【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
[Gal(A)q(NAc)r /Glc(A)q(NAc)r α3/β3]s [Galβ4GlcNAcβ3]t Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、各々独立に０又は１の整数である。）
で表され、式中のｔおよびｕが共に０である場合には、多価の担体に結合しているかまたは高濃度の遊離オリゴ糖として存在することを特徴とするオリゴ糖配列あるいはヘリコバクター ピロリに対する結合能を有する該オリゴ糖配列の類似体または誘導体を包含する結合性物質を、ヘリコバクター ピロリに対する結合能または阻害能を有する組成物の製造に用いる方法。
【請求項２】
該結合性物質が、下記式のいずれかで表されるオリゴ糖配列であって、該オリゴ糖配列のGlcNAcβ3末端のＣ４位がGalβ1-または他のオリゴ糖鎖にグリコシド結合しているオリゴ糖配列を包含することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc   そして 
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc 。
【請求項３】
該結合性物質が、下記式で表されるオリゴ糖鎖および該オリゴ糖鎖の還元末端含有多価結合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
Galβ4GlcNAc,
GalNAcα3Galβ4GlcNAc, GalNAcβ3Galβ4GlcNAc, GlcNAcα3Galβ4GlcNAc,
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc, Galβ3Galβ4GlcNAc, Glcα3Galβ4GlcNAc, 
Glcβ3Galβ4GlcNAc,
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc, Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc,
GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc, GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc,
GlcNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc, GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc,
Galβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc, Glcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc, 
Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc,
GalANAcβ3Galβ4GlcNAc, GalANAcα3Galβ4GlcNAc,GalAβ3Galβ4GlcNAc, 
GalAα3Galβ4GlcNAc, GalANAcβ3Galβ4Glc, GalANAcα3Galβ4Glc, 
GalAβ3Galβ4Glc, GalAα3Galβ4Glc,
GlcANAcβ3Galβ4GlcNAc, GlcANAcα3Galβ4GlcNAc,GlcAβ3Galβ4GlcNAc, 
GlcAα3Galβ4GlcNAc, GlcANAcβ3Galβ4Glc, GlcANAcα3Galβ4Glc,
GlcAβ3Galβ4Glc, GlcAα3Galβ4Glc, 
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc, 
GalNAcα3Galβ4Glc, GalNAcβ3Galβ4Glc, GlcNAcα3Galβ4Glc, 
GlcNAcβ3Galβ4Glc, Galβ3Galβ4Glc, 
Glcα3Galβ4Glc, そして Glcβ3Galβ4Glc    。  
【請求項４】
該結合性物質が、下記（１）〜（３）のいずれかであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 
（１）多糖、ポリラクトサミン鎖またはその結合体に結合している物質、 
（２）糖脂質、少なくとも２種のオリゴ糖鎖を含有するオリゴマー分子、またはミセル状物質、および 
（３）ヘリコバクター ピロリに対して有効な抗生物質に共有結合している物質。  
【請求項５】
該結合性物質が担体に結合してなる構造体を用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該構造体が、下記式で表される構造体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
［ＯＳ−Ｏ−(Ｘ)n−Ｙ］m−Ｚ
（式中、ｍは１以上の整数であり、ｎは０または１であり；
ＯＳはオリゴ糖配列であり; 
Ｏは酸素原子であり；
Ｘは、ラクトシル残基、ガラクトシル残基、ポリ−Ｎ−アセチル−ラクトサミニル残基、並びにＯ−グリカンオリゴ糖配列またはＮ−グリカンオリゴ糖配列の一部からなる群より選ばれる単糖残基またはオリゴ糖残基であり；
Ｙはスペーサー、セラミド脂質成分などの末端結合基、該Ｏまたは該ＸとＺの間の結合、親水性スペーサーおよび可動性親水性スペーサーからなる群より選ばれる１種であり; 
Ｚはオリゴ価または多価の担体であり；
該ＯＳのGlc還元末端またはGlcNAc還元末端は、該末端のＣ１位の酸素原子によって、該Ｙまたは該Ｘを介して該Ｚに結合しており; 
但し、ｍが１を超える整数である場合には、該Ｙは下記式で表されるスペーサーでもよい。 
L1-CH(H/{CH1-2OH}p1)-{CH1OH}p2-{CH(NH-R)}p3-{CH1OH}p4-L2  
（式中、 
Ｌ1およびＬ2は結合基であって、各々独立に酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子である結合原子あるいは置換基を形成する結合に含まれる２つの原子を包含し、該置換基を形成する結合は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−、−Ｎ−、−Ｎ（ＣＯＣＨ3）−、 
−ＣＯ−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＯ−で表されるアミド基、−Ｎ−Ｎ−（ヒドラジン誘導体）、あるいは−Ｏ−Ｎまたは−Ｎ−Ｏで表されるアミノオキシ結合であり； 
Ｌ1は該Ｘである単糖の還元末端のＣ１位に結合した結合基であり、ｎが０の場合には、Ｌ1は該Ｘの−Ｏ−を置換して、該ＯＳの還元末端のＣ１位に直接結合しており； 
ｐ１、ｐ２、ｐ３およびｐ４は各々独立に０〜７の整数であるが、ｐ１、ｐ２、ｐ３およびｐ４の少なくとも１つが１であり； 
｛ＣＨ1-2ＯＨ｝p1が分岐構造を表す場合には、末端基となるＣＨ1-2ＯＨはＣＨ2ＯＨであり、ｐ１が１を超える場合には、該末端基をスペーサーである該Ｙの残りの部分に結合させるための第二級アルコール基である−ＣＨＯＨ−が存在し； 
Ｒはアセチル基（−ＣＯＣＨ3）、Ｚに連結する結合またはＣ1-4アシル基を包含する類似体形成基であり、Ｒが結合である場合にはＬ2は糖鎖末端基の１つまたは２つの原子であり、該Ｃ1-4アシル基はアミド構造、水素原子またはＣ1-4アルキル基を形成するアミンである。）
【請求項７】
該ヘリコバクター ピロリに対する結合能または阻害能を有する組成物が、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態の治療または予防のための医薬組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該医薬組成物が、慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腺癌、ヒトの胃における非ホジキン悪性リンパ腫、肝臓病、膵臓病、皮膚病、心臓病または自己免疫性胃炎、悪性貧血および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）関連胃疾患を含む自己免疫疾患の治療用、あるいは乳幼児突然死症候群の予防用であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該ヘリコバクター ピロリに対する結合能または阻害能を有する組成物が、ヘリコバクター ピロリの感染によって生じる病態の診断用、ヘリコバクター ピロリの型の同定用またはヘリコバクター ピロリ結合アッセイ用であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該ヘリコバクター ピロリに対する結合能または阻害能を有する組成物が、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態の治療または予防のための栄養補助剤、栄養補助組成物または乳児用ミルクであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該ヘリコバクター ピロリに対する結合能または阻害能を有する組成物が、バクテリア性付着因子の同定用、またはヘリコバクター ピロリに対するワクチンの製造用であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該オリゴ糖配列がβ１−６結合によってGalNAc、GlcNAc、GalまたはGlcに結合していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
下記式で表されるオリゴ糖配列を非還元末端として包含するヘリコバクター ピロリ結合性物質およびヘリコバクター ピロリに対する結合能を有する該結合性物質の類似体または誘導体。
Gal(A)q(NAc)r /Glc(A)q(NAc)r α3/β3Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、ｑ、ｒおよびｕは各々独立に０または１であるが、該オリゴ糖配列は
Galα3Gal4βGlc/GlcNAcではない。）
【請求項１４】
下記式で表されるいずれかのオリゴ糖配列、あるいはヘリコバクター ピロリに対する結合能を有する該オリゴ糖配列の類似体または誘導体を包含することを特徴とする、請求項１３に記載の結合性物質。
Glc(A)q(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、ｑ、ｒおよびｕは各々独立に０又は１の整数であり、
但しβ３結合が含まれる場合には、ｑとｒは共に０または１である。）そして
GalA(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、ｒおよびｕは各々独立に０又は１の整数である。）
【請求項１５】
該オリゴ糖配列がβ１−６結合によってGalNAc、GlcNAc、GalまたはGlcに結合していることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の結合性物質。
【請求項１６】
バクテリア、毒素またはウイルスの結合用である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の結合性物質。
【請求項１７】
薬剤用である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の結合性物質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ヘリコバクター ピロリに対する新規受容体およびその用途
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター ピロリに結合する物質またはレセプターおよびその用途、例えば、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態を治療するための医薬組成物または栄養補助組成物、を開示する。更に本発明は、上記レセプターを用いたヘリコバクター ピロリの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター ピロリは、慢性胃炎、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）関連胃疾患、胃や十二指腸の潰瘍、胃ＭＡＬＴ悪性リンパ腫および胃腺癌を含む、様々な消化器系の疾患との関連が知られている（Axon, 1993; Blaser, 1992; DeCross と Marshall, 1993; Dooley, 1993; Dunn et al., 1997; Lin et al., 1993; Nomura と Stemmermann, 1993; Parsonnet et al. 1994; Sung et al., 2000; Wotherspoon et al., 1993）。全体的にまたは部分的に胃腸疾患ではない疾患としては、乳幼児突然死症候群（Kerr et al., 2000 および米国特許第6,083,756号）、自己免疫性胃炎や悪性貧血などの自己免疫疾患（Appelmelk et al., 1998; Chmiela et al, 1998; Clayes et al., 1998; Jassel et al., 1999; Steininger et al., 1998）、ある種の皮膚病（Rebora et al., 1995）、膵臓病（Correa et al., 1990）、腺癌を含む肝臓病（Nilsson et al., 2000; Avenaud et al., 2000）およびじゅく状硬化症などの心臓病（Farsak et al., 2000）が挙げられる。ヘリコバクター ピロリが原因であるかまたは関連する様々な疾患について検討されている（Pakodi et al., 2000）。バクテリアのコロニー形成および感染において最も興味深い事柄は、バクテリアが胃粘膜の上皮細胞表面に付着するメカニズムである。  
【０００３】
糖脂質および糖タンパクを含む糖結合体、例えば、シアリル化糖結合体（Evans et al., 1988）、サルファチドおよびＧＭ３（Saitoh et al., 1991）、Ｌｅb決定基（Boren et al., 1993）、ポリグリコシルセラミド類（Miller-Podraza et al., 1996; 1997a）、ラクトシルセラミド（Angstrom et al., 1998）およびガングリオテトラオシルセラミド（Lingwood et al., 1992; Angstrom et al., 1998）などは、上記微生物を結合するレセプターとして機能することが報告されている。ヘリコバクター ピロリに対するその他の潜在的なレセプターには、多糖硫酸へパリン（Ascensio et al.., 1993）のみならず、リン脂質ホスファチジルエタノールアミン（Lingwood et al., 1992）も含まれる。
【０００４】
Zopfらの米国特許第5,883,079号（1999年3月）、第5,753,630号（1998年5月）および第5,514,660号（1996年5月）には、ヘリコバクター ピロリの結合を阻害する物質としてNeu5Acα3Gal-を含有する化合物が記載されている。シアリル−ラクトース分子はヒト胃腸器系細胞株に対するヘリコバクター ピロリの結合を阻害し（Simon et al., 1999）、アカゲザルの感染モデルにおいても効果を示した（Mysore et al., 2000）。この化合物は臨床試験中である。
【０００５】
Krivanらの米国特許第5,446,681号（1995年11月）は、バクテリアのレセプターと抗生物質の結合体であって、アシアロガングリオシドがペニシリン系抗生物質に結合したものを開示している。特にこの特許では、アモキシシリン−アシアロ−ＧＭ１結合体によるヘリコバクター ピロリの治療を請求している。この発明で開示されるオリゴ糖配列／糖脂質はガングリオ系列の糖脂質には属していない。
【０００６】
Krivanらの米国特許第5,386,027号（1995年1月）および第5,217,715号（1993年6月）は、オリゴ糖配列または糖脂質を病原性バクテリアの阻害に用いることを開示しているが、本願の結合特異性に関する記載はなく、ヘリコバクター ピロリは検討したバクテリアにも請求の範囲にも含まれていない。
【０００７】
糖配列GlcNAcβ3Galはストレプトコッカスのレセプターとして報告されている（Andersson et al., 1986）。複数のバクテリアが重複する結合特異性を示すことが考えられるが、たとえ関連性の非常に高いバクテリア性付着因子であっても、その結合性を予測することは不可能である。ヘリコバクター ピロリの場合、ルイスｂ結合タンパク以外に糖結合分子は知られていない。
【０００８】
発明の概要 
本発明は、下記式：
[Gal(A)q(NAc)r /Glc(A)q(NAc)r α3/β3]s [Galβ4GlcNAcβ3]t Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、各々独立に０又は１の整数である。）
で表され、式中のｔおよびｕが共に０である場合には、多価の担体に結合しているかまたは高濃度の遊離オリゴ糖として存在することを特徴とするオリゴ糖配列あるいはヘリコバクター ピロリに対する結合能を有する該オリゴ糖配列の類似体または誘導体を包含する結合性物質を、ヘリコバクター ピロリに対する結合能または阻害能を有する組成物の製造に用いる方法に関する。
【０００９】
