(57)【要約】  セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、クレオソートからなることを特徴とする５ＨＴ４受容体拮抗薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、
クレオソートからなることを特徴とする５ＨＴ４受容体拮抗薬。
【請求項２】
セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、
グアヤコール、クレオゾール、パラクレゾール、フェノール、オルトクレゾール、及び４−エチルグアヤコールの混合物からなることを特徴とする５ＨＴ４受容体拮抗薬。
【請求項３】
セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、
下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物よりなることを特徴とする５ＨＴ４受容体拮抗薬。
【化１】
2008099912.tif 000008
（ただし、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である。Ｒ１とＲ２がそれぞれアルキル基の場合、同一であってもよく、異なっていてもよい）
【化２】
2008099912.tif 000009
（ただし、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）
【請求項４】
セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、
グアヤコール、クレオゾール、パラクレゾール、フェノール、オルトクレゾール、及び４−エチルグアヤコールからなる群より選ばれた少なくとも１種からなることを特徴とする５ＨＴ４受容体拮抗薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５ＨＴ４（「５ＨＴ4」なる意味。以下同様）受容体拮抗薬に関する。詳しくは、セロトニン受容体の１つである５ＨＴ４レセプターに強く結合し、当該受容体を強力にブロックすることにより、心房細動やその他の不整脈、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）や胃腸運動性障害、ＣＮＳ（Central Nervous System）領域の疾患の治療や予防に用い得る新規な５ＨＴ４受容体拮抗薬（５ＨＴ４受容体アンタゴニスト）に関する。
【背景技術】
【０００２】
周知のように、モノアミン神経伝達物質であるセロトニン（Serotonin,５−hydroxytryptamine，５ＨＴ）は、小腸粘膜や中枢神経系（視床下部や大脳基底核など）に多く分布し、消化管活動や精神活動に大きく関係している。
セロトニンは体内において受容体と結合し、これによりセロトニン活性が生じる。セロトニンの受容体はいくつかが知られており、その１つに５ＨＴ４がある。このセロトニン５ＨＴ４受容体と結合し、該受容体をブロックすることにより、種々の疾患を治療できる可能性が生じるので、各国で５ＨＴ４受容体拮抗薬のスクリーニングや研究開発が活発に行われている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特表平６−５１０２８３号公報
【発明の開示】
【０００３】
本発明者は、新規な５ＨＴ４受容体拮抗薬を見い出すべく鋭意研究を重ねた結果、５ＨＴ４に対して強力に結合してこれをブロックし、しかも他のセロトニン受容体である５ＨＴ３には影響を及ぼさない選択性（特異性）のある５ＨＴ４受容体拮抗薬を発見し、そして本発明に至った。
従って、本発明は、新規な５ＨＴ４受容体拮抗薬を提供するものである。
【０００４】
上記目的を達成するための本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬の第一特徴構成は、セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、クレオソートからなる点にある。
【０００５】
本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬の第二特徴構成は、セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、グアヤコール、クレオゾール、パラクレゾール、フェノール、オルトクレゾール、及び４−エチルグアヤコールの混合物（以下、「クレオソート構成混合物」ともいう）からなる点にある。
【０００６】
本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬の第三特徴構成は、セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物よりなる点にある。
【０００７】
【化１】
2008099912.tif 000002
