【手続補正書】
【提出日】平成15年10月27日(2003.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】      改変型ＧＰ１００およびその使用
【特許請求の範囲】
【０００１】
【請求項１】  動物において免疫応答を調節する能力がある分離および精製された改変型ｇｐ１００核酸分子。
【請求項２】  配列番号１に示す核酸配列を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】  （ａ）ＴがＵでもありうる、配列番号１に示す核酸配列；
【０００２】
（ｂ）（ａ）と相補的である核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸配列と相同的である核酸配列；
（ｄ）（ａ）乃至（ｃ）の核酸配列の断片；
（ｅ）厳密なハイブリダイゼーション条件下で（ａ）乃至（ｄ）の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列；
（ｆ）遺伝コードの縮重によりコドン配列において（ａ）乃至（ｄ）の核酸のいずれとも異なる核酸配列；よりなる群から選択される核酸配列を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】  ウイルス核酸、プラスミド、細菌のＤＮＡ、裸の／遊離ＤＮＡ、およびＲＮＡから成る群より選択されることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の核酸分子。
【請求項５】  ウイルス核酸であり、該ウイルスが、アデノウイルス、アルファウイルスおよびポックスウイルスから成る群より選択されることを特徴とする請求項４記載の核酸分子。
【請求項６】  前記ウイルスが、ワクシニア、鶏痘、アビポックス、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣおよびＭＶＡより成る群から選択されるポックスウイルスであることを特徴とする請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】  前記ウイルスがＡＬＶＡＣであることを特徴とする請求項６記載の核酸分子。
【請求項８】  請求項１から７いずれか１項記載の核酸分子と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む組成物。
【請求項９】  補助剤をさらに含むことを特徴とする請求項８記載の組成物。
【請求項１０】  請求項１から７いずれか１項記載の核酸分子を含み、該核酸によりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１１】  抗原提示細胞であることを特徴とする請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】  樹状細胞であることを特徴とする請求項１０記載の細胞。
【請求項１３】  ポリペプチドをコードする請求項１から７いずれか１項記載の核酸分子が挿入されたウイルスを含む組換えウイルスであって、該組換えウイルスに感染した細胞において前記ポリペプチドの発現をもたらすことを特徴とする組換えウイルス。
【請求項１４】  ポリペプチドをコードする請求項１から７いずれか１項記載の核酸が挿入されたウイルスを含む組換えウイルスであって、該組換えウイルスに感染した細胞が、
【０００３】
（１）前記ポリペプチド；
（２）前記ポリペプチドの断片；
（３）前記ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞；および
（４）前記ポリペプチドまたはその断片を結合する細胞；から成る群より選択されるメンバーに対して直接免疫応答を誘発する能力を有することを特徴とする組換えウイルス。
【請求項１５】  前記ウイルスが、アデノウイルス、アルファウイルス、およびポックスウイルスから成る群より選択されることを特徴とする請求項１３または１４記載の組換えウイルス。
【請求項１６】  前記ウイルスが、ワクシニア、鶏痘、アビポックス、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、およびＭＶＡから成る群より選択されるポックスウイルスであることを特徴とする請求項１５記載の組換えウイルス。
【請求項１７】  前記ポックスウイルスがＡＬＶＡＣであることを特徴とする請求項１６記載の組換えウイルス。
【請求項１８】  請求項１３から１７いずれか１項記載の組換えウイルスと、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む組成物。
【請求項１９】  請求項１から７いずれか１項記載の核酸分子によりコードされる分離タンパク質。
【請求項２０】  改変型ｇｐ１００タンパク質の活性を有する分離タンパク質。
【請求項２１】  配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２２】  有効量の改変されたｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００核酸分子を投与する工程を含むことを特徴とする、動物（ヒトを除く）の免疫系を調節する方法。
【請求項２３】  ｇｐ１００タンパク質がｇｐ１００Ｍタンパク質であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】  ｇｐ１００核酸分子がｇｐ１００Ｍ核酸分子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】  ｇｐ１００Ｍ核酸分子が、配列番号１に示す核酸配列を有することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】  ｇｐ１００Ｍタンパク質が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２７】  改変型ｇｐ１００核酸分子が挿入された有効量のベクターを、必要とする動物（ヒトを除く）に投与して、該動物の免疫系を調節する工程を含むことを特徴とする、動物の免疫系を調節する方法。
【請求項２８】  前記ベクターが、リンホカイン、サイトカイン、および補助刺激分子よりから成る群より選択される分子とともに投与されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】  前記分子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、およびＩＦＮγ１から成る群より選択されるサイトカインであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】  前記分子がリンホカインであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】  前記分子が補助刺激分子であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３２】  前記補助刺激分子がＢ７ファミリーの分子であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】  前記ベクターが、アデノウイルス、アルファウイルスまたはポックスウイルスであることを特徴とする請求項２７から３２いずれか１項記載の方法。
【請求項３４】  前記ベクターが、ワクシニア、鶏痘、アビポックス、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣおよびＭＶＡから成る群より選択されるポックスウイルスであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】  前記ポックスウイルスがＡＬＶＡＣであることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】  動物（ヒトを除く）に対して、有効量の改変型ｇｐ１００タンパク質またはその免疫原性断片、あるいは改変型ｇｐ１００タンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸配列を投与する工程を含むことを特徴とする、癌を予防的に治療する方法。
【請求項３７】  改変型ｇｐ１００タンパク質が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】  前記核酸配列が、配列番号１に示す配列であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３９】  癌が黒色腫であることを特徴とする請求項３６から３８いずれか１項記載の方法。
【請求項４０】  改変型ｇｐ１００タンパク質をコードする核酸配列を含む黒色腫ワクチン。
【請求項４１】  改変型ｇｐ１００タンパク質がｇｐ１００Ｍタンパク質であることを特徴とする請求項４０記載のワクチン。
【請求項４２】  ｇｐ１００タンパク質が配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４１記載のワクチン。
【請求項４３】  ＭＨＣ分子への結合を増強するように改変されていることを特徴とする改変型ｇｐ１００タンパク質。
【請求項４４】  ｇｐ１００Ｍタンパク質であることを特徴とする請求項４３記載の改変型タンパク質。
【請求項４５】  配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４４記載のタンパク質。
【請求項４６】  改変型ｇｐ１００核酸配列、あるいは対応する抗原に対して動物において抗体産生を誘発する能力を有する前記核酸配列に対応するタンパク質またはタンパク質断片を含むワクチン。
【請求項４７】  前記核酸配列に対応するタンパク質がｇｐ１００Ｍタンパク質であることを特徴とする請求項４６記載のワクチン。
【請求項４８】  改変型ｇｐ１００核酸配列がｇｐ１００Ｍ核酸配列であることを特徴とする請求項４６記載のワクチン。
【請求項４９】  ｇｐ１００Ｍ核酸配列が、配列番号１に示す核酸配列であることを特徴とする請求項４８記載のワクチン。
【請求項５０】  ｇｐ１００Ｍタンパク質が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４７記載のワクチン。
【請求項５１】  改変型ｇｐ１００核酸配列または該核酸配列に対応するタンパク質もしくは細胞免疫応答を誘発する能力を有するタンパク質断片を含むワクチン。
【請求項５２】  前記核酸配列に対応するタンパク質がｇｐ１００Ｍタンパク質であることを特徴とする請求項５１記載のワクチン。
【請求項５３】  改変型ｇｐ１００核酸配列がｇｐ１００Ｍ核酸配列であることを特徴とする請求項５１記載のワクチン。
【請求項５４】  ｇｐ１００Ｍ核酸配列が、配列番号１に示す核酸配列であることを特徴とする請求項５３記載のワクチン。
【請求項５５】  ｇｐ１００Ｍタンパク質が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５２記載のワクチン。
【請求項５６】  改変型ｇｐ１００タンパク質をコードするワクチンベクターを含む免疫原性組成物。
【請求項５７】  改変型ｇｐ１００タンパク質がｇｐ１００Ｍタンパク質であることを特徴とする請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】  改変型ｇｐ１００Ｍタンパク質が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５７記載の組成物。
【請求項５９】  前記ベクターが、アデノウイルス、アルファウイルスまたはポックスウイルスであることを特徴とする請求項５６から５８いずれか１項記載の組成物。
【請求項６０】  前記ベクターが、ワクシニア、鶏痘、アビポックス、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、およびＭＶＡから成る群より選択されるポックスウイルスであることを特徴とする請求項６０記載の組成物。
【請求項６１】  前記ポックスウイルスがＡＬＶＡＣであることを特徴とする請求項６０記載の組成物。
【請求項６２】  配列番号１に示す配列を有する核酸分子によりコードされる分離ｇｐ１００Ｍタンパク質の免疫原性断片。
【０００４】
【発明の詳細な説明】
【０００５】
本出願は、その両方が本出願中で参考として援用される、１９９９年１０月２２に出願された米国出願第６０／１６０，８７９号および２０００年８月７日に出願された米国出願第６０／２２３，３２５号の利益を請求する。
【０００６】
発明の分野
本発明は、免疫療法の分野におけるものであり、インビボの免疫応答の生成に適したｇｐ１００の新規な形態の作成物に関する。
【０００７】
発明の背景
皮膚の悪性黒色腫の発生率および死亡率は過去数十年にわたり劇的に上昇した（Liu, T. et al. (1996) Surg Clin North Am 76:1205; Gloster, H.M. et al. (1996) Dermatol Surg 22:217）。現在、黒色腫を発生するアメリカ人の推定寿命リスクは約９０分の１である（Rigel, D.S. et al. (1979) Mayo Clin Proc 72:367）。大部分の初期黒色腫は簡単な外科的切除で治療できるが（Greenstein D.S. et al. (1995) Dennatol Surg 21:927; Whooley, B.P. et al. (1995) Dermatol Surg 4:187; Urist, M.M. et al. (1996) Ann Rev Med 47:211）、疾患が進行した患者は浸襲的な化学療法および／または免疫療法でも治癒するのは稀である（Falkson, C.I. et al. (1995) Anticancer Drugs 6:709）。
【０００８】
黒色腫は数週間以内に転移する浸襲性の原発性病変として存在しうるが、その発生は一般的に数か月乃至数年間にわたり起こり、一連の特徴的な病理段階を経て進行する。最も初期の段階は皮内腫瘍（メラノーマ  インサイツ）として開始する急進的増殖期（ＲＧＰ）黒色腫である。ＲＧＰ黒色腫は数か月または数年間、比較的静止状態の場合もあり、一般に簡単な切除で治癒する。最終的に、大部分のＲＧＰ黒色腫は、簡単な切除では治癒の可能性が低いさらに浸襲性の腫瘍を示す垂直増殖の成分（垂直増殖期黒色腫、ＶＧＰ）を発生する。転移性蔓延は腫瘍進行の最終段階であり、きわめて不良な転帰を示す（Reintgen, D. (1997) Ann Surg 225:1）。
【０００９】
原発性黒色腫患者における生存率を測定する最も重要な予測因子は病変の深さである。腫瘍の厚さが０．７５ｍｍ未満の患者の５年生存率はおよそ９６％であるが、腫瘍の深さが４．５ｍｍ未満の患者の５年生存率はわずかにおよそ３８％である（Whooley, B.P. et al. (1995) Dermatol Surg 4:187; Urist, M.M. et al. (1996) Ann Rev Med 47:211）。そのＲＧＰ前駆体からのＶＧＰ黒色腫の進展は一般に少なくとも数か月かかるため、外科的切除が患者の転帰に対して劇的な効果を示すには「時間枠」が存在する。延長として、残留性疾患に対処する新規な試みがこの時点で最も有効であると提案することは理にかなっている。
【００１０】
黒色腫に対する免疫応答の操作が治療的であることを数種類の証拠が示している。すなわち、１．転移性黒色腫の自然退縮の臨床所見が抗黒色腫免疫応答により起こり得る（Nelson, C.A. et al. (1976) Natl Cancer Enst Monogr 44:145）。２．転移性黒色腫の退縮は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞または腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ’ｓ）を含むまたは含まない高用量のＩＬ−２を投与した一部の患者においても確認されている（Rosenberg, S.A. et al. (1998) J Natl Cancer 1nst 90:1894。３．さらに最近では、多くの黒色腫特異的および関連腫瘍抗原がクローン化されている（Van den Eynde, B. et al. (1997) Curr Opin Immunol 9:684）。これらの試薬の可用性は、特異的ワクチンを開発し、黒色腫細胞を除去する腫瘍特異的Ｔ細胞の可能性を増強しうる期待を示している。これらの抗原はさまざまな送達賦形剤で投与することができ、抗腫瘍応答を最適化するための最も有効な投与方式は現在、明らかではない。
【００１１】
多くの感染症のための在来のワクチンは、初感染チャレンジが有効な防御記憶免疫応答を誘発しうることを示している。循環腫瘍反応性Ｔ細胞の存在下でも、免疫応答を開始させるために必要とされる重要なイベントは、腫瘍抗原が脾臓およびリンパ節の二次リンパ系構造物への侵入を引き起こすことである（Zinkernagel, R.M.et al. (1997) Immunol Rev 156:199）。皮内で局所的に発生する黒色腫は、腫瘍抗原が二次リンパ系器官に達しない限り、免疫系から隠れている。そして腫瘍は、免疫応答が誘発されるまでには、大きな塊に成長するため、急速に腫瘍により圧倒されることがある（Moskophiis, D. et al. (1993) Nature 362:758）。あるいは、局所リンパ節との関係を断ち、またこれと関係する黒色腫細胞は、不十分な抗原提示細胞であり、すなわち高レベルのＨＬＡクラスＩ分子（Ferrone, S. (1995) Immunology Today 61:487）またはＢ７ファミリーの一部分など補助刺激分子（Bluestone, J.a. et al. (1995) Immunity 2:555）を発現することがないため、免疫応答を誘発することはできないとみられる。さらに、腫瘍は免疫応答が開始される前に寛容化サイズに達しうる。深いが転移性でない黒色腫を有する患者における有効なワクチン法は、腫瘍反応性Ｔ細胞を増大させとるともにそれらを活性化させ、末梢に関係し、細胞毒性エフェクター機能を発揮しうるようにしなければならない。
【００１２】
