(57)【要約】【課題】簡易で十分な精度を有し、しかも保存性の良い虫歯リスク判定手段を提供すること。【解決手段】個体から採取した口腔試料から総レンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌の比率（MS比）を求めることによって虫歯リスクの判定を行なう方法であって、レンサ球菌の培養を斜面培地を用いて行うことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から採取した口腔試料あるいは該試料を保存した試料から総レンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌の比率（MS比）を求めることによって虫歯リスクの判定を行なう方法であって、レンサ球菌の培養を斜面培地を用いて行うことを特徴とする判定方法。
【請求項２】
個体から採取した口腔試料が、ブラッシング歯垢または綿棒による歯面擦過歯垢である請求項1に記載の判定方法。
【請求項３】
総レンサ球菌培養用の選択培地とレンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地とを組み合せて用いる請求項１または２に記載の判定方法。
【請求項４】
ミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地として、ストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans)とストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）とを選択培養する培地を用いる請求項３に記載の判定方法。
【請求項５】
さらに、ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）を選択培養する培地を用いる請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
培地がポリミキシンを添加された培地であることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の判定方法。
【請求項７】
総レンサ球菌培養用の選択培地がポリミキシン添加MS培地（MSP培地）である請求項３〜６のいずれかに記載の判定方法。
【請求項８】
ミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地が低濃度のモノバクタム系抗生物質を添加された培地である請求項３〜７のいずれかに記載の判定方法。
【請求項９】
ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）を選択培養する培地が高濃度のモノバクタム系抗生物質を添加された培地である請求項５〜８のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１０】
モノバクタム系抗生物質がアズトレオナムである請求項８または９に記載の判定方法。
【請求項１１】
保存した試料が、個体から採取した口腔試料をスキムミルクを含む保存用溶液中に保存したものである請求項１〜１０のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１２】
保存用溶液がスキムミルクを溶解した滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）である請求項１１に記載の判定方法。
【請求項１３】
保存した試料が、個体から採取した口腔試料を保存用溶液中で冷凍して保存したものである請求項１〜１２のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１４】
次の工程からなる請求項１に記載の虫歯リスク判定方法。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Aを作製
（２）試料液Aから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Bを作製
（３）試料液Bを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Bを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Bと同量の試料液Aをミュータンスレンサ球菌選択培地に塗沫して斜面培地Aを作製
（５）斜面培地Bと斜面培地Aとを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Bと斜面培地Aとに形成された集落の数を比較することにより、虫歯リスクが高いか低いかを判定する工程
【請求項１５】
次の工程からなる請求項１に記載の虫歯リスク判定方法。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Aを作製
（２）試料液Aから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Bを作製
（３）試料液Bを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Bを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Bと同量の試料液Aをミュータンスレンサ球菌選択培地及びストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）選択培地に塗沫して斜面培地A及びA’を作製
（５）斜面培地Bと斜面培地A及びA’とを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Bと斜面培地Aとに形成された集落の数を比較することにより、虫歯リスクの高低を判定し、さらに斜面培地A’にも集落が形成されたときに、より虫歯リスクが高いと判定する工程
【請求項１６】
一定量の試料液の採取、希釈、試料液の培地への塗沫を一定容量の白金耳（エーゼ）を用いて行なうことを特徴とする請求項１４または１５に記載の判定方法。
【請求項１７】
総レンサ球菌培養用の選択培地からなる斜面培地とミュータンスレンサ球菌選択培地からなる斜面培地とを少なくとも有している請求項１〜１６のいずれかに記載される虫歯リスク判定方法に用いるキット。
【請求項１８】
さらにストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）選択培地からなる斜面培地を有してなる請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
さらに保存用溶液を収容したチューブを有してなる請求項１７または１８に記載の虫歯リスク判定用キット。
【請求項２０】
さらに試料採取用の綿棒あるいはエーゼ、試料希釈用のチューブ、試料希釈用及び塗沫用のエーゼをも含んでなる請求項１７〜１９のいずれかに記載の虫歯リスク判定用キット。
【請求項２１】
試料希釈用緩衝液をさらに含んでなる請求項１７〜２０のいずれかに記載の虫歯リスク判定用キット。
【請求項２２】
斜面培地として気密性の高い２段階ストッパー付き試験管を使用した請求項１７〜２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
ポリミキシンが添加された培地を用いる請求項１７〜２２のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虫歯リスクを判定するための方法及びキットに関する。より詳細には、本発明は、歯科診療室や学校などで、虫歯になりやすい虫歯リスクの高い個体とリスクの高くない個体とを簡易に判別するための方法及びキットに関する。さらに、本発明は特に学校などの集団検診において適する判別方法及びキットを提供することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
虫歯は、一旦形成されたら戻らない疾患であるので、予防管理が非常に大切である。
虫歯予防のために、虫歯菌であるミュータンスレンサ球菌を低減化する手段として除菌剤処理をする方法がある。しかし、このような除菌処理は安全性や経済性など改善すべき多くの問題点を抱えており、少なくとも現時点では高度の虫歯リスク者のみを対象に行なうべき予防手段である。この面からも、虫歯リスクの高い個体を予め選別することの必要性がある。
また、個々人の持つ虫歯リスクの高さを的確に把握することは、虫歯予防計画を立てたり、虫歯治療後の予防管理をする上でも重要である。【０００３】
