(57)【要約】  工程（１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、もしくはＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取することにより培養に供する細胞集団を調製する工程、及び工程（２）：前記工程（１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養する工程〔（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ（Ｂ）ＣＤ３リガンド〕を包含することを特徴とする細胞集団の製造方法。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を包含することを特徴とする細胞集団の製造方法。
工程（１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、もしくはＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取することにより培養に供する細胞集団を調製する工程、及び
工程（２）：前記工程（１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養する工程
（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ
（Ｂ）ＣＤ３リガンド
【請求項２】
工程（１）又は工程（２）の実施前に細胞亜集団を採取又は除去する工程を包含する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（２）で得られた細胞集団を請求項１記載の（Ａ）及び／又は（Ｂ）の非存在下で更に培養する工程を包含する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
さらに、工程（１）又は工程（２）で得られた細胞集団に遺伝子を導入する工程を包含する、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
得られる細胞集団が下記からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜４いずれか１項記載の製造方法。
細胞集団（ａ）：Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団
細胞集団（ｂ）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団
細胞集団（ｃ）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項記載の製造方法により得られる細胞集団。
【請求項７】
細胞集団が下記からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６記載の細胞集団。
細胞集団（１）：ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞含有率が高い細胞集団
細胞集団（２）：Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞含有率が高い細胞集団
細胞集団（３）：Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞含有率が低い細胞集団
細胞集団（４）：ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞含有率が低い細胞集団
【請求項８】
請求項６又は７記載の細胞集団を含有する医薬。
【請求項９】
医薬の製造のための、請求項６又は７記載の細胞集団の使用。
【請求項１０】
被験体に、有効量の請求項６又は７記載の細胞集団を投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用な細胞集団を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載する）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載する）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。【０００３】
Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８マーカーを有するＣＤ８陽性Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ細胞と記載する）と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型（１型ヘルパーＴ細胞）あるいはＴｈ２型（２型ヘルパーＴ細胞）に分化する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、以下、ＣＴＬと記載する］に分化する。【０００４】
外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４のがんの治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血単核球などから種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、更にこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子療法などが知られている。【０００５】
従来、免疫療法において、細胞傷害活性を示すＣＴＬを利用した細胞医療が進められているが、最近、前記ＣＴＬの活性を補助するＴｈ細胞を利用したＴｈ細胞医療が注目されている（例えば、非特許文献１、特許文献１）。前記のとおり、Ｔｈ細胞は、Ｔｈ１型とＴｈ２型に分けられる。Ｔｈ１型は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカインを産生し、細胞性免疫のエフェクターとして働く。一方、Ｔｈ２型は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などのサイトカインを産生し、液性免疫の調節を担っている。細胞医療においては、細胞性免疫のエフェクターであるＴｈ１型が重要であると考えられている。【０００６】
近年、免疫療法において、すでに終末分化したエフェクターＴ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞が注目されている。ナイーブＴ細胞は、抗原により一度も活性化されていない細胞であり、ＣＤ４陽性のナイーブＴ細胞に対し、抗原とサイトカイン存在下で培養することにより、Ｔｈ１型及びＴｈ２型サブセットが誘導できることが明らかとなっている。ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７などのリンパ球の細胞表面抗原マーカーを発現することが知られている。【０００７】
前記のとおり、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞やナイーブＴ細胞を初めとするＣＤ４陽性Ｔ細胞は、細胞医療や遺伝子治療の分野において重要であり、細胞集団の製造においては、細胞増殖効率が高く、治療に適した細胞が多く得られる工程を含む方法の開発が望まれている。
【非特許文献１】Ｃｈａｍｏｔｏ  Ｋ．  他９名、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、Ｖｏｌ．６６（３）、Ｐ１８０９〜１８１７
【特許文献１】特開２００５−１７９２９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞治療に有効な細胞集団の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の発明は、下記工程を包含することを特徴とする細胞集団の製造方法に関する。
工程（１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、もしくはＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取することにより培養に供する細胞集団を調製する工程、及び
工程（２）：前記工程（１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養する工程
（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ
（Ｂ）ＣＤ３リガンド【００１０】
本発明の第１の発明は、工程（１）又は工程（２）の実施前に細胞亜集団を採取又は除去する工程を包含しても良く、工程（２）で得られる細胞集団を（Ａ）及び／又は（Ｂ）の非存在下で更に培養する工程を包含しても良い。また、工程（１）又は工程（２）で得られた細胞集団に遺伝子を導入する工程を包含しても良い。【００１１】
本発明の第２の発明は、製造方法が本発明の第１の発明の製造方法による、下記より選択される細胞集団の製造方法に関する。
細胞集団（ａ）：Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団
細胞集団（ｂ）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団
細胞集団（ｃ）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団【００１２】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の製造方法により得られる細胞集団に関する。【００１３】
本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の製造方法により得られる細胞集団を含有する医薬に関する。【００１４】
また、本発明の別の態様では、本発明の第１の発明により得られる細胞集団に、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団を添加して培養することによりＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を高効率に得ることができる。すなわち、本発明は、下記工程を包含することを特徴とする細胞集団の製造方法も提供する。
工程（２−１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去する、もしくはＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取する工程
工程（２−２）：前記工程（２−１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養する工程
（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ
（Ｂ）ＣＤ３リガンド
工程（２−３）：前記工程（２−２）で得られた細胞集団と、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団を混合し培養する工程
なお、工程（２−３）の培養は、工程（２−２）の条件、すなわち（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ、及び（Ｂ）ＣＤ３リガンドの存在下で実施することが好ましい。【００１５】
また、本発明者らは、Ｔ細胞を含有する細胞集団の培養において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率として、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数を２とした場合ＣＤ４陽性Ｔ細胞数を１以上、好適にはＣＤ８陽性Ｔ細胞数を１とした場合ＣＤ４陽性Ｔ細胞数を１以上である細胞集団を用いて培養を実施することにより、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を高効率に得ることができることを見出した。すなわち、本発明の別の態様としては、下記工程を包含することを特徴とする細胞集団の製造方法を提供する。
工程（３−１）：ＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率が２：１以上である細胞集団を得る工程
工程（３−２）：前記工程（３−１）にて得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの存在下で培養する工程
なお、当該工程（３−２）の培養は、ＣＤ３リガンドの存在下に加えて、好適には、フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの存在下で実施することが望ましい。【００１６】
また、本発明者らは、フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養することにより、得られる細胞集団からのＩＬ−５及びＩＬ−９の産生が抑制されていることを見出した。すなわち、本発明の別の態様としては、フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とするＩＬ−５産生抑制剤又はＩＬ−９産生抑制剤、当該有効成分を投与する工程を含むＩＬ−５又はＩＬ−９の産生抑制方法を提供する。さらには、本発明により、フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程を実施して得られる、ＩＬ−５又はＩＬ−９産生量の低い細胞集団、及びその製造方法が提供される。【００１７】
また、本発明者らは、ＶＬＡ−４結合性オリゴペプチド及び／又はフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部を含有するオリゴペプチドにＴ細胞集団の増殖抑制作用があることを見出した。すなわち、本発明の別の態様は、ＶＬＡ−４結合性オリゴペプチド及び／又はフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部を含有するオリゴペプチドを有効成分とする、Ｔ細胞集団の増殖調節剤を提供する。ＶＬＡ−４結合性オリゴペプチドとしては、ＬＤＦＰもしくはＬＤＶＰで表されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドが例示される。また、ヘパリン結合ドメイン由来オリゴペプチドとしては、ＬＩＧＲＫＫで表されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドが例示される。【００１８】
また、本発明者らは、本発明の別の態様として新規な改変型フィブロネクチンフラグメントとそれをコードする核酸、及び当該フラグメントを用いたリンパ球の製造方法を提供する。すなわち、本発明により、下記（ａ）及び（ｂ）から選択されるポリペプチドが提供される。
（ａ）配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記（ａ）のポリペプチドと同等な機能を有する新規なポリペプチド【００１９】
また本発明により、下記の（ｃ）〜（ｇ）から選択される核酸が提供される。
（ｃ）配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸
（ｄ）配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸
（ｅ）配列表の配列番号３０、３７、３９、４５、４７、５２、５４、５９、６１、６７、６９、７２、７４、７６、８０、８４及び８６で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる核酸
（ｆ）前記（ｅ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸
（ｇ）前記（ｅ）の核酸の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じた核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸【００２０】
また、本発明の別の態様として、前記（ａ）及び（ｂ）から選択されるポリペプチドの存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程を含有するリンパ球の製造方法も提供される。当該培養工程は、好適にはＣＤ３リガンドの存在下で実施される。【００２１】
更に本発明の別の態様として、少なくとも前記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程を包含する培養リンパ球の製造方法が提供され、細胞医療の目的に応じた能力の細胞集団の提供が可能になる。特に本発明で提供される細胞集団は細胞医療において障害となる制御性Ｔ細胞含有比率が低いことにおいて臨床上、高い優位性をもつ。【００２２】
また当該方法により下記より選択される細胞集団が提供される。
細胞集団（１）：ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞含有率が高い細胞集団
細胞集団（２）：Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞含有率が高い細胞集団
細胞集団（３）：Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞含有率が低い細胞集団
細胞集団（４）：ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞含有率が低い細胞集団
細胞集団（５）：癌抗原、ウイルス抗原、非自己抗原などの存在下で細胞傷害活性が上昇する細胞集団
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を高含有する細胞集団の製造方法が提供される。当該製造方法は細胞増殖率が高く、また当該製造方法により得られる細胞集団は、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の比率が高く、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の比率が低く、細胞免疫療法による疾患の治療に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明において、「Ｔ細胞」はＴリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１型及びＴｈ２型）、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ＣＴＬ、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞が含まれる。本発明の原料として用いられる「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄液の他、これらより採取、単離、精製又は誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核細胞などを含む細胞集団などが例示される。これらの細胞はＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）や生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の方法により得られた細胞集団をそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。【００２５】
本発明において、「フィブロネクチン（以下、ＦＮと記載）」、「ＦＮのフラグメント」及び「ＦＮのフラグメントの混合物」は、天然から得られたもの、又は人為的に合成されたもの、すなわち非天然のもののいずれでも良い。ＦＮ及びそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なＦＮ又はＦＮのフラグメントとは、これらが天然においてＦＮと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のＦＮ及びＦＮのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。【００２６】
なお、ＦＮは多くのスプライシングバリアントの存在が知られているが、本発明に使用されるＦＮとしては、本発明の所望の効果を発現するものであれば、いずれのバリアントも使用することができる。例えば、血漿由来のＦＮの場合、細胞結合ドメインの上流に存在するＥＤ−Ｂと呼ばれる領域、細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインの間に存在するＥＤ−Ａと呼ばれる領域が欠失していることが知られているが、このような血漿由来のＦＮも本発明に使用することができる。【００２７】
なお、ＦＮは分子量２５万の巨大なタンパク質であり、操作上や所望の効果の発現の観点からはＦＮのフラグメントを使用することが好ましい。本発明に使用できるＦＮフラグメント、並びに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｚｕｋａ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ  Ａ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、及びセキグチ  Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕などより得ることができる。また、ＦＮをコードする核酸配列又はＦＮのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。【００２８】
本発明に使用できるＦＮフラグメントは、ＩＩＩ−８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくはＣＳ−１のいずれかのドメインを含むフラグメントが好ましく、更に複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであっても良い。例えば、ＶＬＡ−５へのリガンドを含む細胞結合ドメイン（Ｃ−ドメイン）、ヘパリン結合ドメイン（Ｈ−ドメイン）、ＶＬＡ−４へのリガンドであるＣＳ−１ドメインなどを含有するフラグメントが本発明に使用される。前記フラグメントとしては、例えば前記のＪ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、並びにこれらの誘導体や改変物が例示される。前記のＣＨ−２９６はレトロネクチン（登録商標）の名称で市販されている。【００２９】
前記ＦＮのフラグメントとしては、配列表の配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列（ＦＮのＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、ＩＩＩ−１１、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１ドメイン）を含有するフラグメントが例示され、好適にはＦＮの細胞結合ドメイン（ＩＩＩ−８〜ＩＩＩ−１０までの領域）、ヘパリン結合ドメイン（ＩＩＩ−１２〜ＩＩＩ−１４までの領域）、ＣＳ−１ドメインのいずれかを含有するフラグメントが例示される。ここで、ＦＮのフラグメントとは、上記の配列表の配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を重複して含むフラグメントも包含される。本発明に使用されるＦＮのフラグメントとして、より好適には、配列表の配列番号９〜２３、２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列を含むフラグメント、もしくは上記に例示したＦＮのフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個、例えば１〜２０個、好適には１〜１０個、より好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるものであっても良い。なお、ここで同等な機能を有するとは、後述の「＜３＞本発明の細胞集団の製造方法」において配列表の配列番号９〜２３、２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列を含むフラグメントと同等の拡大培養率を有すること、もしくは得られるＴ細胞中のナイーブＴ様細胞含有率が同等であることを示す。【００３０】
アミノ酸の置換などは、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状などを変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換などは、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫなど）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。【００３１】
以下、本発明の製造工程について具体的に説明する。
本発明は下記工程を包含することを特徴とする、細胞集団の製造方法である。
工程（１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、もしくはＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取することにより培養に供する細胞集団を調製する工程、及び
工程（２）：前記工程（１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養する工程
（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンのフラグメント及びフィブロネクチンのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ
（Ｂ）ＣＤ３リガンド
なお、本明細書において、前記（Ａ）及び（Ｂ）を本発明における培養成分と記載することがある。【００３２】
＜１＞本発明の工程（１）
本発明の製造方法の工程（１）においては、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、もしくはＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取することにより培養に供する細胞集団を調製することが行われる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の除去は、細胞表面に発現しているＣＤ８を指標として実施することができ、例えば抗ＣＤ８抗体が固定化されたビーズや培養容器などの担体とＴ細胞を含有する細胞集団とを混合し、前記担体に結合したＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去する、又は、前記担体と結合しない細胞集団を回収することにより実施される。抗ＣＤ８抗体が固定化されたビーズとしては、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ８（インビトロジェン社製）、Ｅｌｉｇｉｘ  ａｎｔｉ−ＣＤ８  ｍＡｂ  ｃｏａｔｅｄ  ｎｉｃｋｅｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（バイオトランスプラント社製）などが好適に使用できる。以下、本明細書において、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去した細胞集団を「ＣＤ８除去細胞」と称する。【００３３】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の採取は、細胞表面に発現しているＣＤ４を指標として実施することができ、例えば抗ＣＤ４抗体が固定化されたビーズや培養容器などの担体とＴ細胞を含有する細胞集団とを混合し、前記担体に結合したＣＤ４陽性Ｔ細胞を回収することにより実施される。抗ＣＤ４抗体が固定化された前記担体は、例えば、ＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ４（インビトロジェン社製）などが好適に使用できる。【００３４】
本発明において、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去することにより調製された細胞集団は、具体的にはＴ細胞を含有する細胞集団としてＰＢＭＣを使用した場合、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とともに単球やマクロファージなどを含有する。したがって、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去することにより調製された細胞集団は、細胞表面に発現しているＣＤ４を指標として選別したＣＤ４陽性Ｔ細胞のみからなる細胞集団とは異なる。【００３５】
本発明の工程（１）又は工程（２）の実施前に、例えば特定の細胞表現型を有する任意の細胞亜集団を採取又は除去することもできる。当該操作については、特に限定はないが、細胞表面上の適当なマーカー、例えばＣＤマーカーを指標として実施することができる。例えば抗ＣＤ３抗体や後述の実施例３−（２）に記載のとおり、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を用いて、前記抗体の認識するマーカーを有する細胞亜集団を採取し、本発明に供することができる。しかしながら、操作性、細胞増殖性、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率向上の観点からは、ＣＤ３陽性ＣＤ２８陽性Ｔ細胞の採取は実施しないことが好ましいが、製造される細胞集団の用途に応じて適宜実施することもできる。【００３６】
＜２＞本発明の工程（２）
本発明の製造方法の工程（２）により、工程（１）で得られた細胞集団の、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下での培養が実施される。
（Ａ）ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ
（Ｂ）ＣＤ３リガンド
なお、「（Ａ）及び（Ｂ）の存在下での培養」とは、（Ａ）及び（Ｂ）が共存している状態下での培養のことを意味し、（Ａ）の存在下での培養と（Ｂ）の存在下での培養とを組み合わせた培養を意味するものではない。【００３７】
本発明における工程（２）は、培養開始時から少なくとも１日以上、好ましくは２〜１４日、より好ましくは２〜７日、更に好ましくは３〜７日実施される。なお、当該工程（２）は、免疫療法への使用のために製造される細胞集団の培養工程の全期間であっても良く、また一部の期間であっても良い。一部の期間である場合は、当該工程（２）は培養初期に実施されることが好適であり、培養開始時に実施されることがより好適である。【００３８】
なお、本願明細書において以下、「（Ａ）ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ」を単に「（Ａ）成分」、「（Ｂ）ＣＤ３リガンド」を単に「（Ｂ）成分」と記載することがある。【００３９】
本発明において、（Ａ）成分の培養中の総濃度としては、特に限定はなく、例えば０．００１〜５００μｇ／ｍＬが好適、０．０１〜５００μｇ／ｍＬがより好適である。なお、ここで培養中の濃度とは、培地中に当該成分を含有して使用する態様、及び後述の適当な固相に固定化して使用する態様のいずれにも適用される。【００４０】
本発明において、ＣＤ３リガンドとしては、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗ＣＤ３抗体が例示され、好適には抗ＣＤ３モノクローナル抗体が例示され、例えばＯＫＴ３［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２０６巻、第３４７−３４９頁（１９７９）］が例示される。ＣＤ３リガンドの培養中の濃度としては、特に限定はなく、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合は、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬが好適、０．０１〜１００μｇ／ｍＬがより好適である。なお、ここで培養中の濃度とは、培地中に当該成分を含有して使用する態様、及び後述の適当な固相に固定化して使用する態様のいずれにも適用される。【００４１】
本発明の細胞集団の製造方法において使用される培地は、特に限定はなく、Ｔ細胞の拡大培養に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、例えば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外にサイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分を含んでいても良い。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γなどが例示され、好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。また、適当なタンパク質としては、例えば抗ＩＬ−４抗体やＣＤ２８リガンドが例示される。また、この他、レクチンなどのリンパ球刺激因子を添加することもできる。【００４２】
更に、培地中に血清や血漿を添加しても良い。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０容量％超〜２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清や血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用される。【００４３】
本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば好適には１０ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交換することができる。【００４４】
本発明の細胞集団の製造方法において使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクターなどを使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られる細胞集団の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。【００４５】
なお、（Ａ）成分や（Ｂ）成分、刺激因子、上記培地中に含まれる適当なタンパク質、その他の成分は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグなどの細胞培養用器材（開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラスなどの細胞培養用担体に固定化して使用しても良い。なお、本明細書において刺激因子とは、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカイン及びサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される。例えば、ビーズに固定化する場合、１つのビーズに複数種類の成分を混合して固定化して調製しても良く、１つのビーズに１種類の成分を固定化して複数の種類のビーズを調製しても良い。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。前記の各種成分を細胞培養用器材や細胞培養用担体に固定化する場合、好適には、培養時の使用培地量に対する当該成分の量の割合が前記成分を培地中に溶解して用いる際の濃度と同様の割合となるように調整されるが、所望の効果が得られればこの割合に限定されるものではない。【００４６】
（Ａ）成分や（Ｂ）成分、その他の成分の固相への固定化方法としては、特に限定はないが、例えば、適当な緩衝液の中でこれらの物質を固相と接触させることにより固定化することができる。また、（Ａ）成分の固相への固定化については、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、並びに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法によっても固定化を実施することができる。【００４７】
前記の種々の成分や、本発明に使用される培養成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法により細胞集団を培養した後、該細胞集団と固相とを分離するのみで、前記の有効成分などを除去することができ、該細胞集団への有効成分などの混入を防ぐことができる。【００４８】
本発明の方法の工程（２）において、培養を実施する前に、工程（１）で得られた細胞に遺伝子を導入しても良い。なお、遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。なお、工程（２）の培養後に、遺伝子を導入する工程を更に包含しても良いのは当然である。【００４９】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターなどが使用される。好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。【００５０】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡやＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。【００５１】
レトロウイルスベクター並びにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療などの目的に使用されている。【００５２】
