(57)【要約】本発明は、動物細胞又は動物においてそのゲノム上に組み込まれたトランスジーンが長期にわたり安定的に発現するための方法に関する。具体的には、本発明は、動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）又はそのホモログ、或いは、２つの本質的に同じＸＢ断片間又はホモログ間に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、動物細胞又は非ヒト哺乳動物、並びにそれらの物質生産又は治療への使用を提供する。
2008062904.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡをゲノム上に含むことを特徴とする形質転換動物細胞。
【請求項２】
動物細胞が分化細胞である請求項１に記載の形質転換動物細胞。
【請求項３】
動物細胞が脊椎動物細胞である請求項１又は２に記載の形質転換動物細胞。
【請求項４】
脊椎動物細胞が哺乳動物細胞又は鳥類細胞である請求項３に記載の形質転換動物細胞。
【請求項５】
ＸＢ断片が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３によって示される塩基配列、或いは該塩基配列と少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換動物細胞。
【請求項６】
外来ＤＮＡがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換動物細胞。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡをゲノム上に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
マウスである請求項７に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
ＸＢ断片が、配列番号１によって示される塩基配列、或いは該塩基配列と少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列を含む請求項７又は８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
外来ＤＮＡがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする請求項７〜９のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の形質転換動物細胞の製造方法であって、動物細胞ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）、又は該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ、を作製する工程、該ＸＢ断片間又は該ホモログ間に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを形成するか、或いは該ＸＢ断片又はホモログにフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを形成する工程、得られた該ＤＮＡをベクターに挿入する工程、及び、該ベクターを動物細胞内に導入して該ＤＮＡを細胞ゲノムに組み込み、これによって形質転換動物細胞を得る工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
細胞ゲノムへの組み込みが相同組換えによって行われる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞ゲノムへの組み込みがランダムに行われる請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ベクターが選択マーカーをさらに含む請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法であって、動物細胞ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製するか、或いは該ＸＢ断片又はホモログにフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製し、該ＤＮＡをベクターに挿入する工程、得られたベクターを非ヒト動物由来の卵細胞又は胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入する工程、該卵細胞又はＥＳ細胞を仮親雌動物に移植する工程、出産により外来ＤＮＡを含むキメラ動物を得る工程を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１６】
非ヒト哺乳動物がマウスである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非ヒト哺乳動物が有蹄類である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
キメラ動物同士の交配、又は、該キメラ動物と野生型動物の交配によってホモ接合型の子孫を作出することをさらに含む請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）又はそのホモログ。
【請求項２０】
動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡ。
【請求項２１】
動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ、にフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡ。
【請求項２２】
動物が脊椎動物である請求項２０又は２１に記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
脊椎動物が哺乳動物又は鳥類である請求項２２に記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
ＸＢ断片が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３によって示される塩基配列、或いは該塩基配列と少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列を含む請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項２５】
外来ＤＮＡがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２７】
プラスミド又はウイルスベクターである請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
遺伝子治療用である請求項２６又は２７に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された動物細胞。
【請求項３０】
脊椎動物細胞である請求項２９に記載の動物細胞。
【請求項３１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の形質転換動物細胞、請求項２９又は３０に記載の動物細胞、或いは請求項７〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて外来ＤＮＡを発現し、発現産物を回収することを含むことを特徴とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を生産する方法。
【請求項３２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の形質転換動物細胞、請求項２９又は３０に記載の動物細胞、或いは請求項７〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、外来ＤＮＡを長期間安定的に発現することを含むトランスジーンの安定的発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物ゲノム上のＥｖｘ２−Ｈｏｘｄ１３の遺伝子間領域に由来する特定のＤＮＡ断片又はそのホモログを利用したトランスジーンの長期にわたる安定的発現を可能にする方法に関する。
本発明はまた、そのようなトランスジーンに含まれる外来ＤＮＡを発現し、外来ＤＮＡによってコードされる（ポリ）ペプチド又はタンパク質を長期にわたり安定的に産生することを可能にする動物細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
本発明はさらに、上記ＤＮＡ断片もしくはそのホモログ、２つの上記ＤＮＡ断片もしくはホモログ間に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡ、並びに、該ＤＮＡを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡシス調節エレメントに対するタンパク質−ＤＮＡ相互作用及びタンパク質−ＤＮＡ複合体間のさらなるクロス−トークは、正確な転写調節を決定する。遺伝子は非常に巨大なＤＮＡ分子、多数のエンハンサーやプロモーターなどの推定上のシス調節エレメントを含む高等真核生物の染色体中に埋め込まれているため、正確な遺伝子の発現調節に必要とされるそれらシス調節配列の相互作用はかなり複雑である。適正な転写調節を達成するために、これらの相互作用の選択が必要とされる。ＤＮＡ領域のいくつかは、シス調節エレメント同士の間のこれらの相互作用について上記のような交通制御の役割を演じていると考えられる。
