(57)【要約】  TiC、又はTiC及びTiNを含有する粉末と、標準生成自由エネルギー（ΔGM-O）がΔGM-O＞ΔGTiO2の関係を満たす金属Mの酸化物粉末とを混合し、非酸化性雰囲気中で熱処理することにより、前記金属Mの酸化物をTiにより還元するとともに、得られた金属Mの粒子表面をTi酸化物で被覆することを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法、及び金属の核粒子にTi酸化物を被覆してなり、炭素含有量が0.2〜1.4質量％及び窒素含有量が0.01〜0.2質量％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
2008035681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TiC、又はTiC及びTiNを含有する粉末と、標準生成自由エネルギー（ΔGM-O）がΔGM-O＞ΔGTiO2の関係を満たす金属Mの酸化物粉末とを混合し、非酸化性雰囲気中で熱処理することにより、前記金属Mの酸化物をTiにより還元するとともに、得られた金属Mの粒子表面をTi酸化物で被覆することを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項２】
請求項1に記載の被覆金属微粒子の製造方法において、前記TiC及びTiNを含有する粉末中には10〜50質量％のTiNが含有することを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項３】
請求項1又は2に記載の被覆金属微粒子の製造方法において、前記Ti酸化物がTiO2を主体とすることを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれかに記載の被覆金属微粒子の製造方法において、前記熱処理を650〜900℃で行うことを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項５】
金属の核粒子にTi酸化物を被覆してなる被覆金属微粒子であって、炭素含有量が0.2〜1.4質量％及び窒素含有量が0.01〜0.2質量％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項６】
請求項5に記載の被覆金属微粒子において、炭素含有量が0.2〜1.1質量％及び窒素含有量が0.04〜0.12質量％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項７】
請求項5又は6に記載の被覆金属微粒子において、炭素と窒素の含有量の合計が0.24〜0.60質量％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項８】
請求項5〜7のいずれかに記載の被覆金属微粒子において、前記金属がFe、Co及びNiからなる群から選ばれた少なくとも1種の元素を含むことを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項９】
請求項5〜8のいずれかに記載の被覆金属微粒子において、前記金属がFe元素を含むことを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１０】
請求項9に記載の被覆金属微粒子において、X線光電子分光分析によってO、Ti及びFeの3元素について定量分析したときのFe含有量が14〜20原子％であり、金属Fe成分の比率がFe全体の7〜11％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１１】
請求項9又は10に記載の被覆金属微粒子において、濃度6 Mのグアニジン塩酸塩水溶液中に前記被覆金属微粒子を25℃で24時間浸漬(前記水溶液1 mLあたり前記被覆金属微粒子25 mgの割合)したときの、Feイオン溶出量が50 mg/L以下であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１２】
請求項5〜11のいずれかに記載の被覆金属微粒子において、アルカリ処理をしたことを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１３】
請求項5〜12のいずれかに記載の被覆金属微粒子の表面に、ケイ素酸化物を被覆してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１４】
請求項5〜13のいずれかに記載の被覆金属微粒子の表面に、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、チオール基、トシル基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれた少なくとも１種を固定化してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１５】
請求項5〜14のいずれかに記載の被覆金属微粒子の表面に、リガンドを固定化してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１６】
請求項5〜15のいずれかに記載の金属微粒子の表面に、ブロッキング剤を被覆してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気テープ又は磁気記録ディスク等の磁気記録媒体、電波吸収体、インダクタ又はプリント基板等の電子デバイス(ヨーク等の軟磁性体)、光触媒、核酸抽出用磁気ビーズ、医療用マイクロスフィア等に用いる被覆金属微粒子、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電子機器及び電子デバイスの高性能化及び小型軽量化とともに、それらを構成する材料の高性能化及び微粒子化が要求されている。例えば磁気テープに塗布する磁性粒子は、磁気記録密度の向上を目的として、微粒子化と磁化の向上が同時に要求されている。【０００３】
また、抗原等のタンパク質を分離・回収しアレルギー等の疾病を診断するために、磁気分離法が広く用いられるようになってきており、高磁化を有し耐食性に優れた微粒子の磁気ビーズの要求が高まってきている。【０００４】
磁性微粒子は主に共沈法や水熱合成法等の液相合成法により製造されている。液相合成法で得られる磁性微粒子はフェライトやマグネタイト等の酸化物粒子である。最近では有機金属化合物の熱分解を利用した方法も採用されており、例えばFe(CO)6からFeの磁性微粒子が製造されている。【０００５】
金属の磁性粒子はフェライト等の酸化物粒子に比べて磁化が大きいため、工業的利用への期待が大きい。例えば、金属Feの飽和磁化は218 Am2/kgと酸化鉄に比べて非常に大きいので、磁界応答性に優れ、大きな信号強度が得られるという利点がある。しかし金属Fe等の金属微粒子は容易に酸化し、例えば100μm以下、特に1μm以下の粒径を有する微粒子状にすると、比表面積の増大により大気中で激しく燃えるので、乾燥状態で取り扱うのが難しい。そのため、フェライトやマグネタイト等の酸化物粒子が広く利用されている。【０００６】
乾燥した金属微粒子を取り扱う場合、金属を直接大気(酸素)に触れさせないように粒子表面を被覆することが不可欠である。しかし特開2000-30920号に記載の、粒子自身の金属酸化物で表面を被覆する方法は、少なからず金属を酸化劣化させてしまう。【０００７】
