(57)【要約】【課題】急性肝炎が劇症肝炎に進行すると、肝細胞の破壊が急激かつ大量に発生する結果、予後は極めて不良となる。従って急性肝炎から劇症化への進行を早くに予知し、速やかに適切な処置を開始することが肝要である。しかし近年検査方法や診断技術の向上から肝炎劇症化の予知が可能になってきたにもかかわらず、劇症肝炎の適切な予防・治療剤がなかった。本発明の課題は、副作用の少ない急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療剤を提供することにある。【解決手段】アポリポタンパク質Ａ−IIを含有する医薬組成物が前記課題を解決した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療剤。
【請求項２】
非経口投与薬である請求項１記載の急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療剤。
【請求項３】
急性肝炎又は劇症肝炎患者にアポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する組成物を投与する急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は身体に必要な物質を合成し、老廃物を排泄するなど、生命活動にとって重要な役割を担っている。これらの働きを担う肝細胞がウイルス、アルコール、薬物などにより破壊されると肝臓に炎症が起こり、肝臓の機能が低下する病気が肝炎である。肝炎の症状としては倦怠感、食欲不振、吐き気、発熱、黄疸等が現れるが、肝炎が発生して６ヶ月以内のものを特に急性肝炎と呼び、急性肝炎の症状発現後８週間以内に高度の肝細胞機能障害に基づく肝性昏睡II度以上の脳症を来たし、プロトロンビン時間４０％以下を示す場合を劇症肝炎と呼んでいる。
劇症肝炎では、肝細胞の破壊が急激かつ大量に発生する結果、肝細胞の増殖・再生が間に合わず、予後は極めて不良となる。従って急性肝炎から劇症化への進行を早くに予知し、速やかに適切な処置を開始することが肝要である。【０００３】
我が国の急性肝炎患者数は年間３５万人にも達するが、そのうち劇症肝炎に進行する患者数は年間数千人と言われている。
劇症肝炎の発症機序については、生体側の免疫応答とともに、肝局所における各種要因が密接に関連していると言われているが、その全体像に関してはなお不明な点も多い。【０００４】
急性肝炎から劇症肝炎への進行を予知するためには患者の自覚症状ならびに肝機能検査による各種異常値に注意を払う必要がある。
一般的に急性肝炎から劇症肝炎への過程は、急激な肝細胞破壊による肝合成機能の低下、それに続く肝解毒代謝機能の低下の順を追って進行する。肝細胞の大量かつ急激な破壊は強い倦怠感、食欲不振などの自覚症状となって現れ、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）等のトランスアミナーゼの値とＬＤＨ（Lactate dehydrogenase）値の上昇とともに黄疸が発症する。また肝解毒代謝機能の低下により肝性昏睡IまたはII度の神経症状が現れるので、診断には脳波検査も重要である。最近では劇症肝炎などの肝炎の病態を予測・診断する診断キットおよび診断マーカーについても報告されている（特許文献１）。これらの症状の発現、検査結果、診断技術の向上から、今日ではかなり高い確率で急性肝炎から劇症肝炎への予知が可能となってきた。【０００５】
急性肝炎の治療には安静が基本とされるが、病態進行時においては、グリチルリチン製剤等の肝庇護剤を用いる対症療法が行われている。また、急性肝炎や劇症肝炎の治療剤として、アラニン、グルタチオン、オルニチンの少なくとも一種を含有する薬剤（特許文献２）、血小板活性因子拮抗剤を含有する薬剤（特許文献３）、インシュリン様成長因子又はその誘導体を含有する薬剤（特許文献４）等が提案されているが、その効果は十分ではなく、実用化には至っていない。
劇症肝炎の治療法としては血漿交換、輸血、血液透析その他の対症療法が行われている。最近では肝臓移植も試みられているが、予後は悪く、救命率は30％程度と言われている。また、ウイルスが原因である場合は、抗ウイルス療法としてインターフェロンによる療法も試みられているが、発熱、関節痛、筋肉痛、白血球数や血小板数の減少、食欲低下、体重減少、脱毛、甲状腺機能異常、心筋障害、糖尿病の悪化、タンパク尿などの副作用があるうえ、効果の面でも充分とはいえない。
【特許文献１】特開２００８−１７７７７号公報
【特許文献２】特開平５−２２１８５８号公報
【特許文献３】特開平７−３０４６８９号公報
【特許文献４】特開平９−１４３０９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この様な状況のもと、急性肝炎から劇症肝炎への進行を予知し、速やかに治療を開始することにより劇症化を防止し、また、たとえ劇症化した後であっても治療効果があり、しかも副作用の少ない急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療薬の開発が切に望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血液中の高密度リポタンパク質ＨＤＬ(High density lipoprotein)の成分であるアポリポタンパク質Ａ−IIの生体に及ぼす作用について種々研究を重ねてきたところ、このアポリポタンパク質Ａ−IIが偶然にも急性肝炎の治療、劇症肝炎の予防・治療に有効で、かつ副作用も認められないことを突き止めた。この知見をもとに更に研究を重ねて本発明を完成した。
すなわち本発明は、アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分として含有する急性肝炎の治療または劇症肝炎の予防・治療剤である。【０００８】
本発明の有効成分であるアポリポタンパク質Ａ−IIは高密度リポタンパク質ＨＤＬの主要な構成成分である。ＨＤＬの化学組成の約５０重量％は蛋白質であり、残りの約５０重量％はリン脂質とコレステロールエステルを主体とする脂質成分である。ＨＤＬの蛋白成分のうち、アポリポタンパク質Ａ−IIは、アポリポタンパク質Ａ−Iに次いで多く含まれ、蛋白成分全体の約２０重量％を占めている。
アポリポタンパク質Ａ−IIは、その化学構造がすでに明らかにされており、７７個のアミノ酸からなる分子量約８７００のポリペプチドである。通常、血液中のＨＤＬは、第６残基目のシステインでジスルフィド結合した２量体の構造として存在することが知られている（The Lipid Vol.2, No.3 243-249, 1991-4）。
