【手続補正書】
【提出日】平成17年2月9日(2005.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  ヒトＦＧＦ−２３遺伝子および遺伝子発現産物
【特許請求の範囲】
【請求項１】  単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７８をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドの相補鎖；および
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項２】  配列番号３のコード領域由来の２０〜７５３個連続するヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項３】  配列番号３のコード領域由来の６０〜５００個連続するヌクレオチドを含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】  配列番号３のコード領域由来の２００〜３００個連続するヌクレオチドを含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】  単離された核酸分子であって、該核酸分子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換以外は、以下：
（ａ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
単離された核酸分子。
【請求項６】  ＤＮＡである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】  組換えベクターを作製する方法であって、該方法は、請求項１に記載の核酸分子をプロモーターに作動可能な連結でベクター中へ挿入する工程を包含する、方法。
【請求項８】  請求項７に記載の方法によって産生される、組換えベクター。
【請求項９】  請求項８に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、組み換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項１０】  請求項９の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
【請求項１１】  ポリペプチドを産生する組換え方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１０に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを収集する工程を包含する、方法。
【請求項１２】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸を含む、
単離されたポリペプチド。
【請求項１３】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換以外は、以下：
（ａ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
単離されたポリペプチド。
【請求項１４】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号４のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸を含む、
単離されたポリペプチド。
【請求項１５】  配列番号４のポリペプチドのエピトープ保有部分。
【請求項１６】  配列番号４の１０個と５０個との間の連続するアミノ酸を含む、請求項１５に記載のエピトープ保有部分。
【請求項１７】  アミノ酸ＲＲＨＴＲＳＡＥＤＤＳＥＲＤを含む、請求項１５に記載のエピトープ保有部分。
【請求項１８】  アミノ酸ＹＨＬＱＩＨＫＮＧＨＶＤＧＡＰＨＱを含む、請求項１５に記載のエピトープ保有部分。
【請求項１９】  請求項１２に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２０】  請求項１３に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２１】  請求項１４に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２２】  請求項１２に記載のポリペプチドを薬学的に受容可能なキャリアと組合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項２３】  細胞のための栄養支持物質が必要な患者に該栄養支持物質を提供するための方法であって、該方法は、該患者に配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】  請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドを発現する細胞を前記患者に移植することによって投与され、該細胞は、該患者においてＦＧＦ−２３ポリペプチドを発現する、方法。
【請求項２５】  前記移植された細胞が半透膜にカプセル化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】  前記患者が皮膚細胞の機能不全または皮膚細胞に対する傷害によって特徴付けられた状態に罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】  前記状態が外傷性傷害である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】  前記患者が胎盤細胞の不適性な機能によって特徴付けられる状態に罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】  請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記状態が、先天性欠損症、不妊症、または異常増殖からなる群より選択される少なくとも１つの状態である、方法。
【請求項３０】  前記患者が胸腺の不適性な機能によって特徴付けられる状態に罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】  請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記状態が、白血病、リンパ腫、自己免疫疾患、胸腺の増殖性障害、および胸腺の分化障害からなる群より選択される少なくとも１つの状態である、方法。
【請求項３２】  細胞のための栄養支持物質が必要な患者に該栄養支持物質を提供するための方法であって、該方法は、該患者に配列番号４のポリペプチドを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３３】  前記患者が中枢神経系障害によって特徴付けられる状態に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】  前記状態がパーキンソン病およびアルツハイマー病からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】  ヒト患者の脳における疾患状態を緩和する方法であって、
ここで、該疾患状態は、該ヒト患者において、機能性神経細胞の分解を遅延させること、機能性神経細胞の機能を回復させること、機能性神経細胞の数を増加させることからなる群より選択される少なくとも１つの方法によって緩和され、
該方法は、該患者に、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む薬学的に有効な組成物を投与する工程を包含する、
方法。
【請求項３６】  ヒト患者の胸腺における疾患状態を緩和する方法であって、
ここで、該疾患状態は、該ヒト患者において、機能性胸腺細胞の分解を妨害すること、機能性胸腺細胞の分解を遅延させること、機能性胸腺細胞の数を増加させることからなる群より選択される少なくとも１つの方法によって緩和され、
該方法は、該患者に、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む薬学的に有効な組成物を投与する工程を包含する、
方法。
【請求項３７】  ヒト患者の皮膚における疾患状態を緩和する方法であって、
ここで、該疾患状態は、該ヒト患者において、機能性皮膚細胞の分解を妨害すること、機能性皮膚細胞の分解を遅延させること、機能性皮膚細胞の数を増加させることからなる群より選択される少なくとも１つの方法によって緩和され、
該方法は、該患者に、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む薬学的に有効な組成物を投与する工程を包含する、
方法。
【請求項３８】  ヒト患者の胎盤における疾患状態を緩和する方法であって、
ここで、該疾患状態は、機能性胎盤細胞の分解を妨害すること、機能性胎盤細胞の分解を遅延させること、機能性胎盤細胞の数を増加させることからなる群より選択される少なくとも１つの方法によって緩和され、
該方法は、該患者に、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む薬学的に有効な組成物を投与する工程を包含する、
方法。
【請求項３９】  容器中に梱包された、患者由来のサンプルにおいてＦＧＦ−２３をコードするｍＲＮＡの存在を検出するためのキットであって、該キットは、請求項３に記載のポリヌクレオチドの少なくとも２０個連続するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む、キット。
【請求項４０】  前記ポリヌクレオチドが配列番号４の少なくとも６個連続するアミノ酸をコードする、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】  容器中に梱包された、患者由来のサンプルにおいてＦＧＦ−２３ポリペプチドの存在を検出するためのキットであって、該キットは、請求項１９に記載の抗体を含む、キット。
【請求項４２】  単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７８をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドの相補鎖；および
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項４３】  配列番号１のコード領域由来の２０〜７５３個連続するヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項４４】  配列番号１のコード領域由来の６０〜５００個連続するヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の単離された核酸分子。
【請求項４５】  配列番号１のコード領域由来の２００〜３００個連続するヌクレオチドを含む、請求項４４に記載の単離された核酸分子。
【請求項４６】  単離された核酸分子であって、該核酸分子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換以外は、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
単離された核酸分子。
【請求項４７】  ＤＮＡである、請求項４２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】  組換えベクターを作製する方法であって、該方法は、請求項４２に記載の核酸分子をプロモーターに作動可能な連結でベクター中へ挿入する工程を包含する、方法。
【請求項４９】  請求項４８に記載の方法によって産生される、組換えベクター。
【請求項５０】  請求項４９に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、組み換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項５１】  請求項５０の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
【請求項５２】  ポリペプチドを産生する組換え方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項５１に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【請求項５３】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸を含む、
単離されたポリペプチド。
【請求項５４】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換以外は、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
単離されたポリペプチド。
【請求項５５】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２５１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２〜およそ２５１；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ２４；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸のおよそ２５〜およそ２５１；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７５；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１〜およそ１７７；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１７７〜およそ２５１；および
（ｈ）配列番号２のアミノ酸のおよそ１８０〜およそ２５１、
からなる群より選択されるアミノ酸を含む、
単離されたポリペプチド。
【請求項５６】  配列番号２のポリペプチドのエピトープ保有部分。
【請求項５７】  配列番号２の１０個と５０個との間の連続するアミノ酸を含む、請求項５６に記載のエピトープ保有部分。
【請求項５８】  請求項５３に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項５９】  請求項５４に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項６０】  請求項５５に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーをコードする核酸配列、およびこの核酸配列によってコードされるポリペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
原型の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）であるＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、脳および下垂体から、線維芽細胞の有糸分裂促進剤として本来単離された。しかし、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、発生組織および成体組織において広範に発現され、そしてこれらは、新脈管形成、有糸分裂誘発、細胞分化および組織損傷の修復を含む複数の生物学的活性を有するポリペプチドである（Ｂａｉｒｄ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ３：２３９−２４３（１９９１）；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５７５−６０６（１９８９））。公開された文献に従うと、現在ＦＧＦファミリーは、少なくとも１９個のメンバー（ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１９）からなる。ＦＧＦ−３は、マウス乳腺癌ウイルスによる活性化の一般的な標的であることが同定された（Ｄｉｃｋｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：１８−２６（１９９１）；ＦＧＦ−４〜ＦＧＦ−６は、癌遺伝子産物として同定された（Ｙｏｓｈｉｄａら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：２７−３７（１９９１）；Ｇｏｌｄｆａｒｂら，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ６３８：３８−５２（１９９１）；Ｃｏｕｌｉｅｒら，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：５３−６１（１９９１））。ＦＧＦ−１０は、相同性に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってラット肺から同定された（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：１５９１８−１５９２１（１９９６））。ＦＧＦ−１１〜ＦＧＦ−１４（ＦＧＦ相同性因子（ＦＨＦ）の１〜４）は、ランダムｃＤＮＡ配列決定、データベース検索および相同性に基づくＰＣＲの組み合わせによってヒト網膜から同定された（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９８５０−９８５７（１９９６））。ＦＧＦ−１５は、キメラホメオドメイン癌タンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）の下流の標的として同定された（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：３２２１−３２３２（１９９７））。ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、およびＦＧＦ−１８は、それぞれ、相同性に基づくＰＣＲによって、ラットの心臓および胚から同定された（Ｍｉｙａｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４３：１４８−１５２（１９９８）；Ｈｏｓｈｉｋａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４４：１８７−１９１（１９９８）；Ｏｈｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８１６１−１８１６４（１９９８））。近年、ＦＧＦ−１９が、データベース検索によってヒト胎児脳から同定された（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４４４：１４８−１５１（１９９９））。これらは、約３０〜６０％のアミノ酸同一性を有する保存された約１２０アミノ酸残基のコアを有する。これらのＦＧＦはまた、発生組織および成体組織の両方において重要な役割を果たすようである。従って、既知のＦＧＦとは異なる機能および活性を有するさらなるＦＧＦ分子、ならびにヒト疾患に関与する、組織に特異的に発現されるＦＧＦ分子���ついての必要性が、当該分野に存在する。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、単離されたポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、このポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号１または３の少なくとも８個連続するヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８０％相同性を有する、ポリヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号１または３の配列を有するポリヌクレオチドによって発現されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される。
【０００４】
本発明はさらに、診断プローブまたはプライマーとしての、この単離されたポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの使用を提供する。
【０００５】
本発明はまた、ポリペプチドを含む組成物を提供し、ここで、このポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号１または３によってコードされる少なくとも６個連続するアミノ酸を含む、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１または３を含むポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド；および
（ｃ）配列番号２または４のポリペプチドの改変体、
からなる群より選択される。
【０００６】
本発明の特定の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現制御配列に作動可能に連結される。本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドで形質転換された、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、配列番号１または３に対応する全長ｃＤＮＡおよび全長ポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
他の好ましい実施形態において、ＦＧＦ−２３は、切断部位が変異されている切断不能な変異体である。特定の実施形態において、アミノ酸の１７６位および１７９位が、置換または欠失されている。他の実施形態において、アミノ酸の１７６位および１７９位は変更されていないが、１７６位および／または１７９位付近の１つ以上のアミノ酸が変異されていて、同様に切断不能な形態のＦＧＦ−２３を生じる。
【０００８】
本発明のタンパク質およびポリペプチド組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。このようなタンパク質またはポリペプチドと特異的に反応する抗体を含む組成物がまた、本発明によって提供される。
【０００９】
本発明はまた、前駆体細胞もしくは子孫において発現される稀な分子の単離のためのｃＤＮＡライブラリーの作製に使用される、別な方法では少量の細胞集団である細胞の大量産生を提供する；処置によって産生された細胞は、増殖因子または他の分子を直接発現し得、そして馴化培地は、新規活性に関するアッセイにおいてスクリーニングされる。
【００１０】
本発明はさらに、哺乳動物幹細胞の単離、自己再生、および生存、ならびにその子孫の分化を提供する。
【００１１】
本発明はまた、以下を提供する：異常増殖、萎縮、分解、毒素媒介組織損傷、ならびに手術後組織再生および傷害後組織再生を含むがこれらに限定されない疾患状態において、皮膚細胞の分解を妨害もしくは遅延する組成物および方法、または皮膚細胞の数を増加させる組成物および方法；胸腺および免疫系の障害において、胸腺細胞の分解を妨害もしくは遅延させる組成物および方法、または胸腺細胞の数を増加させる組成物および方法；そして、パーキンソン病およびアルツハイマー病などにおいて、神経組織の分解を妨害または遅延させる組成物および方法、または神経細胞の数を増加させる組成物および方法。
【００１２】
本発明はまた、疾患状態（例えば、癌）、および胸腺、神経組織、皮膚または胎盤由来の細胞の増殖障害または分化障害において有用である、ＦＧＦ−２３機能のインヒビターを同定するための組成物および方法を提供する。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
