(57)【要約】  ラテックス粒子の合成反応において、分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子の懸濁液を含む、免疫学的分析試薬；並びに、（１）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と、（２）ラテックス粒子の合成反応において、前記分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子とを液中で接触させる、免疫学的分析方法を開示する。前記免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法は、検出感度が高く、且つ、従来発生していた非特異的反応を回避することができる。
2008047799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラテックス粒子の合成反応において、分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子の懸濁液を含む、免疫学的分析試薬。
【請求項２】
（１）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と、
（２）ラテックス粒子の合成反応において、前記分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子と
を液中で接触させる、免疫学的分析方法。
【請求項３】
前記接触の後、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する、請求項２に記載の免疫学的分析方法。
【請求項４】
前記接触の後、前記液と前記ラテックス粒子とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析する、請求項２に記載の免疫学的分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法に関する。
なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床診断検査の現場では、多数の検体について疾病診断の指標となる多岐に渡る物質を短時間且つ高精度に測定し、その結果を迅速・正確に治療現場にフィードバックすることが求められており、中でも抗原抗体反応を利用した免疫学的測定によって、微量な分析対象物の正確な定量が多く実施されている。特に検出感度や正確性を向上させるための方法として、分析対象物質に対する抗原又は抗体を、ポリスチレン等の合成高分子（いわゆるラテックス）粒子の表面に担持させた粒子を利用したラテックス凝集法が公知である。ラテックス凝集法とは、分析対象物質と、ラテックス粒子に結合した抗原又は抗体との反応により生じるラテックス粒子の凝集の程度を目視あるいは光学的に検出することにより、短時間に分析対象物質を測定する方法である。
また、ラテックス粒子を磁性粒子にすることで、磁性粒子に結合した第一抗体により分析対象物をトラップし、磁石で集積させて未反応物等を洗浄後（いわゆるＢ／Ｆ分離）、酵素や蛍光剤等シグナルを発生する物質を標識した第二抗体を添加して分析するサンドイッチ法も多用されている。
抗原抗体反応によって定量する分析対象物質の多くは、一般的に生体試料中に含まれる微量成分であり、低濃度領域における定量性を重視している。しかし、疾病の進行度合いによっては測定対象物質濃度が異常に高値を示す場合があるため、臨床検査の現場においては、低値から高値までを正確に測定できる性能を有する試薬が求められている。【０００３】
ラテックス凝集法でもサンドイッチ法でも、ラテックス粒子を用いる場合には、ラテックス粒子の表面に抗原又は抗体を固定することが必要であり、その方法としては、物理的又は化学的に担持させる方法が用いられている。例えば、物理的吸着によりラテックス粒子に抗原又は抗体を直接固定化するか、あるいは、ラテックス粒子の表面の官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、又はエポキシ基などを介した共有結合により、ラテックス粒子に抗原又は抗体を結合させる方法が使用されている。【０００４】
しかし、これらの物理的又は化学的な結合方法では、ラテックス表面に担持可能な抗原又は抗体の量に限界があり、前記ラテックス凝集法やサンドイッチ法の実施には測定範囲や検出感度の面で限界があった。即ち、ラテックス粒子自体の特性（表面の電荷、官能基の導入率、粒度分布等）がロット間、メーカー間で一定ではなく、その為、抗原又は抗体を結合する操作が一定であっても、調製された抗体結合ラテックス粒子の性能はバラツキが生じる。例えば、ラテックス表面への物理的又は化学的な結合方法においても、抗原又は抗体が全て結合できずに、結合後の洗浄により取り除かれたり、遠心や分散処理により、結合した抗原又は抗体が剥がれ落ちたりした。即ち、結合する抗原又は抗体の量がばらつくため、測定範囲や検出感度に影響がある。
また、近年あらたな問題として、非特許文献１に開示されているように、ラテックス粒子表面に抗原又は抗体を結合させることで抗原又は抗体に構造的な変性が起こり、試料中に共存する「変性部位に対して結合する物質」による非特異反応を起こす検体がみられることがあった。これにより、測定結果の信頼性が失われることになり、正確な疾病診断ができなくなる。この問題は、抗原又は抗体、あるいはラテックス粒子をそれぞれ個別に検討しても解決できるものではなく、非常に困難性の高い課題である。【０００５】
【非特許文献１】「臨床病理」，２０００年８月，第４８巻，第８号，７６０−７６３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、ラテックス凝集反応における前記の問題点を克服するために鋭意研究を重ねた結果、分析対象物質に対する抗原又は抗体をラテックス粒子の合成時に共存させることで、従来法より反応性が高く、従来発生していた非特異的反応を回避することができることを見出した。
