(57)【要約】  本発明は、発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織を組織保存液に浸漬すること、浸漬後の該組織中の該標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定すること、及び発光又は蛍光レベルに基づき組織保存液の保存効果を判定することを含む、組織保存液の保存効果の評価方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織を組織保存液に浸漬すること、浸漬後の該組織中の該標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定すること、及び発光又は蛍光レベルに基づき組織保存液の保存効果を判定することを含む、組織保存液の保存効果の評価方法。
【請求項２】
該標識遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該組織中の発光又は蛍光レベルが非破壊的に測定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該組織が発光又は蛍光標識遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物から摘出されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該標識遺伝子が該哺乳動物において偏在性に発現している、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該標的遺伝子が該哺乳動物の目的組織において特異的に発現している、請求項４記載の方法。
【請求項７】
組織保存液が細胞保存液である、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
組織保存液が臓器保存液である、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物組織として臓器の一部が用いられる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、保存効果が確認された組織保存液の製造方法：
（Ｉ）所望の組織保存液の構成成分を配合し、該組織保存液を得ること；
（ＩＩ）（Ｉ）で得られた組織保存液の一部をサンプルとして分離すること；
（ＩＩＩ）発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織を（ＩＩ）で分離されたサンプルに浸漬すること；
（ＩＶ）浸漬後の該組織中の該標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定すること；
（Ｖ）発光又は蛍光レベルに基づきサンプルの保存効果を判定すること；及び
（ＶＩ）（Ｖ）において所望の保存効果が確認されたサンプルが由来する組織保存液を、保存効果が確認された組織保存液として得ること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織保存液の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、数多くの組織保存液が開発され移植医療において用いられている。組織保存液の開発においては、新たな組織保存液の成分及び組成を決定し、ラット等の動物から摘出した組織（臓器）をその保存液中に浸漬した後、保存された組織の動物への移植又は生化学的評価により保存効果を判定していた。そのため、１つの保存液についてその保存効果を評価するまでに極めて長い時間を要するので、迅速に新たな組織保存液を開発することは困難である。従って、より迅速かつ簡便に組織保存液の保存効果を評価する方法の開発が求められている。【０００３】
一方、細胞及び分子の生物学的事象をリアルタイムで明示する画像化ストラテジーの最近の進歩から、生きた動物の中で発現する生物学的プロセスを容易に理解できるようになった。クラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼなどの分子タグの開発は過去１０年にわたり大変革を促し、複雑な生化学的プロセスと生きた細胞におけるタンパク質の作用とを関連付けることを可能にした（非特許文献１、２）。特に、ルミネッセンス光による画像化は生きた細胞内の種々の生物学的プロセスを検討する重要な機会を提供してくれる（非特許文献２、３）。バイオルミネッセンス光レポーターは、哺乳動物の組織内におけるシグナル対ノイズ比がかなり大きく、非侵襲的測定法を用いて正常な動物内で放出された光シグナルを定量できる。本発明者らは、これまでにＧＦＰトランスジェニックラット、ＬａｃＺトランスジェニックラット、及びルシフェラーゼトランスジェニックラットを開発し、これらのラット由来の組織を用いると、移植片の拒絶反応を容易に観察できることを示している（非特許文献４、５）。
非特許文献６には、ＧＦＰトランスジェニックラット由来の細胞が死滅した後においても、ＧＦＰが強い蛍光を発することが開示されている。
【非特許文献１】Science, vol.300(5616), p.87, 2003
【非特許文献２】Nat. Med., vol.4(2), p.245, 1998
【非特許文献３】Annu. Rev. Biomed. Eng., vol.4, p.235, 2002
【非特許文献４】Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.329(1), p.288, 2005
