【手続補正書】
【提出日】平成16年6月23日(2004.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】酵素の結晶構造および該結晶構造の使用
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、結晶化オーロラＡキナーゼに関し、そしてオーロラキナーゼ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）を調べ、そしてオーロラキナーゼ調節剤を設計するための該キナーゼの三次元構造の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
生理学的プロセスおよび病理学的プロセスに関与する酵素などのタンパク質は、薬剤化合物および治療の開発の重要なターゲットである。タンパク質の三次元構造を知ると、こうしたタンパク質の模倣体（ｍｉｍｉｃ）または調節剤の合理的設計が可能になる。目的のタンパク質由来の構造パラメータを用いて、構造データベースを検索することによって、これらのパラメータを模倣するか、または該パラメータと相互作用する可能性がある分子構造を選択することが可能である。その後、選択した分子構造を合成し、そしてその活性に関して試験することが可能である。あるいは、目的のタンパク質由来の構造パラメータを用いて、望ましい活性を持つ模倣体または調節剤を設計し、そして合成することが可能である。こうした模倣体または調節剤は、特定の疾患を治療する療法剤として有用である可能性がある。例えば、ＷＯ９８／０７８３５は、場合によって１以上の化合物と複合体を形成した、プロテインチロシンキナーゼの結晶構造を開示する。該酵素構造および結合した化合物いずれかの原子座標を用いて、未知の構造を持つキナーゼの三次元構造を決定し、そしてキナーゼ機能の調節剤を同定する。別の例として、ＷＯ９９／０１４７６は、抗因子ＩＸ  Ｆａｂ断片（抗体）の結晶構造、および新規抗凝血剤を同定しそして該剤を設計するための該結晶構造の使用を開示する。
【０００３】
タンパク質の三次元構造を知ることは、そのタンパク質の模倣体または調節剤の合理的設計に必須である。構造的知識が欠如していると、非常に有用な薬剤特性を有する可能性がある新規模倣体または調節剤の開発の障壁となる。
【０００４】
真核生物において、細胞周期は主に、タンパク質リン酸化の順序だったカスケードによって制御されている。このカスケードにおいて、非常に重要な役割を果たしている、いくつかのプロテインキナーゼファミリーが現在、同定されてきている。これらのキナーゼの多くの活性は、正常組織に比較した際、ヒト腫瘍で増加している。これは、増加したレベルのタンパク質発現（例えば遺伝子増幅の結果として）によって、あるいは活性化補助因子または阻害性タンパク質の発現変化によって、いずれかで起こる可能性がある。
【０００５】
これらの細胞周期制御因子のうち、最初に同定され、そして最も広く研究されているのは、サイクリン依存性キナーゼ（またはＣＤＫ）である。特定の時期に特定のＣＤＫが活性であることは、細胞周期の開始および細胞周期を通じて協調した進行両方に必須である。例えば、ＣＤＫ４タンパク質は、網膜芽細胞腫遺伝子産物ｐＲｂをリン酸化することによって、細胞周期（Ｇ０−Ｇ１−Ｓ移行）への進入を制御するようである。これによって、ｐＲｂからの転写因子Ｅ２Ｆの遊離が刺激され、これがその後、Ｓ期への進入に必要な遺伝子の転写を増加させるよう作用する。ＣＤＫ４の触媒活性は、パートナータンパク質、サイクリンＤ１に結合することによって刺激される。癌および細胞周期間に直接の関連があるという最初の立証の１つは、多くのヒト腫瘍で、サイクリンＤ１遺伝子が増幅され、そしてサイクリンＤ１タンパク質レベルが増加している（そしてしたがってＣＤＫ４活性が増加している）という観察を用いてなされた（Ｓｈｅｒｒ，  １９９６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１６７２−１６７７；Ｐｉｎｅｓ，  １９９５，  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：６３−７２に概説される）。他の研究によって、ＣＤＫ機能の陰性制御因子が、ヒト腫瘍において、頻繁に下方制御されるかまたは欠失しており、やはりこれらのキナーゼの不適切な活性化につながっていることが示されている（Ｌｏｄａら，  １９９７，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（２）：２３１−２３４；Ｇｅｍｍａら，  １９９６，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ６８（５）：６０５−１１；Ｅｌｌｅｄｇｅら  １９９６，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６；３８８−３９２）。
【０００６】
より最近、ＣＤＫファミリーと構造的に別個のプロテインキナーゼが同定されてきており、該プロテインキナーゼは、細胞周期を制御するのに非常に重要な役割を果たし、そしてまた、腫瘍形成にも重要であるようである。これらには、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）・オーロラおよびＳ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｉｐｌ１タンパク質の新規に同定されたヒト相同体が含まれる。ショウジョウバエ・オーロラおよびＳ．セレビシエＩｐｌ１はアミノ酸配列レベルで非常に相同であり、セリン／スレオニンプロテインキナーゼをコードする。オーロラおよびＩｐｌ１はどちらも、細胞周期のＧ２期から有糸分裂までの移行、中心体機能、紡錘体形成、および娘細胞への適切な染色体分離／隔離を制御するのに関与することが知られる。オーロラＡ、ＢおよびＣと称する、これらの遺伝子の３つのヒト相同体は、細胞周期に制御されるプロテインキナーゼをコードする。これらは、Ｇ２／Ｍ境界（オーロラＡ、Ｃ）で、そして有糸分裂および細胞質分裂（オーロラＢ）において、発現およびキナーゼ活性のピークを示す。いくつかの観察によって、ヒト・オーロラタンパク質、特にオーロラＡが癌に関与しているとみなされている。オーロラＡ遺伝子は染色体２０ｑ１３にマッピングされ、この領域は、乳房腫瘍および結腸腫瘍両方を含むヒト腫瘍で、頻繁に増幅される領域である。初代ヒト結腸直腸癌の５０％より多くで、オーロラＡ  ＤＮＡが増幅され、そしてオーロラＡ  ｍＲＮＡが過剰発現されているため、オーロラＡは、この単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の主なターゲット遺伝子である可能性がある。オーロラＡタンパク質レベルは、隣接する正常組織と比べて、これらの腫瘍において、非常に増加しているようである。さらに、げっ歯類線維芽細胞をヒト・オーロラＡでトランスフェクションすると、形質転換が導かれ、これによって、軟寒天中で増殖し、そしてヌードマウス中で腫瘍を形成する能力が与えられる（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，  １９９８，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  １１７（１１）：３０５２−３０６５）。他の研究によって、オーロラＡを人工的に過剰発現させると、中心体数の増加および異数性の増加が導かれることが示された（Ｚｈｏｕら，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ２０（２）：１８９−９３）。
【０００７】
重要なことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドでヒト腫瘍細胞株を処理することによって（ＢｉｓｃｈｏｆｆおよびＰｌｏｕｇｈｍａｎ，  １９９９，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ９（１１）：４５４−４５９）、またはオーロラＡキナーゼ活性の小分子阻害剤によって（Ｋｅｅｎら  ２００１，  ポスター＃２４５５，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ，  米国ニューオーリンズ）、オーロラＡ発現および機能を抑止すると、有糸分裂、細胞周期停止が導かれ、そしてこうした抑止は、これらの腫瘍細胞株において、抗増殖効果を発揮することもまた立証されている。これによって、オーロラＡ機能の阻害が、ヒト腫瘍および他の過剰増殖疾患の治療に有用である可能性がある抗増殖効果を有するであろうことが示される。
【０００８】
オーロラＡキナーゼの阻害剤を設計するため、多様なリード化合物と複合体を形成した、オーロラＡキナーゼの三次元構造を知ることが必要である。現在まで、オーロラＡキナーゼの三次元構造は入手可能でなかった。さらに、阻害部位を含む、キナーゼドメインの構造決定を可能にするのに十分な品質で、オーロラのいかなる部位の結晶も得ることが可能でなかった。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ヒト・オーロラＡキナーゼの以前は未知であった三次元構造に関する。本明細書に記載するように、出願者らは、他の研究者が遭遇した困難を克服し、そしてＸ線回折法によってタンパク質の三次元構造を決定するのに十分な品質で、オーロラＡキナーゼ触媒ドメインの結晶を作成した。さらに、出願者らは、ＡＴＰ類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）ＡＭＰ−ＰＮＰと複合体を形成した、オーロラＡキナーゼのキナーゼ触媒ドメインの三次元結晶構造とともに、合成阻害剤と複合体を形成したオーロラＡキナーゼ触媒ドメインの三次元結晶構造を決定した。多様な疾患または状態、そして特に、癌などの細胞増殖疾患の治療用の新規オーロラキナーゼ調節剤（特に阻害剤）の同定および構造に基づく設計を可能にするため、この構造情報に対する明らかな必要性がある。本明細書に記載する方法は、多数の目的の阻害剤と複合体を形成した、オーロラＡキナーゼとともに他のオーロラキナーゼの三次元構造の決定を可能にして、細胞増殖疾患を治療するであろう調節剤の合理的設計を補助する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、オーロラＡキナーゼの結晶に関し、そしてオーロラキナーゼ相同体を調べ、そしてオーロラキナーゼ調節剤（好ましくは阻害剤）を設計するための、該三次元構造の使用に関する。本発明はさらに、Ｘ線回折法によって、ポリペプチドの三次元（三次）構造を決定するのに十分な品質の、記載するように複合体を形成したか、または複合体を形成していない、オーロラキナーゼ、特にオーロラＡキナーゼ、またはその触媒部分の結晶に関する。
【００１１】
本発明の第一の側面にしたがって、出願者らは、オーロラＡキナーゼの触媒ドメインを含んでなるポリペプチドの２つの結晶型を提供する。１つの結晶型は、ＡＴＰ類似体ＡＭＰ−ＰＮＰの存在下で、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）を結晶化した際に得られる。第二の結晶型は、合成阻害剤の存在下で、ＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を結晶化した際に得られる。（オーロラＡのアミノ酸残基は、最初のメチオニン直後の最初のアミノ酸をアミノ酸番号１とすることによって、番号付けする）。１つの態様において、第一の結晶型は、空間群Ｐ３２２１を有する。別の態様において、第一の結晶型は、単位格子寸法ａ＝ｂ＝８６．５５、ｃ＝７８．３４Å、α＝β＝９０およびγ＝１２０°を有する。別の態様において、第二の結晶型は、空間群Ｐ２１を有する。別の態様において、第二の結晶型は、単位格子寸法ａ＝５２．６、ｂ＝８８．４、ｃ＝６７．８Å、α＝γ＝９０およびβ＝９０．０１°を有する。別の態様において、これらの結晶型は、結晶中のユニークな反復モチーフに相当する、複合体中の各原子のｘ、ｙ、ｚ座標の三次元セット（表１および表２）によって記載される。表１は、第一の結晶型の複合体分子の座標を含有し；表２は、第二の結晶型の非対称単位（最少ユニーク反復単位）中の２つの独立の複合体分子の座標を含有する。別の態様において、これらの結晶型は、どちらかの阻害剤のいずれかの原子から５Å以内の接触距離にあるすべての残基セットによって近似される、結合部位の数値の定義を含む。結合部位は、リスト、原子座標が表１および表２に列挙される、Ａｒｇ１３６、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｌｙｓ１４０、Ｇｌｙ１４１、Ｖａｌ１４６、Ａｌａ１５９、Ｌｙｓ１６１、Ｌｅｕ１６３、Ｖａｌ１７７、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ１８１、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０９、Ｇｌｕ２１０、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｐｒｏ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０、Ｌｅｕ２６２、Ａｌａ２７２、Ａｓｐ２７３、Ｐｈｅ２７４、Ｇｌｙ２７５、Ｔｒｐ２７６、Ｓｅｒ２７７、Ｖａｌ２７８、およびＨｉｓ２７９に提供されるアミノ酸残基セット（セットＡ）中の原子のｘ、ｙ、ｚ座標によって定義される。結合部位は、代替結晶型、相同体、変異体または突然変異体いずれかにおいても定義可能であり、この場合、結合部位は、各々、表１および表２に記載するような座標を有する、アミノ酸残基、Ａｒｇ１３６、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｖａｌ１４６、Ａｌａ１５９、Ｌｙｓ１６１、Ｌｅｕ１６３、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０９、Ｇｌｕ２１０、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｐｒｏ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０およびＬｅｕ２６２を含む結合部位の最も柔軟でないサブセット（セットＢ）から、１．０Å以下の、アミノ酸残基のすべての原子からの二乗平均平方根偏差を有する。
