【手続補正書】
【提出日】平成17年4月21日(2005.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】
請求項１の方法において、
前記ＳＵＭＯ分子は配列ＩＤ番号：６４から成るものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
請求項１２の方法において、
前記ＳＵＭＯ分子は配列ＩＤ番号：６４から成るものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
可変性Ｈｉｓ６ＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合の作成
Ｎ末端６ｈｉｓ標識ＳＵＭＯ融合ベクターは以下のように構成されている。ＰＣＲ産物は酵母Ｓｍｔ３遺伝子（１６）を鋳型として用いたプライマー、５’−ＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：４０）と５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧ−３’（配列ＩＤ番号：４１）によって製造された（Ｅｒｉｃａ  Ｊｏｈｎｓｏｎによって寄贈された）。前記ＰＣＲ断片はＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって２回消化され、次に同様に消化されたｐＥＴ２４ｄに連結された。本発明は野生型酵母ＳＵＭＯ配列の改変に利用できると言及することは重要である。前記位置２５５におけるＡヌクレオチドはＧヌクレオチドに置換され、スレオニンの代わりにアラニンをエンコードするようになる（配列ＩＤ番号：６４及び６５）。詳細なクローニング戦略は図２において提供される。前記ｐＥＴ２４ｄ  Ｈｉｓ６Ｓｍｔ３ｅＧＦＰ融合、切断部位の＋１位置に２０の異なるアミノ酸のどれかを有している、は以下のように生産された。前記ｅＧＦＰ配列は、プライマー５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＮＮＮＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号：４２）及び５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：４３）、前者のプライマーにおけるＮＮＮは２０アミノ酸の一つをエンコードしている可変コドンに対応する、を用いてテンプレートが増幅された。前記ＰＣＲ産物は精製され、ＢｓａＩとＨｉｎｄＩＩＩで２回消化され、次にそれらは同様に消化された前記ｐＥＴ２４ｄＨｉｓＳＵＭＯベクターに連結された。可変性挿入物を有するクローンからのプラスミドはそれぞれにおける新規コドンの存在を確認するために配列決定をされた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
【図１】図１はユビキチンとユビキチン様タンパク質（ＵＢＬｓ）に対する接合経路を図解した模式図である。前記"Ｃ末端加水分解酵素"列における矢印は前駆体タンパク質の切断を意味している。以前に記載された酵素のみが準備される。特有な経路における特有な酵素を記載しなかったことはその酵素の存在を否定するものではない。
【図２】図２はＳＵＭＯ融合タンパク質を発現するために使用されたクローニング戦略の略図である。このクローニング戦略において、ＢｓａＩ部位は目的ベクター内のＳＵＭＯ配列の下流に直接導入される。ＳＵＭＯとの融合として発現される前記タンパク質をエンコードする核酸配列は５’末端においてＢｓａＩ部位を導入するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された。前記ベクター及び前記ＰＣＲ産物は、ＢｓａＩ及び前記切断されたＰＣＲ産物を前記ベクターに挿入することを可能にする適切な制限酵素（Ｘｘｘと表現されている）によって切断される。
【図３】図３は大腸菌ＳＵＭＯ発現ベクターであるｐＳＵＭＯの環状地図である。（配列ＩＤ番号：３７で）提供された核酸配列は前記ＳＵＭＯエンコード領域及びマルチプルクローニングサイト（多重クローニング部位）を含む。（配列ＩＤ番号：３８で）提供されたアミノ酸配列は６ｘＨｉｓ標識ＳＵＭＯである。制限酵素はそれらの認識配列の上に示されている。前記ｐＳＵＭＯ発現ベクターはｐＥＴ−２４ｄ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を基幹として構成された。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂはクーマシー染色されたゲル及びＵＢＬｓのカルボキシ−末端と標的タンパク質のアミノ−末端との接着が発現を増加する及び／若しくは大腸菌における前記タンパク質の溶解度を増強することを明らかにするグラフデータを示している。ｐＥＴ２４ｄ大腸菌発現ベクターにコード化された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＵＢＬ−ＧＦＰ融合は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現された。発現は１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に３７゜Ｃで４時間、ＬＢ培地中で誘導された（図４Ａ）、若しくは１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に２６゜Ｃで一晩、最小培地で誘導された（図４Ｂ）。左のパネルはクーマシー染色された、総細胞内タンパク質（上段）及び可溶性タンパク質（下段）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。各ゲルの最初のレーンは分子量マーカーである。濃い色の矢印は観察されたＧＦＰ種類を意味しており、淡い色の矢印は予想されたＧＦＰ種類のサイズを意味している。右のパネルは、Ｆｌｕｏｒｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光光度計(ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ)で測定された、可溶性フラクション中のＧＦＰ蛍光存在のＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ（任意単位）（ＡＵ）における定量表示である。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂはクーマシー染色されたゲル及びＵＢＬｓのカルボキシ−末端と標的タンパク質のアミノ−末端との接着は発現を増加する及び／若しくは大腸菌における前記タンパク質の溶解度を増強することを明らかにするグラフデータを示している。