(57)【要約】  本発明の課題は、超高圧処理後の膨潤を抑制できる脱細胞化軟組織の調製方法等を提供することである。  本発明に係る脱細胞化軟組織の調製方法は、単離された軟組織に媒体中で超高静水圧を印加することで、軟組織内の細胞を破壊する印加手順と、破壊された細胞を除去する除去手順と、を含む。媒体は、デキストラン等の水溶性多糖を含有する水溶液である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来の軟組織が脱細胞化された脱細胞化軟組織の調製方法であって、
単離された軟組織に媒体中で超高静水圧を印加することで、前記軟組織内の細胞を破壊する印加手順と、
破壊された細胞を除去する除去手順と、を含み、
前記媒体は、水溶性多糖を含有する水溶液である調製方法。
【請求項２】
前記水溶性多糖は、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、トレハロース、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリビニルピロリドンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
前記超高静水圧は、１０００気圧以上である請求項１又は２記載の調製方法。
【請求項４】
前記印加手順は、前記媒体の温度を、前記超高静水圧における前記媒体の融点以上に保持する温度保持手順を有する請求項１から３いずれか記載の調製方法。
【請求項５】
前記印加手順は、前記媒体に印加される印加圧が、前記媒体の融解圧以上になることを制限する圧力制限手順を有する請求項１から４いずれか記載の調製方法。
【請求項６】
前記軟組織は、角膜である請求項１から５いずれか記載の調製方法。
【請求項７】
動物に移植される移植片であって、
請求項１から６いずれか記載の調製方法で調製された脱細胞化軟組織を備える移植片。
【請求項８】
前記脱細胞化軟組織上に位置し、前記動物において前記軟組織に隣接する隣接組織を更に備える請求項７記載の移植片。
【請求項９】
請求項１から６いずれか記載の調製方法で調製された脱細胞化軟組織を備え、前記動物において前記軟組織に隣接する隣接組織の細胞を培養するために用いられる培養部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物に移植される移植片、及びこの移植片に適した軟組織の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物に移植される移植片の作製方法としては、生体組織をグルタルアルデヒド等の固定剤で化学処理する方法、又は生体組織から細胞成分を除去する方法が、広く使用され、臨床的に応用されている。【０００３】
例えば、角膜移植を所望する患者は、全世界に１００万人以上と見積もられている。しかし、多くの国々において、提供される眼球が不足しているため、角膜移植を受けられる患者数は年間約６万人程度にとどまっている。我が国においても、日本アイバンク協会に登録されている移植待機患者数が約５０００人であるのに対し、献眼者数は約１０００人、利用可能眼球数は約１５００個である。【０００４】
しかも、現在の角膜移植医療では、他人の角膜を移植する同種移植が採用されているため、原疾患による拒絶反応が問題となる。そこで、このような問題の抜本的な解決手段として、人工角膜の開発が待望されている。【０００５】
人工角膜の素材としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等の合成高分子が試みられている。しかし、これら素材と角膜組織との適合性が小さいため、生体角膜と人工角膜との接合部位における脱落や感染症が発生する場合がある。【０００６】
そこで、生体組織との適合性を向上するべく、生体組織から細胞を除去して残存する支持組織である脱細胞化組織を、移植片として使用する技術が近年開発された。脱細胞化組織は、合成高分子に比べ、生体組織に近似した物性を有するため、生体組織との適合性に優れる。【０００７】
