【手続補正書】
【提出日】平成15年6月25日(2003.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】人工ヘモグロビン変異体、医薬組成物、プラスミド、人工ヘモグロビン変異体および人工ヒトヘモグロビン変異体、ならびに人工ヘモグロビンの製造方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基によって置換されている（配列番号５）、人工ヒトヘモグロビン変異体。
【請求項２】健常成人ヘモグロビンと比較して、低い酸素親和性を示す、請求項１に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項３】さらに、健常成人ヘモグロビンに匹敵する、酸素結合における高い協同性を示す、請求項２に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項４】さらに、自動酸化に対する安定性が向上した、請求項３に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項５】組み換え法により製造される、請求項１に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項６】配列番号５に記載の、人工ヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）。
【請求項７】無細胞条件下において、赤血球中における健常成人ヘモグロビンに匹敵する、酸素結合特性を示し、β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基となる変異を有する、人工ヘモグロビン変異体（配列番号５）。
【請求項８】組み換え法により製造される、請求項７に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項９】薬学的に許容される担体中、β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基に置換されている（配列番号５）、非天然ヘモグロビン変異体を含むことからなる非毒性の医薬組成物。
【請求項１０】ヘモグロビン変異体が、無細胞条件下で、健常成人ヘモグロビンと比べて低い酸素結合特性を示す、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】ヘモグロビン変異体が組み換えヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）（配列番号５）である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】プラスミドｐＨＥ７００９。
【請求項１３】自動酸化に対する安定性を示し、アロステリック・エフェクター２，３−ビスホスホグリセリン酸存在下で健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合特性を示し、β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基に置換されている（配列番号５）、低酸素親和性を示す人工ヘモグロビン変異体。
【請求項１４】β鎖１０８位のアスパラギン残基に変異があり（配列番号５）、アロステリック・エフェクター２，３−ビスホスホグリセリン酸存在下のＨｂ Ａと類似した、Ｐ５０により計測される酸素親和性の酸素結合特性、およびヒル係数（ｎｍａｘ）により計測される協同性を示し、該計測値が次の通りである人工ヘモグロビン変異体：
ｐＨ７．４、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中において、Ｐ５０が約１７．４ｍｍＨｇ、ｎｍａｘが約３．１である。
【請求項１５】β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基に置換されている（配列番号５）ヒトヘモグロビン配列をコードするＤＮＡを有する発現プラスミドを、赤血球以外の適切な宿主に導入し、形質転換細胞を増殖させ、人工ヘモグロビンを産生させるため上記ＤＮＡを発現させ、ヘモグロビンを回収し、精製する工程を含むことからなる、人工ヘモグロビンの製造方法。
【請求項１６】宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１５に記載の人工ヘモグロビンの製造方法。
【請求項１７】発現プラスミドがｐＨＥ７００９である、請求項１６に記載の人工ヘモグロビンの製造方法。
【請求項１８】ｐＨＥ７００９で形質転換された細胞から得られた、人工ヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）（配列番号５）。
【請求項１９】β鎖１０５位のロイシン残基がトリプトファン残基に置換されている（配列番号７）、人工ヒトヘモグロビン変異体。
【請求項２０】健常成人ヘモグロビンと比較して、低い酸素親和性を示す、請求項１９に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項２１】さらに、健常成人ヘモグロビンに匹敵する、酸素結合における高い協同性を示す、請求項２０に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項２２】組み換え法により製造される、請求項１９に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項２３】組み換えヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）（配列番号７）。
【請求項２４】無細胞条件下において、赤血球中における健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合特性を示し、β鎖１０５位のロイシン残基がトリプトファン残基に置換されている（配列番号７）変異を有する、人工ヘモグロビン変異体。
【請求項２５】組み換え法により製造される、請求項２４に記載の人工ヘモグロビン変異体。
【請求項２６】薬学的に許容される担体中、β鎖１０５位のロイシン残基がトリプトファン残基に置換されている（配列番号７）、人工ヘモグロビン変異体を含むことからなる非毒性の医薬組成物。
【請求項２７】ヘモグロビン変異体が、無細胞条件下で、健常成人ヘモグロビンと比べて低い酸素結合特性を有する、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】ヘモグロビン変異体が、組み換えヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）（配列番号７）である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】プラスミドｐＨＥ７００４。
【請求項３０】自動酸化に対する安定性を示し、アロステリック・エフェクター２，３−ビスホスホグリセリン酸存在下で、健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合特性を示し、β鎖１０５位のロイシン残基がトリプトファン残基に置換されている（配列番号７）、低酸素親和性を示す人工ヘモグロビン変異体。
【請求項３１】β鎖１０５位のロイシン残基に変異があり（配列番号７）、アロステリック・エフェクター２，３−ビスホスホグリセリン酸存在下のＨｂ Ａと類似した、Ｐ５０により計測される酸素親和性の酸素結合特性、およびヒル係数（ｎｍａｘ）により計測される協同性を示し、該計測値が次の通りである人工ヒトヘモグロビン変異体：
ｐＨ７．４、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中において、Ｐ５０が約２８．２ｍｍＨｇ、ｎｍａｘが約２．６である。
【請求項３２】β鎖１０５位のロイシン残基がトリプトファン残基に置換されている（配列番号７）ヒトヘモグロビン配列をコードするＤＮＡを有する発現プラスミドを、赤血球以外の適切な宿主に導入し、形質転換細胞を増殖させ、人工ヘモグロビンを産生させるために上記ＤＮＡを発現させ、ヘモグロビンを回収し、精製する工程を含むことからなる、人工ヘモグロビンの製造方法。
【請求項３３】宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項３２に記載の人工ヘモグロビンの製造方法。
【請求項３４】発現プラスミドがｐＨＥ７００４である、請求項３３に記載の人工ヘモグロビンの製造方法。
【請求項３５】ｐＨＥ７００４で形質転換された細胞から得られた、人工ヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）（配列番号７）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
承認
本発明は、一部助成金ＨＬ−２４５２５号およびＨＬ−５８２４９号の下で政府の援助を受けて開発された。政府は、本発明に対しある一定の権利を有する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、新規のヘモグロビン変異体、特に、低い酸素親和性を示し、酸素結合に高い共同性を示す組み換えヘモグロビン変異体である「ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）」（または「ｒＨｂ（β１０８Ａｓｎ→Ｇｌｎ）」）および「ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）」（または「ｒＨｂ（β１０５Ｌｅｕ→Ｔｒｐ」）に関する。特に、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）は、既に知られている他の低酸素親和性変異体に比べ、自動酸化に対する抵抗性の増加を示す。本発明はさらに、代用赤血球としてまたはヘモグロビン由来の治療法として有用なヘモグロビン変異体の組み換えＤＮＡ技術を用いた製造方法に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒト血液製剤の赤血球に潜むＨＩＶや肝炎などの病原菌の流行は、適当なドナー不足による血液不足とあいまって、代用赤血球、特にヒトヘモグロビン（「Ｈｂ」）とその誘導体の開発に多大な関心をもたらしている。ヘモグロビン由来の酸素運搬体は、緊急医療時の代用血液のもととなり得る。（例えば、アール・エム・ウィンスロー（Ｗｉｎｓｌｏｗ  Ｒ．Ｍ．）らＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  （１９９２）（以下、「ウィンスローら  （１９９２）」と呼ぶ）参照。（この開示内容は本明細書に引用される。））
【０００４】
ヘモグロビンは、血液の酸素運搬成分であり、赤血球内に存在して血流中を循環している。健常なヒト成人ヘモグロビン（「Ｈｂ Ａ」）は、分子量約６４，５００の四量体タンパク質で、各々１４１のアミノ酸残基を有する同一のα鎖を２つと各々１４６のアミノ酸残基を有する同一のβ鎖を２つ含有している。また、両鎖はヘムとして知られる補欠分子族を有する。赤血球は、ヘモグロビンが還元型、機能型を維持するのを助けている。ヘム−鉄原子は酸化を受けやすいが、赤血球内のシトクロムｂ５またはグルタチオン還元系のどちらかによって再び還元される。（ヘモグロビンについては、アール・エフ・ディカーソン（Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ，  Ｒ．Ｅ．）らのＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ（１９８３）（以下、「ディカーソンら（１９８３）」と呼ぶ）参照。（この開示内容は、本明細書に引用される。））
【０００５】
Ｈｂ Ａの酸化工程には協同性がある、すなわち、最初の酸素分子の結合は、２つ目、３つ目、４つ目の酸素分子の結合を加速させる。酸化工程は、また、ヘテロトロピックアロステリックエフェクターとして知られる、個々のアミノ酸残基と様々な溶解物質との間の相互作用によっても調整されている。これらのエフェクターには、水素イオン、塩素、二酸化炭素、無機リン酸塩、または、２，３−ビスホスホグリセリン酸（「２，３−ＢＰＧ」）若しくはイノシトール６リン酸（「ＩＨＰ」）などの有機ポリアニオンなどのイオンまたは分子が含まれる。
【０００６】
ヘモグロビンは、アロステリック・エフェクター２，３−ＢＰＧに依存してその酸素親和性が変化し、それにより体内での酸素運搬効率を増加させることができる。２，３−ＢＰＧは、ヘモグロビンが結合酸素を組織へ放出することができる濃度で赤血球中に存在する。２，３−ＢＰＧ非存在下では、ヘモグロビンは酸素と強固に結合し、容易に結合酸素を放出しない。Ｈｂ Ａ分子のみを被験体に導入すると、血漿中の２，３−ＢＰＧが欠如しているため、Ｈｂの酸素親和性が下がり、適切に酸素を体内組織に運搬することができない。（ウィンスローら（１９９２）参照。）Ｈｂ由来の酸素運搬体としてまたはヘモグロビン治療法として機能するように設計されたＨｂは、全て効率的な酸素運搬が可能でなければならない、すなわち、Ｈｂ Ａが赤血球内で行うように協同的に酸素と結合、解離しなければならない。
【０００７】
酸素運搬性代用赤血球の候補としてヘモグロビンの無細胞溶液を使用することが、長い間研究されている。（例えば、エー・ジー・ムルダー（Ｍｕｌｄｅｒ，  Ａ．Ｇ．）らのＪ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５：３８３（１９３４）参照。（この開示内容は参考のため本明細書に引用される。））しかしながら、赤血球から精製された非修飾無細胞ヒトヘモグロビンの使用には、上記の感染や供給不足のほかにも、いくつかの限界がある。すなわち、２，３−ＢＰＧなどのアロステリック・エフェクターが喪失することにより酸素親和性が増加すること、およびＨｂ四量体がαβ二量体へと解離することにより腎臓の濾過により排出されてしまうため、長期にわたる腎臓障害を引き起こすことなどである。（例えば、エイチ・エフ・ブン（Ｂｕｎｎ，  Ｈ．Ｆ．）らのＪ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１２９：９０９（１９６９）参照。（この開示内容は、本明細書に引用される。））
【０００８】
ヒトグロビンとヘモグロビンは、以下に示すものにより発現されてきた：例えば、トランスジェニックマウス、トランスジェニックブタ（ケイ・チャダ（Ｃｈａｄａ，  Ｋ．）らのＮａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ３１４：３７７（１９８５）、ティー・エム・タウンズ（Ｔｏｗｎｅｓ，  Ｔ．Ｍ．）らのＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：１７１５（１９８５）およびエム・イー・スワンソン（Ｓｗａｎｓｏｎ，  Ｍ．Ｅ．）らのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５５７（１９９２）参照。）、昆虫細胞培養（ディー・アール・グロブ（Ｇｒｏｅｂｅ，  Ｄ．Ｒ．）らのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３：１３４（１９９２）参照。）、酵母菌（エム・ワーゲンバッハ（Ｗａｇｅｎｂａｃｈ，  Ｍ．）らのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５７（１９９１）およびジェイ・ジェイ・デリアノ（ＤｅＬｉａｎｏ，  Ｊ．Ｊ．）らのＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：９１８（１９９３）参照。）、大腸菌（「Ｅ．  ｃｏｌｉ」）（エス・ジェイ・ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｓ．Ｊ．）らのＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：８５２１（１９９０）、アール・エー・ハーナン（Ｈｅｒｎａｎ，  Ｒ．Ａ．）らのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：８６１９（１９９２）、および、ティー・ジェイ・シェン（Ｓｈｅｎ，  Ｔ．−Ｊ．）らのＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８１０８  （１９９３）（以下、「シェンら（１９９３）」と呼ぶ）参照。）などである。（これらの開示内容は、本明細書に引用される。）多くの点で、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）系は、発現効率が高く特定部位の変異誘発の実施が容易なことから、このような目的には最適とされている。
