(57)【要約】  唾液、鼻汁、涙液等の血液以外の体液を検体とした場合であっても、微量検体で多角的・網羅的な解析を行うことができ、特に非特異的反応を極力抑制し、高感度で正確に測定することができるアレルギー疾患の判定方法を提供すること。    化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を行ったアレルゲン判定チップに、低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過した唾液、涙液、鼻汁等の検体を接触させ、アレルゲン判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を、標識二次抗体を用いるイムノアッセイにより検出するに際して、前記洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシン含有液を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を行ったアレルゲン判定チップに、検体を接触させ、アレルゲン判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を、標識二次抗体を用いるイムノアッセイにより検出するに際して、前記洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシン含有液を用いることを特徴とするアレルギー疾患の判定方法。
【請求項２】
洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシン及びポリエチレングリコール含有液を用いることを特徴とする請求項１記載のアレルギー疾患の判定方法。
【請求項３】
検体の希釈液に塩化カリウム含有液を用いることを特徴とする請求項１又は２記載のアレルギー疾患の判定方法。
【請求項４】
標識二次抗体の希釈液に塩化カリウム含有液を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法。
【請求項５】
標識二次抗体として、Ｃｙ３標識二次抗体を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法。
【請求項６】
検体として、唾液、涙液又は鼻汁を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法。  
【請求項７】
検体として、吸光波長６００ｎｍにおける濁度が２５度以下の唾液、涙液又は鼻汁を用いることを特徴とする請求項６記載のアレルギー疾患の判定方法。
【請求項８】
検体として、低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過した唾液、涙液又は鼻汁を用いることを特徴とする請求項６記載のアレルギー疾患の判定方法。
【請求項９】
アレルゲンが、食物アレルゲンであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法。
【請求項１０】
化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を、グリシンを含む洗浄液及び／又はブロッキング液で行ったことを特徴とするアレルゲン判定チップ。
【請求項１１】
未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を、グリシン及びポリエチレングリコールを含む洗浄液及び／又はブロッキング液で行ったことを特徴とする請求項１０記載のアレルゲン判定チップ。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載のアレルゲン判定チップと、標識二次抗体とを備えたことを特徴とするアレルギー疾患判定キット。
【請求項１３】
標識二次抗体が、標識抗ｓＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＧ抗体，標識抗ＩｇＧ１抗体，標識抗ＩｇＧ４抗体，標識抗ＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＥ抗体から選ばれる１種又は２種以上の標識二次抗体であることを特徴とする請求項１２記載のアレルギー疾患判定キット。
【請求項１４】
さらに、検体希釈用及び／又は標識二次抗体希釈用の塩化カリウムを含む希釈液を備えたことを特徴とする請求項１２又は１３記載のアレルギー疾患判定キット。
【請求項１５】
さらに、検体前処理用の低蛋白吸着性フィルターを備えたことを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか記載のアレルギー疾患判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国民病として３人に１人は何らかのアレルギー症状を持つといわれているアレルギー（食物アレルギー、花粉症、薬物アレルギー、アトピー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚炎等）疾患を、採血することなく、唾液、鼻汁、涙液で判定することができる方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーの原因には、食物を原因とする食物アレルギー、ごみ・埃を原因とする塵アレルギー、家ダニを原因とするアレルギー、花粉症、接触性皮膚炎、金属アレルギー、薬物アレルギー、アトピーなど様々なアレルギーが知られている。これらの中でも、特に食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題が生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。【０００３】
また、今日一般的な臨床検査試料として血液、尿等が用いられているが、特に新生児、乳幼児、重症患者、採血の困難な患者では、採血が与える苦痛と身体への負担が大きな問題となっている。従って、次世代医療の切り札の一つとして、非観血型臨床検査の必要性が挙げられ、国際的にもその取り組みが始まろうとしている。採血は、患者の身体への苦痛や負担、エイズ、Ｂ，Ｃ型肝炎の感染リスク、医療関係者の針刺し事故のリスクがあることから、血液に代わって体液を用いた安全な検査法の開発が希求されている。具体的には、血液に代わって、尿、唾液、鼻汁、涙液、膣液、腸管液等が考えられるが、一般に苦痛が少なく容易に採取可能な、尿、唾液、鼻汁、涙液での技術開発が当面の課題とされている。【０００４】
