(57)【要約】  関節炎，特に関節リウマチを治療及び／又は予防するための薬剤及び方法が提供されている。当該薬剤は，ヒト間葉系幹細胞を含んでなり，当該方法は，ヒト間葉系幹細胞の有効量を患者に投与することを含んでなる。
2009031606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト間葉系幹細胞を含んでなることを特徴とする，関節炎治療剤。
【請求項２】
該関節炎が哺乳類の関節炎である，請求項１の関節炎治療剤。
【請求項３】
該哺乳類がヒト又はげっ歯類である，請求項２の関節炎治療剤。
【請求項４】
該哺乳類がヒトである，請求項２の関節炎治療剤。
【請求項５】
該ヒト間葉系幹細胞がヒト骨髄由来のものである，請求項３又は４の関節炎治療剤。
【請求項６】
該哺乳類がヒトであり，該ヒトが，該ヒト間葉系幹細胞の起源と同一人でないものである，請求項５の関節炎治療剤。
【請求項７】
該哺乳類がヒトであり，該関節炎が関節リウマチである，請求項５又は６の関節炎治療剤。
【請求項８】
注射剤である，請求項１ないし７の何れかの関節炎治療剤。
【請求項９】
静脈内投与用注射剤である，請求項８の関節炎治療剤。
【請求項１０】
哺乳類患者における関節炎を治療するための方法であって，ヒト間葉系幹細胞の有効量を該患者に投与することを含んでなるものである方法。
【請求項１１】
該哺乳類がヒト又はげっ歯類である，請求項１０の治療方法。
【請求項１２】
該哺乳類がヒトである，請求項１０の治療方法。
【請求項１３】
該ヒト間葉系幹細胞がヒト骨髄由来のものである，請求項１０ないし１２の何れかの治療方法。
【請求項１４】
該哺乳類がヒトであり，該関節炎が関節リウマチである，請求項１３の治療方法。
【請求項１５】
該ヒト間葉系幹細胞が注射により該患者に投与されるものである，請求項１０ないし１４の何れかの治療方法。
【請求項１６】
該ヒト間葉系幹細胞が静脈内投与されるものである，請求項１５の治療方法。
【請求項１７】
哺乳類の関節炎治療及び予防剤の製造のためのヒト間葉系幹細胞の使用。
【請求項１８】
該哺乳類がヒト又はげっ歯類である，請求項１７の使用。
【請求項１９】
該哺乳類がヒトである，請求項１７の使用。
【請求項２０】
該ヒト間葉系幹細胞がヒト骨髄由来のものである，請求項１７ないし１９の何れかの使用。
【請求項２１】
該哺乳類がヒトであり，該関節炎が関節リウマチである，請求項２０の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，関節炎治療及び予防剤に関し，特に，ヒトの間葉系幹細胞を有効成分とする関節炎治療及び予防剤，取り分け関節リウマチに対する治療及び予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（rheumatoid  arthritis）は，非化膿性の多発性の慢性関節炎である。その患者数は全世界では約５００万人を数え，日本国内に限っても約７０万人という多数の患者を抱えており，頻度の高い疾患である。関節リウマチの発症は，通常，手足の指の関節等，身体末端部の関節に始まり，次第に膝関節等のような身体中心部寄りの大きな関節が，更には頚椎までもが侵されるようになる。関節リウマチを発症している関節部には，進行の程度に応じて腫脹，強ばりや強い痛みが伴い，それにより患者は日常生活に支障をきたすことになる。炎症の進行により，軟骨の破壊・消失，骨の糜爛，関節腔の消失，関節の変形や脱臼，更には，関節構造自体の消失による骨同士の直接接触（強直）にまで至り得る。【０００３】
関節リウマチ患者では，多くの場合，血中においてＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体（リウマチ因子：ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥ）が陽性であり，またこれは通常，重症患者において特に顕著である。しかしながら，関節リウマチ患者でありながらリウマチ因子陰性のケースも少なからず見られ，他方，関節リウマチ以外でも膠原病，感染症，慢性肝疾患その他の疾患や，高齢者においてリウマチ因子陽性となる場合も見られる。このように，発症におけるリウマチ因子の関わりも含め，関節リウマチの原因は現在のところ明らかでない。【０００４】
病理組織学的には，関節リウマチは，組織への好中球やリンパ球等の炎症系細胞の関節腔内への浸潤に始まる。炎症性サイトカイン等のような可溶性因子の過剰産生下で軟骨上での滑膜の増生が起こり，これが軟骨の破壊及び骨への浸潤と破壊を伴いつつ，滑膜細胞，繊維芽細胞等からなる絨毛状の組織（パンヌス）を形成する。進行と共に関節腔は，増生した滑膜及び炎症性細胞（好中球，炎症性リンパ球その他）で埋め尽くされるようになる。そのような状態では，軟骨消失，骨破壊が進んでおり，関節は既に可動性を失っている。【０００５】
関節リウマチについての現在の治療指針では，関節リウマチと診断された場合，速やかにメトトレキサートなどの抗リウマチ薬を用いることが推奨されている。標準薬として第一選択とされる葉酸合成阻害薬メトトレキサートは，核酸合成阻害を介して免疫抑制作用を発現していると考えられており，死亡を含む重篤な副作用として，白血球減少などの骨髄抑制が報告されている。それ以外にもメトトレキサートには，やはり死亡を含む重篤な副作用として間質性肺炎の発症も報告されている。これらの副作用リスクのため，同薬剤は投与に慎重を要するという問題がある。また，同薬剤が奏効しない関節リウマチ患者の割合が４０％程度もあり，奏効する場合でも投与してから効果が現われるまでに４週間程度は必要とするという難点がある。【０００６】
一方，副腎皮質ステロイド製剤は，免疫抑制作用及び抗炎症作用を有しており，関節リウマチの治療上有効であるが，長期間の使用は，副作用として胃腸障害，骨粗しょう症，満月様顔貌等を引き起こし，しかも効果も低下するという問題がある。更には，投与を中止した場合のリバウンドのリスクのため，脱離が困難であるという問題がある。【０００７】
また，関節リウマチ炎症及び痛みに対して，非ステロイド系消炎鎮痛剤（ＮＳＡＩＤ）も用いられている。しかしながらこれは対症療法に過ぎず，関節リウマチの骨破壊の進行を抑えることはできない。【０００８】
