(57)【要約】  本発明は、第二相解毒酵素活性増強作用、細胞内グルタチオン量増加作用を有する医薬、食品または飼料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
寒天、アガロース、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物、下記式（化１）で表される化合物、
【化１】
2008047663.tif 000014
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである）
、それらの誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤。
【請求項２】
３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物がアガロオリゴ糖である、請求項１記載の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤。
【請求項３】
アガロオリゴ糖が、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースおよびアガロオクタオースを含む混合物である請求項２記載の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤。
【請求項４】
第二相解毒酵素が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、キノンレダクターゼまたはＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼである請求項１〜３いずれか１項に記載の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤。
【請求項５】
請求項１〜４記載いずれか１項に記載の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤を含有する医薬。
【請求項６】
請求項１〜４記載いずれか１項に記載の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤を含有する食品または飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第二相解毒酵素活性増強作用、細胞内グルタチオン量増加作用を有する医薬、食品または飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々が日常摂取している食品や水、大気、薬物中には生体にとって好ましくない成分が含まれており、これらの成分は生体内で異物として認識されると、主として肝臓にて代謝される。肝臓での生体異物代謝は、第一相と第二相とからなる。第一相ではチトクロムＰ４５０やモノオキシゲナーゼ等のいわゆる第一相解毒酵素の作用により、生体内異物は酸化、還元、加水分解を受ける。第二相では、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと称することがある）、キノンレダクターゼ（以下、ＱＲと称することがある）、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（以下、ＵＧＴと称することがある）、グルタチオンペルオキシダーゼ、アリールスルホトランスフェラーゼ等のいわゆる第二相解毒酵素の作用により、第一相で代謝された生体内異物やその他の生体内異物は抱合体の形成や還元が行なわれ、生体内異物代謝が亢進される。【０００３】
ＧＳＴは、還元型のグルタチオンと種々の親電子化合物を抱合させる、特に肝臓に多く発現する酵素である。ＧＳＴは、第一相解毒酵素により代謝されて毒性を発現するようになった代謝物や、その他の生体内異物（毒物）の抱合を触媒することで解毒作用を亢進する。つまり、生体内のＧＳＴ活性を増強することで、毒物が原因となるさまざまな疾患リスクを軽減することができる。近年、天然物由来のＧＳＴ活性を増強させる物質の探索が行なわれており、例えば、大豆加工食品やローレルに含まれるゲルマクラノイド、シソ科植物及びフトモモ科ユーカリ属植物から選択される１種あるいは２種以上の植物あるいはその抽出物、リモネイド配糖体等が知られている（例えば、特許文献１〜４）。【０００４】
グルタチオンは生体内に広く分布するシステイン、グルタミン酸及びグリシンからなるトリペプチドである。グルタチオンは上記のＧＳＴやグルタチオンペルオキシダーゼの基質となることから、これらの酵素による解毒作用の発現の必須成分である。加えて、非酵素的にさまざまな有害物質と結合することでも解毒作用を示す。【０００５】
ＱＲは、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを補酵素として、キノン類や電子受容体となる化合物の還元を触媒する酵素であり、第一相酵素により代謝された酸化物や、活性酸素や過酸化脂質などにより生じた酸化物を還元し、無毒化する作用を有している。近年、天然物由来のＱＲ活性を増強させる物質の探索が行なわれており、例えば、アブラナ科植物に含まれる成分であるイソチオシアネート等の含硫化合物や、インジゴ植物に含有されるインジルビンにＱＲ活性増強作用のあることが知られている（例えば、特許文献５、非特許文献１）。【０００６】
ＵＧＴは、ＵＤＰ−グルクロン酸を糖供与体として、第一相酵素により代謝された代謝物や生体異物にグルクロン酸を転移させ、グルクロン酸との複合体（グルクロノシド）を形成する反応（グルクロン酸抱合）を触媒する酵素であり、これにより基質分子の水溶性を高め、胆汁や血液への移行を促進し、無毒化することが知られている。近年、天然物由来のＵＧＴ活性を増強させる物質の探索が行なわれており、例えば、インジゴ植物に含有されるインジゴイドにＵＧＴ活性増強作用のあることが知られている（例えば、特許文献６）。【０００７】
寒天は、アガロースとアガロペクチンからなる多糖であり、広く食品素材として使用されている。アガロースの低分子化物であるアガロオリゴ糖は、その還元末端に３，６−アンヒドロガラクトピラノースを有するオリゴ糖である。アガロオリゴ糖は健康食品素材としての開発が期待され、その生理作用としては、抗リウマチ作用、抗炎症作用等が報告されている（例えば、特許文献７〜９）。【０００８】
また、Ｌ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（ＤＧＥ）は、上記のようなアガロオリゴ糖を中性からアルカリ性の条件下に維持することにより得られる化合物であり、その生理作用としては、抗リウマチ作用、抗炎症作用等が報告されている（例えば、特許文献１０）。
【特許文献１】特開平１０−２３４３２６号公報
【特許文献２】特開平９−２３４０２０号公報
【特許文献３】特開２００６−１１１５８５号公報
【特許文献４】特開２０００−３１６５２７号公報
【特許文献５】特開２００３−４０７７４号公報
【特許文献６】特開２００３−２４６７３４号公報
【特許文献７】国際公開第００／４３０１８号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９９／２４４４７号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００３／０８６４２２号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９９／６４４２４号パンフレット
【非特許文献１】Ｙ．Ｚｈａｎｇ  他３名，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，１９９２年，Ｖｏｌ．８９，ｐ２３９９−２４０３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、安全で、簡便に摂取可能な、食品素材、医薬品素材、飼料素材として適した解毒作用を有する物質を開発し、当該物質の機能性を利用した医薬、食品または飼料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、寒天、アガロース、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物、下記式（化１）で表される化合物、【００１１】
【化１】
2008047663.tif 000002
（式中、ＸおよびＹは、ＨまたはＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨのとき、ＹはＨ、ＸがＨのとき、ＹはＣＨ２ＯＨである）