【０００９】
エイチ・エフ・ブンらのＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ（Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）ｐｐ．３７−６０（１９８６）（以下、「ブンら（１９８６）」と呼ぶ）（この開示内容は本明細書に引用される）で報告されているとおり、Ｈｂ Ａの天然Ｎ−末端バリン残基は、酸素親和性を制御するボーア効果において、およびアロステリック・エフェクターやアニオンの相互作用において重要な役割を果たすことが知られている。ジェイ・エス・カバナウ（Ｋａｖａｎａｕｇｈ，  Ｊ．Ｓ．）らのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：８６４０（１９９２）（この開示内容は、本明細書に引用される）で報告されているとおり、過剰なメチオニンは、Ｈｂ分子のＮ−末残基の構造を変化させることができる。従って、Ｈｂの酸素結合特性はそのＮ−末端残基が完全であるかに依存しており、そのため、大腸菌系を用いて所望の非修飾および変異Ｈｂを効果的に産生させる前に、発現されたＨｂ内のα−およびβ−グロビンの両方のＮ−末端から余分なメチオニン残基を除去する必要がある。
【００１０】
ヒル係数（「ｎｍａｘ」）として測定されるＨｂの協同的酸化は、その酸素結合特性の便利な基準となる（ディカーソンら（１９８３）を参照。）通常の実験条件下、Ｏ２との結合におけるＨｂ Ａのｎｍａｘ値は、約３である。α１β２（またはα２β１）サブユニット界面においてアミノ酸変異を有する異常ヒトＨｂは、通例、Ｈｂ Ａと比較して、高い酸素親和性および酸素結合における協同性の低下を示す（ディカーソンら（１９８３）、ブンら（１９８６）、エム・エフ・ペルツ（Ｐｅｒｕｔｚ，  Ｍ．Ｆ．）らのＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔｅｉｎｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）を参照。（この開示内容は本明細書に引用される。））
【００１１】
ビー・シャーナン（Ｓｈａａｎａｎ，  Ｂ．）らのＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  １７１：３１（１９８３）（以下、「シャーナンら（１９８３）」と呼ぶ）（この開示内容は本明細書に引用される）で報告されているように、オキシ型のＨｂ Ａ（酸素分子を有するＨｂ Ａ）は、α１β２サブユニット界面のα９４Ａｓｐとβ１０２Ａｓｎ間に特徴的な水素結合を有する。Ｈｂ  Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ（α９４Ａｓｐ→Ａｓｎ）（アール・ジー・シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｒ．Ｇ．）らのＢｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  ４００：３６５  （１９７５）参照。この開示内容は、本明細書に引用される））のようにα９４Ａｓｐ位に、または、Ｈｂ  Ｋａｎｓａｓ（β１０２Ａｓｎ→Ｔｈｒ）（ジェイ・ボナベンチュラ（Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ，  Ｊ．）らのＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４３：９８０  （１９６８）参照。この開示内容は、本明細書に引用される））のようにβ１０２Ａｓｎ位にアミノ酸変異を有するヒトＨｂや、同様にα１β２サブユニット界面に変異を有するその他の変異体は、非常に低い酸素親和性を示す。しかし、オキシ型のＨｂにおいて、α９４Ａｓｐとβ１０２Ａｓｎ間の水素結合が直接切断されたこれらのすべてのＨｂ変異体は、酸素結合に著しく低い協同性を示し、さらに結合状態で二量体へと容易に解離する。
【００１２】
また、デオキシ型からオキシ型への移行時に、Ｈｂ Ａのα１β２サブユニットは滑るような動きをするが、α１β１サブユニット界面はほとんど変化しないまま残されることが知られている（エム・エフ・ペルツのＮａｔｕｒｅ  ２２８：７２６  （１９７０）（以下、「ペルツ  （１９７０）」と呼ぶ）、ジェイ・エム・ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．）らのＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２９：１７５（１９７９）、ジェイ・エム・ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．）らのＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３６：１０３（１９８０）、シャーナンら  （１９８３）、ジー・ファーニ（Ｆｅｒｍｉ，  Ｇ．）らのＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７５：１５９（１９８４）（以下、「ファーミら  （１９８４）」と呼ぶ）を参照。（これらの開示内容は、本明細書に引用される。））。双方のサブユニット界面の特性を示すものとして、特有の水素結合、塩橋、および非共有の相互作用がある。Ｈｂ分子はまた、オキシ型四次構造（Ｒ型構造（Ｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））よりは、デオキシ型四次構造（Ｔ型構造（Ｔ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））において低い酸素親和性を示す（ディカーソンら（１９８３）を参照。）。
【００１３】
α９４Ａｓｐとβ１０２Ａｓｎのいずれも関与しない、低酸素親和性ヒトＨｂ変異体も存在する。例えば、Ｈｂ  Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ（β１０８Ａｓｎ→Ｌｙｓ）（ダブリュー・エフ・モーペン（Ｍｏｏ−Ｐｅｎｎ，  Ｗ．Ｆ．）らのＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ９２：５３（１９７８）およびジェイ・ケイ・オドーネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，  Ｊ．Ｋ．）らのＪ．  Ｂｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：２７６９２（１９９４）（以下、「オドーネルら  （１９９４）」と呼ぶ）参照。）、Ｈｂ  Ｙｏｓｈｉｚｕｋａ（β１０８Ａｓｎ→Ａｓｐ）（オドーネルら  （１９９４）参照。）、および、組み換えＨｂメクォン（β４１Ｐｈｅ→Ｔｙｒ）（ブイ・バウディン（Ｂａｕｄｉｎ，  Ｖ．）らのＢｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １１５９：２２３（１９９２）参照。）はすべてＨｂ Ａに比べ低い酸素親和性を示すが、ヒル係数を測定すると、ｎ値が１．８から２．９の間で変動し、それらは全て可変の協同性を示す。（上記これらの著書の開示内容は、本明細書に引用される。）シー・エイチ・ツァイ（Ｔｓａｉ，  Ｃ．−Ｈ．）らのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：８７５１（１９９９）（以下、「ツァイら（１９９９）」と呼ぶ）は、Ｈｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ、β１０８Ａｓｎ→Ｌｙｓ）が低酸素親和性を示し、Ｔ型四次構造への転換傾向が大きいことを報告している。エス・ティ・ジェオング（Ｊｅｏｎｇ，  Ｓ．Ｔ．）らのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１３４３３（１９９９）（以下、「ジェオングら  （１９９９）」と呼ぶ）は、Ｈｂ（α２９Ｌｅｕ→Ｐｈｅ、α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ、β１０８Ａｓｎ→Ｌｙｓ）が、低酸素親和性と自動酸化への抵抗性と相まった高い協同性を示す。
【００１４】
シェンら（１９９３）および米国特許第５，７５３，４６５号（これらの開示内容は、本明細書に引用される）には、合成ヒトα−およびβ−グロビン遺伝子が、別々のｔａｃプロモーターの制御下で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子と同時発現される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド（ｐＨＥ２）が記載されている。このプラスミドで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、組み換えＨｂ Ａ（以下、「ｒＨｂ Ａ」と呼ぶ）を発現し、そのＮ−末端メチオニンは同時発現されたメチオニンアミノペプチダーゼによって効率良く切断される。生じたＮ−末端メチオニン欠如ｒＨｂ Ａは、天然Ｈｂ Ａと構造および機能特性の多くの点で同一である。
【００１５】
Ｋｉｍ，  Ｈ．Ｗ．（エイチ・ダブリュー・キム）らのＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１１５４７  （１９９４）（以下、「キムら（１９９４）」と呼ぶ）および米国特許第５，８４３，８８８号（これらの開示内容は、本明細書に引用される）は、非天然変異ヘモグロビン（ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）（または「ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）」）が、天然ヘモグロビンと比べて低い酸素親和性を示す一方で、酸素結合に高い協同性を示すことを開示している。
【００１６】
しかしながら、ヘモグロビン由来の代用血液または治療法として、さらなるヘモグロビン変異体が必要とされている。低い酸素親和性と酸素結合に高い協同性を示し、自動酸化に対する安定性が向上した変異ヘモグロビンに特に関心が高まっている。また、組み換え法によって産生されるこのようなヘモグロビン、および、特に代用血液製剤またはヘモグロビン治療法に使用される、このようなヘモグロビン変異体を多量生産する効果的な発現システムが必要とされている。
【００１７】
発明の要旨
従って、本発明の主な目的は、低い酸素親和性および酸素結合に高い協同性を示すヘモグロビン変異体を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、低い酸素親和性および酸素結合に高い協同性を示し、かつ、自動酸化への安定性が向上したヘモグロビン変異体を提供することである。
【００１９】
また、本発明の別の目的は、天然に存在せず、低い酸素親和性および酸素結合に高い協同性を示すヘモグロビン変異体を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、天然に存在せず、低い酸素親和性および酸素結合に高い協同性を示し、かつ、自動酸化への安定性が向上したヘモグロビン変異体を提供することである。
【００２１】
さらに、本発明の別の目的は、天然に存在せず、低い酸素親和性および酸素結合に高い協同性を示し、好ましくは自動酸化に対して安定であり、かつ、人工的に、好ましくは組み換え手段を用いて産生され、正しいヘム構造を有するヘモグロビン変異体を提供することである。
【００２２】
また、本発明の別の目的は、無細胞条件下で、赤血球中の健常成人ヘモグロビンと同様の酸素結合性を示すヘモグロビン変異体を提供することである。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、低い酸素親和性および酸素結合に高い協同性を示し、Ｒ構造に影響を与えることなくＴ構造を安定化させた、ヘモグロビン変異体を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、ヘモグロビン由来酸素運搬体／代用赤血球または治療薬として使用される、人工ヘモグロビンを提供することである。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下の実施態様の１つまたはそれ以上により達成される。
【００２６】
本発明の一つの態様においては、β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基によって置換された、非天然型ヘモグロビン変異体を特徴とする。
【００２７】
好適には、当該ヘモグロビンは、健常成人ヘモグロビンに比べて低い酸素親和性を示し、酸素結合に高い協同性を示し、自動酸化に対して安定で、かつ、組み換え法により産生される。
【００２８】
本発明の別の形態においては、無細胞条件下で、赤血球中の健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を示す、人工ヘモグロビン変異体を特徴とし、該ヘモグロビンは、β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミンに変異したものである。
【００２９】
自動酸化に対して安定な、非天然型低酸素親和性ヘモグロビン変異体は、β鎖１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基に置換されており、アロステリック・エフェクターである２，３−ビスホスグリセンリン酸の存在下で、健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を示す。
【００３０】
さらに別の様態において、本発明は、β鎖１０５位のロイシン残基がトリプトファン残基に置換された、非天然型ヒトヘモグロビン変異体を特徴とする。
好適には、当該ヘモグロビンは、健常成人ヘモグロビンと比べて低い酸素親和性を示し、酸素結合に高い協同性を示し、かつ、組み換え法により産生される。
【００３１】
別の様態において、本発明は、無細胞条件下で、赤血球中の健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を示す、人工ヘモグロビン変異体を特徴とし、該ヘモグロビンは、β鎖１０５位のロイシン残基がトリプトファンに変異したものである。
【００３２】
天然型低酸素親和性ヘモグロビン変異体は、β鎖１０５位におけるロイシン残基がトリプトファン残基に置換されており、アロステリックエフェクターである２，３−ビスホスグリセンリン酸の存在下で、健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を示す。
【００３３】
本発明の他の特徴および有利な効果は、以下の好適な実施態様の説明および請求の範囲にも示されている。
【００３４】
定義
本明細書において「Ｈｂ Ａ」または「天然型Ｈｂ Ａ」とは、ヒト被験体から得られたヒト健常成人ヘモグロビンを意味する。
【００３５】
「組み換えヒト健常成人ヘモグロビン」、「ｒＨｂ Ａ」および「非修飾ｒＨｂ Ａ」とは、組み換えＤＮＡ技術により産生されたヒト健常成人ヘモグロビンを意味し、シェン（Ｓｈｅｎ）ら（１９９３）、および米国特許第５，７５３，４６５号に記載の通り、基本的に天然型Ｈｂ Ａと同じ構造と機能を有する。
【００３６】
「ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）」は、Ｈｂ分子の各β鎖の１０５位に位置するロイシン残基がトリプトファン残基で置換されている、組み換えヒトヘモグロビン変異体を意味する。このヘモグロビンはＨｂ Ａと比較して、低い酸素親和性および酸素結合における高い協同性を示す。ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）は、デオキシ四次構造を安定化させることにより、酸素親和性を低下させるため、α１β２サブユニット界面においてα９４Ａｓｐとβ１０５Ｔｒｐの間で水素結合を形成するように設計されている。
