(57)【要約】（Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、及び（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、を含む、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、
を含む、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法。
【請求項２】
ステップ（Ｂ）の前に、ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞との共培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来し、かつ中胚葉系細胞に分化した細胞を含有した細胞群として、細胞群Ａを分離するために、ステップ（Ａ）で回収した細胞を培養容器中に静置して付着細胞を除去する、請求項１記載の分化方法。
【請求項３】
ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）における血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞が、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射により増殖能力を失わせたＯＰ９細胞である、請求項１又は２記載の分化方法。
【請求項４】
ステップ（Ｃ）の後、（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップを含む、請求項１〜３いずれかに記載の分化方法。
【請求項５】
前記ステップ（Ｄ）において、ＣＤ４０リガンドをさらに添加する、請求項４記載の分化方法。
【請求項６】
（Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、及び
（Ｄ’）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、ヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（Ｄ’）に代えて、
（Ｅ）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で得られた培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（Ｅ）において、ＣＤ４０リガンドをさらに添加する、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）における血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞が、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射により増殖能力を失わせたＯＰ９細胞である、請求項６〜８いずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
ステップ（Ａ）を行なうに先立ち、ヒト胚性幹細胞に導入対象の遺伝子を含む核酸を導入する、請求項６〜９いずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０いずれかに記載の製造方法により得られる樹状細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法、ヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法、及び該製造方法により得られる樹状細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は、抗原タンパク質を貪食し、ペプチドに分解し、生じたペプチドを、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）との複合体としてＴ細胞に提示（以下、「抗原提示」ともいう）してＴ細胞を刺激し、抗原特異的に該Ｔ細胞を活性化する。また、前記樹状細胞は、生体内において抗原提示能力が最も高い細胞である。一方、前記樹状細胞は、自己抗原に反応性を有するＴ細胞の機能を抑制し、免疫学的な自己寛容の維持にも関与している。このように、樹状細胞は、生体内において免疫応答を制御する中心的な役割を果たしている。【０００３】
樹状細胞は、生体内では骨髄中の造血幹細胞から分化され、産生される。また、骨髄中の造血幹細胞は、増殖因子の存在により樹状細胞以外に、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、リンパ球等に分化する。【０００４】
従来、ヒト樹状細胞は、ヒトの末梢血中から樹状細胞を単離すること、あるいは末梢血中の樹状細胞前駆細胞である単球を培養し、分化誘導すること等により得られることが知られている。しかしながら、末梢血中の樹状細胞の存在量は少ないため、大量に得ることは困難であるという欠点がある。また、単球から大量の樹状細胞を作製するためには、前駆細胞である単球を大量に得る必要があり、このために体外血液循環を伴う血球分離操作を行わなければならないという欠点がある。また、この方法で作製した樹状細胞に遺伝子導入を行うためにはウイルスベクターを用いる必要があるという欠点がある。【０００５】
また、マウス胚性幹細胞を分化誘導して樹状細胞を得る方法が報告されている（非特許文献１、特許文献１）。しかしながら、前記非特許文献１に記載の方法では、ヒト胚性幹細胞の樹状細胞を得ることが困難であるのが現状である。また、ヒトを含めた霊長類動物の胚性幹細胞を分化誘導して樹状細胞を得る方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、前記特許文献２に記載の方法では、ヒト胚性幹細胞の樹状細胞を得ることが困難であるのが現状である。
【特許文献１】特開２００４−３１３０３８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０２２３３０パンフレット
【非特許文献１】千住覚（Ｓ．Ｓｅｎｊｕ）ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、第３５０１頁〜第３５０８頁、２００３年５月１日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の１つの側面は、ヒトに由来する樹状細胞を効率よく得ること、ヒト樹状細胞を安定的に供給すること、ヒトの免疫反応を抗原特異的に制御する手段（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する手段、あるいは、特定の抗原に対する免疫抑制性Ｔ細胞を増殖させる手段等）を供給すること、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患（例えば、悪性腫瘍、感染症、自己免疫疾患、アレルギー疾患等）の治療手段を供給すること、臓器移植における拒絶反応と移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：  Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ）を予防または治療する手段を供給すること等の少なくとも１つを可能する、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法を提供することに関する。【０００７】
さらに、本発明の他の側面は、ヒトに由来する樹状細胞を大量に得ること、ヒトに由来する樹状細胞を効率よく得ること、ヒト樹状細胞を安定的に供給すること、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する樹状細胞（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する樹状細胞等）を得ること等の少なくとも１つを可能する、ヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法を提供することに関する。【０００８】
本発明のさらに他の側面は、ヒトの免疫反応を抗原特異的に活性化すること（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活すること等）、免疫応答の抗原特異的な活性化により治療効果が期待される疾患に対する治療効果を得ること等の少なくとも１つを可能する、樹状細胞を提供することに関する。【０００９】
本発明の別の側面では、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療等の少なくとも１つを可能にする医薬の製造のための前記樹状細胞の使用を提供することに関する。【００１０】
また、本発明のさらに別の側面では、免疫応答を抗原特異的に抑制すること、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患等の疾患の治療を行なうこと等の少なくとも１つを可能にする、免疫応答制御剤を提供することに関する。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載からも明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  （Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、
を含む、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法、
〔２〕  ステップ（Ｂ）の前に、ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞との共培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来し、かつ中胚葉系細胞に分化した細胞を含有した細胞群として、細胞群Ａを分離するために、ステップ（Ａ）で回収した細胞を培養容器中に静置して付着細胞を除去する、前記〔１〕記載の分化方法、
