(57)【要約】  本発明は、変形性関節症等における関節軟骨のアポトーシスを効果的に抑制しうる医薬及び方法を提供することを目的とする。即ち本発明は、関節軟骨のアポトーシスを抑制するための医薬であって、破骨細胞形成抑制因子を有効成分とすることを特徴とする医薬、及び、関節軟骨のアポトーシスを抑制するための方法であって、破骨細胞形成抑制因子を被検体に投与することを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節軟骨における軟骨細胞のアポトーシス抑制剤であって、破骨細胞形成抑制因子を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス抑制剤。
【請求項２】
破骨細胞形成抑制因子が被検体の関節内に投与される、請求項１に記載のアポトーシス抑制剤。
【請求項３】
変形性関節症を治療又は予防するための医薬である、請求項１又は２に記載のアポトーシス抑制剤。
【請求項４】
関節軟骨における軟骨細胞のアポトーシスを抑制する方法であって、破骨細胞形成抑制因子を被検体に投与することを特徴とする方法。
【請求項５】
破骨細胞形成抑制因子が被検体の関節内に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
変形性関節症を治療又は予防するための方法である、請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症等における関節軟骨のアポトーシスを抑制するための医薬及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＯＡ）は、例えば、加齢とともに関節軟骨が変性し、関節の炎症及び疼痛を惹起する疾患であり、特に高齢者のＱＯＬを低下させている主要な要因の一つである。その患者数は全国に１０００万人を超えることが明らかになっており、また関節形成術以外に根治的な治療法は確立されていない。現在一般的に行われているＯＡの保存的治療法としては、消炎鎮痛剤の内服・外用、ヒアルロン酸やステロイドの関節内注射などが挙げられるが、いずれも対症療法であり、特に進行例では無効であることも多い。そのため、より効果的なＯＡの保存的治療法の開発が期待されているのが現状である。
また、前記疾患は、メカニカルストレスの蓄積により軟骨の変性と反応性の骨硬化・骨棘形成が進行する病態であるが、その分子レベルの背景に関しては殆ど解明されていない。この要因のひとつとして、遺伝子改変技術が最も進んでいるマウスにおいて適当なＯＡ誘発モデルが存在しなかったことが挙げられる。そこで、近年、ＯＡの病態解明及び治療法の確立を目的として、関節不安定性負荷によるマウスＯＡモデルの確立が亀倉らによって報告された（非特許文献１参照）。このモデルの組織学的解析によって、ＯＡの発症・進行過程は、１）関節軟骨の変性、２）病的肥大軟骨細胞の出現、３）骨硬化と骨棘の形成、の３段階に大きく分類されることが明らかとなった。なお、それぞれの段階には独立した分子背景があるものと考えられているが、その詳細については未だ解明されていないのが現状である。【０００３】
また、破骨細胞形成抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ：ＯＣＩＦ）は、オステオプロテジェリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ：ＯＰＧ）とも呼ばれ（従って、本明細書中、破骨細胞形成抑制因子を「ＯＣＩＦ／ＯＰＧ」と称することがある）、破骨細胞形成促進因子ＲＡＮＫＬのデコイ（おとり）レセプターとして広く知られており、ＲＡＮＫＬと結合することによって破骨細胞分化を強力に阻害することから、骨粗鬆症などの病的な骨量低下に対して効果が期待されているタンパク質である（非特許文献２及び非特許文献３参照）。また、前記破骨細胞形成抑制因子は、アジュバント関節炎マウス等に全身投与することにより、間接的に軟骨の保護効果を奏することが報告されている（非特許文献４参照）。ここで、軟骨下骨は、関節軟骨を裏打ちし、軟骨細胞を力学的に支持するのみならず、血液供給などを介して軟骨細胞の代謝に寄与している部位であるが、前記破骨細胞形成抑制因子を全身投与された各関節炎マウスでは、関節の炎症によって惹起されるこの軟骨下骨における異常な骨吸収が前記破骨細胞形成抑制因子の作用によって抑制されることにより、間接的に関節軟骨が保護されたものと考えられていた。しかしながら、変形性関節症の症状においては、通常炎症は惹起されないため、この知見は破骨細胞形成抑制因子が実際の変形性関節症における軟骨変性を改善することを示唆するものではない。【０００４】
また、ラットの変形性関節症モデル(Ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅの関節内注射或いは前十字靭帯切断により作製)における膝関節軟骨細胞にＴＲＡＩＬ発現が亢進すること、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴＲＡＩＬが軟骨細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献５参照）。【０００５】
しかしながら、このような関節軟骨のアポトーシスを効果的に抑制することができ、変形性関節症等における関節軟骨の変性を効果的に治療又は予防可能な医薬及び方法については、未だ開発がなされておらず、そのため、このような優れた医薬及び方法の提供が望まれているのが現状である。【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｍｅｋｕｒａら（２００５）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １３，６３２−４１
【非特許文献２】Ｙａｓｕｄａら(１９９８)Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９５，３５９７−６０２
【非特許文献３】Ｍｉｚｕｎｏら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４７，６１０−５
【非特許文献４】Ｃａｍｐａｇｎｕｏｌｏら(２００２)Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４６，１９２６−３６
【非特許文献５】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ.  ２００４  Ｆｅｂ;５０(２):５３４−４２
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、変形性関節症等における関節軟骨のアポトーシスを効果的に抑制しうる医薬及び方法を提供することを目的とする。
