(57)【要約】  緑膿菌感染を実質的に予防あるいは治療する能力を有し、緑膿菌感染患者由来の臨床分離株の多様性に対応できるワクチン組成物として使用可能なタンパク質抗原またはペプチド抗原、また、当該抗原に対する抗体を提供することを課題とする。本発明は、緑膿菌に関連する疾患の診断、予防、または治療に用いられるタンパク質抗原またはペプチド抗原およびこれらに対する抗体を提供する。本発明によれば、緑膿菌に関連する疾患の診断、予防、または治療に用いられる、緑膿菌の外膜タンパク質PA4710由来のタンパク質またはペプチドおよびこれらに対する抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号：３で表されるアミノ酸配列における、１８１位から１９８位、２０４位から２５７位、２５９位から３１１位、３１３位から３１９位、３２１位から４３６位、４４０位から４９１位、４９３位から６００位、６０２位から７６４位からなる群より選択されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつ、緑膿菌の表面から露出しているペプチド領域をコードするペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個の保存的置換を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
配列番号：５から１５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個の保存的置換を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項６】
請求項２に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
請求項３に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項８】
請求項４に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項９】
請求項５に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１０】
緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質またはその一部に対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１１】
緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質の一部が、緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質の細胞表面ループ含有領域である、請求項１０に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１２】
請求項１に記載のタンパク質に対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１３】
請求項２に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１４】
請求項３に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１５】
請求項４に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１６】
請求項５に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１７】
請求項６に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【請求項１８】
配列番号：５から１５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、配列番号：５から１５のアミノ酸配列におけるそれ以外のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない抗体またはその機能的断片。
【請求項１９】
緑膿菌表面に結合する請求項１０に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２０】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２１】
緑膿菌が感染している患者において抗菌活性を有する請求項１０に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２２】
患者が、好中球が減少している状態にある患者である、請求項２１に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２３】
緑膿菌が、多剤耐性緑膿菌である、請求項２１に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２４】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２５】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４のいずれかの受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体またはその機能的断片。
【請求項２６】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４のいずれかの受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の抗原と同じ抗原と反応するモノクローナル抗体またはその機能的断片。
【請求項２７】
請求項２０に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２８】
請求項２４に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２９】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマ。
【請求項３０】
緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質に対する抗体を産生することができるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載のタンパク質または請求項２〜９のいずれか一項に記載のペプチドを含んでなる、抗原組成物。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の抗原組成物と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／またはアジュバントとを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられるワクチン組成物。
【請求項３３】
緑膿菌に関連する疾患が、緑膿菌感染に起因する全身感染疾患である、請求項３２に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
緑膿菌感染が、多剤耐性緑膿菌感染である、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
請求項１０〜１９、２１〜２３、２５、２６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、および／または希釈剤とを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物。
【請求項３６】
緑膿菌に関連する疾患が、緑膿菌感染に起因する全身感染疾患である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
緑膿菌感染が、多剤耐性緑膿菌感染である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１０〜１９、２５、２６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含んでなる、緑膿菌感染症診断剤。
【請求項３９】
請求項１０〜１９、２５、２６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含んでなる、緑膿菌の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は緑膿菌外膜タンパク質PA4710由来のタンパク質抗原またはペプチド抗原、および該抗原に対する抗体に関する。本発明はまた、該抗原を含んでなるワクチン組成物に関する。本発明はさらに、該抗体を含んでなる医薬組成物、緑膿菌感染症診断剤、緑膿菌感染症治療剤、緑膿菌の検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌（Pseudomonas  aeruginosa）は、土壌、水中など自然環境中に広く一般的に分布しているグラム陰性桿菌であるが、治療抵抗性の重篤な致死性の感染症を引き起こす。その主な標的は、熱傷、臓器移植または癌患者を含む、一般にcompromised  hostと呼ばれる生体防御機能が衰弱した易感染性の患者であり、緑膿菌は院内感染の主要な原因菌である。さらに本菌による肺感染症は嚢胞性繊維症患者において致死性である。これらの患者に対して、主に抗緑膿菌活性を有する抗菌剤が投与されるが、緑膿菌の薬剤耐性により十分に治療効果が得られない症例が多い。また、緑膿菌に対するワクチンや抗体についても古くから検討されているが、直接、不活化した菌を用いる方法では、緑膿菌の血清型別に種々のワクチンや抗体を調製しなければならない等の欠点があった。【０００３】
このような状況下、緑膿菌間で共通なアミノ酸配列を有する緑膿菌由来のタンパク質を用いた能動免疫または受動免疫による緑膿菌感染症の予防あるいは治療が期待されている。緑膿菌由来のタンパク質をワクチンに応用する例としては、外膜タンパク質OprFおよびOprIの一部分を融合させた組換えタンパク質（特開平８−２４５６９９号公報：文献１）、typeIV  pilinタンパク質（ＷＯ２００４／０９９２５０号公報：文献２）等が知られている。【０００４】
また、緑膿菌由来のタンパク質を標的とする抗体医薬に関しては抗typeIV  pilin抗体（文献２）、抗PA1706（またはPcrV）抗体（ＵＳ６３０９６５１号公報：文献３、ＵＳ６８２７９３５号公報：文献４）、抗PA5158抗体（ＷＯ２００７／０４９７７０号公報：文献５）等が報告されている。【０００５】
しかし、多様な血清型を示す緑膿菌の臨床分離株が共通に保有する菌体由来のタンパク質は、「緑膿菌共通抗原」として緑膿菌感染症の予防、診断あるいは治療に応用可能であるため、常に求められている。【０００６】
ところで、PA4710（またはphuR）遺伝子（Genebank  accession  No.AF055999）にコードされるPA4710（別名PhuR）タンパク質は、TonB依存性受容体ファミリーに属する緑膿菌のヘム取り込み系を構成する外膜ヘミン受容体タンパク質である（Microbiology,  2000,  146,  185-198：文献６、Environmental  Microbiology,  2003,  5,  1350-1369：文献７）。TonB依存性受容体は、22本の外膜貫通βストランドから構成される外膜βバレルとプラグ・ドメインから成る。プラグ・ドメインはペリプラズム側からβバレル内に入り、栓をする形になる。リガンドが結合するとTonB依存性受容体はコンフォメーションの変化を起こし、リガンドをペリプラズムへ取り込む。TonB依存性受容体によるリガンドの取込みにはエネルギーを要する。このエネルギーは、内膜に存在する3つのタンパク質TonB-ExbB-ExbDから成るエネルギー変換複合体より、TonBタンパク質とTonB依存性受容体のアミノ末端に延びたTonBボックスとの相互作用を介して供給される。PA4710タンパク質の部分配列がワクチンの成分として、またこれから産生される抗体組成物を感染症治療薬あるいは診断薬として利用できるとの開示は、唯一D-Squared  Biotechnologies,  Inc.が、実施例を伴わず、幅広い菌種間の鉄取り込み系タンパク質の相同性のみから記載しているのみである（ＷＯ２００２／０８３８４３号公報：文献８、ＷＯ２００３／００６６７２号公報：文献９）。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は緑膿菌感染を実質的に予防あるいは治療する能力を有し、緑膿菌感染患者由来の臨床分離株の多様性に対応できるワクチン組成物として使用可能なタンパク質抗原またはペプチド抗原、また、当該抗原に対する抗体を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため、緑膿菌の外膜タンパク質から新規で有用な「緑膿菌共通抗原」を探索することを試み、種々検討の結果、緑膿菌の外膜にあるPA4710（別名PhuR）タンパク質をコードする遺伝子が、ヒト血清の存在いかんに関わらず、定常的に発現していることをＧｅｎｅＣｈｉｐ解析により見出した（実施例１）。また、67株の緑膿菌臨床分離株について遺伝子解析を実施することによって、PA4710タンパク質におけるアミノ酸配列が保存されている領域を同定すると供に、このアミノ酸配列が保存されている領域の中に、PA4710タンパク質の11箇所にわたる細胞外領域を特定することに成功した（実施例２、９）。