、それらの誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤に関する。本発明の第１の発明において、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物としては、アガロオリゴ糖、特に好適にはアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオースおよびアガロオクタオースを含む混合物であるアガロオリゴ糖が例示される。また、本発明の第１の発明において、第二相解毒酵素としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、キノンレダクターゼまたはＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼが例示される。【００１２】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤を含有する医薬に関する。【００１３】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤を含有する食品または飼料に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、寒天、アガロース、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物、上記式（化１）で表される化合物、それらの誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する、第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤、当該剤を含有する医薬、食品または飼料が提供される。当該剤を含有する医薬、食品または飼料は、その第二相解毒酵素活性増強作用、細胞内グルタチオン量増加作用により、解毒作用を亢進することから、各種疾患への治療用または予防用の医薬、食品または飲料、特に毒物に起因する各種疾患の疾病リスクを低減させる疾患予防用の医薬又は機能性食品として、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、寒天としては、例えば、テングサ科のマクサ、オニグサ、オオブサ、ヒラクサ、オバクサ、ユイキリ等、オゴノリ科のオゴノリ、オオオゴノリ等、イギス科のイギス、エゴノリ等、その他の紅藻類を原料として得られたものを使用することができる。原料藻類は、通常、天日に干して乾燥させたものを用いるが、本発明においては生の藻類および乾燥した藻類が使用できる。また、乾燥時に散水しながら漂白した、いわゆるさらし原藻も使用できる。原料藻類からの熱水抽出物を、冷却することによって、いわゆる「ところてん」が得られる。この「ところてん」から凍結脱水または圧搾脱水によって水分を除き、乾燥させることによって寒天が得られる。本発明において、寒天はその起源となる藻類を問わず、また、棒状、帯状、板状、糸状、粉末状等の種々の形態のものを使用できる。また、寒天は市販されているさまざまな強度の寒天が使用できる。【００１６】
寒天は通常、約７０％のアガロースと約３０％のアガロペクチンを含んでいる。本発明においてアガロースとしては、寒天から公知の方法で精製を進めて調製されたアガロースを使用することができる。精製アガロースは精製度の低いものから高いものまで、様々なアガロース含量のものを使用できる。また、アガロースは市販のアガロースを使用することもできる。【００１７】
本発明において、寒天およびアガロースとしては、分子量１０，０００以上のものと定義し、それ未満の分子量のものについては後述の低分子化物と定義する。すなわち、酸処理等の分解処理を施したものであっても、本願明細書においては分子量１０，０００以上であれば寒天、もしくはアガロースに包含される。【００１８】
本発明において、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロース低分子化物としては、上記の寒天やアガロース、またはそれらの原料となる海藻類を化学的、物理的および／または酵素的方法で部分分解することにより製造することができ、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する低分子化物が得られれば特に限定はないが、化学的分解方法の例としては、酸性から中性領域での加水分解、物理的分解方法の例としては、電磁波や超音波の照射による細断・分解、酵素的分解方法の例としては、加水分解酵素、例えば、アガラーゼ等による加水分解が挙げられる。特に好適には、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロース低分子化物を効率的に製造する観点から、酸分解もしくはα−アガラーゼによる酵素分解が例示される。【００１９】
本発明において、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロース低分子化物としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトースと３，６−アンハイドロガラクトピラノースを交互に有する、分子量１０，０００未満、好ましくは２〜５０糖、より好ましくは２〜３０糖で構成されるアガロースの低分子化物が例示され、特に好適にはアガロオリゴ糖が例示される。なお、本明細書において、アガロオリゴ糖とは、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、もしくはそれらのうちの２種以上の混合物のことを示し、還元末端がβ−Ｄ−ガラクトースであるネオアガロオリゴ糖とは区別される。【００２０】
本発明に使用されるアガロオリゴ糖としては、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、またはアガロオクタオースをそれぞれ単独で使用してもよいが、好適にはこれらの混合物を使用することができる。本発明において、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、およびアガロオクタオースを含有するアガロオリゴ糖を使用する場合、公知の製法により製造されるものを使用することができ、特に限定はないが、例えば、国際公開第００／６９２８５号パンフレットに記載の製法により製造することができる。すなわち、原料寒天を固体酸により酸分解することで得られる、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、およびアガロオクタオースを含有するアガロオリゴ糖を本発明に使用することができる。アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、およびアガロオクタオースを含有するアガロオリゴ糖としては、市販のもの（製品名：アガオリゴ、タカラバイオ（株）製）を使用することもできる。【００２１】
本発明に使用する上記式（化１）で表される化合物は、還元末端に３，６−アンハイドロガラクトピラノースを有する化合物等を中性からアルカリ性の条件下に維持することにより得ることができる。また、構造中に３，６−アンハイドロガラクトピラノースを含有する化合物をｐＨ７未満で酸加水分解および／または酵素分解に供し、ついで得られた酸分解物および／または酵素分解物を中性からアルカリ性の条件下に維持することにより得ることができる。還元末端に３，６−アンハイドロガラクトピラノースを含有する化合物としては、たとえば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース等のアガロオリゴ糖、κ−カラビオース等を挙げることができる。構造中に３，６−アンハイドロガラクトピラノースを有する化合物としては、例えば寒天、アガロース、それらの分解物もしくは前述の３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物等が例示される。【００２２】
