【手続補正書】
【提出日】平成17年2月10日(2005.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養補強された食物であって、
１つ以上の植物由来食物成分、ならびに
添加物としての種子組成物であって、成熟単子葉植物種子から獲得された穀粉、抽出物、または麦芽、および１つ以上の種子産生ヒト乳タンパク質を実質的に未精製形態で含有する組成物、
を含有する食物。
【請求項２】
前記食物中に存在する前記種子産生タンパク質が、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子１、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、およびα−１−抗トリプシンからなる群より選択される、請求項１に記載の食物。
【請求項３】
前記種子産生タンパク質がリゾチームおよびラクトフェリンである、請求項２に記載の食物。
【請求項４】
前記食物が乳幼児用ミルクであり、そして前記種子産生タンパク質が、０．０３ｇ〜０．３ｇタンパク質／リットルミルクの量のリゾチーム、および０．３〜３ｇ／リットルミルクの量のラクトフェリンである、請求項３に記載の食物。
【請求項５】
前記種子組成物が、前記食物の総固体重量の０．１％〜２０％を占める、請求項１に記載の食物。
【請求項６】
前記食物が乳幼児用ミルクであり、そして前記種子組成物が、イネまたはオオムギの成熟種子から獲得された種子抽出物または麦芽を含有する、請求項５に記載の食物。
【請求項７】
成熟単子葉植物種子から獲得された穀粉、抽出物、または麦芽、および１つ以上の種子産生ヒト乳タンパク質を実質的に未精製形態で含有する、摂取可能な単子葉植物種子組成物。
【請求項８】
前記抽出物中に存在する前記種子産生タンパク質が、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子１、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、およびα−１−抗トリプシンからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記種子産生タンパク質がリゾチームおよびラクトフェリンである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
添加された前記抽出物中に、少なくとも１つのヒトタンパク質が、１ｍｇ／ｇ抽出物乾燥重量より多い量で存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）前記穀粉が、成熟単子葉植物種子を製粉することにより調製され；
（ｂ）前記抽出物が、緩衝性水性媒体中に製粉した穀粉を懸濁することにより調製され；そして
（ｃ）前記麦芽が、（ｉ）オオムギ種子を所望の含水率になるまで浸し、（ｉｉ）該浸したオオムギを発芽させ、（ｉｉｉ）発芽を停止するのに有効な条件下で該発芽した種子を乾燥させ、（ｉｖ）該乾燥した種子を粉砕し、（ｖ）必要に応じて、非オオムギ単子葉植物由来の粉砕種子を添加し、（ｖｉ）水中で粉砕種子の混合物を形成し、そして（ｖｉｉ）所望の麦芽が得られるまで該粉砕種子混合物を麦芽処理することにより調製され、ここで、オオムギまたは非オオムギ単子葉植物種子のうちの少なくとも１つがこのような乳タンパク質を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
工程（ｖ）が、前記粉砕した乾燥オオムギ種子に、乳タンパク質を生成する成熟イネトランスジェニック種子を添加する工程を包含する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ヒト乳中に通常存在する１つ以上のタンパク質を抽出可能な形態で含有する、単子葉植物種子。
【請求項１４】
前記ヒト乳タンパク質が、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−１−抗トリプシン、および免疫グロブリンからなる群より選択される、請求項１３に記載の種子。
【請求項１５】
前記ヒト乳タンパク質がリゾチームおよび／またはラクトフェリンである、請求項１４に記載の種子。
【請求項１６】
ヒト乳中に通常見出される２つ以上のタンパク質を含有する、請求項１３に記載の種子。
【請求項１７】
前記乳タンパク質が、収穫された成熟種子中の総タンパク質の少なくとも０．２５重量％を構成する、請求項１３に記載の種子。
【請求項１８】
摂取可能な種子組成物を生成する方法であって：
（ａ）（ｉ）種子成熟特異的プロモーターを有する単子葉植物遺伝子由来の転写調節領域、（ｉｉ）連結されたポリペプチドを内乳細胞のオルガネラに標的化し得る単子葉植物種子特異的トランジット配列をコードする、該転写調節領域に作動可能に連結されたリーダーＤＮＡ配列、および（ｉｉｉ）ヒト乳中に通常存在するタンパク質をコードするタンパク質コード配列を有する第１のキメラ遺伝子で安定に形質転換された単子葉植物を獲得する工程；
（ｂ）種子成熟条件下で該形質転換植物を栽培する工程；
（ｃ）該栽培した植物から成熟種子を収穫する工程；ならびに
（ｄ）該収穫した種子から、ヒト乳タンパク質を実質的に未精製形態で含有する穀粉、抽出物、または麦芽組成物を抽出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記ヒト乳タンパク質が、前記収穫された成熟種子中の総タンパク質の少なくとも０．２５重量％を構成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）前記穀粉が、成熟単子葉植物種子を製粉することにより調製され；
（ｂ）前記抽出物が、緩衝性水性媒体中に製粉した穀粉を懸濁することにより調製され；そして
（ｃ）前記麦芽が、（ｉ）オオムギ種子を所望の含水率になるまで浸し、（ｉｉ）該浸したオオムギを発芽させ、（ｉｉｉ）発芽を停止するのに有効な条件下で該発芽した種子を乾燥させ、（ｉｖ）該乾燥した種子を粉砕し、そして（ｖ）該粉砕した種子を水と混合した後、所望の麦芽が得られるまで該粉砕種子混合物を麦芽処理することにより、調製される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記麦芽がさらに、乳タンパク質を生成する成熟非オオムギトランスジェニック単子葉植物種子を、前記粉砕乾燥種子に添加することにより調製される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
