【手続補正書】
【提出日】平成17年1月17日(2005.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  転写に基づく核酸増幅のための方法および組成物
【特許請求の範囲】
【請求項１】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）該目的の核酸配列を含む一本鎖標的ポリヌクレオチドを第一のプライマーとハイブリダイズする工程であって、ここで該第一プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーである、工程；
（ｂ）該標的ポリヌクレオチドに対する該第一プライマーのハイブリダイゼーションのための部位に関して、該標的ポリヌクレオチド５’の領域に対して終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを必要に応じてハイブリダイズする工程；
（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第一のプライマーを伸長して、第一のプライマー伸長産物および標的ポリヌクレオチドを含む複合体を生成する工程；
（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、第一プライマー伸長産物および標的ポリヌクレオチドの該複合体における該複合プライマーから該ＲＮＡを切断し、これによって別の複合プライマーが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程、および鎖置換によってプライマー伸長を繰り返して置換されたプライマー伸長産物を生成する工程；
（ｅ）プロプロモーターおよび該置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じることを可能にする条件下でハイブリダイズし、これによって該置換されたプライマー伸長産物に相補的な配列を含むＲＮＡ転写物を生成する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の該ＲＮＡ転写物に対して第二のプライマーをハイブリダイズする工程；
（ｇ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二のプライマーを伸長して、第二のプライマー伸長産物および該ＲＮＡ転写物を含む複合体を生成する工程；
（ｈ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいてＲＮＡを切断する酵素を用いて工程（ｇ）の複合体におけるＲＮＡを切断する工程；
（ｉ）該一本鎖第二プライマー伸長産物をプロプロモーターポリヌクレオチドとハイブリダイズする工程であって、ここで該プロプロモーターポリヌクレオチドは、プロプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じることを可能にする条件下で該一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含み、これによって該目的の配列を含むＲＮＡ転写物を生成する工程；
を包含し、
これによって該目的の核酸配列の複数のコピーが生成される、方法。
【請求項２】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）以下を合わせる工程；
請求項１の工程（ｃ）に記載の複合体；
前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な複合プライマーであって、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、複合プライマー；
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；
プロプロモーターおよび置換された複合プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；
ＲＮＡポリメラーゼ；
該目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第二のプライマー；
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
プロプロモーターおよび第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；そして
（ｂ）プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ＲＮＡ切断、請求項１の工程（ｃ）に記載の複合体のＲＮＡが、該複合体中で切断されて複合プライマーが該標的ポリヌクレオチドに結合する場合は、該複合体からの第一のプライマー伸長産物の置き換え、第一プライマー伸長産物に対するプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる第一プライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、第二プライマー伸長産物に対するプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる第二プライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、ならびにＲＮＡ転写を可能にする条件下で、該工程（ａ）の該混合物をインキュベートし、これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）以下を合わせる工程；
請求項１の工程（ｄ）に記載の置換されたプライマー伸長産物；
プロプロモーターおよび置換された第一プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；
ＲＮＡポリメラーゼ；
該目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第二のプライマー；
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
プロプロモーターおよび第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；そして
（ｂ）プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ＲＮＡ切断、第一プライマー伸長産物に対するプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる第一プライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、第二のプライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる第二プライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、ならびにＲＮＡ転写を可能にする条件下で、該工程（ａ）の該混合物をインキュベートし、これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）以下を合わせる工程；
請求項１の工程（ｅ）に記載のＲＮＡ転写物；
該目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第二のプライマー；
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；
プロプロモーターおよび第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；ならびに
ＲＮＡポリメラーゼ；そして
（ｂ）プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ＲＮＡ切断、プライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによるプライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、ならびにＲＮＡ転写を可能にする条件下で、該工程（ａ）の該混合物をインキュベートし、これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）以下を合わせる工程；
第一プライマーであって、ここで該第一プライマーは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である複合プライマーであり、そしてここで該複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、第一プライマー；
必要に応じてポリヌクレオチドであって、該標的ポリヌクレオチドに対する該複合プライマーのハイブリダイゼーションに関して５’である、該標的ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズ可能である終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；
プロプロモーターおよび第一プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；
ＲＮＡポリメラーゼ；
該目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第二のプライマー；
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
プロプロモーターおよび第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；そして
（ｂ）プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ＲＮＡ切断、複合体のＲＮＡが、切断されて複合プライマーが該複合体中の標的ポリヌクレオチドに結合する場合は、第一プライマー伸長産物および標的ポリヌクレオチドを含む該複合体からの第一のプライマー伸長産物の置き換え、プライマー伸長産物に対するプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによるプライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、ならびにＲＮＡ転写を可能にする条件下で、該工程（ａ）の該混合物をインキュベートし、これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】  ５’ＲＮＡ部分が３’ＤＮＡ部分に隣接する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】  多数の複合プライマーを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】  終止配列を含む前記ポリヌクレオチドが、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】  請求項８に記載の方法であって、前記ＴＳＯが前記テンプレートにハイブリダイズする領域における改変を含み、ここで所定の設定条件下で、該ＴＳＯは、改変のないＴＳＯと比べて該領域にさらに強固に結合する、方法。
【請求項１０】  終止配列を含む前記ポリヌクレオチドがブロッキング配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】  請求項１０に記載の方法であって、前記ブロッキング配列が、前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域において改変を含み、ここで所定の設定条件下で、該ブロッキング配列は、改変のないブロッキング配列と比べて該領域にさらに強固に結合する、方法。
【請求項１２】  ＲＮＡを切断する前記酵素がＲＮａｓｅＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】  請求項１に記載の方法であって、プロプロモーターおよび置換された第一プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）である、方法。
【請求項１４】  請求項１に記載の方法であって、プロプロモーターおよび一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、ＴＳＯである、方法。
【請求項１５】  請求項１に記載の方法であって、プロプロモーターおよび置換された第一プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、プロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）である、方法。
【請求項１６】  請求項１に記載の方法であって、プロプロモーターおよび一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む前記プロプロモーターポリヌクレオチドが、ＰＴＯである、方法。
【請求項１７】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）目的の配列を含む一本鎖標的ポリヌクレオチドを第一プライマーとハイブリダイズする工程；
（ｂ）プロプロモーター配列、および該標的ポリヌクレオチドに対する該第一プライマーのハイブリダイゼーションに関して、５’である該標的ポリヌクレオチドの領域に対してハイブリダイズ可能である領域を含む、プロモーターテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）をハイブリダイズする工程；
（ｃ）該プロプロモーターＴＳＯの該プロプロモーター配列に相補的な配列を含む第一プライマー伸長産物が生成されるように、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第一プライマーを伸長して、これにより第一プライマー伸長産物、標的ポリヌクレオチド、およびプロプロモーターＴＳＯの複合体を生成し、ここで該複合体は、二本鎖プロモーター領域を含む、工程；
（ｄ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖プロモーター領域から転写してセンスＲＮＡ転写物を生成する工程；
（ｅ）該工程（ｄ）のセンスＲＮＡ転写物に対して第二プライマーをハイブリダイズする工程；
（ｆ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二プライマーを伸長して、第二プライマー伸長産物およびＲＮＡ転写物を含む複合体を生成する工程；
（ｇ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいてＲＮＡを切断する酵素を用いて、該工程（ｆ）の該複合体においてＲＮＡを切断する工程；
（ｈ）一本鎖第二プライマー伸長産物をプロプロモーターポリヌクレオチドとハイブリダイズする工程であって、ここで該プロプロモーターポリヌクレオチドは、プロプロモーター、およびＲＮＡポリメラーゼによる転写が生じることを可能にする条件下で該一本鎖第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含み、これによって該目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物を生成する工程；
を包含し、
これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する、方法。
【請求項１８】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）以下を合わせる工程；
請求項１７の工程（ｃ）に記載の複合体；
ＲＮＡポリメラーゼ；
該目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第二のプライマー；
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
プロプロモーター、および第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；そして
（ｂ）プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ＲＮＡ切断、プライマー伸長産物に対するプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによるプライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、ならびにＲＮＡ転写を可能にする条件下で、該工程（ａ）の該混合物をインキュベートし、これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）以下を合わせる工程；
請求項１７の工程（ｄ）に記載の置換されたＲＮＡ転写物
該ＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第二のプライマー；
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；
プロプロモーター、および第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；ならびに
ＲＮＡポリメラーゼ；そして
（ｂ）プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ＲＮＡ切断、プライマー伸長産物に対するプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによるプライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、ならびにＲＮＡ転写を可能にする条件下で、該工程（ａ）の該混合物をインキュベートし、これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】  目的の核酸配列の複数のコピーを生成する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）以下を合わせる工程；
標的ポリヌクレオチド；
該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な第一プライマー；
プロプロモーター配列、および該標的ポリヌクレオチドに対する該第一プライマーのハイブリダイゼーションに関して５’である該標的ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズ可能である領域を含むプロプロモーターテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド；
必要に応じてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡポリメラーゼ；
目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能である第二プライマー；
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに
プロプロモーター、および第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むプロプロモーターポリヌクレオチド；そして
（ｂ）プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ＲＮＡ切断、プライマー伸長産物に対するプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによるプライマー伸長産物およびプロプロモーターポリヌクレオチドを含む複合体の形成、ならびにＲＮＡ転写を可能にする条件下で、該工程（ａ）の該混合物をインキュベートし、これによって該目的の核酸配列の複数のコピーを生成する工程
、を包含する、方法。
【請求項２１】  前記標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】  前記標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】  前記第一プライマーおよび第二プライマーが同じである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】  前記第一プライマーおよび第二プライマーが異なる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】  前記第一プライマーおよび第二プライマーが、異なる相補的配列にハイブリダイズする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】  前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】  請求項１７に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドが、ＲＮＡであり、そして前記工程（ｃ）の前記複合体におけるＲＮＡが、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいてＲＮＡを切断する酵素で切断される、方法。
【請求項２８】  請求項１７に記載の方法であって、前記プロプロモーターポリヌクレオチドがプロプロモーターＴＳＯであり、該プロプロモーターポリヌクレオチドが、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、方法。
【請求項２９】  請求項１７に記載の方法であって、前記プロプロモーターポリヌクレオチドがプロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）であり、該プロプロモーターポリヌクレオチドが、プロプロモーター、および第二プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、方法。
【請求項３０】  請求項１または１７に記載の方法であって、用いられるｒＮＴＰの少なくとも１つの型が、標識されたｒＮＴＰであり、これによって標識されたＲＮＡ産物が生成される、方法。
【請求項３１】  前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが１つの酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】  請求項１７に記載の方法であって、前記工程（ｃ）の前記ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、そして該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが１つの酵素である、方法。
【請求項３３】  前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、請求項１または１７に記載の方法。
【請求項３４】  前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】  請求項１７に記載の方法であって、前記工程（ｃ）のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、そして該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、方法。
【請求項３６】  前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】  請求項１７に記載の方法であって、前記工程（ｃ）のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、そして該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、方法。
【請求項３８】  標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法は以下：（ａ）ｒＮＴＰアナログの組み込みの際に転写が終結するように、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログの混合物の存在下で請求項１または１７に記載の方法によって標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；ならびに（ｂ）該増幅産物を分析して配列を決定する工程；を包含する、方法。
【請求項３９】  標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法は以下：（ａ）請求項１または１７に記載の方法によって標的ポリヌクレオチドを増幅する工程であって、ここで第一プライマー伸長産物から生成されたＲＮＡ転写物は、ｒＮＴＰアナログの組み込みの際に転写が終結するように、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログの混合物の存在下で増幅される工程；ならびに（ｂ）該増幅産物を分析して配列を決定する工程；を包含する、方法。
【請求項４０】  一本鎖高次構造多形態によって標的ポリヌクレオチドにおける変異を決定する方法であって、該方法は以下：（ａ）請求項１または１７に記載の方法によって標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｂ）一本鎖高次構造について増幅産物を分析する工程であって、ここで参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した高次構造中の差異は、標的ポリヌクレオチドにおける変異を示す工程；を包含する、方法。
【請求項４１】  標的ポリヌクレオチドにおける目的の配列を特徴付ける方法であって、該方法は以下：
（ｉ）請求項１に記載の方法によって目的の配列を含む標的ポリヌクレオチド配列を増幅する工程であって、該複合プライマーのＲＮＡ部分の配列が公知である工程、および
（ｉｉ）もしあれば工程（ｉ）由来の増幅産物を、参照テンプレート由来の増幅産物の量と比較する工程、を包含し、
ここで
（１）該複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な領域を含む該参照テンプレート由来の増幅産物の量に比べて、検出可能な程度に少ない該テンプレート由来の増幅産物の生成は、該標的ポリヌクレオチドが、該複合プライマーのＲＮＡ部分に対して相補的な配列を含まず、そして該複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列に関して配列改変体であることを示すか；または
（２）該複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な領域を含まない該参照テンプレート由来の増幅産物の量に比べて、検出可能な程度に多い該テンプレート由来の増幅産物の生成は、該標的ポリヌクレオチドが、該複合プライマーのＲＮＡ部分に対して相補的な配列を含み、そして複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列に関して配列改変体ではないことを示す、
方法。
【請求項４２】  請求項４１に記載の方法であって、前記複合プライマーのＲＮＡ部分の配列が、野生型配列に相補的な配列を含み、そして目的の配列が、野生型配列の存在または非存在の決定によって特徴づけされる、方法。
【請求項４３】  請求項４１に記載の方法であって、前記複合プライマーのＲＮＡ部分の配列が、変異体配列に相補的な配列を含み、そして目的の配列が、変異体配列の存在または非存在の決定によって特徴づけされる、方法。
【請求項４４】  請求項４１に記載の方法であって、前記複合プライマーのＲＮＡ部分の配列が、対立遺伝子配列に相補的な配列を含み、そして目的の配列が、該対立遺伝子配列の存在または非存在の決定によって特徴づけされる、方法。
【請求項４５】  マイクロアレイを生成する方法であって、以下：（ａ）請求項１または１７に記載の方法によって標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｂ）基板上に増幅産物を固定して増幅産物を含むマイクロアレイを製造する工程；を包含する方法。
【請求項４６】  目的の配列を特徴付ける方法であって、以下：（ａ）請求項３０に記載の方法によって標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｂ）標識したＲＮＡ産物を分析する工程；を包含する、方法。
【請求項４７】  前記工程（ｂ）が、前記標識したＲＮＡ産物を少なくとも１つのプローブと接触させる工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】  前記少なくとも１つのプローブがマイクロアレイとして提供される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】  請求項４８に記載の方法であって、前記マイクロアレイが、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、および光ファイバーからなる群より選択される材料から製造された基板上に固定された少なくとも１つのプローブを含む、方法。
【請求項５０】  請求項４９に記載の方法であって、前記プローブが、ピン、ロッド、ファイバー、テープ、スレッド、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー、およびシリンダーを含む二次元構造または三次元構造において前記基板に固定されている、方法。
【請求項５１】  請求項４６に記載の方法であって、ここで前記標識したＲＮＡ産物を分析する工程（ｂ）が、該産物の量を決定する工程を包含し、それによってサンプル中に存在する目的の配列の量が定量される、方法。
【請求項５２】  サンプル中の遺伝子発現プロフィールを決定する方法であって、該方法は以下：
（ａ）請求項１〜１７に記載の方法を用いて、該サンプル中の少なくとも２つの目的の配列を増幅する工程；および
（ｂ）目的の各配列の増幅産物の量を決定する工程であって、該量の各々は、該サンプル中の目的の配列の各々の量を示しており、これによって該サンプル中の該遺伝子発現プロフィールが決定される工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】  前記各標的ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】  目的の配列を増幅するためのシステムであって、以下：（ａ）複合プライマーである第一のプライマー；（ｂ）第二プライマー；（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；および（ｇ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；を備える、システム。
【請求項５５】  請求項５４に記載のシステムであって、さらに以下：（ｈ）終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを備える、システム。
【請求項５６】  目的の配列を増幅するためのシステムであって、以下：（ａ）プロプロモーターＴＳＯ；（ｂ）第一プライマー；（ｃ）必要に応じて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；（ｆ）必要に応じて、第二プライマー；（ｇ）ＲＮＡポリメラーゼ；を備える、システム。
【請求項５７】  請求項５４または５６に記載のシステムであって、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが同じ酵素である、システム。
【請求項５８】  請求項５４または５６に記載のシステムであって、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、システム。
【請求項５９】  請求項５４または５６に記載のシステムであって、前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、システム。
【請求項６０】  請求項５４または５６に記載のシステムであって、前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素が同じ酵素である、システム。
【請求項６１】  キットであって、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な複合プライマー、プロプロモーターポリヌクレオチド、および請求項１に記載の方法によって該標的ポリヌクレオチドを増幅するための説明書、を備える、キット。
【請求項６２】  終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに備える、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】  第二プライマーをさらに含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】  キットであって、両方とも標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なプロプロモーターＴＳＯおよび第一プライマー、ならびに請求項１７に記載の方法によって該標的ポリヌクレオチドを増幅するための説明書を備える、キット。
【請求項６５】  第二プライマーをさらに備える、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】  目的の配列の配列を決定する方法であって、以下：核酸増幅産物を配列決定する工程を包含し、ここで該核酸増幅産物は、請求項１または１７に記載の方法によって生成される、方法。
【請求項６７】  サンプル中の目的の核酸配列の存在を検出する方法であって、該方法は、以下：核酸増幅産物における目的の配列の存在を決定する工程を包含し、ここで該核酸増幅産物は、請求項１または１７に記載の方法によって生成される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２０００年６月２６日出願、米国特許仮出願番号６０／２１３，９０８号、および２００１年３月２１日出願、同第６０／２７７，７４８号（その両方とも、その全体が参考として本明細書中に援用されている）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ポリヌクレオチド増幅の分野に関する。より詳細には、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を増幅する（すなわち、多数のコピー（複製）を作成する）ための方法、組成物およびキットを提供する。これには、転写を含み、そしてＲＮＡ／ＤＮＡ複合プライマー、および／または標的スイッチポリヌクレオチドのいずれかを使用する。
【０００３】
（背景技術）
核酸増幅および増幅産物の検出のための方法の開発により、近年、核酸の検出、同定、定量、および配列分析が進歩してきた。これらの方法を使用することによって、ゲノミクス、細胞生物学、分子医学、遺伝学、などの領域において迅速な進歩が助長されてきた。
【０００４】
核酸分析は、病原体の検出および同定に、規定された表現型をもたらす遺伝子変化の検出に、遺伝子疾患またはそのような疾患に対する感受性の診断に、発生における、疾患における、および規定された刺激に応答する遺伝子発現の評価に、ならびに種々のゲノムプロジェクトにおいて、広く用いられる。核酸増幅方法の他の適用としては、稀な細胞の検出、病原体の検出、および悪性腫瘍における変化した遺伝子発現の検出、などが挙げられる。核酸増幅は、規定された核酸配列の存在の検出などの定性的分析、および所定の遺伝子配列の定量の両方について潜在的に有用である。後者は、サンプル中の病原配列の量を評価および決定するため、ならびに正常型から悪性型への細胞のトランスフォーメーションにおいてしばしば見られるような、遺伝子増幅または欠失の決定のために有用である。
【０００５】
規定された核酸配列の存在の検出、およびその配列分析は、標的核酸配列に対する直接的なプローブハイブリダイゼーションによって実行され得るが、この方法は、試験サンプル中に存在する標的核酸配列の量が低い場合、一般に感受性に欠ける。この障害を解決する１つは、規定された核酸配列をさらなる分析にさらにアクセス可能にするためのその核酸配列の複数のコピーの生成のための方法の開発であった。サンプル中の特定の核酸配列の複数のコピーを生成するための方法は、一般に標的増幅方法とされている。ハイブリダイゼーション分析の検出の感度を増大するための他の方法は、ハイブリダイズしたプローブからの複数の産物の生成に基づく。この方法では、例えば、ハイブリダイズしたプローブを切断して複数の産物または連結する隣接プローブを形成し、固有のハイブリダイゼーション依存性産物を形成する。同様に、ハイブリダイゼーション反応の感度の増大は、ハイブリダイゼーション事象によって生成されたシグナルを増幅するための方法（例えば、分枝したＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに基づく方法）によって達成される。
【０００６】
種々の標的核酸増幅方法が近年記載されている。標的核酸増幅は、種々の温度（温度サイクル）での複数サイクルのインキュベーションによって実行されるか、あるいは等温プロセスによって実行される。熱安定性の核酸改変酵素の発見も、核酸増幅技術における迅速な進歩に貢献した。熱安定性の核酸改変酵素（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡのポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼなど）は、熱サイクル法および等温増幅法の両方に依存する方法において用いられる。例えば、「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを用いる核酸の均質的等温増幅および検出（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」のための方法は、ＷＯ／０７００９５Ａ２（Ｌｉｕら）に記載されている。
【０００７】
最も通常に用いられる標的増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーの変性、（二本鎖標的の各鎖に対して１つ）のハイブリダイゼーション、ヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長の複数サイクルに基づき、標的配列の複数の二本鎖コピーを生成する。ＰＣＲの多くのバリエーションが記載されており、そしてその方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列の増幅、配列決定、変異分析およびその他のために用いられている（以下のＰＣＲ  プロトコールを参照のこと：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．およびＷｈｉｔｅ，Ｔ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５５：３３５〜３５０（１９８７））。単一のプライマーを使用する熱サイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）に基づく方法もまた記載されている。熱サイクリングに依存する他の方法としては、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）および関連修復連鎖反応（ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）が挙げられる。
【０００８】
鎖の置き換えに基づく等温核酸増幅方法（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が記載されている。例えば、Ｆｒａｉｓｅｒら、米国特許第５，６４８，２１１号；Ｃｌｅｕｚｉａｔら、米国特許番号５，８２４，５１７号；およびＷａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２〜３９６（１９９２）を参照のこと。他の等温標的増幅方法は、転写に基づく増幅方法である。ここでは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、増幅の早期の段階でプライマー伸長産物中に組み込まれ（ＷＯ／０１０５０）、そして標的配列または標的の相補的配列が、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中間産物におけるＲＮＡ鎖の転写および消化によってさらに、増幅される。例えば、米国特許第５，１６９，７６６号および同第４，７８６，６００号を参照のこと。標的核酸増幅は、種々の温度での（すなわち、熱サイクリング）、または１つの温度での（等温プロセス）、複数サイクルのインキュベーションによって実行され得る。これらの方法としては、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自己継続性配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、およびそれらのバリエーションが挙げられる。例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４〜１８７８（１９９０）；米国特許第５，７６６，８４９号（ＴＭＡ）；および同第５，６５４，１４２号（ＮＡＳＢＡ）を参照のこと。他の増幅方法は、テンプレートスイッチング（切り替え）オリゴヌクレオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＴＳＯ）およびブロッキングオリゴヌクレオチド（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を使用する。例えば、キメラＤＮＡプライマーを利用するテンプレートスイッチ（切り替え）増幅方法は、米国特許第５，６７９，５１２号およびＰａｔｅｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：２９６９〜２９７４（１９９６））に記載されており、そしてブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する方法は、Ｌａｎｅｙらによって米国特許第５，６７９，５１２号に開示されている。