【００３７】
「ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）」は、α１β１界面およびＨｂ分子の中央空洞に位置する各β鎖の１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基で置換されるように、組み換えＤＮＡ技術によって産生されたヒトヘモグロビン変異体を意味する。このヘモグロビンは、低い酸素親和性、酸素結合における高い協同性、および、ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）およびｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）等の、他の既知の組み換え低酸素親和性ヘモグロビン変異体と比較して向上した自動酸化に対する抵抗性を示す。
【００３８】
「自動酸化」は、オキシヘモグロビン（「ＨｂＯ２」または「オキシ−Ｈｂ」）のメトヘモグロビン（「ｍｅｔ−Ｈｂ」）への変化または変換を意味する。ＨｂＯ２ではヘム鉄原子は還元第一鉄（Ｆｅ２＋）状態であるが、ｍｅｔ−Ｈｂではヘム−鉄原子は酸化第二鉄（Ｆｅ３＋）状態である。
【００３９】
「デオキシ」および「オキシ」は、Ｈｂ ＡおよびｒＨｂのヘム鉄原子の酸化状態を意味する。オキシヘモグロビン（「オキシ−Ｈｂ」または「ＨｂＯ２」）は、ヘム基に結合した４つの酸素分子を持つ。デオキシヘモグロビン（「デオキシ−Ｈｂ」）は、酸素分子を含有しない。正常な動脈血では、健常成人ヘモグロビンＡ（「Ｈｂ Ａ」）はオキシ型（「Ｈｂ  Ｏ２  Ａ」または「オキシ−Ｈｂ Ａ」）である。静脈血では、Ｈｂ Ａの一部はデオキシ型（「デオキシ−Ｈｂ Ａ」）である。
【００４０】
「一酸化炭素−Ｈｂ」、「ＨｂＣＯ  Ａ」、「ｒＨｂＣＯ」、および「ＣＯ型」はすべて、酸素分子ではなく一酸化炭素分子と結合したヘモグロビンを意味する。
【００４１】
「フェリ−ヘモグロビン」、「フェリ−Ｈｂ」、「第二鉄型」、「メトヘモグロビン」、「ｍｅｔ−Ｈｂ」、および「Ｆｅ３＋状態」はすべて、それぞれのヘム鉄原子が第二鉄（Ｆｅ３＋）状態に酸化されたヘモグロビンを意味する。フェリ−Ｈｂは酸素と結合しない。
【００４２】
「メチオニンアミノペプチダーゼ」は、ペプチド配列からアミノ−（Ｎ）末端チオニン残基を特定的に切断する、酵素メチオニンアミノペプチダーゼを意味する。
【００４３】
「酸素親和性」は、ヘモグロビン分子への酸素の結合強度を意味する。酸素親和性が高いことは、ヘモグロビンが結合酸素分子を容易に放出しないことを意味する。Ｐ５０は、酸素親和性の尺度である。
【００４４】
「協同性」は、ヘモグロビン分子の４つのサブユニットによる酸素結合を意味し、ヒル係数（ｎｍａｘ）で測定される。２９℃、ｐＨ７．４、０．１Ｍリン酸ナトリウム中におけるＨｂ Ａのｎｍａｘは約３．２である。
【００４５】
２つの典型的な四次構造として、酸素親和性の低いデオキシ−ＨｂのＴ（緊張）四次構造および親和性の高いオキシ−ＨｂのＲ（弛緩）四次構造がある。「Ｒ型」または「Ｒ様」および類似の用語は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでのＤＳＳから１０．７ｐｐｍのプロトン共鳴といった、特徴的な四次構造マーカーを示すヘモグロビンを意味する。「Ｔ型」または「Ｔ様」および類似の用語は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでのＤＳＳから〜１４．０ｐｐｍのプロトン共鳴といった、特徴的なＴ四次構造を示すヘモグロビンを意味する。
【００４６】
方法および結果
シェンら（１９９３）、米国特許第５，７５３，４６５号、およびキムら（１９９５）、米国特許第５，８４３，８８８号に記載された大腸菌（Ｅ．  Ｃｏｌｉ）発現系を使用して、低酸素親和性を示し、かつ、酸素結合における高い協同性を保持する、新しい非天然型人工組み換えヘモグロビン（「ｒＨｂ」）を作製した。これらのｒＨｂの一つであるｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）は、他に知られている特定の低酸素親和性変異体と比較して、自動酸化に対する抵抗の増加を示す。さらに詳しくは、本発明は、本明細書でｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）として表す、Ｈｂ分子のα１β１サブユニット界面および中央空洞に位置する各β鎖の１０８位のアスパラギン残基がグルタミン残基により置換されている、組み換え法により産生されるＨｂ Ａ変異体、および、本明細書でｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）として表す、各β鎖の１０５位のロイシン残基がトリプトファン残基に置換されており、デオキシ四次構造を安定化させて酸素結合親和性を低下させるため分子内のα１β２サブユニット界面においてβ１０５Ｔｒｐとβ９４Ａｓｐの間で新しい水素結合を形成している、組み換え法により産生されるＨｂ Ａの突然変異体に関する。
【００４７】
これらの新しい人工ヘモグロビン（すなわち、完全に血液以外の供給源から得られるヘモグロビン）は、低い酸素親和性および酸素結合における高い協同性を示す。その上、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）は、ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）およびｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）といった他の既知の低酸素親和性変異体と比較して、自動酸化に対する抵抗の増加を示す。さらに、これらの新しい人工ヘモグロビンは、結合の際に未使用サブユニットの解離を示さない。無細胞条件下で、本発明のｒＨｂは、赤血球中のＨｂ Ａと同様またはより低い酸素結合性を示す。したがって、これらのｒＨｂは、ヘモグロビン由来の酸素運搬体、すなわち、潜在的代用血液、またはヘモグロビン治療法として有用である。
【００４８】
また、他の適切な変異を有する低酸素親和性ヘモグロビンの調製および使用も、本発明に含まれる。特に、本発明の方法は、更なる有利な特性を示す他のヘモグロビン変異体の産生に使用することも可能である。代用血液または治療法に適した、低い酸素親和性、高い酸素結合協同性、および自動酸化に対する抵抗の増加を示す、他の有用な変異体の適性を評価する方法は、本明細書で後述する。ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）を得るために好適な物質および方法は、下記の参考例に示す。本発明のｒＨｂの産生は、好適には組み換え法によるが、非組み換え法による産生も可能であると考えられている。
【００４９】
本発明の好適なｒＨｂ変異体、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）は、アロステリックエフェクターＩＨＰの添加および／または温度の低下によって、結合状態のままでＲ四次構造からＴ四次構造に切り替わることができる。したがって、本発明の組み換えヘモグロビンは、α１β２およびα１β１界面におけるサブユニット相互作用の性質ならびにヘモグロビンのアロステリック機構における分子的機序に関して新しい知見を得るために使用することができる。
【００５０】
以下に示すように、本発明のｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）は、低い酸素親和性、つまりボーア効果の増強を示すが、Ｈｂ Ａと同様の協同性を示し、また、他の既知の低酸素親和性組み換えヘモグロビンと比較して、メトヘモグロビン（「ｍｅｔ−Ｈｂ」）への酸化が遅い。例えば、既知の低酸素親和性組み換えヘモグロビンであるｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ、β１０８Ａｓｎ→Ｌｙｓ）（エイチ・ダブリュー・キム（Ｋｉｍ，  Ｈ．−Ｗ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：６６２０−６６２７（１９９６）（以下、「キムら（１９９６）」と呼ぶ）、シー・ホ（Ｈｏ，  Ｃ．）ら、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ：  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ（Ｔｓｕｃｈｉｄａ，  Ｅ．，  Ｅｄ．）、エルセビアー・サイエンス・ＳＡ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＳＡ）、ローザンヌ、スイス、ｐｐ．２８１−２９６（１９９８）（以下、「ホら（１９９８）」と呼ぶ）、ジェオング（Ｊｅｏｎｇ）ら（１９９９）、およびツァイ（Ｔｓａｉ）ら（１９９９）参照。（この開示内容は、本明細書に引用される））は、より早く酸化される。したがって、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）はヘモグロビン由来の酸素運搬体およびヘモグロビン治療法として有用である。
【００５１】
プロトン核磁気共鳴（「１Ｈ−ＮＭＲ」）試験によって、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）のヘムポケット周囲の三次構造並びにα１β１およびα１β２サブユニット界面の四次構造が、Ｈｂ Ａのそれらと類似していることが示された。１Ｈ−ＮＭＲ試験はまた、アロステリックエフェクターＩＨＰの添加および／または温度の低下により、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）がその結合状態を変えることなくＲ四次構造からＴ四次構造に切り替わることが可能であることを示している。このことは、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）のＴ四次構造が、Ｈｂ Ａのそれよりも安定していることを示唆している。これは、ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）（エイチ・ダブリュー・キム（Ｋｉｍ，  Ｈ．Ｗ．）ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４８：８６７（１９９５）（以下、「キムら（１９９５）」と呼ぶ））およびｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｑ）（ホら（１９９８）、ツァイら（１９９９））に見られる低酸素親和性の分子機構と一致している。
【００５２】
ティー・イー・カーバー（Ｃａｒｖｅｒ，  Ｔ．Ｅ．）ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：１４４４３（１９９２）；アール・イー・ブラントレー・ジュニア（Ｂｒａｎｔｌｅｙ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｊｒ．）ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６８：６９９５（１９９６）（以下、「ブラントレーら（１９９３）」と呼ぶ）；およびアール・エフ・エイク（Ｅｉｃｈ，  Ｒ．  Ｆ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：  ６９７６（１９９６）（この開示内容は、本明細書に引用される）によって、Ｂ１０位のＬｅｕ残基をフェニルアラニンで置換すると、ミオグロビンの自動酸化が抑制されること、並びに、α鎖のＢ１０位は、デオキシ−およびオキシ−Ｈｂ ＡのＮＯ反応を低下させることが報告されている。末端のヘムポケットに適切な変異（すなわち、αＬ２９Ｆ）をいれることによるオキシ−Ｈｂ ＡのＮＯ反応の減少は、生体内で記録された高血圧効果の抑制と関連付けられている（ディー・エイチ・ドハーティ（Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｄ．  Ｈ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６：  ６７２（１９９８）（この開示内容は、本明細書に引用される）。したがって、以下に詳述されるように、この変異をβＮ１０８Ｑにさらに加えることにより、二重の突然変異体、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）を作製した。この二重の変異体は、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）と比較して、自動酸化に対してより安定しているが、アロステリックエフェクター２，３−ＢＰＧ  ２  ｍＭの存在下でＨｂ Ａと同等の酸素結合性を示すことが見出された。
【００５３】
変異ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）は、デオキシ四次構造を安定化させることにより酸素親和性を低下させるため、α１β２サブユニット界面においてβ１０５Ｔｒｐと９４Ａｓｐが新しい水素結合を形成するよう設計された。ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）は、非常に低い酸素親和性を示し、Ｈｂ Ａ（２９℃、ｐＨ  ７．４、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で、Ｐ５０＝９．９ｍｍ  Ｈｇ、ｎｍａｘ＝３．２）と比較すると、高い協同性（２９℃、ｐＨ  ７．４、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で、Ｐ５０＝２８．２ｍｍ  Ｈｇ、ｎｍａｘ＝２．６）を維持していることが見出された。
【００５４】
ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のデオキシ四次構造のα１β２サブユニット界面において、β１０５Ｔｒｐとα９４Ａｓｐが新しい水素結合を形成する証拠を示すために、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）変異体およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）変異体が設計された。本発明に従って実施された１５Ｎ−ラベルのｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）中での多核、多次元の核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）試験により、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のβ１０５Ｔｒｐにおいて、インドール窒素が結合したプロトン共鳴が識別された。Ｈｂ ＡおよびｒＨｂ変異体の１Ｈ−ＮＭＲ  試験を使用して、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）が示す低酸素親和性の構造上の原理を調べた。ＮＭＲの結果から、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）がデオキシ四次構造のα１β２サブユニットにおいてβ１０５Ｔｒｐと９４Ａｓｐが新しい水素結合を形成することが示された。ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の低酸素親和性は、β１０５Ｔｒｐとα９４Ａｓｐの間で形成された新しい水素結合に起因すると考えられる。
【００５５】
プロトン核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）分光法を使用して、溶解状態のＨｂの三次構造および四次構造を検討した（ホら（１９９２））。２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−スルホネート（「ＤＳＳ」）のメチルプロトン共鳴から、〜１５から〜９ｐｐｍの位置にある数個の置換性プロトン共鳴が、Ｈｂ Ａのオキシおよびデオキシの両方の状態におけるα１β１およびα１β２サブユニット界面におけるサブユニット間水素結合として特徴付けられた。