導入される外来遺伝子には特に限定はなく、本発明の製造方法により得られる細胞集団を使用する免疫療法や対象疾患に応じて、任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類など）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入しても良い。【００５３】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミドなどに挿入して使用することができる。また、効率の良い遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していても良い。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象の細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させても良い。導入される外来遺伝子は天然のものでも、又は人工的に作製されたものでも良く、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーションなどの公知の手段によって結合されたものであっても良い。更に、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであっても良い。【００５４】
細胞集団の製造方法のその他条件については、公知の方法により実施することができ、例えば上記（Ａ）成分の存在下での培養を実施することにより得られる細胞集団の製造方法については、例えば国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット、国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット、国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット、特開２００７−０６１０２０、国際公開第２００７／０２０８８０号パンフレット、もしくは国際公開第２００７／０４０１０５号パンフレットに記載の方法を参考に実施することができる。【００５５】
＜３＞本発明の細胞集団の製造方法
本発明の製造方法は、その製造の過程において細胞集団の細胞増殖率が高いことを１つの特徴とする。本明細書において、細胞増殖率は拡大培養率とも記載する。細胞増殖率は、ある一定の培養期間において、培養開始時の細胞数が培養後に何倍に増殖したのかを示す数値である。ここで、細胞増殖率が高いとは、前記の工程（２）において前記の（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下で培養した時の細胞集団の細胞増殖率が、前記の（Ａ）成分の非存在下での培養における細胞集団の細胞増殖率と比較して高いことを意味する。好適には本発明の培養条件ではない場合と比較して５％以上、より好ましくは１０％以上高い細胞増殖率で細胞集団を得ることができる。【００５６】
本発明の製造方法において、工程（２）における細胞集団の培養をＣＤ２８リガンド（例えば抗ＣＤ２８抗体）存在下で実施しても良く、ＣＤ２８リガンド非存在下で実施しても良い。以下の実施例で示すとおり、細胞増殖率、操作性、コスト、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率の向上、ＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞の含有率の向上の観点から、抗ＣＤ２８抗体非存在下で実施することが好ましい。【００５７】
本発明の製造方法において、前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施することにより、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率を上げることができる。すなわち、本発明の製造方法により、細胞集団中のＴｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が高い細胞集団を製造することができる。得られた細胞集団中のＴｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率は、後述の実施例１−（６）、２−（２）、３−（３）、２４−（４）、２８−（５）及び２９−（３）に記載のとおり、ＩＬ−４陰性、ＩＦＮ−γ陽性を指標として測定することができる。Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、細胞性免疫のエフェクターであり、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が高い細胞集団は細胞免疫療法において極めて有用である（例えば、前記の非特許文献１）。ここで、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が高い細胞集団とは、本発明の製造方法において、前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施した細胞集団のＴｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が、抗ＣＤ２８抗体の存在下で実施した場合と比較して高い細胞集団を意味し、好適には３％以上、より好適には６％以上高いことを意味する。細胞集団に対するＴｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率については、個人差やドナーの体調によって変動するものであり特に限定はないが、１０％以上、好ましくは１２％以上、より好ましくは１４％以上である。【００５８】
また、本発明の製造方法において、前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施することにより、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率を下げることができる。すなわち、本発明の製造方法により、細胞集団中のＴｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団を製造することができる。得られた細胞集団中のＴｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率は、後述の実施例２８−（５）、（６）、２９−（３）及び（４）に記載のとおり、ＩＬ−４陽性、ＩＦＮ−γ陰性、ＣＤ４陽性ＣＣＲ４陽性を指標として測定することができる。Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、液性免疫のエフェクターであり、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団は細胞免疫療法において極めて有用である。ここで、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団とは、本発明の製造方法において前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施した細胞集団のＴｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が、抗ＣＤ２８抗体の存在下で実施した場合と比較して低い細胞集団を意味し、好適には３％以上、より好適には６％以上低いことを意味する。細胞集団に対するＴｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率については、個人差やドナーの体調によって変動するものであり特に限定はないが、４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下である。【００５９】
すなわち、本発明の製造方法において、前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施することにより、細胞集団におけるＴｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞／Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の比を上昇させる方法が提供される。【００６０】
また、本発明の製造方法において、前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施することにより、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の含有率を下げることができる。すなわち、本発明の製造方法により、細胞集団中のＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団を製造することができる。得られた細胞集団中のＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の含有率は、後述の実施例２８−（７）に記載のとおり、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｆｏｘｐ３陽性を指標として測定することができる。制御性Ｔ細胞は種々の免疫応答反応を抑制する働きをもつことが知られており、制御性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団は細胞免疫療法において極めて有用である。ここで、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団とは、本発明の製造方法において前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施した細胞集団のＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の含有率が、抗ＣＤ２８抗体の存在下で実施した場合と比較して低い細胞集団を意味し、好適には３％以上、より好適には６％以上低いことを意味する。細胞集団に対するＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の含有率については、個人差やドナーの体調によって変動するものであり特に限定はないが、２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下である。【００６１】
本発明の製造方法において、前記の工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施することにより、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団及び／又はＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団を製造することができる。すなわち、本発明の製造方法により、細胞集団中のＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞及び／又はＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の含有率が高い細胞集団を製造することができる。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌはいずれもリンパ球の細胞表面抗原マーカーであり、ナイーブＴ細胞のような未分化な細胞において発現することが知られている。すなわち、本発明の製造方法により得られる細胞集団に高比率に含まれる細胞は、メモリーＴ細胞に分化する前の未分化の細胞、すなわちナイーブＴ細胞として分類できる。以下、本明細書において、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞又はＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞のことを「ＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞」と称することがある。ナイーブＴ細胞は生体に投与した際の生体内での生存率、細胞増殖効果、腫瘍への集積効果が高く、細胞医療分野において有用であることが報告されている。ここで、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞及び／又はＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の含有率が高い細胞集団とは、本発明の製造方法において使用される培養条件で培養を実施して得られる当該細胞の含有率が、本発明の培養条件以外は同等の条件で培養を実施して得られた含有率と比較して高い細胞集団を意味する。具体的には、本発明の製造方法において工程（２）を抗ＣＤ２８抗体の非存在下で実施した細胞集団の前記細胞の含有率が、抗ＣＤ２８抗体の存在下で実施した場合と比較して好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上高い細胞集団を得ることができる。【００６２】
本発明の製造方法において、前記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養を実施することにより、細胞傷害活性が向上した細胞集団を製造することができる。得られた細胞集団の細胞傷害活性は、後述の実施例２７−（４）に記載のとおり測定することができる。ここで、細胞傷害活性が向上した細胞集団とは、本発明の製造方法において前記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養を実施した細胞集団の細胞傷害活性が、（Ａ）成分非存在下で実施した場合と比較して高い細胞集団を意味し、好適には２．５％以上、より好適には５％以上高いことを意味する。【００６３】
更に、本発明の製造方法は、各工程の前又は後に、細胞集団を任意の細胞亜集団に分離する工程、細胞亜集団を採取する工程又は細胞亜集団を除去する工程を包含することもできる。例えば、前記のとおり本発明の培養条件下で培養して得られた細胞集団は、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞の含有率が高く、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団なので、更に所望の表面抗原マーカーを発現する細胞を分離、採取又は除去することにより、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞を細胞亜集団として分離、採取又は除去してもよい。この工程により、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞を更に高含有するＴ細胞集団を取得することが出来る。また、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び／又はＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の少ない細胞集団を取得することができる。また、本発明が、工程（１）で得られた細胞に遺伝子を導入する工程を更に包含する場合、当該遺伝子を発現する細胞を分離、取得しても良い。分離操作としては、特に限定はないが、例えばセルソーター、磁気ビーズ、カラムなどを用いて公知の手法で分離することが出来る。【００６４】
また、本発明の方法により製造された細胞集団からＴ細胞をクローン化することにより、安定したＴ細胞株として維持することもできる。また、本発明の方法により得られた細胞集団を用いて、更に公知の方法により培養することで新たに細胞集団を得ることもできる。【００６５】
本発明の製造方法において、細胞集団の培養をＣＤ２８リガンド（例えば抗ＣＤ２８抗体）存在下で実施しても良く、ＣＤ２８リガンド非存在下で実施しても良い。以下の実施例で示すとおり、抗ＣＤ２８抗体非存在下で実施することは、細胞増殖率及び操作性の向上、コスト削減、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率の向上、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率の低下、ＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞の含有率の向上、ＣＤ４陽性制御性T細胞含有率の低下などの特徴を有するので、ＣＤ２８リガンドの添加は、目的に応じて選択すれば良い。（Ａ）成分及び（Ｂ）成分に共存させる他のリガンドを組み合わせることにより、目的に応じた任意の細胞集団を製造できるできる点で、本発明は極めて有用である。【００６６】
本願発明の製造方法において、前記の工程（２）で得られた細胞集団を前記（Ａ）成分及び／又は前記（Ｂ）成分の非存在下で更に培養する工程を実施しても良い。この工程は、通常の細胞培養の方法、例えば公知のＴ細胞の培養方法により実施すれば良く、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を共存させない以外は、前記工程（２）と同一の条件であっても良い。培地には、前記の工程（２）と同様に、サイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分を含んでいても良い。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γなどが例示される。【００６７】
本発明の細胞集団の製造方法において、総培養日数は４〜１４日間とすることが得られる細胞の質及び培養効率上、好ましい。すなわち、総培養日数が４〜１４日間である場合、得られる細胞集団は、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞の含有率が高い細胞集団であり、細胞医療分野への使用に極めて適している。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。本発明において、総培養日数としては、より好適には５〜１４日間、更に好適には６〜１４日間が望ましい。【００６８】
＜４＞本発明により製造される細胞集団の使用
本発明は、細胞集団の製造方法であり、特に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞の製造方法に関する。すなわち、本発明の方法により製造される細胞集団は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率、ＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞の含有率が高く、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が低い。したがって、種々の疾患の治療や予防に有用である。前記の細胞集団の投与が有効である疾患としては、特に限定はないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎や、インフルエンザ、ウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。特に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染するＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ、ヒト免疫不全ウイルス）が原因となるエイズ（ＡＩＤＳ、後天性免疫不全症候群）の治療に有用である。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。【００６９】
更に本発明は、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞の含有率が高く、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が低い細胞集団を提供する。また、本発明は、当該細胞集団を有効成分として含有する医薬を提供する。当該細胞集団を含有する前記医薬は免疫療法への使用に適している。免疫療法においては、患者の治療に適したＴ細胞が、例えば注射や点滴により患者の静脈、動脈、皮下、腹腔内などに投与される。当該医薬は前記の疾患への使用において非常に有用である。当該医薬は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該Ｔ細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤などと混合し、点滴剤、注射剤として調製できる。なお、治療剤における本発明の細胞集団の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜、決定できる。例えば、医薬における本発明の細胞集団の含有量としては、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０３〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０４〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０５〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量としては、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０６〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０７〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、更に好ましくは１×１０８〜２×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。更に、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療や放射線治療、外科的手術による治療との併用を行うこともできる。【００７０】
更に、本発明は当該細胞集団を有効成分として含有する診断薬を提供する。例えば、患者から得られた細胞を本発明の診断薬により解析、スクリーニングすることにより治療効果の推測、有効な導入遺伝子の選択などが可能である。【００７１】
また本発明は、被験体に有効量の前記の方法により得られる細胞集団を投与することを含む疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において被験体とは、特に限定はないが、好ましくは本発明の方法により製造される細胞集団を投与される前記に記載するような疾患に罹患した生体（例えばヒト患者、非ヒト動物）を示す。【００７２】
また、本明細書中において有効量とは、前記細胞集団を上記被験体に投与した場合に、該細胞集団を投与していない被験体と比較して、治療もしくは予防効果を発揮する該Ｔ細胞集団の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び被験体の年齢、体重、症状などによって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様にすれば良い。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴や注射などにより投与すれば良い。【００７３】
また、本発明は、前記の本発明の製造方法により得られるＣＤ４陽性Ｔ細胞集団に対して、少なくとも１つの刺激因子により刺激を与えることにより、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造する方法を提供する。更に本発明は、前記の製造方法で得られた細胞集団を提供する。このようにして得られる活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む細胞集団は、前記の製造方法により得られるＣＤ４陽性Ｔ細胞集団と同様に医薬の有効成分として使用できる。ここで刺激因子による刺激とは、刺激因子により前記の本発明の製造方法により得られる細胞集団が活性化されるものであれば特に限定はなく、例えば、本発明の製造方法により得られるＣＤ４陽性Ｔ細胞集団と刺激因子の共存下での培養により実施することができる。【００７４】
本明細書において、前記の刺激因子としてのサイトカインとは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に作用し活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２７などが例示され、細胞性免疫を増強させる観点から好適には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２が例示される。【００７５】
本明細書において、ケモカインとは、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０、ＭＩＧが例示される。【００７６】
また、本発明の方法により製造される細胞集団はＴｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率が高いことから、当該細胞集団をさらにＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性ナイーブＴ様細胞）を含有する細胞集団と混合して培養することにより、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を高含有率で培養することができる。すなわち、本発明により、下記（２−１）〜（２−３）の工程を含有する細胞集団の製造方法が提供される。
工程（２−１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去する、もしくはＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取する工程
工程（２−２）：前記工程（２−１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養する工程
（Ａ）ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つ
（Ｂ）ＣＤ３リガンド
工程（２−３）：前記工程（２−２）で得られた細胞集団と、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団を混合して培養する工程【００７７】
前記工程（２−３）の培養は、好適には工程（２−２）の条件、すなわち（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下で実施することが好ましい。また、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞を含有する細胞集団としては、特に限定はないが、例えばＰＢＭＣ、臍帯血単核球もしくはこれらより分離したＣＤ８陽性細胞等を使用することができる。またその他の培養条件等については前記の「＜３＞本発明の細胞集団の製造方法」に記載の方法で実施することができる。なお、上記方法により得られる細胞集団は、ＣＤ８陽性のナイーブＴ様細胞を高比率に含有していることから、細胞医療への用途に極めて適している。【００７８】
本発明者らは、Ｔ細胞を含有する細胞集団の拡大培養において、安定して高い拡大培養率を実現し、かつ得られる細胞集団中のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率が安定して高く維持される方法について種々検討した結果、培養開始時のＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率が極めて重要であることを見出した。すなわち、本発明の別の態様として、下記工程を包含することを特徴とする細胞集団の製造方法が提供される。
工程（３−１）：ＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率が２：１以上である細胞集団を得る工程
工程（３−２）：前記工程（３−１）にて得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの存在下で培養する工程【００７９】
ここで、上記工程（３−１）におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率として、「ＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率が２：１以上」とは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数を２とした場合のＣＤ４陽性Ｔ細胞数が１以上であることを意味し、好適には１：１以上、より好適には１：２以上、さらに好適には１：４以上であることが例示される。当該比率の細胞集団を得る工程としては、特に限定はないが、前記の方法により得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞を高含有する細胞集団からのＣＤ８陽性Ｔ細胞の分離、分離されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の添加、前記の方法により得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞を高含有する細胞集団からのＣＤ４陽性Ｔ細胞の分離、分離されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の添加等を単独又は適宜組み合わせて実施することにより、特定のＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞比率の細胞集団を得ることができる。また、上記工程（３−１）の前に、前記のＴ細胞を含有する細胞集団中のＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有量を測定する工程、すなわち、培養に供されるＴ細胞集団もしくはその由来となるドナーの血液中におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率を測定する工程を加えることもできる。また、さらに高い拡大培養率を実現する観点からは、上記工程（３−２）において、工程（３−１）で得られたＴ細胞の他、同じ由来の血球系細胞、例えば単球、樹状細胞、ＮＫ細胞等が培養に供される細胞集団に含有されていることが好ましく、好適には後述の実施例４に示すとおり、培養する細胞集団と同じドナー由来の単球を予め分離しておいて前記比率となるＴ細胞を含有する細胞集団を工程（３−２）に供する際に単球を混合することが好ましい。また、当該工程（３−２）の培養は、ＣＤ３リガンドの存在下に加えて、好適には、ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの存在下で実施することが好ましい。また、その他の培養条件等については、前記の「＜３＞本発明の細胞集団の製造方法」に記載の方法で実施することができる。【００８０】
また、本発明の別の態様として、ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とするＩＬ−５産生抑制剤、又はＩＬ−９産生抑制剤が提供される。当該ＩＬ−５産生抑制剤及びＩＬ−９産生抑制剤は、ＩＬ−５又はＩＬ−９産生抑制作用を要する疾患を対象とした医薬、機能性食品素材として有用である。当該疾患としては、特に限定はないが、例えば喘息、アレルギー性疾患、アナフィラキシー、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎等の治療又は予防に極めて有用である。当該ＩＬ−５産生抑制剤及びＩＬ−９産生抑制剤、それを含有する医薬又は食品の製造については、ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つを含有していれば特に限定はなく、公知の医薬、食品の製法に準じて製造することができる。また、本発明によりＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つを投与することを特徴とするＩＬ−５又はＩＬ−９産生抑制方法が提供される。ここで投与対象としては、ヒト、家畜もしくはペット用動物のほか、血球系細胞等の各種細胞が例示される。当該抑制方法は上記疾患の治療や予防のほか、研究用試薬として使用することもできる。【００８１】
さらに、本発明により、ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程を実施して得られる、ＩＬ−５又はＩＬ−９産生量の低い細胞集団、及びその製造方法が提供される。当該細胞集団は、ＩＬ−５及びＩＬ−９の産生量が低下していることから、細胞医療分野において当該サイトカインの上昇を抑制しながらの患者への投与が可能となる。当該製造方法は、ＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程以外の条件については、特に限定はなく、例えば前記の「＜３＞本発明の細胞集団の製造方法」に記載の方法で実施することができる。【００８２】
本発明の別の態様として、ＶＬＡ−４結合性オリゴペプチド及び／又はＦＮのヘパリン結合ドメインの一部を含有するオリゴペプチドを有効成分とする、Ｔ細胞集団の増殖調節剤を提供する。ＶＬＡ−４結合性オリゴペプチドとしては、ＬＤＦＰもしくはＬＤＶＰで表されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドが例示される。また、ＦＮのヘパリン結合ドメインの一部を含有するオリゴペプチドとしては、ＬＩＧＲＫＫで表されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドが例示される。また、ここで「オリゴペプチド」とは２０アミノ酸以下のペプチドと定義する。当該オリゴペプチドをＴ細胞集団の拡大培養、特にＦＮ、ＦＮのフラグメント及びＦＮのフラグメントの混合物からなる群より選択される少なくとも１つを使用したＴ細胞集団の拡大培養に使用することにより、細胞増殖率が低下することから、Ｔ細胞集団の拡大培養における細胞増殖性のコントロールに使用できる。さらに当該増殖調節剤と拡大培養促進物質を組み合わせて使用することにより、任意の細胞集団を特異的に拡大培養することもできる。また、当該剤はリンパ球の増殖のメカニズム研究においても有用である。【００８３】
また、後述の実施例２０〜２２に示されるとおり、ＦＮやそのフラグメントを用いた細胞集団の拡大培養において、ＦＮのＶＬＡ−４結合ドメインは、培養に供される細胞の表面上のＶＬＡ−４を刺激してシグナルを誘起させることでリンパ球の拡大培養を実施すること、及び得られた細胞集団中のナイーブＴ様細胞含有率が高く維持させることが本発明により示された。すなわち、本発明により、本発明により得られるＣＤ４陽性Ｔ細胞を高含有する細胞集団に対して、ＶＬＡ−４を刺激しシグナルを誘起させることを特徴とするリンパ球の拡大培養方法、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＤ７陽性細胞及び／又はＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞比率向上方法が提供される。このＶＬＡ−４へのシグナルの誘起方法としては、特に限定はないが、例えばＬＤＦＰを含有するポリペプチドであって、ＶＬＡ−４へのシグナルを誘起する能力のあるポリペプチド、例えば前記のＣＳ−１ドメイン（配列表の配列番号８で表されるポリペプチド）を有するポリペプチドが例示され、本発明により当該能力を有するポリペプチドが提供される。当該ポリペプチドはリンパ球の拡大培養に使用でき、目的に応じて使い分け、任意の細胞集団を製造することができる。【００８４】
また、本発明の別の態様として、Ｔ細胞の拡大培養への使用に非常に有用な下記（ａ）及び（ｂ）から選択される新規なポリペプチドも提供される。
（ａ）配列表の配列番号２９（Ｈ２０４）、３６（Ｈ２９６−ＣＳ１）、３８（Ｈ２９６−ＣＳ２）、４４（Ｈ１１４−ＨＴ）、４６（Ｈ１１４）、５１（Ｈ１１７−ＨＴ）、５３（Ｈ１１７）、５８（Ｈ２０６−ＨＴ）、６０（Ｈ２０６）、６６（Ｈ２９６Ｒ−ＨＴ）、６８（Ｈ２９６Ｒ）、７１（Ｈ１０５−ＨＴ）、７３（Ｈ１０５）、７５（ＣＨ１０５−ＨＴ）、７９（ＣＨ２９６ｍｕｔ２）、８３（ＣＨ２９６ｍｕｔ３）及び８５（ＣＨ２９６ｍｕｔ４）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記（ａ）のポリペプチドと同等な機能を有する新規なポリペプチド【００８５】
以下に、個々のポリペプチドについて説明する。
配列表の配列番号２９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例６にＨ２０４として記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＦＮのＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００８６】
配列表の配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例７にＨ２９６−ＣＳ１として記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＦＮのＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１ドメイン、及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００８７】
配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例８にＨ２９６−ＣＳ２として記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＦＮのＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１ドメイン、ＣＳ−１ドメイン、及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００８８】
配列表の配列番号４４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例９にＨ１１４−ＨＴとして記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＦＮのＩＩＩ−１３及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００８９】
