(57)【要約】  高齢者ほど発症し易い正常眼圧緑内障の症状に似た形態を自発的に、月齢依存的に、確実に発症する簡易な正常眼圧緑内障モデル、及びそれを用い治療・診断に有用な薬物を簡便にスクリーニングする正常眼圧緑内障治療効果評価方法を提供する。  正常眼圧緑内障モデルは、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物、その器官若しくは組織、又はそれらの何れかから採取した細胞である。被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価する方法は、この非ヒト哺乳動物、その器官若しくは組織、又はそれらの何れかから採取した細胞へ、被検物質を投与又は添加し、該器官、該組織、及び／又は該細胞について、形態異常、細胞数、圧力、蛋白質の発現量若しくは活性強度、核酸の発現量、及び／又は抗体の活性強度を指標として測定して、評価するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物、その器官若しくは組織、又はそれらの何れかから採取した細胞であることを特徴とする正常眼圧緑内障モデル。
【請求項２】
該非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１に記載の正常眼圧緑内障モデル。
【請求項３】
転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物、その器官若しくは組織、又はそれらの何れかから採取した細胞へ、被検物質を投与又は添加し、該器官、該組織、及び／又は該細胞について、形態異常、細胞数、圧力、蛋白質の発現量若しくは活性強度、核酸の発現量、及び／又は抗体の活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価する方法。
【請求項４】
該非ヒト哺乳動物を該被験物質の該投与の条件下及び非投与の条件下で夫々飼育し、又は該細胞を該被験物質の該添加の条件下及び非添加の条件下で夫々培養する第１工程、
該指標を観察、測量、又は検出することにより該測定をする第２工程、
該投与の条件下と該非投与の条件下との各々の該指標を比較し、又は該添加の条件下と該非添加の条件下との各々の該指標を比較することにより、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項６】
該器官又は該組織が、眼、網膜、視神経、網膜神経節細胞、網膜神経節層、網膜神経繊維層、網膜顆粒層、網膜網状層、視神経軸索、又は視神経乳頭であることを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項７】
該被験物質とは別に、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）又はその塩を、投与又は添加することを特徴とする請求項４に記載の評価方法。
【請求項８】
該被験物質が、ＮＭＤＡ阻害剤、カルシウム拮抗剤、ＩκＢ分解阻害剤、ＮＦ−κＢデコイオリゴ核酸、及びカルシニューリン阻害剤の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項９】
非ヒト哺乳動物の個体、又は該非ヒト哺乳動物若しくはヒトの細胞に、被検物質を投与又は添加し、該個体中又は該細胞内での転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価する方法。
【請求項１０】
該細胞を該被験物質の該添加の条件下及び非添加の条件下、培養液中で夫々培養する第１工程、
該細胞内又は該培養液中で、該転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度である該指標を該測定する第２工程、
該添加の条件下と該非添加の条件下との各々の該指標を比較して、該添加の条件下での該発現量の増加又は該活性強度の増強により、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする請求項９に記載の評価方法。
【請求項１１】
該細胞が、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の欠損により月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する該非ヒト哺乳動物に由来して、若しくは緑内障患者である該ヒトに由来して、単離されたものであり、又はその細胞株であることを特徴とする請求項１０に記載の評価方法。
【請求項１２】
該非ヒト哺乳動物を該被験物質の該投与の条件下及び非投与の条件下で夫々飼育する第１工程、
該非ヒト哺乳動物の血液中又は細胞内での該転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度である該指標を該測定する第２工程、
該投与の条件下と該非投与の条件下との各々の該指標を比較して、該投与の条件下での該発現量の増加又は該活性強度の増強により、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする請求項９に記載の評価方法。
【請求項１３】
該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１１に記載の評価方法。
【請求項１４】
転写調整因子ＮＦ−κＢの転写誘導活性の抑制剤であることを特徴とする正常眼圧緑内障治療剤。
【請求項１５】
該抑制剤が、ＮＭＤＡ阻害剤、カルシウム拮抗剤、ＩκＢ分解阻害剤、ＮＦ−κＢデコイオリゴ核酸、及びカルシニューリン阻害剤の何れかであることを特徴とする請求項１４に記載の正常眼圧緑内障治療剤。
【請求項１６】
転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現の促進剤であることを特徴とする正常眼圧緑内障治療剤。
【請求項１７】
該促進剤が、ＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子を導入する遺伝子導入剤であることを特徴とする請求項１６に記載の正常眼圧緑内障治療剤。
【請求項１８】
被験者から摘出した器官、組織、それらから採取した細胞、及び採血した血液の何れかに含まれているＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性を測定することを特徴とする正常眼圧緑内障の診断方法。
【請求項１９】
被験者から採取した器官、組織、それらから採取した細胞、及び採血した血液の何れかに含まれているＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子配列の存在を測定することを特徴とする正常眼圧緑内障のリスクの予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中高年齢者に発症し易い正常眼圧緑内障の症状に似た形態を月齢依存的に示す正常眼圧緑内障モデル、及びそれを用いた正常眼圧緑内障治療効果評価方法、正常眼圧緑内障の治療剤、診断・リスク予測に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
失明のうちの主要な疾病の一つである緑内障は、老化や、ストレスのような悪い生活習慣の所為で、視神経が損傷し、視野に欠損が生じた疾病である。【０００３】
緑内障は、眼圧の上昇が主な病因であると考えられていた。眼の水晶体に入った光が網膜の光レセプターで捉えられることにより発せられる生体信号が、網膜の視神経を介し、その視神経が束ねられた眼球の後方の視神経乳頭部から、脳へ伝達される。高眼圧緑内障は、眼圧が高い所為で、次第にこの網膜の視神経が萎縮や膨潤して損傷し、網膜に存する一種の神経細胞である網膜視神経節細胞（ＲＧＣ）がアポトーシスにより死滅し、その後、視神経乳頭部の陥没が惹き起こされ、だんだん視野が狭まり、終には視力を失ってしまうという疾病である。高眼圧緑内障の最近の研究から、虚血、グルタミン酸塩多量摂取、遺伝等が緑内障の発症や進行の危険因子であることや、網膜の蛋白質を直接認識する自己免疫が緑内障の進行に関与していることが、分かってきた。【０００４】
しかし、病因は明らかでないが正常眼圧でも緑内障が、高い頻度で発症する。正常眼圧緑内障は、臨床的に、（１）眼圧が１０〜２１ｍｍＨｇという正常値範囲内、（２）視神経乳頭辺縁部狭細化および陥没、（３）網膜視神経線維層欠損、（４）篩板（篩骨眼窩板）部位での視神経変形・後方偏位、（５）視神経節細胞とグリア細胞の減少という５つのカテゴリーの全ての臨床所見が、総合的に認められるもので、特異的な視神経病変をきたす疾患であると、定義されている。【０００５】
このような正常眼圧緑内障は、網膜視神経節細胞の萎縮・膨潤、アポトーシス及び視神経乳頭部の陥没という高眼圧緑内障と同様な過程を経て、視野欠損を伴いながら、進行し、失明に至らせる。我が国の正常眼圧緑内障患者の割合は高く、人口の数％を占めると言われている。具体的には４０歳以上の２８人に１人（３．６％）が、正常眼圧緑内障である。しかも４０歳を境にそれ以上の中高齢者で、加齢に伴い正常眼圧緑内障罹患率が、男女を問わず、顕著に増加している。正常眼圧緑内障罹患率は、４０歳未満で０．１％程度であるが、４０歳代で２％弱、５０歳代で２％強、６０歳代で約６％、７０歳以上で約７％である。このような正常眼圧緑内障は、我が国では、糖尿病網膜症に次ぎ、第２位の失明原因となっている。この正常眼圧緑内障は、病因も発症機序も明らかでない。その所為で、現在のところ、正常眼圧緑内障の発症により一旦狭窄してしまった視野を回復する抜本的な治療法がない。そこで、交感神経遮断薬・交感神経刺激薬・副交感神経刺激薬・プロスタグランジン関連薬・炭酸脱水酵素阻害薬等の点眼薬を用い、眼圧を下げるという対処療法が行われている。【０００６】
このような正常眼圧緑内障の発症メカニズムを解明したり、治療法・治療剤、予防法・予防剤を開発したりするのに、４０歳を過ぎてから年齢依存的に、発症し易くなりまた症状が悪化し易くなるというヒトの慢性疾患特有の進行過程に似た適当な正常眼圧緑内障モデルが必要である。【０００７】
特許文献１には、アルミニウム化合物を投与して視神経軸索障害を惹起させた正常眼圧緑内障動物モデルが、開示されている。しかし、この動物モデルは、外部からの薬物投与で障害を強制的に惹起させるもので、自発的に発症するものではなく、ましてや月齢依存的な症状の悪化を示すものでもない。【０００８】
【特許文献１】特開２００４−３１３１８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、中高齢者ほど発症し易い正常眼圧緑内障の症状や臨床所見に似た形態を自発的に、月齢依存的に、確実に発症する簡易な正常眼圧緑内障モデル、それを用い治療・診断に有用な薬物を簡便にスクリーニングするための正常眼圧緑内障治療効果評価方法、及び安全で簡便な正常眼圧緑内障治療剤、簡易で確実な正常眼圧緑内障の診断やリスクの予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の正常眼圧緑内障モデルは、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物、その器官若しくは組織、又はそれらの何れかから採取した細胞であることを特徴とする。【００１１】
