(57)【要約】  本発明は、工業的にバイオマスを生成源として水素を生産するために用いることができる、水素収率及び水素生産速度に優れた水素発生菌を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、ＹＮＵ嫌気培地で、４７℃、ｐＨ６．０の条件で回分培養することにより、グルコースを基質として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上の水素を生産することを特徴とするクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌、及び、該クロストリジウム属菌を用いることを特徴とする水素生産方法を提供することを目的とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＮＵ嫌気培地で、４７℃、ｐＨ６．０の条件で回分培養することにより、グルコースを基質として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上の水素を生産することを特徴とするクロストリジウム属菌。
【請求項２】
クロストリジウム・ペルフリンゲンスであることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項３】
水素生産の最適温度が、４７〜５０℃であることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項４】
細胞増殖の最適温度が、４４〜４７℃であることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項５】
ラフィノース分解能を有することを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項６】
クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１  ＮＩＴＥ  ＢＰ−３１８であることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項７】
請求項１記載のクロストリジウム属菌を用いることを特徴とする、水素生産方法。
【請求項８】
請求項1〜６のいずれか記載のクロストリジウム属菌の、水素生産への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌に属する新規水素発生菌、及び該水素発生菌を用いた水素生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料等と異なり、燃焼しても二酸化炭素等やその他の環境汚染物質の排出がほとんどない、クリーンなエネルギーであり、また、再生可能なエネルギーであること等から、石油等の化石燃料に代わるエネルギーとして、水素燃料が注目されている。このため、より効率よく水素を生成する方法に関する研究が世界中で盛んに行われている。
水素は様々な生成源から生成可能であるが、リサイクルの観点から、バイオマスを生成源として生産することが好ましい。バイオマスからの水素生産方法として、主に熱化学的方法と微生物による生物学的方法があるが、生物学的方法が好ましい。通常、バイオマスは、有機性廃棄物やサトウキビ等のエネルギー作物であり、含水量が多いため、高温ガス化等の熱化学的方法では、コストが過大となるためである。【０００３】
バイオマスから水素を生産する際に用いられる微生物は、主に、光合成細菌と発酵細菌に分けられる。光合成細菌は、光エネルギーを用いることにより、バイオマス中の有機物を、完全に水と炭酸ガスにまで分解できるが、日中のみしか利用できないだけでなく、朝夕は光エネルギーが足りないという欠点がある。一方、発酵細菌は、密閉された容器内でも水素生産が可能であり、生ゴミや廃糖蜜等の含水率の高いバイオマスからの水素生産に適している。また、光合成細菌による水素生産よりも水素生産速度が速い。このため、工業上は主に、発酵細菌を用いた水素生産法が用いられる。【０００４】
バイオマスからの水素生産に用いられる嫌気性発酵細菌として、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）等のクロストリジウム属菌や、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等のエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌等がある（例えば、非特許文献１参照。）。クロストリジウム属菌を用いてバイオマスから水素生産を行う方法として、例えば、（１）有機材料から水素を発生させる水素製造方法において、上記有機材料を投入する投入工程と、クロストリジウム属の微生物を投入する微生物投入工程と、上記有機材料と上記微生物とを反応させ水素を生成する反応工程と、を具備し、この反応工程中に、反応・分解を促進させるため上記有機材料と上記微生物を撹拌する撹拌工程を設けることを特徴とする水素製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。その他、エンテロバクター属菌を用いてバイオマスから水素生産を行う方法として、例えば、（２）原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、少なくともその表面に微生物を固定可能な担体が存在する条件下で、エンテロバクター属菌によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする水素およびエタノールの製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。【０００５】
