(57)【要約】  【課題】  本発明の課題は、簡略化され、かつ効率が改善されたＤＮＡ組換え方法を提供することにある。  【解決手段】  上記課題は、ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を挿入する組換えＤＮＡの調製方法であって、（ａ）ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、該ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとを同時に切断する反応と、（ｂ）ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を該ベクターＤＮＡに挿入する反応を、同一の反応場所において実質的に同時に行う工程を含む、組換えＤＮＡの調製方法によって解決される。【選択図】図１
2009025209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を挿入する組換えＤＮＡの調製方法であって、
（a）ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、該ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとを同時に切断する反応と、
（b）ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を該ベクターＤＮＡに挿入する反応を、
同一の反応場所において実質的に同時に行う工程を含む、組換えＤＮＡの調製方法。
【請求項２】
ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を挿入する組換えＤＮＡの調製方法であって、
（a）ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、該ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの両端とを同時に切断する反応と、
（b）ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を該ベクターＤＮＡに挿入する反応を、
同一の反応場所において実質的に同時に行う工程を含む、組換えＤＮＡの調製方法。
【請求項３】
前記制限酵素が、前記ＤＮＡ認識部位から所定の距離離れた部位を前記ＤＮＡ切断部位として認識して切断するものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記制限酵素が、ClassIIS制限酵素である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記目的ＤＮＡ断片がそれぞれ異なる配列を持つ複数のＤＮＡ断片であり、前記ベクターＤＮＡに該複数の目的ＤＮＡ断片を同時に挿入することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
PCRによって増幅した目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡと、PCRによって増幅したベクターＤＮＡとを含むPCR溶液にＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を添加してなる溶液を用いて、上記（a）および（b）の反応を行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡの調製方法に関し、さらに詳しくは、ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を簡略化された手段で効率よく挿入する組換えＤＮＡの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を組換える技術は、1970年代に実用化されたものの、現在も依然として当時と同等の方法が広く用いられている。すなわち、プラスミドと呼ばれる遺伝子のベクター（媒介体）を制限酵素で切断し、目的の遺伝子をＤＮＡ連結酵素で連結させる方法である。この方法により、遺伝子の組換えが広範囲に可能となり、様々な分野に大きな影響を与えた。【０００３】
目的の遺伝子を組換えるためには、まず、目的の遺伝子とベクターを、PCR法や大腸菌、λファージなどを用いて大量調製する必要がある。次に目的遺伝子とベクターの両端を制限酵素で処理し、それぞれの両端が相補的に結合できる形にする。ベクターの自己連結を防ぐ目的で、ベクターＤＮＡの脱リン酸化を行うこともある。この後、電気泳動法などにより目的のサイズのＤＮＡ断片のみを分離し精製する。こうして得られたＤＮＡ断片とベクターとを試験管内で一定のモル比で混ぜ合わせ、ＤＮＡ連結酵素を作用させることでベクターと目的ＤＮＡ断片が結合した環状のＤＮＡが得られる。この環状ＤＮＡを用いて大腸菌などの宿主細胞を形質転換し、大腸菌コロニーをスクリーニングすることで、目的の遺伝子が組み込まれた大腸菌を特定する。こうして得られた組換え大腸菌を培養し、そこからプラスミドＤＮＡを精製することにより、目的の遺伝子が組み込まれたプラスミドが得られる。
しかしながら、上記のような従来法においては、操作が複雑かつ煩雑なため熟練するまでに時間を要するものであった。また、従来法においては、大部分が手作業によるため、遺伝子組換えを要する研究においては、研究者の時間の多くを遺伝子組換え作業に費やさざるをえなかった。
なお最近、制限酵素によって生成された核酸断片の方向性を制御して、方向性のあるクローニングを行なうためのベクターを作製する方法が報告されている（例えば、特開２００７−５０８０１２号公報参照）。
【特許文献１】特開２００７−５０８０１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来技術の問題点を考慮し、簡略化され、かつ効率が改善されたＤＮＡ組換え方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の制限酵素とDNA連結酵素とを組み合わせて用いることにより、多段階の工程を簡略化することができ、簡便で効率良くＤＮＡの組換えを行うことができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は、以下に記載の組換えＤＮＡの調製方法を提供するものである。【０００６】
（１）
(i) ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を挿入する組換えＤＮＡの調製方法であって、
（a）ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、該ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとを同時に切断する反応と、
（b）ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を該ベクターＤＮＡに挿入する反応を、
同一の反応場所において実質的に同時に行う工程を含む、組換えＤＮＡの調製方法。
(ii) ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を挿入する組換えＤＮＡの調製方法であって、
（a）ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、該ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの両端とを同時に切断する反応と、