従来の細胞除去方法としては、界面活性剤やタンパク質分解酵素等の薬液を生体組織に適用する化学的手法や、生体組織に対して５０００気圧以上の超高圧を水中で印加する超高圧処理法（特許文献１参照）が存在する。後者の方法は、感染症の防止が必ずしも確保されていないこと、移植後に薬剤を除去する必要があることといった前者の方法が有する問題を解決できる点で有利である。
【特許文献１】ＷＯ２００４−２４１７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前述した特許文献１に示される方法では、生体組織として軟組織を使用した場合、超高圧処理後の組織が大幅に膨潤するため、組織特性が低下するという問題がある。【０００９】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、超高圧処理後の膨潤を抑制できる脱細胞化軟組織の調製方法、この脱細胞化軟組織からなる移植片、及び脱細胞化軟組織を備える培養部材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、軟組織への超高静水圧の印加を、水溶性多糖を含有する水溶液中で行うことにより、組織の膨潤を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、具体的には、以下のようなものを提供する。【００１１】
（１）  動物由来の軟組織が脱細胞化された脱細胞化軟組織の調製方法であって、
単離された軟組織に媒体中で超高静水圧を印加することで、前記軟組織内の細胞を破壊する印加手順と、
破壊された細胞を除去する除去手順と、を含み、
前記媒体は、水溶性多糖を含有する水溶液である調製方法。【００１２】
（２）  前記水溶性多糖は、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、トレハロース、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリビニルピロリドンからなる群より選ばれる少なくとも１種である（１）記載の調製方法。【００１３】
（１）又は（２）の発明によれば、印加手順において軟組織内の細胞が破壊され、破壊された細胞が除去手順において除去されるため、脱細胞化軟組織が得られる。
ここで、印加手順における媒体として、水溶性多糖を含有する水溶液を採用したので、超高圧処理の印加後における軟組織の膨潤を抑制できる。【００１４】
（３）  前記超高静水圧は、１０００気圧以上である（１）又は（２）記載の調製方法。【００１５】
軟組織に印加される圧力が不足すると、軟組織内に存在する常在菌の細胞の破壊が不充分となり、調製された脱細胞化軟組織に常在菌が残存するおそれがある。
そこで（３）の発明によれば、超高静水圧を１０００気圧以上としたので、常在菌の細胞が充分に破壊され、脱細胞化組織への常在菌の残存が抑制される。よって、安全性を向上できる。【００１６】
（４）  前記印加手順は、前記媒体の温度を、前記超高静水圧における前記媒体の融点以上に保持する温度保持手順を有する（１）から（３）いずれか記載の調製方法。【００１７】
（４）の発明によれば、媒体の温度が超高静水圧における融点以上に保持されるので、超高静水圧まで昇圧された条件においても、媒体の凝固が抑制される。これにより、脱細胞化組織の構造や特性の損傷を抑制できる。【００１８】
（５）  前記印加手順は、前記媒体に印加される印加圧が、前記媒体の融解圧以上になることを制限する圧力制限手順を有する（１）から（４）いずれか記載の調製方法。【００１９】
（５）の発明によれば、印加圧が媒体の融解圧未満に調節されるので、印加手順における昇圧及び降圧の過程での媒体の凝固が抑制される。これにより、脱細胞化組織の構造や特性の損傷を抑制できる。【００２０】
（６）  前記軟組織は、角膜である（１）から（５）いずれか記載の調製方法。【００２１】
角膜由来の脱細胞化組織は、膨潤すると光透過性が低下するため、動物への移植後における有用性が低下する。
