(57)【要約】  細胞の癌化に関与する多数のタンパク質と相互作用する単一のタンパク質を腫瘍マーカとする癌の検査方法を提供する。  細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする癌の検査方法。
【請求項２】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とする請求項１に記載の癌の検査方法。
【請求項３】
前記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２に記載の癌の検査方法。
【請求項４】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードするmRNAを定量することを特徴とする請求項１に記載の癌の検査方法。
【請求項５】
細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする細胞の足場依存性の評価方法。
【請求項６】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とする請求項５に記載の細胞の足場依存性の評価方法。
【請求項７】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードするmRNAを定量することを特徴とする請求項５に記載の細胞の足場依存性の評価方法。
【請求項８】
細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする細胞のアノイキス抵抗性の評価方法。
【請求項９】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とする請求項８に記載の細胞のアノイキス抵抗性の評価方法。
【請求項１０】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードするmRNAを定量することを特徴とする請求項８に記載の細胞のアノイキス抵抗性の評価方法。
【請求項１１】
細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする細胞の浸潤性の評価方法。
【請求項１２】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とする請求項１１に記載の細胞の浸潤性の評価方法。
【請求項１３】
前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードするmRNAを定量することを特徴とする請求項１１に記載の細胞の浸潤性の評価方法。
【請求項１４】
細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定するための試薬を含むことを特徴とする癌の検査用キット。
【請求項１５】
前記試薬は、前記チップの抗体を含むことを特徴とする請求項１４に記載の癌の検査用キット。
【請求項１６】
前記試薬は、前記チップのモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項１４に記載の癌の検査用キット。
【請求項１７】
ユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の抗体からなる癌の検査薬。
【請求項１８】
細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とするユビキチン−プロテオソーム系の異常の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体試料の検査技術に係り、特に癌の検査方法、癌の検査用キット、及び癌の検査薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が癌化しているか否かを検査する場合、細胞内に「腫瘍マーカ」が存在するか否かが検査される。近年、上皮成長因子受容体(HER2 : human epidermal growth factor receptor-2あるいはErbB2)やエストロゲン受容体α(ERα)等が、癌細胞の悪性度に応じて発現量が変化する腫瘍マーカとして注目されている。例えば、乳癌の手術後には、採取された細胞内のHER2及びERαの発現量を測定し、手術後のリスクカテゴリが判定される。また、特にERα等の核内受容体は、細胞の癌化に関与する重要なタンパク質と考えられている（例えば特許文献1参照。）。しかし、細胞の癌化に関与するタンパク質は多数存在する。そのため、細胞の癌化に関与する多数のタンパク質と相互作用する単一のタンパク質を、腫瘍マーカとすることが望まれていた。
【特許文献１】特開2005-233916号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、細胞の癌化に関与する多数のタンパク質と相互作用する単一のタンパク質を腫瘍マーカとする癌の検査方法、癌の検査用キット、及び癌の検査薬を提供することを目的とする。    
