(57)【要約】本発明は、高い安定性と結合活性を有する酸化亜鉛結合性抗体と、これを利用したバイオセンサ等のハイスループットなセンシング技術に関する。具体的には、本発明は、ラクダ抗体のＣＤＲ  Ｈ−１領域に酸化亜鉛認識ペプチドを含むペプチド移植抗体、及び前記抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体（バイオセンサ、プロテインチップ等）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクダ抗体のＣＤＲ  Ｈ−１領域にＥＡＨＶＭＨＫを含むアミノ酸配列からなる酸化亜鉛認識ペプチドを含むペプチド移植抗体、あるいは前記ペプチド移植抗体のＣＤＲ  Ｈ−３領域にさらに変異を有し、かつ前記ペプチド移植抗体より高い酸化亜鉛親和性を有する変異体からなる、酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項２】
前記変異体がＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＸＸＨＸＸＨＸＸＨあるいはＨＸＸＨＸＸＨＸＸＲからなるペプチド（但し、ＸはＧ、Ｌ、Ｒ、又はＶである）を含むものである、請求項１に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項３】
前記変異体がＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＬＧＨＧＧＨＲＬＨ、ＨＬＧＨＧＧＨＧＬＨ、ＨＶＧＨＧＬＨＧＶＲ、又はＨＬＧＨＧＬＨＲＶＨからなるペプチドを含むものである、請求項１に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項４】
酸化亜鉛との解離平衡定数Ｋｄが１．７ｘ１０−７［Ｍ］より小さいことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項５】
酸化亜鉛との解離平衡定数Ｋｄが９．５ｘ１０−９［Ｍ］より小さいことを特徴とする、請求項４に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項６】
前記酸化亜鉛認識ペプチドがＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰである、請求項５に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項７】
ラクダ抗体のＣＤＲ  Ｈ−１領域にＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰからなる酸化亜鉛認識ペプチドを含み、かつ、ＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＬＧＨＧＬＨＲＶＨからなるペプチドを含む、酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項８】
前記ラクダ抗体が、ＣＤＲ間のジスルフィド結合を有しないものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体をコードする遺伝子を含み、該遺伝子によってコードされるタンパク質を発現しうる発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含み、該アミノ酸配列からなるタンパク質を発現しうる請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、その培養物から酸化亜鉛結合性抗体を取得することを特徴とする、酸化亜鉛結合性抗体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体と、前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手段を有するバイオセンサ。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体に、第２のタンパク質を融合させた融合タンパク質。
【請求項１５】
前記第２のタンパク質が、ＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳの配列を有する金認識ペプチドを含むものである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酸化亜鉛と特異的に結合可能な酸化亜鉛結合性ラクダ抗体と、前記抗体発現ベクター、及び前記抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体（バイオセンサ、プロテインチップ等）等に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素と基質、抗原と抗体など、生体分子には極めて特異性の高い分子認識機構が存在する。こうした生体分子の機能は、極めて温和な条件下で、しかも高い安全性と正確性をもって発揮されることから、医療、食品、環境分野などさまざまな分野でその利用が期待されている。
生体分子の認識機構を利用した材料開発では、タンパク質などの生体分子を無機材料に安定して固定化することが重要なポイントとなる。これまで、コーティングされた金表面に関しては、カップリング剤を用いたタンパク質の固定化方法が知られているが、この方法は固定化反応率が悪く、また、タンパク質の活性低下を招いた。これに対し、発明者らはヒト末梢血細胞Ｆａｂ遺伝子ライブラリーをスクリーニングして金結合性タンパク質（金結合性ＶＬあるいはＶＨ）を取得し、当該タンパク質の金基板への固相化に成功した（特許文献１及び２）
金属酸化物は多くの光・電子デバイスに使われる重要な材料である。なかでも、酸化亜鉛は、透明で絶縁体としても半導体としても活用するできることから、バイオセンシングの様々な用途に使用可能な材料といえる。酸化亜鉛を簡便かつダイレクトに生体分子（タンパク質）を固定化できれば、それはハイスループットなセンシング技術開発に極めて有用である。発明者らは、ファージ提示ライブラリーをスクリーニングすることで、酸化亜鉛に特異的で高い結合活性を有するペプチドを取得し（非特許文献１）、これを利用した酸化亜鉛粒子のパターニングに成功した（特許文献３）。
さらに、発明者らは、抗体のヒト型化技術に用いられるＣＤＲ移植法を用いて、前記したマテリアル認識ペプチド（金結合性タンパク質や酸化亜鉛結合性ペプチド）を抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）抗体に融合させることで、マテリアル特異的抗体の開発を試みた（非特許文献２及び３）。しかしながら、ＨＥＬ抗体に融合された酸化亜鉛結合性抗体は不安定で、バイオセンサやプロテインチップ等の実使用には適さないという問題があった。
ラクダ抗体は、カノニカル構造を持たないことや、相補性決定領域（ＣＤＲ）にジスルフィド結合を有することから、ペプチドのＣＤＲ移植には適していないと考えられていた。最近、ＳａｅｒｅｎｓらによりＣＤＲ移植に適したラクダ抗体が開発され（非特許文献４）、癌細胞へのターゲッティングなど医薬分野でのラクダ抗体の利用が期待されるようになってきた。しかしながら、ラクダ抗体をバイオセンサ等の材料開発に利用しようという報告はこれまでなされていない。
【特許文献１】特開２００５−３１４４１１号公報
【特許文献２】特開２００５−３１２４４６号公報
【特許文献３】特開２００６−２２５２９４号公報
【非特許文献１】Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，ｐ２５７１−２５７５，（２００５）
【非特許文献２】第３回東北大学バイオサイエンスシンポジウム（２００６）  講演要旨集  ｐ２４０  ＰＳ−１８９「工学材料を標的とした多機能性抗体に関する研究」
【非特許文献３】第３回東北大学バイオサイエンスシンポジウム（２００６）  講演要旨集  ｐ２４１  ＰＳ−１９０「機能性ペプチドの移植による無機材料結合抗体の創製」
【非特許文献４】Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５２，ｐ５９７−６０７，（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、高い安定性と結合活性を有する酸化亜鉛結合性抗体を提供し、これを利用して抗体を酸化亜鉛に安定的に結合させることで、免疫バイオセンサ等のハイスループットなセンシング技術の開発を可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者らは前記課題を達成するために鋭意検討し、ラクダ抗体を利用することで安定な酸化亜鉛結合性抗体が作製できることを見出した。さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティマチュレーションを用いてこの抗体の親和性をより高め、実使用に適した、高い安定性と結合活性を有する酸化亜鉛結合性抗体の作製に成功した。
すなわち、本発明は、ラクダ抗体のＣＤＲ  Ｈ−１領域にＥＡＨＶＭＨＫを含むアミノ酸配列からなる酸化亜鉛認識ペプチドを含むペプチド移植抗体、あるいは前記ペプチド移植抗体のＣＤＲ  Ｈ−３領域にさらに変異を有し、かつ前記ペプチド移植抗体より高い酸化亜鉛親和性を有する変異体からなる、酸化亜鉛結合性抗体に関する。
前記変異体としては、ＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＸＸＨＸＸＨＸＸＨあるいはＨＸＸＨＸＸＨＸＸＲからなるペプチド（但し、ＸはＧ、Ｌ、Ｒ、又はＶである）を含むもの、たとえば、ＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＬＧＨＧＧＨＲＬＨ、ＨＬＧＨＧＧＨＧＬＨ、ＨＶＧＨＧＬＨＧＶＲ、又はＨＬＧＨＧＬＨＲＶＨからなるペプチドを含むものを挙げることができる。
本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、酸化亜鉛との解離平衡定数Ｋｄが１．７ｘ１０−７［Ｍ］より小さいことが好ましく、９．５ｘ１０−９［Ｍ］より小さいことがより好ましい。