配列表の配列番号４６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例９にＨ１１４として記載されたポリペプチドであり、上記のＨ１１４−ＨＴのＮ末端からＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドである。【００９０】
配列表の配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１０にＨ１１７−ＨＴとして記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＦＮのＩＩＩ−１２及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００９１】
配列表の配列番号５３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例９にＨ１１７として記載されたポリペプチドであり、上記のＨ１１７−ＨＴのＮ末端からＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドである。【００９２】
配列表の配列番号５８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１１にＨ２０６−ＨＴとして記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＦＮのＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００９３】
配列表の配列番号６０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１１にＨ２０６として記載されたポリペプチドであり、上記のＨ２０６−ＨＴのＮ末端からＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドである。【００９４】
配列表の配列番号６６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１２にＨ２９６Ｒ−ＨＴとして記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＦＮのＣＳ−１ドメイン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３及びＩＩＩ−１４を有するポリペプチドである。【００９５】
配列表の配列番号６８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１２にＨ２９６Ｒとして記載されたポリペプチドであり、上記のＨ２９６Ｒ−ＨＴのＮ末端からＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドである。【００９６】
配列表の配列番号７１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１３にＨ１０５−ＨＴとして記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＦＮのＩＩＩ−１４及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００９７】
配列表の配列番号７３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１３にＨ１０５として記載されたポリペプチドであり、上記のＨ１０５−ＨＴのＮ末端からＨｉｓタグ配列を除いたポリペプチドである。【００９８】
配列表の配列番号７５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１４にＣＨ１０５−ＨＴとして記載されたポリペプチドであり、Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＦＮのＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０、アミノ酸配列“ＥＩＤＫＰＳＭＡ”、ＩＩＩ−１４及びＣＳ−１ドメインを有するポリペプチドである。【００９９】
配列表の配列番号７９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１５にＣＨ２９６ｍｕｔ２として記載されたポリペプチドであり、前記の配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるＣＨ−２９６のアミノ酸番号５４３〜５４８に相当する領域が“ＬＩＧＲＫＫ”から“ＶＬＡＫＲＲ”に変換されたポリペプチドである。【０１００】
配列表の配列番号８３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１６にＣＨ２９６ｍｕｔ３として記載されたポリペプチドであり、前記ＣＨ−２９６のアミノ酸番号５６９〜５７２に相当する領域が“ＬＤＶＰ”から“ＬＥＬＰ”に変換されたポリペプチドである。【０１０１】
配列表の配列番号８５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、後述の実施例１７にＣＨ２９６ｍｕｔ４として記載されたポリペプチドであり、前記のＣＨ−２９６のアミノ酸番号５４３〜５４８に相当する領域が“ＬＩＧＲＫＫ”から“ＶＬＡＫＲＲ”に、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号５６９〜５７２に相当する領域が“ＬＤＶＰ”から“ＬＥＬＰ”に変換されたポリペプチドである。【０１０２】
また、本発明においては、下記（ｃ）〜（ｇ）から選択される新規な核酸も提供される。
（ｃ）配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸
（ｄ）配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸
（ｅ）配列表の配列番号３０（Ｈ２０４をコードする核酸の塩基配列）、配列番号３７（Ｈ２９６−ＣＳ１をコードする核酸の塩基配列）、配列番号３９（Ｈ２９６−ＣＳ２をコードする核酸の塩基配列）、配列番号４５（Ｈ１１４−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号４７（Ｈ１１４をコードする核酸の塩基配列）、配列番号５２（Ｈ１１７−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号５４（Ｈ１１７をコードする核酸の塩基配列）、配列番号５９（Ｈ２０６−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号６１（Ｈ２０６をコードする核酸の塩基配列）、配列番号６７（Ｈ２９６Ｒ−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号６９（Ｈ２９６Ｒをコードする核酸の塩基配列）、配列番号７２（Ｈ１０５−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号７４（Ｈ１０５をコードする核酸の塩基配列）、配列番号７６（ＣＨ１０５−ＨＴをコードする核酸の塩基配列）、配列番号８０（ＣＨ２９６ｍｕｔ２をコードする核酸の塩基配列）、配列番号８４（ＣＨ２９６ｍｕｔ３をコードする核酸の塩基配列）及び配列番号８６（ＣＨ２９６ｍｕｔ４をコードする核酸の塩基配列）で表される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列を有する核酸
（ｆ）前記（ｅ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸
（ｇ）前記（ｅ）の核酸の塩基配列において、１もしくは数個の塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じた核酸であって、当該核酸によってコードされるポリペプチドが、前記（ｅ）の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有する核酸【０１０３】
なお、上記（ｃ）の核酸は、前記（ａ）のポリペプチドをコードする核酸であり、前記（ｄ）の核酸は、前記（ｂ）のポリペプチドをコードする核酸である。また、前記（ａ）のポリペプチドは、上記（ｃ）の核酸を用いてタンパク発現に供する場合、Ｎ末端のメチオニン残基が消化されている場合がある。【０１０４】
なお、本明細書において、前記新規なポリペプチドを本発明のポリペプチドと記載し、前記新規な核酸を本発明の核酸と記載することがある。【０１０５】
以下、本発明のポリペプチド、本発明の核酸（ポリヌクレオチド）、及びこれらの製造方法について説明する。【０１０６】
本発明の前記（ｂ）のポリペプチドとしては、好適には配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。ここで、付加とは、例えばポリペプチドＮ末端にＨｉｓタグ配列等のペプチド精製におけるタグ配列の付加、タンパク精製におけるリンカー配列の付加等が例示される。また、欠失とは、前記タグ配列を有するポリペプチドからのタグ配列の除去や、ポリペプチドのＮ末端におけるメチオニン残基の除去等が例示される。なお、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その際のアミノ酸の置換等は、好適には前記の、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状などを変化させ得る程度のものが例示される。【０１０７】
本発明のポリペプチドをコードする配列表の配列番号３０、３７、３９、４５、４７、５２、５４、５９、６１、６７、６９、７２、７４、７６、８０、８４及び８６で表される塩基配列からなる群より選択される核酸は、天然型のＦＮをコードする核酸、もしくは組換え型のＦＮフラグメント、例えば前記のＣＨ−２９６やＨ−２９６等をコードする核酸を用いて、本発明のポリペプチドを構成する各ドメインをコードする核酸を取得し公知の方法によりこれらをつなぎ合わせる、もしくはＰＣＲ法により適当な箇所に範囲を導入することにより取得することができる。例えば、後述の実施例６〜１７に記載の方法により取得することができる。【０１０８】
配列番号３０、３７、３９、４５、４７、５２、５４、５９、６１、６７、６９、７２、７４、７６、８０、８４及び８６で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、本発明のポリペプチドと同等な機能、すなわち前記のリンパ球の製造において所望の効果を有するポリペプチドをコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。上記「ストリンジェントな条件」とは特に限定されず、例えば、これらの塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズさせるＤＮＡに応じて、ハイブリダイゼーション時の、好ましくはさらに洗浄時の温度及び塩濃度を適宜決定することにより設定し得るが、ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第３版〔サンブルーク（ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられる。【０１０９】
具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、５０℃、好ましくは６５℃で保温する条件が例示される。前記の温度は用いるＤＮＡのＴｍ値が既知である場合は、その値より５〜１２℃低い温度としてもよい。さらに、非特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上等の条件下で洗浄を行う、という条件等を追加してもよい。【０１１０】
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた本発明に包含される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及びシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）、塩濃度、又は温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩インキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。【０１１１】
上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を添加及び／又は置換することによって改変することができる。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、及び市販の製品処方物が挙げられる。また、この改変に応じて、上記のハイブリダイゼーション条件の他の要素の改変が必要な場合もある。【０１１２】
また、本発明の核酸としては、配列表の配列番号３０、３７、３９、４５、４７、５２、５４、５９、６１、６７、６９、７２、７４、７６、８０、８４及び８６で表される塩基配列からなる群より選択される核酸の塩基配列において、１ないし数個の塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものも含まれる。例えば配列表の配列番号３０、３７、３９、４５、４７、５２、５４、５９、６１、６７、６９、７２、７４、７６、８０、８４又は８６に記載の塩基配列から１〜６０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜３０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜１５塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、塩基の置換等は、核酸にコードされるポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、塩基の置換等の方法については前記のアミノ酸の置換等に関する記載に準ずる。【０１１３】
一方、このようにして得られた核酸を用いて、本発明のポリペプチド、好適には配列表の配列番号２９、３６、３８、４４、４６、５１、５３、５８、６０、６６、６８、７１、７３、７５、７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを遺伝子工学的に取得することができる。すなわち、当該核酸を適切な発現用ベクター、特に限定はないが、例えばｐＥＴベクターやｐＣｏｌｄベクター等に挿入し、公知の方法により、当該ポリペプチドを、例えば、大腸菌等で発現させることにより取得することができる。【０１１４】
本発明のポリペプチドの存在下で、Ｔ細胞を含有する細胞集団の拡大培養を実施することにより高い拡大培養率が実現されることから、当該ポリペプチドは極めて有用である。さらに、前記ポリペプチドのうち、配列表の配列番号７９、８３及び８５で表されるアミノ酸配列については、ＣＨ−２９６のヘパリン結合ドメイン及び／又はＶＬＡ−４結合ドメインに変異を含むポリペプチドであり、ＦＮやＦＮのヘパリン結合ドメイン又はＶＬＡ−４結合ドメインの機能研究においても極めて有用である。当該ポリペプチドの製造方法については、特に限定はないが、前記の（ｃ）〜（ｇ）から選択される核酸を用いて公知の方法により製造することができ、例えば実施例６〜１７の方法により製造することができる。【０１１５】
また、本発明により、前記（ａ）及び（ｂ）から選択されるポリペプチドの存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程を含有する細胞集団の製造方法も提供される。当該培養工程は、好適にはＣＤ３リガンドの存在下で実施される。また、その他の培養条件としては特に限定はなく、例えば前記の＜３＞本発明の細胞集団の製造方法に記載の方法で実施することができる。さらに上記（ａ）及び（ｂ）で表されるポリペプチドは、ウイルスベクターを利用した細胞への遺伝子導入に使用することも可能である。すなわち、当該ポリペプチドの存在下でウイルスベクターを利用した細胞への遺伝子導入を実施することにより、高効率に遺伝子を細胞に導入することが可能となる。ここでウイルスベクターとしては、特に限定はないが、前記の各種ウイルスベクターが例示される。【０１１６】
なお、本明細書において細胞又は細胞集団の製造は、当該細胞又は細胞集団の誘導（活性化）、維持、拡大培養の各工程、もしくはこれらを組み合わせた工程を包含する工程を指す。
【実施例】
【０１１７】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお以下の実施例で、細胞を各実施例中で用いる刺激因子を固定化した培養器材を用いて培養すること、刺激因子が可溶性の状態で培養液中に添加された培養液により培養すること及び刺激因子を固定化した磁気ビーズ等を用いて培養することを「刺激」と記載することがある。【０１１８】
実施例１  ＦＮフラグメントＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養−１
（１）ＰＢＭＣの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（バクスター社製、以下ＰＢＳと記載）又はダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（インビトロジェン社製又はシグマ社製、以下ＤＰＢＳと記載）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（アマシャムバイオサイエンス社製又はＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）上に重層後、７００×ｇで２０分間遠心した。遠心後、中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製、以下ＲＰＭＩ１６４０と記載）に懸濁した後、ＣＰ−１（極東製薬社製）と２５％ヒト血清アルブミン（ブミネート：バクスター社製）を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて懸濁し、液体窒素中にて保存した。リンパ球の拡大培養にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含む試験用培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。【０１１９】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）及び配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するＦＮフラグメント〔商品名：レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製、以下ＣＨ−２９６と記載〕を固定化した。すなわち２４穴細胞培養プレート（コーニング社製）に終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体と終濃度２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液あるいは終濃度２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６のみを含むＡＣＤ−Ａ液を０．４５ｍＬ／ウェルずつ添加したのち培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にはこの培養器材から抗体、ＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄し各実験に供した。【０１２０】
（３）ＣＤ８除去細胞の調製
実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを、１％ヒトＡＢ血清（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を含むＰＢＳ（以下１％ＨＳ／ＰＢＳと記載）を用いて１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、１％ＨＳ／ＰＢＳで洗浄したＣＤ８ポジティブセレクションビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ８：インビトロジェン社製）をＰＢＭＣ１×１０７ｃｅｌｌｓあたり２×１０７ビーズとなるように添加し、ローテーターを用いて４℃で１時間緩やかに攪拌したのち、磁気分離装置ＭＰＣ−１（Ｄｙｎａｌ社製）上に２〜３分静置してビーズ非結合細胞を回収した（以下、ＣＤ８除去細胞と記載）。回収したＣＤ８除去細胞を５００×ｇで５分間遠心したのち、２％ヒトＡＢ血清と０．２％ヒト血清アルブミンを含むＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製、以下２％ＧＴ−Ｔ５０３と記載）あるいは５％ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含むＸ−ＶＩＶＯ１５（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、以下５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５と記載）を用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。【０１２１】
（４）実施例１−（３）で調製した細胞の拡大培養
実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレート、又はＣＨ−２９６固定化プレートに、２％ＧＴ−Ｔ５０３あるいは５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を０．５ｍＬ／ウェルで添加したのち、実施例１−（３）で調製した細胞懸濁液を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。ＣＨ−２９６のみ固定化したウェルには、１％ＨＳ／ＰＢＳで洗浄した抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ：インビトロジェン社製：以下、Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒと記載）を細胞数に対して３倍量添加した。続いてＩＬ−２（プロロイキン：Ｃｈｉｒｏｎ社製）を、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群については終濃度２００Ｕ／ｍＬ、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群については終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。培養開始３日目には、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群については２％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約６倍希釈し、希釈液４ｍＬを何も固定化していない１２穴細胞培養プレート（コーニング社製）に移し、５％Ｘ−ＶＩＶＯ培養群については、培養液０．８ｍＬを何も固定化していない１２穴細胞培養プレートに移した。培養６日目には、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群については約２倍希釈した後、希釈液６ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに移し、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群については、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈したのち、希釈液１．５ｍＬを何も固定化していない１２穴細胞培養プレートに移した。培養１０日目には、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群については約２倍希釈した後、希釈液１０ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移し、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群については、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈したのち希釈液３ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移した。いずれの培養日においても、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群は終濃度２００Ｕ／ｍＬ、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群は終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後６日目の拡大培養率を表１に示す。なお、拡大培養率はトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して算出した。また、表中において「＋」は「及び」を意味し、以降の表においても同様である。【０１２２】
【表１】
2008143255.tif 000002
【０１２３】
表１に示されるように、ＣＤ８除去細胞拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を固定化した群は、Ｔ  ｃｅｌｌ  ＥｘｐａｎｄｅｒとＣＨ−２９６で刺激した群と比較して高い拡大培養率が得られた。すなわち、初期刺激において、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはＣＤ８除去細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０１２４】
（５）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例１−（４）で得られた培養１２日目の細胞をＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製）を含むＰＢＳ（以下１％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）で洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、ネガティブコントロールにはＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。発現検出用細胞には同様に、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（ベックマンコールター社製）／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を洗浄し、再度ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）に供し、各々の細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。結果を表２に示す。【０１２５】
【表２】
2008143255.tif 000003
【０１２６】
表２に示されるように、ＣＤ８除去細胞拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を固定化した群は、Ｔ  ｃｅｌｌ  ＥｘｐａｎｄｅｒとＣＨ−２９６で刺激した群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞はナイーブＴ細胞にみられる表現型であり、拡大培養後のリンパ球を体内に戻したときの効果が期待できる。したがって、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０１２７】
（６）ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の解析
実施例１−（４）で得られた培養１２日目の細胞を、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＭＰバイオメディカルズ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（以下１０ＦＲＰＭＩと記載）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、あらかじめ１０ＦＲＰＭＩを０．４ｍＬ／ウェルずつ添加した４８穴細胞培養プレート（コーニング社製）に０．２ｍＬ／ウェルずつまき込んだ。ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｏｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ：ＢＩＯＭＯＬ社製）を終濃度５０ｎｇ/ｍＬ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（シグマ社製）を終濃度１μｇ／ｍＬ、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（シグマ社製）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で４時間培養した。培養終了後の細胞を回収し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、ＥＣＤ標識マウスＩｇＧ１もしくはＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（ともにベックマンコールター社製）を添加後、氷上で３０分間インキュベートしたのち、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ  Ｒｅｇｅｎｔ（ベックマンコールター社製）の方法に従って、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩＬ−４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（ベックマンコールター社製）で細胞内染色を行った。なお、ネガティブコントロールにはＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）、ＰＥ標識マウスＩｇＧ１（ダコ社製）を使用した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団について、ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の含有率を測定した。結果を表３に示す。なお、全ての条件において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率は８５％以上であることを確認した。【０１２８】
【表３】
2008143255.tif 000004
【０１２９】
表３より、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で刺激した細胞は、Ｔ  ｃｅｌｌ  ＥｘｐａｎｄｅｒとＣＨ−２９６で刺激したものと比較してＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性の含有率が高い結果が得られた。Ｔｈ１タイプの活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞はＩＦＮ−γを産生することが知られており、初期刺激を抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で行うことにより細胞性免疫で有用なＴｈ１タイプのＣＤ４陽性Ｔ細胞含有率が高くなることが示された。【０１３０】
実施例２  ＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養−２
（１）ＣＤ８除去細胞の拡大培養
実施例１−（１）に記載した方法で分離、保存したＰＢＭＣから実施例１−（３）に記載した方法でＣＤ８除去細胞を調製し、実施例１−（２）の方法で固定化したプレートを用いて実施例１−（４）と同様に拡大培養を行った。ただし、培養器材は１２穴細胞培養プレートを使用し、培養開始時は、あらかじめ２％ＧＴ−Ｔ５０３あるいは５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を３ｍＬ／ウェルで添加したプレートに細胞懸濁液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。また、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体ビーズにはＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８（インビトロジェン社製：以下ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと記載）を使用した。培養開始３日目には、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群については２％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約３倍希釈し、希釈液６ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに移し、５％Ｘ−ＶＩＶＯ培養群については、培養液３．４ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移した。培養６日目には、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群については約２．２倍希釈した後、希釈液１０．５ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移し、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群については、培養液１．６ｍＬを０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を用いて希釈したのちＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移した。培養１０日目には、２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群については２％ＧＴ−Ｔ５０３培地９．５ｍＬを添加し、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群については、ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６での条件は約８．５ｍＬ、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＣＨ−２９６での条件は約１１．５ｍＬの培地を添加した。培養開始後６日目の拡大培養率を表４に示す。【０１３１】
【表４】
2008143255.tif 000005
【０１３２】
表４に示されるように、ＣＤ８除去細胞拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を固定化した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＣＨ−２９６の刺激群と比較して高い拡大培養率が得られた。すなわち、初期刺激において、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはＣＤ８除去細胞の拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０１３３】
（２）ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の解析
実施例２−（１）で得られた培養１２日目の細胞について、実施例１−（６）に記載した方法でＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞を測定した。結果を表５に示す。なお、全ての条件において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率は８５％以上であることを確認した。【０１３４】
【表５】
2008143255.tif 000006
【０１３５】
表５に示されるように、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で初期刺激した細胞は、異なるＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ製品を用いて刺激した細胞と比較した場合においても、ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の含有率が高い結果が得られ、Ｔｈ１タイプのＣＤ４陽性Ｔ細胞が優先的に増殖することが示された。【０１３６】
実施例３  ＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養−３
（１）ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズセレクション細胞の調製
実施例１−（１）に記載した方法で分離、保存したＰＢＭＣを用いて実施例１−（３）と同様の方法でＣＤ８除去細胞を調製した。ただし、調製後の細胞濃度は４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。必要量のＣＤ８除去細胞を１．５ｍＬねじ式チューブ（アシスト社製）にとり、５００×ｇで５分間遠心したのち上清を除去し、１％ＨＳ／ＰＢＳを用いて５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。１％ＨＳ／ＰＢＳで洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを細胞数に対して３倍量添加し、ローテーターを用いて４℃で３０分間穏やかに攪拌した。反応終了後１％ＨＳ／ＰＢＳを適量加えて穏やかに攪拌したのち、ＭＰＣに２〜３分静置してビーズ非結合細胞を取り除いた。ビーズ結合細胞は、はじめに１．５ｍＬねじ式チューブに採取した細胞数換算で４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５に懸濁した。以下この細胞をＴ細胞セレクション細胞と記載する。【０１３７】
