【手続補正書】
【提出日】平成16年10月15日(2004.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  血清コレステロール上昇抑制剤
【特許請求の範囲】
【請求項１】ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌を培養して得られる培養物及び／または菌体を有効成分とする血清コレステロール上昇抑制剤。
【請求項２】ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌が、ヒト腸管内定着性を有するラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)である請求項１記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
【請求項３】ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌が、コレステロールをコプロスタノールに変換する性質を有する菌株であるラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)である請求項１または２記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
【請求項４】ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌を培養して得られる培養物が発酵乳である、請求項１〜３のいずれかに記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
【請求項５】ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)・SBT2055（FERM P-15535）である請求項１〜４のいずれかに記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
【請求項６】ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌を培養して得られる培養物及び／または菌体を添加した血清コレステロール上昇抑制作用を有する飲食品。
【請求項７】ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)・SBT2055（FERM P-15535）である請求項６記載の血清コレステロール上昇抑制作用を有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高コレステロール含有食品の摂取に伴う血清コレステロール値の上昇を抑制するために利用される新規な血清コレステロール上昇抑制剤及び／または血清コレステロール上昇抑制作用を有する飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食生活の欧風化に伴い、高脂肪食品を摂取する機会が増え、高脂血症、動脈硬化症等の生活習慣病が増加している。この現象は、中高年層のみならず、若年層にまで及んでいる。その結果、脂肪、特にコレステロール含量の高い、動物性脂肪あるいはそれを含有する畜肉類の摂取を忌避する傾向さえみられる。
本来、コレステロールは胆汁酸やホルモンの合成、あるいは細胞膜成分として生体内では重要な役割を担っている。しかし、上述のように高脂肪食品を摂取する機会が増えた今日では、食餌性コレステロールの摂取が多くなり、この外来性コレステロールが生体内のコレステロールの上昇をもたらし、各種疾病を引き起こす原因になってきている。
【０００３】
以上のことから、食餌性コレステロールを適正に制御した食生活が重要視されている。そして、そのための食生活が提案されてきている。
一方で、発酵乳及び乳酸菌にはコレステロール低下作用のあることが報告されている。
例えば、Hawordらは、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）をスターターとして用いた発酵乳を２週間ヒトに投与し、血清中のコレステロールが低下したことを報告している〔Lancet 2,957(1979)〕。  更にRaoらは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S.thermophilus）を使用した発酵乳を、また、Grunewaldは、アシドフィルス・ミルクをラットに投与し、血清中のコレステロールが低下したことを報告している〔J．Food Sci.,46,1339(1981)及び同誌,47,2078（1982）〕。
【０００４】
また、本出願人は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）及びビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum )に血清中のコレステロール低下作用があることを見出し特許出願した（特開昭62−258323号公報）。
また、特開平10−229841号公報には、豆乳を乳酸発酵させた飲料が、腸管からのコレステロール吸収を抑制することが開示されている。