【非特許文献５】Transplantation, vol.81, No.8, p.1179-1184, 2006
【非特許文献６】J. Biomed. Opt., vol.10(4), p.41204, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、迅速かつ簡便に組織保存液の保存効果を評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ルシフェラーゼ等の発光又は蛍光標識遺伝子を導入した組織を評価対象の組織保存液中で保存し、保存された組織からの発光又は蛍光のレベルを測定することにより、リアルタイムで組織保存液の保存効果を評価できることを見出し、本発明を完成させた。【０００６】
即ち、本発明は以下に関する。
[１]発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織を組織保存液に浸漬すること、浸漬後の該組織中の該標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定すること、及び発光又は蛍光レベルに基づき組織保存液の保存効果を判定することを含む、組織保存液の保存効果の評価方法。
[２]該標識遺伝子がルシフェラーゼである、[１]記載の方法。
[３]該組織中の発光又は蛍光レベルが非破壊的に測定される、[１]記載の方法。
[４]該組織が発光又は蛍光標識遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物から摘出されたものである、[１]記載の方法。
[５]該標識遺伝子が該哺乳動物において偏在性に発現している、[４]記載の方法。
[６]該標的遺伝子が該哺乳動物の目的組織において特異的に発現している、[４]記載の方法。
[７]組織保存液が細胞保存液である、[１]〜[６]のいずれか記載の方法。
[８]組織保存液が臓器保存液である、[１]〜[６]のいずれか記載の方法。
[９]哺乳動物組織として臓器の一部が用いられる、[１]記載の方法。
[１０]以下の工程を含む、保存効果が確認された組織保存液の製造方法：
（Ｉ）所望の組織保存液の構成成分を配合し、該組織保存液を得ること；
（ＩＩ）（Ｉ）で得られた組織保存液の一部をサンプルとして分離すること；
（ＩＩＩ）発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織を（ＩＩ）で分離されたサンプルに浸漬すること；
（ＩＶ）浸漬後の該組織中の該標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定すること；
（Ｖ）発光又は蛍光レベルに基づきサンプルの保存効果を判定すること；及び
（ＶＩ）（Ｖ）において所望の保存効果が確認されたサンプルが由来する組織保存液を、保存効果が確認された組織保存液として得ること。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法を用いれば、極めて迅速且つ簡便に組織保存液の保存効果を評価することが可能である。また、偏在性に発光／蛍光標識遺伝子が導入されたトランスジェニック動物から摘出された組織を用いれば、一回の試験で多数の種類の組織の保存効果を同時に評価することが可能である。従って、本発明の方法を用いれば、組織保存液の開発スピードが飛躍的に向上する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】保存開始時（０時間）における、各臓器（心臓、肺、腎臓、小腸、膵臓、脾臓、肝臓）中の発光を示す。左：生理食塩水、右：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液。
【図２】保存開始後２４時間における、各臓器中の発光を示す。左：生理食塩水、右：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液。
【図３】保存開始後４８時間における、各臓器中の発光を示す。左：生理食塩水、右：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液。
【図４】保存開始後７２時間における、各臓器中の発光を示す。左：生理食塩水、右：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液。
【図５】小腸、心臓、膵臓及び肺における発光レベルの経時的変化を示す。単位：ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ、◆：生理食塩水、■：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液。
【図６】脾臓、腎臓及び肝臓における発光レベルの経時的変化を示す。単位：ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ、◆：生理食塩水、■：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液。
【図７】種々の組織保存液中に浸漬された肝臓切片からの発光レベルの経時的変化を示す。保存開始時における発光レベルを１００％として示す。バーは左から１、３及び６時間後の発光レベルを示す。ＵＷ：University of Wisconsin液、ＥＣ：Euro-Collins液、ＥＴ−Ｋ：ET-Kyoto液、ＨＴＫ：Histidine-tryptophan ketoglutarate液、Ｐｅｒｆ：Perfadex液。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織を組織保存液に浸漬すること、浸漬後の該組織中の該標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定すること、及び発光又は蛍光レベルに基づき組織保存液の保存効果を判定することを含む、組織保存液の保存効果の評価方法を提供するものである。【００１０】
