【手続補正書】
【提出日】平成17年8月18日(2005.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５９〜配列番号１２８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５９〜配列番号１２８から選択されたいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、転写調節活性を有する蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１〜配列番号５８から選択されたいずれかの配列番号に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、転写調節活性を有する蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）（ａ）から（ｄ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載の塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載の塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドのいずれか一つによってコードされる蛋白質、またはその部分ペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載されたいずれかの蛋白質、またはペプチドに結合する抗体。
【請求項４】
請求項２に記載されたいずれかの蛋白質、またはペプチドと、請求項３に記載の抗体とを接触させ、両者の結合を観察する工程を含む、請求項２に記載されたいずれかの蛋白質、またはペプチドの免疫学的測定方法。
【請求項５】
請求項１に記載されたポリヌクレオチドのいずれか一つを含むベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項５に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項７】
請求項１に記載されたポリヌクレオチドのいずれか一つ、または請求項５に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項２に記載されたいずれかの蛋白質またはペプチドの製造方法。
【請求項９】
配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載された塩基配列、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる１５ヌクレオチド以上の鎖長を持つオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のオリゴヌクレオチドからなる、ポリヌクレオチド合成用プライマー。
【請求項１１】
請求項９に記載のオリゴヌクレオチドからなる、ポリヌクレオチドの検出用プローブ。
【請求項１２】
請求項１に記載のいずれかのポリヌクレオチドもしくはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項１３】
次の工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドの検出方法：
ａ）標的ポリヌクレオチドと請求項９に記載のオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションが可能な条件下でインキュベートする工程、
ｂ）標的ポリヌクレオチドと請求項９に記載のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程。
【請求項１４】
配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載された塩基配列および／または配列番号５９〜配列番号１２８のいずれかに記載のアミノ酸配列から選択された少なくとも１つの配列情報を含むポリヌクレオチドおよび／または蛋白質データベース。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】新規な全長ｃＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質、及びそれらの新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界的なレベルで様々な生物のゲノム配列の解明とその解析が進められている。既に40種類を越える原核微生物、下等真核生物の出芽酵母、多細胞性真核生物である線虫、高等植物であるシロイヌナズナ等で、その全ゲノム配列が決定された。30億塩基対といわれるヒトのゲノムについては、世界的な協力体制のもとでその解析が進められて2001年にドラフト配列が公開された。そして、2002〜2003年にはその全構造が明らかになり、公開されようとしている。ゲノム配列を明らかにする目的は、全ての遺伝子の機能や制御、あるいは遺伝子間、蛋白質間、細胞間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な生命現象を理解するところにある。種々の生物種のゲノム情報から生命現象を解明していくことは、単に学術分野における研究課題として重要であるのみならず、そこで得られる研究成果をいかに産業上の応用へと発展させていくかという点で、その社会的な意義も大きい。
【０００３】
ところが単にゲノム配列を決定しただけでは、全ての遺伝子の機能を明らかにできるわけではない。例えば酵母では、ゲノム配列から推定された約6,000の遺伝子の約半数しか、その機能を推定できなかった。一方、ヒトには約3〜4万種類の遺伝子が存在すると推測されており、さらにオルタナティブスプライシングによるバリアントも考慮に入れると10万種以上のmRNAが存在すると言われている。そこで、ゲノム配列から明らかにされてくる膨大な量の新しい遺伝子の機能を、迅速かつ効率的に解明していくための「ハイスループット遺伝子機能解析システム」の確立が、強く望まれている。
【０００４】
真核生物のゲノム配列では、多くの場合、一つの遺伝子がイントロンによって複数のエキソンに分断されている。そのため、ゲノム配列情報だけからそこにコードされる蛋白質の構造を正確に予測するには、多くの問題がある。一方、イントロンが除かれたmRNAから作製されるcDNAでは、蛋白質のアミノ酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、容易にその一次構造を明らかにすることが可能である。ヒトのcDNAの研究では、これまでに300万を越えるEST（Expression Sequence Tags）データがパブリックドメインに公開されており、それらはヒトの全遺伝子の80%以上をカバーしているものと推定されている。
これらの情報は、ヒト遺伝子構造の解明やゲノム配列におけるエキソン領域の予測、あるいはその発現プロファイルの推定など、様々な角度から利用されている。ところが、これらのヒトEST情報の多くはcDNAの3′末端側近傍に集中しているため、特にmRNAの5'末端近傍の情報が極端に不足している状況にある。また、ヒトcDNAの中で全長でコードされている蛋白質の配列が予測されているmRNAは約1万3千種類程度である。
【０００５】
完全長cDNAでは、その5'末端配列からゲノム配列上でのmRNA転写開始点が特定できる上、その配列の中に含まれるmRNAの安定性や翻訳段階での発現制御に関わる因子の解析が可能である。また、翻訳開始点であるATGコドンを5'側に含むことから、正しいフレームで蛋白質への翻訳を行うことができる。したがって、適当な遺伝子発現系を適用することで、そのcDNAがコードする蛋白質を大量に生産したり、蛋白質を発現させてその生物学的活性を解析することも可能になる。このように、完全長cDNAの解析からはゲノム配列解析を相補する重要な情報が得られる。また、発現可能な全長cDNAクローンは、その遺伝子の機能の実証的な解析や産業分野での応用への展開において、その重要性はきわめて高い。
【０００６】
したがって新規なヒト全長cDNAが単離されれば、それらの遺伝子が関与している種々の疾患に対する医薬品開発に利用され得る。これらの遺伝子がコードする蛋白質はそれ自身に医薬品としての有用性を期待できる。したがって、新規なヒト蛋白質をコードするcDNAの全長を取得することには大きな意義がある。
特にヒト分泌蛋白質、または膜蛋白質には、そのものがティッシュープラスミノーゲンアクチベーター (TPA)のように、医薬品として有用なものや、膜レセプターのように医薬品の標的蛋白質になりうるものが多い。また、シグナル伝達関連蛋白質（Protein kinase等）、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質等は疾患との関係が解明されている遺伝子が多い。更に疾患関連蛋白質の遺伝子は、ヒト遺伝子と疾患の関係が解明されている遺伝子が多い遺伝子群である。
したがって、ヒトにおいて分離が進んでいない新規な全長cDNAを提供する意義は大きい。中でも、分泌・膜蛋白質をコードする蛋白質をコードするcDNAは、蛋白質自身に医薬品としての有用性を期待できること、あるいは疾患に関連する遺伝子を多く含む可能性のあることから、未知のcDNAの分離が望まれている。あるいは、疾患との関連性が強いと予測される遺伝子群である、シグナル伝達蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質、そして疾患関連蛋白質をコードする遺伝子も、治療のための標的分子として、またこれらの蛋白質自身に医薬品としての有用性を期待できる。したがって、これらの蛋白質をコードするcDNAの全長を明らかにすることには大きな意義がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質、並びにその用途の提供を課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オリゴキャップ法[K. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994); Y. Suzuki et al., Gene, 200: 149-156 (1997)]を改良した方法(WO 01/04286)で作成した全長率の非常に高いヒトcDNAライブラリーから、全長cDNAクローンであると予測される、ヒト全長cDNAを効率よくクローニングする方法を開発した。次いで、この方法で取得した全長率の高いcDNAクローンの塩基配列を主に5'側から、また必要に応じ3'側からも決定した。
更に、得られたクローンのうち新規で全長と予測される代表的クローンについて全長塩基配列を決定した。得られた全長塩基配列について、以下に示すデータベースに対してBLASTを用いた相同性検索を行った。本発明の相同性検索は、cDNAの全コード領域を含む全長cDNAの情報に基づいて行われているので、蛋白質のあらゆる部分に対する相同性を解析することができる。したがって本発明においては、相同性検索の信頼性が飛躍的に向上している。
［1］SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/ebi_docsSwissProt_db/swisshome.html)、
［2］GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/GenBank)、
［3］UniGene(Human)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)、および
［4］nr(重複を除いたGenBankの塩基配列のコーディングシークエンス（CDS）データ、
SwissProt、
PDB(http://www.rcsb.org/pdb/index.html)、
PIR(http://pir.georgetown.edu/pirwww/pirhome.shtml)、
PRF(http://www.prf.or.jp/en/)、を組み合わせて構築されている蛋白質データベース)
【０００９】
また得られた5'側の塩基配列をもとに構築した大規模cDNAデータベースを解析して、全長塩基配列を決定したクローンの遺伝子発現プロファイルを解析した。このようなコンピューターを用いた発現プロファイルに加えて、更にPCR法を利用して生細胞における発現プロファイルも解析した。本発明者らは、これらの解析の結果に基づいて、本発明の遺伝子の有用性を明らかにした。
本発明においては、全長塩基配列情報に基づくin silicoでの発現プロファイルの解析によって遺伝子の機能を明らかにしている。発現頻度解析に用いた発現プロファイルは、十分量の断片配列のデータベースに基づいて解析した。この発現プロファイルに、本発明で得られた多くのcDNAクローンの全長塩基配列を照合することによって、発現頻度解析を行った。このように、量的に十分な解析母体（発現プロファイル）に対して、幅広い遺伝子の全長塩基配列を照合したことによって、信頼性の高い解析が可能となった。すなわち、本発明の全長配列を利用した発現頻度解析の結果は、あるcDNAライブラリーの由来となった組織や細胞の遺伝子発現頻度をより正確に反映していると言うことができる。つまり、本発明のcDNAの全長塩基配列情報によって、信頼性の高い発現頻度解析が可能となったことを意味している。     
【００１０】
本発明における全長cDNAクローンは、[1]オリゴキャップ法による全長率の高いcDNAライブラリーの作成、および[2] 5'末端側の配列をアセンブルし、その結果形成されたクラスターの中でも最も全長らしいもの（5'側に長いものが多い）を選択する、という方法を組み合わせて取得した、全長ｃDNAクローンである。しかし、本発明が提供するポリヌクレオチドの5'末端および3'末端の配列をもとに設計されたプライマーを利用すれば、必ずしもこのような特殊な方法を用いずとも、容易に全長cDNAの取得が可能となる。なお、発現可能なcDNAを取得するためのプライマー設計は、ポリヌクレオチドの5'末端および3'末端配列を用いることに限定されない。
【００１１】
すなわち本発明は、次のポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に関する。
〔１〕下記（ａ）から（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５９〜配列番号１２８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５９〜配列番号１２８から選択されたいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、転写調節活性を有する蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１〜配列番号５８から選択されたいずれかの配列番号に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、転写調節活性を有する蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）（ａ）から（ｄ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載の塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載の塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔２〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドのいずれか一つによってコードされる蛋白質、またはその部分ペプチド。
〔３〕〔２〕に記載されたいずれかの蛋白質、またはペプチドに結合する抗体。
〔４〕〔２〕に記載されたいずれかの蛋白質、またはペプチドと、〔３〕に記載の抗体とを接触させ、両者の結合を観察する工程を含む、〔２〕に記載されたいずれかの蛋白質、またはペプチドの免疫学的測定方法。
〔５〕〔１〕に記載されたポリヌクレオチドのいずれか一つを含むベクター。
〔６〕〔１〕に記載のポリヌクレオチド、または〔５〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔７〕〔１〕に記載されたポリヌクレオチドのいずれか一つ、または〔５〕に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。
〔８〕〔７〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔２〕に記載されたいずれかの蛋白質またはペプチドの製造方法。
〔９〕配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載された塩基配列、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる１５ヌクレオチド以上の鎖長を持つオリゴヌクレオチド。
〔１０〕〔９〕に記載のオリゴヌクレオチドからなる、ポリヌクレオチド合成用プライマー。
〔１１〕〔９〕に記載のオリゴヌクレオチドからなる、ポリヌクレオチドの検出用プローブ。
〔１２〕〔１〕に記載のいずれかのポリヌクレオチドもしくはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド。
〔１３〕次の工程を含む、〔１〕に記載のポリヌクレオチドの検出方法：
ａ）標的ポリヌクレオチドと〔９〕に記載のオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションが可能な条件下でインキュベートする工程、
ｂ）標的ポリヌクレオチドと〔９〕に記載のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程。
〔１４〕配列番号１〜配列番号５８のいずれかに記載された塩基配列および／または配列番号５９〜配列番号１２８のいずれかに記載のアミノ酸配列から選択された少なくとも１つの配列情報を含むポリヌクレオチドおよび／または蛋白質データベース。
【００１２】
本発明において、ポリヌクレオチドとはDNAやRNAのようにヌクレオチドが多数重合した分子を意味する。重合するヌクレオチドの数は特に制限されない。ポリヌクレオチドの重合度が比較的低い場合には特にオリゴヌクレオチドとも表現するが、これも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。本発明のポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、天然のものであることもできるし、化学的に合成されたものであることもできる。あるいはまた、鋳型となるDNAをもとにPCRのような酵素的な反応によって合成されたものであっても良い。更に本発明のポリヌクレオチドは、化学的に修飾されたものであっても良い。また本発明には、１本鎖ポリヌクレオチドのみならず、２本鎖ポリヌクレオチドも含まれる。本明細書、特に請求項において、単にポリヌクレオチドと記載するときには、１本鎖ポリヌクレオチドのみならず２本鎖ポリヌクレオチドをも指すものとする。２本鎖ポリヌクレオチドを意味するときには、一方の鎖のみについての塩基配列が記載されることになるが、センス鎖の塩基配列に基づいてその相補鎖の塩基配列は必然的に規定される。
【００１３】
本発明によって提供されるcDNAはいずれも全長cDNAである。本発明における全長cDNAとは、そのcDNAの翻訳開始点となるATGコドンを含むことを意味する。天然のmRNAが蛋白質コード領域の上流や下流に本来備えている非翻訳領域の有無は問わない。また本発明の全長cDNAは、望ましくは終止コドンを有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、５８のポリヌクレオチドが提供された。全長cDNAの分離が進んでいないヒトにおいて、新規な全長cDNAを提供した意義は大きい。分泌蛋白質、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質等は、多くの疾患に関連した蛋白質であることがわかっている。疾患に関連した遺伝子や蛋白質は、診断マーカー、発現や活性を制御する医薬品の開発、あるいは遺伝子治療のターゲットになるなど医薬品の開発等に有効である。
中でも、分泌蛋白質をコードするcDNAは、蛋白質自身に医薬品としての有用性が期待できること、および多くの疾患に関連する遺伝子を含む可能性があることから、本発明によって提供されたこれらのcDNAは、産業上きわめて重要である。さらに、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、転写関連蛋白質、あるいは疾患関連蛋白質といった蛋白質やそれをコードする遺伝子についても、疾患の指標となること等が期待できる。これらのcDNAも、産業上きわめて重要であり、コードする蛋白質の持つ活性の制御や、発現の制御を通じて疾患の治療効果をもたらすこと等が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のすべてのクローン（５８クローン）は新規で、蛋白質の全長をコードするものである。またすべてのクローンは、全長性の高いオリゴキャップ法で取得されたcDNAであり、その5'末端配列をGenBank、UniGeneデータベースの"complete cds"表記のあるmRNA配列に対して、BLAST [S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers & D. J. Lipman, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); W. Gish & D. J. States, Nature Genet., 3: 266-272 (1993)]により相同性検索を行って選別された、ヒトmRNAに対して同一でない（すなわち新規である）クローンであり、またアセンブルを行った結果形成されたクラスターのメンバーのうちでより全長性が高いと思われるクローンである。クラスター中で全長性が高いと思われる塩基配列は、5'側に長いものが最も多かった。
【００１６】
本発明の全ての全長cDNAは、5'末端配列と3'末端配列に基づいて設計されたプライマーセット、あるいは5'末端配列に基づいて設計されたプライマーとポリA配列に対応するオリゴdT配列とで構成されるプライマーセットを使用し、PCR（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4）等の手法を用いることにより合成することができる。
表１に、本発明の全長cDNA５８クローンのクローン名とその全長塩基配列を示す配列番号、および全長塩基配列から推定されるCDS部位と翻訳されたアミノ酸を示す配列番号を示す。CDS部位の存在位置については、「DDBJ/EMBL/GenBank Feature Table Definition」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab/FT/index.html）の規則に従って記載した。開始位置番号はメチオニンをコードする塩基である「ATG」の１文字目であり、終了位置番号はストップコドンの３文字目である。これを「..」で挟んで記載した。ただし、終止コドンが現れないクローンについては上記規則に則って「＞」を用いて終了位置を記載した。
また、BRAMY20170140, CTONG20050280, D3OST30002580, HCHON20035130, OCBBF20060300, OCBBF20066390, SKMUS20012010, SPLEN20095410, TESTI20130010, TESTI20319190, TRACH20079690については、別のORFの機能が転写関連蛋白質に属すると機能解析でき、これらのORFを有するクローンをそれぞれ、BRAMY20170141, CTONG20050281, CTONG20050282, D3OST30002581, HCHON20035131, OCBBF20060301, OCBBF20066391, SKMUS20012011, SPLEN20095411, TESTI20130011, TESTI20319191, TRACH20079691として記載した。
【００１７】
【表１】
2005237384.tif 000001
2005237384.tif 000002
【００１８】
すなわち前記表１中の配列番号に示した本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、当該ポリヌクレオチドを合成するためのプライマーをデザインすることができる。なお全長cDNAの合成を目的とするとき、3'側のプライマーとしてはオリゴdTプライマーを用いることもできる。プライマーの長さは、通常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。後に述べるLA PCRに用いる場合には、25〜35bpの長さとすると良い結果を得ることができる。
【００１９】
目的とする塩基配列に基づいて、特異的な増幅を可能とするプライマーを設計する手法は公知である（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4）。5'側の塩基配列に基づいてプライマーを設計する際には、原則として増幅生成物が翻訳開始点を含むようにする。したがって、たとえば5'側のプライマーを5'側の非翻訳領域(5'UTR)の塩基配列に基づいて設定する場合には、対象となるcDNAに対する特異性を保証できる限り、任意の部分を5'側のプライマーとして選択することができる。
【００２０】
全長cDNAを合成する場合には、その増幅対象塩基配列は長いものでは数千bpにも及ぶ。しかしLA PCR(Long and Accurate PCR)等を利用することにより、このような長い領域の合成は可能である。長いDNAの合成には、LA PCRを利用するのが有利である。LA PCRでは、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持った特殊なDNAポリメラーゼを用いることにより、誤って取りこまれた塩基を除去できる。そのため、長い塩基配列であっても正確に相補鎖合成を進めることができるのである。LA PCRを利用すれば、望ましい条件においては、２０kb以上の増幅が可能とされている。（林健志、実験医学別冊・PCRの最新技術、羊土社,1996）
【００２１】
本発明の全長cDNAを合成するための鋳型となるDNAには、様々な方法によって調製したcDNAライブラリーを利用することができる。本発明における全長cDNAクローンは、[1]オリゴキャップ法による全長率の非常に高いcDNAライブラリーの作製、および[2] 5'末端側の配列をアセンブルし、その結果形成されたクラスターの中でも最も全長らしいクローン（5'側に長いものが多い）を選択する、という方法を組み合わせて取得した、より全長である確率の高いクローンである。
しかし、本発明によって提供される全長塩基配列に基づいてデザインされるプライマーを利用すれば、必ずしもこのような特殊な方法を用いずとも、容易に全長cDNAの取得が可能となる。
【００２２】
すなわち、公知の方法によって調製されたcDNAライブラリー、あるいは市販のcDNAライブラリーは、全長mRNAをまったく含まないものではなく、その割合が非常に低い。したがって、通常のクローニング方法では、これらのライブラリーから全長cDNAクローンを直接スクリーニングすることは困難である。しかし、本発明によって新規な全長cDNAの塩基配列が明らかにされた。全長塩基配列が与えられれば、PCRのような酵素的な合成方法を利用して目的とする全長cDNAを合成することが可能である。ただし、より確実に全長cDNAの合成を行うには、たとえばオリゴキャップ法等によって合成された全長率の高いcDNAライブラリーの使用が望ましいことは言うまでもない。
【００２３】
本発明の全長cDNAクローンの5'-端を含む塩基配列を利用すれば、ゲノム上のプロモーターを含む転写制御領域を単離することが可能となる。既にヒトゲノムの90%以上をカバーするラフドラフト（精度が少し低いヒトゲノム配列解析）が報告されている(Nature, Vol.409, 814-823, 2001)。さらに、2003年までにはヒト全ゲノム配列解析が完了する計画になっている。長いイントロンの存在するヒトゲノムより転写開始点を解析ソフトで解析することは大きな困難がともなう。しかし、本発明の全長cDNAクローンの5'-端を含む塩基配列を用いれば、全長cDNAの5'-端を含む塩基配列からゲノム配列上でのmRNA転写開始点を容易に特定できるため、転写開始点上流配列の中に含まれるプロモーターを含む転写制御に関わるゲノム領域を取得することが容易となる。
【００２４】
本発明の全長cDNAによってコードされる蛋白質は、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質は、例えば、後述するように本発明の蛋白質をコードするDNAを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現した蛋白質を精製することにより調製することが可能である。一方、天然の蛋白質は、例えば、後述する本発明の蛋白質に対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 16.1-16.19)。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーション（例えば、「On the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbit reticulocyte lysate system. Dasso,M.C.,Jackson,R.J.(1989) Nucleic Acids Res.17:3129-3144」参照）などにより本発明の蛋白質を調製することも可能である。
【００２５】
具体的には、本発明のポリヌクレオチドを無細胞転写翻訳系に供することにより蛋白質発現を誘導し、本発明の蛋白質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡから蛋白質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしている蛋白質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。無細胞蛋白質合成系として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B.D.& Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の無細胞蛋白質合成系、または細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、E. coli S30 extract system（Promega社製）とRTS500 Rapid Translation System（Roche社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System（Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSＴＭ（TOYOBO社製）等が挙げられる。
【００２６】
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明の蛋白質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、例えばエピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合蛋白質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該蛋白質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００２７】
前記のようにして明らかにされた本発明による蛋白質の活性に基づいて、本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることができる。ある蛋白質が本発明の蛋白質と機能的に同等であるかどうかは、本発明の蛋白質が備える生物学的な活性を指標として、該活性をある蛋白質が有するかどうかを調べることによって確認することができる。
【００２８】
