(57)【要約】  バチルス属に属する細菌の発酵産物、培養上清および／または培養物を有効成分とする腸上皮細胞からの活性酸素の産生抑制剤、腸上皮細胞からのＩＬ−８の産生抑制剤ならびに炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤が開示される。好ましくは、バチルス属に属する細菌はバチルス・ズブチリスであり、より好ましくはバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である。本発明の腸上皮細胞からの活性酸素の産生抑制剤、腸上皮細胞からのＩＬ−８の産生抑制剤ならびに炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤は、経口的に与えることができ、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群などの疾患の治療および予防に有用である。
2008069102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属に属する細菌の発酵産物を有効成分とする腸上皮細胞からの活性酸素の産生抑制剤。
【請求項２】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１記載の活性酸素の産生抑制剤。
【請求項３】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項１または２に記載の活性酸素の産生抑制剤。
【請求項４】
バチルス属に属する細菌の発酵産物を有効成分とする腸上皮細胞からのＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項５】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項４記載のＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項６】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項４または５に記載のＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項７】
バチルス属に属する細菌の発酵産物を有効成分とする炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項８】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項７記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項９】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項７または８に記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１０】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である請求項７−９のいずれかに記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１１】
バチルス属に属する細菌の培養上清を有効成分とする腸上皮細胞からの活性酸素の産生抑制剤。
【請求項１２】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１記載の活性酸素の産生抑制剤。
【請求項１３】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項１１または１２に記載の活性酸素の産生抑制剤。
【請求項１４】
バチルス属に属する細菌の培養上清を有効成分とする腸上皮細胞からのＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項１５】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１４記載のＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項１６】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項１４または１５に記載のＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項１７】
バチルス属に属する細菌の培養上清を有効成分とする炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１８】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１７記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１９】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項１７または１８に記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２０】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である請求項１７−１９のいずれかに記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２１】
バチルス属に属する細菌の培養物を有効成分とする腸上皮細胞からの活性酸素の産生抑制剤。
【請求項２２】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項２１記載の活性酸素の産生抑制剤。
【請求項２３】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項２１または２２に記載の活性酸素の産生抑制剤。
【請求項２４】
