(57)【要約】  本発明は、以下の工程を含む、ヒト樹状細胞の抗原提示能の評価方法を提供する。  （１）α−ガラクトシルセラミドをパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程  （２）該非ヒト哺乳動物からＮＫＴ細胞含有試料を採取する工程  （３）該試料中に存在するＮＫＴ細胞の活性化を検出する工程  また、該方法により、ＮＫＴ細胞に対して抗原提示能を有すると判定されたヒト樹状細胞を含有してなる、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤も提供される。
2009034961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ヒト樹状細胞の抗原提示能の評価方法：
（１）α−ガラクトシルセラミドをパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程； 
（２）該非ヒト哺乳動物からＮＫＴ細胞含有試料を採取する工程；
（３）該試料中に存在するＮＫＴ細胞の活性化を検出する工程。
【請求項２】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＫＴ細胞含有試料が、脾臓、肝臓または末梢血由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＫＴ細胞の活性化を、該ＮＫＴ細胞が産生する１種以上のサイトカインを指標として評価することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
サイトカインが、インターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−４を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒトＮＫＴ細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞を選別するためのものである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒト樹状細胞がＮＫＴ細胞免疫療法により治療効果が得られうる疾患の患者由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
疾患が癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６または７に記載の方法により、ＮＫＴ細胞に対して抗原提示能を有すると判定されたヒト樹状細胞を含有してなる、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤。
【請求項１０】
癌の治療用である、請求項９記載の剤。
【請求項１１】
以下の工程を含む、ヒトＮＫＴ細胞を活性化し得るリガンドのスクリーニング方法：
（１）被験物質をパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程；
（２）該非ヒト哺乳動物からＮＫＴ細胞含有試料を採取する工程；
（３）該試料中に存在するＮＫＴ細胞の活性化を検出する工程。
【請求項１２】
被験物質の代わりにα−ガラクトシルセラミドを用いて前記（１）〜（３）の工程を実施し、該被験物質をパルスした場合とα−ガラクトシルセラミドをパルスした場合との間で、ＮＫＴ細胞の活性化の程度を比較することをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１１または１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞の有効性を評価可能なアッセイ方法、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫＴ細胞は、自己反応性Ｔ細胞として免疫反応の調節制御に関与し、さらには癌細胞の免疫監視に関わり、抗腫瘍効果を示すことが示唆されている。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄという、ＭＨＣに連鎖していないクラスＩ類似分子を認識して、糖脂質リガンドに反応することが知られている。したがって、ＮＫＴ細胞を特異的に刺激すれば、ＭＨＣ非依存的に癌細胞を攻撃することが期待される。実際に、ヒトＶα２４＋ＮＫＴ細胞は、一度活性化されると、様々な種類の癌に対してＭＨＣ非依存的に抗腫瘍効果を発揮することが報告されている（非特許文献１）。【０００３】
α−ガラクトシルセラミドは、樹状細胞表面のＣＤ１ｄ分子に結合して、ＮＫＴ細胞を特異的に活性化する合成糖脂質リガンドである。α−ガラクトシルセラミドは、ヒトに投与できる薬剤基準値（ＧＭＰグレード）を満たしたものが入手可能になっている。そこで近年、癌患者に対して、α−ガラクトシルセラミドをパルスした樹状細胞を静脈経由で投与し、ＮＫＴ細胞を活性化させることにより癌を治療する、癌の免疫療法が試みられている。この癌免疫療法については、癌患者を対象にした臨床試験（Ｐｈａｓｅ  Ｉ相当）が既に終了しており、治療方法の安全性が確かめられている。しかし、樹状細胞を担癌患者自身から単離するため、免疫療法に用いられる樹状細胞そのものに異常がある場合や、α−ガラクトシルセラミドをロードするのに十分なパルス条件が、樹状細胞により必ずしも一定ではない可能性がある。しかし、現段階では、α−ガラクトシルセラミドをパルスされたヒト樹状細胞が、ヒトＮＫＴ細胞に対する抗原提示細胞として有効であるか否かを評価する系が確立されていない。したがって、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法を実施して、ＮＫＴ細胞からインターフェロン−γが産生しなかった場合に、樹状細胞の抗原提示能力に問題があるのか、あるいは患者側の他の要因が原因なのか、判断することができない場合がある。【０００４】
