(57)【要約】  モノクローナル抗体治療薬を投与した際に起こる体内でのＡＤＣＣをより向上させた医薬、治療・予防方法を提供することを課題とする。また、モノクローナル抗体治療薬の効果を向上させるためのアジュバントを提供する。  ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を組み合わせて医薬とすることにより、γδＴ細胞、モノクローナル抗体治療薬を、それぞれ単独で用いるよりも高い相乗的効果を有する医薬を提供することが可能となる。
2008152822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を含む医薬。
【請求項２】
前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、別々の溶液に懸濁されていることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体治療薬を投与した後に前記γδＴ細胞を投与することを特徴とする請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬を同時に投与することを特徴とする請求項２に記載の医薬。
【請求項５】
前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、同一の溶液に懸濁されていることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
前記γδＴ細胞はビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項８】
前記γδＴ細胞が、自己由来であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項９】
前記γδＴ細胞が、他人由来であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体治療薬が、疾病の原因である細胞の表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持つ抗体であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体治療薬が、トラスツズマブであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体治療薬が、リツキシマブであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体治療薬は、通常投与量の１／２０００倍量〜等量含まれることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１４】
γδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を投与する治療・予防方法。
【請求項１５】
前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、別々の溶液に懸濁されていることを特徴とする請求項１４に記載の治療・予防方法。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体治療薬を投与した後に前記γδＴ細胞を投与することを特徴とする請求項１５に記載の治療・予防方法。
【請求項１７】
前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬を同時に投与することを特徴とする請求項１５に記載の治療・予防方法
【請求項１８】
前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、同一の溶液に懸濁されていることを特徴とする請求項１４に記載の治療・予防方法。
【請求項１９】
前記γδＴ細胞はビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたことを特徴とする請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２０】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項１４乃至１９のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２１】
前記γδＴ細胞が、自己由来であることを特徴とする請求項１４乃至２０のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２２】
前記γδＴ細胞が、他人由来であることを特徴とする請求項１４乃至２０のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体治療薬が、疾病の原因である細胞の表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持つ抗体であることを特徴とする請求項１４乃至２２のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体治療薬が、トラスツズマブであることを特徴とする請求項１４乃至２３のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２５】
前記モノクローナル抗体治療薬が、リツキシマブであることを特徴とする請求項１４乃至２３のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体治療薬は、通常投与量の１／２０００倍量〜等量投与することを特徴とする請求項１４乃至２５のいずれか一項に記載の治療・予防方法。
【請求項２７】
γδＴ細胞を含むことを特徴とするモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【請求項２８】
前記γδＴ細胞はビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたことを特徴とする請求項２７に記載のモノクローナル抗体アジュバント。
【請求項２９】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項２７又は２８に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【請求項３０】
前記γδＴ細胞が、自己由来であることを特徴とする請求項２７乃至２９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【請求項３１】
前記γδＴ細胞が、他人由来であることを特徴とする請求項２７乃至２９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【請求項３２】
前記モノクローナル抗体治療薬が、病気の原因である細胞の表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持つ抗体であることを特徴とする請求項２７乃至３１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【請求項３３】
