(57)【要約】異なる分子種の受容体及び／又はリガンド結合蛋白と、リガンドとの複合体が形成できるようなヘテロダイマーを開発すること。本発明は、ＩＬ−１受容体タイプＩＩの細胞外ドメインと第１化学的部分とを含む第１サブユニットと、ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメインと第２化学的部分とを含む第２サブユニットとからなり、第１化学的部分と第２化学的部分とは、第１サブユニットと第２サブユニットとを会合させて、ＩＬ−１リガンドに結合可能な複合体を形成させる、ヘテロダイマーを提供する。本発明のヘテロダイマーは、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチド等と、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチド等とを含み、前記ＩＬ−受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白は、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチド等と、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチド等とを含むことを特徴とする場合がある。
2008093756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１受容体タイプＩＩ蛋白の細胞外ドメインと第１化学的部分とを含む第１サブユニットと、ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメインと第２化学的部分とを含む第２サブユニットとからなり、
第１化学的部分と第２化学的部分とは、第１サブユニットと第２サブユニットとを会合させて、ＩＬ−１リガンドに結合可能な複合体を形成させることを特徴とする、ヘテロダイマー。
【請求項２】
前記ＩＬ−１受容体タイプＩＩ蛋白の細胞外ドメインは、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかからなり、
前記ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメインは、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかからなることを特徴とする、請求項１に記載のヘテロダイマー。
【請求項３】
第１及び第２化学的部分のうち少なくとも１つはポリヌクレオチド又はポリペプチドであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のヘテロダイマー。
【請求項４】
第１及び第２化学的部分は、ともに免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を含むことを特徴とする、請求項４に記載のヘテロダイマー。
【請求項５】
第１及び第２化学的部分は、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有するポリペプチドかを含むことを特徴とする、請求項３に記載のヘテロダイマー。
【請求項６】
第１化学的部分は、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とを有するポリペプチドか、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とに対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかを含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のヘテロダイマー。
【請求項７】
第２化学的部分は、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とを有するポリペプチドか、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とに対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかを含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のヘテロダイマー。
【請求項８】
第１サブユニットは、
配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、
配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０，８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有し、かつ、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかとを含み、
第２サブユニットは、
配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、
配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０，８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有し、かつ、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかとを含むことを特徴とする、請求項３に記載のヘテロダイマー。
【請求項９】
第１及び／又は第２サブユニットは、特異的結合タグを含むことを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載のヘテロダイマー。
【請求項１０】
前記特異的結合タグは、配列番号１ないし３のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項８に記載のヘテロダイマー。
【請求項１１】
第１サブユニットは、配列番号２５、２７又は２８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドであり、
第２サブユニットは、配列番号２６又は２９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドであることを特徴とする、請求項９に記載のヘテロダイマー。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のヘテロダイマーを有効成分とすることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１３】
自己免疫疾患の治療薬であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬品組成物。
【請求項１４】
前記自己免疫疾患は膠原病であることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬品組成物。
【請求項１５】
前記膠原病は、関節リウマチ及び／又は全身性エリテマトーデス及び／又は全身性強皮症であることを特徴とする、請求項１３に記載の医薬品組成物。
【請求項１６】
配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、
配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有するポリペプチドかとを含む、第１サブユニットをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、
配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、
配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有するポリペプチドかとを含む、第２サブユニットをコード化するポリヌクレオチドとを含む発現ベクターとを含むことを特徴とする、ヘテロダイマーを生産するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的製剤、特に、リガンド抑制作用を有する受容体−Ｉｇ融合蛋白ヘテロダイマーを有効成分として含む生物学的製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉｇ融合蛋白ホモダイマーの構造（図１Ａ）をとる薬は、ＴＮＦ受容体Ｉｇ融合蛋白ホモダイマーであるエタネルセプト（非特許文献１）、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ（非特許文献２）、ＬＦＡ３Ｉｇ（非特許文献３）など、いくつか考案され、実用化されているものもある。これらの薬のように、免疫関連蛋白（サイトカインや増殖因子など）の機能を抑制したり促進したりする薬は、さまざまな病気の治療薬になる可能性があり、その適応症となる疾患は今後さらに広がる可能性がある。
【非特許文献１】A. F. Suffredini, D. Reda, S. M. Banks, M. Tropea, J. M. Agosti, and R. Miller, Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration, J Immunol.155 (1995)5038-5045.
【非特許文献２】D. J. Lenschow, Y. Zeng, J. R. Thistlethwaite, A. Montag, W.Brady, M. G. Gibson, P. S. Linsley, and J. A. Bluestone, Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg, Science.257 (1992)789-792.
【非特許文献３】G. R. Majeau, W. Meier, B. Jimmo, D. Kioussis, and P. S. Hochman, Mechanism of lymphocyte function-associated molecule 3-Ig fusion proteins inhibition of T cell responses. Structure/function analysis in vitro and in human CD2 transgenic mice, J Immunol.152 (1994)2753-2767.