すなわち、ラテックス粒子を合成する際に抗原又は抗体を共存させる低温ミニエマルション重合により作製されたラテックス粒子は、合成完了時に抗原又は抗体がラテックス粒子表面に導入させることで、従来結合できずに洗浄により取り除かれたり、遠心や分散処理により結合した抗原又は抗体が剥がれ落ちたりすることがないラテックス粒子を作製することができた。上記粒子を使用することにより高い反応性を得ることが可能となった。
また、ラテックス粒子を合成する際に抗原又は抗体を共存させるミニエマルション重合により作製されたラテックス粒子は、合成完了時に抗原又は抗体がラテックス粒子表面に導入されているため、結合による立体障害による変性が起こることがなく、従って従来みられていた非特異反応を起こす検体との反応が回避できるようになった。本発明はこうした知見に基づくものである。【０００７】
従って、本発明の課題は、検出感度が高く、且つ、従来発生していた非特異的反応を回避することができる免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題は、本発明による、ラテックス粒子の合成反応において、分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子の懸濁液を含む、免疫学的分析試薬により解決することができる。
また、本発明は、（１）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と、
（２）ラテックス粒子の合成反応において、前記分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子と
を液中で接触させる、免疫学的分析方法に関する。
本発明方法の好ましい態様によれば、前記接触の後、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する。
本発明方法の別の好ましい態様によれば、前記接触の後、前記液と前記ラテックス粒子とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析する。【０００９】
更に、本発明は、
［１］モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤、及びハイドロフォーブを用いてミニエマルション重合を行う際に、抗原又は抗体を共存させて高分子微粒子を製造することを特徴とする、表面に前記抗原又は抗体が導入された高分子微粒子の製造方法；
［２］前記ミニエマルション重合が、重合反応を低温で行う低温エマルション重合である、［１］の製造方法；
［３］前記ラジカル重合開始剤がレドックス開始剤である、［１］又は［２］の製造方法；
［４］前記レドックス開始剤が、アスコルビン酸とＨ２Ｏ２との組合せである、［３］の
製造方法；
［５］前記乳化剤が界面活性剤である、［１］〜［４］の製造方法；
［６］前記乳化剤が、ポリエチレングリコール鎖を有する重合性界面活性剤である、［１］〜［５］の製造方法；
［７］前記ハイドロフォーブがヘキサデカン又はポリスチレンである、［１］〜［６］の製造方法；
［８］［１］〜［７］の製造方法により得られる、高分子微粒子の表面に抗原又は抗体が導入された高分子微粒子
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、検出感度が高く、且つ、従来発生していた非特異的反応を回避することができる免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法を提供することができる。
すなわち、ラテックス粒子を合成する際に抗原又は抗体をさせる低温ミニエマルション重合により作製されたラテックス粒子は、合成完了時に抗原又は抗体がラテックス粒子表面に導入させることで、従来結合できずに洗浄により取り除かれたり、遠心や分散処理により結合した抗原又は抗体が剥がれ落ちたりすることがないラテックス粒子を作製することができ、このようなラテックス粒子を使用することにより高い反応性を得ることが可能である。また、合成完了時に抗原又は抗体がラテックス粒子表面に導入されているため、結合による立体障害による変性が起こることがなく、従って従来みられていた非特異反応を起こす検体との反応を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＢＳＡ導入ラテックス粒子を用いる本発明試薬と、ＢＳＡ結合ラテックス粒子を用いる従来試薬とを用いて、抗ＢＳＡ抗体標準溶液の２倍希釈列を測定した結果を示すグラフである。
【図２】ＢＳＡ導入ラテックス粒子を用いる本発明試薬と、ＢＳＡ結合ラテックス粒子を用いる従来試薬とを用いて、抗ＩｇＧ抗体標準溶液の２倍希釈列を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明では、従来使用されている、物理的又は化学的結合によりラテックス表面に抗原又は抗体を担持させたラテックス粒子に代えて、ラテックス粒子の表面に抗原又は抗体（すなわち、免疫学的パートナー）が導入されたラテックス粒子（以下、パートナー導入ラテックス粒子と称する）を使用する。
従来公知のラテックス粒子では、例えば、物理的吸着によりラテックス粒子に抗原又は抗体を直接固定化するか、あるいは、ラテックス粒子の表面の官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、又はエポキシ基などを介した共有結合により、ラテックス粒子に抗原又は抗体を結合させていた。【００１３】
本発明で用いるパートナー導入ラテックス粒子は、抗原又は抗体の一部がラテックス粒子に埋め込まれることにより、前記抗原又は抗体がラテックス表面に担持されているラテックス粒子である限り、特に限定されるものではない。このようなパートナー導入ラテックス粒子は、例えば、本発明の製造方法により調製することができる。【００１４】
