(57)【要約】  本発明は、非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞であって、天然のオリゴマータンパク質を構成する少なくとも１つの内在性ポリペプチドに対応する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が導入されており、かつ前記内在性ポリペプチドの発現が抑制されていることを特徴とする細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞であって、天然のオリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が導入されており、かつ前記内在性ポリペプチドの発現が抑制されていることを特徴とする細胞。
【請求項２】
オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されている請求項１記載の細胞。
【請求項３】
オリゴマータンパク質が抗原認識レセプターである請求項１記載の細胞。
【請求項４】
抗原認識レセプターがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である請求項３記載の細胞。
【請求項５】
内在性ポリペプチドの発現がＲＮＡ干渉によって抑制されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞。
【請求項６】
オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現が当該ポリペプチドの定常領域に対応するｍＲＮＡの配列を標的とするＲＮＡ干渉によって抑制されている請求項５記載の細胞。
【請求項７】
外来性ポリペプチドが内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ外来性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列を内在性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列と相異させることにより、内在性ポリペプチドの発現が抑制されている、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
以下の工程を実施することを特徴とする非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞の製造方法。
（ａ）天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程；及び
（ｂ）前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。
【請求項９】
オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されている請求項８記載の方法。
【請求項１０】
オリゴマータンパク質が抗原認識レセプターである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
抗原認識レセプターがＴＣＲである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡ干渉によって内在性ポリペプチドの発現を抑制することを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現を当該ポリペプチドの定常領域に対応するｍＲＮＡの配列を標的とするＲＮＡ干渉によって抑制する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
外来性ポリペプチドが内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ外来性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列を内在性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列と相異させることにより、内在性ポリペプチドの発現を抑制する請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を実施することを特徴とする、非天然のオリゴマータンパク質の形成方法。
（ａ）天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程；及び
（ｂ）前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。
【請求項１６】
オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されている請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
オリゴマータンパク質が抗原認識レセプターである請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
抗原認識レセプターがＴＣＲである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＲＮＡ干渉によって内在性ポリペプチドの発現を抑制することを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現を当該ポリペプチドの定常領域に対応するｍＲＮＡの配列を標的とするＲＮＡ干渉によって抑制する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
外来性ポリペプチドが内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ外来性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列を内在性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列と相異させることにより、内在性ポリペプチドの発現を抑制する請求項１９又は２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用な、非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞、当該細胞を製造する方法及び非天然のオリゴマータンパク質の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。【０００３】
Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを発現するＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８マーカーを発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨと記載する）と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型あるいはＴｈ２型に分化する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［Ｔｃ：細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、別名：キラーＴ細胞、以下、ＣＴＬと記載することがある］に分化する。【０００４】
外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４のがんの治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球などから種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、更にこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。【０００５】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）には、主要組織適合性抗原遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）にコードされる主要組織適合性抗原分子（ＭＨＣ分子、ヒトの場合  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎと呼ばれ、以下、ＨＬＡと略す）と抗原ペプチドとの結合物である複合体を、α鎖とβ鎖のヘテロダイマーからなる特異的なＴ細胞レセプター（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。【０００６】
目的の抗原を認識するＴＣＲ遺伝子を、ＣＴＬをはじめとする細胞傷害活性を有するＴ細胞に導入することにより、目的の抗原に特異的な細胞傷害活性をＴ細胞に付与することが期待できる。これに基づき、ＭＡＲＴ１（非特許文献１）、ｇｐ１００（非特許文献２）及びｍＨＡＧ  ＨＡ−２抗原（非特許文献３）など、様々な抗原を標的としたＴＣＲ遺伝子による遺伝子治療が試みられている。しかしながら、例えば、目的の抗原を認識するα鎖及びβ鎖からなるＴＣＲ遺伝子をＴ細胞に導入すると、Ｔ細胞が本来発現する内在性のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖が、導入した目的の抗原を認識するＴＣＲのβ鎖とα鎖との間でミスペアリングを生じる。すなわち、αとβを発現している細胞に、α’とβ’を導入するすると、αβ、αβ’、α’β、α’β’の各へテロダイマーが生じる。これにより、適正なヘテロダイマーを形成して目的の抗原を認識するＴＣＲが減少し、また予期しない抗原を認識するヘテロダイマーが生じる可能性が問題となっていた。【０００７】
この問題の解決方法として、内在性のＴＣＲとヘテロダイマーを形成しない一本鎖ＴＣＲをＴ細胞に導入する方法（非特許文献４）、目的の抗原を認識する抗体とのキメラレセプター（Ｔ−ｂｏｄｙ）をＴ細胞に導入する方法（非特許文献５）が試みられている。しかし、これらの方法で得られるＴ細胞は、内在性のＴＣＲと導入ＴＣＲの両方を有するので、２種類の抗原を認識することが考えられる。更に、リコンビナントＴＣＲは天然には存在しないＴＣＲであるため、Ｔ細胞へのシグナル伝達、安全性など、確認する必要がある。また、別の方法として、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖を発現しないＴ細胞、例えばγ鎖及びδ鎖を発現するＴ細胞（γδＴ細胞）に、目的の抗原を認識するＴＣＲのβ鎖とα鎖を導入する方法がある（非特許文献６）。しかし、この方法で得られるＴ細胞も、前記リコンビナントＴＣＲを使用する方法と同様の懸念が存在する。【０００８】
前記にＴＣＲにより例示したとおり、オリゴマータンパク質（oligomeric protein）を発現する細胞に、構成ポリペプチドとして前記タンパク質に組み込まれうる外来性のポリペプチドを導入すると、内在性ポリペプチドと外来性ポリペプチドが入り混じった、所望の機能を発現できないオリゴマータンパク質を生じたり、内在性ポリペプチドと外来性ポリペプチドの競合により所望の機能を発現するオリゴマータンパク質が減少することが問題となっていた。
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１６３巻、第５０７−５１３頁（１９９９）
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  イムノロジー、第１７０巻、第２１８６−２１９４頁（２００３）
【非特許文献３】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０３巻、第３５３０−３５４０頁（２００３）
【非特許文献４】ジーン  セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第７巻、第１３６９−１３７７頁（２０００）
【非特許文献５】ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第１１４巻、第１７７４−１７８１頁（２００４）
