(57)【要約】本発明は、放射線増感増強剤の提供を目的とする。本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線増感増強剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線増感増強剤。
【請求項２】
ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線増感増強剤。
【請求項３】
腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項４】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項５】
標識タンパク質がＧＦＰである、請求項２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項６】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項７】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項８】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項９】
放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。
【請求項１０】
放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。
【請求項１１】
腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる請求項９又は１０に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項９又は１０に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１３】
標識タンパク質がＧＦＰである、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１４】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１５】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項９又は１０に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１６】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１７】
請求項１〜１６に記載の剤の製造における、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えウイルスの使用。
【請求項１８】
請求項１〜１６に記載の剤の製造における、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスの使用。
【請求項１９】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２０】
標識タンパク質がＧＦＰである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２３】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子がゲノムに組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線増感増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、診断方法及び臨床管理の進歩にもかかわらず、依然として世界における主な死亡原因である（Ｐａｒｋｉｎ  ＤＭ  ｅｔ  ａｌ．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００５；５５：７４−１０８、Ｊｅｍａｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ．２００４  １；１０１：３−２７）。進行癌に対する現在の治療法としては、外科的切除、放射線治療、及び細胞障害性の化学療法が挙げられ、これらの方法を併用することにより、癌患者の生存率を改善することができる。しかしながら、多くの癌患者は、これらの治療法に対してしばしば内因性または獲得性の抵抗性を有するため、病気の進行を余儀なくされる（Ｖｏｋｅｓ  ＥＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；１１：５０４５ｓ−５０５０ｓ、Ｍｉｌａｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ．２００３；２５：１５２−６７）。
放射線治療及び化学療法は、癌細胞のみを標的とすることができないことが問題となっている。従って、腫瘍細胞のみを選択的に傷害するが、正常細胞は傷害しない抗癌剤が必要とされる。
このような状況において、腫瘍細胞特異的に選択的に増殖するウイルスは、新しい癌の治療法をもたらす。このウイルスは、腫瘍組織のみにおいて選択的に増殖後、腫瘍細胞の融解を誘導するように設計される（Ｋｉｒｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７：７８１−７８７，２００１、Ｈａｗｋｉｎｓ  ＬＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．２００２；３：１７−２６）。癌細胞を効果的に標的にするためには、多様な癌において発現するが、正常細胞においては発現しない、組織または細胞特異的なプロモーターを必要とする。
テロメラーゼは、染色体末端を完全に複製するために関与するリボヌクレオタンパク質複合体である（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ＥＨ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）１９９１；３５０：５６９−５７３）。テロメラーゼは、ヒトの癌の８５％以上において活性を示す（Ｋｉｍ  ＮＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６６：２０１１−２０１５）が、正常体細胞では増殖細胞のみで活性を示す（Ｓｈａｙ  ＪＷ，ｅｔ  ａｌ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９６；８：６６−７１）。テロメラーゼの活性化は、発癌における重要なステップであると考えられ、その活性は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現と密接に関連している（Ｎａｋａｙａｍａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８；１８：６５−６８）。
ｈＴＥＲＴプロモーターは、テロメラーゼ活性を有する腫瘍細胞のみで活性化することから、腫瘍細胞においてその下流にあるウイルス遺伝子の選択的発現を可能とし、選択的ウイルス増殖を導く。
本発明者らは、ｈＴＥＲＴプロモーター配列が、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）と連結したＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子の発現を駆動する、弱毒アデノウイルス５型ベクター（ＯＢＰ−３０１又はテロメライシンという）を構築した（Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０：２８５−２９２）。テロメライシンは、ヒト癌細胞において効率的に増殖し、ヒト癌細胞株の顕著な細胞障害を誘導した。一方、テロメラーゼ活性を有しない正常ヒト細胞においては、細胞障害だけではなく、増殖も強く抑制された。
ＯＢＰ−３０１の単独療法は、前臨床試験における優れた結果に基づいて臨床開発が進められているが、良好な治療結果を得るためには、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍効果を促進するための集学的治療が重要である。実際に、腫瘍融解ウイルスについての臨床試験の多くは、化学療法又は放射線治療との組み合わせで実施されている（Ｋｈｕｒｉ  ＦＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０００；６：８７９−８８５、Ｒｅｉｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；６２：６０７０−６０７９、Ｈｅｃｈｔ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９：５５５−５６１、Ｇａｌａｎｉｓ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００５；１２：４３７−４４５）。
電離放射線は、主にＤＮＡ分子を標的とし、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する（Ｋｉｍ  ＣＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００２；３０３：７５３−９）。二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換えなどの通常の分子プロセスによって修復され得る（Ｃａｈｉｌｌ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００６；１１：１９５８−７６）。
ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）は、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有する核タンパク質であり、ＮＨＥＪ経路に必須の構成成分である。ＤＮＡ−ＰＫは、触媒サブユニットであるＤＮＡ−ＰＫｃｓ及び調節サブユニットであるＫｕ自己抗原（Ｋｕ７０／８０）を含む（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ＴＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１９９３；７２：１３１−４２、Ｊｅｇｇｏ  ＰＡ．Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．１９９７；３８４：１−１４）。ＤＳＢの誘導に対する細胞の生存率は、ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復に大きく依存する（Ｗａｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１；２９：１６５３−６０）。ＤＮＡが修復されない場合は、ＤＮＡ損傷により染色体消失及び細胞死が起こりうる（Ｄｉｋｏｍｅｙ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ．１９９８；７３：２６９−７８）。従って、ＤＮＡ−ＰＫは、ヒトの腫瘍が放射線治療及び遺伝毒性の化学療法に対して抵抗性を獲得する上で重要である可能性がある。実際に、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はＫｕのいずれかの発現が欠損した腫瘍細胞は、顕著な放射線感受性を示し（Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５；２６７：１１８３−５）、ＤＮＡ−ＰＫの標的阻害は、薬剤抵抗性の癌細胞の感受性を高め、細胞障害を促進する（Ｋｉｍ  ＣＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００２；３０３：７５３−９）。さらに、Ｋｕ７０／８０は、核へ移行し、ＤＳＢの修復の間、ＤＮＡ−ＰＫｃｓと物理的に相互作用する（Ｋｏｉｋｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９９；１１２：４０３１−９、Ｋｏｉｋｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９９；１８：７４９５−５０５、Ｋｏｉｋｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７６：１１０５−１１）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、腫瘍の有効な放射線療法を可能とする放射線増感増強剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＩＲＥＳ、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含む弱毒アデノウイルス５型ベクター（ＯＢＰ−３０１又はテロメライシンという）が癌の放射線に対する感受性を増加させること、及び放射線の治療効果を増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線増感増強剤。
（２）ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線増感増強剤。
（３）放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。
（４）放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、放射線併用用抗腫瘍剤。
（５）前記放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤の製造における、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれた組換えウイルスの使用。
（６）前記放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤の製造における、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスの使用。
