【手続補正書】
【提出日】平成15年6月23日(2003.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
実施例５からの質量スペクトルを作成するために使用した生のデータを、データ獲得システムからＡＳＣＩＩ形式で取り出す。化学的ノイズの天然の周期を、付録に示す「デコンボルバー（ｄｅｃｏｎｖｏｌｖｅｒ）」コードを使用してこの生のデータから決定し、そして１．０００５７５ａｍｕと決定する。この天然の周期を使用して、スペクトルを、ＭＳにおいて常にポジティブである機器の誤差を補正するために、ベースラインを設定する（出力ファイル＊．ｂｓｌ）（図１６）。ベースライン設定は、データの各１．０００５７５ａｍｕブロックにおける最少データ値が、そのデータのブロック中の全てのデータ点毎を通して差し引きすることによって、ゼロに調整されることを意味する。その後、ベースラインが設定されたデータファイルを、質量欠損（Ｂｒを含有している）ピークを定量化するように「β因子」で処理する。質量欠損ピークは、［７９Ｂｒ］ピークよりも１．９９７９５４ａｍｕ上流の、適合する［８１Ｂｒ］ピークを常に有する（図１６）。次いで、得られた＊．ｂｆｃファイルを、「シークエンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）」コード（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と題された、代理人登録番号第０５２６５．Ｐ００１号の、２００１年１０月１９日に提出された同時係属出願を参照のこと（その開示は、本明細書中で参考として援用されている））を通して、最上位にランクされた溶液から最初の４個の残基までのＮ末端ミオグロビン配列（５−Ｂｒ−３−ＰＡＡ−ＧＬＳＤＧＥ；配列番号１）を用いて処理する。本実施例において、「シークエンサー」コードは、ｂ−イオンの第１の電荷状態についての検索に限定した。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
「シークエンサー」コードを、最初の５個の残基の配列を決定するために実行する場合、配列ＧＬＳＤＷ（配列番号８）（これは、７５６．１９９３の理論上の質量を生じる）は、真の配列の６番目の残基の質量欠損位置に対応するピーク（７５６．１８４０でのＧＬＳＤＧＥ（配列番号９））と重複する（図１７）。これは、５個の残基で最上位にランク付けされる配列であるＧＬＳＤＷ（配列番号８）を生じる。しかし、「シークエンサー」を、６個の残基を通して実行する場合、真の配列ＧＬＳＤＧＥ（配列番号９）もまた、最上位にランクされる。なぜなら、ＧＬＳＤＷ（配列番号８）は、その６番目の残基で競合する配列を増幅しないからである。これは、累積確率アルゴリズムの利点を示す。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
簡潔には、クローニングした未知のＤＮＡ配列（例えば、ｄ（ＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＴ）（配列番号１０））を保持するＭ１３プラスミドを、最初に、Ｍ１３複製起点プライマー（３’−ｄ（ＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ）ｒＡ−５’（配列番号４））とハイブリダイズさせる。このプライマーは、その３’末端をｒＡで標識して、そのプライマーを、ＲＮＡｓｅ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）によって選択的に切断可能にする。反応容量を半分に分け、そして２つのチューブに移す。一方のチューブには、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｄＧＴＰ、ならびに質量欠損標識したｄｄＡＴＰ＊（図２０ａを参照のこと）およびｄｄＧＴＰ＊（図２０ｂを参照のこと）を添加する。他方のチューブには、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ならびに質量欠損標識したｄｄＴＴＰ＊（図２０ｃを参照のこと）およびｄｄＣＴＰ＊（図２０ｄを参照のこと）を添加する。図２０に示す改変されたｄｄＮＴＰは、例示的であり、そして標準的な手順に従って調製される（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．