(57)【要約】  水溶性であり、癌細胞に特異的に発現を示すＬＡＴ１に対して選択的阻害活性を有し、さらには、癌細胞増殖抑制活性の高い、有用な新規芳香族アミノ酸誘導体、それを含有するＬＡＴ１阻害活性剤及びその製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2008081537.tif 000032
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアミノ保護基であり；Ｒ２は、水素原子、アリール基、アラルキル基又はアルキル基であり；Ｒ３は、アミノ基、ジメチルアミノ基又はニトロ基であり；Ｒ４は、水素原子、塩素原子又はジメチルアミノ基であり；Ｘは、ＣＨ又はＮである）で示される化合物又はその薬理的に許容され得る塩である、芳香族アミノ酸誘導体。
【請求項２】
前記化合物におけるＲ１及びＲ２が、水素原子である、請求項１記載の芳香族アミノ酸誘導体。
【請求項３】
水溶性である、請求項１又は２記載の芳香族アミノ酸誘導体。
【請求項４】
ＬＡＴ１阻害活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の芳香族アミノ酸誘導体。
【請求項５】
ＬＡＴ１発現細胞のアミノ酸取り込み抑制効果、ＬＡＴ１発現細胞の増殖抑制効果、ＬＡＴ１発現細胞の組織増大抑制効果又はＬＡＴ１発現細胞由来疾患の延命効果を有する、請求項４記載の芳香族アミノ酸誘導体。
【請求項６】
ＬＡＴ１発現細胞が癌細胞である、請求項５記載の芳香族アミノ酸誘導体。
【請求項７】
癌が膵癌、膀胱癌、乳癌又は胃癌である、請求項６記載の芳香族アミノ酸誘導体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の芳香族アミノ酸誘導体を含有する、医薬組成物。
【請求項９】
ＬＡＴ１阻害剤である、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＬＡＴ１発現細胞のアミノ酸取り込み抑制剤、ＬＡＴ１発現細胞の増殖抑制剤、ＬＡＴ１発現細胞の組織増大抑制剤又はＬＡＴ１発現細胞由来疾患の延命剤である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＬＡＴ１発現細胞が癌細胞である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌が膵癌、膀胱癌、乳癌又は胃癌である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
一般式（ＩＩ）：
【化２】
2008081537.tif 000033
（式中、Ｒ１ａは、アミノ保護基であり；Ｒ２ａは、アリール基、アラルキル基又はアルキル基である）で示される化合物を、一般式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008081537.tif 000034
（式中、Ｒ３は、アミノ基、ジメチルアミノ基又はニトロ基であり；Ｒ４は、水素原子、塩素原子又はジメチルアミノ基であり；Ｘは、ＣＨ又はＮであり；Ｙは、水酸基又はハロゲン原子である）で示される化合物と反応させ、一般式（Ｉａ）：
【化４】
2008081537.tif 000035
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３、Ｒ４及びＸは、前記の通りである）で示される化合物を得る工程（ここで、Ｙが水酸基である場合、溶媒中、縮合剤としてアゾ化合物とホスフィン化合物を用いて−３０〜２５℃で光延反応を行い；Ｙがハロゲン原子の場合、溶媒中、相間移動触媒の存在又は不存在下、塩基を用い、２５〜１００℃で反応を行う）
を含む、一般式（Ｉａ）で示される芳香族アミノ酸誘導体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の一般式（Ｉａ）の化合物中のＲ１ａ及びＲ２ａを脱保護反応に付することにより、式（Ｉｂ）：
【化５】
2008081537.tif 000036
（式中、Ｒ３、Ｒ４及びＸは、前記の通りである）で示される化合物を得る工程
を含む、一般式（Ｉｂ）で示される芳香族アミノ酸誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞において高発現するＬＡＴ１（Ｌ−タイプ  アミノ酸トランスポーター１）に対して選択的な阻害活性を有する新規な芳香族アミノ酸誘導体、それを含有するＬＡＴ１選択的阻害活性剤（例えば抗癌剤として有用）及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞では、その急速な増殖、上昇した細胞内代謝を保障するために糖やアミノ酸の細胞への取り込みが亢進している。これは、それらの栄養素の細胞への取り込みを担当するトランスポーターの機能発現の亢進により実現される。特に、腫瘍細胞に必須アミノ酸を供給するために発現するアミノ酸トランスポーターは、腫瘍細胞増殖の律速段階の一つとなり、その機能抑制により腫瘍の増殖を制御できる可能性がある。【０００３】
アミノ酸トランスポーターは古典的には、アミノ酸輸送システムとして記載され、アミノ酸分子の多様性を反映して多くの輸送システムが同定されている。腫瘍細胞においては、中性アミノ酸に属する必須アミノ酸の多くは、システムＬと呼ばれる輸送システムを介して細胞へ供給される。システムＬは、分枝アミノ酸や芳香族アミノ酸等の大型側鎖を持つ中性アミノ酸を選択的に輸送する輸送システムであり、１９６０年代にＢＣＨ｛２−アミノ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸｝というシクロヘプタン環を持つアミノ酸取り込み抑制薬に特異的な輸送システムとして記載された。システムＬは、広い基質選択性をその特徴とするため、多様な作用薬デザインが可能であると考えられる。【０００４】
システムＬの分子クローニングは、過去に複数の研究グループにより試みられたが成功には至らず、単一のタンパク質ではなく複数因子から構成される可能性が示唆された。本発明者らは、１回膜貫通型タンパク質４Ｆ２ｈｃ（４Ｆ２  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ；  ４Ｆ２抗原重鎖：ＣＤ９８）が、システムＬの活性維持に必須であることに着目し、４Ｆ２ｈｃがシステムＬトランスポーターの構成要素であると考えた。４Ｆ２抗原は、もともとはリンパ球の活性化抗原として１９８１年にモノクローナル抗体により同定されたものであり、当初から、ジスルフィド結合によって連結した重鎖と軽鎖から構成されるヘテロ二量体型タンパク質であることが知られていた。重鎖はその後ｃＤＮＡクローニングにより１回膜貫通型タンパク質であることが示されたが、軽鎖の実体が明らかにされなかったため、腫瘍細胞に高発現する等の情報が蓄積されながらも、４Ｆ２抗原の機能は不明のままであった。本発明者らは、１９９８年に、４Ｆ２ｈｃによって活性化されるアミノ酸トランスポーターとして、Ｃ６グリオーマ細胞からシステムＬのｃＤＮＡを単離した（Ｋａｎａｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：  ２３６２９−２３６３２，  １９９８）。そのｃＤＮＡのコードするＬＡＴ１（Ｌ−ｔｙｐｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １）と名付けた１２回膜貫通型の新規タンパク質は、４Ｆ２抗原軽鎖に相当し、４Ｆ２ｈｃとジスルフィド結合を介して連結してヘテロ二量体を形成する。ＬＡＴ１と４Ｆ２ｈｃの複合体は、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジン等の大型の側鎖を持つ中性アミノ酸をＮａ＋非依存的に輸送し、前述のシステムＬ特異的インヒビターであるＢＣＨによって抑制され、古典的システムＬの特性を示すトランスポーターとして機能する。このように、システムＬがヘテロ二量体構造を持つタンパク質であることが明らかにされ、また４Ｆ２抗原がアミノ酸トランスポーターであることが示されたことになる。【０００５】
ＬＡＴ１は、正常組織における発現は、脳、胎盤、骨髄、精巣等に限られ、胎児肝において強発現するが、成体肝においては発現は検出されない。ＬＡＴ１の部分配列は、機能未同定の癌関連配列ＴＡ１（Ｓａｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５：  １１５２−１１５９，  １９９５；  Ｗｏｌｆ，  Ｄ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：  ５０１２−５０２２，  １９９６)としてすでに報告されていた。そこで、ＬＡＴ１と悪性腫瘍との関わりを明らかにするために、本発明者らはヒト腫瘍細胞株及びヒト悪性腫瘍組織での発現を検討した。その結果、検討した３０種類に及ぶヒト腫瘍細胞株にＬＡＴ１が強発現すること、さらにヒト悪性腫瘍組織で４Ｆ２ｈｃとともに発現が亢進し特徴的な分布を示すことが明らかになった。従って、ＬＡＴ１が腫瘍細胞に発現の亢進するシステムＬの分子実体であることが明らかになった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況下、本発明者らは、ＬＡＴ１阻害活性を示すとともに癌細胞の増殖を抑制する化合物として、一般式（Ｉ−Ａ）：
【化６】
2008081537.tif 000002
で示される芳香族アミノ酸誘導体を提案した（特許文献１）。【０００７】
しかしながら、特許文献１において静脈内投与での癌細胞増殖抑制活性の示されている２化合物（実施例６の３及び実施例４９の３）は水溶性が極めて低く、注射剤としての使用が困難であるという問題点が残されていた。また、唯一水溶性の化合物（実施例９８）は、静脈内投与での癌細胞増殖抑制活性をほとんど示さない。【０００８】
そこで、本発明は、水溶性でありＬＡＴ１選択的阻害活性及び癌細胞増殖抑制活性の高い、有用な新規芳香族アミノ酸誘導体を提供することを目的とする。
【特許文献１】ＷＯ０３／０６６５７４号公報
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、特許文献１に示された一般式（Ｉ−Ａ）の化合物の内、所定構造を有するものが前記作用を奏することを見出し、本発明（１）〜（１４）を完成させたものである。【００１０】
即ち、本発明（１）は、一般式（Ｉ）：
【化７】
2008081537.tif 000003
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアミノ保護基であり；Ｒ２は、水素原子、アリール基、アラルキル基又はアルキル基であり；Ｒ３は、アミノ基、ジメチルアミノ基又はニトロ基であり；Ｒ４は、水素原子、塩素原子又はジメチルアミノ基であり；Ｘは、ＣＨ又はＮである）で示される化合物又はその薬理的に許容され得る塩である芳香族アミノ酸誘導体である。【００１１】
本発明（２）は、前記化合物におけるＲ１及びＲ２が、水素原子である、前記発明（１）の芳香族アミノ酸誘導体である。【００１２】
本発明（３）は、水溶性である、前記発明（１）又は（２）の芳香族アミノ酸誘導体である。【００１３】
本発明（４）は、ＬＡＴ１阻害活性を有する、前記発明（１）〜（３）のいずれか一つの芳香族アミノ酸誘導体である。【００１４】
本発明（５）は、ＬＡＴ１発現細胞のアミノ酸取り込み抑制効果、ＬＡＴ１発現細胞の増殖抑制効果、ＬＡＴ１発現細胞の組織増大抑制効果又はＬＡＴ１発現細胞由来疾患の延命効果を有する、前記発明（４）の芳香族アミノ酸誘導体である。ここで、「ＬＡＴ１発現細胞」とは、定量的ＰＣＲ法（例えば本明細書の試験例５）によりＬＡＴ１の発現が確認できる細胞を指し、例えば癌細胞を挙げることができる。【００１５】
本発明（６）は、ＬＡＴ１発現細胞が癌細胞である、前記発明（５）の芳香族アミノ酸誘導体である。【００１６】