（７）前記組換えウイルスを含む、放射線耐性腫瘍に対する治療剤。
本発明において、上記増感増強剤又は抗腫瘍剤は、腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる。ヒトテロメラーゼのプロモーターとしては、例えばｈＴＥＲＴプロモーターが挙げられ、標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルスプロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーター、あるいは発癌及び発癌抑制因子プロモーターが挙げられる。また、標識タンパク質としては例えばＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を挙げることができる。ウイルスは、アデノウイルスであることが好ましい。
本発明により、癌の放射線療法において腫瘍又は癌細胞にＯＢＰ−３０１などの本発明の組換えウイルスを感染させておくと、該ウイルスは、腫瘍細胞の放射線に対する感受性を増加させることができる。また、あらかじめ腫瘍又は癌細胞を放射線照射した後にＯＢＰ−３０１などの本発明の組換えウイルスを感染させると、該ウイルスは、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる。さらに、本発明の組換えウイルスは、放射線や抗癌剤に耐性を示す腫瘍又は癌細胞を効果的に殺傷することができる。従って、本発明に使用されるウイルスは、放射線の感受性を高めることによって顕著な抗腫瘍効果を示すことができ、放射線との併用療法に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、ヒト癌細胞におけるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線との併用によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍効果を示す図である。ＯＢＰ−３０１感染及び電離放射線の用量又は線量依存的に細胞障害活性が示される。
図１Ｂは、ヒト癌細胞におけるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線との併用によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍効果を示す図である。ヒト癌細胞へのＯＢＰ−３０１の感染により放射線増感増強効果が示される。
図１Ｃは、ヒト癌細胞におけるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線の併用によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍効果を示す図である。図は、ＯＢＰ−３０１及び／又は放射線処置後のヒト癌細胞の位相差画像（倍率×１００）を示す。
図１Ｄは、ヒト癌細胞におけるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスと放射線との併用によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍効果を示す図である。図は、ヒト癌細胞におけるウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖及び拡散（倍率×１００）を示す。
図２Ａは、放射線照射したヒト癌細胞における腫瘍融解アデノウイルスの増殖に関する評価を示す図である。ヒト癌細胞におけるＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析結果が示されている。
図２Ｂは、放射線照射したヒト癌細胞における腫瘍融解アデノウイルスの増殖に関する評価を示す図である。放射線照射したヒト癌細胞におけるＯＢＰ−３０１感染後のアデノウイルスＥ１Ａタンパク質の発現が示されている。
上パネル：４５ｋＤアデノウイルスＥ１Ａタンパク質、下パネル：ローディングコントロールとしての４２ｋＤアクチン。
図２Ｃは、放射線照射したヒト癌細胞における腫瘍融解アデノウイルスの増殖に関する評価を示す図である。放射線照射したヒト癌細胞におけるＯＢＰ−３０１の増殖効率が示されている。
図３Ａは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染性に対する電離放射線の効果を示す。放射線照射したヒト癌細胞において、非増殖性ＧＦＰ発現アデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）を感染させた後のＧＦＰ蛍光発現が示されている。
明視野での顕微鏡観察（上パネル）、及び処置から４８時間後のＧＦＰ発現（下パネル）（倍率×２００）。
図３Ｂは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染性に対する電離放射線の効果を示す図である。放射線照射したＡ４３１及びＡ５４９細胞におけるＡｄ−ＧＦＰ感染後のＧＦＰ発現レベルのフローサイトメトリー分析結果が示されている。
図３Ｃは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染性に対する電離放射線の効果を示す図である。Ａ４３１、Ａ５４９及びＴＥ８細胞におけるＯＢＰ−３０１の感染効率の比較分析結果が示されている。
図４Ａは、ヒト癌細胞におけるＤＮＡ−ＰＫタンパク質複合体の発現及び局在性に対するＯＢＰ−３０１の感染の効果を示す図である。ＯＢＰ−３０１感染後のＡ５４９細胞におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現が示されている。
上パネル：３５０ｋＤアデノウイルスＥ１Ａタンパク質、下パネル：ローディングコントロールとしての４２ｋＤアクチン。
図４Ｂは、ヒト癌細胞におけるＤＮＡ−ＰＫタンパク質複合体の発現及び局在性に対するＯＢＰ−３０１の感染の効果を示す図である。ＯＢＰ−３０１を感染させたＡ５４９細胞におけるＫｕタンパク質の細胞内局在が示されている。
Ｋｕタンパク質は緑で示しＰＩ染色ＤＮＡは赤で示す（倍率×１０００）。
図５Ａは、ｎｕ／ｎｕマウスの側腹に、樹立したＡ５４９を異種移植したときの腫瘍に対するＯＢＰ−３０１の腫瘍内注射及び局所放射線照射の抗腫瘍効果を示す図である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定）。
図５Ｂは、ｎｕ／ｎｕマウスの側腹に、樹立したＡ５４９を異種移植したときの腫瘍に対するＯＢＰ−３０１の腫瘍内注射及び局所放射線照射の抗腫瘍効果を示す図である。
処置から３７日後の腫瘍の代表的な肉眼的所見を示す。
図５Ｃは、ｎｕ／ｎｕマウスの側腹に、樹立したＡ５４９を異種移植したときの腫瘍に対するＯＢＰ−３０１の腫瘍内注射及び局所放射線照射の抗腫瘍効果を示す図である。腫瘍のパラフィルム切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示す（倍率×２００（上パネル）、×４００（下パネル））。
図６は、放射線耐性株の作製手順の概略を示す図である。
図７は、親株と放射線耐性株におけるＣＤ１３３陽性細胞の割合をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。
ａ：親株と放射線耐性株におけるＣＤ１３３陽性細胞の存在をＣＤ１３３−ＡＰＣ抗体を用いてフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。
ｂ：親株及び放射線耐性株におけるＣＤ１３３陽性細胞の割合を示すグラフである。
図８は、放射線耐性株におけるＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞をＦＡＣＳによりソートした後に、ソートした細胞群の純度をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。
図９は、ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の自己複製能力（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ／ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｂｉｌｉｔｙ）をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。
図１０は、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）の存在下におけるＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の自己複製能力をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。
図１１は、ＣＤ１３３陽性細胞の未分化スフェア形成を示す図である。
図１２は、スフェアに含まれるＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の割合を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。
図１３は、ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の抗癌剤（５−ＦＵ）耐性をＸＴＴアッセイにより解析した結果を示す図である。統計的有意差（ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示す。
図１４は、ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の抗癌剤（シスプラチン）耐性をＸＴＴアッセイにより解析した結果を示す図である。統計的有意差（ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示す。
図１５は、ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の抗癌剤（パクリタキセル）耐性をＸＴＴアッセイにより解析した結果を示す図である。統計的有意差（ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示す。
図１６は、ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の放射線耐性をＸＴＴアッセイにより解析した結果を示す図である。統計的有意差（ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示す。
図１７は、テロメライシンのＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞に対する抗腫瘍効果をＸＴＴアッセイにより解析した結果を示す図である。
図１８は、ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞におけるｈＴＥＲＴ発現量の比較を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２００７年４月２７日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２００７−１１９８５８号）の明細書及びに記載の内容を包含する。
１．概要
腫瘍融解アデノウイルスは、標準的な癌治療とは異なるメカニズム、及び一般的な治療方法との相乗的な相互作用により腫瘍細胞を殺傷することがこれまで説明されてきた。しかしながら、併用療法の相乗効果の背景にある分子メカニズムは十分に明らかとなっていない。
そこで本発明者らは、ウイルス増殖を調節することが可能なヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターを有する、テロメラーゼ特異的増殖アデノウイルス（ＯＢＰ−３０１又はテロメライシンという）を構築し、併用療法の相乗効果について検討した。
本発明の一態様として、実施例に示すように、ＯＢＰ−３０１感染と電離放射線照射併用による抗腫瘍効果は、ＸＴＴアッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。アデノウイルスの感染性及び細胞内増殖は、定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。ＤＮＡプロテインキナーゼ（ＰＫ）触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の発現およびＫｕ７０／８０の核移行に対するＯＢＰ−３０１の効果は、それぞれウエスタンブロッティング及び免疫蛍光染色により検討した。また、ｎｕ／ｎｕマウスに移植されたヒトの皮下腫瘍の増殖に対する治療効果を、肉眼的観察及び組織化学的染色により比較した。
その結果、放射線照射後にＯＢＰ−３０１を感染させると顕著なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害を誘導した。放射線照射は、ＯＢＰ−３０１の細胞内増殖速度には影響しなかったが、ＯＢＰ−３０１による細胞障害性を促進した。また、放射線照射後にＯＢＰ−３０１を感染した場合は、ヒト肺癌細胞であるＡ５４９においてＤＮＡ−ＰＫｃｓ発現が減少した。Ｋｕ７０／８０タンパク質は、電離放射線照射後はＡ５４９細胞の核に蓄積したが、ＯＢＰ−３０１の感染後は細胞質に蓄積した。ＯＢＰ−３０１の細胞内注射と局所放射線照射とを併用した場合は、Ａ５４９腫瘍を異種移植したｎｕ／ｎｕマウスにおいて相乗的に有意に治療効果を示し、それぞれ単独で処置した場合よりも効果はさらに高いものであった。
以上のことから、本発明者らは、電離放射線照射及びＯＢＰ−３０１の感染を併用した場合、電離放射線照射によりウイルスの感染性が増加するとともに、ＯＢＰ−３０１の感染によりＤＮＡ修復を阻害し、その結果、両者が互いに腫瘍細胞の感受性を増加させることを見出した。この併用療法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において抗腫瘍効果を促進した。
