(57)【要約】  夾雑物とアントシアニンとを含む粗色素画分から、容易に精製アントシアニンを製造する方法を提供する。アントシアニンとアルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンと共に金属錯体を形成するフラボンを準備する。そして、アルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンの存在下、液体中で、前記夾雑物およびアントシアニンを含む粗色素画分と、前記フラボンとを接触させ、前記アントシアニンと前記フラボンと前記金属イオンとを含む金属錯体を形成させる。前記液体から、前記粗色素画分に含まれる夾雑物を除去して前記金属錯体を回収し、この金属錯体を、例えば、酸性処理することによって、前記金属錯体からアントシアニンを解離させ、純度の高いアントシアニンを得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アントシアニンを含む粗色素画分から精製アントシアニンを精製する精製アントシアニンの製造方法であって、
下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含むことを特徴とする製造方法。
（Ａ）  アントシアニンとアルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンと共に金属錯体を形成するフラボノイドを準備する工程
（Ｂ）  アルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンの存在下、液体中で、前記粗色素画分と前記フラボノイドとを接触させ、前記アントシアニンと前記フラボノイドと前記金属イオンとを含む金属錯体を形成させる工程
（Ｃ）  前記液体から前記金属錯体を回収する工程
（Ｄ）  前記金属錯体からアントシアニンを解離させる工程
【請求項２】
前記フラボノイドが、ツユクサ由来フラボン、ヤグルマギク由来フラボン、ヒマラヤケシ由来フラボノールおよび青色サルビア由来のフラボンからなる群から選択された少なくとも一つのフラボン類である、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項３】
前記フラボノイドが、フラボコンメリン、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７，４’−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ４’−（６−Ｏ−ｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）−７−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ、ｆｌａｖｏｎｏｌ  ３−ｇｅｔｉｏｂｉｏｓｅおよびｆｌａｖｏｎｏｌ  ３−（６−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−b−Ｏ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項４】
前記粗色素に含まれるアントシアニンが、２種類以上のアントシアニンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項５】
前記アントシアニンが、Ｂ環に２つ以上のＯＨ基を有する、ペオニジン系配糖体アントシアニン、デルフィニジン系配糖体アントシアニン、ペチュニジン系配糖体アントシアニンおよびデルフィニジン系配糖体アントシアニンからなる群から選択された少なくとも一つのアントシアニンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項６】
前記粗色素画分が、植物から抽出したアントシアニンを含む粗色素画分であり、前記植物が、シソ、赤キャベツ、ブドウ、黒トウモロコシ、赤大根、ベリー類、豆類、いも類、米類、紫玉ねぎ、オリーブ、およびリンゴからなる群から選択された少なくとも一つの植物である、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項７】
前記アルカリ土類金属イオンが、マグネシウムイオンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項８】
前記重金属イオンが、亜鉛、ニッケル、カドミウム、鉄、コバルト、アルミニウム、銅、マンガン、クロムおよび錫からなる群から選択された少なくとも一つの金属イオンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項９】
前記（Ｂ）工程に先立って、前記粗色素画分をアルカリ処理し、前記粗色素画分に含まれるアントシアニンをアンヒドロベースまたはアンヒドロベースアニオンに変換する工程を含む、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１０】
前記（Ｃ）工程において、エタノール沈殿法または分子量分画法により、前記液体から前記金属錯体を回収する、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１１】
前記（Ｃ）工程において、前記分子量分画法がゲル濾過法である、請求の範囲１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記（Ｄ）工程において、前記金属錯体に、酸性処理、加熱処理および超音波処理からなる群から選択された少なくとも一つの処理を施して、前記金属錯体からアントシアニンを解離させる、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１３】
前記（Ｄ）工程において、前記金属錯体に酸性処理を施して、前記金属錯体からアントシアニンを解離させ、前記（Ｄ）工程の後、前記（Ｄ）工程の酸性処理によって得られたプラス荷電のアントシアニンと電気的に中性のフラボノイドと前記金属イオンとを含む混合物を陽イオン交換樹脂に供して、前記アントシアニンを吸着させ、前記フラボノイドを除去した後、前記吸着したアントシアニンを溶出する、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１４】
請求の範囲１記載の製造方法により得られる精製アントシアニン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、夾雑物とアントシアニンとを含む粗色素画分から精製アントシアニンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油化学の進歩により、着色料として、色彩や耐久性に優れた低価格の合成色素（タール系色素）が開発され、広く使用されてきた。しかしながら、合成色素は、前述のような性質には優れるものの、その安全性が疑問視されている。実際に、合成色素は、毒性の再検討により、現在では、限られた種類しか使用が許可されていない状態である。そして、近年、食や環境の問題が盛んに議論され、安全性が非常に重要なウエイトを占めていることもあり、再度、天然物由来の色素が注目されている。【０００３】
このような天然物由来の色素として、昔からアントシアニンが知られている。アントシアニンは、アントシアニジンをアグリコンとする色素であり、例えば、食品添加物、カラーインク等の色素、医薬品等への着色料として有用な物質である。また、ポリフェノールの１種であることからも、機能性色素としての効果も期待されている。このようなアントシアニンは、例えば、植物の花、葉、果皮、実等に広く存在しており、例えば、赤キャベツ色素、紅花色素、コチニール色素、クチナシ色素、ブドウ果皮色素等の天然着色料が実際に使用されている。しかし、これらの天然着色料は、アントシアニンの精製品ではなく、夾雑物が含まれた未精製品であるため、純度の高い天然物由来アントシアニンの提供が望まれている。【０００４】
しかしながら、天然物からアントシアニンを精製する場合、天然物には様々な夾雑物が含まれている。中には、アントシアニンと同程度の分子量、同程度の電荷等を示す夾雑物も存在し、純度の高いアントシアニンを得るには、例えば、ＨＰＬＣ等で精製するしかない。このような方法は、非常に手間がかかり、大量精製も現実的ではない。さらに、アントシアニンは弱酸性水溶液中で不安定なことからも、非常に精製が困難であった（非特許文献１）。このため、精製した天然物由来アントシアニンは、安全性に優れるものの、非常に高価であり、入手が困難という問題がある。例えば、赤シソの葉に含まれるシソニンについては、グラムあたり数万円オーダーとなることから、容易に購入できないという現状である。
【非特許文献１】Ｇｏｔｏ，Ｔ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．，Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｉｍａｇａｗａ，Ｈ．，Ｉｉｎｏ，Ａ．ａｎｄＴａｋｅｄａ，Ｋ．：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｔｉｏｄｅｌｐｈｉｎ，ａｎ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｍａｋｉｎｏｉ，ｔｈａｔ  ｉｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３（３６），３６９５−３６９８（１９８２）．
【非特許文献２】Ｔａｄａｏ  Ｋｏｎｄｏ，Ｋｕｍｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ、Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔａｋａｔｏｓｈｉ  Ｋａｗａｉ，Ｈｉｒｏｔｏｓｈｉ  Ｔａｍｕｒａ＆Ｔｏｓｈｉｏ  Ｇｏｔｏ；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３５８，Ｎｏ６３８６，１９９２
