(57)【要約】  ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するモノクローナル抗体、及びこれをキメラ化又はヒト化したモノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、医薬として好適な生物学的活性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２７〜３０のいずれかのＬ鎖と配列番号：３１〜３４のいずれかのＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号：３０のＬ鎖と配列番号：３４のＨ鎖を組み合わせた請求項１記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号：３０のＬ鎖と配列番号：３１のＨ鎖を組み合わせた請求項１記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号：２９のＬ鎖と配列番号：３３のＨ鎖を組み合わせた請求項１記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項５】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０６およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０５を有する細胞からなる群より選択される細胞により産生される、請求項１記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０６およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０５を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することを特徴とする、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を有効成分として含むＢ細胞関連疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２０はヒトＢリンパ細胞表面に発現している糖鎖不含タンパク質で、末梢血、脾臓、扁桃、骨髄中の正常Ｂ細胞に加えて、多くの悪性腫瘍Ｂ細胞に発現している。ＣＤ２０のモノクローナル抗体が結合するエピトープは多様性が非常に高く、多様な生物学的応答が報告され、また、ＣＤ２０を認識するモノクローナル抗体が多数報告されている。とりわけ、リツキシマブ（rituximab）は、ヒトＢ細胞であるＳＢ細胞株を免疫して得られるマウス抗体２Ｂ８から由来するキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体（Ｃ２Ｂ８)であり（特許文献１および２参照）、登録商標リツキサン（Rituxan）の名称で低悪性度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療薬として実用化されている。さらにその後、リツキサンはＢ細胞が関与する多くの免疫疾患に対して有効であること、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの悪性腫瘍、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病（ＩＴＰ）などの病原性自己抗体が関与している自己免疫疾患、慢性関節リウマチ（ＲＡ）や多発性硬化症（ＭＳ）のような炎症性疾患に対して有効であることが報告されている（非特許文献１〜４参照）。
リツキシマブはヒト補体に結合し、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）によりリンパ系Ｂ細胞系を溶解することが報告されており（非特許文献５参照）、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）のアッセイでは活性を示し、トリチウム化チミジン導入アッセイでは抗増殖効果と、アポトーシス誘発が報告されている（非特許文献６参照）。
一方、異種動物とのキメラ分子は抗原性を有するため治療薬として一般には好まれないが、リツキシマブを含め、抗ＣＤ２０抗体は正常細胞を含む全てのＢ細胞を標的し除去する性質を有するため抗原性はないと考えられた。しかし、数パーセントではあるが治療期間中に中和抗体を誘起する事例が報告されていること、投与する量や期間によってはさらにその可能性が高まることや、治療対象疾患がＢ細胞リンパ腫から、ＲＡ、ＩＴ、ＭＳに拡大していくなかで抗原性の問題がクローズアップされ、最近、よりヒトに近い配列を有するヒト化抗体またはヒト抗体が要望されるようになっている。
さらに、キメラ抗体は、血中半減期が比較的短い問題を有し、リツキシマブを含めマウス／ヒトのキメラ抗体のベータ半減期（β１／２）は３〜４日に過ぎず、リツキシマブの低悪性度ＮＨＬに対する臨床試験の奏効率は５０％弱であったことが報告されている（非特許文献７参照）。また、リツキシマブのＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）は５．２ｎＭであり、結合親和性があまり高くなく、ＮＨＬ治療において投与量が多くなる問題もある（非特許文献８参照)。
【特許文献１】国際公開第９４／１１０２６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５７３６１３７号明細書
【非特許文献１】Coiffier B et al., Blood 1998; 92:1297-32
【非特許文献２】Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40:205-11
【非特許文献３】Zaja F et al., Heamatologica 2002; 87:189-95
【非特許文献４】Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116:465-7
【非特許文献５】Reff et al., Blood 1994; 83: 435-445
【非特許文献６】Maloney et al., Blood 1996; 88: 637a
【非特許文献７】IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release, December 8, 1998
【非特許文献８】Mitchell ER et al., Blood 1994; 82:435-445
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記のような事情に鑑み、本発明は、医薬としてさらに適した生物学的活性を示す抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成するため、自然の状態のヒトＣＤ２０分子に対する結合親和性の高いモノクローナル抗体を作製し、優れた機能を有する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を得るべく鋭意研究を重ねた。その結果、免疫原としてＣＤ２０抗原が高密度とされるＢ細胞株であるＳＢ細胞やRaji細胞と、遺伝子組換により細胞膜上にＣＤ２０を多量に発現させた非ヒト動物細胞を組み合わせて用いることにより、高親和性のモノクローナル抗体であって、優れた生物学活性を示すものが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：２７〜３０のいずれかのＬ鎖と配列番号：３１〜３４のいずれかのＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体；
（２）配列番号：３０のＬ鎖と配列番号：３４のＨ鎖を組み合わせた（１）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体；
（３）配列番号：３０のＬ鎖と配列番号：３１のＨ鎖を組み合わせた（１）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体；
（４）配列番号：２９のＬ鎖と配列番号：３３のＨ鎖を組み合わせた（１）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体；
（５）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０６およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０５を有する細胞からなる群より選択される細胞により産生される、（１）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体；
（６）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０６およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０５を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することを特徴とする、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の製造方法；
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を有効成分として含むＢ細胞関連疾患治療剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ＣＤ２０抗原の細胞外エピトープに対して強い結合親和性を示し、かつ細胞増殖阻害活性等の生物学的活性を有し、医薬として好適なモノクローナル抗体、特にヒト化モノクローナル抗体、およびその製造方法が提供される。さらにそれらのモノクローナル抗体を含む、Ｂ細胞が関与する疾患の治療剤も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】組換抗体発現用ベクターpNOW-Abの構造を示す制限地図である。
【図２】タンパク発現用ベクターpNOWの構造を示す制限地図である。
【図３ａ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｂ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｃ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｄ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図４ａ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＲＡＪＩ細胞を使用）。
【図４ｂ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＷＩＬ２細胞を使用）。
【図４ｃ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を使用）。
【図４ｄ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＲＣ−Ｋ８細胞を使用）。
【図５ａ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＲＡＪＩ細胞を使用）。
【図５ｂ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＷＩＬ２細胞を使用）。
【図５ｃ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を使用）。
【図５ｄ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである（ＲＣ−Ｋ８細胞を使用）。
【図６ａ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである（ＲＡＪＩ細胞を使用）。
【図６ｂ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである（ＷＩＬ２細胞を使用）。
【図６ｃ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである（ＳＵ−ＤＨＬ４細胞を使用）。
【図６ｄ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである（ＲＣ−Ｋ８細胞を使用）。
【図７ａ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。図の右側の数字は抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、＋はヤギ抗体とのクロスリンクあり、−はヤギ抗体とのクロスリンクなしを表す（これらの表示は図７ａ〜７ｄで共通）。使用細胞はＲＡＪＩ細胞である。
【図７ｂ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。使用細胞はＷＩＬ２細胞である。
【図７ｃ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図７ｄ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図８ａ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。図の右側の数字は抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、＋はヤギ抗体とのクロスリンクあり、−はヤギ抗体とのクロスリンクなしを表す（これらの表示は図８ａ〜８ｄで共通）。使用細胞はＲＡＪＩ細胞である。
【図８ｂ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。使用細胞はＷＩＬ２細胞である。