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するために本発明の第１の特徴は、細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(CHIP : Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含む癌の検査方法であることを要旨とする。【０００５】
本発明の第２の特徴は、細胞内のCHIPの発現量を測定することを含む細胞の足場依存性の評価方法であることを要旨とする。【０００６】
本発明の第３の特徴は、細胞内のCHIPの発現量を測定することを含む細胞のアノイキス抵抗性の評価方法であることを要旨とする。【０００７】
本発明の第４の特徴は、細胞内のCHIPの発現量を測定することを含む細胞の浸潤性の評価方法であることを要旨とする。【０００８】
本発明の第５の特徴は、細胞内のCHIPの発現量を測定するための試薬を含む癌の検査用キットであることを要旨とする。【０００９】
本発明の第６の特徴は、CHIPの抗体からなる癌の検査薬であることを要旨とする。【００１０】
本発明の第７の特徴は、細胞内のCHIPの発現量を測定することを含むユビキチン−プロテオソーム系の異常の検査方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞の癌化に関与する多数のタンパク質と相互作用する単一のタンパク質を腫瘍マーカとする癌の検査方法、癌の検査用キット、及び癌の検査薬を提供可能である。    
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、本発明の実施の形態に係る細胞内のＣＨＩＰの相対発現量を示すグラフである。
【図２】図2は、本発明の実施の形態に係る細胞内のＣＨＩＰの発現量を示す画像である。
【図３】図3は、本発明の実施の形態に係る細胞内のＣＨＩＰの発現量を示すグラフである。
【図４】図4は、本発明の実施の形態に係る細胞内のＣＨＩＰの発現量を示す画像である。
【図５】図5は、本発明の実施の形態に係る細胞のコロニーを示す画像である。
【図６】図6は、本発明の実施の形態に係る細胞の一視野あたりにおけるコロニー数を示すグラフである。
【図７】図7は、本発明の実施の形態に係る細胞の足場依存性を示す第１のグラフである。
【図８】図8は、本発明の実施の形態に係る細胞の足場依存性を示す第２のグラフである。
【図９】図9は、本発明の実施の形態に係る細胞内のリン酸化Ａｋｔの発現量を示す画像である。
【図１０】図10は、本発明の実施の形態に係る細胞の浸潤性を示す画像である。
【図１１】図11は、本発明の実施の形態に係る細胞の浸潤性を示す第１のグラフである。
【図１２】図12は、本発明の実施の形態に係る細胞の浸潤性を示す第２のグラフである。
【図１３】図13は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の重量を示すグラフである。
【図１４】図14は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の体積を示す第1のグラフである。
【図１５】図15は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の体積を示す第2のグラフである。
【図１６】図16は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の体積を示す第3のグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に本発明の実施の形態を説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、この発明の技術的思想を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。【００１４】
チップ(CHIP : Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)は、シャペロンタンパク質であるHsc70及びシャペロンタンパク質である熱ショックタンパク質(HSP)90と結合するユビキチンリガーゼである。CHIPは細胞質に存在し、Hsc70と結合する補助因子(co-chaperon)として発見された。CHIPはN末端側に、Hsc70と相互作用するTPR(tetratricopeptide repeat)という繰り返し構造を有する。またCHIPはC末端側に、U-boxと呼ばれるユビキチンリガーゼに特徴的な構造を有する。ユビキチンリガーゼであるCHIPによって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR : Cystic - Fibrosis Transmenbrane - conductande Regulator)、グルココルチノイド受容体(GR)、上皮成長因子受容体(HER2 : human epidermal growth factor receptor-2あるいはErbB2)、アンドロゲン受容体、シグナル伝達因子Smad、Perl受容体、エストロゲン受容体(ER)、エストロゲン受容体α(ERα)、及び変異型p53タンパク質等が分解される。【００１５】
