(57)【要約】本発明は、従来から知られていた制御性Ｔ細胞であるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞単独では自己免疫疾患を十分にコントロールできないことから、自己免疫疾患を十分にコントロールすることができるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞以外の制御性Ｔ細胞を探索することを課題とする。  本発明の発明者らは、Ｔ細胞アナジー（不応性）に関連する転写因子であると報告されたＥｇｒ−２遺伝子と制御性Ｔ細胞との関連を検討することにより、新規のＴ細胞を単離し、その作用を明らかにすることにより、上記の課題を解決することができることを示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来の単離されたＴ細胞。
【請求項２】
制御性Ｔ細胞としての機能を有する、請求項１に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項３】
制御性Ｔ細胞としての機能が、Ｔ細胞免疫寛容（トレランス）の誘導機能である、請求項１または２に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞。
【請求項５】
哺乳動物のリンパ球集団またはＴ細胞集団から、
（ｉ）ＣＤ４が陽性である細胞（ＣＤ４＋）を採取する工程；
（ｉｉ）ＣＤ２５が陰性である細胞（ＣＤ２５−）を採取する工程；
（ｉｉｉ）ＣＤ４５ＲＢが陰性（低陽性）である細胞（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））またはＣＤ４５ＲＯが陽性である細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）を採取する工程；そして
（ｉｖ）ＬＡＧ−３が陽性である細胞（ＬＡＧ３＋）を採取する工程；
を、（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を順不同で行うことにより、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のＴ細胞を単離する方法。
【請求項６】
哺乳動物のリンパ球集団またはＴ細胞集団を末梢血から採取してからそのまま（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行う、請求項５に記載の哺乳動物由来のＴ細胞を単離する方法。
【請求項７】
哺乳動物のリンパ球集団またはＴ細胞集団を末梢血から採取し、そのリンパ球集団またはＴ細胞集団を増殖させてから（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行う、請求項５に記載の哺乳動物由来のＴ細胞を単離する方法。
【請求項８】
前記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行うことにより単離した本発明のＴ細胞集団をそのまま使用する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の哺乳動物由来のＴ細胞を単離する方法。
【請求項９】
前記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行うことにより単離した本発明のＴ細胞集団を増殖してから使用する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の哺乳動物由来のＴ細胞を単離する方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の哺乳動物由来のＴ細胞を単離する方法。
【請求項１１】
ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来の単離されたＴ細胞を含む医薬組成物。
【請求項１２】
自己抗原に対する免疫反応に起因するかまたは抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患を治療するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
自己免疫疾患または移植臓器拒絶を治療するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病などから選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のＴ細胞を、被検化合物の存在下にて培養する工程；
（ｂ）培養したＴ細胞中でのＥｇｒ−２遺伝子の発現の変化またはＬＡＧ−３遺伝子の発現の変化を測定する工程；
（ｃ）Ｅｇｒ−２遺伝子の発現の増加またはＬＡＧ−３遺伝子の発現の増加を導く化合物を、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）の細胞表面抗原特性を有する哺乳動物由来のＴ細胞を増加させる化合物として選択する工程；
からなる、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する哺乳動物由来のＴ細胞を増加させる化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物由来の新規のＴ細胞集団を提供することに関する。より具体的には、本発明は哺乳動物由来の新規の制御性Ｔ細胞集団を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は、免疫系により、自己と非自己を精密に区別している。生物の免疫系は、本来、自己の構成タンパク質に対しては寛容（トレランス）の状態となっているが、何らかの条件により自己タンパク質に対する免疫応答が生じることがあり、このような自己に対する免疫応答の結果、自己免疫疾患が生じる。現在、自己免疫疾患としては、膠原病、関節リウマチなどが知られているが、動脈硬化や癌、神経変性疾患においても、自己免疫応答が関与していることが明らかにされつつあるなど、広範な疾患の病態に自己免疫応答が関与していると考えられている。
このような自己免疫疾患の治療には、副腎皮質ホルモンの投与や免疫抑制剤の投与など、抗原非特異的な治療方法が用いられている。しかしながら、これら現在適用されている治療方法では、全身的に高度の免疫抑制が引き起こされるため、日和見感染などの重大な問題もまた、生じている。このような状況は、臓器移植後の免疫抑制剤の投与に際しても同様に生じている。そのため、自己免疫疾患の治療や臓器移植による治療の現場においては、自己免疫疾患を引き起こす自己抗原に特異的な免疫抑制療法や、移植抗原に特異的な免疫抑制療法が強く求められている。
最近、自己抗原に特異的な自己免疫寛容の形成において、制御性Ｔ細胞（レギュラトリーＴ細胞、ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）が重要であることが分かってきた。
哺乳動物のＴ細胞は、リンパ球の一種であり、骨髄で産生された前駆細胞が胸腺での選択を経て分化成熟したもののことをいう。末梢血中のリンパ球の７０〜８０％がＴ細胞であることが知られている。このＴ細胞は、細胞表面のマーカー分子としてＣＤ４またはＣＤ８などを発現することを特徴としている。そして、ＣＤ４を発現したＴ細胞はリンフォカインを産生するなどして、他のＴ細胞の機能発現を誘導したりＢ細胞の分化成熟、抗体産生を誘導したりするヘルパーＴ細胞として機能する。一方、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞などを破壊するＣＴＬ（キラーＴ細胞）として機能する。
このようなＴ細胞とは別に、他のＴ細胞の活性を抑制する働きを有するＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞が存在することが示されている。これまでに知られている制御性Ｔ細胞としては、細胞表面にＣＤ４分子、ＣＤ２５分子を発現し、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３  Ｔｒｅｇ細胞）（非特許文献１）が最も一般的であることが知られていた。一方、このＦｏｘｐ３  Ｔｒｅｇ細胞以外に、ＩＬ−１０を産生する制御性Ｔ細胞（ＴＲ１細胞）（非特許文献２）、ＴＧＦβを産生する制御性Ｔ細胞（ＴＨ３細胞）（非特許文献３）、などの存在も示唆されていたが、これらの細胞の細胞表面抗原の発現プロファイルは未知であり、その実体は明らかになっていなかった。
これらの制御性Ｔ細胞は、他のＴ細胞の活性を抑制する働きを有し、結果として生体内で自己免疫寛容を担っていることが予想されていた。しかしながら、機能的Ｆｏｘｐ３遺伝子を欠損したマウスの場合や、胸腺での中枢性免疫寛容を担うＡｉｒｅ遺伝子を欠損したマウスの場合でも、中枢神経、関節、小腸、内分泌腺などには明らかな障害を認めない（非特許文献４）。このことから、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞単独では、自己免疫疾患を十分にコントロールできない可能性が予想された。
Ｅｇｒ−２（Ｅａｒｌｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｇｅｎｅ−２）遺伝子は、Ｋｒｏｘ２０、ＮＧＦ１−Ｂ、Ｚｆｐ−２５、Ｚｆｐ−６、ＮＧＦ１−β（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  １−β）とも呼ばれる全長２８６２ｂｐ（ＣＤＳは３９３−１６５５）である分子であり、Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ型転写因子としてマウス、ヒトよりクローニングされた遺伝子である（非特許文献５；非特許文献６）。この遺伝子は、Ｔ細胞アナジー（不応性）に関連する転写因子であると報告された遺伝子である（非特許文献７）。しかしながら、上述した既知の制御性Ｔ細胞の中には、これと関連するものはなかった。
【非特許文献１】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；１５５：１１５１−１１６４
【非特許文献２】Ｇｒｏｕｘ  Ｈ．Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８９：７３７−７４２
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６５：１２３７−１２４０
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００５，１０２，１４７３５−１４７４０
【非特許文献５】Ｃｈａｖｒｉｅｒ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８  １９８８，ｐｐ．１３１９−１３２６
【非特許文献６】Ｊｏｓｅｐｈ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５  １９８８，７１６４−７１６
