【手続補正書】
【提出日】平成16年7月8日(2004.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの1以上の部分をコードする核酸フラグメントのライブラリーを生成し、可溶性蛋白質ドメインをコードするライブラリー中のフラグメントを同定する方法であり：
非天然ヌクレオチドを、非天然ヌクレオチド及び、存在するならば、それに対応する天然ヌクレオチドの相対量に関連した頻度で、増幅した核酸配列生成物へ組み込むために、非天然ヌクレオチドの存在下で、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を増幅すること；
核酸配列生成物を、非天然ヌクレオチドの存在を認識し、核酸配列生成物の切断又はその非天然ヌクレオチドの切除を行うことができる1以上の反応物と接触させ、それによってポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を生成すること；
そのフラグメントによってコードされる蛋白質ドメインを生成するために、核酸フラグメントのライブラリーを発現し、蛋白質ドメインを25アミノ酸残基より短いアフィニティ・タグとの融合体として発現すること；及び
可溶性蛋白質ドメインを同定するために、前記アフィニティ・タグを用いて可溶性蛋白質を分離すること；
を含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドの1以上の部分をコードする核酸フラグメントのライブラリーを生成する方法であり：
非天然ヌクレオチドを、非天然ヌクレオチド及び、存在するならば、それに対応する天然ヌクレオチドの相対量に関連した頻度で、増幅した核酸配列生成物へ組み込むために、非天然ヌクレオチドの存在下で、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を増幅すること；
核酸配列生成物を、非天然ヌクレオチドの存在を認識し、核酸配列生成物の切断又はその非天然ヌクレオチドの切除を行うことができる1以上の反応物と接触させ、それによってポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を生成すること；
を含む方法。
【請求項３】
核酸配列を増幅する工程を、非天然ヌクレオチドのみ又は非天然及び天然ヌクレオチドの混合物を用いて、PCRを用いて行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
非天然ヌクレオチドがウラシル又は３−メチル アデニンである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
核酸配列が、cDNAライブラリー、RNAライブラリー又はゲノムDNAのサンプル中に存在している、請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドの核酸フラグメントが200から1200ヌクレオチドの間である、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
核酸フラグメントを生成するために、核酸配列が平均して約２ヌクレオチドごとにサンプリングされる請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
非天然ヌクレオチドの部位で核酸配列生成物の認識及び切断が可能な反応物が酵素であり、その酵素が非天然ヌクレオチドの存在を認識し、修飾された核酸配列の部位で又はその近辺で、その核酸配列を切断する請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
酵素がDNAグリコシラーゼ又はエンドヌクレアーゼである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非天然ヌクレオチドがデオキシウラシルであり、酵素がアピュリニック／アピュリミディック・エンドヌクレアーゼ（APE）であり、ウラシル−DNAグリコシラーゼ（UDG）によって触媒される請求項１から９のいずれか一項記載の方法。    
【請求項１１】
核酸フラグメントを増幅することを更に含む請求項１から１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
蛋白質ドメインのライブラリー中で、蛋白質ドメインが定常的な部分、並びに、増幅及び接触工程によってサンプリングされた部分を含む、請求項１から１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
核酸フラグメントを発現ベクター（複数の発現ベクター）へライゲーションすることを更に含む請求項１から１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドのフラグメントを発現できる宿主細胞のライブラリーを生成するために、宿主細胞を発現ベクターで形質転換することを更に含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を発現すること及び、任意にこのように生成したポリペプチドフラグメントを単離することを更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
可溶性蛋白質ドメインを同定する方法であり：
フラグメントによってコードされる蛋白質ドメインを生成するために、核酸フラグメントのライブラリーを発現し、その蛋白質ドメインが25アミノ酸残基より短いアフィニティ・タグとの融合体として発現されること；及び
可溶性蛋白質ドメインを同定するために、前記アフィニティ・タグを用いて可溶性蛋白質を分離すること；
を含む方法。
【請求項１７】
プロテアーゼ切断部位を含んで、前記ポリペプチドフラグメントを発現する請求項１から１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
アフィニティ・タグを含んで、前記ポリペプチドフラグメントを発現する請求項１から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