獲得された前記単子葉植物が、（ｉ）種子成熟特異的プロモーターを有する単子葉植物遺伝子由来の転写調節領域、（ｉｉ）連結されたポリペプチドを内乳細胞のオルガネラに標的化し得る単子葉植物種子特異的トランジット配列をコードする、該転写調節領域に作動可能に連結されたトランジットＤＮＡ配列、および（ｉｉｉ）前記第１のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質以外の、ヒト母乳中に通常存在するタンパク質をコードするタンパク質コード配列を有する第２のキメラ遺伝子でさらに形質転換される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
トランスジェニック単子葉植物であって、該植物は：
（ｉ）種子成熟特異的プロモーターを有する単子葉植物遺伝子由来の転写調節領域、
（ｉｉ）連結されたポリペプチドを内乳細胞のオルガネラに標的化し得る単子葉植物種子特異的トランジット配列をコードする、該転写調節領域に作動可能に連結されたトランジットＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）ヒト乳中に通常存在するタンパク質をコードするタンパク質コード配列、
を有する第１のキメラ遺伝子で安定に形質転換されている、植物。
【請求項２４】
前記キメラ遺伝子の転写調節領域が、イネグルテリン遺伝子、イネグロブリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、およびイネプロラミン遺伝子、オオムギホルデイン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子およびコムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子およびトウモロコシグルテリン遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、およびサトウモロコシカフィリン遺伝子、キビペニセチン遺伝子、ならびにライムギセカリン遺伝子の群より選択される遺伝子のプロモーター由来である、請求項２３に記載の植物。
【請求項２５】
前記キメラ遺伝子のリーダー配列が、イネグルテリン遺伝子、イネグロブリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、およびイネプロラミン遺伝子、オオムギホルデイン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子およびコムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子およびトウモロコシグルテリン遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、およびサトウモロコシカフィリン遺伝子、キビペニセチン遺伝子、ならびにライムギセカリン遺伝子の群より選択される遺伝子由来である、請求項２４に記載の植物。
【請求項２６】
前記キメラ遺伝子の転写調節領域が、イネグルテリンＧｔ１プロモーターであり、前記リーダーＤＮＡ配列が、連結されたポリペプチドをタンパク質貯蔵体に標的化し得るイネグルテリンＧｔ１シグナル配列である、請求項２５に記載の植物。
【請求項２７】
グルテリンＧｔ１プロモーターおよびグルテリンＧｔ１シグナル配列が、配列番号１５により同定される配列内に含まれる、請求項２６に記載の植物。
【請求項２８】
前記キメラ遺伝子の転写調節領域が、イネグルテリンＧｌｂプロモーターであり、前記リーダーＤＮＡ配列が、連結されたポリペプチドをタンパク質貯蔵体に標的化し得るイネグルテリンＧｔ１シグナル配列である、請求項２５に記載の植物。
【請求項２９】
前記グルテリンＧｌｂプロモーターおよびグルテリンＧｔ１シグナル配列が、配列番号１６により同定される配列内に含まれる、請求項２８に記載の植物。
【請求項３０】
前記形質転換された単子葉植物がさらに、Ｒｅｂ、Ｏ２、およびＰＢＦ、ならびにそれらの活性フラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの転写因子をコードする核酸を含有する、請求項２３に記載の植物。
【請求項３１】
前記転写因子が、Ｏ２および／またはＰＢＦである、請求項３０に記載の植物。
【請求項３２】
前記タンパク質コード配列が、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−１−抗トリプシン、および免疫グロブリンからなる群より選択されるヒト乳タンパク質のコード配列である、請求項１８に記載の植物。
【請求項３３】
前記タンパク質コード配列が、配列番号１、３、および７〜１４により同定されるコドン最適化配列の群より選択される、請求項３２に記載の植物。
【請求項３４】
請求項１８に記載の植物であって、該植物はさらに：
（ｉ）種子成熟特異的プロモーターを有する単子葉植物遺伝子由来の転写調節領域、
（ｉｉ）連結されたポリペプチドを内乳細胞のオルガネラに標的化し得る単子葉植物種子特異的トランジット配列をコードする、該転写調節領域に作動可能に連結されたトランジットＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記第１のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質以外の、ヒト乳中に通常存在するタンパク質をコードするタンパク質コード配列、
を有する第２のキメラ遺伝子で安定に形質転換されている、植物。
【請求項３５】
１つ以上のヒト乳タンパク質を含有する麦芽シロップを形成する方法であって、該方法は：
（ｉ）オオムギ種子を所望の含水率になるまで浸す工程、
（ｉｉ）該浸したオオムギを発芽させる工程、
（ｉｉｉ）発芽を停止するのに有効な条件下で該発芽した種子を乾燥させる工程、