（ただし、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である。Ｒ１とＲ２がそれぞれアルキル基の場合、同一であってもよく、異なっていてもよい）
【０００８】
【化２】
2008099912.tif 000003
（ただし、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）
【０００９】
本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬の第四特徴構成は、セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、グアヤコール、クレオゾール、パラクレゾール、フェノール、オルトクレゾール、及び４−エチルグアヤコールからなる群より選ばれた少なくとも１種からなる点にある。
【００１０】
本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬は、セロトニン５ＨＴ４受容体に対して強力に結合し、これをブロックする。しかも、他のセロトニン受容体である５ＨＴ３には影響を及ぼさない。このように、本発明の拮抗薬は選択性（特異性）があるので、心房細動やその他の不整脈、過敏性（大）腸症候群（ＩＢＳ、特に下痢型ＩＢＳ）や胃腸運動性障害、胃食道逆流症、腹痛、アルコール依存症（アルコール中毒）、セロトニン症候群、ＣＮＳ（Central Nervous System）領域疾患の治療用など臨床的にも用いやすくなるといったメリットがある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】は、クレオソート（ＷＣ１）、クレオソート構成混合物（ＷＣ２）、及びセロトニン（各々、3Ｈ−ＧＲ１１３８０８が結合することにより標識されている）の５ＨＴ４受容体ブロック効果（阻害率・抑制効果）を示したグラフを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
本発明は、セロトニン５ＨＴ４受容体に結合する５ＨＴ４受容体拮抗薬であって、クレオソートからなるものである。【００１３】
（クレオソート（木クレオソート））
クレオソートそのものは従来から公知であり、グアヤコール、４−エチルグアヤコール、クレオゾール、オルトクレゾール、パラクレゾール等のクレゾール類、フェノールやキシレノール類等のフェノール誘導体などを含有する。クレオソートは、日本薬局方、米国のナショナル フォーミュラリー（National Formulary）ＸＩＩ等に収載されている。
当該クレオソートは、ブナ、カシ、モミジ、マツ等の樹木、特に広葉樹から得られる木タールを蒸留し、分留により２００〜２３０℃程度（７６０ｍｍＨｇ）の留分を集めて得られるいわゆるウッドクレオソート（木クレオソート）であり、石炭タールから得られるクレオソートとは明確に区別されているものである（緒方規男、馬場達也著、リサーチ コミュニケーションズ イン ケミカル パソロジー アンド ファーマコロジー、６６刊、４１１頁〜４２３頁、１９８９(N. Ogata and T. Baba, Res.Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 66, 411423, 1989)）。【００１４】
上記文献等にも記載されているように、本発明の薬剤の有効成分であるクレオソートはグアヤコール（約２０〜３５％）、クレオゾール（約１５〜２５％）のほか、フェノール、クレゾール類、キシレノール類等の各種フェノール誘導体を含有する混合物であり、特徴的な煙臭及び舌を焼くような味を有する無色〜淡黄色の液体で、比重１．０６４以上を有する。【００１５】
本発明において、クレオソート、クレオソートの構成成分、すなわちグアヤコール、クレオゾール、パラクレゾール、フェノール、オルトクレゾール、及び４−エチルグアヤコールの混合物、または前記混合物より選択された少なくとも１種、好ましくは２種以上、さらに好ましくは３種以上の混合物、あるいは下記化合物（Ｉ−１）、（Ｉ−２）、（Ｉ−３）、及び（Ｉ−４）＜下記化３参照＞および化合物（II−１）、（II−２）、（II−３）、及び（II−４）＜下記化４参照＞が５HＴ４受容体拮抗薬として使用される。【００１６】
【化３】
2008099912.tif 000004
＜化合物（Ｉ−１）、（Ｉ−２）、（Ｉ−３）、及び（Ｉ−４）＞
（ただし、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である。Ｒ１とＲ２がそれぞれアルキル基の場合、同一であってもよく、異なっていてもよい）【００１７】
【化４】
2008099912.tif 000005
＜化合物（II−１）、（II−２）、（II−３）、及び（II−４）＞
（ただし、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基である）【００１８】
（一般式（Ｉ）で示される化合物の例）
一般式（Ｉ）で示される化合物を以下に例示する。
