(57)【要約】吸光光度計やプレートリーダー等の汎用測定機器や目視で測定可能な超高感度測定法を提供する。チオNAD(P)を補酵素とする酵素サイクリング法と標識酵素およびその基質の最適な組合わせにより、シグナル物質であるチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅し、そのチオNAD(P)Hを比色定量することにより、汎用測定機器や目視で測定可能な高感度測定法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
【請求項２】
抗体酵素複合体は、標的タンパク質抗原に特異的な抗体とこの抗体で標識した酵素とからなり、前記標的タンパク質の測定に用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
【請求項４】
酵素標識核酸プローブは、標的核酸に特異的に結合する核酸プローブとこの核酸プローブで標識した酵素とからなり、前記標的核酸の測定に用いられる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生成したチオNADHおよび／またはチオNADPH量の測定は、チオNADHおよび／またはチオNADPHの吸収波長における吸光度を測定することで行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化の計測は、目視により行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、EC番号 2.-で表される転移酵素群、EC番号 3.-で表される加水分解酵素群、EC番号4.-で表される除去付加酵素群およびEC番号5.-で表される異性化酵素群から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
以下の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素
上記酵素の基質
デヒドロゲナーゼ(DH)
NADHおよび／またはNADPH、
チオNADおよび／またはチオNADP
【請求項９】
以下の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素
上記酵素の基質
デヒドロゲナーゼ(DH)
NADHおよび／またはNADPH、
チオNADおよび／またはチオNADP
【請求項１０】
抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、EC番号 2.-で表される転移酵素群、EC番号 3.-で表される加水分解酵素群、EC番号4.-で表される除去付加酵素群およびEC番号5.-で表される異性化酵素群から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である請求項８または９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００７年３月２８日出願の日本特願２００７−８５５５０号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、酵素免疫測定法および核酸プローブ測定法を利用するタンパク質と核酸の高感度測定法に関する。特に本発明は、抗体または核酸プローブに標識する酵素の活性測定にチオNADサイクリング法を応用し、普及型の比色マイクロプレートリーダーや目視でも、標的タンパク質および核酸の超高感度測定を可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質や核酸の高感度測定法としてラジオイムノアッセイ（RIA）法が技術的に確立されているが、検出装置の感度を上げる以外に、現状では10-16mole程度以上の高感度化は技術的に不可能である。しかも、RIA法では測定の場がアイソトープ実験施設に限定されるだけではなく、短寿命の核種を使用すれば試薬の使用期限が極端に短くなる上に、測定感度も急激に低下する。さらに、放射能測定法に特有の放射性廃棄物の問題も抱えている。特に長寿命の核種を使用する場合の廃棄の問題は大きい。したがって、近年、タンパク質や核酸の高感度測定法の開発研究は「非放射性」をキーワードとして展開されてきた。それゆえ、RIA法に関する研究開発や技術的改良はほとんど行われていない現状である。【０００４】
RIA法に代わる高感度測定法として、タンパク質の測定には酵素免疫測定法(ELISA法) [図１]が、核酸の測定にはPCR法がある。酵素免疫測定法は開発当初の比色法(10-13mole)から蛍光法、発光法へと高感度化(10-15mole)が進められ、専用測定装置の開発・改良も進んでいる。しかし、測定操作が簡便になっただけで感度的には限界に達している。(非特許文献1)【０００５】
また、核酸の高感度測定法としてのPCR法では、ターゲット特異的なシグナル検出の問題、増幅効率の問題、PCR産物がプラトーに達する条件等を考え合わせると、核酸の定量は厳密には難しい。
【非特許文献１】「超高感度酵素免疫測定法」（学会出版センター・1993年）
【０００６】
そこで本発明の目的は、検出方法が最も簡便な比色法を用い、感度を幾何級数的に高めた測定法を提供することである。具体的には感度を10-18moles 以上に高めた測定法を提供することである。【０００７】