【非特許文献６】キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、第６６巻、第３３３１−３３３７頁（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、オリゴマータンパク質を発現する細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成しうる外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した際に生じる、内在性と外来性のポリペプチドの混成による望まないオリゴマー形成が抑制された細胞及び前記のオリゴマー形成の抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の発明は、非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞であって、天然のオリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が導入されており、かつ前記内在性ポリペプチドの発現が抑制されていることを特徴とする細胞に関する。【００１１】
本発明の第１の発明において、オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されていても良く、オリゴマータンパク質が抗原認識レセプター、特に、当該抗原認識レセプターがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であっても良い。また、内在性ポリペプチドの発現がＲＮＡ干渉によって抑制されても良く、オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現が当該ポリペプチドの定常領域に対応するｍＲＮＡの配列を標的とするＲＮＡ干渉によって抑制されても良い。さらに、外来性ポリペプチドが内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ外来性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列を内在性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列と相異させることにより、内在性ポリペプチドの発現が抑制されても良い。【００１２】
本発明の第２の発明は、以下の工程を実施することを特徴とする非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞の製造方法に関する。
（ａ）天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程；及び
（ｂ）前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。【００１３】
本発明の第２の発明において、オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されていても良く、オリゴマータンパク質が抗原認識レセプター、特に、当該抗原認識レセプターがＴＣＲであっても良い。また、ＲＮＡ干渉によって内在性ポリペプチドの発現を抑制されても良く、オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現を当該ポリペプチドの定常領域に対応するｍＲＮＡの配列を標的とするＲＮＡ干渉によって抑制されても良い。さらに、外来性ポリペプチドが内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ外来性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列を内在性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列と相異させることにより、内在性ポリペプチドの発現が抑制されても良い。【００１４】
本発明の第３の発明は、以下の工程を実施することを特徴とする、非天然のオリゴマータンパク質の形成方法に関する。
（ａ）天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程；及び
（ｂ）前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。【００１５】
本発明の第３の発明において、オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されていても良く、オリゴマータンパク質が抗原認識レセプター、特に、当該抗原認識レセプターがＴＣＲであっても良い。また、ＲＮＡ干渉によって内在性ポリペプチドの発現を抑制されても良く、オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現を当該ポリペプチドの定常領域に対応するｍＲＮＡの配列を標的とするＲＮＡ干渉によって抑制されても良い。さらに、外来性ポリペプチドが内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ外来性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列を内在性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列と相異させることにより、内在性ポリペプチドの発現が抑制されても良い。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、少なくとも一つの内在性ポリペプチドが外来性ポリペプチドに置換された、所望の機能を保持するオリゴマータンパク質を高い比率で発現する細胞が提供される。当該細胞は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＴＣＲ遺伝子の発現を示す図である。
【図２】ＴＣＲ陽性細胞率を示す図である。
【図３】ＴＣＲ陽性細胞のＰＥの蛍光強度を示す図である。
【図４】ＴＣＲα遺伝子の発現を示す図である。
【図５】ＴＣＲβ遺伝子の発現を示す図である。
【図６】ＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す図である。
【図７】Ｒｍ／Ｆｈ  ｉｎｓｅｒｔ構築のフローチャートを示す図である。
【図８】Ｔ３ベクター構築のフローチャートを示す図である。
【図９】Ｔ７ベクター構築のフローチャートを示す図である。
【図１０】Ｔ１５ベクター構築のフローチャートを示す図である。
【図１１】ｐＳＩＮｓｉ−ｈＨ／ｈＵ構築のフローチャートを示す図である。
【図１２】ＨＢ／ＵＡ  ｉｎｓｅｒｔ構築のフローチャートを示す図である。
【図１３】ＴＮ１ベクター構築のフローチャートを示す図である。
【図１４】ＴＮ５ベクター構築のフローチャートを示す図である。
【図１５】ｐＭＳ−ａ−ｈＵＴＣＲＡ−Ｐｂ１構築のフローチャートを示す図である。
【図１６】ＴＮ９ベクター及びＴＮ１１ベクター構築のフローチャートを示す図である。
【図１７】ＴＣＲ遺伝子の発現を示す図である。
【図１８】ＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す図である。
【図１９】ＴＣＲ遺伝子の発現を示す図である。
【図２０】ＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す図である。
【図２１】細胞内ＩＦＮγ陽性細胞率を示す図である。
【図２２】ＴＣＲ遺伝子の発現（感染５日後）を示す図である。
【図２３】ＴＣＲ遺伝子の発現（感染１１日後）を示す図である。
【図２４】ＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す図である。
【図２５】細胞内ＩＦＮγ陽性細胞率を示す図である。
【図２６】ＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す図である。
【図２７】ＴＣＲ遺伝子の発現を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書において「オリゴマータンパク質」とは、複数の構成ポリペプチド（サブユニット）で構成されたタンパク質を意味する。前記オリゴマータンパク質は同一のポリペプチドが複数組み合わさったホモオリゴマー、複数種のポリペプチドで構成されるヘテロオリゴマーのどちらでも良い。また、構成要素であるポリペプチドの数にも特に限定はなく、二量体（ダイマー）、三量体（トライマー）、四量体（テトラマー）、更に多数のポリペプチドで構成されるオリゴマーのいずれについても本発明を適用することができる。オリゴマータンパク質は、ポリペプチド間のジスルフィド結合（ＳＳ結合）などの共有結合、静電結合などにより形成される。【００１９】
本明細書に記載の「内在性のポリペプチド」は、細胞内で本来の遺伝子から天然の状態で発現しているポリペプチドを意味する。これに対して「外来性のポリペプチド」は、人為的に外部から導入されたポリペプチドを意味し、物理的に細胞に導入されたポリペプチド、導入する細胞には本来存在しない外来遺伝子から発現されるポリペプチドが例示される。また、「非天然のオリゴマータンパク質」は、当該タンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも１つが外来性ポリペプチドに置換されたオリゴマータンパク質であり、外来性ポリペプチドのみから構成されるオリゴマータンパク質、内在性ポリペプチドと外来性ポリペプチドを両方含むオリゴマータンパク質のいずれもが含まれる。本発明を特に限定するものではないが、通常、外来性のポリペプチドは、オリゴマータンパク質を形成し得る範囲で内在性のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有している。【００２０】
本明細書において「ポリペプチドの発現の抑制」とは、当該ポリペプチドをコードする遺伝子からの転写及び／又は翻訳を妨げることにより、最終的なポリペプチドの生成を抑制すること、すなわち、生成物としてのポリペプチド量が減少することを意味する。したがって、ポリペプチドをコードする遺伝子からの転写反応が抑制されない場合でも、転写産物（ｍＲＮＡ）が速やかに分解され、タンパク質の生成が抑制されていれば「発現の抑制」に含まれる。本発明では、好ましくは発現を抑制することが望まれる内在性ポリペプチドの発現が選択的に抑制される。
前記の「ポリペプチドの発現の抑制」のための手段には特に限定はない。好ましくは、ポリペプチドの発現を選択的に抑制可能な手段が使用される。例えば、ポリペプチドの立体構造、アミノ酸配列又はポリペプチドをコードする塩基配列特異的に、ポリペプチドの発現を抑制する手段が本発明には好ましい。前記の手段としては、特に限定はされないが、ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を抑制する手段であるＲＮＡ干渉、リボザイム、アンチセンスＲＮＡが例示される。【００２１】
本明細書において「抗原認識レセプター」とは、抗原を特異的に認識するタンパク質を意味する。抗原認識レセプターとして、ヒト由来のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ヒト以外の生物由来のＴＣＲが例示される。ＴＣＲは、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマー、γ鎖とδ鎖からなるヘテロダイマーが知られているが、本発明においていずれも好適に使用できる。【００２２】
本明細書において「Ｔ細胞」とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ＣＴＬ、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞が含まれる。「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄液の他、これらより採取、単離、精製、誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球などを含む細胞集団が例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞はＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）や生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の方法により得られたＴ細胞集団をそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。【００２３】
