐｓケラタナーゼの治療効果の比較を示すグラフである。
【図６】実施例１の実験結果その２：後肢運動神経機能評価（グリッドテスト）における投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合のＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの治療効果の比較を示すグラフである。
【図７】同、投与濃度が０．００００ ２５Ｕ／２００ μＬの場合のＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの治療効果の比較を示すグラフである。
【図８】実施例１の実験結果その３：後肢運動神経機能評価（フットプリントテスト）における投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合のＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの治療効果の比較を示すグラフである。
【図９】実施例１の実験結果その４：サーマル・アロデニア治療／改善効果の評価（テイルフリックテスト）における投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合のＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの治療／改善効果の比較を示すグラフである。
【図１０】実施例１の実験結果その５：メカニカル・アロデニア治療／改善効果の評価（タッチテスト）における投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合のＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの治療／改善効果の比較を示すグラフである。
【図１１】実施例２の実験その１：Ｋｓ３６ケラタナーゼIIのケラタン硫酸による神経軸索の伸長阻害作用に対する解除効果を示すグラフである。
【図１２】実施例２の実験その２：ケラタン硫酸による神経軸索の伸長阻害作用に対するＹ２７６３２（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、シグマ社）の解除効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】同、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIのＲｈｏキナーゼ活性化抑制作用を示すグラフである。
【図１４】実施例３におけるＡＬＳモデルマウスの脊髄におけるケラタン硫酸の発現を示すウェスタンブロッティングの結果である。
【図１５】同、ケラタン硫酸のミクログリアでの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明改善剤は、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素（エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素）を有効成分とすることを特徴とするものである。ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素は、ケラタナーゼIIとの別名を持つケラタン硫酸分解酵素であり、それ自体は公知の物質である（以降、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素をケラタナーゼIIと略称する）。ケラタナーゼIIは微生物由来の酵素であり、バチルス属細菌Ｋｓ３６株（微生物の受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１０２０４）が産生することが知られている（必要であれば特許第２７２６２７４号公報を参照のこと。以降、Ｋｓ３６株が産生するケラタナーゼIIをＫｓ３６ケラタナーゼIIと略称する）。また、至適反応温度が５０〜６０℃の熱安定性に優れた耐熱性ケラタナーゼIIも知られており、この酵素はバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株（微生物の受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８５）が産生することが知られている（以降、耐熱性ケラタナーゼIIをＢｃケラタナーゼIIと略称する）。ＢｃケラタナーゼIIは、ケラタン硫酸を分解して、主に、硫酸化ケラタン硫酸二糖及びケラタン硫酸四糖を生成することを特徴とする（必要であれば特許第３７３４５０４号、米国特許第5,840,546号、ヨーロッパ特許第0798376 B1等の公報を参照のこと）。また、ＢｃケラタナーゼIIは、例えばバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株からクローニングされた耐熱性ケラタナーゼII遺伝子を、大腸菌等の宿主に組み込んで生産した遺伝子組換え型耐熱性ケラタナーゼIIであってもよい（必要であれば特開２００４−２４１８９号公報やGenBank: ACCESSION No. AY188989 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=32454884を参照のこと。以降、遺伝子組換え型耐熱性ケラタナーゼIIをｒＢＣケラタナーゼIIと略称する）。上記特開２００４−２４１８９号公報に記載されたｒＢＣケラタナーゼIIの全アミノ酸配列を配列番号１として添付する。
