(57)【要約】  本発明の目的は、選択的にラフィノースを合成することが可能な新規α−ガラクトシダーゼを提供することである。本発明によれば、スクロースとガラクトースを原料とした脱水縮合反応において、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が０．５％以上のとき、ラフィノース合成選択率が６５％以上という性質を有するα−ガラクトシダーゼが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特性を有するα−ガラクトシダーゼ。
（１）作用：本酵素は、スクロースとガラクトースを原料とした脱水縮合反応において、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が０．５％以上のとき、ラフィノース合成選択率が６５％以上という性質を有する。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
【請求項２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物に由来する、請求項１記載のα−ガラクトシダーゼ。
【請求項３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ００３株、ＡＫＣ００４株（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８）、ＡＫＣ００５株、ＡＫＣ００６株のいずれかである請求項２記載のα−ガラクトシダーゼ。
【請求項４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ００３株、ＡＫＣ００４株（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８）、ＡＫＣ００５株、ＡＫＣ００６株のいずれかに属するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓおよびその変異体。
【請求項５】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼ。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【請求項６】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【請求項８】
請求項６又は７に記載のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項６又は７に記載のα−ガラクトシダーゼ遺伝子又は請求項８に記載の組み換えベクターを導入した形質転換体。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜３、５、又は１０のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物。
【請求項１２】
α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼから選択される少なくとも１種以上の成分をさらに含有する、請求項１１記載の酵素組成物。
【請求項１３】
請求項１１又は１２のいずれかに記載の酵素組成物を含むラフィノース合成試薬。
【請求項１４】
請求項１〜３、５、又は１０のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼ、請求項１１又は１２に記載の酵素組成物、若しくは請求項１３に記載のラフィノース合成試薬を用いることを特徴とするラフィノースの製造方法。
【請求項１５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
【請求項１６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ００３株、ＡＫＣ００４株（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８）、ＡＫＣ００５株、ＡＫＣ００６株のいずれかに属するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ及び／又はその変異体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
【請求項１７】
請求項９に記載の形質転換体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
【請求項１８】
生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が６５％以上である、請求項１４〜１７のいずれかに記載のラフィノースの製造方法。
【請求項１９】
原料としてスクロース及びガラクト−スを用いる、請求項１４〜１８のいずれかに記載のラフィノースの製造方法。
【請求項２０】
原料中のスクロース濃度が３０％（ｗ／ｖ）〜９０％（ｗ／ｖ）であり、原料中のガラクトース濃度が２％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）である、請求項１９に記載のラフィノースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なα−ガラクトシダーゼ、および、それらを用いたラフィノースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活・社会生活が多様化する中で、健康に対する意識向上から消費者の食品や食品素材等への関心が高まっている。その中で、ラフィノースは、腸内細菌叢を改善する等の機能を有することが認められ、飲食品や医薬品、香粧品等あるいは、その原料として注目を浴びている。さらに最近では、免疫腑活作用やアトピー性皮膚炎に対してもラフィノースが有用であることが明らかとなってきている。【０００３】
現在、ラフィノースは、ビート糖製造の際の副産物として回収されているが、ビート中のラフィノース含有量は０．１％程度に過ぎず、生産量は、主生産物である砂糖の生産量にも関わってくるため、ラフィノース増産には限界がある。【０００４】
従って、このような有用特性をもつラフィノースを安価かつ安定的に市場へ供給するために、天然物からの抽出品のみでなく、安価な原料からの合成品が求められている。【０００５】
これまでに試みられている、ラフィノースの合成方法としては、α−ガラクトシダーゼによる触媒作用を利用した方法が挙げられ、スクロースをガラクトース受容体とし、メリビオースをガラクトース供与体として用いてラフィノースを得る方法（例えば、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２参照）が報告されている。ガラクトース供与体としてはこの他にもｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを利用する方法（例えば、非特許文献３参照）、ガラクチノールを利用する方法（例えば、特許文献２参照）、ガラクトビオースを利用する方法（例えば、特許文献３参照）などが報告されている。【０００６】
また、安価なスクロースとガラクトースを原料として利用可能な例もいくつか報告されている。例えば、Pycnoporus cinnabarinus 由来のα−ガラクトシダーゼを使用して、ラフィノースを得る方法（例えば、非特許文献４参照）や、Mortierella vinacea由来のα−ガラクトシダーゼを利用してラフィノースを合成する方法が開示されている（例えば、非特許文献５参照）。【０００７】
【特許文献１】特許第２６８８８５４号
【特許文献２】特開平１０−８４９７３
【特許文献３】特公平８−２４５９２
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 52(9), 2305-2311, 1988
【非特許文献２】Biosci. Biotech. Biochem., 59(4), 619-623, 1995
【非特許文献３】Phytochemistry, 18, 35-38, 1979
【非特許文献４】Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 38(8), 722-728, 1991
【非特許文献５】Carbohydr. Res., 185, 139-146, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
α−ガラクトシダーゼによるラフィノース生成効率が良いことから、ラフィノース合成原料として、メリビオース、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、ガラクチノールやガラクトビオースを利用する例が報告されているが、これらの手法を用いた場合、使用される原料が高価であり、工業的なラフィノースの製造は困難であった。【０００９】