【０００９】
等温標的増幅方法は、サーモサイクラーを必要としないので、さらに容易に共通の計測プラットフォームに適合する。しかし、以前に公知の等温標的増幅方法は、重大な欠点を有する。鎖置き換え（置換）増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）プロセスによる増幅では、所定の制限酵素についての制限消化部位の存在が必要であり、そのせいで適用可能性が制限される。一方では、既存の転写に基づく増幅方法（例えば、ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡ）は、プライマーの方法（非特異的増幅を生じる傾向があるプロセスである）による増幅産物中へのＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の組み込みの必要のせいで制限されている。さらに、これらの転写に基づく増幅方法によるＤＮＡ標的の増幅の機構は、十分立証されていない。
【００１０】
多数のゲノムの配列決定、および特にヒトゲノムの配列決定の完了は、一般的な分子生物学および細胞生物学、特に分子医学におけるにおける進歩にとって多くの意味がある。等温遺伝子配列決定のための方法の開発は、一般に、種々の試験施設においてこの情報の適用を強化する。なぜなら、等温配列決定は、熱サイクル（熱サイクリング）を要する現在の方法に比べて、遺伝的同定のプロセスを顕著に簡便化するからである。
【００１１】
本発明の方法は、等温、高効率核酸配列増幅、ならびに配列決定などにおいてこれらの増幅方法および産物を用いる方法を提供する。
【００１２】
本明細書に引用される全ての参考文献（特許出願および刊行物を含む）は、その全体が参考として援用されている。
【００１３】
（発明の開示）
本発明は、ポリヌクレオチド配列を増幅するための方法、組成物およびキットを提供する。本方法は、一般に、プライマー（これは、本発明のいくつかの局面において、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合プライマーである）、必要に応じて、終止配列、およびプロプロモーターオリゴヌクレオチド配列の使用を包含する。
【００１４】
従って、１つの局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含し、これにより目的の核酸配列の複数コピーが産生される：（ａ）目的の核酸配列を含む一本鎖標的ポリヌクレオチドを第一のプライマーとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、この第一のプライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む複合プライマーである、工程；（ｂ）必要に応じて、この第一のプライマーのハイブリダイゼーションに関して５’側の標的ポリヌクレオチドの領域に終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程；（ｃ）ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いてこの第一のプライマーを伸長させて、第一のプライマー伸長産物および標的ポリヌクレオチドを含む複合体を生成する工程；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、第一のプライマー伸長産物と標的ポリヌクレオチドとの複合体における複合プライマーからＲＮＡ部分を切断し、その結果、別の複合プライマー（これは、一般的にかつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）がこの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして鎖置換によるプライマー伸長を反復して、置換されたプライマー伸長産物を生成し得る工程；（ｅ）プロプロモーターと置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を生じさせ得る条件下（これらの条件は、一般的には二本鎖プロモーター領域を生成するためのプライマー伸長産物の３’末端の伸長を含むが、必須ではない）でハイブリダイズして、その結果、この置換されたプライマー伸長産物に相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が生成される工程；（ｆ）工程（ｅ）のＲＮＡ転写物に第二のプライマーをハイブリダイズさせる工程；（ｇ）第二のプライマー伸長産物およびＲＮＡ転写物を含む複合体を生成するように、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて第二のプライマーを伸長させる工程；（ｈ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡを切断する酵素を用いて、工程（ｇ）の複合体におけるＲＮＡを切断する工程；（ｉ）この一本鎖の第二のプライマー伸長産物を、プロプロモーターポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、このプロプロモーターポリヌクレオチドは、プロプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼによる転写を生じさせ得る条件下（これらの条件は、一般的には二本鎖プロモーター領域を生成するためのプライマー伸長産物の３’末端の伸長を含むが、必須ではない）でこの一本鎖の第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含み、その結果、目的の配列を含むＲＮＡ転写物が産生される、工程。
【００１５】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを作製するための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含し、これにより、目的の核酸配列の複数コピーが生成される：（ａ）以下を合わせる工程：上記のような第一のプライマー伸長産物と標的ポリヌクレオチドとを含む複合体；この標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る複合プライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）であって、ここで、この複合プライマーはＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含むプライマーである；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；プロプロモーターと、置換された複合プライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド；ＲＮＡポリメラーゼ；目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第二のプライマー；ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；およびプロプロモーターと、第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド、ならびに、（ｂ）以下を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程：プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長；ＲＮＡ切断；複合体のＲＮＡが切断され、そして複合プライマーが複合体中の標的ポリヌクレオチドに結合する場合の、第一のプライマー伸長産物と標的ポリヌクレオチドとを含む複合体からのこの第一のプライマー伸長産物の置き換え；第一のプライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、第一のプライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；第二のプライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、第二のプライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；およびＲＮＡ転写。
【００１６】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含し、これにより、目的の核酸配列の複数コピーが生成される：（ａ）以下を合わせる工程：上記のように生成された置換されたプライマー伸長産物；プロプロモーターと、置換された第一のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド；ＲＮＡポリメラーゼ；目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第二のプライマー；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；および、プロプロモーターと、第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）以下を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程：プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長；ＲＮＡ切断；第一のプライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、第一のプライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；第二のプライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、第二のプライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；およびＲＮＡ転写。
【００１７】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含し、これにより、目的の核酸配列の複数コピーが生成される：（ａ）以下を合わせる工程：上記のような置換されたプライマー伸長産物に相補的な配列を含むＲＮＡ転写物；プロプロモーターと、置換された第一のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド；目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第二のプライマー；ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；プロプロモーターと、第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド；および、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに（ｂ）以下を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程：プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長；ＲＮＡ切断；プライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、プライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；およびＲＮＡ転写。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含し、これにより、目的の核酸配列の複数コピーが生成される：（ａ）以下を合わせる工程：第一のプライマー（ここで、この第一のプライマーは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る複合プライマーであり、ここで、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む）；必要に応じて、標的ポリヌクレオチドへの複合プライマーのハイブリダイゼーションに関して、５’側である、標的ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズし得る終止ポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；プロプロモーターと、第一のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド；ＲＮＡポリメラーゼ；目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第二のプライマー；ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；および、プロプロモーターと、第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド、ならびに、（ｂ）以下を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程：プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長；ＲＮＡ切断；複合体のＲＮＡが切断され、そして複合プライマーが複合体中の標的ポリヌクレオチドに結合する場合の、第一のプライマー伸長産物と標的ポリヌクレオチドとを含む複合体からのこの第一のプライマー伸長産物の置き換え；プライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、プライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、およびＲＮＡ転写。
【００１９】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含し、これにより目的の核酸配列の複数コピーが産生される：（ａ）第二のプライマーをＲＮＡ転写物にハイブリダイズさせる工程であって、このＲＮＡ転写物は、以下を含むプロセスによって産生される：（ｉ）目的の核酸配列を含む一本鎖標的ポリヌクレオチドを第一のプライマーとハイブリダイズさせることであって、ここで、この第一のプライマーは、ＲＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分とを含む複合プライマーである；（ｉｉ）必要に応じて、この第一のプライマーのハイブリダイゼーションに関して５’側の標的ポリヌクレオチドの領域に終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせること；（ｉｉｉ）ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いてこの第一のプライマーを伸長させて、第一のプライマー伸長産物および標的ポリヌクレオチドを含む複合体を生成すること；（ｉｖ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、第一のプライマー伸長産物と標的ポリヌクレオチドとの複合体におけるこの複合プライマーからＲＮＡ部分を切断し、その結果、別の複合プライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）がこの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしかつ鎖置換によるプライマー伸長を反復して、置換されたプライマー伸長産物を生成し得ること；（ｖ）プロプロモーターと、この置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を生じさせ得る条件下（これらの条件は、一般的には二本鎖プロモーター領域を生成するためのプライマー伸長産物の３’末端の伸長を含むが、必須ではない）でハイブリダイズして、その結果、この置換されたプライマー伸長産物に相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が生成されること、ならびに、（ｂ）第二のプライマー伸長産物およびＲＮＡ転写物を含む複合体を生成するように、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて第二のプライマーを伸長させる工程；（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡを切断する酵素を用いて、工程（ｂ）の複合体におけるＲＮＡを切断する工程；（ｄ）この一本鎖の第二のプライマー伸長産物を、プロプロモーターポリヌクレオチドとＲＮＡポリメラーゼによる転写を生じさせ得る条件下（これらの条件は、一般的には二本鎖プロモーター領域を生成するためのプライマー伸長産物の３’末端の伸長を含むが、必須ではない）でハイブリダイズさせる工程であって、ここで、このプロプロモーターポリヌクレオチドは、プロプロモーターと、この一本鎖の第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含み、その結果、目的の配列を含むＲＮＡ転写物が産生される、工程。
【００２０】
本発明の複合プライマーベースの方法において使用される複合プライマーの種々の実施形態が、本明細書中に記載される。例えば、いくつかの実施形態において、複合プライマーのＲＮＡ部分は、３’ＤＮＡ部分に関して５’側である。さらに他の実施形態において、５’ＲＮＡ部分は、３’ＤＮＡ部分に隣接する。本明細書中に記載される複合プライマーベースの方法について、１以上の複合プライマーが使用され得る。複合プライマーベースの方法の好ましい実施形態において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは異なる（例えば、第一のプライマーは複合プライマーであり、第二のプライマーは複合プライマーではない）。好ましい実施形態において、ここで、第一のプライマーおよび第二のプライマーは異なり、これらのプライマーは、類似の配列、好ましくは同一の配列にハイブリダイズし得る。複合プライマーベースの方法のさらに他の実施形態において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、異なる配列にハイブリダイズし得る。
【００２１】
終止配列を含むポリヌクレオチドの種々の例示的実施形態もまた、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態において、終止配列を含むポリヌクレオチドは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）であり、これは、テンプレートへの結合を増強するための１以上の改変を含む（が、必須ではない）。従って、いくつかの実施形態において、ＴＳＯは、テンプレートにハイブリダイズする領域中に改変を含む。ここで、所定の条件下で、ＴＳＯは、改変のないＴＳＯと比べてその領域により強固に結合する。適切な改変の例示は、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、終止配列を含むポリヌクレオチドは、ブロッキング配列であり、これは、ＴＳＯのように、テンプレートへの結合を増強するための１以上の改変を含み得る。従って、いくつかの実施形態において、このブロッカー配列は、テンプレートにハイブリダイズする領域中に改変を含み得る。ここで、所定のセットの条件下で、このブロッカーは、改変のないブロッカーと比べてその領域により強固に結合する。適切な改変の例示は、本明細書中に提供される。
【００２２】
本方法および組成物において使用され得る酵素は、本明細書中に記載される。例えば、ＲＮＡを切断する酵素は、ＲＮａｓｅＨであり得る。
【００２３】
いくつかの局面において、ＴＳＯは、プロプロモーター機能を提供し、また置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域（プロモーターに隣接してもしなくてもよい）も含む。他の実施形態において、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする３’末端の領域を含み、これにより、置換された伸長産物のＤＮＡポリメラーゼ伸長は、転写が生じる二本鎖プロモーターを産生する。いくつかの実施形態において、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）である。いくつかの実施形態において、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドは、以下を含むポリヌクレオチドである：（ａ）終止配列が標的配列にハイブリダイズし得る条件下で、この標的配列にハイブリダイズし得ないテンプレートスイッチに影響を及ぼさない終止配列；（ｂ）プロプロモーター配列（ここで、このプロプロモーター配列は、終止配列が標的配列にハイブリダイズし得る条件下で、この標的配列にハイブリダイズし得ない）；および（ｃ）この標的ポリヌクレオチドの相補配列にハイブリダイズし得る配列。
【００２４】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含し、これにより目的の核酸配列の複数コピーが産生される：（ａ）目的の核酸配列を含む一本鎖標的ポリヌクレオチドを第一のプライマーとハイブリダイズさせる工程；（ｂ）プロプロモーター配列と、第一のプライマーのハイブリダイゼーションに関して５’側である、標的ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズし得る領域とを含むプロプロモーターテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程；（ｃ）第一のプライマーをＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させる工程であって、その結果、プロプロモーターＴＳＯのプロプロモーター配列に相補的な配列を含む第一のプライマー伸長産物が産生され、これにより、第一のプライマー伸長産物、標的ポリヌクレオチドおよびプロプロモーターＴＳＯの複合体が生成され、ここで、この複合体は、二本鎖プロモーター領域を含む、工程；（ｄ）センスＲＮＡ転写物を生成するために、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いて、この二本鎖プロモーター領域から転写させる工程；（ｅ）第二のプライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）を工程（ｄ）のセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズさせる工程；（ｆ）第二のプライマー伸長産物とＲＮＡ転写物とを含む複合体を生成するために、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いてこの第二のプライマーを伸長させる工程；（ｇ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡを切断する酵素を用いて、工程（ｆ）の複合体におけるＲＮＡを切断する工程；（ｈ）一本鎖の第二のプライマー伸長産物を、プロプロモーターポリヌクレオチドとＲＮＡポリメラーゼによる転写を生じさせ得る条件下でハイブリダイズさせる工程であって、ここで、このプロプロモーターポリヌクレオチドは、プロプロモーターと、この一本鎖の第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含み、その結果、目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物が産生される、工程。
【００２５】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含し、これにより、目的の核酸配列の複数コピーが生成される：（ａ）以下を合わせる工程：第一のプライマー伸長産物の上記の複合体；標的ポリヌクレオチドおよびプロプロモーターＴＳＯ（ここで、この複合体は、二本鎖プロモーター領域を含む）；ＲＮＡポリメラーゼ；目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第二のプライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）；ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；および、プロプロモーターと、第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド、ならびに、（ｂ）以下を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程：プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長；ＲＮＡ切断；プライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、プライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；およびＲＮＡ転写。
【００２６】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含し、これにより、目的の核酸配列の複数コピーが生成される：（ａ）以下を合わせる工程：上記のように生成されたセンスＲＮＡ転写物；このＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第二のプライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）；ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；プロプロモーターと、第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド；および、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに、（ｂ）以下を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程：プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長；ＲＮＡ切断；プライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、プライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；およびＲＮＡ転写。
【００２７】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含し、これにより、目的の核酸配列の複数コピーが生成される：（ａ）以下を合わせる工程：標的ポリヌクレオチド；標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る第一のプライマー；プロプロモーター配列と、標的ポリヌクレオチドへの第一のプライマーのハイブリダイゼーションに関して、５’側である、標的ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズし得る領域とを含む、プロプロモーターテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド；必要に応じて、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡポリメラーゼ；目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得る第二のプライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）；ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；および、プロプロモーターと、第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含むプロプロモーターポリヌクレオチド；ならびに、（ｂ）以下を可能にする条件下で、工程（ａ）の混合物をインキュベートする工程：プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長；ＲＮＡ切断；プライマー伸長産物とプロプロモーターポリヌクレオチドとを含む複合体を形成するための、プライマー伸長産物へのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション；およびＲＮＡ転写。
【００２８】
別の局面において、本発明は、目的の核酸配列の複数コピーを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含し、これにより目的の核酸配列の複数コピーが産生される：（ａ）第二のプライマーをＲＮＡ転写物にハイブリダイズさせる工程であって、このＲＮＡ転写物は、以下を含むプロセスによって産生される：（ｉ）目的の配列を含む一本鎖標的ポリヌクレオチドを第一のプライマーとハイブリダイズさせること（これは、一般的かつ好ましくは、第一のプライマーと同じものである）；（ｉｉ）プロプロモーター配列と、第一のプライマーのハイブリダイゼーションに関して５’側である、標的ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズし得る領域とを含む、プロプロモーターテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせること；（ｉｉｉ）第一のプライマーをＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させることであって、その結果、プロプロモーターＴＳＯのプロプロモーター配列に相補的な配列を含む第一のプライマー伸長産物が産生され、これにより、第一のプライマー伸長産物、標的ポリヌクレオチドおよびプロプロモーターＴＳＯの複合体が生成され、ここで、この複合体は、二本鎖プロモーター領域を含む、こと；（ｉｖ）センスＲＮＡ転写物を生成するために、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを用いて、この二本鎖プロモーター領域から転写させること、（ｂ）第二のプライマー伸長産物およびＲＮＡ転写物を含む複合体を生成するように、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて第二のプライマーを伸長させる工程；（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡを切断する酵素を用いて、工程（ｂ）の複合体におけるＲＮＡを切断する工程；（ｄ）一本鎖の第二のプライマー伸長産物を、プロプロモーターポリヌクレオチドと、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を生じさせ得る条件下でハイブリダイズさせる工程であって、ここで、このプロプロモーターポリヌクレオチドは、プロプロモーターと、この一本鎖の第二のプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含み、その結果、目的の配列を含むＲＮＡ転写物が産生される、工程。
【００２９】
プロプロモーターＴＳＯベースの方法の好ましい実施形態において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは同一である。プロプロモーターＴＳＯベースの方法の他の実施形態において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは異なる。特定の実施形態において、ここで、この第一のプライマーおよび第二のプライマーは異なり、これらのプライマーは、類似の配列、好ましくは、同一の配列にハイブリダイズし得る。プロプロモーターＴＳＯベースの方法のさらに他の実施形態において、この第一のプライマーおよび第二のプライマーは、異なる配列にハイブリダイズし得る。
【００３０】
本方法は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡおよびｃＤＮＡを含む、任意のＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的を増幅するために適用可能である。１以上の工程が、組み合わされ得、および／または連続的に（必須の産物が形成される限り、しばしば、任意の順番で）実施され得る。
【００３１】
本発明はまた、本発明の増幅方法の産物を利用する（通常は、分析する）方法を提供する（例えば、配列決定および配列変化の検出）。本発明に従う配列決定の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ｒＮＴＰアナログの組込みに際して転写が終止するように、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログの混合物の存在下で本方法によって標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；ならびに、（ｂ）配列を決定するために増幅産物を分析する工程。
【００３２】
本発明に従う配列決定の別の方法は、以下の工程を包含する：本発明の方法によって標的ポリヌクレオチドを増幅する工程であって、ここで、第一のプライマー伸長産物から生成されたＲＮＡ転写物は、ｒＮＴＰアナログの組込みに際して転写が終止するように、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログの混合物の存在下で増幅される、工程；ならびに、（ｂ）配列を決定するために増幅産物を分析する工程。本発明に従う配列分析の別の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本発明の方法によって標的ポリヌクレオチドを分析する工程；（ｂ）一本鎖コンフォーメーションについて増幅産物を分析する工程であって、ここで、参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した、コンフォーメーションにおける差異は、この標的ポリヌクレオチド配列における変異を示す、工程。
【００３３】
本発明は、標的ポリヌクレオチド中の目的の配列を特徴付けるための方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）本発明の方法によって目的の配列を含む標的ポリヌクレオチド配列を増幅する工程であって、ここで、複合プライマーのＲＮＡ部分の配列は公知である、工程；ならびに、（ｉｉ）工程（ｉ）から、もしある場合、増幅産物を、参照テンプレートからの増幅産物の量と比較する工程であって、ここで、（１）複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な領域を含む参照テンプレートからの増幅産物の量と比較して、ほとんど検出可能ではない増幅産物の産生は、この標的ポリヌクレオチドが、複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列を含まず、かつこの複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列に関して配列改変体である、ということを示す；あるいは、（２）複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な領域を含まない参照テンプレートからの増幅産物の量と比較して、テンプレートからのより検出可能な増幅産物の産生は、この標的ポリヌクレオチドが、複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列を含み、そしてこの複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列に関して配列改変体ではない、ということを示す。
【００３４】
本発明の方法において、複合プライマーのＲＮＡ部分の配列は、野生型配列、変異体配列、または対立遺伝子改変体配列であり得る、目的の配列に相補的な配列を含み得る。
【００３５】
本発明の方法は、標的核酸配列の検出および定量に有用である。
【００３６】
例えば、１つの局面において、本発明は、核酸増幅産物を配列決定する工程を包含する、目的の配列を配列決定するための方法を提供し、ここで、この核酸増幅産物は、本明細書中に記載される増幅方法によって生成される。増幅産物の配列決定は、目的の配列を示す。
【００３７】
なお別の例示において、本発明は、サンプル中の目的の核酸配列の存在を検出するための方法を提供し、本方法は、本明細書中に記載される増幅方法によって生成された核酸増幅産物中の、目的の配列の存在を検出する工程を包含する。増幅産物中の目的の配列の検出は、サンプル中の目的の配列の存在を示す。
【００３８】
本発明の方法の様々な実施形態において、目的の配列は、変異を含む。目的の配列が変異を含むいつかの実施形態において、この変異は、単一ヌクレオチド多型である。いくつかの実施形態において、目的の配列の検出は、目的の配列を含む増幅産物と、この目的の核酸配列にハイブリダイズ可能な核酸プローブとをハイブリダイズすることを含む。他の実施形態において、目的の配列の検出は、目的の配列の相補体を含む増幅産物と、この相補体にハイブリダイズ可能な核酸プローブとをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、ＤＮＡを含む。他の実施形態において、核酸プローブは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、プローブはマイクロアレイとして提供される。いくつかの実施形態において、マイクロアレイは、以下からなる群より選択される材料から製造された基材に固定化されたプローブを含む：紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、および光ファイバー。いくつかの実施形態において、目的の配列およびその相補体は、限定されたプライマー伸長を実施することによって検出され、ここで限定されたプライマー伸長は、増幅産物にハイブリダイズされたプライマーを伸長させることを含み、目的の配列の存在または非存在を示す特徴を有するプライマー伸長産物が生成される。
【００３９】
従って、本発明の方法は、標的核酸配列の検出および定量化のために有用である。本発明の一本鎖核酸増幅産物はまた、プローブ（例えば、固定化プローブ）へのハイブリダイゼーションによる、標的核酸配列の検出および定量化のためにも使用され得る。本発明はまた、マイクロアレイを生成する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本発明の方法によって、標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｂ）この増幅産物を基材の上に固定化し、この増幅産物を含むマイクロアレイを製造する工程。
【００４０】
本発明の１つの局面は、サンプル中の遺伝子発現プロファイルを決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本発明の方法により、サンプル中の少なくとも２つの目的の配列を増幅する工程；および（ｂ）目的の配列の各々の増幅産物の量を決定する工程であって、ここで上記の各量は、このサンプル中の目的の配列の各々の量を示し、これによって、このサンプルの遺伝子発現プロファイルが決定される、工程。１つの実施形態において、各標的ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。別の実施形態において、各標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。
【００４１】
本発明はまた、本明細書に記載の増幅方法において使用される、種々の構成要素（および構成要素の種々の組み合わせ）を含む、組成物、キット、複合体、反応混合物およびシステムを提供する。本発明の１つの局面は、目的の配列を増幅するためのシステムを提供し、このシステムは以下を包含する：（ａ）複合プライマーである第１のプライマー；（ｂ）第２のプライマー；（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；および（ｇ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；ならびに、必要に応じて、（ｈ）終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。本発明の別の局面は、目的の配列を増幅するためのシステムを提供し、このシステムは、以下を包含する：（ａ）プロプロモーターＴＳＯ；（ｂ）第１のプライマー；（ｃ）必要に応じた、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；および必要に応じて（ｇ）第２のプライマー。
