(57)【要約】本発明は、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、骨伝導能に優れた破骨細胞形成抑制因子ＯＣＩＦ／ＯＰＧの徐放性製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、
リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、
前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤。
【請求項２】
前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、請求項１記載の徐放性製剤。
【請求項３】
前記リン酸カルシウムが、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属を含有することを特徴とする、請求項１又は２記載の徐放性製剤。
【請求項４】
前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が１．３〜３．４であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項５】
前記リン酸カルシウムが炭酸基を含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項６】
前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が１×１０２ｎｍ以下であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項７】
前記長径が１ｎｍ〜１×１０２ｎｍであることを特徴とする、請求項６記載の徐放性製剤。
【請求項８】
前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項９】
前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項８記載の徐放性製剤。
【請求項１０】
前記多糖類の含有量が４×１０重量％以下であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１１】
前記含有量が４×１０重量％〜１×１０−１重量％であることを特徴とする、請求項１０記載の徐放性製剤。
【請求項１２】
前記多孔質粒子の直径が１×１０２μｍ以下であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１３】
前記直径が１μｍ〜１×１０２μｍであることを特徴とする、請求項１２記載の徐放性製剤。
【請求項１４】
前記多孔質粒子の比表面積が５×１０ｍ２／ｇ〜２×１０２ｍ２／ｇであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１５】
前記多孔質粒子の気孔率が３×１０％〜８×１０％であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１６】
前記多孔質粒子の生体内吸収が６ヶ月以内であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１７】
前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１８】
前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項１９】
前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、請求項１８記載の徐放性製剤。
【請求項２０】
骨代謝異常症治療剤であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項２１】
骨折治癒促進剤であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項記載の徐放性製剤。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか１項記載の徐放性製剤を含有する骨欠損部充填材。
【請求項２３】
リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を得る工程と、
前記多孔質粒子を、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を含有する溶液に含浸し、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を前記多孔質粒子の孔内面全体に担持する工程と、
前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を担持した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程と、
を含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体が多孔質粒子の孔内面全体に結合されてなる徐放性製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質等の生理活性物質の徐放性製剤には、生理活性物質を高分子によって直接包埋する方法が汎用されている。
これまでに、リン酸カルシウムの一種であるアパタイトを用いた徐放性製剤が、報告されている（非特許文献１及び２）。非特許文献１では、抗生物質を吸着させ、徐放させたこと、一方、非特許文献２では結晶の大きさに応じてカルシウムの溶解により吸着タンパク質が放出されることが報告されている。さらに、非特許文献３は、比表面積３ｍ２／ｇ〜２２ｍ２／ｇで粒子径２００ｎｍ〜５００ｎｍのアパタイト粒子を用いたヒト成長ホルモンの徐放を報告している。また、非特許文献４は、粒子径４０μｍ〜８０μｍのアパタイト粒子に１％程度のヒト成長ホルモンを吸着させ、徐放させたことを報告している。しかし、これらに報告されるアパタイトを用いた徐放性製剤は、積極的に薬物をリン酸カルシウムから徐放させる形態のものではなかった。
また、Ｗ．Ｐａｕｌらは、リン酸カルシウム顆粒からのタンパク質の徐放技術を数多く報告している（非特許文献５〜８）。これらの報告では、徐放化のためにポリ乳酸（ＰＬＡ）やポリエチレン酢酸ビニル（ＰＥＶＡ）等の生分解性高分子を用いたコーティングを行っている。用いる粒子は、２００μｍ〜１０００μｍの大きさで、１１００℃で焼成した緻密体である。
さらに、アパタイト粒子（バルクは除く）を用いた注射投与可能なタンパク質の徐放性製剤が、例えば特許文献１〜２及び非特許文献９に開示されている。特許文献１には、多孔性ハイドロキシアパタイト微粒子に存在する細孔に生物学的活性薬剤、ヒト血清タンパク質、ムコ多糖類を充填し、２価金属イオンを加えることにより栓塞することを特徴とする徐放性組成物が開示されている。
また、特許文献２には、多孔性アパタイト誘導体と、その多孔性アパタイト誘導体に含有されるヒト成長ホルモン及び水溶性２価金属化合物から成ることを特徴とするヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤が開示されている。
非特許文献９では、多孔性アパタイト粒子内にインターフェロンα等のタンパク質を含浸させ、亜鉛イオンを加えることで徐放させている。
特許文献３には、スプレイドライ法により製造するカルシウム化合物とグリコサミノグリカンとの複合粒子及びその製造方法が開示されている。しかしながら、特許文献３には、当該複合粒子が骨充填材、細胞の足場材料、クロマトグラフィー用素材として有用な材料であることが記載されているものの、徐放性製剤に利用できることは記載されていない。
一方、破骨細胞形成抑制因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＯＣＩＦ）（又はオステオプロテジェリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ：ＯＰＧ）とも呼ばれる：以下では「ＯＣＩＦ／ＯＰＧ」と呼ぶ）を含めた生理活性タンパク質の徐放に使用される技術が特許文献４に開示されている。本技術は、アルジネートゲルビーズを用いた生理活性タンパク質に汎用できる徐放性組成物に関するものである。しかしながら、特許文献４には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧの徐放性の最適化検討は報告されておらず、また、徐放試験の実施例も記載されていない。
また、ＯＣＩＦ／ＯＰＧの血中濃度の維持とｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性の向上に利用できる製剤化技術が特許文献５〜８に開示されている。これら特許文献には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧと多糖及びその誘導体とから成る複合体、又はＯＣＩＦ／ＯＰＧとＰｏｌｙＰＥＧ（ｃｏｐｏｌｍｅｒ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ａｌｌｙｌｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ  ａｎｄ  ｍａｌｅａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）とから成る複合体が開示されており、これら複合体によれば、血中滞留性を向上させることによってＯＣＩＦ／ＯＰＧの生物活性が増強されることが報告されている。しかしながら、これらの技術は、ＯＣＩＦ／ＯＰＧの局所投与を指向したものではなく、骨への適合性も考慮されていない。
【特許文献１】特開２００４−７５６６２号公報
【特許文献２】特開２００５−８５４５号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６８９５号公報
【特許文献４】国際公開第９８／４６２１１号パンフレット
【特許文献５】特開２００３−１６０６０１号公報
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／００４５４５６号明細書
【特許文献７】特開２００５−２０６５６９号公報
【特許文献８】米国特許出願公開第２００６／００６２７５４号明細書
【非特許文献１】Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａら，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９２年，第２６巻，ｐ．１０５３−１０６４
【非特許文献２】Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」，２００４年，第２５巻，ｐ．３８０７−３８１２
【非特許文献３】Ｈ．Ｇａｕｔｉｅｒら，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９８年，第４０巻，ｐ．６０６−６１３
【非特許文献４】Ｊ．Ｇｕｉｃｈｅｕｘら，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，１９９７年，第３４巻，ｐ．１６５−１７０
【非特許文献５】Ｗ．Ｐａｕｌ及びＣＰ．Ｓｈａｒｍａ，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」，１９９７年，第１６巻，ｐ．２０５０−２０５１
【非特許文献６】Ｗ．Ｐａｕｌ及びＣＰ．Ｓｈａｒｍａ，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ−ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」，１９９９年，第１０巻．ｐ．３８３−３８８