ｇｐ１００は通常、メラノソームにおいて見出され、メラニン細胞、網膜細胞、および他の神経堤誘導体において発現する（Kawakami, Y. et al. (1997) Int Rev Immunol 14:173）。ｇｐ１００の機能は現在、不明である（Rosenberg, S.A. et a）. (1998) Nature Med 4:321）。質量分析により、３つの免疫優性ＨＬＡ−Ａ２結合ｇｐ１００ペプチド、ｇ９−１５４（アミノ酸１５４−１６２）、ｇ９−２０９（アミノ酸２０９−２１７）；およびｇ９−２８０（アミノ酸２８０−２８８）が確認されている（Kawakami, Y. et al. (1995) J lmmunol 154:3961）。特に、これらのペプチドの２つは、最初のＴ細胞クローンにおいてさらに強力な免疫応答を誘発するために合成的に変化されており、ｇ９−２０９の位置２におけるトレオニンはメチオニンに変化し、ｇ９−２０９における位置９のアラニン残基はバリンに変化した（Parkhurst, M.R. et al. (1996) J Immunol 157:2539）。これらの変化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識されるエピトープを変化させることなくＨＬＡ−Ａ２分子へのペプチドの結合親和性を増大させる。ローゼンバーク（Rosenberg）らはすでにこれらのペプチドの１つによる黒色腫患者の免疫化、および一部の患者における客観的な臨床的応答の達成に成功している（Rosenberg, S.A. et al. (1998) Nature Med 4:321）。
【００１３】
発明の概要
本発明人は、免疫系を調節することにおいて有用な分子を開発した。特に、改変された全部のｇｐ１００のヌクレオチド配列が免疫系を調節することにおいて有用であることを見出した。分離された核酸配列を本明細書中ではｇｐ１００Ｍ核酸配列と呼び、対応するタンパク質を本明細書中ではｇｐ１００Ｍタンパク質と呼ぶ。タンパク質の分子（すなわちタンパク質および核酸）または免疫原性断片を用いて動物の免疫系を初回刺激し追加免疫しうる。
【００１４】
したがって、本発明は、改変型ｇｐ１００タンパク質、好ましくはｇｐ１００Ｍタンパク質をコードする配列を含む分離核酸分子を提供する。好ましくは、本発明による改変型ｇｐ１００タンパク質は、その改変の結果として前記ｇｐ１００タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が改変されているものであるが、免疫系を改変することを可能にするためにｇｐ１００タンパク質を改変する能力がある他のすべての改変は本発明の範囲内である。
【００１５】
ｇｐ１００Ｍの核酸配列は図１に示され、本明細書中では配列番号１として周知でもある。ｇｐ１００Ｍの核酸によりコードされた対応するアミノ酸配列が図２に示され、これは本明細書中で配列番号２と呼ばれる。
【００１６】
したがって、本発明の１つの実施形態において、図１に示された配列（配列番号１）を有する分離核酸分子が提供される。
【００１７】
好ましくは、精製および分離核酸分子は、
（ａ）配列番号１で示され、ＴがＵでもありうる核酸配列；
（ｂ）（ａ）と相補的である核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相同的である核酸配列；
（ｄ）少なくとも１５の塩基、好ましくは２０乃至３０の塩基であり、厳密なハイブリダイゼーション条件下に（ａ）乃至（ｃ）をハイブリッド形成する（ａ）乃至（ｃ）の断片；または
（ｅ）遺伝コードの縮重によりコドン配列における（ａ）乃至（ｃ）の核酸のいずれとも異なる核酸分子を含む。
【００１８】
本発明は、分離ｇｐ１００Ｍタンパク質および／または本発明の核酸分子によりコードされるその免疫原性断片をさらに含む。好ましい実施形態において、ｇｐ１００Ｍタンパク質は図２に示されたアミノ酸（配列番号２）を有する。
【００１９】
これらの断片の好ましい実施形態は配列番号１２４によるまたは配列番号１２５によるアミノ酸配列を有する断片を含む。
【００２０】
本発明は、それを必要とする動物に対し、免疫系を調節する分子を提供するように改変された有効な量のｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００核酸分子を投与することを含む動物の免疫系を調節する方法をさらに提供する。好ましくは、改変型ｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００核酸分子は、それぞれｇｐ１００Ｍタンパク質またはｇｐ１００Ｍ核酸分子であり、改変型ｇｐ１００核酸分子またはｇｐ１００タンパク質は、それぞれ配列番号１および２の配列を有することが最も好ましい。
【００２１】
本発明は、それを必要とする動物に対し、免疫系を調節する分子を提供するように改変されたｇｐ１００核酸配列が挿入されている有効な量のベクターを投与することを含む動物の免疫系を調節する方法であって、好ましくはベクターがウイルスであり、好ましくはウイルスがアデノウイルス、アルファウイルスまたはポックスウイルスである方法をさらに提供する。さらに好ましくは、ウイルスがポックスウイルスである場合には、それがワクシニア、鶏痘、アビポックス、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣまたはＭＶＡ、好ましくはＡＬＶＡＣである。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、改変型ｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００核酸分子は第２剤、好ましくはリンホカイン、サイトカイン、またはＢ７ファミリー分子の一部分など補助刺激分子とともに投与され、好ましくはサイトカインはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦまたはＩＦＮγ１である。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明は、それを必要とする動物に対し、免疫系を刺激する分子を提供するように改変された有効な量のｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００核酸分子を投与することを含む動物の免疫系を刺激する方法であって、好ましくは、それぞれｇｐ１００Ｍタンパク質またはｇｐ１００Ｍ核酸分子であり、最も好ましくは、改変型ｇｐ１００核酸分子またはｇｐ１００タンパク質はそれぞれ配列番号１および２の配列を有する方法を提供する。
【００２４】
本発明は、免疫系を刺激する分子、好ましくはｇｐ１００Ｍ核酸分子を提供するように改変された有効な量のｇｐ１００核酸分子を投与することを含む動物の治療における遺伝子ワクチンの有効性を増強する方法も提供する。好ましい実施形態によれば、動物は癌を有する。
【００２５】
本発明の別の実施形態によれば、免疫系を刺激する分子を提供するように改変された有効な量のｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００核酸分子を含む動物の免疫系を調節するための組成物であって、好ましくは、薬学的に許容可能な希釈剤または担体中のそれぞれｇｐ１００Ｍタンパク質またはｇｐ１００Ｍ核酸分子であり、最も好ましくは、改変型ｇｐ１００核酸分子またはｇｐ１００タンパク質はそれぞれ配列番号１および２の配列を有する組成物が提供される。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、改変型ｇｐ１００タンパク質、好ましくはｇｐ１００Ｍタンパク質、さらに好ましくは配列番号２によるアミノ酸配列を有するｇｐ１００Ｍタンパク質をコードする核酸配列を含む予防的使用または治療的使用の方法が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、改変型ｇｐ１００タンパク質好ましくはｇｐ１００Ｍタンパク質、さらに好ましくは配列番号２によるアミノ酸配列を有するｇｐ１００Ｍタンパク質をコードする核酸配列を含む、癌を予防または治療するための黒色腫ワクチンが提供される。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、改変型ｇｐ１００タンパク質、好ましくはｇｐ１００Ｍ、さらに好ましくは配列番号２によるアミノ酸配列を有するｇｐ１００Ｍをコードする核酸配列を含む、黒色腫を予防または治療するための黒色腫ワクチンが提供される。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、本明細書中に記載された予防的方法または治療的方法において使用するため、ＭＨＣ分子への結合を増強することによりその免疫原性を増大し、または抗黒色腫免疫応答のその誘導を増強するように改変されている改変型ｇｐ１００タンパク質配列が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、改変型ｇｐ１００核酸配列または哺乳動物において対応する抗原に対する抗体の産生を誘発する能力があるその対応するタンパク質を含み、好ましくは、それぞれｇｐ１００Ｍ核酸配列またはｇｐ１００Ｍタンパク質であり、さらに好ましくは配列番号１による核酸配列を有するｇｐ１００Ｍ核酸配列および配列番号２によるアミノ酸配列を有するｇｐ１００Ｍタンパク質を含むワクチンが提供される。
【００３１】
別の態様によれば、本発明は、組成物を接種された宿主動物における抗原または免疫応答を誘導するための抗原、免疫またはワクチン組成物または治療組成物に関し、前記ワクチンは不活化された本質的でないウイルスコード化遺伝子機能を有する改変型組換えウイルスを含み、組換えウイルスは毒性を減弱し、安全性を増強している。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、不活化された本質的でないウイルスコード化遺伝子機能を有する改変型組換えウイルスを含み、組換えウイルスは毒性を減弱し、安全性を増強している免疫原性組成物に関する。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、その中に不活化された本質的でないウイルスコード化遺伝子機能を有し、ウイルスが毒性を減弱している改変型組換えウイルスに関し、改変型組換えウイルスはウイルスゲノムの本質的ない部分における異種源からのＤＮＡをさらに含有する。
【００３４】
本発明の別の実施形態によれば、核酸がポリペプチドに対してコードする本発明による核酸が挿入されているウイルスを含む組換えウイルスが提供され、組換えウイルスは感染細胞におけるポリペプチドの発現を誘発する。
【００３５】
別の実施形態において、本発明による核酸が挿入されている組換えウイルスが提供され、核酸は改変型ｇｐ１００ポリペプチドをコードし、該組換えウイルスに感染した細胞は、
（１）ポリペプチド；
（２）ポリペプチドの断片；
（３）ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞；または
（４）タンパク質またはその断片を結合する細胞、から構成される群から選択されるメンバーに対して直接、免疫応答を誘発することが可能であり、好ましくはウイルスがアデノウイルス、アルファウイルス、またはポックスウイルスであり、好ましくはウイルスがポックスウイルスである場合には、それがワクシニア、鶏痘、アビポックス、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣまたはＭＶＡ、好ましくはＡＬＶＡＣである。
【００３６】
実施形態において、このような組換えウイルスは特定の組換えウイルスおよび薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む組成物の一部である。
【００３７】
さらに別の態様における本発明は、改変型ｇｐ１００タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスの発現に関し、好ましくはウイルスがアデノウイルス、アルファウイルス、またはポックスウイルスであり、好ましくはウイルスがポックスウイルスである場合には、それがワクシニア、鶏痘、アビポックス、ＴＲＯＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣまたはＭＶＡ、好ましくはＡＬＶＡＣであり、したがって、治療、予防、診断または試験のための抗原組成物、免疫組成物またはワクチン組成物を形成するために使用し、ＤＮＡプローブおよびＰＣＲプライマーを作成することにおいて有用である組換えポックスウイルスからのＤＮＡに関する。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、好ましい実施形態を示した詳細な説明および具体的な実施例は、説明のためにのみ示されている。発明の精神および範囲内のさまざまな変更や修正が、この詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
【００３９】
発明の詳細な説明
既述したように、本発明人は、動物の免疫系を調節することにおいて有用である分子を開発した。特に、本発明人は、改変された全ｇｐ１００タンパク質のヌクレオチド配列が免疫系を調節することにおいて有用であることを見出した。本明細書中で用いられる「動物」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを含む動物界の全メンバーを含む。
【００４０】
Ｉ．  本発明の核酸配列
上述したように、発明人は遺伝子（ｇｐ１００Ｍ核酸分子）およびその遺伝子産物（ｇｐ１００Ｍタンパク質）を分離し特徴づけた。
【００４１】
大まかに述べれば、本発明は、免疫系を刺激する分子を提供するように改変されたｇｐ１００の活性を有するタンパク質をコードする配列を含む分離核酸分子を提供する。本明細書中で用いられるように、免疫系を刺激する分子を提供するように改変されたｇｐ１００は、およそ２０９および／または２８０アミノ酸での改変配列を有するｇｐ１００配列（Parkhurst, M.R., et al. J. Immunol. 157:2539-2548 (1996)に記載）および／またはその免疫原性断片を含む。
【００４２】
したがって、本発明は、免疫系を調節する能力がある改変型ｇｐ１００タンパク質をコードするすべての分離核酸および分子を含む。「分離」という用語は、組換えＤＮＡ法により生成される場合に細胞物質または培養基、または化学的に合成される場合に化学前駆物質や他の化学薬品を実質的に含まない核酸を指す。「核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが意図され、二本鎖または一本鎖のいずれかでありうる。本発明の実施形態においては、図１に示した配列を有する分離核酸分子が提供される。
【００４３】
好ましくは、精製および分離核酸分子は、
（ａ）図１に示した核酸配列であって、ＴがＵでもありうる核酸配列；
（ｂ）（ａ）と相補的である核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相同的である核酸配列；
（ｄ）少なくとも１５の塩基、好ましくは２０乃至３０の塩基であり、厳密なハイブリダイゼーション条件下に（ａ）乃至（ｃ）をハイブリッド形成する（ａ）乃至（ｃ）の断片；または
（ｅ）遺伝コードの縮重によりコドン配列における（ａ）乃至（ｃ）の核酸のいずれとも異なる核酸分子を含む。
【００４４】
本発明は、本発明のタンパク質の切断をコードする核酸分子、および以下に記載されるように、本発明のタンパク質の類似体と相同体およびその切断を含むことが理解されよう。さらに、本発明のｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生じる本発明の核酸分子の異型が本発明により包含されることが理解されよう。
【００４５】
さらに、本発明は図１に示した核酸配列およびその断片と実質的な配列相同性を有する核酸配列を含む核酸分子を含むことが理解されよう。「実質的な配列相同性を有する配列」という用語は、これらの配列とわずかに異なる配列を有する核酸配列、すなわち機能的に等価なタンパク質を生じる実質的に同じ様式の配列機能を意味する。
【００４６】
一般に、実質的な相同性を有する核酸配列は、図１に示した核酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０〜９０％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００４７】
本発明の別の態様は、ハイブリダイゼーションの条件、好ましくは厳密なハイブリダイゼーションの条件下に本発明の核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子、および少なくとも１５の塩基を有するその断片を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密な条件は当業者には周知である（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）。ハイブリダイゼーションの方法も当業者には周知である（たとえば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. (1994), Silhavy et al., Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1984); Davis et al. Methods in Enzymol. 65:404 (1980)に記載）。ハイブリダイゼーションの条件を最適化するために考えうる重要なパラメーターは、重要な値である２つの相補ＤＮＡ鎖がそれを超えると相互に分離する融解温度のケイ酸を可能にする式に表されている（Davis et al. Methods in Enzymol. 65:404(1980)）。この式は以下の通りである：  Ｔｍ＝８１．５＋０．４１ｘ（％Ｇ＋Ｃ）＋１６．６  ｌｏｇ（実際のイオン濃度）−０．６３ｘ（％ホルムアミド）−６００／塩基数。適切な厳密な条件下に、ハイブリダイゼーション温度（Ｔｈ）はおよそ２０乃至４０℃、２０乃至２５℃、または、好ましくは計算されたＴｍを下回る３０乃至４０℃である。当業者であれば、最適な温度および塩条件が在来の方法を用いた予備実験において経験的に容易に決定することができる。