請求項２に記載の正常眼圧緑内障モデルは、請求項１に記載されたもので、該非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする。【００１２】
請求項３に記載の評価方法は、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物、その器官若しくは組織、又はそれらの何れかから採取した細胞へ、被検物質を投与又は添加し、該器官、該組織、及び／又は該細胞について、形態異常、細胞数、圧力、蛋白質の発現量若しくは活性強度、核酸の発現量、及び／又は抗体の活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価するというものである。【００１３】
請求項４に記載の評価方法は、請求項３に記載されたもので、
該非ヒト哺乳動物を該被験物質の該投与の条件下及び非投与の条件下で夫々飼育し、又は該細胞を該被験物質の該添加の条件下及び非添加の条件下で夫々培養する第１工程、
該指標を観察、測量、又は検出することにより該測定をする第２工程、
該投与の条件下と該非投与の条件下との各々の該指標を比較し、又は該添加の条件下と該非添加の条件下との各々の該指標を比較することにより、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする。【００１４】
請求項５に記載の評価方法は、請求項３に記載されたもので、該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする。【００１５】
請求項６に記載の評価方法は、請求項３に記載されたもので、該器官又は該組織が、眼、網膜、視神経、網膜神経節細胞、網膜神経節層、網膜神経繊維層、網膜顆粒層、網膜網状層、視神経軸索、又は視神経乳頭であることを特徴とする。【００１６】
請求項７に記載の評価方法は、請求項４に記載されたもので、該被験物質とは別に、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）又はその塩を、投与又は添加することを特徴とする。【００１７】
請求項８に記載の評価方法は、請求項３に記載されたもので、該被験物質が、ＮＭＤＡ阻害剤、カルシウム拮抗剤、ＩκＢ分解阻害剤、ＮＦ−κＢデコイオリゴ核酸、及びカルシニューリン阻害剤の少なくとも何れかであることを特徴とする。【００１８】
請求項９に記載の評価方法は、非ヒト哺乳動物の個体、又は該非ヒト哺乳動物若しくはヒトの細胞に、被検物質を投与又は添加し、該個体中又は該細胞内での転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価するというものである。【００１９】
請求項１０に記載の評価方法は、請求項９に記載されたもので、
該細胞を該被験物質の該添加の条件下及び非添加の条件下、培養液中で夫々培養する第１工程、
該細胞内又は該培養液中で、該転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度である該指標を該測定する第２工程、
該添加の条件下と該非添加の条件下との各々の該指標を比較して、該添加の条件下での該発現量の増加又は該活性強度の増強により、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする。【００２０】
請求項１１に記載の評価方法は、請求項１０に記載されたもので、該細胞が、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の欠損により月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する該非ヒト哺乳動物に由来して、若しくは緑内障患者である該ヒトに由来して、単離されたものであり、又はその細胞株であることを特徴とする。【００２１】
請求項１２に記載の評価方法は、請求項９に記載されたもので、
該非ヒト哺乳動物を該被験物質の該投与の条件下及び非投与の条件下で夫々飼育する第１工程、
該非ヒト哺乳動物の血液中又は細胞内での該転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度である該指標を該測定する第２工程、
該投与の条件下と該非投与の条件下との各々の該指標を比較して、該投与の条件下での該発現量の増加又は該活性強度の増強により、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする。【００２２】
請求項１３に記載の評価方法は、請求項１１に記載されたもので、該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする。【００２３】
請求項１４に記載の正常眼圧緑内障治療剤は、転写調整因子ＮＦ−κＢの転写誘導活性の抑制剤であることを特徴とする。転写調整因子ＮＦ−κＢの転写誘導活性を抑制することは、正常眼圧緑内障の治療法となる。【００２４】
請求項１５に記載の正常眼圧緑内障治療剤は、請求項１４に記載されたもので、抑制剤が、ＮＭＤＡ阻害剤、カルシウム拮抗剤、ＩκＢ分解阻害剤、ＮＦ−κＢデコイオリゴ核酸、及びカルシニューリン阻害剤の何れかであることを特徴とする。【００２５】
請求項１６に記載の正常眼圧緑内障治療剤は、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現の促進剤であることを特徴とする。転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現を促進することは、正常眼圧緑内障の治療法となる。【００２６】
請求項１７に記載の正常眼圧緑内障治療剤は、請求項１６に記載されたもので、該促進剤が、ＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子を導入する遺伝子導入剤であることを特徴とする。このような遺伝子導入剤は、ＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子を導入するので、正常眼圧緑内障の治療法に用いられる。【００２７】
請求項１８に記載の正常眼圧緑内障の診断方法は、被験者から採取した器官、組織、それらから採取した細胞、及び採血した血液の何れかに含まれているＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性を測定することを特徴とする。【００２８】
請求項１９に記載の正常眼圧緑内障のリスクの予測方法は、被験者から採取した器官、組織、それらから採取した細胞、及び採血した血液の何れかに含まれているＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子配列の存在を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の正常眼圧緑内障モデルは、中高年齢者ほど発症し易いヒトの正常眼圧緑内障の慢性疾患特有の症状や臨床所見に似た形態を、自発的に、月齢依存的に、確実に発症するものである。【００３０】
このモデルは、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０欠損が月齢依存的に視神経のアポトーシスを誘発し視神経乳頭陥没を惹き起こし、かつ網膜の視神経節細胞（ＲＧＣ）内に発現している蛋白質を直接認識する自己抗体の産生というヒトの正常眼圧緑内障と同様な発症メカニズムによりその患者の症状と似た形態を示す。そのためこのモデルは、この転写調節因子の活性化と視神経細胞の成長・萎縮・アポトーシスとの関連性を明らかにしたり、視神経細胞萎縮や膨潤の機序を明らかにしたりして、正常眼圧緑内障の発症メカニズムを解明するのに、有用である。【００３１】
この正常眼圧緑内障モデルを用いた評価方法によれば、簡便に再現性良く治療・診断に有用な薬物をスクリーニングして峻別することができる。さらに、この評価方法によれば、ヒトの正常眼圧緑内障発症メカニズムの解明のみならず、治療法・予防法及びそのための薬剤の開発・それによる治療効果の判定に、役立つ。【００３２】
また本発明の正常眼圧緑内障治療剤は、安全で確実に薬効を示し、簡易な治療に有用である。【００３３】
さらに、本発明の正常眼圧緑内障の診断方法や正常眼圧緑内障のリスクの予測方法により、早期発見・早期治療ができ、また前記正常眼圧緑内障治療剤により、治癒が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明を適用する正常眼圧緑内障モデルに用いられるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとの月齢依存的神経節細胞のアポトーシスを示す写真及びグラフである。
【図２】本発明を適用する正常眼圧緑内障モデルに用いられるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとヘテロ型マウスと野生型マウスとの眼圧を示すグラフである。
【図３】本発明を適用する正常眼圧緑内障モデルに用いられるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとヘテロ型マウスと野生型マウスとにおける、正常眼圧緑内障に特有な病理所見である視神経乳頭陥没と視神経の異変(視神経細胞萎縮や膨潤)とを示す写真である。
【図４】本発明を適用する正常眼圧緑内障モデルに用いられるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとにおける、網膜と視神経とでのグリア細胞の活性化を示す写真である。
【図５】本発明を適用する正常眼圧緑内障モデルに用いられるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとにおける、ＮＭＤＡ毒性に対する網膜の視神経節細胞（ＲＧＣ）の感受性を示すグラフである。
【図６】本発明を適用する正常眼圧緑内障モデルに用いられるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとにおける、ＮＭＤＡ毒性に対する網膜の視神経節細胞（ＲＧＣ）の感受性を示す別なグラフである。
【図７】本発明を適用する被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価する方法により、正常眼圧緑内障モデルに用いられるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとについて、被験物質の薬効を示すグラフである。
【発明を実施するための好ましい形態】
【００３５】
以下、本発明を実施するための好ましい形態について、詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００３６】