アポリポタンパク質Ａ−IIの生理的役割については、イン・ビトロの実験で、アポリポタンパク質Ａ−IIがアポリポタンパク質Ａ−Iと置き換わることにより肝リパーゼを活性化したり、ＬＣＡＴ(Lecithin-cholesterol acyltransferase)の活性を抑制するという報告や、アポリポタンパク質Ａ−IIがVIIa凝固因子によるV凝固因子の活性化を阻害するという報告などがあるが、イン・ビボでの役割については未だ明確にはなっていない。
なお、高脂血症患者においてはアポリポタンパク質Ａ−IIの血中濃度が増加する傾向にあり、肝疾患（例えば急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝ガン等）患者においては血中濃度が低下する傾向にあるという報告もなされている（臨床病理XXIX：２，１３５〜１３８（１９８１））。しかし、肝炎患者にアポリポタンパク質Ａ−IIが減少している事実を記載しただけであって、肝疾患、特に、急性肝炎および劇症肝炎に罹るおそれのある患者にアポリポタンパク質Ａ−IIを投与すれば肝炎が予防又は治療することができるということは記載されていない。【０００９】
本発明の有効成分であるアポリポタンパク質Ａ−IIの調製は、ヒトの血漿から、通常のタンパク質分離精製手段により単離することができ、生物を用いる遺伝子組換え技術を用いて生産することもできる。例えば、特開昭６３−２３７７８９号公報には、アポリポタンパク質Ａ−IIの遺伝子をコードする発現ベクターを大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物細胞および酵母などの真核生物細胞に組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養により製造することができる旨記載されている。
アポリポタンパク質Ａ−IIはまた、動物の体内や動物細胞で生産される物質、または遺伝子組換え技術で、アポリポタンパク質Ａ−IIの構造の一部を欠失させたり、構成アミノ酸を他のアミノ酸に置換あるいは修飾した改変体および糖鎖を修飾あるいは欠失させた類似物などでも、急性肝炎又は劇症肝炎の予防・治療効果を有するものである限り使用することができる。純度からいえば、例えば還元ゲル電気泳動で単一バンドを示す程度に精製されたものであればよく、精製法や原材料を限定する必要はない。【００１０】
アポリポタンパク質Ａ−IIの製法の代表的なものとしては、ヒト血漿又はその誘導体から分離、精製する方法（例えばAnalytical Biochemistry 178,301-305(1989)）や遺伝子組換え技術を用いて製造する方法などが挙げられる。ヒト血漿の誘導体としては、たとえばヒト血漿のコーン低温エタノール分画法で得られる沈澱画分ＩＶ−１やKistler and Nitschmannの方法を用いた低温エタノール分画法で得られる沈澱画分Ｂなどが挙げられる。【００１１】
次にヒト血漿または誘導ヒト血漿画分からアポリポタンパク質Ａ−IIを製造する具体的な方法としては、例えば次の方法がある。
まず、アポリポタンパク質Ａ−IIを含有するヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を、低温、例えば１０℃以下で、緩衝液に溶解する。次いでたとえばエタノール/クロロホルム溶液を加えて混合し、遠心分離を行って下層の脂質成分を除去し、上清の蛋白質成分を回収する。回収した上清に対してエタノールを添加し、遠心分離を行って沈殿する高分子の蛋白質を除去し、上清を回収する。さらに、回収した上清に対して再びエタノールを添加し遠心分離を行って沈殿するアポリポタンパク質Ａ−Iを除去し、アポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清を回収する。アポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清は、塩化ナトリウム溶液にて限外ろ過処理を行い、エタノールを除く。その後、リン酸緩衝液にて限外ろ過処理を行った後、適切な濃度まで濃縮する。脱脂が不十分な精製したアポリポタンパク質Ａ−IIは、エタノール/クロロホルム溶液を加えて混合し、遠心分離を行って下層の脂質成分を除去する。上清のアポリポタンパク質Ａ−IIは上記と同様な方法で限外ろ過を行い、エタノールを除いて適切な濃度まで濃縮する。このような操作によって精製されたアポリポタンパク質Ａ−IIが得られる。【００１２】
アポリポタンパク質Ａ−IIの製法として他の好ましい例は、遺伝子組換え技術を用いる方法である。
遺伝子組換え技術によるアポリポタンパク質Ａ−IIの製造は、まずヒトアポリポタンパク質Ａ−II遺伝子をコードするcDNAをDNAライブラリーから入手し、適切なプライマーを用いて遺伝子を増幅し、アポリポタンパク質Ａ−IIをコードするポリヌクレオチドを得る。そのポリヌクレオチドをクローニングベクターに挿入してクローニングした後、アポリポタンパク質Ａ−IIをコードするポリヌクレオチドを切り出し、自体公知の方法により適当な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターを適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞）に導入して形質転換し、この形質転換細胞の培養物から単離、精製することによって取得することができる。
宿主細胞として好ましいものとしては、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）等の細菌類、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母菌類が挙げられる。【００１３】
遺伝子組換え技術によりアポリポタンパク質Ａ−IIをバチルス属菌などの微生物から生産する場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、アポリポタンパク質Ａ−IIをコードするポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養し、この培養物から目的のタンパク質を単離、精製することによりアポリポタンパク質Ａ−IIを得ることができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得ることができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって組換えアポリポタンパク質Ａ−IIを取得することができる。【００１４】
