【手続補正書】
【提出日】平成17年1月24日(2005.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’→３’方向に、一般式
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、
rs1とrs2は共に機能的制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも第一カセットは第二カセットと異なる）
のヌクレオチド配列のカセットを含んで成るヌクレオチドコンカテマー。
【請求項２】
ヌクレオチド配列がcDNA、ゲノムDNAから成る群から選択されるDNA配列を含んで成る、請求項１に記載のコンカテマー。
【請求項３】
少なくとも２つのカセットのrs1-rs2制限部位が、同一の制限酵素によって認識され、更に好ましくは同一である、請求項1又は2に記載のコンカテマー。
【請求項４】
少なくとも１つのカセットがプロモーターと発現可能なヌクレオチド配列との間にイントロンを含んで成り、更に好ましくは実質的に全てのカセットがプロモーターと発現可能なヌクレオチド配列との間にイントロンを含んで成る、請求項1〜3のいずれか１項に記載のコンカテマー。
【請求項５】
少なくとも１つのカセットが一次ベクター由来のカセットを含んで成り、更に好ましくは実質的に全てのカセットが一次ベクター由来のカセットを含んで成る、請求項1〜4のいずれか１項に記載のコンカテマー。
【請求項６】
人工染色体内に含まれる、請求項１〜5のいずれか１項に記載のコンカテマー。
【請求項７】
人工染色体が、酵母人工染色体、メガ酵母染色体、細菌人工染色体、マウス人工染色体、哺乳類人工染色体、昆虫人工染色体、鳥類人工染色体、バクテリオファージ人工染色体、バキュロウイルス人工染色体、又はヒト人工染色体から成る群から選択される、請求項6に記載のコンカテマー。
【請求項８】
異なる発現可能なヌクレオチド配列が異なる発現状態に由来する、請求項１〜7のいずれか１項に記載のコンカテマー。
【請求項９】
異なる発現状態が少なくとも２つの種を表す、請求項8に記載のコンカテマー。
【請求項１０】
コンカテマー化の方法であって、各カセットが第一の粘着末端、スペーサー配列、プロモーター、発現可能なヌクレオチド配列、ターミネーター、スペーサー配列及び第二の粘着末端を含んで成る、ヌクレオチド配列の少なくとも２つのカセットをコンカテマー化する段階を含んで成り、
一次ベクター[RS1-RS2-SP-PR-X-TR-SP-RS2'-RS1']
（ここで、Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチドのスペーサーを表し、
PRはプロモーターを表し、
TRはターミネーターを表す）から出発して、
i) RS2及びRS2'に特異的な少なくとも１つの制限酵素の力を借りて一次ベクターを切断し、一般式[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]（ここで、rs1及びrs2は一緒に機能的制限部位RS2又はRS2'を表す）を有するカセットを獲得し、
ii) rs1とrs2との間の相互作用を介して、切り出されたカセットを構築すること、
を更に含んで成る、方法。
【請求項１１】
一方の末端にRS2又はRS2'を、そして他方の末端に非相補的なオーバーハング又は平滑末端をそれぞれが有するベクターアームの添加を更に含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
一方の末端にRS2又はRS2'を、そして他方の末端に非相補的なオーバーハング又は平滑末端をそれぞれが有するストッパーフラグメントの添加を更に含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ベクターアームをストッパーフラグメントにライゲーションすることを更に含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
更に、
iv)発現状態からmRNAを単離し、
v)当該mRNA配列に相当する実質的に完全長のcDNAを獲得し、
vi)一次ベクター内の、５’→３’方向の一般式：
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
（ここで、CSはクローニング部位を表す）のカセットのクローニング部位内に実質的に完全長のcDNAクローンを挿入すること、
を含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
RS1とRS1'が同一であり、そしてRS2とRS2'が同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
コンカテマーが、酵母人工染色体、メガ酵母染色体、細菌人工染色体、マウス人工染色体、ヒト人工染色体から成る群から選択される人工染色体内にライゲーションされる、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも２つのカセット内のRS2及びRS2'が１つの制限酵素によって開裂し、好ましくは実質的に全てのカセット内のRS2及びRS2'が１つの制限酵素によって開裂する、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
各コンカテマーが５’→３’方向に以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、rs1とrs2は一緒に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
n≧2であり、そして
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が異なる発現状態に由来する）のオリゴヌクレオチドを含んで成る、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも１つのコンカテマーを含んで成る細胞。
【請求項１９】
各コンカテマーが５’→３’方向に以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、rs1とrs2は一緒に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
n≧2であり、そして
少なくとも２つのカセットのrs1-rs2が同一の制限酵素によって認識される）のオリゴヌクレオチドを含んで成る、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも１つのコンカテマーを含んで成る細胞。
【請求項２０】
実質的に全てのrs1-rs2配列が同一の制限酵素によって認識され、更に好ましくは実質的に全てのrs1-rs2配列が実質的に同一である、請求項１８又は１９に記載の細胞。
【請求項２１】
パン酵母, クルイベロマイセス・マリキシャヌス(Kluyveromyces marxianus), K.ラクチス(K. lactis), カンジダ・ウチリス(Candida utilis), ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma), サッカロマイセス・ボウラジイ(Saccharomyces boulardii), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・パラフィニカ(Candida paraffinica), シュワニオマイセス・カステリイ(Schwanniomyces castellii), ピキア・スチピチス(Pichia stipitis), カンジダ・シェハタエ(Candida shehatae), ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis), リポマイセス・リポフェル(Lipomyces lipofer), クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcos curvatus), カンジダ種(Candida spp)(例えば、C.