(57)【要約】  全長ＯＰＮを認識せずに、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのみを認識する抗体およびその用途を提供することを目的とする。Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲ（配列番号１）であるタンパク質またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体および前記抗体を利用したＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの測定方法、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと関連する疾患の診断方法、重篤度の判定方法、治療方法を提供する。
2008032712.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲ（配列番号１）であるタンパク質またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲ（配列番号１）であるタンパク質またはポリペプチドが、トロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントであり、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドが、オステオポンチンである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
トロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントと、α９インテグリンまたはα４インテグリンとの結合を阻害するものである請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ヒト、ブタ、サル、ハムスター、イヌ、マウスまたはラットのトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントを認識するものである請求項１ないし３の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む第１の試薬と、前記第１の試薬に含まれるモノクローナル抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントを認識する抗体を含む第２の試薬とを含有することを特徴とするトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントの測定キット。
【請求項６】
関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別するものである請求項５に記載の測定キット。
【請求項７】
変形性関節炎の重篤度を判定するものである請求項５に記載の測定キット。
【請求項８】
検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントを、請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体で測定することを特徴とするトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントの測定方法。
【請求項９】
請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量を測定し、その量を指標として関節リウマチを診断する方法。
【請求項１０】
検体が尿である請求項９に記載の関節リウマチを診断する方法。
【請求項１１】
請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量を測定し、その量を指標として関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。  
【請求項１２】
更に、検体中のオステオポンチン量を測定し、トロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量とオステオポンチン量に対するトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量の比率を指標とするものである請求項１１に記載の関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。
【請求項１３】
検体が関節液である請求項１１または１２に記載の関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法。
【請求項１４】
請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量を測定し、その量を指標として変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
【請求項１５】
更に、検体中のオステオポンチン量を測定し、トロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量とオステオポンチン量に対するトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量の比率を指標とするものである請求項１４に記載の変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
【請求項１６】
検体が関節液である請求項１４または１５に記載の変形性関節炎の重篤度を判定する方法。
【請求項１７】
請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする炎症性疾患治療剤。
【請求項１８】
炎症性疾患が、肝炎である請求項１７に記載の炎症性疾患治療剤。
【請求項１９】
肝細胞の壊死を抑制するものである請求項１８に記載の炎症性疾患治療剤。
【請求項２０】
炎症性疾患患者に、請求項１７ないし１９の何れかに記載の炎症性疾患治療剤を投与することを特徴とする炎症性疾患の治療方法。
【請求項２１】
請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤。
【請求項２２】
自己免疫疾患が、リウマチである請求項２１に記載の自己免疫疾患治療剤。
【請求項２３】
自己免疫疾患患者に、請求項２１または２２に記載の自己免疫疾患治療剤を投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
【請求項２４】
タグと共に発現させた目的タンパク質を、タグを認識する抗体を用いて検出・精製する目的タンパク質の検出・精製方法において、タグとしてＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲ（配列番号１）であるタンパク質またはポリペプチドを用い、タグを認識する抗体として請求項１ないし４の何れかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする目的タンパク質の検出・精製方法。
【請求項２５】
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲ（配列番号１）であるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ末端に特定のアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
オステオポンチン（以下、「ＯＰＮ」という）は、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖タンパク質であり、成熟体ＯＰＮは生体内のトロンビンにより切断されて、ＯＰＮのＮ末端フラグメント（以下、「ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ」という）およびＣ末端フラグメント（以下、「ＯＰＮ  Ｃ−ｈａｌｆ」という）の２つになる。例えば、ヒトオステオポンチン（以下、「ｈＯＰＮ」という）であれば、ｈＯＰＮのアミノ酸配列の１６８番目のアルギニン残基のＣ末端側で切断されて、ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆとｈＯＰＮ  Ｃ−ｈａｌｆの２つになる。【０００３】
上記ＯＰＮは、多種の生理学的病理学的に重要な機能を担っており、例えば、細胞接着、細胞遊走、腫瘍形成、免疫応答および補体が媒介する細胞溶解の阻害等の機能を持っている。この多様な機能は、多種の細胞表面受容体により媒介されている。トロンビンにより切断されたＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆは、Ｃ末端側にＳＶＶＹＧＬＲ配列を露出し、この配列を介してα９およびα４インテグリンと結合することが明らかにされている。【０００４】
本出願人らはこれまでＯＰＮの生体内における機能を研究し、その結果、上記ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと各種疾患の関連を徐々に明らかにしてきている。例えば、本出願人による国際特許出願（特許文献１）ではリウマチ患者において全ＯＰＮに占めるＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの割合が増大することを報告している。【０００５】
このようにＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと疾患との関連は徐々に明らかになってきているが、その他疾患との関連を更に明らかにするためにも、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを正確に測定することは重要であった。しかし、上記国際特許出願で本出願人らが報告している２Ｋ１抗体は、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末側に認識領域をもつものの、トロンビンにより切断されていないＯＰＮも認識するため、条件によってはＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを正確に測定しているとは言い難かった。【０００６】
また、上記ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆはＯＰＮのトロンビンによる切断によりＳＶＶＹＧＬＲ配列を露出し、この配列を介してα９およびα４インテグリンと結合するという事実から、この結合を効果的に阻害するためには前記配列の少なくとも一部と特異的に結合する抗体が必要であった。
