【手続補正書】
【提出日】平成17年3月10日(2005.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）−（３）：
【化１】
1999269157.tif 000001
［式（１）−（３）中、
Ｒは、水素原子または炭素数１−５のアルキル基であり；
ｎは、０−１０の整数であり；
ｍは、２−１０の整数であり；そして
ｌは、１−１０の整数である］
からなるグループから選択される構造を有する化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の式（１）−（３）の化合物と高分子化合物又は標識化合物との結合体。
【請求項３】
請求項１に記載の式（１）−（３）の化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（４）：
【化２】
1999269157.tif 000002
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製造することを特徴とする、式（４）で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により製造された、式（４）で表される化合物に反応性を示す抗体または抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項４に記載の抗体または抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項６】
ＢＴＺ  ２２−１１またはＢＴＺ  ２２−２１である、請求項４または５に記載の抗体または抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６７０４またはＦＥＲＭ  Ｐ−１６７０５で寄託されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原と結合可能なフラグメントを用いることを特徴とする、式（４）で表される化合物の免疫学的測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、３−イソプロピル−１Ｈ−２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）−オン  ２，２−ジオキシド（以下、本明細書中「ベンタゾン」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本発明はさらに、前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ベンタゾンに反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記ベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合体を使用することを含む、ベンタゾンの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
次に、式（Ｘ１１）の化合物をナトリウムエトキシド（ナトリウムエチラート）、ナトリウムメチラート、水素化ナトリウム等の縮合剤の存在下で加熱撹拌することにより、以下の式（Ｘ１２）：
【化１７】
1999269157.tif 000003
［式（Ｘ１１）中、Ｐ１およびｌは先に定義した通りである］
で表される化合物を得ることができる。反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは５０℃から１２０℃、１０分間から１０時間、好ましくは０．５時間から１時間撹拌することにより行う。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
カルボキシル基の保護基は、酸又はアルカリ存在下で除去することができる。メチル基、エチル基等の低級アルキル基、及びベンジル基、フェニル基などは、水とメタノール、エタノール、ＴＨＦ等の有機溶媒との混合溶液中で、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ存在下、０℃から６０℃、好ましくは０℃から１０℃、５分から２０時間、好ましくは５分から１時間撹拌することによって除去できる。メチル基、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、２−トリメチルシリルエトキシメチル基などはジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等の適当な有機溶媒中で、塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸あるいは酢酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸等の有機酸存在下、マイナス１０℃から６０℃、好ましくは０℃から２５℃、１時間から２０時間、好ましくは２時間から５時間撹拌することにより除去できる。また、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基は加水素分解、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリイソプロピルシリル基、２−トリメチルシリルエトキシメチル基等のシリル基は、フッ化ピリジニウム、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）等によって除去することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応において慣用されている化合物を使用することができる。例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
ベンタゾンの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。（ａ）まず、ベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合体である抗原を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。（ｃ）これに各種濃度のベンタゾンを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びベンタゾンに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、ベンタゾン−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のベンタゾンの量を決定することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
なお、担体に固相化させる抗原としては、抗体を作製したベンタゾン誘導体と高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）−（３）で表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもできる。例えば、式（１）−（３）の化合物でｎ、ｍまたはｌの数が相違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることもできる。さらに、式（１）−（３）に含まれない他のベンタゾン類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本発明のモノクローナル抗体ＢＴＺ  ２２−１１は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でベンタゾンの量を０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。また、ＢＴＺ  ２２−２１は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でベンタゾンの量を０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例９、図２）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