タンパク質または核酸を、酵素免疫測定法を用いて、より高感度に測定するには、酵素免疫測定法の標識酵素によって生成するシグナル物質を増幅することが考えられる。また、シグナル物質を増幅する方法として、いくつかの酵素サイクリング法が知られている。そこで、本発明者らは、酵素免疫測定法を用いたタンパク質または核酸の比色測定による高感度測定法を提供すべく種々検討した。その結果、酵素免疫測定法を、酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法を組み合わせ、シグナル物質としてチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅することで、比色法によって、高感度にタンパク質または核酸の定量や目視による検出が可能であることを見いだして、本発明を完成させた。
【発明の開示】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明の第1の態様は、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法である。
上記方法においては、抗体酵素複合体は、標的タンパク質抗原に特異的な抗体とこの抗体で標識した酵素とからなり、前記標的タンパク質の測定に用いられることができる。
【０００９】
上記課題を解決するための本発明の第２の態様は、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法である。
上記方法においては、酵素標識核酸プローブは、標的核酸に特異的に結合する核酸プローブとこの核酸プローブで標識した酵素とからなり、前記標的核酸の測定に用いられることができる。
【００１０】
上記第１の態様および第２の態様においては、以下の態様がさらに好ましい。（１）生成したチオNADHおよび／またはチオNADPH量の測定は、チオNADHおよび／またはチオNADPHの吸収波長における吸光度を測定することで行う、
（２）生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化の計測は、目視により行う、
（３）抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、EC番号 2.-で表される転移酵素群、EC番号 3.-で表される加水分解酵素群、EC番号4.-で表される除去付加酵素群およびEC番号5.-で表される異性化酵素群から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素である。
【００１１】
上記課題を解決するための本発明の第３の態様は、以下の試薬を含む酵素免疫測定用キットである。
標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素
上記酵素の基質
デヒドロゲナーゼ(DH)
NADHおよび／またはNADPH、
チオNADおよび／またはチオNADP
【００１２】
上記課題を解決するための本発明の第４の態様は、 以下の試薬を含む核酸プローブ測定用キットである。
標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素
上記酵素の基質
デヒドロゲナーゼ(DH)
NADHおよび／またはNADPH、
チオNADおよび／またはチオNADP
【００１３】
上記キットにおいて、抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、EC番号 2.-で表される転移酵素群、EC番号 3.-で表される加水分解酵素群、EC番号4.-で表される除去付加酵素群およびEC番号5.-で表される異性化酵素群から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素であることができる。
【００１４】
本発明によれば、測定感度を10-18moles 以上に高めた酵素免疫測定法を提供することができ、標的タンパク質や標的核酸の高感度測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
〔酵素サイクリング法〕
本発明は、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法に関する。【００１６】
上記抗体酵素複合体は、標的タンパク質抗原に特異的な抗体とこの抗体で標識した酵素とからなり、前記標的タンパク質の測定に用いられる。【００１７】
さらに本発明は、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法に関する。【００１８】
上記酵素標識核酸プローブは、標的核酸に特異的に結合する核酸プローブとこの核酸プローブで標識した酵素とからなり、前記標的核酸の測定に用いられる。【００１９】
上記本発明の方法で用いられている抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、EC番号 2.-で表される転移酵素群、EC番号 3.-で表される加水分解酵素群、EC番号4.-で表される除去付加酵素群およびEC番号5.-で表される異性化酵素群から成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素であることができる。【００２０】
EC番号 2.-で表される転移酵素群としては、例えば、以下のＥＣ番号に分類されるものをいずれも使用できる。
2008117816.tif 000002
2008117816.tif 000003
