【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年8月11日(2004.8.11)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】プロトロンビン活性化によるエル・オブリキア剛毛(L. OBLIQUA BRISTLES)の可溶性タンパク質の精製方法；プロトロンビン活性剤のアミノ酸配列の部分決定の方法；画分IIのプロトロンビン活性化、プロトロンビン活性剤画分のN末端と内部断片配列の決定方法およびプロトロンビン活性剤の利用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトロンビン活性化によるエル・オブリキア剛毛(L. obliqua bristles)の可溶性タンパク質の精製方法、プロトロンビン活性剤のアミノ酸配列の部分的な決定の方法、画分IIのプロトロンビン活性化、プロトロンビン活性剤画分のN末端および内部断片配列の決定方法、同様にプロトロンビン活性剤およびプロトロンビン活性剤の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロトロンビンは血漿タンパク質で、血液凝固に関与しビタミンKに依存する。プロトロンビンの活性化は、プロトロンビナーゼ複合体(それは、Xa因子 、Va因子、リン脂質及びカルシウムイオンによって構成され、プロトロンビンの分子の2つのペプチド間にリンクする場合の切断(順に)によって得られる)によって促進されます。(Mann K G. Prothrombin and Thrombin. In: Colman RW, Marder VJ,  Salzman EW, Hirsh J eds. Haemostasis and Thrombosis. Basic Principles and Clinical Practice. Philadelphia: J. B. Lippincott; 1994. P 184-99)。
【０００３】
第1の切断が、境界Arg320およびIle 321の間に生じる。また、この加水分解は中間活性剤― メイゾトロンビン(meizothrombin)になる。2番目の切断が、境界Arg271及びThr272、又はアミノ酸残基の間に生じて、断片1、2およびセリンプロテアーゼα-トロンビンを出す。(Mann K G. Prothrombin and Thrombin. In: Colman RW,  Marder VJ, Salzman EW, Hirsh J eds. Haemostasis and Thrombosis. Basic Principles and Clinical Practice. Philadelphia: J. B. Lippincott) 1994.  P .184-99)。
【０００４】
リン脂質が存在しない場合、プレトロンビン(prethrombin) は、Xa因子の生理的濃度で活性化される。しかしその活性化速度は、プロトロンビナーゼ複合体を通した活性化と比較すると5桁低い。(Mann KG. Membrane-bound enzyme complexes in blood coagulation. Prog. Hemost Thromb. 1984,. 7:1-23.),そしてその活性化メカニズムは、改変メイゾトロンビンmeizothrombinの代わりに、プレトロンビン(prethrombin)生成を経て起きる。(Mann KG. Membrane-bound  enzyme complexes in blood coagulation.  Prog. Hemost Thromb. 1984,. 7:1-23.) (Heldebrandt CM, Butkowski RJ, Bajaj SP, Mann KG. The activation of prothrombin. H. Partial  reactions, physical and chemical characterization of the intermediates of activation. J Bio1. Chem. 1973; 248: 7149-63)。
【０００５】
α―トロンビンは、フィブリノゲンをフィブリンに変換し、V、VIIIおよびXIII因子を活性化し、血小板を凝集するセリンプロテアーゼである。(Mann KG, Downing MR. Thrombin generation. In: Lundblad RL, Fenton JW, Mann KG, Eds. Chemistry and Biology of Thrombin. Ann Arbor Science; 1977. Pp. ll-21; Lundblad RL, Kingdon HS, Mann KG. Thrombin. Methods Enzymo1. 1976; 45:156-76)。多くの毒ヘビが酵素原を活性化する凝血原(procoagulant)タンパク質を有しており、血液凝固に関連づけられる。
【０００６】
有毒な酵素が、哺乳動物で見出されるものよりも異なった方法で、凝固因子を活性化するメカニズムにより、毒物活性剤は、血液凝固の活性化メカニズムに関する情報に加えることができる。毒物からのプロトロンビン活性剤は、プロトロンビナーゼ複合体の成分との相互作用に依存して、タイプ1(例えばecarina)、タイプ2(例えばNotechis scutatus活性剤)、3(例えばOxyuranus scutellatus)および4(例えばAgkistrodon acutus活性剤)として分類される。(Rosing J,  Tans G.  Inventory of exogenous prothrombin activators. Thromb. Haemost. 1991; 65(5): 627-30)。
【０００７】
タイプ1の活性剤はプロトロンビナーゼ複合体成分に依存せず、タイプ2はCa2+及びVa因子に依存、タイプ3はリン脂質とCa2+に依存する。タイプ4の活性剤は、プロトロンビナーゼ複合体成分を必要または不必要であり、それを触媒活性生成物(例えばトロンビン又は改変メイゾトロンビンmeizothrombin)に変換せずに、プロトロンビン中のペプチド境界を切断することが出来る。
【０００８】
タイプ4及びトロンビンの活性剤は、同じ方法(Arg155-Ser156及びArg284-Thr285)でプロトロンビンを加水分解し、Prethrombin  1及びPrethrombin  2へ同様または同一の断片を形成する。(Rosing J, Tans G. Structural and functional properties of snake venom prothrombin activators. Toxicon. 1992; 30: 1515 - 27.)。
【０００９】
ロノミア・アケロウス(Lonomia achelous)血液リンパでは、2つのタイプのプロトロンビン活性剤が記述された。それらのうちの1つは、プロトロンビン複合体(V因子、カルシウムイオン及びリン脂質)と無関係に、プロトロンビンを直接活性化することができる。 (GUERRERO BAG, Arocha-Pinango stimulate the other Activation of human prothrombin by the venom of Lonomia achelous (Cramer) caterpillars. Thrombos. Res. 1992; 66:169-77)。
【００１０】
エル・オブリキア剛毛(L.obliqua bristles)の粗製抽出物が分析された時、凝血原活性はプロトロンビン及びX因子の活性化によって記述された。
