【手続補正書】
【提出日】平成16年1月26日(2004.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞形成を阻害する方法であり、破骨細胞前駆細胞を、配列番号:3、配列番号:3の断片、または配列番号:3の変種に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程を含む工程であって、ポリペプチドは破骨細胞前駆細胞の分化を阻害し、これにより破骨細胞形成を阻害する方法。
【請求項２】
ポリペプチドが配列番号:3に示されたアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
破骨細胞前駆細胞をsFRP1断片と接触させる工程を含む方法であり、断片が配列番号:5、配列番号:6、または配列番号:7に示された核酸配列によりコードされたシステインリッチドメインを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
破骨細胞前駆細胞がインビトロにある、請求項3記載の方法。
【請求項５】
破骨細胞前駆細胞がインビボにある、請求項3記載の方法。
【請求項６】
破骨細胞前駆細胞をsFRP1に結合する精製したペプチドと接触させる工程を含む、破骨細胞分化を増強する方法であり、ここでペプチドが
(a)配列番号:9もしくは配列番号:40に示されたアミノ酸配列；または
(b)配列番号:9もしくは配列番号:40と少なくとも80％同じアミノ酸配列を含み、sFRPに結合する能力を維持した長さ30個未満のアミノ酸である方法であって、
これにより破骨細胞分化を増強する方法。
【請求項７】
ペプチドが配列番号:10〜12または14〜29のいずれか一つに示されたアミノ酸配列を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが配列番号:9に示されたアミノ酸配列を含む、請求項6記載の方法。
【請求項９】
破骨細胞前駆細胞がインビボにある、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
破骨細胞前駆細胞をsFRP1に結合する精製したペプチドの有効量と接触させる工程を含む、破骨細胞分化を増強する方法であり、ペプチドが式[R1]x-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-[R9]yを有し、
(式中、xおよびyは、0または1の群から独立して選択された整数であり；
R1、R2、R8、およびR9は、任意のアミノ酸残基を含み；
R3は、ValまたはAlaであり；
R4は、AspまたはAlaであり；
R5は、GlyまたはAlaであり；
R6は、ArgまたはAlaであり；
R7は、TrpまたはAlaである。)；
sFRPに結合する能力を維持した長さ30個未満のアミノ酸である方法であって、これにより破骨細胞分化を増強する方法。
【請求項１１】
破骨細胞前駆細胞がインビボにある、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
R1が(a)Gln-Gly-Thr、(b)Ala-Gly-Thr、(c)Gln-Ala-Thr、または(d)Gln-Gly-Alaである、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
R2がLeu、Val、またはAlaである、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
R8がLeuまたはValである、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
R9が(a)Gln、(b)Gln-Gly-Glu、(c)Gln-Leu、(d)Ala-Leu、(e)Gln-Ala、または(f)Thr-Asn-Pro-His-Hisである、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
R1が(a) Gln-Gly-Thr、(b)Ala-Gly-Thr、(c)Gln-Ala-Thr、または(d)Gln-Gly-Alaであり；
R2は、Leu、Val、またはAlaであり；
R8は、LeuまたはValであり；
R9は、(a)Gln、(b)Gln-Gly-Glu、(c)Gln-Leu、(d)Ala-Leu、(e)Gln-Ala、または(f)Thr-Asn-Pro-His-Hisであり；ならびに、
R3はValであり、R4はAspであり、R5はArgであり、R6はGlyであり、およびR7はTrpである、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
R3がValであり、R4がAspであり、R5がGlyであり、R6がArgであり、およびR7がTrpである、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
R1が(a)Gln-Gly-Thr、(b)Ala-Gly-Thr、(c)Gln-Ala-Thr、または(d)Gln-Gly-Alaである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
R2がLeu、Val、またはAlaである、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
R8がLeu、Val、またはAlaである、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
R9が(a)Gln、(b)Gln-Gly-Glu、(c)Gln-Leu、(d)Ala-Leu、(e)Gln-Ala、または(f)Thr-Asn-Pro-His-Hisである、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
配列番号:9もしくは配列番号:40に示されたアミノ酸配列、または配列番号:9もしくは配列番号:40と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、sFRP1に結合する単離されたポリペプチドであり、該ポリペプチドがsFRPに結合する能力を維持し、長さ30個未満のアミノ酸であるポリペプチド。
【請求項２３】
請求項22記載のポリペプチドをコードしている単離された核酸配列。
【請求項２４】
請求項23記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２５】
請求項24記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
式[R1]x-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-[R9]yを含む、sFRP1に結合する単離されたペプチドであり、
(式中、xおよびyは、0または1の群から独立して選択された整数であり；
R1、R2、R8、およびR9は、任意のアミノ酸残基を含み；
R3は、ValまたはAlaであり；
R4は、AspまたはAlaであり；
R5は、GlyまたはAlaであり；
R6は、ArgまたはAlaであり；
R7は、TrpまたはAlaである。)；
該ポリペプチドがsFRPに結合する能力を維持し、長さ30個未満のアミノ酸であるペプチド。
【請求項２７】
請求項26記載のペプチドをコードしている、単離された核酸配列。
【請求項２８】
請求項27記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２９】
請求項28記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
破骨細胞発生を増強する物質をスクリーニングする方法であり、
骨芽細胞および有核の脾細胞を共培養し、共培養物を生成する工程；
共培養物を、該物質および配列番号:3に示されたアミノ酸配列(sFRP-1)と接触させる工程；ならびに
共培養物中の複数の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)-陽性細胞を決定する工程を含む方法であって、対照と比べて、TRAP-陽性破骨細胞数の増加は該物質がsFRP結合を破壊し、破骨細胞発生を増強することを示している方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
配列番号:1は、ヒトsFRP-1のcDNA配列を示す。
配列番号:2は、ヒトsFRP-1オープンリーディングフレームの核酸配列を示す。
配列番号:3は、ヒトsFRP-1のアミノ酸配列を示す。
配列番号:4は、ヒトsFRP-1-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:5は、ヒトsFRP-Δ1-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:6は、ヒトsFRP-Δ2-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:7は、ヒトsFRP-Δ3-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:8は、ヒトsFRP-ΔCRD-M/Hのアミノ酸配列を示す。
配列番号:9は、ペプチドモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号:10は、ANP受容体A(ヒト)由来のペプチドモチーフを示す。
配列番号:11は、A-E4ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:12は、A-F7ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:13は、sFRP-1のネトリン相同ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号:14は、A-C2ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:15〜26は、アラニンスキャニング実験において使用するために生成したペプチドを示す。
配列番号:27は、B-B9のアミノ酸配列を示す。