【０００９】
さらに、本発明者らは、PA4710組換えタンパク質またはこのアミノ酸配列が保存されている領域内にある細胞外領域のペプチドを免疫して得られた抗血清または抗体が、PA4710タンパク質に結合し、緑膿菌の菌体表面にも結合することを見出した（実施例７、８）。また、当該抗体が緑膿菌感染モデルマウスにおいて高い感染防御効果を示すことを確認した（実施例１０〜１２）。
【００１０】
すなわち、本発明者らは、PA4710タンパク質の全長域にわたって詳細な解析を実施することにより、PA4710タンパク質の免疫優性領域を絞り込むことに成功すると供に、その領域に対する抗体が緑膿菌感染モデルマウスにおいて高い感染防御効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、より詳しくは、以下の発明に関するものである。
【００１２】
＜１＞  以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【００１３】
＜２＞  配列番号：３で表されるアミノ酸配列における、１８１位から１９８位、２０４位から２５７位、２５９位から３１１位、３１３位から３１９位、３２１位から４３６位、４４０位から４９１位、４９３位から６００位、６０２位から７６４位からなる群より選択されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつ、緑膿菌の表面から露出しているペプチド領域をコードするペプチド。
【００１４】
＜３＞  ＜２＞に記載のペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個の保存的置換を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１５】
＜４＞  配列番号：５から１５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１６】
＜５＞  ＜４＞に記載のペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個の保存的置換を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１７】
＜６＞  ＜２＞に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１８】
＜７＞  ＜３＞に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１９】
＜８＞  ＜４＞に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【００２０】
＜９＞  ＜５＞に記載のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
【００２１】
＜１０＞  緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質またはその一部に対する抗体またはその機能的断片。
【００２２】
＜１１＞  緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質の一部が、緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質の細胞表面ループ含有領域である、＜１０＞に記載の抗体またはその機能的断片。
【００２３】
＜１２＞  ＜１＞に記載のタンパク質に対する抗体またはその機能的断片。
【００２４】
＜１３＞  ＜２＞に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【００２５】
＜１４＞  ＜３＞に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【００２６】
＜１５＞  ＜４＞に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【００２７】
＜１６＞  ＜５＞に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【００２８】
＜１７＞  ＜６＞に記載のペプチドに対する抗体またはその機能的断片。
【００２９】
＜１８＞  配列番号：５から１５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、配列番号：５から１５のアミノ酸配列におけるそれ以外のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない抗体またはその機能的断片。
【００３０】
＜１９＞  緑膿菌表面に結合する＜１０＞に記載の抗体またはその機能的断片。
【００３１】
＜２０＞  抗体が、モノクローナル抗体である、＜１０＞〜＜１９＞のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
【００３２】
＜２１＞  緑膿菌が感染している患者において抗菌活性を有する＜１０＞に記載の抗体またはその機能的断片。
【００３３】
＜２２＞  患者が、好中球が減少している状態にある患者である、＜２１＞に記載の抗体またはその機能的断片。
【００３４】
＜２３＞  緑膿菌が、多剤耐性緑膿菌である、＜２１＞に記載の抗体またはその機能的断片。
【００３５】
＜２４＞  抗体が、モノクローナル抗体である、＜２１＞〜＜２３＞のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片。
【００３６】
＜２５＞  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４のいずれかの受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体またはその機能的断片。
【００３７】
＜２６＞  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４のいずれかの受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の抗原と同じ抗原と反応するモノクローナル抗体またはその機能的断片。
【００３８】
＜２７＞  ＜２０＞に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【００３９】
＜２８＞  ＜２４＞に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【００４０】
＜２９＞  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマ。
【００４１】
＜３０＞  緑膿菌由来のＰＡ４７１０タンパク質に対する抗体を産生することができるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物。
【００４２】
＜３１＞  ＜１＞に記載のタンパク質または＜２＞〜＜９＞のいずれか一項に記載のペプチドを含んでなる、抗原組成物。
【００４３】
＜３２＞  ＜３０＞または＜３１＞に記載の抗原組成物と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／またはアジュバントとを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられるワクチン組成物。
【００４４】
＜３３＞  緑膿菌に関連する疾患が、緑膿菌感染に起因する全身感染疾患である、＜３２＞に記載のワクチン組成物。
＜３４＞  緑膿菌感染が、多剤耐性緑膿菌感染である、＜３３＞に記載のワクチン組成物。
【００４５】
＜３５＞  ＜１０＞〜＜１９＞、＜２１＞〜＜２３＞、＜２５＞、＜２６＞のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、および／または希釈剤とを含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物。
【００４６】
＜３６＞  緑膿菌に関連する疾患が、緑膿菌感染に起因する全身感染疾患である、＜３５＞に記載の医薬組成物。
【００４７】
＜３７＞  緑膿菌感染が、多剤耐性緑膿菌感染である、＜３６＞に記載の医薬組成物。
【００４８】
＜３８＞  ＜１０＞〜＜１９＞、＜２５＞、＜２６＞のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含んでなる、緑膿菌感染症診断剤。
【００４９】
＜３９＞  ＜１０＞〜＜１９＞、＜２５＞、＜２６＞のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含んでなる、緑膿菌の検出キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
［PA4710タンパク質］
PA4710タンパク質は緑膿菌由来の外膜PA4710タンパク質である。当該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：３に、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号：１に記載される。【００５１】
ここで、大腸菌FhuAタンパク質の構造解析情報（Cell,  1998,  95,  771-778、Science,  1998,  282,  2215-2220）、大腸菌FepAタンパク質の構造解析情報（Nat.  Struct.  Biol.,  1999,  6,  56-63）、大腸菌FecAタンパク質の構造解析情報（Science,  2002,  295,  1715-1719、J.  Mol.  Biol.,  2003,  332,  353-368）、緑膿菌FpvAタンパク質の構造解析情報（J.  Mol.  Biol.,  2005,  347,  121-134）およびPA4710タンパク質の２次構造予測情報から得られる情報より、配列番号：１で表される塩基配列のうち、アミノ酸コード領域2295塩基中の541番目から2295番目の塩基配列（配列番号：２）は、PA4710タンパク質の外膜βバレル蛋白質部分をコードすると推測された。この領域は外膜を貫通する22本の逆平行βストランドから成り、各ストランドをつなぐ21個のループのうち、11個のループが細胞表面に表出すると推測された。以下、この領域を「細胞表面ループ含有領域」と称する。【００５２】
PA4710タンパク質の細胞表面ループ含有領域は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるタンパク質である：
（ｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｉｖ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。【００５３】
本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。【００５４】
PA4710タンパク質の改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１または複数個（好ましくは、１ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。【００５５】
本明細書において、「保存的置換」とは、１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。【００５６】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、０．５×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、６０℃、１５分間の洗浄条件、好ましくは０．５×ＳＳＣ濃度、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件、を意味する。【００５７】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。【００５８】