さらに、本発明者らは、腫瘍の悪性化や放射線耐性などをもたらす癌幹細胞の特異的なマーカーであるＣＤ１３３に着目して鋭意検討を行った結果、本発明のウイルスが、放射線耐性及び抗癌剤耐性を有するＣＤ１３３陽性細胞に対して抗腫瘍効果を有することを見出した。
２．本発明の組換えウイルス
本発明の組換えウイルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれたウイルスをいう。用いられるウイルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ５のアデノウイルスが特に好ましい。
本発明に使用される組換えウイルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーターにより、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子が駆動される。腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高いため、テロメラーゼが含まれる腫瘍細胞においてはテロメラーゼプロモーターが活性化し、これにより本発明に含まれる組換えウイルスが増殖する。このように、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞でしか増殖しないので、癌細胞特異的及びテロメラーゼ特異的に増殖及び複製されることになる。その結果、腫瘍細胞内では、ウイルス増殖による細胞障害が起こり、これにより、本発明に使用される組換えウイルスは腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。このような組換えウイルスを、本発明において放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤として使用することができる。
「テロメラーゼのプロモーター」は、テロメラーゼの転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する。テロメラーゼとは、真核生物染色体の複製時の短縮に拮抗して、テロメア長を維持する酵素である。このようなテロメラーゼのプロモーターの種類は、目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のプロモーターが好ましい。ｈＴＥＲＴは、その５’末端の上流１．４ｋｂｐの領域で、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域がｈＴＥＲＴプロモーターと考えられるが、中でも、翻訳開始部位の上流１８１ｂｐの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、このコア領域を含むものであれば、限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流３７８ｂｐ程度の配列をｈＴＥＲＴプロモーターとして使用するのが好ましい。この３７８ｂｐ程度の配列は、１８１ｂｐのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。４５５ｂｐの長さのｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。また、１８１ｂｐのコア領域の塩基配列を配列番号５に示す。
ｈＴＥＲＴプロモーターは、配列番号１に示される塩基配列又はそのコア領域の塩基配列（配列番号５）のほか、配列番号１又はコア領域の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列よりなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつｈＴＥＲＴプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も含まれる。このようなヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列又はコア領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、０．１％〜０．５％ＳＤＳ及び４２℃〜６８℃の条件が挙げられ、より詳細には、６０〜６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５〜１５分の洗浄を４〜６回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）等を参照することができる。また、配列番号１に示す塩基配列又はコア領域の塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつｈＴＥＲＴプロモーターとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も、用いることができる。
本発明において、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含むこととしたのは、ＩＲＥＳ配列をＥ１Ａ遺伝子とＥ１Ｂ遺伝子との間に挿入したものを使用すると、ウイルスが宿主細胞に感染した際に、増殖能力が高くなるためである。Ｅ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子は、Ｅ１遺伝子に含まれる遺伝子であるが、このＥ１遺伝子とは、ウイルスの有するＤＮＡ複製に関する初期遺伝子（ｅａｒｌｙ：Ｅ）と後期遺伝子（ｌａｔｅ：Ｌ）のうちの初期遺伝子の一つをいい、ウイルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。Ｅ１Ａ遺伝子によりコードされるＥ１Ａタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群（Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４等）の転写を活性化する。Ｅ１Ｂ遺伝子でコードされるＥ１Ｂタンパク質は、後期遺伝子（Ｌ遺伝子）のｍＲＮＡが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号２及び配列番号３に示す。
Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは、それぞれ配列番号２及び配列番号３に示される塩基配列のほか、配列番号２及び配列番号３からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列よりなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ各々Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法及びストリンジェントな条件は前記と同様である。また、配列番号２又は３に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＥ１Ａ及びＥ１Ｂとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）とは、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、１８ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来ｍＲＮＡはこの配列を介して翻訳されることが知られている。ＩＲＥＳ配列からの翻訳効率は高く、ｍＲＮＡの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。したがって、本ウイルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターによりＥ１Ａ遺伝子とＩＲＥＳ配列の下流にあるＥ１Ｂ遺伝子の両方が独立に翻訳される。ＩＲＥＳを使用すると、テロメラーゼのプロモーターの発現制御がＥ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子に独立して及ぶために、Ｅ１Ａ遺伝子あるいはＥ１Ｂ遺伝子のいずれか一方をテロメラーゼのプロモーターで制御する場合に比べて、ウイルスの増殖をより厳格にテロメラーゼ活性を有する細胞に限定することができる。ＩＲＥＳ配列を配列番号４に示す。
また、ＩＲＥＳは、配列番号４に示される塩基配列のほか、配列番号４からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列よりなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＩＲＥＳとしての活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。このような塩基配列は、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法及びストリンジェントな条件は、前記と同様である。また、配列番号４に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつＩＲＥＳとしての活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
また、本発明において、ヒトテロメラーゼのプロモーターは、Ｅ１遺伝子の上流に位置する。テロメラーゼ活性を有する細胞内で増殖を促進することができるからである。
本発明の組換えウイルスに含まれる遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）を用いる方法、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（フナコシ）、ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ社）等によるアガロースゲルを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ＆スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（アプライドバイオシステムズ社））を利用して配列を解析することも可能である。
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように連結させる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のＤＮＡ断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクターとしては、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のＩＲＥＳ（ｍＲＮＡ内部のリボソーム結合部位）が含まれていて、１種類のｍＲＮＡから２箇所のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を翻訳することが可能なｐＩＲＥＳベクターのほか、大腸菌由来のプラスミド（ｐＣＲ４、ｐＣＲ２、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４など）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられ、この他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなども用いられる。本発明の場合は、ｐＩＲＥＳベクターを用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、「ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子」をこの順に含む組み換え遺伝子を作製することができるため、好ましい。ＤＮＡの連結には、ＤＮＡリガーゼを用いることができる。上記組換え遺伝子のウイルスへの組み込みは、例えばエレクトロポレーション法、リポソーム法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
本発明において、ヒトテロメラーゼとしてｈＴＥＲＴを用いる場合について以下に具体的に説明する。
２９３細胞等のＥ１遺伝子を発現している細胞からＥ１Ａ−Ｓ、Ｅ１Ａ−ＡＳ、Ｅ１Ｂ−Ｓ、Ｅ１Ｂ−ＡＳ等のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＤＮＡ−ＰＣＲを行うことによりＥ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を増幅し、必要に応じてＴＡクローニング等の公知の方法を用いて配列を確認した後、公知の制限酵素でＥ１Ａ及びＥ１ＢのＤＮＡ断片を切り出すことができる。
次に、本発明に使用されるｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂからなる遺伝子は、公知のベクター（例えばｐＩＲＥＳ等）に『Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ』の順になるように各遺伝子を、マルチクローニングサイト等を利用して挿入することにより作製することができる。次いで、ＭｌｕＩ、ＢｇｌＩＩＩ等の制限酵素で切り出したｈＴＥＲＴプロモーター配列を、Ｅ１Ａの上流に挿入することができる。
必要に応じて、ｐＳｈｕｔｔｌｅなどの公知ベクターに含まれるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをＭｆｅＩ、ＮｈｅＩ等の適当な制限酵素により取り除き、その部位にｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂから制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで切り出した配列を挿入することができる。このように、本発明に使用されるｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂからなるカセットを組込んだアデノウイルスを、特に「テロメライシン」（「Ｔｅｌｏｍｅｌｙｓｉｎ」）又は「ＯＢＰ−３０１」という。ｈＴＥＲＴプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要なＥ１遺伝子を発現させることによって、ウイルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。
