(57)【要約】  蛋白質加水分解物から、分岐鎖アミノ酸高含有画分を簡便且つ大量に製造する方法の提供を目的とした。分岐鎖アミノ酸を含有する蛋白質分解物の水溶液に、極性有機溶媒を最終濃度を70v/v%以上に加えることで、分岐鎖アミノ酸を高濃度に含む上澄を回収する。分画時のpHは４〜10、用いる蛋白質加水分解物の分解率は90%以上、遊離アミノ酸含有率は50%以下であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐鎖アミノ酸を含有する、蛋白質分解物を、極性有機溶媒濃度70v/v%以上の水溶液環境にせしめた後、沈殿物を除去し可溶性画分を回収する、分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
【請求項２】
TCA可溶化率を指標にした分解率が90%以上であり且つ遊離アミノ酸の含有量が50%以下である蛋白質分解物を用いる、請求項１に記載の、分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
【請求項３】
極性有機溶媒濃度が80v/v%以上である、請求項１に記載の、分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
【請求項４】
分岐鎖アミノ酸を含有する蛋白質分解物の水溶液に、極性有機溶媒を最終濃度70v/v%以上になるように加え、沈殿物を除去し可溶性画分を回収する、請求項１に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
【請求項５】
分岐鎖アミノ酸を含有する蛋白質分解物の乾燥物に、極性有機溶媒濃度70v/v%以上の水溶液を加え、可溶性画分を回収する、請求項１に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
【請求項６】
沈殿物を除去する際の蛋白質分解物溶液のpHが４以上９以下である、請求項１に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
【請求項７】
極性有機溶媒がエタノールである、請求項１に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分岐鎖アミノ酸（BCAA）が吸収性に優れたペプチド態として高濃度に含有された蛋白質分解物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バリン，ロイシン，イソロイシンからなる分岐鎖アミノ酸（BCAA）は、筋蛋白質分解の抑制や蛋白質合成を促進することで、筋肉疲労の抑止や筋肉損傷の改善に関与すると考えられている（非特許文献１，２，３）。これらBCAAの最も一般的な供給源は蛋白質である。しかし蛋白質は、水への溶解に時間がかかり、その水溶液の粘度が高く、摂取後も消化管内でプロテアーゼが作用するまでに時間がかかるため、その吸収速度は早くはなく、摂取の効果は強くは反映されにくい。【０００３】
また遊離アミノ酸は、蛋白質に比べて優れた吸収速度を示すが、遊離アミノ酸、特にBCAAを多量に摂取しようとしても、BCAAの低い溶解度や口内での特有の味、高い浸透圧に由来する腹腔内での膨満感などがあり、ヒトでの大量の摂取は困難な場合が多い。【０００４】
一方、蛋白質を部分加水分解した蛋白質分解物は、基質となる蛋白質と比較して、溶解性，粘度，pH，浸透圧，吸収性，呈味性が大きく異なり、摂取し易く吸収も早い場合が多く、アミノ酸、特にBCAAを蛋白質分解物として摂取することは効果的である。しかしながら、蛋白質を部分分解した蛋白質分解物中のBCAAの含有率は基質となる蛋白質に依存する。例えば植物性蛋白質である大豆蛋白質のBCAA含量は14%程度で、比較的BCAAを多く含むカゼインであっても、その割合は21%程度でしかなく、BCAAの濃縮技術の確立が期待される。【０００５】
特許文献１（特開平3-272694）には、吸着剤等を用いることで芳香族アミノ酸を低減させ、BCAA含量を高めたオリゴペプチドの製造法を示している。しかし、本方法では得られるオリゴペプチド中のBCAA含量はさほど上がらない上に、吸着剤処理に加え脱塩や精密濾過等の処理が必要であり、その製造は非常に煩雑である。【０００６】
特許文献２（WO2005/001106）には、蛋白質分解物からエタノールを用いてグルタミン酸に富む画分を分離する手法について示されている。しかし副生物画分である70%エタノール上澄画分については、何ら触れられていない。また、疎水性アミノ酸については、［００１６］「疎水性アミノ酸に富む硬い高次構造部分は分解されにくく、分子量の大きなポリペプチドとして残存する」、「エタノールの添加によって」「未分解の疎水性ポリペプチドは沈澱する」とあり、疎水性アミノ酸であるBCAAが上澄（溶解）画分に存在することは、示唆されていない。【０００７】
【特許文献１】特開平3-272694号公報
【特許文献２】WO2005/001106号公報
【非特許文献１】Layman D.K.: Role of leucine in protein metabolism during exercise and recovery, Can J Appl Physiol, 27, 646-63, 2002.