（６）の発明によれば、軟組織として角膜を採用したので、角膜由来の脱細胞化組織の膨潤が抑制される。これにより、動物への移植後における有用性を向上できる。【００２２】
（７）  動物に移植される移植片であって、
（１）から（６）いずれか記載の調製方法で調製された脱細胞化軟組織を備える移植片。【００２３】
（８）  前記脱細胞化軟組織上に位置し、前記動物において前記軟組織に隣接する隣接組織を更に備える（７）記載の移植片。【００２４】
（９）  （１）から（６）いずれか記載の調製方法で調製された脱細胞化軟組織を備え、前記動物において前記軟組織に隣接する隣接組織の細胞を培養するために用いられる培養部材。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、印加手順において軟組織内の細胞が破壊され、破壊された細胞が除去手順において除去されるため、脱細胞化軟組織が得られる。ここで、印加手順における媒体として、水溶性多糖を含有する水溶液を採用したので、超高圧処理の印加後における軟組織の膨潤を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施形態に係る調製方法で調製される脱細胞化組織の概略構成図である。
【図２】本発明の一実施例に係る調製方法で調製した脱細胞化組織の膨潤度及び脱細胞化の程度を示す図である。
【図３】本発明の一実施例に係る調製方法で調製した脱細胞化組織の膨潤度の程度を示す図である。
【図４】本発明の一実施例に係る調製方法で調製した脱細胞化組織の透明性を示す図である。
【図５】本発明の一実施例に係る調製方法で調製した脱細胞化組織の透過率を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施例に係る調製方法で調製した脱細胞化組織の力学的特性を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施例に係る移植片の移植直後における状態を示す図である。
【図８】本発明の一実施例に係る移植片の移植８週間後における状態を示す図である。
【図９】本発明の一実施例に係る移植片の移植８週間後における定着状態を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例に係る移植片を移植した際の隣接組織の再生状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明を限定することを意図するものではない。
【００２８】
＜調製方法＞
本発明の脱細胞化組織の調製方法は、印加手順と、除去手順とを含む。各手順の詳細を以下に説明する。
【００２９】
［印加手順］
印加手順は、単離された軟組織に媒体中で超高静水圧を印加することで、軟組織内の細胞を破壊する手順である。使用される軟組織としては、特に限定されないが、例えば、角膜、軟骨、気管、心膜、羊膜、及び皮膚が挙げられる。
【００３０】
ここで、超高静水圧は、軟組織に存在する常在菌の細胞を破壊できるとされる静水圧を指し、具体的には１０００気圧以上であることが好ましい。また、超高静水圧は、軟組織に存在する細菌を破壊できる点で４０００気圧以上であることがより好ましく、ウイルスを破壊できる点で６０００気圧以上であることが更に好ましい。
【００３１】
本発明で使用される媒体は、水溶性多糖を含有する水溶液である。この媒体中で超高静水圧の印加を行うことで、印加手順後における組織の膨潤を大幅に抑制できる。
【００３２】
水溶性多糖としては、特に限定されないが、例えば、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、トレハロース、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリビニルピロリドンが挙げられる。これら水溶性多糖は、１種単独で又は複数種を混合して使用されてよい。
【００３３】