【００５６】
ＮＭＲによって観測されたこれらの水素結合プロトンは、機能の検討において構造マーカーとして使用できる。詳細には、ＤＳＳから〜１４ｐｐｍの共鳴は、デオキシ−Ｈｂ Ａのα１β２界面におけるα４２Ｔｙｒとβ９９Ａｓｐとの間のサブユニット間水素結合して識別されており、これはＨｂ ＡのＴ構造の特徴である（エル・ダブリュー・エム・ファン（Ｆｕｎｇ，  Ｌ．  Ｗ．Ｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４：２５２６（１９７５）（以下、「ファンら（１９７５）」と呼ぶ）、１９７５；アイ・エム・ルッス（Ｒｕｓｓｕ，  Ｉ．Ｍ．）らＢｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ９１４：４０（１９８７）（以下、「ルッスら（１９８７）」と呼ぶ）参照。）。デオキシ型およびＣＯ型両方のＨｂのＴ構造マーカーを様々な条件下で観測することによって、Ｔ構造の安定性を評価し、Ｔ構造からＲ構造への変換を観測することができる。
【００５７】
本発明において、低酸素親和性および高い協同性を示すｒＨｂの設計は、Ｒ構造を乱すことなくＴ構造を安定化させることで達成される（ホら（１９９８）参照）。このことは、低酸素親和性および健常な協同性を示すｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）の設計において表れている（キムら（１９９５）、米国特許第５，８３４，８８８号参照。）。こうして設計した変異は、α１β２サブユニット界面およびＨｂ分子の中央空洞に位置する。１Ｈ−ＮＭＲ試験によると、ｒＨｂＣＯ（αＶ９６Ｗ）にアロステリックエフェクターＩＨＰを添加しおよび／または温度を低下させることにより、その結合状態を変えることなくＲ構造からＴ構造に切り替わることが可能であった。
【００５８】
Ｔ状態にあるｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）の結晶構造は、α１β２サブユニット界面にて、α９６Ｔｒｐ  Ｎε１とβ１０１Ｇｌｕ  Ｏε２の間で水を媒体とする新しい水素結合を示した（ティー・エー・プイウス（Ｐｕｉｕｓ，  Ｔ．Ａ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：９２５８（１９９８）（以下、「プイウスら（１９９８）」と呼ぶ）参照。）。１Ｈ−ＮＭＲ試験および結晶構造解析の両方により、ｒＨｂのＴ構造が安定化していることが示された。本発明ではまた、ＮＭＲ試験によって、ｒＨｂＣＯ（βＮ１０８Ｑ）とｒＨｂＣＯ（βＬ１０５Ｗ）が結合状態のままでＴ四次構造に切り替えられることも示された。これらの結果は、これら２つのｒＨｂのＴ構造が、Ｈｂ Ａのそれよりも安定していることを示唆している。
【００５９】
上に述べたように、本発明の方法は、他の異なる特性を持つ人工ヘモグロビン変異体や自然に発生する突然変異を補うヘモグロビン変異体の産生にも使用することができる。ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）を得るために好適な物質および方法は、下記の参考例に示した。なお、非組み換え法の使用も可能である。
【００６０】
参考例
ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の発現プラスミドの作製
【００６１】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｈｂ Ａ発現プラスミドｐＨＥ２およびｐＨＥ７（それぞれヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子ならびにｃＤＮＡを含有する）は、本発明のヘモグロビン変異体を発現するための出発プラスミドとして使用した。プラスミドｐＨＥ２およびｐＨＥ７の作製並びに該プラスミドにより産生されるｒＨｂ Ａの特性については、シェンら（１９９３）、米国特許第５，７５３，４６５号、ティー・ジェイ・シェン（Ｓｈｅｎ，Ｔ．−Ｊ．）らＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１０８５（１９９７）（以下、「シェンら（１９９７）」と呼ぶ）、キムら（１９９４）、および米国特許第５，８４３，８８８号に全て記載されている（この開示内容は、本明細書に引用される）。
【００６２】
合成グロビン遺伝子を使用した、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）変異体の発現に使用されるプラスミドｐＨＥ２００９は、以下の通り作製した。プラスミドｐＨＥ２を出発プラスミドとして使用し、配列５’−ＣＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号１）（変異コドンに下線を引いた）のオリゴヌクレオチドをディーエヌエー・インターナショナル社（ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）（レイク・オスウィーゴ（Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ）、オレゴン州）より購入し、ｐＨＥ２にβＮ１０８Ｑ変異を導入するためプライマーとして使用した。オリゴヌクレオチド合成の方法は当該分野で公知であり、本発明は特定の方法に限定されない。特定部位への変異導入の手順は「Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ＩＩ  Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ」キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）のプロトコルに従った。得られたプラスミドｐＨＥ２００９には、予測されたβＮ１０８Ｑ変異が含まれていた。
【００６３】
合成グロビン遺伝子を使用した、プラスミドｐＨＥ２０２０（ｒＨｂ（αＤ９４Ａ））変異体およびｐＨＥ２００４（ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）変異体）の作製は、変異オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧ−３’（配列番号２、変異コドンαＤ９４Ａに下線を引いた）および５’−ＧＧＡＡＡＡＣＴＴＣＣＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＴＡＣ−３’（配列番号３、変異コドンβＬ１０５Ｗには下線を引いた）を使用したことを除き、ｐＨＥ２００９の作製と同様に行った。両方のオリゴヌクレオチドを、ディーエヌエー・インターナショナル社（ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）（レイク・オスウィーゴ（Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ）、オレゴン州）より購入した。
【００６４】
プラスミドｐＨＥ２０１７（変異ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、ＢＬ１０５Ｗ））は、プラスミドｐＨＥ２０２０の０．５１ｋｂ  ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ  断片とｐＨＥ２００４の６．３４ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＳｍａＩ断片を結合することにより作製した。ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）変異体を発現するプラスミドｐＨＥ２０１８は、ｐＨＥ２００９の６．０６ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片とｐＨＥ２８４の０．７９ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を結合することにより作製した。プラスミドｐＨＥ２から、変異αＬ２９Ｆを有するプラスミドｐＨＥ２８４を作製する方法は、ジェオングら（１９９９）によってすでに報告されている。
【００６５】
ヒトグロビンｃＤＮＡを用いた、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）変異体を発現するプラスミドｐＨＥ７００９の作製は、以下の通り行った。プラスミドｐＨＥ７のヒトα−グロビンおよびβ−グロビンｃＤＮＡをコードする配列を、当該分野で公知の方法により、ｐＴＺ１８Ｕ（バイオラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州）に挿入した。特定部位の変異導入は、ティー・エム・クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔ．Ｍ．）らＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８５）（この開示内容は、本明細書に引用される）およびシェンら（１９９３）に記載の方法で行った。配列５’−ＡＣＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＴＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴ−３’（配列番号４）（変異コドンＡｓｎ→Ｇｌｎに下線を引いた）からなるオリゴヌクレオチドをディーエヌエー・インターナショナル社（ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）（レイク・オスウィーゴ（Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ）、オレゴン州）より購入し、変異プライマーとして使用した。
【００６６】
次に、プラスミドｐＨＥ７中のヒト健常β−グロビンｃＤＮＡを変異ｃＤＮＡと置換して、プラスミドｐＨＥ７００９を製造した。ｐＨＥ７００９のα−グロビンおよびβ−グロビンｃＤＮＡのＤＮＡ配列を、図１Ａ（配列番号５）に示す。宿主細胞大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９中のプラスミドｐＨＥ７００９を、ｐＨＥ７００９／ＪＭ１０９と名付け、２０００年４月２７日、バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）のアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、寄託番号ＰＴＡ−１７６８号で寄託した。
【００６７】
ヒトグロビンｃＤＮＡを用いた、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）変異体を発現するプラスミドｐＨＥ７００４の作製は、配列５’−ＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号６）（変異コドンＬｅｕ→Ｔｒｐに下線を引いた）のオリゴヌクレオチドをディーエヌエー・インターナショナル社（ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）（レイク・オスウィーゴ（Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ）、オレゴン州）より購入し、変異プライマーとして使用したことを除き、プラスミドｐＨＥ７００９と同様の方法で行った。ｐＨＥ７００４内のα−グロビンおよびβ−グロビンｃＤＮＡのＤＮＡ配列を、図１Ｂ（配列番号７）に示す。宿主細胞大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９中のプラスミドｐＨＥ７００４を、ｐＨＥ７００４／ＪＭ１０９と名付け、２０００年４月２７日、バージニア州（ＶＡ）マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）のアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、寄託番号ＰＴＡ−１７６９号で寄託した。
【００６８】
細胞の増殖
プラスミドｐＨＥ７００９、およびｐＨＥ７００４を、当該分野で公知の方法により、個別に大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）に形質転換した。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）を、１０リットルのマイクロファーム（Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ）発酵槽（ニュー・ブラウンズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、モデルＢｉｏＦｌｏ  ３０００）を用いて、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＴＢ（「Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ」）培地、３２℃の条件で、６００ｎｍの光学密度が１０に達するまで増殖させた。
【００６９】
ＴＢ培地は、１．２％バクトトリプトン、２．４％バクトイーストエキス、０．１７Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０７２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、および１％グルコース溶液を含有する。ｒＨｂの発現は、０．１−０．４ｍＭの濃度になるようにイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）を加えて誘導した。次に培養液にヘミン（２０−５０ｍｇ／Ｌ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加し、さらに少なくとも４時間増殖を続けた。次に遠心分離して細胞を集め、精製が必要になるまで−８０℃で冷凍保存した。（詳細については、シェンら（１９９３）、およびシェンら（１９９７）を参照。）
【００７０】
本発明の組み換えヘモグロビン変異体の発現と産生には、現在、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞が好適であるが、本発明は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）に限定されない。他の適当な発現系、例えば、酵母、昆虫細胞、およびブタ、ヒツジ、ウシなどのトランスジェニック動物を使用してヘモグロビン変異体を発現させることも有効である。プラスミドｐＨＥ７００９およびｐＨＥ７００４は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞に対して最適化されているが、他の発現系に使用することも有効である。また、これらのプラスミドはヒト遺伝子によって作製することも可能である。
【００７１】
ｒＨｂの単離と精製
プラスミドｐＨＥ７００９およびｐＨＥ７００４で形質転換した細胞から得られた組み換えヘモグロビンを、シェンら（１９９３）、およびシェンら（１９９７）に記載の方法を用いて精製した。冷凍保存した細胞ペーストを溶解緩衝液（４０ｍＭトリス塩基／１ｍＭベンズアミジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）））に、細胞ペースト３ｍｌ／ｇとなるように加えた。細胞の溶解手順を使用して、高圧ホモジナイザー（モデル  ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５、アベスティン（Ａｖｅｓｔｉｎ））に細胞ペーストを３回通した。次に溶解物をベックマン遠心分離機（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＪＡ１４ローター）で、４℃、１３，０００回転／分で２．５時間遠心分離した。