〔３〕  ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）における血液細胞の分化と増殖を誘導する性質を有する細胞が、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射により増殖能力を失わせたＯＰ９細胞である、前記〔１〕又は〔２〕記載の分化方法、
〔４〕  ステップ（Ｃ）の後、（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップを含む、前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の分化方法、
〔５〕  前記ステップ（Ｄ）において、ＣＤ４０リガンドをさらに添加する、前記〔４〕記載の分化方法、
〔６〕  （Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、及び
（Ｄ’）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、ヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法、
〔７〕  ステップ（Ｄ’）に代えて、
（Ｅ）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で得られた培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、前記〔６〕記載の製造方法、
〔８〕  前記ステップ（Ｅ）において、ＣＤ４０リガンドをさらに添加する、前記〔７〕記載の製造方法、
〔９〕  ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）における血液細胞の分化と増殖を誘導する性質を有する細胞が、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射により増殖能力を失わせたＯＰ９細胞である、前記〔６〕〜〔８〕いずれかに記載の製造方法、
〔１０〕  ステップ（Ａ）を行なうに先立ち、ヒト胚性幹細胞に導入対象の遺伝子を含む核酸を導入する、前記〔６〕〜〔９〕いずれかに記載の製造方法、並びに
〔１１〕  前記〔６〕〜〔１０〕いずれかに記載の製造方法により得られる樹状細胞、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法によれば、ヒトに由来する樹状細胞を効率よく安定的に供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の分化方法によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する手段（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する手段等）、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患（例えば、悪性腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー疾患等）の治療手段等を供給することできるという優れた効果を奏する。【００１３】
さらに、本発明のヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法によれば、ヒトに由来する樹状細胞を、大量に効率よく安定的に、かつ、細胞ドナーに負担と危険性を負わせること無く供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の製造方法によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する樹状細胞（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する樹状細胞）を得ることができる。【００１４】
本発明の樹状細胞は、個体の免疫反応を抗原特異的に制御（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活）させることができ、個体の免疫反応を抗原特異的に制御することや免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療効果を得ることができるという優れた効果を奏する。【００１５】
また、本発明の免疫応答制御剤によれば、免疫応答を抗原特異的に制御することができ、例えば、悪性腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー疾患等の疾患の治療を行なうことができるという優れた効果を奏する。【００１６】
ヒト胚性幹細胞から免疫抑制活性のある樹状細胞を作製しヒトに投与することにより、ヒト胚性幹細胞の固有の遺伝的背景に由来するアロ（同種異系）抗原に対する免疫寛容を誘導できると期待される。これによって、同じ胚性幹細胞に由来する治療用の分化細胞を、拒絶反応を起こすこと無く移植することが可能となり、胚性幹細胞を用いた再生医療における最大の問題である拒絶反応の問題を解決できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、１つの側面では、（Ａ）ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞とを共培養して、細胞群Ａを得るステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖を誘導する性質を有する細胞とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子の存在下に共培養して、細胞群Ｂを得るステップ、及び
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４の存在下に培養するステップ、
を含む、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法に関する。【００１８】
本発明の分化方法は、ヒト胚性幹細胞が用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分化方法によれば、生体から樹状細胞を単離する場合や単球から分化させる場合に比べ、細胞提供者（ドナー）へ身体的負担と危険性を負わせること無く、大量に供給させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の分化方法によれば、前記胚性幹細胞が用いられているため、必要により、治療効果を示すことが期待される遺伝子（以下、「治療用遺伝子」ともいう）を安全かつ容易に導入し、発現させることができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明によれば、ヒト胚性幹細胞が用いられているため、いわゆる細胞治療等への応用に好適である。【００１９】
本発明に用いられるヒト胚性幹細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターで樹立・分譲されているヒト胚性幹細胞（http://www.shigen.nig.ac.jp/escell/human/top.jsp参照）や各種のヒト胚性幹細胞等が挙げられる。前記ヒト胚性幹細胞は、得られる樹状細胞の使用目的等に応じて、適宜選択されうる。【００２０】
前記「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」すなわちフィーダー細胞としては、例えば、ＯＰ９細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：ＲＣＢ１１２４）、ＳＴ２細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：ＲＣＢ０２２４）、ＰＡ６細胞（理研バイオリソースセンター寄託番号：ＲＣＢ１１２７）等が挙げられる。なかでも、血球細胞への分化誘導効率を向上させる観点から、好ましくは、ＯＰ９細胞が望ましい。【００２１】
本発明において、前記「ヒト胚性幹細胞」と、前記「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」との共培養の際、前記「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞」は、適切な培地の入った培養容器において、当該フィーダー細胞に応じた培養条件下に培養し、該培養容器の底面をほぼ覆う程度まで増殖させた後、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射により細胞増殖を失わせた後に、再度、別途用意した細胞培養容器に移植してフィーダー細胞層を形成させて用いられうる。【００２２】
前記フィーダー細胞の作製に用いられうる培地としては、付着性のほ乳動物細胞の培養に適した培地であればよく、フィーダー細胞として用いる細胞の種類などに応じて適宜選択され得、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ〔ダルベッコ改変イーグル培地（培養液）〕等が挙げられる。【００２３】
前記ステップ（Ａ）に用いられる培養容器は、ヒト胚性幹細胞から中胚葉系の細胞への分化を促進させる観点、フィーダー細胞を長期間安定的に接着させる観点等から、組織培養に適したコーティングが施された培養容器であればよい。前記コーティングは、例えば、ゼラチン、フィブロネクチン等により行なわれうる。【００２４】
前記フィーダー細胞の培養条件としては、フィーダー細胞として用いる細胞の種類などに応じて適宜設定されうる。例えば、ＯＰ９細胞等の場合、０．１重量％  ゼラチン溶液等でコーティングされた培養容器上、２０体積％  ウシ胎仔血清を添加した培地で３７℃、５体積％  ＣＯ２で培養する条件等が挙げられる。【００２５】
前記ステップ（Ａ）において、播種時のヒト胚性幹細胞の細胞密度は、分化能を十分に発揮させる観点、用いる培地（培養液）あたりに得られる中胚葉性細胞の数を最大にする観点等から、好ましくは、１×１０５〜５×１０５細胞／６０ｃｍ２培養容器底面積（または１０ｍｌ培養液）であることが望ましい。【００２６】