【非特許文献３】Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．，Ｕｅｄａ，Ｍ．，Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｉｓｏｂｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｏｔｏ，Ｔ．：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｃｙａｎｉｎ，ａ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｉｇｍｅｎｔ，ｆｒｏｍ  ｂｌｕｅ  ｃｏｒｎｆｌｏｗｅｒ  ｏｆ  Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｃｙａｎｕｓ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３３（９），９７８−９７９（１９９４）．
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｓ．，Ｉｔｏ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６７，９９２（２００６）
【非特許文献５】Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｍ．，Ｋｉｆｕｎｅ，Ｔ．，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，Ｃ．Ｆ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（５）１１６７−１１６９，１９９４
【発明の開示】
【０００５】
そこで、本発明は、夾雑物とアントシアニンとを含む粗色素画分から、容易に精製アントシアニンを製造できる方法の提供を目的とする。前記目的を達成するために、本発明の精製アントシアニンの製造方法は、アントシアニンを含む粗色素画分から精製アントシアニンを製造する方法であって、下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含むことを特徴とする。
（Ａ）  アントシアニンとアルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンと共に金属錯体を形成するフラボノイドを準備する工程
（Ｂ）  アルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンの存在下、液体中で、前記粗色素画分と前記フラボノイドとを接触させ、前記アントシアニンと前記フラボノイドと前記金属イオンとを含む金属錯体を形成させる工程
（Ｃ）  前記液体から前記金属錯体を回収する工程
（Ｄ）  前記金属錯体からアントシアニンを解離させる工程
【０００６】
また、本発明の精製アントシアニンは、本発明の製造方法により得られる精製アントシアニンである。
【０００７】
植物の中でも、例えば、ツユクサにおいては、デルフィニジン型アントシアニンとフラボノイド（例えば、フラボコンメリン）と金属イオン（例えば、マグネシウムイオン）とから形成された金属錯体（例えば、コンメリニン）が、色素として存在することが報告されている（非特許文献２）。この他にも、ヤグルマソウにおいては、シアニジン型アントシアニンとフラボノイドと金属イオンとが金属錯体を形成し（非特許文献３）、ヒマラヤケシや青色サルビアにおいても同様の金属錯体を形成していることが報告されている（非特許文献４および非特許文献５）。そこで、本発明者らは、アントシアニンがフラボノイドと金属イオンとともに金属錯体を自己的に形成する性質を利用して、夾雑物が混在する粗色素画分からアントシアニンを精製する方法の確立を試みた。前述の論文で報告されている金属錯体は、植物中で形成された金属錯体であるか、もしくは、金属錯体の構成成分である特定のアントシアニンと特定のフラボノイドとを単一に精製し、これらの単一精製品を用いて金属イオンの存在下で再構築した金属錯体である。つまり、当該技術分野においては、アントシアニンとフラボノイドと金属イオンとから金属錯体が形成されることは報告されていたものの、夾雑物を含む条件下であっても、アントシアニンを特異的に取り込んだ金属錯体が形成できること、また、複数種類のアントシアニンが存在する場合であっても、金属錯体が形成されること、さらに、論文で記載されたフラボノイドとアントシアニンとの組合せ以外であっても金属錯体が形成されることについては、全く知られていなかった。そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、夾雑物が混在するアントシアニンを含む粗色素画分であっても、金属イオンの存在下、前述のようなフラボノイドと前記粗色素画分中のアントシアニンとを接触させることによって、金属錯体を形成できることを見出した。そして、さらに、アントシアニンを含む金属錯体であれば、共存する夾雑物との分離が可能であることを見出した。アントシアニンと夾雑物とを含む粗色素画分では、前記両者を分離することが極めて困難であるが、アントシアニンを含む金属錯体であれば、共存する夾雑物を容易に除去できることは、本発明者らがはじめて見出した事実である。また、アントシアニンを含む金属錯体から容易にアントシアニンを解離できるため、容易に精製アントシアニンを調製でき、且つ、前記金属錯体は、すでに夾雑物を除去した純度の高い金属錯体であることから、解離によって得られる精製アントシアニンも高い純度となる。
【０００８】
したがって、本発明によれば、簡便且つ容易に前記粗色素画分からアントシアニンを精製でき、これによって、低コストで高純度の精製アントシアニンを提供することが可能となる。したがって、本発明は、例えば、食品分野等を含む、天然色素を利用するあらゆる分野において、極めて有用な技術であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、粗色素画分のＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図２】図２は、本発明の実施例における複合体（金属錯体）のＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例において、アントシアニンに対するＭｇ２＋のモル比（物質量比）と、マロニルシソニンの前後比とをプロットしたグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の精製アントシアニンの製造方法は、前述のように、アントシアニンを含む粗色素画分から精製アントシアニンを製造する方法であって、下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含むことを特徴とする。
（Ａ）  アントシアニンとアルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンと共に金属錯体を形成するフラボノイドを準備する工程
（Ｂ）  アルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンの存在下、液体中で、前記粗色素画分と前記フラボノイドとを接触させ、前記アントシアニンと前記フラボノイドと前記金属イオンとを含む金属錯体を形成させる工程
（Ｃ）  前記液体から前記金属錯体を回収する工程
（Ｄ）  前記金属錯体からアントシアニンを解離させる工程【００１１】
本発明において、前記アントシアニンとフラボノイドと金属イオンとを含む金属錯体は、以下、「複合体」ともいう。なお、本発明の製造方法は、アントシアニンの精製方法ともいえる。【００１２】
＜フラボノイド＞
本発明におけるフラボノイドとしては、アントシアニンと前記金属イオンと共に金属錯体を形成するフラボノイドであればよい。このようなフラボノイドとしては、例えば、以下に示すフラボン（２−フェニルクロモン）やその誘導体等があげられる。前記誘導体としては、例えば、水酸基を含むフラボノール、メトキシ基を含む誘導体等があげられる。前記フラボノイドとしては、例えば、植物由来のフラボンがあげられ、具体例としては、ツユクサ由来のフラボンであるフラボコンメリン（非特許文献２）、ヤグルマソウ由来のフラボンであるａｐｉｇｅｎｉｎ  ４’−（６−Ｏ−ｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）−７−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（非特許文献３）、ヒマラヤケシ由来のフラボノールであるｆｌａｖｏｎｏｌ  ３−ｇｅｔｉｏｂｉｏｓｅあるいはｆｌａｖｏｎｏｌ  ３−（６−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−ｂ−Ｏ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）（非特許文献４）、青サルビア由来のフラボンであるａｐｉｇｅｎｉｎ  ７，４’−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（非特許文献５）、柑橘由来のフラボンであるｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ、ｄｉｏｓｍｉｎ、柑橘由来のフラボンであるｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、そば由来のフラボンであるｒｕｔｉｎ、ａｐｉｇｅｎｉｎ、フラボンであるａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｏ−ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｏｓｉｄｅ、ｓｉｌｙｍａｒｉｎ、オリーブ由来のフラボンであるｌｕｔｅｏｌｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ等があげられる。【００１３】
これらのフラボノイドは、例えば、植物から調製することができる。通常、前記フラボノイドは、アントシアニンの局在箇所に存在することから、植物のアントシアニンが局在する部位より抽出できる。具体例として、ツユクサから前記フラボコンメリンを調製する方法の一例を以下に示す。【００１４】
