【手続補正書】
【提出日】平成15年7月31日(2003.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドと熱ショック蛋白との複合物及びその応用
【特許請求の範囲】
【請求項１】Ｂ型肝炎ウイルス抗原と熱ショック蛋白gp96あるいはhsp78との複合物。
【請求項２】上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原におけるアミノ酸の配列が、YVNTNMG（配列番号１）、YVNVNMG（配列番号８）、YVNTNMGLK（配列番号２）、STLPETTVVRR（配列番号３）、FLPSDFFPSV（配列番号４）、IPIPSSWAF（配列番号５）、WLSLLVPFV（配列番号６）、FLLSLGIHL（配列番号７）及び／または、それらの変異配列であることを特徴とする請求項１記載の複合物。
【請求項３】前記熱ショック蛋白が、非共有結合でＢ型肝炎ウイルス抗原と結合し、あるいは共有結合でＢ型肝炎ウイルス抗原と結合することにより、融合蛋白を形成することを特徴とする請求項１記載の複合物。
【請求項４】濃度0.1−0.15μｍol／Lのgp96蛋白と濃度2.5−3.5μｍol／LのＢ型肝炎ウイルス抗原を5−10％(V／V)グリセリンが含まれた濃度100mmol／Ｌ未満の低塩緩衝液の中で温度30〜39℃で10−30分間反応させることを含むことを特徴とする請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス抗原と熱ショック蛋白gp96あるいはhsp78との複合物を製造する方法。
【請求項５】反応温度が37℃で、反応時間が15分間であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】gp96蛋白またはhsp78の濃度がいずれも0.12μｍol／Lであり、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の濃度が3.0μｍol／Lであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】Ｂ型肝炎ウイルス抗原の熱ショック蛋白gp96あるいはhsp78との複合物が、Ｂ型肝炎の治療及び肝炎続発性肝癌の治療性ワクチン製造に応用されることを特徴とする請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス抗原と熱ショック蛋白gp96あるいはhsp78との複合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドと熱ショック蛋白gp96およびhsp78との複合物及びその応用に関する。
【０００２】
（技術背景）
熱ショック蛋白（hsp）gp96（glycoprotein 96）はgrp94（glucose-regulated protein 94）とも言い、細胞小胞体におけるhsp90ファミリーの１つであり、分子量は、約96KDaで、細胞蛋白の折り畳みと運搬過程において、重要な作用を発揮する。最近の研究によると、これはまたある癌細胞表面に存在していることが発見されている。gp96分子は２つの共通部分を含み、C末端はポリペプチドの結合部位であって5-25個アミノ酸のポリペプチド配列と結合でき、N末端はATPと結合でき、ATP酵素活性を持っている。熱ショック蛋白hsp78は、細胞質中のhsp70ファミリーの１つで、分子量は約78kDaであり、細胞蛋白の折り畳みと運搬過程において重要な作用を発揮している。hsp78分子は、ペアの分子として細胞中の各々の短いペプチドと結合できて２つの機能部位を有し、N末端にはATP酵素活性があり、C末端はポリペプチド基質と結合する。
【０００３】
近年以来の研究により、腫瘍組織あるいはウイルス感染細胞から分離精製されたgp96とhsp78分子により動物を免疫した後、検体は、その腫瘍あるいはウイルスに対して、特異的拒絶反応を起こすことが見出され、更に研究した結果から、gp96とhsp78は、細胞内に形成された全てのペプチド基と結合することが示された。その中には抗原ポリペプチドも含まれる。この特異的免疫反応は、熱ショック蛋白それ自体の代わりにgp96分子とhsp78分子とが結合したポリペプチドによって決定され、腫瘍あるいはウイルス感染細胞由来のgp96分子及びhsp78分子が一般に腫瘍あるいはウイルス特異性ポリペプチドと結合する。gp96分子とhsp78分子は、結合した抗原ペプチドを主な組織適合抗原（MHC）分子に伝達することによって、細胞毒性Ｔ細胞（CTL）を活性化させて検体の細胞免疫反応を引き起こす。gp96とhsp78は、細胞抗原の伝達過程において、重要な作用を発揮するので、gp96-ポリペプチド複合物とhsp78-ポリペプチド複合物は、自体が腫瘍とある伝染疾病の予防または治療に用いられる。
【０００４】