本明細書において、塩基配列またはアミノ酸配列についての「同一性」とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基またはアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。【００５９】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。【００６０】
本発明において、配列番号：４で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：２で表されるＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。【００６１】
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号：２で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。【００６２】
本明細書において、配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するかどうかは配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより決定することができ、例えば、そのタンパク質を遺伝子組み換え技術により発現させ、PA4710タンパク質に対する抗体を作製できるかどうかを評価することにより決定することができる。【００６３】
本発明のタンパク質は、緑膿菌の細胞表面に存在しているため、当該タンパク質は、緑膿菌に対する抗体を作製するための抗原（タンパク質抗原）として用いることができる。【００６４】
本発明者らは、多数の臨床分離株の分析により、PA4710タンパク質（配列番号：３）のうち、アミノ酸配列が保存されている領域を特定することに成功した。特定した領域（５アミノ酸以上のもの）は、以下の通りである：
配列番号：３で表されるアミノ酸配列における、１８１位から１９８位、２０４位から２５７位、２５９位から３１１位、３１３位から３１９位、３２１位から４３６位、４４０位から４９１位、４９３位から６００位、６０２位から７６４位。【００６５】
本発明のペプチドは、これらアミノ酸配列が保存されている領域に含まれるペプチドであって、かつ、緑膿菌の表面から露出しているペプチド領域（以下、「細胞外領域」と称する）のペプチドであることが、緑膿菌感染に対する医薬や診断薬として用いられる抗体を作成するために好ましい。このようなペプチドは、共通抗原となる。細胞外領域は、PA4710タンパク質の構造的特徴の分析及び抗体の緑膿菌表面への結合実験による検証等（実施例２、９参照）によって、特定することができる。本発明者らにより、細胞外領域として、１１カ所のペプチド領域（配列番号：５から１５）が特定された。配列番号：５から１５は、本発明のペプチドの好ましい態様である。【００６６】
本発明の配列番号：５から１５のペプチドのうち、配列番号：１１、１２、１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、それらを標的とした抗体に、緑膿菌感染に対する抗菌活性が認められた（実施例１１、１２）。従って、配列番号：１１、１２、１４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、緑膿菌感染に対する医薬として用いられる抗体を調製するための抗原として、特に好適なペプチドである。【００６７】
抗体を調製する目的において用いられる本発明のペプチドは、上記細胞外領域のペプチド全体である必要はない。抗体の調製が可能である限り、アミノ酸の鎖長に制限はないが、好ましくは、７アミノ酸以上（例えば、８アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１２アミノ酸以上）である。【００６８】
なお、本発明のペプチドは、共通抗原として用いる目的の場合には、上記アミノ酸配列が保存されている領域に含まれるペプチドであることが好ましいが、それ以外の目的の場合（例えば、緑膿菌の特定の株を標的とする場合等）においては、変異が含まれている領域を標的とすることも考えられる。このように本発明のペプチドには、１若しくは数個のアミノ酸に変異が存在するものも含まれる。この変異は、保存的置換であり得る。【００６９】
本発明のペプチドは、電荷による凝集等を防ぐために、N末端やC末端にブロック基を付加することが可能である。N末端には、アセチル化（acetylation）、C末端にはアミド化（amidation）がよく用いられるがこれらに限定されない。本発明のペプチドは、システイン残基を付加し、スペーサーとの結合を強化する修飾などを用いることができる。【００７０】
スペーサーとしては、DMS  (Dimethyl  Suberimidate)、DMA  (Dimethyl  adipimidate)、Sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate)、Sulfo-MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide  ester)などを用いることが一般的であるが、これに限るものでなくスペーサーとして機能する化合物であれば足りる。【００７１】
本発明のペプチドは、担体として、牛血清アルブミン（BSA）、卵白アルブミン（OVA）、ヒト血清アルブミン（HSA）あるいはラパスガイ由来のヘモシアニン（KLH  Keyhole  limpet  hemocyanin）などのキャリアータンパク質を用いることが可能であるがこれらに限定されない。当該ペプチドを別のタンパク質の末端または内部に組み込んだ融合タンパク質を作製し、抗体を作製するための抗原として用いることが出来る。【００７２】
［抗原組成物］
本発明のタンパク質または本発明のペプチドは、タンパク質抗原またはペプチド抗原として用いることができる。従って、本発明によれば、緑膿菌由来の外膜PA4710タンパク質に対する抗体を産生することができる当該タンパク質抗原または当該ペプチド抗原を含んでなる抗原組成物が提供される。【００７３】
ここで、タンパク質抗原またはペプチド抗原は、好ましくは、本発明のタンパク質または本発明のペプチドを当業者に周知の方法に従って精製して用いることができる。【００７４】
本明細書において、「抗原組成物」とは、タンパク質抗原またはペプチド抗原を唯一の構成要素とする組成物でもよく、また他の成分を含んでなる組成物であってもよい。【００７５】
本発明によれば、緑膿菌由来のPA4710タンパク質に対する抗体を産生することができるタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物が提供される。【００７６】
［抗体］
本発明の抗体は、緑膿菌の外膜PA4710タンパク質またはその一部を認識し、かつ、緑膿菌に結合することができる。【００７７】
本発明によれば、緑膿菌由来のPA4710タンパク質の一部が、緑膿菌由来のPA4710タンパク質の細胞表面ループ含有領域である、本発明の抗体またはその機能的断片が提供される。【００７８】
ここで、PA4710タンパク質の細胞表面ループ含有領域は、以下の(i)、(ii)、(iii)、および（iv）から選択されるタンパク質である：
（i）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ii）配列番号：４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（iii）配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（iv）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。【００７９】
本発明によれば、緑膿菌由来のPA4710タンパク質の一部が、(i)アミノ酸配列が保存されている領域（配列番号：３で表されるアミノ酸配列における、１８１位から１９８位、２０４位から２５７位、２５９位から３１１位、３１３位から３１９位、３２１位から４３６位、４４０位から４９１位、４９３位から６００位、６０２位から７６４位）であり、かつ、細胞外領域であるペプチド、(ii)(i)のペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個の保存的置換を有するアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは(iii)(i)または(ii)のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドである、本発明の抗体またはその機能的断片が提供される。【００８０】
本発明によれば、緑膿菌由来のPA4710タンパク質の一部が、(i)配列番号：５から１５で示される細胞外ループ領域であるペプチド、(ii)(i)のペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個の保存的置換を有するアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは(iii)(i)または(ii)のペプチドのアミノ酸配列における連続する少なくとも７アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドである、本発明の抗体またはその機能的断片が提供される。【００８１】
本発明によれば、緑膿菌由来のPA4710タンパク質における配列番号：５から１５のアミノ酸配列で示される細胞外ループ領域のうち、特定の細胞外ループ領域にのみ結合し、それ以外の細胞外ループ領域には結合しない抗体が提供される。【００８２】
本発明によれば、本発明の抗原組成物に応答して、動物自身の免疫系によって産生されることを特徴とする緑膿菌に結合することができる抗体が提供される。【００８３】
本発明の抗体は、緑膿菌感染の治療や診断に、あるいは研究用試薬として、用いることができる。本発明の抗体を緑膿菌感染に適用する態様において、緑膿菌が感染している患者において抗菌活性を有する抗体またはその機能的断片が提供される。この態様において、特に好ましい抗体は、配列番号：１１、１２、１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体である。PA4710タンパク質（配列番号：３）のうち、配列番号：１１、１２、１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの領域に対して、抗体を作用させることにより、緑膿菌に対する抗菌活性を発揮することが可能である。このような抗菌活性を示す具体的な抗体としては、例えば、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体が例示される。一旦、緑膿菌に対する抗菌活性を抗体が発揮するために、その抗体の標的として好ましいペプチド領域が特定された場合、当業者であれば、そのペプチド領域を標的として、同様の活性を示す種々の抗体を作成することができる。本発明には、本発明者らにより見出された、これら標的ペプチド領域に結合する種々の抗体が含まれる。【００８４】
緑膿菌が感染している患者は、例えば、種々の薬剤投与や放射線治療などにより、好中球が減少している状態にある患者であり得る。本発明の抗体によれば、重篤な感染症に発展しやすい、このような患者に対しても効果を発揮することができる点で有利である。また。患者に感染している緑膿菌は、多剤耐性緑膿菌であり得る。本発明の抗体は、通常用いられる抗生物質によっては治療できない、多剤耐性緑膿菌に感染した患者に対しても、有効性を示す点においても有利である。【００８５】
本発明によれば、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４のいずれかの受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体またはその機能的断片が提供される。さらに、これらハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と同じ抗原と反応するモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体が提供される。【００８６】
本発明の抗体は、好ましくは精製された本発明のタンパク質抗原またはペプチド抗原を含んでなる抗原組成物を免疫して抗体が誘発できる量で実験動物へ投与することによって得られる。心臓あるいは動脈から採血し、分離して得た抗血清を精製した後、純粋抗体として使用することができる。【００８７】
