(57)【要約】  本発明は、導入操作が簡便であり、且つin vivoにおいて十分の目的遺伝子発現が得られる安全な遺伝子治療用のウイルスベクターを提供することを目的とする。  本発明により、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)等のヘパリン結合性を有するサイトカイン並びにTARC及びRANTES等のケモカインを、マイナス鎖RNAウイルスをベースとしたウイルスベクターを用いてin vivoにおいて発現させた場合、抗腫瘍効果を示すと共に、従来のアデノウイルスベクターを用いた場合よりも優れた防護効果を誘導することが見出された。そこで、本発明は、サイトカイン遺伝子及びケモカイン遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスベクターに関するものである。当該ウイルスベクターは、癌、特に転移性癌に対する処置に適するものである。また、本発明により、そのようなウイルスベクターを含む組成物、及びそれらを利用した遺伝子治療法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスベクター。
【請求項２】
パラミクソウイルスベクターである、請求項1記載のベクター。
【請求項３】
センダイウイルスベクターである、請求項2記載のベクター。
【請求項４】
サイトカイン遺伝子が、ヘパリン結合性を有するサイトカインをコードするものである、請求項1乃至3のいずれか一項記載のベクター。
【請求項５】
ヘパリン結合性を有するサイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である、請求項4記載のベクター。
【請求項６】
サイトカイン遺伝子がケモカインをコードするものである、請求項1乃至3のいずれか一項記載のベクター。
【請求項７】
ケモカインがTARCまたはRANTESである、請求項6記載のウイルスベクター。
【請求項８】
癌を処置するためのものである、請求項1乃至7のいずれか一項記載のベクター。
【請求項９】
癌が転移性癌である、請求項8記載のベクター。
【請求項１０】
癌が腎臓癌である請求項9記載のベクター。
【請求項１１】
癌が肺癌である請求項9記載のベクター。
【請求項１２】
請求項1乃至１１いずれか一項記載のベクターを含む、抗腫瘍組成物。
【請求項１３】
抗腫瘍組成物が樹状細胞からなる、請求項12記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１４】
GM-CSFをコードする遺伝子を含むベクター、及びケモカインをコードする遺伝子を含むベクターの2種のベクターを含む、請求項13または14記載の抗腫瘍組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療用のウイルスベクターに関する。より詳細には、本発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)等のサイトカインをコードする遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスを利用した、癌、特に転移性癌に対する処置に適したウイルスベクターに関するものである。また、本発明は、そのようなウイルスベクターを含む組成物、及びそれらを利用する遺伝子治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌に対する治療法としては、現在、手術療法、放射線療法、化学療法、並びにインターフェロンα、インターロイキン(例えば、IL-2)等を使用した方法が実施されている。しかしながら、転移性癌については、これらの療法では患者の予後が極めて悪く、5年生存率は10％前後である。また、これらの治療法の問題点の一つとして、コストの高いことが挙げられる。腎癌に対しては、近年、分子標的薬剤を用いた方法も導入されてきているが、本剤でも、その延命効果は数ヶ月程度と考えられている上、連日の服用が必須であり、高頻度の副作用の発現が報告されている。【０００３】
現在、癌、特に転移性癌に対する期待できる治療法として、免疫遺伝子治療が考えられている。免疫遺伝子治療は、副作用が少なく、治療効果に永続性が期待できると共に、コストの面でも患者にとって望ましい医療であると考えられている。例えば、近年の研究により、GM-CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)遺伝子導入自家腫瘍ワクチンが、前臨床癌モデル及び一部の臨床試験において、実質的な抗腫瘍活性を有することが報告されている。血清型5E1欠失アデノウイルス(Ad5)/GM-CSFは、最も有望なベクターの一つである。しかしながら、種々の腫瘍細胞において、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入は、CAR(Coxsackie-Adenovirus受容体)のAd5受容体、並びにインテグリンαvβ3及びαvβ5の発現が無いため制限されている。【０００４】
アデノウイルスベクター以外のベクターとしては、同じく二本鎖DNA由来ベクターであるポックスウイルスベクター、及び一本鎖RNA(RT)ウイルスベクター等のレトロウイルスベクターも汎用されているが、導入操作が煩雑で時間を要するだけでなく、十分量のGM-CSF産生がin vivoにおいて得られず、臨床応用への限界となっている。遺伝子治療戦略の適用の成功にとっての主な障害は、組み換えウイルスベクターが腫瘍塊全体に広がらないこと、及びin vivoでの導入効率が低いことである (非特許文献1)。遺伝子治療を進展させるためには、安全で効率的に遺伝子を標的細胞に導入する能力を持つ新しいベクター系を開発する必要がある。【０００５】
センダイウイルス(SeV)ベクターは、細胞質型ウイルスベクター（発現の全段階が細胞質で行われるベクター）であることから、in vivoで使用しても、搭載遺伝子が宿主染色体へ組み込まれて遺伝毒性を生じる心配が全くない。また、in vitroとin vivoの両方において高い遺伝子導入、発現効率が得られることや、in vitroでは長期持続発現が可能であること等、いくつもの優れた性能を有している。そのためSeVは、遺伝子導入ベクターとして、遺伝子治療・遺伝子ワクチン、さらには抗体産生及び機能解析への応用等を含むの多くの分野において利用できるものと期待されている（非特許文献2及び3）。近年、マイナス鎖RNAウイルスのゲノム操作の進展により非ウイルス遺伝子を付加的に挿入できるようになり、遺伝子導入のアプローチのための新しいクラスのウイルスベクターの開発が可能となってきた (非特許文献2)。
【特許文献１】国際公開 WO2003/25570
【非特許文献１】Nat. Med., 3: 1354-1361, 1997
【非特許文献２】J. Gene Med., 5(7): 543-553, 2003
【非特許文献３】Curr. Opin. Mol. Ther., 7(4): 346-352, 2005
【非特許文献４】Abe J ,et al. Journal of cancer research and clinical oncology. 1995; 121: 587-92
【非特許文献５】Kojima T, Yamazaki K, Tamura Y, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene-transduced tumor cells combined with tumor-derived gp96 inhibit tumor growth in mice. Human gene therapy. 2003; 14: 715-28.
【非特許文献６】Shibata S, Okano S, Yonemitsu Y, et al. Induction of efficient antitumor immunity using dendritic cells activated by recombinant Sendai virus and its modulation by exogenous IFN-beta gene. J Immunol. 2006; 177: 3564-76.
【非特許文献７】Vertuani S, De Geer A, Levitsky V, Kogner P, Kiessling R, Levitskaya J. Retinoids act as multistep modulators of the major histocompatibility class I presentation pathway and sensitize neuroblastomas to cytotoxic lymphocytes. Cancer research. 2003; 63: 8006-13.
【非特許文献８】Soiffer R, Lynch T, Mihm M, et al. Vaccination with irradiated autologous melanoma cells engineered to secrete human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor generates potent antitumor immunity in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 13141-6.
【非特許文献９】Tani K, Azuma M, Nakazaki Y, et al. Phase I study of autologous tumor vaccines transduced with the GM-CSF gene in four patients with stage IV renal cell cancer in Japan: clinical and immunological findings. Mol Ther. 2004; 10: 799-816.
【非特許文献１０】Chu Y, Xia M, Lin Y, et al. Th2-dominated antitumor immunity induced by DNA immunization with the genes coding for a basal core peptide PDTRP and GM-CSF. Cancer gene therapy. 2006; 13: 510-9.
【非特許文献１１】Ellyard JI, Simson L, Parish CR. Th2-mediated anti-tumour immunity: friend or foe? Tissue antigens. 2007; 70: 1-11.
【非特許文献１２】Inoue M, et al. J. virology. 2003; 77: 3238-46
【非特許文献１３】Abe J ,et al. Journal of cancer research and clinical oncology. 1995; 121: 587-92
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、癌、特に転移性癌に対する遺伝子治療法として、免疫遺伝子治療が考えられている。例えば、近年の研究により、GM-CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)遺伝子導入自家腫瘍ワクチンが、前臨床癌モデル及び一部の臨床試験において、実質的な抗腫瘍活性を有することが報告され、血清型5E1欠失アデノウイルス(Ad5)/GM-CSFが最も有望なベクターの一つと期待されている。しかし、種々の腫瘍細胞において、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入は、CAR(Coxsackie-Adenovirus受容体)のAd5受容体、並びにインテグリンαvβ3及びαvβ5の発現が無いため制限されている。また、アデノウイルスベクター以外のベクターとしては、同じく二本鎖DNA由来ベクターであるポックスウイルスベクター、及び一本鎖RNA(RT)ウイルスベクター等のレトロウイルスベクターも汎用されているが、導入操作が煩雑で時間を要するだけでなく、十分量のGM-CSF産生がin vivoにおいて得られず、臨床応用への限界となっている。遺伝子治療を進展させるためには、安全で効率的に遺伝子を標的細胞に導入する能力を持つ新しいベクター系を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
単純な技術により高い効率で遺伝子送達が起こることは、マイナス鎖RNAウイルスベクターを介した遺伝子送達の重要な優位性の１つである。レトロウイルスベクター等を介した遺伝子送達は一般に効率が低く、最適な遺伝子送達のためには遠心で濃縮する必要があるが、遠心操作はしばしばウイルスの力価を低下させる。また、高い効率で感染させるには毒性のある薬剤であるポリブレンを必要とする場合がある（Bunnell, B.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1995, 92: 7739-7743; Chuck, A.S., Hum. Gene Ther., 1996, 7: 743-750; Chinnasamy, D. et al., Blood 2000, 96: 1309-1316; Fehse, B. et al., Br. J. Haematol., 1998, 102: 566-574）。また、ex vivo投与においては、細胞に感染後に、遺伝子が導入された細胞を選択する工程が必要な場合がある。これに対して、マイナス鎖RNAウイルスベクターは特別な薬剤を必要とすることなく、単に細胞に接触させるだけでより優れた遺伝子送達を達成することができる。また感染効率は非常に高く、通常、ベクターの感染後に薬剤等で遺伝子導入細胞を選択する必要はない。さらに、マイナス鎖RNAウイルスベクターを介する遺伝子送達は、細胞への非常に短い暴露（30分以下）で最適効率を達成することができる。臨床場面を考えると、これらの特徴は、ex vivo及びin vivoの両方における投与操作を単純化し、操作に依存した細胞障害等の悪影響を最小化し得るものである。【０００８】
マイナス鎖RNAウイルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、DNAフェーズを持たないため染色体への組み込み（integration）は起こらない（Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers: Philadelphia, pp. 1177-1204, 1996）。このため染色体異常による癌化及び不死化などの安全面における問題が生じない。マイナス鎖RNAウイルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウイルス（SeV）を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466, 1997）。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（flexibility）等の性質上のメリットもある。このように、マイナス鎖RNAウイルスベクターは、ヒトの抗腫瘍遺伝子治療のための高効率ベクターの新しいクラスとなることが示唆される。伝播能を有するSeVベクターは、外来遺伝子を少なくとも4kbまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事も可能である。【０００９】
最近、細胞質型ウイルスベクターであるセンダイウイルスベクター(SeV)が、その腫瘍細胞を含むほとんどの哺乳動物細胞に感染し、その中で増幅できる能力から、遺伝子導入のための新しい有望な手段として認められてきている。さらに、SeVは、腫瘍形成に到る、宿主DNAへの転移による融合を起こす危険がない。本発明者らは、マウス腎臓細胞癌(RENCA(RC))に対するin vivo抗腫瘍活性を、GM-CSFを搭載するSeV18/TSΔF(F遺伝子欠失)ベクター(SeV18+mGM-CSF/TSΔF)、及びGM-CSFを搭載するAd5ベクター(AdV+mGM-CSF)ベクターを各々導入したRCワクチン細胞(RENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF及びRENCA/AdV+mGM-CSF)の間で比較した。【００１０】
その結果、in vivo抗腫瘍効果は、RENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF及びRENCA/AdV+mGM-CSFの間で似通っていた。ワクチン化モデルでは、RENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFは、RENCA/AdV+mGM-CSFと比べより良い防護効果を誘導した(p<0.02)。CTL分析及びサイトカイン分析の両方において、抑制された腫瘍成長を示すRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF及びRENCA/AdV+mGM-CSFで処置された両マウスは、各コントロールと比べ、腫瘍特異的応答、並びにIL-2、IL-4及びIFN-γの有意に高い産生が観察された。特にRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF処置マウスは、RENCA/AdV+mGM-CSF処置マウスと比べて、より著しいIFN-γ産生を示した(p<0.05)。今回得られた結果は、GM-CSF産生量は少ないものの、RENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFがRENCA/AdV+mGM-CSFと同等のin vivo抗腫瘍効果を有することを示し、GM-CSFを搭載したSeVが、自家GM-CSFワクチン産生により広範囲適用可能であるかもしれないことが示唆された。【００１１】
そこで、本発明は、具体的には以下の発明に関するものである。
（１）サイトカイン遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスベクター。
（２）パラミクソウイルスベクターである、上記(1)記載のベクター。
（３）センダイウイルスベクターである、上記(2)記載のベクター。
（４）サイトカイン遺伝子が、ヘパリン結合性を有するサイトカインをコードするものである、上記(1)乃至(3)のいずれかに記載のベクター。
（５）ヘパリン結合性を有するサイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である、上記(4)記載のベクター。
（６）サイトカイン遺伝子がケモカインをコードするものである、上記(1)乃至(3)のいずれかに記載のベクター。
（７）ケモカインがTARCまたはRANTESである、上記(6)記載のウイルスベクター。
（８）癌を処置するためのものである、上記(1)乃至(7)のいずれかに記載のベクター。
（９）癌が転移性癌である、上記(8)記載のベクター。
（１０）癌が腎臓癌である上記（9）記載のベクター
（１１）癌が肺癌である上記（9）記載のベクター。
（１２）上記（1）乃至（１１）いずれか一項記載のベクターを含む、抗腫瘍組成物。
（１３）抗腫瘍組成物が樹状細胞からなる、（12）記載の抗腫瘍組成物。
（１４）GM-CSFをコードする遺伝子を含むベクター、及びケモカインをコードする遺伝子を含むベクターの2種のベクターを含む、（12）または（13）記載の抗腫瘍組成物。
【発明の効果】
【００１２】
サイトカイン遺伝子の発現にマイナス鎖RNAウイルスベクター、特にセンダイウイルスを利用したベクターを使用することにより、遺伝子導入法が簡便化されると共に、in vivoにおいて、より高い防護効果を誘導できることが判明した。本発明のベクター系は、例えば、自家腫瘍ワクチンを製造するための強力な手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下の標記は、具体的には以下のものを指す（以下実施例、図面においても同じ）。
（１）AdV+GFP：GFPを搭載するAd5ベクター（RDB:1727(http://www2.brc.riken.jp/cache/dna/1727)
（２）AdV+mGM-CSF：マウス由来GM-CSF（mGM-CSF）を搭載するAd5ベクター
（RDB:1419(http://www2.brc.riken.jp/cache/dna/1419)）
（３）SeV18+GFP/TSΔF：GFPを搭載する、温度感受性変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター
（４）SeV18+mGM-CSF/TSΔF：mGM-CSFを搭載する、温度感受性変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター
（５）SeV18+hGM-CSF/TSΔF：ヒト由来GM-CSF（hGM-CSF）を搭載する、温度感受性変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター
（６）SeV18+GFP/ΔF：GFPを搭載する、F遺伝子欠失型センダイウイルスベクター
（７）SeV18+mGM-CSF/ΔF：mGM-CSFを搭載する、F遺伝子欠失型センダイウイルスベクター
（８）SeV18+mTARC/ΔF：マウス由来TARC（mTARC）を搭載する、F遺伝子欠失型センダイウイルスベクター
（９）SeV18+mRANTES /ΔF：マウス由来RANTES（mRANTES）を搭載する、F遺伝子欠失型センダイウイルスベクター