還元末端に３，６−アンハイドロガラクトピラノースを含有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオース等のｐＨ７以上の中性からアルカリ性の条件下での維持において、これらの化合物から選択される少なくとも１以上の化合物を溶解または懸濁して反応を行うための反応液の組成は特に限定されるものではないが、好ましくは水（たとえば、蒸留水、イオン交換水、水道水等）を溶媒とし、アルカリの種類に特に限定はないが、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等の無機塩基、トリス、エチルアミン、トリエチルアミン等の有機塩基を溶解させたものが使用可能である。アルカリの濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが、好ましくは０〜２００℃、より好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また反応時間も特に限定はないが、好ましくは数秒〜数日に設定すればよい。アルカリの種類と濃度、反応温度および反応時間ならびに反応液に溶解または懸濁する原料となる上記化合物の量は、当該化合物の種類および目的とする上記式（化１）で表される化合物の生成量により適宜選択すればよい。一般に、ｐＨ７以上であれば良いが、低濃度のアルカリよりも高濃度のアルカリ、低温よりも高温を選択することにより上記式（化１）で表される化合物の生成は速やかに進行する。例えば、アガロビオースまたはκ−カラビオースのｐＨ１１．５の溶液を調製し、３７℃で５分間維持することにより、上記式（化１）で表される化合物が生成する。【００２３】
生成した上記式（化１）で表される化合物を含有するアルカリ液は、目的に応じ中和して用いても良く、またｐＨ７未満に調整し酸性溶液として使用しても良い。また、構造中に３，６−アンハイドロガラクトピラノースを含有する化合物をｐＨ７未満で酸加水分解および／または酵素分解に供し、ついで中性からアルカリ性の条件下に前記同様に維持することにより、上記式（化１）で表される化合物を得る場合、酸加水分解としては、たとえば、酸として塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸等を好ましくは０．００１〜５規定用い、水を溶媒として反応液を調製し、該反応液に原料となる化合物を適量溶解または懸濁して、反応温度を好ましくは０〜２００℃、反応時間を好ましくは数秒〜数日として反応を行えばよい。また、酸としては、固体酸を用いることもできる。また、酵素分解を行う場合、酸加水分解において用いられるのと同様の反応液および反応条件にて、たとえば、酵素としてα−アガラーゼ、例えば国際公開第００／５０５７８号パンフレットに記載のα−アガラーゼを適量用い、当該酵素が活性を示す条件下で反応を行えばよい。【００２４】
反応液中に含まれる本発明の上記式（化１）で表される化合物の精製手段としては、化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、ゲルろ過法、分子量分画膜による分画法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等の精製方法を組合せて精製すればよい。例えば、アガロビオースの中性からアルカリ性の条件下での処理物より上記式（化１）で表される化合物のＸがＣＨ２ＯＨ、ＹがＨである化合物（Ｌ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（以下、ＤＧＥと称することがある））が精製され、κ−カラビオースの中性からアルカリ性での条件下での処理物より、上記式（化１）で表される化合物のＸがＨ、ＹがＣＨ２ＯＨである化合物（Ｄ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（以下、κ−ＤＧＥと称することがある））が精製され得る。なお、ＤＧＥは、上記のアガロオリゴ糖が生体内に取り込まれた際に生成する化合物であると予想されている〔Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．（Ｓｏｒｕｉ）４８：１３−１９，Ｍａｒｃｈ  １０，２０００〕。ＤＧＥの構造を下記式（化２）に示す。【００２５】
【化２】
2008047663.tif 000003
【００２６】
また、本発明の有効成分としては前述の化合物の誘導体を使用することができる。ここで誘導体としては、例えば種々の置換基が結合し、所望の効果を発揮しうるものであれば特に限定はない。置換基としては、例えば、脂肪族基（メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基などの直鎖状脂肪族基やイソプロピル基、イソブチル基、プレニル基、ゲラニル基などの分枝状脂肪族基）芳香族基（フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ピロリル基、インドリル基など）、芳香脂肪族基（ベンジル基、フェネチル基など）、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、燐酸基、チオール基、アミノ基、ニトロ基、アルコキシ基（メトキシ基など）、アシルオキシ基（アセチル基など）、ハロゲン（塩素、臭素、フッ素など）、アミノ酸、ペプチドなどを挙げることができる。また、後述するようにプロドラッグとして機能し得る当該化合物の誘導体であってもよい。【００２７】
本発明の有効成分の誘導体として、寒天、アガロース、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物、例えばアガロオリゴ糖の誘導体としては、特に限定はないが、好適には硫酸化体やメチル化体が例示される。また、上記式（化１）で表される化合物の誘導体としては、好適にはＳＨ基含有化合物との反応により生成する誘導体を使用することができる。これにより得られる誘導体の構造を下記式（化３）に示す。【００２８】
【化３】
2008047663.tif 000004
（式中、ＲはＳＨ基含有化合物からＳＨ基を除いた残基である）【００２９】
使用するＳＨ基含有化合物は少なくとも１つのＳＨ基を有する化合物であれば何ら限定はない。上記式（化３）中のＲは、ＳＨ基含有化合物と上記式（化１）で表される化合物との反応により、上記式（化１）と当該ＳＨ基含有化合物との結合に消費される１つのＳＨ基を除く、残りの残基をいう。従って、ＳＨ基含有化合物がＳＨ基を２以上有する場合には、Ｒで表わされる残基中には１以上のＳＨ基が存在することになる。かかるＳＨ基含有化合物の例としては、メタンチオール、ブタンチオール、メルカプトエタノール、ＳＨ基含有アミノ酸、ＳＨ基含有アミノ酸誘導体等が挙げられる。【００３０】
ＳＨ基含有アミノ酸の例としては、システイン、ホモシステイン等が挙げられる。また、ＳＨ基含有アミノ酸誘導体としては、上記アミノ酸の誘導体、例えばシステイン誘導体、システイン含有ペプチド、システイン誘導体含有ペプチドが例示される。システイン誘導体としては、例えばシステインのアミド化合物、アセチル化合物、エステル化合物等が挙げられる。システイン含有ペプチドとしてはペプチド中にシステインが構成成分となっていれば良く、特に限定はない。当該システイン含有ペプチドとしては、オリゴペプチド、例えばグルタチオンのような低分子物からタンパク質のようなポリペプチドからなる高分子物までを包含する。またシスチン又はホモシスチンを含有するペプチドも反応中にシステイン又はホモシステイン含有ペプチドとなる条件下、例えば還元処理を組合せることにより、本発明においてシステイン又はホモシステイン含有ペプチドとして使用することができる。システイン誘導体含有ペプチドとしては、前記システイン含有ペプチドにおいて、システインがシステイン誘導体からなる物質を挙げることができる。なおシステイン含有ペプチドとしては、糖質、脂質等を含有するシステイン含有ペプチドも包含される。また、上記した各種の物の塩、酸無水物、エステル等であってもよい。【００３１】
上記式（化３）で表される化合物の製造については、特に限定はなく、例えば国際公開第９９／６４４２４号パンフレットに記載の方法を参照することが出来る。【００３２】
前述する本発明に使用される化合物の塩としては、好ましくは医薬として許容される塩であり、公知の方法にて変換することができる。たとえば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸等の無機塩、ギ酸、酢酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸等の有機酸との塩や、ヨウ化メチル等のアルキルハライド、ベンジルハライド等と反応させて得られるアンモニウム塩等が挙げられる。【００３３】
さらに、本発明において使用される化合物は、たとえば、エステルとすることができる等、体内で容易に加水分解し、所望の効果を発揮し得る誘導体（プロドラッグ）を形成可能である。かかるプロドラッグの調製は公知の方法に従えばよい。【００３４】