一方、Pycnoporus cinnabarinus 由来のα−ガラクトシダーゼを使用してラフィノースを得る方法や、Mortierella vinacea由来のα−ガラクトシダーゼを利用してラフィノースを合成する方法は、安価な原料であるスクロースとガラクトースを利用可能であるということから、工業性を考慮した場合非常に有利な方法である。しかしながら、これらのα−ガラクトシダーゼを利用した場合、生成物中に目的とするラフィノース以外の夾雑三糖が生成してしまうことから、最終製品からの夾雑三糖の分離が必要となり、さらに原料の浪費といった問題が生じてしまう。Pycnoporus cinnabarinus 由来のα−ガラクトシダーゼをラフィノース合成反応に用いた場合、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は40%、Mortierella vinacea由来のα−ガラクトシダーゼをラフィノース合成反応に用いた場合、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は６０％と低く、従来の技術では酵素法によりラフィノースを選択的に製造することは不可能であった。【００１０】
本発明は、こうした状況のもとに、安価な原料を用い、選択的にラフィノースを合成することが可能な新規α−ガラクトシダーゼを提供するものであり、本酵素を用いた革新的なラフィノース製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、ラフィノースを選択的に合成可能な新規酵素を発見し、目的ラフィノース以外の夾雑オリゴ糖の生成を抑制したラフィノースの製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［２０］に示す新規なα−ガラクトシダーゼ及びラフィノースの製造方法などに関するものである。
［１］  下記の特性を有するα−ガラクトシダーゼ。
（１）作用：本酵素は、スクロースとガラクトースを原料とした脱水縮合反応において、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が０．５％以上のとき、ラフィノース合成選択率が６５％以上という性質を有する。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００
［２］  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物に由来する、［１］に記載のα−ガラクトシダーゼ。
［３］  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ００３株、ＡＫＣ００４株（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８）、ＡＫＣ００５株、ＡＫＣ００６株のいずれかである［２］に記載のα−ガラクトシダーゼ。
［４］  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ００３株、ＡＫＣ００４株（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８）、ＡＫＣ００５株、ＡＫＣ００６株のいずれかに属するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓおよびその変異体。【００１３】
［５］  下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼ。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
［６］  下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：
［７］  以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：【００１４】
［８］  ［６］又は［７］に記載のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
［９］  ［６］又は［７］に記載のα−ガラクトシダーゼ遺伝子又は［８］に記載の組み換えベクターを導入した形質転換体。
［１０］  ［９］に記載の形質転換体を培養して得られるα−ガラクトシダーゼ。
［１１］  ［１］〜［３］、［５］、又は［１０］のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物。
［１２］  α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼから選択される少なくとも１種以上の成分をさらに含有する、［１１］に記載の酵素組成物。
［１３］  ［１１］又は［１２］のいずれかに記載の酵素組成物を含むラフィノース合成試薬。
［１４］  ［１］〜［３］、［５］、又は［１０］のいずれか一項に記載のα−ガラクトシダーゼ、［１１］又は［１２］に記載の酵素組成物、若しくは［１３］に記載のラフィノース合成試薬を用いることを特徴とするラフィノースの製造方法。【００１５】
［１５］  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
［１６］  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ００３株、ＡＫＣ００４株（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８）、ＡＫＣ００５株、ＡＫＣ００６株のいずれかに属するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ及び／又はその変異体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。
［１７］  ［９］に記載の形質転換体を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするラフィノースの製造方法。【００１６】
［１８］  生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が６５％以上である、［１４］〜［１７］のいずれかに記載のラフィノースの製造方法。
［１９］  原料としてスクロース及びガラクト−スを用いる、［１４］〜［１８］のいずれかに記載のラフィノースの製造方法。
［２０］  原料中のスクロース濃度が３０％（ｗ／ｖ）〜９０％（ｗ／ｖ）であり、原料中のガラクトース濃度が２％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）である、［１９］に記載のラフィノースの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明を用いることにより、ラフィノースを選択的に製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明のα−ガラクトシダーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物に由来するものであり、当該微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物であればどのようなものを用いてもよく、ラフィノースを選択的に合成可能なα−ガラクトシダーゼを発現する任意の微生物を用いることができる。好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株が挙げられる。また、本発明における微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓに属する微生物を親株として得られる変異株であってもかまわない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株, AKC-004株, AKC-005株, AKC-006株はそれぞれ、２００６年（平成１８年）１１月１４日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。受託番号は以下の通りである。なお、AKC-004株は、２００８年（平成２０年）１月３０日に、受領番号ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８、及び受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ１０９４８として国際寄託に移管されている。
AKC-003株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９１）
AKC-004株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９２；ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８；ＦＥＲＭ−ＢＰ１０９４８）
AKC-005株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９３）