本発明の抗体には、PA4710タンパク質またはペプチドを抗原として、当該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体も含む）、遺伝子組換え技術を用いて製造されキメラ抗体およびヒト化抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒト抗体が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、ヒト抗体が望ましい。【００８８】
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。本発明のヒト抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、Intern.  Rev.  Immunol,  1995,  13,  65-93、J.  Mol.  Biol,  1991,  222,  581-597、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報等を参照することができる）。【００８９】
「ヒト化抗体」は、マウス抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ；相補性決定領域）の遺伝子配列だけをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体である。本発明のヒト化抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、ＥＰ２３９４００、ＷＯ９０／０７８６１号公報等を参照することができる）。【００９０】
「キメラ抗体」は、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。具体的には、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合して作製することができる。本発明のキメラ抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報等を参照することができる）。【００９１】
本発明のモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例えば、Antibodies  A  LABORATORY  MANUAL  Ed  Harlow,  David  Lane  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  1988、単クローン抗体実験マニュアル（1987）講談社、富山朔二ら編、単クローン抗体  ハイブリドーマとELISA（1987）講談社、岩崎辰夫ら編等を参照することができる）。【００９２】
本発明のポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて作製することができる。【００９３】
本発明の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、本発明のタンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、およびこれらの重合体等が挙げられる。【００９４】
また、本発明によれば、上記本発明の抗体を産生するハイブリドーマが提供される。本発明のハイブリドーマの好ましい態様において、２００８年５月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４のハイブリドーマが提供される。対応する原寄託は下記の通りである。【００９５】
２００５年１１月２５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２３のハイブリドーマ（４７１０−B−１）、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２４のハイブリドーマ（４７１０−Ｌ３A−１）、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２５のハイブリドーマ（４７１０−Ｌ７−１）、並びに２００７年２月８日付で同センターに寄託された受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２０５のハイブリドーマ（４７１０−Ｌ８B−１）およびＦＥＲＭ  Ｐ−２１２０６のハイブリドーマ（４７１０−Ｌ１０−１）。【００９６】
［ワクチン組成物］
本発明の抗原組成物は、ワクチンとして用いることができる。従って、本発明によれば、緑膿菌由来の外膜PA4710タンパク質に対する抗体を産生することができる抗原組成物を含んでなるワクチン組成物が提供される。【００９７】
本発明によれば、本発明の抗原組成物と、場合によっては１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／またはアジュバントとを含んでなる緑膿菌に関連する疾患の予防または治療に用いられるワクチン組成物を製造することができる。【００９８】
本発明のワクチン組成物に用いられる担体は、投与の様式および経路、並びに標準的な製薬の実際を基にして選択され、キャリアータンパク質（例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ラパスガイ由来のヘモシアニン（ＫＬＨ：Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等）、溶解剤（例えば、エタノール、ポリソルベート、Cremophor  EL（登録商標）等）、等張化剤、保存剤、抗酸化剤、賦形剤（例えば、ラクトース、スターチ、結晶性セルロース、マンニトール、マルトース、リン酸水素カルシウム、軽無水珪酸、炭酸カルシウム等）、結合剤（例えば、スターチ、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等）、安定化剤（例えば、ラクトース、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロゴル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油等）等がある。必要であれば、グリセリン、ジメチルアセトアミド、７０％乳酸ナトリウム、界面活性剤、または塩基性物質（例えば、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、重炭酸ナトリウム、アルギニン、メグルミン、トリスアミノメタン等）等を加えてもよい。【００９９】
キャリアータンパク質の具体例としては、本発明のワクチン組成物の抗原性を高めるため、本発明のペプチドに公知のＫＬＨ溶液（Calbiotec社製  ５０％グリセロール溶液に１ｍｌ当たり１２５ｍｇを溶解させる）をカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）させることができる。【０１００】
本発明のワクチン組成物に用いられる希釈剤は、投与の様式及び経路、並びに標準的な製薬の実際を基にして選択され、例えば、水または生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、重炭酸塩溶液等が挙げられる。【０１０１】
本発明のワクチン組成物に用いられるアジュバントは、投与の様式及び経路、並びに標準的な製薬の実際を基にして選択され、例えば、コレラ毒素、大腸菌の熱不安定腸毒素（ＬＴ）、リポソーム、又は免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ：ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）等が挙げられる。【０１０２】
投与は、緑膿菌による感染のおそれがある投与対象の年齢、体重、性別、一般的な健康状態により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができるが、好ましくは非経口投与である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明の抗原組成物を、薬学的に許容される上記の坦体などと混合等することにより、常法に従って製造することができる。経口投与のための剤型は、固体または液体の剤型、具体的には溶剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等が挙げられる。非経口投与のための剤型は、溶剤、懸濁剤、軟膏剤、クリーム剤、坐剤、眼剤、点鼻剤、点耳剤等が挙げられる。経口投与の場合、香味料及び着色料を加えることもできる。【０１０３】
本製剤の徐放を希望する場合、生物分解性のポリマー（例えば、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ポリグリコリド等）を、増量母材として加えることができる（例えば、米国特許５，４１７，９８６号公報、米国特許４，６７５，３８１号公報、米国特許４，４５０，１５０号公報を参照することができる）。【０１０４】
適当な医薬用の担体および希釈剤等、並びにこれらの使用のために医薬上必要な物は、Remington's  Pharmaceutical  Sciencesに記載されている。【０１０５】
本発明のワクチン組成物の投与量は、例えば、ワクチン抗原の種類、本抗原と共にアジュバントを投与するか否か、共投与されるアジュバントの種類、投与の様式と頻度、及び希望する効果（例えば、予防か、それとも治療か）により、本発明者らによって決定されるが、一般的には、本発明のワクチン組成物を、１成人１投与あたり１μｇ〜１００ｍｇの量で投与する。本ワクチンと共にアジュバントを投与する場合、一般的には、１成人１投与あたり１ｎｇ〜１ｍｇの量を投与する。本発明者らの決定に従って、必要がある場合には、投与を繰り返す。例えば、初期化のための投与に引き続いて、１週間毎に３回の増強のための投与を行うことができる。あるいは増強のための注射を、最初の免疫接種後８〜１２週目に、そして２回目の増強を１６〜２０週目に、同一の調合剤を用いて行うことができる。【０１０６】
［抗体の用途及び医薬組成物]
緑膿菌に関連する疾患
緑膿菌は宿主の抵抗力の低下につれて致命的な結果となる日和見感染の病原菌であり、また、抗生物質に抵抗性であるため、院内感染の主要な原因菌でもある。後記実施例により示されるように、ムチン投与によりマクロファージの機能を低下させたマウス緑膿菌易感染性モデルにおいて、本発明の抗体が実際に感染防御効果を有すること（実施例１０）、また、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ投与により好中球を減少させたマウス緑膿菌易感染性モデルにおいて、本発明の抗体が実際に感染防御効果を有することが確認された（実施例１１）。さらに、マウス多剤耐性緑膿菌易感染性モデルにおいて、本発明の抗体が実際に感染防御効果を有することが確認された（実施例１２）。従って、緑膿菌のPA4710タンパク質（特にその細胞外領域）に本発明の抗体を作用させることにより、緑膿菌に関連する疾患の予防または治療が可能である。本発明の抗体は、種々の性質の緑膿菌に対し、また、種々の症状の緑膿菌感染患者に対し、適用することが可能である。PA4710タンパク質の細胞外領域のうち、配列番号：１１、１２、１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの領域が、このような医療目的において、特に好適な抗体の標的領域である。緑膿菌感染患者において、抗菌活性を示す具体的な抗体としては、例えば、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体が挙げられる。治療に難渋する多剤耐性緑膿菌感染症の予防または治療に対しては、PA4710タンパク質の細胞外領域のうち、配列番号：１４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に対する抗体（例えば、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７４の受託番号のもと寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体）を好適に用いることができる（実施例１２）。【０１０７】
緑膿菌に関連する疾患としては、多剤耐性緑膿菌を含む緑膿菌感染に起因する全身感染疾患、例えば、敗血症、髄膜炎、心内膜炎等が挙げられる。耳鼻科領域では、中耳炎、副鼻腔炎、呼吸器科領域では、肺炎、慢性気道感染症、カテーテル感染症、外科領域では、術後腹膜炎、術後胆道などの炎術後感染症、眼科領域では、眼瞼膿瘍、涙膿炎、結膜炎、角膜潰瘍、角膜膿瘍、全眼球炎、眼窩感染、泌尿器科領域では、複雑性尿路感染症を含む尿路感染症、カテーテル感染症、肛門周辺膿瘍等が挙げられる。この他にも、重症熱傷、気道熱傷を含む熱傷や褥瘡感染症、嚢胞性繊維症等が挙げられる。【０１０８】