HSP90の阻害剤であるゲルダナマイシン、及び肝臓への毒性を減らしたゲルダナマイシンの誘導体である17-AAG（allylaminogeldanamycin）は抗癌剤である。そのため、立体構造を形成する時にHSP90を必要とするクライアントタンパク質の一部に、細胞の癌化に関与するタンパク質が含まれており、HSP90が阻害されると、細胞の癌化に関与するタンパク質が正しい立体構造を形成できず、機能を失うと考えられる。またHSP90のクライアントタンパク質には、HER2、ERα、及び変異型p53タンパク質等、細胞の癌化に関与するタンパク質が含まれる。【００１６】
発明者は、CHIPの発現量の減少や機能の減弱は、HSP90のクライアントタンパク質であり、細胞の癌化に関与するタンパク質の過剰な蓄積を招き、結果として細胞の癌悪性化をもたらすと考えた。そこで発明者は、CHIPの生物学的機能を研究する過程で、癌細胞の悪性度と、癌細胞内のCHIPの発現量とが相関しており、CHIPの発現量の減少が細胞の癌悪性化をもたらすことを見いだした。そのため、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、癌細胞の悪性度を検査することが可能となる。また、細胞内のユビキチン−プロテオソーム系に異常が生じているか否かを検査することも可能となる。なおCHIPの発現量の測定と、HER2、ERα、及び変異型p53タンパク質等の細胞の癌化に関与する他のタンパク質の発現量の測定を組み合わせて、細胞が癌化しているか否かを検査してもよい。【００１７】
ヒト等のほ乳類から採取された細胞内のCHIPの発現量は、例えば、抗CHIP抗体、あるいは抗CHIP抗体の断片を用いたウェスタンブロッティング法、免役沈降法、酵素免疫測定(ELISA)法、放射性免疫測定(RIA : Radio Immuno Assay)法、及び免役組織染色法等のタンパク質解析法により測定可能である。なお、抗体には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも使用可能である。また、細胞内のCHIPをコードするmRNA(CHIP mRNA)の発現量を測定することにより、細胞内のCHIPの発現量を測定してもよい。細胞内のCHIP mRNAの発現量は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法、In situ PCR法、ノザンブロッティング法、In situハイブリダイゼーション法、及びDNAチップ法等の核酸解析法により測定可能である。【００１８】
また癌細胞の悪性度は、癌細胞の分化度で評価される。正常な細胞は分化度が高く、臓器の構造を形成したり、機能を発揮することが可能である。しかし癌細胞においては分化度が低下する。癌細胞の分化度は、臨床的には、癌細胞の足場依存性、アノイキス抵抗性、転移浸潤能、あるいは増殖能力等で評価されている。悪性度が高いほど、癌細胞は足場依存性を失う。また悪性度が高いほど、癌細胞のアノイキス抵抗性、転移浸潤能、及び増殖能力は高くなる。癌細胞が足場依存性を失う要因、アノイキス抵抗性を獲得する要因、転移浸潤能を獲得する要因、及び増殖能力を獲得するそれぞれの遺伝的要因は異なっていると考えられている。これに対し発明者は、CHIPの発現量の減少が、癌細胞の足場依存性の喪失、並びにアノイキス抵抗性、転移浸潤能、及び増殖能力の獲得の総てをもたらすことを見いだした。そのため、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、細胞の足場依存性、アノイキス抵抗性、転移浸潤能、及び増殖能力のそれぞれを評価することが可能となる。具体的には、細胞内のCHIPの発現量が正常時と比較して減少していれば、細胞が足場依存性を失った、あるいはアノイキス抵抗性、転移浸潤能、並びに増殖能力を獲得したと評価することが可能となる。【００１９】
また発明者は、CHIPの発現が抑制された細胞株を作製した。CHIPの発現が抑制された細胞株は、足場依存性が親株であるMCF7細胞と比較して低く、またアノイキス抵抗性、転移浸潤能、及び増殖能力が親株であるMCF7細胞と比較して高い。従来、癌細胞の悪性度の指標となる足場依存性の喪失、並びにアノイキス抵抗性、転移浸潤能、及び増殖能力の獲得の総てを示す細胞で、その原因となる分子との相関関係が明確な細胞株はなかった。そのためCHIPの発現が抑制された細胞株は、癌の浸潤及び転移の研究に有用である。例えば、癌の浸潤及び転移を抑制する薬の探索、あるいはCHIPのクライアントタンパク質の解明等にCHIPの発現が抑制された細胞株は使用可能である。また、癌化が疑われる組織の細胞のCHIPの量を測定する際のコントロール細胞としても、CHIPの発現が抑制された細胞株は使用可能である。さらには、CHIPのクライアントタンパク質を大量に抽出するための材料としても、CHIPの発現が抑制された細胞株は有用である。【００２０】