特開平9-143502号は、カーボンブラック、天然黒鉛等の炭素質物質粒子と、金属単体の粒子又は金属化合物粒子(金属化合物は、金属酸化物、金属炭化物又は金属塩から選ばれる。)とを混合して、不活性ガス雰囲気中で1600〜2800℃に熱処理し、45℃/分以下の冷却速度で冷却することにより、グラファイト被覆金属微粒子を製造する方法を提案している。しかし、この方法は1600〜2800℃と極めて高い温度で金属含有物質粒子を熱処理するので、金属微粒子の焼結が懸念され、かつ生産効率が低い。またグラファイトはグラフェンシートが積層した構造を有するため、球状の金属微粒子を被覆した場合、必ず格子欠陥が導入される。このため、磁気ビーズ等の高耐食性が要求される用途には不満足である。従って、高耐食性の金属微粒子、及びそれを安価に製造し得る工業生産性に優れた方法が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、耐食性に優れ、高磁化を有する被覆金属微粒子、及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者等は、TiC、又はTiC及びTiNを含有する粉末と、TiO2よりも高い標準生成自由エネルギーを有する金属酸化物粉末とを混合し、熱処理することによりTi酸化物で被覆された金属粒子が得られることを見出し、本発明に想到した。【００１０】
すなわち、被覆金属微粒子を製造する本発明の方法は、TiC、又はTiC及びTiNを含有する粉末と、標準生成自由エネルギー（ΔGM-O）がΔGM-O＞ΔGTiO2の関係を満たす金属Mの酸化物粉末とを混合し、非酸化性雰囲気中で熱処理することにより、前記金属Mの酸化物をTiにより還元するとともに、得られた金属Mの粒子表面をTi酸化物で被覆することを特徴とする。【００１１】
前記TiC及びTiNを含有する粉末中には10〜50質量％のTiNを含有するのが好ましい。TiNの含有率は以下の式(1)により定義される。
TiN含有率（質量％）＝[TiN(質量％)]/[TiC(質量％)＋TiN(質量％)]  ・・・式(1)【００１２】
前記Ti酸化物はTiO2を主体とするのが好ましい。【００１３】
前記熱処理は650〜900℃で行うのが好ましい。【００１４】
被覆金属微粒子のX線回折パターンにおいてTiO2の最大ピークの半値幅が0.3°以下であり、かつ金属Mの最大ピークに対するTiO2の最大ピークの強度比が0.03以上であるのが好ましい。最大ピーク強度比は好ましくは0.05以上である。【００１５】
TiO2を主体とするTi酸化物被覆層は高結晶性であり、コアとなる金属微粒子(金属のコア粒子)を十分に保護することができる。ここで「TiO2を主体とする」とは、X線回折測定で検出されるTiO2以外のTi酸化物(例えば不定比組成のTinO2n-1)も含むTi酸化物に相当する回折ピークの中で、TiO2に相当するピークの強度が最大であることを意味する。均一性の観点から、実質的にTiO2からなるのが好ましい。ここで「実質的にTiO2からなる」とは、X線回折パターンでTiO2以外のTi酸化物のピークが明確に確認できない程度にTiO2の割合が多いことを言う。従って、X線回折パターンでノイズ程度にTiO2以外のTi酸化物のピークがあっても、「実質的にTiO2からなる」の条件は満たす。【００１６】
前記金属MはFe、Co及びNiからなる群から選ばれた少なくとも1種の元素を含む磁性金属であるのが好ましく、特にFeであるのがより好ましい。Tiは、Feより酸化物の標準生成エネルギーが小さいため、Feの酸化物を効率良く確実に還元することができる。従って、飽和磁化が高く耐食性に優れた磁性金属微粒子が得られる。磁性金属を核とすることにより、磁気ビーズとして磁気分離工程に用いることが可能となる。【００１７】
金属Mの酸化物はFe2O3であるのが好ましい。保磁力が低下し、分散性が向上した被覆金属微粒子を得るために、金属Mの酸化物粉末とTiC及びTiNを含有する粉末との合計に対するTiC及びTiNを含有する粉末の比率は30〜50質量％であるのが好ましい。【００１８】
被覆金属微粒子は50〜180 Am2/kgの飽和磁化を有するのが好ましい。これにより、被覆層と磁性体(磁性コア)の量のバランスがとれ、耐食性及び磁気特性ともに優れた被覆金属微粒子とすることができる。前記被覆金属微粒子の飽和磁化はより好ましくは95〜180 Am2/kgである。95〜180 Am2/kgの範囲は、マグネタイト等の酸化物磁性体では得ることのできない範囲であり、このような磁気特性を有する被覆金属微粒子は優れた磁気分離性能を発揮する。【００１９】
被覆金属微粒子は8 kA/m以下の保磁力を有するのが好ましい。これにより、残留磁化が極めて小さくなり、磁気凝集が極めて少ない分散性に優れた被覆金属微粒子とすることができる。より好ましい保磁力は4 kA/m以下である。【００２０】
本発明の被覆金属微粒子は、金属の核粒子にTi酸化物を被覆してなる被覆金属微粒子であって、炭素含有量が0.2〜1.4質量％及び窒素含有量が0.01〜0.2質量％であることを特徴とする。【００２１】
本発明の被覆金属微粒子は、炭素含有量が0.2〜1.1質量％及び窒素含有量が0.04〜0.12質量％であるのが好ましく、炭素と窒素の含有量の合計は0.24〜0.60質量％であるのが好ましい。特に高い磁化を得るためには、炭素と窒素の含有量の合計は0.25〜0.55質量％であるのがより好ましい。【００２２】
本発明の被覆金属微粒子は、金属の核粒子にTi酸化物を被覆してなる被覆金属微粒子であって、TiC、又はTiC及びTiNを含有する粉末と、標準生成自由エネルギー（ΔGM-O）がΔGM-O＞ΔGTiO2の関係を満たす金属の酸化物粉末とを混合し、非酸化性雰囲気中で熱処理することにより、前記金属Mの酸化物をTiにより還元するとともに、得られた金属Mの粒子表面をTi酸化物で被覆して得られるのが好ましい。【００２３】
本発明の被覆金属微粒子において、前記Ti酸化物はTiO2を主体とするのが好ましい。【００２４】
本発明の被覆金属微粒子において、前記熱処理は650〜900℃で行うのが好ましい。【００２５】
前記金属がFe、Co及びNiからなる群から選ばれた少なくとも1種の元素を含むのが好ましい。前記金属はFe元素を含むのが好ましい。【００２６】
本発明の被覆金属微粒子は、X線光電子分光分析によってO、Ti及びFeの3元素について定量分析したときのFe含有量が14〜20原子％であり、金属Fe成分の比率がFe全体の7〜11％であるのが好ましい。Feを含有することにより、高い飽和磁化が得られる。【００２７】
本発明の被覆金属微粒子は、濃度6 Mのグアニジン塩酸塩水溶液中に前記被覆金属微粒子を25℃で24時間浸漬(前記水溶液1 mLあたり前記被覆金属微粒子25 mgの割合)したときの、Feイオン溶出量が50 mg/L以下であるのが好ましい。高カオトロピック塩濃度でも高い耐食性を示す被覆金属微粒子は、DNA抽出等の用途に好適である。【００２８】
本発明の被覆金属微粒子は、アルカリ処理をしたものであるのが好ましい。【００２９】
本発明の被覆金属微粒子は、さらにケイ素酸化物を被覆してなるのが好ましい。ケイ素酸化物を被覆することにより核酸抽出担体としての特性を発現する。また酸や塩基を用いての固定化処理においても高い耐食性を示し、抗体等を固定化する用途に好適である。【００３０】
本発明の被覆金属微粒子は、さらにアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、チオール基、トシル基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれた少なくとも１種を表面に固定化してなるのが好ましい。これにより、様々な物質を固定化することが容易にできる。【００３１】
本発明の被覆金属微粒子は、さらにリガンドを表面に固定化してなるのが好ましい。リガンドの特異的な反応を用いて対象物質を捕捉することができる。【００３２】
本発明の被覆金属微粒子は、さらにブロッキング剤を被覆してなるのが好ましい。ブロッキング剤により非特異的な吸着を抑制できる。アミノ基等やリガンドが固定化された部分以外の表面をブロッキング剤で覆うようにすることが好ましい。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の方法により、耐食性に優れた被覆金属微粒子が安価でかつ簡易に得られる。本発明の被覆金属微粒子は、C元素及びN元素の含有量が少なく、金属コア粒子としてFe及び／又はCoを用いた場合に磁性粒子として機能し、高飽和磁化を発現する。また磁性金属粒子は高耐食性のTi酸化物層に被覆されているので、腐食性の溶液中で使用するために高い耐食性が要求される核酸抽出用の磁気ビーズ等に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例1の試料粉末のX線回折パターンを示すグラフである。
