【手続補正書】
【提出日】平成15年11月7日(2003.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】  アルツハイマー病のマーカーとしてのニューロステロイド
【特許請求の範囲】
【請求項１】  血液、体液または組織の試験サンプル中における酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）の形成を検出する方法であり、
（a）上記試験液体または組織を、対照液体または組織中で酸化代謝物を産生する物質によって処理し、
（b）対照液体または組織を上記物質によって処理し、ついで
（c）試験サンプルおよび対照サンプルにおけるDHEA量が上記処理に応答して上昇するか否かを決定することからなり、
この場合、対照サンプルに比較して試験サンプルにおける応答の欠如は体液の上記試験サンプル中で以前に酸化ストレス誘発DHEA形成が起こったことを指示する方法。
【請求項２】  上記体液または組織は脳脊髄液、血清、海馬組織、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトからなる群より選択される「請求項1」記載の方法。
【請求項３】  上記物質はβ-アミロイドタンパク質である「請求項1」記載の方法。
【請求項４】  上記物質はFeSO4，他のフェントン反応物質、および酸化-還元物質からなる群より選択される「請求項1」記載の方法。
【請求項５】  上記DHEAの量は
（i）サンプルを有機溶媒で抽出し、
（ii）抽出された物質をHPLCクロマトグラフィーに付し、
（iii）ラジオイムノアッセイを用いてDHEAを検出する
ことによって測定する「請求項1」記載の方法。
【請求項６】  上記DHEAの量は質量スペクトルにカップリングさせたガスクロマトグラフィーにより測定する「請求項1」記載の方法。
【請求項７】  上記ラジオイムノアッセイは他のニューロステロイドを認識しない特異的抗体を用いて実施される「請求項5」記載の方法。
【請求項８】  上記サンプルは上記物質で処理したのちのラジカル酸素種の上昇についても試験される「請求項1」記載の方法。
【請求項９】  上記ラジカル酸素種は2,7 DCF蛍光または遊離ラジカルを測定する他の方法を用いて測定する「請求項8」記載の方法。
【請求項１０】  処理と効果の間の相関は、効果がビタミンEまたは他の抗酸化剤によってブロックされるかどうかによって確証される「請求項1」記載の方法。
【請求項１１】  上記サンプルはSU 10603によって前処理される「請求項1」記載の方法。
【請求項１２】  患者における神経病理学的障害の存在を診断する方法であり、上記患者のCNS中におけるニューロステロイドの量を測定することからなる方法。
【請求項１３】  対照に比較してニューロステロイド量の上昇は神経病理学的障害の発症を指示する「請求項12」記載の方法。
【請求項１４】  上記ニューロステロイドはDHEAである「請求項13」記載の方法。
【請求項１５】  対照に比較してニューロステロイド前駆体量の低下は神経病理学的障害の発症を指示する「請求項12」記載の方法。
【請求項１６】  上記ニューロステロイドはDHEAの代謝性前駆体である「請求項15」記載の方法。
【請求項１７】  脳脊髄液がCNSの診断用ツールとして使用される「請求項12」記載の方法。
【請求項１８】  上記DHEAの量は
（i）サンプルを有機溶媒で抽出し、
（ii）抽出された物質をHPLCクロマトグラフィーに付し、
（iii）ラジオイムノアッセイを用いてDHEAを検出する
ことからなる方法によって測定される「請求項14」記載の方法。
【請求項１９】  上記前駆体の量を測定する方法において、
（a）上記患者から血液、体液または組織の試験サンプルを得て、
（b）上記試験液体または組織を、対照液体または組織中で酸化代謝物を産生する物質によって処理し、
（c）対照液体または組織を上記物質によって処理し、
（d）サンプル中においてどの程度のDHEAが産生されるかによって前駆体の量を測定することからなる「請求項16」記載の方法であって、対照サンプルに比較して試験サンプル中のより少ない前駆体は神経病理学的障害の存在を指示するものである上記方法。
【請求項２０】  上記物質はFeSO4である「請求項19」記載の方法。
【請求項２１】  上記神経病理学的障害はアルツハイマー病である「請求項12」記載の方法。
【請求項２２】  「請求項1」記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２３】  「請求項12」記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２４】  血液、体液または組織の試験サンプル中における酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）の形成を検出するキットにおいて、上記血液、体液または組織と接触させた場合に酸化代謝物を産生する試薬からなるキット。
【請求項２５】  さらにDHEA-特異的抗体を含む「請求項24」記載のキット。
【請求項２６】  DHEA-特異的抗体からなる神経病理学的障害を検出するためのキット。
【請求項２７】  細胞をβ-アミロイドペプチドに暴露することを含む、細胞におけるDHEA合成の上昇またはその誘発方法であって、そのような暴露の結果DHEAが合成される上記方法。
【請求項２８】  上記細胞は脳細胞である「請求項27」記載の方法。
【請求項２９】  上記脳細胞はアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される「請求項28」記載の方法。
【請求項３０】  上記合成はビタミンEによって阻害される「請求項27」記載の方法。
【請求項３１】  オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトによるDHEAの合成を修飾する化合物を投与することを含むDHEAの合成が関与する神経病理学的疾患の防止または処置方法。
【請求項３２】  上記神経病理学的疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、アミロイドーシス、毛細管拡張性運動失調、ビンスヴァンガー病、脳腫瘍、ハレルホルデン-シュパッツ病、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、リー病、ミトコンドリア障害、多発脳梗塞性痴呆、ペリツエーウス-メルツバヒャー病、ピック病、卒中、外傷性脳傷害、脊髄損傷および他の末梢神経系傷害からなる群より選択される「請求項31」記載の方法。
【請求項３３】  神経病理学的疾患の処置に有用な可能性がある薬物候補を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、
（a）オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトを含む組成物を神経病理学的疾患のスクリーニングに使用できる可能性をスクリーニングする試験化合物に暴露し、
（b）上記化合物のDHEA合成に対する効果を、オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトを含有するが上記化合物を含まない他の点では同一の対照組成物と比較して評価し、
（c）有用な可能性がある化合物をそれらのDHEA合成に対する修飾作用に基づいて同定することからなるアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、同一の発明者らの名前で2000年1月28日に出願された米国特許仮出願一連番号60/178,698からの優先権を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、中枢神経系におけるデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）のレベルの上昇を試験することによる神経病理学的疾患、とくにアルツハーマー病を検出する診断方法に関する。とくに本発明者らは神経病理学的疾患を有する患者の脳においてDHEAが末梢性DHEAの合成に用いられるのとは別の代謝経路によって形成され、同時にこの別経路に関与するステロイド前駆体の低下が神経病理学的疾患のインディケーターとして働くことを発見した。神経活性ステロイドがヒト脳内で合成される機構ならびに正常および病的な脳機能におけるニューロステロイドの役割を理解することはまた、神経病理学的障害のための薬物処置をより良好に標的化する設計を可能にするものと思われる。
【０００３】
（発明の背景）
デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）はヒトにおける主要な副腎ステロイドである（1）。末梢レベルのピークは、成人期の初期にあり、以後加齢とともに徐々に低下する（1, 2）。その末梢における役割は、十分には確立されていないが、主としてアンドロゲンの前駆体として働くものと考えられている（3）。脳におけるDHEAレベルは末梢にみられるレベルより高いが、これらのレベルは、末梢のステロイド作動性臓器を除去したのちにも維持される（4, 5）。DHEAおよびその硫酸塩型はそれらがGABAA受容体複合体、およびシグマ受容体を介するNMDA-仲介グルタミン酸伝達に作用を有する点でニューロアクティブと考えられている（6, 7）。さらに、DHEAおよびDHEA硫酸塩（DHEA-S）は学習および記憶の修飾に関与すると考えられている（8, 9）。
【０００４】
DHEAのニューロステロイドとしての役割は十分に確立されている（10）。しかしながら、DHEAが脳で産生される機構は議論の原因となってきた。活性なシトクロームP450 17α-ヒドロキシラーゼ（P450c17）の存在の証拠はプレグネノロンをDHEAに変換する末梢性ステロイド生成酵素と矛盾している。発生の初期におけるP450c17に対するmRNAの発現にはある種の証拠がある（11）が、この所見を報告した同じグループは成熟齧歯類ではmRNAを検出できなかったと報告している（12）。一つの報告は成熟齧歯類での発現を指示している（13）が、タンパク質または酵素活性の証拠は現れていない（14, 5）。
【０００５】
ニューロステロイドは、多くの様々な臨床状態たとえば記憶（9, 26, 85）、うつ状態（84）および月経前緊張症（67）との関連が指摘されてきた。それらはまた、GABAの阻害を増強する（65）それらの能力により、不安（36, 37, 40, 46）およびてんかん（35, 41, 47）の処置用薬物としての可能性が提案されている。幾つかの研究はヒト脳におけるニューロステロイドの限局的な分布に注目している（30, 31, 38）が、これらのステロイドがどこで合成されたのかに関しては、何の証拠もない。さらに、ニューロステロイドが存在すると考えられる齧歯類またはヒト脳のいずれかにおけるニューロステロイド生合成の調節機構を調べた研究もこれまで報告されていない。
【０００６】
