(57)【要約】より新規な軸索再生促進剤を提供することを目的とし、配列表における配列番号１乃至４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＧＭａタンパク質の軸索成長阻害活性を中和する機能を有するペプチドを有効成分として含有する軸索再生促進剤とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）乃至（ｄ）の少なくともいずれかのペプチドを有効成分として含有する軸索再生促進剤。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｅ）配列番号１乃至４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＧＭａタンパク質の軸索成長阻害活性を中和する機能を有するペプチド
【請求項２】
前記軸索は、中枢神経系の軸索である請求項１記載の軸索再生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞、特に、中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄等の中枢神経が交通事故や脳血管障害等により損傷を受けるとしばしば部分的又は完全な麻痺が起きる。ところが神経機能は失われたまま再生することはできない。これは末梢神経が再生するのと対照的である。したがって、損傷した中枢神経を再生させることは医療分野において重要な課題である。【０００３】
一方、中枢神経が成人の中枢神経の軸索が末梢神経のグラフトを介して再生し得るという報告がある（例えば下記非特許文献１参照）。したがって、成人の中枢神経が再生しない主な原因は、神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆されており、これまでに、中枢神経の再生を阻害する主な阻害物質として、Ｎｏｇｏ、ミエリン結合糖タンパク質（以下「ＭＡＧ」という。）及び乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（以下「ＯＭｇｐ」という。）が同定されている（これらについては例えば下記非特許文献２乃至４参照）。【０００４】
また一方で、本発明者らはこれまでにＲｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（以下「ＲＧＭ」という。）が軸索成長を阻害することを明らかにし、ＲＧＭに対するポリクロ−ナル抗体がＲＧＭの軸索成長阻害活性の中和活性を有することを見いだした（例えば下記特許文献１及び非特許文献５参照）。ＲＧＭはニワトリ胎児において網膜蓋体の突起の形成に関与するタンパク質として最初に同定され、ＲＧＭにより発生期の視神経軸索の反発がおこること（下記非特許文献６及び７参照）、ラットにおいて脊髄が損傷するとこのタンパク質の発現が増大すること（下記非特許文献８参照）、ヒトにおいて脳虚血部位や脳外傷の部位で発現が増大すること（下記非特許文献９参照）が報告されている。【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０８７２６８号パンフレット
【非特許文献１】Ｓ．Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１４、９３１−９３３、１９８１
【非特許文献２】Ｍ．Ｓ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、４３４−４３９、２０００
【非特許文献３】Ｇ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ、１３、７５７−７６７、１９９４
【非特許文献４】Ｖ．Ｋｏｔｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、８２、１５６６−１５６９、２００２
【非特許文献５】Ｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１７３（１）、４７−５８、２００５
【非特許文献６】Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．、６（１１）、１４９７、１９９６
【非特許文献７】Ｍｏｎｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４１９（６９０５）、３９２、２００２
【非特許文献８】Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２１、１５６９−１５７６、２００５
【非特許文献９】Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、６２、１５６１−１５６８、２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記ＲＧＭに対するポリクロ−ナル抗体は軸索再生促進剤として有用であるものの、治療において局所的に投与せざるを得ないといった制限もあり、より新規な軸索再生促進剤を見出すことが望まれている。【０００７】
そこで本発明は、上記課題を解決する新規な軸索再生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題につき鋭意検討を行っていたところ、ＲＧＭタンパク質のアミノ酸配列に由来する部分的なペプチドがＲＧＭの効果を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、上記課題を解決する一手段に係る軸索再生促進剤は、以下（ａ）乃至（ｄ）の少なくともいずれかのペプチドを有効成分として含有する。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｅ）配列番号１乃至４のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＧＭａタンパク質の軸索成長阻害活性を中和する機能を有するペプチド【０００９】
ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒトのＲＧＭａタンパク質のアミノ酸配列の一部に相当するものであり、より具体的にはヒトのＲＧＭａタンパク質の第２４３番目から第２５６番目のアミノ酸配列に相当する。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列も上記配列番号１に記載のアミノ酸配列と同様、ヒトのＲＧＭａタンパク質のアミノ酸配列の一部に相当するものであり、より具体的には第３２６番目から第３４１番目のアミノ酸配列に相当する。なお配列番号５に、ヒトのＲＧＭａタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号６にそのＤＮＡの塩基配列を示しておく。【００１０】
ここで、配列番号３に記載のアミノ酸配列は、ラットのＲＧＭａタンパク質のアミノ酸配列の一部に相当するものであり、より具体的にはラットのＲＧＭａタンパク質の第２４３番目から第２５６番目のアミノ酸配列に相当する。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列も上記配列番号３に記載のアミノ酸配列と同様、ラットのＲＧＭａタンパク質のアミノ酸配列の一部に相当するものであり、より具体的には第３２６番目から第３４１番目のアミノ酸配列に相当する。なお配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドはいずれもラットのものであるが、ＲＧＭタンパク質についてはラットとヒトとの間で高度に保存されたものであるため、ヒトの軸索再生促進剤として効果を発揮することができる。なお配列番号７に、ラットのＲＧＭａタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号８にそのＤＮＡの塩基配列を示しておく。【００１１】
また、本手段において、限定されるわけではないが、軸索は中枢神経系の軸索であることが好ましい。ここで、「中枢神経系」とは脳及び脊髄をいい、限定されるわけではないが、例えば皮質脊髄路の神経、脊髄視床路の神経が該当する。
【発明の効果】
【００１２】
以上により、新規な軸索再生促進剤を提供することができる。本軸索再生促進剤は特に、中枢神経系の軸索の再生に有効である。この結果、脊髄等の中枢神経系に損傷を受けた患者の治療に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本実施形態に係る軸索再生促進剤（以下「本軸索再生促進剤」という。）は、以下の（ａ）乃至（ｄ）の少なくともいずれかのペプチドを含有することを特徴の一つとする。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド【００１４】
本軸索再生促進剤は、ＲＧＭａタンパク質の一部を有するペプチドを有効成分としており、これによりニュ−ロンにおけるＲＧＭａタンパク質の軸索成長阻害活性を中和することが可能であり、軸索の再生を促進することができる。即ち、本軸索再生促進剤は、中枢神経系を損傷した患者を治療するための医薬組成物として有用である。【００１５】
本軸索再生促進剤におけるペプチドは、上記の作用効果を奏する限りにおいて限定されず、配列番号１乃至４に記載されたアミノ酸配列からなるペプチド以外に、これらのアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させたアミノ酸配列からなるペプチドも採用可能である。なお、限定されるわけではないが、例えば置換としては、上記の作用効果が失われない程度の化学的な修飾が施されたアミノ酸への置換、ポリマ−や糖鎖が付加されたアミノ酸への置換が挙げられる。また、限定されるわけではないが、付加としては、例えば配列番号１乃至４に記載のペプチドのＮ末端側又はＣ末端側の少なくとも一方に、製剤化を容易にするアミノ酸、融合タンパク質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸、ペプチドの製造及び生成に便利なアミノ酸、を１個又は数個付加することが挙げられる。【００１６】
本軸索再生促進剤は、上記記載のペプチドの他、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤（例えば蒸留水）、ｐＨ緩衝剤（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合剤成分を含有することができる。【００１７】
本軸索再生促進剤は、その使用形態に応じて、例えば、経口的に又は非経口的に投与することができる。経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁液、油剤、乳化剤等の投与形態を採用することができる。非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば上記の液剤、懸濁液等にしたものを直接損傷部位に投与する方法、注射等により投与する形態を採用することができる。【００１８】
本軸索再生促進剤の投与量は、患者の体重、性別、神経損傷の程度、投与の方法に応じて適宜選択されうるが、例えば非経口投与であって、損傷部位に直接投与する場合、例えば成人１日、１損傷部位あたり上記ペプチドが１ｍｇ以上１００ｍｇ以下の範囲で含まれていることが好ましく、より好ましくは５ｍｇ以上５０ｍｇ以下である。なお、これ以外の非経口投与の場合、例えば注射の場合、この１０倍程度であることが好ましい。【００１９】
また、本軸索再生促進剤に係るペプチドは、限定されることなく周知の方法により作成することができる。例えば、通常の化学的合成法、タンパク分子の酵素的分解法、遺伝子組換技術等により製造することができる。【００２０】