このような状況において，近年注目されているのが，関節リウマチの炎症部位に発現する炎症性サイトカインを介して作用する生物製剤である。その代表的なものは，ＴＮＦ−α阻害薬であるインフリキシマブ，アダリムマブ，エタネルセプトである。しかしながら，インフリキシマブは，キメラ抗体ゆえに，これに対する患者の抗体の出現による効果の低下等の副作用が問題となっている。また，完全なヒト型抗体であるアダリムマブ，エタネルセプトでは患者の抗体の出現は抑制されるものの，単独投与での効果は十分でなく，依然としてメトトレキサートとの同時服用が推奨されている。また，これらいずれのＴＮＦ−α阻害薬も，粟粒結核，肺外結核を含む結核や敗血症等の重篤な感染症，あるいは日和見感染による致死的な呼吸器感染症等の感染症を，副作用として引き起こすおそれがある。【０００９】
上記のように，関節リウマチに対しては，十分な有効性と安全性とを備えた薬剤は，現在までのところ存在しない。その一方で関節リウマ患者の数は既に膨大であり，更に，先進国における人口分布の高齢化も相俟って，急速に増え続けている。【００１０】
関節炎には，関節リウマチの他にも，スティル病に伴う慢性乃至難治性の関節炎がある。スティル病に伴う関節炎の場合も，関節リウマチ同様に，その原因は，ウイルス感染，免疫異常が何らかの形で関与していると推測されているものの，未だ不明である。スティル病に伴うそのような関節炎に対しても，関節リウマチに用いられる非ステロイド系抗炎症剤及び副腎皮質ステロイド剤が治療薬として用いられているが，患者によりその治療効果は一定でない等の問題があり，それら慢性乃至難治性の関節炎に対する有効な治療薬の開発も望まれている。【００１１】
一般に，関節リウマチの炎症部位においては，関節における軟骨及び骨の破壊，関節腔への好中球，リンパ球等の炎症性細胞の浸潤，関節腔における滑膜の過剰な増生等が観察されるが，それらは関節リウマチに限らず関節炎全般に広く認められる現象であり，関節炎における共通の基本的な病理像である。従って，それらを抑制又は阻止できる薬剤は，関節リウマチを含む広範な関節炎の治療に有用であろう。【００１２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は，骨髄等の間葉系組織中にごく僅かに見出される未分化の細胞であり，多能性で，高い増殖能を有するとともに，骨細胞，軟骨細胞，筋肉細胞，腱細胞，ストローマ細胞，脂肪細胞等への分化能を有している。ヒト間葉系幹細胞は，人工培地を用いて培養し増殖させることができ（特許文献１参照），他の培養細胞と同様に，凍結状態で保存して供給することができることが知られている。また，間葉系幹細胞は，骨髄中に限らず，脂肪組織（特許文献２参照），歯髄細胞（特許文献３参照），胎盤組織または臍帯組織（特許文献４参照）等，種々の組織から入手できることが知られている。【００１３】
ヒヒにおける同種異系間での皮膚移植片の拒絶がヒヒの間葉系幹細胞をレシピエント側動物に投与することにより抑制されること，イヌにおける同種異系間での骨髄移植による移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）がイヌの間葉系幹細胞の投与により抑制されること，更に，in  vitro（混合リンパ球反応）において，ヒトのＴリンパ球がヒト間葉系幹細胞（異系）に対し増殖応答をせず，またヒトの混合リンパ球反応がＭＨＣタイプ非特異的にヒト間葉系幹細胞によって抑制されること，及びイヌにおいても同様であること，そしてそれらの結果に基づき，ヒト間葉系幹細胞を，ヒト間の移植における免疫応答の抑制に用いることの可能性についての開示がなされている（同一の優先権基礎出願に基づく特許文献５，６及び後者の翻訳文である特許文献７参照）。【００１４】
間葉系幹細胞のこのような効果に期待して，ヒトの骨髄移植後の急性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対するヒト間葉系幹細胞の抑制効果を評価するための臨床試験が，ステロイド不応性の重症ＧｖＨＤ患者について行われ，結果が報告されている（非特許文献１参照）。この報告では，患者は，悪性腫瘍に対しては抗癌剤（シクロホスファミド，ブスルファン，フルダラビン）及び／又は全身照射（ＴＢＩ）で処置され，ＧｖＨＤの予防及び治療のためにはメトトレキサート及びシクロホスファミド又はプレドニゾロンが投与され，その上でヒト間葉系幹細胞の投与（０．７〜９×１０6個／ｋｇ体重）を受けた。これら免疫系の抑制された状態にある患者に対し，ヒト間葉系幹細胞の投与は，全体として８名中６名において応答を示したことが報告されている。【００１５】
ＧｖＨＤとの関連では，間葉系幹細胞は宿主における免疫細胞の抑制をもたらすと考えられているが（非特許文献２参照），そのメカニズムは十分には解明されていない。間葉系幹細胞を，血管新生，自己免疫疾患，炎症応答（アルツハイマー病，パーキンソン病，脳卒中，脳細胞傷害，乾癬，慢性皮膚炎，接触性皮膚炎，骨関節炎，関節リウマチその他の関節炎，炎症性腸疾患，慢性肝炎におけるもの），癌，アレルギー性疾患，敗血症，外傷（火傷，手術，移植），各種組織・臓器の炎症（角膜，水晶体，色素上皮，網膜，脳，脊髄，妊娠中の子宮，卵巣，精巣，副腎）に対して使用することも提唱されている（特許文献８参照）。しかしながら，同文献では，間葉系幹細胞の機能がin  vitroで調べられているに過ぎず，生体中における，また具体的疾患モデルにおける検討は，何れもなされていないため，それらの疾患に対する間葉系幹細胞の実際的有用性を評価するための如何なる手掛かりも，同文献は提供していない。【００１６】
他方，免疫反応の抑制という点に着目して，間葉系幹細胞が関節リウマチ等の関節炎における活性なＴ細胞を抑制するだけの治療的価値を有するか否かについて，動物実験に基づいた報告がなされている（非特許文献３参照）。それによれば，マウス間葉系幹細胞（異系）が，関節リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎を発症させたマウスに投与（尾静脈内注射，１０6又は４×１０6個）されたが，マウス間葉系幹細胞は如何なる利益ももたらさず，炎症を起こしている関節への同細胞のホーミングも認められないが，関節炎は悪化したことから，間葉系幹細胞は，少なくともそのままでは，炎症性疾患の治療には適さない，と結論づけられている。【００１７】