本発明（７）は、癌が膵癌、膀胱癌、乳癌又は胃癌である、前記発明（６）の芳香族アミノ酸誘導体である。【００１７】
本発明（８）は、前記発明（１）〜（７）のいずれか一つの芳香族アミノ酸誘導体を含有する、医薬組成物である。【００１８】
本発明（９）は、ＬＡＴ１阻害剤である、前記発明（８）の医薬組成物である。【００１９】
本発明（１０）は、ＬＡＴ１発現細胞のアミノ酸取り込み抑制剤、ＬＡＴ１発現細胞の増殖抑制剤、ＬＡＴ１発現細胞の組織増大抑制剤又はＬＡＴ１発現細胞由来疾患の延命剤である、前記発明（９）の医薬組成物である。【００２０】
本発明（１１）は、ＬＡＴ１発現細胞が癌細胞である、前記発明（１０）の医薬組成物である。【００２１】
本発明（１２）は、癌が膵癌、膀胱癌、乳癌又は胃癌である、前記発明（１１）の医薬組成物である。【００２２】
本発明（１３）は、一般式（ＩＩ）：
【化８】
2008081537.tif 000004
（式中、Ｒ１ａは、アミノ保護基であり；Ｒ２ａは、アリール基、アラルキル基又はアルキル基である）で示される化合物を、一般式（ＩＩＩ）：
【化９】
2008081537.tif 000005
（式中、Ｒ３は、アミノ基、ジメチルアミノ基又はニトロ基であり；Ｒ４は、水素原子、塩素原子又はジメチルアミノ基であり；Ｘは、ＣＨ又はＮであり；Ｙは、水酸基又はハロゲン原子である）で示される化合物と反応させ、一般式（Ｉａ）：
【化１０】
2008081537.tif 000006
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３、Ｒ４及びＸは、前記の通りである）で示される化合物を得る工程（ここで、Ｙが水酸基である場合、溶媒中、縮合剤としてアゾ化合物とホスフィン化合物を用いて−３０〜２５℃で光延反応を行い；Ｙがハロゲン原子の場合、溶媒中、相間移動触媒の存在又は不存在下、塩基を用い、２５〜１００℃で反応を行う）
を含む、一般式（Ｉａ）で示される芳香族アミノ酸誘導体の製造方法である。【００２３】
本発明（１４）は、上記発明（１３）の一般式（Ｉａ）の化合物中のＲ１ａ及びＲ２ａを脱保護反応に付することにより、式（Ｉｂ）：
【化１１】
2008081537.tif 000007
（式中、Ｒ３、Ｒ４及びＸは、前記の通りである）で示される化合物を得る工程
を含む、一般式（Ｉｂ）で示される芳香族アミノ酸誘導体の製造方法である。
【発明を実施するための最良形態】
【００２４】
まず、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体を説明する。当該芳香族アミノ酸誘導体は、一般式（Ｉ）：
【化１２】
2008081537.tif 000008
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアミノ保護基であり；Ｒ２は、水素原子、アリール基、アラルキル基又はアルキル基であり；Ｒ３は、アミノ基、ジメチルアミノ基又はニトロ基であり；Ｒ４は、水素原子、塩素原子又はジメチルアミノ基であり；Ｘは、ＣＨ又はＮである）で示される化合物又はその薬理的に許容され得る塩である。
【００２５】
ここで、一般式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１のアミノ保護基としては、アミノ基を一般的に保護し得る基であればよく、具体的にはアシル基、例えば、アルコキシカルボニル、ハロゲン原子等で置換されていてもよい低級アルカノイル、シクロ低級アルキルオキシ、低級アルカノイル、カルボキシ低級アルカノイル、低級アルキルカルバモイル、アロイル、アレーンスルホニル基等が挙げられる。特に好ましいアミノ保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル、トリフルオロアセチル、アセチル等が挙げられる。尚、本明細書における「低級」とは、特に断りのない限り、炭素数１〜６のものを意味する。
【００２６】
Ｒ２のアルキル基としては、低級アルキル基が好ましく、具体的には、メチル、エチル、プロピル等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル、フェネチル等が挙げられる。アリール基としては、フェニル、トリル、キシリル、クメニル、メシル、ナフチル、ビフェニル等が挙げられる。
【００２７】
薬理的に許容される塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルエチレンジアミンなど）との塩、有機酸（酢酸、安息香酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ギ酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸など）との塩、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸など）との塩、アミノ酸（アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）との塩が挙げられる。また、これらの芳香族アミノ酸誘導体及びその塩は、水和物のような溶媒和物の形態であってもよい。
【００２８】
ここで、一般式（Ｉ）の化合物におけるＲ１及びＲ２は、水素原子であることが好適である。また、Ｒ４又はＸは、ベンゾオキサゾール環の結合部位を１位としたとき、４位に存在することが好適である。尚、Ｒ４が水素原子である場合、Ｘは４位に存在することが好適であり、Ｒ４が水素原子以外でありＸがＮである場合、Ｒ４が４位（パラ位）に存在し、Ｘは３位に存在することが好適である。
【００２９】
これらの内、特に以下の８種の化合物が好適である。
【表１】
2008081537.tif 000009
【００３０】
次に、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体の物性を説明する。当該芳香族アミノ酸誘導体は、（１）水溶性である、（２）ＬＡＴ１選択的阻害活性がある、という特性を有する。以下、順に詳述する。
【００３１】
まず、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体は、水溶性である。ここで、「水溶性」とは、ｐＨ３の塩酸酸性条件下かつ２５℃下で、１００μＭ以上（好適には１ｍＭ以上）水に溶解することを指す。
【００３２】
次に、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体は、ＬＡＴ１選択的阻害活性を有する。ここで、「ＬＡＴ１」は、ＬＡＴ１のアミノ酸配列を持つあるいは先行特許（例えば、特開平１１−２９９４８９）で許容された配列のバリーションの範囲の配列を持つ分子を指す。ここで、ＬＡＴ１は、Ｌ型アミノ酸トランスポーター（個々の細胞に栄養としてアミノ酸を供給するトランスポーター）の第一のアイソフォームであり、ロイシン、イソロイシン、バリン等の大型の中性アミノ酸を輸送する機能を有すると共に、腫瘍細胞（特に悪性腫瘍細胞）において高発現する、５０７アミノ酸残基からなる１２回膜貫通型の膜蛋白である。また、「ＬＡＴ１選択的」とは、ロイシンの取り込みに関し、ＬＡＴ２のＩＣ５０の値に対するＬＡＴ１のＩＣ５０の値の比が、０．５以下の値を示すものを指し、さらに好ましくは０．１以下の値を示すことを指す。ここで、「ＬＡＴ２」は、正常細胞型システムＬを指す。当該性質のため、癌タイプのＬＡＴ１に有効で、正常タイプのＬＡＴ２には無効な高い選択性を持つ抑制薬（抗癌剤）の製造が可能となる。即ち、癌細胞のアミノ酸輸送に作用し正常細胞のアミノ酸輸送に作用しないので、副作用の発現が生じ難い。
【００３３】
次に、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体の製造方法を説明する。当該芳香族アミノ酸誘導体は、市場で入手できる原料物質から、後述の製造例又はそれに準じた方法により得られる化合物から合成することができる。例えば、以下に示す方法により製造することができる。
【化１３】
2008081537.tif 000010
【００３４】
式中、Ｒ１ａは、アミノ基の保護基、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル又はトリフルオロアセチルなどのアシル基であり、Ｒ２ａは、アリール、アラルキル又はアルキル基であり、Ｒ３は、アミノ基、ジメチルアミノ基又はニトロ基であり、Ｒ４は、水素原子、塩素原子又はジメチルアミノ基であり、Ｘは、ＣＨ又はＮであり、Ｙは、水酸基、ハロゲン原子等の反応性置換基を表す。
【００３５】
つまり、式(ＩＩ)の化合物を式（ＩＩＩ）の化合物と反応させることにより式（Ｉａ）で表される化合物とし、次いで脱保護することにより式（Ｉｂ）の化合物を得ることができる。なお、式（Ｉａ）の化合物における置換基を、任意に変換した後、脱保護を行ってもよい。
【００３６】
式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物との反応は、（ｉ）Ｙが水酸基の場合、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド等の反応に影響を及ぼさない溶媒中、縮合剤としてアゾジカルボン酸ジエチル等のアゾ化合物およびトリフェニルホスフィン等のホスフィン化合物を用い、反応温度−３０〜２５℃で行う光延反応、(ｉｉ)Ｙがハロゲン原子などの反応性置換基の場合、ジメチルホルムアミド、アセトン等の溶媒中、ヨウ化テトラ-n-ブチルアンモニウム等の相間移動触媒の存在または非存在下、炭酸カリウム、炭酸セシウム等の塩基を用い、反応温度２５〜１００℃で行う反応等により好適に進行し、容易に式（Ｉａ）の化合物を得ることができる。
【００３７】
式（Ｉａ）の化合物におけるアミノ保護基の脱離反応は、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、臭化水素酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の酸を単独で又は混合して用い、ジオキサン、酢酸エチル、メタノール等の溶媒の存在下もしくは非存在下、反応温度０〜１５０℃で行う反応、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム等の塩基を用い、水―テトラヒドロフラン等の混合溶媒中、反応温度０〜２５℃で行う反応、ヨウ化トリメチルシランまたは塩化トリメチルシラン−ヨウ化ナトリウムを用い、アセトニトリル、クロロホルムなどの溶媒中、反応温度４０〜８０℃で行う反応、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフラン等の溶媒中、パラジウム炭素等の触媒の存在下、反応温度２５〜５０℃で行う接触水素添加反応等の脱保護反応あるいはこれら脱保護反応の組み合わせにより好適に行うことができる。
【００３８】
なお、式（Ｉａ）のＲ３がニトロ基である場合は常法により還元してアミノ基に変換後、脱保護反応を行ってもよい。
【００３９】
次に、本発明に係る医薬組成物を説明する。当該医薬組成物は、一般式（Ｉ）で示される芳香族アミノ酸誘導体を有効成分として含有する。ここで、当該医薬組成物は、前述のようにＬＡＴ１阻害剤として有用である他、当該阻害剤として機能する結果、ＬＡＴ１発現細胞（例えば癌細胞）のアミノ酸取り込み抑制剤、ＬＡＴ１発現細胞の増殖抑制剤、ＬＡＴ１発現細胞の機能抑制剤、ＬＡＴ１発現細胞の組織増大抑制剤又はＬＡＴ１発現細胞由来疾患の延命剤としても有用である。より具体的には、癌細胞の増殖抑制作用、悪性腫瘍に伴う血管新生及び糖尿病性網膜症等の網膜の増殖性病変に伴う血管新生の抑制作用、細胞増殖を伴う疾患、例えば、各種炎症性疾患、創傷治療過程の過剰な肉芽形成等の抑制作用、輸送系Ｌを介して輸送される毒物の吸収及び体内分布の制御作用、細胞のアミノ酸代謝が亢進することにより生じる弊害、例えば、糖新生亢進による高血糖、生理的なあるいは各種疾患に伴う滑格筋の萎縮、骨吸収の亢進した状態の抑制作用等の種々の作用を期待した医薬品として有用である。
