(57)【要約】本発明によれば、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドならびにその使用方法が提供される。（Ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。（Ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において、１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーＴ細胞の誘導活性を示すペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチド；
（Ａ）配列番号：１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、
（Ｂ）配列番号：１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されており、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示すペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、癌に対する免疫誘導剤。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、癌の治療及び／又は予防のための薬剤。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導するための薬剤。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドを用いて誘導される、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団。
【請求項１１】
請求項１に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示する抗原提示細胞。
【請求項１２】
請求項６または７に記載の薬剤によって誘導される、請求項１１に記載の抗原提示細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示するエキソソーム。
【請求項１４】
ＨＬＡ抗原がHLA-A2 (HLA-A*0201)である、請求項１３に記載のエキソソーム。
【請求項１５】
抗原提示細胞と請求項１に記載のペプチドを接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを抗原提示細胞へ導入する工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞と請求項１に記載のペプチドを接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、癌に対する免疫を誘導する方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、癌を治療及び／又は予防する方法。
【請求項２０】
癌に対する免疫誘導剤の製造における請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項２１】
癌の治療及び／又は予防のための薬剤の製造における請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項２２】
癌に対する免疫を誘導するための請求項１に記載のペプチド。
【請求項２３】
癌の治療及び／又は予防のための請求項１に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌、胆管細胞癌など、cell division cycle associated 1 (CDCA1)を高発現する癌に対するワクチンとして有効な新規ペプチド、及び当該ペプチドを含む腫瘍の治療および予防のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界各国で肺癌が増加し続けており、現在では世界で年間約100万人の肺癌死がみられている。わが国においても肺癌死は増え続けており2015年には、12万3000人に達すると考えられている。男女比では3対1と男性に多く、男性の癌死亡では、すでに1993年、胃癌を抜いて肺癌が一位となっている。また、女性の喫煙者数の増加にともない、女性の患者数も増加していくと考えられる。肺癌は2000年より癌による死因の第一位となっており、今後、高齢化社会が進むことによって、ますます患者数は増加すると考えられる。肺癌の発生要因では喫煙が最も大きな原因と考えられているが、そのほかにアスベストの吸引、大気汚染なども原因の一つとされている。肺癌治療において重要なことは、早期発見、早期治療であるが、検診で行われている単純胸部X線撮影と喀痰検査は、肺癌の早期発見に関する効果は乏しく、癌死を減らす結果には繋がらないことが近年、指摘されている。今後とも肺癌による死亡者数は増加すると考えられるため、新たな治療戦略の開発は緊急な課題である。【０００３】
わが国における胆道癌の死亡者数は増加傾向にあり、2005年には16,586人が胆道癌で死亡している。胆道癌は多くの場合、初期には自覚症状が見られないことがほとんどであり、胃癌や大腸癌のような消化管の内腔にできる癌と比較すると、癌を早期に発見し診断することが困難である。そのため発見されたときには癌が進行していて、切除不能であることが多い。胆道癌の治療は外科療法のほかに、放射線療法、化学療法があるが、その治療効果は乏しく、新たな治療法を確立することが必要である。【０００４】
一方、近年の分子生物学および腫瘍免疫学の発展により、細胞傷害性（キラー）T細胞およびヘルパーT細胞が、癌細胞あるいは抗原提示細胞の表面にHLA分子を介して提示される、癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が分解されてできたペプチドを認識して、癌細胞を破壊する免疫反応を示すことが明らかとなった。さらに、このような癌を攻撃する免疫反応を刺激する、腫瘍抗原蛋白質および、それらに由来するペプチドが多数同定されてきており、抗原特異的な腫瘍免疫療法の臨床応用が進められている。【０００５】
HLAクラスI分子は、身体のすべての有核細胞の表面に発現しており、細胞質や核で産生される蛋白質が細胞内で分解されて出来たペプチドを結合して、細胞表面に発現する。正常な細胞の表面には、正常な自己の蛋白質に由来するペプチドがHLAクラスI分子に結合しており、これを免疫系のT細胞が識別して破壊することはない。一方、癌細胞は癌になる過程で、正常細胞にはほとんど発現していないか、あるいは、ごく僅かしか発現していない蛋白質を大量に発現することがある。このような癌細胞に特異的に高発現する蛋白質が細胞質内で分解されて出来たペプチドが、HLAクラスI分子に結合して癌細胞の表面に発現すると、細胞傷害性（キラー）T細胞がこれを認識して癌細胞のみを破壊する。また、このような癌特異抗原やペプチドを個体に投与することにより、正常細胞には危害を加えることなく、癌細胞を破壊して癌の増殖を抑制することができる。これを、癌特異抗原を用いた癌免疫療法と呼ぶ。またHLAクラスII分子は、主に抗原提示細胞の表面に発現しており、抗原提示細胞が細胞外から取り込んで、細胞内で分解されて出来た癌特異抗原由来のペプチドを結合して細胞表面に発現する。これを認識したヘルパーT細胞は、活性化され、他の免疫担当細胞を活性化する種々のサイトカインを産生することにより、腫瘍に対する免疫反応を誘導あるいは増強する。【０００６】
そこで、これらの癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発できれば、自己の正常臓器に有害事象を及ぼすことなく、癌だけを有効に排除する治療法になる可能性がある。また、他の治療が行えない、どんな末期の癌患者にでも使用できる治療法になりうると期待される。また、あらかじめ、このような癌を発生するリスクが高いヒトに対して、癌特異抗原およびペプチドをワクチンとして投与することにより、癌の発生を予防できる可能性がある。【０００７】
肺癌の治療法には様々なものがあるにも関わらず、他の癌に比べて予後が悪く、難治性癌の一つになっている。その原因として、進行度が早く、発見されたときにはかなり進んでいる状態であることが多いことが挙げられる。また、手術侵襲が大きいため手術適応となる患者が限られていること、放射線や化学療法では根治が認められにくいということがある。肺癌に特異的に高発現している抗原を標的にした免疫療法を開発できれば、自己の正常臓器に障害を及ぼすことなく、癌だけを有効に排除する治療法になる可能性がある。また、どんな末期の癌患者でも、さらに肺機能が悪すぎて他の治療が行えない患者に対しても使用できる治療法になると期待される。また、肺癌は喫煙者で発生リスクが高いため、このような肺癌ハイリスク群における肺癌予防に関しても、免疫療法が適用できる可能性がある。【０００８】
本発明者等は先に、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を利用した、27,648種のヒト遺伝子を含むゲノムワイドの遺伝子発現解析によって、37症例の非小細胞肺癌および胎生期臓器ならびに様々な成人の正常臓器における、これらの遺伝子の発現プロフィールを検討した。その結果、CDCA1（cell division cycle associated 1、別名  ｈＮｕｆ２；human homologues of Nuf2）（GenBank Accession No. NM_145697）が、胎生期の肝臓ならびに成人の正常臓器では免疫系から隔離されている精巣以外にはほとんど発現しないのに対し、多くの肺癌で高発現することを見いだした。さらにCDCA1は、胆管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌では全ての症例で高発現しており、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、子宮頚癌、骨肉腫、乳癌、軟部肉腫、大腸癌でも40%以上の症例の癌組織で高発現が認められた。この事実はCDCA1が多くの癌腫において、癌特異抗原となりうることを示唆するものである。【０００９】
HLA-A2は人種を問わず人類集団中に高頻度で観察され、日本人でもその約30％が所有している。このため、HLA-A2により細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞に提示される癌抗原ペプチドを同定することが出来れば、日本人のみならず広く欧米白人などにも応用できることになる。したがって、HLA-A2によりキラーＴ細胞に提示される癌抗原ペプチドの同定は、重要な課題である。このような癌抗原ペプチドを、全世界において罹患率、死亡率の高い肺癌に対する免疫療法に応用することができれば、非常に有益であると考えられる。
なお本発明の先行技術文献を以下に示す。
【非特許文献１】DeLuca J.G., Moree, B., Hickey, J.M., Kilmartin, J.V., and Salmon, E.D., hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells J. Cell Biol. 159: 549-555, 2002.
【非特許文献２】DeLuca, J.G.,Dong, Y., Hergert, P, Strauss, J., Hickey, J.M., Salmon, E.D., McEwen, B.F., Hec1 and Nuf2 Are Core Components of the Kinetochore Outer Plate Essential for Organizing Microtubule Attachment Sites., Mol. Biol. Cell 16: 519-531, 2005.
【非特許文献３】Hayama, S., Daigo, Y., Kato, T., Ishikawa, N., Yamabuki, T., Miyamoto, M., Ito, T., Tsuchiya, E., Kondo, S., and Nakamura, Y., Activation of CDCA1-KNTC2, Members of Centromere Protein Complex, Involved in Pulmonary Carcinogenesis., Cancer Res. 66: 10339-10348, 2006.
【非特許文献４】Liu, S.T., Rattner, J.B., Jablonski, S.A., and Yen, T.J., Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells., J.Cell Biol. 175: 41-53, 2006.
【非特許文献５】DeLuca, J.G., Howell, B.J., Canman, J.C., Hickey, J.M., Fang, G., and Salmon, E.D., et al. Nuf2 and Hec1 Are Required for Retention of the Checkpoint ProteinsMad1 and Mad2 to Kinetochores., Current Biology 13: 2103-2109, 2003.