これらの従来技術についてはその作用機構が比較的良く検討されている。主要な作用機構は、菌体のコレステロール吸着による吸収阻害・体外排泄、菌体の胆汁酸吸着による再吸収阻害・体外排泄、あるいは発酵乳摂取による肝臓でのコレステロール代謝促進などであり、これらは良く知られている。
また、近年ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）に属する乳酸菌に多様な生理作用が見出されつつあり、このようなコレステロールの代謝に関する先行技術としては、Usmanらによる菌体のコレステロール吸着作用（J.Dairy Sci.Vol.82,243-248,1998）や上記特開平10−229841号公報に開示された豆乳との併用によるコレステロールのミセル不溶化作用などがあげられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高コレステロール含有食品、例えば、卵黄、バター等を摂取する際、同時またはその食事の前後に経口摂取することによって、これらの食品由来の食餌性コレステロールによる、血清コレステロールの上昇を抑制できる薬剤及び血清コレステロールの上昇を抑制できる飲食品を提供することを課題とする。
本発明者らは、種々の発酵乳の研究を行っていたところ、発酵乳から分離された乳酸菌やヒト由来の乳酸菌の中で特にラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)が、従来見られない高いヒト腸管内定着性を有しており、さらにこのラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌の培養物及び菌体が、新しい作用機構を併せ持つことによってヒト血清コレステロール上昇抑制をもたらすことを見出し、上記課題の解決に成功した。
【０００６】
【発明を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌を培養して得られる菌体及びその培養物を有効成分とする血清コレステロール上昇抑制剤に関する。さらに、本発明は、このような有効成分を含有してなる血清コレステロール上昇抑制作用のある飲食品に関する。
即ち本発明は特許請求の範囲に記載した下記の構成からなる発明である。
（１）ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌を培養して得られる培養物及び／または菌体を有効成分とする血清コレステロール上昇抑制剤。
（２）ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌が、ヒト腸管内定着性を有するラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)である（１）記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
（３）ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌が、コレステロールをコプロスタノールに変換する性質を有する菌株であるラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)である（１）または（２）記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
（４）ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌を培養して得られる培養物が発酵乳である、（１）〜（３）のいずれかに記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
（５）ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）に属する乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）・SBT2055（FERM P-15535）である（１）〜（４）のいずれかに記載の血清コレステロール上昇抑制剤。
（６）ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）に属する乳酸菌を培養して得られる培養物及び／または菌体を添加した血清コレステロール上昇抑制作用を有する飲食品。
（７）ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）に属する乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）・SBT2055（FERM P-15535）である（６）に記載の血清コレステロール上昇抑制作用を有する飲食品。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、上記した課題を解決するためになされたものであって、本発明者らは、目的とする乳酸菌をスクリーニングするに際し、次のような基準を新たに設定し目的に合致する株を選定した。すなわち、本発明者らは、発酵乳やヒト由来の数多くのラクトバチルス・ガセリのうち、胃酸耐性が高い、低ｐＨ条件下での生育が良好である、血清コレステロールの上昇を抑制する、ヒト腸管へ高い定着性を示す、ヒト腸管細胞親和性を示す、胆汁酸耐性がある、コレステロール吸着性を有する、胆汁酸吸着性がある、飲食品に適用した際に生残性が高く、香味、物性も優れている等々の条件を設定し、菌株の選定につき鋭意研究を重ねた。このような条件を満足するラクトバチルス・ガセリ菌については全く知られていなかった。本条件によってスクリーニングした結果、これらの条件に合致する菌株として以下の菌株を選択することができた。なお、これらの菌株は、下記の寄託番号により独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている。
