(57)【要約】ＡＴＰ輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子を単離することを本発明の課題とする。さらに、そのようなトランスポーターを用いる、中枢神経における疼痛や血小板由来のＡＴＰによる血液凝固などを処置および／または調節するための薬剤のスクリーニング法を提供することを、本発明の課題とする。本発明に従って、ＡＴＰ輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子が単離された。さらに、そのようなトランスポーターを用いる、中枢神経における疼痛や血小板由来のＡＴＰによる血液凝固などを処置および／または調節するための薬剤のスクリーニング法が提供される。
2008126517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離および／または精製された核酸であって、
配列番号１、７、９、１１または１３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アニオン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１、７、９、１１または１３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、アニオン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号２、８、１０、１２または１４に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
配列番号２、８、１０、１２または１４に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアニオン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
からなる群から選択される、核酸。
【請求項２】
前記アニオンがヌクレオチドである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ヌクレオチドがＡＴＰ、ＧＴＰ、および、ＡＤＰからなる群から選択されるヌクレオチドである、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ヌクレオチドがＡＴＰである、請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドを含む、人工膜。
【請求項１０】
膜小胞である、請求項９に記載の人工膜。
【請求項１１】
リポソームである、請求項９に記載の人工膜。
【請求項１２】
請求項８に記載のポリペプチドに特異的に反応する、抗体。
【請求項１３】
アニオン輸送タンパク質の活性調節剤のスクリーニング法であって、
（ａ）請求項９に記載の人工膜を提供する工程；
（ｂ）該人工膜に候補薬物を接触させる工程；
（ｃ）該人工膜のアニオン輸送活性を測定する工程；および、
（ｄ）工程（ｃ）で測定されたアニオン輸送活性から、該候補薬物がアニオン輸送タンパク質の活性調節剤であるか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記活性調節剤が阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性調節剤が活性促進剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記アニオン輸送活性がヌクレオチド輸送活性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレオチドがＡＴＰ、ＧＴＰ、および、ＡＤＰからなる群から選択されるヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アニオン輸送活性がＡＴＰ輸送活性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法によって得られた、アニオン輸送タンパク質の活性調節剤。
【請求項２０】
請求項１に記載の核酸の発現を抑制する、ｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のアニオントランスポーターの分野に関する。より具体的には、本発明は、ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）、ＧＴＰ、ＵＴＰ、およびＡＤＰが挙げられるが、これに限定されない）を輸送することができるアニオントランスポーターの分野に関する。さらに、本発明は、疼痛や血小板凝集を制御する薬剤のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）やＡＤＰ（アデノシン２リン酸）等のヌクレオチドは、哺乳類の全ての組織における化学伝達因子である。これらの分子は細胞から遊離し、そして、他の細胞の細胞膜に存在する２種類のＰ２レセプターファミリー（プリン作動性レセプター）、すなわち、Ｇタンパク共役型のＰ２Ｙレセプターサブファミリーとイオン輸送型のＰ２Ｘレセプターサブファミリーと結合することにより、様々な重要な生理作用・病理作用を引き起こす。これらの生理作用としては、例えば、中枢神経における疼痛や血小板由来のＡＴＰによる血液凝固などが含まれる（非特許文献１および２）。また、これらＡＴＰおよび／またはＡＤＰによる生理作用を生じるためには、細胞からＡＴＰまたはＡＤＰが遊離（または分泌）されることが必要である。従って、ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの輸送を調節する薬剤は、中枢神経における疼痛を処置または予防するための薬剤、あるいは、血小板由来のＡＴＰによる血液凝固を調節する薬剤として有用であると考えられる。【０００３】
しかしながら、ＡＴＰ・ＡＤＰの遊離機構は複数存在することが知られているものの（非特許文献１および２）、その機構および機構に関与する分子については未だ不明な点が多々ある。【０００４】
その機構の１つは、引っぱりや低張処理のようなストレスにより内皮細胞や上皮細胞、肝細胞などからＡＴＰを遊離する機構である。２つめの機構は、造骨細胞や上皮細胞からの定常的なＡＴＰ分泌である。３つ目の機構は、神経や神経内分泌細胞あるいはグリア細胞などで観察される調節性のエキソサイトーシスによるものである（図１）。ＡＴＰのエキソサイトーシスは、薬理学的および生理学的にみて最も重要なプロセスであるが、その分子機構についてはよくわかっていない。ＡＴＰがエキソサイトーシスされるためには、まず、分泌小胞中にＡＴＰが蓄積される必要がある。実際、ある種の神経のシナプス小胞や有芯小胞（dense-cored vesicle）、グリア細胞のシナプス小胞様オルガネラ（synaptic-like microvesicle）などにＡＴＰが濃縮されていることが知られている。ＡＴＰが濃縮される過程は不明であるが、何らかの能動輸送体(activetransporter）が関わっていると考えられる。【０００５】
これまでにＡＴＰ輸送能が確認されている哺乳動物のトランスポーターは、ＡＴＰ／ＡＤＰ交換輸送体（ATP/ADP exchanger）のみである（非特許文献１および２）。このトランスポーターは、ミトコンドリアの内膜に存在し、細胞質のＡＤＰとミトコンドリア内で合成されたＡＴＰとを交換するトランスポーターである。この他のトランスポーターとして、最近、Ｍｃｄ４膜タンパク質およびＳａｃ１ｐ膜タンパク質がゴルジ体と小胞体におけるＡＴＰ輸送を司ることが報告された（非特許文献３〜５）。Ｍｃｄ４は、ＡＴＰａｓｅの一種であり、Ｓａｃ１ｐは、ＡＴＰ／ＡＤＰ交換輸送体と同じタイプのトランスポーターである。しかしながら、これらトランスポーターは、ＡＴＰのエキソサイトーシスに直接関与するタンパク質ではない。各種の分泌小胞においてＡＴＰを輸送するトランスポーターの実体は未だ不明である。このようなＡＴＰトランスポーターの実体を解明することにより、ＡＴＰによる化学伝達機構を分子レベルで解明することが可能となり、さらに、ＡＴＰによる化学伝達が関与する生理現象・病理現象を人工的に制御することも可能となる。例えば、このトランスポーターの実体を解明することにより、そのトランスポーターを用いて特異的阻害剤を探索・開発することが可能となる。このような阻害剤は、疼痛や血小板凝集を制御する薬剤として有用であると予想される。【０００６】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【非特許文献１】Burnstock G. (2006) TIPS 27, 166-176.
【非特許文献２】Lazarowski E (2006) Purinergic signaling in neuron-gliainteractions. Wiley. Chibester (Novartis Foundation Symposium 276) p 73-90.
【非特許文献３】Mayinger P, bankaitis VA, Meyer DI. (1995) J Cell Biol. 131,1377-1386.
【非特許文献４】Puglielli L, Mandon EC, Hirschberg CB. (1999) J Biol Chem. 274,12665- 12669.