【非特許文献２】MacLean D.A., Graham T.E., Saltin B.: Stimulation of muscle ammonia production during exercise following branched-chain amino acid supplementation in humans, J Physiol （Lond）, 493, 909-22, 1996.
【非特許文献３】Coombes J.S., McNaughton L.R.: Effect of branched-chain amino acid supplementation on serum creatine kinase and lactate dehydrogenase after prolonged exercise, J Sports Med Phys Fitness, 40, 240-6, 2000.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、BCAAを含有する蛋白質加水分解物から、BCAA高含有画分を簡便且つ大量に製造する方法の提供を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、蛋白質分解物の分画方法を鋭意検討する中で、BCAAを含有する蛋白質分解物の水溶液に、極性有機溶媒を最終濃度を70v/v%以上に加えることで、通常の常識とは異なり、疎水性が強く溶解度の低い、BCAAを多く含む画分が上澄に残り、親水性が強く溶解度の高い、極性アミノ酸を多く含む画分が沈澱する思わぬ現象を発見し、本発明を完成するに到った。
すなわち本発明は、
（１）分岐鎖アミノ酸を含有する、蛋白質分解物を、極性有機溶媒濃度70v/v%以上の水溶液環境にせしめた後、沈殿物を除去し可溶性画分を回収する、分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
（２）TCA可溶化率を指標にした分解率が90%以上であり且つ遊離アミノ酸の含有量が50%以下である蛋白質分解物を用いる、請求項１に記載の、分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
（３）極性有機溶媒濃度が80v/v%以上である、（１）に記載の、分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
（４）分岐鎖アミノ酸を含有する蛋白質分解物の水溶液に、極性有機溶媒を最終濃度70v/v%以上になるように加え、沈殿物を除去し可溶性画分を回収する、（１）に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
（５）分岐鎖アミノ酸を含有する蛋白質分解物の乾燥物に、極性有機溶媒濃度70v/v%以上の水溶液を加え、可溶性画分を回収する、（１）に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
（６）沈殿物を除去する際の蛋白質分解物溶液のpHが４以上９以下である、（１）に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
（７）極性有機溶媒がエタノールである、（１）に記載の分岐鎖アミノ酸高含有画分の製造法。
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、植物あるいは動物に由来する食品蛋白質の分解物から、容易且つ簡便にBCAA高含有画分を得ることができる。これにより、筋肉疲労の抑止や筋肉損傷を効果的に改善するBCAA高含有蛋白質分解物を提供できるようになったものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（原料）
