(57)【要約】  本発明は、放線菌において遺伝子発現を促進させることにより目的タンパク質を高発現させることができるプロモータ、並びに該プロモータを有する発現ベクター及び該ベクターが導入された形質転換体を提供することを目的とする。本発明は、また、上記プロモータ、ベクター又は形質転換体を用いた目的タンパク質を大量生産できる目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。配列番号１〜４に記載の塩基配列のいずれかを有する放線菌用プロモータ、上記プロモータを有する放線菌用発現ベクター、及び上記発現ベクターで形質転換された放線菌、並びに上記形質転換体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列を有する、放線菌用プロモータ。
【請求項２】
配列番号２に記載の塩基配列を有する、放線菌用プロモータ。
【請求項３】
配列番号３に記載の塩基配列を有する、放線菌用プロモータ。
【請求項４】
配列番号４に記載の塩基配列を有する、放線菌用プロモータ。
【請求項５】
前記放線菌は、ロドコッカス属放線菌、マイコバクテリウム属放線菌、ゴルドニア属放線菌、ディエツア属放線菌及びアミコラトプシス属放線菌から選択される１種以上の放線菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロモータ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のプロモータを有する放線菌用発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターで形質転換された放線菌。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を用いた目的タンパク質の製造方法。
【請求項９】
目的タンパク質をコードする遺伝子を、請求項１〜５のいずれか１項記載のプロモータを有する発現ベクターに、該プロモータの下流に発現可能なように挿入し、目的タンパク質を発現できる発現ベクターを得るステップと、
得られた発現ベクターによって放線菌を形質転換し、形質転換体を得るステップと、
得られた形質転換体を増殖可能な培地中で培養するステップと、
前記培養するステップで得られた形質転換体から目的タンパク質を精製するステップと
を含む目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放線菌用プロモータ、該プロモータを有する放線菌用発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換された放線菌に関する。本発明は、またこれらのプロモータ、ベクター又は形質転換体を用いた放線菌における目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属放線菌は、ニトリル類の代謝に関与する酵素やアミノケトンを不斉的に還元する酵素（アミノケトン不斉還元酵素）を産生することが知られている。特に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓは、極めて高いアミノケトン不斉還元活性を有することが知られている。このような放線菌及び酵素は、α−アミノケトンに作用して、光学活性β−アミノアルコールを高収率かつ高選択的に生産する（例えば、特許文献１及び２）。したがって、放線菌において、有用な酵素等の大量生産を目的とする組換えＤＮＡ技術、特に宿主−ベクター系の開発が以前から期待されてきた。【０００３】
しかし、組換えＤＮＡ技術を利用した組換え体や形質転換体の作製における宿主微生物として、一般に大腸菌や酵母、枯草菌などが用いられており、そのための発現ベクターが多く開発されてきたが、放線菌を宿主とする発現ベクターやプロモータの開発は遅れている。【０００４】
本発明者らは、ロドコッカス属放線菌を宿主とするタンパク質の高発現を目的とする新規なシャトルベクターを既に開発している（特許文献３）。これらのシャトルベクターは、ロドコッカス属放線菌及び大腸菌由来のものであり、ロドコッカス属放線菌及び大腸菌の両方で機能することが確認された。しかしながら、ロドコッカス属を含む放線菌において目的タンパク質を高発現させるためのベクターやプロモータの開発が依然と期待されている。【０００５】
一方、非特許文献１には乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のプロモータが開示されており、これらのプロモータが乳酸菌及び大腸菌内で機能することが知られている。しかし、これらのプロモータの放線菌における利用や機能については知られていない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／７３１００号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ０２／０７０７１４号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ０５／０４２７３９号パンフレット
【非特許文献１】Ｍ．Ｋａｋｉｋａｗａら、Ｇｅｎｅ、２１５巻、３７１−３７９頁（１９９８年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、放線菌において遺伝子発現を促進させることにより目的タンパク質を高発現させることができるプロモータ、並びに該プロモータを有する発現ベクター及び該ベクターが導入された形質転換体を提供することを提供することを目的とする。本発明は、また、上記プロモータ、ベクター又は形質転換体を用いた目的タンパク質を大量生産できる目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが、上記の課題を解決するために、放線菌で機能するプロモータを鋭意スクリーニングした結果、非特許文献１で開示された乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のプロモータｐＲ及びｐＬが、放線菌で機能し、放線菌由来のプロモータと同じくらい高い活性を有することを見出し、本発明を完成することに至った。【０００８】
即ち、本願発明によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に記載の塩基配列を有する放線菌用プロモータが提供される。配列番号１及び２に記載の塩基配列は互いに相補鎖であり、それぞれ乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のプロモータｐＲ及びｐＬ領域を含む。また、塩基配列３に記載の塩基配列は乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のｐＲプロモータ領域であり、塩基配列４に記載の塩基配列は乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のｐＬプロモータ領域である。これらの塩基配列を含む塩基配列は、放線菌でプロモータとして機能することができる。本発明のプロモータによれば、放線菌で目的遺伝子や目的タンパク質を高発現させることができる。【０００９】
上記放線菌用プロモータは、好ましくはロドコッカス属放線菌、マイコバクテリウム属放線菌、ゴルドニア属放線菌、ディエツア属放線菌又はアミコラトプシス属放線菌のプロモータとして使用される。【００１０】
また、本発明によれば、上記いずれかのプロモータを有する放線菌用発現ベクターが提供される。本発明の発現ベクターによれば、放線菌で目的遺伝子や目的タンパク質を高発現させることができる。【００１１】
また、本発明によれば、上記の発現ベクターで形質転換された放線菌が提供される。本発明の形質転換された放線菌（形質転換体）によれば、該形質転換体において目的遺伝子や目的タンパク質を高発現させることができる。【００１２】
また、本発明によれば、上記の形質転換体を用いた目的タンパク質の製造方法を提供される。本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、該形質転換体において目的タンパク質を効率よく大量生産することが可能となる。【００１３】
また、本発明によれば、目的タンパク質をコードする遺伝子を、上記のいずれかのプロモータを有する発現ベクターに、該プロモータの下流に発現可能なように挿入し、目的タンパク質を発現できる発現ベクターを得るステップと、得られた発現ベクターによって放線菌を形質転換し、形質転換体を得るステップと、得られた形質転換体を増殖可能な培地中で培養するステップと、上記培養するステップで得られた形質転換体から目的タンパク質を精製するステップとを含む目的タンパク質の製造方法が提供される。本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、放線菌において目的タンパク質を効率よく大量生産することが可能となる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のプロモータ、発現ベクター又は形質転換体によれば、放線菌において目的遺伝子や目的タンパク質の高発現が実現でき、目的に応じて様々な有用なタンパク質を効率よく大量生産することができる。このようなタンパク質はまた様々な工業生産に貢献する。例えば酵素においては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを効率よく大量に生産することができる。目的タンパク質がアミノケトン不斉還元酵素である場合、光学活性β−アミノアルコールの高収率かつ高選択的な製造を可能とする。また、本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、放線菌において目的タンパク質を効率よく大量生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を好適な実施形態に従って説明する。【００１６】
本明細書において、「放線菌用」とは、放線菌において機能することを意味する。即ち、放線菌用プロモータの場合、プロモータが何らかの形（例えばベクターに組み込まれた形）で放線菌に導入されたとき、放線菌においてプロモータの下流に位置する遺伝子の発現を促進し、遺伝子のコードするタンパク質を産生させることができることを意味する。また、放線菌用発現ベクターの場合、ベクターが放線菌に導入されたとき、放線菌において自己複製すること又は放線菌のゲノムに挿入されることができ、かつ発現ベクターに含まれる放線菌用プロモータも機能することができることを意味する。【００１７】
また、ここで遺伝子の発現とは、ｍＲＮＡに転写されることと、該ｍＲＮＡからタンパク質が翻訳されることの両方をいう。ここでタンパク質の発現とは、遺伝子が転写され、翻訳された結果タンパク質が合成されることをいう。【００１８】
本発明の第１のプロモータは、配列番号１に記載の塩基配列を有することを特徴とする。配列番号１に記載の塩基配列は、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍから分離されたファージに含有される配列であり、乳酸菌プロモータであるｐＲプロモータ領域、転写開始部位及びＧＡＴＡＣボックスに相当する塩基配列がそれぞれ含まれている。この塩基配列からなる核酸は放線菌においてもプロモータとして機能することが本発明者らによって初めて証明された。【００１９】
本発明の第１のプロモータは、配列番号１に記載の塩基配列の上流又は／及び下流に、翻訳開始部位、翻訳終止部位、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写調節遺伝子領域（リブレッサー、エンハンサーなど）、ターミネーター、又は遺伝子組み換えのための制限酵素サイトやその他の該プロモータ機能を阻害しないあらゆる塩基配列を含み得る。本発明の第１のプロモータの長さは１７３ｂｐ以上であり、好ましくは１７３ｂｐ〜５００ｂｐ、より好ましくは１７３ｂｐ〜３００ｂｐである。【００２０】
本発明の第１のプロモータは、合成オリゴヌクレオチドであってよく、また、例えば配列番号１３及び１４に示したような一部相補的な２本の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって増幅したり、若しくは適切な鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲによって増幅することがしたりすることもできる。このような鋳型としては、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍテンプレートファージφｇｌｅや、配列番号１に記載の塩基配列を有するプラスミド、ベクター若しくはゲノムなどが挙げられる。また、このようなプライマーとしては、該第１のプロモータを増幅できるプライマーであれば特に限定されないが、当業者が必要に応じて設計することができるものである。【００２１】
本発明の第２のプロモータは、配列番号２に記載の塩基配列を有することを特徴とする。配列番号２に記載の塩基配列は、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍから分離されたファージに含有される配列であり、乳酸菌プロモータであるｐＬプロモータ領域、及びＧＡＴＡＣボックスに相当する塩基配列がそれぞれ含まれている。この塩基配列からなる核酸は放線菌においてもプロモータとして機能することが本発明者らによって初めて証明された。【００２２】