アポリポタンパク質Ａ−IIを含む製剤としては、水溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤化は、医薬上許容される添加剤（希釈剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、界面活性剤等）を適宜混合し、製剤上の常套手段により行うことができる。また凍結乾燥製剤は用時に注射用蒸留水等の溶解液に溶解して用いられる。【００１５】
組換えアポリポタンパク質Ａ−IIを真核細胞で生産する場合には、アポリポタンパク質Ａ−IIをコードするポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを真核細胞内に導入し、その培養物から目的のタンパク質を単離、精製すればよい。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、組換えアポリポタンパク質Ａ−IIを発現できるものであれば、いかなる 真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。【００１６】
組換えアポリポタンパク質Ａ−IIを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。【００１７】
なお、宿主細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、この発明において使用する組換えアポリポタンパク質Ａ−IIは、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などの翻訳後修飾を受けたタンパク質も含まれる。【００１８】
この様にして得られたアポリポタンパク質Ａ−IIは、夾雑物が殆ど含まれていない。また、薬理学的に許容しうる担体と均一に混合して製剤化することができる。担体は、薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜に選択することができる。必要により塩、アミノ酸、有機酸、糖アルコール、アルブミンなどのタンパク質、ポリオールなどの好適な安定化剤と共に保存することが可能である。【００１９】
本発明の薬剤の投与経路は、経口、非経口と特に制限はないが、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、皮内注射等の非経口投与が好ましく、特に静脈注射が好ましい。注射剤とするには、常法に従い、精製されたアポリポタンパク質Ａ−IIの一定量を無菌条件下に注射用蒸留水と混合すればよいが、その際、緩衝剤、等張化剤、安定剤などを適量配合するのが良い。具体例としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸などが好適に用いられる。【００２０】
本発明に係る急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療剤の投与量は、対象となる効果を発揮するのに十分な量とされるが、剤形、投与方法、１日当たりの投与回数、症状の程度、体重、年齢等によって適宜増減することができる。成人に対して静脈内投与する場合は、アポリポタンパク質Ａ−IIとして、通常約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約３〜５００ｍｇ／ｋｇである。この量を１日１回〜３回に分けて投与することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る急性肝炎の治療又は劇症肝炎の予防・治療剤は、アポリポタンパク質Ａ−IIを有効成分とし、副作用がないかまたは極めて少なく、安全且つ効果的に急性肝炎の治療又は劇症肝炎を予防・治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に実施例および実験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００２３】
アポリポタンパク質Ａ−II含有製剤の調製
肝炎ウイルスその他の病原微生物を実質的に除去したヒト血漿を原料とし、ヒト血漿コーン低温エタノール分画法で画分ＩＶ−１を得た。該画分ＩＶ−１の１．２ｋｇを、２〜８℃の低温室で、１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと６Ｍ尿素を含む、ｐＨ７．８〜８．２に調整した溶液２．４Ｌに溶解した。さらに、溶解液と等量のエタノール/クロロホルム溶液（１：１）を加えて混合し、１２０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、上清の蛋白質成分を回収した。回収した上清３．４Ｌに対して１．２倍量であるエタノール４．１Ｌを添加し、１２０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、上清６．８Ｌを回収した。さらに、回収した上清に対して０．８倍量のエタノール５．４Ｌを添加し、１２０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、アポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清１２Ｌを回収した。アポリポタンパク質Ａ−IIが含まれる上清は、分画分子量１００００の限外ろ過膜（ポール社製）を用いて、１２０Ｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を注入して限外ろ過することにより、エタノールを除いた。続いて、２０Ｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を注入して限外ろ過することにより、液を置換した。その後、アポリポタンパク質Ａ−IIが４ｍｇ／ｍＬとなるまで限外ろ過による濃縮を実施した。
