【手続補正書】
【提出日】平成16年12月1日(2004.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】式：
【化１】
2001527079.tif 000001
上式中：
Ｒ1およびＲ2は独立に：
水素；低級アルキル；ハロゲン；アシル；ニトロ；スルホ；
−ＣＨ＝ＮＲ4（ここでＲ4はグアニジノ、複素環基、もしくは−ＮＲ5Ｒ6（ここでＲ5もしくはＲ6は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、低級アルキル、アシル、アリール、複素環基、カルバモイルもしくは低級アルキルアミノカルボニルである）である）；
−ＮＲ5Ｒ6；
−ＣＨ（ＳＲ7）2（ここでＲ7は低級アルキルもしくは２つのＲ7が一緒になってアルキレンを表す）；
−（ＣＨ2）jＲ8［ここでｊは１−６であり、そしてＲ8はハロゲン；置換アリール；未置換アリール；置換ヘテロアリール；未置換ヘテロアリール；Ｎ3；
−ＣＯ2Ｒ9（ここでＲ9は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11（ここでＲ10およびＲ11は独立に水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、低級アルキルアミノカルボニルもしくは低級アルコキシカルボニルであるか、またはＲ10およびＲ11は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；
−ＯＲ12（ここでＲ12は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ13（ここでＲ13は水素、ＮＲ10Ｒ11、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキルもしくは未置換アラルキルである）である；
−ＮＲ10Ｒ11；
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ14（ここでＲ14は水素、低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；または
−Ｓ（＝Ｏ）rＲ15（ここでｒは０ないし２であり、そしてＲ15は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、チアゾリニル、（ＣＨ2）aＣＯ2Ｒ16（ここでａは１もしくは２であり、そしてＲ16は水素もしくは低級アルキルである）、または−（ＣＨ2）aＣ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11である）；である］；
−ＯＲ17（ここでＲ17は水素、低級アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ18（ここでＲ18は置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリールもしくは未置換アリールである）である）；
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ2）jＲ19（ここでＲ19は水素、ハロゲン、ＮＲ10Ｒ11、Ｎ3、ＳＲ15もしくはＯＲ20（ここでＲ20は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキルもしくはＣ（＝Ｏ）Ｒ14である）である）；
−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）jＲ19；
−（ＣＨ2）dＣＨＲ21ＣＯ2Ｒ16A（ここでｄは０−５であり、そしてＲ21は水素、ＣＯＮＲ10Ｒ11もしくはＣＯ2Ｒ16A（ここでＲ16AはＲ16と同義である）である）；
−（ＣＨ2）dＣＨＲ21ＣＯＮＲ10Ｒ11；
−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）mＲ22（ここでｍは０−４であり、そしてＲ22は水素、低級アルキル、ＣＯ2Ｒ9、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、ＯＲ12もしくはＮＲ10Ｒ11である）；
−ＣＨ＝Ｃ（ＣＯ2Ｒ16A）2；
−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）mＲ22；
−ＳＯ2ＮＲ23Ｒ24（ここでＲ23およびＲ24は独立に水素、低級アルキル、もしくは隣接する窒素原子と複素環基を形成する基である）；
−ＯＣＯ2Ｒ13A（ここでＲ13AはＲ13と同義である）；あるいは
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11
であり；
Ｒ3は、水素；低級アルキル；カルバモイル；アミノ；テトラヒドロピラニル；ヒドロキシル；Ｃ（＝Ｏ）Ｈ；アラルキル；低級アルカノイル；もしくはＣＨ2ＣＨ2Ｒ25（ここでＲ25はハロゲン、アミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシルもしくはヒドロキシ置換された低級アルキルアミノである）であり；
