(57)【要約】細胞への核酸導入用導電性基板であって、カチオン性表面電極基板に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸が担持されてなることを特徴とする核酸導入用導電性基板。
2008102728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞への核酸導入用導電性基板であって、カチオン性表面電極基板に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸が担持されてなることを特徴とする核酸導入用導電性基板。
【請求項２】
カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸が直接担持されてなるか、またはカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸がカチオン性高分子を介して担持されてなる請求項１記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項３】
カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブが１回だけ吸着されてなるか、あるいは該表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよびカチオン性高分子が、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブ、カチオン性高分子、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブの順序で交互に積層されてなる請求項２記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項４】
核酸が１回だけ吸着されてなるか、あるいは核酸およびカチオン性高分子が、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互に積層されてなる請求項２または３記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項５】
カチオン性表面電極基板を構成する電極基板が、基板に金、白金およびアルミニウムからなる群より選ばれる金属、または、インジウム・スズ酸化物（ＩＴＯ）の透明半導体薄膜をコーティングした電極基板である請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項６】
カチオン性表面電極基板を構成する電極基板が、金薄膜を有する電極基板である請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項７】
カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されているか、または、カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板である請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項８】
カチオン性表面電極基板が、ミクロパターン化表面をもつ基板である請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項９】
核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよびそれらの発現ベクターからなる群より選択される１種以上である請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板。
【請求項１０】
エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（Ａ）電極の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる工程；
（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸導入用導電性基板および核酸導入方法に関し、さらに詳しくは、エレクトロポレーション法により核酸を細胞に導入する際に使用する導電性基板および核酸を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞へ核酸を導入する方法は、遺伝子や遺伝子にコードされているタンパク質の機能を解明したり、組み換えタンパク質を多量に生産したりする場合等に利用されている。また、細胞への遺伝子導入法は、目的の酵素やサイトカインなどの遺伝子を患者の細胞内に導入し、その遺伝子により体内に目的とする物質を生産させて疾患の治療を行う場合にも利用されている。【０００３】
核酸の生細胞への様々な導入方法の中で、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）は比較的効率よく核酸を細胞内に導入することができ、また広範囲の細胞に適用可能であるという特長を有する。しかしながら、従来のエレクトロポレーション法を含む一般的な遺伝子導入法は、液相均一系で行われるものであり、その操作上総ての細胞に同一種類の遺伝子を導入することに制限されるものであった。ヒトゲノムプロジェクトにより機能未知のものを含む多種類の遺伝子の塩基配列が明らかとなった現在では、その機能発現や機能抑制について細胞レベルでの解析が求められている。したがって、多種類の遺伝子を異なる細胞に効率よく一度に導入できる技術の開発が望まれていた。【０００４】
多種類の遺伝子の異なる細胞への導入を迅速に行う手段として、Ｓａｂａｔｉｎｉらは、多種類の遺伝子を基板にパラレルに配置し、その基板上に接着した細胞に一斉に遺伝子を導入するトランスフェクショナルアレイを開発した（リバーストランスフェクション法）（非特許文献１）。この遺伝子導入アレイでは、発現ベクターに組み込まれた多種類の遺伝子をプリントしたガラス基板上で接着細胞を培養してこれらの遺伝子を細胞へ導入し、さらに発現させることで各種の遺伝子の機能を一斉に解析することができる。しかしながらこの手法は、トランスフェクションにリポフェクション法を用いるものであるため、遺伝子導入の時期を制限することはできず、また遺伝子導入効率に関しても低いというリポフェクション法に起因する問題点が残るものであった。【０００５】
本発明者らは、エレクトロポレーション法により核酸を細胞に導入する遺伝子導入アレイを開発した（非特許文献２および特許文献１）。この遺伝子導入アレイは、電極の表面に核酸を担持させ、得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させ、次いで接着した細胞に電気パルスを印加することにより細胞内に核酸を導入するものである。これによれば、細胞にさほど障害を与えることなく、遺伝子を効率よく細胞に導入することができるとともに、所望の時期に所望の位置で遺伝子導入を実施することができる。さらに、多種類の遺伝子を一度に細胞に導入することができる。しかしながら、数多くの遺伝子の機能を効率よく解析するために、近年遺伝子導入アレイの高密度化が求められている。この高密度化に伴い、遺伝子導入アレイ上のスポットの大きさが小さくなるため、各スポットに接着する細胞数も減少する。従って、少ない細胞数で有意な機能解析を行うために、細胞への遺伝子導入のさらなる高効率化が求められている。
【非特許文献１】Ｊ．Ｚｉａｕｄｄｉｎ，Ｄ．Ｍ．  Ｓａｂａｔｉｎｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：１０７−１１０；２００１
【非特許文献２】Ｆ．Ｙａｍａｕｃｈｉ，  Ｋ．Ｋａｔｏ，  Ｈ．  Ｉｗａｔａ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２：ｅ１８７；（２００４）
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０３５７５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する際に用いる核酸導入用導電性基板および核酸導入方法を提供するものであり、より具体的には、核酸導入用導電性基板に修飾を加えることでエレクトロポレーション法による核酸導入を高効率化することができるため、少ない細胞数で核酸の有意な機能解析を行うことができる核酸導入用導電性基板および核酸導入方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、従来のエレクトロポレーション法による核酸導入方法を改良すべく種々研究を重ねた結果、エレクトロポレーション用の電極表面をカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）で改質することで、電極に接着した細胞への核酸導入効率が格段に向上することを見出した。すなわち、電極にカーボンナノチューブおよび核酸を担持させ、得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させて電気パルスを印加すると、電気パルス印加時に発生する電場がカーボンナノチューブに集中するため局所的に強い電場を細胞に与えることができ、これによって細胞膜に効率よく細孔を開け、核酸導入効率を高めることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の完成により、少ない細胞数で遺伝子等の核酸の有意な機能解析を行うことが可能となり、さらに、数多くの核酸の機能解析を同時に行うことができる核酸導入アレイの作製が可能となった。【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）細胞への核酸導入用導電性基板であって、カチオン性表面電極基板に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸が担持されてなることを特徴とする核酸導入用導電性基板、