バチルス属に属する細菌の培養物を有効成分とする腸上皮細胞からのＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項２５】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項２４記載のＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項２６】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項２４または２５に記載のＩＬ−８の産生抑制剤。
【請求項２７】
バチルス属に属する細菌の培養物を有効成分とする炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２８】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスである請求項２７記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２９】
バチルス属に属する細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である請求項２７または２８に記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項３０】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である請求項２７−２９のいずれかに記載の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤、特に腸上皮細胞のTNF-α刺激による腸上皮細胞由来活性酸素生産抑制および腸上皮細胞由来IL-8産生抑制剤を提供する。本発明の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤は、経口経路によって与えることができ、ヒト消化管における潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患、ないしは炎症との関連が示唆される過敏性腸症候群などを予防し、これらの疾患に伴う血便、下血、腹痛、体重減少、および食欲不振などの諸症状の改善、ならびにこれらの疾患に伴う便秘、下痢、ガス、腹痛などの諸症状を予防、治療又は寛解することができる。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患(IBD)の代表的な疾患には、潰瘍性大腸炎(UC)とクローン病(CD)があり、これらの疾患は、欧米において患者数が多く、近年、日本における症例数も増加傾向にある。これらの疾患は主に10〜20代の若者の発病が多く、腸管に広く炎症や潰瘍が生じ、腹痛や下痢を呈する。症状としては、学童期における成長遅延、直腸脱、鉄欠乏、ないし貧血、消耗、倦怠感、発熱、体重減少などが報告されている。また結腸癌への移行が頻繁に生じることが知られている。現在のところ病因は不明であり、再燃と緩解を繰り返す難治性の疾患である。臨床的知見やノックアウトマウスモデルによる解析から、これら疾患における組織障害では、腸内細菌をはじめ種々の腸管腔に存在する抗原に対する粘膜免疫寛容の破綻と免疫担当細胞の活性化が生じ、炎症が惹起されることが示唆されている。またマクロファージに由来する炎症性サイトカインの過剰産生が認められている。一方、臨床的には確立された有効な治療は無く、現在栄養療法およびサルファ剤やステロイド剤、5-ASA誘導体などを用いた薬物療法や免疫抑制剤などの使用、もしくはこれらの組み合わせ療法が症例ごとに検討されている。【０００３】
一方、過敏性腸症候群(IBS)の有病率は一般人口の10〜15％で１年間の罹患率は1〜2％と概算される。主要文明国では過敏性腸症候群が医療費の増加に及ぼす影響が大きい。さらに過敏性腸症候群による生活の質（QOL）の低下による経済的損失も大きい。治療法については心理的なコントロールを行うとともに、抗コリン剤、緩下剤、整腸剤、粘膜麻痺剤、自律神経調節剤、抗不安剤、抗うつ剤、睡眠薬、抗精神病薬など、症状に応じた段階的な薬物療法が施されている。しかしこれら薬物による副作用が問題となっている。【０００４】
炎症性腸疾患治療にも分子生物学的手法が応用され、炎症を断ち切るための抗サイトカイン療法が適用されるようになった。これらの療法は、有効率は高いものの、なお副作用には注意が必要とされている。【０００５】
炎症性腸疾患の発症、再燃については遺伝的素因、ならびに食事や腸内細菌などの環境因子の影響との相乗効果が考えられ、これらによってもたされる免疫の調節異常が疾患に大きな影響を及ぼしていると考えられる。近年、腸内細菌、特にバクテロイデス属細菌と炎症性腸疾患との因果関係がクローズアップされ、疾患の治療に有効でありかつ副作用の無いプレバイオテクスやプロバイオテクスが注目されており、腸内細菌のバランスの是正や粘膜防御機構の制御が治療上における新しい戦略になると考えられている。また、乳酸菌ラクトバチルス・ガセリが潰瘍性大腸炎の病態に対して防御効果を有することが報告されている（特開２００３-９５９６３号）。【０００６】
これらの炎症性腸疾患の発症原因は腸粘膜免疫系の調節の破錠に伴ったサイトカイン産生異常など免疫系の異常が考えられるが、そのメカニズムについてはほとんど解明されていない。しかしながら活動期腸管粘膜ではマクロファージより産生される腫瘍壊死因子（TNF-α）やインターロイキンIL-1、IL-6、IL-8、インターフェロンγなどの炎症性サイトカインが過剰に産生されていることが明らかにされている。TNF-αやIL-8等炎症性サイトカインの抑制剤は、免疫系を調節する作用があり、過敏性腸症候群を含め、上記したすべての腸疾患に関して、下痢や腹痛、出血など様々な症状を改善すると考えられる。【０００７】
このような理由から、炎症性腸疾患の発症メカニズムの解明と、安全で有効な炎症性腸疾患の予防治療剤の開発が望まれている。【０００８】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【特許文献１】特開２００３-９５９６３号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、バチルス・ズブチリス種の細菌、とりわけC-3102の菌体およびまたはその発酵産物が、腸管上皮細胞においてTNF-α誘導性の活性酸素産生抑制およびIL-8産生抑制作用を有することを見いだして本発明を完成させた。【００１０】