これに対し最近，マウスの間葉系幹細胞（異系）をコラーゲン誘導関節炎マウスに投与（腹腔内，５×１０6個）することにより，関節炎症状が緩解されたとの報告がなされている（非特許文献４参照）。その中では，先の文献（特許文献３）と結果が相反することの理由も述べられており，それによれば，先の文献に記載の実験では不死化しセルライン化した間葉系幹細胞を用いていたこと（これに対し後の報告では，１回のin  vitro継代を経ただけの，初代培養細胞を用いていた），先の文献のセルラインがin  vivoの状況では抗原特異的な免疫応答を阻止するのに効果的ではなかったこと等が指摘されている。しかしながら，それらの相違点に加えて，先の文献においては，間葉系幹細胞が尾静脈より注入されており，後の文献においては腹腔内投与されている，という投与経路の違いも存在する。間葉系幹細胞は，比較的サイズが大きく，接着性があり，腹腔投与では多くが腹膜にトラップされてしまい循環血には極めて移行しにくいと考えられるため，両報告における投与経路の相違は重大である。実際，後の文献には，投与された間葉系幹細胞が，投与後の１週間を通して腹膜にコロニーを形成することが報告されている。同時に血流にも移行し始めるらしいこと及び脾臓に行き着き投与７日後には脾臓に痕跡を残すことも併せて述べられているが，腹膜にトラップされるおそれなしに間葉系幹細胞を直ちに循環血中に入ることのできる静脈注射とは，対照的である。従って，投与後の体内分布の相違が一要因として考えられる。先の文献では，静脈内投与された間葉系幹細胞の，炎症を起こしている関節へのホーミングが認められなかったことが報告され，後の文献においても関節へのホーミングは確認されていない。間葉系幹細胞によりＴＮＦαが多量に分泌されてその結果何らかの「逆説的」な抗炎症作用をもたらす等，メカニズムが後の文献中で考察されているものの，静脈投与で効果が無く，腹腔投与で効果が現われたことの理由については，混沌としている。【００１８】
このように，同種異系の間葉系幹細胞の投与により動物の関節炎を抑制できるか否かについては，投与経路，用いる細胞が初代培養細胞か継代培養細胞かによる影響の可能性の有無など，不明な要素が多く，特に，間葉系幹細胞を静脈内投与した場合に関節炎を抑制できるか否かについて，取り分け，間葉系幹細胞として（初代培養細胞でなく）入手のより容易な継代培養細胞を用い，且つ投与経路を静脈内としたときに，関節炎に対して抑制効果を奏し得るか否かについては，予測は否定的であった。【００１９】
【特許文献１】米国特許第５４８６３５９号
【特許文献２】特開２００４−１２９５４９
【特許文献３】特開２００４−２０１６１２
【特許文献４】特開２００４−２１０７１３
【特許文献５】米国特許第６３２８９６０号
【特許文献６】ＷＯ  ９９／４７１６３
【特許文献７】特表２００２−５０６８３１号
【特許文献８】ＷＯ  ２００５／０９３０４４
【非特許文献１】Transplantation, 81(10):1390-1397(2006）
【非特許文献２】Blood,  105(4):1815-22(2005)
【非特許文献３】Arthritis & Rheumatism, 52(5),1595-1603(2005)
【非特許文献４】Arthritis & Rheumatism, 56(4):1175-1186(2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
上記の背景の下，本発明は，関節炎，特に関節リウマチを治療及び／又は予防するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは，ラットの間葉系幹細胞を，コラーゲン誘導関節炎マウスに静脈注射したしたところ，拒絶反応もなく，しかも投与した細胞がマウスにとって異種であるにもかかわらず，マウスの関節炎を抑制できることを見出した（実施例，実験３）。更に進めて，本発明者らは，ヒト間葉系幹細胞（継代培養物）を，コラーゲン誘導関節炎マウスに静脈注射し，やはり異種細胞であるにも関わらず，関節炎を顕著に抑制することを見出した（実施例，実験１，２）。本発明はこれらの発見に基づいて完成されたものである。【００２２】
すなわち，本発明は以下を提供する。
１．ヒト間葉系幹細胞を含んでなることを特徴とする，関節炎治療及び予防剤。
２．該関節炎が哺乳類の関節炎である，上記１の関節炎治療及び予防剤。
３．該哺乳類がヒト又はげっ歯類である，上記２の関節炎治療及び予防剤。
４．該哺乳類がヒトである，上記２の関節炎治療及び予防剤。
５．該ヒト間葉系幹細胞がヒト骨髄由来のものである，上記３又は４の関節炎治療及び予防剤。
６．該哺乳類がヒトであり，該ヒトが，該ヒト間葉系幹細胞の起源と同一人でないものである，上記５の関節炎治療及び予防剤。
７．該哺乳類がヒトであり，該関節炎が関節リウマチである，上記５又は６の関節炎治療及び予防剤。
８．注射剤である，上記１ないし７の何れかの関節炎治療及び予防剤。
９．静脈内投与用注射剤である，上記８の関節炎治療及び予防剤。
１０．哺乳類患者における関節炎を治療するための方法であって，ヒト間葉系幹細胞の有効量を該患者に投与することを含んでなるものである方法。
１１．該哺乳類がヒト又はげっ歯類である，上記１０の治療方法。
１２．該哺乳類がヒトである，上記１０の治療方法。
１３．該ヒト間葉系幹細胞がヒト骨髄由来のものである，上記１０ないし１２の何れかの治療方法。
１４．該哺乳類がヒトであり，該関節炎が関節リウマチである，上記１３の治療方法。
１５．該ヒト間葉系幹細胞が注射により該患者に投与されるものである，上記１０ないし１４の治療方法。
１６．該ヒト間葉系幹細胞が静脈内投与されるものである，上記１５の治療方法。
１７．哺乳類の関節炎治療及び予防剤の製造のためのヒト間葉系幹細胞の使用。
１８．該哺乳類がヒト又はげっ歯類である，上記１７の使用。
１９．該哺乳類がヒトである，上記１７の使用。
２０．該ヒト間葉系幹細胞がヒト骨髄由来のものである，上記１７ないし１９の使用。
２１．該哺乳類がヒトであり，該関節炎が関節リウマチである，上記２０の使用。
【発明の効果】
【００２３】
ヒト間葉系幹細胞は，哺乳類，特にヒト及びげっ歯類の関節炎を治療し及び／又は予防する薬剤の製造のために使用することができる。またそれにより得られる本発明の関節炎治療及び予防剤は，哺乳動物の関節炎において，関節腔内への炎症性細胞の浸潤や，滑膜の増生，それに伴う軟骨の破壊・消失及び骨の侵食・破壊という炎症の本体を極めて強く抑制することにより関節炎を緩解させ，又はその進行を防止若しくは遅延させることができる。従って，哺乳動物の関節炎，特にヒトの関節炎，取り分け患者数が多く，重症化により生活の質を著しく低下させ，致命的ともなる関節リウマチに対して，炎症そのものを治療し関節の破壊を防ぐ薬剤として，用いることができる。【００２４】