Ｘは、水素；ホルミル；カルボキシル；低級アルコキシカルボニル；低級アルキルヒドラジノカルボニル；−ＣＮ；低級アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ26Ｒ27（ここでＲ26およびＲ27は独立に水素、未置換低級アルキルもしくは未置換アリールであるか；またはＲ26およびＲ27は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；−ＣＨ（Ｒ34）Ｗ（ここでＲ34は水素もしくは低級アルキルであり、そしてＷは−Ｎ＝ＣＨＮ（アルキル）2；グアニジノ；Ｎ3；ＮＲ28Ｒ29（ここでＲ28もしくはＲ29は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、アリル、アルカノイル、アリールオキシカルボニル、未置換アルキルもしくはα−アミノ酸の残基、（その中でカルボキシル基のヒドロキシ基が排除される）である）；−ＣＯ2Ｒ9；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11；−Ｓ（＝Ｏ）rＲ30（ここでＲ30は置換もしくは未置換の低級アルキル、アリールもしくはヘテロアリールである）；あるいは−ＯＲ31（ここでＲ31は水素、置換もしくは未置換のアルキル、または置換もしくは未置換のアルカノイルである）である）；
−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ32（ここでＲ32はヒドロキシル、低級アルコキシ、アミノ、グアニジノ、ウレイド、イミダゾリルアミノ、カルバモイルアミノもしくはＮＲ26AＲ27A（ここでＲ26AはＲ26と同義でありかつＲ27AはＲ27と同義である）である）；あるいは
−ＣＨ2Ｑ（ここでＱは
【化２】
2001527079.tif 000002
により表わされる糖残基であり、
上式中Ｖは水素、メチル、エチル、ベンジル、アセチルもしくはトリフルオロアセチルを表わす）
であり；
Ｙは、水素；−ＯＨ；−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ33（ここでＲ33はアルキル、アリールもしくはアミノである）；−ＯＣＨ2Ｏ−アルキル；−Ｏ−アルキル；またはアラルキルオキシであるか；またはＸおよびＹは−Ｘ−Ｙ−として結合されて−ＣＨ2ＯＣＯ2−もしくは−ＣＨ2Ｎ（Ｒ16B）ＣＯ2−（ここでＲ16BはＲ16と同義である）を形成し；
Ａ1およびＡ2は水素であるか、もしくは双方は結合されてＯを表わすか；または
Ｂ1およびＢ2は水素であるか、もしくは双方は結合されてＯを表わす；
の化合物、あるいはその製薬学的に許容できる塩であるが；ただしＡ1、Ａ2もしくはＢ1、Ｂ2の少なくとも一方がＯを表わし；また、さらにただしＸおよびＹの双方が同時に水素ではない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【化６】
2001527079.tif 000003
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
上式中：
Ｒ1およびＲ2は独立に：
水素；低級アルキル；ハロゲン；アシル；ニトロ；スルホ；
−ＣＨ＝ＮＲ4（ここでＲ4はグアニジノ、複素環基、もしくは−ＮＲ5Ｒ6（ここでＲ5もしくはＲ6は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、低級アルキル、アシル、アリール、複素環基、カルバモイルもしくは低級アルキルアミノカルボニルである）である）；
−ＮＲ5Ｒ6；
−ＣＨ（ＳＲ7）2（ここでＲ7は低級アルキルもしくは２つのＲ7が一緒になってアルキレンを表す）；
−（ＣＨ2）jＲ8［ここでｊは１−６であり、そしてＲ8はハロゲン；置換アリール；未置換アリール；置換ヘテロアリール；未置換ヘテロアリール；Ｎ3；
−ＣＯ2Ｒ9（ここでＲ9は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11（ここでＲ10およびＲ11は独立に水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、低級アルキルアミノカルボニルもしくは低級アルコキシカルボニルであるか、またはＲ10およびＲ11は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；
−ＯＲ12（ここでＲ12は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ13（ここでＲ13は水素、ＮＲ10Ｒ11、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキルもしくは未置換アラルキルである）である）；
−ＮＲ10Ｒ11；あるいは
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ14（ここでＲ14は水素、低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリールである）；または