【非特許文献６】Liu, D., Ding, D., Du, J., Cai, Xin., Huang, Y., Ward, T., Shaw, A., Yang, Y., Hu, R., Jin, C., and Yao, X., Human NUF2 Interacts with Centromere-associated Protein E and Is Essential for a Stable Spindle Microtubule-Kinetochore Attachment. J.Biol.Chem.282: 21415-21424, 2007.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、肺癌、胆道癌などの治療法として実行されている外科療法、化学療法、放射線療法では治療が難しい転移性癌や難治性癌に対する治療法として、癌患者の癌に対する免疫力を強めることにより、癌の増殖を抑制する免疫療法を実現する手段を開発することを解決すべき課題とする。本発明は、癌特異的に高発現する蛋白質由来で、HLA-A2によりキラーＴ細胞に提示されるペプチドを同定することにより、日本人のCDCA1を高発現する様々な癌患者の約30％を対象とすることができる免疫療法を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは肺癌組織におけるcDNAマイクロアレイ解析により、肺癌に高発現する遺伝子CDCA1（GenBank Accession No. NM_145697）を同定した。正常組織におけるCDCA1の発現は、免疫系から隔離された精巣のみで認められる。CDCA1特異的なキラーT細胞による抗腫瘍免疫の誘導の有無を検討するために、日本人の約30%が所有するHLA-A2を発現するHLA-A2トランスジェニックマウスを利用した。つまり今回、HLA-A2結合モチーフを持つヒトCDCA1ペプチドを負荷したマウス骨髄由来樹状細胞を、HLA-A2トランスジェニックマウスに免疫することにより、HLA-A2拘束性のペプチド特異的キラーT細胞が誘導されるか否かを検討した。HLA-A2により提示されたペプチドを認識して活性化されたキラーT細胞が産生するγ-インターフェロン（IFN-γ）をELISPOT 法を用いて検出することにより、免疫されたマウス脾細胞中のCDCA1ペプチドに特異的なキラーT細胞の誘導の有無を検討した。その結果、HLA-A2陽性の癌患者を対象とした免疫療法に応用可能な、新規CDCA1ペプチドを２種類同定した。さらに、これらのペプチドを用いて活性化した癌患者および健常者ドナー由来のCTLがCDCA1発現細胞に対し細胞溶解活性を示すことを確認した。よって、HLA-A2拘束性ヒト・キラーＴ細胞にも認識され、HLA-A2陽性の癌患者に対する癌免疫療法にも応用できることが期待できる。【００１２】
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
〔１〕以下の（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチド；
（Ａ）配列番号：１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、
（Ｂ）配列番号：１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されており、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示すペプチド、
〔２〕Ｎ末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、〔１〕に記載のペプチド、
〔３〕Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンである、〔１〕に記載のペプチド、
〔４〕〔１〕に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、癌に対する免疫誘導剤、
〔５〕〔１〕に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、癌の治療及び／又は予防のための薬剤、
〔６〕〔１〕に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤、
〔７〕〔１〕に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための薬剤、
〔８〕〔１〕に記載のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導するための薬剤、
〔９〕〔１〕に記載のペプチドに対する抗体、
〔１０〕〔１〕に記載のペプチドを用いて誘導される、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団、
〔１１〕〔１〕に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示する抗原提示細胞、
〔１２〕〔６〕または〔７〕に記載の薬剤によって誘導される、〔１１〕に記載の抗原提示細胞、
〔１３〕〔１〕に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原を含む複合体を提示するエキソソーム、
〔１４〕ＨＬＡ抗原がHLA-A2(HLA-A*0201)である、〔１３〕に記載のエキソソーム、
〔１５〕抗原提示細胞と〔１〕に記載のペプチドを接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法、
〔１６〕〔１〕に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを抗原提示細胞へ導入する工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導する方法、
〔１７〕Ｔ細胞と〔１〕に記載のペプチドを接触させる工程を含む、細胞傷害性（キラー）T細胞を誘導する方法、
〔１８〕〔１〕に記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、癌に対する免疫を誘導する方法、
〔１９〕〔１〕に記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、癌を治療及び／又は予防する方法、
〔２０〕癌に対する免疫誘導剤の製造における〔１〕に記載のペプチドの使用、
〔２１〕癌の治療及び／又は予防のための薬剤の製造における〔１〕に記載のペプチドの使用、
〔２２〕癌に対する免疫を誘導するための〔１〕に記載のペプチド、
〔２３〕癌の治療及び／又は予防のための〔１〕に記載のペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Aは、HLA-A2拘束性キラーT細胞が認識するCDCA1ペプチドの同定までのプロトコールを示す図である。（免疫マウスからの脾細胞回収日をDay 0とする。）Bは、ELISPOT解析結果を示す図である。免疫したマウスから得られたキラーT細胞が、CDCA1ペプチドを負荷した細胞に対して、特異的に反応してIFN-γを産生するか否かをELISPOTアッセイを用いて検討した。その結果、CDCA1-1あるいはCDCA1-4ペプチドで誘導したキラーT細胞は、CDCA1ペプチドを添加したT2A2細胞を特異的に識別してIFN-γを産生したが、他のペプチドで誘導したキラーT細胞においては、CDCA1特異的なキラーT細胞の免疫応答は観察されなかった。以上より、CDCA1-1およびCDCA1-4ペプチドは、CDCA1特異的なHLA-A2拘束性キラーT細胞を誘導できるエピトープペプチドであると判定した。Bに記載されたCDCA1ペプチドの番号は、表１のペプチドのポジションの項目に記載されたペプチドの番号に対応し、本明細書に記載された配列番号とは異なる。
【図２】CDCA1ペプチドを特異的に認識して活性化されたキラーT細胞が産生した、IFN-γをELISPOT解析により検出した結果を示す。Aは、CDCA1 65-73 (No. 1) （配列番号：１）ペプチドを負荷したHLA-A2トランスジェニックマウスの骨髄由来の樹状細胞で刺激して誘導したキラーT細胞の結果を示す。CDCA1ペプチドを負荷したT2A2細胞を刺激細胞とした場合は、HLA-A2陽性でCDCA1を負荷していないT2A2細胞を刺激細胞とした場合に比べ、スポットの数も、スポットの面積の総和も有意に大きかった。これよりCDCA1-1 ペプチドは、HLA-A2拘束性キラーT細胞を誘導できるエピトープペプチドであると判定した。Bは、CDCA1 351-359 (No. 4) （配列番号：2）ペプチドを負荷したHLA-A2トランスジェニックマウスの骨髄由来の樹状細胞で刺激して誘導したキラーT細胞の結果を示す。CDCA1ペプチドを負荷したT2A2細胞を刺激細胞とした場合は、HLA-A2陽性でCDCA1を負荷していないT2A2細胞を刺激細胞とした場合に比べ、スポットの数も、スポットの面積の総和も有意に大きかった。これよりCDCA1 351-359 (No.4)ペプチドは、HLA-A2拘束性キラーT細胞を誘導できるエピトープペプチドであると判定した。
【図３】健常人ドナーより誘導したCTLのCDCA1特異的免疫反応を示す。Aは、PBMCからのCDCA1特異的CTL誘導のプロトコールを示す。PBMCを健常人ドナーより単離し、CD8+T細胞およびCD14+細胞をマイクロビーズを用いて単離した。その後、ペプチド反応性CD8+CTLを生成し、GM-CSFとIL-4存在下での5日間の培養によりCD14陽性細胞よりDCを生成した。DCをβ2マイクログロブリン存在下において37℃で4時間培養し、HLA-A2結合ペプチドを負荷した。ペプチドを負荷したDCは放射線照射し、自己CD8陽性T細胞と１：２０の割合で混ぜ合わせた。細胞は２%自己血清含有AIM-V 中にIL-7を添加して培養した。３日後、IL-2を培養液に加えた。１２日と１９日目にペプチド負荷自己DCによりT細胞を再刺激した。DCは用事調製した。IFN-γELISPOT法およびCr放出試験は３回目のペプチド刺激後、５日目と６日目に行った。BとＣに、それぞれCDCA1 65-73 (No.1)ペプチドおよびCDCA1 351-359 (No.4)ペプチドを用いてドナーから誘導されたCTLと標的細胞とを共培養した後のELISPOT法の結果を示す。ペプチド負荷T2細胞に対するIFN-γ産生は非ペプチド負荷T2細胞に対する産生と比較して有意に増加した。Dは、癌患者ドナー１および健常者ドナー１のPBMCから誘導されたCTLによるCDCA1ペプチドを負荷したT2細胞に対する細胞傷害性の結果を示す。Eは、CDCA1 351-359ペプチドに誘導されたCTLの、健常者ドナー１における、用量依存的反応を示す。CTLは、E/T比5において0.2μg/ml以上のペプチドを負荷したT2細胞に反応して大量のIFN-γを産生した。
【図４】健常者ドナーから誘導されたCTLによるCDCA1陽性癌細胞に対する特異的細胞傷害活性の結果を示す。Ａは、COLO201細胞におけるCDCA1遺伝子発現ベクターを導入した時の発現の結果を示す。EF-1αプロモーターとCMVプロモーターでCDCA1-HAを発現誘導するレンチウィルスをHLA-A2は発現するがCDCA1を発現しない癌細胞株（COLO201）へ３回感染させた。細胞溶解物を、抗HA抗体（中段）もしくは抗CDCA1抗体（上段）を用いたウェスタンブロット分析に用いた。Ｂ、ＣおよびＤは、COLO201/CDCA1に対するIFN-γ産生の結果を示す。形質転換していない癌細胞株COLO201におけるIFN-γ産生と比較して形質転換したCOLO201に対して有意にその産生を増加させた。さらに、内在性にCDCA1およびHLA-A2を発現しているPANC1に対するIFN-γ産生は、CDCA1およびHLA-A2を発現していないA549と比較して有意に増大した。ＥおよびＦはドナーから誘導されたCTLと標的細胞とを共培養した時の51Cr放出試験の結果を示す。A549 (CDCA1+, HLA-A2-)またはCOLO201 (CDCA1-, HLA-A2+)には細胞傷害活性を示さなかったが、PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+)には細胞傷害を示した。Ｇは、CD8陽性T細胞における、CDCA1ペプチド反応性CTLとHLA-A2-CDCA1テトラマー陽性CTL間の相関を示している。左図は、標的細胞をペプチド負荷T2細胞としたELISPOT解析を示し、E/T比は5である。右図はFACS解析の結果を示す。左図の解析対象の細胞は、ペプチド負荷DCにより3度PBMC刺激を行った健常者ドナー1由来のCTLで、右図の細胞は、健常者ドナー1のPBMCから分離されたナイーブCD8陽性細胞である。
【００１４】
〔発明の実施の形態〕