前記酸化亜鉛認識ペプチドとしては、ＥＡＨＶＭＨＫを含む７〜２０アミノ酸からなるペプチド、特に７〜１２アミノ酸程度のペプチドが好ましく、たとえばＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰを挙げることができる。
本発明の酸化亜鉛結合性抗体の１つの実施形態として、ラクダ抗体のＣＤＲ  Ｈ−１領域にＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰからなる酸化亜鉛認識ペプチドを含み、かつ、ＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＬＧＨＧＬＨＲＶＨからなるペプチドを含むものを挙げることができる。
なお、前記ラクダ抗体としては、ＣＤＲ間にジスルフィド結合を有しないものが好ましい。
本発明はまた、前記した酸化亜鉛結合性抗体をコードする遺伝子を含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターの一例としては、たとえば、配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む発現ベクターを挙げることができる。
本発明はまた、前記発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、その培養物から酸化亜鉛結合性抗体を取得することを特徴とする、酸化亜鉛結合性抗体の製造方法も提供する。
さらに本発明は、前記酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体（たとえば、粒子やプロテインチップ等の基板）を提供する。
さらに本発明は、前記酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体と、前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手段を有するバイオセンサも提供する。
さらにまた本発明は、前記酸化亜鉛結合性抗体に、材料認識配列を有する第２のタンパク質を融合させたタンパク質も提供する。前記材料認識配列を有する第２のタンパク質とは、本発明の酸化亜鉛認識ペプチドのように、ある材料（たとえば、金属や金属酸化物）を特異的に認識して特異的に結合する配列を含むタンパク質を意味し、たとえばＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳの配列を有する金認識ペプチドや金結合性抗体（特開２００５−３１２４４６号公報、特開２００６−２２５２９４号公報）を挙げることができる。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、酸化亜鉛に簡便に標的物質検出に必要な抗体を固定化できる。これにより、免疫バイオセンサ等のハイスループットなセンシング技術の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１Ａは、ＶＨＨ１  ｏｒ  ２  ｏｒ  ３発現ベクター、図１ＢはｐＴＺ−ＶＨＨ、図１ＣはｐＲＡ４Ｆ２−ＡｕＶＨＨ１の模式図である。
図２Ａは、タンパク質の精製方法、図２ＢはＶＨＨ１，ＶＨＨ２，ＶＨＨ３の大腸菌における発現確認結果を示す。
図３は、ペプチド移植抗体のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すグラフである（グラフ上からＶＨＨ２（黄緑）、ＶＨＨ３（青）、ＷＴ  ＶＨＨ１（黒）、ＶＨＨ１（赤））。
図４は、円偏光二色性スペクトル測定の結果を示すグラフである（グラフ上から、ＷＴ  ＶＨＨ１（黒）、ＶＨＨ３（青）、ＶＨＨ１（赤）、ＶＨＨ２（黄緑））。
図５は、酸化亜鉛粒子とペプチド移植抗体との結合評価のプロセスを示す。
図６Ａは、図５に示される上清、Ｗａｓｈ、Ｅｌｕｔｅ画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果（１：Ｔｏｔａｌ、２：上清画分、３〜５：Ｗａｓｈ画分、６：Ｅｌｕｔｅ画分）を、図６ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる材料識別評価試験の結果を示す。
図７は、ＶＨＨ３の酸化亜鉛に対する結合活性評価結果（１ｍＭリン酸緩衝液）を示す。
図８は、ＶＨＨ１の酸化亜鉛への吸着に対する吸着等温線（Ａ）とラングミュアプロット（Ｂ）を示す。
図９は、ＣＤＲ  Ｈ−３に変異導入を行ったペプチドライブラリーの作製プロトコルを示す模式図である。
図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる材料識別評価結果を示す。
図１１は、４Ｆ２のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すグラフである（ＷＴ  ＶＨＨ１（黒）、ＶＨＨ１（青）、４Ｆ２（橙））。
図１２は、４Ｆ２の円偏光二色性スペクトルを示すグラフである（ＷＴ  ＶＨＨ１（黒）、ＶＨＨ１（青）、４Ｆ２（橙））。
図１３は、酸化亜鉛粒子の分散性評価結果を示す写真である（Ａ：抗体３μＭ、Ｂ：抗体０．５μＭ）。
図１４は、酸化亜鉛粒子に固定した酸化亜鉛結合性抗体の脱離試験結果を示す。
図１５は、Ｆｖ（Ｈ−２），（Ｈ−３），（Ｌ−２），（Ｌ−３）の共発現ベクターの模式図である。
図１６は、マウス由来抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０Ｆｖへの酸化亜鉛認識ペプチドＣＤＲ移植結果を示す。ＡはＨｙＨＥＬ−１０Ｆｖの立体構造を示す。Ｂは重鎖ＣＤＲ−２にペプチド移植した抗体のゲルろ過生成過程を示す。Ｃは、重鎖ＣＤＲ−２にペプチド移植したＶＨ単独（ＶＨ２ｓｄ）の円偏光二色性スペクトルの結果を示す。
図１７は、Ａ：マウス由来抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体Ｆｖ単独での酸化亜鉛結合評価結果（Ｆｖ（Ｈ−２）：Ｖ鎖のＣＤＲ−２に移植、Ｆｖ（Ｈ−３）：Ｖ鎖のＣＤＲ−３に移植、Ｆｖ（Ｈ−２）：Ｌ鎖のＣＤＲ−２に移植、Ｆｖ（Ｌ−３）：Ｌ鎖のＣＤＲ−３に移植）、Ｂ：精製したペプチド移植ＶＨ鎖の酸化亜鉛結合評価結果を示す。
図１８は、酸化亜鉛認識ペプチド断片の酸化亜鉛に対する結合評価結果を示す。
図１９は、本発明の酸化亜鉛結合性抗体を利用したバイオセンサの概念図を示す。
図２０は、ＲｌｆＳ検出によるフロー系でのＧＦＰ固定化評価を示す（展開蛋白質濃度：１０ｍＭ、展開溶媒：１０  ｏｒ  ３０ｍＭ  ＰＯ４３−（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、展開速度：１０ｍｌ／ｍｉｎ、飽和結合量：８９ｎｍｏｌ／ｍ２）。
図２１は、フロー系システムへの酸化亜鉛結合性ラクダ抗体４Ｆ２の固定化評価を示す（飽和結合量：１３０ｎｍｏｌ／ｍ２）。
図２２は、フロー系システムへの抗ＧＦＰラクダ抗体４Ｆ２の固定化評価を示す（ラクダ抗体４Ｆ２（下）：１３４ｎｍｏｌ／ｍ２、抗ＧＦＰラクダ抗体４Ｆ２（上）：１３４ｎｍｏｌ／ｍ２、ＧＦＰの固定化量：１１０ｎｍｏｌ／ｍ２）。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００７−３５０７３号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．酸化亜鉛認識ペプチド
本発明で用いられる酸化亜鉛認識ペプチドは、酸化亜鉛を特異的に認識し、高い親和性で酸化亜鉛に結合可能なペプチドである。発明者らは、これまでファージ提示法を用いたスクリーニングにより、５種の酸化亜鉛に結合性を有するペプチド：ＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰ（ＺｎＯ１：配列番号１）、ＱＮＴＡＴＡＶＳＲＬＳＰ（ＺｎＯ２：配列番号２）、ＡＴＨＴＮＱＴＨＡＬＹＲ（ＺｎＯ３：配列番号３）、ＶＳＮＨＫＡＬＤＹＰＴＲ（ＺｎＯ４：配列番号４）、ＤＳＧＲＹＳＭＴＮＨＹＳ（ＺｎＯ５：配列番号５）を取得している（特開２００６−２２５２９４号公報参照）が、このうち配列番号１のペプチドは、酸化亜鉛に対して１０−７Ｍという高い結合活性を有するものだった。発明者らは、さらにこのペプチドの配列を解析し、ＥＡＨＶＭＨＫ（配列番号６）の７ペプチドが酸化亜鉛の認識に重要であることを特定した（化学工学会代７１年会  研究発表講演要旨集  Ｂ２０６、参考例１参照）。特に、塩基性アミノ酸であるヒスチジンは結合定数に対する影響が大きく、２つのヒスチジンにはさまれたＨＶＭＨ領域が結合モチーフとして重要である可能性が高いと考えられた。
本発明では、前記したＥＡＨＶＭＨＫの７ペプチドを含むアミノ酸配列からなるペプチドを酸化亜鉛認識ペプチドとして利用する。限定するものではないが、前記酸化亜鉛認識ペプチドは、７〜２０アミノ酸、特に７〜１２アミノ酸程度の大きさであることが好ましい。
なお、所望の酸化亜鉛に対する結合性を維持する限り、ペプチドを構成する各アミノ酸は適宜修飾あるいは誘導体化されていてもよく、そのような修飾あるいは誘導体化されたペプチドもまた本発明の酸化亜鉛認識ペプチドに含まれる。
２．ラクダ抗体
２．１  ラクダ抗体の特徴
本発明で用いられる抗体は、ラクダ由来の抗体分子（ラクダ抗体）である。通常、抗体の可変領域は、重鎖と軽鎖からなるヘテロダイマー構造をしている。図１６Ａは、マウス由来の抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０Ｆｖの立体構造であるが、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）サブユニットからなる二量体である。ところが、ラクダ抗体は軽鎖を持たずＶＨ単独ドメインで抗原結合力を示す。そのため、従来の抗体より分子量が小さく、構造が単純で、酵母等を用いて容易に大量生産できる。