【００１１】
ロノミア・オブリキア(Lonomia obliqua)の毒液は、激しい消費性凝固障害を引き起し、出血性症候群に到る。粗製剛毛抽出物は、X因子及びプロトロンビン活性化によって凝血原活性を示す。
【００１２】
1989年以来、ロノミア・オブリキア・キャタピラ(Lonomia obliqua  caterpillar)との接触により引き起こされる出血性症候群は、ブラジルで流行病になり、腎臓障害および脳出血による致命的な症例が記述された。これらの障害は、凝固メカニズムに影響し、顕著なフィブリノゲンの減少そして同様にVおよびXIII因子の減少となる。さらに、α-2-抗プラスミンプラスミノーゲンレベルおよびCタンパク質活性、自然凝固凝血阻害剤の減少となる。これらのデータは、フィブリノゲン欠乏による消費性凝固障害を示している。
【００１３】
ロノミア・オブリキア・キャタピラ(Lonomia obliqua caterpillar)との接触によって引き起こされる障害症状は、そう痒を起こす皮膚炎、溢血および血腫(突発的な反応として又は外傷性の結果として)、粘液腔での出血(歯肉、鼻の出血)、血尿、最近の傷出血そして腹部、肺、腺及び脳の出血である。致命的な場合は、腎臓部の障害および脳出血と関係していた。
【００１４】
ベネズエラにおいてエル・アケロウス(L. achelous)との接触により引き起こされる障害に関する従来の研究は、そのような場合、出血性症候群は、(血管内凝固症候群に関連された)激しい繊維素溶解症候群として説明されると提案された。ロノミア・アケロウス(Lonomia achelous)及びロノミア・オブリキア(Lonomia obliqua)との接触による毒注入の臨床の徴候は全く類似しているが、この発明の研究者らは、研究所での充実した研究結果に基づいて上述に異なる解釈を実証し示唆した。トロンビン生成が、ロノミア・オブリキア(Lonomia obliqua)との接触によって引き起こされる出血性症候群の主要な分子メカニズムであることを示した。
【００１５】
より明確には、過去10年、文献は、ロノミア・オブリキア・キャタピラ(Lonomia obliqua caterpillar)との接触によって引き起こされるブラジル南部でのヒト出血性症候群の症例の増加を示している。その毒は激しい消費性凝固障害を引き起こし、出血性症候群にとなる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ロノミア・オブリキア剛毛(Lonomia obliqua bristles)から調製された粗製抽出物が、プロトロンビン及びX因子の両方を活性化するという記載に基づいている。偶然の毒注入で、凝固因子および繊維素溶解因子に変化がある。
【００１７】
Lopap(ロノミア・オブリキアプロトロンビン活性剤プロテアーゼLonomia obliqua prothrombin activator protease)は、ロノミア・オブリキア・キャタピラー剛毛(Lonomia obliqua caterpillar bristles)抽出物から分離した69kDaのセリンプロテアーゼであり、また、その活性はCa2+ の存在で増加し、プロトロンビンを用量依存でトロンビンにも変換し得る。その作用のメカニズムは、プロトロンビナーゼ複合体成分とは無関係にプレトロンビン(prethrombin)の断片を生成するXa因子のそれに似ている。Lopapは、トロンビンと同じペプチド結合のプロトロンビン配列に基づき、蛍光発生基質を加水分解する。  
【００１８】
本発明は、ロノミア・オブリキア剛毛(Lonomia obliqua bristles)の粗製抽出物から分離したプロトロンビン活性剤セリンプロテアーゼの生物学的特性の確認から開始して、ラットに血液凝固及びトロンビン生成の全体の毒物効果を再現する。
【００１９】
本発明によれば、精製Lopapは、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）中のロノミア・オブリキア剛毛(Lonomia obliqua bristles)の粗製抽出物から得られ、プロトロンビン活性剤はゲルろ過および逆相の2つのクロマトグラフィーステージによって精製された。プロトロンビン活性剤の活性は、発色基質S-2238を使用して測定し、そしてトロンビンで切断させた。
【００２０】
本発明は、ロノミア・オブリキア(Lonomia obliqua)毒の1成分(Lopap)だけが、プロトロンビン活性化によって直接に出血性症候群を引き起こし得ることに到る。従って、治療はロノミア・オブリキア(Lonomia obliqua)との偶然の接触の場合に実行される。
【００２１】
ラットへのLopap注入による凝固パラメーターへの影響を評価すると、微小循環の血管の反応および異なる身体器官の障害は、100 μg/kgの服用量の注入そしてその効果を1時間モニターした時、その血液は非凝固性になることが示された。血小板数は約40%に減少し、またコラーゲンによって血小板凝集を引き起こすことが、全血で完全に止まった。高濃度の毒素状態で、全血の赤血球および白血球の数は変化しなかったが、激しい静脈の閉塞および出血領域が観察された。血管内のトロンビンの生成は、ラットのLopap注入後の血小板減少および血小板のハイポアグリゲーション(hypoaggregation)について説明することができる。トロンビンが、主要かつ最も活発な血小板作用物質である。
【００２２】
Lopap注入の投与5分後の微小循環系を観察すると、後毛細管にフィブリン凝塊が観察される。血管のいくつかの中の閉塞および激しい出血領域が確認された時、顕著な変化がこの投与の1時間後に生じる。この現象は、このような毒にさらされたヒト患者の大多数において観察される血腫に結びつく。実験動物の種々の器官の組織学的分析をLopap注入投与の1時間後に実施した。変化は、肺と腎臓部の組織にのみ見出だされた。出血および壊死エリアが確認されたので上述が最も重要である。穏やか又は激しい毒として分類される患者は、血尿症および時々腎臓部の欠失を示し、時には致命的となる。実験ラットで見つかった腎障害は、出血および／または糸球体中の繊維素沈渣によって引き起こされ得る。
より長い毒注入時間に、他の臓器のマイクロトロンビン（microthromb）及び鬱血シグナルが、中枢神経系を含む、確認されるのも真実である。
【００２３】
これらの記述に基づいて、本発明はLopapを新しいプロトロンビン活性剤と記載し、ロノミア・オブリキア・キャタピラ(Lonomia obliqua caterpillar)の毒が入ったヒト患者に見られる主要な徴候の原因であるまさに重要な要素である。
【００２４】
キャタピラー(caterpillar)毒素の1つ以上のプロトロンビン活性剤が関与しているかどうかを評価するために、ロノミア・オブリキア剛毛(Lonomia obliqua bristles)の可溶性タンパク質をゲルろ過および高機能液体クロマトグラフィー(HPLC)の逆相で精製した。プロトロンビン活性化はChromogenixから、プロトロンビンおよびトロンビンに対する特異発色基質S-2238を使用してモニターされた。プロトロンビン加水分解生成もSDS-PAGEによって確認された。69 kDaのタンパク質が、カルシウムイオンに活性化されたセリンプロテアーゼとして現れ、プロトロンビンをトロンビンへ直接変換し、プロトロンビン活性剤のグループ1に含まれ得る。ロノミア・オブリキアプロトロンビン活性剤プロテアーゼ"Lonomia obliqua Prothrombin Activator Protease" (Lopap) を均一になるまで精製し、そのアミノ酸配列は、他のプロトロンビン活性剤そして他のセリンプロテアーゼとも相同を示さない。
