(57)【要約】  遺伝子増幅法により、２つの遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子）を増幅するためのプライマーセットであって、同一反応系において、同時に、前記３つの遺伝子の各目的領域を特異的に効率良く増幅することができるプライマーセットを提供する。  配列番号５および配列番号２９の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１８および配列番号３８の塩基配列からなるリバースプライマーとをそれぞれ含む２対のプライマーセットを使用する。このプライマーセットを使用することにより、同一反応液において、同時に、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子において検出目的の多型が生じる部位を含む目的領域を、特異的に増幅することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅法により２種類の遺伝子を同時に増幅するためのプライマーセットであって、
前記２種類の遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、
下記（１）および（２）の２種類のプライマーセットを含むことを特徴とする遺伝子増幅用プライマーセット。
プライマーセット（１）
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記６３１番目のチミン塩基（Ｔ）に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
プライマーセット（２）
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ２）配列番号２の塩基配列における４４０番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって２１〜２７塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）配列番号２の塩基配列における５４１番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって１８〜２５塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記５４１番目のアデニン塩基（Ａ）に相補的なチミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（１）および（２）のプライマーセットが、それぞれ下記（１’）および（２’）のプライマーセットである、請求の範囲１記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
プライマーセット（１’）
下記（Ｆ１’）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１’）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ１’）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ１’）配列番号１８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
プライマーセット（２’）
下記（Ｆ２’）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２’）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ２’）配列番号２９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ２’）配列番号３８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項３】
前記遺伝子増幅用プライマーセットが、生体試料中のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子を増幅するためのプライマーセットである、請求の範囲１記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項４】
前記生体試料が、全血である、請求の範囲３記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項５】
遺伝子増幅法により２種類の遺伝子を増幅するための試薬であって、
前記２種類の遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、
請求の範囲１記載の遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする遺伝子増幅用試薬。
【請求項６】
さらに、下記（Ｐ１）および（Ｐ２）に示すオリゴヌクレオチドからなる蛍光標識化プローブを含む、請求の範囲５記載の遺伝子増幅用試薬。
（Ｐ１）配列番号４４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号４５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）配列番号５１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号６２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項７】
遺伝子増幅法により２種類の遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、
前記２種類の遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、
下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする増幅産物の製造方法。
（Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、請求の範囲１記載の遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、同一反応液中で同時に、前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅を行う工程
【請求項８】
前記（Ｉ）工程において、前記反応液に、さらに、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズするプローブおよびＶＫＯＲＣ１遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズするプライマーの少なくとも一方を添加する、請求の範囲７記載の増幅産物の製造方法。
【請求項９】
前記プローブが、下記（Ｐ１）および（Ｐ２）に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選択された少なくとも一つのプローブである、請求の範囲８記載の増幅産物の製造方法。
（Ｐ１）配列番号４４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号４５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）配列番号５１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号６２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲８記載の増幅産物の製造方法。
【請求項１１】
さらに、下記（II）工程を含む、請求の範囲１０記載の増幅産物の製造方法。
（II）前記反応液について、前記蛍光標識化プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定する工程
【請求項１２】
前記試料が、生体試料である、請求の範囲７記載の増幅産物の製造方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、全血である、請求の範囲１２記載の増幅産物の製造方法。
【請求項１４】
前記反応液における全血試料の添加割合が、０．１〜０．５体積％である、請求の範囲１３記載の増幅産物の製造方法。
【請求項１５】
遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、
前記遺伝子がＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、
下記（ｉ）〜（iv）工程を含むことを特徴とする多型解析方法。
（ｉ）請求の範囲７記載の増幅産物の製造方法により、同一反応液中で同時に、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位を含む領域およびＶＫＯＲＣ１遺伝子における検出対象部位を含む領域を増幅させる工程
（ii）前記（ｉ）工程におけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅産物と、前記各遺伝子の各検出対象部位にそれぞれハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
（iii）前記反応液の温度を変化させ、前記各増幅産物と前記各プローブとの各ハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記各検出対象部位の多型を決定する工程
【請求項１６】
前記（ｉ）工程において、増幅反応に先立って、前記反応液に、前記各検出対象部位にそれぞれハイブリダイズ可能なプローブを添加する、請求の範囲１５記載の多型解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子を同時に増幅するためのプライマーセット、それを含む遺伝子増幅用試薬およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞や脳梗塞の患者に対して、血液の凝固を防止する薬剤として、ワーファリンが広く使用されている。ワーファリンの適量は、人種によって大きく異なり、さらに、同じ人種であっても、個人間で差が見られる。ワーファリンを大量に投与すると、例えば、鼻血や皮膚の内出血が生じたり、時には、脳内出血等の副作用を生じたりするおそれがある。このため、治療においてワーファリンの適切な量を患者ごとに決定することは極めて重要となっている。【０００３】
このようなワーファリンの適量値を決定するにあたって、近年、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の多型がワーファリンの薬効に関係していることが報告されている（非特許文献１および非特許文献２）。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、ワーファリン代謝酵素を作るチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子である。ＶＫＯＲＣ１遺伝子は、血液の凝固に関与するビタミンＫに作用するタンパク質をコードする遺伝子である。したがって、これら二つの遺伝子の多型を検出することは、患者に応じてワーファリンの適量を決定し、副作用を低減させるためにも非常に重要である。【０００４】