これら本発明において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法（例えば、部位特異的変異誘発法(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 8.1-8.5)）を利用して調製することができる。また、このような蛋白質は、自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列（表１）において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加された蛋白質も含まれる。
【００２９】
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、３０％以内、または２０％以内、または１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内、または３％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の２％以内であり、更に好ましくは全アミノ酸の１％以内である。あるいは本発明には複数のアミノ酸として数個のアミノ酸の変異を置換する場合が含まれる。数個とは、たとえば５、更には４または３、あるいは２、更には１のアミノ酸を言う。
置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能の保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
【００３０】
また、本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 6.3-6.4)を用いて本実施例において同定された蛋白質をコードするDNAの塩基配列（表１）またはその一部をもとにこれと相同性の高いDNAを単離して、該DNAから機能的に同等な蛋白質を得ることは、通常行いうることである。本発明には、本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするDNAとハイブリダイズするDNAによりコードされる蛋白質も含まれる。機能的に同等な蛋白質を単離する生物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ等の脊椎動物が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３１】
機能的に同等な蛋白質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、洗浄条件として通常「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「0.1xSSC、0.1% SDS、65℃」程度を示すことができる。あるいは、次のような条件を本発明におけるハイブリダイゼーションの条件として示すこともできる。すなわち、ハイブリダイゼーションを「6 x SSC、40 % ホルムアミド、25 ℃」、洗浄を「1 x SSC、55 ℃」で行う条件を用いることができる。より好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「6 x SSC、40 % ホルムアミド、37 ℃」、洗浄を「0.2 x SSC、55 ℃」で行う条件が挙げられる。さらに好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「6 x SSC、50 % ホルムアミド、37 ℃」、洗浄を「0.1 x SSC、62 ℃」で行う条件を用いることができる。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。したがって、ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行うことが望ましい。本明細書においてストリンジェントな条件としては、洗浄のための条件としてたとえば「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度を示すことができる。あるいは、ハイブリダイゼーションを「6 x SSC、40 % ホルムアミド、37 ℃」、洗浄を「0.2 x SSC、55 ℃」で行う条件をストリンジェントな条件として示すこともできる。
【００３２】
なお、当業者であれば、SSCの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。
ただし、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３３】
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離される蛋白質は表１に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明は、請求項１（ａ）に記載の塩基配列に対して高い同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドを包含する。また本発明は、請求項１（ｂ）に記載したポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列に対して高い同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、またはペプチドを包含する。高い同一性とは、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上の配列の同一性を指す。あるいはより望ましくは、９０％以上、または９３％以上、あるいは９５％以上、更には９７％以上、そして９９％以上の同一性を言う。同一性は、BLAST検索アルゴリズムを用いて決定することができる。
【００３４】
本発明におけるアミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、blastnやblastxと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてblastnによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてblastxによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００３５】
また、遺伝子増幅技術（PCR）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4）を用いて、本実施例において同定された塩基配列（表１）の一部をもとにプライマーを設計し、これらDNA配列またはその一部と相同性の高いDNA断片を単離して、これをもとに本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることも可能である。
【００３６】
本発明はまた、表１に示した配列番号に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる２本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80% 、より好ましくは90% 、さらに好ましくは95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、本明細書に記載したアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のDNAを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のDNAが用いられる。プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的である必要があるが、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００３７】
また、本発明のポリヌクレオチドには、表１に示した配列番号に記載されたアミノ酸配列からなる本発明の蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも15bp以上、たとえば50bp以上、好ましくは100bp以上、さらに好ましくは500bp以上の鎖長を有し、通常、3000bp以内、好ましくは2000bp以内の鎖長を有する。このようなアンチセンスDNAには、本発明の蛋白質の異常（機能異常や発現異常）などに起因した疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。該アンチセンスDNAは、例えば、本発明の蛋白質をコードするDNA（例えば、配列番号１〜配列番号５８に記載の塩基配列）の配列情報を基にホスホロチオエート法（Stein, 1988 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 16, 3209-21 (1988)）などにより調製することが可能である。
【００３８】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法に適用することができる。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、（Elbashir, S., et al., Nature, 411: 494-498 (2001)）に記載の方法等を用いることができる。上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のものを用いることができる。
【００３９】
このＲＮＡインターフェアランス法において標的となりうる遺伝子（以下、これを「標的遺伝子」と称することがある）は、本発明のポリヌクレオチドであれば、いかなるものであってもよい。これらのＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有するＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド（以下、これを「２本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい２０ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。
【００４０】
また、解析対象蛋白質が公知蛋白質と比較して、挿入型あるいは置換型バリアントである場合は、２本鎖ポリヌクレオチド配列は挿入あるいは置換部位に設定することができる。また、解析対象蛋白質が公知蛋白質の欠失型バリアントである場合は、欠失部を跨ぐ配列を２本鎖ポリヌクレオチド配列とすることにより、該蛋白質特異的に効果のある配列を選定することができる。さらに、解析対象蛋白質と公知蛋白質のそれぞれをコードするＤＮＡの塩基配列と比較して、解析対象蛋白質をコードするＤＮＡに特異的な塩基配列を選定することによれば、解析対象蛋白質特異的にその発現を阻害することができる。
【００４１】
ヌクレオチドの鎖長は２０ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいかなる長さでもよいが、２０〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞においては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Mareus, P. I., et al., Interferon, 5: 115-180 (1983)）、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（dsRNA-responsive protein kinase: Bass, B. L., Nature, 411: 428-429 (2001)）を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に2'-5'oligoadenylate synthetase（Bass, B. L., Nature, 411: 428-429(2001)）を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物または該動物由来の細胞あるいは組織を被導入体として用いる場合には２０〜３０ｂｐの２本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５'または３'末端が一部突出したものも含む。２本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補正を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
【００４２】
２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法としては上記ポリヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
【００４３】
このようにして調製した２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、または蛋白質に翻訳を受け得るものであればいかなるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業または工業において使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Drosophila）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
【００４４】
被導入体は、細胞、組織あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００４５】
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００４６】
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
【００４７】
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明のポリヌクレオチドの導入体内での発現抑制により、本発明のポリヌクレオチドがコードする蛋白質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドやそのアンチセンスには、例えば、遺伝子治療への応用が考えられる。遺伝子治療の標的となる疾患としては、例えば、癌や各種炎症性疾患が好適であると考えられる。これら分子を遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与を行えばよい。
【００４９】
また本発明は、本発明の蛋白質の部分ペプチドを含む。この部分ペプチドには、例えば、分泌蛋白質においてはシグナルペプチドが除去された蛋白質が含まれる。また、本発明の蛋白質が受容体やリガンドとしての活性を持つものの場合には、その競合阻害剤として機能する、受容体（あるいはリガンド）との結合能を有する部分ペプチドが含まれる。また、抗体調製のための抗原ペプチドが含まれる。部分ペプチドが本発明の蛋白質に特異的であるためには、少なくとも７アミノ酸、好ましくは８アミノ酸以上、より好ましくは９アミノ酸、更に好ましくは１０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、本発明の蛋白質に対する抗体や本発明の蛋白質の競合阻害剤の調製以外に、例えば、本発明の蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングなどに利用し得る。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００５０】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクターに関する。本発明のベクターは、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されない。例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましい。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターは、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内で蛋白質を発現するベクターであれば特に制限されない。例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466〜472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は常法により制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4〜11.11）。
【００５１】
また最近、蛋白質発現を目的とした発現ベクターの構築にGATEWAYシステム（インビトロジェン株式会社）という技術が開発された（実験医学 Vol. 18, No. 19 (12月号), p2716-2717, 2000）。このシステムはラムダファージのもつ2種類の部位特異的組換え酵素（BPクロナーゼとLRクロナーゼ）とその特異的組換え部位をエントリーベクターと蛋白精製の際に有効なタグが既に挿入されているものも含むデスティネーションベクターにそれぞれ採用し、相同組換え反応を利用することによって発現ベクターを得るものである。
まず、１段階目の組換え反応を用いて目的のDNA断片をエントリーベクターへ挿入し、次にこの目的のDNA断片が挿入されたエントリーベクターとデスティネーションベクター間で2段階目の組換え反応をさせ、迅速かつ高効率で発現ベクターを得ることができる。前述のような制限酵素やリガーゼ反応を用いた定法では、発現ベクターを構築し目的の蛋白質を発現させるまで7〜10日間程度の期日が必要となるが、GATEWAYではわずか３〜４日間で目的の蛋白質の発現が可能になり、ハイスループットな発現蛋白質の機能解析が実現できる（http://biotech.nikkeibp.co.jp/netlink/lto/gateway/）。
【００５２】
加えて本発明は、本発明のベクターを保持する形質転換体に関する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。蛋白質を高発現させるための真核細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などを例示することができる。
宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの方法で行うことが可能である。
【００５３】
更に表１に示した配列番号に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、単に全長cDNAの合成のためのプライマーとして利用できるのみならず、全長cDNAによってコードされる本発明の蛋白質の異常を検査・診断するために利用できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをプライマーに用いたポリメラーゼ連鎖反応（ゲノムDNA-PCRやRT-PCR）により本発明の蛋白質をコードするDNAを増幅することができる。また、全長cDNAの5'末端配列からゲノム配列上でのmRNA転写開始点が容易に特定可能なので、PCRやハイブリダイゼーションの手法を用いて5'上流の発現制御領域を容易に取得することができる。取得された遺伝子領域に対して、RFLP解析、SSCP、シークエンシング等の方法により、配列の異常を検査・診断することができる。特に本発明のmRNAの発現が特定の疾患によって変動する場合には、本発明のポリヌクレオチドをプローブやプライマーとして該mRNAの発現量を解析することによって該疾患の検出や診断を行うことができる。
【００５４】
また、本発明は、本発明の蛋白質に結合する抗体に関する。本発明の抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体やキメラ抗体などの特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体の場合には、常法に従いアミノ酸配列に相当するオリゴペプチドを合成して家兎に免疫することにより得ることが可能である（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.12〜11.13）。一方、モノクローナル抗体は、常法に従い大腸菌で発現し精製した蛋白質を用いてマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4〜11.11）。
【００５５】
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質の精製に加え、例えば、本発明の蛋白質の発現異常や構造異常の検査・診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞などから蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ELISA等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
また、本発明の蛋白質に結合する抗体を、本発明の蛋白質に関連した疾患の治療などの目的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的で用いる場合には、ヒト抗体、ヒト化抗体、あるいはキメラ抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、「Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice, Mendez, M.J. et al.(1997) Nat.Genet.15:146-156」参照）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる(Methods in Enzymology 203, 99-121(1991))。
【００５６】
本発明のcDNAがコードしているのは、例えば以下に示すような機能が予測される蛋白質のアミノ酸配列である。これらの蛋白質としての機能を持つことは、SwissProtやGenBankやUnigeneやnrの相同性検索の結果から推定することができる。より具体的には、たとえば実施例として示したように、本発明の全長cDNA（５８クローン）の部分塩基配列と相同性を示す公知の遺伝子・蛋白質を検索し、その遺伝子とそれがコードしている蛋白質の機能を参照すれば本発明のcDNAがコードしている蛋白質の機能を推定することができる。このようにして本発明の全長cDNA５８クローンのうち、３８クローンについては以下のカテゴリーに属する蛋白質をコードしていることが推定された。
分泌・膜蛋白質（４クローン）
転写関連蛋白質（３３クローン）
疾患関連蛋白質（１８クローン）
酵素・代謝関連蛋白質（１クローン）
細胞防御関連蛋白質（１クローン）
発生・分化関連蛋白質（２クローン）
DNA・RNA結合蛋白質（３３クローン）
【００５７】
さらに、１２クローンについては、別のORFが転写関連蛋白質をコードしていることが推定された。
【００５８】
またアミノ酸配列中にシグナル配列、膜貫通領域、核移行シグナル、糖鎖付加シグナル、リン酸化部位、及びZinc fingerモチーフ、SH3ドメイン等を見出すことでも本発明のcDNAがコードしている蛋白質の機能を推測できる。シグナル配列、膜貫通領域の予測にはPSORT [K. Nakai & M. Kanehisa, Genomics, 14: 897-911 (1992)]やSOSUI［T.Hirokawa et.al. Bioimformatics, 14, 378-379 (1998)］(三井情報開発株式会社販売)、MEMSAT［D.T.Jones, W.R.Taylor & J.M.Thornton, Biochemistry, 33, 3038-3049 (1994)］などの予測プログラムの利用が可能である。また、一部アミノ酸配列とGFP蛋白質などとの融合タンパクを作製して、培養細胞等に導入し、蛋白質の局在を調べることでも類推できる。
【００５９】
本発明で得られた全長cDNAはその全塩基配列が決定されれば、その配列をもとにGenBank、Swiss-Prot、UniGene、nrといった各データベースを対象に相同性検索を行う、または全塩基配列から推定されたアミノ酸配列に対してPSORT等によるシグナル配列の検索、SOSUI等による膜貫通領域の検索、Pfam(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml)やPROSITE(http://www.expasy.ch/prosite/)等によるモチーフ検索を行うことで、クローン中にコードされる蛋白質のより詳細な機能予測が可能である。もちろん上記にあるようにcDNAの配列が全塩基配列でなくても、部分的な配列情報(好ましくは300塩基以上)があれば機能予測は可能であることが多い。しかし、部分的な配列情報をもとにした予測は、必ずしも全塩基配列をもとに予測された機能と一致しない場合があり、全塩基配列をもとにした機能予測のほうが好ましいのはいうまでもない。
【００６０】
全塩基配列が明らかになった５８クローン（実施例６参照）について、GenBank、Swiss-Prot、UniGene、nrの各データベースを対象に相同性検索を行った。また全長塩基配列から推定されたアミノ酸配列に対してPSORT、SOSUI、Pfamを用いた機能ドメイン検索を行った。これらの結果からcDNAクローン中にコードされる蛋白質の機能予測、カテゴリー分類を行った。カテゴリー分類は以下の方法で行った。
[1]アノテーションを基本としたカテゴリー化（Swiss-Protのヒットデータであればキーワードを用いる。GenBank、UniGene、nrのヒットデータであればDefinitionやReference情報を用いる）、および推定ORFに対するPSORTを用いたシグナルシークエンス検索、SOSUIを用いた膜貫通領域の検索を行い、まずはその結果をもとに前述の14種類の機能カテゴリーへの分類を行った。
[2]次に、[1]の方法でカテゴリー化できなかったクローンについて、Pfamを用いた機能ドメイン・モチーフの検索結果より、前述の14種類のカテゴリーへ分類可能と推定される機能ドメイン・モチーフを持ったクローンについて追加分類を行った。
【００６１】
分泌・膜蛋白質に属すると推定されたクローンは、以下の４クローンであった。
BRCOC20121720, D3OST30002580, FCBBF30095260, PROST20169800
【００６２】
転写関連蛋白質に属すると推定されたクローンは、以下の３３クローンであった。
ASTRO20168470, BRAMY20270730, BRAWH20096780, BRCAN20280210, BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20075860, CTONG20121010, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30129630, FEBRA20018690, FEBRA20034680, FEBRA20195820, HCHON20035130, HHDPC20031130, NT2NE20010490, NT2NE20142210, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20185830, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20130010, TESTI20156100, TESTI20378190, TRACH20079690, UTERU20145480
【００６３】
疾患関連蛋白質に属すると推定されたクローンは、以下の１８クローンであった。
ASTRO20168470, BRAWH20096780, BRCAN20280210, BRCOC20178270, BRHIP20222280, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30129630, FEBRA20018690, FEBRA20195820, HCHON20035130, NT2NE20010490, PROST20169800, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20156100, TRACH20079690
【００６４】
酵素・代謝関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の１クローンであった。
PROST20169800
【００６５】
細胞防御関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の１クローンであった。
CTONG20092680
【００６６】
発生、分化関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の２クローンであった。
CTONG20121010, NT2NE20142210
【００６７】
DNA・RNA結合蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の３３クローンであった。
ASTRO20168470, BRAMY20270730, BRAWH20096780, BRCAN20280210, BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20075860, CTONG20121010, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30129630, FEBRA20018690, FEBRA20034680, FEBRA20195820, HCHON20035130, HHDPC20031130, NT2NE20010490, NT2NE20142210, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20185830, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20130010, TESTI20156100, TESTI20378190, TRACH20079690, UTERU20145480
【００６８】
別のORFが転写関連蛋白質をコードしていると推定されたクローンは、以下の１２クローンであった。
BRAMY20170141, CTONG20050281, CTONG20050282, D3OST30002581, HCHON20035131, OCBBF20060301, OCBBF20066391, SKMUS20012011, SPLEN20095411, TESTI20130011, TESTI20319191, TRACH20079691
【００６９】
上記以外のクローンのうち、
ASTRO20084250, FEBRA10001900, NT2NE20130190, SMINT20115880, TESTI20023510, TESTI20189410, TESTI20200710 
以上７クローンについては、Pfamによるドメイン検索の結果から、転写関連蛋白質に属する可能性が高いクローンであった。
BRACE20190040, BRAWH20185060, PROST20114390 
以上３クローンについては、Pfamによるドメイン検索の結果から、酵素・代謝関連蛋白質に属する可能性が高いクローンであった。
ASTRO20084250, BRACE20190040, FEBRA10001900, NT2NE20130190, PROST20114390, SMINT20115880, TESTI20023510 
以上７クローンについては、Pfamによるドメイン検索の結果から、DNA・RNA結合蛋白質に属する可能性が高いクローンであった。
【００７０】
以下の５クローンについては、上記のいずれのカテゴリーに属するか明らかでないクローンであったが、全長配列に対する相同性検索、および推定ORFに対するモチーフ検索で何らかの機能が予測されているクローンである。クローン名と相同性検索結果のDefinitionまたはモチーフ検索結果のモチーフ名を//で区切り、以下に示した。
【００７１】
BRCOC20110100//Integrase core domain
MESAN20127350//myelin expression factor-3
PROST20112970//Sterile alpha motif (SAM)/Pointed domain// SAM domain (Sterile alpha motif)
TESTI20044230//Mus musculus testis-specific Y-encoded-like protein (Tspyl1) mRNA, complete cds.
