【手続補正書】
【提出日】平成16年2月10日(2004.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体および少なくとも１つの生物学的にもしくは薬理学的に活性な成分および／または哺乳動物の細胞を含有するゲル形態の注入可能な生体親和性組成物であって、該ヒアルロン酸誘導体は
（ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基によってエステル化されたヒアルロン酸のベンジルエステル；および
（ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシ基の３〜１５％が同じかまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシ基と架橋しているヒアルロン酸の自己架橋誘導体、
からなる群から選ばれる、該生体親和性組成物。
【請求項２】
ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基でエステル化されている、請求項１に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項３】
哺乳動物の細胞は、成人および胎児の両方に由来する軟骨細胞、骨細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、含脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、末梢神経系由来の細胞、内皮細胞、造血細胞、腺細胞、尿道の細胞および幹細胞からなる群から選ばれる、請求項１に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項４】
細胞は軟骨細胞である、請求項１に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項５】
生物学的に活性な成分は薬理学的に活性な成分である、請求項１に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項６】
薬理学的に活性な成分は抗生物質、抗炎症薬、消毒薬、活性ホルモン、抗腫瘍薬または抗ウイルス薬である、請求項５に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項７】
薬理学的に活性な成分は増殖因子、または分化／調節因子である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項８】
増殖因子は、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、酸性または塩基性の繊維芽細胞成長因子、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト成長因子、骨形態形成タンパク質および骨原性タンパク質からなる群から選ばれる要素である、請求項７に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項９】
薬理学的に活性な成分は核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ)である、請求項５に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項１０】
ヒアルロン酸誘導体の繊維、顆粒、ミクロスフェア、ナノスフェアまたはスポンジの断片を更に含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項１１】
ヒアルロン酸誘導体は全ベンジルエステル誘導体である、請求項１０に記載の注入可能な生体親和性組成物。
【請求項１２】
注射投与のための薬物の製造におけるゲル形態の少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体の使用であって、該ヒアルロン酸誘導体は、
（ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基でエステル化されたヒアルロン酸のベンジルエステル；および
（ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシル基の３〜１５％が同じかまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシ基と架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導体、
からなる群から選ばれる、該使用。
【請求項１３】
ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基でエステル化されている、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
哺乳動物細胞は成人および胎児の両方に由来する軟骨細胞、骨細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、末梢神経系由来の細胞、内皮細胞、造血細胞、腺細胞、尿道の細胞、幹細胞および遺伝的に改変した細胞からなる群から選ばれる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
細胞は軟骨細胞である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
軟骨の修復のための注入可能な組成物の製造における、軟骨細胞とヒアルロン酸誘導体とを組み合わせて含有する組成物の使用であって、該ヒアルロン酸誘導体は
（ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基でエステル化されたヒアルロン酸のベンジルエステル；および
（ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシル基の３〜１５％が同じかまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシ基と架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導体、
からなる群から選ばれる、該使用。
【請求項１７】
ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基でエステル化されている、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
哺乳動物細胞の保存中および輸送中の保護のための少なくとも１つのゲル形態のヒアルロン酸誘導体の使用であって、該ヒアルロン酸誘導体は
（ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基によってエステル化されたヒアルロン酸のベンジルエステル；および
（ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシ基の３〜１５％が同じかまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシ基と架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導体、
からなる群から選ばれる、該使用。
【請求項１９】
ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基でエステル化されている、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
哺乳動物細胞は成人および胎児の両方に由来する軟骨細胞、骨細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、末梢神経系由来の細胞、内皮細胞、造血細胞、腺細胞、尿道の細胞、幹細胞および遺伝的に改変した細胞からなる群から選ばれる、請求項１８または１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
細胞は軟骨細胞である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
軟骨損傷の処置のための薬物の製造における、軟骨細胞と、
（ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基でエステル化されたヒアルロン酸のベンジルエステル；および
（ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシ基の３〜１５％が同じかまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシ基と架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導体、
からなる群から選ばれるゲル形態のヒアルロン酸誘導体とを組み合わせた使用であって、