境界エレメントは、染色体を幾つかの互いに独立するユニットに分割する。その結果、独立した染色体上のユニット間での転写調節の影響をお互いに排除している。境界エレメントについては、数個の候補が主にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの遺伝子研究から単離された（非特許文献１〜５）。それらの多くは、ホメオティック遺伝子調節のシス調節エレメントに含まれる（非特許文献１、２及び５）。エンハンサーの使用はうまく組織化されていなければならず、そのような組織化によって、クラスター化されたホメオティックな遺伝子の適正な転写調節が達成され、当該遺伝子群は、動物体内で適正な前後（ａｎｔｅｒｉｏｒ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）セグメント同一性を構築する。これらの配列の突然変異は、セグメント同一性の遺伝子及び形態の変化の発現プロフィールを変える（非特許文献２及び６）。
同様の現象はまた、哺乳動物のオーソローガスなホメオティック遺伝子群でも観察された（非特許文献７及び８）。ホメオボックス（Ｈｏｘ）遺伝子群は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで示されたものと同様に哺乳動物体の前後同一性に関わっている。Ｈｏｘ遺伝子群の調節を誤ると、形態の変化が起こり（非特許文献９及び１０）、ある場合には有害にさえなる場合が有る（非特許文献１１及び１２）。哺乳動物においても、ショウジョウバエの場合のように、エンハンサー−プロモーター相互作用が、Ｈｏｘ遺伝子発現調節を組織化するために必要である（非特許文献７及び８）。盲腸におけるＨｏｘｄ１１遺伝子の発現を調節するエンハンサーは、Ｈｏｘｄ１１から約１０ｋｂ離れているＨｏｘｄ１３プロモーターと会合できない。一方、Ｈｏｘｄ１２−Ｈｏｘｄ１３遺伝子間の配列の欠失をもたらしたマウスにおいてはＨｏｘｄ１３遺伝子はＨｏｘｄ１１に類似の盲腸での発現が見出される（非特許文献７及び８）。したがって、Ｈｏｘｄ１２−Ｈｏｘｄ１３遺伝子間配列はインスレーターとして機能すると結論された。
境界エレメントは染色体を複数のユニットに分割すると予想されるため、エンハンサー活性は境界配列を越えて別のユニットに存在すると考えられるプロモーターに到達できない。これがインスレーター活性である。しかしながら、エンハンサーのインスレーション活性は、境界エレメントの一つの特性である。このほかに、境界エレメントは、遺伝子の発現を抑制するヘテロクロマチンの広がりを妨げる活性も有する（非特許文献６）。最近、これらの２つの活性、すなわちインスレーション活性と位置価保護活性、が互いに分離可能であることが発見された（非特許文献１３）。
【非特許文献１】Ｍ．Ｐｅｉｆｅｒ及びＷ．Ｂｅｎｄｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８６，５：２２９３−２３０３
【非特許文献２】Ｈ．Ｇｙｕｒｋｏｖｉｃｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９０，９：２５７９−２５８５
【非特許文献３】Ｒ．Ｋｅｌｌｕｍ及びＰ．Ｓｃｈｅｄｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２，１２：２４２４−２４３１
【非特許文献４】Ｇｅｏｒｇｉｅｖ及びＣｏｒｃｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２：５１８４−５１８８
【非特許文献５】Ｓ．Ｂａｒｇｅｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００，１２７：７７９−７９０
【非特許文献６】Ｊ．Ｍｉｈａｌｙら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９７，１２４：１８０９−１８２０
【非特許文献７】Ｔ．Ｋｏｎｄｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９９８，１：２８９−３００
【非特許文献８】Ｍ．Ｋｍｉｔａら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０００，２６：４５１−４５４
【非特許文献９】Ｔ．Ａｋａｓａｋａら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９６，１２２：１５１３−１５２２
【非特許文献１０】Ｎ．Ｃｏｒｅら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００，１２４：７２１−７２９
【非特許文献１１】Ｔ．Ｋｏｎｄｏ及びＤ．Ｄｕｂｏｕｌｅ，Ｃｅｌｌ  １９９９，９７：４０７−４１７
【非特許文献１２】Ｍ．Ｋｍｉｔａら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００２，１２９：５５２１−５５２８
【非特許文献１３】Ｆ．Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２，９９：６８８３−６８８８
【発明の開示】
【０００３】
本発明者らは、今回、ＨｏｘＤ複合体（すなわち、Ｅｖｘ２とＨｏｘｄ１３の遺伝子間領域）内の境界エレメントの新たな候補を見出し、この断片が実際、インスレーション活性とともに、位置価保護活性を含むこと、この境界配列が組織特異的な様式で機能すること、並びに、この組織特異的な調節が境界活性から分離可能であることを見出した。このような知見に基づいた発展的研究から、この新規な外来ＤＮＡを同じ２つの境界断片間に挿入する形で作製されたトランスジーンが、動物細胞において、長期にわたって安定的に発現することを見出した。
したがって、本発明は、細胞又は動物においてトランスジーンを安定的に発現する方法、並びに、そのような発現を可能にする動物細胞又は非ヒト哺乳動物を提供することを目的とする。
本発明は、以下の特徴を有する。
（１）動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡをゲノム上に含むことを特徴とする形質転換動物細胞。
（２）動物細胞が分化細胞である上記（１）に記載の形質転換動物細胞。
（３）動物細胞が脊椎動物細胞である上記（１）又は（２）に記載の形質転換動物細胞。
（４）脊椎動物細胞が哺乳動物細胞又は鳥類細胞である（３）に記載の形質転換動物細胞。
（５）ＸＢ断片が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３によって示される塩基配列、或いは該塩基配列と少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列を含む上記（１）〜（４）のいずれかに記載の形質転換動物細胞。
（６）外来ＤＮＡがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の形質転換動物細胞。
（７）非ヒト哺乳動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡをゲノム上に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（８）マウスである上記（７）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（９）ＸＢ断片が、配列番号１によって示される塩基配列、或いは該塩基配列と少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列を含む上記（７）又は（８）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１０）外来ＤＮＡがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする上記（７）〜（９）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（１１）上記（１）〜６のいずれかに記載の形質転換動物細胞の製造方法であって、動物細胞ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）、又は該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ、を作製する工程、該ＸＢ断片間又は該ホモログ間に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを形成するか、或いは該ＸＢ断片又はホモログにフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを形成する工程、得られた該ＤＮＡをベクターに挿入する工程、及び、該ベクターを動物細胞内に導入して該ＤＮＡを細胞ゲノムに組み込み、これによって形質転換動物細胞を得る工程を含むことを特徴とする前記方法。
（１２）細胞ゲノムへの組み込みが相同組換えによって行われる上記（１１）に記載の方法。
（１３）細胞ゲノムへの組み込みがランダムに行われる上記（１１）に記載の方法。