【００４８】
例えば、厳密な条件は、予備ハイブリッド形成インキュべーションおよびハイブリッド形成インキュべーションについて、（ｉ）５０％ホルムアミド含有６ｘＳＳＣ中、４２℃下に４乃至１６時間以内または（ｉｉ）６ｘＳＳＣ水溶液（１  Ｍ  Ｎａｃｌ、０．１クエン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０））中６５℃下に４〜１６時間以内に達成することができる。一般的に、ハイブリダイゼーションの実験は、６０乃至６８℃、例えば６５℃の温度で実施される。このような温度下、厳密なハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ中、好ましくは２ｘＳＳＣまたは１ｘＳＳＣ中、さらに好ましくは０．５ｘＳＳｃ中、０．３ｘＳＳＣまたは０．１ｘＳＳＣ中（ホルムアミドの非存在下）で達成することができる。１ｘＳＳＣは０．１５  Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５  Ｍ  クエン酸ナトリウムを含有する。
【００４９】
３０乃至６００ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドについては、上記の式が用いられ、減算により補正される（塩基対の６００／ポリヌクレオチドサイズ）。厳密な条件は、Ｔｍを下回る５乃至１０℃であるＴｈにより規定される。
【００５０】
２０乃至３０の塩基よりも短いオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションの条件は、上記の規則を正確に従うことはない。このような場合には、Ｔｍを計算する式は以下の通りである：  Ｔｍ＝４ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。例えば、５０％Ｇ＋Ｃの１８ヌクレオチド断片はおよそ５４℃のＴｍを有するであろう。
【００５１】
ｇｐ１００Ｍ遺伝子など改変型ｇｐ１００遺伝子からの核酸分子は、図１に示した核酸配列のすべてまたは一部分に基づく標識核酸プローブを調製し、この標識核酸プローブを用いて適切なＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーニングすることにより分離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより分離された核酸は標準の方法により配列決定することができる。
【００５２】
本発明の核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法およびｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡ源を用いて核酸を選択的に増幅することでも分離することができる。ＰＣＲの使用について図１に示した核酸分子から合成オリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることが可能である。これらの合成オリゴヌクレオチドプライマーをさらに改変し、部位特異的な変異原性に利用されるために通常の核酸配列からｋ特異的な変化を組み入れることもできる。これらのオリゴヌクレオチドプライマーおよび標準のＰＣＲ増幅法を用いてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから核酸を増幅することができる。こうして増幅される核酸を適切なベクターへクローン化し、ＤＮＡ配列分析により特徴づけることができる。さまざまな方法により、例えば、Chirgwinら（Biochemistry、１８、５２９４−５２９９（１９７９））のグアニジニウム−チオシアン酸塩抽出法を用いて、総細胞ｍＲＮＡを分離することにより、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから調製しうることが理解されよう。さらに、逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ベテスダ、メリーランド州から入手可能なＭｏｌｏｎｅｙ  ＭＬＶ逆転写酵素、またはＳｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｋａ株式会社、セントピーターズバーグ、フロリダ州から入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を用いてｃＤＮＡがｍＲＮＡから合成される。
【００５３】
ＲＮＡである本発明の分離核酸分子は、ｃＤＮＡの転写がｇｐ１００Ｍタンパク質をコードするＲＮＡ分子を生じることを可能にする適切なベクターへ本発明の新規なタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより分離することができる。例えば、ｃＤＮＡをベクターにおけるバクテリオファージプロモーターの下流（例えば、Ｔ７プロモーター）でクローニングすることができ、ｃＤＮＡはＴ７ポリメラーゼとともにインビトロで転写することができ、結果として生じるＲＮＡを標準の方法により分離することができる。
【００５４】
本発明の核酸は標準の方法を用いて化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成するさまざまな方法が、ペプチド合成と同様、市販のＤＮＡ合成機（例えば、米国特許第４，５９８，０４９号；米国特許第４，４５８，０６６号；および米国特許第４，４０１，７９６号および第４，３７３，０７１号明細書を参照）において完全に自動化されている固相合成を含めて周知である。
【００５５】
本発明の核酸分子の開始コドンおよび翻訳されていない配列は、ＰＣ／Ｇｅｎｅ（インテリゲネチックス株式会社、カリフォルニア）など、その目的のためにデザインされた現在入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて決定しうる。調節要素は在来の方法を用いて確認することができる。要素の機能は、これらの要素を用いてその要素に操作的に結合する受容体を発現することにより確認することができる。これらの作成物は標準の方法を用いて培養細胞の中へ導入しうる。ＤＮＡにおける調節要素を確認するほかに、このような作生物は、当業界において周知の方法を用いて、その要素と相互作用するタンパク質を確認するために用いることもできる。
【００５６】
本発明は、本発明の新規なタンパク質および選択されたタンパク質、または選択可能な標識タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸も提供する（以下参照）。
【００５７】
ＩＩ．  本発明の核酸配列を発現する方法
ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその改変もしくは組み合わせを含む本発明のポリヌクレオチド分子はさまざまな用途を有しうる。例えば、ポリヌクレオチドを（ｉ）組換え宿主系におけるコード化ポリペプチドを製造する方法、（ｉｉ）免疫系を調節するために用いられる（ポックスウイルスなど）ワクチンベクターの構成において用いることができ；（ｉｉｉ）黒色腫を予防および／または治療するための方法および組成物においてさらに用いられるワクチンベクターとして、（ｉｖ）裸の形でまたは送達賦形剤で製剤化された、ワクチン剤（およびＲＮＡ分子）として、および（ｖ）分子および／または治療アッセイにおける検出試薬／ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、（ｉ）発現に要求される要素の制御下、特に適切なプロモーターの制御下に配置された本発明のＤＮＡ分子を含有する発現カセット；（ｉｉ）本発明の発現カセットを含有する発現ベクター；（ｉｉｉ）本発明の発現カセットおよび／またはベクターで形質転換または形質移入された原核または真核細胞、および（ｉｖ）本発明のＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下に、本発明の発現カセットおよび／またはベクターで形質転換または形質移入された原核または真核細胞を培養すること、および細胞培養株からコード化ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を回収することを含む本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を製造するための方法が提供される。
【００５９】
原核宿主または真核宿主から組換え発現系を選択することができる。真核宿主として酵母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、またはＪＥＧ３細胞）、類人猿細胞（例えば、S podoptera frugiperda (SF9) 細胞）、および植物細胞が挙げられる。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉなど原核宿主が用いられる。細菌および真核細胞は、当業者に対する多くの異なる供給源、例えば、the American Type Culture Collection（ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA）から入手可能である。
【００６０】
発現系の選択は、発現されるポリペプチドに望ましい特徴に依存する。例えば、特に脂質化形態またた他の形態での本発明のポリペプチドを生成することが有用でありうる。
【００６１】
発現カセットの選択は、選択される宿主系および発現されるポリペプチドに望ましい特徴に依存する。一般的に、発現カセットとして、選択宿主系において機能的であり、構成性または誘導性でありうるプロモーター；  リボソーム結合部位；  必要に応じて開始コドン（ＡＴＧ）；  シグナルペプチド（例えば、脂質化シグナルペプチド）をコードする領域；  本発明のＤＮＡ分子；  終止コドン；  および任意に３’末端領域（翻訳および／または転写ターミネーター）が挙げられる。シグナルペプチドコード化領域は、本発明のポリヌクレオチドに隣接し、適切な読み枠に配置されている。シグナルペプチドコード化領域は、成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と相同性または異種性であり、発現に用いられる宿主の分泌装置に対して特異的でありうる。本発明のＤＮＡ分子により構成される読み取り枠は、単独またはシグナルペプチドとともに、転写および翻訳が宿主系において生じるようにプロモーターの制御下に配置される。プロモーター、（および領域をコードするシグナルペプチド）は広く知られており、当業者には入手可能であり、例えば、アラビノース（プロモーターａｒａＢ）により誘導され、Ｅ．ｃｏｌｉなどグラム陰性菌において機能的であるネズミチフス菌のプロモータ（米国特許第５，０２８，５３０号明細書およびCagnon et al., Protein Eng. 4:843 (1991)に記載）、Ｔ７ポリメラーゼを発現する多くのＥ．ｃｏｌｉ株において機能的であるＲＮＡポリメラーゼをコードするバクテリオファージＴ７の遺伝子のプロモーター（米国特許第４，９５２，４９６号明細書に記載）、ＯｓｐＡ脂質化シグナルペプチド、およびＲｌｐＢ脂質化シグナルペプチド（Cagnon et al., Protein Eng. 4:843 (1991)）が挙げられる。
【００６２】
発現カセットは一般的に、選択された発現系においてその複製能のために選択される発現ベクターの一部分である。発現ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）は、Pouwels et al. （Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985, Supp. 1987）において記載されたものから選択することができる。
【００６３】
発現ベクターにで宿主細胞を形質転換／形質移入するための方法は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. （1994）において記載されている選択された宿主系に依存するであろう。
【００６４】
発現次第、本発明の組換えポリペプチド（またはポリペプチド誘導体）が生成され、細胞内区画に残り、細胞外培地または細胞膜周辺腔に分泌／排泄され、または細胞膜内に包埋される。次にポリペプチドは細胞抽出物からまたは組換え細胞培養株の遠心分離後の上清から実質的に精製された形で回収することができる。一般的に、組換えポリペプチドは抗体性親和精製、または小さな親和結合領域への遺伝子融合によるなど、当業者により容易に適応しうる他の方法により精製することができる。抗体性親和精製法は、本発明のポリペプチドを精製することにも利用可能である。本発明のポリペプチドを免疫親和性による精製に有用な抗体は下記の通り得ることができる。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、（ｉ）発現に要求される要素の制御下、特に適切なプロモーターの制御下に配置された本発明のＤＮＡ分子を含有する発現カセット；（ｉｉ）本発明の発現カセットを含有する発現ベクター；（ｉｉｉ）本発明の発現カセットおよび／またはベクターで形質転換または形質移入された原核または真核細胞、および（ｉｖ）本発明のＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下に、本発明の発現カセットおよび／またはベクターで形質転換または形質移入された原核または真核細胞を培養すること、および細胞培養株からコード化ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を回収することを含む本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を製造するための方法が提供される。
【００６６】
ＩＩＩ．  本発明の新規なタンパク質
本発明は、本発明の核酸分子によりコードされる分離タンパク質をさらに含む。本発明の文脈内で、本発明のタンパク質は、生物活性を保持するさまざまな構造的形態の主要タンパク質を含みうる。本明細書中で用いられる「改変型ｇｐ１００」または「改変型ｇｐ１００タンパク質」、「ｇｐ１００Ｍ」または「ｇｐ１００Ｍタンパク質」は、免疫系を調節する分子を提供するように改変されているｇｐ１００タンパク質を意味する。「ポリペプチド」または「タンパク質」により、長さまたは翻訳後改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、一連のアミノ酸が意味される。
【００６７】
本明細書中で用いられる「改変型ｇｐ１００」、「改変型ｇｐ１００タンパク質」、「ｇｐ１００Ｍ」または「ｇｐ１００Ｍタンパク質」という用語は、１個またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含有する、改変型ｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００Ｍタンパク質の類似体を含むことが意図されている。アミノ酸置換の性質は保存型または非保存型でありうる。保存型アミノ酸置換は、同様の荷電、サイズ、および／または疎水性特性のアミノ酸と１個またはそれ以上のアミノ酸を置換することを含む。保存型置換のみが行われると、結果として得られる類似体は改変型ｇｐ１００Ｍタンパク質と機能的に等価となる。非保存型置換は、異なる荷電、サイズ、および／または疎水性特性を有する１個またはそれ以上のアミノ酸と１個またはそれ以上のアミノ酸を置換することを含む。
【００６８】
１個またはそれ以上の挿入を、改変型ｇｐ１００タンパク質、好ましくはｇｐ１００Ｍタンパク質のアミノ酸配列の中へ導入してもよい。アミノ酸挿入は単一のアミノ酸残基または配列アミノ酸から成りうる。
【００６９】
欠失は１個またはそれ以上のアミノ酸、またはｇｐ１００Ｍアミノ酸配列から分離したタンパク質（すなわちアミノ酸）の除去から成りうる。欠失型アミノ酸は隣接的であることも隣接的でないこともありうる。
【００７０】
本明細書中で用いられる「ｇｐ１００Ｍ」、「改変型ｇｐ１００」、「改変型ｇｐ１００タンパク質」または「ｇｐ１００Ｍタンパク質」の表現には、ｇｐ１００Ｍタンパク質の相同体も含まれる。このような相同体は、そのアミノ酸配列が、そのコード化核酸配列が厳密なハイブリダイゼーション条件下（その条件は当業者に周知である）にｇｐ１００Ｍタンパク質を得るために用いられる核酸プローブとハイブリッド形成する他の源からのｇｐ１００Ｍ領域のアミノ酸配列で構成されているタンパク質である。ｇｐ１００Ｍタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７２％、好ましくは７５乃至９０％類似しているアミノ酸配列を含有するタンパク質がｇｐ１００Ｍタンパク質活性を示すことが予想される。
【００７１】
本明細書中で用いられるように、「改変型ｇｐ１００」、「改変型ｇｐ１００タンパク質」、「ｇｐ１００Ｍ」、または「ｇｐ１００Ｍタンパク質」という表現も改変型ｇｐ１００タンパク質、またはｇｐ１００Ｍタンパク質のアイソフォームが考慮されている。アイソフォームは改変型ｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００Ｍタンパク質と同じ数およぶ種類のアミノ酸を含むが、アイソフォームは異なる分子構造を有する。本発明により考慮されるアイソフォームは、本明細書中に記載される本発明のタンパク質と同じ特性を有するものである。その表現には、改変型ｇｐ１００タンパク質またはｇｐ１００Ｍタンパク質に類似性を与える他のタンパク質も含まれている。
【００７２】
大まかに述べれば、本発明は、改変型ｇｐ１００タンパク質、好ましくはｇｐ１００Ｍタンパク質のそれに相当する活性を有する分離タンパク質を提供する。本発明の好ましい実施形態において、タンパク質は図２に示したアミノ酸配列を有する。
【００７３】