前記モノクローナル抗体治療薬が、トラスツズマブであることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【請求項３４】
前記モノクローナル抗体治療薬が、リツキシマブであることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬に関する。また治療・予防方法に関する。さらにモノクローナル抗体治療薬アジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは日本人の最大の死亡原因であり、がん対策の一層の充実が求められている。がんの治療法としては外科療法、化学療法、放射線療法が中心に行われ成果を上げてきたが、それぞれの治療効果の限界や副作用、合併症などは依然として存在し、それらを克服するために新たな治療法の開発、実用化がなされている。【０００３】
近年治療方法の一つとして注目を集め、実績をあげているものにモノクローナル抗体治療薬を用いた治療方法がある。モノクローナル抗体治療薬はがん細胞に特異的又は過剰に発現するタンパク質に特異的に結合する抗体からなる治療薬である。【０００４】
また、がん以外の特定の細胞が原因となる疾病についても、疾病の原因である細胞の表面に発現するタンパク質を標的としたモノクローナル抗体治療薬が開発、実用化されている。【０００５】
しかし依然として、がん細胞がモノクローナル抗体治療薬に対して抵抗性の場合や、一度効果を上げても再発してしまう場合は少なくない。【０００６】
モノクローナル抗体治療薬はタンパク質を介してがん細胞に結合することで、シグナル伝達を阻害したり、補体依存性細胞傷害作用（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＣＤＣという）や抗体依存性細胞傷害作用（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＡＤＣＣという）を賦活化することによりがん細胞を傷害する。【０００７】
ＣＤＣは血清中に存在する補体と呼ばれる１２種のタンパク質によって引き起こされる細胞傷害作用である。標的細胞に結合した抗体によって１２種のタンパクが順次活性化され、細胞膜を破壊する。【０００８】
ＡＤＣＣは標的細胞に結合した抗体を、抗体受容体（Ｆｃγ受容体）を持った細胞（例えば、マクロファージやナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞という））が認識し、傷害因子を分泌して標的細胞を特異的に傷害することをいう。【０００９】
ＡＤＣＣを発揮する代表的な細胞としてＮＫ細胞がある。多くのＮＫ細胞は細胞表面に発現しているＣＤ１６（Ｆｃγ受容体）を介してモノクローナル抗体治療薬のＦｃ部分に結合し、モノクローナル抗体治療薬が結合しているがん細胞を傷害する。そのため、ＮＫ細胞を体内で増やしたり、体外で増やしてから投与したりすることで、効率良くＡＤＣＣを誘導してモノクローナル抗体治療薬の効果を高めようという試みがなされているが、十分な効果を得るには至っていない。【００１０】
一方、Ｔリンパ球の一種であるγδＴ細胞の一部にもＣＤ１６が細胞膜表面に発現している集団があり、マウス抗体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  の実験ではＡＤＣＣを発揮することが知られている（非特許文献１、２）。【００１１】
しかし、γδＴ細胞は個人差があるものの末梢血リンパ球のおよそ１〜５％と少なく、さらにその中に含まれるＣＤ１６陽性細胞はさらに少ない上に、ＣＤ１６陽性γδＴ細胞自体の増殖能力はほとんどなく、それ自体を体内外で増殖させることは困難であった。また、体外でヒト末梢血単核球よりγδＴ細胞を培養しようとする一般的な過程においてＣＤ１６陽性γδＴ細胞が若干認められることも知られていたが、臨床使用可能なヒト抗体やマウス・ヒトキメラ抗体のＡＤＣＣ向上を目指してそれらのＣＤ１６陽性γδＴ細胞を大量に得ようとする努力は成されてこなかった。【００１２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９０，１４４，３３１２−３３１７
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １９９２，１４３，  ９７−１０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、モノクローナル抗体治療薬を投与した際に起こる体内でのＡＤＣＣをより向上させた医薬、治療・予防方法を提供することを課題とする。また、モノクローナル抗体治療薬の効果を向上させるためのアジュバントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち本発明は下記手段を提供するものである。【００１５】
（１）γδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を含む医薬、
（２）前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、別々の溶液に懸濁されていることを特徴とする（１）に記載の医薬、
（３）前記モノクローナル抗体治療薬を投与した後に前記γδＴ細胞を投与することを特徴とする（２）に記載の医薬、
（４）前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬を同時に投与することを特徴とする（２）に記載の医薬、
（５）前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、同一の溶液に懸濁されていることを特徴とする（１）に記載の医薬、
（６）前記γδＴ細胞はビスホスホネートとＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたことを特徴とする（１）乃至（５）のいずれか一項に記載の医薬、
（７）前記ビスホスホネートが、ゾレドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれか一項に記載の医薬、
（８）前記γδＴ細胞が、自己由来であることを特徴とする（１）乃至（７）のいずれか一項に記載の医薬、
（９）前記γδＴ細胞が、他人由来であることを特徴とする（１）乃至（７）のいずれか一項に記載の医薬、
（１０）前記モノクローナル抗体治療薬が、疾病の原因である細胞の表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持つ抗体であることを特徴とする（１）乃至（９）のいずれか一項に記載の医薬、
（１１）前記モノクローナル抗体治療薬が、トラスツズマブであることを特徴とする（１）乃至（１０）のいずれか一項に記載の医薬、
（１２）前記モノクローナル抗体治療薬が、リツキシマブであることを特徴とする（１）乃至（１０）のいずれか一項に記載の医薬、
（１３）前記モノクローナル抗体治療薬は、通常投与量の１／２０００倍量〜等量含まれることを特徴とする（１）乃至（１２）のいずれか一項に記載の医薬。【００１６】
（１４）γδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を投与する治療・予防方法、