ついで、アポリポタンパク質Ａ−II濃縮液５００ｍＬと等量のエタノール/クロロホルム溶液（１：１）を加えて混合し、１２０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、下層を除去し上清７５０ｍＬを回収した。上清は、分画分子量１００００の限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて、２５Ｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を注入して限外ろ過することにより、エタノールを除いた。続いて、２０Ｌの１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を注入して限外ろ過することにより、液の置換を行った。さらに、アポリポタンパク質Ａ−IIを２２ｍｇ／ｍＬ含有するまで濃縮を実施した。続いて、孔径０．２２μｍの無菌ろ過フィルター（ミリポア社製）を用いて無菌ろ過を行い、アポリポタンパク質Ａ−II製剤を得た。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤について分析した結果を表１に示した。【００２４】
【表１】
2008133225.tif 000002
このようにして得られた製剤は、そのまま注射液として用いることができる。
【実施例２】
【００２５】
（１）遺伝子組換えヒトアポリポタンパク質Ａ−IIの発現ベクターの構築
ヒトアポリポタンパク質Ａ−II遺伝子は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製，製品コード９５０５）を鋳型とし、ＰＣＲ法によりクローニングした。この時フォワードプライマーは配列表の配列番号１で示されるものとし、リバースプライマーは配列表の配列番号２で示されるものとした。得られたＰＣＲ断片は、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Invitrogen社製）を用いたＴＡクローニング法によりｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen社製）にクローニングした。
（２）バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）を用いたヒトアポリポタンパク質Ａ−II発現株の作製
得られたヒトアポリポタンパク質Ａ−II遺伝子を含むベクターを用い、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）を形質転換して発現株を構築した。発現株構築の方法は、特許公報第３７３４５９３号に記載されている方法に準じて行った。
まず、プラスミドベクターを当該特許実施例１の手法に準じて構築し、ついでヒトアポリポタンパク質Ａ−II遺伝子を挿入したプラスミドベクターを構築した。次に，当該特許の実施例５に示す方法に準じて、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）をエレクトロポレーション法で形質転換した。
（３）この形質転換体をＴＭＮ培地で３０℃、３日間培養した後、培養液を遠心分離して上清を分取し、培養上清を得た。
得られたヒトアポリポタンパク質Ａ−IIのアミノ酸配列を確認するため、ｐＣＲ２．１ベクター上の塩基配列をmodel3100 DNAシーケンサー（ABI社製）にて分析し、アミノ酸に変換したところ、配列表の配列番号３で示されるものが得られた。
このアミノ酸配列は、Swiss-Prot Protein Knowledgebaseに記載されたヒトアポリポタンパク質Ａ−II(Primary accession number P02652)の成熟タンパク質部分と同一配列であった。
【実施例３】
【００２６】
遺伝子組換えヒトアポリポタンパク質Ａ−IIの発現株（バチルス・ブレビス）培養上清からのアポリポタンパク質Ａ−II含有製剤の調製
ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIを発現、分泌させたバチルス・ブレビス培養上清と１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．６〜７．０）とを等量混合し、撹拌後０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）により沈殿物を除去した。このろ過液を、あらかじめ０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したHis trap FF (GE Healthcare社製)に負荷した。次いで平衡化と同様の溶液を用いて洗浄を行い、次いで０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび４０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）でさらに洗浄を行った。最後に０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび５００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）でHis trap FF吸着画分の溶出を行った。His trap FF吸着画分の溶出液は分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液を注入し、限外ろ過することにより、液の置換を行った。さらに限外ろ過による濃縮を実施してアポリポタンパク質Ａ−IIを１３ｍｇ／ｍＬ含有するまで濃縮した。続いて、孔径０．２２μｍの無菌ろ過フィルター（ミリポア社製）を用いて無菌ろ過を行い、アポリポタンパク質Ａ−II製剤とした。
【実施例４】
【００２７】
実施例３と同様な操作でHis trap FFを実施し、得られた溶出液の組成を分画分子量５０００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて３Ｍ尿素及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む３．３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）を注入して限外ろ過することにより、液の置換を行った。このヒトアポリポタンパク質Ａ−IIを含む画分をあらかじめ３Ｍ尿素及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む３．３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したMacro-prep ceramic hydroxy apatite TypeI４０μｍ（BioRad社製）に負荷し、素通り画分を回収した。