【図８ｃ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図８ｄ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図９ａ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。抗体添加無しの値を１とする。図の右側の数字は抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、＋はヤギ抗体とのクロスリンクあり、−はヤギ抗体とのクロスリンクなしを表す。（これらの表示は図９ａ〜９ｄで共通）。使用細胞はＲＡＪＩ細胞である。
【図９ｂ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。使用細胞はＷＩＬ２細胞である。
【図９ｃ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図９ｄ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図１０ａ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図１０ｂ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１０ｃ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１０ｄ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８である。
【図１１ａ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲＡＪＩ細胞である。
【図１１ｂ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１１ｃ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１１ｄ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図１２ａ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図１２ｂ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１２ｃ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＲＡＪＩ細胞である。
【図１２ｄ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞である。
【図１３ａ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。抗体添加無しのアポトーシス誘導活性を１とした。
【図１３ｂ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。抗体添加無しのアポトーシス誘導活性を１とした。
【図１３ｃ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＲＡＪＩ細胞である。抗体添加無しのアポトーシス誘導活性を１とした。
【図１３ｄ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。（ＸＬ）は二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクを伴うことを示す。使用細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞である。抗体添加無しのアポトーシス誘導活性を１とした。
【図１４ａ】ヒト化抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図１４ｂ】ヒト化抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１５ａ】ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図１５ｂ】ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【符号の説明】
【０００８】
Pcmv: サイトメガロウイルスプロモーター
PAbgh: ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル
Psvd: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター
DHFR: マウスジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡ
PAsv: シミアンウイルス４０ポリＡ付加シグナル
PBR322ori: 大腸菌中での複製起点
Ampr:  大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）
Neor:  哺乳動物細胞中での選択マーカー（Ｇ４１８耐性）
INrbg: ウサギβグロビンイントロン
SPl: 抗体軽鎖シグナルペプチド
VL: 抗体軽鎖可変領域ｃＤＮＡ
Cκ: 抗体κ軽鎖定常領域ｃＤＮＡ 
SPh: 抗体軽鎖シグナルペプチド
Vh: 抗体軽鎖可変領域ｃＤＮＡ
Cγ1: 抗体γ1重鎖定常領域ｃＤＮＡ
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において、「抗体」には、抗体全体のみならず、抗体全体と同等の、抗原に対する結合親和性を示すフラグメント、例えば、元の抗体全体の可変領域を含むフラグメント（例、Fab、F(ab')2など）も包含する。
本発明のモノクレーナル抗体は、ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有し、かつ、優れた生物学的活性を示すモノクローナル抗体であり、マウス由来のモノクローナル抗体、そのキメラ化、ヒト化抗体を包含する。
その好ましい第１の態様は、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対して増殖阻害活性を有し、Raji細胞（浮遊細胞）に対する解離定数（Ｋｄ値）が、リツキシマブの由来するマウス抗体である２Ｂ８の１／２以下の、好ましくは１．７０〜３．３９ｎＭの、ヒトＣＤ２０抗原に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体である。
解離定数（Ｋｄ値）の測定方法は、浮遊細胞に対して測定できる方法であれば特に限定するものではないが、本明細書においては、後の実施例に記載する方法による解離定数とする。【００１０】
ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性は２Ｂ８よりも大きいことが好ましい。増殖阻害活性は、好ましくは、末梢血単核細胞非存在下でのヒトＣＤ２０抗原を有する細胞のin vitro培養に対する増殖阻害活性であり、さらに好ましくは、増殖阻害活性はアポトーシス誘導によるものである。
上記の増殖阻害活性の測定は、例えば、Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS.Avian Dis. 2002 Jan-Mar;46(1):10-6に記載の方法により測定できる。【００１１】
本発明の第１の態様のモノクローナル抗体の具体的な例としては、Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列とＨ鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１及び９、配列番号２及び１０、又は、配列番号３及び１１であるマウスを由来とするモノクローナル抗体と、それらの抗体をキメラ化又はヒト化したものが挙げられる。
キメラ化は、例えば、Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-444に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常領域アミノ酸配列を融合させることにより行うことができる。
ヒト化は、例えば、上記Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-444や、Eduardo A.Padlan, Molecular Immunology, Vol. 28-4/5, pp489-498, 1991； Eduardo A.Padlan et.al., The FASEB Journal,vol.9, pp133-139;およびTai te Wu, Elvin A. Kabat, Molecular Immunology, Vol.29-9, pp1141-1146, 1992に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域ＣＤＲアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いて行うことができる。
キメラ化又はヒト化を行う場合には、複数のマウスモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号１〜３のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＬ鎖と配列番号９〜１１のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＨ鎖を組み合わせたキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、配列番号１〜３のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列をヒト化したＬ鎖と配列番号９〜１１のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲ配列をヒト化したＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。【００１２】
本発明の好ましい第２の態様の抗体は、Raji細胞の浮遊細胞に対する解離定数（Ｋｄ値）が２Ｂ８の１／８以下であるマウス由来モノクローナル抗体をキメラ化またはヒト化したモノクローナル抗体である。
ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３、又はそれらを改変したヒトFc配列を有する抗体（マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上のＣＤ２０に結合した場合、ＮＫ細胞上のFcγRIII（ＣＤ１６）を介したエフェクター細胞の活性化を誘発し、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を起こすことがよく知られている。また、ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒトＩｇＧ又はＩｇＭ、又はそれらを改変したヒトFc配列を有する抗体（マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上のＣＤ２０に結合した場合、補体の活性化を誘発し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を起こすこともよく知られている。
かくして、本発明の第２の態様の抗体は、増殖阻害活性が低いか又は認められず、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを示すことが期待できる。
第２の態様の抗体の具体的な例としては、Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列とＨ鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号４及び１２、配列番号５及び１３、配列番号６及び１４、配列番号７及び１５、又は、配列番号８及び１６であるものが挙げられる。
キメラ化又はヒト化は、第１の態様の抗体と同様に行うことができ、その場合、複数のマウスモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号４〜８のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＬ鎖と配列番号１２〜１６のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＨ鎖を組み合わせたキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、配列番号４〜８のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列をヒト化したＬ鎖と配列番号１２〜１６のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲ配列をヒト化したＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。【００１３】
本発明の好ましい第３の態様の抗体は、リツキシマブが効果を示さない細胞に対しても有効なヒト化したモノクローナル抗体を包含する、２Ｂ８に対する特定の解離定数に限定されない一群のヒト化抗体である。
これらの抗体の例としては、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２４のＨ鎖、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖、配列番号１９のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖または配列番号１９のＬ鎖と配列番号２３のＨ鎖を組み合わせたヒト化ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。【００１４】
