(57)【要約】本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。この複合材料は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、およびＢ）生体適合性を有する足場を含む。本発明はまた、この複合材料を生産するための方法、ならびに生体内の骨形成を促進または誘発するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、および
Ｂ）生体適合性を有する足場、
を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。
【請求項２】
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（１）前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（２）該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量５０，０００の限外濾過に供することにより得られる分子量５０，０００以上の画分に存在する、請求項１に記載の複合材料。
【請求項３】
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が濃縮または凍結乾燥されたものである、請求項１に記載の複合材料。
【請求項４】
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、生体適合性を有する足場の表面および該生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域に付着または分散している、請求項１に記載の複合材料。
【請求項５】
前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および３次元状足場からなる群より選択される、請求項１に記載の複合材料。
【請求項６】
前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、およびラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、請求項５に記載の複合材料。
【請求項７】
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（ＭＥＭ）を含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項８】
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、ヒドロキシアパタイトに付着または分散されており、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（ＭＥＭ）を含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項９】
前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、請求項１に記載の複合材料。
【請求項１０】
前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、請求項９に記載の複合材料。
【請求項１１】
前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、請求項１に記載の複合材料。
【請求項１２】
生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法であって、以下の工程：
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程、および
Ｂ）該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含する、方法。
【請求項１３】
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（１）前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（２）該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量５０，０００の限外濾過に供することにより得られる分子量５０，０００以上の画分に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ａ）工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養し、該培養した上清を採取することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ａ）工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、限外濾過に供し、分子量５０，０００以上の画分に分離することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ａ）工程の後に、前記上清を濃縮または凍結乾燥する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂ）工程が、
前記凍結乾燥した状態の上清とコラーゲン溶液とを合わせる工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｂ）工程が、
前記濃縮した上清とヒドロキシアパタイトとを接触させる工程を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および３次元状足場からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、およびラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生体内の骨形成を促進または誘発するための方法であって、該方法は、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、生体内の骨形成を促進または誘発する必要のある部位に移植する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）アルギン酸
を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。
【請求項２６】
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）ラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物
を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成の低下する病気や骨の損傷または骨の欠損に対しては、骨形成が好ましい治療法である。骨組織が骨折などの損傷や骨腫瘍などによる切除を受けると、骨を作る細胞である骨芽細胞が増殖、分化し、骨が形成して、骨折部や骨欠損部が治癒する。損傷の軽度な症例においては、患部を固定することによって骨芽細胞が有効に機能し、治癒に至る。複雑骨折や骨切除術による大きな欠損、さらに骨髄炎の併発などにより骨芽細胞が有効に機能し得ない環境では、損傷または欠損を修復するための標準的な方法として、自家骨移植が一般に考えられてきた。骨欠損部位が大きくて自家骨では補填できない場合は、人工骨を使用するとしても、自家骨を一部混ぜる方法が多く採られている。しかし、ヒトの場合には自家骨の供給源は限られており、採取できる量に限りがある。また採取のためには余分な手術が必要であり、高額な費用および苦痛を伴い、さらに骨の採取部位（本来正常部位）には新たな骨欠損が生じるという数々の欠点が存在する。
そこで、人工骨のインプラントおよび骨補填材料の使用などさまざまな外科的処置が利用されてきた。外傷や骨腫瘍摘出等により生じた骨等の生体組織欠損部に、骨補填材等の生体組織補填材を補填することにより、骨等の生体組織欠損部を補填修復することが可能になってきている。骨補填材料としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が主として知られている。
しかし、この従来の人工骨のインプラントおよび骨補填材料には、自家骨と比べて、骨形成能が低く骨ができにくく、また靭性が低く衝撃で割れやすいという欠点があった。したがって、外科的処置の予後は必ずしも良好ではなく、複数回の手術を必要とすることも多い。これらの理由により、人工骨の使用割合は増えつつあるものの、未だ３割程度で、残りの６〜７割は自家骨が使用されている。
米国では同種骨が多く使用されている。しかし、日本では、死体を利用することは習慣として馴染みにくく、そのため利用されることは多くない。骨バンクも存在しているが、現在のところその整備は不十分である。
上記の従来の人工骨のこれらの欠点を改良するために、細胞の再生力を利用した再生医療の試みが行われ始めており、骨折部や骨欠損部に対する治療にも応用されている。また、術後の骨欠損部の修復速度を高めるためにも利用されている。この再生医療には骨髄由来の幹細胞が主に使用され、患者から採取した骨髄幹細胞や分化させた骨芽細胞を骨補填材料とともに培養することにより製造される培養骨等の生体組織補填体を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材料を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系幹細胞やさらに分化した骨芽細胞を含む骨補填体を骨欠損部に補填するので、骨補填材料のみを移植する方法と比較すると、上記の人工骨の欠点を補うことができ、また骨が形成されるまでの日数を短縮することができる。
従来の再生医療の方法では、骨髄由来の間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるには、Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓらが提唱した方法（デキサメサゾン、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸の３化合物を使用する方法）もしくはその使用濃度を修正した方法が利用されているが、これらの方法は人工的なもので、自然のものではない（非特許文献１＝Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃら：Ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８．）。さらに、幹細胞の中には、この３化合物混合物によっては分化しない細胞が存在する。その結果、分化誘導された骨芽細胞の性質や機能に不安が存在する。
そこで、骨形成の低下する病気や骨の損傷または骨の欠損に対する治療のために利用される骨芽細胞を、安全に、安価に、かつ安定して提供することが必要とされている。
これまで、骨形成は、骨芽細胞を誘導させると考えられているＢＭＰ（骨形成因子）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７が重要な役割を果たすと考えられてきた。ＢＭＰファミリーには多くのファミリーメンバーが存在するが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７以外の分子は、初期から知られていたＢＭＰ２の配列をもとにして、機能については考慮せずに取得したホモログであり、骨芽細胞を分化誘導するという能力は必ずしも有していない。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７は、マウス、ラットにおいて骨芽細胞を有効に誘導するが、ヒトでは１０００分の１ほどの効果しかないことが報告されている（非特許文献２〜５＝Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら：Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８−１５３４，１９８８．；Ｗｕｅｒｚｌｅｒ  ＫＫら：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｃａｎ  Ｂｅ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２．Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇ．，９：１３１−１３７，１９９８；Ｇｏｖｅｎｄｅｒ  Ｓら：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｐｅｎ  Ｔｉｂｉａｌ  Ｆｒａｃｔｕｒｅｓ．Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．，８４Ａ：２１２３−２１３４，２００２．；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  Ｒら：Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｒａｄｉｏｓｔｅｒｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＢＭＰ−７）ａｎｄ  Ａｕｔｏｇｒａｆｔ  Ｂｏｎｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｄ  Ｐｏｓｔｅｒｏｌａｔｅｒａｌ  Ｌｕｍｂｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ，２７：２６５４−２６６１，２００２．）。
本発明者は、ＢＭＰを異所に移植すると、内軟骨性骨化による骨形成が生じることを観察した。ＢＭＰをクローニングしたＷｏｚｎｅｙらもＢＭＰの活性を測定した際に、ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙという言葉を使用している（非特許文献２＝Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら：Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８−１５３４，１９８８）。この観察により、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７は、骨を直接的に分化誘導させるのではなく、肥大化能を有する軟骨細胞を誘導させ、この肥大化能を有する軟骨細胞が産生する因子が骨芽細胞を分化誘導させて骨形成を導くと考察した（非特許文献６および非特許文献７＝沖花裕行：成長軟骨の産生する骨形成因子、医学のあゆみ、１６５：４１９、１９９３；Ｏｋｉｈａｎａ，Ｈ．＆  Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｙ：Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｅｘａｍｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ  Ｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｔａｌｉｚｅｄ  Ｒｉｂｓ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔａｌ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｚｏｎｅ，ａｎｄ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｃｅｌｌｓ．Ｂｏｎｅ，１３：３８７−３９３，１９９２．）。骨芽細胞の誘導、走化、活性化に直接作用する、分子量５０，０００以上のペプチド性あるいは生体由来の因子は知られていない。
特許文献１（特開２００４−３０５２５９号公報）は、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着させた幹細胞を分化誘導させることにより生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせ、形成された組織細胞を死滅させる処理工程とを備えることを特徴とする生体組織補填体の製造方法を開示している。特許文献１には、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着された幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。この培養に用いる培地には、最小必須培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートのような分化誘導因子、ビタミンＣのような栄養剤が混合されていることが記載されており、最小必須培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、デキサメタゾンを混合した培地を分化誘導に使用している。特許文献１には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。
特許文献２（特開２００４−３０５２６０号公報）は、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着させた幹細胞を分化誘導させることにより生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせ、形成された組織細胞を死滅させる処理工程を備え、この処理工程が、生体組織補填材を凍結してさらに乾燥する工程であることを特徴とする生体組織補填体の製造方法を開示している。特許文献２には、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着された幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。この培養に用いる培地には、最小必須培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートのような分化誘導因子、ビタミンＣのような栄養剤が混合されていることが記載されており、最小必須培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、デキサメタゾンを混合した培地を分化誘導に使用している。特許文献２には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。
特許文献３（特開２００４−４９１４２号公報）は、患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養ステップと、培養された間葉系幹細胞を所定の骨形成培地内で培養することにより骨芽細胞へ分化誘導させる二次培養ステップと、分化誘導された骨芽細胞および産生された骨基質を回収する回収ステップと、回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材顆粒と混合する混合ステップとを備える培養骨の製造方法を開示している。特許文献３には、最小必須培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートのような分化誘導因子、ビタミンＣのような栄養剤が混合されている培地を用いて、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。特許文献３には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。
特許文献４（特開２００５−２０５０７４号公報）は、患者から採取した細胞を培養して得た間葉系幹細胞を骨補填材に担持させ、骨補填材に担持させた前記間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化誘導させる培養骨、もしくは患者から採取した細胞をもとに得た間葉系幹細胞を培養して骨芽細胞へと分化誘導させた後に骨芽細胞を骨補填材に担持させる培養骨の製造方法を開示している。特許文献４には、最小必須培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートのような分化誘導因子、ビタミンＣのような栄養剤が混合されている培地を用いて、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。この方法では、患者から採取した細胞を培養する培養液、または前記間葉系幹細胞を培養する培養液、もしくは前記骨芽細胞へと分化誘導させた後の培養液に多血小板血漿を添加することが必要である。特許文献４には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。
特許文献５（特表２００３−５３１６０４号公報）は、出生後のヒト包皮組織などの出生後のヒト組織から、間葉幹細胞を単離する方法、ならびに単離した間葉幹細胞を、骨形成、脂肪生成、および軟骨形成細胞系譜などの、多様な細胞系譜に分化誘導させる方法が開示されている。特許文献５には、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、抗生物質、骨形成補足剤（デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸−２−リン酸）を含む培地を用いて、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることが記載されている。特許文献５には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。
特許文献６（特開２００６−２８９０６２号公報）は、肥大化能を有する軟骨細胞と足場を用いた骨補填材料を開示している。特許文献６には、本発明の骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料も、この複合材料が生体内の骨形成を促進または誘発することも記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、骨形成の低下する病気の治療や骨の損傷または骨の欠損に対する処置、特に骨腫瘍および複雑骨折などの治療において使用することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法を提供することを課題とする。
本発明は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるために使用することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題は、一部、本発明において、本発明による骨芽細胞分化誘導因子と足場とを使用することによって、予想外に骨形成が進展するという性質をもつ複合材料を見出したことによって解決された。本発明による骨芽細胞分化誘導因子は、該因子単独では、生体に移植しても散逸してしまうため、未分化細胞を骨芽細胞に誘導することはできない。本発明は、この骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場を組み合せることによって、生体内の骨形成を促進または誘発することに初めて成功した。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含む分化因子産生培地において培養することによって得ることができる、誘導骨芽細胞分化誘導因子、および
Ｂ）生体適合性を有する足場、
を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。
（項目１Ａ）
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、および
Ｂ）生体適合性を有する足場、
を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。
（項目１Ｂ）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（１）前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（２）該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量５０，０００の限外濾過に供することにより得られる分子量５０，０００以上の画分に存在する、上記項目に記載の複合材料。
（項目２）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が濃縮されたものである、上記項目の複合材料。
（項目３）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が凍結乾燥されたものである、上記項目に記載の複合材料。
（項目３Ａ）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が濃縮または凍結乾燥されたものである、上記項目に記載の複合材料。
（項目４）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、前記生体適合性を有する足場に付着されている、上記項目に記載の複合材料。
（項目５）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、前記生体適合性を有する足場に分散されている、上記項目に記載の複合材料。
（項目６）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、生体適合性を有する足場の表面および該生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域に付着または分散している、上記項目に記載の複合材料。
（項目７）
前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および３次元状足場からなる群より選択される、上記項目に記載の複合材料。
（項目７Ａ）
前記生体適合性を有する足場が、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、アガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目８）
前記生体適合性を有する足場が、多孔質ヒドロキシアパタイト、超多孔質ヒドロキシアパタイト、アパタイトコラーゲン混合体、アパタイトコラーゲン複合体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ、フィブリンゲル、合成ペプチド、細胞外基質混合物、アルギン酸、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／ポリ乳酸共重合体およびそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目８Ａ）
前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、およびラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目９）
前記分化因子産生培地が、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸の両方を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目１０）
前記分化因子産生培地が、血清成分をさらに含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目１０Ａ）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（ＭＥＭ）を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目１１）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として、最小必須培地（ＭＥＭ）を含み、さらにグルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目１１Ａ）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、ヒドロキシアパタイトに付着または分散されており、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として最小必須培地（ＭＥＭ）を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目１２）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、ヒドロキシアパタイトに付着または分散されており、かつ前記分化因子産生培地が、基礎成分として、最小必須培地（ＭＥＭ）を含み、さらにグルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸を含む、上記項目に記載の複合材料。
（項目１３）
前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、上記項目に記載の複合材料。
（項目１４）
前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、上記項目に記載の複合材料。
（項目１５）
前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、上記項目に記載の複合材料。
（項目１６）
生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法であって、以下の工程：
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含む分化因子産生培地において培養する工程；
Ｂ）該培養によって得られた上清と、該生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含する、方法。
（項目１６Ａ）
生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法であって、以下の工程：
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程、および
Ｂ）該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含する、方法。
（項目１６Ｂ）
前記誘導骨芽細胞分化誘導因子が、（１）前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在するか、または（２）該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量５０，０００の限外濾過に供することにより得られる分子量５０，０００以上の画分に存在する、上記項目に記載の方法。
（項目１６Ｃ）
前記Ａ）工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養し、該培養した上清を採取することを含む、上記項目に記載の方法。
（項目１７）
前記Ａ）工程の後に、前記上清を濃縮する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１８）
前記上清を凍結乾燥する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１８Ａ）
前記Ａ）工程が、前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、限外濾過に供し、分子量５０，０００以上の画分に分離することを含む、上記項目に記載の方法。
（項目１８Ｂ）
前記Ａ）工程の後に、前記上清を濃縮または凍結乾燥する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｂ）工程が、前記上清を、前記生体適合性を有する足場に接触させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｂ）工程は、
前記上清から因子を得る工程、および
該因子を前記生体適合性を有する足場と混合する工程、
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｂ）工程は、
前記濃縮によって得られた上清濃縮物を、前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該生体適合性を有する足場を接触させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２１Ａ）
前記生体適合性を有する足場が、ゲル状足場および３次元状足場からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目２２）
前記生体適合性を有する足場が、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、アガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の方法。
（項目２３）
前記生体適合性を有する足場が、多孔質ヒドロキシアパタイト、超多孔質ヒドロキシアパタイト、アパタイトコラーゲン混合体、アパタイトコラーゲン複合体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ、フィブリンゲル、合成ペプチド、細胞外基質混合物、アルギン酸、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／ポリ乳酸共重合体およびそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の方法。
（項目２３Ａ）
前記生体適合性を有する足場が、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、およびラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される物質を含む、上記項目に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｂ）工程は、
前記濃縮によって得られた上清濃縮物を凍結乾燥する工程、および
該上清濃縮物を前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該希釈した上清濃縮物と生体適合性を有する足場とを接触させる工程を包含し、ここで、該生体適合性有する足場が、多孔質ヒドロキシアパタイト、超多孔質ヒドロキシアパタイト、アパタイトコラーゲン混合体、アパタイトコラーゲン複合体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ、フィブリンゲル、合成ペプチド、細胞外基質混合物、アルギン酸、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／ポリ乳酸共重合体およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目２４Ａ）
前記Ｂ）工程が、
前記凍結乾燥した状態の上清とコラーゲン溶液とを合わせる工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２４Ｂ）
前記Ｂ）工程が、
前記濃縮した上清とヒドロキシアパタイトとを接触させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２５）
前記分化因子産生培地が、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸の両方を含む、上記項目に記載の方法。
（項目２６）
前記分化因子産生培地が、血清成分をさらに含む、上記項目に記載の方法。
（項目２７）
生体内の骨形成を促進または誘発するための方法であって、該方法は、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、生体内の骨形成を促進または誘発する必要のある部位に移植する工程を包含する、方法。
（項目２８）
前記骨形成が、骨の欠損を修復または治療するためのものである、上記項目に記載の方法。
（項目２９）
前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有する、上記項目に記載の方法。
（項目３０）
前記骨形成が、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものである、上記項目に記載の方法。
（項目３１）
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）アルギン酸
を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。
（項目３２）
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）ラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物
を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料。
本発明によって、生体内の骨形成を促進または誘発することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法が提供される。このような複合材料は、生体内の骨形成を促進または誘発することができ、この複合材料を用いることによって、周辺に骨がない部位にまで骨形成を導くことができるようになった。このような複合材料は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１Ａは、肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは赤く染まった。左下のバーは、３００．００μｍ。
図１Ｂは、図１Ａのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では同一部分が青く染まり、細胞が存在することが分かる。左下のバーは、３００．００μｍ。