【００４２】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される成分の種々の組み合わせを含む、反応混合物（または反応混合物を含む組成物）を提供する。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載の方法を実施するキットを提供する。これらのキット（これらは、適切な梱包中にあり、そして一般的には（必ずしも必要でないが）適切な指示書を含む）は、増幅方法において使用される、１つ以上の構成要素を含む。例えば、本発明は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である、複合プライマー（例えば、３’ＤＮＡ部分、および５’であり得、そしてさらに３’ＤＮＡ部分に隣接し得る、ＲＮＡ部分を含む）、プロプロモーターポリヌクレオチド、および本明細書中に記載の任意の複合プライマーに基づく方法に従うこの標的ポリヌクレオチドの増幅のための指示書を含むキットを提供する。このキット中の、複合プライマーおよびプロプロポーターポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のいずれかである。このキットは、以下のような任意の構成成分をさらに含み得る：（ａ）終止ポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；（ｂ）本明細書中に記載の任意の酵素（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ））；（ｃ）プロプロポーターＴＳＯ；および（ｄ）第２のプロモーター。別の例において、本発明は、プロプロモーターＴＳＯおよび第１のプライマー（これは、複合プライマーであっても、そうでなくてもよい）（ここで、これらの両方は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である）、ならびに本明細書中に記載の任意のプロプロモーターＴＳＯに基づく方法に従う標的ポリヌクレオチドの増幅のための指示書を含むキットを提供する。このキットは、以下のような任意の構成成分をさらに含み得る：（ａ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断するような、任意の本明細書中に記載の任意の酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）；（ｂ）プロプロモーターおよび第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズ可能な領域を含むポリヌクレオチド；ならびに（ｃ）必要に応じて、第２のプライマー。
【００４３】
（本発明を実施するための様式）
本発明は、核酸配列を増幅するための、方法、組成物およびキットを提供する。標的核酸配列の増幅は、多くの例、例えば、非常に少量で標的ポリヌクレオチドが存在する場合に、または標的ポリヌクレオチドのうちいくつかの分子だけが利用可能である場合に、あるいは規定された標的核酸のヌクレオチド配列決定の目的のために、有利であり得る。
【００４４】
１つの局面において、本発明は、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合プライマー、および２つのセットまたはラウンドの転写工程（セットまたはラウンドの各々は、「転写モジュール」と、本明細書中で呼称される）を一般に使用する方法を提供し、この工程は、中間体ポリヌクレオチドへのプロプロモーターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づく。別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：第１の転写モジュールにおいて、プロプロモーターテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを使用して、転写されることが可能な中間ポリヌクレオチド複合体を生成して、センスＲＮＡ転写物を生成する工程および第２の転写モジュールにおいて、転写による第１の転写モジュールのＲＮＡ転写物をさらに増幅する工程。
【００４５】
１つの局面において、この増幅方法は、一般に以下のように機能する：複合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマーおよび第１のプロプロモーターポリヌクレオチドは、第１の転写モジュールにおいて、標的ポリヌクレオチド転写物の基礎を形成する。いくつかの実施形態において、終止配列は、この標的鎖に沿ったさらなる複製をそらせるかまたはブロックすることによって、この複製の終点を提供する。一般に、終止配列は、標的鎖にハイブリダイズするのに十分相補的な配列を含む。上述のように、いくつかの実施形態において、終止配列を含むポリヌクレオチドは、ハイブリダイズするのに十分に相補的な配列に加えて、標的鎖にハイブリダイズするのに十分相補的でない配列を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）である。ＤＮＡポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドのコピー化を開始し、プライマー伸長産物を生成するためのプライマーを使用する。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）は、テンプレート鎖とプライマー伸長産物とのハイブリッドからＲＮＡ配列を切断（除去）し、テンプレート上に他の複合プライマーの結合が可能である配列を残す。従って、第２の鎖は、ＤＮＡポリメラーゼによって生成され、これは、以前に複製された鎖を置換し、置換された伸長産物を生じる。プロプロモーターおよび置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含むポリヌクレオチド（これらは、例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドまたはプロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチドであり得る）は、置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズされる。
【００４６】
プライマー伸長産物がプロプロモーター配列を含む場合、この配列に対するプロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ））のハイブリダイゼーションは、二本鎖プロモーター領域を生成する。置換されたプライマー伸長産物が、適切なプロプロモーター配列を含まない場合、プロプロモーター配列は、プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ））を使用して取り込まれる。プロプロモーターポリヌクレオチドは、置換されたプライマー伸長産物に結合する。置換されたプライマー伸長産物から生成された二本鎖プロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、センスＲＮＡ産物（すなわち、標的配列を含み、その相補体とは対照的であるＲＮＡ）を生成するために使用される。次いで、第２のプライマーは、センスＲＮＡに転写物にハイブリダイズされ、そして、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、そして、第２のプライマー伸長産物とセンスＲＮＡ転写物との複合体を生成する。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおけるＲＮＡを切断するリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）は、この複合体内のＲＮＡを切断する。次いで、プロプロモーターポリヌクレオチドは、二本鎖プロモーター領域（これは、本明細書中で使用される場合、プロプロモーターポリヌクレオチドに沿って、ハイブリダイゼーションを介して直接的にか、またはプライマー伸長産物とのハイブリダイゼーションを介して間接的に生じ得る）が生成されるように、一本鎖の第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズされる。二本鎖プロモーター領域からの転写は、目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物を生成する。
【００４７】
従って、本発明は、以下との結合工程および反応工程を包含する、目的の核酸配列の少なくとも１つのコピーを産生するための方法（一般的には、標的ポリヌクレオチド配列の増幅の方法）を提供する：（ａ）標的配列を含む、一本鎖の標的ポリヌクレオチド；（ｂ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む複合プライマーである、第１のプライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸または適切なアナログ；（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを切断するＲＮａｓｅＨのような酵素；（ｆ）必要に応じて、テンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズする部分（または領域）含む、終止配列を含むポリヌクレオチド（例えば、本明細書中に記載の任意のポリヌクレオチド）；（ｇ）プロプロモーター配列（これは、本明細書中に記載のような、いくつかの任意の形態であり得る）および置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を含む、ポリヌクレオチド；（ｈ）リボヌクレオチド三リン酸または適切なアナログ；（ｉ）第２のプライマー（第１のプライマーと同じであってもなくてもよい）；ならびに（ｊ）置換された鎖の転写が生じるような条件下のＲＮＡポリメラーゼ。この組み合わせは、以下のような適切な条件に従う：（ａ）複合プライマー（および、必要に応じて、終止配列を含むポリヌクレオチド）が、このテンプレートにハイブリダイズする条件；（ｂ）プライマー伸長が、この複合プライマーから生じ、二重鎖を形成する条件；（ｃ）ＲＮａｓｅＨが、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からこの複合プライマーのＲＮＡを切断する条件；（ｄ）別の複合プライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第１のプライマーと同一である）が、このテンプレートにハイブリダイズし、そして（ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される）プライマー伸長の別のラウンドが生じ、テンプレートから既にコピーされた鎖を置換する条件；（ｅ）転写が生じ、複合プライマー伸長産物に相補的なＲＮＡ転写物が生じる条件；（ｆ）第２のプライマーが、工程（ｅ）のＲＮＡ転写物にハイブリダイズする条件；（ｇ）プライマー伸長が第２のプライマーから生じ、二重鎖を形成する条件；（ｈ）ＲＮａｓｅＨのようなリボヌクレアーゼが、工程（ｇ）の二重鎖からＲＮＡを切断する条件；（ｉ）プロプロモーターポリヌクレオチドが、（本明細書中に記載のように直接的また間接的に）二重鎖プロモーター領域が生成されるように、工程（ｈ）によって生じた一本鎖の第２のプライマー伸長物産物にハイブリダイズする条件；ならびに（ｊ）転写が生じ、目的の配列を含むセンスＲＮＡ転写物を生成する条件。（第２のプライマーがハイブリダイズする）出発基質として工程（ｊ）の転写物を使用する、転写工程の第２のセットの必要の応じた反復は、目的の配列の指数関数的な増幅を生じる。
【００４８】
本明細書中に記載の組み合わせに関して、同じ反応容器中そして／または同時に、全ての成分と反応する必要はないことが理解される。従って、本発明は、部分組み合わせが本明細書中の増幅操作および／または方法を明白または絶対的に反映する限り、部分組み合わせを提供する。
【００４９】
別の局面において、一般的な要約として、この増幅方法は以下のように機能する：標的ポリヌクレオチド上の第１のプライマーのハイブリダイゼーション部位に関して５’にハイブリダイズされたプロプロモーターＴＳＯに起因する、第１のプライマーの伸長の間のテンプレートスイッチングは、二本鎖プロモーター領域を含むポリヌクレオチド複合体の生成を生じる。プロプロモーターＴＳＯは、標的ポリヌクレオチドに、ハイブリダイズ可能な（すなわち、ハイブリダイズする）配列、および標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能でない（すなわち、このハイブリダイズ可能な配列のハイブリダイズを可能にする条件下では、ハイブリダイズしない）配列を含み、ここで、このハイブリダイズ可能ではない配列はプロプロモーターを含む。第１の転写モジュールにおいて、その標的ポリヌクレオチド配列に沿う第１のプライマーの伸長は、ＴＳＯが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる点で、プロプロモーターＴＳＯの非ハイブリダイズ可能配列へとスイッチされる。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡであるいくつかの実施形態において、このＲＮＡは、第１のプライマー伸長後に切断される。この標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである他の実施形態において、このＲＮＡは第１のプライマー伸長後に切断されない。このプライマー伸長産物とＴＳＯの非ハイブリダイズ可能配列との複合体は、二本鎖プロモーター領域を含む。転写は、この二本鎖プロモーター領域から生じ、センスＲＮＡ転写物を生成する。第２の転写モジュールにおいて、これらのセンスＲＮＡ転写物は、さらなる増幅に供される。この第２のモジュールにおいて、第２のプライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第１のプライマーと同一である）は、センスＲＮＡ転写物にハイブリダイズされ、そして、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第２のプライマー伸長産物とセンスＲＮＡ転写物との複合体を生成する。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリット中でＲＮＡを切断するリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）は、この複合体内でＲＮＡを切断する。次いで、プロプロモーターポリヌクレオチドは、（本明細書中に記載のように、直接的または間接的に）二本鎖プロモーター領域が生成されるように、一本鎖の第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズされる。この二本鎖プロモーター領域からの転写は、目的の配列を含むセンス鎖ＲＮＡ転写物を生成する。
【００５０】
従って、本発明は、以下との結合工程および反応工程を包含する、目的の核酸配列の少なくとも１つのコピーを産生するための方法（一般的には、標的ポリヌクレオチド配列の増幅の方法）を提供する：（ａ）一本鎖の標的ポリヌクレオチド；（ｂ）目的の配列の３’位置において、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な第１のプライマー；（ｃ）プロプロモーターＴＳＯ；（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸または適切なアナログ；（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；（ｇ）リボヌクレオシド三リン酸または適切なアナログ；（ｈ）第１の転写工程において生成されたＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第２のプライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第１のプライマーと同一である）；（ｉ）ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖からＲＮＡを切断するＲＮａｓｅＨのような酵素；（ｊ）第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズする、（本明細書中に記載ような、いくつかの形態の任意のものであり得る）プロプロモーターポリヌクレオチド。この組み合わせは、以下のような適切な条件に従う：（ａ）第１のプライマーおよびプロプロモーターＴＳＯが、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする条件；（ｂ）プライマー伸長産物が、標的ポリヌクレオチドに沿って第１のプライマーから生じ、そしてテンプレートスイッチング後、プロプロモーターＴＳＯの非ハイブリダイズ可能配列は、二本鎖プロモーター領域を含む複合体を形成する条件；（ｃ）転写が、工程（ｂ）の二本鎖プロモーター領域から生じる条件；そして（ｄ）第２のプライマー（これは、一般的かつ好ましくは、第１のプライマーと同一である）は、工程（ｃ）のＲＮＡ転写物にハイブリダイズする条件；（ｅ）プライマー伸長が、第２のプライマーから生じ、二重鎖を形成する条件；（ｆ）ＲＮａｓｅＨのようリボヌクレアーゼが、工程（ｅ）の二本鎖からＲＮＡを切断する条件；（ｇ）プロプロモーターポリヌクレオチドが、（本明細書中に記載のように、直接的または間接的に）二本鎖プロモーター領域が生成されるように、一本鎖の第２のプライマー伸長産物とハイブリダイズする条件；ならびに（ｈ）転写が生じ、目的の配列を含むセンス転写物を生成する条件。
【００５１】
本発明の方法のいずれかを使用して、この方法の適切な工程に標識されたヌクレオチドを取り込むことによって標識されたＲＮＡ産物を生成し得る。これらの標識された産物は、当該分野で公知の方法（これらは、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイのようなアレイの使用を含む）による核酸の定量化および同定のために特に適切である。
【００５２】
いくつの実施形態において、本発明は、方法の核酸配列を配列決定する方法を提供する。本明細書中に記載の方法に基づく配列決定について、適切なｒＮＴＰ、またはそのアナログ（これらは、標識されてもされなくてもよい）が、使用される。従って、本発明は、上記の方法に基づく、目的の配列を含む標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法を提供し、ここで、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログ（これらは、標識されたプライマー伸長ターミネーターであっても、または標識されないプライマー伸長ターミネーターであってもよい）が、使用され、そして、この増幅産物は、以下に記載のように、配列情報について分析される。転写による配列決定は、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログを使用して、ＤＮＡ標的配列およびＲＮＡ標的配列の両方について使用され得る。
【００５３】
本発明は、標的配列中の核酸配列変異を検出する方法を提供する。複合プライマーに基づく方法の１つの実施形態において、標的ポリヌクレオチド中の変異の存在または非存在は、ＲＮＡ部分が本発明の方法を使用して変異された配列を含むかまたは欠失しているかのいずれかである複合プライマーを使用する標的ポリヌクレオチドの増幅能に基づき、検出される。本発明の方法の増幅産物はまた、目的の配列について特徴付けられ得る。例えば、この増幅産物は配列決定され、そして目的の配列を決定し得る。これらはまた、例えば、特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって、変異の検出のために使用される。この増幅された産物を使用して、一本鎖コンフォーメーション多型を決定することによって標的配列中に配列の変更または単一ヌクレオチド多型もまた検出および／または同定し得る。従って、この方法は、本発明の増幅方法を使用してＲＮＡ産物を生成し、そしてアレイ技術または液相（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）技術に基づくような検出／定量の方法によってこの生成物を分析することによって目的の配列を特徴付ける（例えば、検出および／または定量する）方法を提供する。一般に、必ずしもこれに及ばないが、これらの増幅された産物は標識される。
【００５４】
なお別の実施形態において、本発明は、本発明の増幅方法の産物を使用する核酸（ＲＮＡ）のマイクロアレイを作製する方法を提供する。
【００５５】
本発明の方法の種々の構成要素に関する詳細は、以下で提供される。
【００５６】
（一般技術）
本発明の実施は、別段示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用し、これらは、当業者の範囲内である。このような技術は、文献（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９８７および定期的な更新）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓら、編、１９９４））中に完全に説明される。
【００５７】
本発明において使用されるプライマー、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な技術によって調製され得る。好ましくは、本発明のプライマーは、化学的な方法を使用して合成され得る。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４巻、２８７頁（１９８７））は、標準的なホスホルアミダイト固相化学を使用してリン酸ジエステル結合によるヌクレオチドの結合を記載している。
【００５８】
（定義）
「標的ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合、増幅が所望される、目的の配列を含むと知られているか、またはこれらを含むと推定されるポリヌクレオチドである。この目的の核酸は、その実際の配列において既知であっても、また未知であってもよい。一般に、本明細書中で使用される場合の「テンプレート」は、目的の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。いくつかの例において、この用語「標的核酸」、「テンプレートＤＮＡ」、「テンプレートポリヌクレオチド」、「標的核酸」、およびそれらの改変体は、交換可能に使用される。
【００５９】
「増幅」とは、本明細書中で使用される場合、一般に、所望する配列の複数のコピーを生成するプロセスをいう。「複数のコピー」は、少なくとも２コピーを意味する。「コピー」は、テンプレート配列に対する、完全な配列相補性または同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシイノシン）、意図的な配列変更（例えば、テンプレートにハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列変更）、および／または増幅の間に生じる配列エラーを含み得る。
【００６０】
「センス」ポリヌクレオチドは（例えば、センスＲＮＡ転写物）は、本明細書中で使用される場合、標的核酸配列由来の目的の配列を含むポリヌクレオチドをいい、その相補体とは対照的である。
【００６１】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、本明細書中で交換可能に使用されて、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、そしてＤＮＡおよびＲＮＡを含む。このヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは改変塩基、および／またはこれらのアナログあるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらのアナログ）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの組立の前またはその後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合体化によって、重合後にさらに改変され得る。他の型の改変としては、例えば「キャップ」、アナログによる１以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カバマート（ｃａｂａｍａｔｅ）など）、および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）での改変、ペンダント部分（例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン（ｐｌｙ−Ｌ−リジン）など）を含む改変、介在因子（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えば、アクリジン、ソラレンなど）での改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力のある金属など）を含む、アルキル化剤を含む改変、改変された結合（例えば、αアノマー核酸など）での改変）、ならびにポリヌクレオチドの未改変形態が挙げられる。さらに、糖に元々存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換され得るか、標準的な保護基によって保護され得るか、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化され得るか、あるいは固相支持体上に結合体化され得る。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、一般に当該分野で公知のリボース糖もしくはデオキシリボース糖のアナログ形態を含み得、これらとしては、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボースもしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロースもしくはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび失歩の（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が挙げられる。１以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置換され得る。これらの代替の結合基としては、以下の実施形態が挙げられるが、これらに限定されない：ここで、リン酸は、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、”（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）��、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換され、ここで、各ＲもしくはＲ’は、独立して、Ｈであるかまたは必要に応じて置換されたかもしくは置換されていないアルキル（１〜２０個のＣ）であり、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキルを含む。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書中の全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００６２】
「第１の転写モジュール」とは、本明細書中で使用される場合、第１の転写工程までを含む本発明の工程を含むプロセスをいう。「第２の転写モジュール」とは、本明細書中で使用される場合、第１の転写モジュールにおいて産生されたＲＮＡ転写物のプライミングから出発して第２の転写工程までを含むＤＮＡ産物を生成する工程を含む、プロセスをいう。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「標識ｒＮＴＰ」は、それぞれ、標識に直接または間接的に結合されたｒＮＴＰまたはそれらのアナログをいう。例えば、「標識」ｒＮＴＰは、例えば、色素および／または検出可能部分（例えば、特定の結合対（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバー）によって直接標識され得る。「標識」ｒＮＴＰはまた、例えば、標識が結合されるおよび／または結合され得る部分に対する結合によって、間接的に標識され得る。ｒＮＴＰは、ｒＮＴＰの伸長産物への取り込みの後に標識が結合され得る部分（例えば、アミン基）を含み得る。本発明において有用な標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉまたは１４Ｃ）、酵素（例えば、ＬａｃＺ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ジゴキシゲニン）、および比色分析標識（例えば、コロイド状金または着色ガラス）あるいはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。種々の抗リガンドおよびリガンドが（それ自体標識として、または標識に結合するための手段として）使用され得る。天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾール）を有するリガンドの場合、このリガンドは、標識された抗リガンドと組み合わせて使用され得る。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、ｒＮＴＰの「型」は、ヌクレオチドの特定の塩基、すなわち、アデニン、シトシン、ウリジンまたはグアニンをいう。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一般的には約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうである必要はない、短い、一般的に一本鎖の、一般的に合成のポリヌクレオチドをいう。本発明におけるオリゴヌクレオチドは、複合プライマー、ＴＳＯ、ＰＴＯおよびブロッカー配列を含む。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに等価かつ完全に適用可能である。
【００６６】
「プライマー」は、テンプレート配列（例えば、標的ＲＮＡまたはプライマー伸長産物）にハイブリダイズし、そしてテンプレートに対して相補的なポリヌクレオチドの重合を促進し得る遊離の３’−ＯＨ基を一般に有するヌクレオチド配列である。「プライマー」は、例えば、オリゴヌクレオチドであり得る。これはまた、例えば、テンプレート自体中の配列にハイブリダイズし（例えば、ヘアピンループとして）、そしてヌクレオチドの重合を促進し得るテンプレート（例えば、プライマー伸長産物）の配列であり得る。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「ランダムプライマー」は、サンプル中の特別または特定の配列に基づいて設計されないが、むしろ（ランダムプライマーの）配列がサンプル中の１以上の配列に（所定の設定の条件下で）ハイブリダイズする統計的期待値に基づく配列を含むプライマーである。ランダムプライマー（またはその相補体）の配列は、天然に存在してもしなくてもよく、または目的のサンプル中の配列のプールに存在してもしなくてもよい。単一の反応混合物中の複数のＲＮＡ種の増幅は、一般に、ランダムプライマーの多重度、好ましくは大きい多重度を使用する。当該分野で十分理解されるように、「ランダムプライマー」はまた、標的配列の所望の数および／または有意な数にハイブリダイズするように集合的に設計されるプライマーの集団（複数のランダムプライマー）のメンバーであるプライマーをいい得る。ランダムプライマーは、核酸配列の複数の部位でハイブリダイズし得る。ランダムプライマーの使用は、標的の正確な配列の先立つ知識を必要としない、ポリメラーゼによる標的ポリヌクレオチドに対して相補的なプライマー伸長産物を生成するための方法を提供する。
【００６８】
本明細書中でスイッチ可能に使用される場合、「終止ポリヌクレオチド配列」または「終止配列」は、標的配列を含むテンプレートに関してＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の停止をもたらすポリヌクレオチド配列である。終止配列は、一般に、終止点（部位）に対して位置５’でテンプレートにハイブリダイズする部分（または領域）を含む。ハイブリダイズ可能な部分は、終止配列全体を含んでも良いし、含まなくても良い。適切な終止ポリヌクレオチド配列（例えば、ブロッカー配列またはＴＳＯ）の例は、本明細書中に提供される。適切な終止ポリヌクレオチド配列の他の例としては、本明細書中に記載されるような、終止配列（これは、一般にかつ好ましくは、終止配列が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である条件下でテンプレートスイッチ（ｓｗｉｔｃｈ）をもたらさないおよびプロプロモーター配列を含む組み合わせポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６９】
本明細書中でスイッチ可能に使用される場合、「ブロッカー配列」または「ブロック配列」は、終止配列の例であり、そして終止部位に対して位置５’でテンプレート核酸に、一般に、高い親和性で結合するオリゴヌクレオチドをいい、そして標的配列を含むテンプレートに関してＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の停止をもたらす。この３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長をブロックしても良いし、しなくても良い。
【００７０】
本明細書中でスイッチ可能に使用される場合、「終止部位」または「終止点」は、重合化（一般に、プライマー伸長）またはテンプレートスイッチに終止前のＤＮＡポリメラーゼにより最後に複製されるテンプレートの部位、点または領域をいう。例えば、ＴＳＯに関して、これは、テンプレートをＴＳＯのテンプレートポリヌクレオチドからハイブリダイズしていない部分までスイッチする前の、プライマー伸長産物の３’末端に相補的である標的配列における部位または領域である。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、「プロトプロモーター配列」および「プロプロモーター配列」は、一本鎖ＤＮＡ配列領域であり、ここで、二本鎖形態は、ＲＮＡ転写を媒介し得る。いくつかの状況において、「プロトプロモーター配列」、「プロトプロモーター」、「プロプロモーター配列」、「プロプロモーター」、「プロモーター配列」および「プロモーター」は、スイッチ可能に使用される。プロプロモーター配列は、本明細書中に記載されるプロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＴＳＯ、ＰＴＯまたは本明細書中に提供される。本明細書中に記載されるような、終止配列（これは、一般にかつ好ましくは、標的配列が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である条件下でテンプレートスイッチをもたらさない）およびプロプロモーター配列を含む組み合わせポリヌクレオチド）のいずれかによって提供され得る。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド」、「標的スイッチオリゴヌクレオチド」または「ＴＳＯ」は、プライマー伸長の終止部位に対して５’位置でテンプレートにハイブリダイズし得る部分（または領域）および一般に、テンプレートにハイブリダイズしない配列に起因する、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長のプロセスにおいてテンプレートスイッチをもたらし得る部分（または領域）を含むオリゴヌクレオチドをいう。ＴＳＯは、一般に、当該分野で公知である。「テンプレートスイッチ」は、プライマー伸長の一回の過程の間、一般に、ＴＳＯの標的核酸からハイブリダイズしていない部分までのテンプレート核酸における変化をいう。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「プロプロモーターＴＳＯ」は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能ではないプロプロモーター配列（所定の設定の条件下で、ＴＳＯのハイブリダイズ可能な部分または領域が、標的にハイブリダイズする場合、これは、一般に、効果的な条件である）をさらに含むＴＳＯである。プロプロモーター配列は、一般に、必要ではないが、ＴＳＯの５’領域内にある。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）」は、プライマー伸長産物の３’領域にハイブリダイズ可能である、プロプロモーター配列および部分、一般に、３’部分を含むオリゴヌクレオチドをいう。プロプロモーター配列およびハイブリダイズ可能な部分は、オリゴヌクレオチドの同じ、別個の、または重複したヌクレオチドであり得る。
【００７５】
第２の配列に「対応する」第１の配列（例えば、複合プライマーのＲＮＡ部分）は、第１の配列が、第２の配列に関して同一の有意な配列を有することを意味する。この用語は、一般に、変異を検出する状況または標的の配列を特徴付ける状況において使用される。
【００７６】
「阻害する」とは、参照と比較した場合に、活性、機能および／または量を減少または低減することをいう。
【００７７】
「複合体」は、構成要素の集合体である。複合体は、安定であってもなくてもよく、そして直接もしくは間接的に検出され得る。例えば、本明細書中に記載される場合、反応の特定の所定の構成要素、および反応産物の型、複合体の存在が推測され得る。本発明の目的のために、複合体は一般に、最終増幅産物に関して中間体である。
【００７８】
本明細書中でスイッチ可能に使用される、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの「部分」または「領域」は、２以上の塩基の連続配列である。他の実施形態において、領域または部分は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０、２５のいずれかの連続ヌクレオチドである。
【００７９】
別の配列に「隣接する」領域、部分または配列は、その領域、部分または配列に直接接する。例えば、複合プライマーの５’ＤＮＡ部分に隣接するＲＮＡ部分は、その領域に直接的に接する。この例の説明については、図１Ａ〜Ｃを参照のこと。
【００８０】
「反応混合物」は、適切な条件下で反応して複合体（中間体であり得る）および／または産物を形成する構成要素の集合である。
【００８１】
「１つの」（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」など）は、他に示さない限り、複数形を含む。
【００８２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味する。
【００８３】
事象（例えば、ハイブリダイゼーション、鎖の伸長など）が生じるのを「可能にする」条件または事象を生じるのに「適切な」条件、あるいは「適切な」条件は、このような事象が生じるのを妨げない条件である。従って、これらの条件は、事象を可能にする、増強する、容易にするおよび／または招く。当該分野で公知かつ本明細書中に記載されるこのような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度、および緩衝液条件に依存する。これらの条件はまた、所望される事象（例えば、ハイブリダイゼーション、切断、鎖の伸長または転写）に依存する。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、配列「変異」は、参照配列と比較した、目的の配列中の任意の配列変更をいう。参照配列は、野生型の配列または目的の配列の比較が望まれる配列であり得る。配列変異としては、置換、欠失または挿入のような機構に起因する、単一ヌクレオチド変化または配列中の１より多いヌクレオチドの変更が挙げられる。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）もまた、本明細書中で使用されるような配列変異である。
【００８５】
本明細書中で使用される場合「一本鎖コンフォメーション多型」および「ＳＳＣＰ」は、一般に、その特定の核酸配列によって影響されるような一本鎖核酸の特定のコンフォメーションをいう。一本鎖ポリヌクレオチドの配列の変更（例えば、単一ヌクレオチドの置換、欠失または挿入）は、一本鎖ポリヌクレオチドのコンフォメーションの変化または多型を生じる。ポリヌクレオチドのコンフォメーションは、一般に、当該分野で公知の方法（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動および／またはエンドヌクレアーゼ消化に対する感受性によって測定されるような電気泳動移動度）を使用して、検出可能、同定可能および／または識別可能である。
【００８６】