本発明に用いるBCAAを含有する蛋白質分解物とは、種々の出発原料から抽出あるいは分離して得られた蛋白質素材を、更に水溶液あるいは水分散液としてから、加水分解することで得られる。出発原料としては、動物，植物，微生物等に由来する各種原料を使用できるが、食品用の蛋白質高含有原料であることが好ましい。例えば、動物性蛋白質を多く含む、獣乳，卵，魚肉，畜肉や、植物性蛋白質を多く含む、大豆，エンドウ，小麦，落花生，コーン、等を原料とすることができる。そしてこれら原料をそのまま、または分画や抽出等により蛋白質を多く含む画分を分離して、蛋白質素材として用いる。蛋白質素材を更に、等電点沈澱，限外ろ過，イオン交換樹脂処理等の処理により蛋白質を濃縮した物も使用することができる。【００１２】
これら蛋白質素材の中でも、大豆から水溶性蛋白質を抽出し、更に等電点沈澱等により蛋白質を回収した分離大豆蛋白が、汎用性からもBCAA含量濃縮効果からも、出発原料として好ましい。また、分離大豆蛋白から単離して、もしくは脱脂大豆等より直接抽出して得たグリシニンは通常の分離大豆蛋白よりBCAA含量が高く、本発明の原料として優れている。【００１３】
（蛋白質分解物の調製）
上記の蛋白質素材から、以下のようにして蛋白質分解物を調製することができる。分解は、上記蛋白質素材の水溶液あるいは水分散液を基質として、酸分解またはプロテアーゼによる酵素分解が選択できるが、効率よくBCAA高含有画分を得るためには、プロテアーゼによる酵素分解が好ましい。ここで用いるプロテアーゼは、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から、１種類以上、好ましくは２種類以上、さらに好ましくは３種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次もしくは同時に作用させることができる。【００１４】
このプロテアーゼの分類は、酵素化学の分野に於て通常行なわれている、活性中心のアミノ酸の種類による分類方法であり、各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはBacillus中性プロテイナーゼ，Streptomyces中性プロテイナーゼ，Aspergillus中性プロテイナーゼ，サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン，Aspergillus酸性プロテイナーゼ，スミチームAP等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン，パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン，キモトリプシン，ズブチリシン，Streptomycesアルカリプロテイナーゼ，Aspergillusアルカリプロテイナーゼ，アルカラーゼ，ビオプラーゼ等が挙げられるが、これ以外の酵素でも作用pHや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なる為に、「切れ残り」を減らし、分解率の高い蛋白質分解物を得ることができる。【００１５】
或いは異なった起源（起源生物）の酵素を併用することで、更に分解率の高い蛋白質分解物を製造することができる。2種以上、好ましくは3種以上の異なった起源の酵素を、順次もしくは同時に作用させることができる。また、2種以上の分類の異なる酵素に、同分類で起源の異なる酵素を1種以上併用することも好ましい。【００１６】
これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないものが好ましい。また、粗酵素や酵素製剤は複数種のプロテアーゼを含んでいる場合があるが、この際は実質的な活性を示すプロテアーゼが、それぞれ別々に存在するものとして扱うことができる。またそれぞれのプロテアーゼは活性中心や起源により分類することができる。【００１７】
反応pHや反応温度は、それぞれのプロテアーゼの至適条件、或いは活性の得られる条件であり、特に２種以上のプロテアーゼを同時に用いる際は、共に活性が得られる条件を選択する。通常反応pHは各々の酵素の至適pH付近であり、温度は0〜100℃，好ましくは20〜80℃，更に好ましくは40〜60℃で反応を行なう。反応時間もpHや温度により変化するので特には限定しないが、概ね5分〜24時間、好ましくは10分〜12時間、更に好ましくは30分〜6時間が適当である。反応後、反応液は60℃〜100℃で加熱することで残存酵素活性を失活させる。【００１８】