（b）ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を該ベクターＤＮＡに挿入する反応を、
同一の反応場所において実質的に同時に行う工程を含む、組換えＤＮＡの調製方法。
（２）前記制限酵素が、前記ＤＮＡ認識部位から所定の距離離れた部位を前記ＤＮＡ切断部位として認識して切断するものである上記（１）に記載の方法。
（３）前記制限酵素が、ClassIIS制限酵素である上記（１）に記載の方法。
（４）前記目的ＤＮＡ断片がそれぞれ異なる配列を持つ複数のＤＮＡ断片であり、前記ベクターＤＮＡに該複数の目的ＤＮＡ断片を同時に挿入することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）PCRによって増幅した目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡと、PCRによって増幅したベクターＤＮＡとを含むPCR溶液にＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を添加してなる溶液を用いて、上記（a）および（b）の反応を行う、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。【０００７】
本発明はさらに次のような方法も提供する。
（６）前記制限酵素が４塩基以上のＤＮＡ認識部位を認識する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記制限酵素が７塩基以上のＤＮＡ認識部位を認識する上記（６）に記載の方法。
（８）前記ClassIIS制限酵素が、LguI、BfuAI、FokI、BsmAI、BsmFI、SfaNI、またはBbvIである上記（３）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（９）前記ClassIIS制限酵素が、LguIである上記（８）に記載の方法。
（１０）前記ClassIIS制限酵素が、BfuAIである上記（８）に記載の方法。
（１１）前記ＤＮＡ連結酵素が、T4 DNAリガーゼ、E. coli DNAリガーゼまたはT7 DNAリガーゼである、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記ベクターＤＮＡがプラスミドベクターＤＮＡである上記（１）〜〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記ベクターＤＮＡ、前記目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、前記制限酵素および前記ＤＮＡ連結酵素を、同一反応容器内で同時に接触させる、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記目的ＤＮＡ断片が遺伝子を含む上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）前記ポリメラーゼ阻害剤がアフィディコリンである上記（５）〜（１４）のいずれかに記載の方法。【０００８】
また、本発明は以下の方法も提供する。
（１６）前記ベクターＤＮＡおよび前記目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡが、前記制限酵素のＤＮＡ認識部位を含む上記（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記ベクターＤＮＡおよび前記目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡが、互いに相補的な前記制限酵素のＤＮＡ切断部位を含む上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
上記構成からなる本発明によるＤＮＡ組換え方法によれば、ＤＮＡ組換えの作業時間と労力を大幅に削減することができる。また、本発明により、効率的にＤＮＡを組換えることができる。また、本発明の好ましい態様によれば、従来の方法では非常に困難であった、複数のＤＮＡ断片を同時にベクターに挿入することも容易に実現できるという効果も奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における、用語「組換え」は、ある個体の中に外部から特定のＤＮＡを注入することによって個体の遺伝情報を変異させる技術をいう。本明細書で用いる「組換えＤＮＡ」という用語は、自然界で通常は一緒には見出されない少なくとも2つのヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドＤＮＡ分子を指す。【００１１】
本発明の第１の態様は、ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を挿入する組換えＤＮＡの調製方法であって、以下の反応（a）および（b）を同一の反応場所において実質的に同時に行う工程を含むことを特徴とするものである。
（a）ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、該ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとを同時に切断する反応
（b）ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を該ベクターＤＮＡに挿入する反応【００１２】
反応（a）は、ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとを同時に切断する反応である。反応（a）で切断される該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの切断部位は、当該ＤＮＡの両端であってもよい。
ここで、「制限酵素」という用語は、ＤＮＡの特定の塩基配列を認識して切断する酵素をいう。
ここでいう、ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素とは、制限酵素がＤＮＡ認識部位または、認識ヌクレオチド配列と称する特定の二本鎖ＤＮＡ配列と結合するものの、その特定の認識部位では、ＤＮＡを切断せずに、少なくとも1bp離れた部位（好ましくは、所定の距離離れた部位）の配列をＤＮＡ切断部位として認識し二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を意味する。本発明で使用される制限酵素の種類は、このような性質をもっていれば特に限定されないが、II型制限酵素が好ましく、なかでも特に、ＤＮＡ認識部位が４塩基以上、５塩基以上、６塩基以上、特に７塩基以上のものが好ましく、好ましくは、20塩基以下、18塩基以下、16塩基以下、14塩基以下、12塩基以下のものが好適である。また、II型制限酵素の切断様式としては、平滑末端を生じる制限酵素または付着末端を生じる制限酵素でもよいが、付着末端を生じる型が好ましい。本発明で使用される制限酵素は、特にＤＮＡ認識部位とは離れた部位を切断する機能を有し、切断断片は一定の配列ではない数個（２〜６個）の塩基の付着末端を有することを特徴とする、例えばClassIIS制限酵素が好ましい。ClassIIS制限酵素は、その非対称認識部位から最大20bp離れた一定の距離離れた切断部位で二本鎖ＤＮＡを切断する（Szynbalski, W., Gene, 40:169, 1985）ことが知られている。【００１３】