全長アミノ酸配列のほかに、本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されるようにタンパク質の切断およびタンパク質およびその切断の類似体と相同体をも含む。切断タンパク質は少なくとも１５個のアミノ酸残基のペプチドを含みうる。図２に示したアミノ酸配列および／または本明細書中に記載したその切断を有するタンパク質の類似体は、１個またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含有するアミノ酸配列を含みうるが、これに限定されない。アミノ酸置換の性質は保存型または非保存型である。保存型アミノ酸置換は同様の荷電、サイズ、および／または疎水性特性のアミノ酸と１個またはそれ以上のアミノ酸を置換することを含む。保存型置換のみが行われると、結果として得られる類似体は機能的に等価となる。非保存型置換は、異なる荷電、サイズ、および／または疎水性特性を有する１個またはそれ以上のアミノ酸と１個またはそれ以上のアミノ酸を置換することを含む。
【００７４】
１個またはそれ以上のアミノ酸挿入は図２に示したアミノ酸配列の中へ挿入しうる。アミノ酸配列は単一のアミノ酸残基または一連の配列アミノ酸から成りうる。
【００７５】
欠失は１個またはそれ以上のアミノ酸、または図２に示したアミノ酸配列からの分離タンパク質の除去から成りうる。欠失型アミノ酸は隣接的であることも隣接的でないこともありうる。欠失変異による結果として得られる類似体の下限長さは、約１０個のアミノ酸、好ましくは１００個のアミノ酸である。
【００７６】
本発明のタンパク質の類似体は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することにより調製しうる。本発明のタンパク質のる自体の発現のために構成されたヌクレオチド配列における変異は、コード配列の読み枠を保存しなければならない。さらに、変異は、ハイブリッド形成して、受容体ｍＲＮＡの翻訳に有害な影響を与えるループまたはヘアピンなど二次ｍＲＮＡ構造物を生じうる相補領域を生成しないことが好ましい。
【００７７】
負の配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位によりフランキングされた変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の部位で変異を導入しうる。ライゲーション後、結果として得られる再構成された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。
【００７８】
あるいは、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的変異原性法を用いて、必要な置換、欠失、または挿入に従い変更された特定のコドンを有する遺伝子変化を提供しうる。本発明のタンパク質の欠失または切断は、所望の欠失に隣接した便利な制限エンドヌクレアーゼを利用して構成することもできる。制限に続いて、オーバーハングを充填し、ＤＮＡを再連結しうる。上記の変化を製造する模範的方法はSambrookらにより開示されている（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。
【００７９】
本発明のタンパク質は図２に示したアミノ酸配列の相同体及び／又は本明細書中に記載されたその切断をも含む。このような相同体は、そのアミノ酸配列が、そのコード化核酸配列が厳密なハイブリダイゼーション条件下（本明細書中の厳密なハイブリダイゼーションの条件の考察を参照）に本発明のタンパク質を得るために用いられる核酸プローブとハイブリッド形成するアミノ酸配列で構成されているタンパク質である。
【００８０】
相同性タンパク質は、図２に示したアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０〜９０％の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質を含む。相同性は一般的に配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）を用いて測定される。同様のアミノ酸配列は、できる限りの相同性（すなわち同一性）を得るために整列される。このために、配列の中へ人工的にギャップを導入する必要がありうる。最適な整列が配置されると、相同性（すなわち同一性）の程度は、位置の総数に対して、両方の配列のアミノ酸が同一である位置のすべてを記録することにより確立される。例えば、配列の整列はALIGN （商標）またはGENALIGN（商標）コンピュータプログラム（Inteligenetics Suite 5.4, Oxford Molecular）を用いて実施しうる。ALIGNではNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)）およびその最新の修正を使用し、２つの配列間の類似性の領域を位置づける。２つの配列間の最大の類似性の領域を見出すことは、Needleman and Wunsch 1997アルゴリズムの反復性行列計算を用いて厳密な方法で解決することができる。分析は、ループアウトまたは欠失の最小数で連結された内部欠失または挿入のない領域に制限される。Sellers （Ｊ．Appl. Math (Siam) 2６:787 (1974)）は配列間の「距離」の実際のメートル法を開発し、Watermanら（Advan. Math 20:367 (1976)）はこのアルゴリズムを拡大し、任意の長さの挿入および欠失を含めた。Smith（Ｊ．ＭＯｌ． Bioｌ 147:195 (1981)）は、初期のアルゴリズムを改善し、最大の類似性の部分列を見出した。このアルゴリズムは、これらの配列を２００乃至４００の塩基の部分に分け、それらを最後の最良のマッチに再会合することにより５０００もの長い塩基配列を分析するために用いられている。配列を分けてそれを再会合するこの方法は、きわめて強力であることがわかっている。このアルゴリズムにより、プログラムが類似性を検索する部分のサイズが特定される。次にプログラムは隣接した部分列の重複をチェックした後に部分を集合する。欠失の重みおよび重複の相対サイズは制御しうる。プログラムは密接に関連した配列の違いを示す結果を表示する。GENALIGNは多重整列化プログラムである。Martinez/Regions (Sobel and Martinez, Nucleic Acid Res 14:363 (1985)) またはNeedleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))を用いて９９までの配列の整列について分析しうる。GENALIGNは、互いに隣接した最も密接に整列した配列に置く順に配列を配置する。コンセンサス配列が多重配列整列化により表示される。コンセンサス配列の展開に用いられる配列は、他のプログラムに使用される。GENALIGNは検索パラメーターの変更を可能にするため、配列の交互の整列が形成できる。
【００８１】
これらのプログラムはそれらの初期設定値を使用して用いられる。初期設定値は以下の通りである：
ＦａｓｔＤＢ
アミノ−Ｒｅｓ−長さ          ＝２
欠失−ウェイト                ＝５．００
長さ−因子                    ＝０
マッチング−ウェイト          ＝１．００
核−Ｒｅｓ−長さ              ＝４
拡散−因子                    ＝５０
Ｆｉｎｄｓｅｑ
検索パラメーター:
類似性マトリックス              単位
Ｋ−タプル                      ４
ミスマッチペナルティ            １
結合ペナルティ                  ３０
無作為化群長さ                  ０
カットオフスコア                ５
整列パラメーター:
窓サイズ                        ２
ギャップペナルティ              １．００
ギャップサイズペナルティ        ０．３３
本発明は、本発明のタンパク質のアイソフォームも考慮している。アイソフォームは本発明のタンパク質と同じ数と種類のアミノ酸を含むが、このアイソフォームは異なる分子構造を有する。本発明により考慮されるアイソフォームは、本明細書中に記載された発明のタンパク質と同じ特性を有するものである。
【００８２】
図２に示したものなど改変型ｇｐ１００タンパク質の配列と類似した配列を有するポリペプチドとして、天然の対立遺伝子変異形のほか、抗原性の面から、図２に示した配列を有するポリペプチドと類似である変異体または他の非天然変異形が挙げられる。
【００８３】
当業界において周知のように、対立遺伝子変異形は、ポリペプチドの生物機能を変化させることがない１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するとして特徴づけられるポリペプチドの代替形である。「生物機能」により、その機能が細胞の増殖や生存に必要ではない場合でも、自然に発生する細胞におけるポリペプチドの機能が意味される。例えば、ポリンの生物機能は細胞外培地に存在する化合物の細胞への侵入を可能にすることである。生物機能は抗原機能と異なる。ポリペプチドは１つ以上の生物機構を持ちうる。
【００８４】
対立遺伝子変異形は自然状態ではきわめて一般的である。例えば、細菌種（すなわち、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は通常、少数の対立遺伝子変異形により互いに異なるさまざまな菌株により代表される。実際、異なる菌株において同じ生物機能を果たすポリペプチドは、それぞれの菌株において同一ではないアミノ酸配列を持ちうる。このような対立遺伝子の変型は同様にポリペプチドレベルで反映されうる。
【００８５】
本発明は、選択されたタンパク質、または融合タンパク質を生成する選択可能なマーカータンパク質（以下参照）で共役した本発明のタンパク質をも含む。また、本発明の改変型ｇｐ１００タンパク質の免疫原性タンパク質および／または断片は発明の範囲内である。
【００８６】
本発明に含まれる融合ポリペプチドの例として、補助活性を有するポリペプチドに融合した（例えば、コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉ熱変動性毒素のいずれかのサブユニットＢなど）本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体があげられる。融合を達成するためにいくつかの可能性が存在する。まず、本発明のポリペプチドを補助活性を有するポリペプチドのＮ−、または好ましくは、Ｃ−末端に融合することができる。次に、本発明のポリペプチド断片を補助活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列内に融合することができる。
【００８７】
本発明の（切断、類似体、等を含む）タンパク質は、組換えＤＮＡ法を用いて調製しうる。したがって、本発明のタンパク質をコードする配列を有する本発明の核酸分子は、タンパク質の十分な発現を保証する適切な発現ベクターへ周知の方法で組み入れることができる。可能な発現ベクターとして、ベクターが用いられる宿主細胞と適合性である限り、コスミド、プラスミド、または改変型ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。「ベクターは宿主細胞の形質転換に適している」という表現は、発現ベクターが本発明の核酸分子および発現のために用いられる宿主細胞に基づき選択される付随調節性配列を含有し、該調性節配列が核酸分子と操作的に結合されているという意味として定義される。「操作的に結合」は、核酸が核酸の発現を可能にする方法で調節性配列と結合されることを意味することが意図されている。
【００８８】
したがって、本発明は、本発明の核酸分子、またはその断片、および挿入されるヌクレオチド配列の転写および翻訳に必要な調節を含有する本発明の組換え発現ベクターを考慮している。適切な調節性配列は、細菌、真菌、またはウイルス遺伝子を含むさまざまな源から誘導しうる。（例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載された調節性配列を参照）。適切な調節性配列の選択は、選ばれる宿主細胞に依存し、当業界の通常の技術の１つにより容易に達成しうる。このような調節性配列の例として以下のものが挙げられる：  転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、またはリボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）。また、選ばれる宿主細胞および使用されるベクターによって、他の配列（複製開始点、付加ＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を与える配列など）を発現ベクターへ組み入れることができる。必要な調節性配列は、上記の調節性遺伝子配列のほかにｇｐ１００／ｇｐ１００Ｍ遺伝子および／またはそのフランキング領域により供給することもできる。
【００８９】
本発明は、アンチセンス方向で発現ベクターにクローン化した本発明のＤＮＡ核酸分子を含む組換え発現ベクターをさらに提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の転写により、図１に示したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列にアンチセンスされるＲＮＡ分子の発現を可能にする方法で調節性配列に操作的に結合されている。アンチセンス核酸に操作的に結合された調節性配列を選択し、アンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を方向づけることができる。
【００９０】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換または形質移入された宿主細胞の選択を促進する選択可能なマーカー遺伝子をも含む。選択可能なマーカー遺伝子の例は、Ｇ４１８やハイグロマイシン（一部の薬物に対する耐性を与える）、β−ガラクトシダーゼ、ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどタンパク質をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなど選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化によりモニタリングされる。選択可能なマーカー遺伝子がネオマイシン耐性など抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする場合は、Ｇ４１８で形質転換体細胞を選択することができる。当業者には周知であるように、選択可能なマーカー遺伝子を組み入れた細胞は残存するが、このような組み入れられた検出可能な遺伝子を有することがない細胞は死ぬことになる。これにより本発明の組換え発現ベクターの発現を視覚化し評価することが可能となる。選択可能なマーカーは興味の対象となる核酸から分離ベクター上に導入できることも理解されよう。
【００９１】
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現増大；  組換えタンパク質の溶解性増大を提供し；  および／または親和精製においてリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精製における補助となる融合成分をコードする遺伝子も含みうる。例えば、タンパク分解性切断部位を標的組換えタンパク質に添加し、融合タンパク質の精製後の融合成分から組換えタンパク質の分離を可能にしうる。
【００９２】
組換え発現ベクターを宿主細胞へ導入し形質転換宿主細胞を生成することができる。「形質転換宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換または形質移入された原核細胞および真核細胞を含めることが意図されている。「で形質転換された」、「で「形質移入された」、「形質転換」および「形質移入」という用語は、当業界において周知の多くの可能な方法の１つにより細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含することが意図されている。原核細胞は、例えば、電気穿孔法または塩化カルシウム仲介形質転換により核酸で形質転換することができる。核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン仲介形質移入、リポフェクチン、電気穿孔法または微量注入法など在来の方法によって哺乳動物の細胞へ導入することができる。宿主細胞を形質転換および形質移入するための適切な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)）および他の実験室教科書において見出すことができる。
【００９３】
適切な宿主細胞として、多種多様の原核および真核宿主細胞が挙げられる。例えば、本発明のタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉなど細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いた）、酵母菌または哺乳動物の細胞において発現しうる。他の適切な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)において見出すことができる。
【００９４】
本発明のタンパク質は、固相合成（Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154 (1964)）または同種溶液内の合成（Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry (1987), (ed. E. Wansch) Vol. 15, pts. I and II, Thieme, Stuttgart）などタンパク質の化学において公知の方法を用いた化学合成により調製することもできる。
【００９５】
ＩＶ．  ワクチン
本発明は、免疫原が有効な量のｇｐ１００または改変型ｇｐ１００核酸分子、および／または、その免疫原性断片（好ましくは適切な希釈剤または担体との混合物における）である、動物の免疫系を調節するためのワクチンを含む。