【００２５】
精製されたタンパク質がラットに注入された時、剛毛(bristles)の粗製抽出物と同じ結果が得られていることがin vivo実験で示された。従って非凝固血液は、用量依存の方法で確認された。これは、タンパク質の注入後、生体内(intravital)顕微鏡技術を使用して、精巣挙筋の微小循環系の観察で実証された。得られたデータは、Lopap注入が後毛細血管中に血管内凝固および血栓症を生じることを示し、頻繁に臓器障害になる。Lopapは、確実に、エル・オブリキア剛毛(L.obliqua bristles)との偶然の接触後、消費性凝固障害を引き起こす主要な要因である。
【００２６】
本発明の主要な態様は、プロトロンビン活性剤活性でエル・オブリキア剛毛(L.obliqua bristles)の精製プロセスの可溶性タンパク質に関係する。pH 7.4〜8.0のリン酸緩衝塩類溶液(PBS)中でエル・オブリキア剛毛(L.obliqua bristles)の均質化を実行し、次に4℃〜10℃の温度で30〜60分間の2500xgの遠心分離を行い粗製抽出物を得る。そして、粗製抽出物からのプロトロンビン活性剤の精製は、2〜10mlの粗製抽出物の全タンパク質の50〜200mgから実行される。20〜50mMのトリス塩酸緩衝液内の、pH 7.4〜8.0レベルにした50〜100mMのNaC1及び2〜5 mMのベンザミディン(benzamidine)を含む溶出によって、セファデックスG-75(Sephadex G-75)樹脂中のゲルろ過クロマトグラフィーで達成される。そして画分を1〜3mlから収集され、タンパク質プロフィールを280nmのUV吸光度で観察する。
【００２７】
プロトロンビン活性剤作用を含むピークPIIを得るために、プロトロンビンは、トロンビン特異のS-2238比色計基質を使用して、タンパク質ピークで得られた物質中で活性化させる。活性ピークを、HPLC分析装置のC4カラムを通して逆相クロマトグラフィーにかける。次の溶媒を使用した。A:0.1%のTFA水溶液(平衡を保つ)及びB: 溶媒Aとアセトニトリルを1:9(溶出)の比、すなわち溶媒B: 100mlの溶媒Aに900mlのアセトニトリルを加える。35-50%勾配の溶媒Bを30分間使用し、そしてタンパク質検知を、214又は280nmを使用したUV検知装置で行った。その後、0.5-1.0mlの画分が収集され、アセトニトリルの除去のために直ちに凍結乾燥させた。
【００２８】
次の処理は、凍結乾燥された試料を、pH 7.4〜8.0の50〜100mMのNaClを含む20〜50mMのトリス塩酸緩衝液に可溶にすることである。タンパク質ピークで得られたものを使用する画分のプロトロンビン活性剤活性は、トロンビン特異のS-2238発色基質で測定された。活性ピークは、B溶媒の42〜44%の間の溶出分画で得られる。
【００２９】
HPLC分析装置でC4カラムによる逆相クロマトグラフィーによる活性分画の新しいクロマトグラフィー。次の溶媒を使用した。A:0.1%のTFA水溶液(平衡を保つ)および溶媒B: 溶媒Aとアセトニトリルを1:9(溶出)の比: 100mlの溶媒Aに900mlのアセトニトリルを加える。20-80%比例勾配の溶媒Bを20分間使用した。タンパク質検知を、UV検知モニターで吸光度214又は280nmを使用して行った。0.5-1.0mlの分画を収集し、アセトニトリルを除去するために直ちに凍結乾燥させた。凍結乾燥されたサンプルを、pH 7.4〜8.0 の50〜100mMのNaClを含む20〜50mMのトリス塩酸緩衝液中で再び懸濁させた。分画のプロトロンビン活性剤活性は、タンパク質ピークで得られたものを使用し、トロンビンに特異性のS-2238の発色基質によって測定される。42〜44%のB溶媒で溶出された分画に活性ピークがあることが観察される。
【００３０】
精製した物質は、均一性評価用のSDSを含むポリアクリルアミドゲル中の電気泳動法にかけることができる。このゲルはクーマシーブリリアントブルーを使用して染色し得る。
【００３１】
最終のタンパク質濃度の測定は、比色法または280nmの吸光度を使用したタンパク質測定から評価できる。メルク-日立(Merck-Hitachi model D-2500)及び島津Shimadzu UV(SPD-6AV model)が、実施したHPLC分析装置を実現する。本発明の方法では、次の溶媒が溶出のために使用された。HPLCの充分な精製のために、35-50%の勾配の溶媒Bが使用される。
- 溶媒A:  0.1%のTFA水溶液
- 溶媒B:  1:9の比の溶媒Aおよびアセトニトリルまたは他に、900mlのアセトニトリルを100mlの溶媒Aに加える。
【００３２】
別の発明は、プロトロンビン活性剤のアミノ酸配列の部分的決定の方法に関係する。精製されたタンパク質の500-1000pMを、0.02%のCaCl2を含むpH 8.0で37℃、18時間、100mMトリス塩酸緩衝液の10pmolトリプシンで分解させ、15%(v/v)のギ酸との反応で終了させる。この方法では、得られた画分は、C4カラム、0.1%のTFA水溶液（溶媒A）の溶出溶媒およびアセトニトリルを使用したHPLCで分離される：溶剤A (9:1)(溶媒B)。HPLCで分離された断片分離については、0-100%勾配の溶媒Bを30分間の1.0ml/minフローで使用された。
【００３３】
本発明の方法によって、4つの内部ペプチドおよびN末端の配列が決定された。N末端部分は、46のアミノ酸残其を含んでいる。得られた配列は、全タンパク質の約15%に相当し、69KDaの分子量に相当する。
(DVVIDGACPDMKAVSKFDMNAYQGTWYEIKKFPVANEANGDCGSVE)
そして内部ペプチド断片は：
- Fragment I (KSHVYTVPFGA);
- Fragment II (KSNQHRVNIWILSRTK)
- Fragment III (VRAGHVE)
- Fragment IV (FDQSKFVETDFSEKACFF)。
【００３４】
別の発明は、分画IIのプロトロンビン活性剤の反応を決定する方法に関係する。それは90pMのプロトロンビンと5mMのCaCl2 とで、15〜300nMの精製した分画の37℃ 10分間の プレインキュベート(pre-incubate)を意味する。pHを8.0とした50mM のトリス塩酸, 100mMのNaCl, 同様に150mMのイミダゾールで最終容量を500μLとする。40μMの発色其質S-2238(H-D-フェニルアラニル(phenylalanyl)-L-ピペコリル(pipecolyl)-L-アルギニン(arginine)-p-ニトロアニリン・ジヒドロクロライド(nitroaniline dihydrochloride))をインキュベーション混合物に加えて、10分間の発色其質の加水分解で405nmの吸収の分光光度法で評価される。
【００３５】
本発明は、(DVVIDGACPDMKAVSKFDMNAYQGTWYEIKKFPVANEANGDCGSVE)の46アミノ酸残基を備えたN末端部分を含むことにより特徴づけられたプロトロンビン活性剤画分のN末端配列および内部断片の配列にも関係する。内部ペプチドの断片は、断片I(KSHVYTVPFGA);断片II(KSNQHRVNIWILSRTK) ;断片III(VRAGHVE)、および断片IV(FDQSKFVETDFSEKACFF)で、全タンパク質の約15%そして69Kdaの分子量に相当する配列となる。
【００３６】