配列番号:28は、配列番号:9のアミノ酸配列に類似した配列を含むRANKLにおいて認められたアミノ酸配列を示す。
配列番号:29は、配列番号:9のアミノ酸配列に類似した配列を含むネトリン受容体において認められたアミノ酸配列を示す。
配列番号:30〜39および41は、様々な霊長類の核酸配列ならびにPCRおよびハイブリダイゼーション実験に使用したプライマーおよびプローブを示す。
配列番号:40は、A-D9ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
【０１２７】
9. RT-PCRによるsFRP-1発現分析
細胞株または組織から単離した総RNAを、オリゴdTで逆転写し、プライマーsfrp-1a
2005501508.tif 000001
およびsfrp-1b
2005501508.tif 000002
を用いて22サイクルでPCRを行い、これは骨芽細胞給源由来のsFRP-1転写産物の増幅の長い直線相内にあることがわかった。増幅は、製造業者の指示に従い行った。得られたPCR産物を電気泳動し、ナイロン膜に移し、α32P標識した内部検出オリゴヌクレオチドsfrp-1c
2005501508.tif 000003
でハイブリダイズした。gapdh-2
2005501508.tif 000004
ヌクレオチド640〜659位；Tsoら、Nucl. Acids Res.、13:2485-2502(1985)）、およびgapdh-4を用いて、標準化(normalizing)遺伝子、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを、20サイクルのPCRで増幅し、産物をSudaら(J. Cell. Physiol.、166:94-104(1996))の記載するようにα32P標識したgapdh-1で検出した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
【表１】
2005501508.tif 000005
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
UNC5H3中のV-D-G-R-W（配列番号：29のアミノ酸5位〜9位）セグメントは、このタンパク質はネトリン受容体であるので、注目に値した。従って、sFRP-1(配列番号:3)は、リガンド/受容体の関係においてUNC5H3と相互作用することが可能である。RANKL/TRANCE/OPGL中の配列M-V-D-G-S-W-L（配列番号:28のアミノ酸1位〜7位）の存在もまた、sFRP-1(配列番号:3)およびRANKLは、RANKLが破骨細胞形成において重要な役割を果たしている(下記参照)骨を含む、多くの組織において同時発現されたことの追加的証拠であるので、注目される。ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)受容体A中の配列V-V-D-G-R-F-V(配列番号:10のアミノ酸1位〜7位)も、腎臓および眼内の組織におけるこの遺伝子産物およびsFRP-1の同時発現のために、重要である。本明細書に示されたように、sFRP-1(配列番号:3)およびRANKLは、重要な生物学的結果を有する方法で互いに相互作用し、かつそれらの相互作用を調節し、破骨細胞形成へ影響を及ぼすことができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
骨芽細胞(tsJJ2細胞)におけるsFRP-1発現を調査した(tsJJ2細胞株およびtsJ14細胞株に関する説明は、Chambersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:5578-5582(1993)を参照のこと)。これらの結果は、sFRP-1が、破骨細胞形成を促進する骨芽細胞(tsJ2細胞)において優先的に発現されたことを示している。マウスのsFRP-1転写産物は、オリゴヌクレオチドsfrp-1dおよびsfrp-1eを用いて増幅した。増幅産物は、[α-32P]dATP末端標識したオリゴヌクレオチドsfrp-1eをプローブとして使用するサザン分析により証明した。ディファレンシャルディスプレイPCR(ddPCR)もまた、sFRP-1が、破骨細胞発生を刺激する骨芽細胞株においてはアップレギュレーションされるが、破骨細胞分化を支持しない他の2種の株由来の生成物においてはアップレギュレーションされないことを示した。sFRP-1発現の半定量的RT-PCR分析は、転写レベルが、造血前駆細胞との共培養において、破骨細胞形成を促進することが可能な株において遙かに高いことを確認した。このパターンは、追加の骨芽細胞株との比較の場合に認められ、sFRP-1発現が破骨細胞発生に関連しているという知見を補強している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
しかし一般に、1α,25(OH2)ビタミンD3のようなオステオトロピック因子（osteotropic factor）は、骨芽細胞株によるsFRP-1発現の限定された刺激を引き起した。総RNAを、未処理の細胞または1α,25(OH2)ビタミンD3で24時間処理した細胞のいずれかから単離し、オリゴ(dT)で逆転写し、かつマウスのSFRP1およびGAPDHについてPCRを施した。1α,25(OH2)ビタミンD3で24時間処理した骨芽細胞および骨髄の共培養を、陽性対照として含んだ。sfrp-1d
2005501508.tif 000006
およびsfrp-1e
2005501508.tif 000007
のプライマー組合せを、sFRP-1増幅に使用し、かつgapdh-2
2005501508.tif 000008
およびgapdh-4
2005501508.tif 000009
のプライマー組合せを、GAPDH増幅に使用した。得られたPCR産物を、電気泳動し、ナイロン膜に移し、各々、[α-32P]標識した内部検出オリゴヌクレオチドであるsfrp-1f
2005501508.tif 000010
およびgapdh-1
2005501508.tif 000011
と、Southbyらにより説明されたように(Endocrinology、137:1349-1357(1996))ハイブリダイズした。RT-PCR分析は、3つ組で反復した。半定量的RT-PCR分析を、各RT反応について3回行い、2回の独立したRT反応を試験した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
【図１】sFRP-1(配列番号:3)に結合しているA-C2(配列番号:14)／AP(アルカリホスファターゼ)融合タンパク質からの結果を示すグラフである。A-C2/APキメラを発現しているファージで感染した個別の細菌コロニーからのブロスを、sFRP-1(および引き続きBSAで遮断した)またはBSA単独で被覆したELISAウェルにおいてインキュベーションした。これらの各ブロス(I-1、I-2、I-6、I-12、I-13、およびI-14と確定される)は、BSA単独で被覆したウェル(白色バー)と比較してsFRP-1(配列番号:3)で被覆したウェル(点々付きバー)に特異的に結合した、pNPPとの反応および405nmでの発色により測定したAP活性を含んだ。各試料は単独で試験し；これは数回の実験の代表である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
複数の態様および実施例において本開示の原理が例証および説明されているが、当業者には、この開示は、そのような原理から逸脱することなく、配列および詳細に関して変更することができることは理解されなければならない。本発明者らは、前記「特許請求の範囲」の精神および範囲内のあらゆる変更を請求するものである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  The Government of the United States of America, as 
represented by the Secretary of the Department of Health and 
Human Services
<120>  SFRP AND PEPTIDE MOTIFS THAT INTERACT WITH SFRP AND METHODS OF 
THEIR USE
<140>  JP   2002-556615
<141>  2002-01-10
<150>  US 60/260,908
<151>  2001-01-10
<160>  41    
<170>  PatentIn version 3.2
<210>  1
<211>  2075
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  1
cctgcagcct ccggagtcag tgccgcgcgc ccgccgcccc gcgccttcct gctcgccgca     60
cctccgggag ccggggcgca cccagcccgc agcgccgcct ccccgcccgc gccgcctccg    120
accgcaggcc gagggccgcc actggccggg gggaccgggc agcagcttgc ggccgcggag    180
ccgggcaacg ctggggactg cgccttttgt ccccggaggt ccctggaagt ttgcggcagg    240
acgcgcgcgg ggaggcggcg gaggcagccc cgacgtcgcg gagaacaggg cgcagagccg    300
gcatgggcat cgggcgcagc gaggggggcc gccgcggggc cctgggcgtg ctgctggcgc    360
tgggcgcggc gcttctggcc gtgggctcgg ccagcgagta cgactacgtg agcttccagt    420
cggacatcgg cccgtaccag agcgggcgct tctacaccaa gccacctcag tgcgtggaca    480
tccccgcgga cctgcggctg tgccacaacg tgggctacaa gaagatggtg ctgcccaacc    540
