【手続補正書】
【提出日】平成16年9月2日(2004.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌宿主における改良されたタンパク質産生のためのプロモーターを製造する方法であって、
−分泌可能なタンパク質のプロモーターをひとつ選択する工程、
−そのプロモーターを遺伝子改変する工程、
−改変プロモーターをリポーター・タンパク質のコード領域に動作可能に連結する工程、
−適切な培養条件下、真菌宿主中分泌ストレスのもとで改変プロモーターの制御下、選択されたリポーター・タンパク質を発現させる工程、
−同一条件下で非改変プロモーターのもとで得られる発現に比べ、選択されたリポーター・タンパク質のタンパク質発現の増加または減少を示す細胞をスクリーニングまたは選択する工程、
−転写のダウンレギュレーション機構が改変されたプロモーターを含む真菌宿主を回収する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
選択されたリポーター・タンパク質のコード領域が分泌可能なタンパク質のコード領域であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質産生のための真菌宿主を製造する方法であって、
−請求項１または２に記載するように改変された、分泌可能なタンパク質のプロモーターを選択する工程、
−改変されたプロモーターを選択された分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子のコード領域に動作可能に連結する工程、
−適切な培養条件下、真菌宿主中分泌ストレスのもとで改変プロモーターの制御下、選択された分泌可能タンパク質を発現させる工程、
−同一条件下で非改変プロモーターの下での分泌可能なタンパク質の発現に比べ、選択された分泌可能なタンパク質のタンパク質発現の増加または減少を示す細胞をスクリーニングまたは選択する工程、および
−転写ダウンレギュレーション機構が改変されたプロモーターを備える真菌宿主を回収する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記プロモーターが、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、スウォレニン、リグニン分解酵素およびペクチナーゼのプロモーターからなる群から選択されるプロモーター中に位置することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
プロモーターが、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡプロモーターを含む群から選択されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ配列がトリコデルマｃｂｈ１プロモーター中−１６２の上流に位置することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
改変された領域がトリコデルマｃｂｈ１プロモーター中ヌクレオチド−１０３１と−１６２の間に位置することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
改変された領域がトリコデルマｃｂｈ１プロモーター中ヌクレオチド−１０３１と−５０１の間に位置することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
改変された領域がトリコデルマｃｂｈ１プロモーター中ヌクレオチド−３４１と−２１１の間に位置することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質産生のための真菌宿主を製造する方法であって、
−真菌宿主において転写ダウンレギュレーションに関与する複数の制御因子を遺伝子改変する工程、ここでこの制御因子は真菌宿主内で分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターに結合する、あるいは選ばれたある分泌可能なタンパク質の発現における調節シグナルを媒介するものである；
−分泌ストレス条件において、改変真菌宿主内で選択された分泌可能なタンパク質を発現する工程、
−同一条件下での非改変宿主における分泌可能なタンパク質の発現に比べ、選択された分泌可能なタンパク質のタンパク質発現の増加または減少を示す細胞をスクリーニングまたは選択する工程、および
−その真菌細胞を回収する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記制御機構が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、スウォレニン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、リグニン分解酵素およびペクチナーゼを含む群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の転写ダウンレギュレーションに関与していることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記制御機構が、遺伝子ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡによってコードされるタンパク質を含む群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の転写ダウンレギュレーションに関与していることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
真菌宿主が、請求項３乃至９のいずれか１項の方法により取得された宿主であることを特徴とする、請求項１０−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
制御因子がａｃｅ１遺伝子によりコードされ、ａｃｅ１遺伝子の発現または活性が低下または消滅していることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
制御因子がａｃｅ１遺伝子によりコードされ、ａｃｅ１遺伝子の発現または活性が増幅または増加していることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