【図２】実施例1の試料粉末を走査型電子顕微鏡で撮影した写真である。
【図３】実施例26及び実施例26のDNA抽出量と耐久試験時間との関係を示すグラフである。
【図４】フローサイトメータを用いて測定したときの、実施例28、実施例29及び比較例AのFITC蛍光強度と粒子数との関係を示すグラフである。
【図５】フローサイトメータを用いての測定したときの、実施例30、実施例31及び比較例BのFITC蛍光強度と粒子数との関係を示すグラフである。
【図６】フローサイトメータを用いての測定したときの、実施例32のPE蛍光強度と粒子数との関係を示すグラフである。
【図７】被覆金属微粒子を用いて作製したELISAを示す模式図である。
【図８】実施例33の、ヒトアディポネクチン濃度とシグナル強度との関係を示すグラフである。
【図９】実施例34及び実施例35の、ヒトアディポネクチン濃度とシグナル強度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
[1]被覆金属微粒子の製造方法
本発明の被覆金属微粒子は、標準生成自由エネルギー（ΔGM-O）がΔGM-O＞ΔGTiO2の関係を満たす金属Mの酸化物粉末と、Tiを含む粉末（Ti、TiC、TiN等の粉末）とを混合し、得られた混合粉末を非酸化性雰囲気中で熱処理することにより、金属Mの酸化物をTiにより還元するとともに、得られた金属Mの粒子表面を、TiO2を主体とするTi酸化物で被覆することによって製造する。【００３６】
(1)金属Mの酸化物粉末
金属Mの酸化物粉末の粒径は、被覆金属微粒子の目標粒径に合わせて選択し得るが、0.001〜5μmの範囲内であるのが好ましい。粒径が0.001μm未満では、2次凝集が著しく起こるため、以下の製造工程での取り扱いが困難である。また5μm超では、金属酸化物粉末の比表面積が小さすぎるため、還元反応の進行が遅い。金属酸化物粉末の実用的な粒径は0.005〜1μmである。金属Mは遷移金属、貴金属及び希土類金属から選ばれるが、磁性材用であればFe、Co、Ni又はこれらの合金が好ましく、その酸化物としてはFe2O3、Fe3O4、CoO、Co3O4、NiO等が挙げられる。特にFeは飽和磁化が高いため好ましく、酸化物としてはFe2O3が安価である点で好ましい。TiはFeより酸化物の標準生成エネルギーが小さいため、Fe酸化物を効率良くかつ確実に還元することができる。【００３７】
標準生成自由エネルギー（ΔGM-O）がΔGM-O＞ΔGTiO2の関係を満たす金属Mの酸化物であれば、Tiを含む非酸化物粉末により還元することができる。ΔGM-Oは金属Mの酸化物の標準生成エネルギーであり、ΔGTiO2(＝-889kJ/mol)はTiの酸化物の標準生成エネルギーである。例えばFe2O3(ΔGFe2O3＝-740kJ/mol)はΔGFe2O3＞ΔGTiO2を満たすので、Tiを含む非酸化物粉末により還元される。還元によりTiO2の被覆が形成されると被覆金属微粒子の比重が低下する。さらにTiO2は親水性が高いので、TiO2被覆金属微粒子は、例えば磁気ビーズ用のように溶液中(水中等)に分散させて用いる場合に好適である。【００３８】
(2) Ti含有化合物
M酸化物を還元し、Ti酸化物で被覆されたM金属の微粒子を形成するためのTi含有化合物としては、Ti単体粉末及びTi-X（ただしXは、標準酸化物生成自由エネルギーΔGX-OがTiO2の生成標準自由エネルギーΔGTiO2より大きい元素である。）により表される粉末を用いることができる。具体的には、XはAg、Au、B、Bi、C、Cu、Cs、Cd、Ge、Ga、Hg、K、N、Na、Pd、Pt、Rb、Rh、S、Sn、Tl、Te及びZnからなる群から選ばれた少なくとも1種である。Ti酸化物は還元剤として機能しないので用いることができない。ΔGX-O＜ΔGTiO2を満たす元素Xの場合、元素Xが還元剤として作用するので、Ti酸化物が生成しなくなる。M酸化物を還元するに足るTiが含まれていれば、Xの含有量は特に限定されない。【００３９】
MとTiO2以外の相を低減した微粒子を得るためには、前記Ti含有化合物としてTiC、又はTiC及びTiNを使用する。TiCを還元剤として用いるとTiO2以外の相が形成されにくい。またTiNをTiCと併用することによってC残存量が低減する。TiN中のNは熱処理過程で気化してしまうため、実質的にTiだけを試料中に残すことができる。【００４０】
還元反応を効率的に行うためには、Ti含有化合物の粉末の粒径は0.01〜20μmであるのが好ましい。0.01μm未満の粒径であると大気中で粉末が酸化し易いのでハンドリングが難しい。また20μm超であると比表面積が小さく還元反応が進行しにくい。大気中での酸化を抑制しつつ、還元反応を十分に進行させるためには、特に0.1〜5μmの粒径であるのが好ましい。【００４１】
(3)還元反応
M酸化物の粉末に対するTi含有化合物の粉末の比率は、少なくとも還元反応の化学量論比であることが好ましい。Tiが不足すると、熱処理中にM酸化物粉末が焼結し、バルク化してしまう。例えばFe2O3とTiCとの組合せの場合、Fe2O3＋TiCに対してTiCは25質量％以上であることが好ましい。TiCが25質量％未満であると、TiCによるFe2O3の還元が不十分である。一方、TiCの比率が高くなりすぎると、得られるTiO2被覆Fe微粒子のFeの比率が低いため、飽和磁化が低下し保磁力が増大する。従って、TiCの上限は50質量％が好ましい。Fe2O3＋TiCに対するTiCの比率はより好ましくは30〜50質量％であり、最も好ましくは30〜40質量％であり、特に好ましくは30〜35質量％である。保磁力は、TiCが35質量％になると8 kA/mに達し、40質量％になると10 kA/mに達し、50質量％になると15 kA/mに達する。【００４２】
TiC及びTiNを併用する場合、TiNの含有率は10〜50質量％であるのが好ましい。ここでTiNの含有率は式(1)：TiN含有率（質量％）＝[TiN(質量％)]/[TiC(質量％)＋TiN(質量％)] により定義される。TiNの含有率が10質量％未満の場合は元素Cを低減する効果が十分得られない。TiN含有率が50質量％を越えるとCが不足することにより、酸化物から金属Mへの還元が不十分となり、完全な被覆金属微粒子が得られない。M酸化物粉末とTi含有化合物粉末との混合には、乳鉢、スターラ、V字型ミキサ、ボールミル、振動ミル等の攪拌機を用いる。【００４３】
M酸化物粉末とTi含有化合物粉末(Ti酸化物粉末を除く)の混合粉末を非酸化性雰囲気中で熱処理すると、M酸化物粉末とTi含有化合物粉末との酸化還元反応が起こり、TiO2を主体とするTi酸化物で被覆された金属Mの粒子が生成する。熱処理雰囲気は非酸化性であるのが好ましい。非酸化性雰囲気としては、例えばAr、He等の不活性ガスや、N2、CO2、NH3等のガスが挙げられるが、これらに限定されない。熱処理温度は650〜900℃が好ましい。650℃未満であると還元反応が十分に進行せず、また900℃超であると不定比組成のTinO2n-1が生成してしまう。TinO2n-1は、900℃超で金属MがTiO2から酸素を取り込むか、TiO2が非酸化性雰囲気中に酸素を放出することにより生成する。その結果、金属Mの還元が不十分であるか、被覆層が不完全となる。熱処理温度が650〜900℃の場合に、欠陥が少なく、均一性の高いほぼTiO2からなる被覆(被覆層)が形成される。TiO2からなる被覆は、光触媒用の被覆金属微粒子を作製するのに好適である。【００４４】
(4)磁気分離
得られる磁性被覆金属微粒子は非磁性成分(TiO2を主体とするTi酸化物のみからなる粒子)を含んでいる場合があるため、必要に応じて永久磁石を用いて磁気分離操作を複数回行い、磁性粒子だけを回収するのが好ましい。【００４５】
[2]被覆金属微粒子の構造及び特性
(1)被覆金属微粒子の粒径
上記方法により得られる被覆金属微粒子の粒径は、M酸化物粉末の粒径に依存する。高い耐食性及び分散性を得るためには、被覆金属微粒子のメディアン径（d50）は0.1〜10μmが好ましく、0.1〜6μmがより好ましい。メディアン径が0.1μm未満であると、被覆金属微粒子は十分な厚さの被覆を確保できずに耐食性が低くなるだけでなく、1粒子当たりの磁化が極めて小さくなり磁気応答性が低くなってしまう。またメディアン径（d50）が10μmを超えると、液体中での被覆金属微粒子の分散性が低下する。メディアン径（d50）はレーザー回折による湿式粒径測定器で測定でき、粒径分布（体積基準）から求めた積算分布曲線において50％の積算値における粒径値である。【００４６】
