【手続補正書】
【提出日】平成16年10月15日(2004.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
残存有機溶媒からの、他の点では純粋なノナペプチドまたはデカペプチドの精製方法であって、以下の諸工程、即ち、
水、およびメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールから選ばれる少なくとも１種のアルコールを含む溶出溶媒混液に、該ノナペプチドまたは該デカペプチドを溶解させ、
該ノナペプチドまたは該デカペプチドを該溶媒混液に溶かした溶液を、実質的に、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｔ−ブチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピルから選ばれる１種または数種の極性化合物およびヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサンから選ばれる１種または数種の非極性化合物、ならびに必要に応じて５％までの酢酸またはプロピオン酸からなる、激しく撹拌した沈殿溶媒混液に加え、
該沈殿したノナペプチドまたはデカペプチドを単離し、
該単離したノナペプチドまたはデカペプチドを、該極性化合物の１種または混液あるいは同様な極性の溶媒または溶媒混液を用いて洗浄し、
該洗浄したノナペプチドまたはデカペプチドを乾燥させること、
を含み、該水および少なくとも１種のアルコールを含む溶媒混液の水分が８％（ｖ／ｖ）未満であり、該溶出溶媒混液と該沈殿溶媒混液との容量比が１：１０またはそれ以上であることを条件とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、該水および少なくとも１種のアルコールを含む溶媒混液の水分が５％（ｖ／ｖ）未満である方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、該ノナペプチドまたは該デカペプチドがＬＨＲＨ拮抗剤である方法。
【請求項４】
請求項３の方法であって、該ノナペプチドまたは該デカペプチドが、Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−ＭｅＴｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（Ｉ）である方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−ＭｅＴｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（Ｉ）がモノ酢酸塩の形で得られる方法。
【請求項６】
請求項１の方法であって、該溶出溶媒混液と該沈殿溶媒混液との容量比が少なくとも１５である方法。
【請求項７】
請求項１の方法であって、該溶出溶媒混液の該アルコールがエタノールである方法。
【請求項８】
請求項１の方法であって、該沈殿溶媒混液の該極性成分が酢酸エチルである方法。
【請求項９】
請求項１の方法であって、該沈殿溶媒混液の該非極性成分がヘプタンである方法。
【請求項１０】
Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−ＭｅＴｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２のモノ酢酸塩。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ペプチド精製
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、特に中間体サイズのペプチド、より詳細にはＬＨＲＨ拮抗剤などのノナペプチドおよびデカペプチドの精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
中間体サイズの天然および合成ペプチドの多くは無定形物質である。これらの多くは、ＬＨＲＨ（黄体化ホルモン放出ホルモン）拮抗剤である多数のノナペプチドおよびデカペプチドなど、薬理学的に興味深い性質を有している。無定形でのみ知られているこの種の特定の一物質は、式（Ｉ）
Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−ＭｅＴｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２  （Ｉ）
の合成デカペプチドであり、有効なＬＨＲＨ拮抗剤であって、望ましい薬理学的性質を有している。
【０００３】
医薬製剤に使用するには、ＬＨＲＨ拮抗剤（Ｉ）および同様な構造のノナペプチドおよびデカペプチドは、実用上の純品であることが必要である。多段階合成の最後の工程で得られる粗製物は、クロマトグラフィーその他による方法で精製される。クロマトグラフィーからの残存溶媒を除去するため、通常、こうして精製された生成物は、水性媒質に溶かして凍結乾燥する必要がある。これは、取り扱いが容易でない嵩高い生成物をもたらす、費用のかかる工程である。
【０００４】
従って、残存有機溶媒から、他の点では純粋なペプチドを精製するには、凍結乾燥以外の手段による方法を用いることが望ましい。
【０００５】
ＷＯ００１８４２３Ａ号明細書は経口投与のための医薬組成物の製造のために、シクロデキストリン及びＬＨＲＨペプチド同族体、その薬学的に許容できる塩を含む組み合わせを使用することを開示している。アバレリックス（Ａｂａｒｅｌｉｘ）は好ましいＬＨＲＨ同族体である。ＬＨＲＨペプチドのＤ１拮抗剤の酢酸塩は一般に、薬学的に許容しうるものとして開示されている。ＷＯ００１８４２３合明細書に開示されている化合物は医薬品の製造において有用である。
【０００６】
ＷＯ００５５１９０Ａ号明細書はホルモンに依存する腫瘍及びホルモンに影響される疾病に対する医薬の製造のためのＬＨＲＨ拮抗剤デカペプチドを開示しており、これはＨＰＬＣ製剤によって精製され凍結乾燥される。
【０００７】
国際出願ＥＰ０９５５３０８Ａ号明細書は、液体クロマトグラフィーにより同時単一段階での精製でＬＨＲＨデカペプチド拮抗剤の塩酸塩をそのジ酢酸塩に変換する方法を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、残存有機溶媒から他の点では純粋な前記種類のペプチドを精製する方法であって、凍結乾燥をしないで済む方法を提供することにある。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、残存有機溶媒を実質的に含まず、低温沈殿物（Ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）の形をとらないような、他の点では純粋なペプチドを提供することにある。