図１Ｃは、静止軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった。左下のバーは、３００．００μｍ。
図１Ｄは、図１Ｃのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く染まり、細胞が存在することが確認された。左下のバーは、３００．００μｍ。
図１Ｅは、関節軟骨部由来の軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった。左下のバーは、３００．００μｍ。
図１Ｆは、図１Ｅのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された。左下のバーは、３００．００μｍ。
図２は、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地でそれぞれ培養し、各培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、４週齢のラット群では、４日後に採取した培養上清を添加すると約４．１倍、１週後に採取した培養上清では約５．１倍、２週後に採取した培養上清では約５．４倍、３週後に採取した培養上清では約４．９倍にまで上昇した。８週齢のラット群では、４日後に採取した培養上清を添加すると約２．９倍、１週後に採取した培養上清では約３．１倍、２週後に採取した培養上清では約３．８倍、３週後に採取した培養上清では約４．２倍にまで上昇した。ＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、４週齢および８週齢のラット群におけるアルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。４週齢分化上清：４週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、８週齢分化上清：８週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、４週齢増殖上清：４週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清、８週齢増殖上清：８週齢ラット由来の肥大化軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清。
図３Ａは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地またはＭＥＭ増殖培地でそれぞれ培養し、各上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を２４穴プレート上に播種し（ＢＭＥ培地）、１８時間後に各培養上清を添加し、７２時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。上段：ＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、試料は赤く染まり、活性が有ることが確認された。下段：ＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、試料は染まらず、活性がないことが確認された。
図３Ｂは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、その培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をヒドロキシアパタイト上に播種し（ＢＭＥ培地）、１８時間後に培養上清を添加し、７２時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。ＭＥＭ分化因子産生培地で培養した上清を添加した場合、試料は赤く染まり、活性が有ることが確認された。左下のバーは、５００．００μｍ。
図３Ｃは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、その培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のトルイジン青染色の結果を示す。マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をヒドロキシアパタイト上に播種し（ＢＭＥ培地）、１８時間後に培養上清を添加し、７２時間後にトルイジン青染色をした。トルイジン青染色で青く染まることより、試料に細胞は存在することが確認された。左下のバーは、５００．００μｍ。
図３Ｄは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養し、その培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をヒドロキシアパタイト上に播種し（ＢＭＥ培地）、１８時間後に培養上清を添加し、７２時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。ＭＥＭ増殖培地で培養した上清を添加した場合、試料は染まらず、活性がないことが確認された。左下のバーは、５００．００μｍ。
図３Ｅは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培で培養し、その培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のトルイジン青染色の結果を示す。マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をヒドロキシアパタイト上に播種し（ＢＭＥ培地）、１８時間後に培養上清を添加し、７２時間後にトルイジン青染色をした。トルイジン青染色で青く染まることより、試料に細胞は存在することが確認された。左下のバーは、５００．００μｍ。
図４は、肋軟骨由来の静止軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地でそれぞれ培養し、その培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、およびＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみおよびＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。８週齢分化上清：８週齢ラット由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、８週齢増殖上清：８週齢ラット由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清。各値は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみおよびＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１として表した。
図５Ａは、関節軟骨部由来の軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地でそれぞれ培養し、その培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。関節軟骨部由来の軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、およびＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみおよびＭＥＭ増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。８週齢分化上清：８週齢ラット由来の関節軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、８週齢増殖上清：８週齢ラット由来の関節軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清。各値は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみおよびＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１として表した。
図５Ｂは、肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＨＡＭ分化因子産生培地で培養し、その上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。値は、ＨＡＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とした。肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＨＡＭ分化因子産生培地で培養した上清を添加した場合、アルカリホスファターゼの活性が上昇した。
図５Ｃは、肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＨＡＭ増殖培地で培養し、その上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。値は、ＨＡＭ増殖培地のみを添加した場合を１とした。肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＨＡＭ増殖培地で培養した上清を添加した場合、アルカリホスファターゼの活性が上昇しなかった。
図６Ａは、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞においてアルカリホスファターゼ活性を上昇させ、これらの未分化細胞を骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することを示す。一方、ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことを示す。さらに、ＭＥＭ分化因子産生培地またはＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有さない軟骨細胞を培養した場合には、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことを示す。
図６Ｂは、従来型骨芽細胞分化誘導成分として、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸またはこれらの組み合せを培地に添加して肥大化能を有する軟骨細胞を培養し、その培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。Ｄｅｘ：デキサメサゾン、βＧＰ：β−グリセロホスフェート、Ａｓｃ：アスコルビン酸。
図７Ａは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、その上清の分子量５０，０００以上の画分を、２４穴プレート上に播種したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。試料は赤く染まり、この上清の分子量５０，０００以上の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子が存在することが分かった。
図７Ｂは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、その上清の分子量５０，０００以上の画分を、ヒドロキシアパタイト上に播種したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。ヒドロキシアパタイトは赤く染まり、この上清の分子量５０，０００以上の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子が存在することが分かった。
図７Ｃは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、この上清の分子量５０，０００未満の画分を、２４穴プレート上に播種したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。分子量５０，０００未満の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子は認められなかった。左下のバーは、５００．００μｍ。
図７Ｄは、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、この上清の分子量５０，０００未満の画分を、ヒドロキシアパタイト上に播種したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ染色の結果を示す。分子量５０，０００未満の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子は認められなかった。左下のバーは、５００．００μｍ。
図８は、マウスの肋骨・肋軟骨から採取した肥大化能を有する軟骨細胞および肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地でそれぞれ培養し、各培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を示す。肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、３．１倍に上昇した。肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、肋軟骨由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清をそれぞれ添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみおよびＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。以下の略称は添加した培養上清を示す。ＧＣ分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、ＧＣ増殖上清：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清、ＲＣ分化上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、ＲＣ増殖上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清。各値は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみおよびＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１として表した。
図９は、未分化細胞を培養する培地が、未分化細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響を示す。肥大化能を有する軟骨細胞、静止軟骨細胞、および関節軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地でそれぞれ培養した。それぞれの培養上清をマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を測定した。マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を培養する培地として、ＨＡＭ培地またはＭＥＭ培地を使用した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の培養にＨＡＭ培地を用いた場合、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合のみ、アルカリホスファターゼ活性の上昇が認められた。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の培養にＭＥＭ培地を用いた場合も同様の結果が得られた。以下の略称は添加した培養上清を示す。ＧＣ分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、ＧＣ増殖上清：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清、ＲＣ分化上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、ＲＣ増殖上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清、ＡＣ分化上清：関節軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、ＡＣ増殖上清：関節軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清。各値は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみおよびＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１として表した。
図１０は、肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された、未分化細胞を骨芽細胞に分化誘導させる因子を加熱処理したときのアルカリホスファターゼ活性を示す。肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を，沸騰水中で３分間加熱処理した。加熱処理をしていない培養上清、加熱処理した培養上清、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞にそれぞれ添加し、７２時間後にアルカリホスファターゼ活性を測定した。培養上清を加熱処理した場合、アルカリホスファターゼ活性は上昇しなかった。未分化細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子は、加熱処理により熱変性する（失活する）ことが確認された。以下の略称は添加した培養上清を示す。ＧＣ熱処理：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を加熱処理したもの、ＧＣ分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清、分化上清のみ：ＭＥＭ分化因子産生培地のみ。各値は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１として表した。
図１１Ａは、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含むＭＥＭ分化因子産生培地上清におけるＴＧＦβの活性を示す。
図１１Ｂは、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含むＭＥＭ分化因子産生培地上清におけるＢＭＰの活性を示す。
図１２は、試験試料液を超多孔体ヒドロキシアパタイト（アパセラムＡＸフィラー）に付着させ、１８時間培養したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加した。７２時間後にアパタイトを取り出し、アルカリホスファターゼ活性を測定した。添加した超多孔体ヒドロキシアパタイトを以下に示す。ＨＡｐＡＸＧＣ／分化浸漬：アパセラムＡＸフィラーに、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を付着させたもの；ＨＡｐＡＸ分化培地浸漬：アパセラムＡＸフィラーに、ＭＥＭ分化因子産生培地を付着させたもの；ＨＡｐＡＸのみ：アパセラムＡＸフィラー単独；分化培地のみ（ＭＥＭ）：ＭＥＭ分化因子産生培地のみ（アパセラムＡＸフィラー無し）
図１３Ａ〜Ｄは、移植前のコラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料を示す。図１３Ａは、ＨＥ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１３Ｂは、ＴＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１３Ｃは、ＡＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１３Ｄは、ＳＯ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１３Ｅは、コラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円形のものは移植部位を特定するために埋入したシリコンリングである。リングの中央部には、石灰化が認められる。図１３Ｆは、図１３Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円形のものは移植部位を特定するために埋入したシリコンリングである。リング中央部には、石灰化が認められる。
図１４は、コラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図１４Ａは、ＨＥ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図１４Ｂは、ＴＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図１４Ｃは、ＡＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図１４Ｄは、ＳＯ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。
図１５は、図１３に示すコラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率４倍視野）を示す。図１５Ａ〜図１５Ｄは、図１４Ａ〜図１４Ｄに対応する。
図１６は、図１３に示すコラーゲンゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率１０倍視野）を示す。図１６Ａ〜図１６Ｄは、図１４Ａ〜図１４Ｄに対応する。
図１７Ａ〜Ｄは、移植前のアルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料を示す。図１７Ａは、ＨＥ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１７Ｂは、ＴＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１７Ｃは、ＡＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１７Ｄは、ＳＯ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図１７Ｅは、アルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図１７Ｆは、図１７Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。
図１８は、アルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図１８Ａは、ＨＥ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図１８Ｂは、ＴＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図１８Ｃは、ＡＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図１８Ｄは、ＳＯ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。
図１９は、図１７に示すアルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率４倍視野）を示す。図１９Ａ〜図１９Ｄは、図１８Ａ〜図１８Ｄに対応する。
図２０は、図１７に示すアルギン酸と肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率１０倍視野）を示す。図２０Ａ〜図２０Ｄは、図１８Ａ〜図１８Ｄに対応する。
図２１Ａ〜Ｄは、移植前のマトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料を示す。図２１Ａは、ＨＥ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２１Ｂは、ＴＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２１Ｃは、ＡＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２１Ｄは、ＳＯ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２１Ｅは、マトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図２１Ｆは、図２１Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。
図２２は、マトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図２２Ａは、ＨＥ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２２Ｂは、ＴＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２２Ｃは、ＡＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２２Ｄは、ＳＯ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。
図２３は、図２２に示すマトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率４倍視野）を示す。図２３Ａ〜図２３Ｄは、図２２Ａ〜図２２Ｄに対応する。
図２４は、図２２に示すマトリゲルと肥大化能を有する軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率１０倍視野）を示す。図２４Ａ〜図２４Ｄは、図２２Ａ〜図２２Ｄに対応する。
図２５Ａ〜Ｄは、移植前のコラーゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料を示す。図２５Ａは、ＨＥ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２５Ｂは、ＴＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２５Ｃは、ＡＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２５Ｄは、ＳＯ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２５Ｅは、コラーゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。図２５Ｆは、図２５Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。
図２６は、コラーゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図２６Ａは、ＨＥ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２６Ｂは、ＴＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２６Ｃは、ＡＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２６Ｄは、ＳＯ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。
図２７は、図２６に示すコラーゲンゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率４倍視野）を示す。図２７Ａ〜図２７Ｄは、図２６Ａ〜図２６Ｄに対応する。
図２８Ａ〜Ｄは、移植前のアルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料を示す。図２８Ａは、ＨＥ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２８Ｂは、ＴＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２８Ｃは、ＡＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２８Ｄは、ＳＯ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図２８Ｅは、アルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。図２８Ｆは、図２８Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。
図２９は、アルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図２９Ａは、ＨＥ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２９Ｂは、ＴＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２９Ｃは、ＡＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図２９Ｄは、ＳＯ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。
図３０は、図２８に示すアルギン酸と肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率４倍視野）を示す。図３０Ａ〜図３０Ｄは、図２９Ａ〜図２９Ｄに対応する。
図３１Ａ〜Ｄは、移植前のマトリゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料を示す。図３１Ａは、ＨＥ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図３１Ｂは、ＴＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図３１Ｃは、ＡＢ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図３１Ｄは、ＳＯ染色した標本（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図３１Ｅは、マトリゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。図３１Ｆは、図３１Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化は認められない。
図３２は、マトリゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織の全体像を示す。図３２Ａは、ＨＥ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図３２Ｂは、ＴＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図３２Ｃは、ＡＢ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。図３２Ｄは、ＳＯ染色（拡大レンズ倍率３５倍視野）である。
図３３は、図３１に示すマトリゲルと肥大化能を有さない軟骨細胞との複合材料をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率４倍視野）を示す。図３３Ａ〜図３３Ｄは、図３２Ａ〜図３２Ｄに対応する。
図３４Ａは、ヒドロキシアパタイトのみをラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。左上のバーは、１０００．００μｍ。図３４Ｂは、図３４Ａの拡大図（接眼レンズ倍率２０倍視野）である。図３４Ｃは、コラーゲルのみをラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。図３４Ｄは、図３４Ｃと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。図３４Ｅは、アルギン酸のみをラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。図３４Ｆは、図３４Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。図３４Ｇは、マトリゲルのみをラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。図３４Ｈは、図３４Ｇと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。図３４Ｃ〜Ｈにおける円状のものはシリコンリングである。すべての足場において石灰化は認められないことが確認された。
図３５Ａは、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を示す（拡大レンズ倍率３５倍視野）。肥大化した細胞形態が観察される。図３５Ｂは、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を示す（拡大レンズ倍率３５倍視野）。肥大化能を有さない軟骨細胞は肥大化していないことが観察される。図３５Ｃは、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図３５Ｄは、図３５Ｃと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められる。図３５Ｅは、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出し、レントゲン撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められない。図３５Ｆは、図３５Ｅと同じ標本をマイクロＣＴ撮影した図である。円状のものはシリコンリングであり、中央部には、石灰化が認められない。
図３６は、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像を示す。図３６Ａは、ＨＥ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。図３６Ｂは、ＴＢ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。図３６Ｃは、ＡＢ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。図３６Ｄは、ＳＯ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。
図３７は、図３５に示すペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像の拡大図（接眼レンズ倍率１０倍視野）を示す。図３７Ａ〜図３７Ｄは、図３６Ａ〜図３６Ｄに対応する。
図３８は、ペレット状にして培養したラット肋骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞をラット背部皮下に移植し、移植４週間後に移植部位を摘出して染色した組織像を示す。図３８Ａは、ＨＥ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。図３８Ｂは、ＴＢ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。図３８Ｃは、ＡＢ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。図３８Ｄは、ＳＯ染色（接眼レンズ倍率４倍視野）である。
図３９（１）は、肥大化能を有する軟骨細胞を因子産生培地で培養した上清（因子を含む分化培地）を添加したヒト未分化間葉系幹細胞をアルカリホスファターゼ染色した写真である。ヒト未分化間葉系幹細胞が赤く染色されることが確認された。図３９（２）は、（２）ＭＥＭ分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｏｒｕｓの骨芽細胞分化培地）を添加したヒト未分化間葉系幹細胞をアルカリホスファターゼ染色した写真である。ヒト未分化間葉系幹細胞はわずかに赤く染色された。図３９（３）は、（３）ＭＥＭ増殖培地のみ（因子もデキサメサゾンも含まないＭＥＭ増殖培地）を添加したヒト未分化間葉系幹細胞をアルカリホスファターゼ染色した写真である。ヒト未分化間葉系幹細胞はほとんど染色されなかった。ｎ＝３で行った。
図４０Ａは、大腿骨欠損部に、該因子の濃縮凍結乾燥物をコラーゲンゲルの複合材料を移植し、４週間経過したものの写真である。
図４０Ｂは、大腿骨欠損部にコラーゲンゲルのみを移植し、４週間経過したものの写真である。
図４１Ａは、ラット大腿骨に作製した直径３．０ｍｍの骨欠損に移植した４週後の結果である。左列はコラーゲンゲルのみを移植した結果であり、右列は本発明による因子の濃縮凍結乾燥物とコラーゲンゲルとからなる複合材料を移植した結果である。移植後４週目に試料を摘出して、１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬株式会社）で固定した。この試料をマイクロＣＴスキャナで撮影した。マイクロＣＴは、東陽テクニカ社製ＳＫＹＳＣＡＮ１１７２高分解能Ｘ線マイクロＣＴスキャナを使用した。撮影後、同スキャナに付属の再構成ソフトウェアＮＲｅｃｏｎを用いて再構成した。さらに、この再構成画像を三次元ボリュームレンダリングソフトＶＧＳｔｕｄｉｏ  Ｍａｘ（日本ビジュアルサイエンス株式会社）を用いて可視化した。上段は、マイクロＣＴ撮影後再構成し可視化した移植中心部の断層画像で、大腿骨に対する水平断層図。下段は、同部分の立体画像。
図４１Ｂは、４１Ａ試料のＨＥ染色結果である。図４１ＡでのマイクロＣＴ撮影後、脱脂脱灰を行い、パラフィン包埋して、薄切標本を作製し、ＨＥ染色した。左図はコラーゲンゲルのみを移植したＨＥ標本であり、右図は該因子の凍結乾燥物とコラーゲンゲルから成る複合材料を移植したＨＥ標本である。右図においては左図に比べて、旺盛な骨形成像が診られる。