【０００８】
菌株
ラクトバチルス・ガセリ (Lactobacillus gasseri)  SBT 10801 FERM P-18137
ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)  SBT 1703  FERM P-17785
ラクトバチルス・ガセリ (Lactobacillus gasseri)  SBT 10241 FERM P-17786
ラクトバチルス・ガセリ (Lactobacillus gasseri)  SBT 0274  FERM P-17784
ラクトバチルス・ガセリ (Lactobacillus gasseri)  SBT 10239 FERM P-16639
ラクトバチルス・ガセリ (Lactobacillus gasseri)  SBT 2055  FERM P-15535
さらにこれらの菌株は、ヒト腸管細胞に高い親和性を有し、経口で投与した時、生存して腸管内に到達することができ、長期間腸管内に常在することが可能であり、腸管内でヒト血清コレステロールの吸収を抑制し、またコレステロールを腸管内でコプロスタノールに変換する能力を有している。そして、このことにより、コレステロールの体外排出を促進し、食餌性あるいは疾病による血清コレステロールの上昇を抑制できる。体外から投与したラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)に属する乳酸菌が腸内に定着し、このようなコレステロール上昇抑制効果を示すことは全く知られておらず、本発明者らによって初めて明らかにされた。
【０００９】
さらに本発明では、上記寄託菌に限らずヒトや発酵乳から分離されるラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)であって、上記の作用を示すものであれば、いずれのものでも使用できる。
【００１０】
次にこれらの乳酸菌の培養方法を記す。
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)の培地には、乳培地または乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地等種々の培地を用いることができる。このような培地としては、脱脂粉乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地を例示することができる。
培養法は静置培養またはｐＨを一定にコントロールした中和培養で行うが、菌が良好に生育する条件であれば特に培養法に制限はない。
【００１１】
本発明は上述のようにして得られる培養物及び／または菌体を有効成分とする。また乾燥した粉末を有効成分としてもよい。これらの乾燥は凍結乾燥で行なうことが菌体を変質させることなく乾燥することができるので好ましい。
これらの有効成分は経口摂取することが望ましい。その摂取に際しては、高コレステロール含有飲食品に添加して同時に摂取するか、それ自体を高コレステロール飲食品の摂取の前後に摂取してもよい。また、これらの粉末は乳糖等の適当な賦形剤と混合し粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤または粒剤等として経口投与することができる。投与量は、投与対象者の症状、年齢等を考慮してそれぞれ個別に適宜決定されるが、通常成人１日当たり乾燥物として0.5〜50ｇであり、これを１日数回に分けて投与するとよい。
【００１２】
また、本発明の有効成分は、飲食品の製造工程中に原料に添加してもよい。飲食品としてはどのような飲食品でもよく、その例としてコレステロール含量の高いバター等の乳製品、マヨネーズ等の卵加工品、バターケーキ等の菓子・パン類等の食品をあげることができる。但し、本発明の特性として乳酸菌が生存した状態で腸管に定着することが必要であり、過度の加熱は避けなければならない。また、マイクロカプセル等の従来技術を採用して、加熱を避ける手段を講じることが好ましい。
さらにまた、本発明における飲食品は、前述したラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri)の菌株を使用して乳酸発酵を行なって製造されるヨーグルト等であっても良い。
【００１３】
以下に本発明に用いる乳酸菌株としてラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）・SBT2055（FERM P-15535）（以下、LG 2055という）を用いた試験例を示し、菌学的性質及びインビトロ、インビボによる効果を具体的に説明する。しかし、本発明はこの記載内容に限定されるものではない。
(乳酸菌の性状)