アレルギーは、異物として認識される抗原が体内に入ることを防ぐ生体防御物質（ＩｇＥ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ等）が、生体防御を超えて過剰に反応するようになったため、体に害を及ぼしている病態である。これらの生体防御物質（ＩｇＥ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ等）は、血液中以外に、異物の進入部位である粘膜に分泌されている。【０００５】
苦痛が少なく容易に採取可能な、尿、唾液、鼻汁、涙液の中でも、粘膜の環境を反映している特に唾液が注目される。唾液は大唾液腺（耳下腺、顎下腺、舌下線）及び小唾液腺から分泌される体液のことで、透明で粘性があり、物性は比重１．０００〜１．００８ｇ／ｍＬ、ｐＨ６．２〜７．６、組成は水分が９９．５％の他に有機成分（アミラーゼ、マルターゼ、ムチン、血清アルブミン、血清グロブリン、尿酸、尿素等）、無機成分（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等）を含むとされている。唾液を分析して疾患の診断やスクリーニングに役立てるという試みは、約２０年前から行われているが、いまだ血液や尿のように一般的ではない。【０００６】
唾液の利点は、無痛で採取可能であること、無侵襲であること、被験者の年齢や肉体的、精神的なハンディキャップに左右されないこと、繰り返しの採取が容易であることにあり、さらに、唾液は血液の状態をよく反映することから、全身状態のモニターに適していると考えられる。さらに、唾液には、粘膜が分泌するアレルギー関連生体防御物質として、二量体の分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ），ＩｇＧ、微量のＩｇＥが含まれており、その抗体活性及び量は粘膜のアレルギー状態を反映しているため、これらを測定して総合的にアレルギー状態を判断する必要がある。【０００７】
唾液等を検体とする非観血型アレルギー診断方法として、従来、患者に負担、苦痛を与えない方法によりアレルギー抗原特異的な粘膜免疫状態を測定し、アレルギーに直接関与していると考えられる抗原を予測することは、アレルギーの診断と治療にとって重要な情報である。そのため、アレルギー患者のアレルギー抗原に対する特異的分泌型ｓＩｇＡと血中ＩｇＥを測定し、その数値間の相対関係を指標としてアレルギーの重篤度を鑑別する方法（例えば、特許文献１参照）や、患者の唾液等の粘膜試料において食物に存在する食物抗原に対する抗体濃度を測定し、この測定された濃度と該粘膜試料中の抗体の通常濃度とを比較し、患者の食物アレルギー又は食物不耐症の存在を測定する方法（例えば、特許文献２参照）が知られている。【０００８】
他方、本発明者らは、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定することができるアレルギー疾患の判定方法や、検体中のアレルゲン認識抗体をＣｙ３標識二次抗体を用いるイムノアッセイにより検出することができるアレルギー疾患の判定方法として、ダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン蛋白又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基のブロッキング操作を行ったアレルゲンエピトープ判定チップに、検体を接触させ、アレルゲンエピトープ判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出する方法を既に提案している（例えば、特許文献３参照）。【０００９】
【特許文献１】特開２００２−３０３６２８号公報
【特許文献２】米国特許第６８５８３９８号明細書
【特許文献３】特開２００６−２６７０６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまでのアレルギー疾患の判定技術は、アレルギーの状態を表す血液中のアレルゲン特異ＩｇＥ抗体量、体液のｓＩｇＡを測定して判断する例が多かった。しかし、これらの検査での測定結果は、未だ臨床症状を反映していないのが現状で、ＩｇＥのみならず他の抗体（各種のＩｇＧ，ＩｇＡ、ｓＩｇＡ等）を含めて、多角的に診断することで、より詳細に臨床症状を把握する必要がある。前記特許文献３記載のアレルギー疾患の判定方法は、ＩｇＥのみならず他の抗体（各種のＩｇＧ，ＩｇＡ、ｓＩｇＡ等）を含めて、１０μＬ以下という微量検体で多角的・網羅的な解析（２０〜６０抗原以上を一度の測定）を行うことで、より詳細に臨床症状を把握することができるきわめて優れた方法であるが、血液以外の体液は血液に比べ、生体防御物質（ＩｇＥ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ）の濃度が低いことが多く、血清ではなく唾液等の非観血型の検体の場合、この方法をそのまま応用しても、検体が血清のときと比べて分析精度に劣るという問題があることがわかった。本発明の課題は、唾液等の血液以外の体液を検体とした場合であっても、微量検体で多角的・網羅的な解析を行うことができ、特に非特異的反応を極力抑制し、高感度で正確に測定することができるアレルギー疾患の判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、非特異的反応を極力抑制した高感度測定系を実現すべく、すべての単位操作について見直しをしたところ、アレルゲン判定チップ作製工程における洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシンやポリエチレングリコールを配合したり、検体や二次抗体の希釈液に塩化カリウムを配合することにより、非特異的反応が極力抑制された高感度測定系を達成することができることを見い出した。また、唾液には唾液採取直前に食事や授乳することにより、食物残渣が混入することがある。これらは、蛋白チップによるアレルゲン特異抗体量測定において、バックグラウンドのシグナルを高め、測定感度の低下を引き起こすことがある。