他に定義がない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。【００１５】
本発明のペプチドは、日本人および白人集団に高頻度に見出されるHLA対立遺伝子であるHLA-A2により拘束されるエピトープである。具体的には、HLA-A2への結合親和性を指標として、CDCA1由来のHLA-A2結合ペプチドの候補を選択した。選択したペプチドについて、選択したペプチドを添加したHLA-A2トランスジェニックマウス骨髄細胞由来の樹状細胞(BM-DC)によりHLA-A2トランスジェニックマウス生体内でキラーT細胞が誘導されるか否かを評価した。CDCA1-1（YMMPVNSEV（配列番号：１））、CDCA1-4（KLATAQFKI（配列番号：２））により、HLA-A2トランスジェニックマウス生体内で細胞傷害性（キラー）T細胞が誘導された。これらのペプチドで誘導したキラーＴ細胞は、これらペプチドを添加したT2A2細胞に対して免疫応答反応を示した。しかしながら、これらのキラーＴ細胞は、ペプチドを添加しないT2A2細胞に対して免疫応答反応を示さなかった。また、CDCA1-1ならびにCDCA1-4を用いて誘導した癌患者ならびに健常者ドナー由来のCTLは、CDCA1を発現させた細胞株に対して、細胞溶解活性を示した。これらの結果は、CDCA1由来のペプチドが、CDCA1提示細胞に対する免疫反応を誘導するペプチドとして有用であること、ならびにCDCA1由来のペプチドがHLA-A2により拘束されるエピトープペプチドであることを実証している。CDCA1は、肺癌、胆管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、子宮頚癌、骨肉腫、乳癌、軟部肉腫、大腸癌の癌組織の大部分の症例で高発現を認められている。これら事実から、CDCA1が多くの癌腫において、免疫療法の標的として有用であると考えられる。【００１６】
（１）本発明のペプチド、及びそれを含む癌に対する免疫誘導剤
本発明のペプチドは以下の（Ａ）から（Ｄ）の何れかに記載のペプチドである。
（Ａ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されており、細胞傷害性（キラー）T細胞の誘導活性を示すペプチド。
（Ｃ）Ｎ末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、（Ｂ）に記載のペプチド。
（Ｄ）Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンである、（Ｂ）に記載のペプチド。【００１７】
本明細書で言うキラーＴ細胞の誘導活性を示すペプチドとは、キラーＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞／ＣＴＬ）を刺激するＴ細胞誘導活性を有するペプチドを意味する。【００１８】
本発明のペプチドは、キラーＴ細胞の誘導活性を示すペプチドであって、約40アミノ酸未満、好ましくは約20アミノ酸未満、より好ましくは約15アミノ酸未満であり、かつ配列番号：１または２のアミノ酸配列を含むエピトープペプチドである。あるいは、本発明のペプチド（エピトープペプチド）は、キラーＴ細胞の誘導能を保持する限り、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されている、配列番号：１または２のアミノ酸配列を含むペプチドを含みうる。置換、欠失、挿入および/または付加される残基の数は、一般的に、5アミノ酸またはそれ未満、好ましくは4アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満、よりいっそう好ましくは1アミノ酸もしくは2アミノ酸である。【００１９】
変異体ペプチド(すなわち、本来のアミノ酸配列に対して、1個、2個、または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加を行うことにより改変されたアミノ酸配列を含むペプチド)は、本来の生物活性を保持することが知られている(Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13)。アミノ酸の改変は、本来のアミノ酸側鎖の性質を保存することが好ましい。アミノ酸側鎖の性質の例は、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、および共通して、以下の官能基または特性を有する側鎖である：脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P)；ヒドロキシ基含有側鎖(S、T、Y)；イオウ原子含有側鎖(C、M)；カルボン酸およびアミド含有側鎖(D、N、E、Q)；塩基含有側鎖(R、K、H)；ならびに芳香族含有側鎖(H、F、Y、W)。ただし、括弧でくくられた文字は、アミノ酸の一文字記号を示す。【００２０】
好ましい態様において、本発明のペプチド（免疫原性ペプチド）は、ノナペプチド(9-mer)またはデカペプチド(10-mer)である。【００２１】
さらに、高い結合親和性およびキラーT細胞誘導活性を示すペプチドを得るために、天然に存在するCDCA1の部分ペプチドのアミノ酸配列に、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および/または付加による改変を加えてもよい。本明細書において、「数個の」という用語は、5個またはそれ未満、好ましくは3個またはそれ未満、より好ましくは2個またはそれ未満を指す。さらに、HLA抗原へ高い親和性を示すペプチドの配列の規則性は既知であるため(Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al., (1995) J. Immunol. 155:4307-12)、そのような規則性に基づきHLA抗原への親和性を高めることを目的として、本発明のペプチド（エピトープペプチド）を改変することができる。例えば、Ｎ末端から2番目のアミノ酸をロイシンまたはメチオニンに置換することで、高いHLA-A2結合親和性を示すペプチドを得ることができる。同様に、Ｃ末端のアミノ酸をバリンまたはロイシンに置換することでも、高いHLA-A2結合親和性を示すペプチドを得ることができる。【００２２】
エピトープペプチド配列が、異なる機能をもつ内因性または外因性の蛋白質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、特定の物質に対する自己免疫異常またはアレルギー症状等の副作用が引き起こされうる。このような副作用を回避するため、エピトープペプチドの改変に当たっては、公知の蛋白質のアミノ酸配列に一致しないように、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行い、改変後のエピトープペプチドと100%の相同性を示す異なる機能をもつ内因性または外因性の蛋白質が存在しないことを確認する必要がある。このような手順を踏むことにより、HLA抗原との結合親和性を増加させる、および/またはキラーT細胞誘導活性を増加させる上記のアミノ酸配列の改変による危険性が避けられうる。【００２３】
上記のようなHLA抗原に対する高い結合親和性をもつペプチドは、癌ワクチンとして大いに効果的であることが期待されるが、高い結合親和性を指標として選択される候補ペプチドは、実際のキラーT細胞誘導活性の有無について調べる必要がある。キラーT細胞誘導活性は、ヒトMHC抗原を有する抗原提示細胞(例えば、Bリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞)、より具体的には、ヒト末梢血単核白血球由来の樹状細胞を誘導し、関心の対象のペプチドによる刺激後、CD8陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定することにより確認されうる。反応系として、ヒトHLA抗原を発現させるように作製されたトランスジェニック動物(例えば、BenMohamed L, et al., (2000) Hum. Immunol. 61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkoutに記載)が用いられうる。細胞傷害活性は例えば、標的細胞を51Crなどで放射該標的細胞は、固定化ペプチドを有する抗原提示細胞の存在下でキラーT細胞により産生および放出されたIFN-γを測定し、抗IFN-γモノクローナル抗体を用いて培地上のIFN-γ産生ゾーンを可視化することにより細胞傷害活性を調べることができる。【００２４】
実施例に示すように、ペプチドのキラーＴ細胞の誘導活性を調べた結果として、HLA抗原に対する高い結合親和性をもつペプチドは、必ずしもキラーＴ細胞の高い誘導活性をもつとは限らないことが発見された。しかしながら、CDCA1-1（YMMPVNSEV（配列番号：１））、CDCA1-4（KLATAQFKI（配列番号：２））により示されたアミノ酸配列を含むペプチドは、特に高いキラーT細胞誘導活性を示した。【００２５】
上記のように、本発明は、キラーＴ細胞の誘導活性を示すペプチド、すなわち、配列番号：１または２のアミノ酸配列またはそれらの変異体(すなわち、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列)を含むペプチドを提供する。配列番号：１または２に示される9アミノ酸を含むペプチドまたはそれらの変異体は、他の内因性蛋白質とアミノ酸配列が一致しないことが好ましい。特に、Ｎ末端から2番目のアミノ酸のロイシンまたはメチオニンへの置換、または／および、Ｃ末端アミノ酸のバリンまたはロイシンへの置換により、高いHLA-A2結合親和性を示すペプチドを得ることができる。【００２６】
本発明のペプチドは、改変によりキラーＴ細胞の誘導活性を失わない限りにおいて、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化のような改変を含みうる。他の改変は、例えば、ペプチドの血清半減期を増加させるために用いることができるD-アミノ酸または他のアミノ酸のアナログが含まれる。【００２７】
本発明のペプチドの入手・製造方法は特に限定されず、化学合成したペプチドでも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。【００２８】
化学合成ペプチドを入手する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。【００２９】
本発明のペプチドを組み換え蛋白質として産生するには、当該ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ又はその変異体又は相同体を入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを製造することができる。【００３０】
発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものであればよく、ペプチドをコードする遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。また、本発明のペプチドをコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞のいずれでもよく、また宿主への発現ベクターの導入は、各宿主に応じた公知の手法により行えばよい。【００３１】
本発明においては、上記のようにして作製した形質転換体を培養し、培養物中に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物より本発明のペプチドを採取することにより組み換えペプチドを単離することができる。【００３２】
形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる条件にて行えばよい。培養後、形質転換体の培養物から本発明のペプチドを単離精製するには、通常のペプチドの単離、精製法を用いればよい。【００３３】
なお、配列番号：１又は２に記載のアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号：１又は２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列の情報に基づいて、当業者であれば適宜製造又は入手することができる。即ち、配列番号：１又は２に記載のアミノ酸配列において、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、キラーＴ細胞の誘導活性を示すペプチドをコードする遺伝子は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。【００３４】
