【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年3月8日(2004.3.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇｐ１２０の抗原断片に対し特異的である抗体であって、前記抗原断片はＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０の一部、およびＤＣ−ＳＩＧＮがｇｐ１２０に結合することに伴う随伴性の構造変化によりＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０上に露出するｇｐ１２０の一部からなる群から選択されるｇｐ１２０の一部から得られるものであり、前記抗体は樹状細胞が促進するＴ細胞またはマクロファージへのＨＩＶのトランスエンハンスメントを阻害するものである、ｇｐ１２０の抗原断片に対し特異的である抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を生産する不死化細胞系。
【請求項４】
ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０結合複合体に特異的であり、Ｔ細胞またはマクロファージへのＨＩＶの侵入に対して樹状細胞がトランスエンハンスメントを促進する能力を阻害する抗体。
【請求項５】
可溶性ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ。
【請求項６】
請求項５の可溶性ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを薬学的に許容できる担体と共に含む製剤組成物。
【請求項７】
アジュバントおよびｇｐ１２０の抗原断片を含む免疫原組成物であって、前記抗原断片がＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０の一部、およびＤＣ−ＳＩＧＮがｇｐ１２０に結合することに伴う随伴性の構造変化によりＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０上に露出するｇｐ１２０の一部からなる群から選択されるｇｐ１２０の一部から得られる抗原断片である免疫原組成物。
【請求項８】
アジュバントおよびＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０結合複合体を含む免疫原組成物。
【請求項９】
Ｔ細胞またはマクロファージへのＨＩＶの侵入に対するトランスエンハンスメントを促進することができる、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するベクターで形質移入を行ったほ乳類細胞。
【請求項１０】
樹状細胞ではない請求項９に記載のほ乳類細胞。
【請求項１１】
固相担体マトリックスに結合している請求項９に記載のほ乳類細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞に生物学的液体を通過させることを含む、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合するＨＩＶエンベロープ糖蛋白質を発現するウイルスを除去するために生物学的液体を濾過する方法。
【請求項１３】
ヒト細胞である請求項９に記載のほ乳類細胞。
【請求項１４】
ヒトＣＤ４をコード化するＤＮＡ構造物、ヒト転座促進剤、およびヒトＤＣ−ＳＩＧＮを含む形質転換非ヒトほ乳類であって、この形質転換非ヒトほ乳類がＨＩＶの粘膜摂取性、ＨＩＶのリンパ器官への輸送、およびターゲットＴ細胞および／またはマクロファージのＨＩＶによる感染を行う能力を有し、前記感染がＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するＤＮＡ構築物を含まない形質転換非ヒトほ乳類と比較して、大きく強化されている形質転換非ヒトほ乳類。
【請求項１５】
ヒトサイクリンＴをコード化するＤＮＡ構築物をさらに含む請求項１４に記載の形質転換非ヒトほ乳類。
【請求項１６】
前記ヒト転座促進剤がＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３、ＢｏｂおよびＢｏｎｚｏからなる群から選択される請求項１５に記載の形質転換非ヒトほ乳類。
【請求項１７】
マウスである、請求項１４に記載の形質転換非ヒトほ乳類。
【請求項１８】
ヒト化した請求項１の抗体を投与することを含む、ＨＩＶのＴ細胞またはマクロファージへの侵入のトランスエンハンスメントを樹状細胞が促進するのを抑制することによりＨＩＶ感染を治療し、または防ぐ方法。
【請求項１９】
ＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを妨げる化合物を同定する方法において、
（ａ）第一の細胞を試験化合物の存在下でベクターと接触させるステップであって、該ベクターはＤＣ−ＳＩＧＮと結合するウイルスエンベロープ蛋白質を含み、該第一の細胞はＤＣ−ＳＩＧＮを発現するものであり、前記試験化合物が存在しないとき、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ウイルスエンベロープ蛋白質複合体が第一の細胞とベクターとの間に形成されるものであるステップと、
（ｂ）未結合ベクターと試験化合物を第一の細胞から除去するステップと、
（ｃ）第二の細胞を第一の細胞と接触させるステップであって、該第二の細胞はウイルスエンベロープ蛋白質を含むベクターの侵入を受けやすいものであるステップと、
（ｄ）第二の細胞へと侵入したベクターの量を判定するステップと、
を含む方法であって、
ステップ（ｂ）で試験化合物が存在しなかったときより、ステップ（ｂ）において試験化合物が存在したときの方が侵入したベクターの量が少なかった場合、該試験化合物をＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを防ぐ化合物と同定する方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）における前記除去が未結合ベクターと試験化合物を洗浄して第一の細胞から取り除くことを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二の細胞がＴ細胞またはマクロファージである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第二の細胞がＣＤ４と、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３、ＢｏｎｚｏおよびＢＯＢからなる群から選択される転座促進剤とを発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記転座促進剤がＣＣＲ５であり、前記ウイルスエンベロープ蛋白質がＪＲＦＬである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターがマーカー蛋白質を含み、ステップ（ｃ）が細胞中に発現されるマーカー蛋白質の量を検知することにより行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記マーカー蛋白質が、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光性蛋白質からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１９の方法により同定される化合物。
【請求項２７】
ＨＩＶ感染の治療または予防に用いる作用物質を請求項１６に記載の形質転換非ヒトほ乳類を用いて同定するためのアッセイであって、
（ａ）試験化合物を形質転換非ヒトほ乳類に投与するステップと、
（ｂ）形質転換非ヒトほ乳類をＨＩＶエンベロープ糖蛋白質を有するウイルスによって感染させるステップと、
（ｃ）形質転換非ヒトほ乳類の前記感染に対する抵抗力を測定するステップとを含む有するアッセイであって、
試験化合物の存在下で測定された形質転換非ヒトほ乳類の前記感染に対する抵抗力が試験化合物が存在しないときに測定されたものよりも統計的に大きいとき、該試験化合物をＨＩＶ感染の治療または予防に用いる作用物質として同定する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法により同定される化合物。
【請求項２９】
ＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを妨げる化合物を同定する方法であって、
（ａ）第一の細胞と、試験化合物の存在下でベクターおよび第二の細胞と接触させるステップであって、該ベクターはＤＣ−ＳＩＧＮに結合するウイルスエンベロープ蛋白質を含み、前記第一の細胞はＤＣ−ＳＩＧＮを発現し、試験化合物が存在しないとき、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ウイルスエンベロープ蛋白質複合体が第一の細胞とベクターの間に形成されるものであり、前記第二の細胞はウイルスエンベロープ蛋白質を含むベクターの侵入を受けやすい、ステップと、
（ｂ）第二の細胞に侵入したベクターの量を判定するステップと、
を含む方法であって、
試験化合物の存在下の侵入ベクターの量が試験化合物が存在しないときより少ない場合、該試験化合物をＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを妨げる化合物と同定する方法。
【請求項３０】
前記第二の細胞がＴ細胞またはマクロファージである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第二の細胞がＣＤ４と、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３、ＢｏｎｚｏおよびＢＯＢからなる群から選択される転座促進剤とを発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記転座促進剤がＣＣＲ５であり、前記ウイルスエンベロープ蛋白質がＪＲＦＬである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベクターがマーカー蛋白質を含み、ステップ（ｂ）が細胞中に発現されるマーカー蛋白質の量を検知することにより行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記マーカー蛋白質がルシフェラーゼおよび緑色蛍光性蛋白質からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２９の方法により同定される化合物。
【請求項３６】
ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞へのＨＩＶ侵入を妨げる化合物を同定する方法において、
（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞を標識抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体が細胞に侵入しない条件の下で標識抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と接触させるステップであって、ＤＣ−ＳＩＧＮは細胞の表面に存在し、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と細胞表面は結合複合体を形成しているステップと、
（ｂ）化合物の存在下または不在下で前記抗体の細胞侵入を誘導するステップであって、前記化合物の不在下で前記抗体は前記細胞へと侵入するステップと、
（ｃ）細胞表面に結合したままでいる抗体を除去するステップと、
（ｄ）細胞中の標識抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の量を判定するステップと、
を含む方法であって、
前記化合物の存在下での標識抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の細胞中の量が、不在のときより少ない場合に、前記化合物をＨＩＶの細胞侵入を妨げる化合物と同定する方法。
【請求項３７】
前記標識抗ＤＣ−ＳＩＧＮが蛍光性である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記標識抗ＤＣ−ＳＩＧＮが放射性である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞がＤＣ−ＳＩＧＮで形質移入されたＴＨＰ−１細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法により同定される化合物。
【請求項４１】
ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞へのＨＩＶ侵入を妨げる化合物を同定する方法において、
（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞を標識ＨＩＶ粒子が細胞に侵入しない条件の下で標識ＨＩＶ粒子と接触させるステップであって、ＤＣ−ＳＩＧＮは細胞の表面に存在し、ＨＩＶ粒子と細胞表面は結合複合体を形成しているステップと、
（ｂ）化合物の存在下または不在下で前記ＨＩＶ粒子の細胞侵入を誘導するステップであって、前記化合物の不在下で前記ＨＩＶ粒子は前記細胞へと侵入するステップと、
（ｃ）細胞表面に結合したままのＨＩＶ粒子を除去するステップと、
（ｄ）細胞中の標識ＨＩＶ粒子の量を判定するステップとを有するステップと
を含む方法であって、
前記化合物の存在下での標識ＨＩＶ粒子の細胞中の量が、不在のときより少ない場合に、前記化合物をＨＩＶの細胞侵入を妨げる化合物と同定する方法。
【請求項４２】
前記標識ＨＩＶ粒子が蛍光性である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記判定するステップがＦＡＣＳにより行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標識ＨＩＶ粒子が放射性である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞がＤＣ−ＳＩＧＮで形質移入されたＴＨＰ−１細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４１に記載の方法により同定される化合物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の詳細な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【政府の助成】
本発明に至った研究は国立衛生研究所からの助成金第ＡＩ３３８５６号により一部資金援助された。政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００２】
【発明の技術分野】
本発明は一般にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２をはじめとするレトロウイルスによる細胞の結合、移送および感染に関するものである。かかるプロセスを調整する作用物質を同定する方法、かかる作用物質そのもの、およびかかる作用物質の治療的使用もまた提供するものである。関連する診断方法もまた含まれる。
【０００３】
【発明の背景】
ヒト免疫不全ウイルスはＣＤ４＋マクロファージとＴヘルパー細胞に感染する。ＨＩＶ−１侵入には細胞表面が、ウイルスエンベロープ糖蛋白質の結合するＣＤ４を発現していることが必要であるが、細胞膜にウイルスエンベロープの融合が行われるにはこれだけでは十分ではないということがいくつかの研究によって示唆されている。初期の研究によれば形質移入により導入されたＣＤ４遺伝子を発現したヒト細胞はウイルスの侵入を許すが、ヒトＣＤ４を発現するマウスでは侵入が起こらないことが示されている。これらの知見からＨＩＶ−１侵入のためにはＣＤ４に加えて、種特異的な細胞表面補助因子が必要であるとの示唆が得られる。その後の研究により、形質転換Ｔ細胞株（Ｔ細胞親和性株）中で増殖するように適応させたＨＩＶ−１の株が初代単球またはマクロファージを感染することができなかった一方で、初代ウイルス株は単球およびマクロファージを感染するが形質転換Ｔ細胞株を感染しないことがわかった。親和性におけるこの差はエンベロープ糖蛋白質のｇｐ１２０サブユニットにおける特異的な配列の差からもたらされることがわかり、侵入にはＣＤ４の他に複数の細胞型−特異的補助因子が必要であるかもしれないということが示唆された。
【０００４】
ＨＩＶ侵入に必要な補助因子の性質はこれまで不明であったが、最近マクロファージ親和性（Ｍ親和性）ＨＩＶ−１株の侵入のための主たるレセプターがＣＣＲ５であること、さらにＴ細胞株親和性（Ｔ親和性）株の侵入のための主たるレセプターがＣＸＣＲ４であることが発見された。一方サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＭ親和性株とＴ親和性株は共にＣＣＲ５により媒介されるがＣＸＣＲ４では媒介されないことがわかった［Ｃｈｅｗ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：２７０５−２７１４（１９９７）；Ｍａｒｃｏｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：２５２２−２５２７（１９９７）；およびＥｄｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４００５−４０１０（１９９７）］。さらに重要なこととして、ＳＩＶ株はさらにＣＣＲ５欠損のＣＤ４＋細胞を感染することがわかった［Ｃｈｅｎ等、Ｊ．ＶｉｒｏＬ．，７１：２７０５−２７１４（１９９７）；およびＥｄｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４００５−４０１０（１９９７）］。
【０００５】
ヒトにおいてＣＣＲ５親和性ウイルスは主に伝染に関与し、より幅の広い親和性を有するウイルス、特にＣＸＣＲ４に対する親和性を有するウイルスは、免疫不全悪化時期に出現する［Ｆａｕｃｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３８４：５２９−５３４（１９９６）］。ＣＸＣＲ４親和性ウイルスの出現が免疫系衰退の原因であるのか結果であるのかはまだわかっていない。ウイルス進化におけるこの重要な問題への洞察には動物モデルにおける実験操作が必要となるであろう。免疫不全ウイルスの発病学を研究するよい動物モデルとしてはヒト以外の霊長類をＳＩＶに感染させることしかない［Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，８：５５７−５７８（１９９０）］。さらにヒト以外の霊長類の種により、そのＳＩＶ感染に対する応答も大幅に異なる。例えばアカゲザルはヒトのＡＩＤＳに極めて類似した免疫不全により死亡するがスーティマンガベーやミドリザルは免疫系に損傷を殆ど示さず感染を維持することができる［Ｋｅｓｔｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１１０９−１１１２（１９９０）］。これらの種間差はヒト免疫不全ウイルス感染患者における病気の進行を理解し、それと闘う上で重要な鍵を提供する。
【０００６】
ヒトにおけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染の伝播には感染部位の粘膜表面から、２次リンパ器官に存在するＴ細胞ゾーンへとウイルスの転移が生じることが必要であり、ここでＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー細胞およびマクロファージ中において大規模なウイルスの複製が生じる［Ｆａｕｃｉ，Ｎａｔｕｒｅ，  ３８４（６６０９）：５２９−５３４（１９９６）］。これらの細胞は、両者が合わさって感染後の初期において優勢であるＲ５ウイルス分離菌による侵入に必要とされるレセプター複合体を形成するＣＤ４とケモカインレセプターＣＣＲ５の両方を発現している［Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｃｅｌｌ，９３：６７７−６８０（１９９８）；Ｌｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４（１２）：６４２６−６４３１（１９９７）；Ｄｒａｇｉｃ等、Ｎａｔｕｒｅ，３８１：６６７−６７３（１９９６）；１９９９年８月１７日発行米国特許第５，９３９，３２０号、および１９９８年７月７日提出米国特許出願０９／１１６，４９８号、これらの内容はここにそのすべてを参照として援用する］。その他のケモカインレセプター、特にＣＸＣＲ４に対する親和性を有するウイルスは殆ど伝播されることがなく、通常感染の後期にのみ現れる。このようなＣＸＣＲ４親和性分離株はマクロファージ中では複製がうまく行われないため、マクロファージの感染がウイルス伝播における必須要素であるとの提言がなされている。
【０００７】
早期のウイルス転移の機構は明らかではないが、異なる系列の造血細胞の解剖学的分布およびインビトロの感染力研究に基づき、皮膚の中や粘膜表面に存在する未熟な樹状細胞（ＤＣ）がＨＩＶ−１の標的となる最初の細胞であると推定される。ＤＣは生体内のもっとも強力な抗原提示細胞である［Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３９２：２４５−２５２（１９９８）；Ｖａｌｉｔｕｔｔｉ等、Ｎａｔｕｒｅ，３７５：１４８−１５１（１９９５）］。末梢組織中の未熟ＤＣは効率的に抗原を捕獲し、その後２次リンパ器官のＴ細胞領域へと遊走する特異な能力を有する。移動する間にこれらの細胞は成熟し、ケモカインレセプターを初めとする、細胞表面分子の発現プロファイルを変え、抗原を捕獲する能力を失い、リンパ節中の静止Ｔ細胞を誘引し、活性化する能力を獲得する［Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３９２：２４５−２５２（１９９８）；Ａｄｅｍａ等、Ｎａｔｕｒｅ，３８７（６６３４）：７１３−７１７（１９９７）］。ＨＩＶ−１はリンパ組織中のＣＤ４＋Ｔ細胞区画へのアクセスを得るため、ＤＣの移動能力を減じると考えられている［ＳｔｅｉｎｍａｎおよびＩｎａｂａ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，６６（２）：２０５−２０８（１９９９）；Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，９（７）：Ｒ２４８−Ｒ２５０（１９９９）；およびＧｒｏｕａｒｄ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９（４）：５６３−５６７（１９９７）］。
【０００８】
未熟ＤＣは、Ｔ細胞上よりもかなり低いレベルであるにせよ、ＣＤ４とＣＣＲ５を発現し［Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：２４３３−２４３８（１９９６）；Ｒｕｂｂｅｒｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０（８）：３９３３−３９４１（１９９８）］、ＨＩＶ−１のＲ５株による感染が可能であると報告されている。一方、未熟ＤＣはＣＸＣＲ４を発現せず、ＨＩＶ−１のＣＸＣＲ４親和性分離株による感染には耐性がある［Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２７３３−２７３７（１９９８）；Ｂｌａｕｖｅｌｔ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０４３−２０５３（１９９７）；およびＷｅｉｓｓｍａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：８２６−８３０（１９９５）］。ＨＩＶ−１の未熟ＤＣへの侵入がＣＤ４非依存性機構を通じて進行するとの報告もあり［Ｂｌａｕｖｅｌｔ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０４３−２０５３（１９９７）］、ＣＤ４以外のレセプターが関与していることが示唆されている。ＤＣ内でのＨＩＶ−１複製の重要性に関し、相反する報告がなされている［Ｃａｎｑｕｅ等、Ｂｌｏｏｄ，９３（１１）：３８６６−３８７５（１９９９）；Ａｙｅｈｕｎｉｅ等、Ｂｌｏｏｄ，９０（４）：１３７９−１３８６（１９９７）；Ｃａｍｅｒｏｎ等、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，５６（３）：２５７−２６５（１９９４）］。ある状況下においては複製が観察されているが、未熟ＤＣ中の複製は不完全であり、初期のＨＩＶ−１遺伝子のみが転写されるとの報告もまたある。
【０００９】
ウイルス感染した未熟ＤＣは排出リンパ節へと遊走し、そこで一次抗ウイルス免疫反応とＴ細胞の活発な増殖性感染の両方を開始し、ＨＩＶ−１の全身的な分配を引き起こす［Ｃａｍｅｒｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７（５０６８）：３８３−３８７（１９９２）；Ｗｅｉｓｍａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：８２６−８３０（１９９５）］。しかし、サル免疫不全ウイルスによる粘膜の感染によるヒト以外の霊長類によるモデルにおいて、ウイルスの急速な播種にもかかわらず、ＤＣの増殖性感染を示すことは困難であった［Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３１）：１２６１−１２６５（１９９９）］。皮膚または血液から得たＤＣをＨＩＶ−１に暴露することにより、インビトロでの一次ＨＩＶ−１感染をモデリングしようという別の試みにより、これらの細胞がわずかにしか感染されないことが示された。それにも関わらず、単球、マクロファージ、Ｂ細胞およびＴ細胞を初めとする他の白血球ではなく、ＤＣのみがＨＩＶ−１でパルスした後マイトジェン活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養で高レベルの感染を引き起こすことができたのである［Ｃａｍｅｒｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７（５０６８）：３８３−３８７（１９９２）；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ等、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，９：２１−２９（１９９９）；Ｗｅｉｓｓｍａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：８２６−８３０（１９９５）；Ｂｌａｕｖｅｌｔ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０４３−２０５３（１９９７）；Ｃａｍｅｒｏｎ等、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，５９（２）：１５８−１７１（１９９６）］。初期の研究においてＣａｍｅｒｏｎ［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７（５０６８）：３８３−３８７（１９９２）］らはＤＣが自分自身は感染しないが、Ｔ細胞のＨＩＶによる感染を「触媒」する特異な能力を有するとの意見を呈示した。
【００１０】
このように、粘膜表面から２次リンパ器官のＴ細胞領域へのＨＩＶの媒介に関与する蛋白質を同定する必要がある。さらに、この媒介作用を妨げる作用物質を同定する方法を設計する必要がある。
【００１１】
本文中参照を引用するが、この参照は本申請に対する「従来技術」として有効であると認められるべきものではない。
【００１２】
【発明の概要】
本発明は樹状細胞に特異的に発現し、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２である膜結合レセプター、ＤＣ−ＳＩＧＮ、がＨＩＶによるＴリンパ球の感染を促進することを示すことにより、宿主側粘膜防御のウイルスによる侵害とリンパ器官中のＴ細胞の感染との間に存在するミッシングリンクを提供する。本発明はさらに少なくとも部分的にはこの知見に基づき、ＨＩＶ感染に対する予防、予防ワクチン、その治療法および新規の介入戦略を提供する。
【００１３】
本発明はしたがってｇｐ１２０の抗原断片に対し特異的である抗体を提供する。１つの実施例において、この抗原断片はＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０の一部から得られる。もう一つの実施例においてこの抗原断片はＤＣ−ＳＩＧＮがｇｐ１２０に結合することに伴う随伴性の構造変化によりＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０上に露出するｇｐ１２０の一部から得られる。本発明はまたＤＣ−ＳＩＧＮのＴ細胞および／またはマクロファージと相互作用する部分への抗体を提供する。好ましい実施例においてこの抗体はＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０結合複合体に特異的である。本発明の抗体は好ましくは樹状細胞と相互作用し、ＨＩＶのＴ細胞またはマクロファージへの侵入のトランス−エンハンスメントを促進する。
