【手続補正書】
【提出日】平成16年8月5日(2004.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のディジタル・ホログラフィック・イメージングを実行する装置であって、該装置が、
ホログラフィック生成ユニットと、
ホログラフィック復元ユニットと、
処理ユニットと、
試料が収容された媒体を収容することに適合した容器を含む試料ユニットとを備え、
さらに、前記媒体に固有の少なくとも１つのパラメータまたは前記試料に固有の少なくとも１つのパラメータを測定することに適合し、前記媒体が周囲空気と異なる測定手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置において、前記測定手段が前記媒体の誘電特性を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の装置において、前記測定手段が前記媒体の屈折率を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の誘電特性を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の屈折率を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の厚さを測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の表面トポグラフィーを測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置において、さらに、少なくとも前記媒体に固有の１つのパラメータまたは前記試料に固有の１つのパラメータを処理することに適合した処理手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置において、前記処理手段が前記媒体の誘電特性を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の装置において、前記処理手段が前記媒体の屈折率を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の誘電特性を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の屈折率を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の厚さを処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の表面トポグラフィーを処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置において、試料が収容された媒体の部分的または完全な媒体交換を含め、媒体特性を修正または調節することに適合した媒体制御ユニットを備えることを特徴とする装置。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置において、前記試料ユニットの少なくとも一部を機械的に振動させる振動手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項１７】
請求項１６に記載の装置において、前記振動手段が前記媒体制御ユニットに組み込まれたことを特徴とする装置。
【請求項１８】
媒体中に収容された試料のディジタル・ホログラフィック・イメージングを実行する方法であって、該方法が、
少なくとも１つの参照波と少なくとも１つの物体波との間の干渉によって少なくとも１つのホログラムを発生するステップと、
少なくとも１つのホログラムを取得しディジタル化することによって少なくとも１つのディジタル・ホログラムを発生するステップと、
少なくとも１つのディジタル・ホログラムの数値的復元によって少なくとも１つの振幅差画像及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を復元するステップとを含み、
前記方法が、さらに、
試料の少なくとも１つのパラメータを決定するため、及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータを決定するために、少なくとも１つの振幅差画像を処理、及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を処理するステップを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、媒体の少なくとも１つのパラメータが時間を通じて修正され、複数の振幅差画像及び／または複数の定量的位相を獲得するため複数のホログラムが発生され、試料の少なくとも１つのパラメータの経時変化を記述するため前記複数の振幅差画像及び／または前記複数の定量的位相差画像が処理されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、媒体の少なくとも１つのパラメータが時間を通じて修正され、複数の振幅差画像及び／または複数の定量的位相を獲得するため複数のホログラムが発生及び処理され、媒体の少なくとも１つのパラメータの経時変化を記述するため前記複数の振幅差画像及び／または前記複数の定量的位相差画像が処理されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法において、媒体と試料とが互いに相互作用する結果、試料の少なくとも１つのパラメータの修正及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータの修正が生じることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法において、媒体が分散性媒体であり、媒体の誘電特性の値が試料を照明する放射の波長を変化させることによって変化し、試料を照明する放射の波長の変化の結果、試料の少なくとも１つのパラメータの修正及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータの修正が生じることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の厚さであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の表面トポグラフィーであることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の誘電特性であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の屈折率であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法において、媒体の前記パラメータが媒体の誘電特性であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法において、媒体の前記パラメータが試料の屈折率であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法において、振幅差画像のコントラストを増大または減少させるため、及び／または定量的位相差画像のコントラストを増大または減少させるために、媒体の誘電特性が調整されることを特徴とする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の第１の形態によれば、試料のディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）を実行する装置であって、該装置が、ホログラフィック生成ユニットと、