また発明は、次の構造を含むプロトロンビン活性剤と関係する:精製タンパク質は、断片1、2及びトロンビンを生成するプロトロンビンを加水分解するセリンプロテアーゼであると見なされる。
【００３７】
最終的には、本発明は、プロトロンビン活性剤をプロトロンビン状態で異常フィブリノーゲン血症(dysfibrinogening)成分として使用することを目標とする。
【００３８】
精製タンパク質の低用量では、プロトロンビンを活性化およびトロンビンを生成する能力により、コントロールした条件において、循環からフィブリノゲンを取り除き、それをフィブリン・マイクロトロンビン(microthrombs)に変換することが可能である。血漿のフィブリノゲン濃度の減少は、凝固時間の増加を促進し、従って急性の血栓症を抑制する。
【００３９】
タンパク質が、タンパク分解活性を示さないので、それはプロセスで消費されないフィブリノゲンの凝固能力を維持することができる。このように、フィブリノゲン血漿濃度が減少するが、出血性状態の素因とはならない。それに加えて、血漿のプロトロンビンの検知の診断キットを生産するために使用することができる。
【００４０】
作製様式と方法および試薬としての使用。
【００４１】
E-64 (トランス(trans)-エポキシサクシニル(epoxysuccinil)-L-leucilamide-(4-グアニジンブタンguanidine-butane)-プロトロンビンprothrombin、EDTA (エチレン(etilene)-ジアミノ四酢酸(diaminotetraacetic acid))、PMSF (phenylmethylsulphonil fluoride)、NPGB (p-Nitrophenyl-p"-guanidinebenzoate) 及びトリプシンがSigmaから得られた。S-2238 (H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginine-p- nitroaniline dihydrochloride)及びS-2765 (N-(-ベンジルオキシカルボニル(benzyloxycarbonyl)-D-arginyil-L-glycil-L-arginine-p-nitroanilide-dihydrochloride) はChromogenixから得られた。
【００４２】
本発明で使用される他の全ての試薬は、市場の利用可能な最良サプライヤーから入手された。セファデックスG-75(Sephadex G-75)はPharmaciaから、C4 (5μm,4., 6x250mm)カラムはJ.T. Baker、C18(μBondapack 10 μm; 22,5 mmx250mm)はMillipore Corp.から提供された。蛍光性のペプチド基質Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp.(Abz=オルト酸塩(アミノ安息香酸; EDDnp=N-[2,4-dinitrophenyl]エチレンジアミン)の配列はプロトロンビン配列に基づき、"Universidade Federal de Sao Paulo"(University of Sao Paulo ブラジル）の生物物理学部で、前述された手続きに従って合成された。
【００４３】
以下に示される参照例は、本発明を一層良く記載する。しかしながら、これらの参照手続き及びデータは、単に本発明のいくつかのカテゴリーの具体的な実施を参照しておりその利用を制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
記述1:プロトロンビン活性化によるエル・オブリキア剛毛(L. OBLIQUA BRISTLES)の可溶性タンパク質の精製。
【００４５】
エル・オブリキア剛毛(L. OBLIQUA BRISTLES)を、pH 7.4-8.0のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で均質化し、4℃〜10℃で30〜60分間2500xg遠心分離を行い組成抽出物を得た。それはプロトロンビン活性剤活性を示した。プロトロンビン活性剤は、セファデックスG-75樹脂(Sephadex G-75)中のゲルろ過クロマトグラフィーによって、2〜10mlの粗製抽出物から50〜200mgの全タンパク質から精製された。それは50〜100mMのNaCl及び2〜5mMのベンザミディン(benzamidine)を含む20〜50mMのpH7.4〜8.0のトリス塩酸緩衝液で1.0 ml/hのフローで溶出された。1〜3mlの画分が収集され、そしてタンパク質プロフィールは280nmのUV吸収度によって測定された。プロトロンビンは、得られたタンパク質ピークおよびトロンビンに特異なS-2238発色其質を使用して活性化させた。
【００４６】
ピークPIIが得られた。それはプロトロンビン活性剤を含んでいる。HPLC分析装置を使用して、C4カラムでの1つの逆相クロマトグラフィーにかけた。使用した溶媒:A: 0.1%のTFA水溶液(平衡を保つ)およびB:1:9(溶出)の比の溶媒Aおよびアセトニトリル。そして、UVモニターで214〜280nmのタンパク質検知を行って0.5-1.0m1の画分を収集する。その後、それらは、アセトニトリルの除去のために直ちに凍結乾燥され、50〜100mMの NaClを含む pH 7.4〜8.0の20〜50mMのトリス塩酸緩衝液で再び懸濁させた。これは、42%及び44%間の溶媒Bで溶出された画分のプロトロンビン活性剤活性のチェックのために行われる。活性画分を、再び溶媒Bの20-80%間の勾配を使用して、20分間クロマトグラフィーにかける。
【００４７】
精製した物質は、均一性評価用のSDSを含むポリアクリルアミドゲル中の電気泳動法にかける。このゲルは、クーマシーブリリアントブルーにより染色される。最終タンパク質の投薬は、比色分析または280nmの吸光度を用いたたんぱく質アッセイで評価される。
【００４８】
記述2:プロトロンビン活性化によるエル・オブリキア剛毛(L.OBLIQUA BRISTLES)の可溶性タンパク質の精製。
【００４９】
エル・オブリキア・キャタピラ(L.obliqua caterpillar)をCO2環境の中で麻酔し、そして剛毛を除去し氷中に保存した。粗製抽出物は、9.9gの剛毛をpH 7、4の PBS で均質化し4℃で10分間2500gの遠心分離で得られた。プロトロンビン活性剤は、粗製抽出物(12.0 mlに103.5mg)からゲルろ過クロマトグラフィー(カラム: 100x1、8cmのセファデックス(Sephadex) G-75)で精製させた。それは100mM のNaCl及び5mMのベンザミディン(benzamidine)を含むpH 8.0の50mMトリス塩酸緩衝液を使用して、15ml/hのフローで溶出させた。2.0mlの画分を収集し、そしてクロマトグラフィータンパク質プロフィールを280nmのUV吸光度で測定した。プロトロンビン活性化は、トロンビン(PIIピーク、タンパク質: 5.68mg)に特異な発色基質を使用して確認された。活性タンパク質は、Merck-Hitachi (model D-2500)によるHPLC分析装置でC4カラムを使用した逆相クロマトグラフィーをかけ、タンパク質検知には、Shimadzu UV(model SPD-6AV)による214nmのUVモニターにかけた。溶出溶剤は、TFA 0.1%の水溶液(溶媒A)およびアセトニトリルと溶媒A比(9:1) (溶媒B)。HPLCの精製は、30分間1.0ml/minのフローで溶媒Bを35-50%の勾配を使用して実行された。集めたピークは直ちに凍結乾燥させた。プロトロンビン活性化活性を示したタンパク質ピークは、50mMのトリス塩酸緩衝液に再び懸濁させた。それはpH 8.0の100mM NaClを含み、そして溶媒Bを使用して20-80%の勾配の新しいクロマトグラフィーで20分間の1.0 ml/minのフローで同じカラムそして上記の条件で行った。HPLC(PII-4R2)で2回目のクロマトグラフィーの後に、得られたピークのみを集めそしてSDS-PAGEで分析した。10mMのEDTAに対する透析にかけた精製Lopapの一定分量を図4に記述された実験に使用した。