【００９６】
したがって、本発明は、それを必要とする動物に対し、有効な量のｇｐ１００または改変型ｇｐ１００核酸分子、および／または、その免疫原性断片（好ましくは適切な希釈剤または担体との混合物における）を投与することを含む動物の免疫応答を調節する方法も含む。
【００９７】
また、本発明のワクチンは、適切な希釈剤、補助剤および／または担体を含みうる。好ましくは、ワクチンはインビボでのワクチンの免疫原性をさらに増強しうる１つまたはそれ以上の他の補助剤を含む。これらの１つまたはそれ以上の補助剤は、例えば、グラム陰性菌（内毒素）からのＬＰＳのリピドＡタンパク質、ミコバクテリアの二ミコール酸トレハロース、リン脂質リソレシチン、ジメチルジクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、一部の直鎖状ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＰ−ＰＯＥ）ブロック重合体、水酸化アルミニウム（および他のアルミニウム化合物）、およびリポソーム（以下参照）を含む当業界において周知の多くの補助剤から選択しうる。
【００９８】
別の好ましい補助剤／免疫刺激剤は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（“ＣｐＧ”）を含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧはＤＮＡにおいて存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。ＣｐＧは、全身と粘膜の両経路で投与する補助剤として当業界において周知である（WO 9602555; European Patent EP 468520; Davies et al. (1998) J. Immunol. 160:87; McCluskie and Davis (1998) J. Immunol. 161:4463）。多くの研究において、ＢＣＧ遺伝子配列から誘導される合成オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性効果を誘発する能力があることもわかっている（インビトロおよびインビボにおいて； Krieg, (1995) Nature 374:546）。免疫刺激性オリゴヌクレオチド配列の詳細な分析は、ＣＧモチーフが特定の配列文脈内にある必要があり、このような配列が細菌のＤＮＡにおいては一般的であるが脊椎動物のＤＮＡにおいては稀であることを明らかにしている。（例えば、免疫刺激性配列は頻繁であり、プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、この場合、ＣＧモチーフはメチル化されていない；  しかし他の非メチル化ＣｐＧ配列は免疫刺激性であることが知られており、そういうものとして本発明において使用しうる。）
ワクチンは補助剤として免疫応答を増強することが知られているサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦおよびＩＦＮγを含む）サイトカイン、補助刺激性分子（Ｂ７ファミリーのそれなど）および／または他のリンホカインを含みうる。ワクチンは、アジ化ナトリウム、チメルソール、ベータプロピオラクトン、および二元エチレンイミンをも含みうる。
【００９９】
本発明のワクチン組成物は、インビボで生物学的に適合性の形態で対象に対し投与するために適切である。本明細書中で用いられる「インビボでの投与のために適切な生物学的に適合性」という表現は、治療効果が毒性作用を上回る形態の物質が投与されることを意味する。
【０１００】
ワクチンの用量は、動物の疾患段階、年齢、性別、体重、および所望の反応のワクチンの誘発能などの因子により変動しうる。投与方式は最適な治療反応を提供するように調整しうる。例えば、いくつかの分割量を毎日投与し、または治療状況の要件により用量を比例的に減少しうる。ワクチンの用量は、状況によって最適な予防的用量反応を提供するように変えることもできる。
【０１０１】
ワクチンは注射（皮下、静脈内、筋内、鼻腔内等）、経口投与、吸入、経皮的投与（局所クリームまたは軟膏、等）、または座剤適用など便利な方法で投与しうる。
【０１０２】
それ自体として、本発明の１つの態様において、（ｉ）改変型ｇｐ１００タンパク質（またはその免疫原性断片）を含有するワクチン；  （ｉｉ）希釈剤または担体とともに、本発明のｇｐ１００タンパク質（またはその免疫原性断片）を含有する物質の組成物；  （ｉｉｉ）本発明の改変型ｇｐ１００タンパク質（またはその免疫原性断片）の治療的または予防的に有効な量を含有する医薬組成物；  （ｉｖ）本発明の改変型ｇｐ１００タンパク質（またはその免疫原性断片）の免疫原性的に有効な量を投与し、免疫応答を誘発すること（例えば、改変型ｇｐ１００タンパク質に対する防御的または治療的免疫応答）を含む哺乳動物（例えば、ヒト；  あるいは、その方法が獣医用途に用いることができる）において改変型ｇｐ１００タンパク質（またはその免疫原性断片）に対する免疫応答を誘発する方法；  （ｖ）必要とする個体に対し本発明の改変型ｇｐ１００タンパク質（またはその免疫原性断片）の予防的または治療的量を投与することを含む黒色腫を予防および／または治療するための方法が提供される。また、本発明は、黒色腫の予防および／または治療のための薬品の調製における本発明の改変型ｇｐ１００タンパク質（またはその免疫原性断片）の使用を包含する。
【０１０３】
本発明のワクチンは、本発明の改変型ｇｐ１００タンパク質をコードする核酸分子を含みうる。このようなワクチンは核酸ワクチンと呼ばれるが、遺伝子ワクチン、ポリヌクレオチドワクチンまたはＤＮＡワクチンとも呼ばれ、そのすべてが本発明の範囲内である。このような実施形態において、改変型ｇｐ１００ワクチンは宿主動物におけるインビボで製造される。核酸を含有するワクチンは、例えば、レトロウイルスベクター、アルファウイルス、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、他のウイルスベクター、細菌のＤＮＡ、プラスミド、または遊離／裸のＤＮＡを含む適切なベクター（すなわち、『ワクチンベクター』）を用いて送達しうる。
【０１０４】
したがって、本発明の別の態様において、（ｉ）発現に必要とされる要素の制御下に配置された本発明のＤＮＡ分子を含有するワクチンベクター；  （ｉｉ）希釈剤または担体とともに、本発明のワクチンベクターを含有する物質の組成物；  （ｉｉｉ）本発明のワクチンベクターの治療的または予防的に有効な量を含有する医薬組成物；  （ｉｖ）本発明のワクチンベクターの免疫原性的に有効な量を哺乳動物に投与し、免疫応答を誘発すること（例えば、改変型ｇｐ１００タンパク質に対する防御的または治療的免疫応答）を含む哺乳動物（例えば、ヒト；  あるいは、その方法が獣医用途に用いることができる）において哺乳動物における改変型ｇｐ１００タンパク質に対する免疫応答を誘発する方法；  （ｖ）必要とする個体に対し本発明のワクチンベクターの予防的または治療的量を投与することを含む黒色腫を予防および／または治療するための方法が提供される。また、本発明は、黒色腫の予防および／または治療のための薬品の調製における本発明のワクチンベクターの使用を包含する。
【０１０５】
ｉ  ワクチンベクター
ワクチンベクターは、他のウイルスベクターのポックスウイルス、細菌のＤＮＡ、プラスミドまたは遊離／裸のＤＮＡでありうる。ワクチンベクターはレシピエント動物細胞における組込みができないことが好ましい。前記ワクチンベクターからの発現の要素は、レシピエント動物細胞における発現に適したプロモーターを含みうる。
【０１０６】
当業界において入手可能な生きたワクチンベクターとして、アルファウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターなどウイルスベクターのほか細菌ベクター（例えば、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルメット・ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ  （ＢＣＧ））、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））が挙げられる。
【０１０７】
アデノウイルスベクターの例、および本発明のＤＮＡ分子を発現する能力があるアデノウイルスベクターを作成するための方法が、米国特許第４，９２０，２０９号明細書（参考として本明細書中で援用）に記載されている。用いることができるポックスウイルスベクターとして、例えば、鶏痘ウイルス、ワシニアウイルスおよびカナリア痘瘡ウイルスが挙げられ（米国特許第５，７６６，５９９号および米国特許第５，３６４，７７３号、米国特許第５，７５６，１０３号、（ＡＬＶＡＣ（２）、米国特許第５，９９０，０９１号、米国特許第６，００４，７７７号明細書に記載）；  本発明の核酸を発現する能力があるポックスウイルスベクターは、当業者には周知のように相同的組換えにより得ることができるため、本発明のポリヌクレオチドは哺乳動物の細胞における発現のために適切な条件下にウイルスゲノムに挿入される（下記参照）。
【０１０８】
１つの好ましい態様において、改変ポックスウイルスベクターはＡＬＶＡＣ（カナリア痘瘡ウイルスから誘導されている）である。ＡＬＶＡＣは非トリ宿主において生産的に複製することはなく、その安全性プロフィールを改善すると考えられる特徴である。
【０１０９】
ＡＬＶＡＣは、認可カナリア痘瘡ワクチンのプラーククローン化誘導体、Ｋａｎｐｏｘであった弱毒化したカナリア痘瘡ウイルス性ベクターである（Ｔartaglia et a1., Virol. 188:217 (1992)）（米国特許第５，７５６，１０３号明細書）。ＡＬＶＡＣは、Ｋａｎａｐｏｘの一部の一般的特性と同じである一部の一般的な特性を有する。外因性免疫原を発現するＡＬＶＡＣ性組換えウイルスはワクチンベクターとして効果的であることも明らかにされている（Tartaglia, J. et al, In AIDS Research Reviews (vol. 3), Koff, W., Wong-Staol, F., Kenedy, R.C. (eds), Marcel Dekker NY, pp. 361-378 (1993); Tartaglia, J. et al. J. Virol. 67:2370 (1993)）。例えば、狂犬病ウイルスの糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣ組換え体で免疫化したマウスは、狂犬病ウイルスの致死チャレンジから防御され（Tartaglia, J. et al. (1992), Virology 188:217）、ワクチンベクターとしてのＡＬＶＡＣの可能性を示した。ＡＬＶＡＣ性組換え体はイヌジステンバーウイルス（Taylor, J. et al., (1992), Virology 187:321）および狂犬病ウイルス（Perkus, M.E. et al., In Combined Vaccines and Simultaneous Administration: Current Issues and Perspective, Annals of New York Academy of Sciences (1994)）をチャレンジしたイヌ、ネコ白血病ウイルス（Tartaglia, J. et al. J. Virol. 67:2370 (1993)）をチャレンジしたネコ、およびウマインフルエンザウイルス（Taylor, J. et al., In Proceedings of the Third International Symposium on Avian Influenza, Univ. of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, pp. 331-335 (1993)）をチャレンジしたウマにおいても効果的であることがわかっている。
【０１１０】
ＡＬＶＡＶ（２）は、ワクシ二ア転写要素Ｅ３ＬおよびＫ３ＬがＣ６部位内に挿入されている第二世代のＡＬＶＡＣベクターである（米国特許第５，９９０，０９１号；  米国特許第６，００４，７７７号明細書）。Ｅ３ＬはｄｓＲＮＡに特異的に結合する能力があるタンパク質をコードする。Ｋ３Ｌ  ＯＲＦはＥ１Ｆ−２との重要な類似性を有する。ＡＬＶＡＣ（２）内ではＥ３Ｌ遺伝子はその天然のプロモーターの転写制御下にあるが、Ｋ３Ｌは早発／遅発ワクチンＨ６プロモーターの制御下に配置されている。Ｅ３Ｌ遺伝子およびＫ３Ｋ遺伝子はＡＬＶＡＣ（ＩＩ）ｌを感染した細胞におけるＰＫＲを抑制するように作用し、外来遺伝子発現のレベルおよび持続の増強を可能にする。
【０１１１】
別のワクチンベクター系は、自然宿主制限ポックスウイルスの使用を含む。鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）はポックスウイルス科のアビポックス属の原型ウイルスである。鶏痘ウイルスから誘導されるベクターは生成されている  （すなわち、ＴＲＯＶＡＣ、米国特許第５，７６６，５９９号明細書を参照）  アビポックスウイルスの複製はトリ種に制限され （Matthews, Inter Virol. 17:42 (1982)）、ヒトを含む非トリ種における増殖性感染を誘発するアビポックスウイルスの文献における報告は存在しない。この宿主制限により、他の種へのウイルスの伝染に対する固有な安全性障害が提供され、獣医およびヒト用途におけるアビポックスウイルス性ワクチンベクターの使用が魅力的な提案となる。
【０１１２】
ＦＰＶは家禽病原体から抗原を発現するベクターとして有利に用いられている。病原性トリインフルエンザウイルスの赤血球凝集素タンパク質はＦＰＶ組換え体において発現した。組換え体のニワトリやシチメンチョウへの接種後、同種または異種のいずれかの病原性インフルエンザウイルスのチャレンジに対して防御性である免疫応答が誘発された (Taylor, J. et al., (1988) Vaccine 6:504)。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現するＦＰＶ組換え体も開発されている（Taylor, J. et al. (1990) J. Virol. 64:1441; Edbauer, C. et al., (1990) Virology 179:901）。
【０１１３】
ＭＶＡと命名された高度に弱毒化されたワクチン系もポックスウイルス性ワクチンのベクターとして用いられている。ＭＶＡの使用は米国特許第５,１８５，１４６号明細書に記載されている。
【０１１４】
他の弱毒化ポックスウイルスベクターが、野生ウイルス系の遺伝子改変により調製されている。例えば、ＮＹＶＡＣはワクシニアのコペンハーゲン系から特異的な病原性および宿主範囲の遺伝子を除去することにより誘導され（Tartaglia, J. et aL (1992) Virology 188:217）、発現された外来抗原に対する防御的免疫応答を誘発することにおける組換えベクターとして有用であることがわかっている（米国特許第５，３６４，７７３号明細書）。ＴＲＯＶＡＣベクターは、使用しうる弱毒化ポックスウイルスのさらに別の例を提供する（米国特許第５，７６６，５９９号明細書）。
【０１１５】
組換えポックスウイルスは当業界において周知であり、ワクシニアウイルスやアビポックスウイルスなどポックスウイルスの合成組換え体を生成するための方法（米国特許第４，７６９，３３０号；  第４，７４４，８４８号；  第４，６０３，１１２号；  第５，１００，５８７号；  および第５，１７９，９９３号明細書に記載）と類似の２つのステップで作成することができる。明らかに、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣベクターの弱毒化プロフィールおよび外因性免疫原に対する体液性と細胞性の免疫応答を誘発するその明らかな能力に基づき（Tartaglia, J. et al, In AIDS Research Reviews (vol.3), Koff, W., Wong-Staol, P. and Kenedy, R.C. (eds), Marcel Dekker NY, pp. 361-378 (1993); Tartaglia, J. et al. (1993) J. Virol. 67:2370;; Taylor, J. et al., (1992) Virology 187:321）、このような組換えウイルスは、以前に記載されたワクシニア性組換えウイルスよりも明らかに利点を提供する。したがって、改変型ｇｐ１００組換えポックスウイルス、およびそれからの組成物や生成物（特にＡＬＶＡＣ改変ｇｐ１００組換え体およびそれからの組成物や生成物）の提供が、現在の技術状態に対してきわめて望ましい利点となるであろう。
【０１１６】
本発明のプラスミドおよび／または遊離／裸の核酸（すなわち、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ））もワクチンベクターとしてワクチン（例えば、治療的または予防的）目的で動物に投与することができる（米国特許第５５８９４６６号明細書; McDonnell and Askari, NEJM 334:42-45 (1996); Kowalczyk and Ertl, Cell Mol. Life Sci. 55:751-770 (1999)）。本発明のＤＮＡ分子を用いると、それは遊離／裸のまたはプラスミドの形となりうる。一般的に、哺乳動物の細胞において複製ができず、哺乳動物のゲノムでの組込みができない形態である。ＤＮＡ分子はまた、一般的に哺乳動物の細胞における発現のために適したプロモーターの制御下に配置される。プロモーターは一様にまたは組織特異的に機能しうる。非組織特異的プロモーターの例は、早期サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４，１６８，０６２号明細書に記載）およびラウス肉腫ウイルスプロモーターを誘発する。デスミンプロモーターは組織特異的であり、筋細胞における発現を駆動する。さらに一般的に、有用なベクターが記載されている（すなわち、国際公開第９４／２１７９７号パンフレット）。
