(57)【要約】  腎臓の尿細管病変の予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法を提供すること。ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核球、または単球もしくはマクロファージの性質を有する培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
ヒト末梢血単核球、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法。
【請求項３】
被検化合物が示す調節作用の検定を、マクロファージ活性化物質により活性化されたヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を被検化合物の存在下に培養するか、あるいはヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をマクロファージ活性化物質および被検化合物の存在下に培養し、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現するｒＢＡＴの量を、被検化合物の非存在下に培養したときに発現するｒＢＡＴの量と比較することにより行う請求の範囲第２項記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ヒト末梢血単核球の培養をヒトＡＢ型血清の存在下に、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株の培養をウシ胎児血清の存在下に行う請求の範囲第３項記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
ヒト末梢血単核球、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株上に発現するｒＢＡＴの量を、ＦＡＣＳｃａｎ解析により算出することを特徴とする請求の範囲第３項または第４項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ヒト末梢血単核球に対するマクロファージ活性化物質がマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球であり、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株に対するマクロファージ活性化物質がヒトリコンビナントＴＮＦである請求の範囲第２項〜第５項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株が、ヒトリンパ腫培養細胞株Ｕ９３７である請求の範囲第２項〜第６項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
（１）（ａ）ヒト末梢血単核球とマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球との混合培養物を、被検化合物の存在下に培養するか、または（ｂ）ヒト末梢血単核球を、マイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球および被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液からヒト末梢血単核球を回収し、（３）回収したヒト末梢血単核球に抗ｒＢＡＴ抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析によりｒＢＡＴ量を算出し、（５）該ｒＢＡＴ量を被検化合物の非存在下のときのｒＢＡＴ量と比較してｒＢＡＴ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法。
【請求項９】
被検化合物存在下の培養をヒトＡＢ血清中で行う請求の範囲第８項記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
（１）（ａ）ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をヒトリコンビナントＴＮＦおよび被検化合物の存在下に培養するか、または（ｂ）ヒトリコンビナントＴＮＦで処理したヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液から該ヒト培養細胞樹立株を回収し、（３）回収した該ヒト培養細胞樹立株に抗ｒＢＡＴ抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析によりｒＢＡＴ量を算出し、（５）該ｒＢＡＴ量を被検化合物の非存在下のときのｒＢＡＴ量と比較してｒＢＡＴ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被検化合物存在下の培養をウシ胎児血清中で行う請求の範囲第１０項記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ヒト末梢血単核球、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して調節作用を有する化合物と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを組み合わせてなる腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する医薬組成物。
【請求項１３】
化合物が請求の範囲第２項〜第１１項のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択される化合物である請求の範囲第１１項記載の医薬組成物。
【請求項１４】
化合物が、１−クロロ−３−オキソ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−カルボン酸ベンジルエステルである請求の範囲第１２項または第１３項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、配合剤であることを特徴とする請求の範囲第１２項〜第１４項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して調節作用を有する化合物を含有してなる薬剤と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求の範囲第２項〜第１１項のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを腎臓の尿細管病変の予防、緩和または治療を必要とする患者に投与することを特徴とする腎臓の尿細管病変の予防、緩和または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎尿細管障害治療剤のスクリーニング方法に関し、さらに詳しくは、末梢血単核球または単球もしくはマクロファージの性質を有する培養細胞樹立株を被検化合物の存在下に培養し、該細胞上に発現するｒＢＡＴ（related  to  b０，＋−type  amino  acid  transporter；輸送系b0,+関連因子）を検定することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器や組織障害後の修復・再生について、神経組織、皮膚創傷、腎尿細管障害などにかかわる宿主固有の自己免疫性細胞の応答が存在することが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。そして再生促進型ＣＤ１１ｂ−ＣＤ２＋マクロファージと調節型ＣＤ２−ＣＤ４＋Ｔリンパ球を誘導促進する化合物が、選択的に腎尿細管障害を修復することが知られており（特許文献１）、またエフェクターマクロファージの誘導を抑制する化合物が腎臓の尿細管病変の改善効果があることも知られている（特許文献２）。【０００３】
