【手続補正書】
【提出日】平成17年2月10日(2005.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）細胞内細菌によって宿主細胞を感染させるステップと、
２）感染細胞中に存在する細胞内細菌を標識するステップと、
３）ａ）感染細胞の全細胞溶解物、及び
ｂ）感染細胞から得られる精製・溶解細菌
を調製するステップと、
４）ｉ）ステップ３ａ）で得た全細胞溶解物と、ｉｉ）ステップ３ｂ）で得た精製・溶解細菌との、二次元ゲル電気泳動によるタンパク質プロファイルを比較するステップと、
５）全細胞溶解物中に存在するが、該精製細菌中には存在しないか、若しくは有意に低下した量で存在する、ステップ４）で得たタンパク質スポットを検出するステップと、
６）ステップ５）で選択したスポット中のタンパク質を同定するステップ
とを含む、細胞内細菌から分泌されるタンパク質を同定するための方法によって同定可能なタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項２】
免疫原性組成物中に含めることに、及び／又は診断目的に適用可能である、請求項１に記載のタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項３】
免疫原性組成物中に含めることに適した、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ拘束性抗原として提示するための候補であるＴ細胞エピトープを含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
免疫原性組成物中に含めることに適した、ＭＨＣクラスＩ制限抗原として提示するための候補であるＴ細胞エピトープを含む、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
＋／−１０％の平均誤差で決定される、表Ｉに示したタンパク質ＤＴ１〜ＤＴ７７の１つの等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）特性を有する、請求項１に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項６】
表ＩＩＩＡに示した、ＣＴ０１７（遺伝子名ＣＴ０１７（配列番号２２１））、ＣＴ０４４（遺伝子名ｓｓｐ（配列番号２２７））、ＣＴ２４３（遺伝子名ｌｐｘＤ（配列番号２２３））、ＣＴ２６３（遺伝子名ＣＴ２６３（配列番号２３５））、ＣＴ２６５（遺伝子名ａｃｃＡ（配列番号２１９））、ＣＴ２８６（遺伝子名ｃｌｐＣ（配列番号２２９））、ＣＴ２９２（遺伝子名ｄｕｔ（配列番号２１５））、ＣＴ４０７（遺伝子名ｄｋｓＡ（配列番号２１１））、ＣＴ４４６（遺伝子名ｅｕｏ（配列番号２０７））、ＣＴ４６０（遺伝子名ＳＷＩＢ（配列番号２０３））、ＣＴ５４１（遺伝子名ｍｉｐ（配列番号２０９））、ＣＴ６１０（遺伝子名ＣＴ６１０（配列番号２０１））、ＣＴ６５０（遺伝子名ｒｅｃＡ（配列番号２２５））、ＣＴ６５５（遺伝子名ｋｄｓＡ（配列番号２１７））、ＣＴ６６８（遺伝子名ＣＴ６６８（配列番号１９５））、ＣＴ６９１（遺伝子名ＣＴ６９１（配列番号２３３））、ＣＴ７３４（遺伝子名ＣＴ７３４（配列番号２１３））、ＣＴ７８３（遺伝子名ＣＴ７８３（配列番号１９７））、ＣＴ８５８（遺伝子名ＣＴ８５８（配列番号１９９））、ＣＴ８７５（遺伝子名ＣＴ８７５（配列番号２３１））、又はＯＲＦ５（遺伝子名ＯＲＦ５（配列番号２０５））として対応する遺伝子番号によって、あるいは遺伝子名ＤＴ８によって同定される、請求項１に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項７】
＋／−１０％の平均誤差で決定される、表ＩＶに示したタンパク質ＤＴ１、ＤＴ２、ＤＴ３、ＤＴ５、ＤＴ９、ＤＴ１０、ＤＴ１１、ＤＴ１３、ＤＴ１４、ＤＴ１７、ＤＴ４７、ＤＴ５９、ＤＴ６０、ＤＴ６１又はＤＴ６２の１つの等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）特性を有する、請求項１に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項８】
タンパク質ＤＴ４（遺伝子名ＣＴ８５８（配列番号１９９））、ＤＴ２３（遺伝子名ｍｉｐ（配列番号２０９））、ＤＴ４７、ＤＴ４８（遺伝子名ＣＴ８５８（配列番号１９９））、ＤＴ７５、ＤＴ７６（遺伝子名ＣＴ６９１（配列番号２３３））、及びＤＴ７７（遺伝子名ＣＴ２６３（配列番号２３５））から選択される、請求項５に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項９】
＋／−１０％の平均誤差で決定される、表ＩＩに示したタンパク質ＣＰ１〜ＣＰ９１の１つの等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）特性を有する、請求項１に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項１０】
表ＩＩＩＢに示した、ＣＰＮ０１５２（遺伝子名ＣＰＮ０１５２（配列番号２４９））、ＣＰＮ０７０２、ＣＰＮ０７０５（遺伝子名ＣＰＮ０７０５（配列番号２４５））、ＣＰＮ０７１１（遺伝子名ＣＰＮ０７１１（配列番号２６３））、ＣＰＮ０７９６（遺伝子名ＣＰＮ０７９６（配列番号２４３））、ＣＰＮ０９９８（遺伝子名ｆｔｓＨ（配列番号２３９））、ＣＰＮ０１０４（遺伝子名ＣＰＮ０１０４（配列番号２４１））、ＣＰＮ０４９５（遺伝子名ａｓｐＣ（配列番号２４７））、ＣＰＮ０６８４（遺伝子名ｐａｒＢ（配列番号２５１））、ＣＰＮ０４１４（遺伝子名ａｃｃＡ（配列番号２５３））、ＣＰＮ１０１６（遺伝子名ＣＰＮ１０１６（配列番号２３７））、ＣＰＮ１０４０（遺伝子名ＣＰＮ１０４０（配列番号２５５））、ＣＰＮ００７９（遺伝子名ｒｌ１０（配列番号２５７））、ＣＰＮ０５３４（遺伝子名ｄｋｓＡ（配列番号２５９））、ＣＰＮ０６１９（遺伝子名ｎｄｋ（配列番号２６１））、ＣＰＮ０７１１（遺伝子名ＣＰＮ０７１１（配列番号２６３））、ＣＰＮ０６２８（遺伝子名ｒｓ１３（配列番号２６５））、ＣＰＮ０９２６（遺伝子名ＣＰＮ０９２６（配列番号２６７））、ＣＰＮ１０１６（遺伝子名ＣＰＮ１０１６（配列番号２３７））、ＣＰＮ１０６３（遺伝子名ｔｐｉＳ（配列番号２６９））、又はＣＰＮ３０２（遺伝子名ｌｐｘＤ（配列番号２７１））として対応する遺伝子番号によって同定される、請求項１から請求項４のいずれかに記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項１１】
タンパク質ＣＰ３４（配列番号２３８）（遺伝子名ＣＰＮ１０１６（配列番号２３７））、ＣＰ３７（配列番号２４０）（遺伝子名ＣＰＮ０９９８（配列番号２３９））、ＣＰ４６（配列番号２４４）（遺伝子名ＣＰＮ０７９６（配列番号２４３））、ＣＰ４７（配列番号２４６）（遺伝子名ＣＰＮ０７０５（配列番号２４５））、ＣＰ５２（配列番号２５０）（遺伝子名ＣＰＮ０１５２（配列番号２４９））、ＣＰ６３（配列番号２３８）（遺伝子名ＣＰＮ１０１６（配列番号２３７））、及びＣＰ７５（配列番号２６２）（遺伝子名ｎｄｋ（配列番号２６１））から選択される、請求項９に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項１２】
ＤＴ８であり、以下の配列（配列番号１）：
ＭＱＨＴＩＭＬＳＬＥＮＤＮＤＫＬＡＳＭＭＤＲＶＶＡＡＳＳＳＩＬＳＡＳＫＤＳＥＳＮＲＱＦＴＩＳＫＡＰＤＫＥＡＰＣＲＶＳＹＶＡＡＳＡＬＳＥ
を含むことを特徴とする、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのポリペプチド、又はその免疫原性断片。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質と、少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質の少なくとも７個の連続したアミノ酸を含む、タンパク質又はその免疫原性断片。
【請求項１５】
配列番号３〜配列番号４５の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項１６】
配列番号１２２〜配列番号１４８の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの相同体、又はその免疫原性断片。
【請求項１７】
配列番号４６〜配列番号１２１の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質、又はその免疫原性断片。
【請求項１８】
配列番号１４９〜配列番号１９４の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ相同体、又はその免疫原性断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】細胞内細菌からのタンパク質を同定する方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌経路に関係なく細胞内細菌から分泌されるタンパク質の同定を可能にする、方法の新規な組合せに関する。さらに本発明は、これらの方法によって同定されるタンパク質を提供する。分泌されるタンパク質は、免疫原組成物及び／又は診断対象に適した候補物質であることが知られている。本発明は、同定した分泌タンパク質から得たペプチドエピトープ（Ｔ細胞エピトープ）、並びにこれらのタンパク質をコードする核酸化合物も提供する。さらに本発明は、医薬や診断への応用といった、タンパク質又はその断片のさまざまな応用を含む。
【背景技術】
【０００２】
クラミジアは、真核生物の宿主細胞内で増殖する偏性細胞内細菌であり、重要なヒト病原体である。クラミジア目は、１つの科（クラミジア科）を含み、この科は１つの属（クラミジア属）を含み、この属は４つの種：Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコーマクラミジア）、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎クラミジア）、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病クラミジア）及びＣ．ｐｅｃｏｒｕｍに分けられる。
【０００３】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのヒト病原性による亜型は、眼性疾患を起こすＡ〜Ｃ、及び性的接触で伝播され、尿道炎、或いは卵管炎、精巣上体炎及び子宮外妊娠などを伴う合併症を引き起こすＤ〜Ｋ、及び重度の全身感染、性病性リンパ肉芽腫症（ＬＧＶ）を引き起こすＬ１〜Ｌ３に分けられる。ヒト病原体Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、気管支炎及び肺炎を引き起こす呼吸管感染の原因であり、最近、アテローム性動脈硬化の進行との関連付けがなされてきている（Ｓａｉｋｋｕ他、１９８８［１．］、Ｓｈｏｒ他、１９９２［２．］）。
【０００４】
未治療のままである場合、クラミジア感染は、生殖不能、失明及びおそらく血栓症などの重度の合併症を伴って慢性的なものとなる可能性がある。
【０００５】
細胞内での発生サイクルによって、持続的なクラミジア感染が異常な免疫応答を引き起こし、その細菌を明らかにできない場合がある。多くの免疫原性のクラミジアタンパク質、特にＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの主要抗原である主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）［７．］などの表面露出タンパク質だけでなく、Ｈｓｐ６０などのストレス応答タンパク質［８．］は、ワクチン候補であると考えられている。しかしながら、これらの候補はいずれも、ワクチン試験において有効であることは証明されていない。
【０００６】
体液性応答が限られていること、及び防御免疫がほとんどないことを適当に説明できるのは、細菌の細胞内の性質である。したがって、１つの選択的な手法は、細胞媒介性の免疫系によって認識可能なタンパク質を発見することであり、主に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の影響によるクラミジア感染の解明において、この手法が要となることが示されてきている（Ｉｇｕｉｔｓｅｍｅ他、１９９４［９．］）。
【０００７】
多大な注目が分泌タンパク質に集まってきている。なぜならこれらを、宿主細胞のプロテアソームでプロセッシングし、細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ抗原として提示することができ、したがって明らかなワクチン標的となるからである（Ｈｅｓｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎｎ、１９９３［４５］）。この一例はエルシニア感染細胞に関して示されており、この細胞は、ＹｏｐＨエフェクターのエピトープを、ＭＨＣ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対して提示する（Ｓｔａｒｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ、１９９５［１４．］）。クラミジアと宿主細胞の間の相互作用は、細菌の細胞内での生存及び増殖に関して必要不可欠である。
【０００８】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの亜型Ｄ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ他、１９９８［４．］）（８９４個の予想されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む）、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０（１０７３個のＯＲＦを含む）（Ｋａｌｍａｎ他、１９９９［５．］）に関して、完全かつ検索可能であるクラミジアのゲノムが存在する。さらに、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＭｏＰｎ（Ｒｅａｄ他、２０００［１２．］）、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＲ３９（Ｒｅａｄ他、［１２．］及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｊ１３８（Ｓｈｉｒａｉ他、２０００［１３．］の、完全なゲノムが公に入手可能である。ゲノム配列から、クラミジアは、他の細菌のＩＩＩ型分泌遺伝子と相同性があるいくつかの遺伝子を含む、分泌機構に関与する遺伝子を有することが知られている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ他、１９９８［４．］及びＫａｌｍａｎ他、１９９９［５．］）。
【０００９】
分泌エフェクタータンパク質の候補は、ＩＩＩ型分泌亜群中に存在する可能性がある（Ｓｕｂｔｉｌ他、２０００［１０．］）。この見解は、ＣｏｐＮのＩＩＩ型分泌特性の発見によって最近示された（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｈａｃｋｓｔａｄｔ，２０００）［１１．］。しかしながら、ＩＩＩ型分泌タンパク質は、認識可能なシグナルペプチダーゼ開裂部位を欠いており、クラミジア中のこの系によって分泌されるタンパク質のコンセンサス配列は未だ認識されていない。従って、このようなことは、問題となっている特定の細菌に限られる可能性がある。さらに分泌タンパク質は、ゲノム中の予測不能な位置にある機能的に多様な群のタンパク質である可能性がある（Ｓｕｂｔｉｌ他、２０００［１０．］）。
【００１０】
分泌されるクラミジアのエフェクタータンパク質に関する現状の知識は、Ｉｎｃファミリー（Ｒｏｃｋｅｙ他、１９９５）［１５．］［１６．］、ＣｏｐＮ（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｈａｃｋｓｔａｄｔ、２０００）［１１．］）及びＣＴ５２９（Ｆｌｉｎｇ他、２００１）［３７．］のメンバーを含む、封入体膜中に存在するタンパク質に限られる。
【００１１】
クラミジアに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が感染中に生じることが示されており、これは、ＭＨＣクラスＩ抗原を提示するために必須であるクラミジアのタンパク質が、宿主細胞の細胞質に曝されていることを意味する。ＣＴ５２９は、真核細胞内での発現、及びクラミジアに特異的なＴ細胞系による認識によってゲノムライブラリーから同定されてきている（Ｐｒｏｂｓｔ）［４１］。ＣＴ５２９は、マウスワクチンの実験において、感染に対していくらかの防御をもたらすエピトープを有することが示されている。
【００１２】
ウイルスベクターでトランスフェクションすることにより、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ亜型Ｌ２のゲノムライブラリーを真核細胞内で発現させ、次いで、クラミジアに特異的なＴ細胞でスクリーニングすることにより、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを含むタンパク質を検出することが、国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ  ００／３４４８３に記載されている（Ｐｒｏｂｓｔ）［４１］。
この方法によって５つの陽性クローンが同定されており、この中の１つにＣＴ５２９が含まれている。他の一のクローンは３つのオープンリーディングフレームを含んでいたが、残りの３つのクローンについては、それ以上の記載はない。このようなスクリーニングの欠点は、真核細胞での細菌タンパク質の発現が、プロテアソームによるプロセッシングの確率とＭＨＣ抗原としての提示そのものを変えるという点で、細菌における発現と異なっていることにあり、Ｔ細胞クローンの維持及び刺激はｉｎ  ｖｉｖｏでの状況とは異なり、通常の感染中は接触不可能なタンパク質を認識するクローンによって、偽陽性となる場合がある。前述の特許出願中の他の手法は、体液性免疫防御を対象とするワクチンに関する候補の同定に関するものである。
【００１３】
細胞内細菌から分泌されたタンパク質を検索するとき、直接的なアイデアとしては、感染した宿主細胞から細胞質を単離し、細菌タンパク質を探すことである。しかしながら、クラミジアの網状体の脆さのために、この戦略をクラミジアに関して使用することはできない。他の手法は、トランスポゾン分析によって、分泌タンパク質であることが多い病原性因子を同定することであると思われる。しかしながら、クラミジアをトランスフェクトすることはできない。どのタンパク質が分泌されたかを予想することができる戦略は存在しないし、ワクチン開発に適したエフェクタータンパク質をコードする遺伝子が、ゲノム中の予測不能な位置に存在することがある。
【００１４】
したがって、コスト効率の良い方法でワクチン候補の数を制限することができ、最小限の実験ステップを含む信頼できるシステムが必要とされる。
【００１５】
