(57)【要約】本発明は、ダンマラン系列トリテルペンを酸化する活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、およびそれらの利用を提供する。本発明は、具体的には、カンゾウ属植物から得られる、ダンマラン系列トリテルペンを酸化する活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子およびその使用に関し、タンパク質は配列番号１、２または１３に示され、それをコードする遺伝子はそれぞれ配列番号３、４、１４に示される。また、該遺伝子を導入した形質転換体が作製され、トリテルペン酸化酵素を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記ダンマラン系列トリテルペンが、β−アミリンまたは３０−ヒドロキシ−β−アミリンである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
カンゾウ属植物に由来する、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記カンゾウ属植物が、グルキルリザ・ウラレンシスまたはグルキルリザ・グラブラである、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項６】
配列番号２または配列番号１３に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
前記ダンマラン系列トリテルペンが、β−アミリンまたは３０−ヒドロキシ−β−アミリンである、請求項７に記載の遺伝子。
【請求項９】
カンゾウ属植物に由来する、請求項７または８に記載の遺伝子。
【請求項１０】
前記カンゾウ属植物が、グルキルリザ・ウラレンシスまたはグルキルリザ・グラブラである、請求項９に記載の遺伝子。
【請求項１１】
以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの塩基配列を有する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子。
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列
（ｅ）配列番号３に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列
（ｆ）配列番号３に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列
（ｇ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項１２】
配列番号４または配列番号１４に示す塩基配列を有する、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１４】
請求項７〜１２のいずれかに記載の遺伝子または請求項１３に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１５】
カンゾウ属植物である、請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
カンゾウ属植物が、グルキルリザ・ウラレンシスまたはグルキルリザ・グラブラである、請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】
請求項７〜１２のいずれかに記載の遺伝子の発現が増強された、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項７〜１２のいずれかに記載の遺伝子の発現が抑制された、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の形質転換体を培養または育成させ、培養物または育成物から請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質を採取することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質をダンマラン系列トリテルペンに作用させる、ダンマラン系列トリテルペンの酸化方法。
【請求項２１】
植物における請求項７〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子の有無または発現を判定し、植物を選抜する方法であって、前記植物から調製された核酸含有サンプルについて、前記遺伝子もしくはその断片を用いてＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法または核酸ハイブリダイゼーションを行い、前記遺伝子を検出または定量することを含む、前記植物選抜法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンゾウ属植物由来のダンマラン系列トリテルペンを酸化する酵素、それをコードする遺伝子およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンゾウ属植物は、マメ科の多年生草本植物である。その地下部の根およびストロン（ｓｔｏｌｏｎ）は、漢方原料として最も重要なものの一つであり、世界的にも広く薬用に用いられている。カンゾウ属植物のうち、グルキルリザ・ウラレンシス（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、グルキルリザ・グラブラ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ）、およびグルキルリザ・インフラータ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｉｎｆｌａｔａ）の主活性成分は、トリテルペンサポニンのグリチルリチンである。本成分について、生薬学的研究、薬理学的研究、育種学的研究などさまざまな側面から数多くの研究が行われている。ところが、本成分の生合成経路については、トリテルペンであるβ−アミリン以降どのように生合成されるか全く不明であった。良質の生薬を安定かつ持続的に提供するためには、活性成分グリチルリチンの生合成遺伝子そのものあるいは遺伝子発現をマーカーとして、産生に最適な条件の確立や高生産株の選抜などを行う必要がある。ところが生合成経路が不明であるために、このようなアプローチができなかった。また、生合成遺伝子の導入による高グリチルリチン産生植物の分子育種もできなかった。
β−アミリンからソヤサポゲノールＢを生合成する経路については研究が進められており、β−アミリンの２４位を水酸化する酵素をコードする遺伝子ＣＹＰ９３Ｅ（図１）が国際公開第ＷＯ／２００５／０８０５７２号およびＳｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｍｙｒｉｎ  ａｎｄ  ｓｏｐｈｏｒａｄｉｏｌ２４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ  ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２００６  Ｍａｒ；２７３（５）：９４８−５９．に開示されている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、ダンマラン系列トリテルペンを酸化する活性を有するタンパク質、およびそれをコードする遺伝子を同定し、当該タンパク質、遺伝子およびそれらの利用を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、β−アミリンなどのダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する触媒機能を有する新規チトクロームＰ４５０遺伝子（以下Ｐ４５０遺伝子という）を単離することに成功し、本発明を完成した。
本発明は、要約すると以下の通りである。
〔１〕ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質。
〔２〕前記ダンマラン系列トリテルペンが、β−アミリンまたは３０−ヒドロキシ−β−アミリンである、〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕カンゾウ属植物に由来する、〔１〕または〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕前記カンゾウ属植物が、グルキルリザ・ウラレンシスまたはグルキルリザ・グラブラである、〔３〕に記載のタンパク質。
〔５〕以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのアミノ酸配列を有する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
〔６〕配列番号２または配列番号１３に示すアミノ酸配列を有する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔７〕ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
〔８〕前記ダンマラン系列トリテルペンが、β−アミリンまたは３０−ヒドロキシ−β−アミリンである、〔７〕に記載の遺伝子。
〔９〕カンゾウ属植物に由来する、〔７〕または〔８〕に記載の遺伝子。
〔１０〕前記カンゾウ属植物が、グルキルリザ・ウラレンシスまたはグルキルリザ・グラブラである、〔９〕に記載の遺伝子。
〔１１〕以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの塩基配列を有する、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の遺伝子。
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列
（ｅ）配列番号３に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列
（ｆ）配列番号３に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列
（ｇ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
〔１２〕配列番号４または配列番号１４に示す塩基配列を有する、〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の遺伝子。