本発明は、バチルス属に属する細菌の発酵産物、培養上清、または培養物を有効成分とする、腸上皮細胞からの活性酸素の産生抑制剤ならびに腸上皮細胞からのＩＬ−８の産生抑制剤を提供する。別の観点においては、本発明は、バチルス属に属する細菌の発酵産物、培養上清、または培養物を有効成分とする、炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤を提供する。好ましくは、バチルス属に属する細菌はバチルス・ズブチリスであり、より好ましくは、バチルス・ズブチリスＣ−３１０２（FERM  BP-1096）である。また好ましくは、炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎である。【００１１】
本明細書においては、「培養物」とはバチルス属に属する細菌を適当な培地で培養して得られる、細菌菌体、培地および発酵生成物を含む混合物を表す。「発酵産物」とは培養物のうち菌体以外の部分を表し、培養物から菌体を除いて得られる調製物を含む。また、「発酵産物」には培養物から菌体以外の発酵生成物含有物を抽出したものも含まれる。特に液体培地を用いる場合の「発酵産物」を「培養上清」と称する。なお、「発酵産物」および「培養上清」は、培養物から菌体を除去するために当該技術分野において通常用いられる手段、例えば濾過や遠心分離の操作により得ることができる。なお、発酵産物、培養上清は、遠心分離などの操作により得た場合、菌体、または、その断片が全く存在しないことを意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ヒト大腸癌由来細胞株における、TNF-α刺激によるO2-の産生量の増強に与えるC-3102生菌の前処理の効果を示す。
【図２】図２は、ヒト大腸癌由来細胞株における、TNF-α刺激によるO2-の産生量増強に与えるC-3102生菌、死菌および培養上清の前処理の効果を示す。
【図３】図３は、ヒト大腸癌由来細胞株における、TNF-α刺激によるO2-の産生量増強に与えるC-3102培養上清の前処理の影響を示す。
【図４】図４は、ヒト大腸癌由来細胞株における、TNF-刺激によるIL-8  mRNAの発現に与えるC-3102生菌、死菌、培養上清の効果を示す。
【図５】図５は、C-3102培養上清がTNF-αに及ぼす作用の検討結果を示す。
【図６】図６は、C-3102株大豆培養物を添加した飼料を与えたDSS誘発潰瘍性大腸炎モデルラットの体重の推移を示す。
【図７】図７は、C-3102株大豆培養物を添加した飼料を与えたDSS誘発潰瘍性大腸炎モデルラットの血便、下血など症状の発生率を示す。
【図８】図８は、C-3102株大豆培養物を添加した飼料を与えたDSS誘発潰瘍性大腸炎モデルの血漿中のIL-8発現率を示す。
【図９】図９は、C-3102株大豆培養物を添加した飼料を与えたDSS誘発潰瘍性大腸炎モデルラットの体重の推移を示す。
【図１０−１】図１０−１は、C-3102株大豆培養物を添加した飼料を与えたDSS誘発潰瘍性大腸炎モデルラットの血便、下血など症状の発生率を示す。
【図１０−２】図１０−２は、C-3102株大豆培養物を添加した飼料を与えたDSS誘発潰瘍性大腸炎モデルラットの血便、下血など症状の発生率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
バチルス属の菌（Bacillus  subtilisを含む）は古くからヒトの食生活に深くかかわっており、その機能性についての情報は多いが、炎症性腸疾患の予防や治療の効果があることは未だ報告されていない。【００１４】
本発明においては、下記の実施例に示されるように、バチルス属に属する細菌の培養物がDSS（Dextran  Sulfate  sodium）モデルにおいて潰瘍性大腸炎の治療・予防効果を示すことが実証された。さらに、一時的な大腸の炎症は臓器の感覚機能を変化させて過敏性腸症候群の症状発現に先行することが知られており、結腸直腸拡張による自律神経の応答を評価するラットでの試験系で炎症の誘発剤としてTNBS（Trinitrobenzene  Sulfonic  Acid）が使用されている（Adam  B,et  al.,2006,Pain  123(1-2):179-86）。この試薬はDSSと同様に潰瘍性大腸炎の試験系でも用いられているものであり（Charles  O.Elson,et  al.,1995,Gastroenterology  109:1344-1367）、本発明にかかるバチルス属に属する細菌の培養物は過敏性腸症候群に対しても治療・予防効果を示すと考えられる。【００１５】
すなわち、本発明において、バチルス・ズブチリスC-3102が炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群への予防ないし治療効果を有することが明らかになった。加えて、C-3102培養上清がヒトの大腸上皮細胞に対するTNF-α刺激に起因する活性酸素およびIL-8産生抑制作用を示すことが見出された。下記の実施例に示されるように、バチルス・ズブチリスC-3102株の培養上清画分で前処理したヒト大腸上皮細胞では、TNF-α刺激によるIL-8  mRNAの発現が抑制され、抗炎症作用が認められた。また、培養上清とTNF-αをあらかじめ37℃で反応させた場合、TNF-α刺激によるO2-の産生の抑制およびIL-8  mRNAの発現が抑制された。このことから、C-3102によって細胞外に分泌される因子が炎症性サイトカインのTNF-αの作用の中和に関与していることが示唆された。【００１６】
本発明の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤は、バチルス属に属する細菌の培養物、好ましくはバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養物を有効成分として含むことを特徴とする。バチルス・ズブチリスの菌学的性質はバージーズ・マニュアル・オブ・バクテリオロジー  Ｖｏｌ．１１（１９８６）等に記載されており、具体的には例えば以下の特徴を有する。