Ｋｓ３６ケラタナーゼIIと、ＢｃケラタナーゼIIは、ともにエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素ではあるが、高濃度のケラタンポリ硫酸（硫酸化度の高いケラタン硫酸）に対する反応性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、および薬剤による阻害の影響等が異なることから、本質的には異なった酵素であると言える（必要であれば特許第３７３４５０４号、米国特許第5,840,546号、ヨーロッパ特許第0798376 B1等の公報を参照のこと）。本発明における神経障害に基づく機能不全の改善剤の有効成分となる酵素としては、この２種類の酵素が好適に挙げられるが、ＢｃケラタナーゼIIが好ましく、ｒＢＣケラタナーゼIIがより好ましい。
なお、本発明において使用されるケラタナーゼIIは、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素である限り、上記例示酵素に限定されるものではなく、その由来、酵素学的性質も限定されない。【００１０】
ケラタナーゼIIは、脊髄損傷に伴う神経障害や筋萎縮性側索硬化症などの様々な神経障害に基づく運動神経機能不全や知覚神経機能不全などを改善するが、この作用はケラタン硫酸によるＲｈｏキナーゼ活性化の抑制を介したものである。Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）は、細胞質に存在し、結合したＧＴＰ（グアノシン三リン酸）を加水分解する活性を有する低分子量ＧＴＰａｓｅ（グアノシン三リン酸フォスファターゼ）であり、アクチン骨格系あるいはチューブリンを制御することによって細胞の形や運動などの様々な制御を行う重要なリン酸化酵素である。この酵素は１９９０年代に発見され、Ｒｈｏなどのいくつかの細胞内因子によって活性化される。Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系が活性化されることで、アクチン骨格系が不活化し、結果的に神経軸索の伸長が阻害され、成長円錐の崩壊が引き起こされる。ケラタン硫酸によって誘導される神経軸索の伸長阻害がＲｈｏキナーゼ活性化を伴うこと、ケラタナーゼIIの神経障害に基づく機能不全の改善作用がこのＲｈｏキナーゼ活性化の抑制を介していることは、今回、本発明者らによって初めて見出された知見であり、この知見をもとに、本発明は、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の制御をコンセプトとした新規な神経障害に基づく機能不全の改善剤を提供する。【００１１】
本発明改善剤または本発明抑制剤（以下、これらをまとめて本発明薬剤ともいう。）の有効成分である、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIやＢｃケラタナーゼIIに例示されるケラタナーゼIIは、通常の非経口酵素製剤と同様に常法によって非経口製剤に製剤化され、目的とする疾患に応じた投与経路で哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなど）に非経口的に投与され、当該動物の目的疾患の治療または予防に使用される。【００１２】
非経口製剤としては液体製剤（溶液製剤、懸濁剤、点眼剤、点鼻薬、脳、髄腔内や皮膚への局所注入剤等）、固体製剤（凍結乾燥製剤、粉末製剤、顆粒製剤、マイクロカプセル、リポソーム、リポスフェア等）、半固体製剤（軟膏等）が挙げられる。例えば、本発明薬剤を液体製剤として製造する場合、注射用水、医薬上許容される添加物もしくは担体、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂など）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）、増粘剤（ポリビニルアルコールなど）、安定化・活性保持剤（血清アルブミン、ゼラチン、シュークロース、ポリエチレングリコール、デキストラン類、ラクトース、マルトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸など）、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、溶解補助剤、酸化防止剤、容器への吸着を防止するために有効な物質などを適宜添加した溶液に、医薬的に許容されるグレードのケラタナーゼIIを溶解または分散することによって製造することができる。また、このような液体製剤を、ケラタナーゼIIの活性等、薬理学的機能に影響を及ぼさない乾燥方法（凍結乾燥等）で乾燥し、用時溶解型の固体製剤とすることができる。具体的な例としては、医薬的に許容されるグレードのケラタナーゼIIを生理食塩液、注射用水、等張液、油性液等に溶解もしくは懸濁するなどして液体製剤とすることができる。【００１３】
以上のごとく製剤化された本発明薬剤を、目的疾患、症状の程度、投与対象等に応じた投与方法で投与し、神経障害に基づく機能不全を改善、治癒または予防することができる。例えば、神経障害を受けた部位またはその周辺に局所的に投与する投与方法が挙げられ、好ましい。より具体的には、マイクロチューブを用いて浸透圧ポンプによってクモ膜下腔内（髄腔内）に持続投与することができ、このような持続投与法が本発明の目的を考慮すると好ましい。【００１４】