［１８］では、２次元ゲル電気泳動によるオートラジオグラフィーと組み合わせて、［３５Ｓ］−メチオニン／システイン標識したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質によって、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ及びＬ２のタンパク質発現に対するＩＮＦ−γの影響を調べた。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａで培養物中のＨｅＬａ細胞を感染させている間に加えられたＩＮＦ−□□によって、いくつかのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａのタンパク質の顕著な下方制御がもたらされたが、一方でこの影響はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｌ２に関しては明白ではなかった。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ及びＬ２の両方で、〜３０及び〜４０ｋＤａタンパク質が、ＩＮＦ−γに依存して誘導されることが観察された。これらのタンパク質の誘導は、生理学的な量を超える量のＬ−トリプトファンを増殖培地に加えることによって弱められた。これによって、これらＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質のＩＮＦ−γに媒介される誘導特性が、ＩＦＮ−γの媒介による、トリプトファンを分解する宿主細胞の酵素であるインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼの上方制御と関連することが示された。ＩＮＦ−γ誘導性のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質の１つは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｌ２と比較して、有意に分子量（Ｍｗ）の小さなＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａのタンパク質の位置に移動した。
【００１６】
［１９］では、前に記載された（Ｓｈａｗ他、１９９９）ＩＮＦ−γ誘導性Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ及びＬ２のタンパク質を、さらに特徴付けした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用し、次にデータベース検索によって、調製二次元ゲルから、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのトリプトファンシンターゼα（ＴｒｐＡ）及びβ（ＴｒｐＢ）サブユニットとして、そのタンパク質を同定した。タンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ中のＩＮＦ−□□によっても誘導され、３つすべての亜型において、生理学的な量を超える量のＬ−トリプトファンを加えることによって、この誘導は妨げられた。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＡのＴｒｐＡは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ及びＬ２と比較して、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａにおける分子量（Ｍｗ）が小さな蛋白の位置で移動した。これら亜型におけるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｔｒｐＡ遺伝子の分析によって明らかなように、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ及びＣのＴｒｐＡは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ及びＬ２のＴｒｐＡと比較して、〜７．７ｋＤａに切り詰められている。トラコーマを引き起こす亜型（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ）において、トリプトファンシンターゼが切り詰められたり、あるいは存在しないことによって、トリプトファン合成能力が阻害され、これらの亜型をさらにＩＮＦ−γ媒介性のトリプトファン欠乏に対してより感受性にする可能性がある。これによって、ヒト亜型Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ間の病原において見られる相違を説明することができる。
【００１７】
［４３］では、細胞内細菌であるリステリアモノサイトゲネスの、先に記載した分泌タンパク質（ｐ６０）の宿主細胞におけるプロテアソームによる分解が検討された。使用した一般的戦略は、２つのペプチドアルデヒド：Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシン（ＬＬｎＬ）及び（ベンジロキシカルボニル）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−フェニルアラニン（Ｚ−ＬＬＦ）の存在下又は不在下で、［３５Ｓ］−メチオニン／システイン標識を使用する、パルス追跡アッセイに基づくものであり、これらのペプチドアルデヒドは、真核生物プロテアソームのタンパク質分解活性を阻害するものである。ｐ６０に対して産生させたポリクローナル抗体を使用して、プロテアソーム阻害剤処理及び未処理のＬ．モノサイトゲネス感染Ｊ７７４細胞の溶解物から、ｐ６０を免疫沈降させた。１次元ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離された、免疫沈降標識ｐ６０のオートラジオグラフの評価によって、プロテアソーム阻害剤はｐ６０のプロテアソーム分解を阻害することができたことが示唆された。感染細胞当たりのｐ６０−ＣＴＬエピトープの数は、ＬＬｎＬ及びＺ−ＬＬＦを用いた処理によって減少した。これによって、ｐ６０のプロテアソーム分解の阻害とｐ６０−ＣＴＬエピトープ生成の間の関連が示唆された。
【００１８】
［４４］では、防御免疫の背後の機構、及び細胞内の微細物に対する細胞の免疫応答の一般的特徴が、細胞内の微細物に対する実用的な組み換えワクチンの開発に焦点を当てて記載された。抗原送達系を開発するための戦略は、マイコバクテリウムボビスＢＣＧ及びサルモネラチフィａｒｏＡ−に重点を置いて論じられた。これらの非毒性である細胞内細菌を遺伝的に改変して、免疫認識によりワクチンの標的として寄与する抗原を送達することができる。筆者は、ワクチンの開発の標的として分泌タンパク質を使用する利点を指摘する。なぜなら、細菌が宿主細胞内で依然として複製している間に、これらのタンパク質が、プロセッシングされ、細胞媒介性の免疫系に対して提示されるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、新規な方法の組合せによる分泌タンパク質の同定を含むものである。記載した方法の組合せは、感染細胞中に存在する細菌タンパク質のプロテオーム全体から、細胞内細菌のタンパク質のプロテオームを引くことによって、セクレトーム（分泌タンパク質の集合物）を構成させる。
【００２０】
細菌のタンパク質は、真核生物のタンパク質合成に対する阻害剤の存在下でパルス標識し、次いで、２次元ゲル電気泳動を行ない、オートラジオグラフィーを行なうことによって、選択的に可視化することができる。精製した細菌からのタンパク質プロファイルは、感染細胞の全溶解物のタンパク質プロファイルに匹敵し、異なるイメージに存在するタンパク質スポットであるセクレトームは、感染細胞の全溶解物を載せたゲルから、高度な質量分析法によって同定する。
【００２１】
同定した分泌タンパク質は、優れたＴ細胞エピトープであることが予想されるペプチド配列を得るために、高度な人工神経回路網によってさらに分析する。
【００２２】
さらに、その代謝回転が宿主細胞のプロテアソームの阻害剤によって遅くなる、タンパク質が選択される。なぜならこれらのタンパク質は、宿主細胞のプロテアソームに非常に分解されやすく、宿主細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ抗原として非常に提示されやすいからである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
ワクチン候補タンパク質及びエピトープを同定するための他の戦略と比較すると、本発明は候補の数をより限定し、これは新規な方法の組合せによってのみ達成することができる。
【００２４】
本発明は、以下の観察事項に基づくものである。
・細胞内細菌から宿主細胞に分泌されるタンパク質は、精製した細菌には存在しないが、感染細胞の溶解物全体中には存在する。
・精製した細菌、及び感染細胞の溶解物全体の２次元タンパク質プロファイルは、細菌タンパク質の特異的なパルス標識を使用して、２次元ゲル電気泳動により可視化することができる。
・精製した細菌の２次元タンパク質プロファイルを、宿主細胞中に存在する細菌タンパク質の２次元タンパク質プロファイルから差し引くことにより、質量分析法による分泌タンパク質の同定が可能になる。
・細胞内細菌から分泌されるタンパク質は、宿主細胞のプロテアソームによってプロセッシングされ、Ｔ細胞を活性化させることができるＭＨＣクラスＩ抗原を生成させる可能性がある。
・分泌タンパク質は、真核生物プロテアソームの阻害剤の添加に応答して長期の代謝回転を示し、宿主細胞の表面に提示される可能性がある。このようなタンパク質の同定は、２次元タンパク質プロファイルを分析することによって可能である。
・ＭＨＣクラスＩ複合体に関して高い親和性を有するペプチドを認識するように調整した人工神経ネットワークによって、Ｔ細胞エピトープを予測することができる。
【００２５】
以下の定義を、本発明に関して使用する。
【００２６】
（定義）
セクレトーム
細胞内細菌から分泌される可能性が非常に高いタンパク質。
【００２７】
（ＩＩＩ型）分泌亜群
他の生物体からのＩＩＩ型分泌遺伝子と有意に相同性がある遺伝子を有する、一群のクラミジア遺伝子。
分泌群の定義は、他の細菌（たとえば、サルモネラ、シゲラ、エルシニア）中でのＩＩＩ型の分泌と関連がある遺伝子との相同性が知られている任意の遺伝子と、４つの遺伝子まで異なる既知又は未知の機能を有するＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の集合を意味する。
【００２８】
プロテアソーム阻害剤
活性化した２６Ｓ真核生物プロテアソームのタンパク質分解活性を、可逆的又は不可逆的に阻害することができる、化学合成された、あるいは天然に存在する化合物。
当業者は、プロテアソームのタンパク質分解活性は、いくつかの異なる活性（たとえば、大きな疎水性残基の後ろを切断するキモトリプシン様活性、塩基性残基の後ろを切断するトリプシン様活性、酸性残基の後ろを切断するポストグルタミルヒドロラーゼ活性、分岐鎖アミノ酸の後ろを優先的に切断するＢｒＡＡＰ、小さな中性アミノ酸のサブユニットの後ろを切断するＳＮＡＡＰ）を含むことを理解するであろう。プロテアソームを阻害することが知られているいくつかの化合物は市販されており、殆どが細胞透過性ペプチド系の阻害剤（たとえば、ペプチドアルデヒド、ペプチドビニル（ｖｉｎｏｌ）スルホン）である。ペプチド系の阻害剤は、遷移状態の類似体として機能して、プロテアソームの活性部位と付加体を形成し、その一方、天然に存在するクラスト−ラクタシスチン−β−ラクトンは、プロテアソームサブユニットの活性部位の不可逆的な改変によって、プロテアソーム阻害効果を発揮する。これらの化合物及びその組合せを使用すれば、プロテアソーム機能及びＭＨＣクラスＩ抗原のプロセッシングを首尾よく阻害できる可能性がある（たとえば、ＭＧ１１５、ＭＧ１３２、ＭＧ２６２、ＰＳＩ、クラスト−ラクタシスチン−β−ラクトン、エポキシマイシン）。プロテアソーム阻害剤の適用は、パルス標識又は追跡を行う前、その最中、あるいはその後に、クラミジアの発生サイクル中の何れの時点でも行うことができる。
【００２９】
宿主細胞
宿主細胞とは、細胞内細菌によって感染させることができる真核生物細胞である。
当業者は、上皮細胞系（たとえば、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ−２、ＢＨＫ細胞）又は固定化単核細胞系（たとえば、Ｕ−９３７）を含む広範囲の固定化細胞系が、クラミジアによる感染に適した宿主であることを理解するであろう。固定化宿主細胞は天然に存在する癌腫から、あるいは発癌性遺伝子を保有し、無制限の細胞分裂及び増殖をもたらすウイルス（たとえばＳＶ４０）を用いた、初代細胞の形質転換によって得ることができる。宿主細胞の定義は、初代の上皮性又は内皮性哺乳動物細胞系も含み、これらは生きている哺乳動物から、あるいは剖検によって得ることができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて限られた時間増殖させることができ、器官の細胞の培養物であってよい。
【００３０】
遺伝的に改変された宿主細胞
当業者は、適切な宿主細胞として、クラミジアワクチンの開発過程と関連がある遺伝子、たとえば、プロテアソームのサブユニットをコードする遺伝子、又はＭＨＣクラスＩの提示と関連がある機能的に重要なタンパク質をコードする他の遺伝子を過剰発現又は抑制するために、遺伝的に改変されている宿主細胞も含まれることを理解するであろう。
【００３１】
プロテアソーム
プロテアソームは、非リソソームタンパク質分解の主な酵素複合体であり、多くの律速酵素、転写調節物質及び重要な調節タンパク質の迅速な分解を触媒する、ＡＴＰ依存性タンパク質分解経路の必須成分である。
真核生物では、異常なタンパク質、凝集した、折りたたまれていない、若しくは正常な宿主細胞のタンパク質、及び宿主細胞中に存在する細胞内細菌由来のタンパク質を迅速に除去することが必要である。高等な真核生物のプロテアソームは、タンパク質をペプチドに分解するＭＨＣクラスＩ抗原のプロセッシングと非常に関連があり、ペプチドはＴ細胞エピトープとして提示されるために宿主細胞の表面に送達される。
【００３２】
パルス標識
タンパク質の標識とは、放射性同位体（たとえばＬ−［３５Ｓ］−メチオニン、Ｌ−［メチル−３Ｈ］−メチオニン、Ｌ−［メチル−１４Ｃ］−メチオニン、［３５Ｓ］−シスチン、［３Ｈ］−トリプトファン又はこれらの組合せ）を含むアミノ酸を、宿主細胞のタンパク質合成を真核生物のタンパク質合成に対する充分な濃度の阻害剤を使用して阻害する一定の時間内（たとえば０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間）で、細菌タンパク質中に組み込ませることを意味する。
標識は、クラミジアの発生サイクルを通して行うことができる。標識培地は、感染細胞が増殖する最中に、宿主細胞と病原体の両方の増殖を可能とするように、栄養素を充分豊富にしなければならない。宿主細胞のタンパク質合成の阻害は、標識時間中に、シクロヘキサミド又は他の宿主細胞のタンパク質合成に対する阻害剤（たとえばエメチン）を加えることによって行うことができ、タンパク質を合成する細胞内細菌中のみへ、放射性アミノ酸の取り込みを可能にする効果がある。細胞透過性のタンパク質分解に対する阻害剤を、標識時間中に増殖培地に加えることによって、タンパク質分解を延長させることができる。本発明は放射性標識体の使用に限らないことを注意しなければならない。
【００３３】
パルス追跡
標識タンパク質をその合成後に追跡することによって、代謝回転時間、たとえば、標識時間中に合成されたタンパク質の量が好ましくは７５％を超えて（たとえば、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％）低下する時間を評価することができる。この評価は、追跡時間の前後で、ゲル中の所定タンパク質スポットの光学密度を測定することによって行い、これによって、どのくらいの長い時間、タンパク質が感染細胞中に存在するかが明らかになる。追跡は、標識培地を、放射性アミノ酸を含まない増殖培地に置換し、標識後の異なる時点で感染細胞を採取することによって行う。追跡は、標識後の時間を変えて行ない（たとえば、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、７２時間）、標識後のさまざま時点で、どのくらいの長い時間、タンパク質が感染細胞中に存在するかを決定することができる。あるタンパク質の成熟形は、プロペプチドからプロセッシングされることがあり、その結果、追跡時間中に検出量の低下と引き換えに当該成熟形が蓄積する。このような状況下では、追跡時間中の分解を可視化できる前に、成熟タンパク質が蓄積する可能性がある。タンパク質が分解する時間は、細胞透過性であるタンパク質分解の阻害剤を追跡中に増殖培地に加えることによって、延長させることができる。
【００３４】
溶解バッファー
本発明において使用する溶解バッファーは、２次元ゲル電気泳動の前に、感染細胞を溶かしタンパク質を可溶化するために使用されるバッファーである。
【００３５】
溶解バッファーは、９Ｍの尿素、４％ｗ／ｖの３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ；Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、４０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、６５ｍＭのＤＴＥ、及び２％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３〜１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む。高分子量で疎水性のタンパク質を濃縮するために、溶解用バッファーは、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％ｗ／ｖの３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、４０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、６５ｍＭのジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、及び２％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３〜１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を選択的に含ませてもよい。
【００３６】
ある特定のタンパク質の溶解度を増大させるために、溶解バッファーを変え得ることは理解される（たとえばチオ尿素は、疎水性で高分子量であるタンパク質の溶解度を増大させることができるであろう）。
【００３７】
分泌エフェクタータンパク質
分泌エフェクタータンパク質という用語は、細菌によって宿主細胞の細胞質又は細胞内オルガネラに分泌される、タンパク質を意味する。
分泌エフェクタータンパク質は、宿主／病原体の関係に対して多大な影響を有している可能性があり、宿主細胞の細胞質におけるその存在により、プロテアソームに標的にされ、宿主細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ抗原として提示される可能性がある。分泌エフェクタータンパク質は、文献に記載されているいくつかのＳｅｃ依存又は独立系（たとえばＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型）の１つによって分泌されるものと思われる。
【００３８】
細胞内細菌
真核生物の宿主細胞内で感染し増殖する能力を有する細菌（たとえばクラミジア、サルモネラ、シゲラ、リステリア、レジオネラ、エルニシア）。
この定義は、真核生物の宿主細胞を使用してのみ生存及び増殖することができることを意味する偏性の細胞内細菌、あるいは細胞外及び細胞内環境の両方で生存することができることを意味する通性の細胞内細菌である、細胞内細菌を含む。
【００３９】
基本小体（ＥＢ）
超遠心分離によって精製し、電子顕微鏡によって直径約３００ｎｍであり凝縮核を有するとして特徴付けした、クラミジア細菌の集合体。
【００４０】
網状体（ＲＢ）
超遠心分離によって精製し、電子顕微鏡によって直径約１０００ｎｍであり正常な細菌の核を有するとして特徴付けした、クラミジア細菌の集合体。
【００４１】
分析ゲル
タンパク質を可視化するのに必要な量のタンパク質サンプルが載せられた、２次元ＰＡＧＥゲル。本明細書で記載した実施例において分析目的で適用された量は、典型的には２００．０００〜３００．０００計数毎分（ｃｐｍ）であり、染色ゲル（たとえば銀染色、クーマシー染色）では＞１００μｇタンパク質である。
【００４２】