（２）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養
（ｉ）Ｔ細胞セレクションなし群の調製
実施例１−（２）と同様の方法で抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６、又はＣＨ−２９６のみを固定化した１２穴細胞培養プレートに、実施例３−（１）で調製したＣＤ８除去細胞を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。このうちＣＨ−２９６のみ固定化したウェルには、１％ＨＳ／ＰＢＳで洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを細胞数に対して３倍量添加したのち、それぞれを５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を用いて４ｍＬに調製し、これらの条件で処理した細胞をＴ細胞セレクションなし群とした。
（ｉｉ）Ｔ細胞セレクションあり群の調製
実施例３−（１）で調製したＴ細胞セレクション細胞を実施例１−（２）と同様の方法でＣＨ−２９６のみ固定化したウェルに０．５ｍＬ／ウェルずつ添加し、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を用いて４ｍＬに調製した。これらの条件で処理した細胞をＴ細胞セレクションあり群とした。
（ｉｉｉ）上記（ｉ），（ｉｉ）ののプレートについて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養を開始した（培養０日目）。培養開始３日目には、Ｔ細胞セレクションなし群については５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を用いて約６．３倍希釈し、希釈液２０ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移し、Ｔ細胞セレクションあり群については細胞培養液３．２ｍＬを０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈し、希釈液を何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移した。培養６日目には、Ｔ細胞セレクションなし群については、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を用いて２倍希釈した希釈液２０ｍＬを、Ｔ細胞セレクションあり群については約４．７倍希釈した希釈液２０ｍＬをそれぞれ何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコに移し、１０日間培養を継続した。なお、ＩＬ−２はいずれも終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。培養開始後６日目の拡大培養率を表６に示す。【０１３８】
【表６】
2008143255.tif 000007
【０１３９】
表６に示されるように、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６のみの初期刺激がもっとも高い拡大培養率を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせが、好適であることが明確になった。【０１４０】
（３）ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の解析
実施例３−（２）で得られた培養１０日目の細胞について、実施例１−（６）に記載した方法でＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の含有率を測定した。結果を表７に示す。なお、全ての条件において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の含有率は８５％以上であることを確認した。【０１４１】
【表７】
2008143255.tif 000008
【０１４２】
表７に示されるように、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６で初期刺激した細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激した細胞と比較して、ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の含有率が高かった。つまり、初期刺激において抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはＴｈ１タイプのＣＤ４陽性Ｔ細胞が優先的に増殖することが明らかとなった。【０１４３】
実施例４  ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の拡大培養における培養開始時のＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率の影響
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
実施例１−（２）と同様にして行った。ただし、固定化に使用する培養器材は１２穴細胞培養プレートとし、抗ＣＤ３抗体のみを固定化する群も設定した。【０１４４】
（２）ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製
実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣから、実施例１−（３）と同様の方法でＣＤ８陽性Ｔ細胞の分離を行うが、ここではビーズ非結合細胞を除去して、ビーズ結合細胞を得た。回収したビーズ結合細胞を、１％ＨＳ／ＰＢＳを用いて１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、デタッチャビーズ（ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ  ＣＤ４／ＣＤ８：インビトロジェン社製）を細胞１×１０７ｃｅｌｌｓに対し、１０μＬ添加して、ローテーターを用いて室温で１時間緩やかに攪拌したのち、ＭＰＣに２〜３分静置してビーズ非結合細胞を回収した（以下、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と記載）。回収したＣＤ８陽性Ｔ細胞を５００×ｇで５分間遠心したのち、０．５％ヒトＡＢ血清と０．２％ヒト血清アルブミンを含むＧＴ−５０３（以下０．５％ＧＴ−Ｔ５０３と記載）を用いて、０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬなるように懸濁した。【０１４５】
（３）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製
実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを、１％ＨＳ／ＰＢＳを用いて１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、１％ＨＳ／ＰＢＳで洗浄したＣＤ４ポジティブセレクションビーズ（ＣＤ４  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：インビトロジェン社製、以下、本工程で使用する試薬は当該Ｋｉｔ付属品を使用）をＰＢＭＣ１×１０７ｃｅｌｌｓあたり１×１０７ビーズとなるように添加して、ローテーターを用いて４℃で１時間緩やかに攪拌したのち、ＭＰＣに２〜３分静置してビーズ非結合細胞を除去し、ビーズ結合細胞を回収した（ビーズ結合状態で回収）。その後、実施例４−（２）と同様にしてデタッチャビーズを用いてビーズ非結合細胞を回収（以下、ＣＤ４陽性Ｔ細胞と記載）し、５００×ｇで５分間遠心したのち、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて、０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。【０１４６】
（４）モノサイトの調製
実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを、１％ＨＳ／ＰＢＳを用いて１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、ＰＢＭＣ １×１０７ｃｅｌｌｓあたり２０μＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：インビトロジェン社製、以下、本工程で使用する試薬は当該Ｋｉｔ付属品を使用）、及び２０μＬのＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｉｘを添加後、懸濁して４℃で２０分間インキュベートした。その後、５００×ｇで５分間遠心して上清を除去して、１％ＨＳ／ＰＢＳに懸濁したＰＢＭＣを洗浄したモノサイトネガティブセレクションビーズをＰＢＭＣ １×１０７ｃｅｌｌｓあたり１×１０７ビーズとなるように添加して、ローテーターを用いて４℃で１５分間緩やかに攪拌したのち、ＭＰＣに２〜３分静置してビーズ非結合細胞（以下、モノサイトと記載）を回収した。回収したモノサイトを５００×ｇで５分間遠心したのち、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。【０１４７】
（５）実施例４−（２）、（３）、及び（４）で調製した細胞の拡大培養
実施例４−（１）で抗ＣＤ３抗体のみ、もしくは抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したプレートに、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を０．２５ｍＬ／ウェルで添加したのち、実施例４−（４）で調製したモノサイト懸濁液を０．２５ｍＬ／ウェルを添加した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞：ＣＤ８陽性Ｔ細胞の比として、ＣＤ４陽性Ｔ細胞：ＣＤ８陽性Ｔ細胞＝０：１、０．５：１、１：１、２：１、４：１の５条件を設定し、当該個々の条件の比に合うように、また各ウェルの総細胞数が０．２５×１０６ｃｅｌｌｓとなるように（実施例４−（４）で調製した細胞を除く）実施例４−（２）、及び（３）で調製したＣＤ８陽性Ｔ細胞懸濁液及びＣＤ４陽性Ｔ細胞懸濁液を添加した。その後、ＩＬ−２を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。培養開始４日目には、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約１４倍希釈し、希釈液１０ｍＬを何も固定化していないＴ−２５細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに移した。培養７日目には、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約２倍希釈して、希釈液１０ｍＬを何も固定化していないＴ−２５細胞培養フラスコを立てたものに移した。培養１１日目には、０．２％ヒト血清アルブミンを含むＧＴ−Ｔ５０３（以下、０％ＧＴ−Ｔ５０３と記載）を用いて約２倍希釈して全量を２０ｍＬとした。培養１４日目を実験終了日とした。いずれの培養日においても、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。【０１４８】
（６）ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
培養０日目で調製したＰＢＭＣ及び実施例４−（５）で得られた培養１４日目の各細胞を実施例１−（５）と同様の方法で抗体染色を行い、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。ここで、ネガティブコントロールには実施例１−（５）のネガティブコントロールを使用し、発現検出用細胞には同様にＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体にＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター社製）を添加した。培養１４日目のＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の拡大培養率を表８に示す。なお、当該表におけるＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞拡大培養率は、培養１４日目の細胞集団中に含まれるＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞数と培養開始時の細胞集団中に含まれるＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞数とを比較して算出した。なお、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞数とは得られた総細胞数にＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞比率を乗じたものとした。【０１４９】
【表８】
2008143255.tif 000009
【０１５０】
表８に示されるように、培養開始時の細胞集団中のＣＤ８陽性Ｔ細胞に対するＣＤ４陽性Ｔ細胞の比が大きくなるにしたがって、ＣＤ８陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の拡大培養率は高くなり、この効果は抗ＣＤ３抗体に加えＣＨ−２９６を用いて拡大培養を行った場合に、より顕著であることが示された。【０１５１】
実施例５  抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の組み合わせ刺激により得られたＴ細胞のＩＬ−５及びＩＬ−９の産生抑制効果
（１）抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体、及びＣＨ−２９６の固定化
抗ヒトＣＤ３抗体のみ、もしくは抗ヒトＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を組み合わせたプレートの固定化を、実施例４−（１）と同様に行った。また、抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体を組み合わせた固定化を、それぞれ終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにＡＣＤ−Ａ液で調製して実施例４−（１）と同様に行った。【０１５２】
（２）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製
実施例４−（３）と同様の方法で、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製した。【０１５３】
（３）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養
実施例５−（１）で調製した各固定化プレートに、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を０．５ｍＬ／ウェルで添加したのち、実施例５−（２）で調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞懸濁液を１．０ｍＬ／ウェルで添加した。その後、ＩＬ−２を終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。培養開始４日目には、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約１４倍希釈し、希釈液２．０ｍＬを何も固定化していない１２穴細胞培養プレートに移した。培養７日目には、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約２倍希釈して、希釈液２．０ｍＬを何も固定化していない１２穴細胞培養プレートに移した。培養１１日目には、０％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約２倍希釈して全量を４．０ｍＬとし、培養１４日目まで培養を継続した。いずれの継代日においても、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目の拡大培養率を表９に示す。【０１５４】
【表９】
2008143255.tif 000010
【０１５５】
表９に示されるように、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を組み合わせた群は対照群と比較して高い拡大培養率が得られることがわかった。さらには抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を組み合わせるよりも抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６と組み合わせた方が高い拡大培養率が得られた。【０１５６】
（４）培養上清中のＩＬ−５の検出
実施例５−（３）での拡大培養における培養２日目、４日目、７日目、１１日目の培養上清中のＩＬ−５濃度をｈｕｍａｎ  ＩＬ−５  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。測定の際は、キット付属の説明書に従った。ただし、使用した培養上清は、培養２日目以外は継代操作前に分取し、測定日まで−８０℃で凍結保存しておいたものを室温で融解して使用した。【０１５７】
（５）培養上清中のＩＬ−９の検出
０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＬ−９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製，ＭＨ９Ａ４）（以下、Ｃａｐｔｕｒｅ抗体とする）を、２０ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ，３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．２の溶液（以下、Ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと記載）で２．５μｇ／ｍＬに希釈して、ＥＬＡＳＡ用プレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μＬ／ウェル添加して、４℃で遮光して保存した。翌日保存しておいたプレートを取り出し、Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社製）を０．０５％含むＰＢＳ（以下、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒと記載）を２００μＬ／ウェルずつ添加し、アスピレーターで上清を除去した。この作業を３回繰り返し、ウェル内を洗浄した。次にＢＳＡを１％含むＰＢＳ（以下、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒと記載）を３００μＬ／ウェルで添加し、３７℃ ＣＯ２インキュベータ内にて２時間放置した。その後、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ウェル添加し、アスピレーターで上清を除去した。この作業を３回繰り返し、ウェル内を洗浄した。次に実施例５−（３）で拡大培養中において培養２日目、４日目、７日目、１１日目に培養上清を分取（培養２日目以外は継代操作前に分取）し、測定日まで−８０℃で凍結保存しておいたものを室温で融解して１００μＬ／ウェル添加し、ＳｔａｎｄａｒｄのＩＬ−９（５００ｐｇ／ｍＬから５ｐｇ／ｍＬまで１０倍に段階希釈したもの）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ウェル添加し、アスピレーターで上清を除去した。この作業を３回繰り返し、ウェル内をよく洗った。Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＬ−９（ＭＨ９Ａ３）（以下、検出用抗体とする）をＰＢＳで１０倍に希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで２０００倍に希釈したものを１００μＬ／ウェル添加し、ＣＯ２インキュベータ内にて２時間放置した。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ウェル添加し、アスピレーターで上清を除去した。この作業を３回繰り返したのち、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｈｔｓ社製、ＨＥ１０１）をＰＢＳで１０倍に希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５００倍に希釈したものを１００μＬ／ウェル添加して室温で３０分静置したのち、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ウェル添加し、アスピレーターで上清を除去した。この作業を３回繰り返した。ＡＢＴＳ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製、５０−６６−０１）（以下、基質と記載）を１００μＬ／ウェル添加し、１０分室温で遮光（様子を見ながら必要に応じて短縮）した。１５０ｍＭのシュウ酸（以下、ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎと記載）を５０μＬ／ウェル添加して、プレートリーダー（波長４０５ｎｍ）で測定した。【０１５８】
各刺激条件で培養した上清に含まれるＩＬ−５、及びＩＬ−９の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を培養日数ごとに、表１０、及び表１１に示す。当該表においては、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を組み合わせた刺激条件における各サイトカインの濃度を１とした時の各刺激条件のサイトカイン産生比率を示した。なお表中Ｎ．Ｔ．はＮｏｔ  Ｔｅｓｔを意味する。【０１５９】
【表１０】
2008143255.tif 000011
【０１６０】
【表１１】
2008143255.tif 000012
【０１６１】
表１０及び表１１に示されるように、培養期間を通して培養上清中に含まれるＩＬ−５、及びＩＬ−９の濃度は、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を組み合わせた刺激条件下が、抗ＣＤ３抗体のみの刺激条件下、及び抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を組み合わせた刺激条件下よりも低いことが判明した。以上より、抗ＣＤ３抗体にＣＨ−２９６を組み合わせた刺激の方が抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体と組み合わせた刺激よりも高い拡大培養率が得られ、かつＴ細胞の増殖時においてＩＬ−５及びＩＬ−９の産生が少ないことが示された。【０１６２】
実施例６  Ｈ２０４の作成
（１）Ｈ２０４発現ベクターの構築
ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）及びＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）がＮ末端から順に連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ２０４）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０１６３】
（ｉ）ＣＨ−２９６発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６（ＦＮの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン及びＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）発現ベクター（ｐＣＨ１０２）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。【０１６４】
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列（国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット参照）より、配列表の配列番号２５及び２６記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦ及び合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＣＨ−２９６−ＮｄｅＦは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜６に相当する塩基配列を塩基番号１５〜３２にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７０〜５７４に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３４にもつ合成ＤＮＡである。【０１６５】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μＬのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約１．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行った。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１６６】
次に後述のｐＣｏｌｄ１４ＮＤベクターをＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、ｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６とした。【０１６７】
（ｉｉ）Ｈ２０４発現ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号２７及び２８記載の塩基配列を有する合成プライマーＮＶＳ−Ｆ−Ｎｃｏ及びｐＣ−ＴＥＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＮＶＳ−Ｆ−Ｎｃｏは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号３７１〜３７７に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３８にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーｐＣ−ＴＥＲは、配列表の配列番号２８記載のｐＣｏｌｄ１４ベクターの３’ＴＥＲ部分にアニ−リングする配列をもつ合成ＤＮＡである。【０１６８】
国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従いｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターを調製した。このｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターを、本明細書ではｐＣｏｌｄ１４ベクターと呼ぶ。また、ｐＣｏｌｄ１４ベクターのＮｃｏＩサイトを常法によりＮｄｅＩサイトに変換したベクターを調製した。当該ベクターを本明細書ではｐＣｏｌｄ１４ＮＤベクターと呼ぶ。【０１６９】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例６−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（タカラバイオ社製）、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＮＶＳ−Ｆ−Ｎｃｏ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーｐＣ−ＴＥＲ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９５℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液はエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１７０】
次にｐＣｏｌｄ１４ベクターをＮｃｏＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０１７１】
ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４及びＣＳ−１が順に連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２０４とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２０４は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号３７１〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ２０４と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の２９に、塩基配列を配列表の配列番号３０に示す。【０１７２】
（２）Ｈ２０４の発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２０４を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。生育したコロニーを３０ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を３Ｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。なお、この培養の際には、５Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を使用し、１２０ｒ／ｍｉｎ、Ａｉｒ＝１．０Ｌ／ｍｉｎの条件で行った。前記培養後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、約４０ｍＬの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒ／ｍｉｎ、２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。得られた上清の抽出液を２ＬのｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で透析を行い、その約４０ｍＬを用いてさらにイオン交換クロマトによる精製を以下のように行った。すなわち、樹脂容積にして１００ｍＬ分のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ４ｃｍ×２０ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＢ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１Ｍ  ＮａＣｌ］で５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行った。５ｍＬずつ分画を行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量約２３ｋＤａの目的タンパク質を多く含む画分、約１００ｍＬを回収し、２ＬのｂｕｆｆｅｒＡで透析を行った。次に、樹脂容積にして５０ｍＬ分のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ３ｃｍ×１６ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＢで５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行った。５ｍＬずつ分画を行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、分子量約２３ｋＤａの目的タンパク質を多く含む画分、約１００ｍＬを回収し、２Ｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｄ［５０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）］で透析を行った。その後、セントリコン−１０（ミリポア社製）で１０ｍＬまで濃縮を行い、さらに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約２３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２０４とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアース社製）を使用して、タンパク質濃度を測定したところ、２．２ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約９６μＭ）。【０１７３】
実施例７  Ｈ２９６−ＣＳ１の作成
（１）Ｈ２９６−ＣＳ１発現ベクターの構築
Ｈ−２９６（配列表の配列番号１１で表されるアミノ酸配列）のＣ末端にＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）が連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−ＣＳ１）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０１７４】
（ｉ）Ｈ−２９６発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３記載）のアミノ酸番号２７８〜５７４よりなるポリペプチドであるＨ−２９６の発現ベクターを、以下のようにして構築した。【０１７５】
まず、配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号３１記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号２７８〜２８３に相当する塩基配列を塩基番号１３〜３０にもつ合成ＤＮＡである。【０１７６】
上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ及び合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。【０１７７】
反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行った。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１７８】
次にｐＣｏｌｄ１４ベクターをＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。【０１７９】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７８〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。【０１８０】
（ｉｉ）Ｈ２９６−ＣＳ１発現ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号３２記載の塩基配列を有する合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲ、配列番号３３記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｒ、配列番号３４記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｆ、及び配列番号３５記載の塩基配列を有する合成プライマーＦＮ−５６３０ＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲは、ｐＣｏｌｄ１４ベクターの５’ＵＴＲ部分にアニ−リングする合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｒは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５５４〜５５０に相当する塩基配列を塩基番号１〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７４〜５６９に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３３にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｆは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７０〜５７４に相当する塩基配列を塩基番号１〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５５０〜５５５に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３３にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＦＮ−５６３０Ｆは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号４２６〜４３４に相当する塩基配列を塩基番号２〜２８にもつ合成ＤＮＡである。【０１８１】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例６−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＮＣ２−５’ＵＴＲ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｒ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １分、５８℃  １分、７２℃  ４分を１サイクルとする３０サイクルと７２℃  １０分の反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約１．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製し、回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁した。このＤＮＡフラグメントを１Ｌとした。【０１８２】