（10）IrRENCA：RCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（11）IrRENCA/AdV+GFP：上記（1）を導入したRCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（12）IrRENCA/AdV+mGM-CSF：上記（2）を導入したRCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（13）IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF：上記（3）を導入したRCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（14）IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF：上記（4）を導入したRCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（15）IrLLC：LLCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（16）IrLLC/SeV18+GFP/TSΔF：上記（3）を導入したLLCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（17）IrLLC/SeV18+mGM-CSF/TSΔF：上記（4）を導入したLLCワクチン細胞（ワクチン細胞）
（18）LLC/SeV18+GFP/ΔF：上記（6）を導入したLLC細胞
（19）LLC/SeV18+mGM-CSF/ΔF：上記（7）を導入したLLC細胞
（20）LLC/SeV18+mTARC/ΔF：上記（8）を導入したLLC細胞
（21）LLC/SeV18+mRANTES/ΔF：上記（9）を導入したLLC細胞
（22）DC：樹状細胞
(23) DC/LPS：LPS処理したDC
（24）DC/SeV18+GFP/TSΔF：上記（3）を導入した樹状細胞
（25）DC/SeV18+mGM-CSF/TSΔF：上記（4）を導入した樹状細胞
【図１】本試験において用いたウイルスベクターを示す図である。（a）SeV18+GFP/TSΔF 、SeV18+mGM-CSF/TSΔF、及びSeV18+hGM-CSF/TSΔF について示す。SeVゲノムは2つのプロモーター領域によって境界を定められる：リーダー（ld）およびトレーラー（tr）領域。それぞれの外来遺伝子（GFP、mGM-CSF、およびhGM-CSF）を、N遺伝子のリーダー配列とオープンリーディングフレームとの間に挿入した。SeV遺伝子はエンベロープ関連タンパク質、M、F、およびHN、ならびにマイナス鎖ゲノムリボヌクレオチド-タンパク質複合体（RNP）タンパク質、N、P/V/C、およびLをコードする。温度感受性変異を持つセンダイベクターは、エンベロープ関連MおよびHN遺伝子の発現を喪失しており、矢印の先によって示されるように(Inoue M, Tokusumi Y, Ban H, et al. Nontransmissible virus-like particle formation by F-deficient sendai virus is temperature sensitive and reduced by mutations in M and HN proteins. Journal of virology. 2003; 77: 3238-46.)、M、HN、およびL遺伝子においてリボヌクレオチド置換を有する（特許文献1）。 (b) SeV18+GFP/ΔF 、SeV18+mGM-CSF/ΔF、SeV18+mTARC/ΔF及びSeV18+ mRANTES /ΔF について示す。SeVゲノムは2つのプロモーター領域によって境界を定められる：リーダー（ld）およびトレーラー（tr）領域。それぞれの外来遺伝子（GFP、mGM-CSF、およびhGM-CSF）を、N遺伝子のリーダー配列とオープンリーディングフレームとの間に挿入した。SeV遺伝子はエンベロープ関連タンパク質、M、F、およびHN、ならびにマイナス鎖ゲノムリボヌクレオチド-タンパク質複合体（RNP）タンパク質、N、P/V/C、およびLをコードする。 （c）GFPまたはマウスGM-CSF cDNA発現カセット（AdV/GFPまたはAdV/mGM-CSF）を含む組み換え型AdVベクターを、発現コスミドカセットと親ウイルスゲノムとのあいだの相同的組み換えによって構築した(Abe J, Wakimoto H, Yoshida Y, Aoyagi M, Hirakawa K, Hamada H. Antitumor effect induced by granulocyte/macrophage-colony-stimulating factor gene-modified tumor vaccination: comparison of adenovirus- and retrovirus-mediated genetic transduction. Journal of cancer research and clinical oncology. 1995; 121: 587-92.)。これらの遺伝子の発現はCAGプロモーターによって促進された。これらの複製欠損アデノウイルス血清型5型 (Ad5)に基づくベクターは、E1A、E1B、およびE3領域において欠失を有する。
【図２】SeVの大腸癌株に対する遺伝子導入効率と発現効率を、アデノウイルスベクター(AdV)のそれと比較した結果を示す図である。 図面に記している標記については、具体的には以下を指す。（１）AdV+LacZ（moi5）: LacZを搭載したAd5ベクターをmoi5で細胞に導入した。（２）AdV+LacZ（moi50）: LacZを搭載したAd5ベクターをmoi50で細胞に導入した。（３）SeV18+ LacZ /TSΔF（moi1）：LacZを搭載した温度感受性変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターをmoi1で細胞に導入した。（４）SeV18+ LacZ /TSΔF（moi5）：LacZを搭載した温度感受性変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターをmoi5で細胞に導入した。
【図３】様々なマウスおよびヒト細胞株の導入効率を示す図と写真である。（a）RENCA（行1）、LLC（行2）およびH1299細胞（行3）に、MOI 100でSeV18+GFP/TSΔFを導入した（写真では「SeV18+GFP/TSΔF導入群」とラベルしているもの）結果を示す。尚、「control群」は、SeV18+GFP/TSΔF等を何も導入していないRENCA（行1）、LLC（行2）およびH1299細胞（行3）を示す。導入細胞の蛍光顕微鏡を48時間後に行った（GFP相を列3に示す）。導入細胞のバックグラウンド蛍光（コントロール；列1）を「control群」において決定した。位相差ピクトグラムを列2および4に示す。（b）マウス細胞株9例およびヒト細胞株5例に、MOI 0、1、10、50、100、および300で、SeV18+GFP/TSΔFを導入した。GFP発現細胞の百分率をフローサイトメトリー分析によって決定した。棒グラフは、SeV18+GFP/TSΔFの存在下(MOI＝1、10、50、100)または非存在下（MOI＝0）で、導入後48時間目でのGFP陽性細胞の割合を示す。
【図４】マウスおよびヒト腫瘍細胞株へのSeV18+mGM-CSF/TSΔFまたはSeV18+hGM-CSF/TSΔFの導入した結果を示す。（a）4つのマウス腫瘍細胞株の細胞100万個を無血清RPMIにおいてMOI 0、1、10、50、100、および300でSeV/ΔF/mGMによって90分間形質導入して、6-ウェルプレートにおいて10％FBS/RPMIと共に24時間インキュベートした。上清において産生されたマウスGM-CSF量を、ELISAによって測定した。（b）（a）と同様に、MOI 1、10、および100でSeV/ΔF/hGMを形質導入したヒト細胞株4例（NSCLC 2例およびRCC 2例）によって感染後2、3、5および7日目に産生されたヒトGM-CSF量を、ELISAによって測定した。（c、d）SeV感染後の細胞生存率をトリパンブルー排除法によって評価した。親RENCA細胞または親LLC細胞200万個をSeV/ΔF/GFP（MOI＝100）またはSeV/ΔF/mGM（MOI＝100）に90分間感染させて、48時間培養した。トリパンブルー陽性および陰性細胞数を光学顕微鏡下で計数して、トリパンブルーを排除する細胞の百分率を細胞生存率の指標として表示した。（e、f）in vitro増殖アッセイ：RENCAおよびLLC細胞を96ウェルマイクロプレートにおいて104個/ウェルで個々に培養した。これらの細胞にSeV18+GFP/TSΔF（MOI＝1、10、または100）、またはSeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI＝1、10、または100）を無血清培地において90分間感染させて、それぞれ、10％FBS/RPMIまたは10％FBS/DMEMにおいて1、2、および4日間培養した。各時点で（SeV感染後0、1、2、または4日目）、生存細胞数をCell Count Reagent SFを用いてテトラゾリウム色素の取り込みによって分光測光法によって推定した。独立した3回の実験からの代表的なデータを示す。
【図５】（a）マウスRENCA細胞においての、SeV18+mGM-CSF/TSΔF導入によるmGM-CSF産生量を示したものである。上記産生量は、ELISA法によって測定した。（b）ヒトH1299細胞においての、SeV18+hGM-CSF/TSΔF導入によるhGM-CSF産生量を示したものである。上記産生量は、ELISA法によって測定した。 図（a）及び（ｂ）共に、棒グラフは、平均値±SEMを描写する。そして、図（a）及び（ｂ）共に、図の標記の内訳は以下の通りである。  照射（＋）：SeV18+mGM-CSF/TSΔF又はSeV18+hGM-CSF/TSΔFを細胞に導入して１日後に放射線照射を行ったサンプル  照射（−）：放射線照射を行っていないサンプルDay2：SeV18+mGM-CSF/TSΔF又はSeV18+hGM-CSF/TSΔFを細胞に導入後２日目のサンプルDay3：SeV18+mGM-CSF/TSΔF又はSeV18+hGM-CSF/TSΔFを細胞に導入後3日目のサンプルDay5：SeV18+mGM-CSF/TSΔF又はSeV18+hGM-CSF/TSΔFを細胞に導入後5日目のサンプルMOI 1：SeV18+mGM-CSF/TSΔF又はSeV18+hGM-CSF/TSΔFを細胞にMOI＝1の濃度で導入したサンプルMOI 10：SeV18+mGM-CSF/TSΔF又はSeV18+hGM-CSF/TSΔFを細胞にMOI＝10の濃度で導入したサンプルMOI 100：SeV18+mGM-CSF/TSΔF又はSeV18+hGM-CSF/TSΔFを細胞にMOI＝100の濃度で導入したサンプル
【図６】腫瘍（腎臓癌）モデルマウス（RENCAモデルマウス）におけるRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFの効果を示す図である。腫瘍体積（左グラフ  a ）及びマウス生存率（右グラフ b）を経時的に調べた。有意差をアスタリスク（*p＜0.05）で示す。図の標記の内訳は以下の通りである。（１） HBSS(Hanks’ balanced solution salt)を投与した群（２）50Gy照射したIrRENCAを投与した群（３）50Gy照射したSeV18+GFP/TSΔF（MOI＝100）を導入したRCワクチン細胞（IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF（MOI＝100））（４）50Gy照射したSeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）を導入したRCワクチン（IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI＝100））（５）50Gy照射したAdV+GFP（MOI＝300）を導入したRCワクチン（IrRENCA/AdV+mGM-CSF（MOI＝300））（６）50Gy照射したAdV+mGM-CSF（MOI＝300）を導入したRCワクチン（IrRENCA/AdV+mGM-CSF（MOI＝300））（７）50Gy照射したAdV+mGM-CSF（MOI＝5）を導入したRCワクチン（IrRENCA/AdV+mGM-CSF（MOI＝5））
【図７】IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFを用いたCTLアッセイの実験手順の概要を示す図である。
【図８】IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFを用いたCTLアッセイの結果を示す図である。ネガティブコントロールに比べ、腫瘍特異的応答が示されている。
【図９】（a及びｂについて）  IrRENCA/AdV+mGM-CSFまたはIrRENCA/SeV18+mGM-CSFによって免疫したマウスの脾細胞におけるIFN-γ産生およびIL-4産生を、マウスIFN-γ（a）およびIL-4（b）ELISPOTアッセイを用いて評価した図である。前記の腫瘍ワクチンをワクチン接種したRENCA担癌マウスからの脾細胞10000個を、前記の比で刺激細胞と共に20時間インキュベートした。結合したサイトカインをビオチン化抗IFN-γおよび抗IL-4 mAbと共にインキュベートした後、ストレプトアビジン-HRPおよび予め混合したペルオキシダーゼ基質AECと共にインキュベートすることによって可視化した。結果を脾細胞1×105個あたり4回決定からのスポット形成細胞数の平均値＋SDとして表記する。（cからhについて）  RENCA（癌）細胞と上記脾細胞との混合培養の結果を示している。具体的には、上記混合培養で培養した細胞内でのサイトカイン産生量を測定した結果である。  GM-CSF導入腫瘍ワクチン接種によって刺激した脾細胞における、腫瘍特異的サイトカイン産生量を示したものである。培養上清におけるマウスTNF-α（c）、IFN-γ（d）、IL-2（e）、IL-4（f）、IL-5（g）、およびIL-6（h）の濃度をCBA（c〜g）およびELISA（h）によって測定した。有意差をアスタリスク（*p＜0.05）で示す。  図の標記の内訳は以下の通りである。  細胞刺激（−）：RENCA（癌）細胞に放射線照射していないもの  細胞刺激（＋）：RENCA（癌）細胞に放射線照射したもの
【図１０】腫瘍塊における腫瘍浸潤細胞の免疫表現型分析を示す図である。RENCA担癌マウスを、材料および方法において記述されるように、無処置のまま（HBSS）または前記の腫瘍ワクチン細胞（IrRENCA/AdV+GFP、IrRENCA/AdV+mGM-CSF、IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF、およびIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF）によって処置した。切除したRENCA腫瘍を免疫組織学評価に供した。腫瘍におけるCD4+ T、CD8+ T、CD11c+およびFoxP3+ T細胞の分布を評価するために、陽性染色細胞を顕微鏡下で倍率200倍でHPF 30〜70箇所において計数した。棒グラフは、平均値±SEMを示す。有意差をアスタリスク（*p＜0.05）で示す。
【図１１】腫瘍（肺癌）モデルマウス（LLCモデルマウス）におけるIrLLC/SeV18+mGM-CSF/TSΔFの抗腫瘍効果を示す図である。マウスLLC腫瘍細胞2.0×105個を、C57BL/6マウスの右横腹皮下に接種した（0日目）。このことにより、肺癌モデルマウスを作製した。接種後3日目に、50Gy照射したIrLLC（1×106個）、50Gy照射したIrLLC/SeV18+GFP/TSΔF（MOI＝100）（1×106個）、または50Gy照射したIrLLC/SeV18+ mGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）（1×106個）を左横腹の皮下に腫瘍ワクチン接種として4日ごとに3回接種した。腫瘍の体積および生存率を調べた。有意差をアスタリスク（* p＜0.05）で示す。
【図１２】SeV18+mGM-CSF/ΔF等の腫瘍形成の抑制効果を示す図である。Balb/cマウス（n =6）に下記所定の細胞を右横腹部皮下に接種した（投与群（１）〜（11）とする）。尚、（１）から（11）の内訳は以下の通りである。（１）LLC細胞5.0×105個を投与した群（２）SeV18+GFP/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+GFP/ΔF（MOI＝10））5.0×105個を投与した群（３）SeV18+GFP/ΔF（MOI＝100）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+GFP/ΔF（MOI＝100））5.0×105個を投与した群（４）SeV18+mGM-CSF/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+ mGM-CSF/ΔF（MOI＝10））  5.0×105個を投与した群（５）SeV18+mGM-CSF/ΔF（MOI＝100）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+ mGM-CSF/ΔF（MOI＝100））  5.0×105個を投与した群（６）SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10））  5.0×105個を投与した群（７）LLC/SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10） 2.5×105個及びLLC細胞  2.5×105個を投与した群  （８）LLC/SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10）  5.0×104個  及び  LLC細胞  4.5×105個を投与した群を投与した群（９）SeV18+mRANTES/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+ mRANTES/ΔF（MOI＝10））  5.0×105個を投与した群  （１０） LLC/SeV18+ mRANTES/ΔF（MOI＝10）  2.5×105個及びLLC細胞  2.5×105個を投与した群  （１１）LLC/SeV18+ mRANTES/ΔF（MOI＝10）  5.0×104個及びLLC細胞  4.5×105個を投与した群を投与した群
【図１３−１】マウス腫瘍（肺癌）モデル（LLCモデル）におけるDC/SeV18+mGM-CSF/TSΔFの抗腫瘍効果を示した結果である。(a)本結果に係る実験で用いた樹状細胞の培養方法    C57/BL6 マウスの骨髄（頚骨、大腿骨及び上腕骨）から採取した赤血球を除いた細胞を、GM-CSF(10ng/ml)及びIL-4(10ng/ml)を含む10％FBS添加RPMIで6日間培養した。その後、６日間培養した細胞を10％FBS添加RPMIで2日間培養した。これらの過程で、樹状細胞を作製した。上記樹状細胞前駆細胞を、更に下記4通りの培養条件（（i）〜(iv））で2日間培養し、実験で用いた4種類の樹状細胞を作製した。  （i）10％FBS添加RPMI  （ii）LPS1.0μg/mlを含んだ10％FBS添加RPMI（「LPS処理」 とする。）  （iii）SeV18+GFP/TSΔF（MOI＝100）を含む10％FBS添加RPMI   (iv) SeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）を含む10％FBS添加RPMI(b) 下記（１）〜（５）を、各々、C57BL/6雌マウス(n＝4)へ投与する方法の模式図を示した。以下、（1）から（5）の標記は、（a）〜（e）の図面の標記においても同様とする。（１）HBSS(Hanks’ balanced solution salt) （２）DC（上記（a）本文及び（a）(i)記載の条件により、作製した）を含むHBSS（３）DC/LPS（上記（a）本文及び（a）(ii)記載の条件により、作製した）を含むHBSS（４）DC/SeV18+GFP/TSΔF（上記（a）本文及び（a）(iii)記載の条件により、作製した）を含むHBSS（５）DC/SeV18+mGM-CSF/TSΔF（上記（a）本文及び（a）(iv)記載の条件により、作製した）を含むHBSS  C57BL/6マウス（n＝4）に2.0×105個のマウスLLC腫瘍細胞を右横腹部皮下に接種した。このことにより、肺癌モデルマウスを作製した。その3日後に（腫瘍直径が3〜5mm）1.0×106個の所定（（１）〜（5））のサンプルを上記モデルマウスの左横腹部へ皮下注射した。また、上記腫瘍細胞を接種後10日後にも、1.0×106個の所定（（１）〜（5））のサンプルを上記モデルマウスの左横腹部へ皮下注射した。
【図１３−２】マウス腫瘍（肺癌）モデル（LLCモデル）におけるDC/SeV18+mGM-CSF/TSΔFの抗腫瘍効果を示した結果である。(c) グラフd(★)時点においての上記マウスの右側腹部の腫瘍形成を示した写真である。上記（１）〜（５）の各投与群から３匹ずつ選び、右側腹部の腫瘍形成を撮影した。(d) 上記（１）〜（５）を上記マウスへ投与したことによる、腫瘍体積の大きさを示したグラフ。有意差をアスタリスク（* p＜0.05）で示す。(e) 上記（１）〜（５）を上記マウスへ投与したことによる、マウスの生存率について示したグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明により、サイトカイン遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスベクターが提供される。
(1)マイナス鎖RNAウイルス
マイナス鎖RNAウイルスは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のRNA（ネガティブ鎖RNAとも言う）をゲノムとして持つエンベロープウイルスであり、高い感染性を持ち、細胞質においてウイルスが搭載する遺伝子を高発現させる能力を持つ。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型（non-segmented）マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus 及びPneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus及び Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae; Infuluenza virus A, B, C, 及びThogoto-like viruses 等を含む）、ブニヤウイルス（Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus及び Phlebovirus属等を含む）、アレナウイルス（Arenaviridae）等の科に属するウイルスが含まれる。【００１５】
