【手続補正書】
【提出日】平成16年3月4日(2004.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NRRL Y-27328として識別されるメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)種の酵母の生物学的に純粋な培養物であって、生物学的に有効量の当該培養物が適用される植物の一部上の有害な微生物の増殖を競合阻害することができる培養物。
【請求項２】
請求項１に記載の生物学的に純粋な培養物の識別特性の全てを有するメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の生物学的に純粋な菌株。
【請求項３】
請求項１に記載の生物学的に純粋な培養物の識別特性の全てを有する、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の生物学的に純粋な変異体。
【請求項４】
前記有害微生物が、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea), アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger), ペニシリウム・ディジタツム(Penicillium digitatum), ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum), ゲオトリチュム・カンジダム(Geotrichum candidum), リゾプス・ストロニファー(Rhizopus stolonifer), フサリウム種(Fusarium spp.)及びモリニリア種(Molinilia spp.)から成る群から選択される、請求項１に記載のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)種の酵母。
【請求項５】
前記植物の一部が、石果類の果実、ナシ状果の果実、柑橘類の果実、ブドウ、ベリー、野菜及びハーブから成る群から選択される、請求項１に記載のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)種の酵母。
【請求項６】
活性成分として、生物学的に有効量の生物学的に純粋な酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)を含んで成る、農産物の保護における使用のための組成物であって、更に担体を含む組成物。
【請求項７】
前記酵母が、活動期及び休眠からなる群から選択される生理学的状態で供給される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記酵母が、液状懸濁液、乳濁液、粉末、顆粒、凍結乾燥物及びゲルから成る群から選択される物理学的形状で供給される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
更に化学的抗生物質を含んで成る、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化学的抗生物質が、殺菌剤、抗菌剤及び殺虫剤から成る群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記殺菌剤が、イプロジオン、チアベンゾダール、イマザリル(1-(2-2, 4-ジクロロフェニル)-2 (2-プロペニルオキシ-エチル)-1Hイミダゾール)、 フェンヘキサミド、ピリメサミル(Pyrimethamil)及びフルジオキソニル(Fludioxonyl)とシプロジニルの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの化学物質を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
植物の一部の上の有害微生物の増殖を阻害する方法であって、少なくとも１回、農業的に有効量の生物学的に純粋なメツシュニコウィア (Metschnikowia)属の酵母の培養物を植物の一部に適用することを含む方法。
【請求項１３】
前記メツシュニコウィア(Metschnikowia)属の酵母が、NRRL Y-27328として識別されるメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)種の識別特性の全てを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記メツシュニコウィア(Metschnikowia)属の酵母が、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の識別特性の全てを有する、請求項１３に記載のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の菌株を含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記メツシュニコウィア(Metschnikowia)属の酵母が、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の識別特性の全てを有する、請求項１３に記載のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の変異体を含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
植物の一部が、ナシ状果の果実、石果類の果実、柑橘類の果実、ブドウ品種、野菜及び花の球根から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記有害微生物が、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea), アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)及びリゾプス・ストロニファー(Rhizopus stolonifer)から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
包装材料及び、活性成分として、生物学的に有効量の生物学的に純粋な酵母、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)を含み、更に担体を含む、農産物の保護における使用のために識別される組成物を含んで成る製品。
【請求項１９】
前記酵母を農産物に適用するためにデザインされ、そして構築されたアプリケーターを更に含んで成る、請求項１８に記載の製品。
【請求項２０】
農産物がナシ状果の果実、石果類の果実、柑橘類の果実、ブドウ品種、花の球根及び野菜から成る群から選択される、請求項１８に記載の製品。
【請求項２１】
前記有害微生物が、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea), アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger), ペニシリウム・ディジタツム(Penicillium digitatum), ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum), ゲオトリチュム・カンジダム(Geotrichum candidum), 及びリゾプス・ストロニファー(Rhizopus stolonifer)から成る群から選択される、請求項１８に記載の製品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】農産物の損傷を制御するのに有用な新規の拮抗酵母、その使用方法及びそれを含む組成物
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／２７５，５２６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、農産物の損傷を制御するのに有用な新規の拮抗的酵母、それらの使用方法及びそれらを含む組成物、に関する。具体的には、本発明は、酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metshnikowia fructicola)及び、植物の一部、例えば葉、花、果実、根又は野菜上の不所望の微生物の増殖を阻害するためのそれらの使用、に関する。
【背景技術】
【０００３】
現代の農産物（果実、野菜及び花）の業界における最も深刻な問題の１つは、収穫後の農産物の腐敗又は損傷である。果実及び野菜の収穫後の損失は５０％であると予想される。この損失は、真菌及び細菌の感染に大部分起因する。発展途上国においては、収穫後の損失は、適切な取り扱い及び冷凍倉庫設備の欠如により、しばしば深刻である。先進国は適切な冷凍庫を有するが、これらの国の消費者は、遠く離れたところから船で輸送され、そして長期間保存された農産物をしばしば購入する。果実及び野菜の収穫後の腐敗は、開花と果実の成熟との間、又は収穫並びにその後の取り扱い及び保存の間のいずれかに生じる感染に端を発することがある。
【０００４】
合成殺菌剤、例えばイマザリル及びチアベンダゾール(TBZ)が、伝統的に、収穫後の農産物の損失を制御する主な手段とされている。しかしながら、食品業界においては、毒性のある化学物質の使用を減らすための世界的な圧力が増大している。消費者は、通常果実及び野菜上の化学物質の残留について関心があり、そして特に化学物質の収穫後の利用という考えに特に不安を持っている。
【０００５】
更に、環境保護主義者は、化学的殺虫剤の除去及び新鮮な農産物上の化学物質の残留レベルについて声を大にしている。
【０００６】
同時に、病原菌の殺菌剤耐性菌株が、最も一般的に使用されている殺菌剤（例えば、TBZ、イマザリル、ロブラール）に対して出現してきている。最後に、より有効的な殺菌剤のうちのいくつか、例えばキャプタン及びベンレートは登録を抹消され、そしてもはや入手できない。更に、いくつかの型の農産物の収穫後の処理は許可されていない。尚、多くの収穫後の損傷は、収穫前に農産物にコロニーを形成した病原菌の結果である。
【０００７】
これらの要因全てが、人類の健康及び環境に対して危険性のない有効な代替物の開発に関心が集まる原因となっている。生物学的アプローチ、例えば天然化合物の使用は、植物において耐性及び拮抗微生物を誘導し、これらは全て、農産物の腐敗の防止又は制御のための合成殺菌剤に対する潜在的な代替物として提案されてきている。
【０００８】
天然化合物は典型的に、製造するのに非常に費用がかかり、そして効果が限定されている。生物学的アプローチの中でも、それらはあまり期待ができない。
【０００９】
耐性の誘導は理論的にかなり期待されるが、それを試した他の例において２つの問題で苦労している。遺伝子組換え作物(GMO)に基づいた耐性の誘導は、GMOが畑に広範に配置された場合に病原菌が突然変異するので、しばしば残念な結果となる。しかしながら、GMOに関する更に複雑な問題は、消費者及び環境保護主義者による一般的なGMOに対する抵抗であることが判明している。
【００１０】
このことは、残りの「許容される」生物学的アプローチとして、拮抗微生物の開発を中止させる。
【００１１】
近年、果実の収穫後の病気の制御のための微生物による生物的防除剤の使用についての研究はかなりの注目を集めており、そして実験室での利用から商業的な利用へと移行している。これらの努力により、収穫後の病気を制御するための微生物性の生物的防除剤の使用に関する大量の情報が現在入手可能である(Droby et al., 2001)。予想される微生物拮抗薬の選択は、主に、果実の表面及び傷を素早くコロニー化し、外部で栄養素のために病原菌と競争し、生存し、そして広範な温度条件のもとで成長する拮抗薬の能力に基づいている。抗生物質を含む、農薬の存在下で使用されうる拮抗薬は、これまで特徴付けられていない。
