(57)【要約】  本発明は、新たな悪性腫瘍治療薬を提供するものである。  一般式（１）（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）で示される基を示す）で表される化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬。2008152758.tif 0000192008152758.tif 000020
2008152758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2008152758.tif 000009
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）
【化２】
2008152758.tif 000010
（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）
で示される基を示す）
で表される化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬。
【請求項２】
有効成分が、次式（１ａ）〜（１ｃ）
【化３】
2008152758.tif 000011
で表される化合物である請求項１記載の悪性腫瘍治療薬。
【請求項３】
次式（１ｄ）〜（１ｆ）
【化４】
2008152758.tif 000012
で表される化合物。
【請求項４】
悪性腫瘍治療薬製造のための、一般式（１）
【化５】
2008152758.tif 000013
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）
【化６】
2008152758.tif 000014
（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）
で示される基を示す）
で表される化合物の使用。
【請求項５】
一般式（１）で表される化合物が、次式（１ａ）〜（１ｃ）
【化７】
2008152758.tif 000015
で表される化合物である請求項４記載の使用。
【請求項６】
一般式（１）
【化８】
2008152758.tif 000016
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）
【化９】
2008152758.tif 000017
（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）
で示される基を示す）
で表される化合物の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍の治療方法。
【請求項７】
一般式（１）で表される化合物が、次式（１ａ）〜（１ｃ）
【化１０】
2008152758.tif 000018
で表される化合物である請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍治療薬、特に植物由来の成分を有効成分とする悪性腫瘍治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は古来より医薬品資源として注目されており、これまでにも様々な医薬品あるいは医薬品素材が植物中に見出されている。植物由来の悪性腫瘍治療薬としては、イチイ科の植物からの抽出物であるパクリタキセル（タキソール）；クロタキカズラ科クサミズキ、タマミズキ科カンレンボクに含まれるアルカロイドであるカンプトテシン；及びキョウチクトウ科ニチニチソウに含まれるインドールアルカロイドであるビンクリスチン、ビンブラスチン等が知られている。【０００３】
ショウガ科ユウリョウキョウの根茎由来の生薬である良姜（リョウキョウ）には、古くから鎮吐作用があることが知られている。また、リョウキョウには、精油成分として１，８−シネオール、メチルシンナメート、オイゲノール、ピネン、カディネンなどが含まれており、また辛味成分としてガランゴールなどが含まれていることが知られている。【０００４】
一方、クルクミンはウコンに含まれる黄色を呈する色素成分であり、肝機能の改善等の作用の他に抗腫瘍活性があることが知られている（非特許文献１）
【非特許文献１】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００４  Ｍａｒ−Ａｐｒｉ；２４（２Ｂ）：９８７−９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、リョウキョウの抽出成分中に悪性腫瘍活性があることは知られていない。また、クルクミンの神経芽腫細胞に対する増殖阻害活性（ＥＣ５０）は、１０μＭ程度であり、悪性腫瘍治療薬として使用できるものではなかった。【０００６】
本発明の目的は、植物中から新規な悪性腫瘍治療薬を探索することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、リョウキョウの抽出物を対象として抗腫瘍活性を指標にスクリーニングしたところ、クルクミンに類似した構造を有する化合物がクルクミンに比べて顕著に優れた抗腫瘍活性を有し、悪性腫瘍治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、一般式（１）【０００９】
【化１】
2008152758.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）【００１１】
【化２】
2008152758.tif 000004
【００１２】
（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）
で示される基を示す）
で表される化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬を提供するものである。
また、本発明は、悪性腫瘍治療薬製造のための、上記一般式（１）で表される化合物の使用を提供するものである。
また、本発明は、悪性腫瘍治療に用いるための上記一般式（１）で表される化合物を提供するものである。
さらに本発明は、上記一般式（１）で表される化合物の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍の治療方法を提供するものである。【００１３】
また、上記一般式（１）のうち、一部の化合物は新規化合物である。従って、本発明は、次式（１ｄ）〜（１ｆ）【００１４】
【化３】
2008152758.tif 000005
【００１５】
で表される化合物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の悪性腫瘍治療薬は、優れた抗腫瘍活性を有し、その作用は癌細胞に対するアポトーシス誘導能によるものである。従って、新たな悪性腫瘍治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】リョウキョウから本発明化合物の抽出図を示す。
【図２】神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２に対する化合物（１ａ）の細胞傷害活性を示す図である（図中、Ｎｏｒｍは何ら作用させていない神経芽腫細胞、Ｖｅｈは溶媒のみを加えたコントロールを示す。以下同じ。）。
【図３】神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２に対する化合物（１ｂ）の細胞傷害活性を示す図である。
【図４】神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２に対する化合物（１ｃ）の細胞傷害活性を示す図である。
【図５】化合物（１ａ）及び（１ｂ）の細胞傷害活性を示す図である。