本発明の正常眼圧緑内障モデルは、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスによって構成されるものである。
【００３７】
この転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０は、生体防御システムや脳神経細胞の増殖や記憶に重要であることが知られていたが、正常眼圧緑内障モデルによれば、網膜神経節細胞の増殖や電子伝達系においても重要であり、老化に伴うこの転写調節因子活性の減退による緑内障の発症や進行に関与する重要なものである。
【００３８】
ｐ５０（ＮＦＫＢ１）は、ｐ６５（ＲｅｌＡ）に結合して、ＮＦ−κＢ複合体を形成する。サイブタイプにより構成されるＮＦ−κＢファミリーにおいて、ｐ５０（ＮＦＫＢ１）／ｐ６５（ＲｅｌＡ）ヘテロダイマーは、ＮＦ−κＢの中で最も多い型である。ＮＦ−κＢ複合体は、細胞質内で捕捉することによりＮＦ−κＢを不活性化するＩ−κＢ蛋白質によって、阻害されるものである。細胞外からの刺激により、キナーゼ（ＩＫＫβ又はＩＫＫγ）によるＩ−κＢ蛋白質上のセリン残基のリン酸化反応が生じる。リン酸化型のＩ−κＢは、ユビキチン化されプロテアソームにより分解されることで、ＮＦ−κＢがフリーになり活性化する。活性化されたＮＦ−κＢは、核に移行し、特定のＤＮＡ塩基配列(ＮＦ−κＢ結合配列)を認識してＤＮＡと結合し、その後、遺伝子転写を著しく活性化する。一方では、ｐ５０はＤＮＡに結合するために必要であり、ｐ６５は遺伝子転写活性化のために本質的に必要な因子である。
【００３９】
ＮＦ−κＢの幅広い機能的な影響は、癌との関係、神経細胞可塑性との関係、及び神経疾患の治療に、関連している。中枢神経系では、ＮＦ−κＢが神経細胞とグリア細胞とに偏在し、シナプス活性、学習、記憶、生存とアポトーシスのような様々な生理学的メカニズムに重要な役割を果たしている。
【００４０】
ＮＦ−κＢは、外傷性障害、発作及び虚血のような急性神経変異、アルツハイマー病のような慢性神経変異に関わる病態生理学的症例に、介在している。一方、肝細胞等においては、ＮＦ−κＢは、アポトーシスを阻止しているが、神経細胞においては、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）誘導性アポトーシスを促進している。
【００４１】
神経細胞のアポトーシスにおけるＮＦ−κＢの正確な役割を明確にするために、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの表現型を分析したところ、網膜に関し網膜神経節細胞のアポトーシスにＮＦ−κＢｐ５０が関与していることが分かった。
【００４２】
ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスを用いた正常眼圧緑内障モデルによる正常眼圧緑内障治療効果評価方法での月齢依存的な網膜神経節細胞の生存について検討したところ、このマウスがヒトの正常眼圧緑内障疾病に似た多くの特徴を示していた。
【実施例】
【００４３】
以下に、本発明を適用する正常眼圧緑内障モデルを用いて、正常眼圧緑内障治療効果評価方法を行った例を、具体的に示す。【００４４】
用いた試薬・動物と、試験方法とは、以下の通りである。【００４５】
（使用動物）
用いた野生型（即ち正常型）、ヘテロ型(染色体の片方のアレルのみＮＦ−κＢｐ５０遺伝子が欠損)、ホモ型(染色体の両方のアレルにおいてＮＦ−κＢｐ５０遺伝子が欠損)のマウスは、すべて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで戻し交配によって産生したＮＦ−κＢｐ５０欠損Ｆ８マウスの同腹子である。Ｂ６／１２９−Ｆ２遺伝子背景を持つＮｆｋｂ１ｔｍ１Ｂａｌのホモ型のマウスを、ジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から、またＣ５７ＢＬ／６マウスを、日本クレア株式会社から、購入して試験に用いた。これらのマウスは、信州大学学内ガイドラインに従い信州大学動物棟の特定病原体感染防止（ＳＰＦ）室で、飼育した。【００４６】
（ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの作製）
ターゲティングベクターを用いてＮＦ−κＢｐ５０の開始メチオニンを含む遺伝子領域を相同組み換えで薬剤耐性遺伝子(具体的にはネオマイオシン耐性遺伝子)に置き換え、その遺伝子からＮＦ−κＢｐ５０が産生されないようにした。具体的には、ターゲティングベクターを、全能性をもつマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）（１２９マウス系のＥＳ細部＝Ｅ１４  ｃｅｌｌ：４百万細胞／ｍＬ）にエレクトロポレーション法（２５０ボルト、２５０ｍｉｃｒｏＦ、ｔｉｍｅ−ｃｏｎｓｔａｎｔ  ４０−５０ｍｓｅｃ、室温）で導入し、薬剤耐性（ネオマイシン類似体であるＧ４１８：１５０ｍｇ／ｍＬ）を指標にして相同組換えが起きた細胞を選択した。サザンブロット法により、Ｇ４１８によって選択された細胞が、実際にＮＦ−κＢｐ５０のＤＮＡ遺伝子領域が相同組み換えで薬剤耐性遺伝子に置き変わったことを確認した。さらに、逆転写酵素−遺伝子増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ法）とウェスタンブロット法により、ＮＦ−κＢｐ５０のｍＲＮＡとＮＦ−κＢｐ５０が、発現しないことを確認した。一般的には、上記の様な相同組み換えにより相同染色体の一方のみのＮＦ−κＢｐ５０遺伝子が欠損されたＥＳ細胞(組み換えＥＳ細胞)が得られた。次に、得られた組み換えＥＳ細胞を発生させてキメラマウスを得た(Sha,W.  et  al.  Cell  80,  321-330,  1995)。そのため、組み換えＥＳ細胞をマイクロインジェクション法や凝集法により、胚盤胞期叉は８細胞期等の正常なマウス胚に注入し、その様にして得られたキメラ胚を擬妊娠状態にある雌のマウスの子宮角に移植し、この移植マウスを通常通り飼育して、キメラマウス仔を出産させることが出来た。好ましくは、組み換えＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６系マウスの胚に注入することである。このキメラマウスは、通常、その体細胞及び生殖細胞として、組み換えＥＳ細胞由来の細胞と正常細胞とを含んでなり、これを適当な系統の野生型マウス、好ましくはＣ５７ＢＬ／６系マウス、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配することでヘテロ型のＦ１産仔が得られた。通常通り、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ型マウスを産出させた。交配に用いたキメラマウスの生殖細胞が、上記の組み換えＥＳ細胞、すなわち相同染色体の一方に存在する内在性ＮＦ−κＢｐ５０遺伝子が欠損されているＥＳ細胞に由来していれば、該遺伝子の機能が欠損した所望のヘテロ型Ｆ１マウスを得ることが出来る。Ｆ１世代において所期の遺伝子型が達成されているか否かを、その尾から抽出したＤＮＡに対して、サザンブロットやＰＣＲ法により分析を行うことにより確認することが、出来た。【００４７】
本発明では、ＮＦ−κＢｐ５０遺伝子欠損マウスの遺伝的背景を出来るだけＣ５７ＢＬ／６系マウスに近づけることが好ましい。そのために、上記の通りに作製したＦ１ヘテロ型マウスを更にＣ５７ＢＬ／６系マウス、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配し、生まれてきたヘテロ型マウスを再度Ｃ５７ＢＬ／６系野生型マウスと交配するという作業を繰り返す。この交配の作業を通常合計少なくとも５回、好ましくは少なくとも７回行う。この実施例においては、Ｆ１ヘテロ型マウスを更にＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配し、生まれてきたヘテロ型マウスを再度Ｃ５７ＢＬ／６系野生型マウスと交配するという作業を６回繰り返してＦ７ヘテロ型マウスを作製した。雄性Ｆ７ヘテロ型マウスと雌性Ｆ７ヘテロ型マウスとを交配して、Ｆ７世代の野生型マウス、ヘテロ型マウスおよびホモ型マウス（ＮＦ−κＢｐ５０遺伝子欠損マウス)を産出させ、各系統のマウスにおける眼の性状(網膜組織の性状、視神経組織の性状、眼圧等)を比較検討する。【００４８】
（ウェスタンブロット分析）
マウス（ＮＦ−κＢｐ５０欠損Ｆ８マウス）の眼から網膜を、摘出し、変性ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ−４０(界面活性剤)、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)、１ｍｍｏｌのＮａＦ、１ｍＭのＰＭＳＦ(フェニルメチルスルホニルフルオライド)、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、アプロチニンとロイペプチンとペプスタチンの各１μｇ／ｍＬ）中で、ホモジナイズした。この試料を、先ず１０分間９５°Ｃで加熱し、次いで、２０分間１５０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを、網膜の粗抽出物として−３０℃で保存した。この抽出物の１０μｇを、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアセチルアミド  ゲル電気泳動)に付し、通常の手順に従い、ＮＦ−κＢｐ６５又はｐ５０に対するウサギのポリクローナル抗体（サンタクルズ  バイオテクノロジー社製、カリフォルニア州）と神経膠繊維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）に対するヤギのポリクローナル抗体（サンタクルズ  バイオテクノロジー社製、カリフォルニア州）とを用いて、ウェスタンブロット分析を行った。免疫検出可能な蛋白質を、ＥＣＬウェスタンブロットシステム（ＧＥ  ヘルスケア  バイオ−サイエンス社製  （スウェーデン））を用い、視覚化し目的蛋白質の発現を確認した。【００４９】
（網膜神経節細胞標識及び計測）
マウスを、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（７０ｍｇ／ｋｇ）との混合物の腹腔内投与によって、麻酔した。頭蓋上の皮膚を切開し、頭皮を露出させた。注射位置は、脳表面から深さ２ｍｍで、前後直線の前頂の後方３ｍｍで、正中線の外側０．５ｍｍの場所である。頭皮にドリルで枠を開け、神経トレーサー染料であるフルオロゴールド（食塩水中の４％溶液、蛍光色素、デンバー社製、コロラド州）の１μＬを、ハミルトンシリンジにより０．５μＬ／分の速度で付した後、切開した皮膚を縫合した。フルオロゴールドを付してから５〜７日後、マウスを安楽死させ、眼を摘出し、網膜を剥離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の４％パラホルムアルデヒド下で平坦な網膜の全組織標本とした。２３０×１５０μｍで同一サイズの１０視野で、標識細胞数を、蛍光顕微鏡により計測した。計測した視野は、同程度に略５００μｍずつ離してある。視野を、観察者２人による盲検により計測した。各網膜の視野ごとの網膜神経節細胞の平均数は、ボンフェノーニ補正法によるＡＮＯＶＡ（分散分析）によって解析した。【００５０】