また，本発明の関節炎治療及び予防剤は，１回投与等，ごく少ない回数の投与で顕著な効果を現し，効果の発現も迅速であるという利点を有する。しかも，本発明の関節炎治療及び予防剤は，細胞製剤であるにも拘わらず，その薬効成分であるヒト間葉系幹細胞は異種の宿主に対してもその免疫反応を惹起させることがないことから，通常の細胞では免疫抑制手段と併用しない限り実行不可能な，種を超えた投与もでき，またヒトにおいて，本発明の治療及び予防剤に含まれる間葉系幹細胞と患者とのＭＨＣ（主要組織適合性複合体）における相違を考慮することなく投与することもできる。このため，ヒト間葉系幹細胞を含む本発明の薬剤は，予め製造され準備された製剤としてストックしておき，どの患者に対しても同じ製剤を共通して用いることができる。従って，本発明の関節炎治療及び予防剤は，細胞製剤でありながら，患者自身から細胞を採取する必要をなくし，患者を，骨髄等からの細胞採取の肉体的負担とリスクに曝すことがない。従ってまた，関節の患者にヒト間葉系幹細胞を投与することによる本発明の関節炎治療方法は，関節炎，特にヒトの関節炎，とりわけ関節リウマチの治療方法として，高い有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実験１における関節炎の発症率を示すグラフ。
【図２】実験１において，関節炎を発症したコントロール群のマウス（ａ）と関節炎を発症しなかったＭＳＣ投与群のマウス（ｂ）の下肢の外観を示す図面代用写真。
【図３】実験１における，ＭＳＣ投与群とコントロール群のＲＡスコア平均値の推移を示すグラフ。
【図４】実験２における，抗体投与前ＭＳＣ投与群，ＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群，ＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群，及びコントロール群のＲＡスコア平均値の推移を示すグラフ。
【図５】実験３における関節炎の発症率を示すグラフ。
【図６】実験３における，ＭＳＣ投与群とコントロール群のＲＡスコア平均値の推移を示すグラフ。
【図７ａ】実験１における正常マウスの、関節の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。上段が原図、下段が原図に注釈を加えたもの。破線は各組織又は特徴のある領域の境界を示す（以下同じ）。
【図７ｂ】実験１におけるコントロール群のマウスの、関節の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【図７ｃ】実験１におけるＭＳＣ投与群で関節炎未発症のマウスの、関節の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【図７ｄ】実験１におけるＭＳＣ投与群で関節炎発症のマウスの、関節の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【図８ａ】実験２におけるコントール群のマウスの、関節の炎症部位の組織切片の図面代用写真（倍率１０倍）。
【図８ｂ】実験２における抗体投与前ＭＳＣ投与群の、関節の炎症部位の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【図８ｃ】実験２におけるＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群の、関節の炎症部位の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【図８ｄ】実験２におけるＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群の、関節の炎症部位の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【図９ａ】実験３におけるコントロール群のマウスの、関節の炎症部位の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【図９ｂ】実験３におけるＭＳＣ投与群のマウスの、関節の炎症部位の組織切片の図面代用写真（倍率２０倍）。
【符号の説明】
【００２６】
Ａ  関節腔
Ｂ  関節軟骨（硝子軟骨）
Ｃ  軟骨細胞
Ｄ  骨基質（海面骨）
Ｅ．骨髄  
Ｆ  類洞
Ｇ  支持組織
Ｈ  結合組織（筋肉等）
Ｉ  肉芽組織（滑膜細胞、繊維芽細胞を含む）の増生部位
Ｊ  炎症系細胞（多形核顆粒球（好中球、好酸球）、リンパを含む）の浸潤部位
Ｋ  皮膚組織
Ｌ  脂肪細胞
Ｍ  破骨細胞の増生
Ｎ  骨芽細胞の反応性の増大
Ｏ  滑膜細胞の増生部位
★  造血幹細胞
＊  血球
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の関節炎治療及び予防剤は，ヒト間葉系幹細胞を有効成分とする。本発明において，ヒト間葉系幹細胞は，ヒトの骨髄，脂肪組織，歯髄細胞，胎盤組織等，如何なる組織から取得された間葉系幹細胞であってもよいが，骨髄由来の間葉系幹細胞が特に好ましい。ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞は，セルライン化されたものが既に市販されており（PoieticsTM, Cambrex Bio Science Walkersville,  Inc., MD, USA），これをそのまま，又はこれを更に継代培養したものを用いてもよい。【００２８】
本発明において，ヒト間葉系幹細胞は，初代培養細胞である必要はなく，継代培養細胞を使用することができる。初代培養細胞が継代培養細胞より劣ることはないから，初代培養細胞であってもよいが，製品としてあるまとまった量で製造され，貯蔵され，使用される上で，実際上の必然性から，継代培養細胞が用いられる。本発明において，有効成分であるヒト間葉系幹細胞は，例えば凍結保存状態で供給し，これを投与直前に解凍し，水性媒質に懸濁して投与することができる。但し，これに限らず，例えば培養したヒト間葉系幹細胞を回収し，凍結することなく懸濁して投与してもよい。このとき，細胞を懸濁させるための水性媒質としては，例えば，浸透圧やｐＨを血液の値付近に調整し，塩類濃度等を調整した注射用の水溶液等を適宜用いればよく，例えば，酢酸リンゲル液，糖加酢酸リンゲル液等のリンゲル液その他の輸液，生理食塩水，またはブドウ糖液等を用いることができるが，これらに限定されない。輸液用リンゲル液を用いる場合，これに許容量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加してもよい。【００２９】
本発明において，ヒト間葉系幹細胞は，注射剤として静脈内，筋肉内または皮下に投与することができ，静脈内投与がより好ましい。静脈内投与を行う場合，注射剤は，注射器から直接患者に投与することにより投与してもよく，また点滴バッグ中で点滴液に先ず添加して患者に点滴静注を行ってもよい。この他，注射器を用いてヒト間葉系幹細胞を患部へ直接投与することもできる。なお，本発明において「患者」は，ヒト及びヒト以外の哺乳類を包含する。【００３０】