有意に低下した強度／量
二次元ＰＡＧＥゲル上に局在する所定スポットの全領域の平均光学密度において、好ましくは１０％を超える（たとえば２０％、３５％、５０％、６５％、８０％、９０％、１００％）再現性のある検出可能な低下。
【００４３】
有意に増大した強度／量
二次元ＰＡＧＥゲル上に局在する所定スポットの全領域の平均光学密度において、好ましくは１０％を超える（たとえば２０％、３０％、４５％、６０％、７５％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％以上）再現性のある検出可能な増大。
【００４４】
調製用ゲル
本明細書で記載した同定法（たとえばＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ、エドマン分解法）の１つによって、特異的なタンパク質スポットを同定するのに必要な量のタンパク質サンプルを載せた、二次元ＰＡＧＥゲル。
典型的には＞５００μｇを、使用する固定ｐＨ勾配に応じて、調製目的でゲルに載せる。本発明において使用する調製用ゲルの定義は、ＰＶＤＦ膜上に、非固定であるか又は染色プロトコル（たとえば銀染色、クーマシー染色）を使用して固定されている、あるいはエレクトロブロッティングされている、タンパク質を有するゲルを含む。非標識タンパク質と共に分離されるバックグラウンド量の標識タンパク質を調製用ゲルに適用することによって、調製用ゲル上のタンパク質を目に見えるようにすることが可能である。このようなゲルと分析ゲルを比較して、目的のタンパク質を正確に取り出すことも可能である。
【００４５】
ワクチン候補
本発明の方法によって得られる結果に基づいて、潜在的に細胞内細菌から分泌されるタンパク質。
分泌タンパク質は、宿主細胞のプロテアソームによる分解を受けやすいため、これらのタンパク質に由来するペプチドが、感染細胞の表面上でＭＨＣクラスＩ抗原として提示される可能性があり、かくしてＴ細胞によって認識可能となる。したがって、このようなタンパク質は、細胞内細菌に対するワクチンの開発に関する明白な標的であろう。ワクチン候補として記載したタンパク質は、診断試験の成分として有用でもある。
【００４６】
ワクチン
本発明においてワクチンという用語は、適応免疫（体液性又は細胞性）を誘導することができる免疫原組成物として、広い意味で理解すべきである。
適応免疫を誘導することができるワクチン候補は、溶液、懸濁液又は乳濁液のいずれかの形態において、注射可能物質として、動物又はヒト受容対象に投与することができる。免疫原組成物の活性成分であるワクチン候補は、受容対象に注射する前に、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの、薬剤として許容される賦形剤と混合することができる。注射は異なる方法で行うことができる（たとえば皮下に、あるいは筋肉内に）。ワクチン候補は、ｉ）その完全長の、あるいはｉｉ）、免疫原断片、たとえばＴ細胞エピトープを与えるための起源としての、ワクチンを供給することができる。特定のタンパク質又はペプチドを単独で、あるいは他のタンパク質又はペプチドと組み合わせて、動物又はヒト受容対象に投与し、ワクチンとして寄与させ得ることは認知されている。
【００４７】
さらに、ワクチン候補タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ベクター中でクローニングさせることができ、これを注射によって動物又はヒト受容対象中に導入することができる。ＤＮＡ断片はたとえば筋肉細胞によって取り込まれ、プロモーターの制御下で発現し、真核生物中で活性化するであろう。このいわゆるＤＮＡワクチンにおいて、発現したＤＮＡ断片は、免疫系を刺激することができる。
【００４８】
ＭＨＣクラスＩ抗原
主要組織適合性クラスＩ抗原は、宿主細胞の細胞質に曝されているタンパク質由来のペプチドを含み、小胞体中のヘテロ二量体型ＭＨＣクラスＩ分子に結合しており、（ヒトの）ＨＬＡ複合体の溝中で結合した細胞の表面上で提示され、この場合に、この抗原がＴ細胞エピトープとして働くことができる。大部分のＭＨＣクラスＩ提示ペプチドは、宿主細胞の細胞質中で活性化２６Ｓプロテアソームによってプロセッシングされた、タンパク質に由来する。
【００４９】
ＨＬＡ
ヒト白血球抗原、ヒトの主要組織適合性複合体の名称。
【００５０】
Ｔ細胞エピトープ
細胞の表面上の二量体型ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、特定の細胞傷害性Ｔ細胞の受容体によって認識されることができ、典型的には８〜１０個のアミノ酸からなる、短い長さのペプチド。
【００５１】
全細胞溶解物
事前の精製又は分別なしで、溶解バッファー中に直接採取した感染宿主細胞。
全細胞溶解物は、クラミジアの発生サイクル中の任意の時点で得ることができ、全細胞溶解物は、細菌由来のタンパク質を含めて、感染宿主細胞中に存在するすべてのタンパク質の混合物を含むであろうことが理解される。
【００５２】
精製した細菌
感染細胞から精製した細菌。
一例としてクラミジアを使用する場合では、クラミジアを採取する発生サイクル中の時点に応じて、密度勾配超遠心分離法によって、クラミジアのＲＢとＥＢの両方、並びに中間形を精製することが可能である。純度は、電子顕微鏡法によって測定することができる。本発明において、非常に豊富な宿主細胞のタンパク質（たとえばアクチン、βチューブリン、αチューブリン、カルレチキュリン）への混入による、ゲル上に存在するすべてのタンパク質の全体の光学密度に対する貢献を評価することによって、純度は銀染色された二次元ゲル上でも容易に確認される。
【００５３】
同定したタンパク質
質量分析又はエドマン分解法に基づく同定法を使用して同定したタンパク質の名称を、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔの利用可能で以下のものに公開されているｈｔｔｐ：／／ｓｏｃｒａｔｅｓ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ：４２３１／中の遺伝子に関して使用したものに従い且つこれと適合性がある命名法に従って示した。
ｉ）Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、Ｒ．Ｓ．、Ｋａｌｍａｎ、Ｓ．、Ｌａｍｍｅｌ、Ｃ．、Ｆａｎ、Ｊ．、Ｍａｒａｔｈｅ、Ｒ．、Ａｒａｖｉｎｄ、Ｌ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｗ．、Ｏｌｉｎｇｅｒ、Ｌ．、Ｔａｔｕｓｏｖ、Ｒ．Ｌ．、Ｚｈａｏ、Ｑ．、Ｋｏｏｎｉｎ、Ｅ．Ｖ．、Ｄａｖｉｓ、Ｒ．Ｗ．（１９９８）ヒト、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの真性細胞内病原体のゲノム配列（Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｓ：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：７５４〜７５９
ｉｉ）Ｋａｌｍａｎ、Ｓ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｗ．、Ｍａｒａｔｈｅ、Ｒ．、Ｌａｍｍｅｌ、Ｃ．、Ｆａｎ、Ｊ．、Ｈｙｍａｎ、Ｒ．Ｗ．、Ｏｌｉｎｇｅｒ、Ｌ．、Ｇｒｉｍｗｏｏｄ、Ｊ．、Ｄａｖｉｓ、Ｒ．Ｗ．、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、Ｒ．Ｓ（１９９９）。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの類似したゲノム（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ａｎｄ  Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．）Ｎａｔ  Ｇｅｎｔ．２１：３８５〜３８９
【００５４】
ＥＬＩＳＰＯＴ
ＥＬＩＳＰＯＴ法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗原を用いて刺激したＴ細胞を、抗サイトカイン（たとえばＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ）抗体で事前にコーティングしたマイクロタイターウエル中でインキュベートする。インキュベーション時間の後に、活性化Ｔ細胞周辺のサイトカインの局所的な産生を、ホースラディッシュペルオキシダーゼアルカリペルオキシダーゼなどの酵素に結合した二次抗体を加えることによって、可視化することができる。サイトカインの産生の評価は、酵素によって着色物質に転換され、したがってサイトカイン産生細胞を可視化することができる基質を、最後に加えることによって行う。
【００５５】
アジュバント
アジュバントは、哺乳動物受容対象の免疫応答を誘導することができる、特異的な免疫原を含む乳濁液を意味する（たとえばフロイントのアジュバント）。アジュバント及び免疫原は、乾燥細菌又は細菌生成物などの成分で補うことができ、これによって免疫処置した哺乳動物の免疫応答が高められるであろうことが理解される。また、リンホカイン（たとえば、ＩＦＮｇ、ＩＬ１２）又はポリＩ：Ｃなどの免疫調節物質を、免疫原及びアジュバントと共に投与することもできる。
【００５６】
血清変換
抗原に対する応答による、異なるクラス又はサブクラスの抗体の出現。
【００５７】
ミクロ免疫蛍光法（ＭＩＦ又はミクロ−ＩＦ）
免疫蛍光顕微鏡による、固定細菌又はタンパク質に対する抗体を測定するアッセイ。
【００５８】
免疫原性
ヒト又は動物に注射することによって適応免疫を誘導することができる場合、タンパク質又はペプチドは免疫原性である。
【００５９】
（発明の詳細な説明）
全細胞溶解物及び精製した細菌における、二次元ＰＡＧＥによるタンパク質プロファイルの比較
全感染細胞には存在するが精製した細菌には存在しないタンパク質は、細菌、たとえばクラミジアから分泌されていた可能性がある。したがって、本発明の最初の方法は、発生サイクルの異なる時点で標識した感染細胞の全細胞溶解物からの、［３５Ｓ］標識したクラミジアのタンパク質の二次元ＰＡＧＥによるタンパク質プロファイルと、対応する時点で［３５Ｓ］標識した精製細菌の二次元ＰＡＧＥによるタンパク質プロファイルを比較することである。この方法によって、全細胞溶解物のタンパク質プロファイル中には明らかに存在するが、精製した細菌のタンパク質プロファイル中には極僅か検出されるか存在しない、いくつかのタンパク質の検出が可能となる。
【００６０】
これらの研究は、高解像度二次元ＰＡＧＥ（ＩＰＧ）によって、感染後２２〜２４時間で全細胞溶解物で可視化した、合計約６００個のタンパク質スポットから、その強度が基本小体（ＥＢ）中で大幅に低下している、７７のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄタンパク質の存在を解明した。同様に、９１のタンパク質は、感染後５５〜５７時間から標識した全細胞溶解物と精製したＥＢとを比較すると、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０中で強度が大幅に低下していた。
【００６１】
検出し検討を加えたタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄに関しては表Ｉに列挙したタンパク質番号ＤＴ１〜ＤＴ７７で、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関しては表ＩＩに列挙したＣＰ１〜ＣＰ９１で記載した、分子量（Ｍｗ）及び等電点（ｐＩ）を有する。
【００６２】
この方法によって、さらに調査が必要な分泌されている可能性があるタンパク質の概要が与えられる。実施例では、ｉ）全細胞溶解物の標識と対応する時点（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）図１、又は２）全発生サイクル中の各時点（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、図２）のいずれかにおいて標識した、全細胞溶解物と精製ＥＢの比較を示す。
【００６３】
ＲＢを精製することによって、分泌タンパク質とＲＢ特異的タンパク質とを区別することができる。感染細胞の全溶解物のタンパク質プロファイルを、同じ時点において精製したＲＢのタンパク質プロファイルと比較して、分泌タンパク質を同定することができる。この手法では、ＲＢ特異的タンパク質が偽陽性として検出されることはないであろう。調査した時点で合成及び分泌されたタンパク質が、検出されるであろう。タンパク質は、他の時点で合成及び分泌されてもよい。
【００６４】
この方法は、感染直後に分泌されたタンパク質の検出も含み、これは、前の発生サイクル中に合成されているかもしれない。これらのタンパク質は、前の発生サイクル中に標識したＥＢを感染させ、次に全細胞溶解物の二次元ＰＡＧＥによって可視化する。ＥＢがＲＢに分化する前の発生サイクルの初期段階に、サポニンを細胞膜に透過させることによって、宿主細胞の細胞質が得られる［３０，３１］。この時期では破壊されたＲＢからのクラミジアのタンパク質の汚染はないと思われるので、このことが唯一可能となる。
【００６５】
ワクチン候補の同定
調製用二次元ゲルから切除したワクチン候補タンパク質を、高度な質量分析法によって同定する。
【００６６】
切除したスポットは、トリプシンなどの酵素で消化し、これによっていくつかのトリプシンペプチドが生じる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ又は他の手法によって、これらのペプチドの質量が、百万部当たり１００部（ｐｐｍ）より良い精度で決定される。得られた質量は、統計的基礎に基づき分析したタンパク質を同定することができるＭＳ−Ｆｉｔ又はＰｅｐｔｉｄｅ探索ソフトウェアを使用して、データベース中に存在するすべてのタンパク質における理論上のトリプシン切断生成物と整合させる。
【００６７】
全細胞溶解物を載せたゲルからタンパク質スポットを切除するとき、汚染されている宿主細胞のタンパク質が細菌タンパク質と同じ位置に存在する可能性があり、さらに複雑なことに、１つのスポットが２つ以上の細菌タンパク質を含む可能性がある。明白な同定をもたらし得る汚染からの干渉を避けるために、必要な場合は、たとえばＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ又はｐｏｓｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｄｅｃａｙ（ＰＳＤ）を使用して、細菌タンパク質の配列情報を得ることができる。
【００６８】
この方法は、表ＩＩＩ（それぞれＡ及びＢ）中の、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ又はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ＶＲ１３１０からの例によって示されるように、質量分析によって同定されるタンパク質を含む。
【００６９】
したがって、第一の態様では本発明は、細胞内細菌から分泌されるタンパク質を同定するための方法であって、
１）細胞内細菌によって宿主細胞を感染させるステップと、
２）感染細胞中に存在する細胞内細菌を標識するステップと、
３）ａ）感染細胞の全細胞溶解物、及び
ｂ）感染細胞からの精製・溶解された細菌を調製するステップと、
４）ｉ）ステップ３ａ）からの全細胞溶解物と、ｉｉ）ステップ３ｂ）からの精製・溶解細菌との、二次元ゲル電気泳動によるタンパク質プロファイルを比較するステップと、
５）全細胞溶解物中に存在するが、精製した細菌中には存在しないか、あるいは有意に低下した量で存在する、ステップ４）で得たタンパク質スポットを検出するステップと、
６）ステップ５）で選択したスポット中のタンパク質を同定するステップ
とを含む方法に関する。
【００７０】
ワクチン候補のパルス／追跡
この方法の目的は、宿主細胞中で分解される分泌タンパク質を検出することである。同定したワクチン候補タンパク質が宿主細胞内に存在する時間を評価するために、一連のパルス／追跡研究を行う。［３５Ｓ］標識したタンパク質の代謝回転時間を、標識後さまざまな時間でタンパク質を追跡することによって、二次元ゲル上でモニターリングする。代謝回転時間によって、どれだけ速くタンパク質が分解されるか、したがって、どれだけ長くタンパク質が感染細胞中に存在するかに関する、貴重な情報が与えられる。
【００７１】
この方法によって、表Ｉに例示した分泌される可能性があるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質の、推定代謝回転時間が与えられる。
【００７２】
したがって、この本発明の他の態様では、本発明は、細胞内細菌から分泌されるタンパク質を同定するための方法であって、
１）細胞内細菌によって宿主細胞を感染させるステップと、
２）感染細胞中に存在する細胞内細菌をパルス標識するステップと、
３）ステップ２）の後の異なる追跡時間の後に、感染細胞の全細胞溶解物を調製するステップと、
４）ステップ３）で得た異なる追跡時間後に調製した全細胞溶解物の、二次元ゲル電気泳動によるタンパク質プロファイルを比較するステップと、
５）ステップ３）で追跡時間が増大する程少ない量で存在する、ステップ４）で得られたタンパク質スポットを検出するステップと、
６）ステップ５）で選択したスポット中のタンパク質を同定するステップ
とを含む、方法に関する。
【００７３】
プロテアソーム阻害剤と組み合わせたパルス追跡
ワクチンに適した候補の数を限定するために、本発明は、パルス追跡による研究と組み合わせたプロテアソーム阻害剤を用いる方法を含む。これらの実験によって、分泌されるクラミジアタンパク質の代謝回転時間に対する宿主細胞プロテアソームの影響をモニタリングするための、優れたツールが提供される。
【００７４】
ＭＨＣクラスＩ抗原として真核生物細胞の表面上に提示される免疫原性タンパク質は、偏在していなければならず、多機能触媒タンパク質複合体であるプロテアソームのタンパク質分解によって切断されなければならない。プロテアソームは、免疫原性タンパク質を、典型的には８〜１０個のアミノ酸長であるペプチドに切断する。これらのペプチドはＥＲ（小胞体）に運ばれ、そこでヘテロ二量体型ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、その後ＭＨＣ−抗原複合体は細胞の表面に運ばれる。細胞の表面上でＭＨＣ−抗原複合体は、細胞傷害性Ｔリンパ球上の特異的な受容体によって認識される（Ｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ［６．］中に概説されている）。
【００７５】
ペプチドアルデヒドなどの細胞透過性プロテアソーム阻害剤を細胞培養物に加えることによって、真核生物のプロテアソームの活性を阻害し、ＭＨＣクラスＩの提示を妨げることが可能である（Ｒｏｃｋ他、１９９４［３６．］）。プロテアソーム阻害剤を加えることによってその代謝回転時間が延長するクラミジアタンパク質は、おそらく細菌から分泌されており、その後プロテアソームによってプロセッシングされる。さらに、本発明におけるこの点は、宿主細胞中への放出後直ちにプロテアソームで分解されるためプロテアソーム阻害剤の存在下でのみ検出可能となる、クラミジアタンパク質の検出を可能とする。
【００７６】
本発明は、プロテアソーム阻害剤によって影響を受ける、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ＶＲ１３１０というワクチン候補を含む。
【００７７】
タンパク質ＤＴ１、ＤＴ２、ＤＴ３、ＤＴ５、ＤＴ９、ＤＴ１０、ＤＴ１１、ＤＴ１３、ＤＴ１４、ＤＴ３６、ＤＴ４７、ＤＴ５９、ＤＴ６０、ＤＴ６１、ＤＴ６２（以下の表ＩＶに述べるもの）は、追跡時間中にプロテアソーム阻害剤を加えることによってその代謝回転時間が延長する、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのワクチン候補の例である。
【００７８】
