(57)【要約】  本発明は、検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞の生死を判定した後、検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものと細胞とを反応させて、細胞表面に結合している標識を検出する工程を含む抗体医薬感受性（抵抗性の有無）についての簡便な検査方法の提供に関し、標識の検出後、補体を細胞に添加することもできる。
2008041594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞を、細胞培養容器内で培養する工程；
（２）当該細胞容器内で培養された細胞の生死を判定する工程；
（３）前記工程（２）において検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞に関して検査に十分な数の生細胞が存在することが判定された場合に、当該検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを、当該細胞培養容器に添加して培養する工程；及び
（４）細胞表面に結合している当該標識を検出する工程；を含む、抗体医薬感受性検査方法。
【請求項２】
（５）上記工程（４）の後に、補体を前記細胞培養容器に添加する工程；及び
（６）細胞表面に結合している前記標識を検出し、更に補体添加後の細胞の生死を判定する工程；を更に含む、請求項１に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項３】
（７）前記工程（６）の後に、細胞の生死の比率を求める工程；を更に含む、請求項２に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項４】
（ａ）検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞を、細胞培養容器内で培養する工程；
（ｂ）細胞の生死を判定するための試薬、及び、当該検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを、当該細胞培養容器内に添加して培養する工程；及び
（ｃ）細胞培養容器内の細胞の生死を判定し、更に細胞表面に結合している当該標識を検出する工程；を含む、抗体医薬感受性検査方法。
【請求項５】
（ｄ）上記工程（ｃ）の後に、補体を前記細胞培養容器に添加する工程；及び
（ｅ）細胞表面に結合している前記標識を検出し、更に補体添加後の細胞の生死を判定する工程；を更に含む、請求項４に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項６】
（ｆ）前記工程（ｅ）の後に、細胞の生死の比率を求める工程；を更に含む、請求項５に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項７】
上記工程（７）又は（ｆ）の後に、
（Ｘ）前記検査対象者由来の細胞の生死の比率、及び陽性対照となる細胞の生死の比率を比較する工程；を更に含む、請求項３又は６に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項８】
前記工程（２）、（６）、（ｃ）、及び（ｅ）における細胞の生死を判定する工程が、細胞核を染色する試薬を細胞培養容器内に添加する操作を含む、請求項１、２、４又は５に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項９】
上記工程（１）の後、上記工程（５）の前若しくは後、上記工程（ａ）の後、上記工程（ｄ）の前若しくは後のうちの少なくともいずれかにおいて、
（Ｙ）前記細胞培養容器内にオイルを添加する工程；を更に含む、請求項２又は５に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項１０】
前記細胞培養容器に区画を有し、区画の各々が、１〜４ｍｍの直径を有し、２〜５ｍｍの深さを有し、１〜１５μｌの容積を有する、請求項１又は４に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項１１】
前記標識が光学的に検出可能なものであり、当該標識の検出を光学装置により行う、請求項１又は４に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項１２】
前記検査対象がＢ細胞性リンパ腫の患者であり、前記検査対象由来の細胞が当該患者より採取したリンパ腫組織に由来する細胞である、請求項１又は４に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【請求項１３】
前記工程（１）の前、又は前記工程（ａ）の前に、検査対象者由来の細胞をＣＤ１９についてのスクリーニングにかける工程を含み、陽性細胞のみを、工程（１）又は工程（ａ）にかける、請求項１２に記載の抗体医薬感受性検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体医薬感受性検査方法に関する。