【非特許文献７】Ｗ．Ｐａｕｌら，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，２００２年，第６１巻，ｐ，６６０−６６２
【非特許文献８】Ｗ．Ｐａｕｌ及びＣＰ．Ｓｈａｒｍａ，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」２００３年，第１７巻，ｐ．２５３−２６４
【非特許文献９】Ｙ．Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」，２００６年，第１１０巻，第２号，ｐ．２６０−２６５
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、上述した実情に鑑み、骨伝導能に優れたＯＣＩＦ／ＯＰＧの徐放性製剤を提供することを目的とする。
前記特許文献３と同様な方法で製造したリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とから成る複合多孔質粒子から薬物を放出させる製剤化方法等の鋭意検討を進めた結果、ＯＣＩＦ／ＯＰＧを徐放させる基材として当該複合多孔質粒子が最適であり、さらに徐放化させる際に、二価金属イオンを用いることで初期バーストを制御したゼロ次放出を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤。
（２）前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、（１）記載の徐放性製剤。
（３）前記リン酸カルシウムが、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属を含有することを特徴とする、（１）又は（２）記載の徐放性製剤。
（４）前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が１．３〜３．４であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（５）前記リン酸カルシウムが炭酸基を含有することを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（６）前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が１×１０２ｎｍ以下であることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（７）前記長径が１ｎｍ〜１×１０２ｎｍであることを特徴とする、（６）記載の徐放性製剤。
（８）前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（９）前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、（８）記載の徐放性製剤。
（１０）前記多糖類の含有量が４×１０重量％以下であることを特徴とする、（１）〜（９）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（１１）前記含有量が４×１０重量％〜１×１０−１重量％であることを特徴とする、（１０）記載の徐放性製剤。
（１２）前記多孔質粒子の直径が１×１０２μｍ以下であることを特徴とする、（１）〜（１１）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（１３）前記直径が１μｍ〜１×１０２μｍであることを特徴とする、（１２）記載の徐放性製剤。
（１４）前記多孔質粒子の比表面積が５×１０ｍ２／ｇ〜２×１０２ｍ２／ｇであることを特徴とする、（１）〜（１３）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（１５）前記多孔質粒子の気孔率が３×１０％〜８×１０％であることを特徴とする、（１）〜（１４）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（１６）前記多孔質粒子の生体内吸収が６ヶ月以内であることを特徴とする、（１）〜（１５）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（１７）前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、（１）〜（１６）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（１８）前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、（１）〜（１７）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（１９）前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、（１８）記載の徐放性製剤。
（２０）骨代謝異常症治療剤であることを特徴とする、（１）〜（１９）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（２１）骨折治癒促進剤であることを特徴とする、（１）〜（１９）のいずれか１記載の徐放性製剤。
（２２）（１）〜（１９）のいずれか１記載の徐放性製剤を含有する骨欠損部充填材。
（２３）リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を得る工程と、前記多孔質粒子を、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を含有する溶液に含浸し、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を前記多孔質粒子の孔内面全体に担持する工程と、前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を担持した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程とを含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２７１１０２号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、各ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃを経時的に示す。
図２は、１０ｍｇ又は２０ｍｇの各ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃを経時的に示す。
図３は、生産細胞とアミノ酸配列の異なるＯＣＩＦ／ＯＰＧを担持したＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ及びｒｈ−ＯＣＩＦを経時的に示す。
図４は、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持量を増加させたＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦを経時的に示す。
図５は、各ＣｈＳ濃度のＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子埋入の２週間又は４週間後のＢＶ／ＴＶ及びＯｂ．Ｓ／ＢＳの算出結果を示す。
図６は、実施例８におけるμＣＴ画像解析の結果を示す。
図７は、実施例８におけるビラヌーバ・ゴールドナー染色の結果を示す。
図８は、実施例８におけるＨＥ染色及びトルイジンブルー染色の結果を示す。
図９は、実施例８における骨量及び相対類骨量の定量結果を示す。
図１０は、実施例８においてＤＸＡ法により計測した骨密度の結果を示す。
図１１は、実施例９におけるＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ及びＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎをラットに腹腔内投与した場合の血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度の経時変化を示すグラフである。
図１２は、実施例９におけるＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ及びＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎをラットに皮下投与した場合の血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度の経時変化を示すグラフである。
図１３は、実施例９におけるＰＢＳに溶解したｒｈ−ＯＣＩＦをラットに腹腔内投与した場合の血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度の経時変化を示すグラフである。
図１４は、実施例９におけるＰＢＳに溶解したｒｈ−ＯＣＩＦをラットに皮下投与した場合の血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る徐放性製剤は、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含むものである。本発明に係る徐放性製剤において、当該ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体は、多孔質粒子の孔内面全体に担持されている。また、本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンを介してＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と多孔質粒子の孔内面全体とが結合している。
ここで、ＯＣＩＦ／ＯＰＧは、破骨細胞形成抑制活性を指標として単離され、破骨細胞の分化／成熟を抑制する活性を有するタンパク質である（国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号）。
具体的には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧは、下記の（ａ）〜（ｄ）に記載の物理化学的性質を有し、且つ、破骨細胞の分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する（国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号）。
（ａ）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）：約６０ｋＤ（還元条件下）、約６０ｋＤ及び約１２０ｋＤ（非還元条件下）。
（ｂ）親和性：陽イオン交換体及びヘパリンに親和性を有する。
（ｃ）熱安定性：７０℃、１０分間又は５６℃、３０分間の加熱処理により、破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、９０℃、１０分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
（ｄ）内部アミノ酸配列：配列番号１〜３記載のアミノ酸配列を内部アミノ酸配列として有する。
なお、配列番号１〜３記載のアミノ酸配列において、Ｘａａは任意のアミノ酸を取りうるが、好ましくは、配列番号１において１位のＸａａはＴｈｒであり、配列番号２において１位のＸａａはＡｒｇであり、５位のＸａａはＳｅｒであり、１３位のＸａａはＬｅｕであり、配列番号３において１位のＸａａはＴｈｒである。