虫歯の唾液検査では、唾液中のミュータンスレンサ球菌の数を測定し、唾液１ｍｌ中に1万個（１０４cfu）から１０万個（１０５cfu）ないし１００万個（１０６cfu）の範囲で正常値と異常値を設定する方法もあるが、この数字は口腔清掃によって変動が大きい。
唾液中の総菌数とミュータンスレンサ球菌の比率をリスク判定に用いたほうが安定しているので、厚生労働科学研究班では、唾液中のミュータンスレンサ球菌の総レンサ球菌に対する比率（MS比）を判定のために用い、MS比に関する基準値を０．２〜２％の間に設定した（非特許文献１）。【０００４】
このようなMS比を測定するために、唾液中の総レンサ球菌及びミュータンスレンサ球菌のそれぞれを培地培養し形成した集落の数を対比する。
その培養のために、従来は、総レンサ球菌培養のための選択培地とミュータンスレンサ球菌のための選択培地をいずれも平板培地としている。そこにスパイラル装置を用いて試料を塗沫し、37℃の嫌気培養装置内で４８〜７２時間培養後、平板培地上に形成された集落の数を実体顕微鏡下で数え、試料１ｍｌ当たりのミュータンスレンサ球菌数と総レンサ球菌数を算定し、両数値よりMS比を算出している（非特許文献２）。【０００５】
しかしながら、このような従来法では、スパイラル装置、高圧蒸気滅菌器、実体顕微鏡、嫌気培養器等の設備や微生物を無菌的に取り扱う技術が必要不可欠であり、しかも、無菌操作技術を持たない者では実施できないので、歯科診療室や学校保健室などでの実施は不可能である。
また、上記のスパイラル装置を用いる方法では、保存性に難のある平板培地（作製培地の保存期間はせいぜい1ヶ月程度）が使用されるために、測定のつど培地を調製する必要がある。また、培養済み平板を標本として保存することも困難である。
【非特許文献１】「唾液検査の有用性  −う蝕と歯周疾患への対応−」日本歯科医学会雑誌 2007年3月号
【非特許文献２】「ミュータンスレンサ球菌選択培地の改良と新検査システムの確立」ミュータンスレンサ球菌の臨床生物学（クインテッセンス出版）ｐ82〜89  2003年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、上記のような従来法の欠点を解消することで、スパイラル装置、高圧蒸気滅菌器、実体顕微鏡、嫌気培養器等などの特殊な設備や無菌取扱技術を必要としない虫歯リスク判定手段を提供することにある。さらに、本発明の課題は、簡易であっても、十分な精度を有し、しかも長期間使用可能な虫歯リスク判定手段を提供することにもある。さらにまた、本発明の課題は、学校などの集団検診において特に適する判別方法及びキットを提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、選択性と保存性に優れた選択培地からなる斜面培地を使用することによって、スパイラル装置などの特殊設備を使用しなくても、簡易且つ十分な精度を有するMS比による虫歯リスク判定手段を提供できることを見出した。また、試料を一定容量採取できるエーゼを使用することによって、さらに簡易な虫歯リスク判定手段を提供できた。さらにまた、口腔試料の採取方法、採取試料の保存方法を工夫することによって、集団検診など多量の試料をいっせいに判定するために特に適する、簡易な判定手段を提供できた。【０００８】
即ち、本発明は次の虫歯リスク判定方法及びキットからなる。
（１）個体から採取した口腔試料あるいは該試料を保存した試料から総レンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌の比率（MS比）を求めることによって虫歯リスクの判定を行なう方法であって、レンサ球菌の培養を斜面培地を用いて行うことを特徴とする判定方法。
（２）個体から採取した口腔試料が、ブラッシング歯垢または綿棒による歯面擦過歯垢である上記（１）に記載の判定方法。
（３）総レンサ球菌培養用の選択培地とレンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地とを組み合せて用いる上記（１）または（２）に記載の判定方法。
（４）ミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地として、ストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans)とストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）とを選択培養する培地を用いる上記（３）に記載の判定方法。
（５）さらに、ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）を選択培養する培地を用いる上記（４）に記載の判定方法。
（６）培地がポリミキシンを添加された培地であることを特徴とする上記（３）〜（５）のいずれかに記載の判定方法。
（７）総レンサ球菌培養用の選択培地がポリミキシン添加MS培地（MSP培地）である上記（３）〜（６）のいずれかに記載の判定方法。
（８）ミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地が低濃度のモノバクタム系抗生物質を添加された培地である上記（３）〜（７）のいずれかに記載の判定方法。
（９）ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）を選択培養する培地が高濃度のモノバクタム系抗生物質を添加された培地である上記（５）〜（８）のいずれかに記載の判定方法。
（１０）モノバクタム系抗生物質がアズトレオナムである上記（８）または（９）に記載の判定方法。
（１１）保存した試料が、個体から採取した口腔試料をスキムミルクを含む保存用溶液中に保存したものである上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の判定方法。
（１２）保存用溶液がスキムミルクを溶解した滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）である上記（１１）に記載の判定方法。
（１３）保存した試料が、個体から採取した口腔試料を保存用溶液中で冷凍して保存したものである上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の判定方法。
（１４）次の工程からなる上記（１）に記載の虫歯リスク判定方法。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Aを作製
（２）試料液Aから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Bを作製
（３）試料液Bを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Bを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Bと同量の試料液Aをミュータンスレンサ球菌選択培地に塗沫して斜面培地Aを作製
（５）斜面培地Bと斜面培地Aとを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Bと斜面培地Aとに形成された集落の数を比較することにより、虫歯リスクが高いか低いかを判定する工程
（１５）次の工程からなる上記（１）に記載の虫歯リスク判定方法。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Aを作製
（２）試料液Aから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Bを作製
（３）試料液Bを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Bを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Bと同量の試料液Aをミュータンスレンサ球菌選択培地及びストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）選択培地に塗沫して斜面培地A及びA’を作製
（５）斜面培地Bと斜面培地A及びA’とを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Bと斜面培地Aとに形成された集落の数を比較することにより、虫歯リスクの高低を判定し、さらに斜面培地A’にも集落が形成されたときに、より虫歯リスクが高いと判定する工程
（１６）一定量の試料液の採取、希釈、試料液の培地への塗沫を一定容量の白金耳（エーゼ）を用いて行なうことを特徴とする上記（１４）または（１５）に記載の判定方法。
（１７）総レンサ球菌培養用の選択培地からなる斜面培地とミュータンスレンサ球菌選択培地からなる斜面培地とを少なくとも有している上記（１）〜（１６）のいずれかに記載される虫歯リスク判定方法に用いるキット。