臓器障害後の組織修復には、ＤＮＡレベルの修復、細胞レベルの修復、そして器官構造レベルの修復が必要であり、細胞レベルにおいては、臓器に存在する前駆細胞の増殖分化を含む、細胞増殖、蛋白合成が要求され、構造の再構築修復には、損傷した組織が選択的に修復されることが示唆されている（非特許文献３）。【０００４】
損傷した組織細胞に選択的に蛋白合成を促し修復や再生へと導くためには、修復再生の作用を有する細胞が選択的に病変の組織細胞に接着・融合する分子を持つと同時に、蛋白合成を促す分子も発現していることが合目的である。【０００５】
ｒＢＡＴ（related  to  b０，＋−type  amino  acid  transporter）は、アミノ酸トランスポーターのヘテロメリックアミノ酸トランスポーター（heteromeric  amino  acid  transporter：ＨＡＴ）の重鎖（Ｈ鎖）を構成し（非特許文献４、非特許文献５）、アミノ酸トランスポーターの軽鎖（Ｌ鎖）であるＢＡＴ１（b０，＋−type  amino  acid  transporter  １）とヘテロダイマーを形成する補助活性化因子であり、シスチンと塩基性アミノ酸の輸送にかかわる調節因子である。ｒＢＡＴは近位尿細管上皮の先端領域（apical  region）に局在しアミノ酸トランスポーターとして機能する。また、ｒＢＡＴはヒトシスチン尿症の疾患原因因子としても知られている（非特許文献４）。【０００６】
しかしながら、ｒＢＡＴがヒトマクロファージ上に発現すること、およびｒＢＡＴの発現を調節することによりヘテロメリックアミノ酸トランスポーターを発現した修復再生にかかわる細胞を惹起する化合物が存在することは知られていないし、試験管内にて上記の機能をもつ化合物を同定するためのスクリーニング方法も存在しない。【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２４１８５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／７２７３０号パンフレット
【非特許文献１】Renal  Failure(1996)；18：355-375
【非特許文献２】Immunology  Today  (2000)；21：265-269
【非特許文献３】J  Nephrology  (2003)；Vol.16，No.2：186-195
【非特許文献４】Current  Drug  Metabolism(2001)；Vol.2，No.4：339-354
【非特許文献５】Physiology(2005)；20：112-124
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、腎尿細管障害治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、選択的に尿細管病変を軽減し修復する作用を有する公知化合物（特許文献１、２）で治療された動物の尿細管病変に、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのひとつであるＢＡＴ１（b０，＋−type amino acid transporter 1）を発現する単核球細胞が尿細管病変部位に対照動物と比べて優位に局在し、それら動物の尿細管病変は有意に軽減されている知見を得た。【００１０】
さらに本発明者は、ヒト末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell；ＰＢＭＣ）をマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球で刺激培養する際、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株（以下、単にヒト培養細胞株ということもある。）をヒトリコンビナントＴＮＦ（以下、ｒｈＴＮＦともいう。）で刺激培養する際、それぞれ同時に前記公知化合物を添加して培養したところ、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのＨ鎖であるｒＢＡＴの発現を選択的に調整する作用をもつ知見を得た。【００１１】
すなわち、単核球細胞がＢＡＴ１を発現することは、活性化されたｒＢＡＴが腎尿細管病変時の障害細胞に親和性をもって接着融合し、ｒＢＡＴ/ＢＡＴ１複合体が障害を受けた器官組織細胞で必要とされるアミノ酸を広く供給し、細胞障害修復のために蛋白合成を促すことを意味する。【００１２】
そして、前記公知化合物が、ＢＡＴ１を発現する単核球細胞を尿細管病変部位に選択的に誘導すること、さらに、該公知化合物が、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球で刺激培養する際、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をｒｈＴＮＦで刺激培養する際、ｒＢＡＴの発現を選択的に調整する作用をもつことから、選択的に尿細管病変を軽減し修復する作用を有する化合物を容易に探索同定するスクリーニング方法を提供することができる知見を得た。【００１３】
本発明者は、上記の知見に基づいてさらに検討を重ねて、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、
［１］末梢血単核球、または単球もしくはマクロファージの性質を有する培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法、
［２］ヒト末梢血単核球、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法、
［３］被検化合物が示す調節作用の検定を、マクロファージ活性化物質により活性化されたヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を被検化合物の存在下に培養するか、あるいはヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をマクロファージ活性化物質および被検化合物の存在下に培養し、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現するｒＢＡＴの量を、被検化合物の非存在下に培養したときに発現するｒＢＡＴの量と比較することにより行う前記［２］記載のスクリーニング方法、