他方、あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。点突然変異の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析するＤｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（２）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲにより増幅させ、その増幅産物を検出対象配列における目的の変異の有無により切断作用が異なる制限酵素により切断し、電気泳動を行うことによりタイピングを行うＲＦＬＰ解析、（３）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。【０００５】
しかしながら、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要があるため、前記増幅産物が次の反応系に混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析することができない。また、前記（３）のＡＳＰ−ＰＣＲ法については、特異性が低いという問題もある。【０００６】
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、Ｔｍ解析、または、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。これは、以下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することにより、点突然変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、測定値が評価基準値と同程度であれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれば、遺伝子解析の自動化も可能である。【０００７】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法によっても、前述の（１）〜（３）の解析方法と同様に、一つの反応液において、複数の配列を解析することはできないという問題がある。前述のように、ワーファリンの効果には、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型とＶＫＯＲＣ１遺伝子の多型とが関連しているため、両方の遺伝子について多型を解析し、それらの結果に基づいて、総合的にワーファリンの処方を判断することが望まれる。しかしながら、各遺伝子には、アイソザイムが存在するため、ＰＣＲにおいて、目的の遺伝子以外に、アイソザイムのコード遺伝子までもが増幅されるおそれがある。このため、従来の方法では、例えば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を調べるには、各遺伝子の目的領域を別個の反応系において各々増幅させ、得られた増幅産物を別個に解析する必要があった。このように、従来の方法では、これら２つの遺伝子のみを鋳型とし、且つ、各遺伝子の各目的領域のみを特異的に増幅させることは極めて困難である。そして、このように、一つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないという問題がある。【０００８】
【非特許文献１】Simone  Rost  et  al.,  Nature  Vol.427  2004  letters  to  nature
【非特許文献２】Mark  J.  Rieder  et  al.,  The  New  England  Journal  of  Medicine  352;  22,  2005
【発明の開示】
【０００９】
そこで、本発明は、遺伝子増幅法により、２種類の遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ９、ＶＫＯＲＣ１遺伝子）を増幅するためのプライマーセットであって、同一反応系において、同時に、前記２種類の遺伝子の各目的領域を特異的に効率良く増幅することができるプライマーセットの提供を目的とする。
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、遺伝子増幅法により２種類の遺伝子を同時に増幅するためのプライマーセットであって、前記２種類の遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、下記（１）および（２）の２種類のプライマーセットを含むことを特徴とする。
プライマーセット（１）
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記６３１番目のチミン塩基（Ｔ）に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
プライマーセット（２）
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ２）配列番号２の塩基配列における４４０番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって２１〜２７塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）配列番号２の塩基配列における５４１番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって１８〜２５塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記５４１番目のアデニン塩基（Ａ）に相補的なチミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
【００１１】
また、本発明の遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅法により２種類の遺伝子を増幅するための試薬であって、前記２種類の遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、前記本発明の遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の増幅産物の製造方法は、遺伝子増幅法により２種類の遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、前記２種類の遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、本発明の遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、同一反応液中で同時に、前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅を行う工程
【００１３】
本発明の多型解析方法は、遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、
前記遺伝子がＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、下記（ｉ）〜（iv）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）本発明の増幅産物の製造方法により、同一反応液中で同時に、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位を含む領域およびＶＫＯＲＣ１遺伝子における検出対象部位を含む領域を増幅させる工程
（ii）前記（ｉ）工程におけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅産物と、前記各遺伝子の各検出対象部位にそれぞれハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
（iii）前記反応液の温度を変化させ、前記各増幅産物と前記各プローブとの各ハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記各検出対象部位の多型を決定する工程
【００１４】
本発明のプライマーセットによれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子のそれぞれの目的領域（検出目的の多型が存在する部位を含む領域）を、同一反応液において、同時且つ特異的に増幅することができる。このため、前述のような従来法とは異なり、目的領域の増幅にかかる手間やコストを低減することが可能となる。また、このように同一反応液において２種類の遺伝子の各目的領域が、それぞれ特異的に増幅されることから、例えば、各目的領域における検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、各遺伝子の多型をタイピングすることが可能となる。また、一つの反応液で増幅やタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料（例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法によれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子のそれぞれの多型を迅速かつ簡便に解析できることから、本発明は、医療分野において極めて有効といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
＜遺伝子増幅用プライマーセット＞
本発明の遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように２種類のプライマーセット（１）および（２）を含むことを特徴とする。本発明のプライマーセットにより増幅される領域は、後述するが、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、多型の検出目的部位（配列番号１における５２１番目）を含む領域であり、ＶＫＯＲＣ１遺伝子は、多型の検出目的部位（配列番号２における４８４番目）を含む領域である。このため、本発明のプライマーセットを用いて各遺伝子の目的領域を増幅すれば、従来よりも効率良く、この２種類の遺伝子の多型を解析することができる。なお、以下、フォワードプライマーをＦプライマー、リバースプライマーをＲプライマーともいう。【００１７】