〔１３〕〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
〔１４〕〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子または〔１３〕に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
〔１５〕カンゾウ属植物である、〔１４〕に記載の形質転換体。
〔１６〕カンゾウ属植物が、グルキルリザ・ウラレンシスまたはグルキルリザ・グラブラである、〔１５〕に記載の形質転換体。
〔１７〕〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子の発現が増強された、〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔１８〕〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子の発現が抑制された、〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔１９〕〔１４〕〜〔１７〕のいずれかに記載の形質転換体を培養または育成させ、培養物または育成物から〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のタンパク質を採取することを含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔２０〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のタンパク質をダンマラン系列トリテルペンに作用させる、ダンマラン系列トリテルペンの酸化方法。
〔２１〕植物における〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子の有無または発現を判定し、植物を選抜する方法であって、前記植物から調製された核酸含有サンプルについて、前記遺伝子もしくはその断片を用いてＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法または核酸ハイブリダイゼーションを行い、前記遺伝子を検出または定量することを含む、前記植物選抜法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−２０４７６９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、グリチルリチン、ソヤサポニンＩの生合成経路を示し、図１Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析結果を示す。
図２は、トリテルペノイドの合成方法を示す。
図３は、トリテルペノイドの合成方法を示す。
図４は、本発明のタンパク質によるβ−アミリンの変換物の検出結果を示す。
図５は、本発明のタンパク質による３０−ヒドロキシ−β−アミリンの変換物の検出結果を示す。
図６は、ＮＭＲによる１１−オキソ−β−アミリンの測定結果を示す。
図７は、ＮＭＲによる１１α−ヒドロキシ−β−アミリンの測定結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明について詳細に述べる。
（１）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するトリテルペン酸化酵素である。ダンマラン系列トリテルペンとは、２，３−オキシドスクアレンがｃｈａｉｒ（いす型）−ｃｈａｉｒ−ｃｈａｉｒ−ｂｏａｔ（舟型）のコンフォメーションをとって閉環したダンマレンカチオン（ｄａｍｍａｒｅｎｅ  ｃａｔｉｏｎ）から生成する化合物群であり、四環性化合物、五環性化合物などを含む。具体的にはダンマラン型、リモノイド型、クアシノイド型、ルパン型、オレアナン型、ウルサン型トリテルペンが挙げられる。本発明においてダンマラン系列トリテルペンは特に限定されないが、好ましくはオレアナン型トリテルペンである。オレアナン型トリテルペンとしてβ−アミリン、オレアノール酸、ヘデラゲニン、１１−デオキソグリチルレチン酸、カメリアゲニン、ソヤサポゲノール、サイコゲニンが挙げられ、特に限定されないが、好ましくはβ−アミリン、および３０−ヒドロキシ−β−アミリンである。
本発明のタンパク質として、
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質、または
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質
が挙げられる。
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、カンゾウ属植物（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）のストロンから得られた遺伝子（配列番号３）によりコードされるタンパク質である。
本発明において「配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいことを意味する。
このようなアミノ酸配列の例として、配列番号２、配列番号１３に示すアミノ酸配列が挙げられる。配列番号２、配列番号１３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して、それぞれアミノ酸が４箇所、７箇所異なる。また配列番号２、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ配列番号４、配列番号１４に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる。
また、本発明において「配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」の「同一性」は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上である。
本発明のタンパク質の由来は特に限定されないが、カンゾウ属植物が好ましく、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓまたはＧｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａがより好ましい。
本発明におけるカンゾウ属植物とは、マメ科カンゾウ属に分類される植物であって、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｉｎｆｌａｔａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ａｓｐｅｒａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｅｕｒｙｃａｒｐａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｐａｌｌｉｄｉｆｌｏｒａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｌｅｐｉｄｏｔａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ａｃａｎｔｈｏｃａｒｐａ等が例示できる。このうち、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｉｎｆｌａｔａおよびＧｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓからグリチルリチンが検出されたとの報告がある。
本発明のタンパク質は、例えばカンゾウ属植物のストロンあるいは根から公知の方法を用いて得ることができるが、配列番号１、２または１３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を公知の化学合成法により合成してもよいし、後述の当該タンパク質をコードする遺伝子を取得して、公知の遺伝子組換え技術により作製してもよい。
また、配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、または配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、例えば後述の遺伝子を当該技術分野で公知の手法で改変することによって得ることができる。遺伝子に変異を導入するには、例えばＫｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法などの公知手法またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（宝酒造社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（宝酒造社製））、あるいはＬＡＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（宝酒造社製）などを用いて変異を導入できる。また、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法なども用いることができる。
本発明のタンパク質は、ダンマラン系列トリテルペンの酸化方法に用いることができる。例えば、本発明のタンパク質を基質であるβ−アミリンに作用させると、β−アミリンの１１位の炭素が酸化される。酸化によって得られる物質として１１α−ヒドロキシ−β−アミリン、１１−オキソ−β−アミリンなどが例示できる。また、本発明のタンパク質を基質である３０−ヒドロキシ−β−アミリンに作用させると、３０−ヒドロキシ−β−アミリンの１１位の炭素が酸化される。酸化によって得られる物質として１１α，３０−ジヒドロキシ−β−アミリン、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンなどが例示できる。
（２）本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする。
本発明者らは、カンゾウ属植物のストロンからｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーを作製してＥＳＴ解析を行った。β−アミリンから数段階の酸化、配糖化などを経てグリチルリチン（グリチルリチン酸ともいう）を生合成する経路においてＰ４５０遺伝子が関係していると考え、公知のＰ４５０遺伝子の塩基配列で検索を行い、候補遺伝子を絞り込んだ。候補遺伝子について遺伝子発現解析を行い、本発明の遺伝子を同定した（後記実施例参照）。