広範な種々の細胞型および組織型の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、生存および分化を促進するためのそれらの強力な活性のために、ＦＧＦは、筋骨格状態のような創傷治癒（例えば、骨折、靭帯および組織修復、腱炎、滑液包炎など）；皮膚状態（例えば、火傷、切断、裂傷、とこずれ、緩慢潰瘍治癒など）；組織保護、修復、および心筋梗塞および虚血の間の新脈管形成の誘導、神経学的状態（例えば、神経変性疾患および発作）の処置、黄斑変性症を含む眼疾患の処置、を含む多数の異なった徴候についての治療剤として追求され続ける。
【００１４】
現在までに同定された線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質は、種々の細胞型の増殖および分化を制御するシグナル分子のファミリーに属する。ヒト生理学および病理学に対するＦＧＦタンパク質の重要性は、胚形成、血管発達および増殖および骨増殖におけるそれらの重要な役割に部分的に関する。インビトロ実験において、内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、ならびに心筋細胞骨格筋細胞の細胞増殖および分裂を調節する際のＦＧＦの役割を実証してきた。ＦＧＦファミリーの他のメンバーおよびそれらの生物学的役割は、Ｃｒｏｓｓｌｅｙら、Ｄｅｖｅｏｐｍｅｎｔ  １２１：４３９−４５１（１９９５）；Ｏｈｕｃｈｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：２２３５−２２４４（１９９７）；Ｇｅｍｅｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５：２５３−２５７（１９９６）；およびＧｈｏｓｈら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
７：１４２５−１４３４（１９９６）において記載されている。
【００１５】
癌細胞増殖における役割のために、ＦＧＦタンパク質はまた、ヒト健康および疾患に対して重要である。例えば、ＦＧＦ−８は、乳癌細胞および前立腺癌細胞におけるアンドロゲン誘導増殖因子として同定された（Ｔａｎａｋａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６３：２２６−２３０（１９９５）およびＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８９：８９２８−８９３２（１９９２））。
【００１６】
ＦＧＦファミリーの新しいメンバーが本明細書中に記載され、ここで、ＦＧＦタンパク質は、哺乳動物皮膚、胸腺、脳および胎盤において発現される。本発明のマウスＦＧＦをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に示される配列を有する。本発明のヒトＦＧＦをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に示される配列を有する。マウスポリヌクレオチドを、アミノ酸配列全体の保存された領域によって、および既知のＦＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび遺伝子によって共有される相同性の領域によって、ＦＧＦファミリーメンバーをコードするとして同定した。
【００１７】
本発明者らは、ＦＧＦ−２３が、ＦＧＦファミリーの以前に同定されていないメンバーであると考えている。現在まで、少なくとも２０のヒトＦＧＦタンパク質が同定されてきた。多数の場合において、他の哺乳動物（特に、マウスおよびラット）における相同性タンパク質がまた、同定されてきた。ヒトタンパク質は、アミノ酸配列、レセプター特異性、組織発現パターン、および生物学的活性の点において、異なった程度に変化する。
【００１８】
２０のヒトＦＧＦ遺伝子（ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１４およびＦＧＦ−１７〜ＦＧＦ２２）の染色体局在が報告された（図１０）。ヒトＦＧＦ遺伝子は、第１１染色体上にタンデムに連結されるＦＧＦ−３およびＦＧＦ−４を除いて、ヒトゲノムの種々の領域に局在する。ヒトＦＧＦ遺伝子の染色体局在の同定は、しばしば、ヒト疾患を関連させる際に役に立ち、従って、特に興味がある。本発明に従って、ヒトＦＧＦ−２３遺伝子は、ヒト第１９染色体ｐ１３．３に局在する（図１０）。興味深いことに、ヒトＦＧＦ−６遺伝子はまた、同じヒトゲノムＤＮＡにおいて見出された。ヒトＦＧＦ−６遺伝子のコード領域は、ＦＧＦ−２３遺伝子のコード領域から約５．５上流の部位に位置する。
【００１９】
本発明のＦＧＦ−２３は、配列において、現在までに刊行物に記載される全てのＦＧＦタンパク質とは異なる。本明細書中で議論されるように、種々のＦＧＦタンパク質によって果たされる役割についての知識は、増加し続けているが、かなり不完全である。
【００２０】
本発明は、配列番号１のＦＧＦが皮膚、脳および胎盤において発現され、そしてヒトＦＧＦ−２３がこれらの組織の疾患の発症および回復においてある役割を果たし得ることを開示することによって、この知識に追加する。さらに、ＦＧＦ−２３はまた、胸腺において発現され、従って、胸腺から誘導される細胞の障害の発症または回復においてある役割を果たし得る。従って、本発明は、新規な線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２３）の同定、単離および配列決定に基づく。
【００２１】
本発明は、さらに、ＦＧＦ−２３切断の産物を提供することによってこの知識に追加し、ここで、この切断は、例えば、アミノ酸１７９または１７９で生じる。切断は、発現の間に生じ得、そして２０ｋＤａのタンパク質および７〜１２ｋＤａのタンパク質の産物を生じ、非切断発現産物は、２８ｋＤａタンパク質である。これらはこの機構によって束縛されないが、本発明者らは、この切断がアミノ酸１７６および１７９を含み、その両方が、ネイティブなヒトＦＧＦ−２３におけるアルギニンであると考える。
【００２２】
従って、切断は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６：３５４−３４８（２０００）に記載される、リン酸代謝（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の障害において役割を果たし得る。
【００２３】
本発明は、リン酸代謝の障害を処置するための組成物および方法を提供し、ここで、この障害が、ＦＧＦ−２３の切断の結果である。この組成物は、ＦＧＦ−２３、またはＦＧＦ−２３をコードするポリヌクレオチドを含み得、ここで、ＦＧＦ−２３は、変異されて切断部位を変化するかまたは欠失する。このような変異のための好ましい部位は、１７６位および１７９位のアルギニンの１つまたは両方を含む。他の部位は、残基１７６または１７９に近いアミノ酸を含み、ここで、変異は、残基１７６または１７９の近くで切断に影響する。
【００２４】
本発明に従って、新規マウスＦＧＦをコードするＤＮＡが同定された。全てのコード領域のヌクレオチド配列が、マウス第６染色体由来のゲノムフラグメントを使用して決定された。コード領域のヌクレオチド配列は、マウスＦＧＦ（２５１個のアミノ酸）（図２）の完全なアミノ酸配列の解明を可能にした。このタンパク質は、仮にＦＧＦ−２３と命名された。２つのシステイン残基は、ＦＧＦファミリーにおいて十分保存され、そしてこれらのアミノ酸は、マウスＦＧＦ−２３の残基５１および１１３に対応する。システインは、１１３位において見出され、そしてチロシンは、５１位において見出された。
【００２５】
ＦＧＦ−２３をコードするヒト遺伝子は、ヒト胎盤において同定された。ヒトＦＧＦ−２３の全てのコード領域を含むｃＤＮＡは、以下のようなＦＧＦ特異的プライマーを使用するＰＣＲによって増幅された：センスプライマー：５’ａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｔｃａｇａｇｃａ  ３’（配列番号５）；アンチセンスプライマー：５’ｃｔｔｃｃａｇｃｇａｃｃｃｔａｇａｔｇａ  ３’（配列番号６）。
【００２６】
マウス成体組織におけるＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡの発現を、マウスＦＧＦ−２３に特異的な正方向プライマーおよび逆方向プライマー、マウスＦＧＦ−２３に特異的なＴａｑＭａｎプローブ、およびテンプレートとしてのマウス組織ｃＤＮＡ（脳、胸腺、小腸、心臓、肺、肝臓、腎臓、筋肉、皮膚、脾臓、胃および精巣）を用いて、Ｍｏｄｅｌ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒによるリアルタイム定量的ＰＣＲによって調べた。β−アクチンｍＲＮＡの発現をまたコントロールとして調べた。製造業者の指示に従って決定されたＦＧＦ−２３
ｃＤＮＡのコピー数を、それぞれの組織におけるβアクチンｃＤＮＡのコピー数に対して規準化した（図１２）。ＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡは、脳および胸腺において主に発現されることが見出された。しかし、ＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡの発現レベルは、β−アクチンｍＲＮＡの発現レベルと比較して非常に低い。マウスＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡは、もともと皮膚から単離されたが、皮膚におけるＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡの発現は、脳における発現よりもずっと低い。
【００２７】
脳におけるＦＧＦ−２３の役割を解明するために、脳における逐次冠状切片におけるＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡの発現を、３５Ｓ−標識アンチセンスまたはセンスマウスＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによって調べた。個々の特異的標識は、腹側外側視床核（ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ  ｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ）においてのみ観測された（図１３）。試験された他の脳の領域において特異的標識は観測されなかった。運動系に関連する腹側外側視床核は、深い小脳核から運動皮質への活性についての主要なリレーである（Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ｐｐ．６２９−６４８（１９９５））。腹側外側視床切開が、生理学的振せんおよび病理学的振せんの両方の脊柱上の成分に関与する通常の回路を妨害し、これは、腹側外側視床核が生理学的振せんを生成する回路に関係することを示す（Ｄｕｖａｌら、Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１３２：２１６−２２２（２０００））。ＦＧＦは、近位細胞に対して作用する局所的なシグナル分子である（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５８：５７５−６０６（１９８９））。従って、ＦＧＦ−２３は、腹側外側視床核において役割を果たす独特のＦＧＦであることが予期される。
【００２８】
本明細書中でＦＧＦ−２３に対する参照は、本明細書中で特徴付けられそして記載されるＦＧＦ−２３に実質的に相同で、生物学的に等価な任意の起源の増殖因子を含むと解釈されることを意図する。このような実質的に相同な増殖因子は、任意の組織または種に対してネイティブであり得、そして同様に、生物学的活性が、任意の多くの生物学的アッセイ系において特徴付けられ得る。
【００２９】
用語「生物学的に等価」とは、本発明の組成物が、本明細書中に記載されるように単離されたＦＧＦ−２３または本発明の組換え的に産生されたヒトＦＧＦ−２３と必ずしも同じ程度ではないが、同じ様式で同じ増殖特性のいくらかまたは全てを示し得る。
【００３０】
「実質的に相同」により、任意の種由来のＦＧＦ−２３に対するヒトＦＧＦ−２３の相同性の程度が、ＦＧＦ−２３とＦＧＦファミリーの任意の以前に報告されたメンバーとの間の相同性の程度よりも大きいことを意味する。
【００３１】
配列の同一性または同一性パーセントは、非ヒトＦＧＦ−２３との同一性パーセントを決定する場合にはヒトＦＧＦを参照して、非ＦＧＦ−２３成長因子との同一性パーセントを決定する場合にはＦＧＦ−２３を参照して、２つの配列をアラインメントする場合はＬａｓｅｒｇｅｎｅバイオコンピュータソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，ＩＮＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における複数配列アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓら，Ｃａｂｉｏｓ  ８：１８９−１９１，１９９２）を用いた、２つの配列間の同じ残基の百分率を意味することが意図される。この方法において、複数アラインメントは、進行的な様式で実施され、この様式では、ますます大きなアラインメント群が、一連の対様式のアラインメントから算出した類似性スコアを用いてアセンブリされる。最適な配列アラインメントは、最大アラインメントスコアを見出すことにより得られる。最大アラインメントスコアは、所定の進化的間隔にわたって２つの関連するタンパク質において生じる所定のアミノ酸の変化の確率を示す、残基の重み付け表から決定された、アラインメントにおける別個の残基間の全てのスコアの平均である。アラインメントにおいてギャップを空けることおよびギャップを伸ばすことについてのペナルティーは、スコアに寄与する。このプログラムで用いられるデフォルトパラメーターは、以下の通りである：複数アラインメントについてのギャップペナルティー＝１０；複数アラインメントについてのギャップの長さのペナルティー＝１０；対様式でのアラインメントにおけるｋ−タプル値＝１；対様式でのアラインメントにおけるギャップペナルティー＝３；対様式のアラインメントにおけるウィンドウ値＝５；対様式のアラインメントにおいて保存されるダイアゴナル＝５。アラインメントプログラムのために用いられる残基の重み付け表は、ＰＡＭ２５０（Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆｆ編，ＮＤＲＦ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，第５巻，別冊３，３４５頁，１９７８）である。
【００３２】
保存パーセントは、２つの残基が保存的置換（ＰＡＭ２５０残基の重み付け表において０．３以上の対数オッズ値を有すると定義される）を示す位置の百分率に対して同一性残基の百分率を足すことによって、上記のアラインメントから算出される。保存は、非ヒトＦＧＦ−２３との保存パーセントを決定する場合はヒトＦＧＦ−２３に対して参照され、非ＦＧＦ−２３増殖因子との保存パーセントを決定する場合はＦＧＦ−２３に対して参照される。この必要条件を満たす保存的アミノ酸変化は、以下の通りである：Ｒ−Ｋ；Ｅ−Ｄ、Ｙ−Ｆ、Ｌ−Ｍ；Ｖ−Ｉ、Ｑ−Ｈ。
【００３３】
本発明は、１以上の反応性アミノ酸側鎖と共有結合した１以上のポリマーを有するＦＧＦ−２３タンパク質またはこれらの変異体を提供する。例として、限定ではないが、これらのポリマーとして、１以上の遊離のシステインスルフヒドリル残基に結合され得るポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられ、これにより、ジスルフィド結合およびタンパク質が酸化条件に曝露された場合の凝集の形成をブロックする。さらに、ＦＧＦ−２３タンパク質および／またはムテインのぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、半減期、溶解性、およびプロテアーゼ耐性を増加するような改善された特性を提供することが期待される。あるいは、ＦＧＦ−２３タンパク質および／またはムテインは、遊離アミノ基（例えば、リジンεまたはＮ末端アミノ基）へのポリマーの共有結合性の付加により改変され得る。共有結合性の改変のための好ましいシステインおよびリジンは、レセプターもしくはヘパリン結合中に含まれないものまたは適正なタンパク質の折り畳み中に含まれないものである。ＦＧＦ−２３の生化学的および／または生物学的活性をアッセイするための方法が、特定のアミノ酸残基の改変が、所望されるタンパク質の活性を生じるか否かを決定するために使用され得ることは、当業者に明らかである。
【００３４】
１以上のプロテアーゼ切断部位を改変することによるＦＧＦ−２３の安定性を改善することは有益であり得る。従って、本発明は、ＦＧＦ−２３改変体を提供し、このＦＧＦ−２３改変体において、１以上のプロテアーゼ切断部位が（例えば、切断部位での１以上のアミノ酸の置換により）改善された安定性を有するＦＧＦ−２３改変体を作製するために変更された。このような改善されたタンパク質の安定性は、タンパク質生成物および／または治療的使用の間で有益であり得る。
【００３５】
改変のための適切なプロテアーゼ切断部位は、当該分野で周知であり、そして企図される特定の用途によって変化するようである。例えば、代表的な置換は、リジンまたはアルギニンと他のアミノ酸（例えば、アラニン）との置換を含む。活性の喪失（例えば、レセプター結合またはヘパリン結合）は、本明細書中で記載されるように試験され得る。
【００３６】
ＦＧＦ−２３はまた、ハイブリッド形態または改変形態が、ＦＧＦ−２３の生物学的活性を保持する限り、以下を含むＦＧＦ−２３のハイブリッド形態およびＦＧＦ−２３改変形態を含む：融合タンパク質；ＦＧＦ−２３フラグメント；特定のアミノ酸が欠失または置換されたハイブリッド形態および改変形態；１以上のアミノ酸が改変アミノ酸または異常アミノ酸に変更されたような改変；グリコシル化のような改変。融合タンパク質は、本発明のＦＧＦ−２３またはこれらのフラグメントおよびタンパク質生成物の分泌を促進するための非相同性タンパク質のシグナル配列から構成され得る。
【００３７】
ＦＧＦ−２３を含む融合タンパク質または生物学的に活性なこれらのフラグメントもしくはこれらの免疫原フラグメントは、当該分野で公知の方法を使用して生成され得る。このような融合タンパク質は、治療的に使用され得、または単離手順および精製手順を単純化するために生成され得る。ヒスチジン残基は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー精製を可能にするために組込まれ得る。残基ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬは、ｍｙｃモノクローナル抗体により認識される免疫原性決定基を含み得、そしてｍｙｃモノクローナル抗体に基いたアフィニティー精製を可能にするために組込まれ得る。トロンビン切断部位は、選択された部位で分子の切断を可能にするために組込まれ得る；好ましいトロンビン切断部位は、残基ＬＶＰＲＧから構成される。分子の精製は、配列（例えば、残基ＳＡＷＲＨＰＱＦＧＧ、これは、常磁性ストレプトアビジンビーズに結合する）を組込むことにより容易にされ得る。このような実施形態は、参照として援用されるＷＯ９７／２５３４５に記載される。
【００３８】
本発明はまた、ＦＧＦ−２３のフラグメントを含む。配列番号４および配列番号２の好ましいフラグメントには、以下が挙げられる：約１〜約２５１のアミノ酸；約２〜約２５１のアミノ酸；約２５〜２５１のアミノ酸；約１〜約２４のアミノ酸。このようなフラグメントは、標準的な生化学的方法によってタンパク質から調製されるか、またはこのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現することによって調製され得る。
【００３９】
ＦＧＦ−２３は、Ｎ末端に２４のアミノ酸の代表的なシグナル配列を有し、このことはＦＧＦ−２３は分泌分子であることを示唆する。組換えマウスＦＧＦ−２３は、このｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスで感染されたＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞によって効率的に分泌され、ＦＧＦ−２３は分泌分子であることが確認された。
【００４０】
生物学的に活性な部位における変化によりネイティブなＦＧＦ−２３とは異なるＦＧＦ−２３分子もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００４１】
実質的に相同の意味の中にまた含まれるのは、本明細書中に記載されるＦＧＦ−２３に対する抗体との交叉反応性によって単離され得る、またはゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡを含む、コードヌクレオチド配列が、本明細書中のＦＧＦ−２３もしくはそのフラグメントのゲノムもしくはサブゲノムのヌクレオチド配列もしくはｃＤＮＡの相補的配列とのハイブリダイゼーションによって単離され得る、任意のＦＧＦ−２３である。縮重ＤＮＡ配列が、ヒトＦＧＦ−２３をコードし得ることもまた当業者によって認識され、そしてこれらはまた、ＦＧＦ−２３の哺乳動物の対立遺伝子改変体と同様に、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００４２】
増殖因子は、特異的レセプターに作用すると考えられる。本発明によって、ＦＧＦ−２３およびこのファミリーの増殖因子の未だ未知のメンバーは、他の増殖因子ファミリーに関して示されたように、独特な分布を有する特異的レセプターを介して作用する。
【００４３】
本発明の好ましいｈＦＧＦ−２３は、記載された通りに同定された。また、好ましいのは、組換えＤＮＡ技術により調製されたｈＦＧＦ−２３である。「純粋な形態」または「精製された形態」または「実質的に精製された形態」によって、ＦＧＦ−２３組成物が、ＦＧＦ−２３でない他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００４４】
配列番号１または配列番号３に対して８０％の相同性；好ましくは少なくとも８５％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは９５％の相同性を有するＤＮＡおよびＲＮＡを含むポリヌクレオチドが、本発明の範囲内に含まれる。配列番号１または３に対して９６％、９７％、９８％、および９９％の相同性を有するポリヌクレオチドもまた含まれる。相同性パーセントは、当該分野において公知の方法を使用して計算される。このような方法の非限定的な例は、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティとともにアフィンギャップサーチ（ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ  ｓｅａｒｃｈ）を用いてＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を実行するようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムである。
【００４５】
ＦＧＦ−２３はまた、ハイブリッド形態または改変形態が、ＦＧＦ−２３の生物学的活性を保持する限り、以下を含むＦＧＦ−２３のハイブリッド形態およびＦＧＦ−２３改変形態を含む：融合タンパク質；ＦＧＦ−２３フラグメント；特定のアミノ酸が欠失または置換されたハイブリッド形態および改変形態；１以上のアミノ酸が改変アミノ酸または異常アミノ酸に変更されたような改変；グリコシル化のような改変。生物学的活性を保持することにより、応答性の細胞の増殖、生存または分化を促進するＦＧＦ−２３の能力が、保存されることを意味するが、本明細書中に記載される単離されたＦＧＦ−２３または組換えで生成されたＦＧＦ−２３の能力と同じレベルである必要性はない。
