(57)【要約】本発明は、親水部に両イオン性官能基を複数有する両親媒性分子及び該両親媒性分子を構成脂質として含む分子集合体を提供する。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、生理的なｐＨ環境下で安定な小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性ｐＨ環境下で小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。本発明の分子集合体は、薬物、プローブ、核酸、タンパク質等の運搬体として利用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）：
2008143339.tif 000036
［式中、Ｒａは、一つがカチオン性官能基であり、Ｒａが複数ある場合、その他のＲａは水素原子であり、Ｒａ’は、一つがカチオン性官能基であり、Ｒａ’が複数ある場合、その他のＲａ’は水素原子であり、Ｒｂ及びＲｂ’は、それぞれ独立して、アニオン性官能基であり、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基であり、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。］
で表される両親媒性分子。
【請求項２】
水溶液中、生理的なｐＨ環境下でカチオン性官能基及びアニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオンまたはアニオンになり、酸性ｐＨ環境下でアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性ｐＨ環境下でカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する、請求項１記載の両親媒性分子。
【請求項３】
カチオン性官能基は、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基及び第４級アンモニウム塩からなる群より選ばれるものである、請求項１または２記載の両親媒性分子。
【請求項４】
アニオン性官能基は、カルボキシル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
【請求項５】
Ａ０、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−または−ＯＣＯ−である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
【請求項６】
鎖状炭化水素基がミリスチル、パルミチル、ステアリル及びオレイル基からなる群から選ばれるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
【請求項７】
式（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−８）：
2008143339.tif 000037
［式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基である。］
のいずれかで表される両親媒性分子。
【請求項８】
水溶液中、生理的なｐＨ環境下で−ＮＨ２が−ＮＨ３＋になり、かつ、−ＣＯＯＨが−ＣＯＯ−になって両イオン性を示すが、酸性ｐＨ環境下で−ＣＯＯＨのイオン化傾向が減少し、塩基性ｐＨ環境下で−ＮＨ２のイオン化傾向が減少する、請求項７記載の両親媒性分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の両親媒性分子を含む分子集合体。
【請求項１０】
生理的ｐＨ環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性ｐＨ環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させる、請求項９記載の分子集合体。
【請求項１１】
細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときに目的物質をエンドソームの外側に放出させるものである、請求項１０記載の分子集合体。
【請求項１２】
薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属イオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも１種を保持するものである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の分子集合体。
【請求項１３】
プローブまたは核酸を保持するものである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の分子集合体を含む試薬。
【請求項１４】
細胞内の遺伝子発現を制御するものである、請求項１３記載の試薬。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の試薬を含むキット。
【請求項１６】
タンパク質を保持する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ変化に応答して分子集合体に保持される物質の放出挙動を制御することが可能な分子集合体の構成成分として用いられる両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、リポソームなどの分子集合体に保持させた目的物質の放出を制御する方法として、ｐＨ応答性が汎用されている。ここで「ｐＨ応答性」とは、分子集合体がｐＨ変化に応答して分子充填状態や保持物質の放出特性などを変化させる性質をいう。特にホスファチジルエタノールアミン型リン脂質を用いたｐＨ応答性のリポソームがよく知られている（例えば、Ｄ．ＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓらＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４（１９８５）３０９１−３０９８、Ｄ．Ｈ．ＴｈｏｍｐｓｏｎらＬａｎｇｍｕｉｒ，１９（２００３）６４０８−６４１５参照）。これは、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質がｐＨに応答して構造転移し、リポソーム二分子膜の分子充填状態が変化する性質を利用したものであるが、血清存在下ではそのような構造転移が起きにくく、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実用性は低い。
さらに、ｐＨ応答性リポソームとしては、アニオン性脂質とカチオン性脂質とを混合したリポソームが知られている（Ｇ．Ｓｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８０（２００２）３０９−３１９参照）。しかし、アニオン性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせる必要があることから、目的に応じたｐＨ応答性の調整が困難である。また、カチオン性脂質自体は血中滞留性が低く、細胞毒性も高い。さらに、低ｐＨでアニオン性生体膜との融合が可能であるのはカチオン性脂質のみであることから、リポソームの融合度が低いという問題があった。
【発明の開示】
【０００３】
上記のような状況において、薬剤または核酸などを保持することができ、かつ、簡便な方法でその放出挙動を制御することができるｐＨ応答性分子集合体の開発が望まれている。特に、血中投与可能なｐＨ応答性分子集合体が求められている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、親水部に両イオン性官能基を複数有する両親媒性分子を構成成分として含む分子集合体が、生理的なｐＨ環境下で小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性ｐＨ環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性膜（アニオン性生体膜）との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることを見出し、本発明を完成させるに至った。この性質を利用することにより、生体内において、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれたｐＨ応答性分子集合体がエンドソーム内の低ｐＨ環境下でエンドソーム膜と相互作用し、その保持する目的物質を細胞質に放出させることも可能である。
すなわち、本発明は、下記の両親媒性分子、分子集合体、薬剤、試薬及びキット等を提供する。
［１］式（Ｉ）：
2008143339.tif 000002
または、式（ＩＩ）：
2008143339.tif 000003
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ１１、Ａ１２、Ａ２１及びＡ２２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基であり、ｍ、ｎ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。］
で表される両親媒性分子。
［２］式（Ｉａ）：
2008143339.tif 000004
［式中、Ｒａは、一つがカチオン性官能基であり、Ｒａが複数ある場合、その他のＲａは水素原子であり、Ｒａ’は、一つがカチオン性官能基であり、Ｒａ’が複数ある場合、その他のＲａ’は水素原子であり、Ｒｂ及びＲｂ’は、それぞれ独立して、アニオン性官能基であり、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基であり、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。］
で表される両親媒性分子。Ａ０、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であることが好ましく、−ＣＯＮＨ−がより好ましい。また、Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−または−ＯＣＯ−であることが好ましく、−ＣＯＯ−がより好ましい。
［３］水溶液中、生理的なｐＨ環境下でカチオン性官能基及びアニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオンまたはアニオンになり、酸性ｐＨ環境下でアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性ｐＨ環境下でカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する、［２］記載の両親媒性分子。
［４］カチオン性官能基は、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基及び第４級アンモニウム塩からなる群より選ばれるものである、［２］または［３］記載の両親媒性分子。
［５］アニオン性官能基は、カルボキシル基である、［２］〜［４］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［６］ｋが３であり、ｌが３であり、ｍが４であり、ｎが２である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［７］ｋが２であり、ｌが２であり、ｍが４であり、ｎが２である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［８］ｋが３であり、ｌが２であり、ｍが４であり、ｎが２である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［９］ｋが２であり、ｌが３であり、ｍが４であり、ｎが２である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［１０］ｋが３であり、ｌが３であり、ｍが４であり、ｎが１である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［１１］ｋが２であり、ｌが２であり、ｍが４であり、ｎが１である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［１２］ｋが３であり、ｌが２であり、ｍが４であり、ｎが１である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［１３］ｋが２であり、ｌが３であり、ｍが４であり、ｎが１である、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［１４］鎖状炭化水素基がミリスチル、パルミチル、ステアリル及びオレイル基からなる群から選ばれるものである、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の両親媒性分子。
［１５］式（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−８）：
2008143339.tif 000005
［式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基である。］
のいずれかで表される両親媒性分子。
［１６］水溶液中、生理的なｐＨ環境下で−ＮＨ２が−ＮＨ３＋になり、かつ、−ＣＯＯＨが−ＣＯＯ−になって両イオン性を示すが、酸性ｐＨ環境下で−ＣＯＯＨのイオン化傾向が減少し、塩基性ｐＨ環境下で−ＮＨ２のイオン化傾向が減少する、［１５］記載の両親媒性分子。
［１７］生理的なｐＨ環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性ｐＨ環境下でゼータ電位がプラスとなり、アニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させる分子集合体を構成する、両親媒性分子。
［１８］［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の両親媒性分子である、［１７］記載の両親媒性分子。
［１９］［１］〜［１８］のいずれか１項に記載の両親媒性分子を含む分子集合体。前記分子集合体は、薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属イオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも１種を保持するものであることが好ましい。