水溶液における水溶性多糖の濃度は、印加される超高静水圧値、使用される軟組織の種類等に応じ、許容される範囲内に膨潤度を制限できるよう適宜設定されてよい。例えば、軟組織として角膜を使用する場合、水溶性多糖（例えば、デキストラン）の濃度は、通常１質量％以上１０質量％以下であってよい。
【００３４】
具体的な手順としては、例えば、まず、水不透過性フィルムの袋内に水溶性多糖を含有する水溶液を満たし、この水溶液に軟化組織を湿潤させる。そして、内部に気体が残留しないように留意しつつ、袋を厳重に密閉する。この袋を、超高静水圧処理装置（例えば、「Ｄｒ．ＣＨＥＦ（型式）」（神戸製鋼所社製））のチャンバー内に設置し、装置を作動させる。
【００３５】
なお、印加手順の時間は、所望の細胞破壊性が得られる限りにおいて特に限定されないが、通常１０分〜３０分程度でよい。
【００３６】
（温度保持手順）
印加手順は温度保持手順を有することが好ましく、この温度保持手順は、媒体の温度を、超高静水圧における媒体の融点以上に保持する手順である。これにより、超高静水圧まで昇圧された条件においても、媒体の凝固が抑制され、調製される脱細胞化組織の構造や特性の損傷を抑制できる。
【００３７】
なお、媒体の温度は、高すぎると脱細胞化組織の構造や特性が低下するおそれがあることから、通常２５℃〜４０℃であり、好ましくは３０℃付近である。
【００３８】
具体的な手順としては、まず、予め設定した超高静水圧値における媒体の融点を、媒体の組成に基づいて算出する。そして、超高静水圧処理装置を、そのチャンバー内温度が算出した融点以上となるように制御すればよい。媒体の温度は、一定値に固定してもよいし、媒体の融点以上の範囲で変動させてもよい。
【００３９】
（圧力制限手順）
印加手順は圧力制限手順を有することが好ましく、この圧力制限手順は、媒体に印加される印加圧が、媒体の融解圧以上になることを制限する手順である。印加圧の昇圧や降圧の開始時には、瞬間的に媒体の温度が急変し、軟組織の構造や特性が大きく損傷される場合がある。圧力制限手順では、媒体の組成に基づいて融解圧を予め算出し、特に印加圧の昇圧及び／又は降圧の速度を所定値以下に低減することで、媒体温度の急変を抑制する。これにより、昇圧及び降圧の過程での媒体の凝固が抑制され、脱細胞化組織の構造や特性の損傷をより抑制できる。
【００４０】
［除去手順］
除去手順は、破壊された細胞を除去する手順である。移植後において、破壊された細胞の残渣が免疫反応等を誘発することが懸念されるが、この懸念は除去手順により払拭される。
【００４１】
除去の方式は、特に限定されないが、組織の構造や特性の低下を抑制できる適切な液で組織を洗浄すればよい。ここで使用される液としては、例えば、水溶性多糖を含有する水溶液、ＰＢＳ水溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、公知の細胞培養液であってよいが、膨潤をより抑制できる点で、水溶性多糖を含有する水溶液が好ましい。
【００４２】
このようにして調製される脱細胞化組織の保存方式は、滅菌状態である限りにおいて特に限定されず、冷凍状態、液体内での湿潤状態、又は乾燥状態であってよい。保存方式が限定されないことは、本発明の脱細胞化組織の有利な点である。
【００４３】
＜移植片＞
本発明の脱細胞化組織は、動物に移植される移植片の構成として有用である。即ち、本発明の移植片は、前述の脱細胞化組織を備える。また、移植片は、脱細胞化組織が由来する軟組織が動物体内において隣接していた隣接組織を、脱細胞化組織上に備えてよい。例えば、脱細胞化組織（図１（Ｂ）参照）が由来する軟組織が角膜であった場合（図１（Ａ）参照）、隣接組織は角膜上皮又は角膜内皮となる。
【００４４】
＜培養部材＞
本発明の脱細胞化組織は、隣接組織の細胞を培養するために用いられる培養部材としても有用である。即ち、本発明の培養部材は、前述した脱細胞化組織を備えるものであり、この脱細胞化組織上に隣接組織由来の細胞を載置し、適切な条件下で培養することで、特別な装置を使用する必要なく且つ感染を抑制しつつ、細胞培養を行うことができる。これらの点は、従来公知の培養シートや羊膜に比べて格別に有利な効果である。