EC番号 2.-で表される転移酵素群に含まれる酵素の例としては、例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)等を挙げることができる。【００２１】
EC番号 3.-で表される加水分解酵素群としては、例えば、以下のＥＣ番号に分類されるものをいずれも使用できる。
2008117816.tif 000004
2008117816.tif 000005
2008117816.tif 000006
EC番号 3.-で表される転移酵素群に含まれる酵素の例としては、例えば、アルカリホスファターゼ(ALP)、イヌリナーゼ(INL)、β-ガラクトシダーゼ(β-Gal)、α-グルコシダーゼ(α-Glu)、リポプロテインリパーゼ（LPL）等を挙げることができる。【００２２】
EC番号4.-で表される除去付加酵素群としては、例えば、以下のＥＣ番号に分類されるものをいずれも使用できる。
2008117816.tif 000007
EC番号 4.-で表される転移酵素群に含まれる酵素の例としては、例えば、
フマラーゼ(FUM)、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(PEPC)、オキザロアセテートデカルボキシラーゼ(OAC)、マレートシンテターゼ(MLS)等を挙げることができる。【００２３】
EC番号5.-で表される異性化酵素群としては、例えば、以下のＥＣ番号に分類されるものをいずれも使用できる。
2008117816.tif 000008
EC番号 5.-で表される転移酵素群に含まれる酵素の例としては、例えば、トリオースホスフェ−トイソメラーゼ(TIM)、ラクテートラセマーゼ(LRM)、3-ケトステロイドΔ4-Δ5イソメラーゼ等を挙げることができる。【００２４】
本発明の超高感度測定法は、通常の酵素免疫測定法や核酸プローブ法と同様に実施することができる。例えば、被検体に特異的に結合する抗体や核酸プローブを表面に固着させた固相担体、例えば、マイクロプレートやプラスチックチューブ、磁気ビーズ等、通常の測定に用いられている固相担体を用いることができる。【００２５】
抗体および核酸プローブ−酵素複合体は、常法により調製できる。【００２６】
抗体酵素複合体を構成する抗体は、本発明の酵素免疫測定方法により測定されるべき被検体に特異的に結合する抗体から適宜選択することができる。例えば、本発明の酵素免疫測定方法は、タンパク質の分析に用いられるが、その場合、抗体酵素複合体の抗体は、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体である。また、この場合、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体を表面に固着させた基板を用いる。また、抗体酵素複合体を構成する抗体および基板に固着させる抗体は、抗体の断片であっても良い。本発明の酵素免疫測定方法における、被検体は、タンパク質に限定されず、通常の酵素免疫測定方
法が測定対象とするタンパク質以外のすべての物質であることができる。【００２７】
核酸プローブ酵素複合体も同様に測定対象となる核酸に相補的なプローブを適宜選択することができる。【００２８】
本発明の方法において、抗体酵素複合体の酵素または酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う。【００２９】
本発明の方法において、各成分の濃度は以下の範囲にすることができる。
（１）抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの濃度範囲
0.01 μg/ml 〜 1 mg/ml
（２）標識酵素の基質の濃度範囲
1 μM 〜 500 mM
（３）NADHおよび／またはNADPHの濃度範囲
0.01 mM 〜 50 mM
（４）チオNADおよび／またはチオNADPの濃度範囲
0.01 mM 〜 100 mM
（５）デヒドロゲナーゼ(DH) の濃度範囲
0.01 u/ml 〜 5000 u/ml【００３０】
反応条件は、標識酵素およびデヒドロゲナーゼ(DH)の最適温度範囲を考慮して適宜決定できる。例えば、反応温度は、操作が簡便であることから、室温で実施することが好ましい。但し、標識酵素およびデヒドロゲナーゼ(DH)の最適温度範囲を考慮して室温より高い温度または低い温度で実施することもできる。【００３１】
反応時間は、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量の測定、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化の計測が可能な程度まで、チオNADHおよび／またはチオNADPHが蓄積するに十分な時間とすることができる。但し、測定または計測に必要なチオNADHおよび／またはチオNADPHの蓄積量は、測定または計測条件により変化するので、条件に応じて適宜決定できる。【００３２】
抗体酵素複合体の酵素または酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物は、標識酵素および標識酵素の基質として用いる物質により異なるが、例えばアルカリホスファターゼ(ALP)の場合は酵素サイクリング反応に使用する脱水素酵素の基質となりうる化合物のモノリン酸エステルであることができる。標識酵素と基質の組み合わせの例は後述する。【００３３】