これまで、ラクダ抗体は、カノニカル構造を持たないことや、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループを安定化させるためのＣＤＲ  Ｈ−１−Ｈ−３間ジスルフィド結合を持つ抗体が多く、ＣＤＲ領域へのペプチド移植には適していないと考えられていた。しかし、近年、ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇに適した抗β−ｌａｃｔａｍａｓｅラクダ抗体ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０が単離され、“Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＶＨＨ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ”と名づけられた（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２（２００５）５９７）。このｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０は、ＣＤＲｓ間にジスルフィド結合がなく、ＣＤＲ移植後の組換え抗体の発現量も多く、ペプチド移植の鋳型抗体として極めて有用である。本発明では、このようなＣＤＲｓ間にジスルフィド結合を有しないラクダ抗体を用いることが好ましく、前記したｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０をその好適な一例として記載する。
発明者らは、前記したラクダ抗体ＣＤＲ部位に酸化亜鉛認識ペプチドを移植し、その抗体構造が壊れないことを見出した。従来使用されている、ヘテロダイマー構造を持つ、マウス由来の抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体を用いた場合、そのＣＤＲ部分（ＣＤＲ  Ｈ−２）に酸化亜鉛認識ペプチドを移植した融合タンパク質は、酸化亜鉛結合活性を示すものの、その精製過程においてＶＨとＶＬが解離してしまう現象を回避できなかった（図１６Ｂ）。解離したペプチド移植ＶＨ単独では、抗体特有の構造をとることはできず（ランダム構造を示す：図１６Ｃ）、抗体の機能を失ってしまう。
これに対し、ラクダ抗体は、もともと各ドメインが単独であるため、ドメインの解離の現象は起きず、そのＣＤＲ部分に酸化亜鉛認識ペプチドを移植した融合タンパク質は、抗体構造を安定に維持しつつ、酸化亜鉛に対し高い結合活性を示すことが確認された。
また、ラクダ抗体は、一量体であるため、分子量が小さく、すべての分子が共有結合で結ばれているため解離という現象がなく、そのため他のドメインとの融合タンパク質の作製が容易であるという利点を有する。この利点を利用することで、後述するよう、本発明の酸化亜鉛結合性抗体を他の材料認識ペプチド等との融合により、異種材料結合タンパク質を作製することも可能である。
さらに、後述するプロテインチップやバイオセンサでは、抗体構造の安定性極めて重要であるが、一量体であるラクダ抗体は、ダイマー構造を有する従来の抗体に比較して極めて安定性が高く、実使用に適した酸化亜鉛結合性抗体を提供できる。
２．２  ラクダ抗体の一次構造
ラクダ抗体の全アミノ酸配列は公知であり、ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０の配列はＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２８０７−２８１２（２００１）に記載されている。ＣＤＲ領域にジスルフィド結合を有しないラクダ抗体ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０の全アミノ酸配列を配列表の配列番号７に示す。この配列中、２６−３８残基がＣＤＲ  Ｈ−１領域に該当し５３−６９残基がＣＤＲ  Ｈ−２領域に該当し、１０２−１１７残基がＣＤＲ  Ｈ−３領域に該当する。
３．酸化亜鉛結合性抗体（ラクダ抗体−酸化亜鉛認識ペプチド融合タンパク質）
本発明では、前記した酸化亜鉛認識ペプチドをラクダ抗体のＣＤＲ領域（特に、ＣＤＲ  Ｈ−１領域）に移植することで、酸化亜鉛結合性抗体（ラクダ抗体−酸化亜鉛認識ペプチド融合タンパク）を作製する。
３．１  ＣＤＲ移植
抗体分子のうち、抗原結合性部位は、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）あるいは超可変領域と呼ばれる。抗体医薬の作製では、このＣＤＲだけを異種（マウス）由来のものに置換するＣＤＲ移植が、ヒト型抗体の作製に利用されている。
本発明では、このＣＤＲ移植を利用して、ラクダ抗体に酸化亜鉛認識ペプチドを移植する。発明者らは、ラクダ抗体に存在する３つのＣＤＲ領域（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３）のそれぞれについて、野生型の立体構造から、ＣＤＲ表面に露出しており、フレームワーク領域と直接連結していない領域（２９−３５残基，５３−６９残基，１０２−１１７残基）を決定し、酸化亜鉛認識ペプチドの移植を行った。
３．２  ＣＤＲ移植による構造変化と酸化亜鉛結合活性
本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、ＣＤＲ移植によっても本来の抗体構造が維持され、かつ移植した酸化亜鉛認識ペプチドと同等あるいはそれ以上の酸化亜鉛結合性を有するものでなければならない。
前記したラクダ抗体−酸化亜鉛認識ペプチド融合タンパク質の立体構造は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴スペクトル、蛍光スペクトル、円偏光二色性スペクトル等を測定することにより、調べることができる。その結果、野生型ラクダ抗体と融合タンパク質で全く異なる結果が得られた場合、当該部位への移植は抗体構造を変化させ、抗体活性を損なわせることがわかる。
ラクダ抗体−酸化亜鉛認識ペプチド融合タンパク質の酸化亜鉛結合活性は、結合速度、解離速度、解離平衡定数、飽和結合量の測定等により評価することができる。たとえば、解離平衡定数は、融合タンパク質を含む緩衝液に、酸化亜鉛粒子を加えて上清を回収し、未吸着の酸化亜鉛量から、融合タンパク質への結合量を求め、ラングミュアプロットを行なって決定することができる。結合特性の簡便かつ詳細な評価には、表面プラズモン共鳴を用いた方法が好適であり、その方法の詳細は当該分野で周知である。
発明者らが行なった３つのＣＤＲ領域（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３）への移植では、Ｈ−２領域への移植はラクダ抗体特有の構造を変化させ、その活性を失わせることが確認された。さらに、Ｈ−１領域に移植した抗体は移植前の酸化亜鉛認識ペプチドと同等の結合活性（解離平衡定数（Ｋｄ）＝１．７６ｘ１０−７Ｍ）を維持していた。Ｈ−３領域に移植した抗体は酸化亜鉛結合活性を示すものの、Ｈ−１領域に移植した抗体と比較するとその結合活性は弱かった。
この結果から、ＣＤＲ  Ｈ−１領域、特にその抗体表面露出領域に酸化亜鉛認識ペプチドを移植することにより、結合活性の高い酸化亜鉛結合タンパク質が取得できることがわかった。以下、このラクダ抗体ＣＤＲ  Ｈ−１領域に酸化亜鉛認識ペプチドを移植した抗体を「ＶＨＨ１」と呼ぶ。
４．融合タンパク質のアフィニティマチュレーション（高親和性変異体）
発明者らは、前項で作製したＶＨＨ１を母体として、さらにその結合活性を高めた高親和性変異体の取得を試みた。３つのＣＤＲ領域への移植結果から、Ｈ−２領域は抗体構造の安定的維持に必要な領域と判断されたため、Ｈ−３領域を変異体作製のターゲットとした。
４．１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティマチュレーション
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティマチュレーションは、変異導入による変異ライブラリーの作製とライブラリーからの高親和性抗体のスクリーニングの２つの工程からなる。変異導入法としては、当該分野周知の方法、例えばｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ法、ランダム変異導入法、ＣＤＲ  ｗａｌｋｉｎｇを用いて実施することができる。こうして作製された変異ライブラリーからの選択方法としては、低濃度の抗原を用いて高親和性抗体を選択する方法、洗浄条件を厳しく設定し抗原に強く結合している抗体のみ回収する方法、拮抗反応を利用して高親和性抗体のみ選択する方法等が挙げられる。本発明の酸化亜鉛結合性抗体は低分子一本鎖抗体であるため、大量生産が容易で、上記したアフィニティマチュレーションの工程も容易に実施できる。
４．２  高親和性酸化亜鉛結合性抗体変異体の取得
以前の検討から、酸化亜鉛への結合にはＨＸＸＨ（ＨはＲでもよい：配列番号８）という塩基性アミノ酸に挟まれたモチーフが重要であることが予測された。そこで、ＨＸＸＨを３回繰り返した１２ペプチドＨＸＸＨＸＸＨＸＸＨ（ＨはＲでもよく、ＸはＧ（グリシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｒ（アルギニン：配列番号９）、又はＶ（バリン））を、前述のＶＨＨ１に導入し、その酸化亜鉛結合性を評価した。なお、モチーフ内のアミノ酸Ｘについては、これまで報告されている無機材料結合ペプチドの配列情報よりヒスチジン、トリプトファン、アルギニン、リジン、グリシン残基が無機材料結合に重要であること、またアミノ酸をコードするコドンから理論上の計算されるライブラリー規模と、調製可能なライブラリー規模を考慮し、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、ロイシン、バリン残基に限定した。
その結果、ＶＨＨ１よりも優れた酸化亜鉛親和性を有する４つのクローン：ＨＬＧＨＧＧＨＲＬＨ（配列番号１０）、ＨＬＧＨＧＧＨＧＬＨ（配列番号１１）、ＨＶＧＨＧＬＨＧＶＲ（配列番号１２）、又はＨＬＧＨＧＬＨＲＶＨ（配列番号１３）が選択された。これらは、いずれも、ＶＨＨ１と同等の飽和結合量で、解離平衡定数（Ｋｄ）はＶＨＨ１の値（１．７６ｘ１０−７Ｍ）をはるかに下回る。なかでも、４Ｆ２は酸化亜鉛に対する親和性が極めて高く（解離平衡定数（Ｋｄ）＝９．３９ｘ１０−９Ｍ）、しかも他の材料に対してほとんど親和性を示さない優れた選択性を有し、抗体の立体構造も適切に保持されていることが確認された。４Ｆ２の全アミノ酸配列を配列表の配列番号１４に示す。
５．酸化亜鉛結合性抗体発現ベクター
本発明は、前記酸化亜鉛結合性抗体コードする遺伝子を含み、当該酸化亜鉛結合性抗体を発現しうるベクターも提供する。