従来、細胞内のHER2あるいはERαのみの発現量を測定する乳癌の検査方法、あるいは、細胞内のp53タンパク質の突然変異のみを検出する癌の検査方法があった。しかし、細胞の癌化には多くの遺伝子が関与している。そのため、HER2あるいはERαのみの発現量を測定したり、p53タンパク質の突然変異のみを検出しても、細胞が癌化しているか否かを正確に検査するのは困難であった。これに対しCHIPは、HER2、ERα、及び変異型p53タンパク質のいずれをも分解するユビキチンリガーゼである。したがってCHIPの発現量は、HER2やERα等のCHIPで分解される個々のタンパク質の発現量と比較して、細胞の癌化の要因により本質的に関連していると考えられる。さらにCHIPの発現量の減少が、足場依存性を喪失、並びにアノイキス抵抗性、転移浸潤能、及び増殖能力の獲得の総てをもたらすことも、CHIPの発現量と細胞の癌化の要因との関連を裏付ける。そのため、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、細胞が癌化しているか否かを高い精度で検査することが可能となる。また細胞が癌化している場合は、癌細胞の悪性度を高い精度で検査することも可能となる。【００２１】
（第1の実施例）
複数種類のヒト癌由来の培養細胞のそれぞれにおける、CHIP をコードするmRNA(CHIP mRNA)の発現量を検証した。まず、乳癌細胞（MCF7、MDA-MB-231）、肝臓癌細胞（HepG2）、子宮頚癌細胞（HeLa）、肺癌細胞（H1299）、及び大腸癌細胞（HCT116、LS-LM4）から、AGPC（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)法等により、 rRNA、tRNA、及びmRNAを含む全RNA(total RNA)をそれぞれ抽出した。次にランダムプライマー及び逆転写酵素を用いて、全RNAに含まれるmRNAと相補的なcDNAを合成した。その後、以下の配列からなるフォワードプライマー(forward primer)及びリバースプライマー(reverse primer)を用いて、CHIPをコードするcDNA(CHIP cDNA)をリアルタイムPCR (Polymerase Chain Reaction）装置（アプライドバイオシステムズ社ABI7700）で増幅した。なおフォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれの配列は、ゼネティックス社のGENETYX（登録商標）を用いて設計した。同時に、内在性コントロール遺伝子として、β-アクチンをコードするcDNA（β-アクチンcDNA)もリアルタイムPCR装置で増幅した。【００２２】
フォワードプライマー  5'-aggccaagcacgacaagtacat-3'
リバースプライマー   5'-ctgatcttgccacacaggtagt-3'
さらに、一定量のCHIP cDNAを得るために要したPCRのサイクル数と、一定量のβ-アクチンcDNAを得るために要したPCRのサイクル数に基づいて、比較Ct法により、複数種類のヒト癌由来の培養細胞のそれぞれにおける、CHIP mRNAの相対発現量を、乳ガン細胞(MCF7)をキャリブレーターサンプルとして定量した。図1に示すように、乳ガン細胞(MCF7)におけるCHIP mRNAの発現量を1とすると、乳ガン細胞(MDA-MB-231）におけるCHIP mRNAの相対発現量は0.68、肝臓癌細胞（HepG2）におけるCHIP mRNAの相対発現量は0.78、子宮頚癌細胞（HeLa）におけるCHIP mRNAの相対発現量は0.84、肺癌細胞（H1299）におけるCHIP mRNAの相対発現量は1.14、大腸癌細胞（HCT116）におけるCHIP mRNAの相対発現量は1.06、大腸癌細胞（LS-LM4）におけるCHIP mRNAの相対発現量は2.37であった。これに対し、正常組織由来の細胞(HEK293E)におけるCHP mRNAの相対発現量は62であった。【００２３】
（第2の実施例）
複数種類のヒト癌由来の培養細胞のそれぞれにおけるCHIPの発現量を、ウェスタンブロッティング法により検証した。まず、乳癌細胞（MCF7、MDA-MB-231）、肝臓癌細胞（HepG2）、子宮頚癌細胞（HeLa）、肺癌細胞（H1299）、大腸癌細胞（HCT116、LS-LM4）、及びコントロールとして正常組織由来の細胞(HEK293E)のそれぞれを溶解し、8μgのタンパク質画分溶液を得た。次に、各細胞由来のタンパク質画分溶液に含まれるタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(10%SDS-PAGE)で分子量毎に分離した。その後、分離されたタンパク質を、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に転写した。さらに、化学蛍光試薬で標識されたCHIPのポリクローナル抗体を用いて、図2に示すようにニトロセルロース膜に転写されたCHIPを検出した。さらに、検出した化学蛍光試薬の蛍光強度を図3に示すグラフにプロットした。【００２４】