（ヌクレオソームＤＮＡ断片分析）
マウスから摘出された網膜を、最終濃度で０．１％のＮＰ−４０を含む緩衝液Ａ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ）の５００ｍＬに浸し、ホモジナイズした。２３００ｒｐｍで５分間、遠心分離した後、核を単離し、最終濃度で１ｍｇ／ｍＬのリボ核酸分解酵素Ａ溶液と最終濃度で１ｍｇ／ｍＬのプロテナーゼＫとを含んでいる溶解溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のラウロイルサルコシンナトリウム）に再懸濁させ、５０℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後、ヌクレオソームＤＮＡとして−３０℃で保存した後、通常の手法に従って１０％のアガロースゲルに付し電気泳動を行い、ヌクレオソームＤＮＡの断片化を検出することでアポトーシスにより細胞死を誘導されている細胞の存在を検出した。【００５１】
（眼圧測定：ＩＯＰ）
野生型、ヘテロ型、及びホモ型のマウス（ＮＦ−κＢｐ５０欠損Ｆ８マウスの同腹子）について、眼圧を測定した。先ず、マウスを、ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりに浅く麻酔した。通常の方法でＴｏｎｏＬａｂ反響眼圧計（コロニアル  メディカル  サプライ社製、テキサス州ガーランド）を用いて、麻酔誘導後１０分してから順次、眼圧の測定を行った。有意差検定は、スチューデントのｔ検定によって解析された。【００５２】
（形態観察及び透過型電子顕微鏡法）
麻酔後、４％のパラホルムアルデヒドで灌流し、視神経を眼球の後ろ２ｍｍの所から解剖し、固定液（０．１Ｍのカコジル酸塩緩衝液中、２．０％のグルタルアルデヒド及び２．０％のパラホルムアルデヒド）の約２０ｍＬに１２時間浸漬した。その後、視神経を、１％の四酸化オスミウム中で後処理して固定し、エタノール中で脱水し、ＥＰＯＫ８１２（応研商事株式会社製）で包理した。透過型電子顕微鏡観察用に、視神経の長軸と垂直に超薄切片を切出し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛とで染色し、透過型電子顕微鏡ＪＥＭ１２００ＥＸ（日本電子株式会社製）で観察した。また、光学顕微鏡観察には、トルイジンブルー染色を用いた。【００５３】
（ＮＭＤＡ(Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩)注射及び形態観察）
前記のようにして、繰返しＮＭＤＡを注射した。５ｍＭのＮＭＤＡの緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）の２μＬを、月齢２ヶ月の各マウスの左眼の硝子体に注射した。右眼に、ＢＳＳのみを注射した。注射後、２４時間後と４日後とに、眼を摘出し、ＰＢ中で４％パラホルムアルデヒドにより固定した。次いで、脱水し、パラフィンで包理した。横断切片を、視神経乳頭から得、ヘマトキシロン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。神経節層に浸潤している細胞を除き、神経節細胞層の視神経乳頭の端から０．３ｍｍの長さの所の０．３５ｍｍの細胞を計測した。各視野ごとの細胞の平均数を求め、有意差検定をスチューデントのｔ検定によって解析した。【００５４】
（免疫組織化学染色：ＩＨＣ）
パラフィンで包理した網膜及び視神経を免疫組織化学染色の資料として用いた。切片を、脱蝋し、１％のＢＳＡ（牛の血清アルブミン）中で、インキュベートした。その後、切片を、適切な抗体と共に一晩４℃でインキュベートした。抗体として、主に、ＧＦＡＰに対するヤギのポリクローナル抗体、ＮＦ−κＢｐ５０又はｐ６５に対するウサギのポリクローナル抗体（１：２００，サンタクルズ  バイオテクノロジー社製、カリフォルニア州）、及びＣＤ３、ＣＤ１１ｂおよびＧｒ−１に対するウサギのポリクローナル抗体（ＢＤ  ファミンゲン社製  カリフォルニア州）を用いた。インキュベートし終わったら、切片を、洗浄し、第２抗体であるアレクサフロア４８８により標識されている抗ヤギ又は抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００、サンタクルズ  バイオテクノロジー社製、カリフォルニア州）でインキュベートした。最後に、切片を、非退色標本保存液（ベクタシールド、ベクター研究所製、カリフォルニア州）でカバースリップし、共焦点顕微鏡（ソーンウッド社製、ニューヨーク州カールゼイス）を用いて視覚化した。正常なヤギやウサギの抗血清を、対照として用いた。【００５５】
（ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス中の自己抗体産生の同定）
ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと、野生型マウスとから血清試料を得た。野生型マウスに由来するパラフィン包理網膜切片と各マウスより採取された血清試料とを通常の免疫組織化学的手法により反応させ、網膜の蛋白質を直接認識する自己抗体の産生を確認した。ウェスタンブロット分析をするために、月齢２ヶ月の野生型マウスから網膜を抽出し、前記のような１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。免疫ブロット分析は、月齢５ヶ月でＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとから採取した血清試料を用いて行われた。【００５６】
これらの実験による結果を、以下に示す。【００５７】
（網膜中のＮＦ−κＢ発現の結果）
ＮＦ−κＢは、神経系中で発現され、シナプス活性、学習及び記憶のような過程で、重要な役割を果たしている。今までに網膜中でのＮＦ−κＢｐ５０の機能を検討したという報告は、なされていない。この実験は、初めて、ＮＦ−κＢサブユニットに対する抗体との免疫組織化学及びウェスタンブロット分析による網膜中のＮＦ−κＢ発現について、検討したものである。免疫組織化学的な検討によれば、ＮＦ−κＢｐ６５及びｐ５０の発現は、神経節細胞層（ＧＣＬ）中の細胞の細胞質内で検出された。網膜神経節細胞は、およそ４０〜６０％がマウスの網膜の神経節細胞層中の神経であり、細胞の半分が網膜内の無軸索神経細胞である。ＮＦ−κＢｐ６５及びｐ５０発現は、網膜神経節細胞層中のほとんどすべての神経で、検出された。正常なウサギのＩｇＧで行った免疫組織化学的検討では、検出されない。ＮＦ−κＢｐ６５及びｐ５０が、神経節細胞層中の細胞の細胞質でとりわけ発現していることが、示唆された。ウェスタンブロット法によって、ＮＦ−κＢｐ６５、ｐ５０、及びその先駆体蛋白質であるｐ１０５の発現が、両型のマウスから得られた網膜の蛋白質粗抽出物で、夫々検出された。【００５８】
（ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜の網膜神経節細胞生存の月齢依存的な減少の結果）
３週齢での組織学的検査によれば、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜と、野生型マウスの網膜とは、何ら変わりがない。月齢５ヶ月では、夫々の網膜層は、厚さや構造の点で違いがなく、特に内顆粒層及び外顆粒層は、違いがなかった。中枢神経系で、ＮＦ−κＢが、神経細胞とグリア細胞との両方で偏在し、シナプス活性、生存・アポトーシスのような様々な生理学的メカニズムの重要な役割を果たしている。異なる齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜神経節細胞数を調べたところ、ＮＦ−κＢｐ５０発現が、網膜神経節細胞生存に必要なのか否かが、明らかとなった。３週齢、月齢２ヶ月、月齢５ヶ月のマウスの網膜神経節細胞数を、フルオロゴールドによる逆行性標識法で計測した。その結果を図１ａ及び図１ｂに示す。【００５９】
図１ａは、網膜神経節細胞をフルオロゴールドにより付してから５〜７日後に、眼を摘出し、平坦な標本にして、逆行性蛍光標識法を行った典型的な顕微鏡写真である。スケールバーは２５μｍである。【００６０】
図１ｂは、月齢依存的に減少するＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの神経節細胞数を示すグラフである。平坦な標本にした網膜の同一サイズ（２３０×１５０μｍ）の１０視野で、逆行性標識細胞数を、蛍光顕微鏡により計測した。計測した視野は、同程度に５００μｍずつ離してある。各網膜の視野ごとの網膜神経節細胞の平均数を計測し、ボンフェノーニ補正法による分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。棒グラフは、３週齢，月齢２ヶ月及び月齢５ヶ月での視野ごとの網膜神経節細胞の平均数を示している。データは、平均±平均標準誤差（マウスのｎ数は、３週齢で各４匹、月齢２ヶ月で各３〜５匹、月齢５ヶ月で各８〜１２匹）である。＊１ｐ＜０．０１は野生型マウスに対するものであり、＊２ｐ＜０．０１は野生型マウスに対するものである。【００６１】
図１ａ及び同図ｂに示すように、３週齢、月齢２ヶ月で明確な違いがなく神経病変が認められなかったが、月齢５ヶ月で、ｐ５０欠損Ｆ８マウスの網膜神経節細胞数は、同月齢の野生型マウスのものに比べ、顕著に減少しており、その細胞が多数死滅しているという神経病変が認められた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで戻し交配して産生したＦ３マウスの同腹子で、さらに組織学的実験を行った。３週齢、月齢２ヶ月及び月齢５ヶ月のマウスの網膜神経節細胞数を、逆行性標識法で計測した。３週齢、月齢２ヶ月で明確な違いがなかったが、月齢５ヶ月では、ｐ５０欠損Ｆ３マウス中の網膜神経節細胞は、同月齢の野生型マウスのものに比べ、著しく減少していた。【００６２】
さらに、網膜神経節細胞生存数の減少がアポトーシスによって惹き起こされているのか否かを調べるために、網膜の切片でヌクレオソームＤＮＡ断片化分析を行った。神経節細胞のアポトーシスの検出のためのヌクレオソームＤＮＡ断片分析の結果を図１ｃに示す。【００６３】
図１ｃは、網膜を、２週齢及び月齢４ヶ月のマウスから切り採り、ヌクレオソームＤＮＡ断片分析を行ったものである。【００６４】
図１ｃに示すように、月齢４ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜で、ヌクレオソームＤＮＡ断片のラダーがはっきりと検出されていることが示されている。しかし月齢２ヶ月では、いずれにもヌクレオソームＤＮＡ断片のラダーは認められていない。【００６５】
