【手続補正書】
【提出日】平成15年7月18日(2003.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
TM5ヘリックスからのN末端疎水性残基は、その後、パルミチン酸脂質（C16H31O）で置き換えられて、i3ペプチドのサイズを大幅に縮小した。パルミトイル化ペプチドは、C末端アミドで標準的fmoc固相合成方法により合成された。パルミチン酸を50％ N-メチルピロリドン/50％塩化メチルに溶解し、ペプチドの脱保護されたN末端アミンへ一晩結合させた。樹脂からの切断後、パルミトイル化ペプチドは、C18またはC4逆相クロマトグラフィーにより、＞95％純度まで精製された。図1Bに示されるように、パルミトイル化i3ループペプチド、P1pal-19は、細胞外PAR1リガンド、SFLLRN（配列番号：32）により引き起こされるものと特性において一致する急速なCa2+i過渡的状態を引き起こす。さらに、P1pal-19は8±3マイクロモルのEC50で、完全に血小板凝集を活性化する（図1D）。個々の血小板の凝集痕跡は、指示されたペプチドまたはパルミチン酸の10マイクロモルで刺激され、血小板凝集は、記載のように（L. Covic, A. L. Gresser, A. Kuliopulos, Biochemistry 39, 5458-5467（2000））、37℃で、撹拌された血小板の光透過率（％）としてモニターされた。P1pal-19では、30マイクロモルSFLLRN（配列番号：32）（図1C）に対して続いて起こるCa2+i応答が、PAR1の脱感作のために完全に阻害される。同様に、SFLLRN（配列番号：32）での予備刺激は、血小板のP1pal-19に対して完全に脱感作する。パルミチン酸単独では、Ca2+iおよび血小板凝集に影響は及ぼさない（図1B、図1D）。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
実施例2：組換え系における、PAR1を活性化するペプデューシンの能力の評価
本発明によるペプデューシンの能力をその後、それらの細胞貫通能力について評価した。PAR1は、GqおよびGi（β/γ）の両方に結合して、ヒトPAR1を発現するRat1繊維芽細胞において、ホスホリパーゼC-β（PLC-β）（D. T. Hung, T.-K. H. Vu, V. I. Wheaton, K. Ishii, S. R. Coughlin, J. Clin. Invest. 89, 1350-1353（1992））、イノシトールリン酸（InsP）の生成を刺激する。[3H]-イノシトールリン酸の蓄積は、20 mM LiClの存在において測定された。細胞は、200,000細胞/ウェルで12ウェルプレートへ分配した。[3H]-標識ミオイノシトール（2μCi/mL）を実験24時間前に細胞へ添加した。ウェルを10 mM HEPES緩衝液、pH 7.3を含む2 mL DMEで2回、それから20 mM LiClを含む2 mL PBSで2回すすいだ。細胞は、アゴニストまたは規定濃度のi3ループペプデューシンで30分間刺激され、その後、冷たいメタノールおよびクロロホルムで抽出された。抽出物は、1 mL 陰イオン交換樹脂AG1X8、ギ酸型、100メッシュ〜200メッシュサイズを含むカラム（バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、ケンブリッジ、MA）へ注入された。注入後、カラムを10 mL H2Oで2回、および10 mL 60 mM ギ酸アンモニウム/5 mM ボラックス（Borax）で2回洗浄した。カラム画分を4 mL 2 Mギ酸アンモニウム/0.1 M ギ酸で希釈して、7.5 mLシンチレーション反応混液を含むバイアルへ入れ、計数した。二回または三回の測定手段が、刺激されていない細胞の上への折り返し刺激として現されていた。二相のペプデューシンデータは、カレイダグラフ3.05（Kaleidagraph 3.05）を使用する非線形回帰分析により、1つの活性化部位（EC50）および1つの抑制部位（IC50）での2部位の方程式 y＝(100/(1＋(([ペプチド]/EC50)−n1)))＋(100/(1＋(([ペプチド]/IC50)−n2)))−n3（n1およびn2は、それぞれ活性化相および抑制相に関するヒル係数であり、n3はΔ最大振幅である）に適合させた。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
PAR-1細胞またはPAR2-COS7細胞を1 nMから10〜100?Mまでのi3ペプチドまたはマストパラン
