(57)【要約】  多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているニワトリ胚性幹細胞を樹立する。このようなニワトリ胚性幹細胞を遺伝子改変技術に応用可能な細胞であることを評価するために、生殖細胞分化能の指標となるタンパク質を検出する。これにより、遺伝子改変技術に応用可能なニワトリ胚性幹細胞およびその評価方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを特徴とするニワトリ胚性幹細胞。
【請求項２】
請求の範囲１に記載のニワトリ胚性幹細胞であって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
が安定的に発現していることを特徴とするニワトリ胚性幹細胞。
【請求項３】
請求の範囲２に記載のニワトリ胚性幹細胞であって、
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
が安定的にさらに発現していることを特徴とするニワトリ胚性幹細胞。
【請求項４】
多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを検出する検出工程を包含することを特徴とするニワトリ胚性幹細胞を評価する方法。
【請求項５】
前記検出工程が少なくとも１０日にわたって行われることを特徴とする請求の範囲４に記載の方法。
【請求項６】
請求の範囲４に記載の方法であって、
前記検出工程が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
の安定的な発現を検出することによって行われることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求の範囲６に記載の方法であって、
前記検出工程が、
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
の安定的な発現をさらに検出することによって行われることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求の範囲１に記載のニワトリ胚性幹細胞が備えられていることを特徴とする遺伝子改変ニワトリを作出するためのキット。
【請求項９】
ニワトリＬＩＦタンパク質がさらに備えられていることを特徴とする請求の範囲８に記載のキット。
【請求項１０】
請求の範囲１に記載のニワトリ胚性幹細胞をニワトリＬＩＦタンパク質とともに培養する工程を包含することを特徴とする遺伝子改変ニワトリの作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリ胚性幹細胞およびその評価方法に関するものであり、より詳細には、遺伝子改変技術に応用可能なニワトリ胚性幹細胞、および遺伝子改変技術に応用可能なニワトリ胚性幹細胞であることを適切に評価する評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）は、初期胚から分離された、多分化能を有する未分化な細胞であり、多分化能（三胚葉に分化し得る能力）だけでなく自己複製能を有していることが知られている。このようなＥＳ細胞は、再生医療分野等においてさかんに研究されている。また、マウスＥＳ細胞は、遺伝子ターゲティング法を用いて特定遺伝子を改変したマウスの作製等に広く利用されている。【０００３】
近年、生物固有の遺伝子の機能解析は、特定の遺伝子が導入された動物、または特定の遺伝子がノックアウトされた動物を作出することによって、飛躍的に進歩した。このような動物、すなわち、遺伝子改変動物は、医学生物学だけでなく広範な研究領域において使用されており、各領域における研究開発に大きな進歩をもたらしている。【０００４】
遺伝子改変技術に応用するためには、ＥＳ細胞が生殖細胞へ分化し得ることがさらに必要である。しかし、多能性を有しかつ生殖細胞へ分化可能であるＥＳ細胞は、マウス以外では報告されておらず、マウス以外の動物種ではその細胞樹立方法および評価方法の開発が必要である。【０００５】
ニワトリＥＳ細胞を樹立したという報告がこれまでになされている（非特許文献１〜３参照）。これらの報告では、多能性を維持させる培地添加因子としてマウス由来の白血病阻害因子（ＬＩＦ）およびそのファミリーファクターを使用している。また、非特許文献２および３では、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ（ＢＲＬ）細胞の培養上清を用いることによってＥＳ細胞を樹立したと報告されている。
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００３−９８６９号公報（公開日：平成１５年１月１４日）
【特許文献２】ＷＯ２００６／０５４６６６Ａ１パンフレット（国際公開日：２００６（平成１８）年５月２６日）
【非特許文献１】Pain B. et al. Development 122(8): 2339-2348 (1996)
【非特許文献２】van de Lavoir MC. et al. Mech. Dev. 123(1): 31-41 (2005)
【非特許文献３】van de Lavoir MC. and Mather-Love C. Methods Enzymol. 418: 38-64 (2006)
【非特許文献４】Horiuchi H. et al. J. Biol. Chem. 279(23): 24514-24520 (2004)
【非特許文献５】Yamashita Y. et al. Dev. Comp. Immunol. 30(5): 513-22 (2006)
【非特許文献６】Mitsui K. et al. Cell 113(5): 631-642 (2003)
【非特許文献７】Chambers I. et al. Cell 113(5): 643-655 (2003)
【非特許文献８】van de Lavoir MC. et al. Nature 441: 766-769 (2006)。
【発明の開示】
【０００６】
しかし、非特許文献１に記載のニワトリＥＳ細胞は長期継代培養（１０日以上）すると多能性が消失する（非特許文献４および５、ならびに特許文献１参照）。また、非特許文献２および３に記載のＢＲＬ培養上清の具体的な効果は明らかではなく、さらに、この方法で作出されたＥＳ細胞は、ＣＶＨ（ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｖａｓａ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ；生殖系列細胞に特異的に発現し、生殖細胞分化能を有するか否かの指標となる分子）の発現が認められていないので、生殖細胞への分化能を欠失している（非特許文献８参照）。このように、これまでに報告されたニワトリＥＳ細胞は、「多能性を有しかつ生殖細胞へ分化可能である」という特長を有していないので、遺伝子改変技術に応用することができない。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、遺伝子改変技術に応用可能なニワトリＥＳ細胞を樹立するとともに、遺伝子改変技術に応用可能なニワトリＥＳ細胞であるか否かを評価する方法を提供することにある。
【０００８】
本発明に係るニワトリ胚性幹細胞は、多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを特徴としている。上記構成を有していることにより、本発明は遺伝子改変ニワトリ作出に利用可能である。
【０００９】
本発明に係るニワトリ胚性幹細胞は、Ｓａｃｈｉ−１タンパク質およびＣＶＨタンパク質の両方が安定的に発現されていることが好ましい。Ｓａｃｈｉ−１タンパク質としては、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が意図され、ＣＶＨタンパク質としては、（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が意図される。
【００１０】