【００１４】
ある特定の実施例において、この抗体はポリクローナル抗体である。もう一つの実施例において、この抗体はモノクローナル抗体である。さらに別の実施例においてこの抗体はキメラ抗体である。このような実施例の１つにおいて、この抗体は人化抗体である。本発明はまた本発明のモノクローナル抗体を生産する不死化細胞系を提供する。
【００１５】
本発明はまたワクチンと免疫原組成物を提供する。このようなワクチンおよび免疫原組成物は好ましくはアジュバントを含む。このような免疫原組成物の１つはアジュバントおよびＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０の一部より得られる抗原断片を含む。もう一つの実施例においてこの免疫原組成物はアジュバントおよびＤＣ−ＳＩＧＮがｇｐ１２０に結合することに伴う随伴性の構造変化によりＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０上に露出するｇｐ１２０の一部から得られる抗原断片を含む。さらに別の実施例において、この免疫原組成物はアジュバントおよびＴ細胞および／またはマクロファージと相互作用をするＤＣ−ＳＩＧＮの抗原断片を含む。さらに別の実施例においてこの免疫原組成物はアジュバントとＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０結合複合体あるいはその断片を含む。
【００１６】
本発明はさらに可溶性ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを提供する。可溶性のヒトＤＣ−ＳＩＧＮは薬品アッセイに使用することができる他、さらに薬学的に許容可能な担体と共に製剤組成物中に用いることができる。
【００１７】
さらに、本発明はヒトＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するベクターで形質移入を行ったほ乳類細胞を提供する。好ましくはこの細胞はＨＩＶのＴ細胞またはマクロファージへの侵入のトランスエンハンスメントを促進することができる。さらに好ましくは、この細胞はＨＩＶ侵入に必要な転座促進剤および／またはＣＤ４を欠くものである。ある特定の実施例においてこのほ乳類細胞は樹状細胞ではない。好ましい実施例においてこのほ乳類細胞はヒト細胞である。ある特定の実施例においてこの細胞は固相担体マトリックスに結合している。
【００１８】
本発明はさらにＤＣ−ＳＩＧＮに結合するＨＩＶエンベロープ糖蛋白質を発現するウイルスを除去するために生物学的液体を濾過する方法を提供する。１つの実施例においてこの方法は生物学的液体をＤＣ−ＳＩＧＮを含む固相担体に通すことを含む。関連した実施例はヒトＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するベクターで形質移入を行ったほ乳類細胞を含む固相担体に生物学的液体を通すことを含む。もう一つの実施例では、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するベクターで形質移入を行ったほ乳類細胞と生物学的液体を接触させ、ついでこの細胞を除去する。さらに別の実施例では、生物学的液体を樹状細胞と接触させ、ついで樹状細胞を除去する。
【００１９】
本発明はさらに形質転換非ヒトほ乳類を提供する。１つの実施例において形質転換非ヒトほ乳類はＣＤ４をコード化するＤＮＡ構造物、１つ以上の転座促進剤およびＤＣ−ＳＩＧＮを含む。好ましくはＣＤ４、転座促進剤およびＤＣ−ＳＩＧＮはヒト蛋白である。好ましい実施例において形質転換非ヒトほ乳類はＨＩＶの粘膜摂取性、ＨＩＶのリンパ器官への輸送、およびターゲットＴ細胞および／またはマクロファージのＨＩＶによる感染に対する能力または感受性を有する。さらに好ましくは、このＨＩＶ（または適当なベクターアナログ）による感染はＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するＤＮＡ構造体を含まない形質転換非ヒトほ乳類と比較し、極めて強化されている。好ましい実施例において形質転換非ヒトほ乳類はさらにサイクリンＴ（好ましくはヒトサイクリンＴ）をコード化するＤＮＡ構造体をさらに含む。
【００２０】
１つの実施例においてヒト転座促進剤はＣＣＲ３である。別の実施例においてヒト転座促進剤はＣＸＣＲ４である。さらに別の実施例においてヒト転座促進剤はＣＣＲ２ｂである。さらに別の実施例においてヒト転座促進剤はＢｏｂである。さらに別の実施例においてヒト転座促進剤はＢｏｎｚｏである。好ましい実施例においてヒト転座促進剤はＣＣＲ５である。
【００２１】
形質転換非ヒトほ乳類は霊長類、またはウサギ、ラットをはじめとする齧歯類、サルおよびチンパンジーなどのいかなるほ乳類であってもよい。好ましい実施例において形質転換非ヒトほ乳類はマウスである。
【００２２】
本発明は樹状細胞がＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを促進するのを抑制することによりＨＩＶ感染を防ぐまたは治療する方法を提供する。このような実施例の１つは本発明のヒト化抗体を患者に投与することを含む。もう一つの実施例は本発明の可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮを患者に投与することを含む。さらに別の実施例は本発明のアッセイにより同定された化合物を患者に投与することを含む。好ましい実施例において、ＨＩＶ侵入のトランスエンハンスメントが抑制される細胞はＴ細胞またはマクロファージである。
【００２３】
本発明はＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを妨げる化合物を同定する方法をさらに提供する。かかる実施例の１つにおいて、この化合物はウイルス捕獲を妨げる。このような実施例の１つは第一の細胞を試験化合物の存在下でベクターと接触させることを含む。このベクターはＤＣ−ＳＩＧＮと結合するウイルスエンベロープ蛋白質を含み、ここでこの第一の細胞はＤＣ−ＳＩＧＮを発現する。この試験化合物が存在しないとき、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ウイルスエンベロープ蛋白質複合体が第一の細胞とベクターとの間に形成され、試験化合物がこの複合体の形成に及ぼす効果がこのようにして試験される。未結合ベクターを第一の細胞から（好ましくは試験化合物からも）分離し、第一の細胞を次に第二の細胞と接触させる。この第二の細胞はウイルスエンベロープ蛋白質を含むベクターの侵入を受けやすいものである。第二の細胞へと侵入したベクターの量を判定する。第一の細胞とベクターとを用いた培養中に化合物が存在しなかったときよりも、試験化合物が存在したときの方が侵入したベクターの量が少なかった場合、この試験化合物をＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを防ぐ化合物と同定する。
【００２４】
ある特定の実施例において未結合ベクター（および試験化合物）の第一の細胞からの除去は未結合ベクター（および試験化合物）を第一の細胞から洗い流すことによって行う。ある特定の実施例において第二の細胞はＴ細胞またはマクロファージである。別の実施例において第二の細胞はヒトＣＤ４およびヒト転座促進剤を発現する。１つの実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＣＲ３である。別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＸＣＲ４である。さらに別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＣＲ２ｂである。さらに別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＢｏｂである。さらに別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＢｏｎｚｏである。好ましい実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＣＲ５である。
【００２５】
ある特定の実施例においてヒト転座促進剤はＣＣＲ５であり、ウイルスエンベロープ糖蛋白質はＪＲＦＬである。別の実施例においてベクターはマーカー蛋白質を含む。このような実施例の１つにおいて、第二の細胞に侵入したベクターの量はこの細胞で発現したマーカー蛋白質の量を判定することによって求める。特定の実施例においてこのマーカー蛋白質はルシフェラーゼである。別の実施例においてこのマーカー蛋白質は緑色蛍光性蛋白質である。本発明はさらにこれらの方法によって同定される化合物を提供する。
【００２６】
本発明はさらに本発明の形質転換非ヒトほ乳類を用いたＨＩＶ感染の予防または治療に用いる作用物質を同定するアッセイを提供する。このような方法の１つは試験化合物を形質転換非ヒトほ乳類に投与し、形質転換非ヒトほ乳類をウイルスまたはＨＩＶエンベロープ糖蛋白質を有するウイルスベクターによって感染させることを含む。ついで形質転換非ヒトほ乳類の感染に対する抵抗力を判定する、すなわち測定する。試験化合物の存在下で測定された形質転換非ヒトほ乳類の感染抵抗力が試験化合物が存在しないときに測定されたものよりも統計的に大きいとき、この試験化合物をＨＩＶ感染の治療または予防に用いる作用物質として同定する。この方法によって同定された化合物もまた本発明の一部である。
【００２７】
本発明はさらにＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを妨げる化合物を同定する方法を提供する。このような実施例の１つは第一の細胞、ベクターおよび第二の細胞を試験化合物の存在下で接触させることを含む。ベクターはＤＣ−ＳＩＧＮに結合するウイルスエンベロープ蛋白質を含み、第一の細胞はＤＣ−ＳＩＧＮを発現し、試験化合物が存在しないとき、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ウイルスエンベロープ蛋白質複合体が第一の細胞とベクターの間に形成される。さらに第二の細胞はウイルスエンベロープ蛋白質を含むベクターの侵入を受けやすい。その後第二の細胞に侵入したベクターの量を判定する。試験化合物の存在下の侵入ベクターの量が試験化合物が存在しないときより少ないとき、この試験化合物をＨＩＶの細胞侵入のトランスエンハンスメントを妨げる化合物と同定する。特定の実施例において第二の細胞はＴ細胞またはマクロファージである。もう一つの実施例において第二の細胞はヒトＣＤ４とヒト転座促進剤を発現する。１つの実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＣＲ３である。別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＸＣＲ４である。さらに別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＣＲ２ｂである。さらに別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＢｏｂである。さらに別の実施例においてこのヒト転座促進剤はＢｏｎｚｏである。好ましい実施例においてこのヒト転座促進剤はＣＣＲ５である。
【００２８】
ある特定の実施例においてヒト転座促進剤はＣＣＲ５であり、ウイルスエンベロープ糖蛋白質はＪＲＦＬである。別の実施例においてベクターはマーカー蛋白質を含む。このような実施例の１つにおいて、第二の細胞に侵入したベクターの量はこの細胞で発現したマーカー蛋白質の量を判定することによって求める。特定の実施例においてこのマーカー蛋白質はルシフェラーゼである。別の実施例においてこのマーカー蛋白質は緑色蛍光性蛋白質である。本発明はさらにこれらの方法によって同定される化合物を提供する。したがって本発明の主な目的はＡＩＤＳの治療に使用することのできる化合物を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的はＨＩＶ感染の治療用新規化合物を同定するためのアッセイを提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的はＤＣ−ＳＩＧＮの可溶性断片を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的はＤＣ−ＳＩＧＮによって促進されるＨＩＶのＴ細胞への侵入のトランスエンハンスメントを阻害する可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮを生成することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的はＨＩＶのＴ細胞への侵入のトランスエンハンスメントを樹状細胞が促進することを可能にするＤＣ−ＳＩＧＮ多形性を同定することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的はＨＩＶ感染を治療することのできる薬品を同定する方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的はＡＩＤＳ用の形質転換動物モデルを生成する方法を提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的はＡＩＤＳの発症を防ぐまたは遅延するワクチンを提供することである。
【００３６】
本発明のこれら、およびその他の態様は下記の図面および詳細な説明によりさらによく理解されるであろう。
【００３７】
[発明の詳細な説明]
本発明は粘膜組織に存在する樹状細胞（ＤＣ）上に高度に発現し、ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０に結合する、樹状細胞特異性Ｃ型レクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮの性状を提供する。ＤＣ−ＳＩＧＮはウイルスがＤＣに侵入する際のレセプターとしては機能せず、その代わりトランスでＣＤ４およびケモカインレセプターを発現する細胞の効率的な感染を促進する。実際粘膜部位に存在するＤＣ上に高度に発現するＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶ−１を選択的に捕獲し、ＣＤ４と適当なケモカインレセプターとを発現するターゲット細胞の感染をトランス促進する。これらの知見から、ＨＩＶ−１の伝播において、ウイルスは新規トランス感染機構により、初めに粘膜ＤＣにＤＣ−ＳＩＧＮを通じて結合し、その後２次リンパ器官へ移送され、ＣＤ４＋Ｔ細胞に極めて効率よく感染することが示される。
【００３８】
これらの結果はＤＣ−ＳＩＧＮが末梢に存在するＨＩＶ−１を効率よく捕獲し、Ｔ細胞に富む２次リンパ器官中の部位へとその移送を促進し、これらのターゲット細胞の感染をトランスで強化することを予測するものである。これらの研究はＤＣ−ＳＩＧＮおよびｇｐ１２０間の相互作用が治療的介入およびワクチン開発にとって重要なターゲットであることを示している。
【００３９】
本発明はしたがってＨＩＶ−１およびＳＩＶのターゲット細胞への侵入が行われる機構のより深い理解を提供する。ウイルスはＣＤ４にケモカインレセプター（ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４など）の助けを得て結合すること、またサイクリンＴが関与していることが知られている。さて本開示により、ウイルスの末梢粘膜組織との最初の接触からウイルスエンベロープと細胞膜間の融合の開始に至るまでに関与する生物化学的イベントを記載することができる。これにより、さらにこれらのプロセスを妨げることのできる化合物を同定し、それによってＡＩＤＳ治療または予防を行うためのドラッグスクリーニングアッセイの構築を行うことができる。これらの知見からさらにＨＩＶ感染用の小動物モデルを開発することができ、したがってＡＩＤＳの発病学のより一層の理解ならびに、治療法として可能性のある方法を試験するためのシステムを提供することができる。実際現在まで存在しなかったこのような動物モデルを使用することにより、ヒトでの試験に先立ち動物系で薬のテストを行うことができるのである。
【００４０】
抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下で観察されるＨＩＶ−１感染の阻害は粘膜中のＤＣの捕獲フェーズ中かあるいはリンパ組織中のＤＣ−Ｔ細胞相互作用中のｇｐ１２０−ＤＣ−ＳＩＧＮ相互作用の干渉がウイルスの播種を阻害できたことを示している。ｇｐ１２０がＤＣ−ＳＩＧＮに結合する能力をブロックする小分子阻害剤、可能性としてはおそらく糖質ベースのもの、は予防あるいは治療的介入に有効であるかもしれない。ｇｐ１２０がＤＣ−ＳＩＧＮに結合するのを阻害する粘膜抗体を導き出すことを目的としたワクチン戦略もまた初期の感染確立を防ぐのに有効であろう。ｇｐ１２０ワクチンの有効性はＣＤ４およびＣＣＲ５を通じて行われるＨＩＶ侵入を阻害する抗体を中和するレベルの関数として測定されている。本結果はウイルスのＤＣ−ＳＩＧＮへの結合をブロックする、またはＤＣ−ＳＩＧＮが媒介する感染の強化をブロックする抗体のレベルにより予防が予測できることを示している。
【００４１】
さらに実施例２に開示したデータに基づくと、ＨＩＶのＤＣ−ＳＩＧＮとの相互作用により特定のエンドソーム区画内にＨＩＶが取り込まれ、そこでウイルスが酵素による不活性化から保護されているように思われる。さらにウイルスエンベロープ糖蛋白質はこのリサイクルエンドソーム区画中で構造変化を受け、ＨＩＶの膜融合活性が強化されるように思われる。これはインフルエンザおよびトリ白血病ウイルスにその前例がある、不可逆的ｐＨ誘導構造変化の結果であるかもしれず、あるいはリサイクルエンドソーム内で他の分子との相互作用の結果かもしれない。これらの結果からなぜＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞に暴露させたＨＩＶがコントロール細胞に暴露させたＨＩＶよりもより感染性が高いかが説明できる。樹状細胞（およびＴＨＰ細胞）はＣＤ４プラスケモカインレセプターにより簡単には感染することができないため、ウイルスの強化膜融合活性は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現樹状細胞の表面へとリサイクルされた後に、トランスで（ターゲットＴ細胞上に）現れるのであろう。
【００４２】
したがって本発明は樹状細胞および他の細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮ（ＤＣＳ）に結合した後のＨＩＶの内部移行を妨げる化合物を提供する。この内部移行プロセスを阻害する化合物はウイルスのホスト環境で生き残る能力を減少させ、それによってＨＩＶ感染に対し予防薬として作用することができるので、本発明に含まれる。
【００４３】
本明細書において使用するさまざまな用語を下記の通り定義する：
「転座促進物質」は「転座促進剤」および「転座促進蛋白質」と互換性を有して使用されており、ＨＩＶおよび／またはＳＩＶの細胞中への転座においてＣＤ４（アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を有するヒト蛋白質）と「シス」で会合および／または相互作用するＣＤ４＋の細胞上または膜中に見いだされるレセプター蛋白質を指す。本発明で例示する二つの転座促進物質はＣＸＣＲ４（アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を有するヒト蛋白質）およびＣＣＲ５（アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を有するヒト蛋白質）である。ＣＤ４とシスでＨＩＶ−１侵入に機能することが示されているケモカインレセプターファミリーのメンバーとしては少なくとも６つの「既知」のものがあり（即ち既知のヒト転座促進物質）それらは、ＣＣＲ５，ＣＸＣＲ４，ＣＣＲ２ｂ，ＣＣＲ３，Ｂｏｎｚｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびＢＯＢ（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１０）である。
【００４４】
ここで用いる用語「コンフォーマー」は「ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質のコンフォーマー」と互換性を有して使用され、直接ＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用をすることにより、および／またはエンドソーム中に細胞内取り込みを行われた結果、および／またはＨＩＶ糖蛋白質上に模擬エンドソーム効果をもたらす環境に置かれた結果、新規の構造を有するおよび／または関連した特性（例えば電荷）を有することになったＨＩＶ糖蛋白質（例えばｇｐ１２０−ｇｐ４１）である。
【００４５】
ここで使用するＨＩＶの細胞への侵入を助ける第二の因子と共に作用する因子はこの因子が他の因子と同じ膜中にあるとき「シス」で作用すると呼ばれ、一方ＨＩＶの細胞への侵入を助ける第二の因子と共に作用する因子が他の因子と異なる膜中にあるとき、これを「トランス」で作用すると呼ぶ。したがってＣＤ４およびＣＣＲ５は共にＴ細胞膜中にあり、「シス」で作用するが、ＤＣ−ＳＩＧＮは樹状細胞膜中に存在し、したがってＣＤ４あるいはＣＣＲ５に対しては「トランス」で作用する。
【００４６】
特に他に断り書きをしない場合、ここで「作用物質」、「薬としての潜在的可能性を有する物質」、「化合物」、「試験化合物」あるいは「潜在的可能性を有する化合物」は互換性を有して使用される用語であり、ＨＩＶ感染の阻害剤として、および／またはＡＩＤＳの治療／予防に使用する可能性のある化学薬品を指す。したがってこのような「作用物質」、「薬としての潜在的可能性を有する物質」「化合物」および「潜在的可能性を有する化合物」はここに記載のように薬品アッセイおよび薬品スクリーニングなどに用いることができる。
【００４７】
ここで使用する「有機低分子」とはペプチド［あるいは無機化合物（例えば金属）と複合化した有機化合物］を含む有機化合物であり、３キロダルトン未満の分子量を有するものである。このような有機低分子は上に記載した作用物質などに含むことができる。
【００４８】
ある分子が免疫グロブリン（抗体）あるいはＴ細胞抗原レセプターなどの免疫システムの抗原認識分子と特異的に相互作用をすることのできる場合、それを「抗原性」であるという。抗原性のポリペプチドは少なくともおよそ５個の、好ましくは少なくともおよそ１０個のアミノ酸を含む。ある分子の抗原性部分は抗体またはＴ細胞レセプター認識に対し免疫優性である部分であってもよく、あるいは免疫化のためにキャリアー分子に抗原性部分を接合することによってその分子に対する抗体を生成するのに用いられる部分であってもよい。抗原性の分子はそれ自身が免疫原性、すなわちキャリアーなしで免疫反応を惹起する能力を有しなくてもよい。
【００４９】
「Ａ」を含む組成物（ここで「Ａ」は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター、組み換え宿主細胞など）は、組成物中の蛋白質、ＤＮＡ、ベクター（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーによる）の少なくともおよそ７５重量％が［Ａ］であるとき、実質的に「Ｂ」を含まない（ここで「Ｂ」は１つ以上の汚染蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクターなどである）。好ましくは、「Ａ」は少なくとも組成物中Ａ＋Ｂのおよそ９０重量％、もっとも好ましくは少なくともおよそ９９重量％を占める。組成物が実質的に汚染されていず、ここで問題となっている種の活性または特性を有する単一分子量の種のみを含んでいることが好ましい。
【００５０】
「薬学的に許容される」という句は生理的に許容できるものでヒトに投与したときに、急性胃蠕動、眩暈などアレルギーや類似の有害反応を典型的に引き起こさない分子的存在物および組成物を指す。好ましくはここで用いる「薬学的に許容される」とは動物、より詳しくはヒトへの使用が連邦政府または州政府の取り締まり機関により認められており、米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」とは希釈剤、アジュバント、添加剤あるいは賦形剤を指し、これと共に化合物が投与される。このような薬学的担体は水や油などの無菌液であってよく、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油などの動物、植物起源のものならびに石油や合成されたものを含む。水または水溶液、食塩水およびブドウ糖水溶液やグリセロール溶液などは担体として好ましくは使用され、特に注射液として好ましく使用される。適した薬学的担体はＥ．  Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「レミントンの製薬科学」に記載されている。
【００５１】
「治療的に有効量」とは活性、作用および宿主の反応において臨床的に有意な欠損を少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント減少させる、もっとも好ましくは防ぐに十分な量を意味する。言葉を換えると、治療的に有効量とは宿主における臨床的に有意な状況を向上させるに十分な量である。
【００５２】
特定の実施例において「およそ」とは２０％以内、好ましくは１０％以内、もっとも好ましくは５％以内を指す。
【００５３】
核酸と蛋白質
本発明においてはＤＣ−ＳＩＧＮをコード化する（例えばアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有するヒト蛋白質をコード化する）核酸およびキメラ／融合蛋白を含むそのコード化断片の使用が考えられている。好ましい実施例において、この核酸はＤＣ−ＳＩＧＮ（可溶形／可溶部分）をコード化する。同様に本発明はまた転座促進剤、サイクリンＴ（例えばアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有するヒト蛋白をコード化する）およびＣＤ４をコード化するアミノ酸の使用をも考えられている。これらの核酸は例えばこのような蛋白質のヒト同族体を含む形質転換動物を作成するのに使用することができ、それによってＨＩＶ感染を受けやすい形質転換動物を作成することができる。蛋白質、キメラ／融合蛋白質を含むその断片の使用もまた本発明の一部である。
【００５４】
本発明にしたがい、従来の分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術を現行技術の範囲で使用するかもしれない。このような技術は文献に詳しく説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（ｈｅｒｅｉｎ“Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９”）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００５５】
したがって下記の用語がここに登場する場合、下に記載の定義を有するものとする。
【００５６】
「ベクター」とはプラスミド、ファージ、ウイルスまたはコスミッドなどのレプリコンであり、別のＤＮＡセグメントを結合させて、結合したセグメントの複製を生じさせることのできるものである。「レプリコン」は生体内でＤＮＡ複製の自律性ユニットとして機能する、すなわちそれ自身の制御の下で複製することができる、いかなる遺伝的要素（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）であってもよい。
【００５７】
細胞は外来のまたは異種のＤＮＡを細胞内に導入することにより、このようなＤＮＡにより「形質移入」される。細胞は形質移入したＤＮＡが表現型変化に影響を及ぼすとき、外来のまたは異種のＤＮＡにより「形質転換」されたという。形質転換ＤＮＡは染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合により結合され）、その細胞のゲノムを作り上げることが好ましい。
【００５８】
「異種の」ＤＮＡとはその細胞に、あるいは細胞の染色体部位に天然には存在しないＤＮＡを指す。好ましくは異種のＤＮＡはその細胞にとって外来の遺伝子を含む。
【００５９】
「核酸分子」とはリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）あるいはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン「ＤＮＡ分子」）あるいはホスホロチオエートやチオエステルなど、そのホスホエステル類似体のリン酸エステルポリマー型を指し、これは一本鎖の形でも二重らせんの形であってもよい。二重らせんのＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡらせんも可能である。核酸分子という用語、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は分子の一次および二次構造のみを指し、なんらかの特定の三次元形に限定するものではない。したがってこの用語には発見された二重らせんＤＮＡ、とりわけ直線あるいは環状のＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミドおよび染色体が含まれる。特定の二重らせんＤＮＡ分子の構造を論じる際、配列はＤＮＡの非転写鎖（即ちｍＲＮＡと相同の配列を有する鎖）に沿って５′から３′方向に配列を記載する通常の慣習にしたがって記載する。「組み換えＤＮＡ分子」は分子的生物学的操作を行ったＤＮＡ分子である。
