(57)【要約】本発明は、配列番号１から６の何れかに記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡに関する。本発明によれば、モータリン shRNA を利用した抗癌剤を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から６の何れかに記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ。
【請求項２】
以下のセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせからなるＤＮＡ。
（１）配列番号７の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号８の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号９の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（３）配列番号１１の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（１）配列番号１３の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号１５の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；又は
（３）配列番号１７の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１８の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１から６の何れかに記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ。
【請求項４】
請求項1又は３に記載のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、又は請求項２に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、抗癌剤。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡを含む、請求項1に記載のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現できる組み換え発現ベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターに、請求項２に記載のＤＮＡを組み込むことによって得られる、請求項５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項７】
Ｕ６プロモーターを含むベクターに、請求項２に記載のＤＮＡを組み込むことによって得られる、請求項５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項５から７の何れかに記載の組み換え発現ベクターを有効成分として含有する、抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モータリン siRNAを含む癌治療剤に関する。なお、関連出願の相互参照として、本出願は、２００７年６月２０日出願の日本特願２００７−１６２０２９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【背景技術】
【０００２】
モータリンは当初、CD1 ICRマウス由来の正常線維芽細胞の細胞質画分に存在し、不死化線維芽細胞のそれでは検出されないhsp70ファミリーの１つとしてクローニングされた（非特許文献１及び２）。現在では、モータリンは動的なタンパク質であることが判明し、すなわち、その細胞内局在が正常細胞と不死化細胞でことなることや、様々な細胞内小器官への分布、種々のタンパク質と結合能、強力ながん抑制因子であるp53の抑制、タンパク質分解、細胞内分子輸送、ミトコンドリア膜インポート、そしてエネルギー産生に機能する（非特許文献３〜７）。モータリン遺伝子mot-2（マウス）またはhmot-2（ヒト）の大量発現によって正常ヒト線維芽細胞の分裂寿命延長（非特許文献５及び８）、線虫の寿命延長（非特許文献９）、マウス不死化細胞の悪性腫瘍化（非特許文献１０）が引き起こされる。マウスのmot-1タンパク質は、C末端側にある２つのアミノ酸がmot-2と異なり、分子シャペロン能の欠落と不死化細胞に対する細胞老化様表現型の誘導という機能の差が生じる（非特許文献２及び１１）。ヒトのモータリンはマウスと違ってたった１つで、活性がマウスmot-2に近いためhmot-2と呼ばれている （非特許文献１０）。ストレス応答、細胞内分子輸送、抗原提示、細胞分裂制御、腎毒性、分化、がん化という幅広い多機能性から（非特許文献６及び１５）、PBP74（非特許文献１２）, mtHSP70（非特許文献１３）, GRP75（非特許文献１４）という呼び名でも報告されている。最近の研究で、Mot-2はがん抑制タンパク質p53と結合し、その転写活性を抑制することが示されている（非特許文献１６〜２０）。Mot-2によるp53の抑制はNIH3T3の悪性腫瘍化（非特許文献１０）やヒト正常線維芽細胞の分裂寿命延長（非特許文献５）という現象を引きおこすため、モータリンはそれらの一因になると考えられている（非特許文献１０）。また、Mot-2はテロメラーゼと協同で作用してヒト包皮線維芽細胞を不死化させる（非特許文献８）。そして、アンチセンスやリボザイムでモータリンをノックダウンすると、ヒトがん細胞に対してすみやかに増殖阻害を引き起こすことも明らかになった（非特許文献２１〜２４）。
【非特許文献１】Wadhwa, R., Kaul, S. C., Ikawa, Y., and Sugimoto, Y. (1993) J Biol Chem 268, 6615-6621