脳におけるニューロステロイドの役割および脳細胞由来のニューロステロイド合成の機構に関する情報はないにもかかわらず、DHEAの役割、または加齢過程におけるそのレベルの低下に関しては多くの考察がある（1, 2）。ヒトでは末梢のDHEAは年齢とともに低下するので、脳でも加齢とともにDHEAは低下すると推定されてきた。しかしながらこの仮説を支持するために利用できる有効な研究はない。多数の研究が、DHEAおよびDHEA-Sの末梢におけるレベルを、認識機能（23-25）または痴呆もしくはアルツハイマー病の将来の発症（26）と関連づけることを試みてきた。実際、DHAEの補充が最近、宣伝されているインターネットウエブサイトには、初期または後期のアルツハイマー病患者で正常対照に比較してDHEA-Sレベルの有意な低下が報告されている。記憶および認識機能を改良するために有利な可能性に関して、DHEAの補充には様々な意見はあるが、科学的研究も、末梢DHEAレベルと認識能力の関係、または将来の神経病理学的疾患の予言者としての末梢DHEAレベルの使用を結論的に証明するには至っていない。
【０００７】
脳疾患および加齢過程のよりよい理解を発展させる目的で、ならびにこの知識が新しい薬物および診断方法の設計を創造すると思われることから、脳におけるニューロステロイドの合成および調節の更なる理解は有益であると考えられる。
【０００８】
（発明の概要）
文献の報告とは異なり、本発明者らは驚くべきことにアルツハイマー病に罹患している患者では中枢神経系（CNS）のDHEAが上昇していることを発見した。この発見は、アルツハイマー病患者のDHEAレベルは脳を含めて異常に低いと主張するこれまでの報告と矛盾し、多くの会社が最近、アルツハイマー病の発症を防止する手段としてDHEAの補充を提唱している事実と重大な関連を有するものである。しかも本発明者らは、以前の研究の焦点とは異なり、DHEAは脳において、末梢で用いられるのとは別の代謝経路により合成されることも発見した。これらの所見が、神経病理学的疾患とくにアルツハイマー病の診断または検出を目的とする本発明の方法およびキットの基盤となっている。
【０００９】
本発明の方法には、患者の中枢神経系および血清中のニューロステロイド量の測定を包含する。とくに、本発明の方法は、神経病理学的疾患の発症初期のインディケーターとしてDHEAレベルの上昇または新たに同定されたDHEA前駆体レベルの低下のスクリーニングを包含する。細胞をβ-アミロイドタンパク質に暴露することによりDHEAの合成を起こさせる方法または上昇させる方法も、β-アミロイドタンパク質および酸化的ストレスを誘発する他の物質または条件がDHEA合成の別経路に調節的な役割を有するとの本明細書に記載の所見から、本発明に包含される。脳におけるニューロステロイドの生合成およびその調節の機構を理解すること、ならびに脳DHEAの別代謝経路の性質および神経病理学的疾患におけるDHEA産生増加の役割を悟ることは、開示されたスクリーニング方法により同定された患者における疾患の進行の防止または処置を目指すプロアクティブな処置の設計を可能にすると思われる。
【００１０】
図面の簡単な説明
図1：アルツハイマー病（AD）および対照脳におけるニューロステロイドレベル
ヒト脳における内因性ニューロステロイドレベルはHPLC精製後に特異的なラジオイムノアッセイにより測定した。ADおよび対照患者の間のプレグネノロンレベルには有意差はない。しかしながら、調べた3つの領域のすべてにおいてAD患者のDHEAは有意に高いレベルを示す。提示したデータは3〜10サンプルからの二重の測定についての平均±SEMである。NS：有意差なし。**P＜0.01。
【００１１】
図2：ADおよび対照脳におけるP450c17のmRNA発現
RT-PCR増幅P450c17をDNAブロットによって追跡すると、P450c17は対照およびAD患者のいずれの皮質でも発現することを示すが、発現は手許にあったAD患者の一つにのみ見られる。海馬ではP450c17の検知可能な発現は認められず、この領域のDHEAは末梢酵素仲介経路によっては作成されないことが指示される。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号で標識する。
【００１２】
図3：ADおよび対照脳におけるAβ免疫反応性
脳ホモジネートをSDS-PAGEで分離し、β-アミロイド（Aβ）ペプチドのアミノ酸17〜24に対するモノクローナル抗体、4G8でブロットした。A）AD患者の視床下部におけるAβ-免疫反応性の大部分は対照患者の場合よりも低分子量種のものである。対照サンプル中にも同様に検出可能なAβがある。B）Aβ-免疫反応性は対照患者の海馬では検出されないが、AD患者の海馬には存在する。C）Aβ-免疫反応性はすべてのAD患者の前頭皮質に類似の分子量種パターンで存在する。AD前頭皮質Aβ-免疫反応性の大部分は約30 kDaである。対照患者とくにC5患者ではある程度のAβ-免疫反応性は存在するが、この免疫反応性はAD患者の場合より高い分子量、約50 kDaを示す。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号を付す。
【００１３】
図4：ADおよび対照患者からの脳脊髄液（CSF）中DHEAおよびAβレベル
A）DHEAはCSF抽出物からHPLCにより精製し、特異的ラジオイムノアッセイにより測定した。DHEAレベルは対照の場合よりAD対象ではるかに高い。
B）対照患者は98 kDa種のみを有するが、AD患者は46〜98 kDaの広い分子量範囲で存在するAP-免疫反応性を有する。
【００１４】
図5：ADおよび対照患者におけるFeSO4に対する血清応答
AD患者（A）からの血清を10 mM FeSO4で処理した場合、DHEAレベルの上昇はない。しかしながら、対照患者（B）からの血清を10 mM FeSO4で処理した場合、DHEAレベルにおける大きな誘導がみられ、酸化剤により作用されることが可能なDHEA前駆体の存在が指示される。AD患者はこの前駆体をもたず、それは多分、末梢に到達する前に脳で既に変換されたものと考えられる。
【００１５】
図6：ヒト脳細胞はD合成に対する別経路を有する
細胞を、5 mM SU10603の存在下または不存在下にFeSO4濃度を上昇させて処理した。2時間後、細胞およびメジウムをエーテル：酢酸エチルで抽出処理したのち、サンプルを逆相C18 TLCプレート上に流し、分画をジエチルエーテルで抽出してDの量をRIAで測定した。Dレベル（pg/mgタンパク質）を片側ANOVAで分析した。（A）KG-1-C；F＝1.948, p＝0.0979（B）MGM-1；F＝5.004, p＜0.001（C）MGM-3；F＝0.5902, p＝0.7366（D）NHA；F＝4.131, p＜0.01および（E）hNT-PF；F＝0.6552, p＝0.6886．データは平均SEM（n＝4〜15）で示す。すべての実験は、FeSO4に加えて5 mM PとインキュベートしたhNT-PF細胞の場合を除いて、内因性Pの不存在下に実施した。X軸上の標識はFeSO4のmM用量を指示し、SU, SU/3およびSU/10は相当するmM用量のFeSO4とともに添加した5 mM SU10603を指示する。
【００１６】
図7：FeSO4はMGM-1およびNHA細胞内のROSレベルを上昇させる
FeSO4処理は試験したすべての用量でMGM-1およびNHA細胞性ROSのレベルの有意な上昇を引き起こす（*, MGM-1：F=59.883, p＜0.0001；■, NHA：F=25.419, p＜0.0001）。NHA細胞はROS産生の意味でヒトグリオーマ細胞よりもFe+感受性である。
【００１７】
図8：β-アミロイドは細胞性ROSおよびD合成を上昇させる
MGM-1細胞をβ-アミロイド（Aβ）単独またはAβおよびビタミンEと、少なくとも24時間処理した。細胞性ROSおよびDレベルを測定した。Aβは対照のレベル以上にROSを有意に（**P<0.01）上昇させ、これはビタミンEの共処理で部分的にブロックされた（p=0.054 vs Ab）が、なお対照のレベルより有意であった（**P<0.01）。同様に、AbはDレベルを対照以上に有意に（**P<0.01）上昇させ、この作用はビタミンEでブロックされた（*P<0.05 vs Ab）。データは対照以上の平均上昇SEM（n=12）として示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、脳内DHEAレベルの上昇に基づいて、酸化的ストレス関連神経病理学的疾患の初期段階で患者を同定できること、およびこれらの患者におけるDHEAは脳内で別の代謝経路によって合成されることを発見した（16）。この経路は細胞内遊離ラジカルおよび反応性酸素種により新規な前駆体を介して調節され、この前駆体の不存在または低下は、これらの患者のCNS中におけるDHEAの観察される低下と平行する。前駆体の正確な同一性はまだ不明であるが、その存在はFeSO4、および前駆体が存在すると古典的フェントン反応およびDHEAの形成を生じると思われる他の還元剤の添加により（15）測定することができる。
【００１９】
細胞にFe2+を添加して酸素の遊離ラジカルを発生させることは以前に記載されている（88, 89）。酸素遊離ラジカルの発生は神経変性に関係し（44）、酸化的ストレスの証拠はアルツハイマー病の脳において示され（20, 21, 29）、この場合酸化的ストレスはアミロイドプラークおよび神経細線維のもつれの形成に寄与する（45, 83）。β-アミロイドプラークはアルツハイマー病プラークの成分であり（18）、幾つかの機構を介して（55, 58, 59）反応性酸素種（ROS）の増加を引き起こす場合がある。
【００２０】
FeSO4のDHEA形成に対する作用およびFe2+およびβ-アミロイドのROSに対する作用を考慮し、DHEAレベルがアルツハイマー病患者の脳において上昇するという本明細書に報告された発見を考え合わせて、本発明者らは、DHEA合成の別代謝経路はβ-アミロイドによって刺激されると推測した。その結果、オリゴデンドロサイトがβ-アミロイドに暴露された場合、これらの細胞はDHEA合成の増加を生じた。一方、β-アミロイドの作用は、強力な抗酸化剤であることが知られている（52）ビタミンEによってブロックされた。アルツハイマー病患者の脳におけるDHEAレベルの上昇の観察、ならびにオリゴデンドロサイトによるDHEA合成に対する観察されたβ-アミロイドの役割の両者は、上昇したDHEAレベルが神経病理学的疾患過程の初期のインディケーターとして使用される可能性を示唆する。
【００２１】
したがって、本発明は、酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）の形成、すなわち血液、体液または組織の試験サンプル中における別代謝経路によるDHEAの形成を、前駆体の正常レベルの不存在下または低下時にスクリーニングすることによる検出方法を提供する。前駆体の同一性は未知であるが、その存在は、ROSの形成を生じることができる物質で細胞を処理し、ついでDHEAの形成をスクリーニングすることによって定量することができる。この現象は本発明の以前に報告されていたが、この前駆体が特定の組織で欠落または低下していて、比較スクリーニングアッセイを正当化するという事実は本発明によるまで明らかにされなかった。