本発明に係るニワトリ胚性幹細胞は、ｃｈｉｗｉタンパク質が安定的にさらに発現されていることがより好ましい。ｃｈｉｗｉタンパク質としては、（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が意図される。
【００１１】
本発明に係るニワトリ胚性幹細胞は、Ｓａｃｈｉ−１のｍＲＮＡおよびＣＶＨのｍＲＮＡの両方が安定的に発現されていることが好ましい。Ｓａｃｈｉ−１のｍＲＮＡは、配列番号１に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドが意図され、ＣＶＨのｍＲＮＡは配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドが意図される。
【００１２】
本発明に係るニワトリ胚性幹細胞はまた、ｃｈｉｗｉのｍＲＮＡが安定的にさらに発現されていることがより好ましい。ｃｈｉｗｉのｍＲＮＡは、配列番号３に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドが意図される。
【００１３】
本発明に係るニワトリ胚性幹細胞を評価する方法は、多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを検出する検出工程を包含することを特徴としている。上記構成を有することにより、本発明は、胚性幹細胞が遺伝子改変ニワトリ作出に利用可能であるか否かを評価することができる。
【００１４】
本発明に係る評価方法において、上記検出工程は少なくとも１０日にわたって行われることが好ましい。これにより、胚性幹細胞が多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを確認することができる。
【００１５】
また、本発明に係る評価方法において、上記検出工程は、Ｓａｃｈｉ−１タンパク質およびＣＶＨタンパク質の両方の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましく、より詳細には、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の両方の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましい。
【００１６】
なお、本発明に係る評価方法において、上記検出工程は、Ｓａｃｈｉ−１のｍＲＮＡおよびＣＶＨのｍＲＮＡの安定的な発現を検出することによって行われてもよく、より詳細には、（ａ’）配列番号１に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド、および（ｂ’）配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドの安定的な発現を検出することによって行われてもよい。
【００１７】
本発明に係る評価方法において、上記検出工程はさらに、ｃｈｉｗｉタンパク質の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましく、より詳細には、（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましい。
【００１８】
なお、本発明に係る評価方法において、上記検出工程は、ｃｈｉｗｉのｍＲＮＡの安定的な発現を検出することによって行われてもよく、より詳細には、（ｃ’）配列番号３に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドの安定的な発現を検出することによって行われてもよい。
【００１９】
本発明に係るキットは、上記ニワトリ胚性幹細胞が備えられていることを特徴としている。上述したように、本発明に係るニワトリ胚性幹細胞は、遺伝子改変ニワトリ作出に利用可能な細胞である。本発明に係るキットは、ニワトリＬＩＦタンパク質がさらに備えられていてもよい。
【００２０】
本発明に係る遺伝子改変ニワトリの作出方法は、上記ニワトリ胚性幹細胞をニワトリＬＩＦタンパク質とともに培養する工程を包含することを特徴としている。上記構成を有していることにより、ニワトリ胚性幹細胞を分化させることなく遺伝子操作（ターゲティング）し得る。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、培養３日後における胚盤葉細胞のコロニーの形態を示した図である。
【図２】図２は、継代培養後においても安定して増殖するニワトリＥＳ細胞を示した図であり、（ｂ）は（ａ）の強拡大像である。
【図３】図３は、樹立したニワトリＥＳ細胞（２系統）を凍結保存した後に再融解して培養した様子を示す（（ａ）樹立後１年以上経過した細胞、（ｂ）樹立後半年以上経過した細胞）。
【図４】図４は、Ｓａｃｈｉ−１のアミノ酸配列と哺乳類Ｎａｎｏｇのアミノ酸配列とのアラインメント（ａ）およびホメオドメインにおけるＳａｃｈｉ−１のアミノ酸配列と哺乳類Ｎａｎｏｇのアミノ酸配列との同一性を調べた結果（ｂ）を示す図である。
【図５】図５は、Ｓａｃｈｉ−１  ｍＲＮＡの定量的発現解析を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いて行った結果を示す図である。
【図６】図６は、ニワトリの各種組織および細胞を用いた発現解析を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いて行った結果を示す図である。
【図７】図７は、胚盤葉細胞（胚盤葉明域）を用いた蛍光抗体法の結果を示す図であり、（ａ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）は抗Ｓａｃｈｉ−１抗体による免疫染色像を示し、（ｃ）は抗ＣＶＨ抗体による免疫染色像を示す。
【図８】図８は、胚盤葉細胞（胚盤葉明域）を用いた蛍光抗体法の結果を示す図であり、（ａ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）はＤＡＰＩ染色像を示し、（ｃ）は抗ｃｈｉｗｉ抗体による免疫染色像を示す。
【図９】図９は、蛍光抗体法によって始原生殖細胞（ＰＧＣ）を用いた蛍光抗体法の結果を示す図であり、（ａ）および（ｅ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）および（ｆ）はＤＡＰＩ染色像を示し、（ｃ）は抗Ｓａｃｈｉ−１抗体による免疫染色像を示し、（ｄ）は抗ｃｈｉｗｉ抗体による免疫染色像を示し、（ｇ）は抗ＣＶＨ抗体による免疫染色像を示す。なお、（ａ）〜（ｄ）および（ｅ）〜（ｇ）はそれぞれ同じ視野を観察した結果である。
【図１０】図１０は、蛍光抗体法によって精巣切片を用いた蛍光抗体法の結果を示す図であり、（ａ）はＣＶＨ陽性細胞を観察した図であり、（ｂ）はｃｈｉｗｉ陽性細胞を観察した図（いずれも上段が低倍率、下段が高倍率）である。
【図１１】図１１は、樹立したニワトリＥＳ細胞のうちの異なる２系統についての蛍光抗体法の結果を示す図であり、（ａ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）は抗Ｓａｃｈｉ−１抗体による免疫染色像を示し、（ｃ）は抗ｃｈｉｗｉ抗体による免疫染色像を示す。
【図１２】図１２は、樹立したニワトリＥＳ細胞の遺伝子発現を、多能性および生殖細胞分可能能を有している胚盤葉細胞と比較して調べた結果を示す図である。
【図１３】図１３は、樹立したニワトリＥＳ細胞株が遺伝子導入を行った後も多能性および生殖細胞分化能を維持していることを示す図であり、（ａ）は明視野像を示し、（ｂ）はＥＧＦＰの蛍光像を示し、（ｃ）はＣＶＨの抗体染色像を示す。
【図１４】図１４は、ＥＧＦＰ導入後でありかつＣＶＨ陽性のニワトリＥＳ細胞株をレシピエント胚へ移植し、孵卵２〜３日後に回収した胚血液を観察した結果を示す図であり、（ａ）は明視野像を示し、（ｂ）ＥＧＦＰの蛍光像を示す。
【図１５】図１５は、ＥＧＦＰ導入後でありかつＣＶＨ陽性のニワトリＥＳ細胞株をレシピエント胚へ移植し、孵卵して得られたキメラ体の生殖巣からのゲノムＤＮＡに存在するＥＧＦＰを検出した結果を示す図である。