本発明の目的は、本願に記載したヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列を用いた薬剤および上記オリゴ糖配列を用いた医薬組成物、特にヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態を治療するための薬剤、の製造方法を提供することである。
【００１０】
更に本発明は、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる病態の治療方法に関する。また本発明は、本発明に記載のレセプターをヘリコバクター ピロリ結合性物質または阻害性物質として用いるヘリコバクター ピロリの診断剤に関する。
【００１１】
本発明の他の目的は、ヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列を含有する結合性物質、医薬組成物および栄養補助剤または栄養補助組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる他の目的は、上記ヘリコバクター ピロリ結合性物質を用いたバクテリア付着因子の同定方法、ヘリコバクター ピロリの型の同定方法およびヘリコバクター ピロリ結合アッセイを提供することである。
【００１３】
本発明の更なる他の目的は、上記ヘリコバクター ピロリ結合性物質をヘリコバクター ピロリに対するワクチンの製造に用いる方法を提供することである。
【００１４】
発明の詳細の説明 
本発明は、ヘリコバクター ピロリに結合する特定のオリゴ糖鎖からなるファミリーを開示する。種々の天然に存在するグリコスフィンゴ脂質を薄層オーバーレイアッセイでスクリーニングした。使用したグリコスフィンゴ脂質の構造はプロトンＮＭＲおよび質量分析実験で特徴付けた。ヘリコバクター ピロリに結合する物質の三次元構造を比較するために、分子モデリングを用いた。
【００１５】
４種の五糖からなる糖脂質を比較することで、新規な結合特異性を明示した。GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerの非還元末端の糖をGalNAcβ3（略称はｘ2ＧＳＬである）、GalNAcα3またはGalα3（Ｂ５）に置換すると、アノマー性、アセトアミド基の有無および末端糖の４−ＯＨ基の軸配座／赤道配座の違いがあるものの、いずれもヘリコバクター ピロリに対して結合性を示した。特異的結合を示すものには、ヘリコバクター ピロリに対して弱い結合性を示す、短いGalβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、および末端Ｎ−アセチルグルコサミンを有するβ４伸長型糖脂質であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer と NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerも含まれる。一方、公知のシアリル酸依存性の特異性（Evans et al., 1988; Miller-Podraza et al., 1996; 1997a）と比べ、上記した最後のグリコスフィンゴ脂質のＮ−グリコリルノイラミン酸を放出させても、ヘリコバクター ピロリに対する結合性に影響することない。
【００１６】
ヘリコバクター ピロリの一般的な糖結合性はバクテリアの相変異の影響を受けるものの、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerに対する結合は非常に再現性が高く、高親和性の結合が低ピコモルの糖脂質を用いたオーバーレイアッセイでも視覚化された。
【００１７】
結合エピトープの長さは、GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、Galβ4GlcNβ3Galβ4GlcβCer および Galα3Galβ4GlcNβ3Galβ4GlcβCer（活性種を短縮したものと脱Ｎ−アセチル化したもの）がヘリコバクター ピロリに結合しないことを示す実験結果より明らかとなった。このデータは、内部GlcNAc残基が結合に関与するものの、それだけでは十分に強い結合は形成しないことを示した。結合エピトープは、上述の五糖からなるエピトープの末端三糖であると考えられる。これら糖残基の２つしか存在しないGalβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerなどでは結合は弱く、六糖の糖脂質であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerにおいては、末端のGalβ4は結合を阻害し、弱い結合活性を説明した。活性の低い六糖の糖脂質構造にGalα3を付加した七糖の糖脂質であるGalα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerはより高い活性を示し、末端三糖からなるエピトープが優れた結合活性に必要であることを示した。
【００１８】
結合特異性の特徴付けは、活性種の異性体およびの修飾体の分析によって行った。Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerの末端Galに次の修飾を受けた伸長型は、ヘリコバクター ピロリに対する結合アッセイで不活性であった：Fucα2（略称はＨ５−２)、Fucα2とGal/GalNAcα3（Ｂ６−２とＡ６−２）、Neu5Acα3またはNeu5Acα6（シアリルパラグロボシド類）、およびGalα4（Ｐ1）。結合能は、Galβ4GlcNAcβ3(Galβ4GlcNAcβ6)Galβ4GlcβCerで示されるようなβ６−結合した内部ガラクトース分岐鎖の存在によっても破壊された。分岐鎖はGalβ4GlcNAcβ3エピトープの提示に変化をもたらし、二糖の結合部位に立体障害を起こしていると考えられる（Teneberg et al., 1994）。（しかし、結果は、二糖または三糖からなる結合エピトープがβ３結合によって結合している内部ガラクトース残基も結合に関与している可能性を示した。）更に、Neu5Acα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（結合活性種であるｘ2−グリコスフィンゴ脂質の伸長型）またはGalNAcβ3Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（Ｂ５ ＧＳＬの伸長型）はヘリコバクター ピロリに対する結合を示さなかった。
【００１９】
結合活性種と結合不活性種を比較するために分子モデリングを用いた。４種の五糖グリコスフィンゴ脂質（Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerをGlcNAcβ3をGalNAcβ3、GalNAcα3またはGalα3で伸長したもの）について予測した最小エネルギー配座異性体は、これらの化合物がお互いの立体配置を非常に細かく模倣していることを示した。不活性な糖脂質の立体配置は異なっていた。末端糖のアノマー結合が異なる（２つはα結合で２つはβ結合である）にもかかわらず、分子モデリングは最小エネルギー配座に類似点が存在することを示した。末端構造の違いは、Galα3が他の３種に存在するアセトアミド基を有していないこと、GalおよびGalNAcの４−ＯＨ基は軸配座にありGlcNAcが赤道配座にあること、ならびに末端α３−結合化合物の環の形成する平面構造がβ３−結合した対応化合物の平面構造よりも少し上に位置することである。GlcNAcの４位で末端は伸長することが可能であり、これはGalβ4伸長が立体障害を生じるにもかかわらず、４−ＯＨは結合にあまり重要ではないことを示した。これらをまとめると、４種の五糖からなる糖脂質が全て同様の親和性をヘリコバクター ピロリ付着因子に対して示したので、４−ＯＨの位置、アセトアミド基の有無および末端単糖残基のアノマー構造のいずれもが結合が生じるためには重要ではない。
【００２０】
上述の結合の法則に鑑みて、結合性物質に見られる他の４種の末端単糖も以下の三糖からなる結合エピトープを提供すると考えられる：Galβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcα3Galβ4GlcNAc、Glcβ3Galβ4GlcNAc および Glcα3Galβ4GlcNAc。これらは検討した配列と類似しており、アノマー構造、４−エピマー構造またはＣ２ ＮＡｃ／ＯＨ構造の違いがあるだけである。１つ目の物質はヒト赤血球の糖脂質に提示されているものであり、残りの３つの物質は今のところヒト組織では見出されておらず、天然のレセプターの類似体であると考えられる。
【００２１】
結合エピトープは五糖からなる活性糖脂質の末端三糖因子を包含することが明らかとなり、少なくとも大きな繰り返しＮ−アセチルラクトサミンにおいては、エピトープは糖鎖の中心にも存在することがある。本発明者らは、結合エピトープは天然または生合成した糖結合体やオリゴ糖（例えば、糖タンパクのＯ−結合またはＮ−結合したグリカン類）やポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖類に様々な形で提示されることが可能であることを明示した。化学合成法および酵素合成法、特に炭水化物の分野においては、無限に近い数の誘導体や類似体を製造することができる。結合エピトープの大きさは変えることが可能であり、末端単糖のＣ１位，Ｃ２位およびＣ４位について例示したように、非還元末端単糖の欠失やGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcの末端GlcNAcのＣ４位から伸長する（例えば、GlcNAcβ3のＣ４位をグリコシル結合を介してオリゴ糖鎖に結合する）こともできる。オリゴ糖鎖がGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcである場合には、末端GlcNAcβ3のＣ４位はグリコシド結合を介してGalβ１−またはオリゴ糖鎖に結合することができる。特に、三糖からなるエピトープの非還元末端単糖残基のＣ２位とＣ４位およびエピトープの還元末端は、ヘリコバクター ピロリ結合能を有する誘導体やオリゴ価または多価の結合体の製造に用いることができる。単糖残基のＣ６位も誘導体や類似体の製造に用いることができ、特に三糖配列の非還元末端残基および二糖または三糖の結合性物質の還元末端残基のＣ６位が好ましい。
【００２２】
本発明において、「類似体」および「誘導体」は次のように定義される。本発明によると、ヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列の構造類似体や誘導体を設計することができる。従って、本発明は、本発明の結合性物質の構造類似体にも関する。本発明における構造類似体は、ヘリコバクター ピロリのオリゴ糖配列に対する結合に重要な構造因子を包含する。効果的な構造類似体を設計するには、ヘリコバクター ピロリと糖類との結合に重要な構造因子を知ることが重要である。重要な構造因子は修飾されていないか、重要な構造因子を模倣するように修飾されていることが好ましい。これらの因子には、好ましくは三糖または二糖からなるエピトープのGalβ４残基の４−または６−ヒドロキシル基が含まれる。また、環構造の間の結合の位置も重要な構造因子である。高親和性結合には、三糖または二糖からなるエピトープの還元末端GlcNAcのアセトアミド基の位置に対応する位置にアセトアミド基またはアセトアミド模倣基であることが好ましい。アセトアミド模倣基は他のアミド基、例えば、アルキルアミド、アリールアミドおよび第２級アミンであり、好ましくはＮ−エチルまたはＮ−メチル、Ｏ−アセチルまたはＯ−アルキル（Ｏ−エチルやＯ−メチルなど）である。高親和性結合には、末端ウロン酸のカルボキシル基のアミド誘導体やその類似体が好ましい。未修飾のウロン酸の活性は低いｐＨで上昇すると考えられている。
【００２３】
本発明における構造誘導体は、ヘリコバクター ピロリに対する結合能を保持するか向上するように本発明のオリゴ糖鎖を化学的に修飾したものである。本発明によると、オリゴ糖鎖のヒドロキシル基またはアセトアミド基の１つまたは複数を誘導化することが好ましい。本発明は、類似体や誘導体を調製する際に変えることのできる分子上の位置を複数開示する。少なくともいくつかの修飾が可能なヒドロキシル基またはアセトアミド基を化１中のＲ基として示した。
【００２４】
大きな置換基または酸性の置換基、あるいは単糖残基のような構造体は、少なくともGalβ4GlcNAcのＣ２，Ｃ３またはＣ６位のヒドロキシル基や三糖エピトープの非還元末端Ｃ３位ヒドロキシル基に結合している場合には許容されない。レクチン結合性のオリゴ糖類似体を製造する方法はよく知られている。例えば、シアリル化ルイスｘオリゴ糖の類似体は複数製造されており、これらは異なる骨格の活性官能基である（SearsとWong 1996、１２０９０ページを参照）。同様に、へパリンオリゴ糖の類似体もサノフィ社によって製造されており、シアリダーゼに対するシアリル酸模倣阻害剤、例えばZanamivirやTamiflu（Relenza製）、が複数のグループによって製造されている。オリゴ糖類似体は少なくとも１つの六員環または五員環構造に基づいて構築されていることが好ましく、類似体は６個または５個の原子を包含する少なくとも２つの環構造を含有することがより好ましい。オリゴ糖の好ましい類似体は末端ウロン酸アミドを包含するか、または類似体がGalβ4GlcNAc−糖模倣構造に結合している。また、末端ウロン酸アミドがGalに１−３結合しており、更にGlcNAc模倣構造に結合しているものも好ましい。模倣構造においては、単糖環はシクロヘキサンやシクロペンタンなどの環状分子、ベンゼン環を含む芳香族環によって置換されていてもよく、そのようなヘテロ環構造は酸素原子の他に、例えば窒素原子や硫黄原子を包含してもよい。活性環状立体構造を固めるためには、環状構造が許容できる結合基で繋ぐこともできる。典型的な模倣構造は、オリゴ糖配列またはその一部に対するペプチド類似体構造を更に包含してもよい。
【００２５】
活性基が結合活性に与える影響は累積するので、１つの活性基が失われても、分子の異なる場所に活性残基を付加することで補うことができる。分子モデリング、好ましくはコンピューターを用いた分子モデリングを本発明のヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列の類似体構造を製造するのに用いることができる。種々のオリゴ糖配列の分子モデリングの結果が実施例に示されており、ＮＭＲとＸ線結晶回折を除く方法と同じまたは類似した方法を用いて本発明のオリゴ糖配列に対する類似体を得ることができる。類似体を見つけるためには、オリゴ糖をヘリコバクター ピロリの炭水化物結合分子、最も可能性が高いのは上記バクテリアのレクチン、と合体させ、考えられる更なる結合相互作用を探索することができる。
【００２６】
コンビナトリアルケミストリーによって誘導体を調製することで、レクチンに対して高い活性を示すように１価、オリゴ価または多価のオリゴ糖を活性化することもできる。オリゴ糖配列の１つまたは複数の残基を置換することでライブラリーを構築した場合には、それは誘導体ライブラリーと考えることができ、また、本発明のオリゴ糖配列の類似体からライブラリーを構築することもできる。コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーは本発明のオリゴ糖、その前駆体または糖結合体に基づいて構築することができる。たとえば、種々の還元末端を有するオリゴ糖をカーボハイドリッド技術（carbohydrid technology）と呼ばれる技法によって製造することができる。
【００２７】
本発明の好ましい態様においては、コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーは、本発明で開示するヘリコバクター ピロリ結合性物質に結合されている。より好ましい態様においては、ライブラリーは少なくとも６種の異なる分子を包含する。コンビナトリアルケミストリーによる修飾は、化１のＲ8位であるカルボキシル基を種々のアミド基に変化させることで得られるものが好ましい。Ｒ8位で修飾される置換基は、アルデヒド、アミンまたはその他の活性基でもよい。このようなライブラリーは、本発明のオリゴ糖配列に対する微生物性の結合を検出するために用いるのが好ましい。アミノ酸または有機アミド類のコレクションは市販されており、このような物質はウロン酸アミドのコンビナトリアルケミストリーによるライブラリーを合成するために用いることができる。コンビナトリアルケミストリーによるライブラリーから高親和性のバインダーを同定することができ、例えば、ライブラリー中の化合物を用いてバクテリアによる本発明の糖脂質または糖結合体に対する結合を阻害する物質を同定する阻害アッセイを行うことができる。本発明おいて好ましい構造類似体や誘導体は、本発明のヘリコバクター ピロリ結合性のオリゴ糖配列がヘリコバクター ピロリに結合するのを阻害することができる。
【００２８】
現行のＴＬＣアッセイでは、脂質部分または近接したシリカ表面による立体障害はエピトープGlcNAcβ3Galβ4Glcの定量を制限しているものと考えられる。アッセイ系におけるこの配列の活性を用いても、本願明細書においてヘリコバクター ピロリのについて記載した４種の三糖からなるエピトープを特異的に認識するClostridium difficileのトキシンＡを用いた近年の研究（Teneberg et al., 1996）と同様の結果は得られなかった。しかし、Galα3Galβ4GlcのトキシンＡに対する結合は、大きなポリマー様スペーサーによって修飾した糖結合体を用いた他の研究グループによって発表されている（Castagliuolo et al., 1996）。更に、末端単糖が結合に寄与することを考慮すると、エピトープの還元末端にGlcが存在することは可能であり、非活性である脱Ｎ−アセチル型においては、ヒドロキシル基の存在よりも、遊離アミンの陽性電荷の方が結合にとって破壊的であると考えられる。Glcが還元末端に存在する三糖からなるエピトープは、オリゴ価、より好ましくは多価の形で存在する場合に、ヘリコバクター ピロリ結合性物質の有効な類似体であると考えられる。本発明の１つの態様はGlc還元末端を有する糖であり、高濃度、好ましくは１〜１００ｇ／ｌ、より好ましくは１〜２０ｇ／ｌ、の遊離還元糖として用いるものである。このような糖は０．１〜１ｇ／ｌの濃度でも、微量な活性を示すことがわかっている。