乳酸菌の性状を表１に示す。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
（人工胃酸耐性）
胃酸耐性試験は、塩酸を用いてｐＨを1.0、2.0、2.5、または3.0に調整したMRS培地に、各菌株のMRS培養液を、それぞれ10％添加し、さらに4％ペプシン（和光純薬工業社製）溶液を1％添加し、塩酸を用いて所定のｐＨに再調整した後、37℃に保持して各菌株の生菌数を経時的に測定した。その結果、LG2055株はｐＨ2.5の条件では、3時間を経過しても菌数の減少は観察されなかった。また、ｐＨ2.0の条件では、2時間を経過しても菌数に大きな減少は観察されなかった。以上の結果から、LG2055株の胃酸耐性が示された。
【００１６】
（人工腸液耐性）
腸液耐性試験は、牛胆汁末（Ox gall powder: Sigma社製）を0.1、0.2、0.5、または1.0％含むMRS培地に、ｐＨ3.0の人工胃液で２時間処理した各菌株の処理液を、それぞれ1％添加し、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ7.0に調整し、さらにトリプシン（和光純薬工業社製）及びパンクレアチン（和光純薬工業社製）の1％溶液を、それぞれ１％ずつ添加し、窒素ガス置換による嫌気条件で37℃に保持して各菌株の生菌数およびｐＨを経時的に測定した。その結果、LG2055株は1.0%の胆汁末を含む人工腸液中でも生育できることが、生菌数の増加とｐＨの減少により確認できた。以上の結果から、LG2055株の腸消化液耐性が示された。
【００１７】
（ヒト腸管への定着性）
ヒト腸管への定着性は、LG2055株（凍結乾燥物）を牛乳に懸濁してヒトに経口摂取させ、摂取後、経時的に糞便を採取してLG2055株の消長を追跡した。その結果、LG2055株は摂取後90日を経過しても、これを摂取させたヒトの糞便から回収された。これにより、LG2055株の高い腸管定着性が示された。
【００１８】
（インビトロでの菌体のコレステロール吸着能）
〔試験方法〕
12％還元脱脂乳（121℃、10分加熱）にLG2055株を接種し、20℃で24時間培養した。培養終了後、この培養物を90ｇ採取した。これに2％コレステロール（エタノール溶液）を10ｍｌ添加し、良く撹拌した後、室温で１時間放置した。これを10,000回転、20分間遠心分離し、上清液のコレステロール含量を測定し、脱脂乳培養物のコレステロール吸着能とした。対照として、乳酸でｐＨを4.7〜4.8に調整した上記の脱脂乳培地を用いた。
これにより、LG2055株の高いコレステロール吸着効果が示された。
【００１９】
（ヒトの腸管通過能と腸内定着性）
無脂乳固形9.5％、乳脂肪3.0％の乳にLG2055株のスターターを4％接種して39℃で4時間発酵させた発酵乳を健康な成人ボランティア42名に4週間、毎日100ｇを1日1回食させて腸内菌の変化を観察した。試験期間中は腸内菌に影響のある食品やオリゴ糖、薬品の摂取を禁ずる以外は自由に食事をさせて評価を行った。試験前は検出されなかったLG2055株がすべての被験者から4週間後には検出され、LG2055株が高い腸内定着性を有することがわかった。
【００２０】
（血清コレステロール上昇抑制試験）
［試験方法］
１． 乳酸菌脱脂乳培養物の調製
LG2055株を115℃、20分間の滅菌処理をした0.5％酵母エキス（アサヒビール社製）添加の11.55％脱脂乳培地にて37℃、16時間の培養を３代以上行なって賦活させた。これを同培地に3％接種し、37℃で16時間培養した。得られた培養物を、凍結乾燥後、乳鉢で粉砕した。
【００２１】
２．試験飼料
試験飼料の組成を表２に、添加した脱脂粉乳(SM)及びLG2055株脱脂乳培養物（LG）の組成を表３に、試験飼料中の乳酸菌生菌数を表４に示す。飼料へのコレステロール及びコール酸ナトリウム添加量は、コレステリン研究会の報告（コレステリン研究会、日本栄養・食糧学会誌45、 1992）を参考にし、それぞれ0.5％、0.15％とした。また、脱脂粉乳及びLG2055株脱脂乳培養物の配合量はそれぞれ20％とし、それらに含まれるタンパク質含量を考慮してカゼインを添加した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
【表３】
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【００２４】
【表４】
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【００２５】
３．試験動物と試験試料
体重約72gの４週齢雄性ＳＤラット（日本チャールス・リバー社）を20匹購入し、摂食試験開始まで市販粉末飼料ＣＥ−２（日本クレア社）にて予備飼育を行った。５週齢時に、飼料を６時間除去した後、頚静脈採血して血清総コレステロール及びトリグリセリド濃度を測定し（生化学自動分析装置  富士ドライケム5500V、 富士メディカルシステム社製）、血清総コレステロール、トリグリセリド濃度及び体重が等しくなるよう10匹ずつ２群に分けた（脱脂粉乳添加群及びLG2055株脱脂乳培養物添加群；以下、それぞれSM群、LG群と記す）。飼育は５匹ずつステンレス製のケージに入れ、12時間毎の明暗サイクルの環境下で行った。群分け後は、脱イオン水及び各試験飼料を自由摂取させた。
