【手続補正書】
【提出日】平成15年9月30日(2003.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的物質を保存するための水性保存媒体であって、以下の成分、
(a)生物学的物質、
(b)少なくとも一種のポリヒドロキシ化合物であって、前記媒体中の合計量が、該媒体の約５質量％から約60質量％までであるポリヒドロキシ化合物、及び
(c)リン酸イオンであって、該媒体中の合計量が、リン酸イオン対ポリヒドロキシ化合物中のヒドロキシル基のモル比が約0.0625から約0.625までであるような量であるリン酸イオン、
を含むことを特徴とする水性保存媒体。
【請求項２】
前記媒体のpHが、約５から約10までである請求の範囲第１項記載の水性保存媒体。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシ化合物が、単糖類、二糖類、及び多糖類からなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の水性保存媒体。
【請求項４】
前記ポリヒドロキシ化合物が、トレハロースである請求の範囲第３項記載の水性保存媒体。
【請求項５】
前記媒体中のポリヒドロキシ化合物の合計量が、該媒体の約10質量％から約30質量％までである請求の範囲第１項記載の水性保存媒体。
【請求項６】
前記媒体中のポリヒドロキシ化合物の合計量が、該媒体の約10質量％から約30質量％までである請求の範囲第３項記載の水性保存媒体。
【請求項７】
前記生物学的物質が、細胞、タンパク質、及び酵素からなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の水性保存媒体。
【請求項８】
生物学的物質を保存するための水性保存媒体であって、以下の成分、
(a)生物学的物質、
(b)トレハロースであって、前記媒体の約５質量％から約60質量％までの量で存在するトレハロース、及び
(c)リン酸イオンであって、該媒体中のリン酸イオンの合計量が、リン酸イオン対トレハロースのモル比が約0.5から約５までであるような量であるリン酸イオン、
を含むことを特徴とする水性保存媒体。
【請求項９】
前記トレハロースが、該媒体の約10質量％から約30質量％までの量で存在する請求の範囲第８項記載の水性保存媒体。
【請求項１０】
前記pHが、約５から約10までである請求の範囲第９項記載の水性保存媒体。
【請求項１１】
前記生物学的物質が、細胞、タンパク質、及び酵素からなる群から選ばれる請求の範囲第８項記載の水性保存媒体。
【請求項１２】
保存された生物学的物質組成物の調製方法であって、以下の工程、
(a) 水性保存媒体を生成する工程であって、前記媒体が、(i)生物学的物質、(ii)少なくとも一種のポリヒドロキシ化合物であって、前記媒体中の合計量が、該媒体の約５質量％から約60質量％までであるポリヒドロキシ化合物、及び(iii)リン酸イオンであって、該媒体中の合計量が、リン酸イオン対ポリヒドロキシ化合物中のヒドロキシル基のモル比が約0.0625から約0.625までであるような量であるリン酸イオン、を含む工程、そして
(b)少なくとも一種の保存方法を使用して水性保存媒体を保存する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記保存方法が、凍結、凍結乾燥、周囲空気乾燥、真空乾燥、及び噴霧乾燥からなる群から選ばれた一種以上の方法である請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１４】
前記媒体のpHが、約５から約10までである請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリヒドロキシ化合物が、単糖類、二糖類、及び多糖類からなる群から選ばれる請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシ化合物が、トレハロースである請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１７】
前記媒体中の前記ポリヒドロキシ化合物の合計量が、該媒体の約10質量％から約30質量％までである請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１８】
前記媒体中の前記ポリヒドロキシ化合物の合計量が、該媒体の約10質量％から約30質量％までである請求の範囲第１５項記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的物質が、細胞、タンパク質、及び酵素からなる群から選ばれる請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項２０】
保存された生物学的物質組成物の調製方法であって、以下の工程、
(a) 水性保存媒体を生成する工程であって、前記媒体が、(i)生物学的物質、(ii)トレハロースであって、該媒体中のポリヒドロキシ化合物の合計量が、該媒体の約５質量％から約60質量％までであるトレハロース、及び(iii)リン酸イオンであって、該媒体中の合計量が、リン酸イオン対トレハロースのモル比が約0.5から約５までであるような量であるリン酸イオン、を含む工程、そして