（１４）ベクターが選択マーカーをさらに含む上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）上記（７）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法であって、動物細胞ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製するか、或いは該ＸＢ断片又はホモログにフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製し、該ＤＮＡをベクターに挿入する工程、得られたベクターを非ヒト動物由来の卵細胞又は胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入する工程、該卵細胞又はＥＳ細胞を仮親雌動物に移植する工程、出産により外来ＤＮＡを含むキメラ動物を得る工程を含むことを特徴とする前記方法。
（１６）非ヒト哺乳動物がマウスである上記（１５）に記載の方法。
（１７）非ヒト哺乳動物が有蹄類である上記（１５）に記載の方法。
（１８）キメラ動物同士の交配、又は、該キメラ動物と野生型動物の交配によってホモ接合型の子孫を作出することをさらに含む上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）又はそのホモログ。
（２０）動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡ。
（２１）動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ、にフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡ。
（２２）動物が脊椎動物である上記（２０）又は（２１）に記載のＤＮＡ。
（２３）脊椎動物が哺乳動物又は鳥類である上記（２２）に記載のＤＮＡ。
（２４）ＸＢ断片が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３によって示される塩基配列、或いは該塩基配列と少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列を含む上記（２０）〜（２３）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（２５）外来ＤＮＡがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（２６）上記（２０）〜（２５）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
（２７）プラスミド又はウイルスベクターである上記（２６）に記載のベクター。
（２８）遺伝子治療用である上記（２６）又は（２７）に記載のベクター。
（２９）上記（２６）〜（２８）のいずれかに記載のベクターで形質転換された動物細胞。
（３０）脊椎動物細胞である上記（２９）に記載の動物細胞。
（３１）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の形質転換動物細胞、上記（２９）又は（３０）に記載の動物細胞、或いは上記（７）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて外来ＤＮＡを発現し、発現産物を回収することを含むことを特徴とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を生産する方法。
（３２）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の形質転換動物細胞、上記（２９）又は（３０）に記載の動物細胞、或いは上記（７）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、外来ＤＮＡを長期間安定的に発現することを含むトランスジーンの安定的発現方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−３１４３０７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、Ｅｖｘ２−Ｈｏｘｄ１３の遺伝子構造及びそれらの発現を示す。Ａ：Ｅｖｘ２及びＨｏｘｄ１３遺伝子は８ｋｂの距離で互いに近くに存在し、対抗鎖上にコードされている。Ｂ：１１ｄｐｃ胚のＥｖｘ２（左パネル）とＨｏｘｄ１３（右パネル）の発現パターン。Ｅｖｘ２は、四肢及び性器芽などのＨｏｘｄ１３を有する共通の発現領域だけでなく、中枢神経系（ＣＮＳ）内での発現を示した。Ｃ：これら遺伝子の発現パターンを分離する仮説を示すスキーム。Ｅｖｘ２の３’に位置するエンハンサーは、Ｅｖｘ２プロモーター及びＨｏｘｄ１３プロモーターに向かう相互作用に差がある。Ｅｖｘ２−Ｈｏｘｄ１３の遺伝子間領域は、ＣＮＳにおいて特異的にエンハンサーのアクセスを妨げたが四肢では妨げなかった。
図２は、標的化トランスジェニックマウスのＨｏｘｄ９／ｌａｃＺマーカートランスジーン発現パターンを示す。ｒｅｌＯトランスジェニックマウスにおいて、Ｈｏｘｄ９／ｌａｃＺトランスジーンがＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子との中間部に挿入された（Ａ）。ｒｅｌＩ系統では、Ｈｏｘｄ９／ｌａｃＺトランスジーンが、ＥＳ細胞を用いるジーンターゲティング法によってＥｖｘ２のすぐ下流の領域に挿入された（Ａ）。その結果得られたＥＳ細胞を注入しマウスを樹立した。ｌａｃＺ染色パターンは、ｒｅｌＯマウスが、Ｈｏｘｄ１３のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｃ）に観察されるように、脳での発現をもたないが、ｒｅｌＩがＥｖｘ２として明瞭な峡部発現を示すことが示された（Ｂ）。
図３は、標的化トランスジーン実験を用いるインスレーター断片の分析結果を示す。Ａ：実験設計のスキーム。インスレーター候補断片を有するＨｏｘｄ９／ｌａｃＺトランスジーンを、ＥＳ細胞を使用するジーンターゲティングによって、Ｅｖｘ２のすぐ下流の領域に挿入した。得られたＥＳ細胞を注入してマウスを樹立した。Ｂ：赤色で示したＸｈｏＩ−ＮｓｉＩ（ＸＮｓ）断片を３つの断片、すなわちＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ（ＢＢ）、ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ（ＥＢｇ）及びＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ（ＸＢ）断片に切断し、Ｈｏｘｄ９／ｌａｃＺレポータートランスジーンと一緒に転座した。１１ｄｐｃ胚に対するｌａｃＺ染色は、ＸＮｓ（Ｃ）及びＸＢ（Ｆ）がｌａｃＺ遺伝子の脳発現をブロックすることを示したが、一方、ＢＢ（Ｄ）及びＥＢｇ（Ｅ）はブロックしなかった。これらの結果に基づいて、ＸＢ断片をさらに、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ（ＸＥ）とＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ（ＥＥ）に分割し、類似の構造をもつ標的化トランスジェニックマウスを作出した。ＸＥ（Ｇ）及びＥＥ（Ｈ）はともに、脳での発現を示し、インスレーション活性を少しも示さなかった。
図４は、インスレーション活性の空間依存性を示す。Ａ：図２Ａにおけるような、標的化トランスジェニックマウスＸＮｓ及びＸＢの設計の説明。Ｂ：ＸＮｓ（左パネル及び上中央パネル）及びＸＢ（下中央パネル及び右パネル）の発現パターン。ＸＮｓは、四肢（左及び右パネルの四角）及び性器芽（中央パネル）におけるｌａｃＺ発現を示したが、ＸＢはそのような発現を示さなかった。ＣＮＳ内では、ＸＢ断片がエンハンサーとＨｏｘｄ１３プロモーターの相互作用を妨げたが、一方、ＢＢ断片は、四肢及び性器芽内でＸＢ断片のインスレーター活性を消失させた。
図５は、ＸＢ標的化トランスジェニックマウスで観察されたＥｖｘ２及びＨｏｘｄ１３の前成熟発現を示す。Ａ：ＸＢトランスジェニックマウスの７ｄｐｃ胚におけるＥｖｘ２及びＨｏｘｄ１３の発現が特異的にアプレギュレートされた。サンプルＲＮＡの量はβ−アクチンによって標準化されている。Ｂ：ＸＢトランスジェニックマウスにおけるこれらの遺伝子の前成熟発現の仮想的スキーム。野生型又はＢＢ標的化トランスジェニックマウスにおいては、Ｅｖｘ２の下流領域がＨｏｘ発現のための予備段階として、７ｄｐｃ前の胚のＨｏｘ複合体全体に対して抑制する。ＸＢマウスにおいては、この抑制は、ＸＢ断片によるブロッキング機能によってブロックされ、ＨｏｘＤ複合体に入らなかった。
図６は、ＸＢ断片の位置価ブロッカー活性。Ａ：ＮＩＨ３Ｔ３細胞系統に導入された構築物を示す。上の構築物Ｉは、ＣＡＧＧＳプロモーターによって駆動される蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ）を発現し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞でのトランスフェクションによる安定な形質転換体コロニーを得るために、Ｇ４１８選択を可能にするネオマイシン耐性遺伝子を有する。下の構築物ＩＩは、Ｖｅｎｕｓ発現マーカー遺伝子の両側にＸＢブロッカー断片をもつ類似の構成をもつ。Ｂ：トランスフェクションのための実験スキーム。両方の構築物についての安定な形質転換体が、Ｇ４１８耐性により選択された。それらのコロニーを１年間培養で維持した。１、６及び１２ヶ月後に各コロニーからサンプルを得てＦＡＣＳ分析を行った。Ｃ：各構築物の１２コロニーを、蛍光についてテストした。ＸＢ断片のない構築物Ｉは蛍光陽性細胞を減少したが、ＸＢ構築物ＩＩは蛍光を維持した。