2003530875.tif 000001
（配列番号：33）で刺激した。PLC-β活性は、全[3H]-イノシトールリン酸（InsP）形成を測定することにより決定された。図2Bおよび図2Cにおいて示されているように、P1pal-19、およびP1pal-19のN末端の6残基を欠失しているP1pal-13は、それぞれ、180±20 nMおよび700±50 nMのEC50値でInsP生成を刺激し、天然アゴニストのトロンビンとよく似た効力をもつ。図Bおよび図Cにおいて、PLC-β活性は、0.1 nMトロンビン（100％）と比較しての完全反応のパーセントに換算し、二相の活性化特性および抑制特性に適合する2部位の方程式を使って、ペプチド濃度の機能としてプロットした。個々の実験に関する完全なPAR1トロンビン反応は、P1pal-13の7.6倍、P1pal-12およびP1pal-7の9.4倍、P1pal-19およびP1pal-19/Rat1単独の12.4倍、P1pal-19Qの18倍、P1pal-19Eの12.4倍、およびマストパラン実験の9.5倍であった。図Cにおいて、P1pal-19を形質移入されていないRat1細胞（Rat1単独）のわずかな刺激は、SFLLRN（配列番号：32）の添加によりこれらの形質移入されていない細胞（図2Fの「RAT1」）に同様の刺激を引き起こすことから、これらの繊維芽細胞において存在する内因性のラットPAR1に帰することができる。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
PAR1の活性化カーブは、急勾配の活性化相の後、急勾配の抑制相が続く二相になっている。P1pal-19アゴニストをC末端のP1pal-7および対応するN末端のP1pal-12ペプチドに分割することにより、別々に（図1B、図1D、図2B）またはいっしょに（図1B）に添加する場合、血小板またはPAR1-Rat1細胞において刺激活性の減少を生じる。それゆえ、アゴニスト活性をもつためには、C末端のPAR1ペプデューシン残基301〜313位が隣接していなければならない。COS7細胞はヒト受容体PAR1、PAR2、PAR4、コレシストキニンA（CCKA）、コレシストキニンB（CCKB）、サブスタンスP（Sub-P）、またはラットソマトスタチン受容体（SSTR2）を一過的に形質移入された。形質移入された細胞をP1pal-19、P1pal-13、またはP2pal-21の濃度範囲（0.1マイクロモル〜10マイクロモル）で刺激したが、個々の受容体の最高刺激を黒いカラムで報告している。各受容体に関する最高限度の刺激（白抜きのカラム）を定義するために使用される細胞外アゴニストは、PAR1については10 nMのトロンビン、PAR2については100マイクロモルのSLIGKV（配列番号：17）、PAR4については100 nMのトロンビン、CCKAとCCKBについては300 nMのCCK-8、SSTR2については1マイクロモルの
2003530875.tif 000002
（配列番号：18）、およびSub-Pについては1.5マイクロモルの
2003530875.tif 000003
（配列番号：34）である。これらの受容体に対するP1pal-19およびP1pal-13についての完全な活性特性は、補足的材料として含む（補足的情報はサイエンスオンラインのwww.sciencemag.orgで入手可能である）。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
次に、ペプデューシンによるGタンパク質の間接的対直接的活性化間の区別を助けるために、i3ループのC末端/PAR1のTM6のN末端に位置するS309位に点突然変異を導入した。膜周囲の領域は、Gタンパク質の多くの受容体に対する結合の忠実性にとって重要であることが示されており（S. Cotecchia, J. Ostrowski, M. A. Kjelsberg, M. G. Caron, R. J. Lefkowitz, J. Biol. Chem. 267, 1633-1639（1992）; E. Kostenis, B. R. Conklin, J. Wess, Biocehmistry 36, 1487-1495（1997）; M. A. Kjelsberg, S. Cotecchia, J. Ostrowski, M. G. Caron, R. J. Lefkowitz, J. Biol. Chem. 267, 1430-1433（1992））、そしてTM3の重要なDRY残基に直接的接触に至る（K. Palczewskiら、Science 289, 739-745（2000））。