さらに、上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例６−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーｐＣ−ＴＥＲ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １分、５８℃  １分、７２℃  ４分を１サイクルとする３０サイクルと７２℃  １０分の反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製し、回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁した。このＤＮＡフラグメントを３Ｌとした。【０１８３】
次に上記１Ｌ及び３Ｌを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。鋳型ＤＮＡとして１Ｌ及び３Ｌを滅菌水で１００倍希釈したもの各々１μＬ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＦＮ−５６３０Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーｐＣ−ＴＥＲ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９６℃  １分、５８℃  １分、７２℃  ２分を１サイクルとする３０サイクルと７２℃  ５分の反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動により回収、ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＳａｃＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。そのＳａｃＩ、ＸｂａＩ消化物を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製し、約０．５ｋｂｐのＳａｃＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１８４】
次に実施例７−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６をＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＳａｃＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＨ−２９６にＣＳ−１が連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−ＣＳ１とした。【０１８５】
このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−ＣＳ１は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列にＣＨ−２９６のアミノ酸番号５５０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が連結した塩基配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ２９６−ＣＳ１と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号３６に、塩基配列を配列表の配列番号３７に示す。【０１８６】
（２）Ｈ２９６−ＣＳ１の発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−ＣＳ１を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例６−（２）と同様にＨ２９６−ＣＳ１の発現、精製を行った。なお、培養液、細胞破砕溶液、樹脂容積、ｂｕｆｆｅｒＡ、ｂｕｆｆｅｒＢ、ｂｕｆｆｅｒＤ、分画液、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約３５ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２９６−ＣＳ１とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定したところ、２．１ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約６０μＭ）。【０１８７】
実施例８  Ｈ２９６−ＣＳ２の作成
（１）Ｈ２９６−ＣＳ２発現ベクターの構築
前記Ｈ２９６−ＣＳ１のＣ末端にＣＳ−１がもう一つ連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−ＣＳ２）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０１８８】
（ｉ）Ｈ２９６−ＣＳ２発現ベクターの構築
合成プライマーＦＮ−５６３０Ｆ及び合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｒを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例７−（１）−（ｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−ＣＳ１  約２ｎｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＦＮ−５６３０Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−ｎｏ．ｓｔ−ＣＳ１−Ｒ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９６℃  １分、６８℃  ２分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を３．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製し、回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁した。このＤＮＡフラグメントをＨ２９６−ＣＳ１ＤＮＡ断片とした。【０１８９】
さらに、上記ＤＮＡフラグメントを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例７−（１）−（ｉｉ）で調製したＤＮＡフラグメント３Ｌを１００倍希釈したもの、及び上記ＤＮＡフラグメントＨ２９６−ＣＳ１ＤＮＡ断片  ０．５μＬ、２μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、１．６μＬのｄＮＴＰ混合液、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を２０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９６℃  １分、６８℃  ２分を１サイクルとする３サイクルの反応を行った。反応終了後、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＦＮ−５６３０Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーｐＣ−ＴＥＲ、３μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、２．４μＬのｄＮＴＰ混合液、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを追加し、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９６℃  １分、６８℃  ２分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製、回収し、制限酵素ＳａｃＩ及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。そのＳａｃＩ、ＸｂａＩ消化物を１．０％アガロースゲル電気泳動により抽出精製し、約０．６ｋｂｐのＳａｃＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１９０】
次に実施例７−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６をＳａｃＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＳａｃＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＨ２９６−ＣＳ１にＣＳ−１がもう一つ連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−ＣＳ２とした。【０１９１】
このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−ＣＳ２は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列に、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号５５０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が２つ連結した塩基配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ２９６−ＣＳ２と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号３８に、塩基配列を配列表の配列番号３９に示す。【０１９２】
（２）Ｈ２９６−ＣＳ２の発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−ＣＳ２を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例６−（２）と同様にＨ２９６−ＣＳ２の発現、精製を行った。なお、培養液、細胞破砕溶液、樹脂容積、ｂｕｆｆｅｒＡ、ｂｕｆｆｅｒＢ、ｂｕｆｆｅｒＤ、分画液、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約３８ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２９６−ＣＳ２とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を測定したところ、０．９ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約２４μＭ）。【０１９３】
実施例９  Ｈ１１４−ＨＴ及びＨ１１４の作成
（１）Ｈ１１４−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）及びＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）が連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ１１４−ＨＴ）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０１９４】
（ｉ）Ｈ１１４−ＨＴ発現ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号４０記載の塩基配列を有する合成プライマー１３−Ｎｄｅ−Ｆ、配列番号４１記載の塩基配列を有する合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｒ、配列番号４２記載の塩基配列を有する合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｆ、配列番号４３記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＳ１−Ｒ−ＸｂａをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１３−Ｎｄｅ−Ｆは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号６〜１１に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号３７１〜３７７に相当する塩基配列を塩基番号１２〜３２にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｒは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５５５〜５５０に相当する塩基配列を塩基番号１〜１８に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号４５９〜４５４に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３６にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｆは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号４５４〜４５９に相当する塩基配列を塩基番号２〜１９に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５５０〜５５５に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３７にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａは、制限酵素ＸｂａＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７４〜５６９に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３６にもつ合成ＤＮＡである。【０１９５】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例６−（１）−（ｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２０４  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１３−Ｎｄｅ−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｒ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬ（タカラバイオ社製）にセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、６０℃  ４５秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．２８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ１１４−１とした。【０１９６】
さらに、上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例６−（１）−（ｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２０４  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９６℃  ３０秒、５８℃  １分、７２℃  １分を１サイクルとする３０サイクルと７２℃  ３分の反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．０９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ１１４−２とした。【０１９７】
次に上記Ｈ１１４−１及びＨ１１４−２を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。鋳型ＤＮＡとしてＨ１１４−１及びＨ１１４−２を各々０．５μＬ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１３−Ｎｄｅ−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、５８℃  １５秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液はエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。３．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１９８】
次にｐＣｏｌｄＩベクター（タカラバイオ社製）をＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＩＩＩ−１３とＣＳ−１が連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドはシークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１１４−ＨＴとした。【０１９９】
このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１１４−ＨＴは、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号３７１−４５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号５５０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が連結し、そのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ１１４−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号４４に、塩基配列を配列表の配列番号４５に示す。【０２００】
（２）Ｈ１１４−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１１４−ＨＴを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。生育したコロニーを５００ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）に植菌し、ＯＤ＝０．４〜０．６になるまで（約５〜８時間）３７℃で培養した。その後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、その一部である約２．５ｇを１２．５ｍＬのＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ］に懸濁した後、超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒ／ｍｉｎ  ２０分）により上清の抽出液を得た。次に、樹脂容積にして４ｍＬのＴＡＬＯＮ  Ｈｉｓ−タグ精製樹脂（クロンテック社製）をＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで飽和させ、上清の抽出液をアプライした。４℃、１時間攪拌した後、樹脂を５０ｍｌのＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、樹脂に結合していた目的タンパク質を２０ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１５０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で溶出した。得られた溶出液をＶＩＶＡＳＰＩＮ（ザルトリウス社製）で１０ｍｌに濃縮し，２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレントテクノロジー社製）で解析したところ、分子量約１５ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３３μＭ）。【０２０１】
（３）Ｈ１１４の精製
次に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（メルク社製）を用いて、上記（２）で精製したＨ１１４−ＨＴ精製タンパク質５ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断及び目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液をＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ［２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）］にて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて１ｍＬまで濃縮した。得られた濃縮液を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約１３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．８６ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約６６μＭ）。Ｈ１１４のアミノ酸配列を配列表の配列番号４６に、また当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号４７に示す。【０２０２】
実施例１０  Ｈ１１７−ＨＴ及びＨ１１７の作成
（１）Ｈ１１７−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）及びＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）が連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ１１７−ＨＴ）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２０３】
（ｉ）Ｈ１１７−ＨＴ発現ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号４８記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、配列番号４９記載の塩基配列を有する合成プライマー１２−ＣＳ１−Ｒ、配列番号５０記載の塩基配列を有する合成プライマー１２−ＣＳ１−ＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列のアミノ酸番号２７９〜２８５に相当する塩基配列を塩基番号１５〜３５にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー１２−ＣＳ１−Ｒは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５５５〜５５０に相当する塩基配列を塩基番号１〜１８に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号３７０〜３６６に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３３にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー１２−ＣＳ１−Ｆは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号３６６〜３７０に相当する塩基配列を塩基番号１〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５５０〜５５５に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３３にもつ合成ＤＮＡである。【０２０４】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例７−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１２−ＣＳ１−Ｒ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、６８℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ１１７−１とした。【０２０５】
さらに、上記合成プライマーと合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例７−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１２−ＣＳ１−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、５８℃  １５秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．０９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ１１７−２とした。【０２０６】
次に上記Ｈ１１７−１及びＨ１１７−２を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。鋳型ＤＮＡとしてＨ１１７−１及びＨ１１７−２を各々０．５μＬ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、５８℃  １５秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液はエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２０７】
次にｐＣｏｌｄＩベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＩＩＩ−１２とＣＳ−１が連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドはシークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１１７−ＨＴとした。【０２０８】
このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１１７−ＨＴは、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９−３７０のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号５５０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が連結し、そのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ１１７−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号５１に、塩基配列を配列表の配列番号５２に示す。【０２０９】
（２）Ｈ１１７−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１１７−ＨＴを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例９−（２）と同様にＨ１１７−ＨＴの発現、精製を行った。なお、培養液、使用菌体量、樹脂容積、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約１５ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、１．２ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約８０μＭ）。【０２１０】
（３）Ｈ１１７の精製
次に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、上記（２）で精製したＨ１１７−ＨＴ精製タンパク質５ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断及び目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液をＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて２ｍＬまで濃縮した。この濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約１３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．３６ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約２８μＭ）。Ｈ１１７のアミノ酸配列を配列表の配列番号５３にまた当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号５４に示す。【０２１１】
実施例１１  Ｈ２０６−ＨＴ及びＨ２０６の作成
（１）Ｈ２０６−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）及びＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）が順に連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ２０６−ＨＴ）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２１２】
（ｉ）ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号５５及び５６記載の塩基配列を有する合成プライマー１２−Ｎｃｏ−Ｆ２及びＨ２７１−ＢａｍＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１２−Ｎｃｏ−Ｆ２は、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号７〜１２に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３）のアミノ酸番号２７９〜２８５に相当する塩基配列を塩基番号１２〜３２にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２７１−ＢａｍＲは、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号８〜１３に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列表の配列番号１３）のアミノ酸番号５４９〜５４４に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３６にもつ合成ＤＮＡである。【０２１３】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例７−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１２−Ｎｃｏ−Ｆ２、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２７１−ＢａｍＲ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １０秒、６８℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液はエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ―ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２１４】
次にｐＣｏｌｄ１４ベクターをＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１とした。【０２１５】
（ｉｉ）ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号５７記載の塩基配列を有する合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−ＮｃｏをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−Ｎｃｏは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号４６０〜４６６に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３８にもつ合成ＤＮＡである。【０２１６】
上記合成プライマーと合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例７−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６  約０．１μｇ、１０μＬの１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＡＩＤ−Ｆ−Ｎｃｏ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９８℃  １０秒、６８℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液はエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２１７】
次にｐＣｏｌｄ１４ベクターをＮｃｏＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５とした。【０２１８】
（ｉｉｉ）Ｈ２０６−ＨＴ発現ベクターの構築
上記組換えプラスミドを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１１−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｒ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、６０℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ２０６−１とした。【０２１９】
さらに、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１１−（１）−（ｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマー１３−ＣＳ１−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９６℃  ３０秒、５８℃  １分、７２℃  １分を１サイクルとする３０サイクルと７２℃  ３分の反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを２．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．０８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ２０６−２とした。【０２２０】
次に上記Ｈ２０６−１及びＨ２０６−２を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。鋳型ＤＮＡとしてＨ２０６−１及びＨ２０６−２を各々０．５μＬ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｄｅＦ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９６℃  １５秒、５８℃  １５秒、７２℃  ９０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．６３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液はエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２２１】
次にｐＣｏｌｄＩベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＩＩＩ−１２及びＩＩＩ−１３及びＣＳ−１が順に連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドはシークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２０６−ＨＴとした。【０２２２】
このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２０６−ＨＴは、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９−４５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号５５０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が連結し、そのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ２０６−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号５８に、塩基配列を配列表の配列番号５９に示す。【０２２３】