【００１２】
選択培地として創傷部位を利用する拮抗薬を選択するための単純で且つ信頼性のあるスクリーニング技術が開発されている。これらの手順及び他の匹敵するプロトコールを利用して、複数の拮抗細菌、酵母及び糸状菌が単離され、そして収穫後の腐敗に対して、柑橘類及び仁果類の果実を含む様々な収穫産物を保護することが示されている(Droby et al., 1989; Janisiewicz and Roitman, 1988; Chalutz and Wilson, 1990; Roberts, 1990; Droby et al., 1991; Gullino et al., 1991; Janisiewicz, 1994; Lurie et al., 1995; Chand-Goyal and Spotts, 1996; El Ghaouth et al., 1998; Ippolito et al., 2000)。
【００１３】
研究機関及び大規模な研究におけるこれらの微生物拮抗薬のいくつかの成功は、多くの果実及び野菜の管理のために、収穫後の生産物の開発及び促進において、複数の農薬企業による関心を集めた。多くの微生物拮抗薬が特許されており、そして農産物の収穫後の処理における商業的な使用について評価されている。現在、４つの拮抗微生物、２つの酵母、カンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila), 及びクリプトコッカス・アルビダス(Cryptococcus albidus)並びに２つの細菌の菌株、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)が、それぞれASPIRE, YieldPlus, 並びにBIOSAVE-110及びBIOSAVE-111の商品名のもとで市販されている。
【００１４】
農産物の細菌病の生物的防除のための細菌及び酵母の使用について記載している特許には、米国特許第5,314,691号(Coffey et al.); 第5,270,059号(Janisiwicz et al.); 第5,266,316号(Elad et al.); 第5,244,680号(Roberts); 第5,238,690号(Elad et al.); 第5,041,384号(Wilson and Chalutz); 第5,711,946号(Goyal and Roberts)並びにPCT公報WO 92/18009 (Shanmuganathan)及びWO 91/01641(Wilson et al.)が含まれる。これらの各先行技術は、開示された細菌、真菌又は酵母の種又は菌株を含む組成物又はそれを利用する方法として狭く限定されている。これらの技術のいずれにも、広範な農産物における広範な真菌の病原菌に対する有効性を証明した微生物が含まれていない。更に、これらの特許はいずれも、メツシュニコウィア(Metschnikowia)属の酵母が農産物の収穫後の損失を防ぐのに有用であるというヒント又は示唆を含んでいない。
【００１５】
メツシュニコウィア・プルシェリマ(Metschnikowia pulcherrima)は、果実上の少数の有害な微生物の生物的防除において幾つかの効果を有することが知られているが(DeCurtis et al. (1996) Ann. Microbiol. Enzymol. 46: 45-55 and Piano et al. (1997) Postharvest Biol. Technol. 11: 131-140)、それはメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)とは別で且つ遠縁の種である。更に、メツシュニコウィア・プルシェリマ(Metschnikowia pulcherrima)の拮抗薬活性の明らかに限定された範囲は、それを生産業における使用に不適当なものとしている。これまでに、M. プルシェリマ(M. pulcherrima)の生物的防御活性の極めて限定された範囲が証明されている。このことは、それを、広範な農業的な背景における収穫前及び後の商業的な予防に不適当なものにしている。
【００１６】
このように、農産物の損傷を制御するのに有用な新規拮抗酵母、その使用方法及び上記制限のないそれを含む組成物についての広く認識された必要性が存在しており、そしてそれらを有することは極めて有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の１つの観点により、NRRL Y-27328として識別されるメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)種の酵母の生物学的に純粋な培養物であって、生物学的に有効量の培養物が適用される果実上の有害な微生物の増殖を競合阻害することができる培養物が提供される。メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola, MF)は、本明細書では＃２７７として言及され、そして、これはNRS culture collection (NRRL) National Center for Agricultural Utilization Research(Peoria, Illinois, USA)に寄託されており、ここでは寄託番号NRRL Y-27328を割り当てられている。この寄託は、ブタペスト条約を順守して行われた。
【００１８】
本発明の別の観点により、活性成分として、生物学的に有効量の生物学的に純粋な酵母、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)を含む農産物の保護における使用のための組成物であって、更に担体を含む組成物が提供される。
【００１９】
本発明の更に別の観点により、植物の一部の上の有害微生物の増殖を阻害する方法であって、少なくとも１回、農業的に有効量の生物学的に純粋なメツシュニコウィア (Metschnikowia)属の酵母の培養物を植物の一部に適用することを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明の更に別の観点により、包装材料及び、活性成分として、生物学的に有効量の生物学的に純粋な酵母、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)を含み、更に担体を含む、農産物の保護における使用のために定義される組成物を含む製品が提供される。
【００２１】
後で説明する本発明の好ましい態様の更なる特徴により、NRRL Y-27328の生物学的に純粋な培養物の識別特性の全てを有する、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の生物学的に純粋な菌株が提供される。
【００２２】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、NRRL Y-27328の生物学的に純粋な培養物の識別特性の全てを有する、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の生物学的に純粋な突然変異体が提供される。
【００２３】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、有害な微生物は、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea), アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger), ペニシリウム・ディジタツム(Penicillium digitatum), ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum), リゾプス・ストロニファー(Rhizopus stolonifer)、アルタナリア種(Alternaria spp.), モリニリア種(Molinilia spp.)及びフサリウム種(Fusarium spp.)から成る群から選択される。
【００２４】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、植物の一部は、石果類の果実、柑橘類の果実、ブドウ、野菜、花の球根、ハーブ、種子、根、葉、種子及び液果からなる群から選択される。
【００２５】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、酵母は、活動期及び休眠からなる群から選択される生理学的状態で供給される。
【００２６】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、酵母は、液状懸濁液、乳濁液、粉末、顆粒、凍結乾燥物及びゲルから成る群から選択される物理学的形状で供給される。
【００２７】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、組成物は、更に化学的抗生物質を含む。
【００２８】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、化学的抗生物質は、殺菌剤、抗菌剤又は殺虫剤である。
【００２９】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、殺菌剤は、イプロジオン、チアベンゾダール、イマザリル(1-(2-2, 4-ジクロロフェニル)-2 (2-プロペニルオキシ-エチル)-1Hイミダゾール)、 フェンヘキサミド、ピリメサミル(Pyrimethamil)及びフルジオキソニル(Fludioxonyl)とシプロジニルの組み合わせ（例えば、ロブラール、TBZ、イマザリル、テルドール(Teldor), ミトス(Mitos)又はスィッチ(Switch)）からなる群から選択される.少なくとも１つの化学物質を含む。
【００３０】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、メツシュニコウィア(Metschnikowia)属の酵母は、NRRL Y-27328として識別されるメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)種の、又はそれらの任意の菌株の、又はそのような菌株の任意な変異体の、識別特性の全てを有する。
【００３１】
記載した好ましい態様におけるより更なる特徴により、製品は更に、酵母を農産物に適用するためにデザインされ、そして構築されたアプリケーターを含む。
【００３２】
本発明は、広範な微生物によって引き起こされる多くの型の農産物の損傷を制御するのに有用なメツシュニコウィア(Metschnikowia)属の新規拮抗酵母を提供することによって、現在知られている構成の欠点に首尾よく対処する。本発明は更に、当該酵母の使用方法、当該酵母を含む組成物及び当該組成物を含む製品を提供する。本発明は、収穫前の利用から収穫後の産生を提供することができるので、広範囲の承認を享受することが予想される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、広範な微生物の阻害を介して収穫前及び収穫後の腐敗を減少させるために、農産物に適用されうる新規酵母種メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)のものである。メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は、本明細書では菌株＃２７７及び／又はMfとして言及され、そして、これはNRS culture collection (NRRL) National Center for Agricultural Utilization Research(Peoria, Illinois, USA)に寄託されており、ここでは寄託番号NRRL Y-27328を割り当てられている。この寄託は、ブタペスト条約を順守して行われた。