【００４６】
本発明はまた、ＦＧＦ−２３の切断産物（約２０ｋＤａ型および約７〜１２ｋＤａ型を含む）に関する。このような産物は、１７６位または１７９位でのＦＧＦ−２３の切断によって得られる。非切断型もまた提供され、ここで、１７６位および／または１７９位のアルギニンは、変異、欠失もしくは置換されるか、またはこれらの部位の近くの１つ以上のアミノ酸は、変異、欠失もしくは置換され、それによって、これらの部位の１つもしくは両方での切断に影響する。
【００４７】
組換えヒトＦＧＦ−２３は、ＦＧＦ−２３をコードするＤＮＡ配列を適切な形質転換宿主細胞において発現することにより作製され得る。当該分野で周知の方法を使用して、ＦＧＦ−２３をコードするＤＮＤは、発現ベクターに連結され得、宿主細胞に形質転換され、そして形質転換細胞によりＦＧＦ−２３の発現に適切な条件が確立される。
【００４８】
ＦＧＦ−２３をコードするＤＮＡは、宿主細胞の好ましいコドンの使用の利益を受けることにより設計され得る。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるコドンの使用は、例えば、Ｗｅｓｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．１１：９３２３〜９３３５（１９８８）に記載される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるコドンの使用は、例えば、Ｌｌｏｙｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５２８９〜５２９５（１９９２）に記載される。コリネバクテリアの好ましいコドンおよびＥ．ｃｏｌｉの好ましいコドンとの比較は、Ｍａｌｕｂｒｅｓら、Ｇｅｎｅ  １３４：１５〜２４（１９９３）に提供される。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおけるコドンの使用は、例えば、Ａｋａｓｈｉ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３６：９２７〜９３５（１９９４）に記載される。酵母におけるコドンの使用はまた、図７に示され、ショウジョウバエにおけるコドンの使用は、図８に示され、そしてＥ．ｃｏｌｉについてのコドンの使用は、図９に示される。
【００４９】
任意の適切な発現ベクター（例えば、昆虫細胞で使用するための発現ベクター）を使用して、組換えヒトＦＧＦ−２３を産生し得る。バキュロウイルス発現系もまた使用され得る。好ましい方法は、バキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞（例えば、Ｔｒ５細胞またはＳｆ９細胞）での発現である。
【００５０】
本発明は、ヒトＦＧＦ−２３をコードする配列を含む核酸配列を含む。ＦＧＦ−２３をコードする核酸配列と実質的に同一である配列はまた、本発明の範囲内に含まれる。このような実質的に同じ配列は、例えば、周知の手順および標準的な手順により所定の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）においてより容易に発現されるコドンで置換され得る。このような改変された核酸配列は、本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
特定の核酸配列は、当業者により改変され得、従って、ＦＧＦ−２３のアミノ酸配列をコードする全ての核酸配列は、同様にこのように改変され得る。従って、本発明はまた、適切な場合には、このような核酸、または核酸配列の相補体すべてとハイブリダイズし、ＦＧＦ−２３の細胞生存、細胞増殖、または細胞分化活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。本発明はまた、細胞の生存を促進する活性を有するポリペプチドをコードし、そしてＦＧＦ−２３に結合する抗体により認識される核酸配列を含む。抗体を惹起するための好ましい方法およびエピトープは、実施例７に記載される。
【００５２】
本発明はまた、本発明の範囲内に含まれる任意の核酸配列に作動可能に連結された発現調節エレメントを含むベクターを包含する。本発明はまた、本発明の範囲内に含まれる任意の核酸配列に作動可能に連結された発現調節エレメントを含むベクターで形質転換された任意の種類の宿主細胞を含む。
【００５３】
ＦＧＦ−２３を生成するための方法もまた本明細書中で提供される。調製は、細胞型がＦＧＦ−２３を生成する限り、種々の細胞型由来の馴化培地からの単離により行われ得る。第２の、そして好ましい方法は、ＦＧＦ−２３をコードする核酸配列を単離または獲得し、この配列を適切なベクターおよび適切な細胞型に適切な調節配列とともに配列をクローニングし、そしてＦＧＦ−２３を生成するための配列を発現することによる組換え方法の利用を含む。
【００５４】
ＦＧＦ−２３は、皮膚、胸腺、脳、および胎盤における高い発現レベルに基いて記載されてきたが、この因子は、他の細胞型にも作用し得る。ＦＧＦ−２３は、細胞で作用し、これらの生存状態、増殖状態、分化状態または機能を促進するようである。この予測は、公知の増殖因子の活性に基く。ＦＧＦファミリーのメンバーは、これらの発現が、１つのまたはわずかな組織に限られる場合でさえ、異なる機能および発生学的起源の多くの細胞型に作用する。
【００５５】
本発明者らは、本明細書中で、ＦＧＦ−２３が皮膚で発現されることを同定した。これは、例えば、前癌性病変、炎症性疾患、外傷、または毒素関連障害後の回復、および他の皮膚疾患におけるＦＧＦ−２３の役割を示唆する。さらに、ＦＧＦ−２３はまた、胸腺で発現される。これは、例えば、細胞（例えば、胸腺由来の免疫細胞）の障害、例えば、自己免疫障害、白血病およびリンパ腫、免疫不全状態などにおけるＦＧＦ−２３の役割を示唆する。
【００５６】
いくつかのＦＧＦは、脳において発現され、そして好中性因子（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）として重要な役割を果たすことが予期される。ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、脳において大量に存在し（Ｇｏａｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４７：１０６〜１１９（１９８７）、そして脳の種々の領域からの初代培養物に対する生存増強効果を及ぼす（Ｗａｌｉｃｋｅ，Ｐ．Ａ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６１８〜２６２７（１９９８））。ＦＧＦ−１は、中脳および脳幹の運動神経ならびに感覚神経において主に発現する（Ｅｌｄｅ，Ｒ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ７：３４９〜３６４（１９９１））。対照的に、ＦＧＦ−２は、限られた領域（帯状皮質（ｃｉｎｇｕｌａｔｅ  ｃｏｒｔｅｘ）、ｉｎｄｕｓｔｉｕｍ  ｇｒｉｅｕｍ、ｆａｓｃｉｏｌａ  ｃｉｎｅｒｅｒｕｍおよび海馬を含む）におけるニューロンにおいて、ならびに脳の広範な領域における星状細胞において（Ｅｍｏｔｏ，Ｎ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２：２１〜２９（１９８９）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：１４２〜１５２（１９９２））、主に発現する。ＦＧＦ−５は、帯状皮質、海馬および視床において弱く発現する（Ｈａｕｂ，Ｏ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８０２２〜８０２６（１９９０））。ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１１からＦＨＦ−１４は、限られた領域のニューロン（海馬、視床、中脳および脳幹を含む）において発現する（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１３９８：３８〜４１（１９９８））。
【００５７】
黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの変性は、パーキンソン病を引き起こす（Ｆａｌｌｏｎ，Ｊ．Ｈ．およびＬｏｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉａｇｏ，ＣＡ、２１５〜２３８頁（１９９５））。従って、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンについての神経栄養因子は、実質的な注意を受けた。ＧＤＮＦ、Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ、Ａｒｔｅｍｉｎ、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−３は、中脳のドーパミン作動性ニューロンの生存を増強する（Ｌｉｎ，Ｌ．−Ｆ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１１３０〜１１３２（１９９３）、Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：２４５〜２５３（１９９８）、Ｂａｌｏｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：１２９１〜１３０２（１９９８）、Ｈｙｍａｎ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：２３０〜２３２（１９９１）、Ｈｙｍａｎ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：３３５〜３４７（１９９４））。しかし、これらの発現は黒質に限定されない（Ｐｏｃｈｏｎ，Ｎ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：４６３〜４７１（１９９７）、Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：２４５〜２５３（１９９８）、Ｂａｌｏｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：１２９１〜１３０２（１９９８）、Ｅｒｎｆｏｒｓ，Ｐ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５：５１１〜５２６（１９９０））。ＦＧＦ−２３が脳で発現するということは、本発明の非常に重要な知見である。
【００５８】
ドーパミンニューロンが、不可逆的な損傷を受ける前に、おそらく何年もの間、機能不全であると考えられる。従って、ＦＧＦ−２３のような因子は、細胞死の予防または機能の回復において、有用であり得る（Ｄｕｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：Ａ３２〜Ａ３９（１９９９））。ＦＧＦ−２３は、変性をブロックするために、遺伝子移動方法を使用して投与され得る。このような方法は、神経栄養性因子ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）と共に使用される。ラットのパーキンソンモデルにおいて、ナノグラム量のＢＤＮＦおよびＧＤＮＦが、形質転換細胞から測定され、そして神経保護効果は、黒質のドーパミンニューロンの４０％〜７０％救出のオーダーであった。従って、本発明のＦＧＦ−２３を分泌するように操作された線維芽細胞または線維芽細胞細胞株を使用する移植は、因子の分泌および黒質のドーパミンニューロンの救出を可能にし得る。あるいは、ＦＧＦ−２３を有するウイルスベクターを用いた、線条体または黒質領域の注入もまた、神経保護効果を有する。
【００５９】
パーキンソン病では、実質的な黒質中の神経変性は、一般に遅くそして長引く。これは、おそらくは臨床症状が出現する４〜５年前までの初期介入が、変性プロセスをブロックまたは遅延し得ることを示唆する。線条体ドーパミン機能の衰えは、臨床症状の出現前にＰＥＴ画像化およびＳＰＥＣＴ画像化により検出され得、この初期段階における神経保護介入の機会を提供する。
【００６０】
本発明のＦＧＦ−２３はまた、アルツハイマー病のような他の神経変性疾患を処置する際の用途を見出し得る。処置しなければならないさらなる状態としては、発作、物理的刺激、化学的刺激または環境的刺激に起因する脳の外傷、中枢神経系に対する毒性傷害、および任意の他のＣＮＳまたは神経学的障害が挙げられ、ここで、変性プロセスのブッキング、遅延、または逆転がこの疾患または状態を軽減する。
【００６１】
本発明に従って処置され得る他の疾患は、クローン病、腸創傷の治癒、潰瘍、炎症、損傷および手術吻合、運動性および吸収障害、ならびに腸の先天性奇形である。
【００６２】
ＦＧＦ−２３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、本発明に従って決定された。本発明はまた、実施例２に記載されるように、ＦＧＦ−２３の天然に存在する切断産物を提供する。ＦＧＦ−２３が天然に切断される能力は、これらの切断産物が、細胞中の生物学的プロセスにおいて役割を果たし得ることを示す。１つのこのようなプロセスは、リン酸代謝に関係する。ＦＧＦ−２３切断産物に関し本明細書中に開示される結果は、常染色体優性低リン酸血症性くる病（ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ）（ＡＤＨＲ）が、ＦＧＦ−２３（特に、アルギニン１７６（Ｒ１７６Ｑ）およびアルギニン１７９（Ｒ１７９Ｗ）における）の変異に関係するという最近の報告（Ｔｈｅ  ＡＤＨＲ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６：３４５−３４８（２０００））と一致している。それらは、機構によって束縛されないが、本発明者らは、このような変異が、本明細書中に開示される切断部位で生じ、そしてＲ１７６またはＲ１７９に変異を有するＦＧＦ−２３では切断されないと、考える。
【００６３】
本発明に従って、ＦＧＦ−２３は、バキュロウイルスにおいて発現される場合、２つの部分に切断される（プロセスされる）。ゲル上の切断産物の見かけのサイズに基づいて、推定切断部位は、残基１７６および１７９の付近であると考えられる。これらのアルギニン、特にＲ１７６は、プロテアーゼ部位と一致する。従って、本発明はさらに、ＦＧＦ−２３のフラグメントを提供し、このフラグメントには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号４の約１〜約１７５のアミノ酸；配列番号４の約１〜約１７８のアミノ酸；配列番号４の約１７７〜約２５１のアミノ酸；配列番号４の約１８０〜約２５１のアミノ酸；ならびにこれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【００６４】
さらに、ＦＧＦファミリーの他のメンバーに相同的なＦＧＦ−２３の領域は、これらの残基で正確に終わり、ＦＧＦ−２３遺伝子の残りが、ＢＬＡＳＴ検索によって、他のＦＧＦまたは他のタンパク質に対して相同性を有さないＣ末端伸長である。従って、推定切断部位は、ＦＧＦ相同性フラグメント、およびＣ末端を生成する。変異は、これらの部位またはこれらの部位の近傍で、ＦＧＦ−２３のタンパク質分解性プロセシングを防止することによって、骨疾患において役割を果たし得る。タンパク質分解性切断は、活性を必要とし、そしてこれらの部位の変異は、機能をなくした（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）表現型を生じ、そして骨疾患に導く。
【００６５】
ＡＤＨＲに加えて、類似のヒト骨疾患、ＸＬＨ（Ｘ−リンク低リン酸血症性くる病）が存在し、これは、ＰＨＥＸと呼ばれるエンドペプチダーゼにマッピングされている。ＰＨＥＸの基質は、ＦＧＦ−２３であり得、切断部位で、本明細書中に開示されるＦＧＦ−２３フラグメントを生じる。
【００６６】
従って、本発明は、ＦＧＦ−２３を切断不可能にする、これらの部位に変異を有するＦＧＦ−２３の改変体を提供し、これらの改変体は、不活性であり、そしてＦＧＦ−２３も主要なネガティブインヒビターとして使用され得るか、または異常に活性であり、ＦＧＦ−２３に起因する障害を処置するために使用され得るかのいずれかである。変異したＦＧＦ−２３が切断を受けないことは、他の障害に見られるように、くる病の乱されたリン酸代謝をに寄与し得る。あるいは、これらの部位の切断は、ＦＧＦ−２３を不活性化するために必要であり、そしてこれらの部位での変異は、機能を得た表現型を生じて、リン酸消費および骨疾患に導く。
【００６７】
本発明はまた、胸腺機能不全によって特徴付けられる免疫障害を含む胸腺疾患を有する患者を処置するための有効量でＦＧＦ−２３を含む治療剤または薬学的組成物、ならびにＦＧＦ−２３の治療有効量を投与する工程を包含する方法を包含する。これらの組成物および方法は、多数の疾患を処置するために有用である。本明細書中の組成物および方法はまた、変性を予防するため、および／または他の組織においても同様に生存を促進する（例えば、新脈管形成、ニューロンの生存創傷治癒などを促進する）ために有用であり得る。当業者は、ＦＧＦ−２３が特定の細胞型において生存を促進するかまたは機能する際に有用であるか否かを決定するために、当該分野で公知の種々のアッセイを容易に使用し得る。
【００６８】
ＦＧＦ−２３は、皮膚において発現されるので、これは、創傷治癒、および異常増殖、萎縮症、変性が関係する皮膚の疾患において、または毒性損傷の結果として有用である。ＦＧＦ−２３はまた、受胎能、先天性疾患、および胎盤の障害のような胎盤機能に関連する異常において有用で在り得る。
【００６９】
特定の環境では、発現されるＦＧＦ−２３の量を調整するかまたは減少させることが望ましいものであり得る。従って、本発明の別の局面では、ＦＧＦ−２３アンチセンスオリゴヌクレオチドが作製され得、そして１つ以上のＦＧＦ−２３アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを包含する方法が、細胞によるＦＧＦ−２３の発現レベルを減少させるために用いられる。ＦＧＦ−２３アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、ＦＧＦ−２３の発現に関与する特異的な相補的核酸配列との塩基対合を介して相互作用してＦＧＦ−２３の発現が減少されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、ＦＧＦ−２３の発現に関与する特異的核酸配列は、ＦＧＦ−２３をコードするゲノムＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である。このゲノムＤＮＡ分子は、ＦＧＦ−２３遺伝子の調節領域、または成熟ＦＧＦ−２３タンパク質についてのコード配列を含み得る。ＦＧＦ−２３アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそのための方法の背景において用語「ヌクレオチド配列に対して相補的」は、細胞において、すなわち生理学的条件下で、その配列に対するハイブリダイゼーションを可能にするように、このような配列に対して十分に相補的であることを意味する。ＦＧＦ−２３アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約１００ヌクレオチドを含む配列を含み、そしてより好ましくは、ＦＧＦ−２３アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５〜約３０ヌクレオチドを含む。ＦＧＦ−２３アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチド分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対する抵抗性を付与する種々の改変（例えば、改変ヌクレオシド間連結（ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５４８  １９９０；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＢａｎｎｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５（１９９０）、これらは、参考として援用される）、改変核酸塩基および／または糖など）を含み得る。
【００７０】
本発明の治療剤または薬学的組成物は、例えば、局所的な、静脈内、皮下、筋内、経皮、クモ膜下、または脳内を含む、当該分野で公知の任意の適切な経路によって投与され得る。投与は、注射によるような迅速なもの、あるいは緩慢な注入または徐放性処方物の投与によるような一定期間にわたるもののいずれかであり得る。
【００７１】
ＦＧＦ−２３はまた、所望の薬学的または薬力学特性を提供する薬剤と連結され得るか、または結合体化され得る。例えば、ＦＧＦ−２３は、血液脳関門を交差する貫通または輸送を促進することが当該分野で公知の任意の物質（例えば、トランスフェリンレセプターに対する抗体）にカップリングされ得、そして静脈内注射によって投与され得る（例えば、Ｆｒｉｄｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−３７７（１９９３）（これは参考として援用される）を参照のこと）。さらに、ＦＧＦ−２３は、可溶性、安定性、半減期および他の薬学的に有利な特性の所望の特性を得るために、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）に安定に連結され得る。（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ．４：１６９−７３（１９７８）；Ｂｕｒｎｈａｍ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．５１：２１０−２１８（１９９４）（これらが、参考として援用される）を参照のこと）。
【００７２】
組成物は、通常、薬学的調製物の形態で使用される。このような調製物は、薬学分野で周知の様式で作製される。１つの好ましい調製物は、生理学的な生理食塩水溶液のビヒクルを使用するが、他の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理学的濃度の他の非毒性塩、５パーセントのグルコース水溶液、滅菌水など）がまた使用され得ることが、意図される。適切な緩衝液がその組成物中に存在することは、望ましくあり得る。そのような溶液は、所望される場合、凍結乾燥および滅菌アンプル中に保存され得、注射の準備のために滅菌水の添加による再構成のために準備される。最初の溶媒は、水性であっても、あるいは非水性であってもよい。ＦＧＦ−２３がまた、処置が必要な組織に移植され得る、固体または半固体の生物学的に適合性のマトリックスに組み込まれ得る。
【００７３】
キャリアはまた、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘土、清澄さ、色、滅菌性、安定性、分解速度、または処方物の臭気を改変または維持するために、他の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。同様に、キャリアは、血液脳関門を介した放出または吸収または浸透を改変または維持するために、他の薬学的に受容可能な賦形剤をなお含み得る。このような賦形剤は、単位投薬量形態もしくは複数用量形態のいずれかでの非経口投与のためか、または連続的もしくは周期的な注入による脳脊髄液への直接的な注入のための投薬量を処方するために、通常および慣習的に使用される物質である。