このような問題を解決し、どの検体を用いても常に安定した高い感度を保持するため、低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過した唾液等を用いることにより、非特異的反応が極力抑制された高感度測定系を達成することができ、非観血型のアレルギー疾患の判定が可能となることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち本発明は、（１）化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を行ったアレルゲン判定チップに、検体を接触させ、アレルゲン判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を、標識二次抗体を用いるイムノアッセイにより検出するに際して、前記洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシン含有液を用いることを特徴とするアレルギー疾患の判定方法や、（２）洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシン及びポリエチレングリコール含有液を用いることを特徴とする前記（１）記載のアレルギー疾患の判定方法や、（３）検体の希釈液に塩化カリウム含有液を用いることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のアレルギー疾患の判定方法や、（４）標識二次抗体の希釈液に塩化カリウム含有液を用いることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法や、（５）標識二次抗体として、Ｃｙ３標識二次抗体を用いることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法や、（６）検体として、唾液、涙液又は鼻汁を用いることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法や、（７）検体として、吸光波長６００ｎｍにおける濁度が２５度以下の唾液、涙液又は鼻汁を用いることを特徴とする前記（６）記載のアレルギー疾患の判定方法や、（８）検体として、低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過した唾液、涙液又は鼻汁を用いることを特徴とする前記（６）記載のアレルギー疾患の判定方法や、（９）アレルゲンが、食物アレルゲンであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載のアレルギー疾患の判定方法に関する。【００１３】
また本発明は、（１０）化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を、グリシンを含む洗浄液及び／又はブロッキング液で行ったことを特徴とするアレルゲン判定チップや、（１１）未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を、グリシン及びポリエチレングリコールを含む洗浄液及び／又はブロッキング液で行ったことを特徴とする前記（１０）記載のアレルゲン判定チップに関する。【００１４】
さらに本発明は、（１２）前記（１０）又は（１１）記載のアレルゲン判定チップと、標識二次抗体とを備えたことを特徴とするアレルギー疾患判定キットや、（１３）標識二次抗体が、標識抗ｓＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＧ抗体，標識抗ＩｇＧ１抗体，標識抗ＩｇＧ４抗体，標識抗ＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＥ抗体から選ばれる１種又は２種以上の標識二次抗体であることを特徴とする前記（１２）記載のアレルギー疾患判定キットや、（１４）さらに、検体希釈用及び／又は標識二次抗体希釈用の塩化カリウムを含む希釈液を備えたことを特徴とする前記（１２）又は（１３）記載のアレルギー疾患判定キットや、（１５）さらに、検体前処理用の低蛋白吸着性フィルターを備えたことを特徴とする前記（１２）〜（１４）のいずれか記載のアレルギー疾患判定キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】アレルゲン特異抗体測定のためのプロトコールを示す図である。
【図２】唾液のフィルター処理前と処理後の濁度とバックグラウンドの蛍光強度の比較結果を示す図である。（ａ）フィルター処理前と処理後の唾液の濁度及び（ｂ）フィルター処理前と処理後のアレルゲン特異抗体量測定時のバックグラウンドの蛍光強度。フィルター処理により濁度、バックグラウンドの蛍光強度が共に低下した。フィルター処理により測定感度の低下の抑制が可能であることが示された。
【図３】洗浄液とブロッキング液への０．１Ｍグリシン添加によるバックグラウンドの蛍光の低下とアレルゲンとの反応による蛍光の増大結果を示す図である。０．１Ｍグリシン添加前と添加後の（ａ）バックグラウンドの蛍光強度の比較、及び（ｂ）アレルゲンとの反応により測定される蛍光強度の比較。グリシンの添加によりバックグラウンドの蛍光は低下し、アレルゲンとの反応により測定される蛍光は約３０％増大した。
【図４】洗浄液とブロッキング液への１０％ＰＥＧ添加によるバックグラウンドの蛍光の低下結果を示す図である。１０％ＰＥＧ添加前と添加後のバックグラウンドの蛍光強度の比較を示し、ＰＥＧの添加によりバックグラウンドの蛍光強度は約１０％低下した。
【図５】０．３Ｍ  ＫＣｌ添加前と添加後のバックグラウンド蛍光強度の比較結果を示す図である。０．３Ｍ  ＫＣｌ添加前と添加後ではバックグラウンドに非特異的に反応する抗体の蛍光強度が血清を反応させた場合３０〜４０％低下した。これにより、相対的感度増加が確認された。
【図６】スポットするアレルゲン濃度の最適化条件の検討結果を示す図である。ＯＶＭを５〜１００ｆｍｏｌ／ｓｐｏｔの濃度でスポッティングし、唾液を１〜１００倍に希釈して反応を行った。抗原量が点線で囲んだ５０ｆｍｏｌ以上の濃度で、唾液中の抗体含量を定量的に測定が可能であることが判明した。抗原量が２５ｆｍｏｌ以下の少量の場合、検体中の全ての抗体を抗原が捕捉することができず、正しく測定できていないことが示された。
【図７】至適抗原濃度範囲内の７５ｆｍｏｌ抗原濃度の条件下で、唾液検体を１〜１００倍の希釈率で反応させたときの、唾液の希釈率と蛍光強度の変化から、唾液の至適希釈率を測定した。唾液を５〜５０倍希釈した条件下では、高い定量性が得られ、測定には唾液を５〜５０倍希釈することが推奨された。