【非特許文献７】Ｓａｆｆｏｒｄ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，６，４７２−４８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、従来から知られていた制御性Ｔ細胞であるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞単独では自己免疫疾患を十分にコントロールできないことから、自己免疫疾患を十分にコントロールすることができるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞以外の制御性Ｔ細胞を探索することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の発明者らは、Ｔ細胞アナジー（不応性）に関連する転写因子であると報告されたＥｇｒ−２遺伝子と制御性Ｔ細胞との関連を検討することにより、新規のＴ細胞を単離し、その作用を明らかにすることにより、上記の課題を解決することができることを示した。
具体的には、本発明においては、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来の新規なＴ細胞を単離しそして提供することにより、上記の課題を解決することができる。
本発明において単離されたＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の特性を有する新規のＴ細胞は、制御性Ｔ細胞としての機能を有することが示される。具体的には、制御性Ｔ細胞としての機能とは、他のＴ細胞の活性化反応を抑制することであり、その特性としてはアナジー（不応性）が含まれる。
これらの細胞は、哺乳動物のいずれか（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなど）に由来するものであり、いずれの哺乳動物から単離してもよい。
本発明はまた、哺乳動物のリンパ球集団またはＴ細胞集団から、（ｉ）ＣＤ４が陽性である細胞（ＣＤ４＋）を採取する工程、（ｉｉ）ＣＤ２５が陰性である細胞（ＣＤ２５−）を採取する工程、（ｉｉｉ）ＣＤ４５ＲＢが陰性（低陽性）である細胞（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））またはＣＤ４５ＲＯが陽性である細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）を採取する工程、そして（ｉｖ）ＬＡＧ−３が陽性である細胞（ＬＡＧ３＋）を採取する工程、を、（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を順不同で行うことにより、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のＴ細胞を単離する方法を提供することができる。
この方法において、哺乳動物は、いずれの哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなど）であってもよい。
本発明において、哺乳動物のリンパ球集団またはＴ細胞集団を末梢血から採取してからそのまま（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行ってもよく、あるいは哺乳動物のリンパ球集団またはＴ細胞集団を末梢血から採取し、そのリンパ球集団またはＴ細胞集団を増殖させてから（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行ってもよい。
本発明においてはまた、（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行うことにより単離した本発明のＴ細胞集団をそのまま使用してもよく、あるいは（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を行うことにより単離した本発明のＴ細胞集団を増殖してから使用してもよい。
本発明においてはまた、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のＴ細胞を含む、医薬組成物を提供することができる。この医薬組成物を投与することにより、炎症を引き起こす病原性Ｔ細胞の機能的抑制を誘導することができることから、本発明の医薬組成物は、抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患を治療するために使用することができる。本発明における自己抗原に対する免疫反応に起因または抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患には、例えば自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病など）または移植臓器拒絶などが含まれる。
本発明においては、上述したＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のＴ細胞の細胞数を増加させるための化合物をスクリーニングする方法もまた、提供する。上述した作用を有する目的化合物をスクリーニングする方法は：
（ａ）ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のＴ細胞を、被検化合物の存在下にて培養する工程；
（ｂ）培養したＴ細胞中でのＥｇｒ−２遺伝子の発現の変化またはＬＡＧ−３遺伝子の発現の変化を測定する工程；
（ｃ）Ｅｇｒ−２遺伝子の発現の増加またはＬＡＧ−３遺伝子の発現の増加を導く化合物を、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）またはＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＯ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋）、およびＬＡＧ−３陽性（ＬＡＧ−３＋）の細胞表面抗原特性を有する哺乳動物由来のＴ細胞を増加させる化合物として選択する工程；
からなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の制御性Ｔ細胞により、局所的な免疫寛容を誘導することができることから、これまでは免疫抑制剤の投与など全身的に免疫機能を抑制する処置を行うことによる副作用に悩まされていた自己免疫疾患や移植臓器拒絶などの種々の疾患を、患者体内において上述したような副作用を引き起こすことなく、治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、本発明において使用するレトロウイルスベクターｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰおよび対照ベクターｍｏｃｋ  ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターの概略図を示す。
【図２】図２は、Ｍｏｃｋ（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）またはＥｇｒ２（ｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を感染させたマウスＣＤ４陽性脾細胞をフローサイトメーターを用い、ＧＦＰ発現を指標に各４群（ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｌｏｗ、ｍｉｄ、ｈｉｇｈ）に分け分離採取した工程を示す。
【図３】図３は、図２にて分離採取した各４群のそれぞれの細胞よりｃＤＮＡ合成を行い、Ｅｇｒ２  ｍＲＮＡ、およびＬＡＧ−３  ｍＲＮＡレベルにおける発現をリアルタイムＰＣＲ法にて検討した結果を示す。
【図４】図４は、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプター（ＤＯ１１．１０）を共移入することにより、その抑制効果が著しく増強され、抗原特異的免疫抑制が可能なことを示す図である。
【図５】図５は、Ｅｇｒ２およびＤＯ１１．１０をレトロウイルスにて共移入したマウスの脾単核細胞をフローサイトメトリーにてリンパ球およびＣＤ４陽性細胞ｇａｔｅ後、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞レセプター特異抗体ＫＪ−１抗体およびＧＦＰにて展開し、各細胞集団を分離採取した工程を示す。
【図６】図６は、Ｅｇｒ２（ｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）とＤＯ１１．１０（ｐＭＸ−ＤＯＴＡＥ、ｐＭＸ−ＤＯＴＢＥ）を共移入された細胞はｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによりＥｇｒ２を過剰発現するとともに、ＬＡＧ−３の発現がさらに増強されることを示す図である。
【図７】図７は、マウス脾単核細胞のうち、ＬＡＧ−３表面抗原はＣＤ４陽性細胞のうちＣＤ２５陰性の細胞（図７ａ）、かつＣＤ４５ＲＢ陰性からＣＤ４５ＲＢ弱陽性の細胞（図７ｂ）において発現が増強されることを示す図である。
【図８】図８は、ＣＤ４５ＲＢ陰性からＣＤ４５ＲＢ弱陽性のマウスＬＡＧ−３発現細胞において、Ｅｇｒ２  ｍＲＮＡ、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡ、ＬＡＧ−３  ｍＲＮＡの発現が増強されることを示す図である。
【図９】図９は、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ細胞群にてｇａｔｅした細胞を、ＬＡＧ−３、ＣＤ２５にて展開し、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３−  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗの３群の細胞集団を分離採取した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）においてＥｇｒ２発現が最も強く、Ｆｏｘｐ３発現では同様の発現傾向は認められなかったことを示す図である。
【図１１】図１１は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性細胞群にてｇａｔｅした細胞をＬＡＧ−３、ＣＤ４５ＲＢにて展開し、図示の如く各細胞群をフローサイトメーターにて分離採取した工程を示す図である。
【図１２】図１２は、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗにおいてＥｇｒ２発現が最も強く、既知のＦｏｘｐ３−Ｔｒｅｇとは異なったＥｇｒ２−Ｔｒｅｇが存在することを示す図である。
【図１３】図１３は、ＩＩ型コラーゲン免疫後もＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）は存在し、免疫後「Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ」におけるＩＬ−１０発現のさらなる増強が生じていることを示す図である。