（１８）さらにストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）選択培地からなる斜面培地を有してなる上記（１７）に記載のキット。
（１９）さらに保存用溶液を収容したチューブを有してなる上記（１７）または（１８）に記載の虫歯リスク判定用キット。
（２０）さらに試料採取用の綿棒あるいはエーゼ、試料希釈用のチューブ、試料希釈用及び塗沫用のエーゼをも含んでなる上記（１７）〜（１９）のいずれかに記載の虫歯リスク判定用キット。
（２１）試料希釈用緩衝液をさらに含んでなる上記（１７）〜（２０）のいずれかに記載の虫歯リスク判定用キット。
（２２）斜面培地として気密性の高い２段階ストッパー付き試験管を使用した上記（１７）〜（２１）のいずれかに記載のキット。
（２３）ポリミキシンが添加された培地を用いる上記（１７）〜（２２）のいずれかに記載のキット。    
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、特殊な設備や技術を必要としない簡易で精度の高い虫歯リスク判定手段を提供することができた。さらに、本発明の判定手段に用いる培地は保存性が良いために、本発明の判定手段は、長期間にわたって判定が可能になった。さらにまた、本発明の判定手段によって、集団検診に特に適する判定法も確立できた。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】二段階ストッパー付ガラス製小試験管
【図２】試料採取・希釈用チューブ
【図３】本発明の判定方法の一態様を模式化して示した説明図
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明を具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
本発明で用いる口腔試料は、刺激唾液でもブラッシング歯垢あるいは擦過歯垢でもよいが、ミュータンスレンサ球菌の棲息場所である歯垢から唾液に移行する率は個人差があるので、刺激唾液を試料にするとき歯垢のMS比を正確に反映していない場合がある。よって、試料はブラッシング歯垢あるいは擦過歯垢の方が好ましい。学校など集団検診の場では、被検者全員のために多数の歯ブラシを準備するより、綿棒を準備するほうが簡便かつ安価であるので、綿棒によって歯面を擦過して採取した歯垢試料を採取するのが好ましい。
ブラッシング歯垢を採取するには、歯面位置によってMS比が異なってくるので、全歯面に亘ってまんべんなくブラッシングして得るのが好ましい。ブラッシング時間は、少なくとも３０秒間程度は必要である。綿棒による歯面擦過のときは、滅菌小綿棒を用い、全歯面をまんべんなく擦過するのが好ましい。具体的には、小綿棒で全歯の頬側面を30秒間程度擦過して採取する。【００１２】
ブラッシング後、口腔内に溜まった歯垢液、あるいは綿棒による歯面擦過歯垢を採取し、それを希釈液中に懸濁させて口腔試料とする。ブラッシング後、口腔内に溜まった歯垢液を採取するためには、滅菌小綿棒または滅菌エーゼを用いるのが好ましい。一定容量（例えば、1μl ）採取できる市販のプラスチック製滅菌エーゼを用いるのがより好ましい。このようなエーゼを用いれば、採取量が一定になるし、一度採取した歯垢液をPBSに希釈したとき、白濁度が足りなければ、同じエーゼを用いて再度口腔あるいは歯ブラシ内から歯垢液を採取して希釈する工程を、適当な濁度が得られるまで繰り返し行なうことができる。
なお、ミュータンスレンサ球菌の感染有無を調べる目的の場合は、滅菌エーゼで採取した歯垢液を希釈せずに、ミュータンスレンサ球菌用或はストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）用の斜面培地に直接塗抹すればよい。
採取した歯垢液の希釈は、歯垢液を含む滅菌小綿棒あるいは滅菌エーゼを希釈液中に挿入し攪拌することにより行なう。希釈液としては滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いるのが好ましい。
従来の試料採取法では、パラフィンなどを数分噛ませておいて一定時間内に流出する刺激唾液を回収する方法、１分間程度ブラッシングした後、PBSにて含漱処理（うがい）することにより回収する方法が一般的であったが、いずれも乳幼児、低学年学童、障害者などに適用するには難があった。上記の方法によると、乳幼児や低学年学童、障害者などにも適用が可能である。【００１３】
口腔試料を採取した後、すぐ判定できる場合は上記のように希釈工程に進めばよいが、集団検診など多数の試料を採取した場合、すぐに培養・判定に回せないことがある。そのようなとき、採取した口腔試料は保存用溶液に懸濁して保存すれば良い。保存用溶液として、スキムミルクを含有する溶液が使用できる。スキムミルクのPBS溶液が好ましい。スキムミルクの濃度は10重量％程度が最も好ましい。
また、保存用溶液に懸濁させた試料は、家庭用の冷蔵庫（４℃）内で２、３日間保存でき、家庭用冷蔵庫の冷凍室（−２０℃）内であれば1、２週間、−８０℃の超低温庫内で保存するなら数ヶ月から1年の冷凍保存が可能である。
このように保存した試料を用いて培養しても、採取直後の判定結果とほぼ一致した結果が得られる。よって、保存試料を用いる本発明の判定法は、集団検診など多数の試料を一時に採取しても直ぐに判定操作にかかれない場合や、判定不能検体の再検査や判定結果の確認等にきわめて有用である。菌濃度が低過ぎる検体(総レンサ球菌用培地上に形成される集落数が10ケ以下)や濃過ぎる検体（総レンサ球菌用及びミュータンスレンサ球菌用の斜面培地上に形成される集落数がいずれも200ケ以上）では正しい判定結果が得られない。このような判定不能検体については、保存試料を用い後日再検査を行う。低濃度試料の場合は、滅菌エーゼによる塗抹操作を１回ではなく複数回（２〜5回）繰り返して行うことにより、また高濃度試料の場合は、PBS或いはスキムミルク-PBSにて適度に稀釈して塗抹・培養を行なえばよい。【００１４】
本発明のレンサ球菌の培養には斜面培地を用いる。
斜面培地とは、滅菌後の寒天培地を栓付きのガラス製或はプラスチック製試験管中に注入し、ゲルが固まるまで、斜面に静置して作製するものである。平板培地に比べて、操作性、保存性、経済性が優れている。また、試験管を二段階ストッパー付きキャップを使用して密封すると（図１参照）、さらに保存性は高まる。図１には、ガラス管（ａ）と二段階ストッパー付きキャップ（ｂ）と二段階ストッパー付きキャップで密封したガラス管（ｃ）の例を図示した。
培地に抗生物質であるポリミキシンBを添加すると保存性がより高まり、４℃の冷蔵庫中で少なくとも６ヶ月間の保存が可能であった。また、培養済み培地も少なくとも１年間の長期保存（４℃）が可能で、標本としても活用できる。【００１５】
本発明では、総レンサ球菌培養用の選択培地とレンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地とを組み合せて用いる。
総レンサ球菌培養用の選択培地としては、レンサ球菌を培養できるものであればいずれでも良いが、市販されているMS培地を用いることもできる。グラム陰性細菌の増殖を抑制する抗生物質であるポリミキシンBをMS培地に添加して保存性を改善した本発明者が開発したMSP培地を用いるのがより好ましい。
ミュータンスレンサ球菌を選択培養する培地としては、GoldらのMSB培地が良く知られており、これまで本菌群の検出や分離に繁用されてきた。しかし、昨今、バシトラシン耐性菌の増加に伴い、この選択培地にはミュータンスレンサ球菌以外の細菌が少なからず増殖するため、それらを区別するために、培養後の集落形態観察や同定検査が必要不可欠となっている。最近、MSB培地の選択性を改善した改良MSB培地（特開2002-27975）が開発され、虫歯のリスク判定用培地として有用であることが立証されている。したがって、本発明のミュータンスレンサ球菌選択培地としては、選択性が改善された改良MSB培地を使用できる。  また、本発明者は、改良MSB培地を更に改良してBA-1培地、BGA-1培地、BGPA-1培地を開発した。本発明には、これらを用いるのがより好ましい。【００１６】