アメリカニューヨーク大学のPramod K. Srivastavaは自己の研究よりそれぞれ6項のアメリカ特許（特許NO.6017544、6017540、6007821、5837251、5830464）を出願した。これらの特許における主な内容は、熱ショック蛋白（hsp）と非共有結合抗原分子によって形成された複合物を利用して原発性および転移された伝染疾病を治療し、検体を刺激して、免疫反応を生じさせるものであり、その中には、抗原分子が体内のhspと結合したポリぺプチドが含まれ、体外でhspと複合物を形成する複合物の体外抗原あるいは免疫原性フラグメントも含まれる。Hspは主にhsp70、hsp90とgp96蛋白を含む。
【０００５】
現在、gp96とhsp70分子は、水疱性口内炎ウイルス抗原部位ペプチド、鼠H-2Kb制限卵アルブミン蛋白抗原エピトープペプチドとLd制限白血病CTLエピトープペプチドなどの抗原ポリペプチドと結合することが実証された。ところが今まで、ウイルス感染の患者の組織からの分離検定により、hspと結合した抗原ポリペプチドは見つけられていない。
【０００６】
全世界では、3.5億の人がＢ型肝炎ウイルス（HBV）に感染し、中国では、約1.2億が感染し、HBVは慢性肝炎、肝硬変と肝癌を引き起こす第一原因となるため、これは中国国民の生命健康を損なう重大な伝染病である。Ｂ型肝炎から続発する肝癌の確率もかなり高く、Ｂ型肝炎ウイルス核抗原（HBcAg）の肝癌内と肝癌周囲組織における陽性率はそれぞれ62.5％と29.2％である。CTLより引き起こされた細胞免疫反応は検体のウイルス除去とＢ型肝炎治療の主な経路であり、Ｂ型肝炎に感染した患者の体内HBV抗原ポリペプチドは、肝細胞において加工されてから、I類MHC分子に伝達され、特異的CTLを活性化させ、細胞免疫反応を引き起こす。現在、すでにヒトのある程度のHBV核蛋白におけるCTLエピトープを検定し、これにはHLA-A2制限のHBcAg18-27、HLA-A11制限のHBcAg88-96などが含まれる。したがって、Ｂ型肝炎とＢ型肝炎続発性肝癌の予防と治療の新しい型の薬物の研究では、特に、主動的に検体を刺激し、CTL免疫反応を引き起こす薬物は、非常に重要な意味がある。
【０００７】
（発明の公開）
本発明の一つの目的として、gp96およびhsp78と結合するＢ型肝炎ウイルス抗原の複合物を提供する。Ｂ型肝炎ウイルス抗原とは、それぞれ、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第88から94までのアミノ酸配列であって、その配列は、YVNTNMG（配列番号１）あるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第88から96までのアミノ酸配列であって、その配列は、YVNTNMGLK（配列番号２）あるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第141から151までのアミノ酸配列であって、その配列は、STLPETTVVRR（配列番号３）あるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第18から27までのアミノ酸配列であって、その配列は、FLPSDFFPSV（配列番号４）あるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス表面蛋白における第313から321までのアミノ酸配列であって、その配列は、IPIPSSWAF（配列番号５）あるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス表面蛋白における第355から363までのアミノ酸配列であって、その配列は、WLSLLVPFV（配列番号６）あるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルスポリメラーゼにおける第575から583までのアミノ酸配列であって、その配列は、FLLSLGIHL（配列番号７）あるいはその変異配列である。
【０００８】
上記変異配列とは、上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原が、１個或いはあるいは多数個のアミノ酸の入れ替わり、欠損、増加、あるいは側鎖の修飾により得られ、同時に、上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原の配列を持っていることを指す。
【０００９】
本発明の複合物は、熱ショック蛋白が非共有結合でポリペプチドと結合されたものも含み、共有結合でポリペプチドと結合されたものも含む。
【００１０】
本発明のまた１つの目的は、上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドと熱ショック蛋白gp96とhsp78との複合物を製造する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた１つの目的は、本発明におけるこれらの複合物のＢ型肝炎及びＢ型肝炎続発性肝癌の治療と薬物の製造への応用を提供することである。
【００１２】