具体的には、Ｒ２が水素原子の場合は、２−メトキシフェノール（「グアヤコール」）、３−メトキシフェノール、４−メトキシフェノール、２−エトキシフェノール、３−エトキシフェノール、４−エトキシフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）フェノール、３−プロポキシ（またはイソプロポキシ）フェノール、４−プロポキシ（またはイソプロポキシ）フェノールなどが挙げられる。また、Ｒ２がアルキル基の場合は、２−メトキシ−３−メチルフェノール、２−メトキシ−３−エチルフェノール、２−メトキシ−３−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール（「クレオソール」）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（「４−エチルグアヤコール」）、２−メトキシ−４−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−メトキシ−５−メチルフェノール、２−メトキシ−５−エチルフェノール、２−メトキシ−５−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−メトキシ−６−メチルフェノール、２−メトキシ−６−エチルフェノール、２−メトキシ−６−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−エトキシ−３−メチルフェノール、２−エトキシ−３−エチルフェノール、２−エトキシ−３−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−エトキシ−４−メチルフェノール、２−エトキシ−４−エチルフェノール、２−エトキシ−４−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−エトキシ−５−メチルフェノール、２−エトキシ−５−エチルフェノール、２−エトキシ−５−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−エトキシ−６−メチルフェノール、２−エトキシ−６−エチルフェノール、２−メトキシ−６−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）−３−メチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）３−エチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）３−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）４−メチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）４−エチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）４−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）５−メチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）５−エチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）５−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）６−メチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）６−エチルフェノール、２−プロポキシ（またはイソプロポキシ）６−プロピル（またはイソプロピル）フェノール、等が挙げられる。これらは１種を単独で用いても構わないし、２種以上を併用することもできる。【００１９】
（一般式（ＩＩ）で示される化合物の例）
一般式（ＩＩ）で示される化合物を以下に例示する。
具体的には、Ｒ３が水素原子の場合はフェノールであり、Ｒ３がアルキル基の場合は、２−メチルフェノール（「o−クレゾール」）、３−メチルフェノール、４−メチルフェノール（「ｐ−クレゾール」）、２−エチルフェノール、３−エチルフェノール、４−エチルフェノール、２−プロピル（またはイソプロピル）フェノールフェノール、３−プロピル（またはイソプロピル）フェノールフェノール、４−プロピル（またはイソプロピル）フェノールフェノール、等が挙げられる。【００２０】
（適応対象となる疾患）
本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬は、セロトニン受容体である５ＨＴ４受容体の結合薬としてブロックすることにより治療や予防が可能となる全ての疾患が適応対象となる。その疾患を具体的に挙げると、例えば、心房細動やその他の不整脈、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ、特に下痢型ＩＢＳ）や胃腸運動性障害、胃食道逆流症、腹痛、アルコール依存症（アルコール中毒）、セロトニン症候群（激越、錯乱、発汗、幻覚、反射亢進、キクローヌス、頻脈など）、ＣＮＳ（Central Nervous System）領域疾患（例えば、精神的不安、パニック障害などの不安障害、うつ病、抑うつ症、痴呆、不眠症、てんかん、パーキンソン病、偏頭痛など）、頻尿や尿閉、尿失禁などである。【００２１】