【００７４】
用量投与は、使用される投薬量形態および投与経路の薬物動態学的パラメーターに依存して、反復され得る。
【００７５】
ＦＧＦ−２３を含む特定の処方物が経口投与されることがまた、意図される。このような処方物は、好ましくは、固体投薬量形態中に適切なキャリアとともにカプセル化され、処方される。適切なキャリア、賦形剤および希釈剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、珪酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、マグネシウム、ステアレート、水、ミネラルオイルなどが挙げられる。処方物はさらに、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存剤、甘味剤または香味剤を含み得る。組成物は、当該分野で周知の手順を用いることによって、患者への投与後に活性成分の迅速、徐放性または遅延した放出を提供するように、処方され得る。処方物はまた、タンパク質分解性の分解を減少し、そして吸収を促進する物質（例えば、界面活性剤など）を含み得る。
【００７６】
意図される処置レジメンに依存して、ＦＧＦ−２３タンパク質またはその改変体の放出速度を制御することが望ましくあり得、投与頻度を最小化しながら長期の処置を提供する。このような処置レジメンは、例えば、ＦＧＦ−２３タンパク質が比較的不安定であり、その結果、効果的なレベルの活性タンパク質の局在化した濃度が不十分な期間であることが見出される場合に、望ましくあり得る。従って、例えば、特定の疾患に関して、反復した頻繁な注射を実施することは、望ましくも実際的でもない。そのような徐放性系の主要な利点としては、一定速度での薬物の標的化された局所送達、疾患状態を処置するために必要とされる比較的少ない薬物、可能性のある副作用の最小化、および増強された処置効果が挙げられる。また、これらの形態の送達系は、インビボで不安定であり、通常頻繁な投薬間隔を必要とする薬物を保護し得る。そのような状況下において、徐放性は、ヘパリン−アルギネート微小球またはＦＧＦ−２３  ＰＬＧ微小球の調製物を形成するためのＦＧＦ−２３結合体化されたヘパリン−セファロースビーズのカプセル化のような、当該分野で容易に利用可能な方法のうちの１つによって達成され得る。
【００７７】
ヘパリン−アルギネート微小球は、組織への塩基性線維芽細胞増殖因子の送達のために好首尾に使用されている（Ｌｏｐｅｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２８２（ｌ）：３８５−３９０（１９９７））。同様に、アルギネート／ヘパリンセファロース微小球およびフィルムは、小用量での放出を制御するために、塩基性ＦＧＦ−サポニン結合体の放出を制御するための薬物キャリアとして使用される。ｂＦＧＦの溶液へのヘパリンの添加は、ｐＨの変化または温度上昇に伴う活性の損失を回避する。例えば、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２８：４７５−４８４（１９８６）を参照のこと。
【００７８】
ＦＧＦ−２３のヘパリンへの結合は、インビボ発現もしくは投与の間またはインビトロでのタンパク質精製の種々の段階の間のいずれかに、その安定性を増強するために使用され得る。従って、本発明によって、ヘパリンは、ＦＧＦ−２３溶液に添加され得、そしその活性が本明細書中に開示される方法によってアッセイされ得る。
【００７９】
ＦＧＦ−２３結合ヘパリン−セファロースビーズは、アルギン酸カルシウム微小球にカプセル化され、ヘパリン安定化されたＦＧＦ−２３タンパク質の制御された放出を可能にし得る。例えば、微小球は、アルギン酸ナトリウムとＦＧＦ−２３結合ヘパリン−セファロースビーズとの混合溶液を、塩化カルシウムの硬化溶液中に滴下することによって構築され得る。球は、この混合物が硬化溶液に入れられたときに瞬時に形成される。微小球のサイズは、減少した断面積のシリンダーを介して（例えば、皮下注射針を介して）ＦＧＦ−２３結合ヘパリン−セファロースビーズを通過させることによって調整され得る。
【００８０】
カプセル化効率は、カプセル化された増殖因子の量を溶液中に最初に存在した量と比較することによって決定され得る。例えば、ＦＧＦ−２３は、３Ｍ  ＮａＣｌ溶液を用いてヘパリン−セファロースビーズから剥離され得、そして機能的活性のアッセイが実施され得る。
【００８１】
特定の用量は、患者のおおよその体重もしくは体表面積または占有される体の空間の容積に従って算出される。この用量はまた、選択される特定の投与経路に依存して算出される。処置のための適切な投薬量を決定するのに必要とされる計算のさらなる改善は、当業者によって寛容的になされ得る。このような計算は、標的細胞のアッセイ調製物において本明細書中に開示される活性の点から、当業者によって過度の実験を伴わずになわれ得る。正確な投薬量は、標準的な用量応答研究と組み合わせて決定される。実際に投与される組成物の量が、関連する状況の点（処置される状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重篤度、ならびに選択された投与経路を含む）から実施者によって決定されることが理解される。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、ＦＧＦ−２３は、ＦＧＦ−２３またはＦＧＦ−２３前駆体の生物学的な活性形態を産生し得るベクターまたは細胞（すなわち、体によってＦＧＦ−２３の生物学的に活性な形態に容易に変換され得る分子）を、患者に移植することによって治療的に投与され得る。１つのアプローチにおいて、ＦＧＦ−２３を分泌する細胞は、患者への移植のための半透性膜にカプセル化され得る。この細胞は、通常ＦＧＦ−２３またはその前駆体を発現する細胞、あるいはＦＧＦ−２３またはその前駆体を発現するために形質転換され得る細胞であり得る。患者がヒトである場合、ヒト起源の細胞であることおよびＦＧＦ−２３がヒトＦＧＦ−２３であることが好ましい。しかし、本明細書中の処方物および方法は、獣医適用ならびにヒト適用のために使用され得、そして用語「患者」は、本明細書中に使用される場合、ヒト患者および獣医患者を含むことが意図される。
【００８３】
細胞は、患者への移植または植え付けにおける使用のためにエキソビボで増殖され得る（Ｍｕｅｎｃｈら、Ｌｅｕｋ．＆  Ｌｙｍｐｈ．１６：１−１１（１９９４）（これは、参考として援用される））。本発明の別の実施形態において、ＦＧＦ−２３は、移植または植え付けのための細胞のエキソビボ拡大を促進するために使用される。現在の方法は、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、幹細胞因子、およびインターロイキンのような因子を含むバイオリアクター培養系を使用して、赤血球、単球、好中球、およびリンパ球のための造血前駆体細胞を拡大する（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １２：４６６−４７６（１９９４）（これは、参考として援用される））。これらの幹細胞は、ヒトドナーの骨髄から、ヒト末梢血から、または臍帯血細胞から単離され得る。拡大された血球は、特定の疾患状態の結果としてかまたは悪性腫瘍の処置のための高用量の化学療法の結果としてこれらの細胞を欠く患者を処置するために使用される（Ｇｅｏｒｇｅ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １２（補遺１）：２４９−２５５（１９９４）（これは、参考として援用される））。化学療法後の細胞移植の場合、自家組織の移植が、化学療法の前に骨髄細胞を取り除き、悪性腫瘍細部をパージするためにも機能する方法を用いてエキソビボで細胞を拡大し、そしてこの拡大された細胞を化学療法の後にこの患者に戻して移植することによって、実施され得る（総説に関しては、ＲｕｍｍｅｌおよびＶａｎ  Ｚａｎｔ、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：２１３−２１８（１９９４）（これは、参考として援用される）を参照のこと）。
【００８４】
多数の環境において、患者におけるＦＧＦ−２３のレベルを決定することが所望される。ＦＧＦ−２３の発現を示す本報告に沿って、ＦＧＦ−２３の同定は、ＦＧＦ−２３の存在が、細胞の増殖および生存に関連する正常な生理学的機能に役立つという結論の基礎を提供する。内因的に生成されたＦＧＦ−２３はまた、特定の疾患状態において役割を果たし得る。
【００８５】
ＦＧＦ−２３が、皮膚、脳、胸腺および胎盤において発現されるとすれば、ＦＧＦ−２３のレベルが、種々の状態において変化し得るようであり、そしてＦＧＦ−２３レベルの定量が臨床的に有用な情報を提供するようである。さらに、変性状態、変化した生理学的機能の処置において、または皮膚細胞、脳細胞、および胸腺細胞への損傷からの回復において、あるいは胎盤の状態が関与する妊娠の間に、ＦＧＦ−２３を含有する組成物が投与され得、そして血清または任意の所望の組織画分中で特定の標的レベルのＦＧＦ−２３を達成することが所望されるようである。それゆえ、患者におけるＦＧＦ−２３のレベルをモニタリングし得ることが有利である。従って、本発明はまた、患者からのサンプルにおけるＦＧＦ−２３の存在を検出するための方法を提供する。
【００８６】
患者においてＦＧＦ−２３の存在を検出する状況において本明細書中で使用される用語「検出」は、患者におけるＦＧＦ−２３の量のまたはＦＧＦ−２３の量を発現する能力を決定すること、ＦＧＦ−２３を他の増殖因子から区別すること、変性疾患の有望な結果および回復の見込みに関する予後を評価すること、この病的状態の状態の尺度としての一定の期間にわたるＦＧＦ−２３レベルをモニタリングすること、ならびに患者についての好ましい治療レジメを決定するためのＦＧＦ−２３レベルをモニタリングすることを含むことが意図される。
【００８７】
患者におけるＦＧＦ−２３の存在を検出するために、サンプルは、患者から入手される。サンプルは、組織生検サンプル、または血液、血漿、血清、ＣＳＦなどのサンプルであり得る。皮膚、脳、胸腺または胎盤におけるＦＧＦ−２３のレベルを評価する場合、好ましいサンプルは、これらの組織またはこれらの組織に流す静脈から採取したサンプルである。
【００８８】
いくつかの例では、ＦＧＦ−２３遺伝子が、患者において、または患者内の組織もしくは細胞株においてインタクトであるか否かを決定することが所望される。インタクトなＦＧＦ−２３遺伝子とは、遺伝子において変更（例えば、点変異、欠失、挿入、染色体切断、染色体再配列など）が存在しないことを意味し、ここで、このような変更は、ＦＧＦ−２３の生成を変更し得るかまたはその生物学的活性、安定性などを変更して、疾患プロセスもしくは細胞変性状態に対する感受性をもたらし得る。従って、本発明の１つの実施形態では、ＦＧＦ−２３遺伝子における任意の変化を検出および特徴付けする方法が提供される。この方法は、ＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらのフラグメントもしくはそれらの誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供することを含む。オリゴヌクレオチドの誘導体によって、誘導されたオリゴヌクレオチドが、誘導された配列が、ＦＧＦ−２３遺伝子にハイブリダイズするように誘導された配列に十分な配列相補性を有するという点で、誘導された配列と実質的に同じであることを意味する。誘導されたヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列から必ずしも物理的に誘導されず、例えば、化学的合成またはＤＮＡ複製または逆転写または転写を含む任意の様式で生成され得る。
【００８９】
代表的には、患者のゲノムＤＮＡは、患者からの細胞サンプルから単離され、そして１以上の制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴａｑＩおよびＡｌｕＩなど）で消化される。当該分野で周知であるサザンブロットプロトコルを用いて、このアッセイにより、患者または患者における特定の組織が、インタクトなＦＧＦ−２３遺伝子を有するか、またはＦＧＦ−２３遺伝子の異常を有するかを決定する。
【００９０】
ＦＧＦ−２３遺伝子に対するハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡを変性して、一本鎖ＤＮＡを得ること；この一本鎖ＤＮＡをＦＧＦ−２３遺伝子配列に関連した遺伝子プローブと接触させること；およびハイブリダイズしたＤＮＡプローブを同定して、ヒトＦＧＦ−２３遺伝子の少なくとも一部を含む染色体ＤＮＡを検出することを含む。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、標的領域中の配列とのプローブ配列の相補性に起因して、標的配列とハイブリッド構造物を形成するポリヌクレオチドから構成される構造をいう。プローブとして使用するために適切なオリゴマーは、標的化された配列に相補的な最少で約８〜１２の連続したヌクレオチド、好ましくは最少で約２０の連続したヌクレオチドを含み得る。
【００９２】
本発明のＦＧＦ−２３遺伝子プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドであり得、そして例えば、切り出し、転写または化学的合成のような当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。プローブは、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、または酵素マーカーのような、当該分野で公知の任意の検出可能な標識で標識され得る。プローブの標識化は、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得る。これらの方法としては、ＰＣＲ、ランダムプライミング、末端標識化、ニックトランスレーションなどが挙げられる。当業者はまた、標識プローブを用いない他の方法を使用してハイブリダイゼーションを決定し得ることを認識する。ハイブリダイゼーションを検出するために使用され得る方法の例としては、サザンブロッティング、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、およびＰＣＲ増幅を用いた一本鎖コンホメーション多型が挙げられる。
【００９３】
ハイブリダイゼーションは、代表的に、２５℃〜４５℃で行われ、より好ましくは３２℃〜４０℃で行われ、そしてより好ましくは、３７℃〜３８℃で行われる。ハイブリダイゼーションに必要な時間は、約０．２５〜約９６時間であり、より好ましくは、約１〜約７２時間であり、そして最も好ましくは約４〜約２４時間である。
【００９４】
ＦＧＦ−２３遺伝子の異常はまた、ＰＣＲ方法、およびＦＧＦ−２３遺伝子に隣接するかまたはその中に位置するプライマーを使用して検出され得る。ＰＣＲ方法は、当該分野で周知である。簡潔には、この方法は、標的配列に隣接する核酸配列にハイブリダイズし得る２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ、この標的配列は、ＦＧＦ−２３遺伝子内にあり、そして標的配列を増幅する。本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、約８〜約３０塩基の長さの範囲にあるＤＮＡまたはＲＮＡの短い鎖をいう。この目的のために有用なオリゴヌクレオチドプライマーの例は、配列番号５および配列番号６である。上流および下流のプライマーは、代表的には、長さが約２０〜約３０塩基対であり、そしてヌクレオチド配列の複製のための隣接領域にハイブリダイズする。重合化は、デオキシヌクレオチド三リン酸またはヌクレオチドアナログの存在下でＤＮＡポリメラーゼによって触媒され、二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。次いで、二本鎖は、物理学的、化学的または酵素的方法を含む任意の変性方法によって分離される。共通して、物理学的変性方法は、約１〜約１０分間の範囲の時間にわたり、核酸を代表的には、約８０℃〜１０５℃の温度に加熱することを含んで使用される。このプロセスは、所望のサイクル数にわたって繰り返される。
【００９５】
プライマーは、増幅されるＤＮＡ鎖に実質的に相補性であるように選択される。従って、プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、増幅される鎖と選択的にハイブリダイズするように十分に相補的でなければならない。
【００９６】
ＰＣＲ増幅後、次いで、ＦＧＦ−２３またはプレプロＦＧＦ−２３またはそれらのフラグメントを含むＤＮＡ配列を、直接配列決定し、そして本明細書中に開示された配列とこの配列を比較することによって分析し、活性または発現レベルなどを変更し得る改変を同定する。
【００９７】
別の実施形態において、ＦＧＦ−２３を検出する方法は、ＦＧＦ−２３遺伝子を発現する組織の分析に基づいて提供される。この方法は、ＦＧＦ−２３遺伝子を正常に発現する組織サンプルからのｍＲＮＡに、ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程を包含する。このサンプルは、ＦＧＦ−２３遺伝子または特定の細胞のＦＧＦ−２３遺伝子に異常性を有すると疑われる患者から得られる。
【００９８】
ＦＧＦ−２３タンパク質をコードするｍＲＮＡの存在を検出するために、サンプルを患者から得る。サンプルを血液または組織生検サンプルから獲得し得る。サンプルを処理して、そこに含まれる核酸を抽出し得る。サンプルから得られる核酸をゲル電気泳動または他のサイズ分離技術に供する。
【００９９】
サンプルのｍＲＮＡを、プローブとして供しているＤＮＡ配列と接触させて、ハイブリッド二重鎖を形成する。上記で議論したような標識プローブの使用は、得られた二重鎖の検出を可能にする。
【０１００】
ＦＧＦ−２３タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはこのｃＤＮＡの誘導体をプローブとして用いる場合、偽陽性（すなわち、実際は、無傷かつ機能するＦＧＦ−２３遺伝子が存在しない場合の、ＦＧＦ−２３ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションおよび見かけの検出）を防ぐために高ストリンジェンシー条件を使用し得る。ＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡ由来の配列を使用する場合、あまりストリンジェントでない条件が使用され得るが、これは偽陽性の可能性のためにあまり好ましいアプローチではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの間および洗浄手順の間の多くの因子によって決定され、これらの因子としては、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度が挙げられる。これらの因子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹにおいて概説される。
【０１０１】
ＦＧＦ−２３タンパク質をコードするｍＲＮＡのサンプル中での検出の感度を上げるために、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）の技術を使用して、ＦＧＦ−２３タンパク質をコードするｍＲＮＡから転写されたｃＤＮＡを増幅し得る。ＲＴ／ＰＣＲの方法は、当該分野で周知であり、そして以下のように行われ得る。総細胞ＲＮＡは、例えば、標準的なグアニジウムイソチオシアネート法によって単離され、そして総ＲＮＡは、逆転写される。逆転写法は、逆転写酵素および３’末端プライマーを使用する、ＲＮＡのテンプレート上でのＤＮＡの合成を包含する。代表的には、プライマーは、オリゴ（ｄＴ）配列を含む。次いで、このようにして生成されたｃＤＮＡは、ＰＣＲ法およびＦＧＦ−２３特異的プライマーを使用して増幅される。（Ｂｅｌｙａｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：２９１９−２９３２，１９８９；ＫｒｕｇおよびＢｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：３１６−３２５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、１９８７（これらは、本明細書中に参考として援用される））。
【０１０２】
ポリメラーゼ連鎖反応法は、増幅されるべきＤＮＡセグメントの２つの隣接領域に実質的に相補性である２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、上記のように行われる。
【０１０３】
増幅後、次いで、ＰＣＲ産物を電気泳動し、そしてエチジウムブロミド染色またはホスホイメージングによって検出する。
【０１０４】
本発明は、患者から得たサンプル中のＦＧＦ−２３タンパク質の存在を検出する方法をさらに提供する。タンパク質を検出するために当該分野で公知の任意の方法が使用され得る。このような方法としては、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学的方法、結合剤−リガンドアッセイ、免疫組織化学的技術、凝集および相補性アッセイが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１７−２６２、ＳｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編（Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９１を参照のこと（これは、参考として援用される））。抗体をＦＧＦ−２３タンパク質のエピトープと反応させる工程および標識したＦＧＦ−２３タンパク質またはその誘導体を競合的に置き換える工程を包含する結合剤−リガンドイムノアッセイ法が好ましい。好ましい抗体は、実施例３に従って調製される。
【０１０５】
本明細書中で使用されるＦＧＦ−２３タンパク質の誘導体は、特定のアミノ酸が欠失されているか、あるいは修飾アミノ酸もしくは通常でないアミノ酸と置換されているかまたは変更しているポリペプチドを含むことが意図される。ここでＦＧＦ−２３誘導体は、ＦＧＦ−２３と生物学的に等価であり、そしてこのポリペプチド誘導体は、ＦＧＦ−２３タンパク質に対して惹起された抗体と交差反応する。交差反応とは、抗体が、その形成を誘導した抗原以外の抗原と反応することを意味する。
【０１０６】
多くの競合および非競合タンパク質結合イムノアッセイが当該分野で周知である。このようなアッセイで使用される抗体は、例えば、凝集試験で使用されるように非標識であってもよいし、広範な種々のアッセイ方法における使用のために標識されていてもよい。使用され得る標識としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光イムノアッセイなどに使用するための放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、酵素基質もしくは補因子、酵素インヒビター、粒子、色素などが挙げられる。
【０１０７】
ＦＧＦ−２３タンパク質またはそのエピトープに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の多くの方法によってイムノアッセイに使用するために作製され得る。エピトープによって、ポリペプチドの抗原決定基が参照される。エピトープは、そのエピトープに特有の空間的コンホメーションにおいて３つのアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的なコンホメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、そしてこれらの方法としては、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。