−Ｓ（＝Ｏ）rＲ15（ここでｒは０ないし２であり、そしてＲ15は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換アラルキル、未置換アラルキル、チアゾリニル、（ＣＨ2）aＣＯ2Ｒ16（ここでａは１もしくは２であり、そしてＲ16は水素もしくは低級アルキルである）、または−（ＣＨ2）aＣ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11である）；
である］；
−ＯＲ17（ここでＲ17は水素、低級アルキルもしくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ18（ここでＲ18は置換低級アルキル、未置換低級アルキル、置換アリールもしくは未置換アリールである）である）；
−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ2）jＲ19（ここでＲ19は水素、ハロゲン、ＮＲ10Ｒ11、Ｎ3、ＳＲ15もしくはＯＲ20（ここでＲ20は水素、置換低級アルキル、未置換低級アルキルもしくはＣ（＝Ｏ）Ｒ14である）である）；
−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）jＲ19；
−（ＣＨ2）dＣＨＲ21ＣＯ2Ｒ16A（ここでｄは０−５であり、そしてＲ21は水素、ＣＯＮＲ10Ｒ11もしくはＣＯ2Ｒ16A（ここでＲ16AはＲ16と同義である）である）；
−（ＣＨ2）dＣＨＲ21ＣＯＮＲ10Ｒ11；
−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）mＲ22（ここでｍは０−４であり、そしてＲ22は水素、低級アルキル、ＣＯ2Ｒ9、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、ＯＲ12もしくはＮＲ10Ｒ11である）；
−ＣＨ＝Ｃ（ＣＯ2Ｒ16A）2；
−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）mＲ22；
−ＳＯ2ＮＲ23Ｒ24（ここでＲ23およびＲ24は独立に水素、低級アルキル、もしくは隣接する窒素原子と複素環基を形成する基である）；
−ＯＣＯ2Ｒ13A（ここでＲ13AはＲ13と同義である）；あるいは
−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11
であり；
Ｒ3は、水素；低級アルキル；カルバモイル；アミノ；テトラヒドロピラニル；ヒドロキシル；Ｃ（＝Ｏ）Ｈ；アラルキル；低級アルカノイル；もしくはＣＨ2ＣＨ2Ｒ25（ここでＲ25はハロゲン、アミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシルもしくはヒドロキシ置換された低級アルキルアミノである）であり；
Ｘは、水素；ホルミル；カルボキシル；低級アルコキシカルボニル；低級アルキルヒドラジノカルボニル；−ＣＮ；低級アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ26Ｒ27（ここでＲ26およびＲ27は独立に水素、未置換低級アルキルもしくは未置換アリールであるか；またはＲ26およびＲ27は窒素原子と結合して複素環基を形成する）；−ＣＨ（Ｒ34）Ｗ（ここでＲ34は水素もしくは低級アルキルであり、そしてＷは−Ｎ＝ＣＨＮ（アルキル）2；グアニジノ；Ｎ3；ＮＲ28Ｒ29（ここでＲ28もしくはＲ29は水素もしくは低級アルキルであり、そして他方は水素、アリル、アルカノイル、アリールオキシカルボニル、未置換アルキルもしくはα−アミノ酸の残基（その中でカルボキシル基のヒドロキシ基が排除される）である）；−ＣＯ2Ｒ9；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ10Ｒ11；−Ｓ（＝Ｏ）rＲ30（ここでＲ30は置換もしくは未置換の低級アルキル、アリールもしくはヘテロアリールである）；あるいは−ＯＲ31（ここでＲ31は水素、置換もしくは未置換のアルキル、または置換もしくは未置換のアルカノイルである）である）；
−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ32（ここでＲ32はヒドロキシル、低級アルコキシ、アミノ、グアニジノ、ウレイド、イミダゾリルアミノ、カルバモイルアミノもしくはＮＲ26AＲ27A（ここでＲ26AはＲ26と同義でありかつＲ27AはＲ27と同義である）である）；あるいは
−ＣＨ2Ｑ（ここでＱは