本発明は、採取前、標識時間中にプロテアソーム阻害剤で処理したＲＢを、精製する方法も提供する。プロテアソーム阻害剤で処理した精製ＲＢと同時に標識した、プロテアソーム処理した全細胞溶解物を比較することによって、どのタンパク質が宿主細胞の細胞質に分泌され、プロテアソームで分解されるかがさらに解明されるであろう。さらに、これらの実験の宿主細胞系を遺伝的に改変して、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープのプロセッシングの要となる、遺伝子を過剰発現させることができる［３８，３９，４０］（Ｓｉｊｔｓ、２０００、Ｖａｎ  Ｈａｌｌ、２０００、Ｓｈｏｃｋｅｔｔ、１９９５）。このような細胞系を使用することによって、プロテアソーム阻害剤の効果がより顕著になるであろう。したがって本発明は、ＭＨＣクラスＩ抗原の提示と関連がある遺伝子が遺伝的に改変されている、市販の宿主細胞系の使用も含む。
【００７９】
したがって、本発明は、他の態様において、細胞内細菌から分泌されるタンパク質を同定するための方法であって、
１）細胞内細菌によって宿主細胞を感染させるステップと、
２）それぞれプロテアソーム阻害剤の存在下及び不在下で、宿主細胞を培養するステップと、
３）それぞれプロテアソーム阻害剤の存在下及び不在下で培養した、感染細胞中に存在する細胞内細菌を標識するステップと、
４）感染細胞の全細胞溶解物を調製するステップと、
５）それぞれプロテアソーム阻害剤の存在下及び不在下で培養した、感染細胞の全細胞溶解物の二次元ゲル電気泳動によるタンパク質プロファイルを比較するステップと、
６）プロテアソーム阻害剤の存在下で培養した全細胞溶解物中には存在するが、プロテアソーム阻害剤の不在下で培養した全細胞溶解物中には存在しないか、あるいは有意に低下した量で存在する、ステップ５）で得たタンパク質スポットを検出するステップと、
７）ステップ６）で選択したスポット中のタンパク質を同定するステップ
とを含む方法、に関する。
【００８０】
ポリクローナル抗体の生成
本発明は、ワクチン候補に特異的なポリクローナル抗体を提供する。ワクチン候補タンパク質をコードする遺伝子を、たとえばリガンド非依存性クローニング（ＬＩＣ）系を使用してクローニングする。ワクチン候補の配列を含む発現融合タンパク質を使用して、ウサギを免疫処置し、ワクチン候補に特異的なポリクローナル抗体（ＰＡｂ）を含む血清を得る。本発明は、二次元ＰＡＧＥ免疫ブロット法においてＰＡｂを使用して、同時局在化により抗体の正確な特異性を確認するか、あるいは認識されていないイソ型のワクチン候補を同定する。本発明は、免疫ブロット及び同時局在化により、表ＩＩＩに例示したようなワクチン候補の確認／同定を提示する。本発明はＰＡｂを使用して、たとえば間接的な免疫蛍光顕微鏡法によって、ワクチン候補の亜細胞レベルの局在化を決定する。
【００８１】
したがって本発明は、上記の態様の１つも提供し、その方法は、
１）前述の方法のいずれかに従って同定した前記細胞内細菌からのタンパク質に対する抗体を得るステップと、
２）ステップ１）で得た抗体を使用して、細菌を感染させた細胞の全細胞溶解物に二次元ＰＡＧＥ免疫ブロット法を適用するステップと、
３）ステップ２）において反応させたタンパク質スポットを検出するステップと、
４）ステップ３）で選択したスポット中のタンパク質を同定するステップ
とをさらに含む。
【００８２】
４つの態様の組合せも、本発明の一部である。
【００８３】
本発明の方法の好ましい実施形態では、［３５Ｓ］システイン、［３５Ｓ］メチオニン、［１４Ｃ］標識アミノ酸、又はこれらの組合せなどの放射性手段によって、細胞内細菌の標識を行う。
【００８４】
選択したタンパク質スポット中のタンパク質を同定するための方法は、エドマン分解法、又はＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法飛行時間質量分析法）、ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間質量分析法）、ＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳ（ポストソース分解ＭＡＬＤＩ質量分析法）などの任意の質量分析法、又はこのような方法の組合せに基づいて行なうことができる。さらに、タンパク質は、同定に先立って、臭化シアン処理又はヒドロキシルアミン処理などの化学的方法、或いはトリプシン、スリモトリプシン、キモトリプシン、若しくはペプシン、又はこれらの組合せなどの任意の適切な酵素を用いる酵素的方法によって、切断することができる。
【００８５】
細胞内細菌は、通性細胞内細菌又は偏性細胞内細菌であってよく、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｓｉｔａｃｃｉ又はＣ．ｐｅｃｏｒｕｍなどのクラミジア属からの細菌、これらの任意の特定の亜型或いは菌株を含むものが特に関連する。しかしながら、サルモネラ、シゲラ、エルニシア又はリステリアなどの他の細胞内細菌も、本発明に関して興味深いものである。
【００８６】
本発明に従って使用する宿主細胞は、不死化細胞系、たとえばＨｅＬａ、Ｈｅｐ２、ＭｃＣｏｙ又はＵ９３７、哺乳動物ドナーから得たかあるいは剖検によって得た初代細胞系、遺伝的に改変された細胞系、或いは器官細胞の培養物などの当分野で知られている一般的な宿主細胞又は細菌が増殖することができるさらに他の細胞であってよい。宿主細胞は、細胞内細菌による感染の前又はその最中に、ＩＮＦ−γで処理することができ、かつ／あるいは、遺伝的に改変されていて、クラミジアワクチンの開発過程に関連していることが認められている遺伝子を、過剰発現又は抑制することができる。
【００８７】
本発明の方法が１つ又は複数のプロテアソーム阻害剤を使用するとき、ＭＧ１３２、ＭＧ２６２、ＭＧ１１５、エポキシマイシン、ＰＳＩ及びクラスト−ラクタシスチン−β−ラクトンなどの既知の阻害剤が、その使用に適している。
【００８８】
本発明の方法は、その完全長で若しくはその免疫原性断片として、免疫原性組成物中に含めること、及び／又は診断目的に適しているタンパク質、特に免疫原性組成物中に含めることに適した抗原を限定する、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ、より好ましくはＭＨＣクラスＩ拘束性抗原として提示するための候補であるＴ細胞エピトープを含むようなタンパク質の同定に特に関連する。
【００８９】
したがって、本発明の他の重要な態様では、本発明は、特許請求した方法のいずれかによって同定可能なタンパク質、又はその免疫原性断片、好ましくは免疫原性組成物中に含めることに、かつ／あるいは診断目的に適用可能であるような、タンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００９０】
本発明のタンパク質は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから分泌されるタンパク質であってよい。このようなタンパク質は、たとえば、＋／−１０％の平均誤差で決定されるそれぞれ表Ｉ及びＩＩに与える等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）の値を有し、それぞれ表Ｉに与えるＤＴ１〜７７、並びに表ＩＩに与えるＣＰ１〜ＣＰ９１として特徴付けられるタンパク質、及びその免疫原性断片である。
【００９１】
【表１】
2004534526.tif 000001
2004534526.tif 000002
2004534526.tif 000003
2004534526.tif 000004
【００９２】
【表２】
2004534526.tif 000005
2004534526.tif 000006
2004534526.tif 000007
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【００９３】
本発明のより好ましいタンパク質は、表ＩＩＩＡに与えるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質、ＣＴ０１７（遺伝子名ＣＴ０１７：配列番号２２１；タンパク質：配列番号２２２）、ＣＴ０４４（遺伝子名ｓｓｐ：配列番号２２７；タンパク質：配列番号２２８）、ＣＴ２４３（遺伝子名ｌｐｘＤ：配列番号２２３；タンパク質：配列番号２２４）、ＣＴ２６３（遺伝子名ＣＴ２６３：配列番号２３５；タンパク質：配列番号２３６）、ＣＴ２６５（遺伝子名ａｃｃＡ：配列番号２１９；タンパク質：配列番号２２０）、ＣＴ２８６（遺伝子名ｃｌｐＣ：配列番号２２９；タンパク質：配列番号２３０）、ＣＴ２９２（遺伝子名ｄｕｔ：配列番号２１５；タンパク質：配列番号２１６）、ＣＴ４０７（遺伝子名ｄｋｓＡ：配列番号２１１；タンパク質：配列番号２１２）、ＣＴ４４６（遺伝子名ｅｕｏ：配列番号２０７；タンパク質：配列番号２０８）、ＣＴ４６０（遺伝子名ＳＷＩＢ：配列番号２０３；タンパク質：配列番号２０４）、ＣＴ５４１（遺伝子名ｍｉｐ：配列番号２０９；タンパク質：配列番号２１０）、ＣＴ６１０（遺伝子名ＣＴ６１０：配列番号２０１；タンパク質：配列番号２０２）、ＣＴ６５０（遺伝子名ｒｅｃＡ：配列番号２２５；タンパク質：配列番号２２６）、ＣＴ６５５（遺伝子名ｋｄｓＡ：配列番号２１７；タンパク質：配列番号２１８）、ＣＴ６６８（遺伝子名ＣＴ６６８：配列番号１９５；タンパク質：配列番号１９６）、ＣＴ６９１（遺伝子名ＣＴ６９１：配列番号２３３；タンパク質：配列番号２３４）、ＣＴ７３４（遺伝子名ＣＴ７３４：配列番号２１３；タンパク質：配列番号２１４）、ＣＴ７８３（遺伝子名ＣＴ７８３：配列番号１９７；タンパク質：配列番号１９８）、ＣＴ８５８（遺伝子名ＣＴ８５８：配列番号１９９；タンパク質：配列番号２００）、ＣＴ８７５（遺伝子名ＣＴ８７５：配列番号２３１；タンパク質：配列番号２３２）、又はＯＲＦ５（遺伝子名ＯＲＦ５：配列番号２０５；タンパク質：配列番号２０６）としてＣｈｌａｍｙｄｉａ  Ｇｅｎｏｍｅプロジェクト中の対応する遺伝子番号により同定されるタンパク質、あるいはタンパク質名ＤＴ８によって同定されるタンパク質など、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質、表ＩＩＩＢに与えるＣＰＮ０１５２（遺伝子名ＣＰＮ０１５２：配列番号２４９；タンパク質：配列番号２５０）、ＣＰＮ０７０２、ＣＰＮ０７０５（遺伝子名ＣＰＮ０７０５：配列番号２４５；タンパク質：配列番号２４６）、ＣＰＮ０７１１（遺伝子名ＣＰＮ０７１１：配列番号２６３；タンパク質：配列番号２６４）、ＣＰＮ０９９８（遺伝子名ｆｔｓＨ：配列番号２３９；タンパク質：配列番号２４０）、ＣＰＮ０１０４（遺伝子名ＣＰＮ０１０４：配列番号２５５；タンパク質：配列番号２５６）、ＣＰＮ０４９５（遺伝子名ａｓｐＣ：配列番号２４７；タンパク質：配列番号２４８）、ＣＰＮ０６８４（遺伝子名ｐａｒＢ：配列番号２５１；タンパク質：配列番号２５２）、ＣＰＮ０７９６（遺伝子名ＣＰＮ０７９６：配列番号２４３；タンパク質：配列番号２４４）、ＣＰＮ０４１４（遺伝子名ａｃｃＡ：配列番号２５３；タンパク質：配列番号２５４）、ＣＰＮ１０１６（遺伝子名ＣＰＮ１０１６：配列番���２３７；タンパク質：配列番号２３８）、ＣＰＮ１０４０（遺伝子名ＣＰＮ１０４０：配列番号２４１；タンパク質：配列番号２４２）、ＣＰＮ００７９（遺伝子名Ｒｌ１０：配列番号２５７；タンパク質：配列番号２５８）、ＣＰＮ０５３４（遺伝子名ｄｋｓＡ：配列番号２５９；タンパク質：配列番号２６０）、ＣＰＮ０６１９（遺伝子名ｎｄｋ：配列番号２６１；タンパク質：配列番号２６２）、ＣＰＮ０７１１（遺伝子名ＣＰＮ０７１１：配列番号２６３；タンパク質：配列番号２６４）、ＣＰＮ０６２８（遺伝子名ｒｓ１３：配列番号２６５；タンパク質：配列番号２６６）、ＣＰＮ０９２６（遺伝子名ＣＰＮ０９２６：配列番号２６７；タンパク質：配列番号２６８）、ＣＰＮ１０６３（遺伝子名ｔｐｉＳ：配列番号２６９；タンパク質：配列番号２７０）、又はＣＰＮ０３０２（遺伝子名ｌｐｘＤ：配列番号２７１；タンパク質：配列番号２７２）として、対応する遺伝子番号により同定されるタンパク質など、及びその免疫原性断片である。
【００９４】
【表３】
2004534526.tif 000009
2004534526.tif 000010
【００９５】
【表４】
2004534526.tif 000011
【００９６】
図１０中に示すタンパク質ＤＴ４、ＤＴ２３、ＤＴ４７、ＤＴ４８、ＤＴ７５、ＤＴ７６及びＤＴ７７、及び図１１中に示すタンパク質ＣＰ３４、ＣＰ３７、ＣＰ４６（配列番号２４４）、ＣＰ４７、ＣＰ５２、ＣＰ６３及びＣＰ７５は、非常に関連がある。本発明のさらに好ましいタンパク質は、プロテアソーム阻害剤の存在下で長い代謝回転時間を有し、＋／−１０％の平均誤差で決定される表ＩＶに与えたタンパク質ＤＴ１、ＤＴ２、ＤＴ３、ＤＴ５、ＤＴ９、ＤＴ１０、ＤＴ１１、ＤＴ１３、ＤＴ１４、ＤＴ１７、ＤＴ４７、ＤＴ５９、ＤＴ６０、ＤＴ６１又はＤＴ６２の１つの等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）特性を有することによって特徴付けられるタンパク質である、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質である。同様にプロテアソーム阻害剤によって制御されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのタンパク質も、本発明の好ましい実施形態である。
【００９７】
【表５】
2004534526.tif 000012
【００９８】
本発明の他の好ましいタンパク質は、特許請求の範囲で定義する、配列番号１の配列を含むＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのポリペプチドＤＴ８、及びその免疫原性断片である。
【００９９】
本発明のこの態様の他の好ましい実施形態では、このタンパク質は、本発明のタンパク質又はその断片と、少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、あるいはそれは、本発明のタンパク質の少なくとも７個の連続したアミノ酸を含む。
【０１００】
本発明の他の態様においては、それは本発明のタンパク質又はその免疫原性断片をコードする配列を含む、核酸化合物に関する。
【０１０１】
好ましい核酸化合物は、配列番号１の配列を含むポリペプチドＤＴ８をコードする配列（配列番号２）を含む、核酸化合物である。
【０１０２】
他の態様では本発明は、本発明の核酸化合物を含むベクター、及びこのベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞に関する。
【０１０３】
本発明は、前記タンパク質に対する抗体を産生させるための本発明のタンパク質又はその免疫原性断片の使用、細胞内細菌に対する抗体を産生させるための方法であって、本発明のタンパク質又はその免疫原性断片を産生動物に投与し、かつ抗体をそこから精製する方法、及びこの方法によって得ることができる抗体も提供する。
【０１０４】
さらに、他の態様では本発明は、本発明のタンパク質又はその断片を含む薬剤組成物又は診断組成物、本発明の抗体又は核酸化合物、及び診断試薬の調製における、タンパク質又はその断片、抗体又は核酸化合物の使用を提供する。
【０１０５】
ワクチン候補からのＴ細胞エピトープの同定
本発明は、本発明において同定したタンパク質の配列からコンピュータに基づく方法によって予測されるように、あるいは実施例中にさらに記載するようなアッセイにより実験的によって決定されるように、ＭＨＣクラスＩ抗原として表面に露出しておりＴ細胞刺激効果を有する可能性がある、Ｔ細胞エピトープを提供する。
【０１０６】
したがって、本発明の他の重要な態様は、ＭＨＣクラスＩ抗原として表面に提示されておりＴ細胞刺激効果を有する可能性がある、ペプチドエピトープである。このことに従って、本発明は、細胞内細菌からの分泌タンパク質上のＴ細胞エピトープを同定するための方法であって、本発明の方法によって同定したタンパク質又はその免疫原性断片、及びペプチドエピトープに関する、コンピュータによる予測、ＭＨＣクラス分子の結合アッセイ及び／又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどのステップを含む方法を提供する。この態様の一部として、本発明は、前記ペプチドエピトープをコードする配列を含む核酸化合物、及び核酸化合物を含むベクター、及び前記ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞も提供する。
【０１０７】
本発明の好ましいペプチドエピトープは、本発明のタンパク質の４〜２５個の連続したアミノ酸、好ましくは６〜１５個、さらに好ましくは７〜１０個のアミノ酸を含む。
【０１０８】
本発明のより好ましい実施形態では、エピトープは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ又はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質の７〜１０個の連続したアミノ酸を含む。
【０１０９】
本発明の他の好ましいペプチドエピトープは、配列番号１の配列を含むポリペプチドの４〜２５個の連続したアミノ酸、より好ましくは６〜１５個、最も好ましくは７〜１０個のアミノ酸を含む、エピトープである。
【０１１０】
配列番号３〜配列番号４５の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのペプチドエピトープ、配列番号４６〜配列番号１２１の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのペプチドエピトープ、配列番号１２２〜配列番号１４８の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのペプチドエピトープ、及び配列番号１４９〜配列番号１９４の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのペプチドエピトープは、非常に関連がある。同定した本発明のエピトープは、表Ｖ〜ＶＩＩＩでさらに特徴付けする。
【０１１１】
【表６】
2004534526.tif 000013
2004534526.tif 000014
【０１１２】
【表７】
2004534526.tif 000015
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【０１１３】
【表８】
2004534526.tif 000019
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【０１１４】
【表９】
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【０１１５】
ペプチドエピトープは融合タンパク質の一部であるか、あるいは担体成分に結合していてよい。
【０１１６】
ＭＨＣに結合するペプチドを予想するために頻繁に使用される方法は、モチーフ検索に関するものである。最も精巧なモチーフ検索は、ＭＨＣの広がったモチーフを表す完全な母型を使用する。配列と無関係な組合せの特異性は、平均的考慮事項として適切である可能性はあるが、個々のペプチドには適切でないことは確かに知られている。さらに、結晶構造によって、１つのサブサイトでの相互作用が、他のサブサイトでの相互作用に影響を及ぼす可能性があることが実証されている。
【０１１７】
人工神経回路網（ＡＮＮ）は、任意のこのような非線状配列の情報を取り扱い認識するのに非常に適している。情報を調整して、重み付けられた関係によってある構造中ですべてが結びついている入力層、隠れ層及び出力層を有するコンピュータ網に、分配することができる。このようなＡＮＮを調整して、所定の出力（たとえばＭＨＣ結合）と関連がある入力（ペプチド）を認識することができる。ひとたび調整されるとこの網は、結合と適合性がある複雑なペプチドのパターンを認識するはずである。ＡＮＮ手法を使用すると、調整した組のサイズ及び質は非常に重要になる。これはＨＬＡに関して特に当てはまる。なぜなら、わずか１％のランダムなペプチドの組が、任意の所定のＨＬＡに結合するからである。
【０１１８】