［２０］生理的ｐＨ環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性ｐＨ環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させるものである、［１９］記載の分子集合体。
［２１］分子集合体が細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときに目的物質をエンドソームの外側に放出させるものである、［１９］または［２０］に記載の分子集合体。
［２２］目的物質が、薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属イオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも１種である、［２０］または［２１］記載の分子集合体。
［２３］［２２］記載の分子集合体を含む薬剤。
［２４］静脈内投与用薬剤である［２３］記載の薬剤。
［２５］局所投与用薬剤である［２３］記載の薬剤。
［２６］プローブまたは核酸を保持する［１９］〜［２１］のいずれか１項に記載の分子集合体を含む試薬。
［２７］細胞内の遺伝子発現を制御するものである、［２６］記載の試薬。
［２８］［２６］または［２７］記載の試薬を含むキット。
［２９］タンパク質を保持する［１９］〜［２１］のいずれか１項に記載の分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。
本発明によれば、ｐＨ応答性を有する分子集合体及び両親媒性分子を提供することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、ｐＨが生理的な値よりも低くなると分子集合体に保持させた目的物質を放出する放出制御機能を有する。これにより、血中あるいは培地中に滞留していた分子集合体が、細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときにのみ、効率良く、薬物、蛋白質または核酸などをエンドソームから細胞質に放出させることが可能となる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、血中滞留時に血管壁などに吸着されやすいＮ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆａｔｅ（ＤＯＴＡＰ）、１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＤＭＲＩＥ）などのカチオン性脂質を用いることなく、目的物質を小胞体及びエンドソームの外側に送達することができる。このため、本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、アニオン性の生体膜との融合度が高く、生体適合性に優れており、血中滞留性も示すことから、ｉｎ  ｖｉｖｏ製剤としての実用性に優れている。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、アミノ酸と長鎖アルコールとから合成することができるので、血液適合性が高く、細胞毒性も低いと考えられる。また、ｐＨ応答性分子集合体の調製を低コストかつ簡便な方法で行うことができるといった利点もある。
本発明を利用することにより、高機能の薬物運搬体あるいは核酸運搬体の創製に道筋を付けることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の分子集合体が、生体内に投与された後に、血中を滞留して目的の細胞内に取り込まれ、その保持していた目的物質を放出する挙動を示した概念図である。
図２は、化合物３を膜成分とするリポソームのゼータ電位測定結果を示したグラフである。
図３は、ｐＨ応答性リポソームとアニオン性リポソームの凝集度のｐＨによる変化を示したグラフである。
図４は、ｐＨ応答性リポソームとアニオン性リポソームの各ｐＨにおける相対的な膜融合度を示したグラフである。
図５は、（化合物３）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を膜成分とするローダミン標識アルブミン内包リポソームのＣＯＳ−７及びＣＣＤ−３２ＳＫにおける細胞内動態を観察した共焦点顕微鏡写真である。
図６は、ｓｉＲＮＡを内包した（化合物３）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を膜成分とするリポソームによる、ルシフェラーゼタンパク発現ＣＨＯ細胞の遺伝子発現抑制評価の結果を示したグラフである。
図７は、（化合物３）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を膜成分とするリポソームの細胞毒性評価の結果を示したグラフである。
図８は、（化合物３）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を膜成分とするリポソーム投与後の化合物３のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定による血漿中濃度の時間変化の測定結果を示したグラフである。
図９は、（化合物３）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８を膜成分とするリポソーム投与後の化合物３のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定による臓器分布の測定結果を示したグラフである。
図１０は、（●）化合物７／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））または（○）化合物８／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））を膜成分とするリポソームのゼータ電位測定結果を示したグラフである。
図１１は、（●）化合物３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））または（○）化合物１２／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））を膜成分とするリポソームのゼータ電位測定結果を示したグラフである。
図１２は、化合物３または１２を膜成分とするリポソームと、アニオン性リポソームの各ｐＨにおける相対的な膜融合度を示したグラフである。
図１３は、ｓｉＲＮＡ内包リポソーム１（ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＤＨＳＧ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）、ｓｉＲＮＡ内包リポソーム２（αＧｌｕＧｌｕ２Ｃ１６／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）及びｓｉＲＮＡ内包リポソーム３（化合物３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）による、ルシフェラーゼタンパク発現ＣＨＯ細胞の遺伝子発現抑制評価の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、両親媒性分子、分子集合体、薬剤、試薬及びそのキット等を含むものである。以下、それぞれについて詳しく説明する。
［１］両親媒性分子
まず、本発明の両親媒性分子について述べる。
本発明の両親媒性分子は、式（Ｉ）：
2008143339.tif 000006
または、式（ＩＩ）：
2008143339.tif 000007
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ１１、Ａ１２、Ａ２１及びＡ２２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基であり、ｍ、ｎ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。］で表される構造を有している。
本発明の両親媒性分子は、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示されるように、親水部に両イオン性官能基を複数有している。ここで「両イオン性官能基」とは、生理的なｐＨ環境下及び酸性ｐＨ環境下でカチオン性を示す「カチオン性官能基」と、生理的なｐＨ環境下でアニオン性を示す「アニオン性官能基」とを併有する官能基をいう。
本発明の両親媒性分子は、このように両イオン性官能基を複数有し、ｐＨ変化によるカチオン性またはアニオン性の電荷密度が大きいために、両イオン性置換基を一つしか持たない場合に比べて、ｐＨ応答性がより鋭敏になる。
なお、本発明の技術思想に基づいて、両イオン性置換基の数をさらに増加させることもできる。例えば、式（Ｉ）における結合基Ａ１１に、さらに下式：
2008143339.tif 000008
［式中、Ｘ５及びＸ６は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、Ａ１１、Ａ１１２及びＡ１１２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、ｒは、１〜４の整数である。］
で示されるような両イオン性置換基Ｘ５及びＸ６を持つ置換基を導入することによって、両イオン性官能基を親水部に樹岐状に形成していくことも可能である。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、このように親水部に両イオン性官能基を有するものであるので、生理的なｐＨ環境下で中性を示し、酸性ｐＨ環境下でカチオン性を示し、さらには塩基性ｐＨ環境下でアニオン性を示すことができる。
本発明において、「生理的なｐＨ環境下」とは、水溶液のｐＨが中性域であること、好ましくはｐＨ６．０以上８．０未満、より好ましくは７．０以上７．６以下、さらに好ましくは７．２以上７．５以下であることをいう。
また、「酸性ｐＨ環境下」とは、水溶液のｐＨが中性域より低いこと、好ましくはｐＨ７．２未満、より好ましくはｐＨ７．０未満、さらに好ましくはｐＨ６．５未満、特に好ましくはｐＨ６．０未満、とりわけ好ましくはｐＨ５．５以下であることをいう。
さらに、「塩基性ｐＨ環境下」とは、水溶液のｐＨが中性域より高いこと、好ましくはｐＨ８．０超１２以下であることをいう。
本発明において、「カチオン性官能基」は、水溶液中、生理的なｐＨ環境下及び酸性ｐＨ環境下でカチオン性を示すものであれば特に制限されない。このようなカチオン性官能基としては、アミノ基、アンモニウム塩、グアニジノ基、イミダゾール基及びこれらの誘導体などが挙げられる。ここで「誘導体」とは、アミノ基、アンモニウム塩、グアニジノ基、イミダゾール基のもつ水素原子が、低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）、アミノアルキル基（アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど）、これに対応するオリゴ糖のアルキル基、水酸基、ヒドロキシルアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴオキシアルキル基（オリゴオキシメチル、オリゴオキシエチル、オリゴオキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物をいう。これらの中でも、好ましいカチオン性官能基としては、１級アミノ基（−ＮＨ２）、２級アミノ基（−ＮＨＲ）、３級アミノ基（−ＮＲ２）または４級アンモニウム塩（−ＮＲ３＋Ｘ−）などが挙げられる。ここで、Ｒは、それぞれ独立して、低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）を示し、Ｘはハロゲン原子又は炭素数１〜２のアルキル硫酸あるいはパラトルエンスルホン酸を示す。中でも、１級アミノ基が特に好ましい。
本発明において、「アニオン性官能基」は、水溶液中、生理的ｐＨ環境下及び塩基性ｐＨ環境下でアニオン性を示すものであれば特に制限されない。例えば、このようなアニオン性官能基としては、カルボキシル基が好ましい。
本発明において、両イオン性官能基の構造は特に制限されないが、分子集合体を形成したときにより表面側にアニオン性官能基が位置する構造であることが好ましい。より具体的には、カチオン性官能基とアニオン性官能基とがメチレンスペーサーを介して結合していることが好ましく、特にメチレン基が１または２のメチレンスペーサーを介して結合していることがより好ましく、とりわけカチオン性官能基側は疎水部を構成する側に結合している構造であることが好ましい。
本発明の一実施形態において、本発明の両親媒性分子は、式（Ｉａ）で表されるものであることが好ましい。
2008143339.tif 000009
［式中、Ｒａは、一つがカチオン性官能基であり、Ｒａが複数ある場合、その他のＲａは水素原子であり、Ｒａ’は、一つがカチオン性官能基であり、Ｒａ’が複数ある場合、その他のＲａ’は水素原子であり、Ｒｂ及びＲｂ’は、それぞれ独立して、アニオン性官能基であり、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基であり、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。］
本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、水溶液中、生理的なｐＨ環境下でカチオン性官能基及びアニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオン性官能基はカチオンになり、アニオン性官能基はアニオンになるが、酸性ｐＨ環境下ではアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性ｐＨ環境下ではカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する。ここで、「イオン化傾向が減少する」とは、生理的なｐＨ環境下において示したイオン化比率よりもイオン化比率が減少することをいう。