本発明薬剤の投与量、投与期間は、目的疾患、投与対象の動物種、年齢や体重、症状の程度、健康状態などの条件によって医師等の医療専門家によって適宜設定されるべきもので、特に限定はされない。すなわち、障害部位におけるＲｈｏキナーゼの活性化を抑制し、あるいはグリア性瘢痕におけるケラタン硫酸プロテオグリカンのケラタン硫酸鎖を分解するのに有効な量および期間であればよい。
脊髄損傷のモデルにおいて、ラット（体重：０．３キログラム／脳脊髄液量：０．３ ｍＬ）における本発明改善剤の一日当たりの髄腔内投与量は、ケラタナーゼIIの酵素単位として約１．５マイクロユニット（μＵ）（0.000025 U/200 μL）〜３０ミリユニット（ｍＵ）、好ましくは約０．３ ｍＵ(0.005 U/200 μL)〜１０ ｍＵ、最も好ましくは約３．０ ｍＵ（0.05 U/200 μL）である。ここで、カッコ内のU/200 μLは濃度を表し、各濃度の酵素液剤を１日あたり、12 μL投与する。
これを、ラットの体重を０．３キログラムとし、脳脊髄液量を０．３ ｍＬとして、ヒト成人（体重：６０キログラム／脳脊髄液量：１５０ ｍＬ）に換算すると、体重換算で約２００倍、硬膜内へ直接投与することを考慮して、脳脊髄液量で換算すると約５００倍となる。したがって、ヒト成人（平均的な体重６０キログラム／平均的な脳脊髄液量１５０ ｍＬ）への投与量は、以下の通りとなる。
体重換算の場合、一日当たりの髄腔内投与量として、約０．３ ｍＵ〜６０００ ｍＵ、好ましくは約６０ ｍＵ〜２０００ ｍＵ、最も好ましくは約６００ ｍＵである。
また、脳脊髄液量換算の場合、一日当たりの髄腔内投与量は、約０．７５ ｍＵ〜１５０００ ｍＵ、好ましくは約１５０ ｍＵ〜５０００ ｍＵ、最も好ましくは約１５００ ｍＵである。
したがって、上記の換算法を総合的に考慮すると、一日当たりの髄腔内投与量は、約０．３ ｍＵ〜１５０００ ｍＵ、好ましくは約６０ ｍＵ〜５０００ ｍＵ、最も好ましくは約６００ ｍＵ〜１５００ ｍＵである。
投与期間は、損傷部位におけるケラタン硫酸プロテオグリカンの発現量、有害事象の発生等の可能性を考慮し、症状に応じて医師等の医療専門家が決定すべきことではあるが、その目安としては、持続投与においては受傷後約８週間まで、好ましくは約４週間まで、より好ましくは約２週間までである。投与開始時期は、受傷直後乃至受傷後３日から一週間経過後程度であることが好ましい。
なお、有効成分であるケラタナーゼIIの好ましい比活性は、約２ Ｕ／ｍｇタンパク質以上なので、上記の一日当たりの髄腔内投与量は、酵素タンパク質重量としては、約０．３ ｍＵは約０．１５マイクログラム（μｇ）以下、１５０００ ｍＵは約７５００ μｇ以下、６０ ｍＵは約３０ μｇ以下、５０００ ｍＵは約２５００ μｇ以下、６００ ｍＵは約３００ μｇ以下、１５００ ｍＵは約７５０ μｇ以下に相当する。なお、酵素量１ユニット（１ Ｕ）は、サメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸を基質とし、３７℃で１０分間反応させたときに、１分間に１ μｍｏｌのガラクトースに相当する還元末端を生成する酵素量として定義される（必要であれば特開２００４−２４１８９号公報を参照のこと）。【００１５】
なお、本発明薬剤の単位製剤当たりの酵素量または濃度は上記投与量に応じて設定されるが、製剤は必ずしも投与時の酵素量または濃度とする必要はなく、例えば、投与直前あるいは投与時に、希釈液によって有効かつ安全な濃度に希釈してもよい。したがって、本発明はこのような希釈液と、上記本発明薬剤との組み合わせによるキットも提供する。【００１６】
本発明薬剤は人体等への投与を目的した医薬品であるため、有効成分であるケラタナーゼIIは医薬的に許容されるグレードのものであり、エンドトキシン、核酸、プロテアーゼ等の本酵素産生微生物に由来する不純物が極力除かれたものであることが好ましい。エンドトキシン、核酸、プロテアーゼは通常の分析法で検出限界以下であることが好ましく、例えば、エンドトキシン量は、生化学工業（株）製のトキシカラー（登録商標）システムを用いて測定した場合、５．０ ｐｇ／１００ Ｕ以下であることが望ましい。また、核酸はスレッシュホールド法（ＤＮＡ測定装置：スレッシュホールド（モレキュラーデバイス社製））で測定した場合、検出限界以下であることが望ましい。プロテアーゼは、ＦＩＴＣ−カゼインを基質として測定した場合、全蛋白量に対して０．１％以下であることが好ましい。【００１７】
本発明改善剤は、脊髄および脳を含む中枢神経（ＣＮＳ）系または末梢神経系の急性障害、亜急性障害または慢性障害に基づく機能不全の改善、治癒または予防に使用される。本発明改善剤の対象疾患としては、中枢神経の挫傷、外傷性脳損傷、その他の脳損傷、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、腕神経叢損傷、ａｍｂｌｉｏｐｈｉａ、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病を含む神経損傷、神経変性疾患又は神経機能不全が挙げられるが、これに限定されるものではない。脊髄損傷は、交通事故、墜落、挫傷、銃創、およびその他の傷害によってもたらされたニューロンの挫滅などの疾患および外傷性損傷を含む。本発明改善剤を投与することにより、治療対象（患者）の運動神経機能不全（運動神経の機能不全、障害、麻痺に基づく四肢体幹運動機能障害など）や、アロデニアや痛覚過敏反応に基づく疼痛に代表される神経因性疼痛等の知覚神経機能不全（知覚神経の機能不全、障害、麻痺に基づく神経過敏、異常感覚、手足の痺れ、顔面神経麻痺など）において臨床的な改善が得られる。【００１８】
なお、本発明薬剤を、脊髄損傷等の神経障害における改善効果が知られている他の薬剤と併用して治療を行うことも可能である。