【００７２】
次にツァイら（１９９９）に記載の方法で、溶解物の上精をＣＯガスで飽和させ、３０℃で一晩放置した。次に上精をミリポア・ミニタン・アクリリック（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｎｉｔａｎ  Ａｃｒｙｌｉｃ）限外濾過装置に通して、タンパク質を濃縮させた。ポリエチレンイミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を最終濃度を０．５％となるように加え、核酸を沈殿させた。遠心分離後、試料をｐＨ８．３の２０ｍＭトリス−塩酸／０．５ｍＭトリエチレンテトラアミン（「ＴＥＴＡ」）（シグマ（ｓｉｇｍａ））で、一晩、緩衝液を１〜２回交換して透析した。この手順を通じて、試料は４℃、ＣＯ環境下で保存した。シェンら（１９９３）およびシェンら（１９９７）の手順に従って、Ｑ−セファロース・ファスト−フロー・カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陰イオン交換体）を通した後、ｒＨｂ画分を収集した。ファルマシアを酸化、還元してＣＯ型に転化した。このＨｂ溶液を、次にファスト・プロテイン液体クロマトグラフィー（「ＦＰＬＣ」）モノ−Ｓカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陽イオン交換体、ＨＲ１６／１０）を通して、ｐＨ６．８の０．１−０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）中の１０ｍＭリン酸ナトリウム（溶解液Ａ）およびｐＨ８．３の０．１−０．５ｍＭＥＤＴＡ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（溶解液Ｂ）の勾配で溶出して精製した。
【００７３】
ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）は２つの主要なピークで個別に溶出した。図２Ａは、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）のピークａおよびピークｂを示している。図２Ｂは、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）が、３つの主要なピークであるピークａ、ｂ、およびｃで個別に溶出したことを示している。両方のケースで、ピークｂから集められたｒＨｂは、アミノ末端に２％以下のメチオニンを含有し、正しい分子量を有していた。
【００７４】
質量分光分析
質量分光分析に用いるＨｂ試料を、蒸留水に対して充分に透析し、次に凍結乾燥した。分析の直前に、試料を水に溶解して、１２５ｐｍｏｌＨｂ／μｌ  Ｈ２Ｏ（７．８ｍｇ／ｍｌ）の濃度にした。次にこれらの溶液を等分して希釈し、最終濃度１０ｐｍｏｌ／μｌ（５０：５０水／アセトニトリル、０．２％ギ酸を含む）とした。等分したこれらの最終溶液（１０μｌ）を、５μｌ／分で電子噴霧イオン源に導入した。
【００７５】
電子噴霧分析は、シェンら（１９９３）に記載のように、ブイジー・クアトロ−ビーキュー（ＶＧ  Ｑｕａｔｔｒｏ−ＢＱ）（フィソンズ・インスツルメンツ（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ブイジー・バイオテク（ＶＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、オルトリナム（Ａｌｔｒｉｎｃｈａｍ）、英国）で行なった。エドマン分解法の自動サイクルを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ガス／液相シーケンサー（モデル  ４７０／９００Ａ）にオンライン・フェニルチオヒダントイン・アミノ酸解析器（モデル１２０Ａ）を装備して行なった。これら２つの分析手順を使用して、ｒＨｂの性質を評価した。この試験で使用したすべてのｒＨｂは正しい分子量を持ち、アミノ末端に含有するメチオニンは２％以下だった。
【００７６】
ｒＨｂの酸素結合特性
酸素解離曲線は、ヘモックス−アナライザー（Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ）（ティーシーエス・メディカル・プロダクツ（ＴＣＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ハンティントンバレイ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｖａｌｌｅｙ）、ペンシルバニア州）により、２９℃で、ｐＨの関数として測定した。使用したＨｂの濃度は、およそ０．１ｍＭ／ヘムであった。エー・ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ，  Ａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ３１０：３０９（１９７３）（この開示内容は、本明細書に引用される）に記載のメトヘモグロビン（「ｍｅｔ−Ｈｂ」）還元酵素系を、試料中のｍｅｔ−Ｈｂを還元する必要がある場合に使用した。
【００７７】
酸素平衡測定後、直ちに各試料の可視の吸収スペクトルを記録し、イー・アントニニ（Ａｎｔｏｎｉｎｉ，  Ｅ）ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ４５：１２３（１９６５）（この開示内容は本明細書に引用される）に記載されたＨｂの吸光係数を使用してｍｅｔ−Ｈｂの内容を推計した。酸素平衡パラメーターは、アデア（Ａｄａｉｒ）の式を各平衡酸素結合曲線に当てはめ、非線形最小二乗法により導き出された。酸素親和性の単位であるＰ５０は、５０％の飽和度を示す点から求められた。協同性の単位であるヒル係数（ｎｍａｘ）は、線形回帰によるヒルプロットの最大勾配として求められた。ｎｍａｘは６０％〜６５％の間の酸素飽和度で導いた。Ｐ５０測定の誤差範囲はｍｍＨｇでプラスマイナス５％、ｎｍａｘ測定の誤差範囲はプラスマイナス７％である。
【００７８】
ｒＨｂの１Ｈ−ＮＭＲ分光法測定
ｒＨｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）アバンス（ＡＶＡＮＣＥ）ＤＲＸ−３００、アバンス（ＡＶＡＮＣＥ）ＤＲＸ−５００、およびアバンス（ＡＶＡＮＣＥ）ＤＲＸ−６００  のＮＭＲ分光計をそれぞれ３００、５００、および６００ＭＨｚ、温度範囲１０℃〜３６℃の間で操作して得られた。すべてのＨｂ試料は、ｐＨ７．０、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（１００％  Ｈ２Ｏ中）に溶解した。Ｈｂの濃度範囲は、およそ５％（〜３ｍＭのヘム条件）であった。水のシグナルは、ピー・プラトー（Ｐｌａｔｅａｕ，  Ｐ．）らＪ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０４：７３１０（１９８２）（以下、「プラトーら（１９８２）」と呼ぶ）（この開示内容は、本明細書に引用される）にて報告された、「ジャンプ−アンド−リターン」パルスシーケンスを用いて抑制した。プロトン化学シフトは、２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−サルホネート（「ＤＳＳ」）のナトリウム塩のメチルプロトン共鳴を基準とし、２９℃でＤＳＳのシグナルより低磁場側の４．７６ｐｐｍに発生する水のシグナルを内部基準として使用した。
【００７９】
ｒＨｂの自動酸化
ｒＨｂの自動酸化はブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）アバンス（ＡＶＡＮＣＥ）ＤＲＸ−３００  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを用いて、オキシ−マーカー（ＤＳＳより−２．３４ｐｐｍ）の消失率を観測することにより記録した。自動酸化反応は３７℃、ｐＨ７．４、ＥＤＴＡ  ５ｍＭを含むプラズマライト（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ）緩衝液（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ））（５％  Ｄ２Ｏ）中で行われた。ＨｂＯ２の濃度は５％（〜３ｍＭのヘム条件）であった。
【００８０】
関数検討
ｒＨｂの酸素結合特性
図３Ａおよび図３Ｂは、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ）、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、およびＨｂ Ａの、２９℃における酸素結合測定値を、ｐＨの関数として示している。ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）はＨｂ Ａと比較して、ｐＨ６．７９からｐＨ８．０９の範囲において著しく低い酸素親和性を示す。ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）の酸化プロセスは、Ｈｂ Ａのｎｍａｘ値約３．２と比較して、ｐＨに依存して、ｎｍａｘ値が約２．７から３．１  という非常に高い協同性を示す（図３Ｂ）。一方、α鎖のＢ１０位における変異（すなわちαＬ２９Ｆ）は、酸素親和性を高め、協同性を低下させる。ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）は、ｐＨ７．４以下において、Ｈｂ ＡのＰ５０値と比較してわずかに高いＰ５０値を示し、変異の酸素親和性に対する効果が相加的であることを示唆している。ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）は、ｎｍａｘ値２．４から２．８と酸素結合における協同性を保持している（図３Ｂ）。ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）は、ｐＨ７．０から８．０において、Ｈｂ Ａと比較して非常に低い酸素親和性（約２〜３倍低い）を示し、標準的な協同性を保持している。
【００８１】
図４は、２，３−ＢＰＧ非存在下のｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）が、５ｍＭ２，３−ＢＰＧ存在下のＨｂ Ａよりも低い酸素親和性であることを示しており、これらのｒＨｂが代用血液系の酸素運搬体候補となりうることを示している。また、図３Ａおよび図３Ｂは、アルカリボーア効果（これは、Ｈｂ Ａでは、ｐＨの低下に伴い酸素親和性の低下を示す）が、Ｈｂ Ａと比較してｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）では増強されていることも示している。
【００８２】
次の表１は、ヘムごとの酸化の際に放出されるボーアプロトン数の比較である。この計算には、連鎖方程式ΔＨ＋＝−∂ｌｏｇ  Ｐ５０／∂ｐＨを使用した（ジェイ・ワイマン（Ｗｙｍａｎ，  Ｊ．）Ａｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ４：４０７（１９４８）およびＡｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９：２３３（１９６４）（以下、「ジェイ・ワイマン（１９４８）および（１９６４）」と呼ぶ）参照。）（この開示内容は、本明細書に引用される）。ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）の両方が、Ｈｂ Ａよりも多くのボーアプロトンを放出した。
【００８３】
Ｈｂ Ａ、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）、およびｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でのボーア効果
【００８４】
【表１】
2004500871.tif 000001
【００８５】
ｒＨｂの自動酸化
オキシ−Ｈｂ Ａ、オキシ−ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）、オキシ−ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）、オキシ−ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、および他に知られている３つの低酸素親和性変異体、オキシ−ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）、オキシ−ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）およびオキシ−ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）の自動酸化プロセスを、３００−ＭＨｚのＮＭＲ分光計で観測した。ＤＳＳより高磁場側の−２．３４ｐｐｍでの共鳴が、オキシ型Ｈｂ ＡのＥ１１Ｖａｌのγ２−ＣＨ３であると決定されている（シー・ダルビト（Ｄａｌｖｉｔ，  Ｃ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：３３９８（１９８５）参照（この開示内容は、本明細書に引用される））。オキシ−マーカー（ＤＳＳから−２．３４ｐｐｍ）の消失率を時間との関数で観測すると、Ｈｂ試料の自動酸化率を決定することができる。その結果を、図５に示す。
【００８６】
フェロ−Ｈｂの比率は、時間（ｔ）とともにモノ−指数関数的に変化し、自動酸化率定数は、ｋａｕｔｏを自動酸化率定数として、［フェロ−Ｈｂ］ｔ＝［フェロ−ｂ］ｔ＝０×ｅｘｐ（−ｋａｕｔｏ×ｔ）の式で求めることができる。Ｈｂ ＡおよびｒＨｂの自動酸化率定数を、次の表２に示す。３７℃、ｐＨ７．４のプラズマライト（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ）緩衝液中で、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）、およびｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）は、Ｈｂ Ａよりそれぞれ２．８倍、８倍、４．４倍、および８倍早く酸化した。ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）は、研究室で開発された他の既知の低酸素親和性変異体、すなわちｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）と比較して、自動酸化に対してより安定していることが示された。変異αＬ２９ＦをｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）に導入することで、自動酸化率が低下した。
【００８７】
ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）は、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）と比較して、それぞれ２．５倍および２．８倍遅く自動酸化した。このように、変異αＬ２９Ｆは、自動酸化プロセスの速度を下げるのに非常に効果的であり、ミオグロビンでの結果（ブラントレーら（１９９３）参照。）（この開示内容は、本明細書に引用される）でもそのことが示唆されている。
【００８８】
ヘミクローム様のスペクトルが、試験された全ての低酸素親和性ｒＨｂの中で、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）のみの自動酸化プロセスで観測されている。ヘミクロームは、メトヘモグロビン（ｍｅｔ−Ｈｂ）が第二鉄高スピン型から第二鉄低スピン型に転化する際に形成される。第二鉄低スピン型では、末端のイミダゾールがＨ２Ｏリガンドと置き換わる（レビー（Ｌｅｖｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：９３１１（１９９０）；レビー（Ｌｅｖｙ）ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ６１：７５０（１９９２）；ブランバーグ（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）ら、Ａｄｖ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｅｒｉｅｓ  １００：２７１（１９９１）参照）。これは、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）の酸化型がヘミクローム様スペクトルを示すという、ジェオングら（１９９９）の結果に従っており、酸素運搬体の候補として考慮するに相応しくないことを示している。