間葉系幹細胞の投与方式は，単回投与でもよく，２回以上の複数回投与でもよい。患者の症状に応じて，投与回数，投与タイミング等を適宜調整すればよい。【００３１】
本発明において，関節炎治療及び予防剤は，関節炎を発症した患者を治療するために投与することができるが，これに限らず，関節炎の発症リスクが高い関節炎の発症前の患者に予防的に投与することができる。関節炎の発症リスクが高い患者は，病歴，血中に含まれるリウマチ因子の濃度を測定すること等によりスクリーニングすることができる。また，両者の中間的な場合として，関節炎の初期であることが疑われる場合や，関節炎が一旦治癒したと診断された患者において，関節炎の明らかな発症又は再発を防止するために，本発明の関節炎治療及び予防剤を投与することは有用である。これは，関節炎は緩解，増悪を反復して進行することが多く，また，初期等の症状がごく軽い段階では精密且つ的確に診断することが困難であり，外部から確認できない炎症が既に存在している可能性があるため，これを早い段階で処置し，発症を止めることに治療上の大きな意義があるからである。【００３２】
本発明の関節炎治療及び予防剤は，汎用の製剤であるから，これに対して異系（allogeneic）な患者に投与されるのが一般であるが，同系である患者（例えば，間葉系幹細胞の採取源の一卵性双生児）に投与することを妨げるものではなく，また，汎用のものとして製造された本発明の関節炎治療及び予防剤が，その間葉系幹細胞採取に際して偶然にその源となったヒトに対して，自家細胞として，関節炎の治療及び予防のために投与されることを妨げるものでもない。【００３３】
上記投与時における，本発明の製剤中のヒト間葉系幹細胞の密度は１×１０2〜１×１０9個／ｍＬとすることが好ましく，１×１０3〜１×１０8個／ｍＬとすることが更に好ましい。また，ヒトに対する同細胞の投与個数は，意図する投与回数にもよるが，通常，１回の投与につき１×１０5〜１×１０7個／ｋｇ体重の範囲である。但しこれに限られることなく，症状の程度に応じて適宜増減することができる。特に，（本発明者らが見出したところによれば）ヒト間葉系幹細胞は関節炎において炎症部位にホーミングするため，少量のヒト間葉系幹細胞でも炎症部位に集まって優れた効果を示す一方，不要となったヒト間葉系幹細胞は自然消滅するため，ヒト間葉系幹細胞の投与量は，広い範囲で適宜設定することが可能である。
【実施例】
【００３４】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００３５】
〔関節炎モデルマウスの作成〕
４週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを三協ラボサービス（静岡県三島市）より購入し，ＳＰＦ（Specific  Pathogen Free）の環境にて２週間飼育した。飼育環境は１２時間ごとの照明切換え調節及び一定室温の下で，ガンマー線照射済みの餌と水は自由摂取とした。飼育方法に関しては東京医科大学実験動物センターの規約に従った。関節炎発症には，市販の関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルキット（Arthrogen-CIA mAb，Chondrex社）を使用し，添付の説明書に従って操作した。飼育により６週齢，体重約２０ｇに達したマウスの腹腔内に，上記キットに添付の抗タイプIIコラーゲン混合マウス抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）を２００μＬ（２ｍｇ）／匹の割合で尾静脈投与した（「０日目」とする。）。抗体投与後３日目（但し，後述の「実験３」においては抗体投与後４日目）にキットに添付されているリポポリサッカライド（ＬＰＳ）溶液（５００μｇ／ｍＬ）を同マウスの腹腔内に１００μＬ（５０μｇ）／匹の割合で投与した。本法によれば，マウスに投与された上記の抗タイプIIコラーゲン混合抗体が軟骨表面に沈着し，これにより補体の活性化，炎症細胞の浸潤が誘導され，関節炎が発症し進行する。更にＬＰＳを追加投与することにより，激しい関節炎が惹起される。本法により引き起こされるコラーゲン誘導関節炎は，ヒトの関節リウマチのモデルとして利用されている。【００３６】
〔ラット間葉系幹細胞の調製〕
約１０週齢の雄Lew Crj-Tg（CAG/GFP）ysラット（Lew-GFPラット）を過麻酔下，安楽死させ，大腿骨，下腿骨1対を採取し，Tyrode’s液（Sigma社製）で洗浄した。骨の両端を切り落とし，骨髄を１８G針付きシリンジで押し出して，Tyrode’s液中で懸濁した。約２０ｍLの増殖培地（１０％ウシ胎児血清，４ｍＭアラニルグルタミンを含むダルベッコ／ハムＦ１２  １：１混合培地：HyClone社製）を添加し１００μｍナイロンメッシュ（ベクトンアンドディッキンソン社製）を素通りさせた後，さらに増殖培地を加えて３０ｍLとした。有核細胞数をカウントして，８×１０4個／ｃｍ2の密度で，Ｔフラスコ（７５ｃｍ2，２枚）（Nunc社製）に播種し，５％二酸化炭素，３７℃の条件で培養した。３〜４日毎に増殖培地を交換しながら１４日間培養後，増殖培地を除去し，培養容器１個当たり４．８ｍLの０．０５％トリプシン，０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（剥離剤）（Invitrogen社製）を加えて３７℃で５分間インキュベートして細胞を剥離した。培地を適量添加して遠心分離して，上清を捨て，細胞ペレットを２０ｍＬの増殖培地で再懸濁した。約１．９４×１０7個のラット間葉系幹細胞が得られ，これをラット間葉系幹細胞［Ｐ０］とした。【００３７】
ラット間葉系幹細胞［Ｐ０］を約１×１０4個／ｃｍ2の密度で新しい培養容器（セルファクトリー：Nunc社製）に播種し，５％二酸化炭素，３７℃の条件で培養した。３〜４日毎に増殖培地を交換しながら９日間培養後，増殖培地を除去し，６３０ｃｍ2の培養面積当たり２５ｍＬの細胞剥離剤を加えて３７℃で５分間インキュベートして細胞を剥離した。培地を適量添加して遠心分離して，上清を捨て，細胞ペレットを４０ｍＬの増殖培地で再懸濁した。約１．６４×１０8個のラット間葉系幹細胞が得られ，これをラット間葉系幹細胞［Ｐ１］とした。【００３８】
ラット間葉系幹細胞［Ｐ１］を約１×１０4個／ｃｍ2の密度で新しい培養容器に播種し，５％二酸化炭素，３７℃の条件で培養した。３〜４日毎に増殖培地を交換しながら７日間培養後，増殖培地を除去し，６３０ｃｍ2の培養面積当たり２５ｍＬの細胞剥離剤を加えて３７℃で５分間インキュベートして細胞を剥離した。培地を添加して細胞懸濁液を１０５０ｍＬとして，閉鎖系自動細胞洗浄装置（Cytomate：Baxter社製）を用いて細胞を洗浄した。洗浄後，１７３ｍＬの細胞懸濁液中に約１．２０×１０9個のラット間葉系幹細胞が得られ，これをラット間葉系幹細胞［Ｐ２］とした。【００３９】