本発明のマウス由来モノクローナル抗体又は本発明の抗体の作製に使用できるマウス由来モノクローナル抗体は、例えば、つぎのような方法によるスクリーニングで得られたハイブリドーマのクローンから目的の性質を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することにより得ることができる。
感作抗原（免疫原）として、例えば、ＣＤ２０を発現している細胞であるＳＢ細胞又はRaji細胞と、例えば、遺伝子組換えにより商業的に入手可能なＣＤ２０のＤＮＡ（又は、同等の効果を有するそのフラグメント等）で形質転換して細胞表面上にＣＤ２０を発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＤ２０）を用いる。そして、初回免疫、追加免疫、及び、最終免疫を行う際に、初回免疫及び追加免疫が、免疫の少なくとも１回は、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、及び、免疫の少なくとも１回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫のいずれか一方であり、最終免疫が他方であるようにする。
この他の条件は、通常のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製法と同様でよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法に従って、（１）被免疫動物の免疫、（２）免疫された動物からのリンパ球の調製、（３）親細胞の調製、（４）リンパ球と親細胞の細胞融合、（５）スクリーニング及びクローニングによって作製される（例えば、Ailsa M. Campbell (著)、大沢 利昭 (訳)  生化学実験法  モノクローナル抗体、東京化学同人、1989年参照）。
得られたクローンを用いてハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を作製する方法は、本発明のハイブリドーマ作製法で作製されたハイブリドーマを用いることの他は、通常の、モノクローナル抗体の作製の方法と同様でよい。大量作製の場合には、細胞培養による方法、マウスの腹水として作製する方法などが挙げられる。また、キメラ化又はヒト化抗体を作製する場合には、キメラ化又はヒト化抗体をコードする遺伝子を作製し、それを発現ベクターに組み込み、発現ベクターを適当な細胞で発現させることにより作製することができる。【００１５】
例えば、Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域遺伝子を、ヒトイムノグロブリンＬ鎖およびＨ鎖（κ）定常域遺伝子とでキメラ化し、ＣＨＯ細胞用高発現ベクターに組み込む。組換抗体生産用のベクターシステムは市販されているものでよいが、哺乳動物細胞高発現ベクターpNOW（特許第３５８２９６５号公報）を基に、Ｌ鎖、Ｈ鎖両方のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有するダイマー用高発現ベクターpNOW-abに構築したものを使用できる。各ベクターの構成を示す制限地図を図１および図２に示す。キメラ抗体遺伝子が組み込まれた発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、それぞれ生産性の高いクローンを選別する。そのクローンから通常の方法で抗体を作製する。【００１６】
本発明の第１の態様の抗体は、結合親和性がリツキシマブに比べて相対的に高くかつ増殖阻害活性、好ましくはアポトーシス誘導による活性が高いので、キメラ化又はヒト化した抗体はＢ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。また、本発明の第２、第３の態様の抗体は、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対して抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すと考えられるので、Ｂ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。したがって、本発明は、これらキメラ化又はヒト化した抗体を有効成分とするＢ細胞関連疾患に対する治療剤も提供する。
また、本発明の抗体には、アポトーシス誘導に２次抗体によるクロスリンクが必要な抗体と必要としない抗体があり、単体でアポトーシス誘導が可能な抗体は２次抗体を必要としないので、医薬用に好都合である。
さらに、本発明においては、本発明の抗体を２種以上併用してもよい。
Ｂ細胞関連疾患としては、以下に限定するものではないが、例えば、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、関節リウマチ、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、シェーグレン症候群、クローン病、強皮症、多発性硬化症などが挙げられる。
該治療剤は、公知の製剤技術に従って製造でき、他の配合成分は特に限定するものではなく、公知のリツキサンを参考にして、投与量等も決定することができる。【００１７】
さらなる態様において本発明は、配列番号２７〜３０のいずれかのＬ鎖と、配列番号３１〜３４のいずれかのＨ鎖とを組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（本明細書において抗体１７８２、あるいは１７８２シリーズの抗体などと称することがある）を提供する。これらのうち、配列番号３０のＬ鎖と配列番号３４のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（クローンｆｆ）；配列番号３０のＬ鎖と配列番号３１のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（クローンｆｖ）；ならびに配列番号２９のＬ鎖と配列番号３３のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（クローンｓｓ）が好ましいものとして例示される。これらのヒト化抗体もマウス由来のものであり上記のごとくヒト化することができる。【００１８】
ヒト化抗体１７８２シリーズは単独ではアポトーシス誘導活性が弱いが、クロスリンク有りの条件下でリツキサン（ｃ２Ｂ８）のアポトーシス誘導活性と同等あるいはそれを上回る活性を示す。ヒト化抗体１７８２は、ＲＡＪＩ細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞のみならず、リツキサン耐性株であるＲＣ−Ｋ８細胞においてもＣＤＣ活性を示す。なかでも、実施例にて詳述するように、１７８２シリーズのクローンｆｆおよびｆｖのＣＤＣ活性が高く、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞においてリツキサンを大幅に上回るＣＤＣ活性を示す。そして、Ｋｄ値およびＣＤＣ活性の結果を総合すると、１７８２シリーズのクローンｆｆは親和性が最も高く、ＣＤＣ活性も比較的高く、リツキサン耐性株であるＲＣ−Ｋ８株に対してもＣＤＣ活性を有する点において好ましいものである。また１７８２シリーズのクローンｆｖはＣＤＣ活性が最も高く、しかもリツキサン耐性株であるＲＣ−Ｋ８株に対しても有効である点において好ましいものである。特に、１７８２シリーズのクローンｆｆは親和性が非常に高いことから、例えば、ＲＩ標識してＢ細胞関連疾患のミサイル療法に利用可能である。さらに、１７８２シリーズのクローンｆｖはＳＵ−ＤＨＬ４細胞におけるＡＤＣＣ活性が高いという点において好ましいものであり、クローンｓｓはＲＣ−Ｋ８細胞におけるＡＤＣＣ活性が高いという点において好ましいものである。【００１９】
本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１７８２シリーズもまた、Ｂ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。したがって、本発明は、さらなる態様において、１７８２シリーズを有効成分として含有する、Ｂ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤を提供する。その投与方法、投与量は当業者が容易に決定できるものである。Ｂ細胞関連疾患としては上記のものが例示される。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
（１）マウス感作用免疫原の準備
ＣＤ２０を発現しているＢ細胞株であるＳＢ細胞とRaji細胞をin vitroで培養した。
また、別途、Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850から入手したＣＤ２０の全分子をコードするＤＮＡを、特異的なプライマーhCD20-S-GK-Not  aatgcggccgccaccatgacaacacccagaaattc（配列番号２５）、及びhCD20-E-Xba  gctctagattaaggagagctgtcattttc（配列番号２６）を用いてクローニングし、それを哺乳動物細胞用高発現ベクターであるpNOW（図１)に組み込み、構築されたベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析により、細胞表面にＣＤ２０分子を高発現している組換ＣＨＯ細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞）を樹立した。ここにおいて、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体で染色した際に、ＳＢ細胞に比べて蛍光強度が５倍以上のものを高発現しているものとした。【００２１】
（２）免疫原の調製
ＳＢ細胞またはRaji細胞は１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養を行った。ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞は、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌ添加したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（GIBCO、Cat. No. 12052-098）を用いて培養を行った。これらの培養液を１１００ｒｐｍで、５分遠心分離した後、細胞にDulbecco's PBS(-)を加えて懸濁させ再度遠心分離した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（細胞数：１〜３×１０７／ｍｌ）を免疫に用いた。【００２２】
（３）免疫
７〜１１週令のBalb/c系雌性マウスへ、免疫原の調製液をいずれも腹腔内投与した。ＳＢ細胞又はＣＤ２０／ＣＨＯ細胞のうち、いずれか同じ細胞をさまざまな日数間隔で２〜３回繰り返して投与した後、最終免疫には異なった細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞又はRaji細胞）を投与した。投与した細胞数はいずれもマウス１匹当たり１〜３×１０７個であった。
使用した免疫原の組み合わせを表１に示す。【００２３】
（４）細胞融合
最終免疫の３日後、２匹のマウスから脾臓細胞を調製し、Oi,V.T. and L.A. Herzenberg, 1980, in:Selected Methods in Cellular Immunology, eds. B. Mishell and S.M. Shiigi(Freeman and Co.San Francisco, CA) p.351に従って、マウスミエロ−マ（ＮＳ−１）との融合反応をＰＥＧ−１５００の存在下で行なった。【００２４】
（５）１次、２次スクリーニング
ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞（親株）を付着させた９６ウエルプレートを用いてCell ELISAを行い、ＣＤ２０に特異的に反応する抗体を産生しているウエルを選択した。さらに、同じＣＤ２０／ＣＨＯ細胞を付着させた９６ウエルプレートを用い、リツキシマブ（Ｃ２Ｂ８）との競合反応を行って、Ｃ２Ｂ８のエピトープと類似したところに反応する抗体（ウエル）を選択した。
表１にスクリーニング結果を示す。【００２５】
（６）Cell ELISA
Poly-L-Lysineコート９６ウエルプレート（旭テクノグラス、Cat.No.11-023-018）に付着させたＣＤ２０／ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞（親株）をCell ELISAに用いた。その各ウエルにブロッキング液（０．２％−ゼラチン、０．５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）を１５０μｌ入れて３７℃で１時間静置した。１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．０５％−Tween２０水溶液を用いてプレートを５回洗浄した後、サンプル（培養上清の希釈液）を各ウエルに１００μｌ入れて１次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-003）、またはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Fcγ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-008）〕を各ウエルに１００μｌ入れて２次反応を３７℃で１時間行なった。１次、２次の反応液の調製には、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色液（ＯＰＤ）を各ウエルに１００μｌ入れ３０分後に４Ｎ−Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。【００２６】
（７）Cell ELISAでの競合反応
サンプル（培養上清の希釈液）とキメラ抗体（１０〜４０ｎｇ／ｍｌ）の混合溶液を調製した。