まず、ツユクサの花弁を圧搾する。そして、得られた搾汁にエタノールを添加してエタノール沈殿を行い、上清を回収する。エタノールの添加割合は、特に制限されないが、圧搾汁の４〜２０倍（体積）であることが好ましい。なお、エタノールの上清にはフラボコンメリンが含まれ、エタノール沈殿の沈殿物には、ツユクサ由来フラボコンメリンとツユクサ由来アントシアニン（例えば、アオバニンやマロニルアオバニン）と金属イオンとから構成される金属錯体（コンメリニン）が含まれる。つぎに、前記上清を吸着剤に供給して、前記吸着剤にフラボコンメリンを吸着させ、メタノールの濃度交配によって、吸着したフラボコンメリンを溶出させる。この際、前記上清に含まれるフラボコンメリンがツユクサ由来アントシアニンおよび金属イオンと金属錯体を形成している可能性を考慮し、メタノールの濃度交配による溶出に先だって、酸性水溶液を供給し、吸着したフラボコンメリンからツユクサ由来アントシアニンを解離させておくことが好ましい。前記吸着剤としては、例えば、商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ（合成吸着剤、オレガノ社製）があげられる。前記酸性水溶液としては、特に制限されないが、例えば、塩酸等の水溶液があげられる。そして、メタノール濃度交配により溶出したフラボコンメリン画分を回収する。このフラボコンメリン画分は、そのまま使用してもよいし、例えば、濃縮した後、有機溶媒と水との混合液に添加し、加熱によって結晶化させ、さらに乾燥させたものを使用してもよい。なお、フラボノイドは、後述する粗色素画分中のアントシアニンと金属錯体を形成できればよく、例えば、植物から抽出した粗フラボノイド画分をそのまま使用してもよい。【００１５】
他のフラボノイドも、例えば、前述と同様の方法により調製することができる。例えば、ヤグルマソウやヒマラヤケシから目的のフラボノイドを調製する場合も、例えば、花弁から抽出することができる。なお、これらのフラボノイドは、例えば、合成品を使用してもよい。【００１６】
＜金属イオン＞
本発明において、前記金属イオンは、アルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンであればよい。前記アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオンがあげられ、前記重金属イオンとしては、例えば、亜鉛、ニッケル、カドミウム、鉄、コバルト、アルミニウム、銅、マンガン、クロム、錫等のイオンがあげられる。中でも、マグネシウムが好ましい。【００１７】
本発明においては、金属イオン存在下、液体中で前記金属錯体を形成させるため、イオン化する金属化合物を、前記液体に添加することが好ましい。このような金属化合物としては、制限されないが、具体例としては、アルカリ土類金属または重金属の酢酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩等があげられる。【００１８】
＜粗色素画分＞
前記粗色素画分は、アントシアニンを含んでいればよいが、本発明は、アントシアニンが夾雑物と共存する場合に、特に有効なアントシアニンの精製方法であることからも、夾雑物を含む粗色素画分が好ましい。このような粗色素画分としては、例えば、精製処理を施していない植物の抽出物があげられる。植物の抽出液としては、例えば、植物において目的のアントシアニンが含まれる部位の圧搾汁があげられる。例えば、花弁に含まれるアントシアニンを精製するのであれば、花弁の圧搾汁、果実に含まれるアントシアニンを精製するのであれば、果実の圧搾汁、果実や種子の皮に含まれるアントシアニンを精製するのであれば、前記皮の圧搾汁等が使用できる。また、圧搾のみでアントシアニンが抽出できない場合には、例えば、目的のアントシアニンが含まれる部位を溶媒に浸漬した後、圧搾すればよい。前記溶媒は、制限されないが、例えば、水、メタノール等の有機溶媒、これらの混合溶媒があげられ、さらに、トリフルオロ酢酸等を含んでもよい。前記植物としては、例えば、シソ、赤キャベツ、ブドウ、黒トウモロコシ、赤大根、イチゴ、カシスおよびブルーベリーをはじめとするベリー類、黒豆、小豆等の豆類、紫いも等のいも類、赤米など米類、紫玉ねぎ、オリーブ、リンゴ、金時豆、黒豆等の豆類等があげられる。このような植物の圧搾汁には、通常、タンパク質、糖、ビタミン、ミネラル、脂質、アントシアニン以外のフラボノイド類、高分子化したポリフェノール類等の夾雑物が含まれる。【００１９】
このようにして抽出した粗色素画分は、例えば、金属錯体を形成させる前に、予め、糖やタンパク質等の極性成分を除去してもよい。これによって、より効率良く、粗色素画分からアントシアニンを精製することができる。前記極性成分の除去方法としては、制限されないが、例えば、前述のような吸着剤があげられ、具体的に、商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ（合成吸着剤、オレガノ社製）等が使用できる。なお、従来、問題となっていたのは、前述のように、例えば、アントシアニンと分子量や電荷が類似している夾雑物（特に、アントシアニン以外のフラボノイド類や高分子化したポリフェノール類等）であることから、例えば、粗色素画分の準備において、糖やタンパク質を予め除去することは、本発明の効果を否定するものではない。【００２０】
＜アントシアニン＞
本発明において、前記粗色素画分に含まれるアントシアニンは、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。そして、本発明の製造方法により最終的に得られる精製アントシアニン画分に含まれるアントシアニンも、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。アントシアニンは、前述のようにアントシアニジンをアグリコンとする配糖体の総称であり、複数の化合物が存在している。従来においては、前述のように、これらの個々のアントシアニンを分離することではなく、それ以前に、植物由来の粗色素画分に含まれるアントシアニンと夾雑物とを分離すること自体が困難であった。本発明においては、金属錯体を形成することにより、夾雑物とアントシアニンとの分離を簡便に行うことを可能としているのであって、最終的に得られる精製アントシアニン画分に２種類以上のアントシアニンが含まれていてもよい。また、従来、個々のアントシアニンを分離する技術が存在しても、その原料となるアントシアニン画分の純度に問題があったが、本発明によれば、夾雑物を減少させた精製アントシアニン画分を提供できるため、このような問題を解消できる。この点からも、本発明により得られる精製アントシアニン画分は、二種類以上のアントシアニンを含んでいてもよい。さらに、天然由来のアントシアニンは、単品のアントシアニンではなく、複数のアントシアニンの混合物であっても、十分な商品価値を有することは、当該技術分野において周知である。【００２１】
このように粗色素画分に含まれるアントシアニンの種類は、制限されないが、例えば、下記式に示すアントシアニンが好ましい。下記式において、Ｒ１〜Ｒ７は、特に制限されないが、それぞれ、例えば、水素原子、水酸基、またはメトキシ基などの官能基を有するものであり、水酸基はグルコースなどが結合したいわゆる配糖体となっている。先の官能基は同一でも異なっていても良く、少なくとも一つは水酸基である。また、フラボノイドとの金属錯体を形成しやすいことから、下記式に示すアントシアニジンのＢ環に、２個以上の水酸基を有するアントシアニンであることが好ましい。つまり、下記式において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３における少なくとも２つが水酸基であることが好ましい。このようなアントシアニンとしては、例えば、ペオニジン系配糖体アントシアニン、デルフィニジン系配糖体アントシアニン、ペチュニジン系配糖体アントシアニン、デルフィニジン系配糖体アントシアニン等があげられる。アントシアニンの具体例としては、例えば、マロニルシソニン、（メチルマロニル）シソニン、シソニン、シアニン、マロニルアオバニン、アオバニン、シアニジン、デルフィニジン、ルテオリニジン、ペチュニジン、ヨーロピニジン等があげられるがこれには制限されない。なお、「アントシアニジン」および「アントシアニン」とは、狭義には、下記式で表される化合物およびその配糖体のうち特定のもののみをさす場合があるが、本発明では、さらに広く、例えば、植物の花、葉、果皮、実等に存在する色素全般をさす。【００２２】
【化１】
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【００２３】
下記式に、アントシアニンの一例を列挙する。
【化２】
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【表１】
2008111589.tif 000005
【００２４】
つぎに、本発明の製造方法について、フラボノイドとしてツユクサ由来フラボコンメリンを使用した例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。【００２５】
まず、前述のようにして、植物から抽出した粗色素画分を準備する。前記粗色素画分は、そのまま使用してもよいが、金属錯体の形成に先立って、前記粗色素画分をアルカリ処理することが好ましい。このようなアルカリ処理によって、前記粗色素画分に含まれるアントシアニンが、アンヒドロ塩基またはアントヒドロ塩基アニオンとなる。これによって、より効率良く金属錯体を形成することができる。アントシアニンをアンヒドロ塩基に変換する場合は、前記粗色素画分のｐＨを、例えば、５〜９に設定することが好ましく、より好ましくは、７〜９である。また、アントシアニンをアンヒドロ塩基アニオンに変換する場合は、前記粗色素のｐＨを、例えば、９以上に設定することが好ましく、より好ましくは、９〜１２である。なお、アントシアニンの構造変化の一例を、下記式に示す。
【化３】
2008111589.tif 000006
【００２６】