(b)少なくとも一種の保存方法を使用して水性保存媒体を保存する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記保存方法が、凍結、凍結乾燥、周囲空気乾燥、真空乾燥、及び噴霧乾燥からなる群から選ばれた一種以上の方法である請求の範囲第２０項記載の方法。
【請求項２２】
前記トレハロースが、該媒体の約10質量％から約30質量％までの量で存在する請求の範囲第２０項記載の方法。
【請求項２３】
前記pHが、約５から約10までである請求の範囲第２２項記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的物質が、細胞、タンパク質、及び酵素からなる群から選ばれる請求の範囲第２０項記載の方法。
【請求項２５】
生物学的物質の保存用の固体形態の保護剤混合物であって、以下の成分、
(a)少なくとも一種のポリヒドロキシ化合物であって、前記混合物中の合計量が、該混合物の約10質量％から約95質量％までであるポリヒドロキシ化合物、及び
(b)リン酸イオンであって、該混合物中の合計量が、リン酸イオン対ポリヒドロキシ化合物中のヒドロキシル基のモル比が約0.025から約0.625までであるような量であるリン酸イオン、
を含むことを特徴とする保護剤混合物。
【請求項２６】
前記混合物中の該ポリヒドロキシ化合物の合計量が、該混合物の約20質量％から約95質量％までである請求の範囲第２５項記載の保護剤混合物。
【請求項２７】
前記ポリヒドロキシ化合物が、単糖類及び多糖類からなる群から選ばれる請求の範囲第２５項記載の保護剤混合物。
【請求項２８】
前記ポリヒドロキシ化合物が、トレハロースである請求の範囲第２７項記載の保護剤混合物。
【請求項２９】
リン酸イオン対ポリヒドロキシ化合物中のヒドロキシル基の前記モル比が、約0.0375から約0.625までである請求の範囲第２５項記載の保護剤混合物。
【請求項３０】
生物学的物質の保存用の固体形態の保護剤混合物であって、以下の成分、
(a)トレハロースであって、前記混合物中に、該混合物の約10質量％から約95質量％までの量で存在するトレハロース、及び
(b)リン酸イオンであって、該混合物中の合計量が、リン酸イオン対トレハロースのモル比が約0.2から約５までであるような量であるリン酸イオン、
を含むことを特徴とする保護剤混合物。
【請求項３１】
前記トレハロースが、該混合物の約20質量％から約95質量％までの量で存在する請求の範囲第３０項記載の保護剤混合物。
【請求項３２】
リン酸イオン対トレハロースの前記モル比が、約0.3から約５までである請求の範囲第３０項記載の保護剤混合物。
【請求項３３】
水溶液の形態の保護剤混合物であって、以下の成分、
(a)少なくとも一種のポリヒドロキシ化合物であって、前記混合物中の合計量が、該混合物の約５質量％から約60質量％までであるポリヒドロキシ化合物、及び
(b)リン酸イオンであって、前記混合物中の合計量が、リン酸イオン対ポリヒドロキシ化合物中のヒドロキシル基のモル比が約0.0625から約0.625までであるような量であるリン酸イオン、
を含むことを特徴とする保護剤混合物。
【請求項３４】
前記混合物中の該ポリヒドロキシ化合物の合計量が、該混合物の約10質量％から約30質量％までである請求の範囲第３３項記載の保護剤混合物。
【請求項３５】
前記ポリヒドロキシ化合物が、単糖類及び多糖類からなる群から選ばれる請求の範囲第３３項記載の保護剤混合物。
【請求項３６】
リン酸イオン対ポリヒドロキシ化合物中のヒドロキシル基の前記モル比が、約0.0375から約0.625までである請求の範囲第３３項記載の保護剤混合物。
【請求項３７】
水溶液の形態の保護剤混合物であって、以下の成分、
(a)トレハロースであって、前記混合物中に、該混合物の約５質量％から約60質量％までの量で存在するトレハロース、及び
(b)リン酸イオンであって、前記混合物中の合計量が、リン酸イオン対トレハロースのモル比が約0.5から約５までであるような量であるリン酸イオン、
を含むことを特徴とする保護剤混合物。
【請求項３８】
前記トレハロースが、該混合物の約10質量％から約30質量％までの量で存在する請求の範囲第３７項記載の保護剤混合物。
【請求項３９】
請求の範囲第１２項又は第２０項記載の方法により製造された保存された生物学的物質組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
凍結乾燥したサンプルの全てを下記の凍結乾燥プロトコルにかけ、この場合、圧力及び温度は設定値である。サンプルを先に説明したように凍結乾燥機に入れた後、凍結乾燥機を０パスカル（０ミリトル）の圧力で排気した。サンプルを1200分間にわたって-45℃で０パスカル（０ミリトル）に保持し、その後に温度及び圧力を50分間の期間にわたっ