（２）カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸が直接担持されてなるか、またはカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸がカチオン性高分子を介して担持されてなる前記（１）記載の核酸導入用導電性基板、
（３）カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブが１回だけ吸着されてなるか、あるいは該表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよびカチオン性高分子が、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブ、カチオン性高分子、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブの順序で交互に積層されてなる前記（２）記載の核酸導入用導電性基板、
（４）核酸が１回だけ吸着されてなるか、あるいは核酸およびカチオン性高分子が、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互に積層されてなる前記（２）または（３）記載の核酸導入用導電性基板、
（５）カチオン性表面電極基板を構成する電極基板が、基板に金、白金およびアルミニウムからなる群より選ばれる金属、または、インジウム・スズ酸化物（ＩＴＯ）の透明半導体薄膜をコーティングした電極基板である前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板、
（６）カチオン性表面電極基板を構成する電極基板が、金薄膜を有する電極基板である前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板、
（７）金薄膜を有する電極基板が、金蒸着したガラス基板または高分子基板である前記（６）記載の核酸導入用導電性基板、
（８）電極基板表面の金属またはＩＴＯの膜厚が、１ｎｍ〜２００μｍである前記（５）〜（７）のいずれかに記載の核酸導入用導電性基板、
（９）カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されているか、または、カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板である前記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板、
（１０）カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板である前記（９）記載の核酸導入用導電性基板、
（１１）カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にアニオン性高分子が吸着され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板である前記（９）記載の核酸導入用導電性基板、
（１２）カチオン性表面電極基板が、ミクロパターン化表面をもつ基板である前記（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板、および、
（１３）核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよびそれらの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種である前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の核酸導入用導電性基板、
である。【０００９】
本発明はまた、
（１４）エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（Ａ）電極の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる工程；
（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程；
を含む方法、
（１５）エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（ａ）カチオン性表面電極基板を提供する工程；
（ｂ）該カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる工程； 
（ｃ）工程（ｂ）で得られた核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる工程；および
（ｄ）該細胞に電気パルスを印加する工程；
を含む方法、
（１６）工程（ｂ）を、カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブを担持させ、ついで核酸を担持させることにより行う前記（１５）記載の方法、
（１７）工程（ｂ）を、カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブを１回だけ吸着させるか、あるいは該表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよびカチオン性高分子を、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブ、カチオン性高分子、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブの順序で交互吸着法により積層させることにより行う前記（１６）記載の方法、
（１８）工程（ｂ）を、核酸を１回だけ吸着させるか、あるいは核酸およびカチオン性高分子を、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互吸着法により積層させることにより行う前記（１６）または（１７）記載の方法、
（１９）カチオン性表面電極基板を構成する電極基板が、基板に金、白金およびアルミニウムからなる群より選ばれる金属、または、インジウム・スズ酸化物（ＩＴＯ）の透明半導体薄膜をコーティングした電極基板である前記（１５）〜（１８）のいずれか一項に記載の方法、
（２０）カチオン性表面電極基板を構成する電極基板が、金薄膜を有する電極基板である前記（１５）〜（１９）のいずれか一項に記載の方法、
（２１）金薄膜を有する電極基板が、金蒸着したガラス基板または高分子基板である前記（２０）記載の方法、
（２２）カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されているか、または、カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板である前記（１５）〜（２１）のいずれか一項に記載の方法、
（２３）カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物またはシランカップリング剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板である前記（２２）記載の方法、
（２４）カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にアニオン性高分子が吸着され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板である前記（２２）記載の方法、および、
（２５）カチオン性表面電極基板が、ミクロパターン化表面をもつ基板である前記（１５）〜（２４）のいずれか一項に記載の方法、
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞に障害を与えることなく、遺伝子等の核酸を高効率で細胞に導入することができるため小量の核酸ベクターと少ない細胞数で核酸の有意な機能解析を行うことができるとともに、望ましい時期に電極上の望ましい位置で細胞に核酸を導入することができ、さらに、多種類の核酸の機能解析を同時に行うことができる、エレクトロポレーション法に用いる核酸導入用導電性基板および核酸導入方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】接着細胞への核酸導入を行うための本発明の核酸導入用導電性基板および該基板への電気パルス負荷システムの配置図である。
【図２】異なるＣＮＴ−ＣＯＯＨ分散濃度で作製した基板のＩＲ−ＲＡＳチャートである。（ａ）ＣＮＴ−ＣＯＯＨ分散濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、（ｂ）ＣＮＴ−ＣＯＯＨ分散濃度０．０１ｍｇ／ｍＬ、（ｃ）ＣＮＴ−ＣＯＯＨ分散濃度０．００１ｍｇ／ｍＬ
【図３】電極に接着した細胞のエレクトロポレーションから４８時間後の位相差顕微鏡像（左上）、蛍光顕微鏡像（右上）および蛍光強度分布（下）である。（ａ）ＣＮＴ／ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極、（ｂ）ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極。スケールバー：５００μｍ
【図４】電極に接着した細胞のエレクトロポレーションから４８時間後の位相差顕微鏡像（上）および蛍光顕微鏡像（下）である。（ａ）ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／Ａｕ電極、（ｂ）ＰＥＩ２０００／Ａｕ電極。スケールバー：５００μｍ
【図５】電極に接着した細胞のエレクトロポレーションから４８時間後の位相差顕微鏡像（上）および蛍光顕微鏡像（下）である。（ａ）ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極、（ｂ）ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極。スケールバー：５００μｍ
【図６】ＣＮＴ−ＣＯＯＨ担持電極に接着した細胞のエレクトロポレーション４８時間後の蛍光顕微鏡像である。スケールバー：１ｍｍ
【図７】導入されたｓｉＲＮＡによりＧＦＰの発現が抑制された細胞の蛍光顕微鏡像である。スケールバー：１ｍｍ