【０１０８】
タンパク質に対する抗体を調製する１つのアプローチは、このタンパク質の全てまたは一部のアミノ酸配列の選択および調製、この配列の化学合成、および適切な動物（通常は、ウサギまたはマウス）へのその配列の注射である（実施例４を参照のこと）。
【０１０９】
オリゴペプチドは、親水性領域に存在し、従って、おそらく成熟タンパク質において露出しているオリゴペプチドに基づいて、ＦＧＦ−２３タンパク質に対する抗体の生成のための候補物として選択され得る。好ましいオリゴペプチドは、ＲＲＨＴＲＳＡＥＤＤＳＥＲＤ（配列番号４の残基１７５〜１８９）およびＹＨＬＱＩＨＫＮＧＨＶＤＧＡＰＨＱ（配列番号４の残基５１〜６７）である。さらなるオリゴペプチドは、例えば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ
Ｗｅｌｌｉｎｇ，Ｇ．Ｗら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８８：２１５−２１８，１９８５（本明細書中に参考として援用される）を使用して決定され得る。
【０１１０】
他の抗体は、本明細書中に開示されているＦＧＦ−２３の分解産物（例えば、ＦＧＦ−２３の約２０ｋＤａのフラグメントおよび約７〜１２ｋＤａのフラグメント）に対して惹起され得る。
【０１１１】
ＦＧＦ−２３に対する抗体はまた、この抗体が他のファミリーメンバーと交差反応し得るように、本明細書中で同定される、１つ以上の保存された領域を含むオリゴペプチドに対して惹起され得る。このような抗体を使用して、他のファミリーメンバーを同定および単離し得る。
【０１１２】
ＦＧＦ−２３タンパク質またはそのエピトープの調製のための方法は、化学合成、組換えＤＮＡ技術、または生物学的サンプルからの単離を含むが、これらに限定されない。ペプチドの化学合成は、例えば、固相ペプチド合成の古典的なＭｅｒｒｉｆｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、１９６３、これは、参考として援用される）またはＲａｐｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステム（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）（ＣａｐｒｉｎｏおよびＨａｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７：３４０４，１９７２、これは、本明細書中に参考として援用される）でのＦＭＯＣストラテジーによって行われ得る。
【０１１３】
ポリクローナル抗体は、抗原を注射した後に、適切な間隔で引き続き追加免疫することによって、ウサギまたは他の動物を免疫して調製され得る。この動物は、採血され、そして血清は、通常は、ＥＬＩＳＡによって精製したＦＧＦ−２３タンパク質に対して、または肝臓もしくは他の細胞へのＦＧＦ−２３の作用をブロックする能力に基づくバイオアッセイによってアッセイされる。トリ種（例えば、ニワトリ、シチメンチョウなど）を用いる場合、抗体はその卵の卵黄から単離され得る。モノクローナル抗体は、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞のような連続的に複製する腫瘍細胞で免疫したマウスからの脾細胞を融合することによるＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒの方法にならって調製され得る。（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５；ＧｕｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７３：１−４６、ＬａｎｇｏｎｅおよびＢａｎａｔｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８１、これらは、参考として援用される）。次いで、このように形成されたハイブリドーマ細胞は、限界希釈法によりクローニングされ、そして上清をＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、もしくはバイオアッセイによって抗体生成についてアッセイする。
【０１１４】
抗体が標的タンパク質を認識し、かつ特異的に結合する特有の能力は、タンパク質の過剰発現を処置するためのアプローチを提供する。従って、本発明の別の局面は、ＦＧＦ−２３タンパク質の過剰発現を含む疾患を、ＦＧＦ−２３タンパク質に対する特異的な抗体で患者を処置することによって、予防または処置する方法を提供する。
【０１１５】
ＦＧＦ−２３タンパク質に対する特異的な抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか）は、上記で議論されたように、当該分野で公知の任意の適切な方法によって生成され得る。例えば、マウスまたはヒトのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって生成され得るか、あるいはＦＧＦ−２３タンパク質、もしくはその免疫学的に活性なフラグメント、または抗イディオタイプ抗体、もしくはそのフラグメントが動物に投与されて、ＦＧＦ−２３タンパク質を認識し、かつ結合し得る抗体の生成を誘起し得る。このような抗体は、以下に挙げられるがこれらに限定されない任意の抗体クラスおよび任意の抗体サブクラスに由来し得る：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、またはトリ種の場合にはＩｇＹ。
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチドおよび対応する全長遺伝子によってコードされるポリペプチドを使用して、ペプチドライブラリー、タンパク質ライブラリー、低分子ライブラリー、およびファージディスプレイライブラリーをスクリーニングし得、そしてこのポリペプチドおよび他の公知の方法を使用して、アナログもしくはアンタゴニストを同定し得る。
【０１１７】
ネイティブなＦＧＦポリペプチドは、癌において役割を果たし得る。例えば、ＦＧＦファミリーメンバーは、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の顕著な形態学的形質転換を誘導し得、そしてヌードマウスにおいて強力な腫瘍形成性を示す。脈管形成性活性が、ＦＧＦファミリーメンバーによって示された。従って、ＦＧＦのインヒビターを使用して、癌（例えば、前立腺癌）を処置し得る。
【０１１８】
ペプチドのライブラリーは、米国特許第５，０１０，１７５号およびＰＣＴ番号ＷＯ９１／１７８２３において開示される方法に従って、合成され得る。以下に簡潔に記載されるように、ペプチドの混合物を調製して、次いで、これをスクリーニングして、所望のシグナル伝達およびレセプター結合活性を示すペプチドを同定する。’１７５特許の方法に従って、適切なペプチド合成支持体（例えば、樹脂）は、適切に保護されて活性化されたアミノ酸の混合物にカップリングされる。反応混合物中の各アミノ酸の濃度は平衡化されるか、または産物が、開始樹脂にカップリングしたアミノ酸の等モル混合物であるように、そのカップリング反応速度に対して逆比例で調整される。次いで、結合したアミノ酸は脱保護され、そして別の平衡化されたアミノ酸混合物と反応して、全ての可能なジペプチドの等モル混合物を形成する。このプロセスは、所望の長さ（例えば、ヘキサマー）のペプチド混合物が形成されるまで、繰り返される。各工程で全てのアミノ酸を含む必要はないことに注意のこと：いくつかの工程でわずか１または２アミノ酸を含み得る（例えば、特定のアミノ酸が所定の位置で必須であることが公知の場合）ために、混合物の複雑性を低減し得る。ペプチドライブラリー合成が完了した後に、ペプチドの混合物は、選択したポリペプチドに対する結合についてスクリーニングされる。次いで、このペプチドは、活性を阻害または増強する能力について試験される。次いで、所望の活性を示すペプチドが単離され、そして配列決定される。
【０１１９】
ＰＣＴ番号ＷＯ９１／１７８２３に記載される方法は、類似している。しかし、合成樹脂と活性化されたアミノ酸の混合物とを反応させる代わりに、樹脂を２０等分に（または、その工程で添加される異なるアミノ酸の数に対応する多くの部分に）分けて、そして各アミノ酸を樹脂のその部分に個々にカップリングさせる。次いで、この樹脂部分を合わせ、混合し、そして再び第２のアミノ酸との反応のために多くの等分に分ける。この様式で、各反応を容易に完了させ得る。さらに、各工程で全ての樹脂を合わせるのではなく、並行して部分を処理することによって、別個の「サブプール」を維持し得る。これは、どのペプチドが任意の観察されたレセプター結合活性またはシグナル伝達活性を担うかを決定するプロセスを簡単にする。
【０１２０】
このような場合において、例えば、各々１〜２，０００の候補物を含むサブプールを、本発明の１つ以上のポリペプチドに曝す。次いで、陽性結果を生じる各サブプールは、例えば、２０〜１００の候補物を含む、より小さなサブプール（サブ−サブプール）の群として再合成され、そして再アッセイされる。陽性サブ−サブプールは、個々の化合物として再合成され得、そして最終的にはアッセイされて、高結合定数を示すペプチドを決定し得る。これらのペプチドは、ネイティブな活性を阻害または増強する能力について試験され得る。ＰＣＴ番号ＷＯ９１／７８２３および米国特許第５，１９４，３９２号（本明細書中に参考として援用される）に記載される方法は、全ての合成および再合成が数日で行われ得るような、並行した自動化された技術によるこのようなプールおよびサブプールの調製を可能にする。
【０１２１】
ペプチドアゴニストまたはアンタゴニストを、任意の利用可能な方法（例えば、シグナル伝達、抗体結合、レセプター結合、マイトジェンアッセイ）を使用してスクリーニングする。アッセイ条件は、理想的には、ネイティブな活性がインビボで示される条件（すなわち、生理的ｐＨ、温度、およびイオン強度の下で）に似ているべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体で毒性の副作用を引き起こさない濃度でネイティブな活性の強力な阻害または増強を示す。ネイティブなポリペプチドへの結合について競合するアゴニストまたはアンタゴニストは、ネイティブな濃度以上の濃度を必要とし得るが、一方で、ポリペプチドに不可逆的に結合し得るインヒビターは、ネイティブな濃度の桁における濃度で添加され得る。
【０１２２】
ｈＦＧＦ−２３およびｍＦＧＦ−２３のアベイラビリティは、高スループットスクリーニング法（ＨＩＳ）の慣用的な適用により、そのレセプターへのＦＧＦ−２３の結合を阻害する小分子および低分子量化合物の同定を可能にする。ＨＴＳ法とは一般に、治療的潜在性についてのリード化合物の迅速なアッセイを可能にする技術をいう。ＨＴＳ技術は、試験材料のロボット操作、ポジティブなシグナルの検出、およびデータの解読を用いる。リード化合物は、放射能の取込みによって同定され得るか、または読み出しとして吸光度、蛍光または発光に頼る光学アッセイによって同定され得る。Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６２４−６３１。ＦＧＦ分子とＦＧＦレセプターとの間の相互作用を検出するためのアッセイは、例えば、Ｂｌｕｎｔ，Ａ．Ｇ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３７３３−３７８８に記載され、そしてこのようなアッセイは、候補分子がＦＧＦ−２３とそのレセプターとの間の相互作用を阻害し得るか否かを決定するために適応され得る。
【０１２３】
例えば、レセプター結合についてＦＧＦ−２３と競合することによって、ＦＧＦ−２３とそのレセプターとの相互作用を阻害する化合物についての高スループットスクリーニングにおける使用のために適応され得るモデル系が、利用可能である。Ｓａｒｕｂｂｉら、（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：７０−７５は、ＩＬ−１レセプターの活性部位への結合について天然のリガンドと競合する分子を同定するための無細胞非同位体アッセイを記載する。Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｃ．ら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：２０−３１は、一般的な粒子ベースの非放射性方法を記載し、ここで標識リガンドは、粒子上に固定されたそのレセプターに結合し；この粒子上の標識は、レセプター結合について標識リガンドと競合する分子の存在を減少させる。
【０１２４】
本発明の治療的ＦＧＦ−２３ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルにおいて利用され得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る（一般的には、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４（１９９４）；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８４５−８５２（１９９４）；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１８５−１９３（１９９５）；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８−１５３（１９９４）を参照のこと）。本発明の治療薬のコード配列を含む構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所的にまたは全身的にのいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのアプローチを利用し得る。そのようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物のプロモーターまたは異種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るか、または調節され得るかのいずれかである。
【０１２５】
本発明は、目的の選択された核酸分子を保有または発現するために構築される組換えレトロウイルスを利用し得る。利用され得るレトロウイルスベクターは、以下に記載されているものを含む：ＥＰ  ０  ４１５  ７３１；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４（１９９３）；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７（１９９３）；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８（１９９３）；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３（１９９２）；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５（１９９３）；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；およびＥＰ０  ３４５  ２４２。好ましい組換えレトロウイルスは、ＷＯ  ９１／０２８０５に記載されるものを含む。
【０１２６】
前述のレトロウイルスベクター構築物との使用に適したパッケージング細胞株は、容易に調製され得（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９５／３０７６３およびＷＯ
９２／０５２６６を参照のこと）、そして組換えベクター粒子を生成するためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株とも呼ばれる）の作製のために用いられ得る。本発明の特に好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、ヒト（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作られ、それによって、ヒト血清中での不活化を生き延び得る、組換えレトロウイルスの産生を可能にする。
【０１２７】
本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルとして機能し得る、アルファウイルスを基礎としたベクターも用いる。そのようなベクターは、例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ
ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）を含む広範な種々のアルファウイルスから構築され得る。そのようなベクター系の代表的な例としては、米国特許第５，０９１，３０９号、同第５，２１７，８７９号および同第５，１８５，４４０号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／１０５７８；ＷＯ  ９４／２１７９２；ＷＯ  ９５／２７０６９；ＷＯ  ９５／２７０４４；およびＷＯ  ９５／０７９９４に記載されるものが挙げられる。
【０１２８】
本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのようなパルボウイルスを利用し得る。代表的な例は、ＷＯ  ９３／０９２３９においてＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５（１９８８）；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：１０６１３−１０６１７（１９９３）により開示されたＡＡＶベクターを含む。
【０１２９】
アデノウイルスベクターの代表的な例としては、以下に記載されたものが挙げられる：Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；ＷＯ  ９３／１９１９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．：２１５−２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：１１４９８−１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８−２８４８（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．４：４０３−４０９（１９９３）；Ｃａｉｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１２８７−１２９１（１９９３）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０−１３４（１９９３）；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３７２−３７８（１９９２）；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ  １０１：１９５−２０２（１９９２）。本発明に利用可能な例示的なアデノウイルス遺伝子治療ベクターとしては、以下に記載されたものもまた挙げられる：ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）に記載されるように殺したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が、利用され得る。
【０１３０】
他の遺伝子送達ビヒクルおよび方法が、利用され得る。これには、以下を含む：殺した単独のアデノウイルスに連結した、または連結していないポリカチオン性の濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２））；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）を参照のこと）；真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、１９９４年５月９日に出願された米国特許出願第０８／２４０，０３０号および米国特許第６，０１５，６８６号を参照のこと）；光重合化ヒドロゲル材料の沈着；米国特許第５，１４９，６５５号に記載された携帯型遺伝子移入粒子銃；米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載のような電離放射線；核荷電中性化または細胞膜との融合。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：２４１１−２４１８（１９９４）、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１５８１−１５８５（１９９４）に記載される。
【０１３１】
裸のＤＮＡもまた、利用し得る。裸のＤＮＡの例示的な導入方法が、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率が、生物分解性ラテックスビーズの使用により改良され得る。ＤＮＡでコーティングされたラテックスビーズは、このビーズによるエンドサイトーシスの開始後、細胞内へ効率的に輸送される。本方法は、疎水性を増すためのビーズの処理により、さらに改良され得、そしてそれにより、エンドソームの破壊を容易にし得、そして細胞質内へのＤＮＡの放出を容易にし得る。遺伝子送達ビヒクルとして働き得るリポソームが、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ０  ５２４  ９６８に記載される。
【０１３２】
使用に適したさらなる非ウイルス送達は、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２４）：１１５８１−１１５８５（１９９４）に記載されるアプローチのような機械的送達系を含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合したヒドロゲル物質の沈殿を通じて送達され得る。コード配列の送達に用いられ得る遺伝子送達の従来の他の方法は、以下を含む：例えば、米国特許第５，１４９，６５５号に記載される携帯型遺伝子移入粒子銃の使用；米国特許第５，２０６，１５２号およびＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９２／１１０３３に記載される、移入された遺伝子の活性化のための電離放射線の使用。
【０１３３】
ＦＧＦは、機能の損失、不適切な機能／数、機能または生存が延長／レスキューされ得る細胞、組織または器官の異常な機能または死、およびＦＧＦを用いた治療によって逆転または予防され得る異常によって特徴付けられる疾患に関係づけられている。
【０１３４】
肺、気管支または肺胞の細胞または機能の損失、肺または気管支の損傷の治癒、肺不全、肺気腫／慢性閉塞性肺疾患、喘息、感染性疾患または自己免疫疾患の後遺症、肺動脈または静脈の高血圧の後遺症、肺線維症、未熟児の肺疾患、および嚢胞性線維症、ＦＧＦでの処置が容易な状態である。
【０１３５】
虚血性血管疾患は、ＦＧＦ−２３で処置することが容易であり得、ここでこの疾患は、器官への不適切な血流によって特徴付けられる。処置は、治療的新脈管形成を誘導し得るか、または細胞の機能／生存を保存し得る（心筋虚血／心筋梗塞、末梢血管疾患、腎動脈疾患、発作）。心筋細胞または心臓の支持細胞の機能の損失またはその死によって特徴付けられる心筋症（うっ血性心不全、心筋炎、心不全、不整脈、弁障害、肥大、先天性欠損、心動脈または冠状動脈の傷害、創傷、炎症および外科的外傷）はまた、ＦＧＦ−２３を用いて処置され得、骨格筋細胞、骨細胞または支持細胞の機能の損失、その不適切な機能またはその死によって特徴付けられる筋骨格疾患も同様に処置され得る。例としては、骨格ミオパシー、骨疾患および関節炎が挙げられる。