【００６０】
核酸分子は、一本鎖の核酸分子が適当な温度および溶液のイオン強度（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、参照）の条件の下で他の核酸分子にアニールできると、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの他の核酸分子と「雑種を形成することが可能」である。温度およびイオン強度の条件が雑種形成の「厳重度」を決定する。相同核酸用予備スクリーニングのためには、Ｔｍが５５℃に相当する低雑種形成条件が用いられる。例えば５ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％のミルクおよびホルムアミドなし、あるいはホルムアミドが３０％、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）。中度の厳重度の雑種形成条件はより高いＴｍに相当し、例えばホルムアミドが４０％、５ｘまたは６ｘＳＣＣである。高厳重度の雑種形成条件はもっとも高いＴｍに相当し、例えばホルムアミドが５０％、５ｘまたは６ｘＳＣＣである。雑種形成には２つの核酸が相補的配列を有することが必要であるが、雑種形成の厳重度に応じて、塩基間の不適正も起こりうる。雑種形成核酸の適正厳重度は核酸の長さおよび相補性の度合い、変数に応じて異なり、業界ではよく知られている。二つのヌクレオチド配列の間の類似性あるいは相同性の度合いが大きいほど、それらの配列を有する核酸の雑種用のＴｍの値は大きくなる。核酸雑種形成の相対的安定性（Ｔｍが高いことに相当する）は下記の順に減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチドを越える長さの雑種に対してはＴｍを計算する式が考案されている（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、９．５０−１０．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチド、による雑種形成では不適正塩基対の位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１１．７−１１．８参照）。雑種形成可能な核酸の最小長さは好ましくは少なくともおよそ１８ヌクレオチド、好ましくは少なくともおよそ３６ヌクレオチド、さらに好ましくは長さは少なくともおよそ４８ヌクレオチドである。このような核酸は本発明の転座促進物質をコード化する核酸のためのプライマーあるいは核酸プローブとして使用することができる。
【００６１】
ある特定の実施例において「標準雑種形成条件」とはＴｍが５５℃を指し、上記に述べた条件を用いる。好ましい実施例においてＴｍは６０℃であり、より好ましい実施例においてＴｍは６５℃である。
【００６２】
ここで使用する「相同組み換え」とはベクターの外来ＤＮＡ配列を染色体へ挿入する１つの方法を指す。このベクターは相同組み換えのための特定の染色体部位を標的とする。特定の相同組み換えのためには、このベクターは相補的結合を行い染色体中にベクターを組み込ませるため、染色体配列に相同である十分に長い領域を含むであろう。相同領域が長ければ長いほどそして配列の類似性が高ければ高いほど、相同組み換えの有効性は高まるであろう。
【００６３】
ＤＮＡ「コード化配列」とは適当な制限配列の制御の下に置かれると、生体内、あるいは生体外で、細胞のポリペプチドへ転写され翻訳される二重らせんＤＮＡ配列の事である。コード化配列の境界は５′（アミノ）末端での開始コドンと３′（カルボキシル）末端での翻訳停止コドンによって決定される。コード化配列には、これに限るわけではないが原核配列、真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核（例えばほ乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列が含まれる。コード化配列が真核細胞中で発現するよう意図されている場合、ポリアデニル化信号および転写終止配列は通常コード化配列に対し３′に位置する。
【００６４】
転写および翻訳制御配列はプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ制限配列であり、宿主細胞中でのコード化配列の発現を提供する。真核細胞中でポリアデニル化信号は制御配列である。
【００６５】
「プロモーター配列」は細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３′方向）コード化配列の転写を開始することのできるＤＮＡ調節領域である。本発明での定義上、プロモーター配列はその３′末端において転写開始部位と結合され、上流（５′方向）に延び、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで翻訳を開始するに必要最小数の塩基または要素を含むものである。プロモーター配列内に、転写開始部位（便宜上例えばヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより定義される）およびＲＮＡポリメラーゼの結合に応答可能な蛋白結合領域（コンセンサス配列）も見いだされるであろう。
【００６６】
ＲＮＡポリメラーセがコード化配列をｍＲＮＡ中へ転写する際、コード化配列は細胞内で転写および翻訳管理配列の「管理下」にあり、ついでトランス−ＲＮＡスプライシングが行われコード化配列によってコード化される蛋白質中に翻訳される。
【００６７】
「信号配列」は細胞の表面に分泌され、あるいは発現される蛋白質のコード化配列の頭に含まれる。この配列は、宿主細胞がポリペプチドを転座するよう指示する、信号ペプチド、成熟ポリペプチドのＮ−末端をコード化する。「転座信号配列」という用語はここでこの種の信号配列を指すのに用いる。転座信号配列は真核細胞ならびに原核細胞にもとから存在するさまざまな蛋白質と共に発見されており、しばしば両方のタイプの生物において機能を発揮している。
【００６８】
ここで「配列相同性」およびそれを文法的に語形変化した言い回しは、超科（例えば免疫グロブリン超科）からの蛋白質を始めとする「共通の進化の基原」を有する蛋白質と異なる種（例えばミオシンＬ鎖など）からの相同蛋白質の間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋ等、１９８７，Ｃｅｌｌ  ５０：６６７）。
【００６９】
ここで「異種ヌクレオチド配列」とは天然には生成されない核酸を形成するように組み換え方法により、本発明の核酸のヌクレオチド配列に加えられた核酸配列である。このような核酸は融合（例えばキメラ）蛋白質をコード化することができる。したがって異種ヌクレオチド配列は調節および／または構造物性を有するペプチドおよび／または蛋白質をコード化することができる。もう一つのこのような実施例において、異種ヌクレオチド配列は組み換え核酸が発現した後、本発明のヌクレオチド配列によってコード化される蛋白質またはペプチドを検出する手段として機能する蛋白質またはペプチドをコード化することができる。さらに別の実施例において、異種ヌクレオチド配列は本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能することができる。異種ヌクレオチド配列は制限部位、調節部位、プロモーターなどを含む非コード化配列を含んでいてもよい。
【００７０】
「融合蛋白質」および「融合ペプチド」という用語はここで互換性を有して使用され、「キメラ蛋白質および／またはキメラペプチド」ならびに融合「インテイン蛋白／ペプチド」を包含する。融合蛋白質はペプチド結合によりキメラ融合蛋白質中で少なくとも一部の別の蛋白質またはペプチドに結合したＤＣ−ＳＩＧＮなどの本発明の特定の蛋白質の少なくとも一部を含む。ある特定の実施例において、このＤＣ−ＳＩＧＮの一部は抗原性である。例えば、融合蛋白質はマーカー蛋白質またはペプチド、あるいはＤＣ−ＳＩＧＮの分離および／または精製の助けになる蛋白質またはペプチドを含んでいてもよい。
【００７１】
特定の実施例において、少なくともヌクレオチドの５０％（好ましくは少なくとも７５％、もっとも好ましくは少なくとも９０から９５％）においてＤＮＡコード化配列の規定長にわたりマッチングが見られると、二つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」あるいは「実質的に類似」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクで入手可能な標準的ソフトウエアを用いて、またはサザーン雑種形成実験をその特定の形のために特に規定した厳重な条件のもとで行って配列を比較することにより同定することができる。適当な雑種形成条件を決定するのは現在の技術の範囲内のことである。例えば上記Ｍａｎｉａｔｉｓ等、  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを参照のこと。
【００７２】
同様にある特定の実施例において、アミノ酸の７５％以上あるいは、好ましくはおよそ９０％以上が同一であると二つのアミノ酸配列は「実質的に相同」あるいは「実質的に類似」である。好ましくはこの類似または相同の配列は例えばデフォルトパラメータを用いたＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを用いたアラインメントにより同定される。
【００７３】
「対応する」という用語は、類似または相同配列、より好ましくは実質的に類似のまたは実質的に相同の配列を指し、この場合、類似性や相同性が測られる分子と厳密な位置が同一であろうと異なっていようと構わない。「対応する」という用語は配列の類似性を指し、アミノ酸残基あるいはヌクレオチド塩基の位置番号を指すのではない。
【００７４】
核酸／組み換え蛋白質の発現
ＤＣ−ＳＩＧＮ、または転座促進物質、あるいはＣＤ４、またはサイクリンＴ、または抗原断片、またはそのキメラ蛋白質を始めとするその類似体または派生物、をコード化する核酸は適当な発現ベクター、すなわち挿入された蛋白質コード化配列の転写と翻訳に必要な要素を含むベクター、中に挿入することができる。このような要素には「プロモーター」がある。このような核酸は本発明の発現ベクター中のプロモーターと機能的に会合させることができる。ｃＤＮＡとゲノム配列は共にこのような調節配列の制御の下でクローン化と発現を行うことができる。発現ベクターはまた複製開始点を有することが好ましい。
【００７５】
必要な転写および翻訳信号は組み換え発現ベクター上に提供することができるが、蛋白質および／またはその側面領域をコード化する天然遺伝子により供給してもよい。
【００７６】
本発明はまたＤＣ−ＳＩＧＮの類似体および派生物をコード化する核酸に関する。派生物および類似体の生産と使用は本発明の範囲に含まれる。特定の実施例において派生物または類似体はＨＩＶｇｐ１２０−ＤＣ−ＳＩＧＮ相互作用を阻害する能力を有するＤＣ−ＳＩＧＮの可溶性断片である。
【００７７】
ＤＣ−ＳＩＧＮの派生物はＤＣ−ＳＩＧＮをコード化する核酸に対し置換、付加、あるいは削除を行って機能性を修飾した分子を得ることによって生成することができる。ＨＩＶ感染に干渉する派生物が好ましい。このような派生物はＨＩＶあるいはＳＩＶエンベロープ蛋白質に対する親和性を維持するＤＣ−ＳＩＧＮの細胞外領域の可溶性断片をコード化するかもしれない。かかる可溶性派生物はＨＩＶまたはＳＩＶ結合の強力な阻害剤となるかもしれない。
【００７８】
ヌクレオチドコード化配列の縮退により、実質的にＤＣ−ＳＩＧＮと同じアミノ酸配列をコード化する他のＤＮＡ配列を本発明の実施に使用することもありうる。これらに含まれるのは、これに限定するのではないが、対立遺伝子、他の種からの相同性遺伝子、およびＤＣ−ＳＩＧＮのすべてあるいは一部を含むヌクレオチド配列であり、これは配列内で同じアミノ酸残基をコード化する、別のコドンに置換することによって変えたものであり、すなわち沈黙変化を生じているものである。同様に、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮ派生物にはこれに限るわけではないが、一次アミノ酸配列として、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基と置換され、１つ以上の保存的アミノ酸置換を生じている、変化した配列を含めＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むものが含まれる。例えば配列中の１つ以上のアミノ酸残基は機能性等価物として作用する類似の極性を有する別のアミノ酸によって置換することができ、これによって沈黙変化が生じる。配列中のアミノ酸の置換体として選択できる物はこのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーである。このような置換はここで保存的置換と定義される。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。芳香族環構造を含むアミノ酸にはフェニルアラニン、トリプロファンおよびチロシンがある。極性を有する中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがある。プラスに荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンがある。マイナスに荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸がある。このような変更によりポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される見かけの分子量や等電点に影響が出るとは予測されない。
【００７９】
特に好ましい置換は下記の通り。
ArgをLysに置換、またその逆を行いプラスの電荷を維持する、
AspをGluに置換、またその逆を行いマイナスの電荷を維持する、
ThrをSerに変え遊離−ＯＨを維持する、そして
AsnをGlnに変え遊離ＮＨ２を維持する。
【００８０】
本発明のＤＣ−ＳＩＧＮ派生物および類似体をコード化する核酸は当該分野で既知のさまざまな方法によって生産することができる。その生産をもたらすための操作は遺伝子または蛋白質レベルで行われる。例えばクローン化ＤＣ−ＳＩＧＮ配列は当該分野で知られている多数の戦略のどれを用いて修飾しても良い（同上Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）。この配列は適当な部位で制限エンドヌクレアーゼにより切断し、ついで所望によりさらに酵素による修飾を行い、分離し、試験管内で連結する。ＤＣ−ＳＩＧＮ派生物または類似体のコード化核酸の生産において、修飾した核酸が所望の活動がコード化されている領域中で、翻訳停止信号によって中断されない同じ翻訳読みとり枠内に残るよう注意を払わなくてはならない。
【００８１】
さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮをコード化する核酸は生体内または生体外で突然変異させ翻訳、開始および／または終始配列の生成および／または破壊を行い、あるいはコード化領域中に変種を生成し、および／または新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し、あるいは既に存在したものを破壊し、試験管内での修飾をさらに容易に行えるようにすることができる。このような突然変異は樹状細胞のＨＩＶを輸送する能力を減少するものであることが好ましい。当該分野で知られているどのような突然変異生成技法を用いてもよく、これに限定する訳ではないが、試験管内特定部位の突然変異誘発［Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１（１９７８）；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，ＤＮＡ  ３：４７９−４８８（１９８４）；Ｏｌｉｐｈａｎｔ等、Ｇｅｎｅ  ４４：１７７（１９８６）；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１０（１９８６）］、ＴＡＢ登録商標ｌｉｎｋｅｒｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などがあげられる。ＰＣＲ技法は特定部位の突然変異誘発に好ましく用いられる［Ｈｉｇｕｃｈｉ，“Ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ＤＮＡ”，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，ｐｐ．６１−７０（１９８９）］参照。同定、分離された核酸はついで適当なクローニングベクター中に挿入することができる。当該分野で知られている多くのベクター−宿主システムを用いることができる。
【００８２】
ＤＣ−ＳＩＧＮの潜在的キメラパートナーには多数の膜貫通領域、あるいはリン脂質固定装置による修飾のための領域が含まれる。実際本発明の蛋白質／断片はすべて融合あるいはキメラペプチドまたは蛋白質中に置くことにより修飾することができ、または例えばＮ末端ＦＬＡＧ−標識、またはＨ６標識を有するように標識することができる。特定の実施例中でＤＣ−ＳＩＧＮは１９９７年４月２９日に提出された米国特許第５，６２５，０４８号、および１９９７年７月２４日に公表されたＷＯ９７／２６３３３号、これらは共にその全体を参照としてここに援用する、に記載されているように、緑色蛍光蛋白質などのマーカー蛋白質を含むように修飾することができる。
【００８３】
潜在的宿主−ベクターシステムにはこれに限る訳ではないが、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させたほ乳類の細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；イーストベクターを含む酵母などの微生物；あるいはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミッドＤＮＡで形質転換したバクテリアなどがある。ベクターの発現要素はその強度および特異性において異なる。使用した宿主−ベクター系に応じ多くの適当な転写および翻訳要素の中から適当なものを使用することができる。
【００８４】
本発明の組み換え蛋白質、またはその断片、派生物、キメラ構成体、あるいは類似体は組み換えによりコード化配列の組み込みの後染色体に発現するであろう。これに関しては、高レベルでの安定な遺伝子発現を達成するために多数の増幅システムのいずれを使用することもできる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９参照）。
【００８５】
核酸を含む組み換えベクターは、細胞により蛋白の発現が行われる条件の下で適当な細胞培養培地中その細胞内へと培養される。適当な転写／翻訳制御信号および蛋白質コード化配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築するには、多数の方法のうちのいずれを用いてもよい。これらの方法には試験管内組み換えＤＮＡおよび合成技法および生体内組み換え（遺伝子組み換え）が含まれる。
【００８６】
本発明の核酸の発現は当該分野で知られているどのようなプロモーター／エンハンサー要素を用いて制御してもよいが、これらの調節要素は発現のために選択された宿主中で機能するものでなければならない。１つの実施例において転座促進物質は［Ｋｉｌｌｅｅｎ等、ＥＭＢＯ  １２：１５４７−１５５３（１９９３）］に記載されているように、ＣＤ４エンハンサー／プロモーター／サイレンサーの制御下にある。
【００８７】
さまざまな宿主／発現ベクターの組み合わせが本発明のＤＮＡ配列を発現するのに使用できる。さらに、宿主細胞株は挿入配列の発現を変調するよう、または所望の特定のやり方で遺伝子生成物を修飾、あるいはプロセッシングするように選択することができる。宿主細胞により翻訳および翻訳後プロセッシングや蛋白質の修飾、例えばグリコシレーション、あるいは信号配列の切断などの特徴と特有の機構は異なる。発現する異種蛋白の所望の修飾およびプロセッシングを確実に行うために、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。例えばバクテリア系中での発現は非グリコシル化コアプロテイン生成物を生産するのに使用できる。しかしバクテリア中で発現したＤＣ−ＳＩＧＮはきちんと折り畳まれない可能性がある。酵母中での発現はグリコシル化生成物を生産できる。真核細胞中での発現は異種蛋白質の「天然の」グリコシル化と折り畳みが行われる可能性を増加する。さらにほ乳類細胞中での発現は再構成、あるいは構成、転座促進活動のためのツールを提供することができる。さらにベクター／宿主発現システムが異なると、蛋白分解切断などのプロセッシング反応に影響を及ぼす程度も異なる。
【００８８】
ベクターは当該分野で既知の方法によって、例えば形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子ガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体［例えばＷｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔ等、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２，０１２，３１１，ｆｉｌｅｄ  Ｍａｒ．１５，１９９０参照］などにより所望の宿主細胞の中に導入される。
【００８９】
膜内在性蛋白質として発現したＤＣ−ＳＩＧＮは標準的方法により分離、精製することができる。一般に、膜内在性蛋白質は膜を洗剤、例えばこれに限るわけではないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００、ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、ジゴキシン、デオキシコール酸ナトリウムなど、およびその混合物、で溶解することにより得ることができる。可溶化は懸濁液を超音波処理することによって強化することができる。可溶性蛋白質は培養液を集め、封入小体を例えば洗剤により可溶化することによって、また所望により上記に記載した超音波処理やその他の機械的プロセスも使用して処理することによって得ることができる。可溶化した、または可溶性蛋白は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、２次元ゲル電気泳動法、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、イムノアフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差、免疫沈殿法あるいは蛋白質の精製に使用されるその他の標準的技法を含む、さまざまな技法を用いて分離することができる。可溶性のＤＣ−ＳＩＧＮのｇｐ１２０結合部分はまた蛋白分解および／または細胞外領域マイナス膜貫通領域の発現を通じて得ることができる。
【００９０】
この結果から得られるのはＤＣ−ＳＩＧＮにおける突然変異によりｇｐ１２０の結合性が失われるか、または結合後のエンベロープ糖蛋白質の構造変化が失われる（ｇｐ１２０の膜融合活性に欠陥が生じるように）ことにより、感染の伝播または病気の進行から個体が守られるということである。したがって本発明は個体の有する感染および病気の進行に対する疾病素質を予測するためのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子における多形性のテストを提供する。防護多形性もまた本発明の一部である（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１３９４６，Ｌａｎｄａｕ等、参照。ここではそのようなＣＣＲ５変異体が同定された）。
【００９１】
したがって、本発明はＨＩＶ感染から個人を保護するＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子中の突然変異体ならびにこれらの変異体を検出する手段を含む。かかる突然変異体をスクリーニングする方法は遺伝的アプローチと細胞的アプローチのどちらかにより行うことができる。遺伝的アプローチの１つはＰＣＲをベースとした分析を用いてＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子セグメントを増幅するものである。増幅した核酸をその後配列分析するか、あるいはまたはゲル移動度を用いた分析（これにより一本鎖の構造的多型性を検出できる）に付す。得られた結果は野生型の遺伝子からの同じセグメントと比較する。ＤＣ−ＳＩＧＮをコード化する遺伝子またはプロモーターの７つのコード化エキソンおよび横のイントロン／エキソン境界、５′非コード化および３′非コード化エキソンのいずれかを増幅することによりこのような突然変異体対立遺伝子を同定することができる。
【００９２】
別法として細胞アプローチでは個体から末梢血単核細胞を得る。これらの細胞をＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４中で２−６日培養し未熟樹状細胞中へと分化させる。この樹状細胞を（ｉ）抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体で染色する、（ｉｉ）可溶性ｇｐ１２０と標識した抗ｇｐ１２０抗体または可溶性ＣＤ４を組み合わせて染色する、および／または（ｉｉｉ）ここに記載する捕獲／増強アッセイにレポーターウイルスおよびターゲット細胞と共に付す。第一の場合、（ｉ）ＤＣ−ＳＩＧＮに欠ける細胞は検出可能な抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体では染色されないが、ＤＣ−ＳＩＧＮを欠くかまたは突然変異体ＤＣ−ＳＩＧＮをコード化する細胞はｇｐ１２０に結合しないことから同定でき、（ｉｉ）あるいはＨＩＶ感染性を捕獲／増強することができないことから（ｉｉｉ）同定できる。
【００９３】
本発明の蛋白質に対する抗体
本発明にしたがい、組み換え方法により製造した、あるいは化学的に合成したＤＣ−ＳＩＧＮ、または転座促進物質、またはＣＤ４、またはサイクリンＴ、およびその断片、または融合蛋白質を始めとするその他の派生物およびその類似体を本発明の蛋白質を認識するあるいはこの蛋白質の特定のエピトープを認識する抗体を生成するための免疫抗原として使用することができる。このような抗体にはこれに限るわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリがある。本発明の抗体は交差反応性であってもよく、例えば異なる種からの抗体を認識するかもしれない。ポリクローナル抗体は交差反応性の可能性が高い。あるいは、本発明の抗体は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮあるいはそのエピトープに特異性を有するなど、ある１つの形の蛋白質に特異的であってもよい。
【００９４】
ある特定の実施例において、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０上の部位はＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を妨げる抗体を誘発する免疫原のためのベースとして使用することができる。粘膜抗体反応ならびにｇｐ１２０に対する全身性体液反応を誘発するワクチンはＨＩＶのＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を妨げ、したがってＴ細胞の感染を制限することができる。ＨＩＶのＤＣ−ＳＩＧＮへの結合、あるいはＤＣ−ＳＩＧＮが媒介する標的細胞感染の増強を妨げる抗体はしたがって本発明の一部である。かかる抗体は好ましくはウイルスのクレード差に関わらず、ウイルス中で広く抑制を行う。これらの抗体は中和抗体（すわなちターゲット細胞の高濃度のＨＩＶによる感染を抑制する）とは対照的であって、まだヒトにおいて広く中和作用を示していない。優先的に粘膜抗体反応を誘発するワクチンベクター（例えば組み換えサルモネラベクター）は、特にＤＣ−ＳＩＧＮと結合するｇｐ１２０上の部位がグリコシル化を必要としない場合の１つのアプローチとなろう。
【００９５】
ある特定のアプローチはＤＣ−ＳＩＧＮ結合部位を含むｇｐ１２０の断片を適当なアジュバント中で粘膜表面へと送達することである。さらにＤＣ−ＳＩＧＮによって修飾した形のエンベロープ蛋白質を体液反応を誘発するワクチン候補（すなわち新型の融合適格エンベロープワクチン）として使用することができる。したがって、本発明はエンベロープ糖蛋白質上のＤＣ−ＳＩＧＮ誘導エピトープに結合し、感染のトランスエンハンスメントを妨げる幅広い中和抗体を誘発する免疫原としてＤＣ−ＳＩＧＮと単一遺伝子性のｇｐ１２０またはｇｐ１４０オリゴマーの複合体を提供する。このような手段で得られた抗体はＤＣ−ＳＩＧＮ独立の感染よりも標的細胞のＤＣ−ＳＩＧＮ増強感染の方をより一層阻害しやすい。
【００９６】
ＤＣ−ＳＩＧＮはまたＨＩＶの結合を阻止する抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を誘発するための免疫原として使用することができる。ウイルス侵入を増強する能力を発揮しないよう修飾した可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮ（ｇｐ１２０への結合能に欠く、またはｇｐ１２０への結合後のトランスエンハンスメント機能を欠く）は免疫原として使用できる。