【図８】ＣＮＴ−ＣＯＯＨ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００交互積層電極に接着した細胞のエレクトロポレーションから４８時間後の位相差顕微鏡像（左上）、蛍光顕微鏡像（右上）および蛍光強度分布（下）である。（ａ）ＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極、（ｂ）Ｌ−ＰＥＩ２５０００／（ＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００）１／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極、（ｃ）（ＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００）５／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極。スケールバー：５００μｍ
【符号の説明】
【００１２】
図１における記号の意味は次の通りである。
Ａ  電源
Ｂ  エレクトロポレーションバッファー
Ｃ  細胞
Ｄ  ＣＮＴ−ＣＯＯＨおよび核酸が担持された複合層
Ｅ  金薄膜電極（陰極）
Ｆ  金電極（陽極）
Ｇ  シリコーンスペーサ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一側面は、細胞への核酸導入用導電性基板であって、カチオン性表面電極基板に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブ（以下、ＣＮＴ−ＣＯＯＨともいう）および核酸が担持されてなる核酸導入用導電性基板である。【００１４】
本発明の好ましい実施形態としては、カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸が直接担持されてなるか、またはカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸がカチオン性高分子を介してアニオン性電極板表面に担持されてなる核酸導入用導電性基板があげられる。また、電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブを、後述するカチオン性高分子と交互に吸着および担持させて、（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）−カチオン性高分子−（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）−カチオン性高分子−（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）のように多層が形成されていてもよい。すなわち、カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブが１回だけ吸着されてなるものであってもよく、あるいは該表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよびカチオン性高分子が、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブ、カチオン性高分子、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブの順序で交互に積層されてなるものであってもよい。【００１５】
さらに、前記ＣＮＴ−ＣＯＯＨを担持した基板表面に、核酸を、カチオン性高分子と交互に吸着および担持させて、核酸−カチオン性高分子−核酸−カチオン性高分子−核酸のように多層が形成されていてもよい。すなわち、核酸が１回だけ吸着されてなるものであってもよく、あるいは核酸およびカチオン性高分子が、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互に積層されてなるものであってもよい。核酸を多層とすると、核酸の担持量を増やすことができるため細胞への核酸導入効率が向上する。核酸導入用導電性基板の最外層（表面）は、核酸であるのが好ましい。【００１６】
（カルボキシル基を有するカーボンナノチューブ）
本発明で使用される「カルボキシル基を有するカーボンナノチューブ」は、カーボンナノチューブをカルボキシル化することによって調製されるが、原料となるカーボンナノチューブは、シングルウォールナノチューブ（ＳＷＮＴ）であってもよく、マルチウォールナノチューブ（ＭＷＮＴ）であってもよい。また、カーボンナノチューブの直径および長さは特に限定されないが、通常、平均直径が１〜５０ｎｍ、好ましくは１．４〜２０ｎｍ、より好ましくは２〜１５ｎｍ程度であり、平均長さが５０ｎｍ〜１ｃｍ、好ましくは１００〜２０００ｎｍ、より好ましくは２００〜５００ｎｍ程度である。このようなカーボンナノチューブとしては、市販のものを使用することができ、たとえば、Ｍｕｌｔｉ  Ｗａｌｌ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ（ＳＥＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）などを用いることができる。【００１７】
前記カルボキシル基を有するカーボンナノチューブの調製方法としては、公知の方法を採用することができ、たとえば、カーボンナノチューブを濃硫酸と濃硝酸との混酸と混合し、超音波を照射することにより行うことができる。前記混酸における濃硫酸と濃硝酸との混合割合は、濃硫酸１容量に対し濃硝酸０．２〜１容量程度が好ましく、０．３〜０．５容量程度がより好ましい。またカーボンナノチューブと混酸との混合割合は、カーボンナノチューブ１ｍｇに対して、前記混酸を０．０１〜１００ｍＬとすることが好ましく、０．１〜１０ｍＬとすることがより好ましく、０．５〜５ｍＬとすることがさらに好ましい。超音波処理の時間は、適宜設定すればよいが、たとえば、室温で２時間程度とすればよい。本発明に用いられるカルボキシル基を有するカーボンナノチューブやその調製方法については、たとえば、Ｊ．Ｌｉｕら、ＳＣＩＥＮＣＥ  ２８０：１２５３−１２５６；１９９８に記載されている。【００１８】
（核酸）
本発明で使用される「核酸」は、ポリヌクレオチドであっても、オリゴヌクレオチドであってもよく、またＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡの場合、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであってもよい。「核酸」には、ＤＮＡ誘導体またはＲＮＡ誘導体が含まれ、該誘導体とはホスホロチオエート結合を有する核酸、または酵素による分解を避けるためにインターヌクレオチドのリン酸部分、糖部分、または塩基部分に化学修飾を施した核酸を意味する。【００１９】
「核酸」には、疾患症状の治療あるいは改善効果のある生理活性を有するタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡ、または疾患症状の予防、治療あるいは改善効果のある免疫反応を誘導するタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡ、あるいはこれらＤＮＡの一部を含む。【００２０】
「核酸」にはまた、アンチセンス核酸も包含される。「アンチセンス核酸」は特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、細胞内に導入されることにより、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖の分子を形成する。細胞は二本鎖のｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸は該ｍＲＮＡの翻訳を干渉する。「核酸」には、さらにｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ干渉を起こす短い二本鎖ＲＮＡ）が包含される。さらに、「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡなどの発現ベクターが包含される。【００２１】
核酸がタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡである場合、該プラスミドＤＮＡには、細胞内に導入されたとき、コードする遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が必要であり、該プラスミドＤＮＡはプロモータ等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する。また、目的遺伝子が細胞内に導入されたかどうかを確認する必要がある場合、目的遺伝子のほかにさらにレポーター遺伝子を含んだＤＮＡでもよい。本発明においては、核酸は、１種または２種以上用いることができる。【００２２】
「核酸」のサイズは特に制限されないが、一般に、１０ｂｐ〜２００ｋｂｐ、好ましくは、１５ｂｐ〜１００ｋｂｐ、より好ましくは２０ｂｐ〜８０ｋｂｐである。【００２３】
カチオン性表面電極基板にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる方法としては、カチオン性表面電極基板表面に、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブを担持させ、最外層に核酸を担持させる方法が好ましい。このような方法としては、たとえば、
（１）カチオン性表面電極基板を提供し、該カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブを吸着させ、ついで核酸を吸着させる方法、
（２）カチオン性表面電極基板を提供し、該カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブとカチオン性高分子とを交互に吸着させて、（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）−カチオン性高分子−（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）−カチオン性高分子−（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）のように多層を形成させ、ついで核酸を吸着させる方法、
