【手続補正書】
【提出日】平成16年10月18日(2004.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】                明細書【発明の名称】  低密度リボタンパク安定化法【特許請求の範囲】【請求項１】  トレハロースを低密度リポタンパクを含む溶液に１０〜２５０ｍｇ／ｍｌの割合で加え、冷凍ないしは凍結乾燥を行うことからなる低密度リポタンパク安定化法。【発明の詳細な説明】【０００１】【発明の属する技術分野】  本発明は、低密度リポタンパクを安定化させる安定化法に関する。【０００２】【従来の技術】  従来、タンパクの安定化方法としては、グリセロール、ショ糖、ポリオール等を高濃度に加える方法が用いられている。これらグリセロール、ショ糖、ポリオール等は、アルブミン、グロブリン、酵素等のタンパクには有効であり、また、リポタンパクのうち高密度リポタンパク（ＨＤＬ）には有効である。しかし、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）、特に密度画分１．００６〜１．０６３の低密度リポタンパクに対しては効果はない。【０００３】  低密度リポタンパク中に含まれるコレステロール量は、心疾患、動脈硬化のリスクファクターとして知られており、将来、その重要度は増大することが確実と言われている。しかし、その測定における基準となる低密度リポタンパク校正液はきわめて不安定であるため、これを安定化する安定化法が強く要望されている。【０００４】【発明が解決しようとする課題】  本発明は、上述した従来技術の問題点を解決して、低密度リポタンパクを安定化させる有効な安定化法を提供することを目的とする。特に、低密度リポタンパクが、冷凍及び凍結乾燥時に変性することを防止し、かつ、保存時の安定化を効果的に達成できる低密度リポタンパクの安定化法を提供することを目的とする。【０００５】【課題を解決するための手段】  本発明に係る低密度リポタンパク安定化方法は、トレハロースを低密度リポタンパクを含む溶液に加え、冷凍ないしは凍結乾燥を行うことからなるものである。ここで、冷凍ないしは凍結乾燥とは、冷凍の場合、凍結乾燥の場合、及びこれらの中間的な状態と考えられる状態を含むものである。一般的には、通常概念における冷凍または、凍結乾燥を行う。【０００６】  本発明は、安定化剤にトレハロースを用い、それをＬＤＬを含む溶液に加えた後、冷凍保存、もしくは凍結乾燥保存を行う形態で実施できる。【０００７】  本発明者の知見によれば、トレハロースは、リポタンパクのうち、低密度リポタンパク、特に密度画分１．００６〜１．０６３の低密度リポタンパクの有する特異的な変性を効果的に防止する。しかしその作用機構は不明であり、同じ非還元性二糖類であるスクロース、単糖のトレオース、キシロース等には、このような作用はない。【０００８】【発明の実態の形態】  以下、本発明の好ましい実施の形態例について、説明する。ただし当然のことではあるが、本発明は以下の述べる実施の形態例により、限定を受ける物ではない。【０００９】  以下の実施の形態例において、生理食塩水、緩衝液、血清、血漿等、ＬＤＬを含む溶液に、トレハロースを１０〜２５０ｍｇ／ｍｌの割合で加えて溶かす。次に、フィルターろ過（たとえば０．２μｍフィルターを用いる）し、必要に応じて、殺菌剤、防腐剤を加えて、混ぜる。次に、所要量に分注し、冷凍保存（−１０〜−８０℃）、もしくは��結乾燥し、冷凍保存する。【００１０】  実施の形態例１  ０．２μｍフィルターろ過血清１ｍｌに対し、トレハロース５０ｍｇを加え、かき混ぜて溶解した。トレハロース未添加血清と添加血清について、アガロース電気泳動法により、リポタンパク分画パターンを比較したところ、全く差は見られず、トレハロースが低密度、高密度リポタンパクの電荷（等電点）に何ら影響を与えていなかった。【００１１】  次に、トレハロース添加血清及びトレハロース未添加血清を冷凍し、１日経過後、ＬＤＬコレステロールをヘパリンクエン酸法で測定した。その結果、表１に示すように、トレハロース未添加の場合、冷凍により、１０ｍｇ／ｄｌ増加し、ＬＤＬの変性が明らかに生じているが、トレハロース添加血清については差は見られず、トレハロースが凍結時にＬＤＬ保護剤としての作用を示したことがわかる。【００１２】【表１】1999124394.tif 000001