（１５）前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、別々の溶液に懸濁されていることを特徴とする（１４）に記載の治療・予防方法、
（１６）前記モノクローナル抗体治療薬を投与した後に前記γδＴ細胞を投与することを特徴とする（１５）に記載の治療・予防方法、
（１７）前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬を同時に投与することを特徴とする（１５）に記載の治療・予防方法、
（１８）前記γδＴ細胞と前記モノクローナル抗体治療薬とが、同一の溶液に懸濁されていることを特徴とする（１４）に記載の治療・予防方法、
（１９）前記γδＴ細胞はビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたことを特徴とする（１４）乃至（１８）のいずれか一項に記載の治療・予防方法、
（２０）前記ビスホスホネートが、ゾレドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（１４）乃至（１９）のいずれか一項に記載の治療・予防方法、
（２１）前記γδＴ細胞が、自己由来であることを特徴とする（１４）乃至（２０）のいずれか一項に記載の治療・予防方法、
（２２）前記γδＴ細胞が、他人由来であることを特徴とする（１４）乃至（２２）のいずれか一項に記載の治療・予防方法、
（２３）前記モノクローナル抗体治療薬が、疾病の原因である細胞の表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持つ抗体であることを特徴とする（１４）乃至（２２）のいずれか一項に記載の治療・予防方法、
（２４）前記モノクローナル抗体治療薬が、トラスツズマブであることを特徴とする（１４）乃至（２３）のいずれか一項に記載の治療・予防方法、
（２５）前記モノクローナル抗体治療薬が、リツキシマブであることを特徴とする（１４）乃至（２３）のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法、
（２６）前記モノクローナル抗体治療薬は、通常投与量の１／２０００倍量〜等量投与することを特徴とする（１４）乃至（２５）のいずれか一項に記載の治療・予防方法。【００１７】
（２７）γδＴ細胞を含むことを特徴とするモノクローナル抗体治療薬アジュバント、
（２８）前記γδＴ細胞はビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたことを特徴とする（２７）に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント、
（２９）前記ビスホスホネートが、ゾレドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする（２７）又は（２８）に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント、
（３０）前記γδＴ細胞が、自己由来であることを特徴とする（２７）乃至（２９）に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント、
（３１）前記γδＴ細胞が、他人由来であることを特徴とする（２７）乃至（２９）に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント、
（３２）前記モノクローナル抗体治療薬が、疾病の原因である細胞の表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持つ抗体であることを特徴とする（２７）乃至（３１）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント、
（３３）前記モノクローナル抗体治療薬が、トラスツズマブであることを特徴とする（２７）乃至（３２）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント、
（３４）前記モノクローナル抗体治療薬が、リツキシマブであることを特徴とする（２７）乃至（３２）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体治療薬アジュバント。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ビスホスホネートとＩＬ−２（インターロイキン２）とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を組み合わせて医薬とすることにより、疾病の原因である細胞に結合したモノクローナル抗体治療薬のＦｃ部分にγδＴ細胞がＣＤ１６を介して結合し、ＡＤＣＣにより疾病の原因である細胞を効率良く傷害するため、γδＴ細胞、モノクローナル抗体治療薬を、それぞれ単独で用いるよりも高い相乗的効果を有する医薬を提供することが可能となる。例えば、本発明のビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞において、ＣＤ１６陽性γδＴ細胞数は当該患者の血中に存在するＣＤ１６陽性γδＴ細胞数に対し約等量〜数十倍含まれていることから、当該細胞集団を、ＡＤＣＣ活性を主要な作用機序とするモノクローナル抗体治療薬と併用することによって、高いＡＤＣＣ活性を実現できる。【００１９】
また、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞がＡＤＣＣの効果を向上させ、効率よく疾病の原因である細胞を傷害するため、モノクローナル抗体治療薬の投与量を従来よりも減らすことが可能となる。【００２０】
更に、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を組み合わせて医薬とすることで、免疫抑制効果の強い化学療法等の治療法との同時使用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について説明する。【００２２】
まず、ビスホスホネートとＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を含む医薬及び治療・予防方法について説明する。【００２３】
＜医薬及び治療・予防方法＞
本発明の医薬及び治療・予防方法は、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を含む医薬、及びそれらを投与する治療・予防方法である。本発明の医薬は例えば、がん、感染症、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）等の特定の細胞が原因である疾病の患者に投与する治療薬及び治療方法として用いることができる。またγδＴ細胞及びモノクローナル抗体治療薬は、肉眼では見えないがん細胞を傷害することができるため、手術によって取り除くことができなかった微小ながん細胞を選択的に効率良く傷害するがん再発予防薬及び再発予防方法としての利用が可能である。【００２４】
ここで疾病の原因である細胞とは、がん細胞、ウイルスに感染した細胞、自己免疫疾患の原因となる細胞（例えば関節リウマチであればＴＮＦα産生細胞等）などのことをいう。【００２５】