図４２Ａは、大腿骨に作製した骨欠損のサイズが直径２．５ｍｍの骨欠損に移植した４週後の結果である。左列はコラーゲンゲルのみを移植した結果であり、右列は該因子の濃縮凍結乾燥物とコラーゲンゲルから成る複合材料を移植した結果である。移植後４週目に試料を摘出して、１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬株式会社）で固定した。この試料をマイクロＣＴスキャナで撮影した。マイクロＣＴは、東陽テクニカ社製ＳＫＹＳＣＡＮ１１７２高分解能Ｘ線マイクロＣＴスキャナを使用した。撮影後、同スキャナに付属の再構成ソフトウェアＮＲｅｃｏｎを用いて再構成した。さらに、この再構成画像を三次元ボリュームレンダリングソフトＶＧＳｔｕｄｉｏ  Ｍａｘ（日本ビジュアルサイエンス株式会社）を用いて可視化した。上段は、マイクロＣＴ撮影後再構成し可視化した移植中心部の断層画像で、大腿骨に対する水平断層図。下段は、同部分の立体画像。
図４２Ｂは、図４２Ａ試料のＨＥ染色結果である。図４２ＡでのマイクロＣＴ撮影後、脱脂脱灰を行い、パラフィン包埋して、薄切標本を作製し、ＨＥ染色した。右図（本発明による因子の凍結乾燥物とコラーゲンゲルとからなる複合材料を移植したＨＥ標本）においては左図（コラーゲンゲルのみを移植したＨＥ標本）に比べて、良好な骨欠損の修復が診られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「複合材料」とは、細胞と足場を含む材料をいう。
本明細書における「骨欠損」には、骨腫瘍、骨粗しょう症、リウマチ性関節炎、変形性関節症、骨髄炎および骨壊死などの病変；骨固定術、椎間拡張術および骨切術などの矯正手術；複雑骨折などの外傷および腸骨採取などによって生じる骨の欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、骨形成の「促進」とは、すでに骨形成が起こっている場合に、目的とする変化を加えると、その骨形成の速度が増加することをいう。骨形成の「誘発」とは、骨形成が起こっていない場合に、目的とする変化を加えると骨形成が生じることをいう。
骨の欠損部位の「修復」とは、その欠損部位が健常状態になるか、またはそれに近づくことをいう。
本明細書において「固定のみでは修復できない大きさ」とは、インプラントおよび骨補填材料の使用が不可欠である大きさをいう。
（細胞）
本明細書において「成長軟骨細胞（ｇｒｏｗｔｈ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｅｌｌ）」とは、発生期または成長期および骨折修復期または骨増殖期に、骨を形成する組織（すなわち成長軟骨）にある細胞をいう。成長期に骨を形成する組織を成長軟骨と呼ぶのが一般的であるが、本明細書では、発生期、成長期、骨増殖期または骨折修復期に骨を形成する組織を意味する。成長軟骨細胞はまた、肥大（化）軟骨細胞、石灰化軟骨細胞、または骨端（線）軟骨細胞ともいわれる。成長軟骨細胞がヒトに対して用いられる場合、この成長軟骨細胞はヒト由来であることが好ましいが、周知技術により拒絶反応等の問題が克服できることから、ヒト以外に由来する細胞でも用いることができる。
本発明における成長軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト、マウス、ラットまたはウサギ由来である。
本発明における成長軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨などの長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、手骨、足骨および胸骨などの成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部、ならびに骨増殖期の軟骨部から採取され得る。これらの成長軟骨細胞は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法によって調製され得る。
本明細書において「肥大化能を有する軟骨細胞」とは、将来的に肥大化する能力のある細胞をいう。肥大化能を有する軟骨細胞は、天然でとれる「成長軟骨細胞」に加えて、本明細書において以下に定義される「肥大化能」の判定法により肥大化能を有する任意の細胞を含む。
本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト、マウス、ラットまたはウサギ由来である。肥大化能を有する軟骨細胞がヒトに対して用いられる場合、この肥大化能を有する軟骨細胞はヒト由来であることが好ましいが、周知技術により拒絶反応等の問題が克服できることから、ヒト以外に由来する細胞でも用いることができる。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、例えば、肋骨の骨軟骨移行部、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨などの長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、手骨、足骨および胸骨などの成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部、ならびに骨増殖時の軟骨部から採取され得る。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、未分化細胞を分化誘導させて得ることも可能である。
本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、上記部位に限らずどのような場所から採取されたものであってもよい。なぜなら、内軟骨性骨化（軟骨内骨化）によって形成される骨は、体の部位に依らず、すべて同じ機序で形成されるからである。すなわち、軟骨が形成されて、それが骨に置換される。頭蓋骨と鎖骨を除く体のほとんどの骨は、この内軟骨性骨化（軟骨内骨化）によって形成される。したがって、頭蓋骨と鎖骨を除く体のほとんどの骨には、肥大化能を有する軟骨細胞が存在し、その細胞は骨形成を行なう能力を有する。
肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的には肥大化することを特徴とする。
本明細書において「肥大化」とは、検鏡下で形態学的に判断され得る。細胞の肥大化は、細胞が柱状配列をしている場合には増殖層に続いて観察され、柱状配列していない場合には、周囲細胞と比較してより大きい状態をいう。
肥大化能は、５×１０５個の前記細胞を含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培養液を遠心することにより該細胞のペレットを作製し、該細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較し、有意な成長が確認されたときに、肥大化能を有すると判定される。
本明細書において、「静止軟骨細胞」とは、肋軟骨の肋骨移行部（成長軟骨部）から離れた部分に位置する軟骨をいい、生涯に亘って軟骨として存在する組織である。静止軟骨部にある細胞を静止軟骨細胞という。本明細書において、「関節軟骨細胞」とは、関節面に存在する軟骨組織（関節軟骨）にある細胞をいう。
本明細書において、軟骨細胞は、マーカーとして、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンまたはコドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つを発現していることを確認することにより判定される。軟骨細胞のうち、肥大化能を有する細胞は、さらにＸ型コラーゲン、アルカリホスファターゼおよびオステオネクチンからなる群より選択される少なくとも１つを発現していることを確認することによって判定される。Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼまたはオステオネクチンのいずれも発現していない軟骨細胞は、肥大化能を有していないと判定される。従って、本明細書における肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的に肥大化することを確認する代わりに、軟骨細胞マーカー群より選択される少なくとも１つおよび肥大化能を有する軟骨細胞マーカー群より選択される少なくとも１つを発現していることを確認することによっても判定され得る。マーカーは、特異的な染色法、免疫組織化学的な手法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法またはＰＣＲ法などの培養細胞から抽出したタンパク質またはＲＮＡを解析する手法で、局在または発現が同定される。
本明細書において「軟骨細胞マーカー」とは、軟骨細胞において、その局在または発現が軟骨細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンまたはコドロモジュリンの局在または発現）によって軟骨細胞であることが同定できるものをいう。本明細書において「肥大化能を有する軟骨細胞マーカー」とは、肥大化能を有する軟骨細胞において、その局在または発現が軟骨細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼまたはオステオネクチンの局在または発現）によって肥大化能を有する軟骨細胞であることが同定できるものをいう。
本明細書において、「軟骨型プロテオグリカン」とは、コアタンパク質にコンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、ケラタン硫酸、Ｏ−結合オリゴ糖、Ｎ−結合オリゴ糖などのグルコサミノグリカンが多数結合した高分子をいう。この軟骨型プロテオグリカンは、さらにリンクタンパクを介してヒアルロン酸と結合して軟骨型プロテオグリカン集合体を形成する。軟骨組織においてグルコサミノグリカンは豊富で、乾燥重量の２０〜４０％を占める。軟骨型プロテオグリカンは、アグリカンとも称される。
本明細書において、「骨型プロテオグリカン」とは、軟骨型プロテオグリカンより分子量が小さく、コアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、Ｏ−結合オリゴ糖、Ｎ−結合オリゴ糖などのグルコサミノグリカンが結合した高分子をいう。骨組織におけるグルコサミノグリカンは、脱灰骨の乾燥重量の１％以下である。骨型プロテオグリカンとしては、例えば、デコリン、バイグリカンが挙げられ得る。
本明細書において「骨芽細胞」とは、骨基質上に存在し、骨基質形成およびその石灰化を行う細胞である。骨芽細胞は、２０〜３０μｍで、立方体または円柱状の細胞である。本明細書において使用される場合、骨芽細胞は、骨芽細胞の前駆体細胞である「前骨芽細胞」を含み得る。
骨芽細胞は、マーカーとして、Ｉ型コラーゲン、骨型プロテオグリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、基質Ｇｌａタンパク質、オステオグリシン、オステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、オステオネクチンまたはプレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）からなる群より選択される少なくとも１つを発現することによって判定される。加えて、骨芽細胞は、軟骨細胞マーカーであるＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンまたはコドロモジュリンを発現していないことを確認することによって確定され得る。マーカーは、特異的な染色法、免疫組織化学的な手法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法またはＰＣＲ法などの培養細胞から抽出したタンパク質またはＲＮＡを解析する手法で、局在または発現が同定される。
本明細書において「骨芽細胞マーカー」とは、骨芽細胞において、その局在または発現が骨芽細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、Ｉ型コラーゲン、骨型プロテオグリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、基質Ｇｌａタンパク質、オステオグリシン、オステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、オステオネクチンまたはプレイオトロフィンの局在または発現）によって骨芽細胞であることを確認することができるものをいう。オステオグリシンは、骨誘導因子（ＯＩＦ）ともいわれる。オステオポンチンは、ＢＳＰ−Ｉ、２ａｒともいわれる。骨シアル酸タンパク質は、ＢＳＰ−ＩＩともいわれる。プレイオトロフィンは、ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＳＦ−１）、骨芽細胞特異的因子−１ともいわれる。オステオネクチンは、ＳＰＡＲＣ、ＢＭ−４０ともいわれる。
骨芽細胞であると認定するためには、骨芽細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性であることを示すか：骨芽細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別し、軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ骨芽細胞と軟骨細胞とを陽性と識別し、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；骨芽細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、骨芽細胞を陰性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または骨芽細胞と軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、骨芽細胞を陰性と識別し軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。
肥大化能を有する軟骨細胞であると認定するためには、肥大化能を有する軟骨細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性あることを示すか；肥大化能を有する軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別し軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞と軟骨細胞とを陽性と識別し骨芽細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；肥大化能を有する軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別し骨芽細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または肥大化能を有する軟骨細胞と軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別し軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。
（肥大化能を有しない）軟骨細胞であると認定するためには、軟骨細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性あることを示すか；軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別し骨芽細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞を陰性と識別し骨芽細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または軟骨細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞を陰性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。
本明細書において、軟骨細胞、肥大化能を有する軟骨細胞、骨芽細胞および誘導骨芽細胞を認定するためには、例えば、以下の表に列挙される細胞マーカーの組み合わせが用いられ得る。
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本明細書において、軟骨細胞と、肥大化能を有する軟骨細胞と、骨芽細胞とは、前記マーカー以外にも細胞の形態、各種染色を観察することにより識別することができる。
軟骨細胞は、検鏡下では、数個の細胞が集まり、酸性トルイジン青染色でメタクロマジーを示し、アルシアン青染色で青く染まり、サフラニン０染色で赤く染まり、かつアルカリホスファターゼ染色されない細胞である。
肥大化能を有する軟骨細胞は、検鏡下では、細胞が柱状配列をしている場合には増殖層に続いて観察されて増殖層細胞より大きい状態を示し、柱状配列していない場合には、周囲細胞と比較してより大きい状態を示し、酸性トルイジン青染色でメタクロマジーを示し、アルシアン青染色で青く染まり、サフラニン０染色で赤く染まり、かつアルカリホスファターゼ染色される細胞である。
骨芽細胞は、２０〜３０μｍで、立方体または円柱状の形態を示し、かつアルカリホスファターゼ活性を示す細胞である。
上記アルカリホスファターゼ活性は、Ａ）サンプル１００μｌに、５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、Ａ９２２６）を加え、３７℃で１５分間反応させ、１Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を２０μｌ添加したときの４０５ｎｍの吸光度とを測定する工程；およびＢ）該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程によって決定される。この吸光度の差が該アルカリホスファターゼ活性の指標であり、吸光度の差の絶対値を増加させたときに、活性があることを示すと判断される。
このアルカリホスファターゼ活性はまた、Ａ）サンプル１００μｌに、５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、Ａ９２２６）を加え、３７℃で１５分間反応させ、１Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を２０μｌ添加したときの４０５ｎｍの吸光度とを測定する工程；およびＢ）濃塩酸の添加前後の吸光度の差を計算する工程によって決定される。この吸光度の差が該アルカリホスファターゼ活性の指標であり、吸光度の差の相対値を少なくとも約１倍より高く上昇させたときに、活性があることを示すと判断される。実験ごとにｐ−ニトロフェノール濃度が０〜１０ｍＭの溶液を作製し、その吸光度を測定し、横軸に濃度を、縦軸に吸光度を取り、それらの値を一次直線で近似したものを検量線とする。吸光度から絶対値は、この検量線より算出することができる。
本明細書において「誘導骨芽細胞」とは、本発明による誘導骨芽細胞分化誘導因子によって未分化細胞から誘導された細胞をいう。この誘導骨芽細胞は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含む分化因子産生培地において培養して得られる上清または該上清中に存在する誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程；およびＢ）該上清または該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、培地成分とを含む未分化細胞培養培地で、未分化細胞を誘導骨芽細胞への誘導に充分な条件下で培養する工程を包含する方法によって産生され得る。上記誘導骨芽細胞はまた、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程；およびＢ）該誘導骨芽細胞分化誘導因子と培地成分とを含む未分化細胞培養培地で、未分化細胞を培養して誘導骨芽細胞へ分化させる工程を包含する方法によっても誘導され得る。本発明の誘導骨芽細胞は、酸性トルイジン青染色により異染性を示さず、かつサフラニンＯ染色において陰性を示し得る。
本明細書において「誘導骨芽細胞マーカー」とは、誘導骨芽細胞において、その局在または発現が誘導骨芽細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。例えば、その局在または発現によって誘導骨芽細胞であることを確認することができるものをいう。誘導骨芽細胞は、天然の骨芽細胞と同様に、以下のようなマーカーの局在または発現（例えば、Ｉ型コラーゲン、骨型プロテオグリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、基質Ｇｌａタンパク質、オステオグリシン、オステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、オステオネクチンまたはプレイオトロフィンの局在または発現）によって誘導骨芽細胞であることを確認することができる。
本明細書において「分化誘導」とは、細胞、組織または器官のような生物の部分の状態の発達過程であって、特徴のある組織または器官の形成を誘導する過程をいう。「分化」、「分化誘導」は、主に発生学（ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ）、発生生物学（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）などにおいて使用されている。１個の細胞からなる受精卵が分裂を行い成体になるまで、生物は種々の組織および器官を形成する。分化前または分化が十分でない場合のような生物の発生初期は、一つ一つの細胞または細胞群が何ら形態的または機能的特徴を示さず区別することが困難である。このような状態を「未分化」であるという。「分化」は、器官のレベルでも生じ、器官を構成する細胞がいろいろの違った特徴的な細胞または細胞群へと発達する。これも器官形成における器官内での分化といい、このような発達を誘導することも、分化誘導という。
本明細書において、「誘導骨芽細胞分化誘導能」とは、未分化細胞、好ましくは、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞または体性幹細胞、より好ましくは、間葉系幹細胞を本発明の誘導骨芽細胞に分化誘導する能力をいう。この誘導骨芽細胞分化誘導能の一つの指標として、誘導骨芽細胞マーカー（例えば、アルカリホスファターゼ）が使用され得る。具体的には、本発明において使用される因子は、イーグル基礎培地中でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞にこの因子を曝露した場合あるいは最小必須培地（ＭＥＭ）中で間葉系幹細胞にこの因子を曝露した場合、因子を含まない各培地において各細胞を培養した場合と比較して、各細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（例えば、この細胞全体におけるアルカリホスファターゼ活性）を、少なくとも約１倍より高く上昇させたときに誘導骨芽細胞分化誘導能を有すると判断される。このアルカリホスファターゼ活性は、Ａ）該因子を含むかまたは含まないサンプル１００μｌに、それぞれ５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、Ａ９２２６）を加え、３７℃で１５分間反応させ、１Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を２０μｌ添加したときの４０５ｎｍの吸光度とを測定する工程；およびＢ）該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程であって、該吸光度の差が、該アルカリホスファターゼ活性の指標である、工程によって決定される。また、本発明において使用される因子は、イーグル基礎培地中でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞にこの因子を曝露した場合あるいは最小必須培地（ＭＥＭ）中で間葉系幹細胞にこの因子を曝露した場合、各細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（例えば、この細胞全体におけるアルカリホスファターゼ活性）を増加させたときに誘導骨芽細胞分化誘導能を有すると判断される。このアルカリホスファターゼ活性は、Ａ）該因子を含むかまたは含まないサンプル１００μｌに、それぞれ５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、Ａ９２２６）を加え、３７℃で１５分間反応させ、１Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を２０μｌ添加したときの４０５ｎｍの吸光度とを測定する工程；およびＢ）濃塩酸の添加前後の吸光度の差を計算する工程であって、吸光度の差が、アルカリホスファターゼ活性の指標である、工程によって決定される。実験ごとにｐ−ニトロフェノール濃度が０〜１０ｍＭの溶液を作製し、その吸光度を測定し、横軸に濃度を、縦軸に吸光度を取り、それらの値を一次直線で近似したものを検量線とする。吸光度から絶対値は、この検量線より算出することができる。
このアルカリホスファターゼ活性は、骨形成の指標として従来使用されており、アルカリホスファターゼ活性が上昇すると、一般に骨形成が促進したと判断されている（須田立雄編、「骨形成と骨吸収及びそれらの調節因子  １」、株式会社廣川書店、平成７年、３月３０日、ｐ．３９−４４）。
本明細書において、未分化細胞（例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、血管幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞など）に対する「誘導骨芽細胞分化誘導能」とは、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力をいう。例えば、誘導骨芽細胞分化誘導能は、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸によって分化誘導されない未分化細胞を、誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を含み得る。誘導骨芽細胞分化誘導能は、対象とする細胞を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、２．５×１０４／穴）に均一に播種し、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で７２時間培養した場合、誘導骨芽細胞マーカーの少なくとも一種を発現誘導また発現上昇を測定することによって判定され得る。
本明細書において「未分化細胞」とは、最終分化に至っていない細胞、まだ分化し得る細胞をいう。本明細書で使用する場合、未分化細胞は幹細胞（例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞または体性幹細胞）であり得、例えば、間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞など）、造血幹細胞、血管幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞または神経幹細胞であり得る。さらに、未分化細胞は、分化経路にあるすべての細胞を含み、例えば、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＡＴＤＣ５細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＴ−２５０１、初代ラット骨髄由来幹細胞であり得る。これらの細胞は、大日本住友製薬だけでなく、国内外の販売会社（三光純薬、コスモバイオ社、タカラバイオ社、東洋紡績社、住商ファーマバイオメディカル社、Ｃａｍｂｒｅｘ社、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）や細胞バンク等からも入手可能である。本発明において使用される未分化細胞は、誘導骨芽細胞への分化を達成することができる限りどのような細胞でもあってもよい。本発明において使用される未分化細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギなど）に由来する細胞であり得る。これらとしては、例えば、ラット骨髄から採取した間葉系幹細胞が挙げられ得る。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）幹細胞または体性幹細胞（組織幹細胞、組織特異的幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性生殖幹細胞は、始原生殖細胞が特定の環境因子にさらされることにより脱分化して形成されると考えられている細胞であり、胚性幹細胞としての性質をもちながら、由来した始原生殖細胞の性質も一部保持している。体性幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、組織中に存在し、胚性幹細胞より多能性のレベルが低く、分化の方向性が限定されている細胞である。一般に幹細胞は未分化な細胞内構造をしており、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは間葉系幹細胞であり得るが、状況に応じて他の体性幹細胞、胚性生殖細胞または胚性幹細胞も使用され得る。
由来する部位により分類すると、体性幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の体性幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の体性幹細胞としては、膵幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の体性幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の体性幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に内臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。
本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉系の組織に見出される幹細胞をいう。間葉系の組織としては、骨髄、脂肪、血管内皮、平滑筋、心筋、骨格筋、軟骨、骨、じん帯が挙げられるが、これらに限定されない。間葉系幹細胞は、代表的には、骨髄、脂肪組織、滑膜組織、筋組織、末梢血、胎盤組織、月経血または臍帯血（好ましくは、骨髄）に由来する幹細胞であり得る。
本明細書において「増殖培地」とは、基礎培地、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）および血清成分（例えば、ヒト血清、ウシ血清、ウシ胎仔血清）を含んでいる培地をいう。代表的には、血清成分は、０〜２０％程度添加され得る。さらに、基礎培地が最小必須培地（ＭＥＭ）である場合、「ＭＥＭ増殖培地」といい、基礎培地がＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ＨＡＭ）である場合、「ＨＡＭ増殖培地」という。
本明細書において「分化因子産生培地」とは、基礎培地を含み、かつグルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される従来型骨芽細胞分化誘導成分の少なくとも１つを含んでいる培地をいう。分化因子産生培地は、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される従来型骨芽細胞分化誘導成分の少なくとも１つを含んでいてもよい。分化因子産生培地は、従来型骨芽細胞分化誘導成分として、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のすべてを含んでいてもよい。好ましくは、分化因子産生培地は、基礎成分として、最小必須培地（ＭＥＭ）を含み、従来型骨芽細胞分化誘導成分としてβ−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のすべてを含む。好ましくは、「分化因子産生培地」は、血清成分（例えば、ヒト血清、ウシ血清、ウシ胎仔血清）をさらに含んでいてもよい。代表的には、血清成分は、０〜２０％程度添加され得る。分化因子産生培地は、より好ましくは、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含み得る。さらに、基礎培地が最小必須培地（ＭＥＭ）である場合、「ＭＥＭ分化因子産生培地」といい、基礎培地がＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ＨＡＭ）である場合、「ＨＡＭ分化因子産生培地」という。この分化因子産生培地自体には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞、Ｂａｌｂ  ３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力は見出されていない。従って、本発明による因子は、分化因子産生培地中に含まれる成分とは異なると考えられる。
本明細書において「従来型骨芽細胞分化誘導成分」とは、Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓらによって提唱されたもので（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃら：Ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８．）、以来、骨髄細胞から骨芽細胞を分化誘導させる場合に使用されている成分であって、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸の組み合わせをいう。
本明細書において「グルココルチコイド」とは、副腎皮質ホルモンであり、糖質代謝に関係するステロイドホルモンの総称である。グルココルチコイドは、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分としても知られている（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃら：Ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８．）が、上記の細胞に対する分化誘導の効果は知られていない。グルココルチコイドは、糖質コルチコイドとも称される。代表的には、デキサメサゾン、ベタメタゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コルチゾン、コルチゾル、コルチコステロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、デキサメサゾンが使用される。天然のグルココルチコイドと同様な作用を有する化学合成物質も含まれ得る。これらの代表的なグルココルチコイドは、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸とともに、肥大化能を有する軟骨細胞の培養に使用されると、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子を産生することから、本発明においていずれも分化因子産生培地中に含ませることができる。グルココルチコイドは、分化因子産生培地中に、０．１ｎＭ〜１０ｍＭの濃度で含ませることができ、好ましくは、１０〜１００ｎＭの濃度である。
本明細書において「β−グリセロホスフェート」とは、グリセロリン酸（Ｃ３Ｈ５（ＯＨ）２ＯＰＯ３Ｈ２）のうちリン酸基がβ位に結合したものの塩の総称である。塩としては、カルシウム塩、ナトリウム塩などを挙げることができる。β−グリセロホスフェートは、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分としても知られている（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃら：Ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８．）が、上記の細胞に対する分化誘導の効果は知られていない。β−グリセロホスフェートは、グルココルチコイドおよびアスコルビン酸とともに、肥大化能を有する軟骨細胞の培養に使用されると、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子を産生することから、本発明においていずれも分化因子産生培地中に含ませることができる。β−グリセロホスフェートは、分化因子産生培地中に、０．１ｍＭ〜１Ｍの濃度で含ませることができ、好ましくは、１０ｍＭの濃度である。
本明細書において「アスコルビン酸」とは、白色、結晶性の水溶性ビタミンであり、多くの植物体とくに柑橘類に含まれている。ビタミンＣとも称される。アスコルビン酸は、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分としても知られている（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃら：Ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２５４  ３１７−３３０，１９８８．）が、上記の細胞に対する分化誘導の効果は知られていない。本発明において、アスコルビン酸は、アスコルビン酸およびその誘導体を含み得る。アスコルビン酸としては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸グルコシドが挙げられるが、これらに限定されない。天然のアスコルビン酸と同様な作用を有する化学合成物質も含まれ得る。これらの代表的なアスコルビン酸は、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートとともに、肥大化能を有する軟骨細胞の培養に使用されると、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子を産生することから、本発明においていずれも分化因子産生培地中に含ませることができる。アスコルビン酸は、分化因子産生培地中に、０．１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で含ませることができ、好ましくは、１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度である。