本発明では、ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）を選択的に培養できる斜面培地を用いることによって、ミュータンスレンサ球菌の中でも、高い虫歯誘発能を持つことが知られているストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）の感染有無を調べることができる。最近、ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）の選択培地としてMS-SOB 培地が開発された（WO2003/012073国際公開パンフレット）。本発明におけるストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）の選択培地としてこのMS-SOB培地を使用することができる。また、本発明者は、MS-SOB培地を改良して、BA-20培地、BGA-20培地、BGPA-20培地を開発した。本発明には、これらを用いるのがより好ましい。
ストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans）とストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）の両方が増殖する培地とストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）のみが増殖する培地とを組み合せて用いれば、これら2種類の虫歯原因菌の存否と菌数レベルを別々に評価することができ、より精度の高い判定ができる。ストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans）とストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）とを併せて保有する個体は、ストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans）あるいはストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）のみを保有する個体より、虫歯リスクが高いことが知られている。よって、両菌種が検出される個体は、さらに高い虫歯リスクを有することになる。【００１７】
これらの培地の組成は、表１に示すとおりである。
【表１】
2009028445.tif 000002
【００１８】
改良MSB培地は、バシトラシンとショ糖を主な選択剤とするMSB培地にグラミシジン等を新たに添加することにより選択性を大幅に改善したミュ−タンスレンサ球菌用選択培地である。本発明者は、改良MSB培地の更なる改良を試みる過程で、低濃度（10mg/l）のアズトレオナムがグラミシジンと同程度の選択効果を発揮すること、両者を併用すると選択性が著しく向上することを見出し、BA-1培地及びBGA-1培地を開発した。なお、MSP培地とBGPA-1培地は，斜面培地の保存性を高める目的でMS培地とBGA-1培地にポリミキシンBを添加した培地である。ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）の選択培地MS-SOB培地，BA-20培地、BGA-20培地、BGPA-20培地は、いずれもストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans）の増殖を抑える目的で高濃度（200 mg/l）のアズトレオナムが添加された培地である。【００１９】
本発明の虫歯リスク判定を行なう好ましい方法は、次の工程を順次行なう方法である（判定法I）。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Aを作製
（２）試料液Aから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Bを作製
（３）試料液Bを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Bを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Bと同量の試料液Aをミュータンスレンサ球菌選択培地に塗沫して斜面培地Aを作製
（５）斜面培地Bと斜面培地Aとを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Bと斜面培地Aとに形成した集落の数を比較することにより、虫歯リスクが高いか低いかを判定する工程【００２０】
（１）の個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Aを作製する工程は、すでに段落［００１１］〜［００１３］で説明した。なお、保存液が既にスキムミルクとPBSで適当濃度に調整されているときには、緩衝液で希釈することなく試料液Aとすることができる。  【００２１】
（２）の試料液Aから、一定量採取してさらに一定割合以上に希釈した試料液Bを作製するためには、希釈用緩衝液を注入したチューブ（図２参照）に一定量採取できる市販のプラスチック製エーゼ或はピペットなどにより試料液Aを導入攪拌する。例えば、50μl滅菌 PBS入りチューブに１μl用滅菌エーゼを用いて試料液A1μlを添加すれば、50倍に希釈された試料液Bが簡便に作製できる。図２には、試料の採取・希釈のために好ましいチューブの例を図示した。（ａ）はキャップを閉栓したとき、（ｂ）はキャップを開栓したときの図である。【００２２】
（３）この試料液Bを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Bを作製する。具体的には、予め作製した総レンサ球菌培養用の斜面培地に1μl用滅菌エーゼを用いて採取した試料液B 1μlを塗沫することにより、斜面培地Bが作製できる。【００２３】
（４）の斜面培地Aを作製するためには、予め作製したミュータンスレンサ球菌選択培地の斜面培地に、滅菌エーゼを用いて採取した試料液A 1μlを塗沫すればよい。【００２４】
（５）の培養は、（３）で作製した斜面培地Bと（４）で作製した斜面培地Aとを、例えば二段階ストッパー付キャップ（図１参照）を使用して密栓し、恒温器内で静置培養を行なう。  本発明における塗沫操作は、雑菌などが増殖し難い選択培地を使用しているため、厳密な無菌的操作は必ずしも必要ない。注意深く行なえば、微生物の取扱いに不慣れな人でも、キャップの開栓・閉栓等を注意深く行えば、火炎（バーナー）の無い場所で十分施行することができる。また、レンサ球菌は耐気性菌であるので、嫌気培養を行なう必要もない。恒温器は、市販されている格安品で十分である。
培養は、４８〜７２時間程度行なう。温度は３７℃程度が好ましい。【００２５】
（６）一定時間培養後に、斜面培地Bと斜面培地Aとに形成された集落の数を比較することにより虫歯リスクの高低を判定するが、上記（３）及び（４）で説明した具体例では、（３）の斜面培地Bに塗沫された試料は50倍に希釈されたものであるのに対して、（４）の斜面培地Aに塗沫された試料は希釈されていないので、一定時間培養後の両者の集落数が同程度になるときには、斜面培地Bに増殖した菌、すなわち総レンサ球菌数は、斜面培地Aに増殖した菌、すなわちミュータンスレンサ球菌の５０倍存在していたということになる。言い換えれば、この場合の口腔試料中の総レンサ球菌に対するミュータンスレンサ球菌の比率（MS比）は２％であるということになる。
厚生労働省の唾液研究班は、虫歯リスク判定のためのMS比の基準を０．２％〜２％に設定した。したがって、この具体例で説明された方法によれば、斜面培地Aの集落数が斜面培地Bの集落数より多ければ、２％という判定基準以上であり、虫歯リスクが高いということになる。
集落数の多寡は目視で容易に判別できる。よって、この方法によると、斜面培地Aと斜面培地Bの集落の数を目視で比較するだけで、簡易に虫歯リスクが高いか低いかを判定することができることになる。
上記の具体例では、試料Bの希釈倍率が試料Aの５０倍であるので、同等の集落数であるときにMS比は２％であるということになるが、希釈倍率を変更することで異なる判定基準にも容易に適用できる。
また、集落の数は目視で比較することも容易であるが、試料によっては他のレンサ球菌がミュータンスレンサ球菌選択培地やストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）選択培地に増殖することがあるので、ルーペを用いて判定するとさらに良い。ミュータンスレンサ球菌は岩石様のラフ型集落を形成するが、他の口腔レンサ球菌や雑菌はおおむねスムース型集落を形成するので、ルーペを使用すれば両者を容易に識別できる。慣れれば、ミュータンスレンサ球菌選択培地に増殖したストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans）とストレプトコッカス・ソブリヌス(S.sobrinus)の集落をも識別可能である。【００２６】
本発明の虫歯リスク判定を行なうのに、さらに、ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.