前記ステップ（Ａ）におけるヒト胚性幹細胞とフィーダー細胞との共培養に用いられる培地としては、ほ乳動物細胞の培養に適した培養液であればよく、用いられるヒト胚性幹細胞の種類などに応じて適宜選択され得、例えば、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＩＭＤＭ（イスコブ改変ダルベッコ培地）等が挙げられる。なお、かかる培地は、以下のステップ（Ｂ）〜（Ｄ）においても用いられうる。【００２７】
前記ステップ（Ａ）におけるヒト胚性幹細胞とフィーダー細胞との共培養の際の培養気相の条件は、用いられるヒト胚性幹細胞の種類、培養液の組成等に応じて、適宜設定されうるが、例えば、３７℃前後（特に、３７℃）、５体積％  ＣＯ２等の条件が挙げられる。【００２８】
なお、前記ステップ（Ａ）におけるヒト胚性幹細胞とフィーダー細胞との共培養の時間は、ヒト胚性幹細胞を、中胚葉系へ分化した細胞に十分に分化させ、中胚葉系に分化した細胞の数を最大にするため、１５日〜１８日程度が望ましい。この間、２日〜３日に一度、培養液を新しいものと交換する。【００２９】
前記ステップ（Ａ）において得られる細胞群Ａは、中胚葉系細胞の性質を示すものであり、丸い形態を示す細胞の塊を含有する細胞群として得られうる。【００３０】
本発明の分化方法は、ステップ（Ｂ）の前に、ヒト胚性幹細胞と、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞との共培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来し、かつ中胚葉系細胞に分化した細胞を含有した細胞群として、細胞群Ａを分離するために、ステップ（Ａ）で回収した細胞を培養容器中に静置して付着細胞を除去することが好ましい。
つまり、前記ステップ（Ａ）を行なった後、中胚葉系へ分化した細胞を選択的に回収し、樹状細胞への分化の効率を向上させる観点から、フィーダー細胞およびプラスチック表面への付着性の強い細胞群を除去し、細胞群Ａを分離することが好ましい。【００３１】
前記共培養物からの細胞群Ａの単離では、まず、０．２５重量％  トリプシン／１ｍＭ  エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水を、共培養物に添加し、３７℃で、中胚葉系細胞に分化した細胞を分離するに適切な時間、例えば、２０〜４０分間により、ステップ（Ａ）の培養の結果産生された全細胞を回収することを行う。次に、前記回収細胞を、遠心チューブに移し、１，５００回転／分（４５Ｇ）で１０分間の遠心分離操作により沈澱させ、上澄みを吸引除去し、新たな培養液を加えて懸濁させ、新たに用意した培養皿に播種し、３７℃で、例えば２時間以上維持することが好ましい。中胚葉性に分化した細胞の多くは、弱付着性あるいは浮遊性であるため、このような細胞群を細胞群Ａとしてピペッティング操作により回収し、新たに調製した培養液に懸濁する。３７℃で２時間以上維持した間に培養皿底面に強く付着した細胞群は、中胚葉性に分化した細胞以外を多く含むので、これを廃棄する。また、ピペッティング操作により回収した細胞群の浮遊液中に含まれる１００μｍ以上の大きさの細胞塊は、ナイロン製のメッシュ（Ｂ．Ｄ．ＦＡＬＣＯＮ社、セルストレイナー、１００μｍナイロン）等を用いて除去することが望ましい。【００３２】
ステップ（Ｂ）の培養を開始した翌日に培養液を交換することにより、浮遊している死細胞の多くを除去することが望ましい。【００３３】
本発明の分化方法においては、前記ステップ（Ａ）で得られた中胚葉性に分化した細胞を含む細胞群Ａと、血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞（フィーダー細胞）とを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とマクロファージコロニー刺激因子の存在下で共培養する〔ステップ（Ｂ）〕ことに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分化方法によれば、かかるステップ（Ｂ）において、血球系細胞、特に骨髄球系（ミエロイド系）細胞の割合をより向上させることができるため、ヒトに由来する樹状細胞をより効率よく得ることができ、安定的に供給することができるという優れた効果を発揮する。【００３４】
前記「血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞（フィーダー細胞）」としては、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射により細胞増殖能力を失わせたＯＰ９細胞等が望ましく、前記ステップ（Ａ）と同様にフィーダー細胞層を形成させて使用することが望ましい。【００３５】
前記ステップ（Ｂ）における細胞群Ａとフィーダー細胞との共培養の際の培養気相の条件は、用いられる培養液の組成等に応じて、前記ステップ（Ａ）の場合と同様に適宜設定されうる。【００３６】
前記ステップ（Ｂ）においては、細胞群Ａの細胞密度は、分化能を十分に発揮させる観点、用いる培養液あたりの産生細胞数を最大にする観点等から、調整される。多くの場合、ステップ（Ａ）から回収した細胞群Ａを、ステップ（Ａ）における培養容器の２〜４倍程度の体積の培養容器に移植し、ステップ（Ｂ）の培養を行うことが望ましい。【００３７】
前記ステップ（Ｂ）における培地中の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量は、Ｔ細胞刺激活性の強い樹状細胞を産生する観点から、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７５〜１５０ｎｇ／ｍｌの範囲が望ましい。【００３８】
前記ステップ（Ｂ）における培地中のマクロファージコロニー刺激因子の含有量は、Ｔ細胞刺激活性の強い樹状細胞を産生する観点から、２５〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３０〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲が望ましい。【００３９】
なお、前記ステップ（Ｂ）における細胞群Ａとフィーダー細胞との共培養の時間は、細胞群Ａを、血球系細胞、特に骨髄球系（ミエロイド系）細胞の割合を十分に向上させる観点、用いる培養液あたりの産生細胞数を最大にする観点、最終的にＴ細胞刺激活性の強い樹状細胞を作製する観点等から、好ましくは、７〜１０日間であることが望ましい。【００４０】
なお、ステップ（Ｂ）においては、培養期間中、適宜培地交換又は培地の追加を行なってもよい。【００４１】
前記ステップ（Ｂ）において得られる細胞群Ｂは、血球系細胞の性質を示すものであり、用いられる胚性幹細胞の起源となる動物の種類により異なる場合もあるが、例えば、図２のパネルＥに示されるような、丸い形態を示す浮遊細胞を含有する細胞群として得られうる。【００４２】
前記ステップ（Ｂ）に用いられる培養容器は、フィーダー細胞を長期間安定的に接着させる観点等から、ゼラチン、フィブロネクチン等によりコーティングしたものであることが望ましい。【００４３】
前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂは、例えば、ピペッティング等により、回収されることが好ましく、通常、培養液１０ｍｌにつき２×１０５〜８×１０５個の細胞が得られる。この細胞群Ｂを以下のステップ（Ｃ）で用いる。【００４４】
本発明の分化方法においては、前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞群Ｂを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４との存在下に培養する〔ステップ（Ｃ）〕ことに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の分化方法によれば、かかるステップ（Ｃ）を行なうことにより、樹状細胞様細胞の割合をより向上させ、かつＴ細胞に対する刺激活性および抗原提示活性の高い樹状細胞を作製することができるため、ヒトに由来する樹状細胞をより効率よく得ることができ、安定的に供給することができるという優れた効果を発揮する。【００４５】
前記ステップ（Ｃ）における共培養の際の培養気相の条件は、用いられるヒト胚性幹細胞の種類、培地の組成等に応じて、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の場合と同様に適宜設定されうる。なお、ステップ（Ｃ）では、ＯＰ９細胞は用いないことが望ましい。【００４６】
前記ステップ（Ｃ）に用いられる培地は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン−４を含有する。【００４７】
前記ステップ（Ｃ）における培地中の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の含有量は、用いる培養液と刺激因子の量あたりの産生細胞数を最大にする観点から、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは７５〜１５０ｎｇ／ｍｌの範囲が望ましい。【００４８】
前記ステップ（Ｃ）における培地中のインターロイキン−４の含有量は、用いる培養液と刺激因子の量あたりの産生細胞数を最大にする観点から、５〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲が望ましい。【００４９】
なお、前記ステップ（Ｃ）における共培養の時間は、細胞群Ｂを、突起を有する不規則な形状の樹状細胞様細胞に十分に分化させ、最終的に産生される細胞中かかる樹状細胞様細胞の割合を十分に向上させる観点、用いる培養液と刺激因子の量あたりの産生細胞数を最大にする観点等から、３〜６日間程度が望ましい。【００５０】
前記ステップ（Ｃ）において得られる細胞群Ｃの一部は、樹状細胞の性質、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８６の発現等を示すものであり、例えば、図２のパネルＦ又はＧに示されるような、形態的に不均一で、突起を有する形態を示す浮遊細胞を含有する細胞群として得られうる。【００５１】
前記ステップ（Ｃ）に用いられる培養容器は、細胞の付着性が低いもの、例えばコーティングされていないポリスチレン製容器等が望ましいが、細胞非付着性のコーティングがなされた培養容器も使用可能である。【００５２】
