(57)【要約】  経口接種可能なイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス２型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの提供。  イヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株、イヌアデノウイルス２型F1株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌアデノウイルス２型株及びイヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるVP2遺伝子を有するイヌパルボウイルスF3株。
【請求項２】
以下の（１）〜（７）のいずれかのウイルスである請求項１記載のイヌパルボウイルスF3株：
（１）配列番号２６に表される塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（２）配列番号２６に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（３）配列番号２６に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（４）配列番号２６に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（５）配列番号２６に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（６）上記（１）〜（５）のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルス；並びに
（７）上記（１）〜（５）のゲノムの塩基配列からなるDNAと95％以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。
【請求項３】
配列番号５で表される塩基配列又は配列番号５で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるLITR E1A2遺伝子を有し、かつ配列番号７で表される塩基配列又は配列番号７で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるRITR遺伝子を有するイヌアデノウイルス２型F1株。
【請求項４】
ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071601で寄託されたイヌアデノウイルス２型F1株。
【請求項５】
配列番号９で表される塩基配列又は配列番号９で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるH遺伝子を有し、かつ配列番号１２で表される塩基配列又は配列番号１２で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるF遺伝子を有するイヌジステンパーウイルス95-54株。
【請求項６】
ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071602で寄託されたイヌジステンパーウイルス95-54株。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のイヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株。
【請求項８】
請求項７に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株であって、配列番号１で表されるVP2遺伝子の塩基配列において、第885、886、892、894及び895番目の1つ又は複数、好ましくはすべての塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌパルボウイルス株。
【請求項９】
第891番目と892番目の塩基の間に２塩基が挿入され、及び／又は第901番目と902番目の塩基の間に100塩基が挿入された塩基配列を有する、請求項７又は８に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株。
【請求項１０】
請求項３又は４に記載のイヌアデノウイルス２型F1株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌアデノウイルス２型株。
【請求項１１】
請求項１０に記載の弱毒化イヌアデノウイルス２型株であって、配列番号５で表されるLITR E1A2遺伝子において、1つ又は複数の塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌアデノウイルス２型株。
【請求項１２】
請求項５又は６に記載のイヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株。
【請求項１３】
請求項１２に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株であって、以下の（１）〜（３）の変異の少なくとも１つの変異を有する弱毒化イヌジステンパーウイルス株：
（１）配列番号１２で表されるF遺伝子にける第394及び／又は523番目の塩基の変異、
（２）配列番号１０で表されるH遺伝子における第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異、
（３）配列番号１０で表されるH遺伝子における第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。
【請求項１４】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株、請求項１０若しくは１１に記載の弱毒化イヌアデノウイルス２型株並びに請求項１２若しくは１３に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の１種、２種又は３種を含むイヌウイルス感染症ワクチン。
【請求項１５】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株、請求項１０若しくは１１に記載の弱毒化イヌアデノウイルス２型株並びに請求項１２若しくは１３に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の３種類を含むイヌウイルス感染症混合ワクチン。
【請求項１６】
異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、請求項１４又は１５に記載のイヌウイルス感染症混合ワクチン。
【請求項１７】
イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、請求項１６記載のイヌウイルス感染症混合ワクチン。
【請求項１８】
経口接種用である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のイヌウイルス感染症ワクチン。
【請求項１９】
生後４〜18週までの仔イヌに接種した場合に、免疫が成立し得る仔イヌ用の請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のイヌウイルス感染症ワクチン。
【請求項２０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の弱毒化イヌパルボウイルス株、請求項１０若しくは１１に記載の弱毒化イヌアデノウイルス２型株並びに請求項１２若しくは１３に記載の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の１種、２種又は３種をイヌに経口接種することを含む、イヌのウイルス感染症を防御する方法。
【請求項２１】
異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、請求項２０記載のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
【請求項２２】
イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、請求項２０又は２１に記載のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
【請求項２３】
生後４〜18週の仔イヌに接種する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のイヌのウイルス感染症を防御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス２型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するイヌ感染症用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌジステンパーウイルス（Canine Distemper Virus; CDV)は、発熱、中枢神経症状、呼吸器症状、下痢症を呈するイヌの急性の全身性疾病の原因ウイルスである。子イヌで感染する確率が高く、致死率も高い。感染をして一旦は回復しても、中枢神経症状のような後遺症がでたり、ウイルスが体内に潜伏し、数ヶ月〜数年後に再発することがある。代表的な症状は、くしゃみ、鼻水、咳などの呼吸器症状であり、その他に、消化器症状、神経症状などが認められる。消化器症状は、嘔吐、水様性の下痢、血便などであり、神経症状は、興奮、てんかん様発作、チック、後躯マヒ、運動失調などである。【０００３】
