【手続補正書】
【提出日】平成15年4月8日(2003.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
図面の簡単な説明
本発明は本明細書においては例示のみを目的として添付図面を参照しながら説明している。特定の参照例をここでは図面にて詳述するが、記載した特定のものは例示のため、そして、本発明の好ましい実施態様を説明的に論じるためのものであり、本発明の原理と概念的特徴の最も有用で容易に理解できる説明であると考えられるものを与えるために示している。この点に関し、本発明の基礎的理解のために必要である以上に詳細には本発明の構造的詳細を示すことは試みてはおらず、図面と組合せた説明は、本発明の幾つかの形態をどのようにして実際に実施するかを当業者に対して明らかにするものである。
図１は本発明によるＶＥＧＦ発現ベクター構築物を示す。
図２は本発明によるＡｎｇ−１発現ベクターを示す。
図３ａ−ｂはＶＥＧＦ−ＬａｃＺ（３ａ）またはＶＥＧＦ−ＧＦＰ（３ｂ）発現構築物で形質転換された培養ＥＣを示す。
図４ａ−ｃは閉塞した血管（図４ａ）、このような閉塞を治療するための従来技術のバイパス法（図４ｂ）および本発明による閉塞血管を貫通またはバイパスする方法（図４ｃ）を示す。
図５ａは人工的に遮蔽しＶＥＧＦ１６５を発現する組み換えアデノウィルスベクターを注入することにより再開通させたラット後肢動脈枝における閉塞部位と流動の測定を示す。
図５ｂはＶＥＧＦ１６５アデノウィルスベクターまたは生理食塩水（対照）の注射後３、７および１４日のラット大腿動脈中の血流を示すグラフである。数値は平均±Ｓ．Ｄ．，であり、各時点においてｎ＝５である。
図６ａ−ｄはｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰを感染させたＥＣまたはＳＭＣ（それぞれ図６ａ−ｂおよび６ｃ−ｄ）を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡（それぞれ図６ａ−ｃおよび６ｂ−ｄ）写真である。
図７ａ−ｄはレトロＡｎｇ１−ＧＦＰを感染させたＥＣまたはＳＭＣ（それぞれ図７ａ−ｂおよび７ｃ−ｄ）を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡（それぞれ図７ａ−ｃおよび７ｂ−ｄ）写真である。
図８ａ−ｂはアデノウィルス感染後４８時間のＥＣおよびＳＭＣ（それぞれ図８ａおよび８ｂ）におけるＡｎｇ−１  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。図８ａのレーン：１−対照非感染ＥＣ、２−ｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣ、３−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ、４−逆転写反応の陰性対照、５−プラスミドＡｎｇ−１ＤＮＡの陽性対照。図８ｂのレーン：１−Ａｎｇ−１コードプラスミドＤＮＡ、２−ＰＣＲ反応の陰性対照、３−ＲＴ反応の陰性対照、４−ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ、５−ｒＡｄＡｎｇ１感染ＳＭＣ、６−対照非感染ＳＭＣ。総ＲＮＡはアデノウィルスベクター注入後のＥＣおよびＳＭＣから抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ分析は以下に示す実施例の項において記載する通り実施した。試料はβ−アクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅により規格化した。
図９ａ−ｂはレトロウィルス形質導入後４８時間のＥＣおよびＳＭＣ（それぞれ図９ａおよび９ｂ）におけるＡｎｇ−１  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。図９ａのレーン：１−対照非形質導入ＥＣ、２−レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、３−レトロＡｎｇ１形質導入ＥＣ、４−ＲＴ反応の陰性対照。図９ｂのレーン：１−対照非感染ＳＭＣ、２−レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、３−レトロＡｎｇ１形質導入ＳＭＣ、４−ＲＴ反応の陰性対照。総ＲＮＡはレトロウィルスベクターによる形質導入後のＥＣおよびＳＭＣから抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ分析は以下に示す実施例の項において記載する通り実施した。試料はβ−アクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅により規格化した。
図１０はアデノウィルス感染ＥＣおよびＳＭＣにおけるＡｎｇ‐１蛋白の発現を示す写真である。レーン：１−対照非感染細胞、２−ｒＡｄＧＦＰ感染細胞、３−ｒＡｄＵＰ５０幹線細胞、４−ｒＡｄＡｎｇ１感染細胞、Ｃ−陽性対照Ａｎｇ−１組み換え蛋白。
図１１はレトロウィルス形質導入ＥＣおよびＳＭＣにおけるＡｎｇ‐１蛋白の発現を示す写真である。レーン：１−非形質導入ＥＣ、２−レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、３−レトロＡｎｇ１形質導入ＥＣ、４−非形質導入ＳＭＣ、５−レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、６−レトロＡｎｇ１形質導入ＳＭＣ、７−Ａｎｇ１陽性対照。
図１２ａ−ｂはＡｎｇ−１を過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣとＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＥＣとの同時培養物におけるＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ１６５蛋白の発現（それぞれ図１２ａおよび１２ｂ）のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。レーン：１−ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ＋ｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣ、２−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋ｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣ、３−ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ、４−Ａｎｇ−１を安定して過剰発現する陽性対照２９３ＦＬＹＡ細胞。