飼育期間中、毎日飼料摂取量を、採血日及び試験飼料投与後13日目に体重を測定した。採血は、試験飼料投与開始３、７及び９日目に、飼料を除去して６時間経過した後、頚静脈より行なった。また、糞中ステロール排泄量を調べるために、試験飼料投与開始８〜10日目に代謝ケージにて糞を採取した。採取した糞は、表面を生理食塩水で洗浄後、凍結乾燥・粉砕し、分析用試料とした。
試験飼料投与開始14日目に、17時間絶食の後にエーテル麻酔下で開腹し、後大静脈から採血した後、肝臓、盲腸および後腹壁脂肪を摘出し、重量を測定した。
肝臓は、一部を凍結乾燥・粉砕して脂質の分析に供した。盲腸は、内容物のｐＨを測定（ISFET pH Meter KS723、 新電元社製）した後、一部をフローラ解析に、一部を有機酸分析に供した。
【００２６】
４． 血清脂質の分析
採取した血液は、血清を分離し（2,000×g、10min、4℃）、総コレステロール、HDL-コレステロール、トリグリセリド及びリン脂質濃度を測定した。総コレステロール、HDL-コレステロール及びトリグリセリド濃度の測定には、生化学自動分析装置（富士ドライケム5500V、 富士メディカルシステム社製）を、リン脂質濃度の測定には、酵素法（リン脂質Bテストワコー、和光純薬工業社製）を用いて定量した。
【００２７】
５．糞中ステロールの定量
３．で得られた凍結乾燥粉砕試料を約0.1ｇ秤量し、2.5ｍｌの熱エタノール（80℃）で１時間抽出した。抽出後、2,000×g、10分間遠心分離して上澄み液を分離し、この操作を３回繰り返した後、分離上澄み液に窒素ガスを吹き込みながら（50℃）、溶媒を蒸発させた。残渣を２mlのエタノールで再溶解して、サンプル液とした。
中性ステロールの定量には「デタミナTC555」（協和メディックス社製）を、酸性ステロールの定量には「エンザバイル・２」（第一化学薬品社製）を用い、
酵素法にて定量した。
【００２８】
６．肝臓脂質の分析
肝臓脂質は、Folchの方法（Folch, J. Biol. Chem. 226, 497-506,  1957）によりクロロホルム：メタノール＝２：１（v/v）溶液にて抽出・水洗後、トリグリセリド、リン脂質、コレステロール量を定量した。トリグリセリドはアセチルアセトン法（トリグリセリドテストワコー、 和光純薬工業社製）、リン脂質は過マンガン酸塩灰化法（リン脂質テストワコー、 和光純薬工業社製）、コレステロールは酵素法（デタミナTC555、 協和メディックス社製）にてそれぞれ分析した。
【００２９】
７．盲腸内有機酸の分析
盲腸内容物に９倍量の超純水を添加、混合後、常温に30分放置して有機酸を抽出し、遠心分離（10,000×g、20分、4℃）して上清を回収した。回収した上清は0.45μmのフィルターを通してから高速液体クロマトグラフィー（Waters Alliance、 Waters社製）に供し、電気伝導度検出法にて有機酸濃度を測定した。なお、使用したOrganic Acid column（7.8×300mm、 Waters社製）は40℃とし、移動相には5mmol/l p-トルエンスルホン酸溶液（0.8ml/min）、ならびに検出試薬は5mmol/l p-トルエンスルホン酸溶液及び100μmol/l EDTAを含む20mmol/l Bis-tris水溶液（0.8ml/min）を用いた。
【００３０】
８．盲腸内フローラの解析
光岡らのフローラ解析法（Mitsuoka, T., Sega, T., et al.Zentralbl. Bakte
riol.[Orig.]195, 455-469, 1965）に改良を加え、そのうちの３種類の培地を用いた。BL寒天培地（日水製薬社製）ならびにTOS寒天培地は37℃にて2から3日間嫌気培養し、酢酸添加量を１／２にしたLBS寒天培地（BBL社製）は37℃にて2から3日間微好気培養した。
腸内フローラの解析には、各群５匹ずつ用いた。解剖時に盲腸内容物を採取して均一になるよう撹拌し、その1ｇを嫌気性希釈液（Mitsuoka, T., Morishita, Y., et al.Zentralbl. Bakteriol.[Orig.A] 226, 257-63, 1974）に分散した。これをさらに10倍ずつの段階希釈を行い、前述した培地に一定量塗抹し、培養した。培地上に発現したコロニーを、属ならびに菌群毎に糞便1ｇ当たりの対数値として集計した。
【００３１】
［試験結果］
１．成長結果及び臓器重量
試験期間中の成長結果ならびに解剖時の体重、肝臓重量、盲腸重量、盲腸内容物ｐＨ及び後腹壁脂肪重量を表５に示す。両群とも成長は良好であり、いずれの項目についても両群間で有意な差は認められなかった。
【００３２】
【表５】
2003306436.tif 000005
【００３３】
２．血清脂質
経時測定データ解析の結果、血清総コレステロール濃度は経時的に上昇し、経時的な血清総コレステロール濃度の上昇度合いは、SM群に比べLG群で緩やかな傾向が認められた（P＝0.0688）。また、試験飼料投与開始９日目の血清総コレステロール濃度の値について解析した結果、LG群はSM群に比べて有意に低いことが認められた（p<0.05）。
絶食解剖時の血清総コレステロール、HDL-コレステロール、トリグリセリド、リン脂質濃度を表６に示す。血清総コレステロール濃度はLG群でSM群に比べて低い傾向を示し、その他の項目には差は認められなかった。
【００３４】
【表６】