マイナス鎖RNAウイルスは、(i) 複製サイクルは細胞質で排他的に起こるためゲノムDNAに組み込まれるリスクがない、(ii) 導入効率は標的細胞の細胞周期に依存しない、(iii) 異なるウイルスゲノムまたは野生型ウイルスと相同組み換えが起こらない、(iv) 細胞の取り込みに極めて短い接触時間しか要さない、(v) 広範囲の宿主細胞においてウイルスがコードする遺伝子を高強度でかつ調節可能に発現させることができる等の利点がある。本発明において確認された高い防護効果の誘導に加え、このような性質からも、種々のサイトカイン用いた免疫遺伝子治療における利用に適しているものと考えられる。【００１６】
本発明において好適に用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、及びラブドウイルス科(Rhabdoviridae)のウイルスが挙げられる。中でも、パラミクソウイルス科に属するウイルス及びその誘導体が本発明のベクターとして好ましい。ここで、パラミクソウイルスとは、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルス科は、非分節型ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウイルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属及びモービリウイルス属を含む）並びにニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）（ニューモウイルス属及びメタニューモウイルス属を含む）を含む。本発明に利用されるウイルスは、より好ましくはパラミクソウイルス科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、及びモルビリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、さらに好ましくはレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。【００１７】
パラミクソウイルス科ウイルスに含まれるウイルスとして、具体的にはセンダイウイルス(Sendai virus(SeV); マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus(NDV))、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウィルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（simian parainfluenza virus 5(SV5), SPIV-10）、ヒトパラインフルエンザウイルス1, 2, 3, 4a, 4b型（human parainfluenza virus-1,2,3,4a,4b (HPIV-1,2,3,4a,4b)) 、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)等が挙げられる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。【００１８】
センダイウイルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これは、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Hurwitz, J.L. et al., Vaccine 15: 533-540, 1997; Bitzer, M. et al., J. Gene Med,.5: 543-553, 2003）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスをベースとしてベクターを作製した場合、このベクターがヒトの治療へ応用でき、ヒトの癌等を対象とした遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを意味する。【００１９】
ここで、ウイルスの「誘導体」とは、ウイルスベクターの遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、及び化学修飾されたウイルスである。本発明のウイルスベクターは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、及び人為的に構築された株等に由来してもよい。【００２０】
(2)サイトカイン遺伝子
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺伝子はRNAであってもDNAであってもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。一般に、遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするORFをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。【００２１】
本発明のベクターに搭載されるサイトカインは、免疫細胞の分化及び/または増殖を誘導するサイトカインであって、抗腫瘍作用を持つサイトカインを用いることができる。このようなサイトカインとしては、T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ等から産生されるサイトカインであって、T細胞の分化及び/または増殖を誘導するサイトカイン等が含まれる。免疫刺激性サイトカイン遺伝子は、例えば遺伝子配列を基に設計したプライマーを基に、T細胞由来cDNA等からPCR増幅により単離することができる。抗腫瘍効果を示すサイトカインは当業者によく知られており、それらのサイトカイン遺伝子を本発明において好適に用いることができる。例えば、IL-2, IL-4, GM-CSFについては、脳腫瘍動物モデルにおいてその有効性が示されている（IL-2: Iwadate Y. et al., Cancer Res., 61: 8769-8774, 2001; IL-2, IL-4, GM-CSF: Sampson J.H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93, 10399-10404, 1996; GM-CSF: Herrlinger, U. et al., Cancer Gene Ther. 4, 345-352, 1997; IL-4: Seleh, M. et al., J. Natl. Cancer Inst. 91, 438-445, 1999; IL-4: Giezeman-Smits, K.M. et al., Cancer Res. 60, 2449-2457, 2000）。IL-23については、脳の自己免疫疾患において免疫系細胞の遊走に強く関与していることが示された（Becher B. et al., J Clin Invest. 112(8), 1186-91, 2000）。また、Fas-Lについても、chemoattractantとしての効果があることが示されている（Silvestris F et al., Br J Haematol. 122(1) 39-52, 2003）。腫瘍に対する IL-2 等による免疫系賦活化については、以下の文献も参照のこと（Iwadate Y. et al., Cancer Gene Ther. 7, 1263-1269, 2000; Iwadate Y. et al., Cancer Res. 61, 8769-8774, 2001; Iwadate Y. et al., Int. J. Mol. Med. 10, 741-747, 2002; Iwadate Y. et al. Oncology (Basel) 54, 329-334, 1997; Iwadate Y. et al., Int. J. Oncol. 23, 483-488, 2003）。【００２２】
ここで、特に本発明において有用なサイトカイン遺伝子として、GM-CSF等を含む、ヘパリン結合性を有するサイトカインをコードするものが挙げられる。その他、TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)及びRANTES等のケモカインをコードする遺伝子も、本発明のサイトカイン遺伝子に含まれる。GM-CSFの配列は公知であり、例えば M11220 (protein ID AAA52578)、及びA14305 (protein ID CAA01150)等のAccession numberから検索することができる。その他のサイトカインについても、公知の配列情報を利用することができる。【００２３】
本発明において用いられるサイトカイン遺伝子は、ヒト由来であっても、その他の哺乳動物由来、例えはマウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の霊長類由来であってもよい。また本発明においてサイトカインには、生物学的活性を維持している限り天然のサイトカインのバリアントが含まれる。例えばN末端またはC末端の1〜数残基（例えば2、3、4、5、または6残基）のアミノ酸が欠失または付加されたポリペプチド、及び1〜数残基（例えば2、3、4、5、または6残基）のアミノ酸が置換されたポリペプチドなどが挙げられる。サイトカインの生物学的活性は、公知のサイトカイン活性のアッセイ方法により測定することができる。または、本明細書に記載の腫瘍抑制のアッセイ方法により測定することができる。天然のサイトカインと同等の生物学的活性を有するこれらのバリアントをコードする遺伝子は、本発明に方法に従ってマイナス鎖RNAウイルスベクターを介して腫瘍に投与することにより、腫瘍増殖に対して天然のサイトカインと同等の抗腫瘍効果を示すことが期待される。天然のサイトカインのバリアントとしては、天然のサイトカインの断片、アナログ、派生体、及び他のポリペプチドとの融合蛋白質（例えば異種シグナルペプチドを持つサイトカイン、または抗体断片を融合させたポリペプチド等）が含まれる。具体的には、本発明において用いられ得るサイトカインには、天然のサイトカインまたは断片のアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、及び/または付加した配列を含み、天然のサイトカインと同等の生物学的活性を有するポリペプチドが含まれる。断片とは、天然のサイトカインポリペプチドの一部を含むポリペプチドであり、例えばN末端欠失体及びC末端欠失体が含まれる。生物学的活性を持つサイトカインの断片は、通常、天然のポリペプチド（分泌後の成熟型の形態）の70％以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90％以上の連続領域を含む。【００２４】
アミノ酸配列のバリアントは、例えば天然のポリペプチドをコードするDNAに変異を導入することにより調製することができる（Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York, 1983); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, 1985 ; Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), 1989; U.S. Pat. No. 4,873,192）。生物学的活性に影響を与えないようにアミノ酸を置換するためのガイダンスとしては、例えばDayhoffら（Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), 1978）が挙げられる。【００２５】
改変されるアミノ酸数に特に制限はないが、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の30％以内、好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内、より好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内であり、例えば15アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは8アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することにより蛋白質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本発明において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。また、例えば、BLOSUM62置換マトリックス（S. Henikoff and J.G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992）において、正の値の関係にあるアミノ酸間の置換が挙げられる。【００２６】
また、サイトカインバリアントには、天然型ポリペプチドのアミノ酸配列と高いホモロジーを示すアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。高いホモロジーとしては、例えば70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、例えばBLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいてLow complexityを含むフィルターは全てOFFにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然型サイトカイン（分泌後の成熟型の形態）のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。具体的には、天然型サイトカイン (成熟型の形態) の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。【００２７】
また、好適なバリアントとしては、天然のサイトカイン遺伝子のコード領域の一部または全部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードするポリペプチドであって、天然型サイトカインと同等の生物活性を有するポリペプチドが挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、例えば天然のサイトカイン遺伝子のコード領域の配列またはその相補配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100 micro-g/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、60℃、好ましくは65℃、より好ましくは68℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で2xSSC中、好ましくは1xSSC中、より好ましくは0.5xSSC中、より好ましくは0.1xSSC中で、振蘯しながら2時間洗浄する条件である。【００２８】
(3)ウイルスベクター
マイナス鎖RNAウイルスベクターとは、上述のマイナス鎖RNAウイルスをベースとする、上記サイトカイン遺伝子を細胞に導入するための担体を言う。ここで「感染力」とは、マイナス鎖RNAウイルスベクターが細胞への接着能を保持しており、接着した細胞の内部にベクターに含まれる遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、伝播能を有していてもよく、伝播能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。【００２９】
ここで、「ウイルスをベースとする」とは、ウイルスの構成物(蛋白質、RNA等)がそのままの状態、または少なくとも一部改変された状態で、ベクターにおいて利用されていることを意味する。例えば、パラミクソウイルスの蛋白質またはRNAを改変して調製された蛋白質またはRNAは、「パラミクソウイルスに由来する」蛋白質またはRNAである。【００３０】
パラミクソウイルスは、一般に、エンベロープの内部にRNAと蛋白質からなる複合体（リボヌクレオプロテイン; RNP）を含んでいる。RNPに含まれるRNAはパラミクソウイルスのゲノムである（−）鎖（ネガティブ鎖）の一本鎖RNAであり、この一本鎖RNAが、NP蛋白質、P蛋白質、及びL蛋白質が結合し、RNPを形成している。このRNPに含まれるRNAがウイルスゲノムの転写及び複製のための鋳型となる（Lamb R.A. and D. Kolakofsky, "Paramyxoviridae: The viruses and their replication." in Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven Press, New York, N.Y., p. 1177-1204, 1996）。【００３１】
パラミクソウイルスの「NP、P、M、F、HN、及びL遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、及びラージ蛋白質をコードする遺伝子を指す。ヌクレオキャプシド（NP）蛋白質は、ゲノムRNAに結合し、ゲノムRNAが鋳型活性を有するために不可欠な蛋白質である。一般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。ホスホ（P）蛋白質は、RNAポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸化蛋白質である。マトリックス（M）蛋白質は、ウイルス粒子構造を内側から維持する機能を果たす。フュージョン（F）蛋白質は、宿主細胞への浸入にかかわる膜融合蛋白質であり、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（HN）蛋白質は宿主細胞との結合にかかわる蛋白質である。ラージ（L）蛋白質は、RNAポリメラーゼの大サブユニットである。上記各遺伝子は個々の転写制御ユニットを有し、各遺伝子から単独のmRNAが転写され、蛋白質が転写される。P遺伝子からは、P蛋白質以外に、異なるORFを利用して翻訳される非構造蛋白質（C）と、P蛋白質mRNAを読み取り途中のRNA編集により作られる蛋白質（V）が翻訳される。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に、3'から順に、次のように表記される。
レスピロウイルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 N P/C/V M F H - L【００３２】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、野生型ウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。このようなウイルスの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたウイルスゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ウイルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウイルスゲノム上で欠損しているウイルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウイルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のウイルスベクターを、ウイルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウイルス遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、ウイルス遺伝子が欠損しているため、ウイルス遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができという利点も有する。また、ウイルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点もある。【００３３】
ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばF遺伝子、HN遺伝子、M遺伝子、またはその任意の組み合わせが挙げられる。例えば、F遺伝子が欠損した組み換えマイナス鎖RNAウイルスゲノムを発現するプラスミドを、F蛋白質の発現ベクターならびにNP、P、およびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、組み換えウイルスの再構成を行うことができる（WO00/70055, WO00/70070, WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、例えば、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。ウイルス生産細胞で発現させるこれらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、または他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。【００３４】
その他、野生型ウイルスの持つアクセサリー遺伝子を欠損させてもよい。例えばSeVのアクセサリー遺伝子の１つであるV遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現及び複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するSeVの病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al., J. Virol. 71:7266-7272, 1997; Kato, A. et al., EMBO J. 16:578-587, 1997; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179）。このような弱毒化ベクターは、in vivo またはex vivoにおける低毒性の遺伝子導入用ウイルスベクターとして特に有用である。【００３５】