本発明において、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ１１、Ａ１２、Ａ２１及びＡ２２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−である。Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ１１、Ａ１２、Ａ２１及びＡ２２は、それぞれ独立して、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−が好ましく、特に−ＣＯＮＨ−が好ましい。Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ１１、Ａ１２、Ａ２１またはＡ２２が−ＣＯＮＨ−であると、天然のアミノ酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。なお、本明細書において「−結合基−」のように表記した場合、結合位置は、紙面左側が親水部、右側が疎水部である。Ａ３及びＡ４は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−または−ＯＣＯ−が好ましく、特に−ＣＯＯ−が好ましい。Ａ３またはＡ４が−ＣＯＯ−であると、天然のアミノ酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。
本発明において、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の鎖状炭化水素基である。鎖状炭化水素基は、共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に限定されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよく、直鎖であることが好ましい。また、鎖状炭化水素基は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、イソプレノイド鎖、ビニル基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。鎖状炭化水素基の炭素数は、１２〜２０が好ましく、１４〜１８がより好ましい。また、鎖状炭化水素基は二重結合や三重結合などの不飽和結合を有していてもよく、その場合にその数は１〜４が好ましい。炭化水素鎖は分岐鎖であってもよく、分岐鎖としては、例えば、長鎖にイソプレノイド構造を持つものが挙げられる。本発明において、鎖状炭化水素基は、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、及びオレイル基からなる群から選ばれる基であることが好ましく、特にパルミチル基であることが好ましい。鎖状炭化水素基で構成される疎水部と親水部との組み合わせによって分子集合体を形成した際のゼータ電位挙動やアニオン性生体膜に対する融合度を調整することが可能である。鎖状炭化水素基は、親−疎水バランスを考慮しながら、両親媒性分子の親水部との組み合わせ、分子集合体の組成、目的及び用途等に応じて適宜選択すればよい。
本発明において、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。ｋは３であることが好ましく、ｌは３であることが好ましい。ｋ及びｌが３であると、グルタミン酸やその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。また、ｋまたはｌが２であると、アスパラギン酸やその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格である。但し、ｋ及びｌの両方が２であると分子集合体を形成するときに小胞体構造を形成しにくい場合があるため、ｋまたはｌのいずれか一方は３であることが好ましい。尚、カチオン性官能基とアニオン性官能基とはメチレンスペーサーを介して結合していてもよく、カチオン性官能基とアニオン性官能基とが同一の炭素原子に結合していてもよいが、既に述べたとおり、カチオン性官能基とアニオン性官能基とはメチレンスペーサーを介して結合していることが好ましく、特にメチレン基が１または２のメチレンスペーサーを介して結合していることがより好ましい。
また、ｍ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、１〜４の整数であるが、４であることが好ましい。ｍ、ｐ及びｑが４であるとリジンを原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格である。
ｎは１〜４の整数であるが、２〜４であることが好ましい。ｎが２〜４であると、二分子膜中で本発明の両親媒性分子の鎖状炭化水素基を膜平面に対して略垂直に配向させることが期待できる。また、ｎが２〜４であると、水溶液中で両親媒性分子が集合して形成する二分子膜の親−疎水界面が安定であり小胞体構造を形成しやすい。さらに、ｎが２であると、グルタミン酸及びその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点もある。ｎが１であると、アスパラギン酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるが、ｎが２の場合に比べて分子集合体の小胞体構造を形成しにくい場合がある。
式（Ｉａ）における好ましいｋ、ｌ、ｍ及びｎの組み合わせ（ｋ，ｌ，ｍ，ｎ）は、（３，３，４，２）、（２，２，４，２）、（３，２，４，２）、（２，３，４，２）、（３，３，４，１）、（２，２，４，１）、（３，２，４，１）（２，３，４，１）などである。
本発明の両親媒性分子の好ましい実施態様を以下に示す。
2008143339.tif 000010
［式中、Ｒｃ及びＲｄは、前記で定義したとおりである。］
これらの中でも、本発明においては、上記式（Ｉａ−１）、（Ｉａ−２）及び（Ｉａ−４）で示される化合物が好ましく、特に上記式（Ｉａ−１）で示される化合物が好ましい。式中のＲｃ及びＲｄの好適例は、前記したとおりである。
本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−８）で表される本発明の両親媒性分子は、水溶液中では、生理的なｐＨ環境下で−ＮＨ２が−ＮＨ３＋になり、かつ、−ＣＯＯＨが−ＣＯＯ−になって両イオン性を示すが、酸性ｐＨ環境下で−ＣＯＯＨのイオン化傾向が減少し、塩基性ｐＨ環境下で−ＮＨ２のイオン化傾向が減少する。
本発明の両親媒性分子は、公知の反応を組み合わせることによって極めて簡便な方法で製造することができる。例えば、本発明の両親媒性分子は三官能性化合物を順次反応させ、例えば、下記式（Ｉ）：
2008143339.tif 000011
または、式（ＩＩ）：
2008143339.tif 000012
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、Ａ０、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ１１、Ａ１２、Ａ２１及びＡ２２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−であり、ｍ、ｎ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して、１〜４の整数である。］
で表されるようなコア構造を作製する。鎖状炭化水素基は、予め鎖状炭化水素基の供給源を三官能性化合物の一つと反応させて導入し、それを他の三官能性化合物と順次反応させてもよいし、２つ以上の三官能性化合物からなる複合体に導入してもよい。
本発明に用いられる三官能性化合物は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の反応性官能基を少なくとも３つ有するものであれば特に制限されない。例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの各種アミノ酸またはその誘導体、グリセロール、オリゴ糖類、オリゴペプチド類、ポリエステル類、ビニル系オリゴマーまたはこれらから構成される多分岐構造、例えばデンドロン構造などが挙げられる。
ここで、「アミノ酸の誘導体」とは、アミノ酸に含まれる水素原子が、低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル等）、アミノアルキル基（アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど）や対応するオリゴアミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴオキシアルキル基（オリゴオキシメチル基、オリゴオキシエチル基、オリゴオキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物が含まれる。
例えば、リジンの繰り返しからなるオリゴペプチド鎖は、側鎖にアミノ基を任意の数だけ有しており、そこに両イオン性官能基をアミド結合にて任意の数だけ導入することができる。疎水部はオリゴペプチド鎖のＮ末端のカルボキシル基に結合することができる。リジンからなるモノデンドロンでは、末端の官能基の数を世代数にて制御することができる。すなわち、第一世代では２個、第二世代では４個、第三世代では８個となる。
本発明に用いられる鎖状炭化水素基の供給源は、三官能性化合物あるいはそれらからなるコア構造と共有結合しうる反応性官能基、例えばアミノ基、水酸基またはカルボキシル基などを有する鎖状炭化水素基であれば特に制限されない。
本発明に用いられるカルボキシル基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、脂肪酸が挙げられる。例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等であり、それぞれ分岐鎖体も含まれる。また、それらの酸無水物、または酸クロライドも含まれる。
また、アミノ基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一アミンとして、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ヘプタデシルアミン、オクタデシルアミン、ドコシルアミン、オレイルアミン等が挙げられ、それらの分岐鎖体も含まれる。さらに分岐状のイソプレノイド等のアミンも使用できる。また、アミノ基を有する脂肪族炭化水素基の供給源には、Ｎ−メチル−ドデシルアミン、Ｎ−メチル−テトラデシルアミン、Ｎ−メチル−ヘキサデシルアミン、Ｎ−エチル−ドデシルアミン、Ｎ−エチル−テトラデシルアミン、Ｎ−エチル−ヘキサデシルアミン、Ｎ−プロピル−ドデシルアミン、Ｎ−プロピル−テトラデシルアミン、Ｎ−プロピル−ヘキサデシルアミン、ジオレイルアミン等の第二アミンも含まれ、それらの分岐鎖体も用いられる。
水酸基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一飽和アルコールとしてラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等が挙げられる。その他、１，１−ドデセノール、１−オレイルアルコール、リノレニルアルコール等の直鎖第一飽和アルコール、分岐第一飽和アルコール、分岐第一不飽和アルコール、第二飽和アルコールあるいは第二不飽和アルコールが挙げられる。また、これらアルコール類をグリセリンの１，３−位あるいは１，２−位に結合したジアルキルグリセロール、第一飽和アルコール及び第一不飽和アルコールで構成されたジアルキルグリセロールが挙げられる。
その他、本発明に用いられる鎖状炭化水素基の供給源としては、ステロール類が挙げられる。例えば、コレステロール、コレスタノール、シトステロール及びエルゴステロール等である。
本発明の両親媒性分子の代表的な合成経路を示すと以下のとおりである。
2008143339.tif 000013
まず、化合物（ａ）に、鎖状炭化水素基の供給源（例えば、Ｒｃ−ＯＨまたはＲｄ−ＯＨ）を反応させ、化合物（ｂ）を得る。反応は、酸触媒による脱水縮合反応、活性エステル化法、酸無水物法、混合酸無水物法、カルボン酸ハロゲン化法、カルボン酸アジド法等を用いて行うことができる。中でも、酸触媒による脱水縮合が最も簡便であり、精製も容易であるので好ましい。脱水縮合反応は常法に従い行うことができる。但し、酸触媒による脱水縮合の場合、加熱を必要とするため、原料が熱に対して不安定な場合は他の方法を選択するのが好ましい。なお、目的の部位で目的の反応を生じさせるために、必要に応じて、化合物（ａ）の反応性官能基をｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等の保護基で保護しておくことが好ましい。
次に、上記で得られた化合物（ｂ）に、化合物（ｃ）を反応させ、化合物（ｄ）を得る。化合物（ｃ）は、予めアミノ基をｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などにより保護し、カルボキシル基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。次の工程で、化合物（ｅ）及び（ｅ’）が異なる化合物である場合、化合物（ｃ）の２つのアミノ基は、それぞれ反応性の異なる保護基で保護しておくことが好ましい。例えば、一方をｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護し、他方をベンジルオキシカルボニル基で保護しておくと、次の工程で化合物（ｅ）または（ｅ’）を化合物（ｃ）のそれぞれのアミノ基と選択的に反応させることができる。反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いることができる。また、通常のペプチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともできる。なお、反応は、第三級アミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。
反応終了後は、トリフルオロ酢酸などの酸で処理して脱保護し、常法により精製して化合物（ｄ）を得ることができる。なお、反応の終点は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、核磁気共鳴スペクトル及び赤外吸収スペクトル等によって確認することができる。
次いで、得られた化合物（ｄ）のアミノ基に化合物（ｅ）及び（ｅ’）を反応させる。化合物（ｅ）及び（ｅ’）は、予め、アミノ基をｔｅｒｔ−ブトキシ基などにより保護し、カルボキシル基は一方をｔｅｒｔ−ブトキシ基で保護し、他方をＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いることができる。また、通常のペプチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともできる。反応は、第三級アミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。