【図１６】図１６は、樹立／評価したニワトリＥＳ細胞が生殖系列に寄与することを実証した図である。（ａ）はＥＳ細胞を移植することによって誕生した第一世代キメラニワトリ（Ｇ０）の雛（上段）および性成熟した個体（下段）を示し、（ｂ）は（ａ）に示したニワトリから人工授精により誕生したＧ１世代の雛（黒色羽毛）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
〔１．ニワトリ胚性幹細胞〕
本発明に係るニワトリ胚性幹（ＥＳ）細胞は、多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを特徴としている。多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているニワトリＥＳ細胞は、これまでには存在しない。上記構成を有していることにより、本発明に係るニワトリＥＳ細胞は遺伝子改変ニワトリ作出に利用可能である。【００２４】
１つの局面において、本発明に係るニワトリＥＳ細胞は、Ｓａｃｈｉ−１タンパク質およびＣＶＨタンパク質の両方が安定的に発現されていることが好ましく、ｃｈｉｗｉタンパク質が安定的にさらに発現されていることがより好ましい。【００２５】
Ｓａｃｈｉ−１タンパク質としては、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が意図され、ＣＶＨタンパク質としては、（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が意図される。また、ｃｈｉｗｉタンパク質としては、（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が意図される。【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。また、タンパク質の「フラグメント」は、当該タンパク質の部分断片が意図される。本明細書中で使用される場合、タンパク質は、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。【００２７】
用語「単離された」タンパク質は、その天然の環境から取り出されたタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。【００２８】
他の局面において、本発明に係るニワトリＥＳ細胞は、Ｓａｃｈｉ−１のｍＲＮＡおよびＣＶＨのｍＲＮＡの両方が安定的に発現されていることが好ましく、ｃｈｉｗｉのｍＲＮＡが安定的にさらに発現されていることがより好ましい。【００２９】
Ｓａｃｈｉ−１のｍＲＮＡは、配列番号１に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドが意図され、ＣＶＨのｍＲＮＡは配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドが意図される。また、ｃｈｉｗｉのｍＲＮＡは、配列番号３に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドが意図される。【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、その断片部分が意図される。本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されても、化学合成されてもよい。【００３１】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。【００３２】
用語「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然の環境から取り出されたポリヌクレオチドが意図される。例えば、宿主細胞中で発現されたポリヌクレオチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリヌクレオチドと同様に、単離されていると考えられる。【００３３】
本発明に係るニワトリＥＳ細胞（多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているニワトリＥＳ細胞）を樹立するために用いる培地としては、EmbryoMax DMEM（CHEMICON社製）が好ましいがこれらに限定されない。【００３４】
本発明に係るニワトリＥＳ細胞を樹立するために用いる支持細胞（フィーダー細胞）としては、ＳＴＯ細胞またはニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞が好ましいがこれらに限定されない。なお、当業者は、ＣＥＦ細胞をニワトリ組織から容易に調製し得るが、細胞がウイルス等により癌化することを防ぐために、ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ（ＳＰＦ；特定病原体を含まない）受精卵胚を使用することが望ましい。【００３５】
本発明に係るニワトリＥＳ細胞を樹立するために用いるニワトリ受精卵としては、放卵直後の可能な限り新鮮なものであれば特に限定されない。細胞樹立後に細胞の多能性を羽毛色で確認するためには、黒色羽毛の品種（例えば、黄斑プリマスロック種）を利用することが望ましい。なお、羽毛色は一つの目安であり、羽毛色キメラではなくても生殖系キメラであることもあるので、ニワトリ種も特に限定されない。【００３６】
ニワトリ受精卵から回収する胚盤葉は、Eyal-Giladi H. および Kochav S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49(2): 321-37 (1976) に記載の発生段階表におけるステージＸであることが好ましく、発生が進んでいるものは排除されるべきである。胚盤葉の回収にはリング回収が好ましいがこれに限定されない。回収した細胞を分散し、支持細胞上に播種し、コロニーが形成するまで（培養開始から２〜３日間）培養する。形成されるコロニーの直径は５０〜１０００μｍが好ましく、１００〜５００μｍがより好ましく、２００〜５００μｍがさらに好ましい。なお、この時期の細胞（コロニー）を継代することが好ましく、さらなる２〜３日間で上記直径を有するコロニーが形成されるように継代する。【００３７】
このような手順を経ることによって、本発明に係るニワトリＥＳ細胞を樹立することができる。さらに、本発明に係るニワトリＥＳ細胞は凍結保存した後に解凍して用いても、機能を喪失することなく増殖し得る。【００３８】
〔２．ニワトリ胚性幹細胞の評価方法〕
このように、本発明に係るニワトリ胚性幹（ＥＳ）細胞は、多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているので、遺伝子改変技術に応用し得る。多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているニワトリＥＳ細胞は、これまでには存在しない。【００３９】
本明細書を読んだ当業者は、ニワトリＥＳ細胞が遺伝子改変技術に応用し得るか否かを評価するために、多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているか否かを確認すればよいことを、容易に理解する。すなわち、本発明はさらに、ニワトリＥＳ細胞の評価方法を提供する。【００４０】
本発明に係るニワトリＥＳ細胞を評価する方法は、多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを検出する検出工程を包含することを特徴としている。上記構成を有することにより、本発明は、ＥＳ細胞が遺伝子改変ニワトリ作出に利用可能であるか否かを評価することができる。【００４１】
１つの局面において、本発明に係る評価方法は、上記検出工程が、Ｓａｃｈｉ−１タンパク質およびＣＶＨタンパク質の両方の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましく、より詳細には、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の両方の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましい。【００４２】