【００２９】
以下、本明細書においては、ヘリコバクター ピロリ結合性物質をオリゴ糖配列と称する。本発明においてオリゴ糖配列とは、天然または合成の糖結合体あるいは遊離オリゴ糖または遊離オリゴ糖の一部である。このようなオリゴ糖配列は、例えば、糖鎖がバクテリアの多糖である場合に、種々の単糖、オリゴ糖、多糖や多糖配列に結合してもよい。さらに、単糖に対する天然の修飾も多数知られており、オリゴ糖配列のＯ−アセチル化誘導体や硫酸化誘導体が例示できる。本発明においてヘリコバクター ピロリ結合性物質は、天然または合成の糖結合体の一部、あるいは対応する遊離オリゴ糖または遊離オリゴ糖の一部であるオリゴ糖配列を包含してもよい。ヘリコバクター ピロリ結合性物質は複数のヘリコバクター ピロリ結合性物質の混合物を更に包含してもよい。
【００３０】
レセプターオリゴ糖配列から得られた複数の誘導体が現行のアッセイ法の検出限界を下回るほどに結合量を低下させ、認識の特異性を明らかとした。結合に関するデータは、上記オリゴ糖配列の配列が、GalNAcβ3 が Galα3Galβ4GlcNAcに結合したもの（置換配列：GalNAcβ3Galα3Galβ4GlcNAc）または Neu5Acα3 が GalNAcβ3Galβ4GlcNAcに結合したもの（置換配列：Neu5Acα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAc）である場合には、不活性であることを示した。上記オリゴ糖配列がGalβ4GlcNAcである場合には、該配列はα４−ガラクトシル化されておらず（即ち、Galα4Galβ4GlcNAcではなく）、α３−またはα６−シアリル化されておらず（即ち、Neu5Acα3/6Galβ4GlcNAcではなく）、α２−またはα３−フコシル化されていない［即ち、Fucα2Galβ4GlcNAc または Galβ4(Fucα3)GlcNAc または Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc ではなく、α３−フコシル化とは、ルイスｘ、即ち、Galβ4(Fucα3)GlcNAc、を構成するラクトサミンのGlcNAc残基のフコシル化を意味する］。Galβ3がGlcNAcβ3に結合した構造（例えば、Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc/Glc）を有する糖は、本発明で開示したヘリコバクター ピロリ結合性物質とは異なる立体構造を有し、その結合特異性については別途検討した。ヘリコバクター ピロリ結合性物質は糖鎖、糖結合体または他の公知のヘリコバクター ピロリ結合性エピトープを含有する糖化合物［例えばルイスｂ（Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAc または Neu5Acα3Galβ4Glc/GlcNAc）のように糖配列も立体構造も異なるもの］の一部でもよい。種々の結合性物質を組み合わせて用いることは治療上有効であると考えられる。
【００３１】
ヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列は、グリコシルトランスフェラーゼによって酵素的に合成するか、あるいはグリコシダーゼまたはトランスグリコシダーゼによって触媒されるトランスグリコシル化反応で合成することができる（Ernst et al., 2000）。これらの酵素の特異性および補因子の必要性については改良することができる。修飾された特定の酵素を用いてより効率よく合成することもでき、例えば、グリコシンセターゼをトランスグリコシル化のみを触媒するよう修飾することができる。本発明で開示する糖および糖結合体またはそれらと類似した化合物の有機合成も知られている（Ernst et al., 2000）。糖物質は天然の原料から単離して、化学的または酵素学的に修飾してヘリコバクター ピロリ結合性化合物とすることができる。種々の反芻動物の乳から天然のオリゴ糖を単離することができる。グリコシル化酵素を発現するトランスジェニックな生物、例えばウシや微生物も糖の製造に用いることができる。
【００３２】
本発明で開示するウロン酸単糖残基は公知の方法で得ることができる。例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンの６位の炭素に結合したヒドロキシル基を化学的に酸化してカルボン酸にすることができる。酸化反応は、正しく保護されたオリゴ糖や単糖に対して行うことができる。
【００３３】
本発明の好ましい態様においては、ヘキソース、Ｎ−アセチルヘキソサミンまたはヘキソサミンを包含する未保護のポリマーまたはオリゴマーであって、単糖類残基間の結合が６位の炭素原子の間ではないものを、
１）酸化して、ウロン酸残基からなる対応するポリマーまたは６−アルデヒドモノサッカリドをモノマーとして包含するポリマーを得、
２）所望によりカルボン酸基または６−アルデヒド基を誘導化し、好ましくはアミドまたはアミンに変換する、そして
３）加水分解によってウロン酸単糖類またはウロン酸誘導体単糖類を得る。
【００３４】
単糖残基を酸化してウロン酸得るため、ならびにアミンまたはウロン酸ポリマーを加水分解するための化学的または酵素学的な方法は当業界でよく知られている。このような方法を用いるのに特に好ましいのは、１−２結合、１−３結合または１−４結合を有する、セルロース、でんぷんまたは他のグルカン類のオリゴマーまたはポリマー、キチン（GlcNAcポリマー）またはキトサン（GlcNポリマー）などの大量に市販されている化合物、あるいはＮ−アセチルガラクトサミン／ガラクトサミン多糖類（例えば微生物由来のもの）を酸化して得た対応１−４結合糖質である。この方法はガラクタンポリマーに用いることもできる。ウロン酸誘導体はウロン酸含有天然ポリマー、例えば、ペクチンやバクテリア由来多糖類（Ｎ−アセチルヘパリン、ヒアルロン型またはコンロインチン型のバクテリア外生多糖類）を包含するグルクロン酸などが挙げられる。この方法は、以下の工程からなる。
１）多糖類のカルボン酸基を誘導化し、好ましくはアミド結合に変換する、そして
２）該多糖類の加水分解によってウロン酸単糖類またはウロン酸誘導体単糖類を得る。
【００３５】
多糖類の６位炭素に結合した一級アルコールを酸化してアルデヒドまたはカルボン酸にするための化学的および酵素学的な方法も知られている。アルデヒドは更に誘導化して、例えば還元的アミン化反応によってアミンに変換することができる。好ましくは、末端GalまたはGalNAcは、一級アルコール酸化酵素（例えば、ガラクトース酸化酵素）によって酸化し、その後さらに誘導化して、例えばアミン類にすることもできる。
【００３６】
通常の有機化学的手法によってウロン酸残基を二糖類またはオリゴ糖類に結合することができる。また、UDP-GlcAのGlcAを末端Lac(NAc)に転換するグロコニルトランスフェラーゼによってGlcAを結合することもできる。
【００３７】
Ｎ−アセチルヘキソサミンを模倣する単糖誘導体は、ヘキソサミンまたは遊離アミン基を有する単糖類を包含するポリマーかオリゴマーを用い、以下の方法で得ることができる。
１）アミン基を誘導化して２級または３級アミンあるいはアミドに変換し、そして
２）加水分解によって対応する単糖類を得る。
【００３８】
キトサンおよびそのオリゴ糖は、アミンを含有するポリマーまたはオリゴマーの具体例である。
【００３９】
一般的に、カルボン酸、６−アルデヒド、アミンおよび／またはアミドを含有する単糖／単糖類は、以下の工程からなる方法で得ることができる。
１）所望により、炭水化物ポリマーにカルボン酸または６−アルデヒド基を導入し、但し、１級ヒドロキシル基は修飾のために存在し、
２）該ポリマーのカルボン酸基、６−アルデヒド基または１級アミン基を誘導化して、２級または３級アミンあるいはアミドに変換するが、上記工程１）を実施した場合には、工程２）は所望により行えばよく、そして
３）加水分解によって対応する単糖類を得る。
【００４０】
単糖類を得るための加水分解は部分的でもよく、類似体物質の製造に有用な二糖やオリゴ糖を得ることができる。加水分解によって少なくとも３０％の単糖類が得られることが好ましい。化学的工程を実施するための方法は公知である。例えば、多糖類を対応する単糖類に酸化するには、Muzzarelli et al. 1999と2002に記載の方法を行えばよい。これらの方法は、単糖類の保護または還元末端の活性化が防止できるので、未保護の単糖類に適している。
【００４１】
好ましい態様において、GlcAβ3LacまたはGlcAβ3LacNAcを包含するオリゴ糖配列は、特定のグルコウロニダーゼ、例えばウシ肝臓のグルコウロニダーゼ、を用いたトランスグリコシル化によって効率よく合成する。この酵素は、予想しなかった高い収率でトランスグリコシル化反応を行い、部位特異的にβ１−３結合を Galβ4GlcNAc および Galβ4Glを転移することができる。一般的に、トランスグリコシル化反応においては、３０％以上の選択率および収率は得られない。
【００４２】
本発明の１つの態様は、下記式：
[Gal(A)q(NAc)r /Glc(A)q(NAc)r α3/β3]s [Galβ4GlcNAcβ3]t Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、各々独立に０又は１の整数である。）
で表され、式中のｔおよびｕが共に０である場合には、多価の担体に結合しているかまたは高濃度の遊離オリゴ糖として存在することを特徴とするオリゴ糖配列あるいはヘリコバクター ピロリに対する結合能を有する該オリゴ糖配列の類似体または誘導体を包含する結合性物質を、ヘリコバクター ピロリに対する結合能または阻害能を有する組成物の製造に用いる方法に関する。
【００４３】
上記オリゴ糖配列において、Ａは単糖残基のウロン酸または単糖残基の６位炭素原子の誘導体であって、最も好ましくは単糖残基の６位炭素原子の誘導体はウロン酸のアミドである。
【００４４】
本発明の方法に用いることが好ましいヘリコバクター ピロリ結合性物質であるオリゴ糖配列を以下に示す。
Galβ4GlcNAc、
GalNAcα3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcα3Galβ4GlcNAc、
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Galα3Galβ4GlcNAc、Galβ3Galβ4GlcNAc、
Glcα3Galβ4GlcNAc、Glcβ3Galβ4GlcNAc、
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、
GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、
GlcNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、
Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、
Glcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc、
GalANAcβ3Galβ4GlcNAc、GalANAcα3Galβ4GlcNAc、GalAβ3Galβ4GlcNAc、
GalAα3Galβ4GlcNAc、GalANAcβ3Galβ4Glc、GalANAcα3Galβ4Glc、
GalAβ3Galβ4Glc、GalAα3Galβ4Glc、
GlcANAcβ3Galβ4GlcNAc、GlcANAcα3Galβ4GlcNAc、GlcAβ3Galβ4GlcNAc、
GlcAα3Galβ4GlcNAc、GlcANAcβ3Galβ4Glc、GlcANAcα3Galβ4Glc、
GlcAβ3Galβ4Glc、GlcAα3Galβ4Glc、
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc およびこれらの還元末端含有多価結合体、
更にGalNAcα3Galβ4Glc、GalNAcβ3Galβ4Glc、GlcNAcα3Galβ4Glc、
GlcNAcβ3Galβ4Glc、Galα3Galβ4Glc、Galβ3Galβ4Glc、Glcα3Galβ4Glc および
Glcβ3Galβ4Glc 。
【００４５】
本発明の他の態様として、下記化学式１を開示する。
【００４６】
【化１】
2004519459.tif 000001
【００４７】
本発明において好ましいヘリコバクター ピロリ結合性物質またはその混合物、あるいは本発明の方法に適した物質は化１で表されるオリゴ糖構造体であって、式中、ｍは１以上の整数であり、ｌとｎは各々独立に０または１であり；Ｒ1がＨでＲ2がＯＨであるか、Ｒ1がＯＨでＲ2がＨであるか、あるいはＲ1がＨでＲ2がモノサッカリジル基またはオリゴサッカリジル基、好ましくはベータグリコシジル結合したガラクトシル基であり；Ｒ3は各々独立に−ＯＨ、アセトアミド基（−ＮＨＣＯＣＨ3）またはアセトアミド類似体基である。Ｒ7はアセトアミド基（−ＮＨＣＯＣＨ3）またはアセトアミド類似体基である。
更にｌが１である場合には、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は結合Ｒ6に結合した酸素原子であって、糖Ｂにベータ アノマー グリコシド結合を形成するか、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ4は結合Ｒ6に結合した酸素原子であって、糖Ｂにアルファ アノマー グリコシド結合を形成し；ｌが０である場合には、Ｒ6はＢに結合した−ＯＨである。Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、ポリ−Ｎ−アセチル−ラクトサミニル残基、あるいはＯ−グリカンオリゴ糖配列またはＮ−グリカンオリゴ糖配列の一部であり；Ｙはスペーサー、セラミド脂質成分などの末端結合基あるいは該Ｏまたは該ＸとＺの間の結合である。Ｚはオリゴ価または多価の担体である。結合性物質は、ヘリコバクター ピロリに対する結合能を有する、化１の物質の類似体または誘導体であり、例えば、糖ＢのＣ１位と糖残基ＸまたはスペーサーＹとの間の酸素結合（−Ｏ−）を炭素結合（−Ｃ−）、窒素結合（−Ｎ−）または硫黄結合（−Ｓ−）に置換したものである。
【００４８】
化１において、Ｒ8は好ましくはカルボン酸アミド、例えばメチルアミドやエチルアミド、ヒドロキシメチル基（−ＣＨ2−ＯＨ）またはカルボン酸基またはそれらのエステル（メチルまたはエチルエステル）である。また、カルボン酸アミドは、キトサンやガラクトサミン多糖などのアミンを包含する多価担体Ｚあるいはスペーサー、好ましくは親水性スペーサー、を包含するＺに対する結合を有してもよい。Ｒ8に含まれる構造は、上記した物質を模倣した公知の構造でもよい。例えば、２級または３級アミン類やアミド化２級アミンを用いることができる。
【００４９】
化１において、Ｒ9は好ましくはヒドロキシメチル基であるが、Ｒ8について記載したような誘導化に用いることもできる。
Ｒ3はヒドロキシル基、アセトアミド基またはアセトアミド基を模倣する基、例えば、Ｃ1-6アルキルアミド、アリルアミドまたは２級アミン、好ましくはＮ−エチルまたはＮ−メチル、Ｏ−アセチル、あるいはＯ−アルキル（例えば、Ｏ−エチルまたはＯ−メチル）である。Ｒ7はＲ3と同じであるが、より好ましくは、アセトアミド基またはアセトアミド類似体基である。
Ｒ2も好ましくはＧａｌβ４−末端を模倣した六員環構造を包含する。
【００５０】
バクテリア結合性物質は、クラスター、即ち、細胞膜上の糖脂質、ミセルまたはリポソームとして提示されるか、あるいはアッセイに用いるＴＬＣプレートのような固相に提示されていることが好ましい。正しい空間配置によって提示されたクラスターは高い結合親和性を示す。
【００５１】
本発明においては、ヘリコバクター ピロリ結合性エピトープあるいはヘリコバクター ピロリに対して同様または改善された結合能を有する該エピトープの天然または合成した類似体や誘導体を用いることができる。さらに、バクテリア結合性物質を含有する物質、例えば、本願で開示するレセプター活性型ガングリオシドやヘリコバクター ピロリに対して同様または改善された結合能を有する該ガングリオシドの類似体や誘導体などを用いることもできる。バクテリア結合性物質は、オリゴ糖鎖のグリコシル結合した末端エピトープでもよい。又、バクテリア結合性エピトープはオリゴ糖鎖の分岐鎖、好ましくはポリラクトサミン鎖でもよい。
【００５２】
ヘリコバクター ピロリ結合性物質は、抗生物質、好ましくはペニシリン系抗生物質、に結合していてもよい。ヘリコバクター ピロリ結合性物質は抗生物質をヘリコバクター ピロリに的中させる。このような結合体は、ヘリコバクター ピロリに対する処置や治療に必要な抗生物質が少量となるので治療に有利であり、その結果、抗生物質による副作用を低減させる。結合体の抗生物質部分はバクテリアを殺すか弱めるためのものであるが、後述するように、結合体には付着防止効果があってもよい。
【００５３】
