(57)【要約】本発明は、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法を提供することを目的とする。本発明は、電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、イオン性ポリマーを泳動路の内面に固定化し、かつ、硫酸化多糖類を含有する緩衝液を用いるヘモグロビン類の測定方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、イオン性ポリマーを泳動路の内面に固定化し、かつ、硫酸化多糖類を含有する緩衝液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】
イオン性ポリマーは、アニオン性ポリマーであることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項３】
イオン性ポリマーは、カチオン性ポリマーであることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類の測定方法を用いることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項５】
請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類の測定方法を用いることを特徴とする安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン（以下、Ｈｂともいう）類、なかでも糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。【０００３】
従来、ＨｂＡ１ｃの測定は、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等により行なわれてきた。このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。【０００４】
これに対して、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動装置のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。【０００５】
これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能であるとされており、例えば、特許文献１や特許文献２には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する手法が開示されている。
しかしながら、特許文献１の方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高いことから、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。【０００６】
また、特許文献２には、該特許文献の公開前より公知であった２つの技術、即ち硫酸化多糖類のＨｂ類への親和性の利用と、キャピラリー内面の動的コーティング法という２つの技術を組み合わせることにより、ゲル電気泳動法と比較して短時間の測定を実現したものであり、１０分間程度での測定が可能であるとされている。【０００７】
しかしながら、このような動的コーティング法は、測定終了後、次試料の測定時に再びコーティングを行う必要がある。そのため、毎測定開始時に同じコーティング状態とするためには、測定終了後の洗浄操作によりコーティング層を剥し、測定開始前の初期の状態に戻す必要がある。即ち、連続測定する際には、測定の間に洗浄及びコーティング操作を挿入する必要があり、測定時間の延長を招いていた。また、これらの洗浄及びコーティング操作は、測定誤差発生の要因となりうる。加えて、コーティング用の試薬を測定時に具備する必要があるため、コスト的にも不利であった。また、連続測定を行わない場合であっても、１０分程度の測定時間はＨＰＬＣ法と比較して非常に長く、臨床検査に適用するには不充分であった。【０００８】
更に、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃ成分のなかでも、特に糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを、不安定型ＨｂＡ１ｃやカルバミル化Ｈｂ等の、測定の障害となる成分（以下、これらを修飾Ｈｂ類ともいう）から分離しなければならない。しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示された方法によって得られたエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法の技術範囲では安定型ＨｂＡ１ｃを修飾Ｈｂ類から分離することは困難であった。【０００９】
また、一部の試料に含まれる異常Ｈｂ類は、溶血性貧血やサラセミア等のヘモグロビン由来の疾病の診断指標となることが知られており、ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ測定方法においては、安定型ＨｂＡ１ｃと異常Ｈｂ類とを同時に測定する技術が開発されている。しかしながら、これまでのところ電気泳動法によるこのような技術は明らかにされていない。
【特許文献１】特表平０９−５１０７９２号
【特許文献２】特開平０９−１０５７３９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記現状に鑑み、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討した結果、イオン性ポリマーを泳動路に固定化し、かつ、硫酸化多糖類を含有する緩衝液を用いることにより、特に安定型ＨｂＡ１ｃの測定を短時間、高精度で測定することが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
本発明は、電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、イオン性ポリマーを泳動路に固定化し、かつ、硫酸化多糖類を含有する緩衝液を用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
以下に本発明を詳述する。【００１３】
本発明のヘモグロビン類の測定方法を適用することができる電気泳動装置としては、特に限定されず、例えば、一般にキャピラリー電気泳動装置、マイクロチップ電気泳動装置等と呼称される電気泳動装置類が挙げられる。【００１４】