tgctggagca cgagaccatg gcggaggtga agcagcaggc cagcagctgg gtgcccctgc    600
tcaacaagaa ctgccacgcc gggacccagg tcttcctctg ctcgctcttc gcgcccgtct    660
gcctggaccg gcccatctac ccgtgtcgct ggctctgcga ggccgtgcgc gactcgtgcg    720
agccggtcat gcagttcttc ggcttctact ggcccgagat gcttaagtgt gacaagttcc    780
cggaggggga cgtctgcatc gccatgacgc cgcccaatgc caccgaagcc tccaagcccc    840
aaggcacaac ggtgtgtcct ccctgtgaca acgagttgaa atctgaggcc atcattgaac    900
atctctgtgc cagcgagttt gcactgagga tgaaaataaa agaagtgaaa aaagaaaatg    960
gcgacaagaa gattgtcccc aagaagaaga agcccctgaa gttggggccc atcaagaaga   1020
aggacctgaa gaagcttgtg ctgtacctga agaatggggc tgactgtccc tgccaccagc   1080
tggacaacct cagccaccac ttcctcatca tgggccgcaa ggtgaagagc cagtacttgc   1140
tgacggccat ccacaagtgg gacaagaaaa acaaggagtt caaaaacttc atgaagaaaa   1200
tgaaaaacca tgagtgcccc acctttcagt ccgtgtttaa gtgattctcc cgggggcagg   1260
gtggggaggg agcctcgggt ggggtgggag cgggggggac agtgcccggg aacccgtggt   1320
cacacacacg cactgccctg tcagtagtgg acattgtaat ccagtcggct tgttcttgca   1380
gcattcccgc tccctttccc tccatagcca cgctccaaac cccagggtag ccatggccgg   1440
gtaaagcaag ggccatttag attaggaagg tttttaagat ccgcaatgtg gagcagcagc   1500
cactgcacag gaggaggtga caaaccattt ccaacagcaa cacagccact aaaacacaaa   1560
aagggggatt gggcggaaag tgagagccag cagcaaaaac tacattttgc aacttgttgg   1620
tgtggatcta ttggctgatc tatgcctttc aactagaaaa ttctaatgat tggcaagtca   1680
cgttgttttc aggtccagag tagtttcttt ctgtctgctt taaatggaaa cagactcata   1740
ccacacttac aattaaggtc aagcccagaa agtgataagt gcagggagga aaagtgcaag   1800
tccattatct aatagtgaca gcaaagggac caggggagag gcattgcctt ctctgcccac   1860
agtctttccg tgtgattgtc tttgaatctg aatcagccag tctcagatgc cccaaagttt   1920
cggttcctat gagcccgggg catgatctga tccccaagac atgtggaggg gcagcctgtg   1980
cctgcctttg tgtcagaaaa aggaaaccac agtgagcctg agagagacgg cgattttcgg   2040
gctgagaagg cagtagtttt caaaacacat agtta                              2075
<210>  2
<211>  942
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  2
atgggcatcg ggcgcacgga ggggggccgc cgcggggcag ccctgggcgt gctgctggcg     60
ctgggcggcg cttctggccg tgggctcggc agcgagtacg actacgtgag cttccagtcg    120
gacatcggcc cgtaccagag cgggcgcttc tacaccaagc cacctcagtg cgtggacatc    180
cccgcggacc tgcggctgtg ccacaacgtg ggctacaaga agatggtgct gcccaacctg    240
ctggagcacg agaccatggc ggaggtgaag cagcaggcca gcagctgggt gcccctgctc    300
aacaagaact gccacgccgg gacccaggtc ttcctctgct cgctcttcgc gcccgtctgc    360
ctggaccggc ccatctaccc gtgtcgctgg ctctgcgagg ccgtgcgcga ctcgtgcgag    420
ccggtcatgc agttcttcgg cttctactgg cccgagatgc ttaagtgtga caagttcccg    480
gagggggacg tctgcatcgc catgacgccg cccaatgcca ccgaagcctc caagccccaa    540
ggcacaacgg tgtgtcctcc ctgtgacaac gagttgaaat ctgaggccat cattgaacat    600
ctctgtgcca gcgagtttgc actgaggatg aaaataaaag aagtgaaaaa agaaaatggc    660
gacaagaaga ttgtccccaa gaagaagaag cccctgaagt tggggcccat caagaagaag    720
gacctgaaga agcttgtgct gtacctgaag aatggggctg actgtccctg ccaccagctg    780
gacaacctca gccaccactt cctcatcatg ggccgcaagg tgaagagcca gtacttgctg    840
acggccatcc acaagtggga caagaaaaac aaggagttca aaaacttcat gaagaaaatg    900
aaaaaccatg agtgccccac ctttcagtcc gtgtttaagt ga                       942
<210>  3
<211>  313
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  3
Met Gly Ile Gly Arg Thr Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 
1               5                   10                  15      
Val Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ala Ser Gly Arg Gly Leu Gly Ser Glu 
20                  25                  30          
Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gln Ser Gly 
35                  40                  45              
Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Cys Val Asp Ile Pro Ala Asp Leu 
50                  55                  60                  
Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu 
65                  70                  75                  80  
Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser Trp 
85                  90                  95      
Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gln Val Phe Leu 
100                 105                 110         
Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys 
115                 120                 125             
Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met Gln 
130                 135                 140                 
Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro 
145                 150                 155                 160 
Glu Gly Asp Val Cys Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu Ala 