酵素サイクリング系の中でチオNAD(P)を利用するサイクリング系は比較的最近になって登場したユニークなサイクリング系である。この系ではNAD(P)/NAD(P)Hを補酵素として利用する脱水素酵素（Dehydrogenase; DH）を用い、NAD(P)/NAD(P)HとそのアナログであるチオNAD(P)/チオNAD(P)Hが共存する条件下でサイクリングを行い、脱水素酵素の基質をチオNAD(P)H（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数 =11,900）として増幅定量する。チオNAD(P)サイクリング法の測定原理は以下の通りである。【００３４】
【化１】
2008117816.tif 000009
【００３５】
NADHの極大吸収が340 nm（モル吸光係数=6,200）であるのに対し、チオNAD(P)Hは可視域に吸収を示すため（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数=11,900）、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できることをその長所としている。【００３６】
チオNAD(P)を利用するサイクリング系は、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できるという長所を利用して、NADHの吸収増加に基づく脱水素酵素活性測定やその基質の定量法などの従来法のいくつかがチオNADを用いる方法に改良されている。しかしながら、このサイクリング系を酵素免疫測定法等の検出系として高感度化に利用した報告は未だない。
本発明では、標識酵素とサイクリング系を組み合わせることにより、初めて増幅反応を幾何級数的な反応とすることが可能となり、十分な高感度化を行うことが可能となった。【００３７】
本発明の測定法では、酵素免疫測定法の例で示したとおり、酵素複合体とそれに組み合わせた基質で産生された生成物を次の酵素サイクリング反応の基質として用い、酵素サイクリング反応により生成したチオNAD(P)Hの吸収を比色定量するものである。この反応では１種の脱水素酵素で酵素サイクリングを行うため、酵素サイクリング反応の基質としては、還元型基質でも酸化型基質でもよい。【００３８】
上記酵素複合体として用いる標識酵素とその基質およびそれに続くサイクリング反応に用いる脱水素酵素は以下のような性質を持っていることが望ましい。
（１）標識酵素のターンオーバー数が大きい
（２）市販および汎用されている標識酵素が使用できる
（３）酵素サイクリングのターンオーバー数が大きい
（４）酵素サイクリング反応に使用する脱水素酵素に標識酵素のコンタミや標識酵素と同様の活性がない
（５）標識酵素の基質が市販の化合物であるか、または容易に合成ができ、かつ安定性が高い【００３９】
デヒドロゲナーゼ(DH)としては、以下のデヒドロゲナーゼ(DH)を挙げることができる。
2008117816.tif 000010
2008117816.tif 000011
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2008117816.tif 000013
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デヒドロゲナーゼ(DH)としては、より具体的には、例えば、マレートデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、テストステロン−１７β−デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。【００４０】
本発明に使用可能な代表的な標識酵素、基質及び酵素サイクリング用の脱水素酵素の組合わせの一例として以下のものがあげられるが、もちろんこの組み合わせに限られるわけではない。【００４１】
【表１】
2008117816.tif 000023
【００４２】
例えば、上記記載の組合わせの中でサイクリング酵素として3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる場合、使用可能な基質の候補としては、アンドロステロン、11β−ヒドロキシアンドロステロン、11−オキソアンドロステロン、11α−ヒドロキシアンドロステロン、エチオコラノロン、テトラハイドロコルチゾール、プレグナンジオール、リトコール酸、デオキシコレート、ケノデオキシコール酸及びコール酸が挙げられる。【００４３】
サイクリング用の基質としては、酵素の反応速度が速く(基質に対する活性が高い)、低濃度でも反応する(Km値が小さい)ものが好ましい。また、脱水素酵素として好ましい性質は、補酵素としてチオNAD(P)を用いた場合の反応速度である。多くの脱水素酵素では、補酵素としてチオNADを用いた場合の反応速度がNADを用いた場合の数％以内であるのに対し、3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによるアンドロステロンの脱水素反応では、チオNADでの反応速度がNADでの反応速度の約59％もあり、本発明のサイクリング酵素として、好ましい性質を有している。しかも組合わせる標識酵素として、汎用されているアルカリホスファターゼ（ALP）を用いることが可能であり、アルカリホスファターゼの基質となるアンドロステロン3−リン酸の合成が容易であることも好ましい組合わせである。【００４４】
【化２】
