【手続補正書】
【提出日】平成15年12月12日(2003.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを非ランダム的にシャッフルするための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法であって、
ａ）ポリヌクレオチド・ライブラリから、少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドの一本鎖断片を、直接あるいは間接的に得ること、
ｂ）前記断片を、少なくとも二つの断片が隣接的にハイブリダイズするまで、一つ以上の考案組織化テンプレートへハイブリダイズすることによって、少なくとも一つの部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記テンプレートの少なくとも一つが、前記相同ポリヌクレオチドと少なくとも一つのホモロジー領域を共有し、
ｃ）前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを処理して、少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記処理は、順序に無関係に次のことからなり、
（ｉ）ニックをライゲートすること、そして
（ｉｉ）必要に応じて、次のギャップを満たす技術のいずれか、あるいは組合せを行うこと、
隣接的にハイブリダイズする断片数を増加させるよう、前記断片を前記テンプレートへさらにハイブリダイズすることによってギャップを満たすこと、
部分的にハイブリダイズした断片の張り出しフラップをトリムすることによって短いギャップを満たすこと、そして
重合を介して短いギャップを満たすことからなる方法。
【請求項２】
ステップが生体外で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相同ポリヌクレオチドが二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
方法の１サイクルの後に組み換えポリヌクレオチドが形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）、（ｂ）そして／あるいは（ｃ）の一回を超える繰り返し後に、組み換えポリヌクレオチドが形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
方法の次のサイクルで用いるテンプレートあるいは相同ポリヌクレオチドが、方法の前のサイクルで生じた組み換えポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記テンプレートが、最初は二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記テンプレート鎖を排除、分離、あるいは分解するよう、組み換えポリヌクレオチドのテンプレート鎖を処理することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
テンプレートがｍＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
断片が、最初は二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）、（ｂ）あるいは（ｃ）において、補足あるいは代理断片が加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）が、前記相同ポリヌクレオチド上に多数の切断部位を持つ少なくとも一つの制限酵素で、あるいは複数の異なる制限酵素で、前記相同ポリヌクレオチドを断片化することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）における断片が、長さが少なくとも１５残基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）が、別個のポリヌクレオチド・ライブラリから、断片の少なくとも二つの母集団を得ること、あるいは異なる制限酵素を用いて、同じポリヌクレオチド・ライブラリから、断片の少なくとも二つの別個の母集団を得ることからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）が、ＤＮアーゼＩでランダムに前記相同ポリヌクレオチドを断片化することからなり、前記相同ポリヌクレオチド、あるいはそれらから得た断片が、最初は二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）における断片が、長さが少なくとも５０残基である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）の断片が増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）の断片が、テンプレートの全長に沿って隣接する端部を持つ断片を生成するオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて増幅される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）が、相同ポリヌクレオチドを３以上の断片へ断片化することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）そして／あるいはステップ（ｃ）で使用のために、フラップ・エンドヌクレアーゼが加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
フラップ・エンドヌクレアーゼの濃度が約１．８から２．２μｇ／ｍｌであり、ハイブリダイゼーションが約５から２０Ｃの温度で起こり、そしてライゲーションが約６０から７５℃の温度で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド・ライブラリが、天然の遺伝子から、連続的な方向定位の突然変異誘発によって、エラー・プローンＰＣＲによって、ランダムな化学的突然変異誘発によって、生体内でのランダムな突然変異誘発によって、あるいは同じ、または異なる種内の遺伝子系統群からの遺伝子を結合することによって生成されることで、前記ポリヌクレオチド・ライブラリ内に種々の配列がもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド・ライブラリが合成配列からなる、またはステップ（ａ）、（ｂ）あるいは（ｃ）において合成断片が加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
