(57)【要約】測定対象分子を洗い流すことなくプレート上でその十分な残量を確保することができるとともに、未知の測定対象分子の質量分析に使用でき、しかも複数の測定対象分子を同時に質量分析する場合にも使用できる、プレート上での測定対象分子の局在化方法を提供する。（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、（Ｂ）上記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、（Ｃ）上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む。
2008133148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、
（Ｂ）前記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、
（Ｃ）前記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、前記プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子を局在化する方法。
【請求項２】
前記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする、請求項１に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項３】
前記アリール基が、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基であることを特徴とする、請求項２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項４】
前記アルキル基が、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基であることを特徴とする、請求項２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項５】
前記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含み、前記工程（Ａ）において、前記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項６】
前記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含み、前記工程（Ａ）において、前記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程（Ｃ）において、前記プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項７】
工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の間に、
（Ｂ’）前記生体試料を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項８】
測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）請求項１から７のいずれかに記載の方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。
【請求項９】
（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、
（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、前記第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程と、
（Ｂ１）前記第１プレートおよび前記第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、
（Ｂ２）前記第１プレートおよび前記第２プレートを分離する工程と、
（Ｃ）前記第１プレートおよび前記第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、前記第１プレートおよび前記第２プレートの少なくとも一方上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項１０】
前記第１化合物および第２化合物のそれぞれは、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする、請求項９に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項１１】
前記アリール基が、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基であることを特徴とする、請求項１０に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項１２】
前記アルキル基が、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基であることを特徴とする、請求項１０に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項１３】
前記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含み、前記工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を前記第２プレートで局在化することを特徴とする、請求項９〜１２のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項１４】
工程（Ｂ２）および工程（Ｃ）の間に、
（Ｂ’）前記第１プレート上の前記生体試料、および前記第２プレート上の前記生体試料の少なくとも一方を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、請求項９〜１３のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項１５】
測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）請求項９から１４のいずれかに記載の方法により、前記第１プレート上の生体試料中の測定対象分子、および前記第２プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレート上での測定対象分子の局在化方法に関する。より詳細には、本発明は、プレート上で生体試料から測定対象物のみを選択的に局在化することができる方法に関する。本発明は、このような方法を用い、測定対象分子の高いシグナル強度が得られる質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体高分子であるタンパク質および／または糖鎖の高感度な質量分析法の開発が盛んに行なわれており、当該分析法が生化学および医学の分野に急速に普及しつつある。このような質量分析法は、例えば、生体分子の発現およびその機能に関する解析、ならびにバイオマーカー探索等に用いられる。【０００３】
生体高分子が含有される生体試料中には、測定対象分子の他に多数の夾雑分子が混在する。このため、微量の測定対象分子を含む生体試料を高度に精製した場合には、測定対象分子の質量分析感度が検出感度未満になるおそれがあり、ひいては質量分析において当該分子を見逃すおそれもある。また、夾雑分子が測定対象分子に比して高いイオン化効率を有する場合には、測定対象分子の検出は困難である。【０００４】
このような事情を考慮して、質量分析の前段階としての生体試料のイオン化に関する技術として、例えば以下のようなものが開示されている。【０００５】
非特許文献１には、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）を用いて、チップ表面に官能基および／または抗体分子などを固定し、生体試料中の特定分子のみを捕捉、洗浄してレーザー照射によりイオン化を行なう技術が開示されている。【０００６】
特許文献１には、例えば細胞培地またはこのような培地の精製フラクションにおける生体成分の表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量スペクトルプロフィルを作成することを含む、ターゲット分子の精製を監視する技術が開示されている。【０００７】
【非特許文献１】特許庁ホームページ、試料室、標準技術集、一般、質量分析技術（マススペクトロメトリー）、２−１−３−１−１表面増強レーザー脱離イオン化（SELDI）（http://www.jpo.go.jp/shiryou/index.htm参照）
【特許文献１】特表２００５−５０９１７３号公報
【発明の開示】
【０００８】
非特許文献１および特許文献１に示す各技術に開示されている、プレート上の生体試料に対して所定の洗浄により測定対象分子のみを残留させる手法（ＳＥＬＤＩ）を、質量分析に先立って採用する場合には、生体試料を洗浄する際に、測定対象分子の一部が洗い流される。このため、測定対象分子が微量である場合および／または結合が弱い場合は、プレート上での測定対象分子の残量が極めて少なくなり、質量分析に際して、その分析感度が所望の検出感度を遥かに下回るおそれがある。
【０００９】
また、ＳＥＬＤＩを採用した後の質量分析は、測定対象分子が既知の場合には有効であるが、測定対象分子が未知の場合には当該分子がプレートから完全に除去されるおそれがあり有効でない。
【００１０】
さらに、ＳＥＬＤＩを採用した後の質量分析では、所定のチップを選択し所定の洗浄を行うことによって、含量が最大の、もしくは結合が最強の特定の種類のみの測定対象分子に限定してしまう可能性があるが、実際の質量分析の現場においては、ＳＥＬＤＩ測定１回分に使用する生体試料の量で、複数の測定対象分子を同時に分析することが望ましい場合もある。
【００１１】
本発明の目的は、（ａ）測定対象分子を洗い流すことなくプレート上でその十分な残量を確保することができ、（ｂ）未知の測定対象分子の質量分析に使用でき、（ｃ）複数の種類の測定対象分子を同時に質量分析する場合にも使用できる、プレート上での測定対象分子の局在化方法を提供することにある。また、本発明の目的は、このような方法を用い、測定対象分子の高いシグナル強度が得られる質量分析法を提供することにある。
【００１２】
本発明は、（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、（Ｂ）上記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、（Ｃ）上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む、プレート上での測定対象分子を局在化する方法に関する。ここで、プレート上に載置する生体試料には、少なくとも１種の測定対象分子が必ず含まれるものである。換言すれば、当該生体試料が夾雑分子のみからなる場合は除かれる。
【００１３】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、上記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことが望ましい。これらのうち、上記アリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基とすることができる。また、上記アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基とすることができる。
【００１４】
当該局在化方法は、プレート上で単一の測定対象分子を局在化することができることは勿論、プレート上で複数の測定対象分子を局在化することもできる。即ち、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、上記工程（Ａ）において、上記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、上記工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化させることができる。
【００１５】
当該局在化方法は、測定対象分子の局在化のみならず、夾雑分子の局在化も併せて行うことができる。即ち、上記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含む場合に、上記工程（Ａ）において、上記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、上記工程（Ｃ）において、上記プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化させることができる。
【００１６】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の間に、（Ｂ’）上記生体試料を誘導体化する工程をさらに含ませることが望ましい。
【００１７】
なお、上記測定対象分子は、例えば、糖鎖（遊離糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質など）とすることができる。
【００１８】
本発明は、測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）上記のいずれかの方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳｎ測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
【００１９】
本発明は、（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、上記第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程と、（Ｂ１）上記第１プレートおよび上記第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、（Ｂ２）上記第１プレートおよび上記第２プレートを分離する工程と、（Ｃ）上記第１プレートおよび上記第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、上記第１プレートおよび前記第２プレートの少なくとも一方上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む、プレート上での測定対象分子の局在化方法に関する。ここで、プレート上に載置する生体試料には、少なくとも１種の測定対象分子が必ず含まれるものである。換言すれば、当該生体試料が夾雑分子のみからなる場合は除かれる。
【００２０】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、上記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことが望ましい。これらのうち、上記アリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基とすることができる。また、上記アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基とすることができる。
【００２１】
当該局在化方法は、２枚のプレート上で異なる測定対象分子を局在化することができる。即ち、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、上記工程（Ｃ）において、第１プレートの測定対象分子とは異なる測定対象分子を上記第２プレートで局在化させることができる。
【００２２】
当該局在化方法は、２枚のプレートの各々において異なる測定対象分子を局在化することができるのみならず、２枚のプレートの各々において測定対象分子と夾雑分子の局在化を行うことができる。即ち、上記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含む場合に、上記工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を上記第２プレートで局在化させることができる。
【００２３】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、工程（Ｂ２）および工程（Ｃ）の間に、（Ｂ’）上記生体試料を誘導体化する工程をさらに含ませることが望ましい。
【００２４】