本発明で用いられる「ClassIIS制限酵素」の例としては、特に限定されないが、具体的には以下に示すものがあげられる。以下の例ではClassIIS制限酵素を、その切断によって生成する塩基配列断片の突出付着末端の型によって分類する。【００１４】
（ClassIIS制限酵素の例）
１塩基突出付着末端型：
AsuHPI, BciVI, BfiI, BfuI, BmrI, BmuI, Hin4II, HphI, HpyAV, MboII, MnlI, NcuI, AclWI, AlwI, BccI, BcefI, BinI, BspPI, BstH9I, Bst31TI, EacI, HpyC1I, PleI, PpsI
２塩基突出付着末端型：
AcuI, Asp26HI, Asp27HI, Asp35HI, Asp36HI, Asp40HI, Asp50HI, Bce83I, BcgI, BcgI, BmaHI, BpmI, BpuEI, BsaMI, BscCI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BsgI, BsmI, BspCNI, BspKT5I, BsrI, BsrDI, BsrSI, Bst11I, BstF5I, BtsI, BtsCI, CspCI, CspCI, CstMI, EciI, Eco57I, Eco57MI, GsuI, MmeI, Mva1269I, NmeAIII, PctI, TaqII, TaqII, TsoI, Tsp1I, TspDTI, TspGWI, Tth111II, AciI, BceAI, Bme585I, BscAI, BspACI, Bst19I, BstFZ438I, FauI, SmuI, SsiI【００１５】
３塩基突出付着末端型：
BsaXI, BsaXI, RleAI, AbeI, BbvCI, Bco5I, Bco116I, BcoKI, Bpu10I, BpuDI, BseZI, BspQI, BssIMI, Bst6I, Bsu6I, Eam1104I, EarI, Ksp632I, LguI, PciSI, SapI, SimI, VpaK32I
４塩基突出付着末端型
AarI, Acc36I, AceIII, Alw26I, AlwXI, BauI, Bbr7I, BbsI, BbvI, BbvII, Bbv16II, BfuAI, Bli736I, BpiI, BpuAI, BpuSI, BsaI, Bsc91I, BseKI, BseXI, BseYI, BsiI, BslFI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, Bso31I, BsoMAI, Bsp423I, BspBS31I, BspIS4I, BspLU11III, BspMI, BspST5I, BspTNI, BspTS514I, BssSI, Bst12I, Bst71I, Bst2BI, BstBS32I, BstGZ53I, BstMAI, BstOZ616I, BstTS5I, BstV1I, BstV2I, BtgZI, BveI, Eco31I, EcoA4I, EcoO44I, Esp3I, FaqI, FokI, GdiII, LweI, PhaI, SfaNI, Sth132I, StsI
５塩基突出付着末端：
AjuI, AjuI, AloI, AloI, BaeI, BaeI, Bsp24I, Bsp24I, Hin4I, Hin4I, PpiI, PpiI, PsrI, PsrI, TstI, TstI, CseI, HgaI
６塩基突出付着末端型：
CjeI, CjeI, CjePI, CjePI
また、ClassIIS制限酵素として、上記のイソシゾマーをここで用いることができる。【００１６】
これらの中では、LguI（コスモバイオ製（Fermentas））、BfuAI、FokI（宝酒造製）、BsmAIまたはBsmFI（バイオラボ製）、SfaNIまたはBbvIを好適に用いることができる。【００１７】
工程（a）の反応は、当業者に公知の条件で行うことができる（文献：Gene. 1985;40(2-3):169-73. Universal restriction endonucleases: designing novel cleavage specificities by combining adapter oligodeoxynucleotide and enzyme moieties.）。ここで用いられる反応溶液としては、制限酵素を反応させるのに適切なバッファー、例えば、Tris-HCl、Tris-acetate, K-acetate、MgCl2、Mg-acetate、DTT、2-mercaptoethanol、BSAまたはATPなどを好適に組み合わせて用いることができる。この反応系の温度は、例えば、１５〜９０℃、好ましくは２５〜５０℃の範囲である。【００１８】
本明細書において、「目的ＤＮＡ断片」とは、通常、それによってコードされるタンパク質を発現させるために、ベクターに挿入するターゲットとなるものをいう。目的ＤＮＡ断片は、遺伝子を含むＤＮＡであることが好ましいが、また遺伝子以外のＤＮＡ断片、例えばプロモーター、イントロン、RNAi用ベクターなどであっても良い。目的ＤＮＡ断片は、さらに付着末端配列、ベクターへの挿入や遺伝子の読み枠の調製に必要なリンカー配列、遺伝子の適切な発現に必要な配列（例えば、コザック配列、ＳＤ配列、ターミネーター）を有することもできる。
目的ＤＮＡ断片は、反応（a）において、制限酵素により目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを切断することにより、生成される。【００１９】
上記遺伝子等の目的ＤＮＡ断片を含む核酸（ＤＮＡ）は、当業者であれば、一般的な遺伝子組換え技術を利用して容易に作製することができる（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001など参照）。たとえば、増幅したい核酸を含むように設計されたプライマーを使用して、PCRまたはRT-PCR等を行うことによって増幅することができる。テンプレートとして、これらの遺伝子を発現している細胞由来のＲＮＡまたはｃＤＮＡなど、あるいは目的ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを使用することができる。また、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡは、大腸菌、λファージなどを用いて作製することもできる。
さらに、本発明の反応（a）では、目的ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとして、ベクターに含まれた形態のまま利用することもできる。
本発明においてＤＮＡを迅速に組換えるために、当該ベクターはPCRによって増幅したベクター、すなわちPCR産物であることが好ましい。本発明の反応（a）においてPCRで増幅したベクターを、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとして用いる場合、PCR溶液に含まれる残りのテンプレートDNAをDpnIで切断し、予めPCR溶液から排除しておくことが好ましい。DpnIはメチル化DNAのみを特異的に切断する制限酵素である。【００２０】
目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの分離精製は、従来公知の方法で行うことができる。例えば、アガロースゲルを用いる電気泳動法などの一般的な分離精製技術を用いることができる。