パラミクソウイルス科ウイルスにおいてNP、P及びL蛋白質は、（−）鎖一本鎖RNAと結合し、ゲノムRNA複製および蛋白質発現に不可欠な機能を果たす（以下において、場合により、NP,P,L蛋白質を、「ゲノムRNA結合蛋白質」と称す）。NP蛋白質は、ゲノムRNAと非常に強固に結合し、ゲノムRNAに鋳型活性を付与する蛋白質である。ゲノムRNAは、NP蛋白質との結合状態においてのみRNA合成の鋳型活性を有し、NP蛋白質と結合しない状態では鋳型活性は全く有しない。P蛋白質はRNAポリメラーゼの小サブユニットとして、L蛋白質はRNAポリメラーゼの大サブユニットとして、ゲノムRNAに結合する。そのためパラミクソウイルス科ウイルスでは、NP、P、L蛋白質のうち一つでも欠ければ、ゲノムRNA複製は起こらない。【００３６】
例えば、センダイウイルスベクターを用いて外来遺伝子を発現させる場合、搭載した外来遺伝子と同時にウイルス構造蛋白（特に転写複製に必要なRNP構成蛋白であるNP, P, L蛋白）も発現するため、生体に応用された場合には、これらウイルス構造蛋白に対する免疫反応を惹起する可能性がある。このようなウイルス構造蛋白の免疫原性を考慮し、近年、種々のタイプの遺伝子欠損型SeVベクターが開発されている。例えば、ウイルスRNP構成蛋白以外のM,F,HN蛋白質を、それぞれ単独または複数欠損させたベクターが公知である（WO00/70070;WO2003/025570）。例えばM蛋白質をコードする遺伝子が欠失または不活化された弱毒化マイナス鎖RNAウイルスは、弱毒化という特長に加えて、さらにウイルス感染後の粒子形成に必須であるM蛋白質が産生されないためにウイルス粒子が放出されず、子ウイルスによる再感染がなくなるという特長を持たせることができる。また、F蛋白質をコードする遺伝子を欠失または不活化させたセンダイウイルスベクターは、さらに非伝播型ウイルスとなり、安全性が確保されたベクターとなる。そして、HN蛋白質をコードする遺伝子が欠失または不活化されたセンダイウイルスベクターは、細胞表面の糖鎖をシアル酸残基の部分で切断する活性が阻害されるため、新たに作られたウイルス粒子が感染した細胞から遊離しなくなるという特長を持たせることができる。このような、遺伝子欠損型のウイルスベクターも本発明に含まれる。【００３７】
その他、ウイルスゲノムRNAにコードされるエンベロープ蛋白質遺伝子（M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子）に、温度感受性変異が導入されたウイルスベクターも公知である（WO2003/025570）。本発明のウイルスベクターとして、このような温度感受性変異が導入されたものを使用することもできる。【００３８】
さらに、SeVベクターのRNP構成蛋白であるNP, P, Lは、センダイウイルスゲノムの転写複製に必要な蛋白質であり、本来、SeVベクターに必要不可欠な蛋白質である。しかし、これらの蛋白遺伝子をゲノム上欠損させた場合であっても、理論上は、これらの蛋白が発現プラスミド等により外部から供給されれば、ウイルスベクター粒子を再構成・増幅させることが可能である。そして、再構成されたNP, P, L欠損SeVベクターが標的細胞へ感染すると、粒子内に持ち込んでいるNP, P及びL蛋白を利用して、ゲノム上の外来遺伝子のmRNAを転写し、外来遺伝子を発現させることも可能である。このNP, P, L欠損SeVベクターはゲノム上NP, P, L遺伝子が欠損されているため、RNPを複製することができず、非複製SeVベクターに生まれ変わる。これまでに、非複製SeVベクターを作製する目的で、NP蛋白遺伝子を単独で欠失させたベクター、P蛋白遺伝子を単独で欠失させたベクターを構築した報告がある（Molecular Therapy, 13(Suppl.1), S185, May 2006；NSV2006 (13th International Conference Negative Strand Viruses 2006, Salamance, Spain, June 17-22nd, 2006) 要旨集）。さらに、L蛋白がRNAポリメラーゼ活性本体であることを考えると、P遺伝子やNP遺伝子をゲノムから単独に欠失させるのではなく、L遺伝子またはL遺伝子を含む複数の遺伝子を欠失させることにより、非複製型ベクターの特徴をより確実なものにすることができると考えられる。また、L遺伝子を含む複数の遺伝子の欠失は、ウイルス由来の免疫原性蛋白質の影響を最大限に減らすことができるものと期待される。従って、L遺伝子を含む複数の遺伝子、例えばNP, P, L遺伝子全てを欠損することが、免疫原性低減の観点からは望ましい。また、ゲノム長の約半分の長さを占めるL遺伝子の欠失は、より長い目的遺伝子のゲノムへの搭載を可能にすることが期待され、さらに、ゲノムサイズが短くなるほど、転写効率が高く、より高い目的遺伝子の発現量が期待できる。このように、L遺伝子を欠損させたSeVベクターは極めて有用であると考えられる。そのような考えに基づき、本出願人らは、非複製型パラミクソウイルス科ベクターを構築し、それについての出願を行っている（特願2006-193433号）。本発明のベクターは、このようなNP、P、L遺伝子の一部、または全てを欠損させたものであってもよい。【００３９】
NP、P、及びL遺伝子の一部または全てを欠損させたベクターとした場合には、細胞内でベクターを再構成させる時にNP、P、及びL蛋白質を細胞に発現させれば、これら蛋白質がウイルスベクターに取り込まれ、感染性を保持するウイルスベクターを生産することができる。このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細胞内RNPによりゲノムRNAから蛋白質を発現させることはできても、それ自身はL遺伝子等を持たないため、初めと同じような複製能を持つウイルスを再度生産することはできない。このようなベクターは、特に遺伝子治療等の中でもベクターの影響を極力減らす必要のある対象疾患の治療、その他の応用分野において極めて有用である。【００４０】
センダイウイルスを始めとする種々のウイルスの各遺伝子の塩基配列は公知であり、本発明のベクターの作成に当っては、それらの公知の情報を利用することができる。以下に、センダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号を記す：（N遺伝子）M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218；(P遺伝子) M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008；（M遺伝子） D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056；（F遺伝子） D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131；（HN遺伝子） D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131；（L遺伝子） D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、N遺伝子については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; 及び Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 及び Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; 及び Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 及び SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 及び SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 及び SV-5, S76876 、並びに、L遺伝子についてはCDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV,Z30698; 及びSV-5, D13868が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。【００４１】
本発明のベクターとして用いるウイルスゲノムRNAにコードされている遺伝子は、ウイルス由来の遺伝子配列そのまま、または上述のように欠損若しくは不活性化されていてもよいが、何らかの変異が導入されていてもよい。例えば、当業者であれば、各蛋白質の機能を損なわないような軽微な変異を、公知方法によってゲノムRNA上の各遺伝子に導入することができる。例えば、PCR法やカセット変異法等により部位特異的に変異を導入したり、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入したりすることが可能である。【００４２】
例えば、P遺伝子に変異を導入することにより、パラミクソウイルスベクターによる細胞傷害性を低下できることが知られている。本発明のベクターのゲノムRNAがP遺伝子をコードする場合、ゲノム上のRNA遺伝子にこのような変異が導入されていてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他の(-)鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が、例として挙げられる。アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）等のグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換等が挙げられるが、それに限定されない。具体的には、L511のPheへの置換（L511F）等が例示できる。【００４３】
マイナス鎖RNAウイルスベクターはウイルスゲノムRNAに搭載遺伝子をアンチセンスにコードしている。ウイルスゲノムRNAとは、マイナス鎖RNAウイルスのウイルス蛋白質と共にリボヌクレオプロテイン（RNP）を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、このRNAが複製されて娘RNPが形成される機能を持つRNAである。一般にマイナス鎖RNAウイルスのゲノムは、3'リーダー領域と5'トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンス配列として並んだ構成をしている。各遺伝子のORFの間には、転写終結配列(E配列) - 介在配列(I配列) - 転写開始配列(S配列) が存在し、これにより各遺伝子のORFをコードするRNAが別々のシストロンとして転写される。【００４４】
ベクターに含まれるウイルス蛋白質をコードするORF、及びその他の外来遺伝子のORFは、ゲノムRNAにおいて上記のE-I-S配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムRNAにおいて最も3'に近いORFは、3'リーダー領域と該ORFとの間にS配列のみが必要であり、EおよびI配列は必要ない。またゲノムRNAにおいて最も5'に近いORFは、5'トレイラー領域と該ORFとの間にE配列のみが必要であり、IおよびS配列は必要ない。また２つのORFは、例えばIRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら2つのORFの間にはE-I-S配列は必要ない。例えば、野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なRNAゲノムは、3'リーダー領域に続き、N、P、M、F、HN、及びL蛋白質をアンチセンスにコードする６つのORFが順に並んでおり、それに続いて5'トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムRNAにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、例えば、野生型ウイルスと同様に、3'リーダー領域に続き、N、P、M、F、HN、及びL蛋白質をコードするORFが順に並び、それに続いて5'トレイラー領域を配置させることができる。ある種のウイルスにおいては、ウイルス遺伝子が異なっているが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることができる。一般に N、P、及びL遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自律的にRNAゲノムから遺伝子が発現し、ゲノムRNAが複製される。さらにF及びHN遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびM遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは伝播能を有するウイルスベクターとなる。ベクターに搭載させるサイトカイン遺伝子は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。【００４５】
本発明のウイルスベクターは、ゲノムRNA中にサイトカイン遺伝子をコードする。サイトカイン遺伝子を含む組換えウイルスベクターは、上記のウイルスベクターのゲノムにサイトカイン遺伝子を挿入することによって得られる。サイトカイン遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムRNAの3'リーダー領域と3'端に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間、各ウイルス蛋白質ORFの間、及び/または5'端に最も近いウイルス蛋白質ORFと5'トレイラー領域の間に挿入することができる。また、FまたはHN遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域にサイトカイン遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が6の倍数となるように挿入することが望ましい（Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822-4830, 1993）。挿入したサイトカイン遺伝子とウイルスORFとの間には、E-I-S配列が構成されるようにする。E-I-S配列を介して2またはそれ以上の外来遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。【００４６】
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（マイナス鎖（ネガティブ鎖）の3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（WO01/18223）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の3'の近くに挿入するほど発現レベルが高く、5'の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、3'リーダー領域と3'に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間に挿入される。または、3'に一番近いウイルス蛋白質遺伝子と2番目のウイルス蛋白質遺伝子のORFの間、若しくは3'から２番目と３番目のウイルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの3'に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はN遺伝子であり、2番目の遺伝子はP遺伝子、3番目の遺伝子はM遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えば外来遺伝子の挿入位置をマイナス鎖ゲノムのなるべく5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにしたりする等して、ウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。【００４７】
外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加するS配列としては、例えばマイナス鎖RNAウイルスの所望のS配列を用いることができるが、センダイウイルスであれば、3'-UCCCMVUUMC-5'（M= AまたはC; V= A, C, またはG）（配列番号：1）の配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：2）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：3）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：4）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：5）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：6）、及び 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：7）である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5'（配列番号：8）（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3'（配列番号：9））が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。【００４８】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（RNP）であってもよい。RNPは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このようなRNPは、具体的には例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNA、N蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質を含む複合体である。RNPは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムRNAからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘RNPが形成される。ゲノムRNAの複製は、該RNAのコピー数の増加をRT-PCRまたはノーザンハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。【００４９】
本発明のベクターは、上記特徴を有する限りその種類は問われず、ウイルス粒子の構造をとるウイルスベクター、RNP自体であるRNPベクター等を包含する。【００５０】
また、本発明において用いられるウイルスベクターとして、ウイルスゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含む組み換えウイルスを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベースとなるウイルスのゲノムが元来コードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有する組み換えウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。細胞への感染能を与える所望の蛋白質が用いられる。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528, 1981）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また本発明のベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（MuLV）4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばpCL-10A1(Imgenex)（Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705, 1996）。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのgB、gD、gH、gp85蛋白質、EBウイルスのgp350、gp220蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、B型肝炎ウイルスのS蛋白質などが挙げられる。これらの蛋白質は、細胞外ドメインをF蛋白質またはHN蛋白質の細胞内ドメインと結合させた融合蛋白質として用いてもよい。このように本発明において用いられるウイルスベクターには、VSV-G蛋白質等のように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。ウイルスのゲノムRNAにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。【００５１】
また、本発明において用いられるウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着し得るような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体若しくはその断片、またはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質等を含むものであってもよい。これにより、ウイルスベクターの感染の特異性を制御し得る。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上等にある遺伝子）の発現により供給されてもよい。【００５２】