S309P突然変異体を構築し、野生型PAR1と同じレベルまでCOS7細胞へ一過的に発現させた。COS7細胞を野生型（WT）、S309PまたはΔ377PAR1（A. Kuliopulosら、Biochemistry 38, 4572-4585（1999））受容体で、一過的に形質移入した。細胞をP1pal-19、SFLLRN（配列番号：32）、またはトロンビンで刺激し、PLC-β活性を0.1 nMトロンビンでのWT PAR1の100％刺激（9.6倍）に比較しての全[3H]-イノシトールリン酸生成を測定することにより決定した。図Bにおけるトロンビンの非常に高い濃度によるPAR1の明らかな抑制は、PAR1のe1外部ドメインに位置するヒルジン様配列（K51YEPF55）へのトロンビンの持続性相互作用により引き起こされる（D. T. Hung, T. -K. H. Vu, V. I. Wheaton, K. Ishii, S. R. Coughlin, J. Clin. Invest. 89, 1350-1353（1992））。トロンビンのかなりの量がトロンビン付着性PAR1外ドメインへ結合したままでいることができ（S. L. Jacques, M. LeMasurier, P. J. Sheridan, S. K. Seeley, A. Kuliopulos, J. Biol. Chem. 275, 40671-40678（2000））、つながれたSFLLRN（配列番号：32）による分子内連結を阻害する。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
S309P突然変異体は、トロンビン依存性InsPおよびSFLLRN（配列番号：32）依存性InsPの刺激において、それぞれ、17倍と28倍の作用強度の損失、および1.6倍と3.3倍の効力の損失で、不足している（図3B、図3C）。興味深いことに、P1pal-19もまた、S309P突然変異体を刺激するのが、野生型PAR1への影響と比較して作用強度（13倍）および効力（4.3倍）において平行して損失している。P1pal-19はS309P突然変異体のシグナル伝達の欠陥を補正しなかったことから、これは、無傷の受容体におけるi3領域の非常に重要なC末端部分が、Gタンパク質への結合において、外因性ペプデューシンの効果を上回る優勢な効果を発揮することを示している。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例5：ペプデューシンと相互作用するGPCR領域の決定
i3ペプデューシンと直接的に接触するであろう受容体の領域を限定するために、PAR1の全C末端i4ドメインを削除した（Δ377）。ロドプシンのX線構造（K. Palczewskiら、Science 289, 739-745（2000））により、i3ループが、αヘリックス8のN末端領域およびi4カルボキシル末端内のCys-パルミチン酸部分のC末端側への残基に接触しうることを示している。図3Bおよび図3Cに示されているように、Δ377突然変異体はトロンビンおよびSFLLRN（配列番号：32）への応答においてPLC-βを刺激することに欠けている。効力はその2つのPAR1アゴニストについて2倍〜3倍低下し、かつ作用強度はトロンビンについて22倍およびSFLLRN（配列番号：32）について〜30倍変化する。対照的に、P1pal-19ペプデューシンは、Δ377PAR1突然変異体の存在において、有効的にはPLC-βを刺激しない（図3A）。これらのデータは、PAR1のカルボキシル末端がGタンパク質を活性化するためにP1pal-19を必要とすること、かつカルボキシル末端がペプデューシンアゴニストについて結合表面を提供しうることを示している。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例6：アゴニスト活性を欠損するペプデューシンはまだなお、GPCRタンパク質のシグナル伝達を阻害する
血小板は独特なCa2+シグナル伝達特性をもつPAR1およびPAR4の両方のトロンビン受容体を有するため、ヒト血小板は、抗PAR1および抗PAR4ペプデューシンの作用強度および選択性を試験するためには、便利な、生物学的に意味のある系であった（20）。PAR1ペプチド、P1pal12は、PAR1のシグナル伝達を完全に阻害することが見出された。血小板Ca2+測定は、実施例1のように行われた。血小板は3?MのP1pal-12（白抜きの矢印）またはP4pal-15
2003530875.tif 000004