クロストリジウム属菌やエンテロバクター属菌等は、通常、３０〜３８℃で水素を生産する水素発生菌である。これに対し、６５〜８０℃で水素を生産する高温水素発生菌を用いた高温水素発酵法がある。クロストリジウム属菌等を用いた水素生産法に比較して、高温水素発酵法では、水素収率が向上され、また雑菌による基質の汚染を防止しやすい、という利点を有している。例えば、サーモトガ・マリチマ(Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ)は、８０℃の回分培養で、理論上の最大水素収率である４ｍｏｌ／ｍｏｌ−ｇｕｌｃｏｓｅを達成している（例えば、非特許文献２参照。）。このような、高温での高い水素収率は、乳酸等の好ましくない副産物の代謝が抑制されているからであると考えられている。
【非特許文献１】de Vrije and Classen  （２００３）“Dark hydrogen fermentations” in Bio-methane and Bio-hydrogen、ｐ１０３〜１２１
【特許文献１】特開２００１−１５７５９５号公報
【特許文献２】特開２００６−１８０７８２号公報
【非特許文献２】Schroder et al.（１９９４）Archives of microbiology  １６１：ｐ４６０〜４７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
食品廃棄物等のバイオマス中には、水素発生菌による水素生産を阻害する様々な物質が含まれているため、バイオマスから水素を生産するために用いられる水素発生菌は、水素収率と水素生産速度に優れていることが望ましい。
しかしながら、３０〜３８℃で水素を生産する既知のエンテロバクター属菌等は、水素収率及び水素生産速度が十分ではなく、工業的にバイオマスを生成源として水素を生産するために用いることは非常に困難である。【０００７】
一方、６５〜８０℃で水素を生産する高温水素発生菌は、水素収率は優れているが、水素生産速度が非常に遅いため、やはり、工業的利用には適さない。例えば、サーモトガ・マリチマは、８０℃、１Ｌの回分培養液で１時間当たりの水素生産速度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈに過ぎない（例えば、非特許文献２参照。）。このような、高温での水素生産速度の遅さは、菌の細胞密度が低いからであると考えられている。【０００８】
本発明は、工業的にバイオマスを生成源として水素を生産するために用いることができる、水素収率及び水素生産速度に優れた水素発生菌を提供することを目的とする。
また、本発明は、該水素発生菌を用いる水素生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、３０〜３８℃と６５〜８０℃の間の中温において水素生産を行うことにより、水素収率及び水素生産速度の双方を向上させ得ると考え、５０℃前後において水素を良好に生産することができる水素発生菌を見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様に関する。
（１）  ＹＮＵ嫌気培地で、４７℃、ｐＨ６．０の条件で培養することにより、グルコースを基質として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上の水素を生産することを特徴とするクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌。
（２）  クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）であることを特徴とする前記（１）記載のクロストリジウム属菌。
（３）  水素生産の最適温度が、４７〜５０℃であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のクロストリジウム属菌。
（４）  細胞増殖の最適温度が、４４〜４７℃であることを特徴とする前記（１）〜（３）いずれか記載のクロストリジウム属菌。
（５）  ラフィノース分解能を有することを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載のクロストリジウム属菌。
（６）  菌株が、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３１８）である前記（１）〜（５）いずれか記載のクロストリジウム属菌。【００１１】
（７）  前記（１）〜（６）いずれか記載のクロストリジウム属菌を用いることを特徴とする水素生産方法。
（７）に係る水素生産方法においては、前記クロストリジウム属を４７〜５０℃で培養することが好ましい。また、用いる培養液のｐＨは、５．８〜６．５であることが好ましく、６．０〜６．２であることが特に好ましい。【００１２】