ラット間葉系幹細胞［Ｐ２］を約１×１０4個／ｃｍ2の密度で新しい培養容器に播種し，５％二酸化炭素，３７℃の条件で培養した。３〜４日毎に増殖培地を交換しながら７日間培養後，増殖培地を除去し，６３０ｃｍ2の培養面積当たり２５ｍＬの細胞剥離剤を加えて３７℃で５分間インキュベートして細胞を剥離した。培地を添加して細胞懸濁液を４２００ｍLとして，閉鎖系自動細胞洗浄装置（Cytomate：Baxter社製）を用いて細胞を洗浄した。洗浄後，５３３ｍＬ中の胞懸濁液に，約４．３２×１０9個のラット間葉系幹細胞が得られ，これをラット間葉系幹細胞［Ｐ３］とした。【００４０】
ラット間葉系幹細胞［Ｐ３］懸濁液を遠心分離し，１．２%ヒト血清アルブミン（日本製薬製）を含む１８７ｍＬの酢酸リンゲル液（PlasmaLyteA：Baxter社製）で再懸濁し，等量の９％ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン），２０％ＤＭＳＯ（Edward社製）を含む酢酸リンゲル液を加えて混合し分注後，プログラムフリーザーを用いて凍結して，液体窒素気相に保存した。この凍結細胞を用時解凍してラット間葉系幹細胞として，実験３で使用した。【００４１】
〔実験１〕ヒト間葉系幹細胞の投与
投与スケジュール：  関節炎モデルマウスに対して，ＬＰＳ溶液投与後２４時間以内（抗体投与後４日目）に，１×１０6個のヒト間葉系幹細胞（PoieticsTM, Cambrex社：骨髄由来，ＣＤ１０５+，ＣＤ１６６+，ＣＤ２９+，ＣＤ４４+，ＣＤ１４-，ＣＤ３４-，ＣＤ４５-）を３．７％ＤＭＳＯ，５％ＨＳＡを含む０．２１ｍＬの輸液用酢酸リンゲル液（PlasmaLyte A）に懸濁させ，室温に保った状態でマウスの尾静脈より１ｍＬ／分の流速で投与した。細胞投与は，温浴上でマウスを暖めて血管を拡張させた後に，マウスを固定台に入れ，マウスの身体を補綴して行った。ヒト間葉系幹細胞の初回投与後３日目（抗体投与後７日目）に，初回投与と同様の条件でヒト間葉系幹細胞をマウスに投与した（ＭＳＣ投与群）。ヒト間葉系幹細胞非投与群をコントロール群とした。各群のマウスの個体数は１０匹とした。【００４２】
〔実験２〕ヒト間葉系幹細胞の投与
投与スケジュール：  ヒト間葉系幹細胞の予防的効果を調べるために，関節炎モデルマウスに対して，ヒト間葉系幹細胞を，抗タイプIIコラーゲン混合抗体の投与前の２４時間以内（抗体投与前ＭＳＣ投与群），ＬＰＳ溶液投与前の２４時間以内（ＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群），並びにＬＰＳ溶液投与後の２４時間以内（ＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群）にそれぞれ投与した。また，ヒト間葉系幹細胞非投与群をコントロール群とした。ＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群，ＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群，及びコントロール群に対しては，抗体投与前ＭＳＣ投与群にヒト間葉系幹細胞を投与したのと同じタイミングで３．７％ＤＭＳＯ，５％ＨＳＡを含む０．２１ｍＬの輸液用酢酸リンゲル液（PlasmaLyte A）を投与した。各群のマウスの個体数は４匹とした。なお，ヒト間葉系幹細胞のマウスへの投与自体は，上記実験１と同様の方法で行った。【００４３】
〔実験３〕ラット間葉系幹細胞の投与
投与スケジュール：  関節炎モデルマウスに対して，ＬＰＳ溶液投与後２４時間以内（抗体投与後５日目）に，１×１０6個のラット間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社）を３．７％ＤＭＳＯ，５％ＨＳＡを含む０．２１ｍＬの輸液用酢酸リンゲル液（PlasmaLyte A）に懸濁させ，室温に保った状態でマウスの尾静脈より１ｍＬ／分の流速で投与した。細胞投与は，温浴上でマウスを暖めて血管を拡張させた後に，マウスを固定台に入れ，マウスの身体を補綴して行った。ラット間葉系幹細胞の初回投与後３日目（抗体投与後８日目）に，初回投与と同様の条件でヒト間葉系幹細胞をマウスに投与した（ＭＳＣ投与群）。ラット間葉系幹細胞非投与群をコントロール群とした。個体数はＭＳＣ投与群を８匹，コントロール群を６匹とした。【００４４】
〔関節炎の評価〕
＜評価方法＞
関節炎の有無は常法に従い肉眼的な観察により評価した（J Exp Med. 2000; 191: 313-320， Arthritis Rheum. 2007; 56(2): 521-530）。関節炎の重篤度はマウスの肢の腫大の程度から０，１，１．５，２，及び３の５段階のスコアで表した。すなわち，正常な関節を０，軽微な腫大の認められた関節を１，明確な腫大が認められた関節を２，重篤な腫大が認められた関節を３と評価した。上記１と２の中間の重篤度と評価したものを１．５とした。上記スコアを四肢の各々につき評価し，四肢のスコアの合計をその個体の関節炎の重篤度（ＲＡスコア）とした。また，各群のマウスのＲＡスコアの平均値をＲＡスコア平均値とした。【００４５】
＜実験１における関節炎の評価＞
実験１において，抗体投与日から抗体投与後９日目までの関節炎の有無及びその重篤度を観察した。観察した各個体のＲＡスコアを表１に示す。【００４６】
【表１】
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【００４７】
表１に見られるように，ＬＰＳ投与後２４時間以内では，ＭＳＣ投与群とコントロール群の何れの個体にも関節炎は認められなかった。ＭＳＣ投与群では，２回目のヒト間葉系幹細胞投与後（抗体投与後７日目以降），観察期間中に１０匹中３匹の個体で関節炎が観察されず，関節炎の発症率は７０％であった（図１）。一方，コントロール群では，上記期間中に全ての個体で関節炎が観察され，関節炎の発症率は１００％であった（図１）。【００４８】
コントロール群で関節炎が発症したマウスの関節（図２ａ）と，ＭＳＣ投与群で関節炎が発症しなかった関節（図２ｂ）の外観を図２に示す。コントロール群における腫脹が，肉眼的に顕著である。【００４９】