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、前記破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ）を関節内に直接投与することにより、関節内の軟骨細胞のアポトーシスを直接的、かつ効果的に抑制することができ、したがって、変形性関節症における関節軟骨の変性を効果的に治療又は予防することができるという知見である。
【０００９】
前記したような軟骨下骨を介した間接的な軟骨細胞の保護（例えば、前記非特許文献４参照）とは異なり、前記破骨細胞形成抑制因子を関節内に直接投与することによれば、変形性関節症等における軟骨細胞のアポトーシスを直接的、かつ効果的に抑制することができ、そのため、変形性関節症等における関節軟骨の変性を効果的に治療又は予防することができることは、従来全く知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞  関節軟骨における軟骨細胞のアポトーシス抑制剤であって、破骨細胞形成抑制因子を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス抑制剤である。
＜２＞  破骨細胞形成抑制因子が被検体の関節内に投与される、前記＜１＞に記載のアポトーシス抑制剤である。
＜３＞  変形性関節症を治療又は予防するための医薬である、前記＜１＞又は＜２＞に記載のアポトーシス抑制剤である。
＜４＞  関節軟骨における軟骨細胞のアポトーシスを抑制する方法であって、破骨細胞形成抑制因子を被検体に投与することを特徴とする方法である。
＜５＞  破骨細胞形成抑制因子が被検体の関節内に投与される、前記＜４＞に記載の方法である。
＜６＞  変形性関節症を治療又は予防するための方法である、前記＜４＞又は＜５＞に記載の方法である。
【００１１】
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、変形性関節症等における関節軟骨のアポトーシスを効果的に抑制しうる医薬及び方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスの関節軟骨におけるサフラニンＯ染色像である。
【図２】図２は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスのＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅを表したグラフである。
【図３】図３は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスのｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅを表したグラフである。
【図４】図４は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスの関節軟骨の厚みを表したグラフである。
【図５】図５は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスの滑膜及び関節軟骨における抗ＯＣＩＦ／ＯＰＧ抗体を用いた免疫染色像である。
【図６】図６は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスの関節軟骨における抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた免疫染色像である。
【図７】図７は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスの関節軟骨におけるＴＵＮＥＬ染色像である。
【図８】図８は、実施例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスの関節軟骨におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を表したグラフである。
【図９】図９は、参考例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスの関節軟骨におけるサフラニンＯ染色像である。
【図１０】図１０は、参考例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスのＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅを表したグラフである。
【図１１】図１１は、参考例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスのｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅを表したグラフである。
【図１２】図１２は、参考例１における各群の変形性関節症（ＯＡ）モデルマウス大腿骨部のＸ線写真である。
【図１３】図１３は、参考例２における、各年齢層のＯＣＩＦ／ＯＰＧ欠損マウス（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ−／−）及び野生型マウス（ＷＴ）の関節軟骨におけるサフラニンＯ染色像である。
【図１４】図１４は、参考例２における、変形性関節症（ＯＡ）を誘導した若年のＯＣＩＦ／ＯＰＧへテロ欠損マウス（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−）及び野生型マウス（ＷＴ）の関節軟骨におけるサフラニンＯ染色像である。
【図１５】図１５は、参考例２における、変形性関節症（ＯＡ）を誘導した若年のＯＣＩＦ／ＯＰＧへテロ欠損マウス（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−）及び野生型マウス（ＷＴ）のＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅを表したグラフである。
【図１６】図１６は、参考例２における、変形性関節症（ＯＡ）を誘導した若年のＯＣＩＦ／ＯＰＧへテロ欠損マウス（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−）及び野生型マウス（ＷＴ）のｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅを表したグラフである。
【図１７】図１７は、参考例２における、変形性関節症（ＯＡ）を誘導した若年のＯＣＩＦ／ＯＰＧへテロ欠損マウス（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−）及び野生型マウス（ＷＴ）の関節軟骨の厚みを表したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（アポトーシス抑制剤）