【非特許文献５】Coco S et al. (2003) J Biol. Chem. 278, 1354-1362.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）、ＧＴＰ、ＵＴＰ、およびＡＤＰが挙げられるが、これに限定されない）輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子を単離することを本発明の課題とする。さらに、そのようなトランスポーターを用いる、疾患および／または状態（例えば、中枢神経における疼痛や血小板由来のＡＴＰによる血液凝固など）を処置および／または調節するための薬剤のスクリーニング法を提供することを、本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以下の実施例に記載される独創的方法により、アニオントランスポーターのクローニングおよびその機能解析を行うことによって、本発明を完成した。【０００９】
本発明によって以下が提供される。
（項目１）    単離および／または精製された核酸であって、
配列番号１、７、９、１１または１３に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アニオン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号１、７、９、１１または１３に記載の核酸配列と少なくとも８０％相同な配列を含む核酸であって、アニオン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
配列番号２、８、１０、１２または１４に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
配列番号２、８、１０、１２または１４に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアニオン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
からなる群から選択される、核酸。
（項目２）    前記アニオンがヌクレオチドである、項目１に記載の核酸。
（項目３）    前記ヌクレオチドがＡＴＰ、ＧＴＰ、および、ＡＤＰからなる群から選択されるヌクレオチドである、項目２に記載の核酸。
（項目４）    前記ヌクレオチドがＡＴＰである、項目２に記載の核酸。
（項目５）    配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸。
（項目６）    項目１に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目７）    項目１に記載の核酸を含む、細胞。
（項目８）    項目１に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
（項目９）    項目８に記載のポリペプチドを含む、人工膜。
（項目１０）    膜小胞である、項目９に記載の人工膜。
（項目１１）    リポソームである、項目９に記載の人工膜。
（項目１２）    項目８に記載のポリペプチドに特異的に反応する、抗体。
（項目１３）    アニオン輸送タンパク質の活性調節剤のスクリーニング法であって、
（ａ）項目９に記載の人工膜を提供する工程；
（ｂ）該人工膜に候補薬物を接触させる工程；
（ｃ）該人工膜のアニオン輸送活性を測定する工程；および、
（ｄ）工程（ｃ）で測定されたアニオン輸送活性から、該候補薬物がアニオン輸送タンパク質の活性調節剤であるか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（項目１４）    前記活性調節剤が阻害剤である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）    前記活性調節剤が活性促進剤である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）    前記アニオン輸送活性がヌクレオチド輸送活性である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）    前記ヌクレオチドがＡＴＰ、ＧＴＰ、および、ＡＤＰからなる群から選択されるヌクレオチドである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）    前記アニオン輸送活性がＡＴＰ輸送活性である、項目１３に記載の方法。
（項目１９）    項目１０に記載の方法によって得られた、アニオン輸送タンパク質の活性調節剤。
（項目２０）    項目１に記載の核酸の発現を抑制する、ｓｉＲＮＡ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に従って、ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）、ＧＴＰ、ＵＴＰ、およびＡＤＰが挙げられるが、これに限定されない。）輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子が単離された。さらに、そのようなトランスポーターを用いる、中枢神経における疼痛や血小板由来のＡＴＰによる血液凝固などを処置および／または調節するための薬剤のスクリーニング法が提供される。【００１１】
さらに、本発明のポリペプチドおよび／または核酸の機能を抑制する抑制剤が提供され、この抑制剤は、抗炎症剤、ならびに、振せん、癲癇、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症からなる群から選択される疾患の治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＡＴＰ化学伝達システムを模式的に示した図である。ＶＮＵＴは、本発明のタンパク質である。
【図２】図２は、本発明のＳＬＣ１７Ａ９および公知の種々のＳＬＣ１７Ａファミリータンパク質を示した図である。
【図３】図３は、ヒト染色体上でのＳＬＣ１７Ａ９遺伝子座を示す図である。
【図４】図４は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列を示す図である。
【図５】図５は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、種々の生物種由来のＳＬＣ１７Ａ９アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図７】図７は、精製したＳＬＣ１７Ａ９および精製途中の種々の画分のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の写真である。
【図８】図８は、ヒトおよびマウスＳＬＣ１７Ａ９遺伝子のノザンブロットの結果を示す写真である。
【図９】図９は、ＳＬＣ１７Ａ９タンパク質のクロマフィン顆粒での局在を示すウェスタンブロットの結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、ＳＬＣ１７Ａ９によるＡＴＰの取り込みを示す結果である。
【図１１】図１１は、副腎髄質におけるマウスSLC17A9の免疫電子顕微鏡像を示す写真である。
【図１２】図１２は、ウシの副腎、クロマフィン顆粒膜でSLC17A9の発現を確認したウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
【図１３】図１３（Ａ）は、オキソノール−Ｖの蛍光クエンチングを測定することで、K+イオノフォアであるバリノマイシンを添加することで再構成リポソームに膜電位差が形成されていることを示す図である。図１３（Ｂ）は、ヒトSLC17A9を再構成したプロテオリポソームを用いて、放射性ATP(100μＭ)の取込みを経時的に観察した結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、種々の濃度の塩化物イオンにおけるATPの取込みを観察した結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、種々のヌクレオチド(１ｍＭ)を添加したときのATP取込みに対する影響を観察した結果を示すグラフである。
【図１６】図１６（Ａ）および図１６（Ｂ）は、それぞれ、実際にADPとGTP(それぞれ100μＭ)が取込みまれることを経時的に観察したグラフである。
【図１７】図１７は、DIDS（Ａ）、エバンスブルー（Ｂ）の濃度依存的なATPの取込み阻害を測定したグラフである。図１７（Ｃ）は、アトラクチロシド(200μＭ)を添加したときのATP取込みに対する影響を観察した結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ＰＣ１２細胞の免疫染色を行った結果である。使用した抗体は、以下のとおりである：（Ａ）抗ＳＬＣＡ１９抗体のみ、（Ｂ）抗シナプトタグミン抗体のみ、（Ｃ）抗ＳＬＣＡ１９抗体と抗シナプトタグミン抗体での二重染色、（Ｄ）吸収前の抗ＳＬＣＡ１９抗体のみ、（Ｅ）抗ＳＬＣＡ１９抗体のみ、（Ｆ）抗ドーパミン抗体のみ、（Ｇ）抗ＳＬＣＡ１９抗体と抗ドーパミン抗体での二重染色、（Ｈ）は通常の血清（免疫前）のみ、（Ｉ）抗ＳＬＣＡ１９抗体のみ、（Ｊ）抗シナプトフィジン抗体のみ、（Ｋ）抗ＳＬＣＡ１９抗体と抗シナプトフィジン抗体での二重染色。白い棒は、１０μｍを示す。
【図１９】図１９（Ａ）は、ＳＬＣ１７Ａ９  ＲＮＡｉを用いた場合の、ＳＬＣ１７Ａ９の発現への影響を示す結果である。図１９（Ｂ）は、ＲＮＡｉを用いた場合の、ＡＴＰ輸送への影響を示す結果である。
【図２０】図２０は、再構成したｍＳＬＣ１７Ａ９タンパクによるＡＴＰ輸送の経時変化を示すグラフである。横軸は時間（分）、縦軸はＡＴＰ取り込み量（ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）である。黒丸（●）はバリノマイシン添加時、白丸（○）はバリノマイシン非添加時の結果である。
【図２１】図２１は、再構成したｍＳＬＣ１７Ａ９タンパクによるＡＴＰ輸送の速度論を示す。黒四角（■）はバリノマイシン添加時のＡＴＰ取り込み量、白丸（○）はバリノマイシンを添加しなかった時のＡＴＰ取り込み量、黒丸（●）はその差、すなわち、膜電位依存的輸送のＡＴＰ濃度依存性を示す。横軸はＡＴＰ量（μＭ）、縦軸はＡＴＰ取り込み速度（ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／分）を示す。
【図２２】図２２は、再構成したｍＳＬＣ１７Ａ９タンパクによるＡＴＰ輸送の阻害実験の結果を示すグラフである。縦軸はＡＴＰ取り込み量（ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）を示す。添加した阻害剤の量は、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＧＴＰ（２ｍＭ）、ＡＤＰ（２ｍＭ）、Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ（２μＭ）、および、ＤＩＤＳ（２μＭ）である。
【配列表フリーテキスト】
【００１３】
配列番号１は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号２は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。【００１４】