（３）カチオン性表面電極基板を提供し、該カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブを吸着させ、ついで核酸とカチオン性高分子とを交互に吸着させて、核酸−カチオン性高分子−核酸−カチオン性高分子−核酸のように多層を形成させる方法、
（４）カチオン性表面電極基板を提供し、該カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブとカチオン性高分子とを交互に吸着させて、（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）−カチオン性高分子−（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）−カチオン性高分子−（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）のように多層を形成させ、ついで核酸とカチオン性高分子とを交互に吸着させて、核酸−カチオン性高分子−核酸−カチオン性高分子−核酸のように多層を形成させる方法、などを採用することができる。
なお、（２）および（４）の態様においては、ＣＮＴ−ＣＯＯＨとカチオン性高分子とからなる多層の最外層は、ＣＮＴ−ＣＯＯＨであっても、カチオン性高分子であってもよい。【００２４】
（カチオン性表面電極基板）
本発明におけるカチオン性表面電極基板は、電極基板の表面がプラスに荷電したものであればよく、その様なものとしては、（Ｉ）末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されているカチオン性表面電極基板、または、（ＩＩ）カチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板が好適である。【００２５】
（ＩＩ）のカチオン性高分子により電極基板表面が修飾されているカチオン性表面電極基板としては、（ＩＩ−ｉ）電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、（ＩＩ−ｉｉ）電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にアニオン性高分子が吸着され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、などが好適である。【００２６】
前記（Ｉ）のカチオン性表面電極基板は、たとえば、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜を形成させることにより製造できる。【００２７】
前記（ＩＩ−ｉ）のカチオン性表面電極基板は、たとえば、１）電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜を形成させ、ついで２）該単分子膜の表面にカチオン性高分子を吸着させることにより製造できる。カチオン性高分子を吸着させた後、さらにアニオン性高分子とカチオン性高分子とを交互に吸着させて、カチオン性高分子−アニオン性高分子−カチオン性高分子−アニオン性高分子−カチオン性高分子のように多層を形成させてもよい。【００２８】
前記（ＩＩ−ｉｉ）のカチオン性表面電極基板は、たとえば、１）電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物、スルフィド化合物もしくはシランカップリング剤の単分子膜を形成させ、２）該単分子膜の表面にアニオン性高分子を吸着させ、ついで３）該アニオン性高分子の表面にカチオン性高分子を吸着させることにより製造できる。本発明においては、２）、３）を交互に複数回繰り返して多層を形成させてもよい。【００２９】
電極基板における「基板」は、電極を支持するプレート、チップ(マイクロチップを含む)、アレイなどであり、それらを構成する基材は、電極を支持し得る絶縁性のものであればとくに制限がなく、たとえば、ガラス、マイカ、石英、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などの無機絶縁材料；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの高分子の有機絶縁材料を用いることができる。これらのうち、とくにガラス、マイカ、石英、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などの無機絶縁材料が好ましい。【００３０】
一方、電極基板における「電極」は、エレクトロポレーション法における電極になりうるものであればとくに制限がなく、金、銀、白金、アルミニウム、銅などの金属からなる電極；透明電極材料であるＩＴＯ（インジウム−スズ酸化物）電極が好適にあげられる。好ましい形態としては、カチオン性表面電極基板を構成する電極基板が、上記基板に金、白金およびアルミニウムからなる群より選ばれる金属、または、インジウム・スズ酸化物（ＩＴＯ）の透明半導体薄膜をコーティングした電極基板であることである。より好ましくは、金薄膜を有する電極基板である。【００３１】
上記「基板」と「電極」とからなる電極基板の好ましい例は、ガラス基板、高分子基板またはマイカ基板の片面に、金、白金およびアルミニウムからなる群より選ばれる金属、または、ＩＴＯの電極を設けたものがあげられ、より好ましい例は、ガラス基板もしくはマイカ基板、または、高分子基板の片面に金の電極を設けたものが好ましい。【００３２】
電極基板表面の金属またはＩＴＯの膜厚としては、１ｎｍ〜２００μｍであることが好ましい。１ｎｍ未満であると、十分な導電性が得られないおそれがあり、３００μｍを超えると、顕微鏡での細胞の観察が困難となるおそれがある。より好ましくは、５０〜１００ｎｍである。【００３３】
基板の片面に電極を設けるには、公知の方法に従って行えばよく、たとえば上記金属を無機絶縁基板上に真空蒸着法、スパッタリング法、イオン注入法、メッキ法などの公知の手段を用いる方法があげられる。金薄膜を有する電極基板が、金蒸着したガラス基板または高分子基板であることは、本発明の好ましい実施形態の一つである。【００３４】
電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物としては、たとえば、下記一般式（１）：
Ｒ１−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （１）
（式中、Ｒ１はアニオン性官能基を表し、ｎは１〜４０の整数を表す。）
で示されるチオール化合物があげられる。一般式（１）で表わされる化合物の好ましい例としては、アニオン性官能基であるＲ１がカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、またはホスホン酸基であり、ｎが１〜４０、好ましくは７〜１８、より好ましくは１０〜１６のものがあげられる。【００３５】
また、一般式（１）で表わされるチオール化合物の代わりに、下記一般式（１Ａ）または（１Ｂ）：
Ｒ１−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１  （１Ａ）
Ｒ１−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１      （１Ｂ）
（上記式中、Ｒ１およびｎは前記と同一意味を有し、ｍは１〜４０の整数を表す。）
で示されるジスルフィド化合物またはスルフィド化合物を用いることもできる。ｍは、好ましくは７〜１８、より好ましくは１０〜１６である。該ジスルフィド化合物またはスルフィド化合物は対称型であっても、非対称型であってもよいが、対称型のもののほうが、均一な単分子膜が形成される意味で好ましい。【００３６】
電極基板表面に単分子膜を形成させるのに、下記一般式（１Ｃ）：
Ｒ１−（ＣＨ２）ｐ−Ｓｉ（ＯＲ）３      （１Ｃ）
（上記式中、Ｒ１は前記と同一意味を有し、Ｒは炭素数１〜４のアルキル基、ｐは１〜４０の整数を表す。）
で示される末端にアニオン性官能基を有するシランカップリング剤を用いることもできる。ｐは、好ましくは７〜１８、より好ましくは１０〜１６である。【００３７】
好ましい一般式（１）で表わされる化合物またはそのジスルフィドもしくはスルフィド化合物の具体例としては、たとえば、１１−メルカプトウンデカン酸、８−メルカプトオクタン酸、１５−メルカプトヘキサデカン酸、１０−カルボキシデシルジスルフィドなどがあげられる。また、シランカップリング法にて表面にアニオン性官能基を導入する方法としては、２−（カルボメトキシ）エチルトリクロロシランで電極基板表面を処理後加水分解し、電極基板表面にカルボキシル基を導入する方法などがあげられる。【００３８】
また、電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物としては、たとえば、下記一般式（２）：
Ｒ２−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （２）
（式中、Ｒ２はカチオン性官能基を表し、ｎは前記と同一意味を有する。）
で示されるチオール化合物があげられる。Ｒ２で示されるカチオン性官能基としては、たとえば、１級、２級、３級、４級アミノ基があげられ、ｎとしては、１〜４０、好ましくは７〜１８、より好ましくは１０〜１６の整数があげられる。【００３９】
また、一般式（２）で表わされるチオール化合物の代わりに、下記一般式（２Ａ）または（２Ｂ）：
Ｒ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ２  （２Ａ）
Ｒ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ２      （２Ｂ）
（上記式中、Ｒ２およびｎは前記と同一意味を有し、ｍは１〜４０の整数を表す。）
で示されるジスルフィド化合物またはスルフィド化合物を用いることもできる。ｍは、好ましくは７〜１８、より好ましくは１０〜１６である。該ジスルフィド化合物またはスルフィド化合物は対称型であっても、非対称型であってもよいが、対称型のもののほうが、均一な単分子膜が形成される意味で好ましい。【００４０】