sobrinus）選択培地からなる斜面培地を加えればさらに精度の高い判定ができる。
この判定方法は、次の工程からなる方法である（判定法II)。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Aを作製
（２）試料液Aから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Bを作製
（３）試料液Bを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Bを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Bと同量の試料液Aをミュータンスレンサ球菌選択培地及びストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）選択培地に塗沫して斜面培地A及びA’を作製
（５）斜面培地Bと斜面培地A及びA’とを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Bと斜面培地Aとに形成された集落の数を比較することにより虫歯リスクの高低を判定し、さらに斜面培地A’にも集落が形成されたときに、より虫歯リスクが高いと判定する工程【００２７】
判定法IIは、（１）（２）の試料液A、Bの作製と、（３）斜面培地Bの作製は判定法Iと同じである。
判定法IIでは、ストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）選択培地からなる斜面培地に試料液Aを塗沫した斜面培地A’を追加作製する。斜面培地A’の作製方法、その培養は、斜面培地Ａと同様である。
判定法IIでは、判定法Iで行なう斜面培地Aと斜面培地Bとの集落数の比較によるリスク判定に加えて、斜面培地A’に形成した集落の観察結果を判定にプラスする。例えば、斜面培地A’にストレプトコッカス・ソブリヌス（S.sobrinus）の集落が観察された検体では、１段階高いリスクレベルに判定される。
上記で説明した判定法Ｉと判定法IIのフローを合わせて図３に例示した。【００２８】
本発明の虫歯リスク判定用のキットは、少なくとも、総レンサ球菌選択培地からなる斜面培地とミュータンスレンサ球菌選択培地からなる斜面培地とを有している。さらに、ストレプトコッカス・ソブリヌス選択培地からなる斜面培地を加えれば、より精度の高い判定用のキットが構成できる。
培地にポリミキシンが添加されたものを用いれば、長期保存が可能である。ポリミキシンとしてはポリミキシンBがより好ましい。
これらの斜面培地に、試料採取用の小綿棒或はエーゼ、試料希釈用のチューブ、希釈・塗沫用のエーゼをも含んでキットを構成しても良いし、試料希釈用緩衝液をさらに加えてキットにしてもよい。さらにまた、保存用溶液あるいは保存用溶液を収容したチューブをキットに加えれば、集団検診用に特に適したキットを構成できる。
【００２９】
以下には、実施例でもって、本発明の虫歯リスク判定方法をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
＜MS比の簡易測定法の確立＞
（１）斜面培地の作製  
MS及びBGA-1の寒天培地1 mlをディスポのガラス製小試験管（IWAKI製JR2、12×75 mm）に注入し、約3度の傾斜角に保ち固化させ、消毒したマルエムチューブ用ポリ栓(マルエム製、#110412)で密栓後、使用時まで4℃保蔵した。
（２）試料の採取と試料液Aの調製
全歯面をまんべんなく30秒間ブラッシング後、滅菌小綿棒（川本産業製、#100）を30秒間咥えることにより歯垢液を採取した。  1.5 ml用ポリチューブ（アシスト製、#A150）に1 mlの滅菌PBSを注入し、該小綿棒をPBS中に浸漬・攪拌することによって試料液Aを調製した。
（３）試料液Bの調製
新しい1.5ml用ポリチューブに100μlの滅菌PBSを注入する。そこに、1μl用滅菌エーゼ(TGK製、ループ ニードル1μL) にて試料液A 1μlを1回移入することで、100倍希釈の試料液Bを調製した。
（４）塗沫及び培養
MS斜面培地に新しい1μl用滅菌エーゼを用いて試料液B1μlを塗沫し、該ポリ栓で密栓した。またBGA-1斜面培地に同じ滅菌エーゼを用いて試料液A 1μlを塗沫し、該ポリ栓で密栓した。塗抹した両培地を37℃の恒温器（APICA製、ポータブル保冷温庫ACW-700）内で48〜72時間静置培養した。
（５）MS比の算定
培養後、 MS培地とBGA-1培地上に形成された総レンサ球菌とミュータンスレンサ球菌の集落数をルーペを使用して数え、MS比を算出した。【００３１】
（６）結果
上記のMS比測定を成人被験者3名（A〜C）につき一日おきに3回行なった。測定は試料毎にトリプルで行ない、それらの平均値を求めMS比を算出した。
結果を表２に示す。
【表２】
2009028445.tif 000003
表２から分かるように、同じ個体から隔日で3回採取したブラッシング歯垢試料のMS比はほぼ一定の値を示し、本法をMS比測定法として使用できることが判明した。
【実施例２】
【００３２】
＜簡易MS比測定法の有用性試験＞
（１）培地の作製  
MS及びBGA-1の斜面培地を実施例１の（１）と同様の方法で作製した。同時に、スパイラル測定法に使用するMS及びBGA-1の平板培地を常法により作製した。
（２）試料の採取
全歯面を1分間ブラッシング後、５ml のPBSで含嗽することによりブラッシング歯垢液を回収した。
（３）簡易測定法によるMS比の算定
ブラッシング歯垢液の100倍希釈液及び10,000倍希釈液を滅菌PBSを用いて調製し、試料液Ａ、Ｂとした。塗抹、培養、MS比算定は実施例１の（４）、（５）と同様に行なった。
（４）スパイラル法によるMS比の算定
ブラッシング歯垢液の100倍希釈液をBGA-1平板培地に10,000倍希釈液をMS平板培地にスパイラル装置（グンゼ産業製）を用いて塗抹し、ガスパック（BBL製）と嫌気ジャーを使用して37℃、48〜72時間嫌気培養した。 培養後、MS平板培地とBGA-1平板培地の上に形成された集落の数を実体顕微鏡下で数え、歯垢液1ml当りのミュータンスレンサ球菌数と総レンサ球菌数を算出し、MS比を算定した。【００３３】
（５）結果
成人被験者18名からのブラッシング歯垢液を用いて従来法であるスパイラル法と本発明の簡易測定法によりMS比の算定を行なった。簡易測定では試料毎にトリプルで測定を行ない、得られた3回の集落数及び平均集落数よりMS比を算出し、スパイラル法により求めたMS比と比較した。結果を表３に示す。
【表３】
2009028445.tif 000004