【特許文献１】ＷＯ０２／０８１５２２国際公開パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は全長ＯＰＮを認識せずに、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのみを認識する抗体の提供およびこの抗体を利用してＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを正確に測定する方法等を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究をした結果、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として得られた、Ｃ末端に特定のアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体が、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
また、本発明者らは、このモノクローナル抗体を利用すれば、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを正確に測定できることを見出した。更に、前記抗体は、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと関連する疾患の診断や重篤度の判定、治療等に利用可能なことを見出した。更にまた、前記抗体は、Ｃ末端が前記アミノ酸配列であるタンパク質またはポリペプチドを認識するので、前記タンパク質またはポリペプチドをタグとすれば目的タンパク質の検出・精製等に利用可能なことを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明はＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲ（配列番号１）であるタンパク質またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体である。【００１１】
また、本発明は前記モノクローナル抗体を含む第１の試薬と、前記第１の試薬に含まれるモノクローナル抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントを認識する抗体を含む第２の試薬とを含有することを特徴とするトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントの測定キットである。【００１２】
更に、本発明は検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントを、前記モノクローナル抗体で測定することを特徴とするトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメントの測定方法である。【００１３】
また更に、本発明は前記モノクローナル抗体を用いて、検体中のトロンビンで切断されたオステオポンチンのＮ末端フラグメント量を測定し、その量を指標として関節リウマチを診断する方法、関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別する方法または変形性関節炎の重篤度を判定する方法である。【００１４】
更にまた、本発明は前記モノクローナル抗体を有効成分とする炎症性疾患治療剤および炎症性疾患患者に前記炎症性疾患治療剤を投与することを特徴とする炎症性疾患の治療方法である。【００１５】
また、本発明は前記モノクローナル抗体を有効成分とする自己免疫疾患の治療剤および自己免疫疾患患者に前記自己免疫疾患の治療剤を投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法である。【００１６】
更に、本発明はタグと共に発現させた目的タンパク質を、タグを認識する抗体を用いて検出・精製する目的タンパク質の検出・精製方法において、タグとしてＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドを用い、タグを認識する抗体として前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とする目的タンパク質の検出・精製方法である。【００１７】
また更に、本発明は目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクターである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｃ末端に特定のアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを特異的に認識するので、Ｃ末端が前記アミノ酸配列であるＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを認識し、前記アミノ酸配列をＣ末端以外に有するＯＰＮを実質的に認識しない抗体である。【００１９】
従って、このモノクローナル抗体は、このモノクローナル抗体が認識するＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの正確な測定、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと関連する疾患の診断や重篤度の判定、治療、前記抗体と特異的に結合するアミノ酸配列をタグとした目的タンパク質の検出・精製等に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体（以下、「本発明抗体」という）は、Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲ（配列番号１）であるタンパク質またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないことを特徴とするものである。なお、本発明抗体がアミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないとは、本発明抗体が前記タンパク質またはポリペプチドに結合する割合が１.０質量％（以下、単に「％」という）以下、好ましくは０〜０.５％であることをいう。【００２１】
本発明抗体は、上記特徴を有するものであれば、その作製法は特に限定されない。具体的に本発明抗体は、Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドを抗原とし、これを動物に免疫を行い、当該動物から抗体を採取した後、Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチド、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチド等を利用してスクリーニングすることにより得られる。以下に本発明抗体の作製法を詳細に説明する。【００２２】
上記抗原として用いるＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドとしては、特に制限されないが、例えば、Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端からＮ末端側へ  ４〜１０個程度、好ましくは、５〜７個程度連続したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。具体的なポリペプチドとしては、ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端からＮ末端側へ７つ連続したアミノ酸配列ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２）からなるポリペプチド（以下、「ｈＯＰＮ−７ペプチド」という）が挙げられる。このｈＯＰＮ−７ペプチドはｈＯＰＮのアミノ酸配列（配列番号３）の１６２番目から１６８番目に一致する。なお、ｈＯＰＮのアミノ酸配列としては、アクセッションナンバーＢＡＡ０３５５４、ＡＡＣ２８６１９等のものがＰｕｂｍｅｄ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed）等から参照できるが、本発明においてはＢＡＡ０３５５４のものをｈＯＰＮのアミノ酸配列として使用した。また、前記ポリペプチドには抗原性を高めるために生体高分子化合物を結合させ結合物とし、これを抗原とすることが好ましい。更に、この場合には前記ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸にシスティン（Ｃ）を付けて結合させることが好ましい。【００２３】
抗原に用いられるＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドは、特に限定されることなく種々の方法で得ることができる。このうちポリペプチドは、例えば、当業界で公知の方法により合成してもよいし、シンペップ社（Synpep  Corporation）およびタナ社（TANA  Laboratories,  USA）等から合成品を購入することもできる。【００２４】
上記ポリペプチドに結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」という）、サイログロブリン等が挙げられ、このうちＫＬＨおよびサイログロブリンが好ましい。【００２５】
上記ポリペプチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（B.  F.  Er  langer,  et al.  :J.  Biol.  Chem.  234  1090-1094(1954)）または活性化エステル法（A.  E.  KARU,  et  al.  :J.  Agric.  Food  Chem.  42  301-309(1994)）等の公知の方法によって行うことができる。【００２６】
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、上記ポリペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするポリペプチドと生体高分子化合物との結合物が作成される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。【００２７】
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。【００２８】
また、上記反応は通常−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から２時間である。【００２９】
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常−２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。【００３０】
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、上記ポリペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。【００３１】