配列番号３は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９遺伝子クローニングに使用した正方向プライマーの配列である。【００１５】
配列番号４は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９遺伝子クローニングに使用した逆方向プライマーの配列である。【００１６】
配列番号５は、抗ヒトＳＬＣ１７Ａ９抗体の調製に用いたヒトＳＬＣ１７Ａ９のアミノ末端配列である。【００１７】
配列番号６は、抗マウスＳＬＣ１７Ａ９抗体の調製に用いたマウスＳＬＣ１７Ａ９のアミノ末端配列である。【００１８】
配列番号７は、マウスＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号８は、マウスＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。【００１９】
配列番号９は、ラットＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号１０は、ラットＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。【００２０】
配列番号１１は、ウシＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号１２は、ウシＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。【００２１】
配列番号１３は、イヌＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号１４は、イヌＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。【００２２】
配列番号１５は、実施例１８でノックダウンに使用したＲＮＡ配列である。【００２３】
配列番号１６は、実施例１９でマウスＳＬＣ１７Ａ９のクローニングに使用したプライマー配列である。【００２４】
配列番号１７は、実施例１９でマウスＳＬＣ１７Ａ９のクローニングに使用したプライマー配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００２６】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００２７】
本明細書において使用される用語「トランスポーター」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、ＡＴＰ）を、脂質二重膜を越えて輸送する物質をいう。典型的には、トランスポーターは、脂質二重膜中に存在する膜タンパク質である。タンパク質であるトランスポーターは、本明細書において「輸送タンパク質」と互換可能に使用される。【００２８】
本明細書において使用される用語「輸送活性」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、ＡＴＰのようなアニオン）を、脂質二重膜を越えて輸送する活性をいう。アニオンの輸送活性を本明細書において「アニオン輸送活性」といい、ＡＴＰの輸送活性を本明細書において「ＡＴＰ輸送活性」という。【００２９】
本明細書において使用される用語「プロトンポンプ」とは、ＡＴＰをエネルギー源としてＨ＋を輸送する輸送活性を有するタンパク質をいう。代表的なプロトンポンプとしては、大腸菌、ミトコンドリアおよびクロロプラストに存在するＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ、液胞およびクロマフィン顆粒に存在するＶ−ＡＴＰａｓｅ、細胞膜に存在するＮａ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅおよびＨ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅが挙げられるが、これに限定されない。【００３０】
本明細書において使用される用語「人工膜」とは、脂質を原料として人工的に調製された膜であり、好ましくは、脂質二重膜であるがこれに限定されない。「人工膜」としては、例えば、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。【００３１】
本明細書において使用される用語「アニオン輸送タンパク質の活性調節剤」とは、アニオン輸送タンパク質の輸送活性に影響を与える物質をいう。「アニオン輸送タンパク質の活性調節剤」は、輸送活性を促進する物質であっても、阻害する物質であってもよい。【００３２】
本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の核酸および／またはタンパク質を含む製品をいう。必要に応じて、本発明のキットは、リポソームのような人工膜、あるいは、人工膜を調製するための脂質を含む。また、必要に応じて、本発明のキットは、人工膜にプロトンの電気化学的ポテンシャルを形成するためのＡＴＰａｓｅ（例えば、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ）を含む。【００３３】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。【００３４】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１、７、９、１１または１３のいずれかに示される核酸、ならびにその相補鎖、改変体およびフラグメントを包含する。【００３５】
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な塩基配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。【００３６】
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。【００３７】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２、８、１０、１２または１４のいずれかに示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。【００３８】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。【００３９】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。【００４０】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。【００４１】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。【００４２】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。【００４３】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。【００４４】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。【００４５】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【００４６】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。【００４７】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。【００４８】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５
Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。【００４９】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。【００５０】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。【００５１】
配列番号２、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１、７、９、１１または１３の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号２、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１、７、９、１１または１３に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。【００５２】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。【００５３】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。【００５４】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。【００５５】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。【００５６】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。【００５７】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。【００５８】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【００５９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【００６０】
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。【００６１】
「抗体」は、抗体およびそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を包含するが、これらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。本発明の抗体は、配列番号２、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドに、特異的に反応する。【００６２】
本発明の遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウン（抑制）することが可能である。所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、当該分野で公知のｓｉＲＮＡ提供業者（例えば、株式会社  ニッポンイージーティー、富山、日本）により、アニーリングしている２本鎖の合成ｓｉＲＮＡを入手することができる。その合成ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの溶液に溶解し、最終濃度が２０μＭになるように調整し、その後細胞へ導入する。ｓｉＲＮＡを調製する場合には、例えば、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。【００６３】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現生成物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現生成物自体はまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。【００６４】