［４］ヒト末梢血単核球の培養をヒトＡＢ型血清の存在下に、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株の培養をウシ胎児血清の存在下に行う前記［３］記載のスクリーニング方法、
［５］ヒト末梢血単核球、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株上に発現するｒＢＡＴの量を、ＦＡＣＳｃａｎ解析により算出することを特徴とする前記［３］または［４］記載のスクリーニング方法、
［６］ヒト末梢血単核球に対するマクロファージ活性化物質がマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球であり、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株に対するマクロファージ活性化物質がヒトリコンビナントＴＮＦである前記［２］〜［５］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［７］ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株が、ヒトリンパ腫培養細胞株Ｕ９３７である前記［２］〜［６］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［８］（１）（ａ）ヒト末梢血単核球とマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球との混合培養物を、被検化合物の存在下に培養するか、または（ｂ）ヒト末梢血単核球を、マイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球および被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液からヒト末梢血単核球を回収し、（３）回収したヒト末梢血単核球に抗ｒＢＡＴ抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析によりｒＢＡＴ量を算出し、（５）該ｒＢＡＴ量を被検化合物の非存在下のときのｒＢＡＴ量と比較してｒＢＡＴ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法、
［９］被検化合物存在下の培養をヒトＡＢ血清中で行う前記［８］記載のスクリーニング方法、
［１０］（１）（ａ）ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をヒトリコンビナントＴＮＦおよび被検化合物の存在下に培養するか、または（ｂ）ヒトリコンビナントＴＮＦで処理したヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液から該ヒト培養細胞樹立株を回収し、（３）回収した該ヒト培養細胞樹立株に抗ｒＢＡＴ抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析によりｒＢＡＴ量を算出し、（５）該ｒＢＡＴ量を被検化合物の非存在下のときのｒＢＡＴ量と比較してｒＢＡＴ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法、
［１１］被検化合物存在下の培養をウシ胎児血清中で行う前記［１０］記載のスクリーニング方法、
［１２］ヒト末梢血単核球、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して調節作用を有する化合物と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを組み合わせてなる腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する医薬組成物、
［１３］化合物が前記［２］〜［１１］のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択される化合物である前記［１１］記載の医薬組成物、
［１４］化合物が、１−クロロ−３−オキソ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−カルボン酸ベンジルエステルである前記［１２］または［１３］記載の医薬組成物、
［１５］腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、配合剤であることを特徴とする前記［１２］〜［１４］のいずれかに記載の医薬組成物、
［１６］腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して調節作用を有する化合物を含有してなる薬剤と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする前記［１２］記載の医薬組成物、および
［１７］前記［２］〜［１１］のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを腎臓の尿細管病変の予防、緩和または治療を必要とする患者に投与することを特徴とする腎臓の尿細管病変の予防、緩和または治療方法
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法によれば、腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療できる化合物を容易に探索、同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の腎臓の尿細管病変の予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または単球もしくはマクロファージの性質を有する培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする。【００１７】
被検化合物が示す調節作用の検定は、マクロファージ活性化物質により活性化された末梢血単核球または単球もしくはマクロファージの性質を有する培養細胞樹立株を被検化合物の存在下に培養し、該単核球上または該培養細胞樹立株上に発現するｒＢＡＴの量を、被検化合物の非存在下に培養したときに発現するｒＢＡＴの量とを比較することにより行う。【００１８】
本発明で用いる末梢単核球としては、ヒト末梢単核球が好適に挙げられ、このようなヒト末梢単核球は、ヒトの末梢血から自体公知の方法により得ることができる。ヒトの末梢血から単核球細胞を分離する方法としては、例えば、５．７％ｗ／ｖのフィコール４００と、９．０％ｗ／ｖのジアトリゾエイト  ナトリウム（Sodium  diatrizoate）の水溶液であって比重が１．０７７ｇ／ｍｌに調整されたフィコールパック（Ficoll−Paque、登録商標、Pharmacia  Fine  Chemicals社）とを用いた遠心分離方法を挙げることができる。該方法は、（ａ）予め決められた量のフィコールパックを試験管の底に設置する工程、（ｂ）希釈した、または希釈しない血液試料を注意深くフィコールパック上にピペットで移す工程、（ｃ）フィコールパックの比重よりも大きい比重を有する血液成分が、フィコールパック中に進む、またはフィコールパックを通過するように、（ｂ）で作製したフィコールパック血液調整物を約２００〜５００Ｇで約１０〜４０分間遠心分離する工程、および（ｄ）ピペットでフィコールパックの上方に分離された単核球細胞層を採取する工程からなる。【００１９】