バクテリア結合性物質、好ましくはオリゴ価またはクラスター状のものは、ヘリコバクター ピロリの存在によって生じる疾患または病態の治療に用いることができる。これはヘリコバクター ピロリ結合性物質を付着防止に用いることで達成され、例えば、ヘリコバクター ピロリがターゲット細胞や組織のレセプター エピトープに結合するのを阻害する。ヘリコバクター ピロリ結合性物質または医薬組成物を投与すると、それはバクテリアの結合に対してターゲット細胞上のレセプター糖結合体と競合する。その結果、バクテリアの一部またはすべてがターゲット細胞や組織のレセプターの代わりにヘリコバクター ピロリ結合性物質に結合する。ヘリコバクター ピロリ結合性物質に結合したバクテリアは患者から（例えば、胃腸器系における液体の流入によって）除去し、その結果、患者の健康にバクテリアが与える影響を低減させる。使用する結合性物質は、好ましくはヘリコバクター ピロリ結合性物質を包含する溶解性の組成物である。結合性物質は、担体、好ましくはタンパク以外の担体に結合してもよい。担体分子を用いる場合には、複数のヘリコバクター ピロリ結合性物質を１つの担体に結合し、阻害効率を改善することもできる。
【００５４】
ターゲット細胞は主としてターゲット組織（特に胃腸器系）またはターゲット組織と考えられるその他の組織（肝臓や膵臓）の上皮細胞である。ターゲット組織のグリコシル化は病原体による感染によって変化すると考えられる（Karlsson et al., 2000）。ターゲット細胞はターゲット組織の悪性細胞、形質転換細胞または癌化／腫瘍細胞でもよい。形質転換細胞または組織は異なる形のグリコシル化反応を発現し、バクテリアに対するレセプターを提供する場合がある。レクチンまたは糖類が糖タンパクまたは糖脂質からなるレセプターの糖質と結合する（炭水化物−炭水化物間相互作用）ことによって細胞が活性化され、癌化／悪性細胞の場合には、これは癌の増殖または転移につながる。本願に記載のオリゴ糖エピトープのいくつか、例えば、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc（Hu, J. et al., 1994）、Galα3Galβ4GlcNAc（Castronovo et al., 1989）ならびに悪性細胞由来の天然およびシアリル化ポリラクトサミン（Stroud et al., 1996）は、癌関連抗原または癌抗原として報告されている。本願に記載の結合性物質を包含するオリゴ糖配列はリンパ球についても報告されている（Vivier et al., 1993）。ヘリコバクター ピロリは胃リンパ腫とも関連する。本願に記載の結合性物質はヘリコバクター ピロリの前癌状態または悪性の細胞に対する結合および癌の増殖および転移を防止しするために用いることができる。結合阻害は胃がん、特にリンパ腫を治療する可能性がある。ヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列である、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAcがヒト胃粘膜について報告されている。この粘膜性エピトープおよび類似したＯ−グリカン型糖構造体はヒトの胃に存在するヘリコバクター ピロリに対する天然の高親和性レセプターである可能性が非常に高い。これはネオグリコ脂質である類似配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAcがヘリコバクター ピロリに高い親和性で結合し、同様のアッセイにおいてGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Galがヘリコバクター ピロリに対していくらかの結合親和性を示したことによって明示された。従って、好ましいオリゴ糖配列には、Ｏ-グリカン類やGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc/GalNAc/Gal、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc/GalNAc/GalαSer/Thr、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6(Gal/GlcNAcβ3)GlcNAc/GalNAc/GalαSer/Thr等のＯ−グリカン類の類似体、ならびに糖ペプチドやＯ−グリカン配列を包含する糖ペプチドの類似体が含まれる。非還元末端GlcNAcを欠いた配列でさえもいくらかの活性を有する。このような知見に基づき、その他の全てのヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列（ＯＳ）および、特に三糖エピトープは、還元末端に結合して以下の構造を形成していることが特に好ましい：OSβ6Gal(NAc)0-1、OSβ6Glc(NAc)0-1、OSβ6Gal(NAc)0-1αSer/ThrまたはOSβ6Glc(NAc)0-1αSer/Thr。ＳｅｒまたはＴｈｒ化合物あるいはそれらの類似体あるいは還元オリゴ糖は、多価の担体に結合しているものが特に好ましい。還元オリゴ糖は多価担体に還元的に結合することができる。
【００５５】
ターゲット細胞には血液細胞、特に白血球が含まれる。消化性潰瘍と関連するヘリコバクター ピロリ株、例えば、本発明で主として用いた株は、オプソニン作用を受けていないにもかかわらず、顆粒球による炎症反応を刺激した（Rautelin et al., 1994a,b)。バクテリアの食作用において最初に起こる事柄は特定のレクチン様相互作用を含み、その結果、顆粒球の凝集が生じる（OfekとSharon, 1988)。食作用に続いて酸化的バースト反応が生じるが、これはヘリコバクター ピロリ関連疾患の病因を導くものとも考えられる（Babior, 1978)。Ｎ−アセチルラクトサミン繰り返し単位を有するシアリル化および非酸性グリコスフィンゴ脂質は顆粒球から単離され、特徴付けられており（Fukuda et al., 1985; Stroud et al., 1996)、白血球表面のヘリコバクター ピロリに対する潜在的レセプターとして機能しうる。更に、ｘ2グリコスフィンゴ脂質も同じ材料から単離されている（Teneberg, S.、未発表)。本発明は、Ｎ−アセチルラクトサミン特異的レクチンおよびモノクローナル抗体によって認識される、ヒト赤血球および顆粒球に存在するレセプター糖質の存在を立証する（Ｘ2、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc-）。ヘリコバクター ピロリ結合性物質は、ヘリコバクター ピロリに対する白血球の結合の阻害ならびに白血球の活性化に続く酸化的バーストおよび／または炎症の防止に有用である。
【００５６】
ヘリコバクター ピロリは種々のオリゴ糖配列に結合することが知られている。特定の株による結合はより共生的な相互作用であり癌や重度の病態に進行することはない。癌型糖エピトープへの結合に関する本願のデータはヘリコバクター ピロリ結合性物質がより病原性の相互作用も防止することが可能であり、その際、他のレセプター構造に結合した病原性の低いヘリコバクター ピロリ株がいくらか残る。従って、バクテリアの完全な除去はヘリコバクター ピロリ関連疾患の予防には必ずしも必要ない。病原性の低いバクテリアは、病原性の高いヘリコバクター ピロリ株の予防においてプロバイオティックな効果を発揮することも考えられる。
【００５７】
更に、ヘリコバクター ピロリは大きなポリラクトサアミンオリゴ糖類をその表面に有し、少なくともいくつかの株は、本願で説明するようにバクテリアが結合する未フコシル化エピトープを含有する。本願に記載した結合性物質はヘリコバクター ピロリ同士の結合を防止し、そうすることによって、例えば、バクテリアのコロニー形成を阻害することができる。
【００５８】
本発明によると、ヘリコバクター ピロリ結合性物質を、所望により担体と共に医薬組成物に導入することができる。このような医薬組成物は、ヘリコバクター ピロリが患者に存在することによって生じる病態の治療またはヘリコバクター ピロリ結合性物質を用いたこのような病態の治療方法に有用である。本発明によって治療することのできる病態の具体例としては、慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、ヒトの胃における非ホジキン悪性リンパ腫、胃腺癌、ならびにある種の膵臓病、皮膚病、肝臓病、心臓病、乳幼児突然死症候群、自己免疫疾患（自己免疫性胃炎、悪性貧血および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）関連胃疾患を含む）であり、すべてまたは少なくとも一部がヘリコバクター ピロリ感染によって生じる病態である。
【００５９】
ヘリコバクター ピロリ結合性物質を包含する医薬組成物は、更に他の物質、例えば不活性なベヒクルまたは医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。ヘリコバクター ピロリ結合性物質は他の薬剤、例えばヘリコバクター ピロリに対する抗生物質、と共に投与してもよい。
【００６０】
ヘリコバクター ピロリ結合性物質またはこのような結合性物質を含有する医薬組成物は、適当な方法で投与すればよく、経口投与が好ましい。
【００６１】
本願において「治療」とは、疾患または病態を治癒または改善するための治療と、疾患または病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的または慢性的に行うことができる。
【００６２】
本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするヒトまたはヒト以外の哺乳類である。
【００６３】
ヘリコバクター ピロリ結合性物質は、ヘリコバクター ピロリ結合性物質に結合するタンパクまたは（炭水化物−炭水化物総合作用によって結合する）炭水化物をスクリーニングすることで１つ以上の付着因子の同定に用いることもできる。炭水化物結合性タンパクはレクチンまたは炭水化物結合性酵素である。スクリーニングは、例えば、アフィニティークロマトグラフィやアフィニティー交差結合法で行うことができる(Ilver et al., 1998)。
【００６４】
さらに、ヒト組織に提示されているヘリコバクター ピロリ結合性物質に特異的に結合するか不活化する物質を用い、ヘリコバクター ピロリの結合を防止することもできる。このような物質の例としては、Erythrina cristagalliおよびErythrina corallodendronなどの植物性レクチンが挙げられる（Teneberg et al., 1994)。ヒトに用いる場合には、このような結合性物質は、その用途に適したものでなければならず、例えば、ヒト化抗体またはヒト由来の組み換えグリコシダーゼなどの非免疫原生であり、ヘリコバクター ピロリ結合性物質の末端単糖残基を解裂させることのできる物質である。しかし、胃腸器系においては、例えば、食品に由来する多種の天然のレクチンやグリコシダーゼが許容されている。
【００６５】
また、ヘリコバクター ピロリ結合性物質を食品や飼料を含む栄養補助組成物の一部として用いることができる。ヘリコバクター ピロリ結合性物質を機能性食品または機能化食品の一部として用いることが好ましい。機能性食品は、ヘリコバクター ピロリがターゲット細胞または組織に結合するのを阻害するか防止することでヒトまたは動物の健康に正の影響を与える。ヘリコバクター ピロリ結合性物質は既に知られている食品や機能性食品組成物の一部でもよい。機能性食品は、専門機関、例えば米国ＦＤＡ、によって許可されている他の許容される食品材料を含有してもよい。ヘリコバクター ピロリ結合性物質は栄養補助剤、好ましくは食品添加剤や飲料物添加剤として機能性食品または機能性飲料を製造するために用いることができる。食品または食品添加剤は、例えば、ウシやその他の家畜が多量のヘリコバクター ピロリ結合性物質を天然にその乳に産生するようにすることで得ることもできる。これは、動物がその乳に適切なグリコシルトランスフェラーゼを過剰発現させることで達成される。家畜の特定の品種または種を選択し、ヘリコバクター ピロリ結合性物質を多量に産生するように交配することができる。栄養補助組成物または栄養補助剤のためのヘリコバクター ピロリ結合性物質は、バクテリアや酵母などの微生物によって製造することもできる。
【００６６】
ヘリコバクター ピロリ結合性物質を乳幼児用の食品の一部、好ましくは乳児用ミルクの一部として用いることは特に有用である。多くの乳児は、ヒトの天然乳の代わりとして特別な処方のミルクを与えられている。このような処方はヒト乳に存在する特別なラクトースに基づくオリゴ糖、特にラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcやその誘導体である伸長したオリゴ糖を欠くことがある。ラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびパラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース（Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc）はGalβ3Galβ4Glcと共にヒト乳に存在することが知られており、乳幼児用食品の安全な添加物または原料と考えられる。ヘリコバクター ピロリは特に乳児および幼児に高い感染性を示し、この疾患を鑑みると、この段階で感染を予防することは妥当である。ヘリコバクター ピロリは乳幼児突然死症候群の原因となることが知られているが、バクテリアを一掃するための強い抗生物質を用いることは、特に幼児や乳児には不適切である。
【００６７】
摂取される機能性食品（例えば、調製した乳児用ミルク）に含まれるヒト乳オリゴ糖の好ましい濃度は、天然のヒト乳に含まれる濃度と同じであることが好ましい。ヒト天然の乳は、本発明のオリゴ糖配列を包含する多数の遊離オリゴ糖と糖結合体（多価のものも含む）を含有するので、単一分子を天然の濃度よりも高い濃度で用いたとしても、危険な副作用を伴うことなく、ヘリコバクター ピロリに対して強い阻害能を発揮させることもできる。天然のヒト乳は、個体差があるものの、少なくとも１０〜２１０ｍｇ／ｌのラクト−Ｎ−ネオテトラオースを含有する（Nakhla et al., 1999)。その結果、機能性食品においても、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの使用量は好ましくは０．０１〜１０ｇ／ｌであり、より好ましくは０．０１〜５ｇ／ｌ、最も好ましくは０．１〜１ｇ／ｌである。本願に記載した遊離オリゴ糖がGalβ4Glcを還元末端に有する三糖または二糖である場合には、好ましく１〜１００ｇ／ｌ、より好ましくは１〜２０ｇ／ｌの濃度で食される。また、機能性食品に含まれる糖質の合計濃度は、本願のヘリコバクター ピロリ結合性物質を結合する糖質または本願で開示した結合エピトープ／オリゴ糖配列を含有する、ヒト乳に含まれる糖質の合計濃度と同じか類似している。少なくとも１つのケースにおいて、ヒト乳はGalβ3Galβ4Glcを主要な中性オリゴ糖として多量に含有することが報告されている(Charlwood et al., 1999)。
【００６８】
さらに、ヘリコバクター ピロリ結合性物質をヘリコバクター ピロリの感染によって生じる病態の診断に用いることができる。診断用途には、ヘリコバクター ピロリ結合性物質を用いたヘリコバクター ピロリの型の同定方法も含まれる。結合性物質を診断または型同定に用いた場合、例えば、結合性物質はプローブやテストスティックに含まれていてもよく、所望により、テストキットの一部を構成してもよい。このようなプローブやテストスティックがヘリコバクター ピロリを含有するサンプルと接触すると、バクテリアはプローブまたはテストスティックに結合し、サンプルから取り出されてさらに分析される。
【００６９】
結果は、本発明の好ましい三糖配列の非還元末端単糖残基はその６位炭素にカルボキシル基（末端単糖残基がウロン酸、HexAまたはHexANAcであり、HexはGalまたはGlcである）か、対応するHexA(NAc)残基の６位炭素の誘導体か、対応するHex(NAc)残基の６位炭素の誘導体を含有してもよいことを示した。このような末端残基は、好ましくはβ3結合したグルクロン酸であり、より好ましくはメチルアミドなどの６−アミド類である。従って、配列の類似体や誘導体は三糖エピトープの末端６位を変化させるか誘導化することによって製造することができる。
【００７０】
好ましいヘリコバクター ピロリ結合性物質 
本発明のオリゴ糖配列は、予想に反して薄層表面に提示された時に効果的なバインダーとなることが判明した。この方法は糖脂質配列を多価の状態で提示することを可能にした。多価の状態で提示されたオリゴ糖配列の活性は驚くほど高いので、多価の状態こそが本発明のオリゴ糖配列を提示するのに好ましい方法である。
【００７１】
糖脂質は、天然では多価の状態で細胞膜に提示されている。このような提示方法は後述する固相アッセイ法や糖脂質またはネオ糖脂質のリポソームを形成することで模倣することができる。
【００７２】
疎水性ヘキサデシルアニリンの還元的アミン化反応によって製造される本発明のネオ糖脂質はオリゴ糖を効果的に提示することができた。最近発見されたバクテリア結合性のネオ糖脂質は、フォスファチジル エタノールアミン ネオ糖脂質のフォスフォロエステルなどの負の電位を帯びた基を有している。このような化合物の問題点は、この物質の負の電位とリン脂質構造を含む天然の生物学的結合である。負の電位を帯びた分子はタンパクやその他の生物学的物質との多数の非特異的結合に関与することが知られている。さらに多くのこのような構造は不安定であり、酵素学的または化学的に分解されることがある。本発明は、オリゴ糖配列の非酸性結合体に関するものであり、これはオリゴ糖配列は非酸性化学構造に結合していることを意味する。非酸性結合体は中性の物質であることが好ましく、これはオリゴ糖配列が中性の、電位を帯びていない化学構造体に結合していることを意味する。本発明において好ましい結合体は多価の物質である。
【００７３】
従来技術においては、生物活性を有するオリゴ糖配列は、レセプター活性型オリゴ糖構造の一部を還元することで担体に結合していることが多い。アルキル鎖（-CH2-)nおよび／またはベンジル環を含有する疎水性のスペーサーが用いられている。しかし、疎水性構造は、一般的にタンパクやその他の生物活性分子との非特異的相互作用に関与することが知られている。
