【手続補正書】
【提出日】平成16年9月14日(2004.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
バイオサーファクタントを生産するMyroides odoratus SM-1(受託番号FERM P-19061)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】
これらの観点から培養液中にバイオサーファクタントを生産する海洋細菌をスクリーニングし、本発明の菌株を得ることができた。この菌株は、バイオサーファクタントを産生し、油乳化能を示す。
即ち、本発明は、バイオサーファクタントを生産するMyroides odoratus SM-1(受託番号FERM P-19061)（以下、単に「ＳＭ−１」という。）である。
また本発明は、この微生物の培養液、好ましくはその上澄液である。
ここで用いる培地に特に制限はなく、マリンブロス（例えば、Difco社製、Bacto Marine Broth 2216）が好ましいが、下記の基礎塩培地を使用してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
更に本発明は、この培養液から抽出されたバイオサーファクタントである。この抽出方法としては、通常の界面活性剤の抽出法を用いればよいが、例えば、濃塩酸でｐＨ２に調整後、１／４量の酢酸エチルで抽出を例えば３回繰り返すことにより行うことができる。ここで培養液としてその上澄液を用いて抽出を行ってもよい。
また本発明は、上記培養液、又は上記バイオサーファクタントを主要成分とする界面活性剤組成物である。この界面活性剤組成物は、上記培養液、又は上記バイオサーファクタントの一種若しくは２種以上を主要成分として含んでもよく、またこれら以外の公知の界面活性剤を含んでもよい。この培養液としてその上澄液を用いてもよい。更に、この界面活性剤組成物は、必要に応じて、公知の添加剤、例えば、酸化防止剤、香料、精油、防腐剤、化粧用活性剤、加湿剤、ビタミン、スフィンゴ脂質、脂溶性ポリマー等を含んでもよい。
更に、本発明は、上記培養液、上記バイオサーファクタント、又は上記界面活性剤組成物を用いて油、特に原油を乳化する方法である。これらは乳化能を有するため、常法に従い使用すれば、油、特に原油を乳化できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
なお、Myroides odoratus SM-1は、２００２年１０月９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０６１が付与された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
この微生物の形態的性質、培養的性質及び生理学的性質を表１に示す。
【表１】
2004154090.tif 000001
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
2004154090.tif 000002
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は下記の方法により単離した。
（１）１次スクリーニング：
タイ南部海域海水を微生物源として使用し、３％食塩を添加した栄養培地にこの海水を塗り付け、出現したコロニーを分取し、約２００株の細菌を分離した。このコロニーを３％食塩を添加した血液寒天培地に塗布し、溶血反応を示したものを選択し、２３株を選択した。
（２）２次スクリーニング：
市販のマリンブロス（Difco 社製、Bacto Marine Broth 2216）に２滴の人工風化原油(weathered crude oil,「w.c.o.」と略す。：Arabian light crude oilを230℃で２時間処理したもの。)を加えたもので、上記の選択菌株を培養し、強い乳化能を示した９菌株を選択した。
水中では原油は溶解せず塊のままであるので、原油が乳化したということは、培養液中でバイオサーファクタント（以下「ＢＳ」という。）が生産されていることを示す。乳化能を観察して、最も優れた乳化能を示した菌株をＳＭ−１と名付けた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
次に、上記スクリーニングで得られた菌株について、簡単な形態観察、培養及び生理学的所見とともに１６Ｓ リボゾームＲＮＡ遺伝子を解析し、データベースからホモロジー検索により同定した。
遺伝子解析は菌体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、既報の方法（A. Hiraishi, Y. K. Shin, Y. Ueda and J. Sugiyama, J. Microbiol. Methods, 19, 145-154 (1994)）に従って作成した下記のプライマーを用いて、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングしシーケンスした。この結果をＢＬＡＳＴと照合して判定した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
その結果、ＳＭ−１は、Myroides odoratus と判定された。
Myroides odoratusはgut bacteriaあるいは淡水魚から分離されているが、ＢＳ生産に関する報告はない。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
次に、本発明の微生物が産生するＢＳの活性を調べた。
本発明の微生物は、培養液中で原油が乳化されることから（上記２次スクリーニングを参照のこと）、乳化剤（バイオサーファクタント）を産出していることは明らかであるが、その乳化能を次のような方法で定量的に測定した。培養上清は３％ＮａＣｌを含んでいるので、活性測定は３％ＮａＣｌ存在下で行われたことになる。
乳化試験１（ヘキサデカン乳化能力）
４ｍｌの培養上清に同量のヘキサデカンを加えて、２分間vortex mixerで十分撹拌した後、１０分間静置する。結果は、乳化部分の高さの元のヘキサデカン層液全体に占める割合（％）で表わす。この数値が高いほど、乳化能力は高い。
乳化試験２（人工風化原油の乳化力）
２．５ｍｌの培養上清に２滴のｗ．ｃ．ｏ．を加えて室温で２４時間振盪し、生成したミセルの有無と大きさを肉眼で観察した。ミセルが細かいほど乳化能は高い。観察結果は、乳化力が大きく生成するミセルがほぼ識別できないものを「微小」、乳化力が大きいが生成するミセルがほぼ識別できるものを「小」、乳化力が小さく生成するミセルがはっきり識別できるもの（大きさはｍｍ単位であると考えられる。）を「大」、全く乳化が見られなかったものを「なし」とした。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、油分解性、特に原油分解性の新規微生物を提供する。この微生物は、バイオサーファクタントを産生し、これらは原油乳化能を示し、特に高塩分濃度において有効に界面活性剤として機能する。更に、本発明の微生物は、自然界で生分解性を示すため、生物毒性や環境残留性がなく、環境上の問題を引き起こさない。
この培養液から得られたバイオサーファクタントは、粗精製物又は精製物として、原油汚染海域の環境修復や、廃油を含む廃液処理に用いることが可能であり、また合成界面活性剤の代替として、または合成界面活性剤と共に用いて、洗剤、乳化剤、化粧品、研究用試薬、衛生用品又は抗菌剤その他様々な用途に使用することができる。