また、本発明のウイルスベクターにおいては、遺伝子を容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することもできる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクターDNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。本発明のベクターは、必要に応じ、上述のサイトカイン及びその他の遺伝子以外の外来遺伝子を保持していてもよい。【００５３】
(4)ベクター製造法
本発明のマイナス鎖ウイルスベクターを製造するには、哺乳動物細胞において、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAを含むRNPの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちN、P、及びL蛋白質の存在下、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAをコードするcDNAを転写させる。転写によりマイナス鎖ゲノム（ウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、またはプラス鎖（アンチゲノム;ゲノムRNAの相補鎖）を生成させても、ウイルスRNPを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。RNA末端は、天然のウイルスゲノムと同様に3'リーダー配列と5'トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の5'端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてT7 RNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該RNAポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の3'端を制御するには、例えば転写産物の3'端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に3'端が切り出されるようにすることができる（Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587 , 1997及び Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997）。リボザイムとしては、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand）由来の自己開裂リボザイムが使用できる。【００５４】
本発明のサイトカイン遺伝子を含むウイルスベクターは、例えば、センダイウイルスをベースとしたものであれば、Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587, 1997及びYu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997等の文献に記載の方法に準じて、次のようにして構築することができる。【００５５】
まず、所望のサイトカイン遺伝子のcDNA塩基配列を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、サイトカイン遺伝子をNotI部位を利用してウイルスゲノムをコードするDNAに挿入する場合を例にとって説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法等を用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片をPCRにより増幅回収する。増幅された断片の両端がNotI部位とし、さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコピーを付加するために、NotI制限酵素切断部位配列及び転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側合成DNA配列及びリバース側合成DNA配列(アンチセンス鎖)を作成する。【００５６】
例えば、フォワード側合成DNA配列は、NotIによる切断を保証するために 5'側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCG、GCCのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側にスペーサー配列として任意の9塩基または9に6の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3'の末端とすることが好ましい。【００５７】
リバース側合成DNA配列は5'側から任意の2以上のヌクレオチド（好ましくはGCG、GCCのNotI認識部位由来の配列が含まれない4塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側に長さを調節するための挿入断片のオリゴDNAを付加する。これらのオリゴDNAの長さは、センダイウイルスゲノムの総塩基数が6の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of six）」；Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998）。さらに挿入断片の3'側にセンダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-CTTTCACCCT-3'（配列番号:10）、Ｉ配列、好ましくは5'-AAG-3'、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-TTTTTCTTACTACGG-3'（配列番号11）、さらにその3'側に所望のcDNA配列の終始コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴDNAの3'の末端とする。【００５８】
PCRは、例えば、ExTaqポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはVentポリメラーゼ（NEB）を用いて行い、増幅した目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBluescriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切り出し、エンベロープ遺伝子を欠損するゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクローニングする。またプラスミドベクターpBluescriptを介さずにNotI部位に直接挿入し、組換えセンダイウイルスcDNAを得ることも可能である。【００５９】
本発明のウイルスベクターcDNAは、これを試験管内または細胞内で転写させ、必要に応じ別途発現するL、P、NP蛋白質と結合させることにより、RNPを再構成させ、このRNPを含むウイルスベクターを生成させることができる。ウイルス由来蛋白質の一部を発現しないように改変された（−）鎖一本鎖RNAまたはその相補鎖をコードするウイルスベクターcDNAからウイルス粒子を再構成する方法は、公知の方法を参考にして実施することができる（WO97/16539号; WO97/16538号; Durbin, A.P. et al., Virology 235: 323-332, 1997; Whelan, S.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392, 1995; Schnell. M.J. et al., EMBO J. 13: 4195-4203, 1994; Radecke, F. et al., EMBO J. 14: 5773-5784, 1995; Lawson, N.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481, 1995; Garcin, D. et al., EMBO J. 14: 6087-6094, 1995; Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Baron, M.D. and Barrett, T., J. Virol. 71: 1265-1271, 1997; Bridgen, A. and Elliott, R.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404, 1996）。特に、改良された方法は効果的である（WO2005/071092）。【００６０】
本発明のウイルスベクターcDNAにおいて欠失させた遺伝子は、これら欠失させた遺伝子を、宿主細胞に別途導入して発現させることができる。本発明のウイルスベクターcDNAまたは別の発現ベクターにコードされた遺伝子によって、RNPを構築させ、エンベロープ蛋白質を発現させて、ウイルス粒子を再構築すれば、該ウイルス粒子は感染性を保持することができる。また、欠失遺伝子を補うための各遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。RNPを形成させるために発現させる NP、P、及びL等の遺伝子は、ベクターのベースとなったウイルスゲノムにコードされる 遺伝子と完全に同一である必要はない。これらの遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列は、RNPゲノムがコードする蛋白質のアミノ酸配列そのままでなくとも、ゲノムRNAと結合し、細胞内でゲノムへの転写複製活性を持つ限り、変異を導入してもよく、また場合により他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。【００６１】
RNPまたはウイルス粒子の形態で得られた本発明のウイルスベクターは、ウイルスの増殖できる細胞（ウイルスの発現・増殖に必須の遺伝子が欠失されているウイルスベクターについては、それらの欠失遺伝子を発現する細胞）に導入し、培養を行い、培養上清からウイルス粒子を回収することにより増幅することができる。ベクターを導入する細胞は、必要に応じ、ウイルス粒子の形成と放出を促進する機能を有する蛋白質、例えば、C蛋白質を発現する細胞であってもよい。C蛋白質の発現により、ウイルスベクターの高い生産性を得ることができる。センダイウイルスにおいてC蛋白質には、同一読み枠上でそれぞれ異なる開始コドンによって翻訳される４種の蛋白質、C’、C、Y1、Y2が含まれる。ウイルスベクターの再構成においてヘルパー細胞中で発現するC蛋白質は、上記4種の蛋白質のうち、いずれか1種でも複数種、または4種全てが発現していてもよい。本発明のウイルスベクターにおいてゲノムRNAからP遺伝子を欠損させた場合、P遺伝子と読み枠違いのC遺伝子も欠損することになる。ゲノムRNA上C遺伝子が欠損する場合は、C遺伝子をコードする発現ベクターを導入細胞に導入することにより、細胞内でC遺伝子を発現させることが可能である。【００６２】
ウイルスが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウイルスベクター等の再構成においては、サル腎由来のLLC-MK2細胞及びCV-1細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウイルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生理学」, 厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修, メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。【００６３】
RNPを細胞に導入するには、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソーム等と共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。【００６４】
ウイルスベクターcDNAを細胞内に導入する主な方法として、次のものが挙げられる：(i)目的の細胞が取り込めるようなDNA沈殿物を作る方法、(ii)目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つDNAを含む複合体を作る方法、(iii)目的の細胞膜に、DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法。【００６５】
(i)の方法としては、例えば、リン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入ることが知られている（Graham, F.L. and Van Der Eb, J., Virology 52: 456, 1973; Wigler, M. and Silverstein, S., Cell 11: 223, 1977）。Chen及びOkayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、1) 細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4％ CO2 、35℃、15〜24時間、2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、3) 沈殿混液中のDNA濃度が 20〜30μg/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 7: 2745, 1987）。【００６６】
(ii)の方法には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）、Lipofectamine 2000（Invitrogen）等が知られている。 (ii)の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5×105 ）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015, 1983）。【００６７】
(iii)の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で(i)や(ii)の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。【００６８】
以上、３つのカテゴリーの中で(ii)の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができる。本発明においては、好適に用いうるトランスフェクション試薬としてLipofectamine 2000（Invitrogen）、 Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent（Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169）を挙げることができる。【００６９】
cDNAからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
24穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは100 mmペトリ皿等で、10％ウシ胎児血清(FCS)および抗生物質（100 units/ml ペニシリンGおよび100 micro-g/ml ストレプトマイシン）を含む最少必須培地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株LLC-MK2（ATCC CCL-7）をほぼ100％コンフルエントになるまで培養し、例えば 1 micro-g/ml psoralen（ソラレン）存在下、紫外線 (UV) 照射処理を20分処理で不活化した、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスvTF7-3（Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986、Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）を2 PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびUV照射時間は適宜調整することができる。感染1時間後、2〜60 micro-g、より好ましくは3〜20 micro-gの組換えセンダイウイルスのゲノムRNAをコードするDNAを、ウイルスRNPの生成に必須なトランスに作用するウイルス蛋白質を発現するプラスミド（0.5〜24 micro-gのpGEM-N、0.25〜12 micro-gのpGEM-P、及び0.5〜24 micro-gのpGEM-L)（Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）と共にSuperfect（QIAGEN社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。N、P、及びLをコードする発現ベクターの量比は例えば 2：1：2 とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば1〜4 micro-gのpGEM-N、0.5〜2 micro-gのpGEM-P、および1〜4 micro-gのpGEM-L程度で適宜調整する。【００７０】
トランスフェクションを行った細胞は、所望により100 micro-g/mlのリファンピシン（Sigma）及びシトシンアラビノシド（AraC）、より好ましくは40 micro-g/mlのシトシンアラビノシド（AraC）（Sigma）のみを含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579）。トランスフェクションから48〜72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、RNPを含む破砕物をLLC-MK2細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、LLC-MK2細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Roche）、SuperfectTM（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。RNPが導入された細胞では、RNPからのウイルス遺伝子の発現およびRNPの複製の過程が進行しウイルスが増幅する。得られたウイルス溶液（培養上清）を希釈（例えば106 倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウイルスvTF7-3は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたベクターは-80℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した伝播能を持たないウイルスを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するLLC-MK2細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するLLC-MK2細胞を重層して培養することによってエンベロープ遺伝子欠損型ウイルスを増幅することもできる（国際公開番号 WO00/70055 および WO00/70070参照）。【００７１】
回収されたウイルスベクターの力価は、例えばCIU（Cell-Infected Unit）測定または赤血球凝集活性(HA)の測定することにより決定することができる（WO00/70070; Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999）。また、GFP（緑色蛍光蛋白質）等のマーカー遺伝子を搭載したベクターとした場合には、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばGFP-CIUとして）。このようにして測定した力価は、CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070）。【００７２】
回収したウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、及びカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアー、安定剤等として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が10%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、及び特公昭62-30753号公報）、並びに、フコース硫酸含有多糖及び/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができる。【００７３】
以下、参考として、F遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの具体的な構築と調製方法について詳述する（WO00/70055 及びWO00/70070参照）。
<1> F遺伝子欠失型センダイウイルスゲノムcDNA及びF発現プラスミドの構築