図2及び図3に示すように、乳癌細胞（MDA-MB-231）及び肝臓癌細胞（HepG2）におけるCHIPの発現量は、乳癌細胞（MCF7）におけるCHIPの発現量よりも少なかった。子宮頚癌細胞（HeLa）、大腸癌細胞（HCT116)、及び肺癌細胞（H1299）におけるCHIPの発現量は、乳癌細胞（MCF7）におけるCHIPの発現量と同等であった。大腸癌細胞（LS-LM4）におけるCHIPの発現量は、乳癌細胞（MCF7）におけるCHIPの発現量よりも多かった。各細胞内のCHIPの発現量は、図1に示した各細胞内のCHIP mRNAの発現量にほぼ比例していた。【００２５】
また図2及び図3に示すように、複数種類のヒト癌由来の培養細胞のそれぞれにおけるCHIP の発現量は、正常組織由来の細胞(HEK293E)におけるCHIP の発現量と比較して少なかった。したがって、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、細胞が癌化しているか否かを検査可能であることが検証された。【００２６】
（第3の実施例）
RNA干渉(RNAi : RNA interference)法により、CHIPの発現が抑制された乳癌細胞（MCF7）を変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)として作成した。まず、CHIPをコードする遺伝子配列のORF (Open Reading Frame) の610番目から629番目までの標的配列cacgacaag  tacatggcggaに相当する合成ヌクレオチドをタカラバイオ社のpSINsiベクターにクローニングし、プラスミドを調整した。次にプラスミドをパッケージング細胞(293gp)にトランスフェクションし、パッケージング細胞の培地の上清を、感染用組み換えレトロウイルスベクター溶液として回収した。得られた感染用組み換えレトロウイルスベクター溶液を乳癌細胞（MCF7）の培養液に添加し、さらにポリブレン(polybrene)を終濃度が8mg / mlになるよう培養液に添加した。24時間後、G-418硫酸塩を終濃度が1mg / mlになるよう培養液に添加した。約2週間、乳癌細胞（MCF7）の培養を継続し、ネオマイシン耐性の4つの乳癌細胞（MCF7）株を感染細胞株として選択した。【００２７】
また、コントロールとして、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)をコードする遺伝子配列のORFの2400番目から2418番目までのコントロール標的配列gctacacaaatcagcgattに相当する合成ヌクレオチドをpSINsiベクターにクローニングしてプラスミドを調整し、RNAi法によりLacZの発現が抑制された乳癌細胞（MCF7）株をコントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)株として作成した。【００２８】
得られた4つの感染細胞株及びコントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)株からタンパク質を抽出し、CHIPの発現量を抗CHIPポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。図4に示すように、コントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)株と比較して、4つの感染細胞株のすべてにおいて、CHIPの発現量が減少していた。ただし、減少の程度は、感染細胞株毎に異なっていた。コントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)と比較してウエスタンブロット法によりCHIPの発現量が減少していると確認された4つの感染細胞株のそれぞれを、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)株とした。【００２９】
次に変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)株の足場依存性を、軟寒天培地中でのコロニー形成能を指標に検証した。まず、滅菌した濃度1%（質量/体積）のシグマ社のNoble Agar溶液を等量の2倍濃縮DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)と混合し、混合液を調整した。なおDMEMは、FBS (Fetal Bovine Serum)、グルタミン、及び抗生物質を含むものである。調整した混合液2mlを6ウェルプレートに入れ、室温に放置し固化させたものを下層培地とした。