AKC-006株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９４）【００１９】
本発明のα−ガラクトシダーゼは、下記の特性を有する。
（１）作用：本酵素は、スクロースとガラクトースを原料とした脱水縮合反応において、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が０．５％以上のとき、ラフィノース合成選択率が６５％以上という性質を有する。
（２）至適ｐＨ範囲：３．５〜５．０
（３）安定ｐＨ範囲：３．５〜１０．０
（４）分子量：約８０，０００【００２０】
本発明の酵素の具体例としては、基質特異性及び金属イオンの影響として、以下の性質を有するものが挙げられる。
基質特異性：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質とした場合、分解活性は最も高く、次いでメリビオース、次いでラフィノースの順である。一方、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ラクトース、スクロースは分解しない。
金属イオンの影響：カリウム、カルシウム、マグネシウム、クロム、マンガン、コバルト、鉄(II)、鉄(III)イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下は見られない。一方、ニッケル、亜鉛イオンをそれぞれ添加した場合、活性の低下が見られ、銅イオンを添加した場合に最も活性が低下する。
さらに本発明の酵素の具体例としては、下記の特性を有するものでもよい。
（５）（正反応の）至適温度範囲：35〜50℃
（６）安定温度範囲：45℃まで安定である。【００２１】
本発明に用いる微生物の培養方法としては、通常の通気攪拌培養あるいは固体培養が用いられ、一般的に行われている微生物の培養方法が適応できる。培地としては、当該微生物が良好に生育し且つ、微生物中のα−ガラクトシダーゼを順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセロール、スクロース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、セロビオース、エルロース、有機酸、澱粉、オリーブ油、大豆油等を用いることができる。窒素源としては、例えば、硫安、硝安、尿素、アミノ酸、アミン類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、綿実粕、コーンスティープリカー、および大豆粕等があげられる。また、無機塩類としては、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸鉄、炭酸カルシウム等が用いられる。微生物の生育性の点から、培養温度は２５〜８０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃、さらに好ましくは４０〜５５℃である。また、培地のｐＨは広範囲で選択可能であり、微生物の生育性の点からｐＨ３．０〜９．０が好ましく、より好ましくはｐＨ３．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ４．０〜８．０である。【００２２】
本発明のα−ガラクトシダーゼの分離・精製は、例えば以下のようにして実施することができる。【００２３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株を上記の培地で培養し、得られた培養液を、遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。【００２４】
こうして得られた菌体にはα−ガラクトシダーゼが含まれており、リゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いて菌体の破砕を行うことでα−ガラクトシダーゼの粗抽出液を得る。培養条件等により、α−ガラクトシダーゼの活性が培養上清に含まれる場合、培養上清をそのまま、または濃縮等の操作を加え、α−ガラクトシダーゼの粗抽出液として次の精製に用いることもできる。【００２５】
上記のようにして得られる粗抽出液を、通常のタンパクの精製法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、塩析等を組み合わせて分画することによって、α−ガラクトシダーゼを精製することができる。【００２６】
上記の操作の順は特に問わず、各操作は１回、または２回以上行ってもよい。また、それぞれのカラムに試料を通液する前に、透析等によって試料液を適当な緩衝液に交換しておくことが望ましい。さらにそれぞれの段階で試料液を濃縮しても良い。【００２７】
精製の各段階においては、分画された各フラクション中に含まれるα−ガラクトシダーゼ活性を測定し、活性の高いフラクションを集めて次の段階に供試することが望ましい。【００２８】
α−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液４５０μＬに酵素液１５０μＬを混合し、４０℃で５〜３０分間程度反応させた後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液１ｍＬに添加して酵素を失活させ、反応を停止する。得られた溶液の着色度を波長４２０ｎｍの吸収を測定し、各濃度のｐ−ニトロフェノールで作製した検量線を用いて濃度を算出する。また、酵素活性の単位は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして表示する。【００２９】
精製されたα−ガラクトシダーゼの精製度の確認や分子量の測定は、電気泳動やゲル濾過クロマトグラフィー等によって行うことができる。また、酵素学的性質は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定し、あるいは種々の酵素阻害剤や金属イオン等を反応液に添加し、残存活性を測定することによって検討すればよい。さらにα−ガラクトシダーゼを種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。また、基質濃度を変化させて反応を行うことで、各基質に対するα−ガラクトシダーゼのミカエリス定数 （Ｋm）、最大速度（Ｖmax）を求めることもできる。【００３０】
本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の取得は、例えば以下のように行うことができる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ−００４株を上記の培地で培養し、得られた培養液を、遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体と濾液とに分離する。上記のようにして得られた菌体についてリゾチームや超音波破砕機、フレンチプレス等を用いた菌体の破砕を行い、染色体ＤＮＡを単離する。上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、ＤＮＡ断片を得る。上記のようにして得られた染色体ＤＮＡ断片を用いて、ショットガンクローニングやインバースＰＣＲ法等を利用した公知の手段によりα−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長、またはその一部を含むＤＮＡ断片を取得する。ここで得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサー等を利用した公知の方法で解析し、その塩基配列を明らかにする。また、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の部分的な塩基配列のみが明らかになった場合、その塩基配列を基に再度α−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することもできる。また、この操作を繰り返すことで、α−ガラクトシダーゼ遺伝子全長の塩基配列を明らかにすることも可能である。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を基に、ＰＣＲ法や制限酵素を用いた公知の方法によって、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を得ることができる。上記のようにして解読したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列から、α−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を決定することができる。【００３１】