本発明によれば、予防上または治療上の有効量の本発明の抗体を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、緑膿菌に関連する疾患の予防方法または治療方法が提供される。【０１０９】
緑膿菌感染症診断剤
後記の実施例において示されるように、本発明の抗体は、緑膿菌の細胞表面に露出するPA4710タンパク質の細胞外領域と結合することが確認された（実施例８）。また本発明の抗体は、緑膿菌の細胞表面に露出するPA4710タンパク質の細胞外領域と結合することが確認された（実施例９）。これらの結果から、本発明の抗体は、緑膿菌の存在を検出することができることが示唆された。したがって、本発明の抗体は、緑膿菌感染症診断剤として用いることができる。PA4710タンパク質の細胞外領域のうち、配列番号：１１、１２、１４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの領域に結合する抗体が、このような診断において、特に好適な抗体である。【０１１０】
本発明によれば、本発明の抗体を用いる緑膿菌感染の診断方法が提供される。本発明の診断方法は、緑膿菌感染のおそれのあるヒトを含む哺乳動物から喀痰、肺洗浄液、膿、涙、血液、尿等の生体試料を採取し、次いで、採取した試料と本発明の抗体とを接触させ、抗原抗体反応が生じたか否かを判断することにより実施することができる。【０１１１】
緑膿菌感染症診断薬キット
本発明によれば、緑膿菌の存在を検出するためのキットであって、本発明の抗体を少なくとも含んでなるキットが提供される。【０１１２】
本発明の抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することにより緑膿菌の存在を検出する。【０１１３】
従って本発明の検出キットは、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。【０１１４】
医薬組成物
本発明の医薬組成物または用剤は、本発明の抗体を有効成分として用い、好ましくは、精製した抗体組成物と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又は燐酸塩緩衝液などを含有する組成物の形態で使用しても良い。【０１１５】
本発明の医薬組成物は必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤（isotonic  agent）などを含有させることもできる。【０１１６】
薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミンなどを例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、燐酸塩緩衝液、水酸化アルミニウムなどを例として挙げることができる。しかし、これらに限定されるものではない。【０１１７】
投与は、投与対象の年齢、体重、性別、一般的な健康状態により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができるが、好ましくは非経口投与である。【０１１８】
医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、一般的な健康状態、緑膿菌感染症の程度及び投与する抗体組成物の成分により多様である。本発明の抗体組成物は、一般的に静脈内投与の場合、成人には体重１kg当たり１日0.1ないし1000mg、好ましくは１ないし100mgを投与する。【０１１９】
本発明の医薬組成物は、緑膿菌による感染のおそれがある患者に対してあらかじめ投与しておくことが好ましい。【０１２０】
診断剤として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることが出来る。たとえば腹水、目的抗体を含む培養液、または精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ（生理食塩を含むリン酸緩衝液）等で希釈した後、０．１％ナトリウムアジド等を防腐剤として加える。またはラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものも抗体価を求め適当に希釈し、防腐剤を添加して用いる。前記のように本発明の抗体をラテックス粒子に結合させたものは、診断薬として好ましい剤型の一つである。この場合のラテックスとしては適当な樹脂材料たとえばポリスチレン、ポリビニールトルエン、ポリプタジエン等のラテックスが適当である。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１２２】
［実施例１］：GeneChipR解析
ヒト血清添加培地で発現している遺伝子を探索する手法として、GeneChipR発現解析システム（Affymetrix社製GeneChipR P.  aeruginosaゲノムアレイ）を用いた。緑膿菌PAO1菌株を用いて、3通りの培養条件、すなわち0％、20％、50％ヒト血清添加Luria-Bertani（LB）培地（ナカライテスク社製）（最終のLB培地組成は均一）で37℃にて595nmの吸光度が1.0になるまで振とう培養し、RNeasy  Protect  Bacteria  Miniキット（QIAGEN  GmbH社製）を用い、添付文書の方法に従って、全RNAを抽出し、2100バイオアナライザー（Agilent  Technologies社製）により定量を行った。その後、GeneChipRの添付文書の方法に従って実験を行った。遺伝子発現データの解析はMicroarray  Suite  5.0（Affymetrix社製）により行い、シグナルならびにディテクションを計算した。このとき、全プローブセットのシグナルの平均値が1000となるように補正を行った。実験は独立に2回実施した。【０１２３】
その結果、ハウスキーピングタンパク質であるPA4761タンパク質（DnaKあるいはHSP70）は、いずれの培養条件でも血清添加の有無に関わらず、転写産物が検出されたことを示す「Present」と判定され、当該遺伝子が発現していることが示された。また、PA5158タンパク質（OpmG）ならびにPA2019タンパク質（MexX）と会合し薬剤排出ポンプを構成する内膜貫通タンパク質でテトラサイクリンやアミノグシコシド系抗生物質などリボソーム阻害剤によって誘導されるPA2018タンパク質(MexY)（J.  Bacteriology,  2005,  187,  5341-5346）はそれらの薬剤が存在しない今回の条件下では「Absent」と判定され、これらの遺伝子が発現していないことが示された。一方、PA4710遺伝子に関しては、血清非添加条件においては「Absent」と判定され、遺伝子が発現していないことが示されたが、血清添加条件下においては「Present」と判定された。【０１２４】
以上のことから、間違いなくPA4710遺伝子が発現し、その遺伝子産物であるPA4710タンパク質が菌体表面に定常的に存在している可能性が示唆された。このことから、緑膿菌のPA4710タンパク質がワクチンの成分として有用であることが示唆された。【０１２５】
［実施例２］：臨床分離株におけるPA4710遺伝子の解析
使用菌株は、全国の臨床施設において各種臨床材料より分離された緑膿菌67株（明治製菓株式会社  横浜研究所に保管）を試験に供した。これらの株は血液、尿、喀痰、膿、咽頭粘液などに由来しており、血清型は緑膿菌研究会主催の型別検討委員会の決定（1975年）による血清学的分類に基づくA群、B群、E群、G群、I群、M群などが含まれている。【０１２６】
（１）ゲノムDNAの調製
臨床分離の緑膿菌67株について、ミューラーヒントン培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で37℃にて一晩培養し、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からDＮeasy  Tissueキット（QIAGEN  GmbH社製）を用い、添付文書の方法に従って、ゲノムDNAを調製した。【０１２７】
（２）PCR法によるDNA断片の増幅
調製したゲノムDNAを鋳型に、PA4710遺伝子を含む領域をPCRにより増幅した。具体的には、緑膿菌PAO1株のゲノム配列（NCBIのデータベースにおけるアクセッション番号：NC_002516）をもとに、PA4710遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット（配列番号：１６、配列番号：１７）を設計し、Takara  ExTaq（タカラバイオ株式会社製）で添付の説明書に従い、GeneAmp  PCR  System  9700（Applied  BioSystems社製）を用いてPCRを実施した。PCRにて増幅されたDNA断片は、アガロースゲル電気泳動により、目的のサイズ（2635塩基対）であることを確認した。【０１２８】
（３）DNAシーケンサーによるポリヌクレオチド配列の解析
PCR産物は、MultiScreen  PCRプレート（Millipore  Corporation社製）にて精製後、シーケンス反応に供した。PAO1菌株のゲノム配列（NC_002516）をもとに、各PCR産物をシーケンシングできるプライマー（配列番号：１８〜配列番号：２２）を設計し、シーケンス反応にはBigDye  Terminator  v1.1  Cycle  Sequencingキット（Applied  BioSystems社製）を用いた。シーケンス反応は添付の説明書に従い、GeneAmp  PCR  System  9700（Applied  BioSystems社製）で実施した。シーケンス反応産物は、あらかじめ水で膨張させたSephadex  G-50  Fine  DNA  Grade（Amersham  Biosciences  AB社製）をつめたMultiScreen-HVプレート（Millipore  Corporation社製）で精製後、Applied  Biosystems  3730  DNA  Analyzer（Applied  BioSystems社製）を用いてポリヌクレオチド配列の解析を行った。【０１２９】
上記の解析により判明した臨床分離株のポリヌクレオチド配列をポリペプチド配列に置換し、PAO1株のものと比較検討した結果、PA4710タンパク質の全長配列において、17箇所に変異が認められた（表１）。【０１３０】
さらに、大腸菌FhuAタンパク質の構造解析情報（Cell,  1998,  95,  771-778、Science,  1998,  282,  2215-2220）、大腸菌FepAタンパク質の構造解析情報（Nat.  Struct.  Biol.,  1999,  6,  56-63）、大腸菌FecAタンパク質の構造解析情報（Science,  2002,  295,  1715-1719、J.  Mol.  Biol.,  2003,  332,  353-368）、緑膿菌FpvAタンパク質の構造解析情報（J.  Mol.  Biol.,  2005,  347,  121-134）およびPA4710タンパク質の２次構造予測情報から得られる情報を基にした構造分析から、この17箇所の変異を含まないペプチド領域（アミノ酸配列が保存されているペプチド領域）において、細胞外領域（配列番号：５〜配列番号１５）が見出された。これら、緑膿菌のPA4710タンパク質の細胞外領域のペプチドは、「緑膿菌共通抗原」として有用である。【０１３１】
【表１】
2009005040.tif 000002
【０１３２】
［実施例３］：PA4710遺伝子DNA断片のクローニング
緑膿菌PA4710遺伝子（配列番号：１）のアミノ酸コード領域2295塩基中の541番目から2295番目のDNA断片（配列番号：２）を、以下の方法により、無細胞系タンパク質発現ベクターpIVEX2.4d（Roche  Diagnostics社）および大腸菌発現ベクターpET15b（Novagen社）に組み込んだ。【０１３３】
アミノ酸コード領域の1番目から540番目の塩基配列は、シグナル配列およびPA4710タンパク質と同族のTonB依存性受容体に属する大腸菌FhuAタンパク質の構造解析情報（Cell,  1998,  95,  771-778、Science,  1998,  282,  2215-2220）、大腸菌FepAタンパク質の構造解析情報（Nat.  Struct.  Biol.,  1999,  6,  56-63）、大腸菌FecAタンパク質の構造解析情報（Science,  2002,  295,  1715-1719、J.  Mol.  Biol.,  2003,  332,  353-368）、緑膿菌FpvAタンパク質の構造解析情報（J.  Mol.  Biol.,  2005,  347,  121-134）およびPA4710タンパク質の2次構造予測情報を基に、細胞表面に表出しない部分をコードすると推測し、クローニング対象から除外した。【０１３４】