【００９７】
ある特定の実施例において本発明の抗体はＤＣ−ＳＩＧＮに結合することによって露出されるｇｐ１２０上のマスクされたエピトープに特異的である。もう一つの実施例において、本発明の抗体はＤＣ−ＳＩＧＮとＨＩＶの転座促進物質および／またはＣＤ４への結合により生成されるエピトープに特異的である。例えば、ＨＩＶエンベロープ蛋白がＣＤ４へ結合するとｇｐ１２０あるいはｇｐ１３０に構造変化が生じ、これによりｇｐ１２０またはｇｐ１３０の転座促進物質に対する親和性が増加し、それに付随して転座促進物質エピトープのマスクがはずれるであろう。同様に、ＤＣ−ＳＩＧＮがｇｐ１２０あるいはｇｐ１３０へと結合することにより同じ効果が得られる。このような抗体はＨＩＶまたはＳＩＶがＤＣ−ＳＩＧＮへ結合する条件のもとでの結合に基づき、例えば結合を阻害する４℃で選択し、遊離ＤＣ−ＳＩＧＮに結合しないものをスクリーニングすることができる。
【００９８】
ＤＣ−ＳＩＧＮ、その派生物またはその類似体に対するポリクローナル抗体を生産するには当該分野で知られているさまざまな方法を用いることができる。抗体は、さまざまな宿主動物を例えばＤＣ−ＳＩＧＮ、あるいはその派生物（例えば断片または融合蛋白）を、これに限るわけではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどに注射して免疫することによって生産できる。１つの実施例においてＤＣ−ＳＩＧＮまたはその断片は免疫原性担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に接合することができる。宿主種に応じ免疫応答を増加するためにさまざまなアジュバントを使用することができ、一例をあげるとこれに限るわけではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性剤、そして有用である可能性のあるＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントがあげられる。
【００９９】
例えばＤＣ−ＳＩＧＮ、その断片、類似体、または派生物に対するモノクローナル抗体を調整するためには、培養物中に連続した細胞系により抗体分子を生産するために用いられる技法のいずれを使用してもよい。これらの例を挙げると、これに限るわけではないが、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎにより初めて開発されたハイブリドーマ法［Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）］、ならびにトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法［Ｋｏｚｂｏｒ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）］；Ｃｏｔｅ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−２０３０（１９８３）］、そしてヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法［Ｃｏｌｅ等、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５）］をあげることができる。本発明のさらなる実施例においては［ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５］に記載の技術を用いて、無菌動物中でモノクローナル抗体が産生されている。実際本発明にしたがい、例えばＤＣ−ＳＩＧＮに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を、例えば適当な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることにより「キメラ抗体」［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：８７０（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５）］産生のために開発された技法が使用できる。このような抗体もまた本発明の範囲内のものである。ヒトまたは人化抗体は異種抗体よりも免疫反応、特にアレルギー反応を引き起こすことが少ないため、このようなヒトあるいは人化キメラ抗体はヒトの疾患または障害（下記に記載）の治療に好ましく用いることができる。
【０１００】
本発明にしたがい一本鎖抗体の産生のために記載されている技法［米国特許第５，４７６，７８６号および５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎ）；米国特許第４，９４６，７７８号］を、例えばＤＣ−ＳＩＧＮ特定一本鎖抗体の産生に適用することができる。本発明のさらなる実施例においてはＦａｂ発現ライブラリの構築のために記載されている技法［Ｈｕｓｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）］を用いて転座促進蛋白質、またはその派生物、あるいは類似体に所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の速やかで簡単な同定が行われる。
【０１０１】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は既知の技法によって生成できる。例えば、かかる断片としてはこれに限るわけではないが、抗体分子のペプシン消化により製造することができる、Ｆ（ａｂ′）２断片；Ｆ（ａｂ′）２断片のジサルファイド橋を還元することによって製造することができるＦａｂ′断片、そして抗体分子をパパインと還元剤により処理することによって製造できるＦａｂ断片がある。
【０１０２】
抗体の生産において、所望の抗体のスクリーニングは当該分野で知られた技法、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着検査法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、インシチューイムノアッセイ（例えば金コロイド、酵素またはラジオアイソトープ標識などを用いた物）、ウェスタン法、沈降反応、凝集反応法（例えばゲル凝集反応法、赤血球凝集法）、補体結合法、免疫蛍光分析、プロテインＡアッセイ、そして免疫電気泳動法など、によって行うことができる。１つの実施例において抗体結合は一次抗体上の標識を検出することによって検知される。もう一つの実施例において一次抗体は一次抗体へ二次抗体または試薬が結合するのを検出することによって検知される。さらなる実施例において、二次抗体は標識されている。イムノアッセイにおいて結合を検出する方法は数多く当該分野で知られており、これらは本発明の範囲内である。例えばＤＣ−ＳＩＧＮの特定のエピトープを認識する抗体を選択するためには、このようなエピトープを含む転座促進物質断片へ結合する生成物用に作成したハイブリドーマをアッセイすることができる。特定の動物種からのＤＣ−ＳＩＧＮに特異的な抗体は、その動物種の細胞により発現されたＤＣ−ＳＩＧＮまたはその細胞から分離したＤＣ−ＳＩＧＮに結合が陽性であるということに基づき選択することができる。
【０１０３】
先に述べた抗体は、例えばウェスタンブロッティング法、生体内でのＤＣ−ＳＩＧＮのイメージング、適当な生理的サンプル中でのそのレベルの測定など、上記に記載したあるいは当該分野で知られている検出技法を使用して、ＤＣ−ＳＩＧＮの位置確認および活性に関する当該分野で既知の方法に用いることができる。
【０１０４】
抗体（ならびに本発明の他の蛋白質、ペプチドおよび核酸）用の適当な標識には酵素、蛍光体（２、３名前をあげるとすると、例えばイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離のまたはキレート化ランタニド型塩、とりわけＥｕ３＋緑色蛍光蛋白質）、発色団、放射性同位元素、キレート化剤、染料、金コロイド、ラテックス粒子、リガンド（例えばビオチン）、そして化学発光剤があげられる。コントロールマーカーを用いる場合、レセプターとコントロールマーカーには同じ標識を用いても異なる標識を用いてもよい。放射性標識、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅなどの同位体を使用する場合、現在入手可能な既知の計数方法を用いることができる。標識が蛋白質であるとき、例えば酵素や蛍光蛋白質など、検出は現在使用されている比色分析、分光分析、蛍光分光分析および電流測定分析あるいはガス分析のいずれを用いてもよい。
【０１０５】
本発明にしたがい使用することのできる標識の一例は直接標識である。直接標識はその天然の状態において裸眼で、あるいは光学フィルターを使用することにより、および／または刺激、例えば紫外光を加え、蛍光を促進することにより簡単に見ることのできる実体であると定義される。本発明にしたがい使用することのできる着色標識の例としては、例えばＬｅｕｖｅｒｉｎｇ（米国特許第４，３１３，７３４号）が記載したもののような金のゾル粒子などの金属ゾル粒子、Ｇｒｉｂｎａｕ等（米国特許第４，３７３，９３２号）やＭａｙ等（ＷＯ  ８８／０８５３４）が記載したもののような染料ゾル粒子、Ｍａｙ，同上、  Ｓｎｙｄｅｒ（ＥＰ−Ａ  ０  ２８０  ５５９および０  ２８１  ３２７）が記載したもののような着色ラテックス、またはＣａｍｐｂｅｌｌ等（米国特許第４，７０３，０１７号）が記載したもののようなリポソーム中のカプセル化した染料などがある。その他の直接標識としては放射性ヌクレオチド、緑色蛍光蛋白質などの部分を含む蛋白質を始めとする蛍光部分または発光部分がある。これらの直接標識デバイスに加えて酵素を含む関節標識もまた本発明にしたがって用いることができる。
【０１０６】
酵素結合イムノアッセイにはさまざまな型のものが当該分野で知られており、例えばアルカリ性ホスファターゼおよびカラシペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸脱水素酵素、ウレアーゼがあるが、これらおよびその他の酵素はＥｖａ  Ｅｎｇｖａｌｌ  により  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７０：４１９−４３９（１９８０）でまた米国特許第４，８５７，４５３号で詳しく考察されている。適した酵素としてはこれに限るわけではないがアルカリ性ホスファターゼおよびカラシペルオキシダーゼがあげられる。
【０１０７】
本発明に使用するその他の標識には磁気ビーズあるいは核磁気共鳴映像法標識がある。
【０１０８】
もう一つの実施例においてＳｉｄｎｅｙ  Ｐｅｓｔｋａの欧州特許第０３７２７０７号（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８９３１１１０８．８）または  Ｆｏｘｗｅｌｌ等に対し１９９５年１０月１７日賦与された米国特許第５，４５９，２４０号に記載のように、３２Ｐで標識するためにリン酸化部位を本発明の抗体上に作ることができる。
【０１０９】
抗体を始めとする蛋白質は代謝標識により標識することができる。代謝標識は［３５Ｓ］−メチオニンまたは［３２Ｐ］−オルトホスフェートなどの代謝標識を補液した培養液の存在下で蛋白質を発現する細胞を試験管内培養している間に行われる。［３５Ｓ］−メチオニンによる代謝（または生合成）標識に加え、本発明ではさらに［１４Ｃ］−アミノ酸および［３Ｈ］−アミノ酸（トリチウムが非不安定位置で置換された）を用いて標識を行うことをが検討されている。
【０１１０】
ある特定の実施例において、ＤＣ−ＳＩＧＮの活性に作用する、あるいは拮抗する抗体が製造できる。このような抗体はトキシンあるいは放射性元素と接合すると、ＨＩＶ−促進性細胞を破壊標的とするのに使用できる。したがってＨＩＶを収容する細胞は、特にその休眠段階において、例えばリシンあるいは３２Ｐまたは１２５Ｉといった放射性同位元素などのトキシンに接合した抗体がＤＣ−ＳＩＧＮ  ＨＩＶ  ｇｐ１２０複合体に特異的であるとき、このような抗体によって破壊される。
【０１１１】
ワクチン接種および受動免疫療法
ＨＩＶなどのウイルスに対する能動免疫は本発明の蛋白質およびアジュバント、および／または本発明の蛋白質複合体、および／またはその抗原性断片、および／またはその派生物による免疫化（ワクチン接種）によって誘導することができる。例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ結合に必要な、免疫量のｇｐ１２０の一部、あるいは不随する構造変化によりＤＣ−ＳＩＧＮに結合するｇｐ１２０上に露出するｇｐ１２０の一部（ここではまとめて特定のｇｐ１２０エピトープと称する）はワクチンの抗原性成分として作用する。
【０１１２】
例えば特定のｇｐ１２０エピトープのみ、あるいはカプセルに接合したものはＡＩＤＳを引き起こすことができず、本発明にしたがって特定のｇｐ１２０エピトープによりワクチン接種したことで顕在化した能動免疫はすぐさま免疫応答および免疫学的記憶を生じ、したがって、また特に特定のｇｐ１２０エピトープがｇｐ１２０の保存領域である場合には、ＨＩＶによる感染に対し長期間の保護を与える。この特定のｇｐ１２０エピトープまたはその派生物は、ワクチンを生成するためのアジュバントとの混合物として調製できる。好ましくは、このワクチンの抗原性成分として使用される、この特定のｇｐ１２０エピトープまたはその派生物あるいは断片はＨＩＶのすべてあるいは多くの株に共通の抗原である。このワクチンの抗原成分はしたがって好ましくは共通抗原である。
【０１１３】
アジュバントはワクチンを接種する個体に応じて選択される。好ましくは、薬学的に許容されるアジュバントが使用される。例えばヒト用のワクチンには完全および不完全のフロイントアジュバントを始めとする、油、または炭化水素エマルジョンアジュバントを使用すべきではない。ヒトへの使用に適したアジュバントの例としては明礬（アルミナゲル）があげられる。動物用のワクチンにはヒトの使用に不適当であるアジュバントを使用してもよい。
【０１１４】
抗原とアジュバントを含む従来のワクチンの代案として患者の組織の細胞により抗原の発現を行わせるために患者の組織内に抗原をコード化するＤＮＡを直接生体内導入するものがあげられる。このようなワクチンはここで「核酸ベースのワクチン」と呼ぶ。発現ベクターは自己由来の信号配列を含むように設計することができる。例えば裸のＤＮＡベクター（例えばＵｌｍｅｒ等、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９参照），ＤＮＡベクター輸送体（例えばＷｕ等、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔ等、カナダ特許第２，０１２，３１１号１９９０年３月１５日申請），あるいは特定のｇｐ１２０エピトープをコード化する核酸を含むウイルスベクターを組織に注入することができる。適当なウイルスベクターには両栄養性宿主域で細胞中にパッケージしたレトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：５−１４；Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，§９参照）、および弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスがあり、これに限定するわけではないが例えば単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）（例えばＫａｐｌｉｔｔ等、１９９１，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０参照
）、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（例えばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ等、１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０参照），アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えばＳａｍｕｌｓｋｉ等、１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８参照）などがあげられる。完全に、またはほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く、欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは細胞中に導入したのち感染性を有しない。
【０１１５】
本発明の核酸ベースのワクチンを含むベクターは所望の宿主に当該分野で既知の方法、例えば形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子ガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体［例えばＷｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔ等、１９９０年３月１５日申請のカナダ特許第２，０１２，３１１号参照］により導入することができる。
【０１１６】
本発明のワクチン、例えば特定のｇｐ１２０エピトープ抗原またはその抗原的派生物または断片を含むワクチン、または対応する核酸ワクチンは、これに限るわけではないが、例えば筋肉内、腹膜内、静脈内など、どのような非経口経路により投与することもできる。好ましくは、求めるワクチン投与の結果が抗原に対する、さらには病原性生物に対する免疫反応を解明することであるので、投与は直接、あるいはターゲットとすることにより、またはウイルスベクターを選択することにより間接的に、リンパ組織、例えばリンパ節や脾臓に行われる。
【０１１７】
ウイルス感染、好ましくはレトロウイルス、より好ましくはＨＩＶ感染を受けていると思われる、または特に感染を受けやすい動物に対して、本発明の特定のｇｐ１２０エピトープに対する抗血清、ポリクローナル抗体または中和モノクローナル抗体をその動物に投与することによって受動免疫を与えることができる。受動免疫は長期の保護を与える物ではないが、ワクチンを受けてない患者の治療には貴重なツールでありうる。好ましくは、受動免疫治療のために投与される抗体は自己由来の抗体である。例えば、患者がヒトの場合、抗体に対する免疫反応の可能性を最小にするために、抗体がヒト起源のものであり、「人化」されていることが好ましい。
【０１１８】
受動免疫に対する類似の治療としてはＴ細胞への樹状細胞によるＨＩＶの輸送を抑制するに十分な量の可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮの投与がある。この必要量は標準的な技法を用いることにより、当業者により決定できる。
【０１１９】
本発明の能動または受動ワクチン、または可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮの投与は動物患者をウイルスの感染、好ましくはレトロウイルスの感染、より好ましくはＡＩＤＳから守るのに用いることができる。したがって本発明のワクチンは鶏、七面鳥およびペットなどの鳥類；ほ乳類、好ましくは人、に用いることができるが、本発明のワクチンはその他のほ乳類種、これに限定するわけではないが、家で飼われる動物（犬や猫）；家畜（牛、羊、馬、ヤギ、豚など）；齧歯動物および飼いならされていない動物への使用が考えられている。ＡＩＤＳの場合、もちろんワクチン接種は人での使用を想定している。
【０１２０】
ＨＩＶ感染の治療および／または予防において有用な化合物のためのドラッグライブラリをスクリーニングする方法
本発明はウイルス感染のトランスエンハンスメントに基づくアッセイを含む。このようなアッセイは標的細胞の感染をトランスで増強するＤＣ−ＳＩＧＮの能力を阻害する抗体を始めとする化合物をスクリーニングするのに使用できる。このアッセイをさらに発展させて、さらに予防または治療的ワクチンのための反応をモニターするテストキットを作ることができる。このようなアッセイは下記の物を利用することができる。
（ｉ）これに限るわけではないが、ＣＣＲ５あるいはＣＸＣＲ４などの転座促進物質、およびＣＤ４を発現する標的細胞としてのさまざまな細胞系のいずれか、
（ｉｉ）細胞表面の膜小胞中に、または可溶性組み換え材料中に含まれるＤＣ−ＳＩＧＮの原料、および
（ｉｉｉ）レポーター遺伝子をコード化する組み換え型のＨＩＶ、例えば標的細胞の効果的な感染の判定をするためのルシフェラーゼまたは緑色蛍光蛋白質。
【０１２１】
適した細胞系の例としてはこれに限るわけではないが、ＣＤ４を発現するように形質転換治療を行ったマウス３Ｔ３細胞、ヒトＨｅＬａ、Ｕ８７ＭＧ、ＨＯＳおよび２９３細胞がある。さらにＣＸＣＲ４もＣＫＲ−５（ＳＣＬなど）も通常発現しないヒト細胞系も使用することができる。さらに下記の実施例に含まれる細胞系もまた使用できる。
【０１２２】
ＤＣ−ＳＩＧＮで形質移入した細胞系はｇｐ１２０または感染性ＨＩＶ粒子を捕獲するためにアッセイ中で使用することができる。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞はレポーターウイルスでパルスし、洗浄して標的細胞と共に培養する。レポーター活性はその後培養細胞中で分析することができる。いくつかのアッセイにおいてはＤＣ−ＳＩＧＮを発現するように形質移入したＴＨＰ−１細胞または樹状細胞をＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞として使用することができる。
【０１２３】
ＤＣ−ＳＩＧＮで形質移入した細胞系はトランスで標的細胞感染を増強するためにアッセイ中で使用できる。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞と標的細胞の混合物は適したタイターのレポーターウイルスと共に培養したのち、レポーター活性を測定する。バックグラウンド感染のためのコントロールとして、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない細胞を使用する。
【０１２４】
ＤＣ−ＳＩＧＮを含む膜小胞もまた標的細胞と共に使用し、レポーターウイルスを捕獲、あるいはトランスで標的細胞のレポーターウイルスによる感染を増強することができる。１つの実施例において固相担体上にＤＣ−ＳＩＧＮを固定するために脂質単分子膜が用いられる。レポーターウイルスをついで加える。このタイプのある特定の実施例において膜はその後洗浄する。どちらの場合も、標的細胞をそれから加える。
【０１２５】
もう一つの実施例において、固定した固相ＤＣ−ＳＩＧＮは可溶性ｇｐ１２０またはｇｐ１４０で処理し、洗浄し、ついでＤＣ−ＳＩＧＮｇｐ１２０またはｇｐ１４０複合体に特異的に結合する抗体をスクリーニングする。このタイプの好ましい実施例において、抗体はＤＣ−ＳＩＧＮにもｇｐ１２０／１４０のみにも結合しない。ここで同定された抗体はこれらの抗体の固相ＤＣＳ／ｇｐ１２０またはｇｐ１４０複合体への結合を妨げる化合物をスクリーニングするために使用することができる。これらの抗体もまた本発明の一部である。
【０１２６】
可溶性のＤＣ−ＳＩＧＮあるいは分泌されたＤＣ−ＳＩＧＮはここに開示した捕獲あるいは強化アッセイにおいて使用することができる。これらの形のＤＣ−ＳＩＧＮはバクテリアまたはほ乳類細胞系および昆虫細胞を含む真核性発現型中で組み換えバキュロウイルスを用いて調製することができる。これらの形のＤＣ−ＳＩＧＮを調製する１つの手段は信号ペプチド配列をエピトープタグと外部領域（最膜近位）のＮ−末端アミノ酸残基に結合し、これをほ乳類細胞系中で発現させることである。別のアプローチはＤＣ−ＳＩＧＮおよび膜貫通蛋白質の細胞外領域、例えばＣＤ８−α、と融合蛋白を作り、プロテアーゼ分割部位（例えばトロンビンにより認識される）がエピトープで標識された形のＤＣ−ＳＩＧＮ外部領域からその領域を分離することである。抗ＣＤ８親和カラム上で精製したのち、この蛋白質をトロンビンで分割し、可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮを得ることができる。得られた蛋白質はトランスエンハンスメントアッセイ中でモノマーとして使用できるほか、多量体の形で、おそらくビーズまたはその他の固相担体に結合し、捕獲やエンハンスメントアッセイで使用したり、また膜小胞と共に上記のように薬物のスクリーニングに使用することができる。
【０１２７】
ＨＩＶおよびＳＩＶベクターにはこれに限るわけではないが、ＨＩＶまたはＳＩＶルシフェラーゼ、ＨＩＶまたはＳＩＶアルカリ性ホスファターゼ、ＨＩＶまたはＳＩＶ−ＣＤ２４およびＨＩＶまたはＳＩＶ−２ＬＴＲ−緑色蛍光蛋白質が含まれる。このようなベクターにおいてエンベロープ遺伝子はフレームシフトにより不活性化され、レポーター遺伝子をついで挿入してＮｅｆオープン読みとり枠と置換する。さらに、マウスの細胞中でのスクリーニングをより簡単に行うためにさらにベクターを作ることができるが、ここでＨＩＶ−ＬＴＲ駆動レポーターの発現はヒトの細胞中のレベルのほんのおよそ１％にすぎない。このようなベクターはＨＩＶ−ｇｐｔプロトタイプに基づいており、このレポーター、例えばルシフェラーゼがＳＶ４０プロモーターの制御の下にエンベロープ遺伝子中に置かれると、組み込み後、高レベルの発現が保証される。
【０１２８】
ＣＣＲおよびＣＸＲ４に対する親和性がわかっているＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質はスクリーニングに適している。例えばＣＣＲ５−親和性エンベロープ糖蛋白質ＡＤＡおよびＹＵ−２（これはまたＣＣＲ３を使用することもできる）、９２ＵＳ７１５、および９１ＵＳ００５およびＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ５に対し二重親和性を有するもの（９２ＨＴ５９３）はＢＯＢで形質移入した細胞を感染させることができる。一次ＨＩＶ−１株のエンベロープ蛋白質のうちの２つ（二重親和性９２ＨＴ５３９とＣＲ５親和性９２ＢＲＯ２５）もまたＢｏｎｚｏを使用する。さらにＴ親和性エンベロープ糖蛋白質にはＨＸＢ２と９２ＵＧＯ２１が含まれ、９２ＨＴ５９９はＢＯＢまたはＢｏｎｚｏを使用する。その他のＣＣＲ５親和性エンベロープ糖蛋白質にはＢａＬ、９２ＵＧ９７５、９３ＨＴ９６６、９２ＲＷＯ２０、９３ＴＨ９７６，９２ＢＲＯ０２０および９３ＭＷ９６５が含まれる。ＪＲＦＬはＣＣＲ５親和性エンベロープ糖蛋白質であり、ＢＯＢをごく弱く使用する。Ｍａｃ１Ａ１１−ＡｇｍＴＹ０１またはＭａｃ２３９などのＳＩＶのエンベロープ糖蛋白質はＳＩＶにより使用されるレセプターをスクリーニングするのにも使用することができる。
【０１２９】
ＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ感染において果たす役割を同定することにより、ＨＩＶ感染を抑制する特定の作用物質を同定するための特異な一連のプロトコルを提供することができる。したがって本発明は、さまざまな当該分野で知られたスクリーニングアッセイを用いて、ＨＩＶ侵入の作用物質および拮抗物質を同定するための方法も含む。１つの実施例においてかかる作用物質または拮抗物質はＨＩＶのあるいはさらに詳しくはＨＩＶまたはＳＩＶエンベロープ蛋白質のＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を競合的に抑制する。
【０１３０】
１つのこのような実施例において、ＣＤ４および１つ以上の転座促進物質を発現する細胞系は１つ以上の選択されたエンベロープ糖蛋白質によりＤＣ−ＳＩＧＮの存在下でシュードタイプになったＨＩＶ−レポーターウイルスまたはＳＩＶ−レポーターウイルスにより感染することができる。化合物ライブラリに対し、そのシュードタイプウイルスによる細胞の感染を阻害する能力をアッセイにより判定することができる。候補化合物を選択し、ついでＭＬＶ両栄養性エンベロープなどの非−ＨＩＶまたは非−ＳＩＶエンベロープ蛋白質により、あるいは例えばＶＳＶ−Ｇエンベロープによりシュードタイプにしたウイルスによる感染に及ぼす非特異的効果に対し、カウンタースクリーニングを行う。
【０１３１】
当該分野において知られているスクリーニング技法はどれでもＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０会合体の拮抗作用物質をスクリーニングするのに用いることができる。本発明では有機低分子化合物のスクリーニングならびに生体内で結合し、このような活動に拮抗する天然リガンド用のスクリーニングをも考慮されている。例えば、ＨＩＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮ会合体を拮抗する分子を天然生成物ライブラリから本発明のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１３２】
拮抗作用物質の同定およびスクリーニングはさらに蛋白質の構造的特徴を決定する、例えばＸ線結晶学、中性子線回折、核磁気共鳴分光測定法、および構造決定のためのその他の技法を使用することによって容易に行うことができる。これらの技法により作用物質および拮抗物質の合理的な設計または同定を行うことができる。
【０１３３】