【非特許文献２】Wadhwa, R., Kaul, S. C., Sugimoto, Y., and Mitsui, Y. (1993) J Biol Chem 268, 22239-22242
【非特許文献３】Wadhwa, R., Kaul, S. C., Mitsui, Y., and Sugimoto, Y. (1993) Exp Cell Res 207, 442-448
【非特許文献４】Ran, Q., Wadhwa, R., Kawai, R., Kaul, S. C., Sifers, R. N., Bick, R. J., Smith, J. R., and Pereira-Smith, O. M. (2000) Biochem Biophys Res Commun 275, 174-179
【非特許文献５】Kaul, S. C., Reddelb, R. R., Sugiharac, T., Mitsuia, Y., and Wadhwac, R. (2000) FEBS Lett 474, 159-164
【非特許文献６】Wadhwa, R., Taira, K., and Kaul, S. C. (2002) Cell Stress Chaperones 7, 309-316
【非特許文献７】Liu, Y., Liu, W., Song, X. D., and Zuo, J. (2005) Mol Cell Biochem 268, 45-51
【非特許文献８】Kaul, S. C., Yaguchi, T., Taira, K., Reddel, R. R., and Wadhwa, R. (2003) Exp Cell Res 286, 96-101
【非特許文献９】Yokoyama, K., Fukumoto, K., Murakami, T., Harada, S., Hosono, R., Wadhwa, R., Mitsui, Y., and Ohkuma, S. (2002) FEBS Lett 516, 53-57
【非特許文献１０】Kaul, S. C., Duncan, E. L., Englezou, A., Takano, S., Reddel, R. R., Mitsui, Y., and Wadhwa, R. (1998) Oncogene 17, 907-911
【非特許文献１１】Kaul, S. C., Aida, S., Yaguchi, T., Kaur, K., and Wadhwa, R. (2005) J Biol Chem 280, 39373-39379
【非特許文献１２】Domanico, S. Z., DeNagel, D. C., Dahlseid, J. N., Green, J. M., and Pierce, S. K. (1993) Mol Cell Biol 13, 3598-3610
【非特許文献１３】Webster, T. J., Naylor, D. J., Hartman, D. J., Hoj, P. B., and Hoogenraad, N. J. (1994) DNA Cell Biol 13, 1213-1220
【非特許文献１４】Merrick, B. A., Walker, V. R., He, C., Patterson, R. M., and Selkirk, J. K. (1997) Cancer Lett 119, 185-190
【非特許文献１５】Wadhwa, R., Taira, K., and Kaul, S. C. (2002) Histol Histopathol 17, 1173-1177
【非特許文献１６】Wadhwa, R., Takano, S., Robert, M., Yoshida, A., Nomura, H., Reddel, R. R., Mitsui, Y., and Kaul, S. C. (1998) J Biol Chem 273, 29586-29591
【非特許文献１７】Kaul, S. C., Reddel, R. R., Mitsui, Y., and Wadhwa, R. (2001) Neoplasia 3, 110-114
【非特許文献１８】Wadhwa, R., Yaguchi, T., Hasan, M. K., Mitsui, Y., Reddel, R. R., and Kaul, S. C. (2002) Exp Cell Res 274, 246-253
【非特許文献１９】Ma, Z., Izumi, H., Kanai, M., Kabuyama, Y., Ahn, N. G., and Fukasawa, K. (2006) Oncogene
【非特許文献２０】Walker, C., Bottger, S., and Low, B. (2006) Am J Pathol 168, 1526-1530
【非特許文献２１】Wadhwa, R., Takano, S., Taira, K., and Kaul, S. C. (2004) J Gene Med 6, 439-444
【非特許文献２２】Wadhwa, R., Ando, H., Kawasaki, H., Taira, K., and Kaul, S. C. (2003) EMBO Rep 4, 595-601
【非特許文献２３】Pizzatti, L., Sa, L. A., de Souza, J. M., Bisch, P. M., and Abdelhay, E. (2006) Biochim Biophys Acta
【非特許文献２４】Shin, B. K., Wang, H., Yim, A. M., Le Naour, F., Brichory, F., Jang, J. H., Zhao, R., Puravs, E., Tra, J., Michael, C. W., Misek, D. E., and Hanash, S. M. (2003) J Biol Chem 278, 7607-7616