本実験室では、初めて、6例のHBV感染者の肝癌組織において、熱ショック蛋白gp96と結合したポリペプチドより、特異7ペプチドを分離して、アミノ酸配列分析により「YVNTNMG（配列番号１）、あるいはYVNVNMG（配列番号８）」であること、調査によりこの配列が、HBV核蛋白88-94位（HBcAg88-94）に位置することを発見した。この配列は、人工合成されて体外で発現されたgp96蛋白と組立てられ、体外でgp96-7ペプチド複合物を合成し、7ペプチドとgp96-7ペプチド複合物でマウスを免疫することによりマウスを刺激して特異的細胞毒性Ｔ細胞（CTL）を産生できる。gp96-7ペプチド複合物の免疫原性は、単独のペプチドを使用するより200倍以上高い。実験結果より、gp96-7ペプチド複合物は、一種のＢ型肝炎及びその続発性肝癌の新規な治療性薬物として開発できることが分かる。
【００１３】
人工合成された7ペプチド「YVNTNMG（配列番号１）あるいはYVNVNMG（配列番号８）」とN端に蛍光物質で標識された7ペプチドを使用して、体外でgp96蛋白と蛍光物質標識の7ペプチドとの結合の反応系を構築した。反応公式により、
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である。
【００１４】
このうち、Gはgp96蛋白、Pは7ペプチド、GPはgp96蛋白-7ペプチド複合物を表し、k1、k2は反応正方向の速度常数である。その結合反応の平衡常数kは、次の関係式より得られる。
【００１５】
ｋ＝ｋ1／ｋ2＝[GP]／[G][P]
[GP]、[G]と[P]はそれぞれ反応生成物GPと基質G、Pの濃度を表す。結合反応系における最適温度、塩濃度、pH値、添加剤と触媒、gp96蛋白と7ペプチドの最適反応濃度比等の因子を確定して、反応常数を測定し、最適反応系を構成する。
【００１６】
最適反応条件のもとに体外でgp96蛋白-7ペプチド複合物を合成する。
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス抗原である7ペプチドと熱ショック蛋白gp96との複合物の製造方法、即ち濃度0.1−0.15μmol/Lのgp96蛋白と濃度2.5−3.5μmol/LのＢ型肝炎ウイルス抗原を5−10％(v／v)グリセリン含有の濃度100mmol/L以下の低塩緩衝液中で、温度30−39℃で、10−30分間反応させることを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法において、最適反応温度は37℃で、最適反応時間は15分である。
本発明の方法において、gp96蛋白の最適濃度は0.12μmol/L、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の最適濃度は3.0μmol/Lである。
【００１８】
本発明は、またそのＢ型肝炎ウイルス抗原である7ペプチドと熱ショック蛋白gp96との共有結合で形成した融合蛋白を提供した。人工合成はそのペプチドの核酸配列に対応し、分子生物学で常用される方法により行ない、その配列をgp96遺伝子5'端と連結して、大腸菌中で融合発現させる。例えば、制限酵素切断部位BglIIを導入し、その7ペプチドの核酸配列をリガーゼT4によりgp96遺伝子5'端と連結させ、連結生成物の5'と3'端に２つの制限酵素切断部位BamHIとSacIを導入し、発現担体pET30a中に連結させて、大腸菌において発現させる。発現生成物は、gp96と7ペプチドとの融合蛋白である。
【００１９】
本発明におけるgp96蛋白-7ペプチド複合物は、上記gp96が非共有結合で7ペプチドと体外で結合して形成された複合物と、上記gp96が共有結合で7ペプチドと体外で結合して形成された融合蛋白を含み、いずれの公知の免疫方式を使用しても免疫を行うことができ、例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等がある。gp96蛋白-7ペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、0.01nmol、0.05nmol、0.10nmol、または0.50nmol等でもよい。7ペプチドが単独で免疫に用いられる場合、その免疫剤量は、0.2nmol、2nmol、20nmolでもよい。
【００２０】
gp96蛋白-7ペプチド複合物と7ペプチドを免疫に用いる場合は、アジュバントは使用しなくてもよく、あるいは、いずれの公知のアジュバンドを使ってもよい。例えば、FREUNDアジュバンド、クロムミョウバン(chromium alum)等がある。
【００２１】
本実験室では、また9ペプチド「YVNTNMGLK（配列番号２）」を人工合成して、上記の最適反応系により、体外でgp96蛋白-9ペプチド複合物を合成した。いずれの公知の免疫方式によっても免疫を行うことができ、例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等があり、gp96蛋白-9ペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、0.01nmol、0.05nmol、0.10nmol、または0.50nmol等でもよい。9ペプチドが単独で用いられる場合の免疫剤量は、0.2nmol、2nmol、20nmolである。免疫時にアジュバントを使用しなくてもよく、あるいはいずれかの公知アジュバント、例えばFREUNDアジュバント、クロムミョウバン等を使用する。gp96-9ペプチド複合物と9ペプチドをマウス免疫に用いると、いずれもマウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞(CTL)を生じさせる。gp96-9ペプチド複合物の免疫原性は、単独のペプチドを使用するより300倍以上高くなる。実験結果よりgp96-9ペプチド複合物は、新規なＢ型肝炎とＢ肝続発性肝癌の治療性薬物として開発できることが分かる。