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明のいくつかの態様において、Ｋ−２５２ａの３’−エピマー誘導体は製薬学的組成物に処方される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のＫ−２５２ａの３'−エピマー誘導体は、チロシンキナーゼ活性の阻害、例えばＰＫＣもしくはｔｒｋチロシンキナーゼの阻害（この阻害は癌を包含する疾患の治療に有用でありうる）を包含する薬理学的活性を示す。本発明の化合物は栄養因子応答性細胞、例えばコリン作動性ニューロンの機能および／もしくは生存を高めるのに有用である。ニューロンに対する影響は以下、すなわち（１）培養された脊髄のコリンアセチルトランスフェラーゼ（「ＣｈＡＴ」）アッセイ；および（２）培養された基底前脳ニューロン（「ＢＦＮ」）のＣｈＡＴ活性アッセイを初めとするアッセイで立証され得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
栄養因子応答性細胞の栄養因子誘発活性を高めるため、本発明の化合物は、哺乳動物、例えばヒトでのニューロン系統の細胞の機能および／もしくは生存を高める治療薬として使用され得る。とりわけ、それらは、低下されたＣｈＡＴ活性もしくは脊髄の運動ニューロンに対する傷害を伴う障害の治療で有用である。
化学合成
本発明の化合物は後述されるとおり製造され得る（図１−７）。当該化合物は適当に保護されたＫ−２５２ａ誘導体を用いて出発することにより製造され得る。Ｋ−２５２ａは例えばアセテートもしくはシリル誘導体としてラクタムのアミドの窒素を保護され得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
Ｒ1およびＲ2の位置に置換基をもつＫ−２５２ａ誘導体を製造するのに使用される既知の方法が、３’−エピ−Ｋ−２５２ａ上で対応するＲ1およびＲ2の位置に置換基を得るのに使用され得る。例えば、米国特許第４，９２３，９８６；５，４６１，１４６：および５，６５４，４２７号を参照。例えば、１等量のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）でのＸＩＶの処理（図７）はＲ1がＢｒである誘導体ＸＸＶを生じる。２等量のＮＢＳはＲ1およびＲ2双方がＢｒである誘導体を与えるとみられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明はＫ−２５２ａの３’−エピマー誘導体の製薬学的に許容できる塩を包含する。製薬学的に許容できる塩は、製薬学的に許容できる酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、およびアミノ酸付加塩を包含する。酸付加塩は、塩酸塩、硫酸塩およびリン酸塩のような無機酸付加塩、ならびに酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩および乳酸塩のような有機酸付加塩を包含する。金属塩の例は、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩ならびに亜鉛塩である。アンモニウム塩の例はアンモニウム塩およびテトラメチルチルアンモニウム塩である。有機アミン付加塩の例はモルホリンおよびピペリジンとの塩である。アミノ酸付加塩の例は、グリシン、フェニルアラニン、グルタミン酸およびリシンとの塩である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
実験実施例
チロシンキナーゼ活性の阻害
Ｋ−２５２ａのエピマー誘導体を、アンジェレ（Ａｎｇｅｌｅｓ）らにより記述された（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：４９−５５、１９９６）とおり、ＥＬＩＳＡを基礎としたアッセイを使用して、バキュロウイルスで発現されたヒトｔｒｋＡの細胞質ドメインのキナーゼ活性の阻害について試験した。９６穴マイクロタイタープレートを基質溶液（組換えヒトホスホリパーゼＣ−γ／グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質；ロティン（Ｒｏｔｉｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１：５５９−５６７、１９９２）で被覆した。阻害を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、４０μＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．１％ＢＳＡ、２％ＤＭＳＯおよび多様な濃度の阻害剤を含有する１００μｌのアッセイ混合物中で測定した。反応を、ｔｒｋＡキナーゼの添加により開始し、そして３７℃で１５分間進行させた。ホスホチロシンに対する抗体（ＵＢＩ）、次いで二次酵素結合抗体、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））をその後添加した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
プロテインキナーゼＣ活性の阻害