なお、上記測定対象分子は、例えば、糖鎖（遊離糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質など）とすることができる。
【００２５】
測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）上記のいずれかの方法により、上記第１プレート上の生体試料中の測定対象分子、および上記第２プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
【００２６】
本発明のプレート上での測定対象分子の局在化方法は、生体試料を載置するプレートに予め所定の表面処理（所定の化合物の結合）を施すことで、測定対象分子とプレートとの親和性を他の夾雑分子とプレートとの親和性よりも高めることができる。このため、プレート上で測定対象分子を含む生体試料を単に乾燥するだけで、プレート上に測定対象分子を選択的に十分に残留させることができる。
【００２７】
また、本発明の局在化方法は、ＳＥＬＤＩのように測定対象分子を洗い流すことなく、プレート上で乾燥する技法を採用するため、当然に未知の測定対象分子もプレート上に残留する。このため、当該方法は、質量分析を行う対象分子がたとえ未知であっても、適用することができる。
【００２８】
さらに、本発明の局在化方法は、ＳＥＬＤＩのように測定対象分子を洗い流さないため、乾燥した生体試料中に複数の測定対象分子を残留させることができる。このため、当該方法は、質量分析を行う測定対象分子がたとえ複数であっても、適用することができる。
【００２９】
加えて、以上のような効果を奏する本発明の局在化方法を用いた質量分析によれば、測定対象分子の十分なシグナル強度を得ることができるとともに、未知の測定対象分子に対処でき、しかも複数の測定対象分子を同時に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、実施例１に関し、得られた測定試料の写真である。
【図２】図２は、実施例１に関し、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）の分布を示す図である。
【図３】図３は、実施例１に関し、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を示す図である。
【図４】図４は、図２，３中の点Ａにおける質量スペクトルを示す図である。
【図５】図５は、図２，３中の点Ｂにおける質量スペクトルを示す図である。
【図６】図６は、比較例１に関し、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）の分布を示す図である。
【図７】図７は、比較例１に関し、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を示す図である。
【図８】図８は、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルを示す図である。
【図９】図９は、実施例２に関し、ペプチドイオン（ｍ／ｚ＝１０７５）の分布を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例２に関し、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を示す図である。
【図１１】図１１は、図９，１０中の点Ｄにおける質量スペクトルを示す図である。
【図１２】図１２は、図９，１０中の点Ｅにおける質量スペクトルを示す図である。
【図１３】図１３は、実施例３において、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトル（全測定点の平均）を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例３において、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトル（全測定点の平均）を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例３において、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを特定領域に関して示す図である。
【図１６】図１６は、実施例４において、分離した後のフェニルプレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１７】図１７は、実施例４において、分離した後のフェニルプレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１８】図１８は、実施例４において、分離した後のＣ１８プレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１９】図１９は、実施例４において、分離した後のＣ１８プレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２０】図２０は、実施例５において、分離した後のアミノプレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２１】図２１は、実施例５において、分離した後のアミノプレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２２】図２２は、実施例５において、アミノプレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２３】図２３は、実施例５において、アミノプレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらの範囲に限定されるものではなく、当業者の通常の創作能力の範囲で適宜変更することができる。【００３２】
＜プレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ１）＞
本発明のプレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）は、（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、（Ｂ）上記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、（Ｃ）上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む方法である。ここで、測定対象分子とは、当該局在化方法を実施した後に行なう質量分析法において測定対象とする分子を意味する。【００３３】
[プレートを用意する工程]
（プレート）
プレートは、生体試料中の測定対象分子および夾雑分子の少なくとも一方を捕捉することが可能な官能基が結合されているものであれば特に限定されず、金属プレート、非金属膜のいずれとすることもできる。また、プレートはその表面を平面状、凹凸状等、いかなる形状とすることもでき、さらに多孔性とすることもできる。さらに、プレートには所定の官能基が直接結合されていなくてもよく、例えば、プレートと当該官能基との間のスペーサ部分またはポリマーが介在していてもよい。【００３４】
プレート上で測定対象分子を捕捉する例（タイプ１−１）としては、アリール基を結合させたプレート、ジヒドロキシボリル基を結合させたプレート、アミノ基を結合させたプレート、またはヒドロキシ基を結合させたプレートを使用する例が挙げられる。これらのプレートは、測定対象分子との親和性が他の夾雑分子との親和性より高くなるようなプレートの一例である。特に、測定対象分子にピレン標識化を施す場合は、アリール基を結合させたプレートを使用することが、標識された測定対象分子とプレートとの高い親和性が実現され、局在化が良好に達成される点で好ましい。また、測定対象分子に糖鎖が含まれる場合は、ジヒドロキシボリル基を結合させたプレート、アミノ基を結合させたプレート、ヒドロキシ基を結合させたプレートなどを使用することが、糖鎖を含む測定対象分子とプレートとの高い親和性が実現され、局在化が良好に達成される点で好ましい。【００３５】
これに対し、プレートの一部に、夾雑分子と親和性のある官能基（たとえばＣ４、Ｃ８、Ｃ１８など）を結合させることにより、プレート上で任意選択的に誘導体化された夾雑分子を捕捉し、プレート上で測定対象分子と夾雑分子とを分離して、測定対象分子の局在化を図ることもできる（タイプ１−２）。【００３６】
さらに、上記タイプ１，２の組み合わせとして、プレート上に測定対象分子と夾雑分子との双方を別々に捕捉し、プレート上で測定対象分子と夾雑分子とを分離して、測定対象分子の局在化を図ることもできる（タイプ１−３）。このような場合には、例えば、測定対象分子の誘導体化と夾雑分子の誘導体化に応じた所定の官能基を適宜選択して、各誘導体化分子と親和性のある当該官能基をプレートの別の領域に結合し、各分子の局在化領域を分離することができる。【００３７】
なお、上記タイプ１−１〜１−３のいずれにおいても、プレート上で、複数種類の測定対象分子および／または複数種類の夾雑分子を捕捉し、所定の複数の測定対象分子の局在化を図ることもできる。このような場合には、所定の測定対象分子および／または夾雑分子に応じた異なる誘導体化を行うとともに、各分子と親和性のあるそれぞれの官能基をプレートに別々の結合し、それぞれ局在する領域を分離してもよい。あるいは、それぞれに親和性のある官能基を結合したプレートを用いて順番に挟んで、それぞれのプレートに分子ごとに捕捉して分離することもできる。【００３８】
（プレートの作成方法）
以下に、このようなタイプ１−１〜１−３のプレートの一例として、アリール基を結合させたプレートの作成方法を説明する。【００３９】
アリール基を結合させたプレートの作成方法は特に限定されないが、例えば以下のように作成することができる。即ち、プレートへのアリール基導入は、例えば、Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法（Ｈａｒｖａｒｄ大ＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓらＬａｎｇｍｕｉｒ・Ｖｏｌ．１０．１４９８−１５１１（１９９４）に従って行うことができる。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、この板材をベンジルメルカプタン [α−トルエンチオール]のエタノール希釈液に所定時間浸して風乾する。次いで、この板材を別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプする。板材に存在する化合物のメルカプト基が、金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合を生じ、自己組織化単分子膜（ＳＡＭｓ）を形成する。最後に、Ａｕ基板をエタノールで洗浄、乾燥し、フェニル基を結合させたプレートを得ることができる。Ａｕ基板へのアリール基の塗布態様は、上記スタンプに限られず、スピンコート、ロールコート、スクリーン印刷等の各種塗布方法を採用することもできる。【００４０】
ここで使用する基板の金属材料としては、チオールが吸着可能な金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、またはこれらの合金が使用可能である。これらの中でも、大気中で表面酸化が進行しない、安定に作製可能な金が実用上好ましい。【００４１】
なお、アリール基をプレートの全面に均一に結合させる場合には、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを準備することが、アリール基がＡｕ基板の端まで均一に導入されるという理由により肝要である。【００４２】
このようなプレートへのアリール基の導入においては、アリール基をプレートの全面に均一に結合させることはもちろん、不均一に結合させることもできる。例えば、プレート上にアリール基をドット状に結合させ、またはアリール基をドーナツ状に結合させることができる。【００４３】
本発明におけるアリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基などの単環式の基であってもよいし、またはナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、ベンゾチアゾリル基などの縮合多環式の基であってもよい。また、一種類のアリール基のみでなく、複数種類のアリール基をプレートに導入することもできる。このような場合には、例えば、複数のアリール基を混合して導入してもよいし、アリール基の種類によってプレート上でのその導入領域を分けて偏在させてもよい。なお、アリール基には、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＮなどの官能基が結合していてもよい。【００４４】
さらに、アリール基と、他の化合物、例えばボロン酸とを混合して同一のプレートに存在させることもでき、これらを別領域に分けて導入してもよい。【００４５】
プレートに導入する官能基は、アルキル基（例えばＣ４、Ｃ８、Ｃ１８など）であってもよい。さらに、これらのアルキル基にＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＮなどの官能基が結合していてもよい。【００４６】
さらに、同一分子に２個以上の単一官能基または複数の官能基が結合したものを導入してもよい。【００４７】
[測定対象分子を含む生体試料を載置する工程]
（測定対象分子）
「測定対象分子」とは、糖、糖鎖、タンパク質、核酸、複合糖質（糖タンパク質、糖脂質など）などであって、天然から調製する他、化学的または酵素学的に調製するものを含む。なお、本発明における用語「タンパク質」はペプチドを含み、本発明における用語「糖タンパク質」は糖ペプチドを含む。タンパク質は糖鎖、リン酸などを含めて修飾がなされていてもよい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものまたは生体に含まれる分子を模倣して作製されたものを含む。【００４８】
測定対象分子は、そのまま利用してもよいが、一部誘導体化することで、プレート上における各点での、誘導体化した測定対象物質と標識化していない測定対象物質との分布を比較した局在化確認により、質量分析を可能とすることができる。誘導体化はプレートに載置する前におこなってもよいし、プレートに測定対象分子を載置して乾燥した後に行ってもよい。また、誘導体化は標識化合物を用いた標識化であってもよい。以下、誘導体化について詳述する。【００４９】
糖、糖鎖、または複合糖質から化学的あるいは酵素学的に遊離して得た糖鎖（以下糖鎖とする）は、還元末端にある糖のアルデヒド基と、アミノ基あるいはヒドラジド基（−ＣＯＮＨＮＨ２）などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物とを縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を与える。縮合反応は、通常、メタノールまたはＤＭＳＯなどの有機溶媒中で、触媒としての酢酸などの存在下または非存在下において、糖鎖と標識化合物とを加温して行う。その後、ＮａＣＮＢＨ３、ＮａＢＨ４などの還元剤を加えて、加温または室温で還元反応を行う。あるいはまた、縮合反応溶液中に始めから還元剤を共存させる場合もある。還元末端の糖のアルデヒド基とＰＢＨとを縮合させることにより標識する方法では、［Ｍ＋Ｎａ］＋あるいは［Ｍ−Ｈ］−などの親イオンの安定性が低く感度が劣っている。このため、還元反応をさらに行うことで親イオンを多く生成することができる。【００５０】
また、糖、糖鎖または複合糖質の中でもシアル酸を含むものについては、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用いて、シアル酸のカルボキシ基と、標識化合物のアミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などとを反応させることによって標識できる。この反応は、例えば、水溶性カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド存在下で行う。【００５１】
さらに、シアル酸を含む糖、糖鎖、または複合糖質は、シアル酸のＣ７−９位のみを選択的に過ヨウ素酸酸化してアルデヒド基を生じさせることができる。シアル酸のＣ７−９位の選択的酸化は、５ｍＭのＮａＩＯ４水溶液中で０℃、１０〜２０分間にわたり反応させることによって実施することができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物を用いて、上記の選択的酸化により生じたアルデヒド基と、標識化合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を得ることができる。【００５２】