【００２２】
したがって本発明には、一つの診断方法として、血液、体液または組織の試験サンプル中における酸化的ストレス誘発DHEA形成を検出する方法において、
（a）上記試験液体または組織を、対照液体または組織中で酸化的代謝物を産生する物質で処理し、
（b）対照液体または組織中を上記物質で処理し、ついで
（c）試験サンプル中において上記処理に応答して試験サンプルおよび対照サンプル中のDHEA量が上昇するか否かを測定することからなる方法を包含する。この場合、対照サンプルに比較して試験サンプルにおける応答の欠如は、酸化的ストレス誘発DHEAの形成が、体液の上記試験サンプル中で以前に起こったことを指示する。
【００２３】
「酸化的ストレス誘発DHEAの形成」は、プレグノノロンのDHEAへの変換をシトクロームP450 17α-ヒドロキシラーゼ（P450c17）に依存するといわれる末梢において使用される古典的合成経路とは異なる別の代謝経路によって合成されるDHEAをとくに意味する。本発明者らは何らかの特異的な理論に固執することを望むものではないが、別の経路には過酸化水素中間体、とくにC-17またはC-20酸素化ステロイドが関与する（28）。酸化的ストレスとは独立した疾患である精神分裂病の患者からのCSFを使用した予備的データは、対照患者に類似したDHEAレベルを示し、別経路が反応性酸素種（ROS）の形成を包含する神経病理学的疾患にとくに関係するとの仮説の有効性をさらに支持するものである。酸化的ストレスが関与する神経病理学的疾患にみられるDHEAレベルの上昇がROS調節前駆体の低下と平行する事実は、本発明の以前には脳のニューロステロイドの合成および調節について利用できる情報がなかったことを考えれば、きわめて重要な示唆である。
【００２４】
様々なタイプ脳細胞が別経路を介してDHEAを合成する能力を調べたのちに、本発明者らは、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトがこの経路を介してDHEAを合成することができるが、神経細胞では合成できないことを見出した。すなわち、脳障害の開始段階にある患者は、上述の方法によりオリゴデンドロサイトまたはアストロサイトのサンプル中における前駆体レベルの低下を示すことによって検出できる可能性がある。
【００２５】
オリゴデンドロサイト細胞およびアストロサイトはその細胞型に特異的なマーカーの存在により同定することができる。たとえば、MBP（ミエリン塩基性タンパク質）および2',3'-サイクリックヌクレオチド-3'-ホスホジエステラーゼの両者はオリゴデンドロサイト特異的なマーカーであり、一方、グリア原線維酸性タンパク質（GFAP）はアストロサイト特異的マーカーである。これらの細胞タイプに特異的な他のマーカーは本技術分野において周知であり、本技術分野の熟練者によれば本アッセイに使用される細胞の同一性を確証するために、たとえばRT- PCRまたは他のスクリーニング技術を用いて容易に使用することができる。
【００２６】
別代謝経路を介してDHEAを合成するそれらの能力により、様々な細胞系がここに特徴づけられたが、これらの細胞系は、アッセイの対照細胞の便利なソースとして使用できる可能性がある。たとえば、FeSO4はNHA細胞、アストロサイト細胞系によるDHEAの形成に重要な作用を有する。すなわちこの細胞系はここに記載の方法による陽性対照として使用できた。グリオーマ多形腫瘍に由来するMGM-1（70）もFeSO4処理ならびにβ-アミロイド処理に、ROS形成およびDHEA合成の増加によって応答する。これに反して、MGM-3細胞（70）もKG-1-C細胞（69）もFeSO4処置に応答せず、陰性対照として使用できる可能性がある。
【００２７】
本発明者らはさらに、FeSO4処理が対照患者の海馬および皮質においてDHEAを有意に増加させ、これらの患者における別の前駆体の存在が指示される。これに反し、アルツハイマー病の患者では、FeSO4処理に応答する有意なDHEAレベルの上昇は前頭皮質においてのみ認められ、海馬または視床下部ではみられないことを示した。FeSO4処理前のアルツハイマー病患者の脳におけるDHEAの高レベルでの存在およびFeSO4処理後のアルツハイマー病患者および対照患者の海馬におけるDHEAの増加の差を考慮すれば、これはアルツハイマー病患者の海馬における前駆体は既にDHEAに変換されてしまっていることを示唆する。すなわち、脳障害の開始段階にある患者は、上述の方法により海馬組織サンプル中における前駆体レベルの低下を示すことにより診断できる可能性がある。
【００２８】
上に開示された診断方法は、しかしながら、脳脊髄液（CSF）または血清により最も簡単に実施できる。アルツハイマー病患者および対照患者から採取した場合、これらの体液はいずれもFeSO4処理に応答してDHEA形成の低下を示す。CSF液体が本発明のアッセイにおいて診断ツールとして使用できる事実は多分、アルツハイマー病の脳における酸化的ストレス誘発DHEA形成に関する本発明者らの他の所見を考えれば論理的であろう。しかしながら、上述の方法で脳における酸化的ストレス誘発DHEA形成を診断するツールとして血清を使用できるという所見は、この関連ではかなり驚くべきことであった。たとえばアルツハイマー病患者の血清におけるDHEAレベルは対照患者における血清レベルに比べて有意に高くはない。したがって、アルツハイマー病患者の血清中の前駆体レベルは、それにもかかわらず低い事実は、正常時には血清中に見出される前駆体がこれらの患者の脳では既に代謝してしまったことを示唆している。すなわち、上に導入した最初の診断方法は様々な体液およびサンプル、たとえば、脳脊髄液、血清、海馬組織、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトからなる群より選択されるサンプルで実施することができる。
【００２９】
上述のように、本発明者らはまた、β-アミロイドペプチドおよびROSの形成を誘発できる他の試薬が体液または組織サンプル中における前駆体の存在の試験に使用できることを発見した。すなわち本方法には、FeSO4のみならず他の還元剤および／または酸化剤が同様に使用可能であり、とくに他の古典的フェントン反応剤もFeCl3およびH2O2によって例示される。
【００３０】
本発明の方法によって形成されるDHEAの量を正確に測定するために考えられる方法は幾つかあるが、DHEAの量は好ましくは（i）サンプルを有機溶媒で抽出し、（ii）抽出された物質をHPLCクロマトグラフィーに付し、ついで（iii）ラジオイムノアッセイを用いてDHEAを検出することによって測定される。好ましい有機溶媒はエーテル：酢酸エチル（v/v）であるが、任意の溶媒が使用可能であり、多くは本技術分野で周知である。DHEAおよびその硫酸化誘導体、DHEA- Sは市販品を入手可能である（たとえばDiagnostic Systems Laboratories, 445 Medical Centre Blvd., Webster, Texas 77598）。DHEAに特異的な抗体もICN Pharmaceuticals（Costa Mesa, CA）から入手できる。別法として、DHEAの量は質量スペクトルにカップリングさせたガスクロマトグラフィーによっても測定することができる。他の試験では、最初の抽出物をさらに精製工程を設けないで、光学的にステロイドレベルを測定した。しかしながら、本発明者らはDHEAおよび他のニューロステロイドを前もって精製操作を行わないで測定する試みは正確な測定値を与えないことを見出している。
【００３１】
DHEAの別代謝経路における既知の特徴を考えると、本発明の方法は、結果の有効性を確証するために更なるアッセイを補充することもできる。たとえば、サンプルは、調節剤で処理したのち、たとえば2,7DCFの蛍光を用いてラジカル酸素種の増加についても試験する。処理と結果の相関はまた、結果がビタミンEによりブロックされるか否かを測定することにより確証することができる。サンプルはまた、DHEAの代謝前駆体の存在について、それが同定されたのちに、直接試験してもよい。
【００３２】
上述の診断方法はまた、別経路を用いるDHEAの合成を至適化する化合物で、細胞を処理する工程を包含する。たとえば、SU 10603はP450c17の既知の阻害剤である（64）。P450c17はプレグネノロンのDHEAへの古典的変換（非酸化的ストレス誘発経路）に関与する酵素である。すなわち、本発明の方法に使用される細胞の試験サンプルが両経路を介するDHEA合成能を有する場合、SU 10603による処理は古典的経路を介する合成を阻害することによって結果を明瞭にし、別経路の可能性のみが測定される。
【００３３】
トリロスタン（Stegram Pharmaceuticals, Sussex, UK）、3β-HSDの特異的阻害剤もプロゲステロンへのプレグネノロンの変換を阻害することにより、プレグネノロンの代謝を阻害する。細胞サンプルをトリロスタンおよびSU 10603の両者で処理することにより、プレグニノロンの産生を最大にすることができる。メバスタチン、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAリダクターゼ阻害剤、すなわちコレステロール合成の阻害剤で処理することにより、未知の基質のレベルを修飾することもできる。
【００３４】
上述のように、本発明者らは驚くべきことに、DHEAレベルがアルツハイマー病患者の脳において対照患者の脳の場合よりも有意に高く、この上昇と同時に、DHEAの酸化的ストレス誘発代謝経路の前駆体は減少していることを発見した。酸化的ストレスは様々な神経病理学的障害に寄与しDHEAレベルの上昇はこのような様々な神経病理学的疾患、たとえば一般的痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、アミロイドーシス、毛細管拡張性運動失調、ビンスヴァンガー病、脳腫瘍（一部の例では、反応性酸素種の増加を招くことがある）、ハレルホルデン-シュパッツ病、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、リー病、ミトコンドリア障害、多発脳梗塞性痴呆、ペリツエーウス-メルツバヒャー病、ピック病、卒中、および外傷性脳傷害のインディケーターとして使用することができると思われる。実際、外傷性脳傷害の診断は傷害による劇的な急性の酸化的ストレスの上昇によって、開示された診断アッセイがとくに有利である。脊髄損傷および他の末梢神経系傷害はまた、脊髄スワン細胞のニューロステロイドを作成し、傷害による酸化的ストレスを増大させる能力を考慮すれば、診断の標的である。
【００３５】
したがって本発明は、患者における神経病理学的障害の存在を診断する方法であり、上記患者のCNSにおけるニューロステロイドの量を測定することからなる方法を包含する。DHEAレベルまたはその前駆体のレベルを測定するかによって、対照に比べてニューロステロイドの量の増加または減少のいずれかが神経病理学的障害の発症を指示することになる。
【００３６】