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
（複合材料）
１つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。この複合材料は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含む培地において培養することによって得ることができる、誘導骨芽細胞分化誘導因子、およびＢ）生体適合性を有する足場を含み得る。
一つの実施形態において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。この複合材料は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子、およびＢ）生体適合性を有する足場を含み得る。
一つの実施形態において、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、（１）前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在し得るか、または（２）該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量５０，０００の限外濾過に供することにより得られる分子量５０，０００以上の画分に存在し得る。
一つの実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、濃縮されたものであり得る。本明細書において「濃縮された」とは、濃度を濃くされた状態をいう。この誘導骨芽細胞分化誘導因子は、１倍以上に濃縮されたものであり得る。好ましくは、この上清は、２倍以上に濃縮されたものであり得る。
一つの実施形態において、本発明において使用され得る誘導骨芽細胞分化誘導因子は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの）であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、足場が溶液である場合には、その足場と接触させることにより液体になり得る。また、足場が固体である場合には充分に接触させるために、溶媒を用いて溶液にすることもあり得るからである。本明細書において「凍結乾燥された」とは、水溶液を凍結させ、凍結状態のまま真空装置で水分を直接昇華させて乾燥させた状態をいう。
一つの実施形態において、本発明の複合材料では、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、前記生体適合性を有する足場に付着され得る。本明細書において、「付着」とは、ものがついて離れないこと、くっつくことをいう。本明細書において、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性有する足場とが「付着されている状態」とは、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性有する足場とが接触し、誘導骨芽細胞分化誘導因子が生体適合性を有する足場の表面または内部孔内について離れない状態（例えば、吸着、含浸、浸漬、接着、粘着、固着等している状態）をいう。
本明細書において「接触」とは、ものが接すること、触れることをいう。誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを「接触させる」とは、誘導骨芽細胞分化誘導因子が生体適合性を有する足場に付着する程度、触れることをいう。
一つの実施形態において、本発明の複合材料では、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、前記生体適合性を有する足場に分散され得る。例えば、上記誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とが分散されている状態とは、一箇所以上の場所に分かれて存在している状態であり得る。
一つの実施形態において、本発明の複合材料では、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、例えば、生体適合性を有する足場の表面、該生体適合性を有する足場の内部孔内等の領域に、付着または分散され得る。
一つの実施形態において、本発明の複合材料において使用される生体適合性を有する足場は、ゲル状足場、３次元状足場であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。
一つの実施形態において、本発明の複合材料において使用される生体適合性を有する足場は、例えば、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、アガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、またはそれらの組み合わせ等であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。
好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、例えば、多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム気孔率５０％等）、超多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム気孔率８５％、ＢＤ社製３Ｄスキャホールド等）、アパタイトコラーゲン混合体（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム顆粒と新田ゼラチン社製コラーゲンゲルとの混合物等）、アパタイトコラーゲン複合体（例えば、ＨＯＹＡ社製アパコラ等）、コラーゲンゲル（例えば、新田ゼラチン社製等）、コラーゲンスポンジ（例えば、新田ゼラチン社製等）、ゼラチンスポンジ（例えば、山之内製薬社製止血用ゼラチンスポンジ等）、フィブリンゲル（例えば、ニプロ社製ベリプラストＰ等）、合成ペプチド（例えば、３Ｄマトリックス社製プラマックス等）、細胞外基質混合物（例えば、ＢＤ社製マトリゲル等）、アルギン酸（例えば、ケルコ社製ケルトンＬＶＣＲ等）、アガロース（例えば、和光純薬社製アガロース等）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／ポリ乳酸共重合体、それらの組合せであり得る。より好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、細胞外基質であり得る。
好ましい実施形態において、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、ラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物等であり得る。
一つの実施形態において、本発明の複合材料において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地（本明細書では、分化因子産生培地ともいう。）は、グルココルチコイド（例えば、デキサメサゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コルチゾン、ベタメタゾン、コルチゾル、コルチコステロン）、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸等の少なくとも１つを含んでいてもよい。好ましくは、この培地は、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸の両方を含み得る。好ましくは、この培地は、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のすべてを含む。この培地は、さらに、例えば、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのような他の成分を含んでいてもよい。この培地は、血清成分（例えば、ヒト血清、ウシ血清、ウシ胎仔血清）をさらに含むことが有用であり得る。代表的には、血清成分は、０〜２０％程度添加され得る。
また、本発明の複合材料において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地としては、例えば、ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、αＭＥＭ、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）のような培地が挙げられるが、これらに限定されない。この培地は、細胞の増殖および分化誘導を促進する物質を含んでいてもよい。この培地には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力は見出されていない。
一つの実施形態において、本発明の複合材料では、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、凍結乾燥した状態でコラーゲン溶液と混合され、かつ前記培地は、基礎成分として、最小必須培地（ＭＥＭ）を含んでいてもよく、さらにグルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸を含んでいてもよい。
他の実施形態において、本発明の複合材料では、前記誘導骨芽細胞分化誘導因子は、ヒドロキシアパタイトに付着または分散され、かつ前記培地は、基礎成分として、最小必須培地（ＭＥＭ）を含んでいてもよく、さらにグルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸を含んでいてもよい。
一つの実施形態において、本発明の複合材料は、骨の欠損を修復または治療するための骨形成において使用され得る。このような骨の欠損としては、例えば、骨腫瘍、骨粗しょう症、リウマチ性関節炎、変形性関節症、骨髄炎および骨壊死などの病変；骨固定術、椎管拡張術および骨切術などの矯正手術；複雑骨折などの外傷および腸骨採取などによって生じる骨の欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。前記欠損は、固定のみでは修復できない大きさを有するものであってもよい。
他の実施形態において、本発明の複合材料は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるための骨形成において使用され得る。周辺に骨がない部位とは、例えば、皮下、筋肉や脂肪などの軟部組織、消化器、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器、脈管、神経、感覚器であり得るが、これらに限定されない。
本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、イーグル基礎培地中でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞にこの因子を曝露した場合、該因子を含まないイーグル基礎培地において培養した場合と比較して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（例えば、この細胞全体におけるアルカリホスファターゼ活性）を、少なくとも約１倍より高く上昇させる能力を有し、アルカリホスファターゼ活性は、Ａ）該因子を含むかまたは含まないサンプル１００μｌに、それぞれ５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、Ａ９２２６）を加え、３７℃で１５分間反応させ、１Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を２０μｌ添加したときの４０５ｎｍの吸光度とを測定する工程；およびＢ）該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程であって、該吸光度の差が、該アルカリホスファターゼ活性の指標である、工程によって決定される。好ましくは、アルカリホスファターゼ活性は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍または少なくとも１３倍の増加を示す。
本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子はまた、イーグル基礎培地中でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に該因子を曝露した場合、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（例えば、この細胞全体におけるアルカリホスファターゼ活性）を増加させる能力を有し、このアルカリホスファターゼ活性は、Ａ）該因子を含むかまたは含まないサンプル１００μｌに、それぞれ５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、Ａ９２２６）を加え、３７℃で１５分間反応させ、１Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ添加することによって反応を止めたときの吸光度と、その後濃塩酸を２０μｌ添加したときの４０５ｎｍの吸光度とを測定する工程；およびＢ）該濃塩酸の添加前後の該吸光度の差を計算する工程であって、該吸光度の差が、該アルカリホスファターゼ活性の指標である、工程によって決定される。好ましくは、アルカリホスファターゼ活性は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍または少なくとも１３倍の増加を示す。
一つの実施形態において、本発明の複合材料において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、固体（好ましくは、凍結乾燥されたもの）であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、足場が溶液である場合には、その足場と接触させることにより液体になり得る。また、足場が固体である場合には充分に接触させるために、溶媒を用いて溶液にすることもあり得るからである。
本明細書において「因子」（ｆａｃｔｏｒ、ａｇｅｎｔ）とは、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素でもあってもよい。本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、アミノ酸、核酸、ポリサッカライド、脂質、有機低分子、またはそれらの複合体であり得る。
本明細書において「誘導骨芽細胞分化誘導因子」とは、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化させる因子をいい、その活性を保持する限り単体であっても複合体であってもよい。この誘導骨芽細胞分化誘導因子は、肥大化能を有する軟骨細胞を、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含む分化因子産生培地において培養することによって得ることができる。本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子と同一の生物学的活性を有する因子であれば、別の手法で得られた因子または別の形態の因子であっても、本発明において未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化させる因子と交換可能に用いられ得ることが理解される。このような因子は、実施例において基本的に同定されたもの以外であっても、本明細書における開示に基づいて、当該分野における技術常識を用いることによって同定することができる。
本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、Ｉ型コラーゲン、骨型プロテオグリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、基質Ｇｌａタンパク質、オステオグリシン、オステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、オステオネクチンおよびプレイオトロフィンからなる群より選択される誘導骨芽細胞に特異的な物質の発現を増大させる能力を有する。従って、本明細書における誘導骨芽細胞分化誘導因子は、酵素活性においては、未分化細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させることを特徴とし、または遺伝子発現レベルもしくはタンパク質レベルにおいては、未分化細胞において骨芽細胞のマーカー群より選択させる少なくとも１つを発現させる能力を有する因子である。好ましい実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、未分化細胞の、アルカリホスファターゼ活性の上昇、誘導骨芽細胞マーカーの局在または発現を確認することによって同定され得る。別の実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、沸騰水中（通常、約９６℃〜約１００℃、例えば、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃および約１００℃が挙げられる）で３分間の加熱処理により未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性が消失する。沸騰しているがどうかは目視にて確認する。未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性の消失は、誘導骨芽細胞マーカーの局在または発現が実質的に増加しない状態をいう。別の実施形態において、本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、沸騰水中で３分間の加熱処理により未分化細胞のアルカリホスファターゼ活性の上昇を誘導する活性が消失する。未分化細胞のアルカリホスファターゼ活性の上昇を誘導する活性の消失は、アルカリホスファターゼ活性が実質的に上昇しない状態をいう。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。本明細書において用いられる場合、この用語は、好ましくは、核酸分子によって翻訳された形態であることから、通常、直鎖であり、天然のアミノ酸のみから構成されるがそれに限定されない。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体にアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）がある。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
本明細書では、特に言及するときは、「タンパク質」は、比較的大きな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指し、「ペプチド」というときは、比較的小さな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指すことがあることが理解されるべきである。
（肥大化能を有する軟骨細胞）
本発明において使用される肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、またはウサギ由来である。哺乳類動物において骨化方式は共通しており、膜性骨化（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と軟骨性骨化（ｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の二種類の方式がある。膜性骨化は、頭蓋骨の大部分または鎖骨のように体表面の近くにあって平板な骨が形成されるときに機能する様式である。膜性骨化では、軟骨を経ないで結合組織中に直接、膜状の骨が形成される。膜性骨化は、膜内骨化（ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｏｕｓ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）または結合組織性骨化とも呼ばれる。軟骨性骨化は、椎骨、肋骨、肢骨などのような体の内側にある内骨格の形成されるときに機能する様式である。軟骨性骨化では、まず軟骨が形成され、その骨幹部に血管が侵入して軟骨が石灰化し、石灰化軟骨（ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）が形成される。この石灰化軟骨は、形成されると直ぐに破壊され、骨化が起こり、骨および原始骨髄が形成される。この際、軟骨内部に軟骨原基が形成された後、これに成長ホルモン等が作用して長軸および短軸方向へと軟骨が伸長、拡大する。その後、骨端部にも血管が侵入して骨化が生じる。軟骨性骨化は、内軟骨性骨化（ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）または軟骨内骨化（ｅｎｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とも呼ばれる。（藤田尚男、藤田恒夫、「骨の発生」、標準組織学総論、１２７頁；硬組織の起源と進化−序説−、須田立夫、Ｔｈｅ  ＢＯＮＥ、１８巻、４２１−４２６頁、２００４；内軟骨性骨形成の過程、鈴木不二男、「骨はどのようにしてできるか」鈴木不二男著、大阪大学出版会、２１頁、２００４；鈴木隆雄ら編「骨の事典」、朝倉書店を参照のこと。）。従って、本件の未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する能力を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞は、ラット、マウス、ウサギ、ヒト等を含む哺乳類動物に一様に存在し、骨化において重要な役割を果たしている。このように、本件因子は、内軟骨性骨形成を行う哺乳類動物等であれば種にかかわらず、肥大化能を有する軟骨細胞から同様の手順を用いて生成することができる。
ラットにヒト組換えＢＭＰタンパク質を移植すると骨形成を誘導され、ヒト由来ＢＭＰがラット由来ＢＭＰと同様に機能することが分子生物学的に実証され（Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８−１５３４，１９８８．およびＷｕｅｒｚｌｅｒ  ＫＫら、Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇ．，９：１３１−１３７，１９９８を参照のこと。）、ヒトとラットでは、骨化に関連する因子が交換可能に使用されていることが判明している。ＢＭＰ自体は互いにアミノ酸配列レベルでは異なっているが、他方でタンパク質としての性質（すなわち生成の条件等の物性値）は実質的に同一といえる。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部（例えば、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨）、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯（例えば、手骨、足骨または胸骨）、軟骨膜または胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部ならびに骨増殖時の軟骨部のような部位から分離または誘導され得る。本発明において使用される肥大化能を有する軟骨細胞は、肥大化能を有する限り、どのような部位から得られた軟骨細胞であってもよい。肥大化能を有する軟骨細胞は、分化誘導によっても得られ得る。
本発明において誘導骨芽細胞分化誘導因子を、肥大化能を有する軟骨細胞に産生させるときには、この肥大化能を有する軟骨細胞は、代表的に、４×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度に調整され得る。通常、１０４細胞／ｃｍ２〜１０６細胞／ｃｍ２の間で用いられるが、１０４細胞／ｃｍ２未満または１０６細胞／ｃｍ２より多い密度に調整されていてもよい。
本発明において、肥大化能を有する軟骨細胞の培養は上述のようにして分離または誘導された細胞を用いて行われる。
本発明において用いられる肥大化能を有する軟骨細胞は、どのような培地で培養されてもよく、例えば、ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）のような培地中で培養された細胞であるが、これらに限定されない。肥大化能を有する軟骨細胞は、細胞の増殖および分化誘導を促進する物質を含んでいる培地で培養された細胞であってもよい。本発明において、分化因子産生培地は、グルココルチコイド（例えば、デキサメサゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コルチゾン、ベタメタゾン、コルチゾル、コルチコステロン）、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される従来型骨芽細胞分化誘導成分の少なくとも１つを含んでいてもよい。本発明において使用される因子は、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のみを含む分化因子産生培地によっても産生される。好ましくは、この分化因子産生培地は、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のすべてを含む。本発明において、分化因子産生培地は、さらに、例えば、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのような他の成分を含んでいてもよい。分化因子産生培地は、血清成分（例えば、ヒト血清、ウシ血清、ウシ胎仔血清）をさらに含むことが有用であり得る。代表的には、血清成分は、０〜２０％程度添加され得る。
本明細書において、肥大化能を有する軟骨細胞の培養期間は、十分量の因子が産生される期間（例えば、数ヶ月〜半年、あるいは３日〜３週間（例えば、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２０日、１ヶ月以上であり、半年、５ヶ月、４ヶ月、３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、３週間以下の任意の範囲の可能な組み合わせ））であり得る。培養期間が進み、細胞が培養容器にコンフルエントになれば、継代することが好ましい。
一つの局面において、本発明は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、およびＢ）アルギン酸を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。
別の局面において、本発明は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、およびＢ）ラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物を含む、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。
これらの複合材料には、上述の（肥大化能を有する軟骨細胞）等に記載される任意の形態が使用され得る。
（製造方法）
一つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法を提供する。この製造方法は、以下の工程：Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含む培地において培養する工程；Ｂ）該培養によって得られた上清と、該生体適合性を有する足場とを合わせる工程、を包含し得る。
一つの実施形態において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法を提供する。本製造方法は、以下の工程：Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養した結果得られる誘導骨芽細胞分化誘導因子を提供する工程、およびＢ）該誘導骨芽細胞分化誘導因子と、生体適合性を有する足場とを合わせる工程を包含し得る。
一つの実施形態において、本製造方法において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、（１）前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地に存在し得るか、または（２）該肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、分子量５０，０００の限外濾過に供することにより得られる分子量５０，０００以上の画分に存在し得るが、これらに限定されない。
一つの実施形態において、本製造方法では、前記Ａ）工程は、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸および血清成分を含む分化因子産生培地において培養し、該培養した上清を採取することを含み得る。
別の実施形態において、本製造方法では、Ａ）工程は、前記肥大化能を有する軟骨細胞を培養した上清を、限外濾過に供し、分子量５０，０００以上の画分に分離することを含み得る。
一つの実施形態において、本製造方法は、前記凍結乾燥した状態の上清とコラーゲン溶液とを合わせる工程を包含し得る。
一つの実施形態において、本製造方法は、前記上清とヒドロキシアパタイトとを接触させる工程を包含し得る。
一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記Ａ）工程の後に、前記上清を濃縮する工程をさらに包含してもよい。この濃縮する工程では、前記上清は、１倍以上に濃縮されたものであり得る。好ましくは、この上清は、２倍以上に濃縮されたものであり得る。
一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記上清を凍結乾燥する工程をさらに包含してもよい。例えば、この凍結乾燥する工程は、前記上清を凍結し、室温〜約４０℃（好ましくは、室温）、一晩、真空下（−８０〜１００ｋＰａ）で、遠心乾燥する工程であり得るが、これに限定されない。なぜなら、因子が変性しない温度以下（約４０℃以下）で乾燥出来れば充分できさえすれば充分だからである。
一つの実施形態において、本製造方法は、前記上清を濃縮する工程と、上清を凍結乾燥する工程の両方を包含していてもよい。
一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記Ｂ）工程において、前記上清を、前記生体適合性を有する足場に接触させる工程を包含してもよい。例えば、この接触させる工程は、前記上清に、前記生体適合性を有する足場を漬けることによって達成され得る。他の実施形態において、この接触させる工程は、前記上清を上部から滴下させること、一方向から吸引すること、一方向から加圧すること、該上清と該足場とを陰圧下で共存させることによっても達成され得る。
一つの実施形態において、本発明の製造方法は、前記Ｂ）工程において、前記上清から因子を得る工程、および該因子を前記生体適合性を有する足場と混合する工程を包含し得る。
一つの実施形態において、本発明の製造方法の前記Ｂ）工程は、前記濃縮によって得られた上清濃縮物を、前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該生体適合性を有する足場を接触させる工程を包含し得る。例えば、上記濃縮物は、分化因子産生培地、増殖培地、水、生理食塩水、ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）などにより、２〜１０倍に希釈され得る。
一つの実施形態において、本発明の製造方法の前記Ｂ）工程は、前記濃縮によって得られた上清濃縮物を凍結乾燥する工程、および該上清濃縮物を前記生体適合性を有する足場と接触させるのに十分な体積に希釈し、該希釈した上清濃縮物と生体適合性を有する足場とを接触させる工程を包含し得る。
一つの実施形態において、本発明の製造方法において使用される生体適合性を有する足場は、ゲル状足場、３次元状足場等であり得るが、これらに限定されない。
一つの実施形態において、本発明の製造方法において使用される生体適合性を有する足場は、例えば、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、アガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、またはそれらの組み合わせ等であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。
好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、例えば、多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム気孔率５０％等）、超多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム気孔率８５％、ＢＤ社製３Ｄスキャホールド等）、アパタイトコラーゲン混合体（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム顆粒と新田ゼラチン社製コラーゲンゲルとの混合物等）、アパタイトコラーゲン複合体（例えば、ＨＯＹＡ社製アパコラ等）、コラーゲンゲル（例えば、新田ゼラチン社製等）、コラーゲンスポンジ（例えば、新田ゼラチン社製等）、ゼラチンスポンジ（例えば、山之内製薬社製止血用ゼラチンスポンジ等）、フィブリンゲル（例えば、ニプロ社製ベリプラストＰ等）、合成ペプチド（例えば、３Ｄマトリックス社製プラマックス等）、細胞外基質混合物（例えば、ＢＤ社製マトリゲル等）、アルギン酸（例えば、ケルコ社製ケルトンＬＶＣＲ等）、アガロース（例えば、和光純薬社製アガロース等）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／ポリ乳酸共重合体、それらの組合せであり得る。より好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、細胞外基質であり得る。
好ましい実施形態において、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、アルギン酸、ラミニンとコラーゲンＩＶとエンタクチンとの混合物等であり得るがこれらに限定されない。
一つの実施形態において、本発明の製造方法において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地（分化因子産生培地ともいう。）は、グルココルチコイド（例えば、デキサメサゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コルチゾン、ベタメタゾン、コルチゾル、コルチコステロン）、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸等の少なくとも１つを含んでいてもよい。好ましくは、この培地は、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸の両方を含み得る。好ましくは、この培地は、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のすべてを含む。この培地は、さらに、例えば、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのような他の成分を含んでいてもよい。この培地は、血清成分（例えば、ヒト血清、ウシ血清、ウシ胎仔血清）をさらに含むことが有用であり得る。代表的には、血清成分は、０〜２０％程度添加され得る。
また、本発明の製造方法において肥大化能を有する軟骨細胞を培養するのに使用される培地としては、例えば、ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）のような培地が挙げられるが、これらに限定されない。この培地は、細胞の増殖および分化誘導を促進する物質を含んでいてもよい。この培地には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞を骨芽細胞に分化誘導させる能力は見出されていない。
本発明の製造方法には、上述の（複合材料）、（肥大化能を有する軟骨細胞）等に記載される任意の形態が使用され得る。
（足場）
本明細書において「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」とは、細胞を支持するための材料を意味する。足場は、一定の強度、生体適合性を有する。本明細書中で使用される場合、足場は、生物学的物質または天然から供給される物質、天然に存在する物質または合成で供給される物質から製造される。特に言及する場合、足場は、有機体（例えば、組織、細胞）以外の物質（非細胞物質）から形成される。本明細書で使用される場合、足場は、有機体（例えば、組織、細胞）以外の物質から形成された構成物（生物由来の材料（例えば、コラーゲン、ヒドロキシアパタイトも含む）である。本明細書で使用する場合、「有機体」とは、生活機能をもつように組織された物質系をいう。すなわち、有機体は、生物を他の物質系と区別していう。細胞、組織などは有機体の概念に含まれるが、有機体から取り出した生物由来の材料は、有機体には含まれない。細胞が定着する足場の部分としては、足場の表面のほか、内部に孔が存在し、その孔が細胞を収容し得る場合、その内部孔を挙げることができる。例えば、ヒドロキシアパタイトで作製した足場には、通常、細胞を充分に収容し得る孔が多数存在する。