なお、コンタミネーションを除く、精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば市販されている精製キットなどを使用して行うことができる。【００２１】
該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの長さは特に限定されないが、５０〜２００００塩基、より好ましくは、１００〜１００００塩基、さらに好ましくは５００〜５０００塩基（末端部分を含む）のものが好適である。付着末端部分の長さも特に限定されないが、１〜８塩基、好ましくは2〜4塩基が好適である。【００２２】
本発明に用いられる該目的ＤＮＡ断片は、一種類であっても、また異なる配列を持つ２種類以上の複数の遺伝子であっても良いが、効率的に組換えを行なうためには、用いられる目的ＤＮＡ断片は４種類以下が好ましい。ただし、異なる目的ＤＮＡ断片は、いずれも該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを同一の制限酵素で切断されて得られるものであり、目的ＤＮＡ断片同士が連結できるようにその両端の付着末端が、互いに相補的な関係にあり、さらに、ベクターＤＮＡと連結する目的ＤＮＡ断片の付着末端が当該反応において同時に作製されるベクターＤＮＡの付着末端と相補的なものが好ましい。ベクターＤＮＡに複数の目的ＤＮＡ断片を同時に挿入するには、反応（a）で用いられる目的ＤＮＡ断片を含む複数のＤＮＡが、互いに相補的な制限酵素のＤＮＡ切断部位を有していればよく、さらに、当該ＤＮＡの中、ベクターＤＮＡと連結する目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡは、ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と相補的なＤＮＡ切断部位を有していればよい。【００２３】
本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしてはいかなるものでも良く例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、ファージミドベクター、λファージなどのバクテリオファージおよびレトロ ウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス、あるいはコスミド等の自己環状化できる核酸などが挙げられるが、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR325,pUC12,pUC13）、枯草菌由来プラスミド（例えば、pUB110,pTP5,pC194）、酵母由来プラスミド（例えば、pSH19,pSH15）などのプラスミドベクターを用いることが好ましい。
また、ベクターＤＮＡは、市販のベクターを用いてもよいし、当業者であれば、一般的な遺伝子組換え技術を使用して容易に作製することができる。具体的には、上記目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを調製する方法と同様の方法、例えばPCR法などによる増幅、電気泳動法による分離精製や、その他の方法を用いることができる。
PCRで増幅したベクターＤＮＡを用いる場合、メチル化DNAのみを特異的に切断するDpnIでPCR溶液に含まれる残りのテンプレートDNAを切断し、予めPCR溶液から排除することが好ましい。PCR反応液をDpnIで処理することにより、より迅速にDNAを組換えることが可能になる。【００２４】
該ベクターＤＮＡの長さは特に限定されないが、５００〜２００００塩基（付着末端部分を含む）、より好ましくは、１０００〜１００００塩基、さらに好ましくは２０００〜５０００塩基が好適である。付着末端部分の長さも特に限定されないが、１〜８塩基、好ましくは２〜４塩基が好適である。ただし、制限酵素の種類や、形質転換効率などを考慮して当該ベクターの選定は適切に行なわれるべきである。【００２５】
本発明における、ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位とは、該目的ＤＮＡ断片を挿入するために調製されるベクターＤＮＡ部位のことをいう。本発明の好ましい態様では、反応（a）で用いるベクターＤＮＡおよび目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡが、互いに相補的なＤＮＡ切断部位を有するため、ベクターＤＮＡをClass IIS制限酵素のように付着末端を生じる断片を生じる制限酵素を用いて、該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡと同時に切断すれば、ベクターＤＮＡの付着両端は、該ＤＮＡ断片の両端とそれぞれ相補的になるように調製することができる。【００２６】
ここで、本発明の反応（a）において、「目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ」および「ベクターＤＮＡ」は制限酵素により同時に切断されるため、これらのＤＮＡは反応（a）で使用される制限酵素のＤＮＡ認識配列を有する必要がある。
また、付着末端を生じる制限酵素を用いる場合は、反応（b）において目的ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとをＤＮＡ連結酵素により連結させるため、反応（a）において該制限酵素により同時に作製されるベクターＤＮＡの付着末端と目的ＤＮＡ断片の付着末端とは、互いに相補的である必要がある。このためには、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡおよびベクターＤＮＡが、互いに相補的な前記制限酵素のＤＮＡ切断部位を含んでいればよい。
具体的には、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡは、該制限酵素によるＤＮＡ認識配列に加えて、同酵素でベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片の挿入部位を切断して生じる付着末端と相補的な付着末端配列を含む必要がある。
また、ベクターＤＮＡも、該制限酵素によるＤＮＡ認識配列に加えて、同酵素で目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを切断して生じる付着末端と相補的な付着末端配列を含む必要がある。【００２７】
このようなＤＮＡ認識配列および付着末端配列は、PCR法などの公知の技術を利用して目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡおよびベクターＤＮＡに導入することができる。例えば、ＤＮＡ認識配列と付着末端配列のいずれかまたは両方を含むように設計されたプライマーを使用してPCR法を行うことにより、これらの配列を含む目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡまたはベクターＤＮＡを増幅することができる。当業者であれば、プライマーのＤＮＡ認識配列と付着末端配列との間の塩基数は、用いる制限酵素の性質に従って適宜設定することができる。
あるいは、このようなＤＮＡ認識配列および付着末端配列は、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡおよびベクターＤＮＡに、もともと含まれている配列や、これらのＤＮＡを調製する際に利用されるベクターＤＮＡに含まれている配列等を利用することもできる。