例えば、このような薬剤としてはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解する作用を有する、コンドロイチナーゼを有効成分とする薬剤が挙げられる。
コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸を脱離的に不飽和二糖に分解する脱離酵素である。現在入手可能な酵素を以下に列記する。
・コンドロイチナーゼＡＢＣ（Proteus vulgaris由来／生化学バイオビジネス（株）販売）
・コンドロイチナーゼＡＣ Ｉ（Flavobacterium heparinum由来／生化学バイオビジネス（株）販売））
・コンドロイチナーゼＡＣ ＩＩ（Arthrobacter aurescens由来／生化学バイオビジネス（株）販売））
・コンドロイチナーゼＡＣ ＩＩ（Flavobacterium sp. Hp 102由来）
・コンドロイチナーゼＢ（Flavobacterium heparinum由来／生化学バイオビジネス（株）販売））
・コンドロイチナーゼＣ（Flavobacterium sp. Hp 102由来）
・コンドロイチナーゼＡＣ（組み換え体、Flavobacterium heparinum由来／IBEX Technologies Inc.販売）
・コンドロイチナーゼＢ（組み換え体、Flavobacterium heparinum由来／IBEX Technologies Inc.販売）
コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ  ＡＢＣ）〔ＥＣ  ４．２．２．２０又はＥＣ  ４．２．２．４〕は、コンドロイチン硫酸を含むグリコサミノグリカンのＮ−アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ４−ヘキスロン酸残基を持つ不飽和二糖を主に生成する酵素で、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ（コンドロイチン−４−硫酸を多く含む）、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン−６−硫酸を多く含む）および哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒する酵素であり、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸側鎖中のコンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、及びコンドロイチン硫酸Ｃも分解する(Yamagata, T. et al., J.Biol. Chem., 243: 1523-1535(1968)、Hamai A. et al., J. Biol. Chem. 272:9123-9130(1997))。本酵素は、動物組織からムコ多糖類を除去したり、組織中のムコ多糖を同定したりするための研究用試薬として、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）等の細菌の産生する酵素商品が、コード番号:100330（Chondroitinase ABC(Proteus vulgaris)）及びコード番号:100332（Chondroitinase ABC Protease Free(Proteus vulgaris)）として生化学バイオビジネス（株）から試薬として市販されているほか、より高純度（単一タンパク質で、エンドトキシン、核酸、夾雑タンパク質等を含まない）に精製され、比活性が極めて高い酵素が椎間板ヘルニア治療剤として臨床試験が行われ、生体に対する作用が十分に解明されているため、より好ましい。特に日本特許第３９８０６５７号、米国特許第6,184,023号、米国特許第5,773,277号、米国特許第5,763,205号等に記載の高純度かつ比活性の高いコンドロイチナーゼＡＢＣが最も好ましい。なお、上記コンドロイチナーゼＡＢＣは、下記の別称の酵素と同一酵素である。
・コンドロイチナーゼＡＢＣ  Ｔｙｐｅ１
・Chondroitin ABC endolyase 1
・Chondroitin ABC lyase I
・Chondroitin sulfate endolyase
・Chondroitin ABC eliminase
また、上記コンドロイチナーゼＡＢＣ活性を持つ物質の遺伝子はクローニングされており、そのタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列も同定されている（米国特許第5,578,480号、特表２００７−５２０４４７(ＷＯ２００４／１０３２９９)）。代表的なアミノ酸配列としては、米国特許第5,578,480号に記載されているものが挙げられる。このアミノ酸配列は、１０２１個のアミノ酸残基からなるが、アミノ酸：１−２４はシグナル配列を構成し、成熟タンパク質は９９７個のアミノ酸残基からなる（アミノ酸：２５−１０２１）。また、他の代表的なアミノ酸配列としては、アミノ酸配列データベース（UniProtKB/Swiss-Prot：Entry name CABC_PROVU、Primary accession number P59807、Protein name Chondroitin ABC endolyase 1 [Precursor]）に記載されているものが挙げられる。このアミノ酸配列も、１０２１個のアミノ酸残基からなるが、米国特許第5,578,480号に記載されているアミノ酸配列とは２個のアミノ酸が相違する（694番：Q→E、738番：D→N）。さらに、米国特許出願公開第2006/0233782号のSEQ ID NO: 1に記載されたアミノ酸配列は、成熟タンパク質のものであるため、９９７個のアミノ酸残基からなるが、米国特許第5,578,480号に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸：２５−１０２１の範囲では、４個のアミノ酸が相違する（154番：A→T、295番：I→T、694番：Q→E、738番：D→N）。すなわち、米国特許第5,578,480号に記載されているアミノ酸配列を基準として、少なくとも４個のアミノ酸（例えば、154番、295番、694番、738番）を他のアミノ酸に置換したものであっても、同等のコンドロイチナーゼＡＢＣ活性を持つ酵素と見なすことができる。