足場の材料としては、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、細胞外基質混合物、絹、セルロース、デキストラン、アガロース、寒天、合成ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、またはそれらの組み合わせ等であり得るが、これらに限定されない。なぜなら、該因子が付着または分散するもの、もしくは付着または分散させることが出来るものであれば、どんなものでも使用できるからである。
好ましくは、生体適合性を有する足場は、例えば、多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム気孔率５０％等）、超多孔質ヒドロキシアパタイト（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム気孔率８５％、ＢＤ社製３Ｄスキャホールド等）、アパタイトコラーゲン混合体（例えば、ＨＯＹＡ社製アパセラム顆粒と新田ゼラチン社製コラーゲンゲルとの混合物等）、アパタイトコラーゲン複合体（例えば、ＨＯＹＡ社製アパコラ等）、コラーゲンゲル（例えば、新田ゼラチン社製等）、コラーゲンスポンジ（例えば、新田ゼラチン社製等）、ゼラチンスポンジ（例えば、山之内製薬社製止血用ゼラチンスポンジ等）、フィブリンゲル（例えば、ニプロ社製ベリプラストＰ等）、合成ペプチド（例えば、３Ｄマトリックス社製プラマックス等）、細胞外基質混合物（例えば、ＢＤ社製マトリゲル等）、アルジネート（例えば、ケルコ社製ケルトンＬＶＣＲ等）、アガロース（例えば、和光純薬社製アガロース等）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／ポリ乳酸共重合体、それらの組合せであり得る。より好ましくは、前記生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、細胞外基質である。
これらの足場は、顆粒形態、ブロック形態、スポンジ形態などの任意の形態で提供され得る。これらの足場は、孔があってもなくてもよい。このような足場は、市販されているものを使用してもよく、例えば、ＨＯＹＡ株式会社、オリンパス株式会社、京セラ株式会社、三菱ウェルファーマ株式会社、大日本住友製薬株式会社、小林製薬株式会社、ジンマー株式会社などから市販されている。一般的な足場の調製および特徴付けは当該分野において公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。例えば、米国特許第４，９７５，５２６号；同第５，０１１，６９１号；同第５，１７１，５７４号；同第５，２６６，６８３号；同第５，３５４，５５７号および同第５，４６８，８４５号を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。他の足場はまた、例えば、以下の文献において記載されている：ＬｅＧｅｒｏｓおよびＤａｃｕｌｓｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｒａｍｉｃｓ，ＩＩ  １７−２８頁（１９９０，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）のような生体適合物質論文；および、Ｙａｎｇ  Ｃａｏ，Ｊｉｅ  Ｗｅｎｇ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７，（１９９６）４１９−４２４頁のような他の公開された記載；ＬｅＧｅｒｏｓ，Ａｄｖ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．２，１６４（１９８８）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，１４巻、３５１−３６９頁；ならびにＰｉａｔｔｅｌｌｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９６、１７巻、１７６７−１７７０頁を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。
本明細書において「リン酸カルシウム」とは、カルシウムリン酸塩の総称である。例えば、ＣａＨＰＯ４、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏなどの化学式で示される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「ヒドロキシアパタイト」とは、一般組成をＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２とする化合物であり、コラーゲンとともに哺乳類動物の硬組織（骨および歯）の主要構成成分である。ヒドロキシアパタイトは、上記の一連のリン酸カルシウムを含むが、生体硬組織中のアパタイトのＰＯ４およびＯＨ成分は体液中のＣＯ３成分と置換していることが多い。また、ヒドロキシアパタイトは、厚生労働省および米国連邦食品医薬品局（ＦＤＡ（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ））により安全性が承認されている物質である。ヒドロキシアパタイトは、市販のものは生体非吸収性材料であるものが多く、生体内にほとんど吸収されず残存するが、吸収性のものもある。
本明細書において、「細胞外基質混合物」とは、細胞外基質と成長因子の混合物をいう。細胞外基質としては、ラミニン、コラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されない。この細胞外基質は、生体由来であっても、合成されたものであってもよい。
（生体内の骨形成を促進または誘発するための方法）
一つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための方法を提供する。この方法は、誘導骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、生体内の骨形成を促進または誘発する必要のある部位に移植する工程を包含し得る。
一つの実施形態において、本発明の方法では、前記骨形成は、骨の欠損を修復または治療するためのものであり得る。前記欠損は、例えば、固定のみでは修復できない大きさを有するものであってもよい。
他の実施形態において、前記骨形成は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためのものであってもよい。
本発明の生体内の骨形成を促進または誘発するための方法には、上述の（複合材料）、（肥大化能を有する軟骨細胞）等に記載される任意の形態が使用され得る。
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は、イヌ、ネコ、またはウマ、好ましくは、ヒトであり得る。
骨形成の皮下試験は、本来骨の無い部分に骨を形成（異所性骨形成とも呼ばれる）させ、骨形成能を評価する試験である。この試験は容易に実施できるので、当該分野で広く使用されている。骨を治療するときの試験方法には、骨欠損試験が用いられ得る。この試験における骨形成は、骨形成の条件が準備されている環境下で起こり、既に近傍に存在する骨芽細胞および誘導・遊走した骨芽細胞によって骨が形成されるので、通常、皮下試験よりも骨形成率は良いと考えられている。皮下試験の結果は、実際の骨欠損における骨形成の結果によく一致することが知られている（例えば、Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｒ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０：８９３−８９９（１９６５）、Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら：Ｓｃｉｅｎｅｃｅ，２４２：１５２８−１５３２（１９８８）、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｅ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，２３０：２５７−２６５（１９８８）、Ｅｋｅｌｕｎｄ，Ａ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，２６３：１０２−１１２（１９９１）、およびＲｉｌｅｙ，Ｅ．Ｈ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，３２４：３９−４６（１９９６）を参照のこと）。従って、皮下試験の結果で骨形成が得られる場合、当業者は、骨欠損試験において当然に骨形成が得られることを理解する。
本発明の肥大化能を有する軟骨細胞の産生する因子と生体適合性を有する足場とを含む複合材料は、皮下に移植した場合も、骨欠損部に移植した場合も、骨形成が生じることが予測される。足場単独を皮下に移植すると、骨形成は観察されないことが予測される。足場単独を骨欠損部位に移植すると、骨形成は生じるが、その量は、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子と足場との複合材料を移植したときに比べてはるかに少ないと予測される。
本発明の複合材料は、移植することにより骨の修復および再構成に用いることができる。移植する部位としては、特に限定されないが、通常、骨の修復および再構成が望まれる、外傷または骨腫瘍の除去等に起因する骨欠損部が挙げられる。本発明の複合材料は、周辺に骨がない部位に骨を形成させるためにも使用され得る。移植は、公知の骨髄由来幹細胞移植と同様に行うことができる。移植する複合材料の量は、骨欠損部の大きさおよび症状等に応じて適宜選択される。
本発明はまた、必要に応じて、生理活性物質、サイトカインなどとともに使用することができる。
本明細書において「細胞生理活性物質」または「生理活性物質」（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞または組織に作用する物質をいう。そのような作用としては、例えば、その細胞または組織の制御、変化などが挙げられるがそれらに限定されない。生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものであるが改変された作用を持つものであってもよい。本明細書では、生理活性物質は、ペプチドを含むタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得る。
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制御作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用、細胞機能の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に細胞に作用する時点において、サイトカインは、通常、ペプチドを含むタンパク質形態であることが多い。
本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖および分化誘導を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。
骨形成関連のサイトカインには、代表的には、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの因子、ならびにアスコルビン酸、グルココルチコイド、グリセロリン酸などの化合物が挙げられる。
サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能（例えば、細胞接着活性または細胞−基質間の接着活性など）で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本発明における好ましい活性（例えば、幹細胞を増殖させる活性あるいは誘導骨芽細胞を形成させる活性、肥大化能を有する軟骨細胞に本発明による因子の産生を促す活性）を有してさえいれば、本発明の実施において使用することができる。
本発明において使用される誘導骨芽細胞分化誘導因子は、同系に由来する細胞に由来してもよく、生体と同種異系の関係にある個体由来であってもよく、生体と異種の関係にある個体由来であってもよい。
本明細書において「同系に由来する」とは、自己（自家）、純系または近交系に由来することをいう。
本明細書において「生体と同種異系の関係にある個体由来」とは、同種であっても遺伝的には異なる他の個体を起源とすることをいう。
本明細書において「生体と異種の関係にある個体由来」とは、異種個体を起源とすることをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ラット由来の細胞は「生体と異種の関係にある個体由来」である。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０００７】
以下の実施例に用いられる試薬は、例外を除き、和光純薬社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｉｇｍａ社などから市販されるものを用いた。
（培地の調製）
本明細書の実施例では、特に言及する場合を除き、以下の培地を使用した。
2008156221.tif 000003
ＨＡＭ培地、ＢＭＥ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ増殖培地およびＭＳＣＧＭ（増殖培地）は、下記表に示す組成となるように調製した。
2008156221.tif 000004
培地：各培地について基礎培地として使用した培地
ＨＡＭ：ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培地
ＢＭＥ：イーグル基礎培地
Ｄ−ＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ：２５０μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１５２９０−０１８
2008156221.tif 000005
Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ：２５０μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１５２９０−０１８
ＭＳＣＢＭ：Ｃａｍｂｒｅｘ社、ＰＴ−３２３８
ＭＳＣＧＳ：Ｃａｍｂｒｅｘ社、ＰＴ−３００１
（実施例１：肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
（肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
４週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）および８週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をそれぞれのグループとして本実施例において実験した。ラットは、クロロホルムを使用して屠殺した。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋骨・肋軟骨部を採取した。この肋骨・肋軟骨部の境界部分より半透明の成長軟骨部を採取した。この成長軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離１７０×ｇで３分間により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例１によって得られた細胞は、分離の際に使用した酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ）によって障害を受けているので、培養によって障害を回復させ、肥大化能を有する軟骨細胞を、軟骨細胞マーカーの局在、マーカーの発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定した。
（肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの発現）
上記の操作により得られた細胞の溶解物をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で処理する。ＳＤＳ処理した溶液をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供する。その後、転写用膜にブロッティング（ウェスタンブロティング）し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
（肥大化能を有する軟骨細胞マーカー遺伝子の発現）
前記の操作により得られた細胞からＲＮＡを抽出して、ＰＣＲでマーカーの発現を検出することもできる。本実施例では、アルカリホスファターゼ、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、オステオカルシンの発現量について、リアルタイムＰＣＲで測定した。内在性コントロール遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。
試料として、本実施例において調製した肥大化能を有する軟骨細胞（５×１０−５個）を遠心分離（１７０〜２００×ｇで３〜５分間）することによりペレットにして、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養したもの（Ｇｐ１およびＧｐ２）を用いた。培地には、ＨＡＭ培地＋１０％ＦＢＳまたはＭＥＭ培地＋１５％ＦＢＳを用いた。
（全ＲＮＡの抽出）
培養物（培養面積１２ｃｍ２）に対して、ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）１ｍｌを加えた。セルスクレイパーを使って細胞を剥がして、２ｍｌチューブに回収し、室温で１０分放置した。クロロホルム０．２ｍｌを加え、激しくＶｏｒｔｅｘし、４℃で５分静置した。１２，０００×ｇ、４℃で１５分遠心し、上清の水相を１．５ｍｌチューブに採取した。イソプロパノール０．５ｍｌを加えて、Ｖｏｒｔｅｘし、室温で１０分放置した。１２，０００×ｇ、４℃で１５分遠心し、上清を充分に除き、７０％エタノール１ｍｌを加えＶｏｒｔｅｘした。約２０μｌのＲＮａｓｅフリー水に溶かし、−８０℃に保存した。
全ＲＮＡからＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。上記ｃＤＮＡをテンプレートとして、アルカリホスファターゼ、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）、オステオカルシン、およびＧＡＰＤＨの発現を、Ｔａｑｍａｎアッセイ法（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社））を用いて確認した。
次いで、リアルタイムＰＣＲ機器（ＡＢＩ社、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）にて測定を行った。リアルタイムＰＣＲ反応液（２５μＬの２×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、２．５μＬの２０×Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ、２１．５μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、１μＬのテンプレートｃＤＮＡ）を調製し、９６ウェル反応プレートに分注した。５０℃で２分、および９５℃で１０分の後、９５℃で１５秒、および６０℃、１分を４０サイクルでＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応後、しきい値の設定および到達サイクルの算出を、機器（ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）内蔵の解析ソフトにより実施した。各細胞マーカーの値を、ＧＡＰＤＨの値で除して発現量の平均値を算出した。その結果、肥大化能を有する軟骨細胞はアルカリホスファターゼ、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンを発現するが、オステオカルシンは発現していなかった（表Ｉ）。
【表Ｉ】
2008156221.tif 000006
Ｇｐ１およびＧｐ２：肥大化能を有する軟骨細胞のペレットを１週間培養したもの
Ｘ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、基質Ｇｌａタンパク質、プレイオトロフィン、デコリン、バイグリカンについても本実施例と同様の方法により、発現の有無を観察することができる。
（肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの局在）
上記の操作により得られた細胞培養物を、１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはＦＩＴＣ、ＰＥ、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
アルカリホスファターゼについては染色法で検出することもできる。上記の操作によって得られた細胞培養物を、６０％アセトン／クエン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレットＢとナフトールＡＳ−ＭＸとのを混合液に浸漬し、室温暗所で３０分反応させることにより、呈色させた。
肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを確認するために、以下の実験を行った。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイト上に播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した。次いで、この試料（細胞を播種したヒドロキシアパタイト）をアルカリホスファターゼ染色した後、トルイジン青染色した。アルカリホスファターゼ染色は、試料を６０％アセトン／クエン酸バッファー中に３０秒浸漬して固定し、水洗後、アルカリホスファターゼ染色液（２ｍｌの０．２５％ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸アルカリ溶液（シグマアルドリッチ社）＋４８ｍｌの２５％ファーストバイオレットＢ塩溶液（シグマアルドリッチ社））とともに、室温、遮光下で３０分間インキュベートすることにより行い、トルイジン青染色は、トルイジン青染色液（０．２５％トルイジン青溶液、ｐＨ７．０、和光純薬工業）とともに室温、５分間インキュベートすることにより行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は、赤く斑点状に染まった（図１Ａを参照のこと）。トルイジン青では同一部分が青く斑点状に染まり、細胞が存在することが分かる（図１Ｂを参照のこと）。従って、ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞がアルカリホスファターゼ活性を有することが分かった。
（軟骨細胞の肥大化能に関する形態学的検索）
５×１０５個の細胞を含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培養液を遠心することにより細胞のペレットを作製し、この細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較する。有意な成長が確認されたときに、細胞を肥大化能を有すると判定した。
（結果）
実施例１によって得られた細胞は、軟骨細胞マーカーを発現しており、形態学的には肥大化していることを確認した。このことにより、実施例１によって得られた細胞は、肥大化能を有する軟骨細胞であることが確認された。この細胞を以下の実験に用いた。
（肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された因子の検出）
実施例１により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）に加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈した。この細胞液を、ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン社製）に均一に播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
（回収した培養上清が、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、２．５×１０４／穴）に均一に播種した。これらの細胞は、大日本住友製薬だけでなく、国内外の販売会社（三光純薬、コスモバイオ社、タカラバイオ社、東洋紡績社、住商ファーマバイオメディカル社、ステムセル際センス社、Ｃａｍｂｒｅｘ社、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｔｅｍ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｏｓｉｒｉｓ社）や組織資源活用機関（組織細胞バンク）（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク、理化学研究所細胞開発バンク、厚生省国立医薬品食品衛生研究所細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの国内機関、およびＩＩＡＭ、ＡＴＣＣなどの海外機関など）よりからも入手可能である。播種から１８時間後に、上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、以下に示す手順を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
（アルカリホスファターゼ活性の測定）
アルカリホスファターゼ活性を測定するために、該因子を含むかまたは含まないサンプル１００μｌに、それぞれ５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液およびアルカリバッファー（シグマ社、Ａ９２２６）を加え、３７℃で１５分間反応させた。その後、１Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ添加することによって反応を止めて、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。次いで、濃塩酸を２０μｌ添加し、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。これらの吸光度の差を「絶対活性値」と呼び（表では「絶対値」と表示する。）、アルカリホスファターゼ活性の一つの指標として用いた。４週齢において、５回の実験を行い、１回の実験では３試行を行った。８週齢では、３回の実験を行い、１回目２試行、２回目２試行、３回目１試行を行った。各試料の絶対活性値を、対照となる培地のみの絶対値（対照となる培地のみを同様にマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に加えて測定した絶対活性値）で除した値を、本明細書で「相対活性値」（表では「相対値」と表示する）と呼び、本明細書においてアルカリホスファターゼの別の指標として用いた。本実施例では、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に本因子含む培地を添加した場合、本因子を含まない培地を添加して培養した場合と比較して、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞全体のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の値を、少なくとも約１．５倍より高く上昇させる能力を有するときに、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有すると判断した。
相対活性値レベルで評価した場合、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合のアルカリホスファターゼ活性を１とすると、４週齢のラット群では、４日後に採取した培養上清を添加すると約４．１倍、１週後に採取した培養上清では約５．１倍、２週後に採取した培養上清では約５．４倍、３週後に採取した培養上清では約４．９倍にまで上昇した。８週齢のラット群では、４日後に採取した培養上清を添加すると約２．９倍、１週後に採取した培養上清では約３．１倍、２週後に採取した培養上清では約３．８倍、３週後に採取した培養上清では約４．２倍にまで上昇した。（表１上段および図２を参照のこと）。
（誘導骨芽細胞の確認）
（アルカリホスファターゼの染色）
（肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養した上清を添加した場合）
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２（すなわち、２．５×１０４／穴）で２４穴プレート（ベクトン・ディンキンソン社製）および１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイト上に均一に播種した。播種から１８時間後に、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。この細胞培養物を、６０％アセトン／クエン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレットＢとナフトールＡＳ−ＭＸとのを混合液に浸漬し、室温暗所で３０分反応させることにより、呈色させた。
（肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地で培養した上清を添加した場合）
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２（すなわち、２．５×１０４／穴）で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）および１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイト上に均一に播種した。播種から１８時間後に、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）で培養した培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。この細胞培養物を、６０％アセトン／クエン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレットＢとナフトールＡＳ−ＭＸとのを混合液に浸漬し、室温暗所で３０分反応させることにより、呈色させた。
上に示したように、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が上昇することが示された。さらにＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ染色においても、この誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加すると、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は著しい赤色を示した。このことにより、染色法によってもアルカリホスファターゼが発現していることが示された。この結果、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された（表１上段、図２、図３Ａ上段および図３Ｂを参照のこと）。また、前記の方法により細胞のペレットを作製し、酸性トルイジン青およびサフラニンＯでこの細胞を染色すると、異染性（メタクロマジー）は示さず、サフラニンには陰性であった。従って、この細胞は、軟骨細胞ではないことが確認された。従って、分化した細胞は、肥大化能を有する軟骨細胞ではないことが確認できた。
（比較例１Ａ：肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
実施例１と同様の方法により、肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、２．５×１０４／穴）に均一に播種した。播種から１８時間後に、上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１とすると、４週齢のラット群では、４日後に採取した培養上清を添加すると約１．０倍、１週後に採取した培養上清では約１．３倍、２週後に採取した培養上清では約１．１倍、３週後に採取した培養上清では約１．０倍であった。８週齢のラット群では、４日後に採取した培養上清を添加すると約１．２倍、１週後に採取した培養上清では約１．０倍、２週後に採取した培養上清では約１．０倍、３週後に採取した培養上清では約０．９倍であった（表１下段および図２を参照のこと）。ＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、４週齢および８週齢のラット群におけるアルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。
（誘導骨芽細胞の確認）
（アルカリホスファターゼの染色）
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を２４穴プレートおよびヒドロキシアパタイト上に播種し（ＢＭＥ培地）、１８時間培養した。次いで、この細胞培養物に、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清を添加し、７２時間後にアルカリホスファターゼ染色をした。ＭＥＭ増殖培地で培養した上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ染色は染まらず、活性がないことが確認された（図３Ａ下段および図３Ｄを参照のこと）。
【表１】
2008156221.tif 000007
４週齢：５回実験を行った。１回の実験で３試行した。
８週齢：３回実験を行った。１回目２試行、２回目２試行、３回目１試行した。
実施例１と同様の方法を用いて、上記の操作により得られた肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを確認することができる。
（実施例１および比較例１Ａのまとめ）
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、未分化細胞であるマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出された。従来、このような因子は知られておらず、その因子の存在自体が予想外な効果といえる。なお、従来知られているＢＭＰは、別の場所で詳述するように、直接的に誘導骨芽細胞へと分化誘導させる効果はないようである。
（比較例１Ｂ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
（肋軟骨からの静止軟骨細胞の調製）
４週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）および８週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺した。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋軟骨部を採取した。この肋軟骨部分より不透明の静止軟骨部を採取した。この静止軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの１晩処理を除く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
（肋軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）
肋軟骨由来の静止軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを、実施例１と同様の手順を用いて確認した。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった（図１Ｃを参照のこと）。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された（図１Ｄを参照のこと）。ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞にはアルカリホスファターゼ活性がないことが確認された。このことにより、本比較例で使用する細胞液には、肥大化能を有さない軟骨細胞が存在することが確認できた。
（肥大化能を有する軟骨細胞マーカー遺伝子の発現の確認）
本比較例では、実施例１と同様の方法を用いて、アルカリホスファターゼ、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、オステオカルシンの発現量について、リアルタイムＰＣＲで測定した。内在性コントロール遺伝子として、ＧＡＰＤＨを用いた。
試料として、本比較例において調製した肥大化能を有なさい軟骨細胞（５×１０−５個）を遠心分離（１７０〜２００×ｇで３〜５分間）することによりペレットにして、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養したもの（Ｒｐ１およびＲｐ２）を用いた。培地には、ＨＡＭ培地＋１０％ＦＢＳまたはＭＥＭ培地＋１５％ＦＢＳを用いた。
実施例１と同様の方法を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行い、リアルタイムＰＣＲ機器（ＡＢＩ社、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）にて各細胞マーカーの発現量の測定を行った。ＰＣＲ反応後、しきい値の設定および到達サイクルの算出を、機器（ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）内蔵の解析ソフトにより実施した。各細胞マーカーの値を、ＧＡＰＤＨの値で除して発現量の平均値を算出した。その結果、肥大化能を有さない軟骨細胞はＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンを発現するが、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンはいずれも発現しなかった（表ＩＩ）。