テンプレートが、ポリヌクレオチド・ライブラリから、あるいは前記ライブラリのコンセンサス配列から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
一つの断片の３’端部を、そして隣接断片の５’端部を補足するポリヌクレオチドがテンプレートとして用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
組み換えポリヌクレオチドが、重合酵素を使用せずに得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
組み換えポリヌクレオチドが、交差あるいは鎖乗り換えを誘発せずに得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
断片及び組み換えポリヌクレオチドが、サイズ分画せずに得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）が、単一のハイブリダイゼーション事象を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）が単一のハイブリダイゼーション事象を必要とし、ステップ（ｃ）が全くハイブリダイゼーション事象を必要としない、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド・ライブラリあるいはテンプレートが、組み換えポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記一本鎖断片が孤立鎖断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記テンプレートが孤立鎖テンプレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記断片及び前記テンプレートが孤立鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
孤立鎖断片が前記相同ポリヌクレオチドの頂部鎖からのものであり、孤立鎖テンプレートが前記相同ポリヌクレオチドの底部鎖からのものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
孤立鎖断片が前の相同ポリヌクレオチドの底部鎖からのものであり、孤立鎖テンプレートが前記相同ポリヌクレオチドの頂部鎖からのものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
相同ポリヌクレオチドが、互いに３０から９０％相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
テンプレートが、前記相同ポリヌクレオチドの各々に、ほぼ等しく相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
相同ポリヌクレオチドの少なくとも半分が、互いに約２０から４５％だけ相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
さらに、生体外で組み換えポリヌクレオチドを翻訳し、そのタンパク質を発現させることからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
さらに、所望の特性を持つ前記組み換えポリヌクレオチドの少なくとも一つを選択するステップ（ｄ）からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
ステップが生体外で起こる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、ステップ（ｄ）の前に、しかし、テンプレート鎖を排除、分離、あるいは分解した後に、組み換え鎖から二本鎖の組み換えポリヌクレオチドを再生成し、そして前記二本鎖の組み換えポリヌクレオチドをクローンすることからなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ポリヌクレオチドの生体外非ランダム・シャフリングのための、テンプレート調整ライゲーション・オンリーの方法であって、
ａ）ポリヌクレオチド・ライブラリから直接あるいは間接的に、少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドの孤立鎖制限断片を得ること、
ｂ）前記断片を、テンプレートにハイブリダイズする断片のすべてが隣接的にハイブリダイズするまで、一つ以上の考案組織化テンプレートへ反復的にハイブリダイズすること、なお、前記テンプレートは孤立鎖で、過渡的であり、前記テンプレートの少なくとも一つが、前記相同ポリヌクレオチドと少なくとも一つのホモロジー領域を共有し、
ｃ）ニックをライゲートして少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること、そして
ｄ）所望の特性を持つ前記組み換えポリヌクレオチドの少なくとも一つを選択することからなる方法。
【請求項４６】
ポリヌクレオチドの突然変異を含む領域の生体外非ランダム・シャフリングのための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法であって、
ａ）ポリヌクレオチド対立遺伝単位間の突然変異を含む領域に対する制限部位の位置を定めること、
ｃ）前記対立遺伝単位から直接あるいは間接的に、前記制限部位に対応する断片を得ること、
ｂ）前記断片を、少なくとも二つの断片が隣接的にハイブリダイズするまで、一つ以上の考案組織化テンプレートへハイブリダイズすることによって少なくとも一つの部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記テンプレートの少なくとも一つの全体あるいは一部分が、前記対立遺伝単位の前記突然変異を含む領域に相同であり、