（１）グラム陽性
（２）卵円形の芽胞を形成
（３）桿菌
（４）運動性：あり
（５）好気性
（６）カタラーゼ：陽性
（７）５０℃における発育：＋
（８）ｐＨ５．７における発育：＋
（９）クエン酸塩の利用：＋
（１０）糖類からの酸生成の有無：アラビノース、グルコース、キシロース、マンニット：＋
（１１）ＶＰ反応：＋
（１２）デンプンの加水分解：＋
（１３）硝酸塩の還元性：＋
（１４）インドールの生成：−
（１５）ゼラチンの加水分解：＋
（１６）カゼインの加水分解：＋
（１７）液体培地での被膜形成：＋
（１８）牛乳の凝固：−
（１９）牛乳のペプトン化：＋【００１７】
本発明の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤に用いるバチルス・ズブチリスとしては、例えば、バチルス・ズブチリスＣ−３１０２株（生命工学工業技術研究所寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６、寄託日１９８５年１２月２５日）を挙げることができる。【００１８】
バチルス・ズブチリスは、例えば、特開昭63-209580に記載の方法により得ることができる。培地としては、微生物培養に通常使用される炭素源、窒素源、無機物等を含む液体培地又は固体培地を用いて培養することができる。炭素源としては、バチルス・ズブチリスが資化可能な炭素源であればよく、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、スターチ、糖蜜等を、また窒素源としては、例えばペプトン、カゼイン加水分解物、肉エキス、硫安等を挙げることができる。更に、必要に応じて燐酸、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、鉄およびマンガン等の塩類、ビタミン類、アミノ酸類、界面活性剤等を添加することもできる。また、これらの合成培地の他、大豆油かすなどの天然物由来物質を用いて培養してもよい。培養条件としては、好気的条件が好ましく、培養装置としては例えばジャーファーメンターによる通気撹拌液体培養、棚式固体培養、自動製麹培養装置等が好ましく、培養温度は２０〜５０℃、特に３０〜４５℃が好ましく、培養時間は１２時間〜７日間、培養初発ｐＨはｐＨ５〜９、特に好ましくはｐＨ６〜８である。【００１９】
このようにして得られた培養物は、そのまま用いてもよく、培養物を濃縮して用いてもよい。あるいは、濾過、遠心分離、抽出などの方法により、培養物から菌体を分離して発酵産物または培養上清を調製して用いてもよい。さらに、これらの培養物、発酵産物または培養上清に賦形剤等を加えて乾燥粉末、顆粒、錠剤等の製剤として用いてもよい。特に好ましい態様においては、バチルス・ズブチリスは、大豆油かす、大豆煮豆、小豆煮豆、米飯、麦飯、小麦ふすま、煮とうもろこし、その他の穀類などの食用に適した天然物由来物質用いて培養し、培養物から菌体を分離することなく、そのまま食品に配合する。【００２０】
本発明の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤は、液体、粉末、造粒物、錠剤等の形で投与してもよく、食品添加物として飲食品中に配合して摂取してもよい。飲食品としては、例えば、飲料、製菓錠菓、ペースト、パン、魚肉加工製品、乳製品などが挙げられる。本発明の炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防および治療剤をこれらの様々な食品素材に添加して、健康飲料、健康食品あるいは機能性食品として提供することができる。【００２１】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００６−３２９５９６号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００２３】
実施例１．バチルス・ズブチリスC-3102株がヒト大腸上皮細胞に及ぼす作用の検証
以下の実施例においては、バチルス属に属する細菌の例として、バチルス・ズブチリスＣ−３１０２株（生命工学工業技術研究所寄託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６、寄託日１９８５年１２月２５日）を用いた。バチルス・ズブチリスC-3102株の大豆培養物は家畜に対して、腸内細菌叢改善、増体、感染防御、卵殻強化、肉質改善、便臭改善等の効果があり、添加物として利用されている（特公平４−２４０２２）。またこの株の保健効果として、整腸作用、腸内腐敗産物の減少などが知られている。（腸内細菌学会誌  第18巻  第二号  93-99（2004））。【００２４】
バチルス・ズブチリスＣ−３１０２は、下記配列１及び配列２のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと約７００ｂｐｓの断片が増幅するという特徴を持つ。他のバチルス・ズブチリスでは、このＰＣＲプライマーによっては増幅は起こらない。バチルス・ズブチリスＣ−３１０２で増殖された約７００ｂｐｓの断片は、アミラーゼの配列と相同性を有しないという特徴をもち、他のバチルス・ズブチリスと明確に識別される。
配列１：５’−ＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡ−３’（配列番号１）
配列２：５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号２）【００２５】
さらに、バチルス・ズブチリスＣ−３１０２株は以下の性質を有する：
（１）プラスミドＤＮＡを有しない。
（２）ゲノムＤＮＡを調製し、制限酵素ＮｏｔＩまたはＳｆｉＩで消化してアガロース電気泳動により分離したときの消化パターンは図１に示されるとおりである。
（３）B.cerous抗菌物質を産生する。
（４）アンピシリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、リファムピン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシンに対して耐性を有しない（いずれも最小阻害濃度０．０３〜４μｇ／ｍｌ）。【００２６】