反応液はそのまま乾燥を行なうこともできるし、任意のpHに調整することもでき、またpH調整時に発生する沈澱物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去することもできる。この後に活性炭や吸着樹脂により、精製を行なうこともできる。【００１９】
上記の方法により製造した蛋白質分解物の分解率は、90%以上、好ましくは95%以上が、以降の分画をするに際して望ましい。分解率が低い組成では、極性有機溶媒添加後の上澄のBCAAの含有率もBCAAの回収率も上がりにくい。また、分解が進み遊離アミノ酸の多い組成では、BCAAは極性有機溶媒添加後の上澄に溶解せず、含有率も回収率も低下する。遊離アミノ酸含量は50%以下が好ましく、20%以下が更に好ましい。なお、蛋白質分解物の分解率は、１w/w%濃度の試料に、30w/w%のトリクロロ酢酸（TCA）を等量添加し、3,000 rpm，10分間遠心し、得られた上澄をケルダール法にて測定し、別途ケルダール法にて測定した全粗蛋白質に対する割合として算出した。以上に示した蛋白質分解物は、市販品を購入し使用することもできる。【００２０】
（極性有機溶媒分画）
この様にして得られた蛋白質分解物に対して、極性有機溶媒濃度70v/v%以上の水溶液環境にせしめた後、沈殿物を除去し、可溶性画分であるBCAA高含有画分を回収する。具体的には以下の様な処理を行なうことができる。まず、蛋白質分解物を水溶液とする。水溶液中の蛋白質分解物の濃度は特に定めないが、後述する様に極性有機溶媒を添加後の溶液中の最終濃度として最適範囲を設定できる。また、蛋白質分解物水溶液のpHは、アルカリ又は酸溶液を用いて調整することもできる。溶液のpH範囲は、４以上が好ましく、５以上が更に好ましい。また９以下が好ましく、７以下が更に好ましい。【００２１】
上記の蛋白質分解物の水溶液に、最終濃度70v/v%以上、好ましくは80v/v%になるように、極性有機溶媒を添加する。この結果、BCAAのような疎水性アミノ酸を多く含むペプチド群が可溶性画分に分画される。この混合液から遠心分離や濾過等を用いて発生した沈澱を除去することで、BCAAを高濃度に含有する上澄画分を得ることができる。最終濃度70v/v%以上で、極性有機溶媒の濃度依存的に上澄のBCAA含有率は高くなるが、同時に蛋白質分解物としてのBCAAの回収率は下がるので、極性有機溶媒濃度は95v/v%以下が産業利用上は好ましい。【００２２】
極性有機溶媒添加後の蛋白質分解物の濃度は、蛋白質換算で0.1w/v%濃度以上が好ましく、また10w/v%濃度以下が好ましい。蛋白質分解物の濃度が低いと上澄のBCAA含有率が低くなる上に、蛋白質分解物に対して大量の極性有機溶媒が必要となる。他方、蛋白質分解物の濃度が高いと、BCAA高含有画分の回収率が低くなる。【００２３】
用いることができる極性有機溶媒としては、エタノール，メタノール，イソプロパノール，アセトン，メチルエチルケトン等、水溶性の有機溶媒が広く使用できる。しかし、製造するBCAA高含有画分が食品であることから、エタノール，イソプロパノールまたはアセトンを用いることが好ましく、現実的にはエタノールが最も好ましい。極性有機溶媒の混合ないしは分離時の溶液の温度は特に限定するものではないが、通常０℃以上且つ、用いる極性有機溶媒の沸点未満の温度が好ましく、50℃未満が特に好ましい。【００２４】
他の方法として、蛋白質分解物を水溶液とせずに、乾燥状態の蛋白質分解物に、70v/v%以上の含水極性有機溶媒を直接添加して、不溶画分を沈澱として除去し、可溶画分のみを得ることで分画することも可能である。この方法では、極性有機溶媒の最終濃度が高い場合に於て、蛋白質分解物に対する極性有機溶媒の量を低く抑えることができる。この方法における極性有機溶媒の種類や濃度、その含水溶液のpH、蛋白質分解物に対する含水極性有機溶媒の量は、上述した蛋白質分解物水溶液に極性有機溶媒を添加する条件に準じて設定することができる。【００２５】