また、本発明の有効成分としては、前述する化合物の光学異性体、ケト−エノール互変異性体、幾何異性体等の各種異性体を使用することもできる。また、各異性体の単離されたものであっても、その混合物であってもよい。【００３５】
本発明により、寒天、アガロース、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロース低分子化物、上記式（化１）で表される化合物、それらの誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分（以下、本発明の有効成分と称することがある）として含有する、第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤（以下、本発明の第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤と称することがある）が提供される。【００３６】
本願明細書における第二相解毒酵素としては、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キノンオキシダーゼ（ＱＲ）、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、アリールスルホトランスフェラーゼ等が例示される。特に好適には、ＧＳＴ、ＱＲ、ＵＧＴが例示される。本発明の有効成分によるＧＳＴ、ＱＲもしくはＵＧＴの活性増強作用については、特に限定はないが、後述の実施例１〜７に示すとおり、ＧＳＴ、ＱＲもしくはＵＧＴの酵素活性の測定、もしくはＧＳＴ、ＱＲもしくはＵＧＴの遺伝子発現量を測定することにより評価することができる。【００３７】
本発明の有効成分による細胞内グルタチオン量の増加作用については、特に限定はないが、例えば後述の実施例８に示すとおり、細胞中のグルタチオン量を測定することにより評価することが出来る。【００３８】
本発明の第二相解毒酵素活性増強剤または細胞内グルタチオン量増加剤は、上記のような第二相解毒酵素、例えばＧＳＴ、ＱＲやＵＧＴの活性を増強し、さらにいくつかの第二相解毒酵素の基質となる細胞内のグルタチオン量を増加させることにより、生体、特に肝臓における毒物代謝を亢進し、肝臓機能を促進することができる。これにより、本発明の第二相解毒酵素活性増強剤または細胞内グルタチオン量増加剤は、各種毒物が起因となる種々の疾病リスクを低減させることができ、後述する医薬や機能性食品への使用に極めて適している。なお、ＧＳＴ、ＱＲ、ＵＧＴ及びグルタチオンにより代謝促進され得る毒物は、特定の化合物に限定されず、数々の発がん性物質や農薬、環境汚染物質、副作用を有する医薬などの外因性物質など多岐にわたる。すなわち、本発明の第二相解毒酵素活性増強剤または細胞内グルタチオン増加剤が効果を示す疾患は特定の疾患に限定されるものではない。また、このような本発明の有効成分による第二相解毒酵素活性増強作用は、後述の比較例にも示すとおり、β−Ｄ−ガラクトースを還元末端に有するネオアガロオリゴ糖には存在しない。【００３９】
本発明により、本発明の第二相解毒酵素活性増強剤または細胞内グルタチオン量増加剤を含有する医薬（以下、本発明の医薬と称することがある）が提供される。本発明の医薬は第二相解毒酵素の活性増強や細胞内のグルタチオン量を増加させることにより、肝臓の毒物代謝機能を促進させることができる。本発明の医薬は、各種の肝臓機能の低下を伴う疾患、例えば肝炎、肝硬変、肝臓がん、脂肪肝、アルコール性肝疾患等の治療または予防に有用であり、特に本発明の有効成分による第二相解毒酵素活性増強作用または細胞内グルタチオン量増加作用により、これらの疾患の発症リスクを低減させる予防用医薬として極めて適している。また、本発明の医薬はその毒物代謝促進作用により、副作用として肝障害を引き起こすような薬物と併用することで、薬物投与による肝障害を低減させることもできる。この場合、投与形態としては、本発明の有効成分とその他の薬物と混合して製剤化しても良いし、または別々に製剤化して同時に服用しても良い。【００４０】
また、本発明の医薬は、前述の各種疾患のほか、各種毒物が起因となって起こる疾患の予防または治療に対して有用であり、ここで疾患としては、特に限定はないが、例えば、がん、動脈硬化、アルツハイマー、肥満症（メタボリックシンドローム）、皮膚疾患等が例示される。【００４１】
本発明の医薬としては、本発明に係る第二相解毒酵素活性増強剤または細胞内グルタチオン量増加剤として使用される前記有効成分を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。なお、本明細書において医薬とは医薬部外品を包含するものとする。また、本発明の医薬は、本発明の有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分、すなわち、第二相解毒酵素やその活性増強作用を有することが知られている他の成分と併用することもできる。ここで第二相解毒酵素としては、前述する第二相解毒酵素が例示される。また、第二相解毒酵素活性増強作用を有することが知られている他の成分としては、特に限定はないが、例えば、イソチオシアネート、クルクミン等が例示される。【００４２】
さらに本発明の医薬は、グルタチオンやグルタチオンを高含有する成分と併用することもできる。すなわち、本発明の有効成分により活性が増強される第二相解毒酵素の基質となり得るグルタチオン、もしくは細胞内のグルタチオンを増加させる成分を添加することで、解毒作用はさらに増強される。ここで、細胞内のグルタチオンを増加させる成分としては、特に限定はないが、例えば、イソチオシアネート等が例示される。【００４３】
本発明の医薬の製造は、通常、前記有効成分を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。【００４４】
医薬用担体は、医薬の投与形態および製剤形態に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などの医薬用担体が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ハイドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。【００４５】
一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。【００４６】
外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。【００４７】
上記のような各種製剤形態での医薬は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる医薬における有効成分の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。本発明の医薬中の有効成分の含有量としては通常１〜１００重量％程度である。【００４８】
本発明の医薬は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も特に限定はなく、例えば内用、外用および注射により投与することができる。本発明の治療剤又は予防剤を注射により投与する場合は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用により投与する場合は、たとえば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。【００４９】
本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、成人１日当り好ましくは０．００５〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の食品に添加して日常的に摂取させることもできる。【００５０】
本発明により、本発明の第二相解毒酵素活性増強剤または細胞内グルタチオン量増加剤を含有する食品または飼料（以下、本発明の食品または飼料と称することがある）が提供される。本発明の食品または飼料は、前述の本発明の医薬と同様、第二相解毒酵素の活性増強や細胞内のグルタチオン量を増加させることにより、第二相解毒酵素活性増強用、又は細胞内グルタチオン量増加用の食品または飼料として使用することができる。当該食品または飼料としては、各種の肝臓機能の低下を伴う疾患、例えば肝炎、肝硬変、肝臓がん、脂肪肝、アルコール性肝疾患等の治療または予防に有用であり、特に本発明の有効成分による第二相解毒酵素活性増強作用または細胞内グルタチオン量増加作用により、これらの疾患の発症リスクを低減させる機能性食品として極めて有用である。【００５１】