ｐＥＴ２４ｄ大腸菌発現ベクターにエンコードされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＵＢＬ−ＧＦＰ融合は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現された。発現は１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に３７゜Ｃで４時間、ＬＢ培地中で誘導された（図４Ａ）、若しくは１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に２６゜Ｃで一晩、最小培地で誘導された（図４Ｂ）。左のパネルはクーマシー染色された、総細胞内タンパク質（上段）及び可溶性タンパク質（下段）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。各ゲルの最初のレーンは分子量マーカーである。濃い色の矢印は観察されたＧＦＰ種類を意味しており、淡い色の矢印は予想されたＧＦＰ種類のサイズを意味している。右のパネルは、Ｆｌｕｏｒｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光光度計(ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ)で測定された、可溶性フラクション中のＧＦＰ蛍光存在のＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ（任意単位）（ＡＵ）における定量表示である。
【図５】図５は、大腸菌におけるＳＵＭＯ融合タンパク質としてのヒトチロシンキナーゼの発現及び精製を示している、クーマシー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。チロシンキナーゼ及び前記融合タンパク質ＳＵＭＯ−ｔｙｒｏｓｉｎｅキナーゼは、ＬＢ培地若しくは最小培地（ＭＭ）において大腸菌の前記Ｒｏｓｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ菌種（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で発現された。右のパネルはＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製された、前記形質転換された大腸菌細胞からのタンパク質を示している。左のパネルは前記右のパネルと同じレーン配置であるが、１／３量のタンパク質がＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに流されている。最初のレーンにおける数字は分子量基準を意味している。
【図６】図６は大腸菌から精製されたＳＵＭＯ加水分解酵素、及びＳＵＭＯ−チロシンキナーゼ融合タンパク質の部分的な精製及び溶出を表している、クーマシー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示している。大腸菌細胞はＳＵＭＯ加水分解酵素Ｕｌｐ１若しくはＳＵＭＯ−チロシンキナーゼを発現しているベクターで形質転換され、最小培地で培養された。タンパク質は次にＮｉ−ＮＴＡ樹脂によって精製された。ＳＵＭＯ−チロシンキナーゼはさらに１００ｍＭ  ＥＤＴＡ若しくは２５０ｍＭイミダゾールでの溶出によって精製された。前記ゲルは、現在の方法は約９０％純度のＵｌｐ１タンパク質を産出すると示している。
【図７】図７はＳＵＭＯとの融合タンパク質としての肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）リガンド結合ドメインの発現に対する染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。大腸菌細胞はＳＵＭＯ−ＬＸＲ発現ベクターによって形質転換された。前記細胞は次に２０゜Ｃで一晩、若しくは３７゜Ｃで３時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された。各誘導からの総タンパク質（ＷＣ）、可溶性タンパク質（ＣＳ）、及び不溶性タンパク質（Ｉｎｓｏｌ）の１０μｇが１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの１レーン毎に流された。
【図８Ａ】図８Ａ及び８Ｂは３７゜Ｃで発現された（図８Ａ）及び２０゜Ｃで発現された（図８Ｂ）ＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰＫ２融合タンパク質の可溶性を示す、染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを表示している。ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのＳＵＭＯ−融合を発現している大腸菌細胞は０．１（レーン２〜４）、０．２５（レーン５〜７）、及び０．５（レーン８〜１０）ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された。溶解及び遠心分離の後で再懸濁されたオリジナル誘導サンプル（Ｉ）、上清（Ｓ）、及びペレット（Ｐ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。最初のレーンはＢｉｏＲａｄ低分子量マーカーである。
【図８Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは３７゜Ｃで発現された（図８Ａ）及び２０゜Ｃで発現された（図８Ｂ）ＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰＫ２融合タンパク質の可溶性を示す、染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを表示している。ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのＳＵＭＯ−融合を発現している大腸菌細胞は０．１（レーン２〜４）、０．２５（レーン５〜７）、及び０．５（レーン８〜１０）ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された。溶解及び遠心分離の後で再懸濁されたオリジナル誘導サンプル（Ｉ）、上清（Ｓ）、及びペレット（Ｐ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。最初のレーンはＢｉｏＲａｄ低分子量マーカーである。