簡易測定法により得られたMS比はスパイラル法により得られたMS比との間にきわめて高い相関関係が認められた。１回値、2回値、3回値及び平均値のPearsonの相関係数はそれぞれ0.975、0.983、0.930、0.974（いずれも1％水準で有意）であった。【００３４】
【表４】
2009028445.tif 000005
表４は表３のデータを基に、スパイラル法と簡易測定法により求めたMS比が2.0以上であればレベル３、0.２以下であればレベル１、その間の値であればレベル２と虫歯リスクを3段階評価し、スパイラル法による判定値に対する一致率を求めた結果である。簡易測定値によるリスク判定結果はスパイラル法のそれと殆どパラレルで、単独測定でも充分にリスク評価できることが示唆された。                          
【実施例３】
【００３５】
＜簡易リスク判定法の確立と有用性試験＞
成人被験者45名を対象にMS比に基ずく方法（判定法I）とMS比とS.sobrinusの存否に基づく方法（判定法II）による集団検診を一週間隔で2回行ない、それらリスク判定法の有用性を試験した。【００３６】
（１）培地の作製
MSP、BGPA-1、BGPA-20の斜面培地を実施例１の（１）と同様の手順で作製した。なお、密栓にはマルエム製ポリ栓より気密性が高い黄色、青色、赤色の３種の２段階ストッパー付キャップ（TGK製）を加熱消毒して用いた。本キャップで密栓した斜面培地はいずれも、４℃下で保蔵した場合、少なくとも６ヶ月間は明らかな選択性の低下、乾燥、雑菌の増殖などを来たさずに保存可能であった。
（２）試料の採取と試料液Aの調製
ブラッシング歯垢試料の採取は実施例１の（１）と同様に行なった。1.5 ml透明ポリチューブ（フナコシ製、#M50001）に0.5 mlの滅菌PBSを注入し、試料採取した小綿棒をPBS中に浸漬・攪拌することによってやや白濁した試料液Aを調製した。なお、試料液Aに白濁が認められない場合や希薄すぎる場合は小綿棒による採取操作を繰り返し行ない、白濁が顕著すぎる場合はPSBにて適度に希釈して用いた。
（３）試料液Bの調製
新しい滅菌1.5mlポリチューブに50μlの滅菌PBSを注入する。そこに、1μl用滅菌エーゼ(TGK製)にて試料液Aを1μl移入することで、 50倍希釈の試料液Bを調製した。
（４）塗沫及び培養
MSＰ斜面培地（黄キャップ培地）に新しい滅菌エーゼを用いて試料液Bを1μl 塗沫し、消毒ストッパー付黄キャップで密栓した。次いでBGPA-1斜面培地（青キャップ培地）に新しい滅菌エーゼを用いて試料液Aを1μl塗沫し、消毒ストッパー付青キャップで密栓した。またBGPA-20斜面培地（赤キャップ培地）に新しい滅菌エーゼを用いて試料液Aを1μl塗沫し、消毒ストッパー付赤キャップで密栓した。塗抹した３培地を37℃の恒温器（APICA製、ポータブル保冷温庫ACW-700）内で48〜72時間静置培養した。なお、使用済みエーゼは消毒（0.1％ヒビテン等）すれば何回でも再利用が可能である。
（５）リスクレベルの判定
判定法I・・・黄キャップ培地（MSP）上の総レンサ球菌集落数と青キャップ培地（BGPA-1）上のミュータンスレンサ球菌集落数を肉眼（或はルーペ使用）で比較し、下記の基準でリスクレベルを3段階評価した。
レベル１：ミュータンスレンサ球菌集落数が総レンサ球菌集落数より極端に少ない（10分の1以下）。
レベル２：レベル1とレベル3の中間
レベル３：ミュータンスレンサ球菌集落数が総レンサ球菌集落数と同等かそれ以上。
判定法II・・・判定法Iで3段階評価後、赤キャップ培地（BGPA-20）上のS.sobrinus集落の有無を肉眼（或はルーペ使用）で判定し、下記の基準でリスクレベルを4段階評価した。
レベル１：評価がレベル１でS.sobrinus無し
レベル２：評価がレベル１でS.sobrinus有り、評価がレベル２でS.sobrinus無し
レベル３：評価がレベル２でS.sobrinus有り、評価がレベル３でS.sobrinus無し
レベル４：評価がレベル３でS.sobrinus有り
（６）結果
成人被験者４５名から１週間隔で２回採取したブラッシング歯垢試料を用いて上記の判定法I及び判定法IIによるリスクレベルの判定を行なった。結果を表5に示す。【００３７】
【表５】
2009028445.tif 000006
判定法Iと判定法IIにより同一の7名がハイリスク者（レベル3以上）として選別された。 判定法IIではそのうちの4名がよりリスクの高いレベル４として選別された。２回行なった簡易判定法IとIIによる判定結果は45名中38名が同じレベルであり、良好な再現性を示した。
【実施例４】
【００３８】
＜試料採取法の比較＞
次に、試料の採取方法によるレベル判定への影響を試験した。
滅菌小綿棒を用い全歯の頬側面を30秒間擦過して採取した擦過歯垢を、0.5mlの10%スキムミルク-PBS 或いは PBS中に懸濁させた。また同一被検者からのブラッシング歯垢懸濁液を同様に調製した。
10人の被検者から採取した擦過歯垢とブラッシング歯垢の両試料を用いて、実施例３と同じ手順で判定法IIによって虫歯リスクを判定した。【００３９】
結果を表６に示した。
【表６】
2009028445.tif 000007
レベル3以上（判定法II）のハイリスクと判定される被検者は、試料がブラッシング歯垢であっても綿棒による擦過歯垢であってもほぼ同じであった。この結果から、試料をブラッシング歯垢から綿棒による擦過歯垢に替えても、ハイリスク者判定に影響がないことが分かった。
ブラシより綿棒を準備するほうが簡便かつ安価である。よって、特に集団検診などのとき、綿棒によって歯面を擦過して採取した試料を用いれば、簡便かつ安価で有用な判定法になることが分かった。
【実施例５】
【００４０】
＜試料の保存試験１＞
ハイリスク者（判定法Iでレベル３、判定法IIでレベル４）と判定された被検者から試料を採取した。
試料をPBSまたは10%スキムミルク-PBS（スキムミルクを10重量％含むPBS)に懸濁させ、1.5mlチューブに50μlずつ分注し、下記表７に記載の条件で保存した後、実施例３の手順により虫歯リスクレベル判定を行なった。表７には、それぞれの保存試料につき得られた生菌数の平均値とMS比を併記した。生菌数は、 各試料につき実施例３に準じる培養を３回行い、MSP斜面上の総レンサ球菌、BGPA-1斜面上のミュータンスレンサ球菌、BGPA-20斜面上の  S.sobrinus菌の集落数をルーペを使用して算定した。【００４１】
結果を表７に示す。
【表７】
2009028445.tif 000008
この結果から、PBSのみに懸濁した場合には、冷蔵庫（４℃）でも冷凍庫（−２０℃）でも１日以上保存すれば、判定レベルが異なってくることが分かった。