次いで、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞の調製方法について説明する。ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞にはＣＤ１６を発現した細胞（以下ＣＤ１６陽性γδＴ細胞という）が含まれるため、モノクローナル抗体治療薬によって誘導されるＡＤＣＣを向上させることが可能となる。【００２６】
＜γδＴ細胞の調製＞
採血により末梢血を得る。採血する方法としては、真空採血管等による全血採取を利用することができる。採血量は患者又はドナーの末梢血に含まれるγδＴ細胞の割合、γδＴ細胞の培養可能期間、投与数などを考慮し、患者又はドナーの負担とならない程度に設定することが好ましい。例えば、１４日間の培養期間で、投与するγδＴ細胞として１０９個程度のγδＴ細胞を得たい場合には、培養開始時のγδＴ細胞数を３×１０５〜１×１０６個程度確保できるように採血量を設定することが好ましい。
また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接末梢血単核球を取得することが可能である。【００２７】
例えば密度勾配遠心法により末梢血単核球を得る。末梢血単核球を培養液ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン）中に懸濁する。ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液という。なお、ここで示した培養液以外にも、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン）、イスコフ培地（ＩＭＥＭ、インビトロジェン）等の細胞の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。【００２８】
また、必要に応じて血清を０．１〜２０％添加してもよい。血清として、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、以下ＦＣＳという）、ＡＢ血清又は自己血漿等を使用してもよい。【００２９】
得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグ又はプレートに播種する。【００３０】
フラスコ、バッグ又はプレート中に播種された末梢血単核球に濃度が０．０５〜１００μＭ、好ましくは０．１〜３０μＭとなるようにビスホスホネートを添加する。ここで、使用されるビスホスホネートとしては、例えばゾレドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、インカドロネート等のアミノビスホスホネートやエチドロネート等の非アミノビスホスホネート、それらの塩及び／又はそれらの水和物が挙げられる。例えば、ゾレドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物では０．１〜１０μＭ、パミドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、アレンドロネート、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭにすることが好ましい。【００３１】
更に、上記培養液にＩＬ−２を濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加する。【００３２】
ＩＬ−２を添加した後３４〜３８℃、より好ましくは３７℃で、２〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ２存在下で培養する。この際、培養する細胞数に応じ、培養液を適宜添加する。更に、培養液の増加に伴い、ＩＬ−２の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜添加する。【００３３】
培養期間としては７日間以上であれば高純度でγδＴ細胞を含む細胞群が得られるが、γδＴ細胞の総細胞数およびＣＤ１６陽性γδＴ細胞の細胞数を増やすには、１４日間程度培養することが好ましい。【００３４】
得られた細胞を遠心分離等により回収する。【００３５】
回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）等を利用することが好ましい。【００３６】
洗浄後に得られたγδＴ細胞を遠心分離法等を用いて回収し、医薬品として使用可能な液体、例えば、生理食塩水等に懸濁して本発明の薬剤を調製することができる。この際、懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方法に応じて適宜調整される。【００３７】
このようにして得られたγδＴ細胞は単独でも非特異的な細胞傷害活性を発揮することができ、またＣＤ１６陽性γδＴ細胞を含むため、モノクローナル抗体治療薬によって誘導されるＡＤＣＣを向上させることができる。【００３８】
本発明の医薬及び治療・予防方法に用いるγδＴ細胞数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０８〜１０１２個／回／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／回／人以上である。【００３９】
また、生理食塩水等に懸濁したγδＴ細胞をモノクローナル抗体治療薬を用いて治療を行っている患者にアジュバントとして投与することによって、モノクローナル抗体治療薬による疾病の原因である細胞の傷害効果を向上させることができる。【００４０】
γδＴ細胞は、自己由来であれば、投与した際に患者の免疫系に排除されることなく、その機能を発揮することが可能である。【００４１】
γδＴ細胞は、他人由来（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ、アロジェニック）であれば、投与された他人由来のγδＴ細胞が、移植患者体内でＧＶＴ（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｕｍｏｒ）効果を発揮し、インターフェロンγやＴＮＦα（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  α、腫瘍壊死因子α）を産生するため、より強いがんの傷害効果が期待できる。【００４２】
＜モノクローナル抗体治療薬の調製＞
次にモノクローナル抗体治療薬について説明する。モノクローナル抗体治療薬としては、疾病の原因である細胞の表面上の分子を標的とし、ヒトＦｃ部分を持ったヒト抗体、ヒト化抗体およびマウス・ヒトキメラ抗体を用いることができる。例えばＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ２、ヒト上皮増殖因子受容体２型）を標的としたトラスツズマブ、ペルツズマブ、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、上皮増殖因子受容体）を標的としたセツキシマブ、ニモツズマブ、ＣＤ５２を標的としたアレムツズマブ、ＣＤ２２を標的としたエプラツズマブ、ＴＮＦαを標的としたインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、ＣＤ２０を標的としたリツキシマブ、オクレリズマブ、オファリムマブ、ＢｌｙＳ（Ｂ細胞刺激因子）を標的としたベリムマブ、ＩＬ−１を標的としたＡＭＧ１０８、ＩＬ−１５を標的としたＡＭＧ７１４、ＲＡＮＫリガンドを標的としたデノスマブ、Ｆａｓを標的としたＤＥ−０９８など、がんや自己免疫疾患など種々の分野のモノクローナル抗体治療薬があげられる。【００４３】