【０１３６】
ＦＧＦ−２３ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＦＧＦ−２３分子またはその機能の損失に起因する先天性欠損の矯正を補助し得る（肝臓、心臓、肺、脳、四肢、腎臓など）。
【０１３７】
創傷治癒（外傷、疾患、医学的または外科的処置（これらの処置によって枯渇した細胞集団および組織の再生を含む）のいずれかに起因する）の処置は、ＦＧＦ−２３ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのさらに別の使用である。例としては、肝臓再生、手術の創傷治癒、損傷した血管の再内皮形成（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）、外傷創傷の治癒、血管疾患、代謝性疾患などに起因する潰瘍の治癒骨折、炎症性疾患に起因する細胞の損失などが挙げられる。
【０１３８】
ＦＧＦ−２３はまた、この分子の過剰活性を含む癌の処置のための薬物を同定するか、または新たな薬物の同定において有用である新たな標的を同定するスクリーニングにおいて使用され得る。
【０１３９】
全ての前述の実施形態について、臨床科は、特定の状態に基づいて、ＦＧＦ−２３ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ＦＧＦ−２３に対する抗体、またはペプチドアナログまたはアンタゴニストのような低分子が、処置の最も適した形態であるか否かを決定する。これらの形態は、全て本発明の範囲内である。
【０１４０】
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例において記載される。本明細書中に記載される特許請求の範囲の範囲内の他の実施形態は、本明細書中に開示されるように明細書の考慮または本発明の実施から当業者に明らかである。実施例と共に、本明細書は、例示のみとして考慮され、本発明の範囲および精神が実施例に続く特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【０１４１】
（実施例）
（実施例１）
（マウスＦＧＦ−２３の単離および分析）
ＤＮＡを、以下のプライマーを使用して、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してアダプター連結媒介性ＰＣＲによるマウス皮膚ｃＤＮＡから増幅した：５’ｃｔｇａｔｇａｔｔａｃａｔｃａｇａｇｇａｃ３’（マウスＦＧＦ−２３のセンスプライマー、配列番号７）；５’ｃａｃｃａｇｇｔａｇｔｇａｔｇｃｔｔｃｔ３’（マウスＦＧＦ−２３のアンチセンスプライマー、配列番号８）；５’ａｔｃｃａｔａｃａａａｇｇａａｃｃｔｔｃｇ３’（マウスＦＧＦ−２３のアンチセンスプライマー、配列番号９）；５’ｃｃａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃ３’（アダプタープライマー、配列番号１０）；および５’ａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｃｇａｇｃｇｇｃ３’（アダプタープライマー、配列番号１１）。ＦＧＦのコード領域全体を含むｃＤＮＡを、プライマー５’ａｃｔｃａｇｔｇｃｔｇｔｇｃａａｔｇｃｔ３’（マウスＦＧＦ−２３のセンスプライマー）および５’ｇａｃｃｔａｇａｃｇａａｃｃｔｇｇｇａａ３’（マウスＦＧＦ−２３のアンチセンスプライマー）を使用するＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＥＭ−Ｔ  ＤＮＡベクターにクローニングした。ヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そして、アミノ酸配列を配列番号２に示す。タンパク質は、アミノ酸１位〜２４位にシグナル配列を含む２５１アミノ酸を有する。
【０１４２】
（実施例２）
（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞における組換えマウスＦＧＦ−２３の産生）
コード領域の３’末端にＥタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）およびＨｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ）をコードするＤＮＡフラグメント（７５ｂｐ）を有するマウスＦＧＦ−２３ｃＤＮＡを、移入ベクターＤＮＡ（ｐＢａｃＰＡＫ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））中で構築した。タグ配列を有するＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスを、組換えｐＢａｃＰＡＫ９およびＢｓｕ３６Ｉ消化発現ベクター（ＢａｃＰＡＫ６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））での、Ｓｆ９細胞の同時トランスフェクションによって得た。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞を、得られた組換えバキュロウイルスで感染し、そしてＥＸ−ＣＥＬＬ  ４００  完全培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２７℃で７２時間インキュベートした。
【０１４３】
発現の間、ＦＧＦ−２３は、図１４に概略的に示されるように、切断を受け、約２０ｋＤａのフラグメントおよび約７〜１２ｋＤａのフラグメントを生じ得る。フラグメントのサイズは、残基１７６位および１７９位（その両方がアルギニンである）の近くのプロセシングの間のタンパク質切断と一致している。
【０１４４】
１７９位と１８０位との間の切断を、図１６によって示されるように、ＳＦ９細胞から精製されるバキュロウイルス発現タンパク質を分析することによって確認した。細胞培地は、ｈＦＧＦ−２３のいくつかのフラグメントを含んだ。２つのフラグメントは、シグナルペプチドがＮ末端から除去される全長に近い形態を示し、これは、分泌された分子と一致している。このシグナルペプチドは、Ｐ２６とＮ２７との間の切断によって除去される。代替的なシグナルペプチド切断部位は、Ｇ３３とＳ３４との間に存在し、わずかにより小さい分子を生じる。これらの改変体の両方について、切断は、Ｒ１７９切断部位で発生し得る。培地はまた、５１８０−Ｈ２５６からなるＣ末端フラグメントを含んだ。３つの切断産物を、以下の表１に示し、そしてこれらは、図１６の１７４１４、１６７６１、および８２０４の分子量バンドに相関する。
【０１４５】
【表１】
2003531583.tif 000001
（実施例３）
（ウエスタンブロッティング分析による組換えＦＧＦ−２３の検出）
組換えバキュロウイルスに感染したＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞の培養培地および細胞溶解物を、還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。この膜を、抗Ｅタグ抗体（１：５００）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。Ｅタグを有するタンパク質を、記載されるように可視化した（Ｈｏｓｈｉｋａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４４：１８７−１９１（１９９８））。結果を図１１に示す。
【０１４６】
（実施例４）
（ヒトＦＧＦ−２３の単離および分析）
ヒトＦＧＦ−２３遺伝子を染色体１２ｐ１３に位置付けした。配列番号４（図３）において示されるように、タンパク質は、２５１アミノ酸を含み、そして配列番号３のポリヌクレオチド配列によってコードされる。ヒトＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡコード領域の増幅のためのプライマーは、以下のようである：センスプライマー：５’ａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｔｃａｇａｇｃａ３’（配列番号５）；アンチセンスプライマー：５’ｃｔｔｃｃａｇｃｇａｃｃｃｔａｇａｔｇａ３’（配列番号６）。タンパク質は、アミノのおよそ１位〜２４位に位置するシグナルペプチドを有する。
【０１４７】
（実施例５）
（リアルタイム定量的ＰＣＲによるマウス組織におけるＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡ発現の定量的分析）
マウス組織ｃＤＮＡを、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、ランダムヘキサデオキシヌクレオチドプライマーおよび鋳型としてのマウス組織ＲＮＡ（５μｇ，ＯｒｉＧｅｎｅ）を含む反応混合液（２０μｌ）中で合成した。マウスＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡを、マウスＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡに特異的な正方向プライマー、逆方向プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを用いて、Ｍｏｄｅｌ
７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）中でｃＤＮＡから増幅した。マウスβアクチンｃＤＮＡをまた、マウスβアクチンに特異的な正方向プライマー、逆方向プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを用いて増幅した。Ｔｏｋｕｎａｇａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：２８２９（１９９４）。ＦＧＦ−２３およびβアクチンｃＤＮＡのコピー数を、製造業者の説明書に従って決定した。結果を図１２に示す。試験された組織（脳、胸腺、小腸、心臓、肺、肝臓、腎臓、筋肉、皮膚、脾臓、胃、および精巣）のうちで、ＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡは、脳および胸腺において主に発現されることが見出された。結果を表２に要約する。
【０１４８】
【表２】
2003531583.tif 000002
（実施例６）
（インサイチュハイブリダイゼーション）
成体マウスの脳および胸腺を、粉末状ドライアイス中で凍結させ、切片をクリオスタットを用いて１６μｍで切断し、ポリ−Ｌ−リジン−コーティングスライドに解凍載置（ｔｈａｗ−ｍｏｕｎｔｅｄ）し、ハイブリダイゼーションまで−８５℃で保存した。３５Ｓ標識したマウスＦＧＦ−２３アンチセンスまたはセンスプローブを、ウリジン５’−α−［３５Ｓ］チオ三リン酸（約３０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、それぞれＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を使用して転写した。切片を、記載されるように標識されたプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによって試験した。（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５９１８−１５９２１（１９９６））。図１３に示されるように、標識を、腹外側の視床核において検出した（図１３、矢印）。
【０１４９】
（実施例７）
（ＦＧＦ−２３ペプチドでのウサギの免疫によるＦＧＦ−２３に対する抗血清の調製）
ヒトＦＧＦ−２３タンパク質の選択された近接するアミノ酸に対応するペプチド配列を合成し、そして記載されるようにキーホールペットリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合させた（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８８．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。ＫＬＨ結合ペプチドを使用して、ウサギを免疫する。抗血清を、ＦＧＦ−２３に対する特異性、および他のＦＧＦタンパク質との交差反応性について試験した。
【０１５０】
例示的なペプチド配列は以下のようである：
ＲＲＨＴＲＳＡＥＤＤＳＥＲＤ（配列番号４の残基１７５〜１８９）およびＹＨＬＱＩＨＫＮＧＨＶＤＧＡＰＨＱ（配列番号４の残基５１〜６７）。
【０１５１】
（実施例８）
（ＯＫ細胞におけるリン酸取り込みアッセイ）
オポサム腎細胞によるリン酸取り込みに対するＦＧＦ−２３およびその変異体またはフラグメントの効果を、本実施例によって記載されるようにアッセイする。以下の試薬を使用する：
ＦＧＦ−２３
ＦＧＦ−２（ＰＢＳ中１ｎＭに希釈した）
ＰＢＳ中ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン、Ｓｉｇｍａ、番号Ｐ３７９６）ストック１００μｇ／ｍｌ。実験のためにＰＢＳ中１μｇ／ｍｌストックに希釈した。
【０１５２】
［３２Ｐ］正リン酸、ＮＥＮ番号ＮＥＸ０５３  １ｍＣｉ／１ｍｌ水。実験のためのＰＢＳ中１：１０に希釈する。
【０１５３】
トランスフェリン
インシュリン
取り込み溶液：    １３７ｍＭ  ＮａＣｌ
５．４ｍＭ  ＫＣｌ
１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２
１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４
１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４
洗浄溶液（４℃）：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ
１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４
抽出溶液：          ０．５Ｍ  ＮａＯＨ
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
中和溶液：          ０．５Ｍ  ＨＣｌ
この方法を以下のように実行する：
細胞を、ＤＭＥＭ、３０μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインシュリン、５％ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐに維持する。このアッセイを行なうために、２４ウェルプレートを、６０，０００細胞／ウェルで播種し、そして６〜８日にわたってコンフルエントまで増殖させ、３〜４日毎に培地を交換する。アッセイの前の日、培地を、洗浄し、１ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ、トランスフェリン、インシュリン、および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡに交換した。
【０１５４】
アッセイの日、以下の工程を実施する：
（１）細胞を処理する：以下に列挙されるように、ビヒクル、ＦＧＦ−２３、ＦＧＦ−２またはＰＴＨを添加する。３７℃で３時間インキュベートする。
【０１５５】
（２）細胞を洗浄する：予め３７℃まで温めた１〜２ｍｌの取り込み溶液で３回；１ウェル当り１ｍｌの新鮮な取り込み溶液を添加する；インキュベーター中に１０分配置する。
【０１５６】
（３）標識細胞：１ウェル当り２０μｌ（希釈ストック溶液＝２μＣｉ）の［３２Ｐ］正リン酸を添加し、回旋によって十分に混合し、タイマーを開始する。インキュベーターに戻す。
【０１５７】
（４）取り込みを終了する：１５分で、氷上に静置することによって取り込みを終了し、放射性培地を吸引し、１ｍｌ氷冷洗浄溶液で４回洗浄する。吸引する。１ウェル当り２５０μＬの抽出溶液を添加する。
【０１５８】
（５）カウントを抽出する：５〜１０分抽出物をインキュベートした後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心チューブに移す。ウェルを、さらに２５０μＬの抽出溶液で洗浄する。５００μＬの中和溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心チューブに添加することによって中和する。混合するためにボルテックスする。
【０１５９】
（６）計数する：５ｍｌシンチレーション液体（３２Ｐチャネル）中１ウェル当り１００μＬのアリコートを複製する。
【０１６０】
処理は、以下のようであり、各処置を４連で行なう。
【０１６１】
セット１：１００μＬ／ウェルのビヒクル（ＰＢＳ）／ウェル。
【０１６２】
セット２：１００μＬ／ウェルのＰＴＨ（１μ／ｍｌストック；１００ｎｇ／ｍｌ最終）。
【０１６３】
セット３：１００μＬ／ウェルのＦＧＦ−２（ＰＢＳ中１ｎＭストック；１００ｐＭ最終）
セット４：１００μＬ／ウェルのＦＧＦ−２３（このＦＧＦ−２３は、全長、切断産物、および／または切断可能でないＦＧＦ−２３変異体）
セット５：バキュロウイルスコントロールスーパー６×ＨｉｓカラムＦｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ、１００μＬ／ウェル。
【０１６４】
セット６：ＦＧＦ−２３バキュロ６×ＨｉｓカラムＦｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ、１００μＬ／ウェル［ＦＧＦ−２３から切断された］。
【０１６５】
ＰＴＨは、これらの細胞においてリン酸取り込みを阻害する（ポジティブコントロール）。
【０１６６】
ＦＧＦ−２は、リン酸取り込みに対して影響を有さない（ネガティブコントロール）。
【０１６７】
ＦＧＦ−２３（その切断産物および切断可能でないＦＧＦ−２３変異体を含む）で処理された細胞によるリン酸取り込みを、ＦＧＦ−２３の生物学的活性を決定するために、ＰＴＨおよびＦＧＦ−２で処理した細胞と比較する。
【０１６８】
全ての特許、公開された特許出願および本明細書中に引用される刊行物は、本明細書中に十分に示されるように、参考として援用される。
【０１６９】
特定の好ましい実施形態が、本明細書中に記載されているが、このような実施形態は、上記の特許請求の範囲に示される場合を除き、本発明の範囲を限定するとして解釈されることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＦＧＦ遺伝子ファミリーの他のメンバーとＦＧＦ−２３の関係を示す。
【図２】
図２は、マウスＦＧＦ−２３のＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】
図３は、ヒトＦＧＦ−２３のＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図４】
図４は、ヒトＦＧＦ−２３（配列番号４）およびマウスＦＧＦ−２３（配列番号２）のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図５】
図５は、ヒトＦＧＦ−２３およびヒトＦＧＦ−１９のアミノ酸配列の比較を示す。アスタリスクは、配列の同一のアミノ酸残基を示す。
【図６】
図６は、ヒトＦＧＦ−２３およびヒトＦＧＦ−２１のアミノ酸配列の比較を示す。
【図７】
図７は、酵母についてのコドン使用を提供する。表の各列に関する第１の欄の情報は、アミノ酸についての三文字コードを含む。第２の欄は、そのアミノ酸についての明白なコドンを含む。第３の欄は、この表が編集された遺伝子中のコドンの出現数を列挙する。第４の欄は、そのコドン使用が、コドン頻度表において編集されたものと同一である遺伝子における１，０００コドンあたりのそのコドンの推定出現数を列挙する。最後の欄は、その同義のコドンファミリーにおけるコドンの出現の割合を含む。
【図８】
図８は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａについてのコドンの使用を提供する。
【図９】
図９は、Ｅ．ｃｏｌｉについてのコドンの使用を提供する。
【図１０】
図１０は、ヒトＦＧＦファミリーの遺伝子の染色体局在を提供する。
【図１１】
図１１は、細胞培養物由来の組換えマウスＦＧＦ−２３およびＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスに感染したＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞の細胞溶解物の検出を示す。組換えバキュロウイルス感染Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞の細胞培地および細胞溶解物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）電気泳動によって分離した。組換えマウスＦＧＦ−２３を、抗Ｅタグ抗体を用いるウェスタンブロッティング分析によって検出した。Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、分子質量標準タンパク質として使用した。
【図１２】
図１２は、マウス成体組織におけるＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡの発現を示す。ＦＧＦ−２３  ｃＤＮＡを、リアルタイム定量的ＰＣＲによってマウス成体組織ｃＤＮＡから増幅した。ＦＧＦ−２３のコピー数をそれぞれのマウス組織におけるβ−アクチンｃＤＮＡのコピー数に対して規準化した。
【図１３】
図１３は、マウス脳におけるＦＧＦ−２３  ｍＲＮＡの局在を示す。脳の逐次冠状切片を、３５Ｓ−標識マウスＦＧＦ−２３アンチセンス（Ａ）またはセンスプローブ（Ｂ）とハイブリダイズし、そしてＸ線フィルムに曝露した。矢印は、腹側外側視床核を示す。
【図１４】
図１４は、２０ｋＤａおよび７〜１２ｋＤａのフラグメントを示す、ＦＧＦ−２３の概略図である。
【図１５】
図１５は、ＦＧＦ−２３の推定切断部位を示す、ＦＧＦファミリーのメンバーのアライメントを提供する。
【図１６】
図１６は、ＦＧＦ−２３切断産物の分子量を示すＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲルである。
【０１７０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Chiron Corporation
Kyoto University
<120> HUMAN FGF-23 GENE AND GENE EXPRESSION
PRODUCTS
<130> F102K96K34
<140> JP P2001-565759
<141> 2001-03-07
<150> 60/187,854
<151> 2000-03-08
<150> 60/233,368
<151> 2000-09-18
<150> 60/251,650
<151> 2000-12-05
<160> 46
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
atgctaggga cctgccttag actcctggtg ggcgtgctct gcactgtctg cagcttgggc     60
actgctagag cctatccaga cacttcccca ttgcttggct ccaactgggg aagcctgacc    120
cacctgtaca cggctacagc caggaccagc tatcacctac agatccatag ggatggtcat    180