【００１２】
別の態様において、第一の結晶型は、各々、表１ａに列挙した座標を有する、アミノ酸残基、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｖａｌ１４６、Ｌｙｓ１６１、Ｖａｌ１７７、Ａｒｇ１７８、Ａｒｇ１７９、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ１８１、Ｇｌｕ１８２、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ２０９、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０、Ｌｅｕ２６２、Ａｌａ２７２、Ａｓｐ２７３、Ｐｈｅ２７４、Ｇｌｙ２７５、Ｔｒｐ２７６、Ｓｅｒ２７７、Ｖａｌ２７８およびＨｉｓ２７９に定義される結合部位を含んでなる。別の結晶型、相同体、変異体または突然変異体であって、結合部位が、１．５Å以下の、そして好ましくは１．０Å以下の、該アミノ酸残基の主鎖原子からの二乗平均平方根偏差を有するものもまた提供する。
【００１３】
別の態様において、結晶型は、上記態様の結晶型のいずれかを含む、オーロラキナーゼの触媒ドメインと複合体を形成した、オーロラキナーゼ阻害剤をさらに含んでなる。
本発明の別の側面は、上記態様のいずれかにしたがった結晶型の原子座標を用いて、オーロラ化学的調節剤を設計する方法に関する。
【００１４】
本発明の別の側面は、上記態様のいずれかにしたがった結晶型の原子座標を用いて、オーロラ化学的調節剤を選択する方法に関する。
本発明の別の側面は、本発明によって、オーロラに構造的類似性を有すると示された他のタンパク質いずれか、例えばＰＫＡの原子座標を用いて、オーロラ化学的調節剤を設計するかまたは選択する方法に関する。
【００１５】
本発明の別の側面は、上記態様のいずれかにしたがった結晶型の原子座標を用いて、オーロラタンパク質を設計する方法に関する。
本発明の別の側面は、オーロラ調節剤を設計するかまたは選択する方法であって：
タンパク質表面の三次元特性に関する情報を得るため、オーロラ（表１および表２）の原子座標を調べ；
活性部位ＡＴＰ結合ポケットに代わる、重複するまたは重複しない結合ポケットに帰着し；そして
結合ポケット情報を用いて、オーロラ調節剤を選択するかまたは設計する
工程を含んでなる、前記方法に関する。
【００１６】
本発明の別の側面は、オーロラキナーゼの第二のまたは新規の結晶または結晶型と称される、オーロラキナーゼの結晶型の三次元構造を決定する方法であって、オーロラキナーゼの元来の結晶の原子座標（表１または表２）を用い、差フーリエ法または分子置換法を適用して、新規結晶の活性部位ＡＴＰ結合ポケットが第一の結晶におけるものと同等であるように、新規結晶の構造をモデリングする工程を含んでなる、前記方法に関する。特定の態様において、本発明は、オーロラキナーゼＡの結晶型の三次元構造を決定する方法であって、オーロラキナーゼの元来（第一）の結晶の原子座標（表１または表２）を用い、差フーリエ法または分子置換法を適用して、新規結晶の活性部位ＡＴＰ結合ポケットが元来（第一）の結晶におけるものと同等であるように、オーロラキナーゼＡの新規結晶または新規結晶型の構造をモデリングする工程を含んでなる、前記方法である。
【００１７】
特に本明細書に提供するのは、オーロラＡタンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドの結晶型である。触媒ドメインは、全長タンパク質内またはタンパク質断片内に見出すことが可能である。触媒ドメインはまた、野生型オーロラＡ酵素に由来することも可能であるし、あるいはオーロラＡ突然変異体、相同体または変異体に由来することも可能である。突然変異体は、アミノ酸配列に１以上の変化を有する野生型オーロラＡタンパク質である。オーロラ突然変異体は、野生型タンパク質と同じ活性を有することが可能であり、修飾された活性を有することが可能であり、または不活性であることが可能である。変異体は、配列の１以上の部分が除去されたか、あるいはさらなる単数または複数の配列が付加されたため、野生型または突然変異体タンパク質とは異なる長さである、野生型または突然変異体タンパク質である。変異体は、通常、元来の野生型または突然変異体タンパク質と同じ活性を有する。相同体は、アミノ酸配列のある部分が、元来のタンパク質中と同じである、関連タンパク質である。例えば、オーロラＢおよびオーロラＣは、オーロラＡの相同体である。
【００１８】
本発明は、触媒ドメインを伴う、オーロラＡの一部、突然変異体、変異体または相同体いずれかの三次元構造を、高分解能で決定するのに十分な品質の結晶に関する。
本発明のさらなる側面にしたがって、小分子量阻害剤分子と複合体を形成したオーロラＡ触媒ドメインを含有するポリペプチドの結晶型を提供する。例えば、阻害剤分子は、ＡＴＰの加水分解不能類似体であることが可能である。こうした類似体には、例えば、式Ｉ（ＡＭＰ−ＰＮＰ）が含まれる。別の例として、阻害剤は、化学的に合成した分子であることが可能である。こうした分子には、例えば、式ＩＩが含まれる。
【００１９】
【化１】
2005504548.tif 000001
【００２０】
【化２】
2005504548.tif 000002
【００２１】
本発明の別の側面は、オーロラの活性部位ＡＴＰ結合ポケットのユニークな形状である。Ｘ線結晶学を用いて、オーロラＡ触媒ドメインの三次元分子構造を決定した。この結果、我々は、オーロラＡ活性部位ＡＴＰ結合ポケットのユニークな形状（その構成要素アミノ酸の原子座標によって定義）を決定した。さらに、オーロラＡ活性部位結合ポケットに比較した、オーロラＡ基質類似体および阻害剤分子の空間的配置を決定した。この構造情報は、コンピュータ読み取り可能媒体上に記憶させることが可能であり、そして合理的薬剤設計に使用可能である。
【００２２】
キナーゼ全般を研究する際の困難の１つは、活性タンパク質を得ることである。活性化されるためには、特定のキナーゼは、１以上の重要なアミノ酸残基で、リン酸化される必要がある。１００％純粋なリン酸化タンパク質を得るのは、実験的に困難である可能性がある。異なるリン酸化状態は、異なるコンホメーションを有する可能性がある。当業者は、タンパク質試料中のこうした不均一性が、巨大で秩序だった結晶を形成する能力をひどく妨げる可能性があることを認識する。オーロラＡにおいて、Ｔｈｒ２８７のリン酸化は、キナーゼの活性化に必要である。ＡｓｐによるＴｈｒ−２８７の置換（［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡと呼ばれるオーロラＡ突然変異体）は、均質試料を提供可能な活性タンパク質の模倣体を提供する。［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ突然変異体は恒常的に活性である。したがって、この突然変異体の調製は、活性および結晶化可能性の両方の問題に好適に対応する。
【００２３】
マルチドメインタンパク質の結晶化における主要なハードルの１つは、その柔軟性である。オーロラＡの結晶化の機会を増加させるため、触媒ドメインに限定された酵素構築物を用いた。これによって、より硬い、そしてコンパクトなドメインが提供された。触媒ドメイン構築物は、アミノ酸配列を既知の構造の他のキナーゼと比較し、そして類似から、オーロラＡ触媒ドメインを含むポリペプチドの開始残基および終止残基を定義することによって、設計可能である。これによって、触媒ドメインを含む、多数のあり得る構築物変異体が提供される。オーロラＡを結晶化させるさらなる機会を増加させるため、どの触媒ドメイン構築物が、フォールディング単位として完全性を保持しつつ、最もコンパクトであるのかに関して、実験上の証拠を探求した。触媒ドメインに対して、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８由来のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを用いて、限定タンパク質分解を行った。これによって、触媒ドメイン境界が残基１２２〜３９６以内にあると定義された。他の類似の構築物は、例えば、限定タンパク質分解実験のため、異なるプロテアーゼを用いて、類似の方法を通じて、得ることが可能である。こうした方法は、２つのオーロラＡ触媒ドメインポリペプチドの調製、結晶化および構造決定に例示される。加水分解不能ＡＴＰ類似体ＡＭＰ−ＰＮＰと複合体を形成した［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）の構造を図１に示す。式ＩＩの合成オーロラ阻害剤と複合体を形成したＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）の構造を図２ａおよび２ｂに示す。
【００２４】
ＡＭＰ−ＰＮＰ分子は、Ｎ末端ドメイン（残基１２５〜２０８）およびＣ末端ドメイン（残基２１５〜３７４）の間の裂け目を占有する。他のキナーゼとの比較によって、この裂け目がＡＴＰ結合部位部分に相当することが立証される。このように、我々は、オーロラの活性部位ＡＴＰ結合ポケットを同定した。電子密度によって、ＡＭＰ−ＰＮＰが二重コンホメーションを採用する証拠が示される。どちらのコンホメーションにおいても、アデニン環およびリボース部分が類似のポケットを占有し、アデニン窒素原子Ｎ１およびＮ６が酵素のヒンジ領域（残基２０９〜２１４）の主鎖原子との古典的な相互作用を形成する。Ｎ１はＡｌａ−２１２の主鎖窒素と水素結合を形成し、一方、Ｎ６はＧｌｕ−２１０のペプチドカルボニル基と水素結合を形成する。しかし、分子の別の箇所のねじれ角相異によって、アルファおよびベータ・リン酸基が別のポケットを占有することが可能になる。ＡＭＰ−ＰＮＰ分子のガンマ・リン酸基に関しては、どちらのコンホメーションでも電子密度は明らかでない。コンホメーション１では、ベータ・リン酸基はＳｅｒ２７７のＯ酸素原子およびＡｓｎ２６０の側鎖と極性相互作用を形成し、一方、コンホメーション２では、ベータ・リン酸はＧｌｕ−２５９のアミドカルボニルおよび水分子（この構造ではＷａｔ−５４２）と極性相互作用を形成する。
【００２５】
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡに関して決定した三次元構造から、活性部位ＡＴＰ結合ポケットであるＡＭＰ−ＰＮＰ結合ポケットが、表１および表２に列挙される、構成要素アミノ酸残基の原子座標によってユニークに定義されることが確立される。表１に詳述するのと同じ座標を有し、そして表１のＬｙｓ１４０およびＧｌｙ１４１以外は同一の構成要素アミノ酸を持ち、そしてＡｌａ１４０およびＡｌａ１４１で置換されており、そのためこうした表が本明細書において、表１ａと称される、同等のＡＴＰ結合ポケットもまた、定義可能である。
【００２６】
表１：ＡＭＰ−ＰＮＰと複合体を形成した［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）の座標
【００２７】
【表１−１】
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【００２８】
【表１−２】
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【００２９】
【表１−３】
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【００３０】
【表１−４】
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【００３１】
【表１−５】
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【００３２】
【表１−６】
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【００３３】
【表１−７】
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【００３４】
【表１−８】
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【００３５】
【表１−９】
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【００３６】
【表１−１０】
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【００３７】
【表１−１１】
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【００３８】
【表１−１２】
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【００３９】
【表１−１３】
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【００４０】
【表１−１４】
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【００４１】
【表１−１５】
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【００４２】
【表１−１６】
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【００４３】
【表１−１７】
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【００４４】
【表１−１８】
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【００４５】