【０００３】
しかし、その効果の程度と薬の種類には限界があり、今後新たな薬の開発が期待されている。【０００４】
本発明者らも、疾患動物モデルを用いた実験で、いくつかの免疫関連蛋白と免疫グロブリン（Ｉｇ）との融合蛋白ホモダイマーの構造をとる蛋白の治療実験を行ってきた。その中で、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｉｇ、ＩＬ−２２Ｉｇなどいくつかの蛋白が心筋炎ラットに効果があると報告してきた。しかし、より多彩で、より強力な効果を持つ治療薬が開発されるべきではないかと考えた。さまざまな病態形成に大きく関わるサイトカインや増殖因子に対する強力な阻害薬が開発できれば、さまざまな治療薬が期待できる。【０００５】
サイトカインや増殖因子を阻害するには、前述したＴＮＦ受容体Ｉｇ融合蛋白ホモダイマーであるエタネルセプトのように、受容体とＩｇとの融合蛋白が効果的なことがある。その原因の１つは、ＩｇがＦｃＲｎ受容体と結合することにより血液中での半減期が長くなることであると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、サイトカインや増殖因子の受容体にはサイトカインや増殖因子のリガンドの存在下でリガンドと高親和性のヘテロダイマー受容体との複合体を形成する場合がある。このような複合体は、より多彩で、より強力な効果を持つ、リガンド抑制作用を有することが期待される。そこで、異なる分子種の受容体及び／又はリガンド結合蛋白と、リガンドとの複合体が形成できるようなヘテロダイマーを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＩＬ−１受容体タイプＩＩ蛋白の細胞外ドメインと第１化学的部分（chemical moiety）とを含む第１サブユニットと、ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメインと第２化学的部分とを含む第２サブユニットとからなり、第１化学的部分と第２化学的部分とは、第１サブユニットと第２サブユニットとを会合させて、ＩＬ−１リガンドに結合可能な複合体を形成させる、ヘテロダイマーを提供する。【０００８】
本発明のヘテロダイマーにおいて、前記ＩＬ−１受容体タイプＩＩ蛋白の細胞外ドメインは、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかからなり、前記ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメインは、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかからなる場合がある。【０００９】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第１及び第２化学的部分のうち少なくとも１つはポリヌクレオチド又はポリペプチドの場合がある。【００１０】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第１及び第２化学的部分は、ともに免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を含む場合がある。【００１１】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第１及び第２化学的部分は、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有するポリペプチドかを含む場合がある。【００１２】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第１化学的部分は、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とを有するポリペプチドか、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とに対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかを含む場合がある。【００１３】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第２化学的部分は、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とを有するポリペプチドか、配列番号４８ないし５２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列と、配列番号５３ないし５７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列とに対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかを含む場合がある。【００１４】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第１サブユニットは、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０，８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有し、かつ、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかとを含み、第２サブユニットは、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３６、３９、４０、４１又は４２のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０，８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有し、かつ、ＦｃＲｎ受容体と結合するポリペプチドかとを含む場合がある。【００１５】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第１及び／又は第２サブユニットは特異的結合タグを含む場合がある。【００１６】
本発明のヘテロダイマーにおいて、前記特異的結合タグは、配列番号１ないし３のいずれかのアミノ酸配列からなる場合がある。【００１７】
本発明のヘテロダイマーにおいて、第１サブユニットは、配列番号２５、２７又は２８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドであり、第２サブユニットは、配列番号２６又は２９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドである場合がある。【００１８】
本発明は、前記本発明のヘテロダイマーを有効成分とすることを特徴とする医薬品組成物を提供する。【００１９】
本発明の医薬品組成物は自己免疫疾患の治療薬の場合がある。【００２０】
本発明の医薬品組成物において、前記自己免疫疾患は膠原病の場合がある。【００２１】
本発明の医薬品組成物において、前記膠原病は、関節リウマチ及び／又は全身性エリテマトーデス及び／又は全身性強皮症の場合がある。【００２２】
本発明は、本発明のヘテロダイマーを生産するためのキットを提供する。前記キットは、第１サブユニットをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、第２サブユニットをコード化するポリヌクレオチドとを含む発現ベクターとを含む。第１サブユニットは、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３４又は３７に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有するポリペプチドかとを含む。第２サブユニットは、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号３５又は３８に列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ＩＬ−１リガンドと結合するポリペプチドかと、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドか、配列番号４３ないし４７のいずれかに列挙されるアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも８０、８５又は９０％であるアミノ酸配列のポリペプチドであって、ヒンジ機能を有するポリペプチドかとを含む。【００２３】
本明細書で用いられるところの「ヘテロダイマー」とは、相異なる２個のサブユニットが会合した分子集合体をいう。本発明のヘテロダイマーはＩＬ−１リガンドに結合することができる。【００２４】
本明細書で用いられるところの「サブユニット」とは、本発明のヘテロダイマーの構成要素であって、ポリペプチドと、該ポリペプチドに連結した化学的部分（chemical moiety）とからなる。【００２５】