TESTI20327680//EF hand// EF hand
【００７２】
なお、蛋白質の機能が必ずしも上記に示す機能カテゴリーの一つのみに属するわけではないため、いずれで予測された機能カテゴリーにも該当する可能性がある。またこれらの機能カテゴリーで分類されたクローンには、今後の解析により新たな機能が付加される可能性もある。
これらクローンにコードされる蛋白質は、いずれも全長アミノ酸配列を備えることから、適当な発現系を適用して組み換え体として発現させたり、細胞にインジェクションすることにより、あるいは、そのタンパクを特異的に認識する抗体を作製し、用いることで、その生物学的活性、及び細胞増殖・分化といった細胞状態変化への作用を解析することが可能である。
【００７３】
各蛋白質は、それぞれ次に示すような手法にもとづいて、それぞれの蛋白質の生物学的活性の解析が可能である。
分泌蛋白質、膜蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Ion Channels』(R.H.Ashley編、1995)、
『Growth Factors』(I.McKay, I.Leigh編、1993)、『Extracellular Matrix』(M.A.Haralson, J.R.Hassell編、1995)
糖蛋白質関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Glycobiology』(M.Fukuda, A.Kobata編、1993)、
「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『Glycoprotein Analysis in Biomedicine』(Elizabeth F.Hounsell編、1993)、
シグナル伝達関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Signal Transduction』(G.Milligan編、1992)、
『Protein Phosphorylation』(D.G.Hardie編、1993)、または「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『Signal Transduction Protocols』(David A. Kendall, Stephen J.Hill編、1995)、
転写関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Gene Transcription』(B.D.Hames, S.J.Higgins編、1993)、
『Transcription Factors』(D.S.Latchman編、1993)、
酵素・代謝関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Enzyme Assays』(ROBERT EISENTHAL and MICHAEL J. DANSON編、1992)、
細胞分裂・増殖関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Cell Growth, Differentiation and Senescence』(GEORGE STUDZINSKI編、2000)、
細胞骨格関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Cytoskeleton: Signalling and Cell Regulation』(KERMIT L. CARRAWAY and CAROLIE A. CAROTHERS CARRAWAY編、2000)、
「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『Cytoskeleton Methods and Protocols』(Gavin, Ray H.編、2000)、
核蛋白質・RNA合成関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Nuclear Receptors』(DIDIER PICARD編、1999)、
『RNA Processing』(STEPHEN J. HIGGINS and B. DAVID HAMES編、1994)、
蛋白質合成・輸送関連蛋白質：
「The Practical Approach Series」(IRL PRESS社)の『Membrane Transport』(STEPHEN A. BALDWIN編、2000)、
「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『Protein Synthesis Methods and Protocols』(Martin, Robin編、1998)、
細胞防御関連蛋白質：
「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『DNA Repair Protocols』(Henderson, Daryl S.、1999)、
『Chaperonin Protocols』(Schneider, Christine編、2000)、
発生・分化関連蛋白質：
「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『Developmental Biology Protocols』(ROBERT EISENTHAL and MICHAEL J. DANSON編、1992)、
DNA・RNA結合蛋白質：
「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『DNA-Protein Interactions Principles and Protocols』(Kneale, G. Geoff編、1994)、
『RNA-Protein Interaction Protocols』(Haynes, Susan R.編、1999)、
ATP・GTP結合蛋白質：
「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『Signal Transduction Protocols』(David A. Kendall, Stephen J.Hill編、1995) 
【００７４】
蛋白質の生物学的活性の解析方法の一つとして、他の蛋白質やＤＮＡとの相互作用を解析する方法が知られている。相互作用の解析には、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。例えば、転写関連因子やＤＮＡ・ＲＮＡ結合蛋白質は、既知の転写関連因子が認識し標的とするプロモーターやエンハンサー等の遺伝子転写調節領域（以下、「標的転写調節領域」と称する）のＤＮＡおよびその部分断片に対する結合能を測定することにより生物学的活性を解析する方法が知られている（特開２００１−３１４１９０号公報）。解析に使用する標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片として、既知の標的転写調節領域の塩基配列を有するものだけでなく、既知の標的転写調節領域の塩基配列をデーターベース解析し分類してそれぞれ設計した、転写関連因子が共通して認識する標的転写調節領域の共通塩基配列（以下、「コンセンサス塩基配列」と称する）を有するものを使用してもよい。転写関連因子として、v-jun, c-jun, junB, junD, dJRA, c-fos, fosB1, fosB2, Fra-1, LRF-1, v-maf, mafG, NF-E2 p45, aNF-E2, fNF-E2, Nrf short form, GCN4, yAP-1, CREB-2, ATF-3, CRE-BP1, CRE-BP3, ATF-a, CREB-341, CREB-327, CREM, dCREB2, dCREB2-b, dCREB2-c, dCREB2-d, dCREB2-q, dCREB2-r, dCREB2-s, C/EBPalpha, C/EBPbeta, p34C/EBPbeta, CHOP-10, VBP, Hlf, CPRF-2, EmBP-1b, EmBP-1b, GBF1, GBF2, GBF3, CPRF-1, TAF-1, HBP-1a, GBF9, GBF1, GBF12, CPRF-3, TGA1a, TGA1b, O2, STE4, OPI1, E2A, E47, ITF-2/SEF2-1B, SEF-1A, MyoD, p42Tal-1, HEN-1, AhR, Arnt, USF, NF-1A1, NF-1A1.1, NF-1A6, NF-1B1, NF-1B1, NF-1B2, NF-1C2/CTF-2, CTF-4, CTF-6, RF-X1, AP2alphaA/AP-2alpha1, AP2alpha2, AP2alpha3, AP2alpha4, AP2alphaB, AP2beta, AP2gamma, GR, AR, ER, RXR-alpha, PPARalpha, PPARgamma, COUP-TF1,HNF-4alpha1, HNF-4alpha2, CF1, GATA-1, GATA-2, GATA-3, GATA-4, AREA/NIT-2, Sp1, YY1, Egr-1, Egr-2, Egr-3, Snail, CF2-II, Evi-1, Ikaros, MZF-1, Tramtrack69K, HOX9, CDP, HNF-1A, Nkx-2.2, Nkx-2.5, TTF-1, Oct-1A, Oct-1B, Oct-1C, Oct-2, Oct-2.1/Oct-2B, Pax-3, Pax-6, Pax-1, HSF1(short), HSF2, dHSF, fungalHSF, c-Myb, A-Myb, v-Myb, P(long), P(short), C1(long), C1(short), c-Ets-1_p54, Ets-1_deltaiV/VII, Ets-2, Elk-1, SAP-1, SAP-1b, Erg-1, p55erg, Fli-1b, E4TF1-60/GABP-alpha, E74A, IRF-1, IRF-2, p50, NF-ATc, NF-Atp, p91, p84, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, p53, MEF-2A, SRF, E2, TBP, SRY, Sox-5, Sox-9, mat-Mc, CP1A, CP1B, CBF-C, AML1a, 等が知られており、これらの転写関連因子の標的転写調節領域の塩基配列もそれぞれ報告されている（田村隆明、外２名編、「Bio Science  実験医学別冊  新用語ライブラリー  転写因子」、第２版、株式会社羊土社、1999年12月）。
【００７５】
転写関連因子と標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片の結合は、自体公知の測定系を使用して検出することができる。例えば、標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片を固定化したプレートに転写関連因子を含む被検試料を添加し、両者の直接的な結合をＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance, 表面プラズモン共鳴）法を用いて検出することができる。また、転写関連因子または標的転写調節領域のＤＮＡおよびその部分断片を蛍光標識したものを用いて、両者の結合を検出することもできる。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドがコードする蛋白質を含む解析用の被検試料は、前述のように本発明のポリヌクレオチドを適当な方法により転写／翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを無細胞転写翻訳系に供することにより蛋白質発現を誘導し、本発明の蛋白質を取得することができる。
【００７７】
以下の７０クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、既知の標的転写調節領域の塩基配列をデーターベース解析して設計したコンセンサス塩基配列（配列番号１５６〜配列番号２０８）を有する少なくとも一つのＤＮＡおよびその部分断片に対して結合活性を有していた。
ASTRO20084250, ASTRO20168470, BRACE20190040, BRAMY20170140, BRAMY20170141, BRAMY20270730, BRAWH20096780, BRAWH20185060, BRCAN20280210, BRCOC20110100, BRCOC20121720, BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20050281, CTONG20050282, CTONG20075860, CTONG20092680, CTONG20121010, D3OST30002580, D3OST30002581, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30095260, FCBBF30129630, FEBRA10001900, FEBRA20018690, FEBRA20034680, FEBRA20195820, HCHON20035130, HCHON20035131, HHDPC20031130, MESAN20127350, NT2NE20010490, NT2NE20130190, NT2NE20142210, OCBBF20060300, OCBBF20060301, OCBBF20066390, OCBBF20066391, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20112970, PROST20114390, PROST20169800, PROST20185830, SKMUS20012010, SKMUS20012011, SMINT20115880, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20095411, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20044230, TESTI20130010, TESTI20130011, TESTI20156100, TESTI20189410, TESTI20200710, TESTI20319190, TESTI20319191, TESTI20327680, TESTI20378190, TRACH20079690, TRACH20079691, UTERU20134910, UTERU20145480
【００７８】
なお、カテゴリー分類において、分泌・膜蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に growth factor, cytokine, hormone, signal, transmembrane, membrane, extracellular matrix, receptor, G-protein coupled receptor, ionic channel, voltage-gated channel, calcium channel, cell adhesion, collagen, connective tissue 等、分泌・膜蛋白質と推定される記載があった、もしくはPSORTとSOSUIによる推定ORFの解析の結果、シグナルシークエンスや膜貫通領域があったクローンである。
【００７９】
糖蛋白質関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に glycoprotein 等、糖蛋白質関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８０】
シグナル伝達関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に serine/threonine-protein kinase, tyrosine-protein kinase, SH3 domain, SH2 domain等、シグナル伝達関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８１】
転写関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に transcription regulation, zinc finger, homeobox 等、転写関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８２】
疾患関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に disease mutation, syndrome 等、疾患関連蛋白質と推定される記載があった、あるいは全長塩基配列に対するSwiss-Prot、GenBank、UniGene、nrヒットデータが、後述するヒトの遺伝子と疾患のデータベースであるOnline Mendelian Inheritance in Man (OMIM)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/)に登録されている遺伝子、蛋白質であったクローンである。
【００８３】
酵素・代謝関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にmetabolism, oxidoreductase, E.C.No. (Enzyme commission number)等、酵素・代謝関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８４】
細胞分裂・増殖関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、cell division, cell cycle, mitosis, chromosomal protein, cell growth, apoptosis等、細胞分裂・増殖関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８５】
細胞骨格関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にstructural protein, cytoskeleton, actin-binding, microtubles等、細胞骨格関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８６】
核蛋白質・RNA合成関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にnuclear protein, RNA splicing, RNA processing, RNA helicase, polyadenylation等、核蛋白質・RNA合成関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８７】
蛋白質合成・輸送関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にtranslation regulation, protein biosynthesis, amino-acid biosynthesis, ribosomal protein, protein transport, signal recognition particle等、蛋白質合成・輸送関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８８】
細胞防御関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にheat shock, DNA repair, DNA damage等、細胞防御関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００８９】
発生・分化関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、developmental protein等、発生・分化関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【００９０】
DNA・RNA結合蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にDNA-binding, RNA-binding等と記載があったクローンである。
ATP・GTP結合蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にATP-binding, GTP-binding等と記載があったクローンである。
疾患関連蛋白質については、前述したように機能ごとの解析が可能であるほか、疾患関連蛋白質を発現して得られた特異認識抗体を用いて、特定の疾患と蛋白質の発現量や活性との相関を知ることができる。あるいは、ヒトの遺伝子と疾患のデータベースであるOMIMを利用し、解析が可能である。なおOMIMには常に新しい情報が付加されている。したがって当業者は、特定の疾患と本発明の遺伝子との新たな関係を最新のデータベースから見出すことができる。疾患関連蛋白質は、診断マーカー、発現・活性の増減を制御する薬剤、あるいは遺伝子治療のターゲットになるなど医薬品の開発等に有用である。
【００９１】
分泌蛋白質、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質等についても、OMIMを利用してキーワードで検索すると、各キーワードにおいて、多くの疾患に関連した結果が得られた（分泌、膜蛋白質について、OMIMで検索した結果を一例として以下に示す）。あるいは、例えば転写関連蛋白質やシグナル伝達関連蛋白質については、疾患との関連がそれぞれ、藤井・田村・諸橋・影山・佐竹編の実験医学増刊「転写因子研究1999」Vol.17, No.3, (1999)や、遺伝子医学Vol.3,No.2(1999)で報告されている。例えば、がんを例に挙げると、裳華房生命科学シリーズ「がんの生物学」(松原聡著、1992)にあるように、がんには分泌蛋白質、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質ばかりでなく、酵素・代謝関連蛋白質、細胞骨格関連蛋白質、細胞分裂・増殖関連蛋白質といった多くの蛋白質の関与が示されている。このように、疾患関連蛋白質ばかりでなく、分泌蛋白質、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質等も疾患に関与することが多く、医療産業上のターゲットとして、有用なことがわかる。
【００９２】
一例として、分泌、膜蛋白質について、OMIMで検索した結果を以下に示す。OMIM検索に用いたキーワードには、
(1) secretion protein, 
(2) membrane protein, 
(3) channel, 
(4) extracellular matrix,
を用いた。 
検索結果には、OMIM登録番号記号のみを記載した。この番号をもとにOMIMで疾患と遺伝子や蛋白質との関係を示すデータを見ることができる。また、OMIMデータは日々更新されている。
【００９３】
１） Secretion protein（分泌蛋白質）
354 entries found, searching for "secretion protein"
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【００９４】
２） Membrane protein（膜蛋白質）
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【００９５】
３） Channel（膜蛋白質のメンバー）
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*601949, *605222, *601142, *602983, *193245, *600681, *176265, *600235, *176262, *176258, *605206, *604427, *605411, *603305, *601219, *600150, *604065, *602343, *605223, *605720, *603906, *138249, *138253, *600843, *604385, *600003, *600935, *603940, *602727, *602158, 602911, *600397, *602726, *600845, *605080, *600580, *602872, *602106, *176264, *603953, 
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*604415, *604418, *300242, #300071, *604471, *600837, 168350, *118511, 193007, *600300, *604654, #601820, *180297, *600046, *603853, *604678, *604693, #604772, *118508, *603855, *605204, #254210, *182099, *182307, #130600, *601109, *114080, *300103, *182860, *605438, *601129, *603964, *600019, *516060, #185000, *138079, *104210, *605818, *603418, *305990, *305450
【００９６】
４） Extracellular matrix
218 entries found, searching for "extracellular matrix"
*605912, *603479, *602201, *604633, *601418, *601548, *115437, *154870, *600754, *602261, *602285, *602262, *134797, *120361, *604629, *604871, *603321, *603320, *601807, #154700, *116935, *185261, *120360, *185250, *605470, *603767, *253700, *190180, *128239, *308700, *276901, *193300, *120324, *188826, *602109, *155760, *600514, *600261, #177170, *600536, 
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*602402, *602415, *602428, *602453, *602505, #166210, *602600, *602941, *603005, *603196, 603209, *603221, *603234, *603319, *120250, *120210, *120120, *603489, *603551, *118938, *603799, *603842, *603924, *603963, *604042, *604063, *604149, *604160, *601028, *604467, *604510, *604592, *116930, *116806, *601284, *604724, *604806, *604807, *604808, *107269, 
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【００９７】
また、これらと同様に、前述のカテゴリー分類のところに示した各種のキーワード等もOMIMの検索に用いることによって疾患との関連をみることができる。
【００９８】
また、本発明のcDNAの塩基配列を用いれば、そのcDNAの塩基配列を有する遺伝子の発現頻度を解析することができる。更にこうして解析された発現頻度情報に基づいて、当該遺伝子の機能を予測することができる。
疾患に関連した遺伝子を調べる方法として病態組織と正常組織において遺伝子発現量の違いを調べる発現頻度解析がある。発現頻度解析には、ノーザンブロッティング法やRT-PCR法、およびDNAマクロアレイやDNAマイクロアレイを用いた発現頻度解析法がある(実験医学 Vol.17, No.8, 980-1056 (1999)、村松・那波監修 細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」(秀潤社, 2000))。更に、こういった解析方法以外に、発現している遺伝子の塩基配列をコンピューターを利用した解析で比較することによっても発現頻度を解析することができる。例えば、BODYMAPと呼ばれるデータベースは、様々な組織・細胞のcDNAライブラリーから、無作為に遺伝子クローンを抽出し、3'末端領域の塩基配列の相同性情報をもとにして、相同性のあるものはまとめてクラスターとすることによって、クラスター単位で遺伝子を分類して、各クラスターに含有されるクローンの個数を比較することによって遺伝子の発現頻度情報を得ている（http://bodymap.ims.u-tokyo.ac.jp/）。
【００９９】
このような解析手法により、病態組織と正常組織において遺伝子発現量の違いを調べた結果から発現量の違いが明らかな遺伝子は、その疾患に関連した遺伝子といえる。また、病態組織でなくとも、病態に関連した特異的な現象を再現させた培養細胞と正常細胞において遺伝子発現量の違いを調べた結果から発現量の違いが明らかな遺伝子は、その疾患に関連した遺伝子といえる。
【０１００】
全塩基配列が明らかになった５８クローンについて、以下のデータベースを用いて、特定の病態や機能に関連する遺伝子を選択した（実施例７．「In silicoにおける発現頻度解析」参照）。本発明の解析に用いたデータベースは、１,４０２，０７０個のクローンの塩基配列をデータベース化したものであり、解析母数としては十分なデータベースである。このデータベースを構成している配列情報は、実施例１に示した様々な組織や細胞由来のcDNAライブラリーからcDNAクローンを無作為に選択して、その5'末端領域の配列を決定することによって得た。
次にこのデータベースにある各クローンの塩基配列を、塩基配列の相同性検索プログラムによって相同な配列同士をカテゴライズし（クラスター化）、各クラスターに属するクローン数を各ライブラリー毎に集計し規格化することによって、ある遺伝子のcDNAライブラリー内での存在比を解析した。この解析によって、cDNAライブラリーのソースとなっている組織や細胞における、ある遺伝子の発現頻度情報を得た。
