(57)【要約】  本発明は、標的物質と相互作用を有する物質（例えば抗体、ペプチド）を迅速かつ効率的にスクリーニングする方法に関する。本発明のファージによる遺伝子導入を利用する新たなバクテリアツーハイブリッド法、およびバクテリアツーハイブリッド法にファージディスプレイシステムを組み合わせるスクリーニング方法により、標的物質と相互作用を有する物質（例えば抗体、ペプチド）を迅速かつ効率的にスクリーニングすることができる。
2008130027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と相互作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、ａ）ライブラリー遺伝子を含むバクテリオファージライブラリーを調製する工程、
ｂ）標的物質をコードする遺伝子を組み込んだベイトベクターを含む大腸菌に前記ファージを感染させ、ライブラリー遺伝子を含むプレイベクターを大腸菌に導入する工程、
ｃ）標的物質と相互作用を有する物質をコードする遺伝子を含むプレイベクターが導入された大腸菌を選択する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
さらに、
ｄ）工程ｃ）に続いて、大腸菌にヘルパーファージを感染させ、相互作用を有する物質がファージ表面にディスプレイされたファージを得る工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、
ｄ’）工程ｃ）に続いて、大腸菌にヘルパーファージを感染させ、相互作用を有する物質が培養液中に分泌させる工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
大腸菌においてサプレッサー変異の有無を使い分けることにより相互作用を有する物質が培養液中に分泌させる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
標的物質が抗原である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
相互作用を有する物質が抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ライブラリーが一本鎖抗体ライブラリーである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含むスクリーニング方法により得られる物質：
ａ）ライブラリー遺伝子を含むバクテリオファージライブラリーを調製する工程、
ｂ）標的物質をコードする遺伝子を組み込んだベイトベクターを含む大腸菌に前記ファージを感染させ、ライブラリー遺伝子を含むプレイベクターを大腸菌に導入する工程、
ｃ）標的物質と相互作用を有する物質をコードする遺伝子を含むプレイベクターが導入された大腸菌を選択する工程。
【請求項９】
前記スクリーニング方法において、さらにｄ）工程ｃ）の続いて、大腸菌にヘルパーファージを感染させ、相互作用を有する物質がファージ表面にディスプレイされたファージを得る工程を含む、請求項８記載の物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージを用いてライブラリー遺伝子を導入する改良バクテリアツーハイブリッド法、バクテリアツーハイブリッド法とファージディスプレイ法の組合せによるスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1975年にMilsteinらによりハイブリドーマ技術が確立されたことで、モノクローナル抗体が研究及びヘルスケアの面でいかに有用であるかが知られるようになった。その後、遺伝子クローニング技術の進歩により、抗体遺伝子を単離、また大腸菌や哺乳動物細胞での抗体発現が可能となった（非特許文献１）。しかし、ハイブリドーマの作成には抗原免疫、親細胞株とのフュージョン、HATセレクション、そしてスクリーニングと大変な時間がかかる。【０００３】
1985年にはSmithにより、繊維状バクテリオファージ上にタンパク質を発現させる技術が確立され（非特許文献２）、その技術を用いて1990年にMcCaffertyらが抗体分子を繊維状バクテリオファージ上に発現させる、ファージディスプレイのシステムを作り上げた（非特許文献３）。数年後には、このファージディスプレイシステムは、抗体レパートリーを増やすことのできるPCR法を基盤とした技術の進歩と組み合わさり、リコンビナント抗体ライブラリーから多くのモノクローナル抗体を単離できるようになった（非特許文献４）。【０００４】