本発明の発現ベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の酸化亜鉛結合性抗体をコードする遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。塩基配列は、導入する宿主細胞に合わせて適宜最適化してもよい。ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等を利用することができる。
前記プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃＨｉｓ，ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０，ｐＹＥ５２等）などが、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。
前記ベクターへの遺伝子の挿入は、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、次項において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
前記ベクターは、宿主細胞で機能する他の酵素やタンパク質の遺伝子を含んでいてもよい。後述するよう、本発明の酸化亜鉛結合性抗体は他の材料認識ペプチドとの融合タンパク質として発現させることもできる。その場合、前記ベクターには、融合タンパク質をコードする遺伝子を導入すればよい。
６．酸化亜鉛結合性抗体の組換え生産
本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、適当な宿主に前項で記載した発現ベクターを当該遺伝子が発現しうるように導入し、培養することによって、組換え生産することができる。特に、本発明のラクダ抗体を用いた酸化亜鉛結合性抗体は、低分子一量体抗体でジスルフィド結合も有しないため、効率よく組換え生産可能であり、ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０に関しては酵母による高生産が確認されている（前掲）。
宿主細胞としては、原核細胞であれば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。該ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与しうる配列を有するものが好ましい。
例えば、大腸菌であれば、Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株やベクターを使用できる。また、大腸菌で用いられるプロモーターとしては、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等を挙げることができ、いずれも好適に用いることができる。
また、枯草菌であれば、２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，８７−９３）等が用いられるが、これに限定されるものではない。なお、ベクターに枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３，１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７，４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用できる。さらに、これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４−８６４）等が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを好適に用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４５７）、及び電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＥＯ  Ｊ．１，８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ“Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９又はＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．ｉ：３９１−３９６）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパクのプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，ｉ．Ｍ．ａｎｄ  Ｖ．Ｃ．Ｅｍｅｒｙ（１９９３）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２０，１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ  Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７９，１６７−１７４）。
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えば、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｂ．Ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，１−５）等を好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現させることも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，Ｌ．Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，１２５−１３１）。
上記のようにして得られた形質転換体は、常法にしたがい培養することができ、該培養により細胞内、又は細胞外に目的の酸化亜鉛結合性抗体が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
上記培養により、形質転換された宿主細胞内又は細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、タンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、を単独あるいは組合せて利用できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げれば、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。目的とする酸化亜鉛結合性抗体タンパクは、以上に記載した方法を適宜組み合わせることにより、容易に高収率、高純度で製造できる。
７．酸化亜鉛結合性抗体と第２のタンパク質との融合
前述のとおり、ラクダ抗体は一量体抗体であるため、分子量が小さく、各分子がすべて共有結合で結ばれているため解離という現象が起こらない。そのため、本発明の酸化亜鉛結合性抗体を他のタンパク質と融合させた組換えタンパク質を容易に調製することができる。本発明はそのような融合タンパク質も提供する。
融合タンパク質の作製は、既報（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３，１１２６−１１３６．／Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５３，４９７−５０９（２００４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３２８，９８−１０５（２００５））を参照して実施することができる。
融合させるタンパク質として、他の材料認識ペプチドを含むタンパク質（材料認識配列を有する第２のタンパク質）を用いれば、この融合タンパク質は、異なる２つの材料間を連結する役目を果たす。なお、「材料認識配列を有する第２のタンパク質」とは、本発明の酸化亜鉛認識ペプチドのように、ある材料（たとえば、金属や金属酸化物）を特異的に認識して特異的に結合する配列を含むタンパク質を意味する。そのようなタンパク質は、例えば、ＷＯ２００４／０３１３８１、ＷＯ２００５／０１００３１、ＷＯ２００６／０６４６３９、ＷＯ２００６／０６８２５０、ＷＯ２００６／１２６５９５、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００），２９９，７２５−７３５、Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，（２００２），Ｖｏｌ．１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，１６９−１７２、Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，（２００２），Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．１，９５−１００、Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，（２００３），Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．１２．６９４６−６９５１、Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００４），Ｖｏｌ．３０３，２１３−２１７等に記載のものなど、当該分野で多数知られており、それらを適宜利用することができる。こうした融合タンパク質は、ナノ粒子の配列技術とナノ粒子間の接合技術等に利用することができる。
たとえば、金材料認識ペプチド（ＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳ：配列番号２０）や金結合性抗体（特開２００５−３１２４４６号公報、特開２００６−２２５２９４号公報）と本発明の酸化亜鉛結合性抗体を融合させたタンパク質は、金材料表面に酸化亜鉛粒子を固定化することができ、また、酸化亜鉛粒子と金ナノ粒子を接合させることができる。