反応終了後は、上記と同様にして脱保護し、常法に従い精製して化合物（ｆ）を得ることができる。反応の終点は、上記と同様にして確認することができる。
なお、上記反応は、いずれも室温で行うことができる。また、反応は、加圧、減圧または大気圧のいずれの圧力下でも行うことができるが、操作が簡便であることから、大気圧雰囲気下で行うことが望ましい。
本発明の両親媒性分子は、上記のようにして製造することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子を分子集合体の構成成分として用いることにより、生理的条件下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性条件下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。
本発明の両親媒性分子は、親水部にカチオン性官能基とアニオン性官能基とを有することにより上記のような特性を有する分子集合体を構成することができるものであれば、その構造は前記したものに限られない。本発明の技術思想に基づき、設計変更等された化合物であって、上記のような機能を奏するものであればすべて、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
［２］分子集合体
本発明の分子集合体は、その構成成分として、前述した本発明の両親媒性分子を含む。ここで「分子集合体」とは、本発明の両親媒性分子を、必要に応じてステロイド類及び他の両親媒性分子と共に水系媒体に分散させたときに形成される特定の形態をもつ分子の集合物をいう。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、その構成成分として本発明の両親媒性分子を含むものであるので、ｐＨ応答性を示すことができる。すなわち、水溶液中、生理的なｐＨ環境下ではゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成するが、酸性ｐＨ環境下では本発明の両親媒性分子においてアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、分子集合体の正味の電荷がカチオン性になるため、ゼータ電位がプラスとなり、アニオン性生体膜と相互作用しやすくなる。より好ましくは、本発明の分子集合体は、生理的なｐＨ環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性ｐＨ環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。
本発明の分子集合体のゼータ電位がマイナスからプラスに変化するｐＨ範囲は特に限定されるものではない。本発明の分子集合体のゼータ電位がマイナスからプラスに変化するｐＨ範囲は、用いる両親媒性分子の種類や他の構成成分との組み合わせ及びその配合比等によって調整可能であり、目的や用途等に応じて適宜選択することができる。本発明の分子集合体のゼータ電位がマイナスからプラスに変化する好ましいｐＨ範囲は４．０以上、より好ましくは４．５以上、さらに好ましくは５．０以上、特に好ましくは５．５以上である。また、該ｐＨは、好ましくは７．２未満、より好ましくは７．０未満、さらに好ましくは６．５未満、特に好ましくは６．０未満、とりわけ好ましくはｐＨ５．５以下である。本明細書では、これらの上限と下限を自由に組み合わせた範囲が開示されているものとする。
本発明の一実施形態において、本発明の分子集合体は、エンドソーム内環境の代表的なｐＨ４．０〜６．０にてゼータ電位がマイナスからプラスに変化することができるため、標的細胞に取り込まれた際にエンドソーム膜融合して保持している目的物質を細胞質側に放出する能力が高いと考えられる。
本発明の分子集合体が示すこのような挙動は、水溶液のｐＨに応答して、両親媒性分子の親水部の電荷バランスが変化し、それが分子集合体の分子充填状態に影響して分子集合体の構造が変化することによって生じるものと考えられる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体の上記性質を利用することにより、目的物質を目的患部に効率よく送達させることができる。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、細胞内のアニオン性生体膜であるエンドソームに取り込まれたときに目的物質をエンドソームの外側の細胞質に放出させることができる。
以下、図面を参照しながら本発明の分子集合体の放出挙動について説明する。図１は、本発明の分子集合体が、目的の細胞内に取り込まれ、その保持していた目的物質を放出する挙動を示した概念図である。
まず、本発明の分子集合体は、細胞内に取り込まれる前は、生理的なｐＨ環境下で分子集合体の小胞体構造を保持し、内包物を安定に保持している（図１（ａ））。生理的なｐＨ環境下では、分子集合体のゼータ電位は中性またはマイナスであることから、例えば血中に投与した際には、血中滞留時の表面電位がマイナスである血管壁などへの吸着は回避され、良好な血中滞留性を示す。この分子集合体は、生体内を循環しながら細胞膜に近づき、そこでエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる（図１（ｂ））。
エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた分子集合体は、エンドソーム内の酸性ｐＨ環境下でゼータ電位が中性またはマイナスからプラスに変化し、負電荷脂質が豊富なエンドソーム膜はゼータ電位がマイナスであるためにエンドソーム膜への吸着が促進される。そして、エンドソーム膜との相互作用（好ましくは融合）により分子集合体の小胞体構造が変化する。これによって、保持していた目的物質をエンドソームの外側に放出させることができる（図１（ｃ））。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、エンドソームの環境に近いｐＨ環境下で目的物質を送達させることができるため、より多くの目的物質を短時間で細胞質内に送達させることができる。
通常、異物は、細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた後、分解酵素を含むライソソームにおいて消化されてしまう。これに対し、本発明の分子集合体は目的物質を分子集合体に保持させたものであるので、ライソソームにおける分解を受ける前に目的物質を細胞内あるいは核内に効率よく送達させることが可能である。なお、図１は一例であり、分子集合体の形状、目的物質の保持方法、目的物質の放出挙動などは図１に何ら制限されない。
本発明の分子集合体において、使用する本発明の両親媒性分子は１種であっても、２種以上の組み合わせであってもよい。本発明の分子集合体における両親媒性分子の含有量は、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、１０〜１００モル％が好ましく、２０〜８０モル％がより好ましく、３０〜６０モル％がさらに好ましい。本発明の両親媒性分子の含有量が高いほど、目的物質の放出速度または放出率を高めることができる。本発明の両親媒性分子の含有量は、目的物質を導入したい体内の部位、所望の放出率または所望の放出速度などによって適宜調整することができる。
本発明の分子集合体はまた、本発明の両親媒性分子に加えて、他の構成成分を含むことができる。例えば、本発明の分子集合体はステロイド類を含むことができる。ステロイド類としては、ステロール類、胆汁酸、プロビタミンＤ、ステロイドホルモンなど、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する全てのステロイドが挙げられる。中でもステロール類を用いることが好ましい。ステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等が挙げられる。中でもコレステロールを用いることが好ましい。
本発明の分子集合体に用いられるステロイド類の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、１０〜６０モル％が好ましく、２０〜５０モル％がより好ましい。ステロイド類は、分子集合体の安定化剤として作用することができるので、所望の放出速度及び放出率などに応じて適宜調整すればよい。これらのステロイド類は１種でも２種以上を組み合わせて使用してもよい。
さらに、本発明の分子集合体は、本発明の目的を損なわない範囲、特に、本発明の分子集合体を血中投与する場合は血中滞留性に悪影響を及ぼさない範囲であれば、本発明の両親媒性分子以外の両イオン性脂質、カチオン性脂質及びアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも１種のイオン性の脂質成分を含んでもよい。
これらのイオン性脂質は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用することもできる。これらの脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、０〜９０モル％が好ましく、０〜５０モル％がより好ましい。但し、これらのカチオン性脂質は、血中滞留時の血管壁などに吸着されやすいことから、分子集合体の血中滞留性を低下させる場合があるので、カチオン性脂質の使用量は、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、０〜５０モル％程度であることが好ましい。
さらに本発明の分子集合体には、ポリエチレングリコール型脂質を含有することもできる。ポリエチレングリコール型脂質を構成成分として用いることにより、分子集合体の凝集が抑制され、生体内に投与された後の血中滞留時間を延長させることができる。ポリエチレングリコール型脂質は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用することもできる。これらのポリエチレングリコール型脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、０〜３０モル％が好ましく、０．１〜０．５モル％がより好ましい。本発明に用いることができるポリエチレングリコール型脂質のポリエチレングリコール部の分子量は特に制限されないが、２００〜５万程度であることが好ましく、５０００〜２万程度であることがより好ましい。
その他、本発明の分子集合体は、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルエタノールアミン類、スフィンゴミエリン、多種の糖脂質など分子集合体の構成成分として知られているリン脂質を１種または２種以上含有することができる。これらの脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、０〜８０モル％が好ましく、４０〜７０モル％がより好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は目的物質を保持している。ここで「分子集合体が目的物質を保持している」とは、分子集合体内部の親水領域（水相）あるいは脂質二分子膜内または分子膜の外側表面に目的物質が相互作用している状態のことをいう。例えば、（ｉ）水溶性もしくは疎水性の目的物質が分子集合体内部の水相に局在する状態、（ｉｉ）水溶性もしくは疎水性の目的物質が親水性高分子により包括されている複合体が、分子集合体内部の水相に局在する状態、あるいは（ｉｉｉ）疎水性の目的物質が二分子膜内の疎水領域または二分子膜の外側表面に局在する状態などが挙げられる。
本発明の分子集合体に用いられる目的物質は、本発明の分子集合体に保持することができるものであれば特に限定されない。目的物質は、標的となる臓器または組織、細胞の少なくとも一つに作用するものであることが好ましい。例えば、薬物、プローブ、核酸（任意のＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを含む）、タンパク質、ペプチド、金属イオン（任意のリチウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、銅イオン等を含む）及び金属錯体（任意の鉄錯体、銅錯体、白金錯体、ガドリニウム錯体、バナジウム錯体、亜鉛錯体、マンガン錯体を含む）からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体に保持されたこれらの物質は、エンドサイトーシスによって細胞内のエンドソーム内に取り込まれた後、細胞質内に放出されることにより、効率良く細胞内に送達することができる。本発明の分子集合体に保持させる目的物質の分子量は、通常５〜１００００００、好ましくは３０〜１００００００、より好ましくは２００〜５０００００、さらに好ましくは３００〜１０００００である。
本発明に用いられる目的物質は、例えば、酵素、ペプチドまたはタンパク質、抗体（単鎖抗体含む）、受容体、リガンド、各種抗生物質、各種ペプチド性ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、プローブ、各種抗がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官及び肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤、診断用薬などが挙げられる。ペプチドまたはタンパク質の一例としては、抗体、受容体、リガンド、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、細胞成長因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ケラチン、プロテオグリカン等細胞外マトリックス剤としてのポリペプチドまたはその構造の一部としてのオリゴ体、あるいはオキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の機能性ポリペプチドが挙げられる。酵素としては、カタラーゼ、キモトリプシン、チトクローム、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに何ら限定されるものではない。プローブの一例としては、抗体、抗原、色素、あるいは蛍光色素など諸種の標識体や活性物質などが挙げられる。これらの物質は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