【表１−１９】
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【００４６】
【表１−２０】
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【００４７】
【表１−２１】
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【００４８】
【表１−２２】
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【００４９】
【表１−２３】
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【００５０】
【表１−２４】
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【００５１】
【表１−２５】
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【００５２】
【表１−２６】
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【００５３】
【表１−２７】
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【００５４】
【表１−２８】
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【００５５】
【表１−２９】
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【００５６】
【表１−３０】
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【００５７】
【表１−３１】
2005504548.tif 000033
【００５８】
【表１−３２】
2005504548.tif 000034
【００５９】
【表１−３３】
2005504548.tif 000035
【００６０】
表２：空間群Ｐ２１の式ＩＩの阻害剤と複合体を形成した［Ｔ２８７］オーロラＡ（１２２〜３９６）非対称単位中の２分子の座標
【００６１】
【表２−１】
2005504548.tif 000036
【００６２】
【表２−２】
2005504548.tif 000037
【００６３】
【表２−３】
2005504548.tif 000038
【００６４】
【表２−４】
2005504548.tif 000039
【００６５】
【表２−５】
2005504548.tif 000040
【００６６】
【表２−６】
2005504548.tif 000041
【００６７】
【表２−７】
2005504548.tif 000042
【００６８】
【表２−８】
2005504548.tif 000043
【００６９】
【表２−９】
2005504548.tif 000044
【００７０】
【表２−１０】
2005504548.tif 000045
【００７１】
【表２−１１】
2005504548.tif 000046
【００７２】
【表２−１２】
2005504548.tif 000047
【００７３】
【表２−１３】
2005504548.tif 000048
【００７４】
【表２−１４】
2005504548.tif 000049
【００７５】
【表２−１５】
2005504548.tif 000050
【００７６】
【表２−１６】
2005504548.tif 000051
【００７７】
【表２−１７】
2005504548.tif 000052
【００７８】
【表２−１８】
2005504548.tif 000053
【００７９】
【表２−１９】
2005504548.tif 000054
【００８０】
【表２−２０】
2005504548.tif 000055
【００８１】
【表２−２１】
2005504548.tif 000056
【００８２】
【表２−２２】
2005504548.tif 000057
【００８３】
【表２−２３】
2005504548.tif 000058
【００８４】
【表２−２４】
2005504548.tif 000059
【００８５】
【表２−２５】
2005504548.tif 000060
【００８６】
【表２−２６】
2005504548.tif 000061
【００８７】
【表２−２７】
2005504548.tif 000062
【００８８】
【表２−２８】
2005504548.tif 000063
【００８９】
【表２−２９】
2005504548.tif 000064
【００９０】
【表２−３０】
2005504548.tif 000065
【００９１】
【表２−３１】
2005504548.tif 000066
【００９２】
【表２−３２】
2005504548.tif 000067
【００９３】
【表２−３３】
2005504548.tif 000068
【００９４】
【表２−３４】
2005504548.tif 000069
【００９５】
【表２−３５】
2005504548.tif 000070
【００９６】
【表２−３６】
2005504548.tif 000071
【００９７】
【表２−３７】
2005504548.tif 000072
【００９８】
【表２−３８】
2005504548.tif 000073
【００９９】
【表２−３９】
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【０１００】
【表２−４０】
2005504548.tif 000075
【０１０１】
【表２−４１】
2005504548.tif 000076
【０１０２】
【表２−４２】
2005504548.tif 000077
【０１０３】
【表２−４３】
2005504548.tif 000078
【０１０４】
【表２−４４】
2005504548.tif 000079
【０１０５】
【表２−４５】
2005504548.tif 000080
【０１０６】
【表２−４６】
2005504548.tif 000081
【０１０７】
【表２−４７】
2005504548.tif 000082
【０１０８】
【表２−４８】
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【０１０９】
【表２−４９】
2005504548.tif 000084
【０１１０】
【表２−５０】
2005504548.tif 000085
【０１１１】
【表２−５１】
2005504548.tif 000086
【０１１２】
【表２−５２】
2005504548.tif 000087
【０１１３】
【表２−５３】
2005504548.tif 000088
【０１１４】
【表２−５４】
2005504548.tif 000089
【０１１５】
【表２−５５】
2005504548.tif 000090
【０１１６】
【表２−５６】
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【０１１７】
【表２−５７】
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【０１１８】
【表２−５８】
2005504548.tif 000093
【０１１９】
【表２−５９】
2005504548.tif 000094
【０１２０】
【表２−６０】
2005504548.tif 000095
【０１２１】
ＡＴＰ結合ポケットの形状は、表１および表２のアミノ酸残基における原子の原子座標によって定義される。表１は、第一の結晶型から決定されるように、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式で、ＡＭＰ−ＰＮＰ分子とともに、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）触媒ドメインの原子座標を列挙する。表２は、第二の結晶型から決定されるように、ＰＤＢ形式で、式ＩＩの阻害剤とともに、ＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）触媒ドメインの２つの独立の分子の原子座標を列挙する。原子座標は、行あたり１つの原子で、コードＡＴＯＭまたはＨＥＴＡＴＭで始まる行に列挙される。コードに続いて：特有の原子番号；原子名；アミノ酸残基名；タンパク質鎖識別子；アミノ酸残基番号；直交オングストローム空間における原子座標ｘ、ｙ、およびｚ；原子占有因子；原子温度因子；鎖識別子；および原子種である。ＡＴＰ類似体ＡＭＰ−ＰＮＰの原子座標は、−ＡＮＰの残基名を持つ。溶媒水分子は、ＨＯＨの残基名を持ち、そして結晶化緩衝液由来のクエン酸塩および結合リン酸塩はＦＲＡの残基名を持つ。阻害剤複合体において、阻害剤分子はＦＲＡの残基名を持つ。
【０１２２】
実験条件の重要でない変動（突然変異体、変異体および相同体などの構築物における変動、結晶化条件、結晶型、分子置換に用いる試験モデルにおける変動などを含む）を伴い、類似の構造決定を行うことによって、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ活性部位結合ポケットの形状を再生することが可能である。異なる実験によって、見かけ上異なる座標が生じうるが、当業者は、分子の重ね合わせによって、同一のタンパク質または類似のタンパク質の見かけ上異なる２セットの座標が同等であることを示しうることを理解するであろう。例えば、表１および表２の座標は、数値的に異なる。しかし、重ね合わせ後、これらは同一の分子を記述していることがわかる。認められている慣行によれば、原子座標は、実験変動のため、特定の限界内で変動可能であることが認識されるであろう。こうした変動には、標準実験誤差（同一の構築物に関して決定される座標は、いくぶん、例えば０．３Å以内で、変動しうる）および他の変動（例えばオーロラ突然変異体、変異体、または相同体の座標）が含まれる。活性部位ＡＴＰ結合部位の座標はまた、異なる小分子阻害剤の導入に際して異なる可能性もあり、この場合、結合部位の柔軟な部分は、阻害剤の種類に特異的な新たなコンホメーションを採用する。例えば、重ね合わせ後、タンパク質の柔軟な部分が、異なる阻害剤の存在に影響を受けた結果、表１のタンパク質座標は、表２のものとわずかに異なることがわかる。これは、新たな部位の生成よりも、活性部位ＡＴＰ結合部位の修飾となる。当業者は、キナーゼ一般が、柔軟な活性部位を有し、そして触媒活性化状態に関連する、生物学的に適切ないくつかのコンホメーションを採用することを認識するであろう。したがって、活性部位ＡＴＰ結合ポケットの形状を、他のキナーゼのものから区別する目的のため、結合ポケットは、阻害剤結合に対する柔軟なタンパク質反応に最も影響を受けないアミノ酸サブセットによって、最適に定義される。したがって、タンパク質は、重ね合わせ後に、セットＢ中の活性部位残基、すなわち、Ａｒｇ１３６、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｖａｌ１４６、Ａｌａ１５９、Ｌｙｓ１６１、Ｌｅｕ１６３、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０９、Ｇｌｕ２１０、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｐｒｏ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０およびＬｅｕ２６２のすべての原子の位またはその同等物が、表１および表２に提供されるこれらのアミノ酸残基の座標の１．０Å二乗平均平方根偏差以内である場合、本明細書に記載するオーロラ活性部位を有すると言える。同等の残基は、表１または表２のアミノ酸配列位の１つに存在するオーロラ突然変異体、変異体、または相同体いずれかのアミノ酸残基であり、残基が同一でない場合、Ｎ、Ｃα、Ｃβ、Ｃ、Ｏ原子のみが、ｒｍｓｄ計算に顕著に含まれうる。特定の変異体または相同体に、同等の残基が存在しない場合、これらを平均距離の計算から省くこともまた、理解される。
【０１２３】
１．０Åの基準は、上述の種類の変動を許容するのに十分大きいが、オーロラキナーゼおよび他のキナーゼの活性部位を区別するのに十分に小さいことを意図する。この基準が妥当であることを表３に例示し、この表は、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡを最も緊密に関連するキナーゼの１つ、ＰＫＡと比較する。
【０１２４】
【表３】
2005504548.tif 000096
【０１２５】
表３：Åで表した、活性部位におけるセットＢアミノ酸のすべての原子間のｒｍｓ偏差。
最上列は、異なるキナーゼ、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の６つのエントリーのＰＤＢコードを指す。太字の数字はオーロラ座標を含有する表１および表２を指す。したがって、オーロラの独立の構造決定を比較する場合（１−２、１−３、２−３）、ｒｍｓｄは１Å未満であり、一方、オーロラをＰＫＡ（６つの独立の構造）に比較する場合、ｒｍｓｄは１Åより大きい。
【０１２６】
したがって、本発明のさらなる側面にしたがって、表１および表２に提供される原子座標または同等の座標によって定義されるような、オーロラ・プロテインキナーゼにおける活性部位ＡＴＰ結合ポケットの形状を提供する。同等の座標は、最も柔軟でない残基のサブセット（セットＢ）が、表１および表２の座標によって定義されるような、オーロラ活性部位ＡＴＰ結合ポケットにおけるものの平均１．０Å以内の原子位を有するものである。
【０１２７】
本発明のさらなる側面にしたがって、特定のオーロラＡ触媒ドメイン構造を用いることによって、オーロラ（オーロラＡ相同体、変異体、突然変異体、および阻害剤複合体を含む）の結晶型の三次元構造を決定するかまたは設計する方法を提供する。オーロラＡ結晶の原子座標を用いて、差フーリエ法または分子置換法によって、第二のオーロラ結晶の構造をモデリングすることが可能である。