【表ＩＩ】
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Ｒｐ１およびＲｐ２：肥大化能を有さない軟骨細胞のペレットを１週間培養したもの
実施例１と同様の方法を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であることを確認した。
（肋軟骨から採取した静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）
肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）各培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、４日後に採取した培養上清を添加すると約０．９倍、１週後に採取した培養上清では約１．１倍、２週後に採取した培養上清では約１．０倍、３週後に採取した培養上清では約１．１倍であった（表２上段および図４を参照のこと）。
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（比較例１Ｃ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
比較例１Ｂと同様の方法により、肋軟骨から静止軟骨細胞を採取した。静止軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに均一に播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１とすると、４日後に採取した培養上清を添加すると約１．０倍、１週後に採取した培養上清では約１．０倍、２週後に採取した培養上清では約０．９倍、３週後に採取した培養上清では約１．１倍であった（表２下段および図４を参照のこと）。
ＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった（表２下段および図４を参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
【表２】
2008156221.tif 000009
８週齢：３回実験を行った。１回目３試行、２回目１試行、３回目３試行した。
（比較例１Ｂおよび比較例１Ｃのまとめ）
肋軟骨から採取した肥大化能を有さない静止軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養しても、ＭＥＭ増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。
（比較例１Ｄ：関節軟骨由来の軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
（関節軟骨からの軟骨細胞の調製）
８週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺した。ラットの膝関節周囲をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。膝関節部を切開し、無菌的に関節軟骨を採取した。この関節軟骨を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの１晩処理を省く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した。細胞を、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
（関節軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）
関節軟骨部由来の軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを、実施例１と同様の手順を用いて確認した。アルカリホスファターゼ染色では、ヒドロキシアパタイトは染まらなかった（図１Ｅを参照のこと）。トルイジン青染色では、ヒドロキシアパタイトは青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された（図１Ｆを参照のこと）。ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞にはアルカリホスファターゼ活性がないことが確認された。このことにより、本比較例で使用する細胞液には、肥大化能を有さない軟骨細胞が存在することが確認できた。
実施例１と同様の方法および判定基準を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であるか否かを確認する。
（関節軟骨部から採取した軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）
関節軟骨部から採取した軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）各培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、４日後に採取した培養上清を添加すると約１．４倍、１週後に採取した培養上清では約１．１倍、２週後に採取した培養上清では約１．１倍、３週後に採取した培養上清では約１．１倍であった（表３上段および図５Ａを参照のこと）。
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（比較例１Ｅ：関節軟骨部から採取した軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
比較例１Ｄと同様の方法により、関節軟骨部から軟骨細胞を採取した。軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培地１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１とすると、４日後に採取した培養上清を添加すると約１．１倍、１週後に採取した培養上清では約１．０倍、２週後に採取した培養上清では約１．１倍、３週後に採取した培養上清では約１．２倍であった（表３下段および図５Ａを参照のこと）。
関節軟骨部由来の軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった（表３および図５Ａを参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
【表３】
2008156221.tif 000010
（比較例１Ｄおよび１Ｅのまとめ）
関節軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養しても、ＭＥＭ増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。
（実施例２：胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
（胸骨軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
８週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺する。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒する。胸部を切開し、無菌的に胸骨軟骨部体下部および剣状突起部を採取する。この胸骨軟骨部体下部および剣状突起部より半透明の成長軟骨部を採取する。これらの成長軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（Ｄ−ＰＢＳ）中で、３７℃で１時間攪拌する。次いで、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ（インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌する。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（インビトロジェン社製）／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの１晩処理を省く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄する。細胞を、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントする。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とする。
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例１と同様の方法および判定基準を使用して、採取した細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認する。
（胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）
胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収する。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養する。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合と比べて上昇する。
（誘導骨芽細胞の確認）
実施例１と同様の方法および判定基準を用いて、上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清は、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させることを確認する。
（比較例２：胸骨軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製）
実施例２と同様の方法により、胸骨軟骨部より肥大化能を有する軟骨細胞を採取する。肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に培地の上清を回収する。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養する。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
ＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらない。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（実施例２および比較例２のまとめ）
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清が、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させたとき、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在すると判定される。一方、ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清が、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させないときとき、この因子が存在しないこと判定される。この場合、肥大化能を有する軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生すると判定される。
（実施例３：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＨＡＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
（肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって生産された因子の検出）
実施例１により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、ＨＡＭ分化因子産生培地（ＨＡＭ培地、１０％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、播種し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＨＡＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、４日後に採取した培養上清を添加すると約１．２倍、１週後に採取した培養上清では約２．３倍、２週後に採取した培養上清では約３．１倍、３週後に採取した培養上清では約２．２倍であった（表３−２上段および図５Ｂを参照のこと）。
誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が上昇することが示された（表３−２および図５Ｂ）。さらにアルカリホスファターゼ染色法によってもアルカリホスファターゼが発現していることが示された。この結果、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された。
【表３−２】
2008156221.tif 000011
（比較例３Ａ：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＨＡＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
実施例１と同様の方法により、肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、ＨＡＭ増殖培地（ＨＡＭ培地、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。相対活性値レベルで評価した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＨＡＭ増殖培地のみを添加した場合を１とすると、４日後に採取した培養上清を添加すると約１．０倍、１週後に採取した培養上清では約０．９倍、２週後に採取した培養上清では約１．２倍、３週後に採取した培養上清では約１．２倍であった（表３−２下段および図５Ｃを参照のこと）。
ＨＡＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＨＡＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった（表３−２下段および図５Ｃを参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させないことを確認した。
（実施例３および比較例３Ａのまとめ）
ＨＡＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、未分化細胞であるマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、ＨＡＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、ＨＡＭ分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出された。
（比較例３Ｂ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞を、ＨＡＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
比較例１Ｂと同様の方法を使用して肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、ＨＡＭ分化因子産生培地（ＨＡＭ培地、１０％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに均一に播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、培養する。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性をそれぞれ測定する。
ＨＡＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性が、ＨＡＭ分化因子産生培地のみまたはＨＡＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わず、上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させなければ、誘導骨芽細胞に分化していないと判定する。この場合、肋軟骨由来の静止軟骨細胞は、ＨＡＭ分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。
（比較例３Ｃ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞を、ＨＡＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
比較例１Ｂと同様の方法を使用して肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、ＨＡＭ増殖培地（ＨＡＭ培地、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに均一に播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、培養する。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性をそれぞれ測定する。
ＨＡＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性が、ＨＡＭ分化因子産生培地のみまたはＨＡＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらず、上記の操作により得られた細胞培養物の培養上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させなければ、誘導骨芽細胞に分化していないと判定する。この場合、肋軟骨由来の静止軟骨細胞は、ＨＡＭ増殖培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。
（実施例１、実施例３、比較例１Ａ〜１Ｅ、３Ａ〜３Ｃのまとめ）
上記実施例より、肥大化能を有する軟骨細胞は、分化因子産生培地に含まれる基礎培地の種類にかかわらず、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生する。肥大化能を有する軟骨細胞は、いずれの増殖培地でも、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しない。さらに、肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨細胞は、いずれの培地で培養しても未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しない。このことより、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は、肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地中で培養することによってのみ産生されることが示唆される。さらに、培地中に含まれる基礎培地は、通常、細胞培養に用いられ得る培地であれば、誘導骨芽細胞分化誘導因子の産生には影響を及ぼさず、本方法において使用可能であると考えられる。
（実施例４：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
（ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞による因子の検出）
多肢症、腫瘍、提供軟骨組織などのヒト組織由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ヒト組織資源活用機関（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク、理化学研究所細胞開発バンク、厚生省国立医薬品食品衛生研究所細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの国内機関、およびＩＩＡＭ、ＡＴＣＣなどの海外機関、Ｏｓｉｒｉｓ社などの細胞提供業者）より入手する。入手した肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（ＭＥＭ培地、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、播種し、培養し、経時的に培地の上清を回収する。
研究用ヒト間葉系幹細胞を前記機関から入手し、２４穴プレートに均一に播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、培養する。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、研究用ヒト未分化細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が上昇することが示されるとき、未分化細胞が誘導骨芽細胞に分化したと判定される。さらにアルカリホスファターゼ染色においても、アルカリホスファターゼが発現しているとき、未分化細胞が誘導骨芽細胞に分化したことと判定される。
（比較例４Ａ：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
実施例４と同様に入手した肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（ＭＥＭ培地および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に培地の上清を回収する。
研究用ヒト未分化細胞を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して培養する。７２時間後に、実施例１と同じ方法を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定する。
ＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性が、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなければ、未分化細胞を誘導骨芽細胞へ分化誘導させる因子を生成しないと判定される。
ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養する場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生すると予測される。一方、ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、ＭＥＭ増殖培地で培養する場合には、未分化細胞を誘導骨芽細胞へ分化誘導させる因子を生成しないことと予測される。
（比較例４Ｂ：ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を前記機関から入手する。この軟骨細胞に、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地をそれぞれ加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌをそれぞれ添加して、培養する。７２時間後に実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養する場合、アルカリホスファターゼ活性がほとんど変わらなければ、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。また、ＭＥＭ増殖培地で培養する場合、アルカリホスファターゼ活性がほとんど変わらなければ、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと判定される。
ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養しても、ＭＥＭ増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないと予測される。
（実施例５：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ＨＡＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
実施例４と同様に入手したヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞に、ＨＡＭ分化因子産生培地を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、培養する。７２時間後に実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、ＨＡＭ分化因子産生培地で培養する場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を誘導することを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（比較例５Ａ：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ＨＡＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞に、ＨＡＭ増殖培地を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、培養する。７２時間後に実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、ＨＡＭ増殖培地で培養する場合には、未分化細胞を誘導骨芽細胞へ分化誘導させる因子を生成しないことを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（比較例５Ｂ：ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を、ＨＡＭ分化因子産生培地およびＨＡＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
比較例４Ｂと同様に入手したヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞に、ＨＡＭ分化因子産生培地およびＨＡＭ増殖培地をそれぞれ加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収する。研究用ヒト未分化細胞を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌをそれぞれ添加して、培養する。７２時間後に実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞をＨＡＭ分化因子産生培地、ＨＡＭ増殖培地を用いた細胞培養物の培養上清を添加した場合、得られた細胞培養物の培養上清が、未分化細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（実施例４〜５および比較例４Ａ〜５Ｂのまとめ）
上記実施例より、ヒト由来肥大化能を有する軟骨細胞が、分化因子産生培地に含まれる基礎培地の種類にかかわらず、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生するか否かを検討することができる。実施例１、３および比較例１Ａ〜１Ｅ、３Ａ〜３Ｃより、ラット由来の肥大化能を有する軟骨細胞は、いずれの増殖培地でも、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しないことが実証されている。さらに、ラット由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、いずれの培地で培養しても未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生しないことが実証されている。このことより、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は、肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地中で培養することによってのみ産生されることが示唆されている。従って、ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞においても、培地中に含まれる基礎培地が、通常、細胞培養に用いられ得る培地であれば、誘導骨芽細胞分化誘導因子の産生には影響を及ぼさず、本方法において使用可能であると推測される。
（実施例６：肥大化能を有する軟骨細胞の産生する因子が、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞以外の未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）
実施例１と同様の方法を使用して、ＭＥＭ分化因子産生培地またはＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養したときの各培養上清を得た。未分化細胞として、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた。これらの細胞をそれぞれ２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌをそれぞれ添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞では約５．９倍（表４左および図６Ａを参照のこと）であり、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞では約１３．８倍（表４中および図６Ａを参照のこと）であり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では約５．４倍であった（表４右および図６Ａを参照のこと）。
ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１とすると、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞では約１．３倍（表４左および図６Ａを参照のこと）であり、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞では約１．１倍（表４中および図６Ａを参照のこと）であり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では約０．９倍であった（表４右および図６Ａを参照のこと）。
【表４】
2008156221.tif 000012
ＧＣ（４週齢）：１回実験を行った。３試行した。
ＧＣ分化上清：成長軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清
ＧＣ増殖上清：成長軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清
分化培地のみ：ＭＥＭ分化培地そのもの
増殖培地のみ：ＭＥＭ増殖培地そのもの
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞においてアルカリホスファターゼ活性を上昇させ、これらの未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことが確認された。
（比較例６：肥大化能を有さない静止軟骨細胞の培養上清に存在する成分が、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞以外の未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）
比較例１Ｂと同様の方法を使用して、ＭＥＭ分化因子産生培地またはＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養したときの各培養上清を得た。未分化細胞として、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた。これらの細胞をそれぞれ２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌをそれぞれ添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、アルカリホスファターゼ活性は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞では約１．０倍（表５左および図６Ａを参照のこと）であり、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞では約１．１倍（表５中および図６Ａを参照のこと）であり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では約１．０倍であった（表５右および図６Ａを参照のこと）。
ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１とすると、アルカリホスファターゼ活性は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞では約１．３倍（表５左および図６Ａを参照のこと）であり、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞では約０．９倍（表５中および図６Ａを参照のこと）であり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では約１．０倍であった（表５右および図６Ａを参照のこと）。
【表５】
2008156221.tif 000013
ＲＣ（８週齢）：１回実験を行った。３試行した。
ＲＣ分化上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清
ＲＣ増殖上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清
分化培地のみ：ＭＥＭ分化培地そのもの
増殖培地のみ：ＭＥＭ増殖培地そのもの
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらず、この培養上清には、これらの未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在しないことが確認された。ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有さない静止軟骨細胞を培養した場合もまた、これらの培養上清にはこの因子は存在しないことが確認された。
（実施例７：肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を種々の従来型骨芽細胞分化誘導成分を含む培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
実施例１と同様の方法により得られた肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（ＭＥＭ培地および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、さらに、従来型骨芽細胞分化誘導成分として、デキサメサゾン、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸またはこれらの組み合せを添加して培養し、経時的に培地の上清を回収した。
2008156221.tif 000014
それぞれの培養上清１ｍｌをマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（１．２５×１０４細胞／ｃｍ２）に添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した場合のアルカリホスファターゼ活性を測定した。アルカリホスファターゼ活性の測定は、実施例１と同様の方法を使用した。その結果、以下の表および図６Ｂに示されるように、ＭＥＭ分化因子産生培地（Ｄｅｘ＋βＧＰ＋Ａｓｃ）を添加した培地では、アルカリホスファターゼ活性は、０．０４１であり、ＭＥＭ増殖培地にβＧＰ＋Ａｓｃを添加した培地では、アルカリホスファターゼ活性は０．０４４であった。増殖培地に従来型骨芽細胞分化誘導成分の各々を単独で添加した培地では、アルカリホスファターゼ活性は、Ｄｅｘ単独では０．０１６であり、βＧＰ単独では０．０１５であり、Ａｓｃでは０．０１６であった。増殖培地にＤｅｘ＋βＧＰを添加した培地では、０．０２２であり、Ｄｅｘ＋Ａｓｃを添加した培地では０．０１７であった。対照として増殖培地のみで肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培地の上清を、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加した場合、アルカリホスファターゼは０．０１４であった。ＭＥＭ分化因子産生培地のみ、ＭＥＭ増殖培地のみをＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、それぞれ、０．０１６および０．０１４であった。
（誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子の産生に対する従来型骨芽細胞分化誘導成分の効果）
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Ｄｅｘ：デキサメサゾン
βＧＰ：β−グリセロホスフェート
Ａｓｃ：アスコルビン酸
分化培地のみ：ＭＥＭ分化因子産生培地そのもの（軟骨細胞を培養していないもの）
増殖培地のみ：ＭＥＭ増殖培地そのもの（軟骨細胞を培養していないもの）