上記した本発明のペプチドは、後記実施例にも示す通り、癌に対する免疫を誘導することができる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む、癌に対する免疫誘導剤が提供される。【００３５】
本発明の免疫誘導剤は2つまたはそれ以上のエピトープペプチドを組み合わせた混合剤として調製することもできる。複数種類のペプチドを組み合わせた免疫誘導剤は、カクテルであってもよく、または標準的な技術を用いて互いに結合させてもよい。組み合わせるエピトープペプチドは、同一遺伝子由来の異なるアミノ酸配列を有するペプチドでもよく、または異なる遺伝子由来のアミノ酸配列を有するペプチドでもよい。本発明のペプチドを投与すると、投与されたペプチドは抗原提示細胞のHLA抗原上において高密度で提示され、続いて、投与されたペプチドとHLA抗原の間で形成された複合体に対して特異的に反応するキラーT細胞が誘導される。あるいは、被検体から採取した樹状細胞と本発明のペプチドを接触させることにより（被検体から採取した樹状細胞に本発明のペプチドを負荷することにより）、本発明のペプチドを細胞表面上に提示している抗原提示細胞を得ることができる。それぞれの被検体へ、これら抗原提示細胞を再投与することにより、被検者の体内でキラーＴ細胞を誘導することが出来る。その結果、本発明のペプチドを提示している標的細胞に対する免疫応答を増強させることができる。【００３６】
本発明の癌に対する免疫誘導剤は、インビトロ又はインビボ、好ましくはインビトロで用いることにより、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘導することができ、これにより癌に対する免疫を付与することができる。【００３７】
（２）本発明の癌の治療及び／または予防のための薬剤（癌ワクチン）
実施例において、本発明のペプチドは、生体内における癌細胞特異的キラーＴ細胞を誘導することができることが示された。さらに、先の発明では、CDCA1は、肺癌、胆管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、子宮頚癌、骨肉腫、乳癌、軟部肉腫、大腸癌等の大部分の症例で高発現していることが示された。したがって本発明のペプチドを有効成分として1種類以上含有する免疫誘導剤には、癌の治療、及び/又は予防剤としての効果が期待できる。つまり、本発明のペプチドを適当なアジュバントと共に、あるいはペプチドを樹状細胞などの抗原提示細胞に負荷した後に体内に注入することにより、腫瘍攻撃性キラーＴ細胞を誘導ならびに活性化することが期待できる。さらにその結果として抗腫瘍効果も期待できる。また発明のペプチドをコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、この組換えＤＮＡで形質転換されたヒトの抗原提示細胞（樹状細胞など）、BCG結核菌などの細菌、または本発明のペプチドをコードするＤＮＡをゲノムに組み込まれたワクシニアウイルス等のウイルスは、ヒト癌の治療・予防用生ワクチンとして有効に利用できる。なお、癌ワクチンの投与量及び投与法は通常の種痘やＢＣＧワクチンと同様である。【００３８】
本発明において、「ワクチン」という用語(免疫原性組成物とも呼ばれる)は、動物への接種により、抗腫瘍免疫を誘導する、または各種癌を抑制する物質を指す。本発明により、配列番号：１または２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドが、CDCA1を提示する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導しうるHLA-A2拘束性エピトープペプチドであると示唆された。従って、本発明はまた、配列番号：１または２に記載のアミノ酸配列またはそれらの変異体(すなわち、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加を含む)を含むペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法を含む。一般的に、抗腫瘍免疫は、以下のような免疫応答を含む：
（１）CDCA1を発現する細胞を含む腫瘍に対するキラーT細胞の誘導、
（２）CDCA1を発現する細胞を含む腫瘍を認識する抗体の誘導、および
（３）抗腫瘍性サイトカイン産生の誘導。【００３９】
特定のペプチドが動物への接種によりこれらの免疫応答のいずれか1つを誘導する場合、そのペプチドは、抗腫瘍免疫誘導効果をもつと決定される。ペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、インビボまたはインビトロで、ペプチドに対する宿主における免疫系の応答を観察することにより、検出することができる。【００４０】
例えば、キラーT細胞の誘導を検出するための方法は周知である。生体に侵入する異物は、抗原提示細胞(APC)の作用により、T細胞およびB細胞へ提示される。抗原特異的な様式で抗原提示細胞により提示された抗原に対して応答するT細胞は、抗原による刺激により、キラーT細胞(細胞傷害性Tリンパ球またはCTLとも呼ばれる)へ分化し、その後増殖する。この過程は、本明細書では、T細胞の「活性化」と呼ばれる。特定のペプチドによるキラーT細胞の誘導は、ペプチドを負荷した抗原提示細胞により、ペプチドをT細胞へ提示させ、キラーT細胞の誘導を検出することにより評価することができる。さらに、抗原提示細胞は、CD4+ T細胞、CD8+T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果を有する。CD4+T細胞はまた抗腫瘍免疫において重要であるため、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。【００４１】
樹状細胞(DC)を抗原提示細胞として用いて誘導されたキラーT細胞の誘導作用を評価するための方法は、当技術分野において周知である。DCは、抗原提示細胞中で最も強いキラーT細胞誘導作用をもつ。この方法では、試験ペプチドを最初にDCに接触させ、その後、該DCをT細胞と接触させる。DCと接触させたT細胞について、標的細胞に対する細胞傷害性効果をもつT細胞を検出する。該T細胞が標的細胞に対して細胞傷害活性を示すことは、すなわち、試験ペプチドが細胞傷害性T細胞を誘導する活性を有することを示している。標的細胞、例えば腫瘍に対するキラーT細胞の活性は、例えば、51Cr標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。あるいは、3H-チミジン取り込み活性またはLDH(ラクトースデヒドロゲナーゼ)放出を指標として用いて腫瘍細胞損傷の程度を評価することができる。【００４２】
これらの方法によりキラーT細胞誘導活性を有することが確認された試験ペプチドは、DC活性効果およびその後のキラーT細胞誘導活性を有するペプチドである。それゆえに、腫瘍細胞に対してキラーT細胞を誘導するペプチドは、CDCA1を提示する癌に対するワクチンとして有用である。さらに、ペプチドと接触させることにより癌に対してキラーT細胞を誘導する能力を獲得した抗原提示細胞は、癌に対するワクチンとして有用である。さらに、抗原提示細胞によるペプチドの提示によって細胞傷害性を獲得したキラーT細胞もまた、CDCA1を提示する癌に対するワクチンとして利用できる。抗原提示細胞およびキラーT細胞による抗腫瘍免疫を利用する癌の治療方法は、細胞免疫療法と呼ばれる。【００４３】
一般的に、細胞免疫療法のためにペプチドを用いる場合、異なる構造をもつ複数のペプチドを組み合わせることにより、キラーT細胞誘導の効率を増加させることができる。それゆえに、蛋白質断片でDCを刺激する場合、複数種のペプチド断片の混合物を用いることが有利である。【００４４】
ペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導はさらに、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することにより評価することができる。例えば、ペプチドに対する抗体が、ペプチドで免疫された実験動物において誘導される場合、ならびに、腫瘍細胞の成長、増殖、および/または転移がそれらの抗体により抑制される場合、ペプチドは抗腫瘍免疫を誘導すると決定される。【００４５】
抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することにより誘導することができ、抗腫瘍免疫が誘導されることにより、癌の治療および/または予防を可能にする。癌に対する治療および/または癌の発症の予防の効果は、癌細胞の成長の阻害、癌細胞の退縮、および癌細胞の発生の抑制を含みうる。癌をもつ個体の死亡率の減少、血液中の癌マーカーの減少、癌に伴う検出可能な症状の軽減などもまた、癌の治療および/または予防による効果に含まれる。そのような治療的または予防的効果は、癌に対するワクチンの治療的および/または予防的効果がワクチン投与なしの対照と比較して、統計学的に有意であること、例えば5%またはそれ未満の有意レベルで観察されることが好ましい。統計学的な手法としては、例えば、スチューデントt検定、マン-ホイットニーU検定、またはANOVAが、統計学的有意性を決定するために用いられうる。【００４６】
本発明において、被検体は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物は、限定されるわけではないが、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシを含む。【００４７】
本発明のペプチドは、インビボまたはエクスビボで被検体に投与することができる。また、癌を治療および/または予防するための免疫原性組成物を製造するために、本発明の免疫原性ペプチド、すなわち配列番号：１または２のアミノ酸配列またはそれらの変異体ペプチドから選択されるノナペプチドを使用することができる。【００４８】
より具体的には、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として１種類以上含有する、腫瘍を治療するための、および/または腫瘍の増殖、転移などを予防するための薬剤を提供する。本発明のペプチドは、肺癌、胆管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、子宮頚癌、骨肉腫、乳癌、軟部肉腫、大腸癌のような腫瘍の治療において特に有用である。【００４９】
本発明のペプチドは、通常の製剤方法により製剤した薬剤として被検体へ直接投与することができる。そのような製剤は、本発明のペプチドに加えて、薬学的に許容される担体、賦形剤などを、必要に応じて含んでもよい。本発明の薬剤（免疫原性組成物）は、様々な腫瘍の治療および/または予防のために用いられうる。【００５０】
さらに、細胞性免疫を効果的に確立するために、1つまたは複数の本発明のペプチドを有効成分として１種類以上含有する腫瘍の治療および/または予防のための免疫原性組成物に、アジュバントを混合することができる。あるいは、該薬剤は抗腫瘍剤のような他の活性成分と共に投与されうる。適切な製剤には顆粒も含まれる。適切なアジュバントは、文献(Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89)に記載されている。例示的なアジュバントは、フロイントの不完全アジュバント、BCG、トレハロースダイマイコレート（TDM）、リポ多糖（LPS）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、およびミョウバンを含むが、これに限定されない。さらに、リポソーム製剤、薬物が直径数μmのビーズへ結合している顆粒製剤、および脂質が前記ペプチドに結合している製剤が、便利に用いられうる。投与の方法は、経口投与、皮内注射、皮下注射、静脈内注射などであってもよく、全身投与または標的腫瘍の付近への局所的投与を含みうる。【００５１】
本発明のペプチドの用量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、投与の方法などにより適切に調整することができる。用量は、普通、0.001mg〜1000mg、好ましくは0.01mg〜100mg、より好ましくは0.1mg〜10mgであり、好ましくは数日に1回から数ヶ月に1回投与されるが、当業者は適切な用量および投与の方法を容易に選択することができ、これらのパラメーターの選択および最適化は、十分に通常の技術の範囲内である。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾燥したものや、糖などの賦形剤を加えて顆粒にしたものでもよい。【００５２】