【０１２８】
本明細書に記載するオーロラＡキナーゼ触媒ドメインの結晶構造を用いて、他のオーロラキナーゼの三次元構造をモデリングすることが可能である。さらに、代替技術によって収集されるさらなるデータを用いた精密化のため、構造のモデルが利用可能であれば、Ｘ線回折技術に頼らず、そしてしたがってタンパク質の結晶化を必要としない、ＮＭＲ技術などの三次元構造決定の代替法が単純化される。したがって、オーロラＡキナーゼの触媒ドメインの三次元構造の定義は、当業者が、他のオーロラキナーゼの触媒ドメイン構造を決定するのを可能にする。
【０１２９】
オーロラＡキナーゼの触媒ドメインの三次元構造を知れば、タンパク質の作用機構を調べる手段、およびその機能の阻害剤を同定するツールが提供される。オーロラＡキナーゼの触媒ドメインの三次元構造を知れば、オーロラＡキナーゼの活性を阻害する（部分的にまたは完全に）ことが可能な分子を含む、結合可能な分子の設計が可能になる。
【０１３０】
多様な物理化学的特性を有する、本発明のポリペプチドの実例となる結晶型を本明細書に開示する。本発明の好ましい結晶型は、Ｘ線を約３．５Åより優れた分解能に、そしてより好ましくは３．０Åまたはそれより優れた分解能に、そしてさらにより好ましくは２．２Åまたはそれより優れた分解能に回折することが可能であり、そして物質の三次元構造を決定するのに有用である。
【０１３１】
本発明の結晶組成物には、特に、結晶が、付随する表いずれかに示す構造座標によって特徴付けられる、または表に提供されるアミノ酸の主鎖原子に関して、１．５Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標によって特徴付けられる、オーロラキナーゼファミリータンパク質を含んでなるものが含まれる。本発明の結晶組成物にはまた、リスト、原子座標が表１および表２に列挙される、Ａｒｇ１３６、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｌｙｓ１４０、Ｇｌｙ１４１、Ｖａｌ１４６、Ｌｙｓ１６１、Ｌｅｕ１６３、Ｖａｌ１７７、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ１８１、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０９、Ｇｌｕ２１０、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｐｒｏ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０、Ｌｅｕ２６２、Ａｌａ２７２、Ａｓｐ２７３、Ｐｈｅ２７４、Ｇｌｙ２７５、Ｔｒｐ２７６、Ｓｅｒ２７７、Ｖａｌ２７８、およびＨｉｓ２７９に提供されるアミノ酸残基セット（セットＡ）中の原子のｘ、ｙ、ｚ原子座標に定義される結合部位を有することによって特徴付けられるオーロラキナーゼタンパク質を、結晶が含んでなるものも含まれる。さらに、本発明のポリペプチドの結晶型にはまた、結合部位が、表１および表２に提供されるこれらのアミノ酸残基の座標の１．０Å二乗平均平方根偏差以内である、リスト、Ａｒｇ１３６、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｖａｌ１４６、Ａｌａ１５９、Ｌｙｓ１６１、Ｌｅｕ１６３、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０９、Ｇｌｕ２１０、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｐｒｏ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０およびＬｅｕ２６２に提供されるアミノ酸残基セット（セットＢ）中の原子のｘ、ｙ、ｚ原子座標またはその同等物に定義される、オーロラキナーゼファミリータンパク質を、結晶が含んでなるものが含まれる。
【０１３２】
本発明の結晶組成物の構造座標は、三次元形状としての表示のため、あるいは構造座標もしくは該座標が定義する三次元構造のコンピュータ補助操作、または該座標もしくは三次元構造に基づく計算を伴う他の使用のため、コンピュータハードドライブ、ディスケット、ＤＡＴテープなどの、機械読み取り可能記憶媒体上に、機械読み取り可能型で記憶させることが可能である。例えば、オーロラキナーゼファミリーのタンパク質、あるいはこうしたタンパク質の部分または構造的に類似の相同体の三次元構造を定義するデータを、機械読み取り可能記憶媒体に記憶させ、そして典型的には、前記記憶媒体からデータを読み取ることが可能であり、そしてこうしたデータから表現を生成するための命令を含んでプログラミングされたコンピュータを用いて、タンパク質構造の三次元表現として表示することが可能である。本発明はしたがって、表１および表２に示す座標などの、本発明の結晶組成物の構造座標に相当するデータとともに、さらなる所望によるデータおよびこうしたデータを操作するための命令を含有する記憶を有する、コンピュータなどの機械を含む。こうしたデータは、他の関連する構造の解明および薬剤発見などの、多様な目的に使用可能である。
【０１３３】
例えば、第一のデータセットおよび第二のデータセットを用いるための命令を含んでプログラミングされた機械を用いて、第一のセットのこうした機械読み取り可能データを第二のセットの機械読み取り可能データと合わせて、第二のセットの機械読み取り可能データに対応する座標の少なくとも一部を決定することが可能である。例えば、第一のセットのデータは、表１および表２に示すオーロラキナーゼタンパク質の座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含んでなることが可能であり、一方、第二のデータセットは、分子または分子複合体のＸ線回折データを含んでなることが可能である。
【０１３４】
より具体的には、本発明の１つの目的は、オーロラキナーゼファミリーメンバーの新規複合体（例えばＡＴＰ類似体または合成阻害剤などの阻害剤と複合体を形成したもの）、新規オーロラキナーゼファミリーメンバーおよび前述のいずれかの変異体に関する三次元構造情報を提供することである。本発明の結晶組成物またはその一部の構造座標を用いて、例えば分子置換によって、こうしたポリペプチドまたはポリペプチド複合体の結晶型の三次元構造を解くことが可能である。これには、三次元構造を決定しようとしているポリペプチドまたはポリペプチド複合体（例えばＡＴＰ類似体または合成阻害剤などの阻害剤と複合体を形成したもの）の結晶のＸ線回折データを得ることが伴う。提供される構造座標に関して、分子置換技術を用いて、Ｘ線回折データを解析することによって、そのポリペプチドまたは複合体の三次元構造を決定する。例えば、分子置換は、出発点として、既知の構造を有する分子を用いて、未知の結晶試料の構造をモデリングすることが可能である。この技術は、単位格子中、類似の構造、配向および位置を有する２つの分子が、同様に回折するという原則に基づいている。用語「分子置換」は、原子座標が知られている関連分子を配向し、そして配置することによって、原子座標が知られていない結晶の予備モデルを生成することを伴う方法を指す。その後、このモデルから相を計算し、そして観察された振幅と組み合わせて、座標が知られていない構造のおおよそのフーリエ合成を生じる。分子置換は、未知の構造と同じ位置および同じ配向の単位格子中に既知の構造を配置することを伴う。ひとたび配置したら、単位格子中の既知の構造の原子を用いて、仮想上の回折実験から生じるであろう構造因子を計算する。これには、既知の構造と実験データの位置合わせ（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が達成されるまで、６つの寸法（３つの角度寸法および３つの空間寸法）で既知の構造を回転させることが伴う。このおよその構造を精密化し、多様な精密化技術を用いて、より正確で、そしてしばしば、より高い分解能の構造を得ることが可能である。例えば、実験データに定義された構造に関して、生じたモデルを剛体精密化に供することが可能であり、この中で、約５％未満の配置シフトを生じる、６つの寸法において限定されたさらなる回転に、モデルを供する。その後、他の既知の精密化法を用いて、この精密化モデルをさらに精密化することが可能である。
【０１３５】
例えば、分子置換を用いて、表１または表２に示すような座標セットを利用して、ＡＴＰ−ＰＮＰまたは式ＩＩの阻害剤以外のものと複合体を形成したオーロラキナーゼの触媒ドメインの構造を決定することが可能である。
【０１３６】
本発明はまた、オーロラキナーゼの三次元構造を模倣する、オーロラキナーゼＡの相同体などの、オーロラキナーゼ相同体を設計し、そして場合によって、産生することにも関する。該方法は：
（ｉ）オーロラキナーゼ原子の三次元座標を決定し；
（ｉｉ）記憶手段、データ入力手段、画像表示手段を有するコンピュータを提供し、ここで前記記憶手段は、前記記憶手段から座標データを検索し、そして前記画像表示手段上に分子の三次元表現を表示するために動作可能であり、そしてオペレータが選択した、オーロラキナーゼの構造に対する変化に反応して修飾三次元相同体表現を作成し、そして修飾三次元相同体の三次元表現を表示するために動作可能な、三次元分子シミュレーションソフトウェアを含有する；
（ｉｉｉ）オーロラキナーゼ原子の三次元座標データをコンピュータに入力し、そして前記データを記憶手段に記憶させ；
（ｉｖ）オーロラキナーゼの構造における、オペレータが選択した少なくとも１つの変化を、前記コンピュータのデータ入力手段に入力し；
（ｖ）前記分子シミュレーションソフトウェアを実行して、相同体構造の修飾三次元分子表現を作成し；
（ｖｉ）前記画像表示手段上に、相同体の三次元表現を表示し、それによって、構造上の変化から生じるオーロラキナーゼの三次元構造における変化を視覚的に監視可能であり；
（ｖｉｉ）工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）を反復して、多数の相同体を作成し；そして
（ｉｘ）三次元表現によって表現される相同体構造を選択する、ここで、キナーゼ触媒ドメインの三次元立体配置および空間的配置が実質的に保存されたままであり、それによって、オーロラキナーゼの三次元構造を模倣するオーロラキナーゼ相同体を作成する
ことを含んでなる。
【０１３７】
本発明はまた、オーロラキナーゼＡの調節剤などのオーロラキナーゼの調節剤（特に阻害剤）を作成する方法にも関する。該方法は、オーロラキナーゼの活性部位ＡＴＰ結合ポケットであって、（ａ）原子座標が表１および表２に列挙される、Ａｒｇ１３６、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｌｙｓ１４０、Ｇｌｙ１４１、Ｖａｌ１４６、Ｌｙｓ１６１、Ｌｅｕ１６３、Ｖａｌ１７７、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ１８１、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０９、Ｇｌｕ２１０、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｐｒｏ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０、Ｌｅｕ２６２、Ａｌａ２７２、Ａｓｐ２７３、Ｐｈｅ２７４、Ｇｌｙ２７５、Ｔｒｐ２７６、Ｓｅｒ２７７、Ｖａｌ２７８、およびＨｉｓ２７９、あるいは（ｂ）各々表１および表２に記載されるような座標を有する、リスト、Ａｒｇ１３６、Ｌｅｕ１３８、Ｇｌｙ１３９、Ｖａｌ１４６、Ａｌａ１５９、Ｌｙｓ１６１、Ｌｅｕ１６３、Ｉｌｅ１８３、Ｇｌｎ１８４、Ｌｅｕ１９３、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０９、Ｇｌｕ２１０、Ｔｙｒ２１１、Ａｌａ２１２、Ｐｒｏ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｔｈｒ２１６、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｕ２５９、Ａｓｎ２６０およびＬｅｕ２６２に提供されるアミノ酸残基セット（セットＢ）中の原子のｘ、ｙ、ｚ座標によって定義される、前記ＡＴＰ結合ポケットに適合する化合物または分子を同定するか、あるいはこうした化合物または分子を設計し、それによってオーロラキナーゼの調節剤を作成することを含んでなる。
【０１３８】
本発明の別の目的は、相同性モデリング技術および本発明の組成物の構造座標を用いて、オーロラキナーゼタンパク質の触媒ドメイン、または阻害剤と複合体を形成したオーロラキナーゼタンパク質の触媒ドメインの三次元構造を決定する方法を提供することである。相同性モデリングは、１以上の関連するタンパク質、タンパク質ドメインおよび／またはサブドメインの構造座標を用いて、未知の構造のモデルを構築することを伴う。三次元構造を解こうとするタンパク質またはペプチドの共通の部分または相同な部分を、相同構造要素の三次元構造に適合させることによって、相同性モデリングを行うことが可能である。このアプローチを用いて、解こうとする関連構造のものでのアミノ酸（または他の構成要素）置換を用いて、三次元構造の一部またはすべてを再構築することが可能である。例えば、ＡＭＰ−ＰＮＰまたは式ＩＩの阻害剤と複合体を形成したオーロラキナーゼの触媒ドメインの構造座標を用い、相同性モデリングの使用を通じて、別のオーロラキナーゼタンパク質の触媒ドメインの三次元構造を決定することが可能である。表１〜２のオーロラキナーゼ座標と同様の方式で、これらの座標を記憶させ、表示し、操作し、そして別の方式で使用することが可能である。
【０１３９】
したがって、本発明の結晶組成物は、他のオーロラキナーゼポリペプチドの三次元構造を解く際に使用するための出発材料を提供する。
さらなる例として、機械読み取り可能データによって定義される構造を、多様な化学的実体と会合する能力に関して、コンピュータで評価することが可能である。用語「化学的実体」は本明細書において、化学的化合物、少なくとも２つの化学的化合物の複合体、およびこうした化合物または複合体の断片を指す。