肥大化能を有する軟骨細胞を培養するＭＥＭ増殖培地に、従来型骨芽細胞分化誘導成分の各々を単独で添加した場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は産生されなかった。β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸を添加した場合、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子は産生された。デキサメサゾン、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸のすべてを添加した場合（ＭＥＭ分化因子産生培地と同じ場合）にも、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子の産生が促進されることが確認された。
（実施例８：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地中で培養することにより得られる培養上清に含まれる因子の検討）
実施例１と同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、４日から３週間経時的に集めた上清を遠心フィルターに入れ、４０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心し、高分子分画と低分子分画を分離する条件下の遠心式限外濾過により、上清を分子量５０，０００以上の画分と分子量５０，０００未満の画分に分離させた。次いで、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＢＭＥ培地中）を２４穴プレート（１．２５×１０４細胞／ｃｍ２）およびヒドロキシアパタイト（１×１０６細胞／ｍｌ）に播種し、１８時間後に、各培地上清の画分（１ｍｌ）をそれぞれ添加して３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する。
分子量５０，０００以上の画分を添加した場合、２４穴プレートに播種したときもヒドロキシアパタイトに播種したときも両方とも、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は赤く染まった（図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）。この培養上清の分子量５０，０００以上の画分には、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有する因子が存在することが分かった。分子量５０，０００未満の画分を添加した場合、２４穴プレートに播種したときもヒドロキシアパタイトに播種したときもどちらでもＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は染色されず、アルカリホスファターゼ活性は認められなかった（図７Ｃおよび７Ｄを参照のこと）。
以上の結果より、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子は、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地中で培養した培養上清の、分子量５０，０００以上の画分に存在することが分かった。
（実施例９：マウス肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
（マウス肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
８週齢雄性マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ）を本実施例において実験した。マウスは、クロロホルムを使用して屠殺した。マウスの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋骨・肋軟骨部を採取した。この肋骨・肋軟骨部の境界部分より半透明の成長軟骨部を採取した。この成長軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例９によって得られた細胞は、分離の際に使用した酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ）によって障害を受けているので、培養によって障害を回復させた。肥大化能を有する軟骨細胞を、軟骨細胞マーカーの局在または発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定する。
（肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの局在または発現）
上記の操作により得られた細胞の溶解物をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で処理する。ＳＤＳ処理した溶液をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供する。その後、転写用膜にブロッティング（ウェスタンブロティング）し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
上記の操作により得られた細胞培養物を、１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはＦＩＴＣ、ＰＥ、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
アルカリホスファターゼについては染色法で検出することもできる。上記の操作によって得られた細胞培養物を、６０％アセトン／クエン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレットＢとナフトールＡＳ−ＭＸとのを混合液に浸漬し、室温暗所で３０分反応させることにより、呈色させる。
（軟骨細胞の肥大化能に関する組織学的検索）
５×１０５個の細胞を含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培養液を遠心することにより細胞のペレットを作製し、この細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較する。有意な成長が確認されたときに、細胞を肥大化能を有すると判定する。
実施例９によって得られた細胞が、軟骨細胞マーカーの発現しているか否か、形態学的に肥大化しているか否かを検討することにより、これらの細胞が、肥大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認することができる。
（マウス肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された因子の検出）
実施例９により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈した。この細胞液を、ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン社製）に均一に播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
（回収した培養上清が、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導する活性を有するか否かの検討）
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、２．５×１０４／穴）に均一に播種した。播種から１８時間後に、上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。本実施例では、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に本因子含む培地を添加した場合、本因子を含まない培地を添加して培養した場合と比較して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞全体のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の値を、少なくとも約１．５倍より高く上昇させる能力を有するときに、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有すると判断した。
ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合のアルカリホスファターゼ活性を１とすると、アルカリホスファターゼ活性は、約３．１倍にまで上昇した（表６上段および図８を参照のこと）。
（誘導骨芽細胞の確認）
上に示したように、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が上昇することが示された。さらにＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ染色においても、この誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して７２時間培養すると、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は著しい赤色を示す。このことにより、染色法によってもアルカリホスファターゼが発現していることが示される。この結果、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された。
（比較例９Ａ：マウス肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
実施例９と同様の方法により、マウス肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、２．５×１０４／穴）に均一に播種した。播種から１８時間後に、上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合のアルカリホスファターゼ活性を１とすると、アルカリホスファターゼ活性は約１．６倍であった（表６下段および図８を参照のこと）。
ＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった（図８を参照のこと）。
（誘導骨芽細胞の確認）
実施例９と同様の方法を用いて、上記の操作により得られた細胞培養物の上清は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させなかったことを確認した。
（比較例９Ｂ：マウス肋軟骨由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
（肋軟骨からの静止軟骨細胞の調製）
８週齢雄性マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ）をクロロホルムを使用して屠殺した。マウスの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋軟骨部を採取した。この肋軟骨部分より不透明の静止軟骨部を採取した。この静止軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの一晩処理を除く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
（肋軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）
実施例９と同様の方法を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出することができる。また、細胞を形態学的に検索して、得られた細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認することができる。
（肋軟骨から採取した静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）
肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）各培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、アルカリホスファターゼ活性は約０．８倍であった（表６上段および図８を参照のこと）。
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった（表６上段および図８を参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（比較例９Ｃ：マウス肋軟骨から採取した静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
比較例９Ｂと同様の方法により、肋軟骨から静止軟骨細胞を採取した。静止軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培地１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合を１とすると、アルカリホスファターゼ活性が約１．０倍であった（表６下段および図８を参照のこと）。
肋軟骨由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった（表６下段および図８を参照のこと）。上記の操作により得られた細胞培養物の上清は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させないことを確認した。
【表６】
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８週齢：１回実験した。２試行した。
ＧＣ上清：肥大化能を有する軟骨細胞をそれぞれの培地で培養した培養上清
ＲＣ上清：静止軟骨細胞をそれぞれの培地で培養した培養上清
分化培地のみ：ＭＥＭ分化因子産生培地そのもの
増殖培地のみ：ＭＥＭ増殖培地そのもの
（実施例９および比較例９Ａ〜９Ｃのまとめ）
マウス肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて培養した場合、この培養上清には、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出された。
マウス肋軟骨部由来の静止軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養しても、ＭＥＭ増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。
（実施例１０：ウサギ肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子の調製および検出）
（ウサギ肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
８週齢雄性ウサギ（日本白色種）を本実施例において実験した。ウサギは、クロロホルムを使用して屠殺した。ウサギの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋骨・肋軟骨部を採取した。この肋骨・肋軟骨部の境界部分より半透明の成長軟骨部を採取した。この成長軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例１０によって得られた細胞は、分離の際に使用した酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ）によって障害を受けているので、培養によって障害を回復させた。肥大化能を有する軟骨細胞を、軟骨細胞マーカーの局在または発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定する。
（肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの局在または発現）
上記の操作により得られた細胞の溶解物をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で処理する。ＳＤＳ処理した溶液をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供する。その後、転写用膜にブロッティング（ウェスタンブロティング）し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
上記の操作により得られた細胞培養物を、１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはＦＩＴＣ、ＰＥ、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
アルカリホスファターゼについては染色法で検出することもできる。上記の操作によって得られた細胞培養物を、６０％アセトン／クエン酸バッファーで固定し、蒸留水で洗浄後、ファーストバイオレットＢとナフトールＡＳ−ＭＸとのを混合液に浸漬し、室温暗所で３０分反応させることにより、呈色させる。
（軟骨細胞の肥大化能に関する組織学的検索）
５×１０５個の細胞を含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培養液を遠心することにより細胞のペレットを作製し、この細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較する。有意な成長が確認されたときに、細胞を肥大化能を有すると判定する。
（結果）
実施例１０によって得られた細胞が、軟骨細胞マーカーを発現しているか否か、形態学的には肥大化しているか否かを確認することにより、これらの細胞が、肥大化能を有する軟骨細胞であるか否かを確認することができる。
（ウサギ肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された因子の検出）
実施例１０により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈した。この細胞液を、ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン社製）に均一に播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
（回収した培養上清が、未分化細胞を誘導骨芽細胞を分化誘導する活性を有するか否かの検討）
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、２．５×１０４／穴）に均一に播種した。播種から１８時間後に、上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。本実施例では、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に本因子含む培地を添加した場合、本因子を含まない培地を添加して培養した場合と比較して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞全体のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の値を、少なくとも約１．５倍より高く上昇させる能力を有するときに、アルカリホスファターゼ活性を上昇させる活性を有すると判断した。
ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合を１とすると、培養上清を添加すると、アルカリホスファターゼ活性が上昇する。
（誘導骨芽細胞の確認）
上に示したように、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子によって、誘導骨芽細胞マーカーの一つである、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が上昇することが示された。さらにＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ染色においても、この誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に添加して７２時間培養すると、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は著しい赤色を示す。このことにより、染色法によってもアルカリホスファターゼが発現していることが示される。この結果、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞が誘導骨芽細胞に分化したことが確認された。
（比較例１０Ａ：ウサギ肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
実施例１０と同様の方法により、ウサギ肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で２４穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社製、２．５×１０４／穴）に均一に播種した。播種から１８時間後に、上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
ＭＥＭ増殖培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。
（誘導骨芽細胞の確認）
実施例１０と同様の方法および判定基準を用いて、上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを確認することができる。
（比較例１０Ｂ：ウサギ肋軟骨由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
（肋軟骨からの静止軟骨細胞の調製）
８週齢雄性ウサギ（日本白色種）をクロロホルムを使用して屠殺した。ウサギの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋軟骨部を採取した。この肋軟骨部分より不透明の静止軟骨部を採取した。この静止軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）／（ＨＡＭ＋１０％  ＦＢＳ）とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの一晩処理を除く場合もある。翌日、濾過し、遠心分離（１７０×ｇで３分間）により洗浄した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
（肋軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）
実施例１０と同様の方法および判定基準を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であるか否かを確認することができる。
（肋軟骨から採取した静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する因子の検出）
肋軟骨から採取した静止軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）各培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた細胞培養物の上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（比較例１０Ｃ：肋軟骨から採取した静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した場合に産生する因子の調製および検出）
比較例１０Ｂと同様の方法により、肋軟骨から静止軟骨細胞を採取した。静止軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（大日本住友製薬社製、ＣＣＬ−２２６）を２４穴プレートに播種し、１８時間後に上記の培地１ｍｌを添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
肋軟骨由来の静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ増殖培地のみ添加した場合とほとんど変わらなかった。上記の操作により得られた細胞培養物の上清が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞マーカーを発現させるか否かを実施例１と同様の方法および判定基準で確認することができる。
（実施例１０および比較例１０Ａ〜１０Ｃのまとめ）
ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて、ウサギ肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清には、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させ、誘導骨芽細胞に分化誘導する因子が存在することが確認された。一方、ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した場合、この培養上清にはこの因子が存在しないことが確認された。肥大化能を有する軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養すると、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子を産生することが見出された。
ウサギ肋軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞は、ＭＥＭ分化因子産生培地で培養しても、ＭＥＭ増殖培地で培養しても、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子を産生しないことが確認された。
（実施例１１：未分化細胞を培養する培地（未分化細胞培養培地）が、未分化細胞の誘導骨芽細胞への分化誘導に与える影響の検討）
実施例１、比較例１Ｂおよび１Ｄと同様の方法をそれぞれ使用して、肥大化能を有する軟骨細胞、もしくは肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨細胞を採取した。これらの細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地およびＭＥＭ増殖培地にそれぞれ４×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）各培養上清を得た。未分化細胞として、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を用いた。ＨＡＭ培地またはＭＥＭ培地の入った２４穴プレートに、これらの細胞を１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、１８時間後に上記の培養上清１ｍｌをそれぞれ添加して、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーター中で培養した。７２時間後に、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＭＥＭ培地で培養した場合、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加したもののアルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加したものと比較して約１０．８倍高いアルカリホスファターゼ活性の上昇が認められた。ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性の上昇は認められなかった。肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨由来の軟骨細胞を用いた場合は、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて培養した培養上清を添加してもＭＥＭ増殖培地を用いて培養した培養上清を添加しても、いずれもアルカリホスファターゼ活性の上昇は認められなかった。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の培養に用いる基礎培地は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の誘導骨芽細胞への分化誘導に影響を与えないことが分かった（表７および図９を参照のこと）。
【表７】
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ＧＣ（４週齢）：１回実験した。３試行した。
ＲＣ（８週齢）：１回実験した。３試行した。
ＡＣ（８週齢）：１回実験した。３試行した。
ＧＣ分化上清：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清ＧＣ増殖上清：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清
ＲＣ分化上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清
ＲＣ増殖上清：静止軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清
ＡＣ分化上清：関節軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清
ＡＣ増殖上清：関節軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した培養上清
分化培地のみ：ＭＥＭ分化因子産生培地そのもの
増殖培地のみ：ＭＥＭ増殖培地そのもの
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＨＡＭ培地で培養した場合、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加したもののアルカリホスファターゼ活性は、ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加したものと比較して約６．７倍高いアルカリホスファターゼ活性の上昇が認められた。ＭＥＭ増殖培地を用いて肥大化能を有する軟骨細胞を培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性の上昇は認められなかった。肥大化能を有さない静止軟骨細胞および関節軟骨由来の軟骨細胞を用いた場合は、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いて培養した培養上清を添加してもＭＥＭ増殖培地を用いて培養した培養上清を添加しても、いずれもアルカリホスファターゼ活性の上昇は認められなかった（表７および図９を参照のこと）。
（実施例１２：肥大化能を有する軟骨細胞によって産生された、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる因子の熱による変性）
実施例１と同様の方法を使用して、肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）、１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に（４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目に）培地の上清を回収した。この培養上清を、沸騰水中で３分間、加熱処理した。
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（１．２５×１０４細胞／ｃｍ２）をＢＭＥ培地で培養し、１８時間後に、加熱処理をしていない培養上清、加熱処理した培養上清、ＭＥＭ分化因子産生培地のみをそれぞれ１ｍｌを添加した。７２時間後に、実施例１と同様の方法を使用してアルカリホスファターゼ活性を測定した。
ＭＥＭ分化因子産生培地のみを添加して培養したときのアルカリホスファターゼ活性を１とすると、加熱処理していない肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、アルカリホスファターゼ活性は、約１２．８倍であったが、該培養上清を加熱処理した場合には、アルカリホスファターゼ活性は、約１．６倍に減少した（表８および図１０を参照のこと）。この結果より、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清に存在する、未分化細胞を誘導骨芽細胞に分化誘導させる能力を有する因子は、加熱処理により熱変性する（失活する）ことが確認された。
【表８】
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４週齢：１回実験した。３試行した。
熱処理：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を加熱処理したもの
非処理：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清
分化培地のみ：ＭＥＭ分化因子産生培地そのもの
（実施例１３：誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
実施例１と同様の方法により、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を調製した。調製した肥大化能を有する軟骨細胞に、ＭＥＭ分化因子産生培地を加えて１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。この細胞液を、コラーゲンゲル、アルギン酸およびマトリゲルＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製）のそれぞれに均一に播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養し、複合材料を作製した。培養は、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた。
これらの複合材料を同系動物の背部皮下に移植した。移植の４週間後、これらの同系動物を屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、レントゲン撮影およびマイクロＣＴ撮影を行い、パラフィン包埋した。常法に従って薄切標本を作製し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色、トルイジン青（ＴＢ）染色、アルシアン青（ＡＢ）染色、サフラニンＯ（ＳＯ）染色し、移植部位の状態を確認した。
各実験は以下のように行った。
レントゲン撮影：マイクロＣＴ撮影機器（東陽テクニカ社、高分解能Ｘ線マイクロＣＴスキャナＳＫＹＳＣＡＮ１１７２）を用い、１００ＫＶで垂直方向よりレントゲンを撮影した。
マイクロＣＴ撮影：同マイクロＣＴ機器を用い、１００ＫＶで０．４度ずつ回転させて各レントゲンを撮影し、添付ソフトＮＲｅｃｏｎにより再構成し、三次元ボリュームレンダリングソフトＶＧＳｔｕｄｉｏ  Ｍａｘにより三次元画像を得た。
ＨＥ染色：薄切、脱パラした切片を、ヘマトキシリン液に５−１０分浸漬、水洗、色出し後、エオジン液で３−５分浸漬。
ＴＢ染色：薄切、脱パラした切片を０．０５％トルイジン青液に１５−３０分浸漬。
ＡＢ染色：薄切、脱パラした切片を３％酢酸液に３−５分浸漬し、次いでアルシアン青液に２０−３０分浸漬、水洗後、ケルンエヒトロート（ヌクレアファーストレッド）液に１０−１５分浸漬。
ＳＯ染色：薄切、脱パラした切片を鉄ヘマチキシリン液に５−１５分浸漬、水洗、分別（塩酸アルコール）、色出し、１％酢酸液、ファーストグリーン液１−５分、１％酢酸液、サフラニンＯ液３−５分浸漬。
ＭＥＭ分化産生培地で培養することにより誘導骨芽細胞分化誘導能因子を産生する能力を有するようになった、肥大化能を有する軟骨細胞を含む複合材料の全てにおいて骨形成が観察された（図１３〜２４）。
コントロールとして、移植に用いた複合材料の一部を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。薄切切片を作製し、染色した。
本実施例と同様の方法を使用して、実施例２〜３（ラット）、４〜５（ヒト）、７（ラット）、９（マウス）、１０（ウサギ）により調製された肥大化能を有する軟骨細胞を用いて複合材料を製造し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合を効果を検討することができる。さらに、生体適合性を有する足場として、例えば、ヒドロキシアパタイト、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製、カタログ番号３５４２５０、ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘペプチドハイドロゲル）、コラーゲン（スポンジ）、ゼラチン（スポンジ）、アガロースを用いて複合材料を製造し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合の効果を検討することができる。
（比較例１３Ａ：肥大化能を有さない軟骨細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
比較例１Ｂ（ラット）と同様の方法により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いた。この肥大化能を有さない軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地またはＭＥＭ増殖培地のいずれかに希釈し、実施例１３と同様の方法により複合材料を作製した。生体適合性を有する足場として、コラーゲンゲル、マトリゲルＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製）およびアルギン酸を用いた。これらの複合材料を同系動物の背部皮下に移植した。移植の４週間後、これらの同系動物を屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、レントゲン撮影とマイクロＣＴ撮影を行い、パラフィン包埋した。薄切標本を作製し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色、トルイジン青（ＴＢ）染色、アルシアン青（ＡＢ）染色、サフラニンＯ（ＳＯ）染色し、移植部位の状態を確認した。肥大化能を有さない軟骨細胞を用いた場合、いずれの生体適合性を有する足場を用いる複合材料においても骨形成は観察されなかった。ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた結果を図２５〜３３に示す。