本発明の製造方法は、重合反応の際に抗原又は抗体を共存させること以外は、従来公知のミニエマルション重合（例えば、M. Antonietti, K. Landfester, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 689-757、J.
M. Asua, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 1283-1346）と同様にして実施することができる。【００１５】
通常のミニエマルション重合は、これに限定されるものではないが、例えば、モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤、及びハイドロフォーブを混合する工程、前記混合物を剪断する工程、並びに前記混合物を重合開始温度まで加熱して重合させる工程を含むことができる。ミニエマルション重合では、重合用モノマーと乳化剤とを混合した後、例えば、超音波照射による剪断工程を実施することにより、前記剪断力によりモノマーが引きちぎられ、乳化剤に覆われたモノマー微小油滴が形成される。ラジカル重合開始剤の重合開始温度まで加熱することにより、モノマー微小油滴をそのまま重合し、高分子微粒子が得られる。【００１６】
本発明で用いる抗原又は抗体は、界面活性を示す抗原又は抗体である限り、特に限定されるものではなく、ラテックス法（例えば、ラテックス凝集法、ラテックスを用いたＢ／Ｆ分離）に利用可能な抗原又は抗体であることが好ましい。或る抗原又は抗体が界面活性を示すか否かは、公知方法、例えば、表面張力測定、あるいは、ピレンを蛍光プローブに用いた蛍光スペクトル測定により確認することができる。また、本発明で使用する抗原又は抗体としては、前記ピレンを蛍光プローブに用いた蛍光スペクトル測定において、ピレンの第一発光ピーク（Ｉ１）と第三発光ピーク（Ｉ３）の強度比（Ｉ１／Ｉ３）が０．５〜１．６（より好ましくは０．６〜１．５）である抗原又は抗体が好ましい。例えば、前記抗原又は抗体としては、各種抗体、レセプター、酵素、脂質、糖鎖等を挙げることができ、具体的には、ＩｇＧ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、トロンボモジュリン、又はアルブミン（好ましくは血清アルブミン）等を挙げることができる。【００１７】
抗体を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、抗体の種類としては、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ等も使用可能である。【００１８】
本発明で用いることのできるモノマーとしては、通常のミニエマルション重合で使用可能なモノマーを使用することができ、例えば、スチレン、スチレン誘導体（例えば、クロロメチルスチレン、スチレンスルホン酸ナトリウム）、アクリル酸若しくはメタクリル酸、アクリル酸エステル若しくはメタクリル酸エステル［例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート］、酢酸ビニルを挙げることができる。【００１９】
本発明で用いることのできるラジカル重合開始剤としては、通常のミニエマルション重合で使用可能なラジカル重合開始剤を使用することができ、例えば、過酸化開始剤、過硫酸開始剤、アゾ系開始剤、又はレドックス開始剤を挙げることができる。本発明においては、重合反応を低温で行うことができる点で、レドックス開始剤を用いることが好ましい。重合反応時に共存させる抗原又は抗体が生理活性を有する場合、前記重合反応を低温で行うことにより、生理活性の低下を抑制することができる。【００２０】
前記過酸化開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド（ＤＢＰＯ）、過酸化アンモニウムを挙げることができる。前記過硫酸開始剤としては、例えば、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、過硫酸ナトリウム（ＮＰＳ）を挙げることができる。前記アゾ系開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ジメチル２，２’−アゾビスイソブチレート（ＭＡＩＢ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）を挙げることができる。【００２１】
前記レドックス開始剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン［N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine（ＴＭＥＤＡ）］／過硫酸カリウム［potassium
persulfate（ＫＰＳ）］、ＦｅＳＯ４／ＫＰＳ、ＦｅＳＯ４／Ｈ２Ｏ２、アスコルビン酸（ビタミンＣ）／Ｈ２Ｏ２等を挙げることができる。高い転化率（例えば、７５〜９８％）を達成することができる点で、アスコルビン酸／Ｈ２Ｏ２の組合せが好ましい。【００２２】
本発明で用いることのできる乳化剤としては、ミニエマルション重合で一般に使用される各種界面活性剤を用いることができ、例えば、アニオン性化合物、カチオン性化合物、ノニオン性化合物を挙げることができる。前記ノニオン性化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する重合性界面活性剤、長鎖アルコール、ポリビニルアルコール、Ｂｒｉｊ  ３５（ＰＩＥＲＣＥ社）を挙げることができる。【００２３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する重合性界面活性剤としては、例えば、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３（ｎは２以上の整数、好ましくは２〜１００、より好ましくは５〜８０、更に好ましくは８〜５０、特に好ましくは９〜２３）を挙げることができ、より具体的には、例えば、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３［ｎ＝２３；（商品名）ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ（商品名）；新中村化学工業株式会社］、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）９ＣＨ３［ｎ＝９；（商品名）ＮＫエステルＭ−９０Ｇ；新中村化学工業株式会社］を挙げることができる。前記重合性界面活性剤を乳化剤として用いることで、立体反発による分散安定性を得ることができる。