【０１４０】
例えば、化学的実体または部分がオーロラキナーゼファミリータンパク質あるいはその一部または複合体と会合する能力および／またはこうした会合の位置および／または配向を評価する命令を含んでプログラミングされた機械を用いて、オーロラキナーゼファミリータンパク質あるいはその一部または複合体の三次元構造を定義する機械読み取り可能データの第一のセットを、目的の化学的実体または部分の構造を定義する機械読み取り可能データの第二のセットと組み合わせる。こうした方法は、オーロラキナーゼファミリータンパク質とこうした化学的実体の会合の位置、配向およびエネルギー特性への洞察を提供する。オーロラキナーゼと会合するかまたは相互作用する化学的実体は、該タンパク質の天然存在リガンドとの相互作用を阻害する可能性があり、そしてこうした相互作用に仲介される生物学的機能を阻害する可能性がある。こうした化学的実体は薬剤候補である。
【０１４１】
データにコードされるタンパク質構造は、該構造の視覚的検査とともに該構造と化学的実体との会合の視覚的検査を可能にする、図式的形式で表示可能である。あるいは、より定量的な方法または計算的な方法が使用可能である。例えば、化学的実体が本明細書に示す分子または分子複合体のいずれかと会合する能力を評価するための本発明の１つの方法は：ａ）計算的手段を使用して、化学的実体および分子または分子複合体の結合ポケットまたは他の表面特徴の間の適合動作を行い；そしてｂ）適合動作の結果を解析して、化学的実体および結合ポケット間の会合を定量化する工程を含んでなる。
【０１４２】
本発明は、触媒ドメイン内または触媒ドメインに隣接するなど、三次元構造内の、システイン残基などの反応性アミノ酸を同定するため；水アクセス可能表面またはすべての原子の空間充填ファンデルワールス表面を含んでなる表面などの分子表面を生成するかまたは視覚化するため；タンパク質または複合体の表面特徴、例えばリガンド結合ポケットの大きさおよび形状を計算し、そして視覚化するため；三次元構造内、好ましくはリガンド結合部位内または該部位に隣接した、推定上のＨ結合ドナーおよびアクセプターを位置決定するため；三次元構造内、好ましくはリガンド結合部位内または該部位に隣接した、疎水性および親水性領域を計算するため；そして選択した目的の官能基（例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、メチレン、アルキル、アルケニル、芳香族炭素、芳香環、芳香族複素環、置換および非置換ホスフェート、置換および非置換ホスホネート、置換および非置換フルオロ、並びにジフルオロホスホネートなど）に関して、好ましい相互作用エネルギーのタンパク質表面上の領域または該表面に隣接した領域を計算し、そして視覚化するための、本発明の結晶組成物またはその一部の構造座標の使用をさらに提供する。タンパク質および該タンパク質と潜在的なリガンドの部分との相互作用を特徴付けるため前述のアプローチを用いて、反応性アミノ酸（例えばシステイン）に特異的に共有結合可能な化合物を設計するかまたは選択し、そしてタンパク質の表面特徴に対して、相補的特性（例えば大きさ、形状、電荷、疎水性／親水性、水素結合に関与する能力など）を持つ化合物を設計するかまたは選択することが可能であり、こうした表面特徴のセットはあらかじめ選択しておくことが可能である。構造座標を用いて、複合体を形成した状態のタンパク質への既定のリガンドの配向、結合定数または相対親和性を予測するかまたは計算することも可能であり、そして改善された親和性を持つ化合物を設計するかまたは選択するのにこの情報を使用することも可能である。
【０１４３】
こうした場合、オーロラキナーゼファミリータンパク質あるいはその一部または複合体の構造座標を、機械読み取り可能型で、望ましい動作を行うための命令を含んでプログラミングされ、そして必要なさらなるデータ（例えば潜在的なリガンドまたはその部分の構造的および／または機能的特性を定義するデータ、多様なアミノ酸の分子特性を定義するデータ）をいずれも含有する機械に入力する。
【０１４４】
本発明の１つの方法は、オーロラキナーゼファミリータンパク質（例えばオーロラキナーゼファミリータンパク質またはその一部の三次元構造を定義する座標）に結合可能な分子化合物を、化学構造のデータベースから選択することを提供する。オーロラＡキナーゼ触媒ドメインの結晶型の三次元構造と関連する点（構造座標）は、１以上の官能基との相互作用の好ましさに関して特徴付けられる。その後、先の性質決定に基づいて、タンパク質との好ましい相互作用のため配置される、１以上の官能基を含有する候補化合物に関して、化学構造のデータベースを検索する。こうして、三次元構造との好ましい相互作用の点に最適に適合する構造を有する化合物を同定する。
【０１４５】
こうした検索がコンピュータの補助で行われることは、必要ではないが、しばしば、好ましい。この場合、官能基（類）およびタンパク質の原子間の好ましい相互作用に好ましい位置を同定するための命令を含んでプログラミングされた機械を用いて、オーロラキナーゼファミリータンパク質、あるいはその一部または複合体の三次元構造を定義する第一のセットの機械読み取り可能データを、目的の１以上の部分または官能基を定義する第二のセットの機械読み取り可能データと合わせる。タンパク質および官能基（類）間の好ましい相互作用の位置（単数または複数）を定義する、第三のセットのデータを生成する。その後、タンパク質とのそれぞれの好ましい相互作用の位置に最適に適合する官能基を含有する化学的実体を同定するための命令を含んでプログラミングされた機械を用いて、第三のセットのデータを、１以上の化学的実体の三次元構造を定義する第四のセットのデータと合わせる。
【０１４６】
前述の手段いずれかによって選択されるかまたは設計される構造の化合物が、オーロラキナーゼファミリータンパク質に結合し、その天然または非天然リガンドにオーロラキナーゼファミリータンパク質が結合するのを阻害し、そして／またはオーロラキナーゼファミリーメンバーに仲介される生物学的機能を阻害する能力に関して試験可能である。
【０１４７】
新規結晶は、オーロラの相同体、変異体、突然変異体、または阻害剤複合体の結晶であることが可能である。新規結晶モデル中のオーロラ活性部位結合ポケットの形状は、第一のものの形状と同等の形状である。元来のオーロラＡ結晶の活性部位結合ポケットは、表１および表２に提供するような、セットＡのアミノ酸残基およびその原子座標によって定義される。同等の形状は、最も柔軟でないアミノ酸残基のサブセット（セットＢ）の重ね合わせに際して、１Å未満のｒｍｓｄを有すると定義される。
【０１４８】
したがって、本発明は、オーロラＡ結晶の座標（表１および表２）を用い、差フーリエ法または分子置換法によって、オーロラの結晶型の三次元構造を決定するかまたは設計して、活性部位ＡＴＰ結合領域が第一の結晶におけるものと同等であるように、新規オーロラ結晶の構造をモデリングする、方法を提供する。該方法は、以下のように実行可能である。オーロラタンパク質（野生型、突然変異体、変異体または相同体）を精製し、そして純粋なタンパク質として、または阻害剤化合物と複合体を形成した状態で結晶化する。この結晶は、表１および表２に定義する結晶構造の１つと同一の結晶型（同じタンパク質パッキング）を有する可能性があるし、または異なる結晶型（異なるタンパク質パッキング）を有する可能性がある。結晶の回折測定を行い、そして表１または表２の原子座標（または同等の座標）を用いることにより、差フーリエ（同じパッキング）または分子置換（異なるパッキング）の既知の方法によって、結晶の構造を解くことが可能である。本発明は、新規結晶いずれかにおける活性部位ＡＴＰ結合ポケットの薬剤設計における使用を含み、これは、このポケットが元来の結晶におけるものと同等であろうためである。
【０１４９】
本発明は、上述の方法によって設計されるオーロラＡタンパク質（相同体、変異体および突然変異体を含む）をさらに提供する。オーロラＡタンパク質は、野生型オーロラＡと同一の特性を有する可能性があるし、または野生型オーロラＡと比較して、１以上の異なる特性を有する可能性がある。
【０１５０】
本発明のさらなる側面にしたがって、オーロラＡ触媒ドメイン構造（相同体、変異体、突然変異体、および阻害剤複合体のものを含む）および活性部位ＡＴＰ結合ポケットの形状（または先に定義されたのと同等の形状）を用いることによって、オーロラの化学的調節剤（好ましくは阻害剤）を選択するかまたは設計する方法を提供する。ＡＭＰ−ＰＮＰ分子の三次元原子座標およびオーロラＡ触媒ドメインの三次元原子座標に関連した空間的配向からの情報を、オーロラ調節剤（好ましくは阻害剤）を設計するツールとして用いる。さらに、式ＩＩの阻害剤分子の三次元原子座標およびオーロラＡ触媒ドメインの三次元原子座標に関連した空間的配向からの情報を、オーロラ調節剤（好ましくは阻害剤）を設計するツールとして用いる。活性部位結合ポケットの形状に適合する、オーロラの小分子調節剤を選択するかまたは設計することが可能である。
【０１５１】
オーロラＡおよびＰＫＡなどの他のキナーゼ間の基質特異性の相異を説明する構造的決定要因を知れば、オーロラＡ酵素の非常に特異的な調節剤を設計する基礎が提供される。オーロラおよび他のキナーゼ間のＡＴＰ結合ポケット（ＡＴＰポケット中の残基の原子座標の相異によって定義される）を用いて、選択的オーロラＡ調節剤を設計することが可能である。
【０１５２】
本発明のさらなる側面にしたがって、オーロラ活性に影響を及ぼす小分子調節剤による相互作用のための他のポケットを位置決定するための、オーロラＡ触媒ドメインの座標（表１および表２）の使用を請求する。こうしたポケットは、活性部位ＡＴＰ結合ポケットと重複していることが可能であり、または完全に独立であることが可能である。オーロラＡキナーゼの三次元構造は、活性部位ＡＴＰ結合ポケットに対する調節剤相互作用の代替物を提供するこうしたポケットいずれかの発見の際、必須のツールである。
【０１５３】
上述のように、オーロラの作用を調節する（好ましくは阻害する）薬剤の合理的設計に、オーロラＡ結晶構造を使用可能である。これらのオーロラ調節剤を用いて、不適切なオーロラ活性の身体的および薬理学的に望ましくない結果を防止するかまたは治療することが可能である。
【０１５４】
本発明は、ここで、以下の限定されない実施例に関連して、記載されるであろう。
用語の定義
説明（実施例を含む）において、以下の用語を用いる：
用語「原子座標」は、結晶を照射するＸ線の単色ビームから得た回折パターンに関連して、数学的方程式から得たすべての原子の位置に対応する数学的座標を指す。回折データを用いて、結晶の反復単位の電子密度マップを計算する。電子密度マップを用いて、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確立する。当業者は、Ｘ線結晶学によって決定する原子座標セットが標準誤差または実験変動を伴わないわけではないことを理解する。
【０１５５】
用語「単位格子」は、結晶の全体積が構築可能な基本的なビルディングブロックを指す。
用語「空間群」は、単位格子内の対称要素の配置を指す。
【０１５６】
用語「分子置換」は、原子座標が知られている関連分子を配向し、そして配置することによって、原子座標が知られていない結晶の予備モデルを生成することを伴う方法を指す。その後、このモデルから相を計算し、そして観察された振幅と組み合わせて、座標が知られていない構造のおおよそのフーリエ合成を生じる。
【０１５７】
（実施例１）
オーロラＡのキナーゼ触媒ドメインの産生
分子生物学：
オーロラＡの三次元（３次）構造を決定するのに利用可能なポリペプチド（またはタンパク質）を得るため、総遺伝子合成によって、またはクローニングによって、オーロラＡをコードするＤＮＡを得ることが可能である。その後、適切な発現系において、このＤＮＡを発現させ、ポリペプチドを得て、その三次元構造を決定する技術に供することが可能である。
【０１５８】
この場合、アミノ酸２８７（最初のメチオニンの直後の最初のアミノ酸をアミノ酸番号１とする）のスレオニンからアスパラギン酸（１文字アミノ酸暗号を用いるとＴからＤ）への突然変異をコードする、人工的に誘導した突然変異（遺伝子のオープンリーディングフレーム中の最初のＡＴＧのＡを＋１として、ヌクレオチド８６２〜８６４のＧＡＴからＡＣＴ）を所持するヒト・オーロラＡ遺伝子が、これらの研究に用いた発現構築物の基礎をなした。この［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ突然変異体は、Ｊｉｍ  Ｂｉｓｃｈｏｆｆ博士、ＳＵＧＥＮ  Ｉｎｃ．から贈与された。大腸菌で発現させた全長［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡタンパク質は、ほぼ不溶性であり、そして精製に際して凝集するため、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）突然変異体を生成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡのアミノ酸９４〜停止コドンをコードする領域を増幅した。５’ＰＣＲプライマー（５’ＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣ３’；配列番号１）は、スペーサー領域（制限エンドヌクレアーゼによる効率的な切断を可能にする）、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列および塩基２８３〜３０１に対応する配列を含んだ。３’プライマー（５’ＴＧＡＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＧＡＴＴＣ３’；配列番号２）は、スペーサー領域、ＢａｍＨＩ認識配列および停止コドンを含むオーロラＡの３’端（塩基１１８９〜１２１２）配列を含んだ。ＰＣＲ産物を精製し、そして製造者の指示にしたがって、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＡＭＰクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品番号２１１１８８）を用い、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）配列を所持するｐＣＲ−ＳｃｒｐｉｔベクターをＢａｍＨ１で消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動によって分離して、そして［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）配列に対応するＤＮＡ断片を切り出し、そしてＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋキット（Ｑｉａｇｅｎ製品番号２８７０４）を用いて精製した。その後、あらかじめＢａｍＨ１で切断しておいたベクターｐＴＢ３７５ＮＢＳＥに、この断片を連結した。（組換えＤＮＡ分子の組み立て法の詳細は、標準的な教科書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓおよびＡｕｓｕｂｅｌら  １９９９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃに見出すことが可能である）。ｐＴＢ３７５ＮＢＳＥベクターは、ｐＢＲ３２２の可動性（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）マイナス誘導体であるｐＡＴ１５３由来である。挿入された遺伝子は、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にあり、そしてしたがって大腸菌における効率的な転写のためには、ｔｒａｎｓでＴ７ポリメラーゼが発現される必要がある。該プラスミドは、選択のため、テトラサイクリン耐性��コードする。