本発明の薬剤に添加することができるキラーＴ細胞誘導活性を高めるための補助剤としては、ムラミルジペプチド(MDP) ほかのBCG菌などの菌体成分、Nature, vol. 344, p873 (1990)に記載されるISCOM、J.Immunol. vol. 148, p1438(1992)に記載されるサポニン系のQS-21、リポソーム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。また、レンチナン、シゾフィラン、ピシバーニールなどの免疫賦活剤を補助剤として用いることもできる。また、IL-2、IL-4、IL-12、IL-1、IL-6、TNFなどのT細胞の増殖、分化を増強するサイトカイン等、ならびにNKT細胞を活性化するαガラクトシルセラミドやToll様レセプターに結合して自然免疫系を活性化するCpG、リポ多糖（LPS）なども補助剤として用いることができる。【００５３】
本発明のワクチン組成物は、キラーT細胞を初回抗原刺激する成分を含む。脂質は、生体内においてウイルス抗原に対して初回抗原刺激する物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のε-アミノ基およびα-アミノ基に結合し、その後、本発明の免疫原性ペプチドに連結することができる。脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子に注入する、リポソームに封入する、またはアジュバント中に乳化するかのいずれかで、直接投与することができる。脂質初回抗原刺激のもう一つの例として、適切なペプチドに共有結合的に結合している場合、トリパルミトイル-S-グリセリルシステイニルセリル-セリン(P3CSS)のような大腸菌(E. coli)リポ蛋白質により初回抗原刺激することができる(Deres K, et al., (1989) Nature 342:561-4)。【００５４】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターにより発現させることができる。適切な発現ベクターの例は、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒性ウイルス宿主を含む。例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして、ワクシニアウイルスを使用することができる。宿主細胞へ組換えワクシニアウイルスを導入することにより、免疫原性ペプチドを発現させ、それにより、免疫応答を誘発する。ワクシニアベクターを用いた免疫化方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。さらに、BCG(カルメット・ゲラン菌(Bacille Calmette Guerin))を用いることもできる。BCGベクターは、Stover CK, et al., (1991) Nature 31:456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用な幅広い種類の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌(Salmonella typhi)ベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなどが、当技術分野において公知である。例えば、Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806;およびHipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85を参照。【００５５】
また、患者から採取した細胞または、一部のHLA対立遺伝子を共有する他人の（アロ）細胞に試験管内で当該抗原ペプチドを加え、抗原提示させた後、患者の血管内や腫瘍局所などに投与し、患者体内で効果的にキラーＴ細胞を誘導することもできる。また、患者末梢血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培養することにより、試験管内でキラーＴ細胞を誘導した後に、患者血管内や腫瘍局所などに投与することもできる。このような細胞移入による治療は、既に癌治療法として実施されており、当業者間では、よく知られた方法である。【００５６】
本明細書における癌の種類は特に限定されず、具体例としては、肺癌、胆管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、子宮頚癌、骨肉腫、乳癌、軟部肉腫、大腸癌などが挙げられる。本発明を応用する際に適した癌の例としては、肺癌が例示できる。【００５７】
(３)本発明の抗体
本発明は、上記した本発明のペプチドの一部もしくは全部をエピトープ（抗原）として認識する抗体、ならびに当該蛋白質又はペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導されたキラーＴ細胞にも関する。一般的には、キラーＴ細胞は抗体よりも強い抗腫瘍活性を示す。【００５８】
また、本発明の抗体は、本発明のペプチドと同様に、癌抗原であるCDCA1の活性を阻害することができる限り、CDCA1を発現する癌の予防および/または治療剤として有用である。実際の使用法としては、本発明のペプチド又は抗体をそのまま、又は医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤とともに、必要に応じて補助剤も加えて、注射剤として投与することもできる。また、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与してもよい。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤としては、例えばPBS、蒸留水等を挙げることができる。【００５９】
本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、その作製は当業者に公知の方法により行なうことができる。【００６０】
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として哺乳動物又は鳥類を免疫感作し、該哺乳動物又は鳥類から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物又は鳥類を免疫することができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、抗原を、例えば７〜３０日間隔で２〜３回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５〜２ｍｇ程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができる。【００６１】
免疫感作した哺乳動物又は鳥類を一定期間飼育した後、抗体価が上昇してきたら、例えば１００μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物又は鳥類から血液を採取して、当該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。【００６２】
一方、モノクローナル抗体はハイブリドーマを調製して得ることができる。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマを得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。【００６３】
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、本発明のペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明のペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（G.Kohler et al.,Nature,256 495(1975)）により融合してハイブリドーマを作製することができる。【００６４】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用する。細胞融合により得られるハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。さらに必要に応じて、本発明のペプチドを用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行うことにより、本発明のペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。【００６５】
上記の方法に加えて、ＥＢウイルス感染リンパ球等のヒトリンパ球を、本発明のペプチド、ペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物を用いてインビトロで刺激することにより、免疫化細胞を調節することができる。この免疫化されたリンパ球をＵ２６６等のヒト由来の骨髄細胞と融合させることにより、本発明のペプチドに結合するヒト抗体を獲ることもできる（特開昭６３−１７６８８号）。【００６６】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。【００６７】
さらに、本発明のペプチド、ペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物を用いて、ヒト抗体遺伝子群を有するトランスジェニック動物を免疫化することもできる。免疫化されたトランスジェニック動物から抗体産生細胞を採取し、上記のミエローマ細胞株と融合させハイブリドーマを得て、該ハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造することもできる（WO92-03918、WO94-02602、WO94-25585、WO94-33735、WO96-34096）。【００６８】
または、免疫化リンパ球等の、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調整に用いることもできる。【００６９】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技術を用いて調節することもできる（Borrbaeck and Larrick, (1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies）。例えば、ハイブリドーマや免疫化リンパ球等の抗体産生細胞より抗体をコードするDNAをクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入することにより、組換え抗体を調整することができる。【００７０】
また、本発明の抗体は、本発明のペプチドに結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であっても良い。抗体断片としては、Fab、F(ab’)2、Fv、またはHおよびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Fv（scFv）であっても良い（Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83）。より具体的には、抗体をパパインやペプシン等の酵素で処理することにより、抗体断片を調整することができる（Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76、Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96、Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515、Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63、Rousseaux et al., (1986 Methods Enzymol 121:663-9、Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7）。【００７１】
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の様々な分子を結合させることで得られる、修飾抗体を含む。抗体の修飾は、当技術分野で慣例的な化学修飾方法により行うことができる。【００７２】