【００３４】
具体的には、本発明は、ブドウ、柑橘類の果実、仁果類の果実、石果類の果実、花の球根、野菜、根、種子、葉及びハーブの真菌の病原菌の発生及び／又は深刻度を減らすために使用されうる。
【００３５】
「ブドウ」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、食用のブドウ及びワイン用のブドウを含む。
【００３６】
「柑橘類の果実」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、限定しないが、オレンジ、グレープフルーツ、タンジェリン、クレメンタイン、レモン、ライム、キンカン、シトロエン(citroen)、ザボン、マンダリン及びそれらに由来する交配種、を含む。
【００３７】
「仁果類の果実」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、限定しないが、りんご、ナシ及びマルメロ、を含む。
【００３８】
「石果類の果実」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、限定しないが、モモ、プラム、ネクタリン、アプリコット、マンゴー、を含む。
【００３９】
本明細書及び特許請求の範囲のために、用語「阻害する」及び「阻害」は、過程の遅延又は遅れを言及する。従って、阻害は、当該過程が、特許が請求される酵母、その酵母を含む組成物、の適用の結果として、又は特許が請求される方法の実施の結果として、低速で生じる場合に起こるとみなすことができる。
【００４０】
本発明は更に、特許が請求される酵母、特許が請求される酵母を含む組成物、及びそれらの組成物を含む製品の使用方法である。本発明に従う、競合阻害を介する不所望な損傷に対する農産物の保護の原理及び作業は、図面及び添付の説明を参照してより良く理解されるだろう。
【００４１】
本発明の少なくとも１つの態様を詳細に説明する前に、本発明が、その利用において、以下の説明に記載され又は図面に例示された構成の詳細及び構成要素の変更に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の態様でも可能であり、又は様々な方法で実践又は実施することができる。また、本明細書に適用される用語及び術語は、説明のためであり、限定するものとみなされるべきではない。
【００４２】
本発明の１つの観点により、NRRL Y-27328として識別されるメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)種の酵母の生物学的に純粋な培養物が提供される。この培養物は、生物学的に有効量の培養物が適用される植物上の有害な微生物の増殖を競合阻害することができる。メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）の識別特性は、「Metschnikowia fructicola, a New Ascoropic Yeast with Potential for Biocontrol of Postharvest Fruit Rots (Kurtzman and Droby (2001) System Appl. Microbiol 24: in press)」に記載されており、これは引用によって本明細書に全体が組み入れられる。要約すると、NRRL Y-27328は、26S rDNAのD1/D2ドメインが他のメツシュニコウィア(Metschnikowia)属のメンバーと異なる。具体的には、NRRL Y-27328は、その最も近縁の既知の親類であるメツシュニコウィア・プルシェリマ(Metschnikowia pulcherrima)と２．２％異なる。１％の差異が種間の区別にとって十分であることが広く認められている(Kurtzman and Robnett (1998) Antonie Leeuwenhoek 73: 331-371)。従って、26S rDNA配列のD1/D2ドメインが１％未満Mfと異なるメツシュニコウィア(Metschnikowia)は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００４３】
このように、もとの寄託物に物理的に由来するか又は独立して単離されるメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）の任意な生物学的に純粋な菌株は、NRRL Y-27328の識別特性の全てを有する限り、本発明の一部である。これは、それらがNRRL Y-27328の識別特性の全てを保持する限り、生物学的に純粋なメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）の変異体を含む。本明細書及び特許請求の範囲のために、用語「変異体」は、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド及び人工染色体への、自然に起こる変異及び目的をもった遺伝子組換え、例えば点変異の導入、の両方を含む。
【００４４】
Mfの保護に対抗する有害な微生物は、限定しないが、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea), アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger), ペニシリウム・ディジタツム(Penicillium digitatum), ペニシリウム・イタリカム(Penicillium italicum), ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum), ゲオトリチュム・カンジダム(Geotrichum candidum), リゾプス・ストロニファー(Rhizopus stolonifer)、アルタナリア種(Alternaria spp.), モリニリア種(Molinilia spp.)及びフサリウム種(Fusarium spp.)を含む。
【００４５】
本発明は更に、農産物の保護における使用のための組成物によって具現化される。当該組成物は、活性成分として、生物学的に有効量の、生物学的に純粋な酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）を含む。当該組成物は、更に担体を含む。後述する実施例で例示されるように、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）は、１０6細胞/ｍｌ超、好ましくは１０7細胞/ｍｌ超、更に好ましくは１０8細胞/ｍｌ、最も好ましくは１０9細胞/ｍｌ以上の濃度で送達される場合に生物学的に有効である。
【００４６】
当該組成物の酵母は、任意の生理学的状態、例えば活動期又は休眠、で供給されることもある。休眠酵母は、例えば凍結され（例えばDMSO/グリセロール中で）、乾燥され、又は凍結乾燥されることもある。更に、当該組成物の酵母は、限定しないが、液状懸濁液、乳濁液、粉末、顆粒、凍結乾燥物及びゲルを含む任意な生理学的形態で供給されうる。
【００４７】
当該組成物は、スプレー又は水薬として、あるいはエアロゾル化した粉末又は軟膏として適用されうる。当該組成物が休眠酵母を含む場合、それらは、例えば栄養培地中での再水和及び／又はインキュベーションによって、使用前に再び活性化されることを必要とすることがある。好ましくは、休眠酵母は、適用された時に、又は適用の後に活動的になる。
【００４８】
組成物の全体的な効果を増大させるために、化学的抗生物質が更に含まれることもある。好ましくは、化学的抗生物質は、適合性のある殺菌剤、例えばイプロジオン（例えば、ロブラール）又はチアベンダゾール（例えば、Apl-Luster, Arbotect, Mertect, Mycozol, TBZ, Tecto, 及び Thibenzole), イマザリル（すなわち、(1-(2-2, 4-ジクロロフェニル)-2 (2-プロペニルオキシ-エチル)-1Hイミダゾール；例えばBromazil, Deccozil, Fungaflor, Freshgard, 又はFungazil), フェンヘキサミド(例えば、テルドール(Teldor)), ピリメサミル（例えば、ミトス）又はフルジオキソニルとシプロジニルの組み合わせ（例えば、スイッチ）、あるいはそれらの化学的に等価なもの又はそれらを含む組み合わせ、である。あるいは、又は更に、化学的抗生物質は、抗菌剤又は殺虫剤を含む。
【００４９】
本発明は更に、植物の一部上の有害微生物の増殖を阻害する方法であって、少なくとも１回、農業的に有効量の生物学的に純粋なメツシュニコウィア (Metschnikowia)属の酵母の培養物を植物の一部に適用することを含む方法、によって体現される。好ましくは、メツシュニコウィア(Metschnikowia)属の酵母は、NRRL Y-27328として識別されるメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）、又はそれらの任意な菌株又はそのよう菌株の任意な変異体の識別特性の全てを有する。
【００５０】
本発明は更に、梱包材料及び、有害微生物からの農産物の保護における使用のために識別される組成物、を含む製品によって具現化される。当該製品は、活性成分として、生物学的に有効量の、生物学的に純粋な酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）を含み、そして更には担体を含む。好ましくは、当該製品は更に、酵母を農産物に適用するためにデザインされ、そして構築されたアプリケーターを含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、用語「担体」は、農産物又は植物に重大な刺激作用をもたらさず、そして投与された活性成分の生物活性及び特性を抑制しない、任意の物質又は希釈剤を言及する。従って、当該用語は具体的には、限定しないが、水溶液、例えば、培養液、不活性粉末、及び不活性溶媒（例えば、水）を含む。
【００５１】
特許が請求される酵母種、それを含む組成物及び製品並びにそれらの使用方法は、商業的な農業における大きな有用性を見出すことが予想される。それらの有用性は、重要な病原菌に対する広範な活性、及びそれらが有効に適用されうる植物/果実の範囲の広さ、に起因する。更に、Mfは畑で、又は収穫と同時に、又は保存の間に利用されることがある。更に、本明細書の下文の実施例で例示するように、Mfは広範な保存条件のもとで有用である。このように、本発明は、農産物の収穫後の損傷を防ぐ手段として、良性酵母の収穫前の適用を許容する。
【００５２】
本発明の追加的な目的、利点、及び新規特徴は、限定することを意図していない以下の実施例の例により、当業者にとって明らかであろう。更に、上文で描写し、そして特許請求の範囲に記載した本発明の様々な態様及び観点のそれぞれが、以下の実施例における実験的補助であると考えられる。
【実施例】
【００５３】
上文の説明と共に、本発明を限定せずに例示する以下の実施例を参照のこと。
【００５４】