また、本発明の食品または飼料は、前述の疾患のほか、生体内に蓄積された毒物が起因となって起こる疾患の予防または治療に対して有用であり、ここで疾患としては、特に限定はないが、例えば、がん、動脈硬化、アルツハイマー、肥満症（メタボリックシンドローム）、皮膚疾患等が例示される。また、本発明の食品または飼料を摂取することにより、その解毒作用から、肌荒れ、疲労等の体調不良を改善することもできる。【００５２】
本発明の食品の一態様としては、解毒効果、すなわちデトックス効果を有する食品として、前記疾患の発症リスクを低減させる機能性食品（健康維持のための食品）、生体の解毒を促すことにより老化現象を防止する老化防止用の機能性食品、もしくはアルコール摂取前又は後に摂取される二日酔い防止のための機能性食品が例示される。当該機能性食品としては、本発明の有効成分を関与する成分として表示した、上記の疾患の発症リスクを低減させる、解毒効果を有する、老化防止作用のある、もしくは二日酔い防止作用を有する旨の表示を付した特定保健用食品を包含する。【００５３】
本発明の食品または飼料は、前述の本発明の医薬と同様、本発明の有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分、すなわち、第二相解毒酵素やその活性増強作用を有することが知られている他の成分や肝機能を増強することが知られている他の成分と混合して使用することもできる。さらに、本発明の食品または飼料は、前述の本発明の医薬と同様に、第一相解毒酵素やその活性増強を有することが知られている成分と混合して使用することもできる。さらに本発明の食品または飼料は、グルタチオンやグルタチオンを高含有する成分と混合して使用することもできる。なお、本発明の食品の場合は、前記配合可能な成分の中でも食品素材として好適に使用可能な成分、例えば、ブロッコリー、ウコン、ガジュツ、酵母、しじみエキス、かきエキス、マリアアザミエキス、フコイダン、明日葉やそれらの加工物と配合することが好適である。【００５４】
なお、本発明の食品または飼料において「含有」とは、含有、添加および／または希釈を意味する。ここで、「含有」とは食品または飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、「添加」とは食品または飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、「希釈」とは本発明で使用される有効成分に、食品または飼料の原料を添加するという態様をいうものである。また、本発明の食品は、有効成分を食品添加物として添加した食品形態のものも本発明の食品に包含される。【００５５】
本発明の食品または飼料の製造法に特に限定はない。例えば、配合、調理、加工などは一般の食品または飼料のものに従えばよく、それらの製造法により製造することができ、得られた食品または飼料に本発明に係る前記有効成分が含有されていれば良い。【００５６】
本発明の食品としては特に限定はないが、例えば、本発明に係る前記有効成分が含有されてなる、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅など）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシングなど）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆など）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージなど）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮など）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリームなど）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料など）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類など）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなど）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料など）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりんなど）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなど）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテルなど）、固形食品、液体食品（スープなど）、香辛料類などの農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品などが挙げられる。なお、本願明細書において、食品とは飲料をも包含するものであり、例えばアガロオリゴ糖を水に溶解し、適宜既存の飲料に使用される成分を配合して本発明の飲料とすることができる。【００５７】
本発明の食品は、前記有効成分が単独もしくは複数含有、添加および／または希釈されており、その含有量が第二相解毒酵素活性増強作用または細胞内グルタチオン増加作用を発現するための必要量に相当するものであれば特にその形状に限定はなく、粉末状、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状物も包含する。また、本発明の食品としては、前述する本発明の有効成分をそのまま、もしくは適当な乳化剤や賦形剤等と適宜混合したものも包含される。これらの食品はそのまま、もしくは水と混合して飲料として食することができる。【００５８】
本発明の食品中の前記有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と活性発現の観点から適宜選択できるが、例えば食品中の本発明の有効成分が、好ましくは０．０００１〜１００重量％、より好ましくは０．００１〜６０重量％、更に好適には０．０１〜３０重量％である。【００５９】
また本発明の食品は、例えば本発明の有効成分を、成人１日当り好ましくは０．００５〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重となるように摂取すればよい。【００６０】
また、本発明は、前記有効成分を含有、すなわち、含有、添加および／または希釈してなる、第二相解毒酵素活性化阻害作用または細胞内グルタチオン増加作用を有する生物用の飼料を提供するものであり、さらに、別の一態様として、前記有効成分を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法をも提供する。また、本発明の別の一態様として、前記有効成分を含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。【００６１】
本明細書において、生物としては、限定はないが、たとえば養殖動物、ペット動物などが挙げられる。養殖動物としてはウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、ニワトリ、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽、魚類、甲殻類または貝類が例示される。ペット動物としてはイヌ、ネコなどが例示される。飼料としては体調の維持および／または改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。【００６２】
これらの発明によれば、それらを適用する前記例示するような生物において、本発明に使用される前記有効成分の第二相解毒酵素活性化阻害作用または細胞内グルタチオン増加作用に基づき、本発明の前記医薬によるのと同様の効果の発現が期待できる。すなわち、本発明の飼料は、当該生物における毒物が原因となって起こる各種疾患の治療または予防を行なうことができ、例えば、毒物が原因となって起こる各種疾患の発症リスクを低減させることができる。【００６３】
本発明に使用される前記有効成分は通常、対象生物１日当り好ましくは０．００５〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重となるように投与される。投与は、たとえば、当該有効成分を、対象生物に供する人工配合飼料の原料中に添加混合しておくか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加混合することで行うことができる。また、前記有効成分の飼料中の含有量は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、例えば、飼料中、好ましくは０．０００１〜１００重量％、より好ましくは０．００１〜６０重量％、更に好適には０．０１〜３０重量％である。【００６４】