該薬物は患者の関節内腔に注射することを含む、該使用。
【請求項２３】
ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基でエステル化されている、請求項２２に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
関節軟骨を再構築しようという他の試みは、それらの中に分散している同種の軟骨細胞を有する合成基質または軟骨細胞の増殖を刺激することができる増殖因子を移植することからなる。これらの方法は、軟骨組織をインビトロで増殖し、次いで欠損部位に移植することを要する。最も一般的に用いられている合成基質は、コラーゲンゲル、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸およびその共重合体の基質である。それら基質を使用することの主な欠点は、移植された物質に対する免疫応答によって示される。軟骨細胞は、寒天、ヒアルロン酸、繊維接着物質、コラーゲンおよびアルギン酸塩によって構築されたゲル中で培養されることは知られている。しかしながら、これらのゲル中での培養は、それらが一旦移植された部位に接着し、軟骨構造の再構築が可能となるのに必要な機械的な安定性を与えない。その上、繊維などの基質中での軟骨細胞の培養物は脱分化して繊維芽細胞と同じように見える細胞となる。最後に、寒天などの物質によって構築されたゲルは軟骨細胞の再分化を誘発するが、この化合物の使用はヒトの体内への適用については承認されていない。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
関節軟骨の欠損は、支持基質なしで、単離された軟骨の懸濁液を用いて処置されてきた。しかしながら、軟骨細胞はその生存能力を失い、および／または欠損部位に留まらず、そしてそれらは繊維芽軟骨または繊維組織中に埋まった軟骨島を形成すると考えられている（米国特許第5,723,331号）。いくつかの生物学的な物質が組織修復、再構築および創傷治癒のための多孔性のスカホールドを作るのに使用されている（ＷＯ−Ａ−９７／４５５３２）。他のものは耐性に乏しく且つ弱い細胞の増殖を支持することが分かっている（ＷＯ−Ａ−９８／５６８９７）。しかしながら、これらの物質は注入不可能である。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
様々な証拠が、注入目的での細胞懸濁液の使用、特に慢性的な潰瘍および火傷の処置のためのケラチノサイトの使用に関する最近の文献（要約を参照）中に現われている。SilvermanらによるPlast. Reconstr. Surg., 1999年6月, 103(7) 1809-18（フィブリノーゲンおよび軟骨細胞の組み合わせ）；AtalaらによるJ. Urol., 1993年8月, 150(2 ptd 2) p.745-7（軟骨細胞−アルギン酸塩ゲル）を参照のこと。ケラチノサイトの培養物は、文献中で引用されている多数の方法（化学的に定義される培地などと一緒の胎児ウシ血清存在下または不存在下）に従って増殖させることができる。次いで、これらの培養物をそれらを様々な培地中に懸濁する宿主ベッド中に運ぶが、該培地中で最も良く引用される培地の１つは自家移植由来および商業的由来の両方の繊維である。それらの方法を使用するのにはかなりの不利益がある。先ず、細胞懸濁液を使用直前に調製しなければならず、そして細胞をそれらの利用のために使用する組成物とは異なる組成物を有する培地中で保存すべきである。一方、特にこれらが自家移植でない場合にはビヒクルとして使用する繊維接着物質についての別の問題が生じ得る。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
知られているとおり、ヒアルロン酸は多数の生物学的なプロセス（組織の水和作用、プロテオグリカンの組織化、細胞の分化、増殖および血管形成）において重要な役割を果たしている（J. AignerらによるL. Biomed. Master. Res. 1998, 42, 172-181）。ヒアルロン酸誘導体は、該グリコサミノグリカンの全ての性質を保ち、様々な形態に加工することが可能であって、そして誘導の種類およびその割合に応じて変わる溶解度および分解時間を有するという利点がある（欧州特許0216453B1）。その上、ヒアルロン酸誘導体は該ヒアルロン酸の構造に特定の分子を挿入することにより新しい性質を得る。例えば、ヒアルロン酸の硫酸誘導体は、抗凝固性を有し、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ95／25751号）に対して耐性である。該組成物は生物体による免疫応答を引き起こさず、それらが含有する軟骨細胞はそれらの表現型を保っていることが実証された。ヒアルロン酸誘導体は細胞毒性ではなく、軟骨組織の発生に必要な細胞外基質の成分を合成することを可能とする。その上、該誘導体は細胞に対する単なるビヒクルではなく、それらの増殖を刺激することが可能であり、そしてそれらが分解するにつれて三次元構造へと細胞の発生を可能とする。移植した細胞の増殖を刺激するのに加えて、ヒアルロン酸誘導体は組織の再生を刺激する哺乳動物の胎児の細胞外環境と同じような細胞外環境を作ることができる。その上、ヒアルロン酸誘導体が分解するにつれてオリゴマーを放出し、それらは軟骨細胞の始原細胞のレクルートメントを刺激し、且つ軟骨細胞のセルラインの発生を有利にする。それらのヒアルロン酸誘導体は、関節症の処置における使用として提案されている（ＷＯ−Ａ−９７／４９４１２）。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
用語「ヒアルロン酸］は、文献中でＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基によって構成される様々な分子量を有する酸性の多糖類を意味するのに使用されており、このものは細胞表面、脊椎動物の関節組織の塩基性細胞外物質、関節液、眼のガラス液、ヒトのさい帯の組織および雄鶏の冠に存在する。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
ヒアルロン酸は、生体中で重要な役割を果たしており、第１に多数の組織（例えば、皮膚、腱、筋肉および軟骨）の細胞の機械的な支持物として役割を果たしており、従ってそれは細胞外基質の主成分である。ヒアルロン酸は生物学的なプロセスにおける他の機能（例えば、組織の水和作用、潤滑、細胞の移動、細胞の機能および分化）をも果たしている（例えば、A. BalazsらによるCosmetics & Toiletries, 5/84号, 8−17頁を参照）。ヒアルロン酸は上記の天然の組織（例えば、雄鶏の冠）またはある細菌からも抽出し得る。今日、ヒアルロン酸は微生物学的な方法によっても製造可能である。抽出によって得られる全てのヒアルロン酸の分子量は８百万〜１千３百万ダルトンの範囲にある。しかしながら、該多糖類の分子鎖は多数の物理学的もしくは化学的要因（例えば、機械的な影響）の影響下で、または放射剤、加水分解剤、酸化剤もしくは酵素剤の影響下で全く容易に分解し得る。このため、もとの抽出物の通常の精製法においてはよく、低分子量の分解した画分を得る（Balazらによる上記の引用文献を参照）。ヒアルロン酸、その分子画分および個々の塩は薬物として使用されており、それらの使用は化粧品の分野でも提案されている（例えば、Balazによる上記の文献およびフランス特許第2478468号を参照のこと）。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
用語「ヒアルロン酸」は、不適当な意味で用いられているが、上記の通り、様々な分子量を有するＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の改変を有する多糖類の全ての群またはその分解した画分を意味し、そこで複数形の「ヒアルロン酸類」がより適当と思われるかもしれないが、本明細書における記載では、様々な形態（例えば、分子画分を含む）のヒアルロン酸を意味するのに単数形を使用し続ける。略号「ヒアルロン酸」もまた、このひとまとめにした用語を記載するのに使用する。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明は、生物学的な／薬理学的な細胞または分子のための適当な担体として作用するヒアルロン酸誘導体を含有する、注入可能な組成物について記載する。ヒアルロン酸誘導体は、当該分野でよく知られている他の生体適合物質／スカホールドよりも特に適している。生物学的な由来のシステム（例えば、死体の無細胞物質cadaveric acellular)）と比較して、ヒアルロン酸は供給源を限定されずに容易に入手することができ、そしてあまり免疫原性でない（例えば、同種免疫のドナー組織）利点を有する。加えて、ヒアルロン酸は感染性の疾患、特にウイルスによる疾患（例えば、ＨＶ、肝炎など）が交差混入する危険はない。より精製した生物学的な由来の分子（例えば、コラーゲン、プロテオグリカンおよび繊維）または生体親和性の高分子（例えば、ＰＬＬＡ／ＰＧＡ、ＰＴＦＥ）と比較して、ヒアルロン酸は異なる好ましい特性を有する。まず第１に、ヒアルロン酸は通常のタンパク質化合物もしくはタンパク質をベースとする化合物よりも免疫原反応が小さい多糖類である。第２に、ヒアルロン酸は分子構造の修飾なしに全ての哺乳動物種において一般的に見出され、従って非常によく知られており、そしてヒトの身体に耐えられる。第３に、ヒアルロン酸は成人のヒトの場合と同様に発生においても、多数の生物学的効果を有し、このために該分子は各修復／再生のプロセスにおいて基礎となる。最後に、更なる好ましい利点は、ヒアルロン酸がヒトの身体のほとんど全ての組織／器官に存在し、そのものは細胞外基質の主成分であることである。この事実と単純な高分子の組成物であることとを併せると、ヒアルロン酸は多数のタンパク質の細胞外基質分子（例えばコラーゲン）（それらは組織／器官に特異的であることが非常に多い）とは異なったものである。この最後の点は、ヒトの身体の異なるコンパートメントに使用する一般的で且つ生体親和性の運搬ビヒクルを設計する際に重要である。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