（８）  前記（１）〜（６）いずれか記載のクロストリジウム属菌の、水素生産への使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のクロストリジウム属菌は、水素収率に劣ることなく、水素生産速度が非常に速い水素発生菌である。したがって、本発明のクロストリジウム属菌、及び、本発明の水素生産方法を用いることにより、バイオマスを生成源とした場合においても、従来に無く効率よく水素を生産することができる。また、温度維持に大量のエネルギーを必要とする高温水素発酵法に比べて、より少ないエネルギーで温度維持が可能であることから、経済的にも好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株の増殖に対する温度の影響を表したものである。図１Ａは、縦軸を培養液１Ｌ当たりの乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）、横軸を培養時間（ｈ）として、各温度における乾燥菌体重量の経時変化の測定結果を示した図である。◆が３２℃条件下、□が３７℃条件下、△が４１℃条件下、×が４４℃条件下、●が４７℃条件下、及び、▲が５０℃条件下の結果を示している。
【図１Ｂ】クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株の増殖に対する温度の影響を表したものである。図１Ｂは、特に、各温度における最大増殖速度を算出した結果を表したものである。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１において、各培養温度における水素収率を示したものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、各培養温度における培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明におけるＹＮＵ嫌気培地は、表１に示す組成からなる培地であり、嫌気性細菌の培養に適した培地である。各試薬は、通常市販されているものを用いることができる。例えば、日本製薬社製のカゼインペプトン、和光純薬工業社製のＤｒｉｅｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｓ、純正化学社製のＬ−システイン塩酸塩―水和物、純正化学社製のメルカプト酢酸、及び、和光純薬工業社製のＤ（＋）−グルコースを用いることができる。グルコースの濃度は、培養条件等により、適宜決定することができる。また、カゼインペプトンに代えて、カザミノ酸を用いてもよい。【００１６】
【表１】
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【００１７】
本発明のクロストリジウム属菌、特にクロストリジウム・ペルフリンゲンスは、ＹＮＵ嫌気培地で、４７℃、ｐＨ６．０の条件で回分培養することにより、グルコースを基質として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上の水素を生産することを特徴とする水素発生菌である。５０℃前後で水素生産を行うことにより、３０〜３８℃の場合よりも、水素発酵の反応速度が速くなり、より効率よく水素を生産できると考えられるためである。また、水素生産速度が、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上であるような、水素生産能の優れた水素発生菌であれば、多種多様な物質を含むバイオマスを生成源とした場合であっても、従来に無く大量の水素を生産することができるためである。水素生産能は、水素生産速度として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上であれば、特に限定されないが、８０ｍｍｏｌ以上であることが好ましく、１００ｍｍｏｌ以上であることが特に好ましい。【００１８】
本発明のクロストリジウム属菌は、例えば以下の方法により得ることができる。まず、自然界から採取した試料から菌株を分離し、該菌株の中から、５０℃前後の温度条件において、水素生産速度として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上である水素生産能を有する菌株を選択することにより、本発明のクロストリジウム属菌を得ることができる。【００１９】
以下、さらに詳細に説明する。
１．菌株の取得
下水排水等から採取した液や泥等の試料を、表２に示す組成のＡＢＣＭ半流動培地（栄研化学株式会社製）の高層培地に植え付けた後、５０℃の恒温槽で培養してガス発生の活発な試料を選別した。該選別した試料を、ＡＢＣＭ寒天培地（栄研化学株式会社製）に塗布し、５０℃で嫌気培養してコロニーを得た。さらに該コロニーから釣菌した菌を、同様に嫌気培養することにより、純粋単離された菌株を得た。該純粋単離された菌株を、ＹＮＵ嫌気培地に植え付け、５０℃の恒温槽でさらに培養することにより、ガスを活発に生産する菌株を選別した。さらに、該選別した菌株の中から、水素生産能が、水素生産速度として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上である菌株を選別し、このうち１株をＨＮ００１と名付け、水素生産能についてさらに詳細に検討した。なお、水素生産速度は後記実施例１に記載の方法で行った。【００２０】
【表２】
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【００２１】
２．ＨＮ００１株の同定及び生化学的性状