本明細書で用いられるところの「化学的部分（chemical moiety）」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチドの他、糖、脂質、その他の化合物を含む。本発明の化学的部分は、２つのサブユニットを特異的に会合させることができるいずれかの化学物質であって、それぞれのサブユニットに共有結合により連結される化学物質をいう。【００２６】
本明細書で用いられるところの「蛋白質」、「蛋白」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物をいう。前記「ヘテロダイマー」、「サブユニット」、「蛋白質」、「蛋白」又は「ポリペプチド」は、メチル基、チオール基、リン酸、糖鎖、及び／又は、その他の共有結合による修飾を含む場合がある。【００２７】
本明細書で用いられるところの「サブユニット」とは、本発明のヘテロダイマーの構成要素となるポリペプチドをいう。本発明の第１及び第２サブユニットは、それぞれ、第１及び第２化学的部分を含む。第１サブユニットと第２サブユニットとは、第１サブユニットに含まれる第１化学的部分と第２サブユニットに含まれる第２化学的部分との間の相互作用によって会合することができる。会合した第１サブユニット及び第２サブユニットが本発明のヘテロダイマーを構成する。本発明の第１サブユニットは、インターロイキン−１受容体タイプＩＩ（ＩＬ−１ＲＩＩ）の細胞外ドメインか、その誘導体又は変異体かの蛋白を含み、インターロイキン−１リガンドのいずれかと結合することができる。本発明の第２サブユニットは、インターロイキン−１受容体アクセソリープロテイン（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）の細胞外ドメインか、その誘導体又は変異体かの蛋白を含み、インターロイキン−１リガンドのいずれかと結合することができる。【００２８】
本発明の第１及び第２化学的部分が、ポリペプチドの場合には、例えば、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域の他、ロイシンジッパー領域、Ｚｎフィンガー領域を含むがこれらに限定されない同一ポリペプチド同士で会合するものがある。また、相異なる２種類のポリペプチドの間で会合するものには、例えば、細菌Staphylococcus aureus菌由来のプロテインＡと免疫グロブリン重鎖Ｆｃ領域との組合せが代表的であるが、酵母菌その他におけるtwo-hybrid systemによってスクリーニングすることができる。また、Swiss Institute of Bioinformaticsが運営するインターネット上のExPASy Proteomics Server（http://kr.expasy.org/）で公開されるデータベースで検索することができる。第１及び第２化学的部分がポリヌクレオチドの場合には、塩基配列の相補性に基づいて２重らせん構造を形成することにより、第１及び第２サブユニットを会合させることができる。また、第１及び第２化学的部分のうち一方がポリヌクレオチドで、他方が、該ポリヌクレオチドと特異的に結合するポリペプチドの場合や、一方が糖鎖で、他方が、該糖鎖を認識するレクチン蛋白質の全部又は一部の場合がある。さらに、第１及び第２化学的部分のうち一方が酵素基質又はその誘導体で特異的な阻害物質であって、他方が当該酵素又はその活性中心を含む部分の場合がある。さらに、第１及び第２化学的部分のうち一方がビオチンで、他方がアビジンの全部又は一部の場合がある。第１及び第２化学的部分には、サブユニットの会合に影響を与えないか、あるいは、ＩＬ−１リガンドとの複合体形成に有利なようにサブユニットの立体的な配向の自由度を与えるためのリンカーを含む場合がある。【００２９】
本明細書で用いられるところの「融合蛋白」とは、複数の遺伝子に由来する蛋白の全部又は一部が連結した１本のポリペプチドをいう。例えば、本明細書で用いられるところの「ＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白」とは、インターロイキン−１受容体タイプＩＩ（ＩＬ−１ＲＩＩ）の細胞外ドメイン等に加えて、免疫グロブリン重鎖の少なくともヒンジ領域を更に含む第１サブユニットをいう。本明細書で用いられるところの「ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白」とは、インターロイキン−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメイン等に加えて、免疫グロブリン重鎖の少なくともヒンジ領域を更に含む第２サブユニットをいう。前記免疫グロブリン重鎖は、ヒンジ領域に加えて、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）のうち、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインをさらに含む場合がある。【００３０】
本発明で用いられるところの「ＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白」及び「ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白」は、同じ動物種のＩＬ−１受容体タイプＩＩを含む融合蛋白と、ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインを含む融合蛋白とのヘテロダイマーの場合もあるが、異なる動物種のＩＬ−１受容体タイプＩＩを含む融合蛋白と、ＩＬ−１受容体アクセソリープロテインを含む融合蛋白とのヘテロダイマーの場合もある。本発明の融合蛋白に含まれる免疫グロブリン重鎖由来の部分は全て同じ動物種及び／又は同じアイソタイプに属する場合もあるが、異なる動物種及び／又は異なるアイソタイプに属する場合もある。本発明のヘテロダイマーは、異なる動物種及び／又は異なるアイソタイプ由来の免疫グロブリンの相同性の高い部分でキメラ状に連結したポリペプチドを含む場合がある。【００３１】
本明細書で用いられるところの「第１化学的部分」及び「第２化学的部分」は、融合蛋白に連結された状態で相互作用して、第１化学的部分を含む融合蛋白である第１サブユニットと、第２化学的部分を含む融合蛋白である第２サブユニットとを会合させる。第１化学的部分と第２化学的部分とは、さまざまな蛋白質に由来するポリペプチドの場合がある。【００３２】
本明細書で用いられるところの「ヒンジ機能」とは、免疫グロブリンのヒンジ領域が関与する機能のうち、２本のポリペプチドを会合させる機能をいう。本発明のヒンジ機能は、非還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により２本のポリペプチドが会合した２量体が検出されるかどうかにより決定することができる。【００３３】
本明細書で用いられるところの「ＦｃＲｎ受容体」とは、抗体Ｆｃ領域と結合する細胞表面受容体であって、新生児型（ｎｅｏｎａｔａｌ)のものをいう。ＦｃＲｎ受容体は、弱酸性で最も抗体との親和性が高く中性及びアルカリ性では抗体の親和性が低い特徴があり、細胞内に取り込まれた抗体が酸性のリソソームでの分解を免れて血液循環にリサイクルされる機構に関与する。本発明においてＦｃＲｎ受容体との結合は、表面プラズモン共鳴法のプローブ表面に不動化させた本発明のヘテロダイマーに含まれる免疫グロブリン部分が、ｐＨ６．０では同種のＦｃＲｎ受容体蛋白質の可溶性断片と結合するが、ｐＨ７．４では結合しないかどうかによって決定することができる。【００３４】
本明細書で用いられるところの「ＩＬ−１リガンド」とは、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）と、これらの前駆体及び／又は誘導体とを含むが、これらに限定されない、多機能性の向炎症性サイトカインであるインターロイキン−１ファミリーのリガンドであって、配列番号１６又は１９に列挙されるラット又はヒトのＩＬ−１受容体タイプＩＩか、配列番号１７又は２０に列挙されるラット又はヒトのＩＬ−１受容体アクセソリープロテインかと結合することができる可溶性蛋白質をいう。本発明のＩＬ−１リガンドは、ヒト及びラットを含むがこれらに限定されない哺乳類に由来する場合がある。【００３５】
本明細書で用いられるところの「ＩＬ−１受容体タイプＩＩ」とは、前記ＩＬ−１リガンドと結合できるＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーの受容体である。ＩＬ−１受容体タイプＩＩは、ＩＬ−１ベータとの結合親和性がＩＬ−アルファ又はＩＬ−１Ｒａとの結合親和性より高く、細胞内ドメインが、ヒトで２９個のアミノ酸残基、ラットで３５個のアミノ酸残基からなり、ＧＴＰａｓｅ様配列がなく、ＩＬ−１リガンドが細胞外ドメインに結合しても細胞内へのシグナル伝達が起こらない点でＩＬ−１受容体タイプＩと異なる。本発明のＩＬ−１受容体タイプＩＩは、配列番号３０又は３２に列挙されるラット又はヒトのＩＬ−１受容体タイプＩＩ（シグナルペプチドを除く成熟膜蛋白）か、配列番号３４又は３７に列挙されるラット又はヒトＩＬ−１受容体タイプＩＩの細胞外ドメインかを含むがこれらに限定されない、哺乳類の膜蛋白又はその可溶性断片の全部又は一部をいう。【００３６】