上述したタンパク質の発現は、それぞれに対する特異的抗体を用いて確認すればよい。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、Ｓａｃｈｉ−１タンパク質、ＣＶＨタンパク質またはＣｈｉｗｉタンパク質に対する抗体は、それぞれのタンパク質に対する特異的抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本明細書を読んだ当業者は、これらのタンパク質のアミノ酸配列を把握し得るので、それぞれのリコンビナントタンパク質を容易に作製し、動物を免疫することにより、目的の抗体を作製し得る。【００４３】
抗体を用いた目的のタンパク質の検出には、当該分野において周知の種々の技術を用いればよい。【００４４】
他の局面において、本発明に係る評価方法は、上記検出工程が、Ｓａｃｈｉ−１のｍＲＮＡおよびＣＶＨのｍＲＮＡの安定的な発現を検出することによって行われてもよく、より詳細には、（ａ’）配列番号１に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド、および（ｂ’）配列番号５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドの安定的な発現を検出することによって行われてもよい。【００４５】
本発明に係る評価方法において、上記検出工程はさらに、ｃｈｉｗｉタンパク質の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましく、より詳細には、（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の安定的な発現を検出することによって行われることが好ましい。【００４６】
なお、本発明に係る評価方法において、上記検出工程は、ｃｈｉｗｉのｍＲＮＡの安定的な発現を検出することによって行われてもよく、より詳細には、（ｃ’）配列番号３に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドの安定的な発現を検出することによって行われてもよい。【００４７】
上述したｍＲＮＡの発現は、それぞれのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲなどの技術を用いて確認すればよい。ｍＲＮＡの発現を確認するためには、配列番号１、３または５に示される塩基配列に基づいて、増幅用のオリゴヌクレオチド（プライマー）を設計して用いればよい。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド、トリヌクレオチドといわれ、長いものは３０塩基または１００塩基というように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドはより長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。なお、プライマーとして用いる場合、オリゴヌクレオチドの長さは１５〜４０塩基が好ましく、１５〜３０塩基がより好ましく、２０〜３０塩基がさらに好ましい。なお、プライマーの長さは、用途、条件などに応じて当業者が適宜設計し得る。【００４８】
配列番号１、３または５に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドが、それぞれ配列番号１、３または５に示される塩基配列の全長または一部分として合成され得る。得られたオリゴヌクレオチドは、次いで、放射性核種、酵素、ビオチン、蛍光試薬などで標識されて使用される。このようなオリゴヌクレオチドはまた、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されてもよい。また、配列番号２、４または６に示されるアミノ酸配列に基づいて設計した縮重プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってもよい。【００４９】
本発明に係る評価方法において、上記検出工程は少なくとも１０日にわたって行われることが好ましい。これにより、ＥＳ細胞が多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを確認することができる。【００５０】
従来のニワトリＥＳ細胞は長期継代培養（１０日以上）すると多能性が消失することが知られている。ＥＳ細胞が多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているか否かは、上述したようなタンパク質またはｍＲＮＡが安定的に発現しているか否かによって知ることができる。すなわち、対象とする細胞の継代培養開始から１０日間にわたって上述したようなタンパク質またはｍＲＮＡの発現を検出することにより、その細胞が多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているか否かを知ることができる。【００５１】
本明細書中において用いられる場合、「タンパク質が安定的に発現している」は「ｍＲＮＡが安定的に発現している」を包含し、「タンパク質の安定的な発現」は「ｍＲＮＡの安定的な発現」を包含する。【００５２】
本明細書中において用いられる場合、「（検出を）１０日間にわたって行う」は、１０日間の少なくとも最初と最後において目的の検出を行うことが意図され、検出が毎日行われても行われなくてもよい。よって、「（検出を）少なくとも１０日にわたって行う」は、１０日以上の所定の期間の少なくとも最初と最後において目的の検出を行うことが意図される。【００５３】
〔３．遺伝子改変ニワトリ作出方法およびキット〕
遺伝子改変ニワトリを作出するためには、ニワトリの胚性幹（ＥＳ）細胞を首尾よく継代培養しなければならない。ニワトリＥＳ様細胞について、従来の培養方法は、遺伝子改変ニワトリを作製するには大きな問題点を有する。具体的には、ＥＳ様細胞について、公知のいずれの培養方法を用いて培養しても全能性（生殖系列（精子または卵子）に分化する能力）を維持しているのは初代培養時のみであり、継代培養後は全能性を消失している。このことは、ＥＳ様細胞へ遺伝子を導入した後、継代培養を経て遺伝子改変ニワトリを作出することが不可能であることを示す。【００５４】
本発明は、ニワトリＬＩＦタンパク質を備える遺伝子改変ニワトリを作出するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているニワトリＥＳ細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬（例えば、培地、さらなる増殖因子など）をさらに備えていてもよい。【００５５】
遺伝子改変ニワトリを作出するためには、遺伝子を導入した後少なくとも４〜５代の継代が可能なニワトリＥＳ様細胞を得る必要がある。また、ＥＳ細胞の遺伝子操作を行う際には、細胞分化を抑制することが重要である。これらに関して、ニワトリＬＩＦタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）は、マウスＬＩＦタンパク質（ｒｍＬＩＦ）よりも効果が明らかに高い。【００５６】
好ましい実施形態において、本発明に係るキットは、ニワトリＬＩＦタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）をさらに備えている。なお、ニワトリＬＩＦタンパク質については、特許文献１および２を参照のこと。これらの文献は、本発明者らによる特許文献であり、本明細書中に参考として援用される。本実施形態において用いられるニワトリＬＩＦタンパク質は、原核生物宿主にて作製したリコンビナント（原核型）でも真核生物宿主にて作製したリコンビナント（真核型）でもよいが、真核型であることがより好ましい。好ましい実施形態において、本発明に係るキットは、真核型ニワトリＬＩＦタンパク質として精製タンパク質を備えていても、真核型ニワトリＬＩＦタンパク質を安定に供給することができる細胞を備えていてもよい。このような細胞としては、受託番号［ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９９］（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、あて名：日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、受託日：平成１７年１月５日）によって示される細胞が好ましい。また、本実施形態に係るキットは、このような細胞を培養して得られた馴化培地を真核型ニワトリＬＩＦタンパク質として備えていてもよい。【００５７】
