(57)【要約】  本発明は、ケト酸に、アミノ酸脱水素酵素及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸に変換する反応において、補酵素を２回以上に分割して反応に添加することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法である。本発明の方法によれば、基質であるケト酸の純度にかかわらず、酵素的還元アミノ化反応によって、医薬品等の合成中間体として有用な化合物である高光学純度のＬ−アミノ酸を効率良く製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2008047656.tif 000006
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させて、一般式（２）：
【化２】
2008047656.tif 000007
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸に変換する反応において、補酵素を２回以上に分割して反応に添加することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
ケト酸の純度が９５％以下であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
反応開始時における補酵素の添加量が、反応を通じての総添加量の４分の３以下であることを特徴とする請求項１、又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
１回の補酵素の添加量が、反応を通じての総添加量の２分の１以下であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
補酵素を連続的に添加することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
補酵素がＮＡＤである請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
Ｌ−アミノ酸がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン、又はＬ−４−メチルロイシンである請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
アミノ酸脱水素酵素がロイシン脱水素酵素、又はフェニルアラニン脱水素酵素である請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
補酵素再生能を有する酵素がギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である請求項１から８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品等の中間体として有用な、Ｌ−アミノ酸の製造法に関する。より詳細には、対応するケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸に変換する反応において、補酵素を２回以上に分割して添加することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は医薬品等の合成中間体として有用な化合物である。Ｌ−アミノ酸の製造方法としては、抽出法、化学合成法、発酵法、酵素的合成法など種々の方法が知られている。抽出法では蛋白質加水分解物からの大規模な精製設備が必要となる。化学合成法で製造されるアミノ酸は通常ラセミ体であるため、光学活性体を製造するには、高価な分割剤、不斉触媒等を必要とする。発酵法では生成物濃度が低く、抽出法同様大規模な精製設備を必要とし、また、非天然型のアミノ酸の合成には適していない。酵素的合成法は安価な生体触媒を利用することにより、これらの問題点を回避して、より低コストで効率のよい製造方法を提供可能である。Ｌ−アミノ酸の酵素的合成法としては、例えば対応するケト酸にアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸を製造する方法（非特許文献１）が知られている。しかし、上記の方法では、高価な市販酵素や微生物から精製された酵素を使用する必要があり、工業的に使用するには課題を抱えていた。【０００３】
このような課題を解決するための手段として、これらの酵素をコードするＤＮＡを遺伝子組換え手法を用いてクローン化して形質転換体を育種し、該形質転換体を培養することにより、各酵素を高生産する試みがなされている。例えば、補酵素依存性アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生酵素をコードする各遺伝子を有する形質転換体を育種、培養し、ケト酸に作用させてＬ−アミノ酸を製造する方法が知られている（特許文献１、２）。しかし上記特許文献１に記載されている反応により生成するＬ−アミノ酸の濃度は約１０ｍＭと工業的に製造を行なうには低い濃度である。また、特許文献２に記載されている方法では、ケト酸を分割、あるいは連続的に添加することにより反応液中のケト酸の濃度を一定値以下に保つ必要がある。
【特許文献１】特開平１０−２３８９６号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９５／０９３０８１号パンフレット
【非特許文献１】ラメシュ・Ｎ・パテル(Ramesh N. Patel)、「抗高血圧薬オマパトリラットの光学活性中間体の酵素的合成」(Enzymatic synthesis of chiral intermediates for Omapatrilat, an antihypertensive drug)、バイオモレキュラー・エンジニアリング(Biomolecular Engineering)、２００１年、１７号、１６７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは還元アミノ化反応において、純度の低いケト酸を基質として使用すると、反応の生産性が低下する場合があることを見出した。【０００５】
本発明の目的は、上記還元アミノ化反応において基質の純度にかかわらず効率的なＬ−アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意研究した結果、対応するケト酸にアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させることによりＬ−アミノ酸に変換する反応（還元アミノ化反応）を行う際に、反応液中に補酵素を２回以上に分けて添加することにより、低純度のケト酸を基質として使用した場合に生じるＬ−アミノ酸の収率低下等による生産性の低下を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち本発明は、以下の特徴を有する。
本発明の一つの特徴は、一般式（１）：【０００８】
【化３】
2008047656.tif 000002
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させて、一般式（２）：【０００９】
【化４】
2008047656.tif 000003
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸に変換する反応において、補酵素を２回以上に分割して反応に添加することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法である。【００１０】
また、本発明の一つの特徴は、ケト酸の純度が９５％以下である上記Ｌ−アミノ酸の製造方法である。【００１１】
また、本発明の一つの特徴は、反応開始時における補酵素の添加量が、反応を通じての総添加量の４分の３以下である上記Ｌ−アミノ酸の製造方法である。【００１２】
また、本発明の一つの特徴は、１回の補酵素の添加量が、反応を通じての総添加量の２分の１以下である上記Ｌ−アミノ酸の製造方法である。【００１３】
また、本発明の一つの特徴は、補酵素を連続的に添加する上記Ｌ−アミノ酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は上述の構成からなり、基質であるケト酸の純度にかかわらずＬ−アミノ酸を効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。【００１６】
１．還元アミノ化反応に基質として使用するケト酸の種類
本発明の還元アミノ化反応の基質としては、以下の一般式（１）：【００１７】
【化５】
2008047656.tif 000004
で表される（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるケト酸を挙げることができる。【００１８】
上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、４（５）−イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は、２−メトキシカルボニルエチル基などが挙げられる。【００１９】