(2)被覆構造
M金属粒子とTi酸化物被覆層とは1対1のコア-シェル構造になっている必要はなく、TiO2を主体とするTi酸化物層中に2個以上のM金属粒子が分散した構造であっても良い。Ti酸化物の中に2個以上のM金属粒子が含まれていると、金属Mは高含有率で、かつ確実に被覆されるので好ましい。本発明の方法では、M酸化物の還元によるM金属微粒子の形成と、Ti酸化物被覆の形成とが同時に行われるので、M金属微粒子とTi酸化物被覆との間にM金属酸化物層が認められない。また650℃以上の熱処理により得られるTi酸化物被覆の結晶性は高く、ゾル-ゲル法等により得られる非晶質又は低結晶性のTi酸化物被覆より高い耐食性を示す。またTiO2を主体とした被覆を有する本発明の被覆金属微粒子は、被覆に欠陥が少ないので、不定比組成のTinO2n-1の被覆を有するものより高い耐食性を示す。【００４７】
(3)被覆厚さ
TiO2を主体とするTi酸化物被覆の厚さは1〜10000 nmが好ましい。厚さが1 nm未満であると、被覆金属微粒子は十分な耐食性を有さない。また厚さが10000 nm超であると、被覆金属微粒子が大きすぎ、液中での分散性が低いだけでなく、磁性金属微粒子の場合は飽和磁化が低い。より好ましいTi酸化物被覆の厚さは5〜5000 nmである。被覆の厚さは被覆金属微粒子の透過電子顕微鏡(TEM)写真により求める。Ti酸化物被覆の厚さが不均一な場合、最大厚さと最小厚さの平均をTi酸化物被覆の厚さとする。なお、金属微粒子は、TiO2を主体とするTi酸化物で完全に被覆されておらず、部分的に金属粒子が表面に露出しても構わないが、完全に被覆されているのが好ましい。【００４８】
(4)Ti酸化物の結晶性
被覆金属微粒子のX線回折パターンにおけるTiO2の最大ピークの半値幅が0.3°以下で、金属Mの最大ピークに対するTiO2の最大ピークの強度比が0.03以上である場合に、Ti酸化物の結晶性が良く、被覆金属微粒子は耐食性を示す。TiO2が非晶質又は低結晶性の場合、回折ピークは観察されないかブロードであるため、最大ピーク強度比は小さく、半値幅は広い。最大ピーク強度比はより好ましくは0.05以上である。最大ピーク強度比が高くなると被覆の割合が多くなり、飽和磁化が低下する。そのため、最大ピーク強度比は3以下が好ましい。【００４９】
(5)磁性粒子としての機能
金属Mが磁性金属Feの場合、前記製法により得られた被覆金属微粒子は50〜180 Am2/kgの範囲の飽和磁化を有し、磁性粒子として機能する。これは、被覆金属微粒子が磁性金属FeとTiO2から形成されている場合、Fe＋Tiに対するTiの比率が11〜67質量％である場合に相当する。Tiの比率は、X線回折パターンから被覆金属微粒子がFeとTiO2からなることが確認できた場合、被覆金属微粒子の飽和磁化の測定値から算出できる。磁性粒子の飽和磁化が50 Am2/kg未満と小さいと、磁界に対する応答が鈍い。また180 Am2/kg超であるとTiO2を主体とするTi酸化物の含有率が小さく(Fe＋Tiに対するTiの質量比率が11％未満)、金属Fe粒子を十分にTi酸化物で被覆できていないために耐食性が低く、磁気特性が劣化しやすい。従って、高い飽和磁化及び十分な耐食性を同時に得るために、被覆金属微粒子の飽和磁化は180 Am2/kg以下であるのが好ましい。磁気ビーズ等に用いる場合の回収効率や磁気分離性能に優れるためには、被覆金属微粒子の飽和磁化は95〜180 Am2/kgであるのがより好ましい。この範囲の飽和磁化は、92 Am2/kg程度の飽和磁化しか有さないマグネタイト(Fe3O4)では得られない。分散性の観点から、被覆金属微粒子の保磁力は15 kA/m以下が好ましく、8 kA/m(100 Oe)以下がより好ましく、4 kA/m以下が最も好ましい。保磁力が大きい場合でもTiO2被覆を厚くすれば高分散性が得られるが、被覆金属微粒子の飽和磁化は低下してしまう。保磁力が8 kA/mを超えると、磁性粒子は無磁界でも磁気的に凝集するので、液中での分散性が低下する。【００５０】
(6)含有元素の濃度
被覆金属微粒子に含有されるC量は0.2〜1.4質量％以下が好ましい。含有されているCは主に原料として用いたTiC粉の余剰分の残留が原因である。金属Mの酸化物を主としてTiが還元剤となって金属Mへと還元する本発明の製法において、TiC中のCも還元剤の役割を果たし、金属Mの酸化物を補助的に還元している。C量が0.2質量％未満であることは、M酸化物の還元が不十分であることを意味しており好ましくない。C量が1.4質量％超であると金属成分の含有率が低下し、その金属がFe、Co及びNiから選ばれる少なくとも一つの元素を主成分としている場合は、飽和磁化の低下を招く。またCの残留によって被覆金属微粒子が疎水性となり、水溶液中での分散性が低下するので磁気ビーズ等の用途に用いる場合には特に好ましくない。C含有量はより好ましくは0.2〜1.1質量％である。【００５１】
被覆金属微粒子に含まれるN量は0.01〜0.2質量％が好ましい。含有するNは熱処理中に余剰のTiが窒化したことによるものと、原料として用いたTiN粉末の熱処理後残留分に由来するものである。N量が0.01質量％未満であるとTiNを置換した効果が全く得られないため好ましくない。N量が0.2質量％超であると非磁性成分の窒化チタンの含有率が増え、飽和磁化が低下するので好ましくない。さらにコアとなる金属Mの微粒子を十分に被覆する為にはTiがある程度余剰に存在することが好ましく、その結果として一部のTiが熱処理中に窒化されることが好ましい。より好ましいN量は0.04〜0.2質量％である。【００５２】
飽和磁化をより高く保つためには被覆金属微粒子に含有されるCとNの総量を所定の範囲に制御することが重要であり、含有されるCとNの合計(C＋N)が0.24〜1.6質量％であるのが好ましく、より好ましくは0.24〜0.60質量％である。C＋Nが0.24質量％未満であると上述したC及びN含有量の好適範囲から外れ、1.6質量％を越えると飽和磁化の低下を招く。金属Mの微粒子を十分に被覆しながら高い飽和磁化を得るためには0.60以下が特に好ましい。【００５３】
ここで上記被覆金属微粒子中のC含有量は高周波加熱赤外吸収法にて測定、N含有量は不活性ガス中加熱熱伝導法又はケルダール法によって測定される。【００５４】
(7)耐食性
モル濃度が6 Mのグアニジン塩酸塩水溶液1 mL中に、金属MがFeである被覆金属微粒子25 mgを25℃で24時間浸漬したときのFeイオン溶出量は50 mg/L以下であるのが好ましい。この様なFeイオン溶出量を有する被覆金属微粒子は高カオトロピック塩濃度においても高い耐食性を示すため、カオトロピック塩水溶液中での処理を必要とするDNA抽出等の用途に好適である。Feイオン溶出量が50 mg/L以下の耐食性レベルは、アルカリ処理を施さない場合でも発現することがあるが、確実に上記耐食性レベルを得るためにはアルカリ処理を行うのが好ましい。なお、本願明細書の耐食性やX線回折に係る記述から判るとおり、本発明の被覆金属微粒子は被覆金属微粒子集合体（粉末）に相当する用語として用いている。【００５５】
(8)被覆金属微粒子表面
核酸抽出担体としての特性を持たせるために、被覆金属微粒子の表面にケイ素酸化物を主体とする被覆層を形成するのが好ましい。最外殻の被覆層は、金属アルコキシドの加水分解法及びアルコキシド誘導物質を作製することにより形成できる。例えばケイ素アルコキシドの加水分解反応で得られる。ケイ素アルコキシドの具体例としては、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。ケイ素酸化物は、例えば従来からのテトラエトキシシランの加水分解反応で得られ、シリカを析出させるテトラエトキシシランの加水分解反応を制御することで、再現性よく製造することができる。【００５６】