本発明の第２のプロモータは、配列番号２に記載の塩基配列の上流又は／及び下流に、翻訳開始部位、翻訳終止部位、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写調節遺伝子領域（リブレッサー、エンハンサーなど）、ターミネーター、又は遺伝子組み換えのための制限酵素サイトやその他の該プロモータ機能を阻害しないあらゆる塩基配列を含み得る。本発明の第２のプロモータの長さは１７２ｂｐ以上であり、好ましくは１７２ｂｐ〜５００ｂｐ、より好ましくは１７２ｂｐ〜３００ｂｐである。【００２３】
本発明の第２のプロモータは、合成オリゴヌクレオチドであってよく、また、例えば配列番号１３及び１４に示したような一部相補的な２本の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅したり、若しくは適切な鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲによって増幅することがしたりすることもできる。このような鋳型としては、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍテンプレートファージφｇｌｅや、配列番号２に記載の塩基配列を有するプラスミド、ベクター若しくはゲノムなどが挙げられる。また、このようなプライマーとしては、該第２のプロモータを増幅できるプライマーであれば特に限定されないが、当業者が必要に応じて設計することができるものである。【００２４】
本発明の第３のプロモータは、配列番号３に記載の塩基配列を有することを特徴とする。配列番号３に記載の塩基配列は、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍから分離されたファージに含有されるｐＲプロモータ領域に相当する塩基配列である。【００２５】
本発明の第３のプロモータは、配列番号３に記載の塩基配列の上流又は／及び下流に、翻訳開始部位、翻訳終止部位、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写調節遺伝子領域（リブレッサー、エンハンサーなど）、ターミネーター、又は遺伝子組み換えのための制限酵素サイトやその他の該プロモータ機能を阻害しないあらゆる塩基配列を含み得る。さらに、本発明の第３のプロモータは、本発明の第１のプロモータのｐＲ領域以外の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加されたものであってもよい。本発明の第３のプロモータの長さは３２ｂｐ以上であり、好ましくは３２ｂｐ〜５００ｂｐ、より好ましくは３２ｂｐ〜３００ｂｐである。【００２６】
本発明の第３のプロモータは、合成オリゴヌクレオチドであってよく、又は必要に応じて適切な鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲによって増幅してもよい。さらに、本発明の第３のプロモータは、本発明の第１のプロモータのｐＲ領域以外の塩基配列において１以上の塩基の置換、欠失若しくは付加することによって得ることができる。【００２７】
本発明の第４のプロモータは、配列番号４に記載の塩基配列を有することを特徴とする。配列番号４に記載の塩基配列は、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍから分離されたファージに含有されるｐＬプロモータ領域に相当する塩基配列である。【００２８】
本発明の第４のプロモータは、配列番号４に記載の塩基配列の上流又は／及び下流に、翻訳開始部位、翻訳終止部位、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写調節遺伝子領域（リブレッサー、エンハンサーなど）、ターミネーター、又は遺伝子組み換えのための制限酵素サイトやその他の該プロモータ機能を阻害しないあらゆる塩基配列を含み得る。さらに、本発明の第４のプロモータは、本発明の第２のプロモータのｐＬ領域以外の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加されたものであってもよい。本発明の第４のプロモータの長さは２７ｂｐ以上であり、好ましくは２７ｂｐ〜５００ｂｐ、より好ましくは２７ｂｐ〜３００ｂｐである。【００２９】
本発明の第４のプロモータは、合成オリゴヌクレオチドであってよく、又は必要に応じて適切な鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲによって増幅してもよい。さらに、本発明の第４のプロモータは、本発明の第２のプロモータのｐＬ領域以外の塩基配列において１以上の塩基の置換、欠失若しくは付加することによって得ることができる。【００３０】
本発明の発現ベクターは、本発明の第１、第２、第３又は第４のプロモータを有することを特徴とし、放線菌宿主に導入された場合、宿主細胞において機能することができる。ここで、機能することとは、上記プロモータの下流に挿入された外来遺伝子を発現させることができることを意味する。また、放線菌宿主へ導入されることとは、宿主細胞のゲノム遺伝子に挿入されること、又は宿主細胞の染色体外で自己増殖できるプラスミドとして存在することを意味し、宿主細胞において外来遺伝子の持続的発現又は一過性発現をもたらす。【００３１】
本発明の発現ベクターが宿主細胞のゲノム遺伝子に挿入される場合、発現ベクターの全長が宿主細胞のゲノム遺伝子に挿入されてもよく、また、例えば、少なくとも本発明のプロモータ領域、及びその下流の目的タンパク質をコードする遺伝子領域が挿入され、必要に応じてリポーター遺伝子などのマーカー領域が挿入されてもよい。挿入は、ランダムな組換えであってもよく、ゲノム上の特定位置を標的とした相同組換えであってもよい。相同組換えの場合、発現ベクターにおいて宿主ゲノムに挿入したい目的領域の前、後又はその双方に、標的である特定位置の前、後又はその双方にあるＤＮＡ配列とそれぞれ相同性を有する配列を導入することが好ましい。【００３２】
一方、本発明の発現ベクターが宿主細胞に導入され、宿主細胞の染色体外で自己増殖できるプラスミドとして存在する場合、本発明の発現ベクターが自己複製能を有する自己複製ベクターであることが好ましい。この場合、発現が自己複製によって数を増やし、宿主において外来遺伝子の発現量を増加させることができる。本発明の発現ベクターが放線菌において自己複製するために、ＤＮＡ複製領域を少なくとも１つ及びＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードする領域（以下、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域という）を少なくとも１つ備えることが好ましい。【００３３】
このようなＤＮＡ複製領域及びＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域は、プラスミドや微生物によって異なるが、一般的に知られているものであればよい。例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＩＡＭ１４００由来ｐＲＥＴ１１００の場合、ＤＮＡ複製領域としては、配列番号１９〜２１に記載の塩基配列が同定されており、また、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号（２２〜２４）に記載の塩基配列（ｏｒｆ１）、配列番号２５に記載の塩基配列（ｏｒｆ２）、配列番号２６〜３７に記載の塩基配列（ｏｒｆ３）、配列番号３８〜４２に記載の塩基配列（ｏｒｆ４）、配列番号４３〜４７に記載の塩基配列（ｏｒｆ５）、配列番号４８又は４９に記載の塩基配列（ｏｒｆ６）、塩基配列５０又は５１に記載の塩基配列（ｏｒｆ７）、配列番号５２又は５３に記載の塩基配列（ｏｒｆ８）、配列番号５４又は５５に記載の塩基配列（ｏｒｆ９）が同定されている。【００３４】
また、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ  ＪＣＭ３２０３由来のｐＲＥＴ１０００の場合、ＤＮＡ複製領域としては、配列番号５６〜５８に記載の塩基配列が同定されており、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号５９〜６２に記載の塩基配列（ｏｒｆ１０）、配列番号６３又は６４に記載の塩基配列（ｏｒｆ１１）、配列番号６５に記載の塩基配列（ｏｒｆ１２）、配列番号６６又は６７に記載の塩基配列（ｏｒｆ１３）、配列番号６８〜７０に記載の塩基配列（ｏｒｆ１４）、配列番号７１又は７２に記載の塩基配列（ｏｒｆ１５）、配列番号７３又は７４に記載の塩基配列（ｏｒｆ１６）、配列番号７５に記載の塩基配列（ｏｒｆ１７）、配列番号７６〜８０に記載の塩基配列（ｏｒｆ１８）、配列番号８１に記載の塩基配列（ｏｒｆ１９）、配列番号８２に記載の塩基配列（ｏｒｆ２０）、配列番号８３〜８９に記載の塩基配列（ｏｒｆ２１）が同定されている。【００３５】
したがって、本発明のベクターは、自己複製ベクターである場合、例えば、ｐＲＥＴ１１００又はｐＲＥＴ１０００由来のＤＮＡ複製領域を少なくとも１つ、及びｐＲＥＴ１１００又はｐＲＥＴ１０００由来のＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域（ｏｒｆ）を少なくとも１つ備えることが好ましい。【００３６】
本発明の発現ベクターは、さらに必要に応じて、遺伝子組み換えに必要なマルチクローニングサイトや、形質転換体を選択するための薬剤耐性マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、その他のタンパク質をコードする遺伝子領域（オープンリーディングフレーム；ｏｒｆ）、翻訳開始部位、翻訳終止部位、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写調節遺伝子領域（リブレッサー、エンハンサーなど）、ターミネーターなどを含んでもよい。これらはいずれも本技術分野において知られているものである。例えば、薬剤耐性マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。また、リポーター遺伝子としてはｌａｃＺ遺伝子などがある。【００３７】
本発明の発現ベクターは、既知のプラスミドやベクターに基づいて通常なＤＮＡ組み換え手法を用いて構築することができる。例えば、ｐＲＥＴ１０００、ｐＲＥＴ１１００、ｐＲＥＴ１２００、ｐＲＥＴ１３００、ｐＲＥＴ１４００、ｐＲＥＴ１５００、ｐＲＥＴ１６００、ｐＲＥＴ１７００、ｐＲＥＴ１８００及びｐＲＥＴ０５００などのロドコッカス属放線菌由来のプラスミドに、本発明の第１〜第４のいずれかのプロモータを挿入することによって得られる。これらのプラスミドは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００、ＩＡＭ１５０３、ＪＣＭ２８９３、ＪＣＭ２８９４及びＪＣＭ２８９５）、及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ（ＪＣＭ３２０３）から分離することができる。なお、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＩＡＭ１４００及びＩＡＭ１５０３は、東京大学分子細胞生物学研究所が発行した「ＩＡＭ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４」に記載されており、当該研究所から入手することができる。また、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９３、ＪＣＭ２８９４及びＪＣＭ２８９５、並びにＲ．ｒｈｏｄｎｉｉ  ＪＣＭ３２０３は、独立行政法人理化学研究所が発行した「ＪＣＭ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００２」に記載されており、当該研究所から入手することができる。【００３８】
また、本発明の発現ベクターは、ベクターを大量に取得するため、大腸菌でも複製できるように、例えば、大腸菌用のベクターの一部（好ましく大腸菌用ＤＮＡ複製領域及びＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含む）を含むことが好ましい。例えば、放線菌由来のプラスミドと大腸菌用プラスミド若しくはベクターとのシャトルベクターが好ましく用いられる。この場合、自己複製と関係のない配列や、他の不必要な遺伝子の配列を制限酵素処理などによって切断して除くことができる。さらに、本発明の発現ベクターは、宿主染色体に挿入され、目的のタンパク質を製造することができる。【００３９】
本発明の発現ベクターは、約２ｋｂｐ以上であることが好ましく、２ｋｂｐ〜２０ｋｂｐであることがより好ましく、３ｋｂｐ〜１０ｋｂｐであることが特に好ましい。【００４０】