165                 170                 175     
Ser Lys Pro Gln Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu Leu 
180                 185                 190         
Lys Ser Glu Ala Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala Leu 
195                 200                 205             
Arg Met Lys Ile Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys Ile 
210                 215                 220                 
Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro Ile Lys Lys Lys 
225                 230                 235                 240 
Asp Leu Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala Asp Cys Pro 
245                 250                 255     
Cys His Gln Leu Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu Ile Met Gly Arg 
260                 265                 270         
Lys Val Lys Ser Gln Tyr Leu Leu Thr Ala Ile His Lys Trp Asp Lys 
275                 280                 285             
Lys Asn Lys Glu Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys Asn His Glu 
290                 295                 300                 
Cys Pro Thr Phe Gln Ser Val Phe Lys 
305                 310             
<210>  4
<211>  338
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  4
Met Gly Ile Gly Arg Thr Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 
1               5                   10                  15      
Val Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ala Ser Gly Arg Gly Leu Gly Ser Glu 
20                  25                  30          
Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gln Ser Gly 
35                  40                  45              
Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Cys Val Asp Ile Pro Ala Asp Leu 
50                  55                  60                  
Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu 
65                  70                  75                  80  
Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser Trp 
85                  90                  95      
Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gln Val Phe Leu 
100                 105                 110         
Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys 
115                 120                 125             
Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met Gln 
130                 135                 140                 
Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro 
145                 150                 155                 160 
Glu Gly Asp Val Cys Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu Ala 
165                 170                 175     
Ser Lys Pro Gln Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu Leu 
180                 185                 190         
Lys Ser Glu Ala Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala Leu 
195                 200                 205             
Arg Met Lys Ile Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys Ile 
210                 215                 220                 
Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro Ile Lys Lys Lys 
225                 230                 235                 240 
Asp Leu Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala Asp Cys Pro 
245                 250                 255     
Cys His Gln Leu Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu Ile Met Gly Arg 
260                 265                 270         
Lys Val Lys Ser Gln Tyr Leu Leu Thr Ala Ile His Lys Trp Asp Lys 
275                 280                 285             
Lys Asn Lys Glu Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys Asn His Glu 
290                 295                 300                 
Cys Pro Thr Phe Gln Ser Val Phe Lys Gln Ala Tyr Val Glu Gln Lys 
305                 310                 315                 320 
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His 
325                 330                 335     
His His 
<210>  5
<211>  195
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  5
Met Gly Ile Gly Arg Thr Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 
1               5                   10                  15      
Val Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ala Ser Gly Arg Gly Leu Gly Ser Glu 
20                  25                  30          
Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gln Ser Gly 
35                  40                  45              
Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Cys Val Asp Ile Pro Ala Asp Leu 