【実施例】
【００４５】
＜実施例１＞
食用ブタ養殖場からブタ由来の角膜を購入し、４℃にて搬送した。この角膜をＰＢＳ溶液で洗浄した後、媒体としての３．５質量％デキストラン７０を含むＰＢＳ溶液が満たされたポリエチレン製フィルムの袋内に湿潤させた。この袋を、「Ｄｒ．ＣＨＥＦ」（神戸製鋼所社製）のチャンバー内に載置し、温度を３０℃に保持しつつ、４０００気圧の静水圧を３０分間印加した（印加手順）。この間、昇圧及び降圧速度がそれぞれ５０００気圧／分となるように、「Ｄｒ．ＣＨＥＦ」を制御した（圧力制限手順）。その後、印加後の角膜をＰＢＳ溶液で７２時間洗浄し、角膜内部の細胞を除去した（除去手順）。これにより、脱細胞化組織を調製した。【００４６】
＜実施例２＞
印加圧を１００００気圧の静水圧とした点を除き、実施例１と同様の手順で、脱細胞化組織を調製した。【００４７】
＜実施例３＞
媒体の温度を１０℃とした点を除き、実施例２と同様の手順で、脱細胞化組織を調製した。【００４８】
＜比較例１＞
実施例１で使用した角膜を、１ｗ／ｖ％ＳＤＳを含むＰＢＳ溶液に３７℃で２４時間浸漬した後、ＰＢＳ溶液に２４時間浸漬した。これにより、脱細胞化組織を調製した。【００４９】
＜比較例２＞
実施例１で使用した角膜を、１ｗ／ｖ％「ＴｒｉｔｏｎＸ−１００」（登録商標）を含むＰＢＳ溶液に３７℃で２４時間浸漬した後、ＰＢＳ溶液に２４時間浸漬した。これにより、脱細胞化組織を調製した。【００５０】
＜比較例３＞
実施例１で使用した角膜を、１ｗ／ｖ％コール酸ナトリウムを含むＰＢＳ溶液に３７℃で２４時間浸漬した後、ＰＢＳ溶液に２４時間浸漬した。これにより、脱細胞化組織を調製した。【００５１】
＜比較例４＞
デキストラン７０を含むＰＢＳ溶液の代わりに、デキストラン７０を含まないＰＢＳ溶液を用いた点を除き、実施例１と同様の手順で脱細胞化組織を調製した。【００５２】
［評価］
（膨潤度）
実施例及び比較例で調製した脱細胞化組織と、対照区として実施例で使用した印加前の角膜（未処理）とについて、膨潤の程度を観察した。この結果を図２及び図３に示す。図２における（Ａ）は対照区、（Ｂ）は比較例１、（Ｃ）は比較例２、（Ｄ）は比較例３、（Ｅ）は実施例１、（Ｆ）は実施例２の結果をそれぞれ示す。また、（Ａ）、（Ｅ）、（Ｆ）は、各脱細胞化組織の上面図であり、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）は、各脱細胞化組織の側面図である。図３における左側は比較例４、右側は実施例１の結果を示す。【００５３】
図２（Ｂ）〜（Ｄ）に示されるように、化学的処理で脱細胞化を行った比較例１〜３の脱細胞化組織は、その膨潤が甚だしく、対照区における角膜（薄すぎるため、図示せず）の約３倍の膜厚となっていた。これに対して、実施例１及び２の脱細胞化組織は、対照区における角膜の約１．５倍の膜厚であった（図示せず）。従って、脱細胞化を超高静水圧で行うことで、従来技術に比べ、膨潤を格段に抑制できることが確認された。【００５４】
また、図３に示されるように、実施例１の脱細胞化組織は、比較例４の脱細胞化組織よりもはるかに膜厚が小さかった。これにより、水溶性多糖を含有する水溶液中で超高静水圧を印加することで、膨潤を格段に抑制できることが確認された。しかも、実施例１の脱細胞化組織は、比較例４の脱細胞化組織よりも全体的に透明性が高いことから、水溶性多糖を含有する水溶液中で超高静水圧を印加することで、角膜の透明性を向上できることも分かった。【００５５】
（脱細胞化の程度）
実施例及び比較例で調製した脱細胞化組織と、対照区として実施例で使用した印加前の角膜（未処理）との断面について、通常の手順でＨＥ染色を行った。染色後の各組織断面の顕微鏡写真を図２に示す。（Ｇ）は対照区、（Ｈ）はＳＤＳを用いた比較例、（Ｉ）はＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた比較例、（Ｊ）はコール酸ナトリウムを用いた比較例、（Ｋ）は実施例１、（Ｌ）は実施例２の結果をそれぞれ示す。【００５６】