当該反応に用いられるカップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するポリペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。【００３２】
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基と上記ペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。【００３３】
上記いずれかの方法により得られた反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。【００３４】
次に、上記のようにして得られた結合物を抗原として用いた本発明抗体（モノクローナル抗体）の製造方法について説明する。なお、抗体の調製にあたっては、抗原として結合物を用いる以外は、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。【００３５】
上記結合物を抗原とした具体的な免疫方法としては、まず、結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合し、これを抗原として動物を免疫する。【００３６】
免疫される動物としては当該分野で常用されたものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の哺乳動物を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。【００３７】
最後に、常法に従い、上記の免疫を行った動物から得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。そして、その抗体をＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチド等を利用してスクリーニングすることによって本発明抗体を得ることができる。具体的なスクリーニング法としては、まず、Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドと結合する抗体を採取し、次いで、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドと実質的に結合しない抗体を採取する方法等が挙げられる。Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドとしてはヒト、マウス、ラット等のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ等のタンパク質またはＹＧＬＲ（配列番号１）、ＶＹＧＬＲ（配列番号１７）等のポリペプチドが挙げられる。また、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドとしては、ヒト、マウス、ラット等のＯＰＮ等のタンパク質またはＶＹＧＬ（配列番号１８）、ＳＶＶＹＧＬ（配列番号１９）、ＳＶＶＹＧ（配列番号２０）等のポリペプチドが挙げられる。【００３８】
斯くして得られる本発明抗体はＣ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドを認識し、アミノ酸配列ＹＧＬＲをＣ末端以外に有するタンパク質またはポリペプチドを実質的に認識しないものである。そしてこの抗体はポリペプチドまたはタンパク質のＣ末端がＹＧＬＲのもののみを認識するので、このアミノ酸配列をＣ末端に有するｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ等を認識することができる。一方、この抗体は前記アミノ酸配列をＣ末端以外に有するトロンビンで切断されていないｈＯＰＮは認識することができない。また、アミノ酸配列ＹＧＬＲはα９β１、α４β１、α４β７等のα９インテグリンまたはα４インテグリンが認識するアミノ酸配列ＳＶＶＹＧＬＲに含まれているため、この本発明抗体はＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆとα９インテグリンまたはα４インテグリンとの結合を阻害することができる。更に、本発明抗体は、その認識部位がＹＧＬＲであることから、このアミノ酸配列がＣ末端にあるブタ（アクセッションナンバー：Ｐ１４２８７）、サル（ＸＰ＿００１０９３３０７）、ハムスター（ＣＡＩ６５４０７）、イヌ（ＡＢＡ４０７５８）マウス（ＡＡＡ５７２６５等）、ラット（ＢＡＡ１９２４７等）のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆも認識することができる。【００３９】
本発明抗体は上記したようにＯＰＮ Ｎ−ｈａｌｆとα９インテグリンまたはα４インテグリンとの結合を阻害することができる。これらのインテグリンは、炎症反応に関与していることから、インテグリン活性を阻害する薬剤は、潜在的には抗炎症作用を有していると考えられている。従って、本発明抗体は、リウマチ、肝炎、関節炎等の炎症性疾患の治療に有効である。【００４０】
なお、本発明抗体は以下の実施例で示すように、コンカナバリンＡ（以下、「ＣｏｎＡ」という）誘導性肝炎において、肝細胞の壊死を抑制し、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）値の上昇を抑制することができる。従って、本発明抗体は特に肝炎の治療剤とすることが好ましい。【００４１】
また、リウマチの炎症にはインテグリンが協同的に関与していると考えられるので、これらのインテグリンとＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの結合を幅広く遮断する本発明抗体はリウマチやそれ以外の自己免疫疾患の症状の憎悪を抑えることができる。従って、本発明抗体を有効成分とすることでリウマチ性関節炎・若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチ、乾癬性関節炎・乾癬等の治療、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療剤とすることができる。【００４２】
本発明抗体を上記治療剤とするには、本発明抗体を必要によりさらに精製し、その後、常法に従って製剤化すればよい。この治療剤の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、これらは静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。上記製剤化に当たっての本発明抗体の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは本発明抗体の結合力価等により異なるが、例えば０.１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度である。【００４３】
更に、本発明抗体は必要により標識または固相化することにより免疫学的測定法に利用することができる。【００４４】
本発明抗体の標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質等の標識物質と本発明抗体とを常法で結合させることにより行われる。【００４５】
また、本発明抗体の固相化は適切な固相に本発明抗体を結合させることにより行われる。固相としては、免疫化学的測定法において慣用される固相の何れをも使用することができ、例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレート、アミノ基結合型のマイクロタイタープレート等のプレートや、各種のビーズ類が挙げられる。本発明抗体を固相に結合させるには、例えば、本発明抗体を含む緩衝液を固相上に加え、インキュベーションすればよい。【００４６】
更に、本発明抗体は、本発明抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断されたＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを認識する抗体（以下、「ＯＰＮ−１抗体」という）と組み合わせることにより、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを正確に測定することができる。【００４７】
このような本発明抗体と認識部位が異なり、かつ、トロンビンで切断されたＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを認識する抗体としては、例えば、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの全部または１部を抗原とし、常法により得ることができるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が利用できる。【００４８】
上記抗原として用いるＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの全部または１部としては、特に制限されないが、例えば、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＮ末端側のアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは前記アミノ酸配列中、５〜３０個程度、好ましくは１０〜２０個程度連続したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このポリペプチドは、測定対象となるＯＰＮまたはＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの由来となる動物に併せて適宜選択すればよく、例えば、測定対象がｈＯＰＮであればｈＯＰＮのアミノ酸配列（配列番号３）の１７〜３１番目に該当するｈＯＰＮ−１ペプチド、マウスＯＰＮ（以下、「ｍＯＰＮ」という）であればｍＯＰＮのアミノ酸配列（配列番号４）の１７〜３２番目に該当するｍＯＰＮ−１ペプチド、ラットＯＰＮ（以下、「ｒＯＰＮ」という）であればｒＯＰＮのアミノ酸配列（配列番号５）の１７〜３３番目に該当するｒＯＰＮ−１ペプチド等が挙げられる。なお、ｍＯＰＮのアミノ配列としては、アクセッションナンバーＡＡＡ５７２６５、ＡＡＨ０２１１３、ＡＡＨ５７８５８、ＡＡＨ８０７２０、ＣＡＡ３６１３２およびＮＰ０３３２８９のものがＰｕｂｍｅｄから参照できるが、本発明においてはＡＡＡ５７２６５を使用した。また、ｒＯＰＮのアミノ酸配列としてもＡＡＨ７８８７４およびＢＡＡ１９２４７のものがＰｕｂｍｅｄから参照できるが、本発明においてはＢＡＡ１９２４７のものを使用した。【００４９】
ｈＯＰＮ−１ペプチド：ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱ（配列番号６）
ｍＯＰＮ−１ペプチド：ＬＰＶＫＶＴＤＳＧＳＳＥＥＫＬＹ（配列番号７）