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。【００６５】
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され得る媒体（例えば、プラスミド）を包含する。【００６６】
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中で野使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ  １９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。【００６７】
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。【００６８】
本発明の配列番号２、８、１０、１２または１４に記載のポリペプチドをコードする核酸の発現は、好ましくは真核生物細胞において従来の方法によって実行され得る。核酸を発現するために適切な宿主細胞としては、高等真核生物が挙げられ、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方の動物細胞）由来の樹立された組織培養細胞株を包含する。【００６９】
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明の配列番号２、８、１０、１２または１４に記載のポリペプチドの組換え生成のために使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞株（昆虫バキュロウイルス発現系が挙げられる）が使用され得るが、哺乳動物細胞が、好ましい。このような細胞の形質転換、トランスフェクションおよび増殖は、慣用的手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｊ７７４細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ラット乳児腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常は、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常は、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。【００７０】
本発明はまた、本発明の配列番号２、８、１０、１２または１４に記載のポリペプチドおよび配列番号１、７、９、１１または１３に記載のポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む、融合物を包含する。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。そのようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、当該分野で周知である。【００７１】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。【００７２】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【００７３】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。【００７４】
（アニオン輸送タンパク質の活性調節剤のスクリーニング法）
本発明のタンパク質を使用する種々の方法によって、アニオン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。例えば、
（ａ）リポソームにＡＴＰａｓｅ（例えば、液胞型ＡＴＰａｓｅ）と本発明の膜タンパク質を再構成し、
（ｂ）そのリポソームに（１）放射性標識したＡＴＰのみ、（２）放射性標識したＡＴＰと候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）リポソームを遠心して沈澱させ、（１）の場合と（２）の場合とで、そのリポソームに取り込まれた放射性標識ＡＴＰの量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がＡＴＰ輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、アニオン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。【００７５】
あるいは、
（ａ）本発明の膜タンパク質を発現する細胞を調製し（例えば、本発明の遺伝子を用いて形質転換する）、
（ｂ）その細胞に、（１）放射性標識したＡＴＰのみ、（２）放射性標識したＡＴＰと候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）細胞を破壊し、膜画分を調製し、（１）の場合と（２）の場合とで、膜画分に存在する放射性標識ＡＴＰの量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がＡＴＰ輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、アニオン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。【００７６】
（医薬候補薬物のスクリーニング）
本発明のトランスポーター（ポリペプチドおよび／または核酸）の阻害剤または活性調節剤はプリン作動性化学伝達が直接あるいは間接に関与する細胞／生体反応の制御薬となる。なぜなら、理論に拘束されることは望まないが、神経伝達物質であるヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ）のトランスポーター活性を阻害すると、開口放出されるヌクレオチド量が低下し、ヌクレオチド受容体の一種であるプリン受容体を介するプリン作動性化学伝達が低下ないし消失し、その結果、シナプス小胞内への興奮性神経伝達物質の輸送が阻害され、その結果、興奮性神経伝達物質によって生み出される電気的興奮が抑制されることとなる。また、そのような阻害作用は、プリン（ヌクレオチド）のみではなく、ヌクレオシドに対するシグナル伝達をも阻害することが理解される。なぜなら、放出されたヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ）は、細胞外のエクトＡＴＰａｓｅにより速やかにアデノシンにまで分解され、このアデノシンがアデノシン受容体を介して種々の応答を引き起こすため、上記の阻害作用によりアデノシンの生成量が減少・消失すると、アデノシンを介するシグナル伝達自体も減少・消失することが予測されるからである。そのため、本発明のトランスポーターに対する阻害剤は、例えば、過剰な神経の興奮に関連する疾患および／または状態（例えば、癲癇）の治療、予防および／または予後に利用することが可能である。従って、本発明のポリペプチドおよび／または核酸を用いてその阻害剤を提供することによって、抗炎症剤、ならびに、振せん、癲癇、パーキンソン病、アルツハイマー病、大理石症、および、骨粗相症からなる群から選択される疾患の治療薬を提供することができる。【００７７】
上記のような本発明のトランスポーターの阻害剤としては、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーが挙げられるが、これに限定されない。【００７８】
さらに、本発明のトランスポーターを用いることによって、本発明のトランスポーターの活性を増強する機能賦活剤を開発することも可能である。本発明者らは、クロライドイイオンが本発明のヌクレオチドトランスポーターの活性化をもたらすことを確認していることから、そのような機能賦活剤としては、クロライドイオンの模倣物が挙げられるが、これに限定されない。【００７９】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８０】
従来の研究において最も解析された分泌小胞におけるＡＴＰ輸送活性は、副腎髄質のクロマフィン顆粒におけるそれである（BANKSTON LA, GUIDOTTI G. (1996) J. Biol. Chem. 271, 17132-17138.）。クロマフィン顆粒は、およそ０．１Ｍ程度のＡＴＰと数十ｍＭのＡＤＰを含んでいる。顆粒膜におけるＡＴＰの輸送は、ＡＴＰやＡＤＰに対するＫｍが数ｍＭと比較的高く、液胞型ＡＴＰａｓｅが形成するプロトンの電気化学的ポテンシャル差の内で、膜内部が正の膜電位を輸送のエネルギー源として利用することがわかっている。また、１０ｍＭ程度の塩素イオンにより輸送が促進されることも、わかっている。従って、顆粒膜におけるＡＴＰを含むヌクレオチドの輸送は、二次性の能動輸送体によるものであると考えられる。この仮想的なＡＴＰトランスポーターを小胞型ヌクレオチドトランスポーター（vesicularnucleotide transporter, VNUT）と呼んでいる（図１）。【００８１】
この仮想的なＡＴＰトランスポーターについては、その構造はもとより、その存在についても、何ら知られていなかった。そこで、本発明者らは、ＡＴＰが生理条件下ではアニオン（陰イオン）であることから、この輸送体がアニオントランスポーターであるという仮説を立て、その仮説に基づいてＡＴＰトランスポーターのクローニングを試みた。【００８２】
ＳＬＣ１７Ａファミリーは、アニオントランスポーターより構成される（図２）。ＳＬＣ１７Ａの構成員のうちＳＬＣ１７Ａ１からＳＬＣ１７Ａ４は（ＮＰＴ１〜ＮＰＴ４とも呼ばれる）、Ｎａ＋依存性のリン酸トランスポーターである。ＳＬＣ１７Ａ６〜ＳＬＣ１７Ａ８は、分泌小胞に存在する小胞型グルタミン酸トランスポーターである。本発明者らは、哺乳動物ゲノム配列の検索からＳＬＣ１７Ａファミリー中に、これまでに同定されていない９番目の構成員であるＳＬＣ１７Ａ９が存在することを見出した。このＳＬＣ１７Ａ９遺伝子がヒトの２０番目の染色体に存在することが判明した（図３）。ヒトＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列（配列番号１）を図４に、アミノ酸配列（配列番号２）を図５に示す。図５にＴＭＤ１〜ＴＭＤ１２として示されるように、ＳＬＣ１７Ａ９膜タンパク質は、１２個の膜貫通領域を有すると予想された。【００８３】
本発明者らは、クロマフィン顆粒におけるＡＴＰ輸送活性の性質、すなわち、高Ｋｍ値、塩素イオン依存性、および、駆動力がＳＬＣ１７Ａ６〜８の小胞型グルタミン酸トランスポーターと類似する点から、この新しい構成員ＳＬＣ１７Ａ９がＶＮＵＴであるとよ予想した。【００８４】