【００４０】
次に、本発明に係る医薬組成物の使用方法について説明する。まず、投与方法に関しては、当該医薬組成物は、例えば、経口、経皮又は注射等により投与することができる。特に、（１）有効成分である式（Ｉ）の芳香族アミノ酸誘導体はｐＨ３で水溶性であるため、経口投与による胃への局部投与が可能になる点（胃癌）、（２）当該芳香族アミノ酸誘導体は弱酸性（例えばｐＨ５）でも有効量水に溶解可能であるので、例えば膀注といった投与方法での局部投与が可能にある点（例えば膀胱癌）、（３）当該芳香族アミノ酸誘導体は弱アルカリ領域（ｐＨ７．４）でも有効量水に溶解可能であるので、静注での全身投与が可能である点（例えば膵臓癌、乳癌）、といった具合に、癌の部位に対応し、適切かつ効率的な投与方法が自由に選択できる。ここで、具体的投与方法としては、膀胱癌については膀注投与、胃癌については経口投与、乳癌、膵癌については静注投与が好ましい。次に、剤型を例示すると、経口投与用の錠剤、顆粒及びカプセル剤は、慣用の添加剤、例えば、結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）;充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）;用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）;崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を含んでいてもよい。錠剤、顆粒及びカプセル剤は、通常の製剤の分野で公知の方法で被膜を形成してもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよく、使用前に水又は他の適切な溶剤に溶解する凍結乾燥製剤としてもよい。液体製剤は通常の添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂）;乳化剤（例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート又はアラビアゴム）;非水性賦形剤（例えばアーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコールのような油性エステル）;保存剤）（例えばメチル又はプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸塩又はソルビン酸）及び着香剤又は着色剤を含んでいてもよい。経皮投与する場合、有効成分はクリーム、ローション又は軟膏の形態をとっていてもよい。薬剤として用いることができるクリーム又は軟膏製剤は、当該分野で周知の方法により調製することができる。また、注射剤は、化合物(Ｉ)又はその塩を適当な媒体に懸濁又は溶解させることにより製造することができる。注射剤には、局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤のようなアジュバント等を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体（Ｉ）又はその塩の投与量は、化合物（Ｉ）の活性、患者の年齢、体重、全身的な健康度、性別、投与時間、投与経路、疾患の重篤度を含む種々の要因によって適宜調整することができ、例えば、通常、成人1日あたり１０〜５０００ｍｇ程度、好ましくは１００〜３０００ｍｇ程度を、１〜５回に分けて投与することが適当である。
【実施例】
【００４２】
以下に、本発明の芳香族アミノ酸誘導体（Ｉ）の製造法を製造例及び実施例により、また、Ｌ型アミノ酸トランスポーター阻害剤としての作用を試験例により詳細に説明する。【００４３】
<製造例１>
【化１４】
2008081537.tif 000011
１）  ３−アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸  メチルエステル塩酸塩(２１．７  ｇ，  １０６．６  ｍｍｏｌ)、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（２７．０３  ｍｌ，  ２１３．１  ｍｍｏｌ)、およびテトラヒドロフラン（２７０  ｍｌ)の混合物に氷冷攪拌下、ベンゾイルクロリド（１４．７４  ｍｌ，  １２７．９  ｍｍｏｌ)のテトラヒドロフラン（１３５  ｍｌ）溶液を滴下し、同温度で１時間攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ８として酢酸エチルで抽出した。抽出層は水、飽和食塩水で順に洗浄後、乾燥して、溶媒を減圧留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９）で精製して、３−ベンゾイルアミノ−２−ヒドロキシ安息香酸  メチルエステル（２４．６７  ｇ，  ８５％）を無色結晶として得た。
融点：  １０４〜１０５℃【００４４】
【化１５】
2008081537.tif 000012
２）  ３−ベンゾイルアミノ−２−ヒドロキシ安息香酸  メチルエステル（１５．００  ｇ，  ５５．３０  ｍｍｏｌ）の酢酸（２７０  ｍｌ）溶液に１５〜１６℃で７０％硝酸（１７．６  ｍｌ）を滴下し、室温で３時間攪拌した。反応液を氷水（１２００  ｍｌ）中に注ぎ込み１時間攪拌して、析出物をろ取し、水、ジエチルエーテルで順に洗浄後乾燥して３−ベンゾイルアミノ−２−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸  メチルエステル（１４．０１  ｇ，  ８０％)を黄色結晶として得た。
融点：  １９２〜１９９℃【００４５】
【化１６】
2008081537.tif 000013
３）  ３−ベンゾイルアミノ−２−ヒドロキシ−５−ニトロ安息香酸  メチルエステル（１４．０  ｇ，  ４４．２７  ｍｍｏｌ）にポリリン酸トリメチルシリルエステルの１，２−ジクロロベンゼン溶液（０．６７モル溶液；１３２  ｍｌ）を加え、１５０℃で５時間加熱攪拌した。反応液を氷冷し、析出物をろ取しｎ−ヘキサン、冷メタノールで洗浄後乾燥して、(５−ニトロ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル)カルボン酸  メチルエステル（１１．８５  ｇ，  ８４％）を黄色結晶として得た。
融点：  １９３〜１９４℃【００４６】
【化１７】
2008081537.tif 000014
４）  （５−ニトロ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）カルボン酸メチルエステル（１１．０８  ｇ，  ３７．１５  ｍｍｏｌ)のテトラヒドロフラン（１５６０  ｍｌ）溶液にアルゴン雰囲気下−２５℃で、水素化リチウムアルミニウム（１．４１  ｇ，  ３７．１  ｍｍｏｌ）を５分間かけ加え、同温度で１．５時間攪拌した。反応液に同温度で水(１２５  ｍｌ)を加え、氷冷し３時間攪拌した。生じた不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を３００  ｍｌまで減圧留去した。残さをクロロホルムで希釈し、水、飽和食塩水で順に洗浄後乾燥し、溶媒を減圧留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／酢酸エチル＝１２）で精製して、（５−ニトロ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メタノール（６．７１  ｇ，  ６７％）を無色結晶として得た。
融点：  １７７〜１７８  ℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３３４６，  ３２１３，  １６１１  ｃｍ−１
ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ２７１  [Ｍ＋Ｈ]＋
この化合物は、実施例１で原料として用いた。実施例３で使用した[２−(２−クロロ−５−ピリジル)−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル]メタノールは、この方法に準じて合成した。【００４７】
<製造例２>
【化１８】
2008081537.tif 000015
１)  製造例１の１)、２)、３)と同様にして合成した[５−ニトロ−２−(４−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル]カルボン酸メチルエステル（１２．１  ｇ，  ４０．４４  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７５０  ｍｌ）−酢酸エチル（１０００  ｍｌ）溶液に塩化第一すず二水和物（４５．６  ｇ，  ２０２．２  ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、２時間加熱還流した。反応液を氷冷し、飽和食塩水（２００  ｍｌ)を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ８として、不溶物をろ去しテトラヒドロフラン−酢酸エチル(１：２混液)で洗浄した。ろ液、洗液を合わせ水、飽和食塩水で順に洗浄後乾燥した。有機層の溶媒を減圧留去し、残さをジイソプロピルエーテルで洗浄後、乾燥して［５−アミノ−２−(４−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］カルボン酸メチルエステル（９．９１  ｇ，  ９１％）を黄色結晶として得た。
融点：  ２３４〜２３９℃【００４８】
【化１９】
2008081537.tif 000016
２)  [５−アミノ−２−(４−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル]カルボン酸メチルエステル（２３．４  ｇ，  ８６．９０  ｍｍｏｌ)のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３５０  ｍｌ)懸濁液にアルゴン雰囲気下、８０℃で３７％ホルムアルデヒド水溶液（３９  ｍｌ)−ギ酸（３９  ｍｌ)の混液を滴下し、同温度で２時間加熱攪拌した。反応液を氷冷し、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、飽和食塩水を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ８として酢酸エチルで抽出した。抽出層を水、飽和食塩水で順に洗浄後、乾燥して、溶媒を減圧留去し、残さをアミンシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロマトレックス（登録商標）ＮＨ）(ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２．３３)で精製して[５−ジメチルアミノ−２−(４−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル]カルボン酸メチルエステル（１８．２１  ｇ，  ７０  ％)を黄色結晶として得た。
融点：  １３８〜１３９℃【００４９】
【化２０】
2008081537.tif 000017