図７に、本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いるキャピラリー電気泳動装置の一例を示す。図７に示すように、キャピラリー電気泳動装置１１は、陽極槽１２、陰極槽１３、キャピラリー１４、高圧電源１５、検出器１６、及び、一対の電極１７、１８からなり、キャピラリー１４の両端は陽極槽１２及び陰極槽１３内の緩衝液に浸され、管状のキャピラリー１４の内部は緩衝液で満たされている。また、電極１７及び１８は高圧電源１５と電気的に接続されている。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、泳動路であるキャピラリー１４の内面にイオン性ポリマーを固定化する。そして、ヘモグロビン類を測定する際には、キャピラリー１４の一方より試料を注入し、高圧電源１５から所定の電圧を印加することにより、キャピラリー１４内を移動する目的成分を検出器１６によって測定する。【００１５】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において泳動路に固定化されるイオン性ポリマーは、基材となるポリマー分子内にイオン性基を有するものであり、例えば、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマーを用いることができる。【００１６】
上記アニオン性ポリマーは、分子内にアニオン性基を有するポリマーである。
上記アニオン性ポリマーは、親水性であることが好ましく、具体的には例えば、アニオン性基含有多糖類、アニオン性基含有有機合成高分子等が挙げられる。
上記アニオン性基としては、特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。【００１７】
上記アニオン性基含有多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類及びその塩類；アルギン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類及びその塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体へのアニオン性基導入化物及
びその塩類等の公知のアニオン性基含有多糖類等が挙げられる。【００１８】
上記アニオン性基含有有機合成高分子としては、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有（メタ）アクリル酸重合体、２−アクリルアミド−ブチルスルホン酸重合体及びこれらの共重合物等の公知のアミノ基含有有機合成高分子等が挙げられる。【００１９】
上記アニオン性ポリマーの分子量の好ましい下限は５００Ｄａである。５００Ｄａ未満であると、泳動路の内面を充分に被覆することが困難となり、分離性能が不良になることがある。【００２０】
上記カチオン性ポリマーは、分子内にカチオン性基を有するポリマーである。
上記カチオン性ポリマーは、親水性であることが好ましく、具体的には例えば、アミノ化多糖類、アミノ基含有有機合成高分子等が挙げられる。
上記カチオン性基としては、特に限定されず、例えば、１〜４級のアミノ基等が挙げられる。【００２１】
上記アミノ化多糖類としては、例えば、キチン、キトサン等のキトサン誘導体及びその塩類；アミノセルロース、Ｎ−メチルアミノセルロース等のＮ−置換セルロースの誘導体及びその塩類；デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体へのアミノ基導入化物及びその塩類等、公知のアミノ化多糖類等が挙げられる。【００２２】
上記アミノ基含有有機合成高分子としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ポリ２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート等のアミノ基含有（メタ）アクリレート及び共重合物等、公知のアミノ基含有有機合成高分子等が挙げられる。【００２３】
上記カチオン性ポリマーの分子量の好ましい下限は５００Ｄａである。５００Ｄａ未満であると、泳動路の内面を充分に被覆することが困難となり、分離性能が不良になることがある。【００２４】
本発明のヘモグロビン類の測定方法における「泳動路」とは、電気泳動が行われる流路において、測定試料が電気泳動により移動及び／又は分離する部位（測定試料が注入された部位から検出される部位まで）のことをいう。具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリー内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいう。
上記泳動路の内面とは、具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリーの泳動路の内面のことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝の泳動路の内面のことをいう。【００２５】
上記泳動路を構成する素材については特に限定されず、例えば、ガラス製、金属製、樹脂製等が挙げられる。なかでも、ガラス製又は樹脂製であることが好ましい。
また、泳動路内には充填剤粒子のような固形物質が存在してもよいが、泳動路内に充填剤粒子のような固形物質が存在しないことが好ましい。【００２６】
上記泳動路の長さの好ましい下限は１０ｍｍ、好ましい上限は３００ｍｍである。１０ｍｍ未満であると、充分に試料が分離されないため、正確な測定をすることができないことがある。３００ｍｍを超えると、測定時間の延長や得られるエレクトロフェログラムにおいてピーク形状の変形が生じることによって、正確な測定をすることができないことがある。より好ましい下限は２０ｍｍ、より好ましい上限は２００ｍｍである。【００２７】
また、上記泳動路の幅又は直径の好ましい下限は１μｍ、好ましい上限は２００μｍである。１μｍ未満であると、試料成分を検出するための光路長が小さく、測定精度が低下することがある。２００μｍを越えると、泳動路内部で試料が拡散することによって、得られるエレクトロフェログラムにおいてピークがブロードになり、測定精度が低下することがある。【００２８】
上記イオン性ポリマーを泳動路に固定化する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には例えば、イオン性ポリマーを泳動路の内面に接触させて疎水性的又は静電気的な相互作用等を利用して物理的に吸着させる方法；泳動路の内面及びイオン性ポリマーをそれぞれの物質が有する官能基や他の物質等を介して共有結合により固定化する方法等が挙げられる。これらの方法を用いた場合、例えば、加熱工程や乾燥工程等を経ることにより、剥離しにくく、繰り返し測定が可能なイオン性ポリマーの固定化が可能となる。