上記（ａ）の物理化学的性質から判るようにＯＣＩＦ／ＯＰＧは、一量体と二量体の形態をとりうる（国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号）。ＯＣＩＦ／ＯＰＧを発現する細胞（例えば、天然にはヒト胎児肺線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ寄託−受託番号ＣＣＬ１８６））を含む培養液等には、当該一量体と二量体とが通常混在する。そこで、通常の分離方法によりいずれか一方の形態のＯＣＩＦ／ＯＰＧを精製し、本発明において使用してもよい。
ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧは、シグナルペプチドを含む前駆体（ｃＤＮＡ：配列番号４及びアミノ酸配列：配列番号５）として合成され、シグナルペプチドが切断され、成熟型タンパク質（配列番号５に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド（第−２１番目〜第−１番目のアミノ酸配列）を除くアミノ酸配列）となる。本発明において、ＯＣＩＦ／ＯＰＧは、上述のヒト由来のシグナルペプチドを含む前駆体及び成熟型タンパク質のいずれをも含むが、成熟型タンパク質が好ましい。
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体とは、ＯＣＩＦ／ＯＰＧをコードする塩基配列と相補的な塩基配列から成るＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、且つ破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する。例えば、動物細胞、体液又は組織由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧのｃＤＮＡ（配列番号４）と相補的な塩基配列から成るＤＮＡをプローブとし、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる、破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質である。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。このようなストリンジェントな条件は、当業者には周知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的例としては、約４５℃の６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション後、５０℃〜６５℃の０．２  Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄するものが挙げられる。具体的なＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体としては、例えば、国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号に開示のＯＣＩＦ２（ｃＤＮＡ：配列番号６及びアミノ酸配列：配列番号７）、ＯＣＩＦ３（ｃＤＮＡ：配列番号８及びアミノ酸配列：配列番号９）、ＯＣＩＦ４（ｃＤＮＡ：配列番号１０及びアミノ酸配列：配列番号１１）及びＯＣＩＦ５（ｃＤＮＡ：配列番号１２及びアミノ酸配列：配列番号１３）が挙げられる。なお、ＯＣＩＦ２〜５におけるシグナルペプチドのアミノ酸配列及び成熟型タンパク質のアミノ酸配列は、以下の表１に示す通りである。
【表１】
2008041774.tif 000002
また、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ変異体とは、上述のＯＣＩＦ／ＯＰＧ又はＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する。上記複数のアミノ酸は、数個（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個）であってもよい。ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧ（配列番号５記載のアミノ酸配列）においては、Ｃ末端から２０４アミノ酸までを欠失させたＣ末端欠失変異体においても、破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性が確認されており、生物活性は主にＮ末端側のドメインによるものと考えられている（国際公開第９６／２６２１７号、米国特許第６，８５５，８０８号及びＹａｍａｇｕｃｈｉ  Ｋ．ら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８），Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．９，ｐｐ．５１１７−５１２３）。
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ変異体の好適な態様としては、ヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧ（配列番号５記載のアミノ酸配列）において数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列から成り、且つ破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質、及びヒトＯＣＩＦ／ＯＰＧ（配列番号５記載のアミノ酸配列）において第１番目のＧｌｕをＮ末端とし、第１７６番目〜第３７９番目のいずれかのアミノ酸をＣ末端とするタンパク質であって、破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。
さらに、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ変異体には、上述のＯＣＩＦ／ＯＰＧ又はＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも約６０％〜約６５％、好ましくは約７０％〜約７５％、さらに好ましくは約８０％〜約８５％、特に好ましくは約９０％〜約９５％以上同一であるヌクレオチド配列によりコードされ、且つ破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性を有するタンパク質が含まれる。
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ修飾体は、例えば、上述したＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体へのペプチドや糖鎖の酵素的又は化学的修飾体、或いはポリマー等の高分子化合物や多糖類の修飾体を意味する。ＯＣＩＦ／ＯＰＧ修飾体としては、例えばタンパク質の翻訳後修飾（例えば、糖の付加、プロテインキナーゼによるリン酸化やホスファターゼによる脱リン酸化）、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共ポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ＰｏｌｙＰＥＧ（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ａｌｌｙｌｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ  ａｎｄ  ｍａｌｅａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、ヘパリン、デキストラン硫酸等）等の化学修飾等の修飾がなされたＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体が挙げられる。さらに、例えば、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体とＦｃ（ＩｇＧ等の免疫グロブリン由来のＦｃ領域）やアルブミン等のペプチドやタンパク質との融合タンパク質、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体と多糖類（ヘパリン、デキストラン硫酸等）との複合体、及びＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体とＰｏｌｙＰＥＧとの複合体もＯＣＩＦ／ＯＰＧ修飾体に含まれる。
具体的には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体のポリエチレングリコールによる修飾体は、例えば、国際公開第９７／２３６１４号に記載の方法により製造できる。また、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体の多糖類による修飾体において、多糖類としてはデキストラン硫酸、特にデキストラン硫酸ナトリウム５（ＤＳ５）が好ましく、このような修飾体は、例えば特許文献５及び６に記載の方法により製造できる。さらに、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体又は変異体のＰｏｌｙＰＥＧによる修飾体は、例えば特許文献７及び８に記載の方法により製造できる。
なお、ヒト以外の動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、並びにニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ等の鳥類）由来のＯＣＩＦ／ＯＰＧも、上述の定義の範囲内にあれば、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ類縁体、変異体又は修飾体に含まれる。
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体（以下、「ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質」という）は、動物の組織や体液等から、又は動物細胞の培養物等からタンパク質として抽出、精製された天然型のタンパク質として、或いはこれらＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質をコードするＤＮＡ断片又は当該ＤＮＡ断片を含有するベクターで動物細胞や大腸菌等の宿主を形質転換し、生産される遺伝子組換え型（以下では、「ｒｈ」という場合がある）タンパク質として、更にはこれらの修飾体として取得することができる。例えば、国際公開第９６／２６２１７号（及び米国特許第６，８５５，８０８号）に開示のＯＣＩＦ／ＯＰＧの製造方法に準じて、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質をＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質産生細胞より単離・精製することができる。具体的には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質産生細胞を培養し、培養液をヘパリンカラム（ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ、ファルマシア社）に供し、２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出する。次いで、得られたヘパリン吸着性ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質画分をＱ・陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｑ／ＦＦ、ファルマシア社）に供し、その非吸着画分を集める。このようして、ヘパリン吸着性により塩基性のＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質画分を得ることができる。得られたＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質活性画分をＳ・陽イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ−Ｓ／ＨＰ、ファルマシア社）、ヘパリンカラム（ヘパリン−５ＰＷ、トーソー社）、シバクロンブルーカラム（ブルー−５ＰＷ、トーソー社）、逆相カラム（ＢＵ−３００  Ｃ４、パーキンエルマー社）に供することにより、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を単離・精製することができる。