【００１０】
さらに、本発明の諸目的は、以下の、課題を解決するための手段、発明を実施するための最良の形態、および添付の特許請求の範囲から明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、残存有機溶媒から、他の点では純粋なペプチド、特にノナペプチドまたはデカペプチド、より詳細にはＬＨＲＨ拮抗剤であるノナペプチドまたはデカペプチドを精製する方法が提供されている。この方法は、以下の諸工程、即ち、
水、およびメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールから選ばれる少なくとも１種のアルコールを含む溶出溶媒混液に、該他の点で純粋なペプチドを溶解させ、
上記の他の点では純粋なペプチドを該溶媒混液に溶かした溶液を、実質的に、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｔ−ブチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピルから選ばれる１種または数種の極性化合物およびヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサンから選ばれる１種または数種の非極性化合物、および必要に応じて５％までの酢酸またはプロピオン酸からなる、激しく撹拌した沈殿溶媒混液に加え、
沈殿したペプチドを単離し、
単離したペプチドを、該極性化合物の１種または混液あるいは同様な極性の溶媒または溶媒混液を用いて洗浄し、
この洗浄したペプチドを乾燥させること、
を含み、水および少なくとも１種のアルコールを含む該溶媒混液の水分が８％（ｖ／ｖ）未満であり、この溶出溶媒混液と上記沈殿溶媒混液との容量比が１：１０またはそれ以上であることを条件とするものである。
【００１２】
「他の点では純粋なペプチド」とは、除去する必要があるまたはその含量をかなり減じる必要がある揮発性不純物を別にすれば、医薬品に使用するのに十分純粋であるペプチドのことである。該他の点では純粋なペプチドは、通常クロマトグラフィーにより精製を行った物質である。
【００１３】
該他の点では純粋なペプチドは、
Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−ＭｅＴｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２  （Ｉ）
であることが好ましい。
【００１４】
本発明の第１の好ましい態様では、前記溶出溶媒混液の水分は、５％（ｖ／ｖ）未満である。
【００１５】
本発明の第２の好ましい態様では、この溶出溶媒混液と前記沈殿溶媒混液の容量比は、少なくとも１５、特に、少なくとも２０である。
【００１６】
本発明の第３の好ましい態様では、前記溶出溶媒混液のアルコールはエタノールである。
【００１７】
本発明の第４の好ましい態様では、前記沈殿溶媒混液の極性成分は酢酸エチルである。
【００１８】
本発明の第５の好ましい態様では、前記沈殿溶媒混液の非極性成分はヘプタンである。
【００１９】
以下に、好ましい実施態様を説明することによって、本発明をさらに詳述するが、これによって本発明が制限されると理解されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
〔実施例１〕
合成生成物の精製に用いた調製的ＨＰＬＣからの、エタノール−水−酢酸４０：５９：１（ｖ／ｖ／ｖ）に純品（１）（全量１００ｇ）を含む画分をプールし、減圧濃縮して油を得、これをエタノールから２度、共蒸発させた。得られた固体を４４０ｍｌのエタノールに溶かし、この透明な溶液を２０分間かけて８．８Ｌの酢酸エチル／ヘプタン１：１（ｖ／ｖ）に加えた。撹拌を１時間続けた後、ろ過した。得られた無定形生成物を３Ｌの酢酸エチルで洗浄したところ、これによりヘプタンは殆ど全て除去されたことが分かった。この洗浄した生成物は、真空乾燥機中、４０ｏＣ、０．３バールで４８時間乾燥させた。この乾燥生成物の元素分析から、（Ｉ）のモノ酢酸塩の得られたことが示された。これに対し、低温沈殿（Ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）では、対応するジ酢酸塩が得られる。次の表は、本発明により製造した（Ｉ）のモノ酢酸塩の分析パラメータを、対応する凍結乾燥品（ジ酢酸塩）と比較したものである。
【表１】
2005515217.tif 000001
【００２１】
〔実施例２〕
沈殿溶媒または溶媒混液の組成を変更、その他の点では実施例１と同様の方法。純粋な酢酸エチル中で沈殿を行うと、ペプチドの約３重量％乃至約５重量％のロスが生じる。純粋なヘプタン中で沈殿させると、ろ過が困難な粘着性の生成物が生じる。酢酸エチルとヘキサンの１：１（ｖ／ｖ）混液では、ろ過および乾燥させやすい生成物が得られ、ペプチドのロスは、実験を繰り返し行っても、常に０．５重量％未満であった。
【００２２】
〔実施例３〕
油状生成物を溶出溶媒（無水エタノール）に溶かした溶液の水分を変更、その他の点では実施例１と同様の方法。水分を１０％（ｖ／ｖ）にすると、ろ過が困難な粘着性の沈殿生成物が生じる。水分を１５％（ｖ／ｖ）にすると、油状の沈殿生成物が生じる。満足な結果を得るためには、水分は８％（ｖ／ｖ）を超えてはならないが、好ましくは５％（ｖ／ｖ）未満に維持すべきである。水分を５％（ｖ／ｖ）未満とするには、クロマトグラフィーからの油状生成物をエタノールと少なくとも２度共蒸発させればよい。
【００２３】
〔実施例４〕
沈殿温度を変更、その他の点では実施例１と同様の方法。沈殿温度は重要でないことが分かった。０℃から２０℃まで変化させても、生成物の収率および形態に目立った差は認められなかった。
【００２４】
〔実施例５〕
溶出溶媒中の（Ｉ）の濃度を変更、その他の点では実施例１と同様の方法。溶出溶媒のエタノールと共蒸発させたクロマトグラフィーからの油状生成物の濃度は、できるだけ高くすべきであることが分かった。重量で３３０ｇの濃度さえも用いることができた。
【００２５】
〔実施例６〕
溶出溶媒と沈殿溶媒との容積比その他を変更、他の点では実施例１と同様の方法。最適な容積比は、約１：２０であることが分かった。１：１５乃至１：３０の比で満足のいく結果が得られることを明らかにすることができた。１：１０の比にすると、粘着性生成物が生じた。沈殿速度は極めて速い。懸濁液は、溶かした物質を最後に加えてから３０分後にろ過することができる。酢酸エチルを用いて洗浄しても生成物のロスは生じず、効率よくヘプタンを除去することができた。