本明細書で用いられるところの「ＩＬ−１受容体アクセソリープロテイン」は、ＩＬ−１タイプＩとの同一性が高いＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーであって、ＩＬ−１受容体タイプＩが共存するときには前記ＩＬ−１リガンドのうちＩＬ−１アルファ又はＩＬ−１ベータと結合するが、ＩＬ−１受容体タイプＩが存在しないときにはＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータとは結合しない特徴がある。本発明のＩＬ−１受容体アクセソリープロテインは、配列番号３１又は３３に列挙されるラット又はヒトのＩＬ−１受容体アクセソリープロテイン（シグナルペプチドを除く成熟膜蛋白）か、配列番号３５又は３８に列挙されるラット又はヒトＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメインかを含むがこれらに限定されない、哺乳類の膜蛋白又はその可溶性断片の全部又は一部をいう。【００３７】
本明細書で用いられるところの「特異的結合タグ」とは、所望の機能を有するポリペプチドを遺伝子組み換えによって調製する際に、前記所望の機能を有するポリペプチドとペプチド結合で連結した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体からの発現タンパク質の分離、精製又は検出をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂、シリコーン等と特異的に結合するポリペプチドである。本発明の特異的結合タグは、配列番号１に列挙されるラットＧＲＯ（Growth Related Oncogene）／ＣＩＮＣ（Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractants）２アルファのＮ末端タグ、配列番号２に列挙されるラットＧＲＯ／ＣＩＮＣ２アルファＣ末端タグ、配列番号３に列挙されるアミノ酸配列のグルカゴンタグの他、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ等が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、配列番号１に列挙されるラットＧＲＯ／ＣＩＮＣ２アルファのＮ末端タグ、配列番号２に列挙されるラットＧＲＯ／ＣＩＮＣ２アルファＣ末端タグ、配列番号３に列挙されるアミノ酸配列のグルカゴンタグの場合がある。本明細書で用いられるところの「特異的結合タグ」は、本発明の融合蛋白のＮ末端、Ｃ末端及び又はその中間のいずれかの部位に１種類または２種類以上組み合わせて連結される場合がある。【００３８】
本明細書で用いられるところの「発現ベクター」は、大腸菌その他の細菌における薬剤耐性を有する遺伝子組換えベクターであって、本発明のＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白をコード化するポリヌクレオチド及び／又はＩＬ−受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドを挿入して、ＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白及びＩＬ−受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白を、無細胞条件下、又は、原核細胞又は真核細胞内で発現させ、２量体として細胞外に分泌させることができるベクターをいう。好ましい原核細胞は大腸菌であり、好ましい真核細胞は、酵母菌、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞である。好ましいベクターは、プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳであるが、該ベクターはＳＶ４０ウイルスの複製開始点の配列を含むため、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原を発現する霊長類細胞、例えば、ＣＯＳ１細胞又はＣＯＳ７細胞におけるコピー数が多くなるので有利である。また、ｐＣＡＧＧＳにはサイトメガロウイルスＩＥ(immediate early)エンハンサー及びニワトリベータアクチン遺伝子のプロモーターを含むので哺乳類で非常に強い転写活性を有する。【００３９】
本発明の医薬品組成物は、本発明のヘテロダイマーの他に、賦形剤、その他の製剤に通常用いられる物質や、薬剤の患部又は作用部位への送達に必要なカプセル等への充填、ポリエチレングリコール等の付加等が行われる場合がある。【００４０】
本発明のヘテロダイマーは、ＩＬ−１リガンド、特に、ＩＬ−１アルファによる向炎症性の反応を抑制する作用を奏する。培養細胞にＩＬ−１アルファを投与する場合には、ＭＣＰ（Monocyte Chemotactic Protein）−１、ＭＩＰ（Macrophage Inflammatory Protein）−２及び／又はＰＧＥＳ（Prostaglandin E synthase）遺伝子の発現量を増大させる。ＩＬ−１リガンドはさまざまな細胞タイプの細胞で共通の作用を示すので、培養細胞でＩＬ−１応答が抑制されるとき、個体レベルでもＩＬ−１の応答が抑制される蓋然性は高い。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のヘテロダイマーは、ＩＬ−１リガンド、特に、ＩＬ−１アルファによる向炎症性細胞応答を抑制する効果を奏する。そのため、本発明のヘテロダイマーは、ＩＬ−１の作用機序を解明するための研究用試薬として用いることを特徴とするができる。また、本発明のヘテロダイマーを有効成分とする本発明の医薬品組成物は、重症な自己免疫疾患、中でも、関節リウマチや全身性エリテマトーデス、全身性強皮症に代表される膠原病の臨床治療薬として用いることができる。また、ＩＬ−１リガンドが関与する、その他の疾患の臨床治療薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ｉｇ融合蛋白ホモダイマーとＩｇ融合蛋白ヘテロダイマーの構造を示す模式図。
【図２】pCAGGS-IL-1RII Ig GRO2アルファ-C１．０μｇ とpCAGGS-GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig glu０．５μｇをＣＯＳ７細胞に遺伝子導入した３日後の培養上清に含まれる蛋白の濃度を求める計算式と模式図。
【図３】図４ないし６のラットＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いたＩＬ−１に対する抑制効果実験の培養条件を示す模式図。
【図４】ＭＣＰ−１遺伝子の発現量を用いてＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白及びＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白によるＩＬ−１刺激の抑制効果を示すグラフ。
【図５】ＭＩＰ−２遺伝子の発現量を用いてＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白及びＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白によるＩＬ−１刺激の抑制効果を示すグラフ。
【図６】ＰＧＥＳ遺伝子の発現量を用いてＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白及びＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白によるＩＬ−１刺激の抑制効果を示すグラフ。
【図７】ＭＣＰ−１遺伝子の発現量を用いてＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白及びＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白のヘテロダイマーによるＩＬ−１（０．５ｎｇ／ｍＬ＝０．０２８２ピコモル／ｍＬ）刺激の抑制の用量−反応関係を示すグラフ。
【図８Ａ】図９のＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いたＩＬ−１に対する抑制効果実験の培養条件を示す模式図。