（ｉｖ）該乾燥した種子を粉砕する工程、
（ｖ）必要に応じて、非オオムギ単子葉植物由来の粉砕種子を添加する工程、および
（ｖｉ）水中で粉砕種子の混合物を形成する工程、および
（ｖｉｉ）所望の麦芽が得られるまで該粉砕種子混合物を麦芽処理する工程、
を包含し、ここで、オオムギまたは非オオムギ単子葉植物種子のうちの少なくとも１つが、（ｉ）種子成熟特異的プロモーターを有する単子葉植物遺伝子由来の転写調節領域、（ｉｉ）連結されたポリペプチドを内乳細胞のオルガネラに標的化し得る単子葉植物種子特異的トランジット配列をコードする、該転写調節領域に作動可能に連結されたトランジットＤＮＡ配列、および（ｉｉｉ）ヒト母乳中に通常存在するタンパク質をコードするタンパク質コード配列を有する第１のキメラ遺伝子で安定に形質転換された植物から獲得される、方法。
【請求項３６】
工程（ｖ）が、前記粉砕した乾燥オオムギ種子に、乳タンパク質を生成する成熟イネトランスジェニック種子を添加する工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抽出工程が、前記種子を粉砕する工程、および生理学的ｐＨに緩衝化された水性媒体中で前記粉砕種子を懸濁する工程を包含する、請求項１８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、１つ以上の植物由来食物成分、および添加物として種子組成物を含む栄養補強された食物を包含する。この種子組成物は、成熟単子葉植物種子から獲得された穀粉、抽出物、または麦芽、および１つ以上の種子産生ヒト乳タンパク質を実質的に未精製形態で含有する。これらの種子産生タンパク質として、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子１、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、および／またはα−１−抗トリプシンが挙げられ、好ましくは、少なくともリゾチームおよび／またはラクトフェリンである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
別の局面において、本発明は、成熟単子葉植物種子から獲得された穀粉、抽出物、または麦芽、および１つ以上の種子産生ヒト乳タンパク質を実質的に未精製形態で含有する摂取可能な単子葉植物種子組成物を包含する。上記のように、種子産生タンパク質は、好ましくは、ラクトフェリンおよび／またはリゾチームを含むが、代替的にまたはそれに加えて、ラクトフェリシン、上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子１、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、ＩｇＡ、およびα−１−抗トリプシンを含み得る。１つ以上の乳タンパク質は、１ｍｇ／ｇ抽出物乾燥重量より多い量で組成物中に存在する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
通常ヒト乳中に存在する１つ以上のタンパク質を抽出可能な形態で含有する単子葉植物種子もまた開示される。ここで、このヒト乳タンパク質として、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−１−抗トリプシン、および免疫グロブリンが挙げられ、好ましくは、少なくともラクトフェリンおよび／またはリゾチームである。乳タンパク質は、好ましくは、収穫された成熟種子中の総タンパク質の少なくとも０．２５重量％を構成する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
タンパク質コード配列は、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−１−抗トリプシン、および免疫グロブリンからなる群より選択されるヒト乳タンパク質のコード配列であり、好ましくは、単子葉植物における発現のためにコドン最適化された配列である。これらのタンパク質の例示的なコドン最適化配列は、配列番号１、３、および７〜１４により示される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
用語「ヒト乳タンパク質」または「ヒト乳中に通常存在するタンパク質」は、正常なヒト乳に見出される、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ラクタドヘリン、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−１−抗トリプシン、および免疫グロブリン、ならびにその生物学的に活性なフラグメントを含むがそれらに限定されない、１つ以上のタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントをいう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
（Ｆ．ラクタドヘリン（ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ））
ラクタドヘリンは、微生物による感染から母乳で育つ乳幼児を保護するのに役立つ、ヒト乳に存在する保護的な糖タンパク質である。ヒト乳による特定のウイルス感染に対する保護もまた、ラクタドヘリンと関係する（Ｎｅｗｂｕｒｇ，１９９９，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ；Ｈａｍｏｓｈ）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
標準的な食品加工方法によって、食品加工中に穀粉を食品へ加え得る。好ましくは、加工温度は乳タンパク質の変性、例えば６０−７０℃より上には至らない。穀粉をまた、栄養学的組成物として、カプセル、錠剤、または穀粉形態のいずれかで直接的に使用し得る。１つの好ましい穀粉組成物は、ラクトフェリンおよび／またはリゾチームを含む。あるいは、それに加えて、穀粉は、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子−１、ラクタドヘリン（ｌａｃｔｏｈｅｄｒｉｎ）、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、およびα−１−アンチトリプシンのような、１つ以上の他のヒト乳タンパク質を含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