50                  55                  60                  
Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu 
65                  70                  75                  80  
Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser Trp 
85                  90                  95      
Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gln Val Phe Leu 
100                 105                 110         
Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys 
115                 120                 125             
Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met Gln 
130                 135                 140                 
Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro 
145                 150                 155                 160 
Glu Gly Asp Val Cys Ile Ala Met Thr Pro Gln Ala Tyr Val Glu Gln 
165                 170                 175     
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His 
180                 185                 190         
His His His 
195 
<210>  6
<211>  246
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  6
Met Gly Ile Gly Arg Thr Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 
1               5                   10                  15      
Val Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ala Ser Gly Arg Gly Leu Gly Ser Glu 
20                  25                  30          
Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gln Ser Gly 
35                  40                  45              
Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Cys Val Asp Ile Pro Ala Asp Leu 
50                  55                  60                  
Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu 
65                  70                  75                  80  
Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser Trp 
85                  90                  95      
Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gln Val Phe Leu 
100                 105                 110         
Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys 
115                 120                 125             
Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met Gln 
130                 135                 140                 
Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro 
145                 150                 155                 160 
Glu Gly Asp Val Cys Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu Ala 
165                 170                 175     
Ser Lys Pro Gln Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu Leu 
180                 185                 190         
Lys Ser Glu Ala Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala Leu 
195                 200                 205             
Arg Met Lys Ile Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Gln Ala Tyr 
210                 215                 220                 
Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp 
225                 230                 235                 240 
His His His His His His 
245     
<210>  7
<211>  267
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  7
Met Gly Ile Gly Arg Thr Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 
1               5                   10                  15      
Val Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ala Ser Gly Arg Gly Leu Gly Ser Glu 
20                  25                  30          
Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gln Ser Gly 
35                  40                  45              
Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Cys Val Asp Ile Pro Ala Asp Leu 
50                  55                  60                  
Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu 
65                  70                  75                  80  
Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser Trp 
85                  90                  95      
Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gln Val Phe Leu 
100                 105                 110         
Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys 
115                 120                 125             
Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met Gln 
130                 135                 140                 
Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro 
145                 150                 155                 160 
Glu Gly Asp Val Cys Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu Ala 
165                 170                 175     