gtagatggca ccccccatca gaccatctac agtgccctga tgattacatc agaggacgcc    240
ggctctgtgg tgataacagg agccatgact cgaaggttcc tttgtatgga tctccacggc    300
aacatttttg gatcgcttca cttcagccca gagaattgca agttccgcca gtggacgctg    360
gagaatggct atgacgtcta cttgtcgcag aagcatcact acctggtgag cctgggccgc    420
gccaagcgca ttttccagcc gggcaccaac ccgccgccct tctcccagtt cctggctcgc    480
aggaacgagg tcccgctgct gcacttctac actgttcgcc cacggcgcca cacgcgcagc    540
gccgaggacc cacccgagcg cgacccactg aacgtgctca agccgcggcc ccgcgccacg    600
cctgtgcctg tatcctgctc tcgcgagctg ccgagcgcag aggaaggtgg ccccgcagcc    660
agcgatcctc tgggggtgct gcgcagaggc cgtggagatg ctcgcggggg cgcgggaggc    720
gcggataggt gtcgcccctt tcccaggttc gtctag                              756
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Leu Gly Thr Cys Leu Arg Leu Leu Val Gly Val Leu Cys Thr Val
1               5                  10                  15
Cys Ser Leu Gly Thr Ala Arg Ala Tyr Pro Asp Thr Ser Pro Leu Leu
20                  25                  30
Gly Ser Asn Trp Gly Ser Leu Thr His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg
35                  40                  45
Thr Ser Tyr His Leu Gln Ile His Arg Asp Gly His Val Asp Gly Thr
50                  55                  60
Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Thr Ser Glu Asp Ala
65                  70                  75                  80
Gly Ser Val Val Ile Thr Gly Ala Met Thr Arg Arg Phe Leu Cys Met
85                  90                  95
Asp Leu His Gly Asn Ile Phe Gly Ser Leu His Phe Ser Pro Glu Asn
100                 105                 110
Cys Lys Phe Arg Gln Trp Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr Leu
115                 120                 125
Ser Gln Lys His His Tyr Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ile
130                 135                 140
Phe Gln Pro Gly Thr Asn Pro Pro Pro Phe Ser Gln Phe Leu Ala Arg
145                 150                 155                 160
Arg Asn Glu Val Pro Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Arg Pro Arg Arg
165                 170                 175
His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Pro Pro Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val
180                 185                 190
Leu Lys Pro Arg Pro Arg Ala Thr Pro Val Pro Val Ser Cys Ser Arg
195                 200                 205
Glu Leu Pro Ser Ala Glu Glu Gly Gly Pro Ala Ala Ser Asp Pro Leu
210                 215                 220
Gly Val Leu Arg Arg Gly Arg Gly Asp Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ala Asp Arg Cys Arg Pro Phe Pro Arg Phe Val 
245                 250
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgttggggg cccgcctcag gctctgggtc tgtgccttgt gcagcgtctg cagcatgagc     60
gtcctcagag cctatcccaa tgcctcccca ctgctcggct ccagctgggg tggcctgatc    120
cacctgtaca cagccacagc caggaacagc taccacctgc agatccacaa gaatggccat    180
gtggatggcg caccccatca gaccatctac agtgccctga tgatcagatc agaggatgct    240
ggctttgtgg tgattacagg tgtgatgagc agaagatacc tctgcatgga tttcagaggc    300
aacatttttg gatcacacta tttcgacccg gagaactgca ggttccaaca ccagacgctg    360
gaaaacgggt acgacgtcta ccactctcct cagtatcact tcctggtcag tctgggccgg    420
gcgaagagag ccttcctgcc aggcatgaac ccacccccgt actcccagtt cctgtcccgg    480
aggaacgaga tccccctaat tcacttcaac acccccatac cacggcggca cacccggagc    540
gccgaggacg actcggagcg ggaccccctg aacgtgctga agccccgggc ccggatgacc    600
ccggccccgg cctcctgttc acaggagctc ccgagcgccg aggacaacag cccgatggcc    660
agtgacccat taggggtggt caggggcggt cgagtgaaca cgcacgctgg gggaacgggc    720
ccggaaggct gccgcccctt cgccaagttc atctag                              756
<210> 4
<211> 251
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val
1               5                  10                  15
Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu
20                  25                  30
Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg
35                  40                  45
Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala
50                  55                  60
Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala
65                  70                  75                  80
Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met
85                  90                  95
Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn
100                 105                 110
Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His
115                 120                 125
Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala
130                 135                 140
Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg
145                 150                 155                 160
Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg
165                 170                 175
His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val
180                 185                 190
Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln
195                 200                 205
Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu
210                 215                 220
Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile
245                 250
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense PCR primer
<400> 5
agcaccagcc actcagagca                                                 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense PCR primer
<400> 6
cttccagcga ccctagatga                                                 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer for mouse FGF-23
<400> 7
ctgatgatta catcagagga c                                               21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer for mouse FGF-23
<400> 8
caccaggtag tgatgcttct                                                 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer for mouse FGF-23
<400> 9
atccatacaa aggaaccttc g                                               21
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adaptor primer
<400> 10
ccatcctaat acgactcact atagggc                                         27
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adaptor primer
<400> 11
actcactata gggctcgagc ggc                                             23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primer for mouse FGF-23.
<400> 12
actcagtgct gtgcaatgct                                                 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense primer for mouse  FGF-23
<400> 13
gacctagacg aacctgggaa                                                 20
<210> 14
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Arg Ser Gly Cys Val Val Val His Val Trp Ile Leu Ala Gly Leu
1               5                  10                  15
Trp Leu Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro
20                  25                  30
His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr
35                  40                  45
Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala
50                  55                  60
Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu
65                  70                  75                  80
Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His
85                  90                  95
Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu
100                 105                 110
Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro
115                 120                 125
Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser
130                 135                 140
Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu
145                 150                 155                 160
Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro
165                 170                 175
Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu
180                 185                 190
Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala
195                 200                 205
Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys
210                 215
<210> 15
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
1               5                  10                  15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
20                  25                  30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
35                  40                  45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
50                  55                  60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
85                  90                  95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
100                 105                 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115                 120                 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
130                 135                 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
165                 170                 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180                 185                 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195                 200                 205
Ser
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Residues which can beincorporated to allow myc
monoclonal antibody-based affinity purification.
<400> 16
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1               5                  10
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Preferred thrombin cleavagesite.
<400> 17
Leu Val Pro Arg Gly
1               5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Residues that bind to paramagentic steptavidin
beads which facilitates purification of molecules.
<400> 18
Ser Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1               5                  10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligopeptide used for the production of an
antibody to FGF-23 protein.  (residues 175-189 of
SEQ ID NO:4)
<400> 19
Arg Arg His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp
1               5                  10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligopeptide used for the production of an
antibody to FGF-23 protein.  (residues 51-67 of
SEQ ID NO:4)
<400> 20
Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Va lAsp Gly Ala Pro His
1               5                  10                  15
Gln
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E tag
<400> 21
Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu GluPro Arg
1               5                  10
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His6 tag
<400> 22
His His His His His His
1               5
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Ala Lys Arg Ala Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln
1               5                  10                  15
Phe Leu Ser Arg Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro
20                  25                  30
Ile Pro Arg Arg His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp
35                  40                  45
Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala
50                  55                  60
Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala
65                  70                  75                  80
Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala
85                  90                  95
Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile
100                 105                 110
<210> 24
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro
1               5                  10                  15
Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val
20                  25                  30
Ser Ser Asp
35
<210> 25
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln
1               5                  10                  15
Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val
20                  25                  30
His Ser
<210> 26
<211> 56
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Asp Lys Glu Gly Gln Val Met Lys Gly Asn
1               5                  10                  15
Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Leu Leu
20                  25                  30
Glu Val Ala Met Tyr Gln Glu Pro Ser Leu His Ser Val Pro Glu Ala
35                  40                  45
Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala Pro
50                  55
<210> 27
<211> 72
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Ala Trp Phe Leu Gly Leu Asn Lys Glu Gly Gln Ile Met Lys Gly Asn
1               5                  10                  15
Arg Val Lys Lys Thr Lys Pro Ser Ser His Phe Val Pro Lys Pro Ile
20                  25                  30
Glu Val Cys Met Tyr Arg Glu Pro Ser Leu His Glu Ile Gly Glu Lys
35                  40                  45
Gln Gly Arg Ser Arg Lys Ser Ser Gly Thr Pro Thr Met Asn Gly Gly
50                  55                  60
Lys Val Val Asn Gln Asp Ser Thr
65                  70
<210> 28
<211> 78
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Gly Trp Tyr Leu Gly Leu Asn Lys Glu Gly Glu Ile Met Lys Gly Asn
1               5                  10                  15
His Val Lys Lys Asn Lys Pro Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Pro Leu
20                  25                  30
Lys Val Ala Met Tyr Lys Glu Pro Ser Leu His Asp Leu Thr Glu Phe
35                  40                  45
Ser Arg Ser Gly Ser Gly Thr Pro Thr Lys Ser Arg Ser Val Ser Gly
50                  55                  60
Val Leu Asn Gly Gly Lys Ser Met Ser His Asn Glu Ser Thr
65                  70                  75
<210> 29
<211> 78
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Ala Trp Phe Leu Gly Leu Asn Lys Glu Gly Gln Ala Met Lys Gly Asn
1               5                  10                  15
Arg Val Lys Lys Thr Lys Pro Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Pro Leu
20                  25                  30
Glu Val Ala Met Tyr Arg Glu Pro Ser Leu His Asp Val Gly Glu Thr
35                  40                  45
Val Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Ser Lys Ser Thr Ser Ala Ser Ala
50                  55                  60
Ile Met Asn Gly Gly Lys Pro Val Asn Lys Ser Lys Thr Thr
65                  70                  75
<210> 30
<211> 78
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Ala Trp Phe Leu Gly Leu Asn Lys Glu Gly Gln Ala Met Lys Gly Asn
1               5                  10                  15
Arg Val Lys Lys Thr Lys Pro Ala Ala His Phe Leu Pro Lys Pro Leu
20                  25                  30
Glu Val Ala Met Tyr Arg Glu Pro Ser Leu His Asp Val Gly Glu Thr
35                  40                  45
Val Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Ser Lys Ser Thr Ser Ala Ser Ala
50                  55                  60
Ile Met Asn Gly Gly Lys Pro Val Asn Lys Ser Lys Thr Thr
65                  70                  75
<210> 31
<211> 48
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Gln Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Arg Glu Gly Tyr
1               5                  10                    15
Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val
20                  25                  30
Asp Pro Ser Lys Leu Pro Ser Met Ser Arg Asp Leu Phe His Tyr Arg
35                  40                  45
<210> 32
<211> 68
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Trp Phe Met Ala Phe Thr Arg Gln Gly Arg Pro Arg Gln Ala Ser Arg
1              5                  10                   15
Ser Arg Gln Asn Gln Arg Glu Ala His Phe Ile Lys Arg Leu Tyr Gln
20                  25                  30
Gly Gln Leu Pro Phe Pro Asn His Ala Glu Lys Gln Lys Gln Phe Glu
35                  40                  45
Phe Val Gly Ser Ala Pro Thr Arg Arg Thr Lys Arg Thr Arg Arg Pro
50                  55                  60
Gln Pro Leu Thr
65
<210> 33
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Pro Lys
1               5                  10                  15
Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys Arg Tyr Pro Lys
20                  25                  30
Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys
35                  40                  45
Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala
50                  55
<210> 34
<211> 76
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn
1               5                  10                  15
Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val
20                  25                  30
Pro Glu Glu Pro Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe
35                  40                  45
Ser Ser Pro Leu Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr
50                  55                  60
Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys
65                  70                  75
<210> 35
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys
1               5                  10                  15
Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys
20                  25                  30
Ser
<210> 36
<211> 68
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala
1               5                  10                  15
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala
20                  25                  30
Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly
35                  40                  45
Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro
50                  55                  60
Ser Tyr Ala Ser
65
<210> 37
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Leu Trp Tyr Val Ser Val Asn Gly Lys Gly Arg Pro Arg Arg Gly Phe
1               5                  10                  15
Lys Thr Arg Arg Thr Gln Lys Ser Ser Leu Phe Leu Pro Arg Val Leu
20                  25                  30
Asp His Arg Asp His Glu Met Val Arg Gln Leu Gln Ser Gly Leu Pro
35                  40                  45
Arg Pro Pro Gly Lys Gly Val Gln Pro Arg Arg Arg Arg Gln Lys Gln
50                  55                  60
Ser Pro Asp Asn Leu Glu Pro Ser His Val Gln Ala Ser Arg Leu Gly
65                  70                  75                  80
Ser Gln Leu Glu Ala Ser Ala His
85
<210> 38
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Phe Ile Ala Leu Ser Lys Asn Gly Lys Thr Lys Lys Gly Asn Arg
1               5                  10                  15
Val Ser Pro Thr Met Lys Val Thr His Phe Leu Pro Arg Leu
20                  25                  30
<210> 39
<211> 82
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Glu Trp Tyr Val Ala Leu Asn Lys Arg Gly Lys Ala Lys Arg Gly Cys
1              5                 10                 15
Ser Pro Arg Val Lys Pro Gln His Ile Ser Thr His Phe Leu Pro Arg
20                  25                  30
Phe Lys Gln Ser Glu Gln Pro Glu Leu Ser Phe Thr Val Thr Val Pro
35                  40                  45
Glu Lys Lys Lys Pro Pro Ser Pro Ile Lys Pro Lys Ile Pro Leu Ser
50                  55                  60
Ala Pro Arg Lys Asn Thr Asn Ser Val Lys Tyr Arg Leu Lys Phe Arg
65                  70                  75                  80
Phe Gly
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys
1               5                  10                  15
Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr His Phe Leu Pro Arg Ile
20                  25                  30
<210> 41
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys
1               5                  10                  15
Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile
20                  25                  30
Thr
<210> 42
<211> 67
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Trp Tyr Met Ala Phe Thr Arg Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Ser Lys
1               5                  10                  15
Thr Arg Gln His Gln Arg Glu Val His Phe Met Lys Arg Leu Pro Arg
20                  25                  30
Gly His His Thr Thr Glu Gln Ser Leu Arg Phe Glu Phe Leu Asn Tyr
35                  40                  45
Pro Pro Phe Thr Arg Ser Leu Arg Gly Ser Gln Arg Thr Trp Ala Pro
50                  55                  60
Glu Pro Arg
65
<210> 43
<211> 48
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr
1               5                  10                  15
Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val
20                  25                  30
Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser
35                  40                  45
<210> 44
<211> 48
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Arg Tyr Phe Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Asp Gly Ala
1               5                  10                  15
Arg Ser Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val
20                  25                  30
Asp Pro Glu Arg Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Leu Leu Met Tyr Thr
35                  40                  45
<210> 45
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Met Phe Leu Ala Leu Asp Arg Arg Gly Gly Pro Arg Pro Gly Gly Arg
1               5                  10                  15
Thr Arg Arg Tyr His Leu Ser Ala His Phe Leu Pro Val Leu Val Ser
20                  25                  30
<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> consensus sequence
<400> 46
Trp Tyr Val Ala Leu Lys Gly Pro Arg Lys Gly Arg Thr Lys Lys Ala
1               5                  10                  15
His Phe Leu Pro Arg Val
20