【０１５９】
連結反応物でＴＯＰ１０コンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号Ｃ４０４０−１０）をトランスフェクションし、そしてテトラサイクリンを含有する培地上で増殖する能力によって、ｐＴＢ３７５ＮＢＳＥ組換えベクターを所持する大腸菌を同定した。これらの細菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、そして制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１での消化に供して、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）配列を所持するものを同定した。その後、タンパク質発現の前に、ジデオキシ鎖終結ＤＮＡ配列決定によって、挿入物の同一性を確認した。
【０１６０】
ｐＴＢ３７５ＮＢＳＥはＴ７プロモーターの３’に開始コドン（ＡＴＧ）を所持し、そしてまた、ＢａｍＨ１制限エンドヌクレアーゼ認識部位までで、そして該認識部位を含む、以下の配列も所持する：
【０１６１】
【化３】
2005504548.tif 000097
【０１６２】
開始コドンと「インフレーム」でＢａｍＨ１部位に挿入される配列は、したがって、以下のＮ末端融合を含む融合タンパク質として発現されるであろう：
【０１６３】
【化４】
2005504548.tif 000098
【０１６４】
タンパク質への６ヒスチジンの融合は、通常、ニッケルなどの金属イオンに対する親和性によって、タンパク質を精製するための「タグ」を提供するために一般に用いられる。アミノ酸９４〜４０２をコードする［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ配列をＢａｍＨ１部位に挿入したため、該プラスミドは、以下のタンパク質（標準的一文字アミノ酸暗号を用いる）をコードする：
【０１６５】
【化５】
2005504548.tif 000099
【０１６６】
該タンパク質は、本文中、ＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）と称されるであろう。
限定タンパク質分解研究（実施例１中に後述）に基づいて、オーロラＡタンパク質の２つのさらなる一部切除突然変異体型もまた、生成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡのアミノ酸１１３〜４００および１２２〜４００をコードする領域を増幅した。５’ＰＣＲプライマー（［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡの１１３〜４００用の５’ＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＧ３’または［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡの１２２〜４００用の５’ＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＧＣ３’）はＮｄｅ１制限エンドヌクレアーゼ認識配列を所持した。どちらの構築物にも単一の３’プライマー（５’ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧ３’）を用いて、そして該プライマーはＢａｍＨ１認識配列、および停止コドン後のオーロラＡ配列の３’端を所持する。ＰＣＲ産物を精製し、そして製造者の指示にしたがって、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＡＭＰクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品番号２１１１８８）を用い、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、そして大腸菌株ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号１８２５８−０１２）にトランスフェクションした。ｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔベクタークローニング部位のどちらかの側に特異的にハイブリダイズするプライマーＴ３（５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ３’）およびＴ７ｐｒｏ（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’）を用いた、コロニーＰＣＲスクリーニングによって、組換えｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１１３〜４００）またはｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を含有する大腸菌コロニーを同定した。［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１１３〜４００）または［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）配列を所持するｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクターを大腸菌から調製し、そしてＮｄｅ１およびＢａｍＨ１で消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１１３〜４００）または［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を含有する断片を、Ｎｄｅ１およびＢａｍＨ１制限部位の間で、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ製品番号６９８６４−３）に連結した。６ヒスチジンタグをコードする配列、その後のトロンビンプロテアーゼ切断部位をコードする配列とインフレームで、挿入された遺伝子をクローニングした（完全な説明に関しては以下を参照されたい）。挿入された遺伝子は、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にあり、そしてしたがって大腸菌における効率的な転写のためには、ｔｒａｎｓでＴ７ポリメラーゼが発現される必要がある。該プラスミドは、選択のため、カナマイシン耐性をコードする。
【０１６７】
連結反応物でＤＨ５αコンピテント大腸菌をトランスフェクションし、そしてカナマイシンを含有する培地上で増殖する能力によって、ｐＥＴ２８ａ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１１３〜４００）またはｐＥＴ２８ａ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）組換えベクターを所持する細菌を同定した。これらの細菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、そして制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ１およびＢａｍＨＩでの消化に供して、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１１３〜４００）または［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）配列を所持するものを同定した。その後、タンパク質発現の前に、ジデオキシ鎖終結ＤＮＡ配列決定によって、挿入物の同一性を確認した。
【０１６８】
ｐＥＴ２８ａはＴ７プロモーターの３’に開始コドン（ＡＴＧ）を所持し、そしてまた、Ｎｄｅ１制限エンドヌクレアーゼ認識部位までで、そして該認識部位を含む、以下の配列も所持する：
【０１６９】
【化６】
2005504548.tif 000100
【０１７０】
開始コドンと「インフレーム」でＮｄｅ１部位に挿入される配列は、したがって、以下のＮ末端融合を含む融合タンパク質として発現されるであろう（標準的１文字アミノ酸暗号を用いる）：
【０１７１】
【化７】
2005504548.tif 000101
【０１７２】
タンパク質への６ヒスチジンの融合は、通常、ニッケルなどの金属イオンに対する親和性によって、タンパク質を精製するための「タグ」を提供するために一般に用いられる。モチーフ「ＬＶＰＲＧＳ」は、タンパク質をトロンビンとインキュベーションした後、配列「ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲ」のタンパク質分解除去を可能にする特異的トロンビンプロテアーゼ切断部位に対応する。アミノ酸１１３〜４００および１２２〜４００をコードする［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ配列をＮｄｅ１部位に挿入したため、該プラスミドは、以下のタンパク質（標準的一文字アミノ酸暗号を用いる）をコードする：
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１１３〜４００）
【０１７３】
【化８】
2005504548.tif 000102
【０１７４】
このタンパク質は、本文中、ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１１３〜４００）と称されるであろう。
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）
【０１７５】
【化９】
2005504548.tif 000103
【０１７６】
このタンパク質は、本文中、ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）と称されるであろう。
【０１７７】
タンパク質発現
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）配列を所持するｐＴＢ３７５ＮＢＳＥで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（遺伝子型：Ｂ  Ｆ−  ｄｃｍ  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ（ｒＢ-  ｍＢ-）ｇａｌλ（ＤＥ３）［ｐＬｙｓＳ  Ｃａｍｒ］）をトランスフェクションした。この株を震蘯フラスコ中、３０℃で１６時間（テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地）、ＯＤ５５０ｎｍが〜５まで増殖させた。この培養物を、２０ｌ発酵槽（Ｂ．  Ｂｒａｕｎ、ドイツ・メルスンゲン）中、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有する高バイオマス培地に接種した。溶解酸素圧を５０％空気飽和に維持して、３０℃、ｐＨ６．７で、流加培養中、好気的に細胞を増殖させた。６Ｈｉｓ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）の発現を、接種１２時間後（ＯＤ５５０ｎｍが〜１３）に、０．４０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、そして３．０時間後（ＯＤ５５０ｎｍが〜３３）にバッチ遠心分離（７，０００ｘｇ、４℃で３０分間）によって細胞を採取した。
【０１７８】
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）配列を所持するｐＥＴ２８ａで大腸菌ＤＳ４１０（ＤＥ３）（元来の小細胞産生株Ｐ６７８−５４の誘導体）をトランスフェクションした。この株を震蘯フラスコ中、３７℃で３０時間（カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＭ９グルコース培地）、ＯＤ５５０ｎｍが〜１．４まで増殖させた。この培養物を、２０ｌ発酵槽（Ｂ．  Ｂｒａｕｎ、ドイツ・メルスンゲン）中、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有する高バイオマス培地に接種した。溶解酸素圧を５０％空気飽和に維持して、３０℃、ｐＨ６．７で、流加培養中、好気的に細胞を増殖させた。ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）の発現を、接種１６時間後（ＯＤ５５０ｎｍが〜１９）に、０．１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、そして２３時間後（ＯＤ５５０ｎｍが〜２６）にバッチ遠心分離（７，０００ｘｇ、４℃で３０分間）によって細胞を採取した。
