【手続補正書】
【提出日】平成15年8月12日(2003.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
何首烏１０〜５０重量％、遠志１〜１０重量％、丁香１〜１０重量％、生姜１〜１０重量％、南星１〜１０重量％、天麻１〜１０重量％、石菖蒲１〜８重量％、鬱金１〜１０重量％、竹葉１〜８重量％、蚕粉末１〜８重量％、枳殻の実１〜８重量％、茯苓５〜１０重量％、半夏１〜１０重量％、陳皮２〜１０重量％及び甘草１〜５重量％の混合物を従来の抽出方法により抽出することを特徴とする、請求項１に記載の生薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
（比較例１）
人参50g、南星15g、天麻15g、石菖蒲10g、姜黄10g、竹茹10g、白彊蠶10g、枳實10g、白茯苓10g、半夏10g、陳皮6g、甘草6gから成る混合物を1Lの水に入れて徐々に加熱して6〜8時間還流した。その後、液相溶液を濾紙で濾過し、濾液は、凍結乾燥機で水分を完全に除去し、褐色粉末12.2gを得た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
（比較例２）
前記実施例１と同一の成分を同一の組成比で含む生薬混合物を、1Lのエタノールで3時間抽出した。その後、液相溶液を濾紙で濾過した後、濾液中のエタノール成分を凍結乾燥機で完全に除去し、褐色粉末14.1gを得た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
（試験例１：AChE酵素抑制効果試験）
本発明の抽出エキスのAChE酵素抑制効果試験のために、まず電気うなぎから抽出した酵素(AChE; Sigma Cat. No. C-2888)1000ユニットを1mlのPBS(phosphate buffer; 0.1M, pH 7.3)に溶解させた後、これに前記実施例１で製造した抽出エキスの粉末を各々0.025mg/ml、0.05mg/ml及び0.1mg/mlとなるよう溶解させた後、Ellman's coupled assayにより、各々のサンプルに対して、酵素の反応速度因子であるKm(ミカエリス常数)、Vmax(最大速度)を、カップリング剤として5,5−ジチオ−ビス−(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)を用い、紫外可視分光計で、460nmの波長で、各AChE活性を測定した。本発明の抽出物によるAChE抑制効果により、次の表３から分かるように、0.05mg/mlを使用した場合、酵素の活性が30.3%減少し、0.1g/mlを使用した場合、80.4%減少したことを確認した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
精製した脳のAChE酵素活性を、紫外可視分光計を利用して、412nmの波長で、Ellman's coupled assay方法(参照: Ellman, G. L., Biochem. Pharmacol., 7, 88, 1961)により測定したが、この際、時間ごとに、全ての基質における酵素反応速度を、ミカエリス−メンテン反応式(Michaelis-Menten equation)によって計算した。1ml容量の石英キュベットの中にリン酸塩緩衝溶液(0.1M, pH 7.3)790μl、基質(ATCh；アセチルチオコリン)5ml溶液60μl、カップリング剤としてはDTNB(ジチオニトロ安息香酸)5mM溶液120μlを入れて約3分間インキュベーションした後、対照群と試験群の脳から抽出した溶液10μlを各々入れてAChEの活性を評価した。その結果は次の表４に示した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
即ち、まずいくつかの正確な濃度のアセチルコリン標準グラフを作成した後、ラットの脳から抽出した各試料20μlを同一の条件下で分析した。この際、分析条件は、流速10ml/分、検出範囲3.9062nA、溶離液はリン酸塩緩衝溶液(0.1M, pH 7.3)であった。時間ごとに、7匹のラットを一群として、生薬抽出物を投与したラットの脳から生化学的方法によりアセチルコリンを分離し、正常ラットのアセチルコリン濃度と比較した結果を、次の表５に示した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
（試験例１１：ラットの血清における肝機能検査）
20週齢のスプラグドーリーラットを偽薬群(placebo group)(8匹)及び実験群(9匹)に分けて、前記実施例1で製造した生薬粉末500mgを精製水100mlに溶解させた後、各溶液3mlを、毎朝10時に10日間連続して経口投与した。10日後、実験動物を屠殺して血液を採取した。採取した血液を4℃、1500rpmで10分間遠心分離して血清を取り、これに対して公知の方法により肝機能検査を行った。その結果、下記表６から分かるように、偽薬群と実験群でのAST、ALT、ALP、BUNの数値はほぼ同じであり、このことから本発明の生薬抽出物は、一次的な肝毒性がないことが確認された。特に、本発明の生薬抽出物は、比較例１の場合(対照群)と比較しても、著しく低い肝臓毒性数値を示した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.（治療したOVXに対する*p＜0.05）で表した、卵巣摘出(OVX)及び偽手術(sham operation)したラットの体重変化を示すグラフである。
【図２】図２は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05)、卵巣摘出(OVX)及び偽手術(sham operation)したラットに対しての該当大脳の重量変化を示すグラフである。
【図３】図３は、７匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.01)、本発明の組成物が、大脳血流(CBF)及び平均動脈血圧(MABP)に及ぼす効果を測定した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.01)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳ATPの増加を測定した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.01)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳コリン(cerebral choline)量の増加を測定した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.01)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳コリンアセチルトランスフェラーゼ(cerebral choline acetyltransferase；ChAT)の活性増加を測定した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.01)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳アセチルコリン(cerebral acetylcholine；ACh)量の増加を測定した結果を示すグラフである。
【図８】図８は、大脳神経細胞にて大脳ATP及びコリンの量を増加させる本発明の組成物の予想される薬理学的機作を示す図であって、本発明の組成物による脳血流(CBF)量の増加がグルコースの代謝及びコリン性神経伝達物質の合成経路に直接・間接的に影響を及ぼすと考えられる経路を概念的に示した図である。