内部が正の膜電位駆動される組換えトランスポーターの機能をインビトロで測定することは、困難であった。そこで本発明者らは、これまでに小胞型グルタミン酸トランスポーターのインビトロ機能測定法を開発した（Juge N, Yoshida Y, Yatsushiro S, Omote H, Moriyama Y. (2006) J Biol.Chem. 281, 39499-39506.）。この試験法を用いることによって、この作業仮説を検証することが可能となる。本発明者らは、独創的方法によってこの作業仮説を検証し、ＳＬＣ１７Ａ９遺伝子がコードする膜タンパク質がＶＮＵＴそのものであることを見出した。この知見を得るに至った実験を以下の実施例に記載する。【００８５】
（実施例１：ＰＣＲによるＳＬＣ１７Ａ９遺伝子の単離）
（ＰＣＲ）
Ex TaqBuffer（TaKaRa）中に、0.2mM dNTP混合液、1pmol プライマー、1.5U Ex Taq (TaKaRa)を添加し５０μｌとしてＰＣＲを行った。使用したプライマーは、正方向プライマー（配列番号３：５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＣＡＧＧＡ−３’）および逆方向プライマー（配列番号４：５’−ＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＣＴＣ−３’）である。ＰＣＲ条件は、９４℃  ３分で加熱した後、９４℃  ３分、５６℃  ３０秒、７２℃  ２分のサイクルを３０サイクル行い、その後、７２℃で５分加熱を用いた。【００８６】
（エントリーベクターへの連結）
ＰＣＲフラグメントをＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen）を用いて、エントリーベクター（pENTR、Invitrogen）に組み込んだ。反応溶液（６μｌ）は、塩溶液  １μｌ（Invitrogen）、ベクター  10fmol（Invitrogen）、およびＰＣＲ産物  20fmolを含む溶液である。室温で１０分間反応させ、ＳＬＣ１７Ａ９をエントリーベクターに組み込んだ。これをＴＯＰＯ反応液とした。【００８７】
（形質転換）
大腸菌Ｍａｃｈ−１コンピテントセル（Invitrogen）５０μｌに上記ＴＯＰＯ反応液２μｌを加えた。氷上で３０分間放置後、ＳＯＣ培地（Invitrogen）２５０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させ、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートに全量を播種した。プレートを３７℃で一晩培養し、シングルコロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地３ｍｌで一晩培養した。培養した大腸菌からQIAprepSpin Miniprep Kit(Qiagen)を用いて、ＳＬＣ１７Ａ９を含むベクター（ｐＥＮＴＲ／ＳＬＣ１７Ａ９）を得た。このベクターを用いて、ＳＬＣ１７Ａ９のｃＤＮＡの配列決定を行った。【００８８】
ヒトＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列を図４に、アミノ酸配列を図５に示す。また、ヒトＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列と他の生物種のＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列とのアラインメントを図６に示す。【００８９】
（実施例２：ＳＬＣ１７Ａ９膜タンパク質の発現および精製）
（ｐＤＥＳＴ１０への組換え）
実施例１で調製したｐＥＮＴＲ／ＳＬＣ１７Ａ９から、ＬＲクロナーゼを用いてＳＬＣ１７Ａ９のｃＤＮＡをｐＤＥＳＴ１０ベクターへクローニングした。ｐＥＮＴＲ／ＳＬＣ１７Ａ９プラスミド１５０ｎｇにｐＤＥＳＴ１０プラスミド３００ｎｇとＬＲクロナーゼ４μｌを加え、２５℃で１時間インキュベートし、その後、プロテイナーゼＫを２μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。反応液を用いて、ＤＨ５αコンピテント大腸菌を形質転換した。形質転換したＤＨ５α細胞から、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用いてプラスミドを回収し、ｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ９とした。【００９０】
（組換えバックミドの作製）
BaculovirusExpression System with Gateway Technology（Invitrogen）を用いて、ｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ９からＳＬＣ１７Ａ９のｃＤＮＡをバキュロウイルスゲノム（バックミド）に組み込んだ。【００９１】
具体的には、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Invitrogen）２５μｌにｐＤＥＳＴ１０／ＳＬＣ１７Ａ９  ２０ｎｇを加え、氷上で３０分間放置後、４２℃、３０秒、ＳＯＣ培地２２５μｌ加えた。３７℃で４時間インキュベートし、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢプレートの播種し、３７℃で一晩インキュベートした。そしれ、ミニプレップ法にてバックミドを回収した。【００９２】
（ミニプレップ法；バックミド用）
組換えバックミドの作製に用いたミニプレップ法は、以下の手順で行った。まず、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを添加したＬＢ培地３ｍｌに組換えバックミドを有するＤＨ１０Ｂａｃを植菌し、３７℃で培養した。培養した大腸菌を溶液１（５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）２００μｌ中に懸濁し、次に、溶液２（０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）２００μｌを加え、転倒混和した。室温で５分間放置後、溶液３（３Ｍ  ＫＯＡｃ、１１．５％（ｖ／ｖ）酢酸）を２００μｌ加え、転倒混和した。そして、４℃で１０分間放置した後、遠心（１３，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を除いた。沈澱を、さらに、７０％エタノールで２回洗浄した。これにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を無菌的に添加し、４℃に保存した。【００９３】
（ウイルスの調製）
本実施例に用いたウイルスは、以下の手順によって調製した。まず、３５ｍｍのペトリ皿に９×１０５個のＳｆ９細胞を播種した。培地を、０．３５ｍｇ／ｍｌの炭酸水素ナトリウムを添加したGrace's Insect Medium（GIBCO）に交換した後、ＳＬＣ１７Ａ９を含むバックミド１μｇと、cellfectin（Invitrogen）６μｌを用い、リポフェクション法にて、Ｓｆ９に感染させた。２７℃で５時間インキュベートした後、２ｍｌのcompleteTMN-FHに交換し、感染兆候が見られるまで培養し、培地を回収した。これをＰ１ウイルスとした。そして、１００ｍｍペトリ皿に６×１０６個のＳｆ９細胞を播種し（５０％コンフルエント）、１０倍段階希釈したウイルス液１ｍｌを添加し、室温で１時間振とうした。completeTMN-FH：４％ Sea Plaque Agarose＝３：１となるように、混合したペトリ皿の培地を取り除いた後、これを１０ｍｌの重層アガロースを用いて２７℃で７〜１０日密閉して培養し、形成したプラークをピックアップして、再度感染させ、７２時間後、この培地をＰ１ウイルスの場合と同様に回収し、Ｐ２ウイルスとした。【００９４】
（細胞の回収と膜画分の可溶化）
HighFive細胞にＰ２ウイルスをM.O.I.＝１で感染させ、２７℃で培養した。感染６０時間後の細胞をセルスクレーパーにより回収し、７００×ｇ  １０分間遠心して上清を取り除いた。これを破壊緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ（ペプチド研究所）、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（ペプチド研究所））中に懸濁し、再度７００×ｇ  １０分間遠心して上清を取り除いた。これを破壊緩衝液で懸濁し、超音波処理（ＴＯＭＹultrasonic disruptorにて、Output 4、３０秒×８回）後、７００×ｇ  １０分間遠心して上清を回収し、１００，０００×ｇ  １時間、４℃で超遠心して、得られた沈澱を膜画分とした。この分画を、可溶化緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、２％オクチルグルコシド（同仁化学）、１０％  グリセロール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を添加し、ホモジナイザーを用いて懸濁し、１００，０００×ｇ  ３０分の遠心操作を行い、その上清を可溶化画分とした。【００９５】
（アフィニティーカラムを用いたＳＬＣ１７Ａ９の精製）
QIAGENNi-NTA super flowレジンをエコノカラムに充填し（１ｍＬ；５０％  スラリー）、蒸留水にて洗浄した後、ｐＨ８．０の可溶化緩衝液で平衡化した。ここに上記の可溶化画分を入れ、４℃、４時間攪拌しながら、吸着させた。これを１５ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％オクチルグルコシド、２０％  グリセロール、５ｍＭ  イミダゾール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）で洗浄し、溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％オクチルグルコシド、２０％  グリセロール、６０ｍＭ  イミダゾール、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を用いて、精製ＳＬＣ１７Ａ９を溶出した。【００９６】
精製ＳＬＣ１７Ａ９のＳＤＳゲル電気泳動の結果を図７に示す。この結果より、本実施例の方法によってＳＬＣ１７Ａ９が精製されたことが分かる。【００９７】
（実施例３：ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅの精製）
Ｍｏｒｉｙａｍａ  Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２２１４１−２２１４６（１９９１）に記載の手順に従って、プロトンポンプであるＦ０Ｆ１タンパク質を調製した。【００９８】
Ｆ０Ｆ１の大量発現プラスミドｐＢＷＵ１３を含有している大腸菌ＤＫ８を、０．５％グリセロールを含むＴａｎａｋａ培地（３４ｍＭ一カリウムリン酸、６４ｍＭ二カリウムリン酸、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．３ｍＭ塩化マグネシウム、１μＭ硫酸鉄、１μＭ塩化カルシウム、１μＭ塩化亜鉛、１００μｇ／ｍｌイソロイシン、１００μｇ／ｍｌバリン、２μｇ／ｍｌチアミン）で培養した後、菌体を回収した。以降の調製を全て４℃で行った。【００９９】