配列番号２に本発明のα−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がα-ガラクトシダーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよく、あるいは当該アミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。即ち、本発明のα−ガラクトシダーゼは、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼである。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：【００３２】
さらに本発明によれば、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるα−ガラクトシダーゼをコードするα−ガラクトシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配：
（ｃ）配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、α−ガラクトシダーゼ活性を有するアミノ酸配列：【００３３】
上記（ｂ）における「１又は数個のアミノ酸」とは、一般的には１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜３０個のアミノ酸、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸を意味する。【００３４】
上記（ｃ）における「６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、一般的には、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。【００３５】
本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を挙げることができる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって、かつ、α−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：【００３６】
上記（ｂ）における「１又は数個の塩基」とは、一般的には１〜１５０個の塩基、好ましくは１〜９０個の塩基、より好ましくは１〜６０個の塩基、さらに好ましくは１〜３０個の塩基、さらに好ましくは１〜２０個の塩基、さらに好ましくは１〜１５個の塩基、さらに好ましくは１〜１０個の塩基、特に好ましくは１〜５個の塩基を意味する。【００３７】
本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子は公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体遺伝子は、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。即ち、α−ガラクトシダーゼ中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。【００３８】
上記のようにして得られたα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を完全に含むＤＮＡ断片を大腸菌用発現ベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ（＋）のマルチクローニングサイトに挿入、連結して、新たな組換えプラスミドを構築することができる。このプラスミドベクターは大腸菌内で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に発現できるｌａｃプロモーターが導入されており、組換えプラスミドを大腸菌に導入して得られる形質転換体を培養することでα−ガラクトシダーゼの大量発現が可能になる。【００３９】
また、上記以外にも種々の宿主微生物、ベクターを利用したα−ガラクトシダーゼの大量発現は可能であり、例えばＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓの形質転換体を培養することで、α−ガラクトシダーゼの大量発現が可能である。より詳細には、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。このようなベクターを、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させて本発明のα−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを目的のベクターに組み込むことができる。【００４０】
プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。また、微生物宿主がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウムなど、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。【００４１】
また、形質転換微生物により本発明のα−ガラクトシダーゼを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内または培養液中に本発明のα−ガラクトシダーゼを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／または適当な界面活性剤などを添加して本発明のα−ガラクトシダーゼの水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い本発明のα−ガラクトシダーゼを得ることができる。【００４２】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。培養温度は微生物が発育し、本発明のα−ガラクトシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは、１０から４５℃程度、さらに好ましくは２０から３０℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、本発明のα−ガラクトシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２から４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、本発明のα−ガラクトシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。【００４３】
本発明によれば、前述の酵素を用いるに際しては、本発明の酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物を用いてもよい。【００４４】
本発明によれば、上記した本発明のα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物が提供される。上記酵素組成物には、例えば、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、及びポリガラクツロン酸リアーゼから選択される少なくとも１種以上の成分をさらに含有せしめることができる。【００４５】
本発明によれば、上記した酵素組成物を含むラフィノース合成試薬が提供される。【００４６】
本発明において微生物触媒としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ−００４株のほかに、上記形質転換体を用いることができる。本発明においてラフィノース製造に利用する微生物触媒としては通常行われる培養方法によって得られる微生物そのものを利用することができ、α−ガラクトシダーゼを微生物から精製する必要はない。また、場合によっては、微生物培養液、微生物培養上清を利用することもできる。一方、培養法により得られた微生物は必要に応じて、水や緩衝液等で洗浄した後、利用することもできる。例えば、培養した微生物の培養液、または遠心分離、バッファーによる洗浄等により得た微生物懸濁液、微生物または微生物の処理物(例えば微生物の破砕物等)を懸濁または溶解させた水溶液、あるいは微生物または微生物処理物を包括法、架橋法、又は担体結合法によって固定化したものを用いることができる。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００４７】