３)  [５−ジメチルアミノ−２−(４−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル]カルボン酸メチルエステル（１８．１９  ｇ，  ６１．１８  ｍｍｏｌ)のテトラヒドロフラン（２６００  ｍｌ)溶液にアルゴン雰囲気下５℃で、水素化リチウムアルミニウム（２．３２  ｇ，  ６１．１８  ｍｍｏｌ)を１０分間かけ加え、同温度で３０分時間攪拌した。反応液に同温度で水（２６  ｍｌ)を加え、３時間攪拌した。生じた不溶物をろ去し、ろ液の溶媒を１／４容量まで減圧留去した。残さをクロロホルムで希釈し、水、飽和食塩水で順に洗浄後乾燥し、溶媒を減圧留去した。残さをジイソプロピルエーテルで洗浄後、乾燥して［５−ジメチルアミノ−２−(４−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メタノール（１５．７０  ｇ，  ９５％）を黄色結晶として得た。
融点：  １５６〜１５７℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３２２０，  １６２１  ｃｍ−１
ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ２７０  [Ｍ＋Ｈ]＋
この化合物は、実施例２で原料として用いた。【００５０】
<製造例３>
【化２１】
2008081537.tif 000018
製造例１と同様にして合成した［２−(２−クロロ−５−ピリジル)−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル］メタノール（５．５０  ｇ，  １７．９９  ｍｍｏｌ)のテトラヒドロフラン（５５  ｍｌ)懸濁液にジメチルアミンのテトラヒドロフラン溶液(２モル溶液；２７０ｍｌ，  ５４０  ｍｍｏｌ)を加え、アルゴン雰囲気下、１５時間加熱還流した。反応液を室温とし、テトラヒドロフラン（１０００  ｍｌ)及び酢酸エチル(５００  ｍｌ)を加え、水、飽和食塩水で順に洗浄後乾燥して溶媒を減圧留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９）で精製して［２−(２−ジメチルアミノ−５−ピリジル)−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル]メタノール（５．２４  ｇ，  ９３％）を微褐色結晶として得た。
融点：  ２２０〜２２１℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３１９９，  １６２１  ｃｍ−１
ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ３１５  ［Ｍ＋Ｈ］＋
この化合物は、実施例４で原料として用いた。【００５１】
<実施例１>
【化２２】
2008081537.tif 000019
１）  ３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル（６．４２  ｇ，  １７．８３  ｍｍｏｌ）、(５−ニトロ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル)メタノール（５．３０  ｇ，  １９．６１  ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１１．６９，  ４４．５７  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１３７  ｍｌ）溶液に、アルゴン雰囲気下、−１０  ℃でジエチルアゾジカルボキシレート（４０％  トルエン溶液  １９．４０  ｇ）を滴下し、同温度で１時間攪拌した。反応液の溶媒を室温で減圧留去し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／酢酸エチル＝１９）で精製して、３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｏ−（５−ニトロ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル（９．８６  ｇ，  ９０％）を無色結晶として得た。
融点：  ２０７〜２１５℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３２８１，  １７４６，  １６９９  ｃｍ−１
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ６１０／６１２  ［Ｍ−Ｈ］−【００５２】
【化２３】
2008081537.tif 000020
２）  ３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｏ−（５−ニトロ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル（６．５  ｇ，  １０．６２  ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（３２５  ｍｌ）懸濁液に塩化第一すず二水和物（１１．９８  ｇ，  ５３．０８  ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、４時間加熱還流した。反応液を氷冷し、酢酸エチル（１５００  ｍｌ）を加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ８として、不溶物をろ去し酢酸エチルで洗浄した。ろ液、洗液を合わせ、水、飽和食塩水で順に洗浄後乾燥し、溶媒を減圧留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／酢酸エチル＝  ３）で精製後、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：１）で再結晶して、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル（３．８７  ｇ，  ６３％）を淡黄色結晶として得た。
融点：  １８８〜１９０℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３４５０，  ３３４９，  ３２８７，  １７４７，  １７０４  ｃｍ−１
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ５８０／５８２  ［Ｍ−Ｈ］−【００５３】
【化２４】
2008081537.tif 000021
３）  Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル（３．４７  ｇ，  ５．９５  ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２４  ｍｌ）−水（１２  ｍｌ）の溶液に、５  ℃で水酸化リチウム一水和物（６２４  ｍｇ，  １４．８８  ｍｍｏｌ）を加え、５  ℃で１８時間反応させた。反応液を１Ｎ塩酸でｐＨ  ３〜４として、水（１００  ml)を加え、室温で２時間攪拌した。析出物をろ取し水洗後、乾燥して、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン（２．７１  ｇ，  ９６％）を黄色固体として得た。
融点：  ２１９〜２２１℃  （ｄｅｃ．）
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  １６１６  ｃｍ−1
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ４７０／４７２  ［Ｍ−Ｈ］−【００５４】
４）  Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシンを常法により塩酸塩とした。
融点：  １８５〜１８７℃  （ｄｅｃ．）
ＩＲ  （ＫＢｒ）  １７４０，  １７３０  ｃｍ−１
１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ）：  δ  ２．９９（２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ），  ３．９９（１Ｈ，  t,  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ），  ４．８６  （２Ｈ，  ｓ），  ７．０７  （２Ｈ，  ｓ），  ７．０８−７．１６  （２Ｈ，  ｍ），  ７．１９−７．２７  （１Ｈ，  ｍ），  ７．３３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ），  ７．４０  （１Ｈ，  d,  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ），  ７．４７−７．５３  （２Ｈ，  ｍ）
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ４７０／４７２  ［Ｍ−Ｈ］−
元素分析：Ｃ２３Ｈ１９Ｃｌ２Ｎ３Ｏ４・１．８ＨＣｌ・２．６Ｈ２Ｏとして
計算値：Ｃ，４７．２４；  Ｈ，４．４８；  Ｎ，７．１９；  Ｃｌ，２３．０４
実測値：Ｃ，４７．３４；  Ｈ，４．５４；  Ｎ，６．９９；  Ｃｌ，２２．９６【００５５】
<実施例２>
【化２５】
2008081537.tif 000022
１）  実施例１の１）の方法に準じて、３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル及び［５−ジメチルアミノ−２−（４−ピリジル）ベンズオキサゾール−７−イル］メタノールから３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｏ−［５−ジメチルアミノ−２−（４−ピリジル）ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルを合成した。
融点：  １９６〜１９８℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３１９３，  １７４９，  １７１８，  １６１０  ｃｍ−1
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ６０９／６１１  ［Ｍ−Ｈ］−【００５６】
【化２６】
2008081537.tif 000023
２）  実施例１の３）の方法に準じて、３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｏ−［５−ジメチルアミノ−２−（４−ピリジル）ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルから３，５−ジクロロ−Ｏ−［５−ジメチルアミノ−２−（４−ピリジル）ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−Ｌ−チロシンを合成した。
融点：  ２０３〜２０６℃  （ｄｅｃ．）
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３３６４，  １６１５  ｃｍ−１
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ４９９／５０１  ［Ｍ−Ｈ］−【００５７】
３）  ３，５−ジクロロ−Ｏ−［５−ジメチルアミノ−２−（４−ピリジル）ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−Ｌ−チロシンを常法により塩酸塩とした。 
融点：  １８６〜１９０℃  （ｄｅｃ．）
ＩＲ  （ＫＢｒ）  １７３９，  １６３９  ｃｍ−１