本明細書ではがんを対象としたリツキシマブ、トラスツズマブを例として説明する。【００４４】
リツキシマブはヒトＢリンパ球表面に発現するＣＤ２０抗原に結合するモノクローナル抗体であり、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫を対象としたモノクローナル抗体治療薬である。また、ＣＤ２０陽性慢性リンパ性白血病の治療薬として用いられることもある。更に、関節リウマチなどの自己免疫疾患に対する治療薬としての治験も進められている。【００４５】
リツキシマブは例えばリツキサン（登録商標、中外製薬から販売）等として入手することができる。瓶内のリツキシマブ溶液を生理的に許容可能な溶液、例えば生理食塩水等により希釈して調製する。【００４６】
リツキシマブの投与量は０．０００１〜３０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。特に、臨床におけるリツキシマブの投与量は１回３７５ｍｇ／ｍ２であるが、患者の状態に応じて減量することもできる。【００４７】
トラスツズマブはＨＥＲ２に結合するモノクローナル抗体で、ＨＥＲ２過剰発現が確認された転移性乳がんを対象としたモノクローナル抗体治療薬である。また、ＨＥＲ２を過剰に発現したその他のがんの治療薬として用いられることもある。【００４８】
トラスツズマブは例えばハーセプチン（登録商標、中外製薬から販売）等として入手することができる。バイアル内のトラスツズマブを注射用水に溶解して、必要量抜き取り、生理的に許容可能な溶液、例えば生理食塩水等に溶解して調製する。【００４９】
トラスツズマブの投与量は０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。特に、臨床におけるトラスツズマブの投与量は初回投与時は４ｍｇ／ｋｇ、２回目以降は２ｍｇ／ｋｇであるが、患者の状態に応じて減量することもできる。【００５０】
＜医薬の調製及び治療・予防方法＞
調製したリツキシマブ又はトラスツズマブと、γδＴ細胞はそれぞれ別の溶液とし、治療・予防薬として用いることができる。この場合、同時に患者に投与することやモノクローナル抗体治療薬を投与した後、γδＴ細胞を投与することができる。【００５１】
また、調製したリツキシマブ又はトラスツズマブを、γδＴ細胞を懸濁した生理食塩水に添加し、医薬とすることもできる。【００５２】
ビスホスホネートおよびＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を一つの溶液とすることで、１度に２種を投与することができ、患者への負担や作業の軽減を図ることができる。【００５３】
投与頻度としては、同時投与を行う場合はリツキシマブまたはトラスツズマブの投与頻度と同じとし、適時γδＴ細胞を単独で追加投与することも可能である。【００５４】
本薬剤を投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下、リンパ節等へ注射することができる。また、病変部に直接注入してもよく、例えば内視鏡的または経皮的に直接穿針して投与することもできる。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよく、例えばがん栄養血管に選択的に挿入された動脈カテーテルを経由して投与することができる。【００５５】
この際、リツキシマブを添加した場合には投与開始時にはリツキシマブが２５ｍｇ／時の速度となるようにし、患者の状態を観察しながら１００ｍｇ／時、２００ｍｇ／時まで速度を上げることができる。【００５６】
トラスツズマブを添加した場合には９０分以上かけて投与するようにする。【００５７】
また、ビスホスホネートおよびＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞は、モノクローナル抗体治療薬の効果を増強するような特性を持つため、モノクローナル抗体治療薬アジュバントとして用いることが可能である。【００５８】
ビスホスホネートおよびＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞をモノクローナル抗体治療薬アジュバントとして使用し、がん、感染症及び自己免疫疾患等の治療・予防剤と併用する場合には、様々なサイトカイン及びインターフェロン等を組み合わせることも可能である。【００５９】
ビスホスホネートおよびＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞は様々なモノクローナル抗体治療薬に対するアジュバントとして用いることが可能であり、先に例示したのと同様のものが使用できる。【００６０】
モノクローナル抗体治療薬を用いた治療において、モノクローナル抗体治療薬、及びビスホスホネートおよびＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞を含むモノクローナル抗体治療薬アジュバントを投与する順序としては
１）モノクローナル抗体治療薬を同時に別剤として投与する場合、
２）モノクローナル抗体治療薬を含む薬剤を投与した後に、適宜時間を経て別剤として投与する場合、
３）モノクローナル抗体治療薬と混合した薬剤を投与する場合、
等が挙げられ、いずれの順序でも良いが、患者の症状に応じて適宜調整される。【００６１】
ビスホスホネートおよびＩＬ−２で活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞を含むモノクローナル抗体治療薬アジュバントは既存のモノクローナル抗体治療薬のみならず、今後開発されるモノクローナル抗体治療薬の効果をも向上させることが可能である。【００６２】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００６３】
＜γδＴ細胞の調製＞
健常人ドナー及び担がん被験者から血液を採取し、フィコールパック（アマシャム  バイオサイエンス社）を用いた密度勾配遠心法により末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、以下ＰＢＭＣという）を回収した。【００６４】
ＰＢＭＣを１０％となるようにヒトＡＢ血清（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）に、さらに７００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（カイロン）及び１μＭのゾレドロネート（商品名ゾメタ  登録商標、ノバルティス）を添加し、１４日間培養した。【００６５】
１０〜１４日間培養するとエフェクター細胞中に含まれるγδＴ細胞は７０〜９５％となった。【００６６】