抽出物を、例えばカプセル、錠剤、または粉末形態で、直接的な使用のために栄養食品として、または食品加工における食品添加物として使用し得る。１つの実施形態において、抽出物を、典型的にはミルク全重量の乾重量で０．１〜１０％の間の量で、好ましくは乾重量で１−５％の量で、乳幼児用ミルクに添加する。１つの好ましい乳幼児用ミルクは、好ましくは、それぞれ正常ヒト乳で見出されるヒトラクトフェリンまたはリゾチームの５０−２００％の量で、ラクトフェリンおよびリゾチームを両方含む。上記で記載したように、ラクトフェリンはヒト乳１リットルあたり約１グラムの濃度で、そしてリゾチームはヒト乳１リットルあたり約０．１グラムの濃度で存在する。あるいは、またはそれに加えて、抽出物は、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子−１、ラクタドヘリン（ｌａｃｔｏｈｅｄｒｉｎ）、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−１−アンチトリプシン、および免疫グロブリンを含む、１つ以上の他のヒト乳タンパク質を含み得る。同様に、固形乳幼児用食品または栄養飲料への添加物として使用するために、抽出物を乾重量で食品／飲料物質の、好ましくは約０．１〜１０％の間の量で添加する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
好ましい麦芽抽出物またはシロップは、ラクトフェリンおよび／またはリゾチームを含む。あるいは、またはそれに加えて、麦芽は上皮増殖因子、インスリン様増殖因子−１、ラクタドヘリン（ｌａｃｔｏｈｅｄｒｉｎ）、κ−カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、α−１−アンチトリプシンおよび免疫グロブリンのような、１つ以上のヒト乳タンパク質を含む。上記のように、２つ以上の乳タンパク質を含む麦芽を、異なるタンパク質を別々に産生する種子からの麦芽を組み合せるまたは調製することによって、あるいは異なる乳タンパク質（例えばラクトフェリンおよびリゾチーム）を発現するキメラ遺伝子で同時形質転換した植物の種子からの麦芽を調製することによって調製し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４０】
（Ｄ．他の発現プラスミドの作製）
トランスジェニック植物中での組換えポリペプチドの産生のための、本明細書中の植物を形質転換する際に使用するための他の発現プラスミドを、実質的に上記の通りに作製した。これらのプラスミドを、以下に示す：図２８（Ｇｌｂプロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ハプトコリン遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ３２１を示す）；図２９（Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ヒトハプトコリン遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ３２０を示す）；図３０（Ｇｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、κ−カゼイン遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ２９２を示す）；図３１（Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、成熟κ（ｋａｐｐｙ）−カゼインポリペプチドをコードする遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ２９７を示す）；図３２（Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、ラクタドヘリン遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含むＡＰＩ４２０を示す）；図３３（Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、プロペプチドをコードする配列を含まないラクトペルオキシダーゼ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含むＡＰＩ４１８を示す）；図３４（イネＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ラクトペルオキシダーゼ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含むＡＰＩ４１６を示す）；および図３５（Ｂｘ７プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化リゾチーム遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ２３０を示す）；図３６Ａ（Ｇｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、ラクトフェリン遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ２５４を示す）；図３６Ｂ（Ｇｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、ヒトリゾチーム遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ２６４を示す）；図３７（ＧＴ３プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化リゾチーム遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ２２５を示す）；および図３８（ＲＰ−６プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化リゾチーム遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むＡＰＩ２２９を示す）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９３】