現在でも非常に多くの研究者によってファージディスプレイシステムは用いられており、それを応用した技術、例えばリボゾームディスプレイ、mRNA ディスプレイ、酵母細胞ディスプレイなども主要なモノクローナル抗体単離技術として使われている（非特許文献５）。しかしながら、これらのディスプレイシステムを用いるためには、精製したタンパク質を抗原として用いることが必要であり、その抗原準備に時間を要するし、偽陽性クローンが多いことも問題の一つである。【０００５】
一方、1989年にFieldsとSongは生きた酵母内でタンパク質間の相互作用を見ることができる酵母ツーハイブリッドシステムを確立し（非特許文献６）、多くの研究者が細胞内でのタンパク質間相互作用の解析に用いることとなった。1990年代になり、細胞内で機能的な抗体断片を発現させ、細胞内にある抗原と結合させる方法も見出され(細胞内発現法)、細胞内で抗原特異的なモノクローナル抗体を単離する方法が模索され始めた。1999年にはVisintinらにより酵母内でツーハイブリッドシステムを応用したモノクローナル抗体の単離に成功し、それ以後、多くの研究者がこのシステムに改良を加え、現在では細胞内抗体捕捉技術（Intracellular Antibody Capture Technology (IACT)）として確立した技術となっている。【０００６】
ツーハイブリッドシステムは、酵母を用いた系にとどまらず、哺乳類培養細胞やバクテリア内でも行えるようになった（非特許文献７）。現在ではストラタジーン社より、BacterioMatch II ツーハイブリッドシステムとしてキットが市販されている（非特許文献８）。2001年にはMossnerらにより、大腸菌内でのモノクローナル抗体の単離に成功している。ツーハイブリッドシステムは抗原の遺伝子情報があれば用いる宿主細胞内で抗原を発現させるため、抗原タンパク質の精製は必要が無いため、すばやくスクリーニングを開始することができる点で優れていると言える。【０００７】
酵母ツーハイブリッド法とバクテリアツーハイブリッド法の違いは、用いるホストが酵母であるか大腸菌であるかが違う以外には大きな違いはない。しかし大腸菌の成長は酵母と比べると何倍も早く、通常コロニーを目視できるまで24時間以内である。また、遺伝子導入効率も酵母と比較すると約1000倍高い。ツーハイブリッドシステムでは抗原をコードする遺伝子を含むプラスミドとライブラリー・プラスミドを同時に宿主に導入しなければならない。これらの理由から、大きな多様性を持つライブラリーをスクリーニングするには、酵母を用いるより有利だといえる。しかし、それでも巨大なライブラリーを全てスクリーニングするには、何度もエレクトロポレーションによる遺伝子導入を繰り返さなければならない。
【非特許文献１】Winter, G & Milstein, C. Man-made antibodies. Nature 349, 293-299 (1991).
【非特許文献２】Smith, G. Filamentous fusion phage： novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228, 1315-1317(1985).
【非特許文献３】McCafferty, J., Griffiths, AD., Winter, G., Chiswell, DJ. Phage antibodies： filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348, 552-554. (1990).
【非特許文献４】Winter, G., Griffiths, AD., Hawkins, R.E. & Hoogenboom, H.R. Making antibody by phage display technology. Annu Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994).
【非特許文献５】Hoogenboom, H.R. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol 23, 1105-1116 (2005). Review.
【非特許文献６】Fields, S. & Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245-246 (1989)
【非特許文献７】Visintin, M., Tse, E., Azelson, H., Rabbitts, T.H. & Cattaneo, A. Selection of antibodies for intracellular function using a two-hybrid in vivo system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11723-11728 (1999).