次にトリプシン消化後、体積濃度が10%（体積/体積）の血清を含有するDMEM培地を加えて懸濁状態にした30,000個の変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)及びコントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)のそれぞれを2mlの1.5倍濃縮DMEM培地に懸濁し、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)の懸濁液及びコントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)の懸濁液を調整した。次に変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)の懸濁液及びコントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)の懸濁液のそれぞれに濃度1%（質量/体積）のNoble Agar溶液を1ml加え、上層細胞培地とした。上層細胞培地を下層培地上に乗層し、室温に放置して固化させた。その後、6ウェルプレートを37℃で2週間程度培養し、形成されたコロニーをキーエンス社のコンピューター付き顕微鏡を用いて撮影した。図5に示すように、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)は足場依存性を失い、コントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)と比較してコロニー形成数が顕著に増加した。図4及び図6に示すように、顕微鏡の1視野あたりにおける、直径が100μmよりも大きいコロニーの形成数は、CHIPの発現量と負の相関関係にあった。そのため、細胞の足場依存性とCHIPの発現量とは、正の相関関係にあった。したがって、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、細胞の足場依存性を評価可能であることが検証された。【００３０】
（第4の実施例）
変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)株及び乳癌細胞（MDA-MB-231）株のアノイキス抵抗性を検証した。エタノール中に40 mg/mlの濃度でポリヒドロキシエチルメタクリレート(Poly-HEMA : Polyhydroxyethyl methacrylate)を溶かしたPoly-HEMA溶液（シグマ社）を直径60 mmの細胞培養皿に1ml入れ、均等にコートした後にクリーンベンチで風乾させた。次に細胞培養皿のそれぞれに、1×106個の変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)を含む5 mlの培養液、あるいは1×106個の乳癌細胞（MDA-MB-231）を含む5 mlの培養液を加え、48時間37℃で浮遊培養した。またコントロールとしてPoly-HEMA溶液をコートしていない細胞培養皿に1×106個の変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)、あるいは1×106個の乳癌細胞（MDA-MB-231）を播種したものを作製した。培養後に変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)及び乳癌細胞（MDA-MB-231）を回収し、トリパンブルー染色排除法により生細胞数を測定した。図7に示すように、野生型の乳癌細胞（MCF7）は、浮遊培養するとアポトーシスを起こし、生存細胞の割合が低下した。またコントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)も、浮遊培養するとアポトーシスを起こし、生存細胞の割合が低下した。これに対し、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)は、浮遊培養してもアポトーシスを起こしにくくなり、生存細胞が低下する割合も低かった。したがって、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)は、アポトーシスを起こさないアノイキス抵抗性を獲得していた。また図8に示すように、CHIPの発現量が乳癌細胞(MCF7)と比較して少ない乳癌細胞(MDA-MB-231)も、浮遊培養中にアポトーシスを起こさず、ほぼ100%のアノイキス抵抗性を示した。したがって、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、細胞のアノイキス抵抗性を評価可能であることが検証された。【００３１】
（第5の実施例）