本発明の方法においては、発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織が用いられる。【００１１】
本発明の方法において用いられる発光又は蛍光標識遺伝子には、発光又は蛍光を有するタンパク質をコードする遺伝子、及び対応する発光又は蛍光基質と混合することにより発光又は蛍光を生じる酵素をコードする遺伝子が含まれる。前者としては、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＥＧＦＰ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。後者としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素をコードする遺伝子を挙げることが出来る。ルシフェラーゼの基質（発光）としてはルシフェリン（及び必要に応じてＡＴＰ）等を挙げることができる。β−ガラクトシダーゼの基質（発光）としては、ルシフェリンガラクトシド基質（６−Ｏ−β−ガラクトピラノシルルシフェリン）等を挙げることができる。ペルオキシダーゼの基質としては、ルミノール（及び必要に応じて過酸化水素）等を挙げることができる。感度等の観点から、該標識遺伝子としては発光標識遺伝子が好ましい。発光標識遺伝子としては上記酵素をコードする遺伝子が好ましく、該酵素としては、ルシフェラーゼが特に好ましい。ＧＦＰは、細胞の死滅後においても強い蛍光を発してしまうのに対して（J. Biomed. Opt., vol.10(4), p.41204, 2005）、ルシフェラーゼ活性は、組織の生存度（viability）を良好に反映するため、標識遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いることにより、高感度で組織保存液の保存効果を評価することができる。【００１２】
臓器保存においては、初期の段階で生じる臓器（細胞）内のＡＴＰの枯渇が組織中の細胞を死に至らしめる原因の一つとなっている。そのため、組織中のＡＴＰ濃度は、組織の生存度を左右する重要なファクターである。ルシフェラーゼはＡＴＰ依存的にルシフェリンを酸化し、発光を生じる。組織内のルシフェラーゼはルシフェリンと反応し、組織内の残存ＡＴＰレベルを反映した発光を生じ得るので、標識遺伝子としてルシフェラーゼを用いれば、組織内の残存ＡＴＰレベルをも反映した、高感度な組織保存液の保存効果の評価が可能となる。【００１３】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。【００１４】
組織には、保存液中での保存が所望される全ての臓器（例：脳、脊髄、胃、膵臓、腎臓、肝臓、甲状腺、骨髄、皮膚、筋肉、肺、消化管(例: 大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、末梢血、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、骨格筋など）、臓器の一部（切片等）、細胞（例：肝細胞、脾細胞、神経細胞、膵β細胞、骨髄細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例：マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球)、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、精子、卵子、受精卵、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞）が含まれる。【００１５】
組織として、臓器の一部（切片等）を用い、マルチウェルプレート中でこれを組織保存液に浸漬することにより、大量の組織保存液サンプルを一度に評価することができる。従って、この場合、臓器の一部は、マルチウェルプレートの各ウェルに入り得る大きさ（例えば、直径が３〜６ｍｍで、重量が１０〜５０ｍｇ）に、組織スライサー等を用いて調製される。【００１６】
本明細書において組織保存液には、細胞保存液および臓器保存液が含まれる。【００１７】
哺乳動物組織への発光又は蛍光標識遺伝子の導入は、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。例えば、目的とする組織内で機能可能なプロモーターの下流に上記標識遺伝子が連結されたコンストラクト（発現ベクター）により、哺乳動物から分離された組織をインビトロでトランスフェクトし、該組織を適当な培地中で培養することによって、該標識遺伝子を組織内に導入することができる。【００１８】
トランスフェクションの方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、顕微注入（マイクロインジェクション）法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。【００１９】
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、適宜選択することが出来る。【００２０】
プロモーターの種類は、標識遺伝子が導入された組織内で、該標識遺伝子の発現を誘導又は促進できるものであれば特に限定されない。該プロモーターとしては、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＯＳＡ２６等を挙げることができる。【００２１】