あるいは、多くの糖、糖鎖、または複合糖質は、非還元末端にガラクトースを含む。その非還元末端のガラクトースを特異的にガラクトースオキシダーゼによってＣ６位を酸化しアルデヒド基を生じさせることができる。酵素反応は、たとえば、中性の緩衝液中で、室温、２時間で行うことができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物を用いて、上記の酵素的酸化により生じたアルデヒド基と、標識化合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を得ることができる。【００５３】
ガラクトースに標識を行うこれらの方法を、糖タンパク質（糖ペプチドを含む）分子上のシアル酸、ガラクトースなどに適用することが可能である。その場合、糖タンパク質分子を標識できるので、該分子のイオン化効率が高くなる。【００５４】
タンパク質（ペプチドを含む）および糖タンパク質（糖ペプチドを含む）は、その中に含まれるカルボキシ基、アミノ基、またはＳＨ基を用いて標識することができる。カルボキシ基を用いて標識する場合には、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のカルボキシ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。一方、アミノ基を用いて標識する場合には、スクシニミジルエステル基、塩化スルホニル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のアミノ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。さらに、タンパク質または糖タンパク質に含まれるシステイン残基のＳＨ基を用いて標識する場合には、ヨード基（−Ｉ）などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のＳＨ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。【００５５】
標識化合物は、芳香族化合物であっても、縮合多環炭化水素誘導体であってもよい。「芳香族化合物」とは、芳香族環部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、該芳香族環部分と反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物を含む。ここで、芳香族環部分は、ベンゼン環、チオフェン環、ピロール環、ピリジン環などの単環式芳香族環、またはナフタレン環、アントラセン環、ピレン環、キノリン環、インドール環、アクリジン環、ベンゾチアゾール環などの縮合芳香族環であってもよい。「縮合多環炭化水素誘導体」とは、ナフタレン、アントラセン、ピレンなどの縮合多環炭化水素部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、該縮合多環炭化水素と該反応性官能基とを連結するスぺーサ部分とを有する化合物をいう。【００５６】
本発明で用いる標識化合物は、好ましくはピレン誘導体化合物である。「ピレン誘導体化合物」とは、ピレン環と、分析対象の分子に結合することが可能である反応性官能基と、該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。具体的には、１−ピレニルジアゾメタン(1-pyrenyldiazomethane)、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸ヒドラジド（1-pyreneacetic acid, hydrazide）、１−ピレンプロピオン酸ヒドラジド（1-pyrenepropionic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸スクシニミジルエステル（1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンプロピオン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンブタン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレンブタノイル）システイン酸スクシニミジルエステル（N-(1-pyrenebutanoyl)cysteic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrene) iodoacetamide）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードマレイミド（N-(1-pyrene) maleimide）、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrenemethyl) iodoacetamide）、１−ピレンメチルヨードアセテート（1-pyrenemethyl iodoacetate）、アミノピレン（aminopyrene）、１−ピレンメチルアミン（1-pyrenemethyl amine）、１−ピレンプロピルアミン（3-(1-pyrenyl)propylamine）、１−ピレンブチルアミン（4-(1-pyrenyl)butylamine）、１−ピレンスルホン酸クロリド（1-pyrenesulfonyl chloride）１−ピレニルジアゾメタンなどが挙げられる。これらの中でも、１−ピレニルジアゾメタンを用いることが、反応性が高い点で好ましい。【００５７】
また、誘導体化の例として、芳香族基を含まない、アルキル化を行ってもよい。【００５８】
（生体試料の載置方法）
生体試料の載置工程では、誘導体化後の測定分子または誘導体化しない測定分子を、適当な溶媒に溶解し、ピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。乾燥は、室温に放置しても、分子が変化しなければ加温してもよい。必要に応じて、引き続き誘導体化反応を行なう。【００５９】
[プレート上で測定対象分子を局在化する工程]
（マトリックス）
事後的な質量分析におけるマトリックスの役割は、照射されたレーザーの光エネルギーを吸収しマトリックス自身がイオン化を起こして測定対象分子との間でプロトンまたは電子などを受け渡すというものである。マトリックスは、その種類によって固有の光エネルギー吸収帯があるので、照射するレーザーによって使用するマトリックスも異なる。また、マトリックスは、光エネルギーの吸収以外にも、測定対象分子を分子レベルで均一に分散させる分散剤としての役割も有する。このため、測定する分子の違い（タンパク質、核酸、糖類、脂質など）によってマトリックスを適宜選択することが重要である。【００６０】
このようなマトリックスとしては、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、シナピン酸（ＳＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）、ｎｏｒｈａｒｍａｎ、６−ａｚａ−２−ｔｈｉｏｔｈｙｍｉｎｅ（６−ＡＴＴ）、２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ等を使用することができる。高い局在化を達成するためには、マトリックス濃度を適宜選択することが好ましい。具体的には、マトリックス濃度は、測定試料によって選択する必要がある。マトリックス濃度は、例えば０．１〜２０  ｍｇ／ｍｌとすることが特に好ましく、２〜１０ｍｇ／ｍｌとすることが、結晶形を制御できる点で極めて好ましい。【００６１】
（溶媒）
マトリックスを溶解する溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリル等、およびこれらと水との混液を使用することができる。特に、アセトニトリルと水との混液を使用することが、試料およびマトリックスとよく混和し、その後の局在化を実現する点で好ましい。高い局在化を達成するためには、溶媒濃度を適宜選択することが好ましい。具体的には、溶媒濃度は、測定試料によって選択する必要がある。溶媒濃度、例えば、アセトニトリル濃度は、０〜１００％とすることが好ましく、特に、４０〜９０％とすることが、乾燥時間および／または乾燥過程を制御できる点で特に好ましい。【００６２】
（測定対象分子の局在化方法）
マトリックスと溶媒との混合は、特に限定するものではなく、公知のいかなる技術を使用することもできる。例えば、ＤＨＢＡ（高純度マトリックス試薬、島津ジーエルシー製）５ｍｇを、４０％のアセトニトリルを含有する水０．５ｍｌに溶解し、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ溶液を用時調製する。この際、必要に応じて遠心分離した上清を用いる。  
プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程では、まず、測定試料を載置した部位を覆うようにマトリックス溶液をピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。この段階で、測定対象分子が再溶解してマトリックスとの混合溶液となる。【００６３】
次に、混合溶液を乾燥することで、測定対象分子が再移動して局在化を実現する。具体的には、室温に放置しても、分子が変化しなければ加温してもよい。当該乾燥は、測定分子によるが、局在化が十分に起こる時間で行う。乾燥時間は、２分〜２４時間とすることが好ましい。さらに、分析時間の短縮、試料および結晶形態などを変化させない観点から、５分〜３０分とすることがさらに好ましい。【００６４】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ１）によれば、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、工程（Ａ）において、プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化することができる。また、生体試料が少なくとも１種の夾雑分子を含む場合に、工程（Ａ）において、プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、工程（Ｃ）において、プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化することができる。【００６５】
＜プレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ２）＞
[プレートを用意する工程]
タイプ２において、プレートを用意する工程には、（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程とが含まれる。【００６６】
本工程において用いるプレートの種類については、上記したタイプ１と同様である。ただし、第１プレートと第２プレートとでは、異なる化合物を結合させる。これにより、後述するように、異なるプレートで異種の測定対象分子を局在化させることができる。【００６７】
[測定対象分子を含む生体試料を載置する工程]
タイプ２において、測定対象分子を含む生体試料を載置する工程には、（Ｂ１）第１プレートおよび第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、（Ｂ２）第１プレートおよび第２プレートを分離する工程とが含まれる。【００６８】
本工程において用いる測定対象分子の種類については、上記したタイプ１と同様である。第１プレートと第２プレートとにより測定対象分子を含む生体試料を挟む際には、重しなどを置いてよく密着させることが、局在化を高効率で行うことができる点で好ましい。また、生体試料の乾燥の際には、適当な時間をかけて乾燥し、さらに完全に乾燥することが、局在化を高効率に達成できる点で好ましい。例えば、室温〜４５℃で、３０分〜２４時間かけて乾燥することが好ましい。【００６９】
[プレート上で測定対象分子を局在化する工程]
タイプ２において、プレート上で測定対象分子を局在化する工程は、（Ｃ）第１プレートおよび第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、プレート上で測定対象分子を局在化する工程である。【００７０】
本工程において用いるマトリックス、および溶媒の種類については、上記したタイプ１と同様である。【００７１】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ２）によれば、生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、工程（Ｃ）において、第１プレートの測定対象分子とは異なる測定対象分子を第２プレートで局在化することができる。また、生体試料が少なくとも１種の夾雑分子を含む場合に、工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を第２プレートで局在化することができる。【００７２】
＜質量分析法（タイプ１）＞
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
（１）プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）により、プレート上で測定対象分子を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳｎ測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む方法である。【００７３】
（工程（１））
工程１は、上記したプレート上での測定対象分子の局在化方法を行なう工程である。当該工程は、上述したとおりである。【００７４】
（工程（２））
工程２は、工程１で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳｎ測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程である。【００７５】
「質量分析法」とは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、レーザー脱離（ＬＤ）法、高速電子衝撃（ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学（ＡＰＣＩ）法などのイオン化方法によって分子を含む試料をイオン化し、次いで、飛行時間法（タイムオブフライト法、ＴＯＦ法）、二重収束法、四重極集束法などを用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する方法である。【００７６】
本発明においてイオン化法は限定されないが、好ましくは、ＬＤ法、ＦＡＢ法、またはＭＡＬＤＩ法であり、より好ましくは、ＭＡＬＤＩ法である。【００７７】
ＭＡＬＤＩ法においては、メチル化または縮合多環炭化水素が分子に結合していることで、イオン化効率が高くなる。【００７８】
糖、糖鎖、タンパク質、糖など修飾を含むタンパク質、核酸、糖脂質などの分子は、分子量および組成が同一の構造異性体が存在するので、縮合多環炭化水素誘導体による標識化後、プリカーサーイオンの生成を高めて、ＭＳｎ（ｎ＞１）解析を行い、異性体に特異的なイオンを生成して構造情報を得ることができる。糖ペプチドまたは糖タンパク質の糖鎖部分に標識した分子をＭＳｎ（ｎ＞１）解析する場合、標識を含むプロダクトイオンを選択することによって、分子中の糖鎖結合位置を決定することができる。【００７９】
当該タイプ１の質量分析方法においては、当該技術分野で通常用いられるいかなる方法を用いることもできる。【００８０】
＜質量分析法（タイプ２）＞
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
（１）プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ２）により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む方法である。【００８１】
（工程（１））、（工程（２））、および用語「質量分析法」等については、上記の、プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）と同様である。【００８２】
当該タイプ２の質量分析方法においても、当該技術分野で通常用いられるいかなる方法を用いることもできる。
【実施例】
【００８３】
以下に、本発明の効果を実施例に基づいて実証する。【００８４】
（実施例１）