【図８】２７名の食物アレルギー患者の唾液検体（ｓａ００１−ｓａ００２７）をｓＩｇＡで検討した結果を示す図である。牛乳と卵の各種アレルゲン成分をジーンスライドにスポッティングし、小児食物アレルギー患者の唾液検体を１０倍希釈し反応させ、Ｃｙ３標識した二次抗体を用いて検出した。
【図９】唾液中の食物アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出結果を示す図である。牛乳と卵の各種アレルゲン成分をジーンスライドにスポッティングし、小児食物アレルギー患者の唾液検体を５倍希釈し反応させ、Ｃｙ３標識した二次抗体(Anti-Human  ＩｇＥ)を用いて検出した。
【図１０】唾液中の食物アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体の検出結果を示す図である。牛乳と卵の各種アレルゲン成分をジーンスライドにスポッティングし、小児食物アレルギー患者の唾液検体を５倍希釈し反応させ、Ｃｙ３標識した二次抗体(Anti-Human  ＩｇＧ)を用いて検出した。
【図１１】鼻汁及び涙液中に含まれるアレルゲン特異ｓＩｇＡ抗体量の測定結果を示す図である。白樺花粉及びリンゴに対してアレルギー反応を示す患者の鼻汁、涙液を採取、また健常者２名の鼻汁を採取し、白樺花粉、リンゴ、卵、牛乳の抗原タンパクをスポッティングした蛋白チップに鼻汁は２０倍、涙液は１０倍それぞれ希釈して反応させ、Ｃｙ３標識した二次抗体(Anti-Human  ＩｇＡ)を用いて検出した。
【図１２】唾液検体の牛乳・卵アレルギーｓＩｇＡ検査値と、血液のＩｇＥ，ＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ４検査値をレーダーチャートに搭載した診断結果の１例を示す。血液と唾液中のアレルゲン特異的各種抗体量（ＩｇＥ，ＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ４，ｓＩｇＡ）を、それぞれの濃度の相対値（０−２００）を用いて、レーダーチャート（ダイヤモンドグラフ）で相対的、総合的に評価し、病状把握の目安にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のアレルギー疾患の判定方法としては、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を行ったアレルゲン判定チップに、検体を接触させ、アレルゲン判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を、標識二次抗体を用いるイムノアッセイにより検出するに際して、前記洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシン含有液を用いる方法であれば特に制限されず、上記検体としては、血液（血清）、尿、唾液、鼻汁、涙液、膣液、腸管液等特に制限されないが、抗体濃度が低いと考えられる唾液、鼻汁、涙液等の検体が本発明の効果を特に享受しうる点で好ましい。そして、本発明のアレルギー疾患の判定方法によると、検体が血清以外の唾液等の検体であっても、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定することが可能となる。【００１７】
上記アレルゲンとしては、免疫原性を有するものであれば特に制限されず、ハプテンであってもペプチドと結合させることにより免疫原性を生じるものであれば本発明におけるアレルゲンペプチドとして用いることができるが、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母、ゼラチンなどの食物アレルゲンを好適に例示することができ、中でも牛乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリンや、卵白アレルゲンの主要成分としてのオボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンや、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１を具体的に例示することができ、とりわけ、カゼインナトリウム、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンから選ばれる１種又は２種以上、好ましくは８種のアレルゲンを用いることが望ましい。  【００１８】
また、本発明におけるアレルゲンエピトープを含むペプチドとして、糖鎖修飾ペプチド、リン酸化ペプチド、アシル化ペプチド、アセチル化ペプチド、メチル化ペプチド、ユビキチン化ペプチド等の化学修飾ペプチドを用いることもでき、かかる化学修飾ペプチドは、天然の化学修飾ペプチドであっても、人為的な化学修飾ペプチドであってもよい。前記アレルゲンエピトープを含むペプチドとして、ＭＨＣクラスII分子に結合する７〜１５アミノ酸サイズ等のペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチドを用いると、患者抗体と数倍から数十倍高感度に反応する点で好ましい。かかるＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチド等のアレルゲンエピトープを含むペプチドは、ペプチド合成により作製することもできるが、アレルゲンのエピトープを含むプロテアーゼ分解ペプチドとして作製することもできる。かかるプロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、リジルエンドペプチダーゼを挙げることができる。特に、アレルゲンが食物アレルゲンのとき、トリプシン分解ペプチドをプロテアーゼ分解ペプチドとして好適に例示することができる。【００１９】