１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ）：  δ  ３．０６−３．２０  （２Ｈ，  ｍ）,  ３．３９  （６Ｈ，  ｓ），  ４．１０  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ），  ５．６２  （２Ｈ，ｓ），  ７.３５ （２Ｈ，  ｓ），  ７．９０  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ），  ８．２４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ），  ８．７０−８．７４  （２Ｈ，  ｍ），  ９．０３−９．０７  （２Ｈ，  ｍ）
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ５０１／５０３  ［Ｍ＋Ｈ］＋
元素分析：Ｃ２４Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ４Ｏ４・３ＨＣｌ・Ｈ２Ｏとして
計算値：  Ｃ，４５．８５；  Ｈ，４．３３；  Ｎ,８．９１；  Ｃｌ，２８．１９
実測値：  Ｃ，４５．７０；  Ｈ，４．２９；  Ｎ，９．００；  Ｃｌ，２８．２８．【００５８】
<実施例３>
【化２７】
2008081537.tif 000024
１）  実施例１の１）の方法に準じて、３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル及び［２−（２−クロロ−５−ピリジル)−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル］メタノールからＯ−［２−（２−クロロ−５−ピリジル）−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルを合成した。
融点：  ２３８〜２４７℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３２６５，  １７３６，  １７０３  ｃｍ−１
ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ６４７／６４９  ［Ｍ＋Ｈ］＋【００５９】
【化２８】
2008081537.tif 000025
２）  実施例１の２）の方法に準じて、Ｏ−［２−（２−クロロ−５−ピリジル）−５−
ニトロベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルからＯ−［５−アミノ−２−(２−クロロ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルを合成した。
融点：  ２１０〜２１４℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３４４８，  ３３４６，  ３２８６，  １７３９，  １７０３  ｃｍ−１
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ６１５／６１７  ［Ｍ−Ｈ］−【００６０】
【化２９】
2008081537.tif 000026
３）  実施例１の３）の方法に準じて、Ｏ−［５−アミノ−２−(２−クロロ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルからＯ−［５−アミノ−２−(２−クロロ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシンを合成した。
融点：  ２３４〜２４３℃（ｄｅｃ．）
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３３５０，  １６３１，  １５９５  ｃｍ−１
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：    ５０７／５０９  ［Ｍ＋Ｈ］＋【００６１】
４）  Ｏ−［５−アミノ−２−(２−クロロ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシンを常法により塩酸塩にした。
融点：  ２５０℃（ｄｅｃ．）
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３３８５,  １７３９，  １５９５  ｃｍ−１
１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ）：  δ  ３．０７  (２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６.４ Hz),  ４．０６
（１Ｈ，  t,  Ｊ  ＝  ６.４ Hz),  ４．９６  （２Ｈ，  ｓ），  ７．１７  （２Ｈ，  ｓ），  ７．３４−７．４２  （２Ｈ，  ｍ），  ７．５５  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ），  ８．０３  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ２．０  Ｈｚ），  ８．５６  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ）
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ５０７／５０９  ［Ｍ＋Ｈ］＋
元素分析：Ｃ２２Ｈ１７Ｃｌ３Ｎ４Ｏ４・１．８ＨＣｌ・２．１Ｈ２Ｏとして
計算値：Ｃ，４３．２３；  Ｈ，３．７９；  Ｎ，９．１７；  Ｃｌ，２７．８４
実測値：Ｃ，４３．４１；  Ｈ，３．６３；  Ｎ，９．１６；  Ｃｌ，２７．６９．【００６２】
<実施例４>
【化３０】
2008081537.tif 000027
１）  実施例１の１）の方法に準じて、３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステル及び［２−（２−ジメチルアミノ−５−ピリジル）−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル］メタノールから３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｏ−［２−（２−ジメチルアミノ−５−ピリジル）−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル］メチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルを合成した。
融点：  ２３４〜２３６℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３２６７，  １，７４３，  １７０７，  １６１１  ｃｍ−1
ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ６５６／６５８  ［Ｍ＋Ｈ］＋【００６３】
【化３１】
2008081537.tif 000028
２）  実施例１の２）の方法に準じて、３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｏ−［２−（２−ジメチルアミノ−５−ピリジル）−５−ニトロベンズオキサゾール−７−イル］メチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルからＯ−［５−アミノ−２−(２−ジメチルアミノ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルを合成した。
融点：  ２１１〜２１４℃
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３２７５，  １７３７，  １７０６  ｃｍ−1
ＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：  ６２６／６２８  ［Ｍ＋Ｈ］＋【００６４】
【化３２】
2008081537.tif 000029
３）  実施例１の３）の方法に準じて、Ｏ−［５−アミノ−２−(２−ジメチルアミノ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−チロシン  メチルエステルからＯ−［５−アミノ−２−(２−ジメチルアミノ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシンを合成した。
融点：  ２１６〜２２０℃（ｄｅｃ．）
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  １６０５  ｃｍ−1
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：    ５１６／５１８  ［Ｍ＋Ｈ］＋【００６５】
４）  Ｏ−［５−アミノ−２−(２−ジメチルアミノ−５−ピリジル)ベンズオキサゾール−７−イル］メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシンを常法により塩酸塩にした。
融点：  ２０１〜２０５℃（ｄｅｃ．）
ＩＲ  （Ｎｕｊｏｌ）  ３３８２，  １６５７，  １６２９  ｃｍ−１
１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ）：  δ  ３．００−３．１５  （２Ｈ，  ｍ），  ３．２３  （６Ｈ，  ｓ），  ３．９９  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ），  ５．２１  （２Ｈ，ｓ），  ７．０２  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ９．７  Ｈｚ）  ７．２７  （２Ｈ，  ｓ），  ７．３４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ），  ７．５３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ），  ８．０９  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．７，  ２．０  Ｈｚ），  ８．３１  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ）
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：    ５１４／５１６  ［Ｍ−Ｈ］−
元素分析：Ｃ２４Ｈ２３Ｃｌ２Ｎ５Ｏ４・２．１ＨＣｌ・２．６Ｈ２Ｏとして
計算値：Ｃ，４５．０６；  Ｈ，４．７７；  Ｎ，１０．９５；  Ｃｌ，２２．７２
実測値：Ｃ，４５．０９；  Ｈ，４．６０；  Ｎ，１０．８９；  Ｃｌ，２２．７８．【００６６】
<試験例１>  既知化合物及び本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体の水に対する溶解性の比較
本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体の水に対する溶解度を調べた。あわせて、特許文献１に掲載された化合物の溶解度を調べた。その結果を下記表に示す。表から明らかなように、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体（ＫＹＴ−０３５１、ＫＹＴ−０３５３、ＫＹＴ−３５９、ＫＹＴ―３６０）は、酸性条件下で、約３ｗ／ｖ％（４．８ｍＭ）という、水に対する高い溶解性を示した。したがって、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体は、水に溶け易く、静脈投与が可能であることが確認された。尚、表中のＬＡＴ１：ＩＣ５０、ＬＡＴ２：ＩＣ５０／ＬＡＴ１：ＩＣ５０及びヒト乳癌ＭＸ−１に対する増殖率に関する項目については後述する。
【表２】
2008081537.tif 000030