また、ＳＳＲＩやＳＮＲＩなどの抗うつ薬の副作用を緩和あるいは予防する目的で、本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬を使用することもできる。
なお、セロトニンアンタゴニストは、一般的に正常な消化管運動までも抑制するが、本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬はセロトニンアンタゴニストであるにもかかわらず、異常な消化管運動亢進のみを抑え正常な消化管運動については抑えないので、副作用として便秘を起こすことはなく、また例えば、原因が細菌性であるか、非細菌性であるかが分からないような非特異性の腸炎にも適応可能であり、異常な消化管運動を正常化する働きもある。したがって、大腸の過剰な運動を正常化することによって治療効果のある大腸疾患や症状、例えば、上記した過敏腸症候群以外に、潰瘍性大腸炎、クローン病、大腸憩室炎、虚血性大腸炎、大腸内圧抑制剤(大腸縫合不全予防薬）、大腸出血(大腸内での出血：動静脈奇形等）にも治療効果があり、また大腸腸管運動検査薬としても使用可能である。【００２２】
（製剤の形態、及びその他（添加剤など））
本発明においては、上記クレオソート、クレオソート構成混合物または前記クレオソート構成混合物（以下、これらを総称して「有効成分」ともいう）から選ばれた少なくとも２種の混合物が一般的な医薬製剤の形態で用いられる。すなわち、薬学的に許容され、通常使用される賦形剤ないし希釈剤を用いて常法に従い調製され、治療目的に応じて各種の形態とすることができる。その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、内服液剤等の経口投与に適した剤形、注射剤等の血管内投与、筋肉内投与、皮下又は皮内投与等に適した剤形及び坐剤等の直腸内投与に適した剤形等を挙げることができる。【００２３】
錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸等の滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。【００２４】
丸剤の形態に調製するには、やはりこの分野で従来から公知の各種担体を用いることができ、例えば、甘草末、ブドウ糖、小麦粉等の賦形剤、例えば、グリセリン、水シロップ、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン等の結合剤、薬用酵母、アロールート、ラミナリア末等の崩壊剤等が使用される。【００２５】
カプセル剤の形態に調製するには、この分野で従来から公知の各種担体、例えば、乳糖、オリーブ油、大豆油等の賦形剤が使用される。【００２６】
内用液剤は、水性又は油性懸濁液、溶液、シロップ、その他の形態であってもよい。このような液体製剤には、普通に用いられる添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビットシロップ、メチルセルロース、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、乳化剤、例えば、レシチン、モノオレフィン酸ソルビタン、アラビアゴム等が使用できる。【００２７】
注射剤の形態に調製するには、組成物は、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中の乳液のような形態であってもよく、懸濁化剤、安定化剤及び分散剤のような処方剤を含んでいてもよい。【００２８】
坐剤の形態に調製するには、従来公知の担体を広く使用できる。例えば、カカオ脂、グリセロゼラチン、マクロゴール等の基剤が使用できる。坐剤には必要に応じて乳化剤、懸濁化剤が使用できる。更に本発明の薬剤には、必要に応じて着色剤、香味剤等を添加することもできる。【００２９】
本発明の薬剤中における前記有効成分の量は特に制限されず、製剤の形態等に応じて適宜選択すればよいが、一般には、製剤全重量の０．２〜６０％程度が好ましい。
投薬量は、患者の性別、年齢、体重、症状の程度等により適宜選択されるが、一般に、経口投与及び直腸内投与の場合には、成人に対し、前記有効成分を１日当たり体重１ｋｇに対して１〜５００ｍｇ程度、好ましくは２〜１００ｍｇ程度、より好ましくは２〜２５ｍｇ程度とすればよい。注射剤として非経口的に投与する場合は、同じく成人に対し、前記有効成分を１日当たり体重１ｋｇに対して０．２〜３００ｍｇ程度、好ましくは０．２〜５０ｍｇ程度、より好ましくは０．５〜５ｍｇ程度とすればよい。なお、これらを１日２〜４回程度に分けて投薬してもよい。【００３０】
〔実施例〕
下記表１に記載の各成分を、同表に併記した濃度で以って使用し、５ＨＴ３結合実験ならびに５ＨＴ４結合実験を行った。実験の操作は以下の通り。
１．レセプターの調製