本発明の飼料の製造法に特に限定はなく、また配合も一般の飼料に準ずるものであればよく、製造された飼料中に本発明に係る前記有効成分が含まれていればよい。生物飼育用剤も同様にして調製することができる。【００６５】
本発明においては、例えば、第二相解毒酵素活性化阻害作用または細胞内グルタチオン増加作用を有する本発明に使用される前記有効成分を含んでなる飼料を摂取させたり、または本発明に使用される前記有効成分の含有液（例えば、前記浸漬剤を水に溶解させたもの）に対象生物を浸漬したりすることにより、家畜、実験動物、家禽、ペット動物などの体調を良好に維持し、または、改善させたりすることができる。なお、これらの態様は本発明における生物の飼育方法の一態様である。【００６６】
本発明で使用される前記有効成分は、その作用発現にとっての有効量の投与を生体に行っても毒性は認められない。たとえば経口投与の場合、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、それらの混合物、もしくはＤＧＥをそれぞれ２０００ｍｇ／ｋｇ体重でマウスに単回投与しても死亡例は認められない。また、前記有効成分は、ラットへの経口投与において２０００ｍｇ／ｋｇ体重を経口単回投与しても死亡例は認められない。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は特に記載がなければすべて容量％を意味する。【００６８】
調製例１  アガロビオースの調製
寒天（アガー・ノーブル）を１０％濃度となるように０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１９分間加熱した。水で平衡化したトヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）ＨＷ４０Ｃ（東ソー社製）カラム（４．４ｃｍ×８５ｃｍ）に上記試料１０ｍｌをアプライし、毎分１．４ｍｌの流速で水を移動相としてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出する物質は示差屈折計で検出し、７ｍｌずつ分取した。
溶出時間４０６分、４３５分、４７１分および５２４分にピークが認められ、各ピークに対応する画分をシリカゲル６０シートＦ254（メルク社製）にスポットして１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：１で展開し、オルシノール−硫酸法で分析したところ、５２４分のピークはアガロビオースであることが明らかになった。この画分を凍結乾燥して１４０ｍｇのアガロビオースを得た。【００６９】
調製例２  Ｌ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（ＤＧＥ）の調製
市販の寒天（アガー・ノーブル）２．５ｇを５０ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁し、１００℃で１３分間加熱して溶解した。室温まで冷却してＮａＯＨでｐＨ１２に調整し、次いで中和処理を行った。
中和処理物に対し下記の順相ＨＰＬＣを行い、各ピークを分取し、減圧下乾固した後に水に溶解した。ＨＬ−６０細胞を用いて、各画分の癌細胞増殖抑制活性を測定し、保持時間４．０５分〜４．１６分の画分に癌細胞増殖抑制活性を確認した。
次に、この保持時間４．０５分〜４．１６分の画分を大量に分取し、構造解析を行い、この画分がＬ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（Ｌ−ｇｌｙｃｅｒｏ−１，５−ｅｐｏｘｙ−１αβ，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｉｓ−ｈｅｘａ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ：ＤＧＥ）であることを確認した。以下に順相ＨＰＬＣの条件を示す：
カラム：ＰＡＬＰＡＫ  ＴｙｐｅＳ
（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、宝酒造社製）
移動相Ａ：９０％アセトニトリル水溶液
移動相Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
流速：１ｍｌ／分
溶出：移動相Ａ（１０分間）→移動相Ａから移動相Ｂへの直線濃度勾配
（４０分間）→移動相Ｂ（１０分間）
検出：１９５ｎｍにおける吸光度
カラム温度：４０℃【００７０】
実施例１  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の増強作用の評価（１）
１０％ウシ胎児血清（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）含有、ダルベッコ改良イーグル培地（シグマ社製）にＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０２６）を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに０．２ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。次に、ダルベッコ改良イーグル培地に交換し、各ウェルにそれぞれ被験物水溶液を０．４μｌ添加し、２４時間培養した。被験物には調製例１で得られたアガロビオース、市販のアガロオリゴ糖（商品名：アガオリゴ、タカラバイオ（株）製、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオースをそれぞれ約２０〜２５％含有）を用いた。なお、陰性対照として水添加の区分を設定した。培養終了後、培地を除きリン酸緩衝塩溶液で細胞を洗浄した。次に０．１ｍｌの細胞溶解液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），３８．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ−４０）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、酵素溶液とした。酵素溶液２５μｌに、１５５μｌの反応溶液（０．１３Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５），１．３ｍＭ  グルタチオン）を添加した。測定直前に２０μｌの反応基質１０ｍＭ  ＣＤＮＢ（２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ：東京化成社製）を添加し、３４０ｎｍの吸光度変化を測定した。測定は全て３連で行った。また、タンパク量は、酵素溶液をリン酸緩衝塩溶液で５０倍希釈し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。なお、被験物は、表に示す濃度となるように添加した。また、ＧＳＴ活性はコントロールに対するＧＳＴ相対活性として以下の式により算出した。【００７１】
ＧＳＴ活性  ＝  （被験物添加区分の最大レート係数  ÷  被験物添加区分のタンパク量）  ÷  （水添加区分の最大レート係数  ÷  水添加区分のタンパク量）【００７２】
この結果を以下の表１に示す。すなわち、表１は各被験物を添加した細胞におけるＧＳＴ活性を示すものであり、アガロオリゴ糖およびアガロビオースにより顕著なＧＳＴ活性の上昇が認められた。【００７３】
【表１】
2008047663.tif 000005
【００７４】
実施例２  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の増強作用の評価（２）
調製例２で得られたＤＧＥのＧＳＴ活性測定を実施例１に従って行った。測定は、全て３連で行った。なお、ＧＳＴ活性は、コントロールに対するＧＳＴ相対活性として実施例１と同様の式により算出した。
この結果を以下の表２に示す。すなわち、表２はＤＧＥを添加した細胞におけるＧＳＴ活性を示すものであり、ＤＧＥにより顕著なＧＳＴ活性の上昇が認められた。【００７５】
【表２】
2008047663.tif 000006
【００７６】
実施例３  キノンレダクターゼ（ＱＲ）活性の測定