イヌアデノウイルス２型（Canine adeno virus type2; CAV2)は、イヌ伝染性咽頭気管炎の原因として知られている。イヌジステンパーを除く、咳、くしゃみ等の呼吸器症状を示す伝染性の急性・慢性の疾病を総称してケンネルコフと呼ぶが、イヌアデノウイルス２型は、ケンネルコフの原因ウイルスの1つである。また、CAV2からなるワクチンは、イヌ伝染性肝炎を引き起こすイヌアデノウイルス1型(CAV1)と共通の抗原性を有することが知られている。【０００４】
イヌパルボウイルス（Canine parvovirus; CPV)は、強烈な下痢を主徴とする消化器症状を引き起こし、さらに仔イヌでは心筋炎を生じ、死に至らしめる。パルボウイルスは、消毒液、野外環境要因等に対して強い抵抗性を持ち、感染イヌの排泄した便に大量に含まれ、体外に排泄されたあともすぐには死滅せずに自然環境下で数年間生存する。【０００５】
このように上記３種類のウイルス感染症は重症度が高く、特に仔イヌが感染した場合、その死亡率の高さが問題になっていた。【０００６】
これらのウイルス感染症に対しては、すでにワクチンが開発されている(特許文献１及び２を参照）。これらの感染症に対しては、それぞれのウイルスに対する単味ワクチンの他、２種混合ワクチン及び３種混合ワクチンなどが用いられている。【０００７】
使用されているワクチンは注射投与用のものであり、アナフィラキシーや過敏症等の副作用が生じ得ることが報告されている（非特許文献１参照）。また、注射投与のためイヌに痛みやストレスを与えるという問題もあった。さらに、混合ワクチンとして用いる場合、ウイルス同士の干渉により、ウイルスの増殖が抑制され該ウイルスに対する抗体価が上昇しないという問題もあった。特にジステンパーウイルスワクチンとパルボウイルスの混合ワクチンで干渉が生じやすかった（非特許文献２参照）。
【特許文献１】特許3040157号公報
【特許文献２】特表2004-501979号公報
【非特許文献１】Gaskell. R.M. et al., Vet,Rec.150, 126-34 (2002)
【非特許文献２】GEMMA T., et al., J.Vet.Med,Sci.57(3):535-537,1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、経口接種可能なイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス２型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従来、用いられていたイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス２型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対するワクチンの多くは注射投与用であった。注射で投与した場合、アレルギー症状等の副作用が起こりやすいという問題があった。【００１０】
また、生まれたばかりの仔イヌは、母イヌから移行抗体を付与されており、該移行抗体が仔イヌ個体に残存している時期にワクチンを接種しても、母イヌから受け継がれた移行抗体によってワクチンは中和されてしまい、免疫を獲得することができないという問題があった。初乳摂取により、生後2日以内に受動的に獲得されたこの移行抗体は、生後まもなく徐々に減少し始め、個体差があるが、一般に生まれてから12〜14週間目位でほぼ無くなる。仔イヌのワクチン接種は母イヌからの移行抗体の切れた直後の時期に行なうのが理想的と言われている。しかしながら、現実的には母イヌからの移行抗体が減少する時期に、イヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス２型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に罹患する場合が多く、これらの感染症から確実に仔イヌを防御することができないという問題があった。【００１１】
本発明者は、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型及びイヌパルボウイルスの強毒株である野外分離株を弱毒化して新規な株を確立した。従来のワクチンが注射投与用であり、従来のワクチンを経口投与しても、イヌに免疫を成立させることはできなかった。一方、本発明者らが新たに確立した株は経口投与または経鼻投与等の経粘膜投与又は経消化器投与によりイヌに投与してもイヌに免疫を成立させることができ、注射投与による副作用の問題を回避することができることを見出した。また、本発明者等が確立した株は、混合ワクチンとして投与した場合でもウイルス同士が干渉を起こさず混合したすべての株に対して抗体価が上昇した。さらに、これらのワクチンを仔イヌに経口投与した場合、母イヌからの移行抗体により中和されることなく、仔イヌに免疫を成立させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１３】
[１]  配列番号１で表される塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるVP2遺伝子を有するイヌパルボウイルスF3株。【００１４】
[２]  以下の（１）〜（７）のいずれかのウイルスである[１]のイヌパルボウイルスF3株：
（１）配列番号２６に表される塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（２）配列番号２６に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（３）配列番号２６に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（４）配列番号２６に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（５）配列番号２６に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（６）上記（１）〜（５）のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルス；並びに
（７）上記（１）〜（５）のゲノムの塩基配列からなるDNAと95％以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。【００１５】
[３]  配列番号５で表される塩基配列又は配列番号５で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるLITR E1A2遺伝子を有し、かつ配列番号７で表される塩基配列又は配列番号７で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるRITR遺伝子を有するイヌアデノウイルス２型F1株。【００１６】
[４]  ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071601で寄託されたイヌアデノウイルス２型F1株。【００１７】
[５]  配列番号９で表される塩基配列又は配列番号９で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるH遺伝子を有し、かつ配列番号１２で表される塩基配列又は配列番号１２で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるF遺伝子を有するイヌジステンパーウイルス95-54株。【００１８】
[６]  ECACC(European Collection of Cell Cultures)に受託番号07071602で寄託されたイヌジステンパーウイルス95-54株。【００１９】
[７]  [１]又は[２]のイヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株。【００２０】
[８]  [７]の弱毒化イヌパルボウイルス株であって、配列番号１で表されるVP2遺伝子の塩基配列において、第885、886、892、894及び895番目の1つ又は複数、好ましくはすべての塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌパルボウイルス株。【００２１】
[９]  第891番目と892番目の塩基の間に２塩基が挿入され、及び／又は第901番目と902番目の塩基の間に100塩基が挿入された塩基配列を有する、[７]又は[８]の弱毒化イヌパルボウイルス株。【００２２】
[１０]  [３]又は[４]のイヌアデノウイルス２型F1株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌアデノウイルス２型株。【００２３】