本発明によれば、上記した本発明のα−ガラクトシダーゼ又はα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物、ラフィノース合成試薬又は微生物触媒を用いたラフィノースの製造方法が提供される。原料としては、例えばスクロース及びガラクト−スを用いることができる。原料としてスクロースとガラクト−スを利用する際には例えば、α−ガラクトシダーゼによる脱水縮合反応を利用する性質上、原料濃度は高い方が好ましいが、ガラクトース濃度が高くなりすぎるとガラクトース分子間の縮合によりスクロースとガラクトース間の脱水縮合反応が抑制されるため、スクロース濃度は３０％（ｗ／ｖ）〜９０％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、より好ましくは３５％（ｗ／ｖ）〜８０％（ｗ／ｖ）さらに好ましくは４０％（ｗ／ｖ）〜７０％（ｗ／ｖ）が好ましい。ガラクトース濃度は２％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、より好ましくは、５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、さらに好ましくは７％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）が好ましい。また、原料中のスクロースとガラクトースが共に可溶であるような濃度に調製することが好ましい。【００４８】
本発明のα−ガラクトシダーゼ又はα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物又は酵素組成物を含むラフィノース合成試薬又は微生物触媒を用いてラフィノースを製造する際の反応温度は、反応速度や酵素の安定性の点から、好ましくは１０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃であり、さらに好ましくは３０〜６０℃である。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、酵素の安定性の点から、好ましくはｐＨ２．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ３．０〜７．５、さらに好ましくは３．５〜６．０である。反応時間は酵素の使用量によっても異なるが、工業的利用を考慮した際、好ましくは通常２０分〜２００時間、より好ましくは、６〜８０時間である。しかしながら、本発明は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。【００４９】
本発明において、α−ガラクトシダーゼ又はα−ガラクトシダーゼを含む酵素組成物又は酵素組成物を含むラフィノース合成試薬を用いたラフィノース合成反応中、ラフィノースが反応溶液中に０．５％以上蓄積された時点における生成オリゴ糖中のラフィノース含有率を６５％以上に向上することができ、より好ましい条件では８０％以上に向上することができる。本発明における高い生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は、ラフィノースが反応溶液中に０．７５％以上、さらには１．０％以上蓄積された時点においても達成可能である。【００５０】
また一般的に、微生物そのものを用いたラフィノース合成反応では、夾雑酵素の影響により生成オリゴ糖中のラフィノース含有率が低いのに対し、本発明の微生物触媒を用いたラフィノース合成反応では、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は高い。【００５１】
本発明において得られる生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は以下の方法により測定される。
ラフィノース合成反応終了後、反応液を２５倍希釈して、９９℃で１０分間保持することで反応を停止した。反応停止後、遠心分離により微生物を除去し、得られた反応溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量した。測定には、Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社製  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム、検出器はＲＩを用いた。生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は、ＨＰＬＣ分析チャートに検出された各々のピーク面積比から（ラフィノースのピーク面積）／（生成オリゴ糖のピーク面積）×１００により算出した。【００５２】
本発明の方法により製造されるラフィノースを精製、分離する方法としては、一般的に用いられている精製処理方法を利用することができる。すなわち、例えば、遠心分離、ＭＦ膜やＵＦ膜等による膜処理、フィルタープレス等により微生物触媒を除き、陽イオン交換クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマト処理や透析等の脱塩処理により緩衝液や培地等から持ち込まれる塩類等を除去し、さらに、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や溶解度の差等を利用した結晶化処理、その他の常法に従ってラフィノースを分離、精製することができる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良く、移動層方式や擬似移動層方式、多成分分離擬似移動層方式、多成分分離循環方式等を適宜利用することができる。これらのラフィノースの精製、分離処理方法は、バッチ式で行っても良いしカラムを利用するなどして連続的に行っても良い。【００５３】
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９２（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８に移管）：寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ）プレート (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、1日間培養してコロニーを形成させた。【００５５】
ｐＨ７．２に調整した表１に示す培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、５０℃で、２５時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これをジャー培養のシードとした。【００５６】
【表１】
2008102743.tif 000002
【００５７】
次に、ｐＨ７．２に調整した表１に示す培地６Ｌを１０Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記のジャー培養のシード１５ｍＬを移植し、５０℃で、４８時間、２００ｒｐｍ、０．２ｖｖｍで通気攪拌培養を行った。【００５８】
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。得られた菌体のα−ガラクトシダーゼの活性を測定した結果、２６１Ｕであった。【００５９】
この菌体を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  グルコースを含むＬｙｓｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し１５０ｍＬにした。この懸濁液を４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。【００６０】
Ｌｙｓｉｓ緩衝液で洗浄後の菌体を上記Ｌｙｓｉｓ緩衝液に再度懸濁し、１５０ｍＬとした。これに０．０２％のリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製  卵白由来）を添加して、３７℃で、１３時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。【００６１】
菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。【００６２】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて３７．５％飽和とし、４℃で一夜放置して沈殿を生じさせた。この沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。【００６３】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて５４．５％飽和とし、４℃で一夜放置して沈殿を生じさせた。この沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して回収し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ、４℃で、一夜、上記と同じリン酸緩衝液に対して透析した。【００６４】