【非特許文献８】BacterioMatch II Two-Hybrid Syste Vector Kit Instruction Manual
【発明の開示】
【０００８】
このように、さまざまな方法でモノクローナル抗体を得る方法が確立されている。しかし、それぞれの方法には利点と欠点があり、使用する者によって使い分けられているのが現状である。現在直面している大きな課題は、いかに迅速かつ効率よく抗体等を得ることができるかであり、それを可能ならしめる方法の提供が切望されている。
【０００９】
本発明は、上記の現状に鑑み、標的物質と相互作用を有する物質（例えば抗体、ペプチド）を迅速かつ効率的にスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、まずツーハイブリッドシステムに必要な遺伝子群を有する、大きなバクテリオファージライブラリーを作成し、それらファージによる遺伝子導入を利用する新たなツーハイブリッド法を考えた。ファージを用いることで、ターゲットタンパク質遺伝子が挿入されたベイトプラスミドを持つ大腸菌液に、ファージ液を加えるだけでライブラリー・プレイ遺伝子が導入されることになる。これにより、何回ものエレクトロポレーションを行う必要がなくなる。これは、労力・時間の大幅な削減だけではなく、多数のターゲットに対するスクリーニングの際、同じ遺伝子導入効率の条件下で行えるという利点もある。
【００１１】
また、バクテリオファージを利用したバクテリアツーハイブリッドシステムへの遺伝子運搬導入法に用いるプラスミドDNAをさらに改良すれば、ファージディスプレイシステムをも用いることができる。これは、前記したようなツーハイブリッドシステムでの偽陽性クローンの問題を容易に解決する方法として、また、陽性クローンの特性・機能解析に有用である。
【００１２】
このような発想に基づき、鋭意検討した結果、ファージによる遺伝子導入を利用する新たなバクテリアツーハイブリッド法、およびバクテリアツーハイブリッド法にファージディスプレイシステムを組み合わせるスクリーニング方法を完成させ、供試物質と相互作用を有する物質（例えば抗体、ペプチド）を迅速かつ効率的にスクリーニングする方法の提供が可能となった。さらには、大腸菌株においてサプレッサー変異の有無を使い分けることにより、scFvを分泌型タンパク質として得ることもできることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、標的物質と相互作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、ａ）ライブラリー遺伝子を含むバクテリオファージライブラリーを調製する工程、ｂ）標的物質をコードする遺伝子を組み込んだベイトベクターを含む大腸菌に前記ファージを感染させ、ライブラリー遺伝子を含むプレイベクターを大腸菌に導入する工程、ｃ）標的物質と相互作用を有する物質をコードする遺伝子を含むプレイベクターが導入された大腸菌を選択する工程を含む方法に関する。
【００１４】
また本発明は、さらにｄ）工程ｃ）に続いて、大腸菌にヘルパーファージを感染させ、相互作用を有する物質がファージ表面にディスプレイされたファージを得る工程を含む方法に関する。
【００１５】
また本発明は、さらにｄ’）工程ｃ）に続いて、大腸菌にヘルパーファージを感染させ、相互作用を有する物質が培養液中に分泌させる工程を含む方法に関する。
【００１６】
さらに本発明は、前記方法において、サプレッサー変異の有無を使い分けることにより相互作用を有する物質が培養液中に分泌させる方法に関する。
【００１７】
また本発明は、以下の工程を含むスクリーニング方法により得られる物質に関する：ａ）ライブラリー遺伝子を含むバクテリオファージライブラリーを調製する工程、ｂ）標的物質をコードする遺伝子を組み込んだベイトベクターを含む大腸菌に前記ファージを感染させ、ライブラリー遺伝子を含むプレイベクターを大腸菌に導入する工程、ｃ）標的物質と相互作用を有する物質をコードする遺伝子を含むプレイベクターが導入された大腸菌を選択する工程。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、バクテリオファージを用いてライブラリー遺伝子を大腸菌に導入する改良バクテリアツーハイブリッド法、およびバクテリアツーハイブリッド法とファージディスプレイ法の組合せによるスクリーニング方法の概念図である。