次に、この素通り画分を分画分子量５０００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液を注入して限外ろ過することにより、液の置換を行った。さらに限外ろ過による濃縮を実施してアポリポタンパク質Ａ−IIを２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。続いて、孔径０．２２μｍの無菌ろ過フィルター（ミリポア社製）を用いて無菌ろ過を行い、アポリポタンパク質Ａ−II製剤とした。
【実施例５】
【００２８】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
実施例１と実施例４で得られたアポリポタンパク質Ａ−II製剤について、ＯＤ２８０ｎｍの吸光度が同様になるように濃度調整を行った。本サンプルを非還元サンプルとした。別に、本サンプルを３０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ（和光純薬社製）で処理し、還元サンプルとした。非還元および還元サンプルについて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド１５％均一ゲルで電気泳動を行った。その結果を図１に示した。【００２９】
ウエスタンブロティング
実施例１と実施例４で得られたアポリポタンパク質Ａ−II製剤について、ＯＤ２８０ｎｍの吸光度が同様になるように濃度調整を行った。本サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル上の蛋白質をＰＶＤＦ膜（ATTO社製）に転写し、ヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Ａ−IIポリクローナル抗体（SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY社製）を用いて一次反応を行った。次いで、ＨＲＰ標識したウサギ抗ヤギイムノグロブリン抗体（DAKO社製）を用いて二次反応を行い、ＤＡＢ法により発色させた。その結果を図２に示した。【００３０】
図１および図２に示したとおり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで染色された蛋白質は、実施例１の製剤と実施例４の製剤共に抗ヒトアポリポタンパク質Ａ−II抗体と反応したことから、両者は同等の抗原性を持つことが確認された。また、還元電気泳動像において単一バンドであった。
なお、図１および図２の実施例１の製剤と実施例４の製剤のバンド位置を比較すると、実施例４の製剤の方が若干分子量の大きい位置にバンドを認めた。これは、組換え体に付けたHis-Tagの分子量（ヒスチジン６個分）が加算されているためである。
【実施例６】
【００３１】
実施例１及び実施例４で作製した製剤を比較するため、ペプチドマップを作成し検討した。
それぞれの製剤を希釈してアポリポタンパク質Ａ-IIが２００μg/ｍＬになるように調製した溶液２０μＬにサンプルバッファー（３５０ｍＭ Tris-HCl、ｐＨ６．８、３０％Glycerol、１０％SDS、０．３％BPB、３０％2-mercaptethanol）各４μＬを添加し、１００℃で５分間処理した後，ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色（PhastGel Blue R，Amersham Biosciences社製）を行った。
泳動したゲルの１０ｋＤａ付近のバンド全量を用いて、以下のとおり、ゲル内消化を行った。
ゲルを１ｍｍ×１ｍｍ程度になるようカッターで細断し、１ｍＬの精製水中で攪拌・洗浄（２０分×２回）した。次に、５０μＬの７Ｍグアニジン及び１０ｍＭ EDTAを含む０．５Ｍ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．５）中で攪拌・洗浄（３０分）した後、１ｍＬの５０％アセトニトリル及び１ｍＭ EDTAを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中で攪拌・洗浄（２０分×２回）した。さらに、１ｍＬのアセトニトリル中で攪拌・洗浄（５分）した後、スピードバックにてゲルを乾固した。乾固したゲルに１０μＬの２ｍＭ EDTAを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解したエンドプロテイナーゼGlu-C（V8）を添加（酵素：基質＝１：１０）した。氷上で１時間静置してゲルを膨潤させた後、２０〜６０μＬの２ｍＭ EDTAを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を加えてゲルに浸透させ、２５℃で２４時間消化を行った。消化後、スピードバックにて全量が５０μＬ以下になるまで濃縮した。
濃縮した試料に０．１％トリフルオロ酢酸を加えて５５μＬとし、そのうち５０μＬを用いて、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
ＨＰＬＣ条件
装置：LC-10Avpシステム（島津製作所製）
カラム：218TP54（4.6mmI.D.×25cm、バイダック社製）
カラム温度：４０℃
流速：１mL/min
検出波長：２１５nm
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸／８０％アセニトリル
グラジエント条件：0/0→0/5→75/55→100/65→100/75→0/85→0/90(%B/min)
実施例１のペプチドマップの結果を図３に、実施例４のペプチドマップの結果を図４に示した。実施例１及び実施例４で調製した製剤が、His-tagの部分を除き同じペプチドマップを示したことから、実施例１と実施例４は同質のものであることが確認された。
【実施例７】
【００３２】
遺伝子組換えヒトアポリポタンパク質Ａ−IIの発現ベクターの構築および酵母を用いたアポリポタンパク質Ａ−II発現株の作製
ヒトアポリポタンパク質Ａ−II遺伝子は人工合成した。その塩基配列は配列表の配列番号４に示したとおりのものである。