図７は、ＸＢ断片のトランスジェニックマウスにおける位置価ブロッカー活性を示す。（Ａ）：パネルの左側２匹は構築物Ｉ（ＬＣＶＬとして示されている）の卵への注入実験におけるマウス胎児。そのうちの左側はＤＮＡの挿入が有り、右側には外来ＤＮＡは存在していない。右側２匹は構築物ＩＩ（ここではＸＢＬＣＶＬとして示されている）の卵への注入実験におけるマウス胎児。構築物Ｉの場合と同様に、左側にはＤＮＡが挿入されており、右側の胎児には外来ＤＮＡは存在していない。（Ｂ）：表はそれぞれの実験におけるＤＮＡの挿入に対して蛍光が観察できた胎児の数と割合（％）を表している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、第１の態様において、動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）又はそのホモログを提供する。
本発明におけるＸＢ断片は、マウスを例とした図３Ｂに示される約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片、すなわち「ＸＢ断片」を指すが、本発明では、マウスのＸＢ断片だけでなく、他の動物由来の、ＸＢ断片に対応する同等の生物機能をもつそのホモログも対象とする。
本発明は、第２の態様において、動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを提供する。
本発明はまた、第３の態様において、動物ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ、にフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを提供する
本発明におけるＸＢ断片及びそのホモログの生物機能には、異種のトランスジーンが動物細胞又は動物個体のゲノムに導入されたときに導入部位の染色体環境によって引き起こされる抑制に対する保護活性が含まれる。ここで、抑制とは挿入外来遺伝子の発現の喪失を意味する。また、ホモログは、異なる動物種に由来するＸＢ断片に対応するゲノム上のＤＮＡ断片であり、その動物のゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に存在するヌクレオチド配列を本質的に有している。
上記の保護活性に加えて、本発明におけるＸＢ断片及びそのホモログはまた、エンハンサーブロッカー活性も有している。ＸＢ断片及びそのホモログは、Ｅｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子との間に位置する境界エレメントの１つであり、この境界エレメントのために、エンハンサー活性は境界配列を越えてプロモーターに到達することができない。このような活性をエンハンサーブロッカー活性又はエンハンサーインスレーション活性という。
本発明において、動物とは、無脊椎動物、例えばショウジョウバエ、カイコ、ヨトウムシ等の昆虫、及び脊椎動物、例えば哺乳動物、鳥類、両生類、爬虫類及び魚類を指す。好ましい動物は脊椎動物、より好ましい動物は哺乳動物である。哺乳動物の例は、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどの有蹄類などを挙げることができる。また、動物細胞は、上記の動物由来の任意の細胞や細胞系統を含む。好ましい動物細胞は、鳥類細胞、例えば初代培養細胞、哺乳動物細胞、例えば初代培養細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ細胞などである。なお、動物細胞として例えば、ヨトウムシなどの昆虫由来細胞を用いる場合や、カイコの細胞、幼虫、蛹を用いる場合には、例えばバキュロウイルスベクターをベクターとして採用することができる。より詳細には、ヨトウムシなどの昆虫由来細胞の場合は前記ウイルスベクターとして例えばＡｃＮＰＶを、カイコの細胞、幼虫、蛹を用いる場合は前記ウイルスベクターとして例えばＢｍＮＰＶを用いることができる。
本発明における上記のＸＢ断片及びそのホモログの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）、ＥＭＢＬ（欧州ＥＢＩ）などのデータベースを利用して入手することができる。そのための検索システムとしては、例えばＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を使用することができる（高木利久・金久實編、ゲノムネットのデータベースの利用法、第２版、１９９８年、共立出版、東京、日本）。
ＸＢ断片及びそのホモログの例は、マウスについて配列番号１に、ヒトについて配列番号２に、ニワトリについて配列番号３にそれぞれ示した塩基配列、或いは、これらの各塩基配列と少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．９％の同一性を有する塩基配列である。本明細書中、％同一性は、上記配列のいずれかと別の配列とを、ギャップを導入するかまたは導入しないで、整列させたとき、全塩基数に対する同一塩基数の百分率（％）を意味すす。ホモログの検索や％同一性を求めるためのアルゴリズムとして、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどを利用することができる。
ＸＢ断片及びそのホモログは、上記の塩基配列に基づいて作製したプライマーを使用する、かつ、動物の細胞又は組織から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子組換え技術を利用することによって作製することができる。
プライマーは、通常１５〜５０塩基、好ましくは１７〜３０塩基、より好ましくは２０〜２５塩基の長さを有する。
ＰＣＲは、変性、アニーリング及び伸長からなる３つの反応段階を含み、例えば、二本鎖ＤＮＡの変性のための９４℃、１５秒〜６０秒の処理、プライマーと一本鎖鋳型ＤＮＡとのアニーリングのための５５℃、３０秒〜６０秒の処理、及びプライマーの伸長のための７２℃、３０秒〜１０分の処理を含むことができる。変性、アニーリング及び伸長からなる３つの反応段階を１サイクルとして、例えば２０〜４０サイクルを行う。さらに、サイクルの開始前に、９４℃、３０秒〜５分の加熱処理をおこなってもよいし、また、サイクルの終了後に７２℃、３０秒〜１０分の伸長反応を行なってもよい。ＰＣＲ反応には、耐熱性ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ（例えばＡｍｐｌｉＴａｑ、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑなど）が使用される。また、ＰＣＲでは、反応溶媒中に例えば約２０〜２００μＭ濃度のｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）、例えば約１．５〜２．５ｍＭ濃度のＭｇ２＋が必要である。ＰＣＲは、市販の自動化装置（例えばＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（フナコシ、日本）、ＧｅｎｅＡｍｐ（パーキンエルマー）など）を使用すると便利である。増幅産物の検出は、増幅産物のサイズがキロベースオーダーであるため、例えばアガロースゲル電気泳動を用いて行うことができる。ＰＣＲ法については、関谷・藤永編、蛋白質核酸酵素ＰＣＲ法最前線、基礎から応用まで、Ｖｏｌ．４１Ｎｏ．５、１９９６年４月号増刊、共立出版、東京、日本などを参照することができる。
なお、鋳型ＤＮＡは、プロテイナーゼ／フェノール抽出法、プロテイナーゼ／フェノール／クロロホルム法などの慣用技術によって組織や細胞から調製することができる。
本発明において、外来ＤＮＡは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードすることができる。例えば、外来ＤＮＡは、食品や医薬分野において有用なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、例えばホルモン類、酵素類、神経伝達物質類、抗体類などをコードすることができる。外来ＤＮＡはまた、上記のようなペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のプロ体又はプロプレ体、或いはシグナルペプチド結合体などをコードしてもよい。外来ＤＮＡは、その塩基配列をＧｅｎＢａｎｋやＥＭＢＬなどのデータベース或いは文献等の記載から入手し、ＤＮＡ自動合成機や遺伝子組換え技術を利用して合成することができる。
遺伝子組換え技術によるＤＮＡの合成は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９などに記載される技術を用いて行うことができる。例えば、大腸菌、枯草菌などの原核生物用ベクター（例えば市販のプラスミドなど）に目的のＤＮＡを挿入し、原核生物に形質転換し、形質転換体を増殖したのち、ベクターを回収、適当な制限酵素を用いて目的ＤＮＡを切り出すことができる。
本発明において、上記の手順に従って、ＸＢ断片又はそのホモログ、或いは２つの本質的に同じＸＢ断片又はそのホモログ、並びに外来ＤＮＡを準備し、ついで、ＸＢ断片又はそのホモログにフランキングするように外来ＤＮＡを連結するか、或いは２つの本質的に同じＸＢ断片間又はホモログ間に、外来ＤＮＡを連結する。連結は、適当な制限酵素を作用して作った付着末端又は平滑末端を介してＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。
本明細書中で使用する「２つの本質的に同じ」とは、２つのＸＢ断片又はホモログの塩基配列が互いに少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つのＸＢ断片又はホモログの塩基配列は同一である。