上記のほか、本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、Ｈｉｓタグペプチド，ＧＳＴタンパク質，各種結合性タンパク質を融合させることによって、タンパク質精製の用途にも用いることができる。
８．酸化亜鉛結合性抗体による抗体固定化支持体（プロテインチップ、ナノ粒子）
本発明は、酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体を提供する。支持体の形状は酸化亜鉛層を含む限り特に限定されず、基板状（プロテインチップ等）であっても、粒子状（ナノ粒子等）であってもよい。
８．１  プロテインチップ
「安定」・「簡便」・「迅速」な測定が可能なプロテインチップの作製には、（１）タンパク質が吸着しにくい、（２）選択的にタンパク質を固定化できる、（３）基板のパターニングが容易、という条件の達成が望まれる。
従来基板へのタンパク質の固定化法として一般的なものは、（ａ）金基板への金−硫黄結合を利用した固定化法、（ｂ）シランカップリング剤によるシリカ膜への結合を利用した固定化法、（ｃ）前記（ａ）（ｂ）の方法により結合された有機膜に提示された官能基を利用した化学的結合による固定化法、がある。しかし、これらの手法は、タンパク質固定化によりタンパク質の活性が低下する、基板加工が複雑、タンパク質固定化法が多段階にわたる等の問題があった。
これに対し、酸化亜鉛はセラミックスであるためタンパク質が吸着しにくく、本発明にかかる酸化亜鉛結合性抗体（ラクダ抗体）を用いることにより、簡便・迅速に酸化亜鉛表面にタンパク質を固定化できる。また、酸化亜鉛は、半導体加工技術（微細加工技術）を用いることで、様々な構造の基板を作製可能である。さらに、既報のとおり、そのパターニング技術が確立しており（特開２００６−２２５２９４号公報）、プロテインチップ等の固相基板の作製に有用といえる。
なお、固相基板の材質は酸化亜鉛層が形成可能である限り、特に限定されず、金属、ガラス、シリコン等、当該分野で汎用されている基板を適宜用いることができる。
８．２  ナノ粒子／マイクロ粒子
本発明の酸化亜鉛結合性抗体を固定化した酸化亜鉛層を有する粒子（ナノサイズ，マイクロサイズ）はタンパク質精製等の様々な分析に応用できる。特にナノ粒子はその表面積を生かしてマイクロ流路内における高感度分析に有用である。
また、酸化亜鉛結合性抗体を固定化した酸化亜鉛粒子はタンパク質で粒子が修飾されるため水溶液中での分散性がよく、作用物質と効率よく反応する。完全分散が達成されると、タンパク質間相互作用がおきたとき粒子が凝集するため、簡便にタンパク質間の結合が解析できる。なお、こうした分散性の良さは、インクジェット手法やスプレー手法でナノ粒子をパターニングする場合にも重要である。
９．バイオセンサ
本発明はまた、酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体と、前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手段を有するバイオセンサ（免疫バイオセンサ）を提供する。ここで、抗体を介した分子間相互作用とは、抗体−抗原の相互作用に限定されず、抗体と第２抗体を介した抗原との相互作用など、抗体を介したアナライトとの結合・解離のすべてを含む。検出手段は、ＦＥＴのような電気的検出手段、表面プラズモン共鳴のような光学的検出など、周知の検出手段のいずれであってもよい。以下、代表的な実施態様について記載する。また、図１９に本発明の酸化亜鉛結合性抗体を利用したバイオセンサの概念図を示す。
９．１  ＦＥＴ技術を利用したバイオセンサ
電解効果トランジスタ（Ｆｉｅｌｄ−Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ，ＦＥＴ）は、電気的検出を利用したバイオセンサに汎用されている技術である。原理は、ソース電極からドレイン電極へ流れる電流を、第三の電極であるゲート電極で制御し、そのゲート電極表面でタンパク質間相互作用を起こさせるとゲート電極の電荷が変化するため、電流的応答が変化する（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １３６，９３（１９８２））。このゲート電極に酸化亜鉛を用いることによって、ＦＥＴ技術を用いたタンパク質間相互作用が測定できる。すなわち、バイオセンサとして利用できる。
タンパク質間相互作用をＦＥＴによって検出するためには、その反応ができるだけゲート電極表面に近い場所で起こる必要がある。ラクダ抗体４Ｆ２を接合ユニットとしたタンパク質固定化は、ゲート電極に極めて近くに目的タンパク質を固定化できるため、従来よりも高感度なＦＥＴ、これを利用したバイオセンサに有用である。
９．２  表面プラズモン共鳴法を利用したバイオセンサ
表面プラズモン共鳴センサは、表面プラズモン共鳴を利用し、センサーチップ上で分子間相互作用をリアルタイムで解析できるバイオセンサである。既に、市販の表面プラズモン共鳴センサ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ社のＳＰＲ測定用金膜センサーチップＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  Ａｕ等）は容易に入手可能である。センサーチップ上に酸化亜鉛層を形成させれば、本発明の酸化亜鉛結合性抗体は高い結合性で安定に吸着される。こうして、酸化亜鉛結合性抗体を結合させたセンサーチップ上にマイクロ流路を設け、ここにアナライト（抗原）を含むサンプルを一定の流速で送液する。抗体とサンプル中の抗原が相互作用をすれば、表面プラズモン現象により、結合と解離が光学的に検出され、センサグラムとしてリアルタイムでモニターできる。表面プラズモン共鳴センサは、微量サンプルを高感度に検出できるとともに、相互作用のキネティクスをリアルタイムで解析できるという利点がある。したがって、本発明の酸化亜鉛結合性抗体を結合させた表面プラズモン共鳴センサは、抗原抗体間相互作用解析のバイオセンサとして有用である。
さらに、本発明の酸化亜鉛結合性抗体を酸化亜鉛の微細加工や、酸化亜鉛のドット（数百μｍ程度）を用いた２次元表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に応用することも可能である。微細加工した亜鉛などの無機材料（半導体材料）上への酸化亜鉛膜形成は、半導体作製技術を使って容易に実施することができる。たとえば、μｍレベルのパターニングであれば、リフトオフ法やマスキングを利用したスパッタ法で実施可能なほか、Ｐｄ触媒を使った室温でのパターニング（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１４，４１８−４２１（２００２））も可能である。
９．３  リフレクトメトリーを利用したバイオセンサ
リフレクトメトリーとは、レーザーを試料板に反射させ、反射光を測定することによって、試料版表面への蛋白質吸着量を測定する手法である。このリフレクトメトリーの原理とマイクロ流体チップを組み合わせたリフレクトメトリーバイオセンサは容易に入手可能である（フルイドウェアテクノロジーズ（株）のリフレクトメトリーバイオセンサアレイシステムＦｌｕｉｄ−ＲＩｆＳ等）。センサーチップ上に酸化亜鉛層を形成させれば、本発明の酸化亜鉛結合性抗体は高い結合性で安定に吸着される。こうして、酸化亜鉛結合性抗体を結合させたセンサーチップ上にマイクロ流路を設け、ここにアナライト（抗原）を含むサンプルを一定の流速で送液する。抗体とサンプル中の抗原が相互作用をすれば、吸着タンパク質量がセンサグラムとしてリアルタイムでモニターできる。リフレクトメトリーバイオセンサは、微量サンプルを高感度に検出できるとともに、相互作用のキネティクスをリアルタイムで解析できるという利点がある。したがって、本発明の酸化亜鉛結合性抗体を結合させたリフレクトメトリーバイオセンサは、抗原抗体間相互作用解析のバイオセンサとして有用である。
上記の事例に限定されず、本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、赤外線などの電磁波の透過光・反射光・近接場光・水晶発振子マイクロバランスを利用したバイオセンサにも応用可能である。また、他の免疫検出に用いられる周知の技術：たとえば、免疫沈降、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、及びＲＩＡ法等の固相免疫法を適宜応用したバイオセンサの開発も可能である。
１０．その他
酸化亜鉛基板上に固定化した本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、適当な条件を設定することで容易に脱離させることができる。すなわち、条件を変えることで、固定した酸化亜鉛結合性抗体を回収して分析することができる。この際特筆すべきは、脱離に使う溶液は通常のタンパク質調製水溶液（リン酸緩衝液等）でよく、タンパク質は変性することなく、活性構造を維持した状態で脱離させることができることである。
【実施例】
【０００８】
実施例１：酸化亜鉛結合性ラクダ抗体の作製
１．ＺｎＯ認識ペプチドのラクダ抗体への移植
（１）ラクダ抗体ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０
ラクダ抗体は、本来相補性決定領域（ＣＤＲ）ループを安定化させるＣＤＲ  Ｈ−１−Ｈ−３間ジスルフィド結合を有するが、本実施例では、ＣＤＲｓ間にジスルフィド結合を有さない“Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＶＨＨ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ”と名づけられた抗β−ｌａｃｔａｍａｓｅラクダ抗体ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２（２００５）５９７）をペプチド移植する鋳型抗体として用いた。ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０は既報（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｈｙ，２８０７−２８１２（２００１））の配列に従い作製した。