【図１４】図１４は、抑制性細胞として、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ細胞集団（Ｔｈｙ１．２＋）をＬＡＧ−３発現によりｈｉｇｈ、ｌｏｗ、ｎｅｇａの３群に分け分離採取した工程を示す図である。
【図１５】図１５は、Ｅｇｒ−２Ｔｒｅｇ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞）の細胞分裂を抑制し、その抑制能はＬＡＧ−３発現に依存することを示す図である。
【図１６】図１６は、ＲＡＧ１−／−マウスにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞投与により生じる腸炎を、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞の共移入により抑制することができることを示す図である。
【図１７】図１７は、大腸の組織像において、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞投与単独投与において認められた炎症細胞浸潤、腸管壁肥厚などの所見が、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞の共移入により改善していることが認められたことを示す図である。
【図１８】図１８は、フローサイトメーターにて解析にて機能的Ｆｏｘｐ３遺伝子を欠損したＳｃｕｒｆｙマウスの脾細胞にもＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞が存在することを示す図である。
【図１９】図１９は、ＳｃｕｒｆｙマウスのＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抑制能を有し、その抑制能はＬＡＧ−３中和抗体にて減弱することを示す図である。
【図２０】図２０は、Ｒａｇ１−／−マウスにＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞１×１０５ｃｅｌｌｓを腹腔内投与した結果、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもＲａｇ１−／−マウスの炎症性腸炎発症モデルにおける腸炎を抑制することを示す図である。
【図２１】図２１は、Ｅｇｒ２遺伝子発現が抑制されたｓｈＲＮＡ−Ｅｇｒ２骨髄キメラマウスを作製する手法を示すスキーム図である。
【図２２】図２２は、ｓｈＲＮＡ−Ｅｇｒ２骨髄キメラマウスは腸炎発症の特徴である腸管の著しい肥厚を生じることを示す図である。
【図２３】図２３は、Ｂ細胞を欠損するμＭＴマウスではＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞がほとんど認められず、Ｂ細胞を養子導入することでＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞が増殖することより、この細胞集団がＢ細胞依存性に誘導されることを示す図である。
【図２４】図２４は、ＲＩＰ−ｍＯＶＡトランスジーンを含むかまたは含まないＯＴ−ＩＩ  ＴＣＲトランスジェニックマウスの胸腺および脾臓中でのＬＡＧ−３の発現およびＣＤ４５ＲＢの発現のフローサイトメトリーを示す図である。
【図２５】図２５は、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  Ｔ細胞でゲートされた、ＴＥａ正常産仔（左）、ＯＴ−ＩＩ（中）、およびＴＥａ  ＴＣＲトランスジェニックマウス（右）の脾臓およびパイエル板（ＰＰ）におけるＬＡＧ−３の発現およびＣＤ４５ＲＢの発現のフローサイトメトリーを示す図である。
【図２６】図２６は、濾胞中のＥｇｒ−２陽性細胞の数を示す。ＴＥａマウス、ＯＴ−ＩＩマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する脾臓の組織切片中のＥｇｒ−２分子を発現する細胞を、免疫組織化学により調べた結果を示す図である。
【図２７】図２７は、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞の養子導入によるＴＥａ  ＴＣＲトランスジェニックマウスにおける大腸炎の自然発生的発症が阻害されることを示す図である。
【図２８】図２８は、ヒト扁桃腺細胞のうち、ＬＡＧ−３表面抗原はＣＤ４陽性細胞のうちのＣＤ２５陰性の細胞（図２８ａ）、かつＣＤ４５ＲＯ陽性の細胞（図２８ｂ）において発現が増強されることを示す図である。
【図２９】図２９は、ＣＤ４５ＲＯ陽性のヒトＬＡＧ−３発現細胞において、Ｅｇｒ２  ｍＲＮＡ、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡ、ＬＡＧ−３  ｍＲＮＡの発現が増強されることを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の発明者らはまず、Ｔ細胞アナジー（不応性）に関連する転写因子であると報告された遺伝子、Ｅｇｒ−２遺伝子が、制御性Ｔ細胞の活性と関連があるかどうかの検討を行った。具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞にＥｇｒ−２遺伝子を導入し、その形質を導入したＴ細胞をマウスに移入したところ、外来性抗原に対する遅延型過敏反応が顕著に抑制されることが明らかになった。このことから、Ｅｇｒ−２遺伝子が、制御性Ｔ細胞の活性と関連があることが示された。さらに、抗原特異的Ｔ細胞レセプターをＥｇｒ−２遺伝子と共導入することにより、その抑制能は増強され、抗原特異的抑制誘導が可能であることも合わせて示された。
この知見に基づいて、Ｅｇｒ−２遺伝子を導入したＴ細胞の遺伝子発現プロファイルを詳細に検討したところ、この細胞は制御性Ｔ細胞に関連する細胞表面分子ＬＡＧ−３についてのｍＲＮＡ発現と、細胞表面でのそのタンパク質の発現が亢進していることが分かった。このような特徴を手掛かりとしてマウス脾臓内に存在する細胞についてＥｇｒ−２の高発現細胞集団を探索したところ、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞において、Ｅｇｒ−２のｍＲＮＡ発現量が極めて高いことが明らかになった。
このような細胞表面抗原特性を有するＴ細胞はこれまでに全く知られていないことから、本願発明者らは、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性の特徴を有する新規なＴ細胞集団が、Ｔ細胞の免疫寛容誘導機構に重要な役割を果たし、そして自己免疫疾患を十分にコントロールすることができる制御性Ｔ細胞であると考え、詳細な解析を行った。
この細胞の特徴として、抗炎症作用の強いサイトカインとして知られるＩＬ−１０が高発現しており、また細胞自体の特性として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ高発現のナイーブＴ細胞の細胞分裂を抑制し、またｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＲＡＧ１−／−マウスへＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ高発現のナイーブＴ細胞を移入する腸炎モデルにおいてＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性Ｔ細胞を移入することにより腸炎の発症を抑制することが明らかになった。これらの細胞特性から、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）、ＣＤ２５陰性（ＣＤ２５−）、ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）（ＣＤ４５ＲＢ−（ｌｏｗ））、およびＬＡＧ３陽性（ＬＡＧ３＋）の細胞表面抗原特性を有するＴ細胞は、制御性Ｔ細胞であることが示唆された。
また、上述のマウスの知見に基づいて、ヒト扁桃腺内に存在する細胞についてＥｇｒ−２の高発現細胞集団を探索したところ、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞において、Ｅｇｒ−２のｍＲＮＡ発現量が極めて高いことが明らかになった。マウスの場合にＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）のメモリーＴ細胞集団は、ヒトの場合にＣＤ４５ＲＯ蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来ることが知られていたが、ヒトから上述のＴ細胞が得られたことは、この従来の知見と整合していた。また、このＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞は、マウスのＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞と同様に、ＩＬ−１０が高発現していることも示された。
そして、本発明の発明者らは、これらの細胞がＥｇｒ−２の発現量が極めて高いという特徴を有することにちなんで、この細胞を「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」と命名した。
本発明において得られた「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を、これまでも知られていた制御性Ｔ細胞「Ｆｏｘｐ３  Ｔｒｅｇ細胞」（ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞）と比較した。その結果、本発明の「Ｅｇｒ−２Ｔｒｅｇ細胞」においてはＦｏｘｐ３遺伝子の高い発現は見られず、一方従来から知られていた制御性Ｔ細胞「Ｆｏｘｐ３  Ｔｒｅｇ細胞」ではＥｇｒ−２遺伝子の高発現が見られない、という対照的な特徴を示すことが明らかになった。この結果から、本発明の「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」と従来技術の「Ｆｏｘｐ３  Ｔｒｅｇ細胞」とは、相互に異なる独立したＴ細胞集団と考えられた。