【図１】図１は、Ｇｔ１プロモーターおよびＧｔ１シグナル配列の制御下で、ヒトリゾチームコード配列を含む、ｐＡＰＩ１５９発現構築物の地図を示す。
【図２】図２は、イネ（ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔ）の種々の組織における組換えヒトリゾチームの発現について、ウェスタンブロット分析の結果を示す。ここで、レーン１および１５は、ヒト乳リゾチーム標準であり；レーン２は、幅広い範囲の分子量のマーカー（Ｓｉｇｍａ）であり；レーン３およびレーン４は、成熟種子組織抽出物を表し；レーン５およびレーン６は、発芽種子抽出物を示し；レーン７およびレーン８は、根組織抽出物を表し；レーン９およびレーン１０は、若い根組織からの抽出物を表し；レーン１１およびレーン１２は、葉の抽出物を表し；そしてレーン１３およびレーン１４は、それぞれ、若い葉からの抽出物（形質転換されていない（「Ｕ」）植物またはトランスジェニック（「Ｔ」）植物）を表す。ロードした総タンパク質量は、１レーンにつき４０μｇであった。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９の増殖に対して、トランスジェニックイネ種子由来の組換えヒトリゾチーム、ヒトリゾチーム標準（３０μｇ／ｍｌ）、コントロール（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）または形質転換されていないイネ抽出物をインキュベートする効果を示す。インキュベーションの最後（示される時間について）に、混合物のアリコートをＬＢプレート上にプレートし、そして１ｍｌごとのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）を算定した。
【図４】図４は、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓの標準量と同濃度のヒトリゾチーム標準、トランスジェニックイネ（植物）由来のヒトリゾチームおよびニワトリの卵の白身（ｗｈｉｔｅ）由来のリゾチームをインキュベートし、続いて、５分間にわたるリゾチームの活性に起因して混濁度の低下を評価することにより決定される場合の、リゾチーム比活性を示すグラフである。
【図５】図５Ａ：ヒトリゾチーム（「Ｈｌｙｓ」）およびトランスジェニックイネ由来の組換えヒトリゾチーム（「ｒＨＬｙｓ」）の熱安定性。リゾチームを、１００μｇ／ｍｌでＰＢＳ中に溶解した。その混合物を、異なる時間長の間、異なる温度に供した。各熱処理の終わりに、活性アッセイにより残存するリゾチーム活性を評価した。図５Ｂ：ＨｌｙｓおよびｒＨｌｙｓのｐＨ安定性。リゾチームを異なる緩衝液に１００μｇ／ｍｌで溶解した。この混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。そのリゾチーム活性を、活性アッセイにより測定した。
【図６】図６は、いくつかの世代にわたる、トランスジェニックイネ穀粒におけるリゾチーム発現の分析結果を示す。１ｇの玄米粉末からのタンパク質を、０．３５ＭのＮａＣｌをＰＢＳ中に含む４０ｍｌの抽出緩衝液で抽出した。抽出物を、室温で１時間攪拌しながら処理した。ホモジネートを４℃で１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。タンパク質上清を除去し、そしてリゾチーム比濁活性アッセイに必要な場合、希釈した。抽出を３回繰り返し、そして標準偏差値を誤差バーとして示した。リゾチームの収率を、可溶性タンパク質全体のパーセンテージで表わした（％ＴＳＰ）。
【図７】図７は、イネグルテリン（Ｇｔ１）プロモーター、ａＧｔ１シグナルペプチド、およびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ターミネーター／ポリアデニル化部位の制御下で、ヒトラクトフェリンコード配列を含むｐＡＰＩ１６４プラスミドの制限酵素地図である。
【図８】図８は、クマシーブルーを用いて染色した、ヒトラクトフェリンについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示し、ここで、レーン１は、分子量マーカーであり；レーン２〜５は、精製されたヒト由来ラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）であり；レーン６〜１０は、ホモ接合性トランスジェニック株由来の単一の種子抽出物であり、そしてレーン１１は、形質転換されていないＴＰ−３０９からの種子抽出物である。
【図９】図９は、トランスジェニックイネの種々の組織のウェスタンブロット分析結果を示し、ｒＬＦ発現の組織特異性を立証する。レーン１は、分子量マーカーであり；レーン２は、ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）であり；レーン３は、葉からの抽出物であり；レーン４は、葉鞘からの抽出物であり；レーン５は、根からの抽出物であり；レーン６は、種子からの抽出物であり、そしてレーン７は５日目の発芽種子からの抽出物である。
【図１０】図１０は、ペプシン／パンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）処理後のＥ．ｃｏｌｉ増殖（ＥＰＥＣ）における、ネイティブヒトラクトフェリン（「ｎＨＬＦ」）およびトランスジェニックイネにより産生され、精製された組換えヒトラクトフェリン（「ｒＨＬＦ」）の殺細菌効果を説明するバーダイアグラムである。
【図１１】図１１は、ネイティブヒトラクトフェリン（「ｎＨＬＦ」）およびトランスジェニックイネ種子により産生され、精製された組換えヒトラクトフェリン（「ｒＨＬＦ」）によるｐＨ依存性鉄放出を説明するグラフである。