【００１３】  なお、凍結前試料は、液体窒素保存し、−４０℃凍結試料と同時測定し、測定による誤差を回避した。【００１４】実施の形態例２  血清の由来を変え、実施の形態例１と同様の実験を行った。ここでは、安定化の再現性を見るために、血清のロットを変えて実施した。その結果を表２に示す。本例においても、トレハロースの効果が見られる。血清は生物学的材料であるため、十分な再現性が見られないことがあるが、本発明については、安定した再現性が得られることが分かる。【００１５】【表２】1999124394.tif 000002
【００１６】実施の形態例３  実施の形態例１、２とは異なる血清について、実施の形態例１と同様に操作し、保存安定性を調べた。その結果を表３に示す。上記したように、血清は生物学的材料であり、一般に数十人の血清をブレンドしたものが使用され、よって成分組成がどうしても多少は異なって、リポタンパクの強じん性も異なる。したがって本例でも、異なる血清を用いて、いずれの血清に対しても安定化の効果が見られるかどうかを調べたものである。【００１７】【表３】1999124394.tif 000003
【００１８】  本例で調べた血清についても、その保存の状況は、液体窒素−１９０℃保存と比較して、−４０℃保存であっても、４週間、ほとんどＬＤＬコレステロールの値に差は見られず、冷凍安定性が得られていることがわかる。【００１９】実施の形態例４  図１及び図２を参照する。図２は、本例における凍結乾燥前のトレハロース添加血清の電気泳動パターンを示す図である。図１は本例においてトレハロース添加血清を凍結乾燥し、水を加えて復元した血清の電気泳動パターンを示す図であって、本実施の形態例の安定化の効果を示すものである。【００２０】  本例では、血清１ｍｌに対し、トレハロース４０ｍｇの割合で溶かし、防腐剤を加えた後、凍結乾燥を行った。次にこれを３７℃で保存し、加速試験を行った。【００２１】  まず、凍結乾燥に対する安定剤の効果を電気泳動的に調べた。その結果、図２（凍結乾燥前）及び図１（凍結乾燥後復元）に示すように、差は見られない。ＬＤＬのリポタンパク分画割合も、それぞれ４８％、４６％で、有意な差はない。また、凍結乾燥前のＬＤＬコレステロール値は、１４０ｍｇ／ｄｌであったが、凍結乾燥後も１４０ｍｇ／ｄｌで差は見られず、凍結乾燥に対して安定化作用が見られる。【００２２】  次に、３７℃で１０日間保存した結果、スタート時１４１ｍｇ／ｄｌ、１４０ｍｇ／ｄｌ、１４２ｍｇ／ｄｌ、平均１４１ｍｇ／ｄｌであったが、１０日後、１４０ｍｇ／ｄｌ、１４０ｍｇ／ｄｌ、１４１ｍｇ／ｄｌ、平均１４０ｍｇ／ｄｌと、ほとんど差は見られず、保存性も優れていた。【００２３】  なお、本例について、高密度リポタンパクについても測定を行ったが、低密度リポタンパクと同様に安定であり、本例は、高密度リポタンパクについても利用できる。すなわち、本発明は他の安定剤と同様、高密度リポタンパクについて安定化の効果があり、かつ、他の安定化剤では果たせない、低密度リポタンパクに対しての安定化効果をも有する、優れた手法ということができる。【００２４】参考例  しょ糖を血清１ｍｌに対して１５０ｍｇの割合で溶かし、防腐剤を加えて、凍結乾燥を行ったところ、凍結乾燥を行わない場合のＬＤＬコレステロールの濃度は６８ｍｇ／ｄｌであったが、これを凍結乾燥し、水で元の血清に復元し、ＬＤＬコレステロール濃度を測定したところ、４５ｍｇ／ｄｌであった。すなわち、しょ糖では、ＬＤＬの変性を防止できない。【００２５】【発明の効果】  以上説明したように、本発明によれば、トレハロースにより、ＬＤＬ等が凍結に際して変性することを防ぐことができ、冷凍保存による長期保存が可能になる。また、トレハロースは、凍結乾燥に際して、ＬＤＬ等が変性することを防ぐことができ、したがって、凍結乾燥状態にして長期保存が可能になる。【図面の簡単な説明】【図１】  本発明の実施の形態例４の安定化の効果を示す図であり、トレハロース添加血清を凍結乾燥し、水を加えて復元した血清の電気泳動パターンを示す図である。【図２】  本発明の実施の形態例４における上記凍結乾燥する前のトレハロース添加血清の電気泳動パターンを示す図である。【符号の説明】ＬＤＬ・・・電気泳動的に調べたＬＤＬコレステロール値。ＨＤＬ・・・電気泳動的に調べたＨＤＬコレステロール���。