Ser Lys Pro Gln Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu Leu 
180                 185                 190         
Lys Ser Glu Ala Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala Leu 
195                 200                 205             
Arg Met Lys Ile Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys Ile 
210                 215                 220                 
Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro Ile Lys Lys Lys 
225                 230                 235                 240 
Asp Leu Gln Ala Tyr Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 
245                 250                 255     
Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 
260                 265         
<210>  8
<211>  229
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  8
Met Gly Ile Gly Arg Thr Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 
1               5                   10                  15      
Val Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ala Ser Gly Arg Gly Leu Gly Ser Glu 
20                  25                  30          
Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gln Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gln Ser Gly 
35                  40                  45              
Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gln Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala 
50                  55                  60                  
Thr Glu Ala Ser Lys Pro Gln Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp 
65                  70                  75                  80  
Asn Glu Leu Lys Ser Glu Ala Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu 
85                  90                  95      
Phe Ala Leu Arg Met Lys Ile Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp 
100                 105                 110         
Lys Lys Ile Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro Ile 
115                 120                 125             
Lys Lys Lys Asp Leu Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala 
130                 135                 140                 
Asp Cys Pro Cys His Gln Leu Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu Ile 
145                 150                 155                 160 
Met Gly Arg Lys Val Lys Ser Gln Tyr Leu Leu Thr Ala Ile His Lys 
165                 170                 175     
Trp Asp Lys Lys Asn Lys Glu Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys 
180                 185                 190         
Asn His Glu Cys Pro Thr Phe Gln Ser Val Phe Lys Gln Ala Tyr Val 
195                 200                 205             
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His 
210                 215                 220                 
His His His His His 
225                 
<210>  9
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Val or Leu
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Val or Leu
<400>  9
Xaa Val Asp Gly Arg Trp Xaa 
1               5           
<210>  10
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Val Val Asp Gly Arg Phe Val Leu Lys Ile Thr Asp 
1               5                   10          
<210>  11
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  11
Val Val Asp Gly Arg Trp Val Gln Gly Leu Glu Asp 
1               5                   10          
<210>  12
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  12
Asn Gln Gly Arg Asp Val Pro Glu Arg Trp Ser Lys 
1               5                   10          
<210>  13
<211>  141
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Cys Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu Ala Ser Lys Pro Gln 
1               5                   10                  15      
Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu Leu Lys Ser Glu Ala 
20                  25                  30          
Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala Leu Arg Met Lys Ile 
35                  40                  45              
Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys Ile Val Pro Lys Lys 
50                  55                  60                  
Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro Ile Lys Lys Lys Asp Leu Lys Lys 
65                  70                  75                  80  
Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala Asp Cys Pro Cys His Gln Leu 
85                  90                  95      
Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu Ile Met Gly Arg Lys Val Lys Ser 
100                 105                 110         