上記細胞より分泌された成熟形態のｒｃｈＬＩＦは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる（コードする塩基配列は配列番号７に示される塩基配列からなる）。上述した真核型ニワトリＬＩＦタンパク質は、特定の糖鎖が付加されていることによって、物理化学的に安定でありかつ生物活性が高い。真核型ニワトリＬＩＦタンパク質は、ハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースを糖鎖として有していることが好ましく、ハイマンノース型Ｎ結合の糖鎖、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、およびシアル酸の側鎖を有していることがより好ましい。【００５８】
本発明に係る遺伝子改変ニワトリの作出方法は、上述したキットを用いる態様であれば特に限定されず、具体的には、上記ニワトリＥＳ細胞をニワトリＬＩＦタンパク質とともに培養する工程を包含していればよい。【００５９】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【００６０】
また、本明細書中に列挙された学術論文および特許文献は、その全てが本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【００６１】
〔１．ニワトリＥＳ細胞の樹立〕
〔１−１．ニワトリＥＳ細胞培養用培地〕
以下に示す組成を有する培地（Chicken Embryonic Stem cell Medium (CESM)）を用いて、ＥＳ細胞の培養および継代を行った。
・EmbryoMax DMEM (CHEMICON)                  764 mL
・Knockout serum replacement (KSR, GIBCO)    200 mL
・chicken serum (GIBCO)                       20 mL
・100 mM sodium pyruvate solution (和光)       1 mL
・MEM non-essential amino acid (GIBCO)         5 mL
・nucleoside stock solution                   10 mL
（合計）                                    1000 mL
なお、nucleoside stock solutionとして、adenosineを80 mg、guanosineを85 mg、cytidineを73 mg、thymidineを24 mg、uridineを73 mg（試薬は全てSigma社）を100 mlの蒸留水に溶解した後、ろ過滅菌して使用した。また、ＣＥＳＭに、使用直前にβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｒｔｈａｎｏｌ希釈液（ＣＥＳＭ培地１ｍＬに７μＬのβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｒｔｈａｎｏｌを添加した）を１μＬ／ｍＬの濃度で添加した。また天然型ニワトリＬＩＦタンパク質を２０ｎｇ／ｍＬの濃度で同時に添加した。天然型ニワトリＬＩＦタンパク質は受託番号［ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９９］で示されるニワトリ胚線維芽細胞株（ＯＵ２）にニワトリＬＩＦ遺伝子を導入して産生させたタンパク質を精製した（特許文献２参照）。【００６２】
〔１−２．支持細胞〕
ＣＥＦ細胞またはＳＴＯ細胞をコンフルエントになるまで１０％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で培養した。ＣＥＦ細胞には、公知の手順に従って、ＳＰＦ受精卵を１０日間孵卵した胚から調製したものを用いた。また、ＳＴＯ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から分譲を受けた。【００６３】
コンフルエントになった細胞に、１ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ−ＰＢＳを培地に添加（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）した。２時間培養した後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な培地に交換した後に数時間〜一晩培養した。【００６４】
オートクレイブで溶解滅菌した０．１％  ｇｅｌａｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ：ｔｙｐｅＡ，Ｇ−２６２５）−ＤＷを、予め２４ウエルプレートに２００μＬ添加して１時間静置しておいた。上記のように培養した細胞をＰＢＳで３回洗浄した後に、細胞をｔｒｙｐｓｉｎ処理により回収し、細胞数を計測した。【００６５】
１０％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中に１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウエルプレートに４×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）となるように、細胞を播種した。全ての細胞が接着した後に支持細胞として利用可能である（なお、播種５日後までに使用することが好ましい）。【００６６】
〔１−３．ニワトリＥＳ細胞〕
ステージＸの胚盤葉をリング回収した。回収した明域を、１ｍＬのＬＩＦ添加ＣＥＳＭを加えたチューブに浮遊させ、ピペッティングによって細胞を分散させた。上述した支持細胞から培地を除去し、分散させた細胞を添加した。細胞を、３％Ｏ２、５％ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で培養した。培養した胚盤葉細胞は、２〜３日後には１００〜５００μｍ（直径）の円形のコロニーを形成した。図１には、培養３日後における胚盤葉細胞のコロニーの形態を示した。このコロニーを回収し、上記方法で培養しておいた６ウエルプレート（または３５ｍｍ培養ディッシュ）内の支持細胞上で３〜５日間培養した。培地を毎日半量ずつ交換した。２００〜５００μｍ（直径）に増大したコロニーを、同様に継代した。同様の方法で２〜３日の間隔で継代培養した。図２には、継代培養後においても安定して増殖するニワトリＥＳ細胞を示した。（ｂ）は（ａ）の強拡大像であり、細胞質中の核および明瞭な核小体が観察される。【００６７】
〔１−４．ニワトリＥＳ細胞の凍結保存〕
６ｃｍ培養ディッシュで継代培養した２日目のＥＳ細胞に対して１ｍＬの細胞凍結保存液（セルバンカー１；十慈フィールド株式会社）に、回収したコロニーを再浮遊させた。１．５ｍＬ凍結用チューブに１ｍＬの細胞浮遊凍結保存液を加え、凍結保存用コンテナー（ＮＡＬＧＥＮＥ  Ｃｒｙｏ  １℃）に入れて−８５℃のディープフリーザーにて保存した（必要に応じて液体窒素や−１５０℃フリーザーを利用する）。【００６８】
加温しておいた培地を添加して、凍結細胞を迅速に解凍した。解凍後は３７℃に加温しておいたＥＳ細胞培養用培地を用いて遠心分離することにより細胞を洗浄し、継代培養と同様の手順に従って細胞を培養した。なお、培養に使用する培地類を、予め３７℃に加温して使用した。【００６９】