（１）クローンレセプター（Serotonin ５ＨＴ３（Human）receptor）
市販のクローンレセプターをレセプター標品として使用した。
（２）動物組織を用いたレセプター（Serotonin ５ＨＴ４ receptor）
動物組織（モルモット線条体）を秤量（湿重量３．９７７９ｇ）し、１０倍量（３９．７７９ｍｌ）の５０ｍｍｏｌ／Ｌ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加え氷冷下でホモジナイズしたのち遠心分離（５０，０００×ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）した。沈渣を採取しさらに１０倍量（３９．７７９ｍｌ）の５０ｍｍｏｌ／Ｌ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加え氷冷下でホモジナイズしたのち、遠心分離（５０，０００×ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）した。沈渣を採取し１００ｍｇ tissue／ｍＬとなるように５０ｍｍｏｌ／Ｌ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えホモジナイズした。得られた粗膜画分をレセプター標品として使用時まで−８０℃に保存した。【００３１】
２．結合性の検討
各種受容体へのトレーサーの結合に対する被験物質（２濃度）及び陽性物質（２濃度）の阻害率を算出し結合性を検討した。
（１）被験物質溶液の調製
被験物質及び陽性物質を秤量しＤＭＳＯで溶解した後、同液で段階希釈することにより、以下に示す最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した各濃度の溶液を、Milli−Ｑ（超純粋）水で１０倍希釈することにより被験物質溶液及び陽性物質溶液調製した（用時調製）。
被験物質溶液濃度：１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ，１×１０-2ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
ＷＣ１及びＷＣ２においては、０．０１ｍｇ／ｍL ，１ｍｇ／ｍL（最終濃度）
陽性物質溶液濃度：１×１０-7ｍｏｌ／Ｌ，１×１０-5ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（２）置換物質溶液の調製
置換物質を秤量しＤＭＳＯで溶解することにより、最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した溶液をMilli−Ｑ水で１０倍希釈することにより置換物質溶液を調製した（用時調製）。
置換物質溶液濃度
Serotonin５ＨＴ３（Human）：MDL72222，１×１０-5ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
Serotonin５ＨＴ４：Serotonin，１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（３）トレーサー溶液の調製
トレーサー原液を緩衝液で希釈することにより、トレーサー溶液を調製した（用時調製）。
トレーサー溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ３（Human）：3Ｈ-GR65630，０．７７ｎｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
Serotonin ５ＨＴ４：3Ｈ−GR113808，０．５０ｎｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（４）レセプター溶液の調製
レセプター標品を緩衝液で希釈することにより、レセプター溶液を調製した（用時調製）。
レセプター溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ３（Human）receptor：２．１μｇ protein／tube（最終濃度）
Serotonin ５ＨＴ４receptor：５．０ｍｇ tissue／tube（最終濃度）
（５）測定例数
各濃度２例で１回測定した。
（６）測定手順
以下の順序に従い測定を実施した。
１）非特異的結合算出用チューブには置換物質溶液を、総結合算出用チューブには１０％ＤＭＳＯ溶液を、被験物質あるいは陽性物質の阻害率算出用チューブには被験物質溶液あるいは陽性物質溶液をそれぞれ１００μＬ添加
２）緩衝液３００μＬを添加
３）トレーサー溶液１００μＬを添加
４）レセプター溶液５００μＬを添加
５）インキュベート（試験条件に関する事項に記載）
６）セルハーベスターにより濾過（ＧＦ／Ｃ，Whatman）し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）３ｍＬで３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）