本発明のアポトーシス抑制剤は、関節軟骨における軟骨細胞のアポトーシスを抑制するためのアポトーシス抑制剤であり、破骨細胞形成抑制因子を有効成分として含み、更に必要に応じて適宜その他の成分を含んでいる。なお、前記アポトーシス抑制剤の好ましい態様は、変形性関節症における関節軟骨の変性を治療又は予防するための医薬であり、その好ましい投与態様は、被検体の関節内への直接投与である。【００１４】
＜破骨細胞形成抑制因子＞
本発明において、前記破骨細胞形成抑制因子としては、ＯＣＩＦ／ＯＰＧそのものの他、その類縁体若しくはその変異体、又はそれらの修飾体を挙げることができる。【００１５】
前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧは、当初、破骨細胞形成抑制活性を指標として単離されたものであり、破骨細胞の分化／成熟を抑制する活性を有するタンパク質である（国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号）。具体的には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧは、下記の（ａ）〜（ｄ）に記載の物理化学的性質を有し、且つ、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する（国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号）。
（ａ）  分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）：約６０ｋＤ（還元条件下）、約６０ｋＤ及び約１２０ｋＤ（非還元条件下）。
（ｂ）  親和性：陽イオン交換体及びヘパリンに親和性を有する。
（ｃ）  熱安定性：７０℃、１０分間又は５６℃、３０分間の加熱処理により、破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、９０℃、１０分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
（ｄ）  内部アミノ酸配列：配列番号１〜３記載のアミノ酸配列を内部アミノ酸配列として有する。
なお、配列番号１〜３記載のアミノ酸配列において、Ｘａａは任意のアミノ酸を取りうるが、好ましくは、配列番号１において１位のＸａａはＴｈｒであり、配列番号２において１位のＸａａはＡｒｇであり、５位のＸａａはＳｅｒであり、１３位のＸａａはＬｅｕであり、配列番号３において１位のＸａａはＴｈｒである。
ここで、本件実施例（後述）においては、ＯＣＩＦ／ＯＰＧが、関節軟骨のアポトーシスを直接抑制することが見出された。従って、本発明におけるＯＣＩＦ／ＯＰＧは、関節軟骨のアポトーシスを直接抑制する活性を有するものである。
上記（ａ）の物理化学的性質から判るように、ＯＣＩＦ／ＯＰＧは、一量体と二量体の形態をとりうる（国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号）。ＯＣＩＦ／ＯＰＧを発現する細胞（例えば、天然にはヒト胎児肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ寄託−受託番号ＣＣＬ１８６））を含む培養液等には、当該一量体と二量体とが通常混在する。そこで、通常の分離方法によりいずれか一方の形態のＯＣＩＦ／ＯＰＧを精製し、本発明において使用してもよい。
ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧは、シグナルペプチドを含む前駆体（ｃＤＮＡ：配列番号４及びアミノ酸配列：配列番号５）として合成され、シグナルペプチドが切断され、成熟型タンパク質（配列番号５に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド（第１番目〜第２１番目のアミノ酸配列）を除くアミノ酸配列）となる。本発明において、ＯＣＩＦ／ＯＰＧは、上述のヒト由来のシグナルペプチドを含む前駆体及び成熟型タンパク質のいずれをも含むが、成熟型タンパク質が好ましい。【００１６】
前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体とは、ＯＣＩＦ／ＯＰＧをコードする塩基配列と相補的な塩基配列から成るＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、且つ関節軟骨のアポトーシスを抑制するタンパク質を意味し、その中でも、更に活性物質として用いられる場合、関節軟骨の変性改善作用を有するものが本発明の医薬の活性物質として使用される。ＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体は、例えば、動物細胞、体液又は組織由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧのｃＤＮＡ（配列番号４）と相補的な塩基配列から成るＤＮＡをプローブとし、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる、関節軟骨のアポトーシス抑制活性を有するタンパク質である。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。このようなストリンジェントな条件は、当業者には周知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的例としては、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション後、５０〜６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄するものが挙げられる。
具体的なＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体としては、例えば、国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号に開示のＯＣＩＦ２（ｃＤＮＡ：配列番号６及びアミノ酸配列：配列番号７）、ＯＣＩＦ３（ｃＤＮＡ：配列番号８及びアミノ酸配列：配列番号９）、ＯＣＩＦ４（ｃＤＮＡ：配列番号１０及びアミノ酸配列：配列番号１１）、及びＯＣＩＦ５（ｃＤＮＡ：配列番号１２及びアミノ酸配列：配列番号１３）が挙げられる。なお、ＯＣＩＦ２〜５におけるシグナルペプチドのアミノ酸配列及び成熟型タンパク質のアミノ酸配列は、以下の表１に示す通りである。【００１７】
【表１】