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質の破骨細胞分化及び／又は成熟抑制活性は、例えば、久米川正好らの方法（蛋白質・核酸・酵素，１９８９，Ｖｏｌ．３４，ｐ．９９９）及びＴａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．らの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８８，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．１３７３）に従って測定することができる。即ち、例えば生後約１７日のマウス骨髄細胞を標的細胞として用い、活性型ビタミンＤ３（Ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）存在下での破骨細胞の形成抑制を、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導の抑制として試験することができる。
なお、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質のうち、好適にはＯＣＩＦ／ＯＰＧ又はその修飾体であり、より好適にはＯＣＩＦ／ＯＰＧ又はそのＦｃ融合タンパク質である。
一方、リン酸カルシウムナノ結晶とは、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）、アパタイト化合物等であって、大きさが１μｍより小さい結晶の総称を意味する。また、アパタイト化合物とは、一般式Ｃａ１０（ＰＯ４Ｘ）６Ｙ２（式中、Ｘは炭酸基又は欠損を、Ｙは水酸基、炭酸基、ハロゲン基又は欠損を示す）で表される水酸アパタイト、炭酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイト等を意味する。さらに、リン酸カルシウムは、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウム等の１種以上の二価金属を含有していてもよい。なお、リン酸カルシウムにおけるリンに対するカルシウムのモル比は、例えば、１．３〜３．４、好ましくは１．５〜３．０である。
リン酸カルシウムナノ結晶の製造に関しては、例えば、水酸アパタイトナノ結晶を製造する場合には、湿式法により製造することができ、下記の式に従って行うことができる（Ｈ．Ａｏｋｉ，「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ」，１９９４，Ｉｓｈｉｙａｋｕ  ＥｕｒｏＡｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓｉ）。
【化１】
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このようにして、製造したリン酸カルシウムナノ結晶の長径は、例えば、１×１０２ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ〜１×１０２ｎｍ、特に好ましくは１×１０ｎｍ〜５×１０ｎｍである。
また、本発明において多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸が挙げられ、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸が好ましい。なお、本発明に係る徐放性製剤における多糖類含有量は、例えば、４×１０重量％以下、好ましくは４×１０重量％〜１×１０−１重量％、特に好ましくは１重量％〜２×１０重量％である。なお、多糖類としてコンドロイチン硫酸を用いる場合には、例えば、分子量１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、好ましくは１５ｋＤａ〜３５ｋＤａのものを用いる。
本発明に係る徐放性製剤は、以上に説明したＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質、リン酸カルシウムナノ結晶、及び多糖類から製造する。
本発明に係る徐放性製剤の製造方法（以下、「本方法」という）においては、先ずリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供することで、これらリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を製造する。当該多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることが好ましい。リン酸カルシウムナノ結晶に対する多糖類の量は、例えば、リン酸カルシウムナノ結晶に対して、１重量％〜２×１０重量％、好ましくは２重量％〜１×１０重量％とする。また、懸濁液のｐＨは、例えば５〜９、好ましくは６〜８に調整する。さらに、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液は、撹拌操作を継続しながら複合化を促進するために、例えば０時間〜１２時間（好ましくは１時間〜４時間）熟成させた後、スプレイドライに供する。ここで、熟成とは、最終ｐＨを７．５〜８．０の範囲に一定に保ち、複合化により得られる結晶の表面状態を生体とほぼ同じｐＨに保つことで安定させることをいう。具体的には、強アルカリ（水酸化カルシウム）と強酸（リン酸）の中和反応を用いて前記最終ｐＨに設定することにより、熟成を行う。
スプレイドライは、例えばＢｕｃｈｉ社、ヤマト科学社、大川原工業社等の二流体ノズル及び四流体ノズルを装備した市販の装置を用いて定法により行うことができるが、表面積を大きくするために、懸濁液を１μｍ〜５×１０２μｍ程度の微細な液滴にし、１×１０２℃〜３×１０２℃の熱風中に噴出させ、乾燥させる。
このようにして、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の直径は、例えば１×１０２μｍ以下、好ましくは１μｍ〜１×１０２μｍ、特に好ましくは１μｍ〜３×１０μｍである。また、多孔質粒子は、例えば、比表面積５×１０ｍ２／ｇ〜２×１０２ｍ２／ｇ、気孔率３×１０％〜８×１０％である。多孔質粒子の比表面積が５×１０ｍ２／ｇより小さい場合には、十分な量のＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持させることができず、目的とする放出期間にわたって徐放することができない。一方、多孔質粒子の気孔率が３×１０％未満である場合には、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を粒子内部まで均一に担持できず、また８×１０％を超える場合には、多孔質粒子が製剤化途中で壊れる。
スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の生体内吸収は、例えば６ヶ月以内、好ましくは１／２ヶ月〜３ヶ月、特に好ましくは１ヶ月〜２ヶ月である。
次いで、本方法では、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子を、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質含有溶液（例えば、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を含む水溶液の形態）に含浸し、混合することで、均一に分散させ、当該多孔質粒子の孔内面全体にＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持させる。ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質の添加量は、例えば多孔質粒子１ｍｇ当たり１×１０−１μｇ〜２×１０２μｇ、好ましくは１μｇ〜１×１０２μｇとする。多孔質粒子とＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質との混合は、例えば１時間〜１２時間（好ましくは３時間〜６時間）転倒撹拌することにより行われる。
さらに、混合終了後、多孔質粒子とＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質とを含む混合物を遠心分離に供し、上清（上澄み）を除去する。なお、この段階で、遠心分離を行わずに、二価金属イオンによる結合処理に供することもできる。
多孔質粒子の孔内面全体にＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質が担持されたことの評価は、上述の遠心分離後に除去した上清（上澄み）をＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質に対する特異的抗体を用いた免疫学的手法（例えば、ＥＬＩＳＡ）に供し、上清に残存するＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質量を測定することにより行うことができる。このような評価により、上清中にＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質が僅かにしか残存していないことを確認することにより、多孔質粒子の孔内面全体にＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質が十分担持されたと判断することができる。
次いで、得られたＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加し、結合処理に供する。この工程により、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質と、これを担持した多孔質粒子との結合が行われる。
本発明において、結合とは、リン酸カルシウム表面とＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質とを金属イオンを介した配位・イオン・共有性の結合等により担持・結合させること、又は多糖類とＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質との官能基同士の結合を誘起させること、又はリン酸カルシウム表面とＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質と多糖類との間全てに結合を誘起させることを意味する。当該結合によれば、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質と多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合されることとなる。