本発明の分子集合体に保持される目的物質の含有量は、目的物質の種類または目的等によって大きく異なるものではあるが、分子集合体の構成成分の全重量（但し、目的物質の重量を除く）に対して、０．００１〜１０００重量％が好ましく、０．０１〜２００重量％がより好ましく、０．１〜５０重量％がさらに好ましい。
本発明の分子集合体の形状は特に制限されないが、例えば、高分子集合体（ポリマーコンプレックス、高分子ミセル、高分子化リポソーム等）、エマルジョン、リピドマイクロスフィア、二分子膜小胞体（リポソーム）、その他の分子集合体（チューブ、ファイバー、リボン、シート等）などが挙げられる。中でも、リポソームであることが好ましい。
本発明の分子集合体がリポソームである場合、リポソームを水性媒体中に分散させると、リポソームは内水相を含むことができる。このとき、分子集合体に保持されている目的物質は、リポソーム内水相に溶解または分散しているものであることが好ましい。あるいは、リポソーム二分子膜の疎水性領域内に目的物質を保持させるなど、目的物質が二分子膜内に局在したものであってもよい。
なお、本明細書において、分子集合体の構成成分の含有量をいう場合、内水相は考慮しないこととする。
本発明の分子集合体の粒径は、２５〜１００００ｎｍが好ましく、１００〜５００ｎｍがより好ましく、１５０〜３００ｎｍがさらに好ましい。
本発明の分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、リポソームの製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、高速攪拌法、フレンチプレス法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などを用いて製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールまたはエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、オクチルグリコシドまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。
本発明の分子集合体に目的物質を保持させる方法は、目的物質の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば目的物質が水溶性薬物である場合は、分子集合体の製造時に該薬物を水相に溶解し、前述した方法で分子集合体を形成する際に、分子集合体（例えばリポソームの内水相）に内包させることができる。あるいは膜透過性のある水溶性薬物の場合には、分子集合体（リポソーム）を形成させてから、外水相に薬物を溶解して、膜透過性を利用して内水相に内包させることができる。内包されなかった水溶性物質はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。
あるいは、目的物質が脂溶性や両親媒性の薬物である場合は、単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で当該薬物を混合して、前述した方法で分子集合体を形成することにより、分子集合体の疎水部（例えばリポソームの二分子膜内）に薬物を保持させることができる。あるいは前述した方法で分子集合体の分散液を調製してからエタノールやＤＭＳＯなど水と混ざる溶媒に薬物を溶解した溶液を添加して薬物を疎水部に保持させることができる。
目的物質がプローブ、核酸またはタンパク質などの場合は、上記と同様の方法で分子集合体に目的物質を保持させるか、あるいは分子集合体の外側表面に目的物質を局在させることにより目的物質を保持することができる。
［３］分子集合体の用途
（１）薬剤
例えば、本発明の分子集合体に薬物を保持させた場合、本発明の分子集合体は薬剤として使用することができる。薬物の含有量は、薬物の種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量（但し、目的物質の重量を除く）に対して０．００１〜１０００重量％が好ましく、０．０１〜１００重量％がより好ましく、０．１〜１０重量％がさらに好ましい。本発明の薬剤の投与方法は特に限定されない。本発明の薬剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由、さらには疾患部位に対して直接投与（局所投与）することができる。本発明の薬剤の投与量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重１ｋｇ当たり、１日につき、約０．００１〜約１４００ｍｇ（分子集合体の構成成分（脂質）重量）である。
本発明の分子集合体に保持する薬物としては、各種抗がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官及び肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤などが含まれる。
（２）試薬、診断薬及びキット
また、本発明の分子集合体にプローブ、抗体または核酸を保持させた場合、本発明の分子集合体は試薬または診断薬として使用することができる。例えば、本発明の分子集合体にプローブを保持させた場合、本発明の分子集合体は遺伝子等の生体物質検出用試薬・診断薬に、または細胞内物質の局在または機能を診断するための試薬として有用である。
本発明に用いられるプローブは、遺伝子、遺伝子産物等の特定の物質、部位、状態などを検出するための分子であれば特に制限されない。プローブの一例としては、抗体、抗原、色素あるいは蛍光色素など諸種の標識体または活性物質が挙げられる。このうち、生理活性物質（生体に対して作用する物質）として、例えば核酸、タンパク質、その他小分子を含む。例えば、プローブとして蛍光色素を保持させた場合、本発明の試薬は、生体内でのリポソームの局在部位を検出する際などに使用することができる。
本発明の分子集合体に保持させるプローブの含有量は、その種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量（但し、目的物質の重量を除く）に対して０．００１〜１０００重量％が好ましく、０．０１〜１００重量％がより好ましく、０．１〜１０重量％がさらに好ましい。
また、例えば、本発明の分子集合体に核酸を保持させた場合、本発明の分子集合体は核酸導入剤として有用である。本発明の分子集合体を含む核酸導入剤は、ライソソームによって消化されることなく、細胞質内あるいは細胞核内に効率良く目的遺伝子を送達することができるので遺伝子治療等に有用である。
例えば、本発明の分子集合体に、デコイＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡなどの遺伝子発現を制御する核酸を保持させることにより、特定遺伝子のノックダウンを促す試薬等として有用である。
本発明の試薬を遺伝子治療に用いるときは、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接生体内に投与することができる。
本発明の試薬を核酸導入に用いるときは、その使用量は、細胞１×１０４個あたり０．００１〜１００ｐｍｏｌ、好ましくは０．１〜１０ｐｍｏｌ程度の量（分子集合体の構成成分（脂質）モル数）であるが、従来の遺伝子導入試薬として用いられてきたリポフェクトアミン、トランソーム、ＤＯＴＡＰおよびＤＭＲＩＥなどのカチオン性脂質を構成脂質にしたリポソーム試薬等の使用量を参考にして適宜設定することができる。この用量により、従来の遺伝子導入試薬（リポフェクトアミン）に比べて細胞毒性を伴うことなく同程度の導入効率が得られる。
また、本発明は、上記試薬または診断薬を含む、生体物質検出用、細胞内物質の局在または機能診断用あるいは遺伝子治療用キットを提供する。本発明のキットには、緩衝液、ｐＨ調整剤、細胞保護液などを単独で、または適宜組み合わせて含めることができる。必要に応じて、トランスフェクションの対照として用いられる標準核酸を含んでもよい。このような核酸としては、レポーター又はマーカータンパク質（例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等）をコードする核酸が挙げられる。核酸は、プラスミドベクターの形態であってもよい。さらに、本発明のキットには、必要に応じて例えばＤＥＡＥデキストラン等のトランスフェクション増強試薬及び他の添加剤を含めることが可能である。さらに、本発明のキットには、遺伝子、遺伝子産物等の特定の物質、部位、状態などを検出するための使用説明書あるいは核酸を導入するための使用説明書を含めることができる。キットに含まれる各成分は、例えば、各成分を容器中に封入した包装形態としてもよい。
（３）酵素補充治療用タンパク質製剤
本発明の分子集合体にタンパク質を保持させた場合、本発明の分子集合体は酵素補充治療用製剤として使用することができる。タンパク質としては、アデノシンデアミナーゼ、一酸化窒素合成酵素、スーパーオキシドディスムターゼ、アルギノコハク酸合成酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼなどが挙げられる。本発明の酵素補充治療用製剤は、例えば、特定酵素の発現が全くあるいは十分に行われない患者に対して用いることができる。タンパク質の含有量は、種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量（但し、目的物質の重量を除く）に対して０．００１〜１０００重量％が好ましく、０．０１〜２００重量％がより好ましく、０．１〜５０重量％がさらに好ましい。本製剤の投与方法は、特に限定されない。本製剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由で投与することができる。製剤の使用量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重１ｋｇ当たり、１日につき、約０．００１〜約１４００ｍｇ（分子集合体の構成成分（脂質）重量）である。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されない。
〔実施例１〕
ｐＨ応答性両親媒性分子（ＧＧＬＧ：Ｉａ−１）の合成
工程（Ａ）：ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１００ｍＬ）を８５℃にて沸点還流し、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋを用いて反応前に水を除去した。反応液にグルタミン酸（２．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）とヘキサデシルアルコール（１０．７ｇ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、１０時間かけて生成水を除去しながら沸点還流した。反応の進行に伴い、懸濁液は徐々に溶解し透明に変化した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃にて再結晶し、化合物１（収率８３％）を白色粉末で得た。
2008143339.tif 000014
（１）化合物１の分析結果は以下のとおりであった。
薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８３（モノスポット））。
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２５（ｂｒ，５２Ｈ，ａｌｋｙｌ）；１．６２（ｍ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−）；１．８４（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２−）；２．０８（ｍ，１Ｈ，ｇｌｕ  β−ＣＨ２−）；２．４５（ｔ，２Ｈ，ｇｌｕ  γ−ＣＨ２−）；３．４５（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−）；４．０６，４．１２（ｔ，４Ｈ，−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−）
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃａｌｃｄ：５９５．９；Ｆｏｕｎｄ：５９７．３（ＭＨ）＋．
工程（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた化合物１（１．０ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（２０２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、アミノ基をｔ−ブトキシ基で保護し、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたリジン（６１７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加し、さらに６時間室温で撹拌した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過して、アミノ基が保護されたリジン誘導体を得た。
得られた誘導体にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を加え、４℃で、２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で４回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、ろ過し、乾燥して、化合物２（８０％）を白色粉末として得た。
2008143339.tif 000015
化合物２の分析結果は以下のとおりであった。
（２）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．６３（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）；１６７３（νＣ＝Ｏ，ａｍｉｄｅ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８３（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．１９（ｂｒ，５２Ｈ，−ＣＨ２−）；４．３３（ｄ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−）；４．５０（ｂｒ，１Ｈ，ｌｙｓ  α−ＣＨ−）；７．８，８．２（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ２）