本発明の形質転換された放線菌（形質転換体）は、本発明の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする。本明細書における「放線菌」とは、放線菌に属する全ての微生物をいい、代表的な放線菌としては、ロドコッカス属、マイコバクテリウム属、ゴルドニア属、ディエツア属又はアミコラトプシス属微生物が挙げられる。【００４１】
代表的なロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）放線菌としては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｉｋｏｎｕｒｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉａｅ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａａｎｓｈａｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｏｎａｓｃｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｒｉａｔｏｍａｅ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｕｋｉｓａｍｕｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉなどが挙げられる。【００４２】
代表的なマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）放線菌としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃａｐｕｌｃｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｇｒｅｓｔｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｇｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｉｃｈｉｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｖｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｓｔｒｏａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｈｅｍｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｄｅｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｕｍａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｅｌａｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｉｍａｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｉｔａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｕｂｕｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｓｐｉｃｕｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｖｏｌｕｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｏｋｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｓｍｅｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｒｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｕｖａｌｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｅｐｈａｎｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｌｌａｘ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｃｅｔａｍｉｄｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｄｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｉｓｃｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｏｄｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｓｓｉａｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｉｂｅｒｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｄｌｅｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｌｓａｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋｕｂｉｃａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋｕｍａｍｏｔｏｎｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｎｔｉｆｌａｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｇｅｒｉｔｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔ���ｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｒｉｏｋａｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｂｕｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｖｉａｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｍｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｒｃｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｒｉｆｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｕｎｙｏｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｉｍｏｉｄｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｏｔｔｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｍｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔｉｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏｋａｉｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｐｌｅｘ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｓｃｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｌｉｎｓｋｙｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ａｖｉｕｍ  、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ  ｃｈｅｍｏｖａｒ  ｎｉａｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｆｆｉｎｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｏｐｈｉｌｕｍ等が挙げられる。【００４３】
代表的なゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）放線菌としては、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ａｉｃｈｉｅｎｓｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ａｌｋａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ａｍａｒａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ａｍｉｃａｌｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ａｒａｉｉ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｅｆｆｕｓａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｈｉｒｓｕｔａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｊａｃｏｂａｅａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｎａｍｉｂｉｅｎｓｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｎｉｔｉｄａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｐａｒａｆｆｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ、ｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｈａｎｄｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｉｈｗｅｎｓｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｉｎｅｓｅｄｉｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｏｌｉ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐｕｔｉ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｔｅｒｒａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｗｅｓｔｆａｌｉｃａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｗｒｉｇｈｔｐａｔｔｅｒｓｏｎｅｎｓｉｓ等が挙げられる。【００４４】
代表的なディエツア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）放線菌としては、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｃｉｎｎａｍｅａ、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｋｕｎｊａｍｅｎｓｉｓ、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｍａｒｉｓ、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｎａｔｒｏｎｏｌｉｍｎａｅａ、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｎａｔｒｏｎｏｌｉｍｎａｉｏｓ、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｐｓｙｃｈｒａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ等が挙げられる。【００４５】
