(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、その遺伝子由来のレプリコンＲＮＡ、レプリコンＲＮＡが導入されたレプリコン複製細胞、及びそのレプリコン複製細胞を用いた薬剤のスクリーニング方法を提供する。  （Ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（Ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（Ｃ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（Ｅ）配列番号５又は配列番号７で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、を含むレプリコンＲＮＡ、又はＣ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチド、及びＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子型１ｂのレプリコンＲＮＡを細胞に導入することによって、レプリコン複製細胞を作製することができ、そのレプリコン複製細胞により、薬剤のスクリーニングが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号６５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（Ｆ）配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むＣ型肝炎ウイルス遺伝子。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１、又は配列番号６３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチド、及びＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルス遺伝子。
【請求項４】
前記請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の塩基配列においてウリジンがチミンに置換した塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号６、配列番号８、又は配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
ＮＳ４Ｂ領域のペプチドが、配列番号６、配列番号８、又は配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、Ｃ型肝炎ウイルスポリプロテイン。
【請求項７】
配列番号２、配列番号４、配列番号１１、配列番号６２、又は配列番号６４で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第１９１番目のアミノ酸配列からなるコアタンパク質、第１９２番目〜第３８３番目のアミノ酸配列からなるＥ１タンパク質、第３８４番目〜第７４６番目のアミノ酸配列からなるＥ２タンパク質、第７４７番目〜第８０９番目のアミノ酸配列からなるＰ７タンパク質、第８１０番目〜第１０２６番目のアミノ酸配列からなるＮＳ２タンパク質、第１０２７番目〜第１６５７番目のアミノ酸配列からなるＮＳ３タンパク質、第１６５８番目〜第１７１１番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ａタンパク質、第１７１２番目〜第１９７２番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質、第１９７３番目〜第２４１９番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ａタンパク質、第２４２０番目〜第３０１０番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質、からなる群から選択される少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルスタンパク質。
【請求項８】
（Ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号６５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｆ）配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（Ｇ）配列番号５、配列番号７、又は配列番号６５で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、レプリコンＲＮＡ。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチド、及びＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子型１ｂのレプリコンＲＮＡ。
【請求項１０】
（Ａ）Ｃ型肝炎ウイルスの５‘非翻訳領域の第１番〜第３４１番のポリヌクレオチド、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインにおける第１０２７番〜第３０１０番のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び３’非翻訳領域のポリヌクレオチド、又は
（Ｂ）５‘非翻訳領域の第１番〜第３４１番のポリヌクレオチド、３０１０アミノ酸からなるＣ型肝炎ウイルスのポリプロテインをコードするポリヌクレオチド、及び３’非翻訳領域のポリヌクレオチド、
を含む請求項８又は９に記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１１】
インターフェロン抵抗性である請求項８〜１０のいずれか一項に記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１２】
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号１０で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１０で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号６１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号６３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｆ）配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｇ）配列番号３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｈ）配列番号１０で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１０で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｉ）配列番号６１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｊ）配列番号６３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
を含む請求項８〜１１のいずれか一項に記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１３】
前記レプリコンＲＮＡが、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１若しくは配列番号６３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１若しくは配列番号６３で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド
である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１４】
少なくとも１つの選択マーカー遺伝子、又はリポーター遺伝子及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列を含む請求項８〜１３のいずれか一項に記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれか一項に記載のレプリコンＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１７】
請求項８〜１４のいずれか一項に記載のレプリコンＲＮＡ、請求項１５に記載のＤＮＡ、及び請求項１６に記載のベクターからなる群から選択された少なくとも１つを細胞に導入することによって作製されるレプリコン複製細胞。
【請求項１８】
前記細胞が肝細胞由来の細胞である請求項１７に記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１９】
前記肝細胞由来細胞がＨｕｈ−７細胞である請求項１８に記載のレプリコン複製細胞。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のレプリコン複製細胞によって産生されるレプリコンＲＮＡ。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のレプリコン複製細胞によって産生されるＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂからなる群から選択される少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルスタンパク質。
【請求項２２】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のレプリコン複製細胞によって産生されるＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項２３】
Ｃ型肝炎ウイルスの感染を制御する物質をスクリーニングする方法であって、
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のレプリコン複製細胞と、前記物質とを接触させる工程、及びレプリコンＲＮＡの増加度を分析する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項２４】
前記レプリコンＲＮＡ増加度の分析が、レプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルスタンパク質の検出である請求項２３に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」と称することがある）遺伝子、その遺伝子由来のレプリコンＲＮＡ、レプリコンＲＮＡが導入されたレプリコン複製細胞、及びそのレプリコン複製細胞を用いた薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶはＣ型慢性肝炎の原因因子であり、ＷＨＯの統計によれば、世界中で１．７億人の感染者がいると推定されている。ＨＣＶは、フラビウイルス科、フラビウイルス属に分類されるウイルスであり、血液や血液成分を介して感染し、肝臓で増殖すると考えられている。ＨＣＶの感染者は、感染初期においては比較的軽微な症状を引き起こすのみであるが、高頻度に慢性化し、一定期間の無症候性期を経た後、慢性肝炎を発症する。そして感染が長期化するに従って、肝硬変へと病状が増悪化し、高い頻度で肝がんに至る。肝がんの９５％は肝炎ウイルスが関与しており、その８０％がＨＣＶの感染によるものと考えられている。【０００３】
Ｃ型慢性肝炎の治療には、広くインターフェロンが用いられている。近年、インターフェロンの剤型の改良や、インターフェロンとリバビリンとの併用療法などの投与方法の改善により、ＨＣＶが体内から駆除され、完治する割合も徐々に増加してきている。しかしながら、未だにインターフェロン投与による完治率は５割程度であり、インターフェロン治療に抵抗性を示すＨＣＶが多く存在していると考えられる。そのため、インターフェロンに抵抗性のウイルスに対する治療効果を有する薬剤の開発が望まれている。【０００４】