図１３ａ−ｂはＡｎｇ−１を過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣとＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＳＭＣとの同時培養物におけるＶＥＧＦ１６５およびＡｎｇ−１蛋白の発現（それぞれ図１３ａおよび１３ｂ）のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。レーン：１−ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ＋ｒＡｄＡｎｇ１感染ＳＭＣ、２−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ、３−Ａｎｇ−１を安定して過剰発現する陽性対照２９３ＦＬＹＡ細胞。
図１４はＡｎｇ‐１過剰発現ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＥＣの正常な増殖を示すヒストグラムである。細胞はｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ（ＡｄＡｎｇ１）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ（ＡｄＶＥＧＦ）、ｒＡｄＧＦＰ（ＡｄＧＦＰ）で感染させたか、または非感染（対照）である。結果は感染後第７日における増殖を示す。
図１５ａ−ｂはｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣにおけるＴｉｅ２受容体の増強されたリン酸化を示す写真である。ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ、ｒＡｄＧＦＰまたはｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰに感染させたＥＣの蛋白分解物をＴｉｅ２のリン酸化を抗ホスホチロシン抗体による予備免疫沈降を行わない場合、および行った場合についてウエスタンブロットにより分析した（それぞれ図１５ａおよび１５ｂ）。レーン：１−非感染ＥＣ、２−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ、３−ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＥＣ、４−ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ、５−陰性対照２９３細胞（図１５ａのみ）。
図１６ａ−ｈはアデノウィルス感染ＥＣを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの３次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成新芽形成を示す顕微鏡写真である。パネルはｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ａ−ｂ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ＋ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ（図１６ｃ−ｄ）、同時培養ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ｅ−ｆ）および同時培養ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ＋ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ｇ‐ｈ）を示す。２つの代表的な９６時間試験の結果を示す。
図１７ａ−ｄはアデノウィルス感染ＥＣおよびレトロウィルス形質導入ＳＭＣを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの３次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成新芽形成を示す蛍光顕微鏡写真である。パネルは同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ａ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ｂ）、ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＡｎｇ１−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ｃ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＡｎｇ１−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ｄ）。内皮細胞およびＳＭＣはそれぞれ赤および緑の蛍光で示す。各実験群の代表的な４８時間試験を示す。
図１８ａ−ｈは血清枯渇条件下における血管形成分化増殖因子を過剰発現するウィルスで形質転換された血管細胞の同時培養物の生存性を示す蛍光顕微鏡写真である。パネルは以下の通り：ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ（図１８ａ）、ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＳＭＣ（図１８ｂ）、ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｃ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｄ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｅ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｆ）、同時培養ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｇ）および同時培養ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｈ）。
図１９ａ−ｈは血清枯渇２４時間後のＡｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＴＵＮＥＬ−染色ＥＣの増強された生存性を示す光学顕微鏡写真（図１９ａ、１９ｃ、１９ｅおよび１９ｇ）および蛍光顕微鏡写真（図１９ｂ、１９ｄ、１９ｆおよび１９ｈ）である。添加血清の存在下および非存在下（それぞれ図１９ａ−ｂおよび１９ｃ−ｄ）で培養した非形質導入ＥＣおよび添加血清の存在下および非存在下（それぞれ図１９ｅ−ｆおよび１９ｇ−ｈ）で培養したレトロＡｎｇ１−ＧＦＰ形質導入ＥＣを示す無作為の視野を示した。アポトーシス細胞は緑色の蛍光で示す。
図２０はＡｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＥＣにおけるアポトーシス率を示すヒストグラムである。結果は前の図に示したＴＵＮＥＬ試験のデータの定量値を示す。実験群は以下の通り：添加血清の存在下または非存在下［それぞれ血清（＋）または血清（−）］で培養した非形質導入ＥＣ、レトロＡｎｇ１‐ＧＦＰ形質導入ＥＣ。結果は６つの無作為に選んだ顕微鏡視野において計数した総細胞集団中のアポトーシス細胞の比率を示す。