[１１]  [１０]の弱毒化イヌアデノウイルス２型株であって、配列番号５で表されるLITR遺伝子において、1つ又は複数の塩基が変異した塩基配列を有する弱毒化イヌアデノウイルス２型株。【００２４】
[１２]  [５]又は[６]のイヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株。【００２５】
[１３]  [１２]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株であって、以下の（１）〜（３）の変異の少なくとも１つの変異を有する弱毒化イヌジステンパーウイルス株：
（１）配列番号１２で表されるF遺伝子にける第394及び／又は523番目の塩基の変異、
（２）配列番号１０で表されるH遺伝子における第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異、
（３）配列番号１０で表されるH遺伝子における第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。【００２６】
[１４]  [７]〜[９]のいずれかの弱毒化イヌパルボウイルス株、[１０]若しくは[１１]の弱毒化イヌアデノウイルス２型株並びに[１２]若しくは[１３]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の１種、２種又は３種を含むイヌウイルス感染症ワクチン。【００２７】
[１５]  [７]〜[９]のいずれかの弱毒化イヌパルボウイルス株、[１０]若しくは[１１]の弱毒化イヌアデノウイルス２型株並びに[１２]若しくは[１３]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の３種類を含むイヌウイルス感染症混合ワクチン。【００２８】
[１６]  異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、[１４]又は[１５]のイヌウイルス感染症混合ワクチン。【００２９】
[１７]  イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、[１６]のイヌウイルス感染症混合ワクチン。【００３０】
[１８]  経口接種用である、[１４]〜[１７]のいずれかのイヌウイルス感染症ワクチン。【００３１】
[１９]  生後４〜18週までの仔イヌに接種した場合に、免疫が成立し得る仔イヌ用の[１４]〜[１８]のいずれかのイヌウイルス感染症ワクチン。【００３２】
[２０]  [７]〜[９]のいずれかの弱毒化イヌパルボウイルス株、[１０]若しくは[１１]の弱毒化イヌアデノウイルス２型株並びに[１２]若しくは[１３]の弱毒化イヌジステンパーウイルス株からなる群から選択されるウイルス株の１種、２種又は３種をイヌに経口接種することを含む、イヌのウイルス感染症を防御する方法。【００３３】
[２１]  異なるウイルス株同士の間で干渉が生じない、[２０]のイヌのウイルス感染症を防御する方法。【００３４】
[２２]  イヌジステンパーウイルスとイヌパルボウイルスの間で干渉が生じない、[２０]又は[２１]のイヌのウイルス感染症を防御する方法。【００３５】
[２３]  生後４〜18週の仔イヌに接種する、[２０]〜[２２]のいずれかのイヌのウイルス感染症を防御する方法。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の新規な弱毒化イヌジステンパーウイルス株、イヌアデノウイルス株及びイヌパルボウイルス株は、経口投与によりイヌに免疫を成立させることができる。経口投与が可能になることにより、ワクチン接種にかかる時間やコストが低減される。また、一度に多数のイヌに集団投与することも可能である。さらに、母イヌからの移行抗体を保持している仔イヌに対して投与した場合も、移行抗体により中和排除されることなく、仔イヌに対して免疫を成立させることが可能である。従って、イヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス１型及び２型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に罹患するリスクにさらされている、移行抗体が減少しているが、従来のワクチンを中和してしまう仔イヌにも投与することができ、仔イヌをこれらのウイルス感染症から防御することができる。【００３７】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006-248522号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】イヌパルボウイルスのVP2遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。
【図１Ｂ】イヌパルボウイルスのVP2遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図１Aの続き）。
【図１Ｃ】イヌパルボウイルスのVP2遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図１Bの続き）。
【図２Ａ】イヌパルボウイルスのN遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。
【図２Ｂ】イヌパルボウイルスのN遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図２Aの続き）。
【図２Ｃ】イヌパルボウイルスのN遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図２Bの続き）。
【図３Ａ】イヌアデノウイルス２型のLITR  E1A遺伝子の１代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。
【図３Ｂ】イヌアデノウイルス２型のLITR  E1A遺伝子の１代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図３Aの続き）。
【図３Ｃ】イヌアデノウイルス２型のLITR  E1A遺伝子の１代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図３Bの続き）。
【図３Ｄ】イヌアデノウイルス２型のLITR  E1A遺伝子の１代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図３Cの続き）。
【図４】イヌアデノウイルス２型のRITR遺伝子の１代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。
【図５Ａ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の親株の塩基配列、１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。
【図５Ｂ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の親株の塩基配列、１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図５Aの続き）。
【図５Ｃ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の親株の塩基配列、１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図５Bの続き）。
【図５Ｄ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の親株の塩基配列、１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図５Cの続き）。
【図５Ｅ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の親株の塩基配列、１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図５Dの続き）。
【図６Ａ】イヌジステンパーウイルスのF遺伝子の親株の塩基配列及び１４代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。
【図６Ｂ】イヌジステンパーウイルスのF遺伝子の親株の塩基配列及び１４代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図６Aの続き）。
【図６Ｃ】イヌジステンパーウイルスのF遺伝子の親株の塩基配列及び１４代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図６Bの続き）。
【図６Ｄ】イヌジステンパーウイルスのF遺伝子の親株の塩基配列及び１４代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図６Cの続き）。
【図６Ｅ】イヌジステンパーウイルスのF遺伝子の親株の塩基配列及び１４代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図６Dの続き）。
【図７Ａ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である。