それに対して、10%スキムミルク-PBS中に保存した場合には、4℃冷蔵で３日、−20℃冷凍で１週間、−80℃冷凍で６ヶ月後でも生菌数とMS比の大きな減少無しに保存できることが判明した。
【実施例６】
【００４２】
＜試料の保存試験２＞
スキムミルク-PBSが保存液として有用かどうかを確認するための試験を多数の被検者について行なった。
成人被検者２３名から採取した擦過歯垢の10％スキムミルク-PBS懸濁液を1.5mlチューブに50μlずつ分注し、下記に示す各種保存条件下で保存後、実施例３と同じ手順でリスク判定（判定法II）を行ない、判定結果を比較した。
条件１：２時間冷蔵（4℃下で２時間冷蔵保存）
条件２：24時間冷蔵（4℃下で24時間冷蔵保存）
条件３：24時間冷凍（−20℃下で24時間冷凍保存）
条件４：1週間冷凍（−20℃下で1週間冷凍保存）
条件５：再冷凍（−20℃下で24時間冷凍・解凍後、再度1週間冷凍保存）【００４３】
結果を表８に示す。
【表８】
2009028445.tif 000009
表８から分かるように、冷蔵及び冷凍保存後の検体を培養して得られた各被検者のリスクレベルは採取当日に行なったものとほぼ同様の結果を示している。そして、採取当日にレベル４と判定された被検者４名は、4℃下で24時間冷蔵保存後、−20℃下で24時間冷凍保存後、−20℃下で１週間冷凍保存後のいずれでもレベル４と判定されており、採取当日でも冷蔵、冷凍保存後でも、同一ハイリスク者4名が選別されたことが分かる。
以上の結果、検体を10％スキムミルク-PBS中に懸濁すれば冷蔵或いは冷凍保存が可能であり、検体採取日に必ずしも塗抹・培養操作を行なう必要がないことが分かった。
なお、上記表８から再冷凍によっても、ほぼ判定に影響がないことも分かった。
【実施例７】
【００４４】
＜試料の保存試験３＞
採取試料のさらなる長期保存が可能かどうかの検討のため、10％スキムミルク-PBS中に懸濁した成人22名からのブラッシング歯垢試料を−80℃の超低温庫内で１年間長期保存した試料を用いて実施例３と同じ手順でリスク判定（判定法II）を行ない、1年前（採取当日）に行った判定結果と比較した。
結果を表９に示す。
【表９】
2009028445.tif 000010
この結果から、−80℃の超低温庫内で保存すれば、１年間長期保存後であっても、採取当日とほぼ一致する判定が得られることが分かった。このことから、−80℃の超低温庫内であれば、１年間の長期保存後であっても、ほぼ判定に影響がないことが分かった。
【実施例８】
【００４５】
＜集団検診に特に適する虫歯リスク判定キット及びリスク判定法＞
以上から、綿棒によって歯面を擦過して採取した試料がブラッシング歯垢と同様に、本発明の虫歯リスク判定方法に適すること、及び、10％スキムミルク中に保存すれば冷蔵・あるいは冷凍で試料を長期間保存できることが分かったので、その知見にの基づき学校などの集団検診のために特に適する虫歯リスク判定用キットと簡便な判定方法とを確立した。一例を実施例８として示す。
I  キット
次の３種の選択培地と試料採取・塗沫用具からキットを構成する。    選択培地：
BGPA-1斜面培地（青キャップ培地）・・・・・・・・・1本／試料
BGPA-20斜面培地（赤キャップ培地）・・・・・・・・・1本／試料
MSP斜面培地（黄キャップ培地）・・・・・・・・・1本／試料
試料採取・塗抹用具：
滅菌小綿棒・・・・・・・・ １本／被検者
チューブA：100μl 滅菌10％スキムミルク-PBS入りチューブ・・・ 1本／試料  
チューブB：50μl 滅菌PBS入りチューブ・・・・・・・・ 1本／試料
1μl用滅菌（または消毒）エーゼ ・・・・・・・・・ ２本／試料
【００４６】
ＩＩ  操作法：
（１）青キャップ、赤キャップ、黄キャップ培地のガラス面（上部）及びチューブA(スキムミルク入りチューブ）の蓋にマジックペンで氏名（又は識別番号）を明記する。
（２）滅菌小綿棒で全歯頬側面を約30秒間擦り、歯垢を採取する。
（３）採取した歯垢をチューブA(滅菌10％スキムミルク-PBS 100μl）中に懸濁（綿棒を10回前後上下させる）させ、試料液を調製する。
（４）試料液を採取当日、翌日まで4℃下で冷蔵保存後、−20℃下で数日間冷凍保存後、或いは−80℃下で数カ月間冷凍保存後、下記の培養操作を行う（冷凍試料は自然解凍で可）。
（５）１μlエーゼにて試料液１μlを取り、青キャップ培地に塗抹する。
（６）同エーゼにて試料液１μlを取り、赤キャップ培地に塗抹する。
（７）同エーゼにて試料液１μlを取り、チューブB(50μlの滅菌PBS）にて50倍希釈液を作る。
（８）新しいエーゼにて50倍希釈液１μlを取り、黄キャップ培地に塗抹する。
（９）塗抹済み培地を37℃に設定した培養器内で３日間静置培養する。
（１０）残った試料液は再検査或いは確認用に凍結（−80℃又は−20℃）保存する。【００４７】
ＩＩＩ  リスク判定法：
黄キャップ培地に形成された総レンサ球菌の集落数と青キャップ培地に形成されたミュータンスレンサ球菌の集落の多寡を肉眼或いはルーペを使用して比較し、総レンサ球菌に占めるミュータンスレンサ球菌の割合（MS比）が低いか、中等度か、高いかを調べる。次に、赤キャップ培地に形成された集落の有無を調べ、下表の基準にしたがってう蝕リスクを４段階で評価する。
【表１０】
2009028445.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によって、従来法の各種問題点を解決し、歯科診療室の医療現場や集団歯科検診の現場などで微生物の取扱技術を持たない者でも簡単に実施できる簡便・廉価な虫歯リスク判定法を確立できた。
本発明方法は、キット化・製品化も容易で、特別な設備や技術を必要としないため、学校、幼稚園などの集団歯科検診の場におけるハイリスク者選別手段として、診療室チェアサイドにおける来院患者用虫歯予防・管理手段として有用である。
【図１】
2009028445.tif 000012
【図２】
2009028445.tif 000013
【図３】
2009028445.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月28日(2009.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から採取した口腔試料あるいは該試料を保存した試料から総レンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌の比率（ＭＳ比）を求めることによって虫歯リスクの判定を行なう方法であって、