もう一つのアプローチは組み換えバクテリオファージを用いて大きなライブラリを作るものである。「ファージ法」［ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６（１９９０）］、を用いることにより、極めて大きなライブラリの構築ができる（化学的構成要素数１０６  −１０８個）。第二のアプローチは主として化学的な方法を用いるものであり、例えばＧｅｙｓｅｎ法［Ｇｅｙｓｅｎ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９−７１５（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  １０２：２５９−２７４（１９８７）］およびＦｏｄｏｒ等の方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３（１９９１）］などがその例である。Ｆｕｒｋａ等［１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＦＲ：０１３（１９８８）；Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）］、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ［米国特許第４，６３１，２１１号１９８６年１２月発行］およびＲｕｔｔｅｒ等［米国特許第５，０１０，１７５号、１９９１年４月２３日発行］は作用物質または拮抗物質として試験することのできるペプチド混合物を生成する方法を記載している。
【０１３４】
別の面から見ると、合成ライブラリ［Ｎｅｅｄｅｌｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０７００−４（１９９３）；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）；Ｌａｍ等、国際特許出願第ＷＯ９２／００２５２号；Ｋｏｃｉｓ等、国際特許出願第ＷＯ  ９４２８０２８号、これらは両方ともここにその全部を援用する］などは本発明にしたがいＴ細胞中へのＨＩＶ侵入に対するＤＣ−ＳＩＧＮの媒介の阻害剤のスクリーニングに使用することができる。
【０１３５】
このスクリーニングはＤＣ−ＳＩＧＮを発現する組み換え細胞により行うことができるが、あるいは別法として、上述のように、精製した、好ましくは可溶性の蛋白質、例えば組み換えにより生成したものを用いて行うこともできる。例えばｇｐ１２０結合部位を含む標識した、可溶性のまたは可溶化したＤＣ−ＳＩＧＮのｇｐ１２０への結合能はここに記載するように、ランダムファージライブラリまたはケミカルライブラリなどのライブラリをスクリーニングするのに使用できる。当該分野において知られている数多くのアッセイおよび／またはここに例示したアッセイのうちいずれを使用してもよい。
【０１３６】
本発明にはしたがってｇｐ１２０のＤＣ−ＳＩＧＮ（ＤＣＳ）への結合を妨げる化合物も含まれる。ある特定の実施例において、この化合物はオリゴ糖構造に基づいた構造を有する。あるいはこれらはＤＣ−ＳＩＧＮに特異的な抗体であってもよく、またこれらはＤＣ−ＳＩＧＮとの相互作用に要求されるｇｐ１２０の特に保存された領域に特異的な抗体であってもよい。このような化合物は感染、特にＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない細胞の感染を妨げる。
【０１３７】
本発明はまたＤＣ−ＳＩＧＮ非依存性のＨＩＶ−ターゲット細胞融合強化を妨げる化合物を提供する。このような化合物としてはＤＣ−ＳＩＧＮに結合し、ターゲット細胞上のＣＤ４およびＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４を通じてＨＩＶ侵入のトランスエンハンスメントを妨げる抗体があげられる。このような化合物あるいは抗体はｇｐ１２０のＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を妨げないことが好ましい。
【０１３８】
さらに、この結果が示唆するモデルの１つはＴ細胞感染を強化する上でＤＣ−ＳＩＧＮがクラスター化していることが必要とされていることに基づいている。したがって、ウイルスがＤＣ−ＳＩＧＮに結合してもさらに樹状細胞表面上でレセプターの適当なクラスター化が必要とされているのである。ウイルスの結合が生じていたとしても、いくつかの選択された化合物はこのクラスター化をブロックすることができた。このような化合物はしたがってＴ細胞および単球の感染をブロックするであろう。
【０１３９】
さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１をプロセッシングし、ウイルスに持久力をもたせ（感染力の衰えを防ぐ）、Ｔ細胞の感染強化をトランスで行うのをブロックする化合物が同定できる。ウイルスは樹状細胞またはＤＣ−ＳＩＧＮで形質移入した他の細胞と相互作用したのち、プロテアーゼから保護される。したがって、ウイルスのＤＣ−ＳＩＧＮ結合後のこの保護機構を阻害する化合物もまた本発明の一部である。このような化合物はＤＣ−ＳＩＧＮを発現する全細胞と共に、ここに記載の捕獲およびトランスエンハンスメントアッセイを行うことにより同定することができる。捕獲アッセイでは、ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞をレポーターウイルスでパルスした後一日以上経過してからＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞へと添加される標的細胞の感染を阻害する化合物のスクリーニングを行うことができる（下記実施例参照）。
【０１４０】
本発明はさらに生体内で感染を妨げるための可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮの使用を提供する。可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮのいくつかの形（例えば結合するが構造変化は妨げるように修飾したもの）はＨＩＶ感染を妨げたが他の形は融合を強化した。このような形のＤＣ−ＳＩＧＮは突然変異誘発を行って生成し、ｇｐ１２０にひきつづき結合はするものの、捕獲したウイルスをＴ細胞、および／またはその他の標的細胞へ伝播する、および／またはＴ細胞およびその他の標的細胞のトランスでの感染を強化することがない、ＤＣ−ＳＩＧＮ変異体を生産することができる。ある特定のアプローチは標準的修復ミスの多いＰＣＲを用いてＤＣ−ＳＩＧＮ細胞外領域のランダム突然変異誘発を行い、異なる突然変異体クローンを形質移入またはレトロウイルス導入でＴＨＰ−１などの適当な細胞系内に入れ、抗ｇｐ１２０抗体でコートした磁気ビーズを用いて、またはＦＡＣＳを用いてｇｐ１２０に結合する細胞をソートし、ついで各形質移入したクローンをＣＤ４／ＣＣＲ５またはＣＤ４／ＣＸＣＲ４を発現する適当なターゲット細胞へのウイルス伝播能力をテストすることである。トランスにおいて侵入の強化を行うことができない突然変異体の形のＤＣ−ＳＩＧＮは上記に記載の方法を用いて、可溶性または分泌型の形にすることができ、これらのトランスエンハンスメントを阻害する能力はここに記載したアッセイで試験することができる。
【０１４１】
ここに開示した結果に基づくと、ｇｐ１２０のＤＣ−ＳＩＧＮとの相互作用はエンベロープ糖蛋白質中の構造変化をもたらし、それが膜融合活性を強化するように思われる。したがって、ＤＣ−ＳＩＧＮ結合により引き起こされたエンベロープ糖蛋白質（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）の変化型などと特異的に相互作用する、したがってウイルスの侵入を妨げる抗体をはじめとする化合物がまた提供される。このような低分子有機化合物または抗体はトランスエンハンスメントアッセイで薬のスクリーニングを行うことにより、またはＤＣ−ＳＩＧＮおよびｇｐ１２０または可溶性ｇｐ１４０のオリゴマーの複合体を用いることにより同定することができる。例えば、可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮ／ｇｐ１２０はこれら蛋白質の複合体のみまたはｇｐ１２０上の立体配座エピトープのみに特異的に結合するモノクローナル抗体を導き出すのに使用することができる。このような複合体はまたＤＣ−ＳＩＧＮ／ｇｐ１２０またはＤＣ−ＳＩＧＮ／ｇｐ１４０に、またはエンベロープ糖蛋白質の新規構造に特異的に結合する化合物をスクリーニングするのに使用することができる。
【０１４２】
さらに、かならずしもＤＣ−ＳＩＧＮ結合により誘導されるものではないが、ウイルスの膜融合性が強化される細胞内区画へとウイルスを特別に導くことにより誘導される変形エンベロープ糖蛋白質（ｇｐ２２０／ｇｐ４１）と特異的に相互作用する化合物または抗体が本発明に含まれる。このような化合物または抗体はトランスエンハンスメントアッセイで薬のスクリーニングを行うことによって（上述）あるいはＤＣに暴露する（またはＤＣ暴露を模倣する他の手段、例えば低ｐＨに暴露する）ことにより「膜融合性」を高めたＨＩＶ粒子を用いる事により同定することができる。さらに、「融合−強化」構造の可溶性エンベロープ糖蛋白質はｇｐ１２０またはｇｐ４１上の立体配座エピトープにのみ特異的に結合するモノクローナル抗体を誘導するのに用いることができる。このような複合体はエンベロープ糖蛋白質の新規構造へと特異的に結合する化合物をスクリーニングするのにもまた使用できる。
【０１４３】
かかる化合物のスクリーニングを行うには、ＨＩＶ粒子をさまざまなｐＨ条件に暴露しついで中性ｐＨへと戻せばよい。もし特定のｐＨ条件が感染性を増強するのであれば、化合物の感染を妨げる能力をスクリーニングすることができる。例えばシュードタイプウイルス（レポーター遺伝子、例えば蛍ルシフェラーゼをコード化する）をｐＨ活性化し、ついでターゲット細胞（例えばヒトＣＤ４、ヒトＣＣＲ５およびヒトサイクリンＴ１を発現するマウス３Ｔ３細胞、またはその他の適当なレセプターの補体を有するマウスあるいはヒトの細胞）を感染させるのに用いる。ルシフェラーゼ活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。活性化ウイルス構造への化合物の特異性を保証するためにいくつかのコントロールを含ませる。例えばレニラルシフェラーゼをコード化する非ｐＨ暴露シュードタイプウイルスを高濃度に含ませてアッセイを行うことができる。このウイルスの感染性は対象化合物によって影響されることはない。あるいはＶＳＶ−Ｇまたはマウス両栄養性エンベロープ糖蛋白質でシュードタイプとしたレニラルシフェラーゼコード化ウイルスもまた同様、所望の化合物により影響を受けることはない。
【０１４４】
もう一つのアプローチでは精製した初期のエンドソームの内容を用いる。これはついでウイルス（例えばＨＩＶ）と混合し感染性を増加させる（先に記載した低いｐＨ条件に追加および／またはそれに替えて行う）。このような治療の後増加したウイルス感染性を妨げる化合物を上記のアッセイによりスクリーニングする。
【０１４５】
新型のＨＩＶエンベロープ糖蛋白質（低ｐＨおよび／またはエンドソーム環境により誘導された）のＣＤ４／ケモカインレセプターまたは型−特異性ｍＡｂとの相互作用を妨げる化合物を同定するためには別のスクリーニング方法を用いることができる。前者においてはレセプター複合体を発現する細胞への、または例えば脂質関連型のＣＤ４およびＣＣＲ５で被覆されたビーズへのエンベロープの結合をテストする。
【０１４６】
さらに、樹状細胞によるＨＩＶ内部移行によりウイルスがリソソームではなくリサイクリングエンドソーム（実施例２参照）へと向かうようになるという知見は、ＤＣ−ＳＩＧＮの重要な機能の１つを明らかにする。したがって、本発明はさらにＨＩＶをリサイクリングエンドソームから樹状細胞（ならびに他の細胞）のリソソーム区画へと再度向かわせることによりＨＩＶ感染を阻害する化合物をさらに提供する。このような化合物はＨＩＶの感染性を減少させ、免疫抗原性（したがって抗ウイルスＴ細胞免疫反応も）を増加させる。これはＤＣ−ＳＩＧＮの細胞内エンドサイトーシス的機構との相互作用を阻害することにより達成できる。したがって、本発明はＤＣ−ＳＩＧＮの細胞質顆粒領域への特定蛋白の結合を妨げる化合物の同定方法およびこのように同定された化合物を提供する。これらの蛋白質はウイルスの内部移行およびＨＩＶの樹状細胞利用能にとって必要不可欠なものである。
【０１４７】
したがって本発明はＤＣ−ＳＩＧＮの内部移行を阻害する化合物を試験するためのスクリーニングを提供する。このようなスクリーニングの１つは、抗体ベースのスクリーニングである。ある特定の実施例において、標識された抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を適当な細胞（例えばＴＨＰ−ＳＩＧＮ細胞などＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞）へ結合し、３７℃前後で適当な時間（例えば２０−１２０分）温めることによって内部移行を誘導する。表面に結合した抗体をその後、酸性ｐＨまたはプロテアーゼによってストリップし、細胞を洗浄する。残りの標識を測定する。ＤＣ−ＳＩＧＮのエンドサイトーシスを阻害する化合物は標識の蓄積を妨げるであろう。このような実施例の１つにおいて抗体は蛍光標識を有する。関連した実施例において抗体は放射性標識を有する。
【０１４８】
本発明により提供されるもう一つのスクリーニングはＨＩＶ−ベースのスクリーニングである。このようなスクリーニングでは標識ＨＩＶ粒子を用いることができる。これらのＨＩＶ粒子は適当な細胞（例えばＴＨＰ−ＳＩＧＮ細胞などＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞）に結合することができ、内部移行が３７℃前後で適当な時間（例えば２０−１２０分）温めることによって誘導される。表面結合ＨＩＶを酸性ｐＨまたはプロテアーゼでストリップし、細胞を洗浄する。残りの標識を定量する。ある特定の実施例においてＨＩＶ粒子は蛍光標識されており、残りの蛍光をＦＡＣＳ分析または顕微鏡検査法（エンドソーム中の蛍光粒子をモニターする）により測定する。
【０１４９】
ウイルスのリサイクリングエンドソームへの内部移行によりウイルスの感染力が増強されるため、ＨＩＶ−標的細胞融合のＤＣＳ依存性増強を妨げる化合物の同定は重要である。このような方法の１つはウイルス粒子のエンドサイトーシスに続くＨＩＶエンベロープ糖蛋白質における構造変化を妨げる化合物を同定することに基づく。ある特定の実施例において、これらの構造変化はｐＨ依存性構造変化によって引き起こされる。別の方法はエンドソーム区画内での構造変化の後、ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質の型に特異的に結合する化合物を同定することに基づいている。この型のある特定の実施例において、これらの化合物は抗体である。
【０１５０】
ＨＩＶ感染の拮抗剤の投与
本発明にしたがい本発明の治療的組成物の成分を非経口的に、経粘膜的に、例えば経口的に、経鼻的に、あるいは直腸から、または経皮的に導入することができる。投与は例えば静脈内注射など非経口的であることが好ましく、これに限るわけではないが、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、および頭蓋内投与をあげることができる。さらに好ましくはＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０複合体への拮抗剤をＡＩＤＳ治療または予防のために投与する場合は血液中に注射することによって導入してもよい。この拮抗剤はＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０複合体の特定のエピトープまたはＤＣ−ＳＩＧＮとｇｐ１２０に対し競合する可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮを含むＤＣ−ＳＩＧＮの模倣物に対して生成された特定の抗体であってよい。
【０１５１】
もう一つの実施例においてこの治療的化合物は小胞、特にリポソーム中で送達することができる［Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ等、ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），  Ｌｉｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同ｐｐ３１７−３２７；一般に同上参照］。全身性の副作用を減少するためには、これがＤＣ−ＳＩＧＮ−ｇｐ１２０結合の拮抗剤を導入する好ましい方法かもしれない。
【０１５２】
さらにもう一つの実施例において、治療的化合物は制御されたリリースシステムで送達することができる。例えば、上で説明した抗体は静脈内注入、植え込み型浸透圧ポンプ、経皮吸収貼付薬、リポソームまたはその他の投与モードにより投与することができる。１つの実施例においてはポンプを使用することができる［Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ等、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照］。もう一つの実施例においてはポリマー材料を用いることができる［Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）；Ｌｅｖｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ等、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）参照］。さらにもう一つの実施例において、徐放性システムは治療的標的、例えば脳、の近くに配置することができ、それにより全身的用量の一部だけが必要とされる［例えば上記Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照］。
【０１５３】
その他の徐放性システムはＬａｎｇｅｒのレビュー［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）］に記載されている。
【０１５４】
このようにして、拮抗剤を静脈内、動脈内、腹膜内、筋肉内、または皮下的な投与経路により送達することができる。別法として、正しく調剤された拮抗薬は経鼻または経口投与により投与することができる。治療的に有効量（すなわち患者において物質代謝を誘発するに有効な量）を必要な間隔、例えば毎日、１２時間毎になど、で提供することにより確実に拮抗剤を一定供給できる。これらのパラメータは治療している病気の状態の重篤性、食事に加えられている変更など、その他実施されている事項、患者の体重、年齢、性別、および当業者により標準的な医療慣行にのっとって簡単に決定できるその他の基準に応じて異なる。
【０１５５】
この拮抗剤の投与がＡＩＤＳのための有効な治療法となる患者は好ましくは人であるが、関連したウイルス状況にある霊長類であってもよい。したがって、当業者には容易に理解されることであるが、本発明の方法ならびに製剤組成物は特にあらゆる霊長類への投与に適している。
【０１５６】
形質転換ベクターおよび発現の抑制
１つの実施例においては、可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮをコード化する遺伝子、またはアンチセンスまたはＤＣ−ＳＩＧＮｍＲＮＡに特異的なリボザイム（ここで「アンチ遺伝子」と呼ぶ）をウイルスベクター中に生体内で導入する。このようなベクターとしてはこれに限る訳ではないが、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスがあげられる。完全に、またはほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く、欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは細胞中に導入したのち感染性を有しない。欠損ウイルスベクターを使用することによりベクターによる他の細胞の感染のおそれなく特定の、限定された部位の細胞への投与を行うことができる。したがって、マクロファージを特異的に標的とすることができる。特にベクターの例をあげると、これに限る訳ではないが、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ等、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０（１９９１）］，およびＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ等。［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０（１９９２）］、により記載されているベクターのような、弱毒化アデノウイルスベクター、ならびに欠損アデノ随伴ウイルスベクター［Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１（１９８７）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）］などがあげられる。
【０１５７】
もう一つの実施例において遺伝子またはアンチ遺伝子は例えばＡｎｄｅｒｓｏｎ等、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ等、１９８３，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３；Ｔｅｍｉｎ等、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎ等、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ等、１９８８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎ等、米国特許第５，１２４，２６３号；１９９５年３月１６日公布されたＤｏｕｇｈｅｒｔｙ等の国際特許第ＷＯ  ９５／０７３５８号；およびＫｕｏ等、１９９３，Ｂｌｏｏｄ  ８２：８４５に記載されているように、レトロウイルスベクター中に導入することができる。
【０１５８】
１つの実施例において特定のＰＢＭＣをＨＩＶ陽性被験動物（例えばヒト）から除去し、例えばＤＣ−ＳＩＧＮコード化遺伝子を天然の活性を有し、ＩＣＡＭ−３に結合するがＨＩＶのＴ細胞への侵入を促進できない、修飾ＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子で置換する。被験動物からは対応するＰＢＭＣが失われ（例えばこの遺伝子修飾がマクロファージまたはＴ細胞中で行われると、マクロファージまたはＴ細胞が失われる）、修飾ＰＢＭＣがこの被験動物中に再導入される。このような被験動物はＤＣ−ＳＩＧＮに対する適当な天然リガンドに応答する能力を有するが、ＨＩＶの細胞侵入を促進する能力はもはや有しないマクロファージまたはＴ細胞を有することになる。関連実施例においては転座促進物質遺伝子（ＣＣ−ＣＫＲ５あるいはＣＸＣＲ４）もまたＨＩＶ転座／感染をより完全に妨げるように修飾されている。
【０１５９】
標的遺伝子デリバリは１９９５年１０月に公布された国際特許第ＷＯ９５／２８４９４号公報に記載されている。
【０１６０】
別法として、ベクターは生体内でリポフェクションにより導入することもできる［Ｆｅｌｇｎｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；ｓｅｅ  Ｍａｃｋｅｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１（１９８８）；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：３８７−３８８（１９８９）］。標的用に、脂質を化学的に他の分子に結合することができる［上記Ｍａｃｋｅｙ等、参照］標的とされたペプチド、例えばホルモン、あるいは神経伝達物質、および抗体などの蛋白質、または非ペプチド分子は化学的にリポソームに結合することができる。
【０１６１】
またベクターを裸のＤＮＡプラスミドとして生体内で導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは所望のホスト細胞に当該分野で既知の方法により導入することができる、例えば形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子ガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用などである［例えば  Ｗｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔ等、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２，０１２，３１１，ｆｉｌｅｄ  Ｍａｒ．  １５，１９９０参照］。
【０１６２】
上に記したように、本発明は翻訳レベルでのＤＣ−ＳＩＧＮの発現を妨げるために使用できるアンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムの調製をも含むものである。このアプローチにおいてはｍＲＮＡのアンチセンス核酸によるマスキングを行うか、またはリボザイムによる分割を行うことによって特定のｍＲＮＡの翻訳を妨げるためにアンチセンス核酸およびリボザイムを用いる。このようなアンチセンスまたはリボザイム核酸は化学的に生産するか、あるいは「抗原」から発現させることができる。
【０１６３】
アンチセンス核酸は少なくとも特定のｍＲＮＡ分子の一部に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である［Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：２９８（１９８８）参照］。細胞中で、これらはそのｍＲＮＡと雑種形成し、二重らせん分子を形成する。この細胞はこの二重らせん型のｍＲＮＡを翻訳しない。したがってアンチセンス核酸はｍＲＮＡの蛋白質への発現を妨げる。およそ１５個のヌクレオチドを有するオリゴマーおよびＡＵＧ開始コドンと雑種形成する分子は、合成が容易であり、また臓器細胞へと導入した時により大きな分子と比較し、問題を引き起こしにくいため、とりわけ有効である。アンチセンス法は多くの遺伝子の試験管内での発現を阻害するのに使用されてきた［上記Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８；Ｈａｍｂｏｒ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１２３７（１９８８）］。好ましくは合成されたアンチセンスヌクレオチドには天然のホスホエステル結合ではなくむしろホスホロチオレートなどのホスホエステル類似体やチオエステル類が含まれている。このようなホスホエステル結合類似体は分解に対し、より抵抗性があり、安定性が増加し、したがってアンチセンス核酸の有効性が増す。
【０１６４】
リボザイムはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼにやや類似した方法で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に分割する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムはある種のｍＲＮＡは自分自身のイントロンを切除する能力を有するという観察から発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾することにより、研究者達はＲＮＡ分子における特定のヌクレオチド配列を認識し、それを切除する分子を作り上げることができた［Ｃｅｃｈ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ２６０：３０３０（１９８８）］。これらは配列特異的であるので特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化される。
【０１６５】
研究者らはテトラヒメナ型と「ハンマーヘッド」型の二つの型のリボザイムを同定している。テトラヒメナ型リボザイムは４個の塩基配列を認識するが、「ハンマーヘッド」型の法は１１個から１８個の塩基配列を認識する。認識する配列が長くなるほど標的ｍＲＮＡ種の中でより独占的に行われやすくなる。したがって「ハンマーヘッド」型リボザイムは特定のｍＲＮＡ種の不活性化にとってテトラヒメナ型よりも好ましく、１８個の塩基認識配列はより短い認識配列よりも好ましい。
【０１６６】
ＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するＤＮＡ配列はアンチセンス分子、およびＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するｍＲＮＡを分割するリボザイムを調製するのに使用することができ、したがって、ＤＣ−ＳＩＧＮをコード化する遺伝子の発現を阻害し、マクロファージおよびＴ細胞中のＨＩＶ侵入レベルを減少することができる。
【０１６７】
固相担体上の細胞
固相担体にはガラスビーズ、糖ビーズ（セファデックス、セファロース、アガロース、セファセルなど）、磁気ビーズ、およびダウエックス型材料があげられる。生物学的材料は当業者に公知の一般的方法、これに限るわけではないがバッチ法、遠心分離、加圧膜濾過（例えばアミコンあるいはミリポア濾過）およびさまざまな種類のカラムを通すなどにより、固相担体に結合した細胞を通過させることができる。
【０１６８】
形質転換動物