電極基板表面に単分子膜を形成させるのに、下記一般式（２Ｃまたは３Ｃ）：
Ｒ２−（ＣＨ２）ｐ−Ｓｉ（ＯＲ）３                        （２Ｃ）
Ｒ２−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−Ｓｉ（ＯＲ）３      （３Ｃ）
（上記式中、Ｒ、Ｒ２およびｐは前記と同一意味を有し、ｑおよびｒは１〜４０の整数を表す。）
で示される末端にカチオン性官能基を有するシランカップリング剤を用いることもできる。ｑおよびｒは、好ましくは７〜１８、より好ましくは１０〜１６である。【００４１】
好ましい一般式（２）で表わされる化合物またはそのジスルフィドもしくはスルフィド化合物の具体例としては、たとえば、１１−アミノ−１−ウンデカンチオールなどが好適にあげられる。また、一般式（２Ｃ）または（３Ｃ）で表わされる末端にカチオン性官能基を有するシランカップリング剤の具体例として、たとえば、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメチキシシランなどがあげられる。【００４２】
電極基板の表面に単分子膜を形成させるには、常法にしたがって行えばよく、たとえば、電極基板をチオール化合物（一般式（１）または（２）で表わされる化合物）またはそのジスルフィド化合物（一般式（１Ａ）または（２Ａ）で表わされる化合物）もしくはスルフィド化合物（一般式（１Ｂ）または（２Ｂ）で表わされる化合物）、または、シランカップリング剤（一般式（１Ｃ）、（２Ｃ）または（３Ｃ）で表わされる化合物）の溶液に浸漬することにより実施することができる。これにより、電極基板上に高密度、高配向性な単分子膜が形成される。【００４３】
チオール化合物として、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物（一般式（１）で表わされる化合物）またはそのジスルフィドもしくはスルフィド化合物（一般式（１Ａ）もしくは（１Ｂ）で表わされる化合物）、または、末端にアニオン性官能基を有するシランカップリング剤（一般式（１Ｃ）で表わされる化合物）を用いた場合には、これら化合物の単分子膜の表面に、カチオン性高分子を吸着させることにより、前記（ＩＩ−ｉ）のカチオン性表面電極基板が得られる。【００４４】
ここで使用される「カチオン性高分子」は、電極基板の表面に形成された単分子膜と静電気的結合（たとえばイオン結合）によって該単分子膜の表面に結合するカチオン性の高分子であればよく、たとえば、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、アミノアセタール化ポリビニルアルコール、１〜４級アミンを側鎖末端にもつアクリル系あるいはメタクリル系ポリマー（たとえば、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートなど）、酸処理ゼラチン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、プロタミン、キトサン、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアミドアミンデンドリマー（カチオニックデンドリマー）などがあげられる。これらのうち、とりわけポリエチレンイミンおよびポリアリルアミンが好ましい。【００４５】
前記カチオン性高分子の平均分子量は、通常２００〜５，０００，０００、好ましくは５００〜５，０００，０００、より好ましくは６００〜１００，０００、さらに好ましくは８００〜５０,０００である。たとえば、ポリエチレンイミンの場合は、その平均分子量は２００〜２５０，０００が好ましく、６００〜１００,０００がより好ましく、８００〜３０,０００がさらに好ましい。またポリアリルアミンの場合は、その平均分子量は５００〜１５０，０００が好ましく、６００〜１００,０００がより好ましく、８００〜５０,０００がさらに好ましい。【００４６】
単分子膜の表面にカチオン性高分子を吸着させるには、該単分子膜の表面にカチオン性高分子の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば、該単分子膜の表面に、カチオン性高分子を適当な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解させた溶液を添加し、これを室温で静置することにより好適に実施できる。カチオン性高分子溶液の濃度は、特に限定されないが、カチオン性高分子が０．１％〜１０％であるのが好ましい。かくして、単分子膜とカチオン性高分子とがイオン結合により吸着されて、前記（ＩＩ−ｉ）のカチオン性表面電極基板が提供される。【００４７】
一方、チオール化合物として、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物（一般式（２）で表わされる化合物）またはそのジスルフィドもしくはスルフィド化合物（一般式（２Ａ）もしくは（２Ｂ）で表わされる化合物）、または、末端にカチオン性官能基を有するシランカップリング剤（一般式（２Ｃ）または（３Ｃ）で表わされる化合物）を用いた場合には、これら化合物の単分子膜の表面に、直接カルボキシル化カーボンナノチューブを吸着させてカチオン性基板とするか、または、まずアニオン性高分子を吸着させる。【００４８】
ここで使用される「アニオン性高分子」は、電極基板の表面に形成された単分子膜と電気的結合（たとえばイオン結合）によって該単分子膜の表面に結合するアニオン性の高分子であればよく、たとえば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）のような合成高分子；アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルカリ処理ゼラチンのような天然高分子があげられる。【００４９】
単分子膜の表面にアニオン性高分子を吸着させるには、該単分子膜の表面にアニオン性高分子の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば、該単分子膜の表面に、アニオン性高分子を適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した溶液を添加し、これを室温で静置することにより好適に実施できる。アニオン性高分子の溶液中の濃度は、特に限定されないが、０．１％〜１０％であるのが好ましい。【００５０】
ついで、吸着したアニオン性高分子の表面に、カチオン性高分子を吸着させることにより、前記（ＩＩ−ｉｉ）のカチオン性表面電極基板が得られる。ここで用いるカチオン性高分子は前記と同一のものを使用でき、吸着処理も前記と同様に実施できる。【００５１】
（カチオン性表面電極基板へのカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸の担持）
前記で提供されたカチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させることにより、本発明の核酸導入用導電性基板が得られる。【００５２】
カチオン性表面電極基板の表面にＣＮＴ−ＣＯＯＨを吸着および担持させるには、カチオン性表面電極基板の表面に、ＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液を接触させることにより実施でき、たとえば、該カチオン性表面電極基板を、ＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液中に室温で浸漬することにより好適に実施できる。この際、カチオン性表面電極基板をＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液中に立てて浸漬すると、重力による堆積を避け、静電的な吸着のみによってＣＮＴ−ＣＯＯＨを基板に担持することができるため好ましい。また、カチオン性表面電極基板を浸漬中は、ＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液を攪拌することが好ましい。カチオン性表面電極基板に吸着しないＣＮＴ−ＣＯＯＨは、カチオン性表面電極基板の表面を純水で洗浄することにより除去できる。かくして、ＣＮＴ−ＣＯＯＨ担持電極基板が得られる。ＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液は、ＣＮＴ−ＣＯＯＨと純水とを混合および超音波照射して、純水中にＣＮＴ−ＣＯＯＨを分散させることにより得ることができる。純水分散溶液中のＣＮＴ−ＣＯＯＨの濃度としては、０．０１〜５００ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。０．０１ｍｇ／ｍＬ未満であると、十分量のＣＮＴ−ＣＯＯＨ担持させることができないため、本発明の効果を奏さない場合がある。５００ｍｇ／ｍＬを超えると、ＣＮＴ−ＣＯＯＨが純水中に分散しにくくなる。ＣＮＴ−ＣＯＯＨ濃度はより好ましくは、０．０１〜３．０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．０５〜１．０ｍｇ／ｍＬである。【００５３】
カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブが担持されたことの確認は、該基板を用いてＩＲ−ＲＡＳ（高感度反射赤外分光法）で行うことができる。すなわち、ＣＮＴ−ＣＯＯＨ担持電極基板のＩＲ−ＲＡＳを測定すると、担持されたＣＮＴ−ＣＯＯＨに由来するカルボキシル基の吸収ピークが観察される。【００５４】
得られたＣＮＴ−ＣＯＯＨ担持電極基板では、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブは表面全体に担持されている必要はなく、基板表面には＋（プラス）に帯電した部分が存在する。この基板表面の＋（プラス）に帯電した部分に、後述する核酸が吸着して担持されることになる。【００５５】