ｃ）前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを処理して少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記処理が、順序に関係なく次のことからなり、
（ｉ）ニックをライゲートすること、そして
（ｉｉ）次のギャップを満たす技術の一つ、あるいは組合せを行うこと、
隣接的にハイブリダイズする断片数を増加させるよう、前記断片を前記テンプレートへさらにハイブリダイズすることによってギャップを満たすこと、そして
部分的にハイブリダイズした断片の張り出しフラップをトリムすることによって短いギャップを満たすこと、そして
ｄ）所望の特性を持つ前記組み換えポリヌクレオチドの少なくとも一つを選択ことからなる方法。
【請求項４７】
遺伝子系統群の生体外非ランダム低ホモロジー・シャフリングのための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法であって、
ａ）遺伝子系統群ライブラリから直接あるいは間接的に、前記遺伝子系統群のポリヌクレオチドの少なくとも二つからなる孤立鎖制限断片を得ること、
ｂ）前記断片を、少なくとも二つの断片が隣接的にハイブリダイズするまで、一つ以上の考案組織化テンプレートへハイブリダイズすることによって、少なくとも一つの部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記テンプレートは、孤立鎖で、そして過渡的であり、前記テンプレートの少なくとも一つは、前記遺伝子系統群ポリヌクレオチドと少なくとも一つのホモロジー領域を共有し、
ｃ）前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを処理して少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記処理は、順序に関係なく次のことからなり、
（ｉ）ニックをライゲートすること、そして
（ｉｉ）次のギャップを満たす技術の一つあるいは組合せを行うこと、
隣接的にハイブリダイズする断片数を増加させるよう、前記断片を前記テンプレートへさらにハイブリダイズすることによってギャップを満たすこと、そして
部分的にハイブリダイズした断片の張り出しフラップをトリムすることによって短いギャップを満たすこと、そして
ｄ）所望の特性を持つ前記組み換えポリヌクレオチドの少なくとも一つを選択することからなる方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の方法によって得た組み換えポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４８の組み換えポリヌクレオチドによってコード化したタンパク質。
【請求項５０】
ライゲートすること、あるいはギャップを満たすことが起こる前に、隣接的にハイブリダイズする断片の少なくとも二つが、ステップ（ｂ）において隣接的にハイブリダイズする、請求項１あるいは４２に記載の方法。
【請求項５１】
ステップが生体内で起こる、請求項１あるいは４２に記載の方法。
【請求項５２】
ポリヌクレオチドを非ランダム的にシャッフルするための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法であって、
ａ）少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドの一本鎖断片を、少なくとも二つの断片が隣接的にハイブリダイズするまで、一つ以上の考案組織化テンプレートへハイブリダイズすることによって、少なくとも一つの部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記テンプレートの少なくとも一つが、前記相同ポリヌクレオチドと少なくとも一つのホモロジー領域を共有し、
ｂ）前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを処理して少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記処理は、順序に関係なく次のことからなり、
（ｉ）ニックをライゲートすること、そして
（ｉｉ）必要に応じて、次のギャップを満たす技術の一つ、あるいは組合せを行うこと、
隣接的にハイブリダイズする断片数を増加させるよう、前記断片を前記テンプレートへさらにハイブリダイズすることによってギャップを満たすこと、
部分的にハイブリダイズした断片の張り出しフラップをトリムすることによって短いギャップを満たすこと、そして
重合を介して短いギャップを満たすことからなる方法。
【請求項５３】
少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドの一本鎖断片、そして
少なくとも二つの断片が隣接的にハイブリダイズすることが可能な、少なくとも一つの考案組織化テンプレートからなる、ポリヌクレオチド・シャフリング反応混合物。
【請求項５４】
ポリヌクレオチドを非ランダム的にシャッフルする、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法のための、請求項５３に記載のポリヌクレオチド・シャフリング反応混合物の用途。
【請求項５５】
前記断片が少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドからのものであり、
前記断片のいくつかが、組織化テンプレートにほぼ相同であり、
前記断片が、一つ以上の考案組織化テンプレート上にハイブリダイズして、少なくとも一つの部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成することが可能であり、
二つのハイブリダイズ断片が隣接すると、リガーゼとライゲートすることが可能である、断片のライブラリ。
【請求項５６】
ポリヌクレオチドを非ランダム的にシャッフルする、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法のための、請求項５５に記載のライブラリの用途。