代表的なアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）放線菌としては、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ａｌｂａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ａｚｕｒｅａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｂｅｎｚｏａｔｉｌｙｔｉｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｃｏｌｏｒａｄｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｅｃｈｉｇｏｎｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｅｕｒｙｔｈｅｒｍａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｊｅｊｕｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｋｅｎｔｕｃｋｙｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｋｅｒａｔｉｎｉｐｈｉｌａ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｅｒａｔｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｋｅｒａｔｉｎｉｐｈｉｌａ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｏｇａｂｅｃｉｎａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｌｅｘｉｎｇｔｏｎｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｌｕｒｉｄａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｉｎｎｅｓｏｔｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｎｉｉｇａｔｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｕｒｉｄａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｐａｌａｔｏｐｈａｒｙｎｇｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｐｌｕｍｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｒｉｆａｍｙｃｉｎｉｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｒｕｂｉｄａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｒｕｇｏｓａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｔｈｅｒｍｏｆｌａｖａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｔｏｌｙｐｏｍｙｃｉｎａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｔｏｌｙｐｏｐｈｏｒｕｓ等が挙げられる。【００４６】
発現ベクターの導入方法としては、公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などで行うことが可能である。【００４７】
本発明の第１の目的タンパク質の製造方法は、上記の本発明の形質転換体を用いることを特徴とする。まず、上記の形質転換体には、本発明のプロモータの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたベクターが導入される。次に、該形質転換体を培養することで、本発明のプロモータが機能することによって目的タンパク質を発現し、該タンパク質を精製することで目的タンパク質を製造することができる。【００４８】
本発明の第２の目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質をコードする遺伝子を、本発明の第１〜４のいずれかのプロモータを有する発現ベクターに、該プロモータの下流に発現可能なように挿入し、目的タンパク質を発現できる発現ベクターを得るステップと、得られた発現ベクターによって放線菌を形質転換し、形質転換体を得るステップと、得られた形質転換体を増殖可能な培地中で培養するステップと、上記培養するステップで得られた形質転換体から目的タンパク質を精製するステップとを含むことを特徴とする。【００４９】
目的タンパク質は、放線菌において合成できるものであれば特に限定されないが、様々な有用な酵素や生理機能を有するタンパク質やペプチドが挙げられる。例えば酵素においては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどが挙げられる。上述したように、ロドコッカス  エリスロポリスが産生するアミノケトン不斉還元酵素は、光学活性アミノアルコールの製造に大変有用であるため、特に好ましい。【００５０】
目的タンパク質をコードする遺伝子は、目的タンパク質の全てのアミノ酸配列をコードする開始コドンから終止コドンまでのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれる遺伝子であればよく、また遺伝子のエキソン領域のみからなるｃＤＮＡであってもよい。遺伝子の長さは特に限定されないが、好ましく１００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、より好ましくは３００ｂｐ〜４ｋｂｐである【００５１】
プロモータの下流に発現可能なように挿入するというのは、プロモータの下流（３’）側に、かつ該プロモータのコントロール下に、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することをいう。【００５２】
目的タンパク質を発現できる発現ベクターを得るためには、必要に応じて、例えば、プロモータを先にベクターに挿入してから、目的タンパク質をコードする遺伝子をさらにプロモータの下流に発現可能なように挿入する方法、又はプロモータと目的タンパク質をコードする遺伝子との両方を有するＤＮＡ断片遺伝子が発現可能なように予め用意し、その後ベクターに挿入する方法がある。【００５３】
前者の場合、例えば、制限酵素サイトが付加されたプライマーによってＰＣＲでまずプロモータを増幅し、プロモータ及びベクターを制限酵素によって処理し、既知のライゲーション法によってライゲーションした後、同様に目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することが挙げられる。このとき、遺伝子のフレームがずれないように挿入する位置を予め設計しておくとよい。また、場合によって制限酵素処理後のＤＮＡの末端を平滑化にする処理を行ってもよい。【００５４】
後者の場合、例えば制限酵素サイト及びプロモータに相当する塩基配列を含むプライマーによってＰＣＲで目的タンパク質をコードする遺伝子を増幅し、制限酵素処理後、既知のライゲーション法によってベクターにライゲーションすることが挙げられる。このときも、遺伝子のフレームがずれないようにプライマーを予め設計しておくとよい。また、場合によって制限酵素処理後のＤＮＡの末端を平滑化にする処理を行ってもよい。【００５５】
上記制限酵素処理、ＰＣＲ、ライゲーションなどの方法は、いずれも市販の試薬やキットを用いて取扱説明書通りに行うことができる。また、元となるベクターには適切な制限酵素サイトがない場合、先に他のベクターに挿入し、適切な制限酵素によって必要な部分を切り出してから、目的のベクターに挿入することも可能である。このような手法は、本技術分野において公知である。また、このステップで得られる発現ベクターは、上記の本発明の発現ベクターと同じであるため、ベクターに関する説明はここで省略する。【００５６】
次は、得られた発現ベクターによって放線菌を形質転換し形質転換体を得るステップであるが、形質転換手法及び形質転換体に関しては上記で説明した通りである。【００５７】
次は、得られた形質転換体を増殖可能な培地中で培養するステップである。形質転換体を培養する培地としては、使用する微生物が生育可能な条件であれば特に制限はなく公知の方法が使用でき、通常、炭素源、窒素源、その他養分を含む液体培地が使用される。培地の炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトール等の糖類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィン等の炭化水素類、あるいはこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては上記微生物が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩；フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等の無機または有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物等が使用できる。また、培地には、無機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。また、必要に応じて、培地には、微生物の増殖を促進する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質等を添加してもよい。【００５８】
形質転換体の培養は、生育に適した条件下で行うことができる。具体的には培地のｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９、温度０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。微生物の培養は、好気的または嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は１０〜１５０時間が好ましいが、それぞれの微生物により適宜決められるべきである。【００５９】
最後は、上記培養するステップで得られた形質転換体から目的タンパク質を精製するステップである。精製方法としては、目的タンパク質を取得することができれば特に限定されないが、例えば、以下のような方法がある。まず、目的タンパク質が合成された後微生物細胞内に留まる場合、細胞を破砕する必要がある。例えば、上記で培養された微生物細胞の培養液をろ過または遠心分離して、その細胞を水又は緩衝液でよく洗浄する。洗浄した細胞は適量の緩衝液に懸濁し、細胞を破砕する。破砕の方法としては特に制限はないが、例えば、乳鉢、ダイノミル、フレンチプレス、超音波破砕機等の機械的破砕法が挙げられる。得られた微生物の破砕液中より、固形物をろ過または遠心分離によって除去して無細胞抽出液中を取得し、その抽出液から目的タンパク質はタンパク質単離の常法によって採取する。また、目的タンパク質が合成された後微生物細胞外に分泌される場合、細胞を破砕する必要がない。例えば、上記で培養された微生物細胞の培養液をろ過または遠心分離して、無細胞培養液を取得し、この培養液から目的タンパク質をタンパク質単離の常法によって採取する。【００６０】
タンパク質単離の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析；セファデックス等によるゲルろ過法；ジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたイオン交換クロマトグラフィー法；ブチル基、オクチル基、フェニル基等疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法；色素ゲルクロマトグラフィー法；電気泳動法；透析；限外ろ過法；アフィニティークロマトグラフィー法；高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。【００６１】
さらに、前記タンパク質を固定化酵素として用いることもできる。このような方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、タンパク質又はタンパク質産生細胞を固定化したものが挙げられ、共有結合法や吸着法といった担体結合法、架橋法、包括法等により固定化できる。また、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート等の縮合剤を必要に応じて使用してもよい。また、他の固定化法としては、例えば、モノマーを重合反応でゲル化させて行うモノマー法；通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレポリマー法；ポリマーをゲル化させて行うポリマー法；ポリアクリルアミドを用いた固定化；アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、κ−カラギーナン等の天然高分子を用いた固定化；光硬化性樹脂、ウレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定化が挙げられる。【００６２】
このようにして精製された目的タンパク質は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によって単一バンドが確認されれば精製が十分に行われたものと判断される。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の技術範囲を限定するものではない。なお、全ての実施例で使用した制限酵素については、特に明記しない限り「東洋紡績株式会社」の製品であり、制限酵素以外の試薬については、特に明記しない限り「和光純薬工業株式会社」の製品である。【００６４】