【図２】図２は、BacterioMatch II ツーハイブリッドシステムを示す。
【図３】図３は、pAZM1プレイベクターを示す。
【図４】図４は、pAZM1-Gal11pポジティブコントロールプレイベクターを示す。
【図５】図５は、ファージレスキューの検討結果を示す。
【図６】図６は、ファージにより運搬されたプレイベクターによりバクテリアツーハイブリッドシステムが作動するかの確認試験結果を示す。
【図７】図７は、pAZM2ベクターを示す。
【図８】図８は、pAZM1-Gal11pベクターと示す。
【図９】図９は、Stuffer配列を付加したpAZM1ベクターを示す。
【図１０】図１０は、Stuffer配列を付加したpAZM1ベクターを示す。
【図１１】図１１は、最終の基本ベクターを示す。
【図１２】図１２は、一本鎖抗体としての抗原結合性確認試験方法を示す。
【図１３】図１３は、コントロール・ベイトベクターを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（１）バクテリオファージを用いてライブラリー遺伝子を大腸菌に導入する改良バクテリアツーハイブリッド法（図１）
ツーハイブリッドシステムでは抗原をコードする遺伝子を含むプラスミドとライブラリー・プラスミドを同時に宿主に導入しなければならない。これらの理由から、大きな多様性を持つライブラリーをスクリーニングするには、酵母を用いるよりバクテリアの方が有利だといえる。しかし、それでも巨大なライブラリーを全てスクリーニングするには、何度もエレクトロポレーションによる遺伝子導入を繰り返さなければならない。【００２０】
ここで、例えば１×１０12個の多様性を持つプラスミドライブラリーを全てスクリーニングする場合、何回のエレクトロポレーションが必要かを考える。【００２１】
手元にあるコンピーテント細胞が1×１０10CFU／μg CFU(大変良い導入効率であるとの仮定)であり、一回のエレクトロポレーションで使用するプラスミドDNAの最適量が100ngとすると、1μgのプラスミドDNAを導入するためには、10回のエレクトロポレーションが必要となる。使用するプラスミドDNA (5Kb)の平均分子量が3,250,000の場合、1×1012分子のプラスミドDNAを得るためには約5.4μg必要となる。つまり、1×１０12の多様性を持つプラスミドDNAを全て大腸菌に導入するためには54回のエレクトロポレーションが必要ということになる。しかし、これは全てのプラスミドに重複がない場合で、通常はこの何倍もの回数を重ね、全ての多様性をスクリーニング出来たとするため非常に多くの時間と労力がかかる。また、この方法を用いるためには、高効率のコンピーテント細胞や高純度のプラスミドDNAが必要であり、またエレクトロポレーション用キュベットなど多くの器材を要する。ただ一つのターゲットタンパク質に対するスクリーニングならともかく、複数のタンパク質をターゲットとする場合はとても効率的とは言えない。【００２２】
本発明の方法では、まずツーハイブリッドシステムに必要な遺伝子群を有する大きなバクテリオファージライブラリーを作成し、それらファージによる遺伝子導入を利用する。ファージを用いることで、ターゲットタンパク質遺伝子が挿入されたベイトプラスミドを持つ大腸菌液に、ファージ液を加えるだけでライブラリー・プレイ遺伝子が導入されることになる。これにより、何回ものエレクトロポレーションを行わなくても良くなる。これは、労力・時間の大幅な削減だけではなく、多数のターゲットに対するスクリーニングの際、同じ遺伝子導入効率の条件下で行えるという利点もある。
（２）バクテリアツーハイブリッド法とファージディスプレイ法の組合せによるスクリーニング方法（図１）
本発明のスクリーニング方法は、ファージによる遺伝子導入を利用する新たなツーハイブリッド法にファージディスプレイシステムを組み合わせることによる、迅速かつ効率的な、供試物質と相互作用を有する物質（例えば抗体、ペプチド）のスクリーニングする方法である。【００２３】
例えば一本鎖抗体(scFv)ライブラリーをスクリーニングする場合、バクテリアツーハイブリッド法によりポジティブクローンが単離できる。その単離バクテリアにヘルパーファージを感染させ、新たに生み出されるファージ表面にscFvを発現させることができる。つまり、１次スクリーニングによって単離した抗体遺伝子の再確認や解析を、scFvを体表面に有するファージを抗体分子として用いるELISA、FACS、ウェスタンブロットなどで簡便に行うことができる。【００２４】