【図６】化合物（１ｂ）を作用させたＩＭＲ−３２細胞の位相差像及び蛍光像を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の悪性腫瘍治療薬の有効成分は、前記一般式（１）で表される。式（１）中、Ｒ１としては、メトキシ基又は水素原子が好ましい。Ｒ２としては、水素原子が好ましい。また、Ｒ３としてはヒドロキシ基が好ましく、Ｒ４としては、メトキシ基が好ましい。またＲ５は水素原子が好ましい。【００１９】
一般式（１）で表される化合物のうち、以下の式（１ａ）〜（１ｆ）で表される化合物が好ましく、さらに式（１ａ）〜（１ｃ）で表される化合物が好ましく、特に式（１ａ）又は（１ｂ）で表される化合物が好ましい。【００２０】
【化４】
2008152758.tif 000006
【００２１】
【化５】
2008152758.tif 000007
【００２２】
一般式（１）で表される化合物は、例えばリョウキョウから抽出することにより得ることができる。例えば、抽出溶媒としては、低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール及びこれらの水性媒体やエーテルを挙げることができる。これらは単独で用いても良いし、混合しても良い。好ましくは、メタノール、エタノール又はエーテルである。また、酢酸エチルやアセトンなども好ましい抽出溶媒である。本発明に係る化合物は、上記抽出溶媒から分離精製することで得られる。【００２３】
後記実施例から明らかなように、一般式（１）の化合物は、神経芽腫細胞に対して優れた細胞傷害活性を有する。また、その細胞傷害活性はアポトーシス誘導活性に基づくものである。従って、一般式（１）の化合物、あるいはこれらの化合物を含有するリョウキョウ抽出物は、ヒトを含む哺乳動物の悪性腫瘍治療薬として有用である。【００２４】
本発明の悪性腫瘍治療薬の対象となる悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫などの血液や造血組織の腫瘍及び固形腫瘍が含まれる。固形腫瘍としては、神経芽腫の他、皮膚癌、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられる。【００２５】
本発明の医薬は、式（１）の化合物、あるいは前記抽出物に賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用などの剤形に製剤化することによって得られる。【００２６】
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。【００２７】
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。【００２８】
本発明の医薬は、式（１）の化合物として、１日当り約１〜５００ｍｇ／ｋｇを１〜４回投与するのが好ましい。
【実施例】
【００２９】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【００３０】
実施例１
以下、リョウキョウから６種のジアリルヘプタノイド類化合物を分離精製する方法の一例を、図１を用いて説明する。【００３１】
（１）リョウキョウのメタノール抽出エキスは、先ず酢酸エチル−水（１：１）で溶媒分画を行い、酢酸エチル画分（回収量：２５．７ｇ）と水層を得た。
次に酢酸エチル画分について、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０−カラムクロマトグラフィー（以下、カラムクロマトグラフィーを「ＣＣ」と略す。）［Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０使用量：１２０ｇ、溶出液：クロロホルム−メタノール（１：１）］により７の画分（フラクション１〜７）に分画した。
上記画分のうちフラクション（以下、「Ｆｒ．」と略す。）４（回収量：１．５ｇ）はシリカゲル−ＣＣ（シリカゲル使用量：３００ｇ、溶出溶媒：クロロホルム−メタノール）により、１０の画分（フラクション４−１〜４−１０）に分画した。【００３２】
（２）Ｆｒ．４−２（回収量：５．６ｍｇ）は、分取［オクタデシルシリカ（以下、「ＯＤＳ」と略す。）］−高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略す。）を繰返すことにより、アルピノイドＡ（化合物１ｄ；回収量：０．８ｍｇ）を得た。
１ｄ：［α］２５Ｄ：−６．０８ｏ（ＣＨＣｌ３）
ＦＡＢ  ＭＳ  ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］＋７０５
ＨＲ  ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｎａ］＋７０５．３４０３５（ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  ７０５．３４０９６）【００３３】
（３）Ｆｒ．４−５（回収量：６２ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：１００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）］により、５の画分（フラクション４−５−１〜４−５−５）に分画した。Ｆｒ．４−５−２（回収量：３．２ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、アルピノイドＣ（化合物１ｅ；回収量：１．５ｍｇ）を得た。
１ｅ：［α］２５Ｄ：−３．９２ｏ（ＣＨＣｌ３）
ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ：［Ｍ］＋２８０
ＨＲ  ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ：［Ｍ］＋２８０．１４６７３（ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  ２８０．１４６３２）【００３４】
（４）一方、Ｆｒ．４−５−４（回収量：４１ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、７−（４”−ｈｙｄｒｏｘｙ−３”−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１−ｐｈｅｎｙｌｈｅｐｔ−４−ｅｎ−３−ｏｎｅ（化合物１ａ；回収量：３６ｍｇ）を得た。【００３５】
（５）Ｆｒ．４−７（回収量：３１３ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：２００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）］により、３の画分（フラクション４−７−１〜４−７−３）に分画した。Ｆｒ．４−７−２（回収量：２７５ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、５−ｍｅｔｈｏｘｙ−７−（４”−ｈｙｄｒｏｘｙ−３”−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１−ｐｈｅｎｙｌ−３−ｈｅｐｔａｎｏｎｅ（化合物１ｂ；回収量：２７０ｍｇ）を得た。【００３６】