得られたヒトアポリポタンパク質Ａ−II遺伝子を、発現ベクターｐＴＩ１Ｍ５（東田英毅、酵素工学ニュース、第５７号、２００７年４月）のマルチクローニングサイトに挿入し、誘導型発現用ベクターを構築した。この誘導型発現用ベクターおよびロイシン要求性相補ベクターｐＡＬ７を用いて、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＡＴＣＣ３８３９９を岡崎ら（Okazaki et al.,"Nucleic Acids Res.",18,6485-6489,1990）の方法に従って形質転換して発現株を構築した。この発現株をＧ４１８含有液体培地ＹＥＬＧ１０（０．５％Bacto yeast extract、３％Glucose、１０μｇ／ｍＬG418）５ｍＬで３２℃、７日間培養した。この培養液をＹＰＤＧ１００（１％Bacto yeast extract、２％Bactopeptone、２％Glucose、１００μg／ｍＬG418）５ｍＬで３２℃、7日間培養した後、さらに遠心分離して菌体と上清を分け、菌体を回収した。菌体試料を菌体破砕バッファー（５０ｍＭ Tris-HCl、ｐＨ７．５、０．１Ｍ塩化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤（Roche社製））０．８ｍＬで懸濁してから、同容量のガラスビーズを入れて、破砕機で４回破砕を行うことにより、菌体破砕液を調製した。この菌体破砕液を遠心分離し、アポリポタンパク質Ａ−IIを含む上清を回収した。アポリポタンパク質Ａ−IIの発現量は２ｍｇ／Ｌであった。
【実施例８】
【００３３】
遺伝子組換えヒトアポリポタンパク質Ａ−IIの発現株（シゾサッカロミセス・ポンベ）培養菌体からのアポリポタンパク質Ａ−II製剤の調製
実施例７で作製した発現株を、ＹＰＤＧ１００培地（1% Yeast Extract, 2% Peptone、2% Glucose、0.1mg/mL G418)３００ｍＬで培養を行った。ミニジャーファーメンター３基を用い、３０℃で６６時間培養を行い、総量１４．４ｇ（湿重量）の菌体を得た。ミニジャー１基あたりから回収した菌体を約１６〜１７ｍＬの破砕バッファー（５０ｍＭ Tris-HCl、ｐＨ７．５、０．１Ｍ塩化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤（Roche社製））で懸濁しながらメスアップして、２０ｍＬの菌体懸濁液を調製した。続いて、調製した２０ｍＬの各菌体懸濁液に、同容量のガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）を入れて破砕機で４回破砕（２５００ｒｐｍ／６０秒破砕）し、菌体破砕液１３ｍＬを回収した。残りのガラスビーズに付着した粉砕菌体を新たに５ｍＬの破砕バッファーで洗い、この洗い液を先の菌体破砕液に加えた。これを５０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を採取した。アポリポタンパク質Ａ−IIの発現量は２ｍｇ／Ｌであった。
調製した上清について、次の２種類のHis-Tagカラムを使用して精製を行った。まず、上清５４ｍＬを２０ｍＬのTALON Single Step Column（Clontech社製）に負荷し、５００ｍＭイミダゾールを含む溶出バッファー２ｍＬにて溶出した。この溶出液をＤＷで３倍希釈した後、０．６ｍＬのHis Spin Trap Column(GE Healthcare社製)に負荷し、５００ｍＭイミダゾールを含む溶出バッファー０．２ｍＬにて溶出した。
次に、溶出液を０．５ｍＬの高速遠心ろ過カラムVIVA SPIN500 (Sartorius社製)を用い、濃縮並びにＰＢＳバッファー交換（ｐＨ７．５）を実施し、アポリポタンパク質Ａ−IIを含有する製剤を得た。
【実施例９】
【００３４】
動物実験１
実験用に、７週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）２２匹を準備した。そのうちの８匹に、実施例１で調製したアポリポタンパク質Ａ−IIを４ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（Ａ−II投与群）。１０分後、Ａ−II投与群の８匹と他の８匹（対照群）の計１６匹に、ガラクトサミン塩酸塩（Sigma社製）７００ｍｇ／ｋｇとリポポリサッカライド（E. coli 0111:B4、Sigma社製）５０μｇ／ｋｇの劇症肝炎惹起薬剤を腹腔内に単回投与した。一方、アポリポタンパク質Ａ−IIおよび劇症肝炎惹起薬剤のいずれも投与しなかったマウス６匹を正常群とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤を投与してから６時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血清を得た。この血清中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と対照群に対するＡ-II投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Excel、Microsoft）を行った。
その結果を表２に示した。【００３５】
【表２】
2008133225.tif 000003
表２に示されるように、対照群では、正常群と比較して血中のＡＬＴおよびＡＳＴの増加が顕著に認められた。しかし、対照群で認められた肝機能の高度な障害は、Ａ−II製剤投与群では顕著に抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−II製剤による劇症肝炎の予防効果が確認された。Ａ−II製剤投与群において、Ａ−II製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例１０】
【００３６】
動物実験２
実験用に７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）を１８匹準備した。そのうちの８匹に、実施例３で調製したアポリポタンパク質Ａ−IIを３ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（Ａ−II投与群）。１０分後に、Ａ−II投与群８匹と他の６匹（対照群）の計１４匹に、劇症肝炎惹起剤としてコンカナバリンＡＴｙｐｅIV（Sigma社製）を１５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した。また、アポリポタンパク質Ａ−II製剤もコンカナバリンＡも投与しなかったマウス４匹を正常群とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤を投与してから８時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血清を得た。この血清中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と対照群に対するＡ−II投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Excel、Microsoft）を行った。