2008078588.tif 000002
【００１８】
また、前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧ変異体とは、上述のＯＣＩＦ／ＯＰＧ又はＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ関節軟骨のアポトーシス抑制活性を有するタンパク質を意味し、その中で、更に関節軟骨の変性改善作用を有するものが本発明の医薬の活性物質として使用される。ＯＣＩＦ／ＯＰＧ変異体において、上記複数のアミノ酸は、数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個）であってもよい。なお、ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧ（配列番号５記載のアミノ酸配列）においては、Ｃ末端から２０４アミノ酸までを欠失させたＣ末端欠失変異体においても、破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性が確認されており、生物活性は主にＮ末端側のドメインによるものと考えられている（国際公開第９６／２６２１７号、米国特許第６，８５５，８０８号及びＹａｍａｇｕｃｈｉ  Ｋ．ら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８），Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．９，ｐｐ．５１１７−５１２３）。このようなＣ末端欠失変異体も、本発明における関節軟骨のアポトーシス抑制目的において使用することが考えられる。
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ変異体の好適な態様としては、ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧ（配列番号５記載のアミノ酸配列）において数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ関節軟骨のアポトーシス抑制活性、並びに関節軟骨変性改善作用を有するタンパク質、及びヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧ（配列番号５記載のアミノ酸配列）において第２２番目のＧｌｕをＮ末端とし、第１９７番目〜第４００番目のいずれかのアミノ酸をＣ末端とするタンパク質であって、関節軟骨のアポトーシス抑制活性並びに関節軟骨変性の改善作用を有するタンパク質が挙げられる。
更に、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ変異体には、上述のＯＣＩＦ／ＯＰＧ又はＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも約６０〜６５％、好ましくは約７０〜７５％、更に好ましくは約８０〜８５％、特に好ましくは約９０〜９５％以上同一であるヌクレオチド配列によりコードされ、且つ関節軟骨のアポトーシス抑制活性並びに関節軟骨変性改善作用を有するタンパク質が含まれる。【００１９】
前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧ修飾体とは、例えば、上述したＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体のペプチドや糖鎖の酵素的又は化学的修飾体、或いはポリマー等の高分子化合物や多糖類の修飾体を意味する。ＯＣＩＦ／ＯＰＧ修飾体としては、例えばタンパク質の翻訳後修飾（例えば、糖の付加、プロテインキナーゼによるリン酸化やホスファターゼによる脱リン酸化）、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共ポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ＰｏｌｙＰＥＧ（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ａｌｌｙｌｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ  ａｎｄ  ｍａｌｅａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、ヘパリン、デキストラン硫酸等）等による化学修飾等の修飾がなされたＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体が挙げられる。更に、例えば、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体とＦｃ（ＩｇＧ等の免疫グロブリン由来のＦｃ領域）やアルブミン等のペプチドやタンパク質との融合タンパク質；ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体と多糖類（ヘパリン、デキストラン硫酸等）との複合体；及びＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体とＰｏｌｙＰＥＧとの複合体も、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ修飾体に含まれる。
具体的には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体のポリエチレングリコールによる修飾体は、例えば、国際公開第９７／２３６１４号に記載の方法により製造できる。また、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体の多糖類による修飾体において、多糖類としてはデキストラン硫酸、特にデキストラン硫酸ナトリウム５（ＤＳ５）が好ましく、このような修飾体は、例えば、特開２００３−１６０６０１号や米国特許出願公開第２００３−００４５４５６号に記載の方法により製造できる。更に、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体のＰｏｌｙＰＥＧによる修飾体は、例えば、特開２００５−２０６５６９号や米国特許出願公開第２００６−００６２７５４号に記載の方法により製造できる。【００２０】
なお、ヒト以外の動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、並びにニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ等の鳥類）由来のＯＣＩＦ／ＯＰＧも、上述の定義の範囲内にあれば、前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体、又は修飾体に含まれる。【００２１】