【図７Ｂ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図７Aの続き）。
【図７Ｃ】イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列のアラインメントを示す図である（図７Bの続き）。
【図８】イヌパルボウイルス接種後の抗体価の推移を示す図である。
【図９】イヌパルボウイルスの感染防御試験の結果を示す図である。
【図１０】イヌパルボウイルスの安全性試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、弱毒化されたイヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型及びイヌパルボウイルスであり、これらの弱毒化ウイルスを含むイヌジステンパー用ワクチン、イヌアデノウイルス２型感染症ワクチン及びイヌパルボウイルス感染症ワクチンである。【００４０】
弱毒化は元来病原性を有する親株の毒性を低下させることをいい、弱毒化されたウイルス株は感染性はあるが、病原性を有さない。【００４１】
弱毒化させる親株としては、病原性のある野外からのウイルス分離株（ビルレント株）を用いる。病原性のあるウイルス株は、イヌから単離することができる。本発明で親株として用いる病原性のあるウイルス分離株は、イヌジステンパーウイルスとしては95-54株、イヌアデノウイルス２型としてはF1株、イヌパルボウイルスとしてはF3株を用いればよい。弱毒化は親株を弱毒化する突然変異が蓄積するような時間、これらのウイルスを適当な培養細胞中で連続継代することにより、培養細胞へ馴化させて行う。連続継代は、ウイルス株による細胞系への感染、該宿主細胞からの該ウイルス子孫の回収、および該ウイルス子孫による宿主細胞への後続感染により次の継代を得ることを意味する。弱毒化のための継代のための培養細胞としては、VERO細胞（アフリカミドリザル正常腎）、MDCK細胞（イヌ正常腎）、CRFK細胞（ネコ腎由来株化細胞）、B95a（マーモセット由来のＢリンパ芽球細胞）、A72（イヌ細胞）等を用いることができる。このうち、イヌジステンパーウイルスの継代には、VERO細胞又はB95a細胞、好ましくはVERO細胞が好適に用いられ、イヌアデノウイルス２型の継代には、MDCK細胞又はCRFK細胞、好ましくはMDCK細胞が好適に用いられ、イヌパルボウイルスの継代には、A72細胞又はCRFK細胞が好適に用いられる。本発明の弱毒化されたウイルス株は、培養細胞を用いて少なくとも10継代、好ましくは50継代、さらに好ましくは75継代、さらに好ましくは100継代することにより得られる。ウイルスの継代培養は以下の方法で行なう。【００４２】
イヌジステンパーウイルス及びイヌアデノウイルス２型の場合
1．細胞を継代する。【００４３】
2．単層を形成したら、培地を除去する。【００４４】
3．ウイルス液を接種する。【００４５】
4. 37℃で1時間吸着させる。【００４６】
5. 細胞維持培地を加える。【００４７】
6．37℃のCO2インキュベーターで培養する。【００４８】
7．CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。【００４９】
イヌパルボウイルスの場合
1．細胞を継代する。【００５０】
2．ウイルス液を接種する。【００５１】
3．37℃のCO2インキュベーターで培養する。【００５２】
4．CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。【００５３】
親株からの目的ウイルスを連続継代することにより、変異株を取得する。イヌに継代分離株を投与し、該イヌの臨床プロフィールを確認することにより、これらの変異株が弱毒化されたかどうか決定することができる。あるウイルス株がイヌに感染するが病気を発生させる能力を有さないと確認されたら、それは弱毒化されたと判断することができる。【００５４】
弱毒化ウイルスを分離した後、そのゲノムの配列分析を行ってもよい。【００５５】
本発明の弱毒化ウイルスは、ウイルスの病原性に関与する遺伝子に変異が生じ、弱毒化されている。ウイルスの病原性に関与する遺伝子として、イヌパルボウイルスでは、VP1(virion capsid) protein1、VP2(virion capsid protein2)をコードする遺伝子、等があり、イヌジステンパーウイルスでは、F(fusion protein)、H(hemagglutinin protein)、等がある。【００５６】
３種類のウイルスの以下に掲げる遺伝子の親株（Challenge株）の塩基配列又は継代した株の塩基配列の配列を以下の配列番号として配列表に示す。【００５７】
イヌパルボウイルス
VP2  10代継代  配列番号１
VP2  50代継代  配列番号２
N    10代継代  配列番号３
N    50代継代  配列番号４
イヌアデノウイルス２型
LITR  E1A      １代継代  配列番号５
LITR  E1A    ５０代継代  配列番号６
RITR            １代継代  配列番号７
RITR          ５０代継代  配列番号８
イヌジステンパーウイルス
H              親株（Challenge株）  配列番号９
H              １４代継代          配列番号１０
H              ５０代継代          配列番号１１
F              親株（Challenge株）  配列番号１２
F              １４代継代          配列番号１３
NP            １４代継代            配列番号１４
NP            ５０代継代            配列番号１５
イヌパルボウイルスのVP2遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図１A〜１Cに示す。【００５８】
イヌパルボウイルスのN遺伝子の10代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図２A〜２Cに示す。【００５９】
イヌアデノウイルス２型のLITR  E1A遺伝子の１代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図３A〜３Dに示す。【００６０】
イヌアデノウイルス２型のRITR遺伝子の１代継代した株の塩基配列及び50代継代した株の塩基配列の比較を図４に示す。【００６１】
イヌジステンパーウイルスのH遺伝子の親株の塩基配列、１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列の比較を図５A〜５Eに示す。【００６２】
イヌジステンパーウイルスのF遺伝子の親株の塩基配列及び１４代継代した株の塩基配列の比較を図６A〜６Eに示す。【００６３】
イヌジステンパーウイルスのNP遺伝子の１４代継代した株の塩基配列及び５０代継代した株の塩基配列の比較を図７A〜７Cに示す。【００６４】
図１〜７の塩基配列のアラインメントにより、継代により変異する遺伝子が存在することがわかる。これらの遺伝子の変異は、ウイルスの弱毒化に関与しているものと考えられる。【００６５】
イヌパルボウイルスにおいては、VP2遺伝子において、５０代継代したもので１０代継代したものに対して、第885、886、892、894及び895番目の塩基が置換され、５０代継代したものにおいて、第892及び893番目の２塩基（１０代継代したものの第891番目と892番目の塩基の間）並びに第902から1003番目の塩基（１０代継代したものの第901番目と902番目の塩基の間）が挿入されている。【００６６】
イヌジステンパーウイルスにおいては、F遺伝子において、１４代継代したもので親株に対して、第394及び523番目の塩基が置換されている。また、H遺伝子において、５０代継代したもので、親株に対して、第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基が置換されている。さらに、５０代継代したもので、１４代継代したものに対して、第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基が置換されている。【００６７】
本発明は、イヌより分離されたそれぞれのウイルスの親株である、イヌパルボウイルスF3株、イヌアデノウイルス２型F1株及びイヌジステンパーウイルス95-54株を包含する。【００６８】
イヌアデノウイルス２型F1株及びイヌジステンパーウイルス95-54株は、2007年７月１６日付けでECACC（European Collection of Cell Cultures, Centre for Emergency Preparedness and Response, The Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, UK）に、ブタベスト条約に基づきそれぞれ受託番号07071601及び受託番号07071602として寄託されている。【００６９】