上記発現ベクターは、目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましい。その他、標識遺伝子をさらに高発現させる目的で、スプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域との間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも可能である。また、上記発現ベクターは、導入された標識遺伝子が安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含み得る。【００２２】
また、発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物から摘出された組織を用いてもよい。該哺乳動物は、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。例えば、哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子及びその前駆細胞などの生殖細胞に、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの遺伝子導入法によって、発光又は蛍光標識遺伝子を導入し、その生殖細胞に由来する子孫動物を得ることにより、発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物を製造することができる。【００２３】
生殖細胞への遺伝子導入にあたっては、目的とする標識遺伝子を、対象となる哺乳動物の細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結したコンストラクト（発現ベクター）を用いるのが一般的に有利である。【００２４】
具体的には、対象となる哺乳動物の細胞内で機能可能なプロモーターの下流に、標識遺伝子を含むポリヌクレオチドを連結した発現ベクターを、対象となる哺乳動物の受精卵等へマイクロインジェクションし、その受精卵を偽妊娠動物の子宮内に移植することによって、標識遺伝子を高発現する遺伝子導入哺乳動物を作出できる。【００２５】
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、適宜選択することが出来る。【００２６】
プロモーターの種類は、標識遺伝子が導入された哺乳動物内で、該標識遺伝子の発現を誘導又は促進できるものであれば特に限定されない。プロモーターとして、組織非特異的なものを用いることにより、発光又は蛍光標識遺伝子を偏在性（ユビキタス）に発現する哺乳動物を製造することができる。この哺乳動物から摘出された組織を用いれば、一回の試験で多数の種類の組織の保存効果を同時に評価することが可能である。組織非特異的なプロモーターとしては、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＯＳＡ２６、βアクチンプロモーター等を挙げることができる。また、組織特異的プロモーターを用いれば、発光又は蛍光標識遺伝子を目的とする組織に特異的に発現する哺乳動物を製造することができる。例えばα１ＡＴプロモーターを用いれば肝臓特異的に、α−アクチンプロモーターを用いれば骨格筋特異的に、エノラーゼプロモーターを用いれば神経特異的にそれぞれ標識遺伝子を発現させることができる。【００２７】
上記発現ベクターは、目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましい。その他、標識遺伝子をさらに高発現させる目的で、スプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域との間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも可能である。また、上記発現ベクターは、導入された標識遺伝子が安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含み得る。【００２８】
評価対象の組織保存液中への哺乳動物組織の浸漬は、当該技術分野において公知の方法により行うことができる。該方法としては、動物から摘出された組織をそのまま組織保存液中に浸漬する方法、リンゲル液、生理食塩水等の生理的な水溶液で組織中の血液を洗い出した後で、組織を組織保存液中に浸漬する方法、組織保存液により組織を灌流した後で、組織を組織保存液中に浸漬する方法等が挙げられる。保存期間及び保存温度は、目的や組織保存液の種類に応じて適宜設定することが出来るが、通常保存期間は約１〜３０日、保存温度は約１〜１０℃（好ましくは約１〜６℃）である。【００２９】
哺乳動物組織を評価対象の組織保存液中で一定期間浸漬保存した後で、該組織中の発光又は蛍光標識遺伝子による発光又は蛍光のレベルが測定される。発光又は蛍光レベルの測定は、浸漬後の組織を破砕し、破砕液中の発光又は蛍光のレベルを測定してもよく、あるいは非破壊的に組織中の発光又は蛍光レベルを測定してもよい。操作が簡便であり、測定後の組織を引続き評価のための試験に用いることが可能であることから、発光又は蛍光のレベルは好ましくは組織を破壊せずに測定される。発光又は蛍光レベルは、ルミノメーターや、蛍光分光光度計等の自体公知の機器を用いて測定することができる。発光又は蛍光レベルを非破壊的に測定する場合は、発光又は蛍光を検出可能なイメージングシステム等を用いて測定することができる。【００３０】