前記長鎖アルコールとしては、例えば、１−ペンタノール、デカノールを挙げることができる。【００２４】
本発明で用いることのできるハイドロフォーブとしては、通常のミニエマルション重合で使用可能なハイドロフォーブを使用することができ、例えば、ヘキサデカン、シルセスキオキサン、又は疎水性ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル）を挙げることができ、ヘキサデカン又はポリスチレンが好ましい。ハイドロフォーブを用いることにより、オストワルド熟成による粒径の不均一性の増大を抑制し、単分散なラテックス粒子を合成することができる。【００２５】
重合時の反応条件、例えば、溶媒、混合比、温度、反応時間などは、使用するモノマー及び抗原又は抗体の種類、合成する高分子微粒子の平均粒径、微粒子表面に担持させる抗原又は抗体の量などに応じて、例えば、パイロット試験を実施することにより適宜決定することができる。
例えば、重合用モノマー（例えば、スチレンモノマー）４０ｍｍｏｌに対して、抗原又は抗体［例えば、ウシ血清アルブミン、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２］を、通常０．０１〜５ｇ、好ましくは０．０２〜２ｇ、より好ましくは０．０８〜０．８ｇの量で；ラジカル重合開始剤（例えば、アスコルビン酸、Ｈ２Ｏ２）を、通常０．０１〜４ｍｍｏｌ、好ましくは０．０２〜２ｍｍｏｌの量で；乳化剤（例えば、ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ、ＮＫエステルＭ−９０Ｇ）を、通常０．１〜１０ｍｍｏｌ、好ましくは０．２〜５ｍｍｏｌ、より好ましくは０．４〜４ｍｍｏｌの量で；それぞれ、用いることができる。反応時間は、通常１時間以上、好ましくは３〜４８時間、より好ましくは４〜２４時間である。反応温度は、通常０〜８０℃、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは０〜４０℃である。【００２６】
本発明の製造方法において、ミニエマルション重合の際に共存させた抗原又は抗体が高分子微粒子（例えば、ラテックス）表面に導入される作用機序は明らかでないが、本発明者は以下のとおり推測している。すなわち、本発明で用いる抗原又は抗体は界面活性を示すため、その親水的な部分により、水との接合帯である高分子微粒子（例えば、ラテックス）表面に存在すると考えられる。なお、本発明は、この推測に限定されるものではない。【００２７】
本発明では分析においてラテックス法（例えば、ラテックス凝集法、ラテックスを用いたＢ／Ｆ分離）を用いる。分析対象物質に対する抗原又は抗体（例えば、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はそれらの抗体フラグメント）を導入したラテックス粒子と、分析対象物質とを接触させるラテックス上での抗原抗体反応を実施する系において、導入された抗原又は抗体が立体障害による変性のない状態であるため、変性部位に対する非特異的な検体とは反応せずに、従来法より高感度で分析対象物質を分析（検出又は測定、好ましくは測定）することができる。【００２８】
本発明により分析することのできる物質（分析対象物質）は、一般に抗原抗体反応を利用して抗原又は抗体として分析することのできる物質（特に生理活性物質）であれば特に限定されない。分析対象物質の代表例としては、タンパク質、脂質、糖鎖等を挙げることができ、より詳しくは、例えば、各種抗体、レセプター、又は酵素等を挙げることができる。具体的には、ＩｇＧ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、トロンボモジュリン、又はアルブミン（好ましくは血清アルブミン）等を挙げることができる。
また、本発明で分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。【００２９】
本発明では、その分析においてラテックス法を用いる。本発明におけるラテックス法では、分析対象物質に特異的に反応する抗原又は抗体を導入したラテックス粒子を用いる。
パートナー導入ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、通常、０．０５〜０．５μｍの範囲で適宣選択することができる。【００３０】
ラテックス粒子に導入させる抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、抗体の種類としては、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ等も使用可能である。【００３１】
本発明による免疫学的分析試薬は、例えば、抗原又は抗体を導入したラテックス粒子と緩衝液を含む１液系の試薬；緩衝液である第１試薬と、抗原又は抗体を導入したラテックス粒子とモノクローナル抗体との両方を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬；あるいは、緩衝液と導入したラテックス粒子との両方を含む第１試薬と、抗原又は抗体を感作したラテックス粒子を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬など、種々の形態であることができる。【００３２】