【図１２】図１２は、インビトロでの消化後のＨＬｆのＣａｃｏ−２細胞への結合および取り込みを示す。図１２Ａは、分離定数の測定を示す。図１２Ｂは、Ｃａｃｏ−２細胞上のＨＬｆに対する結合部位の数を示す。図１２Ｃは、２４時間以内のＨＬｆおよびＦｅのＣａｃｏ−２細胞への総取り込みを示す。図１２Ｄは、細胞分画中の遊離１２５Ｉの量により決定される、Ｃａｃｏ細胞内への取り込み後のＨＬｆの分解を示す。
【図１３】図１３は、以下の３つのＡＡＴプラスミドを示す：Ｇｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、コドン最適化ＡＡＴ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＡＰＩ２５５；Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ＡＡＴ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＡＰＩ２５０；ならびにＢｘ７プロモーター、Ｂｘ７シグナルペプチド、コドン最適化ＡＡＴ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＡＰＩ２８２。
【図１４】図１４は、ヒトＡＡＴを発現するトランスジェニックイネ細胞の水相抽出物のクマシーブリリアントブルー染色を示す。形質転換されていないイネ穀物およびトランスジェニックイネ穀物の両方をＰＢＳを用いて砕いた（ｇｒｏｕｎｄ）。生じた抽出物を１４，０００ｒｐｍで４℃で１０分間回した。上清を回収し、そしてプレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。
【図１５】図１５は、トランスジェニックイネ穀物由来の組換えヒトＡＡＴのウェスタンブロット分析を示す。トランスジェニックイネ穀物からの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、次いでフィルターにブロットした。イネ穀物のＡＡＴの同定を、抗−ＡＡＴ抗体によるウェスタン分析により行った。
【図１６】図１６は、ＡＡＴを発現するトランスジェニックイネ穀物由来のタンパク質のクマシー染色（図１６Ａ）およびウェスタンブロット分析（図１６Ｂ）を示す。ｒＡＡＴの活性を、バンドシフトアッセイにより示した。異なる供給源由来のＡＡＴサンプルを、同じモルのブタの膵性エラスターゼ（ＰＰＥ）を用いて３７℃で１５分間インキュベートした。バンドシフトアッセイに対するネガティブコントロールを、加えられた等量のＰＰＥと共にインキュベートしたＡＡＴサンプルで調製した。レーンＭは、分子量マーカーである。レーン１ａは、ヒト血漿から精製されたＡＡＴである。レーン１ｂは、ヒト血漿から精製されたＡＡＴ＋ＰＰＥである。レーン２ａは、トランスジェニックイネ種子由来のＡＡＴを含むタンパク質抽出物であり；レーン２ｂは、トランスジェニックイネ種子由来のＡＡＴを含むタンパク質抽出物＋ＰＰＥである。レーン３ａは、形質転換されていない種子抽出物である。レーン３ｂは、形質転換されていない種子抽出物＋ＰＰＥである。シフトしたバンドを、図１６Ａのレーン１ｂ、２ｂおよび３ｂに示した。このシフトしたバンドを、図１６ＢでＡＡＴ実体を含むことをウェスタンブロットにより確認した。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｃは、３つの異なるプロモーターの制御下における、Ｒｅｂコード配列を含む、３つのプラスミドの図解表示である。図１７Ａは、Ｒｅｂ遺伝子およびＲｅｂターミネーターを有するグロブリンプロモーター（Ｇｌｂ）を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｃは、３つの異なるプロモーターの制御下における、Ｒｅｂコード配列を含む、３つのプラスミドの図解表示である。図１７Ｂは、Ｒｅｂ遺伝子およびＲｅｂターミネーターを有する、アクチンプロモーター（Ａｃｔ）を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜Ｃは、３つの異なるプロモーターの制御下における、Ｒｅｂコード配列を含む、３つのプラスミドの図解表示である。図１７Ｃは、Ｒｅｂ遺伝子およびＲｅｂターミネーターを有する、ネイティブＲｅｂプロモーターを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、イネ内乳特異的グルテリンプロモーター（Ｇｔ−１）の制御下における、異なる転写因子のコード配列を含む、２つのプラスミドの図解描写である。図１８Ａは、Ｇｔ１プロモーター、オオムギプロラミンボックス結合因子（ＢＰＢＦ）、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む、プラスミドｐＧＴ１−ＢＰＢＦ（ＡＰＩ２８６）を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、イネ内乳特異的グルテリンプロモーター（Ｇｔ−１）の制御下における、異なる転写因子のコード配列を含む、２つのプラスミドの図解描写である。図１８Ｂは、Ｇｔ１プロモーター、トウモロコシプロラミンボックス結合因子（ＰＢＦ）、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む、ｐＧＴ１−ＰＢＦ（ＡＰＩ２８５）を示す。
【図１９】図１９は、Ｇｌｂプロモーターの制御下で発現されるヒトリゾチーム遺伝子、およびそれ自身のプロモーター（「ネイティブ−Ｒｅｂ」）の制御下で発現されるＲｅｂ遺伝子を含む構築物により形質転換された前駆細胞由来のＴ０トランスジェニック植物の成熟した種子での組換えヒトリゾチームの発現についての分析結果を図示する。分析された各植物の２０個の別個の種子を含む、Ｒｅｂ遺伝子およびリゾチーム遺伝子を含む３０個の植物の種子ならびにリゾチーム遺伝子のみを含む１７個の植物由来の種子を、リゾチームについて分析した。
【図２０】図２０は、２７個（５１％）のコドン変化および３０個（１９％）のヌクレオチド変化を有する成熟配列中の５３コドンを示すために整列した、コドン最適化上皮増殖因子の配列（「Ｅｇ因子」）のネイティブ上皮増殖因子の配列（「ネイティブ遺伝子」）との比較である。