【図９】図９は酵母細胞において発現されたＵＢＬ−ＧＦＰ融合タンパク質のウエスタンブロット（上パネル）であり、ＵＢＬ−ＧＦＰ融合タンパク質は酵母内で同時翻訳的に切断されることを示している。酵母菌種ＢＪ１９９１は硫酸銅調節性プロモーターの制御下において、Ｕｂ−ＧＦＰ、ＳＵＭＯ−ＧＦＰ、Ｕｒｍ１−ＧＦＰ、Ｈｕｂ１−ＧＦＰ、Ｒｕｂ１−ＧＦＰ、Ａｐｇ８−ＧＦＰ、Ａｐｇ１２−ＧＦＰ若しくはＩＳＧ１５−ＧＦＰを発現しているベクターで形質転換された。総細胞抽出物は前記細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーで煮沸し、粘性を減らすためにこのサンプルを簡単にソニケーションすることによって準備された。総酵母タンパク質の２０μｇは１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥミニゲルに供され、抗ＧＦＰウサギポリクローナル抗体及び二次ＨＲＰ−結合抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。矢印は非融合ＧＦＰのサイズを意味している。同一のゲル（下パネル）は全てのサンプルからのタンパク質が等量流されていることを確認するために平行して流され、クーマシーで染色された。
【図１０】図１０はＳＵＭＯ−ＧＦＰ融合は酵母生成新規アミノ終端において同時翻訳的に切断されることを示している一連のウエスタンブロットである。ＳＵＭＯのＣ−末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列に続くＧＦＰの最初のアミノ酸としてのメチオニンに加えて、我々は酵母ＳＵＭＯ−（Ｘ）２０−ＧＦＰ発現ベクターにおける、ＧＦＰの前記アミノ−末端残基を残りの１９アミノ酸で設計した。ＧＦＰ融合タンパク質の２０アミノ−末端変異体を含む全ての発現ベクターは銅誘導性プロモーターの制御下で酵母において発現された。酵母溶菌液はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。前記"非融合−ＧＦＰ"レーンはＳＵＭＯ融合のないＧＦＰのみの発現を表している。前記"ＳＵＭＯ−ＧＦＰ"レーンは細菌的に発現したＳＵＭＯ−ＧＦＰである。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び１１Ｂはｇｐ６７分泌シグナルも含むＳＵＭＯ（図１１Ａ）及びユビキチン（図１１Ｂ）ＧＦＰ融合タンパク質の略図である。構成体Ｅにおいて、非融合ＧＦＰタンパク質のみ発現されている。構成体Ｇにおいて、ｇｐ６７からの７ＫＤａ分泌配列がＧＦＰのＮ終端に接着された。構成体Ｓ及びＵにおいて、ＳＵＭＯ及びユビキチン配列はそれぞれにＧＦＰのＮ終端の枠に挿入される。構成体ＧＳ及びＧＵにおいて、ｇｐ６７配列の後ＳＵＭＯ及びユビキチンがそれぞれ続き、次にＧＦＰが続く。構成体ＳＧ及びＵＧにおいて、ｇｐ６７配列は、それぞれＳＵＭＯ及びユビキチンのＣ終端とＧＦＰのＮ終端の間に挿入される。
【図１１Ｂ】図１１Ａ及び１１Ｂはｇｐ６７分泌シグナルも含むＳＵＭＯ（図１１Ａ）及びユビキチン（図１１Ｂ）ＧＦＰ融合タンパク質の略図である。構成体Ｅにおいて、非融合ＧＦＰタンパク質のみ発現されている。構成体Ｇにおいて、ｇｐ６７からの７ＫＤａ分泌配列がＧＦＰのＮ終端に接着された。構成体Ｓ及びＵにおいて、ＳＵＭＯ及びユビキチン配列はそれぞれにＧＦＰのＮ終端の枠に挿入される。構成体ＧＳ及びＧＵにおいて、ｇｐ６７配列はＳＵＭＯ及びユビキチンのそれぞれに続き、次にＧＦＰが続く。構成体ＳＧ及びＵＧにおいて、ｇｐ６７配列は、それぞれＳＵＭＯ及びユビキチンのＣ終端とＧＦＰのＮ終端の間に挿入される。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び１２Ｂは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードした組換えバキュロウイルスによって感染された。感染後２４時間において、等量の細胞溶解液（図１２Ａ）及び培地（図１２Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。レーンマーカー：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ‐ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰであり、ｅＧＦＰはポジティブコントロールである。
【図１２Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードした組換えバキュロウイルスで感染された。感染後２４時間において、等量の細胞溶解液（図１２Ａ）及び培地（図１２Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットによって解析された。レーンマーカー：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰであり、ｅＧＦＰはポジティブコントロールである。
【図１３Ａ】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードしている組換えバキュロウイルスで感染された。感染後４８時間において、等量の細胞溶解液（図１３Ａ及び１３Ｃ）及び培地（図１３Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットで解析された。レーンは：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｓ−ＰはＳＵＭＯ−プロリン−ＧＦＰである。
【図１３Ｂ】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードしている組換えバキュロウイルスで感染された。感染後４８時間において、等量の細胞溶解液（図１３Ａ及び１３Ｃ）及び培地（図１３Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットで解析された。レーンは：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｓ−ＰはＳＵＭＯ−プロリン−ＧＦＰである。
【図１３Ｃ】図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃは昆虫細胞におけるＳＵＭＯ及びユビキチン融合タンパク質の発現を示しているウエスタンブロットである。Ｈｉ−ｆｉｖｅ昆虫細胞はＳＵＭＯ若しくはユビキチン融合タンパク質をエンコードしている組換えバキュロウイルスで感染された。感染後４８時間において、等量の細胞溶解液（図１３Ａ及び１３Ｃ）及び培地（図１３Ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットで解析された。レーンは：Ｈｉ５はＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞、ＥはｅＧＦＰ、Ｇはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｕはユビキチン−ｅＧＦＰ、ＳはＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＧＵはｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＵＧはユビキチン−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、ＧＳはｇｐ６７−ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ、ＳＧはＳＵＭＯ−ｇｐ６７−ｅＧＦＰ、Ｓ−ＰはＳＵＭＯ−プロリン−ＧＦＰである。