本発明で用いる単球もしくはマクロファージの性質を有する培養樹立株としては、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養樹立株が好適に挙げられる。前記ヒト培養樹立株とはヒトの正常な単球もしくはマクロファージと同様のマクロファージ活性化物質による刺激応答を示すものをいう。このようなヒト培養樹立株としては、例えばヒトリンパ腫培養細胞株などが挙げられ、具体的にはヒトリンパ腫培養細胞株Ｕ９３７が挙げられる。このＵ９３７株は、（財）ヒューマンサイエンス振興財団、研究資源バンク（Health  Science  Research  Resources  Bank）、（泉南市、大阪）から購入し使用することができる。該Ｕ９３７は、ヒト由来瀰漫性組織球性リンパ腫の患者から樹立されたマクロファージ様の細胞活性を合わせもつ培養細胞株であり、多くの単球様の性格を有する非付着浮遊細胞である。【００２０】
本発明で用いるマクロファージ活性化物質としては、末梢単核球または前記培養細胞樹立株にｒＢＡＴを発現させる物質であれば特に限定されないが、ヒト末梢単核球または前記ヒト培養細胞樹立株にｒＢＡＴを発現させる物質が好ましい。例えば、ヒト末梢血単核球に対してはマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球、前記ヒト培養細胞樹立株に対してはヒトリコンビナントＴＮＦが好ましい。ヒトリコンビナントＴＮＦとしては、ヒトリコンビナントＴＮＦ−αでもよく、ヒトリコンビナントＴＮＦ−βでもよいが、ヒトリコンビナントＴＮＦ−βが好ましい。なお、マイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球は、ヒト同種末梢血単核球を用いてマイトマイシンＣ処理したものが好ましい。【００２１】
末梢血単核球または前記培養細胞樹立株のマクロファージ活性化物質による活性化を、ヒト末梢血単核球または前記ヒト培養細胞樹立株を用いた場合を例に挙げて以下に説明する。
ヒト末梢血単核球または前記ヒト培養細胞樹立株のマクロファージ活性化物質による活性化は、次のようにして行うことができる。
すなわち、ヒト末梢血単核球のマクロファージ活性化物質による活性化は、ヒト末梢血単核球（応答ＰＢＭＣ）と、該単核球と同種のヒト末梢血単核球をマイトマイシンＣで処理して得られる単核球（刺激ＰＢＭＣ）とを混合培養することにより行うことができる。
前記マイトマイシンＣ処理は、ヒト末梢血単核球に終濃度約３〜３００μＭ、好ましくは約１２０μＭとなるようにマイトマイシンＣを添加し、３７℃で通常２０〜４０分、好ましくは３０分程度処理することによって行うことができる。前記混合培養は、刺激ＰＢＭＣおよび応答ＰＢＭＣをヒトＡＢ型血清含有培地（例えばＲＰＭＩ培地）に浮遊させ、細胞を同一比率でマイクロプレート、例えばＦａｌｃｏｎ３０４６（Becton  Dickinson社）のウェル中に加え、５％ＣＯ２、３７℃の炭酸ガス培養器にて通常２〜１４日、好ましくは６〜７日間培養することによって好適に行うことができる。
また、ヒト末梢血単核球のマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球による活性化は、被検化合物の存在下に培養する際に、被検化合物に加えてマイトマイシンＣ処理ヒト末梢血単核球（刺激ＰＢＭＣ）を存在させて培養することにより行うことができる。【００２２】
一方、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株のヒトリコンビナントＴＮＦによる活性化は、前記ヒト培養細胞樹立株をヒトリコンビナントＴＮＦと接触させることにより行うか、または被検化合物の存在下に培養する際に、被検化合物に加えてヒトリコンビナントＴＮＦを存在させて培養することにより行うことができる。【００２３】
ヒトリコンビナントＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）、例えばｒｈＴＮＦ−βは、市販品（例えば、カタログ番号：ＰＨＰ０５２、Ｓｅｒｏｔｅｃ社）を使用することができる。前記ヒト培養細胞株をヒトリコンビナントＴＮＦと接触させる際、ｒｈＴＮＦを適当な溶媒（好ましくはＲＰＭＩ１６４０）に溶解して用いることができ、その時の濃度は、終濃度が通常約１〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌとなるようにするのがよい。希釈に用いる培養液はＲＰＭＩ１６４０で、１０％ウシ胎児血清を含むものあるいは血清未添加でもよい。【００２４】
活性化されたヒト末梢血単核球もしくはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株の被検化合物の存在下における培養、またはヒト末梢血単核球あるいはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株のマクロファージ活性化物質および被検化合物の存在下における培養は、適当な培地中、血清の存在下に、好適に実施できる。培地としては、ＲＰＭＩ培地（Goding，J．W．(1980)J．Immunol．Methods 39，285，JAMA 199(1957)519）が好適に使用できる。また、血清としては、ヒト末梢血単核球の場合はヒトＡＢ血清が好ましく、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株の場合はウシ胎児血清が好ましい。培養時間は、通常２〜１４日、好ましくは６〜１０日である。また、培養温度は約３７℃が好ましい。本培養は約５％ＣＯ２の条件下で実施するのが好ましい。【００２５】
培養後、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を回収する。回収した該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現したｒＢＡＴを抗ｒＢＡＴ抗体と反応させ、該抗体が結合したヒト末梢血単核球または該ヒト培養細胞樹立株をフローサイトメーター、例えばＦＡＣＳｃａｎ（Becton  Dickinson社）にて解析することにより、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現したｒＢＡＴの量を算出する。【００２６】