本発明の遺伝子として、
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列、
（ｅ）配列番号３に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列であって、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、または
（ｇ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
が挙げられる。
本発明において「配列番号３に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、配列番号３に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、配列番号３に示す塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよく、あるいは配列番号３に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基に置換してもよいことを意味する。
本発明において「配列番号３に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上である。
このような遺伝子の例として、例えば配列番号４に示す塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。配列番号４に示す塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列と比較して塩基が１１箇所異なる。さらにまた、このような遺伝子の例として、Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａに由来する配列番号１４に示す塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。配列番号１４に示す塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列と比較して塩基が１４箇所異なる。
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち配列番号３で示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基性配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
本発明の遺伝子は、カンゾウ属植物から公知の方法を用いて単離できる。配列番号３、配列番号４、または配列番号１４に示す塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、本発明の遺伝子は、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、当該遺伝子の一部である断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは本発明の遺伝子は、化学合成法などの公知の核酸配列合成法によって合成してもよい。
さらに、配列番号３に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、または配列番号３に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列は、上述の方法で変異を導入するなどして作製することができる。
（３）本発明の組換えベクター
本発明の組換えベクターは、上記遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターの種類は特に限定されず、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＳ１、ｐＴｒｉＥＸＴＭ系（宝酒造）などのベクターを用いることができる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等のウイルスベクターも用いることができる。また、例えばｐＢＩ系などのバイナリーベクターを用いてもよい。
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また目的遺伝子のほかに、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。さらにβ−アミリン合成酵素遺伝子を含めてもよい。
植物細胞で作動可能なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーターなどが挙げられる。また、細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはファージ・ラムダのＰＲもしくはＰＬプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターなどが挙げられる。真菌で作動可能なプロモーターとしては、ＡＤＨ３プロモーター、ｔｐｉＡプロモーターなどが挙げられる。動物細胞で作動可能なプロモーターとしては、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター、ＣＭＶプロモーターなど、昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
エンハンサーとしては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、ＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサーなどが挙げられる。
ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター、大腸菌リポポリプロテインｌｐｐの３’ターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ａｍｙＢターミネーター、ＡＤＨ１遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
（４）本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、上記遺伝子または組換えベクターを適当な宿主に導入することによって作製することができる。
宿主は、導入された遺伝子が発現可能であれば限定されず、大腸菌や枯草菌などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、ピヒア・パストリスなどの酵母、アスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、トリコデルマなどの真菌、または単子葉または双子葉植物、例えばマメ科、アブラナ科などに属する植物、植物細胞、あるいは動物細胞、例えばｓｆ９、ｓｆ２１などの昆虫細胞でもよい。
遺伝子または組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。導入された遺伝子は、宿主のゲノムＤＮＡ中に組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
上述の方法で本発明の遺伝子または組換えベクターを宿主に導入し、遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認してもよい。この確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどにより行うことができる。
また、本発明の遺伝子または組換えベクターを発現可能に導入して、本発明の遺伝子の発現を増強した形質転換体を提供することができる。従って本発明によれば、本発明の遺伝子の発現が増強されることによってグリチルリチンの産生量が増加した形質転換体も提供し得る。
形質転換体が植物の場合、マメ科植物、特にカンゾウ属植物（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓ、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｉｎｆｌａｔａを含む）が好ましい。本発明において「植物」は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、それらの培養物、種子を含み、「形質転換植物」は、遺伝子操作により作製された形質転換植物およびその後代を含む。形質転換の対象は、植物体、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）を含む）または植物細胞でもよく、特に限定されない。
形質転換の結果得られる腫瘍組織、シュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。植物体の再生は、一般的には、適当な種類のオーキシンとサイトカイニンを混ぜた培地の上で根を分化させてから、サイトカイニンを多く含む培地に移植させシュートを分化させた後にホルモンを含まない土壌に移植することによって行う。
さらに、本発明の遺伝子の発現を抑制した形質転換体を提供することができる。そのような形質転換体は、例えばグリチルリチン生合成経路の解明の研究などに用いることができる。本発明の遺伝子の発現の抑制には、該遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれ、遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。遺伝子が人為的または天然に変異、破壊されたり、あるいは各種遺伝子工学的手法、例えばＲＮＡ干渉法、アンチセンス法、リボザイム法、共抑制法、転写因子を制御する方法などを用いることにより、遺伝子の発現を不能にし、または抑制させることができる。
（５）本発明のタンパク質の製造方法
本発明のタンパク質は、宿主に応じて、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で宿主を適切な培地中で培養、あるいは育成することによって、産生することができる。