【図２１】図２１は、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）についての発現カセットを示し、そしてＧｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、コドン最適化ＥＧＦ、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４，１４３ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ２７０（ｐＧｌｂ−ＥＦＧ  ｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図２２】図２２は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）についての発現カセットを示し、そしてイネＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ＥＧＦ、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、３８７７ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ３０３（ｐＧｔ１−ＥＧＦ  ｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図２３】図２３は、トランスジェニックイネ種子における組換えヒトＥＦＧ（「ｒｈＥＧＦ」）のウェスタンブロット分析である。レーン１は、幅広い範囲の分子量のマーカーを示す。レーン２は、１２５ｎｇでロードされた、酵母中で発現されたｒｈＥＧＦを示す。レーン２〜６は、異なるトランスジェニックイネ種子から発現されたｒｈＥＧＦを示す。レーン７は、コントロールの、形質転換されていないＴＰ３０９種子由来である。
【図２４】図２４は、４０個（５７％）のコドン変化および４７個（２２％）のヌクレオチド変化を有する成熟配列中の７０コドンを示すように整列された、ネイティブヒトインスリン様増殖因子Ｉの配列（「ネイティブ遺伝子」）とのコドン最適化インスリン様増殖因子Ｉの配列（「Ｉｎｓｇｆａｃｔ」）の比較である。
【図２５】図２５は、インスリン様増殖因子Ｉ（「ＩＧＦ」）についての発現カセットを示し、そしてイネＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ＩＧＦ、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、３９２８ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ３０４（ｐＧｔ１−ＩＦＧ  ｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図２６】図２６は、インスリン様増殖因子Ｉ（「ＩＧＦ」）についての発現カセットを示し、そしてＧｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、コドン最適化ＩＧＦ、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４１９４ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ２７１（ｐＧｌｂ−ＩＧＦ  ｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図２７】図２７は、トランスジェニックイネ種子において発現される組換えヒトＩＧＦ−Ｉ（「ｒｈＩＧＦ」）のウェスタンブロット分析である。レーン１は、幅広い範囲の分子量のマーカーを示す。レーン２は、１μｇでロードされた、酵母中で発現されたｒｈＩＧＦを示す。レーン３〜９は、異なるトランスジェニック種子から発現されたｒｈＩＧＦを示す。レーン１０は、コントロールの、形質転換されていないＴＰ３０９種子由来である。
【図２８】図２８は、ハプトコリン（ｈａｐｔｏｃｏｒｒｉｎ）についての発現カセットを示し、そしてＧｌｂプロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ハプトコリン、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、５２５０ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ３２１（ｐＧｌｂ−ｇｔ１ｓｉｇ−ハプトコリンｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図２９】図２９は、ハプトコリンについての発現カセットを示し、そしてＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ハプトコリン、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４９４８ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ３２０（ｐＧｔ１−ハプトコリンｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図３０】図３０は、κ−カゼイン（「κ−カゼイン」）についての発現カセットを示し、そしてＧｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、κ−カゼイン遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４４６８ｂｐプラスミド、ＡＰＩ２９２（ｐＧｌｂ−κカゼインｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図３１】図３１は、κ−カゼインについての発現カセットを示し、そしてＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、成熟κ−カゼインポリペプチドをコードする遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４２０４ｂｐプラスミド、ＡＰＩ２９７（ｐＧＴ１κ−カゼインｖ２．１）の制限酵素地図である。