次に本発明のcDNAの塩基配列を持つ遺伝子の、組織や細胞間での発現を解析するために、大量のcDNAクローンを解析した組織や細胞由来のライブラリーを組織・細胞間での発現量の比較の対象にした。すなわち６００個以上のcDNAクローンの塩基配列を解析した組織や細胞について、先に規格化した数値を組織間や細胞間で比較し、遺伝子の発現頻度の変化を解析した。この解析によって以下に続く病態や機能に関連する遺伝子であることが示された。なお、以降に示される表３〜表１１中の各数値は、相対的な発現頻度を示し、数値が大きいほど発現量が多いことを示す。
【０１０１】
骨粗鬆症に関連する遺伝子
骨粗鬆症とは、骨の成分が全体として減少し、骨折しやすくなった病態である。その発症には骨を産生する骨芽細胞と、骨を吸収する破骨細胞の働きのバランス、すなわち骨代謝が関与する。したがって単球／マクロファージ系の前駆細胞から分化する破骨細胞（Molecular Medicine 38. 642-648. (2001)）の増加に関連する遺伝子は、骨代謝に関連した骨粗鬆症に関する遺伝子である。
【０１０２】
単球／マクロファージ系の前駆細胞（糖蛋白質CD34を発現している細胞：CD34+細胞）での発現頻度と比較して、CD34+細胞を破骨細胞分化因子（Molecular Medicine 38. 642-648. (2001)）で処理した細胞で増加または減少する遺伝子を、塩基配列情報にしたがって解析し、探索した。CD34+細胞のRNAから作製したライブラリー（CD34C）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子で処理した細胞のRNAから作製したライブラリー（D30ST, D60STまたはD90ST）のcDNAを解析して比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表３に示す２クローンであった。これらのクローンは骨粗鬆症に関する遺伝子である。
【０１０３】
神経細胞分化関連遺伝子
神経細胞の分化に関する遺伝子は、神経疾患の治療に有用な遺伝子である。神経系の細胞を分化誘導して発現変化する遺伝子は、神経疾患に関すると考えられている。
神経系の培養細胞NT2を分化誘導（レチノイン酸(RA)刺激またはRA刺激後さらに増殖阻害剤処理）して発現変化する遺伝子を探索した。未分化なNT2細胞由来のライブラリー（NT2RM）と分化誘導処理した細胞のライブラリー（NT2RP, NT2RIまたはNT2NE）のcDNAを解析して比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表４に示す７クローンであった。これらの遺伝子は神経疾患に関する遺伝子である。
【０１０４】
癌関連遺伝子
癌の組織では、正常組織とは異なる遺伝子のセットが発現して組織・細胞の癌化に寄与していると考えられている。したがって、正常組織とは異なる発現をする遺伝子は癌関連遺伝子である。正常な組織と比較して癌組織で発現変化する遺伝子を探索した。
乳がん由来のライブラリー（TBAES）と、正常な乳房由来のライブラリー（BEAST）のcDNAを解析して比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１０５】
子宮頸がん由来のライブラリー（TCERX）と、正常な子宮頸管由来のライブラリー（CERVX）のcDNAを解析して比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１０６】
結腸がん由来のライブラリー（TCOLN）と、正常な結腸由来のライブラリー（COLON）のcDNAを解析して比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１０７】
食道がん由来のライブラリー（TESOP）と、正常な食道由来のライブラリー（NESOP）のcDNAを解析して比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１０８】
腎臓がん由来のライブラリー（TKIDN）と、正常な腎臓由来のライブラリー（KIDNE）のcDNAを解析して比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表５に示す１クローンであった。
【０１０９】
肝臓がん由来のライブラリー（TLIVE）と、正常な肝臓由来のライブラリー（LIVER）のcDNAを解析して比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１１０】
肺がん由来のライブラリー（TLUNG）と、正常な肺由来のライブラリー（HLUNG）のcDNAを解析して比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表６に示す２クローンであった。
【０１１１】
卵巣がん由来のライブラリー（TOVER）と、正常な卵巣由来のライブラリー（NOVER）のcDNAを解析して比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表７に示す１クローンであった。
【０１１２】
胃がん由来のライブラリー（TSTOM）と、正常な胃由来のライブラリー（STOMA）のcDNAを解析して比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１１３】
子宮がん由来のライブラリー（TUTER）と、正常な子宮由来のライブラリー（UTERU）のcDNAを解析して比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表８に示す６クローンであった。
【０１１４】
舌がん由来のライブラリー（CTONG）と、正常な舌由来のライブラリー（NTONG）のcDNAを解析して比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表９に示す５クローンであった。
これらの遺伝子は、癌に関する遺伝子である。
【０１１５】
さらに、発生や分化に関連する遺伝子を調べる方法として、発生・分化途中の組織・細胞と、成体の組織細胞において遺伝子発現量の違いを調べる発現頻度解析がある。組織の発生・分化に関する遺伝子は、その組織の構築と機能発現に関する遺伝子であり、傷害のある組織を任意に再生せしめる再生医学に利用可能な有用な遺伝子である。
【０１１６】
全塩基配列が明らかになった５８クローンについて、先に記した5'末端領域の塩基配列のデータベースをもとにして得た遺伝子発現頻度情報を用いて、特定の組識の発生や分化に関わる遺伝子を選択した（実施例７参照）。
【０１１７】
胎児の脳由来のライブラリー（FCBBF, FEBRAまたはOCBBF）と成体の脳由来のライブラリー（BRACE, BRALZ, BRAMY, BRAWH, BRCAN, BRCOC, BRHIP, BRSSN, BRSTNまたはBRTHA）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表１０に示す２８クローンであった。
【０１１８】
胎児の心臓由来のライブラリー（FEHRT）成体の心臓由来のライブラリー（HEART）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１１９】
胎児の腎臓由来のライブラリー（FEKID）成体の腎臓由来のライブラリー（KIDNE）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果、５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０１２０】
胎児の肺由来のライブラリー（FELNG）成体の肺由来のライブラリー（HLUNG）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果、両者で発現変化のある遺伝子は表１１に示す３クローンであった。これらの遺伝子は組織・細胞の再生に関する遺伝子である。
【０１２１】
本発明のcDNAの塩基配列に基づいて、PCR法による発現頻度等を解析することができる。PCRにより得られた増幅産物量を比較する方法は公知である。例えば、エチジウムブロマイド染色によってバンド強度を測定することができる。RI標識や蛍光標識プライマーを用いれば、標識された増幅産物のRIシグナル値や蛍光強度を測定することができる。さらには増幅産物に対してハイブリダイゼーションする標識プローブのRIのシグナル値、あるいは蛍光物質ならば蛍光強度を測定することもできる。こうして得られた測定結果を比較し、発現量に差があるクローンの選抜することができる。
PCRを定量的に行う方法としては、増幅産物のチューブ間誤差やプラトー効果などの問題点を解決するために、内部標準を用いる方法や、既知量の鋳型RNAを段階的に希釈したものをサンプルに加えて目的RNAに由来する増幅産物量と比較して定量を行う競合的PCRなどがある。ATAC-PCR (Adaptor-tagged competitive PCR) 法は、3'末端塩基配列の決定された遺伝子にサイズの異なるアダプターを付加して行う競合的PCRの一種で、複数の組織（細胞）由来のmRNAの発現頻度比を一度に測定することが可能である (Nucleic Acids Research 1997, 25(22):4694-4696、村松・那波監修 細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」(秀潤社, 2000): 104-112)。
【０１２２】
このような解析方法を用いて、顕著な細胞変化(分化、アポトーシスなど)の際に発現量が明らかに変動する遺伝子は、その細胞機能に関連した重要な遺伝子であり、病気・疾患の候補遺伝子となる。さらには、組織特異的な発現を示す遺伝子はその組織内で重要な役割を担う遺伝子であり、その組織が関連した病気・疾患の候補遺伝子の可能性がある。
【０１２３】
例えば、炎症は様々な疾患に関連すること知られている重要な生体反応である。代表的な炎症惹起因子としては、TNF-α(Tumor Necrosis Factor -alpha)が挙げられる。TNF-α刺激により活性化されるシグナルカスケードには、NF-κBを介する経路がある(Cell 1995, 80:529-532)。この経路を経て変動する遺伝子としてはIL-2, IL-6, G-CSFなど多くの炎症に関与する分子がすでに明らかとなっている(Trends Genet. 1999, Jun;15(6):229-35.)。TNF-α刺激により発現変化する遺伝子は、炎症に関すると考えられる。
【０１２４】
また、ヘリコバクター・ピロリの胃上皮への感染は、胃炎、胃十二指腸潰瘍の原因とされている（Mebio 2000, July, 17(7):16-33）。したがって、ヘリコバクター・ピロリとの共培養により発現変化する遺伝子は、胃炎、胃十二指腸潰瘍に関すると考えられる。最近の研究では、ヘリコバクター・ピロリがNF-κB経路を強く活性化することが報告されている (Gastroenterology 2000, 119:97-108)。
【０１２５】
ヒト単球細胞株であるTHP-1をTNF-α(Tumor Necrosis Factor -alpha)存在下で培養して発現変化する遺伝子を探索した結果、発現量が増加したクローンは、なかったが、発現量が減少したクローンは、ASTRO20084250, MESAN20127350であった。
これらのクローンは炎症に関する遺伝子である。
【０１２６】
胃癌細胞株であるMKN45を、ヘリコバクター・ピロリと共培養した時に発現変化する遺伝子を探索した結果、発現量が増加したクローンは、なかったが、発現量が減少したクローンは、HCHON20035130, UTERU20134910であった。
これらのクローンは、胃炎、胃十二指腸潰瘍に関する遺伝子である。
【０１２７】
本発明のcDNAがコードしている蛋白質が、例えば、細胞の増殖・分化などの細胞状態を制御する因子である場合には、以下のようにして医薬品開発を行うことができる。ある種の細胞に、本発明によって提供される蛋白質や抗体を細胞内にマイクロインジェクションすることによって、細胞の増殖・分化などの細胞状態変化や、細胞内の特定の遺伝子の活性化または抑制を指標に低分子化合物等をスクリーニングすることができる。このスクリーニングは、例えば、以下のように行うことができる。
まず、本発明の蛋白質を発現させ組換え蛋白質の精製品を取得する。次いで、その精製蛋白質を、各種細胞株または初代培養細胞の細胞内にマイクロインジェクションして、増殖・分化などの細胞の変化を調べる。または、ある特定の細胞状態変化に作用することが知られている遺伝子の誘導をmRNA量、蛋白質量で検出する。あるいは、ある特定の細胞状態変化に影響を与えることが知られている遺伝子産物（蛋白質）の働きにより変化した細胞内の物質（低分子化合物など）量で検出する。そのときに培養液等に活性をスクリーニングしたい物質（低分子でも高分子でも可能）を添加しておくことにより、細胞状態の変化に及ぼす影響を指標にスクリーニングできる。
マイクロインジェクションしなくとも、本発明で取得した遺伝子を導入した形質転換細胞株を用いてのスクリーニングが可能である。本発明で取得した遺伝子産物が特定の細胞状態変化に作用することが明らかになった場合には、該遺伝子産物の変化を指標にスクリーニングできる。このようなスクリーニングにより、本発明による蛋白質が細胞状態、機能を制御するのを活性化または抑制する物質が開発されれば、医薬品への応用が考えられる。
【０１２８】
また、本発明のcDNAがコードしている蛋白質が、例えば、分泌蛋白質、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質、疾患関連蛋白質については、それぞれの蛋白質を用いた機能の解析に基づいて、例えば以下のようにして医薬品開発を行うことができる。
【０１２９】
膜蛋白質の場合、細胞上に発現して受容体やリガンドとして機能する蛋白質である可能性が高い。したがって、本発明によって提供される膜蛋白質を、公知の、あるいは新規なリガンドや受容体との結合活性に基づいてスクリーニングすれば、新たなリガンド−受容体の関係を見出すことができる。スクリーニングは公知の方法に従って行うことができる。
たとえば次のようにして本発明の蛋白質に対するリガンドをスクリーニングすることができる。すなわち（ａ）本発明の蛋白質またはその部分ペプチド、またはそれらを発現する細胞に被検試料を接触させる工程、および（ｂ）該蛋白質、該ペプチドまたは該細胞に結合する被検試料を選択する工程、とによって特定の蛋白質に結合するリガンドのスクリーニングが可能となる。
【０１３０】
一方、例えば、以下のようにして本発明の蛋白質の受容体を発現する細胞をスクリーニングすることもできる。すなわち、（ａ）本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに被検細胞試料を接触させる工程、および（ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドに結合する細胞を選択する工程、とによって特定の蛋白質に結合する受容体のスクリーニングが可能である。
このスクリーニングは、例えば、以下のように行うことが可能である。まず、本発明の蛋白質を発現させ組換え蛋白質の精製品を取得する。次いで、その精製蛋白質を標識し、各種細胞株または初代培養細胞に対して結合アッセイを行い、これにより受容体を発現している細胞を選定する（本庶・新井・谷口・村松編 新生化学実験講座７ 増殖分化因子とその受容体p203-236 (1991) 東京化学同人）。標識としては、125IなどのRI標識のほか、酵素（アルカリホスファターゼ等）標識も可能である。
また、本発明の蛋白質を標識せずに用いて、本発明の蛋白質と受容体を発現している細胞とを結合させた後に、本発明の蛋白質に対する抗体を標識して用いて検出することも考えられる。上記スクリーニングにより得られた本発明の蛋白質の受容体を発現する細胞は、後述するように該受容体のアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングに用いることが可能である。
【０１３１】
上記のスクリーニングにより、本発明の蛋白質が結合するリガンドや、本発明の蛋白質の受容体やその受容体を発現する細胞が得られれば、それらリガンドや受容体と結合する化合物のスクリーニングが可能となる。またそれらの結合活性を指標に、両者の結合を阻害する化合物（例えば、受容体アゴニストやアンタゴニスト）のスクリーニングが可能となる。
このスクリーニング方法は、本発明の蛋白質が受容体である場合は、（ａ）被検試料の存在下で、本発明の蛋白質または本発明の蛋白質を発現する細胞とリガンドとを接触させる工程、（ｂ）該蛋白質または該蛋白質を発現する細胞とリガンドとの結合活性を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下において検出した場合と比較して該結合活性を低下させる化合物を選択する工程、とを含む。また本発明の蛋白質がリガンドである場合には、（ａ）被検試料の存在下で、本発明の蛋白質を該蛋白質の受容体または該受容体を発現する細胞に接触させる工程、（ｂ）該蛋白質とその受容体または該受容体を発現する細胞との結合活性を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下において検出した場合と比較して、該結合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明の蛋白質との結合活性を指標とした上記のスクリーニングにより単離された化合物を被検試料として用いることも可能である。
【０１３２】
このスクリーニングにより単離される化合物は、本発明の蛋白質自体または本発明の蛋白質に対する受容体のアゴニストやアンタゴニストの候補となる。本発明の受容体とリガンドとの結合活性の低下によるリン酸化などの細胞内シグナルの変化をもとに、得られた化合物が本発明の蛋白質の受容体のアゴニストであるかアンタゴニストであるかを判定することができる。また、スクリーニングによって得られる化合物は、生体内において、本発明の蛋白質と相互作用する分子(受容体も含む)との該相互作用を阻害する化合物の候補ともなる。本発明の蛋白質、または本発明の蛋白質に結合する受容体、またはリガンド、更にはこれらの化合物は、本発明の蛋白質が関連する疾患の予防薬や治療薬への応用、または本発明の蛋白質が関連する疾患の検査薬への応用などが考えられる。
【０１３３】
分泌蛋白質の場合、細胞の増殖・分化などの細胞状態を制御する因子の可能性がある。新たな細胞状態を制御する因子は、ある種の細胞に、本発明によって提供される分泌蛋白質を加えることによって、細胞の増殖・分化などの細胞の状態変化や、細胞内の特定の遺伝子の活性化を指標にスクリーニングすることにより見出すことができる。
このスクリーニングは、例えば、以下のように行うことが可能である。まず、本発明の蛋白質を発現させ組換え蛋白質の精製品を取得する。次いで、その精製蛋白質を、各種細胞株または初代培養細胞に添加して、増殖・分化などの細胞の変化を調べる。または、ある特定の細胞状態の変化に影響を与えることが知られている遺伝子の誘導をmRNA量、蛋白質量で検出する。あるいはある特定の細胞状態変化に影響を与えることが知られている遺伝子産物（蛋白質）の働きにより変化した細胞内の物質（低分子化合物など）量で検出する。
【０１３４】
このようなスクリーニングにより、本発明による蛋白質が細胞状態、機能を制御するとなれば、本発明の蛋白質は、関連した疾患に対して、そのまま、あるいは一部適した状態に改変して、医薬品や検査薬への応用が考えられる。
また、先に膜タンパクについて記述したように、本発明によって提供される分泌蛋白質を用いて、公知の、あるいは新規なリガンドや受容体との結合活性に基づいてスクリーニングすれば、新たなリガンド−受容体の関係を見出すことができ、同様の方法でアゴニスト、アンタゴニストの判定が可能となる。こうして得られる化合物は、生体内において、本発明の蛋白質と相互作用する分子(受容体も含む)との該相互作用を阻害する化合物の候補ともなる。これら化合物は、本発明の蛋白質が関連する疾患の予防薬や治療薬、あるいは検査薬への応用が考えられる。
【０１３５】
シグナル伝達関連蛋白質、転写関連蛋白質の場合は、細胞内外の刺激に反応して、ある蛋白質や遺伝子に作用する因子の可能性がある。新たな蛋白質、遺伝子に作用する因子は、ある種の細胞に、本発明によって提供される蛋白質を発現させることによって、細胞内の特定の遺伝子や蛋白質の活性化を指標にスクリーニングすることにより見出すことができる。
このスクリーニングは、例えば、以下のように行うことが可能である。まず、本発明の蛋白質を発現した形質転換細胞株を取得する。次いで、その形質転換細胞株と、もとの未形質転換細胞株とにおいて、ある特定の遺伝子の変化をmRNA量、蛋白質量で検出する。あるいは、ある特定の遺伝子産物（蛋白質）の働きにより変化した細胞内の物質（低分子化合物など）量で検出する。さらには、ある特定の遺伝子の発現調節領域とマーカー遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等）の融合遺伝子を導入した細胞に、本発明によって提供される蛋白質を同時に発現させることによって、特定の遺伝子の発現の変化を、マーカー遺伝子産物（蛋白質）由来の活性で判定する。
【０１３６】
さらに転写関連蛋白質の場合、疾患に関与する種々の遺伝子の転写を調節する転写因子（以下、「疾患関連転写因子」と称する）への作用を解析することにより、その転写関連蛋白質が特定の疾患に直接的または間接的に関与しているかを解析することが可能である。例えば、疾患関連転写因子として、PPAR, p53, NFκB, AP-1, HIF-1, CREB等が知られている。
【０１３７】
PPARとは、ステロイドホルモン受容体ファミリーであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（peroxisome proliferator-activated receptor）であり、生活習慣病発症、例えば糖尿病や肥満等と関連する内分泌・糖・脂質代謝、さらには血管機能や炎症などの循環器系や発がん機構に関与する種々の標的遺伝子の発現を調節している転写因子として知られており、これらの疾患の治療薬のターゲット分子として注目されている。このPPARは複数のサブタイプ遺伝子が見いだされ、哺乳動物においてはα、γ、およびδ（ヒトではNUC I, マウスではFAAR (fatty acid-activated receptor), カエルではPPARβとも呼ばれる） の主に３種類のサブタイプ が明らかとなっている。α型は主として肝臓、腎臓、褐色脂肪細胞などの脂肪消費臓、その他心筋や消化管に発現が認められ、脂肪酸酸化、ケトン体生成、アポリポタンパクの生成などに関与する。β型は脳に、δ型は組織特異性がみられず普遍的に発現しているが大腸ガン細胞での発現が顕著であり、発ガンとの関係が注目されている。またγ型はγ１型とγ２型などの数種のアイソホームが知られており、γ１型は脂肪組織や免疫系臓器、副腎、小腸で発現し、γ２型は脂肪細胞で特異的な発現がみられ、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っていると考えられている。これらのPPARは別の転写因子であるRXR（レチノイドX受容体）などとヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子上流にある応答配列PPRE（PPAR response element）に結合し、転写を制御することが知られている。
【０１３８】
p53はRB遺伝子に引き続いて、1989年に２番目に同定された癌抑制遺伝子である。p53遺伝子は染色体の17p13.1に存在し、その遺伝子産物は分子量53kDの核内蛋白質である。最初、p53遺伝子はmycに似た癌遺伝子であると考えられていたが、その後、p53蛋白には野性型と変異型があり、野性型は細胞の増殖機能を制御する機能をもち、RB遺伝子と良く似た働きをもつ癌抑制遺伝子であることが明らかになった。p53蛋白は、転写因子としていくつかの遺伝子を制御している。そのうちでもっとも重要なものはサイクリン/Cdk複合体の機能を阻害するp21遺伝子の発現制御であると考えられている。p53の機能自体はリン酸化によって制御されている。癌化の抑制という観点からは、p53の機能として以下の２つが重要である。第１はプログラムされた細胞死であるアポトーシスを起こすシグナル伝達経路上にあることである。第２は細胞がDNA修復を行う間、細胞周期を停止させる働きである。このような機能を通じてp53は放射線や薬剤などによって障害を受けた細胞の細胞周期を停めたり、アポトーシスを引き起こして除去し、遺伝子変化を生じた細胞が癌細胞として増殖していくことを防止していることから、例えば、癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
【０１３９】
NFκBは、サイトカイン（例えば、IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNFなど）やケモカイン，インターフェロン，MHC分子，増殖因子，細胞接着分子などの遺伝子発現を制御し、特に免疫系に重要な働きを持つ転写因子として知られており、例えば、慢性関節リウマチや変形性関節炎などの免疫性疾患や炎症性疾患および癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
【０１４０】
AP-1は、転写因子のFosとJunファミリーからなる複合体で、細胞増殖，分化，特に細胞ガン化や炎症性疾患に関与していることが知られており、例えば、炎症性疾患や癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
【０１４１】
HIF-1は、低酸素状況において活性化される遺伝子転写因子であり、血管内皮増殖因子などの遺伝子発現制御を通じて血管新生の制御に密接に関わることが示されており、例えば、血管新生異常や細胞内酸化異常等に起因する、虚血性疾患、貧血、低酸素症、糖尿病性網膜症、循環器系疾患、癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
【０１４２】
CREB（Cyclic AMP Respones Element Binding protein）は、細胞増殖，分化，学習や記憶プロセス，薬物常用に対する神経系順応、インスリンとグルカゴンなどによるグルコネオジェネシスなどの代謝経路制御などに重要な働きを持つ転写因子として知られており、例えば、記憶障害などの中枢系疾患、循環器系疾患、糖尿病等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
【０１４３】
具体的には、各疾患関連転写因子が認識する遺伝子部位の塩基配列を固相に固定化する。特に疾患関連転写因子が認識する標的転写調節領域のDNAおよびその部分断片が、好適に用いられる。固定化するＤＮＡおよびその部分断片の配列の例示として、PPARγ解析用として配列番号２０９及び配列番号２１０、p53解析用として配列番号２１１及び配列番号２１２、NFκB解析用として配列番号２１３及び配列番号２１４、AP-1解析用として配列番号２１５及び配列番号２１６、HIF-1解析用として配列番号２１７及び配列番号２１８、CREB解析用として配列番号２１９及び配列番号２２０をあげたが、これらに限定されるものではない。ＤＮＡ及びその部分断片は、アニーリングさせたものを固定化する。固相は、例えばウェルプレートが使われ、直接或は例えばストレプトアビジン処理プレート、ニュートラアビジン処理プレート等に固定化される。ＤＮＡ及びその部分断片は、またビオチン標識したものを用いることはより好適な結果をもたらす。ＤＮＡ及びその部分断片の添加量は、好ましくは、1〜100nM/100μl/ウェルである。反応は、10〜30℃（室温）で、約30分〜2時間処理で行うことが好ましい。反応完了後、未反応物を除去し、より好ましくは蛋白質によるブロッキング操作を行う。
【０１４４】
このようにして調製されたウェルプレートに、転写関連因子を含む被検試料を各疾患関連転写因子と共に適宜添加し、被検試料に含まれる転写関連因子の作用を解析する。被検試料に含まれる転写関連因子が、疾患関連転写因子と結合し、固定化ＤＮＡとの親和性を高めるものであれば、反応洗浄後も疾患関連転写因子と転写関連因子の結合体が固定化ＤＮＡと結合した状態でウェル中に残り、例えば吸光度で測定すればコントロールに比較してOD値が上がり、転写関連因子が疾患関連転写因子と固定化ＤＮＡとの親和性に正に作用すると推定出来る。一方、被検試料に含まれる転写関連因子が、疾患関連転写因子と結合し或は結合せずに、疾患関連転写因子と固定化ＤＮＡとの親和性を低めるものであれば、反応洗浄後は疾患関連転写因子と転写関連因子の結合体はウェル中から除去され、例えば吸光度で測定すればコントロールに比較してOD値が下がり、転写関連因子が疾患関連転写因子と固定化ＤＮＡとの親和性に負に作用すると推定出来る。
【０１４５】
本発明のポリヌクレオチドがコードする蛋白質を含む解析用の被検試料は、前述のように本発明のポリヌクレオチドを適当な方法により転写／翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを無細胞転写翻訳系に供することにより蛋白質発現を誘導し、本発明の蛋白質を取得することができる。
【０１４６】
疾患関連転写因子は、該疾患関連転写因子が含まれている細胞抽出液または細胞核抽出液から取得することができる。また、前述のように、疾患関連転写因子をコードするポリヌクレオチドを適当な方法により転写／翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、疾患関連転写因子をコードするｃＤＮＡを使用し、その全長または一部を適当な発現ベクターに挿入し、これを大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞または動物に導入し、疾患関連転写因子が発現したこれらの遺伝子導入細胞の培養上清または細胞内、組織、体液より、組換え蛋白質である疾患関連転写因子を取得することができる。
【０１４７】
以下の35クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、PPARが有する作用を増強または抑制する活性を有し、内分泌・糖・脂質代謝異常等による糖尿病や肥満等の生活習慣病、血管機能異常等による循環器系疾患、炎症、癌等に関連することが推測された。