上記のように調製したＤＮＡ認識配列および付着末端配列を含む、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡおよびベクターＤＮＡを、該制限酵素に接触させることにより、互いに相補的な付着両端を有する目的ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡを同時に調製することができる。【００２８】
次に、反応（b）は、該目的ＤＮＡ断片を発現させるために、ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を、該ベクターＤＮＡに挿入する反応である。反応（b）は、反応（a）で得られた該目的ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡを、ＤＮＡ連結酵素に接触させることにより行うことができる。【００２９】
本明細書で用いるＤＮＡ連結酵素（ＤＮＡリガーゼ）とは、ＤＮＡの２本鎖の切断部分を連結させる酵素であり、隣接したＤＮＡ鎖の５’-リン酸末端と３’-OH末端をホスホジエステル結合で結合させるのに働く酵素である。本明細書において、ＤＮＡ連結酵素とは、反応（a）で得られる該目的ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位とを連結させ得るものであればどのようなものでもよい。本発明で使用されるＤＮＡ連結酵素は、例えば、T4 DNA ligase、T7 DNA ligase、E. coli DNA ligase、Ampligase（Epicentre Biotechnologies）、Pfu ligase（Stratagene）、Rma DNA ligase（Prokaria）、Tsc DNA ligase（Prokaria）、Tth DNA ligase（Eurogenetec）、Taq ligase（NEB）等があげられるが、これら以外の酵素でもATPまたはNAD+要求性のリガーゼで、かつ二本鎖特異的であれば本技術で用いることが可能である。
これらの中ではT4 DNAリガーゼ、E. coli DNAリガーゼまたはT7 DNAリガーゼなどを好適に使用できる。【００３０】
本発明においては、反応（a）および（b）を、同一の反応場所において実質的に同時に行う。例えば、一つの反応容器内において、反応（a）および（b）を同時に行なう。「実質的に同時」とは、実際には、反応（a）の切断反応が先に起こり、反応（b）の挿入反応がその直後に起こることを意味している。具体的には、前記ベクターＤＮＡ、前記目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、前記制限酵素および前記ＤＮＡ連結酵素を、同一反応容器内で同時に接触させる。より具体的には、反応（a）および（b）は、該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、制限酵素およびＤＮＡ連結酵素の四成分を適切な溶液中で混合して行なわれる。
また、遺伝子配列の異なる該目的ＤＮＡ断片をベクターに挿入するために、２種類以上の該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを、同時に混合して用いることもできる。【００３１】
ここで用いられる反応溶液としては、制限酵素および連結酵素に適切なバッファー、例えば、Tris-HCl, Tris-acetate, K-acetate, MgCl2, Mg-acetate, DTT, 2-mercaptoethanol, BSA, ATP、または市販の制限酵素や連結酵素用の調整済みバッファーなどを好適に組み合わせて用いることができる。反応系の温度は、例えば、４〜５０℃、好ましくは４〜３７℃の範囲であり、具体的には、制限酵素、連結酵素の至適な反応温度の範囲において反応させることが好ましい。【００３２】
反応容器は、特に限定しないが、耐熱、耐酸性を有するものであって、パイレックス（登録商標）や試験管などのガラス容器、またはポリプロピレンなどのプラスチック容器を好適に用いることができる。【００３３】
目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、制限酵素およびＤＮＡ連結酵素の四成分を溶液中で混合する場合、各物質の濃度は特に限定されないが、例えば、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡは10 pM〜10 nM、ベクターＤＮＡは10 pM〜10 nM、制限酵素は0.1〜100 ユニット/ml、好ましくは0.1〜10ユニット/ml、ＤＮＡ連結酵素は0.1〜100 ユニット/ml、好ましくは0.1〜10ユニット/ml、程度の濃度になるように混合するのが好ましい。
反応時間は特に限定しないが、10分〜３時間、好ましくは１時間〜２時間とするのが好ましい。【００３４】
ここで、図面を参照して本発明の組換えＤＮＡの調製方法を説明する。
図1は、本発明の組換えＤＮＡの調製方法における各反応工程を説明する図である。ここで、点線の長方形の枠はClassIIS制限酵素LguIのＤＮＡ認識部位、階段状の実線はＤＮＡ切断部位、細い線で囲まれた枠はテンプレートＤＮＡに特異的に結合する配列を示す。
まず、反応容器（例えば、試験管）内において、目的ＤＮＡ断片（ここでは、ＥＧＦＰ）を含むＤＮＡに制限酵素（ここではClassIISに分類されるLguI）を作用させると、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡの両端が切断され、付着末端を有する目的ＤＮＡ断片が得られる（反応ＩＩ）。また同時に、同一試験管内において、ベクターＤＮＡ（ここではプラスミドベクター）に同一の制限酵素を作用させることによって、目的ＤＮＡ断片を挿入できる部位（目的ＤＮＡ断片挿入部位）を持つ直鎖化ベクターが作製される（反応Ｉ）。
この時、同時にＤＮＡ連結酵素（ここではligase）も同じ試験管内に存在させると、制限酵素による切断（反応ＩおよびＩＩ）と、ＤＮＡ連結酵素による連結（ライゲーション；反応ＩおよびＩＩの逆反応）が同時に進行し、すなわち切断と連結を繰り返す平衡反応が起こる。
このとき、該直鎖化ベクターが上記ＤＮＡ断片の付着末端に相補的な付着末端を有している場合は、ＤＮＡ連結酵素により、該直鎖化ベクターと上記ＤＮＡ断片とが連結し（反応ＩＩＩ）、目的ＤＮＡ断片が組み込まれた環状のベクターＤＮＡが生成する反応も進行し得る。しかし、当該環状の組換えベクターＤＮＡには、もはやClassIIS制限酵素の認識部位が存在しないため、生成した組換えベクターＤＮＡがClass IIS制限酵素による切断を受けることはない。このため、反応IIIにおいては、ＤＮＡ連結酵素による、連結反応のみが不可逆的に進行することになる。このため、反応IまたはIIでの平衡は切断反応側に移動するために平衡反応はもはや起こらず、最終目的産物である組換えＤＮＡへの一方向の反応のみが起こる。【００３５】
したがって、本方法（FASTR法：Fully Automatic Single Tube Recombination）（旧REMDI法：Restriction Enzyme=Mediated DNA Incorporation）を利用すれば、目的ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを得るために、制限酵素によって別々にそれぞれを反応させる工程、それぞれの反応物について電気泳動法等を用いて分離精製する工程、脱リン酸化反応などのＤＮＡ断片を加工する工程、また両者を適切なモル比を調整して混合して連結させる工程等という、煩雑な多段階の工程を省略でき、目的の組換えＤＮＡを効率よく作成することが可能となる。【００３６】