標識遺伝子として、発光又は蛍光を有するタンパク質をコードする遺伝子を使用した場合には、浸漬後の組織中の該タンパク質の発光又は蛍光が直接測定される。一方、標識遺伝子として、対応する発光又は蛍光基質と混合することにより発光又は蛍光を生じる酵素をコードする遺伝子（例えばルシフェラーゼ）を使用した場合には、浸漬後の組織（又はその破砕液）を対応する基質（例えばルシフェリン）と接触させることにより生じる発光又は蛍光が測定される。【００３１】
例えば、上記酵素を標識遺伝子として使用し、非破壊的に発光又は蛍光レベルを測定する場合、浸漬後の組織を、対応する基質を含む水溶液（基質液）中に浸す。該水溶液としては、組織保存液、リンゲル液、生理食塩水等の生理的な溶液を用いることができる。組織保存液を用いることにより、蛍光又は発光レベルの測定後の組織を引続き評価のための試験に用いることが可能となる。【００３２】
基質液中の基質濃度は、当業者が通常使用する濃度範囲において適宜設定される。例えば、基質としてルシフェリンを用いた場合の基質濃度は、通常約１０〜１０００μｇ／ｍｌ（例えば１５０μｇ／ｍｌ）である。【００３３】
組織を基質液中に浸してから、実際に発光又は蛍光を測定するまでの時間も適宜設定することができる。この時間が短すぎると発光又は蛍光のレベルが十分ではなく、感度が低下してしまう。一方、この時間が長すぎると基質が分解してしまい、やはり感度が低下してしまう。また、この時間が長すぎると、組織の温度が上昇してしまい、蛍光又は発光レベルの測定後の組織を引続き評価の試験に用いることが困難となる場合がある。このような観点から、組織を基質液中に浸してから約３〜３０分（例えば５分）後に発光又は蛍光のレベルを測定することが好ましい。【００３４】
基質液の温度は、酵素反応を可能とする範囲で適宜設定することが出来る。基質液の温度が低すぎると酵素反応が進行せず、また温度が高すぎると酵素が失活してしまう。このような観点から、基質液の濃度は通常１〜４０℃である。蛍光又は発光レベルの測定後の組織を引続き評価の試験に用いる場合には、組織の保存条件を良好に維持するため、比較的低温（例えば約１〜１０℃、好ましくは１〜６℃）にて蛍光又は発光レベルを測定することが好ましい。従ってこの場合、標識遺伝子として、このような低温条件においても十分な発光又は蛍光を生じるものを選択する必要がある。ルシフェラーゼは、上記低温条件においても、ルシフェリンと反応し、十分な発光を生じ得る。【００３５】
次に、発光又は蛍光レベルに基づき組織保存液の保存効果が判定される。例えば、浸漬操作の前の段階で、組織中の発光又は蛍光標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定しておき、浸漬後の発光又は蛍光レベルを浸漬前のレベルと比較し、浸漬前後での発光又は蛍光レベルの減少の幅を算出する。その結果、発光又は蛍光レベルの減少の幅が小さいほど、組織保存液の保存効果が高いと判定することができる。【００３６】
あるいは、この発光又は蛍光レベルの減少の幅を、組織保存液を用いない場合（例えば生理食塩水等の組織保存効果をほとんど有していない生理的な水溶液を用いた場合）（ネガティブコントロール）について測定する。そして、評価対象の組織保存液を用いた場合の発光又は蛍光レベルの減少の幅をネガティブコントロールと比較し、この減少の幅がネガティブコントロールよりも小さい場合には、評価対象の組織保存液は組織保存効果を有すると判定することができる。【００３７】
上記判定に際しては、上記発光又は蛍光レベルの減少の幅を、保存効果を有することが知られている組織保存液（例：ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液、ＵＷ液等）を用いた場合（ポジティブコントロール）について同時に測定しておくことが好ましい。ポジティブコントロールを設けることにより、本発明の評価方法が確実に機能していることを確認することができ、また、評価対象の組織保存液の保存効果の程度をポジティブコントロールと比較して評価することが可能である。【００３８】
本発明の評価方法を用いれば、新たな組成の組織保存液を効率的に開発することができる。また、本発明の評価方法は、組織保存液を工場において大量に製造する際の、組織保存液の品質管理に有用である。【００３９】
また、本発明は以下の工程を含む、保存効果が確認された組織保存液の製造方法を提供する：
（Ｉ）所望の組織保存液の構成成分を配合し、該組織保存液を得ること；
（ＩＩ）（Ｉ）で得られた組織保存液の一部をサンプルとして分離すること；
（ＩＩＩ）発光又は蛍光標識遺伝子が導入された哺乳動物組織を（ＩＩ）で分離されたサンプルに浸漬すること；
（ＩＶ）浸漬後の該組織中の該標識遺伝子による発光又は蛍光レベルを測定すること；
（Ｖ）発光又は蛍光レベルに基づきサンプルの保存効果を判定すること；及び
（ＶＩ）（Ｖ）において所望の保存効果が確認されたサンプルが由来する組織保存液を、保存効果が確認された組織保存液として得ること。【００４０】
（Ｉ）において、組織保存液の構成成分としては、水、緩衝剤（リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ等）、等張化剤（ソルビトール、グルコース、マンニトール、トレハロース、グリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）、不浸透剤（ラクトビオン酸ナトリウム、ラフィノース）、膠質浸透圧剤（ヒドロキシエチル澱粉、デキストラン等）、活性酵素消去剤（ビタミンＣ、フラボノイド、ポリフェノール、グルタチオン等）、抗生物質等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、水、緩衝剤及び等張化剤を配合し、組織保存液を得る。【００４１】