１−１．フェニルプレートの作成
Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法に従って、プレートへのフェニル基導入を行なった。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、ベンジルメルカプタン [α−トルエンチオール]のエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥してフェニルプレートを得た。本例では、プレートにフェニル基を全面コートしたため、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを使用した。【００８５】
１−２．測定対象分子の局在化および質量分析
上記のように事前に作成したプレート上に、糖鎖１(５００ｆｍｏｌ)を載置し、乾燥させた。その上に、１−ピレニルジアゾメタン５００ｐｍｏｌ含有ＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、２５分にわたって４０℃に加熱して乾燥させることにより、一部ピレン標識化された標識糖鎖１を得た。マトリックスとしてＤＨＢＡ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液、４０％アセトニトリル）０．５μＬを、試料を覆うように滴下し室温で乾燥して、図１に示す標識糖鎖含有測定試料１を調製した。【００８６】
得られた測定試料１を、Ｘ×Ｙ＝２１×２１の合計４４１の領域に分割し、質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ、島津製作所）のラスタースキャンによって各領域のネガティブイオンを測定した。ラスタースキャンによって得られた各領域の測定ファイルの情報を測定位置座標（ｘ、ｙ）、ｍ／ｚおよびシグナル強度を含むテキストに変換した。当該テキスト変換したデータに基づいて、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布および未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）の分布を、公開ソフトＧｒａｐｈ−Ｒを用いて二次元に表示した。【００８７】
図２に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示し、図３に、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示す。また、図４に、図２，３中の点Ａにおける質量スペクトルを示す。また、図５に、図２，３中の点Ｂにおける質量スペクトルを示す。図４および５の縦軸は最大値が同一になるように示してある。【００８８】
図２，３によれば、標識糖鎖イオンと未標識糖鎖イオンとの生成する領域が異なること、換言すれば標識糖鎖の局在化が実現できていることが判明した。また、図４，５によれば、図２，３の結果から所定の領域、即ち、図２，３の各点の中で図２の点の方が、色が濃い領域（例えば、点Ａ）を選択した場合にのみ、所望のイオン（標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン）の他のイオンと比較した高いシグナル強度が選択的に得られることが判明した。【００８９】
以上の効果は、プレートに所定の加工を施してアリール基（フェニル基）を結合させたプレートを使用したことによって奏されたものであり、これにより、本願の効果が実証された。【００９０】
（比較例１）
フェニルプレートの代わりに一般に汎用されているステンレスプレートを用いて、実施例１と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。【００９１】
図６に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示し、図７に、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示す。また、図８に、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルのみを示す。【００９２】
図６，７によれば、標識糖鎖イオンと未標識糖鎖イオンとの生成する領域が同一であること、換言すれば標識糖鎖の局在化が実現できていないことが判明した。また、図８では、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルのみを表示したが、図６，７中の各点の色の濃さに差異がないことからすれば、どの点をとっても、図８の結果が得られることが予想される。【００９３】
以上は、プレートに所定の加工を施さず従来のステンレスプレートを使用したことによって得られた結果であることが判る。【００９４】
（実施例２）
市販の糖タンパク質前立腺特異抗原を電気泳動後、リジルエンドプロテアーゼＣでゲル内消化し、ペプチドＮグリコシダーゼＦ消化を行ない、さらにＣ１８チップ素通り画分を得た。この画分を試料として実施例１で作成したフェニルプレートに載置し、以下実施例１と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。【００９５】
図９に、ペプチドイオン（ｍ／ｚ＝１０７５）のシグナル強度を示し、図１０に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）のシグナル強度を示す。また、図１１に、図９，１０中の点Ｄにおける質量スペクトルを示す。また、図１２に、図９，１０中の点Ｅにおける質量スペクトルを示す。図１１および１２の縦軸は最大値が同一になるように示してある。【００９６】
図９，１０によれば、ペプチドイオンと標識糖鎖イオンとの生成する領域が異なること、換言すればペプチドイオンと標識糖鎖との局在化が実現できていることが判明した。また、図１１，１２によれば、図９，１０の結果から所定の領域、即ち、図９，１０の各点の中で図１０の点の方が、色が濃い領域（例えば、点Ｅ）を選択した場合にのみ、所望のイオン（標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン）の他のイオンと比較した高いシグナル強度が選択的に得られることが判明した。【００９７】
以上の効果は、プレートに所定の加工を施して芳香族化合物を結合させたプレートを使用したことによって奏されたものであり、これにより、本願の効果が実証された。【００９８】
さらに、従来、測定試料中にペプチドが糖鎖とともに混在していると、ペプチドがイオン化し易いため、質量分析において糖鎖イオンはほとんど検出できなかった。しかしながら、実施例２では、ペプチドが糖鎖とともに混在していても、微小領域での局在化による両物質の分離が実現され、生体試料由来の微量糖鎖でも質量分析により同定が可能であることが予想される。【００９９】
（実施例３）
実施例３は、フェニルプレートを用いて糖ペプチドおよびペプチドの局在化を行った例である。まず、ＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドの精製は、以下のようにして行った。即ち、０．６ｍＬチューブにＰＳＡ−ＡＣＴ０．５μｇを含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液９５μＬと、１０Ｕ／μＬサーモライシン水溶液の５μLとを加えて混合溶液を撹拌し、５６．５℃で一晩インキュベーションした。この混合溶液を遠心エバポレーターで乾燥して乾燥物を得、当該乾燥物に、０．８%トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１５０μＬ加え、ヒートブロックを用い、８０℃で４０秒反応させてアシアロ化を行ったサンプルを得た。【０１００】
次いで、当該サンプルに、Ｈ２Ｏを加えて繰り返し乾燥させた。具体的には、当該サンプルに、Ｈ２Ｏ２０μＬ、エタノール２０μＬ、ブタノール８０μＬの順で加えてよく撹拌し、洗浄・平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲル浮遊液（１：１）を１０μＬ加えてよく撹拌した後、１時間振盪した。ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲルの洗浄・平衡化は、５０％エタノールで３回洗浄し、ブタノール／エタノール／水（４：１：１）の混合溶液で３回行った。振盪後、遠心して上清を捨て、これを繰り返して洗浄した。５０％エタノール１００μＬを加えて３０秒振盪し、遠心後上清を回収し、遠心エバポレーターで乾燥した。【０１０１】
最後に、フェニルプレートを用いた局在化およびＭＳ測定を、実施例１と同様に行った。即ち、６０％アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍＬＤＨＢＡの１μＬを滴下し、風乾させてＡＸＩＭＡ−ＱＩＴで測定を行った結果、ネガティブイオンＭＳスペクトルを図１３，１４に示す。なお、図１３は、ピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図１４は、ピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。【０１０２】
図１３，１４によれば、ピレン標識を行わなかった場合には、ペプチドのシグナルａのみが検出された。これに対し、ピレン標識を行った場合には、糖ペプチドのシグナルｂ，ｃ，ｄが特異的に検出されることが明らかになった。ポジティブイオンＭＳスペクトルにおいても同様の結果が得られた。【０１０３】
さらに、測定試料の特定の領域のＭＳスペクトルの例を図１５に示す。図１３，１４に示した、全測定点の平均スペクトルに比較して、糖ペプチドのみのシグナル強度が相対的に高くなる測定点が明らかに存在する、すなわち局在化していることが示された。【０１０４】
（実施例４）
実施例４は、Ｃ１８プレートとフェニルプレートとの間に、糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った例である。まず、Ｃ１８プレートおよびフェニルプレートの作製は、以下のようにして行った。即ち、フェニルプレートは実施例１と同様に作成した。なお、測定試料溶液を保持させるために、直径３ｍｍの穴の空いたＰＤＭＳ(ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ)樹脂製のシート（厚さ１００μm、外形はフェニルプレートと略同形状）を作製し、貼り付けた。貼り付けは、ＰＤＭＳシートの自己吸着により、接着剤等は用いていない。Ｃ１８プレートについてもフェニルプレートと同様に作製した。ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、[１−オクタデカンチオール]のエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥した。本例では、プレートにＣ１８を全面コートしたため、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを使用した。
糖ペプチドの調製は実施例３と同様に行った。【０１０５】
さらに、Ｃ１８プレートおよびフェニルプレートを用いた局在化およびＭＳ測定は以下のようにして行った。即ち、乾燥したＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドに５%アセトニトリルを１２．５μＬ加えて溶解した。ペプチドとして、４ｐｍｏｌ／μＬの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）断片（Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18-39 human, Sigma）を５%含むアセトニトリル溶液をＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドと等量混合し、測定試料とした。穴の空いたＰＤＭＳシートを貼り付けたフェニルプレートに試料溶液０．５μＬを滴下し、Ｃ１８プレートを上にかぶせ、重しを載せて密着させた。この密着体を、ヒートブロックの上に乗せ、この状態のまま４０℃で２．５時間放置し、溶媒を蒸発させた。フェニルプレートとＣ１８プレートを剥がした後、ＰＤＭＳシートをはがし、ピレン標識化のために、１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ）５００ｐｍｏｌの０．２５μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を滴下して、４０℃で放置し反応させた。乾燥させた後一晩真空デシケーター中でさらに乾燥した。【０１０６】
この乾燥物に、６０％アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）を１μＬ滴下し、風乾させてＡＸＩＭＡ−ＱＩＴで測定を行った結果、ネガティブイオンＭＳスペクトルを図１６，１７(フェニルプレートに関し)および１８，１９（Ｃ１８プレートに関し）に示す。なお、図１６，１８にはピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図１７，１９にはピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。【０１０７】
図１６〜１９によれば、いずれのプレートにおいても、ピレン標識を行わなかった場合には、ペプチドのシグナルａのみが検出された。なお、図１６によれば、ペプチドのシグナルが実施例３（図１３）の１／２に低下していることが判る。【０１０８】
これに対し、ピレン標識を行った場合には、Ｃ１８プレートには糖ペプチドのシグナルｂ，ｃ，ｄが検出されないが、フェニルプレートには特異的に検出されることが判る。なお、ポジティブイオンＭＳスペクトルにおいても同様の結果が得られた。【０１０９】
これら（実施例３と４）の結果から、実施例４では、フェニルプレート上の測定試料中の夾雑分子であるペプチドは、その上に重ねたＣ１８プレートに捕捉され、シグナル強度が低下したが、糖ペプチドはフェニルプレートに留まり局在化されてシグナルが低下しないことが判る。さらに、実施例４では、実施例３と比較してシグナル／ノイズ比が向上していることが示された。すなわち、実施例４は実施例３と比較してより効果的な局在化が実現されているといえる。なお、この効果は、同一プレート上にＣ１８結合部分およびフェニル基結合部分を配したものにおいても得られると考えられる。【０１１０】
（実施例５）
アミノプレートに糖ペプチドおよびペプチドを載せて、または、Ｃ８プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った。これらの例では、プレートの種類以外は実施例３および４と同様な操作を行った。実施例５において、Ｃ８プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチド等を挟んで局在化し、その後、これらのプレートを分離した後のアミノプレートに関する結果を、図２０，２１に示す。これに対し、実施例５において、アミノプレートに糖ペプチド等を載せて局在化し、その後、当該アミノプレートに関する結果を図２２，２３に示す。これらの図において、図２０、２２は、ピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図２１、２３は、ピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。【０１１１】
ピレン標識を行わないで測定した結果（図２０、２２）によれば、夾雑ペプチドのみが観測された。一方、ピレン標識を行って測定した結果（図２１、２３）によれば、Ｃ８を重ねずに局在化させたアミノプレートの場合（図２３）と比較して、Ｃ８プレートを重ねた場合（図２１）は、実施例４の場合と同等に、糖ペプチドのシグナル強度が優れた結果を示すことが判る。以上により、Ｃ８プレートとアミノプレートとを使用した場合にも、糖ペプチドとアミノプレートとの親和性が高く、夾雑ペプチド共存下であっても糖ペプチドのシグナルが観察されることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のプレート上での測定対象分子の局在化方法は、測定対象分子を洗い流すことなくプレート上でその十分な残量を確保することができるとともに、未知の測定対象分子の質量分析に使用でき、しかも複数の測定対象分子を同時に質量分析する場合にも使用できる。このため、当該方法は、生化学および医学等の分野で今後益々頻繁に使用されることが予想される、種々の分子の質量分析法に好適に適用することができる点で有望である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月12日(2009.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、