【００２２】
本実験室において、また11ペプチド「STLPETTVVRR（配列番号３）」、10ペプチド「FLPSDFFPSV（配列番号４）」、9ペプチド「IPIPSSWAF（配列番号５）」、9ペプチド「WLSLLVPFV（配列番号６）」、9ペプチド「FLLSLGIHL（配列番号７）」等を人工合成した。上記最適反応系により、体外でgp96蛋白-ポリペプチド複合物を合成して、いずれかの一種の公知の免疫方式により、それぞれ免疫を行う。例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等であり、gp96蛋白-ポリペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、0.01nmol、0.05nmol、0.10nmol、または0.50nmol等である。ポリペプチドが単独で使用される場合は、免疫剤量は、0.2nmol、2nmol、20nmolである。免疫時、アジュバントを使わなくてもよく、あるいはいずれの公知のアジュバントを使ってもよい。例えば、FREUNDアジュバント、クロムミョウバン等がある。gp96-ポリペプチド複合物とポリペプチドをマウス免疫に用いると、いずれもマウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞(CTL)を生じさせる。gp96-ポリペプチド複合物免疫原性は、ペプチドを単独で使用するよりいずれも150倍以上高い。実験結果より、gp96-ポリペプチド複合物は、Ｂ型肝炎とＢ型肝炎続発性肝癌の新規な治療性薬物として開発できることが分かる。
【００２３】
本実験室において、また上記で合成された多種ポリペプチドには、「YVNTNMG（配列番号１）」、「YVNTNMGLK（配列番号２）」、「STLPETTVVRR（配列番号３）」、「FLPSDFFPSV（配列番号４）」、「IPIPSSWAF（配列番号５）」、「WLSLLVPFV（配列番号６）」、「FLLSLGIHL（配列番号７）」等が含まれる。上記の最適反応系により、hsp78蛋白-ポリペプチド複合物を体外で合成し、いずれの公知の免疫方式によっても免疫できる。例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等がある。hsp78蛋白-ポリペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、0.01nmol、0.05nmol、0.10nmol、または0.50nmol等である。7ペプチドが免疫に単独で使用される場合、免疫剤量は、0.2nmol、2nmol、20nmolでもよい。免疫の際、アジュバントを使わなくてもよく、あるいはいずれの公知アジュバントも使用できる。例えば、FREUNDアジュバント、クロムミョウバン等がある。hsp78-ポリペプチド複合物とポリペプチドをマウス免疫に用いると、マウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞(CTL)生じさせる。hsp78-ポリペプチド複合物の免疫原性は、ペプチドを単独で使用するよりいずれも150倍以上高い。hsp78-ポリペプチド複合物は、Ｂ型肝炎とＢ肝続発性肝癌の新規な治療性薬物として開発できることが分かる。
【００２４】
（発明を実施するための最良の形態）
実施例１  肝組織中からのgp96蛋白の精製
HBV感染腫瘍組織３部と未感染の正常組織１部をホモジネート(homogenate)してから遠心分離し、50％−70％の(NH4)2SO4により沈澱させて、沈澱溶解後、ConA  Sepharose(Pharmacia会社)でアフィニティクロマトグラフィーを行い、結合された蛋白を10％α-メチルグルコシドで溶離し、溶離液はPOROS 20QE柱(PE会社BioCAD液体クロマトグラフシステム)でアニオンクロマトグラフィーを行い、この３段階の精製により＞95％純度のgp96蛋白が得られた。gp96蛋白は、gp96／grp94モノクローナル抗体（NeoMarkers会社）によりウエスタン検定された。その純度は、SDS−PAGE、銀染色及び逆相HPLCにより検定された。
【００２５】
実施例２  gp96蛋白からの非共有結合のポリペプチドの放出
精製されたgp96蛋白をトリフルオロ酢酸(TFA)に加え、その最終的な濃度を0.2％(pH約2.0)までにしてから、グラドコル法(分子横断面10KDa、Pall Filtron会社)によりポリペプチドを分離し、MALDI-TOFマススぺクトロメータ(PE会社Voyager−DE系)によりポリペプチド混合物を分析した。ポリペプチド分子量は、ほとんど600-1100Daの間であった。