イヌパルボウイルスF3株は、配列番号１で表される塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるVP2遺伝子を有し、及び／又は配列番号３で表される塩基配列又は配列番号３で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるN遺伝子を有する。「１個又は数個」の「数個」とは９個以内、好ましくは５個以内、さらに好ましくは２個をいう。【００７０】
イヌアデノウイルス２型F1株は、配列番号５で表される塩基配列又は配列番号５で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるLITR E1A2遺伝子を有し、及び／又は配列番号７で表される塩基配列又は配列番号７で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるRITR遺伝子を有する。「１個又は数個」の「数個」とは９個以内、好ましくは５個以内、さらに好ましくは２個をいう。【００７１】
イヌジステンパーウイルス95-54株は、配列番号９で表される塩基配列又は配列番号９で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるH遺伝子を有し、及び／又は配列番号１２で表される塩基配列又は配列番号１２で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるF遺伝子を有する。また、さらに配列番号１４で表される塩基配列又は配列番号１４で表される塩基配列において、１個又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるNP遺伝子を有していてもよい。「１個又は数個」の「数個」とは９個以内、好ましくは５個以内、さらに好ましくは２個をいう。【００７２】
配列番号２６にイヌパルボウイルスF3株の全長配列に近い部分配列を示す。該配列は全長配列の約75〜80％に相当する。該配列はショットガン・シークエンシング法で解析した配列であり、一部クオリティーの低い塩基も存在する。本発明のイヌパルボウイルスF3株は以下のいずれかのウイルスであると特定される。【００７３】
（１）配列番号２６に表される塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
（２）配列番号２６に表される塩基配列の連続する500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750又は4000塩基からなる塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス；
（３）配列番号２６に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
（４）配列番号２６に表される塩基配列の188、200若しくは630番目の塩基〜480番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
（５）配列番号２６に表される塩基配列の500番目の塩基〜4000若しくは4017番目の塩基配列を含むDNAからなるゲノムを有するウイルス、
（６）上記（１）〜（５）のゲノムの塩基配列からなるDNAに相補的な配列からなるDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするDNAからなるゲノムを有するウイルスであり、ここで、ストリンジェントな条件とは、すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件、あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50％ フォルムアミド、４×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10× デンハルツ（Denhardt, s）溶液、100μg/mlサケ精子DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができる条件をいう、並びに
（７）上記（１）〜（５）のゲノムの塩基配列からなるDNAとBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有しているDNAからなるゲノムを有するウイルス。【００７４】
本発明のウイルスの弱毒株は、各ウイルスの親株から上記の変異部位に変異を有する塩基配列を有するウイルス株である。【００７５】
すなわち、イヌパルボウイルスF3株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌパルボウイルス株であって、配列番号１で表されるVP2遺伝子の塩基配列において、第885、886、892、894及び895番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべてが変異した塩基配列を有する株であり、又はさらに第891番目と892番目の塩基の間に２塩基が挿入され、及び／又は第901番目と902番目の塩基の間に100塩基が挿入されていてもよい。【００７６】
イヌジステンパーウイルス95-54株を培養細胞への馴化により弱毒化して得られる弱毒化イヌジステンパーウイルス株は、以下の（１）〜（３）の変異の少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３つを有する株である。【００７７】
（１）配列番号１２で表されるF遺伝子にける第394及び／又は523番目の塩基の変異。【００７８】
（２）配列番号１０で表されるH遺伝子における第56、74、78、94、100、110、116、128、135、142、156、159、174、176、182、204、218、278、306、311、320、350、374、389、398、407、416、437、446、452、456、482、485、489、495、499、531、542、548、551、553、557、558、572、598、610、614、626、629、632、647、650、659、664、680、689、698、707、716、732、737、741、753、755、776、785、788、792、812、821、850、872、884、888、914、923、929、932、935、946、947、955、957、968、977、978、983、999、1010、1011、1016、1019、1044、1051、1067、1076、1079、1094、1096、1115、1116、1120、1136、1139、1146、1147、1160、1176、1184、1214、1232、1255、1263、1268、1269、1292、1295、1301、1319、1325、1351、1356、1374、1382、1385、1395、1406、1442、1444、1445、1454、1457、1466、1479、1499、1511、1514、1520、1525、1535、1537、1538、1559、1570、1585、1592、1604、1607、1608、1609、1610、1615、1619、1644、1657、1658、1676、1720、1733、1734、1758、1762、1776、1778、1838、1840、1845、1851、1871、1877、1879、1889、1894、1896、1908及び1911番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。【００７９】
（３）配列番号１０で表されるH遺伝子における第628、634、644、648、657、681、683、718、744、748、823及び1406番目の塩基の1つ又は複数、好ましくはすべての変異。【００８０】
本発明のワクチンは、イヌジステンパー用ワクチン、イヌアデノウイルス１型及び２型感染症ワクチン及びイヌパルボウイルス感染症ワクチンのそれぞれを単味ワクチンとして使用することもできるし、イヌジステンパー用ワクチンとイヌアデノウイルス１型及び２型感染症ワクチン、イヌジステンパー用ワクチンとイヌパルボウイルス感染症ワクチン、又はイヌアデノウイルス１型及び２型感染症ワクチンとイヌパルボウイルス感染症ワクチンの２種類の混合ワクチン又はイヌジステンパー用ワクチン、イヌアデノウイルス２型感染症ワクチン及びイヌパルボウイルス感染症ワクチンの３種類の混合ワクチンとしても使用することができる。【００８１】
本発明のワクチンは、混合して投与した場合であっても、ウイルス同士で干渉を起こすことなく、混合した弱毒ウイルス株のすべてについて抗体価が上昇し得る。特に、イヌジステンパーウイルスワクチンとイヌパルボウイルスワクチンを含む混合ワクチンを用いた場合でも干渉は生じない。【００８２】
本発明のワクチンの投与量は、公知のワクチンと同様である。ワクチン中のウイルスの含有量は、イヌジステンパーウイルスは約1×102〜約1×1012の50％組織培養感染量(TCID50)、イヌアデノウイルス２型は約1×102〜約1×1012の50％組織培養感染量(TCID50)、イヌパルボウイルスは約1×102〜約1×1012の50％組織培養感染量(TCID50)である。ワクチンのTCID50は細胞変性効果（cytopathic effect; CPE)の有無により測定する。CPEは、培養細胞が顆粒状や円形化、膨化などいろいろな形態を示し、最後には培養容器から脱落して細胞維持液中を浮遊することをいい、顕微鏡で確認することができる。【００８３】