上記のCell ELISAと同様にブロッキング反応をしたあと、この混合溶液を各ウエルに１００μｌ入れて１次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 309-035-082）〕を各ウエルに１００ｕｌ入れて２次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、発色液（ＯＰＤ）を各ウエルに１００μｌ入れ３０分後に４Ｎ−Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
標識抗体はキメラ抗体のみに反応するので、１次反応で添加したサンプル中の抗体がキメラ抗体と競合すれば、測定値の低下が認められた。【００２７】
（８）クローニング
限界希釈法で行った。細胞を９６ウエルプレートに撒いて培養後、１コロニーのウエルの培養上清についてCell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。【００２８】
（９）精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞密度が５×１０５／ｍｌ前後になった時点で無血清培地ＡＳＦ−１０４Ｎ（味の素）に培地を交換して培養を行った。その２〜４日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと、プロテインＧカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を１５０ｍＭ−ＮａＣｌに対して透析した。０．２μｍのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗体（抗ヒトＣＤ２０マウスモノクローナル抗体）とした。【００２９】
【表１】
2009031230.tif 000002
代表的な８クローンの産生するモノクローナル抗体について、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（配列番号１〜８）及びＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列(配列番号９〜１６)は以下のとおりである。【００３０】
1K0924のH鎖V領域配列（配列番号１１）
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTSDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARMSTMITGFDYWGQGTTLTVSS
1K1228のH鎖V領域配列（配列番号１６）
QVQLQQPGAELVKPGASVKVSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLVWIGAIYPGNGDTSYNQKFRGKATLTADISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGYDAMDYWGQGTSVTVSS
1k1422のH鎖V領域配列 (配列番号９)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCRASGYTFTNYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNRKFKGKATLTADTSSSTAYMQFSSLTSADSAVYYCARFTYYYGGTYGAMDYWGQGTSVTVSL
1k1791のH鎖V領域配列 (配列番号１０)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGVNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLEASANTAYLQINNLKNDDMSTYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGTSVTVSS
1k1712のH鎖V領域配列 (配列番号１２)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNQQFKGKATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYCCARSAMISTGNWYFDYWGQGTTLTVSS
1k1402のH鎖V領域配列 (配列番号１３)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARFYYYGSMGAMDYWGQGTSVTVSS
1k1736のH鎖V領域配列 (配列番号１４)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNLHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKVKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWIYYGNYEGTLDYWGQGTSVTVSS
1k1782のH鎖V領域配列 (配列番号１５)
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARSGPYFDVWGAGTTVTVSS
1K0924の Ｌ鎖V領域配列（配列番号３）
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQRPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYYFTISRVEAEDAATYYCQQWNSNPPTHGGGTKLEIK
1K1228の Ｌ鎖V領域配列（配列番号８）
EIILTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSYYLRWYQQKPGFSPKVLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGNTVPLTFGSGTKLEIK
1k1422の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号１)
QIVLTQSPPIMSASLGEEITLTCSASSRVSYMLWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWTSNPCTFGGGTKLEIK
1k1791の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号２)
STVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIYFASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTINTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELK
1k1712の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号４)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMDWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDTATYYCQQWTFNPPTFGSGTKLEIK
1k1402の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号５)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGAGTKLELK
1k1736の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号６)
QIVLSQSPAILSSSPGEKVTMTCRASSSVSYMLWYQQKPGSSPEPWIYATSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGGGTKLEIK
1k1782の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号７)
DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQNIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK
【実施例２】
【００３１】
得られたクローンの一部に関し、モノクローナル抗体遺伝子の可変領域について塩基配列の決定を行うとともに、それらが産生するモノクローナルについて抗体結合親和性の測定及び生物学的特性試験を以下のとおり行った。
（１）結合親和性測定
目的とする抗原を細胞表面で発現しているヒトＢ細胞株由来の浮遊細胞Raji及び、ＣＤ２０抗原を発現していない細胞としてヒトT細胞株由来の浮遊細胞Jurkatを用いた。共にＲＰＭＩ１６４０（ナカライ、Cat.No.30264-85、Lot L4K2844）に１０％ウシ胎仔血清ＦＣＳ(BIOLOGICAL IND. Cat.No.04-001-1A、Lot 815242、補体成分を非働化するためあらかじめ５６℃３０分加温したもの）を添加した培地で３７℃ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター (SANYO MCO-175M)で培養、週２回の継代により維持した。
細胞数の測定は、Burker-Turk血球計算盤(ヱルマ販売(株)Cat.No.03-303-1)を用いて行った。
継代後３〜４日目のコンフルエントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機ＬＸ−１２０ (TOMY)で室温、３０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用いた回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条件である。細胞の表面に残った培地及びFCSを除くため（洗浄）、回収した細胞をDulbecco's Phosphate Buffered Saline(-) 〔Ca、Mgフリー、PBS(-) 、（NaCl：Wako、Cat.No.191-01665、Na2HPO4：Wako、Cat.No.197-02865、Lot ASF2635、KCl：Wako、Cat.No.163-0334T、Lot CEQ7122 、KH2PO4：Wako、Cat.No.169-0425、Lot ELG7616）〕で懸濁後、３０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を除く操作を２回行った。洗浄を終えた細胞を１％ＢＳＡ (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)−ＰＢＳ溶液で懸濁し、細胞密度を５ｘ１０６個／ｍｌに調整した。
１次抗体として、試験抗体又は陽性コントロール抗体（２Ｂ８）１５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００ｎｇ（１．５〜５μｌ）を各々、１．５ｍｌチューブ（ビーエム機器、BMリングロックチューブ Cat.No.BM-15）に分注し、同時に抗体を入れないチューブも４本用意した。また、各々の試験抗体あたり３点のサンプルを準備した。そこに、１％ＢＳＡ（Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)−ＰＢＳ溶液で懸濁液を１００μｌ（細胞数５ｘ１０５個）ずつ加えて混和し、室温で１時間振とう反応させた。
反応後、微量高速冷却遠心機ＭＸ−１００（TOMY）で室温、３０００ｒｐｍ３分間遠心分離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため２００μｌのＰＢＳで懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を除く操作を２回行った。【００３２】
次に、細胞と結合した１次抗体に対して過剰量（５００ｎｇ）のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）２次抗体〔GOAT Anti-mouse IgG(H&L) Fluorescein conjugated,  affinity purified Secondary antibody、Chemicon、Cat.No.AP124F、 Lot 24021014〕および１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液１００μｌ（５００ｎｇ／１００μｌ）を添加・懸濁し、遮光、室温のもと１時間振とう反応させて細胞に結合した１次抗体を検出した。反応後、３０００ｒｐｍで３分間遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体を除くため、２００μｌのＰＢＳで懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を除く操作を２回行った。
こうして得た細胞を１００μｌＰＢＳで懸濁し、９６ウエル平底プレート（住友ベークライトELISA PLATE Cat.No.8496F）へ移した。２次抗体の蛍光量をTyphoon9210イメージアナライザー(Amersham Bioscience)を用いて、Fluorescense mode, ６００Ｖ、526SP/green(532nm)、Focus：底面＋３ｍｍの検出条件で測定した。この際、ＦＩＴＣ標識２次抗体を０、１２．５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０ｎｇ添加したＰＢＳ溶液１００μｌを検量線作成用のコントロールとして用いた。【００３３】