透析により得られた上清を、前記と同じリン酸バッファーで平衡化した「ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ」（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。【００６５】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、２Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ  （ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）」（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、２．０〜０Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。【００６６】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した「ＭｏｎｏＱ  ５／５０  ＧＬ」（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。【００６７】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸バッファーで平衡化した「ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００」（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。【００６８】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製α−ガラクトシダーゼとした。活性収率は１５％で、活性は２７０Ｕ／ｍＬであった。【００６９】
実施例２
実施例１で得られた精製α−ガラクトシダーゼを用いて、その作用に関する実験を行った。【００７０】
（１）至適ｐＨ範囲
各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液に溶解させた６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド１５０μＬに、１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で５分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図１に示す。なお、使用した緩衝液は、グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５〜３．５）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５〜６．０）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．５）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）である。【００７１】
（２）安定ｐＨ範囲
ｐＨ４．０〜１０．０の範囲で１０ｍＭの緩衝液を用いて、各ｐＨで４５℃、１４０分間の加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図２に示す。なお、使用した各ｐＨの緩衝液の種類は前記のものと同様である。【００７２】
（３）至適温度範囲
ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた４．７ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド１９０μＬに、２０倍希釈した本発明の精製酵素液１０μＬを混合し、２０〜６０℃の範囲で５分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図３に示す。【００７３】
（４）安定温度範囲
ｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、３０〜５５℃の各温度で２０分間加熱処理を行い、その残存活性を測定し、前記と同様に最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図４に示す。【００７４】
（５）分子量
分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めた。この結果を図５に示す。分子量は約８０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量８３，１２２とほぼ一致した。【００７５】
（７）基質特異性
１０ｍＭの各種基質を含むｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１５０μＬに１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で２０分間反応させた。ただし、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質に用いた反応では、反応時間を５分間とした。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールの定量、あるいは「Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ」（昭和電工株式会社）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる分析から分解された基質の定量を行い、最大活性を１００とした各基質に対する相対活性を求めた。この結果を表２に示す。また、そのなかで基質となり得たものについて、反応速度を測定した結果を表３に示す。【００７６】
【表２】
2008102743.tif 000003
【００７７】
【表３】
2008102743.tif 000004
【００７８】
（８）阻害因子
ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させた６ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに各種金属イオンを終濃度１ｍＭとなるように添加して１５０μＬとし、１００倍希釈した本発明の精製酵素液５０μＬを混合し、４０℃で２０分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、最大活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を表４に示す。【００７９】
【表４】
2008102743.tif 000005
【００８０】
実施例３
実施例１記載の精製α−ガラクトシダーゼ０．５Ｕを分取し、１．５ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに入れた２００μＬの糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース７３％、ガラクトース１２％を含む）に添加、混合し、６０℃、１，２００ｒｐｍで反応を行った。反応開始から４５時間後に反応液のうち２０μＬを採取し、４８０μＬ蒸留水で希釈を行った後、９９℃で１０分間処理することで酵素を熱失活させた。熱失活後の希釈糖液を常温に戻した後、「Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ」（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行った。その結果を図６に示す。生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は８２％であり、反応液中のラフィノース濃度は１．６７重量％であった。【００８１】
実施例４
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ−００４株の染色体ＤＮＡを調製した。実施例１記載の方法で取得したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ−００４株の培養液６０ｍＬを、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１ｍｇの染色体ＤＮＡを調製した。【００８２】
（２）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離
上記（１）において調製した染色体ＤＮＡから、α−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計、合成した。プライマーの設計は公知の数種の微生物由来α−ガラクトシダーゼ遺伝子のアライメント結果を基に行い、センスプライマーは5'-GAAGTITACGGITTYAGYYTTGTITACAGYGG-3'（配列番号３）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-CCAAACCAICCRTCRTCIARIACRAA-3' （配列番号４）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。なお、配列中、Iはイノシン、YはC又はT、RはA又はGを示す。ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の増幅を行い、３８０塩基対からなるα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を取得した。ここで得られた遺伝子断片の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーを用いて解析した。【００８３】