本発明はまた、開示された診断方法を実施するためのキットを包含する。血液、体液または組織の試験サンプル中の酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）の形成を検出するためのこのようなキットは、上記血液、体液または組織と接触させた場合に酸化的代謝物を産生する試薬からなる。たとえば本発明のキットは、FeSO4のような試薬を含有し、血清およびCSFの混合物の収集に便利なようなバイアルとして設計することができる。
【００３７】
キットにはDHEAの精製を容易にするため、少なくとも1個のミニカラムまたはミニカラムのセットを包含させる。たとえばHPLCカラムのミニチュアバージョンのようなシリカC18逆相カラム（すなわち、Merck, Beckman等）を導入してもよい。本発明のキットにはさらにまたは別法として、キットがDHEAのレベルを直接測定するように設計されるか、または酸化的ストレス誘発代謝経路を介してDHEAを産生するサンプルの能力により前駆体のレベルを測定するように設計されるかによって、DHEA-特異的抗体から構成されてもよい。現時点では入手できるDHEA抗体の特異性は低い。したがって、正確なラジオイムノアッセイ結果を得るためには精製が要求される。しかしながら、さらに特異性の高い抗体が入手できるようになれば、アッセイに要求される精製レベルは低下し、本発明のキットも然るべく改良されることになろう。
【００３８】
DHEAは加齢過程、とくに海馬におけるNMDA受容体に対するその作用による記憶形成の調節に重要であるとずっと推定されてきた。本発明者らは、現在の理論に反して、アルツハイマー病の脳においては対照の脳に比べてDHEAのレベルがはるかに高いことを証明した。しかしながら、DHEAの合成が神経病理学的疾患において保護的な役割を演じているのか、またはその疾患過程の増強に作用しているのかの疑問は残っている。
【００３９】
たとえば、DHEAおよびその硫酸化誘導体は、海馬において興奮性アミノ酸によって誘導される毒性に対し神経保護作用を有する（32）。しかしながら、DHEAのグリアに対する神経保護作用については、これまでほとんど研究されていない。酸化的ストレスに応答してグリアにより形成されるDHEAの観察された上昇は保護の役割を果たすのかもしれない。また、β-アミロイドペプチドが酸化的ストレス誘発DHEAの合成を刺激する可能性を考慮すれば、アルツハイマー病の病態においてはアストロサイトがこのペプチドに反応するようになり、細胞外マトリックス分子およびプラーク形成の強化を助ける増殖因子を産生する可能性もある（33）。このシナリオでは、DHEAの増加は反応性アストロサイトの保護および神経細胞傷害の強化を補助する有害な現象である。DHEAの増加が神経病理学的疾患に重要な役割を果たしているのか、またそれは単純に疾患過程の偶発症状であるのかは今後に残された問題である。
【００４０】
DHEAがアルツハイマー病および他の神経病理学的疾患の病因に重要な役割を果たしているかどうかには無関係に、それは上述の診断方法により疾患の有用なマーカーとして働く。しかし、DHEAが保護的な役割を提供することが見出されたならば、別代謝経路が細胞のβ-アミロイドペプチドへの暴露によって刺激されるという新たな観察は、別代謝経路が可能な細胞によりDHEAを合成する新規な手段を、医薬組成物に使用するために提供できる可能性がある。DHEAおよびDHEA-Sをアルツハイマー病の処置のための医薬組成物に使用することについての考察は、米国特許4,812,447に提供されている。この特許は、引用により本明細書に導入される。
【００４１】
したがって本発明はまた、細胞によるDHEA合成を増大または誘導させる方法において、上記細胞をβ-アミロイドペプチドに暴露させることからなり、このような暴露がDHEAの合成を起こさせる方法を包含する。脳細胞は、現時点でこの様式による合成を促進することが示されている唯一の細胞であるから、合成のために好ましい細胞は脳細胞とくにアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトである。しかしながら、他の細胞がこのような方法に使用できる可能性を同定することも可能である。さらに、別代謝経路に関与する前駆体または酵素が同定されたならば、この所見に基づきDHEAを合成するための、細胞を含まないシステムを創製することも可能になろう。
【００４２】
本発明はまた、DHEA合成の増大が関与する神経病理学的疾患を防止および処置する方法において、オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトによるDHEAの合成を修飾する化合物を投与することからなる方法を包含する。「修飾」の語には、神経病理学的疾患におけるDHEAの役割は有害なことが分かった場合には、その合成阻害、DHEAの役割が保護的であることが分かった場合には、その合成の増強の両者を包含する。DHEAおよびその前駆体は、異なる神経病理学的疾患において異なる役割を果たす可能性がある。
【００４３】
本発明はまた、神経病理学的疾患の処置に有用な可能性がある薬物候補を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、（a）神経病理学的疾患のスクリーニングに使用できる可能性についてスクリーニングする試験化合物をオリゴデンドロサイトまたはアストロサイトからなる組成物に暴露し、（b）オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトを含有するが、上記試験化合物は含まない。他の方法で同定された対照組成物に比べた、上記化合物のDHEA合成に対する作用を評価し、ついで（c）DHEA合成に対するそれらの修飾作用に基づいて有用な可能性のある化合物を同定することからなるアッセイを包含する。この場合も「修飾」の語は、DHEAがその疾患過程に破壊的または保護的役割のいずれを示すかに依存して変動する。
【００４４】
以下の方法および作業実施例は本発明の基底にある概念を例示する目的で提供される。
【００４５】
実験操作
細胞系
ヒトグリオーマ細胞系KG-1-CはRiken Cell Bank（Tsukuba, Japan）から入手した。MGM-1およびMGM-3細胞系はHiroaki KataokaおよびMashi Koono博士（Miyazaki Medical College, Japan）から恵与された。正常ヒトアストロサイト（NHA）はClonetics（San Diego, CA）から購入し、一方、精製ヒト神経細胞（hNT-PF）はStratagene（La Jolla, CA）から購入した。P450c17抗体はUniversity of IllinoisのDale B. Hales博士から恵与された。特異的な3β-HSD阻害剤のトリロスタンはStegram Pharmaceuticals, Sussex, UKから恵与された。P450c17の阻害剤SU 10603（64）はCiba-Geigy, Basel, Switzerlandから恵与された。
【００４６】
組織サンプル
すべてのヒト組織サンプルおよびCSFはHarvard Brain Tissue Resource Center in Belmont, MAから入手した。ステロイド測定のためのサンプルは液体窒素中でスナップ凍結または受動的に凍結した。RNA抽出のためのサンプルはスナップ凍結した。すべての患者の平均年齢は、アルツハイマー病（AD）患者については74.6歳、対照については73.4歳であった。平均死後間隔はAD患者で10.2時間、対照で14.7時間であった。血清サンプルはJ.R. Rapin博士（CEB, Mont Saint-Agnes, France）から入手した。ヒト組織の使用についてのプロトコールはGeorgetown University Internal Reviews Board1によって承認された。
【００４７】
細胞培養
KG-1-Cは混合グリオーマに由来し、オリゴデンドロサイトの特性を有するとして記述されていた（69）。MGM-1およびMGM-3はグリア芽細胞腫多形腫瘍に由来する（70）。3つの細胞系はすべて、10％ウシ胎児血清（Mediatech Cellgro, Gaithersberg, MD）＋100 U/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシンおよび12.5 mg/mLアンフォテリシンB（Sigma, St. Louis, MO）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）中、37℃および6％CO2で増殖させた。NHA細胞は、5％ウシ胎児血清、0.02 mg/mLヒト上皮増殖因子、25 mg/mLインスリン、0.025 mg/mLプロゲステロン、50.0 mg/mLトランスフェリン、50.0 mg/ mLゲンタマイシンおよび0.05 mg/mLアンフォテリシンBを含有するアストロサイト増殖培地（Clonetics, San Diego, CA）中で増殖させた。HNT-PFはNtera2/ D1奇形腫細胞系（NT2）由来の、有糸分裂後分化細胞である。NT2前駆体細胞はインビトロでレチノイン酸（Stratagene, La Jolla, CA）により6週間処理して分化を誘導することができる。HNT-PF細胞は平板し、hNT-PF神経細胞条件培地（Stratagene）中37℃, 6％CO2に維持した。
【００４８】
逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応およびDNAブロッティング
総DNAは、RnazolB（Tel-Test Inc, Friendswood, TX）を用い、酸性グアニジウムチオシアナートフェノールクロロホルム抽出により各細胞化合物タイプから単離した。各細胞タイプからのRNAは、オリゴ（T）およびMuLV逆転写酵素を用い、Perkin Elmer（Foster City, CA）により提供されたプロトコールに従い逆転写した。興味ある遺伝子に特異的なプライマーを用いて特異的なフラグメントを増幅した（表1）。PCR産物を1.5％アガロースゲル上に流し、ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Piscataway, NJ）に移した。プローブは総副腎RNA（PBR, P450scc, P450c17または3b-HSD）または総ヒト脳RNA（MBP）のいずれかからRT-PCRにより合成した。特異性を確認するために、ABI Prismプロトコールを用い、Lombardi Cancer Center Facility, Georgetown University Medical Centerにおいて、プローブを配列決定した。プローブはBoehringer Mannheim（Indianapolis, IN）からのキットを用いてランダムプライムラベルにより標識し、膜と42℃で一夜インキュベートした。膜を洗浄し、2〜24時間, −70℃でXOMAT-ARフィルム（Eastman Kodak, Rochester, NY）に露出した。
2004507712.tif 000001
【００４９】
免疫細胞化学