被覆金属微粒子表面に、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、チオール基、トシル基、ヒドロキシル基の少なくとも1種が固定化されていることが好ましい。これらの官能基が固定化されていることにより簡便に様々なリガンドを固定化できる。また官能基により溶液への分散性を調整することも可能である。【００５７】
被覆金属微粒子表面に、リガンドを固定化するのが好ましい。リガンドとはある特定の物質と特異的に結合する物質である。リガンドは化学的に結合することが好ましいが物理的に吸着させても構わない。リガンドとはアビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、2次抗体、プロテインG、プロテインA、プロテインA/G、プロテインL、抗体、抗原、レクチン、糖鎖、ホルモン、核酸等である。これらの物質が単独で固定化されていてもよいし、複数固定化されていても構わない。アビジン及びストレプトアビジンを被覆金属微粒子表面に固定化することにより、ビオチン標識された物質、例えばビオチン標識抗体、ビオチン標識DNA、ビオチン標識蛍光物質と特異的に結合できる。またアビジンとストレプトアビジンはビオチンと4つの結合部位を持つため、ビオチンが固定化された被覆金属微粒子とアビジン又はストレプトアビジンを結合しさらにビオチン標識された物質と結合できる。2次抗体は特定の抗体と選択的に結合することから1次抗体を固定化することができる。プロテインGは免疫グロブリンG(IgG)と特にFc部位と強く結合することからIgGと選択的に結合できる。プロテインAはIgGの種により結合能に大きな差があり特定のIgGと選択的に結合できる。またプロテインAとIgGの結合はpH依存性を有するため、一旦捕捉後pHを変化させることにより解離することもでき、プロテインAを修飾した被覆金属微粒子はIgG等の精製用に好適に用いることができる。プロテインA/GはプロテインAとプロテインGの特性を組み合わせた融合タンパク質であり、リガントとして好ましく用いることができる。プロテインLはウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ以外のIgと結合することからウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリのIgを含む血清からウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ以外のIgを選択的に捕捉することができる。抗体、抗原は、特定の抗原、抗体と抗原抗体反応により結合を行うことができる。例えば、抗体もしくは抗原を固定化した被覆金属微粒子は免疫学的測定法(イムノアッセイ)に好適に用いることができる。また、抗体、抗原、レクチン、糖鎖、ホルモンは、特定の物質を特異的に捕捉でき、例えばタンパク質や、細胞の回収などに好適に用いることができる。また例えば所望する核酸又は所望する核酸の一部と相補的な核酸を被覆金属微粒子表面に固定化することにより、所望する核酸を選択的に回収することができる。【００５８】
被覆金属微粒子表面は、ブロッキング剤でコーティングしてあることが好ましい。これにより非特異的な吸着を抑制することができる。非特異的な吸着(nonspecificity)とは所望の物質以外が吸着することである。ブロッキング剤としてはウシ血清アルブミン(BSA)、スキムミルク等を用いることができる。市販のブロッキング剤を用いることができ、例えばブロックエース(雪印乳業株式会社)等の非特異吸着を抑制する効果があるものを用いることができる。【００５９】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６０】
実施例1
メディアン径0.03μmのα-Fe2O3粉末とメディアン径1μmのTiC粉末とを、7：3の質量比でボールミルにより10時間混合し、得られた混合粉末をアルミナボート内で、窒素ガス中700℃で2時間熱処理した。得られた試料粉末のX線回折パターンを図1に示す。図1の横軸は回折の2θ(°)を示し、縦軸は回折強度(相対値)を示す。MDI社製解析ソフト「Jade，Ver.5」による解析の結果、回折ピークはα-Fe及びTiO2(ルチル構造)と同定された。【００６１】
α-Feの(200)ピークの半値幅からシェラーの式を用いて算出されたFeの平均結晶子サイズは90 nmであった。2θ＝27.5°のとき得られたTiO2の最大回折ピークの半値幅は0.14であり、TiO2の最大回折ピーク強度のα-Feの最大回折ピーク［(110)ピーク］強度に対する比は0.18であった。これから、TiO2が高い結晶性を有することが分かる。レーザー回折型粒度分布測定装置(HORIBA製：LA-920)で測定したこの試料粉末のメディアン径d50は3.1μmであった。【００６２】
図2に示すSEM写真により、被覆金属微粒子は数μmの粒径を有することが分かる。ほとんどの被覆金属微粒子は、複数のFe粒子2にTiO2層1が被覆して１個の微粒子を形成している。例えば、矢印で示したTiO2層に包含されているFe粒子2(図2中で白色の部分)の粒径は約0.5μmであった。【００６３】
Fe酸化物の標準生成エネルギーΔGFe2O3＝-740 kJ/molに対して、Ti酸化物はΔGTiO2＝-889 kJ/molであるため、TiO2の標準生成エネルギーの方が小さい。従って、α-Fe2O3がTiにより還元され、TiO2が生成したと言える。【００６４】
得られた試料粉末5 gと50 mLのイソプロピルアルコール(IPA)とを100 mLのビーカに投入し、10分間超音波を照射した。次いで永久磁石をビーカの外面に1分間接触させ、磁性粒子だけをビーカ内壁に吸着させ、黒灰色の上澄み液を除去した。この磁気分離操作を50回繰り返し、得られた精製磁性粒子を室温で乾燥させた。この磁性粒子の磁気特性を、最大印加磁界を1.6 MA/mとしてVSM(振動型磁力計)により測定した。精製した磁性粒子におけるFeとTiの質量比は、X線回折パターンから被覆金属微粒子がFeとTiO2からなることを確認した後で、被覆金属微粒子の飽和磁化の測定値から算出した。結果を表1に示す。【００６５】
実施例2〜5
α-Fe2O3粉末とTiC粉末の質量比を、表1に示すように変更した以外実施例1と同様にして試料粉末の作製及び精製を行い、磁性粒子を得た。これらの磁性粒子の組成及び磁気特性を実施例1と同様にして測定した。結果を表1に示す。【００６６】
α-Fe2O3粉末とTiC粉末の質量比を4：6として得られた実施例6の磁性粒子は、高い耐食性を有していたが、飽和磁化Msは48 Am2/kgとなり50 Am2/kgより低く、保磁力iHcは18 kA/mとなり15 kA/m超であった。以上より、金属Fe粒子の特性を生かして高い飽和磁化の値を維持するためにはTiC配合比は30〜50質量％であるのが好ましいことが分かる。【００６７】
【表１】
2008035681.tif 000003
注：(1)原料(混合粉末)中のα-Fe2O3とTiCとの質量比。
(2)精製した磁性粒子中のFe：Tiの質量比。
【００６８】
実施例6
熱処理温度を800℃とした以外は実施例1と同様にして磁性被覆金属微粒子を得た。この試料粉末について磁気特性を実施例1と同様にして測定した。試料粉末中のC量は高周波加熱赤外吸収法(HORIBA製EMIA-520)によって測定し、N量は不活性ガス中加熱熱伝導法(HORIBA製EMGA-1300)によって測定した。結果を表2に示す。【００６９】
実施例7〜11
表3に示す原料配合比で、TiC粉末の一部をメディアン径2.8μmのTiN粉末に置換した以外は実施例6と同様にして磁性被覆金属微粒子を得た。この試料粉末の磁気特性、及びC、Nの含有量を実施例6と同様にして評価した。結果を表3に示す。【００７０】
【表２】
2008035681.tif 000004
【００７１】