そのような薬剤の開発においては、薬剤のスクリーニング系が必要である。ＨＣＶを試験管内でヒトやサル由来の細胞に感染させ、増殖させることが報告されているが、このような増殖系は感染効率、増殖効率ともに低く、薬剤のスクリーニング系として用いることができなかった。【０００５】
最近、脇田らはＣ型劇症肝炎患者から遺伝子型２ａのＨＣＶ遺伝子を単離した（特許文献１）。この単離したＪＦＨ１株から、全長のＲＮＡを試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で合成し、ヒト肝がん由来細胞（Ｈｕｈ７細胞）に導入したところ、細胞内で自律的に複製するレプリコンＲＮＡを得ることができた。更に、レプリコンＲＮＡが導入された細胞の培養上清に感染性粒子が放出されることを確認した。（非特許文献１）。従って、ＪＦＨ１株のレプリコンＲＮＡをヒト肝がん由来細胞（Ｈｕｈ７細胞）に導入し、得られた感染性粒子を再びヒト肝がん由来細胞と培養することにより、再感染増殖系を構築することができる。この再感染増殖系を用いることにより、ＨＣＶに対する薬剤のスクリーニングが始められている。【０００６】
しかしながら、ＪＦＨ１株は遺伝子型２ａのＨＣＶであり、インターフェロンに感受性のＨＣＶである。そのため、インターフェロンに抵抗性を示すＨＣＶ遺伝子領域を有しておらず、インターフェロン抵抗性を規定する領域に作用する宿主側の因子を特定することもできない。従って、インターフェロンに抵抗性のＨＣＶに対して効果のある薬剤をスクリーニングできない可能性がある。【０００７】
また、最近Ｌｅｍｏｎらは、遺伝子型１ａのＨ７７株のレプリコンＲＮＡをヒト肝がん由来細胞（Ｈｕｈ７細胞）に導入した感染増殖系を報告している（非特許文献２）。しかしながら、このレプリコンＲＮＡを導入した細胞の培養上清から得られたウイルス粒子を、再度ヒト肝がん由来細胞に感染させたが、前記のＪＦＨ１株の感染性粒子と比較して感染価が約４００倍低いことから、Ｈ７７株のレプリコンＲＮＡは、感染性を失ったウイルス粒子を放出していると考えられている。従って、試験管内で複製することのできるＨ７７株のＲＮＡレプリコンは、感染性粒子を産生する機能を失っており、本来のＨＣＶの増殖の機能を保持していないと考えられる。
このため、このＨ７７のレプリコンＲＮＡの感染増殖系を用いたスクリーニング系は、生体内で増殖機能を有するＨＣＶに対して有効な薬剤をスクリーニングすることができない可能性がある。【０００８】
以上のとおり、ＨＣＶは効率的な試験管内培養系が存在しなかったため、ＨＣＶ治療に有用な薬剤のスクリーニングを行うことが困難であった。例えば、現在ＨＣＶの治療に広く用いられているインターフェロンは、患者を被検体として直接治療法が開発及び改良されてきており、患者に多大な負担を強いてきた。前記の脇田、及びＬｅｍｏｎの報告したレプリコンＲＮＡは、一部の薬剤のスクリーニングを可能としたが、これらのレプリコンＲＮＡは前記の様な問題を有しており、ＨＣＶの治療に広く用いることができる薬剤をスクリーニングすることができないと考えられる。【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１７１９７８号公報
【非特許文献１】「ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（米国）２００５年、第１１巻、ｐ７９１−７９６
【非特許文献２】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステイト・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Science  of the UnitedState of America）」２００６年、第１０３巻、ｐ２３１０−２３１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＨＣＶの治療に広く用いることができる薬剤を得るために、ＨＣＶの効率的な増殖系、特には、遺伝子型１ｂ型の遺伝子を有し、インターフェロン抵抗性であり、感染性粒子を産生することのできる試験管内での増殖系について、鋭意研究を行った。まず、劇症化肝炎患者の血清中から全長のＨＣＶ遺伝子を単離し、9594塩基の塩基配列を有する配列番号１の全塩基配列を決定した。このＨＣＶ遺伝子より、レプリコンＲＮＡを作製し、ヒト肝がん由来細胞に導入したところ、細胞内で自律的に増殖し、ＲＮＡの複製が起きることを確認した。更に、このレプリコンＲＮＡのＮＳ４Ｂタンパク質の領域に２個のアミノ酸配列の変異を導入することにより、ＲＮＡの複製効率が顕著に上昇し、培養上清中に多くのウイルス粒子が放出されることを見出した。そして、このＨＣＶ粒子を再び、ヒト肝がん由来細胞と培養することにより、再感染増殖系を構築することが可能であった。そして、このレプリコン複製細胞及び感染性粒子を用いた再感染増殖系が、ＨＣＶの治療用の薬剤のスクリーニング、特に、インターフェロン抵抗性のウイルスに対する薬剤のスクリーニング系として有用であることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明は、
（Ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号６５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（Ｆ）配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むＣ型肝炎ウイルス遺伝子に関する。
本発明によるＣ型肝炎ウイルス遺伝子の好ましい態様においては、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１、又は配列番号６３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
また、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチド、及びＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルス遺伝子に関する。
また、本発明は、前記のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の塩基配列においてウリジンがチミンに置換した塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡにも関する。【００１２】
また、本発明は、配列番号６、配列番号８、又は配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにも関する。
更に、本発明は、ＮＳ４Ｂ領域のペプチドが、配列番号６、配列番号８、又は配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、Ｃ型肝炎ウイルスポリプロテインにも関する。
また、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号１１、配列番号６２、又は配列番号６４で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第１９１番目のアミノ酸配列からなるコアタンパク質、第１９２番目〜第３８３番目のアミノ酸配列からなるＥ１タンパク質、第３８４番目〜第７４６番目のアミノ酸配列からなるＥ２タンパク質、第７４７番目〜第８０９番目のアミノ酸配列からなるＰ７タンパク質、第８１０番目〜第１０２６番目のアミノ酸配列からなるＮＳ２タンパク質、第１０２７番目〜第１６５７番目のアミノ酸配列からなるＮＳ３タンパク質、第１６５８番目〜第１７１１番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ａタンパク質、第１７１２番目〜第１９７２番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質、第１９７３番目〜第２４１９番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ａタンパク質、第２４２０番目〜第３０１０番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質、からなる群から選択される少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルスタンパク質にも関する。【００１３】
また、本発明は、（Ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号６５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（Ｆ）配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（Ｇ）配列番号５、配列番号７、又は配列番号６５で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、レプリコンＲＮＡにも関する。
また、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチド、及びＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子型１ｂのレプリコンＲＮＡに関する。
本発明によるレプリコンＲＮＡの好ましい態様においては、（Ａ）Ｃ型肝炎ウイルスの５‘非翻訳領域の第１番〜第３４１番のポリヌクレオチド、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインにおける第１０２７番〜第３０１０番のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び３’非翻訳領域のポリヌクレオチド、又は
（Ｂ）５‘非翻訳領域の第１番〜第３４１番のポリヌクレオチド、３０１０アミノ酸からなるＣ型肝炎ウイルスのポリプロテインをコードするポリヌクレオチド、及び３’非翻訳領域のポリヌクレオチド、
を含む。
本発明によるレプリコンＲＮＡの好ましい態様においては、インターフェロン抵抗性である。
本発明によるレプリコンＲＮＡの別の好ましい態様においては、（Ａ）配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｃ）配列番号１０で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１０で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｄ）配列番号６１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号６３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｆ）配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｇ）配列番号３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｈ）配列番号１０で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１０で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｉ）配列番号６１で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６１で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は
（Ｊ）配列番号６３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列に対して９０％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
を含む。
また、本発明によるレプリコンの別の好ましい態様においては、前記レプリコンＲＮＡが、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１若しくは配列番号６３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１若しくは配列番号６３で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
更に、本発明によるレプリコンの別の好ましい態様においては、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子、又はリポーター遺伝子及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列を含む。【００１４】