（２）ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０及びペプチド移植ラクダ抗体の発現ベクターの構築
Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて、抗β−ｌａｃｔａｍａｓｅ抗体ｃＡｂＢＣＩＩ−１０のＣＤＲ  Ｈ−３領域の１０３−１１４部位にＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰからなる酸化亜鉛認識ペプチド（配列番号１）を移植した抗体ＶＨＨ３をコードする遺伝子を全合成した。その後、ＺｎＯ認識ペプチド配列となっているＣＤＲ  Ｈ−３を野生型のＣＤＲに置換するｐｒｉｍｅｒを用いて野生型ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０（ＷＴ  ＶＨＨ）を作製した。同様にしてＣＤＲ  Ｈ−１、Ｈ−２に酸化亜鉛認識ペプチドを移植し、ペプチド移植ラクダ抗体ＶＨＨ１，ＶＨＨ２を作製した。ＣＤＲへの移植箇所については、野生型ラクダ抗体の立体構造から、ＣＤＲ中の表面に露出している１２アミノ酸残基（２９−３５残基，５３−６９残基，１０２−１１７残基）を選択した。作製した発現ベクターの模式図を図１Ａに示す。また、ＰＣＲ反応溶液組成と反応条件（表１）、使用したＰＣＲプライマーとペプチド移植ラクダ抗体のアミノ酸配列（表２）を以下に示す。
【表１】
2008099968.tif 000002
ＶＨＨ３全合成用ｐｒｉｍｅｒ
2008099968.tif 000003
ＷＴＶＨＨ合成用ｐｒｉｍｅｒ
2008099968.tif 000004
ＶＨＨ１，ＶＨＨ２，ＺｎＯｔａｇ−ＷＴＶＨＨ作製用ｐｒｉｍｅｒ
2008099968.tif 000005
【表２】
2008099968.tif 000006
２．酸化亜鉛認識ペプチド移植ラクダ抗体ＶＨＨ１、ＶＨＨ２、ＶＨＨ３の大腸菌発現と構造・機能評価
前項で作製したＶＨＨ１、ＶＨＨ２、ＶＨＨ３発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、タンパク質を発現させた。タンパク質の精製方法を図２Ａに示す。ＶＨＨ１、ＶＨＨ２、ＶＨＨ３のいずれも、可溶性画分として調製できた（図２Ｂ）。その調製タンパク質を、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／２００ｍＭ  ＮａＣｌ）と円偏光二色性（ＡＶＩＶ円二色性分光計（Ｐｒｏｔｅｒｉｏｎ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）；ｐａｔｈ  ｌｅｎｇｔｈ，１．０ｍｍ；ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．２ｎｍ；ａｖｅｒａｇｅ  ｔｉｍｅ，４ｓ）により評価したところ、ＶＨＨ１とＶＨＨ３は単量体の単一成分で（図３中の赤線，青線）、かつ、ラクダ抗体特有の円偏光二色性を示したのに対し（図４中の赤線，青線）、ＶＨＨ２は均一なゲルろ過クロマトグラムを示さず、円偏光二色性もラクダ抗体特有のものではなかった（図３，４中の黄緑線）。
次に、調製されたＶＨＨ１、ＶＨＨ２、ＶＨＨ３の酸化亜鉛粒子との活性評価を行った。具体的には、粒径１００ｎｍの酸化亜鉛と１０ｍＭリン酸緩衝液（界面活性剤含）中で混合し、遠心後上清と沈殿物（酸化亜鉛）に分離した（図５）。沈殿物に関しては、数回上記リン酸緩衝液で洗浄し、最後に６Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｄｎＨＣｌ）水溶液を用いて吸着しているタンパク質を可溶化させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（図６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、ＶＨＨ１は酸化亜鉛に対して結合し（図６Ａ）、材料特異性も保持していることが分かった（図６Ａ）。ＶＨＨ３に関しては、１０ｍＭリン酸緩衝液を使用した際には結合特性は見られなかったが、１ｍＭリン酸緩衝液を使用した際は、ＺｎＯに結合した（図７）。これより、ＶＨＨ３もＺｎＯに対して結合機能があるが、ＶＨＨ１と比較すると、その結合活性は弱いことがわかった。
さらに、ＶＨＨ１に対して、ラングミュアプロットによる結合評価を行った（図８）。その場合、酸化亜鉛に対するＶＨＨ１の解離平衡定数は、１７６ｎＭあり、ＷＴ  ＶＨＨのＮ末端に酸化亜鉛認識ペプチドを融合したもの（３．３０×１０−７Ｍ）と同程度の活性と評価された。これより、ＣＤＲ  Ｈ−１領域にペプチドを移植しても、ラクダ抗体自身の立体構造は保持され、ペプチドの活性も低下しないことが確認された。
実施例２：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティマチュレーションによる高親和性ラクダ抗体の作製
実施例１で作製されたＶＨＨ１を母体として、より活性を向上させることを試みた。具体的には、酸化亜鉛認識ペプチドを移植していないＣＤＲ  Ｈ−３領域に注目し、そのアミノ酸配列をランダム化しライブラリーを構築した。ＣＤＲ  Ｈ−２領域は、実施例１の結果より、この部分の配列を変えるとラクダ抗体の構造が変性し活性を失うことがわかったため改変には利用しなかった。
ライブラリーは、ＣＤＲ−Ｈ３領域の１０５残基から１１４残基部分を図９に示した配列でライブラリー化して作製した。図中のＨ（Ｒ）部分の遺伝子は、ＤＮＡの塩基配列が、「（ＣもしくはＡもしくはＧ）（ＴもしくはＣもしくはＡ）」となるようし設計し、Ｈｉｓ残基もしくはＡｒｇ残基になるようにした。そして、Ｘに関しては、「（ＣもしくはＧ）（ＴもしくはＧ）（ＡもしくはＴもしくはＧもしくはＣ）」とし、Ｇｌｙ残基もしくはＬｅｕ残基もしくはＡｒｇ残基もしくはＶａｌ残基となるようにした。作製した遺伝子ライブラリーをファージミドベクターｐＴＺへ導入し、Ｍ１３ファージに抗体断片ライブラリーが提示した、ＶＨＨ１ライブラリーを調製した。すなわち、ペプチド移植抗体ＶＨＨ１を鋳型としてＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲによりＣＤＲ  Ｈ−３をランダム化させた遺伝子断片を増幅した後、ファージミドベクターｐＴＺ（図１Ｂ）へ導入した。ＰＣＲ反応溶液組成と反応条件は実施例１の表１と同様であり、変異導入プライマーの配列は以下のとおりである。
ＣＤＲＨ−３ランダム化ｐｒｉｍｅｒ
2008099968.tif 000007
本研究において使用したファージミドベクターｐＴＺは、ｌａｃプロモーターが目的遺伝子とは逆の方向に配置してあり、ｍＲＮＡの転写がｇ３ｐ末端に位置するファージ由来のｇＶＩプロモーターから開始される。これによりｇ３ｐとの融合タンパク質の産生が適度に抑制され、遺伝子欠損を生じることなく、より多種類のクローンを提示させることが可能となる。作製したファージミドベクターを用いてエレクトロポレーション法により大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を形質転換し、２０ｍｌ  ＬＢ培地に植え継ぎ３７℃，Ｏ／Ｎで培養後、プラスミドの抽出を行い、これをファージミドライブラリーとしてファージ提示法の操作に用いた。作製したライブラリーの規模は６．５×１０４，形質転換体は１．２×１０５であった。
次に、作製したファージ抗体ライブラリーからより親和性の高い酸化亜鉛特異的ラクダ抗体を選択した。リン酸は酸化亜鉛表面と結合し、タンパク質の吸着を防ぐことが以前の実験より確認されていたため、ファージ抗体ライブラリー溶液を酸化亜鉛粒子と混合した後、酸化亜鉛に結合しない、もしくは、弱く結合する抗体提示ファージは、リン酸（１０〜５０ｍＭ）と界面活性剤（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を含む水溶液で取り除いた（洗浄操作）。強く結合したファージは、高濃度なリン酸水溶液（２００ｍＭ）を用いて取り除き、取り除いたファージを再増幅させた。
具体的には、調製したファージ抗体ライブラリー８４０μｌをＺｎＯ粉末（０．２ｍｇ）に添加し、１ｈｒ混合した。ＺｎＯに対する非特異吸着分子を１０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）／２００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて洗浄後、０．２Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４，２００ｍＭ  ＮａＣｌ）にて結合ファージ抗体を溶出した。回収したファージ抗体をＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．５まで培養した大腸菌ＪＭ１０９株に再感染させ増幅し、菌体をプレートにまいた。プレート上のファージ遺伝子を含んだ大腸菌を回収後、再びファージ抗体を調製し、繰り返しパニング操作を行った。ＺｎＯに強固に結合するファージ抗体を取得するために、ラウンド毎に洗浄におけるｐｈｏｓｐｈａｔｅ濃度を上げた。以上の操作を４ラウンド繰り返し、ＺｎＯに対する結合能を有する抗体の濃縮を行った。各種条件を表３に示す。
【表３】
2008099968.tif 000008
その結果、ＣＤＲ−Ｈ３に表４のアミノ酸配列を持つラクダ抗体が選択された。各々のラクダ抗体に対して、ラングミュアプロットにより酸化亜鉛に対する親和性を評価したところ、表５の結果が得られ、４Ｆ２が最も親和性が高いことが確認された。
【表４】
2008099968.tif 000009
【表５】
2008099968.tif 000010
４Ｆ２に対しては、材料選択性についても評価した（図１０）。すなわち、酸化亜鉛と同様の方法で、酸化鉄、酸化チタンへの結合性を調べたところ、若干結合するものの、酸化亜鉛に対してのみ強い選択性があることがわかった。また、作製した４Ｆ２を、ゲルろ過クロマトグラフィーと円偏光二色性測定により評価したところ、単量体の単一成分で（図１１中の橙線）、かつ、抗体特有のβ構造の円偏光二色性を示し（図１２中の橙線）、野生型と同様の抗体分子構造を保持していることが確認された。表６に４Ｆ２の全アミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【表６】