BRAWH20096780, BRCOC20110100, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20075860, CTONG20121010, D9OST20033970, FEBRA20018690, FEBRA20034680, HHDPC20031130, NT2NE20010490, NT2NE20142210, OCBBF20066391, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20112970, PROST20169800, PROST20185830, SKMUS20012011, SMINT20115880, SPLEN20054290, SPLEN20095411, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20044230, TESTI20130011, TESTI20156100, TESTI20200710, TESTI20327680, TESTI20378190, UTERU20134910, UTERU20145480
【０１４８】
以下の16クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、p53が有する作用を増強または抑制する活性を有し、癌等に関連することが推測された。
BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20121010, FCBBF10001710, FCBBF30129630, FEBRA20034680, FEBRA20195820, NT2NE20010490, NT2NE20130190, PROST20169800, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20252190, TESTI20156100, TESTI20200710, TESTI20327680
【０１４９】
以下の9クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、NFκBが有する作用を増強または抑制する活性を有し、慢性関節リウマチや変形性関節炎などの免疫性疾患、炎症性疾患、癌等に関連することが推測された。
CTONG20050280, FEBRA10001900, MESAN20127350, PROST20114390, SPLEN20054290, TESTI20327680, TESTI20378190, TRACH20079690, TRACH20079691
【０１５０】
以下の18クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、AP-1が有する作用を増強または抑制する活性を有し、炎症性疾患や癌等に関連することが推測された。
ASTRO20168470, BRCOC20110100, BRCOC20178270, CTONG20050280, CTONG20050281, CTONG20050282, CTONG20075860, CTONG20121010, FCBBF10001710, FEBRA20018690, HCHON20035131, OCBBF20060301, OCBBF20066391, PROST20114390, PROST20169800, PROST20185830, TESTI20023510, TESTI20319191
【０１５１】
以下の18クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、HIF-1が有する作用を増強または抑制する活性を有し、血管新生異常や細胞内酸化異常等に起因する、虚血性疾患、貧血、低酸素症、糖尿病性網膜症、循環器系疾患、癌等に関連することが推測された。
BRACE20190040, BRCAN20280210, HHDPC20031130, MESAN20127350, NT2NE20130190, NT2NE20142210, OCBBF20066391, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20112970, SPLEN20095411, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20130011, TESTI20200710
【０１５２】
以下の25クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、CREBが有する作用を増強または抑制する活性を有し、記憶障害などの中枢系疾患、循環器系疾患、糖尿病等に関連することが推測された。
BRACE20190040, BRCAN20280210, BRCOC20110100, CTONG20050282, CTONG20092680, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30129630, FEBRA10001900, FEBRA20018690, SKMUS20012011, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20044230, TESTI20130011, TESTI20156100, TESTI20189410, TESTI20327680, TESTI20378190, TRACH20079690, TRACH20079691, UTERU20134910
【０１５３】
このようなスクリーニングにより、影響を受けた蛋白質や遺伝子が疾患に関連していた場合、本発明による蛋白質を利用し、直接的に、または、間接的に、その発現や活性調節を行う化合物や遺伝子のスクリーニングが可能となる。
例えば、まず、本発明の蛋白質を発現させ組換え蛋白質の精製品を取得する。次に影響を受けた蛋白質や遺伝子を精製し、その結合を調べる。または、予め阻害剤の候補となる化合物を加えておいた後、それら結合の変化を調べる。あるいは、例えば他遺伝子の発現調節を行う本発明の蛋白質をコードする遺伝子の5'上流転写調節領域を取得し、マーカー遺伝子と融合した遺伝子を導入した細胞に、化合物などを添加して、当該遺伝子の発現を制御する因子を見いだす。
【０１５４】
このようなスクリーニングによって得られた化合物は、本発明による蛋白質が関連した疾患に対して医薬品への応用が考えられる。スクリーニングによって得られた制御因子が蛋白質であっても、同様に、その蛋白質の発現・活性に本来ない影響を与える化合物があれば、その化合物は、本発明による蛋白質が関連した疾患に対して医薬品への応用が考えられる。
分泌蛋白質、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質、疾患関連蛋白質のいずれの場合でも、本発明による蛋白質が酵素としての活性を有するとなれば、本発明によって提供される蛋白質に化合物を適当な条件下で添加し、化合物の変化を指標にスクリーニングすれば可能である。また、この活性を指標に本発明による蛋白質の活性を阻害する化合物のスクリーニングも可能である。
【０１５５】
このスクリーニングは、例えば、以下のように行うことが可能である。まず、本発明の蛋白質を発現させ組換え蛋白質の精製品を取得する。次いで、その精製蛋白質に、化合物を添加して、化合物量および反応生成物量を調べる。または、予め阻害剤の候補となる化合物を加えておいた後、精製蛋白質と反応する化合物（基質）を加えて、その基質量および反応生成物量の変化を調べる。
このようなスクリーニングにより、得られた化合物は、本発明の蛋白質が関連した疾患に対して、医薬品への応用が考えられる。また本発明の蛋白質が生体において正常に機能しているかどうかを調べるなどの検査への応用が考えられる。
【０１５６】
本発明の分泌蛋白質、膜蛋白質、シグナル伝達関連蛋白質、糖蛋白質関連蛋白質、転写関連蛋白質が、新たな疾患関連蛋白質であるかは、上記に挙げた以外に、本発明による蛋白質を発現して得られた特異認識抗体を用いて、特定の疾患と蛋白質の発現量や活性との相関を知ることができる。あるいは、「Method in Molecular Biology」(Humana Press社)シリーズの『Molecular Diagnosis of Genetic Diseases』（Rob Elles編、1996）を参考に解析が可能である。
疾患関連蛋白質は、前述のようなスクリーニングの対象となり、その発現・活性を制御する薬剤の開発に有用である。また、関連した疾患の診断マーカー、あるいは遺伝子治療のターゲットになるなど医療産業上、有用である。
【０１５７】
以上により単離された化合物を医薬品として用いる場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１５８】
更に本発明は、表１に記載された塩基配列および／またはアミノ酸配列から選択された少なくとも１つを含む全長cDNAおよび／または蛋白質データベースに関する。データベースとは、塩基配列情報を検索可能な機械可読式の情報として蓄積した情報の集合を意味する。本発明のデータベースは、本発明によって提供されるcDNAの塩基配列の少なくとも一つを含む。本発明のデータベースは、本発明によって提供されるcDNAのみから構成されていても良いし、公知の全長cDNAやEST等の塩基配列情報をも含むものであることができる。本発明のデータベースには、塩基配列情報のみならず、本発明によって明らかにされた遺伝子の機能情報や、その全長cDNAを保持したクローンの名称などの付随した情報を合わせて記録したり、あるいはリンクさせておくことができる。
【０１５９】
本発明のデータベースは、遺伝子断片の情報に基づく、遺伝子全長の取得に有用である。本発明に基づくデータベースは、いずれも全長cDNAの塩基配列情報からなっている。したがって、ディファレンシャルディスプレー法や、サブトラクション法によって得られた遺伝子断片の塩基配列を、このデータベースの情報に照合すれば、断片の塩基配列に基づいて遺伝子の全長塩基配列を明らかにすることができる。
しかも本発明のデータベースを構成する全長cDNAの配列情報は、全長であることのみならず、遺伝子の発現頻度情報や、公知の遺伝子や蛋白質との相同性検索結果を伴っていることから、遺伝子断片の機能解析を飛躍的に迅速化する。 更に本発明のデータベースは、ヒトの遺伝子に関する情報を蓄積しているものであることから、他の種から単離された遺伝子の塩基配列情報に基づくヒトのホモログの単離に有用である。
【０１６０】
現在では、ディファレンシャルディスプレー法や、サブトラクション法によって、さまざまな遺伝子断片情報を得ることができる。一般にこれらの遺伝子断片は、その全長を取得するためのツールとして用いられる。遺伝子断片が公知の遺伝子のものであれば、公知のデータベースとの照合によって、その全長を明らかにすることは容易である。しかし、公知の遺伝子データベースに一致する塩基配列を見出せない場合には、全長cDNAのクローニングを行わなければならない。これらの断片情報に基づいて全長塩基配列を取得する工程は、しばしば困難を伴う。遺伝子の全長を取得しない限り、その遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列は明らかにできない。したがって、本発明のデータベースは、公知の遺伝子のデータベースでは解明することのできない、遺伝子断片に対応する全長cDNAの特定に貢献する。
【０１６１】
実施例１．  オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製
（１）  mRNA抽出と購入
ヒト組織（下記に示す）より、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法により全RNAとしてmRNAを抽出した。また、ヒト培養細胞やヒト初代培養細胞（下記に示す）をカタログ記載の方法で培養後、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法により全RNAとしてmRNAを抽出した。
以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。サブトラクションしたものについては、サブトラクトライブラリーの作り方も示した。
＜ヒト組織よりmRNA抽出＞
CTONG：舌癌(Tongue, Cancer)；
FCBBF：胎児脳(Brain, Fetal)；
OCBBF：胎児脳(Brain, Fetal)。
【０１６２】
＜培養細胞よりmRNA抽出＞
NT2NE：NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収(NT2 Neuron)。
【０１６３】
＜初代培養細胞よりmRNA抽出＞
ASTRO：正常神経膠星状細胞(Normal Human Astrocyte) NHA5732, 宝酒造 #CC2565；
MESAN：正常メサンギウム細胞(Normal human mesangial cells) NHMC56046-2, 宝酒造 #CC2559；
PEBLM：正常末梢血単核細胞(Human peripheral blood mononuclear cells) HPBMC5939, 宝酒造 #CC2702；
HCHON：正常軟骨細胞HC(Human Chondrocytes), 東洋紡 #T402K-05；
HHDPC：正常頭髪毛乳頭細胞HDPC(Human dermal papilla cells), 東洋紡 #THPCK-001；
D3OST：CD34+細胞を破骨細胞分化因子(ODF)処理誘導3日間；
D9OST：CD34+細胞をODF処理誘導9日間。
【０１６４】
次いで、以下に示すヒト組織より全RNAとして抽出されたmRNAを購入した。以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。サブトラクションしたものについては、サブトラクトライブラリーの作り方も示した。
＜ヒト組織よりのmRNAを全RNAで購入＞
BRACE：小脳(Brain, cerebellum), CLONTECH #64035-1；
BRAWH：全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1；
FEBRA：胎児脳(Brain, Fetal), CLONTECH #64019-1；
PROST：前立腺(Prostate), CLONTECH #64038-1；
SKMUS：骨格筋(Skeletal Muscle), CLONTECH #64033-1；
SMINT：小腸(Small Intestine), CLONTECH #64039-1；
SPLEN：脾臓(Spleen), CLONTECH #64034-1；
TESTI：精巣(Testis), CLONTECH #64027-1；
TRACH：気管(Trachea), CLONTECH #64091-1；
UTERU：子宮(Uterus), CLONTECH #64029-1。
【０１６５】
さらに、次に示すヒト組織よりポリA(+) RNAとして抽出・精製されたmRNAを購入した。各組織由来のポリA(+) RNAに、ポリA(-)RNAを混ぜたRNAからcDNAライブラリーを作製した。ポリA(-)RNAは、全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1の全RNAからポリA(+)RNAをオリゴdTセルロースで除くことにより調製した。以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。
＜ヒト組織よりのmRNAをポリA(+) RNAで購入＞
BRAMY：扁桃(Brain, amygdala), CLONTECH #6574-1；
BRCAN：尾状核(Brain, caudate nucleus), CLONTECH #6575-1；
BRCOC：脳梁(Brain, corpus callosum), CLONTECH #6577-1；
BRHIP：海馬(Brain, hippocampus), CLONTECH #6578-1。
【０１６６】
（２）  cDNAライブラリーの作製
それぞれのRNAよりオリゴキャプ法[M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)]を改良した方法(WO 01/04286)によりcDNAライブラリーを作製した。Oligo-cap linker（配列番号１４０）およびOligo dT primer（配列番号１４１）を用いて、WO 01/04286に記載したようにBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理、TAP（Tobacco Acid Pyrophosphatase）処理、RNAライゲーション、第一鎖cDNAの合成とRNAの除去を行った。次いで、5'（配列番号１４２）と3'（配列番号１４３）のPCRプライマーを用いPCR (polymerase chain reaction)により2本鎖cDNAに変換し、SfiI切断した。次いで、通常は2kb以上（場合によっては3kb以上）に分画したcDNA断片をDraIIIで切断したベクターpME18SFL3（図１）（GenBank AB009864, Expression vector）にcDNAの方向性を決めてクローニングし、cDNAライブラリーを作製した。
実施例７の発現頻度解析の用いたデータベースに供したクローンを含むｃＤＮＡライブラリーも、上記と同様の方法で作成した。
全長cDNA配列解析に用いたcDNAライブラリー名とその由来の関係を表２に示した。
【０１６７】
【表２】
2005237384.tif 000003
2005237384.tif 000004
【０１６８】
オリゴキャップ法を改良した方法で作製した高全長率cDNAライブラリー（既知mRNAの蛋白質コード領域を指標にして算出した各cDNAライブラリーの5'端の全長率は平均９０％）は、真核細胞での発現が可能な発現ベクターpME18SFL3を用いて作製した。pME18SFL3にはクローニング部位の上流にSRαプロモーターとSV40 small tイントロンが組み込まれており、またその下流にはSV40ポリA付加シグナル配列が挿入されている。pME18SFL3のクローン化部位は非対称性のDraIIIサイトとなっており、cDNA断片の末端にはこれと相補的なSfiI部位を付加しているので、クローン化したcDNA断片はSRαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長cDNAを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままCOS細胞などに導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物である蛋白質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
【０１６９】
（３）  オリゴキャップ法で作製したcDNAライブラリーからのクローンの5'-末端の全長性の評価
これらより得たクローンのプラスミドDNAについて、cDNAの5'端（一部のクローンについては3'端も）の塩基配列をDNAシーケンシング試薬（BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 3700, PE Biosystems社製）でDNA塩基配列を解析した。得られたデータをデータベース化した。
オリゴキャップ法を改良した方法で作製したヒトcDNAライブラリーの約111万クローンの5'-末端の全長率を次の方法で求めた。公共データベース中のヒト既知mRNAと5'-末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知mRNA配列より長く5'-末端が伸びている場合、または5'-末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。これをもとに5'-末端の全長率 [全長クローン数／（全長クローン数＋非全長クローン数）] を計算した。この結果、5'-末端の全長率は、90%であった。この結果より、オリゴキャップ法で取得したヒトcDNAライブラリーからのクローンの5'-端配列の全長率が非常に高いことが分かった。
【０１７０】
実施例２．  cDNAクローン末端配列解析と全長塩基配列解析クローンの選択
各cDNAライブラリーより得たクローンのプラスミドDNAについて、cDNAの5'末端の塩基配列をDNAシーケンシング試薬（Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction KitまたはBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 3700, PE Biosystems社製）で解析した。得られたデータについてはデータベース化を行った。
解析されたcDNAクローンの5'末端配列については、GenBank、UniGeneのcomplete cdsの表記があるデータを対象にしたBLASTによる相同性検索を行い、ヒトのmRNA配列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性90%以上かつコンセンサス配列が50塩基対以上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させた。グループ内の、より5'-側に長いクローンを選択し、選択されたクローンについては必要に応じ3'末端配列を5'末端配列と同様の方法で解析取得した。取得された末端配列のデータを解析し、5'末端と3'末端の配列でコンティグを作るクローンは除いた。更に再度前記と同様にBLASTによる相同性検索によりヒトのmRNA配列（特許化または特許出願された配列を含む）に同一なものは除いた。こうして選択したクローンより全長塩基配列解析を行うクローンを得た。
【０１７１】
実施例３．  全長塩基配列解析
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて各々全長cDNAの塩基配列を決定した。塩基配列は、主にカスタム合成DNAプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成DNAプライマーを用い、PE Biosystem社製のDNAシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてDNA塩基配列を解析した。一部のクローンについては、Licor社製DNAシーケンサーも利用した。
また、一部のクローンについてはカスタムプライマーを用いずcDNA が含まれるプラスミドをランダムに切断するショットガン法を用いて同様にDNAシーケンサーでDNA塩基配列を決定した。全長塩基配列は上記方法により決定された部分塩基配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。
次に、決定された全長塩基配列から、蛋白質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。それぞれに対応する配列番号を表１に示す。
【０１７２】
実施例４．相同性検索による機能予測
決定された塩基配列についてGenBank、SwissProt、UniGene、nrに対するBLAST検索を行った。P値またはE値が10-4以下であり、かつアミノ酸データベースを対象にした解析においてはコンセンサス長×相同性＝３０以上のBLAST検索ヒットデータの中から、相同性がより高く、塩基配列及び推定アミノ酸配列に対して機能の予測が比較的容易なヒットデータの中から代表的なものを選択し、相同性検索結果データとして明細書の最後に示した。したがって示したデータはあくまで代表的なものであり、各クローンに相同性を示す分子が、これのみに限定されるというわけではない。また、一部のクローンにおいて、先に記した条件にあてはまらないBLAST検索ヒットデータについては示さなかった。
【０１７３】
実施例５．推定アミノ酸配列に対するシグナル配列、膜貫通領域および機能ドメインの検索
全長塩基配列から推定されたアミノ酸配列に対して、アミノ末端のシグナル配列の有無と膜貫通領域の有無を予測、さらに蛋白質の機能ドメイン（モチーフ）検索を行った。アミノ末端のシグナル配列についてはPSORT [K. Nakai & M.Kanehisa, Genomics, 14: 897-911 (1992)]を、膜貫通領域についてはSOSUI [T.Hirokawa et.al. Bioinformatics, 14: 378-379 (1998)]（三井情報開発株式会社販売）を用いて解析を行った。機能ドメインの検索についてはPfam（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml）を用いた。PSORTやSOSUIにより、アミノ末端のシグナル配列や膜貫通領域が予測されたアミノ酸配列は分泌、膜蛋白質であると予測された。また、Pfamによる機能ドメイン検索において、ある機能ドメインにヒットしたアミノ酸配列はヒットデータをもとに、例えばPROSITE(http://www.expasy.ch/cgi-bin/prosite-list.pl)にある機能カテゴリー分類を参照にしてその蛋白質の機能予測することができる。また、PROSITEでの機能ドメインの検索も可能である。
各ソフトウェアによる検索結果を以下に示す。
【０１７４】
PSORTにより推定アミノ酸配列にシグナル配列を検出されたクローンは、以下の通りであった。
BRCOC20121720, FCBBF30095260
【０１７５】
SOSUIにより推定アミノ酸配列に膜貫通領域を検出されたクローンは、以下の通りであった。数字は推定アミノ酸配列中に検出された膜貫通領域の数を示している。検索結果は、クローン名と膜貫通領域の数を//で区切って示した。
BRCOC20121720//7, D3OST30002580//2, FCBBF30095260//2, HCHON20035130//1, PROST20169800//1
【０１７６】
Pfamにより推定アミノ酸配列に機能ドメインを検出されたクローン名とヒットした機能ドメイン名は以下の通りであった。検索結果は、クローン名//機能ドメイン名のように示し、複数の機能ドメインがヒットした場合には//で区切って並記した。なお同一の機能ドメインが複数ヒットした場合も省略せずに記載した。
ASTRO20084250//KH domain// Zinc finger, C3HC4 type (RING finger)
ASTRO20168470//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// TRAF-type zinc finger// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
BRACE20190040//Integrase DNA binding domain
BRAMY20270730//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// PHD-finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C3HC4 type (RING finger)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
BRAWH20096780//KRAB box// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// PHD-finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
BRAWH20185060//Integrase core domain
BRCAN20280210//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
BRCOC20110100//Integrase core domain
BRCOC20121720//PHD-finger
BRCOC20178270//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
BRHIP20222280//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
CTONG20050280//KRAB box// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// TRAF-type zinc finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
CTONG20075860//Ribulose bisphosphate carboxylase, smal
CTONG20121010//Zinc finger, C2H2 type// CONSTANS family zinc finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
D9OST20033970//KRAB box// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// PHD-finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Putative zinc finger in N-recognin// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
FCBBF10001710//DM DNA binding domain// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
FCBBF20059090//Zinc finger, C2H2 type
FCBBF30095260//DHHC zinc finger domain
FCBBF30129630//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
FEBRA10001900//Zinc finger, C2H2 type
FEBRA20018690//Zinc finger, C2H2 type
FEBRA20034680//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// DnaJ central domain (4 repeats)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// PHD-finger// Zinc finger, C2H2 type
FEBRA20195820//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// TRAF-type zinc finger// Zinc finger, C2H2 type
HCHON20035130//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