ヒトＣＤ４およびＣＣＲ５の形質転換マウスからのＴリンパ球は試験管内でさまざまなＨＩＶ株により感染させることができるがウイルスを動物に注入することによっては感染させることができない。マウスの樹状細胞中にヒトＤＣ−ＳＩＧＮが発現することによりこれらの細胞によるウイルスの粘膜摂取が起こり、ウイルスをリンパ性器官へと運び、ついでヒトＣＤ４およびＣＣＲ５を発現する細胞の生体内感染が生じる。
【０１６９】
本出願の形質転換マウスは、ここに参照として援用する［Ｋｉｌｌｅｅｎ等、ＥＭＢＯ  １２：１５４７−１５５３（１９９３）］に記載のようにして作り出すことができる。ヒトＣＤ４＋マウスＣＤ４−マウスの構築は［Ｋｉｌｌｅｅｎ等、ＥＭＢＯ  １２：１５４７−１５５３（１９９３）］に記載されている。
【０１７０】
形質転換マウスの生成はワクチンおよび新規治療法の開発のためのＨＩＶ発病学のためのモデルシステムとして役立つ。このようなマウスはあらゆるＴ細胞、Ｔ細胞および／またはマクロファージおよび単球のサブセット中にさまざまに組み合わせたヒトＣＤ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＣＲ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、またはＣＸＣＲ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびサイクリンＴ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；ＧｅｎＢａｎｋ  受け入れ番号ＡＦ０４５１６１，Ｗｅｉ等、Ｃｅｌｌ，９２（４）：４５２−４６２（１９９８）］を発現する。これらのタイプの動物はこれらのタイプの細胞中の発現を指示するためにＣＤ４調節配列を用いて作られている。さらにマウスはヒトＤＣ−ＳＩＧＮをその樹状細胞の表面上に発現する。これは、この細胞のサブセット中の発現を指示するためにＣＤ１１ｃプロモーターを用いて行うことができる［Ｄｚｉｅｎｎｉｓ等、Ｂｌｏｏｄ，８５（２）：３１０−３２９（１９９５）］。もう一つのアプローチはＤＣ−ＳＩＧＮｃＤＮＡをマウスＣＸ３ＣＲ１コード化領域の部位に導入するために相同組み換えを用いるものである。後者の遺伝子は樹状細胞中で発現されるが、それがこの部位を標的とする遺伝子の樹状細胞における特異的発現を行わせる。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを樹状細胞中に特異的に発現させる第三の方法は、マウスのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子をヒトＤＣ−ＳＩＧＮｃＤＮＡと置換するために相同組み換えを用いるものである。同様のアプローチがマウスＣＸＣＲ４をヒトＣＸＣＲ４と置換するのに用いられている。もう一つの方法は、最初のエキソンに５′である５ｋｂ以下の配列からなるヒトＤＣ−ＳＩＧＮプロモーターを用いて樹状細胞中の発現を生じさせるものである。このフローサイトメトリーは配列５′を“ＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴ”（アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）にクローニングすることによって生成される。
【０１７１】
本発明のさらなる用途
本開示がＤＣ−ＳＩＧＮがｇｐ１２０に高い親和力を有して結合し、それによりＨＩＶにしっかりと結合することを示しているため、本発明により提供されるいくつかの副次的用途がある。例えばＤＣ−ＳＩＧＮまたはｇｐ１２０と結合するその断片は、単体として固相担体に担持した形においても、あるいは細胞膜中であってもＨＩＶおよび類似のウイルスとの結合に使用することができる。このような結合は血液生成物を濾過するために例えば電気穿孔に使用することができる。別法として、上記に並べあげたようなＤＣ−ＳＩＧＮ誘導生成物はＨＩＶを始めとするウイルス粒子の伝播を防ぐための膣用予防クリームに使用することもできる。
【０１７２】
さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞がここでウイルスのＴ細胞への輸送を促進するのみならずウイルス粒子の寿命を延ばすことが示されているため、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞はレトロウイルスベクター（例えばＨＩＶ）などのウイルスベクターと共に、遺伝子治療、とりわけＴ細胞中で遺伝子輸送が行われるプロトコルにおいて、ウイルスベクターの効果を増強するために用いることができる。
【０１７３】
実際、本発明はＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶウイルスと結合し、それを捕獲する、さらに詳しくはトランスでＨＩＶｇｐ１２０とで相互作用あるいは結合することによりこれが行われる、という発見に関する。このＨＩＶ、とりわけ感染力のあるＨＩＶを捕獲する、そしてこのウイルスを生体内あるいは試験管内で隔離する、という特異な能力はＨＩＶの捕獲が適切である、または必要とされる、さまざまな方法、用途および応用例において使用することができる。したがってＤＣ−ＳＩＧＮを患者からまたは患者のサンプル中からＨＩＶウイルスを捕獲するのに使用できるということもまた考えられている。このことにより、例えばこれに限るわけではないが、分離したＨＩＶの感染力の評価、分離ＨＩＶの薬に対する感受性の評価、例えば遺伝的浮動やウイルス突然変異などの決定あるいは評価を行うための分離したＨＩＶ、特定ＨＩＶ遺伝子またはコード化されたポリペプチドのＤＮＡ配列の分析、そして患者のＨＩＶ集団のその他の特性付け、などのさらなる研究のために、ウイルスを効果的に濃縮することができる。さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮが媒介する捕獲方法は、サンプル中に存在すると推定される、あるいは存在し得るＨＩＶを精製あるいは除去することに使用することができ、とりわけ、このようなサンプルが生物学的／治療的物質、または化合物を含み、あるいは生物学的／治療的物質または化合物の調製あるいは分離に用いられる場合に用いることができる。血液または血液成分から分離あるいは精製された生物学的／治療的物質または化合物の例としてはとりわけ、第VIII因子、その他の凝固因子、および血液細胞成分があげられ、ここで存在が推定されるあるいは存在しうるＨＩＶおよびその他の血液により伝播されるウイルスは除去または不活性化されなければならない。
【０１７４】
ＤＣ−ＳＩＧＮが媒介するＨＩＶのトランス捕獲はＤＣ−ＳＩＧＮがＤＣ−ＳＩＧＮ−ＨＩＶ複合体あるいは会合体を形成し、このＤＣ−ＳＩＧＮ−ＨＩＶ複合体あるいは会合体が分離または捕獲できるのであれば、どのような形状、媒体あるいは供給源でもよいが、ただしＤＣ−ＳＩＧＮをトランスで提供することによって行うことができる。例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞または細胞系、膜小胞中あるいは合成脂質、親油性担体中のＤＣ−ＳＩＧＮ、可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮおよび直接または脂質単分子層、あるいは脂質部分を用いてＤＣ−ＳＩＧＮを表面、分離材料または媒体（例えば樹脂、ビーズおよびカラムなど）へと固定したもの、などのＤＣ−ＳＩＧＮ源のいずれを使用してもよい。
【０１７５】
糖質模倣ペプチドの分離
糖質の生物学的機能を研究する上で大きな障害となるのはこれらの化合物の入手可能性である。しばしばこれらは生物学的供給源からほんのごく少量しか分離できないのである。この問題を解決する方法の１つは調製の簡単な、例えばペプチド類などの他の化合物で糖質を模倣することである。このようなペプチド類を見つけるための有望な方法としてランダムペプチドファージディスプレー技術がある。ＤＣ−ＳＩＧＮレクチンリガンドを模倣する、またはＤＣ−ＳＩＧＮ媒介の相互作用や結合を妨げるペプチド類は、ＨＩＶ予防や治療に有用であろう。ファージディスプレースクリーニングにより同定されたペプチドリガンドはしばしばターゲット分子上の天然結合部位と相互作用し、ターゲットの天然リガンドとしばしば類似している。糖質エピトープまたはリガンドを模倣するペプチドは分離されており、糖質抗原の代わりにペプチド模倣物を用いる方向ですでに研究が行われ、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ等によって論評されている［Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ．等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓ  １７：９５−１０８（１９９８）］。模倣は糖の代わりにアミノ酸を用いて行われているが、糖質決定基を模倣するペプチドの能力により、特異的パターンが再現されていることが示されている。
【０１７６】
ファージディスプレーランダムペプチドライブラリのスクリーニングにより多種多様の分子の供給源と、問題のレセプター分子に結合するペプチドリガンドを同定する強力な手段とが提供される［Ｃｗｉｒｌａ等、ＰＮＡＳ  ８６：６３７−６８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｏｒｔｅｓｅ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：７３−８０（１９９５）］。結合するペプチドを発現するファージはアフィニティー精製法で問題のターゲットにより選択される。それぞれの感染性ファージがその表面に発現されるランダムシーケンスをコード化するため、アフィニティーマトリックスから回収された特定のファージはもう一度感染を行わせることにより増幅することができる。したがって固相担体またはその他の捕獲手段に固定された選択分子を使用して、それに結合するペプチドを選択することができる。本発明に関しては、ＤＣ−ＳＩＧＮまたはｇｐ１２０がこのような系における選択分子として使用できる。この手順により選択分子へと結合する多数のペプチドが明らかになり、しばしば共通のコンセンサスアミノ酸配列が示される。選択されたライブラリメンバーの生物学的増幅および配列研究によりペプチドの一次構造が決定できる。
【０１７７】
スフィンゴ糖脂質を模倣するペプチドはファージペプチドライブラリを用いて見い出されている。ラクトテトラオシルセラミド（Ｌｃ４Ｃｅｒ）およびその異性体であるネオラクトテトラオシルセラミド（ｎＬｃ４Ｃｅｒ）を認識する２つのモノクローナル抗体が二つのスフィンゴ糖脂質の糖質部分を模倣するペプチドを発見するのに用いられた。このペプチドが生物学的に活性であり、β−ガラクトシダーセの活性を修飾することができることがまた示されている［Ｔａｋｉ  等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１８：２１９−２２３（１９９７）］。細菌性病原Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉの細胞壁はカプセル状リポ多糖体のＯ抗原糖質部分を形成する糖の繰り返し単位を含んでいる。糖質エピトープのペプチド模倣物はファージディスプレー技術を用いて分離され、免疫原性模倣物として作用し、特定の抗糖質抗体を誘導することができた［Ｐｈａｌｉｐｏｎ等、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：２６２０−２６２５（１９９７）］。ＨＩＶ関連糖質系を模倣するペプチドもまた報告されている。ＨＩＶ上に発現されたムチン関連炭化水素エピトープを模倣するペプチドに対し、マウス抗血清が作られた。この著者らはペプチド模倣物による免疫化により誘導された抗体は野生のＨＩＶエンベロープ蛋白質と交叉反応したことを示している。これらの抗体を含む血清は試験管中でのＨＩＶ−１細胞不在感染およびＨＩＶ−１に感染した患者からの血清を中和することができたが、一方正常な人からの血清はこのウイルス中和分析においては無効であった［Ａｇａｄｊａｎｙａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：５４７−５５１（１９９７）］。さらにこのような研究には（ａ）Ｌｅｗｉｓ  Ｙ抗原の糖質エピトープのペプチド模倣物が報告され、これにはＬｅｗｉｓ  Ｙ抗原に特異的な抗体にペプチドが結合するうえで極めて重要であることが示されている残渣ＰＷＬＹが含んでいた［Ｈｏｅｓｓ等、Ｇｅｎｅ  １２８：４３−４９（１９９３）］；（ｂ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＣのカプセル状多糖類を模倣するペプチドが示した免疫反応はカプセルに入れた致死量の細菌による感染からマウスを保護することができた［Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋ等、（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２］；さらに（ｃ）レクチンコンカナバリンＡの糖質結合部位を研究し、メチルα−Ｄ−マンノピラノシドのＣｏｎＡへの結合を模倣するペプチドをファージディスプレイランダムヘキサまたはデカペプチドライブラリをスクリーニングすることによって同定した［Ｓｃｏｔｔ等、８９：５３９８−４０２（１９９２）；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ等、ＰＮＡＳ  ８９：５３９３−９７（１９９２）］。
【０１７８】
本発明は下記に例として提供する非限定実施例を参照することによりさらに一層よく理解できるであろう。下記の実施例は本発明の好ましい実施様態をより詳しく説明するために呈示するものである。これらの実施例は本発明の範囲をいかなる意味においても限定するものではない。
【０１７９】
【実施例】
（実施例１）
ＤＣ−ＳＩＧＮ、樹状細胞特異性ＨＩＶ−１結合蛋白質がＴ細胞のトランス感染を強化する
導入
樹状細胞（ＤＣ）は末梢粘膜組織に侵入する微生物を捕獲し、２次リンパ器官へと遊走し、ここで静止Ｔ細胞に抗原の形でこれらを呈示し適応した免疫応答を開始させる。ＤＣがＨＩＶ−１を捕獲しＣＤ４＋Ｔ細胞の感染を促進する機構はまだ明確ではなく、ＤＣとウイルスとの相互作用に特異性があるのかどうかも不明であった。実際現在にいたるまで、Ｔ細胞のＨＩＶ感染に関与するいかなる特異的樹状細胞レセプターもまだ同定されていない。
【０１８０】
方法
抗体：使用した抗体（ｍＡＢ）は２Ｄ７（抗ＣＣＲ５；ＢｅｃｔｏｎおよびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）および抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＡＢ  ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２はヒトＤＣ−免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスのハイブリドーマ上澄みをＤＣのＩＣＡＭ−３に対する結合をブロックする能力を蛍光ビーズ接着試験で測定することによりスクリーニングして得た。
【０１８１】
細胞：未熟樹状細胞（ＤＣ）をＩＬ４とＧＭ−ＣＳＦ（それぞれ５００および１０００  Ｕ／ｍｌ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の存在下で単球から培養した［Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ａｎｄ  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９−１１１８（１９９４）およびＲｏｍａｎｉ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：８３−９３（１９９４）］。７日目に培養したＤＣの表現型をフローサイトメトリーで分析し確認した。ＤＣはＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、αＭβ２（ＣＤ１１ｂ）、αＸβ２（ＣＤ１１ｃ）およびＩＣＡＭ−１を高レベルで発現し、ＬＦＡ−１および  ＣＤ８０を中レベルで発現し、さらに  ＣＤ１４を低レベルで発現する。ＩＣＡＭ−３（Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３）を発現する安定なＫ５６２トランスフェクタントをＫ５６２を１０μｇのＰＣＲＩＩ  ＩＣＡＭ−３プラスミドおよび２μｇのＰＧＫ−ｈｙｇベクター［ｔｅ  Ｒｉｅｌｅ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：６４９−６５１（１９９０）］と共に［Ｌｕｂ等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，８：７１９−７２８（１９９７）］に記載のようにして電気穿孔し共形質移入して生成した。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する安定なＴＨＰ−１トランスフェクタントは上記Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３に関して記載したのと同様にＴＩＰ−１細胞をｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮで電気穿孔し形質移入して生成した。
【０１８２】
ＤＣ−ＳＩＧＮをコード化するｃＤＮＡの分離と発現：免疫沈降させたＤＣ−ＳＩＧＮをペプチド配列決定により同定した。トリプシン消化、得られたペプチドの精製および配列分析をＥｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＢＶ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて行った。Ｃ型レクチンに結合するプラセンタｇｐ１２０をコード化するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲを用いてＤＣからの全ＲＮＡで増幅した。ＰＣＲプライマーはＣ型レクチンに結合するプラセンタｇｐ１２０のヌクレオチド配列に基づいたもので［ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  Ｍ９８４５７，Ｃｕｒｔｉｓ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：８４５６−８３６０（１９９２）］このヌクレオチド配列（５′から３′）は下記の通りである。
ＸＦ２９：  ＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
ＸＲ１２６５：  ＧＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＣＡＧＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ；１２）
クローン化したｃＤＮＡのヌクレオチド配列はプラセンタｇｐ１２０Ｃ型のものと全く同一であった［Ｃｕｒｔｉｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：８４５６−８３６０（１９９２）］。このｃＤＮＡはついで真核細胞発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮ）中にクローン化した。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する安定なＴＨＰ−１トランスフェクタントを上記Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３で記載したのと同様に電気穿孔によりＴＨＰ−１細胞をｐＲｃ／ＣＭＶ  ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮで形質移入して生成した。
【０１８３】
蛍光ビーズ接着試験：カルボキシレートで修飾したＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓ（４８８／６４５ｍｎ，１．０μｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をＩＣＡＭ−３−ＦｃまたはＭ−親和性  ＨＩＶ−１ＭＮエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０のいずれかで標準的技法によりコートした［Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ等、Ｂｌｏｏｄ，９４（２）：７５４−６４（１９９９）］。蛍光ビーズ接着試験をＧｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ等。［Ｂｌｏｏｄ，９４（２）：７５４−６４（１９９９）］に記載のように行った。簡単にいうと、細胞を接着バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５％  ＢＳＡ）中に最終濃度５ｘ１０６（個／ｍｌ）で再懸濁した。５０，０００個の細胞をｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）により室温（ＲＴ）で１０分予備培養した。リガンドコートした蛍光ビーズ（２０個／細胞）を加え懸濁液を３７℃で３０分培養した。接着はＦＡＣＳスキャン（ＢｅｃｔｏｎおよびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーにより、蛍光ビーズに結合した細胞のパーセントを求めて決定した。Ｍ親和性のＨＩＶ−１ＭＮエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０ビーズに対してはストレプトアビジンを先に記載［Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ等、Ｂｌｏｏｄ，９４（２）：７５４−６４（１９９９）］のようにＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓへと共有結合させた。ストレプトアビジンでコートしたビーズをビオチニル化したＦ（ａｂ′）２断片ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（６μｇ／ｍｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に培養し、ついでヒツジ抗ｇｐ１２０抗体Ｄ７３２４（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，  Ｄｕｂｌｉｎ，  Ｉｒｅｌａｎｄ）で４℃で一晩培養した。ビーズを洗浄し、２５０ｎｇ／ｍｌの精製ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍを通じてＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃから提供された）で４℃で一晩培養した。蛍光ビーズ接着試験をＧｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ等。［Ｂｌｏｏｄ，９４（２）：７５４−６４（１９９９）］に記載のように行った。
【０１８４】
異型細胞クラスター化およびＤＣ誘導Ｔ細胞増殖：ＤＣおよびＩＣＡＭ−３発現細胞（２ｘ１０６個／ｍｌ）をそれぞれスルフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；５０μｇ／ｍｌ）およびハイドロエチジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；４０μｇ／ｍｌ）で１時間３７℃で標識した。ＤＣおよびＩＣＡＭ−３発現細胞を混合し（それぞれ５０ｘ１０３個）３７℃で培養した。異なるタイムポイントにおいて、細胞をパラホルムアルデヒド（０．５％）で固定し、異型細胞クラスターかをスローサイトメトリで測定した。ＤＣと静止Ｔ細胞環のクラスター化を異なる方法を用いて評価した。ＤＣ（５０ｘ１０３個）を抗ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２（１０μｇ／ｍｌ）の存在下（または不在下）で１０分間室温で培養した。蛍光染料カルセインＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；２５μ／１０６個／ｍｌで３７℃で３０分）で標識した同種異型ＰＢＬ（１ｘ１０６個）を加え細胞混合物を３７℃で培養した。クラスター化はフローサイトメトリーにより、蛍光Ｔ細胞に結合したＤＣのパーセントを測定することによって求めた。同種異型Ｔ−リンパ球（１００ｘ１０３）をブロッキングｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下にＤＣ（１．５ｘ１０３）に加えた。細胞を４日培養した。４日目に細胞を少なくとも１６時間［３Ｈ］メチルチミジン１．５２ＴＢｑ／ｍｍｏｌ，０．５μＣｉ／ｗｅｌｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）でパルスし、チミジンの取り込みを定量した。
【０１８５】
ＤＣおよびＤＣ−ＳＩＧＮトランスフェクタントのＨＩＶ−１感染：Ｍ親和性株ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌを単球誘導マクロファージ（ＭＤＭ）中で増殖させ高力価とした。ウイルス株のＭＤＭに対する力価測定後７日目に、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ，  Ｍａｒｎｅｓ  ｌａ  Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）でＴＣＩＤ５０を求めたところ１０４／ｍｌと見積もられた。ｍＡｂでＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２）またはＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）（２０μｇ／ｍｌ）またはＣＣＲ５特異性ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β；それぞれ５００ｎｇ／ｍｌ）を組み合わせた物に対し室温で２０分予備培養したＤＣ（５０ｘ１０３）に対し、ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ（感染倍率は細胞１０５個あたり感染性ユニット１０３）を２時間パルスし、洗浄し、活性化したＰＢＭＣ（５０ｘ１０３）で共培養した。ＤＣ−Ｔ細胞シンシチウムの形成は見られなかった。ＨＩＶ−１パルスの洗浄ステップの後、活性化ＰＢＭＣと一緒にｍＡｂまたはケモカインを添加したことを除き感染後実験を同様に行った。培養物の上澄みをＤＣ−Ｔ細胞共培養後５日、６日、７日および９日に集め、ＨＩＶ−１生産指標としてのｐ２４抗原レベルをｐ２４抗原ＥＬＩＳＡによって求めた。ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１０（ｇ／ｍｌ））の存在下で２日培養することにより、ＰＢＭＣを活性化した。シュードタイプとしたウイルス型を２９３Ｔ細胞のプロウイルスプラスミドｐＮＬ−Ｌｕｃ−Ｅ−Ｒ−（ルシフェラーゼレポーター遺伝子含有）あるいはプロウイルスｐＨＩＶ−ｅＧＦＰ（ＧＦＰレポーター遺伝子含有）およびＡＤＡ、ＪＲＦＬおよびＪＲＣＳＦｇｐ１６０エンベロープとのリン酸カルシウムトランスフェクションにより生成した。９２ＵＳ７１５．６，９２ＢＲ０２０．４および９３ＴＨ９６６．８からの一次ウイルスエンベロープコード化プラスミドの分離、同定および構築は先に記載した［Ｂｊｏｒｎｄａｌ等、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７１（１０）：７４７８−８７（１９９７）］。ウイルス株を２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞上で限界希釈することにより評価した。ターゲット細胞の生存性を確実にするためマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）両性エンベロープおよび水疱性口内炎ウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）でシュードタイプとしたＨＩＶ−１を用いた。
【０１８６】
免疫組織化学的分析：組織の冷凍切片（８μｍ）を１００％のアセトン（１０分）で固定し、ＰＢＳで洗浄して第一の抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に６０分３７℃で培養した。洗浄した後最終的な染色をＡＢＣ−ＡＰ  Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて製造者のプロトコルにしたがって行った。核の染色はヘマトキシリンを用いて行った。
【０１８７】
結果