（野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとので眼圧差の結果）
ヒトの緑内障では、網膜神経節細胞のアポトーシスが、高眼圧によってしばしば惹き起こされることが知られている。ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスで検出される網膜神経節細胞のアポトーシスが、ヒトの緑内障での高眼圧によって惹き起こされているか否かの可能性について検討するために、その眼圧を測定した。その眼圧測定の結果を図２に示す。【００６６】
図２は、月齢３ヶ月及び月齢６ヶ月のマウスから個々に得た各眼について眼圧を計測したものである。データは、平均±平均標準誤差（マウスのｎ数は、月齢３ヶ月で各５〜６匹、月齢６ヶ月で各８〜１０匹）である。【００６７】
野生型正常マウスの眼圧は、通常、１０〜２０ｍｍＨｇであるが、図２に示すように、月齢３ヶ月と月齢６ヶ月とでは、野生型マウス、ヘテロ型マウス、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの各々で、眼圧差は無く、その眼圧は正常範囲内であった。このように、高眼圧による物理的な要因は、高齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでの網膜神経節細胞数の低下に関係がないと思われる。【００６８】
（視神経乳頭に特有な陥没と、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでの視神経の異変の結果）
視神経の異変は、緑内障の末梢神経障害に際立っているもう一つの特徴であるので、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの月齢依存的な異変について検討した。ヒトの緑内障では、視神経乳頭に特有な陥没が、認められることが知られている。高齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス中の視神経の形態変化を調べるために、病理組織検査を行なった。網膜での視神経乳頭辺縁部狭細化および陥没は、月齢５ヶ月までの野生型マウス、ヘテロ型マウス、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの各々で、認められなかったが、月齢１０ヶ月でのマウスで顕著な違いが、認められた。その月齢１０ヶ月での結果を、図３ａに示す。【００６９】
図３ａは、視神経乳頭に特有な陥没と、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでの視神経の異変を示すものである。図３ａは、視神経乳頭の組織検査の写真であり、月齢１０ヶ月のマウスから眼を切り採り、試料切片を、ヘマトキシロン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色したものである。【００７０】
図３ａから明らかな通り、野生型マウスにもヘテロ型マウスにも視神経乳頭において組織学的異常が認められなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの視神経乳頭が顕著に陥没しているという際立った異変が認められた。【００７１】
健常人の網膜に、視神経乳頭の陥没のような組織異常が認められないことが確認されており、一方、正常眼圧緑内障患者の網膜に、視神経乳頭の陥没が特長的病理所見として、認められることが確認されている。図３ａのＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの視神経乳頭の陥没は、正常眼圧緑内障患者のみに顕明に認められる特有の視神経乳頭の陥没と、同様な病理所見であった。【００７２】
次に、高齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの視神経が局所的に損失しているか否かを調べるために、組織検査を行なった。光学顕微鏡法によると、野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとは、視神経の断面における太さの差異は認められなかった。しかしながら、高齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでは、視神経の断面の４象限（こめかみ側、鼻側、内部側、上部側）の全てにおいて、重大な軸索変質や、視神経乳頭を通り脳へ繋がる網膜神経節細胞の著しい萎縮や膨潤が認められ、局所的な異変所見ではなかった（図３ｂ）。したがって、視神経細胞の著しい萎縮や膨潤は、高眼圧による物理的な要因によって生じた可能性が低い。【００７３】
さらに、図３ｃは、視神経軸索の形態的異変を検出する電子顕微鏡検査観察（倍率：８０００倍）であり、月齢５ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの各軸索拡大領域を示したものである。スケールバーは２μｍである。図３ｃから明らかなように、月齢５ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの各軸索領域では、野生型マウスと比較して、明らかに軸索数の減少が認められた。さらに、視神経の断面図を電子顕微鏡で観察したところ、同月齢の野生型マウスと比較して、月齢５ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでは著しい軸索の減少と視神経細胞萎縮や膨潤が認められた。ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスにおいて、軸索の減少の結果、結合組織領域が、著しく増加していた。【００７４】
これらの知見は、既に報告されているような他のげっ歯類動物を用いた緑内障モデルと非常に異なっているので、極めて興味深い。明らかに視神経乳頭の陥没が認められる月齢１０ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスは、神経線維層が明らかに損傷されているが、同月齢で同腹子の野生型マウスと同様に内顆粒層の目立ったアポトーシスが観察されていない。これらのことから、高眼圧により、視神経細胞の著しい萎縮や膨潤が生じた可能性が極めて低いことが、明らかとなった。【００７５】
（ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでの網膜と視神経との神経膠繊維酸性蛋白質(ＧＦＡＰ)発現の増大の結果）
グリア細胞は、視神経乳頭及び網膜を含む神経系中での重要な構造的で機能的な構成成分である。ヒトやマウスの眼組織中には、数種類のグリア細胞が存在する。視神経中のグリア細胞には、星状膠細胞、希突起神経膠細胞、ミクログリアがある。網膜には、グリア細胞としてミュラー細胞と星状膠細胞が存在する。何かしらの原因により中枢神経系細胞が損傷しアポトーシスあるいはネクローシスにより死細胞となると、その死細胞を排除するために、グリア細胞（星状膠細胞）が、ＧＦＡＰの発現陽性となり貪食細胞として活性化する。このようなグリア細胞の変化は、ヒトの緑内障の眼や、緑内障実験モデルでは注目されていた。【００７６】
視神経乳頭の断面図の顕微鏡観察の結果を、図４ａに示す。図４ａは、月齢２ヶ月及び月齢５ヶ月のマウスから視神経を切り採った試料切片を、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡観察を行ったものである。矢印は、肥大性星状膠細胞を示している。スケールバーは１０μｍである。図４ａから明らかな通り、月齢５ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの星状膠細胞の形態が、同月齢の野生型マウスに比べ、明らかに肥大していたが、月齢２ヶ月では、何れのマウスでも相違が認められなかった。【００７７】
次いで、免疫組織化学的検討を行った。その結果を図４ｂに示す。グリア細胞の活性化は、ＧＦＡＰ陽性によって判断される。図４ｂは、抗ＧＦＡＰ抗体の免疫組織化学染色による、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜と視神経とでのグリア細胞の活性化を示している。左側に示す４つは網膜切片の断面図であり、スケールバーは１０μｍである。右側に示す４つは視神経切片の断面図であり、スケールバーは２０μｍである。【００７８】
網膜において、異なる二つのグリア細胞、即ち星状膠細胞とミュラー細胞とが、網膜中に存在している。図４ｂ左側の４つの網膜の断面の切片を示す図のように、やや上側（網膜視神経節細胞層）の明部にある星状膠細胞と中程の暗部にあるミュラー細胞とであるグリア細胞が存在している。ミュラー細胞の活性化はＧＦＡＰで検出できないが、星状膠細胞の活性化はＧＦＡＰで染色されるので、検出できる。図４ｂ左側の４つの図に示されているように、野生型マウスの月齢２ヶ月および５ヶ月とＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの月齢２ヶ月との切片は、ＧＦＡＰで染色されていないから星状膠細胞の活性化が認められなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの月齢２ヶ月との切片は、ＧＦＡＰで染色されており星状膠細胞の活性化が認められた。【００７９】
図４ｂ右側の４つの視神経の断面の切片を示す図のように、野生型マウスの月齢２ヶ月および５ヶ月とＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの月齢２ヶ月との切片は、ＧＦＡＰで染色されていないから星状膠細胞の活性化が認められなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの月齢２ヶ月との切片は、矢印で示すようにＧＦＡＰで染色されており星状膠細胞の活性化が認められた。【００８０】
このように、図４ｂから明らかな通り、月齢５ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの神経繊維層や神経節細胞で、ＧＦＡＰが、野生型マウスに比べて、顕著に発現していることが分かった。月齢５ヶ月の野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとの免疫組織化学的分析により、内顆粒層でのＧＦＡＰの免疫反応が、認められなかった。つまり、ミュラー細胞の活性化は、月齢５ヶ月の野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスともに認められなかった。月齢２ヶ月マウスでは、野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとの網膜のＧＦＡＰで、わずかな星状膠細胞がかすかに変形していたにすぎなかった。高齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜中で、ＧＦＡＰ発現が増大、つまり星状膠細胞の活性化が認められた。さらに、視神経の断面図から明らかなように、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの視神経において星状膠細胞の肥大と一層厚い網状組織とが認められた。【００８１】