更に、本発明は、前記のレプリコンＲＮＡをコードするＤＮＡに関する。
更に、本発明は、前記のＤＮＡを含むベクターに関する。
また、本発明は、前記のレプリコンＲＮＡ、前記のＤＮＡ、及び前記のベクターからなる群から選択された少なくとも１つを細胞に導入することによって作製されるレプリコン複製細胞に関する。
本発明によるレプリコン複製細胞の好ましい態様においては、前記細胞が肝細胞由来の細胞であり、好ましくは、前記肝細胞由来細胞がＨｕｈ−７細胞である。【００１５】
また、本発明は、前記レプリコン複製細胞によって産生されるレプリコンＲＮＡに関する。
更に、本発明は、前記レプリコン複製細胞によって産生されるＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂからなる群から選択される少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルスタンパク質に関する。
更に、本発明は、レプリコン複製細胞によって産生されるＣ型肝炎ウイルス粒子に関する。
また、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を制御する物質をスクリーニングする方法であって、前記のレプリコン複製細胞と、前記物質とを接触させる工程、及びレプリコンＲＮＡの増加度を分析する工程を含むスクリーニング方法に関する。
本発明によるスクリーニング方法の好ましい態様においては、前記レプリコンＲＮＡ増加度の分析が、レプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルスタンパク質の検出である。
本明細書において、「レプリコンＲＮＡ」とは、ウイルスＲＮＡを基に作製され、細胞内で自律複製能を有しているＲＮＡを意味し、ＲＮＡの複製を起こすことができる限り、ウイルス粒子を産生することのできるものも、産生することのできないものも含むことができる。
また、本明細書において「インターフェロン抵抗性」とは、試験管内及び生体内でインターフェロンの投与によりＨＣＶの複製又は増殖が顕著に抑制されないことを意味する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＨＣＶ遺伝子によれば、生体内で複製することのできるＨＣＶ遺伝子を試験管内で解析することが可能である。このＨＣＶ遺伝子を利用することにより、本発明のＲＮＡレプリコンを作製することができる。更に、前記ＲＮＡレプリコンが導入されたレプリコン複製細胞により、ＨＣＶに対する薬剤のスクリーニングが可能である。本発明のＨＣＶ遺伝子から作製されたレプリコンＲＮＡは、遺伝子型１ｂのインターフェロン抵抗性のＲＮＡレプリコンである。また、このレプリコンＲＮＡを導入されたレプリコン複製細胞から感染性のウイルス粒子を産生することが可能である。従って、遺伝子型１ｂで、且つインターフェロン抵抗性のＨＣＶの生体内での増殖機構と同じ試験管内のモデルを提供することが可能である。そして、このＨＣＶの増殖モデルを利用することにより、肝炎の重症化を抑制することのできる薬剤のスクリーニング及び医薬の開発を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のレプリコンＲＮＡの細胞への導入によるコアタンパク質の産生を示す。ｐＴＰＦ１及びｐＴＰＦ１／４ＢをＨｕｈ−７細胞にエレクトロポレーションにより導入し、４、２４、４８、及び７２時間後のコアタンパク質の培養上清中の濃度を測定した。
【図２】本発明のレプリコン複製細胞より産生された感染粒子の細胞への再感染を示す。感染後、４、２４、４８、７２、及び９６時間後のコアタンパク質の培養上清中の濃度を測定した。
【図３】本発明のスクリーニング方法を用い、サイクロスポリンＡのコアタンパク質の産生に対する抑制効果を示した。サイクロスポリンＡ添加とコントロールのサイクロスポリン無添加において、レプリコンＲＮＡの導入し、４、２４、４８、及び７２時間後のコアタンパク質の培養上清中の濃度を測定した。
【図４】本発明のレプリコンＲＮＡの細胞への導入によるコアタンパク質の産生を示す。ｐＡＨＣ１及びｐＡＨＣ／４ＢｍをＨｕｈ−７細胞にエレクトロポレーションにより導入し、４、２４、４８、及び７２時間後のコアタンパク質の培養上清中の濃度を測定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明の最良の形態を述べるが、本発明はこの形態に限定されるものではない。
本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子は、遺伝子型１ｂに属するＨＣＶの遺伝子である限り限定されるものではないが、好ましくは本発明のＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。また、インターフェロン抵抗性を示すＨＣＶの遺伝子が好ましい。
ＨＣＶ遺伝子は、その塩基配列によって、少なくとも６種類の遺伝子型に分類することが可能である。そのうち遺伝子型１に属するＨＣＶは、更に、遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂに分類される。遺伝子型１ｂの遺伝子型は、具体的には、配列番号５又は７の塩基配列に対して、９０％以上の相同性を示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するＨＣＶを含む。【００１９】
本発明のＮＳ４Ｂタンパク質としては、配列番号６、配列番号８、又は配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子は、５‘非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と３’非翻訳領域（３‘ＵＴＲ）の間にウイルスの構造タンパク質であるコアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、及び非構造タンパク質であるＰ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする領域からなる。Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子は、感染後に、宿主細胞内でｍＲＮＡとして機能し、約３０００アミノ酸長の一つながりのポリプロテインが合成される。その後、宿主のシグナルペプチダーゼ、シグナルペプチジルペプチダーセ、及びＨＣＶゲノムがコードするプロテアーゼにより切断され、前記の３種の構造タンパク質と７種の非構造タンパク質が産生される。【００２０】
これらの１０種のＨＣＶのタンパク質のうち、ＮＳ４Ｂタンパク質は、ＮＳ３からＮＳ５Ｂまでのその他の非構造タンパク質と複合体を形成し、宿主タンパク質とともに、ＲＮＡ複製複合体を形成し、ゲノムＲＮＡの複製を行うと考えられており、ウイルスの複製において重要な役割を果たしている。劇症肝炎患者から取得したＨＣＶ遺伝子のＮＳ４Ｂ領域にコードされた、本発明の配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリペプチドと称する）、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドと称する）、及び配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＡＨＣ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドと称することがある）特に、ＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチド、及びＡＨＣ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドは、ＨＣＶの遺伝子の複製に関して顕著な効果を示す。
従って、本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子は、好ましくは、ＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリペプチド又はＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、より好ましくは配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（以下、ＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリヌクレオチドと称する）を、最も好ましくは、配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド）、又は配列番号６５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＡＨＣ１−変異ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド）を含むＣ型肝炎ウイルス遺伝子である。しかしながら、本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子は、ＨＣＶ遺伝子の複製に関して顕著な効果を示す限り、これらに限定されるものではなく、例えば、配列番号５、配列番号７、又は配列番号６５で表される塩基配列に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むＣ型肝炎ウイルス遺伝子を挙げることができる。【００２１】
本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子は、ＮＳ４Ｂ領域のポリヌクレオチドを含む限り限定されるものではなく、ＨＣＶの部分ポリヌクレオチドを含む部分Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子及び全長のＨＣＶポリヌクレオチドからなるＣ型肝炎ウイルス遺伝子を含むことができる。ＨＣＶの部分ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１、３、１０、６１、又は６３における任意の塩基配列部分からなるヌクレオチドを挙げることができ、具体的には、５’ＵＴＲ（第１番目〜第３４１番目の塩基配列）、コア（第３４２番目〜第９１４番目の塩基配列）、Ｅ１領域（第９１５番目〜第１４９０番目の塩基配列）、Ｅ２領域（第１４９１番目〜第２５７９番目の塩基配列）、Ｐ７領域（第２５８０番目〜第２７６８番目の塩基配列）、ＮＳ２領域（第２７６９番目〜第３４１９番目の塩基配列）、ＮＳ３領域（第３４２０番目〜第５３１２番目の塩基配列）、ＮＳ４Ａ領域（第５３１３番目〜第５４７４番目の塩基配列）、ＮＳ４Ｂ領域（第５４７５番目〜第６２５７番目の塩基配列）、ＮＳ５Ａ領域（第６２５８番目〜第７５９８番目の塩基配列）、ＮＳ５Ｂ領域（第７５９９番目〜第９３７１番目の塩基配列）、３’非翻訳領域（第９３７２番目〜第９５９４番目の塩基配列）の部分ポリヌクレオチドを挙げることができる。また、全長のＨＣＶポリヌクレオチドからなるＣ型肝炎ウイルス遺伝子としては、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１、又は配列番号６３で表される塩基配列からなるＣ型肝炎ウイルス遺伝子を挙げることができる。【００２２】
本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子は、劇症肝炎患者から分離したものを含む。劇症肝炎とは、肝炎のうち症状発現後８週間以内にII度以上の脳症とプロトロンビン時間４０％以下を呈したものを意味し、１０日以内に脳症の出現する急性型と、それ以後に脳症の出現する亜急性型に分けられる。【００２３】
本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子のクローニングは、例えば、次のようにして行うことができる。劇症Ｃ型肝炎患者の血清から、酸性グアニジンイソチオシアネ−ト・フェノール・クロロホルム法（例えば、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ、日本ジーン社製）等を用い、全ＲＮＡを調製する。３’ＵＴＲ特異的なプライマー及びマウス白血病ウイルスリバーストランスクリプターゼ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いる逆転写反応により、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。【００２４】