本願は、２００６年９月２６日に、日本に出願された特願２００６−２６１２０７号及び、２００６年１２月１１日に日本に出願された特願２００６−３３３３３１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
抗体には、高い結合活性、結合特異性、及び血中での安定性が備わっている。そのため、これらの特徴を生かし、人の各種疾患の診断・予防・治療へ応用することが近年試みられている。中でも遺伝子組み替え技術を利用したキメラ抗体やヒト化抗体の中には目覚しい治療効果があがっているものもある。これらの抗体を利用する抗体医薬の研究・開発が近年注目されている。【０００３】
現在、臨床で用いられている抗体医薬としては、乳がんに対するトラスツマブ（一般名）（ハーセプチン(商品名  Roche社)；Ｈｅｒ２ヒト化モノクローナル抗体）や、Ｂリンパ腫に対するリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ；ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体）等が知られている。【０００４】
抗体医薬の作用機序としては、シグナリングによる増殖抑制やアポトーシス誘導、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）等が挙げられる。中でもＣＤＣは、血中に豊富に存在する補体が抗体を直接認識して標的細胞を攻撃するため、医薬の投与から比較的短時間で効果を発揮すると考えられている（非特許文献１）。しかし、例えば一部のＢリンパ腫患者においては、リツキシマブ抵抗性の者も存在していることが知られている（非特許文献２）。
【非特許文献１】オリバー・マンチェスら（Oliver Manches et al.）、ブラッド（Blood）、第１０１巻、第３号、pp.949-954、２００３年
【非特許文献２】ジェームズ・Ｍ・フォーランら（James M. Foran et al.）、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（British J. Hematology）、第１１４巻、第881頁、２００１年
【非特許文献３】ミルテニーバイオテク(株)、“auto MACSによるCD19+細胞の単離”、[online]、[平成１８年９月２１日検索]、インターネット＜URL: http://www.miltenyibiotec.co.jp/tech_info/prot/pdf_2_human/130-050-301prot-a.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
リツキシマブの例に見られるように、抗体医薬には抵抗性（感受性）という潜在的問題が存在している。この問題に対処するため、従来の方法においては患者から採取した組織や細胞を使って病理標本をまず作製し、この病理標本に対して抗体染色を実施している。
このように病理標本に抗体染色を実施することで、使用する抗体医薬が認識する抗原が標的に発現しているかを同定し、更にその検査結果を受けてどのように治療を行っていくかを医師が決定する必要がある。【０００６】
しかし病理標本作製においては組織・細胞の固定を行う必要があるため、標的細胞の表面に発現している抗原と、細胞内部に存在している抗原とを明確に区別することができないという問題がある。また、抗体医薬の抗原認識部位に変異が入っている可能性がある場合は、抗体医薬が実際の治療において作用を発揮するかどうかを予測するのは難しい。更に、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９等が発現している場合、補体防御系として働くという問題もある。従って、使用する抗体医薬に対応する抗原が標的に存在していることが病理標本を使用して判明していても、実際に抗体医薬を投与する患者においてＣＤＣが有効に作用するかどうかについては不明であるという問題がある。【０００７】
病理標本を使う方法以外には、フローサイトメータにより細胞表面の抗原を検出するものがある。しかしこの方法の実施には、１×１０６程度の大量の標的細胞が必要となるため、この方法を採用することができない場合も多い。例えば、初期癌患者の場合には、腫瘍が小さいため解析に必要十分量の腫瘍細胞を得ることができない場合がある。また、比較的大きな組織を採取できる場合であっても、その中の腫瘍細胞の割合が低く、実質的に解析ができない場合もある。【０００８】
別の問題としては、一般にリツキシマブ等の抗体医薬は高価であるということが挙げられる。抵抗性のために治療効果の望めないことが事前にわかれば、抗体医薬の使用を避けて他の治療方法に切り替えることが可能となる。従って、抗体医薬感受性（抵抗性の有無）についての簡便な検査方法に対する要請が、患者及び医療従事者の双方に存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本願発明は下記、１．〜１３．の構成をとる。