（実施例１）  ロドコッカス属放線菌由来のプラスミドの一部とｐＨＳＧ２９９の一部とのシャトルベクターの構築
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＩＡＭ１４００由来のプラスミドを精製した。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＩＡＭ１４００（東京大学分子細胞生物学研究所  細胞機能情報センターより分譲）を、５ｍＬのＧＰＹ（１％グルコース、０．５％バクトペプトン及び０．３％イーストエキストラクトを含む）培地に植菌し、２５℃で振盪培養した。対数増殖期に１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン溶液を２５０μＬ添加し、さらに２５℃で２時間振盪培養した。【００６５】
培養液を１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を取り除き、さらに１ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で菌を懸濁し、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し上清を取り除いた。ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（同仁化学研究所）を含む）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を２５０μＬ加え懸濁し、３７℃で３０分間放置した。放置後、１００μＬの３Ｍ  ＮａＣｌ及び２５μＬの１０％ＳＤＳを加え、−２０℃で一晩放置した。【００６６】
その後、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清に５０μｇ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（キアゲン）及び５０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ（キアゲン）をそれぞれ０．５μＬ加え３７℃で１５分間放置した後、３７５μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液を添加した。１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を３００μＬ取り、７５０μＬのエタノールを加え、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離しし、５０μＬの滅菌水に沈殿を溶解した。【００６７】
この溶液をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）でプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡは、国際公開ＷＯ０５／０４２７３９号パンフレットに開示のｐＲＥＴ１１００（５４４４ｂｐ）及びｐＲＥＴ１２００（５４２１ｂｐ）の混合物であった。【００６８】
上記で得られたプラスミドＤＮＡ混合物をＡｌｗ４４  Ｉを用いて３７℃で２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績）を用いて平滑末端にし、ｐＲＥＴ１１００由来のＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と、ｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）をＨｉｎｃ  ＩＩを用いて３７℃で２時間消化した後、上記のようにフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液を添加し、エタノールで沈殿させることにより得られたＤＮＡ断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績）を用いてライゲーションした。【００６９】
その後、ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  （東洋紡績）を用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換大腸菌を、直径９０ｍｍのシャーレに対して３０μＬの０．１Ｍ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ガラクトシド）及び３０μＬの４％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−イントール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）が塗布され、かつ１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト及び１％塩化ナトリウムを含む；ｐＨ７．２）寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【００７０】
出現したコロニーのうち白色のコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で６０時間振盪培養した。得られた培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉ（北海道システム・サイエンス）を用いてベクターＤＮＡを精製した。得られたベクターＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動（ナカライテスク）で確認した。このベクターをｐＲＥＴ１１０２と命名した。【００７１】
上記とは別に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＩＡＭ１４００から分離及び精製したプラスミドＤＮＡをＢｓｐＬＵ  １１Ｉ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて４８℃で２時間消化した後にＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈを用いて平滑末端にし、ｐＲＥＴ１２００由来のＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と、ｐＨＳＧ２９９をＨｉｎｃ  ＩＩを用いて３７℃で２時間消化して得られたＤＮＡ断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【００７２】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換大腸菌を、直径９０ｍｍのシャーレに対して３０μＬの０．１Ｍ  ＩＰＴＧ及び３０μＬの４％Ｘ−ｇａｌが塗布され、かつ１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【００７３】
出現したコロニーのうち白色のコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で６０時間振盪培養した。得られた培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製した。得られたベクターＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動に供して確認した。このベクターをｐＲＥＴ１２０２と命名した。【００７４】
（実施例２）  ｐＲＥＴ１１０２及びｐＲＥＴ１２０２のサイズの縮小
実施例１で得られたｐＲＥＴ１１０２をＢａｍＨ  Ｉ及びＨｉｎｃ  ＩＩで３７℃にて２時間消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。この際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒλ／ＥｃｏＲ  Ｉ  ＋  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡績）を使用した。【００７５】
このＤＮＡ断片と、ｐＨＳＧ２９９をＢａｍＨ  Ｉ及びＨｉｎｃ  ＩＩで３７℃にて２時間消化した後０．８％アガロースゲル電気泳動に供しＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【００７６】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換大腸菌を、直径９０ｍｍのシャーレに対して３０μＬの０．１Ｍ  ＩＰＴＧ及び３０μＬの４％Ｘ−ｇａｌが塗布され、かつ１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【００７７】
形成したコロニーのうち白色のコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で６０時間振盪培養した。得られた培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製した。得られたベクターＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し確認した。【００７８】
このベクターをＰｓｔ  Ｉで２時間消化した後Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈを用いて平滑末端にし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃にて３６時間放置した。【００７９】
形成されたコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地に植菌し３０℃で２４時間培養した後、Ｌａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製した。得られたベクターＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し確認した。このベクターをｐＲＥＴ１１３２と命名した。なお、このｐＲＥＴ１１３２をＰｓｔ  Ｉで１時間消化した後０．８％アガロースゲル電気泳動に供して確認したところ、ｐＲＥＴ１１３２がＰｓｔ  Ｉによって切断されないことが確認された。【００８０】
また、実施例１で得られたｐＲＥＴ１２０２をＥｃｏＲ  Ｉ及びＤｒａ  ＩＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス）で２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈを用いて平滑末端にし、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。この際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒλ／ＥｃｏＲ  Ｉ  ＋  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔを使用した。【００８１】
このＤＮＡ断片と、ｐＨＳＧ２９９をＢａｍＨ  Ｉ及びＨｉｎｃ  ＩＩで２時間消化した後０．８％アガロースゲル電気泳動に供しＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製して得た約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【００８２】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に遺伝子導入した。得られた形質転換大腸菌を、直径９０ｍｍのシャーレに対して３０μＬの０．１Ｍ  ＩＰＴＧ及び３０μＬの４％Ｘ−ｇａｌが塗布され、かつ１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【００８３】
出現したコロニーのうち白色のコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で６０時間振盪培養した。得られた培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターをＳａｃ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ又はＥｃｏＲ  Ｉで２時間消化してベクターの確認を行ったところ、ロドコッカス属菌由来の領域が自然発生的に約５００ｂｐが削れたことが判明した。このベクターをｐＲＥＴ１２０４（約５．９ｋｂｐ）と命名した。【００８４】
（実施例３）  アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入された発現ベクターの構築−１