【図８Ｂ】図９のＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いたＩＬ−１に対する抑制効果実験の培養条件を示す模式図。
【図９】ＭＣＰ−１遺伝子の発現量を用いてＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇヒンジ領域融合蛋白及びＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇヒンジ領域融合蛋白のヘテロダイマーによるラットＩＬ−１アルファ刺激の抑制効果を示すグラフ。
【図１０】ＭＣＰ−１遺伝子の発現量を用いてＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白及びＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白のヘテロダイマーによるラットＮＲＫ４９Ｆ細胞に対するヒトＩＬ−１刺激の抑制効果を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下に示す実施例によって本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の詳細な説明のために一例として示すものであり、これらの実施例によって本発明の範囲が制限されると理解するべきではない。
【実施例１】
【００４４】
（実験方法及び結果）
（実験１）
２つの受容体Ｉｇ融合蛋白遺伝子ベクターを遺伝子導入したときに産生される受容体−Ｉｇ融合蛋白ホモダイマーと受容体−Ｉｇ融合蛋白ヘテロダイマー（図１）の濃度比に対する実験を行った。【００４５】
まず、配列番号１２に列挙されるアミノ酸配列のＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドを組み込んだプラスミド（pCAGGS-IL-1RII Ig GRO2アルファ-C）と、配列番号１３に列挙されるアミノ酸配列のＩＬ−１受容体アクセソリープロテイン(Ａｃｐ)Ｉｇ融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドを組み込んだプラスミド（pCAGGS-GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig glu）とをＣＯＳ７細胞に遺伝子導入したときに培養上清中に産生されるホモダイマーとヘテロダイマーとの割合に関する実験を行った。【００４６】
ｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ制限酵素部位に、N末端にＧＲＯ２アルファを、C末端にグルカゴン（glucagon）を結合したＩＬ−１受容体アクセソリープロテイン Ｉｇ融合蛋白遺伝子をＰＣＲにて合成した後組み込み、pCAGGS-GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluを作成した。ここで、この融合蛋白は、Ｎ端側にGRO／CINC２アルファのシグナルペプチドとＲａｔ GRO/CINC２アルファ  ＥＬＩＳＡキットの一方の抗体のエピトープであるGRO/CINC２アルファＮ端側のペプチドRELRCQCLKTLPRVD（配列番号１）が組み込まれている。Ｃ端側にはＧＬＵ  ＲＩＡキットの抗体のエピトープであるグルカゴンの１９−２９アミノ酸AQDFVQWLMNT（配列番号３）が組み込まれている。【００４７】
同様にｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ制限酵素部位に、Ｃ末端にＧＲＯ２アルファを結合したＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白遺伝子をＰＣＲにて合成した後組み込み、pCAGGS-IL-1RII Ig GRO2アルファ-Cを作成した。ここで、この融合蛋白遺伝子は、Ｃ端側にはラットGRO/CINC２アルファ  ＥＬＩＳＡキットのもう一方の抗体のエピトープであるGRO/CINC２アルファＣ端側のペプチドKＩＩQKLLKSDKS（配列番号２）が組み込まれている。【００４８】
ＣＯＳ７細胞を６穴のプレートに１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液にてコンフルエント直前まで培養し、２ｍＬの培養液あたりＦｕｇｅｎｅ６（ロシュ社）３μＬを用いて、それぞれのプラスミドを表１に示すような割合でトランスフェクションし、３日後の培養上清を採取し、該培養上清中に分泌された融合蛋白の濃度を測定した。蛋白濃度の測定にはＧＲＯ−２アルファ蛋白はＲａｔ  GRO/CINC２アルファ  ＥＬＩＳＡキット(ＩＢＬ社)、グルカゴン濃度はＧＬＵ  ＲＩＡキット(第一ラジオアイソトープ研究所)を用いた。それぞれの濃度の測定値と分子量とからモル濃度を計算した。ここで、Ｒａｔ  GRO／CINC２アルファ  ＥＬＩＳＡキットは、GRO/CINC２アルファのＮ端側のペプチドRELRCQCLKTLPRVD（配列番号１）と、Ｃ端側のペプチドKＩＩQKLLKSDKS（配列番号２）とにそれぞれ特異的に結合する２つの抗体によるサンドイッチ法を用いる測定キットである。前記２つの抗体のうち前者の抗体は酵素標識され、後者の抗体は固相に不動化されている。培養上清を添加すると、配列番号１２に列挙されるアミノ酸配列のＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白を含む２量体蛋白質が後者の抗体と結合して不動化されるが、不動化された２量体蛋白質のうち配列番号１３に列挙されるアミノ酸配列のＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白とのヘテロダイマーのみが前者の抗体と結合する。ＧＬＵ  ＲＩＡキットはグルカゴンの１９−２９番目のアミノ酸AQDFVQWLMNT（配列番号３）を認識する抗体によって検出するＲＩＡキットである。【００４９】
【表１】
2008093756.tif 000003
【００５０】
結果は表１に示すように、最も蛋白濃度の高値であったのはpCAGGS-IL-1RII IgGRO-2アルファ-C １．０μｇ＋pCAGGS-GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig glu ０．５μgの時であった。これは図２に示すような構造の蛋白濃度を示すと考えられ、図２に示すような計算よりGRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluのホモダイマーの濃度とIL-1RII Ig GRO2アルファ-CとGRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluのヘテロダイマーの濃度は約７４:１の割合であると考えられた。【００５１】
以下、図２に示した計算を簡単に説明する。ラットGRO/CINC２アルファ  ＥＬＩＳＡキットで測定した濃度は０．０３０２ ｐｍｏｌ／ｍＬ、ＧＬＵ ＲＩＡキットで測定した濃度は４．４７９ ｐｍｏｌ／ｍＬであった。そこで、IL-1RII Ig GRO2アルファ-CとGRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluのヘテロダイマーの濃度をｘ ｐｍｏｌ／ｍＬ、GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluのホモダイマーの濃度をｙ ｐｍｏｌ／ｍＬとすると、図２のような方程式が成り立ち
、ｘ ＝ ０．０３０２ ｐｍｏｌ／ｍＬ、ｙ ＝ ２．２２４ ｐｍｏｌ／ｍＬとなり、１：７４となる。
【実施例２】
【００５２】
（実験２）
ＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いたＩＬ−１に対するＩｇ融合蛋白ホモダイマー及びＩｇ融合蛋白ヘテロダイマーの抑制効果に対する実験を行った。【００５３】
（ａ）ＩＬ−１抑制実験に用いるためのＩｇ融合蛋白ホモダイマーとＩｇ融合蛋白ヘテロダイマーの作成