【図３２】図３２は、ラクタドヘリン（ｌａｃｔａｈｅｄｒｉｎ）についての発現カセットを示し、そしてＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、ラクタドヘリン遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性選択マーカーを含む、４８３４ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ４２０（ｐＧｔ１−ＬＡＤ）の制限酵素地図である。
【図３３】図３３は、ラクトペルオキシダーゼ（プロペプチドのない）についての発現カセットを示し、そしてＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、プロペプチドを含まないラクトペルオキシダーゼ遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性選択マーカーを含む、５６３８ｂｐプラスミド、ＡＰＩ４１８（ｐＧＴ１−ＬＰＯ−Ｓ）の制限酵素地図である。
【図３４】図３４は、コドン最適化ヒトラクトペルオキシダーゼについての発現カセットを示し、そしてイネＧｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ラクトペルオキシダーゼ、Ｎｏｓターミネーターおよびカナマイシン耐性選択マーカーを含む、５８０１ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ４１６（ｐＧｔ１−ラクトペルオキシダーゼ）の制限酵素地図である。
【図３５】図３５は、コドン最適化リゾチームについての発現カセットを示し、そしてＢＸ−７プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化リゾチーム遺伝子、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４４０８ｂｐプラスミド、ＡＰＩ２３０（ｐＢＸ７リゾチームｖ２．１．１）の制限酵素地図である。
【図３６Ａ】図３６Ａは、イネ内乳特異的グロブリンプロモーター（Ｇｌｂ）、Ｇｌｂシグナルペプチド、およびＮｏｓターミネーターの制御下で、異種タンパク質をコードする配列を含む２つのプラスミド（ＡＰＩ２５４（図３６Ａ）およびＡＰＩ２６４（図３６Ｂ））の地図の模式図を示す。ＡＰＩ２５４は、ラクトフェリンをコードする配列を含み、そしてＡＰＩ２６４は、ヒトリゾチームをコードする配列を含む。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、イネ内乳特異的グロブリンプロモーター（Ｇｌｂ）、Ｇｌｂシグナルペプチド、およびＮｏｓターミネーターの制御下で、異種タンパク質をコードする配列を含む２つのプラスミド（ＡＰＩ２５４（図３６Ａ）およびＡＰＩ２６４（図３６Ｂ））の地図の模式図を示す。ＡＰＩ２５４は、ラクトフェリンをコードする配列を含み、そしてＡＰＩ２６４は、ヒトリゾチームをコードする配列を含む。
【図３７】図３７は、コドン最適化リゾチームについての発現カセットを示し、そしてＧＴ−３プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化リゾチーム、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４２７１ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ２２５の制限酵素地図である。
【図３８】図３８は、コドン最適化リゾチームについての発現カセットを示し、そしてＲＰ−６プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化リゾチーム、Ｎｏｓターミネーターおよびアンピシリン耐性選択マーカーを含む、４１０６ｂｐのプラスミドである、ＡＰＩ２２９の制限酵素地図である。
【図３９】図３９Ａ〜Ｂは、Ｇｔ１シグナルペプチドまたはＧｌｂシグナルペプチドを有するＧｔ１プロモーターまたはＧｌｂプロモーターの下での、リゾチームの発現の比較である。図３９Ａは、以下の３つのプラスミドの図式表示である：Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、リゾチーム遺伝子およびＮｏｓターミネーターを含む、プラスミドＡＰＩ１５９；Ｇｌｂプロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、リゾチーム遺伝子およびＮｏｓターミネーターを含む、プラスミドＡＰＩ  ２２８；ならびにＧｌｂプロモーター、Ｇｌｂシグナルペプチド、リゾチーム遺伝子およびＮｏｓターミネーターを含むプラスミドＡＰＩ２６４。図３９Ｂは、ＡＰＩ１５９、ＡＰＩ２２８およびＡＰＩ２６４で形質転換されたトランスジェニックイネ植物中で生成されたリゾチーム陽性種子におけるリゾチームの活性を示す。各構築物の複数の株由来の種子を、リゾチーム活性アッセイにより分析した。各植物由来の個々の種子を分析した。検出可能な量のリゾチームを欠いている種子を、除外した。ヘミ接合性種子およびホモ接合性種子の両方を含む、１植物につき２０個のリゾチーム陽性種子の活性を、平均した。この平均活性を、チャート上にプロットした。
【図４０】図４０は、トランスジェニック株における内乳発達中のヒトリゾチーム発現の時間経過を示す。１０個の小穂を、受粉後７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目（「ＤＡＰ」）に回収し、そしてリゾチーム活性アッセイにより分析した。黒いバーは、１５９−１−５３−１６−１由来である。白いバーは、２６４−１−９２−６−１由来である。
【図４１】図４１は、７つの異なるプロモーター：Ｇｔ１、Ｇｌｂ、Ｇｌｕｂ−２、Ｂｘ７、Ｇｔ３、Ｇｌｕｂ−１およびＲｐ６の下での、トランスジェニックＴ１イネ種子におけるリゾチームの発現レベルを比較している棒グラフである。構築物全てが、Ｇｔ１シグナルペプチドを含む。