【００７４】
後述する実施例で得られたネオ糖脂質に関するデータによると、アッセイに用いた実験条件においてはネオ糖脂質化合物のヘキサデシニルアニリン部分は、研究に用いたバクテリアに対する非特異的結合を起こさなかった。ネオ糖脂質においては、糖結合体のヘキサデシニルアニリン部分は脂質層状の構造を形成すると考えられ、結合のためには存在していない。本発明は結合エピトープに属する単糖残基を還元すると結合が破壊されることを示す。さらに還元された単糖残基は、レセプターエピトープと多価に提示された構造体とを繋ぐ親水性スペーサーとして使えることを見出した。本発明によると、生物活性を有するオリゴ糖を親水性スペーサーを介して多価またはオリゴ価の担体分子に結合し、多価またはオリゴ価の構造体を形成することが好ましい。本願においては、多価構造体（１０個を超えるオリゴ糖残基を包含するもの）およびオリゴ価構造体（２〜１０個のオリゴ糖残基を包含するもの）を全ての多価構造体というが、用途によっては大きな多価構造体よりもオリゴ価の構造体のほうが好ましい場合がある。親水性スペーサーは少なくとも１つのヒドロキシル基を包含する。更に好ましいスペーサーは少なくとも２つ、最も好ましくは３つのヒドロキシル基を包含する。
【００７５】
本発明によると、親水性スペーサーは、好ましくは１つまたは複数の−ＣＨＯＨ−および／またはアセトアミド−ＮＨＣＯＣＨ3やアルキルアミドなどのアミド側鎖を包含する可動性鎖であることが好ましい。ヒドロキシル基および／またはアセトアミド基はインビボにおける酵素的加水分解からスペーサーを保護する。可動性という用語は、スペーサーが可動性の結合を包含し、可動性ではない環構造を形成しないことを意味する。本発明において還元的アミン化反応によって得られた還元単糖残基は、可動性親水性スペーサーの例である。可動性親水性スペーサーはネオ糖脂質や多価結合体の非特異的結合を防止するために最適である。これは、例えば、医薬や機能性食品におけるバイオアッセイ及び生物活性において必須な最適活性である。
【００７６】
可動性親水性リンカーを有する結合体は以下の一般式２で表される。
[OS-O-(X)n-L1-CH(H/{CH1-2OH}p1)-{CH1OH}p2-{CH(NH-R)}p3-{CH1OH}p4-L2]m-Z
（式中、
ＯＳおよびＸは化１において定義した通りであり；
Ｌ1およびＬ2は結合基あって、各々独立に酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子である結合原子あるいは置換基を形成する結合に含まれる２つの原子を包含し、該置換基を形成する結合は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−、−Ｎ−、−Ｎ（ＣＯＣＨ3）−、
−ＣＯ−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＯ−で表されるアミド基、−Ｎ−Ｎ−（ヒドラジン誘導体）、あるいは−Ｏ−Ｎまたは−Ｎ−Ｏで表されるアミノオキシ結合であり；
Ｌ1は該Ｘである単糖の還元末端のＣ１位に結合した結合基であり、ｎが０の場合には、Ｌ1は該Ｘの−Ｏ−を置換して、該ＯＳの還元末端のＣ１位に直接結合しており；
ｐ１、ｐ２、ｐ３およびｐ４は各々独立に０〜７の整数であるが、ｐ１、ｐ２、ｐ３およびｐ４の少なくとも１つが１であり；
｛ＣＨ1-2ＯＨ｝p1が分岐構造を表す場合には、末端基となるＣＨ1-2ＯＨはＣＨ2ＯＨであり、ｐ１が１を超える場合には、該末端基をスペーサーである該Ｙの残りの部分に結合させるための第二級アルコール基である−ＣＨＯＨ−が存在し；
Ｒは好ましくはアセチル基（−ＣＯＣＨ3）、Ｚに連結する結合またはＣ1-4アシル基（好ましくは親水性の基、例えばヒドロキシアルキル）を包含する類似体形成基であり、Ｒが結合である場合にはＬ2は糖鎖末端基の１つまたは２つの原子であり、該Ｃ1-4アシル基はアミド構造、水素原子またはＣ1-4アルキル基を形成するアミンであり；
ｍは１を超える整数であり；
Ｚは多価の担体である。）
【００７７】
式２に示した可動性親水性スペーサーを有する好ましい多価構造体には、次のヘリコバクター ピロリ結合性オリゴ糖配列が含まれる：(OS)β1-3 が Galβ4Glc(red)-Zに結合したもの、OSβ6GlcNAc(red)-Z および OSβ6GalNAc(red)-Z。式中、“(red)”は還元末端単糖および多価担体Ｚのアミン基の還元的アミン化によって得られたアミン結合構造である。
【００７８】
本発明においてオリゴ糖基は、抗原性やアレルギー反応の出現を防止するために、多価またはオリゴ価の形でタンパクまたはペプチドではない担体に結合していることが好ましく、より好ましくは、担体の骨格は天然の非抗原性多糖である。
【００７９】
糖脂質とネオ糖脂質の結合活性を比較すると、Galα3Galβ-を有する配列は、薄層プレート上に多価に提示された際に低い活性を示すことがわかった。末端Galβ4GlcNAc-を有する配列も弱い活性を示した。従って、本発明において最適な多価非酸性物質は以下の末端オリゴ糖配列を包含する。
Gal(A)q1(NAc)r1/Glc(A)q2(NAc)r2α3/β3Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、ｑ１、ｑ２、ｒ１、ｒ２およびｕは各々独立に０または１であり、
但し、ｑ１とｒ１が共に０の場合には、非還元末端単糖残基はGalαではない。）
更に好ましい態様においてはｕは０であり、最も好ましい態様においては多価の形態で提示されているオリゴ糖配列は下記の式で表されるものまたはその類似体または誘導体である。
GalNAc/Glc(NAc)r2α3/β3Galβ4GlcNAc（式中、ｒ２は各々独立に０または１である。）
【００８０】
下記のオリゴ糖配列が特に好ましい。下記の構造はヒトや動物の組織には見出されていない。
Glc(A)q(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u 
（式中、オリゴ糖配列がβ３結合を有する場合には、ｑとｒは各々独立に１または０である）あるいは
GalA(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u   。
【００８１】
上記オリゴ糖配列はその新規性によって特に好ましいものである。このような配列を開裂させるグリコシダーゼは知られていない。従って、これらの配列は特に安定であり、生物学的環境において好ましい。本発明において開示する天然型配列はグリコシダーゼによって開裂させることができるので、特にヒトや動物の体内において用いる際の有用性が低い。このような配列を開裂させるグリコシダーゼはヒト胃腸器系において活性を示すことが知られている。Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼやガラクトシダーゼなどのいくつかのグリコシダーゼは消化酵素として報告されており、飼料などにも存在する。
【００８２】
本発明による新規な結合性物質は、Clostridium difficile SのトキシンＡを阻害するのにも有用である（Teneberg et al 1996）。トキシンＡと公知物質との結合挙動は本願に記載したヘリコバクター ピロリの特異性と類似している。従って、ヘリコバクター ピロリ結合性物質は、例えばClostridium difficile依存性下痢の治療に用いることができる。
【００８３】
糖脂質および炭水化物の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨する命名法（Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29）に従った。
【００８４】
Gal、Glc、GlcNAc および Neu5AcはＤ型であり、FucはＬ型であり、全ての単糖残基はピラナオース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcNまたはGlcNH2と示し、ガラクトサミンはGalNまたはGalNH2と示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、Neu5Ac-残基のα３およびα６結合はそれぞれα２−３およびα２−６結合と同じである。他の単糖残基については、α１−３、β１−３、β１−４およびβ１−６結合はそれぞれα３、β３、β４およびβ６と略すことができる。ラクトサミンはＮ−アセチルラクトサミン（Galβ4GlcNAc）を示し、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）またはその他の天然のシアル酸を示す。本願においてグリカンという用語は、ヒトまたは動物に存在する糖結合体、特に糖脂質または糖タンパクに含まれるオリゴ糖や多糖鎖を広く包含する。脂肪酸と塩基の略記命名法においては、コロンの前の数字が分子の炭素数の長さを示し、コロンの後の数字が分子の二重結合の合計を示す。ＧＳＬという略語はグリコスフィンゴ脂質を示す。グリコスフィンゴ脂質の略語、略称または記号は本文に記載した。ヘリコバクター ピロリとは、ヘリコバクター ピロリに類似したバクテリアを意味する。
【００８５】
本発明において、hex(NAc)-ウロン酸ならびにその誘導体および類似体は以下のように記載した：GlcAはグルクロン酸ならびにグルコースまたはグルクロン酸の６位の炭素の誘導体であり、GalAはガラクツロン酸ならびにガラクトースまたはガラクツロン酸の６位の炭素の誘導体であり、GlcANAcはＮ−アセチルグルクロン酸ならびにＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンウロン酸の６位の炭素の誘導体であり、そしてGalANAcはＮ−アセチルガラクトサミンウロン酸ならびにＮ−アセチルガラクトサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンウロン酸の６位の炭素の誘導体である。
【００８６】
「末端オリゴ糖配列」という表現は、他の単糖残基によってオリゴ糖が非還元末端残基に置換されていないことを示す。
【００８７】
「α３／β３」は、オリゴ糖配列において隣り合った糖残基は互いにα３−またはβ３−結合していることを示す。
【００８８】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
材料と方法
材料  −  ＴＬＣシリカゲル６０（アルミニウム）プレートはMerck製（ドイツ国、ダルムシュタット）である。実験に用いた全てのグリコスフィンゴ脂質は我々の研究室で得たものである。β−ガラクトシダーゼ（Escherichia coli）はBoehringer Mannheim社（ドイツ国）、ハムのＦ１２培地はGibco社（英国)、35Ｓ−メチオニンはAmersham社（英国）、そしてＦＣＳ（ウシ胎児血清）はSera-Lab社（英国）より購入した。β４−ガラクトシダーゼ（Streptococcus pneumoniae）、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae）およびシアリダーゼ（Arthrobacter ureafaciens）はOxford GlycoSystems（英国、アビントン）のものである。ヘリコバクター ピロリ臨床単離株（００２株および０３２株）はそれぞれ胃潰瘍および十二指腸潰瘍の患者から単離したものであり、スウェーデン国、エレブル医学センター（Orebro Medical Center）のD. Danielsson博士によって寄贈されたものである。基準株である１７８７５株はゲーテボルグ大学、カルチャーコレクション（ＣＣＵＧ）のものである。
【００９０】
グリコスフィンゴ脂質類  −  図７Ａおよび７Ｂに示した実験に用いた純粋なグリコスフィンゴ脂質は、（Karlsson, 1987）の記載に従って、原料の全酸性画分または全非酸性画分から得た。一般的に、個々のグリコスフィンゴ脂質は全グリコスフィンゴ脂質画分のアセチル化（Handa, 1963）によって得られ、シリル酸カラムクロマトグラフィを繰り返すことで分離し、次いでマススペクトル分析（Samuelsson et al., 1990)、ＮＭＲ（Falk et al., 1979a,b,c; Koerner Jr et al., 1983）および分解的手法（degradative procedures）（Yang Hakomori, 1971; Stellner et al., 1973）によって特徴付けた。ウサギ胸腺由来の糖脂質については後述する。
【００９１】
糖脂質類の精製  −  酸性グリコスフィンゴ脂質類はウサギ胸腺のアセトン粉末（米国、アーカンソー州、ノースアーカンソー、Pel-Freeze Biological Inc.製）１０００ｇから単離した。アセトン粉末はSoxhlet装置（Soxhlet Apparatus）によって、クロロフォルム／メタノール ２／１（特に記載がない限り容量比）を用いて２４時間抽出し、さらにクロロフォルム／メタノール／水 ８／１／１で３６時間抽出した。抽出した脂質２４０ｇはフォルチ分配（Folch et al., 1957）に付し、回収した親水性相はＤＥ２３セルロース（ＤＥＡＥ）（英国、メイドストン、Whatman製）によるイオン交換ゲルクロマトグラフィに付した。単離工程によって２.５ｇの酸性グリコスフィンゴ脂質が得られた。ガングリオシドはシアル酸の数に基づいて、イオン交換ゲルを用いたガラス製カラム（内径５０ｍｍ）によるオープン管状クロマトグラフィで分離した。カラムは、凹状のグラジエント（予めプログラムされているグラジエントｎｏ．４）を調製するＨＰＬＣポンプ（米国、カリフォルニア州、System Gold Chromatographic Software および Beckman Instruments Inc.製）につなぎ、グラジエントはメタノールで開始して、０．５Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4のメタノール溶液で終了した。流速は４ｍｌ／分で各８ｍｌの画分を２００個回収した。３００〜４００ｍｇのガングリオシド混合物をそれぞれ５００ｇのDEAE Sepharose（CL6、ベッド高さ：約１３０ｍｍ）（スウェーデン国、ウプサラ、Pharmacia社）にアプライした。モノシアル化ガングリオシドはさらにシリカカラム（SH-044-10、３００ｍｍｘ２２ｍｍ（内径）、孔径：１２０Å、粒子径：１０μｍ）（日本国、京都府、Yamamura Ltd.製）を用いたＨＰＬＣで分離した。約１５０ｍｇのモノシアル化ガングリオシドをそれぞれアプライし、直線的な溶出グラジエント（クロロフォルム／メタノール／水を６０／３５／８〜１０／１０３、４ｍｌ／分、２４０画分）を用いた。
【００９２】
部分酸加水分解  −  ガングリオシドの脱シアル化は、１００℃の１．５％ ＣＨ3ＣＯＯＨ水溶液中で行い、その後、得られた産物をＮａＯＨで中和し、窒素下で乾燥した。炭水化物骨格の部分分解には、沸騰水浴中で０．５Ｍ ＨＣｌをもちいて７分間加水分解を行った。その後、得られた産物を中和し、Ｃ／Ｍ／Ｈ2Ｏ，（８：４：３，ｖ／ｖ）2で分配した。下相を回収し、窒素下で蒸発し、回収した糖脂質を分析に用いた。
【００９３】
酵素加水分解による、ヘキサグリコシルセラミドからのペンタグリコシルセラミドの調製  −  ヘプタグリコシルセラミド NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（４ｍｇ、ウサギ胸腺由来）の酸性脱シアリル化（上記参照）によって得られたヘキサグリコシルセラミド Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer をＣ／Ｍ（２：１）に再溶解し、小さなシリカゲルカラム（０．４ｘ５ｃｍ）にアプライした。このカラムはＣ／Ｍ／Ｈ2Ｏ（６０：３５：８，ｖ／ｖ）で溶出した。１本が約０．２ｍｌの画分を複数回収し、炭水化物の存在を試験した。回収したヘキサグリコシルセラミド(２．０ｍｇ）は１．５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２（１．５ｍｇ／ｍｌタウロデオキシコレートナトリウム、０．００１Ｍ ＭｇＣｌ2およびβ−ガラクトシダーゼ（E. coli、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質として測定した活性が５００Ｕ）を含有）に溶解し、サンプルを３７℃で一晩インキュベートした。次に、Ｃ/Ｍ/Ｈ2Ｏ(１０:５:３)を用いて分画し、下相に含まれる糖脂質をシリカゲルクロマトグラフィ（０．４ｘ５ｃｍのカラム）を用いてヘキサグリコシルセラミドについて上述した方法で精製した。混入している界面活性剤を全て除去するために、クロマトグラフィを２回繰り返した。最終的に回収したペンタグリコシルセラミドは０．７ｍｇであった。
【００９４】
糖脂質のエンドグリコシルセラミダーゼによる消化（ItoとYamagata, 1989）  −  反応混合物は、２００μｇの糖脂質、８０μｇのタウロデオキシコレートナトリウムおよび０．８ｍＵの酵素を１６０μｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものだった。サンプルは３７℃で一晩インキュベートし、その後、水（１４０μｌ）とＣ／Ｍ（２：１，容量比，１５００μｌ）を加え、振とうした後、遠心分離に付した。上相は窒素下で乾燥し、少量の水に再度溶解し、水で飽和させたSephadex G-25カラム（０．４ｘ１０ｃｍ）を用い、水で溶出することで脱塩した。１本が約０．１ｍｌの画分を複数回収し、そこに含まれる糖の存在を試験した。
【００９５】