７）濾紙を測定バイアル瓶に移し、液体シンチレーター（Atomlight）５ｍＬを添加し、液体シンチレーションカウンターで測定（測定時間２分）
（７）データ処理
阻害率は、「１００−結合率」より算出した。
結合率：［（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ）］×１００（％）
Ｂ：被験物質あるいは陽性物質存在下での結合放射能量（個別値）
Ｂ０：被験物質あるいは陽性物質非存在下での総結合放射能量（平均値）
Ｎ：非特異的結合放射能量（平均値）
なお、データ処理はExcel2000（Microsoft）で行なった。
（８）試験成績の表示
被験物質及び陽性物質の阻害率は％単位とし、平均値を記載した。数値は小数点以下３桁目を四捨五入し、小数点以下２桁で表示した。【００３２】
３．Dose-response curveの作成（ＩＣ50値の算出）
被験物質及び陽性物質（各５濃度）のdose-response curve（用量−反応曲線）を作成し、薬物がトレーサーとレセプターの結合を５０％抑制する薬物濃度（ＩＣ50値）を算出した。
（１）被験物質及び陽性物質溶液の調製
被験物質及び陽性物質を秤量しＤＭＳＯで溶解した後、同液で段階希釈することにより、以下に示す最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した各濃度の溶液を、Milli−Ｑ水で１０倍希釈することにより被験物質溶液及び陽性物質溶液を調製した（用時調製）。
被験物質溶液濃度：０．０１ｍｇ／ｍＬ，  ０．０４  ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ， ０．２ｍｇ／ｍＬ，０．４ｍｇ／ｍＬ，１．０ｍｇ／ｍL，１０ｍｇ／ｍL（最終濃度）
陽性物質溶液濃度：１×１０-9ｍｏｌ／Ｌ，１×１０-8ｍｏｌ／Ｌ，１×１０-7ｍｏｌ／Ｌ，３×１０-7ｍｏｌ／Ｌ，１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ，１×１０-5ｍｏｌ／Ｌ, １×１０-4ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（２）置換物質溶液の調製
置換物質を秤量しＤＭＳＯで溶解することにより、最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した溶液をMilli−Ｑ水で１０倍希釈することにより置換物質溶液を調製した（用時調製）。
置換物質溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４：Serotonin，１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（３）トレーサー溶液の調製
トレーサー原液を緩衝液で希釈することにより、トレーサー溶液を調製した（用時調製）。
トレーサー溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４：3Ｈ−GR113808，０．５１ｎｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（４）レセプター溶液の調製
レセプター標品を緩衝液で希釈することにより、レセプター溶液を調製した（用時調製）。
レセプター溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４receptor：５．０ｍｇ tissue／tube（最終濃度）
（５）測定例数
被験物質溶液及び陽性物質溶液とも各濃度２例で１回測定した。
（６）測定手順
上記の測定手順の方法に従い測定を実施した。
（７）データ処理
Dose-response curveは、薬物存在下での特異的結合放射能（Ｂ−Ｎ）と非存在下での特異的結合放射能（Ｂ０−Ｎ）との比（（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ））をlogit変換した後、被験物質あるいは陽性物質溶液濃度の常用対数値に対してプロットするlogit−logモデルにあてはめ作成した。Dose-response curveの回帰は、次の回帰式を用いた。
Ｙ＝ａＸ＋ｂ
Ｙ＝logit y＝ｌｎ（ｙ／（１−ｙ））、ｙ＝（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ）
Ｂ：結合放射能（個別値、duplicateで１濃度２点）
Ｂ０：薬物非存在下での結合放射能（平均値）
Ｎ：非特異的結合放射能（平均値）
Ｘ＝ｌｏｇｘ、ｘは被験物質あるいは陽性物質溶液濃度
ａ、ｂ＝定数
得られた回帰式より、ＩＣ50値を算出した。また、回帰の際、被験物質あるいは陽性物質溶液濃度の阻害率が５％〜９５％の範囲を超えたものについては採用せず、範囲内の測定値を用いてＩＣ50値を算出した。なお、データ処理はExcel2000（Microsoft）で行なった。
（８）試験成績の表示