【０１１７】
ＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種では、本発明のポリヌクレオチドが改変型ｇｐ１００タンパク質またはその免疫原性断片の前駆または成熟形態をコードしうる。前駆形態をコードするときは、前駆形態が同種または異種でありうる。後者の場合には、組織型プラスミノーゲン因子（ｔＰＡ）のリーダー配列など、真核リーダー配列を用いることができる。
【０１１８】
本発明のポリヌクレオチド態様の調製において、ポリヌクレオチドを調製し精製するための分子生物学の標準的な方法を用いることができる。ワクチンとしての使用のために、本発明のポリヌクレオチドは当業者に周知のさまざまな方法に従い調製することができる。
【０１１９】
まず、裸の／遊離形態、送達賦形剤（陰イオン性リポソーム、陽イオン性脂質、微小粒子、（例えば、金の微小粒子）、沈降剤（例えば、リン酸カルシウム）など）または他の形質移入促進剤を含まない形でポリヌクレオチドを用いることができる。この場合、ポリヌクレオチドは生理的に許容される溶液（滅菌食塩水または滅菌緩衝食塩水など）中で担体の存在下または非存在下に簡単に溶解することができる。存在下では、担体は等張性、低浸透圧性、または弱高浸透圧性であり、比較的低いイオン強度を有することが好ましい（ショ糖溶液（例えば、２０％ショ糖含有溶液）などにより供給される）。
【０１２０】
あるいは、ポリヌクレオチドは、細胞取り込みにおける補助となる薬剤と結合することができる。すなわち、（ｉ）細胞透過性を改変する化学薬品（ブピバカインなど；  例えば、国際公開第９４／１６７３７号パンフレットを参照）で補完し、（ｉｉ）リポソームへカプセル化し、または（ｉｉｉ）陽イオン脂質またはシリカ、金、またはタングステンの微小粒子と結合することができる。
【０１２１】
陽イオン脂質は当業界において公知であり、遺伝子送達用に一般的に用いられている。このような脂質としてリポフェクチン（ＤＯＴＭＡ  （Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−塩化トリメチルアンモニウム）、ＤＯＴＡＰ  （１，２−ビス（オレイロキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ  （ジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウム）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（３  ベータ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）などコレステロール誘導体が挙げられる。これらの陽イオン脂質の記述が、欧州特許第１８７，７０２号明細書、国際公開第９０／１１０９２号パンフレット、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、国際公開第９１／１５５０１号、第９５／２６３５６号パンフレット、および米国特許第５，５２７，９２８号明細書において見出すことができる。遺伝子送達用の陽イオン脂質は、例えば、国際公開第９０／１１０９２号パンフレットに記載されたＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）など中性脂質と結合して用いられることが好ましい。
【０１２２】
陽イオンリポソームを含有する調製物に他の形質移入促進化合物を添加することができる。それらの数は、例えば、国際公開第９３／１８７５９号、第９３／１９７６８号、第９４／２５６０８号、および第９５／２３９７号パンフレットに記載されている。それらはすなわち、核膜を通じてＤＮＡの輸送を促進するために有用なスペルミン誘導体（例えば、国際公開第９３／１８７５９号パンフレットを参照）およびＧＡＬＡ、グラミシジンＳ、および陽イオン胆汁酸塩など膜透過化化合物（例えば、国際公開第９３／１９７６８号パンフレットを参照）を含む。
【０１２３】
遺伝子送達用に金またはタングステンの微小粒子も用いることができる（国際公開第９１／３５９号および第９３／１７７０６号パンフレットに記載）。この場合、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号明細書、米国特許第５，０１５５８０号明細書、および国際公開第９４／２４２６３号パンフレットなどに記載されている針なし注射装置（『遺伝子銃』）を用いて皮内または表皮内の経路によって微小粒子被覆ポリヌクレオチドを注射することができる。
【０１２４】
陰イオンおよび中性リポソームも当業界において公知であり（例えば、Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL Press (1990)、リポソームを製造するための方法の詳細な説明について参照）、ポリヌクレオチドを含めて、広範囲の製品を送達するために有用である。
【０１２５】
本発明のワクチンベクターはサイトカイン（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）および／または補助刺激分子（例えば、Ｂ７ファミリーの分子など）および／または免疫応答を増強する他のリンホカインをも発現しうる。したがって、ワクチンベクターは、例えば、サイトカインおよび／またはリンホカインおよび／または動物の細胞における発現に必要とされる適切な要素の制御下に配置される補助刺激分子をコードする付加ＤＮＡ配列を含みうる。
【０１２６】
あるいは、本発明の組成物は、それぞれ本発明の態様（すなわち、本発明のポリペプチド誘導体、サイトカインおよび／またはリンホカインおよび／または補助刺激分子）ポリペプチドまたは本発明の誘導体を発現する能力がある一部のワクチンベクターを含みうる。
【０１２７】
ｉｉ  投与様式
動物における癌を治療または予防するためのワクチン接種法において、本発明のワクチンベクターは当業者に周知のワクチン分野における使用の在来の経路により投与することができる。これには、例えば、粘膜（例えば、眼、鼻腔内、経口、胃、肺、腸、直腸、膣、または尿路）表面への、非経口（例えば、皮下、皮内、筋内、静脈内、または腹腔内）経路によるまたは結節内の投与が含まれる。好ましい経路はワクチンベクターの選択によって決まる。投与は一回量で、または間隔を置いて反復して行うことができる。適切な投与量は、ワクチンベクターそのもの、投与経路およびワクチン接種すべき動物の状態（体重、年齢など）など熟練者により理解されるさまざまなパラメーターによって決まる。
【０１２８】
本発明のワクチンまたは免疫原の投与は、予防的または治療的のいずれかの目的のためでありうる。予防的に提供される場合、免疫原は黒色腫による何らかの証拠に先立って、または症状に先立って、または在来の治療により疾患が取り除かれるが再発の重大な危険にある患者において提供される。免疫原の予防的投与は哺乳動物における黒色腫を予防または減弱するために役立つ。治療的に提供される場合、免疫原は疾患の発症時（または発症後）または疾患の何らかの症状の開始時に提供される。免疫原の治療的投与は疾患を減弱するために役立つ。
【０１２９】
特に好ましいワクチン接種法は初回追加免疫プロトコールを包含する。最近の研究では、このプロトコールは、外来遺伝子産物を発現するポックスウイルス組換え体（または遺伝子産物をコードする他の核酸）による免疫化の後、同遺伝子産物（またはそれをコードする核酸）の精製されたサブユニットの製剤の形態を用いて追加免疫することにより、いずれかの産物のみで誘発される応答に対して免疫応答の増強を誘発することが示されている。したがって、初回追加免疫プロトコールにおいて改変型ｇｐ１００を用いることは本発明の範囲内である。初回追加免疫プロトコールを開示した方法論の例が、国際公開第９８／５８９５６号、第００／００２１６号、第９８／５６９１９号、第９７／３９７７１号、および  第９８／５８９５６号パンフレットに記載され、これらは参考として本明細書中で援用される。
【０１３０】
一般にワクチンレシピエントにおいて用いられる裸の／遊離ＤＮＡの量は、ＤＮＡ作成物において用いられるプロモーターの強度、発現遺伝子産物の免疫原性、投与が意図された動物の状態（すなわち、体重、年齢、および動物の一般状態）、投与の様式、および剤型によって決まる。一般に、約１μｇ乃至約１ｍｇ、好ましくは、約１０μｇ乃至約８００μｇおよび、さらに好ましくは、約２５μｇ乃至約２５０μｇの治療的または予防的に有効な量を成人に投与することができる。投与は一回量で、間隔を置いて反復して、または初回追加免疫プロトコール（既述通り）に組み入れて行うことができる。
【０１３１】
ｉｉｉ  経口ワクチン
生きた経口ワクチンとして有用である非毒物発生のコレラ菌変異株が、例えば、米国特許第４，８８２，２７８号明細書（２つのｃｔｘＡ対立遺伝子のそれぞれのコード配列の実質的な量が欠失しているため、機能的なコレラ毒素が生じない株を開示している）；  国際公開第９２／１１３５４号パンフレット（ｉｒｇＡ部位が変異により不活性化されている株；  この株はｃｔｘＡ変異と単一の株で結合することができる）；  および国際公開第９４／１５３３号パンフレット（機能的ｃｔｘＡおよびａｔｔＲＳ１  ＤＮＡ配列を欠く欠失変異）において記載されている。これらの株は、国際公開第９４／１９４８２号パンフレットに記載されているように、遺伝子組換えされて異種抗原を発現する。（前述の発行された特許／特許出願のすべては参考として本明細書中で援用される。）本発明のＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を発現する能力があるコレラ菌株の有効なワクチン用量は、例えば、選択された投与経路で適切な量での約１ｘ１０５乃至約１ｘ１０９、好ましくは約１ｘ１０６乃至約１ｘ１０８の生きた細菌を含有しうる。好ましい投与の経路として、すべての粘膜経路が挙げられ；  最も好ましくは、これらのベクターは鼻腔内または経口投与される。
【０１３２】
異種抗原の組換え発現用に遺伝子組換えされ、またはされていない弱毒化されたネズミチフス菌株、およびその経口ワクチンとしての使用が、例えば、国際公開第９２／１１３６１号パンフレットに記載されている。好ましい投与の経路として、すべての粘膜経路が挙げられ；  最も好ましくは、これらのベクターは鼻腔内または経口投与される。
【０１３３】
当業者には容易に理解されるように、ワクチンベクターとして有用である他の菌株として、フレクスナー（赤痢）菌、ストレプトコッカスゴルドニイ、およびカルメット・ゲラン杆菌も挙げられる（国際公開第８８／６６２６号、第９０／０５９４号、第９２／１７９６号、および第９２／２１３７６号パンフレットに記載され；  そのすべてが参考として本明細書中で援用される）。
【０１３４】
細菌ベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドが細菌のゲノムの中へ挿入することができ、遊離状態で残存し、またはプラスミドで運搬されうる。ワクチン細菌ベクターを含有する組成物に補助剤を添加することもできる。当業者には多くの補助剤が周知である。適切な補助剤が当業者により容易に選択できる。
【０１３５】
Ｖ．  組成物
ｇｐ１００Ｍ遺伝子（ｇｐ１００Ｍ）およびｇｐ１００タンパク質のほか本明細書中に記載された方法を用いて確認される物質を含む改変型ｇｐ１００タンパク質および遺伝子を、インビボでの投与に適した生物適合性の形態で対象に投与するための医薬組成物に調製することができる。「インビボでの投与に適した生物適合性の形態」により、治療効果が毒性作用を上回る形態の物質が投与されることを意味する。物質はそれを必要とする動物に投与しうる。本発明の治療的に活性な量の医薬組成物、または「有効な量」の投与は、「動物の免疫系を調節する」所望の結果を達成するために必要な投与量と時間での有効な量と定義される。治療的に有効な量の物質は、動物の疾患段階、年齢、性別および体重、および動物における所望の反応を誘発する免疫原の能力によって変動しうる。投与方式は、最適な治療反応を提供するように調整しうる。例えば、いくつかの分割量を毎日投与し、または治療状況の要件により用量を比例的に減少しうる。「動物の免疫系を調節すること」は標的動物において免疫応答を生じる能力と定義される。この応答は細胞と体液の両方の免疫応答を包含する。
【０１３６】
活性物質は、注射（皮下、静脈内、筋内、鼻腔内等）、または経口投与、吸入、経皮的適用、または直腸投与、または動物の免疫系の調節を可能にする他の投与経路など便利な方法で投与しうる。投与の経路によって、活性物質は物質内に被覆し、化合物を不活性化しうる酵素の作用、酸および他の自然状態から化合物を防御しうる。
【０１３７】
好ましく用いられる投与の１つの経路は、本発明の改変型ｇｐ１００タンパク質／免疫原性断片、または前記タンパク質／断片をコードする核酸、またはそのいずれかの組成物の結節内注射の経路である。
【０１３８】
本明細書中に記載される組成物は、有効な量の活性物質が混合液中で薬学的に許容される賦形剤と結合されるように、対象に投与することができる薬学的に許容される組成物の調製のためのそれ自体は周知の方法で調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences (1985), Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA)または Handbook of Pharmaceutical Additives (compiled by Michael and Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995))において記載されている。これに基づき、組成物は、独占的ではないが、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤または希釈剤に結合した物質の溶液を含み、適切なｐＨの緩衝溶液中に含まれおよび／または生理的液体と等浸透性でありうる。これに関しては、米国特許第５，８４３，４５６号明細書を参考にすることができる。
【０１３９】
本発明の物質、抗体、および組成物の有用性は実験モデル系において確認しうる。
【０１４０】
以下の非限定的な実施例は本発明の例示である。
【０１４１】
実施例
ＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ（ｖＣＰ１５８４）は、ヒト黒色腫抗原ｇｐ１００の改変形を発現する組換えカナリア痘瘡ウイルスの製剤である。
【０１４２】
Ａ．  分子特性（同一性）
１．  レシピエントの特徴づけ：
ａ．  親の生物：
カナリア痘瘡ウイルス：  科−Poxviridae、亜科−Chordopoxviridae、属−アビポックスウイルス。カナリア痘瘡ウイルスは約３２５ｋｂｐの直鎖状ｄｓＤＮＡゲノムを含有するエンベロープ型ウイルスである。このウイルスはもっぱらトリ種において増殖的に複製する（ (Tripathy D. Avian pox. In: Diseases of Poultry （第９版： B.W. Calnek et al. Eds.） pp. 583-596)。
【０１４３】
ｂ．  ベクターの説明：
ＡＬＶＡＣ（２）は改変され、弱毒化されたカナリア痘瘡ウイルスである（米国特許第５，９９０，０９１号明細書）。カナリア痘瘡ウイルスの原株（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）は一次ニワトリ胎児線維芽細胞（ＣＥＦｓ）上の２００連続継代により弱毒化された。弱毒化ウイルスはプラーク分離され、ＡＬＶＡＣと命名された。ＡＬＶＡＣ（２）を生成するには、２つのワクシニアウイルスコード配列（Ｅ３ＬおよびＫ３Ｌ）の挿入によりＡＬＶＡＣベクターを改変し、ウイルスｍＲＮＡ翻訳の全体的な効率を増強した。Ｅ３Ｌ特異的遺伝子産物はｄｓＲＮＡ結合タンパク質であり、Ｋ３Ｌ読み枠（ＯＲＦ）はｅＩＦ−２のアミノ末端タンパク質との重要な配列類似性を共有する（（; Beattie et al. Virology 183:419 (1991); Beattie et al. Virology 210:254 (1995)。Ｋ３ＬとＥ３Ｌは、ｄｓＲＮＡで活性化されると、翻訳抑制因子ｅＩＦ−２ａをリン酸化し、ｍＲＮＡ翻訳の開始を抑制する細胞タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）の活性を抑制する能力がある。一部の研究の結果は、ワクシニアＫ３ＬおよびＥ３Ｌ遺伝子産物がＰＫＲ活性のダウンレグレーションおよびウイルス特異的遺伝子発現の増大を引き起こすことにより、この提案された機序を実証している（Tartaglia, J. et al. 11' Colloque des Cent Gardes, Elsevier Press (1997)）。
【０１４４】
ｃ．  親の生物からのベクターの誘導：
カナリア痘瘡ウイルス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）の親株は１９７０年にドイツにおいて分離され、１９７３年にメリュー研究所により得られた。ウイルスは一次ニワトリ胎児線維芽細胞（ＣＥＦｓ）上の２００連続継代により弱毒化された。弱毒化ウイルスはＫＡＮＡＰＯＸ（ＮＤ）の名称で１９７５年フランスでワクチンとして登録された。ウイルスはアガロースによる４連続プラーク精製にかけられ、単一のプラーク分離株が選択されＡＬＶＡＣと命名された。
【０１４５】
Ｋ３Ｌコード配列は、テンプレートとしてコペンハーゲンワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミドを用いたＰＣＲ増幅により合成され、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下に配置された。Ｅ３Ｌコード配列および上流調節性要素はコペンハーゲンワクシニアからのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ断片のクローンを含有するプラスミドから得られた。Ｈ６促進化Ｋ３ＬおよびＥ３Ｌ配列を、実施例１に記載した詳細により親のベクターのＣ６部位への挿入を方向づける能力があるドナープラスミドへ挿入した。ドナープラスミドとＡＬＶＡＣ救助ウイルスとの間で以前に記載されたインビトロ組換え（Piccini et al., Methods of Enzymol. 153:545 (1987)）により組換えを行った。結果として得られた組換えウイルス、ｖＣＰ１４６８におけるＥ３ＬおよびＫ３Ｌの発現を確認し、ｖＣＰ１４６８をＡＬＶＡＣ（２）と命名した。