宿主を培養することにより本発明のタンパク質を産生する場合、培地は、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＧ培地、ＹＰＭ培地、ＹＰＤＭ培地、ＳＭＭ培地などが挙げられ、炭素源（例えばグルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトースなど）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素、カゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物などの有機窒素源）、無機塩（例えば二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなど）、ビタミン（ビタミンＢ１など）、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなどの抗生物質）などを適宜含有する。さらに、本発明のタンパク質の基質となるダンマラン系列トリテルペン、好ましくはオレアナン型トリテルペン、さらに好ましくはβ−アミリンを培地に添加してもよい。
培養条件は、遺伝子の発現に適切であれば特に限定されないが、通常１０〜４５℃で、必要に応じて通気、攪拌しながら、数時間〜数百時間、培養する。
培養物（培養上清または培養された形質転換体を含む）から本発明のタンパク質を採取するには、培養物に蓄積されたタンパク質を公知の方法で抽出し、必要に応じて精製すればよい。例えば溶媒抽出法、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で、あるいは適宜組み合わせて、本発明のタンパク質を得ることができる。
なお、本発明のタンパク質の基質となる上記β−アミリンなどのダンマラン系列トリテルペンを培地に添加し、形質転換体を培養すれば、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素が酸化された誘導体を得ることが可能である。
形質転換植物などを育成して本発明のタンパク質を産生する場合、再生した植物体などから、本発明のタンパク質を上記公知の方法で抽出し、必要に応じて精製すればよい。また、カンゾウ属植物の場合、本発明のタンパク質はストロンや根に多く含まれ、上記誘導体、あるいはグリチルリチン生合成経路を経由して産生されたグリチルリチンを、ストロンや根から採取することが可能である。
（６）本発明の遺伝子を用いた植物選抜法
植物における本発明の遺伝子の有無または発現を判定し、植物を選抜する方法は、前記植物から調製された核酸含有サンプルについて、本発明の遺伝子もしくはその断片を用いてＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法または核酸ハイブリダイゼーションを行い、本発明の遺伝子を検出または定量することを含む。
植物の核酸含有サンプルは、公知の手法、例えばフェノール抽出法、フェノール・クロロフォルム抽出法、ＣＴＡＢ法などを用いて調製することができる。
本発明の遺伝子の有無または発現は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法、または核酸ハイブリダイゼーション法を用いて検出または定量することができる。核酸ハイブリダイゼーション法は、例えばＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションが挙げられ、例えばノザンハイブリダイゼーション（分子生物学実験プロトコルＩ（１９９７年），西野・佐野共訳，丸善株式会社参照）、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法（２０００年）村松、那波監修、秀潤社参照）などの手法を利用することができる。
ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法または核酸ハイブリダイゼーションで用いるプライマーまたはプローブは、上記（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの塩基配列を有する遺伝子またはその断片を用いて設計すればよい。
本発明において「断片」とは、上記塩基配列において少なくとも１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、５０塩基、１００塩基、もしくは１５０塩基の連続する塩基配列からなる断片を指す。
本発明で用いるプライマーまたはプローブのサイズは特に限定されないが、プライマーの場合、通常、約１５〜約５０塩基長、好ましくは約１７〜約３０塩基長である。プローブの場合、ノザンハイブリダイゼーションでは、少なくとも約１０塩基長以上から全長、好ましくは約１５塩基長以上から全長、より好ましくは約３０塩基長以上から全長、さらに好ましくは約５０塩基長以上から全長であり、ＤＮＡマイクロアレイでは、約１０〜約５０塩基長、好ましくは約１５〜約３０塩基長、より好ましくは約２０〜約２５塩基長のプローブが使用されるが、これらに限定されない。一般に、プローブが長いほどハイブリダイゼーション効率がよくなり、感度は上がる。逆に、プローブが短いほど感度は下がるが、特異性が上がる。固相上のプローブは、通常０．１μｇ〜０．５μｇの溶液を用いてスポットする。プライマー、プローブの例は、特に限定されないが、例えば配列番号５、配列番号６が挙げられる。
ＰＣＲ条件は、例えばＤＮＡの変性を９４〜９５℃で５秒〜５分間、プライマーのアニーリングを５０〜７０℃で１０秒〜１分間、伸長反応を６８〜７２℃で３０秒〜３分間行い、これを１サイクルとして１５〜４０サイクルほど行い、最後に６８〜７２℃で３０秒〜１０分間の伸長反応を行うことができる。
ＰＣＲ産物は、例えばアガロース電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ドットハイブリダイゼーションなどを用いて検出できる。
本発明の遺伝子の発現量をＰＣＲ法で定量する方法として、内部標準物質を用いたＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる（ＰＣＲ法最前線（１９９６年）関谷、藤永編、共立出版参照）。使用する内部標準としてハウスキーピング遺伝子がよく用いられる。この方法では標的ｍＲＮＡ量が内部標準試料に対して多いか少ないかといった相対的な結果が得られる。１つのサンプルについてのＰＣＲ反応中に、数サイクルごとに反応液をサンプリングして、ＰＣＲ産物の量を定量し、グラフにプロットしていく。そうして得られたグラフの指数増加期のポイントに対して回帰分析を行い、ｙ切片を求めることにより、初期鋳型量を算出することができる（バイオ実験イラストレイティット３「本当に増えるＰＣＲ」（１９９８年）中山広樹著、秀潤社）。
また、発明の遺伝子の発現量をリアルタイム定量ＰＣＲ法で定量することができる。ＰＣＲ生成物が特異的に蛍光標識される反応系で、蛍光強度を検出する装置の備わった温度サイクラー装置によりＰＣＲ反応を行うと、反応中の生成物の量をサンプリングの必要なくリアルタイムでモニターでき、その結果をコンピュータで回帰分析することができる。ＰＣＲ生成物を標識する方法としては、蛍光標識したプローブを用いる方法と、２本鎖ＤＮＡに特異的に結合する試薬を用いる方法とがある。プローブは、ＰＣＲ反応が行われるとＴａｑポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、蛍光を発するようになる。その蛍光量は、ＰＣＲ生成物の量を反映する。ＰＣＲ反応物が検出限界に到達するときのサイクル数（ＣＴ）と初期鋳型量とは逆相関の関係にあることから、リアルタイム測定法ではＣＴを測定することによって初期鋳型量を定量している。数段階の既知量の鋳型を用いてＣＴを測定し検量線を作製すれば、未知試料の初期鋳型量の絶対値を算出することができる。ＲＴ−ＰＣＲで使用する逆転写酵素は、例えばＭ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅ、ＥｘＳｃｒｉｐｔ  ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）などを使用することができる。
核酸ハイブリダイゼーションを行う場合は、プローブ、あるいはサンプル中の核酸にラベリングしてもよく、アイソトープ（例えば３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ）又は蛍光（フルオレサミン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５）のいずれでもラベリングでき、特に限定されない。
またハイブリダイゼーションは、上記ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。
ノザンハイブリダイゼーション法は、一般にＲＮＡ配列の検出、定量のために使用される。植物から公知の手法で得たＲＮＡサンプルを、アガロースゲル電気泳動にかけてサイズ分離し、その後、ナイロンもしくはニトロセルロースメンブレンにＲＮＡを転写し、本発明の遺伝子のラベル化ｃＤＮＡ又はその断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、本発明の遺伝子を検出、定量する。
ＤＮＡマイクロアレイ法は、ガラスやフィルターなどのアレイ上に本発明の遺伝子をコードするｃＤＮＡ又はそのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、あるいはそれらの断片をプローブとして固定化する。公知の手法で得たＲＮＡについて逆転写反応を行い、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰなどを取り込ませてラベル化ｃＤＮＡを得る。アレイ上の固定化プローブとラベル化ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、本発明の遺伝子を検出、定量する。これにより、グリチルリチン高含量の植物を選抜、スクリーニングできる。
なお、上記分子生物学的手法にかかる実験方法等は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０００６】
カンゾウ属植物からのｍＲＮＡ調製とｃＤＮＡライブラリー作製（１）