本明細書中で使用する「フランキングする」とは、互いに実質的に隣接してＤＮＡ同士が結合することを意味し、ＤＮＡ間には、任意の介在配列が存在してもよい。介在配列は、例えば制限酵素部位の配列の一部、リンカー配列、制御配列（例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位など）などを包含することができる。
本発明のＤＮＡにはさらに、必要であれば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節配列を含むことができる。プロモーターは、例えば組織特異的プロモーター、ウイルスプロモーターなどを含む。プロモーターの例は、ＣＡＧＧＳプロモーター、β−ａｃｔｉｎプロモーターなどである。プロモーターは、通常、外来ＤＮＡ配列の５’末端に連結される。
本発明はさらに、外来ＤＮＡを含む上記ＤＮＡを含むベクターを提供する。
本発明のベクターは、上記ＤＮＡを含み、かつ動物細胞のゲノム上にランダムに組換えもしくは挿入可能な限り、又は、相同組換え可能な限り、いずれの種類のベクターであってもよい。好ましいベクターは、プラスミド又はウイルスベクターである。例えば、プラスミドベクターは、ｐＧＴ−Ｎ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰ７２、ｐＰＮＴなどのプラスミドベクター、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどのウイルスベクターであるが、これらに限定されないものとする。なお、動物細胞として例えば、ヨトウムシなどの昆虫由来細胞を用いる場合や、カイコの細胞、幼虫、蛹を用いる場合には、例えばバキュロウイルスベクターをベクターとして採用することができる。より詳細には、ヨトウムシなどの昆虫由来細胞の場合は前記ウイルスベクターとして例えばＡｃＮＰＶを、カイコの細胞、幼虫、蛹を用いる場合は前記ウイルスベクターとして例えばＢｍＮＰＶを用いることができる。
本発明のＤＮＡをベクターに結合するために、ベクターがマルチクローニングサイトなどのクローニング部位を含むと便利である。マルチクローニングサイトは、ユニークな複数の制限部位を含むため、この制限部位の適当な位置に本発明のＤＮＡを容易に挿入することができる。
本発明のベクターはさらに、選択マーカーを含むことができる。選択マーカーは、例えば薬剤耐性遺伝子マーカー（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシヂン耐性遺伝子など）などの形質転換細胞のポジティブ選択のためのマーカー、及び／又は、ネガティブ選択用遺伝子マーカー（例えばＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子など）が含まれる。ネガティブ選択は、例えば抗ヘルペス薬、ＦＩＡＵ、ガンシクロビルなどの薬剤の存在下で非相同組換え細胞を選択的に排除し、これによって相同組換え細胞を選択するために有用である。
本発明のベクターはさらに、動物細胞のゲノムへの相同組換え効率を高めるために、ｌｏｘＰ配列を本発明のＤＮＡの両端部位に含有させることができ、所謂Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系（Ｒ．Ｋｕｈｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６９：１４２７−１４２９）を利用することができる（例えば、相沢慎一，ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，バイオマニュアルシリーズ８，羊土社、東京、日本、１９９５年）参照）。
上記のようにして作製された本発明のベクターを用いて動物細胞を形質転換又はトランスフェクションすることができる。導入方法には、ミクロセル法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが例示されるがこれらに限定されない。
動物細胞には、上に例示したような細胞が包含される。動物細胞は、分化細胞であるのが好ましい。また、好ましい動物細胞は、脊椎動物細胞であり、そのなかで特に哺乳動物細胞又は鳥類細胞が好ましい。哺乳動物細胞の例は初代培養細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ細胞、鳥類細胞の例は初代培養細胞である。
本発明の形質転換動物細胞は、例えば次のような方法で製造することができる。すなわち、この方法は、動物細胞ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）、又は該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ、を作製する工程、該ＸＢ断片間又は該ホモログ間に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを形成するか、或いは該ＸＢ断片又はホモログにフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを形成する工程、得られた該ＤＮＡをベクターに挿入する工程、及び、該ベクターを動物細胞内に導入して該ＤＮＡを細胞ゲノムに組み込み、これによって形質転換動物細胞を得る工程を含む。
上記の方法において、細胞ゲノムへのＤＮＡの組み込みは、ランダムに、或いは、ゲノム上のＸＢ断片又はそのホモログの配列との相同組換えによって行なう。また、細胞ゲノムとＤＮＡの関係において、組込みは、同種間又は異種間のいずれでも行うことができる。
一般に、組換えは、染色体同士又は染色体間で外来ＤＮＡを交換したり移動させたりする反応であり、非常に類似した配列をもつＤＮＡ断片の間で起こる組換えが相同組換えであるのに対して、非類似の又は類似性の低い配列間で起こる組換えが非相同組換え（又は、ランダム挿入）である。哺乳動物細胞では、相同組換えによりゲノムの特定の部位に外来ＤＮＡが組み込まれる確率は非常に低く、逆にランダムな挿入が高頻度に起こることが知られている。本発明では、上記の通り、ゲノムへのＤＮＡの組み込みは、相同組換え又はランダムな挿入のいずれでもよい。ランダム挿入の場合には、内在性遺伝子は変化しないままである。
本発明はさらに、動物細胞ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製するか、或いは該ＸＢ断片又はホモログにフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製し、該ＤＮＡをベクターに挿入する工程、得られたベクターを非ヒト動物由来の卵細胞又は胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入する工程、該卵細胞又はＥＳ細胞を仮親雌動物に移植する工程、出産により外来ＤＮＡを含むキメラ動物を得る工程を含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
外来ＤＮＡを含むＤＮＡは、上に定義したとおりである。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば次のような方法で作出することができる。すなわち、この方法は、動物細胞ゲノム上のＥｖｘ２遺伝子とＨｏｘｄ１３遺伝子の遺伝子間領域に由来する２つの本質的に同じ約２．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＸＢ断片）間、或いは該ＸＢ断片に対応しそれと同等の生物機能をもつそのホモログ間、に挿入された外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製するか、或いは該ＸＢ断片又はホモログにフランキングされた外来ＤＮＡを含むＤＮＡを作製し、該ＤＮＡをベクターに挿入する工程、得られたベクターを非ヒト動物由来の卵細胞又は胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入する工程、該卵細胞又はＥＳ細胞を仮親雌動物に移植する工程、出産により外来ＤＮＡを含むキメラ動物を得る工程を含む。
非ヒト哺乳動物は、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、有蹄類（例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）を含むことができる。好ましい非ヒト哺乳動物がマウスである。
本発明のキメラ動物及びその子孫動物の作製をさらに具体的に説明する。
本発明のキメラ動物を作製する方法として、受精卵に直接ターゲティングベクターを注入し仮親に移植する方法、胚性幹（ＥＳ）細胞を用いる方法などがある。
受精卵（卵細胞）を使用する方法について以下に説明する。
交配した非ヒト雌動物から採取した受精卵の雄性前核に、本発明の上記ＤＮＡ又はベクターをマイクロインジェクション法にて顕微注入したのち、その受精卵を不妊手術をした雄動物と交尾した雌動物（仮親）の卵管に移植し、キメラ動物を出産させる。
キメラ動物の組織の一部を取り出し、ＤＮＡを抽出し、目的の外来ＤＮＡを含むトランスジーンが染色体に組み込まれた動物を、例えばサザンハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション技術、ゲノムＰＣＲ技術などの公知の手法を使用して選択することができる。このとき、外来ＤＮＡに相補的な配列を含む蛍光、放射性ラベルなどで標識した標識プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことができる。蛍光ラベルとしては、フルオレサミン及びその誘導体（例えばＦＩＴＣなど）、ローダミン及びその誘導体（例えばテトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンレッド−Ｘなど）、シアニン蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）などを含む。