組換えウイルスを細胞に感染させるには、例えば、以下の方法で感染させることができる。まず、ヒト大腸癌細胞ＳＷ６２０、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９等の細胞を適当な培養液が入った培養プレートに播き、炭酸ガス存在下で、３７℃で培養する。培養液は、動物細胞培養に一般的に使用されるＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０などが採用され、必要に応じて血清、抗生物質、ビタミン等を添加することができる。培養した細胞に一定量の本ウイルス、例えば、０．１〜１０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、好ましくは、０．１〜１ＭＯＩを接種することにより感染させる。ＭＯＩとは、一定量の培養細胞に一定量のウイルス粒子を感染させる場合のウイルス量（感染単位）と細胞数の比をいい、ウイルスを細胞に感染させる際の指標として用いられる。
ウイルス増殖を確認するには、ウイルス感染細胞を回収し、ＤＮＡを抽出し、本ウイルスが有する適当な遺伝子を標的とするプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで定量的に解析することができる。
３．テロメライシン−ＧＦＰ
本発明は、ヒトテロメラーゼのプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列及びＥ１Ｂ遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのＥ１領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのＥ３領域に組み込まれた組換えウイルスを、放射線増感増強剤又は放射線併用用抗腫瘍剤として提供する。標識カセットは、プロモーター及び標識タンパク質をコードする遺伝子を含むものであり、プロモーターとしては、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター（配列番号６）、ｈＴＥＲＴプロモーター（配列番号１）などが挙げられる。あるいは、発癌及び発癌抑制因子プロモーターを使用することも可能である。「発癌及び発癌抑制因子プロモーター」とは、癌細胞で発現が増強あるいは減弱している因子のプロモーターを意味し、例えばｐ１６プロモーター及びＤＲ５プロモーターが挙げられる。
これらのプロモーターにより標識タンパク質をコードする遺伝子が駆動される。
本発明においては、標識タンパク質をコードする遺伝子としてＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を使用した組み換えウイルスを「テロメライシン−ＧＦＰ」という。
テロメライシン−ＧＦＰの標識カセットに含まれる組換え遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に従い、当業者であれば容易に行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。たとえば、エチジウムブロマイドを用いる方法、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）を用いる方法、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（フナコシ）、ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ社）等によるアガロースゲルを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、フリーズ＆スクイーズ法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（アプライドバイオシステムズ社）を利用して配列を解析することも可能である。その後、上記のようにして得られた遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のＤＮＡ断片を、上記標識タンパク質をコードする遺伝子断片の上流に、当該遺伝子を駆動させうるように上記プロモーターをコードする遺伝子断片を配置するように組換え遺伝子を設計する。このとき、プラスミドとして、シャトルプラスミドｐＨＭ１１などを用いることができる。そして、ＤＮＡリガーゼを用いて両遺伝子を連結させ、ベクターに挿入し、標識カセット組換え遺伝子を作製する。
公知のベクターとしては、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＣＲ４、ｐＣＲ２、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４など）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
その後、上記複製カセット及び標識カセットを含む組換え遺伝子を、適当な制限酵素を用いて切り出し、適当なウイルス発現ベクター挿入することにより、組換えウイルスを作製することができる。ウイルス発現ベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられえるが、上記したように、アデノウイルス、特にタイプ５のアデノウイルスが好ましい。カセットのウイルスへの組み込みは、例えばエレクトロポレーション法、リポソーム法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を用いることができる。
本発明では、具体的には、シャトルプラスミドｐＨＭ１１にｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）由来のＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０Ｐ（Ａ）を挿入し、このプラスミドのＣｓｐ４５１断片を、ｐｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂを組み込んだｐＳｈｕｔｔｌｅベクターのＣｌａＩ部位に挿入することによってテロメライシン−ＧＦＰ組換え遺伝子を得ることができる。
本発明では、具体的には、上記のように作製した組換え遺伝子から、公知の制限酵素により必要な部分の配列を切り出し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）等の市販のキットを用いてＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ等のウイルスのＤＮＡに挿入することができる（得られたものを「ＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢ」という。）。
そして、このＡｄｅｎｏＸ−ｈＡＩＢを公知の制限酵素により線状化した後、２９３細胞等の培養細胞にトランスフェクションすることで、感染性のある組換えウイルスを作製することができる。
４．放射線増感増強剤
本明細書において、放射線増感増強とは、放射線治療の効果を増強すること、及び放射線照射を併用したときに腫瘍を効果的に殺傷できるように腫瘍の放射線に対する感受性を高めることのいずれか一方又は両者を意味する。従って、本発明の放射線増感増強剤の使用態様は、放射線照射前に腫瘍に投与する形態、放射線照射中に腫瘍に投与する形態、放射線照射後に腫瘍に投与する形態、及び放射線耐性となった腫瘍に投与する形態のいずれをも含むものであり、これらの形態の組合せも含む。このような薬剤として、本発明ではテロメライシン又はテロメライシン−ＧＦＰが使用される。「放射線」としては、電離放射線、粒子線及び放射性同位体から生じる放射線、例えばＸ線、γ線、α線、β線、電子線、陽子線、及び中性子線などが挙げられるが、好ましくはγ線である。処置の対象となる生物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サルなどの哺乳動物又はそれらの一部が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、放射線増感の対象となる腫瘍としては、あらゆる種類の腫瘍を用いることができる。例えば、頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前立腺、膵、食道、膀胱、胆嚢・胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌、あるいは白血病、リンパ腫、肉腫、間葉系腫瘍等に有効である。また、皮膚の基底細胞癌や癌幹細胞などにも有効である。ヒトの組織由来の腫瘍細胞及び癌幹細胞のほとんどはテロメラーゼ活性の上昇を示しており、本発明の組み換えウイルスはそのようなテロメラーゼ活性により増殖が活発になった腫瘍細胞に全般的に作用しうる。
近年の研究により、いくつかの種類の腫瘍には、癌幹細胞と呼ばれる細胞が存在することが明らかになっている。癌幹細胞は、腫瘍再形成能を有し腫瘍を悪性化し、放射線や抗癌剤耐性をもたらすことが知られている。また、癌幹細胞は、特異的なマーカーであるＣＤ１３３をその細胞表面に発現することが知られており、他の腫瘍細胞と識別できることが明らかになっている。
本発明において、放射線増感の対象となる腫瘍細胞には、放射線耐性又は抗癌剤耐性を有するものも含まれる。
上記のように、腫瘍細胞では正常細胞と比較してテロメラーゼの発現が極めて高い。従って、本発明の組換えウイルスは、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞のみで増殖するため、結果として腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。そして、ウイルスの感染によって腫瘍細胞の放射線に対する感受性が高まることから、より効果的に腫瘍を殺傷することができる。
放射線を照射するときの照射量は、一般的には６０〜７０Ｇｙが標準的照射量と考えられているが、照射部位によって適宜変更することができる。また、これらの上限及び下限の照射量の範囲から適宜線量の範囲を選択することが可能である。本発明の組換えウイルスは腫瘍の放射線に対する感受性を高めるため、癌の一般的放射線療法で使用される線量よりも少なくて済む。
５．医薬組成物
本発明の組み換えウイルスを含む医薬組成物は、上記放射線増感増強剤のほか、放射線照射と併用するための抗腫瘍剤として、あるいは放射線に耐性となった腫瘍に対する治療剤として使用することができる。
これは、テロメライシンが腫瘍細胞に及ぼす細胞死の作用機序が、従来の抗がん剤によるアポトーシスの作用機序とは異なること、さらに、テロメライシンは、抗腫瘍作用を有する物質で腫瘍細胞が処理された場合でも、何らその影響を受けずに、その細胞内での増殖複製を行うことができるといった、テロメライシンの性質により達成されたものである。
本発明の医薬組成物は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、他の抗腫瘍作用を有する物質（他の抗腫瘍剤）を併用することも可能である。この場合、組換えウイルスと他の抗腫瘍剤とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま用いてもよく、あるいは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合することができる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射（特に腫瘍内注射）、静脈への注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、腫瘍の放射線に対する感受性が高まるため、ウイルスの一日投与量としては、１０６〜１０１１ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０９〜１０１１ＰＦＵ程度とするのがよく、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。また、本発明のウイルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、ウイルスが感染し易くすることもできる。
ここで、本発明において、「併用」とは、本発明の組換えウイルス（医薬組成物）の投与と放射線照射との組合せを意味するが、本発明のウイルスの投与時期は放射線照射の時期を問わず、放射線照射前であっても照射後であっても照射中であってもよく、さらに、これらの時期を任意に組み合わせることが可能である。放射線照射後に投与する場合は、その投与時期は照射直後〜４８時間以内、好ましくは直後〜２４時間以内である。但し、放射線照射によって治療効果が得られない患者（例えば放射線照射に対し耐性である腫瘍を有する患者）に対しても、本発明の医薬組成物を投与することができる。その場合の本発明の組換えウイルスの投与時期は不問であり、以前の放射線照射の時期から相当程度時間又は日数が経過しても投与することができる。また、放射線照射前に投与する場合は、その投与時期は照射前２４〜９６時間前、好ましくは４８〜７２時間前である。さらに、放射線照射と医薬組成物投与の処置間隔および処置回数は、腫瘍の大きさや患者の臨床症状に応じて適宜設定することができる。例えば、放射線を総線量を調節しながら週２〜７日間（好ましくは５日間）連日照射し、その照射期間中に医薬組成物を数回投与することが可能である。
本発明の医薬組成物は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。
（１）正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、造血細胞等の浮遊細胞では本発明のウイルスは感染しにくい。