ｒＯＰＮ−１ペプチド：ＬＰＶＫＶＡＥＦＧＳＳＥＥＫＡＨＹ（配列番号８）【００５０】
また、上記ペプチドを用いてＯＰＮ−１抗体を作製する場合、抗原として前記本発明抗体の作製方法と同様に、上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物を利用しても良い。この上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物は、上記ペプチドのＣ末端側のアミノ酸に、例えばリジン・システィン（ＫＣ）を付けて結合させることが好ましい。【００５１】
上記のようなＯＰＮ−１抗体としては株式会社免疫生物研究所から市販されている下記のものを利用することもできる。
Anti-Mouse  Osteopontin  (O-17)  Rabbit  IgG  Affinity  Purify
（製品番号：18621）
Anti-Human  Osteopontin  (O-17)  Rabbit  IgG  Affinity  Purify
（製品番号：18625）
Anti-Rat  Osteopontin  (O-17)  Rabbit  IgG  Affinity  Purify
（製品番号：18628）【００５２】
本発明抗体とＯＰＮ−１抗体とを用いたＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの具体的な測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E.  Engvall  et  al.,  (1980):  Methods  in  Enzymol.,  70,  419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、イムノクロマト法等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。【００５３】
これらの測定方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より具体的な、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。【００５４】
まず、工程（Ａ）として、本発明抗体を担体に固相化し、次いで、工程（Ｂ）として、抗体が固相化されていない担体表面をＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと無関係な、例えばタンパク質等によりブロッキングする。更に、工程（Ｃ）として、これに各種濃度のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを含む検体を加え、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと本発明抗体との複合体を生成させた後、工程（Ｄ）として、標識したＯＰＮ−１抗体を加え、これにＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆと抗体との複合体を結合させ、最後に工程（Ｅ）として、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの量を決定することができる。なお、工程（Ａ）と工程（Ｄ）に用いる抗体は逆の場合でも測定が可能であるが、本発明抗体を固相化した方が検出感度の点から好ましい。【００５５】
具体的に工程（Ａ）において、本発明抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、上記抗体を固相化させるには、例えば、上記抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の上記抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１〜２０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。【００５６】
また、工程（Ｂ）のブロッキングは、工程（Ａ）で本発明抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液や、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することができる。具体的なブロッキングは、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。【００５７】
更に、工程（Ｃ）において、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを含む検体を固相化した本発明抗体と接触させ、この固相化した本発明抗体でＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを捕捉し、固相化した本発明抗体とＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆとの複合体を生成させる。この複合体を生成させるための条件は限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間〜１晩の反応を行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.２）および０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。【００５８】
また更に、工程（Ｄ）において、固相化した本発明抗体に捕捉されたＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆに、常法により西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質等の標識物質で標識したＯＰＮ−１抗体を加え、固相化した本発明抗体−ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ−標識したＯＰＮ−１抗体の複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識したＯＰＮ−１抗体の量は、固相化した本発明抗体に対して約５,０００〜１０,０００倍、好ましくは最終吸光度が１.５〜２.０となるように希釈された量である。希釈には緩衝液を用いることができ、反応条件は特に限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、固相化した本発明抗体−ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ−標識したＯＰＮ−１抗体の複合体を形成させることができる。【００５９】
最後に工程（Ｅ）において、ＯＰＮ−１抗体の標識に用いた標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの量を算出することができる。【００６０】
標識抗体の標識物質として、西洋わさびペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応の条件は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約３０分間反応させた後、１〜２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させることにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物質として、アルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２Ｎの水酸化ナトリウムを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの濃度を算出することもできる。【００６１】
上記で説明したＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの測定方法を実施するには、本発明抗体を含む第１の試薬と、ＯＰＮ−１抗体を含む第２の試薬とを含有することを特徴とするＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの測定キット（以下、「本発明キット」という）を利用することが好ましい。【００６２】
なお、本発明キットは常法により作製することができる。具体的には、本発明抗体またはＯＰＮ−１抗体のいずれかを標識抗体とし、他に、希釈用緩衝液、標準物質、基質用緩衝液、停止液、洗浄液等を組み合わせればよい。【００６３】
上記の測定方法や測定キットを利用することにより、血漿、血清、尿、関節液等の検体中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを正確に測定することができる。【００６４】
また、上記の測定方法や測定キットを利用して上記検体中、特に尿中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを測定し、その量を指標とすれば、関節リウマチを診断することができる。具体的には、まず、複数名の健常者または関節リウマチ患者の尿を採取し、上記の測定方法や測定キットを利用してＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度を測定し、その平均値を算出しておく。次に、被験者の尿中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度を測定し、その値が健常者の平均値よりも有意に高い（例えば、１５００ｐＭ以上）場合または関節リウマチ患者の平均値より有意に低い値（例えば、１５００ｐＭ未満）でない場合には、その被験者が関節リウマチであると診断することができる。【００６５】
更に、上記の測定方法や測定キットを利用して上記検体中、特に関節液中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを測定し、その量を指標とすれば、関節リウマチと変形性関節炎とを鑑別することができる。具体的には、まず、複数名の変形性関節炎患者または関節リウマチ患者の膝関節液を採取し、上記の測定方法や測定キットを利用してＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度を測定し、その平均値を算出しておく。次に、被験者のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度を測定し、その値が変形性関節炎患者の平均値よりも有意に高い（例えば、２００ｐＭ以上）場合または関節リウマチ患者の平均値より有意に低い値（例えば、２００ｐＭ未満）でない場合には、その被験者が関節リウマチであると診断することができる。また、この鑑別においては、関節液中のＯＰＮ濃度を測定し、これから全ＯＰＮ（ＯＰＮとＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ）に対するＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの比率を算出し、この結果と併せて鑑別しても良い。具体的に、本実施例においては、関節液中の全ＯＰＮに対するＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの比率が、８.５２％以上であればその被験者が関節リウマチであると診断することができる。なお、関節液中のＯＰＮ濃度は、市販のＯＰＮ測定キット（例えば、Human  Osteopontin  Assay  Kit  (L)  -  IBL（株式会社免疫生物研究所製（製品番号：27158）））等を利用して測定することができる。【００６６】