置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、又は、３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。【００２０】
置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、または４−ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。【００２１】
置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。【００２２】
また、上記ケト酸には、該ケト酸を製造する際の副産物、該ケト酸の分解物等の不純物が混入している場合がある。不純物としては例えば、塩酸、硫酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸等の有機酸；ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、リチウム、マンガン、亜鉛、銅等の金属及びそれらの塩；メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等の有機溶媒等を挙げることができる。【００２３】
また、分解物としては例えば、当該ケト酸が脱炭酸することにより生成する一般式（３）：【００２４】
【化６】
2008047656.tif 000005
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるカルボン酸化合物等を挙げる事ができる。【００２５】
このような不純物の混入により純度が低下したケト酸を、後述する還元アミノ化反応の基質として使用すると、反応の生産性が低下する場合がある（参考例１、及び比較例１を参照）。反応の生産性が低下する例としては、生成するＬ−アミノ酸の収率が低下する、反応時間が増加する事等が挙げられる。【００２６】
ここで述べるケト酸の純度とは、該ケト酸製品の乾燥重量に対する該ケト酸製品中に含まれるケト酸の重量の割合を示す。【００２７】
２．還元アミノ化反応に使用する酵素
次に還元アミノ化反応に使用する酵素について説明する。アミノ酸脱水素酵素とは、ケト酸又は環状イミンを還元的にアミノ化する活性を有する酵素であり、例えばフェニルアラニン脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼ等を挙げることができる。【００２８】
これらアミノ酸脱水素酵素による反応は、ＮＡＤＨのような還元型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤＨは酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、及び当該補酵素再生能を有する酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存させて反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。【００２９】
補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素等を挙げることができる。好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。【００３０】
本発明で用いるアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素としては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。【００３１】
アミノ酸脱水素酵素の生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、サーモアクチノマイセス（Thermoactinomyces）属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属、ハルモナス（Halomonas）属、クロストリジウム（Clostridium）属、バチルス（Bacillus）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、エシェリヒア（Escherichia）属、又は、アエロバクター（Aerobacter）属に属する微生物等が挙げられる。【００３２】
好ましくはバチルス（Bacillus）属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくは、バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９、又は、バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１由来の酵素が挙げられる。【００３３】
バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９はフェニルアラニン脱水素酵素を生産する微生物であり、ＥＰ２５６５１４号、及びＢｉｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、５９巻、１０号、１９９４頁で公知である。【００３４】
また、バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株は、ロイシン脱水素酵素を生産する微生物であり、公知のバチルス  サチルス（Bacillus subtilis）のロイシン脱水素酵素とアミノ酸残基数が同じであり、アミノ酸配列で１００％一致する。遺伝子配列では１０９５塩基中、１４塩基が異なっている。【００３５】
バチルス  サチルス（Bacillus subtilis）の遺伝子配列は、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３９０巻、２４９頁およびＮＣＢＩデータベースのアクセッションナンバーＣＡＢ１４３３９で公知である。また、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼがニューロスポラ（Neurospora）属、エシェリヒア（Escherichia）属、アエロバクター（Aerobacter）属で知られていることは、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９６２年、５巻、８８２頁で述べられている。【００３６】
ギ酸脱水素酵素の生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ（Candida）属、クロイッケラ（Kloeckera）属、ピキア（Pichia）属、リポマイセス（Lipomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、モラキセラ（Moraxella）属、ハイホマイクロビウム（Hyphomicrobium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、チオバシラス（Thiobacillus）属、又は、アンシロバクター（Ancylobacter）属に属する微生物等が挙げられる。【００３７】
好ましくはチオバシラス（Thiobacillus）属、又は、アンシロバクター（Ancylobacter）属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）、又は、アンシロバクター  アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来の酵素が挙げられる。【００３８】
上記の各酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。形質転換微生物の作成方法としては、例えばロイシン脱水素酵素活性を示す菌株からロイシン脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成し、これを用いて、特に限定されないが、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）等の宿主微生物を形質転換することにより形質転換体を得る方法が挙げられる。【００３９】
ベクターとしては宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物として、例えば、菌学的性質が当業者に周知であって、形質転換用に提供されているエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）を選択し、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いることが好ましい。【００４０】