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体、又はそれらの修飾体（以下、「ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質」という）は、動物の組織や体液等から、又は動物細胞の培養物等からタンパク質として抽出、精製された天然型のタンパク質として、或いは、これらＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質をコードするＤＮＡ断片又は当該ＤＮＡ断片を含有するベクターで動物細胞や大腸菌等の宿主を形質転換し、生産される遺伝子組換え型（以下では、ヒト遺伝子組換えタンパク質について「ｒｈ」という場合がある）タンパク質として、更にはこれらの修飾体として、取得することができる。例えば、国際公開第９６／２６２１７号（及び米国特許第６，８５５，８０８号）に開示のＯＣＩＦ／ＯＰＧの製造方法に準じて、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質をＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質産生細胞より単離・精製することができる。具体的には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質産生細胞を培養し、培養液をヘパリンカラム（ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ、ファルマシア社）に供し、２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出する。次いで、得られたヘパリン吸着性ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質画分をＱ・陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｑ／ＦＦ、ファルマシア社）に供し、その非吸着画分を集める。このようして、ヘパリン吸着性によりヘパリン親和性のＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質画分を得ることができる。得られたＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質活性画分をＳ・陽イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｓ／ＨＰ、ファルマシア社）、ヘパリンカラム（ヘパリン−５ＰＷ、トーソー社）、シバクロンブルーカラム（ブルー−５ＰＷ、トーソー社）、逆相カラム（ＢＵ−３００  Ｃ４、パーキンエルマー社）に供することにより、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を単離・精製することができる。
また、このように製造されるＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質の関節軟骨変性改善作用は、例えば、後述する実施例に記載の方法により測定することができる。
なお、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質中、本発明の医薬の活性物質としては、好適にはＯＣＩＦ／ＯＰＧ又はその修飾体であり、より好適にはＯＣＩＦ／ＯＰＧである。【００２２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記破骨細胞形成抑制因子の関節への注入時に、ヒアルロン酸ナトリウムを同時に投与することができる。また、前記アポトーシス抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００２３】
＜剤型＞
前記アポトーシス抑制剤の医薬としての剤型には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、前記医薬は被検体の関節内に投与されることを特徴とすることから、前記関節内への直接投与が可能な、注射剤であることが好ましい。前記注射剤としては、例えば、水性注射剤、懸濁性注射剤、用時溶解用固形注射剤などが挙げられる。
前記注射剤は、例えば、前記破骨細胞形成抑制因子に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等の医薬用の添加剤を添加することにより、製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。【００２４】
＜適用＞
前記医薬は、例えば、変形性関節症における関節軟骨の変性の治療又は予防に好適である。
ここで、前記「関節軟骨」としては、特に制限はなく、全身の関節における軟骨の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、膝関節、肩関節、股関節、顎関節等の軟骨などが挙げられる。これらの中でも、前記「関節軟骨」としては、膝関節、股関節の軟骨が好ましい。
なお、前記関節軟骨の「変性」とは、前記関節軟骨が正常でない無い状態を指すものとし、その状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記関節軟骨の磨耗、分解、破壊、消失、変形などが挙げられる。【００２５】
＜投与＞
好ましい投与態様においては、前記医薬は、被検体の関節内に直接投与されることにより使用される。中でも、前記被検体としては、変形性関節症患者が好適であり、中でも、初期から進行期までの変形性膝関節症患者が特に好適である。また、前記被検体としては、炎症を伴わない変形性関節症患者であることが好ましい。前記医薬は、関節内に投与されることから、経口投与が困難な被検体への適用にも好適である。なお、前記被検体の生物種としては、前記医薬の投与対象となり得る生物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、サルなどが挙げられる。好適にはヒト、ウマ、又はイヌであり、より好適にはヒトである。
前記医薬の投与方法の好ましい態様は、関節内投与である。前記関節内投与の手法としては、特に制限はなく、公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記注射剤の剤型として製造した前記医薬を、目的の関節腔内に注射器等を用いて注入することにより行うことができる。