、ＮＯＮＩＳＯＴＯＰＩＣ  ＤＮＡ  ＰＲＯＢＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．およびＭａｎａｋ，Ｍ．Ｍ．，ＤＮＡ  ＰＲＯＢＥＳ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと）。質量欠損標識部分で誘導体化され、そして種々の長さおよび／または組成を有する多くの種類の架橋剤によって分離されたプリン塩基およびピリミジン塩基を含む、多くの他の改変されたｄｄＮＴＰが有用である。ＤＮＡの複製および鎖伸長を、３７℃でのインキュベーションによって開始する。質量のラダーが、ｄｄＮＴＰでの鎖終結によって生成される。反応終了時での変性およびＲＮＡｓｅでの切断工程は、テンプレートからその鎖終結産物を取り外し、そしてプライマーを遊離させ、このプライマーは、ハイブリダイゼーションによって選択的に除去され得る。ＤＮＡフラグメントを質量分析計に適合する緩衝液中に溶解させ、そして陰イオンモードでＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計中に流す。各々のフラグメントについての一連の多価イオンに対応するピークを、機器の製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって供給される標準的なアルゴリズムを使用してデコンボリュートし、ゼロ価の質量のみを含むスペクトルを作成する。その後、このゼロ価のスペクトルをまた、機器供給元のアルゴリズムを使用して、中心軌跡をとる（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
質量スペクトルデータを以下のように分析する。ｄｄＡ＊およびｄｄＧ＊を含有するサンプル由来のスペクトルをデコンボリュートし、そして化学的ノイズを排除して、組み込まれた臭素元素またはヨウ素元素を有するピークのみを残す（図２１）。ｄｄＴ＊およびｄｄＣ＊を含有するサンプル由来のスペクトルを、同様に処理する（図２２）。両方のデコンボリュートしたスペクトルを考慮して、最も高い質量フラグメントを、ｄｄＡ＊／ｄｄＧ＊スペクトルにおいて見出す（４１１４．７３３）（図２１）。このフラグメントはまた、同位体対が存在しない場合には、ヨウ素質量元素を含むフラグメントとして同定され得；従って、「未知」の配列の最後のヌクレオチドは、Ａである。次に低い質量を有する質量フラグメントは、３６９５．６１１および３６９７．６０９の二重線であり、これは、ｄｄＴ＊／ｄｄＣ＊スペクトルにおいて見出される（図２２）。この二重線は、臭素元素の組み込みを示し、そして従って、その配列中の次のヌクレオチドは、Ｔである。このプロセスを、最後のピーク（この場合、ｄｄＴ＊／ｄｄＣ＊スペクトル中の７４８．１８５０での一本のピーク、従って、これは、Ｃに対応する）が見出されるまで、繰り返す。このように、配列ＡＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣ（配列番号１１）を決定し、そして反転させそしてヌクレオチド相補体を置換すると、「未知」の配列ＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＴ（配列番号１０）が、決定される。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
真のユビキチンのＮ末端配列（ＭＱＩＦＶＫ（配列番号１２）、ＧｅｎＢａｎｋから入手した）を、「シークエンサー」を２個、３個および４個の残基に対して実行して、正確に決定した。正確な配列を、１番目の残基での１９個の競合する可能性から２番目にランク付けされた。正確な配列はまた、５番目の残基で２番目に（ＭＱＩＦＲ（配列番号１３）に次いで）にランク付けされた。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍａｒｉｎｅｒ質量分析計での３２５Ｖのノズル電位の高度なフラグメント化条件で行われた、グリコーゲンホスホリラーゼの質量スペクトルを示す。
【図２】
図２は、グリコーゲンホスホリラーゼの質量スペクトル（図１）の、いくつかの２０ａｍｕ区画にわたって約１ａｍｕの間隔で観察される周期的なピークのパターンを示す。