本発明に用いる抗ｒＢＡＴ抗体、例えば抗ヒトｒＢＡＴポリクローナル抗体は、ＢａｕｃｈとＶｅｒｒｙらの方法によって作成することができる（Am  J  Physiol  Renal  Physiol(2002)；283：181）。ヒトｒＢＡＴのアミノ基末端（ＭＡＥＤＫＳＫＲＤＳＩＥＭＳＭＫＧＣ（配列番号１））とマウスｂ０，＋ＡＴ（ＢＡＴ１）のカルボキシル基末端（ＣＨＬＱＭＬＥＶＶＰＥＫＤＰＥ（配列番号２））からなる合成ペプチドを担体であるＫＬＨ（keyhole−limpet  hemocyanin）にカップリングさせてウサギに免疫して抗血清を得る。免疫に用いたペプチドを抗原としたアフィニテイーカラムにて精製抗体を得る。得られたウサギ抗ヒトｒＢＡＴポリクローナル抗体の精製抗体を一次抗体として使用する場合、終濃度は約０．００１〜０．１ｍｇ／ｍｌで用いることができる。【００２７】
フローサイトメーターにて解析する場合、例えばＦＡＣＳｃａｎ解析をする場合を例に挙げて以下説明する。まず、細胞を固定化する。すなわち、前記の如く回収したヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞株に約４％ホルムアルデヒド溶液を添加し、約３７℃において約１０分静置して固定化する（Cytometry  Part  A(2003)；55A:61-70）。細胞固定には、例えば市販の細胞固定／細胞膜浸透化キット（商品名：BD  Cytofix/CytopermTM Kit、カタログNo.554714、BD Bioscience社)のBD  Cytofix/CytopermTM液を用いることができる。次に、抗体が細胞膜を通過できるよう膜透過処理を行う。すなわち、固定化処理後のヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞株に約０．１％サポニン溶液を添加し、約４℃において約３０分静置する。膜透過処理には、例えば市販の前記、０．１％サポニンを含有する細胞固定／細胞膜浸透化キットのBD  Perm/WashTM染色バッファーを用いることができる。ついで、免疫染色を行う。すなわち、膜透過処理後のヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞株の細胞に、一次抗体であるウサギ抗ヒトｒＢＡＴポリクローナル抗体を反応させる。ついで、二次抗体として蛍光標識抗体（例えば、ヤギＦＩＴＣ−抗ウサギ免疫グロブリン）を反応させる。前記蛍光標識抗体で染色されたヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞株を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって、ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞株に発現したｒＢＡＴの量を測定する。【００２８】
上記で測定されたｒＢＡＴ量を、被検化合物の非存在下のときのｒＢＡＴ量と比較することにより、ｒＢＡＴ量の増大または減少を検出し、これにより、ｒＢＡＴの発現に対する被検化合物の調節作用を検定することができる。ここで、腎尿細管病変において低下しているｒＢＡＴ量を増大させ、また腎尿細管病変において高まっているｒＢＡＴ量を減少させる化合物を同定・選択することにより、腎臓の尿細管病変の予防、緩和または治療できる化合物をスクリーニングすることができる。【００２９】
また本発明の別の態様は、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現に対して調節作用を有する化合物（以下、有効成分化合物ともいう。）と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを組み合わせてなる腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する医薬組成物である。前記有効成分化合物と、ヒトリコンビナントＴＮＦとを併用することにより、腎臓の尿細管病変を予防、緩和、または治療する効果を前記化合物単独使用に比べて増強させることができる。
前記有効成分化合物としては、前記スクリーニング方法により選択された腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物が挙げられる。このような化合物としては、国際公開第０１／７２７３０号パンフレットに記載されるような化合物、例えば、下記式（７）：
【化１】
2008133036.tif 000002
（式中、記号は国際公開第０１／７２７３０号パンフレットに記載されたものと同一意味を有する。）
で示される化合物が挙げられる。具体的には、１−クロロ−３−オキソ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−カルボン酸ベンジルエステルなどが挙げられる。また、前記有効成分化合物として下記式（４−２）、（９−１）で示される化合物も挙げられる。
【化２】
2008133036.tif 000003
【００３０】
ヒトリコンビナントＴＮＦとしては、ヒトリコンビナントＴＮＦ−αでもよく、ヒトリコンビナントＴＮＦ−βでもよいが、ヒトリコンビナントＴＮＦ−βが好ましい。
本発明の医薬組成物は、前記有効成分化合物とヒトリコンビナントＴＮＦとを合剤としてもよく、各成分をそれぞれ含む薬剤からなるキットであってもよい。キットである場合、有効成分化合物を含む薬剤とヒトリコンビナントＴＮＦを含む薬剤とを別々に投与してもよく、あるいは同時に投与してもよい。前記有効成分化合物とヒトリコンビナントＴＮＦのモル比率は、通常１：０．００１〜１：０．５、好ましくは１：０．０２〜１：０．１である。
【実施例】
【００３１】
以下、実験例および試験例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。なお、本実験例に使用した被検化合物は、腎糸球体病変を選択的に抑制することが知られている化合物［Ｉ］と、尿細管間質病変を選択的に抑制することが知られている化合物［ＩＩ］であり、これらの構造式は次の通りである（前記特許文献１、２参照）。
（腎糸球体病変を選択的に抑制する化合物）
【化３】
2008133036.tif 000004
（尿細管間質病変を選択的に抑制する化合物）
【化４】
2008133036.tif 000005
【００３２】
［実験例１］
（１）ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の分離
少量のヘパリンを添加したシリンジを用いて正常ヒト末梢血を約３０ｍｌ採血し、直ちに等量の０．９％生理食塩水（１ｍＭ  ＥＤＴＡ添加）と混和した。５０ｍｌチューブに１２ｍｌヒストパック（HISTOPAQUE-1119、カタログNo.1119-1、Sigma-Aldrich社）と１０ｍｌフィコールパック(Ficoll-Paque Plus、Amersham Bioscience社)を重層した上に静かに血液を重層した。室温にて遠心分離（４００Ｇ、２０分）し、血漿成分を約８ｍｌ集め、０．２μｍのミリポアフィルターを通した。リンパ球を含む単核球分画を集め、冷却したＰＢＳ（Ｃａ＋＋）を十分量加えて混和し、４℃にて遠心分離（２５０Ｇ、１０分）した。上清を捨て、２回同様の操作を行なった。ペレットに、先に採取した血漿を約８ｍｌ加えて混和し、３７℃で１０分静置した。４℃にて遠心分離（２５０Ｇ、１０分）し、ペレットに血清未添加ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、Ｓｉｇｍａ社、以下、培養液ＲＰＭＩという）を加えて同様に遠心分離を行なった。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の最終細胞数を２×１０６個／ｍｌに調整した。【００３３】