独立行政法人医薬基盤研究所の薬用植物資源研究センター北海道研究部（北海道名寄市）において圃場栽培されていた７年生Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓのストロン（地下茎）を６月に採取した。ＲＮＡ抽出試薬、ＲＮＡＷＩＺＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて添付のプロトコールに従いトータルＲＮＡを調製した。得られたトータルＲＮＡからｍＲＮＡを調製し、ベクターキャッピング法（Ｋａｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，１２，５３−６２，２００５）によりｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＧＣＡＰｚｆ３（Ｔｓｕｇａｎｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，２２，１６１−１６５，２００５）に組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【実施例２】
【０００７】
カンゾウ属植物からのｍＲＮＡ調製とｃＤＮＡライブラリー作製（２）
独立行政法人医薬基盤研究所の薬用植物資源研究センター筑波研究部（茨城県つくば市）において圃場栽培されていた定植後４年以上経過したと考えられるＧｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓのストロン（地下茎）を１０月に採取した。ＲＮＡ抽出試薬Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び精製カラムＲＮｅｓｅｙ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて添付のプロトコールに従いトータルＲＮＡを調製した。得られたトータルＲＮＡからｍＲＮＡを調製し、オリゴキャップ法（Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−１７４，１９９４、及び、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００，１４９−１５６）によりｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＭＶＦＬ３に組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【実施例３】
【０００８】
シークエンス解析（１）
実施例１で得られたｃＤＮＡライブラリーで大腸菌株ＤＨ１２Ｓ（インビトロジェン社）あるいはＤＨ１０Ｂ  Ｔ１ファージレジスタント（インビトロジェン社）を形質転換し、得られた約３０，０００のシングルコロニーを３８４プレートにピックアップした。コロニーＰＣＲでシークエンス反応の鋳型にするＤＮＡを増幅し、エタノール沈殿による精製を行った。それを鋳型にして、アプライドバイオシステム社のＢｉｇＤｙｅ  ｖｅｒ３．１を用いて、各ｃＤＮＡ断片の５’末端側から、シークエンス反応を行った。エタノール沈殿による精製後、アプライドバイオシステム社の３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてポリヌクレオチド配列の解析を行った。
【実施例４】
【０００９】
シークエンス解析（２）
実施例２で得られたｃＤＮＡライブラリーで大腸菌株ＤＨ５αを形質転換し、得られた約２６，０００のシングルコロニーを３８４プレートにピックアップした。コロニーＰＣＲでシークエンス反応の鋳型にするＤＮＡを増幅し、エタノール沈殿による精製を行った。それを鋳型にして、アプライドバイオシステム社のＢｉｇＤｙｅ  ｖｅｒ３．１を用いて、各ｃＤＮＡ断片の５’末端側から、シークエンス反応を行った。エタノール沈殿による精製後、アプライドバイオシステム社の３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてポリヌクレオチド配列の解析を行った。
【実施例５】
【００１０】
ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）のクラスタリング
理化学研究所から得られた約３０，０００のＥＳＴデータ（実施例３）とＮＥＤＯ（独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構）から得られた約２６，０００のＥＳＴデータ（実施例４）を１つのデータセットに統合し、ＰＨＲＡＰ  ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｒａｐ．ｏｒｇ）を用いてクラスタリングを行った。その結果、１０，３７２個のユニークなコンティグを得た。
【実施例６】
【００１１】
相同性検索によるＰ４５０遺伝子の抽出
実施例５で得られた１０，３７２個のコンティグ配列をクエリーとして、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに登録されている既知タンパク質に対するＢＬＡＳＴＸ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，１９９７）を行い、データベースに登録されている既知のＰ４５０モノオキシゲナーゼに高い相同性を示すコンティグを選抜した。選抜したコンティグを構成する複数のＥＳＴクローンから、最も長い５’末端領域を保持すると判定されるものについて、プラスミドＤＮＡを調製し、クローン化された各ｃＤＮＡ断片（３６個）の全長ポリヌクレオチド配列を決定した。
【実施例７】
【００１２】
遺伝子発現解析
実施例６で得られた３６個のＰ４５０分子種のうち、グリチルリチン生合成に関わる可能性が高い分子種を選抜するために、各Ｐ４５０分子種がＧｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓのどの器官で発現しているのかをＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。
グリチルリチンを高蓄積する地下部組織（肥大根およびストロン）とグリチルリチンが全く検出されない地上部組織（葉および茎）、計４種の異なる植物組織からトータルＲＮＡを調製した。得られたトータルＲＮＡ  １μｇを用いて、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて添付のプロトコールに従いファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った。
各Ｐ４５０遺伝子に特異的にアニールするセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを設計し、４種のファーストストランドｃＤＮＡ  各２μｌを鋳型として、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用いて、２５から３０サイクルのＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で分析し（図１）、根およびストロン由来のファーストストランドｃＤＮＡ鋳型を用いた場合のみでＰＣＲ断片の増幅が見られるＰ４５０分子種を選抜した。このうち、トリテルペンを酸化する酵素活性が認められたＰ４５０分子種（ｉ）と（ｉｉ）（図１の電気泳動図の矢印のバンドに該当）について、以下の実施例を記す。
【実施例８】
【００１３】
Ｐ４５０分子種（ｉ）と（ｉｉ）の全長コード領域の増幅とクローニング
実施例７で調製したＧｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓのストロン由来ファーストストランドｃＤＮＡを鋳型とし、Ｐ４５０分子種（ｉ）と（ｉｉ）のポリペプチドのＮ末端とＣ末端に相当する箇所のオリゴＤＮＡをプライマーとして（配列番号５と６）、アニール温度５５℃でＰＣＲ（３０サイクル、ストラタジーン社製Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用）を行った。なお、配列番号５のプライマーには、５’末端に４塩基（ｃａｃｃ）が付加されているが、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）エントリーベクター（インビトロジェン社）へのクローニングの際に必要である。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯエントリーベクターにクローニングし、得られた６個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られた２種のポリヌクレオチド配列は、配列番号３および配列番号４であり、それぞれから推定されるポリペプチド配列は、配列番号１および配列番号２である。配列番号３で示すポリヌクレオチドと配列番号４で示すポリヌクレオチドは、２６，１６３，１９７，２９４，４８０，５９１，９００，９４５，１０８９，１３７３，１４３４番目の１１箇所が異なる。また、配列番号１で示すポリペプチドと配列番号２で示すポリペプチドは、９，５５，６６，４５８番目の４箇所のアミノ酸が異なる。
【実施例９】
【００１４】
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系による本発明のタンパク質発現ベクターの構築
実施例８において作製した、配列番号３および配列番号４に示すポリヌクレオチドをそれぞれ有するプラスミド（エントリークローン）とデスティネーションベクターｐＤＥＳＴＴＭ  ８（インビトロジェン社）を混合し、塩基配列特異的な組み換え反応（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭａｔｔＬ  ｘ  ａｔｔＲ反応）により、配列番号３および配列番号４に示すＤＮＡ断片をｐＤＥＳＴＴＭ８ベクターに移すことで、昆虫細胞発現用コンストラクトを作製した。塩化カルシウム法によって、得られたコンストラクトで大腸菌株ＤＨ１０Ｂａｃ（インビトロジェン社）を形質転換した。得られたコロニーから、添付のプロトコールに従いＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡ（初代組換えバキュロウイルス）を調製した。
【実施例１０】
【００１５】
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系による本発明のタンパク質の発現