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、モータリン shRNA を利用した抗癌剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
熱ショックタンパク質70ファミリーのひとつであるモータリンは、細胞内分子輸送、ミトコンドリア膜インポート、エネルギー産生、分子シャペロン能、p53活性の抑制など、数々の機能を担う。本発明者らは、抗癌治療のターゲットとしてモータリンに注目し、モータリン特異的siRNAを用いることによって癌細胞を死滅させることができることを実証し、モータリン特異的siRNAが抗癌剤として有用であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【０００５】
即ち、本発明によれば、配列番号１から６の何れかに記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが提供される。
本発明によればさらに、以下のセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせからなるＤＮＡが提供される。
（１）配列番号７の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号８の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号９の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（３）配列番号１１の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（１）配列番号１３の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号１５の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；又は
（３）配列番号１７の塩基配列からなるセンスオリゴヌクレオチド及び配列番号１８の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド；【０００６】
本発明によればさらに、上記のＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１から６の何れかに記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが提供される。【０００７】
本発明によればさらに、上記のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、又はＤＮＡを有効成分として含有する、抗癌剤が提供される。【０００８】
本発明によればさらに、上記のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、又はＤＮＡを有効成分として含有する抗癌剤を用いた癌の治療又は予防方法が提供される。【０００９】
本発明によればさらに、抗癌剤を製造するための、上記のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、又はＤＮＡの使用が提供される。【００１０】
本発明によればさらに、上記のＤＮＡを含む、上記ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現できる組み換え発現ベクターが提供される。
本発明の組み換えベクターは、好ましくは、アデノウイルスベクターに、上記のＤＮＡを組み込むことによって得られる。
本発明の組み換えベクターは、好ましくは、Ｕ６プロモーターを含むベクターに、上記のＤＮＡを組み込むことによって得られる。
本発明によればさらに、上記の組み換え発現ベクターを有効成分として含有する、抗癌剤が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、モータリンshRNAは癌細胞を死滅させる効果が確認された。即ち、本発明により、モータリン siRNAを含む癌治療剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
RNAi（RNA interference）は、細胞に導入された2本鎖RNAが、同じ配列を持つ遺伝子の発現を抑制する現象を言う。RNAiによりモータリンの発現を阻害する物質の具体例としては、下記に説明するようなsiRNA又はshRNA等が挙げられる。【００１３】
siRNA とはshort interfering RNAの略称であり、約２１〜２３塩基程度の長さの二本鎖RNAをいう。siRNAはRNAiを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよく、例えば、化学合成もしくは生化学的合成、又は生物体内の合成で得られたsiRNA、あるいは約４０塩基以上の二本鎖RNAが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖RNA等であればよい。siRNA の配列と、モータリンmRNAの部分配列とは１００％一致することが好ましいが、必ずしも１００％一致していなくてもよい。【００１４】
siRNAの塩基配列と、モータリン遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、モータリン遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。相同性を有する配列は、モータリン遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、７０塩基離れていることがより好ましい。相同性を有する配列としては、例えば、モータリン遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。【００１５】