【００５０】
タンパク質の均一性は、クーマシーブリリアントブルーR-250によって染色したポリアクリルアミドゲル10%(p/v)を使用したSDS-PAGEで分析した。タンパク質濃度は、前述の方法と280nmの吸光度によって決定された。Lopap(300nM)の活性化能力は、アセトニトリルの異なる濃度および凍結乾燥の後にテストされた。
【００５１】
記述3:プロトロンビン活性剤のアミノ酸配列の部分的決定。
【００５２】
500―1000pMの精製タンパク質を、0.02%のCaCl2を含むpH 8.0の100mMのトリス塩酸中の10pmolトリプシンで37℃、18時間で分解させ15%(v/v)のギ酸で反応を止めた。断片分離は、0.1%TFAの水溶液(溶媒A)とアセトニトリル：溶媒A(9:1)(溶媒B)で溶出したC4カラムのHPLCによって得られた。HPLC分離に、溶媒Bの0-100%の勾配を1.0 ml/minのフローを30分間使用した。
【００５３】
記述4:LOPAPのアミノ酸配列の部分的決定。
【００５４】
精製タンパク質（500pM）を、0.02%のCaCl2を含むpH 8.0の100mMのトリス塩酸中のトリプシン（10pmol）で37℃、18時間で分解させた。15%(v/v)のギ酸で反応を止めた。得られた断片は、0.1%TFAの水溶液(溶媒A)とアセトニトリル:溶媒A(9:1)(溶媒B)で溶出したC4カラムのHPLCによって分離させた。
【００５５】
HPLCでの断片分離については、溶媒Bの0―100%勾配を、30分間1.0ml/minのフローで使用された。3つの内部ペプチド及びN末端の配列は、Edman(17)分解の反応を実行するApplied BioSystemからの装置を通して決定された。データバンクSwiss Protein DataBaseは、Lopap一次構造の相同を確認するために利用された。
【００５６】
記述5:プロトロンビン活性剤活性。
【００５７】
Lopap 活性プロトロンビンの能力は、発色基質S-2238を使用して、プロトロンビンによって産生するトロンビン形成アッセイによって間接的に決定された。部分的精製された画分および精製されたLopap(15〜300nM)の剛毛抽出物のプロトロンビン活性化は、最終容量の500μlに対して5mMのCaCl2を使用して評価された。50mMトリス塩酸、100mMのNaCl、pH 8.3、イミダゾール150mMを含む反応で発生した。90nMのII因子または90nMの精製トロンビンを使用したLopapによるプロトロンビン活性化によって形成されたトロンビンによる40μMのS-2238の加水分解は、10分間37℃ の405nmでの分光光度法で評価された。
【００５８】
記述6:X因子を活性化活性。
【００５９】
200mMのNaClおよび10mMのCaCl2を含むpH 8.3の25mMトリス塩酸緩衝液の120μl で、X因子(30nM)を20分間37℃でLopap 75nMを使用してプレインキュベートした。その後、150mMイミダゾールと100mM NaClを含むpH 8.3の50mMトリス塩酸緩衝液の150μlおよび10mM Hepes、500mM NaClそして0.1%のPEG 6000を含むpH 8.0の10mMトリス塩酸緩衝液の165μlとを加えて最終容量として500μlとした。Xa因子の形成は、150μMの基質S-2765を添加後、10分間37℃で405nmの吸光度によって評価された。30nMの精製Xa因子による150 μMの基質S-2765の加水分解は、上記実験条件を用いて確認された。
【００６０】
記述7:精製されたフィブリノゲンに関するLOPAP活性。
【００６１】
Lopap(2μM)を、II因子(90nM)の有無で、5mM CaCl2および100mM NaClを含むトリス塩酸緩衝液(50mM)で、最終ボリュームを300μlとする37℃で10 分間インキュベートした。その後、精製したヒトフィブリノゲン(7.5pM)(Chromogenix)を添加し、そしてプロトロンビンのトロンビンへの変換を凝固時間によって評価された。
【００６２】
記述8:蛍光発生基質による酵素活性に関する実験および切断部位の決定。
【００６３】
実験は、320nm(活性化)および420nm(発光)の波長で日立F-2000の分光蛍光計で蛍光消失基質Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnpを使用して行なった。10μlの基質ストレージ溶液(DMF: H2O, 1:1 v/v で準備された)を加える前に、酵素(73.3pM)を50mMトリス塩酸緩衝液をpH 8.0、37℃の5mlを用いて熱安定した滅菌レシピエントでインキュベートした。速度定数KmおよびKcatは、10分間の連続的速度の測定のデータから決定されました。速度定数は、それぞれの標準誤差で、Wilkinsonによって記述された方法を使用して、Michaelis-Mentenの式によって得られた。切断部位の決定のために、ペプチド性断片をC18カラムを使用し逆相HPLCクロマトグラフィーによって分離させた。溶出溶媒は、0.1%のTFA水溶液(溶媒A)とアセトニトリル：溶媒A比(9:1)の溶媒B。分離に使用された勾配は、1ml/minフローで溶媒Bの10-100%とした。切断部位は、標準としての合成ペプチドの内部断片を用いて決定された。
【００６４】
記述9:LOPAP阻害。
【００６５】
Lopap酵素のアスペクトを確認する実験は、阻害剤を使用して発色基質で行った。阻害剤: Lopap(75nM)を最終容積500μl でインキュベートしたPMSF(10mM)あるいはE-64(3.2mM)。阻害剤は、基質S-2238(40μM)を加える前に、37℃ 15分間Lopapでプレインキュベートした。
【００６６】
記述10:LOPAP活性に関する二価イオンの影響。
【００６７】
Lopapを、4℃で48時間100mM EDTAに対して徹底的に透析した。Lopap(75 nM)は、透析または未透析としても、37℃で10分間、CaCl2 (5mM), MgCl2 (5mM)又はZnCl2(5mM)の有無でインキュベートさせた。そして、II因子(90mM)を加え、40μMの発色基質S-2238、100mM のNaClを含むpH 8.3の50mMトリス塩酸緩衝液を加えて500μlの最終容量とする。基質の加水分解は、Beckman DU-7装置で405nmの分光光度法で20分間測定された。
【００６８】
記述11:NPGBによるLOPAPセリンプロテアーゼ活性の測定。
【００６９】
Lopap活性部位の測定実験は、以前に記述されたプロトコルに従って、NPGB試薬を使用して行なわれた。活性Lopapの濃度は、0.1Mのバルビタールナトリウムバッファー(Sodium barbital buffer)pH8.3で 37℃で最終容量を1.0mlで0.47μMの(NPGB)p-ニトロフェニル(nitrophenyl)-p'-グアニジン安息香酸(guanidinebenzoate)を用いて測定して決定した。得られたp-ニトロフェノールは、Hitachi U-2000分光光度計で410nmを使用し吸光度で定量した。
【００７０】
記述12:LOPAPによって誘発されたプロトロンビン断片の決定。
【００７１】