2008117816.tif 000024
【００４５】
抗体酵素複合体の酵素としてトリオースフォスフェイトイソメラーゼ(TIM)を用いる酵素免疫測定方法を例にして、以下に説明する。
トリオースフォスフェイトイソメラーゼ(TIM)は、ターンオーバー数の高い標識酵素であり、このTIMを用いる酵素免疫測定方法では、TIMの生成物として、ジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトが生成する。そして、TIMの反応生成物を基質とするデヒドロゲナーゼである、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を酵素サイクリング反応に使用する。【００４６】
チオNADサイクリングは適切な脱水素酵素反応を選択すれば1分当たり数百サイクルという効率で脱水素酵素基質を増幅定量することができる。したがって、このような基質を反応生成物として与える酵素の活性はチオNADサイクリングによって超高感度に測定できることになる。【００４７】
[酵素サイクリング用キット]
本発明は、反応性担体に標識化された酵素およびその基質とサイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADHを含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
反応性担体とは測定対象物と結合する活性を持った抗体・核酸プローブ・レクチン等を表す。
反応性担体は測定対象物に適した物を用いればよく、標識酵素およびその基質も適した物を用いればよく特に限定はされない。【００４８】
より具体的には、本発明は、標識酵素及びその基質とサイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADHを含む酵素サイクリング法用キットを包含する。【００４９】
本発明のキットは、以下の試薬を含む酵素免疫測定用キットである。
標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素
上記酵素の基質
デヒドロゲナーゼ(DH)
NADHおよび／またはNADPH、
チオNADおよび／またはチオNADP【００５０】
さらに本発明は、以下の試薬を含む核酸プローブ測定用キットである。
標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素
上記酵素の基質
デヒドロゲナーゼ(DH)
NADHおよび／またはNADPH、
チオNADおよび／またはチオNADP【００５１】
標識酵素およびデヒドロゲナーゼ(DH)については、上記本発明の方法で説明したものをそのまま利用できる。【００５２】
本発明のキットは、市販の酵素標識抗体等をこのキットの構成試薬と組合わせて使用することも可能である。このキットは、酵素サイクリング法を用いる酵素免疫測定方法に利用できる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明がこれら実施例のみに限定されるべきでないことは云うまでもない。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。【００５４】
実施例１  標識酵素としてのFumaraseのサイクリング反応と組合わせた活性測定
反応試液
200 mM Tris緩衝液 pH 9.0
9 mM チオNAD
0.3 mM NADH
300 u/ml MDH
基質液
100 mM Fumaric acid
測定試料
1, 5, 10 u/ml Fumarase【００５５】
測定方法
反応試液180μlをマイクロプレートに分注し、次に基質液を20μl,更に試料を20μl加えて、マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−８００）で405 nmのフィルターを使用して37℃での吸光度変化を測定する。
図２に示される高感度な反応曲線を得た。特に時間の経過と共に反応が幾何級数的に進むことから、測定時間を長くすると感度は飛躍的に増大する。【００５６】
比較例１  標識酵素としてのFumaraseの活性測定
反応試液
200 mM Tris緩衝液 pH 9.0
9 mM チオNAD
300 u/ml MDH
基質液
100 mM Fumaric acid
測定試料
1, 5, 10 u/ml Fumarase【００５７】
測定方法
反応試液180μlをマイクロプレートに分注し、次に基質液を20μl,更に試料を20μl加えて、マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−８００）で405 nmのフィルターを使用して37℃での吸光度変化を測定する。
図３に示される反応曲線を得た。酵素サイクリングと組合わせていないので反応が直線的にしか進行せず、感度が低いことが分かる。【００５８】
実施例２  標識酵素としてのPhosphoenolpyruvate carboxylaseのサイクリング反応と組合わせた活性測定
反応試液
100 mM Na2CO3 (pH 8.0)
0.3 mM NADH 
9 mM チオNAD
300 u/ml MDH
基質液
50 mM Phosphoenolpyruvate
測定試料
0.1 u/ml Phosphoenolpyruvate carboxylase【００５９】
測定方法  