RNAiによりモータリンの発現を阻害する物質としては、siRNA を生成する約４０塩基以上のdsRNA等を用いてもよい。例えば、モータリン遺伝子の核酸配列の一部に対して約７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むRNA又はその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは約１９ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは２１ヌクレオチド以上である。【００１６】
RNAiによりモータリンの発現を阻害する物質としては、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るshRNA（short hairpin RNA）を使用することもできる。shRNAとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことである。また、shRNAとしては３'突出末端を有するのが好ましい。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはDNAであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のDNAであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのDNAである。【００１７】
RNAiによりモータリンの発現を阻害する物質は、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖及びアンチセンス鎖のDNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造のDNAをT7 RNAポリメラーゼによってインビトロでRNAを合成することによって作製してもよい。インビトロで合成する場合は、T7 RNAポリメラーゼ及びＴ７プロモーターを用いて、鋳型DNAからアンチセンス及びセンスのRNAを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、RNAiが引き起こされ、モータリンの発現が抑制される。細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamine及びlipofection等）を用いた方法等により行うことができる。【００１８】
RNAiによりモータリンの発現を阻害する物質としては上述のsiRNA又はshRNAをコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いてもよい。さらに該発現ベクターを含む細胞を用いてもよい。上記した発現ベクターや細胞の種類は特に限定されないが、既に医薬として用いられている発現ベクターや細胞が好ましい。【００１９】
本発明では、配列番号１から６の何れかに記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを用いることができる。具体的には、例えば、以下のセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせからなるＤＮＡを発現させることにより得られる、配列番号１から６の何れかに記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを用いることができる。【００２０】
本発明のモータリン siRNAを含む抗癌剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与等）のいずれの投与経路により投与してもよい。経口投与に適する製剤形態としては、固形又は液体の形態が挙げられ、非経口投与に適する製剤形態としては、注射剤、点滴剤、坐剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤等の形態が挙げられる。本発明の抗癌剤は、その製剤形態により必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤が加えられていてもよい。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、着色剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤及び／又は薬学的アジュバント等が挙げられる。【００２１】
経口用の固形製剤形態の本発明の抗癌剤は、例えば、有効成分であるモータリン siRNAに賦形剤を加え、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、又は矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。経口用の液体製剤形態の本発明の抗癌剤は、有効成分であるモータリン siRNAに矯味剤、安定化剤、又は保存剤など製剤用添加物の１種又は２種以上を加え、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等として調製することができる。【００２２】
本発明の抗癌剤を液体製剤として処方するために使用される溶媒は、水性又は非水性のいずれでもよい。液体製剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を用いてもよい。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。【００２３】