2003306436.tif 000006
【００３５】
３．肝臓脂質
肝臓脂質の分析結果を表７に示す。トリグリセリド、リン脂質、コレステロールのいずれの脂質含量も、両群間で有意な差は認められなかった。
【００３６】
【表７】
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【００３７】
４．盲腸内有機酸
盲腸内有機酸の分析結果を表８に示す。いずれの有機酸についても、両群間で有意な差は認められなかった。
【００３８】
【表８】
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【００３９】
５．盲腸内フローラ
盲腸内フローラ解析の結果を表９に示す。盲腸内フローラは、両群間で差は認められなかった。
【００４０】
【表９】
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【００４１】
以上の結果、以下のことが明らかとなった。
コレステロール負荷食を用いて血清総コレステロール濃度上昇抑制作用を検討した結果、飼育期間中にLG群はSM群に比べ、血清総コレステロール濃度の上昇が抑制されている傾向が認められ、試験飼料投与開始９日目に、SM群に比べLG群で血清総コレステロール濃度が有意に低いことが認められた。
【００４２】
鈴木の報告（SNOW BRAND R&D REPORTS 105, 67-108 , 1995）では、コレステロール負荷モデルで種々の乳酸菌株のコレステロール上昇抑制作用を試験した結果、コレステロール濃度の経時変化パターンにより、その効果を示す型を２つに分類している。第１の型は、対照群に比べて飼育期間の初期から有意に血清コレステロール濃度が低くなる型、第２の型は、対照群に比べて飼育後期になって有意に血清コレステロール濃度が低くなる型である。また、作用機序については、第１の型では、腸管におけるコレステロール吸収抑制作用及び肝臓におけるコレステロールの異化促進作用、第２の型では、肝臓におけるコレステロールの異化促進作用のみが働いている可能性を挙げている。本試験の結果をこの型に当てはめると、LG群は第１の型に近いことが示唆され、血清コレステロール低下の作用機序について、腸管におけるコレステロール吸収抑制作用および肝臓におけるコレステロールの異化促進作用が考えられた。
【００４３】
腸管におけるコレステロール吸収抑制作用については、菌体がコレステロールを吸着することにより起こる吸収抑制作用と、菌体がコレステロールや胆汁酸を吸着することにより複合ミセルの形成が阻害されたり複合ミセルへの溶解が阻害されたりして、結果的に吸収抑制が起こる作用が考えられる。LG2055株のコレステロール吸着作用に関しては、他のLactbacillus gasseri株と比較しても吸着力が強い。この吸着作用および吸着による複合ミセル形成阻害・複合ミセルへの溶解阻害が起こり、コレステロールの吸収抑制作用が働いた可能性があると考えられた。
一方、コレステロールは腸内細菌によってコプロスタノールへ変換される場合がある。コプロスタノールは、コレステロールに比べて消化管からの吸収が悪いことが知られており、コプロスタノール／コレステロール比と血清コレステロール濃度は逆相関するという性質を持つ。すなわち、糞中中性ステロール排泄量は同じでも、コプロスタノールの割合が多い場合には血清コレステロール濃度の低下が起こると考えられる。糞中コプロスタノールが上昇していた本試験では、投与した乳酸菌によって腸管内でコレステロールからコプロスタノールへの変換が起こり、その結果、血清コレステロールの上昇が抑制されたと考えられた。
【００４４】
（血清コレステロール上昇抑制試験（ヒトに対する試験））
次に、ヒトに対して、本発明の培養物（LG2055株を含有する発酵乳）を摂取させたときの、血中脂質に対する影響及び安全性の試験結果を示す。なお本試験はヘルシンキ宣言の主旨に則り、医師の監督下で実施した。
［試験方法］
１．被験者
被験者は、血清総コレステロール値が180mg/dl以上260mg/dl未満を示した境界域および軽度の高コレステロール血症を呈する日本人の成人男性64名である。64名を4群に分け、LG2055株発酵乳200群、LG2055株発酵乳100群、プラセボ発酵乳（従来品）群、非摂取群として二重盲検試験を実施した。
【００４５】
２．発酵乳
発酵乳は、Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricusとStreptococcus thermo
philusから構成されるヨーグルトカルチャーにLG2055株のカルチャーを混合し、これをスターターとして無脂乳固形分11％および乳脂肪分1.5％の発酵乳原料に接種し発酵させて製造した。発酵乳100 gあたりの栄養成分値は、熱量76 kcal、タンパク質4.1 g、脂質1.5 g、炭水化物11.6 g、ナトリウム51 mg、カルシウム140 mgであった。また、発酵乳に含まれるLG2055株の菌数は1×107 cfu/g以上であった。なお、プラセボ発酵乳には、同じ発酵乳原料をヨーグルトスターターのみで発酵させた発酵乳を用いた。両発酵乳に共通して含まれるL. delbruekii subsp. bulgaricusとS. thermophilusの菌数は、それぞれ1×107 cfu/g以上、ならびに1×108 cfu/g以上であった。