ＨＮ００１株の遺伝学的性質を調べるため、ＨＮ００１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を常法により同定した。該塩基配列を配列表の配列番号１に示す。国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）上で、該塩基配列について相同性検索を行ったところ、クロストリジウム・ペルフリンゲンス  ＡＴＣＣ  １３１２４と９８％の相同性を有していた。従って、ＨＮ００１株はクロストリジウム・ペルフリンゲンスに属する微生物と推定された。【００２２】
さらに、偏性嫌気性菌の同定キットであるアピケンキＡＰＩ２０Ａ（ビオメリューＳ.Ａ.社製、輸入販売元：日本ビオメリュー社製）を用いて、製造者のマニュアルに従い、ＨＮ００１株の生化学的性状を調べた。具体的には、基質が含有されている各チューブに、ＨＮ００１株の菌浮遊液を分注し、２４時間嫌気培養する。その後、各チューブの色調変化から、アポラボソフト（ビオメリューＳ.Ａ.社製）を用いて、ＨＮ００１株の糖分解能等を判断した。【００２３】
【表３】
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【００２４】
表３は、アピケンキＡＰＩ２０Ａを用いた独立した５回の実験の、アポラボソフトによる解析結果をまとめたものである。表には、各菌株の期待される測定結果も併せて記載した。表中上段は、各チューブに含有されている基質を表している。ＩＮＤはトリプトファン、ＵＲＥは尿素、ＧＬＵはブドウ糖、ＭＡＮはマンニット、ＬＡＣは乳糖、ＳＡＣは白糖、ＭＡＬは麦芽糖、ＳＡＬはサリシン、ＸＹＬはキシロース、ＡＲＡはアラビノース、ＧＥＬはゼラチン、ＥＳＣはエスクリンクエン酸鉄、ＧＬＹはグリセリン、ＣＥＬはセロビオース、ＭＮＥはマンノース、ＭＬＺはメレジトース、ＲＡＦはラフィノース、ＳＯＲはソルビット、ＲＨＡはラムノース、及びＴＲＥはトレハロースをそれぞれ示している。【００２５】
この結果、ＨＮ００１株は、クロストリジウム・ペルフリンゲンスと同様に、グルコース分解能、スクロース分解能、マルトース分解能、及びマンノース分解能を有していた。一方、ＨＮ００１株は、公知のクロストリジウム・ペルフリンゲンスと異なり、ラフィノース分解能を有していたが、ラクトース分解能及びトレハロース分解能を有していなかった。アポラボソフトによる判定では、ＨＮ００１株は、生化学的性状においては、クロストリジウム・ペルフリンゲンスよりも、アクチノマイシス・ヴィスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）に近いと判断された。【００２６】
遺伝学的性質から、ＨＮ００１株はクロストリジウム・ペルフリンゲンス菌種であることが確認された。また、相同性が９８％であり、完全に一致している既知微生物が検索されなかったこと、及び、生化学的性状において、ラフィノース分解能を有するが、ラクトース分解能及びトレハロース分解能を有さなかったことから、公知の菌株とは異なる性質を有することが明らかである。【００２７】
そこで、出願人は、２００７年２月２３日に、ＨＮ００１株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、国内寄託（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−３１８；原寄託）として寄託した。さらに、出願人は、２００８年３月３日に、該原寄託について、同国際寄託機関にブダペスト条約上の国際寄託への移管申請を行い、２００８年３月７日付で原寄託についての受託証（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−３１８）が発行された。【００２８】
３．増殖の至適温度
クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株の増殖に対する温度の影響を調べるために、３２、３７、４１、４４、４７、及び５０℃の各温度条件下で培養した。
具体的には、まず、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株を、ｐＨ６．０のＡＢＣＭ半流動培地の高層培地入りの試験管に植菌した後、３０℃で１６時間嫌気培養したものを前培養液として調製した。３５０ｍＬのｐＨ６．０のＹＮＵ嫌気培地に、該前培養液を８ｍＬずつ、それぞれ添加した後、各温度条件下でそれぞれ培養し、培養液中の菌体量の経時変化を観測した。培養は、３０ｒｐｍの攪拌速度で行った。また、培養液中の菌体量の測定は、各培養液を遠心処理することにより、沈殿物として菌体を回収した後、該沈殿物の乾燥重量を測定することにより行った。【００２９】
図１は、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株の増殖に対する温度の影響を表したものである。図１Ａは、各温度における乾燥菌体重量の経時変化の測定結果を示した図である。縦軸は培養液１Ｌ当たりの乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）であり、横軸は培養時間（ｈ）である。◆が３２℃条件下、□が３７℃条件下、△が４１℃条件下、×が４４℃条件下、●が４７℃条件下、及び、▲が５０℃条件下の結果を示している。図１Ｂは、該測定結果から、各温度における最大増殖速度を算出した結果を表したものである。この結果から、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株の増殖温度は、４４〜４７℃であることが好ましいことが明らかである。