菌体（ＤＫ８／ｐＢＷＵ１３）約１０ｇを、４０ｍｌの膜調製緩衝液（４℃の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ塩化マグネシウム、０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、フレンチプレス（１，５００ｋｇ／ｃｍ２）で細胞を破砕した。破砕液を１７，０００×ｇにて１０分間遠心分離し、得られた上清をさらに２１０，０００×ｇで１時間２０分間遠心分離した。得られた膜小胞の沈澱を、Ｆ０Ｆ１調製用緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．８％オクチルグルコシド）中に懸濁し、再度遠心分離した。沈澱物として調製した膜小胞６０ｍｇを、２％のオクチルグルコシドを含む３ｍｌのＦ０Ｆ１調製用緩衝液中に懸濁し、Ｆ０Ｆ１を可溶化した。可溶化溶液を、２６０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清画分からＦ０Ｆ１を回収した。回収したＦ０Ｆ１を、１０％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）のグリセロール密度勾配遠心分離（３３０，０００×ｇで５時間）によって精製した。グリセロール密度勾配を、１％オクチルグルコシドを含むＦ０Ｆ１調製用緩衝液で作製した。密度勾配遠心後、遠心管の底から１０分画に分けて分離し、最初の４画分をＦ０Ｆ１として回収し、−８０℃で保存した。【０１００】
（実施例４：ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅと精製ＳＬＣ１７Ａ９のリポソームへの再構成）
２０ｍｇの大豆レシチン（Ｓｉｇｍａ  ｔｙｐｅＩＩＳ）を緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．０、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、バスタイプ超音波装置で透明になるまで超音波処理した。調製したリポソームは分注し、−８０℃で保存した。【０１０１】
次に、実施例３の手法で精製したＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ  ９０μｇと実施例２で精製したＳＬＣ１７Ａ９  ２０μｇを上記リポソーム６００μｇに混合し、−８０℃で１５分間静置し、凍結した。ただちにこれを取り出し、迅速に解凍しＦ緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１００ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ  酢酸マグネシウム）にて２０倍に希釈し、１６０，０００×ｇ  ６０分遠心した。沈澱にＦ緩衝液  ４００μｌを添加し、ホモジナイズし、再構成プロテオリポソームを得た。【０１０２】
（実施例５：ＳＬＣ１７Ａ９遺伝子の発現パターン）
ＲＮＡパネルを以下のように調製した。まず、クローンテック社（現タカラバイオ）から購入したtotal RNA（肝臓、骨格筋、心臓、精巣、肺、腎臓、副腎、甲状腺）を１％  ホルムアルデヒドゲルを用いて電気泳動した。分離したＲＮＡをアマシャム社のＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋のメンブレンにトランスファーし、紫外線により架橋し固定した。このメンブレンを用い、ノザンブロットを行った。プローブは、ヒトＳＬＣ１７Ａ９の１０２９〜１２７４（２９６ｂｐ）を用い、GEHealthcare UL Limitedの３２Ｐ−ｄＣＴＰにより標識した。ハイブリダイズさせたメンブレンを富士フィルム社のイメージングプレートを用い一晩感光させ、このプレートを富士フィルム社製イメージングアナライザーを用いてスキャンした。図８に示すように、ＳＬＣ１７Ａ９遺伝子は副腎髄質を含む様々な組織で発現していることが示された。【０１０３】
（実施例６：ＳＬＣ１７Ａ９タンパク質の局在）
抗ＳＬＣ１７Ａ９抗体を、以下の方法により調製した。ヒトＳＬＣ１７Ａ９のアミノ末端から４０番目の残基までの配列（配列番号５：ＭＴＬＴＳＲＲＱＤＳＱＥＡＲＰＥＣＱＡＷＴＧＴＬＬＬＧＴＣＬＬＹＣＡＲＳＳＭＰＩ）をＧＳＴに融合したペプチドを発現するプラスミドを大腸菌ＢＬ２１株に導入し、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより３時間誘導し、その後、大腸菌を回収した。この大腸菌を超音波によって破砕した後、１５，０００×ｇ  ３０分の遠心の後、上清を回収し、グルタチオンセファロース４Ｂカラムにより、目的の融合タンパク質を回収した。ＳＤＳゲル電気泳動により単一のタンパク質であることを確認した後、白色ウサギにアジュバントとともに注射した。数回の注射後（約一ヵ月後）、血液を採取し、血清として保存した。抗マウスＳＬＣ１７Ａ９抗体は、アミノ末端から８９番目のアルギニンに対応するアミノ酸配列（配列番号６：ＭＱＰＩＰＥＥＴＲＫＴＰＳＡＡＡＥＤＴＲＷＳＲＰＥＣＱＡＷＴＧＩＬＬＬＧＴＣＬＬＹＣＡＲＶＴＭＰＶＣＴＶＡＭＳＱＤＦＧＷＮＫＫＥＡＧＩＶＬＳＳＦＦＷＧＹＣＬＴＱＶＶＧＧＨＬＧＤＲ）を用いて、抗ヒトＳＬＣ１７Ａ９抗体と同様の手順で調製した。【０１０４】
ウェスタンブロットは、MoriyamaとNelsonの方法（Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｙ．，およびＮｅｌｓｏｎ，Ｎ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、８５２１−８５２７）に従い、１０００倍希釈した一次抗体（血清）を用いて行った。【０１０５】
具体的には、電気泳動したＳＤＳポリアクリルアミドゲル上のタンパクをＴｒｉｓ  ９ｇ、グリシン３０ｇ、ＳＤＳ  ０．６ｇ、メタノール６００ｍｌ（総容量３Ｌ）の緩衝液中、３５０ｍＶで２時間電気泳動し、ニトロセルロースに転写させた。転写後、ＴＥＮ緩衝液に１％ＢＳＡを加えた緩衝液中で４時間保温後、一次抗体を同じ緩衝液に加えてさらに２時間保温した。その後、ＴＥＮ緩衝液に０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた緩衝液で１５分間２回洗浄後、同じ緩衝液中で２次抗体で３０分反応させた。反応後、液を捨てさらに４時間洗浄した。洗浄後、ニトロセルロースに残った抗体上のペルオキシダーゼをＥＣＲ法により反応させた。【０１０６】
この結果、ＳＬＣ１７Ａ９がクロマフィン顆粒に存在することが判明した（図９）。【０１０７】
これら実施例５および実施例６の結果から、ＳＬＣ１７Ａ９が、クロマフィン顆粒においてＡＴＰの輸送を担う膜タンパク質、すなわち、ＶＮＵＴであることが証明された。【０１０８】
（実施例７：ＡＴＰ輸送活性の測定）
実施例４で調製したプロテオリポソーム１６μｌとＦ緩衝液を加え、２７℃の水浴において２分間インキュベートした。その後に、終濃度２ｍＭとなるようにＡＴＰ（１．３μＣｉ）を加え、反応を開始した。１２５μｌずつサンプル液を分取し、セファデックスＧ−５０ファインスピンカラムにアプライした。１８０×ｇで２分間遠心して反応を停止した。溶出液をクリアゾル３ｍｌに溶かし、中に含まれる放射能（リポソームに取り込まれたＡＴＰに相当する）を液体シンチレーションカウンターにより計測した。また、図に示すように、１ｍＭ  ＮａＮ３（＋ＮａＮ３）、２μＭ  ＣＣＣＰ（＋ＣＣＣＰ）、５０μＭ  アトラクチロシド（＋Ａｔｒａｃｔｙｌｏｓｉｄｅ）を用いた。結果を図１０に示す。ＡＴＰを添加することによってリポソーム内へのＡＴＰの取り込みが見られること、および、この取り込みにはＳＬＣ１７Ａ９が必須であり、さらに、この取り込みが膜電位より駆動されていることが示された。【０１０９】
（実施例８：ＡＴＰ輸送活性の活性調節剤のスクリーニング）
実施例４で調製したプロテオリポソーム１６μｌとＦ緩衝液を加え、２７℃の水浴において２分間インキュベートした。次に、候補薬物を添加する（代表的には、全反応容量の１／１００〜１／１０００程度の量で、終濃度が１μＭ〜１ｍＭ程度）。その後に、終濃度２ｍＭとなるようにＡＴＰ（１．３μＣｉ）を加え、反応を開始する。１２５μｌずつサンプル液を分取し、セファデックスＧ−５０ファインスピンカラムにアプライする。１８０×ｇで２分間遠心して反応を停止する。溶出液をクリアゾル３ｍｌに溶かし、中に含まれる放射能（リポソームに取り込まれたＡＴＰに相当する）を液体シンチレーションカウンターにより計測する。結果を、候補薬物を添加しない場合の結果（例えば、実施例５の結果）と比較することによって、この候補薬剤がＡＴＰ輸送活性を促進するのか、または阻害／抑制するのかについて決定することができる。【０１１０】
（実施例９：マウス副腎髄質におけるSLC17A9）
マウス副腎髄質中におけるSLC17A9の局在位置を確認するために、金コロイド銀増感電子顕微鏡法を以下のように行った。エーテルにて麻酔したマウスを、心臓から生理食塩水を灌流し、次いで、4%パラホルムアルデヒドを溶解した0.1M リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)を灌流した。副腎を単離してPBSで洗浄した。エタノールで脱水し、LR-Whihte樹脂に包埋したのち、切片化(80nm厚)した。切片を2 % ヤギ血清、2 % BSAを含むPBS(ブロッキング溶液)にて10分間インキュベートした。次いで、ブロッキング溶液で20倍希釈したウサギ抗マウスSLC17A9抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ブロッキング液で十分洗浄した後、切片を抗ウサギIgG金コロイド(金属粒子の直径は10nm)を含むブロッキング溶液中で30分インキュベートした。0.1 M Na-カコジル酸緩衝液(pH7.4)で6回洗浄し、次いで2.5 %グルタルアルデヒドを用いて10分間固定した。さらに洗浄した後、切片を酢酸ウランおよびクエン酸鉛にて二重染色し、HitachiH-7100電子顕微鏡にて解析した。【０１１１】
結果を図１１に示す。図１１は、副腎髄質におけるマウスSLC17A9の免疫電子顕微鏡像を示す写真である。マウスSLC17A9の存在を金コロイドで示している。金コロイドはクロマフィン顆粒に存在しており、SLC17A9タンパクが顆粒上にあることを示している。図中、Mitはミトコンドリアを示す。スケールバーは0.１μｍである。【０１１２】
（実施例１０：ウシ副腎、クロマフィン顆粒でのSLC17A9の発現）
ウシのクロマフィン顆粒膜をNelsonらの方法（Nelson, N, Cidon S, Moriyama Y. (1988) Method Enzymol157, 619-633）で調製し、抗マウスSLC17A9抗体によるウェスタンブロットを行った。その結果、抗マウスSLC17A9抗体が認識する明瞭な一本のタンパク質が存在しており、SLC17A9のカウンターパートの存在が確認できた（左のレーン）。抗マウスSLC17A9抗体によるこのタンパク質の認識反応は、抗原ペプチド(マウスSLC17A9のL8〜R97)によって吸収された（右のレーン）。結果を図１２に示す。【０１１３】
（実施例１１：SLC17A9再構成プロテオリポソームによる膜電位の形成）