（２）Ｈ２０６−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２０６−ＨＴを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例９−（２）と同様にＨ２０６−ＨＴの発現、精製を行った。なお、培養液、使用菌体量、樹脂容積、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約２５ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、１．５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約６０μＭ）。【０２２４】
（３）Ｈ２０６の精製
次に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、上記（２）で精製したＨ２０６−ＨＴ精製タンパク質５ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断及び目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液をＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて１ｍＬまで濃縮した。この濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約２３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．７２ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３１μＭ）。Ｈ２０６のアミノ酸配列を配列表の配列番号６０にまた当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号６１に示す。【０２２５】
実施例１２  Ｈ２９６Ｒ−ＨＴ及びＨ２９６Ｒの作成
（１）Ｈ２９６Ｒ−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｎ末端から順に、Ｈｉｓタグ配列、ＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）及びＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）が連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ２９６Ｒ−ＨＴ）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２２６】
（ｉ）Ｈ２９６Ｒ−ＨＴ発現ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号６２記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＳ１−Ｎｄｅ−Ｆ及び配列番号６３記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＳ１−１２−Ｒ、配列番号６４記載の塩基配列を有する合成プライマーＣＳ１−１２−Ｆ、及び配列番号６５記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２７１−Ｒ−ＸｂａをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＣＳ１−Ｎｄｅ−Ｆは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号６〜１１に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５５０〜５５７に相当する塩基配列を塩基番号１２〜３５にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＣＳ１−１２−Ｒは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号２８３〜２７９に相当する塩基配列を塩基番号３〜１７に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７４〜５７０に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３２にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＣＳ１−１２−Ｆは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５７０〜５７４に相当する塩基配列を塩基番号２〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号２７９〜２８３に相当する塩基配列を塩基番号１７〜３１にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２７１−Ｒ−Ｘｂａは、制限酵素ＸｂａＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５４９〜５４４に相当する塩基配列を塩基番号１９〜３６にもつ合成ＤＮＡである。【０２２７】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１１−（１）−（ｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｎｄｅ−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−１２−Ｒ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９６℃  １０秒、５８℃  １５秒、７２℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。応終了後、該反応液５μＬを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ２９６Ｒ−１とした。【０２２８】
さらに、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１１−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２７１  約０．１μｇ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−１２−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２７１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９６℃  １０秒、５８℃  １５秒、７２℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認し、これをＨ２９６Ｒ−２とした。【０２２９】
次に上記Ｈ２９６Ｒ−１及びＨ２９６Ｒ−２を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。鋳型ＤＮＡとしてＨ２９６Ｒ−１及びＨ２９６Ｒ−２を各々０．５μＬ、２０μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、８μＬのｄＮＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＳ１−Ｎｄｅ−Ｆ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２７１−Ｒ−Ｘｂａ、２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、滅菌水を加えて全量を１００μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９６℃  １０秒、５８℃  １５秒、７２℃  １分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液はエタノール沈殿を行ない、回収ＤＮＡを滅菌水に懸濁して、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＸｂａＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２３０】
次にｐＣｏｌｄＩベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的の、Ｎ末端から順にＣＳ−１、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３及びＩＩＩ−１４が連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドはシークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６Ｒ−ＨＴとした。【０２３１】
このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６Ｒ−ＨＴは、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号５５０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９−５４９のアミノ酸配列をコードする塩基配列が連結し、そのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ２９６Ｒ−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号６６に、塩基配列を配列表の配列番号６７に示す。【０２３２】
（２）Ｈ２９６Ｒ−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ２９６Ｒ−ＨＴを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例９−（２）と同様にＨ２９６Ｒ−ＨＴの発現、精製を行った。なお、培養液、使用菌体量、樹脂容積、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約３４ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．７１ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約２１μＭ）。【０２３３】
（３）Ｈ２９６Ｒの精製
次に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、上記（２）で精製したＨ２９６Ｒ−ＨＴ精製タンパク質５ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断及び目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液をＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて１．５ｍＬまで濃縮した。この濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約３２ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．５５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１７μＭ）。Ｈ２９６Ｒのアミノ酸配列を配列表の配列番号６８にまた当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号６９に示す。【０２３４】
実施例１３  Ｈ１０５−ＨＴ及びＨ１０５の作成
（１）Ｈ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）及びＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）が連結した改変型ＦＮフラグメント（Ｈ１０５−ＨＴ）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２３５】
（ｉ）Ｈ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号７０記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列のアミノ酸番号４６０〜４６６に相当する塩基配列を塩基番号１５〜３５にもつ合成ＤＮＡである。【０２３６】
上記合成プライマーと合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ１０５−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行った。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２３７】
次にｐＣｏｌｄＩベクターをＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドは、シークエンシングにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−ＨＴとした。このｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−ＨＴは、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号４６０〜５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列のＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＨ１０５−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号７１に、塩基配列を配列表の配列番号７２に示す。【０２３８】
（２）Ｈ１０５−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−Ｈ１０５−ＨＴを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例９−（２）と同様にＨ１０５−ＨＴの発現、精製を行った。なお、培養液、使用菌体量、樹脂容積、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの液量は必要に応じて適宜変更した。得られた溶出液をＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて１ｍＬまで濃縮した。この濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約１５ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．２３ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１５μＭ）。【０２３９】
（３）Ｈ１０５の精製
次に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて、上記（２）で精製したＨ１０５−ＨＴ精製タンパク質１ｍｇ分のＨｉｓタグ配列の切断を４℃にて一晩行った後、Ｈｉｓタグなしの目的タンパク質の精製を行った。Ｈｉｓタグの切断及び目的タンパク質の精製は上記Ｋｉｔに付属の操作書に従って行った。切断後の溶液をＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて０．３ｍＬまで濃縮した。この濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約１３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、０．４ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３１μＭ）。Ｈ１０５のアミノ酸配列を配列表の配列番号７３にまた当該タンパク質をコードすると予想される塩基配列を配列表の配列番号７４に示す。【０２４０】
実施例１４  ＣＨ１０５−ＨＴの作成
（１）ＣＨ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
Ｎ末端から順にＨｉｓタグ配列、ＦＮのＣ−ドメイン（ＩＩＩ−８からＩＩＩ−１０までの領域）、アミノ酸配列“ＥＩＤＫＰＳＭＡ”、ＩＩＩ−１４、及びＣＳ−１が連結した改変型ＦＮフラグメント（ＣＨ１０５−ＨＴ）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２４１】
（ｉ）ＣＨ１０５−ＨＴ発現ベクターの構築
実施例１１−（１）−（ｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ１０５をＮｃｏＩ、ＸｂａＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｃｏＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、約０．３５ｋｂｐのＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得、これをＨ１０５ＤＮＡ断片とした。【０２４２】
実施例６−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６をＮｄｅＩ、ＮｃｏＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、約０．８ｋｂｐのＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得、これをＣドメインＤＮＡ断片とした。【０２４３】
次にｐＣｏｌｄＩベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記Ｈ１０５ＤＮＡ断片及びＣドメインＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＣドメインにＨ１０５が連結したタンパク質をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドはシークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ１０５−ＨＴとした。【０２４４】
このｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ１０５−ＨＴは、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号１−２７８のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号４６０−５７４のアミノ酸配列をコードする塩基配列が“Ａ”を挟んで連結し、そのＮ末端にＨｉｓタグ配列とメチオニンを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＣＨ１０５−ＨＴと命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号７５に、塩基配列を配列表の配列番号７６に示す。【０２４５】
（２）ＣＨ１０５−ＨＴの発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ１０５−ＨＴを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例９−（２）と同様にＣＨ１０５−ＨＴの発現、精製を行った。なお、培養液、使用菌体量、樹脂容積、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの液量は必要に応じて適宜変更した。得られた溶出液をＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて１ｍＬまで濃縮した。この濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約４５ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、タンパク質濃度は、５．９ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約１３１μＭ）。【０２４６】
実施例１５ＣＨ−２９６ｍｕｔ２の作成
（１）ＣＨ２９６ｍｕｔ２発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５４３〜５４８に相当するアミノ酸を変換した改変型ＦＮフラグメント（ＣＨ２９６ｍｕｔ２）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２４７】
（ｉ）ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６−ＨＴ発現ベクターの構築
合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦと合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２  約０．１μｇ、５μＬの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＣＨ２９６−ＮｄｅＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約１．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行った。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μＬの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した。１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２４８】
次にｐＣｏｌｄＩベクターをＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６−ＨＴとした。【０２４９】
（ｉｉ）ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ２−ＨＴベクターの構築
配列表の配列番号７７及び７８記載の塩基配列を有する合成プライマーＨＢＤ２ｍｕｔＦ及びＨＢＤ２ｍｕｔＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨＢＤ２ｍｕｔＦ及びＨＢＤ２ｍｕｔＲは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５３７〜５５４に相当する塩基配列のうち５４３〜５４８に相当するアミノ酸配列に相当する塩基配列を変換するよう設計された合成ＤＮＡである。【０２５０】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１５−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ２９６−ＨＴ  １００ｐｇ、２５μＬの２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨＢＤ２ｍｕｔＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨＢＤ２ｍｕｔＲ加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液２．５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約６．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液２μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ２−ＨＴとした。【０２５１】
このｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ２−ＨＴをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、約１．７ｋｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２５２】
次にｐＣｏｌｄ１４ＮＤベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４ＮＤ−ＣＨ２９６ｍｕｔ２とした。【０２５３】
このｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６ｍｕｔ２は、ＣＨ−２９６のＩＩＩ−１４に含まれるアミノ酸番号５４３〜５４８のアミノ酸配列が“ＬＩＧＲＫＫ”から“ＶＬＡＫＲＲ”に変換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＣＨ２９６ｍｕｔ２と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号７９に、塩基配列を配列表の配列番号８０に示す。【０２５４】
（２）ＣＨ２９６ｍｕｔ２の発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６ｍｕｔ２を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例９−（２）と同様にＣＨ２９６ｍｕｔ２の発現誘導を行った。その後菌体を遠心分離により集め、その一部である約２ｇを１０ｍＬの細胞破砕溶液に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒ／ｍｉｎ、２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。得られた上清の抽出液に約２０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、塩濃度を調整した。クロマトグラフィーシステムを用いて、樹脂容積にして５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  カラムをｂｕｆｆｅｒＡで飽和させた後、抽出液約３０ｍＬをアプライし、２５ｍＬのｂｕｆｆｅｒＣ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ  ＮａＣｌ］で目的タンパク質の溶出を行った。溶出液２５ｍＬをＳｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒにて１００倍以上希釈し、ＶＩＶＡＳＰＩＮを用いて５ｍＬに濃縮した。この濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約６３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、タンパク質濃度は、２．２ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約３５μＭ）。【０２５５】
実施例１６  ＣＨ２９６ｍｕｔ３の作成
（１）ＣＨ２９６ｍｕｔ３発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５６９〜５７２に相当するアミノ酸を変換した改変型ＦＮフラグメント（ＣＨ２９６ｍｕｔ３）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２５６】
（ｉ）ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ３−ＨＴベクターの構築
配列表の配列番号２４記載のＣＨ−２９６の塩基配列より、配列表の配列番号８１及び８２記載の塩基配列を有する合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＦ及びＨＢＤ３ｍｕｔＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＦ及びＨＢＤ３ｍｕｔＲは、ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５６３〜５７４に相当する塩基配列のうち５６９〜５７２に相当するアミノ酸配列に相当する塩基配列を変換するよう設計された合成ＤＮＡである。【０２５７】
上記合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１５−（１）−（ｉ）で構築したｐＣｏｌｄＩ−ＣＨ２９６−ＨＴ  １００ｐｇ、２５μＬの２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＲ加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液２．５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約６．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液２μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ３−ＨＴとした。【０２５８】
このｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ３−ＨＴをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、約１．７ｋｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２５９】
次にｐＣｏｌｄ１４ＮＤベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４ＮＤ−ＣＨ２９６ｍｕｔ３とした。【０２６０】
このｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６ｍｕｔ３は、ＣＨ−２９６のＣＳ−１に含まれるアミノ酸番号５６９〜５７２のアミノ酸配列が“ＬＤＶＰ”から“ＬＥＬＰ”に変換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。なお、当該領域はＶＬＡ４結合ドメインとして知られている。当該タンパク質をＣＨ２９６ｍｕｔ３と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号８３に、塩基配列を配列表の配列番号８４に示す。【０２６１】
（２）ＣＨ２９６ｍｕｔ３の発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６ｍｕｔ３を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例１５−（２）と同様にＣＨ２９６ｍｕｔ３の発現、精製を行った。なお、培養液、細胞破砕溶液、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ｂｕｆｆｅｒＡ、ｂｕｆｆｅｒＣ、Ｓｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約６３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、２．５ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約４０μＭ）。【０２６２】
実施例１７ＣＨ−２９６ｍｕｔ４の作成
（１）ＣＨ２９６ｍｕｔ４発現ベクターの構築
ＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号１３）のアミノ酸番号５４３〜５４８及びアミノ酸番号５６９〜５７２に相当するアミノ酸を変換した改変型ＦＮフラグメント（ＣＨ２９６ｍｕｔ４）を得るため、以下のようにして発現ベクターを構築した。【０２６３】
（ｉ）ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ４−ＨＴベクターの構築
合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＦ及び合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＲを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。すなわち、鋳型ＤＮＡとして実施例１５−（１）−（ｉｉｉ）で構築したｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ２−ＨＴ  １００ｐｇ、２５μＬの２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨＢＤ３ｍｕｔＲ加え、滅菌水を加えて全量を５０μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰにセットし、ＮＯＲＭモードで９８℃  １０秒、５５℃  １５秒、７２℃  ３０秒を１サイクルとする３０サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約６．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液２μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドを、ｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ４−ＨＴとした。【０２６４】
このｐＣｏｌｄＩＣＨ−２９６ｍｕｔ４−ＨＴをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ、ＸｂａＩ消化物を抽出精製し、約１．７ｋｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０２６５】
次にｐＣｏｌｄ１４ＮＤベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで消化したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４ＮＤ−ＣＨ２９６ｍｕｔ４とした。【０２６６】
このｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６ｍｕｔ４は、ＣＨ−２９６のＩＩＩ−１４に含まれるアミノ酸番号５４３〜５４８のアミノ酸配列が“ＬＩＧＲＫＫ”から“ＶＬＡＫＲＲ”に、さらにＣＨ−２９６のＣＳ−１に含まれるアミノ酸番号５６９〜５７２のアミノ酸配列が“ＬＤＶＰ”から“ＬＥＬＰ”に変換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。当該タンパク質をＣＨ２９６ｍｕｔ４と命名し、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号８５に、塩基配列を配列表の配列番号８６に示す。【０２６７】
（２）ＣＨ２９６ｍｕｔ４の発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４ＮＤＣＨ−２９６ｍｕｔ４を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、実施例１５−（２）と同様にＣＨ２９６ｍｕｔ４の発現、精製を行った。なお、培養液、細胞破砕溶液、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ｂｕｆｆｅｒＡ、ｂｕｆｆｅｒＣ、Ｓｔｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ、濃縮液の液量は必要に応じて適宜変更した。得られた濃縮液を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析したところ、分子量約６３ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドとして検出され、タンパク質濃度は、１．６ｍｇ／ｍＬであった（分子量から計算して、約２５μＭ）。【０２６８】
実施例１８  ＦＮフラグメント（Ｈ２０４、Ｈ２９６−ＣＳ１、Ｈ２９６−ＣＳ２、Ｈ２０６、Ｈ１１４、Ｈ１１７、Ｈ２９６Ｒ、Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ１０５、ＣＨ１０５−ＨＴ）を用いたリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＮフラグメント（Ｈ２９６−ＣＳ１、Ｈ２９６−ＣＳ２、Ｈ２０６、Ｈ１１４、Ｈ１１７、Ｈ２９６Ｒ、ＣＨ１０５−ＨＴ）を実施例４−（１）と同様の方法で固定化した。ただし、ＦＮフラグメント固定化の際にはＦＮフラグメントを終濃度２５〜１００μｇ／ｍＬとなるようにＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）又はＰＢＳに添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定にあわせるために調整した。また、ＦＮフラグメント（Ｈ２０４、Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ１０５）については、培養器材への固定化をせず、培養開始時に培養液に終濃度０．３３〜０．７３μｇ／ｍＬとなるように直接添加した。また、固定化時の温度を室温又は３７℃（５％ＣＯ２存在下）とした。当該実施例では、ＦＮフラグメントとして実施例６で調製したＨ２０４、実施例７で調製したＨ２９６−ＣＳ１、実施例８で調製したＨ２９６−ＣＳ２、実施例１１で調製したＨ２０６、実施例９で調製したＨ１１４、実施例１０で調製したＨ１１７、実施例１２で調製したＨ２９６Ｒ、実施例１３で調製したＨ１０５−ＨＴ、実施例１３で調製したＨ１０５、実施例１４で調製したＣＨ１０５−ＨＴを使用した。【０２６９】
（２）リンパ球の拡大培養