また、イオン性ポリマー層と泳動路の内面との間に、別種の層を形成してもよい。即ち、最終的に泳動路の最内面にイオン性ポリマー層が形成されていればよい。【００２９】
上記固定化に用いるイオン性ポリマーは、イオン性ポリマーの種類や固定化法にもよるが、好ましくは０．０１〜２０％程度の溶液として上記操作に供されるのが好ましい。０．０１％未満であると、固定化が不充分となる恐れがあり、２０％を超えると固定層が均一にならず、測定途中に剥離し、再現性低下の原因となる可能性がある。【００３０】
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、硫酸化多糖類を含有する緩衝液を用いる。
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、上記緩衝液とは、電気泳動時に泳動路内に満たされる緩衝液、電気泳動時に泳動路の両端に設置される陽極槽及び陰極槽に満たされる緩衝液のほか、測定試料を溶解希釈する溶血希釈液、その他流路内を洗浄する緩衝液等も含む。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、これら全ての緩衝液が硫酸化多糖類を含有するものであってもよく、一部の緩衝液にのみ硫酸化多糖類を含有していてもよい。【００３１】
上記緩衝液としては、緩衝能を有する公知の緩衝液組成物を含有する溶液を使用することができ、具体的には例えばクエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。【００３２】
上記硫酸化多糖類としては特に限定されず、公知の硫酸化多糖類を用いることができる。具体的には例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体への硫酸基導入化物、及び、その塩類や、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等が挙げられる。【００３３】
上記緩衝液中の硫酸化多糖類の含有量の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は１０．０重量％である。０．０１重量％未満であると、硫酸化多糖類添加の効果が発現しにくく、分離が不充分となることがあり、１０．０重量％を超えると、測定時間の延長や分離不良を引き起こすことがある。【００３４】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、測定対象となるヘモグロビン類としては、特に限定されず、例えば、従来公知のヘモグロビン類が挙げられる。具体的には例えば、ＨｂＡ０、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、安定型ＨｂＡ１ｃ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）；アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類；ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常Ｈｂ類等が挙げられる。なかでも、糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを、不安定型ＨｂＡ１ｃや、カルバミル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類等と分離して測定することができる。
このような本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の一つである。【００３５】
本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、ＨｂＡ０、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）を測定することができる。
また、本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、糖尿病以外の疾病の指標となり得るＨｂＡ２を測定することができる。
更に、本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、糖尿病以外の疾病の指標となり得るＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常Ｈｂ類を測定することができる。安定型ＨｂＡ１ｃと同時に、ＨｂＡ２や、異常Ｈｂ類を測定することによって、糖尿病及び糖尿病以外の疾病の指標を同時に得ることができる。
このような本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法もまた、本発明の一つである。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、イオン性ポリマーを泳動路の内面に固定化することで、特に安定型ＨｂＡ１ｃの測定を１試料当り数分という短時間に、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％程度という高精度で測定することを可能となることから、従来技術では困難であった糖尿病患者の電気泳動法によるＨｂＡ１ｃ値の管理を好適に行うことができる。これは、一般に認知される動的コーティング法から固定化コーティング法への変更により得られる効果、即ち測定毎のコーティングが不要となり測定時間が短縮されるといった効果ではなく、従来分離できなかった成分を分離することができるようになるという、予測できなかった効果が得られた結果である。
また、泳動路の内面に固定化を行うことで、測定毎のコーティング操作等が不要となり、更なる短時間測定が可能となり、コーティング剤等の使用も不要となることから、コスト面でも非常に有利となる。
更に、電気泳動法は装置構成がＨＰＬＣよりも簡便であることから、本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いることで、安価なヘモグロビン類の測定方法を提供することが可能となる。
加えて、糖尿病以外の疾病の指標となりうる異常Ｈｂ類等を、安定型ＨｂＡ１ｃと同時に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００３８】
（実施例１）