（２）本発明のウイルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウイルスよりも低い濃度で使用することができる。
（３）本発明のウイルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によって抗ウイルス作用が働く。
（４）放射線照射の感受性を高めることができるため、放射線量及び／又は本発明のウイルス量を少なくしても抗腫瘍効果を得ることができる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
本発明者らは、腫瘍融解アデノウイルスをヒト癌細胞に感染させたときの当該ヒト癌細胞におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現及びＫｕ７０／８０の細胞内局在に対する放射線増感効果を検討した。また、本発明者らは、電離放射線により、標的細胞におけるアデノウイルスの取り込みが変化するか否かを検討した。さらに、放射線治療を併用した場合の腫瘍融解ウイルス療法の治療効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で検討した。
１．材料及び方法
（１）細胞株及び細胞培養
ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株であるＡ５４９及びヒト類表皮癌細胞株であるＡ４３１は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）添加Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。別のヒトＮＳＣＬＣ細胞株であるＨ１２９９及びヒト食道癌細胞株であるＴＥ８は、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で単層培養により通常の方法で増殖させた。
（２）組換えアデノウイルス
腫瘍特異的に選択的に増殖する組換えアデノウイルスベクターであるＯＢＰ−３０１（テロメライシシ）は、以前構築され、特徴付けられている（Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０：２８５−２９２、Ｔａｋｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５；２４：３１３０−４０、Ｕｍｅｏｋａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：６２５９−６５、Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００６；３１２：２５６−６５）。本実施例においては、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｃＤＮＡを含む、選択的増殖性ＯＢＰ−４０１（Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００６；１１９：４３２−４０、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ），２００６．）、及びＧＦＰをコードするｃＤＮＡを含む非増殖性のＥ１欠失アデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）（Ｕｍｅｏｋａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：６２５９−６５）も使用した。これらのウイルスは、ＣｓＣｌ２段階勾配超遠心分離により精製後、ＣｓＣｌ２直線的勾配超遠心分離により精製した。ウイルス力価及び感染力価は、２９３細胞を用いてプラークアッセイにより測定した。
（３）細胞生存率測定
９６ウェルプレートに、１０００細胞／ウェルでヒト腫瘍細胞を播種し、１２時間後に放射線に曝露した。その後、ＸＴＴ（３’−［１−（フェニルアミノカルボニル）−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物）アッセイを行った。細胞は、ＭＢＲ−１５２０Ｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．、東京、日本）を用いて、所定の線量のγ線（０〜２５Ｇｙ）を単回照射した。放射線照射直後に、細胞に所定のＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のＯＢＰ−３０１を感染させた。細胞生存率は、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて製造業者により提供されたプロトコールに従って処置し、５日後に測定した。
（４）蛍光顕微鏡観察
Ａｄ−ＧＦＰ又はＯＢＰ−４０１を感染させた後、ヒト癌細胞におけるＧＦＰ遺伝子の発現は、Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ−１００蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、東京）を用いて評価し、写真を撮影した（倍率：×２００）。
（５）フローサイトメトリー
フローサイトメトリーによる分析では、２×１０５細胞を抗コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）マウスモノクローナル抗体（ＲｍｃＢ；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を用いて、４℃で３０分間標識し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ウサギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を加えてインキュベートし、ＦＡＣＳｃａｌｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。画面上のウインドウでは死細胞及び残渣を排除するようセットした。ＧＦＰ遺伝子のみの発現もＦＡＣＳｃａｌｌｉｂｕｒで評価した。
（６）定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ
細胞は、２５ｃｍ２フラスコに５ｘ１０４の細胞数で播種し、４８時間後に放射線照射した。細胞は、ｍｏｃｋ又は所定の線量のγ線に曝露し、その後１．０ＭＯＩのＯＢＰ−３０１を２時間感染させた。ウイルスを除去後、細胞を３７℃でインキュベートし、２、２４、４８、及び７２時間後にそれぞれトリプシンで処理して回収し細胞内増殖分析に供した。
ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出し、Ｅ１Ａ遺伝子についてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを実施した。Ｅ１Ａに用いた特異的プライマーの配列は以下の通りである。
2008136213.tif 000002
ＰＣＲによる増幅では、９５℃、６００秒の変性ステップ後、９５℃、１０秒の変性、５８℃、１５秒のアニーリング、及び７２℃、８秒の伸長反応を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。データは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて分析した。未処置の細胞の値で割ることにより標準化した値をそれぞれのサンプルについて示した。
（７）ウエスタンブロット分析
本実施例では、Ｅ１Ａに対する一次抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＤＮＡ−ＰＫｃｓに対する一次抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）、及びペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を使用した。細胞は、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、回収し、プロテイナーゼ阻害剤（０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）含有溶解バッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ４０］に溶解した。細胞溶解液は、氷上で２０分静置後、４℃、１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上清は、全細胞抽出物として用いた。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて測定した。等量のタンパク質（５０μｇ）を５分間煮沸し、６−１２．５％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを用い、還元条件下で電気泳動を行った。タンパク質は、Ｈｙｂｏｎｄ−ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）転写膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に転写し、一次抗体とともにインキュベートした後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を加えてさらにインキュベートした。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、東京）を用いて、結合した抗体のペルオキシダーゼ活性を検出した。
（８）免疫蛍光染色
組織培養チャンバースライド（Ｎｕｎｃ，Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）上でセミコンフルエントになった細胞に所定の処理を行い、次にアセトンで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、スライドをＫｕ７０／８０に対する一次抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。スライドは、ＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体であるＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｃｏ．，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）とともに３７℃で２０分間インキュベートした。さらに、スライドをＰＢＳで３回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、緩衝グリセロール溶液をマウントして蛍光顕微鏡観察に用いた。
（９）ｉｎ  ｖｉｖｏヒト腫瘍モデル
ヒトＮＳＣＬＣ細胞であるＡ５４９（２×１０６細胞／マウス）を、５−６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に皮下注射し、直径約５ｍｍになるまで増殖させた。その時点において、マウスを４つのグループに無作為に割り当て、各マウスに３Ｇｙ／腫瘍の線量で１日目から２日ごとに放射線を照射した。放射線照射直後に、５０μｌのＯＢＰ−３０１含有溶液（１投与量：１×１０８ＰＦＵ／個体）又はＰＢＳを腫瘍に注射した。各腫瘍の垂直方向直径を３日ごとに測定し、腫瘍体積は、以下の計算式を用いて計算した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２×０．５
式中、ａは最長径、ｂは最短径であり、０．５は楕円形の体積を計算するための定数である。実験プロトコールは、岡山大学動物実験倫理審査委員会により承認された。
（１０）統計分析
全てのデータは、平均±ＳＤで示した。グループ間の差については、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定を用いて統計学的有意差を検討した。０．０５未満のＰ値が統計学的有意差を意味する。
２．結果
（１）ヒト癌細胞株に対するＯＢＰ−３０１と放射線の併用によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍効果
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＯＢＰ−３０１と電離放射線が相互作用する可能性を検討するため、まず初めに、異なる臓器由来の４種類のヒト癌細胞株（肺［Ａ５４９、Ｈ１２９９］、食道［ＴＥ８］、及び表皮［Ａ４３１］）に対し、各種用量又は線量の効果を評価した。細胞には、γ線の単回照射を行った後、ｍｏｃｋ又はＯＢＰ−３０１のいずれかを感染させ、処置から５日後に細胞生存率をＸＴＴアッセイにより評価した。実験条件を最適化するため、ＯＢＰ−３０１を単独で用いた場合に０〜１００％の細胞障害をもたらすＯＢＰ−３０１の濃度を選択した。
代表的な用量又は線量反応曲線を図１Ａに示す。放射線を併用することにより、ＯＢＰ−３０１の細胞障害活性は、実験に用いた全ての細胞株において用量又は線量依存的に増加した。図１Ａにおいて、データは、ｍｏｃｋを処置した細胞に対する生存細胞の比率として示し、３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）試験の平均±ＳＤとして示す。
Ａ４３１及びＡ５４９細胞の細胞生存率を、処置から５日後に評価した。Ａ４３１細胞においては、１０ＭＯＩのＯＢＰ−３０１の感染により、電離放射線の細胞障害性が５．７倍に増加した（ｍｏｃｋ、ＯＢＰ−３０１感染細胞において、それぞれＬＤ５０＝４．０、０．７Ｇｙ）。Ａ５４９細胞においては、１ＭＯＩのＯＢＰ−３０１の感染により、電離放射線の細胞障害性が４倍に増加した（ｍｏｃｋ、ＯＢＰ−３０１感染細胞において、それぞれＬＤ５０＝２．４、０．６Ｇｙ）（図１Ｂ）。対照的に、非増殖性Ａｄ−ＧＦＰを感染させても、放射線治療に対する効果は認められなかった。図１Ｂにおいて、放射線の線量反応曲線はｍｏｃｋを処置した細胞に対する比率として示し、３重試験の平均±ＳＤとして示す。３種の独立した実験の代表的な結果を示す。