細胞は4チャンバースライド（VWR, W. Chester, PA）中で増殖させ、70％エタノール中4℃で15〜30分間固定させた。スライドを10％ウシ血清中一次抗体と、以下の希釈：PBR；1：200（34）, P450scc；1：200（49）, P450c17；1：200, 3b-HSD；1：100（Oxygene Inc, Dallas, TX）により室温で1時間インキュベートした。HRP-連結抗-ウサギ二次抗体（Transduction Laboratories Inc, Lexington, KY）を希釈12000で1時間室温において適用し、ペルオキシダーゼ反応の検出にはHRP基質、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（Sigma, St. Louis, MO）を用いた。スライドはヘモキシリン（Sigma, St. Louis, MO）で対比染色した。
【００５０】
ステロイド生合成実験
デノボでのステロイド合成：すべてのステロイド合成実験は6080％コンフルーエントの細胞で実施した。細胞がデノボにおいてステロイドを合成する能力を測定するために、細胞を37℃, 6％CO2において2時間、前述のように（50）特異的なステロイド生合成酵素阻害剤とともにインキュベートした。略述すれば、細胞を、血清を含まないメジウム中20 mMのメバスタチン（Sigma, St. Louis, MO）と1時間インキュベートして内因性コレステロール合成をブロックした。ついで、10 mMのトリロスタンおよび5 mMのSU 10603を加えた。30分後、3 mLの3H-メバロナクトン（33 Ci/mmole, DuPont NEN, Boston, MA）と10 mMのコールドのメバロナクトン（Sigma, St. Louis, MO）を加えた。30分後、メジウムおよび細胞を合わせ、氷上で20秒間ホモジネートした。ホモジネートを4 mLのエーテル：酢酸エチル（11, v/v, Fluka, New YorkおよびEM Science, Gibbstown, NJ）で2回抽出し、蒸発させた。抽出液を100％メテノール中に再構築し、Beckman System Gold HPLC システム上126NM 溶媒モジュール、166NM検出器およびBeckman ウルトラスフェアXL 3-mm Spherical 80A 多孔性カラム（Beckman, Fullerton, CA）を用いて分離し、メタノール勾配で溶出した。1分毎に分画を集め、液体シンチレーションスペクトロメトリー（EG & G Wallac, Gaithersberg, MD）によってカウントし、放射標識されたステロイドの産生を測定した。ステロイドは、放射標識標準と比較したそれぞれの保持時間によって同定した（保持時間P=28分, 保持時間プロゲステロン=24分, 保持時間D=18分）。以前の実験で、これらの分画中のステロイドは、ガスクロマトグラフィー・質量スペクトロメトリーによりそれぞれP, プロゲステロンおよびDとして同定された（15）。
【００５１】
別経路：別経路によって合成されたDの量を決定するために、細胞を先に記載されたように処理した（15）。略述すれば細胞を洗浄し、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを、血清を含まないメジウム中、FeSO4の濃度を上昇させながらインキュベートした。神経細胞は血清を含まず、5 mM PおよびFeSO4を含有するメジウム中、10 mM SU10603の存在下または不存在下にインキュベートした。2時間後、細胞およびメジウムを上述のようにホモジナイズし、抽出した。抽出液を、移動相として95％メタノール（v/v）を用い、C18 TLCプレート（Whatman, Clifton, NJ）上に流した。P, プロゲステロンおよびDの放射標識標準もそれぞれのプレートに流し、各サンプルについて適当なステロイド分画を収集した。TLC分画を2 mLのジエチルエーテル（Fluka, New York）で抽出し、蒸発させた。別の実験では、ステロイドをTLCから溶出し、さらにHPLC, RIAおよびガスクロマトグラフィー・質量スペクトロメトリーにより同定した（データは示していない）。
【００５２】
組織サンプル：アルツハイマー病患者および対照患者からの脳サンプルについて、サンプルを前に記載したように（17）処理した。略述すれば、ホモジネートのアリコートを最終濃度30 mM（脳）または10 mM（血清およびCSF）FeSO4で、37℃において2時間インキュベートした。2時間後、サンプルを、内因性レベルについて記載したようにして抽出、精製し、特異的なラジオイムノアッセイでアッセイした。
【００５３】
DHEAの血清およびCSFレベル：血清は11例の患者、AD5例および年齢のマッチした対照6例から得た。血清サンプルは分割して10 mM FeSO4の存在下または不存在下に処理した。血清およびCSFサンプルは脳組織サンプルについて述べたようにして抽出し、HPLCで精製した。DHEAレベルは特異的ラジオイムノアッセイにより測定した。
【００５４】
別経路のβ-アミロイドによる調節：MGM-1細胞は96-ウエル（約5,000細胞/ウエル, ROS測定）または24-ウエル（約15,000細胞/ウエル, Dの測定）プレート（Corning Costar, Acton, MA）上で平板培養した。同時に、1 mgのAb（Ab 1-42, AnaSpec Inc, San Jose, CA）を0.5 mLの血清を含まないメジウムに溶解し、集合させるため4℃でインキュベートした。24時間後、細胞は10％ウシ胎児血清および50 mM Abまたは50 mM Ab＋ビタミンE（Sigma, St. Louis, MO）とともにDMEM中でインキュベートした。対照サンプルは10％FBSとともにDMEM中でインキュベートした。細胞を37℃, 6％CO2において少なくとも12時間インキュベートし、別の実験について上述したようにROS発生またはD合成のために処理した。
【００５５】
ROSの測定
処理メジウムを除去し、細胞をPBSで洗浄した。蛍光プローブ 2,7-ジクロロフルオレセインジアセテート（2,7-DCF, Molecular Probes, Inc, Eugene, OR）を用いて酸化的ストレスのレベルを測定した（48）。細胞を50 mM 2,7-DCFとインキュベートし、Victor2 Multilabel Counter（EG & G Wallac, Gaithersberg, MD）を用いて、485 nm/535 nmで蛍光を測定し、細胞の蛍光値を得た。
【００５６】
ラジオイムノアッセイ
各ステロイドに特異的な抗体（ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA Mesa）を使用するRIAによりP, プロゲステロンおよびDレベルを測定した。データはJaffe and Associates（Silver Spring, MD）からのIBM-PC RIA Data Production Program（バージョン4.1）を使用して解析した。ADおよび対照脳サンプル中のβ-アミロイド種は、β-アミロイドペプチドのアミノ酸17〜24を認識するモノクローナル抗体、4G8（Senetex PLC, Napa, CA）を用いて解析した。0.25 Mスクロース緩衝液中のサンプルを420％の勾配ゲル（Novex, San Diego, CA）上に流した。サンプルをニトロセルロース膜に移し、室温において、1時間一次抗体と希釈1：2000でインキュベートした。膜を二次抗体（1：1000）と室温で1〜1.5時間インキュベートし、ECL試薬（Amersham Pharmacia Biotech, Pisquataway, NJ）を用いて可視化した。ブロットはX-OMATフィルムに露出した。
【００５７】
タンパク質アッセイ
タンパク質のμg量をBradford（1976, 39）の色素-結合アッセイにより、標準としてウシ血清アルブミン（ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA）を用いて測定した。
【００５８】
統計
細胞系を使用した別経路結果の統計解析は、GraphPad（San Diego, CA）からのINSTAT 3.00パッケージを用いて、片側ANOVAにより実施した。ROSおよびβ-アミロイドのデータの解析は、SigmaPlot（Jandel Scientific, San Rafael, CA）により対のないStudentのt-検定を用いて実施した。組織サンプルからの統計データは3〜15の測定値の平均±SEMとして示す。データは正規検定によるWelchのt-検定を用いて解析した。有意差レベルはP＜0.05に設定した。
【００５９】
結果：ニューロステロイド合成の特性および脳細胞系を用いる調節
細胞タイプの特性
グリオーマ細胞系の表現型を決定するため、本発明者らは、MBP, オリゴデンドロサイトマーカー、およびGFAP, アストロサイトマーカーについてRT-PCRを実施した。本発明者らは、3種のグリオーマ細胞系のすべてで、総ヒト脳RNAと同様MBPについてのメッセージを発現すること（データは示していない）を発見した。グリオーマ細胞系は、どれもGFAPに対するメッセージは発現しない（データは示していない）。これらの細胞は集合的にオリゴデンドロサイトと呼ぶ。
【００６０】
CloneticsからのNHA細胞は、GFAPに対して免疫陽性にし、RT-PCRによりGFAPの発現を確認した（データは示していない）。これらの細胞はまた、CD68,マイクログリアのマーカー、および2',3'-サイクリックヌクレオチド-3'-ホスホジエステル、オリゴデンドロサイトマーカー（Clonetics Certificate of Analysis, Clonetics, San Diego, CA）に対して免疫陰性である。HNT-PF細胞はNtera2/ D1奇形腫細胞系から、レチノイン酸で5〜6週間の分化により誘導する。これらの細胞は減数分裂後であり、他の研究者によって十分に特性が明らかにされている。いったん分化すると、それらは3つの神経フィラメントタンパク質を発現するが、GFAPは発現しない（61）。それらはまた、神経細胞に特異的な接着分子たとえばNCAMおよびN-カドヘリンも発現する。電気生理学的には、hNT-PF細胞は、テトロドトキシン-感受性ナトリウム電流で神経細胞様に挙動する（78）。レチノイン酸分化はまた、NMDAおよび非-NMDAサブタイプ両者の機能性グルタミン酸受容体の発現を誘導する（86）。
【００６１】
オリゴデンドロサイトはデノボでPを合成するが、アストロサイトおよび神経細胞は発現しない