て夫々-40℃及び2.7パスカル（20ミリトル）に上昇させた。次いでサンプルを600分間にわたって-40℃及び2.7パスカル（20ミリトル）に保った。次いで温度を50分間の期間にわたって-35℃に上昇させ、次いでサンプルを600分間にわたって-35℃及び2.7パスカル（20ミリトル）に保った。次に温度及び圧力を50分間にわたって夫々-30℃及び6.7パスカル（50ミリトル）に上昇させ、次いでサンプルを600分間にわたって-30℃及び6.7パスカル（50ミリトル）に保った。時間のその期間の終了時に、温度及び圧力を50分間にわたって夫々-25℃及び13.3パスカル（100ミリトル）に上昇させ、サンプルを600分間にわたって-25℃及び13.3パスカル（100ミリトル）に保った。次いで温度を50分間にわたって-20℃に上昇させ、次いでサンプルを600分間にわたって-20℃及び13.3パスカル（100ミリトル）に保った。次に温度を100分間にわたって-10℃に上昇させ、サンプルを600分間にわたってその温度及び13.3パスカル（100ミリトル）に保った。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
次いでサンプルを6.7パスカル（50ミリトル）で0.5℃／分の速度で40℃の最終温度に上昇させた。次いでサンプルを1200-2400分間にわたって０パスカル（０ミリトル）で最終温度に保った。次いで凍結乾燥機を窒素ガスで排気し、保存された細胞組成物サンプルを除去し、50mlのプラスチック遠心分離管中にシールし、37℃のインキュベーター中に貯蔵した。
真空乾燥にかけたサンプルについて、保存媒体0.2mlを1.8mlのプラスチック微小遠心分離管に入れた。次いでサンプルをサバント・インストルメンツSVC-100Hスピードバク・コンセントレーター真空乾燥機に入れ、11.3パスカル（85ミリトル）の最終圧力で約４日にわたって室温で回転蒸発させて、保存された細胞組成物を得た。次いで管をシールし、デシケーター中で室温で貯蔵した。
サンプルをつくり、凍結、真空乾燥又は凍結乾燥にかけた時点で、水性保存媒体からの追加のサンプルを採取し、希釈し、通常の注入塗布技術を使用して寒天培地に塗布して保存方法を行なう前に保存媒体中の生存細胞数を測定した。最初に、サンプルを希釈して約100の細胞/mlの細胞濃度を得た。次いで希釈された保存媒体1ml又は2mlをペトリ皿に入れ、45℃で液体寒天増殖培地（55g/LのMRSラクトバチルス・ブロース及び0.1％のL-システインを含む15g/Lの寒天）と混合した。皿を冷却し、寒天を固化し、その時点で皿を倒立させ、37℃で2-3日にわたっ
て嫌気増殖チャンバー（ガスパック・ジャー）に入れ、その時点でコロニーが寒天中で見えた。原則として、夫々のコロニーは保存媒体中の単一生存細胞に相当する。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
次いで48のバイアルを保存媒体の上記サンプルの夫々について調製した。夫々のバイアルを標識し、計量し、保存媒体1mlを夫々のバイアルにピペットで入れ
た。次いで夫々のバイアルを再度計量した。次いでサンプルを液体窒素中のバイアルの浸漬（“急冷”）又は-45℃以下の温度における凍結乾燥機中の前もって
冷却した棚の上の配置（“遅い凍結”）により凍結した。凍結乾燥したサンプルの全てをビルチス12EL凍結乾燥機中の下記の凍結乾燥プロトコルにかけ、この場合、全ての圧力温度を設定値に設定する。サンプルを先に説明したように凍結乾燥機に入れた後に、凍結乾燥機を０パスカル（０ミリトル）の圧力で排気した。サンプルを600分間にわたって-45℃及び０パスカル（０ミリトル）に保ち、その後に温度及び圧力を50分間の期間にわたって夫々-40℃及び2.7パスカル（20ミリトル）に上昇させた。次いでサンプルを600分間にわたって-40℃及び2.7パスカル（20ミリトル）に保った。次いで温度を50分間の期間にわたって-35℃に上昇させ、次いでサンプルを600分間にわたって-35℃及び2.7パスカル（20ミリトル）に保った。次に温度及び圧力を50分間にわたって夫々-30℃及び6.7パスカル（50ミリトル）に上昇させ、次いでサンプルを600分間にわたって-30℃及び6.7パスカル（50ミリトル）に保った。時間のその期間の終了時に、温度及び圧力を50分間にわたって夫々-25℃及び13.3パスカル（100ミリトル）に上昇させ、サンプルを600分間にわたって-25℃及び13.3パスカル（100ミリトル）に保った。次いで温度を50分間にわたって-20℃に上昇させ、次いでサンプルを600分間にわたって-20℃及び13.3パスカル（100ミリトル）に保った。次に温度を100分間にわたって-10℃に上昇させ、サンプルを600分間にわたってその温度及び13.3パスカル（100ミリトル）に保った。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
次いでサンプルを700分間の期間にわたって6.7パスカル（50ミリトル）で25℃の温度に上昇させた。次いでサンプルを荷卸しまで2140分間にわたって０パスカル（０ミリトル）でその最終温度に保った。次いで凍結乾燥機を窒素ガスで排気し、バイアル中の保存されたLDHサンプルを除去し、LDH活性について測定した。活性を測定する前に、夫々のサンプルを計量して水損失の量を測定し、失われた水の量の精製水（ミリポア社からのミリＱシステム）で再水和した。次いで先に説明したのと同じ方法を使用してLDH活性を測定した。
サンプルの所定の組に関する結果を図１（凍結乾燥）及び図２（凍結）に示す。