前記ステップ（Ｃ）においては、移植する際、懸濁液中の細胞群Ｂの細胞密度は、分化能を十分に発揮させる観点、用いる培養液と刺激因子あたりの樹状細胞の収量を最大にする観点等から、３×１０５〜６×１０５細胞／８ｍｌ培養液であることが望ましい。【００５３】
なお、前記ステップ（Ｃ）における培養時間は、Ｔ細胞反応制御活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、２〜５日間で、細胞の形態により分化の進行程度を評価し適宜決定することが望ましい。【００５４】
本発明の分化方法により得られる樹状細胞は、抗原タンパク質を貪食し、分解し、生じたペプチドをＴ細胞に提示することによりＴ細胞を強く刺激する活性を有する。前記Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原ペプチドを認識するキラーＴ細胞（Ｔｃ）及びＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示された抗原ペプチドを認識するＴヘルパー細胞（Ｔｈ）である。Ｔｈ細胞は、樹状細胞から抗原を提示されて活性化すると、各種のサイトカインを産生し、それによりＢ細胞やマクロファージを活性化させうる。【００５５】
なお、前記ステップ（Ａ）〜（Ｃ）を行なうことにより得られる培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップを含む〔ステップ（Ｄ）〕ことにより、Ｔ細胞刺激性の向上した樹状細胞（成熟樹状細胞）を産生することができる。また、前記ステップ（Ｄ）において、ＣＤ４０リガンドをさらに添加することが好ましく、好ましい樹状細胞（成熟樹状細胞）を産生することができる。【００５６】
前記ステップ（Ｄ）においては、前記ステップ（Ｃ）における顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン−４に加え、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とが用いられているため、Ｔ細胞刺激性の向上した樹状細胞（成熟樹状細胞）を産生することができるという優れた効果を発揮する。また、前記ステップ（Ｄ）において、ＣＤ４０リガンドをさらに添加することにより、好ましい樹状細胞（成熟樹状細胞）を産生することができるという優れた効果を発揮する。【００５７】
前記ステップ（Ｄ）に用いられる培養容器、培養気相の条件は、培養液の組成等に応じて、前記ステップ（Ａ）及び（Ｂ）の場合と同様に適宜設定されうる。【００５８】
前記ステップ（Ｄ）に用いられる培地は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）とリポ多糖、またはさらにＣＤ４０リガンドが添加されていることを除き、前記ステップ（Ｂ）及び（Ｃ）の共培養に用いられる培地と同様である。【００５９】
なお、前記ステップ（Ｄ）における培養時間は、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、２〜４日であればよい。【００６０】
前記ステップ（Ｄ）においては、樹状細胞の成熟を促す因子であれば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）とリポ多糖の代わりに、あるいはこれらに加えて、細菌抽出物、真菌類抽出物、マイコプラズマ抽出物、二本鎖ＲＮＡ、ＣＤ４０リガンド等を用いてもよい。特に、ＣＤ４０リガンドを用いることが好ましい。【００６１】
前記ステップ（Ｄ）において、ＴＮＦ−αの添加量は、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、好ましくは、培養液１ｍｌに対し、５〜２０ｎｇ、好ましくは７.５〜２０ｎｇとすることが望ましい。【００６２】
前記ステップ（Ｄ）において、リポ多糖の添加量は、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、培養液１ｍｌに対し、３〜５μｇ、好ましくは３〜４μｇが望ましい。【００６３】
前記ステップ（Ｄ）において、ＣＤ４０リガンドの添加量は、Ｔ細胞刺激活性のより強い樹状細胞を作製する観点から、培養液１ｍｌに対し、１０〜３０ｎｇ、好ましくは１５〜２５ｎｇとすることが望ましい。【００６４】
前記ステップ（Ｄ）の後、培養物から細胞を回収することができる（ステップ（Ｘ））。また、回収する方法としては、特に限定はないが、ピペッティング操作等が挙げられる。【００６５】
本発明の分化方法によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する手段（例えば、微生物抗原やがん細胞抗原等の特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する手段等）、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患等）の治療手段、臓器移植や細胞移植に伴う拒絶反応を予防および治療する手段等を供給することができる。【００６６】
なお、本明細書において、免疫応答の「制御」とは、免疫応答の抑制及び賦活のいずれをも包含する概念を意図する。【００６７】
本発明は、他の側面では、前記分化方法におけるステップ（Ａ）〜（Ｃ）、及び
（Ｄ’）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、ヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法に関する。【００６８】
また、本発明の製造方法は、別の側面では、前記ステップ（Ｄ’）に代えて、
（Ｅ）前記ステップ（Ｃ）で得られた培養物に、腫瘍壊死因子αとリポ多糖とを添加し、さらに培養するステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で得られた培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離するステップ、
を含む、ヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の製造方法であることが好ましい。また、前記ステップ（Ｅ）において、ＣＤ４０リガンドをさらに添加することが好ましい。【００６９】
本発明の製造方法によれば、前記分化方法のステップ（Ａ）〜（Ｃ）が行なわれるため、本発明の分化方法と同様の観点から、ヒトに由来する樹状細胞を、大量に効率よく安定的に供給することができるという優れた効果を発揮する。【００７０】
また、前記分化方法と同様に本発明の製造方法は、ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）における血液細胞の分化と増殖とを誘導する性質を有する細胞が、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射により増殖能力を失わせたＯＰ９細胞であることが好ましい。【００７１】
本発明の製造方法の前記ステップ（Ｅ）において、培地中の腫瘍壊死因子α、リポ多糖とＣＤ４０リガンドの含有量等は、前記分化方法のステップ（Ｄ）と同様であるのが好ましい。【００７２】
前記ステップ（Ｄ’）及び（Ｆ）のそれぞれにおいて、培養物から、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を分離する手段としては、例えば、樹状細胞に特異的なマーカーに対する抗体を用いたフローサイトメトリーによるセルソーティング、該抗体をコーティングした磁性マイクロビーズを用いたセルソーティング等が挙げられる。【００７３】
前記樹状細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＣｌａｓｓＩ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）等が挙げられる。【００７４】
本発明の製造方法においては、治療用遺伝子等の遺伝子を原材料であるヒト胚性幹細胞に予め導入することにより、樹状細胞に所望の性質を発揮させることもできる。したがって、本発明の製造方法は、他の実施態様では、ステップ（Ａ）を行なうに先立ち、ヒト胚性幹細胞に導入対象の遺伝子を含む核酸を導入することが好ましい。【００７５】
前記導入対象の遺伝子としては例えば、前記治療用遺伝子、具体的には、例えば、免疫抑制のための遺伝子、免疫賦活のための遺伝子、抗原の遺伝子等が挙げられ、より具体的には、特に、抗原をコードする遺伝子、Ｔ細胞の遊走を誘導する因子の遺伝子、Ｔ細胞の反応を増強する因子の遺伝子、Ｔ細胞の反応を抑制する因子の遺伝子等が挙げられる。【００７６】
かかる導入対象の遺伝子を樹状細胞に発現させることにより、生体内で免疫応答の制御に中心的な役割を果たしている樹状細胞の機能を強化することもできる。【００７７】
本発明においては、例えば、抗原をコードする遺伝子を含む核酸が導入されたヒト胚性幹細胞を用いた場合、得られる樹状細胞は、極めて高い抗原特異的Ｔ細胞刺激活性あるいは抗原特異的にＴ細胞反応を抑制する活性を発現する点で有利である。【００７８】
本明細書において、抗原とは、治療や診断のターゲット対象となるタンパク質又はペプチドであり、例えば、各種細菌、各種ウイルス、これらを構成するタンパク、癌細胞に特異的に発現するタンパク質（腫瘍抗原タンパク質）、腫瘍抗原タンパク質の一部であるペプチド、自己免疫疾患やアレルギー疾患において免疫系による認識の標的となっている分子等が挙げられる。【００７９】
核酸の導入は、慣用の方法、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等により行なわれうる。ヒト胚性幹細胞の分化性能を十分に発揮させる観点から、エレクトロポレーション法が望ましい。【００８０】
また、前記核酸は、いわゆるｎａｋｅｄ核酸であってもよく、プラスミドベクターに連結されたものであってもよい。【００８１】
なお、前記ベクターは、必要に応じ、各種プロモーターおよびエンハンサー等の転写促進に有効なエレメントを含有してもよい。【００８２】
本発明においては、操作の容易性、治療用途等の観点から、また、ウイルスベクターの使用に伴う潜在的な危険性を回避するために、非ウイルスベクター、例えば、プラスミドベクターのエレクトロポレーションによる導入が望ましい。【００８３】