ホログラフィック復元ユニットと、処理ユニットと、試料が収容された媒体を収容することに適合した容器を含む試料ユニットとを備え、さらに、前記媒体に固有の少なくとも１つのパラメータまたは前記試料に固有の少なくとも１つのパラメータを測定することに適合し、前記媒体が周囲空気と異なる測定手段を備えることを特徴とする装置が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の第２の形態によれば、媒体中に収容された試料のディジタル・ホログラフィック・イメージングを実行する方法であって、該方法が、少なくとも１つの参照波と少なくとも１つの物体波との間の干渉によって少なくとも１つのホログラムを発生するステップと、少なくとも１つのホログラムを取得しディジタル化することによって少なくとも１つのディジタル・ホログラムを発生するステップと、少なくとも１つのディジタル・ホログラムの数値的復元によって少なくとも１つの振幅差画像及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を復元するステップとを含み、前記方法が、さらに、試料の少なくとも１つのパラメータを決定するため、及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータを決定するために、少なくとも１つの振幅差画像を処理、及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を処理するステップを特徴とする方法が提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
別の代替案では、照射波長λを連続して修正し、照射ビームの入射角を連続して修正した後で複数の振幅差画像１６及び／または複数の定量的位相差画像１７を収集してもよい。処理ユニット１８を使用し、アルゴリズムを適用することによって試料の局所的な誘電特性を計算してもよい。フーリエ・スライスの定理は、回折断層法で一般に適用される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
図３は、生理溶液３７によって満たされた潅流チャンバ３０内に密閉された培養物中の生細胞のイメージングを行う本発明の適用業務の例である。図３ａに示すように、細胞培養物３１は入射放射３２によって照明され、顕微鏡対物レンズ３３は透過放射を収集し物体波３４を形成する。ＣＣＤカメラ３５はホログラムを記録する。ホログラムの例を図３ｂに示す。ホログラムは参照波３６との干渉によって発生する。次に、数値的手順を適用してホログラムを復元する。定量的位相差画像の例を図３ｃに示す。獲得された位相差画像は、例えば図３ｄに提示されるように３Ｄ透視図で表せばよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本発明の適用業務の例として、本発明を適用して培養マウス皮質神経細胞の形態学に対する興奮性神経伝達物質（グルタミン酸）の作用の研究が行われた。神経細胞形態学に対するグルタミン酸の影響は、高濃度（２０〜５００μＭ）で数分間といった長時間の作用を受けた場合興奮毒性としてすでに説明されていた。その固有の特徴のため、本発明の方法は、生理的濃度（ＥＣ50＝７．５μＭ）で短時間（数秒）の作用に対して発生する可逆的な形態学的変化の観察を可能にした。この作用はＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（N-methyl-D-asparaye：ＮＭＤＡ）受容体の活性化に反応して発生することが立証されている。神経細胞におけるグルタミン酸に媒介された形態学的変化の実時間観察の結果の概要を図４に示す。図４ａは、生理溶液中に浸漬された生体マウス皮質神経細胞の定量的位相差画像の通常の例を提示する図４ｂの黒い矩形によって画定される領域内でＤＨＩにより実時間測定された位相信号の経時変化を提示する。細胞は制御溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝生理溶液）中で観察され、持続時間２０秒の短期パルスとして薬剤を加えた。この薬剤のパルスを図４ａの黒い三角形で示す。顕著な位相の増大は、黒い三角形４１、４２、４３及び４４で示すグルタミン酸（ＧＬＵＴ）を単独で加えた時に発生している。ＧＬＵＴの濃度はそれぞれ１５μＭ、１０μＭ、１５μＭ及び２０μＭである。黒い三角形４５及び４６で示す場合には、広域イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬であるキヌレン酸（ＫＹＮ）４００μＭをＧＬＵＴに追加した。この場合位相信号の増大は発生せず、観察されたＧＬＵＴの作用はＫＹＮによって阻害されることを示している。また、黒い三角形４７及び４８で示す場合、ＮＭＤＡに固有の受容体拮抗薬であるＭＫ−８０１を５μＭ、生理溶液中のＧＬＵＴに追加した時にもＧＬＵＴの作用は阻害されている。図４ａに見られるように、グルタミン酸のパルスを加えることによって、数分間持続する可逆的なＯＰＬまたは位相の増大が誘発された。このＯＰＬの増大は３時間を越える期間にわたって数回再現しうるものであった。また、図４ａは、こうしたグルタミン酸に媒介された反応が、広域イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬であるキヌレン酸及びＮＭＤＡに固有の受容体拮抗薬であるＭＫ−８０１によって阻害されたことを示し、作用の受容体固有の性質を強調している。濃度応答曲線（図４ｃ）は、５つの異なる実験に基づいて立証されている。応答振幅は細胞毎に異なっているので、〜１５μＭの濃度で発生する最大振幅について結果を基準化した。ヒルの方程式（Hill equation）を使用した曲線近似は、〜７．５±０．２３μＭのＥＣ50による高度に協調的な挙動（ヒル係数（Hill coefficient）＝３．７５±０．４）を示している。興味深いことに、こうした結果は潅流溶液中にグリシン（３μＭ）が存在するときに得られた。グリシンがない場合、細胞は１５μＭより高いグルタミン酸濃度で反応を開始し、反応したのは細胞の〜２５％だけであった（グリシンが存在する場合〜８０％であるのに対して）。グリシンはＮＭＤＡ受容体コアゴニストであるので、この挙動はグルタミン酸に誘発された反応におけるこうした受容体の役割をさらに強調している。通常の位相増大の最大振幅���〜１０度であるが、これは初期細胞位相の〜５％である。再び一定の細胞屈折率（ｎs＝１．３６５）を想定すると、これは垂直（ｚ）軸方向の〜０．６μｍの増大に相当する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
エー・ジェイ・コーブル（A.J. Coble）他、「ネクチュルス胆嚢上皮の顕微鏡干渉法（“Microscope interferometry of necturus gallblader epithelium”）」、ジョサイア・マーシー・ジュニア財団（Josiah Macy Jr.Foundation）、ニューヨーク、１９８２年、２７０−３０３頁
ケー・シー・スヴォボダ（K.C. Svoboda）他、「光トラッピング干渉法によるキネシン・ステッピングの直接観察（“Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry”）、ネイチャー（Nature），第３６５巻、１９９３年