2008099968.tif 000011
実施例３：ラクダ抗体４Ｆ２を用いた酸化亜鉛粒子の分散性向上
抗体断片（ＷＴ  ＶＨＨ，もしくはＶＨＨ１もしくは４Ｆ２）水溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液）１ｍｌに対して、０．５ｍｇの酸化亜鉛微粒子（粒径１５〜３５ｎｍ）を加え、１０秒間超音波処理をし、その後の粒子分散性を評価した。抗体断片濃度が３μＭの時は、ＶＨＨ１もしくは４Ｆ２使用で酸化亜鉛粒子の分散性は１日経過後も保持されていた（図１２）。しかし、抗体濃度が０．５μＭの時は、４Ｆ２のみ酸化亜鉛微粒子の分散性が維持された（図１３）。
実施例４：固定した酸化亜鉛結合抗体の脱離
酸化亜鉛結合性抗体水溶液を酸化亜鉛粒子と混合・遠心分離後、酸化亜鉛粒子を取り出し、その粒子に様々なリン酸濃度のリン酸緩衝液を加え、抗体の上清への解離を測定した（図１４）。すべての抗体は酸化亜鉛に結合した後、１０ｍＭ以上５００ｍＭ以下のリン濃度のリン酸緩衝液を適切に調製すればその抗体を酸化亜鉛表面より脱離させることができた。
実施例５：４Ｆ２と金認識抗体を融合させた酸化亜鉛−金連結タンパク質の作製
ＺｎＯに高親和性を示す４Ｆ２抗体とＡｕに結合するＡｕ  ＶＨＨ１をヒンジリンカーで融合することで、二重特異性抗体を作製する。Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて、既に報告されているＡｕ結合ペプチド移植抗体ＡｕＶＨＨ１とＺｎＯ結合抗体４Ｆ２をリンカー：Ｌｌａｍａ  ＩｇＧ２  ｕｐｐｅｒ  ｈｉｎｇｅ（ＥＰＫＩＰＱＰＱＰＫＰＱＰＱＰＱＰＱＰＱＰＫＰＱＰＫＰＥＰ（配列番号３９）を介して結合し、４Ｆ２−ＡｕＶＨＨ１の遺伝子を作製する。実施例１にしたがい、以下のプライマーを用いて、この遺伝子を組み込んだ発現ベクター：ｐＲＡ４Ｆ２−ＡｕＶＨＨ１（図１Ｃ）を作製する。
４Ｆ２−ＡｕＶＨＨ１作製用ｐｒｉｍｅｒ
2008099968.tif 000012
この融合タンパク質を介して、金材料表面と酸化亜鉛粒子、あるいは酸化亜鉛粒子と金ナノ粒子を接合できる。
実施例６：表面プラズモン共鳴を用いた結合活性評価
１．酸化亜鉛結合性抗体の酸化亜鉛結合活性評価
ＢＩＡｃｏｒｅ社のＳＰＲ測定用金膜センサーチップＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  Ａｕに酸化亜鉛膜を作製し、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００を用いて抗体の酸化亜鉛膜に対する親和性を測定する。具体的には、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  Ａｕの金プレート表面にスパッタ法などにより、酸化亜鉛膜を数ｎｍ〜５０ｎｍの膜厚で作製する。そして、そのプレートをＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００に設置し、抗体水溶液を流して、抗体の酸化亜鉛膜への吸着を測定する。
酸化亜鉛膜は、作製の条件を変えることによって、結晶構造を変化させることができるので、酸化膜の結晶性の違いによる抗体の吸着特性（下記の結合速度（ｋａ），解離速度（ｋｄ），解離定数（ＫＤ）と飽和結合量）も評価する。定量的評価は、前記装置に添付された解析ソフトに従って得られる結合曲線から、抗体の酸化亜鉛に対する結合速度（ｋａ），解離速度（ｋｄ），解離定数（ＫＤ）を求めて行う。
２．酸化亜鉛結合性抗体固定化亜鉛結合基板の抗原結合活性評価
前項で酸化亜鉛結合性抗体を吸着させた酸化亜鉛膜を有するセンサーチップ（基板）上にマイクロ流路を設け、ここにアナライト（抗原）を含むサンプルを一定速度で送液し、抗体とサンプル中の抗原の相互作用を表面プラズモン現象によりリアルタイムにモニターする。
本発明の酸化亜鉛結合性抗体を吸着させたセンサーチップは、それ自体が、抗原抗体間相互作用のキネティクスを解析するためのセンサーチップとして利用できる。
実施例７：リフレクトメトリーを用いた酸化亜鉛結合性抗体の酸化亜鉛への吸着特性とプロテインチップ・フロー系センサーへの応用
リフレクトメトリーとは、レーザーを試料板に反射させ、反射光を測定することによって、試料版表面への蛋白質吸着量を測定する手法である。このリフレクトメトリーの原理とマイクロ流体チップを組み合わせたリフレクトメトリーバイオセンサアレイシステムＦｌｕｉｄ−ＲＩｆＳ（フルイドウェアテクノロジーズ（株）製）を用いて、そのシリコン基板上に酸化亜鉛薄膜と微小流路を設計し、蛋白質水溶液を展開させることによって、酸化亜鉛基板上への蛋白質吸着量を測定した。
緑色蛍光蛋白質ＧＦＰを展開してみると、１０ｍＭ，３０ｍＭリン酸水溶液中ではほとんど酸化亜鉛基板へ吸着しなかった（図２０中の黒点線，黒破線）。これより、酸化亜鉛表面にＧＦＰはほとんど物理吸着しないことがわかった。しかし、Ｎ末端に酸化亜鉛結合性ペプチド（ＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰ）を融合したＧＦＰは酸化亜鉛基板への明確な吸着を示し、３０ｍＭリン酸水溶液中で飽和結合量が約８９ｎｍｏｌ／ｍ２であった（図２０）。しかし、展開溶液を、蛋白質を含まないリン酸水溶液に交換すると（解離工程）、ペプチド融合ＧＦＰは一部解離していった。
次に、酸化亜鉛結合性ラクダ抗体４Ｆ２を用いて同様の実験を行ったところ、酸化亜鉛結合性ペプチド融合ＧＦＰと同様に酸化亜鉛基板への吸着を示したが、その吸着量は約１３０ｎｍｏｌ／ｍ２とペプチドの約１．５倍であり、さらに解離工程においても、ほとんど蛋白質の解離は観測されなかった（図２１）。これより、酸化亜鉛への結合性が強い４Ｆ２は酸化亜鉛基板上へ、安定的強く、かつ、迅速に蛋白質を固定化できるタグとして使用できることが確認できた。
さらに、４Ｆ２とＧＦＰに結合性を示すラクダ抗体（抗ＧＦＰラクダ抗体）を融合させて、ＧＦＰ検出バイオリフレクトセンサーを作成し、評価した。その結果、４Ｆ２を介して、８０％の活性を保持した状態で抗ＧＦＰラクダ抗体を酸化亜鉛表面へ固定化させることができ、さらに、ＧＦＰも検出できることが確認できた（図２２中の上の線）。
比較例１：マウス由来抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体を用いた酸化亜鉛結合性抗体の作製
実施例１にしたがい、ラクダ抗体のかわりに、抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０Ｆｖ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ：１Ｃ０８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４  ２７６２３−２７６３１（１９９９）、立体構造：図１６Ａ）を用いて、その６つのＣＤＲ領域にそれぞれ酸化亜鉛認識ペプチドを移植した。
すなわち、ＺｎＯ結合性ペプチドの配列（ＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰ）をもとにＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒを設計し、本研究室既存のＨｙＨＥＬ−１０ＶＨ（ｏｒ  ＶＬ）遺伝子を含むベクターｐＲＡ−ＷＴ  ＶＨ（ｏｒ  ＶＬ）を鋳型として、以下のプライマーを用いて、Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲを行い、各ＣＤＲにペプチド配列を移植した。
ＶＨ−２（ＣＤＲＨ−２），ＶＨ−３（ＣＤＲＨ−３）作製用ｐｒｉｍｅｒ
2008099968.tif 000013
ＶＬ−２（ＣＤＲ  Ｌ−２），ＶＬ−３（ＣＤＲ  Ｌ−３）作製用ｐｒｉｍｅｒ
2008099968.tif 000014
【表７】
2008099968.tif 000015
つぎに、ＰＣＲ増幅した各ＤＮＡ断片と本研究室既存の発現ベクターｐＲＡ−ｓｃＦｖ（ＨｙＨＥＬ−１０ｓｃＦｖ発現ベクター）をＮｃｏＩとＳａｃＩＩで制限酵素消化した後、連結し、ＶＨ−２，ＶＨ−３，ＶＬ−２，ＶＬ−３各単独発現ベクターを作製した。さらに、本研究室既存のＨｙＨＥＬ−１０Ｆｖ共発現ベクターｐＲＡ−ｐＫＴＮ２  ＶＨ及びｐＲＡ−ｐＫＴＮ２  ＶＬをＮｃｏＩとＳａｃＩＩで制限酵素消化し、繋ぎかえることでＦｖ（Ｈ−２），（Ｈ−３），（Ｌ−２），（Ｌ−３）の共発現ベクター（図１５）を作製した。
移植した抗体について、酸化亜鉛結合性を調べたところ、重鎖のＣＤＲ−２にペプチド移植したものが、酸化亜鉛結合活性を示したが、精製過程においてＶＨとＶＬが解離してしまう現象を回避できなかった（図１６Ｂ）。ペプチド移植したＶＨ領域のみ単独で、大腸菌発現させ精製し、円偏光二色性を測定したところ、抗体特有のシグナルを示さず、ランダム構造を示すシグナルが得られた（図１６Ｃ）。
上記のとおり、マウス由来抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体は解離を回避することができなかった。そこで、大腸菌発現の際に倍地上清に分泌されてくるＦｖを精製せずにそのまま用いて酸化亜鉛に対する結合評価を行った（図１７Ａ）。その結果、Ｖ鎖のＣＤＲ−Ｈ２に移植したものが活性を示したので、ＶＨ鎖だけの形で精製し、酸化亜鉛に対する結合評価を行った（図１７Ｂ）。ＶＨ鎖は活性は示したものの、構造が不安定であるため、定量的評価はできなかった。
参考例１：短い酸化亜鉛認識ペプチドの結合評価
酸化亜鉛への結合に必要なペプチドの長さを調べるために、酸化亜鉛認識ペプチド（ＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰ）の断片の結合評価を行った（図１８）。その結果、前記配列の１−７アミノ酸残基からなるペプチド（ＥＡＨＶＭＨＫ）が最も高い結合平衡定数（解離平衡定数の逆数）を示すことがわかった。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、酸化亜鉛に抗体分子を安定かつ特定の配向で結合させることができる。この技術は、バイオセンサ、プロテインチップ等、ハイスループットなセンシング技術の開発に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号１：酸化亜鉛認識ペプチド（ＺｎＯ１）