「マイクロアレイ」および「アレイ」は、本明細書中でスイッチ可能に使用される場合、未決定の特徴をしばしば有する生化学的サンプル（標的）に対する推定結合（例えば、ハイブリダイゼーションによる）部位のアレイ、好ましくは整列されたアレイを有する表面を含む。好ましい実施形態において、マイクロアレイは、基板上の規定された位置で固定化された別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのプローブの集合体をいう。アレイは、紙、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、光学繊維または任意の適切な他の固体支持体もしくは半固体支持体のような材料で組み立てられ、そして二次元（例えば、ガラス板、シリコンチップ）または三次元（例えば、ピン、繊維、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー）構成で構成される基板上に形成される。アレイを形成するプローブは、以下を含む多数の方法によって基板に結合され得る：（ｉ）写真平板術を使用するインサイチュ合成（例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、２５１：７６７−７７３；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）、９１：５０２２−５０２６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）、１４：１６７５；米国特許第５，５７８，８３２号；同第５，５５６，７５２号；および同第５，５１０，２７０号を参照のこと）；（ｉｉ）ガラス、ナイロンまたはニトロセルロース上の低密度の媒体（例えば、ｃＤＮＡプローブ）でのスポッティング／印刷（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）、２７０：４６７−４７０；ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６）、１４：４５７−４６０；Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９６）、６：６３９−６４５；およびＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５）、９３：１０５３９−１１２８６）；（ｉｉｉ）マスキングによる方法（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２）、２０：１６７９−１６８４）ならびに（ｉｖ）ナイロンまたはニトロセルロースのハイブリダイゼーション膜上のドットブロットによる方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）。プローブはまた、アンカーに対するハイブリダイゼーションによって、磁気ビーズによって基板上に、またはマイクロタイターウェルまたはキャピラリーのような液相に、非共有的に固定化され得る。このプローブ分子は、一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびｃＤＮＡのような核酸であるが、標的分子に特異的に結合し得るタンパク質、ポリペプチド、オリゴ糖、細胞、組織およびこれらの任意の置換体を含み得る。
【００８７】
用語「３’」は、一般に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または部分から３’側（下流）の、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または部分をいう。
【００８８】
用語「５’」は、一般に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または部分から５’側（上流）の、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または部分をいう。
【００８９】
用語「３’−ＤＮＡ部分」、「３’−ＤＮＡ領域」、「３’−ＲＮＡ部分」および「３’−ＲＮＡ領域」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’末端に向かって位置するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そして同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオチドに結合した最も３’側のヌクレオチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も３’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約２０、より好ましくは約３〜約１８、なおより好ましくは約５〜約１５ヌクレオチドであり得る。
【００９０】
用語「５’−ＤＮＡ部分」、「５’−ＤＮＡ領域」、「５’−ＲＮＡ部分」および「５’−ＲＮＡ領域」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端に向かって位置するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そして同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も５’側のヌクレオチドに結合した最も５’側のヌクレオチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も５’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約２０、より好ましくは約３〜約１８、なおより好ましくは約５〜約１５ヌクレオチドであり得る。
【００９１】
「検出」は、直接および間接検出を含む、検出の任意の手段を含む。例えば、「検出可能なわずかな」産物は、直接的または間接的に観察され得、そしてこの用語は、任意の減少（産物を含まない）を示す。同様に、「検出可能なより多くの」産物は、直接的に検出されようとまたは間接的に検出されようと、任意の増加を意味する。
【００９２】
（増幅方法）
本発明の増幅方法の例は、以下の通りである。提供される一般的な記載が与えられれば、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。例えば、複合プライマーを用いるとの言及は、本明細書に記載される任意の複合プライマーを使用し得ることを意味する。
【００９３】
１つの局面において、本発明の方法は、２つの関連した転写モジュールを利用する：転写を基礎とする複合プライマーベース線形核酸増幅（本明細書において「増強線形増幅」とも称される）を提供する第１の転写モジュールであって、ここで、この第１の転写モジュールは、次いで、第１のモジュールの増幅産物のさらなる等温増幅を可能にする第２の転写モジュールに結合する。本発明の方法は、一般に、２つのプライマー（この両方のプライマーは、増幅される標的核酸鎖に関してセンスである）を利用する。全ての増幅反応は、等温であり得、そして熱サイクルを必要としない。
【００９４】
別の局面において、目的の核酸のセンスＲＮＡ転写物の複数のコピーを産生するための方法は、第１のセットの転写工程（第１の転写モジュール）において転写される得る中間ポリヌクレオチド産物を産生するためのプロプロモーターテンプレートスイッチポリヌクレオチド（ＴＳＯ）を使用、第２のセットの転写工程（第２の転写モジュール）を介してさらに増幅されるＲＮＡ転写物を産生することに基づく。
【００９５】
この増幅方法の産物は、相同または不均質検出（ゲル電気泳動におけるサイズおよび／または移動特性による同定を含む）にいずれかによって、あるいは配列特異的なプローブへのハイブリダイゼーションによって検出され得る。増幅産物の検出は、標的核酸の存在の指標である。定量的分析はまた可能である。例えば、標的配列を含む既知量のポリヌクレオチドを有する参照サンプルの増幅の産物に対して、標的配列を含む未知量のポリヌクレオチドを含む試験サンプルから増幅された産物の量を比較することによって、試験サンプル中の標的配列の量が、決定され得る。下記で考察するように、標的核酸の配列変更および配列決定の分析へのこの増幅方法のさらなる拡大がまた可能である。一本鎖ＤＮＡ増幅産物の量が増大する場合、遊離のＴＳＯおよび／または他のプロプロモーターポリヌクレオチドのような成分のレベルが制限となり、従って、増幅の総能力を制御する。これは、本発明の増幅方法の特有の特徴であり、ここでプロセス中で用いられるこのような成分の量は、最大検出能力（核酸検出および定量プロセスに有利である）について増幅能力を微調整するように調節され得る。
【００９６】
反応混合物中のＴＳＯのような成分の量によって決定されるような増幅産物の総量を調節する能力は、標的ポリヌクレオチドのさらに正確な検出および／または定量を容易にし得る。他の公知の増幅方法（例えば、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなど）によって産生される過度の増幅は、２つ以上の検出プローブを使用する方法を使用する検出および／または定量についての問題を引き起こし得る。結合過剰分析物からの「ホック効果」は、当該分野で公知であり、そして高い分析物の濃度における予想されるレベルに関連して偽陰性または減少したシグナル強度を導く非線形およびシグナルドロップオフを生じる。本発明は、増幅された産物に検出のための選択された方法に適切であるように産生された産物の最大量を制限する利点を有する。
【００９７】
本発明の増幅方法は、非特異的増幅を導き得るプライマー伸長産物へのプロモーター配列の非特異的な組み込みに耐性であるさらなる利点を有する。複合プライマーベースの方法において、プロモーター配列は、本明細書に記載されるようなＴＳＯおよび／または別のプロプロモーターポリヌクレオチドによって導入される。プロプロモーターＴＳＯベース方法において、プロモーター配列は、第１の転写モジュールにおけるプロプロモーターＴＳＯによって導入され、そして本明細書に記載されるような、別のプロプロモーターポリヌクレオチドは、第２の転写モジュールにおけるＴＳＯである。プロプロモーターＴＳＯベースの方法の第１の転写モジュールにおいて、二本鎖機能的プロモーターの形成は、プライマー伸長およびテンプレートスイッチに依存する。第２のモジュールにおける機能的プロモーターの形成は、プロプロモーターＴＳＯのようなプロプロモーターポリヌクレオチドへの第２のプライマー伸長産物のハイブリダイゼーションを必要とする。本発明の方法におけるプロプロモーターポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの工程は、プロセスの特異性を増大する。非特異的な伸長産物は、プライマー伸長産物における特定のプライマーにハイブリダイズ可能であるように設計されたプロプロモーター配列に相補的であるポリヌクレオチド（例えば、３’末端配列）を有しないようである。
【００９８】
この方法は、ＤＮＡ標的モジュールまたはＲＮＡ標的モジュールのいずれかの増幅に適用可能である。本発明の増幅方法は、例えば、標的配列の検出、定量および配列決定に使用され得る。
【００９９】
（複合プライマーベースの増幅方法）
１つの局面において、複合プライマーを使用する目的の核酸配列のセンスＲＮＡ転写物の複数のコピーを産生するための方法を提供する。本発明の複合プライマーベースの増幅方法は、目的の核酸配列の等温指数関数的増幅を提供する。この方法は、複合プライマーおよび一般的に、一般に、必要ではないが、非複合性である第２のプライマーを利用する。１つの実施形態において、本発明はまた、終止配列（例えば、ブロッカー配列（方法１に記載される）またはＴＳＯ（方法２に記載される））を使用する。方法１および２は以下に記載される。
【０１００】
終止配列（使用する場合、ＴＳＯまたはブロッカー配列成分のいずれか）は、規定された３’末端を含む産物を産生するために添加される。いくつかの実施形態において、プライマー結合部位のテンプレート５’内の天然の配列は、核酸重合を阻害し、その結果、プライマー伸長の終止が、達成される。このような天然の配列は、当該分野で公知であるか（例えば、ＧＣリッチ配列）または経験的に決定され得る。終止配列の使用は、プライマー伸長について規定された末端を提供するようにゲノムＤＮＡを増幅する場合、特に有益である。この特徴が、所望でない場合、本発明の方法に従う等温増幅は、終止配列なしで実行され得る。
【０１０１】
等温増幅は、３つの酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  ＨのようなリボヌクレアーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを利用する。ブロッカー配列を使用する、方法１の１つの実施形態は、図１Ａ−Ｆに例示される。ＴＳＯを利用する、方法２の実施形態は、図２Ａ−Ｅに例示される。
【０１０２】
本発明の複合プライマーベースの方法は、一般に、一本鎖ＤＮＡ標的を増幅するように設計される。増幅される標的核酸が、二本鎖ＤＮＡである場合、標的は、最初に変性されて、一本鎖標的を産生する。標的の変性は、当該分野で公知の方法（例えば、熱変性またはアルカリ処理）を使用して実行され得る。標的が、一本鎖ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ）である場合、標的は、最初に転写されて、当該分野で公知の方法によってｃＤＮＡ標的を産生する。
【０１０３】
標的ポリヌクレオチドは、上記に記載されるような、複合プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨのようなリボヌクレアーゼおよび必要に応じて、ブロッカー配列成分またはＴＳＯと組み合わせられる。１つの実施形態において、各増幅反応は、同一配列の複合プライマーを含む。別の実施形態において、各増幅反応は、複合プライマー改変体の混合物を含む、ここで、この改変体は、相同であるが、同一ではない２つの配列を示し、そして、ここで、全ては、同じ標的核酸配列にハイブリダイズし得る。相補性は、好ましくは、少なくとも５０％、さらに好ましくは、少なくとも約７５％、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％である。この実施形態の利点としては、プライマー伸長産物への目的の異なる配列を導入する能力が挙げられる。なお別の実施形態において、各増幅反応は、複合プライマーの混合物を含み、ここで、プライマーは、低相同性か相同性がない２つ以上の同一ではない配列を示し、そしてここで、このプライマーは、好ましくは、同じ標的核酸鎖に沿う異なる標的核酸配列または異なる核酸部位にハイブリダイズする。この実施形態の利点としては、単一の増幅反応における複数の標的核酸種の増幅を介する標的核酸の多量検出および／または分析が挙げられる。
【０１０４】
ブロッカー配列を利用する（または終止ポリヌクレオチドを利用しない）方法は、プロプロモーターポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、ＲＮＡポリメラーゼについての基質である複合体を形成する置換されたプライマー伸長産物の産生を生じる。ＴＳＯを利用する方法は、標的およびテンプレートスイッチポリヌクレオチド（ＴＳＯ）関連部分を含む固有の中間増幅産物の産生を生じる。置換されたプライマー伸長産物に対するＴＳＯのハイブリダイゼーションによって形成される複合体は、最初の標的配列と同じセンスのＲＮＡ産物を産生する、ＲＮＡポリメラーゼによる転写のための基質である。
【０１０５】
複合プライマーベース方法に２つの例示的な実施形態は、以下に記載される：
（方法１：ブロッカー配列ベースのポリヌクレオチド増幅）
いくつかの実施形態において、ブロッカー配列ベースの増幅方法が、提供される。例示的な実施形態は、図１Ａ−Ｆに示される。
【０１０６】
図１Ａ−１Ｆは、本明細書に記載される、以下の複合プライマーを利用する方法の実施形態を例示する；単一のプライマーと同じ標的核酸鎖における配列にさらにハイブリダイズし得る、本明細書に記載されるような、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログのいずれかであるブロッカー配列成分；および第３のオリゴヌクレオチドであるプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）であり、これは、本明細書中に記載されるように、置換された伸長産物の３’末端にハイブリダイズする（そして好ましくは、これに対して、相補的）である３’部分およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を含む５’−部分を含む。本明細書に記載されるＴＳＯにおいて、プロモーター配列に直接隣接する配列は、本発明の方法に従う増幅において使用されるＲＮＡポリメラーゼによって好ましくは、最適な転写活性を提供するように設計され得る。ブロッカー配列成分は、一般に、上流（すなわち、単一のプライマーのハイブリダイズ部位に関連する標的の５’末端に向かって位置する）部位における標的配列にハイブリダイズするように設計される。あるいは表示される、あるいは、そして本明細書に記載されるように、ブロッカー配列は、プライマー伸長産物の３’末端に相補的な標的配列の５’である標的核酸配列のセグメントにハイブリダイズする。ブロッカー配列は、ブロッカーが、標的にハイブリダイズする部位においてプライマー伸長を終止するのに十分な高親和性で結合する。この特徴は、ポリメラーゼによるプライマー伸長にための強い停止を提供し、そしてプライマー伸長産物の３’末端を規定する。
【０１０７】
適切な反応培地および条件は、本明細書中に記載されている。１つの実施形態において、転写は、異なる温度（一般的に、前述の工程の温度よりも低い）で実施される。別の実施形態において、この方法の全ての工程は、等温で実施される。
【０１０８】
一本鎖核酸標的は、複合プライマー、ブロッカー要素、プロプロモーター鋳型オリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ）、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、およびヌクレオチド（例えば、ＮＴＰ（例えば、ｄＮＴＰおよびｒＮＴＰ））と混合される。複合プライマーおよびブロッカー配列要素は、同一の標的鎖にハイブリダイズし、三分子複合体Ｉを形成する（図１Ａ）。プライマーは、標的に沿って、ブロッカー配列のハイブリダイゼーションの位置まで伸長され、複合体ＩＩを形成する（図１Ａ）。
【０１０９】
リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ）は、複合体ＩＩの単一の複合プライマーのＲＮＡ部分（一般的に、５’ＲＮＡ部分）を切断し、複合体ＩＩＩを形成する（図１Ｂ）。本明細書中に記載されるように、リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断するのに特異的であり、そして一本鎖ＲＮＡを消化しない。従って、リボヌクレアーゼは、遊離の複合プライマーを分解しない。遊離のプライマーは、複合体ＩＩＩの標的核酸のプライマー相補部位にハイブリダイズする（図１Ｂ）。このハイブリダイゼーションにより、複合体ＩＶの形成が生じる（図１Ｂ）。この複合体ＩＶにおいて、プライマーの５’ＲＮＡ部分のみが、標的鎖にハイブリダイズする。部分的にハイブリダイズしたプライマーの３’ＤＮＡ部分によるプライマー伸長産物の最５’部分の置換により、複合体Ｖ（ＤＮＡポリメラーゼの基質）の形成が生じる（図１Ｃ）。標的鎖に沿ったプライマーの伸長により、この複合体からの第１プライマー伸長産物（ＶＩ）の置換が生じる。ＲＮａｓｅＨ切断、遊離の複合プライマーのハイブリダイゼーション、および鎖置換産物の生成のサイクルが進行し、複数の一本鎖ＤＮＡ産物（ＶＩＩ）を形成する。置換された伸長産物は、標的配列に完全に相補的であり、そして標的に相補的でない３’末端部分を含まない。
【０１１０】
プロモーター鋳型オリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）は、置換されたプライマー伸長産物の３’末端へのプロプロモーター鋳型の３’末端部分（Ａ）のハイブリダイゼーションにより、置換された伸長産物に結合し、複合体ＶＩＩＩを形成する（図１Ｃ）。本明細書中に記載されるように、ＰＴＯの３’末端は、ブロックされてもされなくてもよい。プロプロモーター鋳型の３’末端がブロックされない場合、鋳型は、置換されたプライマー伸長産物に沿って伸長する。置換された伸長産物の３’末端は、ヌクレオチド（ＤＮＡ）ポリメラーゼにより、ハイブリダイズしたプロプロモーター鋳型のＢ部分に沿って伸長され、複合体ＩＸを形成する（図１Ｄを参照のこと）。この複合体ＩＸは、一方の末端に、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖プロモーター配列を含む。複合体ＩＸを、プロモーター鋳型（ＰＴＯ）のハイブリダイゼーションの産物として、図１Ｄに示す。この産物において、３’末端は、ポリメラーゼによる伸長に対してブロックされる。あるいは、プロモーター鋳型の３’がブロックされない場合、置換されたプライマー伸長産物に沿った３’末端の伸長により、完全な二本鎖複合体の形成が生じる。ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼは、複合体ＩＸの伸長された置換されたプライマー伸長産物の両方の形態を転写する。ＲＮＡポリメラーゼの選択は、この複合体の部分的な二本鎖形態または完全な二本鎖形態のいずれかを転写するその能力を考慮する。複数コピーのセンス一本鎖ＲＮＡ（Ｘ）は、この転写工程により生成される（図１Ｄ）。
【０１１１】
各プライマー伸長産物からの、好ましくは少なくとも約１、より好ましくは少なくとも約５０、さらにより好ましくは少なくとも約７５、なおより好ましくは少なくとも約１００、そして最も好ましくは少なくとも約１０００のＲＮＡ転写産物の生成が期待される。
【０１１２】
図１Ｅに示されるように、第２セットの工程（第２転写モジュール）は、第２オリゴヌクレオチドプライマー４（標的核酸配列に対して複合プライマーと同じセンスである）、第１モジュールで使用されたようなプロモーター鋳型オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素（ＲＴ）、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、およびＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを使用する。ＤＮＡポリメラーゼ活性、逆転写酵素活性、およびＲＮａｓｅＨ活性は、当該分野で公知のように、同一の酵素に含まれ得る。
【０１１３】
この２つのモジュールは、合わされ得るか、または連続的に実行され得る。簡素さの目的のために、これらのプロセスは、本明細書中で連続工程として記載される。第１セットの工程の反応混合物のアリコートは、上述の成分を含む混合物と合わされ、そして増幅反応が、等温で実施される。
【０１１４】
第２プライマー４は、第１モジュールのＲＮＡ産物の３’末端において配列にハイブリダイズする。従って、この第２プライマーは、一般的に、第１セットの工程において使用された複合プライマー（例えば、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー）に相補的な配列の上流である配列に相補的なように設計される。第２プライマーは、一般的に（必ずしもそうではないが）、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（一般的に（必ずしもそうではないが）、非合成性である）である。ハイブリダイズしたプライマーは、ＲＴにより伸長され、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖複合体ＸＩを形成する（図１Ｅ）。複合体ＸＩのＲＮＡ鎖は、ＲＮａｓｅＨにより切断され、一本鎖ＤＮＡ産物ＸＩＩを生成する（図１Ｅ）。この一本鎖ＤＮＡ産物ＸＩＩは、第１セットの工程のプライマー伸長産物と同様に標的核酸配列に対してアンチセンス（すなわち、相補的）である。
【０１１５】
プライマー伸長産物ＸＩＩの３’末端は、一般的に、プロモーター鋳型オリゴヌクレオチドの３’末端に相補的である（第１セットの工程のプライマー伸長産物も同様である）。プロモーター鋳型オリゴヌクレオチドへの生成物ＸＩＩのハイブリダイゼーションにより、複合体ＸＩＩＩの形成が生じる（図１Ｅ）。プライマー伸長産物の３’末端は、ＲＴによりプロモーター鋳型オリゴヌクレオチドに沿って伸長され、１つの末端に二本鎖プロモーター配列を有する部分的な二本鎖ＸＩＶを形成する（図１Ｆ）。部分的な二本鎖ＸＩＶは、センスＲＮＡ産物Ｘを形成するための、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼによる転写のための基質である（図１Ｆ）。
【０１１６】
産物Ｘへのプライマー４のハイブリダイゼーションは、第２転写モジュールについて記載されるプロセスを再開し、それによって、周期性の増幅プロセスまたは指数的な増幅を生じる。第２セットの工程において、目的の最初の配列の増幅の程度は、プロモーター鋳型オリゴヌクレオチドおよび第２プライマーの濃度により制限される。
【０１１７】
上述から明らかなように、本発明の方法は、標的核酸の高効率増幅および本明細書中に記載される等温配列決定のような目的への増幅方法の適用に適する。
【０１１８】
（方法２：ＴＳＯベースの増強された直線的核酸増幅）
１つの実施形態において、本発明のＴＳＯベースの直線的増幅方法は、プライマー伸長産物からの転写に結びつけられて、増強された核酸増幅を提供する。この新規の増幅方法（方法２）の１つの実施形態の概略図を、図２Ａ〜２Ｅに示す。
【０１１９】
本発明のＴＳＯベースの核酸増幅方法は、本明細書中に記載されるような複合プライマーを使用する。本発明の増幅方法において使用される第２オリゴヌクレオチドは、上述のような鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）である。増幅される核酸標的は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＲＮＡ標的の増幅は、当該分野で公知の方法に従う最初のｃＤＮＡ合成工程を必要とする。本発明のＴＳＯベースの増強された直線的増幅方法は、標的ＤＮＡ配列に相同（すなわち、センス）な複数コピーのＲＮＡ産物を生成する。
【０１２０】
一本鎖標的核酸は、当該分野で公知のように、複合プライマー、ＴＳＯオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、およびヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）と、核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅に適した反応培地中で合わされる。１つの実施形態において、転写は、異なる温度（一般的に、前述の工程の温度よりも低い）で実施される。別の実施形態において、この方法の全ての工程は、等温で実施される。
【０１２１】
１つの実施形態において、ＴＳＯは、末端配列として機能し、そしてプロプロモーター配列を提供する。別の実施形態において、ＴＳＯは、プロプロモーター配列を含まない。この実施形態において、プロプロモーター配列は、プロプロモーターを含む別のオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）により別々に提供され、そしてプライマー伸長産物の３’部分にハイブリダイズし得、その結果、プライマー伸長産物の転写が生じ得る。
【０１２２】
次いで、この単一の複合プライマーおよびＴＳＯは、増幅される核酸の同一の鎖にハイブリダイズする。２つのオリゴヌクレオチドは、標的核酸の変性工程前に、標的核酸を含むと思われるサンプルに添加され得る。標的鎖への２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、三分子複合体ＸＶが生じる（図２Ａ）。
【０１２３】
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長を実行する。プライマーは、複合体ＸＶの標的核酸鎖に沿って伸長され（図２Ａ）、そしてＴＳＯハイブリダイゼーションの部位で終了する。標的鎖からＴＳＯの５’非ハイブリダイズ部位への鋳型切り替え、およびＴＳＯ鋳型に沿ったさらなるプライマー伸長により、標的核酸、ＴＳＯ、および第１プライマー伸長産物を含む三分子複合体ＸＶＩの形成が生じる。第１プライマー伸長産物は、標的依存的部位（すなわち、標的核酸に相補的な配列）およびＴＳＯ依存的部位（すなわち、ＴＳＯの非ハイブリダイズ部分に祖補的な配列）の両方を含む特有のＤＮＡである。
【０１２４】
複合体ＸＶＩ（図２Ａ）は、ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）の両方の基質である。ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼは、複合体ＸＶＩの機能性二本鎖プロモーターに結合し、そして第１プライマー伸長産物を転写してセンスＲＮＡ産物Ｘを生成する（図２Ａ）。ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖のＲＮＡ鎖の分解に特異的なリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）は、複合体ＸＶＩ中のプライマー伸長産物の５’部分を分解し、三分子複合体ＸＶＩＩを形成する（図２Ｂ）。
【０１２５】
遊離の複合プライマーは、複合体ＸＶＩＩ中の標的核酸のプライマー相補的部位にハイブリダイズする（図２Ｂ）。このハイブリダイゼーションにより、複合体ＸＶＩＩＩの形成が生じる（図２Ｂ）。この複合体ＸＶＩＩＩにおいて、プライマーのＲＮＡ部分（一般的には、５’ＲＮＡ部分）のみが標的核酸にハイブリダイズする。部分的にハイブリダイズしたプライマーの３’ＤＮＡ部分（ＸＶＩＩＩ）によるプライマー伸長産物の最５’部分の置換により、複合体ＸＩＸの形成が生じる（図２Ｂ）。この複合体ＸＩＸは、ＤＮＡポリメラーゼの基質である。標的鎖（ＸＩＸ；図２Ｂ）に沿ったプライマーの伸長により、この複合体からの第１プライマー伸長産物ＸＸの置換が生じる。反復されるプライマー伸長および鎖置換により、標的核酸に実質的に相補的な複数コピーのポリヌクレオチド（ＸＸ；図２Ｃ）が生成される。
【０１２６】
上述のように生成されたプライマー伸長産物は、プロプロモーター配列を含むＴＳＯを提供するこの実施形態における転写のための鋳型として使用される。置換されたプライマー伸長産物（ＸＸ；図２Ｃ）は、遊離のＴＳＯオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、部分的な二本鎖ＸＸＩを形成する（図２Ｃ）。複合体（二本鎖）ＸＸＩは、プライマー伸長産物およびＴＳＯから得られた、それぞれ、１つの末端の二本鎖部分および２つの非相補的一本鎖を含む。この部分的な二本鎖の二本鎖部分は、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼに対して十分な機能性の二本鎖プロモーターを含む。後者は、部分的二本鎖ＸＸＩのプロモーターを認識し、そしてプライマー伸長産物を転写して複数コピーのセンスＲＮＡ産物Ｘを形成する（図２Ｃ）。
【０１２７】
方法１に記載され、そして図２Ｄ〜２Ｅに示されるように、上述の等温増幅は、第２プライマー４、ＲＴ、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、および必要とされるヌクレオチド三リン酸と反応混合物との組み合わせによるさらなる増幅と結びつけられる。第２プライマー４は、方法１におけるような、センスＲＮＡ産物の５’部分にハイブリダイズし、そしてＲＴにより伸長されてＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二本鎖ＸＸＩＩを形成する（図２Ｄ）。ＲＮａｓｅＨは、ＸＸＩＩのＲＮＡ鎖を切断し、一本鎖アンチセンスＤＮＡプライマー伸長産物ＸＸＩＩＩを生成する（図２Ｄ）。プライマー伸長産物の３’末端は、ＴＳＯにおける配列に相補的である。プライマー伸長産物および遊離のＴＳＯのハイブリダイゼーションにより、複合体ＸＸＩＶの形成が生じる（図２Ｄ）。ＤＮＡポリメラーゼは、ＴＳＯの５’末端に沿ってプライマー伸長産物の３’末端を伸長し、部分的な二本鎖ＸＸＶを形成する（図２Ｅ）。この最終物（ｔｈｅ  ｌａｓｔ）は、１つの末端に二本鎖プロモーター配列を含む限り、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの基質である。プライマー伸長産物の転写により、複数コピーのセンス一本鎖ＲＮＡ産物Ｘの生成を生じる（図２Ｅ）。
【０１２８】
ＲＮＡ産物への第２プライマー４のハイブリダイゼーションおよびＲＴによる伸長は、上述のようなこのプロセスを再開し、それによって方法１に記載されるような標的核酸配列の周期的な増幅を可能にする。
【０１２９】
（プロプロモーターＴＳＯベースの増幅方法）
本発明のプロプロモーターＴＳＯベースの方法は、鋳型切り替え機構を用いた特有のプライマー伸長産物の形成に基づく。本発明の核酸増幅方法は、ヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長およびプライマー非依存的な転写の両方を包含する。この方法は、プライマー伸長の間に鋳型切り替えをもたらし得る単一のプライマーおよびプロプロモーターＴＳＯを使用する。このプライマーおよびプロプロモーターＴＳＯの両方は、同一の標的核酸鎖に相補的である。プロプロモーターＴＳＯは、標的ポリヌクレオチドに相補的な３’部分；およびこの標的に（所定のセットの条件下で）ハイブリダイズし得ない５’部分を含む（ここで、ハイブリダイズし得ない５’部分は、本発明の方法に従う増幅工程において用いられるＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼのための一本鎖のプロモーターである配列（一般的に最５’部分）を含む）。いくつかの実施形態において、プロプロモーター配列に直接隣接する（例えば、プロプロモーター配列に対して３’側）プロプロモーターＴＳＯの配列は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を最大化するよう設計される。このような配列は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される。鋳型切り替えをもたらし得るＴＳＯ配列は、当該分野で公知の基準に従い設計され得る（Ｐａｔｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）、９３：２９６９−２９７４；米国特許第５，６７９，５１２号；同第５，６８３，８７９号；および同第６，０３０，７７４号を参照のこと）。
【０１３０】
プロプロモーターＴＳＯベースの増幅方法は、一般的に、いくつかの酵素：ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、およびＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）、を使用する。この酵素活性は、個々の酵素においてか、または種々の組み合わせにおいて（すなわち、複数の活性を有する１つ以上の酵素において）提供され得る。本発明の方法に従う増幅のために用いられる酵素は、当業者に公知のように、市販されている。
【０１３１】
プライマーおよびプロプロモーターＴＳＯは、一般的に、ＰＣＲ方法において一般的に用いられる濃度と同様の高濃度で提供される。標的ポリヌクレオチドの増幅のレベルは、一般的に、これらのオリゴヌクレオチドの濃度により制限される。プライマーは、伸長産物への組み込みにより消費されるのに対して、プロプロモーターＴＳＯは、伸長産物に組み込まれない。図３Ａ〜Ｂおよび５Ａ〜Ｂに示されるように、プロプロモーターＴＳＯは、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの基質である特有の複合体の形成のための最初の鋳型切り替え（転写プロセス）に参加する。特定の実施形態において、プロプロモーターＴＳＯはまた、図３Ｂに示されるように、転写のための第２基質の形成のための（第１転写モジュール由来のＲＮＡ転写物から逆転写された）一本鎖ＤＮＡ産物への結合に参加する。プロプロモーター配列および上記の一本鎖ＤＮＡ産物にハイブリダイズし得る領域を含む任意のポリヌクレオチドが用いられ得ることが理解される。例えば、ＰＴＯが用いられ得る。
【０１３２】
他の転写ベースの等温増幅スキーム（例えば、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなど）と異なり、本発明のプロプロモーターＴＳＯベースの方法は、これらの以前に記載された転写ベースの核酸増幅方法において必須の中間体である完全な二本鎖ＤＮＡ産物の形成を必要としない。二本鎖中間体ＤＮＡ産物が必要とされないので、（標的ポリヌクレオチド鎖およびその相補鎖に沿ったプライマー伸長のための）正方向および逆方向プライマーの対は使用されない。このことは、プライマーダイマーの形成（２つ以上のプライマーがハイブリダイズし、そして伸長されて標的非依存的な様式で二本鎖プロモーターを含む転写のための二本鎖基質を形成する）を除去することにより、プライマー伸長反応の複雑さを減少させる。本発明において記載されるような単一プライマーを使用する能力は、このプロセスの複雑性を減少させる。このプロセスは、例えば、第１プライマー伸長工程および第２プライマー伸長産物へのハイブリダイゼーションの両方において同一のプロプロモーターＴＳＯを使用することにより伸長される必要のないプロモーター鋳型を使用する能力により、さらに簡素化される。
【０１３３】
（本発明のプロプロモーターＴＳＯベースの方法の例示的な実施形態）
標的核酸の増幅は、一般的に、一本鎖標的に基づき、そして代表的に、（まだ一本鎖でない場合）標的を一本鎖にする工程が先に置かれる。従って、標的核酸が二本鎖ＤＮＡである場合、増幅の第１工程は、一本鎖標的を生成するための変性である。標的核酸がＲＮＡである場合、増幅は、以下に示すように、一本鎖標的ＲＮＡから直接実施し得る。あるいは、増幅は、当該分野で公知の方法によるＲＮＡ標的からのｃＤＮＡの合成の次に行なわれ得る。
【０１３４】
図３Ａ〜Ｂに示されるように、本発明の方法の１つの実施形態において、ＴＳＯおよび単一のプライマーは、標的核酸鎖にハイブリダイズし、三分子複合体Ｉを形成する。この複合体の標的鎖は、図３Ａ〜Ｂに示されるようにＤＮＡであり得、または図４Ａ〜Ｂに示されるようにＲＮＡであり得る。
【０１３５】
ＤＮＡポリメラーゼは、複合体Ｉの標的鎖に沿ってプライマー伸長を実行する。標的がＤＮＡの場合、酵素は、一般的に，ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼであり、そして標的がＲＮＡの場合、酵素は、一般的にＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）である。
【０１３６】
図３Ａ〜Ｂおよび４Ａ〜Ｂに示されるように、プライマー伸長は、ＴＳＯが法的に結合することによって標的特異的配列の複製を効果的に終了させた時に、標的からプロプロモーターＴＳＯの５’非ハイブリダイズ部分に切り換えられる。ＴＳＯの５’非ハイブリダイズ部分に沿った伸長により標的に関連する部分およびＴＳＯに関連する部分から構成される特有の伸長産物の形成を生じる。標的、ＴＳＯ、および第１プライマー伸長産物のこの特有の三分子複合体ＩＩ（図３Ａおよび４Ａ）は、二本鎖プロモーター領域を含み、従って、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの基質となる。
【０１３７】
図４Ａ〜Ｂに示されるように、標的がＲＮＡである場合、複合体ＩＩのＲＮＡ鎖は、ＲＮａｓｅＨにより分解され、複合体ＩＩａを形成する（しかし、必ずしもそうではない）。この複合体ＩＩａは、プロプロモーターＴＳＯおよび第１プリアマー伸長産物を含む。この複合体はさらに、二本鎖プロモーターを含み、そしてＲＮＡポリメラーゼの基質である。
【０１３８】
ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼは、複合体ＩＩ（図３）およびＩＩａ（図４）の二本鎖プロモーターに結合し、そして特有のプライマー伸長産物の転写が開始される。このプロセスにより、標的ポリヌクレオチドと同じセンスである複数コピーの一本鎖ＲＮＡ産物が生成される。
【０１３９】
第２プライマーは、センスＲＮＡ産物にハイブリダイズし、複合体ＩＩＩを形成する（図３Ａおよび４Ｂ）。この第２プライマーは、一般的におよび好ましくは、第１プライマーと同一である。第１および第２プライマーが異なる実施形態において、第２プライマーは、一般的に、第１プライマーと同一の極性のプライマーである。ＲＮＡ産物に沿ったプライマー伸長は、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）により実行され、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖ＩＶを生成する（図３Ａおよび４Ｂ）。
【０１４０】
複合体ＩＶのＲＮＡ鎖のＲＮａｓｅＨ消化により、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の一本鎖ＤＮＡ産物（第２プライマー伸長産物）の形成が生じる。遊離のプロプロモーターポリヌクレオチド（プロプロモーターＴＳＯとして図３Ｂに示される）は、一本鎖ＤＮＡ産物の３’部分にハイブリダイズし、複合体Ｖを形成する（図３Ｂ）。プロプロモーターポリヌクレオチドが、第１工程で用いられるＴＳＯである場合、ＴＳＯの配列に相補的な第２プライマー伸長産物（ＤＮＡ）の配列は、鋳型切り換えプロセスにより、第２プライマー伸長産物に組込まれる。
【０１４１】
このＤＮＡ産物へのプロプロモーターポリヌクレオチド（ＴＳＯとして図３Ｂに示される）の結合により、ＴＳＯの５’オーバーハングが生じ、複合体Ｖの一本鎖ＤＮＡ産物の３’末端が、プロプロモーターポリヌクレオチド（ＴＳＯ）に沿って伸長され、プロモーター配列を複製する。これにより、機能性二本鎖プロモーター配列を含む複合体ＶＩの形成が生じる（図３Ｂ）。複合体ＶＩは、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの基質である。このポリメラーゼは、二本鎖プロモーターに結合し、そして第２プライマー伸長産物を転写して複数コピーのセンスＲＮＡ産物を生成する。このＲＮＡ産物は、上述のようなさらなるプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長の基質である。従って、周期的な増幅が進行し、複数コピーのセンスＲＮＡ産物を形成する。