結合に用いる二価金属イオンとしては、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンが挙げられるが、亜鉛イオンが最適である。ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持した多孔質粒子に対する二価金属イオン量は、例えばＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持した多孔質粒子１ｍｇ当たり１×１０−３ｍｇ〜１ｍｇ、好ましくは１×１０−２ｍｇ〜１×１０−１ｍｇとする。
結合処理では、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加した後、転倒撹拌する。次いで、転倒撹拌後、混合物を遠心分離に供し、上清（上澄み）を除去する。さらに、上清を除去することで得られた残渣を例えば精製水で洗浄した後、沈殿物を例えば１時間〜２４時間（好ましくは１時間〜１２時間）凍結乾燥又は真空乾燥に供する。このようにして、本発明に係る徐放性製剤を得ることができる。
本発明に係る徐放性製剤は、担持するＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質について少なくとも７日以上の長期間の徐放性を発揮する。また、本発明に係る徐放性製剤は、多孔質粒子が天然骨と同じ成分を有するものである。さらに、本発明に係る徐放性製剤は、粒子自体に起因して、骨伝導能を有している。なお、ここで、骨伝導能とは、骨欠損部位に材料を移植した際に、骨形成を阻害せず、骨芽細胞による骨形成を促進することを意味する。本発明に係る徐放性製剤の骨伝導能は、例えば本発明に係る徐放性製剤を骨欠損部位に適用した後、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、トルイジンブルー染色、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色等の骨形態計測による骨芽細胞面等の測定によって評価することができる。また、本発明に係る徐放性製剤は、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持することにより骨量の減少を抑制する効果を有する。
従って、本発明に係る徐放性製剤は、単独で、或いは薬学的に許容される添加物と共に用いることができる。本発明に係る徐放性製剤による治療対象の疾患としては、例えば、骨代謝異常症が挙げられる。即ち、本発明に係る徐放性製剤は、骨代謝異常症治療剤として使用することができる。骨代謝異常症とは、実質的な骨量の減少を特徴とするあらゆる疾患であり、それを治療するか或いは予防するためには骨吸収又は骨吸収速度を抑制する必要がある疾患を意味する。本発明に係る徐放性製剤を用いて治療又は予防される骨代謝異常症には、一次性骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発性若年性骨粗鬆症）、内分泌骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症）、性機能低下に伴う骨粗鬆症（下垂体機能低下症、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群及びＴｕｒｎｅｒ症候群）、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症（骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケス症、ライリー−デイ症候群並びにＯＣＩＦ遺伝子の欠損に起因する若年性パジェット病及び高リン血症）、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による骨減少症、骨パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性病巣、固形腫瘍（乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等）に起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病）、特発性高カルシウム血症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬物（メトトレキセート及びシクロスポリンＡ等の免疫抑制剤、リューブリン等の抗アンドロジェン剤、ヘパリン及び抗てんかん薬）投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、内臓器疾患（小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性胆汁性肝硬変及び肝硬変）に伴う骨減少症、関節リウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、ムチランス型を含む関節リウマチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移（骨溶解性転移）、人工関節のゆるみ（人工関節周囲における骨溶解）、動脈の石灰化、歯周病等の感染症に伴う骨減少症、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨減少症等が包含される。また、本発明における骨代謝異常症は、前記固形腫瘍、癌の骨転移（骨溶解性転移）、又は血液学的悪性疾患による悪液質をも包含する（特開２０００−１７８２００号公報参照）。
本発明に係る徐放性製剤は、患部近傍に埋め込んで使用できるため、歯周骨喪失、癌の骨転移（骨溶解性転移）、人工関節のゆるみ（人工関節周囲における骨溶解）、動脈の石灰化、歯周病等の感染症に伴う骨減少症、外傷性負傷若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死のような、局所的に骨減少が起こる疾患に特に適している。ただし、本発明に係る徐放性製剤は、全身性の疾患に対しても効果が期待できる。
また、上述した本発明に係る徐放性製剤の特徴や効果により、本発明に係る徐放性製剤は、骨折治癒促進剤としての使用に特に適している。
本発明に係る徐放性製剤は、各種剤形に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明に係る徐放性製剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であってよい。また、本発明に係る徐放性製剤を非経口投与する場合は、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等に製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。
本発明に係る徐放性製剤の投与経路としては、用途に応じて適宜決定することができるが、例えば、経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、皮下、筋肉内等が挙げられる。また投与経路としては、患部付近への直接投与も挙げられる。特に、骨の患部又は患部付近に、インプラント等で直接投与することが好ましい。
本発明に係る徐放性製剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数等に応じて適宜決定することができる。例えば、包含されるＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質の有効量として、１回につき体重１ｋｇあたり１×１０−２ｍｇ〜１×１０２ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、１日数回から１ヶ月数回の頻度で投与することが好ましい。特に、骨の患部又は患部付近に、インプラント等で直接投与する場合には、包含されるＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質の有効量として、１投与部位につき１×１０−２ｍｇ〜１×１０２ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、週１回以下の頻度で投与することが好ましい。
さらに、上述したように、本発明に係る徐放性製剤は、多孔質粒子が天然骨と同じ成分を有するものであり、且つ骨伝導能を有するものであること、さらにはＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を担持することにより骨量の減少を抑制する効果を有することから、骨欠損部充填材の主成分として使用することができる。骨欠損部充填材には、本発明に係る徐放性製剤以外に、例えば、生体分解性又は生体溶解性高分子である合成高分子（ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、ポリアンハイドライド、ポリオルソエステル、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリアクリルシアノアクリレート、ポリハイドロキシアルカノエート、ポリフォスフォエステル、ポリアミノ酸、メタアクリル酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテート、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリＮ−アルキルアクリルアミド等）、天然高分子（ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天、プルラン、アルブミン、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ジェランガム、カゼイン、キトサン、フィブリノーゲン等）、及び多孔質インプラント（ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、アパタイト／コラーゲン複合体等）を含有することができる。また、骨欠損部充填材中の本発明に係る徐放性製剤の含有量は、上述の本発明に係る徐放性製剤に包含されるＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質の有効量に関する記載に準じて適宜決定することができる。
以上に説明したように、本発明に係る徐放性製剤（例えば、骨代謝異常症治療剤、骨折治癒促進剤）又は骨欠損部充填材によれば、一定期間安定してＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質を徐放することで、安定的に骨量の減少を抑制することができる。また、本発明において、担体として使用する多孔質粒子は、骨の主成分であるリン酸カルシウムと多糖類を含むものであり、骨芽細胞を活性化することにより担体を核としてアパタイトの結晶が成長すると共に、主成分に骨の細胞外基質である多糖類を有するため内軟骨性骨化を生じて骨形成を促進することができる。
このように、本発明によれば、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ物質の破骨細胞分化抑制による骨吸収の抑制作用と、リン酸カルシウムナノ結晶を核とした骨形成の促進作用の両作用が同時に得られることにより、優れた骨量減少の改善又は骨折治癒効果が期待できる。