モータリンのsiRNAまたはsiRNA発現ベクターなど遺伝子送達の種類に関しては、適用される細胞内でモータリンのsiRNAをコードするRNAまたはsiRNA発現ベクターの発現を得る限り特に方法は限定されるものではなく、例えば、ウイルスベクター、リポソームを用いた遺伝子導入を用いる事が可能である。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、シンリンセムリキウイルス等の動物ウイルスが挙げられる。【００２４】
RNAiによりモータリンの発現を阻害する物質は、細胞に直接注入してもよい。【００２５】
本発明の抗癌剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分として用いる物質の種類等を考慮して、当業者が決定することができる。本発明の抗癌剤の投与量は、例えば、有効成分量として、成人一人当たり、約0.1 ng〜約100 mg/kg、好ましくは約1 ng〜約10 mgであり、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターとして投与される場合は、通常、0.0001〜100 mg、好ましくは0.001〜10 mg、より好ましくは0.01〜1 mgである。本発明の抗癌剤の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよい。【００２６】
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００２７】
（１）実験材料および方法
（ａ）細胞培養、トランスフェクション、ウィルス感染
ヒト由来の正常上皮細胞（TIG-1、WI-38）、骨肉種細胞（U2OS、mortalin過剰発現株U2OS）、繊維肉腫細胞（HT1080）は10%ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン（Life Technologies, Inc.）を添加したDulbecco's modified Eagle's minimal essential medium (DMEM)を培地とし、二酸化炭素濃度5%、湿度95%、37度のインキュベーター内で培養した。【００２８】
mortalinを標的としたshRNA発現プラスミドのトランスフェクションにはFugene（Roche Applied Scinece）を用いた。通常は6cmの培養デッシュ60%コンフルエント程度の細胞に3μgのプラスミドDNAをトランスフェクションした。その後puromycin（2μg/ml）を添加した培地で48時間選択を行った。免疫染色ではトランスフェクション後24時間カバーガラス上で培養し、抗mortalin抗体で染色した。細胞増殖速度の検討は顕微鏡観察による増殖アッセイ、コロニー形成実験を行った。【００２９】
複製可能な発癌性アデノウィルス（Adonco viruses）は既に報告されている方法を用いて作製した（Kim, E., Kim, J. H., Shin, H. Y., Lee, H., Yang, J. M., Kim, J., Sohn, J. H., Kim, H., and Yun, C. O. (2003) Hum Gene Ther 14, 1415-1428）。 モータリンを標的としたshRNAを作るために、ヒトモータリンを標的としたshRNAの発現のためのDNA断片をセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって作製した。【００３０】
Ｎｏ．１（標的配列：gcgtctcatt ggccggcgat a（配列番号１））
センスオリゴヌクレオチド：
caccgcgtcttattggtcggtgatacgtgtgctgtccgttcttctttcagcttgttgcttttt（配列番号７）
アンチセンスオリゴヌクレオチ：
gcataaaaagcgtctcattggccggcgatagaacggacagcacacgttcttctttcaacttatcgc （配列番号８）【００３１】
Ｎｏ．２（標的配列：gatgctggcc agatatctgg a （配列番号２））
センスオリゴヌクレオチド：
caccgatgctggtcagatatctggacgtgtgctgtccgttcttctttcagcttgttgcttttt （配列番号９）
アンチセンスオリゴヌクレオチ：
gcataaaaagatgctggccagatatctggagaacggacagcacacgttcttctttcaacttatcgc（配列番号１０）【００３２】
Ｎｏ．３（標的配列：gactttgacc aggccttgct a （配列番号３））
センスオリゴヌクレオチド：
caccgactttgatcaggtcttgctacgtgtgctgtccgttcttctttcagcttgttgcttttt（配列番号１１）
アンチセンスオリゴヌクレオチ：
gcataaaaagactttgaccaggccttgctagaacggacagcacacgttcttctttcaacttatcgc（配列番号１２）【００３３】
Ｎｏ．４（標的配列：gcaacaagct gaaagaaga（配列番号４））
センスオリゴヌクレオチド：
caccgcgataagttgaaagaagaacgtgtgctgtccgttcttctttcagcttgttgcttttt （配列番号１３）
アンチセンスオリゴヌクレオチ：
gcataaaaagcaacaagctgaaagaagaacggacagcacacgttcttctttcaacttatcgc （配列番号１４）【００３４】
Ｎｏ．５（標的配列：gccagaagga caacatatg（配列番号５））
センスオリゴヌクレオチド：
caccgctagaaggataacgtataacgtgtgctgtccgttatatgttgtccttctggcttttt （配列番号１５）
アンチセンスオリゴヌクレオチ：