健常人の網膜組織の断面の切片で、ＧＦＡＰで染色されないから星状膠細胞の活性化が認められないが、正常眼圧緑内障患者の網膜組織の断面の切片において網膜視神経節細胞層のみで、ＧＦＡＰで染色されており星状膠細胞の活性化が認められることが、知られている。また、視神経の切片でも同様であることが、知られている。月齢５ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの神経繊維層や神経節細胞の結果は、ヒトの病理所見と、極めて類似していた。【００８２】
図４ｃは、ウェスタンブロット分析によるＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜におけるＧＦＡＰ発現を示している。各網膜は、２匹の野生型マウスと３匹のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとから夫々得られたもので、網膜の蛋白質粗抽出物と適切な抗体によりウェスタンブロット分析を行ったものである。図４ｃより明らかなように、グリア細胞の活性化マーカーであるＧＦＡＰ発現は、月齢６ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスから得られた網膜の蛋白質粗抽出物で顕著に検出されたが、野生型マウスでごく微量しか検出されなかった。ウェスタンブロットの結果は、図４ｃに示すとおり、免疫組織化学染色の実験結果を支持している。最近の報告によれば、免疫組織化学染色によりＧＦＡＰで染色された正常なヒトのパラフィン固定網膜は、わずかな星状膠細胞がかすかに染色されていたにすぎない。それとは対照的に、ヒトの正常眼圧緑内障より得られたパラフィン固定網膜での免疫組織化学的結果は、緑内障網膜中で、ＧＦＡＰ陽性の星状膠細胞のみが増加していることを示している。さらに、この免疫組織化学染色の結果は、内顆粒層でＧＦＡＰの免疫反応が起こっていないことを示している。つまり、ミュラー細胞は、ヒトの緑内障網膜組織およびＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜組織中で、ＧＦＡＰ陽性(活性化)ではない。このように、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜のおけるＧＦＡＰの陽性細胞つまり活性化された星状膠細胞の局在性は、ヒトの緑内障の網膜組織において認められるＧＦＡＰの陽性細胞の局在化に、極めて類似している。【００８３】
（ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス中でＮＭＤＡ誘導神経毒性の感受性の結果）
ＮＭＤＡ受容体介在の神経刺激毒性は、緑内障の神経障害に関わっていることが報告されている。神経細胞はＮＭＤＡ受容体を介したカリウム流出に応答してアポトーシスに至るということが知られている。そこで、ＮＭＤＡ誘導神経毒性でのＮＦ−κＢｐ５０の影響について検討した。ＮＭＤＡは、１００ｍｍｏｌという高濃度で速やかに細胞死が起こるという神経細胞毒性を有している。ＮＭＤＡ誘導神経毒性を示すのに低濃度である１０ｍｍｏｌのＮＭＤＡを硝子体腔内注射してから２４時間後に、網膜の組織検査を行なった結果を図５に示す。【００８４】
図５は、ＮＭＤＡ処理後のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス(月齢２ヶ月)での神経節細胞層中の生存細胞の減少数を示すものである。生存細胞は、視神経乳頭の端から各々０．３ｍｍで０．３５ｍｍの距離の所で計測したものである。棒グラフは、処理前とＮＭＤＡ処理してから２４時間後のＧＣＬ中の細胞の数を示している。視野ごとの細胞の平均の数を求め、有意差検定をスチューデントのｔ検定によって解析した。データは、平均±平均標準誤差（マウスのｎ数は、６〜７）である。＊１ｐ＜０．０１は野生型マウスに対するもので、＊２ｐ＜０．０１は野生型マウスに対するものである。【００８５】
図５から明らかなように、同月齢の野生型マウスよりもＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスで網膜神経節細胞が一層減少していたが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとでは、内網状層の厚さの相違がなかった。ＮＭＤＡ処理してから２４時間後、野生型マウスよりもＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの神経節細胞層や硝子体腔で、浸潤細胞が増加していることが観察された。しかし、ＮＭＤＡ処理してから４日後、網膜にも視神経にも浸潤細胞が検出されなかった。免疫組織化学染色により、網膜のほとんどの浸潤細胞は、ＣＤ１１ｂ陽性マクロファージとＧｒ-１陽性好中球とであった。ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでは、１０ｍｍｏｌのＮＭＤＡで処理してから、２４時間で神経節細胞層中でアポトーシスを誘発していたが、野生型マウスでは有意な変化が認められなかった。【００８６】
ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜神経節細胞が、慢性的な生理機序により生じるアポトーシスにより死滅するため、網膜に存在するグリア細胞（具体的には星状膠細胞）がそのアポトーシスにより死滅した網膜神経節細胞を貪食して処理する食細胞として活性化しているようである。また、マクロファージと好中球は、おそらく内網状層や神経節細胞層に侵入し、ＮＭＤＡ処理で急性的にアポトーシスを誘発された死細胞を貪食しているようである。ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとへのＮＭＤＡ処理によりＮＦ−κＢが活性化していることを確かめるために、抗ＮＦ−κＢｐ６５抗体で免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色の結果から、野生型マウスでのＮＦ−κＢｐ５０と同様に、ＮＦ−κＢｐ６５は神経節細胞層中の核へ著しく移行していることが認められた。このようにＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜神経節細胞中でのＮＦ−κＢ活性化に対しＮＭＤＡが影響することが分かった。【００８７】
次に、ＮＦ−κＢｐ６５の発現や活性強度と、正常眼圧緑内障の症状との関連性を確かめるために、下記検討を行った。【００８８】
（野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとへの異なる濃度でのＮＭＤＡ誘起神経細胞毒性）
５０ｍＭ、及び５ｍＭのＮＭＤＡを、夫々硝子体内に各々直接投与し、生存する視神経節細胞を計測した。なお、コントロールとしてＮＭＤＡ未投与の場合に、生存する視神経節細胞も計測した。その結果を、纏めて図６に示す。図６から明らかな通り、比較的高濃度の５０ｍＭのＮＭＤＡを投与した場合、野生型マウス及びＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとも、ＮＭＤＡ投与後、２４時間以内に約半数、９６時間（４日間）以内にほぼ全ての視神経節細胞が、アポトーシスによって死滅していた。一方、比較的低濃度の５ｍＭのＮＭＤＡを投与した場合、野生型マウスでは、ＮＭＤＡ投与後４日以降になってもほぼ全ての視神経節細胞が生存しているのに対し、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでは、２４時間以内に約６０％、９６時間以内にほぼ全ての視神経節細胞が、アポトーシスによって死滅していた。このことから、視神経節細胞におけるＮＦ−κＢｐ５０の発現低下は、ＮＭＤＡ誘導性アポトーシスへの感受性を著しく高めるということが、示された。【００８９】
この結果を利用して、被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価し、有効な正常眼圧緑内障治療薬を峻別するというスクリーニングに用いた例を、以下に示す。【００９０】
（被験物質のスクリーニング：７日間投与コントロール群）
コントロールである燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとに夫々、１日１回ずつ連続して７日間、腹空内投与後、５ｍＭのＮＭＤＡを硝子体内に直接投与して２４時間後の視神経節細胞の数を計測した。その結果を、図７ａに示す。図７ａから明らかな通り、野生型マウスでは、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約６％しかアポトーシスによって死滅しなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでは、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約６０％がアポトーシスによって死滅した。【００９１】
（被験物質:メマンチンのスクリーニング）
アルツハイマー型痴呆治療薬として用いられるもので、グルタミン酸受容体の一つであるＮＭＤＡ受容体の拮抗剤であるメマンチン（塩酸塩；１０ｍｇ／ｋｇ）を、野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとに夫々、１日１回ずつ連続して７日間、腹空内投与後、５ｍＭのＮＭＤＡを硝子体内に直接投与して２４時間後の視神経節細胞の数を計測した。その結果を、図７ｂに示す。図７ｂから明らかな通り、野生型マウスでは、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約３％しかアポトーシスによって死滅しなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでも、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約１５％しかアポトーシスによって死滅しなかった。【００９２】
（被験物質:ロメリジンのスクリーニング）
偏頭痛治療薬として用いられるもので、ピペラジン系カルシウム拮抗剤であるロメリジン（塩酸塩；１００ｍｇ／ｋｇ）を、野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとに夫々、１日１回ずつ連続して７日間、ゾンデで経口投与後、５ｍＭのＮＭＤＡを硝子体内に直接投与して２４時間後の視神経節細胞の数を計測した。その結果を、図７ｃに示す。図７ｃから明らかな通り、野生型マウスでは、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約２％しかアポトーシスによって死滅しなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでも、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約２８％しかアポトーシスによって死滅しなかった。【００９３】