バチルス・ズブチリスC-3102株の生菌、死菌および培養上清の画分につき、TNF-αによって誘導される大腸上皮細胞の炎症の抑制作用を、活性酸素ならびにサイトカインの誘導を指標として検討した。【００２７】
材料と方法
（A）細胞
使用細胞はヒト大腸癌由来のT84細胞株を用いた。培養培地として5％牛胎児血清(FCS)、100  μg/mlストレプトマイシン、100  U/mlペニシリンを添加したDMEM/HAM-F12(1:1)混合培地（DF）を用いて培養する。T84細胞は24穴カルチャープレートまたは35  mmカルチャーディッシュにまき、37℃、5%CO2-雰囲気下で2日間培養を行った後の細胞を使用した。【００２８】
（B）C-3102凍結乾燥菌末の調製
C-3102株はTS培地（Tripticase  Soy  Broth：BBL社+2％agar）に37℃一晩単離培養し、出現したコロニーを5mlのTSブロス（上述培地のagarを除いた培地）に接種し、37℃一晩培養したものをバルクスターターとした。300mlのTSブロスに3mlのバルクスターターを加え、37℃一晩振とう培養後、遠心分離（7000rpm、20min）にて集菌した。集菌ペレットは滅菌水で洗浄し、ふたたび遠心分離して得られたペレットは一晩凍結後凍結乾燥した。このようにして得られた菌末を、（１）C-3102生菌（L）：菌末に無血清のDFを加え、15分ボルテックスミキサーで攪拌し溶解した。（２）C-3102死菌（HK）：生菌を100℃で5分間処理したのち、1,000×gで15分遠心し、ペレットに再びDFを加えて  ボルテックスミキサーで撹拌し溶解した。（３）C-3102培養上清（CM）：無血清のDFで24時間培養した菌の培養上清を0.2μmフィルターでろ過した。以上の三通りの方法で調製した。【００２９】
（C）C-3102の処理方法と条件
37℃、5%CO2-雰囲気下で2日培養を行ったT84細胞をPBSにて5回洗浄し、無血清のDFに交換した。1時間後にC-3102の生菌（L）または死菌（HK）を、T84細胞1個あたり0〜2cfuの濃度に加えた。培養上清（CM）は、C-3102の生菌を24時間培養した上清を0〜2cfu/cellの濃度に相当する量で加えた。【００３０】
（D）TNF-αの処理条件
ヒトリコンビナントTNF-α（R&D  systems社）を24穴カルチャープレートまたは35mmカルチャーディッシュで培養したT84細胞に20ng/mlの濃度で添加した。【００３１】
（E）スーパーオキシドアニオン（O2-）の測定
細胞は24穴カルチャープレートで培養し、C-3102の生菌（L）、死菌（HK）または培養上清（CM）で2時間前処理をし、TNF-α刺激を行った。24時間後の細胞をHBSSで5回洗浄し、チトクロームc（1mg/ml）+PMA溶液を加えて37℃、5％CO2-雰囲気下に1時間インキュベートした。反応液の吸光度（550nm）を測定し、残った細胞はHBSSで3回洗浄し、Lowry変法を用いて蛋白質の定量を行った。1穴あたりのO2-の産生量を算出しnmol/mg-タンパク質/hで示した。【００３２】
（F）RT-PCR
35mmカルチャーディッシュで培養し、TNF-α処理を行った細胞をPBSで3回洗浄し、ISOGEN(ニッポンジーン、富山)を用いてRNAを抽出した。得られたRNA(1μg)はTAKARA  RT-PCR  kit(タカラ、東京)を用いて逆転写を行った。得られた逆転写産物は、IL-8のプライマーセットとして、センスプライマー5’-TTGGCAGCCTTCCTGATTTCT-3’（配列番号３）;アンチセンスプライマー,  5’-TTTCCTTGGGGTCCAGACAGA-3'（配列番号４）;  グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のセンスプライマー,  5’-TCATGACCACAGTCCATGCCATCACT-3’（配列番号５）,  アンチセンスプライマー5-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGATGT-3’（配列番号６）を用いてPCRを行った。【００３３】
結果
（A）TNF-α刺激後のO2-の産生量の増強に与える生菌の前処理の効果
24穴カルチャープレートで培養したT84細胞を0〜2cfu/cellの生菌（L）で2時間前処理した後、20ng/mlのTNF-αを添加した。T84細胞からのO2-産生は、TNF-α刺激によって増強されたが、生菌（L）の前処理による影響は見られなかった。2cfu/cellでは細胞が傷害されており、細胞数の減少に伴うO2-産生の増強であると考えられた（図1）。以上の結果から、生菌（L）の前処理はTNF-α刺激によるO2-産生の増強に影響を与えないことが示唆された。【００３４】
（B）TNF-α刺激によるO2-の産生量増強に与える生菌、死菌および培養上清の前処理の効果
次に死菌（HK）および培養上清（CM）について同様の検討を行った。24穴カルチャーディッシュで培養したT84細胞を0.5cfu/cellの生菌（L）、死菌（HK）および培養上清（CM）で2時間前処理した後、20ng/mlのTNF-αを添加した。O2-は、無処理（N）と比較してTNF-α刺激（M）によって増強された。2時間の前処理による影響について検討した結果生菌ではO2-の産生に影響を与えなかった。死菌（HK）は細胞の傷害が激しく細胞がはがれておりO2-を測定することができなかった。しかしながら培養上清（CM）では、TNF-α刺激によるO2-の産生を有意に抑制していた（図2）。【００３５】
（C）TNF-α刺激によるO2-の産生量増強に与える培養上清の前処理の影響
培養上清（CM）による抑制効果が見られる濃度について以下に検討した。24穴カルチャーディッシュで培養したT84細胞を0.05〜1cfu/cellの培養上清（CM）で2時間前処理した後、20ng/mlのTNF-αを添加した。O2-は、無処理（N）と比較してTNF-α刺激（M）によって増強された。培養上清0.05cfu/cellの濃度から有意なO2-産生抑制効果が見られた（図3）。
以上の結果より、C-3102の培養上清（CM）がT84細胞において、TNF-α刺激によるO2-の産生を抑制することが示唆された。【００３６】