通常、本明細書で使用する命名法及び本発明で利用する実験手順は、分子、生化学、微生物学及び組換えDNA技術を含む。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual"Sambrook et al., (1989) ;"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al.,"Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds)"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 米国特許第4,666,828号; 第4,683,202号; 第4,801,531号; 第5,192,659号及び第5,272,057号に記載の方法;"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994);"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds),"Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ; Mishell and Shiigi (eds),"Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照のこと。利用可能なイムノアッセイは、特許文献及び科学文献において広く説明されており、例えば、米国特許第3,791,932号; 第3,839,153号; 第3,850,752号; 第3,850,578号; 第3,853,987号; 第3,867,517号; 第3,879,262号; 第3,901,654号; 第3,935,074号; 第3,984,533号; 第3,996,345号; 第4,034,074号; 第4,098,876号; 第4,879,219号; 第5,011,771号及び第 5,281,521号; "Oligonucleotide Synthesis"Gait, M. J., ed. (1984);"Nucleic Acid Hybridization"Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation"Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984);"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press, (1986);"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal, B., (1984) and"Methods in Enzymology"Vol. 1-317, Academic Press;"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press (1996)を参照のこと。これらの全てが、本明細書に完全に記載されている場合には引用によって組み入れられる。他の一般的な文献は、本文を通じて供される。それらの中の手順は当業界で周知であると考えられ、そして読者の利便のために供される。それらの中に含まれる情報は全て、引用によって本明細書に組み入れられる。
【００５５】
実施例１
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）の単離
新規酵母種メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）は、イスラエルの中心部で生育したグレープベリー（栽培品種Superior）の表面から単離された。種々の段階において、単一のベリーを１００ｍｌビーカー中の滅菌蒸留水中に浸し、そしてロータリーシェーカー上で１２０ｒｐｍで激しく２時間振とうした。１００μｌのアリコートを洗浄液から除去し、そしてPDA（ポテトデキストロースアガー；DIFCO Laboratories, U. S. A..）培地上に蒔いた。４〜５日のインキュベーションの後、酵母コロニーを、コロニーの特性（色及び形態）に従い無作為にピッキングし、生物学的に純粋な培養物を得るために新鮮な培地上で個別にストリーキングした。培養物は、PDA上での繰り返しのストリーキングによって更に精製した。新規種の同定及び特徴づけが、Microbial Genomics and Bioprocessing center,USDA-ARS (Peoria, IL, USA)で実施された。メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）が、NRRL Y-27328の番号のもとNRRLに寄託された。
【００５６】
実施例２
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）の増殖
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）は、好気的条件のもと、５℃〜３７℃の温度で増殖される。任意の増殖温度は２０〜２７℃である。増殖は中性pHの液体培地（栄養培地；Droby et al., 1989）中で行われる。酵母の細胞密度はその最大（定常期）の増殖に２４〜４８時間で達する。研究所及び小規模の試験にとって、前記培地を含み、且つロータリーシェーカー上で振とうされる、三角フラスコ中での培養が適している。大規模で且つ商業的な試験にとっては、発酵タンク及び工業用増殖培地が好ましい。酵母細胞は、常用の研究室にある遠心機及び工業用の遠心機を用いる遠心によって回収される。発酵培養業界の者は、適当な増殖培地及び市販の装置を用いて培養量を拡大させることができるだろう。
【００５７】
実施例３
ブドウ及びミニトマト上でのメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）の活性の試験的アッセイ
単一のブドウ又はミニトマトを房から取った。表面の消毒は、１％（ｖ/ｖ）次亜塩素酸ナトリウム(pH11.5)中に１分間浸すことによって達成した。消毒した果実は、インキュベーションボックス内のPVCパッドに貼り付けられたマスキングテープの小片上に載せられた。果実はピンで２ｍｍの深さに穴を開けられ、そして１０μｌの拮抗（メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）又は上述のもの）細胞懸濁液を創傷部位上にピペッティングし、そして１〜２時間乾燥させた。続いて、果実は１０μｌの適当な真菌類病原菌（B・シネレア(B. cinerea)又は上述のもの)の分生子懸濁液を接種された。分生子懸濁液は、室温でインキュベートした１週齢の病原菌培養物から得られた。胞子の濃度は１〜５/１０4分生子/ｍｌに調整された。各処理は、７〜１０個の３組の単一の果実に適用された。処理の後、高い相対湿度を維持するために、ポリエチレンで覆われたインキュベーションボックス内に湿ったろ紙を据えた。各組で損傷したベリー/果実のパーセンテージは、２０℃で４〜５日後に評価された。このアッセイは、後述する実施例１６、１７、２６及び２８において利用された。
【００５８】
実施例４
グレープ上でのメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）の活性の畑での試験
ワイン用及び食用のブドウの房の腐敗に対するメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）及び他の酵母は、イスラエルの北部、中心部及び南部の海岸平野に位置するブドウ園の種々のブドウで評価された。トンプソンシードレス及び「Superior seedless」(食用ブドウ）及び「Sauvignon blanc」（ワイン用ブドウ）が試験された。実験のプロットは、異なる実験において処理当たり１〜７個のブドウの木から構成され、これは、少なくとも４組のランダムなブロックとして編成された。酵母拮抗薬及び化学的なスタンダード(ミトス 0.25%)が、手動のバックスプレーを用いて、流出するまで最大４回毎週適用された。
【００５９】
領域内でのブドウの実験における損傷の発生率（腐敗した房の％）は、収穫（畑での評価）の日に決定された。４０個の房が各プロットからサンプル採取され、そして腐敗の病原菌及び腐敗のパーセンテージに従いスコアリングされた。食用ブドウの場合、腐敗は保存においても評価された。およそ３〜５ｋｇのブドウが各プロットから採集され、そして高い相対湿度を作り出すためにポリエチレンバッグで覆われたプラスチックバッグ内に封入された。腐敗の進行は、０℃で３〜４週間、続いて２０℃で４〜７日間（低温貯蔵）又は２０で１０日間（保存期間）の後評価された。SO2の標準的処理が比較として使用された。図１２A及びBで要約したデータは、Mfが、その有効性において化学的な抗菌剤に匹敵することを示している。
【００６０】
実施例５
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola）はセイヨウザクラの腐敗を阻害する
本発明の酵母拮抗薬メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)及びカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)(I-182)の、セイヨウザクラ上の収穫後の腐敗の進行に対するの効果は、108細胞/mlの濃度で試験された。サクラは、酵母細胞懸濁液中に１分間浸漬され、風乾され、そしてその後種々の条件：２４℃で最大６日間；０℃で３０日、続いて保存期間（室温）で４日間；及び調整気相(MA)包装(P-Plus, Sidlaw Packaging Bristol-UK)、続いて保存期間の４日間、で保存された。MA包装で使用したバッグ内の気相は、空気のアリコートを抜き取り、そしてそれをTDC検出器及びPropakカラム(Supelco, Bellepeta, PA, USA)を備えたGCガスクロマトグラフィー内に注射することによって決定した。腐敗した房の数は、貯蔵及び保存期間の後決定された。
【００６１】
図２６で要約したデータは、Mfがカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)よりも有効であることを示している。
【００６２】
実施例６
冷蔵した状態でのメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の増殖特性
Mfが冷却保存の条件下で有用であることを証明するために、酵母細胞が、４℃の冷蔵室内に据えられたロータリーシェーカー上の、肉汁培地、酵母抽出物及びD-グルコースから成る液体培地(NYDB:Droby et al., 1989)を含む三角フラスコ中で増殖された。アリコート(1ml)が１日間隔で増殖培地から無菌的に取り除かれ、連続希釈され、そして固形培地上(NYDA; Droby et al., 1989)にプレーティングされた。２５℃で３〜４日間のインキュベーション後、培地上で増殖しているコロニーの数が数えられ、そして細胞/mlの対数として表された。データを図１に要約する。Mfは、冷蔵した状態で、６日間の間にM. ロイカフティ(M. reukafti)及びK, サーモトレランス(K. thermotolerance)よりもはるかに早く増殖した。
【００６３】
実施例７
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は柑橘類の果実の皮の傷をコロニー化する
Mfが果実の創傷を保護することができることを証明するために、果実の表面上の創傷部位でコロニー化し、そして増殖する能力が試験された。果実は、９５％エタノールで拭かれ、そして解剖用の針(dissecting needle)を用いて傷つけられた(3x3mmの傷)。酵母細胞懸濁液(2x106細胞/ml)のアリコート(20μl)が各傷にピペッティングされた。当該果実は２０℃で、且つ１，２４及び４８時間の間隔でインキュベートされ、そして5x5mmの断片が４つの各傷から切り出され、そして10mlの滅菌蒸留水中で１時間激しく振とうされた。洗浄液の連続的１/１０希釈液が調製され、そして100μlの各希釈液がNYDA上にプレーティングされた。コロニーの数は、２５℃で４８時間のインキュベーションの間数えられた。４つの傷を含む各果実は１回一組を表し、そして各処理は６回一組を含んだ。データ（図２に要約した）をメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)/傷のcfu（コロニー形成単位）として示した。結果は、Mfが室温で複製でき、果実の表面の傷でコロニー化することができることを示す。