Gln Tyr Leu Leu Thr Ala Ile His Lys Trp Asp Lys Lys Asn Lys Glu 
115                 120                 125             
Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys Asn His Glu Cys 
130                 135                 140     
<210>  14
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  14
Gln Gly Thr Leu Val Asp Gly Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  15
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  15
Ala Gly Thr Leu Val Asp Gly Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  16
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  16
Gln Ala Thr Leu Val Asp Gly Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  17
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  17
Gln Gly Ala Leu Val Asp Gly Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  18
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  18
Gln Gly Thr Ala Val Asp Gly Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  19
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  19
Gln Gly Thr Leu Ala Asp Gly Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  20
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  20
Gln Gly Thr Leu Val Ala Gly Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  21
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  21
Gln Gly Thr Leu Val Asp Ala Arg Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  22
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  22
Gln Gly Thr Leu Val Asp Gly Ala Trp Leu Gln Leu 
1               5                   10          
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<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  23
Gln Gly Thr Leu Val Asp Gly Arg Ala Leu Gln Leu 
1               5                   10          
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<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  24
Gln Gly Thr Leu Val Asp Gly Arg Trp Ala Gln Leu 
1               5                   10          
<210>  25
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  25
Gln Gly Thr Leu Val Asp Gly Arg Trp Leu Ala Leu 
1               5                   10          
<210>  26
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  26
Gln Gly Thr Leu Val Asp Gly Arg Trp Leu Gln Ala 
1               5                   10          
<210>  27
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  27
Leu Val Asp Gly Arg Trp Leu Tyr Asn Pro His His 
1               5                   10          
<210>  28
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  28
Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu 
1               5                   
<210>  29
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  29
Thr Leu Cys Pro Val Asp Gly Arg Trp 
1               5                   
<210>  30
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  30
agccttggca gtcaacgacg                                                 20
<210>  31
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  31
gttgtggctt ttgcattgca c                                               21
<210>  32
<211>  14
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (13)..(13)
<223>  v is a, c, or g
<400>  32
tttttttttt ttva                                                       14
<210>  33
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  33
atgaggtcca ccaccctgtt                                                 20
<210>  34
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  34
catggagaag gctggggctc                                                 20
<210>  35
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  35
tgttgaaaac tagtagctg                                                  19
<210>  36
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  36
gctgtgggca aggtcatccc                                                 20
<210>  37
<211>  10
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  37
cttgattgcc                                                            10
<210>  38
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  38
ttaaaattgc tgcctgcctg ag                                              22
<210>  39
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  39
tccgaactac agggacaaca gg                                              22
<210>  40
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  40
Trp Glu Cys Ala Met Tyr Asp Gly Arg Cys Leu Thr 
1               5                   10          
<210>  41
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer/Probe sequence
<400>  41
gcccagaggt atttctcaaa gttg                                            24