代表的なＣＤ１６陽性γδＴ細胞の増殖を図１Ａに示した。培養７日目までは総γδＴ細胞数の増加を認めたが、γδＴ細胞のＣＤ１６陽性率は低かった。それに続く１４日目までの期間は緩やかに総γδＴ細胞数が増加したが、そのうちＣＤ１６陽性であるものの割合が急速に増加した（図１Ａ）。１×１０７個のＰＢＭＣを１４日間培養することにより、平均９．７×１０７個のγδＴ細胞を得たが、平均４．５×１０７個がＣＤ１６陽性γδＴ細胞であった。総γδＴ細胞の増殖比は平均２５０倍であったが、ＣＤ１６陽性γδＴ細胞の増殖比は平均４３０倍であり、ＣＤ１６陽性γδＴ細胞をより効率良く増殖させることが出来た（図１Ｂ，  ｎ＝１０）。培養後のγδＴ細胞に占めるＣＤ１６陽性細胞の割合は、健常人で平均４７％（ｎ＝５）、坦がん患者で平均４０％（ｎ＝５）であり、この方法が坦がん患者においてもＣＤ１６陽性γδＴ細胞を効率良く増殖させることが出来ることが確認された（図１Ｃ）。【００６７】
機能解析の実験を行う際には、事前にエフェクター細胞群から磁気ビーズシステムｍｉｎｉＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク）を用い、必要に応じてＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞及びＣＤ５６陽性細胞を除去してγδＴ細胞の精製を行った。【００６８】
＜細胞株の準備＞
ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株としてＤａｕｄｉ、Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓ細胞株、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞としてＳＫ−ＢＲ３、ＨＥＲ２陰性がん細胞（ネガティブコントロール）としてＭＤＡ−ＭＢ２３１をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手して標的がん細胞として使用した。細胞株は１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン、Ｆａｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、以下ＦＣＳという）を含むＲＰＭＩ１６４０培地により３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。付着性細胞を培養容器からはがす際には０．０５Ｍ  ＥＤＴＡを使用した。【００６９】
＜がん細胞の準備＞
慢性リンパ球性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ、以下ＣＬＬという）の患者から採血し、密度勾配遠心法によりＰＢＭＣを取得した。これらの患者の末梢リンパ球数は正常の１０倍程度に増加しており、そのほとんどががん細胞であることが確認され、これを標的がん細胞として用いた。【００７０】
濾胞性Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）の患者由来のリンパ節生検組織を得た。同時に行った組織学的検査により、リンパ節の大部分はがん細胞で占められていることが確認された。このリンパ節生検組織を少量のＲＰＭＩ１６４０培地内で小切片に分け、ナイロン製のセルステイナー（ＢＤバイオサイエンス）とプランジャーを用いて、単細胞の懸濁液を調製し、これを標的がん細胞として用いた。【００７１】
＜非付着性がん細胞に対する細胞傷害活性＞
標的細胞としてＤａｕｄｉ、Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓ細胞株、ＣＬＬ患者又はＮＨＬ（非ホジキンリンパ腫；Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）患者から取得したがん細胞を使用し、標的細胞と反応細胞を区別するために、標的細胞をＰＫＨ−２６（ＰＫＨ２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ、ＳＩＧＭＡ）で染色した。【００７２】
γδＴ細胞と標的細胞の比（以下Ｅ：Ｔと表す）が１：１〜２５：１となるように４８ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で４時間共培養を行った。共培養の際、ヒトＩｇＧ抗体（シグマ−アルドリッチ）を１０μｇ／ｍＬ添加した群、リツキシマブ（ロシュ）を１０μｇ／ｍＬ添加した群、抗体を添加しない群を準備した。また、標的細胞にリツキシマブのみを添加した群も準備した。【００７３】
共培養した細胞を回収し、アポトーシスの初期および後期段階を同定するＡｎｎｅｘｉｎＶと、アポトーシス後期およびネクローシスを同定する７ＡＡＤ（ＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖ／７ＡＡＤ  ＫＩＴ、ベックマン・コールター）により染色し、それぞれのがん細胞株又はがん細胞に対する細胞傷害活性をＦＡＣＳにより測定した。ＦＡＣＳ解析においてＰＫＨ−２６陽性細胞にゲートをかけることで標的がん細胞の受けた細胞傷害のみを解析することができる。【００７４】
Ａｎｎ＋はＡｎｎｅｘｉｎＶの蛍光を発色していた細胞数、Ａｎｎ−は発色していない細胞数を示す。また、７ＡＡＤ＋は７ＡＡＤの蛍光を発色していた細胞数、７ＡＡＤ−は発色していなかった細胞数を示している。すなわち、Ａｎｎ−７ＡＡＤ＋はネクローシスを起こしている細胞、Ａｎｎ＋７ＡＡＤ＋はアポトーシス後期である細胞、Ａｎｎ＋７ＡＡＤ−はアポトーシス初期である細胞、Ａｎｎ−７ＡＡＤ−は生存している細胞であることを示す。
なお、細胞傷害活性の値は下記の式により算出した。【００７５】
【数１】
2008152822.tif 000003
【００７６】
図２に示すように、ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉに対して、リツキシマブとＣＤ１６陽性γδＴ細胞を多く含む同種γδＴ細胞（患者由来）を併用することにより、それぞれを単独で使用する場合よりも有意に高い細胞傷害活性を得ることが可能であった（併用時の細胞傷害活性はリツキシマブ単独投与時の１０倍、γδＴ細胞単独投与時の２倍、Ｅ：Ｔ＝５：１、ｎ＝１０）。ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓにおいても同様の傾向を認めた（それぞれ２０倍と１７倍、３．５倍と２．５倍、Ｅ：Ｔ＝５：１）。【００７７】
また、図３に示すように、ＣＬＬ患者より得たがん細胞を標的とした場合も、リツキシマブとＣＤ１６陽性γδＴ細胞を多く含む同種γδＴ細胞（他患者由来）を併用することにより、それぞれを単独で使用する場合よりも有意に高い細胞傷害活性を得ることが可能であった（併用時の細胞傷害活性はリツキシマブ単独投与時の３倍、γδＴ細胞単独投与時の６倍、Ｅ：Ｔ＝５：１）。【００７８】