まず、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するためのプライマーセット（１）について説明する。プライマーセット（１）は、前述のように、下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセットである（以下、「ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プライマーセット」ともいう）。
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記６３１番目のチミン塩基（Ｔ）に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド【００１８】
配列番号１に示す塩基配列は、ヒトチトクロームＰ４５０ファミリー２サブファミリーＣポリペプチド９（ＣＹＰ２Ｃ９）の完全長配列における部分配列である。前記塩基配列は、具体的には、例えば、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．ＡＹ７０２７０６に登録されているＣＹＰ２Ｃ９の完全長配列における５２，００１−５３，０００の領域にあたる。【００１９】
前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プライマーセットは、配列番号１における４６７番目〜６３０番目の領域を含むＤＮＡ鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の５２１番目の塩基（配列番号１における５２１番目の塩基）および５２２番目の塩基（配列番号１における５２２番目の塩基）は、ＣＹＰ２Ｃ９の機能に影響を与える点突然変異（Ａ５２１Ｃ、Ｔ５２２Ｃ）の存在が知られている。【００２０】
５２１Ｃの多型は、ＣＹＰ２Ｃ９＊３と呼ばれているのに対して、野生型の配列は、一般的にＣＹＰ２Ｃ９＊１と呼ばれている。５２１番目の塩基がＡであれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子がタンパク質に翻訳された際、アミノ酸３５９位はイソロイシン（Ｉｌｅ）となり、５２１番目の塩基がＣであれば、アミノ酸３５９位はロイシン（Ｌｅｕ）となる多型を示す。本発明において、この部位の多型は、ホモ接合体の場合、ＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊１（５２１Ａ／Ａ）、ＣＹＰ２Ｃ９＊３／＊３（５２１Ｃ／Ｃ）、ヘテロ接合体の場合、ＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊３（５２１Ａ／Ｃ）で表すことができる。また、５２２Ｃの多型は、ＣＹＰ２Ｃ９＊４と呼ばれているのに対して、野生型の配列は、一般的にＣＹＰ２Ｃ９＊１と呼ばれている。５２２番目の塩基がＴであれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子がタンパク質に翻訳された際、アミノ酸３５９位はイソロイシン（Ｉｌｅ）となり、５２２番目の塩基がＣであれば、アミノ酸３５９位はスレオニン（Ｔｈｒ）となる多型を示す。本発明において、この部位の多型は、ホモ接合体の場合、ＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊１（５２２Ｔ／Ｔ）、ＣＹＰ２Ｃ９＊４／＊４（５２２Ｃ／Ｃ）、ヘテロ接合体の場合、ＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊４（５２２Ｔ／Ｃ）で表すことができる。以下、このプライマーセット（１）を、「ＣＹＰ２Ｃ９用プライマーセット」ともいう。【００２１】
本発明において、プライマーセット（１）のＦ１プライマーおよびＲ１プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このように各プライマーの３’末端の塩基を固定することによって、プライマーセット（１）が、例えば、類似する他のアイソザイムの遺伝子（例えば、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ１７、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子等）に結合することを十分に防止することができる。【００２２】
このように、Ｆ１プライマーおよびＲ１プライマーは、その３’末端の塩基が固定されていればよいことから、各プライマーの長さ自体は特に制限されず、一般的な長さに適宜調整することができる。プライマーの長さの一例としては、例えば、１３〜５０ｍｅｒの範囲であり、好ましくは１４〜４５ｍｅｒであり、より好ましくは１５〜４０ｍｅｒである。具体例として、前記Ｆ１プライマーは、配列番号１の塩基配列における４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目（好ましくは、１４〜１７塩基目、より好ましくは１５〜１７塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記Ｒ１プライマーは、配列番号１の塩基配列における６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目（好ましくは、２２〜３０塩基目、より好ましくは２３〜２９塩基目）までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、Ｆ１プライマーとＲ１プライマーの３’末端が固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号１における４６７番目〜６３０番目の領域であるが、得られる増幅産物の全体の長さは使用するプライマーの長さに応じて変化する。【００２３】
また、Ｒ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列に対して、Ｆ１プライマーは、前記塩基配列の相補鎖の塩基配列に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくともよい。すなわち、各プライマーにおける３’末端の塩基を除く部分において、例えば、完全に相補なオリゴヌクレオチドと１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。【００２４】
以下に、Ｆ１プライマーとＲ１プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。また、これらのＦ１プライマーとＲ１プライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号５のオリゴヌクレオチドからなるＦ１’プライマーと配列番号１８のオリゴヌクレオチドからなるＲ１’プライマーとを含むプライマーセット（１’）が特に好ましい。なお、下記表における「Ｔｍ（℃）」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μＭ、ナトリウム当量（Ｎａ  ｅｑ．）５０ｍＭとして算出した値である（以下、同様）。前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる（以下、同様）。【００２５】
【表１】
2008117782.tif 000003
【００２６】
つぎに、ＶＫＯＲＣ１遺伝子を増幅するためのプライマーセット（２）について説明する。前記プライマーセット（２）は、前述のように、下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセットである。以下、このプライマーセット（２）を、「ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プライマーセット」ともいう。
（Ｆ２）配列番号２の塩基配列における４４０番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって２１〜２７塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）配列番号２の塩基配列における５４１番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって１８〜２５塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記５４１番目のアデニン塩基（Ａ）に相補的なチミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド【００２７】
配列番号２に示す塩基配列は、ヒトビタミンＫエポキシドリダクターゼ複合体のサブユニット１（Homo sapiens  vitamin  K  epoxide  reductase  complex,  subunit  1：ＶＫＯＲＣ１）をコードするＶＫＯＲＣ１遺伝子の完全長配列の部分配列である。前記塩基配列は、具体的には、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．ＡＹ５８７０２０に登録されているＶＫＯＲＣ１遺伝子の完全長配列における６００１番目〜７０００番目の領域にあたる。【００２８】
前記ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プライマーセットは、配列番号２における４４１〜５４０番目の領域を含むＤＮＡ鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の４８４番目の塩基（配列番号２における４８４番目の塩基）は、点突然変異の存在が知られている（４８４Ｃ、４８４Ｔ）。これらの多型は、ホモ接合体の場合、例えば、４８４Ｃ／Ｃまたは４８４Ｔ／Ｔ、ヘテロ接合体の場合、４８４Ｃ／Ｔで表すことができる。また、これらの多型は、ホモ接合体の場合、例えば、完全長における塩基の番号に基づいて６４８４Ｃ／Ｃ、６４８４Ｔ／Ｔ、６４８４Ｃ／Ｔで表すことができる（以下、このように表記する）。なお、一般的に、６４８４塩基の多型に関して、欧米人はＣが多く、日本人はＴが多いと報告されている。【００２９】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プライマーセットのＦ２プライマーおよびＲ２プライマーは、前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プライマーセットと同様の理由から、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このため、Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーの長さ自体は特に制限されず、前述と同様の長さが例示できる。具体例として、前記Ｆ２プライマーは、配列番号２の塩基配列における４４０番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって２１〜２７塩基目（好ましくは、２２〜２６塩基目、より好ましくは２３〜２５塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記Ｒ２プライマーは、配列番号２の塩基配列における５４１番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって１８〜２５塩基目（好ましくは、１８〜２３塩基目、より好ましくは１９〜２２塩基目）までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、Ｆ２プライマーとＲ２プライマーの３’末端が固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号２における４４１〜５４０番目の領域であるが、得られる増幅産物の全体の長さは、使用するプライマーの長さに応じて変化する。【００３０】