糖質のパーメチル化  −  パーメチル化はLarson et al., 1987に従って行った。NeedsとSelvendran 1993にて推奨されているように、ヨウ化メチルを加える前に水酸化ナトリウムをサンプルに加えた。いくつかの実験においては、糖質はメチル化の前にＮａＢＨ4で還元した。この場合、ヨウ化メチルの終濃度がＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド)／ヨウ化メチルが１：１となるようにヨウ化メチルの量を増加した（HanssonとKarlsson, 1990)。 
【００９６】
ガスクロマトグラフィー／マススペクトル分析  −  ガスクロマトグラフィーはｏｎ−カラム（on-column）インジェクターとフレームイオン化検出器を設置したHewlett-Packard 5890AシリーズIIガスクロマトグラフィー装置で行った。パーメチル化オリゴ糖は、架橋PS264（フィルム厚：０．０３μｍ）でコートされた溶融シリカキャピラリーカラム（１１ｍｘ０．２５ｍｍ（内径））（Fluka製）を用いて分析した。サンプルは酢酸エチルに溶解し、ｏｎ−カラムに８０℃で注入した。温度は８０℃〜３９０℃に１０℃／分で昇温し、３９０℃に２分維持するようにプログラムされていた。パーメチル化オリゴ糖のガスクロマトグラフィー／マススペクトル分析はJEOL SX-102マススペクトルに接続されたHewlett-Packard 5890AシリーズIIガスクロマトグラフィー装置を用いて行った（HanssonとKarlsson, 1990）。ＦＡＢ-ＭＳ分析はJEOL SX-102マススペクトルで行った。陰イオンＦＡＢスペクトルはＸｅ原子砲撃（10 kV）およびマトリックスとしてトリエタノールアミンを用いて得た。
【００９７】
ＮＭＲスペクトル分析  −  プロトンＮＭＲスペクトルは１１．７５ＴでJeol Alpha 500（日本国、東京、日本電子製）を用いて記録した。サンプルは分析前に重水素で置換しておき、スペクトルは３０℃において、デジタル解像度が０．３５Ｈｚ／ｐｔの条件下で記録した。化学シフトは内部溶液シグナルを用いてＴＭＳ（テトラメチルシラン）に対する相対値として示した。
【００９８】
分析的酵素試験  −  Oxford GlycoSystemsの酵素試験を、終濃度が０．３％となるようにTriton X-100を各インキュベーション混合物に加える以外は製造者の推奨する方法に従って行った。シアリダーゼとβ４−ガラクトシダーゼの混合物を消化に用いる場合には、β４−ガラクトシダーゼキットのインキュベーション用緩衝液を用いた。β-ヘキソサミニダーゼが消化混合物に含まれる場合には、この酵素キットの緩衝液を用いた。インキュベーション混合物の酵素濃度は以下の通りである：Hexβ4HexNAc−ガラクトシダーゼ（S. pneumoniae）は８０ｍＵ/ｍｌ、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ（S. pneumoniae）は１２０ｍＵ/ｍｌ、シアリダーゼ（Arthrobacter ureafaciens）は１Ｕ/ｍｌ。基質の濃度は約２０μＭだった。酵素消化は３７℃で一晩行った。消化後のサンプルは乾燥し、Ｃ/Ｍ/Ｈ2Ｏ（６０:３０:４．５、容量比）で飽和させた小さなSephadex G-25カラム、０．３ｇで脱塩した（WellsとDittmer, 1963)。各サンプルは同じ溶媒２ｍｌに溶解したものをカラムにアプライし、２．５ｍｌのＣ/Ｍ/Ｈ2０（６０:３０:４．５）および２．５ｍｌのＣ/Ｍ（２:１）で溶出した。アプライした溶液および洗浄液を回収し、窒素下で蒸発させた。
【００９９】
その他の分析方法  −  ヘキソースはDubois et al. 1956に従って検出した。
【０１００】
脱−Ｎ−アセチル化  −  GlcNAc／GalNAc残基のアセトアミド成分のアミンへの変換は、公知の記載（Angstrom et al., 1998）に従って、種々のグリコスフィンゴ脂質を無水ヒドラジンで処理することで行った。
【０１０１】
バクテリアの培養  −  ヘリコバクター ピロリは１５％（容量比）のグリセロールを含有するトリプシン ソイブロス中で−８０℃で保存した。バクテリアは初めにＧＡＢ−ＣＡＭＰアガー（Soltesz et al., 1988）中で湿度９８％の微好気条件下（Ｏ2：５〜７％、ＣＯ2：８〜１０％およびＮ2：８３〜８７％）、３７℃で４８〜７２時間培養した。標識する際には、コロニーをＧＡＢ−ＣＡＭＰアガーに接種したが、図１Ａと１Ｂに示した結果を得る際には代わりにブルセラアガー（ミシガン州、デトロイト、Difco製）を用いた。０．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．３で希釈した５０μＣｉの35Ｓ−メチオニン（英国、Amersham製）をプレートの上から振り掛けた。３７℃の微好気条件下で１２〜２４時間インキュベートした後、細胞をそぎ取り、ＰＢＳで３回洗浄し、１ｘ１０8ＣＦＵ／ｍｌとなるようにＰＢＳに再懸濁した。この方法の代わりに、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Sera-Lab製)を添加したハムＦ１２培地（英国、Gibco BRL製)にコロニーを接種した。標識には、培地１０ｍｌ当たり５０μＣｉの35Ｓ−メチオニンを添加し、振とうしながら微好気条件下で２４時間インキュベートした。バクテリアを遠心分離で回収し、培養物の純度と球状細胞が低濃度であることは位相差顕微鏡で確認した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１ｘ１０8ＣＦＵ／ｍｌとなるようにＰＢＳに再懸濁した。いずれの標識方法で得られる懸濁液も、比活性がヘリコバクター ピロリ１００体あたり１ｃｐｍとなった。
【０１０２】
ＴＬＣバクテリアオーバーレイアッセイ  −  クロロフォルム／メタノール／水 ６０:３５:８（容量比）の溶媒系を用い、ガラスまたはアルミで裏打ちされたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（ドイツ国、ダルムシュタット、Merck製）で薄層クロマトグラフィを行った。化学的検出はアニサアルデヒド染色（Waldi, 1962)で行った。バクテリアオーバーレイアッセイは公知の方法（Hansson et al., 1985)で行った。グリコスフィンゴ脂質（１〜４μｇ／レーン、または図の判例に示した濃度）をアルミで裏打ちされたシリカゲルプレートによるクロマトグラフィに付し、ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン１：３（容量比）を用いた０．３〜０．５％ポリイソブチルメチルメタクリレート溶液で１分間処理し、乾燥した後、２％ウシ血清アルブミンと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳに２時間浸漬した。放射線標識されたバクテリア（ＰＢＳで１ｘ１０8ＣＦＵ／ｍｌ、且つ１〜５ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように希釈したもの）をクロマトグラムに振り掛けて２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで繰り返し濯いだ。クロマトグラムを乾燥させた後、ＸＡＲ-５Ｘ線フィルム（米国、ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak Co.,製）に１２〜７２時間露光した。
【０１０３】
ＴＬＣタンパクオーバーレイアッセイ  −  モノクローナル抗体ＴＨ２とErythrina cristagalli レクチン（カナダ国、バーリンガム、Vector Laboratories, Inc.製）の125Ｉによる標識をヨウ素法（Iodogen method）（Aggarwal et al., 1985）で行い、平均２ｘ１０3ｃｐｍ／μｇの標識物を得た。オーバーレイの方法は、Ｔｗｅｅｎを使用せず、125Ｉ標識タンパクを２％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで約２ｘ１０3ｃｐｍ／μｌに希釈したものをバクテリア懸濁液の代わりに用いる以外はバクテリアについて上述した方法と同様に行った。
【０１０４】
分子モデリング  −  グリコスフィンゴ脂質類の最少エネルギー配座異性体は、バイオグラフ（Biograf）分子モデリングプログラム（Molecular Simulations Inc.製）内で、Silicon Graphics 4D／35TGワークステーションを用いてドライディング−ＩＩ力場（Mayo et al., 1990）で予測した。部分原子電荷を電荷平衡法（RappeとGoddard III, 1991）を使って生成し、クーロン相互作用は距離依存電子誘導定数（ε＝３．５ｒ）とした。さらに、特別水素結合項を用い、その中で最大相互作用（Ｄｈｂ）を−４ｋｃａｌ ｍｏｌ-1に設定した。Glcβ1Cer結合の二面角は次のように定義した：グルコース末端からΦ＝ H-1- C-1 - O-1 - C-1、リ＝ C-1 - O-1 - C-1 - C-2 および閘＝O-1 - C-1 - C-2 - C-3（Nyholm と Pascher, 1993 を参照)。
【０１０５】
オリゴ糖GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc は Galβ4GlcNAc（米国、セントルイス、Sigma製）から合成し、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc は Galβ4GlcNAcβ6GlcNAcから合成した。いずれもアクセプターとなる糖質を、８ｍＭ ＭｎＣｌ2および０．２ｍｇ／ｍｌ ＡＴＰの存在下、ヒト血清β３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびUDP-GlcNAcと共に５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中、３７℃で５日間インキュベートすることで行った。Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc は GlcNAcβ6GlcNAc（米国、セントルイス、Sigma製）より得られ、二糖を２０ｍＭ ＭｎＣｌ2の存在下、β４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ウシ乳由来、米国、カリフォルニア州、Calbiochem製）およびUDP-Galと共に５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４中、３７℃で数時間インキュベートすることで行った。六糖であるGalβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc（１ｍｇ、英国、Dextra labs製）は、製造元の推奨する方法により、４００ｍＵのβ３／６−ガラクトシダーゼ（米国、カリフォルニア州、Calbiochem製）で一晩処理した。オリゴ糖類はクロマトグラフィで精製し、純度はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルおよびＮＭＲで求めた。Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcは英国、リーディング、Dextra laboratories製を用いた。糖脂質GlcAβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（日本国、大阪府、和光純薬製）はLanne et al 1995の記載に基づき、Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerに還元した。糖脂質誘導体Glc(A-メチルアミド)β3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerは、Lanne et al 1995の記載に従い、GlcAβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerのグルクロン酸のカルボキシル基のアミド化によって製造した。
【０１０６】
結果
ヘプタグリコシルセラミドであるNeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerはウサギ胸腺より上述した方法に従ってＨＰＬＣで精製した。構造は、ＮＭＲおよびマススペクトルで特徴付けた（データは示していない)。七糖ガングリオシドは、本願発明者らによって試験した大部分の単離ヘリコバクター ピロリ株（約６０株）に結合した。
【０１０７】
ヘプタグリコシルセラミド材料中に存在する可能性のある微量の異性体成分を検出するために、ガングリオシドを脱シアル化し、エンドグリコセラミダーゼで処理し、その後、放出されたオリゴ糖をパーメチル化し、ガスクロマトグラフィおよびＥＩ／ＭＳで分析した（図１Ａと１Ｂ)。予想される炭水化物配列Hex-HexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hexを有する２つの糖質を六糖領域から同定し、それらをｍ／ｚ２１９，４６４，６６８，９１３および１１１８のフラグメントイオンによって確認した。メチル化の前に（ＮａＢＨ4による還元によって）炭水化物がアルジトールに変換された場合には、既に記載されているイオンの他に、はっきりとしたフラグメントイオンがｍ／ｚ２３５、６８４および１１３３に検出された（データは示さない)。全材料の９０％以上を占めた主要な糖質（ピークＢ、図１Ａと１Ｂ)は、ｍ／ｚ １８２に見られる強いフラグメントイオンによって特徴付けられ、β4GlcNAc（ネオラクト系列、２型炭水化物鎖)の存在を証明した。小さな糖質（ピークＡ、図１Ａと１Ｂ）は１型鎖（ラクト系列）の典型的なスペクトルを示し、ｍ／ｚ １８２の非常に弱いフラグメントイオンとｍ／ｚ ２２８の強いフラグメントイオンが検出された。調製物は、さらにトレース量のその他の糖陽性の物質を含んでおり、これは同じ系列の四糖含有糖類および五糖含有糖類である可能性がある。フコース含有糖類は混合物に存在しなかった。アシアロガングリオシドの純度はＦＡＢ／ＭＳおよびＮＭＲスペクトロスコピーで試験した。ヘキサグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢ／ＭＳ（図２Ａ）は予想した炭水化物配列を証明し、セラミド類は主としてスフィンゴシンとＣ１６:０脂肪酸（ｍ/ｚ ５３６．５）からなることを示した。ヘキサグリコシルセラミドに対して得られたＮＭＲスペクトル（図３Ａ）はβ−カップリングを有するアノマー領域（Ｊ〜８Ｈｚ）に対して４つの主要なダブレットを示した。これらの強度比は２:２:１:１であった。４．６５５ｐｐｍ（GlcNAcβ3)、４．２５６ｐｐｍ（内部Galβ4)、４．２０３ｐｐｍ（末端Galβ4）および４．１６６ｐｐｍ（Glcβ）は既にnLcOse6-Cerについて報告されている結果（Clausen et al., 1986）と附合していた。さらに小さなダブレットが４．８０４ｐｐｍに検出され、これは１．８１ｐｐｍの小さなメチルシグナル（大きな２型メチル共鳴の肩に見られるもの）と共に１型鎖の小さな画分の存在を示した。４．１５〜４．２５ｐｐｍの領域における重なりのために、この１型結合の位置と分布を決定することはできなかった。１型結合の全量は約１０％だった。ヘキサグリコシルセラミドをβ−ガラクトシダーゼで消化して得たペンタグリコシルセラミドに含まれる１型鎖も約５％（図３Ｂ）であり、１型結合は糖鎖内部領域および外部領域において均等に分布されている、即ち、糖脂質の約５％が１型−１型であると考えられる。
【０１０８】
糖脂質の結合活性が主要なネオラクト（２型）構造と関連しているかを調べるためにアシアロ−糖脂質をβ４−ガラクトシダーゼおよびβ-ヘキソサミニダーゼで処理し、処理産物をＴＬＣおよびオーバーレイ試験によって検討した（図４Ａ，４Ｂと４Ｃ）。予想した通り、最初の酵素はヘキサグリコシルセラミドをペンタグリコシルセラミドに変換し（４Ａ、レーン３）、２つの酵素の混合物はラクトシルセラミドに分解した（４Ｂ、レーン６)。ＴＬＣプレートを目視で観察したところ、いずれの反応も完全またはほぼ完全であった。同様の結果がシアリダーゼ処理産物および酸処理産物についても得られた。ヘキサグリコシルセラミドのβ4−ガラクトシダーゼ分解は、ＴＬＣプレート上の糖脂質の対応領域のヘリコバクター ピロリ結合活性の消失を伴い、同時にペンタグリコシルセラミド中の領域における強い活性の出現が見られた（４Ｃ、レーン３）。更なるペンタグリコシルセラミドの酵素分解の結果、この領域における結合活性は消失した。四糖領域における結合活性の出現は見られなかった。ＴＬＣプレートの化学染色に対する感度は、全てのトレース量の物質を視覚化するには低かった。
【０１０９】
別の実験において、親ガングリオシドを部分酸分解に付し、放出された糖脂質のヘリコバクター ピロリ結合活性を検討した。図５Ａと５Ｂは加水分解物のＴＬＣ（５Ａ）と35Ｓで標識したヘリコバクター ピロリを加水分解物にオーバーレイしたオートラジオグラム（５Ｂ）を示す。ヘキサ−、ペンタ−、テトラ−およびジグリコシルセラミド領域に位置する糖脂質は結合活性を示したが、トリグリコシルセラミドは不活性であった。
【０１１０】
少なくとも３種のヘリコバクター ピロリ株（１７８７５株、００２株と０３２株）で試験したヘキサ−、ペンタ−およびテトラグリコシルセラミドの結合活性は同等であった。
【０１１１】