【図１４】図１４は異なるｅＧＦＰ融合バキュロウイルスで感染されたＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞におけるｅＧＦＰ発現の一連の顕微鏡写真である。写真はＬｅｉｔｚ  Ｆｌｕｏｖｅｒｔ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅによって励起４８８ｎｍでＨａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  Ｃｏｏｌｅｄ  ＣＣＤカメラによって撮影された。
【図１５】図１５はＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製された、大腸菌において発現されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏＵｌｐ１切断を表した、染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを含む。前記精製されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰ融合、前記Ｕｌｐ１切断部位の＋１位置に異なるアミノ酸を含む、は３０゜Ｃで３時間、精製されたＵｌｐ１加水分解酵素と共にインキュベートされた。レーンは前記＋１アミノ酸の一文字コードを示している。ネガティブコントロール（−Ｖｅ）は３０゜Ｃで３時間、酵素の非存在下でのＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのインキュベーションである。低分子量マーカー（ＬＭＷ）も提供されている。
【図１６】図１６は一組のＵｌｐ１の様々な条件の影響を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを含む。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰは他に指示がない場合室温で１時間、指示された条件下でＵｌｐ１と共にインキュベートされた。低分子量マーカー（ＬＭＷ）も提供された。
【図１７】図１７はＵｌｐ１における様々なプロテアーゼインヒビターの影響を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＨｉｓ６ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰはＵｌｐ１及び１０ｍＭの様々なプロテアーゼインヒビターと共に、１時間室温でインキュベートされた。レーンマーカー：Ｎｏｒｍは同時に基質にＵｌｐ１とＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）が添加されたもの、Ｐｒｅは基質の添加の前にＮＥＭとのＵｌｐ１をインキュベーションしたもの、＋Ｖｅは全てのインヒビター非存在下、−ＶｅはＵｌｐ１  非存在下、レーン１はＥ−６４と共に、レーン２はＥＤＴＡと共に、レーン３はロイペプチンと共に、レーン４はＮＥＭと共に、レーン５はぺプスタチンと共に、レーン６はＴＬＣＫと共に用いたものを示している。低分子量マーカー（ＬＭＷ）も提供された。
【図１８】図１８はＭＡＰＫＡＰ２の精製及び切断を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。大腸菌はＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰ２の発現ベクターで形質転換され、３７゜Ｃで増殖、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された（レーン２〜７）、若しくは２０゜Ｃで増殖、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導された（レーン８〜１３）。細胞溶解液はＮｉ−ＮＴＡ精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。レーン１：ＢｉｏＲａｄ低分子量マーカー；レーン２と８：細胞溶解液の可溶性フラクション；レーン３と９：Ｎｉ−ＮＴＡカラムから通過したフロー；レーン４と１０：Ｎｉ−ＮＴＡカラムの１５ｍＭ  イミダゾール洗浄；レーン５と１１：Ｎｉ−ＮＴＡカラムの３００ｍｍイミダゾール溶出液；レーン６と１２：ＳＵＭＯ加水分解酵素と溶出液との３０゜Ｃ、２時間のインキュベーションの上清；レーン７と１３：加水分解酵素インキュベーションのペレット、を示している。
【図１９】図１９はｐＨ７．５及び８．０におけるＳＵＭＯ加水分解酵素機能を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。精製されたＳＵＭＯ−ＧＦＰは、ナトリウムリン酸バッファー  ｐＨ７．５（レーン１〜６）及び８．０（レーン８〜１３）中で室温において１／５０希釈されたＳＵＭＯ加水分解酵素の精製ストックを用いて切断された。切断反応時間は以下の長さ：レーン１と８：０分間、レーン２と９：１分間、レーン３と１０：２．５分間、レーン４と１１：５分間、レーン５と１２：１０分間、レーン６と１３：２０分間、である。レーン７はブランクであり、Ｍは分子量マーカーである。
【図２０】図２０はＳＵＭＯ加水分解酵素はＳＵＭＯ−β−ガラクトシダーゼを切断することを示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。精製されたＳＵＭＯ加水分解酵素はＳＵＭＯ−β−ガラクトシダーゼを生産した大腸菌と共に室温でインキュベートされ、反応時間は０分間（レーン１）、２．５分間（レーン２）、５分間（レーン３）、１０分間（レーン４）、２０分間（レーン５）である。分子量マーカーはレーンＭで提供される。
【図２１】図２１はウレア存在下におけるＳＵＭＯ加水分解酵素によるＳＵＭＯ−ＧＵＳの切断を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＳＵＭＯ−β−ＧＵＳは１／５０希釈されたＳＵＭＯ加水分解酵素の精製ストックと共に１時間、ｐＨ８．０で増加性濃度のウレアとインキュベートされた。レーンマーカー：Ｍは広範囲分子量マーカー；レーン１は可溶性大腸菌フラクションからのＳＵＭＯ−ＧＵＳ；レーン２：ニッケルカラムから通過したフロー；レーン３：洗浄液；レーン４：溶出液；レーン５〜９：様々な変性剤とＳＵＭＯ−ＧＵＳ及び加水分解酵素、特に、レーン５：なし；レーン６：１ｍＭ  ＤＴＴ；レーン７：０．５Ｍ  ウレア；レーン８：１．０Ｍ  ウレア；レーン９：２．０Ｍ  ウレア、を示している。