クローニングするDNA断片を緑膿菌PAO1株のゲノムDNAからPCR（DNA  Thermal  Cycler  480；Perkin-Elmer社製）により増幅した。DNAポリメラーゼはPyrobest（宝酒造社製）を使用し、反応液にジメチルスルホキシドを5％添加し、PCRプライマーは制限酵素部位XhoI（CTCGAG）およびBamHI（GGATCC）を付加するための塩基を含むプライマー（配列番号：２３、配列番号：２４）を用いた。【０１３５】
PCRの温度条件は、94℃で2分間の加熱の後、94℃で30秒間、60℃で1分間および72℃で2分間を30サイクルとした。PCR産物をGenElute  PCR  DNA  Purification  Kit（Sigma社製）を用いて精製し、XhoI(New  England  Biolabs社製)およびBamHI(東洋紡社製)で切断した。pIVEX2.4dをXhoIおよびBamHIで切断し、これらのDNA断片をアガロースゲル電気泳動し、QIAquick  Gel  Extraction  Kit（Qiagen社製）を用いて抽出精製した。XhoI-BamHIで切断したPCR産物およびpIVEX2.4dをT4  DNAリガーゼ（Invitrogen社製）で連結し、大腸菌DH5α菌株（Competent  High  DH5α、東洋紡社製）を形質転換した。PA4710遺伝子断片が組み込まれたpIVEX2.4dプラスミド（pIVEX-PA4710-1）を、QIAprep  Spin  Miniprep  Kit（Qiagen社製）を用いて精製し、BigDye  Terminator  v1.1  Cycle  Sequencing  Kit（Applied  Biosystems社製）を用いてサイクルシークエンス反応を行い、挿入部分の塩基配列を確認した（3730  DNA  Analyzer、Applied  Biosystems/HITACHI社製）。【０１３６】
次に、pET15bをXhoIおよびBamHIで切断し、pIVEX-PA4710-1のXhoI-BamHI挿入断片と連結して大腸菌を形質転換し、PA4710遺伝子断片が組み込まれたpET15bプラスミド（pET-PA4710-4）を得た。【０１３７】
［実施例４］：PA4710組換えタンパク質の発現ならびに精製
組換えタンパク質の発現には、無細胞および大腸菌の発現系を用いた。【０１３８】
無細胞系は、T7  RNAポリメラーゼと大腸菌ライセートにより転写と翻訳を行うRTS  500  ProteoMaster  E.  coli  HY  Kit（Roche  Diagnostic社製）を使用した。無細胞系タンパク質発現ベクターpIVEX-PA4710-1は、T7プロモーターの下流にHis-タグ（6個の連続したヒスチジン）が融合したPA4710タンパク質をコードするプラスミドである（実施例３参照）。取扱説明書に従って無細胞系反応液を調製し、10μgのpIVEX-PA4710-1を添加して30℃で20時間反応した後、生成した不溶性タンパク質を遠心で回収した。【０１３９】
大腸菌発現系は、T7  RNAポリメラーゼ遺伝子が組み込まれた大腸菌BL21(DE3)菌株とT7プロモーターを有するpETベクターの発現系（Novagen社製）を使用した。大腸菌発現ベクターpET-PA4710-4は、T7プロモーターの下流にHis-タグが融合したPA4710タンパク質をコードするプラスミドである（実施例３参照）。BL21(DE3)菌株を塩化カルシウムで処理（Molecular  Cloning第2版、Sambrook他（1989）参照）し、pET-PA4710-4により形質転換した。形質転換体を50μg/mlアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、新しい培地に200倍希釈で懸濁して37℃で4時間培養後、IPTGを最終濃度0.5mMで添加し、さらに3時間培養した。細胞を遠心で回収し、−20℃で凍結した。細胞をタンパク質抽出試薬BugBuster  Protein  Extraction  Reagent（Novagen社製）で溶解し、添付説明書に準じて封入体を回収した。この際、超音波処理を加え、リゾチーム（卵白リゾチーム、生化学工業社製）は最終濃度200μg/mlとした。【０１４０】
タンパク質の精製には、His-タグを利用したNiキレートクロマトグラフィを用いた。無細胞または大腸菌の発現系で発現した不溶性タンパク質を、溶解バッファー（8M尿素、5mMイミダゾール、200mM  NaClおよび0.05％NP-40を添加したダルベッコリン酸緩衝塩類溶液（PBS））で可溶化した。溶解したタンパク質をNi-NTA  Agarose（Qiagen社製）に結合し、40容量の溶解バッファーで洗浄した。さらに、40容量の洗浄バッファー（NP-40を除いた溶解バッファー）で洗浄した後、溶出バッファー（8M尿素、300mMイミダゾール、200mM  NaClを添加したPBS）により、His-タグ付タンパク質を溶出し回収した。【０１４１】
その結果、無細胞系では1mlの反応液から1.7mgのタンパク質、大腸菌発現系では100mlの培養から7.2mgのタンパク質が最終的に得られた。【０１４２】
［実施例５］：抗原の免疫ならびに血清の調製
緑膿菌はPA103菌株（ATCC29260）をミューラーヒントン寒天培地上にて一晩37℃で培養し、数個のコロニーをLB培地に懸濁後、一晩37℃で振とう培養し、PBSで洗浄、再懸濁した後、１％となるようにホルマリンを加え、24時間以上不活化処理した不活化菌を使用した。PA4710組換えタンパク質による免疫は100μg/mlとなるよう８M尿素溶液に溶解して用いた。【０１４３】
PA4710タンパク質におけるアミノ酸配列が保存されている領域中に見出された細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号：５〜配列番号：１５）のうち、配列番号：６〜配列番号：１５を含むペプチドの合成を、Ｆｍｏｃを用いる固相合成法により実施した。配列番号：６〜配列番号：１５の、各アミノ酸配列のアミノ末端にシステイン残基を付加し、カルボキシル末端をアミド化したペプチド（配列番号:２５〜配列番号：３７）を合成した。【０１４４】
4710Loop2（配列番号：６）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L2（配列番号：２５）は、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  2446.199（計算値ｍ／ｚ  2447.451）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間10.265分にエリア面積比88.29％のピークを与えた。【０１４５】
4710Loop3（配列番号：７）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L3Ａ（配列番号：２６）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1587.823（計算値ｍ／ｚ  1588.713）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間12.205分にエリア面積比59.02％のピークを与えた。【０１４６】
4710Loop3（配列番号：７）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L3Ｂ（配列番号：２７）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1461.256（計算値ｍ／ｚ  1457.65）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間15.568分にエリア面積比73.71％のピークを与えた。【０１４７】
4710Loop4（配列番号：８）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L4（配列番号：２８）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  2683.446（計算値ｍ／ｚ  2682.107）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間13.117分にエリア面積比73.64％のピークを与えた。【０１４８】
4710Loop5（配列番号：９）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L5（配列番号：２９）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  2335.175（計算値ｍ／ｚ  2335.495）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間12.629分にエリア面積比83.12％のピークを与えた。【０１４９】
4710Loop6（配列番号：１０）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L6（配列番号：３０）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1681.271（計算値ｍ／ｚ  1679.824）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間9.656分にエリア面積比73.45％のピークを与えた。【０１５０】
4710Loop7（配列番号：１１）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L7（配列番号：３１）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1731.422（計算値ｍ／ｚ  1730.92）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間14.669分にエリア面積比56.67％のピークを与えた。【０１５１】
4710Loop8（配列番号：１２）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L8Ａ（配列番号：３２）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1337.108（計算値ｍ／ｚ  1335.501）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間14.011分にエリア面積比81.31％のピークを与えた。【０１５２】
4710Loop8（配列番号：１２）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L8Ｂ（配列番号：３３）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1037.734（計算値ｍ／ｚ  1037.066）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間10.083分にエリア面積比70.18％のピークを与えた。【０１５３】
4710Loop9（配列番号：１３）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L9（配列番号：３４）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1316.107（計算値ｍ／ｚ  1315.426）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間11.011分にエリア面積比70.61％のピークを与えた。【０１５４】
4710Loop10（配列番号：１４）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L10（配列番号：３５）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1467.748（計算値ｍ／ｚ  1465.514）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間13.276分にエリア面積比65.81％のピークを与えた。【０１５５】
4710Loop11（配列番号：１５）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L11Ａ（配列番号：３６）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1186.740（計算値ｍ／ｚ  1184.244）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間12.609分にエリア面積比55.14％のピークを与えた。【０１５６】