前記の各工程により製造したBCAA高含有画分は、公知の方法により極性有機溶媒を除去し、濃縮することもでき、この濃縮した液を公知の方法により乾燥して粉末とすることもできる。また、別個に濃縮し、乾燥した不溶性画分と任意の割合で混合することもできる。【００２６】
（分析方法）
このようにして得られたBCAA高含有画分の評価は、以下の試験方法で行なう。
○アミノ酸組成分析
試料２mgに１mlの6N塩酸を加え、110℃，24時間加水分解する。塩酸を減圧除去した後、0.02Nの塩酸に溶解し、0.2mg/mgの試料を0.45μmフィルターでろ過し、アミノ酸自動分析装置（日本電子製 JLC500V）により分析する。【００２７】
○遊離アミノ酸含量測定
試料（４mg/ml）に等量の3%スルホサリチル酸を加え、室温で15分間振とうする。10,000rpm，10分間遠心し、得られた上澄を0.45μmフィルターでろ過し、アミノ酸分析装置（日本電子製 JLC500V）にて、遊離アミノ酸を測定する。遊離アミノ酸量はケルダール法にて得られた全粗蛋白質に対する量として算出する。
（利用）【００２８】
本発明によって得られるBCAA高含有画分は、種々の食品として利用することができるし、あるいは、BCAAを積極的に投与するための薬剤として使用することができる。その形態は例えば、粉末状，顆粒状，固形状，流動物状，液状等の形態や、あるいは錠菓もしくは錠剤の形態とすることができる。【００２９】
本発明によって得られるBCAA高含有画分が薬剤として投与される場合は、有効成分を単独で、又は薬学的に許容される担体と混合して、錠剤，丸剤，散剤，液剤，懸濁剤，乳剤，顆粒剤，硬カプセル剤，軟カプセル剤等の形態に調製して投与することができる。いずれの場合もこれらは適当な薬学的に許容される担体を用いて通常の方法に従い製剤化できる。【００３０】
本発明の組成物が食品の場合は、飲料のような液体食品やプロテインバーのような固形食品とすることができる。また一般の食品に本製法により製造されたBCAA高含有画分を混合して摂取することもできる。また、BCAA高含有画分のみからなる食品も可能である。その他にも例えば、いわゆる栄養補助食品（サプリメント）として、BCAA高含有画分を含む錠剤，顆粒剤，散剤，ドリンク剤等を挙げることができる。
【実施例】
【００３１】
以下に、本発明の有効性を実施例と共に示すが、これらの例示によって本発明の技術思想が限定されるものではない。【００３２】
［製造例１］大豆グリシニン組成物の調製
大豆を破砕し、40℃でヘキサンにより脱脂後、ヘキサンを完全に除くため70℃で１時間加熱した脱脂大豆に８重量倍の水を加え、水酸化ナトリウムでpH8.0に調整した。攪拌抽出しオカラを除去した後、得られた豆乳に最終濃度１mMになるように亜硫酸ナトリウムを加え、硫酸でpHを5.8に調整し、遠心分離で沈殿物を回収し、水酸化ナトリウムで中和後、高温殺菌及び噴霧乾燥を行って大豆グリシニン組成物を得た。なお、大豆グリシニン組成物中のグリシニンの純度は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動によるクマシー染色の結果90%濃度であった。【００３３】
［製造例２］グリシニン分解物の調製
製造例１で調製した大豆グリシニン組成物を基質にして、以下の方法に従いグリシニン分解物を調製した。すなわち、大豆グリシニン組成物の８w/w%濃度の溶液に対し、サモアーゼ（起源；Bacillus thermoproteolyticus, 金属プロテアーゼ, 大和化成）を対蛋白質あたり２w/w%濃度加え、pH9.0， 58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Bacillus sp. セリンプロテアーゼ, ナガセケムテック）を対蛋白質あたり１w/w%濃度加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。スミチームFP（起源；Aspergillus sp., 金属プロテアーゼ，新日本化学工業）を対蛋白質あたり１w/w%濃度加え、pH7.5，58℃で60分作用させた。以上の処理の後、90℃, 20分で反応を停止させた。このようにして調製したグリシニン分解物の蛋白質分解率は、98%であった。【００３４】