１．以下の工程：
（１）検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞を、細胞培養容器内で培養する工程；
（２）当該細胞容器内で培養された細胞の生死を判定する工程；
（３）前記工程（２）において検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞に関して検査に十分な数の生細胞が存在することが判定された場合に、当該検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを、当該細胞培養容器に添加して培養する工程；及び
（４）細胞表面に結合している当該標識を検出する工程；を含む、抗体医薬感受性検査方法。【００１０】
２．上記工程（４）の後に、
（５）補体を前記細胞培養容器に添加する工程；及び
（６）細胞表面に結合している前記標識を検出し、更に補体添加後の細胞の生死を判定する工程；を更に含む、上記１．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１１】
３．前記工程（６）の後に、
（７）細胞の生死の比率を求める工程；を更に含む、上記２．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１２】
４．下記の工程：
（ａ）検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞を、細胞培養容器内で培養する工程；
（ｂ）細胞の生死を判定するための試薬、及び、当該検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを、当該細胞培養容器内に添加して培養する工程；及び
（ｃ）細胞培養容器内の細胞の生死を判定し、更に細胞表面に結合している当該標識を検出する工程；を含む、抗体医薬感受性検査方法。【００１３】
５．上記工程（ｃ）の後に、
（ｄ）補体を前記細胞培養容器に添加する工程；及び
（ｅ）細胞表面に結合している前記標識を検出し、更に補体添加後の細胞の生死を判定する工程；を更に含む、上記４．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１４】
６．前記工程（ｅ）の後に、
（ｆ）細胞の生死の比率を求める工程；を更に含む、上記５．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１５】
７．上記工程（７）又は（ｆ）の後に、
（Ｘ）前記検査対象者由来の細胞の生死の比率、及び陽性対照となる細胞の生死の比率を比較する工程；を更に含む、上記３．又は６．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１６】
８．前記工程（２）、（６）、（ｃ）、及び（ｅ）における細胞の生死を判定する工程が、細胞核を染色する試薬を細胞培養容器内のそれぞれの区画に添加する操作を含む、上記１．、２．、４．、又は５．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１７】
９．上記工程（１）の後、工程（５）の前若しくは後、上記工程（ａ）の後、上記工程（ｄ）の前若しくは後のうちの、少なくともいずれかにおいて、
（Ｙ）前記細胞培養容器内のそれぞれの区画にオイルを添加する工程；を更に含む、上記２．又は５．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１８】
１０．前記細胞培養容器の区画の各々が、１〜４ｍｍの直径を有し、２〜５ｍｍの深さを有し、１〜１５μｌの容積を有する、上記１．又は４．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００１９】
１１．前記標識が光学的に検出可能なものであり、当該標識の検出を顕微鏡により行う、上記１．又は４．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００２０】
１２．前記検査対象がＢ細胞性リンパ腫の患者であり、前記検査対象由来の細胞が当該患者より採取したリンパ腫組織に由来する細胞である、上記１．又は４．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。【００２１】