【０１４２】
故意に終了させない限り、増幅は、全ての遊離ＴＳＯが第２プライマー伸長産物にハイブリダイズするか、またはプライマーが完全に消費されるまで進行すると考えられ得る。
【０１４３】
図３Ａ〜Ｂに示されるように、一旦、第１プライマー伸長産物の転写に続いて形成される場合、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的のいずれかの増幅のＲＮＡ産物は同一であり、そしてその工程の増幅スキームは同一である。
【０１４４】
各転写工程（すなわち、第１または第２プライマー伸長産物の転写）により、出発鋳型から好ましくは少なくとも約１、より好ましくは少なくとも約１００、より好ましくは少なくとも約５００、そして最も好ましくは少なくとも約１０００コピーの一本鎖ＲＮＡ産物が生成されると考えられる（第１転写モジュールにおいて、鋳型は標的ポリヌクレオチドであり；第２転写モジュールにおいて、鋳型は第１転写モジュールにおいて生成されたＲＮＡ転写物である）。
【０１４５】
本発明の増幅方法の増幅産物は一本鎖であり、従って、当該分野で公知の任意の種々の方法により容易に検出可能である。一本鎖核酸の検出のための同質な方法および異質な方法の両方は公知であり、そして本発明の増幅方法の反応生成物の検出および定量のために適切である。
【０１４６】
（本発明の方法において使用される成分および反応条件）
（テンプレート核酸）
増幅される核酸標的としては、精製形態または非精製形態の、任意の供給源由来の核酸が挙げられ、これは、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはこれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、生物学的材料（例えば、微生物（例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌）、植物、動物、ヒト）のゲノムならびにこれらのフラグメントを含むＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡであり得る。核酸の獲得および精製は、当該分野で標準的な技術を使用する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的の増幅は、当該分野で公知のように、最初のｃＤＮＡ合成を必要とする。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの増幅は、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡを得るためのハイブリッドの変性、または変性、続いてｃＤＮＡを得るための逆転写を必要とする。標的核酸は、複合体混合物（例えば、生物学的サンプル）の微小な画分のみであり得、そして当該分野で周知の手順によって種々の生物学的材料から得られ得る。
【０１４７】
標的ポリヌクレオチドの増幅の最初の工程は、ポリヌクレオチドを一本鎖にすることである。標的ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、最初の工程は、標的変性であり得る。変性工程は、熱変性または当該分野において公知の方法（例えば、アルカリ処理）であり得る。
【０１４８】
（複合プライマー）
１つの局面において、本発明の方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡの部分からなる複合プライマーを用いる。このプライマーの複合設計は、新たな（さらなる）複合プライマーの結合によるプライマー伸長産物の続く置換およびポリメラーゼによる新たなプライマーの伸長が達成され得るように、設計される。さらに、プライマー伸長産物のＲＮＡ部分の切断により、以下に記載されるように、複合プライマーによる増幅のための基質ではない増幅産物の生成が生じる。
【０１４９】
本発明の方法および組成物において使用するための複合プライマーは、少なくとも１つのＲＮＡ部分を含み、このＲＮＡ部分は、（ａ）標的核酸（テンプレート）の配列へのＤＮＡ部分のハイブリダイゼーションとは関係なく、この標的核酸の配列に結合（ハイブリダイズ）し得；そして（ｂ）標的ＤＮＡにハイブリダイズした場合、リボヌクレアーゼで切断され得る。この複合プレイマーは、標的核酸に結合して、部分ヘテロ二重鎖を形成し、この部分ヘテロ二重鎖において、プライマーのＲＮＡ部分のみが、ＲＮａｓｅＨのようなリボヌクレアーゼと接触すると切断され、一方、標的鎖は、インタクトなままであり、従って別の複合プライマーのアニーリングを可能にする。
【０１５０】
複合プライマーはまた、標的核酸（テンプレート）の配列にハイブリダイズし得る３’ＤＮＡ部分を含み、その結果、この標的配列（テンプレート）に対するハイブリダイゼーションは、ＤＮＡポリメラーゼにより標的核酸と置換される核酸鎖のハイブリダイゼーションより有利である。このようなプライマーは、核酸の結合親和性に影響を与える周知の因子（例えば、配列長および／または同一性、ならびにハイブリダイゼーション条件）に基づいて合理的に設計され得る。好ましい実施形態において、標的核酸における、複合プライマーの３’ＤＮＡ部分のその相補配列に対するハイブリダイゼーションは、その置換された鎖の５’末端の相同配列の、その標的核酸に対するハイブリダイゼーションより有利である。
【０１５１】
重合による伸長のために適切なプライマーの生成は、当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４２６１８（およびその中で引用される参考文献）に記載される。複合プライマーは、ＲＮＡおよびＤＮＡの組み合わせを含み（上記の定義を参照のこと）、その３’末端ヌクレオチドは、核酸伸長のために適切なヌクレオチドである。この３’末端ヌクレオチドは、プライマー中に存在する場合にＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る、任意のヌクレオチドまたはアナログであり得る。一般的に、この３’末端ヌクレオチドは、３’−ＯＨを有する。適切なプライマーとしては、少なくとも１つのＲＮＡの部分および少なくとも１つのＤＮＡの部分を含むプライマーが挙げられる。例えば、複合プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分（ここで、このＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接している）；または介在ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含み得る。従って、一実施形態において、複合プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、好ましくはここで、このＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接している。別の実施形態において、複合プライマーは、少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する（すなわち、ＲＮＡ部分が、２つのＤＮＡ部分の間にある）５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む。さらに別の実施形態において、本発明の複合プライマーは、３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分（すなわち、ＤＮＡ部分の間のＲＮＡ部分）を含む。
【０１５２】
３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中のＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約４〜約１５ヌクレオチド、最も好ましくは、約５〜約１０ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、ＲＮＡ部分は、約１０、１５、２０、２５、３０、５０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、４、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５３】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の５’−ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約３〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８〜約１７ヌクレオチド、最も好ましくは、約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの他の実施形態において、この５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０、５０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５４】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非５’−ＲＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非５’−ＲＮＡ部分は、好ましくは、約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約６ヌクレオチド、最も好ましくは、約３〜約５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非５’−ＲＮＡ部分（単数または複数）を含む複合プライマーの特定の実施形態において、非５’−ＲＮＡ部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５５】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー（ここで、この５’−ＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接している）の実施形態において、この５’−ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約３〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８〜約１７ヌクレオチド、最も好ましくは、約１０〜約１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー（ここで、この５’−ＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部分に隣接している）の特定の実施形態において、この５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０、５０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５６】
少なくとも１つの５’−ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの介在ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約６ヌクレオチド、最も好ましくは、約３〜５ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの５’−ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの介在ＲＮＡ部分のいくつかの実施形態において、介在ＲＮＡ部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の介在ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約６ヌクレオチド、最も好ましくは、約３〜約５ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、介在ＲＮＡ部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含み、さらに５’−ＲＮＡ部分を含む複合プライマーにおいて、この５’−ＲＮＡ部分は、好ましくは、約３〜約２５ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは、約８〜約１７ヌクレオチド、最も好ましくは、約１０〜１５ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含み、さらに５’−ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５７】
３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマー中のこの３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５８】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中のこの３’−ＤＮＡの長さは、好ましくは、約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５９】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、好ましくは、約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約８ヌクレオチド、最も好ましくは、約３〜約６ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、さらに非３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１６０】
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー（ここで、この５’−ＲＮＡ部分は３’−ＤＮＡ部分に隣接している）の実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含むプライマー（ここで、この５’−ＲＮＡ部分は３’−ＤＮＡ部分に隣接している）の特定の実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１６１】
少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中の非３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約８ヌクレオチド、最も好ましくは、約３〜約６ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含むプライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれか上限を有する、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１６２】
少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマー中のこの３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する５’−および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１６３】
３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の非３’−ＤＮＡ部分（すなわち、この３’−ＤＮＡ部分以外の任意のＤＮＡ部分）の長さは、好ましくは、約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは、約２〜約８ヌクレオチド、最も好ましくは、約３〜約６ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、非３’−ＤＮＡ部分は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つのＲＮＡ部分を含む複合プライマー中のこの３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは、約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、最も好ましくは、約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態において、この３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。種々の部分の長さは、本発明の方法の反応条件下で、必要に応じて、より長くても短くてもよいことが理解される。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、複合プライマーの５’−ＤＮＡ部分は、プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、複合プライマーの５’−ＲＮＡ部分は、プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、複合プライマーの３’−ＤＮＡ部分は、プライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、３’−ＤＮＡ部分は、５’−ＲＮＡ部分に隣接し、そしてプライマーの最も３’側のヌクレオチドを含む（そして５’−ＲＮＡ部分は、プライマーの最も５’側のヌクレオチドを含む）。
【０１６５】
複合プライマーの全長は、好ましくは、約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド、最も好ましくは、約２０〜約２５ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、この長さは、約２５、３０、５０、６０ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１０、１５、２０、２５ヌクレオチドのいずれかであり得る。この長さは、本発明の方法の反応条件下で適切な場合、これらを超えるか、またはこれら未満であり得ることが理解される。
【０１６６】
標的核酸へのハイブリダイゼーション（ハイブリダイゼーションは、当該分野で周知であり、そして理解されており、例えば、イオン強度および温度のような他の因子に依存する）を達成するために、この標的核酸にハイブリダイズし得るプライマーの部分は、標的核酸に対して、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７５％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％相補性である。
【０１６７】
本明細書中に記載されているように、１以上の複合プライマーは、増幅反応において使用され得る。
【０１６８】
増幅方法に依存して、この第１のプライマーは複合プライマーであってもなくてもよい。複合プライマーベースの方法は、一般に、複合プライマーである第１のプライマーの使用を必要とする。プロモーターＴＳＯベースの方法は、複合プライマーである第１のプライマーを使用してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターＴＳＯベースの方法の第１のプライマーは、ＤＮＡを含む。
【０１６９】
（第２プライマー）
本発明の方法における第２プライマーは、転写物上の部位において第１の転写モジュールにおいて生成されるセンスＲＮＡ転写物に（所定の条件下で）ハイブリダイズ可能な配列（これは、プライマー全体であってもなくてもよい）を含み、その結果、この第２プライマーは、本発明の配列を含む。いくつかの実施形態において、第２プライマーのハイブリダイズ可能な配列は、センスＲＮＡ転写物上の所望の結合食いの既知の配列に基づいて設計される。他の実施形態において、このハイブリダイズ可能な配列は、ランダム配列に基づく。いくつかの実施形態において、この第２プライマーは、ランダムプライマーである。
【０１７０】
プロプロモーターＴＳＯベースの方法の実施形態において、第１および第２のプライマーは同じである。プロプロモーターＴＳＯベースの方法の他の実施形態において、第１および第２のプライマーは異なる。プロプロモーターＴＳＯベースのさらに他の実施形態において、第１および第２のプロモーターは、異なる相補配列にハイブリダイズする。
【０１７１】
センスＲＮＡ転写物に対するハイブリダイズ（これは、当該分野で周知でありそして当該分野で理解されるように、例えば、イオン強度および温度のような他の因子に依存する）を達成するために、このセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能な第２プライマーの配列は、このセンスＲＮＡ転写物に対して少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％相補的である。
【０１７２】
一実施形態において、第２プライマーはＤＮＡを含む。別の実施形態において、この第２プライマーは、ＤＮＡからなる。別の実施形態において、この第２プライマーは、ＲＮＡを含む。さらに別の実施形態において、この第２プライマーは、ＲＮＡからなる。さらに別の実施形態において、この第２プライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、第２プライマーは、センスＲＮＡ転写物の３’における自己プライミングによって（例えば、ヘアピンループによって）提供される。これらの実施形態において、センスＲＮＡ転写物の３’末端における配列は、この転写物自体の別の配列にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドの自己プライミングは、例えば、米国特許第６，１３２，９９７号に記載されている。これらの実施形態において、このセンスＲＮＡ転写物の３’末端におけるこの配列は、一般に、この転写物へのこの配列のハイブリダイゼーションおよび／またはこの転写物に沿った伸長の後に切断される。
【０１７４】
本明細書中で記載されるように、１つ以上の第２プライマーは、増幅反応に使用され得る。
【０１７５】
（テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ））
本発明の１つの局面は、標的ポリヌクレオチドに沿ってプライマーの伸長の間にテンプレートスイッチングを行うためにテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を使用する。本発明の複合プライマーベースの方法のいくつかの実施形態において、ＴＳＯは、終止配列として機能する。特定の実施形態において、このＴＳＯは、プロプロモーターポリヌクレオチドとして機能する。
【０１７６】
ＴＳＯは、標的にハイブリダイズし得る３’部分、および重合の間の鎖スイッチについて設計される５’部分を含む。鎖スイッチを行うＴＳＯの設計は、Ｐａｔｅｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２９６９−２９７４（１９９６））により以前に記載されたように、当該分野で公知である。
【０１７７】
この３’部分は、テンプレートが標的ポリヌクレオチドからＴＳＯのハイブリダイズしていない部分スイッチする前のプライマー伸長産物の３’末端に対して相補的である標的ポリヌクレオチドの位置または領域（「終止部位」）に対して３’位のテンプレートにハイブリダイズする。
【０１７８】
一実施形態において、鎖スイッチは、ＴＳＯのハイブリダイズされた部分とハイブリダイズされていない部分との間の接合部に対して直ぐ５’側および３’側のＴＳＯセグメントにおける交互に相補的な短い配列の存在によって促進される。理論に束縛されることを意図しないが、１つの説明は、プライマー伸長産物がＴＳＯにハイブリダイズされる標的核酸の部分まで伸長する（ＴＳＯのハイブリダイズされた部分の置換を介して）事象において、プライマー伸長産物の３’末端は、ＴＳＯのハイブリダイズされた部分とハイブリダイズされていない部分との間の接合部に対してすぐ隣接しているＴＳＯのセグメント中のその相補的な短い配列に結合し得る短い配列を含む、ということである。これは、プライマー伸長産物がテンプレートとしてのＴＳＯテール部分にスイッチする可能性を上げることによってテンプレートスイッチングの効率を増加させる。短い相補配列のはが鎖は、好ましくは、約３〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約１５ヌクレオチド、最も好ましくは、約７〜約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、長さは、約１０、１５、２０、２５ヌクレオチドのいずれかの上限を有する、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかである。この長さは、本発明の方法の反応条件下で適切な場合、これらを超えるか、またはこれら未満であり得ることが理解される。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ＴＳＯの５’部分（本明細書中で「プロプロモーターＴＳＯ」と称される）は、ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖プロモーターの形成のために設計されるプロモーター配列を含む。ＴＳＯのこの実施形態は、終止配列として機能し、かつプロモーターテンプレートを提供するために機能し得る。この実施形態において、ＴＳＯのプロプロモーター配列は、プライマー伸長産物へのプロモーター配列（一般的に、テンプレートＴＳＯのプロプロモーター配列に対して相補的である）の組込みのためのテンプレートとして働く。プライマー伸長産物のプロプロモーター配列にハイブリダイズ可能なプロプロモーター配列を含むＴＳＯの続くハイブリダイゼーションにより、適切なＲＮＡポリメラーゼにより転写を行い得る二本鎖プロモーターが形成する。テンプレートＤＮＡの転写を可能にするテンプレート配列は、それらを得そして／または作製する方法と同様に、当該分野で公知である。好ましくは、このプロモーター配列は、使用される特定のＲＮＡポリメラーゼの適切な転写活性を提供するように選択される。このような選択の基準、すなわち、特定のＲＮＡポリメラーゼにより特に有利な特定のプロモーター配列は、当該分野で公知である。例えば、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６による転写のためのプロモーターの配列は、当該分野で公知である。このプロモーター配列は、原核生物供給源または真核生物供給源由来であり得る。
【０１８０】
１つの実施形態において、プロモーター配列は、使用されるＲＮＡポリメラーゼによる増大された、すなわちより最適な転写を提供するように設計される配列に隣接している。いくつかの実施形態において、この配列は、標的核酸に関係していない（すなわち、これは、実質的にハイブリダイズしない）。より最適な転写は、この配列に作動可能に連結されたプロモーター由来のポリメラーゼの転写活性が連結されていないプロモーター由来のポリメラーゼよりも大きい場合に生じる。最適な転写のための配列の要件は、一般に、種々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについて以前に記載されるように（例えば、米国特許第５，７６６，８４９号および同第５，６５４，１４２号）、当該分野で公知である。
【０１８１】
好ましい実施形態において、テンプレートＤＮＡにハイブリダイズするＴＳＯの３’部分（標的にハイブリダイズする３’部分全体を含む）は、このテンプレートＤＮＡに結合され、その結果、プライマー伸長を行うポリメラーゼによるＴＳＯの置換は、実質的にかまたは少なくとも十分に阻害される。このような結合を達成するために適切な方法としては、当該分野で公知の技術、例えば、Ｇクランプ複素環式改変を含むシトシンアナログの使用（Ｒｌａｎａｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９，９６（７）：３５１３−８に記載される）；および固定された核酸の使用（例えば、Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９８，８（１６）：２２１９−２２；およびＷａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００，９７（１０）：５６３３−８に記載される）が挙げられる。他の適切な方法としては、適切な場合、高いＧＣ含量および／または架橋を有する配列の使用が上げられる。増大された結合を得るためのこれらの方法のいずれかは、単独でかまたは組み合わせて使用され得る。ＴＳＯの置換は、プライマー伸長の事象の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％、ポリメラーゼが、テンプレートを標的核酸鎖からＴＳＯのハイブリダイズされていない部分へとスイッチする場合に、実質的にかまたは十分に阻害される。実質的にかまたは十分に阻害されたＴＳＯ置換はまた、この増幅方法が所望の産物の量の点で良好な結果を生じる場合に、経験的に決定され得る。一般的に、所定の条件下で、「改変された」ＴＳＯは、そのように改変されていない祖と比較して、ＴＳＯにより密に結合する。
【０１８２】
標的核酸鎖にハイブリダイズするＴＳＯ部分の長さは、好ましくは、約１５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは、約２０〜４５ヌクレオチド、最も好ましくは、約２５〜４０ヌクレオチドである。他の実施形態において、この長さは、以下：少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０のいずれか；かつ以下：約２５、４０、４５、５０、５５のいずれか未満である。この長さは、本発明の方法の反応条件下で適切な場合、これらを超えるか、またはこれら未満であり得ることが理解される。標的核酸鎖にハイブリダイズするＴＳＯの相補性は、この標的核酸上の意図される結合配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらにより好ましくは、約７５％、最も好ましくは、約９０％である。
【０１８３】
（終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）
本発明の方法のいくつかの実施形態において、終止配列を含むポリヌクレオチドが含まれ、この例のいくつかは以下に提供される。
【０１８４】
（ｉ）ＴＳＯ
上記のように、ＴＳＯは、標的ポリヌクレオチドに沿ったプライマー伸長を実施するための終止配列を含むポリヌクレオチドとして機能し得る。
【０１８５】
（ｉｉ）ブロッカー配列
いくつかの実施形態において、プライマー伸長終止配列は、ブロッカー配列によって提供される。このブロッカー配列はポリヌクレオチドであり、通常、合成ポリヌクレオチドであり、これは、一本鎖であり、そしてプライマー伸長産物の３’末端（「終止部位」）に対して相補的な標的配列中の標的核酸配列の５’位のセグメントに対してハイブリダイズ可能であり、好ましくはこれに対して相補的である配列を含む。ブロッカーは、ある親和性で、好ましくは高い親和性で標的核酸に結合するヌクレオチドを含み、その結果、ブロッカー配列は、プライマー伸長事象の好ましくは約３０％より多く、より好ましくは約５０％より多く、さらにより好ましくは約７５％より多く、最も好ましくは約９０％より多くにおいて、プライマー伸長の間のＤＮＡポリメラーゼによる置換に抵抗する。ブロッカーポリヌクレオチドの長さおよび組成は、過剰なランダムな非特異的ハイブリダイゼーションが本発明の方法の条件下で回避されるようなものでなければならない。ブロッカーポリヌクレオチドの長さは、好ましくは、約３〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは、約５〜約２５ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約８〜２０ヌクレオチド、最も好ましくは、約１０〜約１５ヌクレオチドである。他の実施形態において、ブロッカーポリヌクレオチドは、以下：少なくとも約３、５、８、１０、１５のいずれか、かつ以下：約２０、２５、３０、３５のいずれか未満である。この長さは、本発明の方法の反応条件下で適切な場合、これらを超えるか、またはこれら未満であり得ることが理解される。ブロッカーポリヌクレオチドの相補性は、標的核酸上の意図される結合配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７５％、最も好ましくは、少なくとも約９０％である。
【０１８６】
一実施形態において、ブロッカー配列は、標的ＤＮＡに結合されるセグメントを含み、その結果、ポリメラーゼによるブロッカー配列の置換（これは、プライマー伸長に影響を与える）が、実質的に、または少なくとも十分に阻害される。このような結合、および実質的な、または十分な置換の阻害を達成するため適切な手段は、本発明の方法において使用されるＴＳＯについて上で記載される通りである。
【０１８７】
一実施形態において、このブロッカーポリヌクレオチドは、核酸伸長のためのプライマーとして効果的に機能し得ない（すなわち、ブロッカー配列からの伸長は、減少されるか、または阻害される）。ブロッカーポリヌクレオチドのプライマー機能をブロックするための技術としては、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加を妨げる任意の技術を含む。このような技術は、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの付加を固定し得ないブロッカーポリヌクレオチドの最も３’位置における、３’ヒドロキシル基の置換もしくは改変、または改変ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）の組み込みが挙げられる。
【０１８８】
（プライマー伸長産物にハイブリダイズするプロプロモーターおよび領域を含む、ポリヌクレオチド）
いくつかの実施形態は、プライマー伸長産物にハイブリダイズするプロプロモーターおよび領域を含む、プロプロモーターポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態において、このプロプロモーターポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、ＰＴＯとして提供される。他の実施形態において、このプロプロモーターポリヌクレオチドは、ＴＳＯ（本明細書中に記載される）として提供される。なお他の実施形態において、プロプロモーターポリヌクレオチドは、末端配列（この末端配列は、実質的にテンプレートスイッチに影響を与えない）を含む部分（一般的に、３’部分）、およびプロモーター配列を含む部分（一般的に、５’部分）を含み、ここで、プロプロモーター配列を含む部分は、一般に、標的ポリヌクレオチドに（末端配列を含む部分が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る条件下で）ハイブリダイズし得ない。末端配列（この末端配列は、実質的にテンプレートスイッチに影響を与えない）を含む部分、およびプロプロモーター配列を含む部分を含むプロプロモーターポリヌクレオチドが提供される、いくつかの実施形態において、このプロプロモーターポリヌクレオチドは、同じ増幅反応において、プライマー伸長の終結に影響を与えること、およびプロプロモーター配列を提供することの両方の機能をし得る。
【０１８９】
（プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド）
いくつかの実施形態において、この方法は、プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）によって提供される転写のためのプロモーター配列を使用する。
【０１９０】
本発明の方法および組成物において使用するためのＰＴＯは、ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖プロモーターの形成のために設計されるプロプロモーター配列、およびプライマー伸長産物の３’末端にハイブリダイズし得る部分を含む、一本鎖ポリヌクレオチド、一般にＤＮＡである。好ましい実施形態において、このプロプロモーター配列は、オリゴヌクレオチドの５’部分に位置し、そしてこのハイブリダイズする配列は、オリゴヌクレオチドの３’部分に位置する。一実施形態において、そして最も代表的に、このプロモーター配列およびハイブリダイズする配列は、異なる配列である。別の実施形態において、このプロモーター配列およびハイブリダイズする配列は、配列同一性において重複する。なお別の実施形態において、このプロモーター配列およびハイブリダイズする配列は、同一の配列であり、従って、ＰＴＯの同一の位置に存在する。このＰＴＯのプライマー伸長産物へのハイブリダイゼーションは、オーバーハング（プライマー伸長産物にハイブリダイズしないＰＴＯの５’末端であって、代表的にこのプロプロモーター配列の全部または一部を含む）を含む二本鎖を生じる実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、適切なＲＮＡポリメラーゼによる転写を実施し得る二本鎖プロモーターを作製するためにオーバーハング中に充填する。
【０１９１】
テンプレートポリヌクレオチドの転写を可能にするプロモーター配列は、当該分野で公知であり、そして上で議論されている。好ましくは、このプロモーター配列は、使用される特定のＲＮＡポリメラーゼの最適な転写活性を提供するように選択される。このような選択のための基準（すなわち、特定のＲＮＡポリメラーゼによって特に好まれる特定のプロモーター配列）がまた、当該分野で公知である。例えば、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６による転写のためのプロモーターの配列は、当該分野で公知である。このプロモーター配列は、原核生物または真核生物供給源由来であり得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、ＰＴＯは、プロプロモーター配列とプライマー伸長産物の３’末端にハイブリダイズし得る部分との間に、介在配列を含む。介在配列の適切な長さは、経験的に決定され得、そして少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１５ヌクレオチドであり得る。介在配列の適切な配列同一性もまた、経験的に決定され得、そしてその配列は、必要ではないが、好ましくは、その配列の欠落と比較して、増幅の程度を増強するように設計される。一実施形態において、介在配列は、使用されるＲＮＡポリメラーゼによる増強された転写またはより最適な転写を提供するよう設計された配列である。一般に、その配列は、標的核酸に関連しない（すなわち、その配列は、標的核酸に実質的にハイブリダイズしない）。より最適な転写は、その配列に作動可能に連結されているプロモーターからのポリメラーゼの転写活性が、作動可能に連結されていないプロモーターからのポリメラーゼの転写活性よりも高い場合に生じる。最適な転写のための配列の要件は、一般に、種々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについて以前に記載されるように（例えば、米国特許第５７６６８４９号および同第５６５４１４２号において）当該分野で公知であり、そしてまた、経験的に決定され得る。
【０１９３】
別の実施形態において、ＰＴＯは、プロプロモーター配列の５’側にある配列を含む。すなわち、ＰＴＯは、プロプロモーター配列の５’側に位置する、さらなるヌクレオチド（これは、転写調節配列であってもなくてもよい）を含む。必要ではないが、一般に、この配列は、プライマー伸長産物に（所定の条件設定下で）ハイブリダイズし得ない。
【０１９４】
一実施形態において、ＰＴＯは、核酸伸長のためのプライマーとして効率的に機能し得ない。ＰＴＯのプライマー機能をブロックするための技術としては、ＤＮＡポリメラーゼによるＰＴＯの３’末端へのヌクレオチドの付加を妨げる任意の技術が挙げられる。このような技術は、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチドの付加を固定し得ない、ＰＴＯの最も３’側の位置における、３’ヒドロキシル基の置換または改変、あるいは改変されたヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）の組み込みが挙げられる。標識、または特定の結合対のメンバーである低分子（例えば、ビオチン）を使用して、３’末端をブロックすることが可能である。非相補性に起因してかまたは水素結合を支持しない構造的改変のいずれかに起因して、プライマー伸長産物にハイブリダイズし得ないヌクレオチドの付加によって、３’末端を伸長不可能にすることも可能である。他の実施形態において、ＰＴＯは、ブロックされない。
【０１９５】