本発明の製造方法は、ヒト胚性幹細胞の段階で、プラスミドベクターをエレクトロポレーションにより導入し、樹状細胞へ分化させるため、従来の末梢血単球あるいは造血幹細胞等から分化誘導して作製した樹状細胞にウイルスベクターを用いて遺伝子導入する方法と比較して、以下のような点において優れている。
１）  従来の末梢血単球あるいは造血幹細胞等から分化誘導して得られた樹状細胞にウイルスベクターを用いて遺伝子導入する方法の場合、樹状細胞を使用する度に遺伝子導入を行なう必要がある。また、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入は、導入効率が不安定であり、かつ、遺伝子導入樹状細胞をクローンとして得ることは極めて困難である。一方、本発明に用いられるヒト胚性幹細胞は、クローンとして単離・増殖・凍結保存することが容易である。そのため、適切な遺伝子改変を行なったヒト胚性幹細胞のクローンを単離したうえで増殖させ凍結保存したストックを作製しておけば、必要時に、樹状細胞へ分化させることにより、遺伝的に均一な樹状細胞を安定して治療に用いることが可能である点で優れる。
２）  ウイルスベクターを用いる場合、導入できる遺伝子の数（種類）と大きさ（サイズ）に制限がある。一方、ヒト胚性幹細胞の場合、通常のプラスミドベクターを使用でき、遺伝子の共導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は複数の薬剤耐性遺伝子を用いた段階的導入により複数の遺伝子を導入できる点で優れる。さらに、本発明においては、遺伝子の標的破壊・改変・導入を行なうこともできる点で優れる。これらの特性は、単に免疫効果の増強を目的として用いるのみでなく、免疫応答の抑制的あるいは質的な制御を行なうなどの目的で、より複雑な遺伝子改変が必要な場合に特に有用である。
３）  ヒト胚性幹細胞を用いる方法では、遺伝子改変ヒト胚性幹細胞クローンを樹立した時点で病原微生物の混入や発がん遺伝子の活性化等の有無を検査し、さらに樹状細胞へ分化した段階での特性を十分に検討したうえで治療に用いることが可能である点で優れる。従って、ウイルスベクターを用いる方法に比べ、治療用途等に有用である。【００８４】
本発明は、別の側面では、前記製造方法により得られる樹状細胞に関する。本発明の樹状細胞によれば、個体の免疫反応を抗原特異的に制御すること（例えば、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活すること等）、免疫応答の抗原特異的な制御により治療効果が期待される疾患に対する治療効果を得ること等が可能になる。【００８５】
したがって、本発明によれば、免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患の治療のための医薬の製造における、前記製造方法により得られる樹状細胞の使用も提供することができる。【００８６】
前記「免疫応答を抗原特異的に制御することにより治療効果を得ることができる疾患」としては、例えば、自己免疫疾患、腫瘍、アレルギー疾患、感染症、臓器移植にともなう拒絶反応と移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等が挙げられる。【００８７】
前記医薬の製造の際には、本発明の樹状細胞を安定に保持しうる助剤、例えば、培地等を適宜用いてもよい。【００８８】
また、本発明によれば、前記製造方法により得られる樹状細胞を有効成分として含有した、免疫応答制御剤も提供することができる。【００８９】
本発明の免疫応答制御剤によれば、本発明の樹状細胞を含有しているため、免疫応答を抑制又は賦活させることができる。【００９０】
本発明の免疫応答制御剤は、有効成分である樹状細胞を安定に保持しうる前記助剤を含有していてもよい。【００９１】
本発明の免疫応答制御剤の薬理評価は、Ｔ細胞増殖アッセイによる測定されるＴ細胞刺激活性等を指標として評価されうる。【００９２】
以下、実施例などにより本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例などにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００９３】
生体外分化誘導により、ヒト胚性幹細胞からの樹状細胞の産生を試みた。図１に、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化誘導培養スケジュールの概略を示す。なお、ステップＢで回収した細胞について、一部凍結保存した。また、各ステップにおける細胞を、倒立顕微鏡（商品名：ＩＸ７０、オリンパス社製）を用いて分析した。【００９４】
（１）ステップ（Ａ）
ヒト胚性幹細胞として、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターから分譲されたＫｈＥＳ−１あるいはＫｈＥＳ−3細胞を用い、樹状細胞への分化誘導培養を行った。【００９５】
１．マイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞の使用
まず、予め培養皿（直径１５ｃｍ、ファルコン社製）上、２０体積％  ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭで、ＯＰ９細胞（理化学研究所バイオリソースセンター供給）を、３７℃、５体積％  ＣＯ２で培養した。前記ＯＰ９細胞が、培養皿の底面をほぼ覆うようになるまで増殖させた。前記ＯＰ９細胞を培養している培養液にマイトマイシンＣ（シグマ社製）の水溶液を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、５体積％  ＣＯ２で１時間静置した。【００９６】
前記マイトマイシンＣで処理したＯＰ９細胞から培養液を吸引除去した後、リン酸緩衝生理食塩水  １０ｍｌを添加し、吸引除去した後、０．２５重量％  トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含むリン酸緩衝生理食塩水  ３ｍｌを添加し、３７℃で１０分間維持した。【００９７】
前記操作により培養皿から剥離したマイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞を２０体積％  ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭに懸濁させ、予め０．１重量％ゼラチン溶液でコーティングした培養皿（直径１０ｃｍ、ファルコン社製）を用いて、３７℃、５体積％  ＣＯ２で培養した。【００９８】
前記ヒト胚性幹細胞を、２０体積％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したαＭＥＭ（α必須培養液）に、３×１０５細胞／１０ｍｌ培養液の密度で懸濁させた。得られた細胞懸濁液を、前記培養皿のマイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞上に播き、３７℃、５体積％  ＣＯ２で培養して、該胚性幹細胞の分化誘導を開始した。分化誘導開始の３、６、９、１２、および１５日後に、培養液を除去し、新たな培養液と交換した。【００９９】
図２のパネルＡは、未分化なヒト胚性幹細胞であり、パネルＢ〜Ｄは、ステップ（Ａ）において分化しつつあるヒト胚性幹細胞由来の細胞の形態を示す。パネルＢは、分化誘導開始後３日目、パネルＣは、１１日目、パネルＤは、１５日目の細胞を示す。図２に示されるように、培養日数が経過するほど、未分化のヒト胚性幹細胞から中胚葉系の細胞への分化が進み、中胚葉系へ分化した細胞の密度が増加していた。また、直径１０ｃｍ培養皿１枚あたりヒト胚性幹細胞８×１０４個で分化培養をはじめた結果、分化誘導開始後１０日目頃までにはフィーダー層の表面は、ほぼヒト胚性幹細胞由来の上皮細胞様細胞で覆われた。パネルＢに示されるように、分化誘導開始後３日目の時点では、多くの細胞が、丸い細胞に囲まれた上皮細胞様の大きく平らな細胞の塊を形成していた。また、パネルＣに示されるように、分化誘導開始後１１−１２日目において、中胚葉に分化した細胞であると思われる丸い細胞の塊が、上皮細胞様細胞塊の周辺に現れていた。２−３日おきに培地を交換し続けると、中胚葉様の丸い細胞の塊は徐々に大きくなった。パネルＤに示されるように、分化誘導開始後１５日目において、中胚葉様の丸い細胞の塊によって、フィーダー層の表面の１０〜２０％が覆われていた。【０１００】
分化誘導開始後１７日目に、リン酸緩衝生理食塩水  １０ｍｌを添加し吸引除去した後、０．２５重量％  トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含むリン酸緩衝生理食塩水  ３ｍｌを添加し、３７℃で３０分間維持し、培養皿中の細胞をすべて培養皿から剥離させた。その後、前記培養皿に、新しい培地を添加して、ＯＰ９細胞およびヒト胚性幹細胞由来の細胞を懸濁し、遠心チューブに移した。【０１０１】
前記の細胞を１，５００回転／分（４５Ｇ）で１０分間の遠心分離操作により沈澱させ、上澄みを吸引除去し、新たな培養液を加えて懸濁させ、新たに用意した培養皿に入れて、３７℃で５時間維持した。その結果、ＯＰ９細胞および中胚葉性細胞以外の細胞系譜に分化した細胞の多くは培養皿底面に付着した。中胚葉性に分化した細胞の多くを含む弱付着性あるいは浮遊性の細胞群をピペッティング操作により回収した。【０１０２】
（２）ステップ（Ｂ）
回収した細胞を新たに調製した培養液に懸濁して、ステップ（Ａ）の最初と同様に、別の培養皿に新たに調製したマイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞フィーダー上へ播種し培養を行った。この際、前記（１）のステップ（Ａ）において、１枚の培養皿から回収されたヒト胚性幹細胞由来の細胞を、培養皿２枚のマイトマイシンＣ処理ＯＰ９フィーダー上に移植した。【０１０３】
前記操作の翌日、培養液を吸引操作により除去し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製））およびマクロファージコロニー刺激因子（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ-ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製））を含有する新たな培養液と交換した。その後、８日間培養を継続した。【０１０４】