ヒト樹状細胞の有効性を評価する方法として、ヒトＮＫＴ細胞株を使用する方法が考えられる。ヒトＮＫＴ細胞株は、α−ガラクトシルセラミドおよびインターロイキン−２存在下において、ヒト初代ＮＫＴ細胞を培養して樹立できる（非特許文献２）。しかし、樹立されたヒトＮＫＴ細胞株は、ヒト初代ＮＫＴ細胞に比較して、リガンドに対して非常に強い親和性を示すことから、末梢血に存在するヒトＮＫＴ細胞とは性質が異なるものと考えられる。したがって、ヒトＮＫＴ細胞株を使用して得られた結果は、純粋にインビボの活性化機能を反映しているとは考えにくい。さらに、ヒトＮＫＴ細胞株は、長期間安定ではない。以上のことから、ヒト樹状細胞の抗原提示能を評価するために、ヒトＮＫＴ細胞株を使用することは、必ずしも適切ではない。【０００５】
また、樹状細胞の抗原提示能を評価するために、治療を必要とする患者自身のＮＫＴ細胞を使用する方法が考えられる。しかし第１に、ＮＫＴ細胞は血液の中では極めて少量しか存在せず、通常末梢血のリンパ球の０．１％以下であることから、評価に十分な数のＮＫＴ細胞を得るためには、大量の末梢血が必要になる。第２に、ＮＫＴ細胞免疫療法の対象である癌患者では、ＮＫＴ細胞の数の減少や機能の欠損が見られるため（例えば、非特許文献３を参照）、抗原提示能が見られなかった場合に、樹状細胞が原因なのか、それとも患者のＮＫＴ細胞の機能欠損が原因なのか、判断できない。以上２つの理由により、患者自身のＮＫＴ細胞を樹状細胞の有効性評価に使用することは、現実的ではない。【０００６】
ＣＤ１ｄ分子が哺乳動物の間で高度に保存されていること（非特許文献４）、マウスＮＫＴ細胞が、α−ガラクトシルセラミドをパルスされたヒト樹状細胞を認識することは、既に報告されている（非特許文献１、３）。しかし、ヒト樹状細胞をマウス個体に投与して、実際に免疫応答が見られたという報告はこれまでになされていない。
このように、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法に使用するためのヒト樹状細胞の品質を事前に評価し得る有効な手段は存在しないのが現状である。
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，５１０２−５１０５，１９９９
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２７２，１４７−１５９，２００３
【非特許文献３】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７，３４８４−３４９２，２００６
【非特許文献４】Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０，１４６−１５１，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞の抗原提示能の有効性を定量的に評価する新たな方法を提供すること、ならびにヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、α−ガラクトシルセラミドをパルスしたヒト樹状細胞をマウスに投与すると、意外にもマウスＮＫＴ細胞が活性化されることを見出した。しかも、このヒト樹状細胞によるマウスＮＫＴ細胞の活性化は、マウス樹状細胞によるマウスＮＫＴ細胞の活性化と相関しており、定量性があることが明らかとなった。この方法を用いれば、ＮＫＴ細胞免疫療法に使用しようとしている樹状細胞が、ＮＫＴ細胞を活性化し得る樹状細胞か否かを判定して、ヒトへの投与前に選別することが可能になる。以上の結果に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）  以下の工程を含む、ヒト樹状細胞の抗原提示能の評価方法：
（ａ）α−ガラクトシルセラミドをパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）該非ヒト哺乳動物からＮＫＴ細胞含有試料を採取する工程；
（ｃ）該試料中に存在するＮＫＴ細胞の活性化を検出する工程。
（２）  非ヒト哺乳動物がマウスである、上記（１）に記載の方法。
（３）  ＮＫＴ細胞含有試料が、脾臓、肝臓または末梢血由来である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）  ＮＫＴ細胞の活性化を、該ＮＫＴ細胞が産生する１種以上のサイトカインを指標として評価することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  サイトカインが、インターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−４を含む、上記（４）に記載の方法。
（６）  ヒトＮＫＴ細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞を選別するためのものである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  ヒト樹状細胞がＮＫＴ細胞免疫療法により治療効果が得られうる疾患の患者由来である、上記（６）に記載の方法。