反応試液180μlをマイクロプレートに分注し、次に基質液を20μl,更に試料を20μl加えて、マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−８００）で405 nmのフィルターを使用して37℃での吸光度変化を測定する。
図４に示される高感度な反応曲線を得た。特に時間の経過と共に反応が幾何級数的に進むことから、測定時間を長くすると感度は飛躍的に増大する。【００６０】
比較例２  標識酵素としてのPhosphoenolpyruvate carboxylaseの活性測定
反応試液
100 mM Na2CO3 (pH 8.0)
0.4 mM NADH 
50 u/ml MDH
基質液
50 mM Phosphoenolpyruvate
測定試料
0.1 u/ml Phosphoenolpyruvate carboxylase【００６１】
測定方法
反応試液180μlをマイクロプレートに分注し、次に基質液を20μl,更に試料を20μl加えて、マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−８００）で340 nmのフィルターを使用して37℃での吸光度変化を測定する。
図５に示される反応曲線を得た。酵素サイクリングと組合わせていないので殆ど反応が進行していないことが分かる。【００６２】
実施例3  標識酵素としてのAlkaline phosphataseのサイクリング反応と組み合わせた活性測定
反応試液
100 mM Tris 緩衝液 pH 9.8
1.8 mM チオNAD 
0.9 mM NADH
3.8 mM MgCl2
25 単位/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase【００６３】
基質液
5 mM Androsterone 3-phosphate
測定試料
10、2.5、0.625  単位/ml  Alkaline phosphatase  （ALP）【００６４】
測定方法
反応試液 800μlを石英セル（光路長 1 cm）に入れ、基質液200μlを加えて37℃で5分間インキュベート後、測定試料2μlを添加して400 nmの吸光度変化を測定する。
図６に示される反応曲線を得た。短時間でも0.625 mU/mlが測定できている。【００６５】
比較例3  標識酵素としてのAlkaline phosphataseの活性測定
反応試液
100 mM Tris 緩衝液 pH 9.8
1.8 mM チオNAD 
3.8 mM MgCl2
25 単位/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase【００６６】
基質液
5 mM Androsterone 3-phosphate
測定試料
10、2,5、0.625  単位/ml  Alkaline phosphatase  （ALP）【００６７】
測定方法
反応試液 800μlを石英セル（光路長 1cm）に入れ、基質液200μlを加えて37℃で5分間インキュベート後、測定試料2μlを添加して400 nmの吸光度変化を測定する。
図７に示される反応曲線を得た。酵素サイクリングと組合わせていないので殆ど反応が進行していないことが分かる。【００６８】
参考例１
ALP標識抗体の作製
抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクローナル抗体を100 mM酢酸緩衝液(pH4.2)に酸100 mMリン酸緩衝1.0 mg/mlの濃度で溶解した溶液1 mlに3 %濃度になるようにペプシンを添加し37℃で3時間加温した後４N-NaOHでpH7付近にpHを調整した。この混合反応液をセファデックスG-200を充填したカラムを用いてゲル濾過し、F(ab')2を得た。【００６９】
このF(ab')2フラクションを1 mlに濃縮した後、22 mM 2-メルカプトエタノール0.1 mlを加え37℃で1時間加温する。この混合反応液をセファデックスG-200を充填したカラムを用いてゲル濾過し、F(ab')を得た。アルカリホスファターゼ(ALP)100 mgを10 mM PBS(pH6.0)1 mlに溶解し、N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide (EMCS)の20 mMの濃度のジメチルホルムアミド溶液0.1 mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1 Mリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過を行ない、マレイミド化ALPと未反応EMCSとを分離した。【００７０】
次に、F(ab')化モノクローナル抗体とマレイイミド化ALPとを混合し、4℃で一昼夜放置した後、セファデックスG-200を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ALP標識モノクローナル抗体を得た。【００７１】
参考例２
不溶性担体固定化モノクローナル抗体の調製
抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクローナル抗体を10 mMPBS(pH7.4) に1 mg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（ヌンク社）の各ウェルに0.1 mlずつ加え、室温で１時間放置した後、PBSで洗浄してから、2 ％ウシ血清アルブミン（BSA）水溶液を0.3 mlずつ加えて室温で2時間放置してブロッキング処理を実施してモノクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。【００７２】