【００２６】
実施例３  逆相HPLCによるポリペプチド分析
ポリペプチド混合物を凍結乾燥した後、溶液A(0.065％TFA、２％アセトニトリル)に溶解させ、C18逆相カラム(Sephasil peptide C18、5nm粒度、4.6X250nm、Pharmacia会社)に入れて、0％から65％までの溶液B(0.05％TFA、100％アセトニトリル)で勾配溶離を行い、流速を１ml／minとして、214nm波長でセンサした。癌組織と正常組織のHPLC図を比較すると、３部の肝癌組織は、正常組織にはないペプチドのピークをともに有していることが分かった。
【００２７】
実施例４  ポリペプチドの微量配列測定と配列分析
上記の特異のペプチドピークを収集して、MALDI-TOFマススぺクトロメータ(PE会社Voyager−DE系)によりその純度を検定したが、分子量798Daの単一ピークしか見られなかった。そのペプチドに対して微量配列測定(ProciseTM491蛋白配列測定器、PE会社)したところ、そのアミノ酸配列は、「YVNTNMG（配列番号１）、あるいはYVNVNMG（配列番号８）」であり、３部の癌組織から得られた配列と一致している。その配列は、PubMedネットワーク蛋白データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)で調べたところHBV核心蛋白88-94の位置であることが分かった。
【００２８】
実施例５  gp96遺伝子クローン
宝生物工程(大連)有限公司のRNA抽出試薬キット(Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver．2．11)を用いて、42℃、2時間熱刺激された人間の血液0.5mLからイソチオシアン酸グアニジン法により、試薬キットの説明通り総RNAを抽出した。
【００２９】
逆転写-ポリメラーゼ鎖式反応(RT−PCR)でヒトgp96遺伝子をクローンし、宝生物(大連)有限公司のRT-PCR試薬キット(TaKaRa RNA LA PCR TM Kit AMV Ver.1.1)により試薬キットの説明通り行なった。用いたプライマーは、
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である。
【００３０】
PCR反応条件は次のようであり、94℃4分、94℃50秒，55℃50秒，72℃3分を全部で30サイクル、72℃5分間である。
【００３１】
PCR生成物は、約2.4Kdのフラグメントであり、フラグメント5’端と3’端には人為的に２つの酵素切断部位BamHIとSacIを導入し、増幅したフラグメントの配列を測定する。gp96遺伝子は2343bpを含み、塩基配列は、文献の記載(Maki, RG, et al, GeneBank, No：003299)と一致している。
【００３２】
実施例６  gp96遺伝子、gp96遺伝子とＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドヌクレオチドの接続フラグメントとの大腸菌における発現及び蛋白精製
増幅されたフラグメントは、BamHIとSacIの酵素により切断し、発現ベクターpET30a(＋)に連結させ、大腸菌BL21中で形質転換を行い、同時に、次のポリペプチドに対応する核酸配列を人工合成する。即ち、「YVNTNMG（配列番号１）」、「YVNTNMGLK（配列番号２）」、「STLPETTVVRR（配列番号３）」、「 FLPSDFFPSV（配列番号４）」、「IPIPSSWAF（配列番号５）」「WLSLLVPFV（配列番号６）」、「 FLLSLGIHL（配列番号７）」である。また上記核酸配列の両端に制限酵素切断部位BglIIを導入して、gp96遺伝子を含むpET30a(＋)に挿入する。
【００３３】
構成されたベクターは、1mMのIPTGにより4時間誘導した後、その生成物を発現させた。10％SDS−PAGEの電気泳動とクマシーブルー染色(Coomassie Brilliant Blue)により発現した生成物の分子量は約100Kdaであり、理論値と基本的に一致している。
【００３４】
gp96蛋白とgp96蛋白のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとの融合蛋白はNi-アフィニティクロマトグラフィーカラム(Pharmacia会社)によりアフィニティークロマトグラフィーを行い、POROS 2OQEカラム(PE会社BioCAD液体クロマトグラフシステム)によりアニオンクロマトグラフィーを行い、精製した。10％SDS−PAGEの電気泳動と銀染色により純度を鑑定し、95％以上の純度のgp96蛋白およびその融合蛋白が得られた。発現されたgp96蛋白生成物とgp96蛋白のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとの融合蛋白は、gp96／grp94モノクローナル抗体(NeoMarkers会社)でウエスタン検定した。
【００３５】