（８）  疾患が癌である、上記（７）に記載の方法。
（９）  上記（６）または（７）に記載の方法により、ＮＫＴ細胞に対して抗原提示能を有すると判定されたヒト樹状細胞を含有してなる、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤。
（１０）  癌の治療用である、上記（９）記載の剤。
（１１）  以下の工程を含む、ヒトＮＫＴ細胞を活性化し得るリガンドのスクリーニング方法：
（ａ）被験物質をパルスしたヒト樹状細胞を、非ヒト哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）該非ヒト哺乳動物からＮＫＴ細胞含有試料を採取する工程；
（ｃ）該試料中に存在するＮＫＴ細胞の活性化を検出する工程。
（１２）  被験物質の代わりにα−ガラクトシルセラミドを用いて前記（ａ）〜（ｃ）の工程を実施し、該被験物質をパルスした場合とα−ガラクトシルセラミドをパルスした場合との間で、ＮＫＴ細胞の活性化の程度を比較することをさらに含む、上記（１０）記載の方法。
（１３）  非ヒト哺乳動物がマウスである、上記（１１）または（１２）記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法を用いれば、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞の選別が可能であり、さらには抗原提示能力の程度を評価することも可能である。また、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法を継続中の患者の、有効性モニタリングに使用することも可能である。さらに、新規リガンドのスクリーニング方法としても有用である。また、本発明の剤は、癌を効率よく縮退させるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】インビトロ、インビボにおけるｈＤＣ／Ｇａｌ投与によるマウスＮＫＴ細胞の活性化を示す図である。Ａ．１×１０５細胞のマウスＤＣ（ｍＤＣ）またはｍＤＣ／Ｇａｌ、あるいはヒトＤＣ（ｈＤＣ）またはｈＤＣ／Ｇａｌを、１×１０５細胞のＣ５７ＢＬ／６マウス肝臓単核細胞と共に培養した。Ｂ．１×１０６細胞のｍＤＣまたはｍＤＣ／Ｇａｌ、およびｈＤＣまたはｈＤＣ／ＧａｌをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した。２日後、免疫したマウスの脾臓細胞を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。示したデータは、独立した３回の実験から得られた値の平均値である。（＊）はｐ＜０．０５であることを示す。
【図２】ｈＤＣ／Ｇａｌ投与後のマウスＮＫＴ細胞の活性化を示す図である。ｈＤＣ／Ｇａｌを段階的な量にて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した（Ａ）。または１×１０６細胞のｈＤＣ／ＧａｌをＪα１８−／−マウスに投与した（Ｂ）。２日後、免疫したマウスの脾臓細胞をαＧＣ存在下または非存在下において１６時間培養し、次いでＩＦＮ−γおよびＩＬ−４  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。データは、同じような結果が得られた少なくとも２回の独立した実験のうち、代表的な例である。（＊）はｐ＜０．０５であることを示す。
【図３】ＩＦＮ−γ分泌は、ＮＫＴ細胞の存在に依存的であることを示す図である。ＩＦＮ−γスポットが、ＮＫＴ細胞に依存的かどうかを調べるために、１×１０６細胞のｈＤＣ／Ｇａｌを投与されたマウスから回収した脾臓細胞から、ＮＫ１．１＋細胞、ＣＤ３＋細胞、またはＣＤ１ｄ−ダイマー＋細胞を除去した。これらの細胞を記載したように培養し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで解析した。示したデータは、独立した３回の実験の平均値である。（＊）はｐ＜０．０５であることを示す。
【図４】ヒトＤＣ／Ｇａｌは、様々な遺伝的系統のマウスのＮＫＴ細胞を活性化できることを示す図である。ｈＤＣ／Ｇａｌ投与後のＮＫＴ細胞活性化について、Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２およびＢＡＬＢ／ｃマウスについて評価した。投与２日後、脾臓細胞を回収して、ＣＤ１ｄ−Ｇａｌ−ダイマー−ＰＥおよびＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ＣＤ１ｄ−ダイマー＋ＣＤ１９−細胞）を使用してＦＡＣＳによりＮＫＴ細胞数について解析した（Ａ）。同様に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌について、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで解析した（Ｂ）。データは、独立した３回の実験の平均値である。