つぎに、前述のようにして、フラボコンメリンを準備し、溶媒中に、フラボコンメリン、前記粗色素画分および金属イオンを添加して混合する。この際、フラボコンメリン、粗色素画分および金属イオンの添加順序は、制限されない。前記溶媒は、制限されないが、例えば、水（例えば、純水）等が使用でき、この他に、アントシアニンを含む植物の抽出液そのものであってもよい。フラボコンメリンおよび粗色素画分は、それぞれ固体でも液体でもよい。前記金属イオンは、例えば、前記溶媒に、直接、前述のような液体中でイオン化する金属化合物を添加してもよいし、金属がすでにイオン化した金属化合物溶液（例えば、酢酸マグネシウム水溶液）を添加してもよい。フラボコンメリンと粗色素画分と金属イオンとを添加した混合液のｐＨは、例えば、６〜９であることが好ましい。温度条件は、制限されず、通常、フラボノイドやアントシアニンの分解を十分に回避できることから、５０℃未満であることが好ましく、例えば、２０〜３０℃である。これらを液体中で混合することによって、フラボコンメリンとアントシアニンと金属イオンからなる金属錯体が瞬時に形成される。【００２７】
前記液体中において、各成分の割合は適宜決定でき、制限されないが、粗色素画分に含まれるアントシアニンに対して、フラボコンメリンと金属イオンとが十分量添加されていることが好ましい。なお、ツユクサにおいて形成される金属錯体コンメリニンは通常、アントシアニンとフラボノイド（フラボコンメリン）と金属イオンのモル比が６：６：２である（前記非特許文献２）。前記フラボコンメリンは、前記粗色素画分のアントシアニン１ｍｏｌに対して、例えば、１〜２０ｍｏｌであることが好ましく、より好ましくは１〜５ｍｏｌである。また、前記金属イオンは、前記粗色素画分のアントシアニン１ｍｏｌに対して、例えば、１０〜５０ｍｏｌであることが好ましく、より好ましくは１０〜２０ｍｏｌである。アントシアニン（Ａ）とフラボコンメリン（Ｆ）と金属イオン（Ｍ）の割合（Ａ：Ｆ：Ｍ）は、例えば、（Ａ）１：（Ｆ）１〜５：（Ｍ）５〜２０であることが好ましく、より好ましくは、（Ａ）１：（Ｆ）１〜２：（Ｍ）５〜２０である。なお、他のフラボノイドを使用する際も、同様の割合に設定できる。【００２８】
このような方法により金属錯体が形成できることは、後述する実施例で証明されているため、本発明の製造方法において、複合体形成の有無を確認することは必須ではない。なお、金属錯体の形成は、例えば、非特許文献２に記載する方法により確認することが可能である。すなわち、前記金属錯体は、可視部吸収スペクトルの長波長シフト、５８０ｎｍ（θ；＋６１５，０００）および６６８ｎｍ（θ；−４８０，０００）におけるＣＤの励起子型（ｅｘｉｔｏｎ−ｔｙｐｅ）の負のコットン効果が観察されること、分子篩カラムクロマトグラフィーでの高分子青色複合体の溶出によって判断できる。【００２９】
つぎに、前記液体から前記金属錯体を回収する。これによって、前記粗色素画分に含まれる夾雑物を除去する。前述の工程において金属錯体が形成されるが、この金属錯体は、特定の成分（すなわち、フラボノイド、アントシアニンおよび金属イオン）から形成される複合体であり、前記粗色素画分に様々な夾雑物が含まれる場合であっても、これらの夾雑物とフラボコンメリンと金属イオンとが金属錯体を形成する可能性は極めて低い。そこで、この金属錯体を回収することによって、その他の成分が除去され、アントシアニンを含む金属錯体を高い純度で回収できる。そして、目的のアントシアニンを含む金属錯体を回収できれば、後述するように前記金属錯体からアントシアニンを解離させたり、解離したアントシアニンとフラボコンメリンと金属イオンとを分離することは、容易である。このため、非常に優れた効率で粗色素画分に含まれる夾雑物を除去して、純度の高い精製アントシアニンを得ることができる。また、本発明は、粗色素画分における夾雑物を除去することが目的であり、前述のように、最終的に得られる精製アントシアニン画分に含まれるアントシアニンは、一種類でもよいし、二種類以上が含まれていてもよい。【００３０】
前記液体から金属錯体と夾雑物とを分離する方法は、特に制限されず、例えば、エタノール沈殿法があげられる。前述のように、ツユクサにおけるコンメリニンは、例えば、エタノール沈殿の沈殿画分に含まれる。したがって、本発明における、フラボコンメリンとアントシアニンと金属イオンとから形成された金属錯体も同様にエタノール沈殿を行うことによって、その沈殿画分から回収できる。エタノールの添加割合は、制限されない。前記工程において複合体を形成させた液体（以下、「反応液」ともいう）に対しては、例えば、水分含量に応じて適宜決定できるが、例えば、エタノール３〜１０倍量（体積）であり、好ましくは３〜６倍量（体積）である。【００３１】
この他に、例えば、ゲル濾過等の分子量分画法により前記金属錯体と夾雑物とを分離することもできる。ゲル濾過法は、例えば、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーが利用でき、従来公知の各種カラムが使用できる。具体例としては、商品名Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ａｍｅｒｓｈａｍ社製）等があげられる。【００３２】
このようにして回収した金属錯体からアントシアニンを解離させることによって、純度の高い精製アントシアニンを得ることができる。アントシアニンを解離させる方法としては、制限されないが、例えば、金属錯体を、酸性処理する方法、加熱処理する方法、超音波処理する方法等があげられる。また、金属錯体をＥＤＴＡ等のキレート剤で処理し、前記金属錯体から金属イオンを除くことによって、アントシアニンを解離させる方法でもよい。この中でも酸性処理を一例として以下に説明する。前記金属錯体に酸性処理を施しても、フラボコンメリンは電気的に中性であり、アントシアニンはプラスに荷電している。したがって、例えば、陽イオン交換樹脂（酸性イオン交換樹脂）を利用すれば、プラスに荷電したアントシアニンは、イオン交換樹脂に吸着し、中性のフラボノイドは非吸着となる。このため、非吸着のフラボノイドを分離した後、アントシアニンが吸着した陽イオン交換樹脂に酸を接触させることで、アントシアニンが溶出され、結果的に金属錯体から解離することとなる。このようにして、粗色素画分に含まれる夾雑物を除去して、純度の高い精製アントシアニンを回収することができる。このような方法であれば、酸処理するのみでアントシアニンを解離できることから、容易に精製アントシアニンを調製できる。【００３３】
なお、酸性処理後のフラボコンメリンとアントシアニンと金属イオンは、例えば、以下のようにして分離することができる。【００３４】
前述のように、金属錯体からアントシアニンを解離させるために酸性処理を行った結果、フラボコンメリンは電気的に中性な状態を維持し、アントシアニンはプラスに荷電した状態となる。このため、両者ならびに金属イオンが含まれる混合液を、例えば、陽イオン交換樹脂に供することによって、アントシアニンのみを回収することが可能となる。すなわち、前記混合液を陽イオン交換樹脂に供すると、プラス荷電のアントシアニンが陽イオン交換樹脂に吸着され、電気的に中性なフラボコンメリンは、吸着されない。そこで、非吸着のフラボコンメリンを除去した後に、例えば、塩濃度交配により吸着したアントシアニンを溶出し、その溶出画分を回収する。このようにして、さらに、フラボコンメリンとアントシアニンとを分離することができる。【００３５】
［実施例］
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００３６】
（１）シソからの粗色素の抽出
赤シソの葉２６００ｇをミキサーで粉砕し、０．５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）含有５０％ＭｅＯＨ  ８．８５Ｌに、４℃で一晩浸漬した。次に、浸漬した葉を取り出し、これを０．５％ＴＦＡ含有５０％ＭｅＯＨ  ２．５５Ｌを用いてハンドスクリュー圧搾機で圧搾し、抽出液を回収した。圧搾後の残渣を、再度０．５％ＴＦＡ含有５０％ＭｅＯＨ  ３Ｌに、４℃で一晩浸漬し、同様にして圧縮抽出処理を行った。得られた抽出液を先の抽出液と混合し（約１５Ｌ程度）、エバポレーターと真空ポンプとを用いて、減圧下で濃縮乾固を行った（１１５．９ｇ）。得られた乾固物４９．５８ｇを、１％ＨＣｌ含有ＭｅＯＨ水溶液で溶解し、濾過した後、溶液中の色素をイオン交換カラムクロマトグラフィー（商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−７、カラムφ２５ｍｍ×４５０ｍｍ）に吸着させた。そして、糖やタンパク質等の極性成分を除去するため、０．５％ＴＦＡ水溶液１Ｌを流した後、さらに、０．５％ＴＦＡ含有８０％ＭｅＯＨ水溶液１．５Ｌを流して吸着した色素を溶出した。回収した溶出液を、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮乾固し、さらに、微量水分と揮発性酸であるＴＦＡとを除去するため、真空ポンプを用いて乾固した。これにより粗色素１２．３ｇを得た。【００３７】
（２）ツユクサからのフラボコンメリンの単離
（２−１）粗コンメリニンの単離
ツユクサの青色花弁の凍結物４．４ｋｇをハンドスクリュー圧搾機で圧搾し、３．６４Ｌの青色の搾汁を得た。これに２１Ｌのエタノールを加えて−２０℃で一晩放置し、色素画分を沈殿させた。これを遠心分離に供し（商品名ＳＣＲ２０Ｂ、ＨＩＴＡＣＨＩ社製、５０００ｐｐｍ、１０分間）、上清と沈殿とに分離し、沈殿を回収した。この回収した沈殿を、減圧下、塩化カルシウム上で乾燥した。これにより、青色固形物として１４．５ｇの粗コンメリニンを得た。なお、粗コンメリニンの吸収スペクトルデータならびにその測定条件を以下に示す。【００３８】
・ＵＶスペクトル測定条件
装置：日本分光社製。商品名Ｖ−５２０−ＳＲ型分光光度計
溶媒：０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）
セル長：１ｍｍ
・コンメリニン吸収スペクトルデータ
ＵＶ−ｖｉｓλｎｍ（ε）：６４５（６６０００）、５９０（１４０２００）【００３９】
（２−２）フラボコンメリンの単離精製