２．ベンジルエステル誘導体
本発明の第１に好ましい物質はヒアルロン酸のベンジルエステルをベースとするものであり、特にヒアルロン酸カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル残基によってエステル化された５０〜７５％のエステルである。ヒアルロン酸カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル残基によってエステル化されたベンジルエステルは「部分エステル」と呼ばれる。その理由は、カルボキシ基の一部だけがエステル化され、残りのカルボキシ基が遊離であるかまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カルシウムまたはカリウム）で塩化されているからである。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の組成物はベンジルエステルが最も好ましく、このものは該ヒアルロン酸のカルボキシ基の５０％がエステル化されている。本発明に記載のヒアルロン酸のベンジルエステルは、カルボン酸のエステル化そのものについて知られる方法によって製造することができ、例えば遊離のヒアルロン酸を触媒作用の物質（例えば、強無機酸または酸性タイプのイオン交換樹脂）の存在下でアルコール（ベンジルアルコール）を用いて処理することによって、または無機塩基もしくは有機塩基の存在下、目的のアルコール残基を導入することができるエーテル化剤を用いて処理することによって製造することができる。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
ベンジルエステルの製造については、いずれかの由来のヒアルロン酸（例えば、上記の天然の出発物質（例えば、雄鶏の冠）から抽出した該酸）を使用することができる。それら酸の製造については文献に記載されており、精製したヒアルロン酸を使用することが好ましい。本発明によれば、有機物質の抽出によって直接的に得られる内在性の酸の分子画分を含むヒアルロン酸を特に使用するが、該有機物質はその分子量が、例えば分子量が１千３百万ダルトンを有する内在性タンパク質の約９０％〜８０％（Ｍ＝１１.７〜１０.４ミリオンダルトン）〜０.２％（Ｍ＝３０,０００ダルトン）の広範囲で変わり、５％〜０.２％が好ましい。該画分は文献中に記載する様々な方法（例えば、加水分解剤、酸化剤、酵素剤または物理的な方法（例えば、機械的な方法または放射線法））を用いて得ることができる。従って、初期の（Primordial）抽出物はこれらと同じ精製法（例えば、Balazsらによる上記の「Cosmetics & Toiletries」における記載を参照のこと）中に得られることが多い。得られた分子画分の単離および精製は、よく知られている技術（例えば、分子ろ過）によって行なう。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明に記載する使用に適した、精製したヒアルロン酸の１つの画分は、例えばBalazsによる小冊子「Healon-A guide to its use in Opthalmic Surgery」 D. Miller & R. Stegmannら編, John Wiley & Sons, N. Y., 81983. 5頁により記載の、「非炎症性の−ＮＩＦ−Ｎａヒアルロン酸」ヒアルロン酸ナトリウムとして知られているものである。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
ベンジルエステルの出発物質として特に重要なものは、ヒアルロン酸から得ることができる２つの精製した画分であり、例えば「ヒアラスチン（Hyalastine）」および「ヒアレクチン（Hyalectin）」として知られている雄鶏の冠から抽出される画分である。ヒアラスチン画分は平均分子量が約５０,０００〜１００,０００ダルトンを有し、一方でヒアレクチン画分は平均分子量が約５００,０００〜約７３０,０００ダルトンの範囲である。これら２つの画分を合わせた画分も単離されており、平均分子量が約２５０,０００〜約３５０,０００を有することを特徴とする。この合わせた画分はある出発物質として入手可能な全ヒアルロン酸の８０％の収率で得ることができ、一方でヒアレクチン画分は出発物質であるＨＡの３０％の収率で得ることができ、ヒアラスチン画分は約５０％の収率で得ることができる。これら画分の製造については、欧州特許第0138572号に記載されている。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
以下の実施例は、ヒアルロン酸のベンジルエステルの製造法について記載する。
実施例１−ヒアルロン酸（ヒアルロン酸）の５０％ベンジルエステル（エステル化されたカルボキシル基は５０％でおよび塩化された（Ｎａ）カルボキシル基は５０％である）の製造
単量体単位が２０ミリ(グラム)当量(milliequivalent)に相当する分子量が１７０,０００ダルトンであるヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（１２.４ｇ）を２５℃でジメチルスルホキシド（６２０ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（１０ミリ当量）を加え、得られた溶液を３０℃で１２時間保つ。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
実施例２−ヒアルロン酸（ヒアルロン酸）の７５％ベンジルエステル（エステル化されたカルボキシ基は７５％でおよび塩化された（Ｎａ）カルボキシル基は２５％である）の製造
単量体単位が２０ミリ当量に相当する分子量が２５０,０００ダルトンであるヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（１２.４ｇ）を２５℃でジメチルスルホキシド（６２０ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（２.５ｇ、１５ミリ当量）を加え、得られた溶液を３０℃で１２時間保つ。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
実施例３−ヒアルロン酸の７５％エステル（エステル化されたカルボキシ基は７５％でおよび塩化された（Ｎａ）カルボキシ基は２５％である）の製造
単量体単位が２０ミリ当量に相当する分子量が８０,０００ダルトンであるヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（１２.４ｇ）を２５℃でジメチルスルホキシド（６２０ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（２.５ｇ、１５ミリ当量）を加え、得られた溶液を３０℃で１２時間保つ。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
自己架橋した生成物は特に部分的な内部エステルであって、「架橋結合」の割合はヒアルロン酸のカルボキシ基数の３〜１５％以内で変わることが好ましい。製造法において、ヒアルロン酸分子のカルボキシ基はそれらの活性化を誘発することができる物質を加えることによって活性化される。活性化反応によって得られる不安定な中間体生成物は、触媒の添加後および／または上記の同一もしくは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシとの内部エステル結合を形成するような温度まで昇温させた後に、自然と分離する。所望する内部エステルの程度により、カルボキシ官能基の全てまたは一部を活性化する（該部分的な物については過剰量の活性化物質を用いるか、または適当な用量法によって得られる）。