（配列番号：9）、黒の矢印）で前処理され、その後、指示されているように、3マイクロモルのSFLLRN（配列番号：32）または200マイクロモルのAYPGKF（配列番号：35）で刺激された。図4A〜図4Cに示されているように、3マイクロモルのP1pal-12は、SFLLRN（配列番号：32）によるヒト血小板のPAR1活性化を効率的に阻害するが、AYPGKF（配列番号：35）によるPAR4活性化を阻害しない（図4A）。さらに、PAR4の完全長i3ループに対応するペプデューシン、P4pal-15は、アゴニスト活性をもっていなかったが、PAR4のシグナル伝達に完全に拮抗することができた。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
血小板をその後、3マイクロモルのP1pal-12または3マイクロモルのP4pal-15のいずれかで1分間、プレインキュベートし、それから、3マイクロモルのSFLLRN（配列番号：32）または200マイクロモルのAYPGKF（配列番号：35）で刺激し、そして図1Dのように血小板凝集をモニターした。完全な血小板凝集トレースは、阻害剤の不在（−）における同量のSFLLRN（配列番号：32）またはAYPGKF（配列番号：35）について示されている。血小板は0.01マイクロモル〜5マイクロモルのP1pal-12またはP4pal-15で1分間前処理され、そして、それぞれ、3マイクロモルのSFLLRN（配列番号：32）または200マイクロモルのAYPGKF（配列番号：35）で刺激された。図4Aに示されているように、3マイクロモルのP4pal-15は、SFLLRN（配列番号：32）によるPAR1の活性化に影響を与えることなく、AYPGKF（配列番号：35）によるPAR4の活性化を阻害し、血小板凝集の効果的な阻害剤である（図4B、図4C）。このように、P4pal-15は、最初に記載されている高作用強度の抗PAR4化合物（血小板中IC50 = 0.6マイクロモル）であり、マウスの管生物学において、PAR4の役割を描写するのを助けるために最近使用されている（Covic, Misra, Kuliopulos, （未発表データ））。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
次に、PAR1、PAR4、およびPAR2発現繊維芽細胞を0.03マイクロモル〜100マイクロモルのP1pal-12、P4pal-15、またはP2pal-21で5分間、前処理し、その後、細胞外アゴニストの0.1 nMのトロンビン、10 nMのトロンビン、または100マイクロモルのSLIGKV（配列番号：17）で、それぞれ刺激した。InsP阻害のパーセントは、完全な細胞外アゴニスト刺激応答と比較して計算される：P1pal-12については5.2倍、P4pal-15については3.1倍およびP2pal-21については3.1倍。抗PAR1および抗PAR4ペプデューシンの両方ともにまた、PAR1またはPAR4を発現する繊維芽細胞において、それぞれ、PLC-βへのシグナル伝達を阻害することができる（図4D）。最後に、PAR2の部分的アゴニストである、PAR2ペプデューシン、P2pal-21（図2D）もまた、繊維芽細胞においてPAR2のシグナル伝達を完全に阻害することができる（図4D）。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
例として、NMR構造解析を使って、本発明者らは、PAR1についてのリガンド結合部位の部分を形成するPAR1の細胞外表面上の領域を同定した。この領域は、受容体残基P85AFIS89から成り立ち、リガンド結合部位-1（LBS-1）と名付けられた。PAR1上のこの領域の突然変異は、分子内リガンド（すなわち、SFLLRN（配列番号：32））またはトロンビンによる受容体活性化において重大な欠陥を引き起こす。受容体のリガンド結合部位のまねをする脂質連結ペプチドの添加は、トロンビン活性型受容体（分子内リガンド）または外因的に添加された分子間リガンドを妨害することが予想されるであろう（図8）。受容体の他の細胞外ループもまた、リガンドと接触する可能性が高く、リガンド結合部位-2（LBS-2）、LBS-3などと名付けられる領域に寄与するものとなりうる。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
PAR1のP85AFIS89配列、および完全な受容体において脂質の二層構造体をもって極めて接近するようになることが予想されている、隣接したC末端残基D90ASGTL95-Cを含む、受容体ペプチド