さらに、本発明改善剤を製剤化した薬剤を、神経因性疼痛における改善効果が知られている他の薬剤と併用して治療を行うことも可能である。例えば、このような薬剤としては、下記例示のような、ＮＳＡＩＤｓやオピオイド、鎮痛補助薬が挙げられる。オピオイド鎮痛薬としては、モルヒネ、フェンタニル、オキシコドン、リン酸コデイン、ペチジン、ブプレノルフィン、トラマドール、ペンタゾジン、ブトルファノールなどが挙げられる。また、鎮痛補助薬としては、抗うつ剤である三環系（アミトリプチン、ノルトリプチン等）、四環系（テトラミド）、ＳＳＲＩ（パロキセチン、フルボキサチン）、ＳＮＲＩ（ミルナシプラン）、抗痙攣薬としては、カルバマゼピン、ラモトリジン、ゾニサミド、バルブロ酸、クロナゼパム等、抗攣縮薬としてバクロフェン等、抗不整脈薬として、リドカイン、メキシレチン等、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬として、ケタミン、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル等、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液含有製剤としてノイロトロピンが挙げられる。また、最近注目されている、Ｃａチャンネルブロッカー（α２δサブユニットに結合する）であるガバペンチン（抗痙攣剤）とプレガバリンが挙げられる。また、抗炎症作用を有する薬剤、例えばコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、デキサメタゾン、ベタメサゾン等のステロイド剤やＲｈｏキナーゼ阻害剤であるファスジルと併用してもよい。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。【００２０】
実施例１：ケラタナーゼIIの脊髄損傷後の機能不全の改善作用
（実験方法）
動物として、Ｓ．Ｄ．ラット（日本ＳＬＣ社、雌、９週齢）を用い、エーテルとケタミンカクテル麻酔下に、第９胸椎と第１２胸椎を椎弓切除し、ＩＨ−０４００  Ｉｍｐａｃｔｏｒを用い、第９胸椎に圧座による脊髄損傷を作製した。損傷後、顕微鏡下で第１２胸椎の硬膜に小切開を加え、マイクロチューブをクモ膜下に挿入した。マイクロチューブには、予め被験サンプルを充填した浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ）を接続した。チューブならびにポンプは棘間靱帯および筋肉に固定し、筋層ならびに皮膚を閉創した。術後、抗生物質の経口投与を２週間行い、排尿反射が回復するまで、徒手排尿を１日１回施行した。被験サンプルは、損傷直後から、１４日間髄腔内に持続投与した（投与速度：１２ μＬ／２４ ｈｒ，総投与量：１６８ μＬ／１４日間）。被験サンプルは、次の５種類とした。
（1）ＢｃケラタナーゼII（特許第３７３４５０４号公報に記載のバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株菌体から抽出した耐熱性ケラタナーゼII）（０．０００００５ Ｕ／２００ μＬ、０．００００２５ Ｕ／２００ μＬ、０．０５ Ｕ／２００ μＬ）
（2）Ｋｓ３６ケラタナーゼII（特許第２７２６２７４号公報に記載のバチルス属細菌Ｋｓ３６株が産生するケラタナーゼII）（０．００００２５ Ｕ／２００ μＬ、０．０００５ Ｕ／２００ μＬ、０．０５ Ｕ／２００ μＬ）
（3）不活性化ＢｃケラタナーゼII（ＢｃケラタナーゼII（０．０５ Ｕ／２００ μＬ）の酵素活性を100℃（10分間）で不活化した酵素）
（4）Ｐｓケラタナーゼ（ケラタン硫酸分解酵素であっても、ケラタン硫酸の硫酸化されていないガラクトースのβ−ガラクトシド結合を加水分解するPseudomonas sp株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ型酵素：以下、Ｐｓケラタナーゼと称す。必要であれば参考文献：Kiyoshi Nakazawa and Sakaru Suzuki, J.Biol. Chem., 250: (3) 912-917(1975), Purification of Keratan sulfate-endogalactosidase and Its Action on Keratan Sulfate of Different Originを参照のこと）（０．０５ Ｕ／２００ μＬ）
（5）生理食塩液（２００ μＬ：コントロール）【００２１】
実験結果その１：後肢運動神経機能評価（ＢＢＢテスト）
