【手続補正書】
【提出日】平成17年6月8日(2005.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
架橋することによってゲル化が抑制されたゼラチンが、高分子タンパク質として浸透圧物質の候補となっている（特表昭６１−５０２４６４号公報）が、このゼラチンは抗原性を有するためにアレルギーやショック症状の誘発が懸念されている。すなわち、当該公報に開示された架橋ゼラチン（Haemaccel）は、血漿増量剤として実用化されているが、ヒスタミンを遊離し、軽度なアナフィラキシー様反応を惹起することが明らかになっている（THE LANCET VOL.344 July 30 (1994) 328-330 など）。よって、高濃度の溶液が繰り返し使用される腹膜透析において係る架橋ゼラチンを使用すれば、さらに重い副作用が誘発されることが予想され、腹膜透析液としては不適切といわざるをえない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明者らは、従来よりコラーゲン、ゼラチンの抗原性に着目し、各種の低抗原性ゼラチンを医薬用安定化剤として開発してきた。特にワクチンの安定剤としての低抗原性ゼラチンは今や実用段階に至っている（特開平７−８２２９９、特開平９−１７６１９６、特開平１０−１７５９６及び特開平１１−１２１９６公報参照）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本発明の腹膜透析液の浸透圧は、配合される低抗原性ゼラチンの分子量およびその他の添加物質によって異なるが、２５０〜６００ｍＯｓｍ／Lの範囲内であればよい。高分子量の低抗原性ゼラチンは浸透圧を軽微にしか増加させないが、２５０ｍＯｓｍ／Lより低いと浸透圧効果が得られず、６００ｍＯｓｍ／Ｌより高いと急激な除水が起こる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
【実施例】
［１］浸透圧剤調製例
（実施例１）浸透圧剤ａ：コラゲナーゼ分解ゼラチン、分子量２００〜２０，０００、FreAlagin（商品名、宮城化学工業社製）
高純度ゼラチン（豚皮由来、宮城化学工業社製）２ｋｇを７Ｌの内毒素不含（ＥＴフリー）の純水で膨潤した後、同様にＥＴフリーの熱水を加えて溶解した。次いで、アルカリ溶液（４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液）を用いてｐＨを７．４に調整し、４０℃まで冷却後、保温した。一方、酵素分解に使用するための固定化酵素は、１００ｍｇのコラゲナーゼ（高純度品）を５０ｇのトヨパール（東ソー社製）に常法に従って共有結合させて調製した。担体への結合量は結合前後の２８０ｎｍにおける吸光度の変化を計測して算出したが、この結果９９％以上の結合率が確認された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
膨潤・溶解した上記高純度ゼラチンの無菌化を図るため、孔径０．２２μｍのメンブレン・フイルターをセットしたろ過器でろ過した後、固定化酵素を充填したバイオリアクターに供給し、酵素分解を行った。バイオリアクターの運転流速は毎時５Ｌに、またカラムの温度は３９±１℃に制御した。バイオリアクターから出てきた酵素反応終了液を分取し、陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換処理などの後処理を行った後、スプレードライ（噴霧乾燥器）で粉末化し、分子量２００〜２０，０００の低抗原性ゼラチン（FreAlagin）を製した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
（実施例２）浸透圧剤ｂ：プロテアーゼ分解ゼラチン、分子量３０，０００〜７０，０００、ＧＬＤゼラチン（商品名、宮城化学工業社製）の調製