【０１７９】
キナーゼドメイン断片の定義
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー後、サイズ排除クロマトグラフィーによって、大腸菌細胞ペーストからＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）を精製した。このタンパク質の溶液特性は、構造研究に好ましくないことが見出された。ＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）の限定タンパク質分解を用いて、優れた溶液特性を持つオーロラＡキナーゼドメインの断片を同定した。ＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）のアリコットを、トリプシン、サーモリシンまたはエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｖ８）でのタンパク質分解消化に供した。クーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）およびＮ末端配列決定を用いた解析によって、タンパク質断片を同定した。切断および精製は、以下に詳細に記載するように、結晶化のため、適切な量の［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）を産生するのに十分な規模で行った。オーロラＡのこれらの断片の性質決定を用いて、ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を含む、さらなる構築物を設計した。ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を生成するのに用いた分子生物学法を実施例１の分子生物学セクションに記載する。
【０１８０】
ＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）を含有する大腸菌の溶解
別に言及しない限り、４℃で以下の方法を行った。Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＰＴ６０００ホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＧＭＢＨ、スイス・バーゼル）を用いて、１．０ｌの溶解緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭベンズアミジン、ｐＨ７．４）に、大腸菌細胞ペースト（２００ｇ）を再懸濁した。Ａｖｅｓｔｉｎ  ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  nＣ５（Ａｖｅｓｔｉｎ，  Ｉｎｃ．、カナダ・オタワ）を用い、１０，０００ｐｓｉの平均圧で単回通過させて、細胞を溶解した。生じた溶解物を１７，０００ｘｇ（平均）で９０分間遠心分離した後、上清を吸引し、そしてペレットを廃棄した。
【０１８１】
ＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）を含有する大腸菌の溶解
別に言及しない限り、４℃で以下の方法を行った。Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＰＴ６０００ホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＧＭＢＨ、スイス・バーゼル）を用いて、１．０ｌの溶解緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭベンズアミジン、ｐＨ７．４）に、大腸菌細胞ペースト（２００ｇ）を再懸濁した。Ａｖｅｓｔｉｎ  ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  nＣ５（Ａｖｅｓｔｉｎ，  Ｉｎｃ．、カナダ・オタワ）を用い、１０，０００ｐｓｉの平均圧で単回通過させて、細胞を溶解した。生じた溶解物を１７，０００ｘｇ（平均）で９０分間遠心分離した後、上清を吸引し、そしてペレットを廃棄した。
【０１８２】
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）の調製
別に言及しない限り、４℃で以下の方法を行った。２５ｍｌ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ  ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ  ＧＭＢＨ、ドイツ・ヒルデン）を充填した２６ｍｍ直径のクロマトグラフィーカラムを１０カラム体積の溶解緩衝液で平衡化した後、該カラム上に、０．９ｍｌ／分の流速で、ＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）を含有する溶解物上清を装填した。２．０ｍｌ／分の流速を用いて、１０カラム体積の洗浄緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）でカラムを洗浄して、弱く結合したか、または非特異的に結合した不純物を取り除いた。２．０ｍｌ／分で溶出緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）を用いて、結合したタンパク質の溶出を達成した。溶出した成分を第二のクロマトグラフィーカラム（あらかじめ１０カラム体積の洗浄緩衝液で平衡化しておいた、２６ｍｍ直径、２５ｍｌのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、スウェーデン・ウプサラ））に流した。１０．０ｍｌの分画を収集し、そしてクーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって解析した後、有意な量のＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）を含有する分画をプールした。この段階で、プール（およそ２００ｍｌ）を、密封容器中、４℃で７日間まで保存した。
【０１８３】
この段階以後、別に言及しない限り、室温ですべての方法を行った。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００プレパックサイズ排除カラムを流出緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中で平衡化した。カラムからは流速１．０ｍｌ／分で流出させた。ＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）プールの１０ｍｌ試料を遠心分離（３１，０００ｘｇ、４℃、６０分間）し、そしてカラム上に装填した。クーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分画（２．０ｍｌ）を解析し、そしてＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）を含有するものをプールした。
【０１８４】
サイズ排除クロマトグラフィーで精製した、濃度１ｍｇ／ｍｌのＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）のプールに対して、室温で限定タンパク質分解を行った。１部分のプロテアーゼに対して１００部分のＭＧ−６Ｈｉｓ−ＧＳ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（９４〜４０２）の質量比を用いて、黄色ブドウ球菌Ｖ８由来のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＵＫ、英国サセックス州ルイス）をプールに添加した。タンパク質分解を３〜７時間の間、連続させた。
【０１８５】
クロマトグラフィーカラムに、それぞれ９：１  ｖ／ｖの比で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｒｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲおよびＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能の混合物を充填した（「Ｓ−１００／Ｑカラム」と称する）。カラム体積は１３０ｍｌであった。流速１．０ｍｌ／分でＳ−１００／Ｑ流出緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール）中で平衡化し、そして流出させた。タンパク質分解プールの試料（８ｍｌ）をＳ−１００／Ｑカラム上に装填して、そして２．０ｍｌの分画を収集した。クーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分画を解析し、そして有意な量の純粋な［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）を含有するものをプールした。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣと組み合わせたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国マンチェスター州）を用いたＬＣ−ＥＳＭＳによって、プール試料を解析した。プールのさらなる試料をＮ末端配列決定に供した。切断されたタンパク質の同一性が、［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）と確認されたら、結晶化に供した。
【０１８６】
ＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）の調製
別に言及しない限り、４℃で以下の方法を行った。１５ｍｌ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ  ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ  ＧＭＢＨ、ドイツ・ヒルデン）を充填した２６ｍｍ直径のクロマトグラフィーカラムを１０カラム体積の溶解緩衝液で平衡化した後、該カラム上に、１．０ｍｌ／分の流速で、ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を含有する溶解物上清を装填した。２．０ｍｌ／分の流速を用いて、７カラム体積の洗浄緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）でカラムを洗浄して、弱く結合したか、または非特異的に結合した不純物を取り除いた。２．０ｍｌ／分で溶出緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４００ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）を用いて、結合したタンパク質の溶出を達成した。１０．０ｍｌの分画を収集し、そしてクーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって解析した後、有意な量のＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を含有する分画をプールした。
【０１８７】
精製のこの段階以後、別に言及しない限り、室温ですべての方法を行った。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０高速脱塩プレパックカラムを流出緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭメルカプトエタノール）中で平衡化した。カラムからは流速３．０ｍｌ／分で流出させた。ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）プールの１０ｍｌ試料をろ過（０．２２μｍ）し、そしてカラム上に装填した。分画を収集し、そして最も濃縮された量のＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を含有するものをプールした。
【０１８８】
１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製ＭＧＳＳ−６Ｈｉｓ−ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）の５０ｍｇ（＋／−２０％）のプールに、ウシ・トロンビン（５００単位、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加した。特異的タンパク質分解切断を４℃で完了するまで進行させて、一部切除突然変異体ＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を産生した。
【０１８９】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００プレパックサイズ排除カラムを流出緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール）中で平衡化した。カラムからは流速１．０ｍｌ／分で流出させた。ＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）プールの１０ｍｌ試料をろ過（０．２２μｍ）し、そしてカラム上に装填した。クーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分画（２．０ｍｌ）を解析し、そしてＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）を含有するものをプールし、そして結晶化に供した。