前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、前記被検体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１回の投与あたり、有効成分である前記破骨細胞形成抑制因子の量としては、好適には０．１〜８０００μｇ、より好適には１〜２０００μｇ、更に好ましくは３〜６００μｇである。
前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記関節軟骨の変性に対し、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。また、前記したように、変形性関節症の発症・進行過程は、１）関節軟骨の変性、２）病的肥大軟骨細胞の出現、３）骨硬化と骨棘の形成、の３段階に大きく分類されることが知られているが、前記医薬を前記変形性関節症の患者に適用する場合には、前記医薬は前記変形性関節症の初期段階、即ち、１）関節軟骨の変性段階で投与されることが好ましい。【００２６】
（方法）
本発明の方法は、変形性関節症等における関節軟骨の変性に際し、関節軟骨のアポトーシスを抑制するための方法であり、破骨細胞形成抑制因子を投与することを含み、更に必要に応じて適宜その他の工程を含む。好ましい投与態様は、被検体の関節内への直接投与である。本方法において、「関節軟骨の変性」、「破骨細胞形成抑制因子」、「被検体」、「関節内に投与」とは、前記した通りである。また、「その他の工程」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記破骨細胞形成抑制因子の関節内投与のため、前記破骨細胞形成抑制因子を含む注射剤を製造する製造工程などが挙げられる。【００２７】
［効果］
前記アポトーシス抑制剤及び方法は、その好ましい態様において破骨細胞形成抑制因子を関節内に直接投与することを特徴とするため、破骨細胞形成抑制因子を関節内の軟骨細胞に直接的、かつ効果的に作用させることができ、そのため、関節軟骨のアポトーシスを効果的に抑制し、変形性関節症に伴う関節軟骨の変性を効果的に治療又は予防することができる。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００２９】
（実施例１：関節軟骨の変性に対する破骨細胞形成抑制因子関節内投与の影響）
本実施例１では、マウスの変形性関節症(ＯＡ)モデルを用い、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ）の関節内投与による関節軟骨の変性に対する治療又は予防効果を調べた。【００３０】
＜方法＞
亀倉らの方法（Ｋａｍｅｋｕｒａら（２００５）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １３，６３２−４１参照）に準じて、各マウス（Ｃ５７ＢＬ／６；９週令、雄）の右膝関節内側側副靭帯、同内側半月板を切除することにより、変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスを作製した。左膝関節はシャム手術側とした。マウスを破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ）投与群とコントロール群とに分け（ｎ＝５）、手術翌日より、５日／週（１回／１日）、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群にはＯＣＩＦ／ＯＰＧ（１００ｎｇ／１０μｌ  ＰＢＳ）を、コントロール群には１０μｌ  ＰＢＳのみを、右膝関節内にそれぞれ注射した。手術後４週にて屠殺し、両膝関節を採取し、固定、脱灰、脱水の後にパラフィン包埋し、薄切標本を作製して、以下の免疫組織学的評価に供した。【００３１】
[免疫組織学的評価]
作製した各群の薄切標本にサフラニンＯ染色を施し、Ｍａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅによるＯＡ重症度評価を行った。また、Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓ４．５（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用い、サフラニンＯで赤色に染色されたプロテオグリカンを含む関節軟骨の厚みを定量した。更に、作製した各群の薄切標本について、抗マウスＯＣＩＦ／ＯＰＧ抗体、抗ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ）抗体を用いて免疫染色を行った。また、ＴＵＮＥＬ法にて各群の関節軟骨のアポトーシスを定量した。【００３２】
［Ｍａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ  評価基準］
Ｈｅｎｒｙ Ｊ． Ｍａｎｋｉｎらの方法（Ｈｅｎｒｙ  Ｊ． Ｍａｎｋｉｎら（１９７１）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ＆Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ５３（３），５２３−５３７参照）に準じ、以下の基準にて点数評価を行った。
＜Ｔｉｄｅｍａｒｋ＞
スコア０：正常
スコア１：血管の関節軟骨深部への侵入が認められる。
＜Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ＞
スコア０：強い染色性が認められる。
スコア１：染色性の低下（低度）が認められる。
スコア２：染色性の低下（中度）が認められる。
スコア３：染色性の低下（重度）が認められる。
スコア４：染色されない。
＜Ｃｅｌｌｓ＞
スコア０：正常
スコア１：びまん性細胞過形成が認められる。
スコア２：軟骨細胞のクローンが認められる。
スコア３：低細胞性が認められる。
＜Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ＞
スコア０：正常
スコア１：関節軟骨表層に不整が認められる。
スコア２：パンヌス及び関節軟骨表層に不整が認められる。
スコア３：関節軟骨中間層への亀裂が認められる。
スコア４：関節軟骨深層への亀裂が認められる。
スコア５：関節軟骨石灰化層への亀裂が認められる。
スコア６：全体的な組織崩壊が認められる。【００３３】
［ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ  評価基準］
亀倉らの方法（Ｋａｍｅｋｕｒａら（２００５）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １３，６３２−４１参照）に準じ、以下の基準にて点数評価を行った。
スコア０：目立った変化はなし。
スコア１：関節軟骨表層部が欠損している。