被験物質及び陽性物質の各濃度における阻害率は、％単位の平均値で表示し、数値は小数点以下３桁目を四捨五入し、小数点以下２桁で表示した。ＩＣ50値は、ｍｏｌ／Ｌあるいはｇ／Ｌで指数単位表示し、数値は小数点以下３桁目を四捨五入し小数点以下２桁で記載した。【００３３】
４．Scatchard解析（Ｋｄ値の算出）
受容体のScatchard解析を行い、トレーサーのレセプターに対する親和性（Ｋｄ値）及び最大結合量（Ｂｍａｘ値）を算出した。
（１）置換物質溶液の調製
置換物質を秤量しＤＭＳＯで溶解することにより、最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した溶液をMilli−Ｑ水で１０倍希釈することにより置換物質溶液を調製した（用時調製）。
置換物質溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４：Serotonin，１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（２）トレーサー溶液の調製
トレーサー原液を緩衝液で希釈し、さらに、段階希釈することにより、トレーサー溶液を調製した（用時調製）。
トレーサー溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４：3Ｈ−GR113808，０．０４，０．０９，０．１８，０．３８，０．７８，１．６４，３．３１ｎｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（３）レセプター溶液の調製
レセプター標品を緩衝液で希釈することにより、レセプター溶液を調製した（用時調製）。
レセプター溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４ receptor：５．０ｍｇ tissue／tube（最終濃度）
（４）測定例数
各濃度２例で１回測定した。
（５）測定手順
上記の測定手順の方法に従い測定を実施した。
（６）データ処理
Scatchard解析は、放射能量をトレーサー濃度に換算し、縦軸にＢ／Ｆ、横軸にＢをプロットしたのち直線回帰し、次式よりＫｄ値及びＢｍａｘ値を算出した。なお、データ処理はExcel2000（Microsoft）で行なった。
Ｂ／Ｆ＝−１／Ｋｄ（Ｂ−Ｂｍａｘ）
−１／Ｋｄは直線の傾き，ＢｍａｘはＢの切片
Ｂ：結合放射能に相当する結合濃度（平均値）
Ｆ：遊離放射能に相当する遊離濃度（平均値）。
（７）試験成績の表示
Scatchard解析で得られたＫｄ値は、ｎｍｏｌ／Ｌ単位で、Ｂｍａｘ値はｆｍｏｌ／ｍｇ tissue単位で表示し、数値は小数点以下３桁目を四捨五入し小数点以下２桁で記載した。【００３４】
５．Ｋｉ値の算出
（１）データ処理
「Dose-response curveの作成（ＩＣ50値の算出）」に用いたトレーサー濃度（Ｌ）、得られたＩＣ50値及び「Scatchard解析」により求めたＫｄ値を用いて、次式より被験物質及び陽性物質Ｋｉ値を算出した。なお、データ処理は、Excel2000（Microsoft）で行なった。
Ｋｉ＝ＩＣ50／Ｐ，Ｐ＝１＋Ｌ／Ｋｄ
（２）試験成績の表示
Ｋｉ値は、ｍｏｌ／Ｌあるいはｇ／Ｌで指数単位表示し、数値は小数点以下３桁目を四捨五入し小数点以下２桁で記載した。【００３５】
６．Dose-response curveの作成（ＩＣ50値の算出）［２］
被験物質及び陽性物質（各７濃度）のdose-response curveを作成し、薬物がトレーサーとレセプターの結合を５０％抑制する薬物濃度（ＩＣ50値）を算出した。
（１）被験物質及び陽性物質溶液の調製
被験物質及び陽性物質を秤量しＤＭＳＯで溶解した後、同液で段階希釈することにより、以下に示す最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した各濃度の溶液を、Milli−Ｑ水で１０倍希釈することにより被験物質溶液及び陽性物質溶液を調製した（用時調製）。
被験物質：７濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ，  ０．０４  ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ， ０．２ｍｇ／ｍＬ，０．４ｍｇ／ｍＬ，１．０ｍｇ／ｍL，１０ｍｇ／ｍL；最終濃度）
陽性物質：７濃度（１×１０-9，１×１０-8，１×１０-7，３×１０-7，１×１０-6，１×１０-5，１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ；最終濃度）
（２）置換物質溶液の調製
置換物質を秤量しＤＭＳＯで溶解することにより、最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した溶液をMilli−Ｑ水で１０倍希釈することにより置換物質溶液を調製した（用時調製）。
置換物質溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４：Serotonin，１×１０-4ｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（３）トレーサー溶液の調製