（２）被検化合物の希釈
滅菌されたＤＭＳＯ原液に被検化合物を溶解した後、培養液ＲＰＭＩで希釈を進め、最終１×１０−６（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度になるように被検化合物を希釈調整して被検化合物を調製した。なお、被検化合物は１０００ｎＭ以下の濃度で活性を検討した。【００３４】
（３）培養および回収
マイトマイシンＣ（終濃度１２０μＭ）にてヒトＰＢＭＣを３７℃で３０分処理し、刺激ＰＢＭＣとした。マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４６、Becton  Dickinson社）の各ウェルに、１０００μｌの応答ＰＢＭＣ（未処理の同種ヒトＰＢＭＣ）溶液（２×１０６個／ｍｌ）、同量の前記刺激ＰＢＭＣ（２×１０６個／ｍｌ）、２５０μｌの被検化合物溶液、２５０μｌのヒトＡＢ血清（１０％終濃度）を加えて、５％ＣＯ２、３７℃にて７日間培養した。培養終了後に、ラバーにて付着細胞を含めてヒトＰＢＭＣを回収した。ＰＢＳ（＋）にて２回洗浄し、０．１〜１×１０６個／ｍｌの細胞を回収した。【００３５】
（４）ＦＡＣＳｃａｎによる解析
回収したヒトＰＢＭＣ溶液０．５ｍｌをＦＡＣＳｃａｎ測定用のチューブに入れ、約４％ホルムアルデヒド溶液を含むBD Cytofix/CytopermTM液(カタログNo.554714、BD Bioscience社)を等量予め加温して加え、３７℃で１０分処理し、細胞を固定した。遠心分離（３００Ｇ、５分）後、上清を捨て、膜透過処理として、細胞ペレットに０．１％サポニンを含有するBD Perm/WashTM染色バッファー(カタログNo.554714、BD Bioscience社)０．５ｍｌを加えて、４℃で３０分静置した。Perm/WashTM染色バッファーにて遠心分離（３００Ｇ、５分）した。遠心分離後、BD Perm/WashTM染色バッファーにて終濃度１．９７６×１０−２ｍｇ／ｍｌに希釈した一次抗体（ウサギ抗ヒトｒＢＡＴポリクローナル抗体）１００μｌをチューブに加え、３７℃で１０分、４℃で２０分反応させた。反応終了後、二次抗体としてヤギＦＩＴＣ標識抗ウサギ免疫グロブリンをPerm/WashTM染色バッファーにて適正濃度に希釈したもの１００μｌを加え、４℃で３０分反応させ、ついで１％ホルマリン−ＰＢＳ溶液３００μｌ〜５００μｌを加えて浮遊させた。ＦＡＣＳｃａｎにて１万個の細胞について、ヒトＰＢＭＣ中の、単球マクロファージより大きな分画(large−macrophage)に発現されるＨＡＴ（Heterodimeric Amino acid Transporter：ＨＡＴ）のピーク値を測定した。
また、一次抗体として、ウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃ（４Ｆ２  heavy  chain）ポリクローナル抗体（Biol  Pharm  Bull  30：415-422，2007参照）を用いて、同様にしてヒトＰＢＭＣ中の、単球マクロファージより大きな分画（large-macropharge）に発現されるＨＡＴのピーク値を測定した。
なお、被検化合物を無添加のものを対照とし、ウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体は、ヒト４Ｆ２ｈｃの１６４−１７５のアミノ酸残基（ＨＫＮＱＫＤＤＶＡＱＴＤ（配列番号３））に相当するペプチドを合成し、そのＣ末端にシステイン残基を導入し、ＫＬＨをカップリングさせて、ウサギに免疫して得た。【００３６】
結果を表１に示す。
【表１】
2008133036.tif 000006
【００３７】
上記表１から、化合物［ＩＩ］は、ｒＢＡＴの発現を著しく活性化したが、ＨＡＴの他の重鎖である４Ｆ２ｈｃの発現を活性化しなかったことが分かる。また、上記表１から、化合物［Ｉ］は、ｒＢＡＴおよび４Ｆ２ｈｃのいずれの発現も増加させなかったことが分かる。これらの結果から、化合物［ＩＩ］はｒＢＡＴの発現に特異的に作用することが分かる。【００３８】
［実験例２］
（１）ヒト由来培養細胞株Ｕ９３７の培養
培養液ＲＰＭＩに１０％終濃度になるようウシ胎児血清を加えた培養液（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩという）中、ヒト由来培養細胞株Ｕ９３７を５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養し、同条件下で維持した。使用時には、１回遠心分離（３００Ｇ、５分）後、上清を捨て、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩを加えて最終細胞数を１×１０６個／ｍｌに調整した。【００３９】
（２）マクロファージ活性化物質の調製
ヒトリコンビナントＴＮＦ−β（カタログ番号：ＰＨＰ０５２、Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）（Blood，(2006）;107:1996-2003）を１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０に溶解し、ｒｈＴＮＦ−β溶液を調製した。【００４０】
（３）被検化合物の希釈
滅菌されたＤＭＳＯ原液に被検化合物を溶解した後、培養液ＲＰＭＩで希釈を進め、最終１×１０−６（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度になるように被検化合物を希釈調整し、１０００ｎＭ以下の被検化合物濃度で活性を検討した。【００４１】
（４）培養および回収
マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４６）の各ウェルに、１０００μｌの培養細胞Ｕ９３７（１×１０６）、１０００μｌのｒｈＴＮＦ−β溶液（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、２５０μｌの被検化合物溶液、２５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培養液を加えて、５％ＣＯ２、３７℃にて１０日間培養した。培養終了後に、ラバーにて付着細胞を含めてＵ９３７を回収した。ＰＢＳ（＋）にて２回洗浄し、０．１〜１×１０６個／ｍｌの細胞数を回収した。【００４２】
（５）ＦＡＣＳｃａｎによる解析