以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明の細胞
本発明の細胞は、天然のオリゴマータンパク質を構成している少なくとも一つの内在性ポリペプチドに対応する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が導入されており、かつ前記の内在性ポリペプチドの発現が抑制されていることにより、非天然のオリゴマータンパク質を発現することができる細胞である。前記の構成により、単純に外来性のポリペプチドを細胞内で発現させた場合に比較して、外来性ポリペプチドを構成ポリペプチドとして含む、所望の機能を有する非天然のオリゴマータンパク質が効率良く形成されるという利点を有している。
発現させようとする非天然オリゴマータンパク質がホモオリゴマーである場合、内在性ポリペプチドの発現を適切な発現抑制手段で抑制し、そのうえで外来性ポリペプチドを発現させれば所望の非天然オリゴマータンパク質が形成される割合が向上する。ヘテロオリゴマーの場合には、構成ポリペプチドの１種のみが外来性のポリペプチドと置換されることでオリゴマータンパク質の機能が変化する場合、構成ポリペプチドのすべてが外来性ポリペプチドに置換される必要のある場合、の２つの場合がある。いずれの場合も、所望の非天然オリゴマータンパク質に取り込まれることが望ましくない、すなわち導入される外来性ポリペプチドに対応する内在性のポリペプチドの発現が抑制されるよう処理される。例えば、ヘテロダイマーであるオリゴマータンパク質を２種類の外来性ポリペプチドで形成させた場合に所望の機能が発揮される場合は、それぞれのポリペプチドに対応する２種類の内在性ポリペプチドの発現を抑制する。また、１種類の外来性ポリペプチドと他の種類の内在性ポリペプチドからなるヘテロダイマーを形成させることが望まれる場合、当該外来性ポリペプチドと競合する内在性ポリペプチドの発現を選択的に抑制する。
また、本発明の細胞は、外来性ポリペプチドの発現と比較して内在性ポリペプチドの発現が選択的に抑制された細胞であれば良いが、発現抑制手段を使用しない場合と比較した内在性ポリペプチドの発現量が２０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上もしくは１００％、すなわち完全に抑制されても良い。【００２４】
本発明が適用されるオリゴマータンパク質には特に限定はなく、構造タンパク質、酵素、転写因子、レセプター、抗体が例示される。また、本発明において、オリゴマータンパク質は細胞表面タンパク質（膜タンパク質）であってもよく、実施例に例示された抗原認識レセプター、例えばＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）への適用が特に好適である。【００２５】
本発明の細胞は、天然のオリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現が抑制されているため、外来性ポリペプチドと内在性ポリペプチドとの競合が抑制され、発現が期待される外来性ポリペプチドを含む適切なオリゴマータンパク質が形成される。【００２６】
本発明において使用される細胞は、オリゴマータンパク質を発現する細胞であれば特に限定はなく、動物細胞、植物細胞、微生物のいずれでも良い。特に限定はされないが、ヒト又はヒト以外の動物由来のＴ細胞は、ヘテロダイマーを形成するＴＣＲを発現するので、前期ＴＣＲの改変を目的として本発明に使用できる。本発明の細胞は、外来性ポリペプチドを導入する時に、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子を欠失させることや、内在性ポリペプチドが発現しないように分化誘導することを必要とせず、内在性ポリペプチドを発現している細胞を利用できるため有用である。【００２７】
本発明では、ポリペプチドの発現を抑制する手段の１つの態様としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）が利用される。１９９８年に報告されたＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡによって配列特異的なｍＲＮＡの分解が生じることによる遺伝子発現の抑制現象として注目されている。前記ＲＮＡ干渉は、長鎖２本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩタイプの活性によりｓｉＲＮＡと呼ばれる２１〜２５ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡに分解され、続いて、該ｓｉＲＮＡが、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるリボ核酸タンパク質複合体に組み込まれ、標的ＲＮＡにＡＴＰ依存的に結合し、標的ＲＮＡを分解するというメカニズムにより起こると考えられている。
本発明におけるＲＮＡ干渉では、内在性ポリペプチドの発現を選択的に抑制することを目的として、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列に相同なもしくは相補的なＲＮＡ分子、又は前記ｍＲＮＡの塩基配列に相同もしくは相補的な配列の鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子が利用される。ここで、「内在性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列に相同もしくは相補的である」及び「内在性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの塩基配列に相同もしくは相補的である」とは、前記のｍＲＮＡの塩基配列に完全に相同もしくは相補的であることを指すのみではなく、所望の機能が発揮される範囲で実質的に相同もしくは相補的であることを包含する。また、本発明に使用されるＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。前記ｓｉＲＮＡは、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域に対し相同もしくは相補的な１種類のｓｉＲＮＡであっても良く、複数の領域に対し相同なもしくは相補的な複数の二本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであっても良い。【００２８】
本発明に使用されるｓｉＲＮＡの鎖長としては、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば１３〜２９塩基の鎖長を有するもの、好ましくは１５〜２５塩基対の鎖長を有するもの、更に好ましくは、２０〜２５塩基対の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列の全てが内在性ポリペプチドのｍＲＮＡの塩基配列に由来するものであっても良く、その一部が前記の塩基配列に由来するものであっても良い。更に、本発明に使用されるｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の有効性の観点から、例えば、３’末端側に２〜４塩基突出した一本鎖領域を有する二本鎖ＲＮＡの形状のもの、更に好ましくは３’末端側に２塩基突出した一本鎖領域を有する二本鎖ＲＮＡの形状のものであっても良い。前記の突出した一本鎖領域として、２〜４塩基の連続するデオキシチミジン残基（ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ）が例示される。【００２９】
本発明に使用されるｓｉＲＮＡは、主にリボヌクレオチドによって構成されるが、その一部にデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの誘導体及び／又はリボヌクレオチドの誘導体を含んでいても良い。本発明のＲＮＡは、特に限定されないが、公知の化学合成法により合成することができる。また、適切な鋳型核酸を使用して酵素的に（例えばＲＮＡポリメラーゼを用いて）調製しても良い。本発明に使用されるｓｉＲＮＡは、分子内で二本鎖を形成し得る一本鎖ＲＮＡに由来するものであっても良く、ｓｉＲＮＡ部分をステムとし、任意の配列をループとしたステム−ループ構造（ショートヘアピン構造：ｓｈ構造）の一本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が例示される。前記の任意の配列としては１〜３０ヌクレオチドの配列が例示されるが、好ましくは１〜２５ヌクレオチド、更に好ましくは５〜２２ヌクレオチドの配列が使用される。【００３０】
本発明に使用されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ分子を、直接細胞に導入しても良く、細胞内で前記ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ分子が転写される核酸構築物を細胞に導入しても良い。直接細胞に導入する場合、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ社）が好適に使用できる。一方、前記ＲＮＡ分子が転写される核酸構築物を使用する場合、特に本発明を限定するものではないが、哺乳動物細胞内で機能を発揮しうるプロモーターの下流に、前記ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含むＲＮＡをコードする核酸が前記ｓｉＲＮＡが転写されうる状態で、すなわち機能的に接続されているものが使用できる。好適な態様として、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制しうる二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡ鎖をコードする核酸がそれぞれプロモーターの下流に配置されている構築物が例示される。
前記核酸構築物に使用されるプロモーターとしては、哺乳動物細胞内で機能しうるものであれば特に限定はなく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、テトラサイクリンで調節可能なプロモーターなどが挙げられる。また、組織特異的プロモーターを用いることは、所望の細胞、部位、臓器などにおいて特異的に内在性ポリペプチドの機能の抑制が可能となる点で有利である。特に限定は無いが、例えば、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーターなどが挙げられる。また、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系プロモーターとしては、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒストンＨ１プロモーターなどが挙げられる。前記テトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン調節型Ｕ６プロモーター、ＴＲプロモーターなどが挙げられる。また、上記プロモーターをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと組み合わせることにより、より厳密にＲＮＡの転写を制御することもできる。【００３１】