なお、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株は、５１℃では増殖が確認されたが、５３℃では増殖が確認されなかった。この結果から、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株は、３２℃〜５１℃において増殖可能であることが分かった。【００３０】
３．水素生産能の測定
クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株を、１６ｍＬのＡＢＣＭ半流動培地の高層培地入りの試験管に植菌し、３０℃で１６時間嫌気培養した。その後、高温に順化させるため、該試験管を４５℃で３０分間嫌気培養したものを前培養液とした。該前培養液を、ｐＨ６．０のＹＮＵ嫌気培地、若しくは、グルコース濃度を２．０％として調製したｐＨ６．０のＹＮＵ嫌気培地に、それぞれ植菌し、後記実施例１と同様に、４７℃で回分培養を行い、水素を生産させた。生産された水素量を、後記実施例１に記載の方法により測定し、水素収率（ｍｏｌ／ｍｏｌ−ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）と最大水素生産速度を算出した。ここで、水素収率とは、１ｍｏｌの単糖から生産された水素のモル数を示したものである。また、最大水素生産速度は、培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度（ｍｍｏｌ／Ｌｈ）と、該培養液中の乾燥菌体重量１ｇ当たりの最大水素生産速度（ｍｍｏｌ／ｇｈ）の２種類で示した。【００３１】
得られたクロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株の水素収率及び最大水素生産速度を、代表的な公知の水素発生菌と比較した。該比較の結果を表４に示す。なお、ＨＮ００１株以外の菌株の水素収率等は、非特許文献１を元に記載したものである。文献上に対応するデータが記載されていなかった箇所は空欄とした。【００３２】
【表４】
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【００３３】
クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株は、４７℃、ｐＨ６．０の条件で回分培養した場合に、水素収率が２．４であった。すなわち、１ｍｏｌのグルコースから２．４ｍｏｌの水素を生産することができる菌株であった。また、培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度が、１６０ｍｍｏｌ／Ｌｈであり、培養液中の乾燥菌体重量１ｇ当たりの最大水素生産速度が、４４ｍｍｏｌ／ｇｈであった。【００３４】
一方、表記載の他の菌株では、培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度は、エンテロバクター・アエロゲネスＨＵ−１０１ｍＡＹ−２の５８ｍｍｏｌ／Ｌｈが最も速く、培養液中の乾燥菌体重量１ｇ当たりの最大水素生産速度は、エンテロバクター・クロアカエ(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ)IIＴ−ＢＴ０８の２９ｍｍｏｌ／Ｌｈが最も速かった。文献値との比較であり、各実験条件が異なることから、単純に比較することはできないものの、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株は、公知の他の水素発生菌よりも、最大水素生産速度が非常に速いことが明らかである。また、水素収率も十分に良好である。したがって、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株、すなわち、本発明のクロストリジウム属菌は、公知の他の水素発生菌よりも、はるかに優れた水素生産能を有していることが明らかである。【００３５】
上記のことから、本発明のクロストリジウム属菌、特にクロストリジウム・ペルフリンゲンスとしては、ＹＮＵ嫌気培地で、４７℃、ｐＨ６．０の条件で回分培養することにより、グルコースを基質として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上の水素を生産することを特徴とする水素発生菌が用いられる。さらに、本発明のクロストリジウム属菌の水素生産能は、水素生産速度として、１Ｌの培養液で１時間当たり８０ｍｍｏｌ以上であることがより好ましく、１００ｍｍｏｌ以上であることが特に好ましい。これら範囲の水素生産能を有するクロストリジウム属菌を用いることにより、従来に無く効率よく水素を生産することができる。【００３６】
また、本発明のクロストリジウム属菌は、上記培養条件において、その水素生産速度が１Ｌの培養液で１時間当たり６０mmol以上であれば、その上限は特に限定されず、より高い水素生産速度を有している方が好ましいが、上述の方法により得られる本発明のクロストリジウム属菌は、通常、同条件下において、６０〜２５０ｍｍｏｌの水素生産速度を有する。また、好ましい該水素生産速度の範囲としては、８０〜２００ｍｍｏｌ、より好ましくは１００〜１８０ｍｍｏｌ、最も好ましくは１００〜１６０ｍｍｏｌの範囲である。【００３７】
４．水素生産の至適温度