［実施例１］最適pHの確認
グリシニン分解物５gに脱イオン水を加え100gとし、10M塩酸もしくは20%水酸化ナトリウム溶液にて既定のpH（4〜10）に調整した。pH調整後のグリシニン分解物溶液に、19容量倍のエタノールを加えた。エタノールの最終濃度は95v/v%、グリシニン分解物の最終濃度は0.25w/v%になる。遠心分離（18,000×g，10分間 4℃）により、可溶性画分として上澄画分、不溶性画分として沈殿画分を得た。ロータリーエバポレーターを用いて上澄画分を減圧乾固させた後、５ml脱イオン水に溶解した。沈殿画分も同様に５ml脱イオン水に溶解した。各画分のアミノ酸量は定法に従いチロシンを標準物質にしてニンヒドリン法にて測定した。分離時pHと上澄画分のBCAA含有率を図１にまとめた。BCAAの含有率はバリン，ロイシン，イソロイシンの含有率の総和とした。上澄画分の総アミノ酸に対するBCAAの割合は、分画前のグリシニン分解物より高く、pHを５〜７に調整した場合、BCAAの含有率は30%以上になった。【００３５】
［実施例２］最適なエタノール濃度と蛋白質分解物濃度の確認
グリシニン分解物30gを脱イオン水に溶解し、10M塩酸にてpH6.0に調整し、脱イオン水にて100gにメスアップした。それぞれ既定量の30w/w%濃度のグリシニン分解物（pH6.0）、脱イオン水、エタノールを混合し、エタノールの最終濃度が60から95v/v%、グリシニン分解物の最終濃度がそれぞれ0.5，1.0，1.5w/v%になるように調製し、遠心分離（18,000×g 10分間 4℃）により不溶性画分と可溶性画分を分けた。以降の操作は、実施例１と同様である。また、エタノール濃度とグリシニン分解物濃度に対する上澄画分のBCAA含有率を図２にまとめた。上澄画分のBCAA含有率はエタノール濃度が70%以上で、上澄画分のBCAA含有率が上昇し、エタノール濃度依存的に上澄画分のBCAA含有率が上昇した。グリシニン分解物の濃度を変えた場合でも、その傾向は変わらなかった。【００３６】
［実施例３］最適なイソプロパノールおよびアセトン濃度の確認
グリシニン分解物30gを脱イオン水に溶解し、10M塩酸にてpH6.0に調整し、脱イオン水にて100gにメスアップした。このグリシニン分解物水溶液と任意の量の脱イオン水を混合したものに、イソプロパノールを最終濃度が40から95v/v%、またはアセトンを最終濃度が60から95v/v%、かつ、グリシニン分解物の最終濃度がそれぞれ1.0w/v%になるように調製し、実施例２と同様な測定を行なった。図３に示すように、エタノールと同様に濃度依存的に上澄画分のBCAA含有率が上昇した。【００３７】
［実施例４］市販の蛋白質分解物を用いたBCAA高画分の製造
動物性蛋白質として、カゼイン蛋白質分解物（DSM Food Specialties 社 「Peptopro」）、植物性蛋白質として分離大豆蛋白分解物（不二製油（株）製 「ハイニュートAM」及び「ハイニュートDC6」）を用いた。なお、それぞれの蛋白質分解物の分解率は、Peptoproが95%、ハイニュートAMが98%、ハイニュートDC6が95%である。それぞれの分解物20gを脱イオン水に溶解し、10M塩酸にてpH6.0に調整し、脱イオン水にて100gにメスアップした。それぞれの蛋白質分解物溶液に19容量倍のエタノールを加えた。エタノールの最終濃度は95v/v%、蛋白質分解物の最終濃度は１w/v%になる。以降の操作は実施例１と同様である。【００３８】
表１に各蛋白質分解物の上澄、沈殿画分のアミノ含有率を示す。それぞれの上澄画分のBCAA含有率（BCAA計）は、カゼイン蛋白質分解物で29.9%、分離大豆蛋白分解物として、ハイニュートAMで32.4%、ハイニュートDC6で28.4%となり、BCAA含有率が、エタノール分画操作により高くなることが確認された。特に大豆蛋白質を用いた場合、分離前後のBCAAの含量を比較したBCAA濃縮率は、２倍前後と著しい上昇が認められた。【００３９】