【図２２】図２２はＳＵＭＯ融合タンパク質の急速な分離を示している染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。Ｈｉｓ６Ｓｍｔ３と融合されたＧタンパク質からのシングルＩｇＧ結合ドメインを発現している大腸菌細胞はグアニジニウムクロライド溶解バッファーで溶解された。細胞溶解上清はＮｉ−ＮＴＡで精製され、Ｕｌｐ１による切断を可能にする未変性バッファーで溶出された。レーンマーカー：ＰＭＷは分子量マーカー；レーン１はグアニジニウムクロライド処理する前の細胞内タンパク質、レーン２はグアニジニウムクロライド細胞溶解液、レーン３はＮｉ−ＮＴＡカラムから通過したフロー、レーン４は溶出液、レーン５は溶出液のＵｌｐ１切断、を示している。
【図２３】図２３はＳＵＭＯのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２）である。
【図２４Ａ】図２４Ａ及び２４ＢはＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）である。
【図２４Ｂ】図２４Ａ及び２４ＢはＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）である。
【図２５Ａ】図２５Ａ及び２５ＢはＳＵＭＯ−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：６）である。
【図２５Ｂ】図２５Ａ及び２５ＢはＳＵＭＯ−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：６）である。
【図２６Ａ】図２６Ａ及び２６Ｂはユビキチン−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：８）である。
【図２６Ｂ】図２６Ａ及び２６Ｂはユビキチン−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：８）である。
【図２７Ａ】図２７Ａ及び２７ＢはＵＲＭ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１０）である。
【図２７Ｂ】図２７Ａ及び２７ＢはＵＲＭ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１０）である。
【図２８Ａ】図２８Ａ及び２８ＢはＨＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１２）である。
【図２８Ｂ】図２８Ａ及び２８ＢはＨＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１２）である。
【図２９Ａ】図２９Ａ及び２９ＢはＲＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１４）である。
【図２９Ｂ】図２９Ａ及び２９ＢはＲＵＢ１−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１４）である。
【図３０Ａ】図３０Ａ及び３０ＢはＡＰＧ８−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１６）である。
【図３０Ｂ】図３０Ａ及び３０ＢはＡＰＧ８−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１６）である。
【図３１Ａ】図３１Ａ及び３１ＢはＡＰＧ１２−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１８）である。
【図３１Ｂ】図３１Ａ及び３１ＢはＡＰＧ１２−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１８）である。
【図３２Ａ】図３２Ａ及び３２ＢはＩＳＧ１５−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２０）である。
【図３２Ｂ】図３２Ａ及び３２ＢはＩＳＧ１５−ＧＦＰのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２０）である。
【図３３】図３３はＳＵＭＯ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２２）である。
【図３４Ａ】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４ＣはＳＵＭＯ−β  ＧＵＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）である。
【図３４Ｂ】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４ＣはＳＵＭＯ−β  ＧＵＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）である。
【図３４Ｃ】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４ＣはＳＵＭＯ−β  ＧＵＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２３）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２４）である。
【図３５Ａ】図３５Ａ、３５Ｂ及び３５ＣはＳＵＭＯ−ＬＸＲαのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２６）である。
【図３５Ｂ】図３５Ａ、３５Ｂ及び３５ＣはＳＵＭＯ−ＬＸＲαのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２６）である。
【図３５Ｃ】図３５Ａ、３５Ｂ及び３５ＣはＳＵＭＯ−ＬＸＲαのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２５）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２６）である。
【図３６Ａ】図３６Ａ及び３６ＢはＳＵＭＯ−チロシンキナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２８）である。
【図３６Ｂ】図３６Ａ及び３６ＢはＳＵＭＯ−チロシンキナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２８）である。
【図３７Ａ】図３７Ａ及び３７ＢはＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３０）である。
【図３７Ｂ】図３７Ａ及び３７ＢはＳＵＭＯ−ＭＡＰＫＡＰ２キナーゼのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３０）である。