また、Ｒ２プライマーは、配列番号２に示す塩基配列に対して、Ｆ２プライマーは、前記塩基配列の相補鎖の塩基配列に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくともよい。すなわち、各プライマーにおける３’末端の塩基を除く部分において、例えば、完全に相補なオリゴヌクレオチドと１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。【００３１】
以下に、Ｆ２プライマーとＲ２プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。また、これらのＦ２プライマーとＲ２プライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号２９のオリゴヌクレオチドからなるＦ２’プライマーと配列番号３８のオリゴヌクレオチドからなるＲ２’プライマーとを含むプライマーセット（２’）が特に好ましい。【００３２】
【表２】
2008117782.tif 000004
【００３３】
また、前述したプライマーセット（１）および（２）の各プライマーは、例えば、反応時間を短縮するために、従来公知の任意の配列を５’末端に付加したものでもよい。【００３４】
このようなプライマーセット（１）および（２）を含む本発明の遺伝子増幅用プライマーセットは、全血試料等の生体試料におけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子を同時に増幅させる際に使用することが好ましい。特に、後述するような多型の検出用プローブとともに使用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合が０．１〜０．５体積％である遺伝子増幅法に使用することが好ましい。この点については、後述する。【００３５】
＜遺伝子増幅用試薬＞
本発明の遺伝子増幅用試薬は、前述のように、遺伝子増幅法により２種類の遺伝子を増幅するための試薬であって、前記２種類の遺伝子がＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、本発明の遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする。本発明の遺伝子増幅用試薬は、本発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何ら制限されない。【００３６】
本発明の遺伝子増幅用試薬は、例えば、本発明のプライマーセットを用いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、さらに、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズするプローブおよびＶＫＯＲＣ１遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズするプライマーの少なくとも一方を含んでもよい。特に、両方のプローブを含むことが好ましい。前述のように本発明のプライマーセットによれば、遺伝子増幅法によって２種類の遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子）のそれぞれの目的領域を、特異的に増幅することができる。このため、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の目的領域における検出対象配列に相補的な２種類のプローブを共存させることによって、例えば、各目的領域の増幅の有無や、検出目的の多型等を、後述する方法によって検出することが可能である。このようなプローブやその利用方法に関しては、後の多型の解析方法において説明する。また、本発明の遺伝子増幅用試薬は、全血等の生体試料における前記２種類の遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましく、特に、前述のようなプローブとともに使用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合が０．１〜０．５体積％である遺伝子増幅法に使用することが好ましい。なお、本発明において、「検出対象配列」とは、多型が存在する部位（検出対象部位）を含む配列を意味する。【００３７】
本発明の遺伝子増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発明の遺伝子増幅用プライマーセットを含有する液体試薬でもよいし、使用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、本発明の遺伝子増幅用プライマーセットの含有量も、特に制限されない。【００３８】
＜増幅産物の製造方法＞
本発明の増幅産物の製造方法は、前述のように、遺伝子増幅法により２種類の遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、前記２種類の遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、本発明の遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、同一反応液中で同時に、前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅を行う工程【００３９】
このように本発明のプライマーセットを用いて増幅反応を行うことによって、前述のように、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子のそれぞれの目的領域を、同一反応液において、同時且つ特異的に増幅させることができる。本発明により増幅させる２つの目的領域は、前述のように、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子における目的の多型が存在する検出対象部位をそれぞれ含む領域である。なお、本発明の増幅産物の製造方法においては、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であって、遺伝子増幅法の種類や条件等は何ら制限されない。【００４０】
前記遺伝子増幅法としては、前述のように特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  acid  sequence  based  amplification）法、ＴＭＡ（Transcription−mediated  amplification）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。【００４１】
本発明を適用する試料としては、例えば、鋳型となる核酸を含んでいればよく、特に制限されないが、例えば、夾雑物が含まれる試料に適用することが好ましい。前記夾雑物が含まれる試料としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液（例えば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。本発明のプライマーセットを用いた増幅産物の製造方法によれば、例えば、様々な夾雑物が含まれる試料（特に、全血や口腔内細胞等の生体試料）であっても、その影響を受け難く、２種類の遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子）のそれぞれの目的領域を特異的に増幅することができる。このため、本発明によれば、従来法では困難であった夾雑物の多い試料であっても、例えば、精製等の前処理を行うことなく、そのまま使用することが可能である。したがって、試料の前処理の観点からも、従来法よりさらに迅速に増幅産物を調製することが可能といえる。【００４２】
前記反応液における試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限されないが、例えば、２体積％以下が好ましく、より好ましくは１体積％以下、さらに好ましくは０．５体積％以下である。【００４３】
また、後述するような光学的検出を目的とする場合、特に、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、全血試料のような生体試料の添加割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。ＰＣＲ反応においては、通常、ＤＮＡ変性（一本鎖ＤＮＡへの解離）のために熱処理が施されるが、この熱処理によって試料に含まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物や濁り等が発生するおそれがある。このため、増幅産物の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生を十分に防止することができるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上することができる。したがって、本発明のプライマーセットの使用に加えて、さらに、全血試料等の試料の添加割合を前述の範囲に設定することによって、より一層、試料の前処理の必要性を排除できる。【００４４】
また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合（例えば、０．１〜０．５体積％）ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５〜１１３ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２．８２５〜５６．５ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは５．６５〜２８．２５ｇ／Ｌの範囲である。なお、前記反応中における全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合とＨｂ重量割合の両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。【００４５】
全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれであってもよい。【００４６】