工程（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた化合物２（５００ｍｇ，６９１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１０７μｌ，８２９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、アミノ基がｔ−ブトキシ基、γ−カルボキシル基がｔ−ブチルエステル基で保護され、α−カルボキシル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたグルタミン酸（６３９ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに６時間室温で撹拌した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過して、アミノ基を保護したリジン誘導体を得た。
得られたリジン誘導体にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を加え、４℃で、２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧乾燥して、本発明の両親媒性分子である化合物３（ＧＧＬＧ：Ｉａ−１）（６５％）を白色粉末として得た。
2008143339.tif 000016
化合物３の分析結果は以下のとおりであった。
（３）：薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（４／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０５（モノスポット））
赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：１７３７（νＣ＝Ｏ，ｅｓｔｅｒ）；１６７３（νＣ＝Ｏ，ａｍｉｄｅ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２３（ｂｒ，５２Ｈ，ａｌｋｙｌ）；３．８８，３．９３（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−Ｌｙｓ−）；４．３４（ｑ，１Ｈ，ｌｙｓ  α−ＣＨ−）；４．４４（ｑ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−ＣＯＯ−）
合成された本発明の両親媒性分子は、三段階で合成でき、精製も再結晶のみで行うことができるため、短時間でかつ簡便な方法で４０％超の高収率で大量合成できる利点を持つ。これは、現在までに報告されているＤＯＰＥなどのリン脂質誘導体と比較しても格段に有利な点である。
〔実施例２〕
リポソームの調製
化合物３（１７４ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）、コレステロール（６９．３ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏ−１，５−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８：ＰＥＧ，Ｍｗ５０００）（６．０ｍｇ、１．０μｍｏｌ）をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質２０ｍｇを注射用水１ｍＬに分散し、６時間攪拌後、高圧押出法（最終孔径０．２２μｍ）にて粒子径約２２５ｎｍのリポソーム（以下、「ｐＨ応答性リポソーム」という場合がある。）を調製した。
（ゼータ電位測定）
調製したリポソーム（［ｌｉｐｉｄ］＝１０ｍｇ／ｍｌ）をｐＨ７．４，７，６，５，４の酢酸緩衝液（３０ｍＭ）にそれぞれ添加し、最終濃度を［ｌｉｐｉｄ］＝１ｍｇ／ｍＬとして３７℃におけるゼータ電位を測定した。Ｍａｌｖｅｒｎ社製の型式Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４を用いて、測定濃度に希釈したリポソーム分散液をキャピラリーセルに充填し、３７℃にて３回測定した。その結果を図２に示す。
図２からわかるように、化合物３を構成成分とするリポソームは、ｐＨの低下に伴ってゼータ電位が上昇し、マイナスからプラスへと変化した。これは、ｐＨ７．４ではリポソームのゼータ電位がマイナスであり、親水部のγ位のカルボキシル基がアミノ基よりも表面に突出しているためであると考えられる。すなわち、ｐＨの低下（ｐＨ５−６）に伴い、ゼータ電位がプラスとなるのはグルタミン酸のカルボキシル基が解離状態から非解離状態になったためであると考えられる。図２において、（○）は化合物３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））のゼータ電位変化を示す。
（アニオン性生体膜との相互作用の検討１）
エンドソーム膜はホスファチジルセリン（ＰＳ），ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）などのアニオン性脂質が多く含有することが知られている。そこで、エンドソーム内におけるｐＨ応答性リポソームの挙動解析として、アニオン性生体膜への吸着作用を明らかとするために、アニオン性リポソーム（ｃ．ａ．２５０ｎｍ）とｐＨ応答性リポソーム（ｃ．ａ．２５０ｎｍ）の各ｐＨでの凝集度（融合も含む）を粒径変化によって測定した。
アニオン性リポソーム（ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）＝４／５／１（モル比），［ｌｉｐｉｄ］＝１ｍｇ／ｍｌ）とｐＨ応答性リポソーム（［ｌｉｐｉｄ］＝１ｍｇ／ｍｌ）を、３０ｍＭ酢酸緩衝液に各々５０μＬ添加し、粒径を光散乱光度計により測定した。Ｂｅｃｋｍａｎ社製の型式Ｎ４  ＰＬＵＳ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、測定濃度に希釈したリポソーム分散液２ｍＬをセルに充填し、動的光散乱法により３回見かけの粒子径を測定した。その結果を図３に示す。図３において、各ｐＨ（４，５，６，７，７．４）における凝集度を示した（ｎ＝３）。
図３からわかるように、アニオン性リポソームまたはｐＨ応答性リポソームはｐＨによらず粒子径は一定であったが、ｐＨ応答性リポソームをアニオン性リポソームと混合すると、分散媒のｐＨ低下に伴い粒径が増大した。ｐＨ６でｐＨ応答性リポソームの粒径は約４００ｎｍになり、さらにｐＨの低下とともに粒径は増大し、ｐＨ４でその粒径は約６５０ｎｍとなった。これはリポソーム間での凝集を意味している。その凝集度はｐＨ応答性リポソームのゼータ電位がプラスになるほど大きくなった。これによりｐＨ応答性リポソームがエンドソーム内のｐＨ環境下で、エンドソーム膜との凝集と融合を促進させるのに必要な性質を有していることを示唆している。
（アニオン性生体膜との相互作用の検討２）
さらに、エンドソーム内のｐＨ環境下におけるｐＨ応答性リポソームとエンドソーム膜を仮想したアニオン性生体膜との膜融合度を、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した希釈法により測定した。
仮想エンドソームとしてジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）／１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏ−２−１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）（ＮＢＤ−ＰＥ）／１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ）（Ｒ−ＰＥ）（＝３／１／０．３／０．００２２／０．００２２、モル比）を構成成分とするアニオン性リポソームを調製した。まず、ｐＨの異なる酢酸緩衝液２００μｌに対し、５００μＭアニオン性リポソーム２５μｌと４．５ｍＭ  ｐＨ応答性リポソーム（化合物３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝５／５／０．０３，モル比）２５μｌを添加し、インキュベート（３７℃，３０分）した。続いて、この混合液２０μｌを１５０ｍＭ生理食塩水８０μｌに添加し、プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ＡＲＶＯ  Ｍｘ−３）にて５３５ｎｍにおける蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，Ｆ．Ｉ．）を検出した（Ｅｘ：４８５ｎｍ）。式（１．１）を用いて各ｐＨにおける膜融合度を算出し、さらに式（１．２）を用いてｐＨ７．４における膜融合度に対する相対的な膜融合度の値を、各ｐＨについて算出した。膜融合度の測定結果を図４に示す。
2008143339.tif 000017
図４からわかるように、膜融合度はｐＨ７．４−６．０の範囲ではほぼ変化しなかったが、ｐＨ６．０−４．０の範囲内で膜融合度の増大が認められた。そしてｐＨ５．０において、ｐＨ７．４における膜融合度の約３．７倍に達した。このことから、ｐＨ応答性リポソームはｐＨ５−６環境下において、ゼータ電位がマイナスからプラスへと変化し、アニオン性生体膜と静電的吸着を経て、膜融合が促進されることが示された。オリジナルデータは表１に示したとおりである。
【表１】
2008143339.tif 000018
〔実施例３〕
ｐＨ応答性リポソームの細胞内動態（ＴＲＩＴＣ標識アルブミン内包リポソームの調製）
Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ−５−（ａｎｄ−６）−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ）２ｍｇを０．１Ｎ−ＮａＯＨ  ａｑ．に溶解し、ｐＨを７．４に調整した。その水溶液をアルブミン１ｍＬ（２５ｇ／ｄＬ）と混合し３時間撹拌後、ゲルカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）にて未結合ローダミンを除去し、ローダミン標識アルブミンを調製した。
次に、ｐＨ応答性混合脂質（化合物３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝５／５／０．０３，モル比）２５μｌををローダミン標識アルブミン水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）で水和し、高圧押出法（最終孔径０．２２μｍ）にてアルブミン内包リポソーム（以下、ローダミン標識アルブミン内包ｐＨ応答性リポソームともいう）を調製した。
（共焦点顕微鏡によるアルブミン内包リポソームの細胞内動態解析）
細胞に取込まれた後のリポソーム内包物の放出挙動を解析するために、細胞内の動態観察を共焦点顕微鏡を用いて行った。まず、ＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞）１ｘ１０５ｃｅｌｌｓを３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種し、２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。続いてダルベッコ改変イーグルス培地（ＤＭＥＭ）（１０％ウシ血清）で希釈した各リポソームを細胞に添加（［ｌｉｐｉｄ］＝５０μｇ／ｄｉｓｈ）し、２時間培養した。その後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、ライソトラッカー（４５０ｎＭ）にてエンドソームまたはリソソームを染色し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）にて内包ローダミン標識アルブミン（赤）とエンドソーム（緑）の局在を観察した。また、ＣＣＤ−３２ＳＫ細胞についても、ＭＥＭ培地に置換し、同様に細胞に取り込まれたリポソームの動態観察を行った。観察結果を図５に示した。
図５からわかるように、ローダミン標識アルブミン内包ｐＨ応答性リポソームは、アルブミン単独で局在している箇所が見られ、アルブミンがエンドソームから脱出していることが示唆された。このことからｐＨ応答性リポソームは、リポソーム内のアルブミンを細胞質へ送達できることが示された。
〔実施例４〕
ｓｉＲＮＡ内包リポソームの調製
実施例１で得られた化合物３（２０ｍｇ）を０．１％ＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）水溶液に分散させた１０ｎｍｏｌ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡ（２１ｂｐ）水溶液５００μＬで６時間水和させた後、高圧押出法（最終孔径０．２２μｍ）にてｓｉＲＮＡ内包リポソームを調製した。また、ｓｉＲＮＡを添加していないことを除いて、上記と同様の方法でｓｉＲＮＡを内包しないリポソームを調製した。
（ｓｉＲＮＡ内包ｐＨ応答性リポソームによるルシフェラーゼ合成阻害評価）
ルシフェラーゼタンパク合成遺伝子が恒常的に発現するＣＨＯ細胞を作製し、ｓｉＲＮＡ内包リポソーム添加後の、ＲＮＡｉによる合成阻害に関する評価を行った。ルシフェラーゼ発現ＣＨＯ細胞５ｘ１０４ｃｅｌｌｓを１２ｗｅｌｌｓプレートに播種し、２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、ｓｉＲＮＡ内包リポソームを血清存在下で細胞に添加（［ｌｉｐｉｄ］＝１００または２００μｇ／ｗｅｌｌ）し、２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、細胞を可溶化し、基質添加後の発光強度を測定しルシフェラーゼ発現量を算出した。その結果を図６に示した。なお、コントロールは、培地のみを添加した場合とした。図６中、ｓｉＲＮＡ内包リポソームをｓｉＲＮＡ（＋）、ｓｉＲＮＡを内包しないリポソームをｓｉＲＮＡ（−）と表記した。
図６からわかるように、添加量の増大とともにルシフェラーゼの発現量が有意に減少し、［Ｌｉｐｉｄ］＝１００μｇ／ｗｅｌｌで約５０％、［Ｌｉｐｉｄ］＝２００μｇ／ｗｅｌｌで約７５％のルシフェラーゼ合成阻害が達成された。このことは、すなわち、ｐＨ応答性リポソームがｓｉＲＮＡをエンドソームから細胞質へ脱出させ、ｓｉＲＮＡによりルシフェラーゼの合成阻害が起こり、細胞に発現していたルシフェラーゼ量のノックダウンに寄与したことを意味する。この結果より、本発明の分子集合体がＲＮＡｉを利用した遺伝子治療に有用な運搬体であることが示された。