検出後、画像を画像解析ソフトImage Quant （Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、ＰＢＳ溶液、および細胞に非特異的に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体に由来するバックグラウンド値として、細胞とＦＩＴＣ標識２次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その４点の平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度のＦＩＴＣ標識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合している２次抗体の量（モル数または重量）を求めた。各１次抗体とＦＩＴＣ標識２次抗体が１：２の割合で反応していると仮定し、結合している１次抗体量を算出した。また遊離の１次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する際、モノクローナル抗体の分子量を１５００００とした。【００３４】
添加する１次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達することを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数（Ｋｄ値）を算出するため、スキャッチャード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生物学研究のための新培養細胞実験法；羊土社、実験医学別冊バイオマニュアルUPシリーズ改訂第２版、212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて３点の値の平均値を用いた。
代表的な８クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール抗体（２Ｂ８）の測定結果を後の表３に示す。【００３５】
（２）生物学的特性試験
（ａ）アポトーシス誘導試験
フローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining）を用いて試験抗体のアポトーシス誘導能を測定した。陽性コントロール（２Ｂ８）、陰性コントロール[Anti-CD3モノクローナル抗体(BD PharMingen社)]を用いた。試験はMEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat.No.4700, Lot.20)を用いて行った。
Raji細胞を遠心後、１０％ＦＢＳ（非動化済）(ICN, Cat.No.2916754, Lot.8005C)を含む新鮮な培地ＲＰＭＩ１６４０(Sigma, Cat.No.R8758, Lot.44K2416)で懸濁し、１２ウエルプレートの各ウエルに５ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で１ｍｌを入れた。各抗体あたり１２ウエルを用い、各抗体を終濃度２μｇ／ｍｌ又は４μｇ／ｍｌになるよう添加した（３ウエル×２種濃度×２時点、計１２ウエル）。培養開始１日後及び２日後に、２ｘ１０５個程度分の細胞を含む培養液を回収し、遠心後ＰＢＳで１回洗浄した。次に８５μｌ  Binding bufferを加え懸濁した。さらに、Annexin V-FITC１０μｌとＰＩ５μｌを加えてよく混和した後、遮光、室温で１５分間反応させた。フローサイトメトリー(FACS Calibur、Becton Dickinson)を用いて測定し、CellQuest（Becton Dickinson）で解析を行った。
代表的な６クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール（２Ｂ８）、陰性コントロール(Anti-CD3)の測定結果を図３ａ〜図３ｄに示した。一般に２Ｂ８のアポトーシスの誘導能は高いとされるが、１Ｋ１７シリーズ（ＣＤ２０／ＣＨＯとRaji細胞で免疫）の細胞融合から得られたクローン１ｋ１７９１、および１Ｋ１４シリーズ（ＳＢ細胞とＣＤ２０／ＣＨＯで免疫）の細胞融合から得られたクローン１ｋ１４２２の産生するモノクローナル抗体は２Ｂ８との比較において高いアポトーシス誘導がみられた。【００３６】
（ｂ）細胞増殖阻害試験
５×１０４個／ｍｌのRaji細胞懸濁液を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で調製して９６ウエルプレートに１００μｌ／ウエルずつ入れて培養した。２４時間後、抗体濃度が１μｇ／ｍｌになるように各抗体溶液を５０μｌ／ウエル添加して培養を継続した。抗体添加７２時間後に発色色素Cell Counting Kit-8(同仁化学  Cat.No.343-07623，Lot. SG076)を１０μｌ／ウエル加え、さらに４時間培養した後で波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記６クローンのモノクローナル抗体と陽性コントロール（２Ｂ８）、および陰性コントロールの吸光度の測定結果を表２に、また、それらの特性を表３に示す。【００３７】
細胞増殖阻害試験
【表２】
2009031230.tif 000003
【００３８】
モノクローナル抗体の特性
【表３】
2009031230.tif 000004
【００３９】
（ｃ）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
この実験では抗ＣＤ２０キメラ抗体のＦｃ部位を介してエフェクター細胞が活性化し、それに伴ってリンパ腫細胞系を溶解する能力について測定を行った。
ヒトＢ細胞由来のRaji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣ−Ｋ８の４種類の細胞を非働化処理した１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては、各々の細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、３７℃中で１５分間の反応によりカルセインを生細胞に取り込ませた後、細胞数を４×１０５個／ｍｌに調整した。カルセインは細胞膜が正常に保たれている細胞にのみ維持されるので生細胞のみを染色することができる。また抗ＣＤ２０キメラ抗体であるリツキシマブ（Ｃ２Ｂ８）と６種類のキメラ抗体（１ｋ０９２４、１ｋ１４０２、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２、１ｋ１７３６、１ｋ１７９１）を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌに調整した。エフェクター細胞は健常者より採血し、直ちにFicollに重層して遠心しリンパ球画分を採取した後、５×１０６個／ｍｌ、１×１０６個／ｍｌ、０．２×１０６個／ｍｌに調整した。
濃度調整をした細胞２５μｌ、各抗ＣＤ２０キメラ抗体溶液２５μｌ（それぞれ終濃度が５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ）、各抗体濃度においてエフェクター細胞５０μｌ（それぞれＥ：Ｔ比が２５：１、５：１、１：１）、計１００μｌを９６穴プレート内で混合し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で４時間反応させた。また、自然な細胞の溶解を算出するために抗体溶液およびエフェクター細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で置き換えたサンプル、抗体に依存しないエフェクター細胞のみの活性を算出するサンプルとして抗体溶液を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で置き換えたサンプル、最大溶解を算出するサンプルとして抗体溶液を２０％TritonＸ−１００で置き換えたサンプルを用意した。
反応後、溶解した細胞は細胞膜が壊れてカルセインが細胞外に出るため、Quencherを用いて反応溶液中に遊離したカルセインの蛍光を消失させた後、蛍光アナライザーにより蛍光量を測定した。
検出後、画像解析ソフト（Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、以下の式を用いて各サンプルの溶解率を算出した。
【数１】
2009031230.tif 000005
【００４０】
ＮＫ細胞などのエフェクター細胞数とターゲットとなる細胞数の割合（Ｅ：Ｔ比）が２５：１のときの各細胞における抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図４ａ〜図４ｄに示す。また、抗体濃度が５μｇ／ｍｌのときの各細胞におけるＥ：Ｔ比と細胞傷害活性の関係図５ａ〜図５ｄに示す。
図４ａ〜図４ｄに示すごとく、Ｅ：Ｔ比が２５：１の条件ではどの細胞でも抗体を加えることにより細胞傷害活性を示している。つまり抗体が細胞傷害に関与している。また、ＷｉＬ２−ＮＳ以外の細胞株では０．２μｇ／ｍｌの抗体濃度で既に１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌと同程度の活性を示し（０．２μｇ／ｍｌで飽和している）、活性は最大値まで達してフラットとなっており、補体依存性細胞傷害活性に必要とされる抗体量よりも少ない抗体量で作用することを示唆している。
図５ａ〜図５ｄに示すごとく、抗体濃度が５μｇ／ｍｌのときの細胞傷害活性のＥ：Ｔ比による影響を見ると、細胞傷害活性がＥ：Ｔ比濃度に依存して上昇しているのがわかる。このことからエフェクター細胞が作用して細胞傷害が起こっていると判断される。【００４１】
（ｄ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
この実験では抗ＣＤ２０キメラ抗体が補体を含む血清の存在下でリンパ腫細胞系を溶解する能力について測定を行った。
ヒトＢ細胞由来のRaji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣ−Ｋ８の４種類の細胞を非働化処理した１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては各々の細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し細胞数を２〜３×１０６個／ｍｌに調整した。また、抗ＣＤ２０キメラ抗体であるＣ２Ｂ８（リツキシマブ）と６種類のキメラ抗体（１ｋ０９２４、１ｋ１４０２、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２、１ｋ１７３６、１ｋ１７９１）を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌに調整した。
濃度調整をした細胞５５μｌ、各抗ＣＤ２０キメラ抗体溶液２５μｌ（それぞれ終濃度が５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ）、５人の健常者より採取したプール血清又はそれを非働化したもの２０μｌ、計１００μｌをボルテックスミキサーにより混合し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２時間反応させた。バックグラウンドの算出サンプルとしては抗体溶液２５μｌを１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０培地２５μｌに置き換えたものを用意した。
反応後、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）溶液で死細胞を染色し、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson）により解析を行った。数値は死細胞のポピュレーションをそのまま採用し、バックグラウンド及び非働化血清を加えたサンプルの値を差し引いてある。
各細胞においての抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図６ａ〜図６ｄに示す。
図６ａ〜図６ｄに示すごとく、Raji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４では６種類全ての抗体が活性を示している。また、濃度依存性も確認できるが、５μｇ／ｍｌの濃度で比較すると１ｋ１７９１は他の抗体に比べて特に高い活性を示し、ついで、１ｋ１７３６、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２が高い活性を示している。この濃度ではRaji、ＷｉＬ２−ＮＳにおいて１ｋ１７９１は他の抗体のおよそ２倍近い細胞傷害を誘導していることが確認できる。しかしながら、他の抗体もリツキシマブと同程度、もしくはそれ以上の活性を示している。
一方、リツキシマブが効かないとされるＲＣ−Ｋ８では、抗体ごとの差異が顕著に現れた。リツキシマブ、１ｋ１４０２および１ｋ１７１２ではほとんどもしくは全く活性がない。それに対し、１ｋ１７９１は非常に高い活性を示し、５μｇ／ｍｌの濃度では約５０％の傷害活性を示している。これに続き、１ｋ０９２４が２５％程度、１ｋ１４２２、１ｋ１７３６が１０％程度の傷害活性を示している。
以上から、今回試験対象とした６種類のキメラ抗体はリツキシマブと同程度あるいはより強いＣＤＣ活性を有していることが確認された。
【実施例３】
【００４２】
（１）結合親和性測定
ヒトＢ細胞株由来のRaji細胞を、ＲＰＭＩ１６４０に非働化処理した１０％ＦＣＳ添加培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後３〜４日目（約１ｘ１０６個／ｍｌ）の細胞培養液を室温、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収後、ＰＢＳ（−）で懸濁、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除く操作を２回行うことで洗浄した。
