【手続補正書】
【提出日】平成16年4月28日(2004.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
i)     1個以上の内因性薬剤排出ポンプ蛋白質を欠損した変異株である酵母宿主細胞；及び
ii)    標的異種蛋白質のコーディング配列を含むベクターであって、当該配列が、前記宿主細胞の形質転換及び染色体組込みの際に、前記宿主細胞膜に前記標的機能蛋白質の過剰発現を生じさせるプロモーターの制御下にあり、ここで、前記標的機能蛋白質が宿主細胞膜内で過剰発現し、かつ、薬剤スクリーニングに適用しうる、前記ベクター、
を含む蛋白質発現系。
【請求項２】
前記宿主細胞がSaccharomyces属の酵母細胞である、請求項1に記載の蛋白質発現系。
【請求項３】
前記宿主細胞がSaccharomyces cerevisiae AD1-8u-株である、請求項1又は2に記載の蛋白質発現系。
【請求項４】
前記宿主細胞が、その通常細胞膜と融合する能力が温度感受性であるところの分泌小胞の形成を引き起こす変異体を含む、前記いずれかの請求項に記載の蛋白質発現系。
【請求項５】
前記宿主細胞がAD1-8u-のsec6-4 変異株である、請求項4に記載の蛋白質発現系。
【請求項６】
前記標的蛋白質の前記コーディング配列が、ゲノム上の定位置で宿主細胞に組み込まれる、請求項1に記載の蛋白質発現系。
【請求項７】
前記コーディング配列が、異種標的蛋白質又はその機能的断片若しくはその変異体の天然コーディング配列全体を含む、請求項1に記載の蛋白質発現系。
【請求項８】
前記標的異種膜蛋白質が、真菌において多剤耐性に関わるポンプ蛋白質、P糖蛋白、嚢胞性繊維症膜貫通調節因子その他薬剤耐性付与の役割を担うヒト、動物、植物又は微生物由来の細胞膜蛋白質から成る群から選ばれる薬剤排出ポンプ蛋白質である、請求項6又は7に記載の蛋白質発現系。
【請求項９】
前記標的異種膜蛋白質が、薬剤排出ポンプ蛋白質である、請求項1〜8のいずれか１項に記載の蛋白質発現系。
【請求項１０】
前記標的異種膜蛋白質が、Candida albicans Cdr1p及びCdr2p由来並びにCandida galbrata Cdr1p 及び Pdh1pから選ばれる、請求項9に記載の蛋白質発現系。
【請求項１１】
前記標的異種膜蛋白質が、前記宿主細胞から欠損されている膜蛋白質のクラスとは異なるクラスの蛋白質である、請求項1〜8のいずれか１項に記載の蛋白質発現系。
【請求項１２】
前記標的異種膜産物が、Candida albicans BenRP及びErg11pから選ばれる、請求項11に記載の蛋白質発現系。
【請求項１３】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項1に記載の蛋白質発現系。
【請求項１４】
前記プラスミドベクターが大腸菌内で複製できる要素を含む、請求項13に記載の蛋白質発現系。
【請求項１５】
前記プラスミドベクターがpABC3である、請求項14に記載の蛋白質発現系。
【請求項１６】
前記プロモーターがSaccharomyces cerevisiae のプロモーターである、請求項1に記載の蛋白質発現系。
【請求項１７】
前記プロモーターがS. cerevisiae のPDR5、PMA1、CTR3、ADH1、PGK及びGAL 並びに細菌 tet0 プロモーター及びtet0::ScHOP1制御性カセットから成る群から選ばれる、請求項16に記載の蛋白質発現系。
【請求項１８】
前記プロモーターがPDR5 プロモーターである、請求項17に記載の蛋白質発現系。
【請求項１９】
前記Saccharomyces プロモーターが、前記宿主細胞膜内の前記標的蛋白質コーディング配列の過剰発現を誘導するように転写調節因子の制御下にある、請求項16〜18のいずれか１項に記載の蛋白質発現系。
【請求項２０】
前記転写調節因子がPdr1-3p 転写調節因子である、請求項19に記載の蛋白質発現系。
【請求項２１】
以下のステップ：
i)   1個以上の薬剤排出ポンプ蛋白質を欠損した変異株を含む酵母宿主細胞の染色体DNAを、標的異種膜蛋白質コーディング配列を含むDNAで形質転換し、ここで前記コーディング配列は、そのプロモーターが宿主細胞膜に標的機能蛋白質を過剰発現させることを促す、宿主プロモーターの制御下にあり、ここで、前記標的機能蛋白質は、宿主細胞膜に過剰に発現し、そして薬剤スクリーニングに適用しうるものとなり；
ii)    前記宿主細胞周辺又は前記形質転換した宿主株由来の細胞膜分画周辺に、少なくとも1の候補化合物を導入し；そして
iii)   前記候補化合物の、前記宿主細胞の増殖及び/又は生存及び/又は前記標的膜蛋白質が関与する特異的な生化学若しくは生理学機能に対する影響があれば、それを測定し；そして又は前記候補化合物と前記標的膜蛋白質との結合を測定する、