(D)TNF-刺激によるIL-8  mRNAの発現に与える生菌、死菌、培養上清の効果
さらに、TNF-刺激による炎症性サイトカインIL-8  mRNAの発現に与える生菌、死菌および培養上清の前処理の効果について検討した。35mmカルチャーディッシュで培養したT84細胞に20ng/mlのTNF-αを添加して継時的にIL-8  mRNAの発現をRT-PCR法を用いて解析した。T84細胞にTNF-α刺激を加えると、1時間よりIL-8  mRNAの発現が見られ3時間でピークとなった。あらかじめ0.5cfu/cellの濃度で生菌（L）、死菌（HK）、培養上清（CM）を2時間前処理した細胞に、20ng/mlの濃度のTNF-をα添加して3時間後のIL-8  mRNAについて解析した。生菌（L）、培養上清（CM）単独で2時間前処理した細胞ではIL-8  mRNAの発現が見られなかったが、死菌（HK）においてはIL-8  mRNAの発現が見られた。これは、死菌（HK）では、抗炎症成分の産生が生じないためであると考えられた。さらに同様な実験の繰り返しを行い、培養上清（CM）で前処理したものでは、IL-8  mRNAの発現が抑制され、生産物が抗炎症作用を有することを強く示唆する結果をえた。以上の結果よりTNF-α刺激によるIL-8  mRNAの発現に対しても培養上清（CM）が抑制的に作用することが明らかになった。【００３７】
(E)培養上清（CM）前処理のIL-8  mRNAの発現抑制効果
さらにこの培養上清（CM）による前処理がIL-8  mRNAの発現を抑制する効果について詳しく検討した。T84細胞を培養上清（CM）で2時間前処理後、細胞を洗浄し、TNF-αを添加したもの（CM-re）では、IL-8  mRNAの発現が抑制されなかった。このことより、培養上清（CM）はT84細胞に作用していないことが示唆された。また、培養上清（CM）を100℃で5分処理したもの（b-CM）でT84細胞を2時間前処理し、TNF-αを添加してIL-8  mRNAの発現について解析したが、抑制効果は見られなかった。このことより、培養上清（CM）中に分泌されている因子がTNF-α活性を中和する可能性が示唆された（図4）。これらの知見は、培養上清（CM）がIL-8  mRNAの発現を抑制する機構は、SODやペプチド等の既存の抗炎症因子とは異なることを示唆している。【００３８】
培養上清自体がTNF-αに直接的に作用しているかどうかについて検討を行った。あらかじめ培養上清とTNF-αを混ぜて37℃で2時間インキュベートして反応させたもの（CM+TNF-α）をT84細胞に添加し、IL-8  mRNAの発現を解析した（B）。培養上清とTNF-αをあらかじめ混ぜ合わせてインキュベートしたものではIL-8  mRNAの発現が抑制された。DFとTNF-αを同様に37℃で2時間インキュベートしたもの（M+TNF-α）では抑制効果が見られなかった。また、培養上清とTNF-αを同時に添加してもIL-8  mRNAの発現は完全には抑制されなかった。以上の結果より、C-3102の培養上清中に分泌されている何らかの因子がTNF-αに対して作用して、炎症の拡大を抑制していることが示唆された（図5）。【００３９】
実施例２．潰瘍性大腸炎モデルに対する効果
潰瘍性大腸炎モデル動物として、デキストラン硫酸ナトリウムを摂取させたラットを用いた。大豆油かす造粒品５Kgに水道水５Kgを加えて１２１℃、１２０分間殺菌して、予め前培養しておいたバチルス・ズブチリス  C-310（FERM  BP-1096）の培養液を摂取し、３７℃４０時間培養したものを乾燥粉砕して、C-3102株大豆培養物を得た。これをCE-2（日本クレア）粉末飼料に混合（約1％）した（2.5×108cfu/g）。５週齢の雄性Sprague  Dawley（IGS）ラット（1群10匹）に、飼料を約1週間自由摂取させた。対照群には、菌末のベースである大豆油かす造粒品を粉砕機にて粉砕し、試験群と同量でCE-2粉末飼料に混合したものを摂取させた。対照食、試験食の摂食期間中、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量5000、硫黄含量15.0〜20.0%、和光純薬工業）を飲水投与（3%w/v）した。【００４０】
試験期間中、体重、便性状、および血漿中のIL-8（CINC-1  IL-8：株パナファームラボラトリーズ）を測定し、試験食最終投与日の翌日に動物を犠牲死させ、解剖して、脾臓重量、結腸長さおよび盲腸重量を測定した。体重の推移を図6に、便性状を図7に、血漿中のIL-8を図8に示す。また、解剖データを表1に示す。なお、図７の★は対照群の投与日数に対して試験食群ではp<0.01（ボンフェローニ調整済みχ２検定)で有意差ありを示す。また、図７の☆は対照群の投与日数に対して試験食群ではp<0.05（ボンフェローニ調整済みχ２検定)で有意差ありを示す。【００４１】
【表１】
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【００４２】
飲水量ならびに摂食量については両群間に差は認められなかったが、体重について試験食群では対照群と比較して重く推移し、最終日には有意差が認められた（p<0.05）（図6）。また便性状については対照群では血便が2日目から認められ、試験食群では4日目、5日目、6日目、7日目ならびに8日目において有意な便性状の差が認められた（図7）。結腸の長さは試験食群で有意に長く（p<0.01）。ラット体重100g当たりの洗浄後の盲腸重量も有意に軽かった（p<0.05）（表1）。また血漿中のIL-8については、試験食群で低下傾向が認められ（図8）、炎症反応の抑制が生じている可能性を示唆している。これらの結果より、C-3102がDSSで誘発される大腸炎の病態に対し、優れた防御効果を有することを確認した。【００４３】
実施例３．潰瘍性大腸炎モデルに対す有効成分の確認試験
実施例２においてC-3102株大豆培養物に抗炎症効果が認められたため、有効成分が菌体にあるいは発酵産物、培養上清成分に存在するのかを調べた。また、C-3102株大豆培養物を水と混合しこれを遠心分離してた水抽出物を加熱処理することによりプロテアーゼ活性を有する成分を失活させ、このことが抗炎症効果に影響するかどうかを調べた。使用動物および試験方法は実施例２と同様である。ラットは1群４匹とし、試験食としては、CE-2粉末飼料に、