抗ＣＤ２０抗体（陽性コントロール抗体：マウス抗体２Ｂ８、キメラ抗体及びヒト化抗体Ｃ２Ｂ８）とRaji細胞を混和し、室温で１時間反応することで１次抗体反応を行った。ここで、抗ＣＤ２０抗体の各々の終濃度は１．３３、２．６７、４．００、５．３３、６．６７、８．００、９．３３、１０．６７、１２．００、１３．３３、１４．６７、１６．００ｎＭの１２点とし、細胞数５ｘ１０６個、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を反応溶液とし液量１００μｌになるよう１．５ｍｌチューブに分注した。同一試験抗体あたり３点のサンプルを準備し、バックグラウンド算出サンプルとして抗体を加えないチューブも４本用意した。
反応後、室温、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の１次抗体を除き、細胞を回収した。【００４３】
細胞と結合した１次抗体に対して過剰量となるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で５ｕｇ／ｍｌに調製したＦＩＴＣ標識二次抗体を１００μｌづつ添加し、懸濁後、遮光、室温のもと１時間反応させた。
ここでＦＩＴＣ標識２次抗体はマウス抗体ではGOAT Anti Mouse IgG (H&L)-FITCをキメラ抗体及びヒト化抗体ではGOAT F(ab') 2F ragment Anti Human IgG (Fcγ)-FITCを用いた。
反応後、室温、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応のＦＩＴＣ標識２次抗体を除き、細胞を回収し、２００μｌのＰＢＳで懸濁し再度遠心し洗浄を行った。
この細胞を１００μｌＰＢＳで懸濁し、９６ウエル平底プレートへ移した。２次抗体の蛍光量をTyphoon９２１０イメージアナライザー（Amersham Bioscience）を用いて測定した。
検出後、画像解析ソフトImage Quant (Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、Excel (Microsoft）で解析を行った。同一試験抗体の平均値を求め、バックグラウンド算出サンプル（細胞とＦＩＴＣ標識２次抗体のみを反応させたもの）の値を各試験抗体の値から差し引くことで、プレート、ＰＢＳ溶液および細胞に非特異的に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体に由来するバックグラウンド値を除いた。同時に１００μｌ当り、０、１２．５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０ｎｇのＦＩＴＣ標識２次抗体単独の蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合している２次抗体のモル数を求めた。各１次抗体とＦＩＴＣ標識２次抗体が１：５の割合で反応していると仮定し、結合している１次抗体量を算出した。遊離の１次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。これらの値を用いて、スキャッチャード解析を行い、解離定数Ｋｄ値を得た。
結果を以下の表４に示す。【００４４】
（２）アポトーシス誘導試験
ヒトＢ細胞株由来細胞に対する抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシス誘導を単独で見る条件（クロスリンク無）及びさらに抗ＣＤ２０抗体のＦｃ領域を認識する２次抗体を添加することによるアポトーシス誘導を見る条件（クロスリンク有）の２条件で反応し、Annexin V-FITC apoptosis kitを用いて初期アポトーシスの検出を行った。
ヒトＢ細胞株由来のRaji、ＷＩＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣＫ８の４種類の細胞を、ＲＰＭＩ１６４０に非働化処理した１０％ＦＣＳ添加培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後３〜４日目（約１ｘ１０６個／ｍｌ）の細胞培養液を室温、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。
抗ＣＤ２０抗体（陽性コントロール抗体：マウス抗体２Ｂ８、キメラ抗体及びヒト化抗体Ｃ２Ｂ８；陰性コントロール：Ａｎｔｉ−ＣＤ３モノクローナル抗体）と新鮮な培養培地で懸濁した細胞を混和し、１．５時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で反応した。ここで、抗ＣＤ２０抗体各々の終濃度は０．２、１、５μｇ／ｍｌの３点、細胞密度１ｘ１０６細胞／ｍｌ、培養培地を反応溶液として液量２５０μｌになるよう１．５ｍｌチューブ内で反応を行った。同一試験抗体あたり３点のサンプルを準備した。
反応後、室温、１２００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の抗体を除き、細胞を回収した。
クロスリンク無の条件では新鮮な培養培地、クロスリンク有条件では抗ＣＤ２０抗体の５倍量のＦｃ領域を認識する２次抗体を２５０μｌづつ添加し、混和後、さらに３時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で反応した。ここで２次抗体はマウス抗体ではGoat Anti mouse IgG, FcγFragmentを、キメラ抗体及びヒト化抗体ではGoat Anti human IgG, FcγFragment specificを用いた。
反応後、室温、１２００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の２次抗体を除き、細胞を回収した。２５０μｌのＰＢＳで懸濁し再度遠心し洗浄を行った
検出試薬としてMEBCYTO apoptosis kit-AnnexinV-FITC ,PI- (MBL, Cat.No.4700, Lot. 21)を使用した。８５μｌのBinding bufferを加え懸濁した後、Annexin V-FITC 5μlとpropidium iodide (PI)５μｌ（終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えてよく混和し、遮光、室温で１５分間反応させた。
フローサイトメトリー（EPICS ALTRA :BECKMAN COULTER）を用いてtotal count２０，０００の細胞を測定し、解析（Expo32: BECKMAN COULTER）を行った。
結果を図７ａ〜図９ｄに示す。【００４５】
（３）ヒト化抗体産生株の調製
（ａ）ＤＮＡ合成
配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を元にしてコドンをＣＨＯ細胞に最適化したＤＮＡを、定法によりデザインし、合成した。
（ｂ）コンストラクトの作成
pNOWを発現ベクターとして１６種類のヒト化1K1791発現コンストラクトを構築した。
ヒト化1K1791発現コンストラクトを作製した。
pNOW-aa1791kg1、pNOW-af1791kg1、pNOW-as1791kg1、pNOW-av1791kg1、pNOW-fa1791kg1、pNOW-ff1791kg1、pNOW-fs1791kg1、pNOW-fv1791kg1、pNOW-sa1791kg1、pNOW-sf1791kg1、pNOW-ss1791kg1、pNOW-sv1791kg1、pNOW-va1791kg1、pNOW-vf1791kg1、pNOW-vs1791kg1、pNOW-vv1791kg1
（ｃ）トランスフェクションと薬剤による選択
トランスフェクション試薬を用いてヒト化1K1791発現コンストラクトをＣＨＯ ＤＧ４４ｃｄＢ細胞に導入した。それぞれの遺伝子を導入したＣＨＯ ＤＧ４４ｃｄＢ細胞１×１０６個を１００ｍｌの選択培地に懸濁し、９６ウエルプレート５枚に撒いた（２００μｌ／ウエル）。５％炭酸ガス存在下に３７℃、３〜４週間培養した。
トランスフェクション試薬：Qiagen, Effectene Transfection Reagent, Cat. No 301427
選択培地：IS CHO-CD w/Hydrolysate/4mM GlutaMAX/0.8 mg/ml G418 
（ｄ）高発現細胞株の選択
１）コロニーが出現しているウエルの上清をとり、ドット・プロット・アッセイ（Dot Blot assay）で抗体産生量を測定した。
２）抗体産生量の多いクローンを２４ウエルプレートに移し、約5日間培養後、上清をとり、サンドイッチELISAで抗体産生量を測定した。
３）発現量が多いクローンを２つ選択し、Ｔ７５フラスコに移した。
（ｅ）小規模培養
１６種類のコンストラクトそれぞれに対して選択した２種のクローンを３０ｍｌの選択培地を含むＴ７５フラスコ中で培養を行った。【００４６】
（４）ヒト化抗体産生株の培養及び精製
抗体産生細胞株（遺伝子組み換えＣＨＯ−ＤＧ４４細胞）を、Hydrolysateを含むIS CHO-CD/with Hydrolysate (Irvine Scientific, Cat. No.91119）に、４ｍＭ  GlutaMax(Invitrogen, Cat 35050-061）、２００μｇ／ｍｌG418 (Sigma,Cat.No.A1720-5G)を添加した培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後約２週間経過した細胞培養液を室温、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養上清を回収し、０．４５μｍ syringe filterで濾過した。５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した
Hi Trap Protein A HP(GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01）カラムに、培養上清を添加後、５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。０．１Ｍクエン酸、ｐＨ４．０で溶出し、４００μｌづつ採取し、その１０／１量にあたる４０μｌの１Ｍ  Tris−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和した。１００倍量のＰＢＳに対して、Slyde-A-Lyzer 10K Dialysis Cassetes（PIERCE CatNo.66453）を用いて２．５時間の透析を２回行った後、１５〜１８時間の透析を１回行った。精製サンプルを０．２２μｍのシリンジフィルターで濾過した後、VIVA SPIN 50,000MWCO PES (VIVASCIENCE Cat No. VS0231)を用いて濃縮を行った。抗体濃度はBECKMAN COULTER DU530を用いてＡ２８０の値より算出した。【００４７】
使用した抗体生産株は、ＣＨＯ細胞hz1791-fv10、hz1791-ff34、hz1791-sf43およびhz1791-ss32であり、これらは、ブタペスト条約の下、平成１８年（２００６年）３月１日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、各々、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４６の受託番号で寄託してある。
これらの細胞株から得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列(配列番号１７〜２４)は以下のとおりである（アンダーライン部分が対応するマウス抗体と異なる）。
ヒト化1k1791の配列
Ｌ鎖V領域配列（配列番号２０）
Ven 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERVTINC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLELK
H鎖V領域配列（配列番号２４）
Ven 1791：QIQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFT NFGVN WVKQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTSTYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１７）
abb 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２１）
abb 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVRQAPGKGLEWMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFVFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１９）
sdr 1791 : STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２３）
sdr 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVRQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１８）
fra 1791 : STVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK 
H鎖V領域配列（配列番号２２）
fra 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVKQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASASTAY LQISSLKAEDMATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS【００４８】
この実験では、AbbL、FraL、SdrL、VenLの４種類 × AbbH、FraH、SdrH、VenHの４種類を組み合わせた合計１６種類の配列組合わせから各２クローンづつについて実験を行った。以上の結果より、Ｋｄ値を基に表５に示すように４グループに分類できる。それぞれのグループより１種類を選抜し以降の実験で使用した。