センダイウイルス（SeV）全長ゲノムcDNA、pSeV18+ b(+)（Hasan, M. K. et al., J. General Virology 78: 2813-2820, 1997）（「pSeV18+ b(+)」は「pSeV18+」ともいう）のcDNAをSphI/KpnIで消化してフラグメント(14673bp)を回収し、pUC18にクローニングしてプラスミドpUC18/KSとする。F遺伝子欠損部位の構築はこのpUC18/KS上で行う。F遺伝子の欠損は、PCR-ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてF遺伝子のORF（ATG-TGA=1698bp）を除いて例えばatgcatgccggcagatga（配列番号：12）で連結し、F遺伝子欠失型SeVゲノムcDNA（pSeV18+/ΔF）を構築する。PCRは、Fの上流には［forward: 5'-gttgagtactgcaagagc／配列番号：13, reverse: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc／配列番号：14］、F遺伝子の下流には［forward: 5'-atgcatgccggcagatga／配列番号：15, reverse: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc／配列番号：16］のプライマー対を用いたPCRの産物をEcoT22Iで連結する。このように得られたプラスミドをSacIとSalIで消化して、F遺伝子欠損部位を含む領域の断片（4931bp）を回収してpUC18にクローニングし、pUC18/dFSSとする。このpUC18/dFSSをDraIIIで消化して、断片を回収してpSeV18+のF遺伝子を含む領域のDraIII断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドpSeV18+/ΔF を得る。外来遺伝子は、例えばpUC18/dFSSのＦ遺伝子欠失部位にある制限酵素 NsiI 及びNgoMIV 部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、NsiI-tailedプライマー及びNgoMIV-tailedプライマーで増幅すればよい。【００７４】
<2> SeV-F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのF遺伝子（SeV-F）を発現するCre/loxP誘導型発現プラスミドの構築はSeV-F遺伝子をPCRで増幅し、Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物が誘導発現されるように設計されたプラスミドpCALNdlw（Arai, T. et al., J. Virology 72, p1115-1121, 1998）のユニークサイト SwaI部位に挿入し、プラスミドpCALNdLw/Fを構築する。F遺伝子欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、SeV-F蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばSeVの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株LLC-MK2細胞を用いることができる。LLC-MK2細胞は、10％の熱処理した不動化ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリンGナトリウム 50単位/ml、およびストレプトマイシン 50 micro-g/mlを添加したMEMで37℃、5％ CO2で培養する。SeV-F遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Cre DNAリコンビナーゼによりF遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドpCALNdLw/Fを、リン酸カルシウム法（mammalian transfection kit (Stratagene)）により、周知のプロトコールに従ってLLC-MK2細胞に遺伝子導入を行う。10cmプレートを用い、40％コンフルエントまで生育したLLC-MK2細胞に10 micro-gのプラスミドpCALNdLw/Fを導入後、10mlの10% FBSを含むMEM培地にて、37℃の５％CO2 インキュベーター中で24時間培養する。24時間後に細胞をはがし、10ml培地に懸濁後、10cmシャーレ５枚を用い、5ml 1枚、2ml 2枚、0.2ml 2枚に蒔き、G418 (GIBCO-BRL)を1200 micro-g/mlを含む10mlの10%FBSを含むMEM培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたG418に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは10cmプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。  F蛋白質の発現誘導は、細胞を6cmシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスAxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821, 1995; Arai, T.et al., J. Virol 72,1115-1121, 1998）により例えば moi=3 で感染させて行うことができる。【００７５】
<3> F遺伝子欠失SeVウイルスの再構築及び増幅
上記 pSeV18+/ΔF の外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてLLC-MK2細胞にトランスフェクションする。LLC-MK2 細胞を5×106 cells/dish で100mmのシャーレに播く。T7 RNAポリメラーゼによりゲノムRNAの転写を行わせる場合には、細胞培養24時間後、ソラレン（psoralen）と長波長紫外線（365nm）で 20 分間処理したT7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（PLWUV-VacT7：Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)）をMOI 2程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば15ワットバルブを5本が装備された UV Stratalinker 2400（カタログ番号 400676 (100V), ストラタジーン社, La Jolla, CA, USA）を用いることができる。細胞を無血清のMEMで洗浄した後、ゲノムRNAを発現するプラスミド、及びマイナス鎖RNAウイルスのそれぞれN、P、L、F、及びHN蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフェクション試薬を用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に 6：2：1：2：2：2 とすることができる。例えば、ゲノムRNAを発現するプラスミド、並びにN、P、L、および FプラスHN蛋白質を発現する発現プラスミド（pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L及びpGEM/F-HN; WO00/70070, Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579, 1996）を、それぞれ12 micro-g, 4 micro-g, 2 micro-g, 4 micro-g及び4 micro-g／dishの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないMEMで細胞を２回洗浄し、40 micro-g/mLの Cytosine beta-D-arabinofuranoside （AraC：Sigma, St.Louis, MO）及び7.5 micro-g/mLのTrypsin（Gibco-BRL, Rockville, MD）を含むMEMで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをOptiMEM に懸濁する（107 cells/ml）。凍結融解を３回繰り返してlipofection reagent DOSPER (Roche #1811169)と混合し（106cells/25 micro-l DOSPER）室温で15分放置した後、上記でクローニングしたF発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（106cells /well 12-well-plate）し、血清を含まないMEM（40 micro-g/ml AraC, 7.5 micro-g/ml トリプシンを含む)で培養し、上清を回収する。F以外の遺伝子、例えばHNまたはM遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。【００７６】
(5)ウイルスベクター組成物及び細胞
本発明のベクターは目的に応じ、組成物として調製することができる。ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。このような担体または媒体としては、例えば滅菌水、塩化ナトリウム溶液、デキストロース溶液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸含有リンゲル溶液、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等が挙げられ、これらとベクターを適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。また本発明の組成物は、脱イオン水、デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。また、リポソームの膜安定化剤（例えばコレステロール等のステロール類）を含んでいてもよい。また、抗酸化剤（例えばトコフェロールまたはビタミンEなど）を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。【００７７】
本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。また本発明の組成物は溶液、凍結乾燥物、またはエアロゾルの形態の組成物であってよい。凍結乾燥物の場合は安定化剤としてソルビトール、シュークロース、アミノ酸及び各種蛋白質等を含んでいてもよい。【００７８】
本発明の態様として、サイトカインをコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターを含む抗腫瘍剤が挙げられる。また別の態様として、本発明のサイトカインをコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターが導入された細胞、及びそのような細胞を含む抗腫瘍剤が含まれる。本発明のベクターを含む組成物、及び本発明のベクターが導入された細胞は、抗腫瘍医薬として有用である。また本発明のベクター組成物および本発明のベクターが導入された細胞は、抗腫瘍ワクチンとして有用である。該ベクター組成物及び細胞は、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またワクチンには、ミョウバン、不完全Freund'sアジュバント、MF59 (オイルエマルジョン)、MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、および QS-21 (soapbark tree Quilaja saponaria 由来）等のアジュバントを組み合わせることもできる。【００７９】
また、組成物または細胞の投与に際しては、アジュバント効果を高めるサイトカイン類を組み合わせても良い。例えば、IL-12 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999）、インターフェロン-γ（米国特許第 5,798,100号）、 IL-4 （J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)）等が挙げられる。【００８０】
(6)遺伝子治療
上述の本発明のウイルスベクター、及び該ベクターを含む組成物または細胞は、ベクターが導入された細胞においてサイトカインを産生することにより、in vivoにおいて免疫反応を惹起することができる。そのため、例えば、サイトカインが効果を有する腫瘍に対する遺伝子治療に好適に用いることができる。例えば、GM-CSFをコードする本発明のウイルスベクターは、実施例において示されるように、各種の癌細胞において発現され、またin vivoにおける抗腫瘍活性を有していた。なお、本明細書において抗腫瘍活性とは、腫瘍の発生及び/または増殖を抑制する活性を意味する。【００８１】
腫瘍組織、または腫瘍の発生が懸念される部位（例えば、腫瘍を除去した部位）等に、本発明のウイルスベクター、または該ベクターを含む組成物若しくは細胞を局所投与することにより、投与部位における抗腫瘍免疫応答を誘導し、腫瘍の発生（再発を含む）または増殖（転移を含む）を抑制することができる。ベクターの導入は、in vivoまたはex vivoで行うことができる。in vivo法では、該ベクターは直接腫瘍部位に注入され、ex vivo法では、該ベクターは体外で細胞に導入され、その細胞が腫瘍部位に注入される。腫瘍部位とは、腫瘍そのもの、腫瘍を除去した部位、またはその近傍を言う。ここで近傍とは、ベクターが導入された細胞から分泌されるサイトカインが腫瘍またはその除去部位に到達する領域である。好ましくは腫瘍またはその除去部位から5 mm以内、例えば3 mm以内、2 mm以内、または1 mm以内である。ベクターまたはベクター導入細胞は所望の担体（例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液等所望の生理的水溶液）中に溶解または懸濁し、これを腫瘍またはその近傍に直接注入することにより実施すればよい。本発明の方法により、腫瘍を効果的に治療または予防することが可能となる。【００８２】
Ex vivo法を用いる場合、細胞を感染させるMOI（多重感染度; 細胞1つあたりの感染ウイルス数）は1〜500の間にすることが好ましく、より好ましくは2〜300、さらに好ましくは3〜200、さらに好ましくは5〜100、さらに好ましくは7〜70である。ベクターと標的細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば1分以上、好ましくは3分以上、5分以上、10分以上、または20分以上接触させればよく、例えば1〜60分程度、より特定すれば5分〜30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。細胞としては、投与する患者由来の細胞を用いることができ、例えば患者由来の線維芽細胞の初代培養細胞を好適に用いることができる。また、異種（xenogeneic）細胞及び同種異系（allogeneic）細胞を用いることもできる（Iwadate, Y. et al., Cancer Res., 61: 8769-8774, 2001）。これらのxenogeneicまたはallogeneicな細胞は、ex vivo注入後、宿主の免疫反応により排除されることが期待される。細胞は、ベクターを導入する前または後に、UV、X線、またはgamma線照射等により分裂能を欠損させ、その後、腫瘍にex vivo投与してもよい。【００８３】
本発明のベクターは、実施例においても示されるように、多様な癌細胞において発現能を有することが確認されていることから、様々な腫瘍の治療に利用することができる。例えば、転移性腎細胞癌（腎癌）は、手術療法、放射線療法、化学療法等の既存の治療法を施しても、治療後5年生存する確率が約10％という、極めて予後不良の疾患であり、新たな治療法の導入が望まれている。本発明のベクターは、血流を介して腫瘍組織へと運搬されること、また、一般的な化学療法に用いられる抗癌剤と比べ副作用が少ないと考えられることから、そのような転移性腎癌を含む転移性の癌に対しても有効に機能するものと考えられる。特に、ヒトGM-CSF遺伝子導入自家腎癌細胞をワクチン細胞として用いた免疫遺伝子治療臨床研究のにおいて、4症例中3例において、腫瘍特異的免疫の誘導が確認でき、ワクチン細胞接種後に定量IL-2を併用したところ、4例中2例の患者が5年以上生存(うち1例は7年8ヶ月生存中)との結果が得られていることから、サイトカインとしてGM-CSF及び/またはIL-2をコードする本発明のベクターは、転移性腎癌を含む転移癌に対して有望と考えられる。【００８４】
本発明のベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子の種類等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、脊髄腔内、または皮下等に行われ得るがそれらに限定されない。経鼻投与は好ましい投与経路の一つである。また局所及び/または全身に投与し得る。投与されるベクター量は好ましくは約105 CIU/mlから約1011 CIU/ml、より好ましくは約107 CIU/mlから約109 CIU/ml、最も好ましくは約1×108 CIU/mlから約5×108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は 2×105 CIU〜 2×1010 CIUが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。本発明のベクターを用いて製造された蛋白質製剤であれば、蛋白質の投与量は例えば、10ng/kgから100μg/kg、好ましくは100ng/kgから50μg/kg、より好ましくは1μg/kgから5μg/kgの範囲であるとよい。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。【００８５】
本発明のベクターの投与対象は特に制限がなく、ヒト及びサル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ等を含む全ての非ヒト哺乳動物が含まれる。【００８６】
本発明のベクターの投与は、腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターによる免疫と組み合わせて行うこともできる。腫瘍抗原の免疫と組み合わせた治療は、ベクターの単独投与に比べ有意に高い抗腫瘍作用を発揮することが期待される。腫瘍抗原の免疫に用いる抗原としては、例えば増殖能を失わせた腫瘍細胞、及び腫瘍細胞溶解物等が挙げられる。腫瘍細胞は、加熱処理、放射線処理、またはマイトマイシンC処理等で処理し増殖性をなくすことが好ましい。例えば、X線照射を利用する場合、総放射線量700〜3300 Radで照射することができる。マイトマイシンC処理法は、例えば、細胞に25〜50 micro-g/mlのマイトマイシン Cを添加し、37℃、30〜60分間保温処理することができる。熱による細胞処理方法は、例えば、50〜65℃で20分間加熱処理を行うことができる。また、腫瘍細胞を用いる代わりに、標的とする腫瘍細胞で発現する腫瘍抗原を用いてもよい。腫瘍抗原は、天然または組み換えポリペプチドであってよい。さらに、腫瘍抗原を発現するベクターを投与してもよい。腫瘍抗原を発現するベクターとしては、特に制限はなく、例えばプラスミド、ウイルスベクター、naked DNAなど、投与個体において腫瘍抗原を発現する能力を持つ所望の発現ベクターが用いられる、このようなベクターは、適当なプロモーター（例えばSV40プロモーター、CAGプロモーター、CMVプロモーター、EF1プロモーター、LTRプロモーター）の下流に腫瘍抗原をコードする核酸が連結された核酸を含むものであってよい。ウイルスベクターを用いる場合は、各ウイルスベクターに適した発現調節配列の制御下に腫瘍抗原をコードする核酸が連結される。【００８７】
所望により、本発明のサイトカインをコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターは、その他の抗腫瘍処置に必要とされる物質（例えば、ベクターを投与する際に必要とされる溶媒、一緒に投与される腫瘍抗原、サイトカイン、アジュバント等）、器具等と組み合わせたキットの形態としてもよい。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００８９】
実験で用いた材料および方法について
（１）マウス
6〜8週齢のBALB/cおよびC57BL/6雌マウスをCLEA Japan, Inc（Tokyo, Japan）から購入して、特定病原体を含まない条件で九州大学動物飼育施設に収容した。動物実験は全て、九州大学医学部の動物実験に関する倫理委員会の承認を受け、日本の福岡県にある九州大学医学部の動物実験に関するガイドラインならびに政府の法律および通知に従って実施した。マウスの実験は、結果を確認するために少なくとも2回行った。【００９０】
(2-1)ベクターの構築（センダイウイルスベクター）
(i)各遺伝子のNotIフラグメントの構築（センダイウイルスの転写シグナル付加）
マウス由来GM-CSF遺伝子cDNA（ｍGM-CSF遺伝子cDNA）（配列番号：17）を鋳型として、pmGMCSF-NNotI（配列番号：18）及びpmGMCSF-CNotI（配列番号：19）の2種のプライマーを用いてPCRを行った。得られたPCR産物をNotIで消化後、pBluescriptTM II KS（Stratagene）にサブクローニングすることにより、センダイウイルスの転写シグナル（斜字）を付加したGM-CSF遺伝子NotIフラグメント（配列番号：20）を構築した。
(ii)GM-CSF遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNAの構築
F遺伝子欠失型SeVベクター（WO00/70070）のcDNA（pSeV18+NotI/ΔF）をNotIで消化し、そのNotI部位に上記(i)において作製したGM-CSF遺伝子NotIフラグメントを挿入し、mGM-CSF遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNA（pSeV18+mGM-CSF/ΔF）を構築した。
(iii)センダイウイルスベクターの再構成と増幅