解析の結果得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子断片の塩基配列をもとに、α−ガラクトシダーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を取得するために、インバースＰＣＲ用ＰＣＲプライマーを設計、合成した。センスプライマーは5'-TGATCAACAACTGGGAAAGCGACCT-3' （配列番号５）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-GAACTGGTCCTGCTGCACAATTCC-3' （配列番号６）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。次に、インバースＰＣＲに用いる鋳型を調製した。上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、得られたＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化し、インバースＰＣＲの鋳型とした。この鋳型に対し、上記のように合成したインバースＰＣＲ用プライマーを用いて、ＰＣＲ法によるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行い、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の全配列を含む４５００塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。【００８４】
（３）塩基配列の解析
ＤＮＡシークエンサーを用いて、（２）で得られたＰＣＲ産物からα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、配列番号１に示す５’末端からのＤＮＡ塩基配列を有する２１９０塩基対のα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を解読した。この配列はこれまで見出されていない新規な遺伝子であった。また、このＤＮＡ塩基配列より類推されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＡＫＣ−００４株が生産するα−ガラクトシダーゼは７３０個のアミノ酸からなり、配列番号２に示すようなＮ末端からのアミノ酸配列を有していた。データベース検索の結果、このアミノ酸配列はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＮ）と５７％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＡ）と５６％、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＡｇａＢ）と５６％、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ由来α−ガラクトシダーゼと５６％の相同性を有し、新規なα−ガラクトシダーゼをコードしていることが明らかになった。【００８５】
（４）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
（３）で得られたα−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列を基に、α−ガラクトシダーゼ遺伝子のＳＤ配列、構造遺伝子、終始コドンを含む領域を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計・合成した。ＰＣＲプライマーの設計は（２）で得られた４５００塩基対からなるＰＣＲ産物の塩基配列を基に行い、センスプライマーは5'-TAAGGTAAAGCAGATGTGCCATT-3' （配列番号７）の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは5'-TTACTCGTACACCGCCTC-3' （配列番号８）の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。（２）で得られた４５００塩基対からなるＰＣＲ産物を鋳型として、合成したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行い、２３２５塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。ここで得られたＰＣＲ産物を平滑末端化、リン酸化した。
制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後に脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ（＋）ベクターに、上記で得られた平滑末端化、リン酸化したＰＣＲ産物を連結し、新たなプラスミドベクターｐＢｌｕｅ／ａｇａＡを構築した。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｌａｃプロモーターが導入されており、α−ガラクトシダーゼを効率的に発現・製造させることができる。得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。【００８６】
（５）形質転換体の培養及びα−ガラクトシダーゼの発現
（４）で作製した組換え大腸菌ＪＭ１０９−ｐＢｌｕｅ／ａｇａＡを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む３０ｍＬのＬＢ培地で３７℃で２４時間、振盪培養した。培養後、組換え大腸菌を遠心分離して回収した。菌体は１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機で破砕した。この破砕液のα−ガラクトシダーゼ活性を、前記の方法で測定したところ、１９．９Ｕ／培養液（ｍＬ）であった。【００８７】
実施例５
実施例４記載の組換え体を培養して得られたα−ガラクトシダーゼ１．０Ｕを分取し、１．５ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに入れた２００μＬの糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース７３％、ガラクトース１２％を含む）に添加、混合し、６０℃、１，２００ｒｐｍで反応を行った。反応開始から１６時間後に反応液のうち２０μＬを採取し、４８０μＬ蒸留水で希釈を行った後、９９℃で１０分間処理することで酵素を熱失活させた。熱失活後の希釈糖液を常温に戻した後、「Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ」（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行った。その結果を図７に示す。生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は８２％であり、反応液中のラフィノース濃度は１．２０重量％であった。【００８８】
実施例６
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-004株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９２（ＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０９４８に移管）：寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をTBAB（Tryptose Blood Agar Base）プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を表１に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。【００８９】
本培養2日後、培養菌体10mL分を15mL容チューブに回収した。培養液を回収した15mL容チューブを10000rpmで遠心後、上清を除去した。次に、100mM酢酸Na buffer (pH5.0)を1mL添加し、再懸濁した後、懸濁液を2mL容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース62．5％、ガラクトース12.5％を含む）を300μL添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度60℃、回転数1200rpmで行った。糖合成反応開始16h後に、反応液40μLを回収し、蒸留水960μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、「Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ」（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行った結果を図８に示した。生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は８０％であった（反応液中のラフィノース濃度は0.70重量％）。【００９０】