4710Loop11（配列番号：１５）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710L11Ｂ（配列番号：３７）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1258.403（計算値ｍ／ｚ  1257.434）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間14.268分にエリア面積比61.47％のピークを与えた。【０１５７】
細胞内領域にあるアミノ酸配列を含むペプチドの合成はＦｍｏｃを用いる固相合成法を用いた。各ペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端にシステイン残基を付加し、カルボキシル末端をアミド化したペプチドを合成した。【０１５８】
細胞外領域4710Loop7（配列番号：１１）と4710Loop8（配列番号：１２）の間に存在する細胞内領域にあるアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710Ａ（配列番号：３８）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1110.919（計算値ｍ／ｚ  1110.25）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間13.687分にエリア面積比71.88％のピークを与えた。【０１５９】
細胞外領域4710Loop9（配列番号：１３）と4710Loop10（配列番号：１４）の間に存在する細胞内領域にあるアミノ酸配列を含む合成ペプチド4710Ｃ（配列番号：３９）では、質量分析により  ［Ｍ＋１］  ｍ／ｚ  1107.356（計算値ｍ／ｚ  1105.097）を観測し、ＨＰＬＣ分析にて、保持時間10.992分にエリア面積比58.52％のピークを与えた。【０１６０】
さらに、上記の合成ペプチドにスペーサーを介してKeyhole  limpet  hemocyanin(KLH)とカップリングさせたコンジュゲートペプチドも同時に調製した。スペーサーとしてはSulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate：Pierce社製）を用いた。なお、ペプチド合成および、そのＫＬＨコンジュゲートペプチドの調製はhermo  ELECTRON社に委託した。【０１６１】
ＫＬＨコンジュゲートペプチドによる免疫は、各ＫＬＨコンジュゲートペプチドの最終濃度が83.3μｇ／ｍｌとなるよう８Ｍ尿素溶液に溶解して用いた。動物への免疫方法としては雄性BNラット（日本チャールスリバー社より購入）あるいは雌性ニュージーランドホワイトウサギ（日本チャールスリバー社より購入）の皮下あるいは筋肉内に初回のみフロインドの完全アジュバントとともに、２回目以降は不完全アジュバントとともに２週間間隔で、計６回投与した。ホルマリン不活化菌、PA4710組換えタンパク質はそれぞれ20μg/animal、各ＫＬＨコンジュゲートペプチドは41.7μg/animalで免疫した。最終免疫の1週間後、頚動脈あるいは腹部大動脈から全採血を行い、室温1時間放置後、遠心分離(1500G、20分間)を行い、上清を抗血清としてラット１匹あたり約５ｍｌ、ウサギ１羽あたり約５０ｍｌを得た。【０１６２】
［実施例６］：抗血清および腹水からのIgG画分の精製
ラット抗血清および腹水からのIgG画分の精製は、McCauley  R&Racker,  E;  Molecular  and  Cellular  Biochemistry  1,  73-81(1973)らの硫安沈殿を用いた方法（硫安沈殿法）に従った。【０１６３】
硫安沈殿法では、抗血清に氷冷飽和硫酸アンモニウム溶液（pH8）を43(v/v)％になるように添加し、得られた懸濁液を室温で15分間攪拌した。10,000xgで20分間遠心することにより沈殿を回収し、10%グリセロールを添加した10mMリン酸カリウム緩衝液（pH8）に溶解後、氷冷飽和硫酸アンモニウム溶液（pH8）を50(v/v)％になるように添加し再度沈殿を析出させることにより２回洗浄を行った。沈殿を、10%グリセロール添加した10mMリン酸カリウム緩衝液（pH8）に溶解し、次いで当該緩衝液に対して一夜透析した。遠心後、陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE-Toyopearl  650M(TOSOH社製)）に添加し、280nmの紫外吸収を測定することにより素通り容積をIgG画分として回収した。最終標品は、Amicon  Ultra-15(Millipore)を用い濃縮し、最終的にPBS(-)溶液に交換した。PA4710組換えタンパク質免疫ラット抗血清5mlより精製を行い、IgG画分として54mgのタンパク質を回収した。得られた精製ＩｇＧ画分を抗PA4710  IgGと命名した。タンパク定量はLowry法に基づくDC  Protein  Assay（Bio-Rad社製）、IgGの純度はSDS-PAGEにより評価した。【０１６４】
また、簡易的な別法としてHarlow&Lane,  288-318,  Chapter  8,  Antibodies,  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor(1988)らのカプリル酸を用いた方法を使用した。ラット抗血清あるいはラット−マウスハイブリドーマをマウス腹腔で増殖させ、得た腹水を10,000xgで20分間遠心し不溶物を除いた上清に、２容量の60mM酢酸ナトリウム（pH4.0）を添加した後、1N塩酸によりpHを4.8に調製した。腹水試料に対して0.06容量のカプリル酸を室温にて除々に添加し30分間攪拌し不溶物を生成させた。13,000xgで10分間遠心し沈殿を除いた後、0.45μmのフィルターを通過させた。得られた試料は、Amicon  Ultra-15(Millipore社製)を用い濃縮後、最終的にPBS(-)溶液に交換し最終標品とした。ラット抗血清10mlあるいは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの受託番号がFERM  BP-10970、FERM  BP-10971、FERM  BP-10972、FERM  BP-10973、FERM  BP-10974であるハイブリドーマから産生されたラットMAbを含むマウス腹水11mL、9mL、11mL、40ｍL、36mLより精製を行い、IgG画分として24mg、6.5mg、2.7mg、4.5mg、6.8mg、5.2mgのタンパク質を回収した。タンパク定量はLowry法に基づくDC  Protein  Assay（Bio-Rad社製）、IgGの純度はSDS-PAGEにより評価した。【０１６５】
［実施例７］：ELISA試験
PA4710組換えタンパク質に結合する抗体をELISA法で検出するため、PA4710組換えタンパク質を8 M尿素を添加したPBSに溶解し、96穴ニッケルプレート（HIS-Select  High  Sensitivity  (HS)  Nickel  Coated  Plates、Sigma社製）にウェルあたり0.5μgのタンパク質を入れ、室温で1時間置いてプレートに結合させた。洗浄バッファー（0.05％Tween  20、5mMイミダゾールおよび500mM  NaClを添加したPBS）で洗浄し、ブロッキングバッファー（0.5％ゼラチンを添加した洗浄バッファー）でブロッキング後、実施例５あるいは６で得られた抗体を含む試料をウェルに入れ、30分間反応後に洗浄し、2次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットIgG抗体、10000倍希釈、Sigma社製）を入れ、30分間反応後に洗浄した。発色基質（TMB  Microwell  Peroxidase  Substrate  System、KPL社製）を添加して反応後、1Mリン酸で酵素反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。【０１６６】
その結果、PA4710組換えタンパク質免疫ラット血清（10,000倍希釈）の吸光度は0.676であったのに対し、陰性対照である免疫前血清（10,000倍希釈）の吸光度は0.058であった。これはPA4710組換えタンパク質免疫ラット血清中に、免疫原としたPA4710組換えタンパク質に結合する抗体が含まれていることを示している。【０１６７】
また合成ペプチド（配列番号：２５〜３９）に結合する抗体をELISA法で検出するため、合成ペプチドを炭酸バッファー（0.15％Na2CO3、0.3％NaHCO3）に溶解し、96穴プレート（Maxisorp、Nunc社製）にウェルあたり1μgのペプチドを入れ、4℃で一晩置いてプレートに吸着させた。PBSで洗浄し、0.5％ウシ血清アルブミンを添加したPBSでブロッキング後、実施例５または６で得られた抗体を含む試料を希釈してウェルに入れ、2時間反応後、0.05％Tween  20を含むPBSで洗浄した。２次抗体をウェルに入れて1時間反応後、0.05％Tween  20を含むPBSで洗浄した。上記と同様に発色し、吸光度を測定した。結果は後述する実施例９において示す
［実施例８］：Whole  cell  ELISA試験
Whole  cell  ELISAは、LB培地で培養したPA103菌株の菌液をELISAプレート(MaxiSorp  Type,  NUNC社製)に分注し４℃で固相化後、洗浄バッファー（0.05％Tween  20含有TBS）で洗浄し、ブロッキングバッファー（2％ウシ血清アルブミン含有TBS）によるブロッキング後、１次抗体サンプルとして、PBSで希釈した実施例５で得られた血清または精製IgG画分を加え、37℃で1時間反応させた。洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットIgG抗体（5000倍希釈、Sigma社製）を用い、発色基質（TMB  Microwell  Peroxidase  substrate  System、KPL社製）を添加して反応後、0.18M硫酸で酵素反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。【０１６８】
その結果、PA4710組換えタンパク質免疫ラット血清については、陰性対照である免疫前ラット血清（100倍希釈）の吸光度が0.142であったのに対し、PA4710組換えタンパク質を免疫したラット血清（100倍希釈）では0.462であった。これはPA4710組換えタンパク質免疫ラット血清中に、菌体表面に露出するPA4710タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（IgG）が含まれていることを示している。【０１６９】
また、PA4710組換えタンパク質免疫ラット血清から得られた精製IgG画分である抗PA4710  IgGについては、陰性対照であるアジュバントのみを投与して得た対照ラット血清より精製したIgG画分（50μg/well）の吸光度が0.116であったのに対し、抗PA4710  IgG（50μg/well）では、0.377であった。これは当該IgG画分中に、細胞表面に露出するPA4710タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（IgG）が含まれていることを示している。【０１７０】
［実施例９］：モノクローナル抗体（MAb）の作製
PA4710組換えタンパク質またはＫＬＨコンジュゲートペプチドの実施例５における最終免疫の１週間後、ラットから麻酔下で無菌的に脾臓を摘出した。得られた脾臓をRPMI-1640培地（Gibco社製）で洗浄した後、スライドグラスに脾臓を挟み、すり潰し微小片として供試脾細胞を得た。得られた脾細胞はRPMI-1640培地で1000rpm、5分間遠心し洗浄した。一方、10％FCS（ウシ胎児血清）を含むRPMI-1640培地で5%CO2、相対湿度100％、37℃で予め培養して対数増殖期にあるミエローマ細胞（P3X63Ag8U1細胞）をRPMI-1640培地で遠心洗浄し、先に述べた脾細胞とミエローマ細胞の比が４：１になるように混合した。混合した細胞を1000rpmで5分間遠心し、上清を捨て細胞を充分にほぐした。この細胞を含む遠心管にポリエチレングリコール（M.W.1000、和光純薬社製）2ｇ、RPMI-1640培地2ｍLおよびDMSO（ナカライテスク社製）0.2mLから成る溶液1ｍLを静かに加え、遠心管をゆっくり回転させ細胞を混合させた。1分後、遠心管をゆっくり回転させながらRPMI-1640培地15ｍLを３分かけ加えた。1000rpmで5分間遠心後、上清を捨て充分に細胞をほぐした後、脾細胞として1.6×106/ｍLとなるようHAT培地（Gibco社製）にて調整し、96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に0.2mLずつ分注した。5%CO2、相対湿度100％、37℃で約１〜2週間培養後、ウェル中に生育しているハイブリドーマが顕微鏡下で観察された。【０１７１】