HHDPC20031130//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
MESAN20127350//Zinc knuckle
NT2NE20010490//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// DM DNA binding domain// Zinc finger, C2H2 type// PHD-finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
NT2NE20130190//Zinc finger, C2H2 type
NT2NE20142210//PAS domain// PAS domain
OCBBF20066390//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
OCBBF20108190//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// IBR domain// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
PEBLM20078320//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// PHD-finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// DnaJ central domain (4 repeats)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
PROST20112970//Sterile alpha motif (SAM)/Pointed domain// SAM domain (Sterile alpha motif)
PROST20114390//Integrase DNA binding domain
PROST20169800//Cytochrome P450
PROST20185830//GATA zinc finger
SMINT20115880//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
SPLEN20054290//Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
SPLEN20095410//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
SPLEN20252190//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// PHD-finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// TRAF-type zinc finger// Zinc finger, C2H2 type
SPLEN20267650//KRAB box// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// TRAF-type zinc finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
TESTI20023510//Transcription termination factor nusG
TESTI20044230//Nucleosome assembly protein (NAP)// Nucleosome assembly protein (NAP)// Nucleosome assembly protein (NAP)
TESTI20130010//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
TESTI20156100//Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
TESTI20189410//PHD-finger
TESTI20200710//PHD-finger// LIM domain containing proteins
TESTI20327680//EF hand// EF hand
TESTI20378190//KRAB box// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
TRACH20079690//KRAB box// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// TRAF-type zinc finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
UTERU20145480//KRAB box// Zinc finger, C2H2 type// Transcription factor S-II (TFIIS)// Zinc finger, C2H2 type// TRAF-type zinc finger// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// wnt family of developmental signaling proteins// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type// Zinc finger, C2H2 type
【０１７７】
実施例６．全長塩基配列による機能カテゴリー分類
全長塩基配列のGenBank、Swiss-Prot、UniGene、nrの各データベースを対象に行った相同性検索の結果（相同性検索結果データ参照）や、全長塩基配列から推定されたアミノ酸配列に対するドメイン検索の結果（実施例５参照）から、クローン中にコードされる蛋白質の機能予測、カテゴリー分類を行った。
【０１７８】
分泌・膜蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に growth factor, cytokine, hormone, signal, transmembrane, membrane, extracellular matrix, receptor, G-protein coupled receptor, ionic channel, voltage-gated channel, calcium channel, cell adhesion, collagen, connective tissue 等、分泌・膜蛋白質と推定される記載があった、もしくはPsortとSOSUIによる推定ORFの解析の結果、シグナルシークエンスや膜貫通領域があったクローンである。
【０１７９】
糖蛋白質関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に glycoprotein 等、糖蛋白質関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８０】
シグナル伝達関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に serine/threonine-protein kinase, tyrosine-protein kinase, SH3 domain, SH2 domain等、シグナル伝達関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８１】
転写関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に transcription regulation, zinc finger, homeobox 等、転写関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８２】
疾患関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中に disease mutation, syndrome 等、疾患関連蛋白質と推定される記載があった、あるいは全長塩基配列に対するSwiss-Protヒットデータ、及びGenBank、UniGeneヒットデータが、ヒトの遺伝子と疾患のデータベースであるOnline Mendelian Inheritance in Man (OMIM)に登録されている遺伝子、蛋白質であったクローンである。
【０１８３】
酵素・代謝関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にmetabolism, oxidoreductase, E.C.No. (Enzyme commission number)等、酵素・代謝関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８４】
細胞分裂・増殖関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、cell division, cell cycle, mitosis, chromosomal protein, cell growth, apoptosis等、細胞分裂・増殖関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８５】
細胞骨格関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にstructural protein, cytoskeleton, actin-binding, microtubles等、細胞骨格関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８６】
核蛋白質・RNA合成関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にnuclear protein, RNA splicing, RNA processing, RNA helicase, polyadenylation等、核蛋白質・RNA合成関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８７】
蛋白質合成・輸送関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にtranslation regulation, protein biosynthesis, amino-acid biosynthesis, ribosomal protein, protein transport, signal recognition particle等、蛋白質合成・輸送関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８８】
細胞防御関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にheat shock, DNA repair, DNA damage等、細胞防御関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１８９】
発生・分化関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、developmental protein等、発生・分化関連蛋白質と推定される記載があったクローンである。
【０１９０】
DNA・RNA結合蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にDNA-binding, RNA-binding等と記載があったクローンである。
【０１９１】
ATP・GTP結合蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンとは、ヒットデータ中にATP-binding, GTP-binding等と記載があったクローンである。
【０１９２】
この機能カテゴリー分類では一つのクローンが上記の複数のカテゴリーに該当する場合は、そのまま複数のカテゴリーに分類した。ただし、蛋白質の機能は必ずしも分類された機能カテゴリーに限定されるわけではなく、今後その他の機能も明らかになる可能性がある。
【０１９３】
分泌・膜蛋白質に属すると推定されたクローンは、以下の４クローンであった。
BRCOC20121720, D3OST30002580, FCBBF30095260, PROST20169800
【０１９４】
転写関連蛋白質に属すると推定されたクローンは、以下の３３クローンであった。
ASTRO20168470, BRAMY20270730, BRAWH20096780, BRCAN20280210, BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20075860, CTONG20121010, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30129630, FEBRA20018690, FEBRA20034680, FEBRA20195820, HCHON20035130, HHDPC20031130, NT2NE20010490, NT2NE20142210, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20185830, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20130010, TESTI20156100, TESTI20378190, TRACH20079690, UTERU20145480
【０１９５】
疾患関連蛋白質に属すると推定されたクローンは、以下の１８クローンであり、Swiss-Protヒットデータ、及びGenBank、UniGene、nrヒットデータが、ヒトの遺伝子と疾患のデータベースであるOnline Mendelian Inheritance in Man (OMIM)に登録されている遺伝子、蛋白質であった（クローン名の後ろのカッコ内は対象となったOMIM Number）。
ASTRO20168470 (604077), BRAWH20096780 (602277), BRCAN20280210 (194538), BRCOC20178270 (194558), BRHIP20222280 (603899), FCBBF10001710 (194558), FCBBF20059090 (194542), FCBBF30129630 (603899), FEBRA20018690 (194542), FEBRA20195820 (604074), HCHON20035130 (194529), NT2NE20010490 (603899), PROST20169800 (604426), SPLEN20095410 (602277), SPLEN20252190 (604077), SPLEN20267650 (602277),  TESTI20156100 (602253), TRACH20079690 (604078) 
【０１９６】
酵素・代謝関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の１クローンであった。
PROST20169800
【０１９７】
細胞防御関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の１クローンであった。
CTONG20092680
【０１９８】
発生、分化関連蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の２クローンであった。
CTONG20121010, NT2NE20142210
【０１９９】
DNA・RNA結合蛋白質のカテゴリーに属すると推定されたクローンは、以下の３３クローンであった。
ASTRO20168470, BRAMY20270730, BRAWH20096780, BRCAN20280210, BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20075860, CTONG20121010, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30129630, FEBRA20018690, FEBRA20034680, FEBRA20195820, HCHON20035130, HHDPC20031130, NT2NE20010490, NT2NE20142210, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20185830, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20130010, TESTI20156100, TESTI20378190, TRACH20079690, UTERU20145480
【０２００】
別のORFが転写関連蛋白質をコードしていると推定されたクローンは、以下の１２クローンであった。
BRAMY20170141, CTONG20050281, CTONG20050282, D3OST30002581, HCHON20035131, OCBBF20060301, OCBBF20066391, SKMUS20012011, SPLEN20095411, TESTI20130011, TESTI20319191, TRACH20079691
【０２０１】
上記以外のクローンのうち、
ASTRO20084250, FEBRA10001900, NT2NE20130190, SMINT20115880, TESTI20023510, TESTI20189410, TESTI20200710 
以上７クローンについては、Pfamによるドメイン検索の結果から、転写関連蛋白質に属する可能性が高いクローンであった。
BRACE20190040, BRAWH20185060, PROST20114390 
以上３クローンについては、Pfamによるドメイン検索の結果から、酵素・代謝関連蛋白質に属する可能性が高いクローンであった。
ASTRO20084250, BRACE20190040, FEBRA10001900, NT2NE20130190, PROST20114390, SMINT20115880, TESTI20023510, TESTI20189410, TESTI20200710 
以上７クローンについては、Pfamによるドメイン検索の結果から、DNA・RNA結合蛋白質に属する可能性が高いクローンであった。
【０２０２】
以下の５クローンについては、上記のいずれのカテゴリーに属するか明らかでないクローンであったが、全長配列に対する相同性検索、および推定ORFに対するモチーフ検索で何らかの機能が予測されているクローンである。クローン名と相同性検索結果のDefinitionまたはモチーフ検索結果のモチーフ名を//で区切り、以下に示した。
【０２０３】
BRCOC20110100//Integrase core domain
MESAN20127350//myelin expression factor-3
PROST20112970//Sterile alpha motif (SAM)/Pointed domain// SAM domain (Sterile alpha motif) 
TESTI20044230//Mus musculus testis-specific Y-encoded-like protein (Tspyl1) mRNA, complete cds. 
TESTI20327680//EF hand// EF hand
【０２０４】
残る５クローンについては、現在のところ機能を推定できる情報の得られないクローンであった。これらクローンについては今後、機能が明らかになる可能性がある。クローン名を以下に示した。
BRAMY20170140, OCBBF20060300, SKMUS20012010, TESTI20319190, UTERU20134910
【０２０５】
実施例７．In silicoにおける発現頻度解析
実施例１に示した様々な組織・細胞由来のcDNAライブラリーを作製し、各ライブラリーからcDNAクローンを無作為に選択して、その5'末端領域の配列を決定し、データベース化した。本データベースは１,４０２，０７０個のクローンの塩基配列をデータベース化したものであり、解析母数としては十分なデータベースである。
次にこのデータベースにある各クローンの塩基配列を、塩基配列の相同性検索プログラムによって相同な配列同士をカテゴライズし（クラスター化）、各クラスターに属するクローン数を各ライブラリー毎に集計し規格化することによって、ある遺伝子のcDNAライブラリー内での存在比を解析した。この解析によって、cDNAライブラリーのソースとなっている組織や細胞における、ある遺伝子の発現頻度情報を得た。
【０２０６】
次に本発明のcDNAの塩基配列を持つ遺伝子の、組織や細胞間での発現を解析するために、大量のcDNAクローンを解析した組織や細胞由来のライブラリーを組織・細胞間での発現量の比較の対象にした。すなわち６００個以上のcDNAクローンの塩基配列を解析した組織や細胞について、先に規格化した数値を組織間や細胞間で比較し、遺伝子の発現頻度の変化を解析した。この解析によって以下に続く病態や機能に関連する遺伝子であることが示された。なお、以降に示される表３〜１１中の各数値は、相対的な発現頻度を示し、数値が大きいほど発現量が多いことを示す。
【０２０７】
骨粗鬆症に関連する遺伝子
骨粗鬆症とは、骨の成分が全体として減少し、骨折しやすくなった病態であるが、その発症には骨を産生する骨芽細胞と、骨を吸収する破骨細胞の働きのバランス、すなわち骨代謝が関与する。したがって単球／マクロファージ系の前駆細胞から分化する破骨細胞（Molecular Medicine 38. 642-648. (2001)）の増加に関連する遺伝子は、骨代謝に関連した骨粗鬆症に関する遺伝子である。
【０２０８】
単球／マクロファージ系の前駆細胞（糖蛋白質CD34を発現している細胞：CD34+細胞）での発現頻度と比較して、CD34+細胞を破骨細胞分化因子（Molecular Medicine 38. 642-648. (2001)）で処理した細胞で増加または減少する遺伝子を、塩基配列情報にしたがって解析し、探索した。CD34+細胞のRNAから作製したライブラリー（CD34C）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子で処理した細胞のRNAから作製したライブラリー（D30ST, D60STまたはD90ST）のcDNAを解析して比較した結果（表３）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
D9OST20033970、D3OST30002580 
これらのクローンは骨粗鬆症に関する遺伝子である。
【０２０９】
神経細胞分化関連遺伝子
神経細胞の分化に関する遺伝子は、神経疾患の治療に有用な遺伝子である。神経系の細胞を分化誘導して発現変化する遺伝子は、神経疾患に関すると考えられている。
神経系の培養細胞NT2を分化誘導（レチノイン酸(RA)刺激またはRA刺激後さらに増殖阻害剤処理）して発現変化する遺伝子を探索した。未分化なNT2細胞由来のライブラリー（NT2RM）と分化誘導処理した細胞のライブラリー（NT2RP, NT2RIまたはNT2NE）のcDNAを解析して比較した結果（表４）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
BRCOC20121720、NT2NE20010490、NT2NE20130190、CTONG20075860、NT2NE20142210、CTONG20050280、OCBBF20108190 
これらの遺伝子は神経疾患に関する遺伝子である。
【０２１０】
癌関連遺伝子
癌の組織では、正常組織とは異なる遺伝子のセットが発現して組織・細胞の癌化に寄与していると考えられている。したがって、正常組織とは異なる発現をする遺伝子は癌関連遺伝子である。正常な組織と比較して癌組織で発現変化する遺伝子を探索した。
【０２１１】
乳がん由来のライブラリー（TBAES）と、正常な乳房由来のライブラリー（BEAST）のcDNAを解析して比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０２１２】
子宮頸癌由来のライブラリー（TCERX）と、正常な子宮頸管由来のライブラリー（CERVX）のcDNAを解析して比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０２１３】
結腸がん由来のライブラリー（TCOLN）と、正常な結腸由来のライブラリー（COLON）のcDNAを解析して比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０２１４】
食道がん由来のライブラリー（TESOP）と、正常な食道由来のライブラリー（NESOP）のcDNAを解析して比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。 
【０２１５】
腎臓がん由来のライブラリー（TKIDN）と、正常な腎臓由来のライブラリー（KIDNE）のcDNAを解析して比較した結果（表５）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
BRAWH20096780 
【０２１６】
肝臓がん由来のライブラリー（TLIVE）と、正常な肝臓由来のライブラリー（LIVER）のcDNAを解析して比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０２１７】
肺がん由来のライブラリー（TLUNG）と、正常な肺由来のライブラリー（HLUNG）のcDNAを解析して比較した結果（表６）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
PROST20185830、SPLEN20054290 
【０２１８】
卵巣がん由来のライブラリー（TOVER）と、正常な卵巣由来のライブラリー（NOVER）のcDNAを解析して比較した結果（表７）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
TRACH20079690 
【０２１９】
胃がん由来のライブラリー（TSTOM）と、正常な胃由来のライブラリー（STOMA）のcDNAを解析して比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。 
【０２２０】
子宮がん由来のライブラリー（TUTER）と、正常な子宮由来のライブラリー（UTERU）のcDNAを解析して比較した結果（表８）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
BRCOC20121720、BRHIP20222280、D3OST30002580、SPLEN20054290、UTERU20134910、UTERU20145480 
【０２２１】
舌がん由来のライブラリー（CTONG）と、正常な舌由来のライブラリー（NTONG）のcDNAを解析して比較した結果（表９）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
CTONG20050280、CTONG20075860、CTONG20092680、CTONG20121010、UTERU20134910 
これらの遺伝子は、癌に関する遺伝子である。
【０２２２】
また、発生や分化に関連する遺伝子を調べる方法として、発生・分化途中の組織・細胞と、成体の組織細胞において遺伝子発現量の違いを調べる発現頻度解析がある。組織の発生・分化に関する遺伝子は、その組織の構築と機能発現に関する遺伝子であり、傷害のある組織を任意に再生せしめる再生医学に利用可能な有用な遺伝子である。
【０２２３】
先に記した1,402,070個のクローンの塩基配列のデータベースを基にして得た遺伝子発現頻度情報を用いて、発生・分化途中の組識・細胞と成体の組識・細胞とを比較して遺伝子発現頻度に変化のある遺伝子を解析した。
【０２２４】
胎児の脳由来のライブラリー（FCBBF, FEBRAまたはOCBBF）と成体の脳由来のライブラリー（BRACE, BRALZ, BRAMY, BRAWH, BRCAN, BRCOC, BRHIP, BRSSN, BRSTNまたはBRTHA）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果（表１０）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
BRACE20190040、BRAMY20170140、BRAMY20270730、BRAWH20096780、BRAWH20185060、BRCAN20280210、BRCOC20110100、BRCOC20121720、CTONG20050280、CTONG20121010、NT2NE20010490、PROST20185830、SKMUS20012010、SPLEN20054290、TRACH20079690、FCBBF10001710、SMINT20115880、UTERU20145480、FEBRA10001900、FEBRA20034680、FEBRA20195820、BRHIP20222280、OCBBF20060300、OCBBF20066390、CTONG20075860、OCBBF20108190、FCBBF30095260、FCBBF20059090
【０２２５】
胎児の心臓由来のライブラリー（FEHRT）成体の心臓由来のライブラリー（HEART）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０２２６】
胎児の腎臓由来のライブラリー（FEKID）成体の腎臓由来のライブラリー（KIDNE）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果５８クローンとも両者で発現変化は見られなかった。
【０２２７】
胎児の肺由来のライブラリー（FELNG）成体の肺由来のライブラリー（HLUNG）のcDNAを解析し、胎児と成体で比較した結果（表１１）、両者で発現変化のある遺伝子は以下のクローンであった。
PROST20185830、SPLEN20054290、D9OST20033970
これらの遺伝子は組織・細胞の再生に関する遺伝子である。
【０２２８】
実施例８．PCR法を用いた発現頻度解析