結果を表３に示した。【００３７】
【表３】
2008133225.tif 000004
表３に示したとおり、対照群では、正常群と比較して血中のＡＬＴおよびＡＳＴの増加が顕著に認められた。しかし対照群で認められた肝機能の高度の障害は、Ａ−II投与群で顕著に抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−II製剤による劇症肝炎の予防効果が確認された。Ａ−II製剤投与群において、Ａ−II製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例１１】
【００３８】
動物実験３
実験用に７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）１８匹を準備した。そのうちの８匹に実施例３で調製したアポリポタンパク質Ａ−IIを１３ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（Ａ−II投与群）。１０分後、Ａ−II投与群８匹と他の６匹の計１４匹に、劇症肝炎惹起剤としてコンカナバリンＡＴｙｐｅIV（Sigma社製）を１５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した。また、アポリポタンパク質Ａ−II製剤も劇症肝炎惹起剤も投与しなかったマウス４匹を正常群とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤を投与してから８時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血清を得た。この血清中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と対照群に対するＡ−II投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Excel、Microsoft）を行った。
結果を表４に示した。【００３９】
【表４】
2008133225.tif 000005
表４に示したとおり、対照群では、正常群と比較して血中のＡＬＴおよびＡＳＴの増加が顕著に認められた。しかし対照群で認められた肝機能の高度の障害は、アポリポタンパク質Ａ−II製剤投与群で顕著に抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−II製剤による劇症肝炎の予防効果が確認された。Ａ−II製剤投与群において、Ａ−II製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例１２】
【００４０】
動物実験４
実験用動物として、８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）１６匹を準備した。そのうち４匹に実施例１で調製されたアポリポタンパク質Ａ−IIを３００ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（Ａ−II投与群）。１０分後、Ａ−II投与群４匹と他の６匹（対照群）の計１０匹に、劇症肝炎惹起剤抗としてＦａｓ抗体（Becton Dickinson社製）を２００μｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回投与した。アポリポタンパク質Ａ−II製剤も抗Ｆａｓ抗体も投与しなかったマウス６匹を正常群とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤を投与してから４時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血清を得た。この血清中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と対照群に対するＡ-II投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Excel、Microsoft）を行った。
結果を表５に示した。【００４１】
【表５】
2008133225.tif 000006
表５に示したとおり、対照群では、正常群と比較して血中のＡＬＴおよびＡＳＴの増加が顕著に認められた。しかし対照群で認められた肝機能の高度の障害は、アポリポタンパク質Ａ−II製剤投与群で顕著に抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−II製剤による劇症肝炎の予防効果が確認された。Ａ−II製剤投与群において、Ａ−II製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例１３】
【００４２】
動物実験５
実験動物として、３２匹の７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）を用いた。
そのうちの２１匹には、コンカナバリンＡＴｙｐｅIV（Sigma社製）を１５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回投与し、何らかの処置を施さないと劇症肝炎を発現するという肝障害モデルマウスを作製した。肝障害モデルマウス１０匹に、コンカナバリンＡ投与１時間後、実施例１で調製したアポリポタンパク質Ａ−IIを１００ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（Ａ−II投与群）。残りの肝障害モデルマウス１１匹には、アポリポタンパク質Ａ−IIを投与しなかった（対照群）。コンカナバリンＡもアポリポタンパク質Ａ−IIも投与しなかったマウス１１匹を正常群とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤を投与してから２４時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血清を得た。この血清中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と対照群に対するＡ−II投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Excel、Microsoft）を行った。