図３には、樹立したニワトリＥＳ細胞（２系統）を凍結保存した後に再融解して培養した様子を示す。いずれの系統の細胞も樹立直後のコロニー形態を維持していることがわかる（（ａ）：樹立後１年以上経過、（ｂ）：樹立後半年以上経過）。【００７０】
〔２．ニワトリＥＳ細胞のマーカー〕
〔２−１．ニワトリＥＳ細胞の多能性維持に寄与する分子Ｓａｃｈｉ−１〕
〔Ｉ〕Ｓａｃｈｉ−１のｃＤＮＡクローニング
ＥＳ細胞であるか否かを評価する従来法は、抗体によるＳＳＥＡ−１の検出またはアルカリフォスファターゼ活性の検出によって行われている。近年、マウスＥＳ細胞や霊長類ＥＳ細胞では、ＥＳ細胞の多能性維持に関わるいくつかの分子が明らかになっている。例えば、マウスＥＳ細胞から発見されたＮａｎｏｇは、ＥＳ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性を維持するために必須であることが報告されており（非特許文献６および７参照）、このような遺伝子またはタンパク質の発現がＥＳ細胞の多能性維持についての新規マーカーとして利用されている。しかし、ニワトリではこのような有用マーカーは見出されていない。【００７１】
本発明者らは独自の着眼点および解析によって、ニワトリＥＳ細胞の評価に有用な遺伝子を見出した。具体的には、ヒトおよびマウスのＮａｎｏｇ遺伝子が、ヒトでは１２番染色体、マウスでは６番染色体上でｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒに近接してコードされていることに着目し、ニワトリにおいてｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒがコードされている１番染色体のゲノム配列の中から哺乳類Ｎａｎｏｇ遺伝子と相同性を有するいくつかの遺伝子断片を見出し、これらの遺伝子断片配列に基づいてＮａｎｏｇ様相同分子（Ｓａｃｈｉ−１）の全ｍＲＮＡ配列を決定した。【００７２】
クローニングしたＳａｃｈｉ−１  ｍＲＮＡは、全長３１３０ｂｐ（予想されるＣＤＳは９３０ｂｐ）であり、３０９アミノ酸をコードする（それぞれ、配列番号１および２）。推定のアミノ酸配列では、哺乳類Ｎａｎｏｇの特徴とされているホメオドメインのＣ末側に存在するトリプトファン（Ｗ）リピートがＳａｃｈｉ−１には見出されなかった（図４の（ａ）中矢印）。また、Ｓａｃｈｉ−１とＮａｎｏｇとの同一性を調べると、ヒトＮａｎｏｇおよびマウスＮａｎｏｇとはそれぞれ２４．３％および２４．６％しかなかった。また、ヒトＮａｎｏｇおよびマウスＮａｎｏｇの間で高度に保存されているホメオドメイン（図４の（ａ）中ボックス）が保存されていたことを除くと、その他の領域はＳａｃｈｉ−１ではほとんど保存されていない。【００７３】
しかし、ホメオドメインに限定すると、ヒトＮａｎｏｇおよびマウスＮａｎｏｇとそれぞれ６５％の同一性を有することがわかった（図４の（ｂ））。Ｂｌａｓｔｐ検索にて得られるホメオタンパク質のアミノ酸配列に基づいて系統樹を作成すると、Ｓａｃｈｉ−１はヒトＮａｎｏｇおよびマウスＮａｎｏｇと最も近縁であり、これらのホメオドメインのみの系統樹比較でも同様にＳａｃｈｉ−１はヒトＮａｎｏｇおよびマウスＮａｎｏｇと最も近縁であった（示さず）。【００７４】
〔ＩＩ〕Ｓａｃｈｉ−１  ｍＲＮＡの遺伝子発現
Ｓａｃｈｉ−１が、マウスＮａｎｏｇおよびヒトＮａｎｏｇと同様にＥＳ細胞の多能性マーカーに利用し得るか否かを調べるために、Ｓａｃｈｉ−１  ｍＲＮＡの定量的発現解析を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いて行った。Ｓａｃｈｉ−１  ｍＲＮＡの発現確認に用いたプライマーの塩基配列は、順方向プライマーが５’−ＡＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号９）であり、逆方向プライマーが５’−ＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＧ−３’（配列番号１０）である。その結果、Ｓａｃｈｉ−１  ｍＲＮＡは、ニワトリＥＳ細胞の基となる放卵直後の胚盤葉細胞でその発現が最も高く、次いで始原生殖細胞で高く発現していることがわかった。また、卵巣でわずかな発現が認められるものの、その他の体細胞では全く発現が認められなかった（図５）。これらの結果は、Ｓａｃｈｉ−１  ｍＲＮＡが多能性を有した細胞または生殖系列細胞でのみ転写されていることを示している。【００７５】
〔２−２．生殖系列細胞で発現する分子ｃｈｉｗｉ〕
〔Ｉ〕ｃｈｉｗｉのｃＤＮＡクローニング
ショウジョウバエの生殖系細胞からクローニングされたＰｉｗｉ遺伝子は、ショウジョウバエにおいて生殖系列の細胞に特異的に発現する遺伝子であることが知られている。その主要な機能は現在も不明であるが、ヒトおよびマウスにおいてその相同遺伝子（ヒトではＨｉｗｉ、マウスではＭｉｗｉ）が次々にクローニングされ、ショウジョウバエと同様に生殖系列の細胞に特異的に発現する遺伝子であることが知られている。本発明者らは、ニワトリにＰｉｗｉ相同遺伝子が存在することを見出し、初めてクローニングを行った。【００７６】
クローニングしたｃｈｉｗｉ  ｃＤＮＡ（３３６３ｂｐ：配列番号３）は８６７アミノ酸をコードし（配列番号４）、アミノ酸レベルでの同一性がＰｉｗｉと６５％、ＨｉｗｉやＭｉｗｉと７７％であることがわかった。また、Ｐｉｗｉファミリーのアミノ酸配列に基づいて系統樹を作成したところ、ｃｈｉｗｉはＨｉｗｉやＭｉｗｉに最も近縁であることがわかった（示さず）。なお、ｃｈｉｗｉとＰｉｗｉファミリー分子とのアミノ酸レベルでの同一性および類似性を表１に示す。【００７７】
【表１】
2008117813.tif 000002
【００７８】
〔ＩＩ〕ｃｈｉｗｉ  ｍＲＮＡの遺伝子発現
ｃｈｉｗｉ  ｍＲＮＡが生殖系細胞に特異的に発現しているか否かを調べるために、ニワトリの各種組織および細胞を用いた発現解析を、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いて行った。ｃｈｉｗｉ  ｍＲＮＡの発現確認に用いたプライマーの塩基配列は、順方向プライマーが５’−ＣＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１１）であり、逆方向プライマーが５’−ＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１２）である。その結果、ｃｈｉｗｉ  ｍＲＮＡは、精巣で最も強く発現し、次いで始原生殖細胞（ＰＧＣ）、胚盤葉細胞、卵巣で発現していることがわかった。このように、Ｐｉｗｉ、Ｈｉｗｉ、Ｍｉｗｉと同様に、ｃｈｉｗｉは、生殖系列の細胞に特異的に発現する遺伝子であることがわかった（図６）。【００７９】
〔３．生殖細胞への分化能の評価〕
〔３−１．抗体によるＥＳ細胞の評価〕
生殖系列細胞で発現するＶａｓａ相同分子（ＣＶＨ：配列番号５および６）が既に知られている。本発明者らは、Ｓａｃｈｉ−１、ｃｈｉｗｉ、ＣＶＨのリコンビナントタンパク質をそれぞれ作製した。具体的には、Ｓａｃｈｉ−１については、配列番号２に示されるアミノ酸配列全長からなるタンパク質、ｃｈｉｗｉについては、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第２４６〜５０４位（配列番号１５）からなるタンパク質、ＣＶＨについては、配列番号６に示されるアミノ酸配列の第１１６〜４６４位（配列番号１６）からなるタンパク質をそれぞれ構築した。これらを用いてウサギを免疫することにより各々のポリクローナル抗体を作製した。ポリクローナル抗体は、抗原結合カラムを用いて特異抗体のみを精製した。また、それぞれのリコンビナントタンパク質を用いてマウスを免疫し、細胞融合法により特異抗体産生性ハイブリドーマを樹立し、各々のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製した。【００８０】