上記のようにして作出されたキメラ動物同士の交配か又はキメラ動物と野生型動物の交配により、ヘテロ接合体を得たのち、ヘテロ接合体同士を交配してホモ接合体を作出、選択する。
次に、ＥＳ細胞を使用する方法について以下に説明する。
ＥＳ細胞は、受精後の胚盤胞又は８細胞期胚内に存在する未分化細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、細胞塊の解離と継体を繰り返しながら樹立された未分化状態を保持したまま増殖を続ける細胞株である。例えばマウスＥＳ細胞株の例としては、Ｄ３細胞株、Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞株、ＴＴ２細胞株、ＡＢ−１細胞株、Ｊ１細胞株、Ｒ１細胞株などが知られている。
上記のように作製したターゲティングベクターを、例えばミクロセル法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの公知の方法を使用してＥＳ細胞に導入する。
得られた組換えＥＳ細胞について、目的の組換え（相同組換え、非相同組換えを含む）が起こっているかどうかは、例えば、プローブ又はプライマーを使用するサザンハイブリダイゼーションやサザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ゲノムＰＣＲ法などによって行うことができる。これによって、組換えが起こったＥＳ細胞を選択する。その後、選択したＥＳ細胞を、野生型の胚盤胞又は８細胞期胚内に導入し、ＥＳ細胞を含む胚を偽妊娠仮親動物の子宮に移植し、出産させることによりキメラ動物を作製する。
ＥＳ細胞を胚盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能である。マウスの場合には、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させて初期発生胚を得るが、組換えＥＳ細胞の導入胚として、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、８細胞期胚を用いる場合には２．５日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて組換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで注入し、キメラ胚を作製する。
一方、仮親とするための偽妊娠雌動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠動物に対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラ動物を作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌動物と仮親となる偽妊娠動物とを、同一の性周期にある雌動物群から作出することが望ましい。
ＥＳ細胞移植胚に由来する動物個体が、このようなキメラマウスの中から得られた場合、このキメラ動物を純系の動物と交配し、例えばマウスなどの場合次世代個体にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウス生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色によることが望ましい。また、体の一部（例えば尾部）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選抜を行うこともまた可能である。
このように、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖させることにより、目的とする外来ＤＮＡを含むトランスジーンが導入された動物個体を得ることができる。得られたヘテロ接合体（＋／−）動物同士を交配させることにより、あるいはキメラ動物と野生型動物を交配させることにより、目的とするホモ接合体（−／−）動物を得ることができる。このようにして作出された動物は、子孫動物に遺伝的に伝達される。それゆえ、本発明の非ヒト哺乳動物は、外来ＤＮＡを含むキメラ動物およびその子孫の両方を包含する。
上記のジーンターゲティング法については、例えば相沢慎一，ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，バイオマニュアルシリーズ８，羊土社東京、日本（１９９５年）を参照することができる。
本発明はさらに、上記のいずれかの形質転換動物細胞を用いて外来ＤＮＡを発現し、発現産物を回収することを含むことを特徴とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を生産する方法を提供する。
外来ＤＮＡの発現はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて行うことができる。具体的には、外来ＤＮＡを発現した組織又は体液を該動物から取り出し、発現産物を慣用の精製技術（下記参照）を組み合わせて用いて精製に供することができる。部位特異的発現のために、例えば臓器又は器官特異的トランジットペプチドもしくはシグナル又は乳汁分泌シグナルをコードするＤＮＡを外来ＤＮＡに連結することができる。
動物細胞の培養に適した培地（例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＭＥＭ培地、ａｌｐｈａ−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）中、適する温度（例えば２５〜４０℃）にて、本発明の動物細胞を培養し、外来ＤＮＡを発現させることができる。外来ＤＮＡがシグナル配列を有するときには、発現産物は細胞外に分泌されるので、培地から発現産物を回収することができる。
発現産物としてのペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、塩析、遠心分離、限外ろ過などの慣用技術を適宜組み合わせて用いることによって精製することができる。
発現産物の同定及び定量は、例えば特異的抗体を用いる免疫学的分析法（例えば酵素抗体法、蛍光抗体法、サンドイッチ法、オクタロニー法など）、ＨＰＬＣやＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによる分子量の測定などの技術を用いて行うことができる。
本発明はさらに、上記の形質転換動物細胞、或いは上記の非ヒト哺乳動物において、外来ＤＮＡを長期間安定的に発現することを含むトランスジーンの安定的発現方法を提供する。
ここで、トランスジーンは、上記定義の外来ＤＮＡを指し、例えばペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードすることが好ましい。
下記の実施例で実証されるように、本発明のＤＮＡが組換え（相同組換え、非相同組換えを含む）によってゲノムに導入された形質転換動物細胞は、長期間、すなわち１年以上、にわたって外来ＤＮＡによってコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を産生することができる。この事実に鑑みて、非ヒト哺乳動物においてもトランスジーンが安定的に発現されるだろう。
特に、トランスジーンが、治療上有効なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする場合には、ヒト患者において、本発明の上記ベクターを遺伝子治療のために使用することができる。この場合、ベクターは、直接患部に注入してもよいし、或いは、リポソーム、特に正電荷リポソーム（例えば中西守ら，蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．４４  Ｎｏ．１１  １５９０−１５９６（１９９９），共立出版（東京、日本）に記載の正電荷コレステロール誘導体、これは外来遺伝子を細胞内のみならず核内に移行することができる。）や高分子ナノ粒子（例えばＹｏｕｎｓｏｏ  Ｂａｅ及びＫａｚｕｎｏｒｉ  Ｋａｔａｏｋａ，生化学Ｖｏｌ．７８  Ｎｏ．９  ８８２−８８７，日本生化学会（東京、日本）（２００６））の内部に含有させて非経口的に、例えば静脈内投与によって投与することができる。疾患は、特に制限されず、例えばハンチントン病、癌などを含む。
さらにまた、本発明のトランスジェニック動物は、それに機能未知の外来遺伝子を導入する場合、長期間にわたり安定的に該遺伝子を発現することが可能であるため、該遺伝子が生体に及ぼす影響を観察することによって、その生物学的機能を解明するために利用することができる。
以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０００６】
（１）実験手法
標的化トランスジーン
Ｈｏｘｄ９／ｌａｃＺレポーターを含むトランスジーンを、該トランスジーンにフランキングする５’部位にテスト断片と一緒に、Ｒ１  ＥＳ細胞内にエレクトロポレーションによってＥｖｘ２遺伝子のすぐ下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。ネオマイシン耐性を用いてＥＳ細胞を選択し、報告にあるように（非特許文献１１：Ｔ．Ｋｏｎｄｏ及びＤ．Ｄｕｂｏｕｌｅ，Ｃｅｌｌ  １９９９，９７：４０７−４１７）、ゲノムサザンハイブリダイゼーションによって相同組換え体を単離した。これらの相同組換え体を用いてキメラマウスを作出し、標的部位に外来遺伝子が挿入されたトランスジェニックマウスを樹立した。