レンサ球菌の培養を斜面培地を用いて行い、且つ、次の工程からなることを特徴とする判定方法。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Ａを作製
（２）試料液Ａから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Ｂを作製
（３）試料液Ｂを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Ｂを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Ｂと同量の試料液Ａをミュータンスレンサ球菌選択培地に塗沫して斜面培地Ａを作製
（５）斜面培地Ｂと斜面培地Ａとを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Ｂと斜面培地Ａとに形成された集落の数を比較して、斜面培地Ａの集落数が多いときに、虫歯リスクが高いと判定する工程
【請求項２】
個体から採取した口腔試料が、ブラッシング歯垢または綿棒による歯面擦過試料である請求項１または１５に記載の判定方法。
【請求項３】
総レンサ球菌培養用の選択培地とレンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地とを組み合せて用いる請求項１、２、１５のいずれかに記載の判定方法。
【請求項４】
ミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地として、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）とストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）とを選択培養する培地を用いる請求項３または１５に記載の判定方法。
【請求項５】
さらに、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）を選択培養する培地を用いる請求項４に記載の判定方法。
【請求項６】
培地がポリミキシンを添加された培地であることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の判定方法。
【請求項７】
総レンサ球菌培養用の選択培地がポリミキシン添加ＭＳ培地（ＭＳＰ培地）である請求項３〜６のいずれかに記載の判定方法。
【請求項８】
ミュータンスレンサ球菌を選択培養する選択培地が低濃度のモノバクタム系抗生物質を添加された培地である請求項３〜７のいずれかに記載の判定方法。
【請求項９】
ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）を選択培養する培地が高濃度のモノバクタム系抗生物質を添加された培地である請求項５〜８のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１０】
モノバクタム系抗生物質がアズトレオナムである請求項８または９に記載の判定方法。
【請求項１１】
保存した試料が、個体から採取した口腔試料をスキムミルクを含む保存用溶液中に保存したものである請求項１〜１０のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１２】
保存用溶液がスキムミルクを溶解した滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である請求項１１に記載の判定方法。
【請求項１３】
保存した試料が、個体から採取した口腔試料を保存用溶液中で冷凍して保存したものである請求項１〜１２のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
個体から採取した口腔試料あるいは該試料を保存した試料から総レンサ球菌中のミュータンスレンサ球菌の比率（ＭＳ比）を求めることによって虫歯リスクの判定を行なう方法であって、
レンサ球菌の培養を斜面培地を用いて行い、且つ、次の工程からなることを特徴とする判定方法。
（１）個体から採取した口腔試料または該試料を保存した試料を緩衝液で希釈して試料液Ａを作製
（２）試料液Ａから、一定量採取してさらに一定割合で希釈した試料液Ｂを作製
（３）試料液Ｂを総レンサ球菌培養用の選択培地に塗沫して斜面培地Ｂを作製
（４）（３）で塗沫した試料液Ｂと同量の試料液Ａをミュータンスレンサ球菌選択培地及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）選択培地に塗沫して斜面培地Ａ及びＡ´を作製
（５）斜面培地Ｂと斜面培地Ａ及びＡ´とを恒温器で一定時間以上培養
（６）一定時間培養後に、斜面培地Ｂと斜面培地Ａとに形成された集落の数を比較して、斜面培地Ａの集落数が多いときに、虫歯リスクが高いと判定し、さらに斜面培地Ａ´にも集落が形成されたときに、より虫歯リスクが高いと判定する工程
【請求項１６】
一定量の試料液の採取、希釈、試料液の培地への塗沫を一定容量の白金耳（エーゼ）を用いて行なうことを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１７】
総レンサ球菌培養用の選択培地からなる斜面培地とミュータンスレンサ球菌選択培地からなる斜面培地とを少なくとも有している請求項１〜１６のいずれかに記載される虫歯リスク判定方法に用いるキット。
【請求項１８】
さらにストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）選択培地からなる斜面培地を有してなる請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
さらに保存用溶液を収容したチューブを有してなる請求項１７または１８に記載の虫歯リスク判定用キット。
【請求項２０】
さらに試料採取用の綿棒あるいはエーゼ、試料希釈用のチューブ、試料希釈用及び塗沫用のエーゼをも含んでなる請求項１７〜１９のいずれかに記載の虫歯リスク判定用キット。
【請求項２１】
試料希釈用緩衝液をさらに含んでなる請求項１７〜２０のいずれかに記載の虫歯リスク判定用キット。
【請求項２２】
斜面培地として気密性の高い２段階ストッパー付き試験管を使用した請求項１７〜２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
ポリミキシンが添加された培地を用いる請求項１７〜２２のいずれかに記載のキット。
【国際調査報告】
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