【手続補正書】
【提出日】平成17年8月15日(2005.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ) インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の水性懸濁液をその前駆体のシステイン残基あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の１〜１５ＳＨ残基を生じる量のシステインまたはシステイン塩酸塩と混合し、
(ｂ) ｐＨ約８〜約１１.５、温度約１５〜約５５℃においてカオトロピック補助剤の４〜９モル溶液に前駆体のシステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液を導入し、得られた混合物をこの温度に約１０〜６０分保持し、ついで
(ｃ) ｐＨ約８〜約１１.５、温度約５〜約３０℃で混合物を混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を約１〜５ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.２〜１.０Ｍに希釈する量の水に導入する
各工程を連続的に実施することからなる、正しく結合したシステイン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体をシステインまたはシステイン塩酸塩およびカオトロピック補助剤の存在下に取得する方法。
【請求項２】
工程(ａ)において、システインまたはシステイン塩酸塩の量は前駆体のシステイン残基あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の１〜６ＳＨ残基を生じる量に相当し、
工程(ｂ)において、前駆体のシステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液をｐＨ８〜１１、温度３０〜４５℃でカオトロピック補助剤４〜９モル溶液に導入し、得られた混合物をこの温度に約２０〜４０分保持し、
工程(ｃ)において、混合物をｐＨ８〜１１、温度１５〜２０℃で、混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を約１〜５ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.２〜１.０Ｍに希釈する量の水に導入する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カオトロピック補助剤はグアニジンまたはグアニジン塩酸塩である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カオトロピック補助剤は尿素である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
工程(ｂ)におけるカオトロピック補助剤の濃度は７.０〜９Ｍである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程(ｂ)における温度は４０℃である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程(ｂ)におけるｐＨは１０〜１１である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程(ｃ)におけるｐＨは１０〜１１である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程(ｃ)における水の量は混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を２.５〜３ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.５Ｍに希釈する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程(ｂ)におけるカオトロピック補助剤の濃度は約８Ｍとし、工程(ｂ)における温度は約４０℃であり、工程(ｂ)におけるｐＨは約１０.６であり、工程(ｃ)におけるｐＨは約１０.６であり、工程(ｃ)における水の量は混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を約２.５〜３ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.５Ｍに希釈する請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体は式II：
Ｒ2−Ｒ1−(Ｂ2−Ｂ29)−Ｘ−Ｙ−Ｇly−(Ａ2−Ａ20)−Ｒ3 (II)
［式中、
Ｒ2は、
ａ）水素原子、
ｂ）リジン（Ｌys）およびアルギニン（Ａrg）よりなる群からのアミノ酸残基、または
ｃ）ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸残基はリジン（Ｌys）またはアルギニン（Ａrg）である２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ1は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）または共有結合であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリン、動物インスリンまたはこれらの位置の１個または２個以上が任意に変化したインスリン誘導体のＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基であり、
Ｘは、
ａ）リジン（Ｌys）およびアルギニン（Ａrg）よりなる群からのアミノ酸残基であるか、または
ｂ）ペプチドのＮ−末端およびカルボキシル末端におけるアミノ酸残基はリジン（Ｌys）またはアルギニン（Ａrg）である２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであるか、または
ｃ）遺伝子によってコ−ド可能な２〜３５個のアミノ酸を有し、１〜５個のヒスチジン残基からなるペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリン、動物インスリンまたはこれらの位置の１個または２個以上が任意に変化したインスリン誘導体のＢ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ3は、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基である］
の配列を有する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
式IIにおいて、
Ｒ2は、
ａ）水素原子、または
ｂ）ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基アルギニン（Ａrg）である２〜25個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ1は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、アラニン（Ａla）、スレオニン（Ｔhr）およびセリン（Ｓer）よりなる群からのアミノ酸残基であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａrg）またはヒトインスリンのＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ3は、アスパラギン（Ａsn）、セリン（Ｓer）およびグリシン（Ｇly）よりなる群からのアミノ酸残基である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
式IIにおいて、
Ｒ2は、
ａ）水素原子、または
ｂ）カルボキシル末端はアルギニン（Ａrg）である２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ1は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、スレオニン残基（Ｔhr）であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａrg）であるかまたはペプチドの最初および末端に２個の塩基性アミノ酸残基とくにアルギニン（Ａrg）および／ またはリジン（Ｌys）がある２〜35個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリンのＡ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ3は、アミノ酸残基アスパラギン（Ａsn）またはグリシン（Ｇly）である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの方法で得られた、正しく結合したシステイン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体から、正しく結合したシステイン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体を製造する方法であって、
該前駆体から、トリプシンまたはトリプシン様酵素を用い、場合によっては、さらにカルボキシペプチダーゼＢを用いる、酵素分解により、および、続く吸着樹脂上での精製により、インスリンまたはインスリン誘導体を得る、上記方法。
【請求項１５】
式Ｉ：
【化２】
1999130798.tif 000001
［式中、
Ｙは、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基であり、
Ｚは、
ａ）Ｈis、ＡrgおよびＬysよりなる群からのアミノ酸残基であるか、
ｂ）ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基ＡrgまたはＬysを含む２もしくは３個のアミノ酸残基を有するペプチドであるか、
ｃ）１〜５個のヒスチジン残基を含む、遺伝子によってコ−ド可能な２〜３５個のアミノ酸を有するペプチドであるか、または
ｄ）ＯＨであり、
Ｒ1は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
Ｒ3は、遺伝子によってコード可能なアミノ酸残基であり、
ここで、Ａ2−Ａ20基は、ヒトインスリン、動物インスリンまたはインスリン誘導体のＡ鎖に対応し、および、Ｂ2−Ｂ29基は、ヒトインスリン、動物インスリンまたはインスリン誘導体のＢ鎖に対応する]
のインスリンまたはインスリン誘導体が得られる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式Ｉにおいて、
Ｙは、アラニン（Ａla）、トレオニン（Ｔhr）またはセリン（Ｓer）であり、
Ｚは、
ａ）アルギニン（Ａrg）であるか、
ｂ）２個のアルギニン残基（Ａrg−Ａrg）を有するジペプチドであるか、
ｃ）ＯＨであり、
Ｒ3は、アスパラギン（Asn）、セリン（Ｓer）またはグリシン（Ｇly）である、
請求項１５の方法。
【請求項１７】
式Ｉにおいて、
Ｙは、トレオニン（Ｔhr）であり、
Ｚは、
ａ）アルギニン（Ａrg）であるか、
ｂ）２個のアルギニン残基（Ａrg−Ａrg）または２個のリシン残基（Ｌys−Ｌys）を有するジペプチドであるか、
ｃ）ＯＨであり、
Ｒ3は、アスパラギン（Asn）、グリシン（Ｇly）である、
請求項１５の方法。
【請求項１８】
式Ｉにおいて、
Ｙは、トレオニン（Ｔhr）であり、
Ｚは、ＯＨであり、
Ｒ3は、アスパラギン（Asn）である、
請求項１６または１７の方法。
【請求項１９】
式Ｉにおいて、
Ｙは、トレオニン（Ｔhr）であり、
Ｚは、２個のアルギニン残基（Ａrg−Ａrg）を有するジペプチドであり、
Ｒ3は、グリシン（Ｇly）である、
請求項１６または１７の方法。