（１）C-3102株大豆培養物を１％添加したもの＜図9  C-3102、図10  C-3102＞、
（２）C-3102株大豆培養物の上記（１）と同量を水と混合しこれを遠心分離して水抽出物を得た。この水抽出物を凍結乾燥し、添加したもの＜図9  protease+、図10  extract＞、
（３）C-3102株大豆培養物の上記（１）と同量を水と混合しこれを遠心分離して水抽出物を得た。この水抽出物を100℃、5分間加熱後、凍結乾燥し、添加したもの＜図9  protease-、図10  Heated  extract＞、
（４）C-3102株大豆培養物の上記（１）と同量を水と混合しこれを遠心分離して水抽出物を得た。この残りの残渣を凍結乾燥したもの＜図9  残渣、図10  residue＞、
（５）大豆カス増粒物を１％添加したもの＜図9  Cont、図10  Control＞
のいずれかの飼料を調製して与えた。対照群については、実施例２に用いた対照食と同じものを与えた。プロテアーゼ活性はProtease  Assay  Kit(PIERCE社)を用いて測定した。体重の推移を図9に、また便性状の変化を図10に示した。体重の推移には群間に有意な差は認められなかった。C-3102株大豆培養物の１％添加分量を水と混合し、遠心分離して取得した水抽出物を凍結乾燥したもの（上記（２）・プロテアーゼ活性あり）を加えた飼料を与えた群については、他群よりも炎症の程度が軽く、加熱処理（上記（３）・プロテアーゼ活性なし）群については対照群（上記（５）・Control）と同程度であったため、抗炎症効果を示す有効成分は加熱失活したものと思われた。【００４４】
上記の実施例２および３に示されるように、潰瘍性大腸炎モデル試験において、飼料にC-3102株大豆培養物を1％添加することによって、体重の推移、血便および下血の発生率、大腸組織での抗炎症作用、ならびに血漿IL-8濃度の低下などで示されるように、大腸炎が抑制されていることがわかった。さらに、実施例３においては、バチルス・ズブチリスC-3102株大豆培養物の水抽出物において抗炎症作用が確認され、この作用は水抽出物を加熱することにより失われた。これらのことから、C-3102株の培養物、発酵産物、培養上清、はTNF-α刺激によって誘導される大腸上皮細胞の炎症応答を抑制する作用を持つことが示唆された。以上の結果より、バチルス・ズブチリスC-3102の菌体または、その培養物、発酵産物、培養上清を用いることにより、経口投与できる、有効性の高い炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防・治療剤を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月30日(2008.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属細菌の大豆培養物を有効成分とする腸上皮細胞からの活性酸素産生抑制剤。
【請求項２】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１記載の活性酸素産生抑制剤。
【請求項３】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項１または２に記載の活性酸素産生抑制剤。
【請求項４】
バチルス属細菌の発酵産物を有効成分とする腸上皮細胞からのＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項５】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項４記載のＩＬ−８産生抑制剤
【請求項６】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項４または５に記載のＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項７】
バチルス属細菌の大豆培養物を有効成分とする炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項８】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項７記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項９】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項７または８に記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１０】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である請求項７−９のいずれかに記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１１】
バチルス属細菌の大豆培養物水抽出物を有効成分とする腸上皮細胞からの活性酸素産生抑制剤。
【請求項１２】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１１記載の活性酸素産生抑制剤。
【請求項１３】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項１１または１２に記載の活性酸素産生抑制剤。
【請求項１４】
バチルス属細菌の培養上清を有効成分とする腸上皮細胞からのＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項１５】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１４記載のＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項１６】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項１４または１５に記載のＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項１７】