Lopap(30nM)は、CaCl2(5mM)およびNaCl(100mM)を含むpH8.0の50mMトリス塩酸緩衝液500μlで37℃、0、1、3、6、8及び24時間、プロトロンビン(500nM)でインキュベートさせた。得られた加水分解断片は、還元性および非還元性条件の下でSDS-PAGE(10%のゲル)によって分析され、そしてクーマシーブリリアントブルーR-250の方法で染色された。
【００７２】
記述13:プロトロンビン活性剤(LOPAP)の精製。
【００７３】
Lopap精製方法は、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび2つの逆相クロマトグラフィーを含んだ。ゲルろ過クロマトグラフィーによって得られたタンパク質プロフィールを図1Aに示す。PIIピークのみ（逆相クロマトグラフィーにかけた）プロトロンビン活性化能力を示した。図1Bに表わされたピークとなる。プロトロンビン活性化活性は、43%のアセトニトリル(図1B)を使用した溶出ピークで検知された。この活性画分を、2番目の逆相クロマトグラフィーにかけて2つのピークとなった。しかしながら、それらのうちの1つだけが、プロトロンビン活性化能(図1C)を示した。単1ピーク(図1D)の存在を確認するために、同じ条件を使用して、活性画分を別の逆相クロマトグラフィーにかけた。この精製はタンパク質となり、表１で分かるように約50%の活性を維持している。タンパク質調整の均一性は図1Dで表わされている。精製された物質は、SDS-PAGE分析による約69KDaの単一バンドタンパク質を示した。
【００７４】
【表１】
2005517426.tif 000001
【００７５】
表１は、Lopap(300nM)活性のアセトニトリルの影響を、アセトニトリルの異なる濃度を用いて測定、その活性を発色基質S-2238を使用して、プロトロンビンからのトロンビン生成実験によって間接的に決定した結果を示す。
【００７６】
記述14:LOPAPのN末端配列および内部ペプチド配列の決定。
【００７７】
46残基(DVVIDGACPDMKAVSKFDMNAYQGTWYEIKKFPVANEANGDCGSVE)のアミノ酸をもつN末端部分は、精製Lopapから得られた。同様にいくつかの内部ペプチド断片配列も得られた：断片I:KSHVYTVPFGA断片II:KSNQHRVNIWILSRTK断片III:VRAGHVE及び断片IV:FDQSKFVETDFSEKACFF。得られた配列は、69 kDaの分子量でとなり全タンパク質の約15%に相当した。
【００７８】
記述15:LOPAPによるプロトロンビン活性化活性。
【００７９】
プロトロンビンのLopap作用で産生されたトロンビンは、服用量依存の方法(図2)となった。プロトロンビン(90nM)を75nMのLopapでインキュベートした。それは
90nMの精製トロンビンを使用して誘発した加水分解と同様にS-2238基質(40 mM)を加水分解し得る同量のトロンビンを産生する。トロンビン活性は1分間のプレインキュベーションから検知された。
【００８０】
記述16:活性化因子XのLOPAP能力。
【００８１】
Lopapは、X因子を活性化する能力を示さなかった。さらにはS-2765発色基質を加水分解することが出来なかった。75 nMのLopapを150μMのS-2765基質で37℃で10分間インキュベートして得た加水分解は、0.34μMであった。反応中に形成されたp-ニトロアニリル(nitroaniline)の濃度は、405nmで8900M-1cm-1の吸光係数の比色定量測定を使用して計算された。X因子(30nM)が実験に加えられた時、得られた基質加水分解は2.6pMであった。Lopapが使用されなかった時、精製されたXa因子(30nM)の吸光度は34μM であった。
【００８２】
記述17:LOPAPによるフィブリノゲン凝固。
Lopapは、長時間のインキュベーション（表２）にも精製されたフィブリノゲン上でトロンビンのような活性を示さなかった。しかしながら、プロトロンビンが存在する場合、固体の血餅が240 秒後に形成される。Ca2+の添加は凝固時間を60秒に縮小した。
【００８３】
【表２】
2005517426.tif 000002
【００８４】
表２は、Lopap(2μM)を、5mMのCaCl2 および100mMのNaCl含む50mMトリス塩酸緩衝液で、300μlを最終容量で、II因子(90nM)を使用または未使用で37℃で10分間インキュベートさせ、精製ヒトフィブリノゲン(7.5μM)を加え、そしてトロンビンへのプロトロンビンの変換を、繊維素FG=フィブリノゲンの凝固時間によって評価したLopapによるフィブリノゲン凝固を示す。
【００８５】
記述18:蛍光発生ペプチドのLOPAP加水分解活性。
【００８６】
プロトロンビン配列に基づいて、消失蛍光発生基質Abz-QTFFNPRTFGSQ-EDDnpを使用し、Lopapに測定した速度論パラメーターは、Kmapp 4.5μM、 Kcat5.32 sec-1、Kcat/Kmapp 1.2x106 M-1sec-1となった。これは、調査した酵素に対し良好な相関および高い触媒効率を示している。これらパラメーターは、Chagas et alによって記述されたものに従って得られた。Lopapは、二つのサイトPhe-Phe(10%)およびArg-Thr(90%)(図3)で加水分解されたAbz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp基質(プロトロンビン分子から推定された)上で活性を示した。
【００８７】
記述19:二価イオンがある状態でのLOPAP活性。
【００８８】
Lopap活性は、EDTAに対する透析後に著しく減少し、Ca2+添加で実質的に回復する(図4)。それに加えて、Lopap活性は、10mMのPMSFによって完全に失活したが、一方3.2mMのE-64はそれに影響しなかった。NPGBによるLopapの推定上のセリン滴定は、NPGBの分子によって1.2のセリン残基のステキオメトリ(stechiometry)を示した。
【００８９】
カルシウム欠如でのそれらの活性に拘わらず、 Ca2+イオン添加後に、Lopapは増強プロトロンビン活性剤活性を示すことが図4で見られる。EDTAに対する徹底的な透析後、Lopap活性は約75%減少する、またCa2+イオン濃度を上げた添加で徐々に回復される。他の二価イオンは、Mg2+およびZn2+のような、同じ結果を生じなかった。
【００９０】
記述20:LOPAPによって誘発されたプロトロンビン断片の決定。
【００９１】
非還元条件において、Lopapによるプロトロンビン加水分解(72kDa)は、いくつかの断片となった（分子量52kDa、36kDa、27kDaそして16kDaでそれぞれペプチドF1/F2、プレトロンビン(prethrombin) 2又は(-トロンビン、断片-1(F1)および断片-2(F2)を表す）。還元条件においては、プロトロンビン活性化は、分子量52kDa、36kDa、32 kDa、27kDaおよび16kDaの断片になり、それぞれF1/F2活性化ペプチド、プレトロンビン(prethrombin) 2、トロンビンB鎖、断片-1(F1)および断片-2(F2)を(図5)表す。
【００９２】
記述21:画分IIのプロトロンビン活性化活性の測定。
【００９３】
15〜300nMの精製画分を37℃、10分間、90pMのプロトロンビンでプレインキュベートし、50mMのトリス塩酸、100mMのNaCl、pH 8で同様に150mMのイミダゾールを使用して5mMのCaCl2 の添加で最終容量を500μLとする。40μMの発色基質S-2238 (H-D-phenylalanyl-L-pipeaklyl-L-arginine-p-nitroanilide dihydrochloride)をインキュベーション混合物へ添加し、加水分解を405nmでの分光光度計で10分間測定する。