Ａ４３１及びＴＥ８細胞に対し、１Ｇｙ放射線照射、１０ＭＯＩのＯＢＰ−３０１の感染、又は両者の併用（放射線照射後のＯＢＰ−３０１感染）を実施し、細胞の形態は、処置から５日後に評価した。位相差顕微鏡観察の場合、１Ｇｙの放射線の単回照射のみを行ったときは、Ａ４３１細胞及びＴＥ８細胞は５日目にサブコンフルエントになるまで増殖することが示された。一方、放射線を１０ＭＯＩのＯＢＰ−３０１感染と組み合わせた場合は、膨張した細胞、及び浮遊細胞を特徴とする、広範な細胞死による細胞生存率の迅速な低下が認められた（図１Ｃ）。ＯＢＰ−３０１の感染単独でも効果を示したが、電離放射線は明らかにＯＢＰ−３０１の細胞障害効果を促進し、ＯＢＰ−３０１感染とγ線照射の併用は、Ａ４３１及びＴＥ８両者において顕著な細胞障害効果を誘導した。
本発明者らは、腫瘍融解ウイルス療法と放射線治療の併用後のウイルスの増殖及び拡散を、視覚的にも確認した。ＯＢＰ−４０１は、ウイルス分布をＧＦＰ蛍光によってモニタすることができる点で有利である。Ａ５４９細胞に２Ｇｙで放射線照射後、０．１ＭＯＩでＯＢＰ−４０１を感染させ、処置から５日後に蛍光顕微鏡により観察した。ほとんどの細胞は細胞死に至ったが、ＧＦＰ発現は強力かつ持続的であり、このことは、ウイルス増殖および周囲の腫瘍細胞への拡散を示している。ＧＦＰ発現は、γ線照射と併用した場合にもＯＢＰ−４０１を感染させたＡ５４９細胞において検出された（図１Ｄ）。これらの結果は、腫瘍融解ウイルス療法と放射線治療の併用が抗腫瘍効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて促進することを示すものである。
（２）ヒト癌細胞におけるＯＢＰ−３０１のウイルス増殖に対する放射線の効果
本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて細胞表面におけるＣＡＲ（抗コクサッキーアデノウイルス受容体）の発現に対する放射線の効果を測定した。Ａ４３１及びＡ５４９細胞に１又は１０Ｇｙの線量で放射線照射し、２４時間後にフローサイトメトリーにより分析した。細胞は、抗ＣＡＲモノクローナル抗体とともにインキュベートし、次にＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出した。ＦＩＴＣ結合アイソタイプ適合（ｍａｔｃｈｅｄ）正常マウスＩｇＧ１を全ての実験においてコントロールとして用いた。ＣＡＲ陽性細胞の比率は、Ａ４３１細胞においては１００％、Ａ５４９細胞においては９９％であり、これらの発現レベルは、低線量（１Ｇｙ）及び高線量（１０Ｇｙ）のγ線照射後においても維持された（図２Ａ）。
本発明者らは、ウエスタンブロット分析によりＯＢＰ−３０１のウイルス増殖に対する放射線の効果を検討した。具体的には、Ａ４３１及びＡ５４９細胞に、ｍｏｃｋを処置或いは１又は２Ｇｙの放射線を照射し、１０又は１ＭＯＩのＯＢＰ−３０１を感染させ、所定の時点で回収した。また、２９３細胞は、陽性対照として用いた。全細胞溶解液は、ゲル電気泳動、ＰＶＤＦ膜への転写、及びＥ１Ａタンパク質のウエスタンブロットに供した。
ウエスタンブロット分析を行った結果、γ線照射後であっても、Ａ４３１及びＡ５４９細胞において、ＯＢＰ−３０１の感染が容易に検出可能なレベルのＥ１Ａタンパク質の発現を誘導することが示された（図２Ｂ）。これらの結果は、ｈＴＥＲＴプロモーターが、放射線照射された腫瘍細胞において転写的に活性を有することを示した。
さらに本発明者らは、子ウイルスの増殖に対する電離放射線の効果を定量的リアルタイムＰＣＲ分析により検討した。Ａ４３１、ＴＥ８、及びＡ５４９細胞に１Ｇｙ（Ａ４３１、ＴＥ８）又は２Ｇｙ（Ａ５４９）の線量で放射線照射し、次に１．０ＭＯＩのＯＢＰ−３０１を２時間感染させた。細胞は、感染から７２時間にわたり所定の時点で回収し、抽出したＤＮＡをアッセイした。ＯＢＰ−３０１の細胞内ウイルスコピー数は、γ線を照射した場合と照射していない場合において、時間経過とともに４〜６桁増加した（図２Ｃ）。感染から約４８時間後にプラトーに達した。これらの結果は、電離放射線はＯＢＰ−３０１の増殖を妨害しないことを示している。
（３）ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの感染に対する放射線の効果
アデノウイルス剤の感染効率は、アデノウイルスが複雑な細胞侵入過程を有するため、外部刺激のみならず細胞種に依存して大きく異なる。従って、本発明者らは、放射線照射によってアデノウイルスのヒト癌細胞株への感染性を改善することができるか否かを、ＧＦＰ遺伝子を発現する非増殖性アデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）を用いて検討した。
ヒト癌細胞であるＡ４３１及びＡ５４９に、異なる放射線量（１〜１０Ｇｙ）の放射線照射を行い、次にそれぞれ５０ＭＯＩ、１０ＭＯＩのＡｄ−ＧＦＰを感染させた。４８時間後、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡観察により評価した。ＧＦＰ発現は、放射線を照射していないＡ４３１及びＡ５４９細胞の一部において認められるが、γ線に曝露したＡ４３１及びＡ５４９細胞では、より高レベルのＧＦＰ発現が認められ、蛍光強度は線量依存的に増加した（図３Ａ）。また、Ａ４３１及びＡ５４９細胞の両者において、放射線量の増加に伴いＧＦＰの発現レベルが増大することが示された（図３Ｂ）。具体的には、上記の通り処置した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、フローサイトメトリーにより分析した。非照射Ａｄ−ＧＦＰ感染細胞のＭＦＩ値を１．０とし、放射線照射細胞の相対的ＭＦＩ値を非照射細胞のＭＦＩ値に対する比率として計算した。γ線照射後の相対的ＭＦＩ値における増加が線量依存的であることは注目に値する。このことは、ヒト癌細胞におけるアデノウイルスの取り込みが電離放射線によって増大することを示している。
放射線がＯＢＰ−３０１の感染性を増大させるか否かを評価するため、１Ｇｙ（Ａ４３１及びＴＥ８）又は２Ｇｙ（Ａ５４９）の線量でγ線を照射後、Ａ４３１、Ａ５４９、及びＴＥ８細胞に１．０ＭＯＩのＯＢＰ−３０１を感染させた。感染から２時間後に抽出したＤＮＡを用いて行った定量的リアルタイムＰＣＲ分析により、放射線照射した細胞におけるＯＢＰ−３０１感染後のＥ１ＡのＤＮＡ量は、放射線を照射していない細胞よりも１．８〜２．５倍高いことが示された（図３Ｃ）。従って、ＯＢＰ−３０１感染前の電離放射線照射により、ウイルス取り込みを増大させて腫瘍融解活性を高めることが示された。
（４）ヒト癌細胞における放射線誘発ＤＮＡ損傷の修復に対するＯＢＰ−３０１感染の効果
電離放射線誘発ＤＮＡ  ＤＳＢの修復に対するＯＢＰ−３０１感染の効果を検討するために、本発明者らは、放射線を照射したＯＢＰ−３０１感染Ａ５４９細胞及び照射していないＯＢＰ−３０１感染Ａ５４９細胞を用いて、ＤＮＡ修復タンパク質であるＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現をウエスタンブロット分析により検討した。具体的には、Ａ５４９細胞に、ｍｏｃｋを処置又は２Ｇｙの放射線を照射し、ｍｏｃｋを感染又は１ＭＯＩのＯＢＰ−３０１を感染させ、処置から１２時間後に細胞を回収した。全細胞溶解液は、電気泳動し、ＤＮＡ−ＰＫｃｓについてウエスタンブロットを行った。ＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質発現は、ＮＩＨイメージソフトウェアを用いた濃度測定スキャニング（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）により定量し、アクチンのシグナルを用いて標準化した。その結果、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現は、１．０ＭＯＩのＯＢＰ−３０１の感染によって、１２時間後に１０倍以上減少した。ＯＢＰ−３０１の感染後に２Ｇｙの電離放射線に曝露しても、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現レベルの減少に影響しなかった（図４Ａ）。同様の結果は、Ａ４３１細胞においても認められた。このことは、ＯＢＰ−３０１の感染によってＤＮＡ損傷の修復が阻害されることを示すものである。
Ｋｕタンパク質は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ依存性ＤＳＢ修復において重要な役割を果たしており、また、アンチセンスによるＫｕタンパク質の機能抑制は、電離放射線に対する腫瘍の感受性を高める可能性がある（Ｌｉ  ＧＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：３２６８−７４．）。また、Ｋｕタンパク質複合体（Ｋｕ７０及びＫｕ８０から構成される）は、独立して細胞質から核へと移行することが報告されている（Ｋｏｉｋｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９９；１１２：４０３１−９、Ｋｏｉｋｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９９；１８：７４９５−５０５、Ｋｏｉｋｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７６：１１０５−１１）。
そこで本発明者らは、ＯＢＰ−３０１の感染がＡ５４９細胞におけるＫｕ７０／８０の細胞内局在に影響するか否かを検討した。具体的には、Ａ５４９細胞に、ｍｏｃｋを処置又は２Ｇｙの放射線を照射し、ｍｏｃｋを感染又は１ＭＯＩのＯＢＰ−３０１を感染させ、次に処置から１２時間後に固定し、抗Ｋｕ７０／Ｋｕ８０抗体（Ｋｕ７０及びＫｕ８０のサブユニットの双方を検出する抗体）を用いて染色した。細胞はＰＩでも染色した。
抗Ｋｕ７０／Ｋｕ８０抗体を用いた間接免疫蛍光染色により、無刺激の条件で核及び細胞質における強く広範な染色が示された。２Ｇｙの線量の放射線を照射すると、核においてＫｕの染色が強く誘導され、反対に、細胞質のＫｕ発現の減少に関与した。対照的に、ＯＢＰ−３０１を感染させると、細胞質のＫｕの染色が増加した。このことは、ＯＢＰ−３０１の感染がＫｕタンパク質の核移行をブロックすることを示すものである。さらに、電離放射線を照射する前にＯＢＰ−３０１を感染させても、Ｋｕの核への移行がブロックされ、Ｋｕ発現は細胞質に維持された（図４Ｂ）。
（５）ヒト腫瘍異種移植片におけるＯＢＰ−３０１の腫瘍内注射と放射線照射の併用による抗癌活性
本発明者らは、ＯＢＰ−３０１と放射線との併用によるヒト細胞Ａ５４９に対するｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療効果を評価した。Ａ５４９細胞（２×１０６細胞／投与）を、異種移植片としてｎｕ／ｎｕマウスの後側腹（ｈｉｎｄ  ｆｌａｎｋ）に移植した。触知可能な直径７−１２ｍｍのＡ５４９腫瘍を有するマウスに３Ｇｙの局所放射線照射を行った後、１０８ＰＦＵのＯＢＰ−３０１又はＰＢＳのいずれかを、１日目から２日ごとに３サイクルで腫瘍内注射した。ＰＢＳをコントロールとして用い、６匹のマウスを１グループとして用いた。アデノウイルスＤＮＡの損傷を防止するため、放射線照射は、ＯＢＰ−３０１の注射の前に行った。ＯＢＰ−３０１の腫瘍内投与又は放射線照射のいずれか一方でも、処置の開始から４２日後にｍｏｃｋを処置した腫瘍と比較すると有意に腫瘍増殖は抑制された（ｐ＜０．０５）。ＯＢＰ−３０１と放射線とを併用すると、いずれか一方の方法により処置したマウス（ｐ＜０．０５）及びｍｏｃｋを処置した腫瘍（ｐ＜０．０１）と比較した場合、より顕著で有意に腫瘍増殖が阻害された（図５Ａ）。図５Ａにおいて、腫瘍の増殖は、腫瘍の平均体積±ＳＥＭによって示した。
ＯＢＰ−３０１と局所放射線照射を併用処置した腫瘍は、処置から３７日後の他のコホートのマウスの腫瘍と比較して、肉眼的にも明らかに小さく、併用処置が極めて有効であることが示された（図５Ｂ）。これに対し、非増殖性アデノウイルスを腫瘍内注射した場合は、放射線照射の併用にかかわらず、Ａ５４９腫瘍の増殖に対する効果が認められなかった。局所放射線照射又はＯＢＰ−３０１感染のいずれかを３サイクル行い、１０日後に切除された腫瘍の切片を用いて病理組織学的分析を行った。その結果、ＯＢＰ−３０１を感染させた場合は、組織が明らかに退縮し、未処置の腫瘍と比較して腫瘍細胞密度の減少を示した。ＯＢＰ−３０１の注射と放射線照射とを併用処置すると、広範な組織破壊が生じ、腫瘍細胞密度がさらに減少した。さらに、併用療法によって誘導される細胞融解の変化（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ）においては、硝子化した無細胞性の間質（ｈｙａｌｉｎｉｚｅｄ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｏｍａ）への置換が認められた（図５Ｃ）。また、腫瘍における広範なウイルス分布を、アデノウイルスヘクソン（ｈｅｘｏｎ）タンパク質の免疫組織化学染色により確認した。
（６）考察
本発明者らは、ＯＢＰ−３０１の感染と電離放射線の相互の増感増強効果を検討し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける併用による抗癌効果を見出した。
腫瘍融解ウイルス療法は、ヒトの癌の分子的側面の理解及びウイルスゲノムの遺伝子改変に関する技術開発に基づいて、今後さらに成長する可能性のある分野である。しかしながら、腫瘍融解ウイルス療法それ自体によっては、標的腫瘍において高いウイルス力価が持続するにもかかわらず、前臨床動物モデル又は臨床研究ではめったに腫瘍を死滅させることができない。
ウイルスは、現在の治療方法によるものとは異なるメカニズムにより腫瘍融解を引き起こす。従って、本発明の腫瘍融解ウイルス療法は、相乗的な作用機序により、有用な集学的臨床アプローチをもたらすものである。テロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルスであるＯＢＰ−３０１は、大部分のヒトの癌におけるテロメラーゼの発現活性により、多様なヒト癌細胞を効率的に殺傷することができる新規の生物剤である。