これらの抗体の特異性を解析した。最初に、多能性を維持しかつ生殖細胞への分化能を保持した胚盤葉細胞（胚盤葉明域）を用いた蛍光抗体法を実施した（図７）。（ａ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）は抗Ｓａｃｈｉ−１抗体による免疫染色像を示し、（ｃ）は抗ＣＶＨ抗体による免疫染色像を示す。示すように、胚盤葉細胞は全てＳａｃｈｉ−１陽性細胞（発現部位は核）であり、その中に少数のＣＶＨ陽性細胞が確認された。ＣＶＨ陽性細胞はＳａｃｈｉ−１陽性細胞でもあり、この細胞が始原生殖細胞（ＰＧＣ）または生殖細胞へ分化する。この結果は既報の結果と一致している。すなわち、ＣＶＨ陽性細胞を含むようにＥＳ細胞を樹立しなければならないし、ＣＶＨ陽性細胞がＥＳ細胞樹立過程に消失してはならない。【００８１】
また、胚盤葉細胞（胚盤葉明域）を用いた蛍光抗体法によって、ｃｈｉｗｉ陽性細胞も胚盤葉明域細胞中に確認された（図８）。（ａ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）はＤＡＰＩ染色像を示し、（ｃ）は抗ｃｈｉｗｉ抗体による免疫染色像を示す。ＤＡＰＩは全ての細胞の核を染色するので、ｃｈｉｗｉ陽性細胞は、ＣＶＨ陽性細胞と同様に、胚盤葉細胞の全てにおいて観察されるわけではないことがわかる。【００８２】
同様に、蛍光抗体法によって始原生殖細胞（ＰＧＣ）を評価したところ、ＰＧＣはＳａｃｈｉ−１、ＣＶＨ、ｃｈｉｗｉの全てが陽性であることがわかった（図９）。（ａ）および（ｅ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）および（ｆ）はＤＡＰＩ染色像を示し、（ｃ）は抗Ｓａｃｈｉ−１抗体による免疫染色像を示し、（ｄ）は抗ｃｈｉｗｉ抗体による免疫染色像を示し、（ｇ）は抗ＣＶＨ抗体による免疫染色像を示す。なお、（ａ）〜（ｄ）および（ｅ）〜（ｇ）はそれぞれ同じ視野を観察した結果である。図中矢印は、それぞれの抗体に対して陽性である細胞を示す。試料には、血流中を循環するｃＰＧＣを用いているので、ＰＧＣ以外に赤血球が混入している（図中、矢尻）。【００８３】
精巣切片を評価した結果を、図１０に示す。Ｓａｃｈｉ−１陽性細胞（示さず）は検出されず、ＣＶＨ陽性細胞（ａ）およびｃｈｉｗｉ陽性細胞（ｂ）が観察された。上段が低倍率で観察した像であり、下段が高倍率で観察した像である。いずれも黒い部分が陽性を示す。ＣＶＨは、精原細胞から精母細胞に至る減数分裂前の雄性生殖細胞において認められるが、精子細胞、精子には認められなかった。これに対して、ｃｈｉｗｉは精子細胞以外の生殖細胞において認められる。【００８４】
多能性を有している細胞の全てが生殖細胞分化能を有しているわけではない。しかし、上記の特異抗体を用いた免疫染色法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏのタンパク質発現を評価すれば、ニワトリＥＳ細胞が多能性を有し、かつ生殖細胞分化能を保持していることを、簡便に調べることができる。本発明において樹立したニワトリＥＳ細胞の半数以上が多能性と生殖細胞分化能の両方を有している。図１１には、樹立したニワトリＥＳ細胞のうちの異なる２系統についての蛍光抗体法の結果を示した。（ａ）は細胞の透過像を示し、（ｂ）は抗Ｓａｃｈｉ−１抗体による免疫染色像を示し、（ｃ）は抗ｃｈｉｗｉ抗体による免疫染色像を示す。上述したように、遺伝子改変ニワトリの作出に利用可能なニワトリＥＳ細胞は、抗Ｓａｃｈｉ−１抗体強陽性（核のみ）であり、かつ抗ＣＶＨ抗体強陽性（細胞質のみ）であることが必要条件であり、評価の信憑性をより高めるためには抗ｃｈｉｗｉ抗体弱陽性（細胞全体）の特徴を有していることがより好ましいといえる。【００８５】
〔３−２．遺伝子発現によるＥＳ細胞の評価〕
ニワトリＥＳ細胞が多能性を有し、かつ生殖細胞分化能を保持していることを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの遺伝子発現レベルで評価するためには、Ｓａｃｈｉ−１およびＣＶＨのｍＲＮＡが同時に発現されていることが必要であり、評価の信憑性をより高めるためにはＣｈｉｗｉのｍＲＮＡが同時に発現されていることがより好ましい。この評価は、ＲＴ−ＰＣＲやｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで簡便に調べることが可能である。ＣＶＨ  ｍＲＮＡの発現確認に用いたプライマーの塩基配列は、順方向プライマーが５’−ＣＧＴＧＧＣＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１３）であり、逆方向プライマーが５’−ＴＴＣＡＧＡＧＣＧＴＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＣＴＣ−３’（配列番号１４）である。樹立したニワトリＥＳ細胞の遺伝子発現を調べた結果を図１２に示した。樹立したＥＳ細胞１および２は、多能性および生殖細胞分可能能を有している胚盤葉細胞と同様の遺伝子発現様式を示している。しかし、樹立したＥＳ細胞の中には、細胞３のようにある遺伝子発現を欠失するものが認められた。このように、Ｓａｃｈｉ−１、ｃｈｉｗｉおよびＣＶＨを用いれば、樹立したニワトリＥＳ細胞の性状を遺伝子発現によって簡便に評価することができる。【００８６】
〔４．遺伝子改変技術に利用可能なニワトリＥＳ細胞〕
遺伝子改変ニワトリの作出に利用可能なニワトリＥＳ細胞は、（１）細胞が自然状態で長期境内培養可能とならなければならず、（２）細胞はコロニーを形成し、マウスや霊長類のＥＳ細胞と同様に、細胞質に占める核の割合が高くかつ明瞭な核小体を保持していることが必要である。また、樹立されたニワトリＥＳ細胞は、（３）凍結保存した細胞の融解後に再度培養しても、多能性および生殖細胞分化能を維持しなければならず、（４）遺伝子改変後も多能性および生殖細胞分化能を維持しなければならない。【００８７】
上記結果により、これらの条件を満たすニワトリＥＳ細胞を得るためには、以下のような条件が好ましいと結論付けられた：（Ｉ）ニワトリ胚の発生段階ステージＸまでの細胞を用いる；（ＩＩ）胚盤葉細胞（ステージＸ）を用いる場合には、生殖細胞の前駆細胞を含む明域の細胞のみを用いる；（ＩＩＩ）生化学的、遺伝子発現的な特徴は、従来報告されていたＳＳＥＡ−１発現やアルカリフォスファターゼ活性の有無とは無関係であり、Ｓａｃｈｉ−１およびＣＶＨのｍＲＮＡが同時に発現されていること（好ましくは、ｃｈｉｗｉのｍＲＮＡも同時に発現されていること）、または、これらの遺伝子産物（タンパク質）が所定の細胞内器官に検出されることが必要である。【００８８】
多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているニワトリＥＳ細胞を得ることができ、遺伝子改変ニワトリ技術に応用し得る。また、本発明を用いれば、遺伝子改変ニワトリ技術に応用し得る細胞であるか否かを評価することができる。【００８９】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。【００９０】
樹立したニワトリＥＳ細胞は遺伝子導入を行った後も多能性および生殖細胞分化能を維持しているのか否かを確認した。樹立したニワトリＥＳ細胞にＥＧＦＰを導入し、０．０２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ−ＰＢＳを用いてこの細胞を３７℃で５分間処理することによりコロニーを単一細胞に分散させた。上述したニワトリＥＳ細胞の培養用培地に、終濃度１０ｍＭとなるようにＹ−２７６３２（ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤）を添加した。この培養用培地中に、単一細胞に分散したＥＳ細胞を５０  ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬとなるように懸濁した。支持細胞（ＳＴＯ）を予め培養しておいた９６ウエルプレート上に、懸濁した細胞を、ウエル当たり１００ｍＬずつ播種した。これにより、理論上、０．５  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなり、必ずウエルに１個の細胞が入る箇所ができる。培地交換を行うことにより培養を継続し、１ウエルに１つのコロニーが形成されるものを選抜した。継代方法は上述した手順に従った。安定に増殖した細胞に対して抗ＣＶＨ抗体による染色を行い、ＥＧＦＰを発現しているコロニー、ＣＶＨを発現しているコロニーを選抜した。【００９１】