TiNの添加量が増加するに従い、C及びNの含有量が低下し、飽和磁化Msは向上した。特にTiN含有率が20〜40質量％(実施例8〜10)の場合は、C量が1.3質量％以下及びN量が0.2質量％以下であり、これらの元素の含有量は極めて少なかった。さらにTiN含有率が40質量％の実施例10は、Msが158 Am2/kgまで向上した。しかしTiN含有率が50質量％の実施例11は、C及びN量は少ないもののMsはTiNを含まない実施例6よりもむしろ低下した。これはCが不足することにより還元反応の進行が不十分であったためと考えられる。しかしながら実施例11の磁性被覆金属微粒子は、保磁力iHcが非常に小さいために残磁が少なく磁気凝集が抑制される。よって磁気ビーズなどの再分散性が要求される用途に適している。【００７２】
実施例12〜17
原料混合にビーズミルを用いて表3に示す時間混合した以外は実施例10と同様にして磁性被覆金属粒子を得た。この磁性粉末のメディアン径(d50)をレーザー回折型粒度分布測定装置(HOLIBA製LA-920)にて測定した。結果を表3に示す。また磁気特性、及びC及びNの含有量も表3に示した。Cの含有量は実施例6と同様の手法でコクサイ電子工業製HFT-9を用いて測定した。Nの含有量はケルダール法を用いて試料に含有されるNをアンモニア化した後、インドフェノール青吸光光度法により分光光度計(島津製作所製UV-1600)にて測定した。これらの実施例のC及びNの含有量は、表2の結果に比べると全体的に低く、Cは0.24〜0.54質量％、Nは0.01〜0.02質量％であった。またCとNの含有量の合計は最小で実施例15の0.26質量％、最大で実施例17の0.55質量％であった。【００７３】
【表３】
2008035681.tif 000005
【００７４】
また実施例6及び実施例8〜10の試料粉末についてアルバック・ファイ製：PHI-Quantera SXMにてX線光電子分光(XPS)分析を実施した。Oの1s、Feの2p3及びTiの2p軌道電子についてそれぞれナロースペクトルを測定し、定量分析を行った。結果を表4に示す。【００７５】
【表４】
2008035681.tif 000006
【００７６】
TiN含有率が増加するとともにFe含有量が増加し、Ti含有量が減少する傾向であった。つまりTiNの添加によってFe含有率が増加した。これはTi酸化物の被覆層が薄くなっていることを意味している。ただし後述するように酸化Fe成分が増えていないことから、Feコア粒子の被覆が破壊されているわけではない。Fe粒子を十分被覆しながら非磁性成分である被覆層の体積を最小限に留めることができるため、磁気特性の向上が見られたと考えられる。またTiN含有率の増加に伴い、酸化Fe成分が減少し金属Fe成分が増加した。特にTiN含有率が20〜40質量％の場合、金属Fe成分の比率(金属Fe/全Fe)はいずれも6％以上であった。これはTiN添加によって被覆度がより完全となり、形成されたTi酸化物の被覆層が薄くなっているにもかかわらず金属Feが酸化されずに維持されているためである。【００７７】
実施例18
実施例6、8、9及び10で得られた試料粉末1 gを50 mLのNaOH水溶液（濃度1 M）中に投入し、60℃で24時間浸漬処理を行った(アルカリ処理)。このアルカリ処理後、水洗して試料粉末を乾燥させた。得られた試料粉末25 mgを1 mLのグアニジン塩酸塩水溶液（濃度6 M）中に25℃で24時間浸漬させた(浸漬試験)後のFeイオン溶出量をICP分析装置(エスアイアイナノテクノロジー社製：SPS3100H)により測定した。結果を表5に示す。【００７８】
【表５】
2008035681.tif 000007
【００７９】
アルカリ処理によってFeイオン溶出量が50 mg/L以下に低下した。またTiN含有率が大きいほどFeイオン溶出量は小さかった。特にTiN含有率40質量％ではアルカリ処理を施す前でもFeイオン溶出量が10 mg/L未満と極めて小さく、耐食性に優れることが分かる。【００８０】
また表3で示した実施例12〜17の被覆金属微粒子に対してアルカリ処理は施さずに実施例18と同様にFeイオン溶出量を測定した。結果を表6に示す。Feイオン溶出量は2.1 mg/L以下であり、耐食性に極めて優れていた。【００８１】
【表６】
2008035681.tif 000008
【００８２】
実施例7〜11及び実施例18〜21で得られた被覆金属微粒子の試料粉末について、実施例1と同様にしてX線回折を行ったところ、いずれの試料粉末もTiO2の最大ピークの半値幅が0.3°以下であり、かつ金属Mの最大ピークに対するTiO2の最大ピークの強度比が0.03以上であった。【００８３】
実施例22
実施例10で得られた被覆金属微粒子を用いて、以下に説明する手法でシリカ被覆処理を施し、磁性シリカ粒子を作製した。上述の被覆金属微粒子の試料粉末5 gを100 mLのエタノール溶媒中に分散し、これにテトラエトキシシランを1 mL添加した。この溶媒を攪拌しながら22 gの純水と4 gのアンモニア水（25％）の混合溶液を添加し1時間攪拌した。攪拌後、磁性粒子を磁石でビーカ内壁に捕捉しながら上澄み液を除去した。得られた磁性粒子に対して上述のシリカ被覆処理をさらに2回繰り返し、最後にイソプロピルアルコールで溶媒置換を行った後、磁性粒子を乾燥させて磁性シリカ粒子を得た。【００８４】
得られた磁性シリカ粒子の磁気ビーズ性能は、Roch社製DNA抽出キット「MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I」を用いて馬血100μLからのDNA抽出量を測定することにより評価した。12 mgの磁性シリカ粒子を150μLのイソプロピルアルコール(IPA)中に分散させた溶液を各々磁気ビーズ液として用いた以外は上記Kitのプロトコルに準拠してDNAを抽出した。抽出液中のDNA量は、UVスペクトル測定機(日立ハイテクノロジーズ社製ダイオードアレー型バイオ光度計U-0080D)を用いて測定した。その結果、100μLの馬血から抽出したDNA量は2.7μgであった。【００８５】
比較例1
市販の磁気ビーズ(Roche製、MagNAPure LC DNA Isolation Kit Iに付属)を用いて実施例22と同様にDNAを抽出した結果、DNA抽出量は2.7μgであった。【００８６】
以上より、本発明の被覆金属微粒子は磁気ビーズとして好適である。【００８７】
実施例23
原料粉末の混合時間を100分とした以外は実施例10と同様に被覆金属微粒子を作製し、この金属微粒子に実施例22と同様にシリカ被覆処理を施し、磁性シリカ粒子を得た。この磁性シリカ粒子のメディアン径(d50)、比表面積及び磁気特性を表7に示す。なお、比表面積は窒素ガスの吸着を利用したBET法(株式会社マウンテック製Macsorb-1201)により測定した。【００８８】
実施例24
原料粉末の混合時間を100分とした以外は実施例6と同様に被覆金属微粒子を作製し、この金属微粒子に実施例22と同様にシリカ被覆処理を施し、磁性シリカ粒子を得た。この磁性シリカ粒子のメディアン径(d50)、比表面積及び磁気特性を実施例23と同様に評価した。結果を表7に示す。【００８９】
比較例1で使用した市販の磁気ビーズについても同様に各特性を測定した。結果を表7に示す。実施例23及び実施例4は比較例1に比べると微粒子かつ高飽和磁化(2倍以上)、及び低い保磁力(10分の1程度)を有していた。【００９０】
【表７】
2008035681.tif 000009
【００９１】
次に表7の各例で用いた磁気ビーズについてヒト全血からのDNA抽出性能を評価した。ヒト全血100μLを検体とした点、及び磁性シリカ粒子を表8に示す質量に変更した点以外は実施例22と同様にして全血からDNAを抽出した。得られた抽出液中のDNA量は、以下の方法によりDNAの2重鎖にインターカレートする性質を持つ蛍光試薬にてDNAを標識し、その蛍光強度を測定することによって測定した。すなわち、2μLのDNA抽出液に198μLの蛍光試薬(インビトロジェン製PicoGreen)の200倍希釈液[TE溶液(10 mMのTris-HCl及び1 mMのEDTA)で希釈]を添加し、DNAと蛍光試薬を反応させ、その蛍光強度を分光蛍光光度計(日立製作所製F-4500)で測定した。波長480 nmの光で励起し、波長520 nmの蛍光強度を測定した。各磁気ビーズのDNA抽出量を表8に示す。また表7で示した比表面積の値を用いて、磁性シリカ粒子の単位表面積あたりのDNA抽出量を算出し、表8に示す。【００９２】