実施例７  gp96蛋白と人工合成のポリペプチドの体外における組立て条件試験  N端にフルオレセイン標識を持っている7ペプチド「YVNTNMG、あるいはYVNVNMG」(寶百盛生物工程公司に委託)を人工合成した。gp96蛋白とポリペプチドを体外で組立て、以下の一連の試験によって、最適反応条件を確立した。
【００３６】
反応系における温度試験：55℃、39℃、37℃、30℃、あるいは28℃
反応系における塩濃度試験：低塩緩衝液(20mmol/L HEPES、pH7.9、20,100あるいは500mmol／L NaCl、2mmol／L MgCl2)、高塩緩衝液(20mmol/L HEPES、pH7.9、0.5,1.0あるいは2.2mol／L NaCl、2mmol／L MgCl2)
反応系におけるpH値試験：pH6.0、7.0、7.9あるいは9.0
反応系における添加剤と触媒：10mmol／L ADP、10mmol／L ATPと10％(V／V )グリセリン
gp96蛋白と7ペプチドの最適反応濃度およびその濃度比率：反応系における7ペプチド濃度はそれぞれ0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μmol／Lであり、反応系におけるgp96蛋白濃度はそれぞれ0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21μmol／Lである。反応常数kを測定した。gp96蛋白の含有量は次の公式、c＝1.45A280-0.74A260、により計算できる。cは蛋白濃度であり、A280とA260はそれぞれ280nmと260nmの光の吸収値である。フルオレセイン標識した7ペプチドの含有量は、378nmにおける吸収値で計算した。結合反応後グラドコル法(分子横断面10KDa，Pall Filtron会社)により未結合の7ペプチドを除去し、gp96蛋白-7ペプチド複合物の含有量を、378nmにおける吸収値で計算した。
【００３７】
実施例８  gp96蛋白と人工合成したポリペプチドとの体外組立て最適反応系の構成
多成分差異分析により反応条件を最適化し、最適反応条件を確定した。
【００３８】
7ペプチド「YVNTNMG（配列番号１）、あるいはYVNVNMG（配列番号２）」(寶百盛生物工程公司に委託)を人工合成して形成された最適な体外結合反応条件系：20mmol/L HEPES、pH7.9、20mmol/L NaC1、2mmol/L MgCl2、10%(V/V)グリセリン、3.0μmol/L 7ペプチド、0.12μmol/L gp96蛋白、37℃反応15分間、グラドコル法(分子横断面10KDa，Pall Filtron会社)により未結合のポリペプチドを除去した。分析測定により、gp96蛋白と7ペプチドは体外においてかなり高い親和力があることが認められた。この結合反応の平衡常数kは、約5−10である。
【００３９】
実施例９  gp96蛋白-7ペプチドの安定性の分析
体外組立てのgp96蛋白-7ペプチド複合物は、リン酸緩衝液(PBS)中において、4℃、-20℃、-70℃での保存ではいずれも不安定であり、10％SDS-PAGEの電気泳動と銀染色による検定では、30日後にgp96蛋白は二量体またはポリマを形成し始めた。冷凍乾燥後4 ℃で保存すると、複合物の安定性は良好であり、90日後の10％SDS-PAGEの電気泳動と銀染色及び逆相HPLCによる測定では、その分解率は5％未満であった。
【００４０】
実施例１０  免疫マウス
12-16週間成長したBALB／cJマウス(H−2d)を選んで、本試験に用いた。
【００４１】
免疫方式としては、サンプルをPBS100μlに溶解してから、頸脊皮下に注射した。皮内注射は、必要な免疫剤量は低いが、操作が難しいため採用しなかった。腹部の注射に必要な免疫剤量は大きく、約0.5nmolでなければ効かないため採用しなかった。
【００４２】
gp96蛋白-7ペプチド複合物の最適免疫剤量は、0.1nmolである。
免疫時間は、第１回の免疫をして１週間後、第２回目の免疫を行う方が、１回に免疫するより効果がが良好である。
【００４３】
免疫アジュバントを使用した試験の結果では、gp96蛋白-7ペプチド複合物は、FREUND不完全アジュバント(FIA)、FREUND完全アジュバント、クロムミョウバン等を使用するため、免疫を増加させる作用がないだけでなく、その免疫原性を低下させるようになる。その原因として、アジュバントは、gp96蛋白-7ペプチド複合物構造に対して破壊作用を持つ可能性がある。7ペプチドに対してFREUNDアジュバント、クロムミョウバンを使用することにより、その免疫活性を著しく向上させることができ、FREUNDアジュバントの効果は、クロムミョウバンより優れている。
【００４４】
そこで、皮下注射免疫を採用し、7ペプチドを緩衝液(90％PBS、10％DMSO／0.1％TFA)に溶解し、gp96蛋白-7ペプチド複合物はPBS中に溶解し、注射の前に1分間激しく振動させ、マウス１匹毎の免疫剤量を7ペプチドでそれぞれ0.2nmol、2nmol及び20nmolとし、ペプチドとFREUNDアジュバントを乳化してから、マウスを免疫した。gp96蛋白-7ペプチド複合物の免疫剤量はそれぞれ0.01nmol、0.05nmol、0.10nmol及び0.50nmolであり、頸脊皮下注射で、第１回の免疫をしてから１週間後に第２回目の免疫をさらに加え、7日後に細胞毒性の分析を行なった。マウスは処理群ごとに10匹使用した。