また当該方法において、異なる配列を持つ目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡを複数存在させて、複数の目的ＤＮＡ断片を同時にベクターＤＮＡに挿入することもできる。目的ＤＮＡ断片が互いに連結するために、各目的ＤＮＡ断片の両端に位置する付着末端が別の目的ＤＮＡ断片の付着末端と相補的な関係にあり、さらに、挿入される目的ＤＮＡ断片がベクターＤＮＡと連結するために、ベクターと連結する目的ＤＮＡ断片の付着末端が、これらを組み込む直鎖化ベクターＤＮＡの両端の付着末端と相補的な関係にあればよい。また、複数の目的DNA断片が正しい順列で結合するためには、それぞれの断片の付着末端が正しい連結部位のみにおいて相補的であればよい。用いるＤＮＡがこれらの配列を有することにより、一度の操作で複数の目的ＤＮＡ断片を同時にそれぞれ、ベクターＤＮＡに導入して、組換えＤＮＡを得ることも可能であり、大幅に従来の工程を省力化させることが可能となる。【００３７】
なお、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、該目的ＤＮＡ断片を挿入するベクターＤＮＡをPCRで増幅を行なうと、PCR後のそれぞれのPCR溶液には熱耐性を持つＤＮＡポリメラーゼの活性が残存しており、当該増幅断片の突出末端が平滑化され得る。したがって、上記反応（a）および（b）の前処理として、事前にそれぞれのPCR溶液からＤＮＡ増幅断片を精製することが好ましい。
しかし、この方法では増幅された目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡと増幅されたベクターＤＮＡを用いて、目的ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡ断片に挿入する前に、増幅産物の精製工程が必要となり効率が悪い。そこで本発明者は、そのような精製工程を省略し得る方法を検討した結果、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤等を用いることにより精製工程を省略し、ＤＮＡ組換えを迅速化する方法を見出した。【００３８】
すなわち、本発明の好ましい態様によれば、目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡおよび目的ＤＮＡ断片を挿入するベクターＤＮＡをPCRにより増幅した後、ポリメラーゼ阻害剤等でＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害させたそれぞれのPCR溶液に対して、そのまま上記反応（a）および（b）を行なうことにより、ＤＮＡの組換えをより効率的に行なうことができる。【００３９】
なお、本明細書中において用いられる「阻害する」とは、好適にはPCR後のポリメラーゼ活性を完全に不可逆的に失わせることを意味するが、該活性を完全に失わせることができなくても、例えば、PCR後において、増幅断片の突出末端を平滑化するような残存するＤＮＡポリメラーゼ活性による副反応を防止する目的で、ＤＮＡポリメラーゼ活性の機能の一部を一時的に抑制させるという意味も含んで用いられる。【００４０】
ここで、上記の熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを阻害する、ポリメラーゼ阻害剤の化学的分子の例としては、アフィディコリン（aphidicolin）、アクチノマイシン D、マイトマイシン C、リファンピシン 2, 3-ジデオキシチミジン 5- ３リン酸（d2TTP）、１-β-D-アラビノフラノシルシトシン5- ３リン酸（araCTP）、ミカノライド、L-ホモセリルアミノエタノール、ケンフェロール 3-O-(6"-アセチル)-β-グルコピラノシド（KAG）、ケルセチン3-O-(6"-アセチル)-β-グルコピラノシド（QAG）等を挙げることができるが、ＤＮＡポリメラーゼの活性を特異的に阻害する化合物であればどのような化合物でも用いることが可能である。
また、上記ＤＮＡポリメラーゼの活性を一時的に中和する、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が挙げられる。このような抗体は、主に、PCRのホットスタート法において用いられるものであるが、本発明においても利用が可能である。
本発明でポリメラーゼ阻害剤として好適に用いられる市場で入手可能な抗体としては、例えばタックＤＮＡポリメラーゼモノクロナール抗体（AppliChem GmbH）、アンチタックモノクロナール抗体（eEnzyme LLC）、プラチナタック抗体（Invitrogen）、タック抗体（Novagen）、JumpStart（登録商標）タック抗体 （Sigma-Aldrich）およびタックポリメラーゼモノクロナール抗体（Takara）等があげられるが、これらに限定はされない。また、PCRで用いるポリメラーゼやその一部のペプチドをエピトープとして作製した抗体もＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として用いることができる。【００４１】
さらに、その他の物理的な方法でポリメラーゼを特異的に破壊する方法も用いることができる。PCRに用いられるポリメラーゼは、一般に耐熱性に優れているため、熱による処理だけでは十分に失活されない場合が多い。しかし、ＤＮＡの安定的な性質から、長時間の高温処理により上記ポリメラーゼの活性のみを特異的に阻害することは可能である。またｐＨを変動させることや、その他の中和可能な薬剤を用いることによって上記ポリメラーゼ活性のみを不可逆的に阻害させることも可能である。【００４２】
なお、PCRにより増幅した目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとベクターＤＮＡを含むそれぞれの溶液中にはテンプレートＤＮＡ（通常はプラスミドＤＮＡ）が混入しており、そのままの溶液を用いてＤＮＡ組換えを行なうと、目的とするＤＮＡ組換え体を含む大腸菌の出現頻度が著しく低下する。しかし、テンプレートＤＮＡとして使用されるプラスミドＤＮＡはヘミメチル化されているので、例えば認識される塩基配列がメチル化されている場合のみ切断反応が起こるＤｐｎＩのような酵素によってテンプレートＤＮＡのみを消化することができる。このように、ＤｐｎＩのような酵素によって反応液中に残存するテンプレートＤＮＡを消化することにより、効率よく目的とするＤＮＡ組換え体を形質転換に用いることができる。
【実施例】
【００４３】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。【００４４】
実施例１：LguIによるＤＮＡの組換え
１．PCR法による、目的ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片の増幅
目的ＤＮＡ断片としては図２に示すように、ＥＧＦＰ配列を、ベクターとしてはpRSET-B（Invitrogen）をそれぞれ用いた。反応溶液（120 mM Tris-HCl, 1 mM dNTP, 1.5 mM MgSO4, 10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4, 0.1% TitonX-100, 0.1 mg/ml BSA）にKOD plus DNAポリメラーゼ（Toyobo）を加えた。テンプレートにはＥＧＦＰ増幅用としてpcDNA3-ＥＧＦＰを、pRSET-B増幅用としてpRSET-Bを用いた。プライマーの組み合わせは図２のとおりである。