【００６７】
<試験例２>  膵臓癌に対する薬効確認試験
２−１．ヒト膵癌組織（膵管癌）の免疫組織染色
ヒトＬＡＴ１のＣ−末端配列（ＣＱＫＬＭＱＶＶＰＱＥＴ）に対して作製したモノクローナル抗体を用いて、ヒト膵管癌のパラフィン切片に対する免疫組織染色を行った。発色は、ジアミノベンチジンにより行った。結果を図１に示す。尚、スケールは図中に示しており、左は弱拡大像、右は強拡大像である。その結果、癌細胞に一致したＬＡＴ１の強い染色｛黒色部分（当該写真は白黒であり、実際には茶色部分）｝が明らかになった。【００６８】
２−２．ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞及びＢｘＰＣ−３細胞のシステムＬアミノ酸トランスポーターの発現量
ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞及びＢｘＰＣ−３細胞、及びヒト膀胱由来培養細胞株Ｔ２４細胞について、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、４Ｆ２ｈｃのｍＲＮＡの発現量を定量ＰＣＲで比較した。ＬＡＴ１は腫瘍細胞型システムＬ、ＬＡＴ２は正常細胞型システムＬ、４Ｆ２ｈｃは、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２の補助因子であり、ＬＡＴ１あるいはＬＡＴ２と結合しヘテロ二量体を形成することによってＬＡＴ１あるいはＬＡＴ２の機能発現に必須のタンパク質である。Ｔ２４細胞は、ＬＡＴ１、４Ｆ２ｈｃの発現の高い細胞として知られるものである。定量ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ  により行った。その結果、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞及びＢｘＰＣ−３細胞ともに、ＬＡＴ１、４Ｆ２ｈｃの高い発現が明らかになった。これらの腫瘍細胞株において、ＬＡＴ２の発現はほとんど検出されなかった（図２）。【００６９】
２−３．ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のロイシン取込みに対する抑制効果
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を２４  穴プレートに１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、４８時間後に、［１４Ｃ］Ｌ−ロイシン（１μＭ）の取込み測定を行った。ＢＣＨ（１，１０，１００及び１０００  μＭ）並びにＫＹＴ０３５１及びＫＹＴ０３５３（ともに０．０１，０．０３，０．１，０．３，１．０，３．０，５．０，１０．０及び３０．０μＭ）による、細胞への［１４Ｃ］Ｌ−ロイシンの取込み阻害を検討した。
その結果、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞において、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３ともにＢＣＨに比し、約１０００倍の親和性をもって、高親和性に抑制することが明らかになった。ＫＹＴ０３５３の方が、ＫＹＴ０３５１より高い親和性を示した（図３）。【００７０】
２−４．ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のロイシン取込みに対する抑制効果
ＢｘＰＣ−３細胞を２４  穴プレートに１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、４８時間後に、［１４Ｃ］  Ｌ−ロイシン（１μＭ）の取込み測定を行った。既存のシステムＬインヒビターＢＣＨ（１，１０，１００及び１０００  μＭ）、あるいはＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３  （ともに０．０１，０．０３，０．１，０．３，１．０，３．０，５．０，１０．０及び３０．０μＭ）による、細胞への［１４Ｃ］Ｌ−ロイシンの取込み阻害を検討した。その結果、ＢｘＰＣ−３細胞において、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３ともにＢＣＨに比し、約１０００倍の親和性をもって、高親和性に抑制することが明らかになった。ＫＹＴ０３５３の方が、ＫＹＴ０３５１より高い親和性を示した（図４）。【００７１】
２−５．ＫＹＴ０３５１のヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を２４穴プレートに１，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１２時間インヒビター添加せずに培養した。培養開始１２時間後、既存のシステムＬインヒビターＢＣＨ  （２０ｍＭ)、あるいはＫＹＴ０３５１（１，１０，３０，１００μＭ）を添加し、その後経時間的に細胞数を計測し、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞の増殖に対する抑制効果を検討した。その結果、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞において、ＫＹＴ０３５１は濃度依存的な増殖抑制効果を示すことが明らかになった（図５）。【００７２】
２−６．ＫＹＴ０３５３のヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を２４  穴プレートに１，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１２時間インヒビター添加せずに培養した。培養開始１２時間後、既存のシステムＬインヒビターＢＣＨ  （２０ｍＭ)、あるいはＫＹＴ０３５３（１，１０，３０，１００μＭ）を添加し、その後経時間的に細胞数を計測し、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞の増殖に対する抑制効果を検討した。その結果、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞において、ＫＹＴ０３５３は濃度依存的な増殖抑制効果を示すことが明らかになった（図６）。【００７３】
２−７．ＫＹＴ０３５１のヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果
ＢｘＰＣ−３細胞を２４  穴プレートに１，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１２時間インヒビター添加せずに培養した。培養開始１２時間後、既存のシステムＬインヒビターＢＣＨ（２０ｍＭ）、あるいはＫＹＴ０３５１（１，１０，３０，１００μＭ）を添加し、その後経時間的に細胞数を計測し、ＢｘＰＣ−３細胞の増殖に対する抑制効果を検討した。その結果、ＢｘＰＣ−３細胞において、ＫＹＴ０３５１は濃度依存的な増殖抑制効果を示すことが明らかになった（図７）。【００７４】
２−８．ＫＹＴ０３５３のヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果
ＢｘＰＣ−３細胞を２４  穴プレートに１，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１２時間インヒビター添加せずに培養した。培養開始１２時間後、既存のシステムＬインヒビターＢＣＨ  （２０ｍＭ）、あるいはＫＹＴ０３５３（１，１０，３０，１００μＭ）を添加し、その後経時間的に細胞数を計測し、ＢｘＰＣ−３細胞の増殖に対する抑制効果を検討した。その結果、ＢｘＰＣ−３細胞において、ＫＹＴ０３５３は濃度依存的な増殖抑制効果を示すことが明らかになった（図８）。【００７５】
２−９．ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のヌードマウス皮下腫瘍に対する増大抑制効果
６週齢の雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ）の皮下に１ｘ１０６個のＭＩＡＰａＣａ−２細胞を接種し、７日後より生理食塩水,ＢＣＨ（２５８ｍＭ）、ＫＹＴ０３５１（２．６ｍＭ）、ＫＹＴ０３５３（２．６ｍＭ）を、１００μl、１２時間毎に腫瘍内注入した。投与開始後の日数を図の横軸として、腫瘍容積の経時間的変化を図に示した。腫瘍容積は、Ｓａｗａ，Ｊｕｎ  Ｗｕ，Ｔａｋａａｋｉ  Ａｋａｉｋｅ，ａｎｄ  Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｍａｅｄａ  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０，６６６−６７１．）に記載の方法に従い、（長径×短経×短経）／２として算出した。その結果、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３ともに、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞ヌードマウス皮下腫瘍に対する増大抑制効果を示すことが明らかになった（図９）。【００７６】
２−１０．ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のヌードマウス皮下腫瘍に対する増大抑制効果
６週齢の雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ）の皮下に１ｘ１０６個のＢｘＰＣ−３細胞を接種し、７日後より生理食塩水，ＢＣＨ（２５８ｍＭ）、ＫＹＴ０３５１（２．６ｍＭ）、ＫＹＴ０３５３（２．６ｍＭ）を、１００μｌ、１２時間毎に腫瘍内注入した。投与開始後の日数を図の横軸として、腫瘍容積の経時間的変化を図に示した。腫瘍容積は、Ｓａｗａ，Ｊｕｎ  Ｗｕ，Ｔａｋａａｋｉ  Ａｋａｉｋｅ，  ａｎｄ  Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｍａｅｄａ  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０，６６６−６７１．）に記載の方法に従い、（長径Ｘ短経Ｘ短経）／２として算出した。その結果、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３ともに、ＢｘＰＣ−３細胞ヌードマウス皮下腫瘍に対する増大抑制効果を示すことが明らかになった（図１０）。【００７７】
２−１１．ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のヌードマウス腹水癌モデルに対する延命効果
６週齢の雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ）の腹腔に５ｘ１０７個のＭＩＡＰａＣａ−２細胞を接種し、２４時間後より生理食塩水、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３を、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、１２時間毎に腹腔内投与した。生理食塩水の注入量は、薬液量と等量とした。投与開始後の日数を図の横軸として、マウス生存数の経時間的変化を図に示した。その結果、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３ともに、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞ヌードマウス腹水癌モデルに対して延命効果を示すことが明らかになった。ＫＹＴ０３５３の方が、ＫＹＴ０３５１より強い延命効果を示した。平均生存日数は、生理食塩水投与群（対照群）が２０．０±４．３日、ＫＹＴ０３５１投与群が２８．４±８．６日、ＫＹＴ０３５３投与群が３４．４±９．９日であった（図１１）。【００７８】