図２（Ｇ）〜（Ｊ）に示されるように、対照区の角膜及び比較例の脱細胞化組織には、染色されたスポットが多数存在しており、細胞が充分に除去されていないことが分かる。これに対して、図２（Ｋ）、（Ｌ）に示されるように、実施例１、２の脱細胞化組織には、染色されたスポットが確認されず、細胞がほぼ完全に除去されたことが分かる。【００５７】
以上から、脱細胞化を超高静水圧で行うことで、膨潤を格段に抑制できるとともに、安全性も格段に向上できることが確認された。【００５８】
（構造の保持）
生体角膜は、角膜内皮細胞のポンプ機能により約７０％の膨潤度に調節され、その透明性が維持されていることが既に知られている。従って、角膜由来の脱細胞化組織を脱水により収縮させた際、透明性が回復するのであれば、移植後に膨潤度が調節されて透明性が回復する可能性が高く、移植片としての応用可能性が示唆されることになる。【００５９】
そこで、対照区の角膜と、実施例２で調製した脱細胞化組織とを、高張液である５０％、１００％グリセロール水溶液に２４時間浸漬することで、脱水処理を行った。その後の角膜及び脱細胞化組織を観察した。この結果を図４に示す。なお、（Ａ）は浸漬前の脱細胞化組織、（Ｂ）は５０％グリセロール水溶液による処理後の脱細胞化組織、（Ｃ）は１００％グリセロール水溶液による処理後の脱細胞化組織、（Ｄ）は１００％グリセロール水溶液による処理後の角膜をそれぞれ示す。【００６０】
（Ａ）に示されるように、脱水処理前の脱細胞化組織は、白濁し、透明性が低かった。これに対し、（Ｂ）、（Ｃ）に示されるように、脱水が進行するにつれ、脱細胞化組織の白濁が解消され、透明性が回復した。従って、実施例２の脱細胞化組織は、その構造が破壊されている訳ではなく、移植後に自然に脱水し、その透明性を回復できることが示唆された。【００６１】
次に、各組織の透過性を数値化して、比較することを試みた。即ち、実施例２、３で調製した脱細胞化組織とを、１００％グリセロール水溶液に７２時間浸漬し脱水処理を行う前後において、波長６００ｎｍでの吸光度を測定することで透過率を測定した。また、対照区として、角膜（対照区１）、この角膜をＰＢＳ溶液中に７２時間浸漬したもの（対照区２）、並びに３．５質量％デキストラン７０を含有するＰＢＳ溶液に浸漬したもの（対照区３）をそれぞれ用意し、その透過率を併せて測定した。この結果を図５に示す。なお、Ａは対照区１、Ｂは対照区２、Ｃは対照区３、Ｄは実施例３、Ｅは実施例４をそれぞれ示す。また、空白バーは脱水処理前の透過率、陰バーは脱水処理後の透過率を示す。【００６２】
Ａ、Ｄ、Ｅに示されるように、実施例２、３の脱細胞化組織はいずれも、脱水処理後に、その透過率が角膜と同等以上にまで回復することが確認された。従って、実施例２、３の脱細胞化組織は、その構造が破壊されている訳ではなく、移植後に自然に脱水し、その透明性を回復できることが示唆された。【００６３】
更に、実施例３の方が、実施例２よりも更に透過性が高かったことから、超高静水圧の印加を３０℃で行うことで、移植片としての有用性をより向上できることも示唆された。【００６４】
（力学強度）
次に、脱細胞化組織の力学的特性についての評価を行った。まず、実施例２、３で調製した脱細胞化組織と、これら脱細胞化組織を５０％グリセロール水溶液に３日間浸漬し脱水処理を行ったものとを、それぞれ幅３ｍｍ、長さ１５ｍｍの短冊状に切り取り、この切片に対して、力学試験機「レオナーＩＩ」（山電社製）を用いて、種々の張力を負荷した際の応力を計測した。また、対照区として、角膜（対照区１）、この角膜をＰＢＳ溶液中に７２時間浸漬したもの（対照区２）、並びに対照区２のものを１００質量％グリセロールに１時間浸漬したもの（対照区３）をそれぞれ用意し、張力及び応力の関係を併せて測定した。この結果を図６（Ａ）に示す。なお、図６（Ａ）におけるＡは実施例３、Ｂは実施例２、Ｃは実施例３の脱水処理後、Ｄは実施例２の脱水処理後、Ｅは対照区１、Ｆは対照区２、Ｆは対照区３をそれぞれ示す。【００６５】