したがって、わずか１００例のペプチド結合体を生成するためには、ランダムなペプチドをスクリーニングする場合、約１０，０００個のペプチドの合成及び試験が必要であると思われる。これは非常な供給源を必要とし、調整した組のこの適度な数の結合体においてさえも面倒な事柄であり、さらにこのことは、試験するそれぞれのＨＬＡに関して繰り返さなければならないと思われる。
【０１１９】
したがって、本発明に関しては、母型の予想を使用して、高い親和性で結合する可能性があるエピトープに関する、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／）のデータベースをスキャンした。これらの多数は、生化学的な結合アッセイにおいて合成され試験されてきている。予想されたように、高い親和性の結合体のより高い提示が得られた（約８０％）。これらのデータを次いで使用して、ＡＮＮを調整した。
【０１２０】
試験した４つのＭＨＣクラスＩ分子の４つに関して、母型適合型の断定より優れたＡＮＮを実施した。予想は、「結合体」と「非結合体」の随意の分類ではなく、実際の結合ＩＣ５０値を予想する方式で行った。実際、広範囲の結合体を予想することが可能であり、これが高い親和性の結合体、及び低い親和性の結合体、及び非結合体の同定につながっている。
【０１２１】
本発明は、ワクチンを調製するための本発明のペプチドエピトープの使用、及び本発明のペプチドエピトープを含み、許容可能な賦形剤を場合によっては含むワクチンをさらに含む。
【０１２２】
本発明の他の態様では、本発明は、クラミジア感染などの細胞内細菌による感染を治療又は予防するための薬剤組成物の調製における、又は代替的には、クラミジアなどの細胞内細菌、又は細胞内細菌に対して産生された抗体の存在を検出するための診断試薬の調製における、本発明のタンパク質、本発明の抗体、本発明の核酸化合物、又は本発明のペプチドエピトープの使用に関する。
【０１２３】
本発明は、ヒトの免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的に有効な量の本発明のタンパク質、抗体、核酸化合物、又はペプチドエピトープを前記ヒトに投与することを含む方法、特にＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ又はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓなどの細胞内細菌によるヒトの感染を治療又は予防するための、そのような方法をさらに提供する。
【０１２４】
最後に本発明は、本発明のタンパク質又はその断片、又は本発明のペプチドエピトープをそれぞれ生成させる方法であって、前記タンパク質又はペプチドエピトープをコードする核酸化合物を含むベクターを用いて、宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、又は感染させること、及び宿主細胞による前記タンパク質又はその断片の発現を可能にする条件下で、宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。
【０１２５】
以下の非制限的な実施例によって、本発明をさらに例示する。
【実施例１】
【０１２６】
哺乳動物細胞培養物の感染
半集密的ＨｅＬａ、ＨＥｐ２、又はＭｃＣｏｙ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）の細胞単層を、［１９．］及び［１７．］において前に記載されたように、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ亜型Ａ（ＨＡＲ−１３）、Ｄ（ＵＷ−３／Ｃｘ）又はＬ２．（４３４／Ｂｕ）（ＡＴＣＣ）の、１つの封入体形成単位（ＩＦＵ）を用いて感染させた。感染培地は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ及びＤに関しては、ＲＰＭＩ１６４０、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％ＦＣＳ、１％ｗ／ｖのグルタミン、１０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｌ２．に関しては、ＲＰＭＩ１６４０、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５％ＦＣＳ、１％ｗ／ｖのグルタミン、１０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンからなっていた。
【実施例２】
【０１２７】
パルス標識／追跡
クラミジアのタンパク質を２時間で標識するために、前に記載されたように（Ｓｈａｗ他、１９９９、２０００）［１８．］［１９．］、ＲＰＭＩ１６４０、１０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、４０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド、１００μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］−メチオニン／システイン（Ｐｒｏｍｉｘ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を含む培地において、感染細胞の培養物をインキュベートした。標識後に、標識培地を正常な増殖培地に変え、次に増殖培地で２回洗浄し、標識後の異なる時点で感染細胞を採取した。同様に、２時間の標識時間後に感染後７２時間までクラミジアを増殖させることによって、標識したＥＢタンパク質を得た。次いで標識したＥＢタンパク質を採取し、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｓｃｈａｃｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｙｒｉｃｋ、１９９４中）［２２．］、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋｎｕｄｓｅｎ他、１９９９［１７．］）に関して本質的に記載された、密度勾配超遠心分離法の２つの連続ステップを使用して精製した。ＥＢ調製物及びパルス追跡調製物中のタンパク質は、全細胞溶解物の調製物からのタンパク質と同じ間隔で標識して、正確な二次元ＰＡＧＥによるタンパク質プロファイルの比較を容易にした。
【実施例３】
【０１２８】
サンプル調製
［３５Ｓ］−標識後に、ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、９Ｍの尿素、４％ｗ／ｖの３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ；Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、４０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、６５ｍＭのＤＴＥ、及びＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３〜１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む、標準溶解バッファー中に溶かした。高分子量で疎水性であるタンパク質を濃縮するために、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％ｗ／ｖの３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、４０ｍＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、６５ｍＭのジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、及び２％ｖｏｌ／ｖｏｌのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３〜１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、（Ｈａｒｄｅｒ他、１９９９［２３．］）に本質的に従って使用した。全細胞溶解物又は精製したＥＢを含むサンプルを超音波処理し、１００００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。サンプルは、使用するまで−７０℃で保存した。
【実施例４】
【０１２９】
クラミジアのタンパク質の分離
全細胞溶解物及び精製したＥＢからのクラミジアのタンパク質を、（Ｓｈａｗ他、１９９９、２０００）［１８．］［１９．］中に本質的に記載された、２次元ゲル電気泳動によって分離した。
【０１３０】
第１次元の等電点（ｐＩ）電気泳動に関しては、１８ｃｍ長のｐＨ３〜１０ＮＬ（非線状）、４〜７Ｌ（線状）又は６〜１１（線状）固定化ｐＨ勾配乾燥細片（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ＩＰ  Ｇｐｈｏｒ（商標）を使用して２０℃で１２時間、２００．０００計数毎分（ｃｐｍ）の標識タンパク質を３５０μｌのバッファーに溶かしたサンプル量で再膨潤させた。本発明で使用した他の細片は、超細型ＩＰＧ細片を含む。これらの細片は表ＩＸに記載する。これらの細片によって我々は、必要な場合、当該のタンパク質を含めて、特定のｐＨ間隔に焦点を当てることができる。２０℃における等電点（ｐＩ）電気泳動中の電圧は、以下のようにプログラム化した：３〜１０ＮＬ、４〜７Ｌ及び６〜１１Ｌ乾燥細片を使用するとき、３００Ｖで１時間、３００〜５００Ｖで２時間（直線的増加）、１０００Ｖで１時間、２０００Ｖで１時間、３５００Ｖで３時間及び５０００Ｖで２４時間。
【０１３１】
【表１０】
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【０１３２】
第１次元の等電点（ｐＩ）電気泳動の後に、６Ｍの尿素、３０％ｖ／ｖのグリセロール、２％ｗ／ｖのＤＴＥ、２％ｗ／ｖのＳＤＳ、０．０５ＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ６．８を含むバッファー中で１５分間、乾燥細片を平衡状態にした。次いでこれらの細片を、ＤＴＥを２．５％ｗ／ｖのヨードアセトアミドに交換したバッファー中で、さらに１５分間平衡状態にした。第２次元の等電点（ｐＩ）電気泳動に関しては、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ｘｉ  Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、９〜１６％直線勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１８ｃｍ×２０ｃｍ×１ｍｍ）上でタンパク質を分離した。分析ゲルは、１０％酢酸及び２５％２−プロパノールを含む溶液に３０分間固定し、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて３０分間処理した。標識タンパク質は、−７０℃でＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ−ＭＲフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を感光させた８〜１０日後に、オートラジオグラフィーによって目に見える状態にした。
【０１３３】
図１Ａは、感染後２２〜２４時間から標識したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質の、高解像度分析した３〜１０ＩＰＧ  二次元ゲル（標準溶解バッファーを使用した）のオートラジオグラフィーの一例を示す。図２Ａは、感染後５５〜５７時間から標識したＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質の、３〜１０ＩＰＧ  二次元ゲル（チオ尿素を含む溶解バッファーを使用した）のオートラジオグラフィーの一例を示す。Ｍｅｌａｎｉｅ  ＩＩソフトウェアによって評価されたように、合計約６００個のタンパク質スポットを、それぞれのゲル上で可視化することができた。
【０１３４】
質量分析法による分析用にサンプルを調製するために、二次元ゲルに５００〜１０００μｇの全細胞溶解物を施した。Ｘ線フィルム上の調製用ゲル上でタンパク質を可視化するために、非標識サンプルと平行して増殖させた細胞からの、２×１０６ｃｐｍの［３５Ｓ］−タンパク質標識タンパク質を、同じゲル上に施した。調製用ゲルをｄｄＨ２Ｏ中で１０分間洗浄し、乾燥させ非固定状態にした。乾燥ゲルと対応するＸ線フィルムの正確な整合を感光後に行うことができるように、放射性インクを使用してゲルの両側のアンカースポットに印を付けた。当該のタンパク質を、最小である３つの同一のゲルから切除し１つに集めた。宿主細胞の汚染が質量分析法による同定において問題であった場合、細型又は超細型乾燥細片（表ＩＸ）を使用したゲルを使用して、分離距離を増大させた。
【実施例５】
【０１３５】
ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳ及びＥｄｍａｎ分解を使用する、ワクチン候補の同定
ワクチン候補を表す全細胞溶解物の調製用ゲルからのタンパク質スポットに、トリプシンによるゲル内の消化を施した。生成したペプチドは、逆層カラム（Ｇｏｂｏｍ他、１９９９［２０．］）又はＰｏｒｏｓ  Ｒ２物質からなるビーズ（Ｇｅｖａｅｒｔ他、１９９７［２１．］）を使用して精製した。次にサンプルを、リフレクトロン方式で操作される、Ｂｒｕｋｅｒ  ＲＥＦＬＥＸ  ＭＡＬＤＩ飛行時間質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｋ、ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。生じた質量を、以前に記載した（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏ１９９６［２４．］）ペプチドマッピングによって、データベース中の存在するタンパク質の理論上のトリプシン切断によって生じるペプチドの質量と比較した。
【０１３６】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して、ＤＴ１をＣＴ６６８（配列番号１９６）として同定する一例を図３に示す。図３Ａは、ＭＡＬＤＩ質量分析計によって得られた、ペプチド質量のフィンガープリントを示す。得られた質量は、ＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアＭＳ−Ｆｉｔを使用して、データベース中の存在するすべてのタンパク質の、理論上のトリプシン切断による生成物と整合させた。検索がゲル上に見られるタンパク質近辺の等電点（ｐＩ）／分子量（Ｍｗ）領域に制限される場合、最高位のタンパク質がＣＴ６６８であった（図３Ｂ）。しかしながら、宿主細胞からのタンパク質が時折ゲル及び全細胞溶解物からのスポット中に存在するので、同定は明白である可能性がある。したがって、必要な場合は、タンデム質量分析及びポストソース分解（ＰＳＤ）分析を使用して、結果を立証した（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｍ、１９９５［２５．］、Ｇｅｖａｅｒｔ、１９９７［２１．］中に概説されている）。
【０１３７】
ゲル内での消化によって生じたペプチドのタンデム質量分析は、エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間（ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）で行った。この方法を使用して、１つのイオン化したペプチドを、サンプルから単離することができる。気体雰囲気との衝突によるこの親イオンの断片化によって、いくつかの新しいイオンが生成し、新しいペプチド質量のフィンガープリントに記録された。これらの新しいイオンはただ１つのアミノ酸によってサイズを区別し、これによって元のペプチドのアミノ酸配列の詳細が得られた（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｍ、１９９５）［２５．］。
【０１３８】
図４Ａは、ＢＬＡＳＴ又はＭＳ−Ｔａｇを使用するデータベース検索によってＣＴ６６８（配列番号１９６）の断片に対応することが見出された配列を与える、ＤＴ１からの断片化ペプチドの親イオンの一例を示す。ヒトのプロゲストロン結合タンパク質から生じる配列タグも、ＣＴ６６８サンプルから同定した。
【０１３９】
検索がヒトのタンパク質に制限される場合、このタンパク質からのペプチドも、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるペプチド質量のフィンガープリントにおいて検出することができると思われる（二重矢印、図３Ａ）。これによって、２つ以上のタンパク質を含む問題のあるスポットを、ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦによって明白に同定することができ、したがって問題のあるＭＡＬＤＩ  ＭＳ同定が確認されることが示される。
【０１４０】
ＭＡＬＤＩの結果を確認するために本発明において使用する他の手法は、ＰＳＤであった。ＰＳＤは、イオン化の後に準安定状態での分解を受けたペプチドを使用し、同じ速度のペプチド断片は異なる質量を有し、したがって異なる運動エネルギーを有することが意味される。運動エネルギーの違いは、断片を磁場で示すことによって解明することができる。高エネルギー断片は、低エネルギー断片よりも磁場にさらに浸透し、したがって遅延する。１つのペプチドの細分化から生じるスペクトルを使用して、ペプチド配列タグ（ＰＳＴ）のアミノ酸配列を推定することができる（Ｍａｎｎ他、１９９３）［２８．］。なぜなら、断片化はペプチド結合において主に起こるからである。ＰＳＴはタンパク質のデータベースに対して整合させることができ、したがって、それらが由来するタンパク質を同定することができる（Ｗｉｌｋｉｎｓ他、１９９６［２７．］）。
【０１４１】
ＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって、スポット番号ＣＰ６３をＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）として同定する一例を、図４Ｂに示す。ＰＳＤスペクトル中の合計３６の観察した質量体から１６個を、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）タンパク質と整合した、１９１９．８０Ｄａの親イオン（Ｋ）ＥＬＬＦＧＷＤＬＳＱＱＴＱＱＡＲ（Ｌ）（配列番号２７４）という配列を有する、ペプチドの理論的断片化に由来する質量体に、１質量単位内で整合させることができた。
【０１４２】
質量分析による手法を使用して、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ（表ＩＩＩＡ）及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（表ＩＩＩｂ）のワクチン候補の同定の例が与えられる。分子量（Ｍｗ）及び等電点（ｐＩ）の値は、電気泳動によって＋／−１０％の平均誤差で決定した。
【０１４３】
ＣＴ８５８（配列番号２００）は６７ｋＤａという理論上の分子量（Ｍｗ）を有しており、これによって同定されたこのタンパク質は、より大きなタンパク質のプロセッシングされた断片であったことが示される。実際、ＤＴ４のＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ分析からの３つのペプチドすべてが、タンパク質のＣ末端部分に位置していた。
【０１４４】
ゲルの塩基性領域中に位置していた他のスポット、ＤＴ４８もＣＴ８５８（配列番号２００）を含んでいた。ＤＴ４８がＣＴ８５８（配列番号２００）として同定された、すべてのペプチドが、タンパク質のＮ末端部分と整合しており、ＤＴ４８がＣＴ８５８のＮ末端断片を表すことが示唆される。