本発明の抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、または、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（CDR）とヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）およびヒト抗体由来の定常領域を含むヒト化抗体も含む。このような抗体は、当技術分野で慣例的な方法により調整することができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体のCDR配列領域を所望の結合活性を備えたげっ歯類のCDR領域と置換することにより得られる（Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6）。したがって、ヒト化抗体は、キメラ抗体と比較して、ヒト抗体のより狭い領域が非ヒト由来の対応する領域と置換された抗体である。【００７３】
ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域も有する完全ヒト抗体を作成することもできる。例えば、インビトロ法では、バクテリオファージ上にヒト抗体断片を提示させた組換えライブラリーを用いてスクリーニングを行うことができる（Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8）。同様に、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物に、ヒト免疫グロブリン座位を導入することによりヒト抗体を作成することもできる（米国特許第6,150,584号、第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号）。【００７４】
上記のようにして得られた抗体は、当技術分野で慣例的な方法により均一になるまで精製することができる。例えば、一般的な蛋白質の分離・精製方法を用いることができる。アフィニティークロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動等を組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができるが、これらの方法に限定されない（Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory）。アフィニティーカラムとして、プロテインAカラムおよびプロテインGカラムを使用することができる。プロテインAカラムとしては、例えば、ハイパーD、POROS、およびセファロースF.F（Pharmacia）が含まれる。【００７５】
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratry Course Manual. Ed Daniel R. et al.）。クロマトグラフィーは、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって行うこともできる。【００７６】
本発明の抗体の抗原結合性を測定するために、例えば、吸光度測定、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、酵素免疫アッセイ法（EIA）、放射免疫アッセイ法（RIA）、免疫蛍光検査法を用いても良いが、これらに限定されない。ELISAの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを添加し、次いで抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を含む試料を添加する。続いて抗原結合性を測定される抗体を認識し、検出可能な標識を有する二次抗体を添加する。プレートを洗浄後、二次抗体の標識を検出するための試薬を添加し、吸光度等を測定する。例えば、二次抗体の標識としてはアルカリフォスファターゼ等の酵素を用いることができ、検出するための試薬としてはｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を用いることができる。また、抗体の活性評価には、BIAcore（Pharmacia）を用いることもできる。【００７７】
本発明の抗体は、サンプル中に含まれる本発明のペプチドを検出することができる。すなわち、本発明の抗体を、例えば、癌組織生検に曝露することにより、癌組織中に本発明のペプチドが存在することを確認することが可能となる。【００７８】
本発明のペプチドを用いて癌の治療および／または予防のための治療を行うに先立ち、本発明の抗体を用いて治療対象の癌が本発明のペプチドを発現していることを確認することにより、治療開始以前にその効果が期待できる被検対象を予測することが可能となる。【００７９】
さらに、本発明の抗体は、種々の癌細胞で発現亢進しているCDCA1のペプチド断片を認識する抗体であるため、診断のみならず治療への応用も期待される。【００８０】
（４）ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団
本発明はまた、本発明のペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導されたヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団に関する。例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球を本発明のペプチドを用いて、インビトロで刺激すると腫瘍反応性活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。また本発明のペプチドを強力な抗原提示細胞である樹状細胞に負荷、あるいは遺伝子導入により発現させて、これらを用いてＴ細胞をインビボあるいはインビトロで刺激することにより、抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。【００８１】
好ましくは、本発明のペプチドと、免疫賦活剤とを用いたインビトロ刺激により、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を誘導することができる。ここで用いる免疫賦活剤としては、細胞増殖因子又はサイトカインなどが挙げられる。【００８２】
上記のようにして得られたヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を癌患者の血管内や腫瘍局所などに移入することにより、腫瘍を抑制することができ、癌を予防及び／又は治療することが可能である。【００８３】
また、本発明のペプチドを用いることにより、上記した通り腫瘍を抑制することができるヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。従って、本発明によれば、本発明のペプチドを含む細胞培養液が提供される。この細胞培養液を用いることにより、腫瘍を抑制することができるヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製することができる。さらに、本発明によれば、上記の細胞培養液、及び細胞培養容器を含む、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、又はこれらを含む免疫細胞集団を作製するための細胞培養キットも提供される。【００８４】
（５）抗原を提示するエキソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとHLA抗原の間で形成された複合体をその表面上に提示するエキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば、第平11-510507号および第2000-512161号の公開された日本語翻訳文に詳細に記載された方法を用いることにより調製することができ、好ましくは、治療および/または予防の標的である被検体から得られた抗原提示細胞を用いて調製される。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、癌ワクチンとして接種することができる。【００８５】
本発明において用いられるHLA抗原の型は、治療および/または予防を必要とする被検体のHLA抗原の型と一致しなければならない。例えば、HLA-A02が挙げられ、好ましくはHLA-A2 (HLA-A*0201)が挙げられる。なお、HLA-A2 (HLA-A*0201)において「HLA-A2」は蛋白質を意味し、「(HLA-A*0201)」は該蛋白質を細分化する遺伝子を指す（現時点では細分化された蛋白質を表現する記号がないため上記のように記載している）。【００８６】
（６）抗原提示細胞、キラーT細胞の誘導方法
本発明は、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いて抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。末梢血単球から誘導した樹状細胞に本発明の１つまたは複数のペプチドを接触させ、刺激することにより抗原提示細胞を誘導することができる。本発明のペプチドを被検体へ投与する場合、本発明のペプチドを細胞表面に提示している抗原提示細胞を、被検体の生体内において誘導することができる。あるいは、本発明のペプチドを抗原提示細胞へ負荷した後、該細胞をワクチンとして被検体に投与するエクスビボ法を用いることができる。例えば、エクスビボ投与は以下の工程を含みうる：
（１）  被検体から抗原提示細胞を収集する工程、および
（２）  工程（１）の抗原提示細胞と本発明のペプチドを接触させる（工程（１）の抗原提示細胞に本発明のペプチドを負荷する）工程。【００８７】
工程（２）により得られた抗原提示細胞は、被検体へワクチンとして投与することができる。【００８８】
本発明はまた、高レベルのキラーT細胞誘導活性を示す抗原提示細胞を誘導するための方法を提供する。該方法はインビトロで、本発明の1つまたは複数のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞へ導入する工程を含む。導入する遺伝子は、DNAまたはRNAでありうる。導入の方法は、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法のような、当分野において通常行われる様々な方法が適切に用いられうるが、これらに限定されない。より具体的には、トランスフェクションは、Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; ＷＯ９９／０８５２１に記載されているように行われうる。遺伝子を抗原提示細胞へ移入することにより、遺伝子は、細胞において転写、翻訳などを受け、その後、得られた蛋白質は、MHCクラスIまたはクラスII経路によりプロセシングされ、抗原提示経路を通って、部分的ペプチドとして抗原提示細胞表面に提示される。【００８９】
本発明はさらに、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いてキラーT細胞を誘導するための方法を提供する。本発明の1つまたは複数のペプチドを被検体に投与することにより、被検体の生体内においてキラーT細胞を誘導し、腫瘍組織におけるCDCA1を提示する癌細胞を標的とする免疫系を増強することができる。あるいは、本発明の1つまたは複数のペプチドを被検体由来の抗原提示細胞およびCD8陽性細胞とインビトロで接触させ、さらに末梢血単核白血球と抗原提示細胞をインビトロで接触させ、刺激することにより、活性化したキラーT細胞を誘導することができる。エクスビボ治療法においては、この活性化したキラーT細胞を被検体へ戻すことで、被検体における腫瘍組織中のCDCA1を提示する癌細胞を標的とする免疫系を増強することができる。例えば、方法は以下の工程を含みうる：
（１）被検体から抗原提示細胞を収集する工程、
（２）工程（１）の抗原提示細胞と本発明のペプチドを接触させる工程（工程（１）の抗原提示細胞に本発明のペプチドを負荷する工程）、
（３）細胞傷害性T細胞を誘導するために、段階（２）の抗原提示細胞をCD8+T細胞と混合し共培養する工程、および
（４）工程（３）の共培養物からCD8+T細胞を収集する工程。【００９０】
工程（４）により得られた細胞傷害活性をもつCD8+T細胞は、ワクチンとして被検体に投与することができる。【００９１】
本発明はさらに、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いて誘導される単離されたキラーT細胞を提供する。本発明の方法により誘導されるキラーT細胞は、好ましくは、治療および/または予防の標的である被検体由来である。本発明の1つもしくは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞またはエキソソームを含む他の薬剤と組み合わせて投与することができる。得られたキラーT細胞は、誘導に用いられたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的である。標的細胞は、CDCA1を内因的に発現させる細胞、またはCDCA1遺伝子がトランスフェクションされている細胞である。本発明のペプチドによる刺激により、本発明のペプチドを細胞表面上に提示する細胞、例えば、肺癌、胆管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、子宮頚癌、骨肉腫、乳癌、軟部肉腫、大腸癌等由来の癌細胞は攻撃の標的になりうる。【００９２】