１３．前記工程（１）の前、又は前記工程（ａ）の前に、検査対象者由来の細胞をＣＤ１９についてのスクリーニングにかける工程を含み、陽性細胞のみを、工程（１）又は工程（ａ）にかける、上記１２．の発明の方法における抗体医薬感受性検査方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗体医薬感受性検査方法を用いることにより、少量の試料でもって、抗体医薬による治療の感受性を簡便に評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】この図は、複数のBリンパ腫について本発明の検査方法によりCDC感受性を評価したものである。図中、DLBCLはびまん性大細胞型B細胞リンパ腫を、FLは濾胞性リンパ腫を、MCLはマントル細胞リンパ腫を、MALTはマルトリンパ腫を、lymphoplasmacytic lymphomaはリンパ形質細胞性リンパ腫を、small lymphocytic lymphomaは、小リンパ球性リンパ腫を、Burkitはバーキットリンパ腫を、Hodgkinはホジキンリンパ腫をそれぞれ表している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の第１形態における、抗体医薬感受性検査方法は、
（１）検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞を、細胞培養容器内で培養する工程；
（２）当該細胞容器内で培養された細胞の生死を判定する工程；
（３）前記工程（２）において検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞に関して検査に十分な数の生細胞が存在することが判定された場合に、当該検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを、当該細胞培養容器に添加して培養する工程；及び
（４）細胞表面に結合している当該標識を検出する工程；を含むことを特徴としている。【００２５】
上記工程（１）を行う前に、検査対象者由来の細胞と、適宜、陽性対象となる細胞とをまず入手する。検査対象者由来の細胞の入手は、検査対象者の患部から外科的方法により、又は白血病化している場合には末梢血の採血によりそれぞれ組織・細胞を採取することができる。一方、陽性対照となる細胞は、本発明の方法で感受性を評価する対象となる抗体医薬により認識される抗原を、細胞表面に発現している細胞であって、細胞株として確立されているものを適宜入手する。陽性対象となる細胞は具体的には、抗体医薬がリツキシマブの場合には、Dａｕｄｉ細胞、Raji細胞等のCD20陽性細胞，トラスツマブの場合には、MCF7等のHer2陽性細胞等である。【００２６】
検査対象者から入手したものが組織の場合には、適宜、メスやハサミを使って組織を細かく切断し、緩衝液（例えばHanks-Buffer）中で懸濁し、更に懸濁液をストレーナーにかけて通過した浮遊細胞のみを回収する。あるいは、検査対象者から採取した組織をフロストガラスにこすりつけ、遊離してきた細胞を緩衝液で回収し、更にストレーナーにかけて通過したもののみを回収する。このような作業により、検査に適した状態の細胞を入手する。次に、以下の工程（１）〜（４）を順次行なう。【００２７】
工程（１）：
細胞を細胞培養容器に、検査に適した培養液（無着色のRPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute) mediumやPBS（リン酸緩衝生理食塩水）など）とともに加え、培養を行う。使用する細胞培養容器としては、通常の細胞培養容器を挙げることができるが、1×１０2 〜1×１０4個程度の少量細胞の培養に適した寸法、容量を有するものが好ましい。具体的には、３８４ウエルプレート、ファイ（直径）２ｍｍの孔を開けた厚さ４ｍｍのシリコン樹脂をガラス底容器に圧着した容器等を用いることが可能である。【００２８】
この段階で、抗体医薬感受性の評価に移行することも可能であるが、検査対象者由来の細胞が均一ではない場合、即ち、多種類の細胞が混在するような場合には、特定の細胞種を濃縮する工程をオプションとして行うことも可能である。例えば、抗体医薬にリツキシマブ（抗-CD20抗体）を使用する場合、予め抗-CD19抗体を使って、細胞表面にCD19を発現している細胞を濃縮しておいてもよい。Ｂ細胞の表面抗原であるCD19抗原は、CD20抗原と発現時期がほぼ同じであり、CD19を発現しているＢ細胞は、CD20を発現していると考えられるためである。この濃縮工程に使用する抗原としては、検査対象者由来の細胞表面の抗原の発現時期についての情報が明確となっていて、尚且つ抗体医薬よりも安価に入手できる抗体が存在する場合に特に有効である。【００２９】
工程（２）：
次に、細胞培養器内で培養されたそれぞれの細胞の生死を判定する。この判定には、細胞の生存度検査試薬として知られる種々のものを使用することが可能である。例えば核染色試薬であるＰＩ(Propidium Iodide)色素を細胞培養区画に添加し、一定時間培養後に顕微鏡にて細胞を観察すると、生細胞は核が染まらないのに対し、死細胞は核が染色されるので、染色の有無で細胞の生死を判定することができる。【００３０】
この生死の判定を行う工程は、更に具体的には、顕微鏡の単一視野内に複数の細胞が含まれ、尚且つ、その生存度が少なくとも５０％以上、より好ましくは８０％以上である特定の視野を探すことに対応している。より好ましくは、評価に適した視野を確定した後、その視野の撮影を行う。撮影後、視野内のそれぞれの細胞にアドレスを付与することで、後の工程の観察・測定結果との照合が、より行いやすくなる。【００３１】