２−１２．ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のヌードマウス腹水癌モデルに対する延命効果
６週齢の雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ）の腹腔に５ｘ１０７個のＢｘＰＣ−３細胞を接種し、２４時間後より生理食塩水、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３を、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、１２時間毎に腹腔内投与した。生理食塩水の注入量は、薬液量と等量とした。投与開始後の日数を図の横軸として、マウス生存数の経時間的変化を図に示した。その結果、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３ともに、ＢｘＰＣ−３細胞ヌードマウス腹水癌モデルに対して延命効果を示すことが明らかになった。ＫＹＴ０３５３の方が、ＫＹＴ０３５１より強い延命効果を示した。平均生存日数は、生理食塩水投与群（対照群）が２１．０±５．０日、ＫＹＴ０３５１投与群が２６．０±４．６日、ＫＹＴ０３５３投与群が３１．８±７．６日であった（図１２）。【００７９】
２−１３．ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のヌードマウス皮下腫瘍における細胞増殖指標及びアポトーシス誘導指標に対する効果
６週齢の雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ）の皮下に１ｘ１０６個のＭＩＡＰａＣａ−２細胞を接種し、７日後より生理食塩水、塩酸（ＨＣｌ、２．６ｍＭ）、（ＢＣＨ（２５８ｍＭ）、ＫＹＴ０３５１（２．６ｍＭ）、ＫＹＴ０３５３（２．６ｍＭ）を、１００μｌ、１２時間毎に腫瘍内注入した。ＭＩＡＰａＣａ−２細胞接種後２７日において、腫瘍を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、パラフィン切片を作製した。常法に従い、抗Ｋｉ−６７で染色し、染色陽性細胞を計数しＭＩＢ−１インデックスを算出した。塩酸は、ＫＹＴ０３５１及びＫＹＴ０３５３が塩酸塩であるため、それと等モル濃度の塩酸を投与した群を生理食塩水投与群に加えて、対照とした。その結果、ＢＣＨ、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３により、ＭＩＢ−１インデックスの減少が観察され、これら化合物のＭＩＡＰａＣａ−２細胞ヌードマウス皮下腫瘍における増殖抑制効果がｉｎ  ｖｉｖｏでも示された。ＫＹＴ０３５３が、最も強いＭＩＢ−１インデックス減少効果を示した（図１３）。【００８０】
さらに、同様の標本を、常法に従い、ＴＵＮＥＬ染色を行い、染色陽性細胞を計数しアポトーシスインデックスを算出した。その結果、ＢＣＨ、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３により、アポトーシスインデックスの上昇が観察され、これら化合物のＭＩＡＰａＣａ−２細胞ヌードマウス皮下腫瘍におけるアポトーシス誘導効果がｉｎ  ｖｉｖｏでも示された。ＫＹＴ０３５３が、最も強いアポトーシスインデックス上昇効果を示した（図１３）。【００８１】
２−１４．ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のヌードマウス皮下腫瘍における細胞増殖指標及びアポトーシス誘導指標に対する効果
６週齢の雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ）の皮下に１ｘ１０６個のＢｘＰＣ−３細胞を接種し、７日後より生理食塩水、塩酸（ＨＣｌ、２．６ｍＭ）、ＢＣＨ（２５８ｍＭ）、ＫＹＴ０３５１（２．６ｍＭ）、ＫＹＴ０３５３（２．６ｍＭ）を、１００μｌ、１２時間毎に腫瘍内注入した。ＢｘＰＣ−３細胞接種後２７日において、腫瘍を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、パラフィン切片を作製した。常法に従い、抗Ｋｉ−６７で染色し、染色陽性細胞を計数しＭＩＢ−１インデックスを算出した。塩酸は、ＫＹＴ０３５１及びＫＹＴ０３５３が塩酸塩であるため、それと等モル濃度の塩酸を投与した群を生理食塩水投与群に加えて、対照とした。その結果、ＢＣＨ、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３により、ＭＩＢ−１インデックスの減少が観察され、これら化合物のＢｘＰＣ−３細胞ヌードマウス皮下腫瘍における増殖抑制効果がｉｎ  ｖｉｖｏでも示された。ＫＹＴ０３５３が、最も強いＭＩＢ−１インデックス減少効果を示した（図１４）。【００８２】
さらに、同様の標本を、常法に従い、ＴＵＮＥＬ染色を行い、染色陽性細胞を計数しアポトーシスインデックスを算出した。その結果、ＢＣＨ、ＫＹＴ０３５１、ＫＹＴ０３５３により、アポトーシスインデックスの上昇が観察され、これら化合物のＢｘＰＣ−３細胞ヌードマウス皮下腫瘍におけるアポトーシス誘導効果がｉｎ  ｖｉｖｏでも示された。ＫＹＴ０３５３が、最も強いアポトーシスインデックス上昇効果を示した（図１４）。【００８３】
以上（２−１〜２−１４）の結果を整理すると、以下の通りである。【００８４】
１．ＭｉａＰａＣａ２とＢｘＰＣ３増殖抑制試験：ヒト膵癌セルライン２種（ＭｉａＰａＣａ２及びＢｘＰＣ３）において、２種の高親和性化合物ＫＹＴ０３５１及びＫＹＴ０３５３の濃度依存的アミノ酸取込み抑制能を明らかにした。さらに、同膵癌セルライン２種において、２種の化合物の濃度依存的増殖抑制効果を明らかにした。【００８５】
２．ヌードマウス腫瘍増殖抑制試験：ＭｉａＰａＣａ２細胞及びＢｘＰＣ３細胞をヌードマウス皮下に接種し、皮下腫瘍を形成させ、それに対する高親和性化合物ＫＹＴ０３５１及びＫＹＴ０３５３投与の効果を経時間的に観察し、抗腫瘍効果を明らかにした。【００８６】
３．マウス延命試験：ＭｉａＰａＣａ２細胞及びＢｘＰＣ３細胞をヌードマウスの腹腔に接種し、１５から２０日で死亡する腹水癌モデルを確立し、それを用いて、高親和性化合物ＫＹＴ０３５１及びＫＹＴ０３５３の延命効果を明らかにした。【００８７】
４．細胞増殖指標及びアポトーシス誘導指標の評価：ＭｉａＰａＣａ２細胞及びＢｘＰＣ３細胞のヌードマウス皮下腫瘍において、細胞増殖指標としてのＭＩＢ−１インデックス、アポトーシス誘導指標としてのアポトーシスインデックスを検討し、ＫＹＴ０３５１及びＫＹＴ０３５３が、ともに細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することをｉｎ  ｖｉｖｏで明らかにした。【００８８】
以上の結果より、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体が、ヒト膵癌治療薬として有効であることが判明した。【００８９】
<試験例３>  膀胱癌に対する薬効確認試験
３−１．ヒト膀胱癌由来Ｔ２４細胞の必須アミノ酸取り込み抑制効果
Ｔ２４細胞がロイシンやイソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン等の必須アミノ酸取り込みに用いているトランスポーターは、ＬＡＴ１に依存していることを確認した（図２）。次に、Ｔ２４細胞を２４穴プレートに１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、４８時間後に、［１４Ｃ］Ｌ−ロイシン（１μＭ）の取込み測定を行った。ＫＹＴ０３５３（ともに０．０１，０．１，１．０，１０．０  μＭ）による、細胞への［１４Ｃ］Ｌ−ロイシンの取込み阻害を検討した。その結果、Ｔ２４細胞において、ＫＹＴ０３５３は、高親和性に抑制することが明らかになった。ここで、図１７より分かるように、ＫＹＴ０３５３は、Ｔ２４細胞の標識ロイシンの取り込みを濃度依存的に抑制し、５０％抑制濃度はＫｉ値０．１μMであった。【００９０】
３−２．ラットを用いた膀胱癌の化学発癌モデルにおける抑制効果
ウイスター系雄性ラット（８週齢、４〜６匹）の飲水に０．０５％のＢＢＮ｛Ｎ−ブチル−Ｎ−（４−ヒドロキシブチル）ニトロサミン｝を１０週間服用させて作成した化学膀胱癌に対して、オスモティックミニポンプを留置し、ＫＹＴ０３５３を２週間膀胱内に持続的に投与した｛図１５（ａ）｝。尚、比較のため、ＫＹＴＯ３５３の代わりに生理食塩水及びＢＣＨを投与した実験も行った。そして、投与終了後に膀胱癌を含む全膀胱重量を測定したところ、ＫＹＴ０３５３投与群では顕著な重量の低下を認めた｛図１５（ｂ）及び（ｃ）｝。肉眼的にも、発癌は強く抑制されていた（図１６）。【００９１】
３−３．ＫＹＴ０３５３のＴ２４細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果
ヒト膀胱癌細胞株（Ｔ２４細胞）を本試験で使用した。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中、３７℃下、５％ＣＯ２／９５％空気環境下で、Ｔ２４細胞を６０ｍｍプレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、１日インヒビター添加せずに培養した。培養開始１日後、実験に先立ち、死んだ細胞を遠心分離機で取り除いた後、新鮮な培地で再懸濁させた。そして、未添加或いはＢＣＨ（２０ｍＭ）又はＫＹＴ０３５３（３０μＭ）を添加し、ウイルス複製を誘発させた。そして、１、４、６、１２及び２４時間後、Ｔ２４細胞を採取し、細胞数計測、Ｔｕｎｅｌ法の実施、アポトーシスに関連する発現遺伝子のＦｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ（ＢＣＨとＫＹＴ０３５３との比較）、死細胞に関連する遺伝子発現プロファイル（ＢＣＨとＫＹＴ０３５３との比較）を調べた。その結果を図１８〜図２１に示す。まず、図１８から分かるように、本発明に係る抗癌剤（ＴＹＫ−０３５３）は、従来の抗癌剤（ＢＣＨ）と比較してその使用量が７００分の１近くでありながら、従来の抗癌剤よりも強い増殖抑制効果を示した。更に、図１９〜図２１から明らかなように、Ｔｕｎｅｌ陽性細胞の出現及びアポトーシスにおいてＫＹＴＯ３５３の関与が示唆されたため、当該薬剤が膀胱癌の抗癌剤として有効であると理解される。【００９２】
<試験例４>   ヒト乳癌に対する薬効確認試験
４−１．増殖抑制作用
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス皮下で継代中のヌードマウス可移植性ヒト腫瘍ＭＸ−１を３×３×３ｍｍのブロックに細切し、移植針（φ３．５ｍｍ）を用いてＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹部皮下に移植した。移植後、腫瘍重量が１００〜３００ｍｇに到達した時点で、腫瘍重量と体重を基準として、群分けを行った。試験化合物を生理食塩水に溶解して５Ｎ塩酸（５μｌ）を添加し、体重１０ｇあたり０．１ｍｌずつ、群分け日（ｄａｙ  ０）から９日間連続静脈内投与した。【００９３】
抗腫瘍活性の評価：抗腫瘍活性は１０日目（ｄａｙ１０）の増殖率を用いて評価した。すなわち、腫瘍体積を腫瘍の長径（ａ）と短径（ｂ）から以下の式で求めた。
【式１】
【００９４】
腫瘍体積（Ｔｖ）＝  １／２×ａｂ２
【００９５】
腫瘍体積は投与開始日を１として相対腫瘍体積を求め、各投与群の平均腫瘍体積とコントロール群の平均腫瘍体積から増殖率を以下の式で求めた。
【式２】
【００９６】
増殖率（ＧＲ）＝  （Ｔｔ／Ｔｃ）×１００
【００９７】