本質的にＴリンパ球に発現する接着分子ＩＣＡＭ−３に結合する分子のスクリーニングを行った。高親和力でＩＣＡＭ−３に結合する樹状細胞特異性Ｃ型レクチンを同定し、ＤＣ−ＳＩＧＮと命名した。ＩＣＡＭ−３の樹状細胞（ＤＣ）への結合をブロックした樹状細胞表面分子に対しモノクローナル抗体を調製した。このような抗体の１つをＤＣ−ＳＩＧＮを精製するのに用い、ついでｃＤＮＡをクローン化するのに使用した。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列分析によりこの分子が先に記載した、ＨＩＶ  ｇｐ１２０結合細胞表面蛋白用プラセンタｃＤＮＡライブラリのスクリーニングで同定された、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一であることがわかった。［Ｃｕｒｔｉｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：８４５６−８３６０（１９９２）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ＷＯ  ９３／０１８２０］これはヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であった。この蛋白質のスプライス変異株が他の研究者により報告されているが、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６  、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７である。
【０１８８】
ＤＣ−ＳＩＧＮはＤＣ特異性ＨＩＶ−１結合蛋白である：ＤＣ−ＳＩＧＮは今樹状細胞（ＤＣ）−Ｔ細胞相互作用を媒介する樹状細胞特異性ＩＣＡＭ−３接着レセプターとして同定された。多種の造血細胞を抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によりフローサイトメトリー分析するとＤＣ−ＳＩＧＮが単球や末梢血リンパ球（ＰＢＬ）などのその他の白血球ではなく試験管内培養ＤＣ上で優先的に発現されことがわかる（図１Ａ、表１）。ＤＣ−ＳＩＧＮを４４ｋＤの免疫沈殿した蛋白のペプチドアミノ酸配列により同定することにより、プラセンタｃＤＮＡライブラリから先に分離されたＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン［Ｃｕｒｔｉｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：８３５６−８３６０（１９９２），ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］とそのアミノ酸配列が１００％同一であることがわかった。この分子がＨＩＶのＤＣへの結合において役割を有するのかどうかを決定するために、フローサイトメトリー接着試験を行い［Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ等、Ｂｌｏｏｄ，９４（２）：７５４−６４（１９９９）］未熟ＤＣへのＨＩＶ−１ｇｐ１２０コート蛍光ビーズの結合能力を調べた（図１Ｂ）。ｇｐ１２０でコートしたビーズは効率よくＤＣに結合し、この結合は完全に抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２によってブロックされた。対照的に中和抗ＣＤ４抗体はｇｐ１２０のＤＣへの結合に何の影響も与えなかった。この結果から一次ＨＩＶ−１レセプターＣＤ４はＤＣ（図１Ｃ−１Ｄ）上で発現しているが、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０はＤＣ−ＳＩＧＮに優先的に結合することがわかる。同様にＣＤ４とＣＣＲ５の発現を共に行わない単球細胞系ＴＨＰ−１はそれがＤＣ−ＳＩＧＮ発現ベクターにより形質移入された後、ｇｐ１２０コートビーズに結合する（図１Ｃ）。
【０１８９】
【表１】
2004536777.tif 000001
【０１９０】
この細胞系、ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮに結合するＨＩＶ−１  ｇｐ１２０もまた抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によって阻害されたが抗ＣＤ４（図１Ｅ）では阻害されなかった。ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＤＣまたはＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ上に発現するＤＣ−ＳＩＧＮへの結合は糖質マンナンまたはＥＧＴＡによって阻害され、先の知見  ［Ｃｕｒｔｉｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：８３５６−８３６０（１９９２）］およびＤＣ−ＳＩＧＮがその他のＣａ２＋結合マンノース型レクチンに相同である［Ｗｅｉｓ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，１６３：１９−３４（１９９８）］という観察と一致した。これらの結果を合わせるとＤＣ−ＳＩＧＮはＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質に対する特異的な樹状細胞表面レセプターであることがわかる。
【０１９１】
ＤＣ−Ｔ細胞共培養物中での有効なＨＩＶ−１感染にはＤＣ−ＳＩＧＮが必要である：ＤＣ−ＳＩＧＮがもっぱらＤＣ上にのみ発現し、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対する高い親和力を有するため、ＤＣまたはＤＣと接触するＴ細胞のＨＩＶ−１感染においてこれが重要な役割を果たしていると推察することは妥当であると思われる。ＣＤ４およびＣＣＲ５を低レベルで発現し、ＤＣ−ＳＩＧＮを豊富に発現する（図１Ｃ−１Ｄ）未熟ＤＣにＲ５分離ＨＩＶ−１ＢＡ−Ｌを２時間パルスし、洗浄して活性化したＴ細胞の存在下で培養した（図２Ａおよび２Ｂ）。これらのレセプターのそれぞれの本分析系における寄与を求めるため、ＣＤ４とＤＣ−ＳＩＧＮおよび３つのＣＣＲ５特異性ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）を組み合わせたものに対する抗体の作用を調べた。感染に先立ち、未熟ＤＣをＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体と共に予備培養するとＨＩＶ−１の複製が大きく阻害された（図２Ａ）。抗ＣＤ４とＣＣＲ５特異性ケモカインのいずれも独力では阻害をしなかったが、これらを組み合わせると抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と同じく効率よくＤＣの感染を阻害した（図２Ａ）。活性化したＴ細胞を同じウイルス負荷で攻撃するとウイルスパルス化ＤＣと共に培養したものよりも弱い感染を示した。
【０１９２】
ＤＣ−ＳＩＧＮがＴ細胞上のＩＣＡＭ−３に結合するため、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体がＤＣ−Ｔ細胞相互作用を妨害し、それによってＨＩＶ−１の伝播を防ぐことは可能である。この可能性を調べるために、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体をＤＣをＨＩＶ−１に暴露した後であって活性化Ｔ細胞を加える前に添加した。この状況で、ＣＣＲ−５特異性ケモカインと抗ＣＤ４抗体のみが強力にＴ細胞のＨＩＶ−１感染を阻害したが、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は何の影響も及ぼさなかった（図２Ｃ）。これらの結果からＤＣ−ＳＩＧＮはＤＣ−Ｔ細胞共培養物中でのＨＩＶ−１の伝播において重要な機能を果たし、この機能はＤＣ−ＳＩＧＮがｇｐ１２０に結合する能力と関連しているが、そのＩＣＡＭ−３との相互作用とは関連しないことが示唆される。
【０１９３】
ＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶ−１侵入を媒介しない：ＤＣ−ＳＩＧＮがＣＤ４プラスＣＣＲ５と同様にＨＩＶ−１侵入を許可するレセプターとして作用するかどうかを調べるために、ＤＣ−ＳＩＧＮ（２９３Ｔ−ＤＣ−ＳＩＧＮ）またはＣＤ４およびＣＣＲ５（２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５）のいずれかを発現する２９３Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の侵入を調べた。細胞にＨＩＶＢＡ−Ｌを一晩パルスし、翌日洗浄し、ｐ２４レベルを求めた。数日後に２９３−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞から収穫した培養物上澄み中には検出可能なｐ２４蛋白は存在しなかったが、２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞は容易に感染した（図３Ａ）。
【０１９４】
ＤＣ−ＳＩＧＮがＣＤ４またはＣＣＲ５のいずれかと共に作用し、ウイルスの侵入を許すのかどうかを調べるためにＲ５分離ＨＩＶ−１ＡＤＡのエンベロープ糖蛋白質でシュードタイプとしたＨＩＶ−１を用いて研究を行った。ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコード化した複製欠陥ＨＩＶ−１ゲノムを用いたことにより一回感染のレベルの定量測定が行える（図３Ｂ）［Ｄｅｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ，  ３８１（６５８４）：６６１−６６６］。ＤＣ−ＳＩＧＮの存在下、または不在下でＣＣＲ５（２９３Ｔ−ＣＣＲ５）とＣＤ４（２９３Ｔ−ＣＤ４）のいずれか、または両者（２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５）を発現する、暫定的に形質移入した２９３Ｔ細胞をレポーターウイルスで感染させ、ルシフェラーゼレベルを２日後に求めた。複製ウイルスにより観察された、ＨＩＶ−１侵入はＤＣ−ＳＩＧＮのみを発現した２９３Ｔ細胞では検出されなかった（図３Ｂ）。ＣＤ４またはＣＣＲ５のいずれかのみと共にＤＣ−ＳＩＧＮが発現した場合には感染は観察されず、ＤＣ−ＳＩＧＮがこれらの分子と複合体を形成し、ウイルスの侵入を許すことはないことが示された。対照的にＣＤ４とＣＣＲ５の両方を発現する２９３Ｔ細胞の感染後には高いルシフェラーゼ活性が得られ、ＤＣ−ＳＩＧＮの発現によりこれらの細胞中へのウイルスの侵入はさらに寄与されなかった（図３Ｂ）。したがってＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶ−１侵入行程においてＣＤ４またはＣＣＲ５の代用とはなり得ない。
【０１９５】
ＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１を捕獲し、ＨＩＶ−１許容細胞のトランス感染を促進する：ＤＣ−ＳＩＧＮがウイルスのターゲット細胞への侵入を媒介するようには見受けられなかったため、ＤＣ−Ｔ細胞共培養物（図２Ａ）においてはＤＣ−ＳＩＧＮはＣＤ４およびＣＣＲ５から独立してＨＩＶ−１のＤＣ上での捕獲とその後のＨＩＶ−１のＣＤ４／ＣＣＲ５陽性Ｔ細胞への伝播の両方を促進するのかもしれない。これを試験するために、ＣＤ４またはＣＣＲ５を発現せず（図１Ｃ）、ＨＩＶ−１で感染できないＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮトランスフェクタントにＨＩＶ−１ＡＤＡエンベロープ糖蛋白質でシュードタイプとした一回ＨＩＶ−ルシフェラーゼをパルスした。未結合ウイルスを洗浄して除いた後、細胞をＨＩＶ−１感染許容性のＣＤ４／ＣＣＲ５発現２９３Ｔ細胞または活性化Ｔリンパ球と共に共培養した。ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞はシュードタイプウイルスを捕獲し、ウイルスの侵入に必要なレセプターを発現したターゲット細胞へとそれを伝播することができた（図４Ａ）。ＨＩＶ−１捕獲は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体がＨＩＶ−１感染を阻害（図４Ａ）し、ＤＣ−ＳＩＧＮ陰性親ＴＨＰ−１細胞がＨＩＶ−１の捕獲および伝播が不能であった（図４Ａおよび４Ｂ）ことから、完全にＤＣ−ＳＩＧＮに依存していた。ＤＣ−ＳＩＧＮが媒介するターゲット細胞の感染は２９３Ｔ細胞がＩＣＡＭ−３陰性なため、ＩＣＡＭ−３に結合するＤＣ−ＳＩＧＮによるものではない。これらの知見は異種細胞の表面で発現したＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１許容細胞をその後感染する能力を保つような形でＨＩＶ−１を捕獲できることを示している。ＤＣ−ＳＩＧＮのＨＩＶ−１捕獲、伝播能はまた、３つの一次分離物を含むさらに５つのＣＣＲ５親和性分離物からのエンベロープ糖蛋白質でシュードタイプとしたＨＩＶ−ルシフェラーゼウイルスでも観察され（図４Ｂ）、またＣＸＣＲ４親和性分離物からのエンベロープ糖蛋白質でシュードタイプとしたＨＩＶ−ルシフェラーゼウイルスでも観察された。
【０１９６】
共培養２日後の付着細胞（２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５）および非付着細胞（ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ）の両方の画分におけるルシフェラーゼ活性を分析すると増殖的ＨＩＶ−１感染はＨＩＶ−１許容性の２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞においてのみ生じたことがわかった。同様に、Ｎｅｆ（ＨＩＶ−ｅＧＦＰ）の代わりに緑色蛍光蛋白遺伝子でシュードタイプとしたＨＩＶ−１ベクターを用いると、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するものではなく、ＣＤ４／ＣＣＲ５を発現する細胞が共培養物中で感染した。したがって、ウイルスパルスＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞をＴ細胞と共培養した後、ＣＤ３＋Ｔ細胞のみがウイルスコード化ＧＦＰを発現した（図４Ｃ）。
【０１９７】
ＨＩＶ−１の性交渉感染には少量のウイルスがウイルスの複製を許容する細胞へのアクセスを行うための手段が必要になるはずである。これはＨＩＶ−１を捕獲し、それを許容細胞に対して呈示することのできるＤＣに対しウイルスが相互作用する能力をもつため行われるのかもしれない。ＨＩＶ−１レベルが限られていると思われる生体内条件を模すために、ＴＨＰ−１トランスフェクタントを低力価のシュードタイプＨＩＶ−１で攻撃し、ついで未結合ウイルスを洗浄により除去せずＨＩＶ−１許容細胞と共に共培養した（図５Ａ）。予想通り、２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞も活性化Ｔ細胞も低力価のシュードタイプＨＩＶ−１では効率的に感染されなかった（図５Ａ）。驚いたことに、親ＴＨＰ−１細胞ではなくＨＴＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮの存在下で、これらの許容細胞を全く同一量のＨＩＶ−１で攻撃すると、有効なＨＩＶ−１感染がトランスで観察された（図５Ａ）。２９３−ＣＤ４−ＣＣＲ５のＤＣ−ＳＩＧＮによるＨＩＶ−１感染の強化は、一次ウイルス分離物３つを含む、５つのその他のＲ５エンベロープによりシュードタイプとしたＨＩＶ−ルシフェラーゼウイルスでも観察された（図５Ｂ）。これらの結果はＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１を隔離するのみならずＨＩＶ−１レセプター複合体へトランスでの呈示により、ＣＤ４−ＣＣＲ５媒介ＨＩＶ−１の侵入を強化することを示している。ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は感染を完全に阻害し（図５Ａ）、ＨＩＶ−１のＣＤ４／ＣＣＲ５陽性細胞への侵入の効率的な促進がＤＣ−ＳＩＧＮに依存していることを示した。
【０１９８】
ＨＩＶ−１暴露部位での粘膜組織中に存在するＤＣはＤＣ−ＳＩＧＮを発現しＣＣＲ５陰性である：ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞がＨＩＶ−１を捕獲でき、このウイルスを他の細胞にトランスで伝播できることが示されたことにより、このＣ型レクチンを発現するＤＣが生体中でのウイルス感染に重要な役割を果たしているのではないかと考えられる。このような細胞が実際生体中に存在するのかどうかを決定するためにＨＩＶ−１の性交渉感染中の第一の暴露部位である、粘膜組織の免疫組織化学的分析を行った（図６Ａ−６Ｃ）。ＤＣ−ＳＩＧＮは直腸、子宮頚および子宮部などの粘膜組織中（それぞれ図６Ａ−６Ｃ）、粘膜固有層中の重層扁平上皮下に存在する、大きく極めて不規則な形態を有する樹状細胞様細胞上で発現した。ＣＤ３，ＣＤ２０、ＣＤ１４およびＣＤ６８に対して染色した一連の切片の分析により、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージからはっきりと識別されることが確認された。同様に、リンパ節と皮膚の染色によりＤＣ−ＳＩＧＮのＤＣ制限発現が示されている。ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ４およびＣＣＲ５の子宮および直腸の粘膜中ＤＣ上での発現を比較すると連続切片中でこれらの組織中のＤＣ−ＳＩＧＮ陽性ＤＣの大半がＣＤ４を共発現するがＣＣＲ５は発現しない（図６Ｄ−６Ｆ）ことがわかった。これは性交渉感染中にＨＩＶ−１と最初の接触をした粘膜部位に存在するＤＣがＣＤ４／ＣＣＲ５の関与を通じてＨＩＶ−１に感染しているのではないことを示している。またこの観察はヒト以外の霊長類の粘膜感染部位でのＤＣが感染しないという最近の発表とも一致する  ［Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３１）：１２６１−１２６５（１９９９）］。
【０１９９】
ＤＣ−ＳＩＧＮ結合ＨＩＶ−１は長期培養後も感染性を維持する：ＨＩＶ−１がＤＣに結合することを通じて２次リンパ器官へのアクセスを得るのであれば、ウイルスは粘膜組織から排出リンパ節中のＴ細胞ゾーンへの伝播中その感染性を維持しなくてはならないであろう。ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合したウイルスがその感染性を長期間保っているのかどうかを決定するために、形質移入したＴＨＰ−１細胞上で発現したＤＣ−ＳＩＧＮにＨＩＶ−１  ｇｐ１２０が結合したままでいる時間を調べる経時実験をまず行った。ｇｐ１２０でコートしたビーズは６０時間以上ＤＣ−ＳＩＧＮに結合したままであることが観察された（図７Ａ）。次に、ＨＩＶ−１パルスＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞が感染性のあるウイルスを保持していることのできる時間長を調べた。ＤＣ−ＳＩＧＮ発現トランスフェクタントにシュードタイプＨＩＶ−１を４時間パルスし、しっかりと洗い流した。パルスした細胞をついで培養物に入れ、規定の間隔で取り出して活性化Ｔ細胞と共に培養した（図７Ｂ）。予測に反し、４日後でもＨＩＶ−１でパルスした細胞はまだターゲット細胞を効率よく感染させることができた。反対にＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞を加えていないウイルスは１日経つとその感染性を失った（図１２参照）。これらの知見は、ＤＣ−ＳＩＧＮとＣＤ４を発現するがＣＣＲ５は発現しない粘膜ＤＣにより捕獲された限られた数のＨＩＶ−１粒子は所属リンパ系組織への遊走中、またその後も感染性を保持するという仮説を支持する。ＣＤ４およびＣＣＲ５を発現するＴ細胞は少数のＨＩＶ−１粒子のＤＣ−ＳＩＧＮ媒介により強化されたトランス感染性により増殖的に感染するのであろう（図７Ｃ）。
【０２００】
上記に記載の結果は一般にすべてのＨＩＶ株とＴ細胞型に当てはまる。したがって図８はＤＣ−ＳＩＧＮがＳＩＶ、ＣＣＲ５、ＣＸＲ４および二重親和性ＨＩＶの捕獲を媒介することを示す。レポーター遺伝子ルシフェラーゼをコード化するウイルスをＣＣＲ５親和性株ＪＲＦＬ、ＡＤＡおよびＪＲＣＦＳＦ；ＣＸＲ４親和性株ＨｘＢ２およびＬＡＩ；二重親和性株８９．６およびＳＩＶ  １Ａ１１からのエンベロープでシュードタイプとした。ＴＨＰまたはＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞をこれらのウイルスでパルスし、洗浄してからターゲット細胞へと加えた。ルシフェラーゼ活性はターゲットのウイルス感染の指標として測定した（図８）。すぐに見て取れるように、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現した促進細胞の存在下でＨＩＶ捕獲が行われたすべての場合においてルシフェラーゼ活性に顕著な増加が見られた。同じ結果は一次ウイルス株からのエンベロープでシュードタイプとしたＨＩＶでも得られた（図９）。
【０２０１】
図１０は活性化Ｔ細胞のＣＸＲ４親和性ＨＩＶ感染の強化を示す。ＴＨＰ、ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞、ＤＣまたは抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と共に予備培養したＤＣをルシフェラーゼレポーター遺伝子をコード化するＨｘＢ２シュードタイプウイルスと共に培養し、活性化Ｔ細胞ターゲットを加えた。これらの結果からコ−レセプタ、すなわち転座促進物質、がＣＸＲ４である場合でも樹状細胞による強化がＤＣ−ＳＩＧＮ依存性であることがさらに確認された。ＣＸＲ４親和性ＨＩＶ感染の強化は、活性Ｔ細胞の場合よりその程度は低いものの、非活性Ｔ細胞でもまたみられる。実際ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しないＴＨＰ細胞の存在下に行われるものと比較し、ＴＨＰ−ＳＩＧＮ細胞の存在下でナイーブ細胞によって行われるＨＩＶ捕獲に関連するルシフェラーゼ活性の増加はおよそ２０倍である。図１２はＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞への結合により、ＨｘＢ２、ＣＸＲ４親和性ウイルスの寿命が大きく延びることを示している。この場合ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞が存在しない場合、一日後にウイルスの感染性が急速に減少するものの、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞の存在下ではウイルスの感染性は３日でピークに達し、少なくとも５日後までは高く保たれる。
【０２０２】
考察
新規樹状細胞特異性接着レセプター、ＤＣ−ＳＩＧＮ、はヒトプラセンタｃＤＮＡライブラリ［Ｃｕｒｔｉｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：８３５６−８３６０（１９９２）］からクローンされた高親和性ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一のものであると同定された。しかし、この結果により、これまで観察されてきたことに反し、ＤＣ−ＳＩＧＮは細胞（ＤＣ）中で特異的に発現することが示された。さらにＤＣ−ＳＩＧＮとＣＤ４を共に発現するＤＣはそのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対する高い親和性により優先的にＤＣ−ＳＩＧＮを用いてＨＩＶ−１を捕獲する。ＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶ−１を効率よくリクルートするばかりでなくＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染を、新規トランス機構により促進する。これらの知見からこれまで他のウイルス系で記載されてない新規のレセプター戦略をＨＩＶ−１が用いていることが示され、またこのウイルスがそのホスト組織中で増殖的感染を確立できるように複数の細胞表面レセプター系を利用していることが示唆される。皮膚および直腸、子宮および子宮頸部などの粘膜組織中に局在するＤＣは初期のＨＩＶ−１感染において役割を果たしていると考えられる。
【０２０３】
ＤＣは真皮または粘膜層下のさまざまな組織中でごくわずかな数存在する異種の細胞集団を形成し、ウイルスおよびその他の病原体に対して最前線の防御を勤めている。これまでにＤＣはＨＩＶ−１を隔離し、このウイルスをＣＤ４＋Ｔ細胞に効率よく運んでいくことがわかっていた。このＤＣの性質はここで開示したようにｇｐ１２０とＤＣ−ＳＩＧＮの相互作用を通じてＨＩＶ−１がこれらの細胞に特異的に結合することによるものである。したがってＤＣはウイルスのＣＤ４およびＣＣＲ５への結合とは無関係である特異的な相互作用を通じて、ＨＩＶ−１を効率よく捕獲するのである。ＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶ−１の侵入を媒介することはできないが、ＣＤ４／ＣＣＲ５陽性Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染を促進する特異なＨＩＶ−１トランスレセプターとしてむしろ機能する（図４および５）。ウイルス力価が低いと、ＣＤ４／ＣＣＲ５発現細胞はＤＣ−ＳＩＧＮのトランスでの助けなしでは検出可能な感染を行うことができない（図５Ａ）。ＨＩＶ−１粒子の数が限定されている条件は、生体内におけるものと類似していると考えられ、したがってこの結果はウイルスが粘膜からＣＤ４およびケモカインレセプターを発現するＴ細胞へと運ばれるのにＤＣ−ＳＩＧＮが必要であることを示唆している。さらにこの結果はＤＣ−ＳＩＧＮに結合したウイルスが驚くほど安定であり、したがってＤＣがリンパを経て粘膜から所属リンパ節へと移動するのに必要な長い時間の間感染性を保つことができることを示している（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０２０４】
ＤＣ−ＳＩＧＮが媒介するＨＩＶ−１感染の強化機構：ＨＩＶ−１がＤＣの機構およびＤＣ−ＳＩＧＮの性質を利用し、ウイルスの複製を行うことのできる細胞を効率的に感染させる機構はいまだ不明である。ＤＣ−ＳＩＧＮがそのＣＤ４／ケモカインレセプター複合体を通じて細胞のトランス感染を効率よく促進するプロセスは特に重要である。ウイルスエンベロープ糖蛋白質のＤＣ−ＳＩＧＮへの結合はＣＤ４および／またはケモカインレセプターとのより効率のよい相互作用を可能にする構造変化を誘導するかもしれない。エンベロープ糖蛋白質がターゲット膜との融合を開始するに先立ち多数の構造的移行が必要である［Ｃｈａｎ  およびＫｉｍ，Ｃｅｌｌ，９３（５）：６８１−６８４（１９９７）］ため、ＤＣ−ＳＩＧＮのｇｐ１２０への結合はこれらの移行の１つを促進または安定化するのかもしれない。ウイルス粒子の感染性を増加する抗ｇｐ１２０抗体はすでに記載されており［Ｌｅｅ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（８）：６０３７−６０４３（１９９７）］、ＤＣ−ＳＩＧＮも同様の効果をエンベロープ糖蛋白質への結合に対して有するであろうと思われる。別法として、ウイルス粒子のＤＣ−ＳＩＧＮへの結合はＤＣの表面に粒子を集中させ、したがってターゲット細胞上のレセプター複合体へ結合が起こった後に、その侵入が生じる確立を増加させるのかもしれない。いずれにせよ、低感染多重度（ＭＯＩ）において、Ｔ細胞はＤＣ−ＳＩＧＮが存在しないと感染しないのであるから、ＤＣ−ＳＩＧＮがＴ細胞の感染を促進することは明らかである。
【０２０５】
ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＨＩＶ−１エンベロープ、ＣＤ４およびＣＣＲ５間に一時的な四元性複合体が形成されるのかどうかはまだわかっていない。ｇｐ１２０−ＣＤ４の複合体の結晶構造を解明したことによりｇｐ１２０内の殆どのグリコシル化部位はＣＤ４結合ポケットの側面に位置するうね中に存在することがわかった［Ｋｗｏｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ，３９３（６６８６），６４８−６５９（１９９８）］。マンナンはＤＣ−ＳＩＧＮへのｇｐ１２０の結合をブロックするので、このＣ型レクチンはｇｐ１２０中の１つ以上の糖質部分に結合しているように思われる。しかしＤＣ−ＳＩＧＮのレクチン領域がｇｐ１２０のポリペプチド主鎖と相互作用しているということも可能である。ｇｐ１２０の突然変異形および可溶性ＤＣ−ＳＩＧＮはトランスにおける感染性の強化機構を解明する助けになるだろう。
【０２０６】
ここに開示したＤＣ−ＳＩＧＮは構造的にＴリンパ球の表面に発現されるＩＣＡＭ−３に結合する。ＤＣ−ＳＩＧＮ結合ＨＩＶ−１によるターゲット細胞の感染性の強化はターゲット細胞上のＩＣＡＭ−３の存在に依存しない。しかしターゲット細胞が２９３−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞の場合よりむしろＴ細胞の場合の方が確実に感染性はより強化された。担体ＤＣからターゲットＴ細胞へのウイルスの伝播の効率がＤＣと活性化Ｔ細胞間の接着を支配するＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１などの、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ３相互作用以外の特異的接着相互作用によって強化されているという可能性もある。したがってＤＣ−ＳＩＧＮに対して生成された抗体は感染後のＨＩＶ−１のＤＣ−Ｔ細胞伝播を阻害しない（図２Ｃ）。