また、本発明に係る徐放性製剤は、特許文献１記載の徐放性組成物とは異なり、ヒト血清タンパク質を含まず、またムコ多糖類等を粒子の孔に充填する必要がない。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ヒドロキシアパタイト／コンドロイチン硫酸複合（以下、「ＨＡｐ／ＣｈＳ」という）多孔質粒子（本発明における多孔質粒子に相当）の合成及び当該粒子の粒径測定
コンドロイチン硫酸（以下、「ＣｈＳ」という；分子量１５ｋＤａ）を分散させた０．２５ｍｏｌ／ｌの水酸化カルシウム懸濁液に、０．１５ｍｏｌ／ｌのリン酸水溶液を滴下し、最終ｐＨを７．５〜８．０に調整し、ＨＡｐ／ＣｈＳゲルを作製した。なお、ＣｈＳ添加量は理想的に得られるヒドロキシアパタイト（以下、「ＨＡｐ」という）重量に対して２、５、１０、２０重量％になるように加えた。１２時間熟成させた後、スプレイドライヤー（商品名：ミニスプレイドライヤー、Ｂｕｃｈｉ社製）によりＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を得た。
また、得られたＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を粒度分布測定に供した。その結果、得られたＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子は、１μｍ〜２０μｍの分布を有し、平均粒子径４μｍであった。
【実施例２】
【０００７】
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子（本発明に係る徐放性製剤に相当）の製造
ＯＣＩＦ／ＯＰＧとしては、Ｓｆ２１細胞で発現させた遺伝子組換え型ＯＣＩＦ／ＯＰＧ−Ｆｃ（以下、「ｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ」という；全長ヒトＯＣＩＦタンパク質とヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質、Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。当該全長ヒトＯＣＩＦタンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド（第−２１番目〜第−１番目のアミノ酸配列）を除くアミノ酸配列から成る成熟型タンパク質である。
５μｇ／ｍｌになるようにｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃを５ｍｌの１０％ＰＢＳに溶解し、次いで実施例１で作製したＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子２５０ｍｇをそれぞれ加えた（０．１μｇ／１ｍｇ；ｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ／ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子）。当該混合物を、室温にて４時間転倒撹拌に供した。
４時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）を３ｍｌ加えてさらに転倒撹拌に供することで行った。当該結合処理によれば、ｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
２時間の転倒撹拌後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）にて上清（上澄み）を分抽し、残渣を精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
また、上述の遠心分離後の上澄みに残存しているｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃを、ＥＬＩＳＡ法（Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ＥＬＩＳＡ，Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎｃ．）により定量した。その結果、いずれの系でも９９％のｒｈ−ＯＣＩＦ−ＦｃがＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子に吸着していることが分かった。
【実施例３】
【０００８】
亜鉛イオン結合処理効果−徐放性１
実施例２で作製したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を１０ｍｇ秤取り、５ｍｌのＰＢＳに分散させ、３７℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、１時間〜７日間の期間で行った。なお、実施例１で作製したＨＡｐ／ＣｈＳ（５重量％）多孔質粒子を用いて、ｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃを担持させ、亜鉛イオンを用いる結合処理を行うことで作製したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子も同様に、放出試験を行った。
撹拌させた試料について、実施例２と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃの定量をＥＬＩＳＡ法を用いて行った。結果を図１に示す。
図１は、各ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃを経時的に示す。図１において、各略号は、以下の通りである。
「ＨＡｐ」：ヒドロキシアパタイトのみ、「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％」：ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理なし）、「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％＋Ｚｎ」：ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理あり）、「ＨＡｐ／ＣｈＳ５％＋Ｚｎ」：ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（５重量％）多孔質粒子（結合処理あり）
図１に示すように、未結合（結合処理なし）ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子と亜鉛イオンを用いて結合処理したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子では、直線的なｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃの放出が観察されたが、亜鉛イオンを加えることにより明らかに放出量が制御されていることが分かった。
【実施例４】
【０００９】
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子量による放出挙動−徐放性２
実施例２で作製したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を１０ｍｇ又は２０ｍｇ秤取り、実施例３と同様の方法で徐放性を検討した。結果を図２に示す。
図２は、１０ｍｇ又は２０ｍｇの各ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃを経時的に示す。図２において、各略号は、以下の通りである。
「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％（１０ｍｇ）」：１０ｍｇのＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理なし）、「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％（２０ｍｇ）」：２０ｍｇのＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理なし）、「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％＋Ｚｎ（１０ｍｇ）」：１０ｍｇのＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理あり）、「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％＋Ｚｎ（２０ｍｇ）」：２０ｍｇのＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理あり）
図２に示すように、５ｍｌのＰＢＳ中での各ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子による徐放は直線的であった。未結合ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子の場合には、７日後に２．５ｎｇ／ｍｌ（重量１０ｍｇ）と５．０ｎｇ／ｍｌ（重量２０ｍｇ）となり、一方、亜鉛イオンを用いて結合処理したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子の場合には、７日後に０．７ｎｇ／ｍｌ（重量１０ｍｇ）と１．４ｎｇ／ｍｌ（重量２０ｍｇ）となり、加える粒子量により正の相関があることが分かる。
【実施例５】
【００１０】
生産細胞とアミノ酸配列の異なるＯＣＩＦ／ＯＰＧを用いた徐放性試験
ＯＣＩＦ／ＯＰＧとして、実施例１で用いた市販のｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ（Ｓｆ２１細胞で発現）と国際公開第９６／２６２１７号及び米国特許第６，８５５，８０８号に記載の方法に準じてＣＨＯ細胞で発現させ、精製したｒｈ−ＯＣＩＦとを用いた。なお、ＣＨＯ細胞で発現させたｒｈ−ＯＣＩＦタンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド（第−２１番目〜第−１番目のアミノ酸配列）を除くアミノ酸配列から成る成熟型タンパク質である。
１０μｇ／ｍｌになるようにｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃとｒｈ−ＯＣＩＦをそれぞれ５ｍｌの１０％ＰＢＳ中に分散させ、実施例１で作製したＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子１２５ｍｇをそれぞれ加えた（０．４μｇ／１ｍｇ；ｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ又はｒｈ−ＯＣＩＦ  ／  ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子）。当該混合物を、室温にて４時間転倒撹拌に供した。
４時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）を３ｍｌ加えてさらに転倒撹拌に供することで行った。当該結合処理によれば、ｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ又はｒｈ−ＯＣＩＦと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