本発明においては、前記のような試薬を用いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合い（凝集度）を光学的に分析（特には測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。ラテックス粒子の凝集度を光学的に検出する具体的方法においては、例えば、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行うことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。測定方法は、公知の方法に従い、用いるラテックス粒子の大きさ（平均粒径）若しくは濃度の選択、又は反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより行うことができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
あるいは、前記試薬と被検試料とを液中で接触させた後、Ｂ／Ｆ分離を行うことにより、ラテックス粒子と液とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析（特に測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。【００３３】
本発明においては、導入させる抗原又は抗体の種類を選択することに加え、ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子を調節することによって、ラテックス粒子凝集反応を更に精密に増幅し、低濃度域の定量可能範囲を更に拡張させることや更に非特異反応を抑制することができる。ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子としては、例えば、ラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子に導入される抗原若しくは抗体量、又はラテックス粒子の粒径等を挙げることができる。【００３４】
本発明で用いる抗原抗体反応の条件は通常の条件と同様であってよく、反応媒体としては、分析対象物質の種類に応じた各種緩衝液を適宜選択することができる。この緩衝液は、分析対象物質を失活させることがなく、且つ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよい。例えば、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液を使用することができる。反応のｐＨは、５〜１０、特に６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決めることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３６】
《実施例１：抗ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗体測定試薬の調製》
（１）ＢＳＡ導入ラテックス粒子の調製
スチレン４０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン４ｍｍｏｌ、ＢＳＡ２００ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．８ｍｍｏｌ、アスコルビン酸０．４ｍｍｏｌ、及び水２０ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力８０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２  ０．４ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃又は６０℃で６時間重合してＢＳＡ導入ラテックス粒子を調製した。なお、得られたＢＳＡ導入ラテックス粒子の平均粒径は０．１０９μｍ（３０℃の場合）及び０．１２１μｍ（６０℃の場合）であった。【００３７】
（２）ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液の調製
ＢＳＡ導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。【００３８】
（３）緩衝液の調製
０．５重量％ＢＳＡを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ＰＨ８．０）に、０．９重量％の濃度となるように塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。以下、ＢＳＡを含まないＮａＣｌ含有トリス緩衝液を「緩衝液Ａ」と、ＢＳＡを含有するＮａＣｌ含有トリス緩衝液を「緩衝液Ｂ」と称する。【００３９】
（４）抗ＢＳＡ抗体測定試薬
実施例１（２）で調製したＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ａ又はＢ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としての抗ＢＳＡ抗体測定試薬として、以下の実施例で評価した。【００４０】
《実施例２：抗ＢＳＡ抗体標準溶液の測定》
（１）抗ＢＳＡ抗体標準溶液の調製
抗ＢＳＡ抗体（Rabbit Anti cow albumin；DAKO社、９００単位）を生理食塩水で倍々希釈し、９００、４５０、２２５、１１３、５６、２８、１４、及び７単位濃度の標準抗ＢＳＡ抗体希釈列を調製した。【００４１】
（２）抗ＢＳＡ抗体標準溶液の測定
標準抗ＢＳＡ抗体希釈列１５μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液Ａ又はＢ９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例１（２）で調製したＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