実施例７
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-003株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９１：寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をTBAB（Tryptose Blood Agar Base）プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を表１に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。【００９１】
本培養2日後、培養菌体10mL分を15mL容チューブに回収した。培養液を回収した15mL容チューブを10000rpmで遠心後、上清を除去した。次に、100mM酢酸Na buffer (pH5.0)を1mL添加し、再懸濁した後、懸濁液を2mL容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース62．5％、ガラクトース12.5％を含む）を300μL添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度60℃、回転数1200rpmで行った。糖合成反応開始38h後に、反応液40μLを回収し、蒸留水960μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、「Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ」（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行ったところ、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は８０％であった（反応液中のラフィノース濃度は0.76重量％）。【００９２】
実施例８
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-005株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９３：寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をTBAB（Tryptose Blood Agar Base）プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を表１に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。【００９３】
本培養2日後、培養菌体10mL分を15mL容チューブに回収した。培養液を回収した15mL容チューブを10000rpmで遠心後、上清を除去した。次に、100mM酢酸Na buffer (pH5.0)を1mL添加し、再懸濁した後、懸濁液を2mL容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース62．5％、ガラクトース12.5％を含む）を300μL添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度60℃、回転数1200rpmで行った。糖合成反応開始38h後に、反応液40μLを回収し、蒸留水960μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、「Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ」（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行ったところ、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は９１％であった（反応液中のラフィノース濃度は0.32重量％）。【００９４】
実施例９
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ AKC-006株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９４：寄託機関; 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をTBAB（Tryptose Blood Agar Base）プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を表１に記載の培地30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで2日間培養した。【００９５】
本培養2日後、培養菌体10mL分を15mL容チューブに回収した。培養液を回収した15mL容チューブを10000rpmで遠心後、上清を除去した。次に、100mM酢酸Na buffer (pH5.0)を1mL添加し、再懸濁した後、懸濁液を2mL容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にスクロース62．5％、ガラクトース12.5％を含む）を300μL添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度60℃、回転数1200rpmで行った。糖合成反応開始38h後に、反応液40μLを回収し、蒸留水960μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、「Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ」（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析を行ったところ、生成オリゴ糖中のラフィノース含有率は76％であった（反応液中のラフィノース濃度は0.86重量％）。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明を用いることにより、安価な原料を用い、選択的にラフィノースを製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの至適ｐＨ範囲（実施例２）を示す。
【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの安定ｐＨ範囲（実施例２）を示す。
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの至適温度範囲（実施例２）を示す。
【図４】図４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼの安定温度範囲（実施例２）を示す。
【図５】図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４菌体から精製したα−ガラクトシダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例２）の結果を示す。
【図６】図６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株から精製したα−ガラクトシダーゼ用いた糖合成（実施例３）の反応液をHPLC分析した結果を示す。
【図７】図７は、組換え大腸菌ＪＭ１０９株から得られたα−ガラクトシダーゼを用いた糖合成（実施例５）の反応液をHPLC分析した結果を示す。
【図８】図８は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＡＫＣ−００４株を培養して得た微生物触媒を用いた糖合成（実施例３）の反応液をHPLC分析した結果を示す。
【図１】
2008102743.tif 000006
【図２】
2008102743.tif 000007
【図３】
2008102743.tif 000008
【図４】
2008102743.tif 000009
【図５】
2008102743.tif 000010
【図６】
2008102743.tif 000011
【図７】
2008102743.tif 000012
【図８】
2008102743.tif 000013
【配列表】
2008102743000001.app
【国際調査報告】
2008102743.tif 000014
2008102743.tif 000015
2008102743.tif 000016
2008102743.tif 000017