【図５】マウスＮＫＴ細胞の活性化は、ｈＤＣ上のαＧＣロード状況に依存することを示す図である。（Ａ）ｈＤＣをαＧＣと共に様々な時間インキュベートしたときの効果を評価した。ｈＤＣを０．５時間、２時間または２４時間αＧＣと共にインキュベートした後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。２日後、脾臓細胞を回収してＥＬＩＳＰＯＴアッセイを先に記載したように行った。（Ｂ）フレッシュなｈＤＣ／Ｇａｌと、液体窒素で２週間凍結保存したｈＤＣ／Ｇａｌを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。２日後、脾臓細胞を回収してＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。示したデータは独立した３回の実験から得られた平均値である。（＊）はｐ＜０．０５であることを示す。（＊＊）はｐ＜０．０１であることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明はヒト樹状細胞（以下、「ｈＤＣ」ともいう）の抗原提示能の評価方法（以下、「本発明の評価方法」ともいう）を提供する。ここで「抗原提示能」とは、樹状細胞表面上のＣＤ１ｄ分子上にＮＫＴ細胞を活性化し得るリガンド、例えばα−ガラクトシルセラミド（以下、「αＧＣ」ともいう）をロードする能力だけでなく、リガンドをロードしたｈＤＣがＮＫＴ細胞を活性化する能力をも含む意味で用いられる。【００１３】
被験対象となるｈＤＣは、αＧＣを介してＮＫＴ細胞を活性化し得るヒト由来の樹状細胞であれば特に制限はなく、ミエロイド系の樹状細胞（ＤＣ１）、リンパ系の樹状細胞（ＤＣ２）のいずれであってもよいが、好ましくはＤＣ１である。ｈＤＣは自体公知のいかなる方法によって調製されてもよく、ヒトの表皮、リンパ系組織のＴ細胞領域、末梢非リンパ系組織、輸入リンパ、真皮などから分離することもできるが、好ましくは、例えば、ヒト末梢血等から密度勾配遠心法などにより単球、骨髄球などを分離し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で約７〜約１０日間培養して、調製することができる。【００１４】
ｈＤＣをパルスするのに用いられるαＧＣには、α−ガラクトシルセラミドまたはその塩もしくはそのエステルなどの他、ＣＤ１ｄに結合するα−Ｃ−ＧａｌＣｅｒなど全ての糖脂質誘導体、樹状細胞を活性化してＮＫＴ細胞に抗原提示され得る限り任意のその誘導体（例えば、ＯＣＨなどの脂肪鎖を短縮した合成脂質等）も包含される。これらは自体公知の方法により合成することができる。ｈＤＣがヒトへの投与を目的とするものである場合は、用いるαＧＣはＧＭＰグレードのものであることが望ましい。
αＧＣによるｈＤＣのパルスは周知慣用の手法により行えばよく、例えば、αＧＣを約１００〜約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地（例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地等）中で、ｈＤＣを約１２〜約４８時間培養することにより実施することができる。αＧＣのパルスは、上記未成熟のｈＤＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養・成熟させる過程で、培地にαＧＣを添加することにより行ってもよい。【００１５】
αＧＣでパルスしたｈＤＣを投与する非ヒト哺乳動物は特に制限されないが、好ましくは、マウス、ラット、イヌ、サルなどであり、より好ましくはマウスである。マウスの場合、系統に特に制限はないが、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどが好ましく挙げられる。性別や齢にも特に制限はないが、例えばマウスの場合、約６〜約８週齢のものを用いることが好ましい。非ヒト哺乳動物の飼育環境にも特に制限はないが、ＳＰＦグレード以上のものを用いることが望ましい。【００１６】
ｈＤＣはαＧＣでパルスした直後にレシピエントである非ヒト哺乳動物に投与してもよいし、通常樹状細胞の凍結保存に用いられる方法（例えば、液体窒素中での保存）により凍結保存し、用時融解して用いてもよい。【００１７】
ｈＤＣの投与経路および投与量は、レシピエントである非ヒト哺乳動物のＮＫＴ細胞が活性化され得る限り特に限定されないが、例えば、マウスの場合、静脈内投与、腹腔内投与等により、約１０６〜約２×１０６細胞を投与することが好ましい。【００１８】
ｈＤＣの投与後、非ヒト哺乳動物を通常の飼育条件下で、ＮＫＴ細胞が活性化されるのに十分な時間飼育した後、該動物からＮＫＴ細胞含有試料を採取する。ＮＫＴ細胞含有試料は特に制限されるものではないが、例えば、脾臓、肝臓、末梢血由来のものであり、好ましくは脾臓もしくは肝臓由来のものである。例えば、マウス脾臓由来の試料を用いる場合であれば、ｈＤＣの投与から約２〜約４日後にマウスから脾臓を切除し、遊離させたものを、後のＮＫＴ細胞の活性化を検出する工程に使用することができる。あるいは、αＧＣなどの特異的リガンドを用いてＮＫＴ細胞を予めソーティングしておいてもよい。【００１９】
ＮＫＴ細胞の活性化の有無およびその程度は、自体公知のいかなる方法によっても測定することができるが、例えば、活性化したＮＫＴ細胞が産生するサイトカインの量を指標として、ＮＫＴ細胞の活性化を評価することができる。活性化したＮＫＴ細胞が産生するサイトカインとしては、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０等が挙げられる。好ましくはＩＦＮ−γ、ＩＬ−４である。測定するサイトカインは１種のみであってもよいし、２種以上であってもよいが、少なくとも１種はＩＦＮ−γもしくはＩＬ−４であることが望ましい。【００２０】