ＱＲ活性測定は、Ｈａｎｓ  Ｊ．  Ｐｒｏｃｈａｓｋａ  ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６９，  ３２８−３３６（１９８８））の方法を一部改良して行った。１０％ウシ胎児血清、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有、ダルベッコ改良イーグル培地にＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに０．２ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。次に、ダルベッコ改良イーグル培地に交換し、各ウェルにそれぞれ被験物水溶液を０．４μｌ添加し、２４時間培養した。被験物には調製例１で得られたアガロビオース、市販のアガロオリゴ糖（商品名：アガオリゴ）を用いた。なお、陰性対照として水添加の区分を設定した。培養終了後、培地を除きリン酸緩衝塩溶液で細胞を洗浄した。次に０．１ｍｌの細胞溶解液（２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８），１％  ＮＰ−４０）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、酵素溶液とした。酵素溶液２５μｌに、１００μｌの反応溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．６７％  ＢＳＡ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０，５μＭ  ＦＡＤ，１ｍＭ  Ｇ６Ｐ，３０μＭ  ＮＡＤＰ，０．３ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ，２Ｕ／ｍｌ  Ｇ６ＰＤＨ（シグマ社製））を添加した。この時、基質ありとなしを設定し、基質ありには反応溶液にさらに終濃度５０μＭになるようにｍｅｎａｄｉｏｎ（シグマ社製）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、７５μｌの２Ｎ  Ｎａ２ＣＯ３を添加して反応を停止し、５９０ｎｍの吸光度を測定した。測定は全て３連で行った。また、タンパク量は、酵素溶液をリン酸緩衝塩溶液で５０倍希釈し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定した。なお、被験物は、表に示す濃度となるように添加した。また、ＱＲ活性はコントロールに対するＱＲ相対活性として以下の式により算出した。【００７７】
ＱＲ活性  ＝  （（被験物添加区分の基質ありの吸光度  −  被験物添加区分の基質なしの吸光度）  ÷  被験物添加区分のタンパク量）  ÷  （（水添加区分の基質ありの吸光度−水添加区分の基質なしの吸光度）  ÷  水添加区分のタンパク量）【００７８】
この結果を以下の表３に示す。すなわち、表３は各被験物を添加した細胞におけるＱＲ活性を示すものであり、アガロオリゴ糖およびアガロビオースにより顕著なＱＲ活性の上昇が認められた。【００７９】
【表３】
2008047663.tif 000007
【００８０】
実施例４  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）  ｍＲＮＡの発現誘導作用の評価
１０％ウシ胎児血清、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有、ダルベッコ改良イーグル培地にＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、６穴プレートのウェルに５ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。次に、ダルベッコ改良イーグル培地に交換し、ウェルに被験物として終濃度１００μｇ／ｍｌになるように市販のアガロオリゴ糖（商品名：アガオリゴ）水溶液を添加し、１６時間培養した。なお、陰性対照として水添加の区分を設定した。培養終了後、培地を除き０．５ｍｌのＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ社製）を加え、細胞を１．５ｍｌのエッペンチューブに回収した。室温で５分間放置し、０．１ｍｌのクロロホルムを加え、乳白色になるまでよく振り混ぜた。室温で５分間放置し、１０，０００ｒｐｍ  １５分間  ４℃で遠心し、上清を別のエッペンチューブに移した。これに０．２５ｍｌのイソプロパノールを加え、よく混合し、室温で１０分間放置した。１０，０００ｒｐｍ  １０分間  ４℃で遠心し、得られた沈殿を０．５ｍｌの７５％ＥｔＯＨで洗浄した。１０，０００ｒｐｍ  ５分間  ４℃で遠心後、沈殿を乾燥させた。２０μｌの注射用水で溶解し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ水溶液を得た。逆転写反応およびリアルタイムＰＣＲは、ＥｘＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲには、ＧＳＴ特異的なプライマーと、対照としてトランスフェリンレセプター（Ｔｆｒｃ）特異的プライマーを用いた。測定は、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて行った。測定は、全て２連で行った。なお、ＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量は、コントロールに対するＧＳＴ  ｍＲＮＡ相対量として以下の式により算出した。【００８１】
ＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量  ＝  （被験物添加区分のＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量  ÷  被験物添加区分のＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）  ÷  （水添加区分のＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量  ÷  水添加区分のＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）【００８２】
この結果を以下の表４に示す。すなわち、表４はアガロオリゴ糖を添加した細胞におけるＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現量を示すものであり、アガロオリゴ糖に顕著なＧＳＴ  ｍＲＮＡ発現誘導活性が認められた。【００８３】
【表４】
2008047663.tif 000008
【００８４】
実施例５  キノンレダクターゼ（ＱＲ）  ｍＲＮＡの発現誘導作用の評価
アガロオリゴ糖のＱＲ  ｍＲＮＡ発現誘導活性を実施例４の方法に従って測定した。被験物として、市販のアガロオリゴ糖（商品名：アガオリゴ）を用いた。測定は、全て２連で行った。なお、ＱＲ  ｍＲＮＡ発現量は、コントロールに対するＱＲ  ｍＲＮＡ相対量として以下の式により算出した。【００８５】
ＱＲ  ｍＲＮＡ発現量  ＝  （被験物添加区分のＱＲ  ｍＲＮＡ発現量  ÷  被験物添加区分のＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）  ÷  （水添加区分のＱＲ  ｍＲＮＡ発現量  ÷  水添加区分のＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）【００８６】
この結果を以下の表５に示す。すなわち、表５はアガロオリゴ糖を添加した細胞におけるＱＲ  ｍＲＮＡ発現量を示すものであり、アガロオリゴ糖に顕著なＱＲ  ｍＲＮＡ発現誘導活性が認められた。【００８７】
【表５】
2008047663.tif 000009
【００８８】
実施例６  ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）活性の増強作用の評価