機能的Ｆｏｘｐ３遺伝子を欠損するｓｃｕｒｆｙというマウスは、様々な臓器への炎症性細胞浸潤を伴った自己免疫様疾患を引き起こし、生後４週以内に死亡することが知られている。このｓｃｕｒｆｙマウスの脾臓内のＴ細胞を検討したところ、本発明の「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」と同じＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性の特徴を有するＴ細胞サブセットが顕著に増殖していることが示された。この細胞表面抗原プロファイルを有するＴ細胞サブセットを回収し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて機能を調べた。その結果、この細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ高発現のナイーブＴ細胞の細胞分裂を抑制し、またｉｎ  ｖｉｖｏにおいては腸炎を引き起こすＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ高発現のナイーブＴ細胞を移入したＲＡＧ１−／−マウスへ移入したところ腸炎の発症を抑制する活性を有することが明らかになった。このような細胞表面抗原プロファイルの共通性および細胞の機能の共通性から判断して、ｓｃｕｒｆｙマウスにおけるＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性の特徴を有するＴ細胞サブセットは、「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」であると考えられる。ｓｃｕｒｆｙマウスはＦｏｘｐ３遺伝子を欠損するにも関わらず、「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」がｓｃｕｒｆｙマウスにおいて顕著に存在していることから判断して、「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」はＦｏｘｐ３遺伝子からは独立した特徴を有していることが裏付けられた。
一方、Ｅｇｒ−２遺伝子ノックアウトマウスは、菱脳の形成障害、末梢神経の髄鞘化障害等の症状を発症し、胎児期に死亡する、胎生致死の特徴を有することが知られている（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７  １９９３，ｐｐ．２０７１−２０８４）。そこで、本発明者らは、レトロウィルスベクターを用いてＥｇｒ−２遺伝子の発現を抑制するｓｈ−ＲＮＡ配列を骨髄細胞中で発現した、骨髄キメラマウスを作製した。このマウスは、骨髄移植後、約４週間で死亡し、組織学的に検討したところ腸炎を発症していることが明らかになった。このように、Ｅｇｒ−２遺伝子の欠損により、本来生体内に存在しているはずのＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性の細胞が減少し、その結果として腸炎などの制御性Ｔ細胞の機能低下に伴う臨床症状を発現することが示された。
これらの知見を総合すると、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞またはＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性を有する制御性Ｔ細胞の本体であり、その分化のために転写因子であるＥｇｒ−２遺伝子が重要な役割を果たしている一方、この制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３遺伝子による機能制御とは独立していることが示された。
以上の知見に基づき、本発明はその一態様において、新規の制御性Ｔ細胞として、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＢ陰性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞またはＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＬＡＧ−３陽性のＴ細胞、「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を提供する。この細胞は、上述したように、これまで知られていた制御性Ｔ細胞である「Ｆｏｘｐ３  Ｔｒｅｇ細胞」とは異なるＴ細胞サブセットに属する細胞集団である。
本発明において「Ｅｇｒ−２」という場合、ヒト「Ｅｇｒ−２」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１１１６１により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「Ｅｇｒ−２」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３４２４８により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、ラット「Ｅｇｒ−２」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４４６０８５により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてＥｇｒ−２遺伝子の発現の有無を検出する場合、Ｅｇｒ−２遺伝子から発現されたｍＲＮＡまたはそれから作成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトの場合ｇｃａｃｃａｇｃｔｇｔｃｔｇａｃａａｃａ  ｔｃｔａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をフォワードプライマーとしてそしてａｇｃａａａｇｃｔｇｃｔｇｇｇａｔａｔｇ  ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をリバースプライマーとして、マウスの場合ａｇｃｃｇｔｔｔｃｃｃｔｇｔｃｃｔｃｔｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）をフォワードプライマーとしてそしてｇｔｃｃｃｔｃａｃｃａｃｃｔｃｃａｃｔｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をリバースプライマーとして、一般的なＰＣＲプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
一方、本発明において「ＬＡＧ−３」という場合、ヒト「ＬＡＧ−３」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２２７７により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「ＬＡＧ−３」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３２５０５により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、ラット「ＬＡＧ−３」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９９７６７８により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてＬＡＧ−３遺伝子の発現の有無を検出する場合、ＬＡＧ−３遺伝子から発現されたｍＲＮＡまたはそれから作成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒトの場合ａｔｃｔｇｃａｇｇａａｃａｇｃａｇｃｔｃ  ａａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）をフォワードプライマーとしてそしてａｇｇｇａｔｃｃａｇｇｔｇａｃｃｃａａａ  ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）をリバースプライマーとして、マウスの場合ｔｔｇｃｔｔｃｔｇｇｇａｃｔｇｃｔｔｔｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をフォワードプライマーとしてそしてｇｃｃａｃｔｇｔｃｔｇｇｔｔｇａｔｇｔｔ  ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をリバースプライマーとして、一般的なＰＣＲプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
一方、本発明において「Ｆｏｘｐ３」という場合、ヒト「Ｆｏｘｐ３」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５４７２８により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「Ｆｏｘｐ３」についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４７３３８０により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコートするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてＦｏｘｐ３遺伝子の発現の有無を検出する場合、Ｆｏｘｐ３遺伝子から発現されたｍＲＮＡまたはそれから作成したｃＤＮＡを鋳型として、マウスの場合ｃａｇｃｔｇｃｃｔａｃａｇｔｇｃｃｃｃｔ  ａｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）をフォワードプライマーとしてそしてｃａｔｔｔｇｃｃａｇｃａｇｔｇｇｇｔａｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）をリバースプライマーとして、一般的なＰＣＲプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
上述した「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」は、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ４５ＲＯ、およびＬＡＧ−３の４種類の細胞表面抗原について、ＣＤ４が陽性であること、ＣＤ２５が陰性であること、ＣＤ４５ＲＢが陰性（低陽性）またはＣＤ４５ＲＯが陽性であること、そしてＬＡＧ−３が陽性であることを指標として、生体から採取される白血球集団またはＴ細胞集団の中から単一の細胞集団として単離することができる。具体的には、本発明の「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」は、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ４５ＲＯ、およびＬＡＧ−３についてセルソーターにて選別することにより、単離することができる。ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ４５ＲＯ、およびＬＡＧ−３の発現に基づく選別は、どのような順番で行ってもよい。
ヒトにおいては「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」の供給源となるＴ細胞集団は、生体の末梢血から得られたリンパ球集団またはＴ細胞集団を使用することができる。具体的には、末梢血を血液成分分離装置を用いて体外循環（アフェレーシス）を行い末梢血単核球を分離し、さらにＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ４５ＲＯ、およびＬＡＧ−３の４種類の抗体で染色を行い、セルソーターを用い「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を単離・採取することができる。また、セルソーターの代わりに、Ｉｓｏｌｅｘ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳなどの磁気細胞分離装置を用いて、「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を分離採取することもできる。