プロテインキナーゼＣ活性を、ミリポア  マルチスクリーン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）ＴＣＡインプレート(in-plate)アッセイ（ピット（Ｐｉｔｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１：４７−５１、１９９６）を使用して測定した。アッセイを、９６穴マルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）−ＤＰプレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））中で実施した。各４０μｌのアッセイ混合物は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、８０ｍｇ／ｍｌホスファチジルセリン、３．２ｍｇ／ｍｌジオレイン、２００ｍｇ／ｍｌヒストンＨ−１（フルカ（Ｆｌｕｋａ））、５ｍＭ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ、１．５ｎｇプロテインキナーゼＣ（ＵＢＩ；ａ、ｂ、ｇのアイソザイムの混合物）、０．１％ＢＳＡ、２％ＤＭＳＯおよびＫ−２５２ａの３’−エピマー誘導体を含有した。反応を３７℃で１０分間進行させた。反応を氷冷５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でクエンチした。プレートを４℃で３０分間平衡化し、その後氷冷２５％ＴＣＡで洗浄した。シンチレーションカクテルをプレートに添加し、そして放射活性をワラック  マイクロベータ  １４５０プラス（Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  １４５０  ＰＬＵＳ）シンチレーション計数器を使用して測定した。ＩＣ50値を、データをグラフパッド  プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）中のＳ字形の用量応答（変動する傾き）等式に適合させることにより算出した。結果を表４に要約する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
Ｋ−２５２ａの３’−エピマー誘導体は、解離されたラット胚脊髄培養物アッセイでＣｈＡＴ活性を増大させた（表５）。化合物ＸＶＩＩは、細胞が対照の組織培養ウェルに付着するための２〜３時間のプレート培養期間の後に、ＣｈＡＴ活性を、対照培養物（Ｋ−２５２ａの３'−エピマー誘導体で処理されない）に対して１９５％まで増大させた。これらのアッセイでは、化合物を解離された脊髄培養物に直接添加した。ＣｈＡＴ活性を対照活性の少なくとも１２０％まで増大させた化合物を活性があるとみなした。増大されたＣｈＡＴ活性が、選択されたＫ−２５２ａの３'−エピマー誘導体の単回の適用後に観察された。結果を表５に要約する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
ニューロンの生存を、蛍光定量的生存率アッセイ（ボジツコ・コイネ（Ｂｏｚｙｃｚｋｏ−Ｃｏｙｎｅ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．５０：２０５−２１６、１９９３）でカルセインＡＭ（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージーン）により４日後に評価した。培養培地を、ダルベッコのリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）で連続的に希釈した。６μＭの最終濃度のカルセインＡＭストックを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションし、次いでＤＰＢＳで連続的に希釈洗浄した。蛍光シグナルを、プレート読取り蛍光定量器（サイトフルオル（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）２３５０）（励起＝４８５ｎｍ；発光＝５３８ｎｍ）を使用して読み取った。各プレートについて、カルセインＡＭを受領するがしかし細胞を含有しないウェルから生じた平均の背景を全部の値から差し引いた。蛍光シグナルの直線性を、細胞密度の範囲での濃度およびインキュベーション時間について確かめた。ニューロンの顕微鏡での計数は相対的蛍光値と直接相関した。
化合物Ｖの製造
化合物ＩＶｂ（米国特許第４，９２３，９８６号）をトリメチルホスファイト（２ｍＬ）に溶解し、そして３時間還流下に加熱した。反応混合物を室温に冷却し、そして、クロロホルム−メタノール（２０：１）を使用してフラッシュシリカゲルカラムを通して洗い流してトリメチルホスファイトを除去した。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；酢酸エチル：ヘキサン；１：１）により精製して化合物Ｖを淡黄色固形物（１５ｍｇ、９５％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ４０６（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．６２（ｓ、３Ｈ）、２．８５（ｄ、１Ｈ）、３．３７−３．４５（ｍ、１Ｈ）、４．９５（ｓ、１Ｈ）、５．００（ｓ、２Ｈ）、５．０９（ｓ、１Ｈ）、６．２９（ｓ、１Ｈ）、６．９０（ｄ、１Ｈ）、７．３３−７．５３（ｍ、５Ｈ）、７．９１（ｄ、１Ｈ）、９．４１（ｄ、１Ｈ）。