なお、カチオン性表面電極基板の表面に、ＣＮＴ−ＣＯＯＨおよびカチオン性高分子を、ＣＮＴ−ＣＯＯＨ、カチオン性高分子、ＣＮＴ−ＣＯＯＨの順序で交互吸着法により積層してもよい。カチオン性高分子としては、上述したものが好適である。ここで交互に実施されるＣＮＴ−ＣＯＯＨの吸着およびカチオン性高分子の吸着は、前記と同様にして実施することができる。【００５６】
ＣＮＴ−ＣＯＯＨを担持したカチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着および担持させるには、該カチオン性表面電極基板の表面に、核酸の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば該カチオン性表面電極基板の表面に、核酸を適当な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した溶液を添加し、これを室温で静置することにより好適に実施できる。カチオン性表面電極基板に吸着しない核酸は、カチオン性表面電極基板の表面を適当な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄することにより除去できる。かくして、核酸担持電極基板（核酸導入用導電性基板）が得られる。【００５７】
なお、カチオン性表面電極基板の表面に、核酸およびカチオン性高分子を、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互吸着法により積層することによっても核酸担持電極基板（核酸導入用導電性基板）が得られる。ここで交互に実施される核酸の吸着およびカチオン性高分子の吸着は、前記と同様にして実施することができる。【００５８】
本発明においては、核酸導入用導電性基板に、ミクロパターン化した表面を有する基板を用いることができる。たとえば、カルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる前のカチオン性表面電極基板の表面を、適当な手段で区画化しておき、複数の異なった核酸をそれぞれ別個の区画に担持させることによりミクロパターン化された核酸担持電極基板（核酸導入用導電性基板）とすることができる。かかるミクロパターン化された核酸担持金属基板（核酸導入用導電性基板）を用いてエレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入すると、核酸を導入する場所を限定することが可能である。【００５９】
本発明の別の側面はまた、
エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（Ａ）電極の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる工程；
（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程；
を含む方法、
でもある。【００６０】
以下、前記各工程について順次説明する。
工程（Ａ）：
電極に核酸を担持させるには、たとえば、
（ａ）カチオン性表面電極基板を提供する工程；
（ｂ）該カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる工程；
を含む方法などがあげられる。カチオン性表面電極基板やその製造方法の好ましい態様については、上述した核酸導入用導電性基板に用いられるものと同様である。また、該カチオン性表面電極基板の表面にカルボキシル基を有するカーボンナノチューブおよび核酸を担持させる方法やその好ましい態様としては、上述した核酸導入用導電性基板の製造方法やその好ましい態様と同様である。【００６１】
工程（Ｂ）：
本工程は、上記で得られた核酸担持電極基板（核酸導入用導電性基板）の表面に、細胞を接着させる工程である。
本発明で使用される「細胞」は、接着性のものであれば、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（たとえば、細菌、酵母）または多細胞生物（たとえば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。たとえば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞でも用いられ、より好ましくは、哺乳動物（たとえば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、肉食類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、とくにヒト由来の細胞が用いられる。ヒト由来細胞の具体例としては、たとえば、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ）などのヒト由来株化細胞；ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト血管内皮細胞、ヒト大動脈平滑筋細胞、ヒト肝細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞などのヒト由来初代培養細胞；間葉系幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞などのヒト由来幹細胞などがあげられる。【００６２】
核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる方法は、特に制限されず、たとえば、細胞の懸濁液を前記基板の上に添加するか、あるいは細胞を適当な培地に懸濁させ、得られた細胞懸濁液を基板上に滴下し、該細胞に適した条件下で培養することにより行うことができる。しかし、核酸を導入する細胞集団内の場所の限定および導入の効率の観点からは、核酸担持電極基板上で細胞を培養して行うのが好ましく、培養することにより細胞は増殖し、該基板の表面に接着する。接着しない細胞は、電気パルスを印加する前に除いておくのが好ましい。非接着細胞の除去は、たとえば、培地を適当な緩衝液と交換することにより行うことができる。【００６３】
工程（Ｃ）：
細胞への電気パルスの印加は、表面に細胞が接着した核酸担持電極基板の電極を一方の電極（第１電極という）とし、細胞を介して第１電極と対峙して反対電極（第２電極という）を設け、第１電極と第２電極の間で、適当な電源を用いて電気パルスを発生させることにより行うことができる。この際、電気パルスは交流または直流のいずれで発生させてもよいが、一般に直流で発生させるのが好ましい。【００６４】
電気パルスを直流で発生させる場合には、核酸を担持した第１電極を陰極（−）としたときには、第２電極は陽極（＋）とする。あるいはその逆も可能である。好ましくは、第１電極を陰極（−）とし、第２電極を陽極（＋）とする。第２電極の材質は、電導性のものであればとくに限定されないが、たとえば金、白金、銀、銅、アルミニウム、ステンレス、タングステン、チタン、コバルト−クロム合金、コバルト−クロム−モリブデン合金（バイタリウム）などの金属；あるいはカーボン、透明電極材料であるＩＴＯ（インジウム−スズ酸化物）があげられる。【００６５】
電気パルスの条件は、細胞の種類、導入される核酸の種類、基板上のカチオン性高分子の種類などにより、電場強度、電気パルスの長さ、パルス印加の回数などを適宜選択すればよい。通常、電場強度は１０〜５００Ｖ／ｃｍ、好ましくは２５〜４００Ｖ／ｃｍ、より好ましくは３０〜３００Ｖ／ｃｍであり、電気パルスの長さは１〜９９ｍｓｅｃ、好ましくは１〜５０ｍｓｅｃであり、より好ましくは３〜２０ｍｓｅｃであり、パルス印加の回数は通常１〜９９回、好ましくは１〜５回、より好ましくは１〜３回であるが、これらに限定されるものではない。【００６６】
電気パルスを印加する時期は、特に限定されず、適宜選択できる。すなわち、細胞を核酸担持電極基板の上に播種後、培養し、該基板上に細胞を接着させてから、必ずしもすぐに電気パルスを印加する必要はなく、接着後好ましい時期、たとえば、細胞の播種から約４〜５日以内であれば、自由に選択して電気パルスを印加することができる。この電気パルスの印加により、細胞中に核酸が効率よく導入される。【００６７】
上記本発明方法を実施するに当たって使用される核酸担持電極基板（核酸導入用導電性基板）および電気パルス負荷システムの配置図の一例を示せば、図１の通りである。この図を用いて本発明方法を説明すると、たとえばガラス基板の表面に金薄膜電極（Ｅ）が設けられており、その上にＣＮＴ−ＣＯＯＨおよび核酸が担持された複合層（Ｄ）が設けられており、さらにその表面に細胞（Ｃ）が接着している。そして、この細胞はたとえばシリコーンスペーサ（Ｇ）で区画化されており、ウェル中にはエレクトロポレーションバッファー（Ｂ）が充填されている。シリコーンスペーサ（Ｇ）の上には金薄膜電極（Ｅ）と平行に反対電極となる金電極（Ｆ）が設けられている。金薄膜電極（Ｅ）と金電極（Ｆ）は電気パルス発信装置である電源（Ａ）に接続されている。本例では、金薄膜電極（Ｅ）と金電極（Ｆ）との間隔は０．５ｍｍに設定されており、ウェル面積は１４×１４ｍｍ２に設定されている。電気パルスの負荷は、金薄膜電極（Ｅ）を陰極（−）とし、金電極（Ｆ）を陽極（＋）とし、電源（Ａ）により電気パルスを発生させることにより、細胞（Ｃ）中に核酸（ＤＮＡ）が導入される。【００６８】
本発明の別の側面として、上記核酸導入法を、ミクロパターン化した表面を有する基板を用いて実施することができる。たとえば、核酸を担持させる前のカチオン性表面電極基板の表面を、適当な手段で区画化しておき、複数の異なった核酸をそれぞれ別個の区画に担持させることによりミクロパターン化された核酸担持電極基板とすることができる。かかるミクロパターン化された核酸担持金属基板を用いて本発明を実施すれば、核酸を導入する場所を限定することが可能である。【００６９】
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７０】
（実施例１）
１．  カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）のカルボキシル化