合成されたＨＣＶのｃＤＮＡを、５’ＵＴＲから３’ＵＴＲまでの特異的プライマーを用いるＰＣＲ〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により、増幅する。増幅されたＨＣＶ遺伝子を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）中にクローニングし、塩基配列を決定する。【００２５】
ＨＣＶ遺伝子の両末端は、５’ＵＴＲ特異的プライマーを用いた５’−ＲＡＣＥ及び３’ＵＴＲ特異的プライマーを用いた３’−ＲＡＣＥ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８（１９８８）〕により得ることができる。得られたｃＤＮＡ断片をつなぎ合わせて、全長ＨＣＶ遺伝子を取得することができる。【００２６】
本発明のＤＮＡは、ＲＮＡである前記のＣ型肝炎ウイルス遺伝子に相当するＤＮＡである限り、限定されるものではなく、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子から逆転写酵素により合成された一本鎖のｃＤＮＡ、及びその１本鎖ｃＤＮＡとその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡを挙げることができる。【００２７】
本発明のポリペプチドは、配列番号１、３、１０、６１、又は６３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドであるか、又はＣ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含むポリペプチドであれば、その領域及び長さは特に限定されるものではないが、好ましくは、配列番号６、配列番号８、又は配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。【００２８】
本発明のＣ型肝炎ウイルスタンパク質は、配列番号２、４、１１、６２、又は６４で表されるアミノ酸配列における第１番目〜第１９１番目のアミノ酸配列からなるコアタンパク質、第１９２番目〜第３８３番目のアミノ酸配列からなるＥ１タンパク質、第３８４番目〜第７４６番目のアミノ酸配列からなるＥ２タンパク質、第７４７番目〜第８０９番目のアミノ酸配列からなるＰ７タンパク質、第８１０番目〜第１０２６番目のアミノ酸配列からなるＮＳ２タンパク質、第１０２７番目〜第１６５７番目のアミノ酸配列からなるＮＳ３タンパク質、第１６５８番目〜第１７１１番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ａタンパク質、第１７１２番目〜第１９７２番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質、第１９７３番目〜第２４１９番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ａタンパク質、又は第２４２０番目〜第３０１０番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質を含むことができる【００２９】
本発明のレプリコンＲＮＡは、遺伝子型１ｂの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含み、細胞内で自律複製能を有しているＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。ＨＣＶのレプリコンＲＮＡの複製に関与するヌクレオチド領域としては、特には、５’ＵＴＲ、３‘ＵＴＲ、及び非構造タンパク質であるＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド領域を挙げることができ、本発明のレプリコンＲＮＡにおいて、これらのすべての領域が重要であるが、複製の効率を上昇させる点において、ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする領域が重要である。特に、ＮＳ４Ｂタンパク質としては、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリペプチドが好ましく、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチド、又は配列番号６６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるＡＨＣ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドがより好ましい。【００３０】
従って、本発明のレプリコンＲＮＡは、ＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特には配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド）、を含むレプリコンＲＮＡが好ましく、ＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特には配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド）、又はＡＨＣ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特には配列番号６５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＡＨＣ１−変異ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド）を含むレプリコンＲＮＡがより好ましい。しかしながら、本発明のレプリコンＲＮＡは、前記のＮＳ４Ｂ領域のポリヌクレオチドを含むレプリコンＲＮＡに限定されるものではなく、配列番号５、配列番号７、又は配列番号６５で表される塩基配列との相同性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むレプリコンＲＮＡを含む。【００３１】
ＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド（配列番号７）は、ＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリヌクレオチド（配列番号５）の２７８番目のＡがＵに置換し、７６３番目のＧがＡに置換されたものである。また、ＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチド（配列番号８）は、ＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリペプチド（配列番号６）の９３番目のグルタミン（Ｑ）がロイシン（Ｌ）に置換し、２５５番目のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）へ置換されたものである。【００３２】
本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子、及びレプリコンＲＮＡの１つの実施態様としては、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチドを含むことができる。
第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンの位置は、３０１０個のアミノ酸からなる遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルス遺伝子における位置である。【００３３】
第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンは、ＮＳ４Ｂタンパク質に含まれるアミノ酸であり、現在までこれらのアミノ酸を含むＮＳ４Ｂタンパク質は報告されていない。従って、これらのアミノ酸を含むＨＣＶポリプロテイン、これらのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡレプリコンも報告されていない。【００３４】
遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルス遺伝子の塩基配列は、特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号１０、配列番号６１、配列番号６３で表される塩基配列との相同性が、９０％以上のものが含まれる。【００３５】
本発明のレプリコンＲＮＡの構造は、細胞内で複製することができる限り、限定されるものではないが、Ｃ型肝炎ウイルスの全長のＲＮＡを含むものや、一部のＲＮＡを含むサブジェノミックのレプリコンＲＮＡを挙げることができる。例えば、サブジェノミックのレプリコンＲＮＡは、５‘非翻訳領域（以下、５’ＵＴＲと称することがある）、３‘非翻訳領域（以下、３‘ＵＴＲと称することがある）、及び非構造タンパク質であるＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド領域を含むことができ、好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号６１、又は配列番号６３で表される塩基配列における第１番目〜第３４１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１、配列番号３、配列番号６１、又は配列番号６３で表される塩基配列における第３４２０番目〜第９５９４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことができる。【００３６】
５‘ＵＴＲは遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルス遺伝子においては、通常３４１ヌクレオチドからなり、レプリコンＲＮＡに含まれる５’ＵＴＲは、塩基配列は限定されないが、その全長の配列を含むことが好ましい。３‘ＵＴＲは、ウイルス株によってその長さは異なるが、通常４１ヌクレオチドの可変領域、株により長さの異なるポリＵ領域、及び９８ヌクレオチドの３’Ｘ領域からなり、レプリコンＲＮＡに含まれる３’ＵＴＲは、塩基配列及び長さは限定されないが、その株における全長の３‘ＵＴＲを含むことが好ましい。【００３７】
また、全長ＲＮＡ及びサブジェノミックＲＮＡに加えて、選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、又はＩＲＥＳ配列を含むこともでき、このようなレプリコンＲＮＡとしては、例えば、配列番号９、配列番号６７、又は配列番号６８に記載のポリヌクレオチドからなるレプリコンＲＮＡを挙げることができる。【００３８】
選択マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子を挙げることができる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などを挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子が最も好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。【００３９】
リポーター遺伝子としては、例えば、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子を挙げることができる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し、本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。【００４０】
ＩＲＥＳ配列としては、限定するものではないが、例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ、ＨＣＶ  ＩＲＥＳ、等が挙げられるが、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、及びＨＣＶ  ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳが最も好ましい。【００４１】