また，抗体投与日から抗体投与後９日目までの関節炎の有無および重篤度を観察し，ＲＡスコアで評価した（表１）。抗体投与日から抗体投与後９日目までのＲＡスコア平均値を，ＭＳＣ投与群とコントロール群で比較すると，抗体投与後８日目ではＭＳＣ投与群で３．４０，コントロール群で４．６０，抗体投与後９日目ではＭＳＣ投与群で３．１０，コントロール群で３．６０と，抗体投与後８日目及び９日目において，ＭＳＣ投与群がコントロール群に対して顕著に低いＲＡスコア平均値を示した（表１，図３）。なお，５日目においては，ＭＳＣ投与群のＲＡスコア平均値がコントロール群に比して幾分高いが，これはＭＳＣ投与翌日（ＬＰＳ投与後２日目）の値であり，この炎症立ち上がり時期においてＭＳＣの投与の効果はＲＡ値には未だ反映されていない。なお，この関節炎モデルは短期間の急激な炎症モデルであり，抗体投与後９日目におけるコントロール群でのＲＡスコアの低下は，炎症のピークが過ぎたことによるものである。【００５０】
上記の結果は，ヒト間葉系幹細胞の２回の投与により，抗タイプIIコラーゲン混合抗体及びＬＰＳにより惹起された関節炎が抑制されることを示している。また，ＭＳＣ投与群において１０匹中３匹で全く関節炎の外観症状が見られていないことは，この激しい炎症モデルにあってＭＳＣが強力な抑制効果を発揮したことを示している。【００５１】
＜実験２における関節炎の評価＞
実験２において，抗体投与日から１０日目までの関節炎の有無及びその重篤度を観察した。表２及び図４に結果を示す。【００５２】
【表２】
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【００５３】
各群とも全ての個体で関節炎の発症が認められた。ＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群ではコントロール群と比較して，抗体投与後４〜５日目（ＭＳＣ投与日及び投与後１日目）のＲＡスコアが顕著に高値を示しているが，これはＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群においてＭＳＣ投与以前に既に強い炎症が起きていたためである。同群において，抗体投与後６日目（ＭＳＣ投与後２日目）にはＲＡスコアがコントロール群より低下しており，このことは，炎症発生後にＭＳＣを投与した場合における顕著な抑制効果を実証している。更に，それ以降，抗体投与後１０日目（ＭＳＣ投与後６日目）まで一貫してコントロール群より低いＲＡ値をＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群は示しており，ＭＳＣが単回投与のみでも関節炎の悪化を抑制できることが分かる。【００５４】
また，抗体投与前２４時間以内に予めヒト間葉系幹細胞を投与した群（抗体投与前ＭＳＣ投与群）では，抗体投与後５日目〜１０日目までの期間中，コントロール群と比較して低いＲＡスコア平均値を示した（表２，図４）。例えば抗体投与後５日目と６日目のそれぞれにおける両群のＲＡスコア平均値を比較すると，抗体投与前ＭＳＣ投与群では０．７５及び１．５，コントロール群では１．５及び３．７５であり，どちらの日においても抗体投与前ＭＳＣ投与群のＲＡスコア平均値がコントロール群の５０％以下と顕著に低い。このことは，感作を受ける前におけるヒト間葉系幹細胞の予防的投与の意義を示すものである。【００５５】
また，ＬＰＳ溶液投与前２４時間以内に予めヒト間葉系幹細胞を投与した群（ＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群）も，抗体投与後３日目〜１０日目までの期間中，コントロール群と比較して低いＲＡスコア平均値を示した（表２，図４）。例えば抗体投与後５日目及び６日目における両群のＲＡスコア平均値を比較すると，ＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群では０．５及び２．０，コントロール群では１．５及び３．７５であり，ＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群のＲＡスコア平均値がコントロール群と比較して顕著に低い。この結果は，既に感作が成立していても，実際に炎症反応が惹起されるよりも前にヒト間葉系幹細胞を予防的に投与することの意義を示すものである。【００５６】
＜実験３における関節炎の評価＞
実験３において，抗体投与日から１１日目までの関節炎の有無及びその重篤度を観察した。結果を表３及び図５に示す。【００５７】
【表３】
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【００５８】
コントロール群では全ての個体で関節炎の発症が観察され，発症率は１００％であった。一方，ＭＳＣ投与群では，８匹中４匹の個体で関節炎の発症が観察されず，発症率は５０％であった（図５）。コントロール群では１匹が抗体投与後１０日目に死亡したが，関節炎との因果関係は不明であった。【００５９】
また，抗体投与後５日目〜１１日目までのＲＡスコア平均値を，ＭＳＣ投与群とコントロール群で比較すると，抗体投与後６日目（初回のＭＳＣの投与が行われた翌日）ですでにＭＳＣ投与群では０．２５とコントロール群の１．８３に比較して顕著に低いＲＡスコア平均値を示した（表３，図６）。また，抗体投与後６日目〜１１日目までを通じて，ＭＳＣ投与群のＲＡスコア平均値は，コントロール群のそれの５０％以下と顕著に低い値を示した。この結果は，ラット間葉系幹細胞を投与することにより，マウスの関節炎の悪化を効果的に抑制できることを示す。【００６０】
〔関節及び組織標本の作製〕
マウスをジエチルエーテル麻酔（和光純薬工業）下で開腹し，心臓より血液を採取後，１０％中性緩衝ホルマリン溶液(和光純薬工業)の中で一週間固定を行った。次に，関節を摘出してティシュー・テック固定包埋カセット(ティシュー・テック社)に入れ，脱水後，ティシュー・テックパラフィンワックスII60を包埋し，パラフィンブロックを作成した。５μｍの薄切組織切片を作成し，脱パラフィン後，マイヤーヘマトキシリン，１％エオジンにて染色を行い，顕微鏡下で観察した。【００６１】
関節及び組織標本の作製は，実験１においては抗体投与後１４日目に，実験２においては抗体投与後１１日目に，実験３においては抗体投与後１８日目に行った。【００６２】
〔実験１における組織学的評価〕
正常マウスの組織切片（図７ａ）では、関節腔（Ａ）が明瞭に観察された。関節軟骨（硝子軟骨）（Ｂ）中には軟骨細胞（Ｃ）が存在し、骨のリモデリングが行われている状態が観察された。また、関節軟骨の深層に濃く染まる雲状の骨基質（海面骨）（Ｄ）が観察された。骨基質内側には骨髄（Ｅ）が存在し、骨髄内部には血管等から構成される類洞（Ｆ）と造血幹細胞(★)が観察された。類洞（Ｆ）内には血球(＊)が観察された。【００６３】