２時間の転倒撹拌後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、生産細胞とアミノ酸配列の異なるＯＣＩＦ／ＯＰＧを担持したＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
次いで、作製したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を１０ｍｇ秤取り、５ｍｌのＰＢＳに分散させて、３７℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、１時間〜１週間の期間で行った。
撹拌させた試料について、実施例２と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃとｒｈ−ＯＣＩＦの定量をＥＬＩＳＡ法を用いて行った。結果を図３に示す。
図３は、生産細胞とアミノ酸配列の異なるＯＣＩＦ／ＯＰＧを担持したＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃとｒｈ−ＯＣＩＦを経時的に示す。図３Ａ（Ｓｆ２細胞で発現させたｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ）及び図３Ｂ（ＣＨＯ細胞で発現させたｒｈ−ＯＣＩＦ）において、各略号は、以下の通りである。
「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％」：ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理なし）、「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％＋Ｚｎ」：ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理あり）
図３に示すように、未結合ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子では、市販のｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ（Ｓｆ２細胞で発現）がＣＨＯ細胞で生産したｒｈ−ＯＣＩＦに対して高い放出量を示した。また、未結合の場合はどちらも不安定な放出であった。一方、亜鉛イオンを用いて結合処理したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子では、いずれにおいても一次直線的な増加が観測された。放出量は市販のｒｈ−ＯＣＩＦ−Ｆｃ（Ｓｆ２細胞で発現）の方が若干高い値を示した。
【実施例６】
【００１１】
ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子の徐放化
実施例２〜５に示したように、徐放性に関して亜鉛イオン結合処理が有効であることが明らかとなったので、さらにＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子１ｍｇ当たりのＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持量を増加させて徐放性試験を行った。試験には、実施例５においてＣＨＯ細胞で生産したｒｈ−ＯＣＩＦを用いた。
８０μｇ／ｍｌになるようにｒｈ−ＯＣＩＦを５ｍｌの１０％ＰＢＳ中に分散させ、実施例１で作製したＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子５０ｍｇを加えた（８μｇ／１ｍｇ；ｒｈ−ＯＣＩＦ／ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子）。当該混合物を、室温にて４時間転倒撹拌に供した。
４時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）を３ｍｌ加えてさらに転倒撹拌に供することにより行った。当該結合処理によれば、ｒｈ−ＯＣＩＦと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
２時間の転倒撹拌後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持量を増加させたＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
次いで、作製したＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を５ｍｇ秤取り、５ｍｌのＰＢＳに分散させて３７℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、１時間〜１週間の期間で行った。
撹拌させた試料について、実施例２と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのｒｈ−ＯＣＩＦの定量をＥＬＩＳＡ法を用いて行った。結果を図４に示す。
図４は、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持量を増加させたＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子から徐放されたｒｈ−ＯＣＩＦを経時的に示す。図４において、各略号は、以下の通りである。
「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％」：ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理なし）、「ＨＡｐ／ＣｈＳ２％＋Ｚｎ」：ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子（結合処理あり）
図４に示すように、実施例５と同様に亜鉛イオン結合処理を行わない場合は、初期に薬物（ｒｈ−ＯＣＩＦ）の大量放出（バースト）が観測されるが、亜鉛イオン結合処理を行うことで殆ど初期バーストを無くすことができた。この実験から、ＯＣＩＦ／ＯＰＧの効果が十分に発揮される濃度範囲（１日当たりＥＤ５０８ｎｇ／ｍｌ〜２４ｎｇ／ｍｌ）に到達させるためには、ＯＣＩＦ／ＯＰＧ担持ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子３０ｍｇ程度で十分であることが明らかであった。
【実施例７】
【００１２】
担体材料（ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子）の骨形成能の評価
生後１０週の日本白色雄性家兎８匹を使用し、ウサギの両下肢骨孔内（計１６肢、ドリルホールは３２個）に、生理食塩水、実施例１で作製したＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子（ＣｈＳ重量：２重量％、１０重量％、２０重量％）の４種類をそれぞれ埋入し、比較した。
ウサギを手術台上に仰臥位で固定し、後肢大腿骨内顆中央と脛骨近位内側中央で骨膜を剥離した。次いで、電動ドリルで直径４ｍｍの骨孔を対側皮質骨まで穿った。
さらに、骨膜、軟部組織、皮膚を４−０ナイロンにて縫合した後、生理食塩水又は各ＣｈＳ濃度のＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子を２３Ｇ針付き注射筒（１ｍｌ）にてホール内に埋入した。
埋入の２週間又は４週間後に、ウサギを屠殺し、その後、ドリルホール部分の骨を２分割（水平断）し、近位側をホルマリン固定、遠位側を７０％Ｅｔｈａｎｏｌ固定に供した。
固定後、それぞれの試料について、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、トルイジンブルー染色、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色を行い、標本を作製した。
各標本の骨形態計測を行い、骨孔内の骨量（Ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ／Ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ，ＢＶ／ＴＶ）、骨芽細胞面（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ／  Ｂｏｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ；Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ）を算出した。結果を図５に示す。
図５は、各ＣｈＳ濃度のＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子埋入の２週間又は４週間後のＢＶ／ＴＶ及びＯｂ．Ｓ／ＢＳの算出結果を示す。図５Ａ及びＢは、それぞれ埋入２週間後のＢＶ／ＴＶ及びＯｂ．Ｓ／ＢＳの算出結果である。また、図５Ｃ及びＤは、それぞれ埋入４週間後のＢＶ／ＴＶ及びＯｂ．Ｓ／ＢＳの算出結果である。図５Ａ〜Ｄにおいて、各略号は、以下の通りである。
「Ｓａｌｉｎｅ」：生理食塩水、「２％ＣｈＳ」：ＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子、「１０％ＣｈＳ」：ＨＡｐ／ＣｈＳ（１０重量％）多孔質粒子、「２０％ＣｈＳ」：ＨＡｐ／ＣｈＳ（２０重量％）多孔質粒子
図５に示すように、ＢＶ／ＴＶ及びＯｂ．Ｓ／ＢＳは、ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群で生理食塩水投与群に比べて増加していた。ＨＡｐ／ＣｈＳ（２０重量％）多孔質粒子投与群は、Ｏｂ．Ｓ／ＢＳが埋入２週間後に大きく、ＢＶ／ＴＶが埋入４週間後に大きいことから、骨芽細胞の活性化により骨形成を促進する可能性が示唆された。
【実施例８】
【００１３】
骨延長におけるＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子の骨誘導評価
日本白色家兎１４匹（１．９ｋｇ〜２．２ｋｇ）を用い、対照群（ｎ＝７）とＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群（ｎ＝７）との２群に分け、実験を行った。
全身麻酔下に全ウサギの右脛骨に対して創外固定器を装着し、脛骨骨切り術を行った。骨切り術の１週間後より１日１ｍｍの骨延長を１４日間行った。
骨延長開始後７日目に、対照群に対しては生理食塩水０．２ｍｌ、ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群には実施例１で作製したＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子１００ｍｇと生理食塩水０．２ｍｌとの混合液０．２ｍｌを注入した。その後６週間の固定期間後にウサギを安楽死させた。
骨誘導評価を、ＴＲＡＰ染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色及びＡＬＰ染色により、順に破骨細胞数（Ｎ．Ｏｃ／ＢＳ）と相対類骨量（Ｏｓｔｅｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ／  Ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ）、骨量（Ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ）、骨芽細胞数を算出した。また、ＨＥ染色及びトルイジンブルー染色を、実施例７に記載の方法と同様にして行った。
μＣＴ画像解析をＴＲＩ／３Ｄ−ＢＯＮ（ラトックシステムエンジニアリング（株）、東京）により行った。