IL-1RII Ig GRO2アルファ-CとGRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluのヘテロダイマーは実験１の様にして作成した培養上清を、セントリコン 遠心式フィルターユニット・ウルトラセルＹＭ−３０（ミリポア社）を用いて８倍濃縮し、以下に示すＩＬ−１抑制実験に用いた。またＩＬ−１に対するＩｇ融合蛋白ホモダイマーであるIL-1RII Ig glu融合蛋白（配列番号１０）のホモダイマーとIL-1RAcp Ig glu融合蛋白（配列番号１１）のホモダイマーを作成するために、以下のようなプラスミドを作成した。一つはｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ制限酵素部位に、Ｃ末端にグルカゴンを結合したＩＬ−１受容体タイプＩＩ  Ｉｇ融合蛋白遺伝子をＰＣＲにて合成した後組み込み、pCAGGS-IL-1RII Ig gluを作成し、もう一つは同様にｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ制限酵素部位に、Ｃ末端にグルカゴンを結合したＩＬ−１受容体アクセソリープロテインＩｇ融合蛋白遺伝子をＰＣＲにて合成した後組み込み、pCAGGS-IL-1RAcp Ig gluを作成した。ヘテロダイマー作成時と同様に、ＣＯＳ７細胞を６穴のプレートに２ｍＬの１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液にてコンフルエント直前まで培養し、Ｆｕｇｅｎｅ６ （ロシュ社）３μＬをとともにそれぞれの単一のプラスミドを１．５μg用いトランスフェクションを行い、IL-1RAcp Ig gluホモダイマーとIL-1RII Ig gluホモダイマーをそれぞれ産生・分泌させ、３日後に培養上清を採取した。これらはヘテロダイマーと同様に、セントリコン遠心式フィルターユニット・ウルトラセルＹＭ−３０を用いて８倍濃縮し、以下に示すＩＬ−１抑制実験に用いた。【００５４】
（ｂ）ＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いたＩＬ−１に対する抑制効果実験
線維芽細胞ではＩＬ−１に反応し、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２及びＰＧＥＳの遺伝子発現が増強することが知られている（Chang H, Hanawa H, Liu H, Yoshida T, Hayashi M, Watanabe R, Abe S, Toba K, Yoshida K, Elnaggar R, Minagawa S, Okura Y, Kato K, Kodama M, Maruyama H, Miyazaki J, Aizawa Y. Hydrodynamic-based delivery of an interleukin-22-Ig fusion gene ameliorates experimental autoimmune myocarditis in rats. J Immunol.2006;177:3635-43.）。そこで、ラット腎臓線維芽細胞株のＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いて、前記（ａ）で作成したＩｇ融合蛋白ホモダイマー及びＩｇ融合蛋白ヘテロダイマーと、大腸菌で産生された組換えラットＩＬ−１アルファ（）とを加え、そのＩＬ−１抑制効果をＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２及びＰＧＥＳの遺伝子発現量を測定することによって検討した。【００５５】
ＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いたＩＬ−１に対する抑制効果実験の条件は、以下の通りである（図３ないし６）。
（１）ＩＬ−１リガンドと、トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液との両方とも添加せずに培養する。
（２）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファは添加するが、トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液は添加しない。
（３）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−1アルファと、何も組み込んでいないpCAGGSを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液２００μＬとを添加する。
（４）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、IL-1RAcp Ig glu融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドをｐＣＡＧＧＳに組み込んだpCAGGS-IL-1RAcp Ig gluコンストラクトを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液２００μＬとを添加する。
（５）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、IL-1RII Ig glu融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドをｐＣＡＧＧＳに組み込んだpCAGGS-IL-1RII Ig glu１μｇコンストラクトをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液２００μＬとを添加する。
（６）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、pCAGGS-IL-1RII Ig gluコンストラクトを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液１００μＬと、pCAGGS-IL-1RAcp Ig gluコンストラクトを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液１００μＬとを添加する。
（７）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、pCAGGS-IL-1RII Ig GRO2アルファ-Cコンストラクト０．５μｇ及びpCAGGS-GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluコンストラクト０．５μｇのコ・トランスフェクションによってホモダイマー及びヘテロダイマーを含むと考えられるＣＯＳ７細胞の培養液２００μＬとを添加する。【００５６】
この時、実験１の結果より、IL-1RII Ig GRO-2アルファ-C融合蛋白とGRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig glu融合蛋白とのヘテロダイマーは、GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig glu融合蛋白のホモダイマーの濃度の１／７４で、かなり低濃度と考えられる。【００５７】
ＮＲＫ４９Ｆ細胞の培養及びＩＬ−１刺激に対する応答の測定は以下のとおりの手順で行った。ＮＲＫ４９Ｆ細胞を６穴のプレートに１０％ＦＢＳと非必須アミノ酸とを添加したＤＭＥＭ培養液にてコンフルエント直前まで培養し、１．８ｍＬの新しい培養液に交換した後、０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）の大腸菌で産生された組換えラットＩＬ−１アルファ（ペプロテック社）と、前記（ａ）で説明したとおりに調製された融合蛋白のヘテロダイマー及び／又はホモダイマー蛋白質ｆを含む培養上清濃縮液を加えた（図３）。同じ条件下の実験は３穴ずつ行った。２４時間後にそれぞれのＮＲＫ４９Ｆ細胞からトライゾル（Trizol、インビトロジェン社）にてＲＮＡを抽出し、さらにランダムプライマーとマウスモロニー白血病ウィルス逆転写酵素(インビトロジェン社)を用いてｃＤＮＡを合成した。ＭＣＰ−１（センスプライマー、5'-ctgtctcagccagatgcagttaat-3'（配列番号４）;アンチセンスプライマー、5'-tatgggtcaagttcacattcaaag-3'（配列番号５））、ＭＩＰ−２（センスプライマー、5'-agctcctcaatgctgtactggt-3'（配列番号６）; アンチセンスプライマー、5'-gttagccttgcctttgttcagtat-3'（配列番号７））及びＰＧＥＳ（センスプライマー、5'-gtgatggagaacagccaggt-3'（配列番号８）; アンチセンスプライマー、5'-gaggaccacgaggaaatgtatc-3'（配列番号９））についてＰＣＲ増幅装置を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の陽性対照サンプルとして、それぞれのプライマーを用いて作成したＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（pGEM-T easy vector、プロメガ社)に組み込み、マグエクストラクタープラスミドキット（MagExtractor plasmid kit、Ｔｏｙｏｂｏ社）にてプラスミドを精製し用いた。【００５８】