回収したＵ９３７溶液０．５ｍｌをＦＡＣＳｃａｎ測定用のチューブ入れ、約４％ホルムアルデヒド溶液、予め加温したBD Cytofix/CytopermTM液を等量加え、３７℃で１０分処理し、細胞を固定した。遠心分離（３００Ｇ、５分）後、上清を捨て、膜透過処理として、細胞ペレットに０．１％サポニン濃度のBD Perm/WashTM染色バッファーを０．５ｍｌ加えて、４℃で３０分静置した。Perm/WashTM染色バッファーにて遠心分離（３００Ｇ、５分）した。遠心分離後、BD Perm/WashTM染色バッファーにて終濃度１．９７６×１０−２ｍｇ／ｍｌに希釈した一次抗体、ウサギ抗ヒトｒＢＡＴポリクローナル抗体をチューブに１００μｌ加え、３７℃で１０分、４℃で２０分反応させた。反応終了後に二次抗体としてヤギＦＩＴＣ標識抗ウサギ免疫グロブリンを１００μｌ加え、４℃で３０分反応させ、１％ホルマリン−ＰＢＳ溶液を３００μｌ〜５００μｌ加えて浮遊させた。ＦＡＣＳｃａｎにて１万個の細胞について、Ｕ９３７中の、ヒトリコンビナントＴＮＦ−βの刺激を受けていないものと比べて、より大きな分画(Large-cell)に発現されるＨＡＴのピーク値を求めた。
また、一次抗体として、ウサギ抗ヒトＢＡＴ１ポリクローナル抗体を用いて、同様にしてヒトリコンビナントＴＮＦ−βの刺激を受けていないものと比べて、より大きな分画(Large-cell)に発現されるＨＡＴのピーク値を求めた。
なお、被検化合物を無添加のものを対照とした。【００４３】
結果を表２に示す。
【表２】
2008133036.tif 000007
【００４４】
上記表１から、化合物［ＩＩ］は、ＨＡＴの重鎖であるｒＢＡＴの発現を著しく活性化したが、軽鎖であるＢＡＴ１の発現は活性化しなかったことが分かる。また表１から、化合物［Ｉ］は、ＨＡＴの重鎖ｒＢＡＴも軽鎖ＢＡＴ１のいずれの発現も殆ど活性化しなかったことが分かる。これらの結果から、化合物［ＩＩ］はｒＢＡＴの発現に特異的に作用することが分かる。【００４５】
［試験例１］
（１）ラット一側尿管閉塞解除モデルの作成
８−９週齢、約２８０ｇのＳＤラット雄を用いて実験モデルを作成した（石橋道男ほか：日本腎臓学会誌４２：２４８，２０００）。すなわち、ラットをエーテル麻酔下にて開腹し左腎下極の高さで尿管を７−０ナイロンで結紮閉腹し、閉塞１４日目に閉塞を解除しカフを用い尿路を再建した。具体的には、１４日後に結紮された閉塞尿管を部分切除し、２５ゲージポリエチレンチューブ（日本シャーウッド製）をカフとして、下方正常尿管断端より内腔に挿入留置し、次に上方の拡張した尿管内にもカフを留置し、それぞれ７−０ナイロンにて結紮固定し尿路を再建した。同時に、対側の右腎を摘出した。閉塞解除後７日目に麻酔下に犠死させ、左閉塞解除腎を摘出した。摘出した腎について病理形態学的検査を実施した。このモデルにおいて、被検化合物を投与しない場合は、閉塞期間中と閉塞解除後の経時的な病理形態学的検討において、腎構造の破壊をきたし、糸球体ボーマン嚢壁肥厚、メサンギウム細胞増生、糸球体硬化、尿細管の萎縮、拡張、間質への細胞浸潤、繊維化を呈した。【００４６】
（２）被検化合物の投与
上記（１）で得たモデルを用いて、被検化合物のインビボの生物学的な効果を検討した。被検化合物は、アラビアゴムとともに被検化合物の原末を滅菌生理食塩水に溶解し、アラビアゴムは５％、被検化合物は３０ｍｇ／ｍｌに調整した。被検化合物をアラビアゴムとともに連日３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで皮下注射した。１４日間の閉塞期間と７日間の閉塞解除の２１日間連日投与した。なお、対照は溶媒である５％アラビアゴムのみを投与した。【００４７】
（３）糸球体病変の観察
被検化合物の投与開始から２２日目に、麻酔下に犠死させ、左閉塞解除腎を摘出し、中性ホルマリンにて固定した。固定されたパラフィン包埋腎組織を４ミクロンの厚みにて薄切し検討した。
組織切片を顕微鏡で観察し、視野内に入る糸球体の数と、病変（尿細管極におけるボーマン嚢上皮細胞の腫大を伴う拡張またはボーマン嚢基底膜の肥厚）の認められる糸球体の数を計数し、５０個の糸球体当たりの病変の認められる糸球体（病変糸球体という）の数を算出した。【００４８】
（４）尿細管間質病変の観察
前記（３）と同様にして得た組織切片を顕微鏡で観察し、尿細管の拡張に伴う尿細管の萎縮、尿細管基底膜の肥厚および尿細管間質の繊維化を観察し、±（ごく軽度の変化が認められた）を０．５点、＋（軽度の変化が認められた）を１点、＋＋（中程度の変化が認められた）を２点、＋＋＋（高度の変化が認められた）を３点とし、その合計を算出した。【００４９】
（５）ＢＡＴ１陽性細胞数の検討
ウサギ抗ヒトＢＡＴ１ポリクローナル抗体の作成のために、ラットＢＡＴ１の４７４−４８７のアミノ酸残基（ＱＭＬＭＥＶＶＰＰＥＫＤＰＥＣ（配列番号４））に相当するペプチド（J  Biol  Chem  274：28845-28848，1999）の４８４（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に変えたオリゴペプチドを合成し（Kidney  Int，(2001）;59:1821-1833）、そのＣ末端のシステイン残基にアジュバンドとしてキーホールリンペッドヘモシアニン（keyhole  limpet  hemocyanine）を結合させ、ウサギに免疫した。血清を免疫後７日目と１４日目に採取した。ＢＡＴ１に相当するオリゴペプチド（４７４−４８７）を結合したアフィニテイーカラムにて血清を吸着解離操作により濃縮し、タンパク量０．５ｍｇ／ｍｌの抗原アフィニテイー精製抗ヒトＢＡＴ１ポリクローナル抗体（ウサギ）を得た。免疫病理学的検討に際しては、パラフィンラット腎臓組織を用いてＰＢＳにて希釈し至適濃度にて使用した。
免疫組織染色は、ベンタナ社製自動免疫染色装置を含めベンタナＨＸシステムベンチマーク（ベンタナジャパン社）のプロトコールを基本にして行った。組織切片は、脱パラフィン後に、１００℃で１時間熱処理を行った。ブロッキングとして１０％ヤギ血清（ヒストファイン  ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を用い、一次抗体としてアフィニテイー精製抗ヒトＢＡＴ１ポリクローナル抗体（ウサギ）を４℃で１８時間反応させた。二次抗体として、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）（ヒストファイン  ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を室温で３０分反応させた。ついでシンプルステインＤＡＢ溶液（ヒストファイン  ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を用いて発色させた。
染色された細胞を顕微鏡にて観察し、尿細管間質病変に存在する全視野内のＢＡＴ１＋細胞数を計数し、糸球体５０個あたりに存在する糸球体病変内のＢＡＴ１＋細胞の数を算出した。【００５０】
（６）結果
結果を表３（化合物［ＩＩ］）および表４（化合物［Ｉ］）に示す。
【表３】
2008133036.tif 000008
【００５１】
【表４】
2008133036.tif 000009
【００５２】