上述したリンパ球集団またはＴ細胞集団を、そのまま上述したＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ４５ＲＯ、およびＬＡＧ−３についてセルソーターの処理に供して「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を単離してもよいが、細胞数が不足する場合には、上述したリンパ球集団またはＴ細胞集団を所望の程度まで増殖させた後に、上述したＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ４５ＲＯ、およびＬＡＧ−３についてセルソーターの処理に供して「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を単離してもよい。その様な場合、リンパ球集団またはＴ細胞集団をＣＤ３・ＣＤ２８共刺激、ＴＧＦ−ｂｅｔａおよびＩＬ−２存在下で培養することにより増殖させることが出来る。
さらに、上述したＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ４５ＲＯ、およびＬＡＧ−３についてセルソーターの処理により単離された「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を、そのまま使用することもできるが、細胞数が不足する場合には、単離された「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」をＣＤ３・ＣＤ２８共刺激、ＴＧＦ−ｂｅｔａおよびＩＬ−２存在下で培養することによりさらに増殖させることもできる。
また、強力な臓器移行性が求められる治療に関しては、上記手法にて単離した「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」に、臓器特異的抗原に対するＴ細胞レセプター遺伝子をレトロウイルスベクターで導入することでより抗原特異的な治療効果を増強することが出来る。
本発明において細胞表面抗原ＣＤ４が陽性である細胞は、細胞をＣＤ４に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にＣＤ４蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。ＣＤ４に対する抗体としては、ヒトの場合Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ４抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社などから入手可能）、マウスの場合ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社などから入手可能）を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原ＣＤ２５が陰性である細胞は、細胞をＣＤ２５に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にＣＤ２５蛍光強度が増強している一集団を除去した集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。ＣＤ２５に対する抗体としては、ヒトの場合Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ−Ｃｙａｎｉｎ−７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）標識抗ＣＤ２５抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社などから入手可能）、マウスの場合ＡＰＣ標識抗ＣＤ２５抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社などから入手可能）を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原ＣＤ４５ＲＢが陰性（低陽性）である細胞は、細胞をＣＤ４５ＲＢに対する抗体を使用するセルソーターによりＣＤ４陽性細胞のうち相対的にＣＤ４５ＲＢを強発現している７０％の細胞を除去すること（以下本文中における「ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ」と同義とする）に基づいて分取することにより、単離することができる。ＣＤ４５ＲＢに対する抗体としては、ヒトの場合Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識抗ＣＤ４５ＲＢ抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社などから入手可能）、マウスの場合Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ４５ＲＢ抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、Ｄａｋｏ社などから入手可能）を利用することができる。尚、ヒトの場合ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）の細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来る。この場合、細胞をＣＤ４５ＲＢに対する抗体を使用するセルソーターにより明確にＣＤ４５ＲＯ蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。ＣＤ４５ＲＯに対する抗体としては、ヒトの場合ＰＥ標識抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能）を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原ＬＡＧ−３が陽性である細胞は、細胞をＬＡＧ−３に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にＬＡＧ−３蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。ＬＡＧ−３に対する抗体としては、ヒトの場合ＡＴＴＯ  ４８８標識抗ＬＡＧ−３抗体（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社などから入手可能）、マウスの場合ＰＥ標識抗ＬＡＧ−３抗体（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社などから入手可能）を利用することができる。
上述したように、本発明の「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」は、制御性Ｔ細胞として局所的な免疫寛容を引き起こす機能を有することから、本発明は、単離された「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を構成成分として含む、自己抗原に対する免疫反応に起因または抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患、例えば、種々の自己免疫疾患、移植臓器拒絶など、を治療するための医薬組成物を提供することができる。
本発明の単離された「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を、例えば種々の自己免疫疾患、移植臓器拒絶などを治療するための医薬組成物において利用する場合、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの細胞懸濁液１００ｍｌから５００ｍｌを経静脈的に投与することにより行うことができる。このようにして投与した本発明の単離された「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」は、血流に乗って全身に運ばれ、局所的な免疫寛容を誘導することができる。
本発明において「抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患」という場合、主として移植臓器拒絶などの疾患のことをいうが、これらには限定されない。また、「自己抗原に対する免疫反応に起因する種々の疾患」という場合、主として関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病などの自己免疫疾患のことをいう。
本発明はまた、本発明の単離された「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」の増殖を誘導することができる化合物をスクリーニングする方法もまた、提供する。具体的には、（ａ）本発明の「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を、被検化合物の存在下にて培養する工程；（ｂ）培養した「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」中でのＥｇｒ−２遺伝子の発現の変化またはＬＡＧ３遺伝子の発現の変化を測定する工程；（ｃ）Ｅｇｒ−２遺伝子の発現の増加またはＬＡＧ３遺伝子の発現の増加を導く化合物を、本発明の「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を増加させる化合物として選択する工程；からなる、「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を増加させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
このような化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて単離された「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を増殖させる際に利用することもでき、またはｉｎ  ｖｉｖｏで「Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞」を増殖させることにより免疫寛容を誘導するために利用することもできる。
【実施例】
【０００８】
実施例１：
本実施例においては、Ｔ細胞アナジーに関連すると予想される転写因子Ｅｇｒ−２が、どのような機序でＴ細胞の抑制能に関連しているのかを明らかにすることを目的として、Ｔ細胞にＥｇｒ−２遺伝子を導入して、Ｅｇｒ−２形質転換Ｔ細胞の作用を調べた。