本発明のスクリーニング方法によれば、あるターゲットタンパク質に対する抗体を1週間以内で単離し、解析することが可能になる。以下に予期される最短のスクリーニング日程を記す。【００２５】
第一日目：ターゲットタンパク質をコードする遺伝子をベイトベクターにクローニングし、レポーター大腸菌株に形質転換する。【００２６】
第二日目：形質転換大腸菌株を液体培養し、増殖期にファージライブラリーを感染させ、選択培地上で培養する。【００２７】
第三日目：陽性コロニーを液体培地で培養し、ヘルパーファージを感染させ、陽性遺伝子を基にしたタンパク質をウイルス表面に発現するファージをレスキューする。【００２８】
第四日目：ELISA、ウェスタンブロット、FACS解析等により、陽性再確認及び特性・機能解析を行う。【００２９】
抗体は、例えば新型鳥インフルエンザが発生した際、そのインフルエンザウイルスの検査に用いられるだけでなく、ウイルス中和抗体としても有用である。
（３）サプレッサー変異の有無の使い分け
大腸菌株においてサプレッサー変異の有無を使い分けることにより、scFvを分泌型タンパク質として得ることもできる。【００３０】
例えば、アンバーストップコドン(TAA)を利用することによりscFvを分泌型タンパク質として得ることができる。BMR大腸菌株はアンバーサプレッサー変異株であり、このストップコドンはストップとして認識されず、グルタミン酸に翻訳される。サプレッサー変異の無い大腸菌株ではストップコドンとして認識され、ここで翻訳が停止し、一本鎖抗体が培養上清中に分泌され、精製が容易にできる。【００３１】
このことにより、単離陽性クローンの2次スクリーニング、及び特性・機能解析の簡便化が可能となる。【００３２】
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例
＜実施例１＞  バクテリアツーハイブリッド／ファージディスプレイシステム用プレイベクター及びコントロールプレイベクターの基本骨格の作成
プラスミドベクターのバックボーンはファージミドベクターであるpBluescriptII SK （＋） ベクターを用いた。【００３３】
Stratagene社よりBacterioMatch II ツーハイブリッドシステムベクターキット (Cat. ＃240065)（図２）を購入し、付属のプラスミドベクターを全てXL-1 Blue MRF-株の大腸菌に導入し、プラスミドを増幅、精製した。【００３４】
pTRGベクター、 pTRG-GaL11pコントロールベクターをNheIとSpeIで消化し、プロモーター部位、RNAP-alpha遺伝子、マルチクローニングサイトを含む断片を得、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端とした後、リン酸化した。それらをPvuIIで消化し、脱リン酸化処理したpBluescriptII SK （＋） ベクターのバックボーンとライゲーションし、大腸菌にトランスフォームした。インサートの有無、及びインサートの方向を調べるために、6個のコロニーからプラスミドを調整し、DraIIIとXhoIで消化後、電気泳動を行った。RNAP-alpha遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子(bla)と同方向のものを（＋）、逆方向のものを（−）とし、以下のようにプラスミド名を決定した（図３および４）。
pAZM1（＋）：  プレイベクター
pAZM1（−）：  プレイベクター
pAZM1-Gal11p（＋）：  ポジティブコントロールプレイベクター
pAZM1-Gal11p（−）：  ポジティブコントロールプレイベクター
pAZM1 ベクターにはpBluescriptII SK （＋） ベクター由来のss-DNA複製のf1 origin が存在し、ヘルパーファージの感染により、新たに作り出される子ファージ中にプラスミドのレプリカが一本鎖DNAの形態で挿入される。このファージが新たな宿主大腸菌に感染した際、その一本鎖DNAが2本鎖プラスミドDNAの形で大腸菌内に複製される。【００３５】