ステロイド合成細胞は、内因性コレステロールをプレグネノロン（P）に変換できる細胞として定義される。体内ではこの能力を有する細胞はほとんどなく、それはステロイド合成組織たとえば副腎、生殖腺、胎盤および脳に限定されている。しかしながら、ほとんどすべての細胞はステロイドを最終ステロイド産物に代謝する能力はもっている。本発明者らは、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル- CoAリダクターゼ阻害剤、メバスタチンで内因性コレステロールの合成をブロックし、細胞を、放射標識コレステロール前駆体、3H-メバロナクトンとインキュベートした。本発明者らはトリロスタンおよびSU 10603でPの代謝をブロックすることにより、Pの産生を最大にすることを試みた。サンプルのHPLC分離は、MGM-3細胞系が、放射標識前駆体からデノボでPを合成することを指示した。一部の実験では、KG-1-C細胞も放射標識されたPを生じたが、多くの実験の結果を合わせると、この作用は有意ではなかった。さらに、KG-1-CおよびMGM-3細胞も放射標識されたDを生じ、SU 10603はこれらの2種の細胞系における内因性Dの産生のブロックに有効ではなかった。これは、ヒト脳内のステロイド生合成に関与する機構は副腎および生殖腺に存在する機構とは異なることを示唆している。MGM-1, NHAおよびhNT-PF細胞はデノボでPを産生しない（データは示していない）。
【００６２】
本発明者らは、ROSの高い内因性レベルがKG-1-CおよびMGM-3細胞におけるデノボD形成に関与していると仮定した。ヒトグリオーマ細胞を、10％ウシ胎児血清を含むDMEM中10 mMのビタミンEの存在下または不存在化に少なくとも12時間処理した。本発明者らは、これらの細胞中のROSおよびDレベルを実験操作の項に記載したようにして測定した。本発明者らは、これらの細胞のビタミンE処理が、非処理の細胞と比較してROSおよびD両者のレベルを低下させることを見出した（データは示していない）。すべての処理でROSおよびDのレベルは相関し、r=0.7034であった。
【００６３】
ヒト脳細胞はmRNAおよび末梢ステロイド生合成機構の様々な成分についての免疫反応性を発現する
ヒト脳におけるステロイド生合成の可能な機構を決定するために、本発明者らは古典的な末梢ステロイド合成経路における4つの成分の発現に注目した。細胞を、mRNA, PBR, P450scc, P450c17および3β-HSDの存在についてアッセイした。3つのグリオーマ細胞系はすべて、4つの成分のすべてに対するmRNAを発現する（データは示していない）。さらに、相当するタンパク質がこれらの細胞において、免疫細胞化学的に検出された（データは示していない）。KG-1-CおよびMGM-1細胞は4つの成分のすべてに対する免疫反応性を発現する。興味あることに、MGM-1細胞はPBR似たい至適化明瞭な核局在化を示す。これは、より攻撃的なヒト乳癌細胞系および生検PBRにおいて、非攻撃的細胞にみられるミトコンドリア局在化（53）と異なり、核および核周辺領域における局在化を見出した本発明者らの実験室からの最近のデータと一致する。MGM-3はPBR, P450sccおよびP450c17に対する免疫反応性を発現するが、3β-HSDに対する免疫反応性は発現しない。しかしながら、MGM-3は3β-HSDに対するメッセージは有する。これは、3β-HSD mRNAの破壊の増大またはタンパク質の変性の増大を指示している。全体的にこれらのデータは、ヒトオリゴデンドロサイトにおいて、mRNAおよびタンパク質の発現はその細胞がデノボでニューロステロイドを合成する能力に相当することを指示している。
【００６４】
ヒトアストロサイトは4つの成分のすべてに対するmRNAを発現する（データは示していない）。それらは、PBR, P450sccおよび P450c17に対して免疫反応性であるが、タンパク質の発現はグリオーマ細胞にみられるよりもはるかに低い。MGM-3細胞と同様に、NHAはmRNAを有するが、3β-HSDに対する免疫反応性は示さない。この場合も、mRNAまたはタンパク質の安定性の変化が指示される。NHA細胞はPおよびDの合成能を示すが、プロゲステロンは合成できない。ヒト神経細胞はPBR, P450c17および3β-HSDに対するmRNAを発現するが、P450sccのmRNAは発現しない。一方、NT2前駆体細胞は4つの成分すべてに対してメッセージを有する（データは示していない）。これは、hNT-PFがデノボでPを合成できないことを指示し、上記データと一致するが、それらはPを他の神経活性なステロイドに代謝することはできる。
【００６５】
オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトはD合成のための別経路を有する：神経細胞は別経路をもたない
本発明者らは最近、ラットグリオーマ細胞が、P450c17とは独立した経路により、DHEA（D）のようなニューロステロイドを合成できることを証明した（15）。本発明者らはヒト脳細胞系における別経路の活性評価の場合と類似のプロトコールを使用した。本発明者らは、MGM-1細胞系が、別経路を介してDを産生する能力を有することを見出した（図6：片側ANOVAのFおよびp値は、図面の簡単な説明の項参照）が、これらの細胞は、放射標識前駆体からデノボでPを産生することはできない。FeSO4はKG-1-CおよびMGM-3のDレベルには有意な影響を与えなかった（図6A, 6C）。KG-1-CおよびMGM-3は、SU 10603によって阻害されない様式で放射標識されたDをデノボで合成した細胞であることに注意すべきである。この場合も、内因性の遊離ラジカルがこれらの細胞におけるDの形成に関与していることが示唆される。FeSO4処理はNHA細胞におけるDの形成に有意な影響を有し（図6D）、この作用は腫瘍細胞系に限定されないことが指示される。この作用は、用いたFeSO4の最高用量でのみ認められ、それらのFeSO4またはROSレベルに対する感受性の意味で細胞タイプ間に差があることを指示するものである。
【００６６】
hNT-PF細胞も、上述のように、SU 10603の存在化または不存在下に、FeSO4の濃度を上昇させてインキュベートした。さらにこれらの細胞は、Dの産生を増強させるために5 mMのPとインキュベートした。最近の研究（15）によりラットC6細胞で基質としてPを与えるとFeSO4の作用を増強できることが示された。ヒト神経細胞はFeSO4処理によって影響されず（図6E）、この別経路はグリア細胞に特異的であることが示唆された。HNT-PF細胞もSU 10603処理によって影響されず、これらの細胞におけるDはP450c17酵素の内因性の活性に由来しないことを示している。したがって、神経細胞のDは完全に他のソースに由来するものと思われる。
【００６７】
調べたヒト脳細胞のすべてにおいてSU 10603はDの形成を阻害しなかった。SU 10603はきわめて複雑な薬理学的性質を有し、場合によってはDレベルを上昇させるようにみえる（図6D）。しかしながら、これはP450c17活性の利用できる唯一の既知阻害剤である。本明細書に提示した結果に反して、この化合物は精巣のライディッヒ細胞においてP450c17の活性を阻害し（データは示していない）、この薬物はP450c17の活性を抑制できることが指示される。
【００６８】
ヒト脳からの細胞系のFeSO4処理は内因性遊離ラジカルを増加させる
本発明者らはFeSO4がDの合成を調節する機構の可能性として、細胞性ROS産生の調節を仮定した。本発明者らは、MGM-1ヒトグリオーマ細胞およびNHA細胞をFeSO4で処理し、これらの細胞中のROSレベルを、実験操作の項に記載の方法で測定した。本発明者らは、試験したすべてのFeSO4濃度で、非処理細胞に比べてROSレベルの有意な上昇を見出した（図7：片側ANOVAのFおよびp値は、図面の簡単な説明の項参照）。NHA細胞は、MGM-1細胞の場合よりさらに明瞭にFeSO4に応答した。これは、FeSO4がこれらの細胞中のROSを上昇させることを指示し、この機構がD合成のレギュレーターである可能性を支持する。
【００６９】
β-アミロイドによる処理は、MGM-1ヒトグリオーマ細胞中のROSおよびDレベルを上昇させる
本発明者らは、内因性の細胞性ROSがKG-1-CおよびMGM-3細胞にみられるデノボでのD形成に関与し、ROS形成を誘導するFe2+の添加（図7）はMGM-1およびNHA細胞においてDの形成を起こさせることを示した。他の処理によって生じるROSの増加がDの形成を増加させるか否かを調べるために、本発明者らはMGM-1細胞を、10 mMの抗酸化剤、ビタミンEの存在下または不存在下に50 mMのAβで処理した。Aβによる処理は、対照レベルに対して2,7-DCFの蛍光に有意な増加を生じる（p<0.01, Studentの対のないt-検定）ことが見出され、ROSの増加が指示された（図8A）。この増加はビタミンEによる同時処理で部分的にブロックされた（p=0.054）が、対照のレベルよりもまだ有意であった（p<0.01）。Aβによる処置はまた、対照に比較してDのレベルも有意に上昇させた（p<0.01, 図8B）。この有意な上昇はビタミンEによる処理でブロックされた（p<0.05 vs. Aβ）。このデータROSがヒト脳でDの合成を調節する役割を演じていることを示唆するものである。
【００７０】
考察
齧歯類で脳に見出されるステロイドは末梢および局所起源の両者であることを示すかなり多数の証拠はあるが、ヒト脳のニューロステロイド合成能については何も知られていない。すなわち、ここに報告されるのはヒト脳細胞におけるステロイド生合成機構の最初の証明である。本発明者らは、放射標識前駆体mRNAからのデノボでのPの生合成、ならびにPBR, P450scc, P450c17および3β-HSDのタンパク質発現、さらにD合成のための遊離ラジカル仲介、別経路の存在について検討した。
【００７１】
本発明者らは、オリゴデンドロサイトにおけるPのデノボでの合成を証明したが、アストロサイトおよび神経細胞では証明されなかった。これは、オリゴデンドロサイトが脳で合成されるPのソースである可能性を示す（62）ラットモデルで得られたデータを確認し、ニューロステロイドの生合成を研究するためのモデルとしてラットを使用することの正当性を認めるものであろう。しかしながら、本発明者らは、アストロサイトまたは神経細胞がPをプロゲステロンおよびDまたは他の神経活性化合物に代謝する能力を有する可能性も排除しなかった。オリゴデンドロサイトはステロイド合成細胞と命名し、アストロサイトおよび神経細胞をステロイド代謝細胞集団と命名することができる。これは、神経細胞の興奮性に役割を果たす神経活性ステロイドは多くの様々な、末梢を含めたソースから局所的に産生されることが可能であることを意味する。
【００７２】