【００６４】
実施例８
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)によるコロニー化は、栄養素のための競合による柑橘類の果実の皮の傷を保護する。
mfが栄養素のために競合することができることを明らかにするために、表面を滅菌したグレープフルーツが、へたの周りを果実当たり３つの傷により傷つけられた。各傷は、3mmの深さまで解剖用の針を挿入することによって作られた。30μlの拮抗Mf細胞の水性懸濁液が各傷の中にピペッティングされた。１〜２時間後、20μlのP. ディジタツム(Penicillium digitatum)の胞子懸濁液(5x104胞子/ml)が各傷に適用された。染み込まされたグレープフルーツの皮が、グレープフルーツ上のP. ディジタツム(Penicillium digitatum)が誘導した病巣の縁で水に浸された皮から調製された。10gの皮がブレンダー内でホモジェナイズされ、蒸留水で２０％の強度に希釈され、そしてオートクレーブされた。P. ディジタツム(Penicillium digitatum)の濃縮胞子懸濁液のアリコートが、5x104胞子/mlの最終胞子濃度になるまで、皮を浸したものに添加され、これをメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の細胞懸濁液で前処理した果実の傷に接種するために使用した。コントロールの果実は、類似のP. ディジタツム(Penicillium digitatum)胞子水中懸濁液で接種された。各果実は３つの部位で接種された。１２個の果実が各処理に使用され、処理当たり合計３６カ所の接種部位をもたらした。傷の感染のパーセントは、２４℃でのインキュベーションの５日後に測定された。データを図３に要約する。結果は、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)がレッドグレープフルーツのペニシリウム・ディジタツム(Penicillium digitatum)(Pd)の感染に対して保護することが成功することを示すが、皮から抽出された補助的な栄養素の存在下では保護することに失敗することを示す。これらの結果は、栄養素のための競争がMfの保護能力における主要な役割を果たしていることを明確に示している。
【００６５】
実施例９
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は濃度依存的にアオカビの腐敗から保護する。
Mfの保護効果が濃度依存性であることを証明するために、表面を滅菌したグレープフルーツが実施例８のようにへたの周りを傷つけられた。30μlの拮抗Mf細胞の水性懸濁液が各傷の中にピペッティングされた。１〜２時間後、20μlのP. ディジタツム(Penicillium digitatum)の胞子懸濁液(5x104胞子/ml)が各傷に適用された。腐敗のパーセントが、２４℃のプラスチックトレイ中の湿度のある条件下での１週間のインキュベーションの後に決定された。処理当たり１２個の果実が使用された。データを図４に要約する。結果は、腐敗の完全な阻害が108cfuの濃度で達成されたが、部分的な保護は107及び106cfuで達成されたことを示す。
【００６６】
実施例１０
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は抗生物質を産生しない。
抗生物質の広範に及ぶ使用について大きな関心が存在するので、mfが果実を保護する機構が試験された。果実を保護するMfの能力が抗生物質の産生によって媒介されているか否かを決定するために、Mfは主要な果実の病原菌（アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger), ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea), ペニシリウム・ディジタツム(Penicillium digitatum)）に対してスクリーニングされた。酵母細胞は、PDAプレートの一方の側にストリーキングされた。真菌の培養物を含むアガープラグ(0.5x0.5mm)がプレートの他方の側に据えられ、そしてプレートは２５℃で一週間インキュベートされた。
【００６７】
代表的な結果を図５に示す。３つの試験した病原菌の阻害は観察されなかった。このことは、Mfが拡散性の抗生物質を産生しないことを証明している。
【００６８】
実施例１１
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)による阻害は、キチナーゼ活性と関連している。
Mf及び他の酵母の相対的な生体駆除効果を試験するために、りんごが水道水で洗浄され、乾燥され、4mmの深さで且つ2〜3mmの直径の均一な傷が各果実の側面上に作られた。各傷は、108細胞/mlの濃度の40μlの酵母懸濁液で接種された。３時間後、104胞子/mlのP. エクスパンサム(Penicillium expansum)を含む20μlの懸濁液が各傷に添加された。処理されたリンゴは周囲温度及び高い相対湿度のパーセントで保存され、傷の腐敗は接種から１０日後に決定された。感染した（腐敗した）各傷で決定された。各処理は、１０個の果実３組で構成した。各果実は１つの部位に傷をつけられた。
【００６９】
結果を図６に要約する。キチナーゼ活性（挿入）の検出は、以下の通り実施された：ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-PAGEは、基質としての0.01%(w/v)グリコールキチン及び0.1%(w/v)を含む15%(w/v)ポリアクリルアミドゲルを用いることによってpH8.9で実施された。酵母の液体培養物の懸濁液から得られた、粗製の酵素調製物が10%(w/v)スクロース及び2% SDS/125mM Tris-HCl (pH6.7)中で２分間煮沸された。電気泳動は室温で１．５時間20mAで実施された。電気泳動後、ゲルは、回転する装置上で、200mlの100mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)中で、３７℃で一晩インキュベートされた。インキュベーション期間の終了時、ゲルを0.01%(w/v) calcoflour white M2R/0.3M Tris-HCl (pH 8.9)で５分間染色され、そして穏やかに振とうしながら２時間100mlの蒸留水中でゲルをインキュベートすることによって脱色した。溶菌領域は、ゲルをUV光のもとに据えることによって可視化した。calcoflour white M2Rが加水分解したキチンを染色しないので、Mfレーンの黒いバンドは、酵母Mfが他の試験した酵母と比較して大量のキチナーゼを産出したことを示している。図６に表した結果は、ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)からリンゴを保護するMfの能力がキチン分解活性と非常に相関していることを示している。この活性を欠いているほかの酵母（単離物#47及び#273）はペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)に対してあまり有効ではなかった。このデータは、キチン分解活性が、競合相手同様Mfの保護効果に寄与していることを示している。
【００７０】
実施例１２
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)に対する温度の効果
０〜４２℃の及ぶ温度に対する長時間の曝露後に生育可能なままでいるMfの能力は、固形のポテトデキストロースアガープレート上で試験された。MfはPDAプレート上で軽くストリーキングされ、そして指定の温度で４日間インキュベートされ、そして次に２５℃へと更に４日間移された。増殖は可視的に評価された。結果を表１に要約する。
【００７１】
【表１】
2004528030.tif 000001
【００７２】
これらの結果は、Mfが０〜５℃での保存の後も生育可能のままであり、そしてMfが３７℃以下の温度に耐えることができることを示している。
【００７３】
実施例１３
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は化学的殺菌剤と相乗作用で働く。
単一のブドウ（栽培品種Superior；食用ブドウ）が、1%(v/v)次亜塩素酸ナトリウム(pH11.5)中に１分間浸すことによって表面殺菌され、そしてインキュベーションボックス内のPVCパッドに貼り付けられたマスキングテープの小片上に載せられた。ブドウはピンで２ｍｍの深さに穴を開けられ、そして２０μｌの拮抗細胞懸濁液(107細胞/ml)又はイプロジオンのロブラール銘柄(5ppm)あるいはその両方を創傷部位上にピペッティングし、そして１〜２時間乾燥させた。続いて、ブドウは、室温でインキュベートした１週齢の病原菌培養物から得られた１０μｌのB・シネレア(B. cinerea)の分生子懸濁液を接種された。胞子の濃度は１〜５/１０4分生子/ｍｌに調整された。各処理は、３組の７〜１０個の単一の果実に適用された。処理の後、高い相対湿度を維持するために、ポリエチレンで覆われたインキュベーションボックス内に湿ったろ紙を据えた。各組で腐敗したブドウのパーセンテージは、２０℃で４〜５日後に評価された。図７で要約した結果は、イプロジオンのロブラール銘柄とMfとの間に有意な相乗作用が存在することを示す。
【００７４】
実施例１４
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は様々な農薬と両立する。
Mtが様々な一般的に利用されている化学的殺虫剤との組み合わせに適していることを確かめるために、１０％の強度の液体培地(NYDB)を、添加された種々の濃度の一般的な農薬と一緒にMfの細胞懸濁液(25mlの109細胞/ml)で接種され、そしてロータリーシェーカー上室温でインキュベートされた。以下の市販の農薬を利用した：TBZ (0.02%); テルドール (0.015%); ミトス (0.025%); ロブラール (0.02%); スィッチ (0.01%); 及びイマザリル (0.005%)。試料を無菌的にインキュベーション０分、２時間及び４８時間に取り除いた。試料を連続希釈し、そして30μlの希釈物のアリコートをPDA上にプレーティングした。プレートを２５℃で３〜４日間インキュベートし、そしてコロニー形成単位(CFU)を数えた。
【００７５】
図８に要約した結果は、Mfが試験した農薬、殺菌剤に影響を受けず、但し、スィッチ (0.01%); 及びイマザリル (0.005%)はその増殖を遅らせたが防ぎはしなかった。
【００７６】
実施例１５
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は畑の条件のもとで生存する。
Mfが他の酵母菌株よりも畑での使用に更に適していることを証明するために、ブドウはイスラエルの中心部にある海岸(トルーマン)で食用ブドウの収穫前及び収穫後の腐敗を調整する酵母拮抗薬Mfの効果を評価するために設計された実験的プロットから回収された。２３１（メツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)）、４１４（クルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerance)）及びMfを用いて108細胞/mlの濃度で酵母(21/6から開始)を毎週スプレーすることが実施された。ブドウは、最初のスプレー日に、房が乾燥した後で、且つその後の各スプレーの前に回収された。