本発明において、試料に含まれる標的核酸は、例えば、ＤＮＡである。前記ＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいし、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物ＤＮＡであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれているＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）から逆転写反応（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse  Transcription  PCR））により生成させたｃＤＮＡがあげられる。【００４７】
本発明の増幅産物の製造方法において、遺伝子増幅反応の開始に先立ち、前記反応液にアルブミンを添加することが好ましい。このように、アルブミンを添加すれば、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生をより一層低減することができ、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長鎖の合成工程（増幅工程）や、一本鎖ＤＮＡへの解離工程前に、アルブミンを添加することが好ましい。【００４８】
前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲であり、好ましくは０．１〜１重量％であり、より好ましくは０．２〜０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。【００４９】
つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、ＤＮＡを標的核酸とし、ＰＣＲにより、２種類の遺伝子、すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各増幅産物を、同一反応液において同時に製造する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。【００５０】
まず、ＰＣＲ反応液を調製する。本発明のプライマーセットの添加割合は、特に制限されないが、プライマーセット（１）および（２）のＦプライマーを、それぞれ０．１〜２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、プライマーセット（１）および（２）のＲプライマーを、それぞれ０．１〜２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。各プライマーセットにおけるＦプライマーとＲプライマーとの添加割合（Ｆ：Ｒ、モル比）は、特に制限されないが、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは１：０．５〜１：２である。【００５１】
反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるように設定できるが、例えば、１００〜２０００倍であり、好ましくは２００〜１０００倍である。【００５２】
前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸および溶媒があげられる。また、前述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。【００５３】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（rTth  DNA  polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８８）（Pfu  DNA  polymerase：Stratagenes社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０）（商標Vent：Biolab  New  England社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。【００５４】
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液（２５ｍＭ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノール、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、１００μＭ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡ）中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。【００５５】
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。【００５６】
前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。【００５７】
また、前記ＰＣＲ反応液は、さらに、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。【００５８】
反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器（サーマルサイクラー）等に応じて適宜決定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。【００５９】
つぎに、ＰＣＲを行う。ＰＣＲのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（１）全血由来二本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの解離、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）は、それぞれ以下の通りである。また、サイクル数も特に制限されないが、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。本発明のプライマーセットを使用した場合、前述のように増幅効率に優れるため、従来の方法によれば５０サイクルに３時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、約１時間程度（好ましくは１時間以内）で５０サイクルを完了することも可能である。【００６０】
【表３】
2008117782.tif 000005
【００６１】
以上のようにして、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各目的領域の増幅産物を、同一反応液において同時に製造することができる。【００６２】
本発明の増幅産物の製造方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによって、増幅産物の有無や、各遺伝子の各目的領域における遺伝子型を検出することもできる。増幅産物の有無は、従来公知の方法により確認できる。具体的には、例えば、前記（Ｉ）工程において、前記反応液に、さらに、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子またはＶＫＯＲＣ１遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブ（例えば、蛍光標識化プローブ）を添加しておき、さらに、（II）工程として、前記反応液について、前記プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定することによって確認できる。また、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の両方について増幅産物の有無を確認する場合は、各遺伝子に対するプローブをそれぞれ添加しておき、前記（II）工程において、前記反応液について、各プローブにおける各蛍光標識の蛍光強度を測定することによって確認できる。他方、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子における多型の検出については、本発明の一形態として、以下に説明する。【００６３】
＜ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子多型およびＶＫＯＲＣ１遺伝子多型の解析方法＞
本発明の遺伝子多型の検出方法は、遺伝子が、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子であり、各遺伝子における検出対象部位の多型を、同一反応液を用いて解析する方法であって、下記（ｉ）〜（vi）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）  本発明の増幅産物の製造方法により、同一反応液中で同時に、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位を含む領域およびＶＫＯＲＣ１遺伝子における検出対象部位を含む領域を増幅させる工程
（ii）前記（ｉ）工程におけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅産物と、前記各遺伝子の各検出対象部位にそれぞれハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
（iii）前記反応液の温度を変化させ、前記各増幅産物と前記各プローブとの各ハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記各検出対象部位の多型を決定する工程【００６４】
このように本発明のプライマーセットを用いて増幅産物の製造することによって、前述のように、２種類の遺伝子、すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子における多型の目的部位を含む領域を増幅することができる。【００６５】
前記（ii）工程におけるプローブは、特に制限されないが、例えば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の検出対象配列に相補的なプローブ（以下、「ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブ」ともいう）およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の検出対象配列に相補的なプローブ（以下、「ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブ」ともいう）があげられる。プローブは、いずれか１種類でもよいが、各遺伝子の多型を同一反応液を用いて決定できることから、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブとＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブの両方を併用することが好ましい。【００６６】