【００４６】
３．摂取方法
LG2055株発酵乳200群、LG2055株発酵乳100群、プラセボ発酵乳群には、該当する発酵乳を11週間にわたり1日1回朝食時に摂取させた。LG2055株発酵乳200群にはLG2055株発酵乳を200ｇ/day、LG2055株発酵乳100群にはLG2055株発酵乳を100ｇ/day、プラセボ発酵乳群にはプラセボ発酵乳を200g/day、それぞれ摂取させた。
【００４７】
［測定方法］
各被験者について、観察期間前（以下、観察前と記す）、観察後の摂取期間直前（以下、摂取前と記す）、摂取4週間後、摂取8週間後、摂取11週間後（終了時：以下、摂取後と記す）、摂取後の観察期間後（以下、観察後と記す）の6回、血液検査を実施した。
血液検査項目は、血球成分（赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球、血小板）、総コレステロール、レムナント様粒子（RLP）コレステロール、LDLコレステロール、HDLコレステロール、トリグリセライド、LDL、VLDL、βリポ蛋白、リポ蛋白（a）、アポ蛋白A1、アポ蛋白A2、アポ蛋白B、アポ蛋白E、カイロミクロン、遊離脂肪酸（NEFA）、BUN、クレアチニン、尿酸、Na、K、Cl、空腹時血糖、ヘモグロビンA1C、総蛋白、A/G比、アルブミン、GOT、GPT、γ‐GTP、総ビリルビン、ALP、LDHである。
血液検査は、常法にて行った。また、血液検査の実施においては、血清タンパク成分及び血清脂質値への外因的影響を避けるため、最低5分以上の安静状態を維持した後、坐位にて採血を行った。
【００４８】
［測定結果］
試験期間中における血清脂質に関する検査値の推移を表10に示した。血清総コレステロール値の推移に関しては、さらに図1に示す。非摂取群ではすべての期間を通じて、血清総コレステロール値に変化がみられなかった。プラセボ発酵乳群では、摂取期間において総コレステロール値の平均が208.8 mg/dlから215.7 mg/dlへわずかに増加したものの有意な変化は観察されなかった。一方、LG2055株発酵乳200群では、摂取前の血清総コレステロール値の平均は212.2 mg/dlから摂取後平均200.8 mg/dlに有意に低下し(p<0.05)、プラセボ発酵乳群、非摂取群との間に有意な差を認めた(それぞれp<0.05, p<0.1)。同様の傾向は、LDLにおいても観察された。LG2055株発酵乳200群のLDL値は、摂取前の平均432.1 mg/dlから摂取後の367.5 mg/dlに有意に低下し(p<0.001)、プラセボ発酵乳群、非摂取群との間に有意な差を認めた（p<0.05, p<0.1）。この他、βリポ蛋白（p<0.05）、アポ蛋白B（p<0.05）、アポ蛋白 E（p<0.05）、トリグリセライド（p<0.1）、NEFA（p<0.01）、カイロミクロン（p<0.1）において、LG2055株発酵乳200群で摂取後に有意に低下した。LG2055株発酵乳100群では、血清総コレステロール値の平均が摂取前の212.4 mg/dlから摂取後には206.5 mg/dlに低下した。
【００４９】
【表１０】
2003306436.tif 000010
【表１０のつづき】
2003306436.tif 000011
【００５０】
試験期間中における血球成分（赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球、血小板など）においては、摂取期間中、いずれの群においても有意な変動はみられず、またいずれの群間においても有意差を認めなかった。検査値を個別にみた場合においても、異常変動を示した例は観察されなかった。
血清生化学に関する検査値も、摂取期間中、群間あるいは期間において顕著な変化はみられなかった。また、いずれの値も正常範囲内であり、個別にみた場合においても、肝機能検査値、腎機能検査値、および空腹時血糖値、電解質バランスにおいて、異常変動を示した例は認めなかった。
【００５１】
以上の結果から、LG2055株発酵乳200群の血清総コレステロール値が有意に低下（表10、図2）し、本群とプラセボ発酵乳群の比較（表10）から、これがLG2055株の作用であることが分かった。また、LG2055株発酵乳200群と非摂取群の比較（表10）により、血清脂質を改善する目的で本発酵乳を積極的に摂取する有用性が示された。LG2055株発酵乳100群の血清総コレステロール値も低下した。
本試験においてボランティアは、LG2055株を1×107 cfu/g以上含有する発酵乳を毎日100ｇ、あるいは200ｇ、連続11週間摂取したが、副作用と思われるような血液学的変化、生理学的変化、臨床上の変化は認められなかった。これにより、LG2055株を含有する発酵乳の食品としての安全性が確認された。
【００５２】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。しかし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
LG2055株を10％還元脱脂乳培地（121℃、10分加熱）で培養し、本培養物を凍結乾燥して粉末化し、本発明の血清コレステロール上昇抑制剤を調製した（Ａ）。
【００５３】
【実施例２】