変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)における、セリン・スレオニンリン酸化酵素(Akt)のリン酸化状態を検証した。Aktは細胞内のアノイキス経路の情報伝達を行い、リン酸化により活性化されると、細胞増殖を促進し、アポトーシスを阻害する。そこで、まず変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)から8μgのタンパク質画分溶液を得た。次に、タンパク質画分溶液に含まれるタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動(10% SDS-PAGE)で分離し、ニトロセルロース膜に転写してウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの抗体には、473残基のセリン(Ser)がリン酸化されたAktの抗体である抗リン酸化Akt抗体（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号9271）と、抗Akt抗体（セルシグナリングテクノロジー社、カタログ番号9272）を用いた。図9に示すように、Poly-HEMA溶液でコートされた細胞培養皿で浮遊培養されたコントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)においては、アポトーシスを阻害するリン酸化Aktは減少していた。これに対して、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)においては、Poly-HEMA溶液でコートされていない細胞培養皿で培養しても、Poly-HEMA溶液でコートされた細胞培養皿で浮遊培養しても、リン酸化Aktの発現量は変化していなかった。したがって、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、細胞のアノイキス抵抗性を評価可能であることが検証された。【００３２】
（第6の実施例）
変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)の転移浸潤能を、インベージョンアッセイで検証した。まず、ベクトン・ディッキンソン(BD)社のマトリゲル（登録商標）インベージョンチャンバー（カタログ番号354480）のインサートを24ウェルプレートのウェルにセットし、0.5 mlのDMEM培地をインサート及びウェル内に入れ、二酸化炭素(CO2)インキュベーター内で37℃、2時間水和させた。水和後、培地を取り除いた。次に、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)をトリプシン消化によって細胞培養皿から剥がし、体積濃度が0.2%（体積/体積）の血清を含む培地で、細胞数が3×105 細胞/mlになるように再懸濁し、細胞懸濁液を調整した。【００３３】
インサート及びウェルから培地を除き、ウェルには体積濃度が10%（体積/体積）の血清を含む培地を入れ、インサートには0.5mlの細胞懸濁液を加えた。次に、24ウェルプレートをCO2インキュベーターにいれ、37℃で24時間インキュベートした。インサートは、マトリゲル基底膜マトリックスの薄膜でコートされ、直径が8μmの孔が設けられた多孔膜を備える。インキュベーション中、非浸潤性の細胞はマトリゲル基底膜マトリックスの薄膜を移動できず、マトリゲル基底膜マトリックスの薄膜上に留まる。これに対し浸潤性の細胞は、マトリゲル基底膜マトリックスの薄膜及び多孔膜に浸潤し、多孔膜の下面に移動する。インキュベーション後、綿棒を用いてインサート内の非浸潤性の細胞を取り除き、PBS (Phosphate Buffered Saline)で簡単に洗浄した。その後、インサートを体積濃度が4%（体積/体積）のパラホルムアルデヒド(PFA : paraformaldehyde)溶液を0.5 ml入れたプレートに移し、室温で15分放置し、浸潤性の細胞を固定した。【００３４】
次にインサートをPBSで5分間洗浄することを3回繰り返し、クリスタルバイオレットで浸潤性の細胞を染色して顕微鏡で浸潤性の細胞数を計測した。なお、少なくとも5視野の撮影画像から細胞数を計測した。また同一の条件で、コントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)についても浸潤性の細胞の数を計測した。図10の浸潤性の細胞の撮影画像に示すように、コントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)と比較して、CHIPの発現量が少ない第2の感染細胞株及び第4の感染細胞株由来の変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)の方が顕著な浸潤性を示した。また図11に示すように、CHIPの発現量と浸潤性は、負の相関関係にあり、コントロール細胞(LacZ RNAi MCF-7)の186倍の第4の感染細胞株由来の変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)がマトリゲル基底膜マトリックスの薄膜及び多孔膜を浸潤していた。したがって、CHIPの発現量の減少は、細胞の浸潤性を増加させることが示された。よって、細胞内のCHIPの発現量を測定することにより、細胞の浸潤性を評価可能であることが検証された。【００３５】