【００４５】
実施例１１  細胞毒性(CTL)の分析
マウスを免疫して7日後、マウス１匹毎に3×107脾臓細胞を得て、それらを10mM HEPESを含む緩衝液、5×10-5Mのメルカプトエタノール、抗生物質及び10％(V／V)のFCSを有する培養液中に浮遊させ、培養瓶において、放射線照射(4500 Rad)された同じ起源のLPS−刺激のBリンパ細胞(3：1)と1μg/m1のペプチドを完全培地中、37 ℃で培養した。6日後、脾臓細胞を収集して、4時間の51Cr放出標準試験(具体方法は、Kuhrober, A, et．al．1997．International Immunology, 9(8)：1203-1212を参考)を行って、細胞の毒性活性を測定した。簡単に言えば、ターゲット細胞を10μg／mlペプチドに37℃、30分間で感作させた後、異なる数量のエフェクター細胞を入れる。反応系は、100μlの完全培地である。37℃で共培養を4時間行なった後、上澄みを収集して、特異裂解率を測定する。
【００４６】
51Cr放出試験の結果より、7ペプチドまたはgp96蛋白-7ペプチド複合物がいずれもマウスを刺激して特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成させることが分かった。但し、gp96蛋白-7ペプチド複合物の免疫原性は、7ペプチドの200倍以上であり、各々のマウスが0.1nmol(約10μg)のgp96蛋白-7ペプチド複合物で免疫された場合、ただちに検体を誘発して、強烈な細胞免疫反応を引き起こし、細胞毒性より測定したターゲット細胞の裂解率は、60％以上となる。実験結果より、gp96蛋白-7ペプチド複合物により抗HBV感染とHBV感染の肝癌の新規な治療薬物の開発が可能であることが分かる。
【００４７】
実施例１２  その他のgp96−ポリペプチド複合物の免疫活性の測定
上記抗原7ペプチドの他、さらに他の6種のＢ型肝炎ウイルスの抗原ポリプチドを選んでgp96と体外で組立て、その免疫活性を測定した。6種の抗原ポリペプチドはそれぞれ、(1)核抗原ポリペプチド「YVNTNMGLK（配列番号２）」(核蛋白アミノ酸配列88-96に位置する)、(2)核抗原ポリペプチド「STLPETTVVRR（配列番号３）」(核蛋白アミノ酸配列141−151に位置する) 、(3)核抗原ポリペプチド「FLPSDFFPSV（配列番号４）」(核蛋白アミノ酸配列18−27に位置する)、(4)表面抗原ポリペプチド「IPIPSSWAF（配列番号５）」(表面蛋白アミノ酸配列313-321に位置する)、(5)表面抗原ポリペプチド「WLSLLVPFV（配列番号６）」(表面蛋白アミノ酸配列355-343に位置する)、(6)ポリメラーゼ抗原ポリペプチド「FLLSLGIHL（配列番号７）」(表面蛋白アミノ酸配列575-583に位置する)、である。この6種のポリペプチドは、それぞれ人工合成されたものであり、実施例８に述べられた最適反応系により体外でgp96と結合させた。この6種のポリペプチドは、すべてgp96と比較して高い親和力を持っている。結合反応の平衡常数Kの測定によると、この6種のポリペプチドのgp96との結合反応において、いずれもK値は5以上であった。
【００４８】
実施例１０における方法を用いて、上記6種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとgp96から形成された複合物と、上記gp96と7種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの融合蛋白でそれぞれマウスを免疫した。また実施例１１における方法によって、この6種の複合物をCTL分析した。51Cr放出実験から、この6種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとgp96より形成された複合物は、いずれもマウスを刺激して特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成させることが分かる。6種のポリペプチドとgp96から形成された複合物における免疫活性は、単独のポリペプチドより150−300倍高い。マウス１匹毎の免疫剤量が0.1nmol(約10μg)の時には、ただちに検体を誘発して、強烈な細胞免疫反応を引き起こす。この6種のポリペプチドとgp96から形成された複合物の毒性の測定より、ターゲット細胞の裂解率は、60％-85％の間であることが分かった。
【００４９】