結果を表６に示した。【００４３】
【表６】
2008133225.tif 000007
表６に示したように、対照群では正常群と比較してＡＬＴおよびＡＳＴの増加が認められた。しかし、対照群で認められた肝機能の高度な障害は、アポリポタンパク質Ａ−II製剤投与群で顕著に抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−II製剤による劇症肝炎の治療効果が確認された。Ａ−II製剤投与群において、Ａ−II製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例１４】
【００４４】
動物実験６
実験動物として、３２匹の７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）を用いた。
そのうちの２１匹には、コンカナバリンＡＴｙｐｅIV（Sigma社製）を１５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与し、何らかの処置を施さないと劇症肝炎を発現するという肝障害モデルマウスを作製した。肝障害モデルマウス１０匹に、コンカナバリンＡ投与１時間後、実施例１で調製したアポリポタンパク質Ａ−IIを５００ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（Ａ−II投与群）。残りの肝障害モデルマウス１１匹には、アポリポタンパク質Ａ−IIを投与しなかった（対照群）。コンカナバリンＡもアポリポタンパク質Ａ−IIも投与しなかったマウス１１匹を正常群とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤を投与してから２４時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血清を得た。この血清中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と対照群に対するＡ−II投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Excel、Microsoft）を行った。
結果を表７に示した。【００４５】
【表７】
2008133225.tif 000008
表７に示したように、対照群では、正常群と比較してＡＬＴおよびＡＳＴの増加が認められた。しかし、対照群で認められた肝機能の高度な障害は、アポリポタンパク質Ａ−II製剤投与群では顕著に抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−II製剤による劇症肝炎の治療効果が確認された。Ａ−II製剤投与群において、Ａ−II製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【実施例１５】
【００４６】
動物実験７
実験動物として、２４匹の７週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）を用いた。
そのうちの１６匹には、コンカナバリンＡＴｙｐｅIV（Sigma社製）を１５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与し、何らかの処置を施さないと急性肝炎を発現するという肝障害モデルマウスを作製した。実施例１で調製したアポリポタンパク質Ａ−IIを上記肝障害モデルマウス８匹に、コンカナバリンＡ投与１時間後に、５００ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した（Ａ−II投与群）。残りの肝障害モデルマウス８匹には、アポリポタンパク質Ａ−IIを投与しなかった（対照群）。コンカナバリンＡもアポリポタンパク質Ａ−IIも投与しなかったマウス８匹を正常群とした。
アポリポタンパク質Ａ−II製剤を投与してから２４時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血清を得た。この血清中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と対照群に対するＡ−II投与群の効果について、それぞれスチューデントのｔ検定（Excel、Microsoft）を行った。
結果を表８に示した。【００４７】
【表８】
2008133225.tif 000009
表８に示したように、対照群では、ＡＬＴおよびＡＳＴの増加が正常群と比較して認められた。しかし、対照群で認められた肝機能の高度な障害は、実施例１のアポリポタンパク質Ａ−II投与群で顕著に抑制された。この実験により、アポリポタンパク質Ａ−IIによる急性肝炎の治療効果が確認された。Ａ−II製剤投与群において、Ａ−II製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
近年、日本でも急性肝炎から劇症肝炎へと移行する症例が増える傾向にある。しかし、患者の自覚症状、医師の注意深い診断から、医療機関では患者の劇症肝炎化を予知し、本発明の急性肝炎の治療、劇症肝炎の予防・治療剤を適切な時期に投与することにより、急性肝炎を治癒し、劇症肝炎への進行を未然に防止することができる。またたとえ、劇症肝炎を発症してしまっていても、本発明の薬剤を投与することにより、その症状を緩和することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を示す。図中、左端の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。（１）は分子量マーカー、（２）は実施例１の製剤（非還元）、（３）は実施例４の製剤（非還元）、（４）は実施例１の製剤（還元）、（５）は実施例４の製剤（還元）、（６）は分子量マーカーを示す。
【図２】ウエスタンブロッティング電気泳動像を示す。（１）は実施例１の製剤（非還元）、（２）は実施例４の製剤（非還元）、（３）は実施例１の製剤（還元）および（４）は実施例４の製剤（還元）を示す。
【図３】実施例１の製剤（血漿由来アポリポタンパク質Ａ−II）のペプチドマップを示す。
【図４】実施例４の製剤（遺伝子組換えアポリポタンパク質Ａ−II）のペプチドマップを示す。１７分付近にHis-Tagに関するピーク（矢印）が検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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