【００８９】
自動酸化率定数、低酸素親和性変異体の酸素親和性および協同性
【００９０】
【表２】
2004500871.tif 000002
【００９１】
ａ  Ｈｂ ＡおよびｒＨｂの自動酸化率定数（ｋａｕｔｏ）は、３７℃、ｐＨ７．４のプラズマライト（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ）緩衝液中、［オキシ−Ｈｂ］の３ｍＭヘムによって得た。
【００９２】
ｂ  酸素親和性および協同性は、２９℃、ｐＨ７．４、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で得た。タンパク質濃度は、０．１ｍＭヘムであった。
【００９３】
ｃ  ジェオングら（１９９９）より。
【００９４】
ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）の構造検討
【００９５】
１Ｈ−ＮＭＲ測定
１Ｈ−ＮＭＲ分光計は、Ｈｂ Ａおよびその変異体の三次および四次構造変化の観測に優れた装置である（シェンら（１９９３）；キムら（１９９４）；キムら（１９９５）；キムら（１９９６）；およびディー・バリック（Ｂａｒｒｉｃｋ，  Ｄ．）らＮａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ４：７８（１９９７）参照（この開示内容は本明細書に引用される））。
【００９６】
５００ＭＨｚで測定したＣＯ型Ｈｂ Ａ、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）、およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）について、図６Ａは置換性プロトン共鳴を示し、図６Ｂは環流シフトプロトン共鳴を示す。環流シフト共鳴は、ヘムポケット中のアミノ酸残基に関連したヘム基の配向性および／または立体配座、すなわちＨｂ  分子の三次構造に対する感度がよい（シー・ホ（Ｈｏ，  Ｃ．）Ａｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ４３：１５３（１９９２）（以下、「ホ（１９９２）」と呼ぶ）参照（この開示内容は、本明細書に引用される））。約−１．８および約−１．７ｐｐｍでの共鳴が、ＨｂＣＯ  Ａのβ鎖およびα鎖のＥ１１Ｖａｌにおけるγ２−ＣＨ３とそれぞれ決定された（リンドストーム（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ）ら（１９７２）；ダルビト（Ｄａｌｖｉｔ）ら（１９８５）参照）。これら２つの共鳴はｒＨｂＣＯ（βＮ１０８Ｑ）では変化しない。
【００９７】
しかし、ｒＨｂＣＯ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）のα−Ｅ１１Ｖａｌのγ２−ＣＨ３と決定された共鳴は、高磁場側に約−２．０ｐｐｍシフトする。このことは、ｒＨｂＣＯ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）中α−Ｅ１１バリン残基のγ２−ＣＨ３基が、ＨｂＣＯ  Ａのそれよりも標準のヘムの近くに位置していることを示唆している。α２９Ｌは、Ｅ１１Ｖａｌに極めて接近しており、
【００９８】
したがって、αＬ２９Ｆアミノ酸置換体は、α鎖末端のヘムポケット特定部位の立体構造を変えると考えられる。これらのｒＨｂの環流シフト共鳴には、他にもいくつかの変化がある。この実験から、環流シフト共鳴の強度および位置のわずかな違いは、多くのｒＨｂ変異体に見られる一般的な特徴といえる。（例えば、シェンら（１９９３）；キムら（１９９４）；キムら（１９９５）；キムら（１９９６）；ホら（１９９８）；ディー・ピー・サン（Ｓｕｎ，  Ｄ．  Ｐ．）らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：６６６３（１９９７）（以下、「サンら（１９９７）」と呼ぶ）（この開示内容は、本明細書に引用される）およびツァイら（１９９９）参照。これらの変化は、変異の結果、ヘムおよび／またはヘムポケット中のアミノ酸残基の配置がわずかに調整されることを反映している。
【００９９】
Ｈｂ分子の置換性プロトン共鳴は、サブユニット界面の置換可能なプロトンから発生する。本発明において特に関心があるのは、ＤＳＳより１４．２、１２．９、１２．１、１１．２、および１０．７ｐｐｍの置換性プロトン共鳴であり、これらはＨｂ Ａのデオキシ（Ｔ）および／またはオキシ（Ｒ）の両方の状態における、α１β１およびα１β２サブユニット界面のサブユニット間水素結合として特徴付けられているものである（ルッスら（１９８７）；ファンら（１９７５）；およびホら（１９９２）参照（この開示内容は、本明細書に引用される））。
【０１００】
ＤＳＳより１２．９ｐｐｍおよび１２．１ｐｐｍの共鳴は、それぞれ、α１２２Ｈｉｓとβ３５Ｔｙｒ、およびα１０３Ｈｉｓとβ１３１ＧＩｎの間の水素結合であると決定されている（ルッスら（１９８７）、およびシンプラセアヌ（Ｓｉｍｐｌａｃｅａｎｕ）ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．（印刷中）（２０００）（以下、「シンプラセアヌら（２０００）」と呼ぶ）参照）。ｒＨｂＣＯ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂＣＯ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）（図６Ａに示す）のスペクトル中では、１２．１ｐｐｍにおけるＨｂＣＯ  Ａの化学シフトに対応して、１つではなく３つの共鳴が発生する。主ピークは１２．０ｐｐｍで発生し、その肩は１１．８ｐｐｍにあり、付加的な共鳴が１２．３ｐｐｍにある。１２．３ｐｐｍおよび１１．８ｐｐｍの共鳴の強度は、１２．０ｐｐｍおよび１２．９ｐｐｍでの共鳴の強度の１０分の１にも満たない。
【０１０１】
これは、これら２つの付加的な共鳴に追加のプロトンが寄与している可能性は低いことを示唆している。１１．８、１２．０、および１２．３ｐｐｍでの共鳴の積分値の合計は、１２．９ｐｐｍの単一の共鳴のものとほぼ同じである。これは、ＣＯ型のｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）の３つの立体異性体が共存していることを示唆している。
【０１０２】
２９℃、ｐＨ７．０、０．１Ｍリン酸塩中のデオキシ型ｒＨｂおよびＨｂ Ａについて、図７Ａに超微細シフトを示し、図７Ｂに置換性プロトン共鳴を示す。ＤＳＳからの６３ｐｐｍの共鳴が、デオキシ−Ｈｂ Ａのα鎖の近接ヒスチジン残基（α８７Ｈｉｓ）の超微細シフトＮδＨ−置換性プロトンであると決定され、ＤＳＳからの７７ｐｐｍの共鳴が、デオキシ−Ｈｂ Ａのβ鎖（β９２Ｈｉｓ）の対応する残基であると決定されている（エス・タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｓ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：５１９６（１９８０）、およびジー・エヌ・ラマール（Ｌａ  Ｍａｒ，  Ｇ．  Ｎ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ９６：１１７２（１９８０）参照（この開示内容は、本明細書に引用される））。
【０１０３】
ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）のこれら２つの近接ヒスチジル共鳴の化学シフト位置は、Ｈｂ Ａのそれらとまったく同じである。これは、このｒＨｂの近接ヒスチジン残基の周囲に動きがないことを示唆している。しかし、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）のＤＳＳから６３ｐｐｍの共鳴は、低磁場側に４ｐｐｍシフトし、６７ｐｐｍとなっている。これは、αＬ２９Ｆの変異の結果、α鎖の近接ヘムポケットの環境が変化したことを反映している。
【０１０４】
１０−２５ｐｐｍからのスペクトル領域は、ヘムポケットの近接に位置するアミノ酸残基およびポルフィリン環の超微細シフト共鳴ならびに置換性プロトン共鳴から発生する。デオキシ−Ｈｂ Ａとデオキシ−ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）の間には、１０−２５ｐｐｍの共鳴において、顕著な差は見られない。しかし、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）は、１６−２０ｐｐｍの領域上でスペクトルの変化がある。
【０１０５】
これは、α鎖およびβ鎖両方のヘムポケットの環境が変化したことを反映している。１４．２ｐｐｍの共鳴が、デオキシ−Ｈｂ Ａのα１β２界面におけるα４２Ｔｙｒとβ９９Ａｓｐ間のサブユニット間水素結合として識別されている（ファンら（１９７５））。これは、Ｈｂ Ａのデオキシ（Ｔ）四次構造の特徴（ペルツ（１９７０））である。これに対するｒＨｂ（αＬ２９Ｆ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）の共鳴は、高磁場側に０．５ｐｐｍシフトして１３．７ｐｐｍとなる。これは、このデオキシ型のα１β２界面における水素結合が、αＬ２９Ｆの変異によって動かされていることを示唆している。
【０１０６】
本発明における低酸素親和性および高い協同性を示すｒＨｂに特有の特徴は、これらｒＨｂのＣＯ型にＩＨＰを添加および／または温度を低下させることによって、１４．２ｐｐｍにＴ−マーカーが出現することである（キムら（１９９５）；ホら（１９９８）；ツァイら（１９９９）参照）。ＣＯ型ｒＨｂの置換性プロトン共鳴の温度依存性を調べることにより、酸素親和性の構造的影響を評価することができる。
【０１０７】
図８Ａおよび図８Ｂならびに図９Ａおよび図９Ｂは、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中におけるＣＯ型のｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）について、４ｍＭ  ＩＨＰ非存在下（図８Ａ、図９Ａ）または存在下（図８Ｂ、図９Ｂ）での置換性プロトン共鳴を、温度別に示したものである。４ｍＭのＩＨＰ存在下、ｐＨ７．０、０．１Ｍリン酸塩中では、１４．２ｐｐｍのｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）の共鳴は、２９℃から観測することができる（図８Ｂ）。ＣＯ結合したｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）のスペクトルにおいて、低温、４ｍＭのＩＨＰ存在下でＴ−マーカーが出現するということは、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）のＴ状態が、Ｈｂ ＡのＴ状態よりも安定していることを示唆している。しかし、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）の該スペクトルの共鳴は、低温（例えば、１１℃）、４ｍＭのＩＨＰ存在下で、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）のスペクトルの共鳴よりも強度が弱かった。
【０１０８】
ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の構造の検討
ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）は、デオキシ四次構造の安定化により酸素結合親和性を低下させるため、α１β２サブユニット界面においてα９４Ａｓｐとの間で水素結合を形成するよう設計した。ｒＨｂ（ＢＬ１０５Ｗ）のβ１０５Ｔｒｐが、デオキシ四次構造のα１β２サブユニット界面においてα９４Ａｓｐと新しい水素結合を形成することを証明するために、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）を作成した。１５Ｎ−ラベルのｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）での多核、多次元の核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）試験により、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のβ１０５Ｔｒｐのインドール窒素結合プロトン共鳴が識別された。１Ｈ−ＮＭＲ  試験を利用して、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の低酸素親和性の構造上の基礎を調べた。
ＣＯ型ｒＨｂの構造の１Ｈ−ＮＭＲ測定
【０１０９】
図１０Ａは、ＣＯ型のＨｂ Ａ、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の置換性プロトン共鳴を示している。置換性プロトン共鳴は、サブユニット界面の置換可能なプロトンから発生する。最近の１５Ｎ−ラベルｒＨｂ Ａの多核、多次元のＮＭＲ試験で、１０．６ｐｐｍ、１０．４ｐｐｍ、および１０．１ｐｐｍの共鳴が、それぞれ、β３７Ｔｒｐ、α１４ＴＩＰ、およびβ１５Ｔｒｐであると決定されている（シンプラセアヌら（２０００））。Ｈｂ Ａのオキシ型結晶構造（シャアナン（１９８３））は、α１β２サブユニット界面でβ３７Ｔｒｐが水素結合を形成する相手方の候補として、α９４Ａｓｐの可能性が高いことを示唆している。ＣＯ型ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のスペクトルは、置換性プロトン共鳴領域内での追加プロトン共鳴を示している（図１０Ａ）。
【０１１０】
β３７残基およびβ１０５残基が両方ともα１β２界面に位置し、Ｒ四次構造では近い位置にある（シャアナン（１９８３））ことから、β１０５位のＬｅｕをＴｒｐに置換することにより、β３７Ｔｒｐのプロトン共鳴を元の化学シフトからシフト変化させる可能性がある。このことは、追加の共鳴（１１．０ｐｐｍまたは１０．８ｐｐｍのいずれか）がβ１０５Ｔｒｐに由来することを示唆している。このため、ｒＨｂ（β１０５Ｗ）のスペクトルにおける当該共鳴を決定するため、１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の異核、二次元（「２Ｄ」）のＮＭＲ試験を行った。
【０１１１】
ＣＯ型ｒＨｂ（αＤ９４Ａ）のスペクトルは、１０．６ｐｐｍでの共鳴（Ｈｂ Ａでは、β３７Ｔｒｐと決定されている）が欠如しており、Ｈｂ Ａ（図１０Ａ）と比較して９．７ｐｐｍに新しい共鳴が出現することを示した。この結果において、β３７Ｔｒｐの１０．６ｐｐｍの共鳴が、９．７ｐｐｍ（水の共鳴に近い）へシフトしたことは、ＣＯ型ｒＨｂ（αＤ９４Ａ）においてα９４とβ３７間の水素結合が欠如したことに原因があることを示唆している。また、この結果から、１０．６ｐｐｍの共鳴が、α９４Ａｓｐとβ３７Ｔｒｐのサブユニット間水素結合に対するものであることを確認した。ＣＯ型ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）のスペクトルでは、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ）と比較して、１０．８ｐｐｍに１つの追加プロトン共鳴が出現したことを示している。この１０．８ｐｐｍでの共鳴は、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のβ１０５ＴｒｐのインドールＮＨであると決定した。