本発明者らは、ステロイド生合成機構の4種の成分について、mRNAの存在および免疫反応性を調べた。オリゴデンドロサイトはmRNA、ならびにPBR, P450scc, P450c17および3β-HSDに対する免疫反応性を有する。これはオリゴデンドロサイトが前駆体からコレステロールを作成し、コレステロールをミトコンドリアに輸送し、それをPに代謝する能力を確認する。P450c17の酵素活性は、これらの細胞におけるD形成をブロックする特異的阻害剤SU10603の不安定性により検出されなかった（図6A〜C）。アストロサイトもmRNA、ならびにPBR, P450sccおよび P450c17に対する免疫反応性を有するが、本発明者らはP450sccに対する活性は見出すことはでなかった。P450sccが機能するためには、アストロサイトにはない補因子が必要であり、この場合、酵素活性は防止される。これらの結果は、オリゴデンドロサイトに由来するPからの神経活性ステロイドを作成できるステロイド代謝細胞としてのアストロサイトの可能性ある役割を指示する。アストロサイトは、P450c17によってPをDに変換できる可能性があるが、P450c17の阻害剤、SU 10603（64）はこれらの細胞内のDレベルには影響しない（図6D）。オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトの両者では、免疫反応性P450c17は検知できる何らの活性も示さなかった。アストロサイトにおけるP450sccと」同様、これらのタイプの細胞にはない補因子がこの酵素の機能には要求されるのかもしれない。興味あることに、すべてのグリア細胞では、DNAブロットによって同定される2つのアイソフォームがP450c17には存在するように思われる。以前の研究において、ラットの皮質および小脳でP450c17の2つの転写体が見出されている（81）。一方または他方のアイソフォームが優先的に翻訳され、これらのアイソフォームは異なる活性を有する。最後に、神経細胞は、PBR, P450c17および 3β-HSDのmRNAを発現するが、P450sccのmRNAは発現しない。これは、これらの細胞が、本発明者らのデノボでの実験によって支持されるように、デノボではPを作成できないことを指示する。神経細胞がPを他のステロイドに代謝するかどうかは残された問題である。
【００７３】
脳でのD生合成の機構についての分野には論争がある。1994年、Liebermanおよび共同研究者らは、末梢のステロイド生合成には無関係な化合物と反応し、ニューロステロイドを産生する別のニューロステロイドの前駆体がラット脳抽出物中に存在すると提唱した。彼らは、ラット脳の有機抽出物を様々な抗酸化化合物で処理し、Dの遊離が起こることを証明した（28）。本発明者らは、P450c17 mRNAおよびタンパク質はないのに、ラットグリオーマ細胞を様々な酸化化合物で処理した場合、同じくDが形成されることを証明した（15）。この別経路は脳由来の細胞に特異的であり、細胞のない環境では再現できなかった（15）。今回はこの別経路がヒト脳からの細胞系に存在することを報告する。
【００７４】
オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトは別経路でDを産生することができる。D合成のROS誘導にはある閾値が存在するように思われる。これは、オリゴデンドロサイトとアストロサイトでは異なっている。アストロサイトは、グリオーマ細胞よりもFe2+に応答して、より多くのROSを産生するようにみえる。これはFeSO4に対する感受性が高いことを指示する。これは多分、正常のヒト脳細胞において、D合成のROS誘導の閾値が高いことを指示するものと思われる。これらのデータは、様々な条件下での脳の酸化的環境が、グリアによるDの形成に影響することを示唆している。神経細胞がD合成のための別経路をもらず、別経路はグリアに特異的であることが示唆される。Fe2+に応答しないオリゴデンドロサイトは、P450c17に独立した様式で、デノボにおいてDを合成できる。これは多分、高い内因性ROSによるものであろう。興味あるコトニ、グリオーマ細胞系のビタミンE処理は、MGM-1細胞にみられるレベルに対し、MGM-3 ROSおよびDレベルを低下させるが、KG-1-C細胞はこの抗酸化剤によってそれほど劇的には影響されない。これらのデータは、単離されたオリゴデンドロサイトおよびアストロサイトが一次培養システムにおいて、Fe2+に応答してDを産生することを見出した本発明者らに実験室での結果（42）を確認するものである。
【００７５】
ステロイド合成モデルに理想的な前駆体を添加して酵素活性を研究すること、すなわちP450c17を介してDの形成のためにPを添加することは、慣用方法であることに注意すべきである。本発明者らは、Pを添加することにより方法が生理学的機構ではないP450c17仲介D形成の方向に偏る可能性を考慮したので、上に報告した研究を、前駆体を用いないで実施することを選択した。本発明者らはhNT-PF細胞でのみPを使用した。この場合は細胞数が限られているので、至適条件を用いることを選択している。これらの条件下には、PはP450c17酵素によりDに代謝されなかった。5μMのPをオリゴデンドロサイトまたはアストロサイトに添加してもDの産生の増加は生じなかったこと（データは示していない）に留意すべきである。
【００７６】
内因性であり、偏りを生じないP450c17酵素活性を阻害する手段として、本発明者らはSU 10603を使用した。この化合物はP450c17の特異的阻害剤として開発されたが、他のP450も、P450sccを含めて阻害することが明らかにされている。本発明者らは、SU 10603単独の添加は、用いたいずれの細胞系においても、Pレベルには影響しないことを見出している（データは示していない）。これは薬物がP450sccの活性を変化させないことを指示している。SU 10603が試験したヒト脳細胞系でDの形成を阻害しなかったことを考慮し、本発明者らは、ヒト脳細胞系においては、P450c17はD形成の機構ではないと結論する。
【００７７】
上述のように、齧歯類の脳におけるP450c17活性の存在は論争の種となっていた。最近の研究で、本発明者らはラットオリゴデンドロサイトにおけるP450c17 mRNAおよびタンパク質の発現を見出したが、別経路がD形成に関与するアストロサイトでは見出すことができなかった（42および未発表データ）。しかしながら、Zwain & Yenは最近、Dはラット脳で、さらに特定すればアストロサイトおよび神経細胞でP450c17経路を介して形成できたことを報告した（87）。Dの単離および特徴解析に用いられた技術が、すなわちHPLC, TLCおよびGC-MSついでRIA（15, 42, および本報告）対直接RIA（87）と多様なため、ラットで得られたデータと本明細書に報告されたデータを現時点で比較することは困難である。
【００７８】
ROSの発生が生理学的な関連で別経路の調節に関与したか否かを決定するため、本発明者らはMGM-1細胞を、アルツハイマー病のプラークであるAβで処理した。Aβは神経細胞に毒性を示し、細胞性ROSの増加を引き起こす（54）。この作用は抗酸化剤たとえばビタミンEでブロックすることができる（52）。本発明者らはAβ処理がMGM-1ヒトグリオーマ細胞における細胞性ROSを上昇させ、Dレベルを上昇させる。ROSおよびDにおける上昇は両者ともビタミンEの同時処理によってブロックできた。これは、脳におけるD合成の調節機構に関する最初の証明であり、これはヒト脳とくに神経病理学におけるDの役割に関する洞察を可能にする。
【００７９】
Aβは神経細胞に毒性を示すが、アストロサイトの活性化（56）および細胞骨格の再編成（80）を誘導する。しかし、アストロサイトの生存能には影響しない（76）。アストロサイトの活性化ついでコンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（30）および増殖因子（90）の沈着はプラークの形成に関与するものと思われる。グリア細胞がそのDを産生する能力によってAβの毒性作用に抵抗し、海馬における神経保護作用を発揮すること（32）も考えられる。
【００８０】
ヒト脳腫瘍ではPBRが上方調節されていることが知られている（43, 68）。これはステロイド生合成経路の一般的な上方調節を指示するものかもしれない。さらに、AD脳の特異的な領域およびパーキンソン患者からの脳（66）では、PBR結合部位が有意に増加している。ステロイド生合成成分の上方調節は、別経路の活性と同様に、脳内のホメオスターシスの変化、神経細胞変性または外傷の徴候かもしれない。ニューロステロイドの生合成の上昇は変化または毒性のある細胞環境の特性かもしれない。別経路は、正常なホメオスターシスが破壊した環境下のみで、核PBRを有し、したがって古典的な酵素経路を介してはニューロステロイドを合成できないMGM-1細胞のように、脳ステロイド生合成における実行者になるのかもしれない。すなわち、傷害または疾患による細胞過程の変化が、正常時には別経路は使用しない細胞において、別経路の機能が可能になるのかもしれない。
【００８１】
実施例1
本発明者らは、AD患者および年齢がマッチした対照からの視床下部、海馬および皮質からのサンプルにおけるプレグノロン（P）およびDHEA（D）のレベルを測定した。本発明者らは、海馬または前頭皮質においてはPレベルに有意な差を見出さなかった（図1）。視床下部のPレベルには変化がみられるが、このサンプル中に存在するPの量はきわめて少なく、1回の測定を行うことしかできなかった。3つの領域のすべてでDレベルには有意な上昇が認められた（p<0.01 vs.対照レベル、図1）。β-アミロイド（Aβ）はまたヒトグリオーマ細胞で、多分、細胞内ROSレベルの上昇により、Dの形成を誘導できるので、AD患者Dのこの上昇は多分、AD脳における酸化的ストレスのレベルの上昇による。
【００８２】
本発明者らは、末梢におけるDの形成に関与する酵素、P450c17の発現をヒト皮質および海馬で、特異的なP450c17放射標識プローブによるRT-PCRついでサザンブロットを用いて調べた。本発明者らは、AD（2例の患者からの1例）および対照患者の両者の皮質にはP450c17の発現はあるが、海馬では発現がみられないこと（図2）を発見した。これは、海馬に見出されるDが、内因性P450c17活性からではなく、別経路の活性に由来することを強く示唆する。
【００８３】
本発明者らは、ヒト脳サンプル中のAβレベルをイムノブロット解析により調べた。モノクローナル抗体4G8を用い、ADおよび対照患者の両者の視床下部にAβ-免疫反応性の存在を発見した（図3A）。しかしながら、対照患者に存在するAβ-免疫反応性は、AD視床下部における約50 kDaに対して約70 kDaで、高い分子量を示す。最近の研究で、神経細胞に毒性を示すAβ型は低分子量であることが証明された。高分子量複合体は毒性がない（27）。
【００８４】
海馬では、ADサンプルは分子量範囲4580 kDaの、はるかに高いAβロードを有する（図3B）のに対し、対照サンプルは検出できるAβ-免疫反応性をほとんどもたない。これは、海馬中のDは、存在するAβの高いレベルによって誘導される酸化的ストレスの結果として形成されるとする仮説を支持する。この関連で、AD患者は比較的一定したレベルのAβ-免疫反応性、20〜50 kDaの範囲を有する。対照患者も検出可能なAβ-免疫反応性を有するが、これらの患者は約30〜50 kDaの範囲の高い分子量種を有する傾向がある。
【００８５】
本発明者らは次に、30 mMのFeSO4で処理したのち別経路を介してPおよびDを作成するADおよび対照脳の能力を調べた。本発明者らは、FeSO4が対照患者におけるいずれの領域におけるPレベルにも有意に影響しないが、視床下部においては強い影響の示唆がある。処置はADの視床下部および前頭皮質におけるPレベルを有意に上昇させたが、AD海馬では上昇させなかった（表2）。DレベルはFe2+処理にもっと応答性である。30 mMのFeSO4は対照患者の海馬および皮質でDの有意な上昇を生じるが、視床下部には何の影響もなかった。AD患者は皮質のDに有意な上昇を示したが、海馬および視床下部では、有意な変化は示さなかった。