真菌宿主の菌株が、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、ペニシリウム属、フミコラ属、トリポクラジウム・ジオデス（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｇｅｏｄｅｓ）、クルイベロマイセス属、ピキア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属、ヤロウィア属、スキゾサッカロミセス属、サッカロミセス属を含む群から選択されることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
真菌宿主菌株がアスペルギルス属またはトリコデルマ属に属していることを特徴とする請求項１０乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
真菌宿主菌株がアスペルギルス・ニガーまたはトリコデルマ・リーセイに属していることを特徴とする請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
真菌において、同種または異種の分泌可能なタンパク質を過剰生産する方法であって、
−適切な培地において請求項１または２に記載の方法または請求項３乃至９のいずれかに記載の方法によって得られたプロモーターを選択された分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に結合する、ここで上記プロモーターは促進されたタンパク質の発現に基づいて選択またはスクリーニングされるものである、工程、
−適切な培養条件の下で、選択された分泌可能なタンパク質をプロモーターの調節下真菌宿主内で発現させる工程；あるいは
−請求項１０−１７のいずれかに記載の方法により得られた真菌宿主内で選択された分泌可能タンパク質を発現させる、ここで上記真菌宿主は促進されたタンパク質発現に基づいてスクリーニングまたは選択されたものである、工程；および
−培地からタンパク質産物を回収する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
真菌において、同種の分泌可能なタンパク質を過少生産する方法であって、
−適切な培地において請求項１または２に記載の方法または請求項３乃至９のいずれかに記載の方法によって得られたプロモーターを、選択された分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に結合する工程、ここで上記プロモーターは低下したタンパク質の発現に基づいて選択またはスクリーニングされるものである；
−適切な培養条件の下で、選択された分泌可能なタンパク質をプロモーターの調節下真菌宿主内で発現させる工程；あるいは
−請求項１０−１７のいずれかに記載の方法により得られた真菌宿主内で、選択された分泌可能タンパク質を発現させる工程、ここで上記真菌宿主は促進されたタンパク質発現に基づいてスクリーニングまたは選択されたものである；および
−培地からタンパク質産物を回収する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の方法であって、タンパク質産物が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、リグニン分解酵素、ペクチナーゼ、免疫グロブリンまたはｔＰＡなどの細菌または下等もしくは高等真核生物または真菌もしくは哺乳類に由来するタンパク質を含む群から選択されるものであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法であって、
−分泌可能なタンパク質の遺伝子を選択する工程、
−転写ダウンレギュレーションによって制御されないプロモーターに、選択された分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子のコード領域を動作可能に連結する工程、
−適切な培養条件の下で、真菌宿主においてダウンレギュレーションに関与するタンパク質を過剰産生するかこれらの調節因子の活性が増大したものを産生する真菌宿主中で選択されたタンパク質を生産する工程、および
−宿主の培地から選択された分泌可能なタンパク質を回収する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
プロモーターが請求項１または２に記載の方法によって得られた、または請求項３−９のいずれかに記載の方法により得られ、促進されたタンパク質発現に基づいてスクリーニングまたは選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
プロモーターが、トリコデルマｇｐｄ１、ｃＤＮＡ１、ｙｐｔ１、ｓａｒ１、ｂｇｌ２プロモーターおよびアスペルキルスのｇｐｄＡプロモーターからなる群から選択されるものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ダウンレギュレーションを仲介するタンパク質がＡＣＤＩである、請求項２２−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの上流ー１０３１位とー１６２位の間に存在し（配列番号５の１１８６−２０５３ヌクレオチド）、分泌ストレスかで分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションを仲介するＤＮＡ配列、またはｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、ｐｅｐＡプロモーターからなる群から選択されるプロモーター内で同一の機能を有するＤＮＡ配列。
【請求項２７】
トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの上流ー１０３１位とー５０１位のヌクレオチド間に存在する（配列番号５の１１８６−１７１４ヌクレオチド）、請求項２６に記載のＤＮＡ配列。
【請求項２８】
トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの上流ー３４１位とー２１１位のヌクレオチド間に存在する（配列番号５の１８７６〜２００４位のヌクレオチド）、請求項２６に記載のＤＮＡ配列。
【請求項２９】
分泌ストレス下で真菌宿主において、分泌タンパク質の発現を促進または減少させるための、遺伝的に改変されている請求項２６から２８のいずれかに記載のＤＮＡ配列の使用。