pAZM1がヘルパーファージにより子ファージ中に取り込まれ、新たな宿主に伝搬されるかをポジティブコントロールプレイベクター pAZM1-Gal11p（＋）を用いて検討した。この際、宿主は全てバクテリアツーハイブリッドシステムで用いるレポーター大腸菌であるBacterioMatch II スクリーニング用レポーター大腸菌(BMR大腸菌株)を用いた。【００３６】
pAZM1-Gal11p（＋）、pAZM1-Gal11p(−)、ポジティブコントロールとしてpBluescriptII SK（＋）、ネガティブコントロールとしてpBTをBMR大腸菌株にトランスフォームし、単一コロニーを600nmの吸光度が0.8になるまで培養した。それらにM.O.I.が20になるようにM13KO7ヘルパーファージを30分間感染させ、その後培地を交換し、一晩培養した（ファージレスキュー）。その培養上清を回収し、あらかじめ培養しておいたBMR大腸菌に加え、30分間インキュベート後にアンピシリンを含むLBプレート培地にまき、一晩培養した。pAZM1-Gal11p（＋）、ｐAZM1-Gal11p（−）及び、ポジティブコントロールとして用いたpBluescriptII SK （＋）由来の培養液を用いたものは大腸菌コロニーが見られたが、ネガティブコントロールのpBT由来のものは見られなかった（pBT以外にはf1 originが存在し、かつアンピシリン耐性遺伝子を持つ）。よって、作成したpAZM1ベクターは、ファージによる運搬が上手く行われることを確認できた（図５）。
＜実施例２＞  ファージにより運搬されたプレイベクターによりバクテリアツーハイブリッドシステムが作動するかの確認
検証プラスミドベクターとしてpAZM1-Gal11p（＋）、pAZM1-Gal11p（−）を、ネガティブコントロールとしてpAZM1（＋）、pAZM1（−）、pBluescriptII SK （＋）を用いて、実験を行った。まずそれぞれをトランスフォームした大腸菌からファージをレスキューし、レスキュー・ファージ液とした。【００３７】
BacterioMatch II ツーハイブリッドシステムベクターキットに付属のpBT ベクター pBT-LGF2 ベクターをあらかじめトランスフォームした大腸菌液にレスキュー・ファージ液を加え感染後、LBプレート培地にまき一晩培養した。コントロール培地であるアンピシリン・クロラムフェニコールを含むプレートには全てで大腸菌コロニーが見られた（pBluescriptII SK （＋）をバックボーンとするベクターはアンピシリン耐性遺伝子を、pBTベクターがクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つ）。試験培地であるアンピシリン・クロラムフェニコール及びストレプトマイシンを含むプレートではpAZM1-Gal11p（＋）、pAZM1-Gal11p（−）由来のレスキュー・ファージを感染させたものだけに多くのコロニーが検出できた（システム・インターラクション・コントロールであるGal11タンパク質とGal4トランスクリプションアクティベータータンパク質の相互作用があるものに限り、BMR大腸菌株にあらかじめ存在するストレプトマイシン耐性遺伝子が発現し、試験培地で生存できる）。これにより、ファージにより運搬されたプレイベクターによりバクテリアツーハイブリッドシステムが動くことが確認できた（図６）。
＜実施例３＞  完全なバクテリアツーハイブリッド／ファージディスプレイシステム用プレイベクターの作成
ファージ表面に抗体分子をディスプレイされるためには、１）ファージ膜タンパク質をコードする遺伝子にディスプレイしたいタンパク質遺伝子をつなぎ、フュージョンタンパク質の形で大腸菌内に発現させること、２）発現したフュージョンタンパク質を大腸菌膜表層に移行させるため、リーダー配列（leader sequence）を付加することが必要である。【００３８】
また、最終的なプレイベクターは一本鎖抗体ライブラリー遺伝子を挿入するため、Stuffer配列を付加することとした。【００３９】