ＮＫＴ細胞におけるサイトカインの産生は、例えば、該サイトカインに対する抗体を用いて測定することができる。例えば、細胞培養上清を用いてＲＩＡ法、ＦＩＡ法、ＥＩＡ法などの慣用のイムノアッセイによりＮＫＴ細胞の活性化を評価することもできるが、好ましい一実施態様においては、抗サイトカイン抗体を固定化した固相にＮＫＴ細胞含有試料を接触させ、固液分離後に固相に結合したサイトカインを、標識した抗サイトカイン抗体を用いてサンドイッチ法により検出・計数する方法が用いられる。標識剤としては酵素、蛍光物質、発光物質、色素、放射性同位元素などが挙げられる。ビオチン化した抗サイトカイン抗体と標識剤を結合した（ストレプト）アビジンとを用いてもよい。標識剤としてアルカリフォスファターゼ等の酵素を用いたアッセイ系は、ＥＬＩＳＰＯＴの名で、サイトカイン産生細胞の検出用として知られている。【００２１】
ＮＫＴ細胞含有試料を抗サイトカイン抗体と接触させる前に、あるいは接触させている間に、ＮＫＴ細胞をαＧＣで再刺激する。対照として、αＧＣで再刺激しなかったＮＫＴ細胞についてもサイトカイン産生を測定することが望ましいが、αＧＣで再刺激しない場合の産生が検出限界以下であることが既知のサイトカインを指標として用いる場合には、省略することも可能である。【００２２】
例えば、上記ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、αＧＣで再刺激した場合のサイトカイン産生細胞を示すスポット数が、再刺激しなかった場合と比較して有意に増加した場合、被験対象であるｈＤＣはＮＫＴ細胞に対して抗原提示能を有すると判定することができる。
本発明の評価方法によれば、ｈＤＣの投与量依存的にＮＫＴ細胞が活性化されるので、ｈＤＣの定性的評価のみならず定量的な評価も可能である。さらに、ｈＤＣによる非ヒト哺乳動物ＮＫＴ細胞の活性化は、レシピエント由来のＤＣによるＮＫＴ細胞の活性化とも定量性よく相関するので、レシピエントの個体差による評価のばらつきを補正することも可能である。【００２３】
本発明の評価方法は、ヒトに実際に投与することなくｈＤＣの抗原提示能の有無およびその程度を判別することができるので、ＮＫＴ細胞免疫療法に使用するｈＤＣを選別するために使用できる。例えば、ｈＤＣに対して一定条件でαＧＣをパルスしても、αＧＣのロード率が悪いｈＤＣや、あるいはαＧＣのロード率は良くてもＮＫＴ細胞を活性化できないｈＤＣが存在する可能性があることから、パルスされた全てのｈＤＣが、ＮＫＴ細胞に対して効率よく抗原提示できるわけではない。したがって、ＮＫＴ細胞免疫療法を実施する前に、有効なｈＤＣを事前に選別することが好ましい。特に自家移植を行う場合には、患者由来のＤＣがＮＫＴ細胞を活性化するのに十分な抗原提示能を有するか否かを事前に判別できれば、治療戦略の決定上極めて有意義である。即ち、ＮＫＴ細胞免疫療法の適応対象である患者の末梢血等から上記と同様の手法により単離したＤＣについて、本発明の評価方法を実施した結果、該患者のＤＣがＮＫＴ細胞に対して十分な抗原提示能を有すると判定された場合には、自家移植によるＮＫＴ細胞免疫療法を選択することができる、もしくは選択することが好ましいと判定することができ、該ＤＣがＮＫＴ細胞に対して十分な抗原提示能を有しないと判定された場合には、同種異系移植もしくはＮＫＴ細胞免疫療法以外の治療法を選択すべきである、もしくは選択することが好ましいと判定することができる。【００２４】
また、上述の通り、本発明の評価方法は定量的であることから、ｈＤＣのＮＫＴ細胞活性化能の程度を評価するために使用できる。例えば、同種異系移植を選択する場合、本発明の評価方法を用いてよりＮＫＴ細胞の活性化能力の高いｈＤＣを選別することができる。また、個々のｈＤＣ能力値に基づいて、投与するｈＤＣ数を決定することが可能である。さらに、長期凍結保存したｈＤＣを用時融解して用いる場合、投与前にｈＤＣの品質管理を行う目的で、ＮＫＴ細胞の活性化能力が維持されていることを確認するのに用いることができる。【００２５】
また、本発明の評価方法は、ＮＫＴ細胞免疫療法を継続中の患者について、治療の有効性モニタリングを行うために使用できる。例えば、免疫療法開始前と開始後に得た患者由来のｈＤＣについて、それぞれＮＫＴ細胞活性化能を評価して比較することにより、該患者に対するＮＫＴ細胞免疫療法が有効であるか否かについて、検討することが可能である。この場合、ｈＤＣの評価は、患者から単離した際にその都度行ってもよいし、治療開始前に単離したｈＤＣを凍結保存しておき、治療開始後に単離したｈＤＣと同時に抗原提示能の評価を実施してもよい。【００２６】
ＮＫＴ細胞免疫療法の適応対象となる疾患としては、例えば、癌、糖尿病（Ｉ型糖尿病）、アレルギー疾患、関節リウマチ、膠原病などの自己免疫疾患、気管支喘息などが挙げられるが、ｈＤＣによるＮＫＴ細胞の活性化により症状が緩和され得る疾患であれば、これらに限定されない。癌としては、あらゆる種類の原発性癌が挙げられ、また、初期癌および転移・浸潤能を有する進行癌を含むあらゆる状態の癌が挙げられる。【００２７】
本発明はまた、本発明の評価方法により抗原提示能を有すると判定されたｈＤＣを有効成分として含有してなる、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤を提供する。ここで「ヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤」とは、その薬剤を投与した結果、投与対象であるヒト体内のＮＫＴ細胞が活性化され得る医薬を意味する。本発明のヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤（以下、「本発明の剤」ともいう）は、例えば、ヒトにおける上記した各種疾患の予防・治療に有用である。【００２８】