また更に、関節液中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの量は、変形性関節炎のグレードと相関が認められるので、これを指標とすれば、上記鑑別の他に、変形性関節炎の重篤度を判定することもできる。具体的に関節液中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの量は、軽度よりも中等度、重度で高値（軽度は平均値５５．０ｐＭに対し、中等度では１６３．９ｐＭおよび重度では１４２．２ｐＭの平均値）を示す。また、関節液中の全ＯＰＮ（ＯＰＮとＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ）に対するＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの比率も変形性関節炎のグレードと相関が認められるので、この結果と併せて変形性関節炎の重篤度を判定しても良い。具体的に、本実施例においては、関節液中の全ＯＰＮに対するＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの比率が、０.９３％以下であればその被験者が変形性関節炎の軽度であり、１.８１％以上であればその被験者が変形性関節炎の中等度あるいは重度であると判定することができる。【００６７】
本発明抗体はＣ末端がアミノ酸配列ＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドを特異的に認識するので、前記抗体が認識するタンパク質またはポリペプチドを、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ等の周知のタグと同様にして目的タンパク質の検出・精製等に用いることができる。【００６８】
具体的に、目的タンパク質の検出であれば、まず、Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、検出の対象となる目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを常法により作製し、これらをベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。次に、この組換えベクターを用いて周知のタンパク質発現系で目的タンパク質とＣ末端がアミノ酸配列ＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドとを含む組換えタンパク質を発現させる。最後に、この組換えタンパク質を常法により標識した本発明抗体で検出する。【００６９】
上記目的タンパク質の検出に用いられるベクターとしては、タンパク質発現系が小麦胚芽抽出液を用いた無細胞合成系であればｐＥＵベクター等が挙げられる。この場合、ベクターは目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端に、Ｃ末端のアミノ酸配列がＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを結合させたものを挿入したものが好ましく、また、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端にＳＰ６等のプロモーターを挿入したものが好ましい。【００７０】
また、上記目的タンパク質の検出に用いられるベクターとしては、タンパク質発現系が    大腸菌等を用いた細胞合成系であればｐＧＥＸベクター、ｐＱＥベクター等が挙げられる。【００７１】
一方、目的タンパク質の精製であれば、上記と同様にして周知のタンパク質発現系で目的タンパク質とＣ末端がアミノ酸配列ＹＧＬＲであるタンパク質またはポリペプチドとを含む組換えタンパク質を発現させ、これを担体に固定化した本発明抗体に結合させる。次に、これを０.１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ２.５）等により結合を解離させ、組換えタンパク質を精製する。【００７２】
上記目的タンパク質の精製において本発明抗体を固定化する担体としてはホルミルセルロファイン（生化学工業株式会社製）が挙げられ、また、固定化方法としてはアミノ基を利用する方法が挙げられる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。また当業者は、本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができるが、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。【００７４】
参  考  例  １
抗原用ポリペプチドの入手：
抗原用ポリペプチドとして、下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ａ）〜（ｃ）のＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をシンペップ社（Synpep  Corporation）、タナ社（TANA  Laboratories,  USA）およびオースペップ社(Auspep)より購入した。なお、ポリペプチド（ａ）はｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端のアミノ酸からＮ末端側に連続したアミノ酸配列からなるアミノ酸配列（ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのアミノ酸配列の１６２〜１６８番目に該当するアミノ酸配列（以下、この配列を有するポリペプチドを「ｈＯＰＮ−７ペプチド」という））にシスティン（Ｃ）を付けたものである。また、ポリペプチド（ｂ）はｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのアミノ酸配列の１７〜３１番目に該当するアミノ酸配列にシスティン（Ｃ）を付けたものである。更に、ポリペプチド（ｃ）は全長ｈＯＰＮのアミノ酸配列の１５３〜１６９番目に該当するアミノ酸配列にシスティン（Ｃ）を付けたものである。
ポリペプチド（ａ）：ＣＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号９）
ポリペプチド（ｂ）：ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ（配列番号１０）
ポリペプチド（ｃ）：ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ（配列番号１１）【００７５】
参  考  例  ２
免疫用抗原の作製：
上記の各ポリペプチドとサイログロブリンとの結合物をＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法により、以下のようにして作製した。なお、結合物を作るにあたり、サイログロブリンとポリペプチドとＥＭＣＳのモル比はそれぞれ１：３００：４００とした。【００７６】
まず、実施例１の各ポリペプチド４ｍｇを、それぞれ約１ｍｌの蒸留水に溶解した。一方、１ｍｌの０.０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.０）に５ｍｇのサイログロブリンを溶解したものと、ジメチルホルムアミドで溶解したＥＭＣＳ８０ｍｇ／ｍｌとをそれぞれ上述モル相当量になるように混合し、サイログロブリン−ＥＭＣＳ複合体溶液を作成した。この複合体溶液を３つに分け、その各々にそれぞれのポリペプチド溶液を上述モル相当量加えることにより、ＥＭＣＳで架橋されたポリペプチドとサイクログロブリンとの結合物溶液を作製した。【００７７】
この結合物溶液を、ＰＢＳを用いて透析し、結合物として１０ｍｇ／ｍｌになるように濃度を調製した。このようにして得られた上記の各ポリペプチドとサイログロブリンとの結合物を免疫用抗原として以下の実施例および参考例に用いた。【００７８】
実  施  例  １
モノクローナル抗体の作製：
免疫用抗原として、実施例２において得られたポリペプチド（ａ）とサイログロブリンとの結合物を用い、これを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。マウスに４回免疫を行った後、免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（Ｊ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ.  １４６：３７２１−３７２８）記載の方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化したポリペプチド（ａ）に反応する細胞を選択することにより行い、その結果、３９Ｅ１と３４Ｅ３というハイブリドーマを得た。【００７９】
上記のようにして選択したハイブリドーマのそれぞれを無血清培地であるＧＩＴ培地（和光純薬）中で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。次いでこの培地から遠心（１,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウムの５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）により回収した。更にこの沈殿を、２倍に希釈したバインディングバッファー（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＭＡＰＳ  ＩＩｋｉｔ製）に溶解させた後、プロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に通してＩｇＧを吸着させた。その後、このカラムにＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製し、ヒトＯＰＮ Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端を含むポリペプチドを認識する抗体をそれぞれのハイブリドーマから得た。そしてこれらの抗体を３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体と名付けた。なお、モノクローナル抗体３４Ｅ３抗体を産生するハイブリドーマ（Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ．  ３４Ｅ３）については、平成１８年７月１１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９７として国際寄託した（平成１８年７月１１日付で上記センターに国内寄託したＦＥＲＭ  Ｐ−２０９５７より移管）。【００８０】