全長塩基配列をもとにして、特異的なPCRプライマーを作製し、ATAC-PCR法(Adaptor-tagged competitive PCR法: Nucleic Acids Research 1997, 25(22):4694-4696、村松・那波監修 細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」(秀潤社、2000): 104-112)による発現頻度解析を行った。炎症惹起因子によって発現変化する遺伝子を特定することによって、炎症にかかわる遺伝子を同定することができると考えられる。そこでこの系に適した単球系細胞株であるTHP-1細胞株において、炎症惹起因子であるTNF-αによって発現が変化する遺伝子を解析した。
【０２２９】
THP-1細胞株（大日本製薬より入手）を5%ウシ胎児血清（GIBCO BRL社製）を含有するRPMI1640培地（シグマ社製）でコンフルエントに達するまで培養した後、10 ng/mlのTNF-α(human recombinant TNF-α; ファルマシアバイオテク社製)を含む培地に交換し、37℃, 5％CO2条件下で培養を続けた。その後1, 3時間後に細胞を回収し、それぞれISOGEN試薬（ニッポンジーン社）を使用してtotal RNAを抽出した。抽出操作は、ISOGEN試薬の添付書類記載の方法に従った。また、TNF-αで刺激しない細胞からも同様にtotal RNAを抽出した。
【０２３０】
ヘリコバクター・ピロリとの共培養により発現変化する遺伝子を特定することによって、ヘリコバクター・ピロリの胃上皮への感染による胃炎や胃十二指腸潰瘍発症に関する遺伝子を同定することができると考えられる。最近の研究では、ヘリコバクターに由来する各種の物質が炎症反応のトリガーとなることがわかってきており、その中でも、cag pathogenicity island (cag PAI)とよばれる遺伝子群がNF-κB経路等の活性化に関与していることが報告されている(Gastroenterology 2000, 119:97-108)。さらに動物モデルを用いた試験により、胃炎等の発症にcag PAIが関与していることが示されている(Journal of Experimental Medicine 2000, 192:1601-1610)。そこでこの系に適した胃がん細胞株とcag PAI陽性ヘリコバクター・ピロリ(TN2)を共培養して、発現変化する遺伝子を解析した。さらに、ヘリコバクター・ピロリの共培養による遺伝子発現変化に対する、cag PAIの関与を調べるため、cag PAIの遺伝子のひとつであるcagEの変異株（TN2ΔcagE株）を共培養させた際の発現変化と、cag PAI陽性株(TN2)を共培養させた際の発現変化を比較した。
【０２３１】
胃癌細胞株MKN45（理研ジーンバンク・細胞開発銀行より分譲）を10%ウシ胎児血清(GIBCO BRL社製)を含有するRPMI1640培地（シグマ社製）でコンフルエントに達するまで培養した後、細胞に対して100倍量（個あるいはコロニー数）のヘリコバクターピロリ（cag PAI陽性株（TN2）、あるいはcagE変異株（TN2ΔcagE：両株とも東京大学医学部・小俣教授より供与））を含む培地に交換し、37℃, 5％CO2条件下で培養を続けた。その後３時間後に細胞を回収し、ISOGEN（ニッポンジーン社）を使用してtotal RNAを抽出した。抽出操作は、ISOGENの添付書類記載の方法に従った。また、ヘリコバクター・ピロリを共培養させない細胞からも同様にtotal RNAを抽出した。
【０２３２】
ATAC-PCR法による解析は、基本的に、村松、那波監修 細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ１「DNAマイクロアレイと最新PCR法」（秀潤社、2000）P104-P112に従って行った。内部標準サンプル（対象クローンのキャリブレーションカーブを作成するためのサンプル）と測定サンプルは以下の二つの反応系に分けてアダプター結合反応を行った。６種のアダプター（AD-1, AD-2, AD-3, AD-4, AD-5, AD-6：以下の配列参照）とサンプルの組み合わせは以下のとおりであった。
【０２３３】
反応系Ａ
AD1;内部標準10倍
AD2;THP-1細胞、無刺激
AD3;内部標準３倍
AD4;THP-1細胞、TNF-α刺激1時間
AD5;THP-1細胞、TNF-α刺激3時間
AD6;内部標準1倍
【０２３４】
反応系B
AD1;内部標準1倍
AD2;MKN45細胞、無刺激
AD3;内部標準３倍
AD4;MKN45細胞、TN2（ヘリコバクター・ピロリ）共培養
AD5;内部標準10倍
AD6; MKN45細胞、TN2ΔcagE（cagE遺伝子変異株）共培養
【０２３５】
アダプター配列
AD1;
配列番号117//5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3'
配列番号118//3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCCTAG-5'
AD2;
配列番号119//5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGACT-3'
配列番号120//3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCTGACTAG-5'
AD3; 
配列番号121//5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGCATACT-3'
配列番号122//3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCGTATGACTAG-5'
AD4; 
配列番号123//5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGATCCATACT-3'
配列番号124//3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCTAGGTATGACTAG-5'
AD5; 
配列番号125//5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTCAATCCATACT-3'
配列番号126//3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCAGTTAGGTATGACTAG-5'
AD6;
配列番号127//5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTACTCAATCCATACT-3'
配列番号128//3'-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATGAGTTAGGTATGACTAG-5'
【０２３６】
この際の内部標準サンプルには、Fetal Brain , Testis , Trachea ,Spleenの各組織（あるいは培養細胞。いずれもユニーテック社）のtotal RNAを混合して用いた。RNAの調製は常法とおり行った。
遺伝子特異的プライマーの配列と解析対象としたクローン名の対応は以下のとおりである。遺伝子特異的プライマーは、アダプター付加cDNA由来のPCR産物が70〜200bpとなるように設計した。競合的PCRに使用したアダプター特異的プライマー（蛍光(FAM)が付加されている）の配列は、GTACATATTGTCGTTAGAACGC（22塩基、配列番号129）であった。PCR反応は基本的には94℃、3分の後、94℃、30秒/ 50℃、60秒/ 72℃、90秒のサイクルを35回あるいは40回繰り返した。
【０２３７】
実験に用いたクローン特異的プライマーの塩基配列
以下にクローン名、（反応系名）、プライマー配列、配列番号の順に//で区切って示した。反応系A（THP-1細胞）、反応系B（MKN45細胞）で別々のプライマーを用いたクローンについては（のみ）、それぞれの配列を示した。
【０２３８】
ASTRO20084250//TAGAAAATATGCTGGGTG//配列番号130
BRCAN20280210//CACTGGATTTTCTTCACTT//配列番号131
CTONG20121010//GGAAGATGGGACCTCAGT//配列番号132
HCHON20035130//GTGGAAGATGCTCGACTG//配列番号133
MESAN20127350//CAGAAGACAGGTTGCCAG//配列番号134
TESTI20044230//AGGTCTTTTGTGTGCTGA//配列番号135
TESTI20156100//ACTGGGCACATTCATAAA//配列番号136
TESTI20200710//AATTGTGACAAGCAGCAG//配列番号137
TESTI20319190//AAGCTGGGATGATAAGGG//配列番号138
UTERU20134910//AAGGAAGCCAACTCATGC//配列番号139
【０２３９】
発現頻度解析の結果を表１２に示す。表に示さないクローンの中には、発現量が低い、あるいはPCR産物の大きさが予想と異なるなどで測定が行えなかったクローンがあった。また、ポジティブコントロールとして測定したIL-8などの遺伝子の発現量は上昇していることが確認された。
【０２４０】
ヒト単球細胞株であるTHP-1細胞をTNF-α存在下で培養して発現変化する遺伝子を探索した結果、刺激後1、3時間後のいずれかで２倍以上の発現量上昇を示したクローン（発現量が刺激前後共に0.1以下のものは除く）は、なかった。
【０２４１】
一方、TNF-α刺激で２倍以上の発現量低下を示したクローン（刺激後1、3時間後のいずれかで発現量が上昇しているクローンを除く）は、無刺激での発現が比較的高いクローン（相対数値1以上）に限ってみると、ASTRO20084250, MESAN20127350であった。
これらのクローンがTNF-αによって惹起される炎症反応と関連がある遺伝子であることがわかった。
【０２４２】
胃癌細胞株であるMKN45を、cag PAI陽性のヘリコバクター・ピロリ(TN2)と共培養した時に発現変化する遺伝子を探索した結果、２倍以上の発現量上昇を示したクローン（発現量が刺激前後共に0.1以下のものは除く）は、なかった。
【０２４３】
一方、ヘリコバクター・ピロリとの共培養により２倍以上の発現量低下を示したクローンは、無刺激での発現が比較的高いクローン（相対数値1以上）に限ってみると、HCHON20035130, UTERU20134910であった。
これらのクローンは、胃炎、胃十二指腸潰瘍に関する遺伝子である。
【０２４４】
実施例９．標的転写調節領域に対する結合能の解析
（１）無細胞蛋白質合成系を用いた本発明の蛋白質の調製
本発明のポリヌクレオチド、すなわち本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含むプラスミドに対してProc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14652-14657(2002)に記載されている方法に準じてPCR反応を行い、転写用のＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡを鋳型としてSP6 RNA Polymerase（Promega社製）を用いて転写反応を行ないmRNAを合成し、エタノール沈殿操作により得られたmRNAを精製した。このmRNAを用いたタンパク合成は特開2002-204689およびProc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14652-14657(2002)に準じた重層法による無細胞蛋白質合成系を用いて行った。重層法無細胞蛋白質合成系にて使用する翻訳溶液(25μl)にはProc.Natl.Acad.Sci.USA,97:559-564(2000)に従って調製された6μｌの小麦胚芽抽出液および上述したmRNA (0.02nmol) を添加して用い、その組成は24 mM Hepes/KOH(pH 7.8), 1.2 mM ATP, 0.25 mM GTP, 16 mM creatine phosphate, 10 μg creatine kinase, ribonuclease inhibitor(20units), 2 mM DTT, 0.4 mM spermidine, 0.3 mM Ｌ型アミノ酸（20種）, 2.7 mM magnesium acetate, 100 mM potassium acetate, 5 μg 小麦胚芽由来tRNA, 0.05% Nonidet P-40および0.005% NaN3から成る。また翻訳用緩衝液は31.3mM HEPES/KOH(pH7.8) , 2.67mM Mg(OAc)2 , 93mM KOAc , 1.2mM ATP, 0.257mM GTP , 16mM creatine phosphate, 2.1mM DTT, 0.41mM spermidine, 0.3mMＬ型アミノ酸（20種）, 1μM E-64 , 0.005% NaN3 , 0.05% NP-40から成る。重層法による無細胞蛋白質合成はまず96穴プレートに翻訳用緩衝液を125μｌずつ加え、この翻訳用緩衝液が入ったそれぞれの穴に底からゆっくりと翻訳溶液を重層し、このプレートを２６℃インキュベーターで保温して１６時間反応させることにより行った。
【０２４５】
（２）標的コンセンサス配列を固定化したセンサーチップを用いたSPR測定方法
BIAapplications handbook, chapter4.4に従い、センサーチップ表面にビオチン化した以下の53種類の二重鎖DNAを別々に固定化した。センサーチップはSAタイプ（ビアコア社製）を用い、SPR測定および解析は、BIACORE3000（ビアコア社製）を用いた。
【０２４６】
公知の転写因子と、設計した標的転写調節領域のＤＮＡまたはＤＮＡ断片の塩基配列（以下、「標的配列」と称する）の関係は、次の通りである。
［１］v-jun, c-jun, junB, junD, dJRA, c-fos, fosB1, fosB2, Fra-1, LRF-1, v-maf, mafG, NF-E2 p45, aNF-E2, fNF-E2, Nrf short form, GCN4, yAP-1, CREB-2, ATF-3, CRE-BP1, CRE-BP3, ATF-a, CREB-341, CREB-327, CREM, dCREB2, dCREB2-b, dCREB2-c, dCREB2-d, dCREB2-q, dCREB2-r, dCREB2-sのコンセンサス標的配列//TGATGACGT//配列番号156
［２］C/EBPalpha, C/EBPbeta, p34C/EBPbeta, CHOP-10のコンセンサス標的配列//AAGTGGCGAAAGAGACA//配列番号157
［３］VBP, Hlf, CPRF-2, EmBP-1b, EmBP-1b, GBF1, GBF2, GBF3, CPRF-1, TAF-1, HBP-1a, GBF9, GBF1, GBF12, CPRF-3, TGA1a, TGA1b, O2, STE4のコンセンサス標的配列//AGAAGCACGTGG//配列番号158
［４］OPI1, E2A, E47, ITF-2/SEF2-1B, SEF-1A, MyoD, p42Tal-1のコンセンサス標的配列//AACAGATGGT//配列番号159
［５］HEN-1の標的配列//GGGGCGCAGCTGCGGCCC//配列番号160
［６］AhR, Arnt のコンセンサス標的配列//GGGGATTGCGTG//配列番号161
［７］USFの標的配列//GTCACGTGGT//配列番号162
［８］NF-1A1, NF-1A1.1, NF-1A6, NF-1B1, NF-1B1, NF-1B2, NF-1C2/CTF-2, CTF-4, CTF-6のコンセンサス標的配列//CTGTGGGGTTTGGCACGGGGCCA//配列番号163
［９］RF-X1の標的配列//GGTAACATAGCAAC//配列番号164
［１０］AP2alphaA/AP-2alpha1, AP2alpha2, AP2alpha3, AP2alpha4, AP2alphaB, AP2beta, AP2gammaのコンセンサス標的配列//CGCCCCCCGGCG//配列番号165
［１１］GRの標的配列//GGTACAAAATGTTCT//配列番号166
［１２］ARの標的配列//AACATTATGTTCT//配列番号167
［１３］ERの標的配列//AAGGGAAAATGACCCCC//配列番号168
［１４］RXR-alphaの標的配列//GGTCATAGGGGT//配列番号169
［１５］PPARalphaの標的配列//CTAGGGCAAAGGTCA//配列番号170
［１６］PPARgammaの標的配列//GGTCAAAGGTCA//配列番号171
［１７］COUP-TF1,HNF-4alpha1, HNF-4alpha2の標的配列//TGAACTTTGA//配列番号172
［１８］CF1の標的配列//GGGGTCACC//配列番号173
［１９］GATA-1, GATA-2, GATA-3, GATA-4のコンセンサス標的配列//CCAGATAAGG//配列番号174
［２０］AREA/NIT-2の標的配列//TATCTC//配列番号175
［２１］Sp1の標的配列//GGGGGGGGGG//配列番号176
［２２］YY1の標的配列//CGGCCATCTTGGCT//配列番号177
［２３］Egr-1, Egr-2, Egr-3のコンセンサス標的配列//TGCGTGGGCG//配列番号178
［２４］Snailの標的配列//CACCTGTTTTCA//配列番号179
［２５］CF2-IIの標的配列//GTATATATA//配列番号180
［２６］Evi-1の標的配列//AGATAAGATAA//配列番号181
［２７］Ikaros, MZF-1のコンセンサス標的配列//TTGGGAGG//配列番号182
［２８］Tramtrack69Kの標的配列//GGACCTGC//配列番号183
［２９］HOX9の標的配列//TGACAGTTTAACGA//配列番号184
［３０］CDPの標的配列//CCAATAATCGAT//配列番号185
［３１］HNF-1Aの標的配列//GGTTAATGATTAACCAC//配列番号186
［３２］Nkx-2.2, Nkx-2.5, TTF-1のコンセンサス標的配列//TTAAGTGGTT//配列番号187
［３３］Oct-1A, Oct-1B, Oct-1C のコンセンサス標的配列//ATGCAAAT//配列番号188
［３４］Oct-2, Oct-2.1/Oct-2Bのコンセンサス標的配列//TATTTGCAT//配列番号189
［３５］Pax-3, Pax-6のコンセンサス標的配列//CGTCACGCTTGA//配列番号190
［３６］Pax-1の標的配列//CCGTTCCGCTCTAGATAT//配列番号191
［３７］HSF1(short), HSF2, dHSF, fungalHSFのコンセンサス標的配列//AGAAAAGAAAAGAAA//配列番号192
［３８］c-Myb, A-Myb, v-Myb, P(long), P(short), C1(long), C1(short)のコンセンサス標的配列//AACGGGCCC//配列番号193
［３９］c-Ets-1_p54, Ets-1_deltaiV/VII, Ets-2, Elk-1, SAP-1, SAP-1b, Erg-1, p55erg, Fli-1b, E4TF1-60/GABP-alpha, E74Aのコンセンサス標的配列//GACAGGAAGTG//配列番号194
［４０］IRF-1, IRF-2の標的配列//GAAAAGCGAAACC//配列番号195
［４１］p50の標的配列//GGGGACTTTCC//配列番号196
［４２］NF-ATc, NF-Atpのコンセンサス標的配列//AGGAAAA//配列番号197
［４３］p91, p84のコンセンサス標的配列//GAATTCCGGGAAATGG//配列番号198
［４４］STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6のコンセンサス標的配列//TTTCCCGGGAAATG//配列番号199
［４５］p53の標的配列//GGACATGCCCGGGCATGTC//配列番号200
［４６］MEF-2Aの標的配列//CTCTAAAAATA//配列番号201
［４７］SRFの標的配列//CCATATATGGACAT//配列番号202
［４８］E2の標的配列//AACCAAAAACGGTAA//配列番号203
［４９］TBPの標的配列//TATAAAA//配列番号204
［５０］SRY, Sox-5, Sox-9の標的配列//AAAAAACAATAGGG//配列番号205
［５１］mat-Mcの標的配列//TCATTGTT//配列番号206
［５２］CP1A, CP1B, CBF-Cのコンセンサス標的配列//CTGATTGGCTACC//配列番号207
［５３］AML1aの標的配列//TGTGGT//配列番号208
【０２４７】
上記の５３種類のコンセンサス標的配列（配列番号１５６〜配列番号２０８）を有するDNAに関し，それぞれの5’側にビオチンが付加したDNAとその相補な塩基配列を有するDNAを定法により個別にアニーリングさせ，合計５３種類の二本鎖化したＤＮＡを調製した。一方、解析に用いるセンサーチップは1枚に付きフローセルが4分割されている。フローセル1には何も固定化せずコントロール区として用い、フローセル2,3および4はそれぞれ上記で調製した二本鎖DNＡを３種類づつ固定化した。センサーチップのDNAの固定化密度を一定にするため、DNA固定化によるSPR応答値の上昇（ΔRU−DNA）をDNA分子量（MW）で割った値（D）が各フローセルで一定になるようにΔRU-DNAを調節した。同様の要領で残りのDNAについても固定化を行った。以上のようにセンサーチップの作製ができた後、クローンのcDNAがコードする本発明の蛋白質との結合活性解析を行った。ＳＰＲ法によるDNAと蛋白質間での結合活性解析は既に多数報告がある。今回の実施例ではMolecular Microbiology, 36(3), 557-569(2000)の測定条件を参考にした。フローセル1-2-3-4が直列につながった流路に設定しておく。そこにランニングバッファーを一定流量（5uL/min）で流しておき、SPR測定値を安定させ、各フローセルのベースライン値（SPR-baseline）を測定する。次に蛋白質溶液を同流量で流し、蛋白質分子とDNA鎖との間で特異的結合を形成させる。一定時間注入後の各フローセルのSPR応答値（SPR-bound）を測定した。
【０２４８】
（４）SPR法により得られた測定結果の解析方法
SPR-bound-SPR-baselineなる計算により、真の結合量（B）を求め、さらに標準化した値（ｎB）を求めた。以下の７０クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、５３種類のコンセンサス標的配列（配列番号１５６〜配列番号２０８）を有するＤＮＡの少なくとも一つに対して結合活性を有していた（表１３）。表１３で、AはｎBが100以上、BはｎBが50以上100未満、CはｎBが5以上50未満、DはｎBが0から5未満、であることを示す。
ASTRO20084250, ASTRO20168470, BRACE20190040, BRAMY20170140, BRAMY20170141, BRAMY20270730, BRAWH20096780, BRAWH20185060, BRCAN20280210, BRCOC20110100, BRCOC20121720, BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20050281, CTONG20050282, CTONG20075860, CTONG20092680, CTONG20121010, D3OST30002580, D3OST30002581, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30095260, FCBBF30129630, FEBRA10001900, FEBRA20018690, FEBRA20034680, FEBRA20195820, HCHON20035130, HCHON20035131, HHDPC20031130, MESAN20127350, NT2NE20010490, NT2NE20130190, NT2NE20142210, OCBBF20060300, OCBBF20060301, OCBBF20066390, OCBBF20066391, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20112970, PROST20114390, PROST20169800, PROST20185830, SKMUS20012010, SKMUS20012011, SMINT20115880, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20095411, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20044230, TESTI20130010, TESTI20130011, TESTI20156100, TESTI20189410, TESTI20200710, TESTI20319190, TESTI20319191, TESTI20327680, TESTI20378190, TRACH20079690, TRACH20079691, UTERU20134910, UTERU20145480
【０２４９】
実施例１０．疾患関連転写因子に対する調節作用活性の解析
（１）無細胞蛋白質合成系を用いた本発明の蛋白質の調製
実施例９で標的転写調節領域に対する結合能を有することが示された７０クローンのcDNAがコードする蛋白質につき、さらに疾患関連転写因子に対する調節作用活性を解析した。各クローンのcDNAがコードする蛋白質は、実施例９（１）の方法に準じて調製した。
【０２５０】
（２）解析用プレートの調製
転写関連蛋白質の疾患関連転写因子に対する調節作用活性の測定系に用いるDNAは、転写因子が結合する塩基配列を有することを特徴とし、5´側にビオチン（Bioと表記する）が付加した一本鎖DNA（oligo-Ａと記載する）とその相補的配列を有する一本鎖DNA（oligo-B）と記載するをアニーリングさせることにより、二本鎖化したDNAを用いた。以下に用いたDNA配列を記載する。
【０２５１】
転写因子PPARγが認識する配列として、配列番号209と配列番号210を含むビオチン化ＤＮＡをアニーリングさせた二本鎖ＤＮＡ
oligo-Ａ；配列番号209//5´- Bio-GGAACTAGGTCAAAGGTCATCCCCT-3´
oligo-B；配列番号210//3´-CCTTGATCCAGTTTCCAGTAGGGGA-5´
転写因子p53が認識する配列として、配列番号：211と配列番号：212を含むビオチン化ＤＮＡをアニーリングさせた二本鎖ＤＮＡ
oligo-Ａ；配列番号：211//5´-Bio-CTTGGACATGCCCGGGCATGTCCCTC-3´
oligo-B；配列番号：212//3´-GAACCTGTACGGGCCCGTACAGGGAG-5´
転写因子NFκBが認識する配列として、配列番号213と配列番号214を含むビオチン化ＤＮＡをアニーリングさせた二本鎖ＤＮＡ
oligo-Ａ；配列番号213//5´-Bio-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3´
oligo-B；配列番号214//3´-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5´
転写因子AP-1が認識する配列として、配列番号215と配列番号216を含むビオチン化ＤＮＡをアニーリングさせた二本鎖ＤＮＡ
oligo-Ａ；配列番号215//5´-Bio-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3´
oligo-B；配列番号216//3´-GCGAACTACTCAGTCGGCCTT-5´
転写因子HIF-1が認識する配列として、配列番号217と配列番号218を含むビオチン化ＤＮＡをアニーリングさせた二本鎖ＤＮＡ
oligo-Ａ；配列番号217//5'-Bio-GATCGCCCTACGTGCTGTCTCAGATC-3'
oligo-B；配列番号218//3'-CTAGCGGGATGCACGACAGAGTCTAG-5'
転写因子CREＢが認識する配列として、配列番号219と配列番号220を含むビオチン化ＤＮＡをアニーリングさせた二本鎖ＤＮＡ
oligo-Ａ；配列番号219//5´-Bio-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3´
oligo-B；配列番号220//3´-TCTCTAACGGACTGCAGTCTCTCGATC-5´
【０２５２】
上記によって作成した二本鎖ＤＮＡを固定する固相担体として、BioTechniques ,32:1168-1177(2002)の方法に準じてストレプトアビジンをコートした96ウェルプレート｛ビオチン結合能20 ng/well (80 pmol/well)、ストレプトアビジンコートエリア300 μl｝またはTransAMキット（ACTIVE MOTIF社）もしくはBD Mercury TransFactorキットに添付のプレートを適宜使用した。
【０２５３】
（３）PPARγに対する調節作用活性の解析
解析試料としてはPPARγを含むPMA処理THP-1細胞核抽出溶液（2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社）1μlを9μlの希釈溶液｛20mM Hepes(pH 7.5) , 400mM NaCl, 20%glycerol, 0.1 mM EDTA, 10 mM NaF, 10 μM Na2MoO4, 1 mM NaVO3, 10 mM pNPP, 10 mMb-glycerophosphate，1mM DTT｝と混合後、35μlの反応溶液｛10mM Hepes(pH 7.5) , 4%glycerol, 50mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1 mM MgCl2，10μg/ml Herring sperm ｝および実施例１０（１）の方法によって調製した本発明の蛋白質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはPMA処理THP-1細胞核抽出溶液1μl，9μl希釈溶液，35μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例１０（２）によって作成した、PPARγが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、１ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で１時間反応させた。