【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
内部エステル基に変換するカルボキシ基は、カルボキシ基を含有するヒアルロン酸、または好ましくは塩化したカルボキシ基（例えば、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属などの金属塩が好ましい）を含有するヒアルロン酸および４級アンモニウム塩を有する上記の全て（以下に記載するもの）を出発として活性化することができる。しかしながら、有機塩基（例えば、アミン）との塩をも出発物質として使用することができる。


【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
従って、架橋ヒアルロン酸の好ましい製造法は、遊離であるかもしくは塩化したカルボキシ基を有するヒアルロン酸を、できれば中間体である活性化誘導体の形成を容易にする補助剤および／または第３級の有機塩基もしくは無機塩基の存在下でカルボキシ官能基を活性化する剤を用いて処理すること、該混合物を加熱または照射に曝露すること（特に、ＵＶ光を使用）、および望むならば、遊離のカルボキシ基を塩化するかまたは塩化したカルボキシ基を遊離にすることを特徴とする。カルボキシ基を活性化することができる物質の１つとして、文献中に記載する物質、例えばペプチド合成の方法において通常使用する物質を使用することができる。しかしながら、出発物質ＨＡの分子構造を改変したりまたは破壊するような影響を有するものを除く。活性化エステルの生成を導く好ましい物質は、例えばカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンジル−イソプロピルカルボジイミド、ベンジル−エチルカルボジイミド、エトキシアセトン、ウッドワード試薬（Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３−スルホネート）、または脂肪族、環状脂肪族もしくは芳香族炭化水素由来のハロゲン誘導体、または１つ以上の活性基が存在することによってハロゲンが可動（mobile）されたヘテロサイクリックな化合物由来のハロゲン誘導体が挙げられ、該活性基としては例えば、クロロアセトニトリル、特に２−クロロ−Ｎ−アルキルピリジンの塩（例えば、２−クロロ−Ｎ−メチルピリジンのクロロ体）、または低級アルキル基（炭素数が１〜６のアルキル）を有する他のアルキル誘導体が挙げられる。クロリド誘導体の代わりに、当然他のハロゲン誘導体（例えばブロミド誘導体）を使用することができる。