参  考  例  ３
ポリクローナル抗体の作製（１）：
免疫用抗原として、実施例２において得られたポリペプチド（ｂ）とサイログロブリンとの結合物を用い、１週間、または２週間おきに結合物溶液の５０μｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）を投与し、ウサギを免疫化した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。その後、全採血を行い１，５００ｒｐｍで１５分間の遠心により抗血清を分離し、ウサギポリクローナル抗体（以下、この抗体を「ｈＯＰＮ−１抗体」という）を得た。【００８１】
参  考  例  ４
ポリクローナル抗体の作製（２）：
免疫用抗原として、実施例２において得られたポリペプチド（ｃ）とサイログロブリンとの結合物を用い、免疫化する動物としてマウスを用いる以外は参考例３と同様にしてマウスポリクローナル抗体（以下、この抗体を「ｈＯＰＮ−５抗体」という）を得た。【００８２】
参  考  例  ５
ＯＰＮの作製：
ｈＯＰＮはｈＯＰＮの遺伝子（アクセッションナンバー：Ｊ０４７６５）をベクターであるｐｃＤＮＡ３.１へ常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い組み込み、更にそのベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションした。次に、この細胞を培養した際の培養上清から抗ＯＰＮ−１抗体カラム（株式会社免疫生物研究所製）にて精製することにより得た。このｈＯＰＮをトロンビンを用いて３７℃、９０分処理することによりＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを得た。更に、ｍＯＰＮおよびrＯＰＮ、更にはそれらを上記と同様にトロンビンで処理してｍＯＰＮおよびｒＯＰＮのそれぞれのＮ−ｈａｌｆを得た。【００８３】
実  施  例  ２
ウエスタンブロッティングによる抗体の特異性の確認：
実施例１で得られた３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体の特異性を確認するために、常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウエスタンブロッティングを行った。なお、ウエスタンブロッティングには、参考例５で作製したｈＯＰＮまたはｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ、ｈＯＰＮまたはｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆにトロンビンを加えて３７℃、９０分で処理したもの（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（＋））、ｈＯＰＮまたはｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆにトロンビンを加えず処理したもの（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（−））を用いた。また、対照として免疫に用いたポリペプチドが異なる参考例３で得たｈＯＰＮ−１抗体および参考例４で得たｈＯＰＮ−５抗体を用いて、同様にウエスタンブロッティングを行った。これらの結果を図１に示した。【００８４】
図１は、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体がｈＯＰＮには反応せず、ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆにのみ反応するという結果を示した。一方、ｈＯＰＮ−１抗体およびｈＯＰＮ−５抗体はｈＯＰＮおよびｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの両方に反応していた。この結果により３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体がＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆにのみ反応する特異的な抗体であることが示された。【００８５】
実  施  例  ３
ウエスタンブロッティングによる抗体の交差性の確認：
上記３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体を用いて、ｍＯＰＮおよびｒＯＰＮに対してウエスタンブロットを行った結果を図２に示す。また、対照として本出願人の国際特許出願（ＷＯ０２／０８１５２２国際公開パンフレット）に記載の以下のポリペプチド（ｄ）（ｍＯＰＮの１３８番目〜１５３番目に該当するアミノ酸配列にシスティン（Ｃ）を付けたものである）を抗原として得られた抗体（以下、この抗体を「ｍＯＰＮ−５抗体」という）を用い、上記と同様にウエスタンブロットを行った。この結果も図２に示した。
ポリペプチド（ｄ）：ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号１２）【００８６】
図２は、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体がｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆだけでなく、ｍＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆおよびｒＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆに対しても反応することを示した。このことは３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体がｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ、ｍＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆおよびｒＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆに交差性を有することおよび前記抗体の認識部位が、ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ、ｍＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆおよびｒＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端に共通のアミノ酸配列であることを示した。【００８７】
実  施  例  ４
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築：
（１）ｈＯＰＮ−１抗体とＨＲＰとの結合物の作製
参考例３で得られたｈＯＰＮ−１抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）との結合物を以下のように作製した。必要量のＨＲＰを蒸留水に溶解し、ＮａＩＯ４で酸化させた後、ｐＨ４.４の１ｍＭ酢酸緩衝液に一晩透析した。また、ｈＯＰＮ−１抗体の２ｍｇもｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析したｈＯＰＮ−１抗体とＨＲＰを、抗体１ｍｇに対してＨＲＰが０.４ｍｇになるように混合し、室温で２時間反応させた。次いで、これにＮａＢＨ４を加え氷中で２時間反応させた後ＰＢＳに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、ｈＯＰＮ−１抗体とＨＲＰとの結合物（以下、これを「ｈＯＰＮ−１標識抗体」という）を作製した。【００８８】
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートの作製
１０μｇ／ｍｌの３９Ｅ１抗体あるいは３４Ｅ３抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに加え、また比較の目的で同様にｈＯＰＮ−５抗体を加えた。次いで、これを４℃で一晩反応させた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、３９Ｅ１抗体あるいは３４Ｅ３抗体を固相化したサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。また、上記（１）で作製したｈＯＰＮ−１抗体とＨＲＰとの結合物を標識抗体とした。【００８９】
（３）標準曲線の作製
上記（２）で作製した９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートと、上記（１）で作製したｈＯＰＮ−１標識抗体を用いて、ｈＯＰＮ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（−））およびｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（＋））の測定を行った。また、コントロールとしてｈＯＰＮの測定を行った。これらの結果を図３に示した。３９Ｅ１抗体または３４Ｅ３抗体とｈＯＰＮ−１標識抗体を用いてｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの測定をした場合には、それぞれ濃度依存的に良好な直線性を示した。また、ｈＯＰＮとの交差性はそれぞれ約０.３９％であった。一方、ｈＯＰＮ−５抗体とｈＯＰＮ−１標識抗体を用いてｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの測定をした場合にはいずれも濃度依存的に良好な直線性を示したものの、ｈＯＰＮとの交差性が約２５％もあった。【００９０】
実  施  例  ５
細胞接着阻害活性試験：
（１）マウスメラノーマ細胞接着試験