このように、遺伝子導入後にも単一細胞に分散し得るということは、ニワトリＥＳ細胞の株化が可能であることを示す。また、図１３の（ａ）〜（ｂ）に示すように、導入したＥＧＦＰがコロニー全体で発現しているニワトリＥＳ細胞を得ることができた。また、図１３の（ｃ）に示すように、それらのほとんどが生殖細胞分化能を示すＣＶＨ陽性細胞であることがわかる。これらの結果は、本発明にかかる技術が、生殖系列キメラニワトリの作出を高頻度に実現させることを示すだけでなく、高度な遺伝子改変技術（ノックイン／ノックアウト）へ応用することも可能であることを示す。【００９２】
上記のニワトリＥＳ細胞株（ＥＧＦＰ導入後でありかつＣＶＨ陽性の細胞）をレシピエント胚へ移植し、孵卵２〜３日後に胚血液を回収した。この時期の胚血液中には一時的に始原生殖細胞（ＰＧＣ）が胚血流中を循環しているが、この時期のＰＧＣは赤血球と形態が異なるため光学顕微鏡の明視野で容易に区別することができる。また、ＥＳ細胞株由来のＰＧＣはレシピエント胚由来のＰＧＣとＥＧＦＰの有無に従って識別し得る。【００９３】
図１４において矢印で示すように、ＰＧＣはその細胞内に多くの顆粒を有しており、胚赤血球よりも大型の細胞として顕微鏡下で観察される（図１４の（ａ）−（ｂ）左図）。この視野を、蛍光顕微鏡で観察すると、この視野に存在するＰＧＣはＥＧＦＰ陽性であり、移植したＣＶＨ陽性のＥＧＦＰ導入ＥＳ細胞株から派生したＰＧＣであることがわかる（図１４の（ａ）−（ｂ）右図）。この結果は、作出したＥＳ細胞株が生殖細胞に分化することを早期に確認することが可能であることを示すとともに、作出したＥＳ細胞株が確実に生殖細胞へ分化することを示している。【００９４】
同様に、ニワトリＥＳ細胞株（ＥＧＦＰ導入後でありかつＣＶＨ陽性の細胞）をレシピエント胚へ移植し、孵卵して得られたキメラ体（１０日胚以降、一部孵化した雛）から生殖巣を摘出した。摘出した生殖巣からゲノムＤＮＡ（３０検体）を調製し、このゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行ってＥＧＦＰを検出した。使用したプライマー配列は、順方向プライマーが５’−ｇｔａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇ−３’（ＥＧＦＰ−ＳＦ：配列番号１７）であり、逆方向プライマーが５’−ｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃ−３’（ＥＧＦＰ−ＳＲ：配列番号１８）である。結果を図１５に示す。【００９５】
図中、Ｍはマーカーを示し、１は、ＥＧＦＰ遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行った陽性コントロールを示し、２は、鋳型なしでＰＣＲを行った陰性コントロール、３−３２は、摘出した生殖巣から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った結果を示す。【００９６】
図１５に示すように、３０検体中１４検体の生殖巣においてＥＧＦＰ遺伝子が検出され、ＥＧＦＰ導入後でありかつＣＶＨ陽性の細胞が高頻度（約４７％）で生殖巣にて分化していることが確認された。【００９７】
このように選抜したニワトリＥＳ細胞をレシピエント胚へ移植し、そのレシピエントを孵化させることによって、第一世代のキメラニワトリを誕生させた。図１６は、樹立／評価したニワトリＥＳ細胞が生殖系列に寄与することを実証した図である。図１６の（ａ）はＥＳ細胞を移植することによって誕生した第一世代キメラニワトリ（Ｇ０）の雛（上段）および性成熟した個体（下段）を示す。移植したＥＳ細胞は、黄斑プリマスロック種（黒色羽毛）由来であるので、第一世代のキメラニワトリは、（ａ）に示したように、黒色および白色が混ざり合った羽毛として識別することができる。さらに、上述した第一世代のキメラニワトリ（Ｇ０）を性成熟させることによって、約３％の確率で黒色羽毛の第二世代のニワトリ（Ｇ１）を確実に誕生させることができた。図１６の（ｂ）は（ａ）に示したニワトリから人工授精により誕生したＧ１世代の雛（黒色羽毛）を示す。【００９８】
ニワトリの羽毛色遺伝子は、白色が優性であるため、黒色羽毛ニワトリ由来ＥＳ細胞が生殖細胞に分化しない限り、黒色羽毛のニワトリをＧ１として誕生させることができない。例えば、Ｇ０が雄の場合、Ｇ０のニワトリの精子を黒色羽毛の雌に人工授精する。また、Ｇ０が雌の場合、雄の黒色羽毛のニワトリの精子を人工授精する。いずれの場合も黒色羽毛ニワトリ由来ＥＳ細胞が生殖細胞に分化しない限り、Ｇ１では黒色羽毛のニワトリを誕生させることができない。すなわち、上記の手法によって黒色羽毛のＧ１世代が誕生することは、本発明に係るニワトリＥＳ細胞が生殖細胞に分化できることの最終証明となり、得られたＧ１世代の個体がＥＳ細胞由来の遺伝子を受け継いだ個体であることを実証しているということを、当業者は容易に理解する。【００９９】
このように、本発明に係るニワトリＥＳ細胞は、確実に生殖細胞分化能を有しており、遺伝子改変ニワトリの作出に好適であることが実証された。また、このようなニワトリＥＳ細胞を評価する、本発明に係る評価方法は、遺伝子改変ニワトリの作出に貢献する、優れた評価方法であることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
生殖細胞分化能を有しているニワトリ胚性幹細胞株を樹立したことによって、遺伝子改変ニワトリの作出を現実的にした。すなわち、本発明を用いれば、所望の遺伝子改変ニワトリを容易に作出することができる。得られた遺伝子改変ニワトリは、動物工場として種々の局面において有用に活用され得る。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月27日(2008.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有しているニワトリ胚性幹細胞であって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
が安定的に発現していることを特徴とするニワトリ胚性幹細胞。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
請求の範囲１に記載のニワトリ胚性幹細胞であって、
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
が安定的にさらに発現していることを特徴とするニワトリ胚性幹細胞。
【請求項４】
多分化能および生殖細胞分化能を安定的に有していることを検出する検出工程を包含し、
該検出工程が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
の安定的な発現を検出することによって行われることを特徴とするニワトリ胚性幹細胞を評価する方法。
【請求項５】
前記検出工程が少なくとも１０日にわたって行われることを特徴とする請求の範囲４に記載の方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
請求の範囲４に記載の方法であって、
前記検出工程が、
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
の安定的な発現をさらに検出することによって行われることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求の範囲１に記載のニワトリ胚性幹細胞が備えられていることを特徴とする遺伝子改変ニワトリを作出するためのキット。
【請求項９】
ニワトリＬＩＦタンパク質がさらに備えられていることを特徴とする請求の範囲８に記載のキット。
【請求項１０】
請求の範囲１に記載のニワトリ胚性幹細胞をニワトリＬＩＦタンパク質とともに培養する工程を包含することを特徴とする遺伝子改変ニワトリの作出方法。
【国際調査報告】
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