【図３８Ａ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｂ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｃ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｄ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３８Ｅ】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、３８Ｄ、及び３８ＥはＳＵＭＯ−β  ＧＡＬのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３１）及びヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３２）である。
【図３９】図３９はＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰの環状地図である。
【図４０Ａ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ及び４０ＦはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｂ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ及び４０ＦはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｃ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ及び４０ＦはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｄ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ及び４０ＦはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｅ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ及び４０ＦはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４０Ｆ】図４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ及び４０ＦはＹＥｐＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３３）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４１】図４１はＹＥｐＵＢＧＵＳの環状地図である。
【図４２Ａ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＵｂＧＵＳのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｂ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＵｂＧＵＳのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｃ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＵｂＧＵＳのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｄ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＵｂＧＵＳのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｅ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＵｂＧＵＳのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｆ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＵｂＧＵＳのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４２Ｇ】図４２Ａ、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｆ、及び４２ＧはＹＥｐＵｂＧＵＳのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３４）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４３】図４３はｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰの環状地図である。
【図４４Ａ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｂ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｃ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｄ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４４Ｅ】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃ、４４Ｄ、及び４４ＥはｐＦａｓｔＢａｃ  ＳＵＭＯ−ｅＧＦＰのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３５）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４５】図４５はｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）の環状地図である。
【図４６Ａ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｂ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｃ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｄ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。
【図４６Ｅ】図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄ、及び４６ＥはｐＳＵＭＯ（ｐＥＴ２４ｄ６ＨｉｓｘＳＵＭＯ）のヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：３６）である。選択制限酵素部位が表示されている。