【０１１２】
図１０Ｂは、ＣＯ型Ｈｂ Ａ、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の環流シフトプロトン共鳴を示す。環流シフト共鳴はヘム配置およびヘムポケットの三次構造に非常に感度よく反応する（ホ（１９９２）参照）。ＣＯ型ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の環流シフトプロトン共鳴のスペクトルは、Ｈｂ Ａのスペクトルとわずかな違いしかないが、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の環流シフトプロトン共鳴のスペクトルは、Ｈｂ Ａのスペクトルとは大きく異なっている。これらの差は、αＤ９４Ａの変異を加えたことにより、ヘム立体構造および／またはヘムポケット内のアミノ酸残基が調整されたことを示唆している。従前の試験により、環流シフト共鳴のわずかな差は、多くのｒＨｂにおいて一般的な特徴であることが示されている。（キムら（１９９４）；キムら（１９９５）；キムら（１９９６）；サンら（１９９７）参照）。
【０１１３】
ＣＯ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の異核２次元ＮＭＲ試験
ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける１１．０ｐｐｍおよび１０．８ｐｐｍのプロトン共鳴を決定するために、ＣＯ型の１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の異核２次元ＮＭＲ試験を行った。その結果を、図１１Ａおよび図１１Ｂ、ならびに図１２Ａ−図１２Ｄに示す。
【０１１４】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＣＯ型１５Ｎ−ラベルのｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ Ａの６００ＭＨｚのＨＭＱＣスペクトルを示す。このスペクトルは１５Ｎを分断せずに得たため、Ｔｒｐ残基の化学シフト座標（１Ｈε１、１５Ｎε１）で双極子が観測された。一般的に、Ｔｒｐ残基の１Ｈε１共鳴は、通常プロトン次元内で〜９から〜１２ｐｐｍに出現し（カバナー（Ｃａｖａｎａｇｈ）ら（１９９６）；ＢｉｏＭａｇＲｅｓＢａｎｋ（１９９９）（ｗｗｗ．ｂｍｒｂ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｒｅｆ＿ｉｎｆｏ／ｓｔａｔｓｅｌ．ｈｔｍ）参照。）、それらの１５Ｎε１共鳴は、通常１５Ｎ次元内で〜１２１から〜１３３ｐｐｍ（ＢｉｏＭａｇＲｅｓＢａｎｋ）に出現する。ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、１１．０ｐｐｍおよび１０．８ｐｐｍでのプロトン共鳴の１５Ｎ化学シフトは、それぞれ１３４ｐｐｍおよび１２９ｐｐｍであり、これらの共鳴がＴｒｐ残基由来であることを示唆している。
【０１１５】
プロトンの化学シフトは窒素の化学シフトに比べて容易に環境からの影響を受けるため、（１１．０、１３４）ｐｐｍをβ３７Ｔｒｐと決定し、また、（１０．８、１２９）ｐｐｍをβ１０５Ｔｒｐと決定した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。これはまた、図１０Ａに示されている内容と一致する。また、ＨＭＱＣスペクトルは、Ｔｒｐ１５Ｎε１化学シフトと、炭素結合したプロトン１Ｈδ１との相互関係を示す。図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、ＣＯ型１５Ｎ−ラベルのｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）とｒＨｂ Ａの両方のスペクトルにおいて、α１４Ｔｒｐおよびβ１５Ｔｒｐの１Ｈδ１の交差ピークが、それぞれ（７．３、１２９）および（７．１、１２７）ｐｐｍで観測された。同様に、ＣＯ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ Ａのスペクトルにおいて、より弱い強度のβ３７Ｔｒｐの１Ｈδ１交差ピーク（２つの結合のカップリングを通して）が、（７．３、１３４）ｐｐｍで観測されている（結果は図１１Ｂには示していない）。β３７Ｔｒｐおよびβ１０５Ｔｒｐの１Ｈδ１交差ピークがＣＯ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ Ａのスペクトルにおいて見られないことから（図１１Ａ）、存在するＴｒｐ決定に関するより多くの証拠を得るため、異なる混合時間でのＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ実験を行った。
【０１１６】
図１２Ａ−図１２Ｄで示すように、４つのＴｒｐ残基すべての１Ｈδ１および１Ｈζ２の交差ピークが、短い混合時間で見られた。これらの交差ピークの強度は、混合時間が６０または１００分になると低下する（図１２Ｃ、１２Ｄ）。図１２Ａ−図１２Ｄはまた、β３７Ｔｒｐとβ１０５Ｔｒｐの１Ｈδ１および１Ｈζ２の化学シフトがお互いに非常に近接していることも示している。これらすべての結果により、Ｔｒｐ残基を決定することができる。
【０１１７】
デオキシ型ｒＨｂの構造の１Ｈ−ＮＭＲ試験
図１３Ａは、デオキシ型Ｈｂ Ａ、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の３００−Ｍｈｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける近接ヒスチジンの超微細シフトＮδＨ共鳴を示している。デオキシ型ｒＨｂ変異体の近接ヒスチジンの超微細シフトＮδＨ共鳴スペクトルは、Ｈｂ Ａのそれと非常によく似ている。
【０１１８】
図１３Ｂは、デオキシ型Ｈｂ Ａ、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の３００−Ｍｈｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける、超微細シフトおよび置換性プロトン共鳴を示している。超微細シフトプロトン共鳴は、ヘム基およびその近接アミノ酸残基のプロトンと、ヘムポケット中のＦｅ（ＩＩ）の不対電子の超微細な相互作用によって発生する（ホ（１９９２））。ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の＋２４から＋１６ｐｐｍの領域における超微細シフトプロトン共鳴は、Ｈｂ Ａと非常によく似ているが、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の当該超微細シフトプロトン共鳴は、Ｈｂ Ａと幾分異なっている。
【０１１９】
図１３Ｃは、デオキシ型Ｈｂ Ａ、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の３００−Ｍｈｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける置換性プロトン共鳴を示す。〜１４ｐｐｍの１Ｈ共鳴を、デオキシ−Ｈｂ Ａのα１β２界面におけるα４２Ｔｙｒとβ９９Ａｓｐとの間のサブユニット間水素結合として識別した。これは、Ｈｂ ＡのデオキシＴ型四次構造の特性である（ファンら（１９７５）参照）。〜１２．２ｐｐｍの共鳴は、α１β２界面におけるα１０３Ｈｉｓとβ１３１Ａｓｐとの間の水素結合であると決定した（非公開の結果）。〜１１．１ｐｐｍの共鳴は、α１β２界面におけるα９４Ａｓｐとβ３７Ｔｒｐとの間の水素結合であると暫定的に決定されている（ファンら（１９７５）；イシモリら（１９９２））。最近の１５Ｎ−ラベルｒＨｂ Ａに対する異核、多次元のＮＭＲ試験によって、〜１３．０ｐｐｍの共鳴がα１２２Ｈｉｓであると決定され、〜１１．１ｐｐｍの共鳴がβ３７Ｔｒｐであると決定している（未発表の結果）。
【０１２０】
デオキシ型のｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のスペクトルは、置換性プロトン共鳴の領域内に追加プロトン共鳴が出現することを示している（図１３Ｃ）。これは、１２．７ｐｐｍの追加の共鳴がβ１０５Ｔｒｐに由来することを示唆している。デオキシ型のｒＨｂ（αＤ９４Ａ）においてはα９４とβ３７との間の水素結合が欠如していることから、β３７Ｔｒｐの共鳴は、元の化学シフトからシフトして、水の共鳴に近い状態に変化するはずである（ＣＯ型で観測された状態と類似している）。デオキシ型ｒＨｂ（αＤ９４Ａ）のスペクトルは、〜１１．１ｐｐｍでの共鳴（Ｈｂ Ａでは、β３７Ｔｒｐと決定）が欠如していることを示している（図１３Ｃ）。
【０１２１】
しかし、デオキシ型ｒＨｂ（αＤ９４Ａ）のβ３７Ｔｒｐの新しい化学シフトがどれであるかは明らかにされていない。デオキシ型ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）のスペクトルには、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ）のスペクトルと比較して、追加のプロトン共鳴が１１．１ｐｐｍに出現している。この共鳴は、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）のβ１０５Ｔｒｐに由来していると見られる。ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）においてα９４ＡｓｐをＡｌａで置換すると、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のβ１０５ＴｒｐのＮＨ共鳴に対する化学シフトが、高磁場側に１．７ｐｐｍシフトし、水の共鳴に近い状態となる。
【０１２２】
これらの結果は、デオキシ型のｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）において、β１０５Ｔｒｐとα９４Ａｓｐの間に新しい水素結合が形成されることを示唆している。
【０１２３】
デオキシ型１５Ｎ−ラベルのｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の異核２次元ＮＭＲ試験
デオキシ型ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける、１２．７ｐｐｍの共鳴がβ１０５Ｔｒｐであることをさらに確認するため、デオキシ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の異核２次元ＮＭＲ試験を行った（図１４および図１５Ａ−図１５Ｄ）。図１４は、デオキシ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の６００−ＭＨｚ  ＨＭＱＣスペクトルを示す。
【０１２４】
ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける１２．７ｐｐｍのプロトン共鳴の１５Ｎ化学シフトは１３４ｐｐｍで、この共鳴がトリプトファン残基に由来していることを示している。また、デオキシ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のＨＱＭＣスペクトルにおいて、Ｔｒｐ  １５Ｎε１の１Ｈδ１交差ピークが、β１０５Ｔｒｐ、β３７Ｔｒｐ、α１４Ｔｒｐおよびβ１５Ｔｒｐについて、それぞれ（７．８、１３４）、（７．６、１３５）、（７．１、１２９）、および（７．０、１２７）ｐｐｍに観測された。また、Ｈｉｓ  １５Ｎε１の１Ｈε１  および１Ｈζ２との交差ピークが、α１０３Ｈｉｓではそれぞれ（８．３、１６３）および（７．１、１６３）ｐｐｍに、α１２２Ｈｉｓではそれぞれ（７．６、１６７）および（７．０、１６７）ｐｐｍに観測された。また、現在の決定に関してより多くの根拠を示し、デオキシ型ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）中のβ１０５Ｔｒｐの微小環境を調べるために、異なる混合時間でのＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ実験を行った。
【０１２５】
β１０５Ｔｒｐ（１２．７ｐｐｍ）では、その１Ｈδ１および１Ｈζ２の交差ピークを、それぞれ７．８および８．２ｐｐｍに、４つ全ての混合時間において観測した（図１５Ａ−図１５Ｄ）。β３７Ｔｒｐ（１１．２ｐｐｍ）については、その１Ｈδ１および１Ｈζ２の交差ピークを、それぞれ７．６および７．３ｐｐｍに、４つ全ての混合時間において観測した（図１５Ａ−図１５Ｄ）。さらに、図１５Ａ−図１５Ｄに示される通り、デオキシ型の１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のＮＯＥＳＹ−ＨＱＭＣスペクトルにおいて、β１０５Ｔｒｐ残基とβ３７Ｔｒｐ残基との間にＮＯＥ効果を観測した。
【０１２６】
ＣＯ型のＨｂに対するＩＨＰおよび温度の影響
図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＣＯ型のＨｂ Ａ、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）について、１１、２０、または２９℃、ＩＨＰ非存在下（図１６Ａ）またはＩＨＰ存在下（図１６Ｂ）における、置換性プロトン共鳴を示す。ＩＨＰ非存在下では、Ｔマーカーは低温のｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）のスペクトルにおいてのみ観測された。ＩＨＰ存在下では、Ｔマーカーは３つ全てのｒＨｂ変異体で観測された。
【０１２７】
これらの結果は、これらのｒＨｂ変異体が、その結合状態を変えることなく、温度の低下および／またはＩＨＰの添加によって、Ｒ構造からＴ構造に切り替わることが可能であることを示している。Ｔマーカーが出現した側における、ＩＨＰ存在下のＣＯ型ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のスペクトルは、ＩＨＰ非存在下のものと比較して、いくつかの違いを示した。ＩＨＰ存在下では、温度を低下させることにより、隣接する１２．９および１１．０（または１０．８）ｐｐｍの共鳴から、１３．１および１１．２ｐｐｍの新しいピークが、徐々に出現する（図１６Ｂ）。
【０１２８】
これらの変化を観測するために、１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）に対するより詳細なＨＳＱＣ実験を、ＩＨＰ非存在下および存在下の両方で行った。ＩＨＰ存在下のＨＳＱＣ実験については、低温下でも行った（図１７Ａ−図１７Ｄ）。２９℃、ＩＨＰ存在下、β３７Ｔｒｐ（１１．０、１３４）ｐｐｍの交差ピーク（１Ｎε１、１５Ｎε１）は消滅した。β１０５Ｔｒｐの、２９℃、ＩＨＰ存在下における（１０．８、１２９）ｐｐｍの交差ピーク（１Ｎε１、１５Ｎε１）は、ＩＨＰ非存在下と比較して非常に弱かった（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。ＩＨＰ存在下で温度が低下すると、（１１．０、１３４）ｐｐｍの交差ピークが再び出現し、２つの新しい交差ピークが（１１．０、１３１）および（１０．９、１３０）ｐｐｍに出現する（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）。これら２つの新しい交差ピークは、β３７Ｔｒｐおよびβ１０５Ｔｒｐに由来すると見られる。
【０１２９】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＩＨＰ非存在下または存在下、１１、２０、２９℃における、ＣＯ型のＨｂ Ａ、ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）、およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の環流シフトプロトン共鳴を示している。ＣＯ型ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の環流シフトプロトン共鳴は、ＩＨＰ非存在下ではＨｂ Ａとごく僅かしか違わないが、ＩＨＰ存在下では、Ｈｂ Ａとは非常に異なる。ＣＯ型のｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の環流シフトプロトン共鳴は、ＩＨＰ非存在下および存在下の両方において、Ｈｂ Ａとは非常に異なるが、ＩＨＰ存在下では、これらｒＨｂの環流シフトプロトン共鳴は互いに非常に類似している。