gcataaaaagccagaaggacaacatataacggacagcacacgttatacgttatccttctagc （配列番号１６）【００３５】
Ｎｏ．６（標的配列：gaatgaggct agaccttta （配列番号６））
センスオリゴヌクレオチド：
caccgagtgaggttagatctttaacgtgtgctgtccgttaaaggtctagcctcattcttttt （配列番号１７）
アンチセンスオリゴヌクレオチ：
gcataaaaagaatgaggctagacctttaacggacagcacacgttaaagatctaacctcactc （配列番号１８）【００３６】
その断片を、アデノウイルスpSP72-E3シャトルベクター（Cancer Gene Therapy, 12, p61-71, 2005）のBamH1とHindIIIサイトに組み込みpSP72-E3-shMotを作り出した。モータリンに特異的なshRNAを発現する殺腫瘍アデノウイルスを作製するために、SP72ΔE3-shMotシャトルベクターをXmnIで直線化した。その後、SpeI-処理したE1A- 、 E1B-  ダブル変異にした複製全アデノウイルスベクターpdl-ΔB7を用いて大腸菌BJ5183に同時に形質転換して相同組み換えを行い、pΔB7-shMoアデノウイルスベクターを作成した。相同組み換えを確認するために、プラスミドDNAは一晩の大腸菌培養物から精製し、HindIIIで切断し、切断パターンを分析した。適切な相同組み換えＡdプラスミドDNAをPacIで切断し、293細胞にトランスフェクションしてアデノウイルスAd-ΔB7-shMotを作製した。E1を欠失した複製インコンピテントAd (Ad-ΔE1、Ａｄゲノム1341-3535の塩基配列の欠失；Int. J. Cancer, 88 p454-463, 2000)と、E1A、E1Bのダブル突然変異に置き換えた複製アデノウイルス(Ad-ΔB7)を調製した。すべてのウイルスは、293細胞で増殖させ、CsCl密度遠心法により精製し、10mMのトリスと4％のシュークロース、2mＭのMgCl2の保存溶解液中で、-80℃で保存した。ウイルス粒子数は260nmのOD260の吸光度で測定した。１吸光ユニットは1012／ｍｌのウイルスに相当した。また、感染のタイターは（プラーク形成単位／ｍｌ）は293細胞の限界希釈法による決定した。MOIは感染効率から計算した。ウィルス感染は細胞を48ウェルプレートに準備しMOIを10−300で感染させた。ウィルス感染による細胞増殖速度の解析は上述の方法で行った。【００３７】
図１は、本実施例で用たアデノウイルスベクターの図を示す。 示したすべてのアデノウイルスベクターは全長アデノウイルス遺伝子を用い、大腸菌プラスミドに組替え操作した。Ad- Δ E１ はすべての E１ 領域を削除した。； Ad- Δ B７はretinoblastoma （RB）結合部位の変異を持つE１Aと E１B 領域を失ったものである。Ad- Δ B7- shMot は U６ プロモーターによって制御されたmortalin 特異的なshRNAを働かせる。ΔE１A 、Δ E１B とΔ E３ はそれぞれ E１A 、 E１B と E３ 遺伝子の削除を示す。 ITR ＝ inverted terminal repeat；Ψ ＝ パッケージシグナル；IX＝ タンパク質ＩＸ。 アスタリスクは E１A のRb タンパク質結合部位の変異を示す。【００３８】
（ｂ）siRNA発現ベクターの構築
siRNA発現ベクターの構築のために、テトラサイクリンによる誘導が可能なU6プロモーターを持つベクターを用いた（Miyagishi, M., and Taira, K. (2002) Nat Biotechnol 20, 497-500）（Miyagishi, M., Sumimoto, H., Miyoshi, H., Kawakami, Y., and Taira, K. (2004) J Gene Med 6, 715-723）。siRNAの標的部位はアルゴリズムを用いて設計した（http://www.igene-therapeutics.co.jp）。siRNAの標的となるmortalinの配列を表１に示す。【００３９】
siRNA構築物の典型例では、センス配列オリゴ（5'-caccGttGCtCACTtCAAGAGAGgtgtgctgtccCTCTCTTGGAGTGGGCGGCtttttt-3'）及びアンチセンス配列オリゴ（5'-GCATaaaaaaGCCGCCCACTCCAAGAGAGggacagcacacCTCTCTTGaAGTGaGCaaC-3'）を作製した。下線部分は、標的部位の配列を示す。ＣからＴ、及びＧからＡへの変異をセンス配列のみに挿入した。100μMのセンス及びアンチセンスのオリゴヌクレオチド５μlを混合して、100-150ｍＭのNaCl中で最終容量（20μｌ）でサーマルサイクラー（99℃２分、2時間かけて72℃から４℃まで低下）を用いてアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを希釈し（１：２００）、そのうち２μlを、BspM I で切断して精製したpciPurベクターにハイ・ライゲーションキット（タカラ）を用いてライゲーションした。形質転換した細菌から調製したプラスミドDNAの配列をアンチセンスベクタープライマー (CAGGAAACAGCTATGAC)（配列番号１９）を用いて決定し、クローニングされたＤＮＡ断片を確認した。【００４０】
【表１】
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【００４１】
（２）結果