本発明のレプリコンＲＮＡは、インターフェロン抵抗性であることが好ましい。インターフェロンによりＨＣＶ患者の治療を行った際に、インターフェロンが有効であるか否かは、例えば、ウイルス側の要因及び宿主側の要因が考えられる。ウイルス側の要因としては、インターフェロンに抵抗性を示すＨＣＶ遺伝子領域を挙げることができるが、本発明のレプリコンＲＮＡは、インターフェロンに抵抗性を示すＨＣＶ遺伝子領域を含むものが好ましい。インターフェロンに抵抗性を示すＨＣＶ遺伝子領域としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＮＳ５Ａ領域のＩＦＮ感受性の指標と考えられているＩＳＤＲ領域を挙げることができる。【００４２】
本発明のレプリコンＲＮＡは、遺伝子型１ｂの塩基配列のポリヌクレオチドを含むものが好ましいが、例えば、配列番号５、配列番号７、又は配列番号６５で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むＲＮＡレプリコンを挙げることができる。【００４３】
本発明のＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡの形態で、前記のレプリコンＲＮＡをコードするＤＮＡであれば限定されず、例えば、レプリコンＲＮＡを産生するためのＲＮＡプロモ−ターを含むこともできる。【００４４】
本発明のレプリコンＲＮＡは、任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、レプリコンＲＮＡは、例えば、以下のような方法で作製することができる。
前記のレプリコンＲＮＡをコードするＤＮＡを、常法によりクローニングベクターに挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。このＤＮＡをＲＮＡプロモーターの下流に挿入して、レプリコンＲＮＡを産生することのできるＤＮＡクローンを作製する。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。ＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ３  ＲＮＡプロモーターが挙げられ、Ｔ７  ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。【００４５】
ＤＮＡを挿入するベクターとしては、特に限定されないが、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができるが、好ましくはプラスミドベクターである。【００４６】
本発明のレプリコンＲＮＡは、前記のＤＮＡが挿入されたベクターから作製することが可能である。ＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５’非翻訳領域から、常法により開始させることができる。鋳型ＤＮＡがプラスミドクローンの場合には、そのプラスミドクローンから、ＲＮＡプロモーターの下流に連結された前記ＤＮＡ領域を制限酵素によって切り出し、そのＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、好ましくは合成されるＲＮＡの３’末端がウイルスゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域と一致し、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。例えば、本発明の全長のレプリコンＲＮＡの１つの好ましい態様の場合は、５’ＵＴＲの上流にＴ７ＲＮＡプロモーター、３’ＵＴＲ末端に制限酵素ＸｂａＩ部位を有したベクターに挿入し、ＸｂａＩ消化後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりＨＣＶゲノムＲＮＡを合成することができる。【００４７】
本発明のレプリコン複製細胞は、前記のＲＮＡレプリコンを任意の細胞に導入することによって作製することができる。レプリコンＲＮＡを導入する細胞としては、特に限定されないが、ヒト肝由来細胞、マウス肝由来細胞、又はサル肝由来細胞が好ましく、特にはヒト肝がん由来細胞であるＨｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、又はＨｅｐ３Ｂ細胞、あるいはＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、又は２９３細胞を挙げることができる。レプリコンＲＮＡの細胞内への導入は、任意のトランスフェクション法により行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法を挙げることができるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。【００４８】
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを用いる場合には、そのレプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。例えば、レプリコンＲＮＡにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、そのレプリコンＲＮＡをトランスフェクションした細胞を培養ディッシュに播種し、Ｇ４１８（ネオマイシン）を０．０５ミリグラム／ミリリットル〜３．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で添加する。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から２〜３週間後にコロニーとして可視化することできる。【００４９】
本発明のレプリコン複製細胞は、レプリコンＲＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質、及びＣ型肝炎ウイルス粒子を産生する。従って、レプリコン複製細胞を用いて、レプリコンＲＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質、及びＣ型肝炎ウイルス粒子を産生することが可能である。【００５０】
レプリコン複製細胞中で複製されたレプリコンＲＮＡは、任意のＲＮＡ抽出法によって細胞内から抽出することが可能である。細胞から抽出したＲＮＡは、再び、細胞に導入することによって、レプリコンＲＮＡとして機能させることができる。本発明のＣ型肝炎ウイルスタンパク質は、細胞内あるいは培養上清中に分泌されたものを利用することができる。産生されたＣ型肝炎ウイルスタンパク質は、公知の方法によって抽出し、精製することが可能である。また、レプリコン複製細胞によって産生されたＣ型肝炎ウイルス粒子は、細胞内及び培養上清中に分泌されたものを利用することが可能である。本発明のＣ型肝炎ウイルスタンパク質、及びＣ型肝炎ウイルス粒子は、レプリコンＲＮＡに改変を加えることによって、ＲＮＡ、ウイルスタンパク質、又はウイルス粒子を修飾し、病原性を弱めることにより、ワクチンとしても使用することができる。【００５１】
前記レプリコン複製細胞を用いることによって、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を制御する物質をスクリーニングすることが可能である。「Ｃ型肝炎ウイルスの感染を制御」とは、例えば、ＨＣＶのＲＮＡの複製の制御（例えば、促進又は抑制）、ＲＮＡからタンパク質への翻訳の制御（例えば、促進又は抑制）を意味する。
具体的には、レプリコン複製細胞と試験物質を接触させ、レプリコンＲＮＡの増加度を分析することによって試験物質のスクリーニングを行うことができる。レプリコンＲＮＡの増加度とは、レプリコンＲＮＡの複製の速度又は量の変化を意味する。具体的には、レプリコン細胞中のレプリコンＲＮＡの量を検出又は測定し、対照の被検物質と接触しないレプリコン複製細胞のレプリコンＲＮＡの量と比較することによって、被検物質をスクリーニングすることができる。また、細胞中又は上清中のＣ型肝炎ウイルスタンパク質の量を検出又は測定し、対照の被検物質と接触しないレプリコン複製細胞のそれと比較することによっても、被検物質をスクリーニングすることが可能である。スクリーニングにおいて検出又は測定することのできるＣ型肝炎ウイルスタンパク質は、特に限定されないが、好ましくは、コアタンパク質であり、市販のキットを用いてコアタンパク質を測定することも可能である。また、スクリーニング方法を自動化することによって、ハイスループットのスクリーニング方法に適応することも可能である。【００５２】
更に、本発明のスクリーニング方法は、スクリーニングされた薬剤の効果を評価する方法としても有効である。薬剤の評価をこのスクリーニング方法で行う必要がある場合は、薬剤を製造する方法としても利用することができる。【００５３】
《作用》
Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチドを含むＣ型肝炎ウイルス遺伝子、及びレプリコンＲＮＡについて、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
本発明者らは、後述の実施例９において用いた、ＡＨＣ１株の代わりに、他の３０１０個のアミノ酸をコードする遺伝子型１ｂの株を用いて、実施例９の操作を繰り返し、実施例９と同様の結果を得た。但し、ＮＳ４Ｂタンパク質以外の適応変異を有するサブジェノミックレプリコンとしては、塩基数５３０８番目のＴがＣに変異して、３０１０個のＨＣＶポリプロテインの第１６５６番のアミノ酸がＶ（バリン）からＡ（アラニン）に変異したレプリコンと、その変異に加えて、塩基数６８４６番目のＡがＧに変異して、３０１０個のＨＣＶポリプロテインの第２１６９番のアミノ酸がＴ（チロシン）からＡ（アラニン）に変異したレプリコンが得られた。【００５４】
ＴＰＦ１株、ＡＨＣ１株、及び前記の遺伝子型１ｂの株から得られた実験結果から、以下のことが考えられる。第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするヌクレオチドを含む遺伝子型１ｂのレプリコンＲＮＡは、このヌクレオチドを含まないレプリコンＲＮＡと比較して、ＲＮＡの複製効率が上昇する。すなわち、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡは、この２つの適応変異を有することによって、ＲＮＡの複製効率が上昇する。
前記のＮＳ４Ｂタンパク質における２つの前記適応変異を有するレプリコンＲＮＡを用い、細胞にトランスフェクションすることによって、確実にレプリコン複製細胞を得ることができる。このレプリコン複製細胞から得られたレプリコンＲＮＡは、ＮＳ４Ｂタンパク質における２つの前記適応変異に加えて、他の１つ以上の適応変異が導入されていることがある。すなわち、ＮＳ４Ｂタンパク質における２つの前記適応変異に加えて、他の１つ以上の適応変異が導入されることにより、レプリコンＲＮＡの複製効率が上昇することもある。【００５５】
前記のＮＳ４Ｂタンパク質における２つの前記適応変異以外の適応変異としては、既知の適応変異及び未知の適応変異が含まれる。既知の適応変異としては、表１に示した変異が報告されている。
【表１】
2008136470.tif 000002
【実施例】
【００５６】
《実施例１：劇症Ｃ型肝炎ウイルス全長遺伝子の単離及び解析》
（Ａ）血清からのＲＮＡの抽出
劇症肝炎患者の急性期に採取した血清250μLより、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche
diagnostics corporation)を用い、メーカーの推奨する方法に従い、ＲＮＡを精製した。【００５７】
（Ｂ）ｃＤＮＡの合成及びＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
精製したＲＮＡにXR58Rプライマーを加え、SuperSucript II reverse transcriptase (Invitrogen社)により、メーカーの推奨する方法に従い、42℃、1時間逆転写反応を行わせ、cDNAを得た。得られた反応液にRNaseH（Invitrogen）を加え、37℃、30分反応させ、RNAを分解した。この反応液を、HC-LongA1プライマーと1b9405Rプライマー及びTakara LA Taq DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、9分間からなる30回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション（PCR）を行い、cDNAを増幅した。更に、得られた反応液の一部を、HC85FとHC9302Rプライマーを用いてPCRを行い、HCV cDNAを増幅した。【００５８】