本発明の剤は、常套手段にしたがって、αＧＣでパルスした有効量の上記ｈＤＣを医薬として許容される担体と混合するなどして、経口／非経口製剤として製造することができる。ｈＤＣは、本発明の評価方法により抗原提示能を有すると判定されたｈＤＣの由来するヒトから、あらためて単離し、上記と同様にして培養し、αＧＣでパルスしたものであってもよいし、αＧＣでパルスしたｈＤＣの一部を上記評価方法に用い、残りを凍結保存しておいて、用時融解して用いてもよい。【００２９】
本発明の剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合しても良い。【００３０】
本発明の剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記水性液に約５×１０６〜約１×１０７細胞／ｍｌとなるように、αＧＣでパルスしたｈＤＣを懸濁させればよい。【００３１】
このようにして得られる製剤は、安定で低毒性であるので、ヒトに対して安全に投与することができる。投与対象はｈＤＣの由来する患者本人であること（即ち、自家移植）が好ましいが、投与されるｈＤＣに対して適合性があることが予測されるヒトであれば、これに限定されない。投与方法は特に限定されず、経口又は非経口的に投与することができるが、好ましくは注射もしくは点滴投与であり、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、患部直接投与などが挙げられる。本発明の剤の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば、非経口投与の場合、１回につきｈＤＣ量として約６×１０５〜約１×１０７細胞を、約１〜約２週間隔で、約４〜約８回投与するのが好都合である。【００３２】
本発明はまたヒトＮＫＴ細胞を活性化し得る、またはαＧＣによる活性化を調節（阻害および増強）し得る物質のスクリーニング方法を提供する。該方法は以下の工程を含む。
（ａ）被験物質をパルスしたｈＤＣを、非ヒト哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）該非ヒト哺乳動物からＮＫＴ細胞含有試料を採取する工程；
（ｃ）該試料中に存在するＮＫＴ細胞の活性化を検出する工程。【００３３】
本発明のスクリーニング方法の工程（ａ）において、スクリーニングに用いられる被験物質は、任意の公知化合物および新規化合物、またはそれらの化合物ライブラリーであり得る。化合物としては、例えば、タンパク質（オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、糖鎖（細菌多糖体など）、糖脂質（血液型物質など）、糖タンパク質、脂質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、単純化学物質（低分子化学物質など）などが挙げられる。スクリーニングに用いられる被験物質は、単独または複数個（２個〜１０００個など）の組み合わせにて、同時にパルスされ得る。例えば、化合物ライブラリーのスクリーニング工程においては、組み合わせる候補被験物質の数を絞り込んでいくことにより、最終的な候補被験物質が同定され得る。αＧＣによる活性化を調節し得る物質をスクリーニングする場合には、被験物質とともにαＧＣをｈＤＣにパルスする。【００３４】
工程（ａ）で用いるｈＤＣは、αＧＣでパルスした場合にＮＫＴ細胞を活性化し得ることが予め確認されているものであることが望ましい。しかし、その場合でも、被験物質とαＧＣとのリガンドとしての性能、即ち、ＮＫＴ細胞の活性化能力を正しく比較するために、また、該ｈＤＣの抗原提示能が維持されていることを確認する意味でも、被験物質の代わりにαＧＣを用いて、同様に工程（ａ）〜（ｃ）を行うことが好ましい。【００３５】
本発明のスクリーニング方法において、工程（ａ）〜（ｃ）は上記した本発明の評価方法と同様の方法により行うことができる。尚、工程（ｃ）において、ＮＫＴ細胞含有試料中に存在するＮＫＴ細胞の活性化を、抗サイトカイン抗体を用い活性化ＮＫＴ細胞が産生するサイトカインを指標として行う場合、抗サイトカイン抗体と接触させる前に、あるいは接触させている間に、パルスした単独または複数個の被験物質でＮＫＴ細胞を再刺激する。対照として、被験物質で再刺激しなかったＮＫＴ細胞についてもサイトカイン産生を測定することが望ましい。【００３６】
例えば、上記したＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、被験物質で再刺激した場合のサイトカイン産生細胞を示すスポット数が、再刺激しなかった場合と比較して有意に増加した場合、該被験物質はＮＫＴ細胞を活性化するリガンドとして作用し得ると判定することができる。また、陽性対照であるαＧＣでパルスした場合と比較することにより、該被験物質のＮＫＴ細胞活性化能力の程度を定量的に評価することもできる。
一方、αＧＣおよび被験物質でパルスした場合に、αＧＣのみでパルスした場合に比べて有意に変化した場合、該被験物質はαＧＣによるＮＫＴ細胞の活性化を調節し得ると判定することができる。該被験物質がαＧＣと競合的にＣＤ１ｄ上にロードされるのか、あるいは、αＧＣのロード率やロードされたαＧＣのＮＫＴ細胞活性化能力を変化させるのかは、被験物質のみでｈＤＣをパルスした場合に、該ｈＤＣがＮＫＴ細胞を活性化し得るかどうかによって判別することができる。【００３７】