損傷１日後および損傷１週後から１０週後まで１週間に１回、Ｂａｓｓｏらの方法（Basso, D.M., Beattie, M.S. & Bresnahan, J.C., Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp. Neurol., 139, 244-256（1996））に準じ、Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スケールを用いて後肢運動神経機能を評価した。検査はブラインド下で実施し、検査者２人の結果を平均した値で表した。結果を図１〜図５に示す。
図１から明らかなように、ＢｃケラタナーゼIIの０．０５ Ｕ／２００ μＬ投与群、０．００００２５ Ｕ／２００ μＬ投与群において、生理食塩液投与群に比して顕著な後肢運動神経機能の回復が認められた。中でも０．０５ Ｕ／２００ μＬ投与群の効力が優れていた。
図２から明らかなように、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIの０．０５ Ｕ／２００ μＬ投与群、０．０００５ Ｕ／２００ μＬ投与群において、生理食塩液投与群に比して顕著な後肢運動神経機能の回復が認められた。中でも０．０５ Ｕ／２００ μＬ投与群の効力が優れていた。
図３から明らかなように、ＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIの後肢運動神経機能の回復に対する効力は、投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合には同等であった。
図４から明らかなように、投与濃度が０．００００２５ Ｕ／２００ μＬのような低濃度の場合、後肢運動神経機能の回復に対する効力は、熱安定性に優れたＢｃケラタナーゼIIでは認められたが、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIでは認められなかった。この結果から、ＢｃケラタナーゼIIは、その優れた安定性から、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIよりも、より低用量で有効性を示し、より優れた治療薬となることが明らかとなった。
図５から明らかなように、ＢｃケラタナーゼII、不活性化ＢｃケラタナーゼII、Ｐｓケラタナーゼを０．０５ Ｕ／２００ μＬの投与濃度で投与した場合、後肢運動神経機能の回復に対する効力は、ＢｃケラタナーゼIIにおいてのみ認められた。この結果から、後肢運動神経機能の回復治療に対する有効成分となり得るのは、ケラタン硫酸を分解するケラタナーゼと称する酵素の中でもケラタナーゼIIであること、不活性化ＢｃケラタナーゼIIには効力がないことから、ＢｃケラタナーゼIIの効力は、そのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性に起因することが明らかとなった。【００２２】
実験結果その２：後肢運動神経機能評価（グリッドテスト）
損傷１週後から１０週後まで１週間に１回、ラットを２ｃｍ×２ｃｍの網（グリッド）の上に置き、３分間歩行させ、グリッドを下肢でグリップできた回数ならびに全歩数を計測した。全歩数のうち、グリップできた割合を％グリップ値とし、左右それぞれの値を平均して表した。ＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIを０．０５ Ｕ／２００ μＬの投与濃度で投与した場合の結果を図６に、０．００００２５ Ｕ／２００ μＬの投与濃度で投与した場合の結果を図７にそれぞれ示す。
図６から明らかなように、ＢｃケラタナーゼII投与群とＫｓ３６ケラタナーゼII投与群の％グリップ値は、投与濃度が０．０５ Ｕ／２００ μＬの場合には同等であり、いずれも生理食塩液投与群の％グリップ値に比して高値を示した。
図７から明らかなように、投与濃度が０．００００２５ Ｕ／２００ μＬのような低濃度の場合、後肢運動神経機能の回復に対する効力は、熱安定性に優れたＢｃケラタナーゼIIでは認められたが、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIでは認められなかった。この結果から、ＢｃケラタナーゼIIは、その優れた安定性から、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIよりも、より低用量で有効性を示し、より優れた治療薬となることが明らかとなった。【００２３】
実験結果その３：後肢運動神経機能評価（フットプリントテスト）
損傷１日後および損傷１週後から１０週後まで１週間に１回、ラットの後肢にインクを塗布し、５０ｃｍの紙の上を歩行させることで、後肢の足跡を得た。紙の上に記された後肢の足跡の歩幅を左右それぞれ計測し、平均して表した（単位；ｍｍ）。ＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIを０．０５ Ｕ／２００ μＬの投与濃度で投与した場合の結果を図８に示す。
図８から明らかなように、ＢｃケラタナーゼII投与群とＫｓ３６ケラタナーゼII投与群の歩幅は、生理食塩液投与群の歩幅に比して広く、これらの投与群において後肢運動神経機能の回復が認められた。【００２４】
実験結果その４：サーマル・アロデニア治療／改善効果の評価（知覚神経の熱刺激に対する作用：テイルフリックテスト）
損傷前および損傷１週後から１０週後まで１週間に１回、ラットの尻尾を５５℃の湯浴に浸し、尻尾を揺らすまでの時間（反応時間）を計測した（単位；秒）。測定は１５分間隔で３回実施し、平均値で表した。ＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIを０．０５ Ｕ／２００ μＬの投与濃度で投与した場合の結果を図９に示す。