なお、比較のために、平均粒径０．１１μｍのポリスチレンラテックス粒子（日本合成ゴム製：固形分１０％）を用いて、前記粒子１％濃度１ｍＬにＢＳＡを０．３％（３ｍｇ／ｍＬ）量感作して調製したＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液を使用した。【００４２】
結果を表１及び図１、並びに表２に示す。表１及び図１には、緩衝液Ａ又はＢを使用した場合の、実施例１（４）に記載の本発明試薬（重合温度＝３０℃）の結果を、従来試薬の結果と併せて示す。また、表２には、緩衝液Ａ（すなわち、ＢＳＡ不含）を用いた場合の、実施例１（４）に記載の本発明試薬（重合温度＝３０℃又は６０℃）の結果を、従来試薬の結果と併せて示す。【００４３】
表１及び図１から明らかなように、緩衝液Ａ（すなわち、ＢＳＡ不含）を用いた場合、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液の場合（本発明試薬）には、抗ＢＳＡ抗体濃度が９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）２４５１３に対して、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液の場合（従来試薬）には、９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）３８５と、明らかにＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液が高感度であった。また、緩衝液Ｂ（すなわち、０．５％ＢＳＡ含有）を用いると、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液ともに、抗ＢＳＡ抗体希釈列との反応性はみられなかった。【００４４】
【表１】
2008047799.tif 000003
【００４５】
表２から明らかなように、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液（本発明試薬）において、重合反応を低温（３０℃）で実施して得られたＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液の場合には、抗ＢＳＡ抗体濃度が９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）２４５１３に対して、高温（６０℃）で実施して得られたＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液は９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）８４８０と、低温でのＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液のほうが高感度であった。また、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液の場合（従来試薬）には、９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）３８５と、明らかにＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液が高感度であった。【００４６】
【表２】
2008047799.tif 000004
【００４７】
《実施例３：抗ＢＳＡ抗体測定試薬によるヒト血清の測定》
本実施例では、標準抗ＢＳＡ抗体希釈列の代わりに、正常検体であるヒト血清５例（検体Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）と非特異的検体であるヒト血清３例（検体Ｎｏ．６〜Ｎｏ．８）を用いること以外は、前記実施例２（２）の操作を繰り返した。なお、前記非特異的検体は、ラテックス粒子にＢＳＡを結合したＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液に対して非特異的に反応し、ＢＳＡを結合していないラテックス粒子懸濁液とは反応しない検体である。【００４８】
結果を表３に示す。
表３から明らかなように、正常検体（血清ＮＯ．１〜Ｎｏ．５）、非特異的検体（血清Ｎｏ．６〜Ｎｏ．８）ともにＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液との反応はみられないが、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液においては、ＢＳＡを含まない緩衝液（緩衝液Ａ）においても、０．５％ＢＳＡを懸濁させた緩衝液（緩衝液Ｂ）においても、非特異検体との強い反応がみられた。【００４９】
【表３】
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【００５０】
《実施例４：抗ＩｇＧ測定試薬の調製》
（１）ＩｇＧ導入ラテックス粒子の調製
スチレン４０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン４ｍｍｏｌ、ＩｇＧ  ２００ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．６ｍｍｏｌ，アスコルビン酸０．４ｍｍｏｌ、及び水２０ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力８０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２  ０．４ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で６時間重合してＩｇＧ導入ラテックス粒子を調製した。なお、ＩｇＧ導入ラテックス粒子の平均粒径は０．３１８μｍであった。【００５１】
（２）ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液の調製