目的のプライマー伸長産物にハイブリダイズするＰＴＯの部分の長さは、好ましくは、約５〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１０〜約４０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、約１５〜約３５ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約２０〜約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズする部分は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０のいずれかであり、そして約３０、４０、５０、６０のいずれか未満である。ハイブリダイズする部分の相補性は、目的のプライマー伸長産物のその意図される結合配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７５％、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％である。
【０１９６】
（末端配列およびプロプロモーター配列を含む組み合わせポリヌクレオチド）
本発明の方法のいくつかの実施形態において、末端配列およびプロプロモーター配列は、単一の組み合わせポリヌクレオチドに提供される。この組み合わせポリヌクレオチドは、末端配列が標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得ない条件下でテンプレートスイッチに影響を与えない末端配列を含む部分（一般的に、３’部分）、およびプロプロモーター配列を含む部分（一般に、５’部分）を含み、ここで、プロプロモーター配列を含む部分は、一般に、標的ポリヌクレオチドに（末端配列を含む部分が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る条件下で）ハイブリダイズし得ない。末端配列は、当該分野で公知の技術を使用して（例えば、テンプレートスイッチを促進するのに公知である設計特性（Ｐａｔｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６，９３：２９６９−２９７４に記載される）が組み合わせポリヌクレオチド中に存在しないことを確実にすることによって）テンプレートスイッチに影響を与えないように、設計され得る。この組み合わせポリヌクレオチドは、このプライマーにハイブリダイズし得るテンプレート配列に対して５’方向に存在するテンプレートの配列にハイブリダイズし得る。このポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの相補的配列にハイブリダイズし得る配列をさらに含む。この標的ポリヌクレオチドの相補配列にハイブリダイズし得る配列は、組み合わせポリヌクレオチドの末端配列および／またはプロプロモーター配列と、重複しなくても、重複しても、または同一の広がりを有していてもよい。一般におよび好ましくは、この標的ポリヌクレオチドの相補配列にハイブリダイズし得る配列は、この標的ポリヌクレオチドの相補配列の３’部分にハイブリダイズし得る。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態において、末端配列を含む部分およびプロプロモーター配列を含む部分を含む組み合わせポリヌクレオチドは、同じ増幅反応において、プライマー伸長の終結に影響を与えること、およびプロプロモーター配列を提供することの両方の機能をする。
【０１９７】
（ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼ）
本発明の増幅方法は、以下の酵素のいくつかまたは全部を使用する：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。これらの活性の１以上は、１つの酵素に見出されそして使用され得る。例えば、ＲＮａｓｅＨ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって供給され得るか、または別の酵素において提供され得る。本方法に有用な逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を有しても有さなくともよい。
【０１９８】
本発明の１つの局面は、プライマー−ＲＮＡ複合体からの一本鎖ｃＤＮＡの形成である。このプロセスは、一般に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性、およびリボヌクレアーゼ活性を使用する。
【０１９９】
本発明の方法および組成物における使用のためのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従ってプライマーの伸長をもたらし得る。従って、好ましいＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも主にリボヌクレオチドから構成される核酸テンプレートに沿って核酸プライマーを伸長し得るポリメラーゼである。本発明の方法および組成物における使用のために適切なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写酵素が挙げられる。多くの逆転写酵素（例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）由来の逆転写酵素）は、１より多い活性（例えば、ポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼ活性）を含み、そしてｃＤＮＡ分子の形成において機能し得る。しかし、いくつかの例において、ＲＮａｓｅＨ活性を欠く逆転写酵素を使用することが好ましい。ＲＮａｓｅＨ活性を欠く逆転写酵素は、当該分野で公知であり、これらには、野生型逆転写酵素の変異（この変異が、ＲＮａｓｅＨ活性を排除する）を含む逆転写酵素が挙げられる。これらの場合において、他の供給源由来のＲＮａｓｅＨ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉから単離されたＲＮａｓｅＨ）の添加が、ｃＤＮＡの形成に使用され得る。
【０２００】
本発明の方法および組成物における使用のためのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従ってプライマーの伸長をもたらし得る。従って、好ましいポリメラーゼは、少なくとも主にデオキシヌクレオチドから構成される核酸テンプレートに沿って核酸プライマーを伸長し得るポリメラーゼである。本発明の特定の方法に従うポリヌクレオチドの増幅は、そのポリヌクレオチドから核酸鎖を置換し得るＤＮＡポリメラーゼの使用を包含し、そのポリヌクレオチドに、置換された鎖が結合される。そして一般に、そのポリメラーゼが示す鎖置換能が大きいほど（すなわち、それほど高い鎖置換能を有さない他のポリメラーゼと比較して）好ましい。好ましくは、このＤＮＡポリメラーゼは、核酸鎖にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの３’末端での結合について高い親和性を有する。好ましくは、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的なニック（ｎｉｃｋｉｎｇ）活性を有さない。一般に、このポリメラーゼは、好ましくは、プライマーまたはプライマー伸長ポリヌクレオチドの分解を最小化するように、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をほとんどまたは全く有さない。一般に、このエキソヌクレアーゼ活性は、ｐＨ、塩濃度、テンプレートが二本鎖または一本鎖のいずれであるか、などの因子に依存し、これら全ては、当業者に精通している。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠失された変異体ＤＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載の増幅方法に適切である。好ましくは、このＤＮＡポリメラーゼは、このポリメラーゼとプライマー伸長産物の５’末端との間の接触頻度の少なくとも約２５％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７５％、そして最も好ましくは、少なくとも９０％において、テンプレート核酸からのプライマー伸長産物を置換する。いくつかの実施形態において、鎖置換活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用が、好ましい。このようなポリメラーゼは、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５７４４３１２号（およびそこに引用される参考文献）に記載される）。好ましくは、このＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディング活性をほとんどまたは全く有さない。
【０２０１】
本発明の方法および組成物における使用に適切なＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第５６４８２１１号および同第５７４４３１２号に開示されるＤＮＡポリメラーゼを含み、これらには、エキソ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、エキソ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、エキソ−Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）、配列決定グレードのＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０２０２】
本発明の方法および組成物における使用のためのリボヌクレアーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおいてリボヌクレオチドを切断し得る。好ましくは、このリボヌクレアーゼは、その切断されるリボヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの同一性および型に拘わらず、リボヌクレオチドを切断する。好ましくは、このリボヌクレアーゼは、配列同一性に非依存的に切断する。本発明の方法および組成物に適切なリボヌクレアーゼの例は、当該分野で周知であり、これらとしては、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を含む。
【０２０３】
本発明の方法および組成物における使用のためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知である。真核生物性または原核生物性のいずれかのポリメラーゼが、使用され得る。例としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。一般に、選択されるＲＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載されるようなプロプロモーターポリヌクレオチドによって提供されるプロモーター配列から転写され得る。一般に、このＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼであり、これは、好ましくは、プロモーター領域が二本鎖である限り、一本鎖ＤＮＡテンプレートから転写され得る。
【０２０４】
一般に、本発明の方法および組成物において使用される酵素は、これらの方法および組成物の核酸成分の実質的な分解を生じるべきではない。
【０２０５】
（反応条件および検出）
本発明の方法を行うために適切な反応媒体および条件は、本発明の方法に従う核酸の増幅を可能にするものである。このような媒体および条件は、当業者に公知であり、そして種々の刊行物（例えば、米国特許第５，５５４，５１６号；同第５，７１６，７８５号；同第５，１３０，２３８号；同第５，１９４，３７０号；同第６，０９０，５９１号；同第５，４０９，８１８号；同第５，５５４，５１７号；同第５，１６９，７６６号；同第５，４８０，７８４号；同第５，３９９，４９１号；同第５，６７９，５１２号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４２６１８）に記載される。例えば、緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液であり得るが、他の緩衝液もまた、その緩衝液成分が本発明の方法の酵素成分に対して非阻害性である限り、使用され得る。ｐＨは、好ましくは、約５〜約１１、より好ましくは、約６〜約１０、さらにより好ましくは、約７〜約９、そして最も好ましくは、約７．５〜約８．５である。反応媒体はまた、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋のような二価の金属イオンを、約０．０１〜約１５ｍＭ、そして最も好ましくは、約１〜１０ｍＭの範囲内の遊離イオン最終濃度で含み得る。反応媒体はまた、その媒体の総イオン強度に寄与する他の塩（例えば、ＫＣｌまたはＮａＣｌ）を含み得る。例えば、ＫＣｌのような塩の範囲は、好ましくは、約０〜約１２５ｍＭ、より好ましくは、約０〜約１００ｍＭ、そして最も好ましくは、約０〜約７５ｍＭである。反応媒体は、増幅反応の実行に影響を及ぼし得るが、これらの方法の酵素成分の活性に不可欠ではない添加剤をさらに含み得る。このような添加剤としては、ＢＳＡ、一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質）のようなタンパク質、およびＮＰ４０またはＴｒｉｔｏｎのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。酵素活性を維持し得る試薬（例えば、ＤＴＴ）もまた、含まれ得る。このような試薬は、当該分野で公知である。適切な場合、この方法において使用されるＲＮａｓｅの活性を阻害しないＲＮａｓｅインヒビター（例えば、ＲＮａｓｉｎ）もまた、含まれ得る。本発明のこれらの方法の任意の局面が、同じ温度または種々の温度で生じ得る。好ましくは、増幅反応（特に、第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成工程以外のプライマー伸長、および鎖置換）は、等温で行われ、これは、煩わしい熱サイクルプロセスを回避する。増幅反応は、テンプレートポリヌクレオチドおよびプライマー伸長産物に対する本発明のオリゴヌクレオチド（プライマーおよび／またはプロプロモーターポリヌクレオチド）のハイブリダイゼーションを可能にし、かつ使用される酵素の活性を実質的に阻害しない温度で行われる。温度は、好ましくは、約２５℃〜約８５℃、より好ましくは、約３０℃〜約８０℃、そして最も好ましくは、約３７℃〜約７５℃の範囲にあり得る。いくつかの実施形態において、その転写工程のための温度は、先行する工程の温度よりも低い。これらの実施形態において、転写工程の温度は、好ましくは、約２５℃〜約８５℃、より好ましくは、約３０℃〜約７５℃、そして最も好ましくは、約３７℃〜約７０℃の範囲にあり得る。
【０２０６】
本発明の方法においてプライマー伸長産物の合成のために使用され得るヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸）は、好ましくは、約５０〜約２５００μＭ、より好ましくは、約１００〜約２０００μＭ、さらにより好ましくは、約２００〜約１７００μＭ、そして最も好ましくは、約２５０〜約１５００μＭの量で提供される。いくつかの実施形態において、プライマー伸長鎖におけるその存在が鎖置換を増強する（例えば、通常のＡＴ、ＣＧ塩基対形成よりも弱い塩基対形成を生じることによって）、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが、含まれる。このようなヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログとしては、デオキシイノシンおよび他の改変された塩基が挙げられ、これら全ては、当該分野で公知である。本発明の方法におけるＲＮＡ転写物の合成に使用され得るヌクレオチドおよび／またはアナログ（例えば、リボヌクレオシド三リン酸）は、好ましくは、約０．２５〜約６ｍＭ、より好ましくは、約０．５〜約５ｍＭ、さらにより好ましくは、約０．７５〜約４ｍＭ、そして最も好ましくは、約１〜約３ｍＭの量で提供される。
【０２０７】
本発明の増幅反応のオリゴヌクレオチド成分は、一般に、増幅される標的核酸配列の数より多く存在する。これらは、標的核酸の量の約１０倍、１０２倍、１０４倍、１０６倍、１０８倍、１０１０倍、１０１２倍のいずれか、または少なくとも約１０倍、１０２倍、１０４倍、１０６倍、１０８倍、１０１０倍、１０１２倍のいずれかで提供され得る。複合プライマーおよびプロプロモーターポリヌクレオチドは、各々、約５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２５００ｎＭ、５００ｎＭのいずれか、または少なくとも約５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２５００ｎＭ、５０００ｎＭのいずれかの濃度で提供され得る。
【０２０８】
一実施形態において、前述の成分は、増幅プロセスの開始時に同時に添加される。別の実施形態において、成分は、増幅反応に必要とされそして／または許容される場合に、増幅プロセス中の適切な時点の前または後で、任意の順序で添加される。このような時点（いくつかを以下に記載する）は、当業者によって容易に同定され得る。本発明の方法に従う核酸増幅に使用される酵素は、それらの温度安定性および／または当業者に公知の他の考慮によって決定されるように、標的核酸の変性工程の前、その変性工程の後、または標的ポリヌクレオチドへのプライマーのハイブリダイゼーション後のいずれかに、反応混合物に添加され得る。これらの実施形態において、反応条件および成分は、異なる反応間で変更され得る。従って、例えば、二本鎖ＤＮＡ標的から一本鎖種を形成する前に、プロプロモーターＴＳＯベースの方法において、この標的を含むサンプルとプライマーおよびプロプロモーターＴＳＯとを混合することが可能である。使用される増幅酵素の熱安定性に依存して、本発明に従う増幅に必要とされる酵素が、一本鎖標的の形成の初期工程の前、または後期段階のいずれかで、サンプルに添加され得る。いくつかの実施形態において、増幅工程の始めに、核酸改変酵素（本明細書中に記載される）を含むことが所望され得、このプロセスは、当該分野で公知である熱安定性の核酸改変酵素を一般に必要とする。これらの酵素は、以下を含む：例えば、熱安定性ＤＮＡリガーゼ（例えばＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ；Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．ＡＫ１６Ｄリガーゼ；Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓリガーゼ）；熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、ＴｔｈまたはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）；ならびに熱安定性逆転写酵素（例えば、ｒＴｔｈ  ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）。
【０２０９】
増幅プロセスは、種々の時点で停止され得、そしてその後、再開され得る。これらの時点は、当業者に容易に同定され得る。１つの時点は、第１プライマー伸長の終了時である。別の時点は、第２プライマー伸長の終了時である。反応を停止するための方法は、当該分野で公知であり、これらには、例えば、酵素活性を阻害する温度への反応混合物の冷却、または酵素を破壊する温度への反応混合物の加熱が挙げられる。反応を再開するための方法もまた、当該分野で公知であり、これらには、例えば、酵素活性を可能にする温度への反応混合物の温度の上昇、または破壊（枯渇）された酵素の補充が挙げられる。いくつかの実施形態において、反応物の１以上の成分が、反応の再開前、再開時または再開後に補充される。あるいは、反応は、中断することなく進行（すなわち、開始から終了まで）され得る。
【０２１０】
増幅産物検出は、標的配列の存在を示す。定量分析もまた、可能である。直接的および間接的な検出方法（定量化を含む）は、当該分野で周知である。例えば、標的配列を含む未知の量のポリヌクレオチドを含む試験サンプルから増幅された産物の量を、その標的配列を含む既知の量のポリヌクレオチドを有する参照サンプルの増幅産物と比較することによって、試験サンプル中の標的配列の量が決定され得る。本発明の増幅方法はまた、配列変化の分析および標的核酸の配列決定にまで広げられ得る。さらに、検出は、例えば、ＲＮＡ増幅産物からの翻訳産物の試験によってもたらされ得る。
【０２１１】
（本発明の組成物およびキット）
本発明はまた、本明細書中に記載される方法において使用される組成物およびキットを提供する。組成物は、本明細書中に記載される任意の成分、反応混合物および／または中間体、ならびに任意の組み合わせであり得る。
【０２１２】
例えば、本発明は、以下の任意の２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つを含む組成物を提供する：（ａ）複合プライマーである第１プライマー；（ｂ）第２プライマー；（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；および（ｇ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリットからＲＮＡを切断する酵素。いくつかの実施形態において、この複合プライマーは、この組成物中に含まれる場合、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分（いくつかの実施形態において、このＲＮＡ部分は、ＤＮＡ部分に隣接している）を含む。他の実施形態において、この複合プライマーは、少なくとも１つの介在性ＲＮＡ部分を有する５’ＤＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む。他の実施形態において、この組成物は、ＴＳＯをさらに含む（すなわち、本明細書中に記載されるＴＳＯ実施形態のいずれかにおいて、テンプレートへの結合を増強する１以上の改変体を含むＴＳＯを含む）。いくつかの実施形態において、この組成物は、末端ポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドをさらに含む。
【０２１３】
別の実施形態において、本発明は、以下のいずれか２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つを含む組成物を提供する：（ａ）プロプロモーターＴＳＯ；（ｂ）第１プライマー（ＤＮＡからなり得る）；（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；（ｆ）必要に応じて、第２プライマー（ＤＮＡからなり得る）；および（ｇ）ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２１４】
本明細書中に記載される組成物のいくつかの実施形態において、この組成物は、複数の酵素活性を含む単一の酵素をさらに含む。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが同じ酵素（例えば、逆転写酵素）であり得るか；ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素は、同じ酵素であり得るか；ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素は、同じ酵素であり得るか；または、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素の３つ全ての活性が、単一の酵素に存在し得る。
【０２１５】
上記組成物のうちのいずれかが、テンプレート（標的配列を含む）および／または本明細書中に記載される酵素のいずれか（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、および／またはＲＮＡポリメラーゼ）をさらに含み得る。これらの組成物は、一般的に、水性形態であり、好ましくは、適切な緩衝液中にある。
【０２１６】
本発明はまた、本明細書中に記載される増幅産物を含む組成物を提供する。従って、本発明は、本明細書中に記載の方法のいずれかによって生成される、標的配列のコピーであるセンスＲＮＡ分子の集団を提供する。
【０２１７】
これらの組成物は、一般に、適切な媒体中にあるが、これらは、凍結乾燥形態であり得る。適切な媒体としては、水性媒体（例えば、純水または緩衝液）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
本発明は、本発明の方法を行うためのキットを提供する。従って、種々のキットが、適切なパッケージング中に提供される。これらのキットは、本明細書中に記載される用途の任意の１以上に使用され得、そして従って、以下の用途の任意の１以上についての指示を備え得る：ポリペプチド（ＲＮＡおよび／ＤＮＡ）の増幅；目的の核酸配列の配列決定；核酸配列の増幅に基づく配列変異の検出。
【０２１９】
本発明のキットは、本明細書中に記載される成分の任意の組み合わせを含む、１つ以上の容器を備え、そして以下は、このようなキットの例である。例えば、本発明は、以下のいずれか２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つを含むキットを提供する：（ａ）複合プライマーである第１プライマー；（ｂ）第２プライマー；（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）プロプロモーターポリヌクレオチド；（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ；および（ｇ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素。いくつかの実施形態において、複合プライマーは、キットに含まれる場合、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分（いくつかの実施形態において、ＲＮＡ部分は、ＤＮＡ部分に隣接する）を含む。他の実施形態において、複合プライマーは、少なくとも一つの介在するＲＮＡ部分を有する５’ＤＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む。他の実施形態において、キットは、さらに、ＴＳＯ（すなわち、本明細書中に記載されるＴＳＯ実施形態のいずれかであり、これは、テンプレート経の結合を増強する１つ以上の改変を含むＴＳＯを含む）を含む。いくつかの実施形態において、キットは、さらに終止ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、さらに、本明細書中に記載される複合プライマーに基づく方法に従って標的ポリヌクレオチドを増幅するためにキットで提供される成分のいずれかを使用するための指示を含む。
【０２２０】
別の実施形態において、本発明は、以下のいずれか２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つを含むキットを提供する：（ａ）プロプロモーターＴＳＯ；（ｂ）第１プライマー（ＤＮＡからなり得る）；（ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素；（ｆ）必要に応じて、第２プライマー（ＤＮＡからなり得る）；および（ｇ）ＲＮＡポリメラーゼ。いくつかの実施形態において、キットは、さらに、本明細書に記載されるプロプロモーターＴＳＯの基づく方法のいずれかに従って、標的ポリヌクレオチドを増幅するために、キットで提供される成分のいずれかを使用するための指示を含む。
【０２２１】
キットはまた、必要に応じて、デオキシヌクレオシド三リン酸、および／またはリボヌクレオシド三リン酸を含む。キットはまた、１つ以上の適切な緩衝液（本明細書中に記載される）を含み得る。核酸配列決定に有用なキットは、必要に応じて、プライマー伸長産物への組み込みの際に、ヌクレオチド重合の終結をもたらす、標識されているかまたは標識されていないヌクレオチドアナログを含み得る。このキットにおける１つ以上の試薬は、乾燥粉末として、通常は凍結乾燥されて、賦形剤を含んで提供され得、これは、溶解の際に、本明細書中に記載される方法のいずれかを実施するために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。各成分は、別個の容器にパッケージされ得るか、またはいくつかの成分は、交差反応性および貯蔵寿命により許される場合には、１つの容器中に組み合わせられ得る。
【０２２２】
本発明のキットは、必要に応じて、１セットの指示を含み得、これは一般に、意図される核酸増幅のため、そして／または適切な場合には、核酸配列決定および配列変異の検出のような目的のために増幅産物を使用するために、本発明の方法の成分の使用に関連する記載された指示である。指示を含む電気的記憶媒体（例えば、磁気ディスクまたは光ディスク）は、指示を提供する許容可能な様式である。指示はまた、インターネットのような広域ネットワーク（ＷＡＮ）によってアクセス可能な、中央サーバにこの指示を記憶することによって提供され得る。
【０２２３】
キットに含まれる指示は、一般的に、本発明の方法を実施するために必要な試薬（このキットに含まれていても含まれていなくても）に関する情報、このキットの使用方法に関する指示、および／または適切な反応条件を含む。例えば、本発明は、以下を含むキットを提供する：標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能である配列を含む第１複合プライマー、および本明細書中に記載される複合プライマーの基づく方法に従う標的ポリヌクレオチドを増幅するために、プライマーを使用するための指示。別の例において、キットは、さらに、第２プライマー、および必要に応じて、本明細書中に記載される複合プライマーに基づく方法に従って標的ポルヌクレオチドを増幅するためにプライマーを使用するための指示を含み得る。他の例において、キットは、さらなる成分、例えば、（ａ）プロプロモーターポリヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）のいずれか；および（ｂ）本明細書中に記載される酵素のいずれか（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性）およびＲＮＡポリメラーゼ）、ならびに本明細書中に記載される複合プライマーに基づく方法に従って標的ポリヌクレオチドを増幅するための成分を使用するための指示をさらに含み得る。
【０２２４】
このキットの成分は、任意の好都合な適切なパッケージングにパッケージされ得る。これらの成分は、別個にか、または１つもしくは複数の組合せでパッケージされ得る。キットが、本発明の増幅方法を実施するために提供される場合には、ＲＮＡポリメラーゼ（含まれる場合）は、好ましくは、転写工程の前の工程において使用される成分とは別個に提供される。
【０２２５】
このキット内の種々の成分の相対量は、本明細書中に開示される方法を実施するために起こることが必要である反応を実質的に最適化し、そして／または任意のアッセイの感度をさらに最適化する範囲の濃度を提供するように、広く変動され得る。本発明の組成物およびキットに関して、任意の成分が、本明細書中に記載される成分の実施形態のいずれかを含み得る。
【０２２６】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法を実施するためのシステムを提供する。これらのシステムは、上記で議論された成分の種々の組み合わせを含む。システムは、一般的に、本発明の増幅方法を実行するための１つ以上の装置を含み得る。このような装置は、例えば、加熱デバイス（例えば、加熱ブロックまたは水浴）および本明細書中に記載される方法の１つ以上の工程の自動化をもたらす装置を備える。
【０２２７】
本発明はまた、本明細書中に記載される成分の種々の組み合わせを含む、反応混合物（または反応混合物を含む組成物）を提供する。反応混合物の例は、（ａ）第１プライマー伸長産物および標的ポリヌクレオチドの複合体；（ｂ）プロプロモーター配列（例えば、ＰＴＯまたはＴＳＯ）を含むポリヌクレオチド；（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼ；および（ｄ）第２プライマーである。他の反応混合物が本明細書中に記載され、本発明によって包含される。
【０２２８】
本発明はまた、本明細書中に記載される複合体のいずれか（本明細書中に記載される方法において、中間体である）を含む組成物を含む。このような複合体の例は、図１〜４に概略的に示される。
【０２２９】
（本発明の増幅方法および組成物を使用するための方法）
本発明の方法および組成物は、種々の目的で使用され得る。例示の目的で、配列決定、遺伝子型決定（核酸変異）、マイクロアレイ調製、および本発明の方法によって生成した増幅核酸産物を使用して、核酸を特徴付ける方法が記載される。
【０２３０】
（本発明の方法を使用する、ポリヌクレオチドの配列決定）
本発明の増幅方法は、例えば、目的の配列の配列決定のために有用である。この配列決定プロセスは、本明細書中に記載される増幅方法について記載されるように、実施される。
【０２３１】
本発明の方法を使用する配列決定は、ＲＮＡ転写の早期の（故意の）終結に基づき得る。ＲＮＡ転写物への組み込みの際に反応混合物中のｒＮＴＰ重合の終結をもたらす、ｒＮＴＰアナログ（これは、標識されていても標識されていなくてもよい）を含むことは、短縮型ＲＮＡ産物の生成を生じ、これは、このアナログの取り込み部位におけるＲＮＡポリメラーゼのブロッキングから生じる。
【０２３２】
１つの実施形態において、配列決定の方法は、（ａ）転写がｒＮＴＰアナログの取り込みの際に終結するように、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログの混合物の存在下で、本明細書中に記載される方法によって目的の配列を含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｂ）配列を決定するために増幅された産物を分析する工程を包含する。
【０２３３】
別の実施形態において、配列決定の方法は、（ａ）転写がｒＮＴＰアナログの取り込みの際に終結するように、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログの混合物の存在下で、本明細書中に記載される方法によって目的の配列を含む標的ポリヌクレオチドを増幅する工程（ここで、ＲＮＡ転写物が、ｒＮＴＰおよびｒＮＴＰアナログの混合物の存在下で第２プライマー伸長産物から生成される）；および（ｂ）配列を決定するために増幅された産物を分析する工程を包含する。
【０２３４】
適切なｒＮＴＰアナログとしては、他の配列決定方法において通常使用されるものが挙げられ、そして当該分野において周知である。ｒＮＴＰアナログ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼターミネーター）の例としては、３’−ｄＮＴＰが挙げられる。Ｓａｓａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）９５：３４５５−３４６０。これらのアナログは、例えば、蛍光色素または放射性同位体で標識され得る。これらの標識はまた、質量分析に適切な標識であり得る。これの標識はまた、特異的結合対のメンバーである低分子であり得、そしてこの特異的結合対の他方のメンバー（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン、それぞれ）の結合に続いて、検出可能であり得、この結合対の最後のメンバーが、酵素に結合され、この酵素は、比色定量、蛍光比色法、または化学発光のような方法によって検出され得る、検出可能なシグナルの発生を触媒する。上記例の全ては、当該分野において周知である。これらは、ポリメラーゼによってＲＮＡ転写物に組み込まれ、そしてテンプレート配列に沿ったさらなる伸長を停止するよう働く。得られた短縮型重合産物は、標識される。蓄積される短縮型産物は、アナログの各々の取り込み部位（これは、テンプレート配列上の相補的ヌクレオチドの種々の配列位置に相当する）に従って長さが変動する。
【０２３５】
配列情報の説明のための、反応生成物の分析を、当該分野において公知の種々の方法のいずれかを使用して実施し得る。このような方法としては、ゲル電気泳動および適切なスキャナを用いる標識されたバンドの検出、配列決定ゲル電気泳動および放射性同位元素標識されたバンドの燐光による直接的な検出（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓリーダー）、反応に使用される標識に対して特異的な検出器に適合されたキャピラリー電気泳動などが挙げられる。この標識はまた、結合タンパク質と結合体化した酵素と組み合わせた、標識の検出のために使用される結合タンパク質に対するリガンド（例えば、ビオチン標識された鎖ターミネーター、および酵素に結合体化したストレプトアビジン）であり得る。この標識は、検出可能なシグナルを発生させるその酵素の酵素活性によって検出される。当該分野において公知の他の配列決定方法を用いてと同様に、種々のヌクレオチド型（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）についての配列決定反応が、単一の反応容器内でか、または別個の反応容器内（各々が、種々のヌクレオチド型の１つに相当する）のいずれかで実施される。使用されるべき方法の選択は、当業者に容易に明らかな実用的な考慮（例えば、使用されるヌクレオチド三リン酸アナログおよび／または標識）に依存する。従って、例えば、アナログの各々が差示的に標識される場合には、配列決定反応は、単一の容器内で実施され得る。本発明の方法による配列決定分析の最適な実施のための、試薬および反応条件の選択のための考慮は、以前に記載された他の配列決定方法についての考慮と類似である。試薬および反応条件は、本発明の核酸増幅方法に対して上記されたようなものであるべきである。
【０２３６】
（本発明の増幅方法を利用する、一本鎖コンホメーション多型に基づく変異検出を含む、変異検出）
本発明の方法によって生成されたＲＮＡの増幅産物はまた、配列の変更以外は標的核酸配列と同一である参照核酸配列と比較した場合の、標的核酸配列における任意の変更の検出のための分析に適切である。
【０２３７】
増幅方法のＲＮＡ産物は、一本鎖コンホメーション多型（ｒＳＳＣＰ）に基づく変異検出に適切である。本発明の増幅方法は、一本鎖コンホメーション多型を検出するための適切な手段（例えば、参照核酸と比較した場合の試験核酸における特定の配列特徴の存在および／または任意の差異の存在を説明するための、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ産物の特異的移動度パターンの同定のための電気泳動分離法）に直接組み合わせられ得る。
【０２３８】
ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動に基づく方法は、種々の一本鎖コンホメーション異性体の検出および分析のために使用され得る。あるいは、配列依存型二次構造を認識するヌクレアーゼを使用する、一本鎖ＲＮＡ産物の切断が、配列特異的コンホメーション多型の決定のために有用であり得ることもまた、ありそうである。このような２次構造特異的ヌクレアーゼは当該分野において公知である（例えば、ＣｌｅａｖａｓｅＴＭアッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ）として公知の５’ヌクレアーゼ）。電気泳動の方法は、ハイスループットの変異または遺伝子型決定の検出方法のための、潜在的により適切な方法である。
【０２３９】
所定の核酸配列に対する配列特異的な電気泳動パターンの決定は、例えば、試験配列の特異的対立遺伝子の検出のために有用である。さらに、種々の対立遺伝子に対する電気泳動移動度パターンは、十分に区別され得、これによって、異種接合の遺伝子型、または多重対立遺伝子のために必要とされるような、単一の個体由来の核酸サンプルにおける２つの対立遺伝子の検出を可能にすることが予測される。試験核酸配列における任意の変更（例えば、塩基の置換、挿入または欠失）は、この方法を使用して検出され得る。この方法は、特異的な一塩基多型（ＳＮＰ）の検出および新たなＳＮＰの発見のために有用であると予測される。従って、本発明はまた、一塩基多型を含むポリヌクレオチドを検出するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本明細書中に記載される方法のいずれかを使用して、標的ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｂ）一本鎖コンホメーションに対して増幅産物を分析する工程であって、ここで、参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した場合のコンホメーションの差異が、標的ポリヌクレオチドにおける一塩基多型を示し、これによって、一塩基多型を含むポリヌクレオチドが検出される、工程。
【０２４０】
（本発明の複合プライマーに基づく増幅方法を使用する変異検出）
本発明の等温増幅方法において使用するための、複合プライマーの独特の特性は、標的核酸配列における規定された変異、または多型部位（例えば、ＳＮＰ）の検出のための等温方法に対する基礎を提供する。この方法は、遺伝子型決定、薬物耐性を導く変異の検出などのために有用である。これらの方法は、複合プライマーのＲＮＡ部分に一般的にハイブリダイズする、テンプレート鎖の領域内の特徴配列（従って、それらの位置に関して規定される、「規定」変異と呼ばれる）に適用可能である。
【０２４１】