前記（２−１）のエタノール沈殿後に分離した上清を、エバポレーターと真空ポンプとを用いて、減圧下で濃縮乾固した。これにより、フラボコンメリンの多く含まれる紺色の油状物と黄色の固形物とを得た。黄色の固形物をジメチルスルホキシドに溶解させ、その溶液をＨＰＬＣ分析した結果、フラボンの１種「フラボコンメリン」であることが確認できた。この溶液と、超純水で希釈した前記紺色の油状物とを混合して濾過した後、溶液中のフラボコンメリンをイオン交換カラムクロマトグラフィー（商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−７、カラムφ２５ｍｍ×４５０ｍｍ）に吸着させた。まず、前記カラムに、１％塩酸水溶液０．７２Ｌを流した。これにより、イオン交換樹脂に吸着したフラボコンメリンがツユクサ由来アントシアニンと複合体を形成している場合でも、前記ツユクサ由来アントシアニンをフラボコンメリンから解離させることができる。続いて、前記カラムに、超純水７．５Ｌ、２０％ＭｅＯＨ水溶液６Ｌ、３０％ＭｅＯＨ水溶液６Ｌ、４０％ＭｅＯＨ水溶液９Ｌ、６０％ＭｅＯＨ水溶液３Ｌをこの順序で流して、吸着したフラボコンメリンを溶出した。フラボコンメリンは、２０％ＭｅＯＨ水溶液を２Ｌ流した時点から溶出が確認された。そこで、この時点から４０％ＭｅＯＨ水溶液を５Ｌ流した時点までをフラクションＩとして回収し、さらに、４０％ＭｅＯＨ水溶液５Ｌ流した時点から６０％ＭｅＯＨ水溶液を１Ｌ流した時点までをフラクションIIとして回収し、さらに、６０％ＭｅＯＨ水溶液を１Ｌ流した時点から６０％ＭｅＯＨ水溶液を３Ｌ流した時点までをフラクションIIIとして回収した。フラクションＩを減圧下で濃縮して、乾固物６．９８ｇを得た。フラクションIIおよびIIIからは乾固物が得られなかった。前記フラクションＩから得られた乾固物に超純水５０ｍＬおよびアセトニトリル１００ｍＬを加え、加熱することによって、フラボコンメリンを析出させた。析出したフラボコンメリンを減圧下で乾燥することによって、５．２８ｇ（純度９０％）のフラボコンメリンを得た。なお、得られたフラボコンメリンの吸収スペクトルデータならびにその測定条件を以下に示す。コンメリニンは、前記非特許文献２に示すように、可視部吸収スペクトルの長波長シフト、可視部の強い励起子型の負のコットン効果により判断できる。【００４０】
・ＵＶスペクトル測定条件
装置：日本分光社製。商品名Ｖ−５２０−ＳＲ型分光光度計
溶媒：超純水
セル長：１ｍｍ
・フラボコンメリン吸収スペクトルデータ
ＵＶ−ｖｉｓλｎｍ（ε）：３２６（１９８００）、２７１（２２２６０）【００４１】
（２−３）ツユクサ残渣からの粗色素およびフラボコンメリンの単離
前記（２−１）で得られた圧搾後の残渣を、０．５％ＴＦＡ含有５０％ＭｅＯＨ  ３Ｌに、４℃で１ヶ月浸漬した後、抽出液と残渣とに分離した。この残渣を、再度、０．５％ＴＦＡ含有５０％ＭｅＯＨ  ３Ｌに浸漬し、同様にして抽出を行い、抽出液を回収した。この抽出液をと先の抽出液とを混合し、エバポレーターと真空ポンプとを用いて、減圧下で濃縮乾固した（１０．１８ｇ）。この乾固物１０．１８ｇを超純水で溶解し、濾過した後、溶液中の色素画分およびフラボコンメリンをイオン交換カラムクロマトグラフィー（商品名Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−７、カラムφ２５ｍｍ×４５０ｍｍ）に吸着させた。そして、糖やタンパク質等の極性成分を除去するため、０．５％ＴＦＡ水溶液４Ｌを流した後、さらに、１０％ＭｅＯＨ水溶液２Ｌ、３０％ＭｅＯＨ水溶液４Ｌ、４０％ＭｅＯＨ水溶液２Ｌをこの順序で流して、吸着したフラボコンメリンを溶出した。フラボコンメリンは、３０％ＭｅＯＨ水溶液を流した時点から溶出が確認されたので、この時点からの溶出液を回収した。回収したフラクションを減圧下で濃縮し、乾固物を得た。この乾固物に超純水２０ｍＬおよびアセトニトリル１５０ｍＬを加え、加熱することにより、フラボコンメリンを析出させた。析出したフラボコンメリンを減圧下で乾燥することによって、０．６１ｇのフラボコンメリンを得た。続いて、フラボコンメリンを溶出した後、前記イオン交換カラムに、０．５％ＴＦＡ含有８０％ＭｅＯＨ水溶液１．５Ｌを流し、吸着した色素画分を溶出させた。回収した溶出液を、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮乾固し、さらに、微量水分と揮発性酸であるＴＦＡとを除くため、真空ポンプによって乾固した。これにより、ツユクサの粗色素０．８２ｇを得た。【００４２】
（３）シソ由来アントシアニンとツユクサ由来フラボコンメリンとの複合体形成
前記（１）で調製したシソ由来の粗色素（乾固物）３ｍｇに超純水１ｍＬを加え、０．５Ｎアンモニア水１ｍＬで中和した後、減圧下で濃縮乾固した。なお、中和により、シソ由来粗色素に含まれるアントシアニンは、アンヒドロベース型に変換される。この乾固物に、超純水５０μＬと、前記（２−２）で調製したフラボコンメリン３ｍｇを水５０μＬに溶解したフラボコンメリン溶液を加え、さらに、０．５Ｍ酢酸マグネシウム水溶液２５μＬを加えた。この混合液は、混合によって瞬時に青色となった。この混合液を減圧下で濃縮し、混合液中の複合体をゲル濾過カラムクトマトグラフィー（商品名ｓｅｐｈａｄｅｘＧ−１０、カラムφ１０ｍｍ×１５０ｍｍ）に吸着させ、水で溶出することにより精製した。そして、濃い青色の溶出画分を、複合体含有画分として回収した。なお、シソ由来アントシアニンとツユクサ由来フラボコンメリンとを含む複合体の形成は、前述のコンメリニンと同様に、可視部吸収スペクトルの長波長シフト、可視部の強い励起子型の負のコットン効果により判断した。【００４３】
シソ由来アントシアニンとツユクサ由来フラボコンメリンとの複合体の収率を確認した。まず、複合体形成に使用した粗色素を１％ＴＦＡ含有ＭｅＯＨに溶解して、吸光度測定を行った。他方、形成した複合体には、前記粗色素と同じ希釈倍率となるように１％ＴＦＡ含有ＭｅＯＨを添加した。そして、この溶液を１０分間超音波処理して、前記複合体からシソ由来アントシアニンを解離した後、吸光度測定を行った。そして、複合体の吸光度（Ｃ）を粗色素の吸光度（Ｐ）で割った値の百分率（１００×Ｃ/Ｐ）を、複合体の収率（％）とした。その結果、粗色素の吸光度（Ｐ）が０．５１４、複合体の吸光度（Ｃ）が０．１４４であったことから、収率（１００×Ｃ／Ｐ）は、「約２８．０２％」となった。【００４４】
・ＵＶスペクトル測定条件
装置：日本分光社製。商品名V-520-SR型分光光度計
溶媒：1%TFA含有MeOH
セル長：1mm
波長：529nm（粗色素）、529nm（複合体）【００４５】
以上のように、複合体の形成が確認されたことから、夾雑物が含まれる粗色素を用いても、アントシアニンとフラボコンメリンとの複合体を形成でき、アントシアニンを解離することによって、アントシアニンを精製できることがわかった。また、赤シソの葉には、少なくとも４種類のアントシアニンが含まれることが知られている。このように２種類以上のアントシアニンが含まれる粗色素を使用しても、アントシアニンとフラボコンメリンとの複合体を形成できることがわかった。この結果から、本発明によれば、例えば、赤シソの葉を原料とする場合、複合体（金属錯体）を形成するのみで、アントシアニンを精製することができる。【００４６】
なお、シソ由来アントシアニンとツユクサ由来フラボコンメリンとの複合体は、ツユクサ由来アントシアニンとツユクサ由来フラボコンメリンとの複合体よりも、紫がかった青色を呈していた。前者の複合体が、後者の複合体に比べ、可視における極大吸収波長が短波長側にシフトしたためと考えられる。これは、シソ由来アントシアニンは、母核がシアニジンであるのに対し、ツユクサ由来フラボコンメリンに元来含まれるツユクサ由来アントシアニンは、母核がデルフィニジンであることに起因すると推測される。【００４７】
（４）複合体の構成成分の分析
つぎに、フラボコンメリンが、各種アントシアニンと複合体を形成しているか否かを確認した。前述のように赤シソの葉には、少なくともシソニン（Ｓ）、マロニルシソニン（ＭＳ）、（メチルマロニル）シソニン（ＭＭＳ）およびシアニン（Ｃ）が含まれている。そこで、どのような組成比で各種アントシアニンとフラボコンメリンとが複合体を形成しているのかを確認した。【００４８】
前記（３）で使用した粗色素と前記（３）で形成した複合体とについて、下記条件によりＨＰＬＣ分析を行った。この結果を、図１および図２に示す。図１は、粗色素のＨＰＬＣクロマトグラム、図２は、複合体のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。なお、下記ＨＰＬＣ条件に示すように移動相ＡおよびＢは、酸性溶媒であることから、複合体をＨＰＬＣに供することによって、前記複合体からアントシアニンが解離する。したがって、図２のピークは、直接的には、解離したアントシアニンのピークであるが、間接的には、それぞれのアントシアニンを含む複合体のピークである。つまり、図２のピークから、各アントシアニンを取り込んだ複合体の量や、各複合体の比率等を求めることができる（以下、同様）。【００４９】
図１の上段に示すように、粗色素のクロマトグラムでは、紫外部（２８０ｎｍ）において夾雑物（例えば、タンパク質や有機酸、アントシアニン以外のフラボノイド類、高分子化したポリフェノール類等）のピークが見られるが、図２の上段に示すように、複合体のクロマトグラムでは、フラボコンメリンと微量の不純物のピークが検出されただけであった。このことから、粗色素に含まれるほとんどの夾雑物、特に、従来問題となっていた、アントシアニン以外のフラボノイド類や高分子化したポリフェノール類は、複合体形成には適さない物質であって、複合体形成に使用されず、前述のカラムクロマトグラフィーによって除去されたことがわかる。【００５０】
・ＨＰＬＣ分析条件
送液ポンプ：JASCO社製、商品名PU−980×2
検出器：JASCO社製、商品名MD2010Plusフォトダイオードアレー検出器
カラム：商品名Develosil  ODS-HG-5  250ｍｍ×4.6ｍｍ
移動相Ａ：  酢酸：アセトニトリル：水：リン酸＝2：2.5：94：1.5
移動相Ｂ：  酢酸：アセトニトリル：水：リン酸＝20：25：53.5：1.5
サンプル注入量：10μL
流速：1mL/min