【０１４６】
ｄ．  クローニング部位：
Ｃ５と命名した部位をＡＬＡＶＡＣ（２）ベクターへの改変型ｇｐ１００コード配列の挿入のために用いた。ウイルスゲノムの広範な逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）内に存在するＣ５部位によって、この部位への挿入は結果として挿入配列の２つのコピーが生じることになる。挿入部位の概略が図４に示されている。現在、Ｃ５コード化ポリペプチドに帰する機能はなく、この領域にコードされると推論されるアミノ酸の読み枠も現存のタンパク質データベースの記載事項との重要な相同性を共有することはない。
【０１４７】
２．  ドナーの特徴づけ
ａ．  ドナー生物
それぞれヒトｇｐ１００をコードする遺伝子（黒色腫拒絶抗原）を含有するプラスミドｐＣＤＮＡ３−ｇｐ１００およびＰＣＲＩＩ−ｇｐ１００を用いた。
【０１４８】
ｂ．  ドナー遺伝子：
（ｉ）発現ドナー遺伝子：  ヒトｇｐ１００黒色腫抗原。
【０１４９】
（ｉｉ）プロモーター：  ワクシニアウイルス早発／遅発Ｈ６プロモーター（PerkusM.E. et al, J. Virol.63:3829 (1989)）。
【０１５０】
ｃ．  組換え生物におけるドナー遺伝子：
改変型ｇｐ１００タンパク質のコード配列がＡＬＶＡＣ（２）へ挿入され、ＨＬＡクラスＩとの２つのＣＴＬエピトープの相互作用のために増強された改変型ｇｐ１００抗原を発現した。
【０１５１】
実施例１
ワクシニアＥ３Ｌ／Ｋ３Ｌコード配列のＡＬＶＡＣのＣ６部位への挿入
Ｋ３Ｌコード配列はテンプレートとしてｐＳＤ４０７（コペンハーゲンワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ断片含有）を用いたＰＣＲ増幅により合成された。オリゴヌクレオチド  ＭＰＳＹＮ  ７６３  （５’−ＣＣＣＴＣＴ  ＡＧＡＴＣＧ  ＣＧＡＴＡＴ  ＣＣＧＴＴＡ  ＡＧＴＩＴＧ  ＴＡＴＣＧＴ  ＡＡＴＧＣＴ  ＴＧＣＡＴｆ  ＴｆＣＩＴＡ  ＴＴＣＧＴ−３’）（配列番号１０９）およびＭＰＳＹＮ  ７６４  （５’−ＣＣＣＧＡＡ  ＴＩ’ＣＡＴＡ  ＡＡＡＡＴＴ  ＡＴｌＧＡＴ  ＧＴＣＴＡＣＡ−３’）（配列番号１１０）をＰＣＲ反応のプライーとして用いた。およそ３２５ｂｐのＰＣＲ断片が３１５ｂｐ断片を産するＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化された。この３１５ｂｐ断片をアガロースゲルから分離することで精製し、ストラタジーン（La Jolla, CA.）からのＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ消化ｐＢＳＳＫ＋ベクターと連結した。核酸配列を確認した。このプラスミドはｐＢＳ  ７６３／７６４で消化した。ｐＢＳ  ７６３／７６４をＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで消化することにより、３４０ｂｐ断片はプラスミドベクターｐＭＭ１５４へクローニングするために分離された。ＰＭＭ１５４はＮＹＶＡＣ  ｔｋ  挿入ベクターバックグラウンドにおける無関係の遺伝子を制御するワクシニアＨ６プロモーターを有するカセットを含む。ＰＭＭ１５４は、Ｋ３Ｌ遺伝子を含有するｐＢＳ７６３／７６４からの３４０ｂｐ断片がｐＭＰＴＫＨ６Ｋ３Ｌを生成するＨ６プロモーターの近くに方向づけられるように、ＮｒｕＩ（部分的）およびＸｈｏＩでの消化により調製された。エントモポックス４２ｋプロモーターの制御下に優性の選択可能なマーカーＥｃｏ  ｇｐｔを含有するプラスミドｐＭＰ４２ＧＰＴをＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、０．７Ｋｂｐ  ４２ｋ−Ｅｃｏｇｐｔ発現カセットを得た。この０．７Ｋｂｐ断片を精製し、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ  ｃｕｔ  ｐＭＰＴＫＨ６Ｋ３Ｌへ連結し、プラスミドｐＭＰＴＫＨ６Ｋ３Ｌｇｐｔを生成した。このプラスミドをＸｈｏＩで消化し、Ｈ６／Ｋ３Ｌおよび４２ｋ／Ｅｃｏｇｐｔ発現カセットを含有する１．２ｋｂｐ断片を生成し、これは次にゲル精製された。１．２Ｋｂｐ  ＸｈｏＩ断片をＡＬＶＡＣ  Ｃ６挿入プラスミドｐＣ６ＬのＨｈｏｌ部位へ挿入し、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｌｇｐｔを生成した。
【０１５２】
全体のＥ３Ｌ遺伝子は、コペンハーゲンワクシニアからのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ断片のクローンを含むｐＳＤ４０１ＶＣから分離された２．３ｋｂｐのＥｃｏＩ断片内に含まれている。２．３ＫｂｐのＥｃｏＲＩ断片はさらに部分的にＥｃｏＲＩで消化されプラスミドｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３ｇｐｔを生成していたｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｌｇｐｔへ挿入された。プラスミドｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３ｇｐｔはＸｈｏｌで消化された。結果として得られる６・８Ｋｂｐのベクター断片を精製し、自己連結し、結果としてプラスミドｐＭＰＣ６Ｅ３が生じた。プラスミドｐＭＰＴＫＨ６Ｋ３ＬをＰｓｐＡＩで消化し、結果として得られるＨ６／Ｋ３Ｌ発現カセットを含有する５６０ｂｐの断片をＰｓｐＡＩ消化ｐＭＰＣ６Ｅ３へ連結し、結果としてプラスミド作成物ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３が生じた。プラスミドｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３はワクシニアＨ６／Ｋ３Ｌ発現カセットおよびＡＬＶＡＣ  Ｃ６挿入部位配列によりフランキングされた内因性プロモーターを有するワクシニアＥ３Ｌ遺伝子を含む。
【０１５３】
実施例２
ドナー遺伝子の遺伝子改変：
プラスミドｐＣＤＮＡ３−ｇｐ１００でＭＮ５２２を形質転換し、プラスミドｐＭＥＬ  ｇｐｌ００  ＃１を得た。遺伝子Ｃ５ドナープラスミドＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ−１８はＢａｍＨＩでポリリンカー領域内で消化され、アルカリホスファターゼで処理され、キナーゼ化およびアニール化オリゴヌクレオチドＳＰＣ５ＰＬ１（５’−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＣＧＡ−ＣＧＡ−ＧＣＴ−ＣＧＡ−ＡＴＴ−ＣＧ−３’）（配列番号１１１）およびＳＰＣ５ＰＬ２（５’−ＧＡＴ−ＣＣＧ−ＡＡＴ−ＴＣＧ−ＡＧＣ−ＴＣＧ−ＴＣＧ−ＡＣ−３’）（配列番号１１２）へ連結してプラスミドＮＶＱＨ６ＭＣ５  ＃１０を生成した。オリゴヌクレオチドＭＥＬｇｐ０１（５’−ＣＣＣ−ＴＣＧ−ＣＧＡ−ＴＡＴ−ＣＣＧ−ＴＴＡ−ＡＧＴ−ＴＴＧ−ＴＡＴ−ＣＧＴ−ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＴＣＴ−ＧＧＴ−ＣＣＴ−ＡＡＡ−ＡＡＧ−３’）（配列番号１１３）およびＭＥＬｇｐ０２（５’−ＣＣＣ−ＣＴＣ−ＧＡＧ−ＡＴＡ−ＡＡＡ−ＡＴＣ−ＡＧＡ−ＣＣＴ−ＧＣＴ−ＧＣＣ−ＣＡＣ−ＴＧＡ−３’）（配列番号１１４）をプラスミドｐＭＥＬ  ｇｐ１００＃１とともにＰＣＲにおいて用いて、ｇｐ１００遺伝子の５’末端に連結したＨ６プロモーターの部分を含有する２ｋｂの断片を生成した。この断片をＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＶ／Ｘｈｏｌ消化ＮＶＱＨ６ＭＣ５＃１０へクローン化し、Ｈ６プロモーターへ連結したｇｐ１００遺伝子を含むプラスミドＣ５Ｈ６ＭＥＬｇｐ１００  ＃５を生成した。
【０１５４】
プラスミドＣ５Ｈ６ＭＥＬｇｐ１００＃５におけるｇｐ１００遺伝子を慣用のプラマーを用いて配列決定した。このクローン内に６５ｂｐの欠失が確認され、ｐＣＤＮＡ３−ｇｐ１００に存在することが示された。プラスミドＰＣＲＩＩ−ｇｐ１００をオリゴヌクレオチドＭＥＬｇｐ０５（５’−ＣＣＣ−ＡＴＣ−ＴＧＧ−ＣＴＣ−ＴＴＧ−ＧＴＣ−３’）（配列番号１１５）およびＭＥＬｇｐ１３（５’−ＴＧＡ−ＣＡＴ−ＣＴＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−３’）（配列番号１１６）とともにＰＣＲで用いて、０．６ｋｂの断片を生成した。この断片をＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、Ｃ５Ｈ６ＭＥＬｇｐ  ＃５からのＡｓｐ７１８／ＢａｍＨＩ（部分）断片へ連結し、Ｈ６プロモーターの制御下に全体のｇｐ１００遺伝子を含むプラスミドＣ５Ｈ６ＭＥＬｇｐ１００を生成した。
【０１５５】
既存のプラスミドｐＣ５Ｈ６ＭＥＬｇｐ１００を、それぞれアミノ酸２０９および２８０で開始する２つのＣＴＬエピトープの部位定方向突然変異誘発のテンプレートとして用いた。用いたプライマーを以下に示す：
２０９−Ａ
ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＣｌＴ  ＴＣＴ  ＣＣ  （配列番号１１７）
２０９−Ｂ
ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＣＧ  （配列番号１１８）
２８０−Ａ
ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣ  （配列番号１１９）
２８０−Ｂ
ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＴＣ  （配列番号１２０）
改変されたエピトープを含有する部分を配列決定し、４４０ｂｐ  Ｎｃｏｌ／ＭｌｕＮ１断片として分離した。この断片をＮｃｏｌおよびＭｌｕＮ１で消化したｐＣ５Ｈ６ＭＥＬｇｐ１００へ連結し、改変されたエピトープ２０９−２Ｍおよび２８０−９ｖとともに完全なｇｐ１００遺伝子を有するプラスミドを生成した。
【０１５６】
配列データはｐ＃１０でのＧからＣへの置換を示し、ａ．ａ．＃４をバリンからロイシンへ変化させた。これは以下の対のプライマーを用いたＰＣＲにより補正された：
ＭＥＬ２５
ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＴＧ（配列番号１２１）
ＭＥＬ２７
ＡＴＣ  ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＧＴＩ  ＡＡＧ  ＴＩＴ  ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴ（配列番号１２２）
ＭＥＬ２５はｂｐ＃５４９をＣからＧへ変化させ、容易なスクリーニングのための独特のＮｃｏｌ部位を破壊した。これはアミノ酸を変化させることはない。
【０１５７】
結果として得られるＰＣＲ断片をＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ５で消化し、誤差を補正する等価な断片を置換した。結果として得られるプラスミドは図３に示されているｐｃ５ｇｐ１００−Ｍである（配列番号１２３）。
【０１５８】
レシピエントの遺伝子改変：
ドナープラスミドｐＣ５ｇｐ１００ＭとＡＬＶＡＣ（２）救助ウイルスとの間の組換えは、Ｃ５部位においてワクシニアＨ６促進改変ヒトｇｐ１００を含有する組換えウイルスｖＣＰ１５８４を生成した。
【０１５９】
実施例３
組換え生物の確認および精製のためのスクリーニング：
本発明の組換え生物の確認および精製のためのスクリーニングの態様を以下に記載する。
【０１６０】
（１）プラーク精製は、インサイツプラークハイブリダイゼーションを用いて行い（ピチニら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ．１５３：５４５（１９８７））、これを用いて組換えウイルスを確認し、最終ウイルス製剤の純度を明らかにした。インサイツプラークハイブリダイゼーション分析は、ｇｐ１００作成物（５８０ｂｐの断片）およびＣ５挿入部位に対して特異的な放射標識プローブで行った。
【０１６１】
（２）制限分析：  ウイルスゲノムＤＮＡをＡＬＶＡＣ親またはＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ（ｃＣＰ１５８４）に感染した細胞から分離した。ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩまたはＢａｍＨＩ）で消化した。結果として得られるＤＮＡ断片をアガロースゲルにより電気泳動で分画し、臭化エチジウム染色により視覚化した。Ｃ５部位でのｍｏｄ  ｇｐ１００発現カセットの挿入を確認した。
【０１６２】
（３）免疫沈降分析：これらは既述通り(Taylor et al .J. Virol. 64:1441 (1990))、感染していないＨｅＬａ細胞またはＡＬＶＡＣ親ウイルス、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００（ｖＣＰ１４６５）またはＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ（ｖＣＰ１５８４）から誘導した放射標識ライセートを用いて行った。簡単に言えば、ＨｅＬａ細胞培養株を［３５Ｓ］−メチオニンを補充したメチオニンを含有しない培地中１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度で感染した（３５ｕＣｉ／ｍｌ）。感染18時間後に、細胞を溶解した。ウサギ抗ｇｐ１００血清（ＡＺＮ−ＬＡＭ、オランダ、ナイメーヘン大学、Ｍ．シュロイルスより受理）を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画した。ゲルを固定し、１／２時間１Ｍ  サリチル酸ナトリウムで蛍光光度分析のために処置した。乾燥したゲルをコダックＸＡＲ−２フィルムに露出し、タンパク質種を視覚化した。抗−ｇｐ１００による結果は、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００感染ＨｅＬａ細胞中ではｇｐ１００の発現を示すが、親に感染細胞については発現を示さない。（図６を参照）
（４）ウエスタンブロット。１８時間、１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度でＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ（ｖＣＰ１５８４）、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００（ｖＣＰ１４６５）またはＡＬＶＡＣにＨｅＬａ細胞を感染させた。細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移した。ブロットをＡＺＮ−ＬＡＭ（１／５０００希釈）でインキュべートした後、ＨＲＰ接合ブタ抗ウサギ強化化学発光（ＥＣＬ）検出法（アマシャム）を利用した。結果は、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００およびＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ感染細胞における全長ｇｐ１００の発現を示している。
【０１６３】
（５）プラーク免疫スクリーン分析。これはｖＣＰ１５８４材料上で行い、継代時のウイルスの表現型安定性を評価した。ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００Ｍ（ｖＣＰ１５８４）の生産バッチ材料の表現型安定性を、プラークレベルでの挿入遺伝子の発現を測定する免疫プラークアッセイにより分析した。Ｈｇｐ１００ｍｏｄの細胞内および表面発現の検出のために透過化処理した細胞を利用したアッセイをこの試験のために選んだ。
【０１６４】
試験および対照の試薬（それぞれ、ＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ  （ｖＣＰ１５８４）およびＡＬＶＡＣ標準およびＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００Ｍ）を希釈したアガロース下にＣＥＦ単層上にプレーティングし、６０ｍｍの皿当り４０〜２００プラークを得た。３７℃で１２０時間インキュべートした後、ｇｐ１００Ｍタンパク質の内部発現の検出のためにプラークイムノアッセイにより感染単層を処理した。試験および対照の試料の陽性および陰性のプラークをカウントした。使用した一次抗体は、１：８００の希釈でのモノクローナル抗−ＥｉＭＢ５０であった。使用した二次抗体は、１：５００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合ウサギ抗マウス抗血清であった。
【０１６５】
（ｖＣＰ１５８４）により生成された個別プラークによるヒト改変型ｇｐ１００タンパク質の内部発現の分析結果は表１に示されている。
【０１６６】
結果は、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００Ｍの９８．７％のプラーク集団がｇｐ１００Ｍタンパク質を発現しており、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００Ｍが表現型として安定であることを示している。
【０１６７】
プラーク免疫スクリーン分析の結果は、ＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍがｇｐ１００タンパク質の発現に関して表現型として安定であることを示している。
【０１６８】