公知の組成の組織保存液（ET-Kyoto液、UW液、Euro-Collins液、Histidine-tryptophan ketoglutarate液、Perfadex液等）を製造する場合には、その決定された組成に基づき構成成分を配合すればよい。また、新たな組成の組織保存液を開発する場合は、任意の配合比率で構成成分を配合する。【００４２】
（ＩＩ）では、（Ｉ）で得られた組織保存液から、評価に十分な量がサンプルとして分離される。【００４３】
（ＩＩＩ）〜（Ｖ）の工程は、上述の本発明の評価方法に従って行われる。ここで、公知の組成の組織保存液を製造する場合には、すでに一定の組織保存効果を有することが確認されているロットの同一組成の組織保存液をポジティブコントロールとして用いることが好ましい。【００４４】
そして、（Ｖ）において一定の保存効果が確認されたサンプルが由来する組織保存液を、保存効果が確認された組織保存液として得ることができる。【００４５】
本発明の製造方法を用いれば、一定の組織保存効果を有することが確認された組織保存液を安定的に製造することができる。【００４６】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
［実施例１］
試験方法
試験溶液（組織保存液又は生理食塩水）にルシフェリンを適量溶解し、発光用溶液とした。発光用溶液中のルシフェリン濃度は１５０μｇ／ｍｌであった。組織保存液としては、ET-Kyoto液を用いた。ルシフェラーゼ遺伝子を導入したLewisラット（Luc-LEW）（Transplantation, vol.81, No.8, p.1179-1184, 2006）から臓器（心臓、肺、腎臓、腸、膵臓、脾臓、肝臓）を取り出し、臓器中の血液を取り除いた後、該臓器を４℃の発光用溶液中に浸けた。Luc-LEWラットは、ルシフェラーゼ遺伝子を偏在性に発現している（Transplantation, vol.81, No.8, 2006）。臓器を浸けてから５分後にリアルタイムin vivoイメージングシステム（IVIS Imaging System、Xenogen社）を用いて臓器からの発光光量を測定した。発光光量の測定の間、発光用溶液の温度は４℃に維持した。発光光量を測定後、そのまま冷蔵庫（４℃）中で臓器を保存した。２４、４８及び７２時間後に発光用溶液を新しいものに交換し、交換から５分後に上記と同様にIVISを用いて臓器からの発光光量を測定した。発光光量を数値化し（単位：p/sec/cm2/sr）、試験溶液の臓器保存効果を比較した。【００４８】
結果
保存開始から０〜７２時間後の臓器からの発光のイメージを図１〜４に、各臓器の発光光量の経時的変化を図５及び６に示す。
保存開始時においては、試験溶液としてＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液を用いた場合の発光光量は、生理食塩水を用いた場合とほぼ同一であった。しかし、各臓器を生理食塩水中で７２時間保存すると臓器からのルシフェラーゼ発光はほとんど認められなくなったが、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液中で保存すると依然として臓器からの有意なルシフェラーゼ発光が確認された（図４〜６）。
以上の結果から、臓器からのルシフェラーゼ発光を指標として、組織保存液の保存効果を評価できることが示された。【００４９】
［実施例２］
ルシフェラーゼ遺伝子を導入したLewisラット(Luc-LEW) (Transplantation, vol. 81, No.8, p.1179-1184, 2006)から肝臓を取り出し、肝臓中の血液を取り除き、氷冷（４℃）で保護した。直ちに4℃の低温室内にて以下の作業を行った。組織スライサーにより摘出肝臓を直径3 mmにスライスした。肝臓スライスはそれぞれ約14 mgの均一なスライスとして作成された。試験溶液（組織保存液又は生理食塩水）220 μlを96wellプレートの各wellに注入し、検査する肝臓スライスを試験溶液に浸漬した。組織保存液としては、University of Wisconsin液、ET-Kyoto液、Euro-Collins液、Histidine-tryptophan ketoglutarate液又はPerfadex液を用いた。試験溶液中の最終的なルシフェリン濃度が190 μg/mlとなるように、インジェクターからルシフェリン溶液20 μlを添加し、プレートリーダー(Mithras LB 940、Berthold社)を用いて肝臓スライスからの発光光量を測定した。発光光量の測定後、試験溶液を新しいものと交換し、次の測定まで4℃で保存した。上記方法により、保存開始時（０時間）、及び保存開始から１、３及び６時間後の発光光量を測定し、試験溶液の臓器保存効果を比較した。【００５０】
結果を図７に示す。
肝臓切片を生理食塩水中で保存すると、ルシフェリンの発光量は急激に減少したが、組織保存液を用いた場合には発光量の減少は緩やかであった。
以上の結果から、組織切片を使用しても、組織からのルシフェラーゼ発光を指標として、組織保存液の保存効果を評価できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の方法を用いれば、従来法と比較して簡便な方法で、組織保存液の保存効果を評価することが可能となる。
本発明は日本で出願された特願２００７−０６４１７１（出願日：２００７年３月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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