（表１）各種蛋白質分解物の分画結果
2008123033.tif 000002
【００４０】
［実施例５］グリシニン分解物へのエタノール溶液添加
脱イオン水とエタノールを混合して調製した40から90v/v%のエタノール溶液をグリシニン分解物0.4gに40ml加え、懸濁した。グリシニン分解物の最終濃度は１w/v%になる。遠心分離（18,000×g，10分間 4℃）により、可溶性画分として上澄画分を回収し、実施例１と同様に分析を行なった。図４に示すように、上澄画分のBCAA含有率はエタノール濃度が80%以上で、上澄画分のBCAA含有率が上昇し、エタノール濃度依存的に上澄画分のBCAA含有率が上昇した。【００４１】
［実施例６］低分解率蛋白質分解物を用いたBCAA画分の分画
特許文献２に準じて試料を調製した。すなわち、分離大豆蛋白（不二製油（株）製 「フジプロ-R」）の10w/w%濃度の溶液をに対し、5%アンモニア水溶液でpH9.0に調整し、ビオプラーゼを対蛋白質あたり２w/w%濃度加え、50℃で20時間作用させた。減圧乾燥にて半量に濃縮し、酢酸にてpH5.0に調整し、氷冷後、5,000rpmで10分間遠心分離し、上澄Ａ（ペプチド画分）および沈澱Ａを回収した。上澄Ａに同容量のエタノールを加え冷却後、5,000rpmで10分間遠心分離し、上澄Ｂおよび沈澱Ｂを得た。上澄Ｂに70v/v%になるまでエタノールを加え、5,000rpmで10分間遠心分離し、上澄Ｃ（BCAA画分）および沈澱Ｃを回収した。【００４２】
実施例６の結果および、実施例５で行なった高分解率なグリシニン分解物の、70v/v%エタノール沈澱の組成データを表２に示す。分解率の低い分離蛋白分解物のBCAA画分（上澄Ｃ）は、グリシニン分解物と比較すると、BCAA濃縮率がやや低い上に回収率が低いことが判った。特許文献２には、「疎水性アミノ酸に富む硬い高次構造部分は分解されにくく、分子量の大きなポリペプチドとして残存し、エタノールの添加によって未分解の疎水性ポリペプチドは沈澱する」とある。しかし本実施例によれば、BCAAは70v/v%エタノールの添加により上澄画分に分配すること、更にプロテアーゼの分解が進むことで、BCAAペプチドは切り出され、その収率が大きく向上することが判った。【００４３】
（表２）低分解度蛋白質分解物の分画結果
2008123033.tif 000003
【００４４】
これらの結果より、蛋白質分解物に対して、極性有機溶媒を最終濃度70v/v%以上、好ましくは80v/v%以上の水溶液環境にせしめた後、沈殿物を除去することで、上澄画分の総アミノ酸に対するBCAAの含有率が高くなることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のBCAA高含有画分の製造法は、蛋白質分解物から容易な方法でBCAA高含有画分を得ることができる。このBCAA高含有画分は筋肉疲労の抑止や筋肉損傷を効果的に改善することができる食品素材，食品若しくは医薬品として実施することができる。したがって、食品産業や医薬品産業において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例１で行なったエタノール分画の、上澄画分のBCAA含有率と蛋白質分解物のpHの関係を示すグラフである。
【図２】実施例２で行なったエタノール分画の、上澄画分のBCAA含有率とエタノール濃度及び蛋白質分解物濃度の関係を示すグラフである。
【図３】実施例３で行なったイソプロパノール分画およびアセトン分画の、上澄画分のBCAA含有率と極性有機溶媒濃度の関係を示すグラフである。
【図４】実施例５で行なった粉体に直接エタノール溶液を添加するエタノール分画の、上澄画分のBCAA含有率とエタノール濃度の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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