【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
活性化中間体（特に、エステル）を形成する反応は文献内で推奨する温度で行なうが、しかしながらこの温度は周囲の環境の要求により変わるべきものであり、これは当業者が容易に決めることができる。内部エステル結合の生成は、かなり広範囲にわたる温度（例えば、約０℃〜約１５０℃の間であり、室温またはわずかにそれより高い温度（例えば、２０℃〜７５℃）が好ましい）で生じる。適当な波長（例えば、紫外線）の照射に曝露する場合と同様に、温度の上昇は内部エステルの生成を容易にする。


【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ヒアルロン酸の基質はいかなる由来のものであってよく、上記の多数の種類のものであり得る。好ましいヒアルロン酸の出発物質は、平均分子量が約１５０,０００〜７３０,０００ダルトンの範囲であり、特に１５０,０００〜４５０,０００ダルトンを有するものである。


【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
加えて、分子内部架橋結合の量を変えることができるが、本発明の好ましい物質はカルボキシ基の３〜１５％程度が架橋しているヒアルロン酸を使用する。


【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
ゲル形態で製造する場合には、架橋した誘導体は修飾していないヒアルロン酸よりも高い粘性を有する。粘性をコントロールすることによって、分解時間および接着防止の効果を変えることができる。粘度が少なくとも２００Ｐａ＊／秒であるゲルが好ましい。粘度が少なくとも２５０Ｐａ＊／秒であるゲルがより好ましく、少なくとも３００Ｐａ＊／秒であるものがより一層好ましいが、３５０Ｐａ＊／秒または４００Ｐａ＊／秒の粘性を有するゲルが最も好ましい。