カラム温度：40℃
【表２】
2008111589.tif 000007
【００５１】
そして、粗色素については、５４０ｎｍクロマトグラムから、各アントシアニン（Ｓ、ＭＳ、ＭＭＳおよびＣ）のピーク面積の割合（％）を求め、これを粗色素における各アントシアニンの組成割合（％）とした。また、シアニン（Ｓ）のピーク面積の割合（％）を１として、他のアントシアニンのピーク面積の比率をそれぞれ求めた。他方、前記（３）で形成した複合体についても、５４０ｎｍクロマトグラムから、複合体に含まれていた各アントシアニンのピーク面積の割合（％）を求め、これを各アントシアニンが含まれている複合体の組成割合（％）とした。また、複合体についても、Ｓのピーク面積の割合（％）を１として、他のアントシアニンのピーク面積の比率を求めた。この結果を下記表に示す。なお、複合体の形成は、３回行い、平均値ならびに標準偏差を求めた。【００５２】
【表３】
2008111589.tif 000008
【００５３】
前記表３に示すように、粗色素には、主成分としてＳ、ＭＳ、ＭＭＳおよびＣのアントシアニンが上記の比率で含まれていることが確認された。そして、複合体についても、Ｓ、ＭＳ，ＭＭＳおよびＣのアントシアニンを含む複合体がそれぞれ上記比率で形成されていることが確認された。この結果から、前記粗色素のように複数のアントシアニンが存在する場合であっても、アントシアニンとフラボコンメリンとの複合体が形成できること、また、フラボコンメリンは、各種アントシアニンとの複合体を形成できることがわかった。なお、この実施例では、赤シソの葉からの抽出物からタンパク質等の極性成分を除去するためにＡｍｂｅｒｌｉｔｅで処理を行っているが、この処理を行っていない粗色素であっても、同様に複合体が形成され、複合体の形成によってアントシアニンが精製できることは確認済みである。
【実施例２】
【００５４】
前記実施例１に示すように、複数のアントシアニンが存在する場合であっても、各種アントシアニンとフラボコンメリンとの複合体を形成できることがわかった。そこで、粗色素中のアントシアニンの組成比を変化させることによって、複合体形成時における各種アントシアニンの選択性を確認した。【００５５】
（１）粗色素の調製
（１−１）粗色素の酸加水分解
前記実施例１で調製したシソ粗色素２０．６ｇを１％ＨＣｌ含有ＭｅＯＨ水溶液に溶解し、ＨＰＬＣによって加水分解反応を観察しながら、室温で２日間放置し、前記粗色素に含まれるマロニルシソニンからマロン酸を除去して、シソニンに変換した。この反応液を減圧下で濃縮乾固し、さらに、微量水分と揮発性酸であるＨＣｌとを除くため、真空ポンプにより乾固した。これにより、シソニンを主成分とした粗色素１３．４５ｇを得た。これを粗色素Ａという。また、前記実施例で調製したシソ粗色素２．０ｇを３％ＨＣｌ含有ＭｅＯＨ水溶液に溶解し、ＨＰＬＣによって加水分解反応を観察しながら、室温で１日放置し、前記粗色素に含まれるマロニルシソニンからマロン酸を除去して、シソニンに変換した。この反応液を減圧下で濃縮乾固し、さらに、微量水分と揮発性酸であるＨＣｌとを除くため、真空ポンプにより乾固した。これにより、シソニンを主成分とした粗色素１．７ｇを得た。これを粗色素Ｂという。【００５６】
（１−２）粗色素の配合調整
前記酸加水分解処理で得られた前記粗色素Ａおよび前記粗色素Ｂと、前記実施例１で調製した粗色素とを混合し、組成の異なる粗色素を調製した。前記組成比は、シソニン（Ｓ）とマロニルシソニン（ＭＳ）の比（物質量比Ｓ：ＭＳ）が、所定比（１：０．２５、１：０．４、１：０．４９、１：２．４２、１：３．７１、１：４．３１）となるようにした。なお、組成比は、ＨＰＬＣ分析を行い、ＭＳとＳとのピーク面積比から確認した。【００５７】
（２）複合体の構成成分の分析
前記実施例１の（３）と同様にして、複合体を形成し、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。そして、前記実施例１の（４）と同様にして、複合体含有画分のＨＰＬＣ分析を行い、各組成の粗色素ならびに複合体について、ピーク面積の割合（％）と、シアニン（Ｓ）のピーク面積の割合（％）を１としたピーク面積の比率とを求めた。さらに、各アントシアニンについて、複合体形成前の粗色素のピーク面積比（Ｂ）と、複合体形成後の複合体のピーク面積（Ａ）との比（前後比Ａ／Ｂ）を求めた。前後比Ａ／Ｂは、相対的に大きい程、そのアントシアニンが、選択的に複合体に取り込まれていることを意味する。なお、複合体の形成は、３回行い、平均値及び標準偏差を求めた。これらの結果を下記表に示す。【００５８】
【表４】
2008111589.tif 000009
【表５】
2008111589.tif 000010
【表６】
2008111589.tif 000011
【表７】
2008111589.tif 000012
【表８】
2008111589.tif 000013
【表９】
2008111589.tif 000014
【００５９】
前記表４〜９に示すように、マロニルシソニン（ＭＳ）の前後比（Ａ／Ｂ）は、シソニン（Ｓ）の前後比（１）よりも大きい値を示した。例えば、表４（Ｓ：ＭＳ＝１：０．２５）では、粗色素において、ＭＳがＳの０．２５倍量であるのに対して、複合体においては、ＭＳがＳの２．０８倍量にまで増加している。同様に、表５（Ｓ：ＭＳ＝１：０．４）では、粗色素において、ＭＳがＳの０．４倍量であるのに対して、複合体においては、２．２５倍に増加し、表６（Ｓ：ＭＳ＝１：０．４９）では、粗色素において、ＭＳがＳの０．４９倍量であるのに対して、複合体においては、２．２０倍に増加した。このことから、マロニルシソニンは、シソニンよりも、選択的に複合体形成において取り込まれていることがわかる。このような結果から、複合体形成時、周囲に存在するアントシアニンが非選択的に複合体に取り込まれるのではなく、選択性をもって、アントシアニンが取り込まれているといえる。さらに詳しく説明すると、アントシアニンの構造により、複合体に取り込まれる速度が異なり、ＭＳとＳとでは、ＭＳの方が、選択的に取り込まれていることがわかった。
【実施例３】
【００６０】
前記実施例２において、アントシアニンの選択性が確認されたが、前記実施例２においては、各種アントシアニンを含む粗色素とツユクサ由来フラボコンメリンとを等量（重量比１：１）で使用している。アントシアニンまたはフラボコンメリンが過剰に存在した場合、アントシアニンとフラボコンメリンとの衝突確率が異なるため、選択性に影響がある可能性が考えられる。そこで、アントシアニンまたはフラボコンメリンが過剰量存在する条件における、アントシアニンの選択性を確認した。【００６１】
粗色素とフラボコンメリンの使用量を以下のように変更した以外は、前記実施例２と同様にして、複合体の形成、ならびに、ＨＰＬＣ分析による構成成分の分析を行った。アントシアニンとフラボコンメリンが重量比１：１の等量条件として、粗色素３ｍｇ、フラボコンメリン３ｍｇを使用した。フラボコンメリン過剰の条件として、粗色素２ｍｇ、フラボコンメリン８ｍｇを使用した。アントシアニン過剰の条件として、粗色素８ｍｇ、フラボコンメリン２．７ｍｇを使用した。なお、粗色素ならびにフラボコンメリンは、前記実施例１と同じものを使用した。これらの結果を下記表に示す。【００６２】
【表１０】
2008111589.tif 000015
【表１１】
2008111589.tif 000016
【表１２】
2008111589.tif 000017
【００６３】
フラボコンメリン過剰の条件（表１１）では、マロニルシソニン（ＭＳ）とシアニン（Ｃ）の前後比は、それぞれ１．０７と１．１２であった、この結果は、等量条件（表１０）におけるマロニルシソニン（ＭＳ）とシアニン（Ｃ）の前後比１．３７および１．３と比較して低い値であり、すなわち、複合体の形成前後で、構成成分の変化が少ないことを示した。フラボコンメリン過剰の条件では、等量条件と比較すると、フラボコンメリンがアントシアニンより過剰に存在するため、両者の衝突確率が上がり、マロニルシソニン（ＭＳ）とシソニン（Ｃ）の選択性の差が小さくなったと考えられる。一方、アントシアニン過剰の条件（表１２）では、マロニルシソニン（ＭＳ）とシアニン（Ｃ）の前後比は、それぞれ１．２９と１．２５であった。この結果は、等量条件（表１０）におけるマロニルシソニン（ＭＳ）とシアニン（Ｃ）の前後比１．３７および１．３と同等の値であり、大きな差は見られなかった。この条件は、アントシアニンがフラボコンメリンの３倍存在する条件であるが、等量条件と同程度の結果であることから、アントシアニンの量は、アントシアニンの選択性には影響を与えないことがわかった。
【実施例４】
【００６４】
粗色素に含まれる４種のアントシアニンを分離し、任意の２成分間における複合体への取り込みの選択性を確認した。【００６５】
（１）アントシアニンの単離
中圧液体クロマトグラフィーによって、実施例１で調製した粗色素から、マロニルシソニン（ＭＳ）、シソニン（Ｓ）、シアニン（Ｃ）、（メチルマロニル）シソニン（ＭＭＳ）をそれぞれ単離した。まず、アントシアニンの分離を良くするために、予め、前記カラム内に、以下に示す１００％原液（移動相溶液）１００ｍＬ、２０％原液（１００％原液を０．５％ＴＦＡ水溶液で希釈、以下同様）１００ｍＬを、この順序で流速２ｍＬ／ｍｉｎの条件下３０分間以上流した。実施例１で調製した粗色素１ｇを２０％原液に溶解し、前記ガラスカラムの先端に粗色素を吸着させた。そして、そのまま２０％原液を流し続け、前記ガラスカラムの２／３の所まで色素が移動した時点で、３０％原液（１００％原液を０．５％ＴＦＡ水溶液で希釈）に変えた。以後、３０％原液を流しながら溶出液を分取し、目視確認により、色素濃度の高いフラクション（２００ｍＬ／フラクション）を回収した。引き続き、溶媒を、６０％原液、８０％原液、１００％原液の順に流し、同様にして溶出液の分取、ならびに、色素濃度の高いフラクションの回収を行った。その結果、４０％原液で５フラクション、６０％原液で３フラクション、８０％原液で１フラクションの計９フラクションを回収した。この操作を繰り返し、合計７ｇの粗色素の分取を行った。
・ＭＰＬＣ条件
送液ポンプ：日本分光社製、商品名PU−980
カラム：商品名ODS  Develosil  10〜20μm  ガラスカラム300×25mm  i.d.