常法（インビトロジェン社、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号１０３５９０１６）に従い、実施例９において作製したＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡを昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ９）に感染・増殖させ、純化した高力価ウイルス液（力価＝約１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を調製した。１．０ｘ１０６個の昆虫細胞を３ｍｌのＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）に懸濁し、３０μｌの高力価ウイルス液を加え、室温で３０分インキュベートした。５０ｍｌのＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（終濃度１００μＭのアミノレブリン酸、終濃度１０％のウシ胎仔血清、終濃度１００μＭのクエン酸鉄、終濃度０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を添加したもの）を加えた後、３００ｍｌ容フラスコに移し、２７℃、１５０ｒｐｍで９６時間培養した。
【実施例１１】
【００１６】
昆虫細胞からのミクロソーム画分の調製
実施例１０で得られた昆虫細胞培養液５０ｍｌを２，３３０ｇ、４℃で５分間遠心し、昆虫細胞を回収した。昆虫細胞を、氷冷したリン酸バッファーで３回洗浄した後、５ｍｌの５０ｍＭリン酸−カリウムバッファー（ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌを含む）に懸濁した。ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＦＥＲ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社）を用いて、細胞を超音波破砕した後、２，３３０ｇ、４℃で２０分間遠心分離を行った。上清を回収し、１００，０００ｇ、４℃で一時間遠心分離し、得られたペレット（ミクロソーム画分）を２ｍｌの５０ｍＭリン酸−カリウムバッファー（ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌを含む）に懸濁した。
【実施例１２】
【００１７】
基質トリテルペノイドの調製
ミクロソーム画分を用いた活性試験に用いるトリテルペノイドは図２および図３に示す方法で合成した。
１）β−アミリン
オレアノール酸（ＳＩＧＭＡ社製）をトリメチルシリルジアゾメタンと反応させカルボン酸をメチルエステル体とし、水酸基をｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基とし保護した。メチルエステルを還元しアルコールへと導きメシルクロリドを作用させメシルエステル体とした後、還元的置換反応によりメチル体へと導いた。このメチル体を脱保護してβ−アミリンを得た。構造は１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを解析し確定した。
２）１１−オキソ−β−アミリン
β−アミリンの３位水酸基をテトラヒドロピラニル基で保護し、塩化ルテニウムとｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを作用させ１１位メチレン炭素をカルボニル基へと導いた。その後、脱保護を行い１１−オキソ−β−アミリンを得た。構造は１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを解析し確定した。
３）１１α−ヒドロキシ−β−アミリン
１１−オキソ−β−アミリンにリチウムアルミニウムヒドリドを作用させ１１位のカルボニル基を還元し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し１１α−ヒドロキシ−β−アミリンと１１β−ヒドロキシ−β−アミリンを得た。構造は１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを解析し確定した。
４）１１−デオキソグリチルレチン酸
グリチルレチン酸（ＳＩＧＭＡ社製）に亜鉛と塩酸を作用させ１１位のカルボニル基を還元し１１−デオキソグリチルレチン酸を得た。構造は１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを解析し確定した。
５）３０−ヒドロキシ−β−アミリン
１１−デオキソグリチルレチン酸にトリメチルシリルジアゾメタンを作用させカルボン酸をメチルエステル体へと導き、エステルを還元し３０−ヒドロキシ−β−アミリンを得た。構造は１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを解析し確定した。
６）３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン
３０−ヒドロキシ−β−アミリンの水酸基をテトラヒドロピラニル基として保護し、塩化ルテニウムとｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを作用させ１１位メチレン炭素をカルボニル基へと変換し、脱保護を行い３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンを得た。構造は１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを解析し確定した。
７）１１α，３０−ジヒドロキシ−β−アミリン
３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンにリチウムアルミニウムヒドリドを作用させ１１位のカルボニル基を還元し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、１１α，３０−ジヒドロキシ−β−アミリンと１１β，３０−ジヒドロキシ−β−アミリンを得た。構造は１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを解析し確定した。
【実施例１３】
【００１８】
ミクロソーム画分を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
実施例１１で得られたミクロソーム画分５０μｌと、２５μｌの１Ｍリン酸−カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１μｌ（終濃度０．１ｕｎｉｔ／ｍｌ）の精製シロイヌナズナＰ４５０還元酵素（Ｍｉｚｕｔａｎｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｏｈｔａ，Ｄ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１６，３５７−３６７，１９９８）、２５μｌ（終濃度１ｍＭ）のＮＡＤＰＨ、５μｌ（終濃度２０μＭ）の反応基質（β−アミリンあるいは３０−ヒドロキシ−β−アミリン）、３９４μｌの滅菌水を混合した後、３０℃、１，０００ｒｐｍにて撹拌させながら２時間インキュベートした。
【実施例１４】
【００１９】
変換物の同定
実施例１３で得られた反応溶液は酢酸エチルで抽出され、酢酸エチル区は溶媒を乾燥除去した後、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを加え、８０℃で３０分間加熱し、トリメチルシリルエーテル体に誘導体化しＧＣ−ＭＳ分析の試料とした。ＧＣ−ＭＳはＡｕｔｏｍａｓｓ（ＪＥＯＬ）−６８９０Ｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、カラムはＨＰ−５ｃｏｌｕｍｎ（Ｊ  ＆  Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；０．３２ｍｍ  ｘ  ３０ｍ；０．２５ｍｍ  ｆｉｌｍ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を用いて変換物を分析した。変換物の同定は実施例１２で調製したトリテルペノイドを標品としてＧＣの保持時間ならびにＭＳスペクトルを比較することで決定した。
配列番号１に示すポリペプチドを発現する昆虫細胞、および、配列番号２に示すポリペプチドを発現する昆虫細胞、それぞれから調製したミクロソームを用いて酵素アッセイを行った結果、どちらの場合においてもβ−アミリンの変換物として、１１α−ヒドロキシ−β−アミリンと１１−オキソ−β−アミリンが検出された。図４に配列番号１のポリペプチドを用いた結果を示す。全イオンクロマトグラムの点線の矢印はβ−アミリン、２重線の矢印は１１−オキソ−β−アミリン、３重線の矢印は１１α−ヒドロキシ−β−アミリンを示す。配列番号２のポリペプチドを用いた場合も、配列番号１のポリペプチドを用いた場合と同様の結果が得られた。さらに、３０−ヒドロキシ−β−アミリンと配列番号１のポリペプチドを反応させると、１１α，３０−ジヒドロキシ−β−アミリンと３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンが検出された。図５に配列番号１のポリペプチドを用いた結果を示す。全イオンクロマトグラムの点線の矢印は３０−ヒドロキシ−β−アミリン、２重線の矢印は３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン、３重線の矢印は１１α，３０−ジヒドロキシ−β−アミリンを示す。配列番号２のポリペプチドを用いた場合も、配列番号１のポリペプチドを用いた場合と同様の結果が得られた。一方、対照実験として、ボイドベクターを導入した昆虫細胞に由来するミクロソーム画分を用いて同様の実験を行った。反応基質としてβ−アミリンを用いた場合、図４のベクターコントロールの全イオンクロマトグラムに記載の通り、１１α−ヒドロキシ−β−アミリン、１１−オキソ−β−アミリンのいずれも生成されなかった。反応基質として、３０−ヒドロキシ−β−アミリンを用いた場合、図５のベクターコントロールの全イオンクロマトグラムに記載の通り、１１α，３０−ジヒドロキシ−β−アミリン、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンのいずれも生成されなかった。これにより、グリチルリチンの生合成に関与すると考えられる、β−アミリン骨格の１１位を酸化し、水酸基およびカルボニル基に変換するトリテルペン酵素が初めて同定された。
【実施例１５】
【００２０】