（Ｃ）ｃＤＮＡのクローニング
増幅したＤＮＡ断片は、0.7%アガロースゲルを用い電気泳動によって分離し、QIAquick gel purification kit (QIAGEN社)を用い、メーカーの推奨する方法に従って、DNA断片を回収した。回収したDNA断片は、pGEM-T easyベクター（Promega社）と連結反応させ、そのプラスミドによりDH5α株を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択し、2YT培地を用いて培養した。培養した菌体からWizard Plus SV Miniprep DNA Purification Systemを用いプラスミドを精製した。【００５９】
（Ｄ）塩基配列の決定
HCV cDNAの塩基配列は、HCVの遺伝子型１ｂの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、決定した。CEQ
DTCS Quick Start Kit（ベックマン・コールター）を用い、メーカーの推奨する方法に従い、反応を行い、CEQ2000 XL DNA analysis system (Software version 4.0.0、ベックマン・コールター)により解析した。得られたデータをSequencher (Version 4.1.2、Gene Codes Corporation)により解析した。得られたHCVクローンをpTPF1-0193と命名した。【００６０】
（Ｅ）５’非翻訳領域のｃＤＮＡの取得と塩基配列の決定
更に、前記の（Ａ）の工程で得られたRNAより、5’RACE法により、5’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。5’RACE
System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version2.0 (Invitrogen社)のキットを用い、添付の指示書に従って、実施した。
cDNA合成のためのアンチセンスプライマーは、Chiba-asを使用した。SuperScript II Reverse
Transcriptase（Invitrogen）でcDNAを合成し、S.N.A.P columnで精製後、cDNAにTdT-tailing反応を行い、dCTPを付加した。キットに添付の5’RACE Abridged Anchorプライマー及びKY78プライマーでTakara LA Taq DNA polymerase（宝酒造）を用いて、１回目のPCRを行った。このPCR産物の一部を鋳型として、キットに添付のUTPプライマーとKM2プライマーで、Takara
LA Taq DNA polymerase（宝酒造）を用いて２回目のPCRを行い、PCR産物を得た。このPCR産物をpGEM-T
easyベクターにクローニングし、前記（Ｄ）の工程に従い、塩基配列を決定した。得られた配列番号1における第1位から第709位までを含むHCV
cDNAクローンをpTPF1-0007と命名した。【００６１】
（Ｆ）３’非翻訳領域のｃＤＮＡの取得と塩基配列の決定
前記の（Ａ）の工程で得られたRNAより、３’RACE法により、３’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。まず、患者のRNAにPoly(A) Tailing Kit（Ambion）を用いて、添付の指示書に従い、Poly(A)を付加した。XR58Rプライマーの代わりにdT-Adpプライマーを、1st  PCRのプライマーとして3UTR-1Fプライマー及びAdpプライマーを、２nd PCRのプライマーとしてXR58F及びAdpプライマーを用いた以外は、前記工程（Ｂ）〜（Ｄ）の操作を繰り返した。得られたHCV cDNAクローンを pTPF1-8994と命名した。【００６２】
得られたＨＣＶ株をTPF1株と命名した。TPF1株は、全長9594塩基のＨＣＶであり、その塩基配列を配列番号1に示した。得られたTPF1株のポリヌクレオチドは、その342番から9374番の間に、3010個の一つながりのアミノ酸をコードする翻訳領域を有するものであった。ＴＰＦ１株のポリプロテインのアミノ酸配列を配列番号2に示す。【００６３】
以下にクローニング及び塩基配列の決定に用いたプライマーを示す。
XR58R（配列番号１２）：5’-tcatgcggct cacggacctt tcacagctag-3’
HClongA1（配列番号１３）：5’-atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat-3’
1b9405R（配列番号１４）：5'-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3’
HC85F（配列番号１５）：5'-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3’
HC9302R（配列番号１６）：5’-tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t-3’
chiba-as（配列番号１７）：5'-tgcacggtct acgagacct-3’
KY78（配列番号１８）：5’-ctcgcaagca ccctatcagc cagt-3’
KM2（配列番号１９）：5’-aggcattgag cgggtttat-3’
dT-Adp（配列番号２０）：5’-ctagactcga gtcgacatcg tttttttttt
tttttttt-3’
3UTR-1F（配列番号２１）：5’-atcttagccc tagtcacggc-3’
Adp（配列番号２２）：5’-ctagactcga gtcgacatcg-3’
XR58F（配列番号２３）：5’-ctagctgtaa aggtccgtga gccgcatga-3’
M13 Primer M3（配列番号２４）：5’-gtaaaacgac ggccagt-3’
M13 Primer RV（配列番号２５）：5’-caggaaacag ctatgac-3’
104（配列番号２６）：5’-aggaagactt ccgagcggtc-3’
HC841S（配列番号２７）：5’-ggaacttgcc cggttgctct ttctctatct tc-3’
E1（配列番号２８）：5’-attccatggt ggggaactgg gctaa-3’
HC2069S（配列番号２９）：5’-taacaatacc ttgacctgcc ccacggactg-3’
HC2430S（配列番号３０）：5’-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtacgg-3’
HC2461AS（配列番号３１）：5’-gaccctacac cgtacaggta-3’
HC2769S（配列番号３２）：5’-ttggaccggg agatggctgc atcgtg-3’
HC3632F（配列番号３３）：5’-cacccaaatg tacaccaatg t-3’
HC3928S（配列番号３４）：5’-tacccgttga gtctatggaa ac-3’
HC4016AS（配列番号３５）：5’-cacttggaat gtctgcggta-3’
HC4498S（配列番号３６）：5’-agggggggag gcatctcatt ttctg-3’
HC4888F（配列番号３７）：5’-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta-3’
HC5381F（配列番号３８）：5’-ggtcattgtg ggcaggatca t-3’
HC5692S（配列番号３９）：5’-ctgcctggaa accccgcgat-3’
HC5858F（配列番号４０）：5’-tggcagcata ggccttggga aggt-3’
HC6315F（配列番号４１）：5’-aagacctggc tccagtccaa g-3’
5A-1（配列番号４２）：5’-ttccatgctc accgacccct c-3’
HC7090S（配列番号４３）：5’-gtggagtcag agaataaggt-3’
HC7743F（配列番号４４）：5’-cagaagaagg tcacctttgac-3’
HC8192S（配列番号４５）：5’-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3’
HC8939F（配列番号４６）：5’-ctacggggcc tgttactcca ttgaac-3’【００６４】
《実施例２：サブジェノミックＲＮＡレプリコンの作成》
Ｃ型肝炎ウイルスTPF1株の全長のポリヌクレオチドを、pBluescriptIISK(+)のT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入した（以下、pTPF1と称する）。【００６５】
次に、pTPF1の構造タンパク質をコードする領域と非構造タンパク質をコードする領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンリン酸転移酵素、NPT-II）及びEMCV-IRES（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）と入れ替えて、plasmid DNA pRepTPF1を構築した。この構築手順は、既報（Lohmann
et al., Science, (1999) 285, p.110-113）に従った。【００６６】
具体的にはまずpTPF1を制限酵素AgeI及びBsrGIで切断し、その切断部位に、pTPF1由来の5’UTRからCore領域におよぶ配列とpcDNA3.1(+)由来のネオマイシン耐性遺伝子とをPCR増幅により増幅し制限酵素AgeIとPmeIで切断した断片、及びEMCV-IRESからNS3領域におよぶ配列をPCR増幅により結合し制限酵素PmeI及びBsrGIで切断した断片を連結挿入した。このplasmid DNA pRepTPF1をXbaIで切断したものを鋳型に、Megascript T7 kit (Ambion)を用いてRNAを合成した。メーカーの推奨する方法にてRNAを精製した。【００６７】
ヒト肝がん細胞（Huh7、JCRB0403）はDulbecco’s
modified Eagle medium (D-MEM, IWAKI)に10%ウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ50 U/mL、50 μg/mLとなるように加えたものを培養液として、5%二酸化炭素付加、37℃で培養を行った。コンフルエントになる前の細胞をトリプシン、EDTA処理により培養皿から剥離させ、血清添加培地に再懸濁することによりトリプシンを不活化する。PBSで2回洗浄後、1.25% DMSOを添加したCytomix（120mM Potassium chloride、10mM Potassium phosphate、5mM Magnesium
chloride、25mM HEPES、0.15mM
Calcium chloride、2mMEGTA、pH7.6）に再懸濁し、ギャップ0.4 cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。【００６８】
適当量のRNAを細胞に加えた後、５分間氷上で十分冷却する。エレクトロポレーター（Bio-Rad）で、960uF、２５０Vにてパルスを加える。直ちに8mLの培地に再懸濁し、一部をプレートに播く。一定時間培養した後、培養プレートにG418（ネオマイシン）を1mg/mLの濃度で添加した。その後、4日間隔で培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から約20日間培養後の培養プレートから生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、pRepTPF1レプリコンRNAが自律複製している細胞を樹立することができた。レプリコンRNA複製の有無は、細胞性RNAに含まれる複製レプリコンRNAのコピー数を、定量的RT-PCR法にて解析した。【００６９】
マイナス鎖の定量方法
レプリコンRNAの自律複製が起こっていることは、細胞中にHCV RNAの5’UTR領域のマイナス鎖が検出できるか否かで調べた。マイナス鎖の特異的な定量法は特願平08−187097号公報に記載のマイナス鎖RNAの特異的検出法と同様の方法で行った。