また、CHIPの発現量が乳癌細胞(MCF7)と比較して少ない乳癌細胞(MDA-MB-231)の転移浸潤能を、変異細胞(CHIP RNAi MCF-7)と同じ条件を用いてインベージョンアッセイで検証した。結果として、図12に示すように、1.67±1.15個の乳癌細胞(MCF7)がマトリックスの薄膜及び多孔膜を浸潤したのに対し、630±55個の乳癌細胞(MDA-MB-231)がマトリックスの薄膜及び多孔膜を浸潤した。乳癌細胞(MDA-MB-231)の結果からも、CHIPの発現量の減少が、細胞の浸潤性を増加させることが示された。【００３６】
（第7の実施例）
CHIPの発現量と、癌細胞の悪性度との関係を、in vivoで検証した。まず10匹の４週齢のT細胞機能欠如マウス(日本クレア社、BALB/cAJcl-nu/nu)を一週間飼育した。その後、10匹のT細胞機能欠如マウスを、乳癌細胞(MDA-MB-231)が移植されるMDA-MB-231群と、乳癌細胞(MCF-7)が移植されるMCF-7群に、それぞれ5匹ずつグルーピングした。なお、MDA-MB-231群にグルーピングされたT細胞機能欠如マウスの体重の分布と、MCF-7群にグルーピングされたT細胞機能欠如マウスの体重の分布は、ほぼ等しくした。5週齢時に1×107個の乳癌細胞(MDA-MB-231)を0.1mlのマトリゲルに懸濁した細胞懸濁液0.1 mlを調整し、20ゲージの注射針と1.0 mlシリンジを用いて、MDA-MB-231群にグルーピングされたマウスの側腹部皮下に接種した。また1×107個の乳癌細胞(MCF-7)を0.1mlのマトリゲルに懸濁した細胞懸濁液0.1 mlを調整し、20ゲージの注射針と1.0 mlシリンジを用いて、MCF-7群にグルーピングされたマウスの側腹部皮下に接種した。なお1匹あたり少なくとも5カ所以上に接種した。その後、一週間に2回、ノギスを用いて腫瘍の短径及び長径のそれぞれを測定し、腫瘍の容量を下記(1)式により算出した。同様に40匹のT細胞機能欠如マウスを10匹ずつ４群にグルーピングし、３つの感染細胞株及びコントロール細胞（ＬacZ RNAi MCF-7）株をそれぞれ1×107個ずつ0.1mlのマトリゲルに懸濁した細胞懸濁液0.1 mlを調整し、20ゲージの注射針と1.0 mlシリンジを用いてマウスの側腹部皮下に接種した。その後、一週間に2回、ノギスを用いて腫瘍の短径及び長径のそれぞれを測定し、腫瘍の容量を下記(1)式により算出した。【００３７】
V＝S2×L÷2    …(1)
ここで、Vは腫瘍の容量を、Sは腫瘍の短径を、Lは腫瘍の長径を示す。腫瘍の容量の測定を3ヶ月程継続し、腫瘍の長径が約3 cmになった時点でマウスを殺害し、腫瘍の重量を測定した。乳癌細胞(MDA-MB-231)が移植されたマウスの殺害時の腫瘍の平均重量は、図13に示すように、3.7±2.3gであった。また乳癌細胞(MCF-7)が移植されたマウスの殺害時の腫瘍の平均重量は、1.0±0.3gであった。図14に示すように、CHIPの発現量が少ない乳癌細胞(MDA-MB-231)を移植されたマウスにおいては、移植後45日で腫瘍の容量が3,000mm3に達した。一方、図15に示すように、感染細胞株が移植されたマウスの腫瘍の容積は親株である乳癌細胞(MCF-7) が移植されたマウスの腫瘍の容積と比較して大きく、特に第３の感染細胞株において顕著であり、移植後77日の腫瘍容積が2.5倍に達した。また図16に示すように、コントロール細胞株では腫瘍容積の増大は観察されず、腫瘍容積増大効果はRNAi操作によるものではなくCHIP発現量の減少によるものだと評価できる。乳癌細胞(MDA-MB-231)は、コロニー形成能及び浸潤性が乳癌細胞(MCF-7)と比較して高い、悪性度の高い癌細胞である。乳癌細胞(MCF-7)におけるCHIPの発現量をRNAiで抑制すると、乳癌細胞(MDA-MB-231)と同様にコロニー形成能及び浸潤性が上昇し、in vivoでの腫瘍増大速度も上昇する。そのため、腫瘍の増殖速度は、CHIPの発現量に依存していることが検証された。【００３８】
（配列表の説明）
本明細書の配列表に記載された配列番号1乃至4は、以下の配列を示す。【００３９】
［配列番号 : 1]  第1の実施例で用いたフォワードプライマーの塩基配列。【００４０】
［配列番号 : 2]  第1の実施例で用いたリバースプライマーの塩基配列。【００４１】
［配列番号 : 3]  第3の実施例で用いたCHIPの塩基配列。【００４２】
［配列番号 : 4]  第3の実施例で用いたLacZの塩基配列。【００４３】
本明細書において塩基を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号、あるいは当該分野における慣用略号を用いる。以下に、略号の例を示す。【００４４】
a : アデニン
t : チミン
g : グアニン
c : シトシン
【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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