前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子のそれぞれに対するプローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定でき、例えば、多型の検出目的部位を含む検出対象配列として、各遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基づいて設計してもよい。また、多型の検出目的部位の塩基は、各多型の種類に応じて適宜決定できる。【００６７】
すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の場合、配列番号１の５２１番目の塩基において、Ａ（ＣＹＰ２Ｃ９＊１）およびＣ（ＣＹＰ２Ｃ９＊３）の多型が知られていることから、例えば、５２１番目がＡである検出対象配列、および、５２１番目がＣである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。また、配列番号１の５２２番目の塩基において、Ｔ（ＣＹＰ２Ｃ９＊１）およびＣ（ＣＹＰ２Ｃ９＊４）の多型が知られていることから、例えば、５２２番目がＴである検出対象配列、および、５２２番目がＣである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。【００６８】
また、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の場合、配列番号２における４８４番目の塩基に「Ｃ」および「Ｔ」の多型が知られていることから、例えば、４８４番目がＣである検出対象配列、および、４８４番目がＴである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。このように、多型が生じる検出目的部位の塩基を前述のようないずれの塩基に設定してプローブを設計しても、後述するような方法により、各遺伝子の検出目的部位においてどのような多型を示すかを判断することが可能である。なお、プローブは、例えば、人種間における多型の傾向を考慮して設計することが好ましい。例えば、日本人の場合、配列番号２における４８４番目の塩基にＣの多型が少ないことから、例えば、４８４番目のＣとパーフェクトマッチになるプローブとし、他方、欧米人の場合、４８４番目の塩基にＣの多型が多いことから、例えば、４８４番目のＴとパーフェクトマッチになるプローブとするという手法をとることも可能である。【００６９】
なお、各プローブは、各遺伝子の目的領域について増幅反応を行った後に反応液に添加することもできるが、容易且つ迅速に解析を行えることから、例えば前記（ｉ）工程の増幅反応に先立って、予め反応液に添加しておくことが好ましい。【００７０】
前記（ｉ）工程において、前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、各プローブを１０〜４００ｎｍｏｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜２００ｎｍｏｌである。また、プローブの標識として蛍光色素を用いている場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよく、この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。この場合、標識化プローブと非標識プローブのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒである。【００７１】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。【００７２】
前記（iii）工程において、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナルの測定は、前述した、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で標識化された標識化プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、ハイブリッド形成体の融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。【００７３】
本発明においては、２つの遺伝子についてそれぞれの多型を確認するため、２種類のプローブは、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識（例えば、蛍光標識）によって標識化されていることが好ましい。このように異なる標識を使用することによって、同一反応液であっても、検出条件を変えることによって、各増幅産物を別個に解析することが可能となる。【００７４】
前記標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、Ｃであることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする検出対象配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がＧとなるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが検出対象配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出対象ＤＮＡにおけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。【００７５】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商品名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（商品名、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(商品名、モレキュラープローブ社製)等があげられる。２種類のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（検出波長４５０〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５〜７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（検出波長５１５〜５５５ｎｍ）のいずれか２種類の組み合わせ等があげられる。【００７６】
以下に、前述したＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を解析（検出）するためのプローブの配列の具体例を示す。なお、本発明は、これには制限されない。【００７７】
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブとしては、例えば、下記プローブ（１）があげられる。下記プローブ（１）は、センス鎖を検出するためのプローブであり、配列番号１において５２１番目がＣである領域に相補的な配列からなる。また、本発明におけるプローブの具体例としては、例えば、前述のように、以下に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
プローブ（１）
配列番号１における５１６番目のグアニン塩基（Ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１７〜２２塩基目までの領域に相補的な配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基に相補的なシトシン塩基を３’末端とするオリゴヌクレオチド【００７８】
プローブ（１）の具体例を、下記表に示す。
【表４】
2008117782.tif 000006
【００７９】
また、前述のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブを用いて、配列番号１における５２２番目の多型（ＣＹＰ２Ｃ９＊４）を検出することも可能である。例えば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブは、配列番号１において、５２１番目がＣであり５２２番目がＴである領域に相補的な配列である。つまり、このプローブに完全にマッチすれば、ＣＹＰ２Ｃ９＊３（Ａ５２１Ｃ）であり、一塩基異なるミスマッチの場合は、ＣＹＰ２Ｃ９＊１（野生型）、二塩基異なるミスマッチの場合は、ＣＹＰ２Ｃ９＊４（Ｔ５２２Ｃ）であると判断できる。【００８０】
前記表の各プローブにおける大文字の塩基Ｇは、ｋに置き換えることができ、前記ｋは、ＧおよびＴのいずれでもよい。また、大文字のＡは、ｒに置き換えることができ、前記ｒは、ＡおよびＧのいずれでもよい。【００８１】
ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブとしては、例えば、下記プローブ（２−１）および（２−２）があげられる。下記プローブ（２−１）は、アンチセンス鎖を検出するためのプローブであり、配列番号２において４８４番目がＣである領域と同じ配列からなる。他方、下記プローブ（２−２）は、センス鎖を検出するためのプローブであり、配列番号２において４８４番目がＣである領域に相補的な配列からなる。また、本発明におけるプローブの具体例としては、例えば、前述のように、以下に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
プローブ（２-１）
配列番号２における４７７番目のシトシン塩基（Ｃ）を一塩基目として３’方向に向かって１８〜２４塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を５’末端とするオリゴヌクレオチド
プローブ（２-１）
配列番号２における４７２番目のグアニン塩基（Ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１５〜２４塩基目までの領域に相補的な配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基に相補的なシトシン塩基を３’末端とするオリゴヌクレオチド【００８２】
プローブ（２−１）の具体例を、下記表の配列番号４７〜５３に、プローブ（２−２）の具体例を、下記表の配列番号５４〜６３に、それぞれ示す。
【表５】
2008117782.tif 000007
【００８３】
前記表の配列番号４７〜５３の各プローブにおいて、大文字の塩基Ｃは、ｙに置き換えることができ、前記ｙは、ＣおよびＴのいずれでもよい。他方、前記表の配列番号５４〜６３の各プローブにおいて、大文字の塩基Ｇは、ｒに置き換えることができ、前記ｒは、ＧおよびＡのいずれでもよい。【００８４】