図９から明らかなように、生理食塩液投与群では、損傷前に比して、損傷後、経日的に反応時間が短縮していき、熱刺激に対して過敏反応を示した。一方、ＢｃケラタナーゼII投与群とＫｓ３６ケラタナーゼII投与群では、損傷早期には生理食塩液投与群と同様の傾向を示したが、損傷５週後以降からは、熱刺激に対する過敏反応は改善し、損傷８週後には、損傷前とほぼ同程度の安定した反応時間となり、これらの投与群において知覚神経機能の正常値に至る顕著な回復（サーマル・アロデニア治療／改善効果）が認められた。【００２５】
実験結果その５：メカニカル・アロデニア治療／改善効果の評価（知覚神経の圧刺激に対する作用：タッチテスト）
損傷前および損傷１週後から１０週後まで１週間に１回、ラットを小箱に入れ、１５分間静置させた。ラットが落ち着いたところで、下からｖｏｎ  ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔ（刺激強度の異なる数種のフィラメント）で後肢の足底を刺激した。強い刺激、弱い刺激を繰り返し、正確な刺激閾値を決定する方法であるＵｐ−ｄｏｗｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Chaplan, S.R., Bach, F.W., Pogrel, J.W., Chung, J.M., Yaksh, T.L., Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw., J. Neurosci. Methods 53, 55-63（1994））を用い、ラットが痛みを感じて後肢を動かすｆｉｌａｍｅｎｔの圧刺激を左右それぞれ計測し、平均値で表した（単位；グラム）。ＢｃケラタナーゼIIとＫｓ３６ケラタナーゼIIを０．０５ Ｕ／２００ μＬの投与濃度で投与した場合の結果を図１０に示す。
図１０から明らかなように、生理食塩液投与群では、損傷前に比して、損傷１週後から２週後にｆｉｌａｍｅｎｔの圧刺激が高値を示し、後肢への刺激に対して鈍感反応を示した。しかし、損傷４週後以降には、損傷前に比してｆｉｌａｍｅｎｔの圧刺激が低値を示し、さらに、損傷６週後では後肢への僅かな刺激でも反応してしまう、知覚過敏症状を示した。一方、ＢｃケラタナーゼII投与群とＫｓ３６ケラタナーゼII投与群では、損傷６週後までは生理食塩液投与群と同様の傾向を示したが、損傷７週後以降は徐々に知覚過敏反応は改善した。損傷１０週後には、損傷前と同程度のｆｉｌａｍｅｎｔの圧刺激となり、これらの投与群において知覚神経機能の正常値に至る顕著な回復（メカニカル・アロデニア治療／改善効果）が認められた。【００２６】
実施例２：ケラタナーゼIIの神経軸索伸長作用及びＲｈｏキナーゼ活性化抑制作用
実験その１：神経軸索伸長阻害の解除
（実験方法）
生後１日目（Ｐ１）のマウス脳より、プライマリー皮質神経組織を採取後、皮質を小片に細切し、カルシウムおよびマグネシウム・フリー・ハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ）中に浮遊させ、０．２５％トリプシン、０．１％デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で３７℃にて１５分間処理した。単離した神経細胞は、２％の神経細胞培養用添加物Ｂ−２７添加剤（B27 Supplement for Neuronal Cells）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Basal Medium for Neuronal Cells；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、被験サンプルを塗布した８ウェルチャンバーに播種した後、一晩インキュベートした。神経細胞培養開始から２４時間後にチャンバースライドを４％パラホルムアルデヒドにて固定処理し、神経細胞をＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  IIIβ  ｔｕｂｕｌｉｎ（ＴＵＪ１）抗体（ＣＯＶＡＮＣＥ社）を用いた免疫組織化学的手法によって同定した。１回の実験あたり８０個から９０個の神経細胞の軸索長を計測し、平均値を算出しグラフで示した。被験サンプルは、次の３種類とした。
（1）２５ μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジン（シグマ社、以下同じ）を塗布したもの
（2）２５ μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンを塗布してからさらにExtracellular proteoglycan mixture solution（ＰＧ）（０．５ μｇ／ｍＬ：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、Neurocan, Phosphacan, Versican, Aggrecanの混合物、以下同じ）を塗付したもの
（3）２５μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンを塗布してからさらにＰＧ（０．５μｇ／ｍＬ）とＫｓ３６ケラタナーゼII（０．０１ Ｕ／ｍＬ：生化学工業（株））を塗付したもの【００２７】
（実験結果）