ウイルスの再構成及び増幅はLiらの報告（Li, H.-O. et al., J. Virology 74: 6564-6569, 2000; WO00/70070）及びその改良法（WO2005/071092; Inoue M, et al. J. virology. 2003; 77: 3238-46.）に従って行った。ベクターの製造には、Cre/loxP発現誘導システムを利用してF蛋白質を発現誘導できるF蛋白質のヘルパー細胞を使用した。当該システムはCre DNA リコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドpCALNdLw（Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121, 1988）を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにCre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルス（AxCANCre）をSaitoらの方法（Saito, I. et al., Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821, 1995; Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121, 1998）で感染させて挿入遺伝子を発現させた。
これらの方法によって、mGM-CSF遺伝子を搭載したF遺伝子欠失型SeVベクター（SeV18+ mGM-CSF/ΔFと表記する）を調製した（図1 ｂ）。このSeV18+ mGM-CSF/ΔFは、実施例10で示されている実験でサンプルとして使用している。
また、上記方法と同様の方法により、マウス由来TARC（PUBMED   Accession No. NM_011332）を搭載したF遺伝子欠失型SeVベクターF遺伝子欠失型SeVベクター（SeV18+ mTARC/ΔFと表記する）とマウス由来RANTES（PUBMED  Accession No. X70675）を搭載したF遺伝子欠失型SeVベクターF遺伝子欠失型SeVベクター（SeV18+ mRANTES/ΔFと表記する）を調製した（PUBMED  URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）。
さらに、M蛋白質にG69E，T116A，及びA183Sの温度感受性変異を、HN蛋白質にA262T，G264，及びK461Gの温度感受性変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つ、F遺伝子を欠失したmGM-CSF発現センダイウイルスベクター（以下SeV18+mGM-CSF/TSΔFと標記する。）（全長配列を配列番号：21として記す）を作製した（図1 a）。【００９１】
（2-2）ベクターの構築（アデノウイルスベクター）
E1A、E1B、およびE3遺伝子を欠損し、GFPまたはマウスGM-CSF遺伝子（それぞれ、AdV/GFPおよびAdV/GM）搭載する複製欠損組み換え型Ad5アデノウイルスベクターは、既に記述されたとおりに構築され（Abe J ,et al. Journal of cancer research and clinical oncology. 1995; 121: 587-92.）、RIKEN Bio Resource Center（BRC）の厚意によって提供された。組み換え型ウイルスベクターを293細胞（ATCC）において増幅（propagate）させて、293細胞におけるプラーク形成アッセイによって力価を決定した（TCID50法）。アデノウイルス溶液は、使用するまで-80℃で保存した。組み換え型アデノウイルスベクターは、その抗腫瘍活性を本試験における組み換え型SeVベクターの活性と比較するためのコントロールとして用いた（図1ｃ）。【００９２】
（３）腫瘍細胞株および培養培地
マウス骨髄単球性白血病細胞株であるWEHI-3B細胞は、Dr. D. Metcalf（University of Melbourne）の厚意によって提供され、およびマウス腎細胞癌細胞株であるRENCA細胞は、Dr. M. Azuma（Tokyo Medical and Dental University）の厚意によって提供された。LLC（マウスルイス肺癌）およびEL4（マウスリンパ腫）細胞株は、American Type Culture Collection（Manassas, VA）から購入した。ヒト非小細胞癌細胞株PC9、H1299、H460、およびLK87は、Dr. K. Takayama（Kyushu University）の厚意により提供された。ヒトRCC（腎細胞癌）細胞株、Caki-1、Caki-2およびA498 は、American Type Culture Collection（ATCC）（Manassas, VA）から購入した。OSRC-2およびVMRC-RCW細胞はそれぞれ、RIKEN BioResource Center（BRC）（Ibaraki, Japan）およびJapanese Collection of Research Bioresources（JCRB）（Osaka, Japan）から購入した。細胞株は全て、5％CO2を含む湿潤大気中で37℃で培養した。DMEM（GIBCO BRL, NY）において維持したLLC細胞を除く腫瘍細胞株は全て、10％熱不活化FBSならびにペニシリン（100単位/ml）、ストレプトマイシン（0.1 mg/ml）および2 mMブルタミンを添加したRPMI 1640（GIBCO BRL）（完全培地：CM）を含む組織フラスコまたはペトリ皿において培養した。【００９３】
（４）ワクチン細胞の作製
SeV18+ｍGM-CSF/TSΔF及び、コントロールとして、AdV+mGM-CSFに加えて、GFP搭載F欠損SeVベクター(SeV18+GFP/TSΔF)、GFP搭載AdV（AdV+GFP）を、各々、RENCA細胞に導入することにより、実験に用いるワクチン細胞を作製した（RENCA/SeV18+ｍGM-CSF/TSΔF, RENCA/AdV+mGM-CSF, RENCA/SeV18+GFP/TSΔF, RENCA/AdV+GFP）。ワクチン細胞につき、1.0×106個から培養液中に24時間で産生されるGM-CSFの量をELISA法により計測した(BD Pharmingen, NJ)。GM-CSF産生レベルは、SeV18+ｍGM-CSF/TSΔF (MOI=100)及びAdV+mGM-CSF (MOI=300)形質導入RENCA（RENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF, RENCA/AdV+mGM-CSF）で、各々、147.5及び1241ng/106細胞/48時間であった。【００９４】
（５）非伝播性SeV感染後の腫瘍細胞の生存率
細胞生存率をトリパンブルー排除法によって決定した。RENCA細胞200万個またはLLC細胞200万個を100 mmペトリ皿に播種した。上記細胞を、無血清RPMIまたはDMEMにおいて、SeV18+GFP/TSΔF（MOI＝100）またはSeV18+ｍGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）に90分間感染させ、CMにおいて48時間培養し、トリプシン処理を行って、希釈し、0.4％（w/v）トリパンブルー（GIBCO BRL）によって染色した。トリパンブルー陽性細胞数およびトリパンブルー陰性細胞数を光学顕微鏡下で計数した。トリパンブルーを排除する細胞の百分率を細胞生存率の指標として得た。細胞の形態学も同様に、光学顕微鏡下で可視化した。【００９５】
（６）in vitro 増殖アッセイ
増殖アッセイに関して、RENCAまたはLLC細胞を96ウェルマイクロプレートにおいて濃度1×104個/ウェルで個々に培養した。細胞接着を促進するためにCMと共に4〜5時間インキュベートした後、腫瘍細胞をPBSによって洗浄し、無血清RPMIまたはDMEMにおいてSeV18+GFP/TSΔF（MOI＝1、10、もしくは100）またはSeV18+ｍGM-CSF/TSΔF（MOI＝1、10、もしくは100）に90分間感染させて、1〜4日間インキュベートした。各時点（SeV感染後0、1、2および4日目）で、生存細胞数をCell Count Reagent SF（Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan）を用いてテトラゾリウム色素を組み入れることによって分光測光法によって推定した。試薬を添加して、細胞をさらに1時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmでのOD値を決定した。独立した3回の実験からのアッセイは全て、1試料あたり3回ずつ行った。【００９６】
（7）統計分析
統計分析に関して両側のStudent t-検定を用いた。統計学的有意性に関する両側の検定からp値を得た。カプラン-マイヤー曲線を用いて生存をプロットして、統計学的関連性をStatviewソフトウェアを用いてログランク比較によって決定した。確率値はp<0.05である場合に有意であると見なされた。【００９７】
〔実施例1〕SeVベクターの大腸癌株に対する遺伝子導入効率と発現効率
(i)発現実験
大腸癌株7種（SW620, SW837, Colo205, Colo320, WiDr, HCT116, HCT116, LS174）にLacZ搭載ベクターを感染させた。LacZ遺伝子搭載センダイウイルスベクター(SeV18+LacZ)は、文献に記載の方法に従い作成した(Shiotani A, Fukumura M, Maeda M, Hou X, Inoue M, Kanamori T, Komaba S,Washizawa K, Fujikawa S, Yamamoto T, Kadono C, Watabe K, Fukuda H, Saito K, Sakai Y, Nagai Y, Kanzaki J, Hasegawa M. Skeletal muscle regeneration after insulin-like growth factor I gene transfer by recombinant Sendai virus vector. Gene Ther 8(14): 1043-50, 2001)。コントロールとして、LacZ遺伝子搭載アデノウイルスベクター(AdV+LacZ)を用いた(http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/004003003.shtml)。AdVについては、Moi=5及び50、SeVについては、Moi=1及び5とした。感染から48時間後にLacZ活性を蛍光基質fluorescein di-β-D-galactopyranoside (FDG)を用いて、各ベクターを導入した細胞の蛍光強度をフローサイトメーターで測定することにより、ベクターの発現効率を調べた。その結果、moi5において、AdVを用いた場合よりも、本発明のSeVを用いた方が高いLacZ発現が得られ、本発明のSeVが、癌細胞への遺伝子導入に適したものであることが確認された（図２）。【００９８】
更に図3においても示すように下記のような実験を行った。
in vitroで繁殖させたヒト腫瘍細胞株9例およびマウス腫瘍細胞株5例を採取して、SeV/ΔF/GFPによって形質導入し、遺伝子形質導入効率に関して調べた。フローサイトメトリー分析により、用量依存的なGFP発現が示され、MOI 10〜100において最適な発現が得られた（図3a、b）。【００９９】
その他、以下の細胞についてGFP発現試験を行い、SeVの細胞への導入効率を、蛍光発現の有無に基づき確認した。
(1)殆どの細胞につき、moi=10で100％GFPの蛍光が観察可能であったもの
大腸癌（SW620, SW837, SW480, Colo205, Colo320, LS174, WiDr, HCT116, HT29）
食道癌（T, Tn, YES）
グリオーマ（U87, A172, U251, mutant p53）
膵臓癌（膵臓腺癌）（Panc I, BXPC-3, MIAPACA-2, ASPA-1）
乳癌（MSF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s, MDA-MB-157, MDA-MB-468）
卵巣癌（OVACAR 3, OVACAR4, OVACAR5, OVACAR8, SKOV3）
肺癌（A549(非小細胞肺癌セルライン), PC14(非小細胞肺癌セルライン), RERF-LC-A1, ANIP-973(肺腺癌 meta hirono stock)）
頭頸部癌
口腔扁平上皮癌（HO-1-u-1(TKG0455), HSC-2(TKG0487)）
口腔癌（KB（TKG0401））
喉頭癌（HEp-2（TKG0403））
歯肉癌（Ca9-22（TKG0485）
前立腺癌（PC-3, DU145）
（2）殆どの細胞につき、moi=100で70〜80％GFPの蛍光が観察可能であったもの
マウスメラノーマ（B16）
マウス扁平上皮癌（SCCVII）
舌癌（SAS(TLG0470), HSC-3(TKG0484), HSC-4(TKG0489), TF）
ヒト前立腺癌（LNCAP）【０１００】
〔実施例2〕SeV18+mGM-CSF/TSΔFまたはSeV18+hGM-CSF/TSΔFを導入した腫瘍細胞におけるGM-CSF発現
次に、SeV18+mGM-CSF/TSΔFまたはSeV18+hGM-CSF/TSΔFを導入した腫瘍細胞において、GM-CSFの発現量を定量した。図4aにおいて示されるように、SeV18+mGM-CSF/TSΔFを導入した組織学的に異なるマウス腫瘍細胞株4例において、マウスGM-CSFの発現量は、50より大きいMOIでは最大となり、300 ng/106個/24時間より大きくなった。同様に、SeV18+hGM-CSF/TSΔFを形質導入した2種類のNSCLC細胞株（ヒト細胞株）および2種類のRCC細胞株（ヒト細胞株）は、導入後少なくとも7日間MOI依存的に高いGM-CSFを産生した（図4b）。よって、SeV18+mGM-CSF/TSΔF及びSeV18+hGM-CSF/TSΔFが、様々な腫瘍細胞株において、高い遺伝子導入能を有することを証明した。【０１０１】
〔実施例3〕SeV18+mGM-CSF/TSΔFを導入した腫瘍細胞の増殖または生存率
センダイウイルスベクターに外因性遺伝子搭載しただけによる腫瘍細胞の生存および生育に影響を及ぼす可能性を除外するために、およびセンダイウイルスを構成する遺伝子自体が腫瘍細胞の生存および生育に影響を及ぼす可能性を除外するために、次の実験を行った。SeV18+GFP/TSΔFまたはSeV18+mGM-CSF/TSΔFのいずれかを導入したRENCA腫瘍細胞またはLLC腫瘍細胞を、同じ条件でin vitroで培養して、細胞生存率および増殖を評価した。【０１０２】
実験方法
細胞生存率をトリパンブルー排除法によって決定した。RENCA細胞200万個またはLLC細胞200万個を100 mmペトリ皿に播種した。上記細胞を、無血清RPMIまたはDMEMにおいて、SeV18+GFP/TSΔF（MOI＝100）またはSeV18+ｍGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）に90分間感染させ、CMにおいて48時間培養し、トリプシン処理を行って、希釈し、0.4％（w/v）トリパンブルー（GIBCO BRL）によって染色した。トリパンブルー陽性細胞数およびトリパンブルー陰性細胞数を光学顕微鏡下で計数した。トリパンブルーを排除する細胞の百分率を細胞生存率の指標として得た。細胞の形態学も同様に、光学顕微鏡下で可視化した。【０１０３】
実験結果
LLC細胞においては、SeV18+GFP/TSΔFとSeV18+mGM-CSF/TSΔFとの導入の違いで、細胞の生存率に違いがあまり見られない。しかし、RENCA細胞においては、SeV18+GFP/TSΔFの導入に比べ、SeV18+mGM-CSF/TSΔFの導入においては、有意に大きい細胞生存率を示した（p<0.05）（図3c、d）。さらに、様々なMOIでのSeV18+GFP/TSΔF又はSeV18+mGM-CSF/TSΔFを導入したRENCA細胞およびLLC細胞においては、4日間連続して、ベクター未導入細胞（コントロール）と同じ増殖速度を有した（p<0.05）（図3e、f）。
よって、センダイウイルスベクターに外因性遺伝子搭載しただけによる腫瘍細胞の生存および生育に影響を及ぼす可能性は除外させる。また、センダイウイルスを構成する遺伝子自体が腫瘍細胞の生存および生育に影響を及ぼす可能性も除外される。【０１０４】
〔実施例4〕SeV18+mGM-CSF/TSΔFの抗腫瘍効果（その1）
IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFとIrRENCA/AdV+mGM-CSFについて、腎癌に対する抗腫瘍活性を、腫瘍の大きさ及びマウス生存率により比較した。【０１０５】
SeV18+mGM-CSF/TSΔFを導入した腫瘍細胞において、放射線照射により、どれだけ上記腫瘍細胞内におけるmGM-CSFの発現に影響を及ぼすかを調べる目的で、次の実験を行った。SeV18+mGM-CSF/TSΔFを導入したRENCA細胞（マウス由来癌細胞）またはSeV18+hGM-CSF/TSΔFを導入したH1299細胞（A549）（ヒト由来癌細胞）に、放射線照射（それぞれ、50 Gyおよび100 Gy）を行って、上記細胞内でのGM-CSF産生量を測定した。
放射線照射された上記RENCA細胞及びは上記H1299細胞細胞において、SeV18+mGM-CSF/TSΔF等を導入後5日目に大量のGM-CSFを継続的に産生した（図5a、b）。【０１０６】
マウスへの投与
凍結保存から融解して、in vitroで1〜2週間培養して生育させたRENCA細胞（mirine renal cell carcinoma）をトリプシン処理して、HBSSにおいて2回洗浄し、BALB/cマウスの右横腹皮下に接種した（0日目、1×106個/マウス、n＝9）。腫瘍の体積を週に2または3回モニターした。このことにより、腎細胞癌モデルマウスを作製した。上記細胞を上記マウスに接種して7日後に（腫瘍直径が3〜5mm）、1.0×106個のワクチン細胞（50Gy照射したIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF (MOI=100)及び50Gy照射したIrRENCA/AdV+mGM-CSF (MOI=300)）を左横腹部へ皮下注射した。ワクチン投与は同部位（左横腹部皮下）へ1週間おきに計3回施行した。コントロールとして、50Gy照射したIrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF (MOI=100)、50Gy照射したIrRENCA/AdV+GFP (MOI=300)、50Gy照射したRC及び HBSS(Hanks’ balanced solution salt)を投与した。腫瘍の大きさ(mm3)（図6a）、及び上記モデルのマウス生存率(％)を調べた（図6b）。
本実験結果より、IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFは、IrRENCA/AdV+mGM-CSFと同等以上の抗腫瘍効果を有していることが明らかとなった。具体的には、IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF (MOI=100)の投与（図の標記（7））による効果が、IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF (MOI=300)の投与による腫瘍抑制の効果（図の標記（6））より同等以上の腫瘍抑制の効果があったことである。また、IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI=100）の投与群においては、他の投与群と比べ、上記モデルマウスの生存率が高いことが示された。本実験結果により、SeV18+mGM-CSF/ΔFが腫瘍増殖を抑制する効果を有することが示唆される。【０１０７】
〔実施例5〕CTLアッセイ及びサイトカイン分析
続いて、腎癌モデルマウスにおいて、IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFを投与することにより、上記モデルマウスにおいての腫瘍の縮小が、免疫応答によって誘導されるか否かを確認した。具体的には、RENCA細胞に対するCTL活性を測定した（51Cr CTLアッセイ）。
腫瘍細胞におけるMHCクラスI発現は癌免疫療法におけるCTL認識にとって必要であることから(Vertuani S, De Geer A, Levitsky V, Kogner P, Kiessling R, Levitskaya J. Retinoids act as multistep modulators of the major histocompatibility class I presentation pathway and sensitize neuroblastomas to cytotoxic lymphocytes. Cancer research. 2003; 63: 8006-13.)、CTLアッセイの前に、本発明者らはフローサイトメトリーによってRENCA腫瘍細胞およびWEHI-3B腫瘍細胞におけるMHCクラスI（H-2Kd）表面発現を評価した。RENCA細胞およびWEHI-3B細胞におけるMHCクラスI発現はそれぞれ、高い、または中等度であった（データは示していない）。
上記CTL活性の測定法について、図７で模式図を示した。具体的には、1.0×106個のマウスRENCA細胞を右横腹部皮下に接種した。このことにより、腎癌モデルマウスを作製した。7日目より毎週、計3回所定のワクチン等を、左横腹部へ皮下注射することにより、上記マウスへ投与した。尚、所定のワクチン等とは以下のものをいう。
(1) HBSS
(2) 50Gy照射したIrRENCA/AdV+GFP（MOI＝300）
(3)  50Gy照射したIrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF（M＝100）
(4)  50Gy照射したIrRENCA/AdV+mGM-CSF（MOI＝300）
(5)  50Gy照射したIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF（M＝100）
尚、図８（a）及び（ｂ）で示している実験結果についての実験においては、上記
マウスへの上記所定のワクチン（上記（4）、上記(5)）の投与量は、3.0×106個である。図８（ｃ）及び（ｄ）で示している実験結果についての実験においては、上記マウスへの上記所定のワクチン（上記（2）、上記(3)、上記（4）、上記(5)）の投与量は、1.0×106個である。