（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、前記第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程と、
（Ｂ１）前記第１プレートおよび前記第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、
（Ｂ２）前記第１プレートおよび前記第２プレートを分離する工程と、
（Ｃ）前記第１プレートおよび前記第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、前記第１プレートおよび前記第２プレートの少なくとも一方上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項２】
前記第１化合物および第２化合物のそれぞれは、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする、請求項１に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項３】
前記アリール基が、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基であることを特徴とする、請求項２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項４】
前記アルキル基が、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基であることを特徴とする、請求項２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項５】
前記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含み、前記工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を前記第２プレートで局在化することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項６】
工程（Ｂ２）および工程（Ｃ）の間に、
（Ｂ’）前記第１プレート上の前記生体試料、および前記第２プレート上の前記生体試料の少なくとも一方を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
【請求項７】
測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）請求項１〜６のいずれかに記載の方法により、前記第１プレート上の生体試料中の測定対象分子、および前記第２プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレート上での測定対象分子の局在化方法に関する。より詳細には、本発明は、プレート上で生体試料から測定対象物のみを選択的に局在化することができる方法に関する。本発明は、このような方法を用い、測定対象分子の高いシグナル強度が得られる質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体高分子であるタンパク質および／または糖鎖の高感度な質量分析法の開発が盛んに行なわれており、当該分析法が生化学および医学の分野に急速に普及しつつある。このような質量分析法は、例えば、生体分子の発現およびその機能に関する解析、ならびにバイオマーカー探索等に用いられる。
【０００３】
生体高分子が含有される生体試料中には、測定対象分子の他に多数の夾雑分子が混在する。このため、微量の測定対象分子を含む生体試料を高度に精製した場合には、測定対象分子の質量分析感度が検出感度未満になるおそれがあり、ひいては質量分析において当該分子を見逃すおそれもある。また、夾雑分子が測定対象分子に比して高いイオン化効率を有する場合には、測定対象分子の検出は困難である。
【０００４】
このような事情を考慮して、質量分析の前段階としての生体試料のイオン化に関する技術として、例えば以下のようなものが開示されている。
【０００５】
非特許文献１には、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）を用いて、チップ表面に官能基および／または抗体分子などを固定し、生体試料中の特定分子のみを捕捉、洗浄してレーザー照射によりイオン化を行なう技術が開示されている。
【０００６】
特許文献１には、例えば細胞培地またはこのような培地の精製フラクションにおける生体成分の表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量スペクトルプロフィルを作成することを含む、ターゲット分子の精製を監視する技術が開示されている。
【０００７】
【非特許文献１】特許庁ホームページ、試料室、標準技術集、一般、質量分析技術（マススペクトロメトリー）、２−１−３−１−１表面増強レーザー脱離イオン化（SELDI）（http://www.jpo.go.jp/shiryou/index.htm参照）
【特許文献１】特表２００５−５０９１７３号公報
【発明の開示】
【０００８】
非特許文献１および特許文献１に示す各技術に開示されている、プレート上の生体試料に対して所定の洗浄により測定対象分子のみを残留させる手法（ＳＥＬＤＩ）を、質量分析に先立って採用する場合には、生体試料を洗浄する際に、測定対象分子の一部が洗い流される。このため、測定対象分子が微量である場合および／または結合が弱い場合は、プレート上での測定対象分子の残量が極めて少なくなり、質量分析に際して、その分析感度が所望の検出感度を遥かに下回るおそれがある。
【０００９】
また、ＳＥＬＤＩを採用した後の質量分析は、測定対象分子が既知の場合には有効であるが、測定対象分子が未知の場合には当該分子がプレートから完全に除去されるおそれがあり有効でない。
【００１０】
さらに、ＳＥＬＤＩを採用した後の質量分析では、所定のチップを選択し所定の洗浄を行うことによって、含量が最大の、もしくは結合が最強の特定の種類のみの測定対象分子に限定してしまう可能性があるが、実際の質量分析の現場においては、ＳＥＬＤＩ測定１回分に使用する生体試料の量で、複数の測定対象分子を同時に分析することが望ましい場合もある。
【００１１】
本発明の目的は、（ａ）測定対象分子を洗い流すことなくプレート上でその十分な残量を確保することができ、（ｂ）未知の測定対象分子の質量分析に使用でき、（ｃ）複数の種類の測定対象分子を同時に質量分析する場合にも使用できる、プレート上での測定対象分子の局在化方法を提供することにある。また、本発明の目的は、このような方法を用い、測定対象分子の高いシグナル強度が得られる質量分析法を提供することにある。
【００１２】
本発明は、（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、（Ｂ）上記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、（Ｃ）上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む、プレート上での測定対象分子を局在化する方法に関する。ここで、プレート上に載置する生体試料には、少なくとも１種の測定対象分子が必ず含まれるものである。換言すれば、当該生体試料が夾雑分子のみからなる場合は除かれる。
【００１３】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、上記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことが望ましい。これらのうち、上記アリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基とすることができる。また、上記アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基とすることができる。
【００１４】
当該局在化方法は、プレート上で単一の測定対象分子を局在化することができることは勿論、プレート上で複数の測定対象分子を局在化することもできる。即ち、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、上記工程（Ａ）において、上記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、上記工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化させることができる。
【００１５】
当該局在化方法は、測定対象分子の局在化のみならず、夾雑分子の局在化も併せて行うことができる。即ち、上記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含む場合に、上記工程（Ａ）において、上記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、上記工程（Ｃ）において、上記プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化させることができる。
【００１６】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の間に、（Ｂ’）上記生体試料を誘導体化する工程をさらに含ませることが望ましい。
【００１７】
なお、上記測定対象分子は、例えば、糖鎖（遊離糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質など）とすることができる。
【００１８】
本発明は、測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）上記のいずれかの方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
【００１９】
本発明は、（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、上記第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程と、（Ｂ１）上記第１プレートおよび上記第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、（Ｂ２）上記第１プレートおよび上記第２プレートを分離する工程と、（Ｃ）上記第１プレートおよび上記第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、上記第１プレートおよび前記第２プレートの少なくとも一方上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む、プレート上での測定対象分子の局在化方法に関する。ここで、プレート上に載置する生体試料には、少なくとも１種の測定対象分子が必ず含まれるものである。換言すれば、当該生体試料が夾雑分子のみからなる場合は除かれる。
【００２０】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、上記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことが望ましい。これらのうち、上記アリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基とすることができる。また、上記アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基とすることができる。
【００２１】
当該局在化方法は、２枚のプレート上で異なる測定対象分子を局在化することができる。即ち、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、上記工程（Ｃ）において、第１プレートの測定対象分子とは異なる測定対象分子を上記第２プレートで局在化させることができる。
【００２２】
当該局在化方法は、２枚のプレートの各々において異なる測定対象分子を局在化することができるのみならず、２枚のプレートの各々において測定対象分子と夾雑分子の局在化を行うことができる。即ち、上記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含む場合に、上記工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を上記第２プレートで局在化させることができる。
【００２３】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、工程（Ｂ２）および工程（Ｃ）の間に、（Ｂ’）上記生体試料を誘導体化する工程をさらに含ませることが望ましい。
【００２４】
なお、上記測定対象分子は、例えば、糖鎖（遊離糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質など）とすることができる。
【００２５】
測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）上記のいずれかの方法により、上記第１プレート上の生体試料中の測定対象分子、および上記第２プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
【００２６】
本発明のプレート上での測定対象分子の局在化方法は、生体試料を載置するプレートに予め所定の表面処理（所定の化合物の結合）を施すことで、測定対象分子とプレートとの親和性を他の夾雑分子とプレートとの親和性よりも高めることができる。このため、プレート上で測定対象分子を含む生体試料を単に乾燥するだけで、プレート上に測定対象分子を選択的に十分に残留させることができる。
【００２７】
また、本発明の局在化方法は、ＳＥＬＤＩのように測定対象分子を洗い流すことなく、プレート上で乾燥する技法を採用するため、当然に未知の測定対象分子もプレート上に残留する。このため、当該方法は、質量分析を行う対象分子がたとえ未知であっても、適用することができる。
【００２８】
さらに、本発明の局在化方法は、ＳＥＬＤＩのように測定対象分子を洗い流さないため、乾燥した生体試料中に複数の測定対象分子を残留させることができる。このため、当該方法は、質量分析を行う測定対象分子がたとえ複数であっても、適用することができる。
【００２９】
加えて、以上のような効果を奏する本発明の局在化方法を用いた質量分析によれば、測定対象分子の十分なシグナル強度を得ることができるとともに、未知の測定対象分子に対処でき、しかも複数の測定対象分子を同時に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、実施例１に関し、得られた測定試料の写真である。
【図２】図２は、実施例１に関し、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）の分布を示す図である。
【図３】図３は、実施例１に関し、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を示す図である。
【図４】図４は、図２，３中の点Ａにおける質量スペクトルを示す図である。
【図５】図５は、図２，３中の点Ｂにおける質量スペクトルを示す図である。
【図６】図６は、比較例１に関し、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）の分布を示す図である。
【図７】図７は、比較例１に関し、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を示す図である。
【図８】図８は、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルを示す図である。
【図９】図９は、実施例２に関し、ペプチドイオン（ｍ／ｚ＝１０７５）の分布を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例２に関し、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布を示す図である。
【図１１】図１１は、図９，１０中の点Ｄにおける質量スペクトルを示す図である。
【図１２】図１２は、図９，１０中の点Ｅにおける質量スペクトルを示す図である。