０．５％ＧＴ−Ｔ５０３に０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１８−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＮフラグメント固定化プレートに０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を  １．０ｍＬ／ウェルで添加しておき、細胞懸濁液を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。続いて終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて１４．３倍希釈し、希釈液１０ｍＬを何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、８日目には各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて２倍希釈し、希釈液１０ｍＬを何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移し、いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養１１日目には０％ＧＴ−T５０３を用いて約２倍希釈施して全量を２０ｍＬとした。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。算出した拡大培養率を元に、抗ＣＤ３抗体のみで刺激した際の拡大培養率を１としたときの細胞増殖比率を算出した。結果を表１２に示す。【０２７０】
【表１２】
2008143255.tif 000013
【０２７１】
表１２に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｈ２０４、Ｈ２９６−ＣＳ１、Ｈ２９６−ＣＳ２、Ｈ２０６、Ｈ１１４、Ｈ１１７、Ｈ２９６Ｒ、Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ１０５、ＣＨ１０５−ＨＴ）を固定化した培養器材を使用又は培地中に直接添加した群においては、対照群と比較して高い細胞増殖比率が得られた。つまり、ＦＮフラグメント（Ｈ２０４、Ｈ２９６−ＣＳ１、Ｈ２９６−ＣＳ２、Ｈ２０６、Ｈ１１４、Ｈ１１７、Ｈ２９６Ｒ、Ｈ１０５−ＨＴ、Ｈ１０５、ＣＨ１０５−ＨＴ）はリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。【０２７２】
実施例１９  実施例１８で得られたリンパ球のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例１８−（２）で調製した培養開始１４日目の細胞について実施例１−（５）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行い、含有比率を測定した。ただし、染色用抗体としてＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体に加え、ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用した。各陽性細胞の含有比率を元に、抗ＣＤ３抗体のみで刺激した際の各含有比率を１としたときの陽性細胞比率を算出した。結果を表１３に示す。【０２７３】
【表１３】
2008143255.tif 000014
【０２７４】
表１３に示されるように、ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−ＣＳ１、Ｈ２９６−ＣＳ２、Ｈ２０６、Ｈ１１４、Ｈ１１７、Ｈ２９６Ｒ、ＣＨ１０５−ＨＴ）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−ＣＳ１、Ｈ２９６−ＣＳ２、Ｈ２０６、Ｈ１１４、Ｈ１１７、Ｈ２９６Ｒ、ＣＨ１０５−ＨＴ）を用いることにより、生体内で高い細胞傷害活性を示す細胞への分化能の高いナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０２７５】
実施例２０  ＣＨ−２９６変異体（ＣＨ２９６ｍｕｔ２、ＣＨ２９６ｍｕｔ３、ＣＨ２９６ｍｕｔ４）を用いたリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体、ＣＨ−２９６及び３種のＣＨ−２９６変異体の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体、ＣＨ−２９６及び３種のＣＨ−２９６変異体（ＣＨ２９６ｍｕｔ２、ＣＨ２９６ｍｕｔ３、ＣＨ２９６ｍｕｔ４）を実施例４−（１）と同様の方法で固定化した。ただし、各ＦＮフラグメント固定化の際にはＦＮフラグメントが終濃度４〜５０μｇ／ｍＬとなるようにＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）又はＰＢＳに添加した。なお、ＦＮフラグメントの濃度は、培養器材への各ＦＮフラグメントの固定化量を一定にあわせるために調整した。当該実施例では、ＦＮフラグメントとしてＣＨ−２９６、実施例１５で調製したＣＨ２９６ｍｕｔ２、実施例１６で調製したＣＨ２９６ｍｕｔ３、実施例１７で調製したＣＨ２９６ｍｕｔ４を使用した。なお、ＣＨ２９６ｍｕｔ２はＣＨ−２９６のヘパリン結合ドメインに、ＣＨ２９６ｍｕｔ３はＣＨ−２９６のＶＬＡ４結合ドメインに、ＣＨ２９６ｍｕｔ４はＣＨ−２９６のヘパリン結合ドメイン及びＶＬＡ４結合ドメインの両方にアミノ酸置換により変異を導入したＣＨ−２９６変異体である。また、抗ＣＤ３抗体のみを固定化する群も設定した。【０２７６】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例１８−（２）と同様の方法で、リンパ球の拡大培養を行った。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。算出した拡大培養率を元に、抗ＣＤ３抗体のみで刺激した際の拡大培養率を１としたときの細胞増殖比率を算出した。結果を表１４に示す。【０２７７】
【表１４】
2008143255.tif 000015
【０２７８】
表１４に示されるように、ＣＨ−２９６もしくはその変異体を用いた場合は抗ＣＤ３抗体のみを使用したときと比較して細胞増殖比率は高くなった。また、リンパ球拡大培養初期にＣＨ−２９６変異体を固定化した培養器材を使用した群は、ＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群と比較して細胞増殖比率は低下した。またその抑制効果は、ＣＨ２９６ｍｕｔ４で最も強い結果となった。つまり、リンパ球拡大培養時におけるＣＨ−２９６の細胞増殖作用にはヘパリン結合ドメイン及びＶＬＡ４結合ドメインが重要であることが明らかとなった。【０２７９】
実施例２１  実施例２０で得られたリンパ球のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析
実施例２０−（２）で調製した培養開始１４日目の細胞について実施例１９と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の解析を行い、含有比率を計測した。各陽性細胞の含有比率を元に、抗ＣＤ３抗体のみで刺激した際の含有比率を１としたときの陽性細胞比率を算出した。結果を表１５に示す。【０２８０】
【表１５】
2008143255.tif 000016
【０２８１】
表１５に示されるように、ＣＨ−２９６もしくはその変異体を用いた場合は抗ＣＤ３抗体のみを使用したときと比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞比率、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞比率、及びＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞比率は高くなった。また、ＣＨ−２９６変異体を固定化した培養器材を使用した群は、ＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が低い結果が得られた。またその抑制効果は、ＣＨ２９６ｍｕｔ４で最も強い結果となった。つまり、リンパ球拡大培養時におけるＣＨ−２９６のナイーブＴ様細胞増殖作用にはＶＬＡ−４結合ドメイン及びヘパリン結合ドメインが重要であることが明らかとなった。【０２８２】
実施例２２  阻害ペプチド（ＶＬＡ４−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＨＢＤ２）を用いたリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を実施例１−（２）と同様の方法で固定化した。ただし、０．２４ｍＬ／ウェルずつ固定化液を添加し、室温又は３７℃（５％ＣＯ２存在下）で５時間固定化した。【０２８３】
（２）ペプチドとの反応
当該実施例で使用するペプチド（細胞表面上のＶＬＡ-４結合ドメインもしくはへパリン結合ドメインの機能部位に特異的に結合するペプチド）を初期刺激に先立ち、細胞と反応させることにより、目的とする効果を阻害するかどうかを検証するため、以下のペプチド反応を行った。【０２８４】
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＰＢＭＣを、ＧＴ−Ｔ５０３を用いて０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。その後、ＶＬＡ４−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（アミノ酸配列：Ｐｈｅｎｙｌａｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ２、ＢＡＣＨＥＭ社製）又はＦＮ  フラグメント（ＦＮのアミノ酸配列の１９５４〜１９５９番：配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸番号８４〜８９：Ｈ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ、ＢＡＣＨＥＭ社製、以下ＨＢＤ２と記載）を含むＧＴ−Ｔ５０３を添加し、ＰＢＭＣが最終０．１５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した（この溶液を以下細胞懸濁液と記載）。その際、細胞懸濁液中における各ペプチドの終濃度は１００及び５０μｇ／ｍＬとなるように調整した。対照群には各ペプチドと同量のＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ：シグマ社製）を添加した。室温で３０分静置することによりペプチドとの反応を行った。【０２８５】
（３）リンパ球の拡大培養
実施例２２−（２）でペプチド反応させた細胞懸濁液に、終濃度０．５％ヒトＡＢ型血清、０．２％ヒト血清アルブミン、１０００Ｕ/ｍＬ ＩＬ−２となるように、それぞれ必要量を添加した。実施例２２−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６固定化プレートに０．１２×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように細胞懸濁液を播種し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。培養開始後４日目の細胞増殖比率を表１６及び１７に示す。なお、細胞増殖比率はトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、ＤＭＳＯ添加の対照群、それぞれの細胞数を１として比較した際の時の細胞増殖比率とした。【０２８６】
【表１６】
2008143255.tif 000017
【０２８７】
【表１７】
2008143255.tif 000018
【０２８８】
表１６及び１７に示されるように、リンパ球拡大培養開始前にＶＬＡ４−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ又はＨＢＤ２と反応させることにより対照群と比較して細胞増殖比率は低下した。つまり、リンパ球拡大培養時におけるＣＨ−２９６の細胞増殖作用にはＶＬＡ−４結合ドメイン及びヘパリン結合ドメインが重要であることが明らかとなった。【０２８９】
実施例２３  ＦＮフラグメント（Ｃ２７４）を用いたリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＮフラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体及び配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＦＮフラグメント（Ｃ２７４）を実施例４−（１）と同様の方法で固定化した。【０２９０】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例２３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、又は抗ヒトＣＤ３抗体及びＣ２７４固定化プレートを用いて、実施例１８−（２）と同様の方法でリンパ球の拡大培養を行った。結果を表１８に示す。【０２９１】
【表１８】
2008143255.tif 000019
【０２９２】
表１８に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＦＮフラグメント（Ｃ２７４）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。つまり、ＦＮフラグメント（Ｃ２７４）はリンパ球拡大培養時において好適に使用されることが明らかとなった。【０２９３】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の解析
実施例２３−（２）で調製した培養開始１４日目の細胞について実施例２１と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の解析を行い、含有比率を測定した。結果を表１９に示す。【０２９４】
【表１９】
2008143255.tif 000020
【０２９５】
表１９に示されるように、ＦＮフラグメント（Ｃ２７４）を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性細胞集団の比率が高い結果が得られた。ＦＮフラグメント（Ｃ２７４）を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０２９６】
実施例２４  ＣＨ−２９６を用いたリンパ球の拡大培養におけるＴｈ１タイプ細胞比率の解析
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６フラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を実施例４−（１）と同様の方法で固定化した。【０２９７】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例１８−（２）と同様の方法でリンパ球の拡大培養を行った。ただし、培養開始時（培養０日目）には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、培養開始４日目に、各群とも０．０１５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％ＧＴ−Ｔ５０３により希釈し（液量１０ｍＬ）、培養液を何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後７日目の細胞を回収しトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２０に示す。【０２９８】
【表２０】
2008143255.tif 000021
【０２９９】
表２０に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して培養後のリンパ球の拡大培養率が高い結果が得られた。【０３００】
（３）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例２４−（２）で得られた培養７日目の細胞を実施例１−（５）と同様の方法でＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析を行い、含有比率を測定した。ただし、抗体反応後の細胞洗浄の際は１％ＢＳＡ／ＰＢＳを使用した。結果を表２１に示す。【０３０１】
【表２１】
2008143255.tif 000022
【０３０２】
表２１に示されるように、ＣＨ−２９６を固定化した培養容器を使用した群においては、対照群と比較して、培養７日目のリンパ球中におけるＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性細胞含有比率が高い結果が得られた。【０３０３】
（４）ＩＬ−４産生細胞の解析
実施例２４−（２）で得られた培養７日目の細胞を、１０ＦＲＰＭＩに４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、あらかじめ１０ＦＲＰＭＩを０．３ｍＬずつ添加した４８穴細胞培養プレートに０．１ｍＬ／ウェルずつまき込んだ。ＰＭＡを終濃度５０ｎｇ/ｍＬ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎを終濃度１μｇ／ｍＬ、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で４時間培養した。培養終了後の細胞を回収し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、ＥＣＤ標識マウスＩｇＧ１もしくはＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（ベックマンコールター社製）を添加後、氷上で３０分間インキュベートしたのち、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ  Ｒｅｇｅｎｔの方法に従って、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩＬ−４抗体、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体で細胞内染色を行った。なお、ネガティブコントロールにはＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）、ＰＥ標識マウスＩｇＧ１（ダコ社製又はベックマンコールター社製）を使用した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、測定した細胞全体についてのＩＬ−４産生陽性細胞の比率を解析した。結果を表２２に示す。また、ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の解析の結果を表２３に、ＣＤ４陽性ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の解析の結果を表２４に示す。【０３０４】
【表２２】
2008143255.tif 000023
【０３０５】
【表２３】
2008143255.tif 000024
【０３０６】
【表２４】
2008143255.tif 000025
【０３０７】
表２２に示されるように、ＣＨ−２９６を固定化した培養容器を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のリンパ球全体におけるＩＬ−４産生細胞の陽性率が低い結果が得られた。当該実施例より、リンパ球の拡大培養初期にＣＨ−２９６を作用させることでＩＬ−４産生細胞すなわちＴｈ２タイプの細胞の含有比率を抑制できることが明らかとなった。また表２３、表２４に示されるようにＣＨ−２９６を固定化した培養容器を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のＩＬ−４陰性ＩＦＮ-γ陽性細胞の比率が高い結果が得られた。当該実施例より、リンパ球の拡大培養初期にＣＨ−２９６を作用させることでＩＬ−４陰性ＩＦＮ-γ陽性細胞すなわちＴｈ１タイプの細胞の含有比率を高くできることが明らかとなった。以上の結果より、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせは細胞性免疫に有用なＴｈ１タイプのＴ細胞を効率的に培養できることが示された。【０３０８】
実施例２５  ＦＮフラグメント（ＣＨ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６）及び抗４−１ＢＢ抗体を用いたリンパ球の拡大培養−１
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＮフラグメント（ＣＨ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６）、抗４−１ＢＢ抗体の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体及びＦＮフラグメント（ＣＨ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６）、共刺激因子である抗４−１ＢＢ抗体（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を実施例４−（１）と同様にして固定化した。ただし、Ｈ２９６−Ｈ２９６及び抗４−１ＢＢ抗体については終濃度５μｇ／ｍＬとなるように固定化した。【０３０９】
（２）リンパ球の拡大培養
実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣ  ０．５３×１０６ｃｅｌｌｓを０．６％ヒトＡＢ型血清含有ＫＢＭ５５１（以下０．６％ＫＢＭ５５１と記載）５．３ｍＬに懸濁し、実施例２５−（１）で作製したプレートに添加した後、終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加して５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各ウェル内の細胞を懸濁し、その一部を０．６％ＫＢＭ５５１を用いて８．３倍希釈し、希釈液７．８ｍＬを何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移し、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、７日目には各群の培養液に等量の無血漿ＫＢＭ５５１を添加して２倍希釈し、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１０日目には、無血漿ＫＢＭ５５１を用いて各群の細胞培養液を２倍希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに希釈液１５．６ｍＬをそれぞれ移した。各群において終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１０日目及び１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２５に示す。【０３１０】
【表２５】
2008143255.tif 000026
【０３１１】
表２５に示すように、リンパ球拡大培養初期にＣＨ−２９６あるいはＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用することで、抗ＣＤ３抗体のみ、あるいは抗ＣＤ３抗体と抗４−１ＢＢ抗体を固定化した培養器材を使用した群と比較して、培養期間によらず、高いリンパ球の拡大培養率が得られた。このことから、ＣＨ−２９６あるいはＨ２９６−Ｈ２９６はリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０３１２】
（３）ＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞、ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析
実施例２５−（２）で調製した培養１０日目又は１４日目の細胞を実施例１９と同様の方法でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞、ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析を行った。それぞれの陽性細胞の含有比率を算出した、培養１０日目の結果を表２６に、培養１４日目の結果を表２７に示す。【０３１３】
【表２６】
2008143255.tif 000027
【０３１４】
【表２７】
2008143255.tif 000028
【０３１５】
表２６及び表２７に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＣＨ−２９６あるいはＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用することで、抗ＣＤ３抗体のみ,あるいは抗ＣＤ３抗体と抗４−１ＢＢ抗体を固定化した培養器材を使用した群と比較して、培養期間によらず、高い比率でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞集団、ＣＣＲ７陽性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞集団が得られた。当該実施例より、リンパ球拡大培養初期にＣＨ−２９６あるいはＨ２９６−Ｈ２９６を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３１６】
実施例２６  ＣＨ−２９６、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒト４−１ＢＢ抗体及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いたリンパ球の拡大培養
（１）ＰＢＭＣ及び非働化済み血漿の分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを用いた５０ｍＬ分の採血を実施後、７００×ｇで２０分間遠心した。遠心後の上清である血漿画分とＰＢＭＣを含む細胞画分をそれぞれ回収した。血漿画分は、５６℃３０分非働化処理を行った後、９００×ｇで３０分間遠心した。遠心後の上清を非働化済み血漿として回収し、各実験に供した。ＰＢＭＣを含む細胞画分はＤＰＢＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ上に重層して７００×ｇで２０分間遠心した。中間層のＰＢＭＣをピペットで回収、洗浄し、チュルク染色液（ナカライテスク社製）を用いて生細胞数を算出し、各実験に供した。【０３１７】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒト４−１ＢＢ抗体の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ＣＤ３抗体、ＣＨ−２９６、抗ＣＤ２８抗体、抗４−１ＢＢ抗体を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）のみ、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）及びＣＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８抗体（終濃度５μg／ｍＬ）、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）及び抗４−１ＢＢ抗体（終濃度５μg／ｍＬ）を含むＡＣＤ−Ａ液をバッグ面積が８６ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ２１５（タカラバイオ社製）に１０．４ｍＬ／バッグずつ添加し、５％ＣＯ２中３７℃で５時間インキュベートした。また、上記のバッグは使用前にＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した後各実験に供した。【０３１８】
（３）リンパ球の拡大培養
実施例２６−（１）で分離したＰＢＭＣ ０．６×１０７ｃｅｌｌｓを０．６％非働化済み血漿含有ＫＢＭ５５１（タカラバイオ社製、以下０．６％血漿含有ＫＢＭ５５１と記載）１２０ｍＬに懸濁し、実施例２６−（２）で作製した固定化条件の異なるＣｕｌｔｉＬｉｆｅ２１５にそれぞれ添加した。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件については、１％ＨＳ／ＰＢＳで洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８）を細胞数に対して３倍量添加した。終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ２１５内の細胞を懸濁し、この懸濁液１２０ｍＬを３８０ｍＬの０．６％血漿含有ＫＢＭ５５１を用いて希釈して何も固定化していないガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅＥｖａ（タカラバイオ社製）に移した。この際、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激群については、細胞懸濁後、磁気ビーズ分離装置ＭＰＣ−１を用いてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去した。いずれの群についても終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培養を継続し、培養開始７日目には各ＣｕｌｔｉＬｉｆｅＥｖａに細胞懸濁液と等量の０％血漿含有ＫＢＭ５５１（以下、無血漿ＫＢＭ５５１と記載）を添加し２倍希釈した後、いずれも終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始１０日目にトリパンブルー染色法を用いて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２８に示す。【０３１９】
【表２８】
2008143255.tif 000029
【０３２０】
表２８に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用することで、抗ＣＤ３抗体のみ、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体及び抗４−１ＢＢ抗体を固定化した培養器材又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用した群と比較して、高い拡大培養率が得られた。このことから、ＣＨ−２９６はリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０３２１】
（４）ＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析
実施例２６−（３）で調製した培養１０日目の細胞を実施例１−（５）と同様の方法でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の解析を行った。それぞれの陽性細胞の含有比率を算出した結果を表２９に示す。【０３２２】
【表２９】
2008143255.tif 000030
【０３２３】
表２９に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用することで、抗ＣＤ３抗体のみ、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体及び抗４−１ＢＢ抗体を固定化した培養器材又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用した群と比較して、高い比率でＣＣＲ７陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞集団が得られた。当該実施例より、リンパ球拡大培養初期にＣＨ−２９６を用いることにより、ナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３２４】
実施例２７  培養リンパ球を用いたＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＭＬＲ）
（１）培養細胞の凍結保存と融解
実施例２６−（３）で調製した培養１０日目の細胞をＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、ＣＰ−１と２５％ＨＳＡを１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて懸濁後、液体窒素中にて保存した。使用時には、これら保存培養細胞を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。【０３２５】
（２）Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲ
実施例２７−（１）で調製した細胞を用いてＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った。実施例２７−（１）で融解した培養細胞を５％ヒトＡＢ型血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（全てＣａｍｂｒｅｘ社製）、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（以下５ＨＲＰＭＩと記載）を用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した（以下、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞と記載）。一方、実施例１−（１）と同様の方法で調製したＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｏｎｏｒ（非自己ドナー：実施例２６−（１）記載のドナーとは異なるドナー）由来のＰＢＭＣをＸ線照射装置（ＨＩＴＥＸ社製２６０型）を用いてＸ線照射（０．８８Ｃ／ｋｇ）し、５ＨＲＰＭＩで洗浄後、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した（以下、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞と記載）。２４穴細胞培養用プレートに、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞：Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞比が１：１になるように調製した各細胞懸濁液を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。次にＩＬ−２を終濃度５００Ｕ／ｍＬになるよう各ウェルに添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始２日目に、各ウェルに１ｍＬずつ５ＨＲＰＭＩを添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬになるようにＩＬ−２を添加した（最終容量：２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。培養開始４日目に各ウェル内の細胞を懸濁後、半量ずつ２ウェルに分け、すべてのウェルに５ＨＲＰＭＩを１ｍＬ及び終濃度５００Ｕ／ｍＬになるようにＩＬ−２を添加した（最終容量：２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。培養開始７日目まで培養を継続し、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表３０に示す。【０３２６】
【表３０】
2008143255.tif 000031
【０３２７】
表３０に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用したリンパ球は、抗ＣＤ３抗体のみ、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体及び抗４−１ＢＢ抗体を固定化した培養器材又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用した群と比較して、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲにおいて非自己抗原認識細胞がより高い拡大培養率で増殖することが明らかとなった。このことから、ＣＨ−２９６はリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０３２８】
（３）Ｐｈｙｔｏｈｅｍａａｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）  ｂｌａｓｔ細胞の調製
実施例１−（１）と同様の方法で調製したＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｏｎｏｒ由来のＰＢＭＣを５ＨＲＰＭＩで１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、６穴細胞培養用プレート（コーニング社製）に３ｍＬずつ播種した。ＩＬ−２を終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように、ＰＨＡ（シグマ社製）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培養４日目には、培養液に５ＨＲＰＭＩを１２ｍＬ添加し、ＩＬ−２を終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加後５ｍＬ／ｗｅｌｌで６穴細胞培養用プレートに細胞懸濁液を分配した。培養開始７日目まで培養を継続した。【０３２９】
（４）非自己特異的細胞傷害活性の測定