本発明のワクチンは、獣医学的に有効量の本発明のウイルスワクチンを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。ワクチンは、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内または皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮または皮内の各経路によって接種できる。この中でも経口接種、経鼻接種及び経粘膜接種が好ましい。また、本発明のワクチンは飲料水や餌に含ませた状態でイヌに摂取させてもよい。本発明は、ワクチンを含む飲料水及び餌も包含する。【００８４】
本発明のワクチンは、母イヌからの移行抗体を有しており、通常の注射による接種では移行抗体によりワクチンウイルスが排除され、免疫が成立しない仔イヌに対しても免疫を成立させることができる。仔イヌとしては、移行免疫を有している生後４〜18週、好ましくは４〜８週の仔イヌが対象となる。
【実施例】
【００８５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００８６】
実施例１  ウイルスの弱毒化
ウイルス親株は以下のようにして分離した。【００８７】
イヌパルボウイルスF3株は、福島県郡山市保健所より入手した雑種犬糞便より常法により分離した。【００８８】
イヌアデノウイルス2型F1株は日本全薬工業株式会社内にして飼育していた自家繁殖ビーグル犬咽喉等拭い液より常法により分離した。【００８９】
イヌジステンパーウイルス95-54株は、日本全薬工業株式会社に検査依頼のあった犬鼻汁検体より日本全薬工業株式会社が分離した。【００９０】
ウイルスの継代培養は以下の方法で行なった。【００９１】
イヌジステンパーウイルス及びイヌアデノウイルス２型の場合
1．細胞を継代する。【００９２】
2．単層を形成したら、培地を除去する。【００９３】
3．ウイルス液を接種する。【００９４】
4. 37℃で1時間吸着させる。【００９５】
5. 細胞維持培地を加える。【００９６】
6．37℃のCO2インキュベーターで培養する。【００９７】
7．CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。【００９８】
イヌパルボウイルスの場合
1．細胞を継代する。【００９９】
2．ウイルス液を接種する。【０１００】
3．37℃のCO2インキュベーターで培養する。【０１０１】
4．CPEが観察されたら、−80℃で凍結するとともに更に継代する。【０１０２】
実施例２  ウイルス遺伝子の特定領域の配列決定
イヌジステンパーウイルス（CDV）H及びF遺伝子配列の決定
10cm径の細胞培養用シャーレ（ファルコン製）にフルシート状に発育したVero細胞に2〜3mLのウイルス液を接種し、37℃で1時間吸着後、増殖用培地15mlを加え、37℃で3〜4日間培養した。細胞変性効果が全体の50% 程度となった時点で、市販のRNA抽出キット（TRIZOL試薬、ライフテックオリエンタル製）を用いて、ウイルス感染細胞内から全RNAを抽出した。操作は添付の使用説明書に従った。すなわち、シャーレから培地を除き、細胞に1mlのTRIZOL試薬を加え、ピペッティングによりホモジナイズし、得られた細胞溶解液を1.5ml 遠心チューブに移して室温で5分間静置した。これに0.2ml のクロロホルムを加え、混和後、室温で3分間静置した。遠心（12000 ×g、15分間、4℃）後、水層を別の遠心チューブに移してイソプロパノール沈殿操作を行った。得られた沈殿を75% エタノールで遠心洗浄（7500 ×g、5分間、4℃）し、風乾後、ジエチルピロカーボネート処理水（DEPC水）で0.5〜1.0μg /μlの濃度に溶解したものをウイルスRNA溶液とした。【０１０３】
逆転写反応には0.5ml チューブを用い、ウイルスRNA溶液1μl、CDV H 又はFリバースプライマー0.25μl 、5× 1st Strand Buffer （逆転写酵素添付品）2μl 及びDEPC水4.55μlを加えて全量を7.8μl とし、さらにミネラルオイル(Sigma製、DNase、RNase、and Proteaseフリー) を１滴重層した。70℃ で10分間加熱後、直ちに氷冷した。次いで、M-MLV逆転写酵素（200 units/μl ライフテックオリエンタル製）0.5μl、デオキシヌクレオチド混合溶液（Pharmacia製）0.5μl、0.1M ジチオスレイトール1μl 及びRNase阻害剤（RNasin； 40 units / μl、TOYOBO製）0.2μlを加えて総量10μl のRT反応液とし、37℃で1時間反応させCDV H及びF遺伝子 mRNAのcDNAを合成した。反応終了後、70℃で10分間加熱した。【０１０４】
このRT反応液全量に10× PCR Buffer （Taq DNA ポリメラーゼ添付品）10μl、各プライマー（CDV H フォワードプライマー及びリバースプライマー又はCDV Fフォワードプライマー及びリバースプライマー）0.5μlずつ、dNTPs Mixture（各2.5mM、Taq DNAポリメラーゼ添付品）8μl、滅菌蒸留水70.5μl 及びTaq DNAポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq； 5 units / μl、宝酒造製）0.5μlを加えて全量100μl のPCR反応液とした。PCR用のDNA増幅装置はサーマルサイクリックリアクター（TC-100、東洋紡エンジニアリング製）を用い、これにPCR反応液をセットし、94℃ 1分間、58℃ 1分間、72℃ 2分間のサイクルを30回繰り返した。反応終了後、反応液の一部をとり、0.7% アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下でCDV H及びF遺伝子DNAの増幅を確認した。【０１０５】
その後、宝酒造（株）遺伝子解析センターにシークエンス及び遺伝子解析を委託した。【０１０６】
イヌアデノウイルス２型（CAV２）遺伝子配列の決定
75cm2角型培養フラスコにフルシート状に発育したMDCK細胞を、10ml のリン酸緩衝液で洗浄した後、ウイルス液を1ml 接種した。37℃で30分間静置してウイルスを吸着させた後、これに20ml の細胞増殖用培地を加えて、37℃で40時間静置培養した。【０１０７】
ウイルス感染細胞からのウイルスDNAの抽出は、品川らの方法(Shinagawa et.al. Microbiol.Immunol. 27 817-822 1983)に従って実施した。【０１０８】
培地を除去し、2ml の細胞溶解液を加え室温に10分間静置した後、37℃で5分間保温した。これに0.5ml の5M塩化ナトリウムを加え穏やかに反転攪拌し、37℃に5分間保温後、3〜4時間氷冷した。10000×gで5分間遠心し、上清に10mM トリス- 塩酸緩衝液で飽和させたフェノールを等量加え、室温で10分間振盪後、16000×gで10分間遠心した。水層を除去し、フェノール層に等量の10mM トリス - 塩酸緩衝液を加え同様に振盪、遠心した。水層を完全に除去後、フェノール層に1.5倍容のエタノールを加えて、10分間氷冷し、4000×gで10分間遠心した。【０１０９】
得られた沈殿を0.5ml の80% エタノールで洗浄後、0.5mlのTENS溶液に溶解し、これに250〜500μgのProteinase K 粉末を加え、不溶性物質が確認できなくなるまで約1時間37℃で保温した。この酵素分解溶液に等量のフェノール：クロロホルム（1：1）を加えて同様の操作を行い、さらにこの水層に等量のクロロホルムを加えて同様に処理した。得られた水層に1/10容の3M酢酸ナトリウム溶液と1ml のエタノールを加え、−70℃ にて1時間静置後、10000×g で10分間遠心した。得られた沈殿を80% エタノールで洗浄後、20μlのTE緩衝液に溶解しウイルスDNA溶液とした。【０１１０】
その後、宝酒造（株）遺伝子解析センターにシークエンス及び遺伝子解析を委託した。【０１１１】
イヌパルボウイルス（CPV）VP-2遺伝子の配列決定
CPVにおけるVP-2遺伝子解析は、以下の方法にて実施した。増殖用培地で調整したA72細胞浮遊液（7×105/ml）5mlに2〜3mlのウイルス液を加え、25cm2の角型培養フラスコ（ファルコン製）に播種した。37℃で3〜4日間培養し、細胞変性効果が全面に拡がった時点で培養液を回収した。遠心（3000rpm、10分間）後、得られた上清を滅菌蒸留水で100倍希釈したものをウイルス希釈液とした。【０１１２】
0.5ml チューブにウイルス希釈液5μl、10× PCR Buffer （Taq DNA ポリメラーゼ添付品）10μl、各プライマー（VP-2 フォワードプライマー及びリバースプライマー）0.5μlずつ、dNTPs Mixture（Taq DNAポリメラーゼ添付品）8μl および滅菌蒸留水を加えて95μlとし、さらにミネラルオイル（Sigma製、DNase、RNase and Proteaseフリー）を一滴重層し、DNA増幅装置（サーマルサイクリックリアクター・TC-100、東洋紡エンジニアリング製）にセットして、94℃で5分間加熱した。次いでTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq；5 units/μl、宝酒造製）0.5μl 及び滅菌蒸留水を加えて全量100μlのPCR反応液とし、94℃ 30秒間、55℃ 2分間、72℃ 2分間のサイクルを30回繰り返した。反応終了後、反応液の一部をとり、0.7% アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で遺伝子DNAの増幅を確認した。【０１１３】