（被験物質:ＭＫ−８０１のスクリーニング）
ＮＭＤＡ受容体拮抗剤であるＭＫ−８０１（(5S,10R)-(-)-5-メチル-10,11-シ゛ヒト゛ロ-5H-シ゛ヘ゛ンソ゛-[a,d]-シクロ-ヘ゜フ゜タン-5,10-イミン
ハイト゛ロケ゛ン マレート））（１０ｍｇ／ｋｇ）を、野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとに夫々、１日１回ずつ連続して７日間、腹空内投与後、５ｍＭのＮＭＤＡを硝子体内に直接投与して２４時間後の視神経節細胞の数を計測した。その結果を、図７ｄに示す。図７ｄから明らかな通り、野生型マウスでは、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約２％しかアポトーシスによって死滅しなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでも、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約９％しかアポトーシスによって死滅しなかった。【００９４】
以上の結果から、これら被験物質、特に塩酸メマンチン及びＭＫ−８０１は、視神経節細胞をＮＭＤＡ誘導性アポトーシスから保護する作用を有していることが明らかとなった。【００９５】
ところで、神経細胞は、ＮＭＤＡ−受容体を介したカリウム流出に応答してアポトーシスに至ることが、知られている。ＮＭＤＡ誘導性アポトーシスは、カルシウムの神経細胞への流入により脱リン酸化酵素カルシニューリンを活性化させる。つまり、カルシニューリンの活性化が、神経細胞をアポトーシスへと誘導すると、考えられている。脳硬塞により虚血状態に陥った神経細胞では、一過性にカルシニューリンの活性化が著しく高まり、これにより神経細胞がアポトーシスに至ると、考えられている。カルシニューリンの阻害剤であるＦＫ５０６（プログラフ）は、サイトカイン産生を抑制する免疫抑制剤として作用するもので、脳硬塞での損傷から神経細胞を保護することが、明らかにされている。そこで、ＦＫ５０６の視神経節細胞をＮＭＤＡ誘導性アポトーシスから保護する効果について、検討した。【００９６】
（被験物質:ＦＫ５０６のスクリーニング）
コントロール群は、前記のＰＢＳの７日間投与コントロール群に代えて２週間投与したこと以外は前記と同様にしたものである。この２週間投与コントロール群は、図７ｅの通りである。一方、ＦＫ５０６（３ｍｇ／ｋｇ）を、野生型マウスとＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスとに夫々、１日１回ずつ連続して２週間、腹空内投与後、５ｍＭのＮＭＤＡを硝子体内に直接投与して２４時間後の視神経節細胞の数を計測した。その結果を、図７fに示す。図７fから明らかな通り、野生型マウスでは、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約５％しかアポトーシスによって死滅しなかったが、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでも、ＮＭＤＡ投与処理後、２４時間以内に視神経節細胞の約３４％しかアポトーシスによって死滅しなかった。【００９７】
以上の結果から、ＦＫ５０６は、視神経節細胞をＮＭＤＡ誘導性アポトーシスから保護する作用を有していることが明らかとなった。【００９８】
（ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス中での網膜神経節細胞に対する自己抗体の産生の結果）
既に、網膜神経節細胞に対する自己抗体が、緑内障患者の神経障害の進行に、関与している可能性が報告されている。最近、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでの自己抗体が産生することも報告されている。ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス中で網膜神経節細胞に対する自己抗体が産生させているか否かを確かめるために、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスや野生型マウスから得た血清で免疫組織化学染色を行った。神経節細胞層は、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスから得た血清ではっきりと染色されたが、野生型マウスから得た血清では染色されなかった。さらに、高齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス中で自己免疫作用の可能性を確かめるために、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスと野生型マウスとから得た抗血清でウェスタンブロット分析を行った。同解析結果より、正常な網膜の蛋白質粗抽出物内に存在する蛋白質を直ちに認識する複種類の自己抗体が、月齢５ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスで産生されている可能性が示されたが、野生型マウスから検出されなかった。ウェスタンブロット分析の結果は、抗血清による免疫組織化学染色の実験結果を支持している。高齢のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウス中で自己抗体が産生されている可能性が示され、またこの自己免疫メカニズムが、網膜神経節細胞のアポトーシスに関与しているかもしれないことが示された。【００９９】
以上のことから、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスは、ヒトの中高年齢者に認められる網膜神経節細胞のアポトーシスによる死滅、視神経乳頭の顕著な陥没、網膜に存在する星状膠細胞の活性化、視神経細胞の萎縮や膨潤、自己抗体の産生、月齢に関連なく一定した眼圧のような正常眼圧緑内障の臨床所見と、類似する点が多いから、正常眼圧緑内障を自発的に発症する動物モデルであることが、確かめられた。【０１００】
次に、このＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの正常眼圧緑内障モデルを用いて、ヒトの正常眼圧緑内障に有効な薬剤の探索を行う別な正常眼圧緑内障治療効果評価方法について、検討することにした。【０１０１】
正常眼圧緑内障患者の大多数が前兆症状性偏頭痛を患っているという臨床所見から、正常眼圧緑内障と前兆症状性偏頭痛、両疾患において共通のリスクファクターが存在している可能性が示されている。従って、正常眼圧緑内障の治療に、偏頭痛治療用のＣａ拮抗剤が有効である可能性がある。前兆症状性偏頭痛のリスクファクターの解析により同疾患の染色体上の感受性ローカスが、４番染色体２４（４ｑ２４）であることが知られている。驚くべきことに、ＮＦ−κＢｐ５０（ＭＩＮ：１６４０１１）の遺伝子は、４番染色体２４（４ｑ２４）にコードされている。つまり、ＮＦ−κＢｐ５０の非活性が、正常眼圧緑内障のリスクファクターの一つである可能性が示されている。ＮＭＤＡ等の刺激により誘導されるＣａシグナルカスケードには、ＮＦ−κＢの活性化が関与している。したがって、Ｃａ拮抗剤はＮＦ−κＢの活性化を抑制する。そのため、ジヒドロピリジン誘導体やベンゾジアゼピン誘導体やパパベリン誘導体のようなＣａ拮抗剤が正常眼圧緑内障の治療薬となる可能性がある。本発明の評価方法によれば、ヒトの緑内障の組織を用いてｐ５０の発現を、検討することが可能であり、現在検討を行っている。【０１０２】
以上、詳細に説明したように、ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスでは、月齢４ヶ月以降になると視神経節細胞のアポトーシスが認められ、月齢５ヶ月以降で顕著な視神経節細胞数の減少が認められる。さらに、月齢５ヶ月では認められなかった視神経繊維層の萎縮が、月齢７ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜で認められた。そして、月齢１０ヶ月のＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜において、著しい視神経乳頭陥没が認められた。ＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜の視神経節細胞のアポトーシスによる死滅が、最初に認められ、後に視神経繊維層の萎縮や視神経乳頭陥没が徐々に生じてくることを確認した。【０１０３】
ヒトの正常眼圧緑内障の年齢別有病率は、年齢３０〜４９歳（０．９３％）、年齢５０〜６９歳（１．８６％）、年齢７０歳以上（４．８９％）であり、正常眼圧緑内障は中高年齢層から徐々に発症が認められる。このようなＮＦ−κＢｐ５０欠損マウスの網膜異常症状の罹患率は、ヒトの正常眼圧緑内障の年齢別有病率に極めて類似している。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の正常眼圧緑内障モデルは、ヒトの正常眼圧緑内障に関与しているＮＦ−κＢｐ５０が欠損した非ヒト哺乳動物やその細胞を用いたものであるから、このモデルを用いた正常眼圧緑内障治療効果評価方法は、同じく哺乳類であるヒトの正常眼圧緑内障の発症メカニズムの解明、病因の特定、治療薬や予防薬の探索、治療法や予防法の開発等の実験に、用いることができる。【０１０５】
本発明の正常眼圧緑内障治療剤は、病因の不明な正常眼圧緑内障を治療するのに有用である。さらに本発明の正常眼圧緑内障の診断方法や正常眼圧緑内障のリスクの予測方法により、正常眼圧緑内障の早期発見・早期治療の資することができ、また併せてこの正常眼圧緑内障治療剤により、治癒が可能である。
【図１】
2009008511.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月21日(2010.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物と、該非ヒト哺乳動物に由来する眼の器官若しくは組織と、その器官若しくは組織から採取した細胞との何れかであることを特徴とする正常眼圧緑内障モデル。
【請求項２】
該非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１に記載の正常眼圧緑内障モデル。
【請求項３】