Ａ〜Ｄに示されるように、実施例２、３で調製した脱細胞化組織は、優れた応力を示すとともに、脱水処理後においても、角膜と同等以上に高い応力を示すことが確認された。従って、移植後に自然に脱水した後も、角膜と同等の強度を保持できることが示唆された。【００６６】
更に、切片の厚みを測定し、応力歪み特性から弾性率を算出した。この結果を図６（Ｂ）に示す。なお、図６（Ｂ）におけるＡは対照区１、Ｂは対照区２、Ｃは実施例３、Ｄは実施例２を示し、空白バーは脱水処理前の弾性率、陰バーは脱水処理後の弾性率を示す。【００６７】
Ａ〜Ｄに示されるように、実施例２、３で調製した脱細胞化組織は、優れた弾性率を示すとともに、脱水処理後においても、角膜と同等以上に高い弾性率を示すことが確認された。従って、移植後に自然に脱水した後も、角膜と同等の弾性率を保持でき、角膜の代替物としての機能を充分に発揮できることが示唆された。【００６８】
（臨床１）
ウサギの角膜実質のみを、４箇所において部分的に切除した。一方、実施例２で調製した脱細胞化組織及び実施例２で使用した角膜を、切除部位と同じ大きさに切り取ることで、移植片を作製した。この移植片の各々を、切除部位に埋入し、残しておいた角膜上皮を被せた。この時点におけるウサギの眼球の状態を図７に示す。その後、ウサギを通常の条件で８週間飼育した後、眼球の状態を再び観察した。この結果を図８に示す。図７及び８における１及び４で示される切除部位には角膜の移植片を、２及び３で示される切除部位には脱細胞化組織の移植片を、それぞれ埋入した。【００６９】
図７及び８に示されるように、角膜の移植片を埋入した切除部位１、４は、移植直後において透明性を有していたが、移植８週間後において白濁していた。一方、実施例２の脱細胞化組織の移植片を埋入した切除部位２、３は、移植直後においてやや白濁していたものの、移植８週間後には周囲と同等レベルにまで透明化していた。【００７０】
更に、移植８週間後の角膜を回収し、その切除部位１及び２における切断面について、それぞれＨＥ染色を行った。染色後における顕微鏡写真を図９に示す。図９におけるＡは切除部位１、Ｂは切除部位２における断面である。【００７１】
図９に示されるように、切除部位１では埋入された移植片の周囲に多数の細胞が湿潤していることが観察され、免疫反応が活発に発生していることが分かった。これに対して、切除部位２では、移植片の周囲における細胞の湿潤がほとんど観察されず、移植片が周囲組織に定着していることが確認された。【００７２】
（臨床２）
角膜上皮を被せず、脱細胞化組織の移植片を露出させた点を除き、臨床１で述べると同様の手順で試験を行った。移植１週後、２週後、及び３週後において、フルオレセインナトリウムを、フローレンス試験紙を用いて眼球に滴下し、その後１〜１０分の間における眼球を蛍光照射下で観察した。なお、この蛍光色素は、角膜上皮を染色することはできず、角膜実質を染色できることが既に確認されている。この結果を図１０の上段に示す。観察後は試薬を生理食塩水にて洗い流し、１週間ごとに繰り返し観察を行った。また、移植１週後、２週後、及び３週後における眼球を可視光下で観察した結果を図１０の下段に示す。【００７３】
図１０の上段に示されるように、移植１週間後では上皮が存在しないために移植片が蛍光色素で染色されていたが、２週間後では染色される移植片の部位が限定的になり、３週間後では染色された部位はほとんど観察されなかった。これにより、実施例２の脱細胞化組織は、隣接組織である角膜上皮を再生する能力を備えることが実証された。【００７４】
また、図１０の下段に示されるように、移植１週間後では眼球の大部分が白濁していたが、２週間後では白濁部位が限定的になり、３週間後では眼球全体が透明になり、血管浸潤等の現象は観察されなかった。これにより、実施例２の脱細胞化組織は、移植後に透明性を回復する能力を備えることが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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