工程（３）：
次に、上記工程（２）の生死判定工程において、評価に十分な数の生細胞が存在する視野が得られた場合に、検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを、培養容器へ添加して培養を続行する。検査対象者由来の生細胞表面に、抗体医薬が認識する抗原が発現している場合には、当該標識を付加した抗体は、その抗原に結合する。耐性患者の一部にはB細胞表面にCD２０抗原を発現していない場合があるので、当該標識を付加した抗体は、細胞表面に結合しない。よって、当該抗体の添加後、一定時間が経過した時に、生細胞が含まれる視野を当該標識の検出に適した状態で撮影することにより、生細胞表面の抗原発現の有無を判定することが可能である。
解析対象の細胞の数が多いほど、解析結果の信頼性は向上する。しかし、データの取得、解析に時間がかかってしまう。そこで、解析結果の信頼性と解析時間を考慮すると、解析対象の細胞の数は、望ましくは20個から20000個、より望ましくは100個から10000個、さらに望ましくは200個から3000個、最も好ましくは500個から2000個である。【００３２】
抗体医薬は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体等を利用することができるが、作用の観点からはキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体が特に好ましい。【００３３】
工程（４）：
次に、抗原発現の有無の判定を、抗体医薬に付加した標識の検出に適した状態で行う。例えば当該標識が蛍光色素の場合には、当該色素の検出に適した光を照射することにより行われる。これらの工程における細胞の観察、標識の検出等に用いる光学装置は、例えばオリンパス社製レーザー走査型共焦点顕微鏡  FV-1000により行うことが可能である。【００３４】
以上の工程を経ることにより、検査対象者由来の細胞表面に、投与予定の抗体医薬が認識する抗原が発現しているかどうか、即ち、臨床において当該抗体医薬を患者に投与した場合に、効果が期待できる患者であるか否かを評価することが可能である。【００３５】
本発明の検査方法においては、上記工程（１）〜（４）を行った後、
（５）補体を前記細胞培養容器に添加する工程；及び
（６）細胞表面に結合している前記標識を検出し、更に補体添加後の細胞の生死を判定する工程；を更に含むことが可能である。【００３６】
工程（５）：
工程（５）においては、補体を添加する。補体としては、使用する抗体医薬と同種のもの、即ち、抗体医薬がヒト化抗体である場合には、ヒト由来の補体を用いることが好ましく、特に好ましくは検査対象者本人のものである。より具体的には健常者由来又は検査対象者由来の血清を、例えば添加後の培養液全体に占める割合が約１０％（ｖ/ｖ）となるように培養器に添加し、一定時間培養する。補体源としては、血清、血漿、全血、精製補体液等を用いることができる。補体は壊れやすいため、新鮮なうちに取り扱う必要がある。そこで、入手しやすさ、取り扱いやすさから、血清または、血漿が好ましい。【００３７】
工程（６）：
次に、上記工程（４）と同様にして、細胞表面上の抗原の存在を検出する工程（６）を行う。上記工程（３）後に細胞表面に当該抗体医薬が結合している場合には、工程（５）の補体添加によりＣＤＣが生じて、細胞膜が破壊される。そのため、上記工程（４）において標識されていた細胞は、上記工程（２）において添加した染色試薬により、例えば核が染色されて検出されることとなる。一方、工程（２）において死細胞と判定された細胞は、この工程においても死細胞として判定され、検査対象者由来の細胞が抗体医薬耐性である場合には、生細胞として判定される。【００３８】
工程（７）：
本発明の検査方法においては、上記工程（６）の後に、
（７）細胞の生死の比率を求める工程；を更に含めることができる。この工程では、陽性対象となる細胞の生死の比率を求めることで、補体が有効に作用したか否かを判定することが可能となる。即ち、補体の添加量が少なかった場合、補体の活性が低かった場合、撹拌が不十分な場合、温度が適切でなかった場合、補体添加後の培養時間が短すぎた場合には、陽性対象細胞においてＣＤＣが十分に生じず、生細胞の割合が高くなる。一方、陽性対象細胞が所定の割合で（例えば、８０％以上）死んだとき、ＣＤＣが十分に作用したと定義する。したがって、補体によるＣＤＣが十分に働いた場合には、陽性対象細胞はかなりの割合で死細胞となる。また、検査対象由来の細胞の生死の比率を求めることにより、抗体医薬の有効性が定量的に示されることとなる。従って、この工程（７）を行うことで、補体が十分に作用したか否か、及び治療における抗体医薬の有効性の度合いを確認することが可能となる。【００３９】
本発明の第２形態における、検査方法においては、