１つの実施形態において、複合プライマーのＲＮＡ部分は、配列変更の存在が疑われる試験標的核酸の配列に相補的であるように設計される。換言すれば、このプライマーは、参照ＲＮＡ配列（例えば、野生型配列）（この配列に対して、試験核酸における配列が比較される）に相補的である配列を含むＲＮＡ部分を含む。いくつかの実施形態において、変更された配列（すなわち、配列変更を含む配列）および参照配列は、対立遺伝子である。配列変更は、単一のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得る。
【０２４２】
別の実施形態において、複合プライマーのＲＮＡ部分は、試験標的核酸に存在すると疑われる変更された配列に相補的であるように、設計される。換言すれば、このプライマーは、試験標的核酸に相補的である配列を含むＲＮＡ部分を含み、従って、参照配列（例えば、野生型配列）（この配列に対して、試験標的核酸における配列が比較される）に相補的ではない。いくつかの実施形態において、変更された配列（すなわち、配列変更を含む配列）および参照配列は、対立遺伝子である。
【０２４３】
複合プライマーのＲＮＡ部分（一般に、５’ＲＮＡ部分）は、既知の正常野生型配列、または既知の変異体もしくは多型遺伝子型に相補的な配列を含む。一般に、適切な複合プライマーは、標的核酸配列が、ミスマッチが存在する場合（すなわち、プライマーが変異配列を有し、そして標的が有さないか、またはその逆）と比較してプライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列を含む場合には、プライマーが標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にするＲＮＡ部分を含み、ここで、この標的核酸は、結合したプライマー伸長産物を有し、そしてその５’−ＲＮＡ部分が切断されている。配列変更の存在は、一般に、増幅方法の開始工程を防止しない。複合プライマーは、標的配列にハイブリダイズして、三分子複合体を形成し、そして伸長する。次いで、ＲＮａｓｅＨのようなリボヌクレアーゼが、その複合体の伸長プライマーのＲＮＡ部分を切断する。ミスマッチ塩基対の存在は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの切断のパターンに影響を与えるようであるが、この切断は、それでもなお起こるようである。５’ＲＮＡ部分のハイブリダイゼーションによる、複合体への複合プライマーの結合である、次の工程は、ミスマッチによって阻害され、好ましくは防止される。この効果は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの大きさ、および反応条件のストリンジェンシーのような要因に依存する。これらの要因は、当該分野において周知であり慣用的である技術によって、複合プライマーの設計において考慮される。ミスマッチが複合プライマーのＲＮＡ部分の切断を阻害し、これによって標的配列の増幅を防止することもまた可能である。別の可能性は、ミスマッチがプライマーのＲＮＡ部分の切断の効率を低下させ、これによって、増幅のより低い効率またはより少ない増幅産物の産生を生じることである。複合プライマーがこの増幅工程において標的にハイブリダイズすることができないことによって、プライマー伸長鎖の置換、および増幅産物の複数のコピーの産生のさらなる工程が、防止される。本発明の方法による変異の検出は、増幅産物の非存在または存在、あるいは蓄積された増幅産物の量の定量的比較に基づき得ることが、理解される。例えば、複合プライマーが参照配列（例えば、野生型）を含む場合には、標的鎖における変異の存在は、検出可能な増幅産物を導かないかもしれない；あるいはこれは、検出可能な産物を導くかもしれないが、変異なしのテンプレート鎖から産生されるものより少ない。
【０２４４】
複合プライマーが、変異遺伝子型に完全に相補的であるＲＮＡ部分（一般に５’ＲＮＡ部分）を含む場合、正常な遺伝子型である配列の増幅は妨げられるが、変異遺伝子型標的が増幅される。従って、この場合、増幅産物の複数のコピーの検出および／または定量的決定は、変異遺伝子型の標的配列の存在の指標である。例えば、目的の核酸サンプル、または野生型配列を有する標的核酸の参照サンプルのいずれかを含む平行な反応を、実行し得る。後者の反応に比べた前者におけるより多くのプライマー伸長産物の蓄積は、目的のサンプルにおける変異遺伝子型の存在の指標である。あるいは、複合プライマーが、試験標的の正常遺伝子型配列に完全に相補的である５’ＲＮＡ配列を含む場合、変異遺伝子型の標的配列の増幅は妨げられ、そして、増幅産物の検出および／または定量的決定は、正常な遺伝子型の指標である。
【０２４５】
本発明の複合プライマーに基づく増幅方法のいずれも、上記変異の検出に適切である。
【０２４６】
（核酸のマイクロアレイを調製するための方法）
本発明の増幅方法の産物の一本鎖の性質は、増幅産物を含むマイクロアレイを調製するために特に適切である。
【０２４７】
増幅産物は、固体または半固体の支持体または表面に結合され得る。これは、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製され得る。
【０２４８】
固体基材（例えば、ガラススライド）に対して核酸を結合するためのいくつかの技術が当該分野で周知である。１つの方法は、増幅された核酸中に、固体基材へ結合し得る部分（例えば、アミン基、アミン基の誘導体、または正の電荷を有する別の基）を含む改変塩基またはアナログを組み込むことである。次いで、増幅された産物は、固体基材（例えば、ガラススライド）と接触される。この基材は、アルデヒドまたは別の反応性基（増幅された産物上にある反応性基と共有結合を形成し、そしてガラススライドに対する共有結合になる）で被覆（コート）されている。増幅された産物を含むマイクロアレイは、Ｂｉｏｄｏｔ（ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｎｃ．Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）スポッティング装置およびアルデヒド被覆ガラススライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて製造され得る。増幅産物は、アルデヒドで被覆（コート）されたスライド上にスポットされ得、そして公開された手順（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５）９３：１０６１４〜１０６１９）に従って処理され得る。アレイはまた、ガラス、ナイロン（Ｒａｍｓａｙ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）、１６：４０〜４４）、ポリプロピレン（Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），２２４（１）：１１０〜６）、およびシリコーンスライド（Ｍａｒｓｈａｌｌ，ＡおよびＨｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）、１６：２７〜３１）上にロボットでプリントされ得る。アレイアセンブリに対する他のアプローチとしては、電場内の微細なマイクロピペッティング（ＭａｒｓｈａｌｌおよびＨｏｄｇｓｏｎ、前出）、および正に被覆されたプレートに対する直接的なポリヌクレオチドのスポッティングが挙げられる。アミノプロピルシリコン表面化学を用いた方法のような方法も、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｔ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ、およびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／に開示のように、当該分野で公知である。
【０２４９】
マイクロアレイを作製するための１つの方法は、高密度ポリヌクレオチドアレイを作製することによる。ポリヌクレオチドの迅速な蒸着のための技術が公知である（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１１：６８７〜６９０）。例えば、マスキング（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９２）、２０：１６７９〜１６８４）によって、マイクロアレイを作製するための他の方法がまた、用いられ得る。原則として、そして上記するように、任意のタイプのアレイ（例えば、ナイロンハイブリダイゼーションメンブレン上のドットブロット）が用いられ得る。しかし、当業者に認識されるように、ハイブリダイゼーション容積がより小さいので、非常に小さいアレイが頻繁に好ましい。
【０２５０】
増幅されたポリヌクレオチドは、紙、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、光ファイバー、または任意の他の適切な固体もしくは半固体（例えば、薄層のポリアクリルアミドゲル（Ｋｈｒａｐｋｏら、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（１９９１）１：３７５〜３８８））表面を含む基材上にマトリックスとしてスポッティングされ得る。
【０２５１】
アレイは、平坦な基材上に２次元マトリックスとして組み立てられ得るか、またはピン、ロッド、ファイバー、テープ、スレッド、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー、シリンダー（円柱）、および標的分子のハイブリダイゼーションおよび検出に適切な任意の他の構成を含む３次元構造を有し得る。１実施形態において、増幅産物が結合される基材は、磁気ビーズまたは粒子である。別の実施形態において、固体基材は、光ファイバーを含む。なお別の実施形態において、増幅産物は、キャピラリー内の液体相中に分散し、次にここで固相に対して固定される。
【０２５２】
（核酸の特徴付け）
本発明の方法によって得られる増幅産物は、さらなる特徴付けに特に従順である。このことは部分的に、この産物が一本鎖であることに起因する。この増幅産物は、例えば、当該分野において公知のプローブハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンブロッティング、およびプローブアレイへのハイブリダイズ）を使用して、分析され得る。これらはまた、当該分野において公知の電気泳動に基づく方法（例えば、ディファレンシャルディスプレイおよびサイズ特徴付け）によって、分析され得る。
【０２５３】
増幅産物は、目的の配列の配列を決定するために使用され得る。例えば、本発明の増幅方法によって生成した、目的の配列を含む増幅産物は、任意の適切な配列決定方法による配列決定に供され得る。適切な配列決定方法は当該分野において公知であり、そして例えば、プライマー伸長産物への組み込みの際にヌクレオチドの重合を終結させる、ヌクレオチド三リン酸を使用することが挙げられる。
【０２５４】
増幅産物はまた、サンプル中の目的の核酸配列の存在の検出および／または定量のために使用され得る。例えば、サンプルにおける目的の核酸配列の存在は、この目的の配列を含むことが疑われるサンプル中のポリヌクレオチドを増幅することから生じた増幅産物において、この目的の配列を検出することによって、検出され得る。いくつかの実施形態において、目的の配列は、変異（例えば、一塩基多型、挿入、欠失または置換）を含む。増幅産物中の目的の配列は、当該分野において公知の種々の方法（例えば、目的の配列を含む（かまたは含むと疑われる）増幅産物を、目的の配列とハイブリダイズ可能な核酸プローブとハイブリダイズさせることが挙げられる）のいずれかによって、検出され得る。適切な核酸プローブは、当業者に明らかであり、そして例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡを含むプローブが挙げられる。これらのプローブは、任意の適切な形態（例えば、適切な基材（これは、紙、ガラス、プラスチック、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコンおよび光ファイバーのような材料から作製され得る）上に固定されたプローブを含み得る、マイクロアレイとしての形態が挙げられる）で提供され得る。増幅産物における目的の配列の検出はまた、限定されたプライマー伸長のような方法によって達成され得る。この方法は、当該分野において公知であり、そして例えば、米国特許第５，８８８，８１９号；同第６，００４，７４４号；同第５，８８２，８６７号；同第５，７１０，０２８号；同第６，０２７，８８９号；同第６，００４，７４５号；同第５，７６３，１７８号；同第５，０１１，７６９号；同第５，１８５，２４３号；同第４，８７６，１８７号；同第５，８８２，８６７号；ＷＯＵＳ８８／０２７４６；ＷＯ９９／５５９１２；ＷＯ９２／１５７１２；ＷＯ００／０９７４５；ＷＯ９７／３２０４０；ＷＯ００／５６９２５、および同時係属中の、米国出願番号６０／２５５，６３８（２０００年１２月１３日に出願された）に記載されている。
【０２５５】
１つの実施形態において、本発明の増幅方法は、ＲＮＡ重合の間に標識ヌクレオチドの組み込みによって標識された一本鎖ＲＮＡ産物の複数のコピーを生成するために、利用される。例えば、本発明の方法による増幅は、適切な標識ｒＮＴＰを使用して実施され得る。これらの標識ｒＮＴＰは、標識に直接付着され得るか、または標識に付着し得る部分を含み得る。この標識は、この増幅産物に、共有結合的にかまたは非共有結合的に、付着され得る。適切な標識は当該分野において公知であり、そして例えば、結合対の検出可能な第２のメンバーを使用して検出／定量され得る、特異的結合対のメンバーであるリガンドが挙げられる。従って、例えば、Ｃｙｅ３−ｄＡＴＰまたはＣｙｅ５−ｄＡＴＰの存在下での、本発明の方法による標的ポリヌクレオチドの増幅は、これらのヌクレオチドの、増幅産物への取込みを生じる。
【０２５６】
標識された増幅産物は、これらを例えば、ｃＤＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブのような適切なプローブを含む、（ガラス、チップ、プラスチックを含む任意の適切な表面の）マイクロアレイ、ビーズ、または粒子と接触させることによる分析（例えば、検出および／または定量）のために、特に適切である。従って、本発明は、本発明の増幅方法を使用して標識ＲＮＡ産物を生成すること、およびこの標識産物を分析することによって、目的の配列を特徴付ける（例えば、検出および／または定量する）方法を提供する。標識産物の分析は、例えば、固体基板または半固体基板上の特定の位置に固定されたプローブ、規定された粒子に固定されたプローブ、あるいはブロット（例えば、膜）に固定されたプローブ（例えば、上記のようなアレイ）への、この標識増幅産物のハイブリダイゼーションによって実施され得る。標識産物を分析するための他の方法は、当該分野において公知であり、例えば、プローブを含む溶液にこれらの産物を接触させ、引き続いてこの標識増幅産物とプローブとを含む複合体を、この溶液から抽出することによる。これらのプローブの同一性は、増幅産物の配列同一性の特徴付けを提供し、従って、外挿によって、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチドの同一性を提供する。標識産物のハイブリダイゼーションは検出可能であり、そして検出された特定の標識の量は、目的の特定の配列の標識された増幅産物の量に比例する。この測定は、例えば、サンプル中の種々のポリヌクレオチド種の相対的な量を測定するために有用である。アレイ上の規定された位置においてハイブリダイズされた標識産物の量（例えば、この標識に関連する検出可能なシグナルによって示されるような）は、サンプル中の対応する標的ポリヌクレオチド種の検出および／または定量のための指標であり得る。
【０２５７】
（遺伝子発現プロフィールの決定）
本発明の増幅方法は、サンプル中の複数の遺伝子の発現のレベルを決定する際の使用に特に適切である。なぜなら、本明細書中に記載される方法は、同一サンプル中の複数の標的ポリヌクレオチド（直接的な標的としてはＲＮＡ、またはＲＮＡサンプルから調製されたｃＤＮＡ）を増幅し得るからである。上記のように、増幅産物は、本明細書中に記載され、そして／または当該分野において公知であるような、種々の方法によって検出および定量され得る。ＲＮＡは、遺伝子発現の産物であるので、サンプル中の種々のＲＮＡ種（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルは、種々の遺伝子の相対発現レベル（遺伝子発現プロフィール）の指標である。従って、サンプル中に存在する目的の配列の量の決定は、配列の増幅産物を定量することによって決定される場合に、サンプル供給源の遺伝子発現プロフィールの決定を提供し得る。
【０２５８】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、限定するためではない。
【０２５９】
（実施例）
（実施例１：複合プライマーに基づく方法の第１の転写モジュール）
本実施例に記載される一般的な方法はまた、本明細書中に提供される複合プライマーに基づく方法の第１の転写モジュールの他の実施例において、利用される。
【０２６０】
（緩衝液）
複合プライマーに基づく実施例全体にわたって使用した緩衝液を、以下の材料で作製する。
【０２６１】
ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＴＢＥ緩衝液：８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）
ＦＸ緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ９．０）、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ＮＰ−４０。
【０２６２】
（単一の複合プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲｎａｓｅ  Ｈを使用する増幅方法の第１の転写モジュールの第１の説明）
配列増幅を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．８ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＩＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍのｄＮＴＰ）、０〜６％ＤＭＳＯ、０〜８％グリセロール、０〜１００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、０．６単位／μｌ組換えリボヌクレアーゼインヒビター（ｒＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、０．５〜５μＭ複合プライマーＩＡ００５、および１００〜２００ｎＭプロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃを含む１５μｌの反応物中で実施した。複合プライマーＩＡ００５は、以下の配列を有する２０マープライマーである：ＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵＣＣＡＧＴＧＴ（配列番号１）。プロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃは、以下の配列を有する５５マーオリゴヌクレオチドである：ｇｇＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣｇＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡｇｇｇＡｇＡｇＣｇｇＴＡＣｇＣＴｇＡＴＣＡＡＡｇＡＴＣＣｇＴｇ−ビオチン（配列番号１２）。
【０２６３】
反応を、２つの酵素以外の全ての成分を用いて構築した。７０℃または９９℃に１０秒間加熱した後に、プログラム可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、これらの反応混合物を、個々の実施例に記載されるように、５５℃、６０℃、または６５℃に冷却した。低い方の温度に達したら、０．０５〜０．２４単位のＲＮａｓｅ  Ｈ（希釈剤／保存溶液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３０％グリセロール；ハイブリダーゼ熱安定性ＲＮａｓｅ  Ｈ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、５Ｕ／μｌのストック溶液から希釈した）および１．０〜５．０単位のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加した。これらの反応物を、５５℃〜６５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーションの終了時に、ＲＮＡ転写工程が所望されるまで、反応物を４℃に冷却した。
【０２６４】
ＲＮＡ転写を、２．５μｌの上記線状増幅反応混合物、および４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３ｍＭの各ｒＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、７．５％ＤＭＳＯ、１単位／μｌ
ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、および２０単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を含む１０μｌの反応物中で、３７℃で３時間実施した。
【０２６５】
（ＤＮＡテンプレート）
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２のＪ遺伝子領域由来の配列を、以下の実施例のいくつかのためのＤＮＡテンプレートとして選択した。以下の３種のＤＮＡテンプレートを、これらの実験のために使用した：合成ＤＮＡ標的（ＩＡ０１３）、ＰＣＲ増幅によって産生した一次一本鎖ＤＮＡ（３５１塩基）テンプレート、およびＥ．ｃｏｌｉのＫ１２株由来のゲノムＤＮＡ（調製は実施例４に記載される）。合成ＤＮＡ標的ＩＡ０１３は、以下を含む：
スペーサー１８−スペーサー１８ＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧＣＡＡＣＡＡＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＣＡＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＴ。スペーサー１８とは、ポリオキシエチレンスペーサーをいう。１００ｂｐ  ｓｓＤＮＡ産物に対するオリゴの移動性を遅延するために、これらをオリゴに添加した。ＰＣＲ増幅によって産生した、上記一次一本鎖ＤＮＡ（３５１塩基）テンプレートの配列は、以下である：
【０２６６】
【化１】
2004513617.tif 000001
ここで、ＰＣＲプライマーは太字でありかつ下線を引かれており、そして複合プライマーは太字であり、ここでＲＮＡ部分は斜字である。
【０２６７】
（ＰＣＲ増幅産物からのｓｓＤＮＡ標的の調製）
増幅のための一本鎖ＤＮＡテンプレートを、プライマーＩＡ００６およびＩＡ００４を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｊ遺伝子の３５１ｂｐセグメントのＰＣＲ増幅によって調製した。プライマーＩＡ００６は、以下の配列を有する２３マーである：ＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡｇＡＴＣＣＧＴ。プライマーＩＡ００４は、以下の配列を有する２６マーである：ＣＧＣＡＴＡＣＧＧＡＡＴＡＧＣＴＴＡＣＣＧＧＴＣＴ。
【０２６８】
ＰＣＲを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ９．０）、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ＮＰ−４０、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、４００ｎＭのプライマーＩＡ００６、４００ｎＭ  ５’−リン酸プライマーＩＡ００４、および０．２μｌのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株の粗製溶解物を含む、１００μｌの反応物中で実施した。改変した「タッチダウンＰＣＲ」プロトコルを、以下のパラメータで使用した：９５℃で５秒間、６８℃で１分間を５サイクル；９４℃で５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を５サイクル；９４℃で５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル；７２℃で１５分間、次いで無期限に４℃で保持。５’位にリン酸を有するプライマーＩＡ００４を合成して、センス鎖がλエキソヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｎｄａｓｅ  ｋｉｔ，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって消化されることから保護した。Ｓｔｒａｎｄａｓｅによる消化を、製造元の推奨に従って、実施した。簡単に言えば、上記のように調製したＰＣＲ産物を、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および０．６容量のイソプロパノールを添加することによって反応混合物から沈澱させ、−２０℃に１時間冷却し、そして微小遠心機で最高速度で３０分間遠心分離した。ＤＮＡペレットを、７５％エタノールで１回洗浄し、次いで８０μｌの水への再懸濁の直前に、風乾した。濃度を、２６０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．から推定し、そして６０単位のλエキソヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｎｄａｓｅ，Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加した。消化を、３７℃で２０分間進行させ、次いでこの反応物を、７５℃で１０分間加熱し、そして４℃に冷却した。インキュベーションを、プログラム可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で実施した。残りのＤＮＡを、ＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、製造元の推奨手順に従い、そしてキットに備えられた緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を使用して、精製した。簡単に言えば、１０容量の緩衝液ＰＮ（Ｑｉａｇｅｎ）を、サンプルに添加した。次いで、全容量をＱｉａｇｅｎスピンカラムに適用し、そして遠心分離した（微小遠心機で６０００ｒｐｍ、１分間）。濾液を処分し、そしてカラムを５００μｌの緩衝液ＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ）で２回洗浄した。次いで、このカラムを、最高速度で３分間の遠心分離によって、徹底的に乾燥させた。ＤＮＡを、５０μｌの緩衝液ＥＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５））（Ｑｉａｇｅｎ）に溶出した。濃度は、２６０ｎｍにおけるＯＤから、約２．５×１０１２コピー／５μｌであると推定された。ゲル分析により、有意な二本鎖ＤＮＡ（全体の半分未満）が残ったが、濃度における誤差が２倍未満であることが明らかとなった。ＤＮＡをＴＥ緩衝液中１０１０コピー／５μｌに希釈した。系列希釈物を、必要に応じてこの１０１０コピーストック溶液から調製した。Ｏ．Ｄ．測定に基づく濃度を、制限希釈ＰＣＲ分析によって確認した。
【０２６９】
（ゲル電気泳動）
増幅産物を、１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３））中のＮｏｖｅｘプレキャスト４−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ｐａｒｔ  ｎｏ．ＥＣ６２２５５）で、Ｎｏｖｅｘ電気泳動装置（ＥＩ９００１−ＸＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ，Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動により分離した。反応混合物（５μｌ）を、１μｌの６×Ｇｅｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（４０％スクロース、０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノール）と混合し、そしてサンプル全体を即座に、各ウェルに充填した。ゲルを、全てのサンプルがゲルに入るまで約５分間、２５０Ｖに供し、そしてこの電圧を、４５分間、１７５Ｖに低下させた。ゲルを、プラスチックプレート間から取り出し、そして１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３））中０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドで染色した。二本鎖ＤＮＡ分子サイズマーカー（Ｈｉ−Ｌｏ  ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ，Ｂｉｏｎｅｘｕｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を、泳動した各ゲルの１つのレーンに含めた。このマーカーは、以下のサイズの１６のフラグメントを含む：５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５５０ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、６０００ｂｐ、８０００ｂｐ、および１００００ｂｐ。代表的に、５０〜２０００ｂｐが、使用されたゲル上で分割され得る。
【０２７０】
（ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションの実施例のためのオリゴヌクレオチドプローブ（ｓｓＤＮＡ産物についてはＩＡ０１０；ｓｓＲＮＡ産物についてはＩＡ０１４）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（アデノシン５’−［γ−３２Ｐ］三リン酸、トリエチルアンモニウム塩、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；ＰＢ１０２１８，＞５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）を使用して、５’末端標識した。プライマーＩＡ０１０は、以下の配列を有する２１マーである：ＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＧＴＧＴ。プライマーＩＡ０１４は、以下の配列を有する３１マーである：ＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧ。標識反応物（総容量５０μｌ）は、７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ
ＤＴＴ、１μｇオリゴ（プライマーＩＡ０１０については１４７ｐｍｏｌ；プライマーＩＡ０１４については１０１ｐｍｏｌ）、２５０μＣｉ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、および３０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含んだ。インキュベーションを、３７℃で３０分間行い、続いてＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。崩壊速度（ｃｐｍ）を、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｍｉｎａｘｉ  Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ４０００  Ｓｅｒｉｅｓ液体シンチレーションカウンターで、１μｌの標識オリゴをＣｈｅｒｅｎｋｏｖ計数することによって、決定した。
【０２７１】
ハイブリダイゼーションを、３０μｌの反応物において実施した。産物ＤＮＡ（またはＲＮＡ）（１０μｌ）を、２０μｌのプローブ混合物に添加した。反応物は、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０６ｃｐｍのプローブ（１４．３日の半減期を使用する崩壊に対応する）を含んだ。６５℃で１５秒間加熱した後に、ハイブリダイゼーションを、４２℃で３０分間進行させ、続いて４℃に冷却した。これらの工程を、加熱したカバーを備えるプログラム可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で実施した。ハイブリダイゼーション反応物の容量全体を、１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３））中の１０％ポリアクリルアミドゲルで、１５０Ｖで３時間電気泳動した。ゲルをガラスプレートから取り出し、プラスチックのラップに包み、そしてオートジオグラフィーフィルム（ＢｉｏＭａｘ  ＭＲ，Ｋｏｄａｋ）に−２０℃で一晩（約１６時間）、２枚の増感紙を用いて曝露した。
【０２７２】
（実施例２：複合プライマーに基づく増幅方法の第１の転写モジュールの第２の説明）
単一の複合プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＴＳＯまたはブロッカーを使用する増幅を実施した。上記のような全ての反応成分を含む反応混合物、および複合プライマー、ＲＮａｓｅ  Ｈ、またはＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような主要な試薬の１つを含まない反応混合物を、１０１０コピーの合成ｓｓＤＮＡ標的（ＩＡ０１０（実施例１に配列が示されている））でスパイクした。全ての反応物を含み、そして標的ｓｓＤＮＡを含まない、陰性コントロール反応物をもまた含めた。標的ＤＮＡ配列の増幅を、上記のように実施した。標的の変性を、７０℃で実施し、そして等熱増幅を、６５℃で実施した。
【０２７３】
この増幅産物を、ゲル電気泳動によって分割した。プライマー、ＲＮａｓｅ  Ｈ、またはＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼを含まない反応混合物においては、増幅産物が検出されなかった。
【０２７４】
線形増幅法のｓｓＤＮＡ産物に対する、プローブＩＡ０１０のハイブリダーゼーションおよびオートラジオグラフィーで、増幅産物の同一性を確認した。この実験における、合成オリゴヌクレオチド標的の線形増幅を、ブロックされていないプロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド（ＩＡ０１５ｂ）を使用して実施した。プロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチドＩＡ０１５ｂは、以下の配列を有する５５マーである：ＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧ。この増幅反応のために使用した標準的な反応成分は、上記に与えられる。最初の変性工程を、７０℃で１０秒間実施した。この反応物を６５℃に冷却し、そしてＢｃａポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈを添加した後に、この温度でさらに３０分間インキュベートした。コントロール反応（ＤＮＡなし、プライマーなし、ＲＮａｓｅ  Ｈなし、Ｂｃａなし）においては、ハイブリダイゼーションが検出されなかった。
【０２７５】
（実施例３：複合プライマーに基づく増幅方法の、プロモーターテンプレートオリゴヌクレオチドに基づく第１の転写モジュール）
プロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）は、以下の２つの必須の配列モチーフを含む：Ｔ７プロモーター配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡｇＧＡＧ））およびｓｓＤＮＡテンプレートに相補的な配列。ＰＴＯの４つのバージョン（ＩＡ０１２、ＩＡ０１２ｂ、ＩＡ０１５、ＩＡ０１５ｂ）を設計した。ＩＡ０１２  ＰＴＯは、６７マーであり、以下の配列を有する：ＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧ。ＩＡ０１２  ＰＴＯは、コアのＴ７プロモーターに加えて、以下の２つの配列を含む：５’伸長（５’−ＧＧＡＡＴＴＣ）、およびプロモーターと標的ＤＮＡ相補配列との間のスペーサー（５’−ＡＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＣ）。ＩＡ０１５は、より短いＰＴＯ（４８マー）であり、５’伸長とスペーサーとの両方を欠く。ＩＡ０１５  ＰＴＯは、以下の配列を有する：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧ。ＩＡ０１２ｂ  ＰＴＯは、スペーサーを含むが伸長を含まない、６０マーである。ＩＡ０１２ｂ  ＰＴＯは、以下の配列を有する：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧ。ＩＡ０１５ｂは、伸長を含むが、スペーサーを含まない。ＩＡ０１５ｂの配列を、実施例２に開示する。キメラオリゴヌクレオチドＩＡ００５、ＩＡ０１９、およびＩＡ０２０以外の全てのプライマーを、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）によって合成し、そしてＰＡＧＥで精製した。
【０２７６】
ＩＡ０１２、ＩＡ０１２ｂ、ＩＡ０１５、およびＩＡ０１５ｂが、ｓｓＤＮＡテンプレートをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに対する基質に転換する能力を、形成したオーバーラップ伸長産物の転写後に生成したＲＮＡの量を、合成オリゴ生成物（ＩＡ００９）とＰＴＯの各々との間で比較することによって、評価した。合成オリゴ生成物ＩＡ００９は、以下の配列を有する１００マーである：ＡＧＴＧＴＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＴＴＴＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＡＣＧＧＡＴＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＧ。オーバーラップ伸長を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１００ｎＭ  ＩＡ００９、１００ｎＭ  ＰＴＯ、および１単位のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、１５μｌの反応物中で実施した。反応を、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼなしで、９５℃に加熱し、次いで１０分間にわたって６０℃に冷却して、実施した。ＤＮＡポリメラーゼの添加後、反応物を、６０℃で３０分間インキュベートした。反応混合物の一部（２．５μ１）を、標準ＲＮＡ転写反応混合物に添加し、そしてこの転写反応物を、ゲル電気泳動によって評価した。
【０２７７】
ＩＡ０１２またはＩＡ０１２ｂのいずれかより有意により多いＲＮＡが、より短いＰＴＯ（ＩＡ０１５、ＩＡ０１５ｂ）を用いて生成した転写基質によって生成された。５’伸長を含むがスペーサーを含まないＰＴＯ（ＩＡ０１５ｂ）は、明らかにより高い収率のＲＮＡを生成した。しかし、全ての場合において、複数の生成物が、主要なＲＮＡバンドに加えて出現した。３’ブロックＰＴＯの改善された性能を実証するために、ＩＡ０１５ｂと同じ配列を有するが、３’の遊離ＯＨを排除するように３’ブロッキング基（ビオチン）を有する、第５のＰＴＯを設計する。ＰＴＯの３’の遊離ＯＨをブロックすることにより、機能的プロモーター配列の、増幅産物への非特異的取り込み（これは、転写産物の非特異的生成をもたらす）を開始する能力が排除される。３’ブロックＰＴＯおよびブロックされていないＰＴＯの、増強された等熱線形増幅における性能を、合成オリゴヌクレオチド標的の増幅から、標準的な条件を使用して、評価した。３’ブロックＰＴＯ（ＩＡ０１５ｃ）は、ＩＡ０１５ｂに匹敵する収率の特異的ＲＮＡを生成したが、バックグラウンドは有意に低かった。陰性コントロール反応物（ＤＮＡテンプレートなし）、および１０１０コピーのオリゴ標的（ＩＡ０１３）を含む反応物を、３０分間、１時間、または２時間、５５℃で、ＩＡ０１５ｂまたはＩＡ０１５ｃのいずれかを鎖置換反応に含めて、鎖置換によって増幅した。３’−ＯＨがブロックされていない場合には、非特異的ＲＮＡが、全ての反応において生成し、そして特異的ＲＮＡバンドの同定をあいまいにした。対照的に、ブロックされたＰＴＯは、主として単一のＲＮＡ産物を生成した。
【０２７８】
（実施例４：複合プライマーに基づく増幅方法の第１の転写モジュールによる、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡのＪ遺伝子配列の増幅）