前記８日間の培養期間中、図２のパネルＥに示されるように、球形の浮遊細胞が出現し、徐々にその数を増した。さらに、浮遊細胞群は、形態的に徐々に不均一になり、突起を持った不規則な形の樹状細胞様細胞が含まれていた。【０１０５】
移植後９日目、ピペッティング操作により、ヒト胚性幹細胞に由来する浮遊する細胞を回収した。図２のパネルＥに、ヒト胚性幹細胞から分化した細胞（移植後５日目、分化誘導開始後２２日目）の形態を示す。【０１０６】
（３）ステップ（Ｃ）
前記（２）のステップ（Ｂ）で回収したヒト胚性幹細胞由来の細胞を、５×１０５個／８ｍｌ  培養液の密度で懸濁させた。得られた細胞懸濁液  ８ｍｌを、ストローマ（フィーダー）細胞なしの１枚の培養皿（直径６ｃｍ）に移植し、３７℃、５体積％  ＣＯ２でさらに培養した。なお、前記培養液として、終濃度１００ｎｇ／ｍｌ  顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と終濃度１０ｎｇ／ｍｌ  インターロイキン−４（ＩＬ−４；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と１０体積％  ウシ胎仔血清とを含むＲＰＭＩ−１６４０を用いた。【０１０７】
その結果、一部の（＜１０％）細胞は、マクロファージのように培養皿の表面に付着した。また、かかる段階において、浮遊細胞の多くは、図２のパネルＦに示される突出部のある不規則な形状を示す細胞（樹状細胞様細胞）であった。【０１０８】
（４）ステップ（Ｄ）
前記（３）のステップ（Ｃ）における移植後３〜４日目に、培養物中に、終濃度２０ｎｇ／ｍｌ  腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）と終濃度３μｇ／ｍｌ  リポ多糖（ＬＰＳ、大腸菌由来；ＳＩＧＭＡ社製）とを添加し、３７℃、５体積％  ＣＯ２でさらに培養することにより、前記（３）のステップ（Ｃ）で得られた培養物中の浮遊細胞を刺激した。【０１０９】
その結果、浮遊細胞中に含まれる樹状細胞様細胞の比率が増加し、付着していた細胞のうち一部が浮遊細胞となった。【０１１０】
（５）ステップ（Ｘ）
刺激後１〜３日目、ピペッティング操作により、細胞を回収した。この培養段階におけるヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞の細胞数は、分化誘導開始時の未分化胚性幹細胞の数の２倍前後であった。【０１１１】
その結果、図２のパネルＧ−Ｉに示されるのと同様に、突起をもった不規則な形の細胞が得られた。【０１１２】
２．ステップ（Ａ）におけるマイトマイシンＣ処理ＳＴ２細胞又はＰＡ６細胞の使用
前記実施例１における（１）ステップ（Ａ）において、マイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞の代わりにマイトマイシンＣ処理ＳＴ２細胞又はマイトマイシンＣ処理ＰＡ６細胞を用いて、該ＯＰ９細胞の場合と同様にステップ（Ａ）を行なった。【０１１３】
その結果、実施例１のマイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞を用いた場合に比べ、マイトマイシンＣ処理したＳＴ２細胞又はＰＡ６細胞を用いた場合には、上皮様細胞がより多く現れ、丸い細胞の塊は非常に少なかった。【０１１４】
３．ステップ（Ａ）におけるマイトマイシンＣ未処理ＯＰ９細胞の使用
前記実施例１における（１）ステップ（Ａ）において、ＯＰ９細胞をマイトマイシンＣにて前処理した場合と前処理しない場合とを比較した。【０１１５】
その結果、実施例１のＯＰ９細胞をマイトマイシンＣにて前処理した場合に比べ、ＯＰ９細胞をマイトマイシンＣにて前処理しない場合、ステップ（Ｂ）において出現した血液細胞性の分化を示す球形の細胞が、極めて少数であった。【０１１６】
４．ステップ（Ｂ）におけるマイトマイシンＣ処理ＳＴ２細胞またはＰＡ６細胞の使用
前記実施例１における（２）ステップ（Ｂ）において、マイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞の代わりにマイトマイシンＣ処理ＳＴ２細胞又はマイトマイシンＣ処理ＰＡ６細胞を用いて、該ＯＰ９細胞の場合と同様にステップ（Ｂ）を行なった。【０１１７】
その結果、実施例１のマイトマイシンＣ処理ＯＰ９細胞を用いた場合に比べ、マイトマイシンＣ処理ＳＴ２細胞又はＰＡ６細胞を用いた場合には、ステップ（Ｃ）後に得られる浮遊細胞数が半数以下であった。
【実施例２】
【０１１８】
細胞表面分子解析
フローサイトメトリー（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン−ディキンソン社製）を用いて、生理的に存在している樹状細胞に発現している細胞表面分子が、前記実施例１におけるヒト胚性幹細胞由来の細胞にも発現しているかどうかを調べた。【０１１９】
前記実施例１で得られたヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞、すなわちステップ（Ｃ）（細胞数：約200,000）後及びステップ（Ｘ）（細胞数：約200,000）の細胞を、Ｆｃブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）中５分間処理した。その後、得られた産物を、下記フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）〔Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製〕：抗ヒトＣＤ８０（クローンＬ３０７．４、マウスＩｇＧ１）、抗ヒトＣＤ８３（クローンＨＢ１５ｅ、マウスＩｇＧ１）、抗ヒトＣＤ８６（クローンＦＵＮ−１、マウスＩｇＧ１）、抗ヒトＣＤ４０（クローン５Ｃ３，マウスＩｇＧ１）及び抗ヒト組織適合性白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ（クローンＬ２４３、マウスＩｇＧ２ａ）を用いて染色した。また、アイソタイプ適合対照として、マウスＩｇＧ２ａ（クローンＧ１５５−１７８）とマウスＩｇＧ１（クローンＭＯＰＣ−２１）を用いて染色した。ともに、２５℃で３０分間静置した。【０１２０】
その後、細胞を、ＰＢＳ／２体積％  ＦＣＳで３回洗浄した。【０１２１】
洗浄後の細胞について、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ソフトウェアを備えた細胞解析装置（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。【０１２２】
その結果、図３に示されるように、ステップ（Ｃ）後の細胞群では、ＣＤ８６とＣＤ４０は発現していたが、それ以外の分子については一部のみが発現していた（左コラム）。一方、ステップ（Ｘ）で回収されたヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞の多くは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６のそれぞれを、発現していた（右コラム）。このことはフローサイトメトリーを用いることによって、本発明のステップ（Ｄ’）と（Ｆ）において、ヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞が分離できることを意味する。
【実施例３】
【０１２３】
実施例１と同様に、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞の産生を行った。図４に、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化誘導スケジュールの概略を示す。実施例１のステップ（Ａ）からステップ（Ｃ）を同様に行った後、実施例１の（３）のステップ（Ｃ）における移植後３〜４日目に、培養物中に、終濃度１０ｎｇ／ｍｌ  腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、終濃度３μｇ／ｍｌ  リポ多糖（ＬＰＳ、大腸菌由来；ＳＩＧＭＡ社製）、および終濃度２０ｎｇ／ｍｌ  ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０−ｌｉｇａｎｄ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）を同時に添加し、３７℃、５体積％  ＣＯ２でさらに培養することにより、実施例１の（３）のステップ（Ｃ）で得られた培養物中の浮遊細胞を刺激した。その結果、実施例１と比べて、浮遊細胞中に含まれる樹状細胞様細胞の比率が増加し、付着していた細胞のうち一部が浮遊細胞となった。
【実施例４】
【０１２４】
細胞表面分子解析
フローサイトメトリー（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて、生理的に存在している樹状細胞に発現している細胞表面分子が、前記実施例３におけるヒト胚性幹細胞由来の細胞にも発現しているかを調べた。【０１２５】
前記実施例３で得られたヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞、すなわちステップ（Ｃ）後（細胞数：約200,000）及びステップ（Ｘ）（細胞数：約200,000）の細胞を、Ｆｃブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）中５分間処理した。その後、得られた産物を、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＨＬＡ−ＣｌａｓｓＩモノクローナル抗体（クローンＧ46-2．6  BD Biosciences社製）を用いた以外は実施例２と同様にＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ソフトウェアを備えた細胞解析装置（商品名：ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。【０１２６】