α９およびα４インテグリンを有するマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−Ｆ１０（北海道大学より供与）を用いて、以下の方法によりこの細胞に対して接着活性を持つポリペプチドを以下のポリペプチドを用いて検定した。まず、検定に用いたポリペプチドのうち、ｍＯＰＮのアミノ酸配列（配列番号４）中、１７〜３２番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド（ｍＯＰＮ−１ペプチド）、１５５〜１７２番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド（ｍＯＰＮ−３ペプチド）、１４７〜１５３番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド（ｍＯＰＮ−７ペプチド）、１３８〜１５３番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド（ｍＯＰＮ−５ペプチド）、１４３〜１４７番目のアミノ酸配列に該当するポリペプチド（ＧＲＧＤＳペプチド）はシンペップ社（Synpep  Corporation）、タナ社（TANA  Laboratories,  USA）およびオースペップ社(Auspep)より購入した。また、全長ＯＰＮ（Ｆｕｌｌ  ｍＯＰＮ）およびマウスＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ（ｍＯＰＮ−Ｎ）の各タンパク質は参考例５と同様にして調製した。
ｍＯＰＮ−１ペプチド：ＬＰＶＫＶＴＤＳＧＳＳＥＥＫＬＹ（配列番号７）
ｍＯＰＮ−３ペプチド：ＫＳＲＳＦＱＶＳＤＥＱＹＰＤＡＴＤＥ（配列番号１３）
ｍＯＰＮ−５ペプチド：ＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号１４）
ｍＯＰＮ−７ペプチド：ＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号１５）
ＧＲＧＤＳペプチド：ＧＲＧＤＳ（配列番号１６）【００９１】
上記ポリペプチドまたはタンパク質はそれぞれ０.１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９.５）で２０μｇ／ｍｌの濃度に調整した後、９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに５０μｌ／ｗｅｌｌづつ加えた。次いでこれを４℃で一晩反応させた後、０.５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、その後ＰＢＳで洗浄して上記ポリペプチドまたはタンパク質を固相化したＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。次に、このプレートにＢ１６−Ｆ１０細胞を０.２５％ＢＳＡ／Ｄ−ＭＥＭで１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した後、各ウエルに２００μｌずつ加え、これを１時間、３７℃でインキュベート後０.２５％ＢＳＡ／Ｄ−ＭＥＭで洗浄し、プレートから接着していない細胞を取り除いた。そして、各ウエルに０.５％クリスタルバイオレットを含む２０％メタノールを加え、３０分間染色した。全てのウエルは、水で３回すすぎ、接着した細胞は２０％酢酸により転溶させた。各ウエルの上清をウエルに接着した細胞の相対的数を求めるために５９０ｎｍの吸収を測定し、イムノリーダーで分析した。これらの結果を図４に示した。【００９２】
図４は、α９およびα４インテグリンを有するマウスメラノーマ細胞株が、アミノ酸配列ＧＲＧＤＳを含まないポリペプチドであるｍＯＰＮ−１ペプチド、ｍＯＰＮ−３ペプチドとは殆ど接着しないことを示した。【００９３】
（２）接着阻害試験
３９Ｅ１抗体、３４Ｅ３抗体あるいはｍＯＰＮ−５抗体が、ｍＯＰＮに含まれるポリペプチド（ｍＯＰＮ−５ペプチド、ｍＯＰＮ−７ペプチドおよびＧＲＧＤＳペプチド）に対する細胞の接着を阻害するかどうかを以下の方法で調べた。まず、９６穴プレートを、４℃で一晩、種々の濃度のｍＯＰＮ−５、ｍＯＰＮ−７およびＧＲＧＤＳペプチドでプレコートし、次いで１０分間、３７℃の条件で０.５％ＢＳＡのＰＢＳにより非特異的接着をブロックするための処理を行った。次に、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６−Ｆ１０を、０.２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭに懸濁させ、細胞懸濁液（細胞濃度は、５×１０４細胞／ウエル）２００μｌを、種々の濃度の前記抗体の何れかの存在下または非存在下で、９６穴プレートに注入し、１時間、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、培地をプレートから除去し、全てのウエルを０.２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭで２回洗浄した。接着した細胞は固定し、２０％メタノール中の０.５％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。全てのウエルは、水で３回すすぎ、接着した細胞は２０％酢酸により転溶させた。各ウエルの上清をウエルに接着した細胞の相対的数を求めるために５９０ｎｍの吸収を測定し、イムノリーダーで分析した。これらの結果を図５に示した。【００９４】
図５は、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体が、マウスメラノーマ細胞株とｍＯＰＮ−５およびｍＯＰＮ−７との接着を阻害することを示した。また、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体は、マウスメラノーマ細胞株とＧＲＧＤＳペプチドとの接着に影響を及ぼさないことから、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体が、ｍＯＰＮとα４およびα９インテグリンとの接着を阻害することが確認された。なお、図５においてＧＲＧＤＳペプチドを含むポリペプチド（ｄ）を抗原として得られたｍＯＰＮ−５抗体がＧＲＧＤＳペプチドとマウスメラノーマ細胞株との接着を阻害していないのは、ｍＯＰＮ−５抗体が短いＧＲＧＤＳペプチドを認識しないためである。【００９５】
実  施  例  ６
３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体を用いた精製系の構築：
３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体の認識部位が、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端のアミノ酸からＮ末端側に連続したアミノ酸配列であることを示すために以下の実験を行った。  まず、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体の作製に用いたｈＯＰＮ−７ペプチド内の異なる５つの部分を有する以下のポリペプチド（I）〜（V）をコードするポリヌクレオチドを３’側に有し、５‘側には、これらのポリペプチド（I）〜（V）を結合させたい任意のポリペプチド配列のＣ末部分をコードするポリヌクレオチドを持つように設計した５パターンのプライマー（アンチセンスプライマ―）を作製した。センスプライマ―にはＳＰ６プロモーターに対するプライマ―を作製した。そしてこれらのアンチセンスプライマ―とセンスプライマ―を用いたＰＣＲ法で、ｍＲＮＡ合成に必要なプロモーターからｃＤＮＡの３’端までを合成した。更にこのＰＣＲ産物を鋳型としてｍＲＮＡを合成し、そのｍＲＮＡから更にそれぞれの塩基配列に対応したタンパク質を小麦胚芽抽出液（セルフリーサイエンス製）を用いた無細胞合成系で合成した。３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体と合成した各タンパク質およびコントロールとしてｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを用いてウエスタンブロッティングを行った。また、対照として本出願人らが報告しているＷＯ０２／０８１５２２国際公開パンフレットに記載の上記ポリペプチド（ｃ）を抗原としたモノクローナル抗体である２Ｋ１抗体を用いて、同様にウエスタンブロッティングを行った。これらの結果を図６に示した。
2008032712.tif 000003
【００９６】
図６は、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体は、抗原に用いたｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端のアミノ酸Ｒを含み、それからＮ末端側に連続したアミノ酸配列からなるポリペプチド（I）、（II）およびｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを認識し、ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端のアミノ酸Ｒを含まないポリペプチド（III）〜（V）は認識しないという結果を示した。一方、２Ｋ１抗体はポリペプチド（I）〜（V）の何れをも認識できず、ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆもほとんど認識しないという結果を示した。これらの結果より、３９Ｅ１抗体および３４Ｅ３抗体がトロンビン開裂されたｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆのＣ末端のアミノ酸Ｒを認識していることを示すとともに、ポリペプチドやタンパク質の検出・精製タグとして有用であることが示された。【００９７】
実  施  例  ７
ＥＬＩＳＡ法による慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者尿中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ量
の測定：
インフォームドコンセントを得た健常者２３例およびＲＡ患者２５例について尿を採取し、Human  Osteopontin  Assay  Kit  (L)  -  IBL（株式会社免疫生物研究所製（製品番号：27158）および実施例４で作製したＥＬＩＳＡ系を用いて、全長ＯＰＮ濃度およびＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度を測定した。尿サンプル中の全長ＯＰＮおよびＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度はｐＭ、また数値は平均±標準誤差で表した。これらの濃度を測定した結果を表１に示した。【００９８】
【表１】
2008032712.tif 000004
【００９９】
測定の結果、尿中全長ＯＰＮ濃度については、健常人とＲＡ患者の間に統計的有意差は認められなかったが、尿中ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度は、健常者が８０１.５±１７８．４ｐＭであったのに対し、ＲＡ患者が２１２８.４±４２９.４ｐＭという結果となり、健常者尿の濃度よりも有意に高値を認めた。【０１００】