実施例２７−（２）で調製した培養開始後７日目の細胞の非自己特異的細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。実施例２７−（３）で幼若化（ブラスト）させたＰＨＡ  ｂｌａｓｔ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で２時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。実施例２７−（２）で調製した培養開始後７日目の細胞をエフェクター細胞として３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製又はコーニング社製）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注した。Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を３０倍量のＫ５６２細胞と混合し、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞が１×１０５／ｍＬとなるように調整し、１００μＬ／ウェルずつ添加した。なお、Ｋ５６２細胞はｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的細胞傷害活性を排除するために用いた。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比をＥ／Ｔ比として示し、Ｅ／Ｔ比３０で測定を行った。上記細胞懸濁液の入ったプレートを２１０×ｇで１分間遠心後、５％ＣＯ２存在下３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー〔Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製（励起４８５ｎｍ／測定５３８ｎｍ）〕によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「細胞傷害活性（％）」は以下の式１にしたがって算出した。
式１：細胞傷害活性（％）＝
｛（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）｝×１００【０３３０】
上式において最小放出量はＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量はＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。測定結果を表３１に示す。【０３３１】
【表３１】
2008143255.tif 000032
【０３３２】
表３１に示されるように、リンパ球拡大培養初期に抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用したリンパ球は、抗ＣＤ３抗体のみ、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体及び抗４−１ＢＢ抗体を固定化した培養器材又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用した群と比較して、非自己抗原特異的細胞傷害活性が高かった。このことから、ＣＨ−２９６はリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。【０３３３】
実施例２８  ＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養−４
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＨ２９６−Ｈ２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＮフラグメント（ＣＨ−２９６、Ｈ２９６−Ｈ２９６）を実施例４−（１）と同様の方法で固定化した。ただし、ＣＨ−２９６のみ固定化する条件も設定し、ＦＮフラグメント（Ｈ２９６−Ｈ２９６）については終濃度３μｇ／ｍＬとなるように固定化した。【０３３４】
（２）ＣＤ８除去細胞の調製、及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズセレクション細胞（ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ結合細胞）の調製
実施例１−（１）に記載した方法で分離、保存したＰＢＭＣを用いて、実施例１−（３）と同様の方法でＣＤ８除去細胞を、また実施例３−（１）と同様の方法でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いたＴ細胞セレクション細胞（ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ結合細胞）を調製した。調製後の細胞は、２％ＧＴ−Ｔ５０３、及び５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５にそれぞれ細胞濃度が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。【０３３５】
（３）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養
実施例２８−（１）で作成したプレートに、２％ＧＴ−Ｔ５０３、及び５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５をそれぞれ２ｍＬ添加しておき、抗ＣＤ３抗体及びＦＮフラグメント（ＣＨ−２９６又はＨ２９６−Ｈ２９６）を固定化したプレートには、実施例２８−（２）で調製したＣＤ８除去細胞を、ＣＨ−２９６のみを固定化したプレートには、実施例２８−（２）で調製したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ結合細胞(ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激される細胞)をそれぞれ２ｍＬ添加した後、５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。  培養開始後３日目には、培養液２．５ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移し、さらに培養最終日まで静置して培養する条件（以下、静置培養と記載）と、ＬＡＢＯ  ＳＨＡＫＥＲ（ＲＩＯ  ＣＲＡＦＴ社製）を用いて振とうしながら培養する条件（以下、振とう培養と記載）を設定した。培養開始後３日目、５日目、７日目、１０日目には、細胞濃度が０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各培地で希釈し、総培養液量が１２．５ｍＬとなった次の培養日から培養上清８．７５ｍＬを新しい培地と交換して培養開始１２日目まで培養を継続した。また、いずれの培養日においても２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群は終濃度２００Ｕ／ｍＬ、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群は終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。振とう条件での培養開始５日目の拡大培養率を表３２に示す。また静置条件での培養開始後５日目、及び１２日目の拡大培養率を表３３に示す。【０３３６】
【表３２】
2008143255.tif 000033
【０３３７】
【表３３】
2008143255.tif 000034
【０３３８】
表３２、表３３に示されるように、培養条件、培地条件、培養日数によらず抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６で刺激した群においては、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６で刺激した群よりも高い拡大培養率が得られた。すなわちＣＤ４陽性細胞の拡大培養においては、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６の組み合わせが好適に使用できることが示された。【０３３９】
（４）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の解析
実施例２８−（３）において振とう培養条件下で得られた培養１２日目の細胞を実施例１−（５）と同様の方法で、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞の含有率を算出した。結果を表３４に示す。【０３４０】
【表３４】
2008143255.tif 000035
【０３４１】
表３４に示されるように、いずれの培地においても抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６で刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有率が高い値を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６の組み合わせはナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３４２】
（５）ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞、及びＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞の解析
実施例２８−（３）で得られた培養１２日目の細胞について、実施例２４−（４）と同様の方法で、ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞及びＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞の含有比率を測定した。ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞比率の結果を表３５に、ＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞の含有比率測定の結果を表３６に示す。なお、全ての条件においてＣＤ４陽性細胞について解析を行った。【０３４３】
【表３５】
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【０３４４】
【表３６】
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【０３４５】
表３５、表３６に示されるように、培養条件、培地条件によらず、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６で刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した群と比較して、ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の比率が高く、ＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞の比率が低かった。Ｔｈ１タイプの活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞はＩＦＮ−γを産生し、Ｔｈ２タイプの活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞はＩＬ−４を産生することが知られている。すなわち、リンパ球培養時の刺激において抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６の組み合わせはＴｈ１タイプのＣＤ４陽性Ｔ細胞が優位に増殖し、Ｔｈ２タイプのＣＤ４陽性細胞増殖を抑制し、本発明により細胞免疫に好適な細胞集団が製造できることが明らかとなった。【０３４６】
（６）ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞の解析
実施例２８−（３）で得られた培養１２日目の細胞を、実施例１−（５）と同様の方法で、ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ４抗体（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体を用いてＣＣＲ４陽性Ｔ細胞を測定した。ここではネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１、及びＲＤ１標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を使用した。各々の細胞集団について、ＣＤ４陽性ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞の含有比率を算出した。結果を表３７に示す。【０３４７】
【表３７】
2008143255.tif 000038
【０３４８】
表３７に示されるように、いずれの培養条件、培地条件においても抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６で初期刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した群と比較して、ＣＤ４陽性ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞の含有比率が低いことが示された。ＣＣＲ４はＴｈ２タイプのＣＤ４陽性Ｔ細胞に選択的に発現することが知られている。すなわち、リンパ球培養時の刺激において抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６の組み合わせはＴｈ２タイプのＣＤ４陽性細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。【０３４９】
（７）制御性Ｔ細胞（ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞）の解析
実施例２８−（３）で得られた培養１２日目の細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２５抗体（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）、ＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体を添加した後、室温・暗所で１５分間インキュベートした。ここでは、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１、ＥＣＤ標識マウスＩｇＧ１を使用した。ＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＸＡＴＩＯＮ／ＰＥＲＭＥＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＷＯＲＫＩＮＧ  ＳＯＬＮ．（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加して４℃、暗所で３０分間反応させた。Ｐｅｒｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加して、４℃、３００ｇ、５分間遠心して上清を除去した。再度、Ｐｅｒｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、ＰＥ標識マウス抗ヒトＦｏｘｐ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｃｅ社製）を添加し、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。この時ネガティブコントロールにはＰＥ標識マウスＩｇＧ１を添加した。Ｐｅｒｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄し、上清を除去した後再度Ｐｅｒｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団について、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の含有比率を算出した。結果を表３８に示す。【０３５０】
【表３８】
2008143255.tif 000039
【０３５１】
表３８に示されるように、いずれの培養条件においても抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６で刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した群と比較して、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞の含有率が低いことが明らかとなった。ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞として知られており、種々の免疫応答反応を抑制する働きをもつことが知られている。すなわち、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６もしくはＨ２９６−Ｈ２９６の組み合わせは、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の増殖を抑制し、本発明により細胞免疫療法において悪影響のあるＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞細胞含有比率の低い、当該療法に好適な細胞集団が製造できることが明らかとなった。【０３５２】
実施例２９  ＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養−５
（１）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養
実施例２８−（１）と同様の方法で固定化したプレートに２％ＧＴ−Ｔ５０３又は５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５を添加し、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を固定化したプレートには実施例２８−（２）と同様の方法で調製したＣＤ８除去細胞を、ＣＨ−２９６のみを固定化したプレートには実施例２８−（２）と同様の方法で調製したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ結合細胞を添加して、それぞれの刺激条件についてウェルあたりの最終総細胞数１×１０６ｃｅｌｌｓ又は２×１０６ｃｅｌｌｓ（いずれも総液量４ｍＬ）となるように初期播種細胞数条件を設定し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始３日目には、培養液２ｍＬを何も固定していないＴ２５細胞培養フラスコを立てたものに移し、振とう培養条件にて培養を継続した。ただし、振とう培養時にはＭｉｌｄ  Ｍｉｘｃｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて振とうを行った。その後、培養開始６日目、及び７日目には、細胞濃度が０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各培地で希釈し、総培養液量が１０ｍＬになった次の培養日から培養上清７ｍＬを新しい培地と交換した。培養開始１０日目まで培養を継続した。また、いずれの培養日においても２％ＧＴ−Ｔ５０３培養群は終濃度２００Ｕ／ｍＬ、５％Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養群は終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始６日目の拡大培養率を表３９に示す。【０３５３】
【表３９】
2008143255.tif 000040
【０３５４】
表３９に示されるように、いずれの培地条件、初期播種細胞数においても、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６で刺激した群では、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６で刺激した群よりも高い拡大培養率が得られた。すなわち、リンパ球の拡大培養時に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせが好適に使用されることが示された。【０３５５】
（２）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の解析
実施例２９−（１）で得られた培養１０日目の細胞を実施例１９と同様の方法で、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の含有比率を解析した。ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の含有比率測定の結果を表４０に示す。【０３５６】
【表４０】
2008143255.tif 000041
【０３５７】
表４０に示されるように、いずれの初期播種細胞数においても抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６で刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞含有比率が高い値を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。【０３５８】
（３）ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞、及びＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞の解析
実施例２９−（１）で得られた培養１０日目の細胞について、実施例２４−（４）に記載した方法でＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞、及びＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞の含有比率を測定した。ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞についての結果を表４１に、またＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞についての結果を表４２に示す。なお、全ての条件においてＣＤ４陽性細胞について解析を行った。【０３５９】
【表４１】
2008143255.tif 000042
【０３６０】
【表４２】
2008143255.tif 000043
【０３６１】
表４１、表４２に示されるように、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６で刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した群と比較して、ＩＬ−４陰性ＩＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の含有比率が高く、ＩＬ−４陽性ＩＦＮ−γ陰性Ｔ細胞の含有比率が低かった。つまり、リンパ球拡大培養時に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせで刺激することにより、Ｔｈ１タイプのＣＤ４陽性Ｔ細胞が優先的に増殖し、Ｔｈ２タイプのＣＤ４陽性細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。【０３６２】
（４）ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞の解析
実施例２９−（１）で得られた培養１０日目の細胞を、実施例２８−（６）と同様の方法で、ＣＤ４陽性ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞の含有比率を算出した。結果を表４３に示す。【０３６３】
【表４３】
2008143255.tif 000044
【０３６４】
表４３に示されるように、いずれの培地条件、初期播種細胞数においても抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６で刺激した細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した細胞と比較して、ＣＤ４陽性ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞の含有比率が低かった。すなわち、リンパ球拡大培養時に抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６を組み合わせることでＴｈ２タイプのＣＤ４陽性細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。【０３６５】
実施例３０  ＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養−６
（１）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養
実施例２９−（１）と同様の方法で、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養を行った。ただし、培地は２％ＧＴ−Ｔ５０３を使用し、ＣＨ−２９６による初期刺激期間は４日間とした。また培養開始６日目、７日目及び９日目に、培地の交換と細胞の希釈を行った（以下培養方法Ａと記載）。また、培養開始３日目に培養液２ｍＬを何も固定化していないＴ２５細胞培養フラスコに立てたものに移し、それぞれ新しい培地を添加し総培養液量を１０ｍＬとした上で、培養開始７日目には、それぞれ新しい培地を１０ｍＬ添加し、総培養液量を２０ｍＬとした上で静置培養条件にて培養を継続する群も同時に設定した（以下培養方法Ｂと記載）。いずれの培養日においても終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、１０日目まで培養を継続した。培養開始６日目の培養方法Ａについての拡大培養率を表４４に、培養開始７日目の培養方法Ｂについての拡大培養率を表４５に示す。【０３６６】
【表４４】
2008143255.tif 000045
【０３６７】
【表４５】
2008143255.tif 000046
【０３６８】
表４４、及び表４５に示されるように、いずれの初期細胞数条件、培養方法においても、抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６で初期刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６で刺激した群よりも高い拡大培養率が得られた。すなわち、リンパ球拡大培養時においては抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせを用いて刺激することが好適であることが示された。【０３６９】
（２）ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の解析
実施例３０−（１）で得られた培養１０日目の細胞を実施例１９と同様の方法で、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞、及びＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞の含有比率を算出した。結果を表４６、表４７に示す。【０３７０】
【表４６】
2008143255.tif 000047
【０３７１】
【表４７】
2008143255.tif 000048
【０３７２】
表４６、表４７に示されるように、いずれの初期播種細胞数、培養方法においても抗ＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６で刺激した群は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ及びＣＨ−２９６を用いて刺激した群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞含有比率及びＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞含有比率が高い値を示した。つまり、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６の組み合わせはナイーブＴ様細胞を高効率で増殖できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０３７３】
本発明により、細胞増殖率、Ｔｈ１型ＣＤ４陽性Ｔ細胞、Ｔｈ２型ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ナイーブＴ様細胞、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の比率を任意に変化させた細胞集団を製造することができる。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０３７４】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11.
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:10 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:11 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:12 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:13 ; Fibronectin fragment named ＣＨ−２９６.
SEQ ID NO:14 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:15 ; Fibronectin fragment named ＣＨ−２９６Na.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CHV-90.
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named CHV-179.
SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named CHV-181.
SEQ ID NO:21 ; Fibronectin fragment named H-275-Cys.
SEQ ID NO:22 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:23 ; Fibronectin fragment named H105-H105.
SEQ ID NO:24; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named ＣＨ−２９６.
SEQ ID NO:25; PrimerＣＨ−２９６-NdeF.
SEQ ID NO:26; Primer H296-HindR.
SEQ ID NO:27; Primer NVS-F-Nco.
SEQ ID NO:28; Primer pC-TER.
SEQ ID NO:29; Fibronectin fragment named H204.
SEQ ID NO:30; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H204.
SEQ ID NO:31; Primer H296-NcoF.
SEQ ID NO:32 ; Primer NC2-5' UTR.
SEQ ID NO:33 ; Primer CS1-no.st-CS1-R.
SEQ ID NO:34 ; Primer CS1-no.st-CS1-F.
SEQ ID NO:35 ; Primer FN-5630F.
SEQ ID NO:36 ; Fibronectin fragment named H296-CS1.
SEQ ID NO:37 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-CS1.
SEQ ID NO:38 ; Fibronectin fragment named H296-CS2.
SEQ ID NO:39 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-CS2.
SEQ ID NO:40 ; Primer 13-Nde-F.
SEQ ID NO:41 ; Primer 13-CS1-R.
SEQ ID NO:42 ; Primer 13-CS1-F.
SEQ ID NO:43 ; Primer CS1-R-Xba.
SEQ ID NO:44 ; Fibronectin fragment named H114-HT.
SEQ ID NO:45 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H114-HT.
SEQ ID NO:46 ; Fibronectin fragment named H114.
SEQ ID NO:47 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H114.
SEQ ID NO:48 ; Primer H296-NdeF.
SEQ ID NO:49 ; Primer 12-CS1-R.
SEQ ID NO:50 ; Primer 12-CS1-F.
SEQ ID NO:51 ; Fibronectin fragment named H117-HT.
SEQ ID NO:52 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H117-HT.
SEQ ID NO:53 ; Fibronectin fragment named H117.
SEQ ID NO:54 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H117.
SEQ ID NO:55 ; Primer 12-Nco-F2.
SEQ ID NO:56 ; Primer H271-BamR.
SEQ ID NO:57 ; Primer AID-F-Nco.
SEQ ID NO:58 ; Fibronectin fragment named H206-HT.
SEQ ID NO:59 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H206-HT.
SEQ ID NO:60 ; Fibronectin fragment named H206.
SEQ ID NO:61 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H206.
SEQ ID NO:62 ; Primer CS1-Nde-F.
SEQ ID NO:63 ; Primer CS1-12-R.
SEQ ID NO:64 ; Primer CS1-12-F.
SEQ ID NO:65 ; Primer H271-R-Xba.
SEQ ID NO:66 ; Fibronectin fragment named H296R-HT.
SEQ ID NO:67 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296R-HT.
SEQ ID NO:68 ; Fibronectin fragment named H296R.
SEQ ID NO:69 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296R.
SEQ ID NO:70 ; Primer H105-NdeF.
SEQ ID NO:71 ; Fibronectin fragment named H105-HT.
SEQ ID NO:72 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H105-HT.
SEQ ID NO:73 ; Fibronectin fragment named H105.
SEQ ID NO:74 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H105.
SEQ ID NO:75 ; Fibronectin fragment named CH105-HT.
SEQ ID NO:76 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named CH105-HT.
SEQ ID NO:77 ; Primer HBD2mutF.
SEQ ID NO:78 ; Primer HBD2mutR.
SEQ ID NO:79 ; Fibronectin fragment namedＣＨ−２９６mut2.
SEQ ID NO:80 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment namedＣＨ−２９６mut2.
SEQ ID NO:81 ; Primer HBD3mutF.
SEQ ID NO:82 ; Primer HBD3mutR.
SEQ ID NO:83 ; Fibronectin fragment namedＣＨ−２９６mut3.
SEQ ID NO:84 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment namedＣＨ−２９６mut3.
SEQ ID NO:85 ; Fibronectin fragment namedＣＨ−２９６mut4.
SEQ ID NO:86 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment namedＣＨ−２９６mut4.
【配列表】
2008143255000001.app
【国際調査報告】
2008143255.tif 000049
2008143255.tif 000050
2008143255.tif 000051
2008143255.tif 000052
2008143255.tif 000053
2008143255.tif 000054
2008143255.tif 000055
2008143255.tif 000056