そして、これらのプローブは、前述のように、それぞれ異なる蛍光色素（異なる波長で検出される蛍光色素）で標識化することが好ましい。例えば、前記表に示すプローブを消光プローブとする場合、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブ（１）は、３’末端のシトシンを前述のような蛍光色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ等）で標識化し、ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブは、（２−１）の場合、５’末端のシトシンを、（２−２）の場合、３’末端のシトシンを、前述のような蛍光色素（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ等）で標識化することが好ましい。また、５’末端に蛍光色素を標識化したプローブは、例えば、プローブ自体が伸長することを予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。【００８５】
前記プローブは、一例であって、本発明は、これには何ら限定されないが、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブとしては、前記配列番号４４の塩基配列からなるプローブ、配列番号４５の塩基配列からなるプローブが好ましく、ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブとしては、前記配列番号５１の塩基配列からなるプローブ、前記配列番号６２の塩基配列からなるプローブが好ましい。【００８６】
次に、本発明の解析方法について、一例として、下記プローブを用いて、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型（ＣＹＰ２Ｃ９＊３、配列番号１における５２１番目の塩基の多型）およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の多型（Ｃ６４８４Ｔ、配列番号２における４８４番目の塩基の多型）を検出する方法を説明する。なお、本発明はこれには制限されない。【００８７】
（Ｐ１）配列番号４４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号４５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
５’−gggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY  FL)−３’
５’−ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY  FL)−３’
（Ｐ２）配列番号５１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号６２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
５’−(Pacific  Blue)‐catcgacCcttggactagga-P−３’
５’−aagGgtcgatgatctc‐(Pacific  Blue)−３’【００８８】
まず、前記２種類の標識化プローブを添加した反応液を用いて、前述のようにＰＣＲを行い、同一反応液中で、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各目的領域を同時に増幅させる。前記反応液は、例えば、本発明のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、鋳型となる核酸を含む試料、および、前記プローブを含む。この他に、核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。【００８９】
次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。【００９０】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。【００９１】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。【００９２】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。【００９３】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。【００９４】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。【００９５】
本発明においては、２つの遺伝子の各多型を検出するため、２種類のプローブの各標識に応じた条件で、それぞれのＴｍ値を決定する。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、例えば、検出波長５１５〜５５５ｎｍ、ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブのＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、例えば、検出波長４５０〜４８０ｎｍで検出することができる。【００９６】
そして、これらのＴｍ値から、各遺伝子の検出対象部位における遺伝子型を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、前記検出対象部位における遺伝子型を決定することができる。例えば、検出対象配列における目的部位の塩基を変異型（例えば、配列番号１における５２１番目の塩基がＣ）と仮定し、それを含む検出対象配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、前記増幅産物の多型は、野生型（例えば、配列番号１における５２１番目の塩基がＡ）と判断できる。さらに、両方のＴｍ値が検出された場合には、ヘテロ接合体と決定できる。このようにして、各標識化プローブに対する２つのＴｍ値から、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を判断することができる。【００９７】
具体例として、前述のようなプローブ（Ｐ１、Ｐ２）を使用した場合、以下のように判断できる。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子検出用プローブとして例示した前記Ｐ１は、配列番号１における５２１番目の塩基と対応する塩基をＧに設定している。したがって、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、変異型（ＣＹＰ２Ｃ９＊３）と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、前記増幅物の多型は、野生型（ＣＹＰ２Ｃ９＊１）と判断できる。さらに、両方のＴｍ値が検出された場合には、ヘテロ接合体を決定できる。他方、ＶＫＯＲＣ１遺伝子検出用プローブとして例示した前記Ｐ２は、ＶＫＯＲＣ１の完全長配列の６４８４番目の塩基（配列番号２における４８４番目の塩基）をＣに設定している。したがって、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、野生型（Ｃ６４８４Ｃ）と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、前記増幅物の多型は、変異型（Ｃ６４８４Ｔ）と判断できる。さらに、両方のＴｍ値が検出された場合には、ヘテロ接合体を決定できる。【００９８】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。【００９９】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。【０１００】
つぎに、本発明の実施例について、説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【０１０１】
被検者２名からヘパリンリチウム採血管を用いて採血を行った（サンプル１、２）。得られた血液０．１μＬを下記組成のＰＣＲ反応液５０μＬに添加し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、４５０〜４８０ｎｍ（蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅの検出）および５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの検出）とした。なお、５０サイクルのＰＣＲに要した時間は、約１時間であった。【０１０２】
【表６】
2008117782.tif 000008
【０１０３】
（プローブ）
ＣＹＰ２Ｃ９用プローブ  （配列番号４４）
5’−gggagaaggtcaaGgtatc−(BODIPY  FL)−3'
ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブ  （配列番号５１）
5’−(Pacific  Blue)−catcgacCcttggactagga−P−3’【０１０４】
（プライマーセット）
ＣＹＰ２Ｃ９  Ｆ１プライマー  （配列番号５）
5'−gagcccctgcatgcaa−3'
ＣＹＰ２Ｃ９  Ｒ１プライマー  （配列番号１８）
5'−gatactatgaatttggggacttcgaa−3'
ＶＫＯＲＣ１遺伝子  Ｆ２プライマー  （配列番号２９）
5'−gaggatagggtcagtgacatggaa−3'
ＶＫＯＲＣ１遺伝子  Ｒ２プライマー  （配列番号３８）
5'−ccctgcccgagaaaggtgat−3'【０１０５】
ＣＹＰ２Ｃ９用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は５９℃（以下の各図において＊３）、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は５４℃（以下の各図において＊１）である。ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は６１．０℃（以下の各図においてＣ）、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は５３．０℃（以下の各図においてＴ）である。【０１０６】
サンプル１およびサンプル２の結果をそれぞれ図１に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示し、横軸は温度を示す（以下、同様）。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を決定した。これらの実施例の結果を裏付けるために、前記被検者２人について、ＲＦＬＰ法によって、ＣＹＰ２Ｃ９およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施していない全血試料を使用して、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて前記遺伝子のそれぞれの多型を解析することができた。
