【手続補正書】
【提出日】平成15年7月8日(2003.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の配列、または、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の配列と少なくとも約５０％の同一性を有しかつポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸。
【請求項２】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の配列、または、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の配列と少なくとも約７０％の同一性を有しかつポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸。
【請求項３】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の配列、または、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載の配列と少なくとも約９０％の同一性を有しかつポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸。
【請求項４】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５に記載の配列、前記配列と実質的に同一の配列、および前記配列と相補的な配列、からなる群から選択される配列を含む請求項１〜３のいずれか1項記載の単離核酸。
【請求項５】
90℃〜113℃の範囲においてポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸である、請求項１〜３のいずれか1項記載の記載の単離核酸。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離核酸。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸と中等度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離核酸。
【請求項８】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５に記載の配列、前記配列と実質的に同一の配列、および前記配列と相補的な配列からなる群から選択される配列の少なくとも１０個の連続した塩基を含む単離核酸。
【請求項９】
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に記載の配列および前記配列と実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項１０】
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に記載の配列および前記配列と実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を有するポリペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項１１】
請求項９または１０記載のポリペプチドと少なくとも約５０％の相同性を有する精製ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項９または１０記載のポリペプチドと少なくとも約７０％の相同性を有する精製ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項９または１０記載のポリペプチドと少なくとも約９０％の相同性を有する精製ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４若しくは１６に記載の配列を有する精製ポリペプチドまたは請求項１〜３、９または１０のいずれか1項記載の核酸によってコードされる精製ポリペプチドであって、ポリメラーゼ活性を有する前記精製ポリペプチド。
【請求項１５】
70℃〜113℃の範囲でポリメラーゼ活性を有する、または、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１４に記載の精製ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に記載の配列および前記配列と実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を含むポリペプチドまたは請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドと特異的に結合する精製抗体。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸の配列を含む核酸、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５に記載の配列を含む核酸、前記配列と実質的に同一の配列を含む核酸、前記配列と相補的な配列を含む核酸、少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む前記いずれかの核酸のフラグメント、および配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３、１５に記載の配列と相補的な配列の少なくとも約３０個の連続したヌクレオチドを含むフラグメント、からなる群から選択される核酸を入手し；さらに
前記核酸の配列中の１つまたは２つ以上のヌクレオチドを別のヌクレオチドに改変するか、前記配列中の１つまたは２つ以上のヌクレオチドを欠失させるか、または前記配列に１つまたは２つ以上のヌクレオチドを付加することを含む、変種の作製方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸の配列、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５に記載の配列および前記配列と実質的に同一の配列からなる群から選択される核酸配列、または、請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドのアミノ酸配列、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に記載の配列および前記配列と実質的に同一の配列、からなる群から選択されるポリペプチド配列を保存したコンピュータ読取り可能媒体、コンピューターシステムまたはデータ保存装置。
【請求項１９】
請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドまたは請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチドであって、熱に対して安定であり、耐熱性であり、さらに核酸配列の生成または修復を触媒する酵素であり、さらに、約６０℃から１１３℃の温度に曝露した後で復元可能であって活性を取り戻すことができる酵素である、精製された前記ポリペプチド。
【請求項２０】
核酸を含むサンプルを、請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチド、請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチド、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に記載の配列を有するポリペプチド、および、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に記載の配列と少なくとも５０％の配列相同性を有するポリペプチド、からなる群から選択されるポリペプチドと接触させることを含む核酸配列の生成または修復を触媒する方法であって、前記接触が核酸配列の生成または修復を促進する条件下で行われ、前記ポリペプチドがポリメラーゼ酵素活性を有するポリペプチドである、前記方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドの製造方法であって、
ｉ）請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチドまたは請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドをPCR増幅反応においてDNA鋳型と接触させること、または、
ii) 請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチドまたは請求項１４のいずれか1項記載のポリペプチドをPCR増幅反応において、20kbよりも長いDNA鋳型と接触させること、または、
iii）請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチドまたは請求項１４のいずれか1項記載のポリペプチドをPCR増幅反応において、グアニジン-シトシン(GC)含量が90％よりも高いDNA鋳型と接触させること、
を含む、前記ポリヌクレオチドの製造方法。
【請求項２２】
下記i)〜iii)からなる群より選ばれる核酸プローブ：
ｉ）10から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも５０％相補的であって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、または、