その結果、図５に示されるように、ステップ（Ｃ）後の細胞群では、少なくともＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩが発現していた（左コラム）。一方、ステップ（Ｘ）で回収されたヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、またはＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩのそれぞれを発現し、ステップ（Ｃ）の細胞よりも高く発現していた（右コラム）。これは、ＣＤ４０リガンドをさらに添加する場合により成熟した樹状細胞に分化させることができ、さらにフローサイトメトリーを用いることによって、本発明のステップ（Ｄ’）と（Ｆ）において、ヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞が分離できることを意味する。
【実施例５】
【０１２７】
ヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞によるＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−αおよびＩＬ（インターロイキン）−１２産生の解析
前記実施例３で得られたヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞、すなわちステップ（Ｃ）後の細胞を、図６に示されるようにＣＤ４０リガンド（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、リポ多糖（ＬＰＳ：終濃度３μｇ／ｍｌ；ＳＩＧＭＡ社製）、あるいはＯＫ４３２（A群3型ストレプトコックス・ピオゲネスSu株ペニシリン処理凍結乾燥粉末    製品名：ピシバニール；中外製薬社製：終濃度１０μｇ／ｍｌ懸濁液）を用いて刺激し、７２時間後に培養液を回収して、ＥＬＩＳＡ法により培養液中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の濃度を測定した。樹状細胞様細胞の密度は、１５０μｌの培養液あたり１．２ｘ１０５個の条件で培養を行った。ＥＬＩＳＡは、Ｐｉｅｒｃｅ社製のキットを用いて行った。その結果、図６に示されるように、ヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞は、リポ多糖の刺激に対してＴＮＦ−αを産生し、ＯＫ４３２の刺激に対してＩＬ−１２を産生することが確認された。これは、ヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞が外来物質で刺激され、サイトカインを産生することができることを意味する。
【実施例６】
【０１２８】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によるＴ細胞刺激活性の解析
ヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞が、Ｔ細胞を刺激し、増殖反応を起こさせる活性を有しているかどうか、アロ（同種異系）のＴ細胞と共培養した場合の、Ｔ細胞増殖を定量することにより検討した。反応性Ｔ細胞として、ヒトの末梢血Ｔ細胞を用いた。また、刺激細胞として、実施例１で得られたステップ（Ｂ）の８日目、ステップ（Ｃ）後、ステップ（Ｘ）後の細胞のそれぞれをＸ線照射（４０Ｇｙ）して得られた細胞を用いた。【０１２９】
ヒトのヘパリン添加血液から、商品名：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、単核細胞群を単離した。【０１３０】
ついで、抗ヒトＣＤ１４抗体をコートした磁性ビーズ（商品名、ｓｕｐｅｒｍａｇｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、単核細胞群からＣＤ１４−細胞を単離した。次に、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡのそれぞれに対する抗体をコートした磁性ビーズを細胞群に付着させた後に、前記と同様に磁性ビーズを用いてこれらの分子を発現する細胞群を除去し、残った細胞をＴ細胞として使用した。【０１３１】
１×１０２〜１×１０４の前記刺激細胞を、９６ウェル丸底培養皿（ファルコン社製）において、１０体積％  熱不活性化ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５体積％  ＣＯ２で５日間Ｔ細胞とともに共培養した。最後の８時間、［３Ｈ］−チミジン（２４７．９Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ）を前記培地に、０．０３７Ｍｂｑ／ウェルとなるように添加した。培養後に、細胞を、ガラス繊維製フィルター（Ｗａｌｌａｃ社製）に取り、細胞における［３Ｈ］−チミジンの取込みをシンチレーションカウンター（パーキンエルマー社、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ）を用いて計測した。結果を図７に示す。【０１３２】
その結果、図７に示されるように、ステップ（Ｘ）後のヒト胚性幹細胞由来樹状細胞を刺激細胞とした場合に、反応性Ｔ細胞の強い増殖反応が認められた。また、ステップ（Ｃ）後のヒト胚性幹細胞由来樹状細胞を刺激細胞とした場合には、反応性Ｔ細胞の比較的弱い増殖反応が認められた。また、ステップ（Ｂ）の８日目の細胞は、Ｔ細胞刺激活性をほとんど有していないことがわかった。
【実施例７】
【０１３３】
抗原提示能力の評価
前記実施例１ステップ（Ｘ）で得られた樹状細胞について、ＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを特異的に認識して増殖反応を示すヒトのＴ細胞株ＳＡ３２．５に対する抗原提示能力を調べた。【０１３４】
（１）合成ペプチドの作製
ヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ｐ１１１−１３１（ＬＱＤＶＭＮＩＬＬＱＹＶＶＫＳＦＤＲＳＴＫ；配列番号：１）に相当するオリゴペプチドを合成し、精製した。【０１３５】
（２）ペプチド抗原提示アッセイ
合成ペプチドを用いたアッセイにおいて、実施例１のステップ（Ｘ）で得られた樹状細胞を、前記（１）で得られた合成ペプチド存在下（６μＭ）、３７℃、５体積％  ＣＯ２で３時間インキュベーションし、培地で３回洗浄した後、Ｘ線照射（４０Ｇｙ）して、増殖能力を失わせた。【０１３６】
ＧＡＤ６５  ｐ１１１−１３１を認識するヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンであるＳＡ３２．５（５×１０４／ウェル）と、抗原（前記合成ペプチド）が負荷された樹状細胞（３×１０２〜３×１０４／ウェル）とを、９６ウェル平底培養プレート上、１０体積％  ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５体積％  ＣＯ２で培養することにより、Ｔ細胞増殖アッセイを行なった。【０１３７】
培養４８時間後、培地に、［３Ｈ］−チミジンを添加し、さらに１６時間培養した。その後、細胞を採取し、ＳＡ３２．５の増殖に伴う３Ｈチミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した。なお、陰性対照として、ペプチドを負荷していない樹状細胞を用い、前記と同様に、ＳＡ３２．５とともに培養した。結果を図８のパネルＡに示す。【０１３８】
その結果、パネルＡに示されるように、ペプチドを負荷した樹状細胞が、ＳＡ３２．５の増殖を誘導するという結果が得られた。
【実施例８】
【０１３９】
ヒト胚性幹細胞由来樹状細胞による抗原の限定分解と提示
前記実施例１のステップ（Ｘ）で得られた樹状細胞が、タンパク質抗原を細胞内に取込み、これを限定分解してペプチドを産生し、細胞表面上のＨＬＡ−ＤＲ分子上に提示する活性を有しているかどうか検討した。【０１４０】
（１）組換えタンパク質の作製
ＧＡＤ６５  ｐ９６−１７４タンパク質断片をコードするＤＮＡ断片を、原核生物の発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に連結し、ついで、得られたベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、それにより、該Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合ＧＡＤ６５タンパク質（ＧＳＴ−ＧＡＤ）を発現させた。Ｆｒａｇｉｏｎｉ及びＮｅｅｌが報告した方法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１０、１７９−１８７（１９９３）〕により、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α中での組換えタンパク質産生を誘導し、組換えタンパク質を細菌封入体から抽出した。グルタチオン−アガロース（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、組換えタンパク質を精製した。なお、融合タンパク質の純度及び量は、硫酸ラウリルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。得られた組換えタンパク質を、商品名：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、低分子量のペプチド断片から分離し、透析によってバッファーを培地に置換した。【０１４１】
（２）抗原提示アッセイ
組換えタンパク質を用いたアッセイにおいては、実施例１のステップ（Ｘ）で得られた樹状細胞をＸ線照射（４０Ｇｙ）し、増殖能力を失わせたものを抗原提示細胞として使用した。【０１４２】
前記ＳＡ３２．５（３×１０４／ウェル）と、樹状細胞（３×１０４／ウェル）とを、ＧＳＴ又は前記（１）で得られたＧＳＴ−ＧＡＤタンパク質の存在下（０．０１〜３μＭ）、９６ウェル平底培養プレート上、１０体積％  ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５体積％  ＣＯ２で培養することにより、Ｔ細胞増殖アッセイを行なった。【０１４３】