以上の実験結果より、gp96とＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの体外での組立てにより合成された複合物は、抗HBV感染とHBV感染の肝癌の新規な治療薬物として開発できることが明らかとなった。実験条件に限られた本出願特許では、すべての種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの体外での組立て及びその免疫活性を測定することは不可能であるが、7種の代表的なＢ型肝炎ウイルス核抗原、表面抗原及びポリメラーゼ抗原を研究対象として、体外において、gp96と結合させて、免疫活性を測定した。大量の実験の結果より、gp96とこれらのＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドから形成された複合物は、いずれもマウスを刺激して、強烈な免疫反応を引き起こすことが分かった。gp96は、Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの新しい良好なアジュバントとして、新規な治療ワクチンとして開発されることができる。したがって上記7種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの他、いずれのＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドのgp96との結合も、新しい型のワクチンとして、本発明の請求範囲に含まれる。
【００５０】
実施例１３  熱ショック蛋白hsp70遺伝子クローンとその発現
宝生物工程(大連)有限公司のRNA抽出試薬キット(Catlimox-14TM RNA Isolation Kit Ver2.11)を採用して、200mgのヒトの肝癌組織から、イソチオシアン酸法を用いて試薬キットの説明通り、総RNAを抽出した。
【００５１】
逆転写−ポリメラーゼ鎖式反応(RT-PCR)を採用して、ヒトhsp70ファミリー中のhsp78をクローンした。宝生物工程(大連)有限公司のRT-PCR試薬キットを使用し、試薬キットの説明通り行なった。用いたプライマーは：
2004506045.tif 000003
である。
【００５２】
PCR反応条件は、94℃4分、94℃50秒，55℃50秒，72℃2分の30回サイクル、72℃5分等である。
【００５３】
PCRの生成物は、約2.0kbの断片であり、断片の5’端と3’端に2つの酵素切断部位BamHIとSalIを導入し、増幅した断片に対して、配列を測定した。hsp78の遺伝子は、1965bpを含み、塩基配列は文献報告(Mech. Ageing Dev.1998, 104(2)：149-158)と一致している。
【００５４】
増幅された断片は、BamHIとSalI酵素の切断により発現ベクターPET30a(＋)転化大腸菌BL21に連結され、同時に、次のポリペプチドに対応する核酸配列を人工合成する。即ち「YVNTNMG（配列番号１）」、「YVNTNMGLK（配列番号２）」、「STLPETTVVRR（配列番号３）」、「FLPSDFFPSV（配列番号４）」、「IPIPSSWAF（配列番号５）」、「WLSLLVPFV（配列番号６）」、「FLLSLGIHL（配列番号７）」である。上記の核酸配列の両端に制限性酵素切断部位BglIIを導入してhsp78遺伝子を含むpET30a(＋)中に挿入した。
【００５５】
構成されたベクターは、1mMのIPTGによる誘導4時間後に発現させ、10％SDS-PAGEの電気泳動とクマシーブルーでの染色により測定した。発現産物の分子量は、約80kDaで、理論値と基本的に一致している。
【００５６】
発現産物は、ADP-Agaroseのアフィニティクロマトグラフィ(Sigma)とMonoQ(Pharmacia)アニオンクロマトグラフィにより精製し、10％SDS-PAGEの電気泳動とクマシーブルーでの染色（電気泳動に使用するサンプル量は約5μg）により純度を検定して、95％以上の純度の蛋白を得た。発現させたhsp78及びその融合蛋白はhsp70モノクローナル抗体(Sigma)によりウエスタン検定を行なった。
【００５７】
実施例１４  hsp78-ポリペチド免疫原性の測定
hsp78と7種のポリペプチドの体外での組立てにより形成された複合物の最適反応系は、gp96(実施例８を参考)と同じであり、体外で合成された複合物、hsp78と7ポリペプチドとの融合蛋白でマウスを免疫した。マウスの免疫方式、免疫剤量及び免疫プログラムは、gp96(実施例１０を参考)と同じである。細胞毒性（CTL）分析方法は、gp96(実施例１１を参考)と同じである。51Crの放出実験の結果から、hsp78-7ペプチド複合物はマウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成させ、hsp78-7ペプチド複合物の免疫原性は、単独の7ペプチドの150倍以上であり、マウス１匹毎の免疫が0.1nmol(約10μg)では、検体を誘発して強烈な細胞免疫反応を引き起こし、細胞毒性測定よりターゲット細胞の裂解率は50％以上であることが分かった。実験の結果からhsp78−7ペプチド複合物は、新規な抗HBV感染の肝癌の治療薬物として開発できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は7ペプチドとgp96-7ペプチド複合物でマウスBALB/cJ(H-2d)を7日免疫した後、引き起こされた特異的CTL反応を示す図である。特異的ターゲット細胞に対するエフェクター細胞CTLの裂解百分率を、4時間の標準51Ｃｒの放出により測定した。エフェクター細胞とターゲット細胞の比はそれぞれ4、8、12、25、50、100であり、図における裂解百分率は、10匹のマウスの平均値である。