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４（経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４５１；平成１３年２月１５日に受託）を５ｍＬのＧＰＹ培地に植菌し３０℃で４８時間振盪培養した後、その培養液を１００ｍＬのＧＰＹ培地に植え継ぎ３０℃で１０時間、２００ｒｐｍで培養した。培養液をＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｓｅｔ（キアゲン）及び  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ５００／ｇ（キアゲン）を用いて精製し、ゲノムＤＮＡを取得した。【００８５】
取得したゲノムＤＮＡを鋳型として、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子（ｍａｋ遺伝子）に相当する塩基配列をＰＣＲ法によって増幅した。プライマーとしては、ＭＡＫＦ１（センス）：５’−ＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号５）、及びＭＡＫＲ２（アンチセンス）：５’−ＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号６）を使用し、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡績）を用い、反応条件としては、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが６８℃３０秒、伸長反応が６８℃１分５０秒で、３０サイクルを行った。【００８６】
ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱した後、Ｓｍａ  Ｉを用いて３０℃で２時間消化したｐＵＣ１８（約２．７ｋｂｐ；タカラバイオ）と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。得られたライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  を用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換大腸菌を、直径９０ｍｍのシャーレに対して３０μＬの０．１Ｍ  ＩＰＴＧ及び３０μＬの４％Ｘ−ｇａｌが塗布され、かつ１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地にプレーテリングし、３０℃で６０時間放置した。【００８７】
出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。得られた培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し確認した。【００８８】
次に、上記で得られた発現ベクターを鋳型として、さらにＰＣＲを行った。プライマーとしては、ＭＡＫＰｓｔＦ（センス）：５’−ＧＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＣＣ−３’（配列番号７）、及びＭＡＫＨｉｓＢｇｌＩＩＲ（アンチセンス）：５’−ＣＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＣ−３’（配列番号８）を用い、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いて、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが６８℃３０秒、伸長反応が６８℃１分５０秒で、３０サイクルを行った。【００８９】
得られたＤＮＡ断片をＢｇｌ  ＩＩを用いて３７℃で２時間消化した後、１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した（約０．８ｋｂｐ）。このＤＮＡ断片と、ｐＱＥ７０（キアゲン）をＳｐｈ  Ｉを用いて３７℃で２時間消化した後Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ  を用いて平滑末端にし、さらにＢｇｌ  ＩＩを用いて３７℃で２時間消化した後０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製して得られたＤＮＡ断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【００９０】
得られたライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【００９１】
形成したコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製した。得られたベクターＤＮＡをＢｇｌ  ＩＩを用いて３７℃で２時間消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し確認したところ、全長が約４．２ｋｂｐであり、目的としたｐＱＥ７０のマルチクローニングサイトにｍａｋ遺伝子が挿入された発現ベクターであることが確認された。この際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒλ／ＥｃｏＲ  Ｉ  ＋  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔ及びｐＱＥ７０を用いた。この発現ベクターをｐＭＡＫ８４１７−２と命名した。【００９２】
また、ｐＲＥＴ１２０４を鋳型とし、ｐＲＥＴ１２００由来の一部の配列をＰＣＲによって増幅した。プライマーとしては、Ｐ１２０４ｒｅｐ−Ｅｃ２９５８（センス）：５’−ＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＣＡ−３’（配列番号９）及びＰ１２００ｒｅｐ−Ｐｓｔ５１９５（アンチセンス）：５’−ＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧ−３’（配列番号１０）を用い、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いて、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが６０℃３０秒、伸長反応が６８℃５０秒で、３０サイクルを行った。【００９３】
ＰＣＲ反応後ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製し、制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉで２時間消化した後、１．６％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。得られたＤＮＡ断片（約０．６ｋｂｐ）と、ｐＭＡＫ８４１７−２をＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉを用いて３７℃で２時間消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片（約４．２ｋｂｐ）とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【００９４】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【００９５】
形成したコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてＤＮＡ精製し、ＥｃｏＲ  Ｉを用いて３７℃で２時間消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的としたｐＲＥＴ１２００由来のプロモータの下流にｍａｋ遺伝子が挿入された発現ベクター（約４．８ｋｂｐ）であった。【００９６】
得られたベクターを鋳型とし、ｐＲＥＴ１２００由来のプロモータ及びその下流のｍａｋ遺伝子の部分をＰＣＲによって増幅した。プライマーとしては、ｐＱＥ７０Ｆ１（センス）：５’−ＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１１）、及びｐＱＥ７０Ｒ１１３５Ｂｍ（アンチセンス）：５’−ＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１２）を用い、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いて、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが６０℃３０秒、伸長反応が６８℃３分間で、３０サイクルを行った。【００９７】
得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、その産物をＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで２時間消化した後０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。このＤＮＡ断片（約２．４ｋｂｐ）と、ｐＲＥＴ１１３２をＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで２時間消化したＤＮＡ断片（約５．３ｋｂｐ）を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【００９８】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【００９９】
得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した後Ｌａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製し、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。その際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒλ／ＥｃｏＲ  Ｉ  ＋  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔを使用した。得られたベクターＤＮＡをＥｃｏＲ  Ｉを用いて３７℃で２時間消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的としたｐＲＥＴ１２００由来のプロモータ及びその下流に位置するｍａｋ遺伝子を有するベクター（約７．７ｋｂｐ）であることが確認された。このベクターをｐＲＥＴ１１３８と命名した。【０１００】
（実施例４）  アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入された発現ベクターの構築−２
合成オリゴヌクレオチドであるＰＴＲｔＦ：５’−ＣＡＡＴＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＴＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＣＧＡＴＡＣＴＴＴＡＡＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴ−３’（配列番号１３）、及びＰＴＲｔＲ：５’−ＴＴＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＧＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＴＧＴＡＴＣＧＧＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＴＴＡＡＡＧＴＡＴＣＧ−３’（配列番号１４）を使用し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用して、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが５０℃３０秒、伸長反応が６８℃１０秒間、５サイクルでＰＣＲ反応を行った。【０１０１】
ＰＣＲ反応液の一部を鋳型とし、さらにＰＣＲを行った。プライマーとしては、ＰＴＲＲＰｓｔ−Ｆ：５’−ＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴ−３’（配列番号１５）、及びＰＴＲＲＥｃｏ−Ｒ：５’−ＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＧＴＡ−３’（配列番号１６）を用い、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用して、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが５０℃３０秒、伸長反応が６８℃１０秒間、３０サイクルでＰＣＲ反応を行った。【０１０２】