このようなベクターとしては、例えば、当業者が容易に入手可能、あるいは市販されているｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ株式会社）、ｐＡＣＹＣ１８４（株式会社 ニッポンジーン）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＣ１０１（フナコシ株式会社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（タカラバイオ株式会社）、又は国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレットの明細書の記載に基づいて当業者が製造しうるｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。【００４１】
それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。【００４２】
このようにして得られた形質転換体の一例として、チオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６７２）、又はエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）（国際公開第ＷＯ０３／０３１６２６号パンフレット参照）等を挙げることができる。【００４３】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。【００４４】
上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｌ−アミノ酸の製造に利用することができる。微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。【００４５】
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。【００４６】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。【００４７】
３．還元アミノ化反応
次に、還元アミノ化反応によるケト酸からのＬ−アミノ酸の製造方法について説明する。還元アミノ化反応では、ケト酸と前述のアミノ酸脱水素酵素、及び、補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。【００４８】
また、本発明において使用するアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素は、それぞれの活性を有する微生物を培養して生産したものを用いてもよいし、あるいはそれぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよく、さらに複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。【００４９】
本発明において、生産されたアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素は、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物等で目的の酵素活性を有しているものを意味する。【００５０】
更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。【００５１】
上記還元アミノ化反応にＮＡＤ等の補酵素を添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０．０００００１当量以上、２当量以下、より好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。補酵素添加量の上限は特に制限されないが、経済性の点から、通常は２当量以下、好ましくは０．１当量以下、より好ましくは０．０１当量以下である。【００５２】
さらに、前項１．で挙げた反応の生産性を低下させる低純度のケト酸を基質とした場合、ＮＡＤ等の補酵素を２回以上に分けて添加する（分割添加）ことにより、全量を反応開始時に添加（一括添加）した場合に比べて、反応の生産性を向上させることが可能である（実施例１、及び比較例１を参照）。反応の生産性が向上する例としては、生成するＬ−アミノ酸の収率が向上する、反応時間が短縮できる事等が挙げられる。上記のような低純度のケト酸を基質として使用し、補酵素を反応開始時に一括添加する場合も、補酵素を多量に添加すれば、反応の生産性を向上させることが可能であるが、分割添加を行うことにより補酵素の総添加量を削減することが可能である。【００５３】
補酵素を分割添加する場合、反応開始時に添加する補酵素の量としては、反応を通じての総添加量の４分の３以下であることが好ましく、より好ましくは３分の２以下、さらに好ましくは２分の１以下、特に好ましくは３分の１以下、４分の１以下である。【００５４】
また、補酵素を分割添加する場合における一回の添加量としては、反応を通じての総添加量の３分の２以下であることが好ましく、より好ましくは２分の１以下、さらに好ましくは３分の１以下、特に好ましくは４分の１以下である。【００５５】
さらに補酵素を分割添加する場合における、補酵素の添加回数は２回以上が好ましく、より好ましくは３回以上であり、さらに好ましくは４回以上である。また、補酵素は反応中に連続的に添加することも可能である。【００５６】
上述のような補酵素の分割添加による反応の生産性向上効果は、基質の純度が９５％以下の場合に有効であり、９０％以下の場合により有効であり、８５％以下の場合に特に有効である。【００５７】
上記還元アミノ化反応の基質であるケト酸の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は１０℃以上、８０℃以下、好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。【００５８】
上記反応のｐＨは、４以上、１２以下で行うのが好ましく、さらに好ましくはｐＨ６以上、１１以下である。ｐＨの調整は酸、又は塩基を添加することで行うことができる。【００５９】
本反応の基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記還元アミノ化反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。【００６０】
本発明の還元アミノ化反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との二相系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必要に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、金属などを添加することもできる。【００６１】
上記のような還元アミノ化反応により生成したＬ−アミノ酸の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。
【実施例】
【００６２】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００６３】
（比較例１）還元アミノ化反応によるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの合成（補酵素一括添加）
後述する参考例４に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を、滅菌した培地Ａ（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、アンピシリン０．０１％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３３℃で４８時間、振とうして好気的に培養した。【００６４】
得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水に懸濁して、菌体濃縮液を得た。【００６５】
純度８３．２％のトリメチルピルビン酸９６．２ｍｇに、上記菌体濃縮液、及びトリメチルピルビン酸の１．４モル当量のギ酸アンモニウムを添加し、さらに５Ｍアンモニア水を添加してｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して２ｍｌになるよう反応液を調製した。この反応液にＮＡＤをトリメチルピルビン酸の０．０００９モル当量となるよう添加して、３０℃で攪拌し、２１．５時間反応を行なった。【００６６】
残存したトリメチルピルビン酸、及び生成したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率・光学純度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析したところ、トリメチルピルビン酸の残存率は１８．８ｍｏｌ％、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率は８１．１ｍｏｌ％、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【００６７】
高純度のトリメチルピルビン酸を使用した場合（参考例１）に比べてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率は低下し、トリメチルピルビン酸の残存率は増加した。【００６８】