【００８６】
AD脳における上昇がCSFにも反映されるかを調べるため、本発明者らは対照およびAD患者のCSF中のDレベルを測定した。本発明者らはAD CSFと対照CSFでDレベルの35-倍の上昇を認めた（図4A）。これは脳にみられた2〜4倍の上昇（表2）に比べて著しい増大である。
2004507712.tif 000002
【００８７】
さらに、免疫ブロットで検出されるAβ-免疫反応性は、ADと診断された患者からのCSF中で対照患者に比べて上昇している（図4B）。本発明者らは、Dの血清レベルおよび血清中のDに対する10 mMのFeSO4の効果を調べた。ADでは対照患者に比べて血清Dレベルに一般的な低下がみられるが、この低下は本研究では有意ではない。FeSO4は対照の血清におけるDレベルに1.5〜3倍の上昇を生じるが、AD血清には作用はなかった（図5）。血清Dレベルには患者対患者で広範な変動があるが、対照患者におけるFeSO4に応答したDの上昇はすべてのサンプルで生じた。
【００８８】
考察
本発明者らは、アルツハイマー病（AD）および対照脳におけるDHEA（D）およびプレグネノロン（P）のレベルを、ADの発症によってニューロステロイドのプロフィルに何らかの有意な変化があるか否かを決定するために測定した。本発明者らは、調べた3つの領域のすべてでADの脳ではDは有意に上昇するが、Pレベルには有意な影響はみられない。これは、多分β-アミロイド（Aβ）の作用によるAD脳における酸化的ストレス上昇の他の反映である。他の研究では、AD脳からの神経細胞細胞質および神経細胞およびグリアの核にカルボニールの増加（29）ならびにADにおける脂質過酸化、タンパク質過酸化およびミトコンドリアエネルギー代謝の破壊（17, 19-21）が示され、ADの発症における反応性酸素種の役割が指示されている。
【００８９】
本発明者らは、脳のDの起源を解析するため、ヒトの脳におけるP450c17に注目した。本発明者らは、前頭皮質にはP450c17に対するメッセージはあるが、海馬にはP450c17の検出可能な発現はないことを見出した。これは海馬におけるDは末梢のソースに由来し、海馬に蓄積し保存されたものか、または別経路の活性に由来するかのいずれかである。本発明者らはこれらの患者からの末梢血清Dレベルは測定しなかったが、刊行された報告には、末梢Dのレベルが0.3〜2μg/ mL（2）、健康な高齢者（年齢60〜90）で1.83 nmol/L（30, 年齢=76〜93）、およびステロイドを服用していない年齢3〜85歳の患者で約0.260 nmol/L（26）であると指示されている。Dの本発明者らの測定レベルは、対照およびAD患者の両者の血清で報告された値よりも高く、以前に報告されたレベル（31）に匹敵するか（P）またはそれらのレベルより低い（D）。対照に比較して、ADの視床下部、海馬および前頭皮質における高いDレベルは、Dが酸化的ストレスの増大により誘導される別経路の活性に由来できることを指示する。さらにADの脳ではAβ-免疫活性種、とくに毒性を示した（27）低分子種のレベルが上昇している。
【００９０】
本発明者らは、ADおよび対照の脳における別経路の活性の可能性を調べた。本発明者らは、FeSO4による処置が対照の視床下部ならびにADの視床下部および前頭皮質における有意なPの上昇を引き起こすことを発見した。FeSO4は対照患者の海馬および皮質におけるDの有意な増加をもたらし、これらの領域における別経路の前駆体の存在を指示する（28）。視床下部には影響はない。AD患者では前頭皮質にのみDの有意な増加がみられ、別経路の前駆体がそこには存在するが、視床下部または海馬にはないことを指示している。FeSO4処理前に存在するDの高レベルは、ADの脳では、別経路の前駆体は既に変換されてしまっていることを示唆するものである。これがADの脳におけるより高いDの内因性レベルおよびより小さいFeSO4の効果を生じる。
【００９１】
ADの脳におけるDのレベル増加は加齢におけるDの役割に関する現在の考え方に反するものである。加齢とともにDレベルが低下することは、加例とともに起こる多くの問題における役割を果たしている可能性があるその過程の特性と考えられてきたのである。年齢に関連する認知の変化および痴呆の防止を試みるDの置換が多くの臨床研究の焦点とされてきた（23-26）。本発明者らは今回、Dの現実のCNSレベルがADの病態においては増加していることを示す。これは正常な加齢とともに末梢でみられた事実の反対である。この観察がADの発症初期を試験するための診断方法およびキットを編み出した本発明の基礎として用いられた。
【００９２】
ADの診断および処置における一つの大きな問題は、臨床家にとってその疾患の発症を決定できないことである。現在では、これは脳の全体的な収縮を探すためのMRIスキャンおよび痴呆の状態を決定するための認知試験の組み合わせによって行われている。典型的な症状は疾患過程のきわめて後期まで起こらない。CSF中のDの変化が実際に脳内の酸化状態によって調節されているならば、疾患の進行の早期にCSF中のDに変化がみられる筈である。本発明者らはまた、別の前駆体が対照患者の血清中に検出できるが、AD患者では検出されないことを示した。表2に示したデータの更なる解析では、血清はFeSO4処理に対して、試験した他の脳領域よりも大きな応答を示すことが指示される。したがって、別の前駆体がFeSO4処理によって間接的に血液CSF中に存在するか否かを決定することによって、脳内の酸化的ストレスの状態を予測することが可能な筈である。これは、別のD前駆体の利用性がADの発症および進行を決定するツールとして使用できることを指示する。
2004507712.tif 000003
2004507712.tif 000004
2004507712.tif 000005
2004507712.tif 000006
2004507712.tif 000007
2004507712.tif 000008
2004507712.tif 000009
2004507712.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】
アルツハイマー病（AD）および対照脳におけるニューロステロイドレベル
ヒト脳における内因性ニューロステロイドレベルはHPLC精製後に特異的なラジオイムノアッセイにより測定した。ADおよび対照患者の間のプレグネノロンレベルには有意差はない。しかしながら、調べた3つの領域のすべてにおいてAD患者のDHEAは有意に高いレベルを示す。提示したデータは3〜10サンプルからの二重の測定についての平均±SEMである。NS：有意差なし。**P＜0.01。
【図２】
ADおよび対照脳におけるP450c17のmRNA発現
RT-PCR増幅P450c17をDNAブロットによって追跡すると、P450c17は対照およびAD患者のいずれの皮質でも発現することを示すが、発現は手許にあったAD患者の一つにのみ見られる。海馬ではP450c17の検知可能な発現は認められず、この領域のDHEAは末梢酵素仲介経路によっては作成されないことが指示される。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号で標識する。
【図３】
ADおよび対照脳におけるAβ免疫反応性
脳ホモジネートをSDS-PAGEで分離し、β-アミロイド（Aβ）ペプチドのアミノ酸17〜24に対するモノクローナル抗体、4G8でブロットした。A）AD患者の視床下部におけるAβ-免疫反応性の大部分は対照患者の場合よりも低分子量種のものである。対照サンプル中にも同様に検出可能なAβがある。B）Aβ-免疫反応性は対照患者の海馬では検出されないが、AD患者の海馬には存在する。C）Aβ-免疫反応性はすべてのAD患者の前頭皮質に類似の分子量種パターンで存在する。AD前頭皮質Aβ-免疫反応性の大部分は約30 kDaである。対照患者とくにC5患者ではある程度のAβ-免疫反応性は存在するが、この免疫反応性はAD患者の場合より高い分子量、約50 kDaを示す。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号を付す。
【図４】
ADおよび対照患者からの脳脊髄液（CSF）中DHEAおよびAβレベル
A）DHEAはCSF抽出物からHPLCにより精製し、特異的ラジオイムノアッセイにより測定した。DHEAレベルは対照の場合よりAD対象ではるかに高い。
B）対照患者は98 kDa種のみを有するが、AD患者は46〜98 kDaの広い分子量範囲で存在するAP-免疫反応性を有する。
【図５】
ADおよび対照患者におけるFeSO4に対する血清応答
AD患者（A）からの血清を10 mM FeSO4で処理した場合、DHEAレベルの上昇はない。しかしながら、対照患者（B）からの血清を10 mM FeSO4で処理した場合、DHEAレベルにおける大きな誘導がみられ、酸化剤により作用されることが可能なDHEA前駆体の存在が指示される。AD患者はこの前駆体をもたず、それは多分、末梢に到達する前に脳で既に変換されたものと考えられる。
【図６】
ヒト脳細胞はD合成に対する別経路を有する
細胞を、5 mM SU10603の存在下または不存在下にFeSO4濃度を上昇させて処理した。2時間後、細胞およびメジウムをエーテル：酢酸エチルで抽出処理したのち、サンプルを逆相C18 TLCプレート上に流し、分画をジエチルエーテルで抽出してDの量をRIAで測定した。Dレベル（pg/mgタンパク質）を片側ANOVAで分析した。（A）KG-1-C；F＝1.948, p＝0.0979（B）MGM-1；F＝5.004, p＜0.001（C）MGM-3；F＝0.5902, p＝0.7366（D）NHA；F＝4.131, p＜0.01および（E）hNT-PF；F＝0.6552, p＝0.6886．データは平均SEM（n＝4〜15）で示す。すべての実験は、FeSO4に加えて5 mM PとインキュベートしたhNT-PF細胞の場合を除いて、内因性Pの不存在下に実施した。X軸上の標識はFeSO4のmM用量を指示し、SU, SU/3およびSU/10は相当するmM用量のFeSO4とともに添加した5 mM SU10603を指示する。
【図７】
FeSO4はMGM-1およびNHA細胞内のROSレベルを上昇させる
FeSO4処理は試験したすべての用量でMGM-1およびNHA細胞性ROSのレベルの有意な上昇を引き起こす（*, MGM-1：F=59.883, p＜0.0001；■, NHA：F=25.419, p＜0.0001）。NHA細胞はROS産生の意味でヒトグリオーマ細胞よりもFe+感受性である。
【図８】
β-アミロイドは細胞性ROSおよびD合成を上昇させる
MGM-1細胞をβ-アミロイド（Aβ）単独またはAβおよびビタミンEと、少なくとも24時間処理した。細胞性ROSおよびDレベルを測定した。Aβは対照のレベル以上にROSを有意に（**P<0.01）上昇させ、これはビタミンEの共処理で部分的にブロックされた（p=0.054 vs Ab）が、なお対照のレベルより有意であった（**P<0.01）。同様に、AbはDレベルを対照以上に有意に（**P<0.01）上昇させ、この作用はビタミンEでブロックされた（*P<0.05 vs Ab）。データは対照以上の平均上昇SEM（n=12）として示す。