【図１３】図１３は、実施例３において、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトル（全測定点の平均）を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例３において、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトル（全測定点の平均）を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例３において、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを特定領域に関して示す図である。
【図１６】図１６は、実施例４において、分離した後のフェニルプレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１７】図１７は、実施例４において、分離した後のフェニルプレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１８】図１８は、実施例４において、分離した後のＣ１８プレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１９】図１９は、実施例４において、分離した後のＣ１８プレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２０】図２０は、実施例５において、分離した後のアミノプレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２１】図２１は、実施例５において、分離した後のアミノプレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２２】図２２は、実施例５において、アミノプレートの、ピレン標識を行わなかった場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図２３】図２３は、実施例５において、アミノプレートの、ピレン標識を行った場合のネガティブイオンのＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらの範囲に限定されるものではなく、当業者の通常の創作能力の範囲で適宜変更することができる。
【００３２】
＜プレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ１）＞
本発明のプレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）は、（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、（Ｂ）上記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、（Ｃ）上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む方法である。ここで、測定対象分子とは、当該局在化方法を実施した後に行なう質量分析法において測定対象とする分子を意味する。
【００３３】
[プレートを用意する工程]
（プレート）
プレートは、生体試料中の測定対象分子および夾雑分子の少なくとも一方を捕捉することが可能な官能基が結合されているものであれば特に限定されず、金属プレート、非金属膜のいずれとすることもできる。また、プレートはその表面を平面状、凹凸状等、いかなる形状とすることもでき、さらに多孔性とすることもできる。さらに、プレートには所定の官能基が直接結合されていなくてもよく、例えば、プレートと当該官能基との間のスペーサ部分またはポリマーが介在していてもよい。
【００３４】
プレート上で測定対象分子を捕捉する例（タイプ１−１）としては、アリール基を結合させたプレート、ジヒドロキシボリル基を結合させたプレート、アミノ基を結合させたプレート、またはヒドロキシ基を結合させたプレートを使用する例が挙げられる。これらのプレートは、測定対象分子との親和性が他の夾雑分子との親和性より高くなるようなプレートの一例である。特に、測定対象分子にピレン標識化を施す場合は、アリール基を結合させたプレートを使用することが、標識された測定対象分子とプレートとの高い親和性が実現され、局在化が良好に達成される点で好ましい。また、測定対象分子に糖鎖が含まれる場合は、ジヒドロキシボリル基を結合させたプレート、アミノ基を結合させたプレート、ヒドロキシ基を結合させたプレートなどを使用することが、糖鎖を含む測定対象分子とプレートとの高い親和性が実現され、局在化が良好に達成される点で好ましい。
【００３５】
これに対し、プレートの一部に、夾雑分子と親和性のある官能基（たとえばＣ４、Ｃ８、Ｃ１８など）を結合させることにより、プレート上で任意選択的に誘導体化された夾雑分子を捕捉し、プレート上で測定対象分子と夾雑分子とを分離して、測定対象分子の局在化を図ることもできる（タイプ１−２）。
【００３６】
さらに、上記タイプ１，２の組み合わせとして、プレート上に測定対象分子と夾雑分子との双方を別々に捕捉し、プレート上で測定対象分子と夾雑分子とを分離して、測定対象分子の局在化を図ることもできる（タイプ１−３）。このような場合には、例えば、測定対象分子の誘導体化と夾雑分子の誘導体化に応じた所定の官能基を適宜選択して、各誘導体化分子と親和性のある当該官能基をプレートの別の領域に結合し、各分子の局在化領域を分離することができる。
【００３７】
なお、上記タイプ１−１〜１−３のいずれにおいても、プレート上で、複数種類の測定対象分子および／または複数種類の夾雑分子を捕捉し、所定の複数の測定対象分子の局在化を図ることもできる。このような場合には、所定の測定対象分子および／または夾雑分子に応じた異なる誘導体化を行うとともに、各分子と親和性のあるそれぞれの官能基をプレートに別々の結合し、それぞれ局在する領域を分離してもよい。あるいは、それぞれに親和性のある官能基を結合したプレートを用いて順番に挟んで、それぞれのプレートに分子ごとに捕捉して分離することもできる。
【００３８】
（プレートの作成方法）
以下に、このようなタイプ１−１〜１−３のプレートの一例として、アリール基を結合させたプレートの作成方法を説明する。
【００３９】
アリール基を結合させたプレートの作成方法は特に限定されないが、例えば以下のように作成することができる。即ち、プレートへのアリール基導入は、例えば、Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法（Ｈａｒｖａｒｄ大ＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓらＬａｎｇｍｕｉｒ・Ｖｏｌ．１０．１４９８−１５１１（１９９４）に従って行うことができる。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、この板材をベンジルメルカプタン [α−トルエンチオール]のエタノール希釈液に所定時間浸して風乾する。次いで、この板材を別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプする。板材に存在する化合物のメルカプト基が、金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合を生じ、自己組織化単分子膜（ＳＡＭｓ）を形成する。最後に、Ａｕ基板をエタノールで洗浄、乾燥し、フェニル基を結合させたプレートを得ることができる。Ａｕ基板へのアリール基の塗布態様は、上記スタンプに限られず、スピンコート、ロールコート、スクリーン印刷等の各種塗布方法を採用することもできる。
【００４０】
ここで使用する基板の金属材料としては、チオールが吸着可能な金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、またはこれらの合金が使用可能である。これらの中でも、大気中で表面酸化が進行しない、安定に作製可能な金が実用上好ましい。
【００４１】
なお、アリール基をプレートの全面に均一に結合させる場合には、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを準備することが、アリール基がＡｕ基板の端まで均一に導入されるという理由により肝要である。
【００４２】
このようなプレートへのアリール基の導入においては、アリール基をプレートの全面に均一に結合させることはもちろん、不均一に結合させることもできる。例えば、プレート上にアリール基をドット状に結合させ、またはアリール基をドーナツ状に結合させることができる。
【００４３】
本発明におけるアリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基などの単環式の基であってもよいし、またはナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、ベンゾチアゾリル基などの縮合多環式の基であってもよい。また、一種類のアリール基のみでなく、複数種類のアリール基をプレートに導入することもできる。このような場合には、例えば、複数のアリール基を混合して導入してもよいし、アリール基の種類によってプレート上でのその導入領域を分けて偏在させてもよい。なお、アリール基には、ＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＮＨ2、ＮＯ2、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ3、ＣＮなどの官能基が結合していてもよい。
【００４４】
さらに、アリール基と、他の化合物、例えばボロン酸とを混合して同一のプレートに存在させることもでき、これらを別領域に分けて導入してもよい。
【００４５】
プレートに導入する官能基は、アルキル基（例えばＣ４、Ｃ８、Ｃ１８など）であってもよい。さらに、これらのアルキル基にＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＮＨ2、ＮＯ2、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ3、ＣＮなどの官能基が結合していてもよい。
【００４６】
さらに、同一分子に２個以上の単一官能基または複数の官能基が結合したものを導入してもよい。
【００４７】
[測定対象分子を含む生体試料を載置する工程]
（測定対象分子）
「測定対象分子」とは、糖、糖鎖、タンパク質、核酸、複合糖質（糖タンパク質、糖脂質など）などであって、天然から調製する他、化学的または酵素学的に調製するものを含む。なお、本発明における用語「タンパク質」はペプチドを含み、本発明における用語「糖タンパク質」は糖ペプチドを含む。タンパク質は糖鎖、リン酸などを含めて修飾がなされていてもよい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものまたは生体に含まれる分子を模倣して作製されたものを含む。
【００４８】
測定対象分子は、そのまま利用してもよいが、一部誘導体化することで、プレート上における各点での、誘導体化した測定対象物質と標識化していない測定対象物質との分布を比較した局在化確認により、質量分析を可能とすることができる。誘導体化はプレートに載置する前におこなってもよいし、プレートに測定対象分子を載置して乾燥した後に行ってもよい。また、誘導体化は標識化合物を用いた標識化であってもよい。以下、誘導体化について詳述する。
【００４９】
糖、糖鎖、または複合糖質から化学的あるいは酵素学的に遊離して得た糖鎖（以下糖鎖とする）は、還元末端にある糖のアルデヒド基と、アミノ基あるいはヒドラジド基（−ＣＯＮＨＮＨ2）などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物とを縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を与える。縮合反応は、通常、メタノールまたはＤＭＳＯなどの有機溶媒中で、触媒としての酢酸などの存在下または非存在下において、糖鎖と標識化合物とを加温して行う。その後、ＮａＣＮＢＨ3、ＮａＢＨ4などの還元剤を加えて、加温または室温で還元反応を行う。あるいはまた、縮合反応溶液中に始めから還元剤を共存させる場合もある。還元末端の糖のアルデヒド基とＰＢＨとを縮合させることにより標識する方法では、［Ｍ＋Ｎａ］+あるいは［Ｍ−Ｈ］-などの親イオンの安定性が低く感度が劣っている。このため、還元反応をさらに行うことで親イオンを多く生成することができる。
【００５０】
また、糖、糖鎖または複合糖質の中でもシアル酸を含むものについては、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用いて、シアル酸のカルボキシ基と、標識化合物のアミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などとを反応させることによって標識できる。この反応は、例えば、水溶性カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド存在下で行う。
【００５１】
さらに、シアル酸を含む糖、糖鎖、または複合糖質は、シアル酸のＣ7-9位のみを選択的に過ヨウ素酸酸化してアルデヒド基を生じさせることができる。シアル酸のＣ7-9位の選択的酸化は、５ｍＭのＮａＩＯ4水溶液中で０℃、１０〜２０分間にわたり反応させることによって実施することができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物を用いて、上記の選択的酸化により生じたアルデヒド基と、標識化合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を得ることができる。
【００５２】
あるいは、多くの糖、糖鎖、または複合糖質は、非還元末端にガラクトースを含む。その非還元末端のガラクトースを特異的にガラクトースオキシダーゼによってＣ6位を酸化しアルデヒド基を生じさせることができる。酵素反応は、たとえば、中性の緩衝液中で、室温、２時間で行うことができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物を用いて、上記の酵素的酸化により生じたアルデヒド基と、標識化合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を得ることができる。
【００５３】
ガラクトースに標識を行うこれらの方法を、糖タンパク質（糖ペプチドを含む）分子上のシアル酸、ガラクトースなどに適用することが可能である。その場合、糖タンパク質分子を標識できるので、該分子のイオン化効率が高くなる。
【００５４】
タンパク質（ペプチドを含む）および糖タンパク質（糖ペプチドを含む）は、その中に含まれるカルボキシ基、アミノ基、またはＳＨ基を用いて標識することができる。カルボキシ基を用いて標識する場合には、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のカルボキシ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。一方、アミノ基を用いて標識する場合には、スクシニミジルエステル基、塩化スルホニル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のアミノ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。さらに、タンパク質または糖タンパク質に含まれるシステイン残基のＳＨ基を用いて標識する場合には、ヨード基（−Ｉ）などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のＳＨ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。
【００５５】
標識化合物は、芳香族化合物であっても、縮合多環炭化水素誘導体であってもよい。「芳香族化合物」とは、芳香族環部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、該芳香族環部分と反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物を含む。ここで、芳香族環部分は、ベンゼン環、チオフェン環、ピロール環、ピリジン環などの単環式芳香族環、またはナフタレン環、アントラセン環、ピレン環、キノリン環、インドール環、アクリジン環、ベンゾチアゾール環などの縮合芳香族環であってもよい。「縮合多環炭化水素誘導体」とは、ナフタレン、アントラセン、ピレンなどの縮合多環炭化水素部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、該縮合多環炭化水素と該反応性官能基とを連結するスぺーサ部分とを有する化合物をいう。
【００５６】