アニオン性ポリマーであるデキストラン硫酸（和光純薬社製）を０．２重量％含有する水溶液を調製した。次いで、フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）に、０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌをこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、得られたデキストラン硫酸水溶液を２０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入してデキストラン硫酸水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再びデキストラン硫酸水溶液を注入し、空気の注入及び乾燥を５回繰り返した。
得られたデキストラン硫酸固定化キャピラリーを、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製  ＰＡＣ／Ｅ  ＭＤＱ）にセットした。その後、硫酸化多糖類であるコンドロイチン硫酸（和光純薬社製：硫酸化多糖類）を２重量％含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）をキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。【００３９】
（健常人血の測定）
測定試料としては、健常人血よりヘパリン採血した血液を用い、該健常人全血７０μＬに、硫酸化多糖類としてコンドロイチン硫酸を２．０重量％含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μＬを添加して溶血希釈したものを用いた。
キャピラリーの一方より試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に２０ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、ヒト血液中の安定型ＨｂＡ１ｃのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。得られたエレクトロフェログラムを図１に示す。図１中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。なお、安定型ＨｂＡ１ｃの分離は、約１．５分の電気泳動時間で行うことができた。【００４０】
（修飾Ｈｂを含む試料の測定）
健常人血の測定で用いた健常人全血に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、修飾Ｈｂの一種である不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含む試料を人為的に調製した。得られたエレクトロフェログラムを図２に示す。図２中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図２に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃが良好に分離された。【００４１】
（実施例２）
アニオン性ポリマーであるポリメタクリル酸の０．５重量％水溶液を用い、実施例１と同様の方法でキャピラリー内面をコーティングした後、緩衝液として、硫酸化多糖類であるデキストラン硫酸を２．０重量％含有するリンゴ酸緩衝液を用いた以外は、実施例１と同様にしてキャピラリー電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。【００４２】
（実施例３）
ガラス製マイクロチップ（３０ｍｍ×２０ｍｍ×２ｍｍ）にクロス十字型の泳動路を作製し、泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。
泳動路をアニオン性ポリマーであるコンドロイチン硫酸（１．０重量％水溶液）を用いて、実施例１と同様の手順でコーティングした後、実施例１と同様の緩衝液を用いて、１０００Ｖにて、マイクロチップ電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは図１及び図２と同様であった。【００４３】
（実施例４）
カチオン性ポリマーであるキトサン（和光純薬社製、キトサン１００）を０．２重量％含有する０．２Ｎ塩酸溶液を用い、実施例１と同様の方法でキャピラリー内面をコーティングした後、緩衝液として、硫酸化多糖類であるコンドロイチン硫酸を２．０重量％含有するクエン酸緩衝液を用いた以外は、実施例１と同様にしてキャピラリー電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。【００４４】
（実施例５）
カチオン性ポリマーであるポリブレン（ナカライテスク製）の０．５重量％水溶液を用い、実施例１と同様の方法でキャピラリー内面をコーティングした後、緩衝液として、硫酸化多糖類であるデキストラン硫酸を２．０重量％含有するリンゴ酸緩衝液を用いた以外は、実施例１と同様にしてキャピラリー電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。【００４５】
（実施例６）
ポリジメチルシロキサン製マイクロチップ（３０ｍｍ×２０ｍｍ×２ｍｍ）にクロス十字型の泳動路を作製し、泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。
泳動路をカチオン性ポリマーであるキトサン（１．０重量％水溶液）を用いて、実施例３と同様の方法でコーティングした後、緩衝液として硫酸化多糖類であるデキストラン硫酸を２．０重量％含有するリンゴ酸緩衝液を用いた以外は、実施例３と同様にしてマイクロチップ電気泳動法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは、図１及び図２と同様であった。【００４６】
（比較例１）
アニオン性ポリマーをキャピラリー内面に固定化せず、測定直前にキャピラリー内に通液する動的コーティング法を用いることにより測定を行った。
即ち、フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）を０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、実施例１で用いたデキストラン硫酸水溶液を１分間通液した。
次に、２．０重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製：硫酸化多糖類）を含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を上記キャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした後、実施例１と同様の方法で修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムには、ピークが検出されなかった。【００４７】