さらに、ＤＸＡ（Ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ）法による骨密度計測を、ＤＣＳ−６００（アロカ（株）、東京）により行った。
結果を図６〜１０に示す。
図６は、μＣＴ画像解析の結果を示す。図６から判るように、対照群及びＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群は、両者ともに骨形成が良好であった。ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群は、対照群と比して良好な骨髄内海綿骨の形成が観察された。
図７は、ビラヌーバ・ゴールドナー染色の結果を示す。また、図８は、ＨＥ染色及びトルイジンブルー染色の結果を示す。図７及び８より、ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群は対照群と比して良好な海綿骨を形成することがビラヌーバ・ゴールドナー染色及びＨＥ染色で示された。また、図８の如く、対照群では骨髄内で内軟骨性骨化が生じ（太い矢印）、ｌａｃｕｎａｅには立方形の活性化した骨芽細胞が並んでいた（細い矢印）。一方、図８に示すように、ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群でも同様に骨髄内で内軟骨性骨化が生じていた（太い矢印）。一部には髄内に数層の線維芽細胞に包まれてＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子の顆粒が残存している個体も確認できた。
図９は、骨量（図９Ａ）及び相対類骨量（図９Ｂ）の定量結果を示す。図９Ａ及びＢにおいて、「対照」は対照群の結果を示し、「ＨＡｐ／ＣｈＳ」はＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群の結果を示す。図９に示すように、ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群においては、骨量が多く、相対類骨量が少ない傾向にあった。これはＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群で新生骨形成とその成熟が促進されていることを示す。
図１０は、ＤＸＡ法により計測した骨密度の結果を示す。図１０において、「対照」は対照群の結果を示し、「ＨＡｐ／ＣｈＳ」はＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群の結果を示す。図１０に示すように、ＤＸＡ法により計測した骨密度もＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子投与群が高い傾向にあり、組織像とともにＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子の骨形成促進能を裏付けていた。
【実施例９】
【００１４】
ラットにおける徐放性の評価
８００μｇ／ｍｌになるようにｒｈ−ＯＣＩＦ（実施例５に示した、ＣＨＯ細胞で生産したもの）を１２．５ｍｌの１０％ＰＢＳ中に分散させ、実施例１で作製したＨＡｐ／ＣｈＳ（２重量％）多孔質粒子１２５ｍｇを加えた（８０μｇ／ｍｇ；ｒｈ−ＯＣＩＦ  ／  ＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子）。当該混合物を、室温にて４時間転倒撹拌に供した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。以下では、結合処理を施していない粒子を、「ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ」という。
４時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）を０．７５ｍｌ加えてさらに２時間の転倒撹拌に供することにより行った。当該結合処理によれば、ｒｈ−ＯＣＩＦと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。以下では、結合処理を施した粒子を「ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎ」という。
ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎについて、２時間の転倒撹拌後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った。当該洗浄を３回行った。２時間の転倒撹拌後に分抽した上澄み溶液と３回洗浄後の上澄み溶液のｒｈ−ＯＣＩＦ濃度をＡＤＶ０１（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ）で定量することで吸着量を算出した。同様に、ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳについても上澄み溶液のｒｈ−ＯＣＩＦ濃度を定量し、吸着量を算出した。その結果、ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ及びＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎのｒｈ−ＯＣＩＦ吸着量は、それぞれ７９．６０±０．０９μｇ／ｍｇ及び７９．７６±０．０２μｇ／ｍｇであり、共に理論量とほぼ同じ吸着量を示していた。以下のラットにおける徐放性の評価においては、当該ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ及びＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎを用いた。
ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳとＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎをそれぞれ２００ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｆ３４４ラット（１２週齢の雌、日本チャールスリバー）に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与又は背部へ皮下（ｓ．ｃ．）投与した。なお、ラットは各群５匹とした。
ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ又はＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎの投与前及び投与１、２、３、４及び７日後に、各ラットより０．２ｍｌずつ採血し、それぞれの血液サンプルから調製した血清中のｒｈ−ＯＣＩＦ濃度をＯＣＩＦ−ＥＬＩＳＡ（Ｋ．Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１４，ｐ５１８，１９９９）で測定した。腹腔内投与の結果を図１１に、皮下投与の結果を図１２に示す。図１１及び１２において、縦軸は血清中のｒｈ−ＯＣＩＦ濃度であり、横軸は表示されている投与後の経過日数におけるサンプルを示す。
一方、対照実験として、ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で希釈したｒｈ−ＯＣＩＦを１６．０ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｆ３４４ラット（１２週齢の雌、日本チャールスリバー）に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与又は背部へ皮下（ｓ．ｃ．）投与した。なお、ラットは各群５匹とした。
ｒｈ−ＯＣＩＦの投与前及び投与の０．５、１、２、４、６、２４時間後に、各ラットより０．２ｍｌずつ採血し、それぞれの血液サンプルから調製した血清中のｒｈ−ＯＣＩＦ濃度をＯＣＩＦ−ＥＬＩＳＡで測定した。腹腔内投与の結果を図１３に、皮下投与の結果を図１４に示す。図１３及び１４において、縦軸は血清中のｒｈ−ＯＣＩＦ濃度であり、横軸は表示されている投与後の経過時間におけるサンプルを示す。
図１３及び１４に示すように、製剤化していないｒｈ−ＯＣＩＦは、いずれの投与経路によっても投与２〜６時間後をピークに、血清中濃度が急速に減少していた。
それに対し、図１１に示すように、ｒｈ−ＯＣＩＦをＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子に担持させた場合、腹腔内投与においては投与１日後でも１０００ｎｇ／ｍｌ以上（ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎでは１３００ｎｇ／ｍｌ以上）という高い血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度を保持した。更にＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎにおいては、２日後でも５００ｎｇ／ｍｌに近い血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度を維持しており、優れた徐放効果が示された。
また、図１２に示すように、皮下投与のＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎ（亜鉛イオンを用いて結合処理した場合）では、投与４日後まで安定して１００ｎｇ／ｍｌ以上の血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度を維持しており、非常に優れた徐放効果を示した。皮下投与のＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ（亜鉛イオンを用いて結合処理していない場合）では、ＯＣＩＦ−ＨＡｐ／ＣｈＳ−Ｚｎと比較すると維持期間は短いものの、２日後においても１００ｎｇ／ｍｌ以上の血清中ｒｈ−ＯＣＩＦ濃度を維持しており、この製剤も優れた徐放効果を有することが示された。
いずれの投与経路においても、亜鉛イオンを用いた結合処理をしていないｒｈ−ＯＣＩＦを担持したＨＡｐ／ＣｈＳ多孔質粒子でも一定の徐放効果が得られ、亜鉛イオンを用いた結合処理をすることによりその効果が顕著に促進された。また、その効果は皮下投与において顕著であることが示された。
このように、実験動物への投与においても、本発明に係る製剤化技術をＯＣＩＦに適用することにより、長期間にわたってＯＣＩＦの血中濃度を維持させることができることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明によれば、安定に、且つ多量にＯＣＩＦ／ＯＰＧを担持した徐放性製剤が提供される。本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンによって多孔質粒子とＯＣＩＦ／ＯＰＧとの結合性が改善されており、初期バーストがほとんど無く、一定期間安定してＯＣＩＦ／ＯＰＧを徐放することができる。また、本発明に係る徐放性製剤は、骨の主成分であるリン酸カルシウム化合物及び多糖類を含む多孔質粒子を担体として用いており、骨芽細胞を活性化することにより担体を核としてアパタイトの結晶が成長すると共に、主成分に骨の細胞外基質である多糖類を有するため内軟骨性骨化を生じて骨形成が促進されるという、これまでの徐放性製剤には無い特徴を有する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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