転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物と、該非ヒト哺乳動物に由来する眼の器官若しくは組織と、その器官若しくは組織から採取した細胞との何れかへ、被検物質を投与又は添加し、該器官、該組織、及び／又は該細胞について、形態異常、細胞数、軸索数、圧力、蛋白質の発現量若しくは活性強度、核酸の発現量、及び／又は抗体の活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価する方法。
【請求項４】
該非ヒト哺乳動物を該被験物質の該投与の条件下及び非投与の条件下で夫々飼育し、又は該細胞を該被験物質の該添加の条件下及び非添加の条件下で夫々培養する第１工程、
該指標を観察、測量、又は検出することにより該測定をする第２工程、
該投与の条件下と該非投与の条件下との各々の該指標を比較し、又は該添加の条件下と該非添加の条件下との各々の該指標を比較することにより、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項６】
該器官又は該組織が、眼球、網膜、視神経、網膜神経節細胞、網膜神経節層、網膜神経繊維層、網膜顆粒層、網膜網状層、視神経軸索、又は視神経乳頭であることを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項７】
該被験物質とは別に、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）又はその塩を、投与又は添加することを特徴とする請求項４に記載の評価方法。
【請求項８】
該被験物質が、ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤、カルシウム拮抗剤、及びカルシニューリン阻害剤の少なくとも何れかの薬物であることを特徴とする請求項３に記載の評価方法。
【請求項９】
非ヒト哺乳動物の個体と、該非ヒト哺乳動物若しくはヒトに由来する眼の器官若しくは組織と、該器官若しくは該組織から採取した細胞との何れかに、被検物質を投与又は添加し、それらの該器官、該組織、又は該細胞内での転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価する方法。
【請求項１０】
該細胞を該被験物質の該添加の条件下及び非添加の条件下、培養液中で夫々培養する第１工程、
該細胞内又は該培養液中で、該転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度である該指標を該測定する第２工程、
該添加の条件下と該非添加の条件下との各々の該指標を比較して、該添加の条件下での該発現量の増加又は該活性強度の増強により、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする請求項９に記載の評価方法。
【請求項１１】
該細胞が、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の欠損により月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する該非ヒト哺乳動物に由来して、若しくは緑内障患者である該ヒトに由来して、単離されたものであり、又はその細胞株であることを特徴とする請求項１０に記載の評価方法。
【請求項１２】
該非ヒト哺乳動物を該被験物質の該投与の条件下及び非投与の条件下で夫々飼育する第１工程、
該非ヒト哺乳動物の血液中又は細胞内での該転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度である該指標を該測定する第２工程、
該投与の条件下と該非投与の条件下との各々の該指標を比較して、該投与の条件下での該発現量の増加又は該活性強度の増強により、該被験物質を該評価して峻別する第３工程
を有することを特徴とする請求項９に記載の評価方法。
【請求項１３】
該非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１１に記載の評価方法。
【請求項１４】
ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤、カルシウム拮抗剤、及びカルシニューリン阻害剤の少なくとも何れかの薬物であることを特徴とする正常眼圧緑内障治療剤。
【請求項１５】
該薬物が、該ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤と、ピペラジン系カルシウム拮抗剤からなる該カルシウム拮抗剤と、該カルシニューリン阻害剤との何れかであることを特徴とする請求項１４に記載の正常眼圧緑内障治療剤。
【請求項１６】
該ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤がメマンチン塩酸塩と(5S,10R)-(-)-5-メチル-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ-[a,d]-シクロ-ヘプタン-5,10-イミン  ハイドロゲン  マレートとの何れかであり、該ピペラジン系カルシウム拮抗剤がロメリジン塩酸塩であり、該カルシニューリン阻害剤がプログラフ（登録商標）であることを特徴とする請求項１５に記載の正常眼圧緑内障治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の正常眼圧緑内障モデルは、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物と、該非ヒト哺乳動物に由来する眼の器官若しくは組織と、その器官若しくは組織から採取した細胞との何れかであることを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
請求項３に記載の評価方法は、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０が欠損しそれにより月齢に応じて正常眼圧緑内障症状を自発的に発現する非ヒト哺乳動物と、該非ヒト哺乳動物に由来する眼の器官若しくは組織と、その器官若しくは組織から採取した細胞との何れかへ、被検物質を投与又は添加し、該器官、該組織、及び／又は該細胞について、形態異常、細胞数、軸索数、圧力、蛋白質の発現量若しくは活性強度、核酸の発現量、及び／又は抗体の活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価するというものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
請求項６に記載の評価方法は、請求項３に記載されたもので、該器官又は該組織が、眼球、網膜、視神経、網膜神経節細胞、網膜神経節層、網膜神経繊維層、網膜顆粒層、網膜網状層、視神経軸索、又は視神経乳頭であることを特徴とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
請求項８に記載の評価方法は、請求項３に記載されたもので、該被験物質が、ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤、カルシウム拮抗剤、及びカルシニューリン阻害剤の少なくとも何れかの薬物であることを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
請求項９に記載の評価方法は、非ヒト哺乳動物の個体と、該非ヒト哺乳動物若しくはヒトに由来する眼の器官若しくは組織と、該器官若しくは該組織から採取した細胞との何れかに、被検物質を投与又は添加し、それらの該器官、該組織、又は該細胞内での転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性強度を指標として測定をして、該被験物質の正常眼圧緑内障治療効果を評価するというものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
請求項１４に記載の正常眼圧緑内障治療剤は、ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤、カルシウム拮抗剤、及びカルシニューリン阻害剤の少なくとも何れかの薬物であることを特徴とする。転写調節因子ＮＦ−κＢの転写誘導活性を抑制することは、正常眼圧緑内障の治療法となる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
請求項１５に記載の正常眼圧緑内障治療剤は、請求項１４に記載されたもので、該薬物が、該ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤と、ピペラジン系カルシウム拮抗剤からなる該カルシウム拮抗剤と、該カルシニューリン阻害剤との何れかであることを特徴とする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
請求項１６に記載の正常眼圧緑内障治療剤は、請求項１５に記載されたもので、該ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤がメマンチン塩酸塩と(5S,10R)-(-)-5-メチル-10,11-ジヒドロ-5H-ジベンゾ-[a,d]-シクロ-ヘプタン-5,10-イミン  ハイドロゲン  マレートとの何れかであり、該ピペラジン系カルシウム拮抗剤がロメリジン塩酸塩であり、該カルシニューリン阻害剤がプログラフ（登録商標）であることを特徴とする。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
別な正常眼圧緑内障治療剤は、ＩκＢ分解阻害剤やＮＦ−κＢデコイオリゴ核酸であってもよく、ＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子を導入する遺伝子導入剤であってもよく、転写調節因子ＮＦ−κＢｐ５０の発現の促進剤であってもよい。このような遺伝子導入剤は、ＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子を導入するので、正常眼圧緑内障の治療法に用いられる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
正常眼圧緑内障の診断方法は、被験者から採取した器官、組織、それらから採取した細胞、及び採血した血液の何れかに含まれているＮＦ−κＢｐ５０の発現量又は活性を測定することを特徴とする。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
正常眼圧緑内障のリスクの予測方法は、被験者から採取した器官、組織、それらから採取した細胞、及び採血した血液の何れかに含まれているＮＦ−κＢｐ５０をコードする遺伝子配列の存在を測定することを特徴とする。
【国際調査報告】
2009008511.tif 000009
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2009008511.tif 000011
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