【実施例２】
【０１０７】
被検者２名から綿棒により口腔細胞を採取し、滅菌蒸留水５００μＬに懸濁した（サンプル３および４）。この懸濁液２．５μＬを下記組成のＰＣＲ反応液４７．５μＬに添加し、前記実施例１と同様にしてＰＣＲならびに経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、４５０〜４８０ｎｍ（蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅの検出）および５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの検出）とした。なお、５０サイクルのＰＣＲに要した時間は、約１時間であった。【０１０８】
【表７】
2008117782.tif 000009
【０１０９】
サンプル３およびサンプル４の結果を図２にそれぞれ示す。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を決定した。これらの実施例の結果を裏付けるために、前記被検者２人について、ＲＦＬＰ法によって、ＣＹＰ２Ｃ９およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施していない口腔細胞試料を使用して、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて前記遺伝子のそれぞれの多型を解析することができた。
【実施例３】
【０１１０】
配列番号１における５２１番目の塩基がＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊３（５２１Ａ／５２１Ｃ）のヘテロ接合体を示し、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の６４８４番目（配列番号２における４８４番目）の塩基が６４８４Ｔ／Ｔのホモ接合体を示すヒトの精製ゲノムを準備した。この精製ゲノム１μＬを下記組成のＰＣＲ反応液４９μＬと混合し、前記実施例１と同様にして、同様にしてＰＣＲならびに経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、４５０〜４８０ｎｍ（蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅの検出）および５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの検出）とした。なお、５０サイクルのＰＣＲに要した時間は、約１時間であった。【０１１１】
【表８】
2008117782.tif 000010
【０１１２】
この結果を、図３に示す。同図に示すように、ＣＹＰ２Ｃ９について、２つのピークが得られたことから、配列番号１の５２１番目の塩基を区別して検出することが可能であることがわかった。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を決定した。これらの実施例の結果は、ゲノムの情報と一致した。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて前記遺伝子のそれぞれの多型を解析することができた。
【実施例４】
【０１１３】
配列番号１に示す５２２番目のＴがＣに変異したＶＫＯＲＣ遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ９＊４）を挿入したプラスミドを調製した。このプラスミド１μＬを実施例３と同じＰＣＲ反応液４９μＬと混合し、前記実施例１と同様にして、同様にしてＰＣＲならびに経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、４５０〜４８０ｎｍ（蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅの検出）および５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの検出）とした。なお、５０サイクルのＰＣＲに要した時間は、約１時間であった。【０１１４】
ＣＹＰ２Ｃ９用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は６０．０℃（以下の各図において＊３）、１個の塩基がミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は５４．０℃（以下の各図において＊１）、２個の塩基がミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は４９．０℃（以下の各図において＊４）である。【０１１５】
この結果を、図４に示す。同図に示すように、４９．０℃にピークが得られたことから、ＰＣＲ増幅物は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子用プローブに対して、配列番号１における５２１番目の塩基がミスマッチ（すなわち５２１番目がＡ）であり、５２２番目の塩基がミスマッチ（すなわち５２２番目がＣ）であることがわかる。したがって、ＰＣＲに供したサンプルの多型は、ＣＹＰ２Ｃ９＊４であり、プラスミドの情報と合致していた。
【実施例５】
【０１１６】
配列番号１における５２１番目の塩基がＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊１（５２１Ａ／５２１Ａ）のホモ接合体を示し、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の６４８４番目（配列番号２における４８４番目）の塩基が６４８４Ｔ／Ｔもしくは６４８４Ｃ／Ｃのホモ接合体、６４８４Ｔ／Ｃのヘテロ接合体を示すヒトの精製ゲノムを準備した。これらの精製ゲノム１μＬを下記組成のＰＣＲ反応液４６μＬと混合し、前記実施例１と同様にして、同様にしてＰＣＲならびに経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、４５０〜４８０ｎｍ（蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅの検出）および５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの検出）とした。なお、５０サイクルのＰＣＲに要した時間は、約１時間であった。【０１１７】
また、配列番号１における５２１番目の塩基がＣＹＰ２Ｃ９＊１／＊１（５２１Ａ／５２１Ａ）のホモ接合体を示し、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の６４８４番目（配列番号２における４８４番目）の塩基が６４８４Ｔ／Ｃのヘテロ接合体を示す患者からＥＤＴＡ採血管により血液を採取した。血液１０μＬと下記検体希釈液１  ７０μＬとを混合し、さらに、前記混合液１０μＬと下記検体希釈液２  ７０μＬとを混合した。この混合液１７μＬを９５℃で１０分間加熱処理してから、下記ＰＣＲ反応液４６μＬと混合し、前記実施例１と同様にして、ＰＣＲ反応ならびに経時的な蛍光強度の変化の測定を行った。
（検体希釈液１）
10mM  Tris-HCl（pH8）、0.1mM  EDTA、0.3%  SDS、0.5%アジ化ナトリウム
（検体希釈液２）
10mM  Tris-HCl（pH8）、0.1mM  EDTA、0.5%アジ化ナトリウム【０１１８】
【表９】
2008117782.tif 000011
【０１１９】
（プローブ）
ＣＹＰ２Ｃ９用プローブ  （配列番号４５）
5’−ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY  FL)−3'
ＶＫＯＲＣ１遺伝子用プローブ  （配列番号６２）
5’−aagGgtcgatgatctc‐(Pacific  Blue)−3’【０１２０】
（プライマーセット）
ＣＹＰ２Ｃ９  Ｆ１プライマー  （配列番号５）
5'−gagcccctgcatgcaa−3'
ＣＹＰ２Ｃ９  Ｒ１プライマー  （配列番号１８）
5'−gatactatgaatttggggacttcgaa−3'
ＶＫＯＲＣ１遺伝子  Ｆ２プライマー  （配列番号２９）
5'−gaggatagggtcagtgacatggaa−3'
ＶＫＯＲＣ１遺伝子  Ｒ２プライマー  （配列番号３８）
5'−ccctgcccgagaaaggtgat−3'【０１２１】
これの結果を、図５および図６に示す。図５は、試料として精製ゲノムを使用した結果であり、図６は、試料として血液を使用した結果である。図５に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の各多型を決定した。これらの実施例の結果は、ゲノムの情報と一致した。また、図５に示すように、ホモ接合体のＶＫＯＲＣ１遺伝子に関して、６４８４Ｔ/Ｔと６４８４Ｃ／Ｃとで、異なる位置にピークが得られたことから、６４８４番目の塩基を区別して検出できることがわかった。ヘテロ接合体についても、前述の２種類のホモ接合体に対応する２つのピークが得られたことからも、両者を区別できることがわかった。さらに、図６に示すように、血液試料を使用した場合においても、精製ゲノムを使用した場合と同様に、各遺伝子を増幅し、且つ、各多型に応じたピークが得られることがわかった。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて前記遺伝子のそれぞれの多型を解析することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
以上のように、本発明のプライマーセットによれば、ワーファリンの効果に関与するＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子の検出目的の多型が生じる部位をそれぞれ含む領域を、同一反応液において、同時且つ特異的に増幅することができる。このため、前述のような従来法とは異なり手間やコストを低減することが可能となる。また、このように同一反応液において２つの遺伝子の目的領域を特異的に増幅できることから、例えば、それぞれの目的領域における検出対象配列に相補的な２種類のプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、前記２種類の多型をそれぞれタイピングすることが可能となる。また、一つの反応液で増幅やタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料（例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法によれば、各遺伝子の各多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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