表３および表４から、尿細管間質病変に関しては、化合物［ＩＩ］を投与した群では、同病変が顕著に改善され（有意差：ｐ＝０．０１、対照に対するスコア−低下率：６０％）、かつ同病変に存在するＢＡＴ１陽性細胞の数が顕著に増大した（対照に対する平均増加数：１６．５個）が、化合物［Ｉ］の投与群では、同病変に存在するＢＡＴ１陽性細胞の数に有意な増加はなく、尿細管間質病変は改善されなかった（有意差：なし、対照に対するスコア−低下率：１８％）ことが分かる。
一方、糸球体病変に関しては、化合物［ＩＩ］を投与した群では、同病変があまり改善されず（対照に対する病変糸球体低下率：４４％）、同病変に存在するＢＡＴ１陽性細胞の数も殆ど増加しなかった（対照に対する増加数：０．３個）が、化合物［Ｉ］の投与群では、糸球体病変を顕著に改善した（対照に対する病変糸球体低下率：６７％）ことが分かる。
以上のことから、化合物［ＩＩ］は尿細管間質病変を選択的に抑制する薬剤であるのに対し、化合物［Ｉ］は糸球体病変を選択的に抑制する薬剤であることが分かる。【００５３】
前記実験例１および２の結果と試験例の結果から、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起されるｒＢＡＴの発現の変動を指標として腎尿細管病変の予防・緩和・治療薬をスクリーニングできることが確認された。【００５４】
［試験例２］
（１）ラット一側尿管閉塞解除モデルの作成
９週齢、約３００〜３２０ｇのＳＤラット雄を用いて実験モデルを作成した（石橋道男ほか：日本腎臓学会誌４２：２４８，２０００）。すなわち、ラットをエーテル麻酔下にて開腹し左腎下極の高さで尿管を７−０ナイロンで結紮し閉塞し、閉塞作成後１４日目に閉塞部を切除して解除しカフを用いて左尿管尿管吻合術により尿路を再建した。具体的には、１４日後に結紮された閉塞尿管を部分切除し、２５ゲージポリエチレンチューブ（日本シャーウッド製）をカフとして約３〜５ｍｍの長さにしたものを、まず、下方正常尿管断端内腔に挿入留置し７−０ナイロンにてカフを結紮固定し、次に上方の拡張した尿管内に下方尿管内に留置したチューブを挿入して、拡張尿管も７−０ナイロンにてカフを結紮固定し、左尿管尿管吻合術を終了し尿路を再建した。同時に、対側の右腎を摘出した。
閉塞解除後７日目に麻酔下にラットを犠死させ、左閉塞解除腎を摘出した。摘出した腎について病理形態学的検査を実施した。このモデルにおける被検化合物を投与しない対照群の場合は、閉塞期間中と閉塞解除後の経時的な病理形態学的検討において、腎構造の破壊をきたし、糸球体ボーマン嚢壁肥厚、糸球体尿腔（urinary space）尿細管極開口部の拡大、尿細管の萎縮、拡張、間質への細胞浸潤、繊維化を呈した。腎機能的には、高度の腎不全状態が閉塞解除後６〜７日目には正常の３０％腎機能レベル、血漿クレアチニン値では２．０ｍｇ／ｄｌまで回復した。【００５５】
（２）被検化合物の投与とＴＮＦとの併用投与
被検化合物は試験例１と同様に化合物[ＩＩ]を用い、アラビアゴムとともに被検化合物の原末を滅菌生理食塩水に溶解し、アラビアゴムは５％、被検化合物は３０ｍｇ／ｍｌに調整した。被検化合物をアラビアゴムとともに３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量にて連日皮下注射した。
ヒト以外にはＴＮＦ−β（Tumor Necrosis Factor-beta）の分離同定がなされておらず（Aggarwal BB. Comparative analysis of the structure and function of  ＴＮＦ−α  and  ＴＮＦ−β. In Aggarwal BB, Vilcek J (eds.): Tumor necrosis factors: Structure, Function and Mechanism of action. New York, NY, Dekker, 1992, p61参照）、ラットリコンビナントＴＮＦ−βを用いた実験はできないため、本試験例の実験モデルにおいては、ラットリコンビナントＴＮＦ−α(R&D System社、Cat Number:510-RT)にラットリコンビナントＴＮＦ−βの活性も含まれることを予想してラットリコンビナントＴＮＦ−αを用いた。投与量としては、非特許文献（Reynolds JL et al. J Pharmacol Exp Ther 2004; 310:1216-1225）で、ラットリコンビナントＴＮＦ−α（R&D Systems社）を１日持続静注法で１μｇ投与していることから、１日１回の腹腔内投与量を０．４５μｇとした。生理食塩水にて希釈したものを０．４５ｍｌ（０．４５μｇを含む）腹腔内に隔日投与した。
実験群は、化合物[ＩＩ]投与と、ラットリコンビナントＴＮＦ−α投与の代わりに生理食塩水０．４５ｍｌを腹腔内に投与した化合物[ＩＩ]単独投与群をグループ１とし、化合物[ＩＩ]とラットリコンビナンＴＮＦ−αの併用投与群をグループ２とした。
投与期間は、左尿管閉塞を作成する５日前から開始し、１４日間の閉塞期間とさらに７日間の閉塞解除期間までとした。
上記（１）で得たモデルを用いて、化合物[ＩＩ]とＴＮＦを併用投与することにより、化合物[ＩＩ]単独投与よりも腎尿細管障害後の修復再生が促進されることを検討した。すなわち、閉塞解除後３日目と６日目に採血し、血漿クレアチン値を測定した。右腎は左腎の閉塞解除時に摘出されているので、測定された血漿クレアチン値は閉塞解除した左腎の腎機能を表す。なお、腎機能は１／血漿クレアチンｍｇ−１・ｄｌとして表示した。【００５６】
（３）結果
結果は、下記表５の通りである。
【表５】
2008133036.tif 000010
注）化合物［ＩＩ］およびＴＮＦ−α共に投与しない対照群（ｎ＝４）では、閉塞解除後６日目の腎機能が平均０．４６５（１／血漿クレアチンｍｇ−１・ｄｌ）であった。また、有意差検定はグループ１ｖｓグループ２で行った。【００５７】
腎機能は閉塞解除後３日目から回復を示すが、閉塞解除後６日目においてグループ１（化合物［ＩＩ］単独投与群）は対照群比べて、腎機能が０．４６５から０．７０６に改善・上昇しており、化合物［ＩＩ］が腎機能改善効果を有することが分かる。また、グループ１とグループ２（化合物［ＩＩ］とＴＮＦ−α併用投与群）を比較すると、グループ２は閉塞解除後３日目、閉塞解除後６日目のいずれも腎機能障害からの回復が良い傾向を示した（閉塞解除後６日目の有意差検定：ｐ＝０．０８６）。
以上の結果から、腎臓の尿細管病変を予防、緩和または治療する化合物［ＩＩ］とラットリコンビナントＴＮＦ−αの併用投与群では、尿管閉塞を作成する５日前から予防的に併用投与し、引き続き尿管閉塞後も１４日間の閉塞期間と６日間の閉塞解除期間を合わせた２０日間投与を継続したことにより、腎臓の尿細管病変を化合物［ＩＩ］単独投与群と比べてより有効に予防、緩和または治療できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明方法によれば、簡便な方法で腎尿細管病変の予防・緩和・治療薬をスクリーニングできるため、医薬品産業において有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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