ヘキサグリコシルセラミドから末端ガラクトースを外し、シリカゲルクロマトグラフィで精製した強い結合を示すペンタグリコシルセラミドについて詳細に検討した。この糖脂質の陰イオンＦＡＢ／ＭＳスペクトルから炭水化物配列がHexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hex-であることが確認され、ヘキサグリコシルセラミドと同じセラミド組成物が見られた（図２Ｂ）。ペンタグリコシルセラミドより得られたプロトンＮＭＲスペクトル（図３Ｂ）にはアノマー領域中に５つの主要なβ−ダブレット、即ち、４．６５３ｐｐｍ（内部GlcNAcβ3)、４．６１５ｐｐｍ（末端GlcNAcβ3)、４．２６１ｐｐｍ（２倍強度、内部Galβ4）および４．１６６ｐｐｍ（Glcβ）が検出された。これらはGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerと符合し、末端Galβを失った六糖化合物とも一致した。さらに小さなβ−ダブレットが、３置換GlcNAcβ（１型鎖）に対応する４．７８７ｐｐｍに検出された。予想したメチルシグナルはより大きな１．８２ｐｐｍのメチルシグナルの肩に見られたが、ピークの重なりがこれらシグナルの定量を妨げた。アノマープロトンの積分値から計算したところ、糖脂質の約６％が１型鎖であった。従って、２型と１型炭水化物鎖の相対比は六糖糖脂質のそれと同様であった。ヘキサグリコシル画分およびペンタグリコシル画分の両方についてＴＬＣプレートに見られる２つのスポットは、β4−ガラクトシダーゼに対する感受性をから判断して、糖鎖の組成による差ではなくセラミドの多様性を反映していた。上方のペンタ領域のスポットは、アシアロガングリオシドの非選択的加水分解およびアシアロ産物からの４−結合ガラクトース選択的開裂の両方の場合に出現した。さらに、上方のクロマトグラフィ副画分を有するヘキサグリコシルセラミドをβ４−ガラクトシダーゼおよびβ-ヘキソサミニダーゼで分解した場合には、得られるラクトシルセラミドは２つの明確なクロマトグラフィ上のバンドを示した。クロマトグラフィ上では相同なヘキサグリコシルセラミドは１つのラクトシルセラミドバンドについてのみ得られた。ペンタ領域の上方および下方の副画分はいずれもオーバーレイ試験で高い活性を示した。
【０１１２】
ネオラクト系列の六糖、五糖または四糖のグリコスフィンゴ脂質（六糖、五糖または四糖のグリコスフィンゴ脂質の構造については、それぞれ図７Ａと７Ｂのレーン６、レーン５およびレーン１にアプライしたグリコスフィンゴ脂質の構造を参照）は、ＴＬＣオーバーレイ法による準定量試験によって試験した。糖脂質の希釈系列をシリカゲルプレートにアプライし、ヘリコバクター ピロリに対する結合を標識したバクテリアのオーバーレイおよびオートラジオグラフィ後に目視で評価した（図６Ａと６Ｂ）。最も活性の高い種はペンタグリコシルセラミドであり、少なくとも０．０３９ｎｍｏｌ/スポット（７回の実験の平均値、標準偏差はδn-1＝０．０１６ｎｍｏｌ）の陽性反応をＴＬＣプレート上で示した。ヘキサ−およびテトラグリコシルセラミドはそれぞれ約０．２と０．３ｎｍｏｌの糖脂質／スポットのヘリコバクター ピロリを結合した。
【０１１３】
試験した系列において、高次糖脂質類に対するヘリコバクター ピロリの結合は非常に再現性が高かった。ペンタグリコシルおよびヘキサグリコシルセラミドに対して記録されたヘリコバクター ピロリ０３２株の結合頻度は〜９０％（プレートの合計数は約１００）だった。
【０１１４】
イソレセプターの存在と結合特異性を明示した結合アッセイ（図７Ａと７Ｂ） 
ウサギ胸腺由来のネオラクト核を有する七糖グリコスフィンゴ脂質NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよびそこから誘導したテトラ〜ヘキサグリコシルセラミドの他に、ネオラクト系列の他の糖脂質類に対しても結合特異性は存在した。
【０１１５】
薄層プレートで分離した精製グリコスフィンゴ脂質に対するヘリコバクター ピロリ（０３２株）の結合をオーバーレイアッセイで検出した結果を図７Ａと７Ｂに示した。ヘリコバクター ピロリのネオラクトテトラオシルセラミドに対する結合（レーン１）ならびにNeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerから誘導した五糖および六糖グリコスフィンゴ脂質に対する結合（レーン５と６）は、上記の結果と同一であった。しかし、予想に反し、結合はGalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（ｘ２グリコスフィンゴ脂質、レーン7）および脱フコシル化Ａ６-２グリコスフィンゴ脂質GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerにも見られた。Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（Ｂ５グリコスフィンゴ脂質、レーン２）も結合活性を有するという結果と合わせて、これらの結果は、各グリコスフィンゴ脂質にそれぞれ特異的な付着因子が複数存在するのではなく、交差反応の可能性を示した（下記参照)。さらに、上述した異なるグリコスフィンゴ脂質含有五糖の伸長物の中でバクテリア付着因子によって許容されたものはGalβ4が胸腺由来GlcNAcβ3-末端化合物に結合したものだけだった（レーン６）。従って、その他の伸長構造であるNeuAc-x2（レーン８）とGalNAcβ3-B5は結合を示さなかった。Ｂ５の内部GlcNAcβ3のアセトアミド基は結合に必須であり、この成分の水和ヒドラジンによる脱−Ｎ−アセチル化は結合の完全な消失を招いた（レーン３）。これはネオラクトテトラオシルセラミドを同様に処理した場合と同じであった。
【０１１６】
五糖グリコスフィンゴ脂質の交差結合  本発明で用いた種々のネオラクトを基礎とするグリコスフィンゴ脂質分子の結合特異性を理解するために、活性および不活性の構造体の好ましい立体配置について分子モデリングで検討した。図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄにｘ２グリコスフィンゴ脂質とその他の３種の配列を示す：脱フコシル化Ａ６-２、Ｂ５および脱−Ｎ−アセチル化Ｂ５であり、化学的に修飾されたＢ５構造以外は類似した結合強度を有する。さらにウサギ胸腺由来の五糖グリコスフィンゴ脂質（図９Ａを参照）の構造は、ｘ２構造と比べて末端残基の４位が異なるだけで活性は同等であることからこの比較に含めるべきである。４つの活性構造がすべてネオラクト核を有し、それぞれGalNAcβ3, GalNAcα3, Galα3 および GlcNAcβ3の末端を有する。これらの構造の最小エネルギー立体配座異性体は公知の方法（Teneberg et al., 1996）で製造した。その他の最小エネルギー立体配座異性体は文献（Bock et al., 1985; Meyer, 1990; Nyholm et al., 1989）に見られる先行技術に基づくものである。シアル酸末端含有グリコスフィンゴ脂質類においては、例えば図９Ｃに示したように、α３−結合残基のグリコシジル二面角としてｓｃ配座を採用したが、その他の立体配座の影響（Siebert et al., 1992)、特にａｃ配座のもの、についても試験した。さらにα６−結合変異体についても、いくつかの最小エネルギー立体配座異性体（Breg et al., 1989）を同様の目的で作製した。
【０１１７】
上述したように、４種の結合活性を有する五糖グリコスフィンゴ脂質が存在し、いずれもネオラクト核を有することは、分析結果の裏に潜んだ理由が同じ付着部位に対する交差結合であることを示唆した。しかし、見た目には、ウサギ胸腺から得られた五糖化合物と比べて末端が異なるＢ５グリコスフィンゴ脂質、即ち、先のものはGlcNAcβ3を有し、後のものはGalα3である、が同様に活性を有することに驚くかも知れないが、これもネオラクト系列の結合特異性に含むべきである。これら２つの末端糖がアノマー結合においても異なる（図８Ｃと９Ａ）にもかかわらず、最小エネルギー立体配座は立体構造上の非常に高い類似性を示し、違いはGalα3がアセトアミド基を欠失し、４−ＯＨが軸配座にあり、その環の形成する平面構造が対応する五糖化合物の平面構造よりも少し上に位置することである。しかし、４-ＯＨの位置もアセトアミド基の有無も結合に重要ではなく、それぞれ末端がGalNAcβ3とGalNAcα3であるｘ２および脱フコシル化Ａ６-２グリコスフィンゴ脂質（図８ＡとＢ）がヘリコバクター ピロリ付着因子に対する結合親和性を示すことからも分かる。これらの発見を鑑みて、ヒト赤血球から単離したGalβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（StellnerとHakomori, 1974）はバクテリア付着因子に結合すると考えられる。結合の法則に鑑みて、さらにヘリコバクター ピロリ結合エピトープ中の３種の末端単糖、具体的にはGlcNAcα3Galβ4GlcNAc, Glcβ3Galβ4GlcNAc および Glcα3Galβ4GlcNAc が三糖結合エピトープであると考えられる。これらの化合物は今までにヒト組織には見出されておらず、天然のレセプターの類似体であると考えられる。Galβ3Galβ4GlcNAc-糖脂質も３種の類似体も残念なことに試験のために入手することはできなかった。
【０１１８】
ネオラクト七糖化合物、NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、の分子モデリングも行った。図１０はGlcβCer結合を有する伸長物の最小エネルギー配座異性体の２種の投影図を示す。シアル酸はｓｎ配座で示したが、アンチ立体配座も同様に未分岐の構造に見られると考えられる（Siebert et al., 1992)。シアル酸も、六糖化合物９Ｂと比べてヘリコバクター ピロリに対する結合活性にわずかな影響しか与えないようである。１つ目の投影図と図９Ａおよび９Ｂとの比較は、七糖構造にも同様の結合エピトープが存在することを示唆した。
【０１１９】
ネオラクト結合エピトープの脱線状化  ウサギ胸腺の七糖化合物を化学的および酵素学的に分解して得た構造体の相対結合強度は、三糖配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3が最小結合配列を構成する可能性を示唆した。従って、六糖化合物においては、末端Galβ４による阻害効果が予想され、オラクトテトラオシルセラミドにおいては、エピトープの３つの糖のうち２つしか存在しないので、末端GlcNAcβ3の欠失は結合強度を低下させると考えられる。内部GlcNAcβ3の必要性は、アセトアミド基を脱−Ｎ−アセチル化してアミンにしたネオラクトテトラオシルセラミドおよびＢ５が共にバクテリアに対する結合を失ったことによって明示される。この結合性の欠失は、付着因子とアセトアミド成分との好ましい相互作用の欠失および／またはこれらグリコスフィンゴ脂質の好ましい立体配座の変化によって生じると考えられる。しかし、内部Galβ4の配置の変化によって結合エピトープに対する接触に立体障害が生じる状況を描くことは難しい。従って、最小結合配列がGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3配列を包含しなければならないことを確立したので、今度は、Ｐ１、Ｈ５-２および２つのシアリルパラグロボシド構造が結合性を欠く理由は、これら伸長物が提案した結合エピトープに直接干渉するという考えによって合理化するのは容易である。さらに、ウシ バターミルク由来のグリコスフィンゴ脂質（Teneberg et al., 1994)、即ちネオラクトテトラオシルセラミドの内部Galβ4にβ６−結合した側鎖Galβ4GlcNAcβは、結合エピトープへの接触がブロックされているために結合しない。
【０１２０】
種々の結合活性五糖配列の伸長物は、胸腺由来構造においてはGalβ4の付加のみが許容されることを示し、これは４−ＯＨの位置が赤道配座でも軸配座でもよく、それに続く立体障害による結合親和性の欠失を示した。NeuAcα3のｘ２への付加や、GalNAcβ3のＢ５への付加の結果、結合は完全に失われる。さらに、Ｈ５-２におけるFucα2単位の負の影響は、ヘリコバクター ピロリがＡ６−２とＢ６−２の両方に結合しないことによって確認された。Ｂ５と同じ三糖が末端にある伸長構造については、２つ目の内部結合エピトープが存在するにもかかわらず、Ｂ５と同様に、この末端三糖が観察された結合を担っていた。しかし、内部エピトープに対する結合は排除される可能性が高く、最後から２番目のGalβ4はウサギ胸腺由来の六糖化合物が五糖構造に比べて結合強度が低下するのと同様に結合強度を低下させる。さらにウサギ胸腺由来の七糖化合物のシアル酸残基は本発明に用いたバクテリア株に対する結合に影響を与えることはなく、その結果、エピトープ領域の外に位置することがわかる。 ヘリコバクター ピロリのシアル酸依存性および非依存性の結合が得られるかどうかは、バクテリアの株と培養条件の両方に依存する（Miller-Podraza et al., 1996,1997a,b)。
【０１２１】
以上をまとめると、ネオラクト系列のグリコスフィンゴ脂質の結合エピトープは、最大活性を得るためには三糖配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3を包含しなければならない。本願で用いたイソレセプターの結合パターンの比較および図８Ａ〜Ｄおよび９Ａ〜Ｄの構造から演繹されることは、重要ではない末端GlcNAcβ3のアセトアミド基と同じ残基の４-ＯＨを除けば、大部分の三糖は結合を生じるために重要である。
【０１２２】
レセプターの生物学的提示  インビトロにおいて入れ代わりヘリコバクター ピロリに対するレセプターとして機能する４種の五糖グリコスフィンゴ脂質のうち、ｘ２のみが天然にヒト組織に見られるが、胃癌における腫瘍組織以外には胃粘膜に見られなかった（Kannagi et al., 1982b)。Thorn et al., 1992の研究は、しかしながら、ｘ２グリコスフィンゴ脂質および末端GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ配列を有する伸長した構造が数種のヒト組織に存在することを示したが、残念なことに、胃上皮組織は検討した組織に含まれていなかった。そのため、数人の血液型Ａの個人のヒト胃粘膜上皮細胞から得た全非酸性グリコスフィンゴ脂質（レーン１〜６）に対してGalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ特異的モノクローナル抗体ＴＨ２による薄層クロマトグラムオーバーレイを実施した（図１１Ｂ）。しかし、このアッセイでは、胃上皮由来のグリコスフィンゴ脂質類に対する結合は検出されなかった。E. cristagalliのGalβ4GlcNAc-結合レクチンを用いた対応するオーバーレイを図１１Ａ、１１Ｂと１１Ｃに示した。胃上皮由来の種々のグリコスフィンゴ脂質において、初めの３つのレーンは四糖領域に対するバンドに対して弱い結合を示し、これはネオラクトテトラオシルセラミドに対すると考えられ、グリコスフィンゴ脂質の量が少なかったため、これらのバンドのヘリコバクター ピロリに対する結合は検出することができなかった（Teneberg et al., 2001)。
【０１２３】
さらに、Ｂ５グリコスフィンゴ脂質または上述した伸長構造に見られる配列であるGalα3Galβ4GlcNAcβは、Galα3の付加に関与するトランスフェラーゼが発現されないことから、健常なヒト組織には存在しないと考えられる（Larsen et al., 1990)。従って、上述した結合エピトープを有するターゲットレセプターが胃上皮細胞表面に提示されている場合には、このようなレセプターは糖タンパクの繰り返しＮ−アセチルラクトサミン因子に基づくものであり、脂質に基づく構造ではないと結論される。
【０１２４】
しかし、消化性潰瘍と関連するヘリコバクター ピロリ株、例えば、本発明で主として用いた株は、オプソニン作用を受けていないにもかかわらず、顆粒球の炎症反応を刺激した（Rautelin et al., 1994a,b)。バクテリアの食作用において最初に起こる事柄は特定のレクチン様相互作用を含み、その結果、顆粒球の凝集が生じる（OfekとSharon, 1988)。食作用に続いて、酸化的バースト反応を生じるが、これはヘリコバクター ピロリ関連疾患の病因を導くものとも考えられる（Babior, 1978)。顆粒球の酸性および非酸性グリコスフィンゴ脂質には、ネオラクト核と繰り返しラクトサミン単位の両方を有するものを含み、シアル化七糖化合物も含まれる、これらはアセチル型のシアル酸アセトアミド基が単離および特徴付けられているもの（Fukuda et al., 1985; Stroud et al., 1996）を含み、ヘリコバクター ピロリに対する白血球表面の潜在的レセプターとして機能しうる。更に、Ｘ2グリコスフィンゴ脂質も同じ材料から単離されている（Teneberg, S.、未発表)。
【０１２５】
図１１Ｂに戻ると、モノクローナル抗体ＴＨ２は顆粒球と赤血球の両方の五糖領域、即ち、ｘ２グリコスフィンゴ脂質に対応するとも考えられる領域、のバンドに結合する（それぞれレーン７と８)（Teneberg, S., 未発表; Thorn et al., 1992; Teneberg et al., 1996)。同様に、ネオラクトテトラオシルセラミドも顆粒球と赤血球の両方に存在することが E. cristagalli のレクチンを代わりに用いたオーバーレイアッセイ（図１１Ｃ、レーン７と８）から分かった。この２つのケースにおいて、ヘリコバクター ピロリはネオラクトテトラオシルセラミドに結合した（Bergstom, J., 未発表)。顆粒球については、Fukuda et al., 1985の結果に基づいた、ネオラクトテトラオシルセラミドを１つのＮ−アセチルラクトースアミン単位で伸長させたものに対応すると考えられる比較的弱いバンドが六糖領域に見られた。これらグリコスフィンゴ脂質が上述した凝集反応における主要なターゲットであるか否かは未だ明らかとなっていない。
【０１２６】
ネオ糖脂質および新規糖脂質の分析 