ヒトアデノウイルス血清型５に由来するアデノウイルス剤の感染効率は、ＣＡＲの発現に依存して大きく異なる（Ｗｉｃｋｈａｍ  ＴＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１９９３；７３：３０９−１９）。実際に、本発明者らは、低レベルのＣＡＲしか発現しない一部の腫瘍に対してはＯＢＰ−３０１が効果を示さないこと（Ｔａｋｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５；２４：３１３０−４０）、及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤であるＦＲ９０１２２８を処置した腫瘍細胞におけるＣＡＲのアップレギュレーションが、細胞内ウイルス増殖量を増大させ、これにより、相乗的な抗腫瘍効果を促進すること（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００６；３１２：２５６−６５）を以前に示した。ＨＤＡＣ阻害剤とは対照的に、本発明者らは、放射線照射は試験に用いた標的細胞株全てにおいてＣＡＲの発現を有意に増加しないことを見出した。また、放射線治療は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＥ１Ｂ５５ｋＤａ欠失腫瘍融解アデノウイルスであるＯＮＹＸ−０１５の感染との併用効果を示すにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて悪性グリオーマ細胞においてＣＡＲ発現を変化させなかったこと（Ｇｅｏｅｒｇｅｒ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００３；８９：５７７−８４）が報告されている。しかしながら、興味深いことに、アデノウイルスの感染性が電離放射線の照射後に増加することが、ＯＢＰ−３０１そのものだけでなく非増殖性Ａｄ−ＧＦＰでも確認された。ＯＢＰ−３０１の感染から２時間経過直後のウイルスＤＮＡのレベルは、未処置の細胞よりも放射線照射した細胞において明らかに高い値を示した。
これらの結果は、ウイルス感染前に放射線照射を行ってもＯＢＰ−３０１によるＣＡＲ非依存性の細胞侵入を可能にし、それにより、アデノウイルス感染のＣＡＲ依存性による制限を克服しうることを示す。
ＯＢＰ−３０１は、腫瘍細胞に放射線照射することにより効率よく取り込まれるが、増殖量は、放射線照射の有無に関係なく３種類の細胞株において変化しなかった。このことは、感染前に放射線照射しても基本的なウイルス増殖サイクルは変化しないことを示している。
本発明者らのデータは、ＯＢＰ−３０１の感染後のＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質の発現において有意なダウンレギュレーションを示した。以前報告されたように、考えられる説明の一つは、アデノウイルスＥ４産物が、ＤＮＡ−ＰＫとの物理的な複合体を形成することによって、ＤＮＡ−ＰＫ依存性ＤＳＢ修復を阻害するというものである（Ｂｏｙｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９９；２６３：３０７−１２）。
ＤＮＡ  ＤＳＢは、Ｋｕ複合体とＤＮＡ−ＰＫの相互作用を促進し、ＤＮＡ損傷のより効率的な修復を確実にするため、Ｋｕタンパク質は電離放射線への応答において核へ移行する。本発明者らは、ＯＢＰ−３０１の感染がこの核移行を阻害し、細胞質におけるＫｕ発現の増加を引き起こすことを見出した。従って、ＯＢＰ−３０１を感染させた腫瘍細胞は、電離放射線への感受性をより高めると言える。
本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究は、ＯＢＰ−３０１感染及び電離放射線が互いにヒト腫瘍細胞の感受性を高め、これにより併用療法の効果を増加し得ることを示す。電離放射線は、迅速なＤＮＡ  ＤＳＢを引き起こし、ウイルスの取り込みを促進する。一方、ＯＢＰ−３０１の感染は、ウイルスが増殖し、その細胞障害効果を誘導し、細胞の放射線への感受性を高めるために時間を必要とする。従って、実際の臨床応用においては、外部放射線治療（ｅｘｔｅｒｎａｌ−ｂｅａｍ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）後にＯＢＰ−３０１の腫瘍内注射を行うことが、併用効果を最大にする治療計画として適切であろう。
患者は多くの場合、月曜日から金曜日まで一日毎に放射線治療を受けることから、ＯＢＰ−３０１は、腫瘍内投与により、次の放射線治療までの間に腫瘍病巣において増殖し、拡散することが可能となる。本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験は、相対的に低用量のＯＢＰ−３０１（１〜１０ＭＯＩ）が、種々のヒト腫瘍細胞株において電離放射線の細胞障害活性を有意に促進することを示した。さらに、ＧＦＰ発現腫瘍融解ウイルス（ＯＢＰ−４０１）の感染及び増殖は、蛍光顕微鏡で観察した場合に、単回治療後に生き残った腫瘍細胞において認められた。このことは、反復治療が、ウイルス感染により予め放射線に増感した腫瘍細胞を殺傷する上でより効果的であることを示している。この推測は、ｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植モデルにおいて確認することができた。
ＯＢＰ−３０１の腫瘍内注射と局所放射線照射とを組み合わせて交互に一日間隔で３サイクル行うことにより、長期間にわたり、異種移植したＡ５４９腫瘍の増殖が明らかに阻害された。また、組織学的分析は、ＯＢＰ−３０１と放射線の併用が、それぞれの方法を単独で行うよりも腫瘍破壊においてより大きな効果をもたらすことを示した。
本発明者らの実験で示されたｉｎ  ｖｉｖｏにおける優れた抗腫瘍活性については、いくつか説明をすることができる。第一に、上述したように、放射線治療とウイルス療法の反復サイクルは、腫瘍細胞の両治療法に対する感受性を高め、それにより、相乗的な抗腫瘍活性を得ることができる。第二に、ＯＢＰ−３０１は、高いテロメラーゼ活性を伴って、放射線照射した腫瘍において増殖の促進を示す内皮細胞を殺傷することにより血管供給を阻害する（Ｔｓａｉ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５；４：１３９５−１４００）。また、局所放射線照射それ自身は、腫瘍部位における血管内皮細胞を攻撃し得るが、一方で局所注射したＯＢＰ−３０１の血流への移動を防止する。実際に、電離放射線は内皮細胞の増殖、管形成、遊走、及びクローン原性細胞の生存（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を阻害する（Ａｂｄｏｌｌａｈｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：８８９０−８．）。
また、ウイルス療法及び放射線治療は、明確なメカニズムにより、腫瘍の異なる部分における腫瘍細胞を標的とすることが考えられる。例えば、腫瘍を低酸素状態にすると、腫瘍細胞は電離放射線に対してより抵抗性となり（Ｈｏｃｋｅｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００１；９３：２６６−７６．）、腫瘍領域に局在する細胞は、低酸素条件下において生存し増殖し得る。このため、電離放射線に抵抗性を有する低酸素条件下の腫瘍細胞をいかにして殺傷するかが臨床上の課題となっている。
一方、低酸素状態は、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）によってｈＴＥＲＴ遺伝子プロモーターの転写活性を誘導すること（Ｎｉｓｈｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；２４：６０７６−８３、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６；２５：６１−９）から、ＯＢＰ−３０１は、低酸素条件下であっても増殖し、腫瘍細胞を効率的に殺傷すると推測し得る。従って、ｈＴＥＲＴ特異的腫瘍融解ウイルス療法は、局所放射線治療後に生存している腫瘍細胞を死滅させるために効果的である。
この併用療法の別の利点としては、これらの治療法が異なる細胞障害メカニズムによって機能することから、交差耐性の可能性が低いことが挙げられる。
要約すると、本発明者らのデータは、ＯＢＰ−３０１の感染と電離放射線とが互いにそれぞれの生物学的効果を改善し、それにより互いに増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏの前臨床モデルにおける抗腫瘍活性を大きく促進することを示す。
【実施例２】
【０００７】
近年の研究により、いくつかの種類の腫瘍には、癌幹細胞と呼ばれる細胞が存在することが明らかになっている。癌幹細胞とは、正常幹細胞の自己複製様式に類似した特徴を有する腫瘍細胞であり、腫瘍再形成能を有し腫瘍を悪性化する。そして、放射線耐性や抗癌剤耐性をもたらすことが知られている。
従って、腫瘍の放射線療法及び化学療法を効果的に実施するためには、放射線耐性や抗癌剤耐性を有する癌幹細胞を殺傷することが求められる。
また、癌幹細胞は、特異的なマーカーであるＣＤ１３３をその細胞表面に発現する。
そこで、本発明者らは、放射線耐性及び抗癌剤耐性を有する癌幹細胞がＣＤ１３３陽性であることに着目し、本発明のウイルスが、放射線耐性株の細胞群から単離したＣＤ１３３陽性細胞に対して抗腫瘍効果を示すか否かについて検討を行った。
１．細胞株の準備
ヒト胃癌細胞（ＭＫＮ４５）（以下「親株」ともいう）を３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）で培養した後、２Ｇｙの電離放射線を照射し、その後１４日間の回復期間（細胞集団が再成長する期間）を設けた。電離放射線の照射と回復期間の設定は３回繰り返して行った（計６Ｇｙの照射）。その結果、電離放射線耐性株（ＭＫＮ４５Ｒ３）を得た（図６）。
得られた放射線耐性株（ＭＫＮ４５Ｒ３）及び親株（ＭＫＮ４５）におけるＣＤ１３３陽性細胞の割合を、それぞれＣＤ１３３−ＡＰＣ抗体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社）及びＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｎｓｏｎ社）を用いてフローサイトメトリーによって解析した。
その結果、親株の細胞群におけるＣＤ１３３陽性細胞の割合は平均約２％であり、放射線耐性株の細胞群におけるＣＤ１３３陽性細胞の割合は平均約２２％であった。この結果から、ＣＤ１３３陽性細胞の割合は放射線耐性株の細胞群において著しく上昇することがわかった（図７）。
前記放射線耐性株の細胞群からＣＤ１３３陰性細胞（ＣＤ１３３−）およびＣＤ１３３陽性細胞（ＣＤ１３３＋）を、ＦＡＣＳを用いてそれぞれソートした。その結果、ＣＤ１３３陰性細胞は、９７．５％の純度でソートすることが可能であり、ＣＤ１３３陽性細胞は７６．５％の純度でソートすることが可能であった（図８）。
ソート後のＣＤ１３３陰性細胞およびＣＤ１３３陽性細胞は、その後の実験に用いた。
２．ＣＤ１３３陽性細胞の自己複製能力
上記１．で得られたソート後のＣＤ１３３陰性細胞及びＣＤ１３３陽性細胞の自己複製能力（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ／ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｂｉｌｉｔｙ）を、フローサイトメトリーによって検討した。
具体的には、放射性耐性株の細胞群をＦＡＣＳでソートした直後の、ＣＤ１３３陰性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陰性細胞群、及びＣＤ１３３陽性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陽性細胞群を、それぞれ分化促進因子であるウシ血清１０％を加えたＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２週間培養した。この過程において、ソート直後の細胞、培養１週間後の細胞、及び培養２週間後の細胞に含まれるＣＤ１３３陰性細胞及びＣＤ１３３陽性細胞をＦＡＣＳを用いて定量した（図９）。
その結果、ＣＤ１３３陽性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陽性細胞群に含まれる細胞は、ＣＤ１３３陽性細胞とＣＤ１３３陰性細胞に分化増殖したが、ＣＤ１３３陰性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陰性細胞群に含まれる細胞は、主にＣＤ１３３陰性細胞として増殖した。
次に、分化抑制因子である白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）の存在下におけるＣＤ１３３陽性細胞の自己複製能力を、フローサイトメトリーで検討した。
具体的には、放射性耐性株の細胞群をＦＡＣＳでソートした直後の、ＣＤ１３３陰性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陰性細胞群、及びＣＤ１３３陽性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陽性細胞群を、それぞれ分化促進因子であるウシ血清１０％及び分化抑制因子である白血病抑制因子（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１週間培養した。その結果、ソート直後の、ＣＤ１３３陽性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陽性細胞群において、ＣＤ１３３陽性細胞からＣＤ１３３陰性細胞への分化は抑制され、ＣＤ１３３陽性細胞群に占めるＣＤ１３３陽性細胞の割合は、白血病抑制因子を添加しなかった場合と比較して上昇した（図１０）。
３．ＣＤ１３３陽性細胞の未分化スフェア形成