スコア２：関節軟骨欠損部位がＴｉｄｅｍａｒｋ上部に達している。
スコア３：関節軟骨欠損部位が石灰化層に達している。
スコア４：軟骨下骨が露出している。【００３４】
＜結果＞
結果を図１〜８に示す。
サフラニンＯ染色標本において、コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群では変形性関節症の特徴的所見である関節軟骨表層の染色性低下、関節軟骨の菲薄化、軟骨細胞のクローン性増殖、細胞数の増減が明らかであった。一方、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群ではこれらの所見が軽度であり、サフラニンＯ染色にて赤色に染色される関節軟骨の厚みが保たれていた（図１）。また、変形性関節症の重症度の指標であるＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅは共に、コントロール群に比べ、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群が有意に低い値を示した（図２、図３）。また、Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓ４．５（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いサフラニンＯで染色された関節軟骨の厚みを定量したところ、関節軟骨の厚みは、コントロール群に比べ、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群が有意に大きな値を示した（図４）。【００３５】
抗ＯＣＩＦ／ＯＰＧ抗体を用いて免疫染色を行った結果、コントロール群ではＯＣＩＦ／ＯＰＧは関節軟骨の深層を中心に発現し、滑膜における発現は非常に弱かった（図５、左欄）。一方、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群では関節軟骨の表層や滑膜細胞においてＯＣＩＦ／ＯＰＧの強い局在が認められた（図５、右欄）。また、抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いて免疫染色を行った結果、ＴＲＡＩＬはコントロール群、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群共に、関節軟骨全層にわたって発現が認められた（図６）。【００３６】
ＴＵＮＥＬ法によって関節軟骨細胞のアポトーシスを定量した結果、コントロール群では関節軟骨のほぼ全層にわたってＴＵＮＥＬ陽性細胞が分布したが、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群ではＴＵＮＥＬ陽性細胞数が有意に減少していた。即ち、ＯＣＩＦ／ＯＰＧの関節内投与により、変形性関節症における軟骨細胞のアポトーシスが抑制されることが明らかとなった（図７、図８）。【００３７】
以上の結果から、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ）の関節内投与は、変形性関節症モデルマウスにおける関節軟骨の変性を効果的に抑制できることが示された。また、この効果は、前記破骨細胞形成抑制因子が関節内に投与されることにより、前記破骨細胞形成抑制因子が軟骨細胞に直接的に作用し、ＴＲＡＩＬによる軟骨細胞のアポトーシスを抑制することに起因するものであることが示唆された。【００３８】
（参考例１：関節軟骨の変性に対する破骨細胞形成抑制因子全身投与の影響）
前記実施例１における関節内投与の有用性を示すため、参考例１として、関節軟骨の変性に対する破骨細胞形成抑制因子(ＯＣＩＦ／ＯＰＧ)の全身投与の影響を調べた。【００３９】
＜方法＞
亀倉らの方法（Ｋａｍｅｋｕｒａら（２００５）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １３，６３２−４１参照）に準じて、各マウス（Ｃ５７ＢＬ／６；９週令、雄）の右膝関節十字靭帯、同内側半月板を切除することにより、変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスを作製した。左膝関節はシャム手術側とした。マウスを破骨細胞形成抑制因子(ＯＣＩＦ／ＯＰＧ)投与群とコントロール群とに分け（ｎ＝５）、手術翌日より、５日／週（１回／１日）、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群にはＯＣＩＦ／ＯＰＧ（２００μｇ／１００μｌ  ＰＢＳ）を、コントロール群には１００μｌ  ＰＢＳのみを、腹腔内にそれぞれ投与した。手術後２週にて屠殺し、両膝関節を採取し、固定、脱灰、脱水の後にパラフィン包埋し、薄切標本を作製して、以下の免疫組織学的評価に供した。【００４０】
[組織学的評価]
作製した各群の薄切標本にサフラニンＯ染色を施し、Ｍａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅによるＯＡ重症度評価を前記実施例１と同様に行った。また、各群の大腿骨のＸ線写真を撮影し、骨量の変化を確認した。【００４１】
＜結果＞
結果を図９〜１２に示す。
全身投与の場合では、サフラニンＯ染色標本において、コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群共に、変形性関節症の特徴的所見である関節軟骨表層の染色性低下、関節軟骨の菲薄化、軟骨細胞のクローン性増殖、細胞数の増減が明らかであった（図９）。また、変形性関節症の重症度の指標であるＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅでは、コントロール群、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群間に有意差は認められなかった（図１０、図１１）。一方で大腿骨のＸ線写真では、コントロール群に比べ、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ投与群において大腿骨海綿骨量の増加が認められた（図１２）。【００４２】
上記の通り、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ）の全身投与は、変形性関節症モデルマウスにおける硬骨量を増加させたが、関節軟骨の変性を抑制することはできなかった。
前記実施例１及び参考例１の結果から、ＯＣＩＦ／ＯＰＧの関節内投与は全身投与より、関節軟骨変性の抑制作用において、優れた効果を示すことが明らかになった。【００４３】
（参考例２：関節軟骨の変性に対する内在性破骨細胞形成抑制因子の作用）