同一質量(12 mg)で比較すると比較例1に比べて実施例23の単位面積当たりのDNA抽出量は約2.7倍多い。また使用するビーズ質量を2 mgまで減少（単位面積当たりのDNA抽出量は12 mgの場合の約6倍となる。）させてもDNA抽出量は約2μgで安定していた。実施例23の磁性シリカ粒子は、比較例1に比べてメディアン径が小さくDNA抽出に有効な表面が多いため、ビーズ質量の使用量が少ない場合でも十分にDNAを抽出することができる。また飽和磁化が高い（表7参照）ため、DNAを捕捉した磁気ビーズを高効率に磁気捕集でき、かつ洗浄工程等での滅失が極めて少ないので、比較例1に比べて単位面積当たりのDNA抽出量が十分高い。実施例24の磁性シリカ粒子は実施例23よりはやや劣っていたが、比較例1に対しては高いDNA抽出性能を示した。【００９３】
【表８】
2008035681.tif 000010
【００９４】
実施例25
実施例17で得られた被覆金属微粒子に実施例22と同様にしてシリカ被覆処理を施し、磁性シリカ粒子を得た。この磁性シリカ粒子の磁気ビーズとしての性能安定性を評価するため、以下に述べる耐久試験を実施し、試験後の磁性シリカ粒子のDNA抽出性能を評価した。耐久試験は、0.32 gの磁性シリカ粒子と4 mLのイソプロピルアルコール(IPA)を6 mL容量のスクリュー缶瓶に充填し、60℃で1、10、50、100hの各時間保持して行った。通常、磁気ビーズは室温又は冷蔵保存するのに対し、このように60℃で保温することにより強制的に劣化させ耐久度を評価できる。耐久試験後の各磁気ビーズを用いて実施例16と同様に馬血100μLからDNAを抽出した。図3にDNA抽出量と耐久試験時間の関係を示す。【００９５】
実施例26
実施例17で得られた被覆金属微粒子に対して、1 mLのテトラエトキシシランと同時に0.05gのアルミニウムイソプロポキシド(テトラエトキシシランの5質量％に相当)を添加した以外は実施例22と同様にしてシリカ被覆処理を施し、磁性シリカ粒子を得た。この磁性シリカ粒子に実施例25と同様の耐久試験を実施し、耐久試験後のDNA抽出性能を評価することにより磁気ビーズ性能の安定性を調べた。結果を図3に示す。【００９６】
実施例25及び実施例26のDNA回収量はどちらも安定しており、IPAへの浸漬時間が100h経過（室温保存に対して24倍の加速試験）してもDNA回収量は殆ど変化していない。すなわち実施例25及び実施例26の磁性シリカ粒子のDNA抽出性能は優れた耐久性を有していた。これは被覆金属微粒子が表3に示すように耐食性に優れているため、IPA中60℃で加熱・保持しても被覆金属微粒子の変質や特性の劣化が起こらないことを表している。すなわち、本発明の磁性シリカ粒子は安定したDNA抽出性能を発現しており、磁気ビーズに適用した場合は性能の長期安定性に優れる。【００９７】
実施例27
原料配合時にビーズミルを用いた以外は実施例10と同様にして磁性被覆金属微粒子を得た。この試料粉末の粒径をレーザー回折型粒度分布測定装置(HORIBA製：LA-920)で測定すると0.8μmであった。【００９８】
実施例28
実施例27で得られた被覆金属微粒子を用いた以外は実施例22と同様にしてシリカ被覆処理を行い、シリカ被覆金属微粒子を得た。前記シリカ被覆金属微粒子0.1gと2 mLの3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)水溶液とを混和し、1時間攪拌した。大気中で乾燥しアミノ基が固定化された磁気ビーズ(アミノ基コート磁気ビーズ)を得た。Bang Laboratories社製のBioMag Plus Amine Particle Protein Coupling Kitを用い、下記の手順で前記アミノ基コート磁気ビーズにストレプトアビジンを固定化した。まず15mgのアミノ基コート磁気ビーズと、キット付属ピリジンウォッシュバッファー(PWB)により5％に調整した600μLのグルタルアルデヒドを混合し3時間室温で攪拌した。この分散液の非磁性成分を磁気分離により除去しPWBで4回洗浄した。得られた磁気ビーズをPWBに懸濁させた液とストレプトアビジン(和光純薬社製)を混合し、4℃で16時間攪拌した。600μLのキット付属クエンチング溶液を加え30分室温で攪拌し、非磁性成分を磁気分離により除去し、PWBで4回洗浄し、ストレプトアビジンを固定化した被覆金属微粒子(ストレプトアビジンコート磁気ビーズ)を得た。この被覆金属微粒子をビオチン化フルオレセインイソチオシアナート（fluoresceinisothiocyanate、FITC)(Molecular Probes社製fluorescein biotin)で染色後、フローサイトメトリーを用いてベックマンコールター社製フローサイトメータEPICSaALTRAにて測定し、ストレプトアビジンの固定化量を定量的に評価した。結果を図4に示す。【００９９】
実施例29
実施例28と同様の方法でアミノ基を導入し、無水コハク酸を用いカルボキシル基を固定化し、さらにカルボジイミドを用いて活性化することによりストレプトアビジンを固定化した。実施例28と同様にビオチン化FITCで染色後フローサイトメトリーを用い測定し、ストレプトアビジンの固定化量を定量的に評価した。その結果を図4に示す。【０１００】
フローサイトメータは、１粒子毎の蛍光強度を測定する装置である。多数個の粒子を測定し、そのヒストグラムが蛍光強度の強い方にシフトしていることは、粒子表面により多くの蛍光物質が存在することを示す。またビオチンはストレプトアビジンとビオチン-アビジン結合により親和的に結合することが知られている。ストレプトアビジンが表面に固定化された磁気ビーズをビオチン化FITCと反応させてフローサイトメータで測定し、得られたヒストグラムがFITC蛍光強度の強い方にシフトしていることは、粒子表面に固定化されているストレプトアビジンの固定化量がより多いことを示している。【０１０１】
図4から明らかなように、実施例28及び実施例29のストレプトアビジンコート磁気ビーズは、ストレプトアビジンを固定化していない被覆金属微粒子（比較例A）（実施例27で得られた被覆金属微粒子にシリカ被覆処理を行った被覆金属微粒子）と比較しFITC蛍光強度が強くストレプトアビジンが固定化されていることが分かった。【０１０２】
実施例30
実施例28のストレプトアビジンコート磁気ビーズにビオチン化された抗体(biomeda社製Epithelial Specific Antigen-Biotin Labeled，Affinity Pure)を反応させて抗体を固定化した被覆金属微粒子(抗体固定磁気ビーズ)を得た。2次抗体(Beckman Coulter社製PE標識Goat F(ab')2 Anti Mouse IgG(H＋L))で染色しフローサイトメトリーを用い測定を行った。結果を図5に示す。【０１０３】
実施例31
ストレプトアビジンの代わりにVU-1D9抗体を用いた以外は実施例29と同様の方法でVU-1D9抗体を固定化した被覆金属微粒子(抗体固定磁気ビーズ)を得た。2次抗体(Beckman Coulter社製PE標識Goat F(ab')2 Anti Mouse IgG(H＋L))で染色しフローサイトメトリーを用い測定を行った。結果を図5に示す。【０１０４】
２次抗体は抗体と選択的に結合する。抗体が表面に固定化された磁気ビーズをPE化２次抗体と反応させフローサイトメータで測定し、得られたヒストグラムがPE蛍光強度の強い方にシフトしていることは、粒子表面に固定化されている抗体の固定化量がより多いことを示す。【０１０５】
図5から明らかなように実施例30及び実施例31の抗体固定磁気ビーズは、抗体を固定化していない被覆金属微粒子（比較例B）（実施例28で得られた被覆金属微粒子）と比較しPE蛍光強度が強く抗体が固定化されていることが分かった。【０１０６】
実施例32
ストレプトアビジンの代わりにMouse IgG抗体を用いた以外は実施例29と同様の方法でMouse IgG抗体を固定化した被覆金属微粒子を、ブロックング剤(雪印乳業株式会社製Block Ace)を溶解させた溶液に一晩浸漬し、ブロッキング剤コート磁気ビーズを得た。固定化されているRabbit IgG抗体と特異的に反応する2次抗体(Beckman Coulter社製PE標識Goat F(ab')2 Anti Mouse IgG(H＋L))で染色した実施例32A、特異的に反応をしない2次抗体(Beckman Coulter社製PE標識Goat F(ab')2Anti Mouse IgM)で染色した実施例32B、及び比較例として無染色の試料（比較例C）をフローサイトメトリーを用い測定した。結果を図6に示す。【０１０７】