結果は以下のとおりである。ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２及びＰＧＥＳの遺伝子発現量は、いずれも、ＩＬ−１により顕著に増大した。その増大は、ホモダイマーを含む培養液を添加すると若干抑制された。しかし、ホモダイマーに比べてはるかに低濃度しか含まれないと考えられるヘテロダイマーを含む培養液では、ＩＬ−１で顕著に増大した遺伝子発現量はほぼ完全に抑制された（図４ないし６、図中の（１）〜（７）は図３の条件を示す。）。つまり、ヘテロダイマーはホモダイマーに比べて非常に強力なＩＬ−１抑制作用を有することが示された。
【実施例３】
【００５９】
（実験３）
実験１で説明したとおり、ラットGRO/CINC２アルファ  ＥＬＩＳＡキットで測定することにより、ヘテロダイマーの濃度を定量することができた。そこで、図４ないし６に示した実験でＮＲＫ４９Ｆ細胞を刺激するのに用いたときと同じ濃度のＩＬ−１アルファについて異なる濃度のヘテロダイマーによる抑制作用の用量−反応関係を調べる実験を以下のとおり行った。なお、図４ないし６に示した実験でＮＲＫ４９Ｆ細胞を刺激するのに用いたＩＬ−１アルファの重量濃度（０．５ｎｇ／ｍＬ）は、ＩＬ−１アルファの分子量が約１７７００であるから、０．０２８２ｐｍｏｌ／ｍＬのモル濃度に相当する。【００６０】
結果を図７に示す。驚くべきことに、ヘテロダイマーは、ＩＬ−１アルファの２０分の１のモル濃度でもほぼ完全にＩＬ−１刺激を抑制した。これは、本発明のヘテロダイマーが、単にＩＬ−１リガンドと溶液中で等モル反応で結合することによりＩＬ−１刺激を抑制するのではなく、何か別の作用機序で抑制していることを強く示唆する結果である。
【実施例４】
【００６１】
（実験４）
次に、ヘテロダイマーを構成するそれぞれの融合蛋白のうち、免疫グロブリン由来の部分をヘテロダイマーを形成するのに最小限必要なヒンジ領域だけを残した場合の抑制効果を調べた。【００６２】
ＮＲＫ４９Ｆ細胞を用いたＩＬ−１に対する抑制効果実験の条件は、以下の通りである（図８Ａ、８Ｂ及び９）。以下の（Ａ）ないし（Ｌ）では、それぞれの融合蛋白のＣ末端にグルカゴンタグが含まれており、グルカゴンタグを有する融合蛋白の濃度の測定を実験１と同様の手順で行うことによって、最終濃度が全て２．８ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製してＮＲＫ４９Ｆ細胞に添加した。【００６３】
（Ａ）ないし（Ｆ）は、ＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を全て２．８ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製した培養液を２００μＬ添加する点を除いて、それぞれ図３の（１）ないし（６）と同じである。【００６４】
（Ｇ）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、pCAGGS-IL-1RII Ig gluコンストラクト０．５μｇと、pCAGGS-IL-1RAcp Ig gluコンストラクト０．５μｇとをコ・トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を全て２．８ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製したものとを含む培養液を２００μＬ添加する。【００６５】
（Ｈ）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、配列番号３４に列挙されるラットＩＬ−１受容体タイプＩＩの細胞外ドメインのＣ末端に配列番号３に列挙されるグルカゴンタグが連結したIL-1RII glu融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドをｐＣＡＧＧＳに組み込んだpCAGGS-IL-1RII gluコンストラクトを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を全て２．８ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製したものとを含む培養液を２００μＬ添加する。【００６６】
（Ｉ）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、配列番号３５に列挙されるラットＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメインのＣ末端に配列番号３に列挙されるグルカゴンタグが連結したIL-1RAcp glu融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドをｐＣＡＧＧＳに組み込んだpCAGGS-IL-1RAcp gluコンストラクトを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を全て２．８ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製したものとを含む培養液を２００μＬ添加する。【００６７】
（Ｊ）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、pCAGGS-IL-1RII gluコンストラクトを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を全て１．４ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製したものと、CAGGS-IL-1RAcp gluコンストラクトを１μｇトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を全て１．４ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製したものとを含む培養液を２００μＬ添加する。【００６８】
（Ｋ）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、pCAGGS-IL-1RII gluコンストラクト０．５μｇとCAGGS-IL-1RAcp gluコンストラクト０．５μｇとをコ・トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を２．８ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製したものとを含む培養液を２００μＬ添加する。【００６９】
（Ｌ）０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ＩＬ−１アルファと、配列番号１４に列挙されるラットＩＬ−１受容体タイプＩＩの細胞外ドメイン、ラット免疫グロブリンヒンジ領域及びグルカゴンタグからなるIL-1RII Ig-hinge glu融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドをｐＣＡＧＧＳに組み込んだpCAGGS-IL-1RII Ig-hinge gluコンストラクト０．５μｇと、配列番号１５に列挙されるラットＩＬ−１受容体アクセソリープロテインの細胞外ドメイン、ラット免疫グロブリンヒンジ領域及びグルカゴンタグからなるIL-1RAcp Ig-hinge glu融合蛋白をコード化するポリヌクレオチドをｐＣＡＧＧＳに組み込んだpCAGGS-IL-1RAcp Ig-hinge gluコンストラクト０．５μｇとをコ・トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のグルカゴンタグの最終濃度を２．８ｐｍｏｌ／ｍＬになるように調製したものとを含む培養液を２００μＬ添加する。【００７０】
結果を図９に示す。図９は、条件（Ｂ）で処理されたＮＲＫ４９Ｆ細胞で発現するＭＣＰ−１遺伝子の発現量を１００％として、各条件でのＭＣＰ−１遺伝子の発現量を棒グラフで示したものである。図９に示すとおり、条件（Ｇ）及び（Ｌ）でヘテロダイマーを含む培養液を添加すると、ＩＬ−１リガンドによる刺激が顕著に抑制された。また、（Ｌ）の免疫グロブリンヒンジ領域だけを含む融合蛋白より（Ｇ）の免疫グロブリンヒンジ領域からＣＨ２及びＣＨ３ドメインまで含む融合蛋白の方が抑制作用が強力であった。これらの結果から、融合蛋白に連結したペプチドタグの種類に関係なくヘテロダイマーを形成すればＩＬ−１抑制作用を奏することが明らかになった。また、免疫グロブリンのヒンジ領域だけの融合蛋白のヘテロダイマーよりも、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインも含む融合蛋白のヘテロダイマーの方がＩＬ−１抑制作用が強いことから、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインもＩＬ−１抑制作用に関与することが示唆される。
【実施例５】
【００７１】
（実験５）