ＰＣＲ産物を２．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製したＤＮＡ断片をＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉで２時間消化した後２．０％アガロースゲル電気泳動に供し、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。この際、サイズマーカーは１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡績）を使用した。【０１０３】
得られたＤＮＡ断片と、ｐＭＡＫ８４１７−２をＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉを用いて３７℃で２時間消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片（約４．２ｋｂｐ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【０１０４】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。【０１０５】
形成したコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃６０時間振盪培養した。培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉ（北海道システム・サイエンス）を用いてベクターＤＮＡ精製し、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した（約４．４ｋｂｐ）。さらに精製したベクターＤＮＡをＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉで２時間消化し、２％アガロースゲル電気泳動で、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が確認され、このＤＮＡ断片の遺伝子配列を解析した結果、配列番号１に記載の塩基配列であった。この発現ベクターをｐＭＡＫ８４１７−１７と命名した。【０１０６】
ｐＭＡＫ８４１７−１７を鋳型とし、ｐＱＥ７０Ｆ１：５’−ＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１５）及びｐＱＥ７０Ｒ１１３５Ｂｍ：５’−ＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１６）をプライマーとして、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用して、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが６０℃３０秒、伸長反応が６８℃３分間、３０サイクルでＰＣＲ反応を行った。【０１０７】
ＰＣＲ反応液をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、精製したＰＣＲ産物をＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで２時間消化した後０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。このＤＮＡ断片（約２ｋｂｐ）と、ｐＲＥＴ１１３２をＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで２時間消化したＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片（約５．３ｋｂｐ）を混合しＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした後、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した後Ｌａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製し、０．８％アガロースゲル電気泳動で目的とした配列番号１に記載の塩基配列及びその下流に位置するｍａｋ遺伝子を有するベクターであることが確認された。その際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒλ／ＥｃｏＲ  Ｉ  ＋  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔ及びｐＲＥＴ１１３２を使用した。ここで得られたベクターをｐＲＥＴ１１３７（約７．３ｋｂｐ）と命名した。【０１０８】
（実施例５）  アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入された発現ベクターの構築−３
合成オリゴヌクレオチドであるＰＴＲｔＦ：５’−ＣＡＡＴＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＴＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＣＧＡＴＡＣＴＴＴＡＡＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴ−３’（配列番号１３）、及びＰＴＲｔＲ：５’−ＴＴＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＧＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＴＧＴＡＴＣＧＧＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＴＴＡＡＡＧＴＡＴＣＧ−３’（配列番号１４）を使用し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用して、９４℃、２分間にて鋳型ＤＮＡの変性を行った後、アニーリングが５０℃３０秒、伸長反応が６８℃１０秒間で、５サイクルでＰＣＲ反応を行った。【０１０９】
ＰＣＲ反応液の一部を鋳型とし、ＰＴＲＬＥｃｏ−Ｆ（センス）：５’−ＡＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＡＧＴＣＧＣＴＣＡＣＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１７）、及びＰＴＲＬＰｓｔ−Ｒ（アンチセンス）：５’−ＡＧＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＧＴＡ−３’（配列番号１８）をプライマーとして、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用して、アニーリングが５０℃３０秒、伸長反応が６８℃１０秒間で、３０サイクルでＰＣＲ反応を行った。【０１１０】
ＰＣＲ産物を２．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉで２時間消化した後２．０％アガロースゲル電気泳動に供し、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。この際、サイズマーカーは１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒを使用した。【０１１１】
得られたＤＮＡ断片と、ｐＭＡＫ８４１７−２をＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉを用いて３７℃で２時間消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片（約０．２ｋｂｐ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【０１１２】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換した。形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。形成したコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃６０時間振盪培養した。【０１１３】
培養液をＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてＤＮＡ精製し、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。さらに精製したベクターＤＮＡをＥｃｏＲ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉで３７℃２時間消化し、２％アガロースゲル電気泳動で、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を確認され、このＤＮＡ断片の遺伝子配列を解析したところ、配列番号２に記載の塩基配列を含むことが確認された。この発現ベクターをｐＭＡＫ８４１７−１８と命名した。【０１１４】
ｐＭＡＫ８４１７−１８をＥｃｏＲ  Ｉで３７℃２時間消化及び精製した後Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで３７℃２時間消化したＤＮＡ断片を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。その際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒλ／ＥｃｏＲ  Ｉ  ＋  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔを使用した。【０１１５】
精製したＤＮＡ断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈで平滑末端にし、このＤＮＡ断片と、ｐＲＥＴ１１０２をＨｉｎｃ  ＩＩで３７℃２時間消化した後ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片（約８．１ｋｂｐ）とを混合しＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。【０１１６】
ライゲーション産物をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した後、Ｌａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉを用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認したところ、目的とした配列番号２に記載の塩基配列及びその下流に位置するｍａｋ遺伝子を有する発現ベクターであることが確認された。その際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒλ／ＥｃｏＲ  Ｉ  ＋  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔ、及びｐＲＥＴ１１０２を使用した。このベクターをｐＲＥＴ１１２２（約９．１ｋｂｐ）と命名した。【０１１７】
（実施例６）  Ｅ．  ｃｏｌｉにおける所定プロモータの活性測定
プロモータの活性測定はアミノケトン不斉還元酵素の活性測定によって行われた。上記で得られたｐＲＥＴ１１３７及びｐＲＥＴ１１３８をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈを用いてＥ．  ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。３０℃で２４時間放置後、得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し３０℃で２４時間培養した。培養液を１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含む１００ｍＬのＬＢ液体培地に植え継ぎ、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液を４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を取り除いて、得られた菌体を還元酵素活性の測定に使用した。【０１１８】
活性測定は、Ｏ．Ｄ．＝５の菌量で、２％グルコース及び０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含む３％ＥＡＭ（２−Ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｐｒｏｐａｎ−１−ｏｎｅ）を含む反応液で行った。なお、ＥＡＭの合成は、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、（１９２８）５０、Ｐ２２８７−２２９２」の文献に記載されている方法で行った。反応液を３０℃で１６時間振盪し反応させた後、菌体反応液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィーＬＣ−２０１０Ｃ；島津製作所）に供した。分析カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  Ｐｈ−３  ３．０×７５ｍｍ（ジーエル  サイエンス）、カラム温度は４０℃、溶離液は０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含む７％アセトニトリル溶液、検出波長は２２０ｎｍで行った。【０１１９】