ＩｇＧ導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。【００５２】
（３）抗ＩｇＧ抗体測定試薬
実施例４（２）で調製したＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ｂ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としての抗ＩｇＧ抗体測定試薬として、以下の実施例で評価した。【００５３】
《実施例５：抗ＩｇＧ抗体標準溶液の測定》
（１）抗ＩｇＧ抗体標準溶液の調製
抗ＩｇＧ抗体（Anti-IgG H&L chains；MILES-YEDA社、２．８ｍｇ／ｍＬ）を生理食塩水で倍々希釈し、２．８、１．４、０．７、０．３５、０．１７５、０．０８８、及び０．０４４ｍｇ／ｍＬの、７濃度の標準抗ＩｇＧ抗体希釈列を調製した。【００５４】
（２）抗ＩｇＧ抗体標準溶液の測定
標準抗ＩｇＧ抗体希釈列２μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例４（２）で調製したＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
なお、比較のために、平均粒径０．２８３μｍのポリスチレンラテックス粒子（セキスイ社製：固形分１０％）を用いて、前記粒子１％濃度１ｍＬにＩｇＧを１％（１０ｍｇ／ｍＬ）量感作して調製したＩｇＧ結合ラテックス粒子懸濁液と、ＩｇＧ未感作のラテックス粒子懸濁液とを使用した。【００５５】
実施例４（３）に記載の本発明試薬の結果を、従来試薬の結果と併せて、表４及び図２に示す。
表４及び図２から明らかなように、ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（本発明試薬）には、抗ＩｇＧ抗体濃度が１．４ｍｇ／ｍＬで吸光度変化量（ΔＡｂｓ）８１２に対して、ＩｇＧ結合ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（従来試薬）には、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）２１９と、明らかにＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液が高感度であった。【００５６】
【表４】
2008047799.tif 000006
【００５７】
《実施例６：抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２測定試薬の調製》
（１）抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子の調製
スチレン１０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン１ｍｍｏｌ、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２  ５０ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．２ｍｍｏｌ、アスコルビン酸０．１ｍｍｏｌ、及び水５ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力５０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２  ０．１ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら室温で６時間重合して抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子を調製した。なお、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子の平均粒径は０．２４９μｍであった。【００５８】
（２）抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液の調製
抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。【００５９】
（３）ＣＲＰ測定試薬
実施例６（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ｂ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としてのＣＲＰ測定試薬として、以下の実施例で評価した。【００６０】
《実施例７：ＣＲＰ標準溶液の測定》
（１）ＣＲＰ標準溶液の調製
ＣＲＰ（オリエンタル酵母株式会社製リコンビナントＣＲＰ溶液１００ｍｇ／ｄＬ）を生理食塩水で希釈し、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、及び０．１ｍｇ／ｄＬの、６濃度の標準ＣＲＰ希釈列を調製した。【００６１】
（２）ＣＲＰ標準溶液の測定
標準ＣＲＰ希釈列２μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例６（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。【００６２】
実施例６（３）に記載の本発明試薬の結果を、表５に示す。
表５から明らかなように、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（本発明試薬）、０．１〜３．２ｍｇ／ｄＬの範囲においてＣＲＰ標準液と濃度依存的な反応性が得られた。【００６３】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、免疫学的分析（特にラテックス凝集法）の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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