その後、宝酒造（株）遺伝子解析センターにシークエンス及び遺伝子解析を委託した。【０１１４】
配列決定において、RT-PCRは以下のプライマーを用いて行った。【０１１５】
CDV H     フォワードプライマー 5’-AATGCTAGAGATGGTTTAATT-3’（配列番号１６）
リバースプライマー 5’-AGGGCTCAGGTAGTCCAGC-3’（配列番号１７）
CDV F     フォワードプライマー 5’-CATAGCAAGCCAACAGGTCAACCAGG-3’（配列番号１８）
リバースプライマー5’-CCTGGCAATCAAGCGAGATATATG-3 （配列番号１９）
CPV VP-2  フォワードプライマー 5’-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCA-3’（配列番号２０）
リバースプライマー 5’-ATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAG-3’（配列番号２１）
実施例３  イヌジステンパーウイルスワクチンについての免疫原性試験及び感染防御試験からなる有効性評価試験、並びに病原性復帰試験からなる安全性評価試験
（１）有効性評価試験
イヌジステンパーウイルス（CDV）95-54株が経口接種で高い免疫原性を有する株であるかを調べるため、Vero細胞で24代継代し弱毒化した株をイヌに接種しCDVに対する中和抗体の産生について比較した。【０１１６】
約3か月齢のビーグル犬 １２頭を性別および月齢から経口投与群５頭、皮下注射群２頭、非接種群５頭の３群に分けた。経口投与群の供試犬には105.5/mLの濃度のCDV95-54株 培養上清 2mL/頭 を３週間間隔で２回経口および経鼻(各1mL)投与した。経鼻・経口による強毒株の攻撃は、約10cmの長さに切断したファイバースコープ用噴霧カテーテル（PW-6C-1、オリンパス光学工業製）の先端ノズル部分を19Gの注射針に取り付け、CDV抗体陰性犬の右側鼻腔内に挿入し、鼻咽頭部に噴霧して行った。皮下注射群の供試犬には105.5/mLの濃度のCDV 95-54株 培養上清 2mL/頭を３週間間隔で２回皮下注射した。1回目接種２日前から２回目接種後３週間目まで毎日、供試犬の一般臨床観察を行った。両群ともに1回目接種日から試験終了まで一週ごとに採血し、CDV抗体価測定を実施した。【０１１７】
また、免疫を付与した犬が経鼻・経口攻撃して感染を防御することができるかどうかを、感染防御用の攻撃用ウイルスとして弱毒していないCDV95-54強毒株を用い確認した。経鼻・経口による強毒株の攻撃は、105.5/mLの濃度のCDV95-54強毒株培養上清1mlを、免疫原生を確認した方法と同様に1回投与した。ウイルス接種前から接種後21日目まで毎週血清を採取し、CDV中和抗体価の測定を常法に従って実施した。【０１１８】
表１に示すように、皮下、経鼻・経口群ともに、ワクチンとして良好な免疫原性を有し、感染防御効果が確認された。
【表１】
2008032796.tif 000002
【０１１９】
（２）  安全性評価試験
病原性復帰試験免疫用ウイルスとして、95-54株 培養上清（Vero細胞で24代継代、105.89 TCID50/mL）を用いた。【０１２０】
供試動物は生後約3〜3.5か月の健康でCDV抗体陰性のビーグル犬を使用した。
【表２】
2008032796.tif 000003
【０１２１】
病原性復帰試験の1代目及び継代5代目には病原性試験を実施した。すなわち、供試犬5頭に対し、Vero細胞で24代継代した95-54株培養上清を鼻腔及び口腔内へそれぞれ1 mLずつ、シリンジを用いて滴下することで接種を行った。試験期間はワクチン接種前4日目（−4d）から接種後21日目までとし、下記の検査を実施した。【０１２２】
病原性復帰試験のウイルス継代用として、血液と糞便からウイルス検出を毎日行い、常法に従って継代した。【０１２３】
病原性試験検査項目は以下の通りであった。
【表３】
2008032796.tif 000004
【０１２４】
病原性試験の結果、弱毒化ウイルス株は、1頭にのみ、一過性の軽度の発熱が認められたが、ワクチンとして問題となるような病原性を有しないことが判明した。また、病原性の復帰も認められなかった。【０１２５】
実施例４  イヌパルボウイルスワクチンについての免疫原性試験及び感染防御試験からなる有効性評価試験、並びに病原性復帰試験からなる安全性評価試験
（１）有効性評価試験
CPV免疫原性試験
供試ウイルスとしてCPV F3株 培養上清（105.30/mL）（Vero細胞 68代継代）を用いた。【０１２６】
供試動物として約３か月齢のビーグル犬 5頭を用いた。約3か月齢のビーグル犬 5頭をCPV F3株 培養上清 2mL/頭 を３週間間隔で２回経口および経鼻(各1mL)投与した。1回目接種２日前から２回目接種後３週間目まで毎日、供試犬の一般臨床観察を行った。1回目接種日から試験終了まで一週ごとに採血し、CPV-HI価を測定することにより、CPV抗体価測定を実施した。【０１２７】
CPV感染防御試験
供試ウイルスとしてF3株 Vero細胞 68代継代培養上清（105.00TCID50/mL）を用いた。【０１２８】
攻撃用ウイルスとしてF3野外強毒株を用いた。【０１２９】
供試動物として4〜5か月齢の健康でCPV抗体陰性のビーグル犬を用い、ワクチン候補株接種群として５頭、対照群として３頭、計８頭用いた。【０１３０】
免疫期間を終了した６Ｗに、供試犬全頭にF3強毒株１mLを経口投与し、攻撃した。試験期間は攻撃前２日目(-2ｄ)から攻撃後14日目（14ｄ）までとし、毎日採血を行い、血中のCPVの有無をPCRによるCPV DNAの検出により行なうとともに、表3に示した試験検査を行なった(但し、抗体価測定はHI抗体価)。【０１３１】
結果を図８及び９に示す。用いた弱毒化パルボウイルスは、ワクチンとして十分な免疫原性を有し、また感染を防御することもできた。【０１３２】
（２）  安全性評価試験
CPV病原性復帰試験
供試ウイルスとしてF3株 Vero細胞 68代継代培養上清（105.00TCID50/mL）を用いた。【０１３３】
供試動物として約３ヶ月齢の健康でCPV抗体陰性のビーグル犬17頭を用いた。【０１３４】
病原性復帰試験の1代目及び継代5代目には病原性試験を実施した。まず、供試犬5頭に対し、F3 株培養上清を鼻腔及び口腔内へそれぞれ1 mLずつ、シリンジを用いて滴下することで接種を行った。病原性復帰試験のウイルス継代用として、血液と糞便からウイルス検出を毎日行い、常法に従って継代した。病原性試験検査項目は以下の通りであった。【０１３５】
検査項目は表３に示すとおりであり、抗体価のみHI価を測定した。【０１３６】
結果を図10に示す。病原性試験の結果、弱毒化ウイルス株は病原性を有しないことが判明した。また、病原性の復帰も認められなかった。【０１３７】
実施例５  CAV２免疫原性試験
供試ウイルスとしてCAV F1株 培養上清（104、105.5、107/mL、対照区）（MDCK細胞 105代継代）を用いた。【０１３８】
供試動物として約３か月齢のビーグル犬 16頭を用いた。【０１３９】
約3か月齢のビーグル犬4頭/群をCAV F1株 培養上清 1mL/頭 を経口(各1mL)投与した。1回目接種日から試験終了まで一週ごとに採血し、CAV抗体価測定を実施した。弱毒化イヌアデノウイルス２型ワクチンは免疫原性を有していた。【０１４０】
実施例６  混合ワクチンの有効性試験
上述したそれぞれのワクチン株を混合し経口投与した際に、免疫を賦与する能力を有しているかどうかを確認した。比較用の供試ワクチンには、次の日本国内で市販されている代表的なワクチンを用いた。【０１４１】
本発明のワクチンとしてはVero細胞で24代継代し弱毒したイヌジステンパーウイルス（CDV）、MDCK細胞で105代継代し弱毒したイヌアデノウイルス２型（CAV2）及びA72細胞で68代継代し弱毒したイヌパルボウイルス（CPV)の３種類のワクチン株のウイルス液を混合したものを用いた。【０１４２】
１．バンガード5：ジステンパー・イヌアデノウイルス（2型）感染症・イヌパラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症混合生ワクチン（ファイザー株式会社、製造番号：478101）
２．デュラミューン5：ジステンパー・イヌアデノウイルス（2型）感染症・大パラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症混合生ワクチン（共立製薬株式会社、製造番号：101152A）
３．“京都微研”キャナイン6：ジステンパー・イヌアデノウイルス（2型）感染症・イヌパラインフルエンザ・イヌパルボウイルス感染症・イヌコロナウイルス感染症混合生ワクチン（株式会社微生物化学研究所、製造番号：7-2）
４．本発明のワクチン：ジステンパー・イヌアデノウイルス（2型）感染症・イヌパルボ
ウイルス感染症混合ウイルス液