さらに、図４に示すように、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫の患者由来がん細胞を標的として自家γδＴ細胞（患者本人由来）を用いた場合、リツキシマブとＣＤ１６陽性γδＴ細胞を多く含むγδＴ細胞を併用することにより、それぞれを単独で使用する場合よりも有意に高い細胞傷害活性を得ることが可能であった（併用時の細胞傷害活性はリツキシマブ単独投与時の７倍、γδＴ細胞単独投与時の２倍、Ｅ：Ｔ＝５：１）。【００７９】
＜付着性がん細胞に対する細胞傷害活性＞
標的細胞としてＳＫ−ＢＲ３とＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（プロメガ社）の解説に従いｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ（ＭＴＳ  ａｓｓａｙ）を行った。ＭＴＳ（テトラゾリウム化合物）は生細胞によって生物的に還元され、組織培養液に可溶な発色性のホルマザン産物へと変換されるため、この発色の吸光度を測定することにより共培養後の標的細胞生存率および傷害率が測定可能となる。【００８０】
ＳＫ−ＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を９６穴プレートに１×１０４個／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃で一昼夜培養して接着させた。γδＴ細胞と標的細胞の比がＥ：Ｔ＝１：１〜２５：１となるようにγδＴ細胞を添加し、共培養を４時間行った。共培養の際、ヒトＩｇＧ抗体を２μｇ／ｍＬ添加した群、トラスツズマブ（ロシュ）を２μｇ／ｍＬ添加した群、抗体を添加しない群を準備した。また、標的細胞にトラスツズマブのみを添加した群も準備した。【００８１】
共培養の後、培地及び培地中に浮遊している細胞を取り除き、ＭＴＳテトラゾリウム塩（３１７  μｇ／ｍｌ）を含む新しい培地を加えた。【００８２】
３時間の反応後、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて４９０ｎｍに対する光学密度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ、以下ＯＤという）を測定した。
細胞傷害活性は以下の式により算出した。【００８３】
【数２】
2008152822.tif 000004
【００８４】
図５に示すように、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＳＫ−ＢＲ３に対して、トラスツズマブとＣＤ１６陽性γδＴ細胞を多く含む同種γδＴ細胞（患者由来）を併用することにより、それぞれを単独で使用する場合よりも有意に高い細胞傷害活性を得ることが可能であった（併用時の細胞傷害活性はトラスツズマブ単独投与時の１５倍、γδＴ細胞単独投与時の１１倍、Ｅ：Ｔ＝５：１、ｎ＝８）。しかし、ＨＥＲ２陰性乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１においては、併用効果はほとんど見られなかった。【００８５】
＜ＨＥＲ２発現細胞株に対する細胞傷害活性＞
標的細胞としてＨＥＲ２高発現乳がん細胞株であるＢＴ４７４（ＡＴＣＣより購入）を使用し、ＡＤＣＣ活性の測定を行った。ＢＴ４７４をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（同仁科学）１０μｇ／ｍＬで３７℃、３０分染色後洗浄し、トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン、中外製薬）０．２μｇ／ｍＬを添加した群と添加しない群を準備した。それぞれの群を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔｅｒ）に１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。そこへＣＤ１６を発現したγδＴ細胞を多く含む細胞集団を標的細胞に対して１：１〜２５：１となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４時間共培養を行った。
次いで１時間ごとのターゲット細胞の蛍光強度を測定、０時間測定時の蛍光強度からの残存率を算出し、下記の式により細胞傷害活性を求めた。【００８６】
【数３】
2008152822.tif 000005
【００８７】
図６に示すようにＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＢＴ４７４に対して、トラスツズマブとビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞を併用することにより、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞を単独で使用する場合よりも高い細胞傷害活性を得ることが可能であった。【００８８】
＜トラスツズマブの濃度依存性＞
ＳＫ−ＢＲ３を９６穴プレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃で一昼夜培養して接着させた。ＣＤ１６を発現したγδＴ細胞を含む細胞集団と標的細胞のＥ：Ｔが１：１〜２５：１となるようにγδＴ細胞を添加し、共培養を４時間行った。共培養の際、トラスツズマブを０．００１〜１μｇ／ｍＬ添加した群と添加しない群を準備した。【００８９】
共培養の後、培地及び培地中に浮遊している細胞を取り除き、ＭＴＳテトラゾリウム塩（３１７  μｇ／ｍｌ）を含む新しい培地を加えた。【００９０】
３時間の反応後、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて４９０ｎｍに対するＯＤを測定した。また、細胞傷害活性は（数２）の式により算出した。【００９１】
図７に示すように、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞はＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＳＫ−ＢＲ３に対して、トラスツズマブの濃度が０．１μｇ／ｍＬ以上の濃度において高いＡＤＣＣ活性を得ることが可能であった。ハーセプチンの添付文書によると、ハーセプチンと投与時の血中動態は承認されている初回投与時の４ｍｇ／ｋｇを投与した場合最高血中濃度は７２±１７μｇ／ｍＬ、２回目以降の２ｍｇ／ｋｇを投与した場合は最高血中濃度は４３±８．５μｇ／ｍＬであるから、γδＴ細胞は十分にＡＤＣＣ機能を発揮することができる。また、ハーセプチン濃度が０．１μｇ／ｍＬでもγδＴ細胞はＡＤＣＣ機能を発揮できることからハーセプチンとγδＴ細胞と組み合わせた医薬では、モノクローナル抗体治療薬の投与量を少なくしても（ハーセプチンの最高血中濃度と本実施例濃度を比較すると約１／７００〜１／４００）、ほぼ同等の細胞傷害活性効果が得られることが示唆された。【００９２】
＜リツキシマブの濃度依存性＞
標的細胞としてＣＤ２０陽性細胞株であるＤａｕｄｉとＲａｊｉを使用し、標的細胞と反応細胞を区別するために、標的細胞をＰＫＨ−２６で染色した。【００９３】
ＣＤ１６陽性γδＴ細胞を多く含む細胞集団と標的細胞のＥ：Ｔが５：１、１０：１となるように４８ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で４時間共培養を行った。共培養の際、リツキシマブ（商品名：リツキサン、全薬工業、中外製薬）を０．０１〜１０μｇ／ｍＬ添加した群と添加しない群を準備した。【００９４】