本参考例２では、関節軟骨の変性に対する内在性の破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ）の作用を調べるため、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ欠損マウス、及び、野生型マウスにおける関節軟骨の組織学的差異を検討した。【００４４】
＜方法＞
まず、加齢依存的な関節軟骨の変性に対する内在性ＯＣＩＦ／ＯＰＧの作用を調べるため、実験動物として、若年（８週齢）及び老齢（６ヶ月齢）の、ＯＣＩＦ／ＯＰＧホモ欠損マウス（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ−／−）、ＯＣＩＦ／ＯＰＧヘテロ欠損マウス（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−）、及び、同腹の野生型マウス（ＷＴ）をそれぞれ準備した。各マウスは日本クレア株式会社より入手した。各マウスの膝関節の薄切標本に、サフラニンＯ染色を施し、組織学的特徴を比較した。
その結果、若年のＯＣＩＦ／ＯＰＧ−／−マウスでは、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウス及びＷＴマウスに比べ、関節軟骨層の菲薄化、軟骨下骨への血管の浸潤、骨軟骨接合部の不規則性が観察された（図１３、Ａ〜Ｃ）。また、老齢のＯＣＩＦ／ＯＰＧ−／−マウス及びＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウスでは、ＷＴマウスに比べ、表面の線維化（Ｅ、矢尻）やプロテオグリカン欠損（Ｆ、矢印）が観察された（図１３、Ｄ〜Ｆ）。加齢に従い、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ−／−マウスにおける軟骨変性は亢進され、これはＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウスにおいても同様であった。これらの結果から、加齢依存的な関節軟骨の変性を防ぐためには、十分な量のＯＣＩＦ／ＯＰＧ発現が必要であり、内在性ＯＣＩＦ／ＯＰＧが、関節軟骨変性の抑制に作用していることが示された。【００４５】
しかしながら、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ−／−マウスにおいては軟骨下骨の減少も観察されたことから、上記結果からは、内在性ＯＣＩＦ／ＯＰＧが関節軟骨変性を抑制するにあたり、軟骨細胞の代謝に直接的に作用しているのか、或いは、ＲＡＮＫシグナルを介した軟骨下骨における破骨細胞性の骨吸収の抑制を通じて、間接的に作用しているのかが定かではなかった。そこで本発明者らは、若年（８〜１２週齢）のＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウス（ｎ＝７）、及び同腹のＷＴマウス（ｎ＝７）を実験動物として選択し、内在性ＯＣＩＦ／ＯＰＧの、関節軟骨に対する直接的な作用を検討した。用いた週齢（８〜１２週齢）において、関節軟骨の構造及び総骨量については、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウスとＷＴマウスとの間で差異は見られなかった。亀倉らの方法（Ｋａｍｅｋｕｒａら（２００５）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １３，６３２−４１参照）に準じて、各マウスの内側側副靭帯、内側半月板を切除することにより、変形性関節症（ＯＡ）モデルマウスを作製した。各マウスを手術後４週にて屠殺し、ＯＡを誘導した膝関節を採取し、固定、脱灰、脱水の後にパラフィン包埋し、薄切標本を作製して、以下の組織学的評価に供した。【００４６】
[組織学的評価]
作製した各マウスの膝関節の薄切標本にサフラニンＯ染色を施し、Ｍａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅによるＯＡ重症度評価、及び、関節軟骨の厚み定量を、前記実施例１と同様に行った。【００４７】
＜結果＞
結果を図１４〜１７に示す。
亀倉らの文献（Ｋａｍｅｋｕｒａら（２００５）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １３，６３２−４１）で報告されている通り、ＯＡを誘導したＷＴマウスで内側脛骨軟骨の変性が観察された（図１４、ａ及びｃ）。ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウスでは、ＷＴマウスに比べ、軟骨変性の亢進が明らかであった（図１４、ａ〜ｄ）。また、変形性関節症の重症度の指標であるＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ、ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｓｔｒｕｎｃｉｏｎ  ｓｃｏｒｅは共に、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウスで、ＷＴマウスよりも約２５％高い値を示した（図１５、図１６、Ｐ＜０．０５）。また、軟骨下骨の形態については、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウスとＷＴマウスとの間で差異は見られなかった（図１４、ｃ及びｄ）のに対し、軟骨の厚みはＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−マウスにおいて有意に減少していた（図１７、Ｐ＜０．０５）。なお、図１５〜１７中、各データは平均±ＳＤで表し、「＊」はＯＣＩＦ／ＯＰＧ＋／−とＷＴ間の差異が統計学的に有意であったことを示す（Ｐ＜０．０５）。【００４８】
以上の結果から、内在性破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ）は、変形性関節症の進行に対する関節軟骨の維持に重要な役割を果たしていることが示された。また、このＯＣＩＦ／ＯＰＧの関節軟骨に対する作用は、軟骨下骨を介した間接的な軟骨細胞の保護によるものではなく、軟骨細胞に直接的に影響を及ぼすことによるものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の医薬及び方法は、関節軟骨の変性の治療又は予防に好適であり、中でも、変形性関節症の治療又は予防に特に好適である。
【図１】
2008078588.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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