【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
以下の実施例は、本発明の物質を製造するのに有用な架橋ヒアルロン酸生成物の製造法について記載する。
実施例４−３％架橋したヒアルロン酸（ヒアルロン酸）の製造
生成物は、分子内エステルに使用するカルボキシ基が３％であり、ナトリウムで塩化されたカルボキシ基が９７％である。


【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
単量体単位が１０ミリ当量に相当する分子量が１７０,０００ダルトンであるヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でジメチルホルムアミド（２４８ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０.０３ｇ、０.３ミリ当量）を加える。


【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
２−クロロ−１−メチルピリジニウムクロリド（０.０７６ｇ、０.３ミリ当量）のＤＭＳＯ（６０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を３０℃で１５分間保つ。


【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
水（１００ｍＬ）および塩化ナトリウム（２.５ｇ）によって形成される溶液を加え、得られた混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（７５０ｍＬ）中にゆっくりと注ぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過し、アセトン：水（５：１）（１００ｍＬ）を用いて３回洗浄し、アセトン（１００ｍＬ）で３回洗浄し、最後に３０℃で２４時間真空乾燥する。


【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
単量体単位が１０ミリ当量に相当する分子量が９５,０００ダルトンであるヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でジメチルホルムアミド（２４８ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０.０５１ｇ、０.５ミリ当量）を加え、該得られた溶液を３０分間撹拌する。


【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（０.１２８ｇ、０.５ミリ当量）のＤＭＳＯ（６０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を３０℃で１５分間保つ。


【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例６−１０％架橋したヒアルロン酸（ヒアルロン酸）の製造
生成物は、分子内エステルに使用するカルボキシ基が１０％であり、ナトリウムで塩化されたカルボキシ基が９０％である。


【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
単量体単位が１０ミリ当量に相当する分子量が６２０,０００ダルトンであるヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でＤＭＳＯ（２４８ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０.１０１ｇ、１.０ミリ当量）を加え、得られた溶液を３０分間撹拌する。


【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
２−クロロ−１−メチルピリジニウムクロリド（０.２５５ｇ、１.０ミリ当量）のＤＭＳＯ（６０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を３０℃で１５分間保つ。


【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
実施例７−１５％架橋したヒアルロン酸（ヒアルロン酸）の製造
生成物は、分子内エステルに使用するカルボキシ基が１５％であり、ナトリウムで塩化されたカルボキシ基が８５％である。


【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
単量体単位が１０ミリ当量に相当する分子量が１７０,０００ダルトンであるヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でＤＭＳＯ（２４８ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミンクロリド（０.１５２ｇ、１.５ミリ当量）を加え、得られた溶液を３０分間撹拌する。


【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
２−クロロ−１−メチルピリジニウムクロリド（０.３８２ｇ、１.５ミリ当量）のＤＭＳＯ（２０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を３０℃で４５時間保つ。


【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
４．６  骨髄間質（bone marrow stroma）由来の細胞培養の調製
骨髄間質は、滅菌条件中、標準的手法にしたがい、ヘパリン溶液（３，０００ユニット／ｍＬ）１ｍＬを含む１０−ｍＬシリンジに連結されたヘパリン処理プラスチック管を用いて、腸骨稜から吸引することによって単離できる。骨髄そのもの以外に、骨髄から単離された幹細胞を用いることも可能である。この場合、脛骨（または他のいずれかの骨）の内側近位表面を、麻酔薬下に、小さな切開を介して曝露する。皮下組織および骨膜を切開し、折り返して骨表面を曝露させる。脛骨を１６または１８ゲージニードルで穿孔処理し、ヘパリン溶液（３，０００ユニット／ｍＬ）１ｍＬを含むシリンジに連結されたヘパリン処理プラスチック管を通して骨髄を吸引する。吸引された物質を、滅菌条件下、５０ｍＬプラスチック管に移し、１，３００ｒｐｍで１０分間遠心する。遠心された細胞を暖かい Hank's 塩基性塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、再び遠心し、１％抗生物質溶液（ペニシリン１０，０００ユニット、１０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）および±デキサメタゾン（０．４μｇ／ｍＬ）に富むα最小必須培地（α−ＭＥＭ）を含む完全培養培地に懸濁する。この細胞懸濁物を１ｃｍ２当たり３〜５×１０６有核細胞の密度で３５−ｍｍ Perti カプセルに注ぐ。間葉幹細胞を、５％ＣＯ２および９５％空気を含む加湿雰囲気下、３７℃の完全培養培地中でインキュベートする。