【００９４】
記述22:正常ヒト血奬のLOPAP活性。
【００９５】
Lopapのプロコアギュラント(procoagulant)活性の検査に、剛毛の粗製抽出物(10〜30μg)または1〜16μgの精製酵素(Lopap)を、100μl正常ヒト血奬で37℃でインキュベートした。プロコアギュラント(procoagulant)活性は、凝固時に6.25mMのCaCl2 添加後、最終容量を400μlとして測定された。Lopapがある状態の血漿の新しいカルシウム沈着時間を、Lopap又は粗製抽出物(コントロール)が無い状態での血漿凝固時間と比較した。
【００９６】
記述23:微小循環系でのLOPAPの効果。
【００９７】
生体内顕微鏡観察:微小循環系でのLopapの効果は、麻酔をかけた(250gの腹腔内ナトリウムペントバルビタール(sodium pentobarbital)、50mg/kg)ラットの内精筋膜でin situ に測定された。この手続きに使用された外科技術は記述されている。
【００９８】
簡潔には、動物をサーモスタットで37℃にコントロールされた特別のボード上に維持する。それは透明なプラットフォームを含み、その上に強い光線を透すように組織を置く。試料は、Ringer-Lockeウォームアップ溶液（154mM NaCl、 5.6mM KCl、 2mM CaCl2、6mM NaHCO3、及び6mM グルコースpH 7.2〜7.4 、1%のゼラチンを含む）使用して、組織の潅注を通じて湿度および暖かさを維持した。3色顕微鏡(Axioskope, Carl Zeiss)に取付けたカラービデオカメラによって、微小循環系画像をテレビモニターおよびコンピューター画像によって同時に視覚化させた。テレビモニター画像はビデオに記録されました。また、コンピューター画像はソフトウェア技術(KS300、Kontron)を使用して評価された。画像は、x10/025の縦距離対物レンズ/開口数およびx1.6 otpovarを使用して得られた。Lopap(100μg/kg)をi.v注入(尾部の静脈)そして血管微小循環系動態をモニターを通して観察した。対照動物には、等価な量の無菌食塩水を与えた。注入および微小循環系の観察の1時間後に、腹部大動脈から血液を(500μg)集め、血液凝固時間を測定した。
【００９９】
記述24:in vivioの研究。
【０１００】
Lopap(100μg/kg)を、重さ200〜250gのオスのWistarラットの尾部静脈に注入した。対照ラットに、同じ条件下で150mM のNaClを投与した。分析の1時間後、それらの血液は使い捨て注射器を使用して腹部大動脈から集められた。細胞カウントの血液は、2.7mMのNa2-EDTAで収集し、そして血小板凝集の研究には139mMのクエン酸3ナトリウム(全血の9パーツの1パーツ)で収集した。低濃度血小板血漿は4℃、15分1900gの遠心分離でクエン酸塩血液から得られた。全血の血小板凝集は、Sano-Martins IS, Santoro ML, Castro SCB, Fan HW, Cardoso JLC, theakson RDG. Platelet aggregation in patient's blood bitten by the Brazilian snake Bothrops jararaca. Thromb. Res. 1997; 87 (2): 183-95.に記述に基づいて実行された。コラーゲン(最終濃度5μg/ml)(Hormon-Chemie Germany)が、血小板凝集を誘発する作用物質として使用された。血液細胞カウントについては、Serono-Baker 9020+AXシステムが使用され、そしてフィブリノゲンは、Diagnostica Stagoからの試薬とコントロール物質を使用してvon Clauss(gerinnungsphysiologische schnellmethode zur  bestimmung des fibrinogens. Acta Haemato1 1957, 17: 237-46)に従って測定された。
【０１０１】
記述25:組織病理学。
【０１０２】
in vivoの研究に同じ動物が、組織病理学の分析に使用された。脳、肺、肝臓および腎臓断片を、10%のホルマリン溶液に48時間さらした。その後、それらをパラフィンにつけ、ルーチンの組織学的分析のために準備、そしてエオシンで染色後測定された。
【０１０３】
記述26:統計分析。
【０１０４】
Lopap注入ラットおよび対照ラットの血液での血小板カウントおよび全血血小板凝集を比較するために、統計ソフトウェアStataTM5.0をスチューデントT-testに適用した。
結果:
a) 血漿のLopap活性:
剛毛粗製抽出物を、クエン酸正常ヒト血漿を使用してインキュベートさせた。得られた凝固時間は290-80秒(表１)で、一方、Lopap (1-16μg)クエン酸正常ヒト血漿凝集は同様の時間(表１)を要することを示した。
b) Lopapを使用した生物学的検査。
【０１０５】
1.生存中の顕微鏡使用研究:
タンパク質の静脈内投与は、挙睾筋の微小循環系に顕著な変化を引き起こした。血栓形成は、注入の5分後、小さな血管(直径 10-30μm)、主として小静脈の中で観察されました。全体の小静脈のうっ血を伴う全身の毒物注入および小動脈の血管での血栓が、明白に視覚化された時(図6)、この効果は40分後により明白となった。出血性の領域は、Lopapの投与後30分で視覚化された。注入の1時間後に、Lopapで処置された動物から収集した血液は、凝固していなかった。食塩水処置された対照動物は微小循環の変化を示さなかった。
【０１０６】
2.凝固バラメータ "in vivo"
Lopap注入されたラットは、対照ラットと比較すると血小板係数は一様に約40%減少した。コラーゲン誘起血小板凝集は、毒物注入ラットでは止まった。赤血球および白血球細胞の形態的または定量的な変化は観察されなかった。フィブリノゲンはこれらの動物の血漿には検知されなかった。
【０１０７】
3. 組織病理学:
Lopap注入の1時間後に、顕著な白血球浸潤が実験動物の肺の中に観察された。(図7BおよびC)。好中球と単球は、小さな血管の内皮細胞に付着した。これらの細胞も器官の柔組織スペース(図7C)で検知された。顕著なうっ血が、糸球体血管および近位尿細管と遠位尿細管の間の血管で（図8b)で観察された。出血は、糸球体血管の中だけではなく臓器の他の血管でも観察された。髄質エリアに関しては、細管細胞は、無色透明の壊死の病巣域を示した。他の器官が分析された時、組織学的な変化は見出されなかった。
【０１０８】
ロノミア・オブリキア・キャタピラ(Lonomia obliqua caterpillar)との偶然の接触は、血液の非凝固およびトロンビンと関係する凝固因子に変化を引き起こし、出血性症候群に到る。X因子のようなプロ凝固(Pro-coagulating)タンパク質および動物毒のプロトロンビン活性剤が、フィブリノゲン欠乏によって消費性凝固障害の原因となる。プロトロンビンを活性化する最も重要な方法は、プロトロンビナーゼ複合体によるものであるが、プロトロンビンは、蛇毒成分の様な外因性因子のよる別の方法でも活性化される。
【０１０９】
他のプロトロンビン活性剤によって生成された断片とLopap(表３)によって産生されたプロトロンビン加水分解生成物を比較した後に、作用のメカニズムには、プレトロンビン(prethrombin) 2及びトロンビンの形成を含むことが示唆される。