ＤＮＡを、トリプトン−ＮａＣｌ培地中で一晩増殖させた２５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２（ＡＴＣＣ  １０７９８）から単離した。ゲノムＤＮＡを、リゾチーム消化によって単離し、そしてカオトロピック溶解溶液（Ｂａｃｔｏｚｏｌ  Ｋｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）中に、製造元の推奨する手順に従って、可溶化した。簡単に言えば、細菌を、６０００×ｇで５分間の遠心分離によって、収集した。細胞ペレットを、Ｂａｃｔｏｚｙｍｅ消化緩衝液中に再懸濁させ、そして５０℃で３０分間インキュベートした。得られた溶解物は、この消化の終了時に透明であり、消化されていない細胞の凝集物が全く見られなかった。この溶解物を４容量のＤＮａｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）と混合し、そして１５分間室温でインキュベートした。ＤＮＡを、０．６容量の氷冷エタノールの添加によって、この溶液から沈澱させた。室温で５分間のインキュベーションの後に、沈澱したＤＮＡを、微小遠心機の最高速度で５分間の遠心分離によって、収集した。このＤＮＡペレットを、７５％エタノールで洗浄し、再度遠心分離し、そして頻繁に撹拌しながら５０℃〜５５℃に３０分間加熱することによって、１．５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。得られた溶液を２２ゲージの注射針に繰り返し通して、ＤＮＡをせん断し、そしてこの溶液の粘度を低下させた。１／１０容量の５Ｍ酢酸アンモニウムおよび３容量の氷冷エタノールの添加によって、ＤＮＡが再度沈澱した（ＥＰＩ００５−３５）。−２０℃で１時間のインキュベーションの後に、ＤＮＡを、微小遠心器の最高速度での遠心分離によって、収集した。このペレットを７５％エタノールで洗浄し、再度遠心分離し、そして１５０μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。ＴＥ緩衝液中の２つの希釈物を、Ｏ．Ｄ．測定（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６４０分光計）のために調製し、この測定から、５０μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡが、２６０ｎｍにおいて１のＯ．Ｄ．を生じると仮定することによって、、ＤＮＡ濃度を算出した。これら２つの希釈物のＤＮＡ濃度は、２４．２μｇ／１０μｌおよび２４．６μｇ／１０μｌであった。これら２つの測定値の平均（２４．４μｇ／１０μｌ）は、約２．５×１０９のゲノムコピー／５μｌに対応する（５ｆｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ＝１コピー）。
【０２７９】
（ＤＮＡ増幅）
ＤＮＡを、ＴＥ緩衝液中で、１０９、１０８または１０７コピー／５μｌに連続的に希釈し、９５℃５分間の加熱によって変性した後、氷上で急速に冷却した。一本鎖テンプレートＤＮＡもまた、１０９コピー／５μｌに希釈した。反応物を、ＤＮＡなし、１０７、１０８、１０９または２．５×１０９コピーのゲノムＤＮＡを含むよう構築した。
【０２８０】
増幅を、以下を含む１５μｌ反応物中で実施した：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．８ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＩＴＰ（ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、６％ＤＭＳＯ、８％グリセロール、１００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、０．６単位／μｌ組換えリボヌクレアーゼインヒビター（ｒＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、５μＭ複合プライマーＩＡ００５（実施例１において配列を開示する）、２００ｎＭ  プロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃ（実施例１において配列を開示する）。反応物を、２つの酵素を除いた全ての成分で構築した。プログラム可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で９９℃１０秒間の加熱の後、反応物を６０℃３０分間でインキュベートした。６０℃に達したときに、０．６μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ（５Ｕ／μｌのストック溶液から、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３０％グリセロール中に希釈した０．０５単位）（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および１．０μｌ  Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．０単位、Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加した。６０℃のインキュベーションの最後に、反応物を４℃に冷却した。鎖解離産物の５．０μｌ容量を各ＲＮＡ転写反応物（総容量２０μｌ）に添加した。ＲＮＡ転写を標準的な条件を用いて、反応容量を２０μｌまでスケールアップして実施して、直接のゲル分析（５μｌ）およびプローブハイブリダイゼーション（１０μｌ）のために十分な材料を提供した。
【０２８１】
指定された合成一本鎖標的の増幅と異なり、複合プライマーを基にした本発明の方法に従うゲノムＤＮＡの増幅は一般に、指定された停止の形成を、指定された３’末端を有するｓｓＤＮＡ産物の形成に必要とする。プライマー伸長のための指定された停止の形成を、阻害剤を用いて達成し得、この阻害剤は、標的鎖上の指定された部位にハイブリダイズし、ポリメラーゼによって置換され得ない。あるいは、本実施例におけるように、ＧＣに富んだ配列のプライマー部位の上流に、プライマー伸長のための停止点を提供し、従って、指定された３’末端を有するｓｓＤＮＡ産物の形成を導く。
【０２８２】
本発明の等温性の増大された線形増幅方法（複合プライマーを基にした方法の最初の転写モジュール）を用いた、ゲノムＤＮＡの指定された配列の増幅が達成された。ｓｓＲＮＡ産物が、特定のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることが見出された。
【０２８３】
（実施例５：複合プライマーを基にした増幅方法の最初の転写モジュールの効率に対する複合プライマー設計の効果の評価）
複合プライマーに基づく、本発明の増幅方法の最初の転写モジュールにおける、３つの複合プライマーのそれぞれの効率を評価した。等温性の線形増幅を、以下を含む１５μｌの反応物中で実施した：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．８ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＩＴＰ（ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、６％  ＤＭＳＯ、８％グリセロール、１００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、０．６単位／μｌ組換えリボヌクレアーゼインヒビター（ｒＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、５μＭ複合プライマー、２００ｎＭプロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃ。ＰＴＯ  ＩＡ０１５Ｃの配列を実施例１において開示する。複合プライマーＩＡ００５（２０マー）の配列を実施例１において開示する。英数字名のついた他の複合プライマー配列は、以下の通りである：
ＩＡ０１９（２０マー）ＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵＣＣＡＧＴＧＴ
ＩＡ０２０（２１マー）ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵＣＣＡＧＴＧＴ。
英数字名のついていない４つの他の複合プライマー配列を用いた。これらの配列は、それぞれ以下の通りである：
（１）ＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵＣＣＡＧＴＧＴ
（２）ＧＡＣＧＡＴＧＣＧＵＣＴＣＣＡＧＴＧＴ
（３）ＧＡＣＧＧＡＴＧＣＧＧＵＣＴＣＣＡＧＵＧＴ
（４）ＧＡＣＧＧＡＴＧＣＧＧＵＣＴＣＣＡＧＵＧＵＣＣＡ。
【０２８４】
これらの複合プライマーは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）により合成された。オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分を、５’シリル保護基を酸不安定性の２’−オルトエステル保護基（２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテルまたは「２’−ＡＣＥ」（Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１１８２０−１１８２１（１９９８）およびＳｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（印刷中））と合わせて用いて合成した。プライマーは、ＰＡＧＥで精製したものであった。
【０２８５】
反応物を、２つの酵素を除いた全ての成分で構築した。プログラム可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で７０℃１０秒間の加熱の後、反応物を５５℃〜６５℃まで冷却した。低い方の温度に達したときに、０．０５単位のＲＮａｓｅ  Ｈ（５Ｕ／μｌのストック溶液から、希釈／保存溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．５）、３０％グリセロール）（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＲＮａｓｅ  Ｈ、  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて希釈した）（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および２．０単位のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加した。反応物を５５℃〜６５℃３０分間でインキュベートした。インキュベーションの終りに、ＲＮＡ転写まで反応物を４℃に冷却した。ＲＮＡ転写を３７℃３時間で、以下を含む１０μｌ反応物中で実施した：上記線形増幅反応物２．５μｌおよび４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５．０ｍＭ
ＤＴＴ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３ｍＭの各ｒＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、７．５％  ＤＭＳＯ、１単位／μｌ  ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および２０単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
【０２８６】
複合プライマーの各々を用いて生じた増大された線形増幅の産物を、ゲル電気泳動によって分離した。複合プライマーを、標的鎖上の同じ部位でハイブリダイズするよう設計し、これらは、３’末端のデオキシヌクレオシドの数が異なった。ＲＮＡ産物の最大収量は、プライマーＩＡ０２０を用いて生じ、次にＩＡ００５およびＩＡ０１９で等しく多く生じた。他の４つの複合プライマーは、ＲＮＡ産物をより少ない量で生じた。等温性の線形増幅工程についての最適な温度は、予期されたように、異なるプライマーについて異なった。
【０２８７】
（実施例６：複合プライマーを基にした増幅方法の最初の転写モジュールおよび遺伝子型特異的な複合プライマーを用いた遺伝子型決定）
ゲノムＤＮＡを、試験細胞から前記実施例に記載される方法を用いるか、当業者に公知の他の方法を用いて単離する。種々の生物（細菌、ウイルス、真菌、酵母、植物、および動物を含むが、これらに限定されない）を遺伝子型決定する。遺伝子型特異的プライマーを、特定の核酸配列の１つの遺伝子型にハイブリダイズする３’末端ヌクレオチドを含むか、または遺伝子型の対応物にハイブリダイズするかのいずれかで設計する。特定の遺伝子型を決定する配列変異は、点変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠損等であり得る。
【０２８８】
指定された標的核酸配列の増幅を、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム配列の増幅について、上記実施例で記載されるように実施する。遺伝子型特異的プライマーおよびプルーフリーディング活性を欠くＤＮＡポリメラーゼを用いることで、増幅産物の生成が、指定された遺伝子型の標的配列の存在を示す。プライマーの３’末端の、標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを阻止する配列変異は、増幅を阻止する。この増幅産物は、１本鎖核酸配列を検出する、当該分野で公知の種々の方法のいずれか１つによって検出される。例えば、特定の標識オリゴヌクレオチドプローブの、増幅産物へのハイブリダイゼーションは、ゲル電気泳動によって検出される。
【０２８９】
二倍体細胞の遺伝子型決定が必要な場合（例えば、ホモ接合体またはヘテロ接合体の遺伝子型の決定）に、特定の核酸標的配列の、野生型および変異遺伝子型または１つの遺伝子型および他の遺伝子型のいずれかについて設計された特定のプライマーを用いた増幅を実施することが可能である。特異的プライマーを用いた増幅反応を、分離した反応容器中で実施する。１反応のみのチューブ中の増幅産物またはそれ以下の増幅産物を検出することで、ホモ接合体遺伝子型（すなわち、野生型または変異ホモ接合体のいずれか）が示される。両方の増幅反応物中の増幅産物を検出することで、ヘテロ接合体遺伝子型が示される。
【０２９０】
（実施例７：複合プライマーを基にした増幅方法および遺伝子型特異的プローブハイブリダイゼーションを用いた遺伝子型決定）
ハイブリダイゼーションによる配列決定の方法を、前記実施例において記載する。特異的プローブのハイブリダイゼーションによる配列同一性の決定において、本発明の方法により生じる増幅産物が、一本鎖でありかつ特異的プローブのハイブリダイゼーションにおいて用いることが容易に可能である限り、本発明の等温方法を用いることは特に有用である。指定された遺伝子型に対し特異的なプローブを、当該分野で公知の方法を用いて設計する。一方の遺伝子型の増幅によって生じた増幅産物に対してであって他方に対してではない選択的プローブへのハイブリダイゼーションを支持するハイブリダイゼーション基準を決定することが可能である。１ヌクレオチドほどの配列変異でもプローブハイブリダイゼーションを阻止し得る。以下の因子は、ハイブリダイゼーション基準に考慮される：プローブ長、ハイブリダイゼーション反応の温度、および緩衝液組成（特に、２価イオン濃度）。分析に用いられるプローブは、溶液中にあり得るか、または固相表面に結合され得る。さらに、プローブは、直接標識され得るか、または特定の結合対のメンバーに結合され得、従って、直接または間接的に標識され得る特定の結合対の別のメンバーに特異的に結合し得る。
【０２９１】
ゲノムＤＮＡを、試験試料から、当該分野で公知の方法によるかまたは上記実施例で記載のように単離する。試験ＤＮＡを、記載される増幅成分、標的特異的複合プライマーおよびプロプロモーター配列（例えば、ＰＴＯ）と合わせる。合わせたものを、本明細書中に記載されるようなインキュベーション条件に供して、一本鎖ＲＮＡ増幅産物を生じる。増幅産物の遺伝子型特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを、溶液中または遺伝子型特異的プローブが結合した固相において実施する。増幅産物が１本鎖なので、この産物は、固相（例えば、スライドガラス）に結合して、空間的に分離した特異的プローブのアレイ（すなわち、ジーンチップ）を生成するのに、理想的に適している。あるいは、この固相は、特異的プローブが結合した粒子を含む。プローブの増幅産物へのハイブリダイゼーションの検出を、当該分野で公知の種々の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に開示）によって実施する。この特異的プローブを標識して、ハイブリダイゼーションに起因する標識のスペクトル特性の変化を検出し、そしてコンピュータアルゴリズムにより記録する。
【０２９２】
特異的プローブの増幅産物へのハイブリダイゼーションに起因する粒子の会合をまた、プローブハイブリダイゼーションの検出に使用する。標識された増幅産物が生じ、そしてこの産物の固相表面上に固定化されたプローブへのハイブリダイゼーションを検出し、そしてコンピュータアルゴリズムにより記録する。標識された増幅産物の生成を、４つのｒＮＴＰの１つを、標識されたｒＮＴＰアナログに置換して、標識化ｒＮＴＰを、転写工程の間に取りこむことによって実施する。この標識は、色素、または低分子（例えば、ビオチン）であり、この低分子は、次いで特異的結合物（例えば、標識化ストレプトアビジン）に結合することによって検出される。固体表面上へのプローブハイブリダイゼーションを検出する方法は、当該分野で公知である。
【０２９３】
（実施例８：複合プライマーを基にした増幅方法を用いたｒＳＳＣＰ（ＲＮＡ
Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（一本鎖ＲＮＡ高次構造多型）による遺伝子型決定）
遺伝子型決定を、本明細書中に記載される複合プライマーを基にした方法を用いた特異的標的核酸配列の増幅および一本鎖ＲＮＡ産物の電気泳動バンドパターン（これは、一本鎖高次構造を反映する）の決定によって実施する。配列変化を検出するためのＳＳＣＰの使用は、広く用いられている。遺伝子型に特異的な一本鎖高次構造を、試料をゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動に供することによって決定する。本発明の方法に従う標的核酸配列の増幅による一本鎖産物の生成は、この増幅方法にｒＳＳＣＰ分析をあわせることによって遺伝子型決定に特に適した方法を付与する。
【０２９４】
精製された試験ゲノムＤＮＡを、上記のような本発明の増幅方法の構成成分、ならびに標的特異的複合プライマーおよびプロプロモーター配列（例えば、ＰＴＯ）と合わせる。合わせたものを、標的配列の等温増幅の条件に供する。増幅産物を含むこの反応混合物を、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動のいずれかに、当該分野で公知の機器および条件を用いて供する。増幅産物の電気泳動のバンドパターンを決定する。オリゴヌクレオチド産物の可視化をインターカレーター色素を含有させることで達成する。増幅産物の電気泳動パターンを、既知の遺伝子型の細胞から得た標的核酸配列の増幅によって生じた増幅産物の電気泳動パターンと比較する。電気泳動移動度のパターンにおける任意の変化は、配列変異性を示す。本発明の増幅方法とｒＳＳＣＰとの組み合わせは、指定された標的配列の配列多型の発見および事前に指定された遺伝子型の検出の両方のための簡単な方法を提供する。既知の核酸配列または指定された遺伝子型の電気泳動パターンを事前に決定し得、そして試験ＤＮＡの増幅産物により生じるパターンを、遺伝子型決定のために、既知のパターンと比較する。
【０２９５】
（実施例９：第１および第２の転写モジュールに関連する複合プライマーを基にした方法を用いたＥ．ｃｏｌｉ  Ｊ−遺伝子標的配列の増幅）
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＪ−遺伝子の指定された配列の増大された等温性の線形増幅後にこの配列の等温性の指数関数的増幅を行ってｓｓＲＮＡの複数のコピーを生じることを記載する。
【０２９６】
（ｉ）最初の例において、増大された線形の等温性増幅のＲＮＡ産物を、１つの複合プライマーの３つの異なる設計を用いて生成した。３つの複合プライマーの各々の本発明の増幅方法における効率を評価した。
【０２９７】
等温性の線形増幅方法を、以下を含む１５μｌの反応物中で実施した：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．８ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＩＴＰ（ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、６％  ＤＭＳＯ、８％グリセロール、１００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、０．６単位／μｌ組換えリボヌクレアーゼインヒビター（ｒＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、５μＭ複合プライマー（ＩＡ００５またはＩＡ０１９またはＩＡ０２０）、２００ｎＭプロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃ。全ての反応物は、１０９コピーの３５１ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡテンプレートを有した。反応物を、２つの酵素を除いた全ての成分で構築した。
【０２９８】
プログラム可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で７０℃１０秒間の加熱の後、反応物を５５℃〜６５℃まで冷却した。複合プライマーＩＡ００５を６０℃まで冷却し、複合プライマーＩＡ０１９およびＩＡ０２０を５５℃、６０℃および６５℃までそれぞれ個別の反応物中で冷却した。低い方の温度に達したときに、０．０５単位のＲＮａｓｅ  Ｈ（５Ｕ／μｌのストック溶液から、希釈／保存溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３０％グリセロール）を用いて希釈した（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＲＮａｓｅＨ、  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））および２．０単位のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加した。反応物を５５℃〜６５℃３０分間でインキュベートした。インキュベーションの終りに、ＲＮＡ転写まで反応物を４℃に冷却した。ＲＮＡ転写を３７℃３時間で、以下を含む１０μｌ反応物中で実施した：上記線形増幅反応物２．５μｌおよび４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３ｍＭの各ｒＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、７．５％  ＤＭＳＯ、１単位／μｌ  ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および２０単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
【０２９９】
各複合プライマーを用いて生じた増大された線形増幅の産物を、ゲル電気泳動により分離した。３つの複合プライマーを、標的鎖の同じ部位にハイブリダイズするよう設計し、これらは、３’末端のデオキシヌクレオチドの数が異なった。ＲＮＡ産物の最大収量は、プライマーＩＡ０２０を用いて生じた。等温性の線形増幅工程についての最適な温度は、予想されたように、異なるプライマーによって異なった。プライマー設計のさらなる最適化は、増幅の効率を増大すると期待された。
【０３００】
（ｉｉ）上記のように、プライマーＩＡ０２０を用いて生じた線形増幅の産物を、次いで等温性の指数関数的増幅に供した。
【０３０１】
プライマーＩＡ０２０を用いた５５℃での上記線形増幅からの反応混合物（ｓｓＤＮＡ産物を含む）を、１：１０に希釈し、そして２．５μｌのこの希釈液を、以下を含む５μｌの転写混合物に添加した：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３ｍＭの各ｒＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、７．５％  ＤＭＳＯ、１単位／μｌ  ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および２０単位  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｄＮＴＰｓ（１．０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．８ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＩＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、ＭＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ）、ＲＮａｓｅＨ（０．０５Ｕ）、ＰＴＯ  ＩＡ０１５ｃ（２００ｎＭ）ならびにプライマーＩＡ０２４（ｌμＭ）。反応物を３７℃で、それぞれ０、５、１０、２０、４０および６０分インキュベートした。これらの時点におけるアリコートをゲル電気泳動（５〜２０％ポリアクリルアミドゲル、Ｎｏｖｅｘ）に供し、このゲルをＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＴＭを用いて染色し、産物のバンドをイメージングシステムを用いて可視化した。産物は、２０分の反応の後に明確に検出可能になった。
【０３０２】
（ｉｉｉ）反応効率を最適化する条件の決定を図って、以下の条件／因子を試験した：
Ｉ．上記プロトコル中のＲＮａｓｅＨは、耐熱性酵素であった。この酵素のＥ．ｃｏｌｉのＲＮａｓｅＨ（これは、耐熱性ではなく、３７℃でより活性であり得る）との置換は、増幅条件を改善することが想定された。
【０３０３】
ＩＩ．特異性改善（スメアを減少する）のために、逆転写酵素の濃度を下げる。
【０３０４】
反応物を上記のようにセットアップし、以下の改変を加えた：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（０．０８Ｕ）およびＭＭＬＶ逆転写酵素（２５Ｕ）を、上記プロトコル中のＲＮａｓｅＨおよび逆転写酵素の代りに用いた。２つの標的配列を、これらの条件を用いて試験した：上記のようなＪ遺伝子標的配列、およびまた合成一本鎖ＤＮＡ標的（ＩＡ００９）。これらの反応を６０分間３７℃で実施した。増幅効率は、これらの条件下で改善されたようであり、指定された産物のバンドをより生じ、かつ全体にわたるストリーキング（これは、高い非特異的産物の生成を示す）を減じた。
【０３０５】
（配列）
本実施例において用いた配列は、以下の通りである：
（複合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマー）
ＩＡ００５  ｒ｛ＡＣｇｇＡＵｇＣｇｇＵＣＵＣＣ｝ＡｇＴｇＴ（２０マー）
ＩＡ０１９  ｒ｛ＡＣｇｇＡＵｇＣｇｇＵＣＵＣＣＡｇ｝ＴｇＴ（２０マー）
ＩＡ０２０  ｒ｛ｇＡＣｇｇＡＵｇＣｇｇＵＣＵ｝ＣＣＡｇＴｇＴ（２１マー）
これらのプライマーは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）により合成された。オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分を５’−シリル保護基を酸不安定性の２’−オルトエステル保護基（２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテルまたは「２’−ＡＣＥ」（Ｓｃａｒｉｎｇｅ、ＳＡ、ＦＥ  ＷｉｎｃｏｔｔおよびＭＨ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１１８２０−１１８２１（１９９８）およびＳｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、印刷中））と合わせて用いて合成した。オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
【０３０６】
複合オリゴヌクレオチド以外の全てのオリゴヌクレオチドは、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）により合成された。
【０３０７】
（ＰＴＯ）
ＩＡ０１５ｃ（５５マー）：
ｇｇＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣｇＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡｇｇｇＡｇＡｇＣｇｇＴＡＣｇＣＴｇＡＴＣＡＡＡｇＡＴＣＣｇＴｇ−ビオチン
（Ｊ−遺伝子標的配列（Ｊ−遺伝子由来のＰＣＲ産物））
【０３０８】
【化２】
2004513617.tif 000002
ＰＣＲプライマーを太字／下線で示す。キメラプライマーを太字で示し、ＲＮＡ部分をイタリックで示す。
【０３０９】
（合成オリゴ鎖置換産物（ＩＡ００９））
ＩＡ００９（１００マー）：
ＡｇＴｇＴＣＣＡＣＣＣＣＴｇＣＣｇｇｇＡＴＴＴＴＡＡＣｇｇＡＣＡｇＣｇＴＴＴＴｇＣＴｇＣｇＣＴＣＡＡＣＡＣｇＡＣＣＡＴｇＡＣＣＡＴｇＡＣＡＴＴＴｇＴＴｇＣＡＣｇｇＡＴＣＴＴＴｇＡＴＣＡｇＣｇＴＡＣＣｇ
以上の本発明は、図示および実施例によって、理解を明確にする目的でいくぶん詳細に記載されるが、いくらかの改変および修飾が実施され得ることが当業者に理解される。従って、本明細書中の記載および実施例は、付随する特許請求の範囲によって記述される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、ブロッカー配列成分を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、ブロッカー配列成分を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図１Ｃ】
図１Ｃは、ブロッカー配列成分を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図１Ｄ】
図１Ｄは、ブロッカー配列成分を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図１Ｅ】
図１Ｅは、ブロッカー配列成分を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図１Ｆ】
図１Ｆは、ブロッカー配列成分を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図２Ａ】
図２Ａは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド配列を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド配列を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図２Ｃ】
図２Ｃは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド配列を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図２Ｄ】
図２Ｄは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド配列を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図２Ｅ】
図２Ｅは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド配列を終止ポリヌクレオチドとして使用する複合プライマー等温増幅プロセス工程の概略図である。
【図３Ａ】
図３Ａは、テンプレートスイッチを使用するＤＮＡ標的の単一プライマー等温増幅の工程の概略図である。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、テンプレートスイッチングを使用するＤＮＡ標的の単一プライマー等温増幅の工程の概略図である。
【図４Ａ】
図４Ａは、テンプレートスイッチングを使用するＲＮＡ標的の単一プライマー等温増幅の工程の概略図である。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、テンプレートスイッチングを使用するＲＮＡ標的の単一プライマー等温増幅の工程の概略図である。
【０３１０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Nugen Technologies, Inc.
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR
TRANSCRIPTION-BASED NUCLEIC ACID AMPLIFICATION
<130> F1-0236W30
<140> JP 2002-506251
<141> 2001-06-26
<150> US 60/277,748
<151> 2001-03-21
<150> US 60/213,908
<151> 2000-06-26
<160> 21
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Chimeric IA005 RNA-DNA Primer
<400> 1
acggaugcgg ucuccagtgt                                                  20
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Guanine has biotin molecule
attached. IA015C
<400> 2
ggaattctaa tacgactcac tatagggaga gcggtacgct gatcaaagat ccgtg           55
<210> 3
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA013
<400> 3
cggtacgctg atcaaagatc cgtgcaacaa atgtcatggt catggtcgtg ttgagcgcag      60
caaaacgctg tccgttaaaa tcccggcagg ggtggacact ggagaccgca tccgt          115
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer
<400> 4
cggtacgctg atcaaagatc cgtgcaacaa atgtcatggt catggtcgtg ttgagcgcag      60
caaaacgctg tccgttaaaa tcccggcagg ggtggacact ggagaccgca tccgtcttgc     120
gggcgaaggt gaagcgggcg agcatggcgc accggcaggc gatctgtacg ttcaggttca     180
ggttaaacag cacccgattt tcgagcgtga aggcaacaac ctgtattgcg aagtcccgat     240
caacttcgct atggcggcgc tgggtggcga aatcgaagta ccgacccttg atggtcgcgt     300
caaactgaaa gtgcctggcg aaacccagac cggtaagcta ttccgtatgc g              351
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA006
<400> 5
cggtacgctg atcaaagatc cgt                                              23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA004
<400> 6
cgcatacgga atagcttacc ggtct                                            25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA010
<400> 7
atgtcatggt catggtcgtg t                                                21
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA014
<400> 8
ctcaacacga ccatgaccat gacatttgtt g                                     31
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA015b
<400> 9
ggaattctaa tacgactcac tatagggaga gcggtacgct gatcaaagat ccgtg           55
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacteriophage
<400> 10
taatacgact cactataggg aggag                                            25
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA012
<400> 11
ggaattctaa tacgactcac tatagggaga gatcgagtag ctccggtacg ctgatcaaag      60
atccgtg                                                                67
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA015
<400> 12
taatacgact cactataggg agagcggtac gctgatcaaa gatccgtg                   48
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA012b
<400> 13
taatacgact cactataggg agagatcgag tagctccggt acgctgatca aagatccgtg      60
<210> 14
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: IA009 (Single Stranded DNA)
<400> 14
agtgtccacc cctgccggga ttttaacgga cagcgttttg ctgcgctcaa cacgaccatg      60
accatgacat ttgttgcacg gatctttgat cagcgtaccg                           100
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Chimeric DNA/RNA Primer.  IAO19
<400> 15
acggaugcgg ucuccagtgt                                                  20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Chimeric DNA/RNA Primer.  IAO20
<400> 16
gacggaugcg gucuccagtg t                                                21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Chimeric DNA/RNA Primer.
<400> 17
gcaagacgga ugcggucucc agtgt                                            25
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Chimeric RNA/DNA Primer.
<400> 18
gacgatgcgu ctccagtgt                                                   19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Chimeric RNA/DNA Primer.
<400> 19
gacggatgcg guctccagug t                                                21
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer: Chimeric RNA/DNA Primer.
<400> 20
gacggatgcg guctccagug ucca                                             24
<210> 21
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Primer
<400> 21
atcgagtagc tc                                             12