本発明で使用される核酸構築物の構築には特に限定はない。例えば、目的遺伝子の機能を抑制しうる二本鎖ＲＮＡのセンス、アンチセンス鎖が下記のようなシステムで転写されるように構築することができる：（Ａ）異なる２つのプロモーターの下流にセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ接続し、この２つの転写ユニットを順方向に配置した、別個にセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを転写するタンデムタイプ、（Ｂ）１つのプロモーターの下流にセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ順方向に配置した、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが直接又はループで連結されたステム−ループタイプ（又はショートヘアピンタイプ）のＲＮＡを転写するタイプ、あるいは、（Ｃ）センス鎖及びアンチセンス鎖を（それぞれ両ストランド）でコードする核酸の両端側のそれぞれにプロモーターを配置して、別個のプロモーターで両ＲＮＡ鎖を転写する対向タイプ。本発明では、使用条件、例えば、哺乳動物細胞の種類、センス配列とアンチセンス配列の種類などに応じ、タンデムタイプ、ステム−ループタイプ、対向タイプを使い分けることができる。【００３２】
本発明で使用する核酸構築物は、より安定的に細胞内で効果を発揮しうるように、適切なベクター、例えばプラスミドベクターやウイルスベクターに組み込まれていても良い。更に、細胞の染色体ＤＮＡ上に本発明の核酸構築物を組み込んでも良い。前記プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えばＲＮＡ干渉用の核酸を発現させるｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡプラスミド（商品名、ｉＧＥＮＥ社製）、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＳＥＣ  Ｈｙｇｒｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＢＡｓｉベクター（タカラバイオ社製）などが例示される。ウイルスベクターとしてはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。市販されているアデノウイルスベクターの例としてＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）が、市販されているレトロウイルスベクターの例としてｐＳＩＮｓｉベクター（タカラバイオ社製）、ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）が、それぞれ例示される。【００３３】
作製されたベクターは、当該ベクターに適した適切な方法、例えば、プラスミドベクターの場合はエレクトロポレーション法やリポフェクション法などによって、また、ウイルスベクターの場合には当該ウイルスの細胞への感染能を利用して、目的の細胞に導入することができる。【００３４】
本発明において、非天然のオリゴマータンパク質に含まれる外来性ポリペプチドは、前記外来性ポリペプチドに対応する内在性ポリペプチドと共存した場合、両者はオリゴマータンパク質の形成について競合するとともに、外来性ポリペプチド、内在性ポリペプチドのそれぞれが含まれる複数種のオリゴマータンパク質が形成される。本発明の細胞で発現される外来性ポリペプチドは、内在性ポリペプチドと比較して、使用される発現抑制手段により発現が抑制されにくいポリペプチド、好適には抑制されないポリペプチドであれば特に限定はされない。例えば、発現抑制手段としてｓｉＲＮＡを使用する場合、導入する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子は、それから転写されるＲＮＡが前記ｓｉＲＮＡと高い相同性もしくは相補性を有しない塩基配列、すなわち、前記ｓｉＲＮＡの作用を受けない配列であることが好ましい。ｓｉＲＮＡが作用するＲＮＡ上の領域が、内在性ポリペプチドと外来性ポリペプチドで同一である場合、外来性ポリペプチドについて、コードされるアミノ酸配列を変えずに塩基配列を変換することができる。遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。適切なコドンの選択により、コードされるアミノ酸配列には変化を与えずに、塩基を変換（サイレント変異と呼ばれる）することができる。すなわち、塩基配列は相異するがアミノ酸配列は同一である。サイレント変異は、コドンの３番目の塩基を変換する場合が多い。外来性ポリペプチドをコードする遺伝子にこのサイレント変異を導入すると、内在性ポリペプチドの発現を抑制するｓｉＲＮＡが、前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるＲＮＡに作用せず、発現の抑制が低減される。これにより、外来性ポリペプチドの発現と比較して内在性ポリペプチドの発現を選択的に抑制することができる。以下、本明細書において、前記のようにサイレント変異を導入した遺伝子を「コドン変換型」遺伝子と呼ぶことがある。上記の塩基配列の変換に際しては、特に本発明を限定するものではないが、使用される宿主において使用頻度の高いコドンや翻訳効率を上昇させる配列を選択して塩基配列を変換することにより、外来性ポリペプチドの発現効率の向上が期待される。【００３５】
更に、ｓｉＲＮＡによって内在性ポリペプチドの発現を抑制する別の態様として、前記ｓｉＲＮＡが作用するＲＮＡの領域に対応する外来性ポリペプチドのアミノ酸配列について、外来性ポリペプチドの機能を損なわない範囲において、他のアミノ酸の置換、例えば類似するアミノ酸への置換によってアミノ酸配列を変化させても良い。類似するアミノ酸とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４７巻、第１３０６−１３１０頁（１９９０）を参照）。保存的アミノ酸置換を外来性ポリペプチドに導入することにより、内在性ポリペプチドの発現を抑制するｓｉＲＮＡが、前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるＲＮＡに作用せず、発現の抑制が低減される。これにより、外来性ポリペプチドの発現と比較して内在性ポリペプチドの発現を選択的に抑制することができる。【００３６】
Ｔ細胞レセプター（Ｔ細胞受容体：ＴＣＲ）は、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマー（ヘテロ二量体）、γ鎖とδ鎖からなるヘテロダイマーの２種類が存在する。ＴＣＲの各鎖とも可変（Ｖ）領域、結合（Ｊ）領域、定常（Ｃ）領域からなる。ＴＣＲのＶ領域の多様性は、ＤＮＡの再編成によるＶ領域をコードする遺伝子セグメントの組み合わせと再編成結合部位のずれ、及び結合部位へのＮ配列の挿入によって生じる。α鎖とβ鎖のＶ領域には、アミノ酸配列の変異が特に高い超可変領域（ＣＤＲ）が認められる。【００３７】
本発明の一態様として、非天然のＴＣＲを発現する細胞であって、前記非天然のＴＣＲを構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が導入されており、かつ前記外来性ポリペプチドに対応する内在性ポリペプチドの発現が抑制されたＴ細胞が挙げられる。例えば、所望の抗原を認識するＴＣＲを外来性ＴＣＲとしてＴ細胞に導入する場合、内在性ＴＣＲの発現が抑制される本発明のＴ細胞では、外来性ポリペプチドと内在性ポリペプチドとのミスペアリングが減少し、目的とする外来性ポリペプチドを含有するＴＣＲヘテロダイマーの分子数が増加する。更に、内在性ＴＣＲの発現が抑制されるので、細胞表面に存在するＴＣＲのうち、非天然ＴＣＲの占める割合が増加し、非天然のＴＣＲのみを発現する単価なＴ細胞が増加する。したがって、抗原に対する特異性が向上し、細胞治療などの分野において有用である。また、内在性ＴＣＲを発現する細胞に外来性ＴＣＲを導入する際、内在性ＴＣＲと外来性ＴＣＲの遺伝子発現が競合し、外来性ＴＣＲの発現が低下する可能性がある。さらに、ミスペアリングしたＴＣＲによる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの副作用が発生する可能性がある。本発明の細胞は、前記の外来性ＴＣＲの発現低下やＧＶＤＨをはじめとする副作用を回避しうる。
内在性ＴＣＲのＶ領域のアミノ酸配列は個々のＴ細胞によって異なるのに対し、Ｃ領域のアミノ酸配列は個々のＴ細胞に共通の配列で同じ塩基配列の遺伝子にコードされているため、ｓｉＲＮＡの標的とするのに好適である。更に、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子にｓｉＲＮＡが作用する領域において、外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を変換（置換）して、すなわち、前記コドン変換型遺伝子とし、非作用領域とすることにより、内在性ポリペプチドの発現を抑制し、外来性ポリペプチドの発現を効率よく行うことができる。【００３８】
例えば、内在性ＴＣＲの発現を抑制する場合、特に限定はされないがＴＣＲをコードする遺伝子のＣ領域のうち、内在性α鎖の塩基配列ＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴ（配列番号１９）を、外来性α鎖は塩基配列ＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣ（配列番号２０）にコドン変換すれば良い。上記２つの塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＳＫＤＳＤＶＹ（配列番号２１）で共通であるが、配列番号３及び配列番号４に記載されるＲＮＡをアニールさせて作製される二本鎖ｓｉＲＮＡにより、内在性ＴＣＲのα鎖が選択的に抑制される。外来性ＴＣＲα鎖の一例として、配列番号１に記載される塩基配列にコードされるポリペプチドが挙げられる。配列番号１において、塩基番号６８〜８８３の塩基配列がＴＣＲα鎖をコードする。このうち、塩基番号６８〜４０１がＶ領域を、塩基番号４０６〜４６１がＪ領域を、塩基番号４６２〜８８３がＣ領域をそれぞれコードする。配列番号１の塩基番号５６９〜５８９が、前記配列番号２０に相当し、内在性ＴＣＲα鎖と配列が異なっている。【００３９】
また、内在性β鎖の塩基配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣ（配列番号２２）を、外来性β鎖は塩基配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣ（配列番号２３）にコドン変換すれば良い。上記２つの塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＡＴＩＬＹＥＩ（配列番号２４）で共通であるが、配列番号５及び配列番号６に記載されるＲＮＡをアニールさせて作製される二本鎖ｓｉＲＮＡにより、内在性ＴＣＲのβ鎖が選択的に抑制される。外来性ＴＣＲβ鎖の一例として、配列番号２に記載される塩基配列にコードされるポリペプチドが挙げられる。配列番号２において、塩基番号６８〜１００６の塩基配列がＴＣＲβ鎖をコードする。このうち、塩基番号６８〜４１４がＶ領域を、塩基番号４２７〜４７０がＪ領域を、塩基番号４７１〜１００６がＣ領域をそれぞれコードする。配列番号２の塩基番号９０２〜９２２が、前記配列番号２３に相当し、内在性ＴＣＲβ鎖と配列が異なっている。【００４０】
本発明の外来性ＴＣＲが導入されたＴ細胞が投与される疾患としては、当該Ｔ細胞に感受性を示す疾患であればよく特に限定はないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。また、本発明の細胞は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。【００４１】
本発明において、外来性ポリペプチドをコードする遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。【００４２】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターなどが使用される。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。【００４３】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡやＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。【００４４】
レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療などの目的に使用されている。【００４５】
外来性ポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミドなどに挿入して使用することができる。また、効率の良い遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節配列、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していても良い。また、相同組換えにより導入対象のＴ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に前記の遺伝子を配置させても良い。
前記の「ポリペプチドの発現の抑制」のための手段に使用される核酸、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含むＲＮＡが転写される核酸構築物と、前記の外来性ポリペプチドをコードする遺伝子は、別々に細胞に導入することができ、また、同一のベクターにより細胞に導入することができる。【００４６】
（２）本発明の細胞の製造方法及び非天然のオリゴマータンパク質の形成方法
本発明の細胞の製造方法及び内在性と外来性のポリペプチドの混成によるオリゴマー形成の抑制方法は、以下の工程を実施することを特徴とする。
（ａ）オリゴマータンパク質を発現する細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する少なくとも一つの内在性ポリペプチドに対応する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程；及び
（ｂ）前期内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。
本発明の細胞の製造方法は、前記（１）に記載する本発明の細胞の製造方法である。当該方法で得られる細胞は、外来性のポリペプチドを含む非天然のオリゴマータンパク質の形成に関して、内在性ポリペプチドによる干渉が低減されているため、単純に外来性のポリペプチドを細胞内で発現させた場合に比較して、所望の機能を有する非天然のオリゴマータンパク質が効率良く形成される。
前記工程（ａ）と工程（ｂ）の順序は、特に限定はなく、どちらが先であっても良く、同時に実施されても良い。本発明の方法で実施される工程に、内在性ポリペプチドの発現が抑制された細胞を分離もしくは単離する工程を加えて、前記細胞を含有する細胞集団を誘導、培養もしくは単離することができ、更にこれらの細胞を含有する細胞集団を製造する方法も本発明の方法に含まれる。この分離もしくは単離工程は、適切な非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドの発現を指標に実施することができる。【００４７】
更に、本発明の方法の工程に、公知のタンパク質や化学成分を加えても良く、例えばＴ細胞の場合、サイトカイン類、ケモカイン、その他の成分を加えても良い。本明細書において、サイトカインとは、Ｔ細胞に作用し活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２７などが例示され、細胞性免疫を増強させる観点から特に好適には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２が例示される。また、ケモカインとは、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０、ＭＩＧが例示される。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【００４９】
実施例１  野生型及びコドン変換型ヒトＴ細胞受容体α及びβ遺伝子の作製
コドン変換型のヒト抗ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲα遺伝子を、野生型の遺伝子の一部を変換して作製した。この遺伝子を含む核酸断片を、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした。コドン変換型のヒト抗ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲα遺伝子を含む核酸断片の配列を配列表の配列番号１に示す。
コドン変換型のヒト抗ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲβ遺伝子を、野生型の遺伝子の一部を変換して作製した。この遺伝子を含む核酸断片を、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔのＫｐｎＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした。コドン変換型のヒト抗ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲβ遺伝子を含む核酸断片の配列を配列表の配列番号２に示す。【００５０】
実施例２  ｓｉＲＮＡによるヒト末梢血単核球における遺伝子抑制効果の確認
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）へ、Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ社）を用いて、配列番号３及び４をアニールさせて作製した野生型ＴＣＲαに対する二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＣＲ−Ａ）５０ｐｍｏｌ及び、配列番号５及び６をアニールさせて作製した野生型ＴＣＲβに対する二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＣＲ−Ｂ）５０ｐｍｏｌを混合し、製品説明書の手順に従って導入した。ネガティブコントロールとして配列番号７及び８をアニールさせて作製したｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＣ）を１００ｐｍｏｌ導入した。導入２日後に細胞を回収し、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて全ＲＮＡの抽出及びＤＮＡｓｅＩ処理を行った。抽出した全ＲＮＡをランダムプライマー（６ｍｅｒ）を用いて、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴａｓｅにて逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ及び配列番号９、１０の野生型ＴＣＲα増幅用プライマー、配列番号１３、１４の野生型ＴＣＲβ増幅用プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、野生型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ遺伝子発現量の相対値を算出した。全ＲＮＡ量の補正は配列番号１７、１８のβ−アクチン遺伝子増幅用プライマーを用いて行った。【００５１】
対照実験群の野生型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって遺伝子抑制効果を評価した。図１に結果を示す。図中、縦軸は野生型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ遺伝子発現量についてネガティブコントロールを１００としたときの相対値で示す。横軸は、導入したｓｉＲＮＡを示す。図１に示されるように、野生型ＴＣＲα及びβに対する二本鎖ｓｉＲＮＡの導入により、野生型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現抑制効果を示した。【００５２】
実施例３  ｓｉＲＮＡによるヒト末梢血単核球におけるタンパク発現抑制効果の確認
実施例２にて二本鎖ｓｉＲＮＡを導入したヒト末梢血単核球を、二本鎖ｓｉＲＮＡ導入３日後に、ＰＥ−ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  ＴＣＲ  抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）にて染色し、フローサイトメーターにてＴＣＲ陽性細胞率、及びＴＣＲ陽性細胞のＰＥの蛍光強度を測定した。図２にＴＣＲ陽性細胞率を示し、図３にＴＣＲ陽性細胞のＰＥの蛍光強度を示す。横軸は、導入したｓｉＲＮＡを示す。縦軸は図２ではＴＣＲ陽性細胞率を示し、図３ではＴＣＲ陽性細胞のＰＥの蛍光強度を示す。図２及び３に示されるように、野生型ＴＣＲα及びβに対する二本鎖ｓｉＲＮＡの導入により、ヒト末梢血単核球の内在性の野生型ＴＣＲα／β複合タンパクの発現率及び発現量の低下がみられた。【００５３】
実施例４  コドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの作製
まず、マウスゲノムを鋳型に配列番号２５記載のｐＰＧＫ５プライマー及び配列番号２６記載のｐＰＧＫ３プライマーでＰＣＲを行い、ＰＧＫプロモーターを含むＤＮＡ断片を取得した。この断片をｐＴ７  Ｂｌｕｅベクター（ＭＥＲＣＫ社製）にＴＡクローニングした。
次に、このプラスミドからＮｏｔＩとＢａｍＨＩでＰＧＫプロモーター部位を切り出し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＮｏｔＩとＢａｍＨＩサイトにクローニングしｐＢＳ−ＰＰＧＫを作製した。
ｐＭＳＣＶｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型に配列番号２７記載の３ＭＳＣＶ５プライマー及び配列番号２８記載の３ＭＳＣＶ３プライマーでＰＣＲを行いＣＭＶ３‘ＬＴＲ部位を増幅し、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで切断し、ｐＭＴベクター［ジーン  セラピー  第７巻、第７９７−８０４頁（２０００）に記載されているｐＭベクター］のＸｈｏ−ＥｃｏＲＩサイトにクローニングし、ｐＭＳＭＣを作製した。【００５４】
実施例１のコドン変換型ＴＣＲβ遺伝子をクローニングしたプラスミドから、ＰｓｔＩでコドン変換型ＴＣＲβ遺伝子を切り出し、ｐＢＳ−ＰＰＧＫのＰｓｔＩサイトにクローニングしｐＢＳ−Ｐｂ２を作製した。
次に、ｐＢＳ−Ｐｂ２からＳａｃＩＩとＸｈｏＩでＰＧＫプロモーター＋変換型ＴＣＲβ遺伝子を切り出し、ｐＭＳＭＣのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングし、ｐＭＳ−Ｐｂ２を作製した。
実施例１のコドン変換型ＴＣＲα遺伝子をクローニングしたプラスミドから、ＮｏｔＩでコドン変換型ＴＣＲα遺伝子を切り出し、ｐＭＳＭＣのＮｏｔＩサイトにクローニングしｐＭＳ−Ｍａ２を作製した。
次に、ｐＭＳ−Ｍａ２からＮｏｔＩでコドン変換型ＴＣＲα遺伝子を切り出し、ｐＭＳ−Ｐｂ２のＮｏｔＩサイトにクローニングし、ｐＭＳ−ａＰｂ１を得た。【００５５】
プラスミドベクターｐＭＳ−ａＰｂ１により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして供した。
調製したｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターを２９３Ｔ細胞に、Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）細胞にポリブレンを使用する方法により感染させ、限界稀釈法により細胞のクローン化を行った。得られたクローン細胞の培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターによりろ過し、ＭＳ−ａＰｂ１コドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルス溶液とした。【００５６】