【０１４５】
ＣＴ６１０（配列番号２０２）は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＤとＬ２の両方において、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ及びＥｄｍａｎ分解によって、ＥＢから同定された。しかしながら、タンパク質は全細胞溶解物と比較してＥＢ中では大幅に低下しており、したがってワクチンの候補であると依然としてみなされた。Ｅｄｍａｎ分解によるＣＴ６１０（配列番号２０２）の同定は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｌ２  ＣＴ６１０（配列番号２０２）から行った。そのＮ末端はＭＮＦＬＤＱであると決定し、これはＣｈｌａｍｙｄｉａ  Ｇｅｎｏｍｅプロジェクト（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ他、１９９８ｂ）［３５．］から予想された、ＭＭＥＶＦＭＮＦＬＤＱ配列とは異なる。
【０１４６】
ＥＳＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって生成した４つの配列タグに基づいて、ＤＴ８を同定した。これらの配列は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのゲノム中の、いかなる予想されたオープンリーディングフレームにも対応しなかった［３５．］。しかしながら、ＢＬＡＳＴによって６つすべてのリーディングフレーム中のクラミジアのゲノムを検索することによって、４つすべての配列タグに関して相当な整合性を生み出すことができると思われる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列、及びその周辺を分析することによって、７．２ｋＤａのタンパク質を含む、リボゾーム結合部位を含む新規なオープンリーディングフレームが解明された。翻訳されたＤＴ８（配列番号１）のＤＮＡ配列を、図５に示す。この発見によって、どのようにして本発明で使用した質量分析手法が、大きなゲノム配列決定プロジェクトでは無視される可能性がある、ワクチン候補をコードするおそらく重要なＯＲＦを同定することができるかが例証される。
【０１４７】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのスポットＣＰ６３は、ＣＰＮ１０１６、ＣＴ８５８（配列番号２００）のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ相同体のＮ末端断片として同定し（図２Ｂ及びＣ、表ＩＩＩＢ）、両方のクラミジア種におけるこれらのタンパク質のプロセッシングが示される。
【０１４８】
以下の実施例では、同定したタンパク質のいくつかの例の性質の、より詳細な調査を示す。
【実施例６】
【０１４９】
感染細胞の全溶解物と精製したＲＢの比較
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ又はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに感染した細胞を、実施例２に記載したように、シクロヘキシミドの存在下で２時間、［３５Ｓ］−メチオニン／システインで標識した。標識時間の終わりに感染細胞を、実施例３に記載したように溶解バッファー中で直接採取した、あるいはクラミジアのＲＢをすぐに精製するために使用した。ＲＢの精製は、Ｓｃｈａｃｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｙｒｉｃｋ、１９９４［２２．］によって本質的に記載された、密度勾配超遠心分離法によって行った。
【０１５０】
図１０では、感染後２２〜２４時間から標識した感染ＨｅＬａ細胞の全溶解物からの、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質のゲル画像からの領域のいくつかの例を、感染後２２〜２４時間から標識したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄに感染したＨｅＬａ細胞から精製した、ＲＢ及びＥＢのゲル画像からの対応する領域と比較する。質量分析による同定を、表ＩＩＩに挙げた、ＤＴ４（ＣＴ８５８のＣ末端断片（ＣＴ８５８の配列は、配列番号２００の配列である））、ＤＴ４８（ＣＴ８５８のＮ末端断片配列番号２００の配列である））、ＤＴ２３（Ｍｉｐ；配列番号２１０）、ＤＴ７６（仮想タンパク質ＣＴ６９１（配列番号２３４））及びＤＴ７７（仮想タンパク質ＣＴ２６３（配列番号２３６））に関して行った。
【０１５１】
図１１では、感染後５５〜５７時間で標識したＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに感染したＨＥｐ−２細胞のゲル画像、及び発生サイクル中の時点で標識した精製ＥＢからのゲル画像からの領域のいくつかの例を、感染後３４〜３６時間で標識したか、あるいは感染後３６時間で感染細胞の全溶解物として採取したか、あるいは感染後３６時間でＲＢとして精製した、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに感染した細胞の培養物の画像からの対応する領域と比較する。
【０１５２】
図１１で円で囲んだタンパク質スポットは、以下のように同定した。図１１Ａ及びＥは、ＣＰＮ１０１６の２つの断片として同定した、ＣＰ３４及びＣＰ６３を示す。図１１Ｂは、ＣＰＮ０９９８（配列番号２４０）として同定した、ＣＰ３７を示す。図１１Ｃは、それぞれＣＰＮ０７９６（配列番号２４３）及びＣＰＮ０７０５（配列番号２４６）として同定した、ＣＰ４６（配列番号２４４）及びＣＰ４７を示す。図１１Ｄは、ＣＰＮ０１５２（配列番号２５０）として同定した、ＣＰ５２を示す。図１１Ｆは、ＣＰＮ０６１９（配列番号２６２）として同定した、ＣＰ７５を示す。
【実施例７】
【０１５３】
ＩＩＩ型分泌遺伝子亜群中に位置するタンパク質の検出及び同定
大部分の細胞内細菌のＩＩＩ型分泌遺伝子は、１つの遺伝子群中に病原性細胞群として位置するが、クラミジアのＩＩＩ型分泌遺伝子は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓとＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの両方では、ゲノム中の異なる場所に位置する、３つの異なる群中において同定されてきている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ他、１９９８［４．］及びＫａｌｍａｎ他、１９９９［５．］）。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ、Ｄ及びＬ２、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０の包括的なプロテオミクス解析の一部として、ＩＩＩ型分泌群中に存在したタンパク質を、精製したＥＢに関して行ったゲルから同定した。
【０１５４】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓから同定したＩＩＩ型分泌タンパク質には、細菌の細胞質から分泌機構にタンパク質を輸送するのに必要な、Ｙｏｐ分泌ＡＴＰアーゼ（ｙｓｃＮ）、Ｙｏｐ輸送担体タンパク質Ｌ（ＹｓｃＬ）及び分泌シャペロン（ＳｙｃＥ）がある。さらに、未知の機能を有するがＩＩＩ型分泌亜群中に位置する、同定したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質にはＣＴ５６０、及び多量のＣＴ５７７及びＣＴ５７９がある。ＣＴ６６８（配列番号１９６）は全細胞溶解物中には明らかに存在するが、精製したＥＢには存在せず、ＹｓｃＮの隣に位置するために、このタンパク質が分泌する可能性がある。タンパク質のゲノム位置は、図９に示す。
【０１５５】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関しては、ＩＩＩ型分泌器官からのタンパク質ＬｃｒＥ（ＣＰＮ０３２４）、ＹｓｃＣ（ＣＰＮ０７０２）、ＹｓｃＮ（ＣＰＮ０７０７）及びＹｓｃＬ（ＣＰＮ０８２６）が、同定されてきている。ＹｓｃＣ（ＣＰ８９図ＩＩ、表ＩＩ）は、おそらく封入体膜中の局在性のために精製したＥＢには存在せず、封入体膜ではＹｓｃＣは宿主細胞の細胞質に曝されている。ＹｓｃＣ（ＣＰＮ０７０２）及びＹｓｃＮ（ＣＰＮ０７０７）周辺に位置するＩＩＩ型群中に存在する、２つのタンパク質を、精製したＥＢよりも全細胞溶解物中において著しく多い量で検出した。これらはＣＰＮ０７０５（配列番号２４６）（ＣＰ９０、図ＩＩ、表ＩＩ）及びＣＰＮ０７１１（配列番号２６４）（ＣＰ７６、図ＩＩ、表ＩＩ）であった。これらのタンパク質は封入体膜中に位置するか、全細胞溶解物中に存在する可能性もあり、いずれの場合もこれらのタンパク質は、プロテアソームの影響を受ける可能性がある。
【実施例８】
【０１５６】
分泌タンパク質の候補のパルス追跡実験
同定した候補タンパク質が感染細胞中に存在することができると思われる時間を評価するために、本発明は一連のパルス追跡実験を提供する。以下の実施例では、感染細胞の培養物を２２〜２４時間から［３５Ｓ］標識した。標識時間の後、［３５Ｓ］−メチオニンを含まない通常のＲＰＭＩ増殖培地に培地を変更し、標識後の異なる時間で細胞を採取した。いくつかの独立した実験からの結果によって、おそらく宿主細胞の濃度及び／又は感染の効率のわずかな違いによる、わずかな変化が示された。
【０１５７】
図１Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、パルス／追跡実験の例を与える。ＣＴ６６８（配列番号１９６）及びＤＴ８（配列番号１）（図１：それぞれＡ、Ｂ）の強度は、合成の１．５時間後に大幅に低下し、４．５時間で、ＥＢ段階までゲルにはほとんど存在しなかった。ＣＴ６１０及びＣＴ７８３（図１：それぞれＣ、Ｄ）は有意に低下したが、４．５時間で、ＥＢ段階まで依然として検出可能であった。ＣＴ８５８（Ｄ）のＣ末端断片（及びＣＴ８５８（ＣＴ８５８の配列は配列番号２４０の配列である）のＮ末端断片）は、最初の追跡時間中に徐々に増加したが、ＥＢには存在せず、クラミジアの発生中に切断産物が蓄積したことが示唆される。ＣＴ８５８（配列番号２００）のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ相同体のＮ末端断片、ＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）もＥＢには存在しなかった（図２）。
【実施例９】
【０１５８】
プロテアソーム阻害剤と組み合わせたパルス追跡実験
この実施例は、プロテアソームでプロセッシングされるのはどのワクチン候補であるかの、決定の仕方を示す。細胞透過性であるプロテアソーム阻害剤を、標識及び追跡時間中に感染細胞の培養物に加え、タンパク質の代謝回転時間を、プロテアソーム阻害剤を加えない標識／追跡に関して観察したものと比較した。この手法の重要性の一例は、図６に示す。タンパク質は感染後２２〜２４時間から、１０〜１００μＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２の存在下又は不在下で標識した。次いで標識培地を、通常の増殖培地中で２回洗浄した後の、ＭＧ１３２を含むかあるいは含まない増殖培地に交換し、感染後２４時間〜感染後２８時間で追跡した。細胞溶解物に二次元ＰＡＧＥ（ＩＰＧ）を施し、ＭＧ−１３２を含まない対照、及び標識直後に採取したタンパク質を含むゲルと比較した（図６Ａ、Ｂ及びＣ）。本発明は、プロテアソーム阻害剤を用いた処理のために増大した代謝回転時間を有した、１５個のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質を提供する。
【０１５９】
ＤＴ９、ＤＴ１０及びＤＴ１１のレベルは、標識時間の直後に採取した対照中よりも、追跡＋ＭＧ−１３２ゲル中で実際に高かった。これによって、ＤＴ９、ＤＴ１０及びＤＴ１１が、プロテアソームによって非常に速く分解されることが示される。対照的に、プロテアソーム阻害剤を加えることによって、ＤＴ７のレベルが著しく影響を受けることはなかった。
【０１６０】
本発明は、プロテアソームの触媒活性の異なる部分を阻害する、いくつかの他のプロテアソーム阻害剤（たとえばＭＧ１１５、ＭＧ２６２、ＰＳＩ及びラクトシステイン）の使用を含み、これによってプロテアソームで分解される他のタンパク質を解明することができる（表ＩＶ）。
【実施例１０】
【０１６１】
クラミジアタンパク質の代謝回転時間に対するプロテアソーム阻害剤の影響を調べるための、遺伝的に改変された細胞系の使用。
本発明は、市販のマウス胚細胞系ＭＥＣ−ＰＡ２８、細胞系ＰＷ８８７５の使用も提供する。ＭＥＣ−ＰＡ２８はプロテアソームのＩＦＮ−γ誘導性ＰＡ２８α及びβサブユニットでトランスフェクトし、ＭＥＣ２１７細胞系はプロテアソームのＩＦＮ−γ誘導性ＬＭＰ２、ＬＰＭ７、及びＭＥＣＬでトランスフェクトする。ＭＥＣ−ＰＡ２８及びＭＥＣ２１７を半集合状態まで増殖させ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ又はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させる。プロテアソームのサブユニットでトランスフェクトしていない、対照のマウス胚細胞系を平行して感染させた。
【０１６２】
細胞系ＭＥＣ−ＰＡ２８及びＭＥＣ２１７から過剰発現されたサブユニットをコードするトランスフェクト遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ抗原のプロセッシング及び提示に必要不可欠なので、パルス標識／追跡と組み合わせたプロテアソーム阻害剤を使用する実験手順を、前述のようにこれらの宿主細胞を用いて行う。
【実施例１１】
【０１６３】
ワクチン候補をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のクローニング及び発現
ワクチン候補をコードするＯＲＦのクローニング及び発現を、製造者の教示書に従ってｐＥＴ−３０ＬＩＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用して行った。
【０１６４】
遺伝子のＰＣＲ用に使用したプライマーは、以下の５’端及び３’端ＬＩＣ突出部を有していた：
正方向プライマー：５’ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＸ−遺伝子特異的配列３’
逆方向プライマー：５’ＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴ−遺伝子特異的配列３’
（Ｘ：挿入用特異的配列の第１のヌクレオチド）
上記プライマーにおけるＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴ及びＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴは、それぞれ配列番号２７５及び２７６の配列である。
【０１６５】
完全長の遺伝子又はリーダー配列を含まない遺伝子を、Ｅｘｐａｎｄ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＰＣＲによって増幅させた。３５のＰＣＲサイクルを、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で以下のように行った：９２℃で１５秒間（変性）、５５℃で１５秒間（プライマーアニーリング）及び６８℃で４分間（伸長）。生成したＰＣＲ産物は、遺伝子特異的配列の近くにＬＩＣ突出部を含んでいた。ＰＣＲ産物は、精製されたＷｉｚａｒｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）であり、ｐＥＴ−３０ベクターに連結させた。ｐＥＴ−３０ベクターは、カナマイシン耐性をコードする遺伝子、及びＬＩＣクローニング部位の上流のヒスチジンタグを含む。
【０１６６】
候補遺伝子を含むｐＥＴ−３０ベクターを、コンピテント大腸菌Ｎｏｖａ  Ｂｌｕｅ菌株に形質転換した。コロニーはカナマイシンアガープレート上で選択し、選択したコロニーに関する対照ＰＣＲは、ベクター特異的プライマー及び挿入用特異的プライマーを使用して行った。プラスミドＤＮＡは、候補遺伝子に特異的な挿入体を含む陽性コロニーから精製した。次にプラスミドＤＮＡを、大腸菌（ＢＬ２１）に形質転換した。挿入陽性コロニーを、カナマイシンアガープレート上で選択した。Ｎ末端に位置するヒスチジンタグを含む遺伝子特異的挿入体を含む、融合タンパク質の発現は、１ｍＭのＩＰＴＧ（Ａｐｏｌｌｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＧＢ）を加えることによって、５００ｍｌのＬＢ培地中で誘導した。
【０１６７】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＤからのＣＴ６６８（配列番号１９６）、ＣＴ８５８（配列番号２００）、ＣＴ７８３（配列番号１９８）、ＣＴ６１０（配列番号２０２）、ＹｓｃＮ及びＤＴ８（配列番号１）、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０からのＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）及びＹｓｃＣの、組換え融合タンパク質を発現する大腸菌（ＢＬ２１）を生成させた。
【０１６８】
組換え融合タンパク質は、ニッケル樹脂カラム（Ｈｉｇｈ  Ｔｒａｐ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、前に記載したように、溶解した細菌から精製した。精製したタンパク質の、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを施した。融合タンパク質を表すクーマシー染色されたバンドを、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって明白に同定して、正確な融合タンパク質が生成されたことを確認した。ポリクローナル抗体を含む血清を、Ｋｎｕｄｓｅｎ他によって［１７］に記載されたように、５０μｇの融合タンパク質をフロイトのアジュバントに溶かしたものを３回筋肉内注射し、５０μｇの融合タンパク質をＰＢＳに溶かしたものを２回静脈内注射し、ニュージーランド白ウサギを免疫処置することによって得た。
【実施例１２】
【０１６９】
ワクチン候補に対するＰＡｂを使用するウエスタンブロッティング
ＰＡｂが正しいワクチン候補を確認したことを確認するため、考えられる翻訳後の改変又はプロセッシングを可視化するために、二次元ＰＡＧＥ免疫ブロット法を行った。全細胞溶解物からの、５００μｇの非標識、及び２×１０６ｃｐｍの標識したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ又はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質を二次元ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質はＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングした。１５０ｍＭのＮａＣｌ（又は高級塩の形、４００ｍＭ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２％ｗ／ｖのゼラチン、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び２％ｖ／ｖの正常なヤギ血清（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ  Ｄｅｎｍａｒｋ）を含むバッファー中にＰＡｂを溶かした、１／５００〜１／１０００希釈物を使用して、免疫染色を行った。
【０１７０】