上記注射により免疫した7日後のマウスの脾臓細胞を用いて in vitroCTL活性分析(51Cr放出)を行った（図7）(Shibata S, Okano S, Yonemitsu Y, et al. Induction of efficient antitumor immunity using dendritic cells activated by recombinant Sendai virus and its modulation by exogenous IFN-beta gene. J Immunol. 2006; 177: 3564-76.)。
さらに、免疫したマウス脾臓細胞のin vitroでのサイトカイン産生能を調べた(サイトカイン分析)。具体的には、HBSS、RENCA/AdV+GFP、RENCA/SeV18+GFP/TSΔF、RENCA/AdV+mGM-CSF、及びRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFにより免疫したマウスの脾臓細胞（計2回のワクチン接種から6日後）を用いて、上清サイトカイン(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、IFN-γ)分析を行った。（in vitroにて脾臓細胞と再刺激として50Gy照射したRENCA細胞（ありなし）を20時間共培養した上清）。【０１０８】
CTLアッセイ等の結果
ワクチン化モデルでは、CTL分析(図8)及びサイトカイン分析の両方において、抑制された腫瘍成長を示すIrRENCA/AdV+mGM-CSF、及びIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF Fで処置された両マウスは、各コントロールと比べ、腫瘍特異的応答、並びにIL-2、IL-4及びIFN-γの有意に高い産生が観察された。特にRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF処置マウスは、IrRENCA/AdV+mGM-CSF処置マウスと比べて、より著しいIFN-γ産生を示した(p<0.05)（データは示さず）。図8のCTL分析の結果からも明らかなように、RENCA細胞において、ネガティブコントロールに比べ、腫瘍特異的応答が示されている。
図8で示した実験結果より、RENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFが、IrRENCA/AdV+mGM-CSFと同等以上のin vivo抗腫瘍効果を有することが示された。その結果、本発明のベクターがIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFが、自家GM-CSFワクチン産生により広範囲で適用可能であることが示唆された。【０１０９】
〔実施例6〕GM-CSF形質導入腫瘍ワクチン接種後の脾細胞による腫瘍特異的サイトカイン産生
GM-CSF形質導入RENCAワクチン接種の免疫調節効果を決定するために、本発明者らは、RENCAワクチン細胞免疫免疫応答性マウスを用いて、放射線照射RENCA細胞の存在下または非存在下で脾細胞におけるサイトカイン産生量を調べた。
第一に、in vitroで再刺激した場合のIL-4またはIFN-γ産生脾細胞の数を定量するために、無処置、またはIrRENCA/AdV+GFP、IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF、IrRENCA/AdV+mGM-CSF、もしくはIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFによって処置したマウスから採取した脾細胞を、IFN-γおよびIL-4に関するin vitro ELISPOTアッセイに供した。放射線照射RENCA細胞の存在下で同時培養すると、IFN-γおよびIL-4の双方を分泌するIrRENCA/AdV+mGM-CSFまたはIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFのいずれかによって処置したRENCA担癌マウスからの脾細胞数は、それぞれのコントロール群（IrRENCA/AdV+GFPまたはIrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF）からの脾細胞数より有意に多かった（p<0.05）。さらに、IFN-γを分泌するirRC/SeV/GM細胞を処置したマウスからの脾細胞数は、irRC/AdV/GM細胞で処置したマウスからの脾細胞より有意に多かった（p<0.05）（図9a）。無関係な抗原である放射線照射WEHI-3B細胞の存在下でのIFN-γまたはIL-4産生細胞数は、抗原の非存在下での細胞数と同程度に少ないことから、これらの増強されたIFN-γ産生細胞は腫瘍抗原特異的である（図9b）。
次に、本発明者らは、無処置のまま（HBSSのみ）またはIrRENCA/AdV+GFP、IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF、IrRENCA/AdV+mGM-CSF、もしくはIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFを処置したマウスからの脾細胞によって産生された様々なin vitro炎症性サイトカインを調べた。再刺激のための放射線照射RENCA細胞の存在下または非存在下で20時間同時培養後、上清を採取して、以下の炎症性サイトカインを測定した：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、およびTNF-α。ELISPOTアッセイと同様に、IrRENCA/AdV+mGM-CSFまたはIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFによって処置したマウスからの脾細胞によって産生されたIFN-γ、IL-2、およびIL-4の産生量は、それぞれのGFPコントロールを処置した脾細胞より有意に高かった（p<0.05）（図9d、e、f）。特に、IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFを処置したマウスの脾細胞からのIFN-γ産生のみは、ELISPOTアッセイ（p<0.05）と同様に、IrRENCA/AdV+mGM-CSFを処置したマウスのものより大きかった（図9d）。IrRENCA/AdV+GFPを処置したマウスの脾細胞から産生されたIL-2は、IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔFを処置したマウスより有意に高かった（p<0.05）（図9e）。HBSS処置群を除く、それぞれのワクチン群におけるTNF-αおよびIL-6産生量は、刺激細胞の存在下で上昇したが、それぞれのGFP処置群およびGM-CSF処置群のあいだでは有意差を認めなかった（図9c、h）。興味をそそられることに、刺激細胞の存在下でIrRENCA/AdV+mGM-CSFまたはIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF細胞によって処置した双方のマウスからの脾細胞によって産生されたIL-5産生量は、それぞれのコントロール（IrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF対IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF；p<0.05）と比較して上昇した（図9g）。この結果は、ワクチン接種が、GM-CSF誘導抗腫瘍反応に関与すると思われる(Soiffer R, Lynch T, Mihm M, et al. Vaccination with irradiated autologous melanoma cells engineered to secrete human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor generates potent antitumor immunity in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 13141-6. ; Tani K, Azuma M, Nakazaki Y, et al. Phase I study of autologous tumor vaccines transduced with the GM-CSF gene in four patients with stage IV renal cell cancer in Japan: clinical and immunological findings. Mol Ther. 2004; 10: 799-816. ; Chu Y, Xia M, Lin Y, et al. Th2-dominated antitumor immunity induced by DNA immunization with the genes coding for a basal core peptide PDTRP and GM-CSF. Cancer gene therapy. 2006; 13: 510-9. ; Ellyard JI, Simson L, Parish CR. Th2-mediated anti-tumour immunity: friend or foe? Tissue antigens. 2007; 70: 1-11.)好酸球を全身的に活性化することを示唆している。【０１１０】
尚、本実施例にかかる上記サイトカイン産生量を調べるための更に具体的な実験方法を以下に示す。
ELISPOTアッセイ
2回目の腫瘍ワクチン細胞をマウスへ接種後6日目に、その接種されたマウスを屠殺して、ELISPOTアッセイキット（Cytokine ELISPOT Set, BD Pharmingen, NJ）を用いて、その脾細胞をマウスIFN-γおよびIL-4分泌に関して試験した。ImmunoSpot(商標)ELISPOT 96-ウェルプレートを、5μg/ml精製抗マウスIFN-γまたは抗マウスIL-4モノクローナル抗体によってコーティングして、4℃で終夜インキュベートした。0.05％Tween 20を含むPBSによってウェルを洗浄して、ブロッキング緩衝液（10％FBSを含むRPMI 1640）と共に室温で2時間インキュベートした。RBC枯渇脾細胞（1×105個）を、総容積200μlにおいて放射線照射RENCAまたはWEHI-3B細胞の存在下で、前記の脾細胞：放射線照射腫瘍細胞比（100：1および50：1）で5％CO2で37℃で20時間インキュベートした。陽性コントロールとして、T細胞刺激のためのマイトゲンとして知られるPMA（20 ng/mlホルボル12-ミリステート13-アセテート；Sigma, St. Louis, MO）を前記のウェルに添加した。プレートを洗浄した後、ウェルを2μg/mlのビオチン化抗マウスIFN-γまたは抗マウスIL-4モノクローナル抗体と共に室温で2時間インキュベートした。次に、プレートを十分に洗浄して、ストレプトアビジン-HRP溶液と共に室温で1時間インキュベートして、2回洗浄し、最終基質溶液（AEC色素原と混合したAEC基質、BD Pharmingen, NJ, US）と共にインキュベートした後、室温で5分間スポットの発生に関してモニターした。乾燥後、IFN-γまたはIL-4分泌細胞を示すスポットを、Zeiss Axiovert解剖顕微鏡（Jena, Germany）下で手動で計数して、1試料あたり4個ずつの決定のスポットの平均数＋SDとして表記した。
CBAおよびELISAアッセイ
ELISPOT分析と同様に、2回目の腫瘍ワクチン接種後6日目に採取したRBC枯渇マウス脾細胞（5×106個）を放射線照射RENCA細胞の存在下または非存在下で10：1の比で全量1.0 mlにおいて37℃で20時間インキュベートした。細胞上清を回収して、マウスIL-2、IL-4、IL-5、TNF-α、およびIFN-γ濃度をBDマウスTh1/Th2サイトカインCBA（Cytometric Bead Array）キット（BD Pharmingen）を用いて製造元のプロトコールに従って測定した。IL-6の濃度は、マウスIL-6イムノアッセイキット（R&D Systems, MN）を用いて製造元の技法に従って測定した。【０１１１】
〔実施例7〕放射線照射GM-CSF形質導入RENCAワクチン細胞によって刺激された腫瘍浸潤性白血球の免疫組織化学的特徴付け
放射線照射GM-CSF形質導入RENCAワクチン細胞による抗腫瘍効果に関与する重要な免疫細胞を同定するために、無処置または前記のワクチン接種（IrRENCA/AdV+GFP、IrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF、IrRENCA/AdV+mGM-CSF、又はIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔF）によって処置したRENCA担癌マウスにおける腫瘍浸潤性白血球（TIL）の分布プロフィールを、免疫組織化学（IHC）によって査定した。【０１１２】
実験方法
上記の治療的RENCAモデルにおける2回目の前記の腫瘍ワクチン細胞を接種後6日目に、OCT化合物（Sakura Fine Technical Co., Tokyo, Japan）を重層することによって、確立されたRENCA結節を瞬間凍結した。試料は全て、分析するまで-80℃で保存した。連続低温槽（serial cytostate）（8〜10μm）凍結切片を、Superfrostスライドガラス（Matsunami, Osaka, Japan）に接着させて、アセトンにおいて室温で10分間固定して、空気乾燥させ、蒸留水ですすいで抱埋培地を除去した。標準的な技法に従って染色を行った。簡単に説明すると、切片を適当に希釈した一次抗体、マウスCD4（GK1.5）、CD8（53-6.7）、CD11c（N418）、およびFoxP3（FJK-16s）（全て、eBioscience, San Diego, CA）と共に製造元の説明書に従って連続的に4℃で終夜インキュベートした後、ビオチン化抗ラットまたは抗ハムスター二次Ab（eBioscience）と共に1時間インキュベートした。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ（Dako Japan Co. Ltd, Kyoto, Japan）と共に30分間インキュベートした後、3,3'-ジアミノベンジジン（Nakalai tesque, Kyoto, Japan）基質を用いてAg-Ab反応を展開した。各インキュベーション段階のあいだにスライドガラスをPBSによって3回洗浄して、メイヤーのヘマトキシリンによって対比染色を行い、段階的に等級が下がるアルコールおよびキシレンによって脱水した後、標本を作製した。インキュベーションは全て湿潤チャンバーにおいて行った。Zeiss Axiovert顕微鏡によって写真を撮影した。染色細胞を一連の高倍率野（HPF）において可視化して、倍率200倍の顕微鏡下でHPF 30〜70箇所を計数した。陽性細胞の百分率を計算して、結果を平均値±SDとして表記する。【０１１３】
実験結果
IHC分析により、IrRENCA/AdV+mGM-CSFまたはIrRENCA/SeV18+mGM-CSF/TSΔFを処置したマウスからの腫瘍塊では、それぞれのコントロール（IrRENCA/AdV+GFPおよびIrRENCA/SeV18+GFP/TSΔF）を処置したマウスより多くの浸潤性CD8+T細胞が明らかとなった（p<0.05）（図10）。CD11c（樹状細胞）およびFoxP3（調節性T細胞）染色は、それぞれの腫瘍ワクチン接種群において有意差を示さなかった。【０１１４】
〔実施例8〕SeV18+mGM-CSF/TSΔFの抗腫瘍効果（その2）
肺癌モデルマウスを用いて、SeV18+mGM-CSF/TSΔFの腫瘍抑制効果を調べた。
LLC細胞をBALB/cマウスの右横腹に皮下接種して（0日目、2×105個/マウス、n＝6）した。このことにより、肺癌モデルマウスを作製した。LLC細胞接種後3日目（腫瘍が触診可能となった時期）(Kojima T, Yamazaki K, Tamura Y, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene-transduced tumor cells combined with tumor-derived gp96 inhibit tumor growth in mice. Human gene therapy. 2003; 14: 715-28.)から4日毎に3回（3、6、および9日目）に、下記所定のワクチン細胞等を、上記モデルマウスの左横腹に皮下接種した。所定のワクチン細胞等とは、以下のことを指す。
（１）HBSSのみ、
（２）50Gy照射したIrLLC  1.0×106個
（３）50Gy照射したIrLLC/SeV18+GFP/TSΔF（MOI＝100）1.0×106個
（４）50Gy照射したIrLLC/SeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）1.0×106個
IrLLC/SeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）の投与群（上記（４））において、他の投与群（上記（１）〜（３））に比べ、上記マウスにおいての腫瘍の抑制が見られた（図11（a））。
また、IrLLC/SeV18+mGM-CSF/TSΔF（MOI＝100）の投与群（上記（４））においては、他の投与群（上記（１）〜（３））に比べ、上記マウスの生存率も高かった。
本実験結果により、SeV18+mGM-CSF/ΔFが腫瘍増殖を抑制する効果を有することが示唆される。【０１１５】
〔実施例9〕SeV18+mGM-CSF/ΔF、SeV18＋mTARC/ΔF、及びSeV18＋mRANTES/ΔFの抗腫瘍効果
Balb/cマウス（n =6）に下記所定の細胞を右横腹部皮下に接種した。そのことにより、マウス体内における腫瘍の形成具合を観察した（図12）。尚、所定の細胞とは以下のものとする。
（１）LLC細胞5.0×105個
（２）SeV18+GFP/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞 5.0×105個
（３）SeV18+GFP/ΔF（MOI＝100）を導入したLLC細胞 5.0×105個
（４）SeV18+mGM-CSF/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞 5.0×105個
（５）SeV18+mGM-CSF/ΔF（MOI＝100）を導入したLLC細胞 5.0×105個
（６）SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10））5.0×105個
（７）LLC/SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10）2.5×105個とLLC細胞2.5×105個  
（８）LLC/SeV18+mTARC/ΔF（MOI＝10）5.0×104個とLLC細胞4.5×105個
（９）SeV18+mRANTES/ΔF（MOI＝10）を導入したLLC細胞（LLC/SeV18+mRANTES/ΔF（MOI＝10））5.0×105個  
（１０）LLC/SeV18+ mRANTES/ΔF（MOI＝10）2.5×105個とLLC細胞2.5×105個
（１１）LLC/SeV18+ mRANTES/ΔF（MOI＝10）5.0×104個とLLC細胞4.5×105個
本実験結果により、SeV18+mGM-CSF/ΔF、SeV18＋mTARC/ΔF、及びSeV18＋mRANTES/ΔFが、腫瘍形成を抑制する効果を有することが示唆される。【０１１６】
〔実施例10〕SeV18+mGM-CSF/TSΔFの抗腫瘍効果（その3）
C57BL/6マウス（n＝4）に2.0×105個のマウスLLC腫瘍細胞を右横腹部皮下に接種した。このことにより、肺癌モデルマウスを作製した。その3日後に（腫瘍直径が3〜5mm）5.0×105個のDC/SeV18+mGM-CSF/TSΔFを上記マウス左横腹部へ皮下注射した。具体的な実験方法は、図13（a）及び（ｂ）に記載した。
図13（c）〜（e）に示しているように、DC/SeV18+mGM-CSF/TSΔFの投与群においては、他の投与群と比べ、上記マウスにおいての腫瘍増殖の抑制が見られた（図13（a））。また、DC/SeV18+mGM-CSF/TSΔFの投与群においては、他の投与群と比べ、上記マウスの生存率も高かった。
本実験結果により、SeV18+mGM-CSF/ΔFが腫瘍増殖を抑制する効果を有することが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明者らにより、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)等のヘパリン結合性を有するサイトカインを、マイナス鎖RNAウイルスをベースとしたウイルスベクターを用いてin vivoにおいて発現させた場合、抗腫瘍効果を示すと共に、従来のアデノウイルスベクターを用いた場合よりも優れた防護効果を誘導することが見出された。本発明のサイトカイン遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスベクターは、簡単な手法により、効果的に腫瘍増殖を抑制するものであり、癌遺伝子治療へ広く適用されることが期待される。本発明のウイルスベクターは、種々の癌の治療に応用できるが、特に転移性癌の処置にも適したものである。【０１１８】
尚、上記実施例は、SeV18+GM-CSF/TSΔF、SeV18+GM-CSF/ΔF等という特定のベクターを用いて行われたが、本発明のベクターはこの実施例の形態に限定されるものではない。例えば、上記［発明を実施するための最良の形態］において詳述したように、多様なセンダイウイルスベクターを使用することができる。例えば、F遺伝子を欠失していないセンダイウイルスベクター、または温度感受性のセンダイウイルスベクター等に、GM-CSF等のヘパリン結合性を有するサイトカイン遺伝子を搭載した場合でも、上述の実施例と同様の効果が得られることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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