増殖率が５０％以下となった投与群を有効とした。一方、化合物の投与が原因で死亡例が認められた投与群および初回投与時点の体重に比べ２０％以上の体重減少が認められた投与群を毒性とした。
【表３】
2008081537.tif 000031
【００９８】
以上のように特許文献１で唯一水溶性の実施例９８（ＫＹＴ−０３２８）の化合物は、毒性用量まで増殖抑制作用を示さないが、ＫＹＴ−０３５１、ＫＹＴ−０３５３、ＫＹＴ−０３５９及びＫＹＴ−０３６０の４化合物は、１２．５又は２５ｍｇ/ｋｇで増殖率５０％以下となり、増殖抑制作用を示した。
表２でも示したように、投与量２５ｍｇ／ｋｇでの増殖率の値で比較すれば、ＫＹＴ−０３２８にくらべて、ＫＹＴ−０３５１、ＫＹＴ−０３５３，ＫＹＴ−０３５９，ＫＹＴ−０３６０は、より低い増殖率の値を示している。すなわち、当該物質は、乳癌ＭＸ−１に対して、より有効な増殖抑制作用を有することが明らかとなった。
【００９９】
<試験例５>  他の癌への応用の検討
５−１．各種ヒト癌細胞株についての定量的ＰＣＲ法
各種ヒト癌細胞株について定量的ＰＣＲ法を実施することにより、これらヒト癌細胞株におけるＬＡＴ１発現を定量化した。その結果を図２２に示した。当該図より分かるように、今回試験した膵臓癌、膀胱癌及び乳癌の他、胃癌をはじめとする他の癌でも高い発現性を示すことが確認された。
【０１００】
５−２．ヒト胃癌での免疫組織染色
ＬＡＴ１及び４Ｆ２ｈｃの発現を、術前化学療法及び放射線療法を行わなかった胃癌症例５０例の病理組織標本を免疫組織染色することにより確認した。５μｍの組織切片は脱パラフィン後、３％  Ｈ２Ｏ２加メタノール及び０．１％  ＮａＮ２で３０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．０５Ｍトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄後、５％ヤギ血清で２０分室温にて処理した。一次抗体は抗ヒトＬＡＴ１抗体、並びに抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体（Nawashiro H, Otani N, Shinomiya N, Fukui S, Ooigawa H, Shima K, et al. L-type amino acid transporter 1 as a potential molecular target in human astrocytic tumors. Int J Cancer. 2006;119:484-492）を用い、４℃で終夜反応させた。２次抗体処理以降の発色は、ＤＡＫＯ社 ＥＮＶＩＳＩＯＮ（酵素標識ポリマー法）を用い、３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅで発色した。
【０１０１】
その結果、まず、摘出胃細胞内ＬＡＴ１ならびに４Ｆ２ｈｃの分布は、細胞質内にびまん性に発現しているもの（ｄｉｆｆｕｓｅ ｔｙｐｅ）と内腔に結節状に発現しているもの（ｎｏｄｕｌａｒ ｔｙｐｅ）とに分けられた（図２３）。発現形式をｄｉｆｆｕｓｅ ｔｙｐｅ とｎｏｄｕｌａｒ ｔｙｐｅ とに分類すると、癌組織のｄｉｆｆｕｓｅ ｔｙｐｅは４Ｆ２ｈｃで９５．９％（４７/４９）、ＬＡＴ１で８９．１％（４１/４６）の発現率であり、これに対し正常組織では４Ｆ２ｈｃで９．１％（４/４４)、ＬＡＴ１で４．７％（２/４３）であった（図２７）。以上の所見を統計処理すると、癌組織と正常組織とでは４Ｆ２ｈｃ（ｐ<０．００５）とＬＡＴ１（ｐ<０．００５）の発現分布形式が有意に異なっていた。細胞内染色パターンに関係ない陽性染色率だけの胃癌組織５０例中の免疫組織染色における４Ｆ２ｈｃとＬＡＴ１の発現（図２７）は、それぞれ９８．０％ (４９/５０)および９２．０％(４６/５０)であり、またいわゆる正常組織では４Ｆ２ｈｃの発現は８８．０％(４４/５０)、ＬＡＴ１の発現は８６．０％ (４３/５０)であり、癌組織と正常組織の間には有意差は認めなかった。
粘膜下に癌細胞が浸潤している組織では癌細胞のみにＬＡＴ１と４Ｆ２ｈｃの染色像が見られ（図２４）、その他の組織には陽性染色所見は認められなかった。通常のＨＥ染色では見つけにくい癌細胞も本法では区別が容易であった。
またリンパ節転移巣では癌細胞が転移した部位に一致してＬＡＴ１と４Ｆ２ｈｃのｄｉｆｆｕｓｅな発現が見られた（図２５）。癌組織近傍のリンパ管への癌細胞浸潤部位（Ｌｙ+）にもＬＡＴ１発現が認められた（図２６）。
The Japanese Gastric Carcinoma Societyに準じた組織分類別に見ると、ＬＡＴ１と４Ｆ２ｈｃの発現には組織学的な差は見られなかった。また癌細胞浸潤が粘膜下層までの早期癌とそれ以上の進行癌とに分けても発現には差は認めなかった。
以上のように、ヒトの胃癌組織においてＬＡＴ１及び４Ｆ２ｈｃが発現していることが、明らかになった（図２３〜図２６）。
【０１０２】
さらに、表２で示したように、ＫＹＴ−０３５１、ＫＹＴ−０３５３，ＫＹＴ−０３５９，ＫＹＴ−０３６０は、ＬＡＴ１に対し、低いＩＣ５０の値を示す。これは、当該物質が、ＬＡＴ１の活性阻害に有意に働くことを示す、客観的な値である。さらに、当該物質のＬＡＴ１に対するＩＣ５０の値とＬＡＴ２に対するＩＣ５０の値の比を見れば、非常に低い値を示す。すなわち、正常細胞に発現するＬＡＴ２に対しては、活性阻害剤として作用しないが、癌細胞に発現を示すＬＡＴ１に対してのみ、選択的に阻害活性を有することとなる。したがって、例えば胃癌についても、本発明に係る芳香族アミノ酸誘導体が有効であることが推定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、試験例２における、ヒト膵癌組織（膵管癌）の免疫組織染色の結果を示した図である。
【図２】図２は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞及びＢｘＰＣ−３細胞のシステムＬアミノ酸トランスポーターの発現量の結果を示した図である。
【図３】図３は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のロイシン取込みに対する抑制効果を示した図である。
【図４】図４は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のロイシン取込みに対する抑制効果を示した図である。
【図５】図５は、試験例２における、ＫＹＴ０３５１のヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果を示した図である。
【図６】図６は、試験例２における、ＫＹＴ０３５３のヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果を示した図である。
【図７】図７は、試験例２における、ＫＹＴ０３５１のヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果を示した図である。
【図８】図８は、試験例２における、ＫＹＴ０３５３のヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖抑制効果を示した図である。
【図９】図９は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のヌードマウス皮下腫瘍に対する増大抑制効果を示した図である。
【図１０】図１０は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のヌードマウス皮下腫瘍に対する増大抑制効果を示した図である。
【図１１】図１１は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のヌードマウス腹水癌モデルに対する延命効果を示した図である。
【図１２】図１２は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のヌードマウス腹水癌モデルに対する延命効果を示した図である。
【図１３】図１３は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２細胞のヌードマウス皮下腫瘍における細胞増殖指標及びアポトーシス誘導指標に対する効果を示した図である。
【図１４】図１４は、試験例２における、ヒト膵癌由来培養細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のヌードマウス皮下腫瘍における細胞増殖指標及びアポトーシス誘導指標に対する効果を示した図である。
【図１５】図１５は、試験例３における、ラットを用いた膀胱癌の化学発癌モデルにおける抑制効果を示した図である。ここで、図１５（ａ）は、ラット内にオスモティックミニポンプを留置した際の様子を示した図である。図１５（ｂ）は、投与終了後におけるラットの体重を示した図である。図１５（ｃ）は、投与終了後におけるラット膀胱の相対重量を示した図である。
【図１６】図１６は、試験例３における、膀胱発癌におけるＬＡＴ１インヒビターの連続投与の効果を示した図である。
【図１７】図１７は、試験例３における、ヒト膀胱癌由来培養細胞株Ｔ２４細胞のロイシン取込みに対する抑制効果を示した図である。
【図１８】図１８は、試験例３における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、非処理、ＢＣＨ処理及びＫＹＴ０３５３処理した際の、Ｔ２４細胞数の経時間的変化を示した図である。
【図１９】図１９は、試験例３における、試験後のＴ２４細胞のＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色の結果（図の上段）及びＴＵＮＥＬ染色の結果（図の下段）を示した図である。
【図２０】図２０は、試験例３における、アポトーシスに関連した発現遺伝子についての、ＢＣＨ  Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ及びＫＹＴ０３５３  Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅの比較図である。
【図２１】図２１は、試験例３における、死細胞に関連した遺伝子発現プロファイル（ＢＣＨ、ＫＹＴ０３５３）を示した図である。
【図２２】図２２は、試験例５における、各種ヒト癌細胞株について定量的ＰＣＲ法を実施した結果を示した図である。
【図２３】図２３は、試験例５における、正常胃粘膜（Ａ：ＬＡＴ１、  Ｂ：４Ｆ２ｈｃ）、中程度分散型腺癌（Ｃ：ＬＡＴ１、Ｄ：４Ｆ２ｈｃ）、Ｔｕｂｌａｒ  腺癌（Ｅ：ＬＡＴ１、Ｆ：４Ｆ２ｈｃ）のＬＡＴ１、４Ｆ２ｈｃの免疫組織染色像を示した図である。
【図２４】図２４は、試験例５における、粘膜下への浸潤症例（低分化型腺癌）の図である（左：ＬＡＴ１  右：４Ｆ２ｈｃ）。
【図２５】図２５は、試験例５における、リンパ節転移症例（中程度分化型腺癌）の免疫組織染色像を示した図である。リンパ節（左上：ＬＡＴ１、右上：４Ｆ２ｈｃ）と原発巣（左下：ＬＡＴ１、右下：４Ｆ２ｈｃ）の染色像を示す。
【図２６】図２６は、試験例５における、脂肪組織への浸潤とリンパ管内への浸潤を認めた症例（低分化型腺癌)におけるＬＡＴ１染色像の図である。脂肪組織内への浸潤（Ａ：40倍、Ｂ：400倍)とリンパ管内への浸潤（Ｃ：40倍、Ｄ：400倍）を示した。
【図２７】図２７は、試験例５における、免疫組織染色の結果のまとめ（U：上部、M：中部、L：下部、E：食道浸潤、D：十二指腸浸潤、侵達度、m：粘膜層、mm：粘膜筋板、sm：粘膜下組織、mp：固有筋層、ss：漿膜下組織、se, si：漿膜、Ly：リンパ管侵襲、v：血管侵襲、n：リンパ節転移）の図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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