前記３．水素生産能の測定と同様に前培養液を調製した。ｐＨ６．０又は６．５のＹＮＵ嫌気培地を３５０ｍＬ入れた５００ｍＬ容のフラスコに、該前培養液を８ｍＬずつ、それぞれ添加した後、後記実施例１と同様に、３０ｒｐｍの攪拌速度で回分培養を行い、水素を生産させた。培養温度は、４１、４４、４７及び５０℃でそれぞれ行った。また、自動調節によってｐＨを一定に保った。生産された水素量を、後記実施例１に記載の方法により測定し、水素収率と培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度を算出した。【００３８】
【表５】
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【００３９】
表５は、各培養温度における水素収率と培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度を示したものである。ｐＨ６．０とｐＨ６．５のいずれにおいても、４１℃において最大水素生産速度は最も遅かったが、それぞれ５９．８ｍｍｏｌ／Ｌｈと４１．１ｍｍｏｌ／Ｌｈであった。これらの値は、他の培養温度における最大水素生産速度に比較すると遅いものの、表４との比較から明らかであるように、十分に良好な最大水素生産速度である。したがって、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株は、４７〜５０℃において、良好に水素を生産し得ることが明らかである。【００４０】
また、表５より明らかであるように、最大水素生産速度はｐＨ６．０とｐＨ６．５のいずれにおいても４７℃で最速となり、水素収率はｐＨ６．０とｐＨ６．５のいずれにおいても５０℃が最高となった。つまり、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株、すなわち、本発明のクロストリジウム属菌の水素生産は、４７℃〜５０℃が最も適していることが明らかである。また、増殖の至適温度が４４〜４７℃であることから、増殖速度は、必ずしも水素生産速度と比例しないことがわかった。【００４１】
本発明のクロストリジウム属菌は、下水排水等から採取した液や泥等、すなわちバイオマス中に元々生息していた菌の中から、水素発生能、特に水素生産速度に優れた菌を選出して得られたものである。したがって、本発明のクロストリジウム属菌は、バイオマスを生成源とした場合においても、従来に無く効率よく、大量の水素を生産することができる。【００４２】
本発明のクロストリジウム属菌は、通常、クロストリジウム属菌の培養に用いられている方法により、培養することができる。嫌気培養をすることが好ましい。回分培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）であってもよく、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）であってもよい。コンタミネーションのリスクが軽減され、かつ、特別な装置等も必要ないため、少量の水素を生産させる場合には、回分培養であることが好ましい。一方、培養環境を常に一定に保ちやすく、生産性が安定するため、工業的な生産等の大量に水素を生産する場合には、連続培養であることが好ましい。連続培養を行う場合には、本発明のクロストリジウム属菌を、通常用いられている担体等に固定してもよい。【００４３】
本発明のクロストリジウム属菌の培養に用いられる培養液は、特に限定されるものではなく、市販されている嫌気性細菌用の培地等の、通常、クロストリジウム属菌の培養に用いられている培養液を用いることができる。該培地として、例えば、ＡＢＣＭ半流動培地やＹＮＵ嫌気培地がある。培養液のグルコースの濃度は、培養条件等により、適宜決定することができる。また、培養温度は本発明のクロストリジウム属菌が培養可能な温度であれば特に限定されるものではないが、４４〜４７℃であることが好ましい。【００４４】
本発明のクロストリジウム属菌を常法により培養することにより、効率よく水素を生産することができる。水素生産時の培養液は、通常、クロストリジウム属菌の培養に用いられている培養液であれば、特に限定されるものではないが、ＹＮＵ嫌気培地であることが好ましい。また、本発明のクロストリジウム属菌であれば、本発明の効果を損なわない限り、生ごみ等の食品廃棄物その他産業廃棄物を培養液の原料とすることもできる。このような原料を用いた場合であっても、本発明のクロストリジウム属菌によれば、従来にない効率で水素を生産することができる。【００４５】
また、水素生産時の培養温度は、その水素生産効率の観点から、４７〜５０℃であることが好ましい。また、水素生産時の培養液のｐＨは、特に限定されないが、５．８〜６．５であることが好ましく、６．０〜６．２であることが特に好ましい。【００４６】
また、水素生産時の培養液又は当該発酵培地としての食品廃棄物等に含まれる糖成分としては、本発明のクロストリジウム属菌による水素発酵の基質となるものであれば特に限定されないが、例えば、グルコース、マルトース、スクロース等の単糖類、デンプン等の多糖類等が挙げられる。これら水素発酵の基質となる成分の濃度は、培養条件等により、適宜決定可能であるが、培養液中０．５〜５重量％であることが好ましく、１．５〜２．５重量％であることがより好ましい。【００４７】