バチルス属細菌の大豆培養物水抽出物を有効成分とする炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１８】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１７記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項１９】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項１７または１８に記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２０】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である請求項１７−１９のいずれかに記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２１】
バチルス属細菌の大豆発酵産物を有効成分とする腸上皮細胞からの活性酸素産生抑制剤。
【請求項２２】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項２１記載の活性酸素産生抑制剤。
【請求項２３】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項２１または２２に記載の活性酸素産生抑制剤。
【請求項２４】
バチルス属細菌の大豆発酵産物を有効成分とする腸上皮細胞からのＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項２５】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項２４記載のＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項２６】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項２４または２５に記載のＩＬ−８産生抑制剤。
【請求項２７】
バチルス属細菌の大豆発酵産物を有効成分とする炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２８】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項２７記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項２９】
バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）である請求項２７または２８に記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【請求項３０】
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である請求項２７−２９のいずれかに記載の炎症性腸疾患及び／又は過敏性腸症候群の予防および治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ことより、培養上清（ＣＭ）中に分泌されている因子がＴＮＦ−α活性を中和する可能性が示唆された（図４）。これらの知見は、培養上清（ＣＭ）がＩＬ−８  ｍＲＮＡの発現を抑制する機構は、ＳＯＤやペプチド等の既存の抗炎症因子とは異なることを示唆している。
［００３８］
培養上清自体がＴＮＦ−αに直接的に作用しているかどうかについて検討を行った。あらかじめ培養上清とＴＮＦ−αを混ぜて３７℃で２時間インキュベートして反応させたもの（ＣＭ＋ＴＮＦ−α）をＴ８４細胞に添加し、ＩＬ−８  ｍＲＮＡの発現を解析した（Ｂ）。培養上清とＴＮＦ−αをあらかじめ混ぜ合わせてインキュベートしたものではＩＬ−８  ｍＲＮＡの発現が抑制された。ＤＦとＴＮＦ−αを同様に３７℃で２時間インキュベートしたもの（Ｍ＋ＴＮＦ−α）では抑制効果が見られなかった。また、培養上清とＴＮＦ−αを同時に添加してもＩＬ−８  ｍＲＮＡの発現は完全には抑制されなかった。以上の結果より、Ｃ−３１０２の培養上清中に分泌されている何らかの因子がＴＮＦ−αに対して作用して、炎症の拡大を抑制していることが示唆された（図５）。
［００３９］
実施例２．潰瘍性大腸炎モデルに対する効果
潰瘍性大腸炎モデル動物として、デキストラン硫酸ナトリウムを摂取させたラットを用いた。大豆油かす造粒品５Ｋｇに水道水５Ｋｇを加えて１２１℃、１２０分間殺菌して、予め前培養しておいたバチルス・ズブチリス  Ｃ−３１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６）の培養液を摂取し、３７℃４０時間培養したものを乾燥粉砕して、Ｃ−３１０２株大豆培養物を得た。これをＣＥ−２（日本クレア）粉末飼料に混合（約１％）した（２．５×１０８ｃｆｕ／ｇ）。５週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＩＧＳ）ラット（１群１０匹）に、飼料を約１週間自由摂取させた。対照群には、菌末のベースである大豆油かす造粒品を粉砕機にて粉砕し、試験群と同量でＣＥ−２粉末飼料に混合したものを摂取させた。対照食、試験食の摂食期間中、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０００、硫黄含量１５．０〜２０．０％、和光純薬工業）を飲水投与（３％ｗ／ｖ）した。
［００４０］
試験期間中、体重、便性状、および血漿中のＩＬ−８（ＣＩＮＣ−１  ＩＬ−８：株パナファームラボラトリーズ）を測定し、試験食最終投与日の翌日に動物を犠牲死させ、解剖して、脾臓重量、結腸長さおよび盲腸重量を測定した。体重の推移を図６に、便性状を図７に、血漿中のＩＬ−８を図８に示す。また、解剖データを表１に示す。なお、図７の★は対照群の投与日数に対して試験食群ではｐ＜０．０１（ボンフェローニ調整済みχ２検定）で
【国際調査報告】
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