上記化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣチップとしては、シリコン、ガラス、ステンレス、プラスチック等の基板上にダイヤモンド又はダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）をコーティングしたダイヤモンド／ＤＬＣチップに、アレルゲンのアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチド（以下、「アレルゲンペプチド」ということがある）をカップリング反応等により結合させることができるような化学修飾がなされたダイヤモンド／ＤＬＣチップであれば特に制限されず、例えば、かかる化学修飾としては、ダイヤモンド／ＤＬＣチップ表面を塩素処理、アンモニア処理、ジカルボン酸処理等による塩素化、アミノ化、カルボキシル化等がなされたダイヤモンド／ＤＬＣチップを例示することができるが、中でも、カルボキシル化ダイヤモンド／ＤＬＣチップを好適に例示することができる。【００２０】
上記化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣチップは、活性化試薬により活性化処理に付される。例えば、カルボキシル化ダイヤモンド／ＤＬＣチップにアレルゲンのアレルゲンペプチドを固定化させる方法として、基盤表面に導入されたカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を利用し、アミノ基（−ＮＨ２基）を持つアレルゲンペプチドを1-Etyl-3-(3-dimethylamino Propyl)-carbodiimide, hydrochloride（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）やN-Hydroxy-succinimide（ＮＨＳ）やその他の化学架橋剤を用いて共有結合により固定化させることが好ましい。なお、チップの活性化とカップリング反応の概略は、前記特許文献３の図１３に示されている。【００２１】
上記活性化処理後のチップはＭｉｌｌｉＱ水（超純水）で洗浄され、ペプチドのカップリング反応（固定化操作）が行われるが、このペプチドの固定化操作の前処理として、十分な除湿、乾燥がペプチドの固定化量と固定化量の均一性に重要な因子であり、そのため真空デシケーターで１時間減圧乾燥処理することが好ましい。また、ペプチドのカップリング反応は、活性化処理後のチップ、好ましくは乾燥処理が施されたチップにアレルゲンペプチド溶液をスポッティングして、例えば３７℃で３時間インキュベーションすることにより行うことができるが、かかるアレルゲンペプチド溶液として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む溶液にアレルゲンペプチドを溶解した溶液を用いると、抗体の結合量が増加する点で好ましい。本発明においては、アレルゲンペプチドのカップリング反応後の、未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作に使用する洗浄液及び／又はブロッキング液にグリシン含有液を用いることが、アレルゲンエピトープやアレルゲンと検体中の抗体（１次抗体）との反応における非特異的反応を極力抑制する上で必要とされる。グリシン含有液におけるグリシン濃度は、０．０１〜１Ｍ、特に０．０５〜０．５Ｍが好ましく、中でも０．１〜０．２Ｍが好ましい。例えば、洗浄液にはグリシンを溶解したＰＢＳ（Phosphate buffered saline）等の緩衝液が好適に用いられ、ブロッキング液としては、グリシンを溶解したＢＳＡ（Bovine serum albumin）溶液等を好適に例示することができる。このような洗浄液やブロッキング液を、好ましくは併用して未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を行うことにより、バックグラウンドを低下させることができると同時に、蛍光強度や発色強度を上昇させ、約３５％測定感度を向上させることができる。【００２２】
また、上記洗浄及びブロッキング操作に、グリシンに加えてポリエチレングリコールをも含む洗浄液やブロッキング液を用いることが好ましい。グリシン及びポリエチレングリコール含有洗浄液やブロッキング液におけるポリエチレングリコール濃度は、１〜３０％、特に５〜２０％が好ましく、中でも８〜１２％が好ましい。例えば、洗浄液にはグリシンとポリエチレングリコールを溶解したＰＢＳ等の緩衝液が好適に用いられ、ブロッキング液としては、グリシンとポリエチレングリコールを溶解したＢＳＡ溶液等を好適に例示することができる。このような洗浄液やブロッキング液を、好ましくは併用して未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を行うことにより、バックグラウンドを低下させることができると同時に、相対的に蛍光強度や発色強度を上昇させ、測定感度を向上させることができる。【００２３】
このように、洗浄及びブロッキング操作後に、必要に応じてブロッキング液をアスピレーターで吸引除去することにより、本発明のアレルゲン判定チップを作製することができる。すなわち、本発明のアレルゲン判定チップは、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）チップを活性化試薬により活性化した後、アレルゲン又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基の洗浄及びブロッキング操作を、グリシンを含む洗浄液及び／又はブロッキング液、好ましくはグリシン及びポリエチレングリコールを含む洗浄液及び／又はブロッキング液で行ったことを特徴とする。このアレルゲン判定チップに、次いで検体が適用される。【００２４】
前記のように、本発明のアレルギー疾患の判定方法における検体としては、唾液、涙液、鼻汁、尿等の非血液成分が好ましく、また、唾液等は前処理することが特に好ましい。前処理としては、唾液等の体液の吸光波長６００ｎｍにおける濁度が２５度以下、好ましくは２０度以下、より好ましくは１５度以下とすることが測定感度を向上させる上で望ましく、具体的には、遠沈処理でもよいが、低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過処理する方法が特に好ましい。したがって、本発明は、低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過した唾液、涙液又は鼻汁を検体として用いることを特徴とする非観血タイプのアレルギー疾患の判定方法にも関するということができる。低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過により、唾液、涙液、鼻汁等の体液の吸光波長６００ｎｍにおける濁度が２５度以下とし、本発明のアレルゲン判定チップに適用して、非特異的な吸着を抑制して高感度で各種アレルゲンを解析することができる。低蛋白吸着性フィルターとしては、市販の製品を使用することができ、例えば、MILLEX GV Filter Unit０．２２μｍフィルター（MILLIPORE社製）、フィルターインサート＜サイズ０．２＞（TreffLab社製）、ＳＥＩＴＺデプスフィルター（日本ポール株式会社製）を例示することができる。また、これら検体の希釈液に塩化カリウム（ＫＣｌ）含有液を用いることで、バックグラウンドを低下させ、相対的に蛍光強度や発色強度を上昇させることができ、測定感度を向上させることができる。塩化カリウムの濃度としては、０．１〜０．５Ｍ、好ましくは０．２〜０．４Ｍである。【００２５】