アフィニティ・タグの長さが15アミノ酸より短いペプチドである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アフィニティ・タグが蛋白質フラグメントのC末端に融合している請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
アフィニティ・タグがポリヒスチジン、Flag又はGluエピトープ、S-tag、カルモジュリン結合ペプチド又はリボヌクレアーゼSである請求項１８から２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
アフィニティ・タグがHis6-tagである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
可溶性蛋白質ドメインを細胞から放出することを更に含む請求項１４から２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
蛋白質を放出する工程が非変性条件下で行われる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
非変性条件が酵素又は非変性界面活性剤の使用を含むことである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
壊れなかった細胞、細胞細片及び不溶性物質を選別して分けることを更に含む請求項１４から２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
遠心分離によって溶菌液を清澄することを更に含む請求項１４から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
異なる蛋白質で形質転換させた細胞を、アフィニティー・クロマトグラフィーによって、並行して精製することを更に含む請求項１４から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
蛋白質ドメインライブラリーを、固相上に固定されたアフィニティ・タグの結合パートナーを有する固相と接触させることによって、可溶性蛋白質ドメインを分離する工程を行う請求項１から２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記結合パートナーが：
(a)ポリヒスチジン・アフィニティ・タグに結合するためのNi2+又はCo2+のような金属イオン；  又は
(b)Flag又はGluエピトープ・アフィニティ・タグに結合するための抗Flag抗体；  又は
(c)S-tagアフィニティ・タグに結合するためのストレプトアビジン；  又は
(d)カルモジュリン結合ペプチド・アフィニティ・タグに結合するためのCa2+存在下でのカルモジュリン；  又は
(e)リボヌクレアーゼSアフィニティ・タグに結合するためのアポリボヌクレアーゼS；である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
可溶性蛋白質フラグメントの存在をアッセイすることを更に含む請求項１から３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
アッセイの工程が抗タグELISA、SDS-PAGE又はLC-ESI-MSを用いて行われる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
可溶性蛋白質ドメインのアッセイの工程が、1以上の前記蛋白質ドメインの蛋白質発現レベルを定量することを含む請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
可溶性蛋白質の同定又は配列決定を更に含む請求項１から３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
フラグメント又はドメインの前記ライブラリーを：
（a）候補化合物がライブラリー内に存在する蛋白質フラグメント又はドメインと結合するか否か、及び／又は、ライブラリー内に存在する蛋白質フラグメント又はドメインの活性を調整するか否かを決定するために、1以上の候補化合物；  及び／又は
（b）ライブラリーに存在する蛋白質フラグメント又はドメインがテスト蛋白質に結合するか否か、及び／又は、テスト蛋白質の活性を調整するか否かを決定するために、１以上のテスト蛋白質；
と接触させることを更に含む請求項１から３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
ライブラリーに存在する蛋白質フラグメント又はドメインの間で、結合又は活性の調整が生じているか否かを決定するために、可溶性蛋白質フラグメント又はドメインの2以上のライブラリーを接触させることを更に含む請求項１から３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
ライブラリーを構築するのに用いた蛋白質のどの部分が、結合及び生物活性に関係しているかを決定するために用いられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
リガンドとレセプター、酵素と基質、抗体と抗原、又は低分子と蛋白質との間の結合を決定するために使用される請求項３５から３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項記載の方法によって生成されるライブラリー。
【請求項４０】
(a)元の核酸配列の核酸フラグメントのライブラリーであり、核酸フラグメントが、200から1200ヌクレオチドの間のサイズ幅を有しており、好ましくは、元の核酸配列から平均して約２ヌクレオチドごとにサンプリングされるライブラリー；  又は    
(b)(a)に記載の核酸フラグメントを複数含む発現ベクターのライブラリーであり、核酸配列フラグメント及びアフィニティ・タグを発現するために、それぞれのフラグメントが、アフィニティ・タグをコードする核酸配列及び任意の1以上の更なる配列にライゲーションされているライブラリー；  又は
(c)(b)に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞のライブラリー；  又は
(d)工程(a)に記載の核酸配列を発現することによって生成されるポリペプチド・フラグメントのライブラリーであり、それぞれのポリペプチドがアフィニティ・タグと結合しているライブラリー；
である、請求項３９に記載されたライブラリー。