ここで、図２において普通大文字は順方向、上下反転大文字は逆方向のプライマー配列をそれぞれ示す。小文字はそれぞれの相補鎖配列を便宜的に示す。点線の長方形の枠はClassIIS制限酵素LguIの認識部位、階段状の実線は切断部位、細い線で囲まれた枠はテンプレートＤＮＡに特異的に結合する配列を示す。また、ＡはpRSET-Bに対するプライマーセット（配列番号８および配列番号９）、ＢはＥＧＦＰに対するプライマーセット（サンプル１：配列番号１１および配列番号１４、サンプル２：配列番号１１および配列番号２８、配列番号２９および配列番号１６）をそれぞれ示す。
反応サイクルは94℃2分を１サイクル、94℃15秒、60℃30秒、68℃90秒を35サイクル、68℃5分を1サイクル行った。サンプル１ではＥＧＦＰ1断片を、サンプル2では付着末端配列の異なるＥＧＦＰを２断片増幅した。【００４５】
２．電気泳動法による、反応産物の分離精製
PCR産物をアガロースゲル（1%アガロース、1×TAE（40mM Tris-acetate（pH8.3）、1mM EDTA））で分離し、それぞれの断片を精製した（QIAquick、Invitrogen）。PCR産物の電気泳動結果を図３に示す。ここで、１〜２レーンはpRSETベクター、３〜５レーンはＥＧＦＰ断片をそれぞれ示す。また、ＭはＤＮＡマーカー（2-log DNA marker, NEB）を示す。【００４６】
３．組換えベクターＤＮＡの作製
上記２．で精製したそれぞれのＤＮＡ断片と制限酵素およびＤＮＡ連結酵素とを混ぜ合わせ、室温にて静置した。具体的には、反応溶液（25 mM Tris-HCl, 16 mM Tris-acetate, 33 mM K-acetate, 5 mM MgCl2, 5 mM Mg-acetate, 5 mM DTT, 50μM 2-mercaptoethanol, 60μg/ml BSA, 0.5 mM ATP）にＤＮＡ断片とＤＮＡ連結酵素（1μl, T4 DNA Ligase, NEB）と制限酵素（5μl, LguI, Fermentas）を加え、室温で2時間静置した。【００４７】
４．組換えベクターＤＮＡの大腸菌での発現
上記３．で作製した組換えベクターＤＮＡを含む反応液5μlをコンピテント大腸菌（XL10 Gold, Stratagene）に加え、氷上で10分間静置した後、42℃で45秒熱処理した。大腸菌に200μlのLB培地を加え37℃で1時間培養した後、1×LBプレート（100μg/ml アンピシリン含有）に散布し、37℃で15時間培養した。
大腸菌コロニーをそれぞれのサンプル（サンプル１およびサンプル２）から8個ずつ合計16個選択し、各コロニーの一部をPCR溶液（1×GoTaqプレミックス(Promega)、T7フォワードプライマー、pRSETリバースプライマー）に懸濁し、コロニーダイレクトPCRを行った。【００４８】
５．組換えＤＮＡの特定
上記のPCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、PCR産物の断片長を計測した。
図４にコロニーダイレクトPCRの結果を示す。１〜８レーンはサンプル１、９〜１６レーンはサンプル２由来のコロニーから増幅した断片を示す。１〜８レーンのバンド950bpはサンプル１の断片が組み込まれたことを示している。また、９〜１６レーンでは、サンプル２で示される２断片が連結して同時に組み込まれているため、１断片サンプルの約２倍長のバンド（1650bp）が検出されている。ＭはＤＮＡサイズマーカー（2-log DNA marker, NEB）を示す。それぞれのサンプルにおいて、８コロニー中８個の陽性クローンを得た。【００４９】
６．クローン配列の解読
T7フォワードプライマーとpRSETリバースプライマーにより、目的ＤＮＡ断片とベクター間の結合部位付近の塩基配列を解読した結果を図５に示す。塩基配列を解読した結果、原理通りの結合が形成されていることが確認できる。【００５０】
実施例２：BfuAIによるＤＮＡの組換え
１．PCR法による、目的ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片の増幅
目的ＤＮＡ断片としてはＥＧＦＰ配列を、ベクターとしてはpRSET-B（Invitrogen）をそれぞれ用いた。反応溶液（120 mM Tris-HCl, 1 mM dNTP, 1.5 mM MgSO4, 10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4, 0.1%TitonX-100, 0.1 mg/ml BSA）にKOD plus DNAポリメラーゼ（Toyobo）を加えた。反応サイクルは94℃2分を１サイクル、94℃15秒、60℃30秒、68℃90秒を35サイクル、68℃5分を1サイクル行った。テンプレートにはＥＧＦＰ増幅用としてpcDNA3-ＥＧＦＰを、pRSET-B増幅用としてpRSET-Bを用いた。プライマーの組み合わせは図６のとおりである。
ここで、図６において普通大文字は順方向、上下反転大文字は逆方向のプライマー配列をそれぞれ示す。小文字はそれぞれの相補鎖配列を便宜的に示す。点線の長方形の枠はClassIIS制限酵素BfuAIの認識部位、階段状の実線は切断部位、細い線で囲まれた枠はテンプレートＤＮＡに特異的に結合する配列を示す。また、ＡはpRSET-Bに対するプライマーセット（配列番号２０および配列番号２１）、ＢはＥＧＦＰに対するプライマーセット（サンプル１：配列番号２３および配列番号２６、サンプル２：配列番号２３および配列番号３２、配列番号３３および配列番号３６）をそれぞれ示す。サンプル２では、異なる付着末端配列を含むＥＧＦＰを２断片増幅した。【００５１】
２．電気泳動法による、反応産物の分離精製
PCR産物をアガロースゲル（1%アガロース、1xTAE）で分離し、それぞれの断片を精製した（QIAquick、QIAGEN）。【００５２】
３．組換えベクターＤＮＡの作製
上記２．で精製したそれぞれのＤＮＡ断片と制限酵素およびＤＮＡ連結酵素とを混ぜ合わせ、室温にて静置した。具体的には、反応溶液（25 mM Tris-HCl, 16 mM Tris-acetate, 33 mM K-acetate, 5 mM MgCl2, 5 mM Mg-acetate, 5 mM DTT, 50μM 2-mercaptoethanol, 60μg/ml BSA, 0.5 mM ATP）にＤＮＡ断片とＤＮＡ連結酵素（1μl, T4 DNA Ligase, NEB）と制限酵素（5μl, BfuAI, NEB）を加え、室温で2時間静置した。その後、反応溶液を熱失活させた。【００５３】
４．組換えベクターＤＮＡの大腸菌での発現
上記３．で作製した組換え用ベクターＤＮＡを含む反応液5μlをコンピテント大腸菌（XL10 Gold, Stratagene）に加え、氷上で10分間静置した後、42℃で45秒熱処理した。大腸菌に200μlのLB培地を加え37℃で1時間培養した後、1×LBプレート（100μg/ml アンピシリン含有）に散布し、37℃で15時間培養した。
大腸菌コロニーをそれぞれのサンプル（サンプル１およびサンプル２）から8個ずつ合計16個選択し、各コロニーの一部をPCR溶液（1x GoTaqプレミックス(Promega)、T7フォワードプライマー、pRSETリバースプライマー）に懸濁し、コロニーダイレクトPCRを行った。【００５４】
５．組換えＤＮＡの特定