移動相溶液：酢酸：アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸＝20：2.5：54.5：0.5を100％原液とする。【００６６】
ＭＰＬＣ分取の結果、シアニン（Ｃｙ３，５−ｄｉｇｌｃ）７２ｍｇ、シソニン（Ｃｙ３−ｐｃ・ｇｌｃ−５−ｇｌｃ）７６ｍｇ、マロニルシソニン（Ｃｙ３−ｐｃ・ｇｌｃ−５−Ｍａ・ｇｌｃ）９０ｍｇ、（メチルマロニル）シソニン（Ｃｙ３−ｐｃ・ｇｌｃ−５−Ｍｅｔｈｏｘｙ  Ｍａ・ｇｌｃ）４４ｍｇを得た。なお、マロニルシソニンの純度は２０％、シソニンの純度は６５％であった。【００６７】
・ＵＶスペクトル測定条件
装置：日本分光社製、商品名V-520-SR型分光光度計
溶媒：0.1%HCl含有MeOH
セル長：１mm
・マロニルシソニン吸収スペクトルデータ
ＵＶ−ｖｉｓλｎｍ（ε）：529(5640)、313.4(3200)、292.5(3580)
・シソニン吸収スペクトルデータ
ＵＶ−ｖｉｓλｎｍ（ε）：527(13360)、313.4(9560)、292.5(10760)【００６８】
（２）アントシアニンの２成分の組合せ
下記の組合せで、２成分の物質量が当量となるように混合し、アントシアニン混合物１および２を調製した。
アントシアニン混合物１：  ＭＳ／ＭＭＳ
アントシアニン混合物２：  Ｓ／ＭＭＳ【００６９】
（３）複合体の構成成分の分析
粗色素に代えて、２種類のアントシアニン混合物（１〜２）を使用した以外は、前記実施例２と同様にして、複合体の形成、ならびに、ＨＰＬＣ分析による構成成分の分析を行った。これらの結果を下記表に示す。【００７０】
【表１３】
2008111589.tif 000018
【表１４】
2008111589.tif 000019
【００７１】
前記表１３に示すように、アントシアニン混合物１（ＭＳ／ＭＭＳ）を使用した系では、前後比が、ＭＳ１．４倍、ＭＭＳ０．７６倍の結果であることから、ＭＳの方がＭＭＳよりも選択性が高いといえる（ＭＳ＞＞ＭＭＳ）。前記表１４に示すように、アントシアニン混合物２（Ｓ／ＭＭＳ）を使用した系では、前後比が、Ｓ１．１０倍、ＭＭＳ０．９２倍の結果であることから、Ｓの方がわずかにＭＭＳよりも選択性が高いといえる（Ｓ＞ＭＭＳ）。【００７２】
以上の結果から、複合体形成におけるアントシアニンの選択性については、ＳとＭＭＳ間では顕著な差はなく、特にＭＳの選択性が高いことが示唆された（ＭＳ＞＞Ｓ≒ＭＭＳ）。なお、マロニルシソニン（ＭＳ）とシソニン（Ｓ）では、その構造から、マロニルシソニンの方が構造安定性に優れると考えられる。したがって、本実施例の結果によれば、複合体形成において、複合体の安定性とアントシアニンの選択性とに相関関係があると推測される。
【実施例５】
【００７３】
自然界におけるツユクサ由来コンメリニンは、アントシアニン（マロニルアオバリン）、フラボン（フラボコンメリン）およびマグネシウム（マグネシウムイオン）が６：６：２の比率で構成される金属錯体である。そこで、複合体の形成において、アントシアニンに対するマグネシウムの量を変化させ、これがアントシアニンの選択性に与える影響を確認した。【００７４】
前記実施例４で単離したマロニルシソニン（ＭＳ）とシソニン（Ｓ）とを用いて、下記に示すようにアントシアニン混合物を調製した。なお、ＭＳとＳとは、１００％の精製物ではないため、両者の比率を物質量比で表す。
・アントシアニン混合物
組成  ＭＳ：Ｓ＝０．４：１（物質量比）
ＭＳ＝１ｍｇ
Ｓ＝１ｍｇ【００７５】
そして、粗色素に代えて、前記アントシアニン混合物を使用し、アントシアニン混合物とフラボコンメリンの添加量（３ｍｇ：３ｍｇ）を下記量に変更し、さらに、酢酸マグネシウム水溶液の添加量を下記所定量に変更した以外は、前記実施例１と同様にして、複合体の形成を行った。【００７６】
・アントシアニン混合物の物質量
１．１μｍｏｌ（Ｓ＝１ｍｇ、ＭＳ＝１ｍｇ）
・フラボコンメリンの物質量
１．１μｍｏｌ（１．５ｍｇ）
・０．５酢酸マグネシウム水溶液の添加量
０．７２μＬ（０．３６μｍｏｌ）、
５μＬ（２．５μｍｏｌ）
２５μＬ（１２．５μｍｏｌ）
１００μＬ（５０μｍｏｌ）
１２５μＬ（６２．５μｍｏｌ）【００７７】
そして、アントシアニン混合物と、形成した複合体について、それぞれ前記実施例１と同様にして吸光度測定を行い、収率（１００×Ｃ／Ｐ）を求めた。さらに、実施例２と同様にして、複合体のＨＰＬＣ分析を行った。この結果を下記表に示す。【００７８】
【表１５】
2008111589.tif 000020
＊１  アントシアニン混合物の物質量を１とした場合のＭｇ２＋の物質量比
＊２  アントシアニン混合物におけるシソニンのピーク面積（％）を１として、アントシアニン混合物におけるＭＳ、ならびに、各複合体のＭＳのピーク面積の比率を、ピーク面積比として求めた。
＊３  ＭＳについて、複合体形成前のアントシアニン混合物におけるＭＳピーク面積比（Ｂ）と、複合体形成後の複合体（ＭＳ）のピーク面積（Ａ）との比を、前後比（Ａ／Ｂ）として求めた。【００７９】
また、混合アントシアニンに対するＭｇ２＋のモル比（物質量比）と、マロニルシソニンの前後比とをプロットしたグラフを図３に示す。【００８０】
前記表および図３に示すように、マグネシウムがアントシアニン（アントシアニン混合物）の１／３当量（対アントシアニン物質量比０．３３）の条件では、ＭＳが複合体形成前後で３．１８倍（前後比Ａ/Ｂ）に増加した。そして、アントシアニンに対するマグネシウムの量が増加するにしたがって、複合体形成前後におけるＭＳの比率（Ａ／Ｂ）は減少していき、具体的には、マグネシウムがタンパク質の５６．８２当量（対アントシアニン物質量比５６．８２）の条件で、ＭＳが複合体形成前後で１．４３倍にまで減少した。この結果から、アントシアニンに対するマグネシウムの物質量が少ない程、ＭＳが取り込まれた複合体の増加率が高くなり、アントシアニンに対するマグネシウムの物質量が多い程、前記増加率は低くなることがわかった。したがって、複合体形成においてマグネシウム量を調整すれば、例えば、シソニンとマロニルシソニンの組成をコントロールすることが可能となるため、アントシアニンの精製において、複合体に含まれるシソアントシアニンを選択的に抽出できるというさらなる効果が得られる。特に、マロニル基は酸に不安定であることから、マロニルシソニンよりもシソニンを選択的に単離する際に有用である。
【実施例６】
【００８１】
複合体の形成において、アントシアニンに対するフラボコンメリンの量を変化させ、これがアントシアニンの選択性に与える影響を確認した。なお、マグネシウムイオンは過剰量とした。【００８２】
以下に示す条件に変更した以外は、前記実施例１と同様には、以下と同様にして、複合体の形成を行った。
【表１６】
2008111589.tif 000021
【００８３】
そして、アントシアニン混合物と、形成した複合体について、それぞれ前記実施例１と同様にして吸光度測定を行い、収率（１００×Ｃ／Ｐ）を求めた。さらに、実施例２と同様にして、複合体のＨＰＬＣ分析を行った。この結果を下記表１７および１８に示す。表１７は、前記条件１の複合体の結果であり、表１８は、前記条件２の複合体の結果である。【００８４】
【表１７】
2008111589.tif 000022
＊１  アントシアニン混合物の物質量を１とした場合のフラボコンメリンの物質量比
＊２  アントシアニン混合物におけるシソニンのピーク面積（％）を１として、アントシアニン混合物におけるＭＳ、ならびに、各複合体のＭＳのピーク面積の比率を、ピーク面積比として求めた。
＊３  ＭＳについて、複合体形成前のアントシアニン混合物におけるＭＳピーク面積比（Ｂ）と、複合体形成後の複合体（ＭＳ）のピーク面積（Ａ）との比を、前後比（Ａ／Ｂ）として求めた。
＊４  フラボコンメリン
【００８５】
【表１８】
2008111589.tif 000023
＊１  アントシアニン混合物の物質量を１とした場合のフラボコンメリンの物質量比
＊２  アントシアニン混合物におけるシソニンのピーク面積（％）を１として、アントシアニン混合物におけるＭＳ、ならびに、各複合体のＭＳのピーク面積の比率を、ピーク面積比として求めた。
＊３  ＭＳについて、複合体形成前のアントシアニン混合物におけるＭＳピーク面積比（Ｂ）と、複合体形成後の複合体（ＭＳ）のピーク面積（Ａ）との比を、前後比（Ａ／Ｂ）として求めた。
＊４  フラボコンメリン【００８６】
前記表１７に示すように、アントシアニン混合物（ＭＳ：Ｓ＝０．４０：１）を使用して、フラボコンメリン量を変化させた場合、フラボコンメリン量にかかわらず、ＭＳの複合体形成前後の増加率（Ａ／Ｂ）は、１．５前後であった。また、前記表１８に示すように、アントシアニン混合物（ＭＳ：Ｓ＝５．４４：１）を使用して、フラボコンメリン量を変化させた場合、フラボコンメリン量にかかわらず、ＭＳの複合体形成前後の増加率（Ａ／Ｂ）は約１倍と、組成の変化はほとんど見られなかった。これらの結果から、マグネシウム過剰の条件下においては、フラボコンメリンの量は、アントシアニンの選択性に特に影響を与えていないことがわかった。【００８７】
なお、本実施例では、アントシアニン混合物に対してマグネシウムを４５当量使用するマグネシウム過剰条件であり、フラボコンメリンもアントシアニンに対して１当量から１０当量の過剰量を使用した。このため、理論上、全てのアントシアニンが複合体形成に使用可能な条件といえる。しかしながら、条件１（ＭＳ：Ｓ＝０．４０：１）では、全てのアントシアニンが取り込まれることはなく、前述のように、複合体形成後、ＭＳの組成比は１．５倍前後増加している。一方、条件２（ＭＳ：Ｓ＝５．４４：１）では、アントシアニン混合物と複合体とでＭＳの組成比はほとんど変化していない。また、条件１（ＭＳ：Ｓ＝０．４０：１）では、複合体の最大収率が５７．０１％であるのに対して、条件２（ＭＳ：Ｓ＝５．４４：１）では、複合体の最大収率が４３．２８％であり、前記条件１と比較して約１４％低下している。以上の点から、複合体形成においては、条件１のようにＭＳの組成比が低い粗色素原料（アントシアニン混合物）であっても、選択性の高いＭＳがＳよりも先に取り込まれるため、複合体形成後のＭＳの比は増加し、反対に、複合体の収率は低下すると考えられる。