2003530875.tif 000005
（配列番号：36）が合成された（図9B）。非脂質化LBS1ペプチドは、PAR1依存性血小板Ca++流量のトロンビンおよびSFLLRN（配列番号：32）による活性化に対して、相対的に弱いアンタゴニストであった（それぞれ、図9Cおよび図9D）。同様に、非脂質化LBS1ペプチドは、3 nMのトロンビンの血小板凝集を阻害しなかった（図9E）。目立って対照的なことには、C末端脂質化ペプチド、LBS1-PE（図9A）は、血小板凝集の効果的な阻害剤であった。図9Eに示されているように、25マイクロモルのLBS1-PEは3 nMのトロンビン誘発性血小板凝集を完全に阻害した。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
実施例8：ペプデューシンのG結合性MC4肥満受容体活性化
メラニン細胞刺激ホルモン（α-MSH）のようなメラノコルチンアゴニストによるMC4受容体（MC4R）の活性化は、マウスにおいて摂食障害（食欲の喪失）および体重減少を引き起こす。MC4Rの突然変異体は極度に肥満したヒトにおいて見出された。ここで、本発明者らは、ヒトMC4Rの第三の分子内ループに対応するペプデューシン、MC4pal-14
2003530875.tif 000006
（配列番号：37）を合成し、その同族の受容体とともに、アゴニスト活性についてそのペプデューシンを試験した。MCR4で一過的に形質移入したCOS7繊維芽細胞へMC4pal-14を添加することにより、アゴニストと認められているα-MSHと比較して35％、アデニル酸シクラーゼ活性を刺激した。MC4pal-14の活性特性は、活性化相（EC50、〜150 nM）および抑制相（IC50、〜10マイクロモル）をもつ二相である。これらのデータは、ペプデューシンがG結合性受容体経路を活性化でき、かつMC4pal-14およびその誘導体がヒトにおける抗肥満剤として使用されうることを示している。さらに、α-MSHのような全身に注入されるペプチドアゴニストとは違って、これらの細胞貫通型ペプデューシンは血液脳関門を渡って中枢神経系に位置しているMC4のような受容体を活性化することが予想されるであろうことは注目すべきである（図7）。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
【表１】
2003530875.tif 000007
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面】
【図１Ａ】
2003530875.tif 000008
【図１Ｂ】
2003530875.tif 000009
【図１Ｃ】
2003530875.tif 000010
【図１Ｄ】
2003530875.tif 000011
【図１Ｅ】
2003530875.tif 000012
【図２Ａ】
2003530875.tif 000013
【図２Ｂ】
2003530875.tif 000014
【図２Ｃ】
2003530875.tif 000015
【図２Ｄ】
2003530875.tif 000016
【図２Ｅ】
2003530875.tif 000017
【図２Ｆ】
2003530875.tif 000018
【図２Ｇ】
2003530875.tif 000019
【図３Ａ】
2003530875.tif 000020
【図３Ｂ】
2003530875.tif 000021
【図３Ｃ】
2003530875.tif 000022
【図４Ａ】
2003530875.tif 000023
【図４Ｂ】
2003530875.tif 000024
【図４Ｃ】
2003530875.tif 000025
【図４Ｄ】
2003530875.tif 000026
【図４Ｅ】
2003530875.tif 000027
【図５】
2003530875.tif 000028
【図６Ａ】
2003530875.tif 000029
【図６Ｂ】
2003530875.tif 000030
【図６Ｃ】
2003530875.tif 000031
【図６Ｄ】
2003530875.tif 000032
【図７】
2003530875.tif 000033
【図８】
2003530875.tif 000034
【図９Ａ】
2003530875.tif 000035
【図９Ｂ】
2003530875.tif 000036
【図９Ｃ】
2003530875.tif 000037
【図９Ｄ】
2003530875.tif 000038
【図９Ｅ】
2003530875.tif 000039