４０ｍｇのマルチウォールナノチューブ（Multi-walled carbon nanotubes: ＭＷＮＴ）（平均直径：１．２−２０ｎｍ、平均長さ：１００−２０００ｎｍ、層数：５−２０、ＳＥＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）を、４０ｍＬの混酸（濃硫酸：濃硝酸＝３：１（容積比））に混合し、２時間超音波を照射した。水酸化ナトリウムを用いて同溶液を中和し、次いで該溶液のろ過を行い、得られたろ過物を純水により洗浄した。洗浄したろ過物を凍結乾燥することによりカルボキシル化されたＣＮＴ（ＣＮＴ−ＣＯＯＨ）を得た。【００７１】
２．アニオン性の自己組織化単分子（ＳＡＭ）膜を形成させた金表面を用いたＣＮＴ担持電極の作製
ピラニア溶液（濃硫酸：過酸化水素＝７：３（容積比））を用いて洗浄したガラス基板（２２ｍｍ  ×  ２６ｍｍ  ×  ０．５ｍｍ）にクロムおよび金を熱蒸着した（Ｃｒ：Ａｕ＝１：４９（ｎｍ））。同基板を１ｍＭに調製した１１−メルカプトウンデカン酸のエタノール溶液に２４時間浸漬し、カルボキシル基を有する自己組織化単分子（ＳＡＭ）膜を得た（ＣＯＯＨ−ＳＡＭ）。同基板を１０ｍｇ／ｍＬに調製した分子量が２５０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ２５０００）のリン酸生理食塩水ＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）に３０分間浸漬し、カチオン性を有する基板を得た（ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ）。同基板を０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬまたは０．１ｍｇ／ｍＬに調製したＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液に２時間浸漬し、静電的にＣＮＴ−ＣＯＯＨを基板に担持させた（ＣＮＴ／ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ）。このようにして得たＣＮＴ−ＣＯＯＨ担持電極のＩＲ−ＲＡＳは図２の通りである。図２から分かるように、分散液のＣＮＴ−ＣＯＯＨ濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬもしくは０．１ｍｇ／ｍＬのとき、担持されたＣＮＴ−ＣＯＯＨに由来する吸収ピークが確認され、ＣＮＴが担持されたことが分かった。【００７２】
３．  ＣＮＴ／ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極による遺伝子導入
得られたＣＮＴ／ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極を７０％エタノールで滅菌し、クリーンベンチ内で乾燥させた。同電極にシリコーンシート（内面積：１４ｍｍ  ×  １４ｍｍ、高さ：０．５ｍｍ）を圧着し、５０μｇ／ｍＬに調製したｐＥＧＦＰ−Ｃ１（サイトメガロウイルスのプロモータ下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現できるように遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡ）のＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）を３０分間接触させた。同基板をＰＢＳにて２回洗浄し、ヒト胎児腎臓由来（ＨＥＫ２９３）細胞を４．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。培地は最少必須培地（Minimal essential medium：ＭＥＭ）に０．１ｍｇ／ｍＬの非必須アミノ酸（アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン）、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを加えたものを使用した。十分な細胞接着を促すため、３７℃、５％  ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。比較対象としてＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極を使用した。【００７３】
培地を４℃のＰＢＳと置換し、対極電極（ＣｒとＡｕとを、Ｃｒ：Ａｕ＝１：１９９（ｎｍ）の膜厚で熱蒸着したガラス基板）を被せた。細胞が接着した電極を−極に、対極電極を＋極につなぎパルス電圧を印加した。印加したパルス電圧は１３Ｖ、１０ｍｓ、１回とした。パルス印加後、電極上の接着細胞を培地中で４８時間培養した。【００７４】
４．  緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）発現解析
エレクトロポレーションから４８時間後のＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡により観察し、より定量的な解析として、ＧＦＰの発現効率をフローサイトメトリーにより算出した。その結果は、図３の通りである（位相差顕微鏡像：左上、蛍光顕微鏡像：右上、蛍光強度分布（フローサイトメトリーにより得られたヒストグラム）：下、ａ：ＣＮＴ／ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極、ｂ：ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極）。図３から分かるように、ＣＮＴ／ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極上の細胞がＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極上の細胞と比較してよりＧＦＰを発現しており、その発現効率はＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極では２０％程度、ＣＮＴ／ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極では４０％程度であり、電極上にＣＮＴを担持させることで遺伝子導入効率が格段に高くなった。【００７５】
（実施例２）
１．  金表面を用いたＣＮＴ担持電極の作製
実施例１の２に従い金薄膜蒸着基板を作製した後、同基板を１０ｍｇ／ｍＬに調製した分子量が２０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ２０００）のＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）に３０分間浸漬し、カチオン性を有する基板を得た（ＰＥＩ２０００／Ａｕ）。同基板を０．１ｍｇ／ｍＬに調製したＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液に２時間浸漬し、ＣＮＴ−ＣＯＯＨを基板に担持させた（ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／Ａｕ）。【００７６】
２．  遺伝子導入および遺伝子発現解析
得られたＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／ＡｕおよびＰＥＩ２０００／Ａｕ電極を用いて、実施例１の３に従いプラスミドの吸着および細胞の播種を行った。ただし、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１溶液の濃度および電極との接触時間をそれぞれ５μｇ／ｍＬおよび３時間とした。
上記電極を用い、実施例１の３に従いエレクトロポレーションを行った。実施例１の４に従い、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーにより解析した。【００７７】
３．  ＧＦＰ発現解析
エレクトロポレーションから４８時間後のＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡により観察した。結果は図４の通りである（位相差顕微鏡像：上、蛍光顕微鏡像：下、ａ：ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／Ａｕ電極、ｂ：ＰＥＩ２０００／Ａｕ電極）。図４から分かるように、ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／Ａｕ電極上の細胞がＰＥＩ２０００／Ａｕ電極上の細胞と比較してよりＧＦＰを発現していた。フローサイトメトリーにより、その発現効率はＰＥＩ２０００／Ａｕ電極では２０％程度、ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／Ａｕ電極では４０％程度であった。電極上にＣＮＴを担持させることで遺伝子導入効率が格段に高くなった。【００７８】
（実施例３）
１．  インジウム−スズ酸化物（ＩＴＯ）表面を用いたＣＮＴ担持電極の作製
電極素材であるＩＴＯが蒸着されたガラス基板を１０ｍｇ／ｍＬに調製したＰＥＩ２０００のＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）に３０分間浸漬し、カチオン性を有する基板を得た（ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ）。同基板を０．１ｍｇ／ｍＬに調製したＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液に２時間浸漬し、ＣＮＴ−ＣＯＯＨを基板に担持させた（ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ）。【００７９】
２．  遺伝子導入および遺伝子発現解析
得られたＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／ＩＴＯおよびＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極を用いて、実施例１の３に従いプラスミドの吸着および細胞の播種を行った。ただし、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１溶液の濃度および電極との接触時間をそれぞれ５μｇ／ｍＬおよび３時間とした。【００８０】