（比較例２）
カチオン性ポリマーをキャピラリー内面に固定化せず、測定直前にキャピラリー内に通液する動的コーティング法を用いることにより測定を行った。
即ち、フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）を０．２Ｎ  ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ  ＨＣｌの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、実施例１で用いたキトサン溶液を１分間通液して、キャピラリー内面を動的にコーティングした。
次に、２．０％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製：硫酸化多糖類）を含むリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を上記キャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に通液した。【００４８】
その後、実施例１と同様の方法で修飾Ｈｂ含有試料の測定を行ったところ、図３に示すエレクトロフェログラムが得られた。図３中のピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図３に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃを示すピーク１は修飾Ｈｂを示すピーク３に重なり、分離できなかった。【００４９】
（比較例３）
カチオン性ポリマーをキャピラリー内面に固定化せず、測定直前にキャピラリー内に通液する動的コーティング法を用いることにより測定を行った。即ち、フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長２３ｃｍ）を０．２Ｎ  ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ  ＨＣｌの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、０．５重量％のアルブミン（ウマ由来：和光純薬社製）を含むリンゴ酸緩衝液を１分間通液した。次に、０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製：硫酸化多糖類）を含むリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を上記キャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に通液した。キャピラリーの一方より試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に８．５ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、修飾Ｈｂ含有試料の測定を行った。得られたエレクトロフェログラムは図３と同様であり、安定型ＨｂＡ１ｃを修飾Ｈｂから分離できなかった。【００５０】
（比較例４）
緩衝液としてコンドロイチン硫酸を含有しないクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用いたこと以外は実施例４と同様の操作をして健常人血の電気泳動を行った。得られたエレクトロフェログラムにはピークが検出されなかった。【００５１】
（比較例５）
緩衝液としてデキストラン硫酸を含有しないリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用いたこと以外は実施例６と同様の操作をして健常人血の電気泳動を行った。得られたエレクトロフェログラムにはピークが検出されなかった。【００５２】
（評価）
（１）修飾Ｈｂ類の分離性能確認
実施例１〜６及び比較例２、３の測定条件について、健常人血試料と、該健常人血を元に調製した修飾Ｈｂ含有試料、即ち実施例１と同様の方法により健常人血にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られた不安定型ＨｂＡ１ｃ含有試料と、更に他の修飾Ｈｂ含有試料、即ちシアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたカルバミル化Ｈｂ含有試料を調製し、各試料における安定型ＨｂＡ１ｃ値を求めた。
各試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出した。
得られた各修飾Ｈｂ含有試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値から、得られた健常人血試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値を差し引いた値（ΔＨｂＡ１ｃ値）を求めた。
結果を表１に示した。
なお、比較例１、４については、安定型ＨｂＡ１ｃのピークが検出されなかったため、測定対象外とした。【００５３】
【表１】
2008047703.tif 000002
【００５４】
表１に示すように、実施例１〜６の測定条件においては、修飾Ｈｂ含有試料と修飾Ｈｂを含有しない健常人血試料との安定型ＨｂＡ１ｃの測定値の差はほとんどなく、測定値差は０．２％以下であり、修飾Ｈｂ類の存在下においても、安定型ＨｂＡ１ｃが正確に測定できることが確認された。
一方、比較例２、３においては、修飾Ｈｂ類と安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不充分なため、０．７〜１．３％の測定値差が確認され、修飾Ｈｂが含まれた場合には、安定型ＨｂＡ１ｃ値が正確に測定できないことが確認された。【００５５】
（２）同時再現性試験
実施例１〜６及び比較例２、３の測定条件を用いて、同一の健常人血試料を１０回連続して測定し、得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。
ＣＶ値は（標準偏差／平均値）を算出することにより求めた。
なお、比較例２、３では、１回の測定が終了した時点で、０．２ＮのＮａＯＨ溶液を１分間通液し、泳動用緩衝液を２分間通液してキャピラリー内を洗浄した後、再び各コーティング溶液を１分間通液して、キャピラリー内面に動的コーティングを施した後、次測定試料を注入し、測定を繰り返し行うことによって同時再現性試験を行った。
結果を表２に示した。【００５６】
（３）耐久性試験