配列番号２：酸化亜鉛認識ペプチド（ＺｎＯ２）
配列番号３：酸化亜鉛認識ペプチド（ＺｎＯ３）
配列番号４：酸化亜鉛認識ペプチド（ＺｎＯ４）
配列番号５：酸化亜鉛認識ペプチド（ＺｎＯ５）
配列番号６：酸化亜鉛認識領域の配列
配列番号７：ｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０
配列番号８：酸化亜鉛結合モチーフ
配列番号９：Ｈ−３領域導入配列
配列番号１０：高親和性変異体Ｈ−３領域導入配列（３Ｄ２）
配列番号１１：高親和性変異体Ｈ−３領域導入配列（３Ｅ２）
配列番号１２：高親和性変異体Ｈ−３領域導入配列（４Ｄ４）
配列番号１３：高親和性変異体Ｈ−３領域導入配列（４Ｆ２）
配列番号１４：４Ｆ２の全アミノ酸配列
配列番号１５：ＶＨＨ１の全アミノ酸配列
配列番号１６：ＶＨＨ２の全アミノ酸配列
配列番号１７：ＶＨＨ３の全アミノ酸配列
配列番号１８：図９のｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０  ＣＤＲ  Ｈ−３配列（１０２−１１７位）
配列番号１９：図９のｃＡｂ  ＢＣＩＩ−１０  ＣＤＲ  Ｈ−３移植配列
配列番号２０：金認識ペプチド
配列番号２１〜３８：プライマー
配列番号３９：リンカー配列（Ｌｌａｍａ  ＩｇＧ２  ｕｐｐｅｒ  ｈｉｎｇｅ）
配列番号４０〜５５：プライマー
［配列表］
2008099968.tif 000016
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【図１】
2008099968.tif 000039
【図８】
2008099968.tif 000040
【図２０】
2008099968.tif 000041
【図２１】
2008099968.tif 000042
【図２２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008099968.tif 000047
【図６】
2008099968.tif 000048
【図７】
2008099968.tif 000049
【図９】
2008099968.tif 000050
【図１０】
2008099968.tif 000051
【図１１】
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【図１２】
2008099968.tif 000053
【図１３】
2008099968.tif 000054
【図１４】
2008099968.tif 000055
【図１５】
2008099968.tif 000056
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2008099968.tif 000059
【図１９】
2008099968.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月21日(2008.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクダ抗体のＣＤＲ  Ｈ−１領域にＥＡＨＶＭＨＫを含むアミノ酸配列からなる酸化亜鉛認識ペプチドを含むペプチド移植抗体、あるいは前記ペプチド移植抗体のＣＤＲ  Ｈ−３領域にさらにＨＸＸＨＸＸＨＸＸＨ又はＨＸＸＨＸＸＨＸＸＲからなるペプチド（但し、ＸはＧ、Ｌ、Ｒ、又はＶである）を含む変異体からなる、酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記変異体がＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＬＧＨＧＧＨＲＬＨ、ＨＬＧＨＧＧＨＧＬＨ、ＨＶＧＨＧＬＨＧＶＲ、又はＨＬＧＨＧＬＨＲＶＨからなるペプチドを含むものである、請求項１に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項４】
酸化亜鉛との解離平衡定数Ｋｄが１．７ｘ１０−７［Ｍ］より小さいことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項５】
酸化亜鉛との解離平衡定数Ｋｄが９．５ｘ１０−９［Ｍ］より小さいことを特徴とする、請求項４に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項６】
前記酸化亜鉛認識ペプチドがＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰである、請求項５に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項７】
ラクダ抗体のＣＤＲ  Ｈ−１領域にＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰからなる酸化亜鉛認識ペプチドを含み、かつ、ＣＤＲ  Ｈ−３領域にＨＬＧＨＧＬＨＲＶＨからなるペプチドを含む、酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項８】
前記ラクダ抗体が、ＣＤＲ間のジスルフィド結合を有しないものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体をコードする遺伝子を含み、該遺伝子によってコードされるタンパク質を発現しうる発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含み、該アミノ酸配列からなるタンパク質を発現しうる請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、その培養物から酸化亜鉛結合性抗体を取得することを特徴とする、酸化亜鉛結合性抗体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体と、前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手段を有するバイオセンサ。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体に、第２のタンパク質を融合させた融合タンパク質。
【請求項１５】
前記第２のタンパク質が、ＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳの配列を有する金認識ペプチドを含むものである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月13日(2009.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクダ抗体のCDR H-1領域にEAHVMHKを含むアミノ酸配列からなる酸化亜鉛認識ペプチドを含むペプチド移植抗体、あるいは前記ペプチド移植抗体のCDR H-3領域にさらにHXXHXXHXXH又はHXXHXXHXXRからなるペプチド（但し、XはG、L、R、又はVである）を含む変異体からなる、酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項２】
前記変異体がCDR H-3領域にHLGHGGHRLH、HLGHGGHGLH、HVGHGLHGVR、又はHLGHGLHRVHからなるペプチドを含むものである、請求項１に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項３】
酸化亜鉛との解離平衡定数Kdが1.7x10-7[M]より小さいことを特徴とする、請求項１又は２に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項４】
酸化亜鉛との解離平衡定数Kdが9.5x10-9[M]より小さいことを特徴とする、請求項３に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項５】
前記酸化亜鉛認識ペプチドがEAHVMHKVAPRPである、請求項４に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項６】
ラクダ抗体のCDR H-1領域にEAHVMHKVAPRPからなる酸化亜鉛認識ペプチドを含み、かつ、CDR H-3領域にHLGHGLHRVHからなるペプチドを含む、酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項７】
前記ラクダ抗体が、CDR間のジスルフィド結合を有しないものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体をコードする遺伝子を含み、該遺伝子によってコードされるタンパク質を発現しうる発現ベクター。
【請求項９】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含み、該アミノ酸配列からなるタンパク質を発現しうる請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、その培養物から酸化亜鉛結合性抗体を取得することを特徴とする、酸化亜鉛結合性抗体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか1項に記載の酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体と、前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手段を有するバイオセンサ。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の酸化亜鉛結合性抗体に、第2のタンパク質を融合させた融合タンパク質。
【請求項１４】
前記第2のタンパク質が、LKAHLPPSRLPSの配列を有する金認識ペプチドを含むものである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【国際調査報告】
2008099968.tif 000061
2008099968.tif 000062
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