【０２５４】
この後洗浄用緩衝液｛10 mM phosphate buffer(pH 7.5) , 50 mM NaCl, 0.1%Tween 20, 2.7 mM KCl｝を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液｛10mM phosphate buffer (pH 7.5) , 50mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mg/ml BSA｝に溶解した抗PPARヤギ抗体 (0.2μg/ml) を100 μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液によって充分な洗浄を行ない、抗体希釈液によって1000倍に希釈したHRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識抗ヤギIgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄用緩衝液によって充分な洗浄を行なった後、発色用基質（TMB）を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M 硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm，リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率（％）で表示した。すなわち｛（解析試料値―陽性試料値）／（陽性試料値―陰性試料値）｝x100で表記した。その結果を、表１４の「PPAR」のカラムに示す。表１４で、-Aはこの割合が-50%未満、-B は-50%以上-30%未満、-Cは-30%以上-10%未満、+/-Dは-10%以上10%未満、+Cは10%以上30%未満、+Bは30%以上50%未満、+Aは50%以上、であることを示す。
【０２５５】
以下の35クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、PPARが有する作用を増強または抑制する活性を有し、内分泌・糖・脂質代謝異常等による糖尿病や肥満等の生活習慣病、血管機能異常等による循環器系疾患、炎症、癌等に関連することが推測された。
BRAWH20096780, BRCOC20110100, BRHIP20222280, CTONG20050280, CTONG20075860, CTONG20121010, D9OST20033970, FEBRA20018690, FEBRA20034680, HHDPC20031130, NT2NE20010490, NT2NE20142210, OCBBF20066391, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20112970, PROST20169800, PROST20185830, SKMUS20012011, SMINT20115880, SPLEN20054290, SPLEN20095411, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20044230, TESTI20130011, TESTI20156100, TESTI20200710, TESTI20327680, TESTI20378190, UTERU20134910, UTERU20145480
【０２５６】
（４）p53に対する調節作用活性の解析
解析試料としては活性化p53を含むH2O2処理MCF-7細胞核抽出溶液（2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社）1μlを9μlの希釈溶液｛20mM Hepes(pH 7.5) , 400mM NaCl, 20%glycerol, 0.1 mM EDTA, 10 mM NaF, 10 μM Na2MoO4, 1 mM NaVO3, 10 mM pNPP, 10 mM-glycerophosphate，1mM DTT｝と混合後、35μlの反応溶液｛20mM Hepes(pH 7.5) , 10%glycerol, 5mM KCl, 0.5mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1mM DTT, 0.17μg/ml poly[d(I-C)]｝および実施例１０（１）の方法によって調製した本発明の蛋白質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはH2O2処理MCF-7細胞核抽出溶液1μl，9μl希釈溶液，35μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例１０（２）によって作成した、p53が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、１ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で１時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液｛10 mM phosphate buffer(pH 7.5) , 50 mM NaCl, 0.1%Tween 20, 2.7 mM KCl｝を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液｛10mM phosphate buffer (pH 7.5) , 50mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mg/ml BSA｝に溶解した抗p53 ウサギ抗体 (0.2μg/ml) を100 μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。
【０２５７】
この後洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識抗ウサギIgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質（TMB）を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M 硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm, リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率（％）で表示した。すなわち｛（解析試料値―陽性試料値）／（陽性試料値―陰性試料値）｝x100で表記した。その結果を、表１４の「p53」のカラムに示す。表１４で、-Aはこの割合が-50%未満、-B は-50%以上-30%未満、-Cは-30%以上-10%未満、+/-Dは-10%以上10%未満、+Cは10%以上30%未満、+Bは30%以上50%未満、+Aは50%以上、であることを示す。
【０２５８】
以下の16クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、p53が有する作用を増強または抑制する活性を有し、癌等に関連することが推測された。
BRCOC20178270, BRHIP20222280, CTONG20121010, FCBBF10001710, FCBBF30129630, FEBRA20034680, FEBRA20195820, NT2NE20010490, NT2NE20130190, PROST20169800, SPLEN20054290, SPLEN20095410, SPLEN20252190, TESTI20156100, TESTI20200710, TESTI20327680
【０２５９】
（５）NFκBに対する調節作用活性の解析
解析試料としてはNFκBを含むTNF-α処理HeLa細胞核抽出溶液（2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社）1μlを19μlの希釈溶液｛20mM Hepes(pH 7.5) , 350mM NaCl, 20%glycerol, 1%Igepal-CA630, 1 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA，5mM DTT｝と混合後、25μlの反応溶液｛4mM Hepes(pH 7.5) , 8%glycerol, 120mM KCl, 1%BSA, 2mM DTT , 10μg/ml Herring sperm｝および実施例１０（１）の方法によって調製した本発明の蛋白質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはTNF-α処理HeLa細胞核抽出溶液1μl，19μl希釈溶液，25μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液，25μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例１０（２）によって作成した、NFκBが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、１ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で１時間反応させた。
【０２６０】
この後洗浄用緩衝液｛10 mM phosphate buffer(pH 7.5) , 50 mM NaCl, 0.1%Tween 20｝を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液｛10mM phosphate buffer (pH 7.5) , 50mM NaCl, 0.1%Tween20｝に溶解した抗ＮＦκB抗体 (0.2μg/ml) を100 μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液1000倍で希釈したHRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識抗IgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質（TMB）を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M 硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm，リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率（％）で表示した。すなわち｛（解析試料値―陽性試料値）／（陽性試料値―陰性試料値）｝x100で表記した。その結果を、表１４の「NFκB」のカラムに示す。表１４で、-Aはこの割合が-50%未満、-B は-50%以上-30%未満、-Cは-30%以上-10%未満、+/-Dは-10%以上10%未満、+Cは10%以上30%未満、+Bは30%以上50%未満、+Aは50%以上、であることを示す。
【０２６１】
以下の9クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、NFκBが有する作用を増強または抑制する活性を有し、慢性関節リウマチや変形性関節炎などの免疫性疾患、炎症性疾患、癌等に関連することが推測された。
CTONG20050280, FEBRA10001900, MESAN20127350, PROST20114390, SPLEN20054290, TESTI20327680, TESTI20378190, TRACH20079690, TRACH20079691
【０２６２】
（６）転写因子AP-1に対する調節作用活性の解析
解析試料としては活性化AP-1を含むPMAおよびInomycin処理WI-38細胞核抽出溶液（2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社）1μlを19μlの希釈溶液｛20mM Hepes(pH 7.5) , 400mM NaCl, 20%glycerol, 0.1 mM EDTA, 10 mM NaF, 10 μM Na2MoO4, 1 mM   NaVO3, 10 mM pNPP, 10 mM b-glycerophosphate，1mM DTT｝と混合後、25μlの反応溶液｛10mM Hepes(pH 7.5) , 12%glycerol, 8mM NaCl, 0.2mM EDTA, 0.1%BSA, 1mM DTT, 0.17μg/ml poly[d(I-C)]｝および実施例１０（１）の方法によって調製した本発明の蛋白質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としては活性化AP-1を含むPMAおよびInomycin処理WI-38細胞核抽出溶液1μl，19μl希釈溶液，25μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液，25μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例２によって作成した、AP-1が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、１ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で１時間反応させた。この後洗浄用緩衝液｛10 mM phosphate buffer(pH 7.5) , 50 mM NaCl, 0.1%Tween 20, 2.7 mM KCl｝を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液｛10mM phosphate buffer (pH 7.5) , 50mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA｝に溶解した抗リン酸化-c-Jun抗体 (0.4μg/ml) を100 μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。
【０２６３】
この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識抗IgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質（TMB）を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M 硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm，リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率（％）で表示した。すなわち｛（解析試料値―陽性試料値）／（陽性試料値―陰性試料値）｝x100で表記した。その結果を、表１４の「AP-1」のカラムに示す。表１４で、-Aはこの割合が-50%未満、-B は-50%以上-30%未満、-Cは-30%以上-10%未満、+/-Dは-10%以上10%未満、+Cは10%以上30%未満、+Bは30%以上50%未満、+Aは50%以上、であることを示す。
【０２６４】
以下の18クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、AP-1が有する作用を増強または抑制する活性を有し、炎症性疾患や癌等に関連することが推測された。
ASTRO20168470, BRCOC20110100, BRCOC20178270, CTONG20050280, CTONG20050281, CTONG20050282, CTONG20075860, CTONG20121010, FCBBF10001710, FEBRA20018690, HCHON20035131, OCBBF20060301, OCBBF20066391, PROST20114390, PROST20169800, PROST20185830, TESTI20023510, TESTI20319191
【０２６５】
（７）転写因子HIF-1に対する調節作用活性の解析
解析試料としてはHIF-1を含むCoCl2処理Cos-7細胞核抽出溶液（2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社）1μlを9μlの希釈溶液｛20mM Hepes(pH 7.5) , 400mM NaCl, 20%glycerol, 0.1 mM EDTA, 10 mM NaF, 10 μM Na2MoO4, 1 mM NaVO3, 10 mM pNPP, 10 mMb-glycerophosphate，1mM DTT｝と混合後、35μlの反応溶液｛10mM Hepes(pH 7.5) , 5%glycerol, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 10mg/ml BSA, 1mM DTT｝および実施例１０（１）の方法によって調製した本発明の蛋白質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはHIF-1を含むCoCl2処理Cos-7細胞核抽出溶液1μl，9μl希釈溶液，35μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液，35μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの，測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例１０（２）によって作成した、HIF-1が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、１ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で１時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液｛10 mM phosphate buffer(pH 7.5) , 50 mM NaCl, 0.1%Tween 20, 2.7 mM KCl｝を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液｛10mM phosphate buffer (pH 7.5) , 50mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mg/ml BSA｝に溶解した抗HIF-1マウス抗体 (0.25μg/ml) を100 μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。
【０２６６】
この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識抗マウスIgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質（TMB）を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M 硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm，リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率（％）で表示した。すなわち｛（解析試料値―陽性試料値）／（陽性試料値―陰性試料値）｝x100で表記した。その結果を、表１４の「HIF-1」のカラムに示す。表１４で、-Aはこの割合が-50%未満、-B は-50%以上-30%未満、-Cは-30%以上-10%未満、+/-Dは-10%以上10%未満、+Cは10%以上30%未満、+Bは30%以上50%未満、+Aは50%以上、であることを示す。
【０２６７】
以下の18クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、HIF-1が有する作用を増強または抑制する活性を有し、血管新生異常や細胞内酸化異常等に起因する、虚血性疾患、貧血、低酸素症、糖尿病性網膜症、循環器系疾患、癌等に関連することが推測された。
BRACE20190040, BRCAN20280210, HHDPC20031130, MESAN20127350, NT2NE20130190, NT2NE20142210, OCBBF20066391, OCBBF20066390, OCBBF20108190, PEBLM20078320, PROST20112970, SPLEN20095411, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20130011, TESTI20200710
【０２６８】
（８）転写因子CREBに対する調節作用活性の解析
解析試料としてはCREBを含むForskolin処理WI-38細胞核抽出溶液（2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社）1μlを19μlの希釈溶液｛20mM Hepes(pH 7.5) , 400mM NaCl, 20%glycerol, 0.1 mM EDTA, 10 mM NaF, 10 μM Na2MoO4, 1 mM NaVO3, 10 mM pNPP, 10 mMb-glycerophosphate，1mM DTT｝と混合後、25μlの反応溶液（10mM Hepes(pH 7.5) , 4%glycerol, 50mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1 mM MgCl2，1%BSA, 1mM DTT , 10μg/ml Herring sperm ）および実施例１０（１）の方法によって調製した本発明の蛋白質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはForskolin処理WI-38細胞核抽出溶液1μl，19μl希釈溶液，25μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液，25μl反応溶液および本発明の蛋白質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例１０（２）によって作成した、CREBが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、１ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で3時間反応させた。
【０２６９】
この後、洗浄用緩衝液｛10 mM phosphate buffer(pH 7.5) , 151mM NaCl, 0.1%Tween 20, 2.7 mM KCl｝を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液｛10mM phosphate buffer (pH 7.5) , 151mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA｝に溶解した抗CREB抗体 (0.2μg/ml) を100 μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識抗IgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質（TMB）を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させて発色を行なった。この後0.5M 硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm，リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率（％）で表示した。すなわち｛（解析試料値―陽性試料値）／（陽性試料値―陰性試料値）｝x100で表記した。その結果を、表１４の「CREB」のカラムに示す。表１４で、-Aはこの割合が-50%未満、-B は-50%以上-30%未満、-Cは-30%以上-10%未満、+/-Dは-10%以上10%未満、+Cは10%以上30%未満、+Bは30%以上50%未満、+Aは50%以上、であることを示す。
【０２７０】
以下の25クローンのcDNAによってコードされる蛋白質は、CREBが有する作用を増強または抑制する活性を有し、記憶障害などの中枢系疾患、循環器系疾患、糖尿病等に関連することが推測された。
BRACE20190040, BRCAN20280210, BRCOC20110100, CTONG20050282, CTONG20092680, D9OST20033970, FCBBF10001710, FCBBF20059090, FCBBF30129630, FEBRA10001900, FEBRA20018690, SKMUS20012011, SPLEN20095410, SPLEN20252190, SPLEN20267650, TESTI20023510, TESTI20044230, TESTI20130011, TESTI20156100, TESTI20189410, TESTI20327680, TESTI20378190, TRACH20079690, TRACH20079691, UTERU20134910
【０２７１】
【表３】
2005237384.tif 000005
【０２７２】
【表４】
2005237384.tif 000006
【０２７３】
【表５】
2005237384.tif 000007
【０２７４】
【表６】
2005237384.tif 000008
【０２７５】
【表７】
2005237384.tif 000009
【０２７６】
【表８】
2005237384.tif 000010
【０２７７】
【表９】
2005237384.tif 000011
【０２７８】
【表１０】
2005237384.tif 000012
【０２７９】
【表１１】
2005237384.tif 000013
【０２８０】
【表１２】
2005237384.tif 000014
ヒト単球細胞株THP-1に対するTNF-α刺激による各クローンの発現変化、および胃癌細胞株MKN45とヘリコバクター・ピロリの共培養による各クローンの発現変化。THP-1のctl, TNF_1h, TNF_3hはそれぞれTHP-1に対して、無刺激、TNF-α 10 ng/mLで刺激後1時間、およびTNF-α 10 ng/mLで刺激後3時間のmRNA中での相対発現量を、MKN45のctl, Hp, ΔcagEはそれぞれMKN45に対して、MKN45のみで培養、cag PAI陽性ヘリコバクター・ピロリ(TN2)を1:100個（コロニー）で3時間共培養させた後、およびcagE変異株 (TN2ΔcagE)を1:100個（コロニー）で3時間共培養させた後のmRNA中での相対発現量を示す。
【０２８１】
【表１３（Ａ）】
2005237384.tif 000015
【０２８２】
【表１３（Ｂ）】
2005237384.tif 000016
【０２８３】
【表１４】
2005237384.tif 000017
【０２８４】
相同性検索結果データ
全長塩基配列及び推定アミノ酸配列に対する相同性検索結果データ
以下に示す検索結果には、比較配列の長さの単位にaaとbpが混在している。
各データは、配列名、ヒットデータのDefinition、P値、比較配列の長さ、相同性、ヒットデータのAccesion No.の順に//で区切って記載した。
【０２８５】
ASTRO20084250//Ciona savignyi mRNA for PEM-3, complete cds.//3.50E-56//154aa//64%//AB001769
ASTRO20168470//ZINC FINGER PROTEIN 135.//4.80E-103//289aa//59%//P52742
BRACE20190040
BRAMY20170140
BRAMY20270730//Fugu rubripes zinc finger protein, isotocin, fatty acid binding protein, sepiapterin reductase and vasotocin genes, complete cds.//7.80E-155//398aa//66%//U90880
BRAWH20096780//ZINC FINGER PROTEIN 184 (FRAGMENT).//5.00E-140//514aa//52%//Q99676
BRAWH20185060
BRCAN20280210//H.sapiens HZF10 mRNA for zinc finger protein.//3.30E-54//219aa//49%//X78933
BRCOC20110100
BRCOC20121720
BRCOC20178270//ZINC FINGER PROTEIN 83 (ZINC FINGER PROTEIN HPF1).//4.90E-101//272aa//64%//P51522
BRHIP20222280//ZINC FINGER PROTEIN 85 (ZINC FINGER PROTEIN HPF4) (HTF1).//1.70E-217//505aa//75%//Q03923
CTONG20050280//ZINC FINGER PROTEIN ZFP-36 (FRAGMENT).//8.00E-149//490aa//55%//P16415
CTONG20075860//Homo sapiens mRNA for SPIN protein.//3.90E-123//204aa//69%//Y14946
CTONG20092680//Rattus norvegicus protein associating with small stress protein PASS1 (Pass1) mRNA, complete cds.//1.40E-11//98aa//40%//AF168362
CTONG20121010//ZINC FINGER PROTEIN 29 (ZFP-29).//7.80E-131//380aa//58%//Q07230
D3OST30002580
D9OST20033970//ZINC FINGER PROTEIN 91 (ZINC FINGER PROTEIN HTF10) (HPF7).//2.50E-152//541aa//52%//Q05481
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【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】pME18SFL3のベクターのマップ
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005237384.tif 000018