ii) 配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも５０％相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド領域を有し、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、および、
iii) 15から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも５０％相補的であって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ。
【請求項２３】
下記i)〜iii)からなる群より選ばれる核酸プローブ：
ｉ）10から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも７０％相補的であって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、
ii) 配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも７０％相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド領域を有し、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、および、
iii) 15から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも７０％相補的であって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ。
【請求項２４】
下記i)〜iii)からなる群より選ばれる核酸プローブ：
ｉ）10から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも９０％相補的であって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、
ii) 配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも９０％相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド領域を有し、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、および、
iii) 15から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも９０％相補的であって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ。
【請求項２５】
下記i)〜iii)からなる群より選ばれる核酸プローブ：
ｉ）10から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも５０％相補的であって、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、
ii) 配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも５０％相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド領域を有し、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、および、
iii) 15から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも５０％相補的であって、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ。
【請求項２６】
下記i)〜iii)からなる群より選ばれる核酸プローブ：
ｉ）10から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも７０％相補的であって、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、
ii) 配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも７０％相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド領域を有し、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、および
iii) 15から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも７０％相補的であって、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ。
【請求項２７】
下記i)〜iii)からなる群より選ばれる核酸プローブ：
ｉ）10から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも９０％相補的であって、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、
ii) 配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも９０％相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチド領域を有し、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ、および
iii) 15から50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、および１５に記載の配列からなる群から選択される核酸配列の核酸標的領域と少なくとも９０％相補的であって、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズして検出可能な標的:プローブ二重鎖を生成する核酸プローブ。
【請求項２８】
請求項１１〜１４のいずれかに1項記載のポリペプチドを含む液体または乾燥酵素調製物。
【請求項２９】
請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチド、または請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチド、またはそれらのフラグメントを小分子と混合して、改変小分子を生成することを含む小分子の改変方法。
【請求項３０】
請求項１１〜１４に記載のポリペプチドのアミノ酸配列、または配列番号：２、４、６、８、１０、１２もしくは１４、１６に記載の配列、または前記配列と相同な配列であるアミノ酸配列を有し、９０℃から１１３℃の範囲の温度でポリメラーゼ活性を有する精製タンパク質を収納する少なくとも１つの容器を含むキット。
【請求項３１】
以下を含むDNA分子の配列を決定する方法：
（ａ）プライマーを第一のDNA分子とハイブリダイズさせること；
（ｂ）前記第一のDNA分子をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドまたは請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸によってコードされるポリペプチドおよびターミネーター分子と接触させて混合物を作製すること；
（ｃ）前記第一のDNA分子と相補的なDNA分子のランダムな集団を合成するために十分な条件下で前記混合物をインキュベートすることであって、前記合成されたDNA分子はその5'末端にターミネーターヌクレオチドを含んでおり；さらに
（ｄ）前記第一のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部分を決定することができるように前記合成されたDNA分子をサイズによって分離すること。
【請求項３２】
以下を含む、mRNAからcDNAを調製する方法：
（ａ）mRNAをオリゴ（ｄＴ）プライマーまたは他の相補性プライマーと接触させてハイブリッドを生成すること；および、
（ｂ）cDNAが得られる条件下で、工程（ａ）で生成される前記ハイブリッドを請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチドまたは請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドおよび４種の異なるdNTPと接触させること。
【請求項３３】
以下を含む二本鎖DNAの増幅方法：
（ａ）第一および第二のプライマーを提供することであって、ここで前記第一のプライマーは前記DNA分子の第一の鎖の3'末端または3'末端近くの配列と相補的で、さらに、前記第二のプライマーは前記DNA分子の第二の鎖の3'末端または3'末端近くの配列と相補的であり；
（ｂ）請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチドまたは請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドの存在下で、前記第一の鎖と相補的な第三のDNA分子および前記第二の鎖と相補的な第四の鎖が合成されるような条件下で、前記第一の鎖と前記プライマーをハイブリダイズさせ、および、前記第二の鎖と前記第二のプライマーをハイブリダイズさせること；
（ｃ）前記第一と第三の鎖、および前記第二と第四の鎖を変性させること；および、
（ｄ）（ａ）から（ｃ）までの工程を１回または２回以上繰り返して増幅DNA分子を生成すること。
【請求項３４】
請求項１〜３のいずれか1項記載の核酸によってコードされるポリペプチドまたは請求項１１〜１４のいずれか1項記載のポリペプチドをPCR増幅反応においてDNA鋳型と接触させることを含む、非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をDNA分子に取り込ませる方法。