結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、ケラタン硫酸を含むＰＧ存在下では、神経軸索の伸長が約７０％阻害されたが、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIの共存下では、ＰＧによって誘導された神経軸索の伸長阻害作用が、ほぼ１００％解除された。以上の結果から、ケラタナーゼIIには、神経軸索の伸長阻害作用に対する解除効果があることが明らかとなった。【００２８】
実験その２：Ｒｈｏキナーゼ活性化の抑制
（実験方法）
次に、ケラタナーゼIIの上記実験その１の作用メカニズムを調べるために、Ｒｈｏキナーゼの関与を検討した。被験サンプルを塗布した８ウェルチャンバーを作製し、実験その１の方法と同様にして神経細胞を播種した。神経細胞培養開始から２４時間後、１５μＭのＹ２７６３２（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、シグマ社）を添加し、さらに２４時間培養した。その後、チャンバーを４％パラホルムアルデヒドにて固定処理し、神経細胞をＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  IIIβ  ｔｕｂｕｌｉｎ（ＴＵＪ１）抗体（ＣＯＶＡＮＣＥ社）を用いた免疫組織化学的手法によって同定した。１回の実験あたり８０個から９０個の神経細胞の軸索長を計測し、平均値を算出しグラフで示した。被験サンプルは、次の４種類とした。
（1）２５ μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジン（シグマ社、以下同じ）を塗布してからさらに１０ μｇ／ｍＬラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、以下同じ）を塗布したもの
（2）２５ μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンを塗布してからさらに１０ μｇ／ｍＬのラミニンと２０ μｇ／ｍＬのケラタン硫酸（生化学工業（株）、以下同じ）を塗布したもの
（3）２５ μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンを塗布してからさらに１０ μｇ／ｍＬのラミニンと４０ μｇ／ｍＬのケラタン硫酸を塗布したもの
（4）２５ μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンを塗布してからさらに１０ μｇ／ｍＬのラミニンと２０ μｇ／ｍＬのケラタン硫酸とＫｓ３６ケラタナーゼII（０．０１ Ｕ／ｍＬ、生化学工業（株））を塗布したもの【００２９】
（実験結果）
図１２に、被験サンプル（２）についてＹ２７６３２を添加しなかった場合（ａ）と添加した場合（ｂ）の神経軸索の伸長程度の蛍光顕微鏡写真を示す。また、図１３に、それぞれの被験サンプルについてＹ２７６３２を添加しなかった場合と添加した場合の神経細胞の軸索長の計測結果を示す。図１２と図１３から明らかなように、ケラタン硫酸によって誘導された神経軸索の伸長阻害作用は、Ｙ２７６３２の添加によって解除された。この結果から、ケラタン硫酸は、Ｒｈｏキナーゼ活性化を介して神経軸索の伸長阻害を誘導していることがわかった。また、ケラタン硫酸によるＲｈｏキナーゼ活性化を介した神経軸索の伸長阻害作用が、Ｙ２７６３２を添加しなくても、Ｋｓ３６ケラタナーゼIIの共存によって解除されたことから、ケラタナーゼIIは、Ｒｈｏキナーゼ活性化を抑制することでケラタン硫酸による神経軸索の伸長阻害作用の解除効果を発揮していることが明らかとなった。【００３０】
実施例３：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）モデル脊髄でのケラタン硫酸の発現
ＡＬＳモデルマウスであるＳＯＤ１−Ｇ９３ＡマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社より購入した。ＡＬＳモデルマウス２匹より脊髄を摘出し、蛋白質を抽出後、ウェスタンブロッティングを実施した。ケラタン硫酸量は、抗ケラタン硫酸抗体５Ｄ４（生化学工業（株））にて検出した。その結果、ＡＬＳモデルマウスでは、野生型マウス（ＷＴ）に比してケラタン硫酸の発現増強が検出された（図１４）。
次に、ＡＬＳモデルマウスの脊髄でのケラタン硫酸発現細胞を免疫組織化学的手法により調べた。ＡＬＳモデルマウスの脊髄を摘出し、組織切片を作製後、抗ケラタン硫酸抗体５Ｄ４とミクログリア細胞の特異マーカーを認識するＩｂａ１で２重染色を行ったところ、ケラタン硫酸のミクログリアでの発現が確認された（図１５）。
ＡＬＳは、グリオーシスが起こることで知られているが、以上の結果から、ケラタン硫酸は、グリオーシスの主体であるアストロサイトではなく、しかし、病気の成り立ちに深く関わっているといわれているミクログリアに特異的に発現することがわかった。この現象は、脊髄損傷や脳刺傷の際に、ケラタン硫酸が、ミクログリアのみならず、オリゴデンドロサイトにも発現することを考えると、ＡＬＳに特異的な発現様式であるといえる。【００３１】
製剤例１：
ｒＢｃケラタナーゼII（遺伝子組換え型耐熱性ケラタナーゼII）を生理食塩液に溶解して濃度が０．００００２５ Ｕ／μＬ〜０．０５ Ｕ／２００μＬの溶液製剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を、脊髄損傷等の神経障害に基づく運動神経や知覚神経の機能不全の改善剤、具体的には例えば、神経因性疼痛の改善剤のための有効成分として提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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