【０１１０】
【表３】
2005517426.tif 000003
【０１１１】
表３は、加水分解の後に得られたプロトロンビン断片と異なる活性剤との比較表(SDS-PAGE分析、A:還元条件;  B:非還元条件)を示す。
【０１１２】
明らかに、メイゾトロンビン(meizothrombin)がLopapにより形成されず、また、プレトロンビン(prethrombin)2に似ている分子量を持つ生成物が生成されるので、Lopapはタイプ4活性剤として分類され得る。しかしながら、Lopapが活性トロンビンを生成することができる一方、タイプ4の活性剤は、プロトロンビンを活性酵素生成物に変換することができない。他方、形成された断片の分子量は、プロトロンビナーゼ複合体が在る時、Xa因子によって形成されたものに似ている。それに加えて、蛍光消失基質の加水分解から得られた結果は、主鎖の切断が、トロンビン(Arg-Thr)で結合する同じ切断に生じることを示した。
【０１１３】
自己触媒作用は、プロトロンビンを含む加水分解実験、およびプロトロンビンへの真のLopap活性化メカニズムを実行するときに検知される主要な問題の1つである。組換えプロトロンビンが使用され、さらに質量分析解析および断片のアミノ酸配列が実行される場合のみ解明確認される。
【０１１４】
本発明の著者は、エル・オブリキア(L. obliqua)の剛毛から、69kDaのプロトロンビン活性剤セリンプロテアーゼを精製した。予備結果は、Lopap活性化能がプロトロンビナーゼ複合体に依存しない、しかしながら、Ca2+イオンは、この活性の増加を誘発することを示した。Lopap精製プロセスは、有機溶媒の使用を含んでおり、30%のアセトニトリルを使用する場合約50%そして50%のアセトニトリルを使用する場合約80%に到るような目に見える活性ロスを引き起こす(表３)。したがって、タンパク質特異的活性を計算することは全く困難である。それほど根本的でない精製方法は効率的でなく、現在、組み換えLopapの生成が実行されている。
【０１１５】
Lopapは、Ca2+イオンを通して活性化されるセリンプロテアーゼとして特徴づけられそして構造的には文献で記載されている他のプロトロンビン活性剤とは異なる。N末端セグメントは、Manduca Sexta血液リンパの精製昆虫シアニン(insecticyanin)のN末端部分と比較した時、45.6%の同一性を示した。断片I、II、IIIおよびIVは、同じ蛋白質(G86 - Q97; D124 - E148; I160-Y177)の内部断片配列と夫々36.4%、37.5%、42.9%および55.5%同一性を示した。
【０１１６】
精製Lopapの均一性は、ただ1つのN末端残基によって確認された。消失蛍光基質は、配列Tyr277-Ser288を側面にもつトロンビン境界Arg284-Thr285を含むようにプログラムされた。Lopapは、トロンビンによって切断されるプロトロンビンに対応するペプチド境界でこの基質を切断する。
【０１１７】
本発明で実証されたことは、LopapがX因子を活性化することが出来ない、そしてLopapと異なりX因子の活性剤は、エル・オブリキア剛毛(L. obliqua bristles)の粗製抽出物からの精製(予備結果)を必要とする。そのような毒(図８)には少なくとも2つのプロコアギュラント(procoagulant)がある。
【０１１８】
本発明によれば、Lopapは新しいプロトロンビン活性剤で、エル・オブリキア・キャタピラ(L.obliqua caterpillar)の毒にさらされた患者に見出される消費性凝固障害の原因である非常に重要な因子である。
【０１１９】
低用量での精製タンパク質は、プロトロンビン産生トロンビンを活性化する能力により、コントロールした条件下で、循環からフィブリノゲンを引き出し、そして繊維素微小凝塊に変換する。血漿のフィブリノゲン濃度の減少は、血液凝固時間が更に長くなり、激しい血管の血栓症の回避を可能とする。
【０１２０】
Lopapはフィブリノゲン的な活性を示さないため、プロセスで消費されないフィブリノゲンの凝固能は維持される。このように、フィブリノゲン血漿濃度が減少するが、患者は、出血状態に対して疾病素質を持たない。それに加えて、ディスプロトロンビネミアスdysprothrombinemias(Kini  RM, Rao VS, Joseph JS. Haemostasis; 2001. p 218-24)の血漿プロトロンビンの測定分析キットに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ロノミア・オブリキア・キャタピラ(LONOMIA OBLIQUA CATERPILLAR)の剛毛抽出物で見出されたプロトロンビン活性剤LOPAPの精製を示す図。A)は、セファデックス(Sephadex) G-75中のゲルろ過クロマトグラフィープロトロンビン活性化能力を、発色基質S-2238の使用で検知したもの、B)は、溶媒Bの35-50%の線形勾配での溶出後のゲルろ過ステージの画分PIIの逆相クロマトグラフィー(HPLCシステム、C4カラム)によるもの、C)は、前述の第2の逆相クロマトグラフィー、ただし溶媒Bの勾配は20-80%によるもの、D)は前述のピークPII-4R2の逆相クロマトグラフィーを示す。ライン1は、精製タンパク質20μgのSDS-PAGE及びライン2は、分子量標準:ホスホリパーゼB、94kDa;アルブミン、67kDa、オバルブミン、43kDa;carbonic anidrase、30kDa; トリプシン阻害因子、21kDa; (-ラクトアルブミン、14.4kDaを示す。
【図２】Lopap(15-300nM)を、90nMプロトロンビンで37℃で10分間プレインキュベートを行い、発色基質S-2238(40μM)を用いて37℃でインキュベートし5mMのCaCl2にさらし最終容積を500μLとした実験データを示す図。○ 15nM;黒三角 30nM;..上付きA 75nM; 黒四角 150nM; □ 300nM
【図３】LOPAPによる蛍光発生基質の加水分解の実験データを示す図。ここでA)は Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnpをpH 8.0、50mMトリス塩酸緩衝液で37℃ で3時間、Lopapでインキュベートさせ、その混合物を記載したHPLCのクロマトグラフィーによって分析したもの、そしてB)は73.3pMのLopapで加水分解された0.8〜8.0μMの蛍光発生基質で得られたMichaelis-Mentenプロフィールを示す図。
【図４】LOPAPのプロトロンビン活性化能力の二価のイオンの影響の実験データを示す図。ここでは下記の、Lopap(75nM)を、透析または未透析で、40μMの発色基質S-2238およびプロトロンビン90nMで37℃でインキュベート;コントロール:プロトロンビン無し;□ 5mM CaCl2を使用した非透析Lopapとの反応;黒四角 Ca2+を使用しない非透析Lopapとの反応;黒三角100mM EDTAに対して透析されたLopap;..上付きA 5mM CaCl2を使用した透析Lopapとの反応;* 5mM MgCl2を使用した透析Lopapとの反応;○ 5mM ZnCl2を使用した透析Lopapとの反応。
【図５】LOPAPによるプロトロンビン加水分解のSDS-PAGEプロフィールを示す図:ここではLopapによるプロトロンビン加水分解のプロフィールで、ヒトプロトロンビン(500nM)は0.1.3.6.8および24時間Lopap(30nM)でインキュベートさせ、還元条件の後にSDS-PAGE(10%のポリアクリルアミドゲル)が分析結果が示されている。