まず、ｃＤＮＡライブラリより得られたＦｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈのＥｇｒ２  ｃＤＮＡをレトロウイルスベクターｐＭＸ（Ｏｎｉｓｈｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：３２４−３２９）に導入し、ｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウイルスベクターを作製した（図１）。同様の手法にて、Ｆｏｘｐ３、ＤＯＴＡＥ、ＤＯＴＢＥを導入したレトロウイルスベクターを作製した（ＤＯＴＡＥ、ＤＯＴＢＥはそれぞれニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）に対する特異的Ｔ細胞レセプターα鎖、β鎖に対応するｃＤＮＡである）。尚、Ｅｇｒ２およびＦｏｘｐ３はＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現により移入遺伝子の発現を評価するため、レトロウイルスベクターにＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）／ＧＦＰを共導入したものを作製した。また、コントロールとしてｍｏｃｋ  ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを使用した（図１）。各プラスミドはパッケージング細胞株のＰＬＡＴ−Ｅ細胞にトランスフェクションすることにより遺伝子組み換えレトロウイルス産生細胞を得た。ついでその培養上清より得られたレトロウイルスをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を用い脾細胞に感染させた。
このようにして得られたＭｏｃｋ（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）またはＥｇｒ２（ｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）レトロウイルスベクターをマウス脾臓細胞に感染させてＥｇｒ２を発現させ、得られたマウスＣＤ４陽性脾細胞をフローサイトメーターを用い、ＧＦＰ発現を指標に各４群（ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｌｏｗ、ｍｉｄ、ｈｉｇｈ）に分け分離採取した（図２）。そして、図２にて分離採取した各４群のそれぞれの細胞よりｃＤＮＡ合成を行い、Ｅｇｒ２  ｍＲＮＡ、およびＬＡＧ−３  ｍＲＮＡレベルにおける発現をリアルタイムＰＣＲ法にて検討した（図３）。尚、ｍＲＮＡ発現はβ−アクチンにて標準化した相対的発現量である。以下、リアルタイムＰＣＲ法は同様の手法を用いて解析を行った。その結果、Ｅｇｒ２の発現とともにＬＡＧ−３も発現増強を認めた（図３）。
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥｇｒ２の抑制能評価のため、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）に対する遅延型過敏反応を検討した。具体的には、ＯＶＡ２００μｇと完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ、ＣｈｏｎｄｒｅｘまたはＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）を混和したものをＢａｌｂ／ｃ  マウス（６〜８週齢）の尾部に皮内注射した。初回免疫の６日後に、単離した脾単核細胞（Ｂａｌｂ／ｃ  マウス（６〜８週齢））に先述のｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ｐＭＸ−Ｆｏｘｐ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ｐＭＸ−ＤＯＴＡＥ、ｐＭＸ−ＤＯＴＢＥレトロウイルスをそれぞれ感染させ７２時間後、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ８、−ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１９陽性細胞をビオチン化抗ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１９抗体及びストレプトアビジン結合マグネットビーズによりｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎし、ＣＤ４陽性細胞を濃縮させた後、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅをＯＶＡ免疫されたマウス尾部より静脈注射にて移入した。各実験群は、Ｍｏｃｋ（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）、ＤＯ１１．１０（ｐＭＸ−ＤＯＴＡＥ、ｐＭＸ−ＤＯＴＢＥ）、Ｆｘｐ３（ｐＭＸ−Ｆｏｘｐ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）、Ｅｇｒ２（ｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）の各レトロウイルスを図表の如く感染させた（各群ｎ＝１２匹）。各レトロウイルス感染細胞移入４８時間後、右足底部にＯＶＡ２０μｇ／ＰＢＳ１００μｌを追加免疫し、同時に左足底部にＰＢＳ１００μｌを投与、追加免疫２４時間後にΔフットパッド（右フットパッド厚−左フットパッド厚）ｍｍを計測し遅延型過敏反応の指標（Δフットパッド（再免疫２４時間後‐再免疫前）ｍｍ）とした。
この結果、Ｅｇｒ２はＦｏｘｐ３と同様、遅延型過敏反応を抑制した。また、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプターを共移入することによりその抑制効果は著しく増強され、抗原特異的免疫抑制が可能なことが示された（図４）。
さらに、図２と同実験条件にてＥｇｒ２（ｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）とＤＯ１１．１０（ｐＭＸ−ＤＯＴＡＥ、ｐＭＸ−ＤＯＴＢＥ）を共移入したマウスの追加免疫２４時間後の脾単核細胞をフローサイトメトリーにて分離解析した。脾単核細胞はフローサイトメトリーにてリンパ球およびＣＤ４陽性細胞ｇａｔｅ後、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞レセプター特異抗体ＫＪ１−２６抗体およびＧＦＰにて展開し、図中の如く各細胞集団を分離採取した。また、図３中にて分離採取した細胞よりｃＤＮＡ合成を行い、Ｅｇｒ２  ｍＲＮＡ、ＬＡＧ−３  ｍＲＮＡ、およびＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡレベルにおける発現をリアルタイムＰＣＲ法にて検討した。この結果、移入した細胞はｐＭＸ−Ｅｇｒ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによりＥｇｒ２を過剰発現するとともに、ＬＡＧ−３の発現も増強され、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプターが共発現することにより、ＬＡＧ−３も発現がさらに著しく増強され、Ｅｇｒ−２の抑制能には抗原特異的なＴ細胞レセプターシグナルが重要であることも示された（図５、図６）。
以上のことにより、Ｅｇｒ２がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて制御性Ｔ細胞様の活性誘導をすることが示された。また、Ｅｇｒ２形質転換Ｔ細胞が、ＬＡＧ−３を顕著に発現し、Ｅｇｒ２の発現量とＬＡＧ−３の発現量が正相関を示し、さらにＬＡＧ−３発現は抗原特異的Ｔ細胞レセプターにより増強されることが明らかになった。
実施例２：
本実施例においては、Ｅｇｒ−２遺伝子を発現するＴ細胞を採取することを目的として細胞分取を行った。
マウス脾単核細胞をＣＤ４−Ｃｙ７ＡＰＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ、ＬＡＧ−３−ＰＥを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、ＬＡＧ−３表面抗原はＣＤ４陽性細胞のうちＣＤ２５陰性の細胞（図７ａ）ＣＤ４５ＲＢ陰性からＣＤ４５ＲＢ弱陽性の細胞（図７ｂ）に発現の増強を認めた（Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞）。尚、Ｆｏｘｐ３−ＴｒｅｇはＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞群と定義され、Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇとは異なった細胞集団である。
さらに、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＬＡＧ−３発現の有無によりフローサイトメーターを用いて分離採取し、ｃＤＮＡ合成後、リアルタイムＰＣＲ法にてＬＡＧ−３  ｍＲＮＡ、Ｅｇｒ２  ｍＲＮＡ、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡ、およびＩＬ−１０  ｍＲＮＡ発現を検討したところ、ＬＡＧ−３発現細胞でのＥｇｒ２  ｍＲＮＡ、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡ、ＬＡＧ−３  ｍＲＮＡの発現増強を認めた（図８）。また、Ｆｏｘｐ３発現はＬＡＧ発現と有意な相関は示さなかった。
次に、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ細胞群にてｇａｔｅした細胞を、ＬＡＧ−３、ＣＤ２５にて展開し、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３−  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗの３群の細胞集団を分離採取した（図９）。
図９にて分離採取した細胞よりｃＤＮＡ合成を行い、リアルタイムＰＣＲ法にてＥｇｒ２  ｍＲＮＡおよびＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡの発現につき検討した。その結果、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）においてＥｇｒ２発現が最も強く、Ｆｏｘｐ３発現では同様の発現傾向は認められなかった（図１０）。
さらに、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性細胞群にてｇａｔｅした細胞をＬＡＧ−３、ＣＤ４５ＲＢにて展開し、図示の如く各細胞群をフローサイトメーターにて分離採取、ｃＤＮＡ合成後、リアルタイムＰＣＲ法にてＥｇｒ２  ｍＲＮＡおよびＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡの発現につき検討した。その結果、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ−３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗにおいてＥｇｒ２発現が最も強く、既知のＦｏｘｐ３−Ｔｒｅｇとは異なったＥｇｒ２−Ｔｒｅｇが存在することが示された（図１１、図１２）。