４８時間後、培養物に、３Ｈチミジンを添加し、さらに１６時間培養した。ＳＡ３２．５の増殖に伴う３Ｈチミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した。【０１４４】
その結果、図８のパネルＢに示されるように、ＧＳＴ融合ＧＡＤ６５タンパク質を加えた場合のみに、ＳＡ３２．５の増殖を誘導した。これらの結果は、ヒト胚性幹細胞由来樹状細胞は溶解している抗原タンパク質を細胞内に取込み、分解し、ペプチドとしてＨＬＡ−ＤＲ分子上に提示する能力があることを示す。
【実施例９】
【０１４５】
電気穿孔法によるヒト胚性幹細胞への遺伝子導入
ヒト胚性幹細胞に電気穿孔法によりプラスミドベクターの導入を行った。すなわち、マウス胚由来繊維芽細胞上に保持された未分化ヒト胚性幹細胞を回収し、ダルベッコ改良イーグル培養液（ＤＭＥＭ）０．２ｍｌに、２×１０６個を浮遊させ、プラスミドＤＮＡ６０μｇを加え、４ｍｍギャップのキュベットにて１５０Ｖ、１５０μＦの条件にて、電気穿孔を行った。電気穿孔装置は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のジーンパルサーを用いた。遺伝子導入を行った後、選択薬剤であるＧ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を含有する培養液中で培養したのち、遺伝子導入細胞クローンを単離した。上記の遺伝子導入では、ＨＬＡクラスＩＩ分子上にヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）ｐ１１１−１３１（ＬＱＤＶＭＮＩＬＬＱＹＶＶＫＳＦＤＲＳＴＫ；配列番号：１）を提示する効果のあるベクター、ｐＩｉ−ＧＡＤを用いた。このベクターからは、ヒトのインバリアント鎖の一部がＧＡＤペプチドと置換された構造を有するタンパク質が発現される。
【実施例１０】
【０１４６】
遺伝的改変により抗原遺伝子を導入したヒト胚性幹細胞から樹状細胞の作製と樹状細胞分化後の導入遺伝子の機能的発現の確認
上記の実施例９で得られた遺伝子導入ヒト胚性幹細胞クローンを実施例１と同様にして樹状細胞へ分化させ、前記実施例７および実施例８で用いたＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを特異的に認識して増殖反応を示すヒトのＴ細胞株ＳＡ３２．５に対する刺激能力を調べた。【０１４７】
ＳＡ３２．５（５×１０４／ウェル）と、X線照射をした、ｐＩｉ−ＧＡＤが導入されているヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞（３×１０２〜３×１０４／ウェル）あるいはｐＩｉ−ＧＡＤが導入されていないヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞（３×１０２〜３×１０４／ウェル）を、９６ウェル平底培養プレート上、１０体積％  ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃、５体積％ＣＯ２で培養することにより、Ｔ細胞増殖アッセイを行なった。【０１４８】
その結果、図９に示されるように、ｐＩｉ−ＧＡＤが導入されているヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞は、ＳＡ３２．５の増殖を誘導し、ｐＩｉ−ＧＡＤが導入されていないヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞は、ＳＡ３２．５の増殖を誘導しなかった。この結果は、ヒト胚性幹細胞の段階で導入した遺伝子が、樹状細胞に分化した後に発現し、機能できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明によれば、例えば、ヒト胚性幹細胞に由来する樹状細胞を大量に効率よく安定的に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法（スケジュール）の概略図を示す。
【０１５１】
【図２】図２は、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞に分化させた際の経時的な細胞の顕微鏡写真を示す図である。図中、パネルＡは分化誘導開始前、パネルＢは、分化誘導開始後３日目、パネルＣは、11日目、パネルＤは、15日目、パネルＥは、22日目（ステップB 5日目）、パネルＦは、26日目（ステップC 1日目）、パネルＧは、28日目（ステップC 3日目）、パネルＨ及びＩは、32日目（ステップD 4日目）の細胞を示す。
【０１５２】
【図３】図３は、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞に分化させた際の培養液中の浮遊細胞（図１におけるステップC由来細胞（左コラム）およびステップX由来細胞（右コラム））における細胞表面分子CD80、CD83、CD86、CD40、およびHLA-DRのそれぞれの発現を解析した結果を示す図である（縦軸：細胞数、横軸：蛍光強度）。各パネル中、太い実線のヒストグラムが、解析の対象とする分子に特異的な抗体による染色を施したものの蛍光強度を示し、細い線のヒストグラムは、アイソタイプ抗体による対照であり、非特異的な抗体染色の場合の蛍光強度を示す。
【０１５３】
【図４】図４は、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞への分化方法（スケジュール）の概略図を示す。
【０１５４】
【図５】図５は、ヒト胚性幹細胞から樹状細胞に分化させた際の培養液中の浮遊細胞（図４におけるステップＣ由来細胞（左コラム）およびステップＸ由来細胞（右コラム））における細胞表面分子ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＣｌａｓｓＩのそれぞれの発現を解析した結果を示す図である（縦軸：細胞数、横軸：蛍光強度）。各パネル中、太い実線のヒストグラムが、解析の対象とする分子に特異的な抗体による染色を施したものの蛍光強度を示し、細い線のヒストグラムは、アイソタイプ抗体による対照であり、非特異的な抗体染色の場合の蛍光強度を示す。なお、図３と図５の左カラム（ＨＬＡ−ＣｌａｓｓＩを除く）は、同一のデータを示す。
【０１５５】
【図６】図６は、実施例３で得られたヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞様細胞、すなわちステップ（Ｃ）後の細胞を、ＣＤ４０リガンド（２０ｎｇ／ｍｌ）、リポ多糖（ＬＰＳ：３μｇ／ｍｌ）、あるいはＯＫ４３２（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激し、７２時間後に培養液を回収して、ＥＬＩＳＡ法により培養液中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の濃度を測定した結果を示す図である。
【０１５６】
【図７】図7は、ヒト胚性幹細胞から分化誘導された細胞によるアロ（同種異系）Ｔ細胞刺激活性を解析した結果を示す図である。図中、丸は、ステップ（X）終了後の培養液中の浮遊細胞、ひし形は、ステップ（C）終了後の培養液中の浮遊細胞、四角は、ステップ（B）の８日目の培養液中の浮遊細胞を示し、各浮遊細胞をそれぞれX線照射し、刺激細胞として用いた場合のT細胞増殖反応を示す。
【０１５７】
【図８】図8は、ヒト胚性幹細胞より分化誘導された樹状細胞による抗原提示能を調べた結果を示す図である。パネルＡは、分化誘導された樹状細胞に、ＧＡＤ６５抗原由来ペプチド（濃度6μＭ）を負荷し、Ｘ線を照射し、それにより増殖能力を欠損させ、ＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを認識するＴ細胞株ＳＡ３２．５とともに培養した場合のＳＡ３２．５の増殖反応を示す（四角）。パネルＡ中、ＳＡ３２．５による、３Ｈチミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した値を示す。また、陰性対照として、樹状細胞にＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを負荷していないものをＳＡ３２．５とともに培養した場合の結果を示す（ひし形）。パネルＢは、ヒト胚性幹細胞から分化誘導された樹状細胞にＸ線を照射し、それにより増殖能力を欠損させ、遺伝子組換えにより作製したＧＳＴ融合ＧＡＤ６５タンパク質抗原（ＧＳＴ−ＧＡＤ）を含む培養液中でＴ細胞株ＳＡ３２．５とともに培養した場合のＳＡ３２．５の増殖反応を示す（四角）。パネルＢにおいて、パネルＡと同様に、３Ｈチミジン取り込みにより、増殖反応を定量化した値を示す。陰性対照として、ＧＳＴ−ＧＡＤのかわりに、ＧＳＴタンパクを含む培養液中で培養した場合の結果を示す（ひし形）。
【０１５８】
【図９】図９は、ＧＡＤ６５由来のペプチド抗原を提示する遺伝子発現ベクターを導入したヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞によるＧＡＤ６５特異的Ｔ細胞の刺激を示す。分化誘導した樹状細胞に、Ｘ線を照射し、それにより増殖能力を欠損させ、ＧＡＤ６５抗原由来ペプチドを認識するＴ細胞株ＳＡ３２．５とともに培養した場合のＳＡ３２．５の増殖反応を示す（四角）。ＳＡ３２．５による、３Ｈチミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した値を示す。また、陰性対照として、遺伝子発現ベクターを導入していないヒト胚性幹細胞由来の樹状細胞をＳＡ３２．５とともに培養した場合の結果を示す（ひし形）。
【配列表フリーテキスト】
【０１５９】
配列番号：1は、ヒトＧＡＤ６５タンパク質の部分配列である。
【図１】
2008056734.tif 000002
【図２】
2008056734.tif 000003
【図３】
2008056734.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2008056734.tif 000009
【図９】
2008056734.tif 000010
【配列表】
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【国際調査報告】
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