上記電極を用い、実施例１の３に従いエレクトロポレーションを行った。ただし印加したパルス電圧は３３Ｖ、１０ｍｓ、１回とした。実施例１の４に従い、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーにより解析した。【００８１】
３．  ＧＦＰ発現解析
エレクトロポレーションから４８時間後のＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡により観察した。結果は図５の通りである（位相差顕微鏡像：上、蛍光顕微鏡像：下、ａ：ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極、ｂ：ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極）。図５から分かるように、ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極上の細胞がＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極上の細胞と比較してよりＧＦＰを発現していた。フローサイトメトリーにより、その発現効率はＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極では２０％程度、ＣＮＴ／ＰＥＩ２０００／ＩＴＯ電極では４５％程度であり、電極上にＣＮＴを担持させることで遺伝子導入効率が格段に高くなった。【００８２】
（実施例４）
１．  ＣＮＴ担持遺伝子導入アレイの作製
金薄膜を熱蒸着したガラス基板（Ｃｒ：Ａｕ＝１：４９（ｎｍ））を１ｍＭに調製した１−ヘキサデカンチオールのエタノール溶液に２４時間浸漬し、メチル基を有するＳＡＭ膜（ＣＨ３−ＳＡＭ）を形成させた。直径１ｍｍの円形スポットを２５個有する透明な円形部を有するフォトマスクを通してＵＶ照射を２時間行い、ＣＨ３−ＳＡＭ膜の一部を光分解し金を露出させた。同基板を１ｍＭに調製した１１−メルカプトウンデカン酸のエタノール溶液に１時間浸漬し、露出させた金部位にＣＯＯＨ−ＳＡＭを形成させた。同基板を１０ｍｇ／ｍＬに調製したＰＥＩ２０００のＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）に３０分間浸漬した。同基板を０．１ｍｇ／ｍＬに調製したＣＮＴ−ＣＯＯＨの分散溶液に２時間浸漬することで、ＣＮＴ担持遺伝子導入アレイを作製した。【００８３】
２．  ＣＮＴ担持遺伝子導入アレイによる位置特異的遺伝子導入
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１をアレイ状に吸着させるため、５μｇ／ｍＬに調製したｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）をＣＯＯＨ−ＳＡＭの部分にスポットした。実施例１の３に従い電極上に接着したＨＥＫ２９３細胞にｐＥＧＦＰ−Ｃ１を導入した。【００８４】
３．  ＧＦＰ発現解析
エレクトロポレーションから４８時間後のＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡により観察した。結果は図６の通りである。図６から分かるように、位置特異的にＧＦＰの発現が観察された。【００８５】
（実施例５）
１．  ＣＮＴ担持遺伝子導入アレイの作製
実施例４の１に従い、ＣＮＴ担持遺伝子導入アレイを作製した。【００８６】
２．  ＣＮＴ担持遺伝子導入アレイによる位置特異的な短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入
ＧＦＰ配列を特異的に発現抑制するｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｅｎｓｅ：５’−ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡ  ＡＧＵＵＣＡＵ−３’（配列番号１）、およびａｎｔｉｓｅｎｓｅ；５’−ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣＣＧ−３’（配列番号２））を使用した。５μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬに調製したＧＦＰ−ｓｉＲＮＡのＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）をスポットした。ＧＦＰを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を６．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でＣＮＴ担持遺伝子導入アレイに播種し、十分な細胞接着を促すため、３７℃、５％  ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。細胞が接着したＣＮＴ担持遺伝子導入アレイにパルス電圧を１３Ｖ、１０ｍｓ、１回の条件で印加し細胞にｓｉＲＮＡを導入した。コントロールとしてＧＦＰ配列に対して非特異的なｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｉＲＮＡ、ｓｅｎｓｅ；５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号３）、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号４））を使用した。【００８７】
３．  ＧＦＰ発現抑制解析
実施例１の４に従い、ＧＦＰの発現抑制を観察した。結果は図７の通りである。図７から分かるように、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡにより位置特異的にＧＦＰの発現を抑制することができた。【００８８】
（実施例６）
遺伝子導入効率、さらに遺伝子の発現量は電極表面のＣＮＴ量に依存すると予想される。ＣＮＴ−ＣＯＯＨと直鎖型ポリエチレンイミン（Ｌ−ＰＥＩ）とを交互に積層させて、種々のＣＮＴ−ＣＯＯＨ／Ｌ−ＰＥＩ積層回数の電極基板を作製し、遺伝子発現量を調べた。【００８９】
１．  アニオン性の自己組織化単分子（ＳＡＭ）膜を形成させた金表面にＣＮＴ−ＣＯＯＨおよびカチオン性高分子を交互に積層させた電極の作製
実施例１の２に従いカルボキシル基を有するＳＡＭ膜を形成させた金薄膜蒸着基板を作製した後、同基板を１ｍｇ／ｍＬに調製した分子量が２５０００の直鎖型ポリエチレンイミン（Ｌ−ＰＥＩ２５０００）のＰＢＳ溶液（ｐＨ  ７．４）に３０分間浸漬し、カチオン性を有する基板を得た（Ｌ−ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ）。同基板を０．１ｍｇ／ｍＬに調製したＣＮＴ−ＣＯＯＨの純水分散溶液に２時間浸漬し、ＣＮＴ−ＣＯＯＨを基板に担持させた（ＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ）。この操作を数回行い、ＣＮＴ−ＣＯＯＨおよびＬ−ＰＥＩ２５０００が交互に積層された電極を作製した。作製された電極はその交互積層の回数に従い、（ＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００）ｎ／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ（ｎ；交互積層回数）のように表記した。【００９０】
２．  遺伝子導入および遺伝子発現解析
得られた電極を用いて、実施例１の３に従いプラスミドの吸着および細胞の播種を行った。ただし、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１溶液の濃度および電極との接触時間をそれぞれ５μｇ／ｍＬおよび３時間とした。また、細胞の播種密度を２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２とした。
上記電極を用い、実施例１の３に従いエレクトロポレーションを行った。実施例１の４に従い、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーにより解析した。図８に結果を示す。図８中、（ａ）はＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極であり、（ｂ）はＬ−ＰＥＩ２５０００／（ＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００）１／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極であり、（ｃ）は（ＣＮＴ／Ｌ−ＰＥＩ２５０００）５／ＣＯＯＨ−ＳＡＭ電極である。【００９１】
３．  ＧＦＰ発現解析
図８に示したように、積層数の少ない電極上に接着した細胞（図８（ａ）および（ｂ））での遺伝子の発現効率は４０％程度であり、電極間に大きな差はなかったが、積層数の多い電極上の細胞(図８（ｃ））は５０％程度の発現効率を示した。ＣＮＴ−ＣＯＯＨおよびＬ−ＰＥＩ２５０００を交互に積層させ電極上のＣＮＴ担持量を増加させることで遺伝子導入効率が高くなった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明にかかる核酸導入用導電性基板および核酸導入方法を用いると、細胞に障害を与えず、効率よく核酸導入が可能であるため、少ない細胞数で核酸の有意な機能解析を行うことができるとともに、核酸導入の時期、場所を限定でき、さらに、多種類の核酸の機能解析を同時に行うことができる。このため、本発明にかかる核酸導入用導電性基板および核酸導入方法は、細胞レベルでの遺伝子や遺伝子産物の機能解析が効率よく実施でき、細胞生物学、ポストゲノム、プロテオーム研究を大きく促し、医療への多大な貢献をなすものである。
【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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