pRepTPF-1を鋳型にin vitroで合成したRNAをエレクトロポレーションで導入した細胞から、有意な量のマイナス鎖が検出でき、細胞内においてレプリコンRNAが自律的に複製していることが確認された。【００７０】
《実施例３：適応変異の解析》
実施例２に従って、pRepTPF1を鋳型にin vitroで合成したRNAをHuh7細胞へトランスフェクションすることで樹立したレプリコンRNA複製細胞株から、ISOGEN（日本ジーン）を用いて、メーカーの推奨する条件に従い細胞内RNAを抽出した。【００７１】
この細胞内RNAから実施例1でTPF1より遺伝子を取得したのと同様の手順で、レプリコンRNAのほぼ全領域にわたるDNAを増幅した。具体的には、抽出した細胞内RNAを鋳型としてSuperSucript II reverse
transcriptase (Invitrogen)とXR58RプライマーとによりレプリコンRNAに対するcDNAを合成した。【００７２】
このcDNAの一部を用い、EMCV-S1プライマー：5’-tgcacatgct
ctacatgtgt ttagtcgagg-3’（配列番号６０）とHC9405Rプライマーの存在下で、Takara LA Taq DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、6分間からなる30回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション（PCR）を行うことにより、HCV cDNAの増幅を行った。pGEM-T easyベクターにクローニングしたクローンの配列を決定したところ、塩基数5752番目のＡがＴ、6237番目のGがAへの置換が認められた。その結果、配列番号2のアミノ酸番号1804に相当するアミノ酸がQ（グルタミン）からL（ロイシン）、アミノ酸番号1966に相当するアミノ酸がE（グルタミン酸）からK（リジン）へそれぞれ変異した。【００７３】
次に、前記のアミノ酸置換がレプリコンRNAの複製に及ぼす影響について検討した。まず、実施例2において作製したHCV RNAレプリコン pRepTPF1にアミノ酸番号1804（QからLへ）及びアミノ酸番号1906（EからKへ）の適応変異をQuick
Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いメーカーの推奨する方法に従い、導入した。このアミノ酸置換を導入したレプリコンRNAをpRep4Bと命名した。【００７４】
変異を引き起こす塩基配列を有しないpRepTPF1及びアミノ酸変異を有するpRep4Bのplasmid DNAをXbaIで切断したものを鋳型に、Megascript T7 kit (Ambion)を用いてRNAを合成した。メーカーの推奨する方法にてRNAを精製した。精製したそれぞれのRNAをHuh7細胞にトランスフェクションし、G418存在下で約20日間培養を行いクリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されたコロニー数を計測し、トランスフェクションしたレプリコンRNA量1μg当りのコロニー数を計算した。【００７５】
RepTPF1 RNA 1μgをトランスフェクションした場合には1個のG418耐性コロニーが選択され、Rep4B RNA 1μgをトランスフェクションした場合には104個のコロニーが選択された。つまり、レプリコンRNAにおけるアミノ酸変異を引き起こす塩基変異は、Huh7細胞においてレプリコンRNAの複製効率を増大させる適応変異であると考えられた。【００７６】
《実施例４：HCV RNAの複製に対する適応変異の効果》
実施例２において作成した完全長HCV
DNA pTPF1を制限酵素SfiIで切断し、その切断部位に、pRep4Bを制限酵素SfiIで切断した断片を連結挿入することで、適応変異が挿入された完全長HCV DNA
pTPF1/4Bを作成した。【００７７】
この適応変異が挿入されたpTPF1/4Bより合成された完全長HCV RNAのHuh7細胞における複製効率をpTPF1の場合と比較した。具体的には実施例２と同様の方法を用い、完全長HCV RNAをin vitroで合成し、Huh7細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションを行った細胞は、直ちに10mLの培地に再懸濁し、12 wellプレートに（直径22.1mm）に1mLずつ播き培養を開始した。4時間、24時間、48時間及び72時間に培養上清を回収した。回収した培養上清は、2krpmで10分間遠心し上清を回収した。上清100μLをHCVコア抗原のキット（富士レビオ、ルミパルス）を使用し測定した。【００７８】
図１に示すように、適応変異を導入したpTPF1/4Bの上清中におけるコア抗原の測定値は、いずれのポイントにおいても、適応変異を持たない対照のpTPF1の場合より高かった。このことは本発明の適応変異を完全長HCV RNAレプリコンに導入することにより、細胞内において高効率に複製し、コア蛋白質を上清中に分泌していることを示している。肝臓で複製している構造と同じ全長型ゲノムが、in-vitroで複製可能であることを示したものである。
特に、本発明のＴＰＦ１−ＮＳ４Ｂポリペプチドにおいて、前記の適応変異を有するＴＰＦ１−変異ＮＳ４Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、レプリコンＲＮＡに用いることにより、ＲＮＡの複製効率が上昇したものと考えられる。【００７９】
《実施例５：再感染可能なHCV粒子の構築》
実施例４において培養上清中に分泌されたコア抗原がウイルス粒子を形成し、in vitroにおいて再感染可能か検討した。具体的には、pTPF1/FL4Bより合成された完全長HCV RNAをHuh7細胞にトランスフェクションし、72時間培養を行った後に培養上清を回収した。回収した培養上清は2krpmで10分間遠心後、フィルター濾過（0.45μm、Millipore）を行い破砕した細胞等を除去した。【００８０】
フィルター濾過を行った上清は、12
wellプレート（直径22.1μm）に培養したHuh7細胞と3時間、4℃の低温条件下で反応させた。反応後、5%二酸化炭素付加、37℃のインキュベーター内に移し培養を行った。4時間、24時間、48時間、72時間及び96時間に細胞を１ｍＭEDTA-PBSで剥離し遠心分離にて回収した。細胞ペレットを50μL RIPA緩衝液（20mM
Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mMEDTA, 1%NP40, 0.1%Deoxycholate, 0.1%SDS
complete protease inhibitor cocktail (Roche diagnostics corporation)）に溶解し、10krpmで5分間遠心により上清を回収した。上清5μLをHCVコア抗原のキット（富士レビオ、ルミパルス）を使用し測定した。【００８１】
図２に示すように、pTPF1/4Bの培養上清を処理した細胞内のコア抗原は4時間から24時間にかけていったん減少した後、48時間から上昇し、96時間後も増加していた。このことは本発明の完全長HCV RNAが細胞中で複製し放出された培養上清中には、新たなHuh7細胞に感染可能なウイルス粒子が含まれることを示している。【００８２】
《実施例６：インターフェロン感受性の急性肝炎患者からのＣ型肝炎ウイルス全長遺伝子の取得》
インターフェロン治療で奏効を示した急性肝炎患者の血清からＣ型肝炎ウイルス全長遺伝子の取得を試みた。患者血清からRNAの抽出試薬であるISOGEN-LS（日本ジーン）を用い、添付の指示書に従ってRNAを抽出した。【００８３】
このRNAから実施例1でTPF1より全長遺伝子を取得したのと同様の手法を用い、第85位から第9302位までの、HCV遺伝子を取得した。pGEM-T easyベクターにクローニングし、配列を決定したところ、遺伝子型1bに属する典型的な全長遺伝子であった。【００８４】
続いて、3’非翻訳領域の核酸配列を決定した。抽出したRNA2.5μLにプライマー8913Fを5 pmole(0.5μL)加え、70℃で３分間保持し、氷中で急冷した。これに５ｘFirst-Strand Buffer ２μL、0.1M DTT １μL、20mM
dNTP 0.5μL、RNase Inhibitor(宝酒造) 20units、SuperSucript II reverse
transcriptase (Invitrogen) 0.5μLを加え、全量で10μLになるようにジエチルピロカーボネイト処理した滅菌水を加えた。この混合液を42℃、60分反応させた。RNAを破壊するため、RNaseH（宝酒造、60U/μL）を12U加え、37℃で30分保持し、その後７２℃、３分で失活させ、cDNAとして用いた。【００８５】
このcDNA、2μLをプライマー8913F及びRP2を用いて前記と同様の方法でPCRを行った。このPCRの産物の一部を用い、8939FとR1のプライマーで2回目のPCRを行い、約600baseのPCR産物を得た。このPCR産物をpGEM-T
Easy ベクターにクローニングし配列を決定した。【００８６】
一方HCV cDNAの5’末端は、以下のように単離し配列を決定した。前述のRNaseHで処理したcDNA反応液の一部を、HCLongH1及びHC705Rと、Takara EX Taq DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、20秒、55℃、30秒、72℃、1分からなるサーマルサイクルを35回繰り返すPCRにより、既に報告されているHCV cDNAの第1位から709位に相当する断片を増幅させた。このPCR産物をpGEM-T easyベクターにクローニングし、配列を決定した。【００８７】
以上により、全ウイルスゲノム配列を取得し、これをAHC1株と命名した。得られたAHC1株は、全長9594塩基長であり、決定された全ウイルスゲノムの塩基配列は、その342番から9374番の間に、3010個の一つながりのアミノ酸をコードする翻訳領域を有するものであった。その塩基配列を配列番号１０に、アミノ酸配列を配列番号１１に示した。【００８８】
以下にクローニング及び遺伝子解析に用いたプライマーを示す。
XR58R（配列番号１２）：5’-tcatgcggct cacggacctt tcacagctag-3’
HClongA1（配列番号１３）：5’-atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat-3’
1b9405R（配列番号１４）：5'-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3’
HC85F（配列番号１５）：5'-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3’
HC9302R（配列番号１６）：5’-tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t-3’
HC8913F（配列番号４７）：5’-cttgaaaaag ccctggattg tcagat-3’
HC8939F（配列番号４６）：5’-ctacggggcc tgttactcca ttgaac-3’
R1（配列番号４８）：5’-acatgatctg cagagaggcc agtatcagca ctctc-3
HClongH1（配列番号４９）：5'-gccagccccc tgatgggggc gacactccac c-3’
HC705R（配列番号５０）：5'-agccgcatgt aagggtatcg atgac-3’’
RP2（配列番号５１）：5’-acatgatctg cagagaggcc-3’
M13PrimerM3（配列番号２４）：5’-gtaaaacgac ggccagt-3’
M13PrimerRV（配列番号２５）：5’-caggaaacag ctatgac-3’
HC161S（配列番号５２）：5’-gagtacaccggaattgccaggacgaccggg-3’
104（配列番号２６）：5’-aggaagactt ccgagcggtc-3’
HC841S（配列番号２７）：5’-ggaacttgcc cggttgctct ttctctatct tc-3’
HC1405S（配列番号５３）：5’-attccatggt ggggaactgg gccaa-3’
E1（配列番号２８）：5’-attccatggt ggggaactgg gctaa-3’
HC2006AS（配列番号５４）：5’-catccatgtg cagccgaacc aatt-3’