上記本発明の判定方法におけるイムノアッセイとしては、判定チップに捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を検出することができる公知のイムノアッセイであれば特に制限されないが、標識二次抗体を用いるＥＬＩＳＡが好ましく、標識二次抗体としては、Ｃｙ３，Ｃｙ５，ＦＩＴＣ，ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ，アルカリフォスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体を例示することができるが、Ｃｙ３標識二次抗体を好適に挙げることができる。また、二次抗体としては標識抗ｓＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＧ抗体，標識抗ＩｇＧ１抗体，標識抗ＩｇＧ４抗体，標識抗ＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＥ抗体から選ばれる１種又は２種以上の標識二次抗体を好適に挙げることができる。これら標識二次抗体の希釈液に塩化カリウム（ＫＣｌ）含有液を用いることで、バックグラウンドを低下させ、相対的に蛍光強度や発色強度を上昇させることができ、測定感度を向上させることができる。塩化カリウムの濃度としては、０．１〜０．５Ｍ、好ましくは０．２〜０．４Ｍである。【００２６】
本発明のアレルギー疾患判定キットとしては、上記本発明のアレルゲン判定チップと、標識二次抗体とを備えたキットであれば特に制限されず、標識二次抗体としては上記の標識二次抗体、例えば、蛍光や酵素で標識された標識抗ｓＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＧ抗体，標識抗ＩｇＧ１抗体，標識抗ＩｇＧ４抗体，標識抗ＩｇＡ抗体，標識抗ＩｇＥ抗体から選ばれる１種又は２種以上の標識二次抗体を具体的に例示することができる。また、このアレルギー疾患判定キットには、前記の検体希釈用及び／又は標識二次抗体希釈用の塩化カリウムを含む希釈液や、検体前処理用の低蛋白吸着性フィルターを備えたものが好ましい。【００２７】
また、本発明のアレルギー疾患の判定方法やアレルギー疾患判定キットにおける二次抗体としては、抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も使用することができ、例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。【００２８】
本発明のアレルギー疾患の判定方法においては、１〜５μＬの検体液、好ましくは低蛋白吸着性フィルターで加圧ろ過した唾液を用い、検体中の抗体を定量的に測定することができる上に、同一条件下、１０種類以上、好ましくは２５種類以上、例えば２５〜６０種類のアレルゲンを一度に定量的に測定することができ、これにより、同一患者におけるｓＩｇＡとＩｇＧの反応性の異同や、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定することが可能となる。【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［実験材料］
ジーンスライドＤＬＣ（東洋鋼鈑）、３８４穴マイクロプレート平底 (CORMING)、反応プレート(SANPLATEC)及びMILLEX GV Filter Unit ０．２２μｍ (MILLIPORE)を購入して用いた。オボアルブミン (ＯＶＡ) (SIGMA)、オボムコイド (ＯＶＭ) 、コンアルブミン(SIGMA)、α−カゼイン(SIGMA)、β−カゼイン(SIGMA)、α−ラクトアルブミン(SIGMA)、β−ラクトグロブリン(SIGMA)、Human Serum Immunoglobulins Ｇ，Ａ and Ｍ(67/086) (NIBSC)、Goat anti-humanＩｇＡ  (ZYMED)、Ｃｙ３ TM Protein ArreyDyePack(Amersham Biosciences) を購入して用いた。また、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）ｐＨ６．０／３０％  ＰＥＧ、０．１Ｍ  グリシン in ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｍＬ Bovine serum albumin（ＢＳＡ）／０．１Ｍ  グリシン  １０％  ＰＥＧ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／０．３Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＴＢＳ）を用いた。【００３１】
［測定手順］
活性化処理済のジーンスライド(R)を購入し、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ６．０）／３０％ＰＥＧで抗原タンパクを１０〜７５ｆｍｏｌ／ｍＬの濃度に溶解した。各々の溶液を３８４穴プレートにＡｐｐｌｙし、GeneMachines（OmmniGrid Accent；NIPPN TechnoCluster,Inc）により、スライド上に１ｎＬスポットした。さらに、スライドを３７℃遮光下で１時間乾燥し、抗原を固定化した。同様に標準溶液〔Human Serum Immunoglobulins Ｇ，Ａ and  Ｍ (67/086) 〕を段階希釈（０．２４〜３．１２ｕｎｉｔ／ｍＬ）してスポットし、スライドに固定化した。【００３２】
［未反応活性基のブロッキング反応］