（ａ）検査対象者由来の細胞、及び適宜陽性対照となる細胞を、細胞培養容器内で培養する工程；
（ｂ）細胞の生死を判定するための試薬、及び、当該検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを、当該細胞培養容器内に添加して培養する工程；及び
（ｃ）細胞培養容器内の細胞の生死を判定し、更に細胞表面に結合している当該標識を検出する工程；を含むことができる。【００４０】
本発明の第２形態の検査方法においては、上記工程（ｂ）で細胞の生死を判定するための試薬、及び、当該検査対象者に投与予定の抗体医薬に標識を付加したものを細胞培養容器内に添加することを除き、工程（１）〜（４）を含む上記態様の操作と同一の操作を行う。工程（ａ）〜（ｃ）を含む本検査方法は、検査対象者由来の細胞の生存度が高い場合に特に適用することができる。【００４１】
本発明の第２形態の検査方法においては、上記工程（ｃ）の後に、
（ｄ）補体を前記細胞培養容器に添加する工程；及び
（ｅ）細胞表面に結合している前記標識を検出し、更に補体添加後の細胞の生死を判定する工程；を更に含めることが可能である。
上記工程（ｄ）で添加される補体の補体源としては、血清、血漿、全血、精製補体液等を用いることができる。補体は壊れやすいため、新鮮なうちに取り扱う必要がある。そこで、入手しやすさ、取り扱いやすさから、血清または、血漿が好ましい。
また、上記工程（ｅ）の後に、
（ｆ）細胞の生死の比率を求める工程；を更に含めることが可能である。【００４２】
上記工程（ｄ）における補体添加により、工程（ｃ）までに抗体医薬が細胞表面の抗原に結合している場合には、ＣＤＣが生じる。そして補体添加後の細胞表面の標識の検出と、細胞の生死の判定、及び細胞の生死の比率をそれぞれ求めることにより、検査対象者が抗体医薬への抵抗性を有するか否か、及び補体が有効に作用したか否かを確認することができる。【００４３】
本発明の検査方法においては、第１形態の工程（７）又は第２形態の（ｆ）の後に、
（Ｘ）前記検査対象者由来の細胞の生死の比率、及び陽性対照となる細胞の生死の比率を比較する工程；を更に含むことができる。この工程を含めることで、検査対象者に実際に抗体医薬を投与した場合に、ＣＤＣがどの程度有効に作用するかを推定することが可能となる。更に、感受性の評価が正しく行われたかどうかを判断することができる。特に、被検細胞と陽性対照細胞を同一容器で処理を行う場合は、完全に同一条件で比較を行うことができるので、試験がより正しく行われたかどうか（標識した抗体医薬が作用しているかどうか、補体の活性が十分であったか、実験条件が適切であったかどうかなど）を正確に評価できる。【００４４】
本発明の検査方法においては、（Ｙ）前記細胞培養容器内のそれぞれの区画にオイルを添加する工程；を更に含むことができる。この添加時点は、第１形態においては、工程（１）の後、又は、工程（５）の前若しくは後であり、より好ましくは工程（１）の直後、又は工程（５）の直後である。第２形態においては、工程（ａ）の後、又は、工程（ｄ）の前若しくは後であり、より好ましくは工程（ａ）の直後又は工程（ｄ）の直後である。
ここで定義されるオイルとは、検査対象の細胞や細胞培養液、種々の薬剤等を覆い、蒸発を防止する作用を持つ液体である。比重が水より小さく、水と混和せず、かつ蒸気圧が低い液体であればよい。特に好ましいものは、ミネラルオイル、シリコンオイルなどである。
オイル添加工程を含める理由は、本発明の検査方法において検査対象者由来の細胞数が少量である場合、培養は、容積の小さい（１μｌ〜１ｍｌの範囲）培養区画内で行われるため、培養環境中の温度では培地の蒸発の問題が生じる可能性があるためである。オイルを、それぞれの区画内の培地表面を覆うのに十分な量で添加することで、培地の蒸発を防ぐことが可能となる。また、オイルは、培地、補体源（血清、血漿、全血、精製補体液）に対して比重が軽いため、上記工程（５）の前にオイルを添加しておいても、補体をオイル上に滴下すれば、補体は自動的にオイルの層を通過し、その下にある培地と混合する。また、オイルは光学的な観察にも影響を与えることはない。従って、オイルは、本発明の工程の任意の段階で添加することができる。但し、培地の蒸発を防止する観点からは、補体添加前に、培地表面を覆うのに十分な量で添加することが好ましい。また、補体添加後にオイルを添加する場合には、同様の観点から補体添加直後に行うことが望ましい。【００４５】
本発明の検査方法においては、例えば、
前記細胞培養容器が区画を有し、区画の各々が、１〜４ｍｍの直径を有し、２〜５ｍｍの深さを有し、１〜１５μｌの容積を有するものとすることができる。この範囲の大きさの区画を有する培養容器を使用することで、容器の中に浮遊している細胞が対流を起こさず少量の細胞数での検査が可能となる。また、この容積の場合には、添加する抗体医薬や補体が、添加後、比較的短時間で区画内に広がるため好ましい。【００４６】