【０１９０】
解析
ＳＤＳ  ＰＡＧＥには、２−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中ですべての試料を希釈し、２分間煮沸し、そして８〜１６％勾配の１．５ｍｍ厚ｘ１０ウェルＮＯＶＥＸゲル（ＮＯＶＥＸ、カリフォルニア州サンディエゴ）上に装填した。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色した。ＰＴＨアミノ酸のオンライン検出を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ４７７Ａペプチド配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）上で、エドマン分解を行った。エレクトロスプレー供給源（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国マンチェスター州）およびオンラインＷａｔｅｒｓ  ２７９０  Ａｌｌｉａｎｃｅ搬送系（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）を備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴを用いて、マススペクトルを得た。ＭｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、２．７％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μ  Ｃ５  ３００＿１５０ｘ２．００ｍｍ逆相カラムに、タンパク質を直接装填し、そして流速８０μｌ／分で３０分間に渡って２．７％〜９０％アセトニトリル勾配で展開した。溶出したタンパク質の分画（およそ２５％）を質量分析計に通過させた。
【０１９１】
（実施例２）
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ触媒ドメイン構築物の結晶化
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）：ＡＭＰＰＮＰ複合体をハンギングドロップ蒸気拡散法によって１５℃で結晶化した。タンパク質［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）を〜１０ｍｇ／ｍｌ溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中）に濃縮し、その後、５ｍＭ  ＡＭＰ−ＰＮＰをこの溶液に添加して、そして複合体を氷上で３０分間インキュベーションした。結晶化試験をセットアップする前に、この複合体溶液を１０分間微量遠心分離した。ドロップは、複合体溶液およびリザーバー緩衝液（０．２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．６Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液ｐＨ３．８）の１：１体積混合物を含有し、最終ドロップ体積４μｌを生じた。［Ｔ２８７Ｄ］オーロラ（１２２〜３９６）−ＡＭＰ−ＰＮＰ結晶は、空間群Ｐ３２２１に属し、単位格子寸法は、ａ＝ｂ＝８６．５５Å、ｃ＝７８．３４Å、およびα＝β＝９０°、γ＝１２０°であり、そして非対称単位あたり、１つの複合体分子を含有する。データ収集前に、０．２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．６Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ  リン酸クエン酸ｐＨ３．８、３０％グリセロールを含有する凍結緩衝液に結晶を簡単に（約２０秒間）移した後、窒素ガス流中で１００Ｋに冷却した。
【０１９２】
式ＩＩの化学的に合成した阻害剤を含むＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）複合体を以下のように結晶化した。式ＩＩの化合物の調製は、特許公報第ＷＯ  ０１／２１５９７号、公開日０１年３月２９日（出願番号ＰＣＴ／ＧＢ００／０３５９３号、国際出願日００年９月１９日）の実施例１９に記載される。１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質（ＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００））、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有する溶液に５ｍＭの化合物を添加した。タンパク質複合体溶液、並びに２２％ＰＥＧ４０００および０．２Ｍ硫酸アンモニウムを含有するリザーバー溶液を１：１体積で混合することによって、ドロップを形成した。１５℃でハンギングドロップ蒸気拡散法によって結晶化を達成した。キャピラリー中にマウントした結晶から、室温でデータを収集した。結晶をＸ線ビーム中で平行移動させて（ｔｒａｎｓｌａｔｅ）多数の曝露を可能にしうる。オーロラＡ阻害剤結晶は、空間群Ｐ２１で、単位格子寸法ａ＝５２．６、ｂ＝８８．４、ｃ＝６７．８Å、α＝γ＝９０およびβ＝９０．０１°であり、そして非対称単位中に２つの複合体分子を含有する。
【０１９３】
（実施例３）
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ触媒構築物の構造決定
ＡＤＳＣ  Ｑｕａｎｔｕｍ  ４  ＣＣＤ検出装置上、ＳＲＳ、Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ、ビームラインＰＸ９．６で、回折データを収集した。データにインデックスをつけ、そしてプログラムＭｏｓｆｌｍに組み込み、そしてプログラムＳＣＡＬＡ（ＣＣＰ４）で基準化した。プログラムＡＭｏＲｅを用いて、分子置換および分解能３．０Åまでの剛体精密化を行った。検索モデルはマウスＰＫＡ由来であり、残基３２〜３１０でモデルを一部切除し、そしてすべて非同一である残基をＡｌａで置換した。この段階で、データの５％を相互確認セットとして取っておき、そして最初のモデルは、最大尤度標的および全体の異方性温度因子訂正を用いて、プログラムＣＮＸ中、ねじれ角シミュレーテッド・アニーリングを経た。その後、モデルは、作業（ｗｏｒｋｉｎｇ）Ｒ因子が３０％未満に低下するまで、手動再構築およびシミュレーテッド・アニーリングの反復周期を経て、その時点で個々の束縛された等方性温度因子精密化を行った。異なる結晶型で同一のオーロラタンパク質を含む阻害剤複合体を両方とも同時に構築すると、解釈が困難な領域を解明する際、非常に有益であることが立証された。さらに再構築および水の添加を、フリーＲ因子が収束するまで、反復した。
【０１９４】
結晶学的データおよび精密化統計を表４および表５に示す。
表４：オーロラ−ＡＭＰＰＮＰ複合体データおよび精密化統計
【０１９５】
【表４】
2005504548.tif 000104
【０１９６】
表５：オーロラ−阻害剤複合体データおよび精密化統計
【０１９７】
【表５】
2005504548.tif 000105
【０１９８】
（実施例４）
オーロラＡキナーゼの構造の説明
ＡＴＰ類似体ＡＭＰ−ＰＮＰとの二元複合体中の［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜３９６）の構造は、分解能２．２Åまで解かれている。式ＩＩの合成阻害剤との二元複合体中のＧＳＨＭ−［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ（１２２〜４００）の構造は、分解能２．１Åまで解かれている。該構造は、キナーゼ触媒ドメインの残基を含有する。［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡのキナーゼドメインは、プロテインキナーゼに特徴的な二葉性（ｂｉｌｏｂａｌ）構造とともに、２葉間に位置する、ＡＴＰおよび阻害剤結合部位を示す。Ｎ末端ドメイン（葉）は、ねじれたβシートおよび１回ねじれたヘリックスを含んでなる。Ｃ末端葉は、主にヘリックスを含んでなるが、βシートの小さい領域もまた含む。ポリペプチド鎖の一部は、秩序が乱れている。特に、Ｔ２８７置換を含有する残基２７９〜２９０の活性化ループは、電子密度では可視でない。活性化ループの秩序だっていない性質は、キナーゼ結晶構造における共通の特徴である。
【０１９９】
構造は、恒常的に活性である突然変異、Ｔ２８７Ｄの導入にもかかわらず、触媒的に不活性であるキナーゼに典型的なコンホメーションを採用する。結晶化実験を行うｐＨが酸性であったため、導入されたアスパラギン酸が陽子を得て、そしてしたがって野生型活性化タンパク質におけるリン酸化スレオニンを模倣することがもはや不可能であろうと考えられる。ペプチド基質への突然変異体酵素のキナーゼ活性を、図３に示すように多様なｐＨ値で測定すると、実際に、ｐＨが低下するにつれて、活性は有意に減少する。
【０２００】
［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ複合体に見られる不活性コンホメーションは、明らかに、式ＩＩの阻害剤およびＡＴＰ類似体と結合可能であり、そしてしたがって、構造に基づく設計を可能にし、こうした設計は、柔軟性、並びに例えば活性状態および不活性状態間で、キナーゼが経験しうるコンホメーション変化を許容することを必要とする。阻害剤の場合、阻害剤の立体的な大きさによって、不活性コンホメーションが強いられる可能性がある。
【０２０１】
オーロラＡは、ＰＫＡとしても知られるサイクリックＡＭＰ依存プロテインキナーゼにまったく緊密に関連しており、そして１．４Åの全体のｒｍｓｄで、構造が重なり合う。オーロラＡのＡＴＰ結合の裂け目は、Ｎ末端葉の残基１７４〜１８２に形成される、ヘリックスの位置がシフトしたため、ＰＫＡの同等の裂け目より、広がっている。［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡの構造において、ヘリックスは、ＰＫＡの同等のヘリックスと比較して、ＡＴＰ結合ポケットからおよそ３Å離れて移動しており、したがって、２葉間の裂け目の長さが伸びている。伸びた裂け目を、式ＩＩのものなどの、伸長した阻害剤分子が利用可能であり、そしてこうした裂け目は、特異的阻害剤の設計に重要である可能性がある。活性化ループに先行する保存されたＤＦＧモチーフ（Ａｓｐ２７３Ｐｈｅ２７４Ｇｌｕ２７５）は、電子密度中、明らかである。この領域は、触媒に必要なアスパラギン酸残基を含有する。すべてのキナーゼにおいて、ＡＴＰ結合に重要なグリシンリッチループは、主鎖原子全体で、優れた電子密度を示すが、温度因子は非常に高く、ループの有意な可動性が示唆される。しかし、Ｐｈｅ１４３などのいくつかの残基の側鎖の密度は劣っており、そしてこれらは、多数のコンホメーションを採用する可能性がある。
【０２０２】
ＡＭＰ−ＰＮＰ分子は、２つのコンホメーションを採用する（図１）。両コンホメーション中のアデニン環およびリボース部分は、キナーゼ分子に関して、類似の位置を占有する。アデニン環およびオーロラＡのヒンジ領域間に、古典的な水素結合相互作用が形成される。これらは、アデニン環のＮ６およびＧｌｕ２１０の主鎖酸素間、並びにアデニン環のＮ１およびＡｌａ２１２の主鎖窒素間である。２つのコンホメーションの相異は、リボース環およびリン酸基間のねじれ角の相違から生じ、そしてまた、リン−酸素結合のねじれ角にもよる。１つのコンホメーションにおいて、βリン酸基は水分子に対して水素結合を形成し、これが次に、Ａｓｐ２７３に対して水素結合を形成する。他のコンホメーションにおいて、βリン酸基はＳｅｒ２７７およびＧｌｎ２６０と水素結合を形成する。どちらのコンホメーションでも、αリン酸はＬｙｓ１６１と塩架橋を形成し、そしてまた、Ｖａｌ２７８の主鎖窒素と水素結合を形成する。γリン酸の電子密度はどちらのコンホメーションでも存在せず、高い度合いの無秩序があることが示唆された。γリン酸のこの無秩序はまた、他の結晶構造、例えばチェックポイントキナーゼのものでも見られている。
【０２０３】
式ＩＩの分子はまた、オーロラＡキナーゼ分子の２つのドメイン間の裂け目のＡＴＰ結合部位においても結合する。式ＩＩの分子は、伸長したコンホメーションを採用し、このコンホメーションは、利用可能な結合ポケットの度合いを示す（図２ｂ）。主鎖ペプチドと古典的なキナーゼ（アデニン擬似体）阻害剤の水素結合相互作用は、阻害剤のＮ（１７）およびアミノ酸残基２１２のアミド間で起こる。阻害剤のピペリジン部分が溶媒中に伸長する（図２ｂの左側）。阻害剤のもう一方の端では（図２ｂの右側）、残基Ｌｅｕ１６３、Ｌｅｕ１８１、Ｌｅｕ１９５、Ｌｅｕ２０７およびＴｒｐ２７６に形成される疎水性ポケットに、ベンゾイル部分が適合する。この阻害剤は、ＡＴＰの位置よりさらに遠方のタンパク質領域を利用し、そしてこれが特異性を達成するのを補助する可能性があるため、ＡＭＰＰＮＰより、設計の開始ポイントとしてより興味深いものに相当する。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、ＡＭＰ−ＰＮＰとの［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ複合体の構造の図式的表現である。阻害剤は２つのコンホメーションを有する。
【図２ａ】図２ａは、図１とほぼ同じ方向で描いた、合成阻害剤と複合体を形成したオーロラＡの構造の図式的表現である。
【図２ｂ】図２ｂは、長い活性部位結合ポケットを占有する、伸長した阻害剤を示すために回転させた、合成阻害剤と複合体を形成したオーロラＡの図式的表現である。
【図３】図３は、ｐＨの関数としての［Ｔ２８７Ｄ］オーロラＡ活性のグラフである。