この結果より、本キットで測定される尿中ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆの測定が慢性関節リウマチ疾患の新しい診断マーカーとして用いられることが明らかとなり、これにより本発明のキットによる尿検体を利用した非侵襲的検査が可能となる。【０１０１】
実  施  例  ８
ＥＬＩＳＡ法による変形性関節炎（ＯＡ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者膝
関節液中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ量の測定：
変形性関節炎（ＯＡ）１０７関節の膝関節液と関節リウマチ（ＲＡ）１８関節の膝関節液を採取し、−８０℃で凍結保存した。ＯＡはＫｅｌｌｇｒｅｎ＆Ｌａｗｒｅｎｃｅのｇｒａｄｅ  １、２に相当する軽度４５関節、ｇｒａｄｅ  ３に相当する中等度３３関節、ｇｒａｄｅ  ４に相当する重度２９関節であり、ＲＡはＬａｒｓｅｎ分類ｇｒａｄｅ  ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖの重度例である。関節液を１０倍希釈後、実施例４で作製したＥＬＩＳＡキットを用いて、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度を求めた。また、比較としてHuman  Osteopontin  Assay  Kit  (L)  -  IBL（株式会社免疫生物研究所製（製品番号：27158）を用いて全長ＯＰＮ濃度も測定した。更に、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ／ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ+全長ＯＰＮ（ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ量／ＯＰＮ  全量）の値も求めた。これらの結果を表２に示した。【０１０２】
【表２】
2008032712.tif 000005
【０１０３】
ＯＡとＲＡの比較：
・全長ＯＰＮは、有意差無し
・ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆは、ＲＡで高値（Ｐ＝０.０００１）
・ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ+全長ＯＰＮは、有意差無し
・ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ／ＯＰＮ
Ｎ−ｈａｌｆ+全長ＯＰＮは、ＲＡで高値（ｐ＜０.０００１）
ＯＡのグレード間での比較：
・全長ＯＰＮは相関無し
・ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆはグレードと正の相関有り（ｐ＝０.００３７、ｒ＝０.２８２）、軽度より中等度、重度で高値（ｐ＝０.０３６３）
・ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ／ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ+全長ＯＰＮは、グレードと正の相関有り（ｐ＝０.００４８、ｒ＝０.２７４）、軽度より中等度、重度で高値（ｐ＝０.０１８９）【０１０４】
この結果により、関節液中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ濃度を測定することによりあるいはＯＰＮ全量に対するＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ量の比率を求めることにより、ＯＡとＲＡの鑑別およびＯＡの重篤度の判定が可能となる。【０１０５】
実  施  例  ９
ウエスタンブロット法による患者膝関節液中のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ量の検出：
実施例８で採取した患者膝関節液のうち、実施例８のＥＬＩＳＡ法による測定結果でＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ量が高値を示した膝関節液と測定値がほとんど認められなかった膝関節液を用いてウエスタンブロット法により本願のＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ抗体を用いて検出した。詳しくは、これら膝関節液の０.１５ｍｌをＤ−ＰＢＳにて２倍に希釈し、これにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を２０μｌ添加し、室温で３０分混和した。次にこれを１.０ｍｌのＰＢＳで５回洗浄し、０.７Ｍの塩化ナトリウム／ＰＢＳ溶液の０.１ｍｌで溶出させ、更に、これに等量の２倍のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）緩衝液と混和し、煮沸処理を行い、ウエスタンブロットのサンプルとした。このサンプルに対し、実施例１で得られた３４Ｅ３抗体を用いて常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウエスタンブロッティングを行った。【０１０６】
実施例８のＥＬＩＳＡ法でＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ量が高値を示した患者膝関節液では、ウエスタンブロット法においてもその濃度に従ってＯＰＮ  Ｎ−Ｈａｌｆのバンドが認められた。一方、ＥＬＩＳＡ法では測定値がほとんど認められなかった膝関節液では、ウエスタンブロット法においてもＯＰＮ  Ｎ−Ｈａｌｆのバンドは認められなかった。【０１０７】
実  施  例  １０
肝炎モデルマウスへの３４Ｅ３抗体投与：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣｏｎＡを２００ｕｇ／匹、静脈内投与し肝炎を発症させた。ＣｏｎＡ投与の前３時間に、３４Ｅ３抗体またはコントロール抗体を４００ｕｇ／匹、静脈内投与した。ＣｏｎＡ投与２４時間後に、血清を回収し、ＡＬＴ値を測定した。【０１０８】
３４Ｅ３抗体投与群は、コントロール抗体投与群と比べて有意にＡＬＴレベルの低下が見られた。このことから３４Ｅ３抗体はＣｏｎＡ投与による肝細胞の壊死を抑制できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明のトロンビン開裂ＯＰＮ（ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ）のＣ断端ペプチドを認識する抗体は、トロンビン開裂ＯＰＮを認識し、かつ全長ＯＰＮを認識しないものである。そして、これを利用したＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ測定キットは、これまで市販されているＯＰＮ測定キットと異なり、ＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆを正確に測定することができる。
従って、本発明の測定キットは、ＯＰＮが関連する炎症系の疾患の診断や、発症に関するメカニズム等の研究に利用することができる。また、本抗体そのものを抗体医薬として炎症系疾患の治療剤としても用いることができ、更にはＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆその他トロンビン開裂ＯＰＮのＣ末断端を有するペプチドを精製するためのタグとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は３４Ｅ３抗体、３９Ｅ１抗体、ｈＯＰＮ−１抗体およびｈＯＰＮ−５抗体を用いたウエスタンブロッティングを示す図面である（図中、レーン１はｈＯＰＮ、２はｈＯＰＮ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（−）、３はｈＯＰＮ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（＋）、４はｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ、５はｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（−）、６はｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（＋）を示す）。
【図２】図２は３４Ｅ３抗体、３９Ｅ１抗体およびｍＯＰＮ−５抗体を用いたウエスタンブロッティングを示す図面である。
【図３】図３は実施例４で作製したＥＬＩＳＡ用プレートを用いてｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（＋））、ｈＯＰＮ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（−））およびコントロール（ｈＯＰＮ）を測定した結果を示す図面である（図中、ＡはｈＯＰＮ−５抗体とｈＯＰＮ−１標識抗体により測定した結果、Ｂは３４Ｅ１抗体とｈＯＰＮ−１標識抗体により測定した結果およびＣは３９Ｅ３抗体とｈＯＰＮ−１標識抗体により測定した結果を示す）。
【図４】図４はマウスＯＰＮ由来の各種ポリペプチドの、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−Ｆ１０に対する接着試験の結果を示す図面である。
【図５】図５はマウスＯＰＮ由来の各種ポリペプチドに対する３４Ｅ３抗体（３４Ｅ３）、３９Ｅ１抗体（３９Ｅ１）およびｍＯＰＮ−５抗体（Ｍ−５）の接着阻害活性を測定した結果を示す図面である（図中、ＡはｍＯＰＮ−５ペプチドを用いた接着阻害試験の結果、ＢはｍＯＰＮ−７ペプチドを用いた接着阻害試験の結果およびＣはＧＲＧＤＳペプチドを用いた接着阻害試験の結果を示す）。
【図６】図６は３４Ｅ３抗体、３９Ｅ１抗体およびｈＯＰＮ−５抗体と各種ポリペプチドまたはタンパク質を用いたウエスタンブロッティングを示す図面である（図中、レーン１は−ｍＲＮＡ、２はｃＤＮＡ、３はｃＤＮＡ−ＹＧＬＲ、４はｃＤＮＡ−ＶＹＧＬＲ、５はｃＤＮＡ−ＶＹＧＬ、６はｃＤＮＡ−ＳＶＶＹＧＬ、７はｃＤＮＡ−ＳＶＶＹＧ、８は精製ｈＯＰＮ  Ｎ−ｈａｌｆ）。
【図１】
2008032712.tif 000006
【図２】
2008032712.tif 000007
【図３】
2008032712.tif 000008
【図４】
2008032712.tif 000009
【図５】
2008032712.tif 000010
【図６】
2008032712.tif 000011
【配列表】
2008032712000001.app
【国際調査報告】
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2008032712.tif 000013
2008032712.tif 000014
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