上記のスクリーニング方法により得られた、ＮＫＴ細胞を活性化し得るリガンド化合物もしくはαＧＣによる該細胞の活性化能力を増強し得る化合物は、αＧＣの代わりに、あるいはそれとともに、本発明の評価方法に用いることができる。また、該化合物で、あるいは該化合物およびαＧＣでパルスしたｈＤＣを、上記ヒトＮＫＴ細胞免疫療法剤に有効成分として配合することができる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。【００３９】
（試料の回収および調製）
健康な血液供与者から得た静脈血から、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心により分離した。ＰＢＳでＰＢＭＣを３回洗浄し、使用するまで液体窒素タンク中に保管した。書面によるインフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言にしたがって患者から得た。全ての研究は理化学研究所治験審査委員会により承認を得た。【００４０】
（マウス）
６〜８週齢の、無菌Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２およびＢＡＬＢ／ｃメスマウスを日本クレア（東京）から購入した。これらのマウスおよびＪα１８−／−マウスは、ＳＰＦ条件下で飼育、維持し、研究所の指針にしたがって、研究を行った。【００４１】
（試薬）
αＧＣは、理化学研究所にて合成した。αＧＣおよびビヒクル（０．４％  ＤＭＳＯ）は、ＰＢＳに希釈した。ヒトリコンビナント（ｒ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。抗マウス−ＣＤ１９モノクローナル抗体（１Ｄ３）、抗−ＴＣＲβモノクローナル抗体（Ｈ５７−５９７）およびマウスＩｇＧ１（Ａ８５−１）は、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーには、リコンビナントの可溶性二量体の、マウスＣＤ１ｄ：Ｉｇ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）−ＰＥおよびＦＩＴＣ標識した抗マウスＣＤ１９抗体を使用した。解析には、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒＴＭ装置およびＣＥＬＬＱｕｅｓｔＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。【００４２】
（ヒトおよびマウスＤＣの生成）
磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して、ＰＢＭＣから、ＣＤ１４＋単球を精製し、５００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−４および１００ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦ存在下にて、７日間培養した。αＧＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）または等量のビヒクルを６日目にｈＤＣに添加して、さらに２４時間培養した。マウス骨髄由来のＤＣは、既に報告されたように、５％ＦＣＳおよびマウスＧＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ−１６４０中で骨髄前駆体から増殖した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，１６９３−１７０２，１９９２）。６日目に、αＧＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）を未成熟ＤＣに添加し、多くの実験では、さらに２日間培養した。αＧＣをパルスしたＤＣ（ＤＣ／Ｇａｌ）は、８日目に回収した。【００４３】
（免疫したマウスの脾臓におけるＮＫＴ細胞のサイトカイン産生量を定量するための単一細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
９６穴タイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体または抗マウスＩＬ−４モノクローナル抗体（どちらも１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で被覆した。ヒトＤＣ／Ｇａｌで免疫した２日後、脾臓細胞（３×１０５細胞／穴）を、ビヒクルまたはαＧＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかと共に１６時間培養した。培養後、プレートを洗浄し、ビオチン化した抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体または抗マウスＩＬ−４モノクローナル抗体（どちらも１μｇ／ｍｌ、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートした。ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４スポット形成細胞数（ＳＦＣ）は、顕微鏡で定量した。【００４４】
（統計解析）
マンホイットニーのＵ検定を使用してデータの相違を解析した。Ｐ＜０．０５は、統計的有意であると考えられる。【００４５】
実施例１  インビトロおよびインビボでのｈＤＣによるＮＫＴ細胞活性化