【００７７】
各回収で、プロット当たり５個のブドウが、20mlの水を含む150mlの滅菌したプラスチックカップ内に無菌的にサンプル採取され、そして200rpmで１時間ロータリーシェーカー上で振とうされた。１：１０の連続希釈の後、20μlの各希釈液を、20gのグルコース、1gの酵母抽出物、10gのプロテアーゼペプトン及び15gのアガーを含み、1Lの蒸留水中250gのペニシリンG(細菌の増殖を抑制するためのもの）で修正したBasal yeast agar培地(BYA)を含むペトリ皿中にプレーティングされた。ペトリ皿を室温で３〜４日間インキュベートした後、コロニーの数を数えた。酵母の生存可能性はCFU/ベリーとして表す。図９に要約した結果は、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)が、食用ブドウ（栽培品Superior）上、メツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）又はクルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerance)（４１４）よりも畑でより良く生存することを示している。
【００７８】
実施例１６
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)はブドウ上のアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)及びボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)の増殖を阻害する。
Mfが重要なブドウの病原菌に対して有効であることを証明するために、単一のブドウが房から取り除かれ、1% (v/v)次亜塩素酸ナトリウム(pH11.5)中に１分間浸漬することによって表面を殺菌し、そして上述のようにマスキングテープの小片上に載せられた。ブドウは上述のようにピンで穴を開けられ、そして拮抗薬細胞懸濁液が創傷部位に適用され、そして上述のように乾燥するまで放置された。30μlの、108細胞/mlの各菌株の細胞懸濁液を使用した。続いて、ブドウは10μlのアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) （図１０）又はボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)（図１１）の分生子懸濁液を接種された。調製された分生子懸濁液及び胞子の濃度は、上述のように調整された。
【００７９】
各処理は３組の７〜１０個のブドウに適用された。当該処理の後、湿ったろ紙が、高い相対湿度を維持するために、ポリエチレンで覆ったボックスの中に据えられた。各組の腐敗したブドウのパーセンテージは、２０℃で４〜５日経過した後に評価された。
【００８０】
図１０及び１１は、Mfが食用ブドウ上の傷上でのアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)及びボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)の増殖を制御するのに、アッセイした酵母の中で最も有効であることをはっきりと示している。図１１において、A42はカンジダ・ギリエモンジイ(Candida guilliemondii)を示し、495はデバリョマイセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)を示し、そして菌株243及び509は未同定の酵母である。
【００８１】
実施例１７
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)はブドウの房の腐敗を制御する。
畑におけるMfのより優れた品質を証明するために、ワイン用及びブドウ用ブドウの房の腐敗に対する化学的殺菌剤スプレー(ミトス)と比較したMfの効果は、イスラエルの北部、中心部及び南部の海岸平野に位置するブドウ園の様々なものについて、トンプソンシードレス及び「Superior seedless」(食用ブドウ）及び「Sauvignon blanc」（ワイン用ブドウ）上で評価された。
【００８２】
実験のプロットは、異なる実験において処理当たり１〜７個のブドウの木から構成され、これは、少なくとも４組のランダムなブロックとして編成された。酵母拮抗薬及び化学的なコントロールが、手動のバックスプレーを用いて、流出するまで最大４回毎週適用された。ワイン用及び食用ブドウの実験における腐敗の発生率は、収穫の日に決定された。４０個の房が各プロットからサンプル採取され、そして腐敗の病原菌及び腐敗のパーセンテージに従いスコアリングされた。食用ブドウにおいては、腐敗は保存においても評価された。およそ３〜５ｋｇのブドウが各プロットから採集され、そして高い相対湿度を作り出すためにポリエチレンバッグで覆われたプラスチックバッグ内に封入された。腐敗の進行は、０℃で３〜４週間、続いて２０℃で４〜７日間の後評価された。
【００８３】
図１２A及び１２Bは、108細胞/mlの濃度でワイン用ブドウに適用されたMfが、アスペルギルス(Aspergillus), ボツリチス(Botrytis)及びリゾプス(Rhizopus)によって生じた房の腐敗を制御するのにミトス(0.25%)よりも有効であったことを明確に示している。
【００８４】
図１３A及び１３Bは、107細胞/mlほどの低さの濃度での酵母Mfの収穫前の適用は、M. ラウカウフィイ(M. raukaufii)又はK. サーモトレランス(K. thermotolerance)よりも、畑でのブドウの房上で進行したリゾプスの腐敗を制御するのにより有効であった。
【００８５】
図１４は、108 (Mf)及び107 Mf-1)細胞/mlの濃度で食用ブドウ（栽培品種Superior）に適用されたMfが冷蔵保存の後に病気の深刻度を低下させたことをはっきりと示している。
【００８６】
図１５は、収穫前に108及び107細胞/mlの濃度で食用ブドウ（栽培品種Thompson）に適用されたMfが、２０℃での最大２週間の保存の間にアスペルギルス(Aspergullus)によって生じた房の腐敗を制御するのに、カートン当たり１つのSO2飽和パッドでの化学的処理に対しより優れていたことをはっきりと示す。
【００８７】
図１６は、Mfが、アスペルギルス(Aspergillus) +ボツリチス(Botrytis) +リゾプス(Rhizopus)の病原菌によって生じたブドウに対する損傷を制御するのに、メツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）、クルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerance)（４１４）又はミトスよりも更に有効であることをはっきりと示している。
【００８８】
要約すると、これらの結果は、真菌拮抗薬としてのMfの使用が、ブドウの収穫前及び収穫後の房の腐敗の制御のために一般的に利用される化学的殺菌剤程度に有効であることを示している。
【００８９】
実施例１８
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は様々な病原菌から花の球根を保護する。
白ユリの球根がある部位で傷つけられ、そして108細胞/mlの濃度の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)、カンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)又はバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の細胞懸濁液中に１分間浸漬され、２〜３時間乾燥させられ、そして流出するまで球根にスプレーすることによってフサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)(105胞子/ml；図１７A及びB)又はペニシリウム・ヒルスツム(Penicillium hirsutum)(105胞子/ml；図１８A及びB)の胞子を接種された。水をスプレーされた球根は、コントロールとして使用した。感染した球根のパーセントは、９℃で２週間の保存期間、続いて２０℃での１週間の保存の後に決定された。
【００９０】
図１７A及びBに要約したデータは、Mfが、白ユリの球根上のフサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)の腐敗の制御において、B.サブチリス(Bacillus subtilis)よりも効果的であることを示している。図１８A及びBに要約したデータは、Mfが、白ユリの球根上のペニシリウム・ヒルスツム(Penicillium hirsutum)の腐敗の制御において、C. オレオフィラ(Candida oleophila)よりも効果的であることを示している。要約すると、Mfは、C. オレオフィラ(Candida oleophila)又はB.サブチリス(Bacillus subtilis)よりもユリの球根についての広範な保護を提供する。
【００９１】
実施例１９
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は石果類の果実の天然の感染を防ぐ。
石果類の果実の天然の腐敗の進行に対する酵母拮抗薬メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)及びカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)の効果を評価するために、「Flavortop」ネクタリンが利用された。果実はMf又はカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)の細胞懸濁液(108細胞/ml)中に浸漬された。水道水（２０℃）中に浸漬された果実はネガティブコントロールとしての役割を果たした。処理済の果実は０℃で３０日間保存され、そしてその後２４℃で１０日間維持された。この第二のインキュベーション後、腐敗の発生が決定された。全ての実験において、各処理はそれぞれ３０個の果実を３組含んだ。
【００９２】
図１９に要約した結果は、Mfが、アルタナリア種(Alternaria spp.)、モニリニア・フルクチコラ(Monilinia fructicola)、R. ストロニファー(Rhizopus stolonifer)、B. シネレア(Botrytis cinerea),及びP. エクスパンサム(Penicillium expansum)によるネクタリンの天然の感染を防ぐのに、カンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)よりも効果的であることを示している。
【００９３】
実施例２０
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は石果類の果実の傷のペニシリウム(Penicilium)感染を阻害する。
石果類の果実（「Flavortop」ネクタリン及び「Swelling」モモ）は解剖用の針で傷つけられ（１〜２mmの深さ）、そして30μlの酵母細胞懸濁液(108細胞/ml)がそれぞれの傷に適用された。使用した酵母細胞拮抗薬は、C. オレオフィラ(Candida oleophila)又はメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)のいずれかであった。処理済の果実は風乾され、そして20μlのペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)の胞子懸濁(105胞子/ml)を接種され、そしてプラスチックトレイ内で、２４℃の湿った条件のもとで保持された。感染した傷のパーセンテージは、接種後４及び５日目に決定された。図２０に要約した結果は、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)が、ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)による傷のコロニー化を防ぐのに、カンジダ・ オレオフィラ(Candida oleophila)よりも効果的であったことを示す。