なお、酵素等の標識物質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したベンタゾン誘導体自体のみならず、式（１）−（３）で表される他の誘導体を用いることもできる。例えば、式（１）−（３）においてｎ、ｍまたはｌの数が相違する化合物を各々抗体作製用と標識競合用の化合物として用いることができる。さらに、式（１）−（３）に含まれない他のベンタゾン類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。（ｃ）工程においてベンタゾンを含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、ベンタゾンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体との複合体が生成する。ベンタゾンを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えば６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加したホウ酸緩衝液を使用することができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
本発明のモノクローナル抗体ＢＴＺ  ２２−１１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でベンタゾンの量を０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。また、ＢＴＺ  ２２−２１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でベンタゾンの量を０．００１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例１１、図３）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
例えば、ＢＴＺ  ２２−１１およびＢＴＺ  ２２−２１は、ベンタゾンの類縁化合物、例えば、ベンタゾンの代謝物である６−ヒドロキシベンタゾン及びＮ−メチルベンタゾン、並びに除草剤のベンスルフロンメチルおよびメフェナセット、殺虫剤のフェニトロチオンおよびイミダクロプリド、殺菌剤のプロベナゾールおよびトリシクラゾールに対してほとんど反応せず、ベンタゾンに対する特異性の高い抗体である（実施例１２）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
６−［Ｎ−（２−メトキシカルボニルフェニル）スルファモイルアミノ］ヘキサン酸メチル（２）
アセトニトリル２０ｍｌに６−アミノヘキサン酸メチル塩酸塩（１）３.６ｇ（２０ｍｍｏｌ）、塩化スルフリル２.７ｇ（２０ｍｍｏｌ）および五塩化アンチモン０.０２ｇを加えた。この懸濁液を２時間撹拌下に環流させた後、更に塩化スルフリル２.７ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加え、２時間環流させた。反応混合物を濃縮後、残渣をトルエン３ｍｌに溶解し、この溶液をトルエン１０ｍｌ中のアントラニル酸メチル３.０ｇ（２０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２.２ｇ（２２ｍｍｏｌ）に２０℃から４０℃で加え、次いで６０℃で１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル１５０ｍｌで抽出し、酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、濾液を濃縮した。残渣の固体をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１の混合溶媒で再結晶し、４.９ｇ（７５％）の目的物（２）を得た。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
３−（５−カルボキシペンチル）−１Ｈ−２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）−オン  ２，２−ジオキシド（３）
６−［Ｎ−（２−メトキシカルボニルフェニル）スルファモイルアミノ］ヘキサン酸メチル（２）１.０ｇ（３ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、この溶液にナトリウムエチラート０.７ｇ（１０ｍｍｏｌ）を室温下に加え、９０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮後、残渣に３Ｎの塩酸を加え酸性とし、酢酸エチル１５０ｍｌで抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、濾液を濃縮した。残渣の固体をトルエンで再結晶し、０.７ｇ（７３％）の目的物（３）を得た。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
１−（５−カルボキシペンチル）−３−イソプロピル−２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）−オン  ２，２−ジオキシド
３−イソプロピル−２，１，３−ベンゾチアジアジン−４（３Ｈ）−オン  ２，２−ジオキシド（ベンタゾン）０．６ｇ（２．５ｍｍｏｌ）と６−ブロモヘキサン酸０.６ｇ（３.０ｍｍｏｌ）をトルエン１５ｍｌに溶解した。この溶液に室温下トリエチルアミン０.６ｇ（５.９ｍｍｏｌ）を加え、撹拌下に１.５時間環流した。反応混合物に酢酸エチル７０ｍｌを加え、有機層を水、２Ｎの塩酸、水の順に洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）に通し、０.６ｇ（収率６７％）の目的物を得た。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
５−（５−エトキシカルボニルペンチルオキシ）アントラニル酸メチル（２）
５−ヒドロキシアントラニル酸メチル（１）３.３ｇ（２０ｍｍｏｌ）、６−ブロモヘキサン酸エチル４．９ｇ（２２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム３．０ｇ（２４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド６０ｍｌに入れ、１６０℃で１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出、有機層を水洗し、炭酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し２.８ｇ（収率４５％）の目的物（２）を得た。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
融点：９４−９７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ６，４００ＭＨｚ）
δ  １．４１（６Ｈ，ｄ，２ＣＨ３），    １．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），
１．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），      １．８４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），
２．２５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２），      ４．５６（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２），
４．７９（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），        ７．９０（２Ｈ，ｍ，Ａｒ：Ｈ），
８．１４（１Ｈ，ｄ，Ａｒ：Ｈ），
１２．０６（２Ｈ，ｂｒ，ＮＨ，ＣＯＯＨ）
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
先ず、実施例１で作製したベンタゾン誘導体−１の５μmolを無水ジオキサン５０μlに溶解し、ここにトリ−ｎ−ブチルアミン２.６２μl及びクロロ蟻酸イソブチル１.４３μlを添加し、３７℃で１時間撹拌した。さらに、０．２Ｍホウ酸緩衝液１．５ｍｌに溶解したＫＬＨまたはＢＳＡ１０ｍｇを加え、常温で６時間反応を行った。ＰＢＳで透析後、７％Ｋ２ＣＯ３を含んだＰＢＳの条件下で４時間処理し、再度ＰＢＳで透析して目的物を得た。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
1999269157.tif 000004