ミヤコグサＰ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅの酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲの構築
ミヤコグサＥＳＴｄａｔａｂａｓｅ（かずさＤＮＡ研究所）を検索し、シロイヌナズナＰ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅとアミノ酸レベルで７０％以上の配列を選抜した。全長コード領域を含むと思われるＥＳＴクローン（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＶ７７８６３５）をかずさＤＮＡ研究所より入手し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＤＮＡ配列を決定した（以下、ＬｊＣＰＲとする）。ＬｊＣＰＲ導入プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−））を鋳型にして、ＣＰＲ−Ｆ（Ｎｏｔ），ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧ（配列番号７）とＣＰＲ−Ｒ（Ｐａｃ），ＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＣＡＴＣＡＣＧＣＡＡＡＴＡＣ（配列番号８）の両プライマーを用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績）を用いて９４℃２分間の後、９４℃２０秒間、６０℃４０秒間、６８℃２分間の保温を１サイクルとして１５サイクルからなるＰＣＲ反応を行なった。さらに６８℃で２分間保温した。ＰＣＲ反応産物をＴＡｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。ＤＮＡ配列を確認後、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩで消化し、酵母発現用ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）もＮｏｔＩ，ＰａｃＩで消化し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ）を用いてライゲーションし、ＬｊＣＰＲの酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲを得た。
【実施例１６】
【００２１】
ミヤコグサβ−アミリン合成酵素（ＯＳＣ１）遺伝子ｃＤＮＡの酵母発現ベクターｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１の構築
ミヤコグサβ−アミリン合成酵素（ＯＳＣ１）遺伝子ｃＤＮＡ導入プラスミド（Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  １７０：２４７−２５７）をＫｐｎＩ、ＸｂａＩで消化し、ＯＳＣ１  ｃＤＮＡ領域を切り出した。ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ）もＫｐｎＩ、ＸｂａＩで消化し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ）を用いてライゲーションし、ｐＡＵＲ１２３−ＯＳＣ１を得た。ｐＡＵＲ１２３−ＯＳＣ１のＰＡＤＨ１からＴＡＤＨ１領域をＡＵＲ１２３−Ｆ，ＧＧＡＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＣＴＡＡＣＡＴＧＴＡＧＧＴＧＧ（配列番号９）とＡＵＲ１２３−Ｒ，ＴＡＡＴＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＧＧ（配列番号１０）の両プライマーを用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績）を用いて  ９４℃２分間の後、９４℃２０秒間、５５℃４０秒間、６８℃１分３０秒間の保温を１サイクルとして２０サイクルからなるＰＣＲ反応を行なった。さらに６８℃で２分間保温した。また、ｐＹＥＳ３／ＣＴ（インビトロジェン）の１番から９６０番塩基（ＰＧＡＬ１からＣＹＣ１ＴＴ）を除く領域をＹＥＳ３−Ｆ，ＴＧＣＧＧＣＣＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧ（配列番号１１）とＹＥＳ３−Ｒ，ＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧ（配列番号１２）を用いてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績）を用いて９４℃２分間の後、９４℃２０秒間、５５℃４０秒間、６８℃１分３０秒間の保温を１サイクルとして２０サイクルからなるＰＣＲ反応を行なった。さらに６８℃で２分間保温した。両ＰＣＲ反応産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いて結合し、ミヤコグサＯＳＣ１酵母発現ベクターｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１を得た。
【実施例１７】
【００２２】
酵母での発現ベクター構築
実施例８において作製した、配列番号３に示すポリヌクレオチドを有するプラスミド（エントリークローン）とデスティネーションベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴＴＭ５２（インビトロジェン社）を混合し、塩基配列特異的な組み換え反応（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭａｔｔＬ  ｘ  ａｔｔＲ反応）により、配列番号３で示すＤＮＡ断片をｐＹＥＳ−ＤＥＳＴＴＭ５２に移し替えることで、酵母細胞発現用コンストラクトを作製した。
ｐＥＮＴＥＲ−Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングされた配列番号３に示す遺伝子をＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（インビトロジェン）を用いて酵母発現用ベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（インビトロジェン）に組み込み、配列番号３に示す遺伝子の酵母発現ベクターｐＤＥＳＴ５２−ＧｕＣＹＰ８８を得た。
【実施例１８】
【００２３】
形質転換酵母の培養
酵母ＢＪ２１６８株（ニッポンジーン）（ＭＡＴａ  ｐｒｃ１−４０７  ｐｒｂ１−１１２２  ｐｅｐ４−３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｕｒａ３−５２  ｇａｌ２）をＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲ、ｐＤＥＳＴ５２−ＧｕＣＹＰ８８およびｐＹＥＳ２（インビトロジェン）で形質転換した。
【実施例１９】
【００２４】
形質転換酵母における生成物の確認
実施例１８で調製したｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲ、ｐＤＥＳＴ５２−ＧｕＣＹＰ８８の３つ全てのベクターを保持する酵母を１００ｍｌのＳＣ−Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ培地２８℃、１３５ｒｐｍ、２日間培養した。培養した酵母を３０００ｇ、１０分間遠心することにより集菌し、ガラクトース（２０ｍｇ／ｍｌ）、塩化ヘミン（１３μｇ／ｍｌ）を添加した１００ｍｌのＳＣ−Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ−グルコース培地に懸濁し、２８℃、１３５ｒｐｍ、２日間培養した。遠心処理により集菌し、凍結乾燥処理を行なった。５ｍｌの酢酸エチルを加え混合した後、酢酸エチル抽出物を回収した。この操作を３回繰り返した。酢酸エチル抽出物を減圧下で濃縮した。ｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲ、ｐＹＥＳ２の３つ全てのベクターを保持する酵母についても同様に、培養、抽出を行なった。実施例１４に記述した方法と同じく、酢酸エチル区は溶媒を乾燥除去した後、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを加え、８０℃で３０分間加熱し、トリメチルシリルエーテル体に誘導体化しＧＣ−ＭＳ分析の試料とした。変換物の同定は実施例１２で調製したトリテルペノイドを標品としてＧＣの保持時間ならびにＭＳスペクトルを比較することで決定した。ｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲ、ｐＤＥＳＴ５２−ＧｕＣＹＰ８８の３つ全てのベクターを保持する酵母の抽出物からβ−アミリンと１１α−ヒドロキシ−β−アミリンと１１−オキソ−β−アミリンが検出された。一方、対照実験として行った、ｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲ、ｐＹＥＳ２の３つ全てのベクターを保持する酵母の抽出物からはβ−アミリンのみが検出され、１１α−ヒドロキシ−β−アミリンならびに１１−オキソ−β−アミリンは検出されなかった。これにより、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは、酵母においてもβ−アミリンの１１位を酸化し、水酸基およびカルボニル基に変換するトリテルペン酸化酵素であることが明らかとなった。
【実施例２０】
【００２５】
ＮＭＲによる１１−オキソ−β−アミリンの同定