スライドを反応プレートに移し、洗浄液（ＰＢＳ中０．１Ｍグリシン）を８ｍＬ添加後、５分間シェーキングしアスピレーター（VARIABLE SPEED PUMP；BIORAD）で洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水で２回洗浄した。遠心機で遠沈（１，０００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）してスライド表面の水滴を除去し、ブロッキング試薬（１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／０．１Ｍグリシン）を２０μＬ／ｂｌｏｃｋ添加し、冷蔵（４℃）遮光下で静置し、終夜反応させた。【００３３】
［アレルゲン特異抗体の捕捉反応］
ブロッキング試薬をアスピレーターで吸引除去し、抗体希釈液（１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／０．３Ｍ  ＫＣｌ）で検体を適宜希釈した（５〜２０倍希釈程度）。各ｂｌｏｃｋに希釈した検体（一次抗体）を２０μＬずつサンプリングし、３７℃遮光下で１時間静置した。【００３４】
［二次抗体との反応］
一次抗体液をアスピレーターで吸引除去し、スライドを反応プレートに移し、洗浄液（５０ｍＭ  ＴＴＢＳ）を８ｍＬ添加後、５分間シェーキングし、洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水で２回洗浄した。遠心機でＳｐｉｎ  ｄｏｗｎ（１，０００ｒｐｍ  １ｍｉｎ）してスライド表面の水滴を除去し、１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／０．３Ｍ  ＫＣｌで希釈した二次抗体（１．５〜６μｇ／ｍＬに調製）を２０μＬ／ｂｌｏｃｋ添加し、３７℃遮光下で１時間静置した。【００３５】
［抗原に捕捉された抗体の検出］
二次抗体液を吸引除去し、スライドを反応プレートに移し、５０ｍＭ  ＴＴＢＳを８ｍＬ添加後、５分間シェーキングし、洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水で２回洗浄した。遠心機でＳｐｉｎ  ｄｏｗｎ（１，０００ｒｐｍ  １ｍｉｎ）してスライド表面の水滴を除去した。蛍光スキャナー（ＦＬＡ−８０００；FUJIFILM）で蛍光強度を測定（Ｅｘ：５３２ｎｍ，Ｅｍ：５７０ｎｍ）し、同時に測定した標準溶液の検量線から測定値を算出した。【００３６】
図１にプロトコールを示す。
【実施例２】
【００３７】
［検体採取］
唾液の採取は、スポンジを噛ませて採取容器に移すことにより採取した。すなわち、円筒スポンジを口腔に挿入し、誤飲に注意して、約４５秒噛みしめることにより流涎を吸収させた。次いで、取り出したスポンジから唾液を絞り出して容器に回収した。採取した検体は、測定まで凍結保存（−２０℃以下）した。【００３８】
［唾液検体の前処理］
唾液を０．４５〜０．２ミクロンの低蛋白吸着性フィルター（MILLEX GV Filter Unit ０．２２μｍ（MILLIPORE）フィルター）によって加圧ろ過し、食物残渣による影響を排除した。食物残渣の排除レベルは、測定可能な基準値を濁度で評価し（図２（ａ）参照）、それぞれ検体について、アレルゲン特異抗体量測定時の条件下でバックグラウンドの蛍光強度を測定した（図２（ｂ）参照）。この結果、唾液の濁度はフィルター処理前３３．８度から、フィルター処理後２４．２度と低下し、アレルゲン特異抗体量測定の時のバックグラウンドの蛍光強度も低下させることができ、フィルター処理の測定感度低下の抑制効果が示された。なお、濁度の測定はＦ−２０００（HITACHI）の機種を用いて、吸光波長は６００ｎｍで測定した。
【実施例３】
【００３９】
［唾液中のアレルゲン特異抗体を測定する際に必要な非特異的反応抑制条件］
１．非特異的反応抑制のための洗浄液とブロッキング液にグリシン、ポリエチレングリコールの使用
これまで抗原タンパク固定化後の洗浄やブロッキングにトリス（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を含む溶液を使用してきたが、非特異的反応を抑制する目的で、抗原タンパク固定化後の洗浄液及びブロッキング試薬に０．１Ｍグリシンを添加したものを用いた。グリシンは、最も分子量の小さなアミノ酸で、固定化した抗原タンパクの立体構造への影響が少ないと予想されるアミノ酸である。これにより、バックグラウンドのシグナル（蛍光強度）を約３０〜４０％低下させ、アレルゲンとの抗原抗体反応で測定される相対的蛍光強度を上昇させた。さらに抗原に結合する抗体の反応性も上昇させた。以上の、バックグラウンドの低下と抗体の反応性の上昇から、抗原に反応する抗体の蛍光強度は約３０％高くなり、測定感度を向上させた（図３参照）。さらに、スポッティングの際、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加した抗原蛋白の周囲の蛍光強度が著しく低く抑えられていたことをヒントに、ブロッキング試薬にＰＥＧを添加した。これにより更にバックグラウンドの蛍光を抑え、高感度化を達成した（図４参照）。【００４０】
２．唾液あるいは血清、及び二次抗体反応液へ０．３Ｍ  ＫＣｌの塩を添加する事による非特異的反応抑制の例
カルボキシル化ＤＬＣチップに対し希釈した健常者（Normal）の唾液あるいは血清、アレルギー患者（Patient）の唾液あるいは血清、及び希釈液のみ（Buffer）を１時間反応し、その後、Ｃｙ３標識したａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＥを６．０μｇ／ｍＬを加えて３０分反応させた。そのとき使用する希釈溶液は１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０に０．３Ｍ  ＫＣｌを添加したものと添加しないものを用意し、それぞれのバックグラウンドの蛍光強度を比較した。唾液あるいは血清、及び二次抗体反応時の希釈溶液に０．３Ｍ  ＫＣｌを添加することで非特異的反応による蛍光強度を３０〜４０％低く抑えることができた（参照としての図５は、非特異的反応が比較的強い血清の例を示す）。
【実施例４】
【００４１】
［唾液中の特異抗体測定のための抗体濃度と抗原濃度の最適化条件の検定］