を含む医薬又は農薬として有用な薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞がSaccharomyces属の酵母である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞がSaccharomyces cerevisiae AD1-8u-株である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞がAD1-8u-株のsec6-4 変異株である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的異種膜蛋白質が薬剤排出ポンプ蛋白質である、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的異種膜蛋白質が、真菌における多剤耐性に関わるポンプ蛋白質、P糖蛋白、嚢胞性繊維症膜貫通調節因子その他薬剤耐性付与の役割を担うヒト、動物、植物または微生物由来の細胞膜蛋白質から成る群から選ばれる薬剤排出ポンプ蛋白質である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的膜蛋白質が薬剤排出ポンプ蛋白質であり、かつ、前記候補化合物が排出ポンプ阻害剤である、請求項21〜26のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記コーディング配列及びプロモーターが、プラスミドベクターを介して前記宿主細胞に導入される、請求項21に記載の方法。
【請求項２９】
前記プラスミドベクターが大腸菌内での複製を可能にする要素を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記プラスミドベクターがpABC3である、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロモーターがSaccharomyces cerevisiae のプロモーターである請求項28〜30のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロモーターがS. cerevisiae のPDR5、PMA1、CTR3、ADH1、PGK及びGAL 並びに細菌 tet0 プロモーター及びtet0::ScHOP1制御性カセットから成る群から選ばれる、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記プロモーターがPDR5 プロモーターである、請求項31又は32に記載の方法。
【請求項３４】
前記Saccharomyces のプロモーターが、前記宿主細胞膜への前記標的蛋白質コーディング配列の過剰発現を誘導するように転写調節因子の制御下にある、請求項31〜33のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記転写調節因子がPdr1-3p 転写調節因子である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
請求項21〜35のいずれか１項に記載の方法及び請求項1〜20のいずれか１項に記載の蛋白質発現系に使用される本書に定義されるpABC3 ベクター。
【請求項３７】
請求項21〜35のいずれか１項に記載の方法、及び請求項1〜20のいずれか１項に記載の蛋白質発現系を使用して同定された生理活性な、医薬又は農薬化合物。
【請求項３８】
前記化合物が化合物ライブラリーから得られた、請求項37に記載の化合物。
【請求項３９】
本書に定義されるKN20を含む、請求項37又は38に記載の化合物。
【請求項４０】
抗真菌剤として適した、本書に定義されるKN20を含む化合物。
【請求項４１】
好適な担体又は賦形剤とともに本書に定義される化合物KN20を含む抗真菌剤組成。
【請求項４２】
多剤排出機構により輸送されるfluconazoleその他の異物から成る群から選ばれる既知の抗真菌成分と混合された、本書に定義される化合物KN20を含む抗真菌剤組成。
【請求項４３】
請求項21〜35のいずれか１項に記載の方法及び請求項1〜20のいずれか１項に記載の蛋白質発現系により製造された精製膜蛋白質。
【請求項４４】
以下の：
(i)    1以上の天然薬剤排出ポンプ蛋白質を欠損させた変異株を含む宿主細胞；
(ii)   標的異種蛋白質のコーディング配列を含むベクターであって、前記配列が、前記宿主細胞の形質転換及び染色体組込みにより宿主細胞膜に標的機能性蛋白質の過剰発現を生じさせるプロモーターの制御下にあり、ここで前記標的機能性蛋白質は、宿主細胞膜内で過剰に発現され、そして薬剤スクリーニングに適用しうる；そして
(iii)  前記形質転換及び薬剤スクリーニング手順を実行するための説明書、
を含む、医薬又は農薬として有用な薬剤のスクリーニング用キット。
【請求項４５】
前記宿主細胞が、S. crevisiae のAD1-8u-株を含め、そして前記ベクターがpABC3であり、そしてPDR5 プロモーター及び異種の薬剤排出ポンプ蛋白質コーディング配列を含む、請求項44に記載のキット。
【請求項４６】
前記ポンプ蛋白質がC. albicans のCdr1p、Cdr2p、BenRp、Erg11p並びにC. galbrata のCdr1p及び Pdh1pから成る群から選ばれる、請求項44又は45に記載のキット。