上記のPCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、PCR産物の断片長を計測した。
図７にコロニーダイレクトPCRの結果を示す。１〜８レーンはサンプル１、９〜１６レーンはサンプル２由来のコロニーから増幅した断片を示す。950bp付近のバンドは、サンプル１の断片（ＥＧＦＰ）が組み込まれたことを示している。また1650bp付近のバンドは、１断片サンプル（950bp）の約２倍長のバンドであるが、これはサンプル２で示される２断片（ＥＧＦＰ×2）が連結して同時に組み込まれていることを示している。ＭはＤＮＡサイズマーカー（2-log DNA marker, NEB）を示す。サンプル1では8コロニー中8個の陽性クローンを、サンプル２では８コロニー中５個の陽性クローンをそれぞれ得た。【００５５】
実施例３：ポリメラーゼ阻害剤によるＤＮＡ組換えの迅速化
１．PCR法による、目的ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片の増幅
実施例１と同じように、PCR法で、目的遺伝子とベクターのそれぞれのＤＮＡ断片を増幅した。目的遺伝子としてはＥＧＦＰ配列を、ベクターとしてはpRSET-B（LguI部位欠損型,Invitrogen）をそれぞれ用いた。反応溶液（120 mM Tris-HCl, 1 mM dNTP, 1.5 mM MgSO4, 10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4, 0.1%TitonX-100, 0.1 mg/ml BSA）にKOD plus DNAポリメラーゼ（Toyobo）を加えた。プライマーの組み合わせは図２のとおりである。反応サイクルはとしては、94℃2分を１サイクル、94℃15秒、60℃30秒、68℃90秒を45サイクル、68℃5分を１サイクルとして反応を行った。テンプレートにはＥＧＦＰ増幅用としてpcDNA3-ＥＧＦＰを、pRSET-B増幅用としてpRSET-Bを用いた。【００５６】
２．組換えベクターＤＮＡの作製
反応溶液（25 mM Tris-HCl, 16 mM Tris-acetate, 33 mM K-acetate, 5 mM MgCl2, 5 mM Mg-acetate, 5 mM DTT, 50μM 2-mercaptoethanol, 60μg/ml BSA, 0.5 mM ATP）に、上記１．においてそれぞれ個別に増幅した、目的ＤＮＡ断片を含む溶液およびベクターＤＮＡ断片を含む溶液を加え、これにＤＮＡ連結酵素（1μl, T4 DNA Ligase, NEB）、制限酵素（5μl, LguI, Fermentas）およびポリメラーゼ阻害剤（5 mM, aphidicolin, コスモバイオ）を加え、室温で2時間静置した。
さらに、上記の反応溶液に1μlのDpnI（NEB）を加えて37℃で30分間静置し、テンプレートＤＮＡのみを消化した。【００５７】
３．組換えベクターＤＮＡの大腸菌での発現
上記２．で作製した組換えベクターＤＮＡを含む反応溶液2.5μlを25μlのJM109コンピテント大腸菌（Stratagene）にトランスフォームし、LBプレート上に散布した。
翌日、LBプレートをイメージアナライザ（LAS-1000, 富士フィルム）で蛍光撮影し、画像解析ソフトウエア（MetaMorph,モレキュラデバイス）を用いて全コロニー数と蛍光コロニー数をそれぞれ計測した。図８において、大腸菌コロニーとして全コロニー、またＥＧＦＰ陽性として蛍光コロニーをそれぞれ示している。
１断片組換えの場合（図２：サンプル１）で３７３５コロニー中２７６９個が、２断片組換えの場合（図２：サンプル２）で９３６コロニー中６８８個が、それぞれＥＧＦＰ陽性となり、組換え効率はそれぞれ、７４．１％と７３．５％であった。
以上の実験によって、ポリメラーゼの残存活性を薬剤などで阻害することにより、PCR産物を直接組換え反応に使用可能であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、簡略化され、かつ効率が改善されたＤＮＡ組換え方法を提供することができる。このような本発明のＤＮＡ組換え方法を用いることによって、各種酵素およびインターフェロンやインターロイキンなどのサイトカインや、ホルモンなどの有用タンパク質を効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本発明の目的ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んでなる組換えＤＮＡを作製する方法を説明する図である。
【図２】図２は、実施例１における、LguIを用いたＤＮＡ組換えの模式図とプライマーの配列を示す。
【図３】図３は、実施例１において得られたPCR産物の電気泳動結果を示す。
【図４】図４は、実施例１において得られたコロニーダイレクトPCRの結果を示す。
【図５】図５は、実施例１において得られたＤＮＡシーケンシングによる結合部位付近の塩基配列の解読結果を示す。
【図６】図６は、実施例２における、BfuAIを用いたＤＮＡ組換えの模式図とプライマーの配列を示す。
【図７】図７は、実施例２において得られたコロニーダイレクトPCRの結果を示す。
【図８】図８は、実施例３において得られた組換えベクターＤＮＡの大腸菌での発現効率の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号１〜３６：合成ＤＮＡ
【図１】
2009025209.tif 000003
【図２】
2009025209.tif 000004
【図３】
2009025209.tif 000005
【図４】
2009025209.tif 000006
【図５】
2009025209.tif 000007
【図６】
2009025209.tif 000008
【図７】
2009025209.tif 000009
【図８】
2009025209.tif 000010
【配列表】
2009025209000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月18日(2009.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ベクターＤＮＡに目的ＤＮＡ断片を挿入する組換えＤＮＡの調製方法であって、
（ａ）ＤＮＡ認識部位とＤＮＡ切断部位とが異なる制限酵素の存在下、該ベクターＤＮＡの目的ＤＮＡ断片挿入部位と該目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡとを同時に切断する反応と、
（ｂ）ＤＮＡ連結酵素の存在下、該目的ＤＮＡ断片を該ベクターＤＮＡに挿入する反応を、
ＰＣＲによって増幅した目的ＤＮＡ断片を含むＤＮＡと、ＰＣＲによって増幅したベクターＤＮＡとを含むＰＣＲ溶液にＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を添加してなる溶液を用いて、同一の反応場所において実質的に同時に行う工程を含む、組換えＤＮＡの調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
上記ＰＣＲ溶液にさらにテンプレートＤＮＡを消化するＤｐｎＩを添加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2009025209.tif 000011
2009025209.tif 000012
2009025209.tif 000013
2009025209.tif 000014