図6から明らかなように実施例32のブロッキング剤コート磁気ビーズは特異的に反応する2次抗体とのみ反応することが分かった。つまり、非特異的な吸着は起こっていないことが分かった。【０１０８】
実施例33
図7に示すように、実施例29で作製したストレプトアビジン16を固定化した被覆金属微粒子17にビオチン標識抗ヒトアディポネクチン抗体 (マウス)15 (R＆D SYSTEMS社製Anti-human Adiponectin/Acrp30 Antibody Biotin labeled)を30分インキュベートし、抗体15が固定化された被覆金属微粒子17を得た。この被覆金属微粒子17を用いてサンドイッチ式ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法を行った。最初に、抗体15が固定化された被覆金属微粒子17とヒトアディポネクチン14(BioVendor社製Human Adiponectin，His-Tagged Fusion Protein)をインキュベートした。その後、被覆金属微粒子17をヒトアディポネクチンELISAキット(大塚製薬)付属の抗ヒトアディポネクチン抗体(ラビット)13(第一抗体液)とインキュベートし洗浄後、さらに西洋ワサビペルオキターゼ(HRP)標識ラビットIgGポリクローナル抗体(ゴート)12(酵素標識抗体液)とインキュベートし洗浄を行った。基質と反応させた後反応停止液で反応を停止させ、UVスペクトル測定機を用いシグナル強度（450 nmの吸光度）を測定した。ヒトアディポネクチン14の濃度を変更し同様の操作を行い、ヒトアディポネクチン14濃度とシグナル強度との関係を得た。その結果を図8に示す。【０１０９】
図8から明らかなようにヒトアディポネクチンの濃度とシグナル強度との間には相関関係がみられた。濃度が既知のヒトアディポネクチン液を用い検量線を作成後、濃度未知のヒトアディポネクチン液のシグナル強度を測定することによりヒトアディポネクチン濃度を求めることがでる。つまり本発明の被覆金属微粒子がイムノアッセイに好適であることが分かった。【０１１０】
実施例34
実施例26の磁性シリカ粒子を用いた以外は実施例33と同様の方法で、ビオチン標識抗ヒトアディポネクチン抗体(マウス)が固定化された被覆金属微粒子を得た。前記被覆金属微粒子を用い実施例33と同様の方法で、サンドイッチ式ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法を行った。結果を図9に示す。【０１１１】
実施例35
実施例25の磁性シリカ粒子を用いた以外は実施例33と同様の方法で、ビオチン標識抗ヒトアディポネクチン抗体(マウス)が固定化された被覆金属微粒子を得た。前記被覆金属微粒子を用い実施例33と同様の方法で、サンドイッチ式ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法を行った。結果を図9に示す。【０１１２】
図9から明らかなようにヒトアディポネクチンの濃度とシグナル強度との間に相関関係がみられた。濃度が既知のヒトアディポネクチン液を用い検量線を作成後、濃度未知のヒトアディポネクチン液のシグナル強度を測定することによりヒトアディポネクチン濃度を求めることができる。つまり本発明の被覆金属微粒子がイムノアッセイに好適であることが分かった。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月12日(2008.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｉＣ及びＴｉＮを含有する粉末と、標準生成自由エネルギー（ΔＧＭ−Ｏ）がΔＧＭ−Ｏ＞ΔＧＴｉＯ２の関係を満たす金属Ｍの酸化物粉末とを混合し、非酸化性雰囲気中で熱処理することにより、前記金属Ｍの酸化物をＴｉにより還元するとともに、得られた金属Ｍの粒子表面をＴｉ酸化物で被覆することを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の被覆金属微粒子の製造方法において、前記ＴｉＣ及びＴｉＮを含有する粉末中には１０〜５０質量％のＴｉＮが含有することを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の被覆金属微粒子の製造方法において、前記Ｔｉ酸化物がＴｉＯ２を主体とすることを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の被覆金属微粒子の製造方法において、前記熱処理を６５０〜９００℃で行うことを特徴とする被覆金属微粒子の製造方法。
【請求項５】
金属の核粒子にＴｉ酸化物を被覆してなる被覆金属微粒子であって、炭素含有量が０．２〜１．４質量％及び窒素含有量が０．０１〜０．２質量％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項６】
請求項５に記載の被覆金属微粒子において、炭素含有量が０．２〜１．１質量％及び窒素含有量が０．０４〜０．１２質量％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の被覆金属微粒子において、炭素と窒素の含有量の合計が０．２４〜０．６０質量％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の被覆金属微粒子において、前記金属がＦｅ、Ｃｏ及びＮｉからなる群から選ばれた少なくとも１種の元素を含むことを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の被覆金属微粒子において、前記金属がＦｅ元素を含むことを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１０】
請求項９に記載の被覆金属微粒子において、Ｘ線光電子分光分析によってＯ、Ｔｉ及びＦｅの３元素について定量分析したときのＦｅ含有量が１４〜２０原子％であり、金属Ｆｅ成分の比率がＦｅ全体の７〜１１％であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の被覆金属微粒子において、濃度６Ｍのグアニジン塩酸塩水溶液中に前記被覆金属微粒子を２５℃で２４時間浸漬（前記水溶液１ｍＬあたり前記被覆金属微粒子２５ｍｇの割合）したときの、Ｆｅイオン溶出量が５０ｍｇ／Ｌ以下であることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれかに記載の被覆金属微粒子において、アルカリ処理をしたことを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれかに記載の被覆金属微粒子の表面に、ケイ素酸化物を被覆してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１４】
請求項５〜１３のいずれかに記載の被覆金属微粒子の表面に、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、チオール基、トシル基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれた少なくとも１種を固定化してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１５】
請求項５〜１４のいずれかに記載の被覆金属微粒子の表面に、リガンドを固定化してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【請求項１６】
請求項５〜１５のいずれかに記載の金属微粒子の表面に、ブロッキング剤を被覆してなることを特徴とする被覆金属微粒子。
【国際調査報告】
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