【００９４】
実施例２１
石果類の果実のペニシリウム(Penicilium)感染のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)による阻害は濃度依存性である。
石果類の果実（「Flavortop」ネクタリン及び「Swelling」モモ）は実施例２０に記載のように傷つけられ、そして30μlの変化するMf懸濁液(107, 108及び109細胞/ml)がそれぞれの傷に適用された。処理済の果実は、上述の実施例２０のように扱われた。図２１に要約した結果は、Mfの109細胞/mlが、ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)による傷のコロニー化を競合阻害するのに完全に有効であり、一方、より低い濃度は有意な程度の保護を提供したことを示す。
【００９５】
実施例２２
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)はナシ状果の果実のペニシリウム(Penicillium)感染を阻害する。
ゴールデンデリシャスアップルは解剖用の針で傷つけられ（１〜２mmの深さ）、そして30μlの変化する酵母細胞懸濁液(108及び109細胞/ml)がそれぞれの傷に適用された。処理済の果実は風乾され、そして20μlのペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)の胞子懸濁(105胞子/ml)を接種され、そして上述の実施例２０及び２１のように保存された。感染した傷のパーセンテージは、接種から５日目に決定された。
【００９６】
図２２に要約した結果は、ナシ状果の果実において、例えば石果類の果実において、109細胞/mlのMfがペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)による傷のコロニー化を競合阻害するのに完全に有効であり、そして、より低い濃度は有意な程度の保護を提供したことを示す。
【００９７】
実施例２３
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)の収穫前の適用はイチゴ中のボツリチスを阻害する。
酵母拮抗薬の収穫前の適用の現実を示すために、108細胞/mlの濃度のMf細胞懸濁液が、バックスプレーによって、商業用の領域内のイチゴ植物に対し、毎週の間隔で適用された。最初の適用は、開花の時に行われた。酵母の処理は図２３に示した割合で異なる市販の殺菌剤と比較された。第４回目の適用の後、上記領域内の腐敗した果実の数が各処理において数えられた（図２３A）。更に、果実は収穫され、１℃で３日間、続いて２４℃で３日間保存され、腐敗した果実のパーセンテージが決定された（図２３B）。これらの結果は、上記領域内で適用されたMfが上記領域内での、且つ収穫後の保存の間の、腐敗からの保護を提供することを示している。Mf処理は、市販の殺虫剤のものに匹敵する保護レベルを提供する。
【００９８】
実施例２４
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)はグレープフルーツのアオカビを阻害する。
収穫後の腐敗を防ぐMfの多機能性を証明するために、アオカビの腐敗がグレープフルーツにおいて、２０℃での６，１４，１８，２４日の保存の後に決定された。実験は、商業的な作業を模倣したパイロット規模の柑橘類の梱包ラインで決定された。ステーション(station)に進入後、果実は淡水による過剰な洗浄を受け、続いて、温風を吹くファンのもとで乾燥を受けた。次に、果実は、Mf, メツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）又はカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)（１８２）の細胞懸濁液(108細胞/ml)に浸され、温風の送風のもとで乾燥され、そして商業的なカートン内に梱包された。果実は２０℃で保存され、そして腐敗の存在について異なるインキュベーション期間の後に検査された。
【００９９】
図２４に要約した結果は、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)が、グレープフルーツのアオカビの腐敗の進行を防ぐのに、メツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）又はカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)（１８２）よりも有効であったことをはっきりと示している。
【０１００】
実施例２５
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)はトマト上のボツリチス(Botrytis)を阻害する。
保存の間の野菜、及び果実の保護におけるMfの有用性を証明するために、アッセイはチェリートマト上で実施された。当該アッセイの詳細は実施例３に示されている。図２５に要約した結果は、106ほどの低さのMfの濃度がチェリートマトの人工的な感染の後にボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)の進行を阻害することをはっきりと示している。
【０１０１】
実施例２６
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)はチェリー上のボツリチス(Botrytis)を阻害する。
石果類の果実の保護におけるMfの相対的な有効性を試験するために、スィートチェリー上の収穫後の腐敗の進行を遅らせるC. オレオフィラ(Candida oleophila)又はMFの能力が試験された。各酵母拮抗薬は108細胞/mlの濃度で適用された。チェリーは種々の塩溶液又は酵母細胞懸濁液中に１分間浸され、風乾され、そして次に０℃で３０分間、続いて２４℃で４日間保存された。図２６に要約した結果は、メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)が、冷蔵保存及びその後の室温での保存のもとでのスィートチェリー上のボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)の天然の腐敗の進行を遅らせるのに、C. オレオフィラ(Candida oleophila)よりも優れていることをはっきりと示している。
【０１０２】
実施例２７
メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)は種々の条件下でトマト上のボツリチス(Botrytis)を阻害する。
種々の条件下でチェリートマトを保護するMfの効果を決定するために、トマトは酵母を処理され、そして上述（実施例３）のようにB.シネレア(Botrytis cinerea)を接種された。水で処理され、そしてB. シネレア(Botrytis cinerea)を接種されたトマトは、コントロールとしての役割を果たした。処理後、トマトを３つの群に分けた。１つのグループを５℃で１４日間インキュベートし、第二群を１０℃で１４日間インキュベートし、そして第三群を２０℃で５日間インキュベートした。図２７に要約した結果は、MFが試験した全ての条件のもと有意な保護を提供することをはっきりと示している。特に印象的なのは、冷蔵保存のもとでMfにより完全な保護が与えられたトマトである。
【０１０３】
本発明はそれらの特定の態様に関して説明したが、多数の代替物、修飾及び変更は当業者にとって明らかであることは自明である。従って、特許請求の範囲の精神及び広い範囲の中にある全てのそのような代替物、修飾及び変更を包含することが意図される。
【０１０４】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許文献が各刊行物、特許又は特許文献が具体的に且つ個別に引用によって本明細書に組み入れられることが示唆されるような程度まで、引用によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。更に、本明細書中のあらゆる引用の記載及び識別は、そのような引用が本発明に対する従来技術として利用可能であるという許可としてみなされるべきではない。
【０１０５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、４℃でインキュベートした、本発明の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)並びにメツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）及びクルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerance)（４１４）についての時間の関数としての細胞数のグラフであり、Mfが低温で他の酵母よりも早く増殖することを示している。
【図２】図２は、柑橘類の果実の表面の傷中の、本発明の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)についての時間の関数としての、傷当たりのコロニー形成単位(cfu)のグラフである。
【図３】図３は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)によるレッドグレープフルーツのペニシリウム・ディジタツム(Penicillium digitatum)(Pd)によって生じた腐敗(%)の遅れ及び染み込まされたグレープフルーツの皮から得られた外来性の栄養素の添加の効果を例示するヒストグラムである。
【図４】図４は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)に対する、P. ディジタツム(Penicillium digitatum)によって生じたアオカビの腐敗の応答が濃度依存性であることを例示するヒストグラムである。
【図５】図５は、固形の増殖培地中での本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)のによる異なる収穫後の病原菌の長距離の阻害の欠如を示すペトリ皿の写真である。
【図６】図６は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)と、それらの生物学的制御活性を有する酵母単離物#47及び#273の間の、リンゴ上のペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)に対するキチン分解活性の相関を例示するヒストグラムである。差し込み図は、酵母Mfが他の酵母単離物と比較して大量のキチナーゼを産生することを示している。
【図７】図７は、食用ブドウのボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)に対する、本発明の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)と、殺菌剤ロブラール（イプロジオン）との相乗効作用を例示するヒストグラムである。