実施例１〜６及び比較例２、３の測定条件を用いて、同一の健常人血試料を１００回連続して測定して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値の最大値と最小値との差（Ｒ値）を算出した。結果を表２に示した。【００５７】
【表２】
2008047703.tif 000003
【００５８】
表２に示すように、実施例１〜６では、同時再現性試験において、バラツキ度合いを示すＣＶ値が約１％と良好な値を示し、糖尿病患者の安定型ＨｂＡ１ｃ値を管理できる水準であることが確認された。また、耐久性試験における連続１００試料測定時のバラツキ幅についても、０．２〜０．３％程度と非常に小さくなっていた。この結果から、実施例１〜６の測定条件を用いた場合、安定型ＨｂＡ１ｃの高精度の分離が可能であり、繰り返し測定をする場合においても、安定的に安定型ＨｂＡ１ｃ値を得ることが可能となることが確認された。
一方、比較例２及び比較例３の測定条件を用いた同時再現性試験では、ＣＶ値が極めて大きく、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理する上で全く不充分な値となっていた。また、耐久性試験では、繰り返し測定を行うことによって徐々に測定値が変化し、最終的に大きなバラツキ幅（Ｒ値）を示し、比較例２の条件では約５０回の測定で測定不能となり、比較例３の条件では約６０回の測定で測定不能となった。【００５９】
（４）異常Ｈｂ類の測定
異常Ｈｂを含む試料として、ＡＦＳＣヘモコントロール（ヘレナ研究所社製）を用いた以外は、実施例１、比較例２の測定条件と同様の方法によって、異常Ｈｂ類を含む試料の測定を行った。
実施例１の測定条件を用いて測定した結果、得られたエレクトロフェログラムを図４に示す。また、比較例２の測定条件を用いて測定した結果、得られたエレクトロフェログラムを図５に示す。図４及び図５中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク４はＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク５はＨｂＳ、ピーク６はＨｂＣを示す。なお、実施例２〜６の測定条件により得られたエレクトロフェログラムは図４とほぼ同様な形状を示した。
図４に示すように、実施例１の測定条件を用いて測定した場合、安定型ＨｂＡ１ｃと共に、異常ＨｂであるＨｂＳ及びＨｂＣが、短時間で精度よく分離された。
一方、図５に示すように、比較例２の測定条件を用いて測定した場合、異常Ｈｂ類であるＨｂＳ及びＨｂＣを分離することはできなかった。
この結果から、実施例１〜６の測定条件を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃの測定による糖尿病診断に加えて、他のＨｂ由来の疾病について同時にスクリーニング検査することが可能となることが確認された。【００６０】
（５）ＨｂＡ２を含む試料の測定
ＨｂＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を用いた以外は、実施例１の測定条件と同様の方法によって、ＨｂＡ２を含む試料の測定を行った。
得られたエレクトロフェログラムを図６に示す。図６中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク４はＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク７はＨｂＡ２を示す。なお、実施例２〜６の測定条件を用いて測定した場合、得られたエレクトロフェログラムは図６とほぼ同様の形状を示した。
図６に示すように、実施例１の測定条件を用いて測定した場合、ＨｂＡ２を分離することができ、安定型ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ２との同時測定が可能であった。
一方、比較例２の測定条件を用いて測定した場合、ＨｂＡ２を分離することはできなかった。
この結果から、実施例１〜６の測定条件を用いることによって、安定型ＨｂＡ１ｃの測定による糖尿病診断に加えて、他のＨｂ由来の疾病について同時にスクリーニング検査することが可能となることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、電気泳動法を用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の同時測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】実施例１の測定条件により、健常人血を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。
【図２】実施例１の測定条件により、修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。
【図３】比較例２の測定条件により、修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムを示す。
【図４】実施例１の測定条件により、異常Ｈｂ（ＨｂＳ及びＨｂＣ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。
【図５】比較例２の測定条件により、異常Ｈｂ（ＨｂＳ及びＨｂＣ）を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。
【図６】実施例１の測定条件により、ＨｂＡ２を含む試料を測定した場合に得られたエレクトロフェログラムである。
【図７】本発明のヘモグロビン類の測定方法を用いた電気泳動装置の一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００６３】
１１  キャピラリー電気泳動装置
１２  陽極槽
１３  陰極槽
１４  キャピラリー
１５  高圧電源
１６  検出器
１７  電極
１８  電極
１  安定型ＨｂＡ１ｃ
２  ＨｂＡ０
３  修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）
４  ＨｂＦ（胎児性Ｈｂ）
５  ＨｂＳ
６  ＨｂＣ
７  ＨｂＡ２
【図１】
2008047703.tif 000004
【図２】
2008047703.tif 000005
【図３】
2008047703.tif 000006
【図４】
2008047703.tif 000007
【図５】
2008047703.tif 000008
【図６】
2008047703.tif 000009
【図７】
2008047703.tif 000010
【国際調査報告】
2008047703.tif 000011
2008047703.tif 000012
2008047703.tif 000013
2008047703.tif 000014