トレーサー原液を緩衝液で希釈することにより、トレーサー溶液を調製した（用時調製）。
トレーサー溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４：3Ｈ−GR113808，０．５１ｎｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）
（４）レセプター溶液の調製
レセプター標品を緩衝液で希釈することにより、レセプター溶液を調製した（用時調製）。
レセプター溶液濃度
Serotonin ５ＨＴ４ receptor：５．０ｍｇ tissue／tube（最終濃度）
（５）測定例数
被験物質溶液及び陽性物質溶液とも各濃度２例で１回測定した。
（６）測定手順
上記の測定手順の方法に従い測定を実施した。
（７）データ処理
Dose-response curveは、薬物存在下での特異的結合放射能（Ｂ−Ｎ）と非存在下での特異的結合放射能（Ｂ０−Ｎ）との比（（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ））をlogit変換した後、被験物質あるいは陽性物質溶液濃度の常用対数値に対してプロットするlogit-logモデルにあてはめ作成した。Dose-response curveの回帰は、次の回帰式を用いた。
Ｙ＝ａＸ＋ｂ
Ｙ＝logit y＝ｌｎ（ｙ／（１−ｙ））、ｙ＝（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ）
Ｂ：結合放射能（個別値、duplicateで１濃度２点）
Ｂ０：薬物非存在下での結合放射能（平均値）
Ｎ：非特異的結合放射能（平均値）
Ｘ＝ｌｏｇｘ、ｘは被験物質あるいは陽性物質溶液濃度
ａ、ｂ＝定数
得られた回帰式より、ＩＣ50値を算出した。また、回帰の際、被験物質あるいは陽性物質溶液濃度の阻害率が５％〜９５％の範囲を超えたものについては採用せず、範囲内の測定値を用いてＩＣ50値を算出した。なお、データ処理は、Excel2000（Microsoft）で行った。
（８）試験成績の表示
被験物質及び陽性物質の各濃度における阻害率は、％単位の平均値で表示し、数値は小数点以下３桁目を四捨五入し、小数点以下２桁で表示した。ＩＣ50値は、ｍｏｌ／Ｌあるいはｇ／Ｌで指数単位表示し、数値は小数点以下３桁目を四捨五入し小数点以下２桁で記載した。【００３６】
７．Ｋｉ値の算出［２］
（１）データ処理
「Dose-response curveの作成（ＩＣ50値の算出）［２］」に用いたトレーサー濃度（Ｌ）、得られたＩＣ50値、及び「Scatchard解析」により求めたＫｄ値を用いて、次式より被験物質及び陽性物質Ｋｉ値を算出した。なお、データ処理は、Excel2000（Microsoft）で行った。
Ｋｉ＝ＩＣ50／Ｐ，Ｐ＝１＋Ｌ／Ｋｄ
（２）試験成績の表示
Ｋｉ値は、ｍｏｌ／Ｌあるいはｇ／Ｌで指数単位表示し、数値は小数点以下３桁目を四捨五入し小数点以下２桁で記載した。【００３７】
８．試験結果に関する事項
（１）結合性の検討
Serotonin ５ＨＴ３及びSerotonin ５ＨＴ４受容体に対する木クレオソート関連８物質の阻害率は、Serotonin ５ＨＴ４受容体におけるＷＣ１及びＷＣ２の１ｍｇ／ｍＬの濃度において、それぞれ９６．０９％及び９３．０２％を示した。この結果より、Serotonin ５ＨＴ４受容体に対するＷＣ１及びＷＣ２のＫｉ値を算出することとした。
（２）Dose-response curveの作成（ＩＣ50値の算出）
ＷＣ１及びＷＣ２のSerotonin ５ＨＴ４受容体に対するＩＣ50値は、それぞれ０．０７６ｍｇ／ｍＬ及び０．１８３ｍｇ／ｍＬを示した。
（３）Scatchard解析（Ｋｄ値の算出）
Serotonin ５ＨＴ４受容体のＫｄ値及びＢｍａｘ値は、それぞれ０．４２ｎｍｏｌ／Ｌ及び５．５０ｆｍｏｌ／ｍｇ tissueを示した。
（４）Ｋｉ値の算出
ＷＣ１及びＷＣ２のSerotonin ５ＨＴ４受容体に対するＫｉ値は、それぞれ０．０３４ｍｇ／ｍＬ及び０．０８３ｍｇ／Ｌを示した。
結果を表１，表２および図１に併記する。表１は、さまざまな受容体への放射性リガンドの結合に対するさまざまな検体の効果を表す。表２は、セロトニン４型受容体への放射性リガンドの結合に対する検体と陽性物質の抑制効果とＩＣ５０を表す。【００３８】
【表１】
2008099912.tif 000006
【００３９】
【表２】
2008099912.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の５ＨＴ４受容体拮抗薬は、心房細動やその他の不整脈、過敏性（大）腸症候群や胃腸運動性障害、胃食道逆流症、腹痛、アルコール依存症、セロトニン症候群、ＣＮＳ領域疾患の治療用などに利用することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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