モータリンは発癌において発現が増加し、悪性の癌細胞に関与している（Wadhwa, R., Takano, S., Kaur, K., Deocaris, C. C., Pereira-Smith, O. M., Reddel, R. R., and Kaul, S. C. (2006) Int J Cancer；及び、Dundas, S. R., Lawrie, L. C., Rooney, P. H., and Murray, G. I. (2005) J Pathol 205, 74-81）（特開２００６−８９４７１号公報)。本発明者らは、モータリン発現siRNAを構築し、ヒト癌細胞に対する効果を検討した。(i) U6プロモーター (Miyagishi, M., and Taira, K. (2002) Nat Biotechnol 20, 497-500)、 (ii)アデノ腫瘍退縮性ウイルス(Adonoc-motshRNAs) (Kim, E., Kim, J. H., Shin, H. Y., Lee, H., Yang, J. M., Kim, J., Sohn, J. H., Kim, H., and Yun, C. O. (2003) Hum Gene Ther 14, 1415-1428) を用いた２種類のsiRNAを作製した。テトラサイクリン誘導性U6プロモーターを用いたモータリンshRNA (596, 696 ,906)および恒常性Adonoc-motshRNAs (7, 8 ,9)を構築した（表１、図１）。以下に示すデータにおいて、モータリンshRNAは癌細胞を死滅させる効果があり、癌治療に用いることができることが実証された。【００４２】
図２においては、表示したモータリンshRNAをヒト骨肉腫細胞にトランスフェクションした。トランスフェクト細胞はピューロマイシン(2 ug/ul)を添加した培地で48〜96時間培養し、選択した。テトラサイクリン誘導性構築物は培地にドキシサイクリン(1μg/ml)を加え誘導させた。【００４３】
図２Ａは、モータリンshRNAトランスフェクトおよびコントロール細胞におけるモータリンの免疫染色を示す。モータリンshRNAトランスフェクト細胞の約６０％で非常に弱い染色が示された。
図２Ｂでは、ベクタートランスフェクト細胞は健常であるが、モータリンshRNAトランスフェクト細胞は死滅した。
図２Ｃでは、ピューロマイシン選択細胞を低密度(2000 個/10cm ディッシュ)で蒔き、１５日間、コロニー形成の観察を行った。コロニー形成率の大幅な低下が示された。【００４４】
図３では、既に示したようにモータリンshRNA発現アデノ腫瘍退縮性ウイルスを作製した（Kim, E., Kim, J. H., Shin, H. Y., Lee, H., Yang, J. M., Kim, J., Sohn, J. H., Kim, H., and Yun, C. O. (2003) Hum Gene Ther 14, 1415-1428）。これらのウイルスはヒト癌細胞において選択的複製を示す。これらをMOI100で正常および癌細胞にウイルス感染させた。【００４５】
図３Ａは、Adonco-motshRNAウイルス感染細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。正常細胞(TIG-1とWI38)は感染48-60時間後においても効果を示さないが、癌細胞(U2OSとHT1080)は各６種のshRNAにおいて顕著な死滅が示された。【００４６】
図３Ｂでは、感染後３６−４８時間における細胞生存率を検討した。癌細胞は非常に低い生存率を示したが、正常細胞では６種いずれのshRNAにおいても著しい効果が見られなかった。【００４７】
図４には、MOI 0-300でAdonco-motshRNA およびコントロールを感染させたU2OS細胞の増殖の結果を示す。MOI 25において、＃７および＃９細胞が死に始め、MOI 300で100%の細胞が死滅した。＃８およびコントロールウイルス細胞は大量感染（MOI 200-500の感染領域）で死滅を引き起こした。【００４８】
図５では、Adonco-motshRNAを感染させたヒト正常繊維芽細胞についても図４で示した癌細胞と並行して、感染後36-48時間での増殖を検討した。細胞死滅は各６種の感染癌細胞にほぼ選択的に見られた。【００４９】
図６では、既に示したようにレトロウイルスによりU2OS細胞内でモータリンを過剰発現させた（Wadhwa, R., Takano, S., Kaur, K., Deocaris, C. C., Pereira-Smith, O. M., Reddel, R. R., and Kaul, S. C. (2006) Int J Cancer）。コントロールおよびモータリン過剰発現細胞を元のU2OS細胞と同様に６種のAdonco-motshRNAで感染させた。モータリン過剰発現U2OS細胞は残存したが、元のU2OS細胞は各６種のAdonco-motshRNAにより効果的に死滅した。この結果はshRNAによるモータリンのノックダウンが癌細胞の死滅を導くことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本研究で用いられたアデノウイルスベクターの図を示す。
【図２】図２は、モータリンshRNAをヒト骨肉腫細胞にトランスフェクションした結果を示す。
【図３】図３は、モータリンshRNA発現アデノ腫瘍退縮性ウイルスを正常細胞および癌細胞に感染させた結果を示す。
【図４】図４は、Adonco-motshRNA およびコントロールを感染させたU2OS細胞の増殖を示す。
【図５】図５は、Adonco-motshRNAを感染させたヒト正常繊維芽細胞についても図４で示した癌細胞と並行して、感染後36-48時間での増殖を検討した結果を示す。
【図６】図６は、コントロールおよびモータリン過剰発現細胞を、元のU2OS細胞と同様に６種のAdonco-motshRNAで感染させた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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