実施例５  ヒト末梢血単核球へのコドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルスの感染及びｓｉＲＮＡの導入
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例４で作製したコドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルスを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で２回感染を行い、変換型ＴＣＲ発現導入末梢血単核球を作製した。感染３日後に、Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ社）を用いて、実施例２及び３にて遺伝子抑制効果が確認された野生型ＴＣＲαに対するｓｉＴＣＲ−Ａ  ５０ｐｍｏｌ及び野生型ＴＣＲβに対するｓｉＴＣＲ−Ｂ  ５０ｐｍｏｌを混合し、製品説明書の手順に従って導入した。ネガティブコントロールとしてｓｉＮＣを１００ｐｍｏｌ導入した。各実験群は、例数２にて行った。ｓｉＲＮＡ導入２日後に細胞を回収し、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩ処理を行った。抽出した全ＲＮＡをランダムプライマー（６ｍｅｒ）を用いて、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社製）にて逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）及び配列番号９、１０の野生型ＴＣＲα増幅用プライマー、配列番号１１、１２のコドン変換型ＴＣＲα増幅用プライマー、配列番号１３、１４の野生型ＴＣＲβ増幅用プライマー、配列番号１５、１６のコドン変換型ＴＣＲβ増幅用プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量の相対値を算出した。全ＲＮＡ量の補正は配列番号１７、１８のβ−アクチン遺伝子増幅用プライマーを用いて行った。
対照実験群の野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって遺伝子抑制効果を評価した。図４にＴＣＲα、図５にＴＣＲβの結果を示す。図中、縦軸は野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、又は変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量についてネガティブコントロールを１００としたときの相対値で示す。横軸は、導入したｓｉＲＮＡを示す。図４及び５に示されるように、野生型ＴＣＲαかつβに対する二本鎖ｓｉＲＮＡの導入により、ＰＢＭＣにおいて野生型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現を抑制するが、変換型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現の抑制は起こっていない。【００５７】
実施例６  コドン変換型ＴＣＲ導入ヒト末梢血単核球へのｓｉＲＮＡの導入によるコドン変換型ＴＣＲタンパク発現への効果
実施例５において、コドン変換型ＴＣＲ導入したヒト末梢血単核球へｓｉＲＮＡを導入して３日後に、ＨＬＡ−Ａ２４０２  ＭＡＧＥ−Ａ４  テトラマー−ＰＥ（ＭＢＬ社製）及びＨｕｍａｎ  ＣＤ８  ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  （ＣＡＬＴＡＧ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により染色し、フローサイトメーターによりＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。各実験群は、例数２にて行った。図６にＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したｓｉＲＮＡを示し、縦軸はＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。図６に示されるように、野生型ＴＣＲα及びβに対する二本鎖ｓｉＲＮＡの導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパクの発現率の増強が見られた。【００５８】
実施例７  コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの作製
ｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６ベクター（タカラバイオ社製）のＢａｍＨＩ−ＣｌａＩサイトに配列番号２９及び３０をアニールさせて作製した２本鎖ＤＮＡをクローニングして、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６−ＴＣＲＡを作製した。また、ｐＢＡｓｉ−ｍＵ６ベクター（タカラバイオ社製）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに配列番号３１及び３２をアニールさせて作製した２本鎖ＤＮＡをクローニングして、ｐＢＡｓｉ−ｍＵ６−ＴＣＲＢを作製した。
図７に示すように、作製したｐＢＡｓｉ−ｍＵ６−ＴＣＲＢをＥｃｏＲＶにて切り出して得られた、ｍＵ６−ＴＣＲＢ  ｉｎｓｅｒｔをｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６−ＴＣＲＡのＰｍｅＩサイトにクローニングし、ｐＳＩＮｓｉ−Ｒｍ／Ｆｈを得た。作製したｐＳＩＮｓｉ−Ｒｍ／ＦｈをＮｈｅＩ及びＣｌａＩにて消化し、末端の平滑化を行うことにより、Ｒｍ／Ｆｈ  ｉｎｓｅｒｔを得た。
図８に示すように、実施例４にて作製したｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターをＭｌｕＩにて消化し、末端の平滑化を行い、前記Ｒｍ／Ｆｈ  ｉｎｓｅｒｔをクローニングしてＴ３ベクターを作製した。
また、図９に示すように、実施例４にて作製したｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターのをＣｌａＩにて消化し、末端の平滑化を行い、Ｒｍ／Ｆｈ  ｉｎｓｅｒｔをクローニングしてＴ７ベクターを作製した。
次に、図１０に示すように、配列番号３３に示す人工合成遺伝子をＭｌｕＩ及びＳａｃＩＩにて消化して得たＴＣＲ−ｌｏｏｐ−ＭｌｕＩ／ＳａｃＩＩを、実施例４にて作製したｐＭＳ−ａＰｂ１のＭｌｕＩ−ＳａｃＩＩサイトにクローニングすることにより、Ｔ１５ベクターを得た。
さらに、図１１に示すように、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＨ１ベクター（タカラバイオ社製）をＣｌａＩ消化後に平滑末端化を行い、ＮｏｔＩにて消化して得られた断片をｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６（タカラバイオ社製）のＰｍｅＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングし、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＨ／ｈＵを作製した。
図１２に示すように、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＨ／ｈＵをＢａｍＨＩにて消化して得られた断片を前記ｐＳＩＮｓｉ−Ｒｍ／ＦｈをＢａｍＨＩにて消化したサイトにクローニングを行いｐＳＩＮｓｉ−ＲＨＢ／ＦＵＡを作製し、これをＮｈｅＩ及びＣｌａＩにて消化し、平滑末端化を行って、ＨＢ／ＵＡ  ｉｎｓｅｒｔを得た。
図１３に示すように実施例４にて作製したｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターをＭｌｕＩにて消化し、末端の平滑化を行い、ＨＢ／ＵＡ  ｉｎｓｅｒｔをクローニングして、ＴＮ１ベクターを作製した。
図１４に示すようにＴ１５ベクターをＮｏｔＩにて消化後、末端平滑化を行って、α１−ｂｌｕｎｔ  ｉｎｓｅｒｔを作製した。また、Ｔ１５ベクターをＮｏｔＩにて消化し、ベクターのセルフライゲーションを行って得られたｐＭＳ−ｌｏｏｐ−Ｐｂ１ベクターをＭｌｕＩ消化後、平滑末端化を行ったサイトにα１−ｂｌｕｎｔ  ｉｎｓｅｒｔをクローニングすることによりＴＮ５ベクターを作製した。
図１５に示すように実施例４にて作成したｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターをＮｏｔＩにて消化して、α１  Ｎｏｔ  ｉｎｓｅｒｔを作製した。また、ｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターをＮｏｔＩにて消化後、末端平滑化を行った後、ＣｌａＩにて消化してＰＧＫ＋β１  ｉｎｓｅｒｔを作製した。さらに、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６−ＴＣＲＡベクターをＣｌａＩにて消化後、平滑末端を行った後、ＮｏｔＩにて消化して、ｈＵ６−ＴＣＲＡ  ｉｎｓｅｒｔを得た。ｐＭＳ−ａＰｂ１のＮｏｔＩ−ＣｌａＩサイトにＰＧＫ＋β１  ｉｎｓｅｒｔ及びｈＵ６−ＴＣＲＡ  ｉｎｓｅｒｔをクローニングすることによりｐＭＳ−ｈＵＲＡ−Ｐｂ１を作製後、ＮｏｔＩにて消化し、α１  Ｎｏｔ  ｉｎｓｅｒｔをクローニングすることにより、ｐＭＳ−ａ−ｈＵＴＣＲＡ−Ｐｂ１を作製した。
図１６に示すように、ｐＳＩＮｓｉ−ＲＨＢ／ＦＵＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて消化後末端平滑化を行って、ｈＨ１−ＴＣＲＢ−ｂｌｕｎｔ  ｉｎｓｅｒｔを得た。ｐＭＳ−ａ−ｈＵＴＣＲＡ−Ｐｂ１をＣｌａＩ消化後、末端平滑化を行ってｈＨ１−ＴＣＲＢ−ｂｌｕｎｔ  ｉｎｓｅｒｔをクローニングすることにより、ＴＮ９ベクター及びＴＮ１１ベクターを作製した。
プラスミドベクターｐＭＳ−ａＰｂ１、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５、ＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ９ベクターにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして供した。
調製したｐＭＳ−ａＰｂ１、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５、ＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ９ベクターを２９３Ｔ細胞に、Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）細胞にポリブレンを使用する方法により感染させ、細胞の培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターによりろ過し、ＭＳ−ａＰｂ１、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５、ＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ９レトロウイルス溶液とした。【００５９】
実施例８  ヒト末梢血単核球へのコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの感染１