（６）ヌクレオチド配列分析。これはｖＣＰ１５８４で行い、Ｈ６促進黒色腫ｇｐ１００Ｍカセットのヌクレオチド配列を確認した。配列分析は、予想配列に対するヌクレオチドの差を示さなかったため、ｖＣＰ１５８４の生産時に変異は誘導されなかった。この分析を行うために、ｖＣＰ１５８４ゲノムＤＮＡから生成した、２．２ｋｂのＰＣＲ由来断片（Ｈ６促進黒色腫ｇｐ１００Ｍカセットを包含）を含有するプラスミドクローンのプールを用いた。
【０１６９】
２．２ｋｂのＰＣＲ断片（Ｈ６促進黒色腫ｇｐ１００Ｍカセット含有）の連結により得られた９つの陽性クローンをｐＢＳ−ｓｋ−（ストラタジーン）へ貯蔵することによりｐＢＳ／１５８４を生成した。２．２ｋｂのＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマー、ＩＤＣ５−１およびＩＤＣ５−２によるｖＣＰ１５８４ゲノムＤＮＡから由来した。ｐＢＳ／１５８４を配列決定するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列は図５に示されている。
【０１７０】
実施例４
この実施例は改変型ｇｐ１００分子のカニクイザルにおける注射の結果を提供する。
【０１７１】
方法および実験計画
試験系
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）目的飼育動物。
【０１７２】
供給元：  シコンブレック「シミアン  コンサーベーション  ブリーディング  アンド  リサーチ  センター株式会社」
Ｆｅｍａ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，  ４４  Ｇｉｌ  Ｐｕｙａｔ  Ａｖｅｎｕｅ  Ｍａｋａｔｉ（フォリピン、マニラ）。
【０１７３】
試験動物の数：  １２匹（雄６、雌６）。
【０１７４】
治療開始時の齢：  ２６乃至３８か月齢
−治療開始時（−１日）の体重範囲：
−雄：  １．７３乃至２．３４ｋｇ
−雌：  １．７１乃至２．６５ｋｇ。
【０１７５】
動物管理
−ハウジング：  １空調室
−温度：  １９乃至２５℃（目標範囲）
−相対湿度：  ＞４０％
−換気：  毎時最低８回の換気
−明暗サイクル：  １２時間明（人工）／１２時間暗
ケージング：  動物を１匹ずつステンレス鋼網ケージ（約５４０ｘ８１０ｘ７６０ｍｍ）に収容した。
【０１７６】
−飼料：  化学および細菌の汚染について分析された拡大完全市販霊長類用飼料（Mazuri diet, Special Diet  Services Ltd., Witham, Essex, CMS, 3AD, Great Britain） 。
【０１７７】
配給量：  １００ｇ飼料／動物／日。
【０１７８】
また、動物には毎日果物（リンゴまたはバナナ）が与えられた。
【０１７９】
動物は臨床検査のための採血前および剖検前に少なくとも１６時間絶食した。
【０１８０】
−水：  自由に飲料水（ボトルによって）
−汚染：  試験の目的達成を妨げる可能性のあるレベルで飼料または水に存在する汚染は認められなかった。
【０１８１】
治療前手順
−動物の健康手順：  全動物に対し到着時に健康障害の臨床検査および順化期間の獣医の臨床検査を行った。
【０１８２】
−順化期間：  動物の到着と治療の開始との間に少なくとも３週間。
【０１８３】
実験計画
−治療群への割当は体重クラスに基づき無作為割当法を用いて順化期間に行った。
【０１８４】
−動物を表２に示した治療群に割当てた。投与用量レベルは表３に示されている。
【０１８５】
試験品／対照品の投与
群１と群２の動物
−投与方法：  左鼠径リンパ節に注射。それぞれの投与前に塩酸ケタミン（イマルゲン（登録商標）５００−メリアル、リヨン、フランス）の筋内注射により動物を軽く麻酔した。毎回同じリンパ節に注射した（左側）。各注射の前にヨード（ベテジン（登録商標）−べトキノール、リュール、フランス）で局所消毒した。
【０１８６】
群３
−経路：  皮下
−投与方法： 皮下導入した滅菌注射器および針を用いたボーラス注射。ヨード（ベテジン（登録商標）−べトキノール、リュール、フランス）で局所消毒した後に４箇所の注射部位を用いた。１群と２群の動物と同じ条件下になるために、各投与前に塩酸ケタミン（イマルゲン（登録商標）５００−メリアル、リヨン、フランス）の筋内注射により動物を軽く麻酔した。表４に示した通り、背部／肩甲骨間部の４箇所の注射部位を用いた。
【０１８７】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析
さまざまな治療群におけるサルにおいて生成された細胞仲介免疫応答を評価するためにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた。特に、ｇｐ１００抗原に反応してサルから得られたＴリンパ球からのＩＦＮγ産生を測定するためにＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮγアッセイを用いた。
【０１８８】
材料と方法
プレート：  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥマルチスクリーンＨＡプレート／ＭＡＨＡ  Ｓ４５．１０（９６穴）。
【０１８９】
捕獲抗体：  ＭＡＢＴＥＣＨモノクローナル抗−ＩＦＮγ  抗体／Ｇ  −Ｚ４  １ｍｇ／ｍＬ。
【０１９０】
検出抗体：  ＭＡＢＴＥＣＨモノクローナル抗−ＩＦＮγ  抗体／７−Ｂ６−１−ビオチン１ｍｇ／ｍＬ。
【０１９１】
酵素：  ＳＩＧＭＡ、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＰＡ接合／Ｅ２６３６
基質：  ＢＩＯＲＡＤ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ−アルカリホスファターゼ接合基質
キット／参照：  １７０−６４  ３２。
【０１９２】
コーティング
０．１Ｍ  ｐＨ９．６の炭酸水素炭酸緩衝液中に１／１０００で希釈した１μｇ／ｍＬの捕獲抗体をウェル当り１００μＬを多重穴プレートへ配置する。一夜４℃下でインキュべートする。１×ＰＢＳ中で４回洗浄する。
【０１９３】
飽和
１０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸、Ｈｅｐｅｓ緩衝剤およびＰｅｎｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏで補充したＲＰＭＩをウェル当り２００μＬ配置する。３７℃下で２時間インキュべートする。
【０１９４】
試験
免疫化動物からの細胞を（ａ）培地のみ; （ｂ）濃度１ｍｇ／ｍＬでプールしたペプチド；および（ｃ）非特異的刺激（ＰＭＡ−Ｉｏｎｏ）に対して試験した。ＩＦＮ−γ産生を刺激するためにこの実施例で用いた貯蔵ペプチド、ｇｐ１００由来であり、表５乃至８に示されている。各試料の最終量は２００μＬである。３７℃下に２０時間インキュべートする。１×ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で４回洗浄する。
【０１９５】
検出
１／１０００の１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈した１μｇ／ｍＬで検出抗体をウェル当り１００μＬ配置する。室温下に２時間インキュべートする。１×ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で４回洗浄する。
【０１９６】
反応
１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に１／６０００に希釈したＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＰＡ接合をウェル当り１００μＬ配置する。室温下に４５分間インキュべートする。１×ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で４回洗浄する。
【０１９７】
基質添加
予め調製した基質をウェル当り１００μＬ配置する。例えば、１プレート、以下のように調製：  ９．６ｍＬの蒸留水、０．４ｍＬｎｏ２５×緩衝液、０．１ｍＬの溶液Ａ（ＮＢＴ）および０．１ｍＬの溶液Ｂ（ＢＣＩＰ）。室温下に３０〜４５分間インキュべートする。蒸留水中で洗浄する。乾燥させ、プラスチックフィルムに移す。Ｚｅｉｓｓ画像分析器を用いて斑点の数をカウントする。各斑点は個別のＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞に対応する。
【０１９８】
結果
ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果は図８〜１１に示されている。結果は、試験した動物のうち、ｇｐ１００抗原の節内投与を受けた動物の２匹中２匹（すなわち１００％）、ｇｐ１００抗原の皮下投与を受けた動物の４匹中２匹（すなわち５０％）が、陽性の細胞仲介免疫応答を示したことを示している。
【０１９９】
ＥＬＩＳＡ分析
当業界において周知の標準の方法を利用してＥＬＩＳＡを行った。簡単に言えば、ヒトｇｐ１００（“ｈｇｐ１００”；バキュロウイルス中で産生）をコーティング緩衝液（炭酸−炭酸水素塩、ｐＨ９．６）中に希釈し、０．５μｇ／穴で９６穴に添加した。プレートを一夜４℃下に配置した。次にプレートを洗浄し、３７℃下に２時間、遮断緩衝液（リン酸緩衝食塩水／０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／１．０％ＢＳＡ、ｐＧ７．２）を添加した。次にプレートを洗浄し、希釈緩衝液（リン酸緩衝食塩水／０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／０．１  ＢＳＡ、ｐＨ７．２）中で血清を希釈した。この試験のため、サルの血清を１：８００に希釈し、「７」段階の３倍希釈を各試料で行った。ヒト血清対照は希釈緩衝液中で１：５０に希釈し、「７」段階の２倍希釈を行った。各希釈を二通りに行った。さらにプレーと３７℃下に２時間インキュべートした。プレーとを洗浄し、希釈緩衝液中に１：１０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合抗ヒト二次抗体（ヤギからの抗ヒトＩｇ全抗体（アマシャム  ライフ  サイエンス、ＮＡ９３３））をウェルに添加し、３７℃下に１時間インキュべートした。プレートを洗浄し、基質緩衝液（５０ｍＭリン酸／２５ｍＭクエン酸、ｐＨ７．２）中Ｈ２Ｏ２とともにＯＰＤ（ｏ−ニ塩酸フェニレンジアミン）基質をウェルに添加した。動態ＥＬＩＳＡについて、プレートを反復して（１５分間２分間隔で）停止せずに（『停止』緩衝せずに）読んだ。プレートを４５０ｍｍで読んだ。
【０２００】
上記の実験の結果は表９と図１２に示されている。群２の動物はＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００（ｍｏｄ）の節内注射後に改変型ｇｐペプチド２０９（２Ｍ）および２９０（９Ｖ）の追加免疫を受け；群３の動物はＡＬＶＡＣ（２）作成物の皮下注射後にペプチドの追加免疫を受け；群１の動物は対照として食塩水の節内注射を受けた。
【０２０１】
図１２からわかるように、抗原の両種類の注射は抗原に対する有意な体液反応を誘発した。
【０２０２】
要約すれば、この実験の結果は、本発明による腫瘍抗原の注射は有意な体液および細胞仲介反応を誘発することを示している。
【０２０３】
実施例５
この実施例は、ＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍで初回抗原刺激し、改変型ｇｐ１００ペプチド（ｇ２０９−２Ｍとｇ２８０−９Ｖ）を追加免疫したヒト黒色腫患者から得られたデータを示している。
【０２０４】
免疫化プロトコール
ＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍによる初回−追加スケジュール（『初回』；１ｍｌの０．４％ＮａＣｌ中に再懸濁した凍結乾燥ＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ；０．５ｍｌ注射（注射１回当り約０．５ｘ１０７．０９ＣＣＩＤ５０））およびペプチドｇ２０９−２Ｍとｇ２８０−９Ｖ（『追加』；１週間当り１ｍｌ総量中１０００μｇ／ペプチド（１日０．２ｍｌ／注射ｘ５日））で患者５人を皮下免疫化した。全患者は：１）ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性であり；２）年齢が１８乃至７０歳であり；３）病理学的に明らかな悪性黒色腫を示し；４）７つの細胞仲介免疫（ＣＭＩ）皮膚検査のうち少なくとも２つまたはそれ以上に対する反応性により免疫適格性を示し；５）以下の範囲内の血液の血液学および化学の値を示した：
2003512829.tif 000001
Patients “primed" with ALVAC(2)-gp100M on weeks 1, 4 and 7; “boosted" with peptides on weeks 10 and 13.
患者は１週、４週および７週にＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００で「初回」抗原投与され、１０週および１３週にペプチドで「追加」免疫された。
【０２０５】
ＥＬＯＳＰＯＴ分析：  これらの結果は表１０および１１に示されている。末梢血液単核細胞（“ＰＢＭＮＣ”）をフィコール勾配で密度遠心分離より分離した。ｇ２０９−２Ｍおよびｇ２８０−９ＶまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合Ｆｌｕペプチド（すべて５０μｇ／ｍｌ）の混合物といっしょにＡＩＭ−Ｖ培地中３ｘ１０６／ｍｌで８日間バルク培養した。培養の３日目および５日目にＩＬ−２を添加した。９日目に細胞を収集し、カウントし、それぞれのペプチドの存在下および非存在下に、２ｘ１０５細胞／ウェル＋５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を、抗ＩＮＦ−γ抗体で前コーティングされていたＥＬＩＳＰＯＴプレート含有ニトロセルロース膜中にプレーティングした。プレートを培養の４８時間後に展開した。報告された数はペプチドで再刺激した２つのウェルとＩＬ−２のみで処置した２つのウェルの平均の差である。
【０２０６】
反応は２ｘ１０５ＰＢＭＮＣ当りのスポットの数（電子ＥＬＩＳＰＯＴリーダーでカウントされるが、ほとんどの場合に手動カウントで確認される）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の数はルーチンに測定されないが、一般的にこの数よりも２〜５倍少ない。
【０２０７】
好ましい実施形態における発明の原理を例示し説明したところで、本発明がこのような原理から逸脱することなく配置や細部について改変できることは当業者には理解されるべきである。
【０２０８】
本明細書中で参照したすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許または特許出願が具体的におよび個別的にその全体が参考として援用されるべきであれば、同じ程度にその全体が参考として本明細書中で援用される。
【表１】
2003512829.tif 000002
【表２】
2003512829.tif 000003
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
2003512829.tif 000010
【表１０】
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【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】
ｇｐ１００Ｍ  ｃＤＮＡの核酸配列を示す図
【図２】
ｇｐ１００Ｍタンパク質の推論されたアミノ酸配列を示す図
【図３】
Ｃ５Ｈ６ｇｐ１００Ｍの核酸配列、Ｈ６促進ヒトｇｐ１００Ｍ挿入カセットを示す図
【図４】
ＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ（ｖＣＰ１５８４）ゲノムを示す概略図
【図５】
ｐＢＳ／１５８４を配列決定するために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列を示す図
【図６】
非感染ＨｅＬａ細胞またはＡＬＶＡＣ親ウイルス、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００、またはＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍのいずれかで感染した細胞からの免疫沈降の結果を示す図
【図７】
ＡＬＶＡＣ親ウイルス、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００、またはＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍの１つで感染したＨｅＬａ細胞のウエスタンブロットを示す図であり、ＡＬＶＡＣ−ｇｐ１００、またはＡＬＶＡＣ（２）−ｇｐ１００Ｍ感染細胞における全長ｇｐ１００タンパク質の発現を示す
【図８】
腫瘍抗原の結節内注射を受けた動物のＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示す棒グラフ
【図９】
腫瘍抗原の結節内注射を受けた動物のＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示す棒グラフ
【図１０】
腫瘍抗原の皮下注射を受けた動物のＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示す棒グラフ
【図１１】
腫瘍抗原の皮下注射を受けた動物のＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示す棒グラフ
【図１２】
ＡＬＶＡＣ−改変型ｇｐ１００／改変型ｇｐ１００ペプチド免疫原の一連の結節内（群２）および皮下（群３）投与後の抗体反応を示すグラフ


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
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