（１）目的抗体のスクリーニング
PA4710組換えタンパク質またはPA4710タンパク質の推定細胞外領域（配列番号：５〜１５）に結合する抗体を実施例７に記載したELISA法で検出した。また、緑膿菌の細胞表面に結合する抗体を実施例８に記載したwhole  cell  ELISA法で検出した。【０１７２】
（２）目的抗体産生細胞のクローニング
スクリーニングの結果、目的抗体を産生していると判定されたハイブリドーマを５個/0.2ｍLあるいは２０個/0.2mLとなるようBM-Condimed  H1  Hybridoma  Cloning  Supplement（Roche  Diagnostics社製）を5%含む10%FCS/HT（Gibco社製）培地にて調整し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに0.2ｍLずつ分注して培養した。１〜２週間後にクローンの生育が顕微鏡下で観察できた。スクリーニングの項で述べた方法で分析し、目的抗体を産生しているクローンを選択した。再度上記の方法でハイブリドーマとして１個/0.2ｍLあるいは２個/0.2ｍLとなるようBM-Condimed  H1  Hybridoma  Cloning  Supplementを５%含む10%FCS/HT（Gibco社製）培地にて調整したハイブリドーマを、各ウェルに0.2ｍLずつ分注した。１〜２週間後にスクリーニングの項で述べた方法で分析し目的の抗体を産生する単クローンを選択し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの受託番号がFERM  BP-10970、FERM  BP-10971、FERM  BP-10972、FERM  BP-10973、FERM  BP-10974であるハイブリドーマを得た。【０１７３】
（３）in  vitroにおける細胞の培養およびMAbの産生
96穴マイクロプレートで充分増殖させた目的クローンは48穴プレート、12穴プレート、50ｍL、250ｍLフラスコに徐々にスケールアップして10％FCS-RPMI培地で培養した。このようにして得られた細胞の培養上清に産生されているMAbを実施例７に記載したELISA法で検出した。【０１７４】
その結果、細胞外領域である4710Loop3（配列番号：７）に含まれる実施例５の合成ペプチド4710L3A（配列番号：２６）を吸着したウェルへの結合を検出するELISAでの吸光度が、陰性対照である10%FCS-RPMI培地では0.078であったのに対し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの受託番号がFERM  BP-10971であるハイブリドーマの培養上清は、吸光度が1.382であった。細胞外領域である4710Loop7（配列番号：１１）に含まれる実施例５の合成ペプチド4710L7（配列番号：３１）を吸着したウェルへの結合を検出するELISAでの吸光度が、10%FCS-RPMI培地では0.097であったのに対し、受託番号FERM  BP-10972であるハイブリドーマの培養上清は、吸光度が0.637であった。また、細胞外領域である4710Loop8（配列番号：１２）に含まれる実施例５の合成ペプチド4710L8A（配列番号：３８）を吸着したウェルへの結合を検出するELISAでの吸光度が、10%FCS-RPMI培地では0.071であったのに対し、受託番号FERM  BP-10970であるハイブリドーマの培養上清は、吸光度が1.211であった。さらに、受託番号FERM  P-21205であるハイブリドーマの培養上清は、細胞外領域である4710Loop8（配列番号：１２）に含まれる実施例５の合成ペプチド4710L8B（配列番号：３３）を吸着したウェルへの結合を検出するELISAでの吸光度が0.497であったのに対し、4710L8B以外のペプチド（配列番号：２５〜配列番号：３２、配列番号：３４〜配列番号：３９）を吸着したウェルへの結合を検出するELISAでの吸光度は0.060〜0.088であった。受託番号FERM  BP-10974であるハイブリドーマの培養上清は、細胞外領域である4710Loop10（配列番号：１４）に含まれる実施例５の合成ペプチド4710L10（配列番号：３５）を吸着したウェルへの結合を検出するELISAでの吸光度が0.810あったのに対し、4710L10以外のペプチド（配列番号：２５〜配列番号：３４、配列番号：３６〜配列番号：３９）を吸着したウェルへの結合を検出するELISAでの吸光度は0.061〜0.085であった。以上の結果から、それぞれのペプチドに結合するMAbが産生されていることが明らかとなった。【０１７５】
（４）in  vivoにおける細胞の腹水化およびMAbの産生
ＢＡＬＢ/ｃ-ｎｕ／ｎｕマウス（日本チャールスリバー社より購入）に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの受託番号がFERM  BP-10971、FERM  BP-10972、FERM  BP-10970、FERM  BP-10973、FERM  BP-10974であるハイブリドーマを１×１０7／ｍｏｕｓｅとなるように腹腔内投与し、１〜２週間後に腹水を採取した。腹水中に含まれるＭＡｂは実施例６に記載した方法で精製し、得られた精製ＩｇＧ画分をそれぞれ、抗4710L3A  IgG(MAb)、抗4710L7  IgG(MAb)、抗4710L8A  IgG(MAb)、抗4710L8B  IgG(MAb)、抗4710L10  IgG(MAb)と命名した。このラットＭＡｂのＩｇＧのサブクラスは、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＲＭＴ１、大日本製薬社製）によって重鎖および軽鎖を判定した結果、重鎖はそれぞれIgG1、IgG2a、IgG1、IgG2b、IgG2bであり、軽鎖は全てκと判定された。【０１７６】
実施例６に記載した方法でマウス腹水より精製した上記MAbの緑膿菌表面への結合を、実施例８に記載したwhole  cell  ELISAにて確認した。【０１７７】
抗4710L7  IgG(MAb)の結果：受託番号がFERM  BP-10972であるハイブリドーマを投与したマウス腹水から精製して得たIgG画分である抗4710L7ＩｇＧ（ＭＡｂ）の吸光度が、0.601であったのに対し、陰性対照であるアジュバントのみを投与し得た対照ラット血清より精製したIgG画分（50μg/well）の吸光度は0.280であった。この結果から、当該IgG画分中に、細胞表面に露出するPA4710タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（IgG）が含まれていることが明らかとなった。【０１７８】
抗4710L8B  IgG(MAb)の結果：受託番号がFERM  BP-10973であるハイブリドーマを投与したマウス腹水から精製して得たIgG画分である抗4710L8B  IgG(MAb)の吸光度が、0.530であったの対し、陰性対照であるアジュバントのみを投与し得た対照ラット血清より精製したIgG画分（50μg/well）の吸光度は0.244であった。この結果から、当該IgG画分中に、細胞表面に露出するPA4710タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（IgG）が含まれていることが明らかとなった。【０１７９】
抗4710L10  IgG(MAb)の結果：受託番号がFERM  BP-10974であるハイブリドーマを投与したマウス腹水から精製して得たIgG画分である抗4710L10  IgG(MAb)の吸光度が、0.435であったのに対し、陰性対照であるアジュバントのみを投与し得た対照ラット血清より精製したIgG画分（50μg/well）の吸光度は0.092であった。この結果から、当該IgG画分中に、細胞表面に露出するPA4710タンパク質の細胞外領域を認識する抗体（IgG）が含まれていることが明らかとなった。【０１８０】
［実施例１０］：正常マウスにおけるPA103菌株全身感染に対するPA4710組換えタンパク質免疫ラット血清の感染防御能
正常マウス全身感染モデルでの評価は、4週齡のＣＤ−１マウス(日本チャールスリバー社より購入)に5％ムチン含有生理食塩水500μlに懸濁したPA103菌株の生菌1.0x105cfu/マウス（20LD50）を腹腔内に投与し、直後に生理食塩水で2.5倍希釈した血清サンプルを0.1mL/マウスで尾静脈より投与し、７日後の生死で感染防御活性を判定した。【０１８１】
その結果、陰性対照のラットsham血清では7匹中5匹のマウスが死亡したが、ホルマリン不活化PA103菌株を免疫したウサギ血清投与群では全例生存し、感染防御活性が認められた。この条件下で、PA4710組換えタンパク質免疫ラット血清投与群は7匹中6匹生存し、感染防御活性が認められた。【０１８２】
［実施例１１］：好中球減少マウスにおけるPA103菌株全身感染に対するPA4710モノクローナル抗体の感染防御能
好中球減少マウス全身感染モデルでの評価は、cyclophosphamide（以下、CYとする。Sigma-Aldrich社製）の12.5mg/mL（生理食塩水）を調製し、4週齡のCD-1雄性マウスに125mg/kgの投与量でday-5、-2、0に合計3回腹腔内投与して末梢血中の好中球を減少させた。その後、生理食塩水250μlに懸濁したPA103菌株の1.8x105cfu/マウス（133LD50）を腹腔内に接種し、直後に生理食塩水で希釈したサンプル（血清および精製IgG画分）を0.2mL/マウスで尾静脈より投与し、７日後の生死で感染防御活性を判定した。【０１８３】
その結果、精製血清IgG画分をサンプルとした場合（0.5mg/mouse）、陰性対照であるラットsham  IgG投与群は7匹中6匹のマウスが死亡し生存は1匹のみだったが、ホルマリン不活化PA103菌株免疫血清より得られた抗PA103  IgG投与群では7匹中5匹生存し、感染防御活性が認められた。この条件下で、実施例９で得られたラットＭＡｂである抗4710L7  IgG(MAb)および抗4710L8Ｂ  IgG(MAb)投与群は、７匹中それぞれ４および５匹生存し、感染防御活性が認められた。【０１８４】
［実施例１２］：好中球減少マウスにおける多剤耐性緑膿菌全身感染に対する精製血清IgG画分およびモノクローナル抗体の感染防御能
多剤耐性緑膿菌MSC06120菌株に対する各種抗菌剤の最小発育阻止濃度は、イミペネム：32μg/ml、アミカシン：64μg/ml、シプロフロキサシン：＞256μg/mlであった。本菌株を用いた好中球減少マウス全身感染モデルでの評価は、CYの12.5mg/mL（生理食塩水）を調製し、4週齡のCD-1雄性マウスに125mg/kgの投与量でday-5、-2、0に合計3回腹腔内投与して末梢血中の好中球を減少させ、その後、生理食塩水250μlに懸濁したMSC06120菌株の1.73x105cfu/マウス（15.5LD50）を腹腔内に接種し、直後に生理食塩水で希釈したサンプルを0.2mL/マウスで尾静脈より投与し、７日後の生死で感染防御活性を判定した。【０１８５】
その結果、精製血清IgG画分およびモノクローナル抗体をサンプルとした場合（0.5mg/mouse）、陰性対照であるラットsham  IgG投与群は７匹中４匹のマウスが死亡し生存は３匹だったが、ホルマリン不活化PA103菌株免疫血清より得られた抗PA103  IgG投与群では７匹中４匹生存した。この条件下で、実施例６で得られた抗4710  IgGおよび実施例９で得られたラットＭＡｂである抗4710L10  IgG(MAb)投与群は、７匹中それぞれ６および５匹生存し、感染防御活性が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明は、緑膿菌感染症を実質的に予防あるいは治療する能力を有し、さらには緑膿菌感染症患者由来の臨床分離株の多様性に対応するワクチン組成物およびポリクローナル抗体（以下、PAbと記す）またはモノクローナル抗体（以下、MAbと記す）を提供するものであり、緑膿菌感染症の予防若しくは治療剤、または緑膿菌感染症診断薬への応用を可能にするものである。【０１８７】
さらに本発明の抗体は、緑膿菌の外膜ないしは細胞外に存在するPA4710タンパク質の細胞外領域と結合し、しかもこれらの領域は、血清型等によらず株間での保存性が極めて高く多様な臨床分離株と反応すると考えられるため、緑膿菌感染症に対し高い治療効果が期待される。
【配列表】
2009005040000001.app
【国際調査報告】
2009005040.tif 000003
2009005040.tif 000004
2009005040.tif 000005
2009005040.tif 000006