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例７で作製したＴ３、Ｔ７、Ｔ１５コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルス及びコントロールとしてコドン変換型ＴＣＲ発現ｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で２回感染を行い、コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現導入末梢血単核球を作製した。２回目ウイルス感染３日後に細胞を回収し、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩ処理を行った。抽出した全ＲＮＡをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）にて逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社製）及び配列番号９、１０の野生型ＴＣＲα増幅用プライマー、配列番号１１、１２のコドン変換型ＴＣＲα増幅用プライマー、配列番号１３、１４の野生型ＴＣＲβ増幅用プライマー、配列番号１５、１６のコドン変換型ＴＣＲβ増幅用プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量の相対値を算出した。全ＲＮＡ量の補正は配列番号３４、３５のＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーを用いて行った。
対照実験群の野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型ＴＣＲ遺伝子抑制効果及び変換型ＴＣＲ遺伝子発現量を評価した。図１７に結果を示す。図中、縦軸は野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、又は変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量について遺伝子導入なしのネガティブコントロールを１００としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図１７に示されるように、野生型ＴＣＲαかつβに対するｓｉＲＮＡの導入により、ＰＢＭＣにおいて野生型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現を抑制する。Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５ではｐＭＳ−ａＰｂ１に比べて、変換型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現は低い。【００６０】
実施例９  コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入によるコドン変換型ＴＣＲタンパク発現への効果１
実施例８において、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルス２回目感染３日後に細胞を回収し、実施例６の同様の方法によりＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図１８にＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。図１８に示されるように、Ｔ１５コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパクの発現率がコントロールのコドン変換型ＴＣＲ発現ｐＭＳ−ａＰｂ１と比較して向上した。実施例８に示されるように、ｓｉＲＮＡ発現ユニットの挿入により、コドン変換型ＴＣＲ遺伝子の発現量はｐＭＳ−ａＰｂ１に比べて低いものの、ｓｉＲＮＡによる野生型ＴＣＲ遺伝子の発現抑制効果により、コドン変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパク発現率の増強が見られた。【００６１】
実施例１０  ヒト末梢血単核球へのコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現レトロウイルスベクターの感染２
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例８と同様にコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現導入末梢血単核球を作製した。ウイルス感染７日後に全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩ処理を行った。実施例８と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行い、野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量の相対値を算出した。
対照実験群の野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型ＴＣＲ遺伝子抑制効果及び変換型ＴＣＲ遺伝子発現量を評価した。図１９に結果を示す。図中、縦軸は野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、又は変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量について遺伝子導入なしのネガティブコントロールを１００としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図１９に示されるように、野生型ＴＣＲαかつβに対するｓｉＲＮＡの発現により、ＰＢＭＣにおいて野生型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現を抑制する。また、ウイルス感染３日後の実施例８の結果よりも、７日後で野生型ＴＣＲ遺伝子の発現抑制効果が高くなっている。しかし、野生型ｓｉＲＮＡ発現ユニットの挿入によりｐＭＳ−ａＰｂ１に比べて、変換型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現は低い。【００６２】
実施例１１  コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現レトロウイルスベクター導入によるコドン変換型ＴＣＲタンパク発現への効果２
実施例１０において、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現レトロウイルス２回目感染７日後に細胞を回収し、実施例６と同様の方法によりＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図２０にＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。図２０に示されるように、Ｔ３、Ｔ７コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型ＴＣＲ発現ｐＭＳ−ａＰｂ１と比較して向上した。実施例１０に示されるように、ｓｉＲＮＡ発現ユニットの挿入により、コドン変換型ＴＣＲ遺伝子の発現量は低下するものの、ｓｉＲＮＡによる野生型ＴＣＲ遺伝子の発現抑制効果により、コドン変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパク発現率の増強が見られた。【００６３】
実施例１２  コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入によるコドン変換型ＴＣＲ複合体の抗原特異的サイトカイン産生能１
Ｔ２細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９２）にＨＬＡ−Ａ２４０２  ｃＤＮＡを遺伝子導入して作製されたＴ２Ａ２４細胞へ、ＭＡＧＥ−Ａ４１４３−１５１ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４（＋）細胞又は、ペプチドをパルスしていないＴ２Ａ２４（−）細胞と、実施例１０における、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５、ＭＳ−ａＰｂ１導入細胞３日後の細胞を混合した細胞、及び、導入３日後の細胞にＰＭＡとイオノマイシンにて抗原非特異的に刺激した細胞へ、Ｂｒｅｆｅｒｄｉｎ  Ａを添加したのち一晩３７℃にてインキュベートした後、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＩＯ  Ｔｅｓｔ  ＩＦＮγ−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）にてＣＤ８染色及び細胞内ＩＦＮγ染色を行い、フローサイトメーターによりＣＤ８陽性であって、かつＩＦＮγ陽性である細胞の割合を測定した。図２１に細胞内ＩＦＮγ陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はＩＦＮγ陽性細胞率を示す。図２１に示されるように、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１５コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入により、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原特異的ＩＦＮγ産生能がコントロールであるＭＳ−ａＰｂ１導入細胞と同程度であることが確認された。【００６４】
実施例１３  ヒト末梢血単核球へのコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの感染３
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例７で作製したＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ９コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルス及びコントロールとしてコドン変換型ＴＣＲ発現ｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で２回感染を行い、コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現導入末梢血単核球を作製した。２回目ウイルス感染５日後及び１１日後に細胞を回収し、実施例８と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行い、野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量の相対値を算出した。
対照実験群の野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型ＴＣＲ遺伝子抑制効果及び変換型ＴＣＲ遺伝子発現量を評価した。図２２に感染５日後の結果を、図２３に感染１１日後の結果を示す。図中、縦軸は野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、又は変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量についてＭＳ−ａＰｂ１導入細胞を１００としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図２２及び図２３に示されるように、野生型ＴＣＲαかつβに対するｓｉＲＮＡの発現により、ＰＢＭＣにおいて野生型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現を抑制する。【００６５】
実施例１４  コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現レトロウイルスベクター導入によるコドン変換型ＴＣＲタンパク発現への効果３