一方、コントロール群のマウスの関節の炎症部位の組織切片（図７ｂ）では、関節軟骨（Ｂ）と接するように、滑膜細胞、繊維芽細胞等から構成される肉芽組織の増生（Ｉ）が観察された。また、肉芽組織の増生（Ｉ）等により関節腔（Ａ）が消失していた。肉芽組織の増生部位の近傍では、硝子軟骨（Ｂ）の表層から中層において軟骨細胞（Ｃ）が減少し、骨の破壊性変化が観察された。更に、肉芽組織の増生部位（Ｉ）と接するようにして、多形核顆粒球（好中球、好酸球）、リンパ球等の炎症系細胞の広範な浸潤（Ｊ）が観察された。炎症系細胞の浸潤は結合組織（Ｈ）の近傍でも観察された。【００６４】
ＭＳＣ投与群でＲＡスコア上関節炎の発症が認められなかったマウスの関節の炎症部位の組織切片（図７ｃ）では、硝子軟骨（Ｂ）と結合組織（Ｈ）に接するように、肉芽組織の増生（Ｉ）が観察された。しかし、その程度はコントロール群と較べると軽微であった。炎症系細胞の浸潤と骨の破壊性変化は認められず、関節腔（Ａ）は良好に保持されていた。これらの結果は、２回のヒト間葉系幹細胞の投与により、関節炎に付随する、関節における骨の破壊性変化、炎症細胞の浸潤、肉芽組織の増生等の諸症状が抑制されたことを示す。【００６５】
ＭＳＣ投与群でＲＡスコア上関節炎の発症が認められたマウスの関節の炎症部位の組織切片（図７ｄ）では、組織切片下部の硝子軟骨（Ｂ）と接するように肉芽組織の増生（Ｉ）が観察された。また、肉芽組織の増生部位（Ｉ）には炎症系細胞の浸潤（Ｊ）が観察された。但し、硝子軟骨（Ｂ）中には軟骨細胞（Ｃ）が正常マウスのものと同等レベル存在し、骨の破壊性変化は認められなかった。また、関節腔（Ａ）は比較的良好に保持されていた。これらの結果は、外見上関節炎が発症したマウスにおいても、２回のヒト間葉系幹細胞の投与により、関節炎に付随する、関節における骨の破壊性変化、炎症細胞の浸潤、肉芽組織の増生等の諸症状が抑制されたことを示す。【００６６】
〔実験２における組織学的評価〕
コントロール群の組織切片（図８ａ）を観察したところ、硝子軟骨（Ｂ）と接するようにして肉芽組織の増生（Ｉ）が観察された。また、硝子軟骨（Ｂ）と結合組織（Ｈ）の間に、肉芽組織の増生（Ｉ）と広範な炎症系細胞の浸潤（Ｊ）が認められ、これらにより関節腔が消失していた。肉芽組織の増生部位（Ｉ）近傍の硝子軟骨（Ｂ）では、表層から中層にかけて軟骨細胞（Ｃ）が減少し、骨の破壊性変化が観察された。炎症系細胞（Ｊ）の浸潤は結合組織（Ｈ）近傍でも観察された。【００６７】
一方、抗体投与前ＭＳＣ投与群の組織切片（図８ｂ）では、関節腔（Ａ）と脂肪組織（Ｌ）の間に肉芽組織の増生（Ｉ）と炎症系細胞の浸潤（Ｊ）が観察された。しかしながら、関節腔（Ａ）は良好に保持され、骨の破壊性変化は観察されなかった。これらの結果は、抗体投与による感作前、すなわち関節炎発症前にヒト間葉系幹細胞を投与することによって、関節炎に付随する関節における諸症状を抑制できること示す。すなわちヒト間葉系幹細胞が関節炎に対して予防的効果を有することを示すものである。【００６８】
ＬＰＳ投与前ＭＳＣ投与群組織切片（図８ｃ）では、組織切片右上部の支持組織（Ｇ）と関節腔（Ａ）の間に炎症系細胞の浸潤（Ｊ）が観察された。組織切片左下部の硝子軟骨（Ｂ）の左端で軟骨細胞（Ｃ）が減少しており、軽度な骨の破壊性変化が観察された。これらの症状はコントロール群のものと比較しても軽度であった。また、関節腔（Ａ）は保持されていた。これらの結果は、ＬＰＳ投与前における免疫感作の初期段階においてヒト間葉系幹細胞を投与することによっても、関節炎に付随する関節における諸症状を抑制できること示す。すなわちヒト間葉系幹細胞が初期段階の関節炎に対して効果を有することを示すものである。【００６９】
ＬＰＳ投与後ＭＳＣ投与群組織切片（図８ｄ）では、結合組織（Ｈ）と硝子軟骨（Ｂ）の間に肉芽組織の増生（Ｉ）と広範な炎症系細胞の浸潤（Ｊ）が観察された。肉芽組織の増生部位（Ｉ）、又は炎症系細胞の浸潤部位（Ｊ）と接する付近の硝子軟骨（Ｂ）では軟骨細胞（Ｃ）が減少しており、骨の破壊性変化が観察された。但し、これらの症状はコントロール群のものと比較すると軽度であった。また、関節腔（Ａ）は保持されていた。これらの結果は、１回のヒト間葉系幹細胞の投与により、関節炎に付随する上記の諸症状が抑制されていることを示す。【００７０】
〔実験３における組織学的評価〕
コントロール群のマウスの関節の炎症部位の組織切片（図９ａ）を観察したところ、関節腔内（Ａ）において肉芽組織の増生（Ｉ）と炎症系細胞の浸潤（Ｊ）が観察された。組織切片左側の骨基質（Ｄ）では、硝子軟骨（Ｂ）が消失しており、骨の破壊性変化が観察された。また、骨基質（Ｄ）では破骨細胞の増生（Ｍ）、骨芽細胞の反応性の増大（Ｎ）が観察された。【００７１】
一方、ＭＳＣ投与群の組織切片（図９（ｂ））においては、硝子軟骨（Ｂ）、軟骨細胞（Ｃ）、骨基質（Ｄ）ともに異常は認められず、骨の破壊性変化はなかった。炎症性細胞の浸潤も観察されなかった。但し、滑膜上皮に増生（Ｏ）が観察されたが、その程度は軽微であった。これらの結果は、３回のラット間葉系幹細胞の投与により、マウス関節炎に付随する上記の諸症状が抑制されていることを示す。【００７２】
〔製剤実施例１〕  注射剤
ヒト間葉系幹細胞（骨髄由来）・・・  ５×１０7個
酢酸リンゲル液・・・・・・・・・・  全量５ｍＬ
酢酸リンゲル液中にヒト間葉系幹細胞を懸濁させ，全量を５ｍＬに調整して注射剤とする。【００７３】
〔製剤実施例２〕  注射剤
ヒト間葉系幹細胞（骨髄由来）・・・  １×１０8個
滅菌生理食塩水・・・・・・・・・・  全量１０ｍＬ
滅菌生理食塩水中にヒト間葉系幹細胞を加えて懸濁させ，全量を１０ｍＬに調整して注射剤とする。【００７４】
〔製剤実施例３〕  注射剤
ヒト間葉系幹細胞（骨髄由来）・・・  ２×１０6個
５％ブドウ糖輸液・・・・・・・・・  全量２ｍＬ
５％ブドウ糖輸液中にヒト間葉系幹細胞を加えて懸濁させ，全量を２ｍＬに調整して注射剤とする。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
ヒト間葉系幹細胞を有効成分とする本発明の関節炎治療及び予防剤は，哺乳類，取り分けヒトの関節炎における滑膜の炎症自体を抑制・防止，軟骨及び骨の破壊を抑制・防止する。従って，本発明は，哺乳類，特にヒトの関節炎，取り分け患者数の多い関節リウマチの治療及び予防，再発防止のための薬剤として利用することができる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【国際調査報告】
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