実施例３：
本実施例においては、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎発症モデルを用いてＥｇｒ２−Ｔｒｅｇの検討を行った。
ＤＢＡ−１Ｊマウス（６〜８週齢）の尾部にウシ由来ＩＩ型コラーゲンと完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ、ＣｈｏｎｄｒｅｘまたはＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）を混和したものを皮内注射し（ｄａｙ０）、その後ＩＩ型コラーゲンの追加免疫（ｄａｙ２１）を行うことによりＩＩ型コラーゲン誘導関節炎発症誘発を行った。関節炎誘発後、図１１と同様の手法により各細胞群を分離採取しリアルタイムＰＣＲ法による解析を行った。その結果、ＩＩ型コラーゲン免疫後もＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）は存在し、免疫後「Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ」におけるＩＬ−１０発現のさらなる増強を認めた（図１３）。尚、Ｅｇｒ−２は関節炎発症後も高発現を維持していた。
実施例４：
本実施例においては、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ−３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）の抑制能につき検討した。
ナイーブＴ細胞サブセットとしてＣＦＳＥラベルしたＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢ  ｈｉｇｈの細胞集団（Ｔｈｙ１．１＋）５×１０４ｃｅｌｌｓを、抗原提示細胞として１５００ｒａｄ放射線照射した脾細胞（Ｔｈｙ１．２＋）１×１０５ｃｅｌｌｓを用いた。抑制性細胞として、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ細胞集団（Ｔｈｙ１．２＋）をＬＡＧ−３発現によりｈｉｇｈ、ｌｏｗ、ｎｅｇａの３群に分け分離採取した（各群５×１０４ｃｅｌｌｓ）（図１４）。各細胞群を図中の如く可溶性ＣＤ３抗体存在下に７２時間共培養し、Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋にてｇａｔｅした細胞のＣＦＳＥ発現減弱をＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢ  ｈｉｇｈの細胞集団分裂増殖の指標として評価を行った。
その結果、Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞は、ナイーブＴ細胞サブセット（ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞）の細胞分裂を抑制し、その抑制能はＬＡＧ−３発現に依存することが明らかになった（図１５）。
実施例５：
本実施例においては、Ｒａｇ１−／−マウスにＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞１×１０５ｃｅｌｌｓを腹腔内投与し、炎症性腸炎発症モデルを作製した。
腸炎は体重減少および組織像にて評価した。体重は細胞移入日（ｄａｙ０）を１００％とした。各群は、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞１×１０５ｃｅｌｌｓのみ、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞１×１０５ｃｅｌｌｓ＋ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞１×１０５ｃｅｌｌｓおよび、ＰＢＳのみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）の３群にて評価した。ＲＡＧ１−／−マウスにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞投与により生じる腸炎を、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞の共移入により抑制することが出来た（図１６）。また、大腸の組織像においても、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞投与単独投与において認められた炎症細胞浸潤、腸管壁肥厚などの所見が、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞の共移入により改善していることが認められた（図１７）。
実施例６：
現在Ｆｏｘｐ３は抑制性Ｔ細胞のマスター遺伝子と考えられている。そこで、本実施例においては、そのＦｏｘｐ３の機能的遺伝子を欠損しているＳｃｕｒｆｙマウスを使用してＥｇｒ２−Ｔｒｅｇに関する検討を行った。
まず、Ｆｏｘｐ３の機能的遺伝子を欠損しているＳｃｕｒｆｙマウスの脾細胞をＣＤ４−Ｃｙ７ＡＰＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ、ＬＡＧ−３−ＰＥを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、フローサイトメーターにて解析にてＳｃｕｒｆｙマウスの脾細胞にもＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞が存在することが示された（図１８）。
また、ナイーブＴ細胞サブセットとしてＣＦＳＥラベルしたＣ５７ＢＬ／６マウスＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢ  ｈｉｇｈの細胞集団（Ｔｈｙ１．１＋）５×１０４ｃｅｌｌｓを、抗原提示細胞として１５００ｒａｄ放射線照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｗｈｏｌｅ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ（Ｔｈｙ１．２＋）１×１０５ｃｅｌｌｓを用いた。抑制性細胞としては、ＳｃｕｒｆｙマウスＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ細胞集団（Ｔｈｙ１．２＋）２．５×１０４ｃｅｌｌｓを用いた。各細胞群を図中の如くｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ３抗体存在下に７２時間共培養し、Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋にてｇａｔｅした細胞のＣＦＳＥ発現減弱をＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢ  ｈｉｇｈの細胞集団分裂増殖の指標として評価を行った。また、同条件にて培養上清中にＬＡＧ−３中和抗体を加えた系も検討した。その結果、機能的Ｆｏｘｐ３遺伝子を欠損したＳｃｕｒｆｙマウスのＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抑制能を有し、その抑制能はＬＡＧ−３中和抗体にて減弱することが示された（図１９）。
さらに、Ｒａｇ１−／−マウスにＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞１×１０５ｃｅｌｌｓを腹腔内投与し、炎症性腸炎発症モデルを作製した。腸炎は体重減少および組織像にて評価した。体重は細胞移入日（ｄａｙ０）を１００％とした。各群は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞１×１０５ｃｅｌｌｓのみ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞１×１０５ｃｅｌｌｓ＋ＳｃｕｒｆｙマウスＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ−３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ（Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ）細胞１×１０５ｃｅｌｌｓおよび、ＰＢＳのみ（ｃｏｎｔｒｏｌ）の３群にて評価した。その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもＲａｇ１−／−マウスの炎症性腸炎発症モデルにおける腸炎を抑制することが示された（図２０）。
以上のことより、Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３の機能に依存せず抑制能を発揮する新規抑制性Ｔ細胞集団であり、その抑制能はＬＡＧ−３を介していることが示された。
実施例７：
本実施例においては、Ｅｇｒ２遺伝子の機能を解析する為、ｓｈＲＮＡ−Ｅｇｒ２レトロウイルスを作製し、Ｅｇｒ２遺伝子をｓｉｌｅｎｃｉｎｇし、マウスのフェノタイプ解析を行った。
具体的には、５ＦＵを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞を採取し、ｓｈＲＮＡ−Ｅｇｒ２レトロウイルスを感染させた後、放射線照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移入することで、ｓｈＲＮＡ−Ｅｇｒ２骨髄キメラマウスを作製した（図２１）。その結果、Ｅｇｒ２遺伝子発現がｓｉｌｅｎｃｉｎｇされることにより、ＬＡＧ−３発現は抑制され、ｓｈＲＮＡ−Ｅｇｒ２骨髄キメラマウスは腸管の著しい肥厚を認めた（写真は骨髄移植３０日後のマウス大腸）（図２２）。また、骨髄移植後、著しい腸炎を発症し約４週間で死亡した。
実施例８：