【０１３０】
さらに、ＩＨＰ存在下のＣＯ型ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）の環流シフトプロトン共鳴は、温度を下げると、ｒＨｂ（αＤ９４Ａ／βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）と非常に類似したものとなる（図１８Ｂ）。ＩＨＰ存在下のＣＯ型のｒＨｂ  （αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）の環流シフトプロトン共鳴のスペクトルは、安定したＴ構造を持つＣＯ型ｒＨｂのスペクトルの１つのタイプを表すと考えられている。したがって、ｒＨｂ変異体とＨｂ Ａのヘムポケット立体構造の違いは、置換性プロトン共鳴のＴマーカーを考慮に入れると、これらのｒＨｂ変異体が容易にＲ構造からＴ構造に切り替えられることも示唆している。−１．８および１．９ｐｐｍの共鳴は、それぞれＨｂ Ａのα鎖およびβ鎖のヘムポケット末端バリン（Ｅ１１）と決定されている（シー・ダルビト（Ｄａｌｖｉｔ，  Ｃ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：３３９８（１９８５）およびシー・ティー・クラエスク（Ｃｒａｅｓｃｕ，  Ｃ．Ｔ．）ら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８１：８７（１９８９）（この開示内容は、本明細書に引用される））。
【０１３１】
Ｈｂ Ａのスペクトルと比較して、β鎖の末端バリン（Ｅ１１）の共鳴は、特に、ＩＨＰ存在下において、α鎖よりも、ｒＨｂ変異体のスペクトルがより影響を受けていた（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。これらの結果から、ＩＨＰ、温度、または本明細書に記載の変異によって誘導されるＲ構造からＴ構造への切り替えは、主にβ鎖で行われていることが判明した。
【０１３２】
適切に架橋したｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）および／またはｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）は、当該分野における公知の方法により、臨床学的または獣医学的に使用することが許容可能な、ヘモグロビン由来の代用血液または治療用ヘモグロビンとして具体化することができる。（例えば、アール・エム・ウインスロー（Ｒ．Ｍ．  Ｗｉｎｓｌｏｗ）ら編、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ（バークハウザー（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）（１９９５）参照。（この開示内容は、本明細書に引用される））。本発明のヘモグロビンは、敗血性ショックの治療および透析中のアナフィラキシー・ショックの治療などにも有効に使用することができる。
【０１３３】
本発明を例示の目的で詳細に記述したが、このような詳細な説明は、単にそのためになされたものであり、本発明の請求の範囲により限定されることを除き、本発明の思想と範囲から逸脱することがない限り、本発明の当業者が適宜変更して実施することができるものである。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、プラスミドｐＨＥ７００９由来の、組み換えヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）のアルファ−およびベータ−グロビン遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号５）である。
図１Ｂは、プラスミドｐＨＥ７００４由来の、組み換えヒトヘモグロビン変異体ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）のアルファ−およびベータ−グロビン遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号７）である。
図２Ａおよび図２Ｂは、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）（ピークｂ）（図２Ａ）およびｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）（ピークｂ）（図２Ｂ）のＦＰＬＣプロファイルを示す。
図３Ａおよび図３Ｂは、酸素親和性（Ｐ５０）又はヒル係数（ｎｍａｘ）とｐＨとの相関関係を示す。記号は、それぞれ、ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ）（□）；ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）（△）；ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）（×）；ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）（▲）；およびＨｂ Ａ（○）であり、いずれも２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液条件下で測定した。酸素解離データは、０．１ｍＭ  Ｈｂ条件下で測定した。
図４は、ｐＨ７．４、２９℃、０．１Ｍリン酸緩衝液中、アロステリックエフェクター２，３−ＢＰＧ（５ｍＭ）の存在下又は非存在下での、ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）；ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）；ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）；およびＨｂ Ａの酸素飽和度曲線を示す。タンパク質濃度は、ヘム０．１ｍＭであった。
図５は、ｐＨ７．４、３７℃、ＥＤＴＡ  ５ｍＭおよびＤ２Ｏ  ５％のプラズマライト緩衝液中の自動酸化を示す。Ｈｂ Ａ（○）；ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）（▲）；ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）（△）；ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ）（▽）；ｒＨｂ（αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）（▼）；ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）（◇）；およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、αＶ９６Ｗ、βＮ１０８Ｋ）（□）である。自動酸化工程は、３００−ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ、ＤＳＳ基準により、−２．３４ｐｐｍに観測されるオキシ−マーカーの消滅率により測定した。
図６Ａおよび図６Ｂは、５００−ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。それぞれｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液条件下で、ＣＯ型におけるＨｂ Ａ；ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）；およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）につき、置換性プロトン共鳴（図６Ａ）および環流シフトプロトン共鳴（図６Ｂ）を示す。
図７Ａおよび図７Ｂは、３００−ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。それぞれｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液条件下で、ＣＯ型におけるｒＨｂ Ａ；ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ）；ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）；およびｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）の近接ヒスチジンの第一鉄超微細シフトＮδＨ共鳴ならびに超微細シフトで置換性プロトン共鳴を示す。
図８Ａおよび図８Ｂは、５００−ＭＨｚスペクトルを示す。それぞれｐＨ７．０、５００ＭＨｚ、種々の温度（７℃、１１℃、１７℃、２３℃、２９℃）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、アロステリックエフェクター非存在下（図８Ａ）または４ｍＭイノシトール６リン酸（「ＩＨＰ」）存在下（図８Ｂ）での、ＣＯ型ｒＨｂ（βＮ１０８Ｑ）の置換性プロトン共鳴を示す。
図９Ａおよび図９Ｂは、５００−ＭＨｚ  のスペクトルを示す。４ｍＭ  ＩＨＰ非存在下（図８Ａ）または存在下（図９Ｂ）、ｐＨ７．０、種々の温度（７℃、１１℃、１７℃、２３℃、２９℃）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中での、ＣＯ型ｒＨｂ（αＬ２９Ｆ、βＮ１０８Ｑ）の置換性プロトン共鳴を示す。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、６００−ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す。ｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でのＣＯ型Ｈｂ Ａ；ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）；ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）；およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）３〜６％水溶液の、置換性プロトン共鳴（図１０Ａ）または環流シフトプロトン共鳴（図１０Ｂ）を示す。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、９０％  Ｈ２Ｏ／１０％  Ｄ２Ｏ条件下での、ＣＯ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）（図１１Ａ）またはＨｂ Ａ（図１１Ｂ）５〜８％の水溶液の、６００−ＭＨｚ  ２次元異種核相関（「ＨＭＱＣ」）スペクトルである。
図１２Ａ〜図１２Ｄは、種々の時間：１５秒（図１２Ａ）；３０秒（図１２Ｂ）；６０秒（図１２Ｃ）または１００秒（図１２Ｄ）に測定した、ｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、９０％  Ｈ２Ｏ／１０％  Ｄ２Ｏ条件下での、ＣＯ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）５％水溶液の、６００−ＭＨｚ  ２次元  ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ  （「ＮＯＥＳＹ」−核オーバーハウザー効果相関二次元ＮＭＲ）スペクトルである。
図１３Ａ〜図１３Ｃは、ｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、デオキシ型Ｈｂ Ａ；ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）；ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）；またはｒＨｂ（αＤ９４Ａ）３〜６％水溶液の３００−ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図１３Ａは、３００−ＭＨｚで測定した近接ヒスチジンの超微細シフトＮδＨ共鳴；図１３Ｂは、３００−ＭＨｚで測定した超微細シフト置換性プロトン共鳴：図１３Ｃは、３００−ＭＨｚで測定した置換性プロトン共鳴を示す。ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）およびｒＨｂ（αＤ９４Ａ）は、酸化工程で容易にｍｅｔ−Ｈｂを形成するので、ｍｅｔ−Ｈｂの形成を減少させるため、少量の亜ジチオン酸ナトリウムをこれらのＮＭＲサンプルに添加した。
図１４は、ｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、９０％  Ｈ２Ｏ／１０％  Ｄ２Ｏ条件下における、デオキシ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）５〜８％水溶液の６００−ＭＨｚ  ２次元  ＨＭＱＣスペクトルである。
図１５Ａ〜図１５Ｄは、種々の時間：１５秒（図１５Ａ）；３０秒（図１５Ｂ）；６０秒（図１５Ｃ）および１００秒（図１５Ｄ）に測定した、ｐＨ７．０、２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、９０％  Ｈ２Ｏ／１０％  Ｄ２Ｏ条件下における、デオキシ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）５％水溶液の６００−ＭＨｚ  ２次元  ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣスペクトルである。二つの交わるピーク間の実線は、残基内の１Ｈε１と他の残基の１Ｈδ１および１Ｈζ２との間におけるＮＯＥ効果を、β３７Ｔｒｐとβ１０５Ｔｒｐについて示したものである。
図１６Ａ〜図１６Ｂは、ｐＨ７．０、温度が１１℃、２０℃若しくは２９℃、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、２ｍＭ  ＩＨＰ非存在下（図１６Ａ）または存在下（図１６Ｂ）で測定した、ＣＯ型Ｈｂ Ａ；ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）；ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）；またはｒＨｂ（αＤ９４Ａ）３〜６％水溶液の置換性プロトン共鳴６００−ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
図１７Ａ〜図１７Ｄは、２ｍＭ  ＩＨＰ存在下または非存在下、ｐＨ７．０、各温度、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、９０％  Ｈ２Ｏ／１０％  Ｄ２Ｏ条件下での、ＣＯ型１５Ｎ−ラベルｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）５〜８％水溶液の６００−ＭＨｚ  ２次元異種核相関（「ＨＳＱＣ」）スペクトルである。図１７Ａは、ＩＨＰ非存在下、２９℃；図１７Ｂは、２ｍＭ  ＩＨＰ存在下、２９℃；図１７Ｃは、２ｍＭ  ＩＨＰ存在下、２０℃；そして図１７Ｄは、２ｍＭ  ＩＨＰ存在下、１７℃のデータをそれぞれ示す。
図１８Ａ〜図１８Ｂは、２ｍＭ  ＩＨＰ非存在下（図１８Ａ）または存在下（図１８Ｂ）、ｐＨ７．０、各温度、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中での、ＣＯ型Ｈｂ Ａ；ｒＨｂ（βＬ１０５Ｗ）；ｒＨｂ（αＤ９４Ａ、βＬ１０５Ｗ）；またはｒＨｂ（αＤ９４Ａ）３〜６％水溶液の環流シフトプロトン共鳴６００−ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。