まず、リーダー配列を得るため、pET22bをPCRのテンプレートとし、pelB リーダーの断片を得た。その際使用したアンチセンス・プライマーにはXbaIサイトを付加してあり、PCR断片をXbaIで消化することにより、断片の両端にXbaI消化部位ができる。pAZM1ベクターのRNAP alphaとそのプロモーターの間にはXbaI消化部位が存在する。よって、pAZM1（＋）、pAZM1（−）、pAZM1-Gal11p（＋）、pAZM1-Gal11p（−）をそれぞれXbaIで消化し、脱リン酸化し、PCR断片を挿入した。インサートの有無、及びインサートの方向を調べるために大腸菌コロニーPCRを行い、陽性クローンのプラスミドを調整しXbaI消化による再チェックを行った。それぞれ以下のようにプラスミド名を決定した（図７および８）。
pAZM2（＋）：  pelBリーダー配列を有するプレイベクター
pAZM2（−）：  pelBリーダー配列を有するプレイベクター
pAZM2-Gal11p（＋）：  pelBリーダー配列を有するポジティブコントロールプレイベクター
pAZM2-Gal11p（−）：  pelBリーダー配列を有するポジティブコントロールプレイベクター
ここで再度、簡単にバクテリアツーハイブリッドシステムが働くか検討したところ、（−）クローンが優位に働くことが分かった。これは大腸菌内でのRNAP alphaタンパク質の発現量によるものだと考えられる。よって、これ以後は（−）クローンをベースとしてベクターを作成することとした。【００４０】
一本鎖抗体ライブラリー遺伝子を挿入するための、Stuffer配列を付加するために約400bpのヒトkappa軽鎖の遺伝子をテンプレートとして、センス・アンチセンス、各2本のプライマーでPCRを行った。その際、センスプライマー側にはBamHIサイトと(GGGGS)x3のフレキシブルリンカーを、アンチセンスプライマー側にはc-Myc、6xHisタグ及びEcoRIサイトが付加され、Hisタグの後にアンバーストップコドン(TAA)を挿入した（BMR大腸菌株はアンバーサプレッサー変異株であり、このストップコドンはストップとして認識されず、グルタミン酸に翻訳される。サプレッサー変異の無い大腸菌株ではストップコドンとして認識され、ここで翻訳が停止し、一本鎖抗体が培養上清中に分泌され、精製が容易にできる）。またそれぞれ、一本鎖抗体ライブラリー遺伝子が５’側がSfiIサイト、３’側がNotIサイトで挿入可能なように設計した。そのPCR断片をBamHI及びEcoRIで消化した pAZM2（−）プラスミドバックボーとライゲーションし、大腸菌にトランスフォームした。同時にBacterioMatch II ツーハイブリッドシステムベクターキットに付属のオリジナルのプレイベクターであるpTRGと、ファージ表面に抗体分子はディスプレイはされないが、ファージによりプラスミドが伝搬されることが既知のpAZM1（−）ベクターにもStuffer配列を付加した（図９及び１０）。【００４１】
これらのインサートの有無を調べるために大腸菌コロニーPCRを行い、陽性クローンのシーケンスを確認した。それぞれ以下のようにプラスミド名を決定した。
pAZM3（−）：  pelBリーダー配列とstufferを有するプレイベクター
pTRG-stuffer：   stuffer を有するKitオリジナルプレイベクター
pAZM1（−）stuffer：   stufferを有するファージによる遺伝子運搬可能なプレイベクター
次に、一本鎖抗体をファージ表面に、フュージョンタンパク質の形でディスプレイさせるために、ファージ膜タンパク質の一つであるgIIIタンパク質遺伝子の単離を試みた。この際、gIIIタンパク質のC末端のみがディスプレイに必要であることが知られていること、また、フュージョンタンパク質をなるべく小さくするためにgIIIタンパク質の198番目のアミノ酸以後の遺伝子が増幅されるようにプライマーを設計した。センスプライマーにはEcoRIサイトとスペーサーとして(GGGGS)x1を、アンチセンスプライマーにはストップコドン(TAG)とXhoIサイトを付加した。PCRのテンプレートとしてM13KO7ファージを感染させた大腸菌とM13KO7ファージをそのまま用いたが、両方ともに増幅された。その断片を一旦pBluescriptII SK（＋）にクローニングし、シーケンスを確認、EcoRIとXhoIで消化し、pAZM3（−）およびpAZM1（−）ベクターに組み込んだ。これらのインサートの有無を調べるために大腸菌コロニーPCRを行い、陽性クローンのシーケンスを確認した。それぞれ以下のようにプラスミド名を決定した（図１１）。
pAZM4（−）：  バクテリアツーハイブリッド／ファージディスプレイシステムのための最終プレイベクター