化合物ＶＩの製造
窒素下、０℃の化合物Ｖ（１６１ｍｇ、０．３９７ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（８ｍＬ）溶液に、ＢＨ3 ＴＨＦ（１．５９ｍＬの１Ｍ溶液、１．５９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、そしてその後一夜室温に温めた。混合物を０℃に再冷却し、そして１０％ＮａＯＨ（０．１ｍＬ）を気体の活発な発生を伴い添加した。過酸化水素（８０ｍＬ）をその後一滴ずつ添加した。０℃で３０分間攪拌した後に、反応を酢酸エチル（１５ｍＬ）で希釈し、そして水（３×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして淡緑色固形物まで真空中で濃縮した。生成物をクロマトグラフィー（シリカゲル：ヘキサン：酢酸エチル；１：１）により精製して化合物ＶＩを白色固形物（０．１２ｇ、７１％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ４２４（Ｍ＋Ｈ）+；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．５４（ｓ、３Ｈ）、２．５１（ｍ、１Ｈ）、２．９９−３．０１（ｍ、２Ｈ）、３．４７（ｍ、１Ｈ）、３．８（ｍ、１Ｈ）、５．０４９（ｓ、２Ｈ）、６．２１（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、６．９８（ｍ、１Ｈ）、７．１３−７．４９（ｍ、６Ｈ）、７．９４−８．０２（ｍ、２Ｈ）、９．３４（ｄ、１Ｈ）。
化合物ＶＩＩの製造
室温で窒素下の化合物Ｖａ（ＴＢＤＭＳ−Ｖ）（３５０ｍｇ、０．６７３ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、ピリジン（０．４３５ｍＬ、５．３９ｍｍｏｌ）、次いで四酸化オスミウム（６．７３ｍＬ、０．６７３ｍｍｏｌ、ＣＣｌ4中０．１Ｍ）を添加した。反応混合物を室温で３６時間攪拌した。この時間の間に混合物は色を黄色から橙褐色まで変化させた。水性重亜硫酸ナトリウム（３０ｍＬ）を反応混合物に添加し、そして反応を３０分間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で濃縮して淡褐色薄膜を得た。混合物を、酢酸エチルを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物ＶＩＩａ（ＴＢＤＭＳ−ＶＩＩ）を黄色固形物（２８０ｍｇ、７６％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ+）：ｍ／ｅ  ５４４（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ０．５６（ｄ、６Ｈ）、１．０７９（ｓ、９Ｈ）、２．０４（ｄｄ、１Ｈ）、２．１２（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、２．４０（ｓ、３Ｈ）、２．８６（ｄｄ、１Ｈ）、３．５２（ｂｒｏａｄ  ｓ、３Ｈ）、４．９９（ｓ、２Ｈ）、６．９８（ｄｄ、１Ｈ）、７．３２（ｔ、１Ｈ）、７．３９−７．４６（ｍ、４Ｈ）、７．９７（ｄｄ、２Ｈ）、９．３５（ｄ、１Ｈ）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
化合物ＸＸＩＩＩは上述されたアッセイで以下のＩＣ50値を示した。すなわち、ｔｒｋＡキナーゼの阻害、４ｎＭ；ＶＥＧＦレセプターキナーゼの阻害、２５ｎＭ、およびプロテインキナーゼＣの阻害、＞１０００ｎＭ。
化合物ＸＸＶの製造
室温で窒素下の、化合物ＸＩＶ（３０．４ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の攪拌されたＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１１．６ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応混合物は当初色が淡橙色であり、そして徐々に淡紫色になった。反応混合物を室温で一夜攪拌した。溶媒を真空中で除去し、そして、固形物を、ヘキサン−酢酸エチル（２：１）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。化合物ＸＸＶを灰白色固形物（３１．２ｍｇ、８８％収率）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ  ５４７（Ｍ＋Ｈ）+、1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、３００ＭＨｚ）：δ２．４２（ｓ、３Ｈ）、２，７７−２．８３（ｍ、１Ｈ）、２．８６（３Ｈ、ｓ）、３．１６６（ｄｄ、１Ｈ）、４．１０５（ｓ、１Ｈ）、５．０７（ｓ、２Ｈ）、６．３９（ｓ、１Ｈ）、７．０１（ｄｄ、１Ｈ）、７．９５（ｄ、１Ｈ）、７．５８（ｄ、１Ｈ）、７．３４−７．５７（ｍ、４Ｈ）、９．５０（ｓ、１Ｈ）。
化合物ＸＸＩＸの製造