本実施例においては、本発明のＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞が、生体内でどのような機序で誘導されるかを明らかにすることを目的として、Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞の誘導実験を行った。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢ細胞欠損マウスであるμＭＴマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の脾臓およびパイエル板を小さな組織片に細かく切断し、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からＣＤ４＋のＴ細胞を採取し、この細胞について実施例２に記載する様に、ＰＥ−抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体（ＬＡＧ−３−ＰＥ）およびＦＩＴＣ−抗ＣＤ４５ＲＢモノクローナル抗体（ＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣ）を用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは脾臓由来の細胞およびパイエル板由来の細胞ともに、本発明のＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞と同じ表現型（すなわち、ＬＡＧ−３＋ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ）を有するＴ細胞が存在するが、μＭＴマウスでは、ＬＡＧ−３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗを有するＴ細胞が存在しないことが明らかになった（図２３）。
この結果から、生体内におけるＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞の分化誘導に際して、Ｂ細胞が何らかの機能を果たしている可能性が示されたので、本実施例においてはさらに、Ｂ細胞欠損マウスであるμＭＴマウスに対してＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓から採取したＢ細胞を移植して、本発明のＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞がμＭＴマウス生体内で誘導されるかどうかを検討した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取した脾臓の単一細胞懸濁液をＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を製造者のプロトコルに従って使用するＭＡＣＳにより、ネガティブ選択をすることによって精製した。ＭＡＣＳでソートされたＢ細胞の精製度は、＞９８％であった。このように精製された２×１０７Ｂ細胞をμＭＴマウスの静脈内に注射した。対照マウスには、ＰＢＳを注射した。細胞移植後９週間後に、マウスを犠死させ、そして脾臓細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
その結果、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ細胞を移植したμＭＴマウスでは、本発明のＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞と同じ表現型（ＬＡＧ−３＋  ＣＤ４５ＲＢ  ｅｘ  ｌｏｗ）を有するＴ細胞が、μＭＴマウスと比較して有意に増加することが明らかになった（図２３）。従って、生体内における本発明のＥｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞の分化誘導に際しては、Ｂ細胞の存在が必要不可欠であることが明らかになった。
実施例９：
次いで、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が分化誘導のために胸腺間質細胞により発現される自己−ペプチド／ＭＨＣとのより高い親和性のアゴニスト性相互作用を必要とされることが知られていたことから、本実施例においては、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞が、Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞と同様の胸腺の選択プロセスを通じて、分化誘導されるのかどうかを調べた。
ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−ＩＩマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）およびＲＩＰ−ｍＯＶＡマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して、膵島および胸腺中でラットインスリン遺伝子プロモータの調節下で膜結合型のＯＶＡを発現すると同時に、Ｉ−Ａｂとの関連でＯＶＡペプチドを認識するトランスジェニックＴＣＲ（Ｖα２およびＶβ５．１／５．２）も発現する、ＲＩＰ−ｍＯＶＡ／ＯＴ−ＩＩ二重−トランスジェニックマウスを作出した。このＲＩＰ−ｍＯＶＡ／ＯＴ−ＩＩ  二重−トランスジェニックマウスにおいて、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞の頻度は、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞の頻度がこれらの臓器中で増加したのとは対照的に、胸腺および脾臓において増加しなかった（図２４）。この図において、上パネルおよび下パネルのプロットはそれぞれ、ＣＤ４＋  Ｖβ５．１／５．２＋およびＣＤ４＋  ＣＤ２５−  Ｖβ５．１／５．２＋Ｔ細胞についてゲートされたものである。
一方、ＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウスは、脾臓およびパイエル板において正常マウスと同等数のＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞を含有したが、Ｉ−Ｅα鎖−特異的Ｉ−Ａｂ−拘束性トランスジェニックＴＣＲを発現するＴＥａトランスジェニックマウスは、特に脾臓において、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞をほとんど有さなかった（図２５）。
さらに、ＴＥａマウスは、組織学的検討においても脾臓濾胞中に非常に少数のＥｇｒ−２−発現細胞しか含有しなかった（図２６）。この図において、それぞれのバーは、１つの濾胞からの測定数を示す。このデータは、各群３匹のマウスから集めたものである。
すべてのエラーバーは、標準偏差を示す；２つのアスタリスクは、Ｐ＜０．０１であることを示す。
これらの結果を合わせると、Ｅｇｒ２−Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺における自己抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体との高い親和性相互作用が分化に必要であるＦｏｘｐ３−Ｔｒｅｇとは分化誘導の形態が全く異なる抑制性Ｔ細胞であることも明らかとなった。興味深いことに、ＴＥａトランスジェニックマウスは、本発明者の飼育環境下において、１０週齢で自然発生的な大腸炎を発症し、この動物をマウスを大腸炎モデルとして使用することができた（図２７）。この図において、ＴＥａマウスの大腸、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞の養子導入を受けたＴＥａマウスの大腸、そして正常のＴｅａ同腹子の大腸（対照）の代表的な肉眼的写真（左）およびヘマトキシリン−エオジン組織切片（右）を示す。そして、ＴＥａトランスジェニックマウスに正常なＣ５７ＢＬ／６マウスからＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞を移植すると、ＴＥａトランスジェニックマウスにおける大腸炎の自然発症が顕著に抑制されることが示された（図２７）。これらの知見から、ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞が、大腸炎誘導性Ｔ細胞応答を調節するための治療能力を有することが示唆される。
実施例１０：
本実施例においては、実施例２において得られたマウスの知見に基づいて、ヒト扁桃腺由来細胞から、Ｅｇｒ−２遺伝子を発現するＴ細胞を採取することを目的として細胞分取を行った。
ヒト扁桃腺由来細胞をＣＤ４−Ｃｙ７ＡＰＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、ＬＡＧ−３−ＰＥを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。ＣＤ４５ＲＢ陰性（低陽性）の細胞集団は、ヒトの場合にはＣＤ４５ＲＯ蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来ることが知られていたため、実施例２において使用したＣＤ４５ＲＢ−ＦＩＴＣの代わりに、本実施例においてはＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣを使用した。
その結果、ＬＡＧ−３表面抗原はＣＤ４陽性細胞のうちＣＤ２５陰性の細胞（図２８ａ）ＣＤ４５ＲＯ陽性の細胞（図２８ｂ）に発現の増強を認めた（Ｅｇｒ−２  Ｔｒｅｇ細胞）。
さらに、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＬＡＧ−３発現の有無によりフローサイトメーターを用いて分離採取し、ｃＤＮＡ合成後、リアルタイムＰＣＲ法にてＬＡＧ−３  ｍＲＮＡ、Ｅｇｒ２  ｍＲＮＡ、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡ、およびＩＬ−１０  ｍＲＮＡ発現を検討したところ、ＬＡＧ−３発現細胞でのＥｇｒ２  ｍＲＮＡ、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡ、ＬＡＧ−３  ｍＲＮＡの発現増強を認めた（図２９）。また、Ｆｏｘｐ３発現はＬＡＧ発現と有意な相関は示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
現在、自己免疫疾患や移植臓器拒絶などの、望まれない抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患を治療するためには、免疫抑制剤の投与など全身的に免疫機能を抑制する処置を必要としており、それに伴う重症感染症を含めた副作用が大きな問題となっていたが、本発明の制御性Ｔ細胞を投与することにより、局所的な免疫寛容を誘導することができることから、患者体内において上述したような副作用を引き起こすことなく、自己抗原に対する免疫反応に起因するかまたは望まれない抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する、自己免疫疾患や移植臓器拒絶などの種々の疾患を治療することができる。
［配列表］
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２９】
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【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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