オリゴ糖類GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc, GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc, Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcならびにマルトへプタオース（米国、セントルイス、Sigma製）をシアノボロハイドライドを用いて４−ヘキサアデシニルアニリン（ＨＤＡと略す、スウエーデン国、ストックホルム、Aldrich製）を還元的にアミン化した（Halina Miller-Podraza, いずれ発行される)。産物をマススペクトルで特徴づけ、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc(red)-HDA, GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc(red)-HDA, Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA, GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA および マルトへプタオース(red)-HDA［“(red)-”は糖質の還元末端グルコースおよびヘキサアデシニルアニリン（ＨＤＡ）のアミン基の還元的アミン化によって得られたアミン結合構造である］ことが確認された。化合物Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDAは、はっきりとした結合活性を示し、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc(red)-HDAは上述したＴＬＣオーバーレイアッセイにおいてヘリコバクター ピロリに対して強い結合を示し、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc(red)-HDA および マルトへプタオース(red)-HDAは弱い結合を示すか、または不活性であった。この例は四糖GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galがヘリコバクター ピロリに結合する構造であることを示す。還元によってGlc-残基のピラノース環構造が壊れるので還元末端Glc-残基は結合に必要はないと考えられる。一方、還元末端GlcNAcのインタクトな環構造は三糖GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcの優れた結合に必要である。
【０１２７】
ＮＨＫ−１糖脂質GlcAβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerの生合成した前駆体類似体および新規な糖脂質であるGlcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer および Glc(A-メチルアミド)β3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerをＴＬＣオーバーレイアッセイで試験したところ、ヘリコバクター ピロリに対する結合活性が見られた。Glc(A-メチルアミド）とはグルクロン酸誘導体であって、カルボキシル基がメチルアミンによってアミド化されたものである。Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer構造はヘリコバクター ピロリに対して強い結合を示し、Glc(A-メチルアミド)β3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerはヘリコバクター ピロリに対して非常に強い結合を示した。
【０１２８】
トランスグリコシル化反応によるGlcAβ3Galβ4Glc(NAc）の製造 
アクセプターである糖質Galβ4GlcまたはGalβ4GlcNAc（約１０〜２０ｍＭ）を１０倍モル量の、過剰量のパラニトロフェニル−β−グルクロン酸とウシ肝臓β−グルクロニダーゼ（２００００Ｕ、Sigma製）を含むｐＨが約５の緩衝液と共に３７℃で、撹拌しながら５日間インキュベートした。産物はＨＰＬＣで精製した。
【０１２９】
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【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】ヘキサグリコシルセラミドをエンドグリコセラミダーゼで消化して得たパーメチル化オリゴ糖のＥＩ／ＭＳ。上の図はオリゴ糖のガスクロマトグラムであり、下の図はガスクロマトグラムのピークＡのＥＩ／ＭＳスペクトルである。
【図１Ｂ】ヘキサグリコシルセラミドをエンドグリコセラミダーゼで消化して得たパーメチル化オリゴ糖のＥＩ／ＭＳ。上の図はオリゴ糖のガスクロマトグラムであり、下の図はガスクロマトグラムのピークＢのＥＩ／ＭＳスペクトルである。
【図２Ａ】ヘキサグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢマススペクトルである。
【図２Ｂ】ペンタグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢマススペクトルである。
【図３Ａ】六糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンＮＭＲスペクトルであり、微量な１型成分に対して良好なシグナル／ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図３Ｂ】五糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンＮＭＲスペクトルであり、微量な１型成分に対して良好なシグナル／ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図４】ウサギ胸腺グリコスフィンゴ脂質の酵素分解を示す。シリカゲルの薄層プレートはＣ／Ｍ／Ｈ2Ｏ（容量比は６０：３５：８）で展開した。ＡとＢは４−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Ｃは35Ｓでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン１：ヘプタグリコシルセラミド NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、レーン２：脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド（酸処理後に得たもの）、レーン３：β４−ガラクトシダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン４：シアリダーゼおよびβ４−ガラクトシダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド、レーン５：ヒト赤血球由来の参照用グリコスフィンゴ脂質類（ラクトシルセラミド、トリヘキソシルセラミドおよびグロボシド）、レーン６：β４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン７：シアリダーゼ、β４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド。
【図５】ウサギ胸腺ヘプタグリコシルセラミド NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerの部分酸加水分解後に得たＴＬＣ産物を示す。展開溶媒は図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃと同じである。Ａは４−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Ｂは35Ｓでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン１：ヘプタグリコシルセラミド、レーン２：脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド（酸処理後）、レーン３：ペンタグリコシルセラミド、レーン４：加水分解物、レーン５：参照用グリコスフィンゴ脂質類（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃと同じ）。
【図６Ａ】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。ＴＬＣプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図４と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ヘキサグリコシルセラミドおよびペンタグリコシルセラミド（Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）を用い、各糖脂質の量（ｐｍｏｌ）はレーン１：１２８０、レーン２：６４０、レーン３：３２０、レーン４：１６０、レーン５：８０、レーン６：４０、レーン７：２０とした。
【図６Ｂ】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。ＴＬＣプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図４と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ペンタグリコシルセラミドおよびテトラグリコシルセラミド（GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer および Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）を用い、各糖脂質の量（ｐｍｏｌ）はレーン１：１２８０、レーン２：６４０、レーン３：３２０、レーン４：１６０、レーン５：８０、レーン６：４０、レーン７：２０とした。
【図７】Ａは４−メトキシベンザアルデヒドで検出した分離グリコスフィンゴ脂質を示す薄層クロマトグラムであり、Ｂはそこに放射線標識したヘリコバクター ピロリ０３２株を結合させた分離グリコスフィンゴ脂質を示すオートラジオグラムである。アルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Merck製）上で、クロロフォルム／メタノール／水の容量比が６０：３５：８の溶媒系を用いてグリコスフィンゴ脂質を分離した。結合アッセイは、「材料と方法」の欄で記載したように行った。オートラジオグラフィは７時間行った。各レーンは以下のグリコスフィンゴ脂質を含んでいた。  レーン１）Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ネオラクトテトラオシルセラミド）、４μg；  レーン２）Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｂ５グリコスフィンゴ脂質）、４μg;   レーン３）Galα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer、４μg；  レーン４）Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｂ６ ２型 グリコスフィンゴ脂質)、４μg；  レーン５）GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、４μg；  レーン６）Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、４μg；  レーン７）GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ｘ２ グリコスフィンゴ脂質)、４μg；  レーン８）NeuAcα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-x2）、４μg；  レーン９）Fucα2Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｈ５ ２型 グリコスフィンゴ脂質）、４μg；  レーン１０）NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（シアリルネオラクトテトラオシルセラミド）、４μg。
【図８Ａ】ヘリコバクター ピロリに結合するグリコスフィンゴ脂質であるGalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。アノマー性に違いがあるものの、アセトアミド基の有無、末端糖の４−ＯＨ基の軸配座または赤道配座、ならびに末端α３−結合化合物の環の形成する平面構造がβ３−結合した対応化合物の平面構造よりも少し上に位置することは、図８Ａ〜８Ｃに示したグリコスフィンゴ脂質類のみならず、ウサギ胸腺から誘導したGlcNAcβ3-末端を有する構造体（図９Ａを参照）とも重要な立体構造上の類似点が存在することを示し、バクテリア付着因子に対してこれらが示す類似した親和性を説明した。一方、内部GlcNAcβ3のアセトアミド基は結合に必須であった（図８Ｃと図８Ｄを参照）。
【図８Ｂ】ヘリコバクター ピロリに結合するグリコスフィンゴ脂質であるGalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最少エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。
【図８Ｃ】ヘリコバクター ピロリに結合するグリコスフィンゴ脂質であるGalα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最少エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。
【図８Ｄ】ヘリコバクター ピロリに結合しないグリコスフィンゴ脂質であるGalα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4GlcβCer について予測した、最少エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。
【図９Ａ】結合活性を有するグリコスフィンゴ脂質である GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。Ｂ５の内部GlcNAcにおけるアセトアミド成分の脱Ｎ−アセチル化（図８Ａ，８Ｂ，８Ｃおよび８Ｄ）は結合能を完全に除去するという発見と共に、結合エピトープが図８Ｃに示したＢ５の末端三糖からなるものでなければならないことが分かった。これは末端Ｎ−アセチルガラクトサミンのアセトアミド基が必須ではないためである。
【図９Ｂ】結合活性を有するグリコスフィンゴ脂質であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4-GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。このグリコスフィンゴ脂質はヘリコバクター ピロリに対する結合能を有しているが、その親和性は低下している。
【図９Ｃ】結合活性を有していないグリコスフィンゴ脂質であるNeuAcα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。このグリコスフィンゴ脂質はヘリコバクター ピロリに対する結合能を完全に失っている。
【図９Ｄ】結合活性を有していないグリコスフィンゴ脂質であるGalα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。このグリコスフィンゴ脂質はヘリコバクター ピロリに対する結合能を完全に失っている。
【図１０】七糖化合物であるNeuGlcα3Galβ4-GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerの最小エネルギー配座異性体であって、互いに対して９０°回転させた２種投影図である。シアリル酸のグリコリル成分の末端炭素原子および２つのGlcNAc残基のアセトアミド基のメチル炭素原子は、配向を分かりやすくするために黒で示した。Glcβcer結合については、図示するために長鎖の立体構造を任意で選択したが、ここに示したものよりも最小結合配列であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3のほうが近接するGlcβCer立体構造中の付着因子に対してより露出した状態にあると考えられる。
【図１１】ヒト胃粘膜から得た上皮細胞、ヒト顆粒球およびヒト赤血球のそれぞれより単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分の薄層クロマトグラムであり、Ｂはモノクローナル抗体ＴＨ２を結合させたもので、ＣはE. cristagalli 由来のレクチンを結合させたものである。Ａは同じ画分を４−メトキシベンザアルデヒドで染色した。オートラジオグラフィは１２時間行った。レーン１〜６には、血液型がＡである５人から提供されたヒト胃粘膜から得た上皮細胞より単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分を８０μｇずつアプライし、レーン７にはヒト顆粒球より単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分を４０μｇアプライし、レーン８にはヒト赤血球より単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分を４０μｇアプライした。オーバーレイアッセイは、「材料と方法」の欄で記載したように行った。