LG2055株をヨーグルトミックス（生乳に２％脱脂乳を添加し、100℃、10分加熱した）に接種し、20℃で24時間培養した。紙カップに充填し冷却後、本発明のコレステロール上昇抑制用ヨーグルトとした（Ｂ）。
【００５４】
【実施例３】
LG2055株をホエー培地（0.5％酵母エキス、0.1％トリプチケースペプトン添加）で培養後、遠心分離を行い菌体を除去した。この上清液に最終濃度が50％になるように、氷冷したエタノールを添加し沈澱物を得た。この沈澱物を0.2N・NaClに溶解し、上述のエタノール沈澱を更に３回繰り返し、沈澱物を約500mg/（Ｌ・培養物）得た。この培養物１ｇを乳糖５ｇと混合し顆粒状に成形して本発明の血清コレステロール上昇抑制用顆粒剤を得た。
【００５５】
【実施例４】
高コレステロール含有食品に配合した例を示す。
発酵バター                   （ｗｔ／ｗｔ）
乳脂肪                             ９６．８％
食塩                                 １．２
実施例１で得られた本発明品Ａ         ２．０
【００５６】
バターケーキ              （ｗｔ／ｗｔ）
バター                             ２４％
薄力粉                             ２４
砂糖                               ２４
全卵                               ２４
実施例２で得られた本発明品Ｂ         ４
香料                                少々
【００５７】
マヨネーズ                  （ｗｔ／ｗｔ）
サラダ油                          ６５％
卵黄                              １７
食酢                              １０
実施例１で得られた本発明品Ａ        ３
香辛料                              ４．４
グルタミン酸モノナトリウム          ０．６
【００５８】
【実施例５】
LG 2055株をＭＲＳ液体培地（Difco社製）５Ｌに接種後、37℃、18時間静置培養を行った。培養終了後、7,000rpm、15分間遠心分離を行い、培養液の1/50量の濃縮菌体を得た。次いで、この濃縮菌体を脱脂粉乳10％（重量）、グルタミン酸ナトリウム１％（重量）を含む分散媒と同量混合し、ｐＨ７に調整後、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物を60メッシュのフルイで粉体化し、本発明の血清コレステロール上昇抑制用凍結乾燥菌末を得た。
【００５９】
【実施例６】
第13改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、上記実施例５で得られたLG2055株の凍結乾燥菌末１ｇにラクトース（日局）400ｇ、バレイショデンプン（日局）600ｇを加えて均一に混合し、本発明の血清コレステロール上昇抑制用散剤を製造した。
【００６０】
【実施例７】
脱脂乳を80〜85℃で20〜30分間殺菌した後、ホモジナイズし、冷却した。これにスターターとして本菌株LG2055株の純培養物を２〜５％加え、37〜40℃で16時間発酵させ、乳酸含量２％の酸乳（脱脂乳培地における培養物）を得た。次いで、生じたカードを砕きながら、5℃に冷却し、これを酸乳とした。別に、ショ糖15％のほかに適量の酸味料、香料、色素を含有する糖液を調合し、ホモジナイズし、70〜80℃で20〜30分間殺菌した後、5℃に冷却し、糖液とした。このようにして得た酸乳35に対して糖液65の割合で混合して酸乳飲料を得た。
【００６１】
【実施例８】
ビタミンＣ40ｇまたはビタミンＣとクエン酸の等量混合物40ｇ、グラニュー糖100ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物60ｇに、上記実施例１で得られた脱脂乳培地における培養物の凍結乾燥粉末を40ｇ加えて十分に混合した。混合物を袋に詰め、１袋1.5ｇのスティック状本発明の血清コレステロール上昇抑制用栄養健康食品を150袋製造した。
【００６２】
【実施例９】
次の配合により本発明の血清コレステロール上昇抑制剤を製造した。
（１）LG2055株の還元脱脂乳培地における培養物の凍結乾燥物50ｇ、
（２）ラクトース90ｇ、
（３）コーンスターチ29ｇ、
（４）ステアリン酸マグネシウム１ｇ、
この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、1錠あたり有効成分を40ｍｇ含有する錠剤100個を製造した。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）に属する乳酸菌を培養して得られる菌体、その培養物を有効成分とする血清コレステロール上昇抑制剤を提供することができる。
本発明の血清コレステロール上昇抑制剤は、食品素材としても有用である。さらに、本発明の血清コレステロール上昇抑制剤は、他の生理機能に影響を及ぼすことなく血清コレステロールの上昇を抑制するのに有効である。
【図面の簡単な説明】
【図1】血清総コレステロール値の推移を示す。