（６）Ｆｒ．４−８（回収量：１１２ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：２００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）］により、５の画分（フラクション４−８−１〜４−８−５）に分画した。Ｆｒ．４−８−２（回収量：９９．５ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、５−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−（４”−ｈｙｄｒｏｘｙ−３”−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１−ｐｈｅｎｙｌ−３−ｈｅｐｔａｎｏｎｅ（化合物１ｃ；回収量：９７ｍｇ）を得た。一方、Ｆｒ．４−８−４（回収量：１２ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、アルピノイドＢ（化合物１ｆ；回収量：１０．３ｍｇ）を得た。【００３７】
表１に化合物（１ｄ）、（１ｆ）、（１ｅ）のＮＭＲスペクトルを示す。【００３８】
【表１】
2008152758.tif 000008
【００３９】
実施例２（抗腫瘍活性）
抗腫瘍活性は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロミド）法により測定した。
９６−ｗｅｌｌプレートにＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁した腫瘍細胞（１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を１００μＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ２，３７℃，飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０−４〜１×１０−８Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを０．２μＬずつそれぞれ添加し、４８時間腫瘍細胞に作用させた。次に、０．５％ＭＴＴ液を１０μＬ加え、３時間後に反応停止液（０．０４Ｎ  ＨＣｌ／イソプロパノール）を１００μＬ加え反応を停止させた。よくピペッティングをした後、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍ（ｔｏｐ）及び６５５ｎｍ（ｂｏｔｔｏｍ）における吸光度を測定した。各検体の各濃度における細胞生存率は、コントロール群に対する百分率により求め、そこからＥＣ５０値を算出した（図２〜５）。腫瘍細胞としては、神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２を用いた。【００４０】
実施例３（アポトーシス誘導能）
アポトーシス誘導能は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色法で核染色することにより試験した。
６−ｗｅｌｌプレートにＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁した細胞（ＩＭＲ−３２：２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を２ｍＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ２，３７℃、飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０−６Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを４μＬずつそれぞれに添加し、２４時間細胞に作用させた。次に、０．０２５％Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２溶液を１００μＬ加え、１５分後に蛍光顕微鏡にて位相差像及び蛍光像を撮影し、細胞の形態変化を観察した。その結果、化合物（１ｂ）は、１μＭで、核の凝集化及び断片化が認められることから、ＩＭＲ−３２細胞に対する細胞傷害活性はアポトーシス誘導によるものであることが判明した（図６）。【００４１】
その結果、図２〜図６に示すように、式（１）の化合物は、１０−７Ｍという低い濃度から強力な抗腫瘍活性を有していた。また、その細胞傷害活性はアポトーシス誘導によるものであった。
【図１】
2008152758.tif 000021
【図２】
2008152758.tif 000022
【図３】
2008152758.tif 000023
【図４】
2008152758.tif 000024
【図５】
2008152758.tif 000025
【図６】
2008152758.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月9日(2009.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2008152758.tif 000027
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）
【化２】
2008152758.tif 000028
（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）
で示される基を示す）
で表される化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬。
【請求項２】
有効成分が、次式（１ａ）〜（１ｃ）
【化３】
2008152758.tif 000029
で表される化合物である請求項１記載の悪性腫瘍治療薬。
【請求項３】
次式（１ｄ）〜（１ｆ）
【化４】
2008152758.tif 000030
で表される化合物。
【請求項４】
悪性腫瘍治療薬製造のための、一般式（１）
【化５】
2008152758.tif 000031
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）
【化６】
2008152758.tif 000032
（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）
で示される基を示す）
で表される化合物の使用。
【請求項５】
一般式（１）で表される化合物が、次式（１ａ）〜（１ｃ）
【化７】
2008152758.tif 000033
で表される化合物である請求項４記載の使用。
【請求項６】
一般式（１）
【化８】
2008152758.tif 000034
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基を示し；Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ３は水素原子又はヒドロキシ基を示し；Ｒ４は水素原子又はメトキシ基を示し；破線はその部分が二重結合になっていてもよいことを示し；Ｒ５は水素原子又は式（ａ）
【化９】
2008152758.tif 000035
（式中、矢印は結合部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び破線は前記と同じ）
で示される基を示す）
で表される化合物の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍の治療方法。
【請求項７】
一般式（１）で表される化合物が、次式（１ａ）〜（１ｃ）
【化１０】
2008152758.tif 000036
で表される化合物である請求項６記載の方法。
【請求項８】
神経芽腫治療薬である請求項２記載の悪性腫瘍治療薬。
【請求項９】
悪性腫瘍が神経芽腫である請求項５記載の使用。
【請求項１０】
悪性腫瘍が神経芽腫である請求項７記載の方法。
【国際調査報告】
2008152758.tif 000037
2008152758.tif 000038
2008152758.tif 000039
2008152758.tif 000040
2008152758.tif 000041
2008152758.tif 000042