実施例4  1ステップ法によるPumilio(プミリオ)の測定
反応試液
200 mM Glycine 緩衝液 pH 8.8
1.5 mM チオNAD 
1.0 mM NADH
0.5 mM Androsterone 3-phosphate
20 単位/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase【００７３】
測定試料
1, 10, 100, 200 ng/ml  Pumilio【００７４】
測定方法
参考例2の方法で調製した抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio(標準物質)を0〜200 ng/mlの範囲で含有する0.1 ％BSA含有TBS溶液(pH7.5) 50 μl加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、参考例1の方法で調製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を約3 μg/mlの濃度で含有する0.1 ％BSA-1 mM MgCl2-0.1 mM ZnCl2含有TBS溶液(pH7.5) 50 μlを加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに反応試液 100μlを加え、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-800AFC）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定し、30分間の吸光度変化を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図８に示される低濃度まで濃度依存性の良い検量線を得た。【００７５】
実施例5  2ステップ法によるPumilio(プミリオ)の測定
反応試液A
100 mM Tris-HCl(pH 8.0)
0.2 mM Androsterone 3-phosphate【００７６】
反応試液B
200 mM Glycine 緩衝液 pH 8.8
3.0 mM チオNAD 
2.0 mM NADH
40 単位/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase【００７７】
測定試料
0.1, 0.5, 1, 2, 5 ng/ml  Pumilio【００７８】
測定方法
参考例2の方法で調製した抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio(標準物質)を0〜10 ng/mlの範囲で含有する0.1 ％BSA含有TBS溶液(pH7.5) 50 μl加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、参考例1の方法で調製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を約3 μg/mlの濃度で含有する0.1 ％BSA-1 mM MgCl2-0.1 mM ZnCl2含有TBS溶液(pH7.5) 50 μlを加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに反応試液A 50μlを加え、１時間インキュベートした。次に、各ウェルに反応試液B 50μlを加え、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-800AFC）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定し、30分間の吸光度変化を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図９に示される低濃度まで濃度依存性の良い検量線を得た。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、高感度かつ簡便な測定が要求される臨床検査分野や食品検査分野において好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】酵素免疫測定法（ELISA法）の測定原理
【図２】実施例1で得られたFumaraseについての活性測定結果。
【図３】比較例１で得られたFumaraseについての活性測定結果。
【図４】実施例２で得られたPhosphoenolpyruvate carboxylaseについての活性測定結果。
【図５】比較例２で得られたPhosphoenolpyruvate carboxylaseについての活性測定結果。
【図６】実施例３で得られたAlkaline phosphataseについての活性測定結果。
【図７】比較例３で得られたAlkaline phosphataseについての活性測定結果。
【図８】実施例４で得られた検量線。
【図９】実施例５で得られた検量線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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