さらに、水素生産時のその他培養条件は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されるものでもないが、上記培養温度、培養液等の条件も含めて、水素生産速度が、６０〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈ、好ましくは８０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈ、さらに好ましくは１００〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ・ｈとなる範囲で本発明のクロストリジウム属菌を培養することが好ましい。【００４８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株を、１６ｍＬのＡＢＣＭ半流動培地の高層培地入りの試験管に植菌し、３０℃で１６時間嫌気培養した。その後、高温に順化させるため、該試験管を４５℃で３０分間嫌気培養したものを前培養液とした。ｐＨ６．０のＹＮＵ嫌気培地を３５０ｍＬ入れた５００ｍＬ容のジャーファーメンターに、８ｍＬの該前培養液を添加し、３０ｒｐｍの攪拌速度で回分培養を行った。培養温度は、それぞれ、３２、３７、４１、４４、４７、又は５０℃とした。また、自動調節によってｐＨを一定に保った。【００５０】
生産された水素ガスは、１０％水酸化ナトリウム水溶液を通して、二酸化炭素を除去した後、水上置換法によりメスシリンダーに回収して定量した。ガスクロマトグラフィーを用いた分析により、回収したガスが水素ガスであることを確認した。生産された水素量から、水素収率と培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度を算出した。【００５１】
図２Ａは各培養温度における水素収率を、図２Ｂは各培養温度における培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度をそれぞれ示したものである。４７℃における最大水素生産速度は約１３５ｍｍｏｌ／Ｌｈであった。また、最大水素生産速度は４７℃が最も速かったが、水素収率は３２℃と５０℃付近で高くなる傾向が観察された。【００５２】
実施例１の結果から、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１株、すなわち、本発明のクロストリジウム属菌は、ＹＮＵ嫌気培地で、４７℃、ｐＨ６．０の条件で回分培養することにより、グルコースを基質として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上の水素を生産すること、及び、水素生産時の培養温度は、４７℃〜５０℃が最も適していることが明らかである。
【実施例２】
【００５３】
ＹＮＵ嫌気培地のｐＨを、５．５、６．０、６．５、及び７．０とし、かつ、培養温度を４７℃のみとした以外は、全て実施例１と同様にして、各培養から生産された水素量を測定し、水素収率と培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度を算出した。【００５４】
【表６】
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【００５５】
表６は、各ｐＨにおける水素収率と培養液１Ｌ当たりの最大水素生産速度をそれぞれ示したものである。水素収率と最大水素生産速度のいずれもｐＨ６．０で最大であった。ｐＨ６．５においても、最大水素生産速度は８０．４ｍｍｏｌ／Ｌｈであり、６０ｍｍｏｌ／Ｌｈを大きく上回っていたことから、水素生産時の培養液のｐＨは、５．８〜６．５であることが好ましく、６．０〜６．２であることが特に好ましいことが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のクロストリジウム属菌は、非常に優れた水素生産能を有しているため、バイオマス等を生成源とした水素の製造分野で利用が可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月5日(2008.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＮＵ嫌気培地で、４７℃、ｐＨ６．０の条件で回分培養することにより、グルコースを基質として、１Ｌの培養液で１時間当たり６０ｍｍｏｌ以上の水素を生産することを特徴とするクロストリジウム属菌。
【請求項２】
クロストリジウム・ペルフリンゲンスであることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項３】
水素生産の最適温度が、４７〜５０℃であることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項４】
細胞増殖の最適温度が、４４〜４７℃であることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項５】
ラフィノース分解能を有することを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項６】
クロストリジウム・ペルフリンゲンスＨＮ００１  ＮＩＴＥ  ＢＰ−３１８であることを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【請求項７】
請求項１記載のクロストリジウム属菌を用いることを特徴とする、水素生産方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか記載のクロストリジウム属菌の、水素生産への使用。
【請求項９】
ラクトース分解能及びトレハロース分解能を有しないことを特徴とする、請求項１記載のクロストリジウム属菌。
【国際調査報告】
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