（７）Ｔ細胞受容体 (TCR)
本発明はさらに、CDCA1-1ならびにCDCA1-4を認識するT細胞受容体（TCR）のサブユニットを形成するポリペプチドをコードする核酸ならびにその使用法を提供する。TCRは、少なくとも７つの膜貫通タンパク質よりなる。ジスルフィド結合で連結した（α、β）ヘテロ二量体がクロノタイプ抗原認識単位を形成し、一方、ε、γ、δおよびζ、η鎖よりなるCD3の非変異鎖は、シグナル伝達経路にリガンド結合を結び付け、その結果、Ｔ細胞活性化および細胞性免疫応答が生じる。このように抗原認識を担うαβサブユニットは、T細胞が特定の標的を認識するような特異性を獲得するために必要である。そこで、特異的に本発明のペプチドを認識するTCRを合成するために、本発明のペプチドを用いて誘導したCTL由来のTCRサブユニットであるαおよびβの核酸配列は、当業者に知られた方法を用いて同定することができる（WO2007/032255およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。同定したTCRサブユニットから形成されたTCRはCDCA1ペプチドを提示する標的細胞へ結合することができるため、殺細胞効果をもつ細胞へ導入することでその有用性を示すことができる。【００９３】
このため、このTCRサブユニットをコードする核酸は適切なベクター（例えばレトロウィルスベクター）へ組み込むこともできる。 このベクターは当業者に知られた方法で作成することができる。このTCRサブユニットを組み込まれたベクターはT細胞へ導入するために用いることができる。特に患者由来のT細胞を形質転換することで、CDCA1発現細胞を特異的に認識し、攻撃するT細胞（CTL）を得ることができる。このように得られたTCR導入CTLは一般的な方法により培養し、増殖させることができる（Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。以上の方法で得られたCTLは細胞免疫治療に用いることができる。【００９４】
本発明はまた、HLA抗原と本発明の1つまたは複数のペプチドとの間で形成された複合体を提示する抗原提示細胞を提供する。本発明の1つまたは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチドを接触させる抗原提示細胞は、好ましくは、治療および/または予防の対象である被検体より採取した抗原提示細胞である。本発明のペプチド、ペプチドを提示する抗原提示細胞、エキソソーム、もしくは活性型キラーT細胞は他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。【００９５】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９６】
［実施例１］
（１）HLA-A2に結合性を示すCDCA1ペプチドレパートリーの選択
ヒトCDCA1のアミノ酸配列をBIMAS system により検索して、推定されたHLA-A2との結合親和性(binding affinity) が高いものから順に41種類を選択した（表１）。【００９７】
【表１−１】
2009025117.tif 000002
【表１−２】
2009025117.tif 000003
本発明で同定されたHLA-A2拘束性キラーＴ細胞エピトープを下線で示す。【００９８】
[実施例２]
先に報告した方法を用いて（Komori Hら、Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006）、まずHLA-A2トランスジェニックマウスの骨髄細胞から樹状細胞（ＤＣ）を誘導した。このようにして得られたBM-DCに、CDCA1ペプチドを添加（10μM）し、HLA-A2トランスジェニックマウス一匹あたり5×105個のBM-DC を腹腔内に投与した。1週間の間隔をおいて2回同様に投与しマウスを免疫した後、マウスの脾細胞を回収してキラーT細胞の検出に用いた。CD8＋T細胞由来のキラーT細胞の誘導を厳密に検討するために、脾臓の採取後に脾細胞からMACS ビーズを用いてCD4+T細胞を取り除いたものを用いた。【００９９】
図１Ａは、HLA-A2トランスジェニックマウスにおいて、HLA-A2拘束性キラーT細胞が認識するCDCA1ペプチドの決定までのプロトコールを示す。（免疫されたマウスからの脾細胞回収日をDay0とする）
Day-21  (1)HLA-A2トランスジェニックマウスの骨髄細胞にGM-CSFを加え、骨髄由来の樹状細胞（以下BM-DC）の誘導を開始する。
Day-14 (2) 誘導したBM-DCに４種類のCDCA1ペプチドの混合物を添加し、2時間後に1匹あたり5×105  個を腹腔内に投与する。
(1)(2)を1週毎2回繰り返す。
Day 0 免疫したHLA-A2トランスジェニックマウスの脾細胞を回収し、再びBM-DCを CDCA1ペプチドと2時間インキュベートしたものと共培養した後に、6日間培養した。
Day 6 CDCA1ペプチドを特異的に認識するキラーT細胞を検出するために、抗原刺激後にガンマーインターフェロンを産生するT細胞を、ELISPOT法により定量した。ターゲット細胞としてBM-DCに、それぞれのCDCA1ペプチドを負荷したものと、負荷していないものを利用した。【０１００】
ELISPOT法によるCDCA1特異的キラーT細胞活性の検討
これらの誘導したキラーT細胞の中に、確かにCDCA1に特異的に反応してIFN-γを産生するものが存在するか否かについてELISPOT法にて検出した。IFN-γの検出は、Mouse IFN-γ ELISPOT set (BD社)を用いて行った。刺激細胞（ターゲット）に対して、キラーT細胞（エフェクター）が反応してIFN-γを産生すると、それぞれが赤いスポットとして検出される。標的細胞として、HLA-A2陽性でCDCA1を発現していないT2A2細胞と、CDCA1ペプチドを負荷したT2A2細胞を用いた。T2A2細胞はTAP遺伝子の発現を欠損するマウスT2細胞株に、HLA-A2遺伝子を導入した細胞株であり、理研細胞バンクより購入した。この細胞では、TAP欠損により外部から添加したペプチドがHLA-A2分子に結合する性質を持つ場合にのみ、HLA-A2分子とペプチドの複合体が細胞表面に発現する。まず、抗マウス IFN-γ抗体を、ELISPOTプレート(BD Bioscience社)に18時間コーティングした。その後、10％FCS/RPMIにて2時間ブロッキングを行った。エフェクター細胞(100μL /well)と標的細胞(100μL /well)を混合し、37℃で22時間培養した。エフェクター／ターゲット比（E/T比）は、5：1で実験を行なった。その後、プレートを滅菌水で洗浄し、ビオチン化抗マウスIFN-γ抗体と2時間、さらにストレプトアビジン-HRPと1時間反応させ、基質溶液にてIFN-γ陽性のスポットを検出した。スポットのカウントは、MINERVA TECH社の自動解析ソフトを用いて行った。ペプチドNo.1から20の結果を図１Ｂに示す。同様な実験により、４１のペプチドのうちCDCA1 65-73(No. 1) （配列番号：１）、CDCA1 351-359(No. 4) （配列番号：２）ペプチドで誘導したキラーT細胞において、CDCA1特異的キラーT細胞の免疫応答が観察された(図２)。
CDCA1 65-73(No. 1)（配列番号：１）ペプチドで誘導したキラーT細胞の解析結果を図２Ａに、CDCA1 351-359(No. 4)（配列番号：２）ペプチドで誘導したキラーT細胞の解析結果を図２Ｂに示す。【０１０１】
[実施例３]
患者、血液試料および細胞株
NSCLC患者由来の血液試料はインフォームドコンセントを得た後に日常診断より得られた。CDCA1陰性ヒト大腸癌細胞株COLO201は健康科学研究資源バンクから供与された。これらの試料におけるHLA-A2発現はHLA-A2モノクローナル抗体BB7.2（One Lambda Inc.、カノガパーク、カリフォルニア州）を用いてフローサイトメトリーにより確認された。【０１０２】
レンチウィルス遺伝子導入
レンチウィルスベクター経由遺伝子導入はTahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002;30:11-7.に記述された方法を用いた。簡潔には、17 μgのCDCA1 cDNA含有CSII-CMV-RfAとCSIIEF-RfA自己不活性ベクター(Miyoshi H, et al. J Virol 1998;72:8150-7.)と10 μg のpCMV-VSV-G-RSV-Rev およびpHIVgpを293T細胞にLipofectamine 2000(Invitrogen corporation, カリスバッド、カリフォルニア州、USA)を用いて10cmディッシュ上で形質転換させ、６０時間後、培養液を回収し、ウィルス粒子は超遠心(50,000 × g、2 時間)によりペレットにした。このペレットを50 μlのRPMI 1640溶液に懸濁し、10 μlのウィルス懸濁液を、5 × 104 個のCOLO201が入っているU底９６ウェルプレートの各ウェルへ加えた。形質転換されたCDCA1遺伝子の発現はウェスタンブロットで確認した。【０１０３】
CDCA1反応性ヒトCTLの誘導
単球由来DC細胞をHLA提示ペプチドに対し応答するCTL誘導のために抗原提示細胞として使用した。DCは以前報告されたin vitroの方法(Suda T, et al. Cancer Sci 2007., Nakahara S, et al. Cancer Res 2003;63:4112-8.)で得られた。簡潔には、HLA-A*0201陽性健常者ボランティアまたはNSCLC患者からフィコールプラーク溶液(GE Healthcare UK, Ltd.、バッキンガムシャー、イギリス)を用いて単離した抹消血単核球（PBMC）からマイクロビーズ(Miltenyi Biotec、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ)を用いてCD8陽性CD14陽性集団を選別した。DCを得るため、CD14陽性集団は2%自己血漿含有AIM-V (Invitrogen)中で、100 ng/mLの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）と10 ng/mL インターロイキン(IL)-4（PeproTec Inc.、ニュージャージー州、USA）の存在下において培養された。培養４日後、成熟DCを調製するため、OK-432をデッシュに加えた。サイトカイン誘導DCの培養開始５日後、20 μg/mLのHLA-A2結合性ペプチドをAIM-V中に4 μg/mLのβ2-microglobulin (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、USA)の存在下で３７℃、２時間の条件で負荷させた。これらペプチド負荷DCは放射線照射(3,500 cGy)され、１：５０の比で抗CD8マイクロビース(Miltenyi Biotec)を用いてPBMCから得られた自己CD8陽性T細胞と混合した。培養は４８ウェルプレートで行われ、各ウェルは0.5 mLの2%自己血漿含有AIM-V 中に1×104 個のペプチド負荷DC、 5 ×105個のCD8陽性T細胞および10 ng/mLのヒトIL-7 (Wako、大阪、日本)の条件で調整された。培養３日後、ヒトIL-2(PeproTec Inc.)を20 IU/mLの濃度に成るよう加えた。１２日目と１９日目にT細胞はさらにペプチド負荷自己DCで再刺激された。DCは適宜上記の方法で調製した。CTLの抗原特異性応答は、２５日目の３度目のペプチド刺激６日後にIFN-γ・ ELISPOT法とクロム（Cr）放出試験により評価された。【０１０４】
標的細胞に対するCTL応答