【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
５．  医薬的または生物学的に活性な成分
ヒアルロン酸の５０〜７０％ベンジルエステルおよび３〜１５％ＡＣＰヒアルロン酸誘導体は注射投与のデリバリー系に関する優秀な担体であることがわかったため、生物学的または薬理学的活性成分は哺乳類、例えばヒト患者に投与するのに望ましいすべてのタイプであってよい。薬理学的に活性な物質として特に重要なのは、それ自体当業者に既知である、抗生物質、抗炎症薬、消毒薬、活性ホルモン、抗腫瘍薬（anti-tumoral agents）および抗ウイルス薬である。


【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
生物学的に活性な物質は好ましくは哺乳類または患者の生物学的プロセスに影響する物質である。特に重要なのは、フィブロネクチン、ＲＧＤまたはインテグリン配列のような生体材料に対する細胞の接着を助ける物質、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、酸性または塩基性の繊維芽細胞成長因子（ａＦＢＦまたはｂＦＢＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、骨形態形成タンパク質（bone morphogenic proteins、ＢＭＰＳ）、例えばＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６、および骨原生タンパク質（osteogenic proteins, ＯＰｓ）、例えばＯＰ−１、ＯＰ−２およびＯＰ−３のような成長因子、ＤＮＡおよびＲＮＡのような特定の遺伝子または遺伝子配列または遺伝子転写物をコードする核酸、ならびに分化／調節因子である。


【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
ゲルは、細胞が結果として担体中で均一に分散するようなやり方で、機械によって取り扱うことができる。次いで、組合せ物を、滅菌注射器および／または当分野において外科医が常套的に使用するような関節鏡検査装置を用いることにより注入し、欠損した範囲を満たす。ヒアルロン酸担体の特性によって、細胞がこの欠損に滞留し、修復／再生過程の間にこの担体と置き換わる細胞外基質を細胞が産生し始める。さらに、例えば間葉性幹細胞を使用する場合に、未分化の軟骨形成細胞に委ねるため、あるいは投与した細胞および／または宿主細胞の成長を促進するために、送達された細胞とゲルの組合せ物に分化因子および／または成長因子を加えることができる。


【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
この目的とする組成物は、軟骨形成細胞が均一に分散している、ヒアルロン酸由来の粒子を少なくとも含む固体の懸濁液とともに、少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含むゲルの注射可能な組合せの形態で製造することができる。細胞は、実施例１１に記載したとおりに回収し、単離し、増殖させる。次いで、細胞を、前記のＡＣＰまたはベンジルエステル誘導体から製造された、線維、顆粒、ミクロスフェア、ナノスフェアまたはスポンジの断片の形態の少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含む液体媒体中で混合する。手術室内で、またはさらには細胞培養インキュベーターなどのより管理された雰囲気において、室温にて、１５分〜４８時間、好適には３０分間〜２４時間、またはより好ましくは１時間〜３時間、細胞を微粒子に付着させる。次いで、微粒子に付着した細胞をゲル内に均一に取り込ませ、そして上記のとおり注入する。ヒアルロン酸由来の成分の組合せは、微粒子画分とゲル画分との比率が考慮されるような組合せである。最適な比率は、具体的な臨床的適用ごとに調整すべきであり、微粒子：ゲルを９：１から１：９の割合の間で変更することができる。


【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
実施例１２−成長因子を取り込んでいるヒアルロン酸誘導体担体の注射可能な組合せによる骨不癒合の処置
骨不癒合は、複雑性骨欠損または代謝異常の患者を処置するときの成形外科手術において起きる一般的な合併症である。現時点の技術水準での骨不癒合の処置は、薬剤投与または無細胞の生体用材料の適用によるものである。比較的最近の方法として、宿主修復系を刺激するために特定の生物学的因子を使用して骨カルス形成を妨害する状態を克服するというものがある。このような生物学的に活性な分子は、例えば、骨形成因子（ＢＭＰ）である。しかし、物質が局所的に作用しなければならず、循環系（脈管系および／またはリンパ系）によって分散してはならないため、当業者は様々な担体を試験している。本発明の目的とするヒアルロン酸由来の化合物は、この適応症に特に適している。なぜなら、ヒアルロン酸は骨伝導性（osteo-conductive）であるだけでなく骨誘導性（osteo-inductive）でもあるからである。このように、ある特定の量のＢＭＰが放出する一方で、ヒアルロン酸は、この生物学的に活性なタンパク質の効果と好ましい骨形成を強化することもできる。