本発明で用いる標識化合物は、好ましくはピレン誘導体化合物である。「ピレン誘導体化合物」とは、ピレン環と、分析対象の分子に結合することが可能である反応性官能基と、該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。具体的には、１−ピレニルジアゾメタン(1-pyrenyldiazomethane)、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸ヒドラジド（1-pyreneacetic acid, hydrazide）、１−ピレンプロピオン酸ヒドラジド（1-pyrenepropionic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸スクシニミジルエステル（1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンプロピオン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンブタン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレンブタノイル）システイン酸スクシニミジルエステル（N-(1-pyrenebutanoyl)cysteic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrene) iodoacetamide）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードマレイミド（N-(1-pyrene) maleimide）、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrenemethyl) iodoacetamide）、１−ピレンメチルヨードアセテート（1-pyrenemethyl iodoacetate）、アミノピレン（aminopyrene）、１−ピレンメチルアミン（1-pyrenemethyl amine）、１−ピレンプロピルアミン（3-(1-pyrenyl)propylamine）、１−ピレンブチルアミン（4-(1-pyrenyl)butylamine）、１−ピレンスルホン酸クロリド（1-pyrenesulfonyl chloride）１−ピレニルジアゾメタンなどが挙げられる。これらの中でも、１−ピレニルジアゾメタンを用いることが、反応性が高い点で好ましい。
【００５７】
また、誘導体化の例として、芳香族基を含まない、アルキル化を行ってもよい。
【００５８】
（生体試料の載置方法）
生体試料の載置工程では、誘導体化後の測定分子または誘導体化しない測定分子を、適当な溶媒に溶解し、ピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。乾燥は、室温に放置しても、分子が変化しなければ加温してもよい。必要に応じて、引き続き誘導体化反応を行なう。
【００５９】
[プレート上で測定対象分子を局在化する工程]
（マトリックス）
事後的な質量分析におけるマトリックスの役割は、照射されたレーザーの光エネルギーを吸収しマトリックス自身がイオン化を起こして測定対象分子との間でプロトンまたは電子などを受け渡すというものである。マトリックスは、その種類によって固有の光エネルギー吸収帯があるので、照射するレーザーによって使用するマトリックスも異なる。また、マトリックスは、光エネルギーの吸収以外にも、測定対象分子を分子レベルで均一に分散させる分散剤としての役割も有する。このため、測定する分子の違い（タンパク質、核酸、糖類、脂質など）によってマトリックスを適宜選択することが重要である。
【００６０】
このようなマトリックスとしては、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、シナピン酸（ＳＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）、ｎｏｒｈａｒｍａｎ、６−ａｚａ−２−ｔｈｉｏｔｈｙｍｉｎｅ（６−ＡＴＴ）、２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ等を使用することができる。高い局在化を達成するためには、マトリックス濃度を適宜選択することが好ましい。具体的には、マトリックス濃度は、測定試料によって選択する必要がある。マトリックス濃度は、例えば０．１〜２０  ｍｇ／ｍｌとすることが特に好ましく、２〜１０ｍｇ／ｍｌとすることが、結晶形を制御できる点で極めて好ましい。
【００６１】
（溶媒）
マトリックスを溶解する溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリル等、およびこれらと水との混液を使用することができる。特に、アセトニトリルと水との混液を使用することが、試料およびマトリックスとよく混和し、その後の局在化を実現する点で好ましい。高い局在化を達成するためには、溶媒濃度を適宜選択することが好ましい。具体的には、溶媒濃度は、測定試料によって選択する必要がある。溶媒濃度、例えば、アセトニトリル濃度は、０〜１００％とすることが好ましく、特に、４０〜９０％とすることが、乾燥時間および／または乾燥過程を制御できる点で特に好ましい。
【００６２】
（測定対象分子の局在化方法）
マトリックスと溶媒との混合は、特に限定するものではなく、公知のいかなる技術を使用することもできる。例えば、ＤＨＢＡ（高純度マトリックス試薬、島津ジーエルシー製）５ｍｇを、４０％のアセトニトリルを含有する水０．５ｍｌに溶解し、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ溶液を用時調製する。この際、必要に応じて遠心分離した上清を用いる。  
プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程では、まず、測定試料を載置した部位を覆うようにマトリックス溶液をピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。この段階で、測定対象分子が再溶解してマトリックスとの混合溶液となる。
【００６３】
次に、混合溶液を乾燥することで、測定対象分子が再移動して局在化を実現する。具体的には、室温に放置しても、分子が変化しなければ加温してもよい。当該乾燥は、測定分子によるが、局在化が十分に起こる時間で行う。乾燥時間は、２分〜２４時間とすることが好ましい。さらに、分析時間の短縮、試料および結晶形態などを変化させない観点から、５分〜３０分とすることがさらに好ましい。
【００６４】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ１）によれば、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、工程（Ａ）において、プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化することができる。また、生体試料が少なくとも１種の夾雑分子を含む場合に、工程（Ａ）において、プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、工程（Ｃ）において、プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化することができる。
【００６５】
＜プレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ２）＞
[プレートを用意する工程]
タイプ２において、プレートを用意する工程には、（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程とが含まれる。
【００６６】
本工程において用いるプレートの種類については、上記したタイプ１と同様である。ただし、第１プレートと第２プレートとでは、異なる化合物を結合させる。これにより、後述するように、異なるプレートで異種の測定対象分子を局在化させることができる。
【００６７】
[測定対象分子を含む生体試料を載置する工程]
タイプ２において、測定対象分子を含む生体試料を載置する工程には、（Ｂ１）第１プレートおよび第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、（Ｂ２）第１プレートおよび第２プレートを分離する工程とが含まれる。
【００６８】
本工程において用いる測定対象分子の種類については、上記したタイプ１と同様である。第１プレートと第２プレートとにより測定対象分子を含む生体試料を挟む際には、重しなどを置いてよく密着させることが、局在化を高効率で行うことができる点で好ましい。また、生体試料の乾燥の際には、適当な時間をかけて乾燥し、さらに完全に乾燥することが、局在化を高効率に達成できる点で好ましい。例えば、室温〜４５℃で、３０分〜２４時間かけて乾燥することが好ましい。
【００６９】
[プレート上で測定対象分子を局在化する工程]
タイプ２において、プレート上で測定対象分子を局在化する工程は、（Ｃ）第１プレートおよび第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、プレート上で測定対象分子を局在化する工程である。
【００７０】
本工程において用いるマトリックス、および溶媒の種類については、上記したタイプ１と同様である。
【００７１】
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ２）によれば、生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、工程（Ｃ）において、第１プレートの測定対象分子とは異なる測定対象分子を第２プレートで局在化することができる。また、生体試料が少なくとも１種の夾雑分子を含む場合に、工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を第２プレートで局在化することができる。
【００７２】
＜質量分析法（タイプ１）＞
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
（１）プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）により、プレート上で測定対象分子を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む方法である。
【００７３】
（工程（１））
工程１は、上記したプレート上での測定対象分子の局在化方法を行なう工程である。当該工程は、上述したとおりである。
【００７４】
（工程（２））
工程２は、工程１で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程である。
【００７５】
「質量分析法」とは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、レーザー脱離（ＬＤ）法、高速電子衝撃（ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学（ＡＰＣＩ）法などのイオン化方法によって分子を含む試料をイオン化し、次いで、飛行時間法（タイムオブフライト法、ＴＯＦ法）、二重収束法、四重極集束法などを用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する方法である。
【００７６】
本発明においてイオン化法は限定されないが、好ましくは、ＬＤ法、ＦＡＢ法、またはＭＡＬＤＩ法であり、より好ましくは、ＭＡＬＤＩ法である。
【００７７】
ＭＡＬＤＩ法においては、メチル化または縮合多環炭化水素が分子に結合していることで、イオン化効率が高くなる。
【００７８】
糖、糖鎖、タンパク質、糖など修飾を含むタンパク質、核酸、糖脂質などの分子は、分子量および組成が同一の構造異性体が存在するので、縮合多環炭化水素誘導体による標識化後、プリカーサーイオンの生成を高めて、ＭＳn（ｎ＞１）解析を行い、異性体に特異的なイオンを生成して構造情報を得ることができる。糖ペプチドまたは糖タンパク質の糖鎖部分に標識した分子をＭＳn（ｎ＞１）解析する場合、標識を含むプロダクトイオンを選択することによって、分子中の糖鎖結合位置を決定することができる。
【００７９】
当該タイプ１の質量分析方法においては、当該技術分野で通常用いられるいかなる方法を用いることもできる。
【００８０】
＜質量分析法（タイプ２）＞
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
（１）プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ２）により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む方法である。
【００８１】
（工程（１））、（工程（２））、および用語「質量分析法」等については、上記の、プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）と同様である。
【００８２】
当該タイプ２の質量分析方法においても、当該技術分野で通常用いられるいかなる方法を用いることもできる。
【実施例】
【００８３】
以下に、本発明の効果を実施例に基づいて実証する。
【００８４】
（実施例１）
１−１．フェニルプレートの作成
Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法に従って、プレートへのフェニル基導入を行なった。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、ベンジルメルカプタン [α−トルエンチオール]のエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥してフェニルプレートを得た。本例では、プレートにフェニル基を全面コートしたため、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを使用した。
【００８５】
１−２．測定対象分子の局在化および質量分析
上記のように事前に作成したプレート上に、糖鎖１(５００ｆｍｏｌ)を載置し、乾燥させた。その上に、１−ピレニルジアゾメタン５００ｐｍｏｌ含有ＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、２５分にわたって４０℃に加熱して乾燥させることにより、一部ピレン標識化された標識糖鎖１を得た。マトリックスとしてＤＨＢＡ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液、４０％アセトニトリル）０．５μＬを、試料を覆うように滴下し室温で乾燥して、図１に示す標識糖鎖含有測定試料１を調製した。
【００８６】
得られた測定試料１を、Ｘ×Ｙ＝２１×２１の合計４４１の領域に分割し、質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ、島津製作所）のラスタースキャンによって各領域のネガティブイオンを測定した。ラスタースキャンによって得られた各領域の測定ファイルの情報を測定位置座標（ｘ、ｙ）、ｍ／ｚおよびシグナル強度を含むテキストに変換した。当該テキスト変換したデータに基づいて、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布および未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）の分布を、公開ソフトＧｒａｐｈ−Ｒを用いて二次元に表示した。
【００８７】
図２に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示し、図３に、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示す。また、図４に、図２，３中の点Ａにおける質量スペクトルを示す。また、図５に、図２，３中の点Ｂにおける質量スペクトルを示す。図４および５の縦軸は最大値が同一になるように示してある。
【００８８】
図２，３によれば、標識糖鎖イオンと未標識糖鎖イオンとの生成する領域が異なること、換言すれば標識糖鎖の局在化が実現できていることが判明した。また、図４，５によれば、図２，３の結果から所定の領域、即ち、図２，３の各点の中で図２の点の方が、色が濃い領域（例えば、点Ａ）を選択した場合にのみ、所望のイオン（標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン）の他のイオンと比較した高いシグナル強度が選択的に得られることが判明した。
【００８９】