Ｃ５７ＢＬ／６由来の肝臓単核細胞を刺激するために、αＧＣをロードしたヒトまたはマウスＤＣを使用した（図１）。インビトロでは、マウスＤＣは、αＧＣ依存的にＮＫＴ細胞を刺激して、ＩＦＮ−γが産生された一方、ヒトＤＣはＮＫＴ細胞を効率的に刺激しなかった（図１Ａ）。次に、αＧＣでパルスしたマウスＤＣ（ｍＤＣ／Ｇａｌ）またはヒトＤＣ（ｈＤＣ／Ｇａｌ）を投与した２日後に、免疫したマウスにおけるＮＫＴ細胞反応を試験した（図１Ｂ）。その結果、ｈＤＣ／Ｇａｌを投与したマウスから、１００個以上のαＧＣ特異的なＩＦＮ−γスポットが検出された。この結果から、この手法がＮＫＴ細胞刺激に対するＤＣ機能を評価するのに有用であることが示された。ヒトＤＣをマウスに投与した場合、非特異的な応答が生じてしまうと考えられたが、図１のように評価に使えるようになるとは、予想していない結果であった。【００４６】
実施例２  ｈＤＣ／Ｇａｌ投与によるマウスＮＫＴ細胞活性化の用量依存性
αＧＣをパルスしたｈＤＣを段階的な量にてＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した２日後に、ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生について調べた（図２Ａ）。パルスしていないｈＤＣをマウスに投与しても、ＩＦＮ−γスポットは検出されなかった。ｈＤＣ／Ｇａｌを投与したマウスでは、ＩＦＮ−γ産生スポット数は投与したｈＤＣ／Ｇａｌの数に相関して増加し、１×１０６細胞が適量であると決定した。ＮＫＴ細胞欠損マウスであるＪα１８−／−マウスに、１×１０６個のｈＤＣ／Ｇａｌを投与しても、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４産生スポットはいずれも観察されなかった（図２Ｂ）。このことから観察されるサイトカイン産生は、リガンドとＮＫＴ細胞の相互作用に依存していることが示された。【００４７】
実施例３  インビトロ機能アッセイにおけるＮＫＴ細胞依存性の確認
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでみられたＩＦＮ−γスポットが、ＮＫＴ細胞およびリガンドの存在に依存的か否かを検討した（図３）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行う前に、１×１０６個のｈＤＣ／Ｇａｌを投与したマウスの脾臓細胞由来のＮＫ１．１＋細胞、ＣＤ３＋細胞、またはＣＤ１ｄ−ダイマー＋細胞を除去すると、ほとんどのスポットが消失することを見出した。このことから、ＩＦＮ−γ産生細胞は、少なくともＮＫ１．１＋ＣＤ３＋ＣＤ１ｄ−ダイマー＋細胞に依存していることが示された。【００４８】
実施例４  ｈＤＣ／ＧａｌによるＮＫＴ細胞活性化のマウス系統非依存性の確認
ＮＫＴ細胞の活性化がマウスの系統依存的かどうかを調べるために、様々な系統のマウスにおいて、ｈＤＣ／Ｇａｌに対するＮＫＴ細胞の反応について試験した。ｈＤＣ／Ｇａｌを投与した２日後に、Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞を回収して、ＦＡＣＳ解析を行った。全てのマウス系統において、ＮＫＴ細胞数が２倍以上増加していることが明らかとなった（図４Ａ）。試験した系統のマウス全てにおいて、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を産生する細胞が同様に増加していることも見出した（図４Ｂ）。これらの結果から、マウスの特異的な遺伝的バックグラウンド、すなわちＣ５７ＢＬ／６に限定して実験が成功したのではなく、野生型マウスの多くの系統が、この方法を用いてｈＤＣの有効性について評価する際に使用できることが示された。【００４９】
実施例５
（ａ）αＧＣパルスの条件検討
ｈＤＣをαＧＣと共に０．５時間、２時間または２４時間培養した後に、ｈＤＣがインビボにおいてマウスＮＫＴ細胞を活性化する能力について試験した。αＧＣを０．５時間パルスしたｈＤＣを投与したマウスにおけるＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞は、ほとんどゼロに等しいが、αＧＣを２時間パルスしたｈＤＣは、αＧＣを２４時間パルスしたｈＤＣを投与したマウスのおよそ半分の活性が見られた（図５Ａ）。【００５０】
（ｂ）ｈＤＣ／Ｇａｌの安定性試験
さらに、安定性試験として、液体窒素中に２週間保存したｈＤＣ／Ｇａｌに比較して、フレッシュなｈＤＣ／Ｇａｌ培養物を投与したマウスにおけるＮＫＴ細胞活性化に相違があるかどうかについて調べた。図５Ｂに示した結果から、フレッシュでも、予め凍結したｈＤＣでもどちらも同程度のＮＫＴ細胞反応を示すことが明らかとなった。このことは、αＧＣを一度ロードしたｈＤＣは非常に安定であり、凍結保存により長期使用が可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の方法を用いれば、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法に使用するヒト樹状細胞の選別が可能であり、さらには抗原提示能力の程度を評価することも可能である。また、ヒトＮＫＴ細胞免疫療法を継続中の患者の、有効性モニタリングに使用することも可能である。さらに、新規リガンドのスクリーニング方法としても有用である。また、本発明の剤は、癌を効率よく縮退させるのに有用である。【００５２】
本発明は、２００７年９月１０日出願の日本国特許出願、特願２００７-２３４７３４を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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