【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
骨内植のために使用する製剤は、ＢＭＰ、例えばＢＭＰ２、を取り込んでいるゲルか、またはゲルとＢＭＰを取り込んでいる微粒子との組合せである。ゲルと微粒子の比率は、上記のように調整することができる。骨前駆体に対する直接的なヒアルロン酸の作用により骨形成を促進する（骨誘導）ため、およびさらに組織が誘導する骨伝導（osteoconduction）を刺激するために、後者の組合せが企図されるが、これに限定されない。さらに、例えばＢＭＰ２や特定の抗生物質を混合することにより、骨成長を骨不癒合における一般的な合併症である感染から保護することができる。


【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
実施例１３−ヒアルロン酸誘導体ベースのゲルおよびゲル／固体組合せ物中の異なる細胞の注入による皮膚形成異常の処置
例えば、乳房切除または広範な顔の火傷後の、皮膚形成異常は、人の生活の質に相当な影響を与える。現時点の技術水準での処置は、組織増強分解性物質、例えばコラーゲン、の投与によるものである。しかし、このような仮の処置は、美観を損なう特徴を永久に消し去るものではなく、継続的な投与が必要である。安定した増強は、細胞外基質が正しく産生されてもとの皮膚の外形が再び確立される場合にのみ達成される。液体の懸濁液にて注入される細胞は、脈管系またはリンパ系のいずれかによって分散されると思われ、永続的に組織化した細胞外基質を合成する能力は低下する。担体系は、永続的な付着が起きるまでの周囲の組織に対する一時的な安定したよりどころを保証し、ヒアルロン酸誘導体ベースの製剤によって構成することができる。さらに、文献において知られているように、ヒアルロン酸は、ある程度、創傷治癒過程の促進において直接作用する。


【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
このように、線維芽細胞などの細胞外基質産生細胞は、これを、前記のようなヒアルロン酸誘導体ベースのゲル中に取り込ませることによって送達することができる。次いで、線維芽細胞を皮下の空隙に注入し、周囲の組織への付着の自然の過程が起こるまでその部位に固着させることができる。別法では、均一に分散した細胞を送達するために線維芽細胞が最初に付着する、ゲル内に取り込まれた微粒子の組合せを使用することができる。各種製剤の比率および組成は上に記載されている。例えば、乳腺細胞またはアジポサイト（adypocyte）（分化したまたは未分化の）などの線維芽細胞以外の細胞は、皮膚の陥没を満たすために使用することができる。


【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
実施例１４−注射可能なヒアルロン酸誘導体固体／ゲル製剤中に取り込まれた遺伝的に処理された細胞による自己免疫疾患の処置
自己免疫疾患は、例えば若年型糖尿病におけるインスリンまたは慢性関節リウマチにおける軟骨組織成分などの特定の生体因子に対する免疫系の自己反応性応答に起因する。自己免疫疾患は、全世界で百万人が罹患している慢性の病気である。現在の薬理学的プロトコルは、合併症に関して局所的または全身的に送達された総合的な抗炎症物質を投与することによる、その疾患の症状にその焦点が当てられている。新しい時代の処置は、例えば、酵素的阻害物質または受容体アンタゴニストなどのより強力で特異的な化合物の使用によるものであろう。しかし、疾患の永続的な抑制は、これら物質の継続的投与を頼みとしており、薬物に関連する合併症が進行する危険性が伴う。別の最先端の解決方法は、例えば、遺伝的に形質転換された細胞をex vivoで使用し、免疫反応を中和する特異的な生物学的または薬学的な物質を産生させることによる。この特定の適用では、細胞を局所的に注入し、この細胞は、長期間、恐らくはその人の一生にわたり、その生存が維持されなければならない。この目的のためには、細胞が適用部位と融和しなければならないが、これは細胞がそこに最初に送達され取り込まれるような支持体を提供することにより達成することができる。上記実施例に記載のヒアルロン酸誘導体は、人体のほぼすべての区画に受け入れられる特定の特性でもってこの要求を満たしている。したがって、上に記載したように、軟骨形成細胞を回収して単離することができる。次いで、当業者によって常套的に使用される技術を用いて、細胞が生体による制御を受けるようにトランスフェクトし、例えば抗ＩＬ−１または抗ＴＮＦα等の抗リウマチ物質を発現させ、増殖させることができる。そして、細胞を、前に使用した同じビークル中にて慢性関節リウマチの患者に送達する。


【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
ヒアルロン酸誘導体ベース製剤の別の応用は、in vivo 遺伝子治療プロトコルのための遺伝物質の送達によって構成される。実施例１０に記載されたヒアルロン酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの組合せを、適当な担体中にて直接注入して、例えば膵嚢胞線維症に関与するような欠陥肺細胞をトランスフェクトする。