実施例１に記載と同様に、高純度ゼラチン（宮城化学工業社製）２ｋｇを７Ｌの内毒素不含（ＥＴフリー）の純水で膨潤した後、同様にＥＴフリーの熱水を加えて溶解した。次いで、アルカリ溶液を用いてｐＨを７．４に調整し、４０℃まで冷却後、保温した。一方、酵素分解に使用する固定化酵素は、１００ｍｇのＧＬＤ酵素（宮城化学工業製）を５０ｇのキトパール（富士紡績社製）担体に常法に従って共有結合させて調製した。担体への結合量は結合前後の２８０ｎｍにおける吸光度の変化を計測して算出したが、この結果９９％以上の結合率であることが確認された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
膨潤・溶解した上記高純度ゼラチンの無菌化を図るため、孔径０．２２μｍのメンブレン・フイルターをセットしたろ過器でろ過した後、固定化酵素を充填したバイオリアクターに供給し、酵素分解を行った。バイオリアクターの運転流速は毎時５Ｌに、またカラムの温度は３９±１℃に制御した。バイオリアクターから出てきた酵素反応終了液を分取し、陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換処理などの後処理を行った後、スプレードライ（噴霧乾燥器）で粉末化し、分子量３０，０００〜７０，０００の低抗原性ゼラチン（ＧＬＤゼラチン）を製した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
この組成の調製液に、上記実施例１の浸透圧剤ａ（コラゲナーゼ分解ゼラチン、分子量２００〜２０，０００、FreAlagin）を４（質量／容量）％［４０ｇ／Ｌ相当量］添加し、実施例１の透析液Ａを調製した。ｐＨは６．６２、浸透圧は３７９ｍＯｓｍ/Ｌであった。なお、浸透圧は、ｐＨ浸透圧計ＨＯＳＭ−１型（東亜電波工業社製）を用いて測定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
以下同様に、上記浸透圧剤ａに代えて、実施例２の浸透圧剤ｂ（プロテアーゼ分解ゼラチン、分子量３０，０００〜７０，０００、ＧＬＤゼラチン）、比較例１の浸透圧剤ｃ（グルコース）、比較例２の浸透圧剤ｄ（特開昭６２−６０５６３相当品）を使用し、同様に処理して、それぞれ透析液Ｂ（ｐＨが７．１８、浸透圧が５１５ｍＯｓｍ/Ｌ）、透析液Ｃ（ｐＨが５．０３、浸透圧が３１７ｍＯｓｍ/Ｌ）、透析液Ｄ（ｐＨが５．８０、浸透圧が４２１ｍＯｓｍ/Ｌ）を得た。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
各透析液を１２１℃、２０分でオートクレーブ滅菌してから、以下の試験に供した。
［３］薬理試験
（１）透析膜を用いた in vitro 透析試験
［２］で調製した透析液の効果を調べるため、透析膜としてディスポダイアライザー（セルロースエステル膜、φ１０ｍｍ、５ｍＬ容量、分画分子量２５，０００、フナコシ製）を使用してin vitro 透析試験を実施した。透析液Ａ、Ｂ、Ｃの各１．５ｍＬを各ダイアライザー内に添加し、電子天秤（ＡＥ２４０、Ｍｅｔｔｌｅｒ製）を用いて重量を測定した（透析前重量）。この各ダイアライザを、予め３７℃に加温した５０ｍＬのハンクス平衡塩溶液（フェノールレッド不含、ＧＩＢＣＯ製、２９０ｍＯｓｍ/Ｌ）中に浸漬し、透析を開始した。透析開始後、各ダイアライザーは３７℃に維持した恒温槽にて水平方向に振盪させながらインキュベートした。透析開始の１、２、４、６、８時間後に各ダイアライザーを取り出し、速やかに秤量後、ハンクス液中に戻した。透析開始後の秤量値から、各透析前重量を減じ、１ｇを１ｍＬに換算した各吸水量を算出した。さらに、この値より、１．５ｍＬを１００％として透析開始後の各吸水率を求めた。各透析液について４例を行い、それぞれ平均値と標準誤差とを算出した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
（３）腎不全ラットを用いた in vivo 透析試験
上記（２）の正常ラットを用いた in vivo 試験と同様のＳＤ系雄性ラットにシスプラチンを使用して腎不全を誘発し、病態に対する本発明の浸透圧剤を含有する腹膜透析液の効果を調べた。シスプラチン投与時のラットの体重は３２４〜４７６ｇ、腹膜透析試験開始時の体重は２７１〜４４９ｇであった。