細胞培養
１０％ＦＢＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＭＥＭ培地を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養した。エレクトロポレーションによって構築物を導入した。２つの構築物を含む形質転換体の各プールからの１２個のコロニーを無作為に単離し、さらなる試験に使用した。これらの形質転換体の培養を続けて、培養の開始から１、６及び１２ヶ月目に、それらの蛍光を観察した。
遺伝子発現
確立したプロトコールを用いて、β−ガラクトシダーゼの染色とｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。Ｈｏｘｄ１３プローブはこれまで記載されている。Ｅｖｘ２プローブは、Ｅｖｘ２遺伝子の３’ＵＴＲに対応するＥｖｘ２遺伝子のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩゲノム断片から誘導された。
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を試薬としてＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ（Ｃｏｒｂｅｔｔ社）を用いたリアルタイムＰＣＲによって、Ｅｖｘ２及びＨｏｘｄ１３遺伝子の発現を観察した。野生型交配の３匹のプラグ（ｐｌａｇｕｅ）から７ｄｐｃ胚を単離し、ＸＢ標的化トランスジェニックヘテロ接合体マウスの交配から６プラグを単離し、各胚の同腹子からｃＤＮＡプールを作製した。ｃＤＮＡ量を調整するために、β−アクチンを用いるＰＣＲを行い、ｃＤＮＡの希釈比を決定した。
使用したプライマーを以下のとおりである。
2008062904.tif 000003
2008062904.tif 000004
本発明者らは、ｃＤＮＡの各プールにつき３連のＰＣＲを行い、β−アクチン、Ｅｖｘ２及びＨｏｘｄ１３について単離したｃＤＮＡの連続希釈系列によって作成された標準曲線を用いて生成物量を算出した。
（２）結果
Ｅｖｘ２とＨｏｘｄ１３の発現プロフィールの相違点
Ｅｖｘ２遺伝子はＨｏｘｄ１３遺伝子の隣に位置し、Ｈｏｘｄ１３遺伝子とは８ｋｂ以内の距離で離間している。また、この遺伝子は、ＨｏｘＤ遺伝子とは逆向きのＤＮＡ鎖上にコードされている（図１Ａ）。Ｅｖｘ２は、交尾後の１０日胚（１０ｄｐｃ胚ともいう）において、その近傍のＨｏｘｄ１３遺伝子と異なる発現プロフィールを示す（図１Ｂ）が、発生初期の発現プロフィールは互いにほとんど同じである。Ｅｖｘ２は、１０ｄｐｃ胚の中枢神経系、特に峡部内突起、において発現を開始するが、一方、Ｈｏｘｄ１３は、胚期及び胎児期にそのような前方発現パターンを示さなかった（図１Ｂ）。先の研究で、本発明者らは、ＥＳ細胞に相同組換え系を用いることによってＥｖｘ２の周囲にＨｏｘｄ９／ｌａｃＺマーカートランスジーンの一連のインサートを有するマウスを作出した（図２Ａ）（非特許文献１１）。Ｅｖｘ２ポリ（Ａ）＋シグナルのすぐ下流に挿入されたトランスジーン（ｒｅｌＩ）はＥｖｘ２発現を反映するが、一方、Ｅｖｘ２の開始コドンとＨｏｘｄ１３の開始コドンの中間部に挿入された別のトランスジーン（ｒｅｌＯ）はＨｏｘｄ１３に類似しており、１１ｄｐｃ胚における中枢神経系での発現を欠く（図２Ｂ）（非特許文献１１）。これらの遺伝子のＣＮＳ、指及び生殖器での発現を駆動するエンハンサー活性は、Ｅｖｘ２から約２５０ｋｂ下流の領域に位置している（Ｆ．Ｓｐｉｔｚら，Ｃｅｌｌ  ２００３，１１３：４０５−４１７）。これらの結果から、エンハンサーブロッカーエレメント（すなわち、インスレーター）がＥｖｘ２のプロモーター領域付近に存在し、ＣＮＳにおいてＨｏｘｄ１３とのエンハンサー相互作用を妨げることが示された（図１Ｃ）（非特許文献１１、及び非特許文献１２：Ｍ．Ｋｍｉｔａら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００２，１２９：５５２１−５５２８）。
境界機能に関する候補配列が、Ｅｖｘ２のすぐ下流の領域に、レポーターとしてのＨｏｘｄ９／ｌａｃＺとともに、ＥＳ細胞を使用した相同組換えによって転座挿入された（図２Ａ、図３Ａ及び３Ｂ）。それにより得られた挿入したＤＮＡを有するＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、マウス胚を作製した。これらのキメラ及びキメラ由来の子孫のいずれかの組織をβ−ガラクトシダーゼ活性について染色した。導入した断片がインスレーターとしての活性を有している場合、ｌａｃＺ染色パターンがＨｏｘｄ１３様パターンと類似することが予想されるが、そうでない場合、ｌａｃＺパターンはＣＮＳ発現するＥｖｘ２パターンとして示すはずである。先の観察（非特許文献１１）から、境界配列は、Ｅｖｘ２プロモーターと、Ｅｖｘ２部位とＨｏｘｄ１３部位の中間部にあるＮｓｉＩ部位、すなわちｒｅｌＯトランスジーン挿入部位、との間に位置すると推定された（非特許文献１１）（図２）。ｌａｃＺの染色パターンから、候補領域、すなわちＥｖｘ２遺伝子の第１エキソン中のＸｈｏＩ部位とｒｅｌＯトランスジーン挿入用のＮｓｉＩ部位との間の５ｋｂ断片、をｌａｃＺレポータートランスジーンと一緒に挿入したとき、Ｈｏｘｄ１３様発現が示された。すなわち、ＸｈｏＩ−ＮｓｉＩ断片が脳のエンハンサー活性をブロックした（図３Ｃ）。この観察は実験の設計を評価するのにおいても役立つ。本発明者らは、ＸｈｏＩ−ＮｓｉＩ（ＸＮｓ）断片を、Ｅｖｘ２開始コドンの部位から、それぞれ約２ｋｂの重複した３つの断片、すなわちＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ（ＸＢ）、ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ（ＥＢｇ）及びＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ（ＢＢ）に分けた（図３Ｂ）。ＥＢｇ断片を有するトランスジェニックマウスとＢＢ断片を有するトランスジェニックマウスはともにＥｖｘ２様ｌａｃＺ発現パターンを示し（図３Ｄ及び３Ｅ）、このことから、トランスジェニックマウスはＨｏｘｄ９／ｌａｃＺプロモーターに対するＣＮＳエンハンサーの相互作用をブロックしないことが示された（図３）。一方、ＸＢ断片は、トランスジーンの脳での発現を完全に消失させる活性を示し、それにより境界活性を有することを示した（図３Ｆ）。本発明者らはさらに、ＸＢの２．５ｋｂ断片を３つの断片に切断した（図３Ｂ）。これらのより短い断片は境界活性を示さず、エンハンサー相互作用をブロックすることが出来なかった（図３Ｇ及び３Ｈ）。これらのことから、この２．５ｋｂ断片内に分散する複数のタンパク質結合部位を含む特定の長さのＤＮＡが、適正な境界機能のために必要であり、この境界活性が複数のＤＮＡ−タンパク質複合体の相互作用の結果であることが示された（図３）。
２つの機能的配列はＥｖｘ２−Ｈｏｘｄ１３インスレーター配列を含む
ＸＮｓ標的化トランスジェニックマウス及びＸＢ標的化トランスジェニックマウスのｌａｃＺ発現パターンの比較から、それらの発現パターンには明らかな差異が認められた（図４Ａ及び４Ｂ）。図３に示されるように、断片はともに、挿入したｌａｃＺレポーター遺伝子の脳ＣＮＳ発現をブロックした。一方、本発明者らはＸＮｓマウスの四肢及び外性器においてＨｏｘｄ１３発現に類似したｌａｃＺの染色を観察することができたが、ＸＢマウスでは四肢及び性器芽においては発現を認めることが出来なかった（図４Ｂ）。これらの結果から、ＸＢ断片が構成的なインスレーターであること、これに加えて、そのブロッカー活性の特異性が、コアブロッカー配列ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩの外にあるＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ部位（ＢＮｓ）中の配列によって決まることが示された。このＢＮｓ断片内の配列は、四肢及び生殖器においてＸＢ断片のブロッカー活性に抗するか或いは該活性を除去する可能性があり、それにより、Ｈｏｘｄ１３から１０までの４つの遺伝子は四肢及び生殖器において発現されうる（図３Ｃ）。したがって、Ｅｖｘ２−Ｈｏｘｄ１３系中のブロッカー配列は、２つのユニットである構成的ブロッカーとブロッカーレギュレーターとに分けることができる。
標的化トランスジェニックマウスの致死性とＨｏｘｄ１３発現
ＸＢ断片のエンハンサーブロッキング活性をさらに調べるために、ＸＢ断片をもつ標的化トランスジェニックマウスにおけるＨｏｘｄ１３及びＥｖｘ２の発現パターンを観察することを試みた。１１．５ｄｐｃ胚由来の数匹の同腹子を集め、その中にＸＢ断片のホモ接合型標的化トランスジェニックマウスがいないことが判明した。さらなる分析により、ホモ接合型対立遺伝子が７．５ｄｐｃ胚にさえ見つけることができなかった（表１）が、一方、ＢＢ標的化トランスジーンをもつ対照群においては８．５ｄｐｃ及び１１．５ｄｐｃ胚でホモ接合型トランスジェニクマウスを見出すことができた（表１）。
【表１】