【０２０７】
生体内のＨＩＶ感染におけるＤＣの役割：ＨＩＶ−１の侵入において作用していることがわかっていたＨＩＶ−１レセプターはＣＤ４と、ＣＣＲ５やＣＸＣＲ４などのＧ蛋白結合ケモカインレセプターのサブセットのみであった。ＣＣＲ５は「マクロファージ親和性」とこれまで分類されたウイルス株に対する主なレセプターとして機能し、このケモカインレセプターを利用することのできる株のみが個体間で有効な伝播をすることができた［Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｃｅｌｌ，９３：６７７−８０（１９９８）］。その他ＤＣ−ＳＩＧＮおよびガラクトシルセラミドを始めとするｇｐ１２０結合レセプターがこれまでに同定された［Ｈａｒｏｕｓｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３（５０１７）：３２０−３２３（１９９１）］が、これらがウイルスの侵入に関与していることはいまだ示されていなかった。本開示によりＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１に結合するのみならずＨＩＶ−１を隔離し、それによって、ＣＤ４とケモカインレセプターを発現する細胞への侵入を触媒することが示された。この結果および異なるレセプターの粘膜組織での発現パターンはＤＣ−ＳＩＧＮがウイルスの感染の初期の段階に重要な機能を有することと一致する。おどろくべきことに、ここに開示した免疫組織化学的分析はＤＣ−ＳＩＧＮが多量に発現するにもかかわらず、ＣＣＲ５はＨＩＶ−１関連の粘膜組織の粘膜固有層中に発現しないことをはっきりと示した（図６）。この観察は生殖器官中に存在するＤＣにＣＣＲ５が欠けていることを示したＨｌａｄｉｋ等の知見［Ｈｌａｄｉｋ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（７）：５８３３−４２］を確認し拡張するものであり、本結果はＨＩＶ−１が粘膜部位に存在するＤＣを感染できないことを示すものである。
【０２０８】
したがってＤＣ−ＳＩＧＮはこれらの細胞の感染というよりむしろ、ウイルスの粘膜組織中に存在するＤＣへの結合を媒介することにより、初期のＨＩＶ−１暴露において極めて重要な役割を演じている。ＤＣ−ＳＩＧＮの未熟ＤＣ上の高レベルの発現およびそのｇｐ１２０へのＣＤ４に勝る高い親和性［Ｃｕｒｔｉｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：８３５６−８３６０（１９９２）］はＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１がごくわずかしか存在しないときであっても、このウイルスを効率よく捕獲する能力を有していることを示す。ＨＩＶ−１はＤＣの遊走性を利用してリンパ組織中のＴ細胞区画へのアクセスを得るのであろう。ＤＣはその遊走を開始するために活性化されなくてはならず、したがって多価ウイルス粒子との相互作用によるＤＣ細胞表面上のＤＣ−ＳＩＧＮの多重結合形成によりこの過程が開始されるのかもしれない。興味深いことに、ＤＣ−ＳＩＧＮと会合したＨＩＶ−１の安定性を時間的に見ると、４日以上にわたりＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶ−１を捕獲、結合することができ、その後もまだこのウイルスは許容細胞を感染することができることがわかっている。ＨＩＶ−１がこのように感染性の状態に長期にわたり保存されるため、粘膜表面からウイルスの伝播が行われるリンパ球様区画へＤＣによる輸送に十分な時間が与えられているように思われる（図７Ｃ）［Ｓｔｅｉｎｍａｎ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １５６：２５−３７（１９９７）も参照のこと］。いくつかのグループは抗原暴露またはＨＩＶ−１の攻撃の後、２日内にＤＣは末梢から排出リンパ節へと遊走できると報告している［Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８（１０）：４５４３−７（１９９７）；Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３１）：１２６１−５（１９９９）］。ウイルス粒子はＤＣの細胞内液包内でも報告されている。この観察により細胞が所属リンパ節に到達するのに必要な時間の間ＤＣ−ＳＩＧＮ結合ＨＩＶ−１が内部移行され、保護されているのかもしれないことが示唆される。
【０２０９】
本発明の結果はＨＩＶ−１がＤＣによってリンパ球様区画へと運ばれた後、ＤＣ−ＳＩＧＮがこの結合したウイルス粒子をＴ細胞上に存在するＣＤ４／ＣＣＲ５複合体に対して呈示し、ウイルスのこれらの細胞内への侵入を多大に強化する（図７Ｃの模式図参照）することを示した。ＤＣ−ＳＩＧＮに対するモノクローナル抗体はＣＤ４／ＣＣＲ５陽性の単球由来ＤＣと共に培養したＴ細胞共培養中で生じる増殖性感染をブロックすることが示された。したがって、不可欠であるＨＩＶ−１レセプターがターゲット細胞上にシスで存在した場合であっても、ＤＣ−ＳＩＧＮはＴ細胞のＨＩＶ−１感染に対してトランスレセプターとして作用し、一次共培養物中で極めて重要な存在となっている。これは主にトランスで作用するレセプターの最初の例である。興味深いことに、ＣＤ４はトランスレセプター機構により、ＣＣＲ５を発現するＣＤ４陰性細胞のＨＩＶ−１感染をも促進することができるが、これが生体内の感染において重要な経路であるのかどうかについては不明である［Ｓｐｅｃｋ等、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，９（１０）：５４７−５０（１９９９）］。この場合、エンベロープ糖蛋白質のＣＤ４との相互作用はウイルスのＣＤ４陰性細胞上のＣＣＲ５への結合を許す構造的変化をもたらす。ここに呈示した結果と合わせて、これらの研究は適切なレセプターがないため、あるいはＨＩＶ−１暴露部位に関して解剖学的に見た分布の点から、感染が困難であろうと思われる細胞の感染を促進するためにＨＩＶ−１がトランスでレセプターを使用することができることを示している。ＨＩＶ−１感染におけるＤＣ−ＳＩＧＮの役割を発見したことにより、ＨＩＶ−１の伝播の機構を理解し、ウイルス感染を予防またはブロックするための戦略を開発するための重要な手がかりが得られるだろう。
【０２１０】
（実施例２）
エンドソーム区画中へのＨＩＶの取り込み
ＤＣ−ＳＩＧＮで形質移入したＴＨＰ−１細胞（ＴＨＰ−ＳＩＧＮ細胞）をＨＩＶでパルスすると、ウイルスはその後およそ２０分以内で内部移行し、外部プロテアーゼによる処理および／またはその後の洗浄ステップから保護される。これらの細胞から得られたＨＩＶはその後ターゲットＴ細胞を感染することができる。正反対に、プロテアーゼ処理がｔ＝０で行われれば、ターゲット細胞の保護がないので、その後の感染も生じない。これらの結果はＨＩＶがエンドサイトーシスによって取り込まれ、その後細胞から感染力を有した形で放出されることを示している。同様の結果が一次樹状細胞を用いた場合にも得られた（図１３）。ＤＣ−ＳＩＧＮが媒介するｇｐ１２０の内部移行の時間的経過とそれに続くｇｐ１２０トリプシン感受性の喪失を図１４Ｂに示す。
【０２１１】
ＨＩＶ粒子の取り込みとその後のＴＨＰ−ＳＩＧＮ細胞からの放出はリサイクリングエンドソームを通じてやり取りを行うトランスフェリンに類似の動態を有する（図１５Ａ−１５Ｂ）。さらにＨＩＶ粒子は共焦点顕微鏡法によりエンドソーム小胞中にＬＡＭＰ＋リソソームとは、はっきりと区別して観察されるが、このことはＤＣ−ＳＩＧＮが媒介するリサイクリングエンドソームへのＨＩＶの取り込みと一致する（図１６Ａ−１６Ｂ）。
【０２１２】
したがって、ＴＨＰ−ＳＩＧＮ細胞はＨＩＶを捕獲し、その感染性をトランスで増加することができる。対照的に、ＴＨＰ−ＣＤ４＋細胞は、ＨＩＶを捕獲することのできるものの、トランスでは感染性を増強することができない。ＣＤ４が後期エンドソームおよびリソソームへと移動することがわかっているので、このレセプターにＨＩＶを結合することにより、その取り込みと分解が行われるであろう。
【０２１３】
ここに記載した特定の実施例により本発明の範囲を限定してはならない。実際ここに記載のものに加え、本発明で可能な各種の変形は、先の記載および添付の図面から当業者には明らかであろう。かかる変形は付随する特許請求の範囲内のものである。
【０２１４】
核酸またはポリペプチドに対してあげたすべての塩基の大きさあるいはアミノ酸の大きさ、並びにすべての分子量あるいは分子質量の値は概略値であり、解説のために提供したものである。
【０２１５】
ここではさまざまな出版物を引用したが、その開示はここにそのすべてを参照として援用する。


【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−１ＤはＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対する樹状細胞（ＤＣ）特異的レセプターであることを示すものである。図１ＡはＤＣ−ＳＩＧＮがＤＣによって特異的に発現することを示す。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で単球から培養された未熟ＤＣは高レベルのＤＣ−ＳＩＧＮを発現するが、静止末梢血リンパ球または単球はＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない。ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１）の発現はＦＡＣＳ分析によって決定した。３つの実験の中で代表的な１つの例を示す。図１Ｂは、ＣＤ４ではなくＤＣ−ＳＩＧＮが、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＤＣへの結合を媒介することを示す。ＤＣはＨＩＶ−１ｇｐ１２０でコートした蛍光ビーズに結合させた。接着は抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（２０μｇ／ｍｌ）、マンナン（２０μｇ／ｍｌ）およびＥＧＴＡ（５ｍＭ）で阻害されたが、抗ＣＤ４中和抗体（２０μｇ／ｍｌ）によっては阻害されなかった。３つの中で代表的な実験を１つ示す。図１Ｃ−１Ｄは未熟ＤＣ（図１Ｄ）が低レベルのＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）およびＣＣＲ５（２Ｄ７／ＣＣＲ５）と、高レベルのＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１）を発現することを示す。ＤＣ−ＳＩＧＮによる形質移入が安定に行われたＴＨＰ−１細胞（ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ、図１Ｃ）は高レベルのＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１）を発現するが、ＣＤ４およびＣＣＲ５は発現されない（塗りつぶしたヒストグラム）。ＣＤ４およびＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体はアイソタイプがマッチしていた。該当するアイソタイプコントロールを点線で示す。図１ＥはＤＣ−ＳＩＧＮトランスフェクタント（ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ）がＨＩＶ−１ｇｐ１２０に結合することを示す。ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮおよび模擬トランスフェクタントをＨＩＶ−１ｇｐ１２０でコートした蛍光ビーズに結合させた。接着は抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（２０μｇ／ｍｌ）、およびＥＧＴＡ（５ｍＭ）で阻害されたが、抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）中和抗体（２０μｇ／ｍｌ）によっては阻害されなかった。３つの中で代表的な実験を１つ示す。
【図２】  図２Ａ−２ＣはＤＣ−ＳＩＧＮがＤＣ−Ｔ細胞共培養物中でＨＩＶ−１の感染を媒介することを示す。図２ＡはＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体がＨＩＶ−１の感染を阻害することを示すが、これはＤＣ−Ｔ細胞共培養物中で測定された。ＤＣ（５０ｘ１０３）は室温で２０分ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）またはＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２）（２０μｇ／ｍｌ）に対する遮断ｍＡｂと共に、あるいはＣＣＲ５−特異性ケモカイン（ＣＣＲ５トリオ：ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ１β；５００ｎｇ／ｍｌ）を組み合わせたものと共に予備培養した。予備培養した未熟ＤＣに２時間ＨＩＶ−１（Ｍ親和性ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ株）をパルスし、未結合ウイルス粒子とｍＡｂを洗い流した。その後、ＤＣを活性化したＰＢＭＣ（５０ｘ１０３）と９日間共培養した。共培養物上澄みを集めｐ２４抗原レベルをＥＬＩＳＡで測定した。２つのうち代表的な実験１つを示す。図２ＢはＤＣ−Ｔ細胞共培養物中でＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ４およびＣＣＲ５をブロックすることにより、ＨＩＶ−１感染の阻害が起こることを示す。ＤＣ−Ｔ細胞共培養物中、実験第５日目のＨＩＶ−１複製を図５Ａに示す。第５日目の結果はＤＣ−Ｔ細胞共培養物の第６日、７日および９日目のものを代表している。ＤＣはまた抗ＣＤ４およびＣＣＲ５特異性ケモカインと共にＤＣ−ＳＩＧＮに対するｍＡｂと一緒に予備培養した。ｐ２４値は３つ作成した培養物の平均±標準偏差を示す。２つのうち代表的実験１つを示す。図２ＣはＤＣ−ＳＩＧＮとＩＣＡＭ−３との相互作用がＤＣ結合ＨＩＶ−１のＴ細胞への伝播に関与していないことを示す。ＤＣ（５０ｘ１０３）は２時間ＨＩＶ−１（Ｍ親和性ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ株）をパルスし、洗浄し、活性化ＰＢＭＣ（５０ｘ１０３）と共に９日間ＣＣＲ５特異性ケモカイン（ＣＣＲ５トリオ：ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ１β；５００ｎｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）ｍＡｂとＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２）（２０μｇ／ｍｌ）の存在下で９日間共培養した。抗体をＤＣのＨＩＶ−１感染後、ＰＢＭＣ添加の前に加えた。２つのうち代表的な実験１つを示す。
【図３】  図３Ａ−３Ｂは標的細胞上に発現したＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１の侵入を媒介しないことを示す。図３ＡはＤＣ−ＳＩＧＮまたはＣＤ４およびＣＣＲ５で形質移入を行いＨＩＶ−１（ＣＣＲ５親和性ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ株）を２時間パルスした２９３Ｔ細胞から得た結果を示す。細胞はその後９日間培養した。上澄みを集めｐ２４抗原レベルをＥＬＩＳＡで測定した。２つの実験の中から代表的なもの１つを示す。図３ＢはＤＣ−ＳＩＧＮで暫定的に形質移入を行い、ついでシュードタイプとしたＣＣＲ５親和性ＨＩＶ−１ＡＤＡウイルスでポリブレン（２０μ／ｇ／ｍｌ）の存在下に感染させたＣＤ４とＣＣＲ５のどちらかまたは両方を安定に発現している２９３Ｔ細胞から得た結果を示す。ルシフェラーゼ活性を２日後に評価した。３つのうち代表的な実験１つを示す。
【図４】  図４Ａ−４ＣはＤＣ−ＳＩＧＮがＣＤ４＋Ｔ細胞に感染性を保持しているＨＩＶ−１を捕獲することを示す。図４ＡはＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１を捕獲し、トランスでＨＩＶ−１許容細胞の感染を促進することを示す。ＴＨＰ−１トランスフェクタント（１００ｘ１０３）を２０分室温においてＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２；２０μｇ／ｍｌ）に対する遮断ｍＡｂと共に予備培養した。ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞をＲ５株ＨＩＶ−１ＡＤＡエンベロープによるシュードタイプＨＩＶ−ルシフェラーゼウイルスで感染させた。別法として活性化したＴ細胞をシュードタイプＨＩＶ−１ＡＤＡウイルスで感染させた。３７℃で２時間の後、感染細胞を十分に洗浄し、２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞または活性化した一次Ｔ細胞（１００ｘ１０３）に加えた。ＨＩＶ−１の感染を２日後にルシフェラーゼ活性を測定することによって求めた。３つの中で代表的な実験を１つ示す。図４ＢはＤＣ−ＳＩＧＮがさまざまな一次分離株からのＭ親和性ＨＩＶ−１エンベロープによるシュードタイプＨＩＶ−１ウイルスの捕獲を媒介する能力を有することを示す。ＤＣ−ＳＩＧＮが媒介する捕獲は２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞上でＪＲＦＬ、ＪＲＣＳＦおよび一次ウイルス９２ＵＳ７１５．６、９２ＢＲ０２０．４および９３ＴＨ９６６．８から得られたＣＣＲ５特異性ＨＩＶ−１エンベロープでシュードタイプとしたＨＩＶ−ルシフェラーゼウイルスにより図４Ａの項に記載されているように行われた。２つのなかで代表的な実験１つを示す。図４Ｃは活性化したＴ細胞がＴ細胞／ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ共培養物中でＨＩＶ−１により感染されることを示す。ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞をＭ親和性ＨＩＶ−１ＡＤＡでシュードタイプとし、ついで活性化Ｔ細胞と共に共培養したＨＩＶ−ｅＧＦＰウイルスと共に培養した。ＣＤ３−陰性ＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞はＨＩＶ−１に感染しなかったがＣＤ３−陽性Ｔ細胞は感染した。Ｔ細胞、ＣＤ３（トリカラー）の着色によりゲートされた、はＧＦＰに対し陽性であったが、当初ＨＩＶ−ＧＦＰを捕獲したＣＤ３陰性のＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮはＧＦＰを発現しなかった。２つの中で代表的な実験を１つ示す。
【図５】  図５Ａ−５ＢはＤＣ−ＳＩＧＮがトランスで作用することによってＴ細胞のＨＩＶ−１感染を強化することを示す。ウイルスの負荷が低い場合、トランスのＤＣ−ＳＩＧＮはＨＩＶ−１許容細胞の感染にとり極めて重要である。ＴＨＰ−１トランスフェクタント（１００ｘ１０３）をＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２；２０μｇ／ｍｌ）に対する遮断ｍＡｂと共に、室温で２０分予備培養した。ＴＨＰ−１を少量の、すなわち一回の感染アッセイにおける検出閾値で、シュードタイプＨＩＶ−１ＡＤＡウイルス（図５Ａ）あるいはその他のＨＩＶ−１のＲ５分離物（５Ｂ）で感染させた。３７℃で１時間保った後、細胞／ウイルス懸濁物をそのまま２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５または活性化Ｔ細胞（１００ｘ１０３）のいずれかに加えた。感染力は２日後にルシフェラーゼ活性を測定することにより求めた。２つのうちで代表的な実験１つを示す。
【図６】  図６Ａ−６ＩはＤＣ−ＳＩＧＮがＣＣＲ５を発現しない粘膜組織中に存在するＤＣ上に発現することを示す。粘膜組織切片上のＤＣ−ＳＩＧＮ発現の免疫組織化学的分析である。図６Ａ−６Ｃは抗ＤＣ−ＳＩＧＮｍＡｂで染色した異なる組織の切片である：頚管（図６Ａ）直腸（図６ｂ）および子宮（図６Ｃ）（原倍率：２００倍）。すべての粘膜組織には粘膜固有層中にＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞が含まれていた。連続切片を染色することによりこれらのＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞がＣＤ３，ＣＤ２０，ＣＤ１４およびＣＤ６８を発現しないことがわかる。図６Ｄ−６Ｉは直腸（図６Ｄ−６Ｆ）および子宮（図６Ｇ−６Ｉ）の連続切片をＤＣ−ＳＩＧＮ（図６Ａおよび６Ｄ）、ＣＤ４（図６Ｂおよび６Ｅ）あるいはＣＣＲ５（図６Ｃおよび６Ｆ）に対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を示す。
【図７】  図７Ａ−７ＣはＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１を捕獲し長期にわたり感染性を有することを示す。図７ＡはＴＨＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮの結合するＨＩＶ−１ＭＮｇｐ１２０の時間的経過を示す。ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞はｇｐ１２０でコートしたビーズと共に培養した。ビーズはＦＡＣＳスキャン分析により６０時間以上結合していたことがわかった。図７ＢはトランスでＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１に結合しＴ細胞を感染するウイルスを４日以上保持していることを示している。ＴＨＰ／ＴＨＰ−ＳＩＧＮ細胞に対し抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２、２０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下でＨＩＶ−１シュードタイプウイルスを４時間パルスした。洗浄後、ＨＩＶ−１パルス細胞を３７℃で数日感培養した。コントロールとして全く同量のウイルスを３７℃で細胞を含まない培地中で培養した。毎日一定量のＨＩＶ−１パルス細胞をＨＩＶ−１許容２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞に加え感染力を測定した。ルシフェラーゼ活性を検査するための溶解産物を共培養物から２日後に得た。図７ＣはＨＩＶ−１が初期暴露後ＤＣ−ＳＩＧＮをトランス−レセプターとして徴用するモデルを表している。ＤＣは粘膜暴露中にＨＩＶ−１によって標的にされる主な細胞であり、ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性である。ＨＩＶ−１はＤＣ−ＳＩＧＮに高親和性相互作用を通じて接着し、ＨＩＶ−１を運ぶ未熟ＤＣはリンパ組織へと遊走する。到着すると、ＤＣはＴ細胞とクラスターを形成し、ＤＣ−ＳＩＧＮはトランスでＴ細胞のＨＩＶ−１感染を強化し、増殖的で持続性の感染へと導く。
【図８】  図８はＤＣ−ＳＩＧＮがＳＩＶおよびＲ５、Ｘ４そして二重親和性ＨＩＶの捕獲を媒介することを示す。レポーター遺伝子ルシフェラーゼをコード化するウイルスをＣＣＲ５親和性株ＪＲＦＬ，ＡＤＡおよびＪＲＣＳＦ；ＣＸＲ４親和性株ＨｘＢ２およびＬＡＩ；二重親和性株８９．６；そしてＳＩＶ  １Ａ１１からのエンベロープでシュードタイプとした。ＴＨＰまたはＴＨＰ−ＤＣＳＩＧＮ細胞にこれらのウイルスをパルスし、洗浄し、その後ターゲット細胞へと加えた。ルシフェラーゼ活性を測定しターゲットのウイルス感染の指標とした。
【図９】  図９はＤＣ−ＳＩＧＮが一次ウイルス株からのエンベロープでシュードタイプとしたＨＩＶの捕獲を媒介することを示す（アッセイ条件は図８の項参照；検査ウイルスが異なることを除き同じアッセイを行った）。
【図１０】  図１０は活性化Ｔ細胞のＣＸＲ４親和性ＨＩＶ感染の強化を示す。ＴＨＰ，ＴＨＰ−ＤＣＳＩＧＮ細胞、ＤＣ（樹状細胞）または抗ＤＣＳＩＧＮ抗体と共に予備培養したＤＣを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコード化するＨｘＢ２シュードタイプウイルスと共に培養し、活性化したＴ細胞ターゲットを加えた。
【図１１】  図１１は非活性化Ｔ細胞のＣＸＲ４親和性ＨＩＶ感染の強化を示す（アッセイ条件については図１０を参照；非活性化Ｔ細胞を検査したことを除き同じアッセイを行った。）
【図１２】  図１２はＤＣ−ＳＩＧＮへの結合がＨｘＢ２の寿命をのばすことを示す。ＴＨＰまたはＴＨＰ−ＤＣＳＩＧＮ細胞にＨｘＢ２をパルスし、洗浄した後指示されている異なるタイムポイント（パルス後の時間）でターゲット細胞へと添加した。「ＨｘＢ２捕獲ウイルス」とは培地のみに加えられているウイルスを指す。
【図１３】  図１３Ａ−１３ＢはＨＩＶシュードタイプ粒子のプロテアーゼ保護を示す。図１３Ａはルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むシュードタイプ非複製補体ＨＩＶ  ＪＲＦＬ粒子と共に氷上で培養したＴＨＰ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞の結果を示す。細胞はついで二回洗浄し、細胞の半分を３７℃で２０分内部移行を行わせ、残りの半分は氷上に維持した。細胞をその後氷に戻しレポーターＧＦＰをコード化するシュードタイプＨＩＶ  ＪＲＦＬと共に培養した。洗浄後細胞をトリプシンで処理するかまたは模擬処理し、２９３Ｔ.ＣＤ４.ＣＣＲ５.ターゲット細胞と共に培養した。ＨＩＶルシフェラーゼおよびＨＩＶ  ＧＦＰ粒子の両方による感染は感染後４８時間の時点で調べた。図１３Ｂは、ＨＩＶ粒子がヒト血液から得たＤＣに結合していることを除き図１３Ａと同じものである。
【図１４】  図１４Ａ−１４ＢはＨＩＶｇｐ１２０−ＦＩＴＣのＤＣ−ＳＩＧＮによる内部移行を示す。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＴＨＰ細胞を氷上でＦＩＴＣに直接接合しているＨＩＶｇｐ１２０により染色した。染色細胞をついで３７℃に移し、一定量を指示した時間に採取した。各タイムポイントで、細胞をトリプシン処理または模擬処理した。細胞をＤＣ−ＳＩＧＮの表面発現に対して染色し、プロテアーゼ処理の有効性を検証した。図１４Ａは染色ＴＨＰ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞のＦＡＣＳ分析である。図１４Ｂはトリプシン処理から保護されたＨＩＶ  ｇｐ１２０−ＦＩＴＣ画分の時間に対するプロットを示す。染色に先立ちパラホルムアルデヒドで固定したＴＨＰ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞に結合したＨＩＶｇｐ１２０−ＦＩＴＣはトリプシン処理からの保護を示さなかった。
【図１５】  図１５Ａ−１５ＢはトランスフェリンおよびＨＩＶのＴＨＰ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞によるリサイクルを示す棒グラフである。図１５ＡにおいてＴＨＰ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞は氷上でトランスフェリンと共に培養した後、洗浄し、３７℃に移し、１時間おいた。酸によるストリッピングを行い細胞の表面に残るトランスフェリンを除去してから培地に置いた。ここに示した時間毎に一定量の上澄みを取り、ＥＬＩＳＡにより放出トランスフェリンのアッセイを行った。５時間後、細胞と会合して残っているトランスフェリンの量を細胞をペレット化し、溶解し、ＥＬＩＳＡでトランスフェリンの量を測定することによって求めた。図１５ＢでＴＨＰ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞をＨＩＶ粒子と共に氷上で培養し、トランスフェリン実験と同様に処理した。放出されたＨＩＶをｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【図１６】  図１６Ａ−１６Ｂは蛍光共焦点顕微鏡検査法によりイメージ化したＨＩＶ粒子の内部移行を示す。ＨＩＶ  ＭＮ粒子をＴＨＰ  ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞へ氷上で結合させ、遊離ウイルスを洗い流した。結合粒子をＨＩＶに対するポリクローナルヒト血清、ついでＣｙ３に接合した抗ヒト第二抗体を用いて検出した。図１６Ａにおいて細胞は染色後ただちにアッセイに付すか、または３７℃での４時間の培養を行った後アッセイに付した。図１６ＢにおいてＨＩＶは３７℃で１時間内部移行させた。細胞をついで固定し、透過性にし、リソソームマーカーである、ヒトＬＡＭＰ−１に対するＦＩＴＣ接合抗体を用いて染色した。


【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004536777.tif 000004
【図４】
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【図５】
2004536777.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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