本発明のヘテロダイマーが動物種を超えてＩＬ−１抑制作用を有するかどうかを調べるために、実験２の条件（７）と同様の実験をラットＩＬ−１アルファの代わりに大腸菌で産生された組換えヒトＩＬ−１アルファ（ペプロテック社）を用いて行った。すなわち、pCAGGS-IL-1RII Ig GRO2アルファ-Cコンストラクト０．５μｇ及びpCAGGS-GRO2アルファ-N IL-1RAcp Ig gluコンストラクト０．５μｇのコ・トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養液中のヘテロダイマーのモル濃度をラットGRO/CINC２アルファ  ＥＬＩＳＡキットを用いて定量した。異なる濃度のラット由来のヘテロダイマーと、０．５ｎｇ／ｍＬ（終濃度）ヒトＩＬ−１アルファとを含む培養液をＮＲＫ４９Ｆ細胞に添加してＩＬ−１抑制作用をＭＣＰ−１遺伝子の発現量によって定量化した。【００７２】
図１０に結果を示す。図１０は、０．０２８２ｐｍｏｌ／ｍＬのヒトＩＬ−１アルファで刺激したＮＲＫ４９Ｆ細胞におけるＭＣＰ−１遺伝子の発現量を１００％として、各条件でのＭＣＰ−１遺伝子の発現量を棒グラフで示したものである。図１０に示すとおり、ラット由来の融合蛋白のヘテロダイマーはヒトＩＬ−１アルファに対しても抑制作用を奏した。これは、本発明のヘテロダイマーがラットという動物種だけに限定してＩＬ−１抑制作用を奏するのではなく、種差を超えてヒトにおいてもＩＬ−１抑制作用を奏することを示す。【００７３】
（考察）
今回ＩＬ−１の抑制効果で示したように、受容体−Ｉｇ融合蛋白ヘテロダイマーは、そのリガンドに対して、強力な抑制効果が期待できる可能性があり、このような構造を持つ多様な生物学的製剤は、自己免疫疾患やその他の疾患に対して、臨床的に有用であると考えられる。【００７４】
本明細書に添付する配列表の概要は以下のとおりである。
配列番号
１  GRO2 alpha-N    ペプチド    RELRCQCLKT LPRVD
２  GRO2 alpha-C    ペプチド    KIIQKLLKSD KS
３  glucagon      ペプチド    AQDFVQWLMN T
４  MCP-1 sense prmer  ヌクレオチド  ctgtctcagc cagatgcagt taat
５  MCP-1 antisense primer  ヌクレオチド  tatgggtcaa gttcacattc aaag
６  PIP-2 sense primer  ヌクレオチド  agctcctcaa tgctgtactg gt
７  PIP-2 antisense primer  ヌクレオチド  gttagccttg cctttgttca gtat
８  PGES sense primer  ヌクレオチド  gtgatggaga acagccaggt
９  PGES antisense primer  ヌクレオチド  gaggaccacg aggaaatgta tc
１０  ラットIL-1RII Ig glu        ペプチド
１１  ラットIL-1RAcp Ig glu        ペプチド
１２  ラットIL-1RII Ig GRO2 alpha-C      ペプチド
１３  ラットGRO2 alpha-N IL-1RAcp Ig glu    ペプチド
１４  ラットIL-1RII Ig-hinge glu      ペプチド
１５  ラットIL-1RAcp Ig-hinge glu      ペプチド
１６  ラットIL-1RII全長        P43303: 1‐416      ペプチド
１７  ラットIL-1RAcp全長        Q63621: 1‐570      ペプチド
１８  ラットIg HG1 CH1‐hinge‐CH3      P20759: 1‐326      ペプチド
１９  ヒトIL-1RII全長          P27930: 1‐398      ペプチド
２０  ヒトIL-1RAcp全長        Q9NPH3: 1‐570      ペプチド
２１  ヒトIg HG1  CH1‐hinge‐CH3      P01857: 1‐330      ペプチド
２２  ヒトIg HG2  CH1‐hinge‐CH3      P01859: 1‐326      ペプチド
２３  ヒトIg HG3  CH1‐hinge‐CH3      P01860: 1‐290      ペプチド
２４  ヒトIg HG4  CH1‐hinge‐CH3      P01861: 1‐327      ペプチド
２５  ラットIL-1RII Ig glu（シグナルペプチドP43303: 1‐13無）        ペプチド
２６  ラットIL-1RAcp Ig glu（シグナルペプチドQ63621: 1‐20無）        ペプチド
２７  ラットIL-1RII Ig GRO2 alpha-C（シグナルペプチドP43303: 1‐13無）      ペプチド
２８  ラットIL-1RII Ig-hinge glu（シグナルペプチドP43303: 1‐13無）      ペプチド
２９  ラットIL-1RAcp Ig-hinge glu（シグナルペプチドQ63621: 1‐20無）      ペプチド
３０  ラットIL-1RIIシグナルペプチド無      P43303:14‐416      ペプチド
３１  ラットIL-1RAcpシグナルペプチド無    Q63621: 21‐570      ペプチド
３２  ヒトIL-1RIIシグナルペプチド無      P27930: 14‐398      ペプチド
３３  ヒトIL-1RAcp-シグナルペプチド無      Q9NPH3:21‐570      ペプチド
３４  ラットIL-1RII細胞外ドメイン      P43303:14‐355      ペプチド
３５  ラットIL-1RAcp細胞外ドメイン      Q63621: 21‐367      ペプチド
３６  ラットIg HG1 ヒンジ−CH3      P20759: 98‐326      ペプチド
３７  ヒトIL-1RII細胞外ドメイン      P27930: 14‐343      ペプチド
３８  ヒトIL-1RAcp細胞外ドメイン      Q9NPH3: 21‐367    ペプチド
３９  ヒトIg HG1 ヒンジ−CH3        P01857: 99‐330      ペプチド
４０  ヒトIg HG2 ヒンジ−CH3        P01859: 99‐326      ペプチド
４１  ヒトIg HG3 ヒンジ−CH3        P01860: 12‐290      ペプチド
４２  ヒトIg HG4 ヒンジ−CH3        P01861: 99‐327      ペプチド
４３  ラットIg HG1 ヒンジ        P20759: 98‐112      ペプチド
４４  ヒトIg HG1 ヒンジ        P01857: 99‐110      ペプチド
４５  ヒトIg HG2 ヒンジ        P01859: 99‐110      ペプチド
４６  ヒトIg HG3 ヒンジ        P01860: 12‐73      ペプチド
４７  ヒトIg HG4 ヒンジ        P01861: 99‐110      ペプチド
４８  ラットIg HG1 CH2        P20759: 113‐219      ペプチド
４９  ヒトIg HG1 CH2          P01857: 111‐223      ペプチド
５０  ヒトIg HG2 CH2          P01859: 111‐219      ペプチド
５１  ヒトIg HG3 CH2          P01860: 74‐183      ペプチド
５２  ヒトIg HG4 CH2          P01861: 111‐220      ペプチド
５３  ラットIg HG1 CH3        P20759: 220‐326      ペプチド
５４  ヒトIg HG1 CH3          P01857: 224‐330      ペプチド
５５  ヒトIg HG2 CH3          P01859: 220‐326      ペプチド
５６  ヒトIg HG3 CH3          P01860: 184‐290      ペプチド
５７  ヒトIg HG4 CH3          P01861: 221‐327      ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2008093756.tif 000011
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2008093756000001.app
【国際調査報告】
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2008093756.tif 000017
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