共培養した細胞を回収し、ＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖ／７ＡＡＤ  ＫＩＴにより染色し、それぞれのがん細胞株に対する細胞傷害活性をＦＡＣＳにより測定した。また、細胞傷害活性の値は（数１）の式により算出した。【００９５】
図８に示すように、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞はＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株ＤａｕｄｉとＲａｊｉに対して、リツキシマブの濃度が０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度において高いＡＤＣＣ活性を得ることが可能であった。【００９６】
＜γδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を併用する場合の適時性＞
標的細胞としてＣＤ２０陽性細胞株であるＲａｊｉを使用し、標的細胞と反応細胞を区別するために、標的細胞をＰＫＨ−２６で染色した。【００９７】
ＣＤ１６陽性γδＴ細胞を多く含む細胞集団と標的細胞のＥ：Ｔが１：１〜２５：１となるように４８ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で４時間共培養を行った。共培養の際、リツキシマブの血中濃度域でγδＴ細胞とリツキシマブが同時に存在することを想定し、０．１〜２００μｇ／ｍＬ添加した群と添加しない群を準備した。実際にリツキシマブを通常用量で投与した場合、得られる最高血中濃度は１９４．３±５８．３μｇ／ｍＬである（リツキサンインタビューフォームより抜粋）。【００９８】
また、共培養の際、あらかじめ標的細胞にリツキシマブを１０μｇ／ｍＬで、４℃、３０分間処理した後にリツキシマブを洗浄除去した群、リツキシマブを１０μｇ／ｍＬ添加した群と添加していない群を準備した。【００９９】
図９に示すように、ビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞はリツキシマブの濃度が０．１〜２００μｇ／ｍＬの条件下において同程度のＡＤＣＣ活性を有していることが確認された。このことから、リツキシマブが高濃度に存在していてもγδＴ細胞によるＡＤＣＣ活性に影響を与えないことが示され、γδＴ細胞とリツキシマブを同時に投与できる可能性が示された。【０１００】
また、リツキサンの添付文書によると、リツキサン投与時の血中動態は、最高血中濃度１９４．３±５８．３μｇ／ｍＬであるから、γδＴ細胞は十分にＡＤＣＣ機能を発揮することができる。また、リツキサン濃度が０．１μｇ／ｍＬでもγδＴ細胞はＡＤＣＣ機能を発揮できることからリツキシマブとγδＴ細胞と組み合わせた医薬では、モノクローナル抗体治療薬の投与量を少なくしても（リツキサンの最高血中濃度と本実施例濃度を比較すると約１／２０００）、ほぼ同等の細胞傷害活性効果が得られることが示唆された。【０１０１】
図１０に示すように、標的細胞にリツキシマブを処理し洗浄した群とリツキシマブが共存している群に傷害活性の差は確認されず、γδＴ細胞単独よりも高い傷害活性を有していることが確認された。このことから、リツキシマブをあらかじめ投与し、腫瘍細胞とリツキシマブが結合した条件下に、γδＴ細胞を投与することにより高い傷害活性が期待できることが示された。洗浄した群とリツキシマブが共存している群と傷害活性の差が確認されなかったことから、γδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬は混合して同時に投与しても、先にモノクローナル抗体治療薬を投与してその後にγδＴ細胞を投与する時間差投与しても細胞傷害活性を示すことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
以上説明したように、本発明のビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞とモノクローナル抗体治療薬を含む医薬及び治療・予防方法は効率よく疾病の原因である細胞を傷害することができる。またビスホスホネートとＩＬ−２とで活性化及び／又は増殖させたγδＴ細胞を含むモノクローナル抗体治療薬アジュバントはモノクローナル抗体治療薬が誘導する疾病の原因である細胞に対するＡＤＣＣを向上させることができる。したがって、本発明は例えばがん治療のための薬剤等の医薬製剤分野や、免疫細胞療法や骨髄移植等の医療分野等に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】（Ａ）  代表的なＣＤ１６陽性γδＴ細胞の増殖パターン。（Ｂ）  １４日間の培養後のＣＤ１６陽性、陰性および総γδＴ細胞数の比較。（Ｃ）  同増殖比の比較。
【図２】ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ）に対するリツキシマブ、同種γδＴ細胞（患者由来）、および併用時の細胞傷害能の比較。
【図３】ＣＤ２０陽性ＣＬＬ細胞に対するリツキシマブ、同種γδＴ細胞（他患者由来）、および併用時の細胞傷害能の比較。
【図４】ＣＤ２０陽性ＮＨＬ細胞に対するリツキシマブ、自己γδＴ細胞、および併用時の細胞傷害能の比較。
【図５】ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＳＫ−ＢＲ３および、陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１に対するトラスツズマブ、同種γδＴ細胞（患者由来）、および併用時の細胞傷害能の比較。
【図６】ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＢＴ４７４に対するγδＴ細胞、トラスツズマブ併用時の細胞傷害能の比較。
【図７】ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株ＳＫ−ＢＲ３に対するγδＴ細胞のＡＤＣＣ活性におけるトラスツズマブの濃度依存性。
【図８】ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株（Ａ）Ｄａｕｄｉ（Ｂ）Ｒａｊｉに対するγδＴ細胞のＡＤＣＣ活性におけるリツキシマブの濃度依存性。
【図９】ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株Ｒａｊｉに対するγδＴ細胞のＡＤＣＣ活性におけるリツキシマブの血中濃度域での影響。
【図１０】ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞株Ｒａｊｉに対するγδＴ細胞のＡＤＣＣ活性におけるリツキシマブの洗浄条件または共存下での細胞傷害能の比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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