通常の化学的合成法としては、限定されるわけではないが、例えば、ペプチド合成機を使用した固相合成法を好ましく用いることができる。また、限定されるわけではないがこの方法により得たペプチドに対しては精製を行うことが好ましく、限定されるわけではないが、周知の精製方法、例えば、塩析法、限外ろ過法、逆相クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を好ましく用いることができる。【００２１】
遺伝子組換技術としては、限定されるわけではないが、例えば、目的とするアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換し、この形質転換された微生物や動物細胞を培養することによって目的のアミノ酸配列からなるペプチドを得る技術が採用できる。なお、ここで用いられる発現ベクターとしては、限定されることなく周知のものを採用することができ、例えばプラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。また、限定されるわけではないがこの方法により得たペプチドに対しては精製を行うことが好ましく、例えば、培養した培地から細胞抽出液又は培養上清を回収し、上記した精製法を用いることが好ましい。【００２２】
（実験例）
本軸索再生促進剤の効果について実験を行い確認した。以下説明する。もちろん、本発明が以下に示す実験例に狭く限定されるものではないことは言うまでもない。【００２３】
（１）ペプチドの合成
Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）により以下に示すアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。
【表１】
2008038599.tif 000003
【００２４】
（２）ＲＧＭａ−ＣＨＯ細胞の生成
次に、Ｆｌｐ−ＩｎＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、かつ、この製造元の指針に従い、ＲＧＭａ発現細胞を作成した。２種類の制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＳｅｃＴａｇ２ベクターからシグナルペプチドを含むＨＡ−ＲＧＭａフラグメントを調製し、これをｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションした。このコンストラクト（ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ／Ｉｇκｌｅａｄｅｒ／ＨＡ／ＲＧＭａ）およびｐＯＧ４４をＦｌｐ−ｉｎＣＨＯ細胞にコトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢ（５００μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地で２週間増殖させた後、ＨＡ−ＲＧＭａを安定に発現する細胞（以下「ＲＧＭａ−ＣＨＯ細胞」という。）を得た。なお、ＨＡ−ＲＧＭａの発現はウエスタンブロットおよび免疫細胞化学を用いて免疫的に検出することにより確認した。【００２５】
（３）軸索成長アッセイ
出生後７−９日（Ｐ７−９）の仔ラットからの小脳顆粒細胞をトリプシン処理（ＰＢＳ中０．２５％トリプシン、３７℃、１５分間）により分離し、血清含有培地に再懸濁し、粉砕し、ＰＢＳで３回洗浄した。チャンバースライド（Ｌａｂ  Ｔｅｋ  ＩＩ；Ｎｕｎｃ）中のＲＧＭａ−ＣＨＯ細胞又は対象ＣＨＯ細胞のコンフルエント単層上にニューロンを播種した。中和アッセイのためにＰｅｐ１またはＰｅｐ２をそれぞれ示される濃度（１μＭ、４μＭ、１０μＭ）で培養物に加えた。培養物を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間成長させた。次に、細胞を４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドで固定し、ニューロン特異的βチューブリンＩＩＩ蛋白質を認識するモノクローナル抗体（ＴｕＪ１）（１：１０００；Ｃｏｖａｎｃｅ）を用いて免疫染色した。次に、各βチューブリンＩＩＩポジティブのニューロンについて、最長の神経突起の長さを測定した。【００２６】
この結果を図１に示す。なお図中“ｃｏｎｔｒｏｌ”は対象ＣＨＯ細胞の場合、“ＲＧＭ−”はＲＧＭタンパク質が発現している場合（以下「ＲＧＭ−ＣＨＯ細胞」という。）、“ｐｅｐ１  １μＭ”はｐｅｐ１を１μＭ加えた場合、“ｐｅｐ１  ４μＭ”はｐｅｐ１を４μＭ加えた場合、“ｐｅｐ１  １０μＭ”はｐｅｐ１を１０μＭ加えた場合、“ｐｅｐ２  １μＭ”はｐｅｐ２を１μＭ加えた場合、“ｐｅｐ２  ４μＭ”はｐｅｐ２を４μＭ加えた場合、“ｐｅｐ２  １０μＭ”はｐｅｐ２を１μＭ加えた場合、をそれぞれ示している。なお、縦軸はニューロンあたりの最長の神経突起の平均長さで表され、データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。【００２７】
図１に示されるように、Ｐｅｐ１及びＰｅｐ２は、用量依存的にＲＧＭａの阻害効果を有意に逆転させることができる。このことは、これらのペプチドがインビトロでＲＧＭａに対して中和試薬として機能していることを示しており、これらペプチドを有効成分とすることで軸索成長促進剤として利用可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明に係る軸索再生促進剤は、中枢神経系を損傷した患者のための治療剤として産業上の利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は，本発明のペプチドによるＲＧＭａタンパク質の阻害効果を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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