（ｐＨ応答性リポソームの毒性評価）
ｐＨ応答性リポソームの毒性評価をＷＳＴ  Ａｓｓａｙを用いて行った。ルシフェラーゼ発現ＣＨＯ細胞１ｘ１０４ｃｅｌｌｓを９６ｗｅｌｌｓプレートに播種し、２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、リポソームを血清存在下で細胞に添加［ｌｉｐｉｄ］＝５，１０，２０または４０μｇ／ｗｅｌｌ）し、２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。続いてＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で２回洗浄後、ＷＳＴ１／ＥＣＳ試薬（ＩｍｍｕｎｏＫｏｎｔａｃｔ社）を添加した。１時間培養（３７℃、５％ＣＯ２）した後、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）は下記の式を用いて算出し、その結果を図７に示した。
2008143339.tif 000019
Ｉ０：細胞なし  Ｉ１００：リポソーム添加無し  Ｉｘ：リポソーム添加有り
図７からわかるように、ｐＨ応答性リポソームでは、脂質添加量［Ｌｉｐｉｄ］μｇ／ｍＬが２０μｇ／ｗｅｌｌ以下では、細胞の生存率がほぼ１００％であり、４０μｇ／ｗｅｌｌ添加系における細胞生存率はほぼ７０％であった。細胞試験は９６ｗｅｌｌプレートで実験したが、ルシフェラーゼ活性測定は１２ｗｅｌｌプレートで実験した。よって毒性評価の結果を１２ｗｅｌｌで換算すると２００μｇ／ｗｅｌｌ添加時では細胞毒性は全く示されていないと類推できる。よって、細胞質でのルシフェラーゼの発現の減少はリポソーム膜脂質由来の毒性からではなく、ｐＨ応答性リポソームにより送達したｓｉＲＮＡに由来した結果であるといえる。
〔実施例５〕
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）内包ｐＨ応答性リポソームのｉｎ  ｖｉｖｏ体内動態試験
ＢＳＡ内包ｐＨ応答性リポソームのラット血漿及び組織中における化合物３の濃度測定を行った。ＢＳＡ内包ｐＨ応答性リポソームのラット血漿及び組織中における化合物３の濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定した。
なお、ｐＨ応答性リポソームの体内動態解析として以下の分析装置を利用した。
遠心機：ＭＸ−３０１（トミー精工）
ＨＰＬＣ：ＬＣ−２０Ａシステム（島津製作所）
システムコントローラー；ＳＣＬ１０Ａｖｐ
ポンプ；ＬＣ−２０ＡＤ
デガッサー；ＤＧＵ−２０Ａ３
オートインジェクター；ＳＩＬ−２０ＡＣ
カラムオーブン；ＣＴＯ−２０ＡＣ
ＭＳ：ＡＰＩ２０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ）
インターフェース；ＴｕｒｂｏＩｏｎ  Ｓｐｒａｙ
（投与実験）
混合脂質（化合物（３）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８＝５／５／０．０３（ｍｏｌ））から高圧押出法にてｐＨ応答性リポソームを調製した。粒子径は２００−２５０ｎｍになるように調製した。また内水相にＢＳＡを内包した。調製したｐＨ応答性リポソームをエーテル麻酔下、ＳＤ系ラット（オス、体重３００ｇ以下）の尾静脈から、ｐＨ応答性リポソーム（［Ｌｉｐｉｄ］＝２０ｍｇ／ｍＬ）を２ｍｌ／ｋｇで投与した。ラット使用例数をＮ＝３とする。投与前、投与後５分、１、２、６、２４時間に採血（５００μＬ程度）を行い、遠心（２，０００ｘｇ、２０分）して血漿を得（リポソーム浮遊血漿）、これを−８０℃で保存した。また、投与後２４時間の採血を終えた後、肝、脾、肺、腎を摘出して湿重量を測定し、−８０℃で保存した。その後、臓器湿重量の４倍量の生理食塩水でホモジネートした．
（測定用サンプルの調製方法）
・検量線およびＬＣ−ＭＳ分析用サンプル
１０μＬの血漿及び肝臓ホモジネート溶液に対して１００μＬのＧＧＬＧ標準溶液を添加するところまで行ったものを検量線測定用サンプルとした。
・試料測定用サンプル
１０μＬの血漿及び臓器ホモジネート溶液に対して１００μＬのメタノールを添加するところまで行ったものを試料測定用サンプルとした。
上記測定用サンプルに内部標準物質（１，５−ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌ  Ｎ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ（αＧｌｕ−Ｇｌｕ２Ｃ１６））添加溶液（９００μＬ）を加え、ボルテックス攪拌した後、室温にて１０分間以上静置させた。その後、再度ボルテックス攪拌し、４℃、１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離して、その上清をＬＣバイアルに移した。
高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）−タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
ＨＰＬＣ条件
カラムにＣＡＰＬＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ（株式会社資生堂）（３μｍ、２．０×５０ｍｍ）を用い、カラム温度は４０℃に設定した。０．１％酢酸水溶液（Ａ）−０．１％酢酸メタノール（Ｂ）でグラジェント溶出させた。流速は０．２５ｍＬ／分でグラジェントプログラムは表２に示したとおりである。なお、オートインジェクター温度は１５℃とし、ニードル洗浄液は洗浄ポンプをクロロホルム／メタノール（１：１）洗浄ポートをメタノールで行った。
【表２】
2008143339.tif 000020
ＭＳ／ＭＳ条件
ＨＰＬＣで分離した溶離液をｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＥＳＩイオン化し、ＭＲＭモードで測定した。パラメータは表３に示したとおりである。
【表３】
2008143339.tif 000021
内部標準物質として化合物３に構造が近似した次式で示されるαＧｌｕＧｌｕ２Ｃ１６を用いた。
2008143339.tif 000022
血漿及び製剤中の化合物３（ＧＧＬＧ）の濃度
血漿測定用検量線検体を測定し、１／ｘ２の重み付け，Ｑｕａｄｒａｔｉｃで１−３００μｇ／ｍＬ血漿の検量線を作成した。得られた検量線の式に血漿測定用検体のピークエリア／ＩＳピークエリアを代入して血漿中の化合物３の濃度を算出した。その結果を表４に示した。図８は、この結果をグラフで示したものである。なお、図８中、（−◇−）はａｎｉｍａｌ  １、（‥□‥）はａｎｉｍａｌ  ２、（−・△・−）はａｎｉｍａｌ  ３の結果をそれぞれ示す。ＰＫパラメータは表５に示したとおりである。
【表４】
2008143339.tif 000023
【表５】
2008143339.tif 000024
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定における血漿中の化合物３の濃度から、化合物３の半減期は４．８時間であることがわかった。以上の結果により、化合物３を含有するｐＨ応答性リポソームが良好な血中滞留性を示すことがわかった。
（組織中の化合物３（ＧＧＬＧ）の濃度）
組織測定用検量線検体を測定し，１／ｘ２の重み付け，Ｑｕａｄｒａｔｉｃで１−１００μｇ／ｍｌの検量線を作成した。得られた検量線の式に組織測定用検体のピークエリア／ＩＳピークエリアを代入して組織中の化合物３の濃度を算出した（組織ホモジネートの比重を１ｇ／ｍＬとして計算）。結果を表６に示した。なお、図９は、この結果をグラフにしたものである。
【表６】
2008143339.tif 000025
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定における投与２４時間後の臓器中の化合物３の分布は主に肝臓、脾臓に局在していた。これは通常のリポソーム製剤の臓器分布と同じであった。化合物３が腎臓あるいは肺にはほとんど局在していないことから、ｐＨ応答性リポソームが血中滞留性を有することを示している。従って、ｐＨ応答性リポソームは臓器を標的とした薬物、プローブ、核酸及びタンパク質の運搬体として有用であることがわかる。
〔実施例６〕
ｐＨ応答性両親媒性分子の合成
実施例１の工程（Ａ）で得られた化合物１（１．０ｇ，１．６７ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（２０２ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、γアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、εアミノ基をベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基で保護し、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたリジン（６１７ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）を添加し、さらに６時間室温で撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過して凍結乾燥後、化合物４を得た。
2008143339.tif 000026
化合物４をＴＦＡ処理してＢｏｃ基を脱保護し、クロロホルムに溶解し、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。純水にて洗浄後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去し、化合物５を得た。
2008143339.tif 000027
化合物５（５００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（７１ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、αアミノ基をＢｏｃ基、γカルボキシル基をＯｔＢｕ基で保護し、αカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたグルタミン酸Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ（３１０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を添加し、さらに６時間室温で撹拌して反応させた。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過して、凍結乾燥後化合物６を得た。
2008143339.tif 000028
化合物６をＨ２／Ｐｄ−Ｂｌａｃｋ存在下で、Ｚ基を脱保護し、αアミノ基をＢｏｃ基、βカルボキシル基をＯｔＢｕ基で保護し、αカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたアスパラギン酸Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕを反応させＴＦＡにて脱保護し、化合物７（Ｉａ−２）を得た。
2008143339.tif 000029
化合物７（Ｉａ−２）の同定：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（５／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０５（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．３０（ｂｒ，５２Ｈ，ａｌｋｙｌ）；１．６２（ｍ，４Ｈ，ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；４．２８（ｑ，１Ｈ，ｌｙｓ  α−ＣＨ−）；４．４７（ｑ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−ＣＯＯ−）；
化合物７を得る方法と同様にして、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）の代わりにＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕを用い、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕの代わりにＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）を用いて化合物８（Ｉａ−４）を合成した。
2008143339.tif 000030
化合物８（Ｉａ−４）の同定：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（５／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０７（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８４（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２３（ｂｒ，５２Ｈ，ａｌｋｙｌ）；３．６８，３．９４（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−Ｌｙｓ−）；４．３４（ｑ，１Ｈ，ｌｙｓ  α−ＣＨ−）；４．６０（ｑ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−ＣＯＯ−）
実施例１の工程（Ｂ）で得られた化合物２（５００ｍｇ，６９１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１０７μｌ，８２９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、アミノ基をＢｏｃ基、βカルボキシル基をｔ−ブチルエステル基で保護し、α−カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたアスパラギン酸Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ（６３９ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに６時間室温で撹拌して反応させた。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で３回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから４℃で再結晶し、グラスフィルター（Ｇ６）ろ過して、アミノ基を保護したリジン誘導体を得た。