生後約３か月のCDV抗体陰性のビーグル犬を、各社のワクチンにつき３頭ずつ無作為に割り当て、ワクチン1ドース分（ウイルス液1mL（105.89TCID50/ml））を３週間間隔で２回、経口接種した。ワクチン接種前から接種後６週目まで毎週血清を採取し、CDV中和抗体価の測定を常法に従って実施した。なお、ワクチン株によって抗原交差性の異なることが考えられるため、中和用ウイルスはそれぞれのワクチンから分離したワクチン株を用いた。【０１４３】
各ワクチンを経口接種したイヌにおけるCDV中和抗体価を表１に示した。バンガード接種イヌでは３頭中１頭にワクチン接種後２週目より抗体産生がみられたが、残る２頭は抗体陰性のままであった。デュラミューン接種イヌでは１頭に５週目より抗体産生がみられたが低力価で、残る２頭は抗体陰性のままであった。キャナイン接種イヌでは１頭が３週目に、もう１頭では６週目に抗体産生がみられたが、残る１頭は抗体陰性のままであった。これらの結果から、市販ワクチンの経口接種によりCDVに対する免疫を確実に賦与させることはできないことが明らかとなった。【０１４４】
CPV及びCAV2に対する抗体価の推移については、各群間において明確な差は認められなかった。
【表４】
2008032796.tif 000005
【０１４５】
実施例７  移行抗体保有犬に対する経口生ワクチンの免疫原性確認
母親からの移行抗体のレベルが高い子犬にワクチン接種をしても、ワクチンウイルスが中和されてしまい、免疫が成立しない。最近ではワクチン中のウイルス含量を高めることにより、高レベルの移行抗体を乗り越えるワクチンも市販されている。【０１４６】
本発明者は、作製したワクチンウイルスを注射ではなく、自然感染ルートである経口から投与した場合、低レベルの移行抗体であれば乗り越えられて抗体応答がみられるのではないかという仮説を立てた。【０１４７】
そこで本実施例では、移行抗体を保有する子犬にワクチンウイルスを経口投与して抗体価を測定し、その免疫原性を確認した。【０１４８】
材料と方法
（1）供試動物
ワクチンウイルス投与時に約7〜8週齢で、移行抗体を保有する健康なビーグル種の子犬10頭を日本農産工業株式会社（Nosan:Beagle）から導入した（表５）。供試犬はアイソレータ内で個別飼育した。
【表５】
2008032796.tif 000006
【０１４９】
（2）供試ワクチン
日本全薬工業株式会社中央研究所において弱毒化したジステンパーウイルス（CDV）、犬アデノウイルス2型（CAV2）及び犬パルボウイルス（CPV）を用い、各ウイルス液を混合しての供試ワクチンを作製した。各ウイルスの含有量は下記のとおりである（表６）。【０１５０】
ジステンパーウイルス 95-54/666株は、ジステンパーウイルス 95-54株をVero細胞を用いて24代継代した株であり、アデノウイルス２型 F1-HP株は、アデノウイルス２型 F1株をMDCK細胞を用いて105代継代した株であり、パルボウイルスF3/666株は、パルボウイルス F3株をVero細胞を用いて68代継代した株である。
【表６】
2008032796.tif 000007
【０１５１】
（3）試験方法
試験日程を表７に示した。導入から3日間の馴致後、0Wに第一回目のワクチンウイルスの投与を行った。経口投与はウイルス液1 mLをシリンジに採り、これを飲ませることで行った。さらにその3週後にも同ウイルス液を経口投与した。第一回目投与前から第二回目投与後2週目まで1週間ごとに血清を採取し（計6時点）、CDV及びCAV2は中和抗体価、CPVはHI価を測定した。抗体応答の判定基準は、各抗体価がワクチン投与前と同等以上に上昇した場合、抗体応答ありと判定した。
【表７】
2008032796.tif 000008
【０１５２】
結果及び考察
1）CDV中和抗体価
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCDV中和抗体価の推移を表８に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表９に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有（1:4から1:22）していた。第一回ワクチン投与後1週目には10頭中9頭が抗体陰性となったが、2週目には１頭を除き抗体陽転化し、第二回ワクチン投与後2週目（試験終了時）には1:512から1:2,048となった（表８）。【０１５３】
移行抗体価が1:8以下ではワクチン1回投与で抗体応答率が100％（7頭中7頭）となった。一方、1:10以上では3頭中1頭が1回投与では応答がみられなかったものの、2回投与後には全頭陽転化した（表９）。
【表８】
2008032796.tif 000009
【表９】
2008032796.tif 000010
【０１５４】
2）CAV2中和抗体価
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCAV2中和抗体価の推移を表１０に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表９に示した。第一回投与前にはすべての個体が移行抗体を保有（1:4から1:128）していた。試験終了時には全頭陽転化しており、抗体価は1:64から1:6,472までの範囲となった。【０１５５】
移行抗体価が1:8以下ではワクチン1回投与で抗体応答率が100％（2頭中2頭）となった。一方、1:10以上では応答率の低下がみられたものの、2回投与後には全頭陽転化した（表１０）。
【表１０】
2008032796.tif 000011
【０１５６】
3）CPV中和抗体価
ワクチンウイルス投与後の供試犬におけるCPV-HI抗体価の推移を表１１に、ワクチン接種前に保有する移行抗体レベルごとの抗体応答率を表９に示した。供試犬10頭中2頭はワクチン投与時に抗体陰性であったため、移行抗体保有犬のデータには含めなかった。参考までに、この2頭は第一回ワクチン投与後1週目に陽転化した。残る8頭は1:16から1:128の移行抗体を保有していた。試験終了時の抗体応答率は75％（8頭中6頭）で、抗体価は1:128から1:2,048の範囲であった。【０１５７】
移行抗体価が1:16以下ではワクチン1回投与で抗体応答率が100％（2頭中2頭）となった。一方、1:32以上になると1回投与では全頭応答がみられなかったが、2回投与後で75％（6頭中4頭）の応答率となった。【０１５８】
一般に高いレベルの移行抗体を乗り越えるためには、ワクチン株の免疫原性とともに接種ウイルス量が重要であることが知られている。本実施例において作製したワクチンのCPV含有量は市販ワクチンのものと比べると低く、そのため移行抗体が高レベルの個体では応答が得られにくかったと考えられる。したがってワクチン中のウイルス含有量を高めることにより、高いレベルの移行抗体を保有する子犬に対しても免疫を付与できる可能性がある。
【表１１】
2008032796.tif 000012
【０１５９】
本実施例の成績から、1回または2回のワクチン投与により各ウイルスに対する抗体応答が得られたことから、ワクチンの経口接種は移行抗体保有犬に対しても有効であることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
経口接種可能なイヌジステンパーウイルス感染症、イヌアデノウイルス２型感染症及びイヌパルボウイルス感染症に対する本発明のワクチンは、これらの感染症に対するイヌの予防又は治療のために有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６１】
配列番号１６〜２５  人工配列の説明：プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１Ａ】
2008032796.tif 000013
【図１Ｂ】
2008032796.tif 000014
【図１Ｃ】
2008032796.tif 000015
【図２Ａ】
2008032796.tif 000016
【図２Ｂ】
2008032796.tif 000017
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2008032796.tif 000019
【図３Ｂ】
2008032796.tif 000020
【図３Ｃ】
2008032796.tif 000021
【図３Ｄ】
2008032796.tif 000022
【図４】
2008032796.tif 000023
【図５Ａ】
2008032796.tif 000024
【図５Ｂ】
2008032796.tif 000025
【図５Ｃ】
2008032796.tif 000026
【図５Ｄ】
2008032796.tif 000027
【図５Ｅ】
2008032796.tif 000028
【図６Ａ】
2008032796.tif 000029
【図６Ｂ】
2008032796.tif 000030
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
2008032796.tif 000034
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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