本発明の検査方法においては、前記標識が光学的に検出可能なものであり、当該標識の検出を顕微鏡により行うことができる。より具体的には、標識はAlexa488、Cy3、Cy5、TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate)、FITC（fluorescein isothiocyanate）等の蛍光標識である。【００４７】
本発明の検査方法は、例えばＢ細胞性リンパ腫の患者を対象として実施することができる。この場合、検査対象由来の細胞として当該患者より採取したリンパ腫組織に由来する細胞を使用し、抗体医薬として抗-ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）を使用することが可能である。Ｂ細胞性リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫の約７０％を占める疾患であり、Ｂ細胞においては通常ＣＤ２０抗原が発現している。そのため、抗-ＣＤ２０抗体と補体の組合せによりＣＤＣを生じさせることが可能であり、本発明の検査方法の検査対象となりえる。【００４８】
本発明の検査方法が適用可能なＢ細胞性リンパ腫の具体例としては、前駆Ｂリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ細胞性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾片縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、形質細胞腫瘍、節外製濾胞辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節製濾胞辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫などがある。その他の抗体医薬としては、B細胞性リンパ腫に対するイブリツモマブ、乳がんに対するトラスツマブ（抗Her2抗体医薬）等が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
（実験方法）
種々のリンパ腫患者から採取したリンパ腫組織を、ハサミまたはメスで細かく切断しhanks-buffer中に懸濁し、この懸濁液さらにストレーナーを通過させて浮遊細胞を回収した。リンパ腫組織由来の細胞の陽性対照として、Daudi細胞を準備した。リンパ腫由来細胞について、CD19陽性細胞のみを磁気ビーズを用いて単離した（非特許文献３）。【００５０】
リツキシマブをインビトロジェン社製Alexa488 Monoclonal antibody labelingkit  (A20181)の方法に準じてAlexa488で標識化した。標識化したリツキシマブは、１０ｎｇ/ｍｌの濃度で使用した。核染色色素として、ＰＩを５μｇ/ｍｌの濃度で使用した。
標識化したリツキシマブ及びＰＩを培地へ添加し、５分間培養した後、細胞観察用にガラス底面容器又は384wellプレートに細胞を移した。倒立型顕微鏡により、容器内の細胞を観察し、一つの培養区画当たり、１０００〜１００００個程度の細胞が含まれるようにした。その後、容器を、３７℃に保持された顕微鏡のステージ上に設置した。容器底面より細胞の観察、撮影、蛍光標識の検出、核染色の有無の検出を行った。
この第一回目の観察では、リツキシマブに標識された蛍光色素を検出して、ＣＤ２０抗原の発現状態と、核の染色の状態を確認する。ＣＤ２０抗原を発現して生きている細胞は、核は染色されず、細胞膜だけ染色される。また、死んだ細胞は、核染色色素のＰＩにより染色される。そこで、ＣＤ２０抗原を発現して生きている細胞の細胞密度が適切な部分を観察対象領域として選ぶ。
次に、ヒト血清（補体源）を培養区画容積全体の1-20%の任意の割合で添加し、３７℃で５〜３０分間、培養した。再び、容器底面より細胞の観察、撮影、蛍光標識の検出、核染色の有無の検出を行った。
この第二回目の観察は、第一回目の観察でＣＤ２０抗原を発現して生きている細胞を対象とし、核が染色されているかどうかを観察することにより、補体添加後に生きている細胞と死んだ細胞の数や比率を測定した。これによりＣＤＣ感受性を判断した。【００５１】
（結果）
補体添加前及び補体添加後のＣＤ２０抗原の発現状態から細胞の生死を比較した。生細胞数と死細胞数とから、ＣＤＣ反応が生じた割合（CDC感受性）を求めた。その結果を図１に示す。病理検査などにより決定された病名とＣＤＣ反応が生じた割合（CDC感受性）を示す図である。このように、臨床的に同じ病名でもCDCの感受性に大きな違いがあることが分かった。したがって、本発明は抗体医薬の選択に非常に有効であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の抗体医薬感受性検査方法は、少量の細胞を使用して、簡便に、抗体医薬の感受性について検査を行うことを可能にする。
【図１】
2008041594.tif 000003
【国際調査報告】
2008041594.tif 000004
2008041594.tif 000005
2008041594.tif 000006