HC2199AS（配列番号５５）：5’-aggggtagtg ccaaagcctg tatgggtagt-3’
HC2430S（配列番号３０）：5’-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtacgg-3’
HC2769S（配列番号３２）：5’-ttggaccggg agatggctgc atcgtg-3’ 
HC3111AS（配列番号５６）：5’-ataatgaccc ccggcgactt tccgcactaa c-3’
HC3591AS（配列番号５７）：5’-catggtagac agtccagcac-3’
HC4016AS（配列番号３５）：5’-cacttggaat gtctgcggta-3’
HC4498S（配列番号３６）：5’-agggggggag gcatctcatt ttctg-3’
HC4888F（配列番号３７）：5’-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta-3’
1b5290AS（配列番号５８）：5’-gacatgcatg tcatgatgta tttg-3’
HC5950AS（配列番号５９）：5’-ctcatgacct taaaggccac-3’
HC5858F（配列番号４０）：5’-tggcagcata ggccttggga aggt-3’
HC6315F（配列番号４１）：5’-aagacctggc tccagtccaa g-3’
5A-1（配列番号４２）：5’-ttccatgctc accgacccct c-3’
HC7090AS（配列番号４３）：5’-accttattct ctgactccac-3’
HC7743F（配列番号４４）：5’-cagaagaagg tcacctttgac-3’
HC8192S（配列番号４５）：5’-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3’【００８９】
《実施例７：インターフェロンによるHCV
RNAレプリコン複製阻害》
インターフェロンのHCV複製阻害作用を完全長HCV RNAレプリコンを用い評価を試みた。インターフェロンの阻害作用の評価に使用した完全長HCV RNAは、実施例4においてHuh7細胞において高効率に複製可能なpTPF1/4B、及び実施例6において取得したAHC1とpTPF1/4Bのキメラ体を用いた。キメラベクターは完全長HCV DNA pTPF1を制限酵素AgeIとBsrGIで切断し、その切断部位に、ＡＨＣ１を制限酵素AgeIとBsrGIで切断した断片を連結挿入することで、AHC1の構造蛋白質領域が挿入されたHCV DNA pTPF1/AHC1_AgeBsrを作成した。【００９０】
実施例2と同様の方法を用いてpTPF1/4B及びpTPF1/AHC1_AgeBsrの完全長HCV RNAを合成し、Huh7細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションを行った細胞は、直ちに15mLの培地に再懸濁し、12 wellプレートに（直径22.1mm）に1mLずつ播き培養を開始した。【００９１】
培養開始24時間後、様々な濃度（0.1IU/mLから300IU/mL）のインターフェロンを溶解した培地と交換した。更に24時間培養後、細胞を１ｍＭEDTA-PBSで剥離し遠心分離にて回収した。細胞ペレットを50μL RIPA緩衝液（20mM
Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mMEDTA, 1%NP40, 0.1%Deoxycholate, 0.1%SDS
complete protease inhibitor cocktail (Roche diagnostics corporation)）に溶解し、10krpmで5分間遠心により上清を回収した。上清5μLをHCVコア抗原のキット（富士レビオ、ルミパルス）を使用し測定した。【００９２】
細胞内におけるコア抗原量をコントロール（インターフェロン無添加区）に対して、50%のコア抗原量を示すインターフェロン濃度をプロットにより算出し、IC50とした。結果は表２に示した。
【表２】
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【００９３】
前記試験の結果より、pTPF1/4Bがインターフェロン抵抗性であり、一方のpTPF1/AHC1_AgeBsrがインターフェロン感受性であることが示された。このことは本発明の完全長HCV RNAレプリコンは、インターフェロン抵抗性のＲＮＡレプリコンであり、インターフェロン抵抗性を示すＣ型肝炎ウイルスの治療薬開発に有用であると考えられる。【００９４】
《実施例８：シクロスポリンAによるHCV RNAレプリコン複製阻害》
シクロスポリンAのHCV RNAレプリコン複製に対する阻害作用の評価を試みた。評価にはpTPF1/4Bを使用した。実施例2と同様の方法を用いてHuh7細胞にトランスフェクションを行い、12 wellプレートに播種した。4時間培養後、シクロスポリンA 1μgを溶解した培地と交換した。【００９５】
シクロスポリンA含有培地と交換後、24時間、48時間及び72時間培養後の細胞を実施例7と同様の方法を用いて細胞内のHCVコア抗原量をHCVコア抗原のキット（富士レビオ、ルミパルス）を使用し測定した。【００９６】
図3に示すように、シクロスポリンA（CsA）添加区はトランスフェクション後4時間を最大とし、その後減少していることを確認した。一方、コントロール（CsA無添加区）は4時間から24時間にかけていったん減少した後、48時間から上昇し、72時間後も増加することを確認した。よってＣｓＡは抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有することが確認された。このことは本発明の完全長HCV RNAは、これまでに報告されているＣ型肝炎治療薬の試験系（スクリーニング方法）として利用できることを示している。更にHCVの複製及び/又はHCV蛋白質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用可能である。【００９７】
《実施例９：ＴＰＦ１株のＮＳ４Ｂタンパク質における適応変異の効果》
ＴＰＦ１株を用いたＲＮＡレプリコンで得られたＮＳ４Ｂタンパク質における２つのアミノ酸の適応変異が、他の遺伝子型１ｂのＨＣＶ遺伝子におけるレプリコンＲＮＡの複製に与える影響を検討した。
実施例６で得られたＡＨＣ１株の３０１０個のアミノ酸のＮＳ４Ｂ領域のタンパク質に適応変異が導入されるように、ヌクレオチドに変異を導入した。具体的には、Quick Mutagenesis Kit (Stratagene)を用い、メーカーの推奨する方法に従い、第１８０４番のアミノ酸をＱ（グルタミン）からＬ（ロイシン）へ、第１９６６番のアミノ酸をＥ（グルタミン酸）からＫ（リジン）へ変異させるためのヌクレオチドの変異を導入した。得られたクローンのＲＮＡの塩基配列を配列番号６１に、アミノ酸配列を配列番号６２に示す。【００９８】
得られた変異が導入された適応変異ＡＨＣ１株の全長のポリヌクレオチドを用いたことを除いては、実施例２の操作を繰り返し、適応変異を有するプラスミドＤＮＡ  ｐＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂを取得した。このｐＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂを制限酵素ＸｂａＩで切断したものを鋳型として、ＲｅｐＡＨＣ１／４ＢレプリコンＲＮＡを取得し、ヒト肝がん細胞（Huh7、JCRB0403）にトランスフェクションし、ＲｅｐＡＨＣ１／４ＢレプリコンＲＮＡが自律複製している細胞株を樹立した。
コントロールとして、適応変異が導入されていないＡＨＣ１株の全長のポリヌクレオチドを用いて同じ操作を繰り返した場合は、レプリコンＲＮＡが自律複製している細胞株は樹立できたが、ＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂレプリコンの約1000分の１の効率であった。従って、遺伝子型１ｂのＨＣＶ遺伝子に、ＮＳ４ｂタンパク質の２つの適応変異をコードするヌクレオチドの変異を導入することにより、レプリコンＲＮＡが効率的に自律複製することがわかった。【００９９】
次に、得られた細胞株を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返し、複製したレプリコンＲＮＡのヌクレオチド配列を決定した。その結果、塩基数３６８５番目のＣがＴに変異しており、配列番号１１のアミノ酸番号１１１５に相当するアミノ酸がＰ（プロリン）からＬ（ロイシン）に変異していた。この変異を前記ｐＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂに導入し、プラスミドｐＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂｍを得た。ｐＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂから得られたレプリコンＲＮＡであるＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂと、ｐＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂｍから得られたレプリコンＲＮＡであるＲｅｐＡＨＣ１／４ＢｍをＨｕｈ７にトランスフェクションして、得られたコロニー数を計算した。ＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂの塩基配列を配列番号６７に、ＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂｍの塩基配列を配列番号６８に示す。
ＲｅｐＡＨＣ１／４ＢのＲＮＡ  １μｇをトランスフェクションした場合には約１０Ｅ３個のＧ４１８耐性コロニーが選択され、ＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂｍ  ＲＮＡ  １μｇをトランスフェクションした場合には約１０Ｅ６個のコロニーが選択された。従って、ＮＳ４Ｂタンパク質における２つの前記適応変異に加えて、他の１つ以上の適応変異が導入されることにより、レプリコンＲＮＡの複製効率が上昇することがわかった。【０１００】
次に、完全長のＨＣＶ  ＤＮＡとして、ｐＴＰＦ１の代わりにｐＡＨＣ１を用いたこと、及びｐＲｅｐ４Ｂの代わりにｐＲｅｐＡＨＣ１／４Ｂｍを用いたことを除いては、実施例４の操作を繰り返し、完全長のＨＣＶ  ＤＮＡであるｐＡＨＣ１およびｐＡＨＣ１／４Ｂｍを作製し、ｐＡＨＣ１から作製したレプリコンＲＮＡであるＡＨＣ１、及びｐＡＨＣ１／４Ｂｍから作製したレプリコンＲＮＡであるＡＨＣ１／４ＢｍのＨｕｈ７細胞へのトランスフェクション後の培養上清中のコア抗原の量を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すように、適応変異を有するＡＨＣ１／４ＢｍのレプリコンＲＮＡをトランスフェクションした細胞の２４時間、４８時間、及び７２時間後の培養上清中のコア抗原の測定値は、対照のＡＨＣ１をトランスフェクションした細胞の培養上清中のコア抗原の測定値より高かった。なお、レプリコンＲＮＡであるＡＨＣ１／４Ｂｍの塩基配列を配列番号６３に、コードされているアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明のレプリコンＲＮＡは、細胞内に導入することによって、自律的に複製し、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質、及び感染性粒子を産生することができる。このレプリコンＲＮＡが導入されたレプリコン複製細胞は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の試験管内モデルとして、生体内におけるＨＣＶの増殖機構を反映しており、このレプリコン複製細胞を、ＨＣＶの治療薬のスクリーニング方法に用いることが可能である。更に、前記スクリーニング方法は、ＨＣＶの治療薬のスクリーニング以外にも、治療薬の製造の工程において品質管理のために用いることができ、医薬品の製造方法として利用することが可能である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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