得られたリジン誘導体にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を加え、４℃で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で２回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧乾燥して、本発明の両親媒性分子である化合物９（Ｉａ−３）を白色粉末として得た。
2008143339.tif 000031
化合物９（Ｉａ−３）の同定：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（５／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．１５（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８３（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２４（ｂｒ，５２Ｈ，ａｌｋｙｌ）；３．６４，３．８８（ｔ，１Ｈ，Ａｓｐ  α−ＣＨ−Ｌｙｓ−）；４．３３（ｑ，１Ｈ，ｌｙｓ  α−ＣＨ−）；４．６１（ｑ，１Ｈ，Ａｓｐ  α−ＣＨ−ＣＯＯ−）
〔実施例７〕
リポソームの調製
化合物７，８または９（０．１７７ｍｍｏｌ）、コレステロール（０．１７９ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（１．０μｍｏｌ）をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質２０ｍｇを注射用水１ｍＬに分散し、６時間攪拌後、高圧押出法（最終孔径０．２２μｍ）にて粒子径約２４０ｎｍのリポソームを調製した。
調製したリポソーム（［ｌｉｐｉｄ］＝１０ｍｇ／ｍｌ）をｐＨ７．４，７，６，５，４の酢酸緩衝液（２０ｍＭ）に添加し、最終濃度を［ｌｉｐｉｄ］＝１ｍｇ／ｍＬとして３７℃におけるゼータ電位を測定した。
化合物９（Ｉａ−３）を主成分として用いた場合、この脂質組成の混合脂質を水に分散させた際に凝集し、高圧押出時にろ過されてしまったと考えられる。おそらく親水部にアスパラギン酸を用いた脂質は、水和しにくいと考察できる。
これに対して、化合物７を主成分として用いた場合、及び化合物８を主成分として用いた場合はリポソームを形成した。図１０中、（●）は化合物７を主成分とするリポソーム（化合物７／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））のゼータ電位変化を示し、（○）は化合物８を主成分とするリポソーム（化合物８／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））のゼータ電位変化を示す。化合物７（Ｉａ−２）を主成分としたリポソームでは、ゼータ電位がマイナスからプラスへの転じるｐＨがおよそ５．５程度であったのに対し、化合物８（Ｉａ−４）を主成分とするリポソームではそのｐＨは４．８程度であった。この結果より親水部にグルタミン酸とアスパラギン酸とを用いた両親媒性分子はリポソームを形成し、ｐＨ変化によりゼータ電位が変化するｐＨ応答性を示すことが明らかとなった。
〔実施例８〕
アルキル鎖長の異なる両イオン性脂質の合成
実施例１の工程（Ａ）と同様の方法にて、グルタミン酸とテトラデシルアルコールまたはステアリルアルコールを用いて、アルキル鎖長が１４または１８である化合物１０（１，５−ｔｅｔｒａｄｅｃｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）及び化合物１１（１，５−ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）をそれぞれ合成した。
2008143339.tif 000032
2008143339.tif 000033
化合物１０及び化合物１１を用いて、アルキル鎖の異なるグルタミン酸を２個親水部に持つ化合物１２及び１３をそれぞれ合成した。
2008143339.tif 000034
化合物１２の同定：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（５／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０５（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２７（ｂｒ，４４Ｈ，ａｌｋｙｌ）；１．５５（ｂｒ，４Ｈ，ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−），４．３４（ｑ，１Ｈ，ｌｙｓ  α−ＣＨ−）；４．４４（ｑ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−ＣＯＯ−）
化合物１３の同定：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール（５／１）（容量／容量）：Ｒｆ：０．０４（モノスポット））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ、δ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，６Ｈ，−ＣＨ３）；１．２７（ｂｒ，６０Ｈ，ａｌｋｙｌ）；１．６５（ｂｒ，４Ｈ，ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−），４．１２（ｔ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−Ｌｙｓ−）；４．３５（ｑ，１Ｈ，ｇｌｕ  α−ＣＨ−ＣＯＯ−）；３．６０（ｔ，４Ｈ，ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−）
〔実施例９〕
リポソームの調製ならびにゼータ電位及び融合度の測定
化合物３、１２または１３を構成成分とするリポソームをそれぞれ調製し、得られたリポソームを用いてゼータ電位及び融合度を測定し、物性を比較した。
（リポソームの調製）
化合物３、１２または１３（０．１７７ｍｍｏｌ）、コレステロール（０．１７９ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（１．０μｍｏｌ）をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質２０ｍｇを注射用水１ｍＬに分散し、６時間攪拌後、高圧押出法（最終孔径０．２２μｍ）にて粒子径約２４０ｎｍのリポソームを調製した。
（ゼータ電位測定）
調製した各リポソーム（［ｌｉｐｉｄ］＝１０ｍｇ／ｍｌ）をｐＨ７．４，７，６，５，４の酢酸緩衝液（２０ｍＭ）にそれぞれ添加し、最終濃度を［ｌｉｐｉｄ］＝１ｍｇ／ｍＬとして３７℃におけるゼータ電位を測定した。その結果を図１１に示す。図中、（●）は化合物３を主成分とするリポソーム（化合物３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））のゼータ電位変化を示し、（○）は化合物１２を主成分とするリポソーム（化合物７／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３（モル比））のゼータ電位変化を示す。
化合物１３を主成分として用いた場合、混合脂質を調製した後、水に分散させた際に分散性が悪く、凝集し、高圧押出時にろ過されてしまった。疎水部の大きな化合物１３は、この脂質組成では親−疎水バランスが悪く、小胞体構造をとりにくいためであると考えられる。これに対して、化合物３を主成分として用いた場合、及び化合物１２を主成分として用いた場合はリポソームを形成した。化合物３を主成分としたリポソームでは、ゼータ電位がマイナスからプラスへの転じるｐＨがおよそ５．７程度であったのに対し、化合物１２を主成分とするリポソームではそのｐＨは７．０程度であった。これによりリポソーム膜成分である両親媒性分子の親水部構造が同じ場合でも、疎水部のアルキル鎖長によってゼータ電位挙動が変わることが判明した。
（融合度測定）
実施例２と同様の方法で、アニオン性リポソーム（ＤＯＰＣ／ＤＰＰＧ，５／１（モル比））に対するｐＨ応答性リポソームの融合度を算出した。測定方法は以下のとおりである。１ｍＭのアニオン性リポソームと９ｍＭ（混合脂質換算）の各ｐＨ応答性リポソームをそれぞれ５０μＬを１．９ｍＬの各ｐＨの酢酸緩衝液に添加し、３７℃で静置した。３０ｍｉｎ経過後、１００ｍＬを分注し１．９ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加え、石英セルに移し蛍光測定（λｅｘ：４６０ｎｍ，λｅｍ：５３０ｎｍ）した。測定は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製の型式ＲＦ−５３００ＰＣを用いて行った。結果を図１２に示す。
化合物３を主成分としたリポソームでは、従来の報告どおりｐＨ７．４では１５％程度の融合度であったが、ｐＨ５．５で融合度が極大値をとり、その値は６０％程度であった。他方、アルキル鎖長が１４である化合物１２を主成分としたリポソームではｐＨ７．４でも融合度が４５％程度と高く、また融合の極大はｐＨ６．５で６５％を超えていた。
ゼータ電位測定結果を考慮すると、化合物１２は中性領域でもゼータ電位がプラスとなり、さらには相転移温度が低いことから、アニオン性のリポソームに融合しやすいものと考察される。
〔実施例１０〕
ｓｉＲＮＡ内包リポソームのルシフェラーゼ合成阻害評価
（ｓｉＲＮＡ内包リポソームの調製）
従来用いられている脂質組成である、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＤＨＳＧ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／１／０．０３３，モル比）から成るｓｉＲＮＡ内包または未内包リポソーム群（リポソーム１）、αＧｌｕＧｌｕ２Ｃ１６／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８（５／５／０．０３，モル比）から成るｓｉＲＮＡ内包または未内包リポソーム群（リポソーム２）をそれぞれ調製し、これらを本発明の化合物３を主成分とする化合物３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ（５／５／０．０３，モル比）から成るｓｉＲＮＡ内包または未内包リポソーム群（リポソーム３）と比較した。尚、αＧｌｕＧｌｕ２Ｃ１６（１，５−ｈｅｘａｄｅｃｙｌ−Ｎ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）は、実施例５でも述べたとおり下記式で示される親水部に両イオン性官能基を一つ有する化合物である。
2008143339.tif 000035
ここで用いた１，５−ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＤＨＳＧ）は負電荷脂質であり、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）はリン脂質である。
以下のようにして、ルシフェラーゼタンパク合成遺伝子が恒常的に発現するＣＨＯ細胞に、各ｓｉＲＮＡ内包リポソーム添加した後のＲＮＡｉによる合成阻害に関する評価を行った。まず、ルシフェラーゼ発現ＣＨＯ細胞５ｘ１０４ｃｅｌｌｓを１２ｗｅｌｌｓプレートに播種し、２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、ｓｉＲＮＡ内包リポソームを血清存在下で細胞に添加（［ｌｉｐｉｄ］＝２００μｇ／ｗｅｌｌ）し、２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、細胞を可溶化し、基質添加後の発光強度を測定し、ルシフェラーゼ発現量を算出した。その結果を図１３に示した。なお、コントロールは、培地のみを添加した場合とした。図中、ｓｉＲＮＡ内包リポソームをｓｉＲＮＡ（＋）、ｓｉＲＮＡを内包しないリポソームをｓｉＲＮＡ（−）と表記した。
ルシフェラーゼ発現ＣＨＯ細胞のみでは、ルシフェラーゼ発現量が４．２ｘ１０４ＲＬＵ／μｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ程度であった。これに対しｓｉＲＮＡ内包リポソーム１（ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＤＨＳＧ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）ではやや発現量が低下したが、ｓｉＲＮＡ未内包リポソーム１添加時の発現量とほぼ同等であった。よってリポソーム１では内包したｓｉＲＮＡによる阻害は起きていないと判断した。
一方、ｓｉＲＮＡ内包リポソーム２（αＧｌｕＧｌｕ２Ｃ１６／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）あるいはリポソーム３（ＧＧＬＧ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−Ｇｌｕ２Ｃ１８）では、コントロール群と比較してそれぞれ１５、７０％程度のルシフェラーゼ合成阻害が確認された。ｓｉＲＮＡ未内包リポソーム群では、この阻害が起きていないことから、この結果は、内包したｓｉＲＮＡによりルシフェラーゼの合成阻害が起こったことを意味している。さらに、ｓｉＲＮＡデリバリーの効率はリポソーム２よりもリポソーム３の方が優れていた。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の分子集合体は、薬物、プローブ、核酸及びタンパク質等をエンドソーム内から細胞質側へ効率よく放出させる運搬体として有用であり、各種疾患治療用の製剤として利用価値が十分にあると考えられる。
【図１】
2008143339.tif 000038
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５】
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【国際調査報告】
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