スポッティングする最適な抗原濃度を求める為、ＯＶＭを５〜１００ｆｍｏｌ／Ｓｐｏｔの濃度範囲でスポッティングし、唾液検体を１〜１００倍の希釈率下で反応を行った。唾液を１〜１００倍に希釈した条件では、ＤＬＣチップ上の抗原量が点線で囲った５０ｆｍｏｌ以上の濃度存在するときに、唾液中の抗体含量を定量的に測定可能であることが判明した。ＤＬＣチップ上の抗原量が２５ｆｍｏｌ以下の場合は、唾液中の抗体を全て抗原が補足することができず、検体中の抗体含量を正しく測定することができないことが判明した（表１及び図６参照）。至適抗原濃度範囲内の７５ｆｍｏｌの抗原をＤＬＣチップ上に搭載した条件下で、唾液を１〜１００倍希釈して検定したところ (図７参照)、５〜５０倍の希釈条件下で抗体含量の測定における高い定量性が得られ、測定時の唾液の希釈倍率が決定された。【００４２】
【表１】
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【実施例５】
【００４３】
［小児食物アレルギー患者検体の解析］
以上の基礎検討を基盤に、食物アレルギータンパクチップを用いた小児を対象とした食物アレルギーの検体の解析を行った。徳島大学の倫理委員会の承認の上で、十分なインフォームドコンセントのもとに承諾の得られた２７患者の臨床検体を健康保険鳴門病院から供与いただき、それらの食物(卵・牛乳)アレルギー検査を行った。最初に、卵と牛乳のアレルゲン成分を検定する目的で、ジーンスライドにブランクとして３０％  ＤＭＳＯ、３０％  ＰＥＧを、スタンダードとしてWHO Human Serum ＩｇＥ，Ｇ，Ａを、その下にアレルゲンのタンパク質をそれぞれスポッティング(ｎ＝４）し、唾液を１０倍に希釈し反応を行い、二次抗体にＣｙ３標識したAnti-Human  ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧを用いて蛍光強度を検出し、測定結果を示した(図８〜１０参照)。ほとんどの患者がオボアルブミンとコンアルブミンに反応を示したのに対し、α−カゼイン、β−カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、オボムコイドでは、アレルギー患者間で反応性が大きく異なることがわかった。このように、ジーンスライドを用いた上記の測定系は、唾液中のアレルゲンタンパク質に対するアレルゲン特異ｓＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ抗体量の定性、定量測定が可能であることが示された。図８はｓＩｇＡ抗体量の定性、定量測定結果を、図９はアレルゲン特異ＩｇＥ抗体量の定性、定量測定結果を、図１０はアレルゲン特異ＩｇＧ抗体量の定性、定量測定結果を示す。このように、患者のアレルギー状態が唾液中のアレルゲンタンパク質に対するアレルゲン特異ＩｇＥ、ＩｇＧ、ｓＩｇＡ抗体で詳しく調べることが可能となる。具体例として、図９，１０に示すように、患者Ａの場合α−カゼインにＩｇＥが弱く反応し、オボアルブミンにはＩｇＥ、ＩｇＧが共に強く反応し、オボムコイドにはＩｇＧのみが強く反応している。患者Ｂの場合、オボムコイドとオボアルブミンにＩｇＥ、ＩｇＧの反応が見られるが、特にＩｇＥ反応が強い。患者Ｃの場合は、オボアルブミンにＩｇＥ、ＩｇＧが共に反応し、コンアルブミンにＩｇＥが弱く反応している。【００４４】
本発明によるアレルゲン特異的唾液のｓＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＥの評価と、微量血液（１〜２μＬ）によるアレルゲン特異的ＩｇＧ１，ＩｇＧ４，ＩｇＡ，ＩｇＥを、レーダーチャート等により、多角的に評価する（図１２）ことで、１）現在のアレルギー状態をエビデンスに基づいて多角的に把握出来る、２）治療の有効性、病状経過を多角的に把握できる、等の利点がある。
【実施例６】
【００４５】
唾液以外の体液として、鼻汁や涙液を使用した検出例を示す。同様に、アレルゲンとしてシラカバ花粉抗原タンパク（Ｂｅｔｖ１ａ）、リンゴ抗原タンパク（Ｍａｌｄ１．８）、オボムコイド、オボアルブミン、α−カゼイン、β−ラクトグロブリンをスポッティングしたタンパクチップを作製し、白樺花粉およびリンゴに対しアレルギー反応を示す患者の鼻汁と涙液、健常者２名の鼻汁を採取し、鼻汁中および涙液中のアレルゲン特異ｓＩｇＡ抗体量の測定を行った。その結果、鼻汁や涙液でもアレルゲン特異ｓＩｇＡ抗体量の測定が可能であり、患者の症状や診断に有用であることが判明した。具体的には、特にアレルギー症状を示さない健常者でも、リンゴ抗原タンパクに反応するｓＩｇＡ抗体が検出されるが、シラカバ、リンゴに対するアレルギーのある患者では、健常者と反対にむしろこれらの抗原に対するｓＩｇＡ抗体は検出されないか微量なことが分かる。即ち、血液中のＩｇＥ抗体とは反対に、アレルギー患者ではｓＩｇＡ抗体が鼻汁や涙液に十分な量できない事が、アレルギー症状を起こしていると考えることができる。あるいは抗原の侵入する粘膜面では、抗原と反応するｓＩｇＡがアレルギーを回避している事を示唆する。また白樺花粉およびリンゴに対しアレルギー反応を示す患者でも、涙液ではα−カゼインに対し、鼻汁ではβ−ラクトグロブリンに対する反応が観察され、過去のアレルギーの痕跡、あるいは食物不耐症が確認された。このように、患者の現在の病状以外に、病歴の解析、食物不耐症の解析に有用な情報を提供している（図１１参照）。 
【実施例７】
【００４６】
更に、卵及び牛乳のアレルゲンを搭載した食物アレルギータンパクチップを用いて、患者の血清及び唾液中のアレルゲン特異ＩｇＥ，ＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ４，ｓＩｇＡの各抗体量を測定し、その相対量をレーダーチャートに表した（図１２参照）。レーダーチャートの形、およびレーダーチャートの形の変化が、患者の病状解析、治療歴、診断に役立てることができると推定される。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によると、唾液等の血液以外の体液を検体とした場合であっても、微量検体で多角的・網羅的な解析を行うことができ、特に非特異的反応が極力抑制される結果、高感度で正確にアレルギー疾患の判定をすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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