実施例１３において、ＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ９コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルス２回目感染４日後に細胞を回収し、実施例６と同様の方法によりＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図２４にウイルス感染４日後のＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。図２４に示されるように、ＴＮ５、ＴＮ９コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型ＴＣＲ発現ＭＳ−ａＰｂ１に比べて向上した。実施例１３に示されるように、ｓｉＲＮＡ発現ユニットの挿入により、変換型ＴＣＲβの遺伝子発現はコントロールのＭＳ−ａＰｂ１導入細胞と比べて低いものの、ｓｉＲＮＡによる野生型ＴＣＲ遺伝子の発現抑制効果により、変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパク発現率の増強が見られた。【００６６】
実施例１５  コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現レトロウイルスベクター導入によるコドン変換型ＴＣＲ複合体の抗原特異的サイトカイン産生能２
実施例１２と同様の方法により、実施例１３におけるＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ９、ＭＳ−ａＰｂ１導入細胞４日後の細胞を使用して、ＣＤ８陽性であって、かつＩＦＮγ陽性である細胞の割合を測定した。図２５に細胞内ＩＦＮγ陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はＩＦＮγ陽性細胞率を示す。図２５に示されるように、ＴＮ１、ＴＮ５、ＴＮ９コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現レトロウイルスベクター導入により、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原特異的ＩＦＮγ産生能がＭＳ−ａＰｂ１導入細胞と比べて同程度以上であることが確認された。【００６７】
実施例１６  ヒト末梢血単核球へのコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの感染４
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例７で作製したＴＮ５、ＴＮ９コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルス及びコントロールとしてコドン変換型ＴＣＲ発現ｐＭＳ−ａＰｂ１ベクターを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で２回感染を行い、コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現導入末梢血単核球を作製した。
２回目感染４日後に細胞を回収した。ＴＮ５、ＴＮ９、ＭＳ−ａＰｂ１導入細胞の細胞あたりのベクターの平均コピー数は、それぞれ３．６４、２．２１、９．１５ｃｏｐｙ／ｃｅｌｌであった。また、実施例６と同様の方法によりＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図２６にウイルス感染４日後のＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。図２６に示されるように、ＴＮ５、ＴＮ９コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入により、細胞あたりのベクターのコピー数がＭＳ−ａＰｂ１より少ないにもかかわらず、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型ＴＣＲ発現ＭＳ−ａＰｂ１と同等であった。【００６８】
実施例１７ヒト末梢血単核球へのコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ  共発現レトロウイルスベクターの感染４
実施例１６にてヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現導入末梢血単核球を作製した。ウイルス感染５日後にＭＡＧＥ−Ａ４テトラマーにて染色を行い、Ａｎｔｉ−ＰＥ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）にて、ＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞のみを分取した。分取した細胞より、全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩ処理を行った。実施例８と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行い、野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量の相対値を算出した。
対照実験群の野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、変換型ＴＣＲβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型ＴＣＲ遺伝子抑制効果及び変換型ＴＣＲ遺伝子発現量を評価した。図２７に結果を示す。図中、縦軸は野生型ＴＣＲα、変換型ＴＣＲα、野生型ＴＣＲβ、又は変換型ＴＣＲβ遺伝子発現量についてＭＳ−ａＰｂ１導入細胞を１００としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図２７に示されるように、野生型ＴＣＲαかつβに対するｓｉＲＮＡの発現により、ＰＢＭＣにおいて野生型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現を抑制する。また、ＴＮ５およびＴＮ９ではｐＭＳ−ａＰｂ１に比べて、変換型ＴＣＲα及びβ遺伝子発現は低いにもかかわらず、野生型のＴＣＲαかつβに対するｓｉＲＮＡの発現による内在性ＴＣＲ遺伝子の抑制により、図２６に示すようにＴＮ５、ＴＮ９コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型ＴＣＲ発現ＭＳ−ａＰｂ１と同等まで上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明により、医療分野において有用なオリゴマータンパク質を発現する細胞、特にＴ細胞及び当該Ｔ細胞を製造する方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
SEQ ID NO:1: Codon modified anti-MAGE A4 TCR alpha chain.
SEQ ID NO:2: Codon modified anti-MAGE A4 TCR beta chain.
SEQ ID NO:3: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-A. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:4: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-A. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:5: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-B. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:6: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-B. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:7: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-C. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:8: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-C. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:9: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR alpha chain.
SEQ ID NO:10: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR alpha chain.
SEQ ID NO:11: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR alpha chain.
SEQ ID NO:12: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR alpha chain.
SEQ ID NO:13: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR beta chain.
SEQ ID NO:14: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR beta chain.
SEQ ID NO:15: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR beta chain.
SEQ ID NO:16: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR beta chain.
SEQ ID NO:17: Synthetic oligonucleotide primer for beta-actin.
SEQ ID NO:18: Synthetic oligonucleotide primer for beta-actin.
SEQ ID NO:19: Portion of TCR alpha chain.
SEQ ID NO:20: Portion of codon-modified TCR alpha chain.
SEQ ID NO:21: Portion of TCR alpha chain.
SEQ ID NO:22: Portion of TCR beta chain.
SEQ ID NO:23: Portion of codon-modified TCR beta chain.
SEQ ID NO:24: Portion of TCR beta chain.
SEQ ID NO:25: Synthetic oligonucleotide primer pPGK5.
SEQ ID NO:26: Synthetic oligonucleotide primer pPGK3.
SEQ ID NO:27: Synthetic oligonucleotide primer 3MSCV5.
SEQ ID NO:28: Synthetic oligonucleotide primer 3MSCV3.
SEQ ID NO:29: Synthetic oligonucleotide for pSINsi-hU6-TCRA.
SEQ ID NO:30: Synthetic oligonucleotide for pSINsi-hU6-TCRA.
SEQ ID NO:31: Synthetic oligonucleotide for pBAsi-mU6-TCRB.
SEQ ID NO:32: Synthetic oligonucleotide for pBAsi-mU6-TCRB.
SEQ ID NO:33: Synthetic oligonucleotide for TCR-loop-MluI/SacII.
SEQ ID NO:34: Oligonucleotide primer for amplification of GAPDH gene.
SEQ ID NO:35: Oligonucleotide primer for amplification of GAPDH gene.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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