CTLは、標的細胞として各癌細胞株またはペプチド負荷もしくは非負荷T2細胞を各エフェクター細胞/標的細胞比で共培養し、51Cr放出試験およびIFN-γ・ELISPOT法を従来の方法(Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006;12:2689-97., Makita M, et al. Clin Cancer Res 2002;8:2626-31., Yokomine K, et al. Cancer Sci 2007;98:1930-5.)で行った。簡潔には、標的細胞を3.7 KBq Na2 51Cr4 (Perkin Elmer Life Sciences)を用いて３７℃、CO2インキュベーター内で１時間かけて標識した。標識した標的細胞を３度リンスし、３時間、３７℃で20 μg/mlのペプチドとインキュベートすることでペプチド負荷標的細胞を調製した。標的細胞は、平底マイクロタイタープレートに200 μlの用量に成るようエフェクター細胞と混合し、インキュベートされた。インキュベート６時間後、その上清50 μlを各ウェルから回収し、放射線活性をガンマカウンターで定量した。特異的細胞傷害活性は、既存の方法(Suda T, et al. Cancer Sci 2007;98:1803-8.)にて特異的な51Crの放出の割合で算出し評価された。ELISPOT法も既存の方法(Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006;12:2689-97.)にて行われた。【０１０５】
HLA-A2陽性健常者ドナー由来PBMCからのCDCA1応答性CTLの誘導
HLA-A2(A*0201)陽性健常者ドナーよりPBMCを単離し、CD8+ T細胞とCDCA1 65-73 (No. 1) （配列番号：１）ペプチドまたはCDCA1 351-359(No. ４) （配列番号：２）ペプチドを負荷した単球由来DCと共培養し、毎週3回CD8+ T細胞の刺激を行った（図３A）。 【０１０６】
癌患者または健常者ドナーより誘導したCTLを標的細胞と共培養し、CDCA1 65-73 (No. 1) （配列番号：１）ペプチドまたはCDCA1 351-359 (No. ４) （配列番号：２）ペプチドを負荷したT2細胞を標的としてELISPOT法および51Cr放出試験を行った。図３Bに示すように、癌患者ドナー１では、CDCA1 65-73 (No. 1) （配列番号：１）ペプチドを負荷したT2で刺激したCTLのIFN-γの産生が、負荷しないT2に比較して著しく多かった。健常者ドナー１から誘導されたCTLは、CDCA1 351-359 (No. ４) （配列番号：２）ペプチドを負荷したT2細胞に対して多量のIFN-γを産生した (1ウェルあたり300スポット以上)(図３C)。さらに、癌患者ドナー１および健常者ドナー１由来のCTLは、51Cr放出試験においてCDCA1 65-73 (No. 1) （配列番号：１）ペプチドまたはCDCA1 351-359 (No. ４) （配列番号：２）ペプチドを負荷したT2細胞に対する細胞傷害活性を示した（図３D）。図３Eに示すように、様々な濃度のCDCA1ペプチドを負荷したT2細胞でCTLを刺激すると、CTLは、用量依存的にCDCA1ペプチド負荷T2細胞に反応した。ペプチドを負荷しないT2細胞やHLA-A2結合性のHIV由来ペプチドを負荷したT2細胞に対する反応と比較し、CTLは0.2μg/ml以上の濃度のペプチドを負荷したT2細胞に反応して大量のIFN-γを産生することがわかった。上記の結果は、これらのCTLがペプチドに特異的な細胞傷害活性を持つことを示している。【０１０７】
CDCA1を導入したCOLO201(COLO201 / CDCA1, CDCA1+, HLA-A2+ ； 図４A）を標的細胞としてCTLのCDCA1特異的免疫反応を検討した。図４Bに示すように、CDCA1 65-73 (No. 1) （配列番号：１）ペプチドにより刺激された健常者ドナー由来のCTLは、CDCA1を発現しないCOLO201/空ベクター導入細胞に比較してCOLO201 / CDCA1に対してIFN-γを多量に産生した。CDCA1 351-359 (No. ４) （配列番号：２）ペプチドにより刺激された健常者ドナー２由来のCTLもまた、COLO201 / CDCA1に対して特異的免疫反応を示した（図４C）。さらに、このCTLはPANC1細胞（CDCA1+, HLA-A2+）に対して免疫反応を示し、A549細胞（CDCA1+, HLA-2-）に対しては示さなかった（図４D)。【０１０８】
CDCA1由来ペプチドの癌免疫療法への応用には、これらCDCA1ペプチド応答性CTLがCDCA1を内在的に発現する腫瘍細胞に対して特異的に細胞傷害性を示し得ることが最も重要と考えられる。図４Eに示すように、癌患者ドナー１においてCDCA1 65-73 (No. 1) （配列番号：１）ペプチドにより得られたCDCA1反応性CTLは、PANC1細胞(CDCA1+, HLA-A2+)に対して細胞傷害活性を示し、A549細胞(CDCA1+, HLA-2- )あるいはCOLO201細胞(CDCA1-, HLA-A2+)に対しては示さなかった。同様に、CDCA1 351-359 (No. ４) （配列番号：２）ペプチドにより刺激された健常者ドナー１由来のCTLもまた、PANC1細胞(CDCA1+, HLA-A2+)に対して細胞傷害活性を示し、A549細胞(CDCA1+, HLA-2- )に対しては示さなかった。これらの結果は、これらのペプチドが癌細胞において自然にプロセシングされ、HLA-A2と共に癌細胞表面に提示され、CTLに認識され得ることを示している。【０１０９】
HLA-A2拘束性CDCA1特異的CTLを検出するため、CDCA1351-359ペプチドを結合させたPEラベルHLA-A*0201テトラマーを、医学生物学研究所（Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.）（名古屋、日本）より購入した。図４Gに示すように、CD8陽性T細胞において、CDCA1351-359ペプチド反応性CTLとテトラマー陽性CTLの間に強い相関が見られた。この結果は、本研究で用いたCD8陽性T細胞において、HLA-A2拘束性CDCA1ペプチド特異的CTLが存在することを証明している。【０１１０】
考察
自然にプロセシングされ、腫瘍細胞に提示されるTAA誘導ペプチドの同定はペプチドに基づく癌免疫療法の確立に重要である。NSCLCと正常組織を用いたcDNAマイクロアレイ分析を用いて新規癌-精巣抗原であるCDCA1を同定した。CDCA1はNSCLCと正常精巣に強く発現しているが、調べた他の正常組織にはmRNAとタンパク質共に発現していない。精巣は免疫系から隔離された組織であることから、CDCA1応答性CTLはNSCLCのみ攻撃すると考えられる。このため、NSCLC患者の免疫療法におけるTAAとしてCDCA1が選択された。【０１１１】
免疫誘導治療の結果として引き起こされる癌細胞の免疫逃避としてTAAの欠損、変異または発現低下のリスクを最小限にすることができるため、免疫療法の標的としてNSCLCの増殖や生存に必須のTAAの同定が望まれていた(Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48.)。CDCA1の機能として紡錘体マイクロチューブと動原体の結合に働き、細胞周期の維持に重要な働きをすることが報告されている(DeLuca JG, et al. J Cell Biol 2002;159:549-55.)。さらに、CDCA1は、有糸分裂時の適切な染色体分離において重要な役割を果たし、種を越えて高く保存されている核分裂周期(NDC)複合体の構成要素である(DeLuca JG, et al. Curr Biol 2003;13:2103-9.)。CDCA1はHela細胞におけるセントロメアタンパク質E (CENP-E)の動原体局在に必須であり、siRNAによるCDCA1の発現抑制により有糸分裂遮断のため異常な染色体分離が起き、それに続き細胞死を引き起こす(Liu D, et al. J Biol Chem 2007;282:21415-24.)。この有糸分裂からの異常な逸脱はアポトーシスとカタストロフの特徴を有する(DeLuca JG, et al. J Cell Biol 2002;159:549-55.)。以上より、CDCA1は細胞機能にとって必須であり、癌細胞の増殖と生存において重要な役割を果たす。【０１１２】
さらに、CDCA1とkinetochore associated 2 (KNTC2)は進化において保存されたセントロメアタンパク質複合体の一員である(Hayama S, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48.)。その発現の上昇が免疫染色によりNSCLC患者の予後不良に関与している(Hayama S, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48.)。このため、NSCLC組織におけるCDCA1の発現レベルは外科的手術後の患者の予後予測のための有用なマーカーである。NSCLCの進行においてCDCA1の関与を示唆している。以上より、CDCA1を標的とした免疫療法は予後不良なNSCLCの患者に有効であると考えられる。【０１１３】
本発明において、HLA-A2トランスジェニックマウスによりHLA-A2拘束性マウスCTLの産生を促した２つのHLA-A2拘束性CDCA1エピトープペプチドを同定した。さらに、CDCA1応答性ヒトCTLがこれらのペプチドを刺激した健常者ドナーにおいてPBMCから調整することができた。これらのCDCA1ペプチド特異的なCTL株はHLA-A2制限様式でCDCA1を発現する癌細胞を殺傷した（図４）。【０１１４】
ＢＩＭＡＳソフトウェアによりHLA-A0201分子に高い結合親和性を有すると予測されたCDCA1由来ペプチドを選択したが、いくつかのアミノ酸配列はヒトとマウスCDCA1とで保存されていなかった。CDCA1 65-73 (No. 1) ペプチドにおいてヒトとマウスの間で２つのアミノ酸配列の相違 (ヒト：YMMPVNSEV / マウス：YMMPMNIEV)、CDCA1 351-359(No. ４)ペプチドにおいて１つの相違が見られた(human KLATAQFKI / mouse KLATARFKI)。しかし本発明では、健常者ドナーから上記エピトープペプチド応答性CTLを誘導することが確認できた。 【０１１５】
in vitroでCDCA1ペプチドを用いた健常者ドナーのPBMCの刺激によりCDCA1応答性CTLを誘導した。ペプチド提示DCにより誘導されたCTLは、HLA-A2拘束性にCDCA発現癌細胞に対して細胞傷害活性を示した。健常者ドナーからのCDCA1特異的CTLの誘導は更なるTAAの探求を続けるために意味がある。さらに、現在NSCLC、小細胞癌、胆管細胞癌、膀胱癌および腎細胞癌の患者から単離したPBMCによりCDCA1応答性CTLの誘導を試みている。ペプチドまたはタンパク質のワクチン(Rosenberg SA, et al. Nat Med 1998;4:321-7.)、ペプチド、タンパク質または腫瘍溶解物を負荷した樹状細胞での免疫(Kugler A, et al. Nat Med 2000;6:332-6.)およびex vivoでの腫瘍特異的CTL株による養子性移植などを含むいくつかの細胞媒介癌免疫療法のための方法がある(Falkenburg JH, et al. Blood 1999;94:1201-8.)。本発明により同定されたCDCA1ペプチドはこれらの免疫療法に応用できると考えられる。【０１１６】
本発明により同定された、HLA-A2を介してキラーＴ細胞に提示されるペプチドを用いて、探索医療で癌免疫療法の安全性と有効性を示せれば、欧米白人にも臨床応用できる可能性がある。また、日本人のみならず欧米白人でも陽性者の頻度が高いHLA-A2により、キラーＴ細胞に提示されるペプチドを同定することにより、日本人ならびに欧米白人の肺癌患者の30％に応用可能な、癌免疫療法薬が開発される可能性が高い。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
HLA-A2は、日本人集団では約30%のヒトが所有するHLAクラスI対立遺伝子である。本発明の対象となるCDCA1ペプチドは、当該ペプチドとHLA-A2分子の複合体を発現する癌細胞を破壊するヒト細胞傷害性T細胞を誘導できる。したがって、本発明が対象とするペプチドは、HLA-A2を所有する、肺癌、胆管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、子宮頚癌、骨肉腫、乳癌、軟部肉腫および大腸癌の患者の免疫療法に応用することが可能である。このため、これらの癌の増殖や進展を抑制するための治療剤の開発に有用である。
【図１】
2009025117.tif 000004
【図２】
2009025117.tif 000005
【図３】
2009025117.tif 000006
【図４】
2009025117.tif 000007
【配列表】
2009025117000001.app
【国際調査報告】
2009025117.tif 000008
2009025117.tif 000009
2009025117.tif 000010
2009025117.tif 000011
2009025117.tif 000012
2009025117.tif 000013
2009025117.tif 000014
2009025117.tif 000015