実施例１８で調製したｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲ、ｐＤＥＳＴ５２−ＧｕＣＹＰ８８の３つ全てのベクターを保持する酵母を４００ｍｌのＳＣ−Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ培地（６本、計２．４Ｌ）で２８℃、１２５ｒｐｍ、２日間培養した。培養した酵母を３０００ｇ、１０分間遠心することにより集菌し、ガラクトース（２０ｍｇ／ｍｌ）、塩化ヘミン（１３μｇ／ｍｌ）を添加した４００ｍｌのＳＣ−Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ−グルコース培地（６本、計２．４Ｌ）に懸濁し、２８℃、１２５ｒｐｍ、２日間培養した。遠心処理により集菌し、凍結乾燥処理を行なった。凍結乾燥した菌に１００ｍｌクロロホルムを加え、混合した後、クロロホルム抽出物を回収した。この操作を３回繰り返した。クロロホルム抽出物を減圧下で濃縮した。抽出物を、シリカゲルクロマトグラフィーで分画した。シリカゲルはＷａｋｏ  ｇｅｌ  Ｃ−３００（和光純薬工業）を用い、２．８ｘ４０ｃｍのサイズで行ない、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）の溶媒を流し、溶出液を７ｍｌずつ分画した。２２−２９番フラクションを集め溶媒除去し、シリカゲルＴＬＣプレートＬＫ６Ｆ（Ｗｈａｔｍａｎ）２０ｘ２０ｃｍに付した。トルエン：アセトン（１９：１）の溶媒で展開した後に、１１−オキソ−β−アミリンと同じＲｆ値のシリカゲルをかき取りクロロホルムで溶出した。溶媒除去後、重クロロホルムに溶解し、日本電子社製（５００ＭＨｚ）ＮＭＲを用いて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。これら２つの画分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは実施例１２で調製した標品の１１−オキソ−β−アミリン（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ：δ  ０．８１（３Ｈ，ｓ），０．８６（３Ｈ，ｓ），０．８９（３Ｈ，ｓ），０．９０（３Ｈ，ｓ），１．００（３Ｈ，ｓ），１．１３（３Ｈ，ｓ），１．１４（３Ｈ，ｓ），１．３６（３Ｈ，ｓ）２．３４（１Ｈ，ｓ），２．７９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．４，１３．８Ｈｚ），３．２３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１０．９Ｈｚ），５．５９（１Ｈ，ｓ））と完全に一致した。図６に１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【実施例２１】
【００２６】
ＮＭＲによる１１α−ヒドロキシ−β−アミリンの同定
実施例１８で調製したｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＬｊＣＰＲ、ｐＤＥＳＴ５２−ＧｕＣＹＰ８８の３つ全てのベクターを保持する酵母を４００ｍｌのＳＣ−Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ培地（１２本、計４．８Ｌ）で２８℃、１２５ｒｐｍで、２日間培養した。培養した酵母を３０００ｇ、１０分間遠心することにより集菌し、ガラクトース（２０ｍｇ／ｍｌ）、塩化ヘミン（１３μｇ／ｍｌ）を添加した４００ｍｌのＳＣ−Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ−グルコース培地（１２本、計４．８Ｌ）に懸濁し、２８℃、１２５ｒｐｍ、２日間培養した。遠心処理により集菌し、凍結乾燥処理を行なった。凍結乾燥した菌に１００ｍｌ酢酸エチルを加え、混合した後、酢酸エチル抽出物を回収した。この操作を３回繰り返した。酢酸エチル抽出物を減圧下で濃縮した。抽出物を、シリカゲルクロマトグラフィーで分画した。シリカゲルはＷａｋｏ  ｇｅｌ  Ｃ−２００（和光純薬工業）を用い、２．８ｘ４０ｃｍのサイズで行ない、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）の溶媒を流し、溶出液を７ｍｌずつ分画した。４３−５７番フラクションを集め溶媒除去し、シリカゲルＴＬＣプレートＬＫ６Ｆ（Ｗｈａｔｍａｎ）２０ｘ２０ｃｍに付した。ヘキサン：酢酸エチル（１：１）の溶媒で展開した後に、１１α−ヒドロキシ−β−アミリンと同じＲｆ値のシリカゲルをかき取りクロロホルムで溶出した。溶媒除去後、重クロロホルムに溶解し、日本電子社製（５００ＭＨｚ）ＮＭＲを用いて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。この画分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは実施例ＹＹで調製した標品の１１α−ヒドロキシ−β−アミリンと完全に一致した（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ：δ  ０．８１（３Ｈ，ｓ），０．８４（３Ｈ，ｓ），０．８９（６Ｈ，ｓ），１．００（３Ｈ，ｓ），１．０１（３Ｈ，ｓ），１．０６（３Ｈ，ｓ），１．２２（３Ｈ，ｓ），３．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．９，１１．２Ｈｚ），４．１９（１Ｈ，ｍ），５．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ））。図７に１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【実施例２２】
【００２７】
植物発現ベクターの構築
配列番号３に示すポリヌクレオチドを有するエントリークローンと植物形質転換用バイナリーベクターであるｐＢＩ−ＯＸ−ＧＷ（インプランタイノベーションズ社）あるいはｐＨＲ−ＯＸ（ｇｆｐ）（關と村中、バイオサイエンスとバイオインダストリー、６４，１７−２２，２００６）とを混合し、塩基配列特異的な組み換え反応（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ  ａｔｔＬ  ｘ  ａｔｔＲ反応）により、配列番号３に示すＤＮＡ断片を、ｐＢＩ−ＯＸ−ＧＷおよびｐＨＲ−ＯＸ（ｇｆｐ）に組み込んだ。
【実施例２３】
【００２８】
シロイヌナズナの形質転換
実施例２２において得られた各植物形質転換コンストラクトをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）株に導入した。各植物形質転換コンストラクトを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて既知の方法（Ｃｌｏｕｇｈ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ａ．Ｆ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１６，７３５−７４３，１９９８）により、シロイヌナズナ（エコタイプＣｏｌ−０）の形質転換種子を取得した。得られた形質転換種子の表面をエタノールで殺菌した後、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび２５０ｍｇ／ｌのクラフォラン（アベンティス・ファーマ社）を添加したＭＳ寒天培地に播種し、２３℃、日長１６時間で培養することで配列番号３で示すポリヌクレオチドを有する形質転換シロイヌナズナを選抜した。ｐＢＩ−ＯＸ−ＧＷ（インプランタイノベーションズ社）を用いた形質転換により、配列番号１に示すポリペプチドを高発現するシロイヌナズナ植物個体が得られる。また、アグロバクテリウム・リゾゲネス由来のｒｏｌ遺伝子クラスター（毛状根誘導に必要とされる遺伝子セット）をＴ−ＤＮＡ上に有するｐＨＲ−ＯＸ（ｇｆｐ）ベクターを用いて形質転換を行った個体からは、既知の方法（Ｓｅｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５９，７９３−８０７，２００５）により、配列番号１で示すポリペプチドを高発現するシロイヌナズナ培養毛状根を作出し、長期的に培養維持することができる。
【実施例２４】
【００２９】
Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａからのトリテルペン酸化酵素遺伝子の単離
カンゾウ属植物の一つであるＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａは、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓと同様にグリチルリチンを産生する。Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａにおいて、配列番号３および４で表される遺伝子と同等の機能を有すると推測される相同遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ法により単離した。
（独）医薬基盤研究所、薬用植物資源研究センター、北海道研究部（北海道名寄市）から分譲されたＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａのストロンから、実施例８と同様の方法により、ｃＤＮＡを単離した。得られた６個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られた配列は、配列番号１４であり、それから推定されるポリペプチド配列は、配列番号１３である。配列番号１３は配列番号１および配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９８．６％の同一性を有していた。
さらに、配列番号１３で示されるポリペプチドについても、実施例１３〜１７に示した方法により、形質転換酵母におけるβ−アミリン酸化活性を調べた結果、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓから得られた配列番号１および配列番号２で示すポリペプチドと同様に、β−アミリンの１１位を酸化し、水酸基およびカルボニル基に変換するトリテルペン酸化酵素であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によれば、ダンマラン系列トリテルペンの１１位の炭素を酸化するタンパク質、それをコードする遺伝子を提供でき、例えば該タンパク質をグリチルリチン合成に適用したり、あるいは、カンゾウ属植物などに前記遺伝子を導入して高発現させ、グリチルリチンの産生量を高めることなどが可能になる。
本発明は、β−アミリンからグリチルリチンの生合成経路の解明に適用することができる。またカンゾウ属植物のグリチルリチン産生量を増加することができる。さらに工業的なグリチルリチンの製造に適用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【国際調査報告】
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