なお、本明細書において、例えば、ヒト化１７９１抗体のクローンｆｖという場合、ｆｒａ１７９１のＬ鎖（配列番号：１８のＬ鎖）およびＶｅｎ１７９１のＨ鎖（配列番号：２４のＨ鎖）を組み合わせた抗体クローンをいう（下線は説明のために付加）。他のクローンについても同様とする。
コントロール：c2B8
グループＩ：        Kd = ２０ nM＜ 
グループＩＩ：        Kd = １０−２０ nM 
グループＩＩＩ：      Kd = ８-１０ nM 
グループＩＶ：        Kd = ＜８ nM 【００４９】
表４  ヒト化抗体結合解離定数
【表４】
2009031230.tif 000006
【００５０】
表５  ヒト化抗体結合解離定数
【表５】
2009031230.tif 000007
【００５１】
さらに、マウス抗体８種類でのアポトーシス実験結果を図７ａ〜図７ｄに示す。４種類全ての細胞においてマウス抗体８種類および既知のＣＤ２０抗体２Ｂ８、２Ｈ７について２つのタイプに分けることができた（但し一部例外を除く）。
グループＡ：m0924 , m1422 , m1791 , m2B8
グループＢ：m1228 , m1402 , m1712 , m1736 , m1782 , m2H7
(但し、ｍ０９２４はＳＵ−ＤＨＬ４細胞ではグループＢに含まれる)
すなわち、抗ＣＤ２０抗体単独で十分なアポトーシス誘導能が示され、２次抗体によるクロスリンク条件下でもほぼ同程度であるグループＡと抗ＣＤ２０抗体単独でのアポトーシス誘導能は十分に示されないがクロスリンク条件下で大きく増加するグループＢである。またグループＡに含まれる抗体は親和性が２Ｂ８と同程度であり、グループＢに含まれる抗体は２Ｂ８より高い親和性であるものが含まれる。アポトーシス誘導に２次抗体の存在を必要とせず、単体でアポトーシス誘導が可能なグループＡの方が医薬としては都合よいといえる。
細胞別にみるとアポトーシスの割合がＲＡＪＩ、ＷＩＬ２−ＮＳ、ＲＣＫ８では高いものでも３０〜４０％であるのに対し、ＳＵ−ＤＨＬ４では高いもので８０％以上を示す結果となった。【００５２】
ヒト化抗体４種類での結果を図８ａ〜図９ｄに示す。
マウス抗体同様、４種類全ての細胞においてヒト化１７９１抗体４種類について２つのタイプに分けることができた。
グループＡ：fv10 , ff34
グループＢ：sf43 , ss32 , c2B8
Ｃ２Ｂ８と同等の親和性を示すグループＡのfv10、ff34抗体はクロスリンク無しでＣ２Ｂ８と同程度のアポトーシス活性をもち、クロスリンク条件下で明らかに活性が増加する。グループＢのsf、ss抗体はグループＡの抗体より、解離定数が大きく親和性は弱いが、これらの抗体単独でＣ２Ｂ８よりやや高いアポトーシス活性を示した。
抗ＣＤ２０抗体によるＢ細胞に対するアポトーシス誘導能について、単独で十分なアポトーシス誘導能を示す場合、クロスリンク条件下でもその割合はほぼ同等であるが、抗体の種類、未飽和条件などで抗ＣＤ２０抗体単独では十分なアポトーシス誘導能が示されない場合、クロスリンク条件下でアポトーシス活性は増加すると考えられる。
なお、図９ａ〜図９ｄは、実験日のnoAb（抗体添加無し）での早期アポトーシス（％）を１とするグラフである。
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するヒト化抗体１７９１の４種のクローンｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのアポトーシス活性について、表６にまとめた。【００５３】
表６  ヒト化抗体１７９１のアポトーシス活性のまとめ
【表６】
2009031230.tif 000008
【００５４】
次に、ヒト化１７９１抗体クローンであるｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓについて、Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞を用いてＣＤＣ活性を測定した。結果を、それぞれ表７に示す。リツキシマブ（ｃ２Ｂ８）およびクローン１７９１（ｃ１７９１）は、それぞれ対照である。【００５５】
表７  本発明のヒト化抗体のＣＤＣ活性
【表７】
2009031230.tif 000009
【００５６】
表７の結果から、クローンｆｆおよびｆｖは、リツキシマブと同程度あるいはそれよりも強いＣＤＣ活性を発揮することがわかった。また、ｓｆはＷｉＬ２細胞およびＲＣＫ８細胞において極めて高いＣＤＣ活性を示した。【００５７】
抗体濃度とＣＤＣ活性の関係を調べるための実験も行った。抗体は実施例２に記載のごとく調製したものよりも精製が進んだものを使用した。精製は下記の手順にて行った。
抗体産生細胞株（遺伝子組み換えＣＨＯ−ＤＧ４４細胞）はHydrolysateを含むIS CHO-CD/w（Irvine Scientific, Cat. No.91119）に、４ｍＭ  GlutaMax（Invitrogen, Cat 35050-061）、２００μｇ／ｍｌ G418（Sigma,Cat.No.A1720-5G）を添加した培地で３７℃でＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。継代後約２週間経過した細胞培養液を室温、３５００r.p.m.で５分間遠心分離し、培養上清を回収し、０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。５０ｍＭ  Tris-HCl,pH7.0で平衡化した。Hi Trap Protein A HP（GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01）カラムに、培養上清を添加後、５０ｍＭ  Tris-HCl,pH7.0で洗浄した。０．１Ｍクエン酸，ｐＨ４．０で溶出し、４００μｌづつ採取し、その１０／１量にあたる４０μｌ  １Ｍ  Tris-HCl,pH9.0で中和した。１００倍量のＰＢＳに対して、Slyde-A-Lyzer 10K Dialysis Cassetes（PIERCE CatNo.66453）を用いて２．５時間を２回後、１５〜１８時間１回の透析を行った。
透析後のサンプルをVIVA SPIN 50,000MWCO PES（VIVASCIENCE CatNo.VS0231）を用いて濃縮した。このサンプルをＰＢＳで平衡化したHiLoad 16/60 superdex 200prep grade（GE Healthcare CatNo.17-1069-01）カラムに添加した。精製サンプルを０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した後、VIVA SPIN 50,000MWCO PES（VIVASCIENCE CatNo. VS0231）を用いて濃縮を行った。抗体濃度はBECKMAN COULTER DU530を用いてＡ２８０の値より算出した。【００５８】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するヒト化抗体ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、ｓｓ、およびキメラ抗体ｃ１ｋ１７９の、濃度とＣＤＣ活性の関係を図１０ａ〜図１０ｄに示す。いずれの実験系においても、濃度５μｇ／ｍｌ以上においてヒト化抗体ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＣＤＣ活性はリツキサン（Ｃ２Ｂ８）の活性と同程度であるかあるいはそれを上回っていた。特に、ＲＣ−Ｋ８細胞に対してリツキサンがほとんどＣＤＣ活性を示さなかったのに対し、本発明のヒト化抗体１７９１の４つのクローンはＲＣ−Ｋ８細胞に対してリツキサンの少なくとも約４倍以上のＣＤＣ活性を示した。【００５９】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＡＤＣＣ活性についても調べた。抗体濃度とＡＤＣＣとの関係を調べた結果を図１１ａ〜図１１ｄに示す（Ｅ：Ｔ比は２５）。本発明のヒト化抗体１７９１の４つのクローンｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＡＤＣＣ活性はリツキサン（Ｃ２Ｂ８）の活性と同程度であるかあるいはそれを上回っていた。ＡＤＣＣ活性の結果からも、本発明のヒト化抗体１７９１シリーズの有効性が示された。
【実施例４】
【００６０】
さらなるヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ヒト化抗体１７８２）の取得
単独ではアポトーシスを誘導しない親和性が高い抗体グループから、最も親和性が高い抗体として１７８２シリーズを選び、ヒト化を行った。前記実施例に記載した方法に準じてヒト化抗体１７８２を取得し、その性質を調べた。得られたヒト化抗体の性質についても、前記実施例に記載の方法に準じて調べた。【００６１】
配列番号２７〜３４のアミノ酸配列を元にしてコドンをＣＨＯ細胞に最適化したＤＮＡを、定法によりデザインし、合成した。次いで、pNOWを発現ベクターとして１６種類のヒト化1K1782発現コンストラクトを構築した。コンストラクトは下記のとおり：
pNOW-aa1782kg1、pNOW-af1782kg1、pNOW-as1782kg1、pNOW-av1782kg1、pNOW-fa1782kg1、pNOW-ff1782kg1、pNOW-fs1782kg1、pNOW-fv1782kg1、pNOW-sa1782kg1、pNOW-sf1782kg1、pNOW-ss1782kg1、pNOW-sv1782kg1、pNOW-va1782kg1、pNOW-vf1782kg1、pNOW-vs1782kg1、pNOW-vv1782kg1。
さらに、実施例３に記載した方法に従って、トランスフェクションと薬剤による選択を行い、高発現細胞株の選択、小規模培養を行い、ヒト化抗体産生株の培養及び抗体の精製を行った。【００６２】
使用した抗体生産株は、ＣＨＯ細胞ｈｚ１７８２−ｓｓ２１、ｈｚ１７８２−ｆｖ０２、ｈｚ１７８２−ｆｆ１４およびｈｚ１７８２−ｓｆ２３であり、このうちｈｚ１７８２−ｓｓ２１、ｈｚ１７８２−ｆｖ０２およびｈｚ１７８２−ｆｆ１４は、ブタペスト条約の下、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、平成１９年（２００７年）８月３１日に、各々、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０６およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９０５を与えられた。【００６３】
これらの細胞株から得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列(配列番号１７〜２４)は以下のとおりである。
ヒト化1k1782の配列
Ｌ鎖V領域配列（配列番号：２７）
Ven 1782 : DILLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNIGTSIH WYQQKPGQSPRLLIK YASESFS
GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSWPFT FGSGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号：３１）
Ven 1782 : QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFT  SYWMH   WVKQAPGQGLEWIG
YITPSTGYTDYNKKFKD  KATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR  SGPYFDV WGAGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号：２８）
abb 1782 : DIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNIGTSIH WYQQKPGQSPRLLIK YASESFT 
GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSWPFT FGSGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号：３２）
Abb 1782 ： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMH WVRQAPGQGLEWMG
YITPSTGYTDYNQKFQG  RVTLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR  SGPYFDV WGAGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号：２９）
sdr 1782 : DILLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNVGTSLH WYQQKPGQSPRLLIK YASERFT 
GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSWPFT FGSGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号：３３）
sdr 1782 : QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMH WVKQAPGQGLEWIG
YITPSTGYTDYNQKFQG KATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDV WGAGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号：３０）