精製したSLC17A9  10μｇと大豆由来の脂質0.5mgを混ぜ、-80℃で5分以上インキュベートした。これを手で素早く解かし、20 mM MOPS-Tris(pH7.0)、0.15 M 酢酸ナトリウム、2 mM酢酸マグネシウム、0.5 mM DTTを含む緩衝液で60倍に希釈した。これを4 ℃で1時間、200,000×gで遠心し、上清を捨て、20 mMMOPS-Tris(pH7.0)、0.15 M 酢酸ナトリウム、2 mM 酢酸マグネシウム、0.5 mM DTTを含む緩衝液で再懸濁し、SLC17A9再構成プロテオリポソームとした。コントロールとして、SLC17A9を含まないリポソームを用いた。【０１１４】
オキソノール−Ｖを用いた膜電位差測定は、蛍光分光計を用いてMoriyama Y and Yamamoto A (1995) J. Biol. Chem. 270, 22314-22320.の方法で測定した。【０１１５】
ヌクレオチドの輸送活性は、以下の手順で測定した。再構成プロテオリポソームを20 mM MOPS-Tris(pH7.0)、0.15 M 酢酸カリウム、2 mM 酢酸マグネシウム、4 mM 塩化カリウムからなる緩衝液にて27℃、2分インキュベートし、バリノマイシンを終濃度2μＭになるように加え、さらに2分インキュベートした。0.1mM [α-32P]ATP(3.7 GBq/mmol)の添加時を活性測定の開始とする。所定の時点で反応液130μＬを回収し、セファデックスG-50(fine)スピンカラムにて760×gで2分遠心する。カラムを通過した反応液に含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定することによりATPの取込みを測定した。ADP、GTPの輸送活性の測定では、基質としてATPの代わりに[2,8-3H]ADP(0.37GBq/mmol)、[α-32P]GTP(3.7 GBq/mmol)を使用した。【０１１６】
阻害剤実験ではプロテオリポソームをインキュベートするときに所定の濃度の阻害剤を加えた。結果を図１３（Ａ）および（Ｂ）に示す。図１３（Ａ）に示すように、オキソノール−Ｖの蛍光クエンチングを測定した。Ｋ＋イオノフォアであるバリノマイシン（Ｖａｌ）を添加することで再構成リポソームに膜電位差が形成された。この反応はエタノールで起こらなかった。SLC17A9を含まないリポソームでも同様に膜電位は発生した。図１３（Ｂ）に示すように、ヒトSLC17A9を再構成したプロテオリポソームを用いて、放射性ATP(100μＭ)の取込みを経時的に観察した。バリノマイシンを添加したときにATPの取込みが活性化された。従って、SLC17A9は膜電位依存的にATPを輸送することが明らかとなった。この取り込みはSLC17A9タンパクが存在しないリポソームでは起こらなかった。右上のグラフは種々の濃度のATP取込みを観察した結果を示すものである。ATPに対するKmは0.8mMであった。【０１１７】
従来の再構成プロテオリポソームはＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含むものであったが、本実施例の再構成プロテオリポソームはＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを用いずに再構成している。そのため、本実施例の再構成プロテオリポソームを用いることによって、トランスポーターに対する阻害剤の真の影響を測定することが可能となった。【０１１８】
（実施例１２：SLC17A9再構成プロテオリポソームによるＡＴＰ輸送は、クロライドを必要とする）
種々の濃度の塩化物（クロライド）イオンを用いた以外は、実施例１１と同様の条件を用いて、SLC17A9再構成プロテオリポソームによるＡＴＰ輸送を観察した。ＡＴＰ取込み活性は、クロライドイオンが4mMの時に定常状態に達し、維持された。すなわち、SLC17A9タンパクはATP取込みにおいて塩化物イオン（クロライド）を要求することが明らかとなった。結果を図１４に示す。【０１１９】
（実施例１３：SLC17A9再構成プロテオリポソームによるＡＴＰ輸送に対する、種々のヌクレオチドの影響）
種々のヌクレオチド（１ｍＭ）がSLC17A9再構成プロテオリポソームによるＡＴＰ輸送に影響を与えるか否かについて、実験した。結果を図１５に示す。この結果はATP以外にADPやGTP等が輸送基質として認識されていることを示唆する。【０１２０】
（実施例１４：SLC17A9再構成プロテオリポソームによるＡＤＰおよびＧＴＰ輸送）
SLC17A9がＡＴＰ以外のヌクレオチド（例えば、ＡＤＰおよびＧＴＰ）についての輸送活性を有するか否かを決定するために、SLC17A9再構成プロテオリポソームによるＡＤＰおよびＧＴＰ輸送を測定した。図１６（Ａ）および図１６（Ｂ）は、それぞれ、実際にADPとGTP(それぞれ100μＭ)がSLC17A9再構成プロテオリポソーム内に取込みまれることを経時的に観察したグラフである。SLC17A9はATPのみならず、GTPも輸送するヌクレオチドトランスポーターであることが明らかとなった。【０１２１】
（実施例１５：ＡＴＰ輸送阻害剤による阻害効果の測定）
DIDS（図１７Ａ）およびエバンスブルー（図１７Ｂ）の濃度依存的なATPの取込み阻害を測定した。ID50はそれぞれ１．５μＭ、４０ｎＭであった。【０１２２】
アトラクチロシド(200μＭ)の添加によるATP取込みに対する影響を観察した（図１７（Ｃ）。Mg2+が存在するときのみATPの取込みは阻害された。この2つの結果から、本発明のリポソームを用いることでこのトランスポーターの阻害剤を精度よく定量することができることが明らかとなった。【０１２３】
（実施例１６：SLC17ファミリーに属する他のタンパク質による輸送活性）
SLC17ファミリーに属する他のタンパク質について、SLC17A9と同様に再構成したときのATP取込みを観察した。SLC17ファミリーに属するそれぞれのトランスポータータンパク質をSLC17A9と同様に精製し、実施例１１の手法に従って再構成し、輸送活性測定についてもSLC17A9と同様に0.1mM [α-32P]ATPを添加し2分後のATP取込みを測定した。結果を以下の表１に示す。【０１２４】
【表１】
2008126517.tif 000003
この結果から、ＳＬＣＡ１９によるＡＴＰ輸送活性が、他のＳＬＣファミリータンパク質には見られない独特のものであることが、確認された。【０１２５】
（実施例１７：細胞内におけるＳＬＣＡ１９の局在）
抗ＳＬＣＡ１９抗体を、抗シナプトタグミン抗体、抗ドーパミン抗体または抗シナプトフィジン抗体と組み合わせて、ＰＣ１２細胞の二重免疫染色を行った。結果を図１８に示す。（Ａ）は抗ＳＬＣＡ１９抗体のみでの染色、（Ｂ）は抗シナプトタグミン抗体のみでの染色、（Ｃ）は抗ＳＬＣＡ１９抗体と抗シナプトタグミン抗体での二重染色、（Ｄ）は吸収前の抗ＳＬＣＡ１９抗体のみでの染色、（Ｅ）は抗ＳＬＣＡ１９抗体のみでの染色、（Ｆ）は抗ドーパミン抗体のみでの染色、（Ｇ）は抗ＳＬＣＡ１９抗体と抗ドーパミン抗体での二重染色、（Ｈ）は通常の血清（免疫前）のみでの染色、（Ｉ）は抗ＳＬＣＡ１９抗体のみでの染色、（Ｊ）は抗シナプトフィジン抗体のみでの染色、（Ｋ）は抗ＳＬＣＡ１９抗体と抗シナプトフィジン抗体での二重染色の結果を示す写真である。（Ａ）〜（Ｃ）および（Ｅ）〜（Ｇ）および（Ｉ）〜（Ｋ）のそれぞれの組合せは、同一の細胞の蛍光染色の結果である。白い棒は、１０μｍを示す。二重免疫染色の結果から、SLC17A9は分泌顆粒のマーカーであるシナプトタグミンと共局在していることが示された。SLC17A9はドーパミンとも共局在していた。しかし、SLC17A9はシナプス様マイクロベシクルのマーカーであるシナプトフィジンとは共局在していなかった。従って、これらの結果から、SLC17A9は分泌顆粒に局在していることが示された。【０１２６】
（実施例１８：ＲＮＡｉによるSLC17A9のノックダウン）
以下のように、ＲＮＡｉによるSLC17A9のノックダウンを行った。Qiagen HP OnGuard siRNA Designによってデザインされた、ＲＮＡｉ用配列を用いた。使用したＲＮＡｉの核酸配列は、UAUUCGAGAGAAUGUCACG（配列番号１５）である。この配列を使用しHiPerFecttransfection reagent (Qiagen) was used for transfection of 25 nM AllStarsnegative control siRNA or rat SLC17A9 siRNA 25 nMで処理、３日間培養することにより、ＳＬＣ１７Ａ９のノックダウンを行った。その後、以下の文献に記載された方法に従いKCl刺激にて放出されるATP量（３０分間）を定量した。（FabbroA, Skorinsva E, Grandolfo M, Nistri A, Giniatullin R (2004) Quantalrelease of ATP from clusters of PC12 cells. J Physiol 560:505-517.）ノックダウンした細胞（ＲＮＡｉ）とコントロール細胞（コントロール）でのSLC17A9mRNA量をリアルタイムＰＣＲで測定したところ、図１９（Ａ）に示されるように、ＲＮＡｉによって、SLC17A9 mRNA量が減少していた。ＲＮＡｉによるＡＴＰ輸送活性に対する影響を試験したところ、図１９（Ｂ）に示されるように、ＫＣｌ依存性のＡＴＰ放出が、SLC17A9RNAiによって抑制された（** < 0.01, *** < 0.001）。この実験により、SLC17A9の発現産物が、ＡＴＰ輸送を担うことが確認された。【０１２７】
（実施例１９：SLC17A9のマウスホモログの精製、再構成および輸送活性測定）
（１．マウスSLC17A9(mSLC19A9) cDNAのクローニング）
マウス副腎由来のtotalRNA(Clontechより購入)をプライマー（5’-caccatgccatcccagcgctcta-3’：配列番号１６、および、5’-ttagaggtcctcatgagtggggac-3’）を用いてPCR法にてクローニングした。ＰＣＲ条件は、９４℃３分の後、９４℃  ３０秒：５６℃３０秒：７２℃  ２分のサイクルを３０サイクル繰り返し、その後、７２℃  ５分加熱した。ＰＣＲは、２０ｎｇの鋳型に、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、１ｐｍｏｌ  プライマー、１．５Ｕ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を添加し、１×Ｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬのスケールで行った。【０１２８】
次に、ＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、上記ＰＣＲによって得られたフラグメントをエントリーベクターに挿入した。具体的には、Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｆｍｏｌおよび上記のＰＣＲ産物  ２０ｆｍｏｌを用いて、６μＬのスケールで室温で反応を行った。上記反応混合物２μＬを、大腸菌Ｍａｃｈ−１に形質転換し、クローンを得た（ｐＥＮＴＥＲ／ｍＳＬＣ１７Ａ９と命名）。【０１２９】