還元酵素活性を測定した結果、ｐＲＥＴ１１３７を保持するＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９は６０μｇ／ｈ／Ｏ．Ｄ．の活性を示し、ｐＲＥＴ１１３８を保持するＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９は活性が検出できなかった。ｐＲＥＴ１１３８は、ロドコッカス属放線菌由来のプロモータ領域を含んでいるが、大腸菌において機能しないことが判明した。【０１２０】
（実施例７）  ロドコッカス・エリスポリスにおける所定プロモータの活性測定
５ｍＬのＧＰＹ培地にＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４株を植菌し、３０℃で３６時間振盪培養した。その培養液１ｍＬを１００ｍＬのＬＢ培地に植え継ぎ、３０℃で１０時間、２００ｒｐｍで培養した。培養した菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により集菌し、集菌した菌体を超純水（ｍｉｌｌｉＱ；日本ミリポア）で２回洗浄した。洗浄し終えた菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により集菌し、２．４ｍＬの１０％グリセロール溶液に懸濁した。懸濁液を３００μＬずつ分注し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。【０１２１】
作製したコンピテントセル９０μＬとＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉで調整したｐＲＥＴ１１０２、ｐＲＥＴ１１２２、ｐＲＥＴ１１３７又はｐＲＥＴ１１３８のプラスミドＤＮＡ５μＬを氷上で混合した。混合溶液を氷上で冷却した０．１ｃｍ  ｃｕｖｅｔｔｅ（日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）に静かに流し込み、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）にセットした。２０ｋＶ／ｃｍ、４００Ω、２５μＦでパルスし、直ちに３００μＬのＬＢ培地を加え、２５℃で３時間放置した。その懸濁液の一部を１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で７２時間放置した。【０１２２】
形成されたコロニーを５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で７２時間培養した。培養液を４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を取り除いて、得られた菌体を還元酵素活性の測定に使用した。【０１２３】
活性測定は、Ｏ．Ｄ．＝５の菌量で、２％グルコース及び０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含む３％ＥＡＭの反応液で行った。反応液を３０℃で１６時間振盪反応した後、菌体反応液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣに供した。分析カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  Ｐｈ−３  ３．０×７５ｍｍ、カラム温度は４０℃、溶離液は０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含む７％アセトニトリル溶液、検出波長は２２０ｎｍで行った。【０１２４】
ＥＡＭ反応を測定した結果、ｐＲＥＴ１１０２を保持するＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４は０．２μｇ／ｈ／Ｏ．Ｄ．、ｐＲＥＴ１１２２を保持するＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４は１０μｇ／ｈ／Ｏ．Ｄ．の活性を示し、ｐＲＥＴ１１３７を保持するＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４は２０μｇ／ｈ／Ｏ．Ｄ．の活性を示し、ｐＲＥＴ１１３８を保持するＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＭＡＫ−３４は２０μｇ／ｈ／Ｏ．Ｄ．の活性を示した。ｐＲＥＴ１１２２及びｐＲＥＴ１１３７は、乳酸菌由来のプロモータを含んでいるが、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおいてアミノケトン不斉還元酵素を高発現させることが確認された。また、そのプロモータの活性は、ロドコッカス属放線菌由来のプロモータを含むｐＲＥＴ１１３８と同等のものであった。【０１２５】
（実施例８）  ロドコッカス・エリスポリス以外の放線菌における所定プロモータの活性測定
５ｍＬのＬＢ液体培地にＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ  ＮＢＲＣ  １５０６５、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｍａｒｉｓ  ＮＢＲＣ  １５８０１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ  ＮＢＲＣ  １４５３１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＢＲＣ  １５５６４、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ  ＮＢＲＣ  １５５９１、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ  ＮＢＲＣ３７０７（上記６株は、ＮＢＲＣ（独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門、〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より分譲）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ  １０７４３、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ  ＪＣＭ  １３０１１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ  １３３６６、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ  ＪＣＭ  ３３７６、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ  ＪＣＭ  ９９１９、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｕｋｉｓａｍｕｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ  １１３０８、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ  ＪＣＭ  １００８７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ  １３２７０、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２３１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａａｎｓｈａｎｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ  １１３７４、Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ  ＪＣＭ  ３１９９、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｒｉａｔｏｍａｅ  ＪＣＭ  １３３９６、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ  ＪＣＭ  ３２０３、及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＪＣＭ  ９７０３（上記１４株は、ＪＣＭ（独立行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室  〒３５１−０１９８  埼玉県和光市広沢２−１）より分譲）を植菌し２５℃で振盪培養した。島津紫外可視分光光度計ＵＶ−１６０Ａ（株式会社島津製作所）を使用して、培養液を波長６１０ｎｍで測定し、吸光度が０．８に達するまで振盪培養した。その培養液３ｍＬを１００ｍＬのＬＢ培地に植え継ぎ、２５℃で１２時間振盪培養した。培養した菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により集菌し、集菌した菌体を超純水で２回洗浄した。洗浄し終えた菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により集菌し、２．４ｍＬの１０％グリセロール溶液に懸濁した。懸濁液を３００μＬずつ分注し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。【０１２６】
作製した各々のコンピテントセル９０μＬとＬａｂｏ  Ｐａｓｓ（商標）Ｍｉｎｉで調整したｐＲＥＴ１１０２またはｐＲＥＴ１１３７のプラスミドＤＮＡ５μＬを氷上で混合した。混合溶液を氷上で冷却した０．１ｃｍのキュベットに静かに流し込み、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにセットした。２０ｋＶ／ｃｍ、４００Ω、２５μＦでパルスし、直ちに３００μＬのＬＢ培地を加え、２５℃で３時間放置した。その懸濁液の一部を１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、２５℃で７日間放置した。形成されたコロニーを５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、２５℃で７日間振盪培養した。培養液を４℃で１２ｋｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を取り除いて、得られた菌体を還元酵素活性の測定に使用した。【０１２７】
活性測定は、Ｏ．Ｄ．＝５の菌量で、２％グルコース及び０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含む３％ＥＡＭの反応液で行った。反応液を３０℃で１６時間振盪反応した後、菌体反応液を１２ｋｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣに供した。分析カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  Ｐｈ−３  ３．０×７５ｍｍ、カラム温度は４０℃、溶離液は０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含む７％アセトニトリル溶液、検出波長は２２０ｎｍで行った。【０１２８】
活性測定した結果を表１にまとめた。表１に示したすべての放線菌について、ｐＲＥＴ１１０２を保持する放線菌と比較するとｐＲＥＴ１１３７を保持する放線菌には高い活性がみられた。【０１２９】
【表１】
2008072547.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明のプロモータ、発現ベクター又は形質転換体によれば、放線菌において目的遺伝子や目的タンパク質の高発現が実現でき、目的に応じて様々な有用なタンパク質を効率よく大量生産することができる。このようなタンパク質はまた様々な工業生産に貢献する。例えば酵素においては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを効率よく大量に生産することができる。目的タンパク質がアミノケトン不斉還元酵素である場合、光学活性β−アミノアルコールの高収率かつ高選択的な製造を可能とする。また、本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、放線菌において目的タンパク質を効率よく大量生産することができる。
【配列表】
2008072547000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月29日(2009.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008072547000001.app
【国際調査報告】
2008072547.tif 000003
2008072547.tif 000004
2008072547.tif 000005
2008072547.tif 000006