スフェアとは、幹細胞が無血清培地で接着せず浮遊している状態で、未分化なまま増殖する際に形成する細胞のコロニーであると言われている。そこで、本節では、ソート後のＣＤ１３３陽性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陽性細胞群がスフェアを形成するか否かについて検討を行い、さらにスフェアに含まれる細胞について検討を行った。
ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞を、ＦＡＣＳによりソート、分離した後、ウシ血清を含まず、上皮増殖因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２週間増殖させた。その結果、ＣＤ１３３陽性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陽性細胞群は容易にスフェアを形成したが、ＣＤ１３３陰性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陰性細胞群は線維芽細胞様の増殖を示し、スフェアをほとんど形成しなかった（図１１）。
また、ＣＤ１３３抗体を用いてスフェアをフローサイトメトリーで分析すると、ＣＤ１３３陽性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陽性細胞群から培養して得られたスフェアの細胞は、ＣＤ１３３陽性細胞とＣＤ１３３陰性細胞の両方を含んでいた（図１２右パネル）。これに対し、ＣＤ１３３陰性細胞が大多数を占めるＣＤ１３３陰性細胞群から培養した細胞は、ＣＤ１３３陰性細胞のみを含んでいた（図１２左パネル）。この結果は、ＣＤ１３３陽性細胞が自己複製能力を有していることを示すものである。
４．ＣＤ１３３陽性細胞とＣＤ１３３陰性細胞の抗癌剤耐性、放射線耐性についての検討、並びにテロメライシン（ＯＢＰ−３０１）の抗腫瘍効果の検討
ＦＡＣＳによりソートしたＣＤ１３３陽性細胞群とＣＤ１３３陰性細胞群を、９６−ウェル培養プレートに１ウェルあたり５×１０２個の細胞数で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
以下に示すとおり、化学抗癌剤の投与、電離放射線の照射、テロメライシン感染のいずれかを行い、７日後にＸＴＴアッセイで細胞の生存率を測定した。
（１）ＣＤ１３３陽性細胞とＣＤ１３３陰性細胞の抗癌剤耐性についての検討
上記培養細胞に、５−ＦＵ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、パクリタキセルをそれぞれ異なる濃度で処理し、７日後にＸＴＴアッセイで生存率を測定した。薬剤耐性は次式で計算した。
（薬剤投与群の吸光度）／（未処理の群の吸光度）×１００％
ＣＤ１３３陽性細胞とＣＤ１３３陰性細胞を５−ＦＵ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、パクリタキセルで処理した結果をそれぞれ、図１３、図１４、図１５に示す。実験は３度繰り返して行い、同様の結果が得られた。統計的有意差（ｐ＜０．０５）はアスタリスクで示した。
実験の結果、ＣＤ１３３陽性細胞は化学抗癌剤に対して高い薬剤耐性を示した。
（２）ＣＤ１３３陽性細胞とＣＤ１３３陰性細胞の放射線耐性についての検討
上記培養細胞に３〜１０Ｇｙの放射線を照射し、７日後にＸＴＴアッセイで生存率を測定した。電離放射線耐性は次式で計算した。
（放射線照射後の細胞の吸光度）／（未処理の細胞の吸光度）×１００％
結果を図１６に示した。ＣＤ１３３陽性細胞は、電離放射線に対して高い耐性を示した。
実験は３回繰り返し行い、同様の結果を得た。統計学的有意差（ｐ＜０．０５）はアスタリスクで示した。
（３）癌幹細胞に対するテロメライシンの抗腫瘍効果
上記放射線耐性の癌幹細胞に３ＭＯＩ〜４０ＭＯＩのテロメライシンを投与し、７日後、ＸＴＴアッセイで細胞の生存率を調べた。
耐性は次式で計算した。
（テロメライシン投与群の吸光度／未処理の群の吸光度）×１００
テロメライシンの抗腫瘍効果の結果を図１７に示した。テロメライシンは、ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞の両細胞を効果的に投与量依存的に殺傷することがわかった。
５．ｈＴＥＲＴ活性の比較
癌幹細胞は自己再生能、コロニー形成能、多分化能、腫瘍形成能などの特徴を有する。自己再生能や多分化能の特徴から、癌幹細胞は高いテロメラーゼ活性を示す可能性があり、テロメライシンの抗腫瘍効果が発揮できると期待される。
ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞でテロメラーゼ発現が異なる可能性を検討するため、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のｍＲＮＡレベル、テロメラーゼ触媒性サブユニット、テロメラーゼ活性のｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒを測定し、比較した。
ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞を培養し、それぞれの全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（キアゲン）を用いて抽出した。抽出した全ＲＮＡはＤＮａｓｅによって処理し、引き続き、ランダムヘキサマーとＭｕＬＶ逆転写酵素（アプライドバイオシステムズ）によって逆転写した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。１８μｌのＰＣＲ反応液につき、２μｌの希釈したｃＤＮＡ（全ＲＮＡ１００ｎｇをテンプレートとして得られたもの）を加えた。発現レベルはハウスキーピング遺伝子のｈ−ＰＢＧＤ（ロシュ）によって正規化した。
その結果、図１８に示すとおり、ＣＤ１３３陽性細胞でのｈＴＥＲＴ発現量は、ＣＤ１３３陰性細胞よりも高かった。
本実施例により、テロメライシン（ＯＢＰ−３０１）を放射線照射後の腫瘍細胞に感染させることにより、放射線耐性を有する腫瘍細胞を殺傷できることが明らかとなった。これは、本発明の薬剤が放射線治療の効果を著しく増強することを示すものであり、また、本発明の薬剤が放射線と併用するための抗腫瘍剤として顕著な効果を有することを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明により、癌の放射線療法において腫瘍又は癌細胞にＯＢＰ−３０１を感染させておくと、腫瘍細胞の放射線に対する感受性を増加させることができる。また、あらかじめ腫瘍又は癌細胞を放射線照射した後にＯＢＰ−３０１を感染させると、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる。さらに、本発明により、放射線や抗癌剤に耐性を示す腫瘍又は癌細胞を効果的に殺傷することができる。従って、本発明に使用されるウイルスは、放射線の感受性を高めることによって顕著な抗腫瘍効果を示すことができ、放射線との併用療法に極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０００９】
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月8日(2010.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に使用されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、腫瘍又は癌に対する放射線増感増強剤。
【請求項２】
放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に使用されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、腫瘍又は癌に対する放射線増感増強剤。
【請求項３】
腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項４】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがhTERTプロモーターである、請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項５】
標識タンパク質がGFPである、請求項２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項６】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はhTERTプロモーターである、請求項２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項７】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項８】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項９】
腫瘍又は癌が癌幹細胞である請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項１０】
腫瘍又は癌が放射線耐性又は抗癌剤耐性のものである請求項１又は２に記載の放射線増感増強剤。
【請求項１１】
腫瘍又は癌がCD133陽性のものである請求項１０に記載の放射線増感増強剤。
【請求項１２】
放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、腫瘍又は癌に対する放射線併用用抗腫瘍剤であって、前記組換えウイルスが106〜1011PFU/日の用量で患者に投与される、前記抗腫瘍剤。
【請求項１３】
放射線照射前、照射後及び照射中の時期から選ばれる少なくとも１つの時期に投与されることを特徴とする、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスを含む、腫瘍又は癌に対する放射線併用用抗腫瘍剤であって、前記組換えウイルスが106〜1011PFU/日の用量で患者に投与される、前記抗腫瘍剤。
【請求項１４】
前記組換えウイルスは、放射線照射の照射後48時間以内、放射線照射の26〜96時間前、又はこれらの組み合わせの時期に投与されるものである、請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１５】
前記組換えウイルスは、１週あたり２〜７日の放射線の連日照射期間中に投与されるものである、請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１６】
放射線照射量が3Gy〜70Gyである、請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１７】
腫瘍又は癌の放射線に対する感受性を高めることができる請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１８】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがhTERTプロモーターである、請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１９】
標識タンパク質がGFPである、請求項１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２０】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はhTERTプロモーターである、請求項１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２１】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２２】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２３】
腫瘍又は癌が癌幹細胞である請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２４】
腫瘍又は癌が放射線耐性又は抗癌剤耐性のものである請求項１２又は１３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２５】
腫瘍又は癌がCD133陽性のものである請求項２４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２６】
請求項１、３、４、７、９〜１２、１４〜１８、２１及び２３〜２５のいずれか１項に記載の剤の製造における、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれた組換えウイルスの使用。
【請求項２７】
請求項２〜１１及び１３〜２５のいずれか１項に記載の剤の製造における、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子をこの順に含む複製カセットがウイルスゲノムのE1領域に組み込まれ、かつ、標識タンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子の発現を制御しうるプロモーターを含む標識カセットがウイルスゲノムのE3領域に組み込まれた組換えウイルスの使用。
【請求項２８】
ヒトテロメラーゼのプロモーターがhTERTプロモーターである、請求項２６又は２７に記載の使用。
【請求項２９】
標識タンパク質がGFPである、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター又はhTERTプロモーターである、請求項２７に記載の使用。
【請求項３１】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項２６又は２７に記載の使用。
【請求項３２】
標識タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御しうるプロモーターが発癌及び発癌抑制因子プロモーターである、請求項２７に記載の使用。
【国際調査報告】
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