【図８】図８は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)と、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)及びペニシリウム種(Penicillium sp.)を制御するために使用される種々の殺菌剤とについての時間の関数としてのcfuのグラフである。表したデータは、Mfが試験した殺菌剤と両立することができ、且つそれらに影響を受けないことを示している。
【図９】図９は、畑での利用と収穫の間の、食用ブドウ（栽培品種Superior）上の、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)、メツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）及びクルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerance)（４１４）についての時間の関数としてのcfuのグラフである。
【図１０】図１０は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger),によって引き起こされる食用ブドウの腐敗に対する本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果を他の酵母単離物と比較するヒストグラムである。
【図１１】図１１は、研究所のアッセイにおいてボツリチス(Botrytis)によって引き起こされる食用ブドウの腐敗に対する本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果を他の酵母単離物と比較するヒストグラムである。
【図１２Ａ】図１２Aは、腐敗した房のパーセントと、未処理のコントロール及び化学的に処理されたブドウと比較した、畑で適用された108細胞/mlの本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果のヒストグラムである。アスペルギルス(Aspergillus)、ボツリチス(Botrytis)及びリゾプス(Rhizopus)の増殖を示す。
【図１２Ｂ】図１２Bは、病気の指数と、未処理のコントロール及び化学的に処理されたブドウと比較した、畑で適用された108細胞/mlの本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果のヒストグラムである。アスペルギルス(Aspergillus)、ボツリチス(Botrytis)及びリゾプス(Rhizopus)の増殖を示す。
【図１３Ａ】図１３Aは、畑におけるリゾプス(Rhizopus)の感染の結果としての病気の指数と、M. ラウカウフィイ(M. raukaufii)又はK. サーモトレランス(K. thermotolerance)と比較した、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果のヒストグラムである。
【図１３Ｂ】図１３Bは、畑におけるリゾプス(Rhizopus)の感染の結果としての腐敗した房のパーセントと、M. ラウカウフィイ(M. raukaufii)又はK. サーモトレランス(K. thermotolerance)と比較した、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果のヒストグラムである。
【図１４】図１４は、未処理のもの（コントロール）及び、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(108細胞/ml(Mf)及び107 (Mf-1)細胞/ml)で畑で処理されたブドウについての、腐敗したベリー/3kgを示すヒストグラムである。腐敗は、収穫後に発生したボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)によって引き起こされた。
【図１５】図１５は、未処理のもの（コントロール）と本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(108細胞/ml(Mf)及び107 (Mf-1)細胞/ml)で畑で処理されたブドウを比較する、保存の結果として腐敗したベリー/3kgを示すヒストグラムである。腐敗は、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea), リゾプス・ストロニファー(Rhizopus stolonifer), 及びアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)によって引き起こされた。
【図１６】図１６は、アスペルギルス(Aspergillus)及びボツリチス(Botrytis)及びリゾプス(Rhizopus)によって引き起こされた畑でのブドウに対する損傷の制御において、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果を、メツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）及びクルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerance)（４１４）及びミトスと比較するヒストグラムである。
【図１７Ａ】図１７Aは、白ユリの球根上のフサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)の腐敗の制御において、C. オレオフィラ(Candida oleophila)及びB.サブチリス(Bacillus subtilis)と比較した本発明の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果を例示するヒストグラムである。
【図１７Ｂ】図１７Bは、白ユリの球根上のフサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)の腐敗の制御において、C. オレオフィラ(Candida oleophila)及びB.サブチリス(Bacillus subtilis)と比較した本発明の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果を例示するヒストグラムである。
【図１８Ａ】図１８Aは、白ユリの球根上のペニシリウム・ヒルスツム(Penicillium hirsutum)の腐敗の制御において、C. オレオフィラ(Candida oleophila)及びB.サブチリス(Bacillus subtilis)と比較した本発明の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果を例示するヒストグラムである。
【図１８Ｂ】図１８Bは、白ユリの球根上のペニシリウム・ヒルスツム(Penicillium hirsutum)の腐敗の制御において、C. オレオフィラ(Candida oleophila)及びB.サブチリス(Bacillus subtilis)と比較した本発明の酵母メツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の効果を例示するヒストグラムである。
【図１９】図１９は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)又はカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)の存在下での、０℃で３０日間の保存及び室温での追加の１０日間の保存の間の、種々の病原菌によるネクタリンの天然の感染に由来する腐敗の合計のパーセントを例示するヒストグラムである。
【図２０】図２０は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)又はカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)の存在下での、ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)によるネクタリンの人工的な感染後の感染した傷のパーセントを例示するヒストグラムである。
【図２１】図２１は、ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)によるネクタリンの人工的な感染後の感染した傷のパーセントが、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の適用した用量に比例して低下することを例示するヒストグラムである。
【図２２】図２２は、ペニシリウム・エクスパンサム(Penicillium expansum)による人工的な感染後のリンゴの腐敗の合計のパーセントが、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の適用した濃度により変化することを例示するヒストグラムである。
【図２３Ａ】図２３Aは、畑におけるイチゴのボツリチス(Botrytis)の腐敗の進行に対する本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の収穫前の適用の効果を例示するグラフである。テルドール 50% (WG power formulation)-015%; テルドール５００（液体製剤-0.15%; スィッチ-0.06% (0.06g/m2(60g/dunam)); スィッチ 0.1%(0.1g/m2 (100g/duman))。
【図２３Ｂ】図２３Bは、畑におけるイチゴのボツリチス(Botrytis)の腐敗の進行に対する本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の収穫後の保存の間の効果を例示するヒストグラムである。テルドール 50% (WG power formulation)-015%; テルドール５００（液体製剤-0.15%; スィッチ-0.06% (60g/dunam); スィッチ 0.1%(100g/duman)。
【図２４】図２４は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)又はメツシュニコウィア・ロイカフティ(Metchnikowia reukafti)（２３１）又はカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)（１８２）の存在下又は不在下でのグレープフルーツのアオカビの腐敗に由来する腐敗の合計のパーセントを例示する一連のヒストグラムである。
【図２５】図２５は、適用されたメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)に対する、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)に人工的に感染したチェリートマトの腐敗のパーセントの濃度依存性を示すヒストグラムである。
【図２６】図２６は、セイヨウザクラ上での、且つ冷蔵保存（０℃で３０日及び２４℃で更に４日の保存の後）の間及び後の、ボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)に由来する天然の腐敗を減少させる本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf: 108細胞/ml)の能力及びC. オレオフィラ(Candida oleophila)の能力を例示する腐敗した果実のパーセントのヒストグラムである。
【図２７】図２７は、本発明のメツシュニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)(Mf)の存在下又は不在下での、且つ異なる保存温度での、チェリートマト上でのボツリチス・シネレア(Botrytis cinerea)(5x104胞子/ml)に由来する腐敗のパーセントを例示するヒストグラムである。