使用した二次抗体は、抗体バッファーに１／２０００で希釈した、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）であった。ブロット試料は、明確な反応が検出されるまで、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸トルイジン（ＢＣＩＰ）／ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色した。免疫ブロット試料をコンピュータでスキャニングし、次にＸ線フィルムに約８日間曝した。Ｍｅｌａｎｉｅ  ＩＩ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、免疫染色されたタンパク質を、［３５Ｓ］標識したそれらの相当物と比較した。
【０１７１】
図７Ａ１及び７Ａ２では、ＣＴ８５８（配列番号２００）に対するＰＡｂ２４５に関する、二次元ＰＡＧＥ  ＩＭＢ画像全体の例を示す。ＰＡｂ２４５は、対応する標識されたバックグラウンドから示されるように（図７Ａ２）、ＤＴ４（ＣＴ８５８のＣ末端断片）及びＤＴ４８（ＣＴ８５８のＮ末端断片）と再現的に反応する（図７Ａ１）。
【０１７２】
図７Ｂ１及び７Ｂ４は、ＣＴ６６８及びＹｓｃＮに関するＩＭＢを示す。ゲル上の免疫反応性があるタンパク質スポット、及び標識されたバックグラウンド（図７Ｂ２及びＢ５）に基づくそれらの局在性は、分析ゲル上のタンパク質の位置に対応し（図７Ｂ３及びＢ６）、したがってＰＡｂが正しいタンパク質と反応したことが確認された。
【０１７３】
本発明は、いくつかのイソ型のＣＴ６１０のレベルが、未処理の対照と比較して、ＭＧ１３２で処理した感染細胞において明らかに増大することを示す、ＩＭＢの例を提供する。ＤＴ７はＣＴ６１０として同定し、これはＤＴ９、ＤＴ１０、ＤＴ１１及びＤＴ１２の真上に位置していた（図６Ａ）。全細胞溶解物の二次元ゲルブロット試料上で（図７Ｃ１）、ＣＴ６１０に対するＰＡｂ２５５を用いるＩＭＢは２列のスポット、ＤＴ７を表す１列、ＤＴ９、ＤＴ１０、ＤＴ１１及びＤＴ１２を表す他の１列と明らかに反応した。したがってＣＴ６１０は、おそらく翻訳後の改変又はプロセッシングが異なるために、異なるイソ型中に存在する。細胞をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で処理した場合、ＤＴ９、ＤＴ１０及びＤＴ１１の量は明らかに増大した（図７Ｃ２）。
【０１７４】
ＰＡｂ２５５を用いるＩＭＢを、ＭＧ１３２の存在下及び不在下でそれぞれ６時間処理した全細胞溶解物からのタンパク質を含む、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＰＶＤＦブロット試料に行った。図７Ｃ４は、未処理の対照（レーンａ及びｃ）と比較した、ＭＧ１３２処理した感染細胞からのタンパク質を含むレーン（レーンｂ及びｄ）中の、ＤＴ７列のスポットを表すバンドの下の、追加的バンドを明らかに示す。ＤＴ７列を表す上側バンドのレベルは、プロテアソーム阻害剤による処理によって著しく変わることはなかった。
【実施例１３】
【０１７５】
異なる宿主細胞中での増殖時の、異なる亜型のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの候補の発現
本発明は、分泌されている可能性があるタンパク質の発現レベルの、亜型／宿主細胞特異的な違いを考慮する。なぜなら、宿主細胞／クラミジアの相互作用は、他の亜型に関して、あるいは他の宿主細胞中での培養によって、異なる可能性があるからである。このことは、一般的なＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓワクチン用の可能性が最も高い、ワクチン候補の選択と関連がある。
【０１７６】
ＣＴ６６８（配列番号１９６）、ＣＴ８５８（配列番号２００）、ＣＴ７８３（配列番号１９８）及びＣＴ６１０（配列番号２０２）はすべて、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ、Ｄ及びＬ２の同じ位置で検出した。このことは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＤとＬ２の間のこれらのタンパク質をコードする遺伝子が、非常に保存されていることと一致する。さらに、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ａ、Ｄ及びＬ２をＨｅＬａ細胞ではなくＭｃＣｏｙ又はＨｅｐ−２細胞中で培養すると、これらすべてのタンパク質が発現され、これらのタンパク質の発現は、使用する細胞のタイプとは無関係であることが示された。しかしながら、感染後２２〜２４時間又は感染後３４〜３６時間から標識したクラミジアのタンパク質を含むゲルに基づくと、亜型Ａ及びＤにおいて、ＤＴ８（配列番号１）は等電点（ｐＩ）５．１及び分子量（Ｍｗ）７．５で検出可能であった。しかしながら、亜型Ｌ２では、タンパク質の純粋な電荷及び等電点（ｐＩ）を変えるわずかなアミノ酸の置換のためにおそらく、ＤＴ８（配列番号１）は等電点（ｐＩ）６．４及び分子量（Ｍｗ）７．５で検出された。
【実施例１４】
【０１７７】
ワクチン候補の間接的な免疫蛍光顕微鏡検査
半集密的ＨｅＬａ細胞の単層を含む、ウエル及びガラスカバー片を、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ又はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄで感染させた。約５０％の細胞のみが感染するように、力価の低いクラミジアを使用し、これによって感染した細胞と感染しなかった細胞を明らかに区別することができた。細胞はＰＢＳ中で２回洗浄し、感染後の異なる時間にホルムアルデヒド又はメタノール中で固定し、間接的な免疫蛍光顕微鏡検査を施した。必要な場合は、アセトン沈降ＨｅＬａタンパク質によってＰＡｂを事前に吸着させて、ヒトタンパク質との最小限の交差反応を得た。
【０１７８】
図８に示す例では、事前に吸着させたウサギＰＡｂの１／２００希釈物、及びＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＭＯＭＰ（ＭＡｂ３２．３）を対象とするマウスモノクローナル抗体又はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するＭＡｂ１８．３の１／２５希釈物を使用した。フルオレセインイソチオシアネート結合型（ＦＩＴＣ）ヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）ＩｇＧ抗体、及びローダミン結合型ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｔｒｉｃｈｅｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、二次抗体として使用した。二重の免疫染色を行って、クラミジア封入体に対するワクチン候補の亜細胞レベルの局在性を決定した。
【０１７９】
短い代謝回転時間を有していたＤＴ８を対象とするＰＡｂ２４９は、クラミジア封入体中のＲＢとわずかに反応した（図８Ａ３）。ＨｅＬａ細胞のタンパク質との交差反応が最小限であったにもかかわらず、封入体以外の宿主細胞構造に対する顕著な反応は、検出されなかった。
【０１８０】
対照的にＣＴ８５８（配列番号２００）は、感染細胞では宿主細胞の細胞質を明らかに染色したが、非感染細胞ではしなかった（図８Ｂ３）。一般に染色は、封入体の境界でより強かった。宿主細胞の細胞質の染色は、パルス追跡実験によって予想された長い代謝回転時間と一致して、感染後１２時間〜感染後７２時間で可視化することができた。ＣＴ８５８（配列番号２００）の相同体であるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）に対して産生されたＰＡｂを、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させたＨｅｐ−２細胞と反応させると、同じ反応特性が観察された。
【実施例１５】
【０１８１】
スポット番号ＣＴ６６８（配列番号１９６）（ＤＴ１及びＤＴ２）
ＣＴ６６８を、ＩＩＩ型分泌遺伝子と相同性がある遺伝子を含み、予想された認識可能なシグナルペプチダーゼ切断部位は含まない、亜群の１つのＹｓｃＮ  ＡＴＰアーゼのすぐ上流に置いた。ＣＴ６６８は、約４〜６時間Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ中のみに存在し、その間に量が確実に減少した。ＣＴ６６８（配列番号１９６）のみに対するＰＡｂは、ＩＭＦの封入体中のＲＢとわずかに反応するようであるが、このタンパク質の短い代謝回転時間を考慮すると、宿主細胞中での迅速な分解によって、これを説明することができる。ＣＴ６６８（配列番号１９６）は感染後１２〜４０時間から検出され、これによってこのタンパク質が、細胞内分化の大部分中に生成されることが示唆される。したがって、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓはＣＴ６６８（配列番号１９６）を連続的に宿主細胞に運び、ＣＴ６６８はそこで機能を果たし、すぐに分解される可能性がある。
【０１８２】
ＣＴ６６８（配列番号１９６）の２つの変異体を同定した。塩基性変異体が、感染後２２〜２４時間から標識し次に採取したＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質を含むゲル上に最も多量に存在した。興味深いことに、行ったすべての研究において時間と共に、酸性変異体の強度は増大し、塩基性変異体の強度は低下した。ＣＴ６６８（配列番号１９６）を３０分間隔で追跡すると、酸性変異体の増大が１時間で既に検出可能であった（図１Ｂ）。
【０１８３】
この発見によって、変性は、カルバメート化又はアミド化などの変性を生み出す可能性がある、ゲルの施された条件によるものではないことを示唆することができる。そのかわりに変性は、タンパク質を変性させる未知の酵素にのみ原因があるようである。
【０１８４】
Ｃ．ｐｓｉｔａｃｉｉ中の分泌タンパク質の変性は記載されてきており、この場合ＩｎｃＡが、封入体膜への転移の後に、宿主細胞のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼによってリン酸化される（Ｒｏｃｋｅｙ他、１９９７）［２９．］。ＣＴ６６８（配列番号１９６）の代謝回転時間はプロテアソーム阻害剤を用いた処理によって延長され、生成された少なくとも限られた量のＣＴ６６８（配列番号１９６）は、プロテアソームでプロセッシングされる可能性があることが示唆される。
【実施例１６】
【０１８５】
スポット番号ＤＴ８（ＤＴ８）（配列番号１）
ＤＴ８（配列番号１）は、相同性検索に基づいてＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの特異的なタンパク質である、新規な７．２ｋＤａのタンパク質である。ＰＳＯＲＴ分析によって、このタンパク質に関する認識可能なリーダー配列が存在しないことが示された。理論上の配位、等電点（ｐＩ）５．２１／７．２ｋＤａは、実験によって決定されたものと非常に一致した。ＣＴ６６８（配列番号１９６）に関して認められた多くの特徴が、ＤＴ８（配列番号１）に関しても観察された。６時間未満の短い代謝回転時間を観察し、ＩＭＦはＲＢとごくわずかな反応を示した。
【０１８６】
ＤＴ８中の停止コドンの後ろに、Ｒｈｏ非依存性のタンパク質の転写停止を示す、潜在的なステムループ領域を予想することができる。
【実施例１７】
【０１８７】
スポット番号ＤＴ７、ＤＴ９、ＤＴ１０、ＤＴ１１、ＤＴ１２（ＣＴ６１０（配列番号２０２））
他の細菌中の分泌と関連がある遺伝子と相同性がある、いかなる遺伝子の近くにも、ＣＴ６１０（配列番号２０２）は位置していなかった。このタンパク質は全細胞溶解物とＥＢの両方から同定されたが、Ｍｅｌａｎｉｅ  ＩＩ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって、全細胞溶解物中において少なくとも３０倍多いと評価された。このタンパク質は、ＣＴ６１０（配列番号２０２）に対して産生されたＰａｂ２５５によって決定されたように、２つの分子量（Ｍｗ）の多形によって表されるいくつかのイソ型で検出された。これらのスポットの列によって、ＤＴ７（上列）及びＤＴ９、１０、１１、１２（下列）が表された。この両方の列は、パルス追跡実験において短い代謝回転時間を有していた。興味深いことに、ＤＴ９、ＤＴ１０及びＤＴ１１の量は、パルス追跡／ＭＧ１３２実験に基づくプロテアソーム阻害剤を用いた処理によって大幅に増大した。パルス追跡実験は、Ｐａｂ２５５を用いるＳＤＳ  ＰＡＧＥ  ＩＭＢによって確認した。
【０１８８】
したがって本発明は、ＣＴ６１０（配列番号２０２）のいくつかのイソ型が分泌され、プロテアソームでプロセッシングされる証拠を提供する。ＣＴ６１０（配列番号２０２）イソ型の異なる結末は、ワクチン候補に対して産生されたＰａｂを使用してこのようなイソ型を検出することの妥当性を示す。
【実施例１８】
【０１８９】
スポット番号ＤＴ３（ＣＴ７８３（配列番号１９８））
ＣＴ７８３（配列番号１９８）は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質ジスルフィド結合イソメラーゼであることが示唆されてきている。ＣＴ７８３（配列番号１９８）は、チオレドキシンジスルフィドイソメラーゼ（ＣＴ７８０）、及びＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍからのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと相同性を示す。３３のアミノ酸リーダー配列をＰＳＯＲＴ及びＳｉｇｎａｌＰによって予想することができ、切断されたタンパク質の理論上の等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）は、実験によって決定されたものと一致した。さらに、ＣＴ７８３（配列番号１９８）に対して産生されたポリクローナル抗体は、４〜７ＬＩＰＧを使用する二次元ＰＡＧＥ  ＩＭＢにおいて正確なスポットを染色した。
【０１９０】
Ｎ末端リーダー配列の切断のために、おそらくこのタンパク質がＩ型又はＩＩＩ型の系によって分泌されることはないが、ＩＩ型の系によって分泌される可能性が高い。わずかなＰＳＯＲＴ予想によって細菌内の膜中の亜細胞レベルの局在性が示唆されたが、大部分のＰＤＩは正常では周辺質に位置している。ＣＴ７８３（配列番号１９８）は非常に短い代謝回転時間を有しており、合成後の約４〜６時間の追跡の後には、クラミジア中にはほとんど存在しない。
【０１９１】
ＣＴ７８３（配列番号１９８）の代謝回転時間はプロテアソーム阻害剤によって延長され、プロテアソームの潜在的なプロセッシングが示唆された。
【実施例１９】
【０１９２】
スポット番号ＤＴ４及びＤＴ４８（ＣＴ８５８（配列番号２００））及びＣＰ６３（ＣＰＮ１０１６（配列番号２３８））
ＣＴ８５８は切断性のＮ末端リーダー配列を有しており、これは６７ｋＤａの周辺質のタンパク質であると予想されたが、ゲル上の２箇所の異なる位置で同定された。ＤＴ４をＣＴ８５８（配列番号２００）として同定した配列タグはすべて、ＣＴ８５８（配列番号２００）のＣ末端部分と整合した。全細胞溶解物を含む二次元ＰＡＧＥ  ＰＶＤＦ膜のＩＭＢでは、ＰＡｂ２４５は、このＣ末端断片と明らかに再現的に反応した。さらにＰａｂ２４５は、これもまたＤＴ４に関して見られたのと同様に、パルス追跡実験において長い代謝回転時間を有する、タンパク質スポットＤＴ４８と反応した。
【０１９３】
ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって、ＤＴ４８はＣＴ８５８（ＣＴ８５８の配列は配列番号２００の配列である）のＮ末端断片としても同定された。ＤＴ４８の分子配位は、等電点（ｐＩ）７．３／分子量（Ｍｗ）２５．８であった。ＣＴ８５８（配列番号２００）のＮ末端部分によって、異なる長さのＮ末端（シグナルペプチドなし）に等電点（ｐＩ）／分子量（Ｍｗ）ツールを使用して、実験によって決定したものと一致したものを有する、ペプチドが生成する。この分析によって、Ｋ２３３Ｓ２３４Ｍ２３５周辺の切断部位が示唆される。
【０１９４】
ＣＴ８５８（ＣＴ８５８の配列は配列番号２００の配列である）のＮ末端及びＣ末端断片は、ＥＢ段階（感染後７２時間）まですべて二次元ゲル上で検出することができるが、精製されたＥＢ中では検出することができないという事実は、宿主細胞の細胞質中での長い代謝回転時間を示す。このことは、ＩＭＦ実験による７２時間までの、宿主細胞の細胞質中でのＣＴ８５８（配列番号２００）の非常に明白な検出と一致した。ＣＴ８５８は大腸菌からの尾部特異的プロテアーゼ（ｔｓｐ）とわずかな相同性を示し、これはペニシリン結合タンパク質のプロセッシングと関連しており、ヒト内部光受容体レチノイド結合タンパク質からのＩＲＢＰドメインを含み、疎水性リガンドを結合させる（Ｓｉｌｂｅｒ他、１９９２）［３２．］。ＩＩ型分泌は、Ｐ．ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ及びＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａを含めた、いくつかのグラム陰性細菌において、分解性タンパク質の輸送と関連してきている（Ｈｏｂｂｓ及びＭａｔｔｉｃｋ，１９９３に概説された）［３３．］。Ａｅｒｏ  ｓｉｇｉｎｏｓａ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａでは、分泌されるエラスターゼ（ａｈｐＢ）が、細菌の毒性に関して重要であることが近年示唆されてきている（Ｃａｓｃｏｎ他、２０００）［３４．］。
【０１９５】
これらのタンパク質には、ＣＴ８５８（配列番号２００）と類似の結末がある。これらのタンパク質は大抵、切断性シグナルペプチドを含むプロペプチドとして合成され、次いで成熟タンパク質にプロセッシングされる。尾部特異的プロテアーゼとも相同性を示す、他のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質は、仮想タンパク質ＣＴ４４１である。このタンパク質がＣＴ８５８と同じ分泌特性を示す可能性があるかどうかは、依然として決定されていない。
【０１９６】
ＣＴ８５８（配列番号２００）の同じ亜細胞レベルの局在性が、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ相同体、ＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）に対するＰａｂ２５３を含むＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）に関して観察され、したがって２つのクラミジア種間のこの遺伝子の機能的な保存が示される。
【実施例２０】
【０１９７】
その遺伝子番号によって同定した、分泌されたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質は、ヒトのＨＬＡ−Ａ２と親和性があるペプチドを認識するために調整したＡＮＮによって分析した。表Ｖ〜ＶＩＩＩでは、ＨＬＡ−Ａ２への予想される結合に関して、ＡＮＮによって選択したペプチドを列挙し、その親和性（Ｋｄ）をｎＭで与える。値は低いほど良い。５０ｎＭ未満のＫｄを有する大部分のペプチドは、免疫原性である。５００ｎＭ未満（ただし５０ｎＭを超える）のＫｄを有するペプチドは、免疫原性である可能性がある。所定のペプチドの結合は、アンカー位置Ｐ２又はＰ９の次善のアミノ酸を置換することによって改善することができ、これは天然のペプチドを対象とする特異性を保つことが多い戦略である。
【実施例２１】
【０１９８】
実験動物モデル中で、ワクチン候補が特異的な細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する能力の決定