【図３】
図３は、５０〜５５０ａｍｕの範囲の３２５Ｖでのグリコーゲンホスホリラーゼフラグメント化データについての、１ａｍｕの間隔での全ＭＳピークの重ね合わせを示す。
【図４】
図４は、同位体質量数の関数として、周期表の元素についての核結合エネルギーを示す。
【図５】
図５は、少なくとも１つの臭素置換基を有する多数の標識部分の構造を示す。
【図６】
図６は、少なくとも１つのヨウ素置換基を有する多数の標識部分の構造を示す。
【図７】
図７は、実施例１に提供される方法を使用して配列決定され得る、高マンノース型オリゴサッカライドの構造を提供する。
【図８】
図８Ａは、標識１で標識された高マンノース型オリゴサッカライド消化物についての、デコンボリュートした質量欠損スペクトルを示す。図８Ｂは、標識２で標識された高マンノース型オリゴサッカライド消化物についての、デコンボリュートした質量欠損スペクトルを示す。図８Ｃは、標識３で標識された高マンノース型オリゴサッカライド消化物についての、デコンボリュートした質量欠損スペクトルを示す。
【図９】
図９は、標識１および標識２で標識された脂質についての、デコンボリュートした質量欠損スペクトルを示す（実施例２を参照のこと）。
【図１０】
図１０は、Ｂｒが標識の残部へアミノ酸（Ｒ）を通じて連結される質量欠損元素である、光切断が可能な質量欠損標識についての一般的な構造を示す。
【図１１】
図１１Ａは、光浄化型（ｐｈｏｔｏ  ｃｌｅａｒｅｄ）質量欠損の、デコンボリュートした質量欠損スペクトルを示す。図１１Ｂは、光浄化型一同位体（ｍｏｎｏ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ）質量欠損タグの、タグ臭素同位体分解スペクトルを示す。図１１Ｃは、同位体分解質量スペクトルを示す。
【図１２】
図１２Ａは、質量スペクトルの他の化学的ノイズからのｂ−イオンフラグメントの分解を示す。図１２Ｂは、質量スペクトルの他の化学的ノイズからのａ−イオンフラグメントの分解を示す。図１２Ｃは、質量スペクトルの他の化学的ノイズからのｄ−イオンフラグメントの分解を示す。
【図１３】
図１３Ａは、標識の一価（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｒｇｅｄ）のｂイオンの質量に対応する、周期的なノイズによってシフトさせられる臭素同位体対の二重ピーク（ｄｏｕｂｌｅｔ）を示す。図１３Ｂは、標識されたミオグロビンのＮ末端の一価のｂ１イオンの質量に対応する周期的なノイズによってシフトさせられる臭素同位体対の二重ピークを示す。
【図１４】
図１４Ａおよび図１４Ｂは、一価のａ１イオンに対応している周期的な種によってシフトさせられる、臭素同位体対の二重ピークを示す。
【図１５】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、一価のｄａ２イオンに対応している周期的な種によってシフトさせられた、臭素同位体対の二重ピークを示す。
【図１６】
図１６は、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計でインソースでフラグメント化された、５−Ｂｒ−３−ＰＡＡ標識ミオグロビンの生の、ベースラインを設定された、およびβ因子質量スペクトルを示す。
【図１７】
図１７は、５−Ｂｒ−３−ＰＡＡ標識ミオグロビン（配列番号１および配列番号２）中の最初の５残基の配列を決定するための、「配列決定装置」コードの使用の結果を示す。
【図１８】
図１８は、イオン化が可能な基（Ａ１．．．．Ａｎ）、質量欠損元素（Ｂ１．．．．Ｂｎ）、およびコア無水コハク酸反応性部分（ＳＡ）の組み合わせを含有する質量欠損標識についての一般式（図１８ａ）、ならびに｛（Ａ１．．．．Ａｎ）−（Ｂ１．．．．Ｂｎ）−ＳＡ｝質量欠損標識についての全体の合成スキーム（図１８ｂ）を示す。
【図１９】
図１９は、本明細書中で提供される標識ストラテジーと組み合わせて、Ｓａｎｇｅｒによって記載された方法を使用する例示的な配列決定技術を説明する。
【図２０】
図２０は、本明細書中に提供される配列決定方法において使用され得る、標識された塩基を示す。
【図２１】
図２１は、ｄｄＡ＊／ｄｄＧ＊質量スペクトル（配列番号５）を示す（実施例１８を参照のこと）。
【図２２】
図２２は、ｄｄＴ＊／ｄｄＣ＊質量スペクトル（配列番号５および配列番号６）を示す（実施例１８を参照のこと）。