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致死性は５世代以上の異系交配ののちにおいても分離しえないので、表現型は、Ｅｖｘ２遺伝子に隣接のＸＢ断片のさらなるコピーの存在と密接に関連する。トランスジーンの挿入による、Ｈｏｘｄ１３又はＥｖｘ２転写の誤った調節が生じている可能性を調べるために、ＸＢトランスジェニックマウス系統からの７ｄｐｃ胚中のＨｏｘｄ１３又はＥｖｘ２の発現を試験した（図５Ａ）。胚の１同腹子から調製したｃＤＮＡの一連のプールを、リアルタイムＰＣＲに掛けて遺伝子発現を分析した。野生型マウスの同系交配からの胚、ＢＢマウスの同系交配からの胚、及びＸＢマウスの同系交配からの胚の３種類のｃＤＮＡプールを構築した。野生型及びＢＢマウスにはＨｏｘｄ１３及びＥｖｘ２の発現がほとんどなかった。一方、ＸＢ交配からのｃＤＮＡプールはこれら遺伝子の発現を示したが発現の程度はｃＤＮＡプール間で異なっていた（図５Ａ）。これらの結果から、ＸＢトランスジェニック系統が本来野生型においてはＨｏｘｄ１３、Ｅｖｘ２の発現が見られない７ｄｐｃ前の胚でＨｏｘｄ１３又はＥｖｘ２の発現をすること、また、これらのマウスで観察される致死性がこの未熟な段階での発現に対応することが示された。先の研究において、本発明者らは、ＨｏｘＤ複合体の外部の領域がＨｏｘＤ複合体中の遺伝子の初期発現を抑制し、７ｄｐｃ胚以前におけるＨｏｘｄ遺伝子の前成熟発現を妨げることを示した（非特許文献１１）。ＸＢマウスではその抑制領域とＨｏｘＤ複合体との間にＸＢ断片が挿入されたことになる。調節配列を含まない構成的境界を形成するＸＢ断片の余分なコピーの存在が、この抑制領域によってリクルートされる抑制を妨害し、そして、Ｈｏｘｄ遺伝子（この場合、Ｅｖｘ２及びＨｏｘｄ１３遺伝子）の未成熟的な発現を可能にする（図５Ｂ）。したがって、これらの結果から、ＸＢ断片がエンハンサーブロッカー活性のみならず、抑制に対する保護活性をももつことが示された。
染色体環境からの抑制に対する保護活性
外来遺伝子がゲノム内に導入されるとき、トランスジーンは、時間を経るに連れ、挿入部位の染色体環境によって引き起こされる抑制をしばしば受ける。境界配列は染色体ドメインを分離するので、そのような抑制的な位置効果とエンハンサー相互作用に必ず干渉する（非特許文献１３：Ｆ．Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２，９９：６８８３−６８８８）。本発明者らの観察から、ＸＢ断片が抑制に対する保護活性を有していることが示されたので、本発明者らはさらに、ＸＢ断片がゲノム中のランダムな位置でも位置価保護のために働くかどうかを証明するためにその可能性を調べた。
蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓを発現するための構築物のうち２つを、この分析のために調製した。構築物（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）Ｉは境界断片を含まないが、構築物（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ＩＩは、Ｖｅｎｕｓマーカー遺伝子の両側に境界断片を含む（図６Ａ）。これらの構築物はともに、安定な形質転換体の単離を容易にするために抗生物質（ネオマイシン）に対する耐性マーカーを保持した。これらの構築物をＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、１０日間ネオマイシン耐性に対して選択して、ランダムに組み込まれた形質転換細胞株を得た（図６Ｂ）。各構築物に対して１２個の安定な形質転換コロニーを拾い上げた。これらのクローンのほとんどが、ゲノムサザンハイブリダイゼーションによって、低コピー数（１〜５コピー）のトランスジーンを含んでいることが確認されている。コロニーの単離後、それらをネオマイシンなしで培養、保持し、ＦＡＣＳにより蛍光の維持を観察した（図６Ｂ）。ネオマイシンなしでの培養が１ヶ月の段階においては、細胞クローンのほとんど（ただし、構築物ＩＩからの１つ（ＸＢブロッカーがフランキングしている）を除く）が、Ｖｅｎｕｓによる蛍光の発現を維持していた（図６Ｃ）。発現を維持しなかった１つについては、おそらく実験の最初の段階においてトランスジーンの破壊が起こったためであると推定される。さらに５ヶ月の培養（合計６ヶ月）において、構築物ＩとＩＩからの形質転換コロニー間で劇的な差を示した（図６Ｃ）。１２個の構築物Ｉクローンのうち７個は、ほぼ完全に蛍光を失ったが、１２個の構築物ＩＩにおいては、そのうち３個だけが蛍光を失ったにすぎなかった。また、構築物Ｉ形質転換体からの１クローンは、依然として、全細胞数のうち７５％以上の蛍光細胞を含有したのに対して、構築物ＩＩからの４クローンでは、細胞のほとんどで蛍光を示した（図６Ｃ）。培養の１年後、構築物Ｉクローンのうち９個が蛍光を消失したが、構築物ＩＩ形質転換体からのクローンはでは、ほぼ完全に蛍光を維持（ＦＡＣＳ分析により７５％以上の細胞が蛍光を保持）した。まとめると、ＸＢをフランキングしたＶｅｎｕｓマーカーは明らかに、ＸＢ非フランキングマーカーと比べて有効に蛍光を維持した（図６Ｃ）。これらの結果は、ＸＢ断片が位置価保護活性をもつことを示している。
エンハンサーブロッカー機能の組織特異性
Ｅｖｘ２及びＨｏｘｄ１３の発現プロフィールは、発現開始の時機や将来の指領域での発現などの多くの共通点を有しているが、それらの発現プロフィールは、脳と脊髄での発現に差を示す。Ｅｖｘ２はこれらの中枢神経系（ＣＮＳ）で強い発現を有するが、Ｈｏｘｄ１３はそのような発現を示さない。これらの違いが、プロモーターに対してエンハンサーが会合する能力の差異から生じることは、いくつかの証拠から示されている。興味深いことに、指及び脳でこれらの遺伝子を駆動するエンハンサーがともに、ＨｏｘＤ複合体から同じ配向で、すなわちＨｏｘｄ１３からＥｖｘ２を越えて、位置している。ブロッキング活性（インスレーター活性）は構成的なブロッキングよりは組織特異的なモードで作用することが示された。この研究の中で、本発明者らは、このインスレーションのための機能的な領域が２つのユニット、すなわち構成的ブロッカー活性をもつ２．５ｋｂ断片と、インスレーション活性の組織特異性を調節するもう１つの機能的配列とに分けることができることを示した。これらの２つの機能的な配列の間の相互作用の詳細なメカニズムの基礎は依然として解明される必要があるが、一連の標的化トランスジーンによって、境界レギュレーターの存在が境界配列に干渉して指や生殖器で機能する、すなわちクロマチン構成が組織特異的動態を獲得することが示された。
本研究において、本発明者らは、Ｅｖｘ２−ＨｏｘＤ境界が組織及び時間特異的様式で作用し、この境界エレメントが２つの機能性断片、すなわち境界エレメントと、構成的境界に組織特異性を付与する境界調節断片とに分けることができることを示した。構成的境界エレメントは、それがプロモーターと一緒に挿入される時、染色体環境からの抑制的影響からプロモーターを保護することができる。この断片は、真核生物細胞において、外来プロモーターの安定な発現のための良いツールを提供することができる。
トランスジェニックマウスでのトランスジーンの安定的発現
細胞において使用したＸＢ断片に挟み込まれていないＶｅｎｕｓ発現構築物（構築物Ｉ）とＸＢ断片をその両端に持つ構築物ＩＩをＣ５７Ｂ１６受精卵に注入し、それぞれの構築物が染色体中にランダムに挿入されたトランスジェニックマウスを作製した。それぞれのトランスジェニックマウスのＶｅｎｕｓの発現を検出する為、１３．５日胚のマウス胎児を回収し、ＤＮＡの挿入を確認すると同時に蛍光を観察した。ここで用いたプロモーターは先の実験と同様ＣＡＧＧＳプロモーターを用いており、本来このプロモーターは体全体に一様な遺伝子の発現をもたらすと考えられている。
構築物Ｉのトランスジェニックマウスでは、２４匹のマウス胎児が構築物Ｉを持っていたが、蛍光を発現した物はそのうちの２匹だけであった。また、そのうちの一匹は非常に光が弱く、またもう一匹は図７に示した様にモザイク状に光が強い部位と弱い部位が混在している。これは、一様に体全体で遺伝子が発現していないことを示している。構築物ＩＩを挿入したトランスジェニックマウスは１２匹回収できた。そのうち９匹から比較的強い光りが観察できた。また、図７に見られる様にその光も体全体に一様に強弱なく観察できた。これは遺伝子が部位特異性なく発現していることを示している。すなわち、トランスジーンの挿入位置の周囲の情報に左右されることなく（抑制の影響も活性化の影響も受けていないと考えられる）、プロモーター本来の性質が保たれていることを示している。
従って図７に示すように、個体レベルでもトランスジーンが安定的に発現されることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、動物ゲノムに導入されたトランスジーンが長期にわたり安定的に発現させることができるため、トランスジーンによってコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の生産、或いは、動物における遺伝子治療等での使用に有用である。
本発明により、トランスジーンがランダムに（図６参照）又は相同組換え的に（図１〜図４参照）ゲノム上に導入されて含む動物細胞又は動物は、長期間にわたり該トランスジーンを安定的に発現し、かつ子孫伝達可能である、という利点が提供される。このような特性のために、トランスジーンを含む動物細胞はペプチド、ポリペプチド、タンパク質等の物質の生産のために使用できる。また、治療上有効なタンパク質をコードする外来ＤＮＡを含むトランスジーンを保有するベクターは、遺伝子治療のために使用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【国際調査報告】
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