パルミオレオフィリア(C. palmioleophila)),  ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii), カンジダ属(Candida), ロドトルラ種(Rhodotorula spp), サッカロマイセス種(Saccharomycopsis spp)., アウレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans), カンジダ・ブルンプチイ(Candida brumptii), カンジダ・ハイドロカーボフマリカ(Candida hydrocarbofumarica), トルロプシス属(Torulopsis), カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis), サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae), ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra), カンジダ・フラベリ(Candida flaveri), エレモテシウム・アシュビイ(Eremothecium ashbyii), ピキア種(Pichia spp.), クルイベロマイセス属(Kluyveromyces), ハンセヌラ属(Hansenula), クロエケラ属(Kloeckera), ピキア属(Pichia), パチソレン種(Pachysolen spp.), 又はトルロプシス・ボンビコラ(Torulopsis bombicola)を含んで成る群から選択される酵母細胞である、請求項１８又は１９に記載の細胞。
【請求項２２】
少なくとも１つのコンカテマー、好ましくは、実質的に全てのコンカテマーが、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンカテマーである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２３】
少なくとも１つのヌクレオチドコンカテマーを含んで成る人工染色体であって、当該コンカテマーが、
５’→３’方向に、一般式
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、
rs1とrs2は一緒に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、そして
n≧2である）のヌクレオチド配列カセットを含んで成る、人工染色体。
【請求項２４】
前記コンカテマーが、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンカテマーである、請求項２３に記載の人工染色体。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の少なくとも１つの人工染色体を含んで成る細胞。
【請求項２６】
トランスジェニック細胞を産生するための方法であって、宿主細胞に、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンカテマーを挿入することを含んで成る方法。
【請求項２７】
５’→３’方向に、一般式
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
（ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、そして
TRはターミネーターを表す）のヌクレオチド配列カセットを含んで成る一次ベクター。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列がDNA配列である、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
プロモーターとクローニング部位との間及び／又はクローニング部位とターミネーターとの間にイントロン配列を更に含んで成る、請求項２７又は２８に記載のベクター。
【請求項３０】
クローニング部位が発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１】
RS2とRS2'が同一である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２】
RS1とRS1'が同一である、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３３】
TRとRS2'との間にスペーサー配列を更に含んで成る、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４】
プロモーターが外部から制御可能なプロモーターである、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３５】
カセットを含んで成る一次ベクターが、高コピー数を有し、E.コリにおいて増殖することができ、そしてE.コリにおける維持のための選択マーカーを有するプラスミドベクターである、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３６】
一次ベクターを調製する方法であって、５’→３’方向に、一般式
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
（ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、
TRはターミネーターを表す）のヌクレオチド配列を含んで成るカセットを含んで成る一次ベクターのクローニング部位内に発現可能なヌクレオチド配列を挿入すること、
を含んで成る方法。
【請求項３７】
発現状態から全mRNAを単離し、そしてベクター内への挿入のために完全長のcDNAを獲得すること、を更に含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
実質的に完全長のcDNAを得るために、cDNAの選択を更に含んで成る、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
５’→３’方向に、一般式：
[RS1-RS2-SP-PR-X-TR-SP-RS2'-RS1']
（ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、
−ここで、当該発現可能なヌクレオチド配列は、１つの発現状態から単離され、そして
−少なくとも第一及び第二の一次ベクターが、前記第一及び第二の一次ベクター内の２つの異なるプロモーターの制御下で発現可能な同一のペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る）のヌクレオチド配列のカセットをそれぞれが含んで成る少なくとも２つの一次ベクターを含んで成るヌクレオチドライブラリー。
【請求項４０】
宿主細胞が、細菌、例えばE.コリ又はバチルス・サブチリス、又は真菌、例えば酵母を含んで成る群から選択される、請求項３９に記載のライブラリー。
【請求項４１】
実質的に全てのベクターが同一のRS2及びRS2'配列を含んで成る、請求項３９に記載のライブラリー。
【請求項４２】
請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの一次ベクターを含んで成る、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項４３】
ヌクレオチドライブラリーを調製する方法であって、発現可能なヌクレオチド配列を獲得し、当該発現可能なヌクレオチド配列を、
一般式
[RS1-RS2-SP-PR-CS-TR-SP-RS2'-RS1']
（ここで、
RS1及びRS1'は制限部位を表し、
RS2及びRS2'はRS1及びRS1'と異なる制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、
PRはプロモーターを表し、
CSはクローニング部位を表し、そして
TRはターミネーターを表す）のヌクレオチド配列を５’→３’方向に含んで成るカセットを含んで成る一次ベクター混合物のクローニング部位内にクローニングし、そして一次ベクターを宿主細胞内に伝達すること、
を含んで成る方法。