ＵＧＴ活性は、Ｂ．Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，  Ｐ．  Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７７，  ｐ１６９（１９８１））の方法を一部改良して行った。１０％ウシ胎児血清、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有、ダルベッコ改良イーグル培地にＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、１２穴プレートのウェルに２ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。次に、ダルベッコ改良イーグル培地に交換し、各ウェルに被験物として市販のアガロオリゴ糖（商品名：アガオリゴ）の水溶液を４μｌ添加し、２４時間培養した。なお、陰性対照として水添加の区分を設定した。培養終了後、培地を除きリン酸緩衝塩溶液で細胞を洗浄した。次に凍結融解を行った後、０．２ｍｌの反応液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１５ｍＭ  ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ，ナカライテスク社製））を加えよく攪拌し、氷中で３０分間インキュベートした。この酵素溶液８０μｌを９６穴マイクロタイタープレートに移し、２０μｌの２０ｍＭグルクロン酸（和光純薬社製）を添加する画分と添加しない画分を設定し、３７℃で１時間インキュベートした。
また、既知濃度のＰＮＰを用いて検量線を作成した。その後、１００μｌの２Ｍグリシンバッファー（ｐＨ１０．４）を加え、４０５ｎｍの吸光度を測定した。測定は全て３連で行った。なお、被験物は、表に示す濃度となるように添加した。また、ＵＧＴ活性はコントロールに対する抱合されたＰＮＰの量比とし、以下の式により算出した。【００８９】
ＵＧＴ活性  ＝  （（グルクロン酸なしの被験物添加区分のＰＮＰ量）  ―  （グルクロン酸ありの被験物添加区分のＰＮＰ量））  ÷  （（グルクロン酸なしの水添加区分のＰＮＰ量）  ―  （グルクロン酸ありの水添加区分のＰＮＰ量））【００９０】
この結果を以下の表６に示す。すなわち、表６はアガロオリゴ糖を添加した細胞におけるＵＧＴ活性を示すものであり、アガロオリゴ糖に顕著なＵＧＴ活性の上昇が認められた。【００９１】
【表６】
2008047663.tif 000010
【００９２】
実施例７  ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）  ｍＲＮＡの発現誘導作用の評価
アガロオリゴ糖のＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現誘導活性を実施例４の方法に従って測定した。被験物として、市販のアガロオリゴ糖（商品名：アガオリゴ）を用いた。測定は、全て２連で行った。なお、ＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量は、コントロールに対するＵＧＴ  ｍＲＮＡ相対量として以下の式により算出した。【００９３】
ＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量  ＝  （被験物添加区分のＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量  ÷  被験物添加区分のＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）  ÷  （水添加区分のＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量  ÷  水添加区分のＴｆｒｃ  ｍＲＮＡ発現量）【００９４】
この結果を以下の表７に示す。すなわち、表７はアガロオリゴ糖を添加した細胞におけるＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現量を示すものであり、アガロオリゴ糖に顕著なＵＧＴ  ｍＲＮＡ発現誘導活性が認められた。【００９５】
【表７】
2008047663.tif 000011
【００９６】
実施例８  細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）量増加作用の評価
ＧＳＨ量の測定は、Ｃｌａｒｉｓｓａ  Ｇｅｒｈａｕｓｅｒら  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７，  ２７２−２７８（１９９７））の方法を一部改良して行った。１０％ウシ胎児血清、１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有、ダルベッコ改良イーグル培地にＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに０．２ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。次に、ダルベッコ改良イーグル培地に交換し、各ウェルにそれぞれ被験物水溶液を０．４μＬ添加し、２４時間培養した。被験物には調製例１で得られたアガロビオース、市販のアガロオリゴ糖（商品名：アガオリゴ）を用いた。なお、陰性対照として水添加の区分を設定した。培養終了後、培地を除き、リン酸緩衝塩溶液で細胞を洗浄した。溶液を除き、凍結融解を３回繰り返した後、０．１ｍｌのバッファーＡ（１２５μＭ  リン酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５），６．３ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、細胞溶解液とした。細胞溶解液２５μｌに、１００μｌの反応溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  Ｇ６Ｐ，３０μＭ  ＮＡＤＰ，２Ｕ／ｍｌ  Ｇ６ＰＤＨ，０．２５Ｕ／ｍｌ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  （シグマ社製），０．６ｍＭ  ＤＴＮＢ）を添加した。室温で５分間インキュベートした後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。測定は全て３連で行った。スタンダートとして、細胞溶解液の代わりに２−２００μｌのＧＳＨを２倍希釈列にした溶液を同時に測定した。また、タンパク量は、細胞溶解液をリン酸緩衝塩溶液で５０倍希釈し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定した。
なお、被験物は、表に示す濃度となるように添加した。また、ＧＳＨ量はコントロールに対するＧＳＨ相対量として以下の式により算出した。【００９７】
ＧＳＨ量  ＝  （被験物添加区分のＧＳＨ量  ÷  被験物添加区分のタンパク量）  ÷  （添加区分のＧＳＨ量  ÷  水添加区分のタンパク量）【００９８】
この結果を以下の表８に示す。すなわち、表８は各被験物を添加した細胞内のＧＳＨ量を示すものであり、アガロオリゴ糖およびアガロビオースにより顕著なＧＳＨ量の上昇が認められた。【００９９】
【表８】
2008047663.tif 000012
【０１００】
比較例  ネオアガロオリゴ糖のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性、キノンレダクターゼ（ＱＲ）活性の増強作用の評価
ネオアガロオリゴ糖としてネオアガロヘキサオースのＧＳＴ活性とＱＲ活性の増強作用をそれぞれ実施例１と実施例３と同様の方法で評価した。その結果を表９に示す。すなわち、表９はネオアガロヘキサオースを添加した細胞におけるＧＳＴ活性、ＱＲ活性を示すものであり、ネオアガロヘキサオースに有意なＧＳＴ活性とＱＲ活性の上昇は認められなかった。【０１０１】
【表９】
2008047663.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明により、寒天、アガロース、３，６−アンハイドロガラクトピラノースを還元末端に有するアガロースの低分子化物、上記式（化１）で表される化合物、それらの誘導体およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する、第二相解毒酵素活性増強剤又は細胞内グルタチオン量増加剤、当該剤を含有する医薬、食品または飼料が提供される。当該剤を含有する医薬、食品または飼料は、その第二相解毒酵素活性増強作用、細胞内グルタチオン量増加作用により、解毒作用を亢進することから、各種疾患への治療用または予防用の医薬、食品または飲料、特に疾病リスクを低減させる疾患予防用の医薬又は機能性食品として、極めて有用である。
【国際調査報告】
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