【実施例７】
【００８８】
実施例１〜６ではフラボコンメリンを用いたが、以下では、他のフラボンを用いて複合体の形成を確認した。【００８９】
まず、シソ粗色素のＴＦＡ塩を準備した。シソ粗色素のＴＦＡ塩は、実施例１（１）の方法で抽出した赤シソ葉の色素抽出液を乾固したものであり、カラムクロマトグラフィーによる精製は行っていない。一方、フラボンとして、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（フナコシ社製）を使用した。【００９０】
次に、前記シソ粗色素ＴＦＡ塩約９ｍｇを超純水１５０μＬに溶解させ、この溶液に０．５Ｍアンモニア水溶液を１ｍＬ加え、直ちに減圧下濃縮乾固させた。ここへ、測り取った前記ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  １０μｍｏｌを、固体のまま加えた。さらに、０．５Ｍ酢酸マグネシウムを含む５０％エタノール水溶液６００μＬ（３００μｍｏｌ）を加えた。これを適宜超音波で溶解させ、濃縮乾固し、分析時まで冷凍保存した。次に、冷凍保存しておいたサンプルを最小量の超純水に溶解させ、ｓｅｐｈａｄｅｘＧ−１０（商品名）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（０．８〜１．０ｃｍ×１０．５〜１１．５ｃｍ）に吸着させ、超純水を流した。そして、ｓｅｐｈａｄｅｘＧ−１０で最も早く溶出し、最も色素濃度の高い２つのフラクションを分取した。その結果、Ｓｈｅｐｈａｄｅｘにて溶出時間が早いフラクションに、色素とａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅとが溶出するフラクションがあった。これは、エタノールを加えることにより、色素とこのフラボンとが共沈殿したことを示す。すなわち、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅによりシソ由来アントシアニンを精製できることが確認された。【００９１】
さらに、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅに代えて、フラバコンメリン、柑橘由来のフラボンであるｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ、ｄｉｏｓｍｉｎ、柑橘由来のフラボンであるｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、そば由来のフラボンであるｒｕｔｉｎ、ａｐｉｇｅｎｉｎ、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７−ｏ−ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｏｓｉｄｅ、ｓｉｌｙｍａｒｉｎ、オリーブ由来のフラボンであるｌｕｔｅｏｌｉｎ  ７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（全てフナコシ社製）をそれぞれ用いる以外は、実施例７と同様の操作を行った。この結果、各フラボンとシソ由来アントシアニンとの共沈殿が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の精製アントシアニン製造方法によれば、簡便且つ容易に前記粗色素画分からアントシアニンを精製でき、さらに、低コストで高純度の精製アントシアニンを提供することが可能となる。したがって、本発明は、例えば、食品分野等を含む、天然色素を利用するあらゆる分野において、極めて有用な技術であるといえる。
【図１】
2008111589.tif 000024
【図２】
2008111589.tif 000025
【図３】
2008111589.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月16日(2008.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アントシアニンを含む粗色素画分から精製アントシアニンを精製する精製アントシアニンの製造方法であって、
下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含むことを特徴とする製造方法。
（Ａ）アントシアニンとアルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンと共に金属錯体を形成するフラボノイドを準備する工程
（Ｂ）アルカリ土類金属および重金属の少なくとも一方の金属イオンの存在下、液体中で、前記粗色素画分と前記フラボノイドとを接触させ、前記アントシアニンと前記フラボノイドと前記金属イオンとを含む金属錯体を形成させる工程
（Ｃ）前記液体から前記金属錯体を回収する工程
（Ｄ）前記金属錯体からアントシアニンを解離させる工程
【請求項２】
前記フラボノイドが、ツユクサ由来フラボン、ヤグルマギク由来フラボン、ヒマラヤケシ由来フラボノールおよび青色サルビア由来のフラボンからなる群から選択された少なくとも一つのフラボン類である、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項３】
前記フラボノイドが、フラボコンメリン、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ７，４’−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ａｐｉｇｅｎｉｎ  ４’−（６−Ｏ−ｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）−７−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ、ｆｌａｖｏｎｏｌ  ３−ｇｅｔｉｏｂｉｏｓｅおよびｆｌａｖｏｎｏｌ  ３−（６−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−ｂ−Ｏ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項４】
前記粗色素に含まれるアントシアニンが、２種類以上のアントシアニンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項５】
前記アントシアニンが、Ｂ環に２つ以上のＯＨ基を有する、ペオニジン系配糖体アントシアニン、デルフィニジン系配糖体アントシアニン、ペチュニジン系配糖体アントシアニンおよびデルフィニジン系配糖体アントシアニンからなる群から選択された少なくとも一つのアントシアニンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項６】
前記粗色素画分が、植物から抽出したアントシアニンを含む粗色素画分であり、前記植物が、シソ、赤キャベツ、ブドウ、黒トウモロコシ、赤大根、ベリー類、豆類、いも類、米類、紫玉ねぎ、オリーブ、およびリンゴからなる群から選択された少なくとも一つの植物である、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項７】
前記アルカリ土類金属イオンが、マグネシウムイオンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項８】
前記重金属イオンが、亜鉛、ニッケル、カドミウム、鉄、コバルト、アルミニウム、銅、マンガン、クロムおよび錫からなる群から選択された少なくとも一つの金属イオンである、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項９】
前記（Ｂ）工程に先立って、前記粗色素画分をアルカリ処理し、前記粗色素画分に含まれるアントシアニンをアンヒドロベースまたはアンヒドロベースアニオンに変換する工程を含む、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１０】
前記（Ｃ）工程において、エタノール沈殿法または分子量分画法により、前記液体から前記金属錯体を回収する、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１１】
前記（Ｃ）工程において、前記分子量分画法がゲル濾過法である、請求の範囲１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記（Ｄ）工程において、前記金属錯体に、酸性処理、加熱処理および超音波処理からなる群から選択された少なくとも一つの処理を施して、前記金属錯体からアントシアニンを解離させる、請求の範囲１記載の製造方法。
【請求項１３】
前記（Ｄ）工程において、前記金属錯体に酸性処理を施して、前記金属錯体からアントシアニンを解離させ、前記（Ｄ）工程の後、前記（Ｄ）工程の酸性処理によって得られたプラス荷電のアントシアニンと電気的に中性のフラボノイドと前記金属イオンとを含む混合物を陽イオン交換樹脂に供して、前記アントシアニンを吸着させ、前記フラボノイドを除去した後、前記吸着したアントシアニンを溶出する、請求の範囲１記載の製造方法。
【国際調査報告】
2008111589.tif 000027
2008111589.tif 000028