１つの手法では、ワクチン候補を完全長の組み換えタンパク質として使用して、ヒトのＨＬＡクラスＩ分子を発現するトランスジェニックＡ２マウスを含めた、実験動物（マウス又はモルモット）を免疫処置する。
【０１９９】
他の手法では、コンピュータアルゴリズムによって、ワクチン候補をＴ細胞エピトープに関してスクリーニングし、次にこれらのエピトープを含むペプチドを合成し、完全長のワクチン候補に関して記載したように免疫処置用に使用する。
【０２００】
第３の手法では、８〜１０個のアミノ酸長のペプチドを、それらがワクチン候補の配列全体を覆うように重複法で合成し、放射標識した中間結合体と競合する、ＭＨＣクラスＩの結合アッセイ用に使用する。優れた結合体であるペプチドは、完全長のワクチン候補に関して記載したように免疫処置用に使用する。
【０２０１】
ワクチン候補は、ペプチド／タンパク質の組合せとして、あるいはアジュバントの単独のペプチド／タンパク質として投与する。ワクチン候補は、ＤＮＡワクチンとして、あるいはワクチン候補を発現するウイルスによって投与することもできる。
【０２０２】
免疫処置した動物からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離法によって精製し、磁気ビーズに結合する抗体を使用することによって、あるいは他の方法によって、ＣＤ８＋細胞を精製する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、ＥＬＩＳＰＯＴ及びトリチウム化チミジンの取り込みなどの増殖アッセイによって、特異的溶解物のアッセイ（クロム放出）によって測定する。
【０２０３】
免疫処置した動物からの精製したＰＢＭＣ又はＣＤ８＋細胞を、制限的に希釈して、照射済みの抗原提示細胞、成長因子、及び特異的又は非特異的刺激物質と共に、マイクロタイタープレート上に置く。特異的な刺激に関しては、優れたＴ細胞エピトープとして予想されたか、あるいはＭＨＣクラスＩ分子への優れた結合体であることが見出された、単独のワクチン候補タンパク質又はペプチドを使用する。非特異的な刺激に関しては、クラミジア感染した細胞を使用する。細胞は９〜１４日間培養し、その間に抗原特異的な細胞が増殖する。特異的な細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって刺激された細胞からのサイトカイン分泌を測定することによって決定する。Ｔ細胞の増殖は、トリチウム化チミジンの取り込み、次にシンチレーション計測によって測定する。増殖した細胞の細胞障害性は、クラミジア感染した細胞、又は標的細胞と同様にワクチン候補タンパク質／ペプチドを発現する組み換え細胞を使用する、クロム放出アッセイなどの細胞障害性アッセイを使用して測定する［４２．］。
【実施例２２】
【０２０４】
クラミジア感染に対してマウス及びモルモットを保護する能力に関する、ワクチン候補の試験
実験動物を（前に記載したように）、単独のタンパク質／ペプチドとしてのワクチン候補で、あるいはワクチン候補の組合せで免疫処置する。免疫処置の次に、それらの動物をクラミジアで（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関しては鼻腔内感染、及びＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに関しては性感染）、実験的に感染させる。感染に対する保護は、クラミジアを培養すること、免疫組織化学法、定量的ＰＣＲ、及び感染による血清変換を調べることによって測定する。
【実施例２３】
【０２０５】
ヒト中で、クラミジア感染がワクチン候補特異的な細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する能力の決定
ヒトの血清サンプルを、クラミジアに対する抗体の存在に関して、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｄａｃ）によって試験する。ワクチン候補特異的な細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に関して、血清陽性の個体を選択する。
【０２０６】
クラミジアに関して抗体陽性であると試験されるヒトからの、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離法によって精製し、抗体及び磁気ビーズを使用すること、又は他の方法によって、ＣＤ８＋細胞を精製する。ワクチン候補タンパク質／ペプチドを特異的に対象とするＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、実施例１９に記載した方法によって測定する。
【実施例２４】
【０２０７】
診断目的のＥＬＩＳＡ試験を開発するための、ワクチン候補の使用
本発明の分泌タンパク質は、精製した微細菌中では存在しないか、あるいは大幅に減少しているので、精製した基本小体に基づく免疫アッセイは、このようなタンパク質に対する抗体を検出することができない。したがって分泌タンパク質は、体液性免疫応答とも関連がある、認識されていない主要な抗原であってよい。さらに、分泌されるクラミジアのタンパク質に基づくＥＬＩＳＡによって、クラミジアによる持続的な感染を検出することができる。なぜなら分泌タンパク質は、クラミジア分化の細胞内の段階中にのみ発現するからである。
１）分泌タンパク質は、精製された組み換えタンパク質として生成させる。あるいは、分泌タンパク質を表す重複合成ペプチドも生成させる。
２）ＥＬＩＳＡプレートを、分泌タンパク質を表す精製した組み換えタンパク質（又は分泌タンパク質に由来する合成ペプチド）でコーティングする。ＥＬＩＳＡプレートを、１５％ウシ胎児血清でブロッキングして、非特異的な結合を回避する。
３）ミクロ−ＩＦ又はＥＬＩＳＡ（Ｍｅｄａｃ）を使用して、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ又はＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体に関して、患者の血清をスクリーニングする。陽性の血清を、分泌タンパク質を表す組み換え抗原でコーティングした、ＥＬＩＳＡプレート上で試験する。
４）抗体結合抗ヒトＩｇＧを検出するために、ＩｇＡ又はＩｇＭを使用する。陽性対照として、感染したマウスからの血清を使用する。
５）ミクロ−ＩＦ又はＥＬＩＳＡ（Ｍｅｄａｃ）からの結果を、分泌タンパク質を表す組み換えタンパク質に基づくＥＬＩＳＡと比較する。
【０２０８】
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【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１Ａ】感染後（ｈ．ｐ．ｉ．）２２〜２４時間から［３５Ｓ］−標識し、標識直後に採取し、二次元ＰＡＧＥによって分離した全細胞溶解物からの、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質のゲル画像の例を示す図である。黒矢印は、感染後２２〜２４時間から標識し感染後７２時間で精製した精製ＥＢ（基本小体）からのタンパク質を含むゲル上で、その強度が大幅に低下しているタンパク質を示す。示したスポット（ＤＴ１〜７７）の等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）の特性は、表Ｉに挙げる。
【図１Ｂ−１Ｅ】図１Ａからの選択した領域の拡大によって示される、合成後の異なる時間での、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ中の同定したワクチン候補及びそれらの存在の例を示す図である。タンパク質代謝回転の時間は、ＥＢの精製までの発生サイクル中の、標識後の異なる時間で追跡することによって評価した。上部の目盛は、ゼロで始まる標識後の時点を示し、下部の目盛は２４時間で始まる感染後の時間を表す。図１Ｂ：ＤＴ１及びＤＴ２（ＣＴ６６８；配列番号１９６）。図１Ｃ：ＤＴ８（配列番号１）。図１Ｄ：ＤＴ７（上矢印）及びＤＴ１１（下矢印）（両方共ＣＴ６１０；配列番号２０２として同定）。図１Ｅ：ＤＴ３（下矢印、ＣＴ７８３；配列番号１９８）、ＤＴ４（上矢印、ＣＴ８５８；配列番号２００）。
【図２Ａ】感染後５５〜５７時間から［３５Ｓ］−標識し、標識直後に採取し、二次元ＰＡＧＥによって分離したＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０のタンパク質のゲル画像の例を示す図である。黒矢印は、発生サイクル中の２時間、すなわち感染後６、１２、２４、３６、４２、４８、５４、６０時間に標識し感染後７２時間で精製した、ＥＢからのタンパク質のゲル上で、その強度が大幅に低下しているタンパク質を示す。矢印は、精製ＥＢからのゲル上で、強度が大幅に低下しているタンパク質を示す。示したスポット（ＣＰ１〜９１）の等電点（ｐＩ）及び分子量（Ｍｗ）の特性は、表ＩＩに挙げる。
【図２Ｂ−２Ｃ】図２Ａの拡大部分を示す図である。前に記載したように標識し二次元ＰＡＧＥによって分離したＥＢタンパク質の画像の、対応する拡大を示す図である。図２Ｂ及び図２Ｃの拡大部分によって、全細胞溶解物中には存在するがＥＢ中には存在しない、２つのタンパク質、ＣＰ６３（ＣＰＮ１０１６；配列番号２３８として同定）及びＣＰ６５の例を与える。濃縮したスポットはＥＢと全細胞溶解物の両方に存在し、ポリペプチドデホルミラーゼとして同定されてきている。
【図３Ａ】スポット番号ＤＴ１を仮想タンパク質ＣＴ６６８（配列番号１９６）として同定するために使用した、ペプチド質量のフィンガープリントを示す図である。中空矢印は、トリプシンの自己消化から生じたペプチドを示す。これらのピークを使用して、スペクトルの内部補正を行った。黒矢印は、ＣＴ６６８配列（配列番号１９６）と整合するペプチド質量を示す。二重矢印は、ヒトの汚染タンパク質に由来するペプチドを示す。
【図３Ｂ】図３Ａから得たペプチド質量に関する、同定用ソフトウェアＭＳ−Ｆｉｔの使用からの結果を示す図である。最高位のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質はＣＴ６６８（配列番号１９６）であることを示す。
【図４Ａ】ＣＴ６６８（配列番号１９６）のアミノ酸配列と整合する、二重電荷１７４４．９Ｄａの親イオン（Ｒ）ＫＩＶＤＷＶＳＳＧＥＥＩＬＮＲ（Ａ）（黒矢印）（配列番号２７３）を含むスポットＤＴ１の、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって生じたペプチド質量スペクトルを示す図である。点線は、親イオンの断片化によって生じたＹ−ペプチドイオンを示す。推定したアミノ酸配列は、太い一文字のコードで示す。
【図４Ｂ】スポットＣＰ６３のＰＳＤ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって生じたペプチド質量スペクトルを示す図である。１９１９．８Ｄａの親イオン（Ｋ）ＥＬＬＦＧＷＤＬＳＱＱＴＱＱＡＲ（Ｌ）（配列番号２７４）を断片化し、配列を明らかにするいくつかのペプチドを生成した。これらの２つは、２４３．３５Ｄａのｂ２−イオン（ＥＬ）及び３５６．３４Ｄａのｂ３−イオン（ＥＬＬ）によって例示され、これらはロイシンの質量（１１３Ｄａ）だけ質量が異なる。
【図５】新規なＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ特異的ワクチンタンパク質候補ＤＴ８のヌクレオチド配列（配列番号２）、及び一文字のコードによって示される対応するアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。太字のアミノ酸配列は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによって得られた配列タグによって覆われていた。
【図６】１つのプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２と組み合わせた、パルス追跡実験を示す図である。図６．１：感染後２２〜２４時間から標識し、２０μＭのＭＧ−１３２の存在下でさらに４時間追跡した、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質を載せた、二次元ゲルの全体のゲル画像。図６Ａ．６Ｂ及び６Ｃ：ＭＧ−１３２と共に（追跡＋ＭＧ−１３２）あるいはＭＧ−１３２なしで（追跡）行った追跡実験を比較すると、ＭＧ−１３２で処理したためにより長い代謝回転時間を有する、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質を含む領域の拡大図。最初の列は、２時間の標識時間の直後に採取した感染細胞の、タンパク質プロファイルを表す。ＭＧ１３２を用いずに標識の直後に採取した全細胞溶解物を含むゲルと比較して、ＭＧ１３２の存在下で標識及び追跡した全細胞溶解物を含むゲル上で、ＤＴ９、ＤＴ１０及びＤＴ１１の強度が著しく高いことを言及しておく。
【図７Ａ】ＰＡｂ２４５を使用した全細胞溶解物のＩＭＢの、全体のゲル画像を示す図である。Ａ１：それぞれＣＴ８５８（ＣＴ８５８は配列番号２００に相当する）のＣ末端及びＮ末端断片である、スポット番号ＤＴ４及びＤＴ４８との反応を示すＩＭＢ。Ａ２：対応するＩＭＢの放射標識されたバックグラウンド。
【図７Ｂ】ＹｓｃＮ（Ｂ１）に対するＰＡｂ２４１、及びＣＴ６６８（配列番号１９６）（スポットＤＴ１及びＤＴ２）（Ｂ４）に対するＰＡｂ２３８を用いるＩＭＢを示す図である。ＩＭＢの対応するオートラジオグラフィーは、Ｂ２：ＹｓｃＮ及びＢ５：ＣＴ６６８（配列番号１９６）との同時局在を示す。分析二次元ゲル上には、ＹｓｃＮ（Ｂ３）及びＣＴ６６８（Ｂ６）が局在する。
【図７Ｃ】ＣＴ６１０（配列番号２０２）に対するＰＡｂ２５５を用いるＩＭＢを示す図である。Ｃ１：ＰＡｂ２５５がスポットの列を染色することを示す、二次元ゲルブロットの拡大図。上部はＤＴ７を表し、下部はＤＴ９、１０、１１及び１２を表す。Ｃ２：感染後３０時間で細胞を採取する前に、ＭＧ１３２を用いて６時間、感染細胞を処理した影響を示す拡大図。ＭＧ１３２処理によって、ＤＴ７を表す列と比較して、ＤＴ９、ＤＴ１０、及びＤＴ１１の量の明らかな相対的増加がもたらされることを言及しておく。Ｃ３：対応する標識された分析ゲル。Ｃ４：ＰＡｂ２５５を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＩＭＢ：レーンａ及びｃ：感染後３０時間で採取した全感染細胞溶解物の、（それぞれ）２０μｇ及び１０μｇ。レーンｂ及びｄ：感染後３０時間で細胞を採取する前に、５０μＭのＭＧ１３２で６時間処理した全感染細胞溶解物の、（それぞれ）１０μｇ及び５μｇ。
【図８】ワクチン候補の亜細胞レベルの局在性を示す、間接的な免疫蛍光顕微鏡検査を示す図である。Ａ及びＢ：Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄで感染させ、感染後２４時間でホルマリンで固定したＨｅＬａ２２９細胞。Ｃ：Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させ、感染後７２時間でホルマリンで固定したＨＥｐ−２細胞。列１は、Ｎｏｒｍａｓｋｙ画像を示す。列２は、ローダミン結合ＧＡＭ  ＩｇＧ抗体によって目に見える状態にした、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ＭＯＭＰに対するＭＡｂ３２．３との反応を示す。列３は、ＦＩＴＣＨ結合ＧＡＲ  ＩｇＧ抗体によって目に見える状態にした、問題のワクチン候補に特異的なウサギポリクローナル抗体との反応を示す。調べたワクチン候補は、Ａ：ＤＴ８（配列番号１）、Ｂ：ＣＴ８５８（配列番号２００）、Ｃ：ＣＰＮ１０１６（配列番号２３８）（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣＴ８５８（配列番号２００）相同体）である。白い単頭矢印は、感染細胞中のクラミジア封入体の境界を示す。中空の矢印は、感染していない細胞を示す。ＣＰＮ１０１６が、ＣＴ８５８と同じ亜細胞レベルの局在性及び分泌特性を示すことを言及しておく。
【図９】ＩＩＩ型分泌亜群１、２及び３中に位置する、同定したタンパク質を含めたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄからの同定したワクチン候補のいくつかの例の、ゲノムの局在性を示す図である。
【図１０】感染後２２〜２４時間から標識した感染細胞の全溶解物、標識し同じ時点で精製したＲＢ、及び感染後７２時間で精製したＥＢからの、二次元ゲル画像中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄから分泌される候補の位置を示す図である。ゲルはすべて、非線状でｐＨ３〜１０であるＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐを使用して作製した。  感染後２２〜２４時間：感染後２２〜２４時間から［３５Ｓ］−標識し、標識直後に採取し、二次元ＰＡＧＥによって分離した感染細胞の全溶解物からの、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質の、図１Ａに示したゲル画像の拡大図。  精製したＲＢ：感染後２２〜２４時間から標識した直後に、感染後２４時間でＲＢとして精製した細菌からの、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄのタンパク質のゲル画像からの対応する領域。  精製したＥＢ：感染後２２〜２４時間から標識し、感染後７２時間でＥＢとして精製した細菌からの、タンパク質のゲル画像からの対応する領域。  列Ａ〜Ｇにおいて、分泌される候補ＤＴ４、ＤＴ４８、ＤＴ２３、ＤＴ７６、ＤＴ７７、ＤＴ４７及びＤＴ７５が濃縮された。
【図１１】感染後５５〜５７時間から標識した感染細胞の全溶解物、精製したＥＢ、感染後３４〜３６時間で標識した感染細胞の全溶解物、及び標識し同じ時点で精製したＲＢからの、二次元ゲル画像中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０から分泌される候補の位置を示す図である。  感染後５５〜５７時間：感染後５５〜５７時間から［３５Ｓ］−標識し、標識直後に採取し、非線状でｐＨ３〜１０であるＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐを使用する二次元ＰＡＧＥによって分離した、細胞の全溶解物からの、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０のタンパク質の、図２Ａに示したゲル画像の拡大図。  精製したＥＢ：発生サイクル中の２時間、すなわち感染後６、１２、２４、３６、４２、４８、５４、６０時間に標識し、感染後７２時間でＥＢとして精製した細菌からの、タンパク質のゲル画像からの対応する領域（非線状でｐＨ３〜１０であるＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ）。  感染後３４〜３６時間：感染後３４〜３６時間で標識し、標識直後に採取した感染細胞の全溶解物からの、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０のタンパク質のゲル画像からの対応する領域（線状でｐＨ４〜７であるＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ）。  感染後３６時間のＲＢ：感染後３４〜３６時間から標識した直後に、感染後３６時間でＲＢとして精製した細菌からの、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＶＲ１３１０のタンパク質のゲル画像からの対応する領域（線状でｐＨ４〜７であるＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ）。  Ａ〜Ｆにおいて、分泌される候補ＣＰ３４、ＣＰ３７、ＣＰ４６（配列番号２４４）、ＣＰ４７、ＣＰ５２、ＣＰ６３及びＣＰ７５が濃縮された。  Ｇは、分泌される候補を含まないＡ〜Ｆ中の領域の、親画像からの領域を示す。