pAZM1（−）deltagIIIp：  ファージ運搬可能で、かつディスプレイ可能なプレイベクター
＜実施例４＞  一本鎖抗体が大腸菌内で抗原に結合し、バクテリアツーハイブリッドの系が作動するかの検証。【００４２】
本発明者らは、抗HEN 卵リゾチーム抗体を産生するハイブリドーマC3を有している。そのハイブリドーマ細胞からQuickPrep micro mRNA 精製キット(Amersham： Cat. #27-9255-01)を用いてｍRNAを精製した。それをテンプレートとし、oligo-dTでcDNA化し、マウス抗体重鎖・軽鎖遺伝子特異的なプライマーでPCR増幅した。重鎖と軽鎖の間には(GGGGS)x3のフレキシブルリンカーを挿入し、５’側にSfiIサイト、３’側にNotIサイトが付加されるように設計した。pBluescriptII SK （＋）にクローニング後、シーケンスを確認した。【００４３】
一本鎖抗体としての抗原結合性を確認するために、それら一本鎖抗体遺伝子をpcDNA3.1-Hing-MusStuffer ベクター（一本鎖抗体の下流にマウスIgG1のヒンジ領域以後の配列を付加させるために作成した、哺乳動物細胞用発現ベクター）にサブクローニングし、そのプラスミドDNAをHEK293T細胞株にトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後に細胞培養上清を回収し、培養上清中の抗体量を定量的ELISAにより測定した。そのサンプルのHELタンパク質に対する結合をELISAで測定した（図１２）。【００４４】
その結果、C３ハイブリドーマクローン由来の一本鎖抗体のHEL抗原への結合が見られたため、これらをpAZM4（−）、pAZM1（−）deltagIIIp及びpAZM1（−）stufferベクターに挿入し、一本鎖抗体バクテリアツーハイブリッド／ファージディスプレイシステムのコントロール実験用プレイベクターとした。またネガティブコントロールとして、ヒトT細胞表面抗原に特異的な抗体から得られた一本鎖抗体をそれぞれのベクターに組み込み、コントロール実験用ネガティブプレイベクターとした。それぞれ以下のようにプラスミド名を決定した。
pAZM4（−）Anti-HEL-C3
pAZM4（−）#48： コントロール実験用ネガティブプレイベクター
pAZM1（−）Anti-HEL-C3
pAZM1（−）＃48： コントロール実験用ネガティブプレイベクター
BMR大腸菌株にあらかじめ導入しておくコントロール・ベイトベクターを作成した（図１３）。本発明者らが有するHELをコードする遺伝子をテンプレートとし、５’側にNotIサイト、３’側にBamHIサイトが付加されるように設計したプライマーを用いてPCR増幅し、BacterioMatch II ツーハイブリッドシステムベクターキットに付属のpBTベクターに組み込み、BMR大腸菌株にトランスフォームした。これらのインサートの有無を調べるために大腸菌コロニーPCRを行い、陽性クローンのシーケンスを確認した(pBT-HEL)。【００４５】
一本鎖抗体バクテリアツーハイブリッド／ファージディスプレイシステムのコントロール実験を行うため、pAZM4（−）一本鎖抗体プラスミドを持つ大腸菌にヘルパーファージを感染させ、ファージをレスキューした。それらレスキューファージ液をpBT-HELを持つBMR大腸菌株及び、pBT エンプティーベクターを持つBMR大腸菌株に加えて感染させ、試験培地であるアンピシリン・クロラムフェニコール及びストレプトマイシンを含むLBプレート培地で培養した。pAZM4（−）Anti-HEL-C3由来のファージが感染した大腸菌では優位にコロニーが生育することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のファージによる遺伝子導入を利用する新たなバクテリアツーハイブリッド法、およびバクテリアツーハイブリッド法にファージディスプレイシステムを組み合わせるスクリーニング方法により、標的物質と相互作用を有する物質（例えば抗体、ペプチド）を迅速かつ効率的にスクリーニングすることが可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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