以上の効果は、プレートに所定の加工を施してアリール基（フェニル基）を結合させたプレートを使用したことによって奏されたものであり、これにより、本願の効果が実証された。
【００９０】
（比較例１）
フェニルプレートの代わりに一般に汎用されているステンレスプレートを用いて、実施例１と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。
【００９１】
図６に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示し、図７に、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示す。また、図８に、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルのみを示す。
【００９２】
図６，７によれば、標識糖鎖イオンと未標識糖鎖イオンとの生成する領域が同一であること、換言すれば標識糖鎖の局在化が実現できていないことが判明した。また、図８では、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルのみを表示したが、図６，７中の各点の色の濃さに差異がないことからすれば、どの点をとっても、図８の結果が得られることが予想される。
【００９３】
以上は、プレートに所定の加工を施さず従来のステンレスプレートを使用したことによって得られた結果であることが判る。
【００９４】
（実施例２）
市販の糖タンパク質前立腺特異抗原を電気泳動後、リジルエンドプロテアーゼＣでゲル内消化し、ペプチドＮグリコシダーゼＦ消化を行ない、さらにＣ１８チップ素通り画分を得た。この画分を試料として実施例１で作成したフェニルプレートに載置し、以下実施例１と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。
【００９５】
図９に、ペプチドイオン（ｍ／ｚ＝１０７５）のシグナル強度を示し、図１０に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）のシグナル強度を示す。また、図１１に、図９，１０中の点Ｄにおける質量スペクトルを示す。また、図１２に、図９，１０中の点Ｅにおける質量スペクトルを示す。図１１および１２の縦軸は最大値が同一になるように示してある。
【００９６】
図９，１０によれば、ペプチドイオンと標識糖鎖イオンとの生成する領域が異なること、換言すればペプチドイオンと標識糖鎖との局在化が実現できていることが判明した。また、図１１，１２によれば、図９，１０の結果から所定の領域、即ち、図９，１０の各点の中で図１０の点の方が、色が濃い領域（例えば、点Ｅ）を選択した場合にのみ、所望のイオン（標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン）の他のイオンと比較した高いシグナル強度が選択的に得られることが判明した。
【００９７】
以上の効果は、プレートに所定の加工を施して芳香族化合物を結合させたプレートを使用したことによって奏されたものであり、これにより、本願の効果が実証された。
【００９８】
さらに、従来、測定試料中にペプチドが糖鎖とともに混在していると、ペプチドがイオン化し易いため、質量分析において糖鎖イオンはほとんど検出できなかった。しかしながら、実施例２では、ペプチドが糖鎖とともに混在していても、微小領域での局在化による両物質の分離が実現され、生体試料由来の微量糖鎖でも質量分析により同定が可能であることが予想される。
【００９９】
（実施例３）
実施例３は、フェニルプレートを用いて糖ペプチドおよびペプチドの局在化を行った例である。まず、ＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドの精製は、以下のようにして行った。即ち、０．６ｍＬチューブにＰＳＡ−ＡＣＴ０．５μｇを含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液９５μＬと、１０Ｕ／μＬサーモライシン水溶液の５μLとを加えて混合溶液を撹拌し、５６．５℃で一晩インキュベーションした。この混合溶液を遠心エバポレーターで乾燥して乾燥物を得、当該乾燥物に、０．８%トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１５０μＬ加え、ヒートブロックを用い、８０℃で４０秒反応させてアシアロ化を行ったサンプルを得た。
【０１００】
次いで、当該サンプルに、Ｈ2Ｏを加えて繰り返し乾燥させた。具体的には、当該サンプルに、Ｈ2Ｏ２０μＬ、エタノール２０μＬ、ブタノール８０μＬの順で加えてよく撹拌し、洗浄・平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲル浮遊液（１：１）を１０μＬ加えてよく撹拌した後、１時間振盪した。ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲルの洗浄・平衡化は、５０％エタノールで３回洗浄し、ブタノール／エタノール／水（４：１：１）の混合溶液で３回行った。振盪後、遠心して上清を捨て、これを繰り返して洗浄した。５０％エタノール１００μＬを加えて３０秒振盪し、遠心後上清を回収し、遠心エバポレーターで乾燥した。
【０１０１】
最後に、フェニルプレートを用いた局在化およびＭＳ測定を、実施例１と同様に行った。即ち、６０％アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍＬＤＨＢＡの１μＬを滴下し、風乾させてＡＸＩＭＡ−ＱＩＴで測定を行った結果、ネガティブイオンＭＳスペクトルを図１３，１４に示す。なお、図１３は、ピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図１４は、ピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。
【０１０２】
図１３，１４によれば、ピレン標識を行わなかった場合には、ペプチドのシグナルａのみが検出された。これに対し、ピレン標識を行った場合には、糖ペプチドのシグナルｂ，ｃ，ｄが特異的に検出されることが明らかになった。ポジティブイオンＭＳスペクトルにおいても同様の結果が得られた。
【０１０３】
さらに、測定試料の特定の領域のＭＳスペクトルの例を図１５に示す。図１３，１４に示した、全測定点の平均スペクトルに比較して、糖ペプチドのみのシグナル強度が相対的に高くなる測定点が明らかに存在する、すなわち局在化していることが示された。
【０１０４】
（実施例４）
実施例４は、Ｃ１８プレートとフェニルプレートとの間に、糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った例である。まず、Ｃ１８プレートおよびフェニルプレートの作製は、以下のようにして行った。即ち、フェニルプレートは実施例１と同様に作成した。なお、測定試料溶液を保持させるために、直径３ｍｍの穴の空いたＰＤＭＳ(ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ)樹脂製のシート（厚さ１００μm、外形はフェニルプレートと略同形状）を作製し、貼り付けた。貼り付けは、ＰＤＭＳシートの自己吸着により、接着剤等は用いていない。Ｃ１８プレートについてもフェニルプレートと同様に作製した。ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、[１−オクタデカンチオール]のエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥した。本例では、プレートにＣ１８を全面コートしたため、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを使用した。
糖ペプチドの調製は実施例３と同様に行った。
【０１０５】
さらに、Ｃ１８プレートおよびフェニルプレートを用いた局在化およびＭＳ測定は以下のようにして行った。即ち、乾燥したＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドに５%アセトニトリルを１２．５μＬ加えて溶解した。ペプチドとして、４ｐｍｏｌ／μＬの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）断片（Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18-39 human, Sigma）を５%含むアセトニトリル溶液をＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドと等量混合し、測定試料とした。穴の空いたＰＤＭＳシートを貼り付けたフェニルプレートに試料溶液０．５μＬを滴下し、Ｃ１８プレートを上にかぶせ、重しを載せて密着させた。この密着体を、ヒートブロックの上に乗せ、この状態のまま４０℃で２．５時間放置し、溶媒を蒸発させた。フェニルプレートとＣ１８プレートを剥がした後、ＰＤＭＳシートをはがし、ピレン標識化のために、１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ）５００ｐｍｏｌの０．２５μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を滴下して、４０℃で放置し反応させた。乾燥させた後一晩真空デシケーター中でさらに乾燥した。
【０１０６】
この乾燥物に、６０％アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）を１μＬ滴下し、風乾させてＡＸＩＭＡ−ＱＩＴで測定を行った結果、ネガティブイオンＭＳスペクトルを図１６，１７(フェニルプレートに関し)および１８，１９（Ｃ１８プレートに関し）に示す。なお、図１６，１８にはピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図１７，１９にはピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。
【０１０７】
図１６〜１９によれば、いずれのプレートにおいても、ピレン標識を行わなかった場合には、ペプチドのシグナルａのみが検出された。なお、図１６によれば、ペプチドのシグナルが実施例３（図１３）の１／２に低下していることが判る。
【０１０８】
これに対し、ピレン標識を行った場合には、Ｃ１８プレートには糖ペプチドのシグナルｂ，ｃ，ｄが検出されないが、フェニルプレートには特異的に検出されることが判る。なお、ポジティブイオンＭＳスペクトルにおいても同様の結果が得られた。
【０１０９】
これら（実施例３と４）の結果から、実施例４では、フェニルプレート上の測定試料中の夾雑分子であるペプチドは、その上に重ねたＣ１８プレートに捕捉され、シグナル強度が低下したが、糖ペプチドはフェニルプレートに留まり局在化されてシグナルが低下しないことが判る。さらに、実施例４では、実施例３と比較してシグナル／ノイズ比が向上していることが示された。すなわち、実施例４は実施例３と比較してより効果的な局在化が実現されているといえる。なお、この効果は、同一プレート上にＣ１８結合部分およびフェニル基結合部分を配したものにおいても得られると考えられる。
【０１１０】
（実施例５）
アミノプレートに糖ペプチドおよびペプチドを載せて、または、Ｃ８プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った。これらの例では、プレートの種類以外は実施例３および４と同様な操作を行った。実施例５において、Ｃ８プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチド等を挟んで局在化し、その後、これらのプレートを分離した後のアミノプレートに関する結果を、図２０，２１に示す。これに対し、実施例５において、アミノプレートに糖ペプチド等を載せて局在化し、その後、当該アミノプレートに関する結果を図２２，２３に示す。これらの図において、図２０、２２は、ピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図２１、２３は、ピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。
【０１１１】
ピレン標識を行わないで測定した結果（図２０、２２）によれば、夾雑ペプチドのみが観測された。一方、ピレン標識を行って測定した結果（図２１、２３）によれば、Ｃ８を重ねずに局在化させたアミノプレートの場合（図２３）と比較して、Ｃ８プレートを重ねた場合（図２１）は、実施例４の場合と同等に、糖ペプチドのシグナル強度が優れた結果を示すことが判る。以上により、Ｃ８プレートとアミノプレートとを使用した場合にも、糖ペプチドとアミノプレートとの親和性が高く、夾雑ペプチド共存下であっても糖ペプチドのシグナルが観察されることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のプレート上での測定対象分子の局在化方法は、測定対象分子を洗い流すことなくプレート上でその十分な残量を確保することができるとともに、未知の測定対象分子の質量分析に使用でき、しかも複数の測定対象分子を同時に質量分析する場合にも使用できる。このため、当該方法は、生化学および医学等の分野で今後益々頻繁に使用されることが予想される、種々の分子の質量分析法に好適に適用することができる点で有望である。
【０１１３】
上述のように本発明の一つ態様としては以下のものを挙げることができる。
１．（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、
（Ｂ）前記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、
（Ｃ）前記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、前記プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子を局在化する方法。
２．前記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする、１に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
３．前記アリール基が、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基であることを特徴とする、２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
４．前記アルキル基が、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基であることを特徴とする、２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
５．前記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含み、前記工程（Ａ）において、前記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化することを特徴とする、１〜４のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
６．前記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含み、前記工程（Ａ）において、前記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程（Ｃ）において、前記プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化することを特徴とする、１〜４のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
７．工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の間に、
（Ｂ’）前記生体試料を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、１〜６のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
８．  測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）請求項１〜７のいずれかに記載の方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。
【国際調査報告】
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