fra 1782 : DILLTQSPATLSVSPGERATLSC RASQNIGTSIH WYQQRPGQSPRLLIK YASESFS
GIPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDIADYYC QQSNSWPFT FGSGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号：３４）
fra 1782 : QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMH WVKQAPGQGLEWIG
YITPSTGYTDYNKKFKD KATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDV WGAGTTVTVSS
本明細書において、ヒト化１７８２抗体のクローンｆｖという場合、ｆｒａ１７８２のＬ鎖（配列番号：３０のＬ鎖）およびＶｅｎ１７８２のＨ鎖（配列番号：３１のＨ鎖）を組み合わせた抗体クローンをいう。他のクローンについても同様とする。【００６４】
（ａ）ヒト化抗体１７８２の親和性測定
実施例３の結果を参考にヒト化抗体１７８２も同様に４つのグループに分類されると仮定し、各グループに属するｓｓ、ｓｆ、ｆｆおよびｆｖを選抜した。これらの抗体およびリツキサン（ｃ２Ｂ８）およびヒト抗体２ｆ２についてＣＤ２０に対するＫｄ値を測定した結果を表８に示す。
なお、本明細書において、例えば、ヒト化１７８２抗体のクローンｓｆという場合、ｓｄｒ１７８２のＬ鎖（配列番号：２９のＬ鎖）およびｆｒａ１７８２のＨ鎖（配列番号：３４のＨ鎖）を組み合わせた抗体クローンをいう（下線は説明のために付加）。他のクローンについても同様とする。【００６５】
表８  ヒト化抗体１７８２結合解離定数（Ｋｄ）
【表８】
2009031230.tif 000010
前記実施例に準じてこれらのヒト化抗体のＫｄ値を調べた。使用細胞はＲａｊｉ細胞であった。なお、ここで一次抗体の検出はＦＩＴＣ標識ＰｒｏｔｅｉｎＡを用いて行い、一次抗体とＰｒｏｔｅｉｎＡの結合比は１：３として解析した。
ヒト化抗体１７８２のクローンｆｆのＫｄ値が最も低く、リツキサンおよびヒト抗体２ｆ２のＫｄ値よりも低かった。すなわち、ヒト化抗体１７８２のクローンｆｆはＣＤ２０に対する親和性が最も高いことがわかった。【００６６】
（ｂ）ヒト化抗体１７８２の細胞増殖阻害活性
ヒト化抗体１７８２の４つのクローンｆｖ、ｆｆ、ｓｆおよびｓｓについて、アポトーシス誘導活性、ＣＤＣ活性（％）およびＡＤＣＣ活性を調べた。これらの活性の測定は、上記実施例に記載した方法に準じて行った。【００６７】
（ｂ１）ヒト化抗体１７８２のアポトーシス誘導活性
ＲＣ−Ｋ８、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＡＪＩおよびＷＩＬ２ＮＳ細胞を用いて、ヒト化抗体１７８２のアポトーシス誘導活性測定を行った。結果を図１２ａ−図１２ｄに示す（図中、右側の数値は抗体濃度を示し、ＸＬは二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクがあることを示す）。
図１３ａ〜図１３ｄは、抗体添加無しのアポトーシス誘導能を１とした場合のヒト化抗体１７８２のアポトーシス誘導活性を示す。
ヒト化抗体１７８２シリーズは単独ではアポトーシス誘導活性が弱かったが、クロスリンク有りの条件下でリツキサン（ｃ２Ｂ８）のアポトーシス誘導活性と同等あるいはそれを上回る活性を示した。これらの結果を表９にまとめた。【００６８】
表９  ヒト化抗体１７８２のアポトーシス誘導活性（表中、ＸＬは二次抗体（ヤギ抗ヒト抗体）によるクロスリンクがあることを示す）。
【表９】
2009031230.tif 000011
【００６９】
（ｂ２）ヒト化抗体１７８２のＣＤＣ活性
まず、ヒト化抗体１７８２のクローンｆｖおよびｆｆのＣＤＣ活性を、ＲＣ−Ｋ８細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞を用いて測定した。結果を図１４ａおよび図１４ｂに示す。抗体濃度０．１μｇ／ｍｌと１μｇ／ｍｌでの活性に大差はなかった。ヒト化抗体１７８２のクローンｆｖおよびｆｆはいずれの細胞に対しても高いＣＤＣ活性を示した。リツキサン耐性株であるＲＣ−Ｋ８株において、ｆｖのＣＤＣ活性が最も高かった。ＳＵ−ＤＨＬ４細胞においてもヒト化抗体１７８２のクローンｆｖおよびｆｆは高いＣＤＣ活性を示し、リツキサンのＣＤＣ活性を上回った。
ヒト化抗体１７８２の４つのクローンｆｖ、ｆｆ、ｓｆおよびｓｓのＣＤＣ活性を、ＲＡＪＩ細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞およびＲＣ−Ｋ８細胞を用いて測定した結果を表１０にまとめた。【００７０】
表１０  ヒト化抗体１７８２のＣＤＣ活性
【表１０】
2009031230.tif 000012
ヒト化抗体１７８２は、ＲＡＪＩ細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞のみならず、リツキサン耐性株であるＲＣ−Ｋ８細胞においてもＣＤＣ活性を示した。なかでもクローンｆｆおよびｆｖのＣＤＣ活性が高く、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞においてリツキサンを大幅に上回るＣＤＣ活性を示した。
Ｋｄ値およびＣＤＣ活性の結果を総合すると、クローンｆｆは親和性が最も高く、ＣＤＣ活性も比較的高く、リツキサン耐性株であるＲＣ−Ｋ８株に対してもＣＤＣ活性を有する点で好ましいものであり、クローンｆｖはＣＤＣ活性が最も高く、しかもリツキサン耐性株であるＲＣ−Ｋ８株に対しても有効である点で、好ましいものである。特に、クローンｆｆは親和性が非常に高いことから、例えば、ＲＩ標識してＢ細胞関連疾患のミサイル療法に利用可能である。【００７１】
（ｂ３）ヒト化抗体１７８２のＡＤＣＣ活性
まず、ヒト化抗体１７８２のクローンｆｖおよびｆｆのＡＤＣＣ活性を、ＲＣ−Ｋ８細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞を用いて測定した。結果を図１５ａおよび図１５ｂに示す。抗体濃度０．１μｇ／ｍｌと１μｇ／ｍｌでの活性に大差はなかった。ＲＣ−Ｋ８細胞においては、クローンｆｆのＡＤＣＣ活性がクローンｆｖおよびリツキサンのＡＤＣＣ活性を上回った。ＳＵ−ＤＨＬ４細胞においては、クローンｆｖはリツキサンと同等のＡＤＣＣ活性を示したが、クローンｆｆのＡＤＣＣ活性は比較的低かった。【００７２】
ヒト化抗体１７８２の４つのクローンｆｖ、ｆｆ、ｓｆおよびｓｓのＡＤＣＣ活性を、ＲＡＪＩ細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞およびＲＣ−Ｋ８細胞を用いて測定した結果を表１１にまとめた。【００７３】
表１１  ヒト化抗体１７８２のＡＤＣＣ活性
【表１１】
2009031230.tif 000013
クローンｆｖはＳＵ−ＤＨＬ４細胞におけるＡＤＣＣ活性が高いという点で好ましいものであり、クローンｓｓはＲＣ−Ｋ８細胞におけるＡＤＣＣ活性が高いという点で好ましいものである。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、自然の状態のヒトＣＤ２０分子に対する結合親和性の高い、医薬として好適な生物学的活性を示す抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、特にヒト化抗体、およびそれらの製造方法、ならびにそれらを含有するＢ細胞関連疾患の治療剤が提供される。したがって、本発明は、癌の治療薬の製造分野、癌研究の分野などにおいて利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
SEQ ID NO: 17: L chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 18: L chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
SEQ ID NO: 19: L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
SEQ ID NO: 20: L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
SEQ ID NO: 21: H chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 22: H chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
SEQ ID NO: 23: H chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
SEQ ID NO: 24: H chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
SEQ ID NO: 25: primer
SEQ ID NO: 26: primer
SEQ ID NO: 27: L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1782
SEQ ID NO: 28: L chain V region sequence of humanized antibody abb 1782
SEQ ID NO: 29: L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1782
SEQ ID NO: 30: L chain V region sequence of humanized antibody fra 1782
SEQ ID NO: 31: H chain V region sequence of humanized antibody Ven 1782
SEQ ID NO: 32: H chain V region sequence of humanized antibody abb 1782
SEQ ID NO: 33: H chain V region sequence of humanized antibody sdr 1782
SEQ ID NO: 34: H chain V region sequence of humanized antibody fra 1782
【図１】
2009031230.tif 000014
【図２】
2009031230.tif 000015
【図３ａ】
2009031230.tif 000016
【図３ｂ】
2009031230.tif 000017
【図３ｃ】
2009031230.tif 000018
【図３ｄ】
2009031230.tif 000019
【図４ａ】
2009031230.tif 000020
【図４ｂ】
2009031230.tif 000021
【図４ｃ】
2009031230.tif 000022
【図４ｄ】
2009031230.tif 000023
【図５ａ】
2009031230.tif 000024
【図５ｂ】
2009031230.tif 000025
【図５ｃ】
2009031230.tif 000026
【図５ｄ】
2009031230.tif 000027
【図６ａ】
2009031230.tif 000028
【図６ｂ】
2009031230.tif 000029
【図６ｃ】
2009031230.tif 000030
【図６ｄ】
2009031230.tif 000031
【図７ａ】
2009031230.tif 000032
【図７ｂ】
2009031230.tif 000033
【図７ｃ】
2009031230.tif 000034
【図７ｄ】
2009031230.tif 000035
【図８ａ】
2009031230.tif 000036
【図８ｂ】
2009031230.tif 000037
【図８ｃ】
2009031230.tif 000038
【図８ｄ】
2009031230.tif 000039
【図９ａ】
2009031230.tif 000040
【図９ｂ】
2009031230.tif 000041
【図９ｃ】
2009031230.tif 000042
【図９ｄ】
2009031230.tif 000043
【図１０ａ】
2009031230.tif 000044
【図１０ｂ】
2009031230.tif 000045
【図１０ｃ】
2009031230.tif 000046
【図１０ｄ】
2009031230.tif 000047
【図１１ａ】
2009031230.tif 000048
【図１１ｂ】
2009031230.tif 000049
【図１１ｃ】
2009031230.tif 000050
【図１１ｄ】
2009031230.tif 000051
【図１２ａ】
2009031230.tif 000052
【図１２ｂ】
2009031230.tif 000053
【図１２ｃ】
2009031230.tif 000054
【図１２ｄ】
2009031230.tif 000055
【図１３ａ】
2009031230.tif 000056
【図１３ｂ】
2009031230.tif 000057
【図１３ｃ】
2009031230.tif 000058
【図１３ｄ】
2009031230.tif 000059
【図１４ａ】
2009031230.tif 000060
【図１４ｂ】
2009031230.tif 000061
【図１５ａ】
2009031230.tif 000062
【図１５ｂ】
2009031230.tif 000063
【配列表】
2009031230000001.app
【国際調査報告】
2009031230.tif 000064
2009031230.tif 000065
2009031230.tif 000066
2009031230.tif 000067
2009031230.tif 000068
2009031230.tif 000069
2009031230.tif 000070
2009031230.tif 000071
2009031230.tif 000072
2009031230.tif 000073