（トリメチルピルビン酸  ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、移動相：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９５／５、流速：１ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍ。【００６９】
（Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン  ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、住化分析センター社製）、移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液／メタノール＝９５／５、流速：１ｍｌ／分、カラム温度：３５℃、検出：２５４ｎｍ。【００７０】
（実施例１）還元アミノ化反応によるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの合成（補酵素分割添加）
比較例１で使用した純度８３．２％のトリメチルピルビン酸９６．２ｍｇに、比較例１と同量のロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の菌体濃縮液、及びトリメチルピルビン酸の１．４モル当量のギ酸アンモニウムを添加し、さらに５Ｍアンモニア水を添加してｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して２ｍｌになるよう反応液を調製した。この反応液にＮＡＤをトリメチルピルビン酸の０．０００３モル当量となるよう添加して、３０℃で攪拌した。【００７１】
反応開始から３時間目、及び６時間目にそれぞれＮＡＤを基質の０．０００３モル当量添加して２１．５時間目まで反応を行なった。【００７２】
残存したトリメチルピルビン酸、及び生成したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率・光学純度を比較例１と同様の方法で分析したところ、トリメチルピルビン酸の残存率は０.４ｍｏｌ％、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率は１０４．３ｍｏｌ％、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【００７３】
補酵素を一括添加した場合（比較例１）に比べてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率向上、トリメチルピルビン酸の残存率の減少が認められた。【００７４】
（参考例１）還元アミノ化反応によるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの合成
純度９８．５％のトリメチルピルビン酸８１．２ｍｇに、比較例１と同量のロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の菌体濃縮液、及びトリメチルピルビン酸の１．４モル当量のギ酸アンモニウムを添加し、さらに５Ｍアンモニア水を添加してｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して２ｍｌになるよう反応液を調製した。【００７５】
この反応液にＮＡＤを基質の０．０００９モル当量となるよう添加して、３０℃で攪拌して２２時間目まで反応を行なった。【００７６】
比較例１と同様の方法で分析したところ、トリメチルピルビン酸は消失し、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンが変換率９６．４ｍｏｌ％、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上で生成していた。【００７７】
（参考例２）ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
チオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）のゲノムを鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号１、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲを行なった。【００７８】
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇにＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）１．２５Ｕ（０．２５μｌ）、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒII（タカラバイオ社製）５μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ溶液４μｌ、２０μＭプライマー水溶液各２μｌを添加し、さらに滅菌水を加えて総量が５０μｌになるように調製した反応液を作製し、熱変性（９６℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、９０秒）を２５サイクル繰り返した後、４℃まで冷却することにより行なった。【００７９】
ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレットの明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。【００８０】
得られたプラスミドをエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。【００８１】
得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。【００８２】
得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを回収した。【００８３】
（参考例３）ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株のゲノムを鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号３、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は参考例２と同様にして行なった。【００８４】
ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＴ（ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレットの明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）のＮｄｅＩ認識配列を一塩基置換により破壊したプラスミドベクター）とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ロイシン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。【００８５】
得られたプラスミドをエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。【００８６】
得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。【００８７】
得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ロイシン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを回収した。【００８８】
（参考例４）ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
参考例３で得られたロイシン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、ロイシン脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴａＫａＲａＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて回収した。【００８９】
同様に、参考例２で得られたギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドをギ酸脱水素酵素遺伝子の下流のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ部位で切断したＤＮＡ断片と、上記ロイシン脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することにより、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。【００９０】
得られたプラスミドをエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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