ｐＥＮＴＥＲ／ｍＳＬＣ１７Ａ９の挿入物を、ｐＤＥＳＴ１０に組み換えた。具体的には、ｐＥＮＴＥＲ／ｍＳＬＣ１７Ａ９  １５０ｎｇに、ｐＤＥＳＴ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）７５ｎｇとｃｌｏｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを添加し、ＴＥ緩衝液を添加し、総量４μＬとし、さらに、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを加え、２５℃で３時間反応させた。その後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（終濃度０．２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１０分反応させた後、反応混合液２μＬを大腸菌ＤＨ５αの形質転換に用いた。得られたプラスミドをｐＤＥＳＴ１０／ｍＳＬＣ１７Ａ９と命名した。【０１３０】
次に、ｐＤＥＳＴ１０／ｍＳＬＣ１７Ａ９  ２０ｐｇをＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５μＬに添加し、ミニプレップ法によりＢａｃｍｉｄを回収した。【０１３１】
（２．マウスSLC17A9(mSLC19A9)発現のためのウイルスの調製）
以下の手順によって、ウイルスを作製した。３５ｍｍのプレートに９×１０５個のＳｆ９細胞を播種し、培地をＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＧＩＢＣＯ）（０．３５ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを補填）に交換し、上記で調製したＢａｃｍｉｄ  １μｇとセルフェクション（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μＬを用い、リポフェクション法にてトランスフェクションした。２７℃で５時間のインキュベート後、感染の兆候が見られるまで数日培養した。感染兆候が見られた後に、培地を回収し、遠心（５００ｇ、５分、４℃）したのち、上清のみを回収し、これをＰ１ウイルスとして使用した。【０１３２】
次に、以下の手順によって、ウイルスを単離した。１００ｍｍのプレートに６×１０６個のＳｆ９細胞を播種（５０％  コンフルエント）し、１０倍段階希釈したウイルス液１ｍＬを添加して、室温で１時間振とうした。混合プレートの培地を除いた後、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＴＭＮ−ＦＨ：４％  ＳｅａＰｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅ＝３：１の混合物  １０ｍＬを重層した。アガロースが固化した後、２７℃で７〜１０日密閉し、培養した。形成したプラークをピックアップして、再度感染させた。７２時間後、この培地をＰ１ウイルスと同様に回収し、これをＰ２ウイルスとした。このＰ２ウイルスをＳｆ９細胞に、Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝０．１〜０．２程度で感染させ、２７℃で５日間培養した。この培地を回収し、ハイタイターウイルスとした。【０１３３】
ウイルスの力価を以下の手順で測定した。１００ｍｍプレートに６．０×１０６個のＳｆ９細胞を播種し（５０％  コンフルエント）、１０倍希釈系列で１０−５から１０−８に希釈したウイルス液１ｍＬを加えて室温で１時間シーソーで振とうさせながら感染させた。各濃度につきプレートを３枚用意した。ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＴＮＭ−ＦＨとオートクレーブ滅菌後の４％  ｓｅａ  ｐｌａｑｕｅ  ａｇａｒｏｓｅを４８℃の水浴でインキュベートし、同量を無菌的に混合して再度水浴でインキュベートした。これを５ｍＬと、室温のｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＴＮＭ−ＦＨ  ５ｍＬを混合し、感染後のシャーレより培地を除いて重層した。アガロースが固まった後、静かに２７℃のインキュベーターに移し、密閉して培養した。７日から１０日ほどで形成されるプラークを計数し、ハイタイターウイルス１ｍＬあたりの力価を算出した。【０１３４】
（ウイルス感染細胞の回収と膜画分の可溶化）
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞にＭ．Ｏ．Ｉ．＝１で感染させ、２７℃で培養した。感染６０時間後の細胞をセルスクレーパーにより回収し、７００×ｇ  １０分遠心して上清を取り除いた。これをＤｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＤＴＴ、１μｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ（同仁化学）、１μｇ／ｍＬ  ロイペプチン（同仁化学）］で懸濁し、もう一度７００×ｇ  １０分遠心して上清を取り除いた。これをＤｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。これをＴＯＭＹ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  によりソニケーション（Ｏｕｔｐｕｔ  ４、３０ｓｅｃ×８回）した後、７００×ｇ  １０分遠心して上清を回収し、１００，０００×ｇ  １時間超遠心して、膜画分とした。【０１３５】
このペレットをＳｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ［２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、２％  オクチルグルコシド（同仁化学）、１０％  グリセロール、１μｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍＬ  ロイペプチン］をいれホモジナイザーを用いて懸濁し、１００，０００×ｇ  ３０分の遠心操作を行い、その上清を膜の可溶化画分とした。【０１３６】
（アフィニティカラムを用いたmSLC17A9タンパクの精製）
ＱＩＡＧＥＮ  Ｎｉ-ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒ  ｆｌｏｗレジンをエコノカラムに充填し（１ｍＬ；５０％  スラリー）、蒸留水にて洗浄した後、ｐＨ８．０のＳｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化した。ここに上記で調製した可溶化画分を入れ、４℃、４時間撹拌しながら吸着させた。これを１５ｍＬのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％  オクチルグルコシド、２０％  グリセロール、５ｍＭ  イミダゾール、１μｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍＬ  ロイペプチン］で洗浄し、イミダゾールを６０  ｍＭにした同液（Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）にて溶出し、精製タンパク質とした。【０１３７】
（再構成）
精製したｍＳＬＣ１７Ａ９タンパク２０μｇと大豆由来の脂質０．５ｍｇを混合し、−８０℃で５分以上インキュベートした。これを手で素早く解かし、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ  酢酸ナトリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、０、５ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液で３０倍に希釈した。これを４℃で１時間、２００，０００×ｇで遠心し、上清を捨て、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ  酢酸ナトリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液で再懸濁して、再構成した。【０１３８】
（ヌクレオチド輸送活性の測定）
再構成プロテオリポソームを２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ  酢酸カリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、４ｍＭ  塩化カリウムからなる緩衝液にて２７℃、２分インキュベートし、バリノマイシンを終濃度２μＭになるように加え、さらに２分インキュベートした。０．１ｍＭ［α−３２Ｐ］ＡＴＰ（３．７ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）の添加により活性測定を開始とした。所定の時点で反応液１３０μＬを回収し、セファデックスＧ−５０（ｆｉｎｅ）スピンカラムにて７６０×ｇで２分遠心した。カラムを通過した反応液に含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定することによりＡＴＰの取込みを測定した。また、阻害剤実験ではプロテオリポソームをインキュベートするときに所定の濃度の阻害剤を加えた。【０１３９】
（結果）
上記の測定法により、再構成したｍＳＬＣ１７Ａ９タンパクによるＡＴＰ輸送の経時変化を測定した。結果を、図２０に示す。図に示した各時点においてサンプリングした。Ｖａｌはバリノマイシンを意味する。【０１４０】
再構成したｍＳＬＣ１７Ａ９タンパクによるＡＴＰ輸送の速度論を図２１に示す。黒四角（■）はバリノマイシン添加時のＡＴＰ取り込み量、白丸（○）はバリノマイシンを添加しなかった時のＡＴＰ取り込み量、黒丸（●）はその差、すなわち、膜電位依存的輸送のＡＴＰ濃度依存性を示す。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈでＫｍおよびＶｍａｘを算出したところ、それぞれ、０．２３ｍＭおよび２３．８ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質と算出された。【０１４１】
次に、再構成したｍＳＬＣ１７Ａ９タンパクによるＡＴＰ輸送の阻害実験を行った。ＡＴＰ、ＧＴＰ、またはＡＤＰいずれかを２ｍＭ、あるいは、Ｅｖａｎｓ  ＢｌｕｅまたはＤＩＤＳのいずれかを２μＭ添加して、放射性ＡＴＰの取り込み（２分間）を測定した。結果を図２２に示す。輸送活性のＡＴＰ特異性が確認された。その一方で、ＧＴＰおよびＡＤＰの双方を認識し、ＡＴＰと競合することが実証された。【０１４２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明に従って、ＡＴＰ輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子が単離された。従って、本発明に従って、ＡＴＰ輸送系を人工的に再構成することが可能となった。さらに、本発明に従って、本発明のトランスポーターを用いる、中枢神経における疼痛や血小板由来のＡＴＰによる血液凝固などを処置および／または調節するための薬剤のスクリーニング法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月30日(2009.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法によって得られた、アニオン輸送タンパク質の活性調節剤。
【国際調査報告】
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