本比較例と同様の方法を使用して、比較例１Ｄ（ラット）、３Ｂ（ラット）、４Ｂ（ヒト）、５Ｂ（ヒト）、９Ｂ（マウス）および１０Ｂ（ウサギ）により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いて複合材料を製造し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合を効果を検討することもできる。さらに、生体適合性を有する足場として、例えば、ヒドロキシアパタイト、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製、カタログ番号３５４２５０、ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘペプチドハイドロゲル）、コラーゲン（スポンジ）、ゼラチン（スポンジ）、アガロースを用いて複合材料を製造し、皮下に移植した場合の効果を検討することもできる。
（比較例１３Ｂ：足場を単独で皮下に移植した場合の効果）
足場を単独で移植すること以外、実施例１３と同様の方法を用いた。足場であるヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲル、アルギン酸、またはマトリゲルＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製）のそれぞれを単独で同系動物の背部皮下に移植した。その結果、骨形成は観察されなかった（図３４）。
本比較例と同様の方法を使用して、例えば、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製、カタログ番号３５４２５０、ＢＤ  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘペプチドハイドロゲル）、コラーゲン（スポンジ）、ゼラチン（スポンジ）を単独で同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植し、各足場についての効果を検討する。
（実施例１４：誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞のペレットを皮下に移植した場合の効果）
（誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞ペレットの調製）
実施例１と同様の方法により、肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を調製した。この細胞（５×１０５個）に、ＭＥＭ分化因子産生培地を加えて５×１０５個／０．５ｍｌに希釈した。この細胞液を、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）することにより、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを調製し、３７℃にて１週間培養した（図３５Ａ）。
このペレットを３７℃にて１週間培養した後、同系動物の背部皮下に移植した。培養は、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた。移植の４週間後、これらの同系動物を屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、レントゲン撮影とマイクロＣＴ撮影を行い、パラフィン包埋した。常法に従って薄切標本を作製した。実施例１３と同様の方法を用いて、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色、トルイジン青（ＴＢ）染色、アルシアン青（ＡＢ）染色、サフラニンＯ（ＳＯ）染色し、移植部位の状態を確認した。その結果、誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子を産生する能力を有する、肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを移植した場合、移植部位において骨形成が観察された（図３５Ｃ〜Ｄ、図３６および３７）。
本実施例と同様の方法を使用して、実施例２〜３（ラット）、４〜５（ヒト）、７（ラット）、９（マウス）、１０（ウサギ）により調製された肥大化能を有する軟骨細胞を用いて細胞ペレットを調製し、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植した場合の効果を検討することができる。
（比較例１４Ａ：肥大化能を有さない軟骨細胞のペレットを皮下に移植した場合の効果）
比較例１Ｂ（ラット）と同様の方法により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いた。この細胞（５×１０５個）に、ＭＥＭ分化因子産生培地を加えて５×１０５個／０．５ｍｌに希釈した。遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）することにより、肥大化能を有さない軟骨細胞ペレットを作製し、３７℃にて１週間培養した（図３５Ｂ）。次いで、このペレットを同系ラットの背部皮下に移植した。実施例１４と同様の方法を用いて、移植部位における、肥大化能を有さない軟骨細胞と生態適合性足場とを用いる複合材料を移植した場合の影響を観察した。その結果、移植部位に骨形成は認められなかった（図３５Ｅ〜Ｆおよび図３８）。
本比較例と同様の方法を使用して、比較例１Ｄ（ラット）、３Ｂ（ラット）、４Ｂ（ヒト）、５Ｂ（ヒト）、９Ｂ（マウス）および１０Ｂ（ウサギ）により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いて細胞ペレットを調製する。次いで、同系動物もしくは免疫不全動物の皮下に移植する。移植後、実施例１４と同様の方法を用いて、移植部位における、肥大化能を有さない軟骨細胞の細胞ペレットを移植した場合の影響を観察することができる。
（実施例１５．肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導能を有する因子と、ＢＭＰ、ＴＧＦβとの関係）
実施例１と同様の方法を用いて、ラット肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。この肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を加えて４×１０４細胞／ｃｍ２に希釈し、培養し、経時的に各培地の上清を回収した。その後、以下のアッセイを行い、アルカリホスファターゼの活性を測定した。
（ＴＧＦβアッセイ）
ＴＧＦβアッセイは、Ｎａｇａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎａｍｅｌ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ（ＨＰＤＬ）ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ．Ｒｅｓ．，３９：２４９−２５６，２００４．に記載の方法を用いて行った。ＨＰＤＬ細胞を５×１０４／穴で９６穴プレートに播種し、２４時間培養した。培養液を１０ｎＭ  １α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と検査試料を含む培地に交換した。９６時間培養後、ＰＢＳで洗浄し、アルカリホスファターゼ活性を測定した。具体的には、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１００ｍＭ  ２−アミノ−２−メチル−１，３プロパンジオール塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０）中で、３７℃にて、１０分間反応させた。ＮａＯＨを添加した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、吸光度は、約０．１５１５、約０．２５４５、約０．１２４２（表９および図１１Ａを参照のこと。）であった。
【表９】
2008156221.tif 000019
（ＢＭＰアッセイ）
ＢＭＰアッセイは、Ｉｗａｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎｏｇｇｉｎ  Ｂｌｏｃｋｓ  Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｅｎａｍｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，８１：３８７−３９１，２００２．に記載の方法を用いて実施した。ＳＴ２細胞を５×１０４／穴で９６穴プレートに播種し、２４時間培養した。培養液を２００ｎＭ  ａｌｌ−トランスレチノイン酸と検査試料を含む培地に交換した。７２時間培養後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼ活性を測定した。具体的には、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１００ｍＭ  ２−アミノ−２−メチル−１，３プロパンジオール塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０）中で、３７℃にて、８分間反応させた。ＮａＯＨを添加した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した培養上清を添加した場合、吸光度は、約０．０５、約０．０７５、約０．０７５（表１０および図１１Ｂを参照のこと。）であった。
【表１０】
2008156221.tif 000020
誘導骨芽細胞分化誘導因子を含むＭＥＭ分化因子産生培地上清には、ＴＧＦβの活性が認められた。つまり、この分化因子産生培地にはＴＧＦβが存在することが証明された（図１１Ａを参照のこと。）。また、ＢＭＰの活性もわずかに観察された（図１１Ｂを参照のこと。）。ＢＭＰの系はＴＧＦβの存在で抑制がかかる。それにもかかわらず、ＴＧＦβが存在する分化因子産生培地上清においてアルカリホスファターゼ活性が上昇した。以上の結果より、このアルカリホスファターゼ活性の上昇は、ＢＭＰではない誘導骨芽細胞分化誘導因子により誘導されたと考えられる。
（実施例１６．骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料が、未分化細胞を骨芽細胞に誘導する能力の検討）
本実施例では、実施例１と同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、４日から３週間、経時的に集めた上清を遠心フィルターに入れ、４０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心分離し、高分子分画と低分子分画を分離する条件下の遠心式限外濾過により、上清を分子量５０，０００以上の画分と分子量５０，０００以下の画分に分離すると同時に、分子量５０，０００以上の画分を１０倍濃縮した。この濃縮した培地上清を、分化因子産生培地で５倍に希釈した。この遠心分離には、５０Ｋ膜（ミリポア社製、アミコンウルトラ１５、５０，０００ＮＭＷＬ、カタログ番号ＵＦＣ９０５０２４）を用いた。
超多孔体ヒドロキシアパタイト（アパセラムＡＸフィラー：Ｌｏｔ．０３２３１７１０、３ｍｍ角）と充分に該アパタイトが浸漬する量の希釈液（例えば、該アパタイト顆粒１０粒に対して希釈液１ｍｌ）を、注射筒に入れて引くことにより、脱気した。この際、約０．３ｍｌの希釈液がヒドロキシアパタイトに付着された。
次いで、１８時間前に２４ウェルプレートに播種したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（１．２５×１０４細胞／ｃｍ２）に、上記のようにして作製した骨芽細胞誘導因子を付着させた超多孔体ヒドロキシアパタイヒドロキシアパタイトをウェル当り１０粒添加した。マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を培養する培地として、ＢＭＥ培地を用いた。７２時間後にアパタイトを取り出し、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
（比較例１１）
比較例として、実施例１６と同様の方法で、アパセラムＡＸを分化因子産生培地に浸漬したもの、アパセラムＡＸ単独、分化因子産生培地単独（１ｍｌ）を調製した。次いで、実施例１１と同様に、１８時間前に、播種したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＢＭＥ培地中、１．２５×１０４細胞／ｃｍ２）に、分化因子産生培地にアパセラムＡＸを浸漬したもの（１０粒／ｗｅｌｌ）、アパセラムＡＸ単独、分化因子産生培地単独（１ｍｌ）を添加し、７２時間後にこれらを取り出した。次いで、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。さらに、実施例１６と同様の方法によりＲＮＡを抽出した。
その結果、分化因子産生培地を１とした場合、アルカリホスファターゼ活性は、骨芽細胞分化誘導因子を含む培養上清にアパセラムＡＸを浸漬したものでは、５．８であり、アパセラムＡＸを分化因子産生培地に浸漬したものでは、１．４であり、アパセラムＡＸ単独では、１．４であった（表１１および図１２）。
【表１１】
2008156221.tif 000021
因子＋アパタイト：骨芽細胞分化誘導因子を含む培養上清にアパセラムＡＸを浸漬したもの
分化培地＋アパタイト：アパセラムＡＸを分化因子産生培地に浸漬したもの
アパタイト単独：アパセラムＡＸ単独
分化培地のみ：ＭＥＭ分化因子産生培地そのもの
以上の結果より、骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料は、未分化細胞を骨芽細胞に誘導し、骨芽細胞を産生することが確認された。
（実施例１７．骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料を骨欠損部位および皮下に移植した場合の効果）
（複合材料の作製）
実施例１と同様の方法を用いて、４週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）および８週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）から肥大化能を有する細胞を得た。この肥大化能を有する軟骨細胞を、分化因子産生培地で培養し、その培養上清を得た。この培養上清を５０Ｋ膜（ミリポア社製、アミコンウルトラ１５、５０，０００ＮＭＷＬ、カタログ番号ＵＦＣ９０５０２４）を用いて、４０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心分離し、分子量５０，０００以下の成分を除去すると共に分子量５０，０００以上の成分を１０倍濃縮した。
この濃縮液を凍結させ、遠心乾燥させ、電動式粉砕装置（クライオプレスＣＰ−１００Ｗ、マイクロテックニチオン社）で粉砕した。この粉砕乾燥物３０ｍｇを採取し、足場に複合化した。
足場として、コラーゲンキット（コラーゲンゲル培養キット、新田ゼラチン社）を用いてコラーゲンゲルを作製した。具体的には、コラーゲンゲルは、酸性コラーゲン溶液０．８ｍｌ、再構成用緩衝液（２６０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＯＨ）０．１ｍｌ、粉砕乾燥物３０ｍｇを混合し、温度を３７度にすることにより作製した。複合材料の大きさは１〜１．５ｃｍ３であった。この複合材料を、埋入する欠損の大きさにあわせて切削した。
（骨の欠損部位の作製方法）
移植する同系動物もしくは免疫不全動物を麻酔し、無菌的に大腿骨または脛骨の皮膚を切開し、軟部組織をそらせて、大腿骨または脛骨の骨欠損作製部位を露出させた。あるいは、頭蓋骨の皮膚を切開し、頭蓋骨の骨欠損作製部位を露出させる。歯科用穿孔器にトレフィンバールまたはディスクを装着し、穿孔骨欠損または離断骨欠損を作製した。
（骨欠損部位への移植）
本実施例では、移植の４週間後に大腿骨を摘出し、マイクロＣＴ測定および組織標本作製によって、骨形成を評価する。
上記方法を用いて、ラット（Ｗｉｓｔａｒ系、１２週齢、オス）の大腿骨に、直径３ｍｍ×深さ１〜２ｍｍの骨欠損を作製し、上記の複合材料を埋入した。その結果を図４０Ａに示す。
（皮下ポケットの作製方法）
移植する同系動物もしくは免疫不全動物を麻酔し、無菌的に皮膚を切開する。開創部に丸先はさみを挿入し、皮膚を皮下組織と剥離することにより、ポケットを作製する。
（皮下への移植）
上記方法を用いて、ラット（Ｗｉｓｔａｒ系、１０週齢、オス）の背部皮下に、直径１〜２ｃｍの皮下ポケットを作製し、上記の複合材料を埋入する。その後、骨形成能を評価する。
（マイクロＣＴ）
常法に従い、摘出した試料を１０％中性ホルマリン緩衝液で固定する。固定試料をマイクロＣＴにかけて得たＣＴ画像を新生骨量測定ソフトで解析する。
（組織標本）
常法に従い、固定試料をパラフィン包埋し、薄切切片を作製する。作製した薄切切片を染色することで、骨形成を判定する。
さらに、以下の表１２に列挙した足場を用い、上記方法により複合材料を作製し、ラットの骨欠損部位および皮下に移植する。移植した部位について骨形成能を評価する。
【表１２】
2008156221.tif 000022
足場として表１２に列挙した足場を用いた複合材料を用いて皮下および骨欠損部位に移植しマイクロＣＴおよび組織標本を用いて、骨形成を判定することができる。
（比較例Ａ：足場を単独で皮下および骨欠損部位に移植した場合の効果）
実施例１７と同様の方法を用いて、表１２に列挙した足場を、それぞれ単独で同系動物もしくは免疫不全動物の皮下および骨欠損部位に移植し皮下に移植した場合、骨形成は観察されないかどうかを判定することができる。骨欠損部位に移植した場合、足場単独でも骨形成は生じるが、その量についても、実施例１７の方法を用いて、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子と足場との複合材料を移植したときに比べることができる。
（実施例１８．肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子による骨芽細胞の誘導）
（肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子の調製）
本実施例では、実施例１と同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養し、４日から３週間、経時的に集めた上清を遠心フィルターに入れ、４０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心分離し、高分子分画と低分子分画を分離する条件下の遠心式限外濾過により、上清を分子量５０，０００以上の画分と分子量５０，０００以下の画分に分離すると同時に、分子量５０，０００以上の画分を１０倍濃縮した。この濃縮した培地上清を、分化因子産生培地で５倍に希釈した。この遠心分離には、５０Ｋ膜（ミリポア社製、アミコンウルトラ１５、５０，０００ＮＭＷＬ、カタログ番号ＵＦＣ９０５０２４）を用いた。
（骨髄由来未分化間葉系幹細胞の調製）
４週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットをクロロホルムを使用して屠殺した。ラットの大腿部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。大腿部を切開し、大腿骨を無菌的に摘出した後、両端を切除して骨幹部を採取した。注射針をつけた注射筒にＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を１０〜１５ｍｌ入れて、骨髄をフラッシュアウトした。この骨髄液をＴ−７５フラスコ（ベクトンディキンソン社）に播種し、最終培養液量を３０ｍｌとした。この骨髄液を３７℃で、１週間培養した。培地として、ＭＥＭ分化因子産生培地を用いた。培養液は２回／週、半量を交換した。１週間後に底面に接着した細胞を未分化間葉系細胞とした。この細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、インビトロゲン社、カタログ番号１４１９０（Ｄ−ＰＢＳ）で洗浄後、０．０５％トリプシン液（インビトロゲン社）で剥離し、遠心（１７０×ｇ、３分間）により回収洗浄して、使用した。
（Ｉ．肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子の直接添加）
本実施例において調製した骨髄由来未分化間葉系幹細胞（１×１０−５／ｍｌ／ｗｅｌｌ）をウェルに播種し、ＭＥＭ増殖培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）で一晩（１８時間）培養した。培養後、因子を含むＭＥＭ分化因子産生培地（最小必須培地（ＭＥＭ培地）および１５％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、デキサメサゾン１０ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）または因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を１ｍｌウェルに添加し、さらに７２時間培養した。その後、骨芽細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ活性を測定した。アルカリホスファターゼ活性の測定は実施例１と同様の方法を用いた。その結果を以下の表に示す。
【表１３】
2008156221.tif 000023
因子（＋）：因子を含むＭＥＭ分化因子産生培地を添加した群
因子（−）：因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を添加した群
肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子は、初代ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させることが確認された。
（ＩＩ．肥大化能を有する軟骨細胞の産生する骨芽細胞分化誘導因子をヒドロキシアパタイトに含浸させた後に添加）
（ヒドロキシアパタイトの調製）
ヒドロキシアパタイトとして、アパセラムＡＸ（ＨＯＹＡ社製、人工骨ＡＢ−０１、ＧＡ−３を用いた。アパセラムＡＸが浸漬する量の希釈液（例えば、該アパタイト顆粒１０粒に対して希釈液１ｍｌ）とアパセラムＡＸとを、注射筒に入れて引くことにより、脱気した。この際、約０．３ｍｌの希釈液がヒドロキシアパタイトに付着した。
本実施例において調製した骨髄由来未分化間葉系幹細胞（１×１０−５／ｍｌ／ｗｅｌｌ）をウェルに播種し、ＭＥＭ増殖培地で一晩（１８時間）培養した。次に、因子を含むＭＥＭ分化因子産生培地または因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を含浸させたアパセラムＡＸを、本実施例において培養した細胞の入ったウェルに添加し、さらに７２時間培養した。その後、骨芽細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼの活性を測定した。アルカリホスファターゼ活性の測定は実施例１と同様の方法を用いた。その結果を以下の表に示す。
【表１４】
2008156221.tif 000024
因子（＋）：因子を含む分化因子産生培地を含浸させたアパセラムＡＸを添加した群
因子（−）：因子を含まない分化因子産生培地（分化因子産生培地そのもの）を含浸させたアパセラムＡＸを添加した群
肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子は、初代ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させることが確認された。
（実施例１９．骨芽細胞分化誘導因子と生体適合性を有する足場とを用いる複合材料を骨欠損部位に移植した場合の効果）
（複合材料の作製）
実施例１と同様の方法を用いて、４週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）および８週齢雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）から肥大化能を有する細胞を得た。この肥大化能を有する軟骨細胞を、分化因子産生培地で培養し、その培養上清を得た。この培養上清を５０Ｋ膜（ミリポア社製、アミコンウルトラ１５、５０，０００ＮＭＷＬ、カタログ番号ＵＦＣ９０５０２４）を用いて、４０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心分離し、分子量５０，０００以下の成分を除去すると共に分子量５０，０００以上の成分を１０倍濃縮した。
この濃縮液を凍結させ、遠心乾燥させ、電動式粉砕装置（クライオプレスＣＰ−１００Ｗ、マイクロテックニチオン社）で粉砕した。この粉砕乾燥物３０ｍｇを採取し、足場に複合化した。
０．８ｍｌコラーゲン液（セルマトリックス、コラーゲンゲル培養キット、新田ゼラチン社、大阪）、０．１ｍｌ再構成用緩衝液（２６０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＯＨ）に対して、３０ｍｇの凍結乾燥物を混合し（最終約１ｍｌ）、２４穴培養プレート内のセルカルチャーインサート（ＰＥＴ膜、０．４ｕｍポアサイズ、Ｆａｌｃｏｎ、ベクトンディキンス社、Ａｕｃｋｌａｎｄ，ＮＺ）に３分して入れ、固化させた。次いで、下部にＭＥＭ増殖培地（インビトロジェン社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ）を満たした後、一晩３７℃で保存した。
翌日、１２週齢の雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）（日本医科学動物資材研究所、東京）に麻酔をし、無菌的に大腿骨の皮膚を切開し、軟部組織をそらせて、大腿骨の骨欠損作製部位を露出させた。このラットの大腿骨（遠位の外側上果に近い骨幹部）に、トレフィンバール（ミクロ精工社、東京）で、直径３．０もしくは２．５ｍｍの骨欠損を作製した。
（骨欠損部位への移植）
上記のようにして作製した骨欠損部位に、凍結乾燥物とコラーゲンゲルとの混合物を埋入した。反対側の大腿骨の外側上果に近い骨幹部には、同じサイズの骨欠損を作成し、コラーゲンゲルのみを（凍結乾燥物の代りに０．１ｍｌＭＥＭ液を使用して、一晩３７℃で保存したものを）埋入した。
（マイクロＣＴ撮影）
マイクロＣＴ機器は、東陽テクニカ社製ＳＫＹＳＣＡＮ１１７２高分解能Ｘ線マイクロＣＴスキャナを使用した。１００ＫＶで０．４度ずつ回転させて各レントゲンを撮影し、添付ソフトＮＲｅｃｏｎにより再構成し、三次元ボリュームレンダリングソフトＶＧＳｔｕｄｉｏ  Ｍａｘ（日本ビジュアルサイエンス株式会社）により三次元画像を得た（図４１〜４２）。
（形態学的観察）
ＨＥ染色：薄切、脱パラした切片を、ヘマトキシリン液に５−１０分浸漬、水洗、色出し後、エオジン液で３−５分浸漬。
（比較例）
反対側の大腿骨の外側上果に近い骨幹部には、同じサイズの骨欠損を作製し、コラーゲンゲルのみを（凍結乾燥物の代りに０．１ｍｌＭＥＭ増殖培地を使用して、一晩３７℃で保存したものを）埋入した。
実施例１９と同様の方法を使用して、マイクロＣＴの測定および形態学的観察を行った。
（結果）
結果を以下の表１５に示す。骨欠損の直径３．０ｍｍおよび２．５ｍｍのどちらにおいても、コラーゲンのみを移植した群と比べて、因子とコラーゲンゲルとを用いる複合材料を移植した群おいて新生骨の比率が高かった。
【表１５】
2008156221.tif 000025
サンプル：５回の試行を行った。サンプル１〜２は、直径３．０の骨欠損を作製した群であり、サンプル３および４は、直径２．５ｍｍの骨欠損を作製した群を示す。
ＮＯ．は各試行時のラットの番号を示す。試行１〜試行４はｎ＝３。
Ｃｏｌ：同一ラットの左右の大腿骨に骨欠損を作製し、いずれか一方にＣｏｌ（コラーゲンのみを移植）した。
ＧＣ：同一ラットの左右の大腿骨に骨欠損を作製し、いずれか一方にＧＣ（因子とコラーゲンを移植）した。
ＲＯＩ体積：解析した部分の体積。
（実施例２０Ａ．ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導に対する因子の効果）
（ラット由来の肥大化能を有する軟骨細胞による因子の検出）
本実施例では、実施例１と同様の方法を使用して、ラット肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子を調製した。
（ラット骨髄由来未分化間葉系幹細胞の採取）
実施例１８と同様の方法を使用して、ラット大腿骨の骨髄より細胞を採取し、１週間培養した。２．５×１０−４個／ｍｌの上記細胞液、１ｍｌを２４穴プレートに播種し、ＭＥＭ増殖培地で培養し、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞を調製した。
（試料の添加およびアルカリホスファターゼ活性の測定）
上記初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞のＭＥＭ増殖培地での培養開始から１８時間後に、下記試料液（各１ｍｌ）を初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞に添加した。さらに、７２時間培養し、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
（添加した試料）
（１）肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地で培養した上清；因子を含む分化因子産生培地
（２）ＭＥＭ分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地；Ｍａｎｉａｔｏｐｏｏｒｕｓの骨芽細胞分化培地
（３）ＭＥＭ増殖培地のみ；因子もデキサメサゾンも含まないＭＥＭ増殖培地
その結果を以下の表に示す。
誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加すると、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞は、因子もデキサメサゾンも含まないＭＥＭ増殖培地を添加したものと比べて２倍以上もアルカリホスファターゼ活性を上昇させた。他方、デキサメサゾンを含むが誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない分化因子産生培地のみを添加しても初代ラット骨髄細胞由来間葉系幹細胞はアルカリホスファターゼ活性を上昇させるが、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加したものとくらべるとわずかなものであった。図８等の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清には従来型の低分子量の成分（デキサメサゾンを含む）は含まれていないと考えられ、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清の効果は、誘導骨芽細胞分化誘導因子自体の効果であると考えられることから、本実施例の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、従来型骨芽細胞分化誘導成分であるデキサメサゾンよりも骨芽細胞への分化誘導能力が高いと考えられる。
【表１６】
2008156221.tif 000026
（実施例２０Ｂ：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した上清が、ラット初代骨髄由来未分化間葉系幹細胞に与える影響）
本比較例では、比較例１Ａと同様の方法を用いて、ラット由来肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地中で培養した培地の上清を回収した。
実施例１８と同様の方法を用いて、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞を調製した。
（試料の添加およびアルカリホスファターゼ活性の測定）
上記初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞のＭＥＭ増殖培地での培養開始から１８時間後に、下記試料液（各１ｍｌ）を初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞に添加した。さらに、７２時間培養し、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
（添加した試料）
ＧＣ／分化：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した上清
ＧＣ／増殖：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した上清
増殖：添加した試料液が、ＭＥＭ増殖培地
結果を以下の表に示す。
肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した上清には、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させる因子が存在するが、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した上清には、初代ラット骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させる因子は存在しないことが確認された。
【表１７】
2008156221.tif 000027
ＨＡＭ分化因子産生培地で培養したラット由来肥大化能を有する軟骨細胞が、ラット初代骨髄由来間葉系幹細胞に与える影響についても、本実施例と同様の方法を用いることにより、確認することができる。
（実施例２１Ａ．ヒト未分化間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導に対する因子の効果）
（ラット由来の肥大化能を有する軟骨細胞による因子の検出）
本実施例では、実施例１と同様の方法を使用して、ラット肋骨・肋軟骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した場合に産生する細胞機能調節因子を調製した。
（ヒト間葉系幹細胞の調製）
ヒト間葉系幹細胞株（ｈＭＳＣ：ＰＴ−２５０１）をＣａｍｂｒｅｘ社から購入し、１週間培養した。２．５×１０−４個／ｍｌの上記細胞液、１ｍｌを２４穴プレートに播種し、ＭＳＣＧＭ培地（増殖培地）で培養した。
（試料の添加およびアルカリホスファターゼ活性の測定）
上記ヒト間葉系幹細胞のＭＳＣＧＭ培地（増殖培地）での培養開始から１８時間後に、下記試料液（各１ｍｌ）をヒト間葉系幹細胞に添加した。さらに、７２時間培養し、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
（添加した試料）
（１）肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地で培養した上清；因子を含む分化因子産生培地
（２）ＭＥＭ分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地；Ｍａｎｉａｔｏｐｏｏｒｕｓの骨芽細胞分化培地
（３）ＭＥＭ増殖培地のみ；因子もデキサメサゾンも含まないＭＥＭ増殖培地
その結果を以下の表に示す。
誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加すると、ヒト葉系幹細胞は、因子もデキサメサゾンも含まないＭＥＭ増殖培地を添加したものと比べて５倍以上もアルカリホスファターゼ活性を上昇させた。他方、デキサメサゾンを含むが誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない分化因子産生培地のみを添加してもヒト間葉系幹細胞はアルカリホスファターゼ活性を上昇させるが、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加したものとくらべるとわずかなものであった。図８等の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清には従来型の低分子量の成分（デキサメサゾンを含む）は含まれていないと考えられ、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清の効果は、誘導骨芽細胞分化誘導因子自体の効果であると考えられることから、本実施例の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、従来型骨芽細胞分化誘導成分であるデキサメサゾンよりも骨芽細胞への分化誘導能力が高いと考えられる。
【表１８】
2008156221.tif 000028
（アルカリホスファターゼ染色）
上記ヒト間葉系幹細胞のＭＳＣＧＭ培地（増殖培地）での培養開始から１８時間後に、下記試料液（各１ｍｌ）をヒト間葉系幹細胞に添加した。さらに、７２時間培養し、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ染色をした。
（添加した試料）
（１）肥大化能を有する軟骨細胞を分化因子産生培地で培養した上清；因子を含む分化因子産生培地
（２）ＭＥＭ分化因子産生培地のみ；本発明による因子を含まないが、デキサメサゾンを含む培地；Ｍａｎｉａｔｏｐｏｏｒｕｓの骨芽細胞分化培地
（３）ＭＥＭ増殖培地のみ；因子もデキサメサゾンも含まないＭＥＭ増殖培地
その結果を図３９に示す。
誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加すると、ヒト間葉系幹細胞は、因子もデキサメサゾンも含まないＭＥＭ増殖培地を添加したものと比べてアルカリホスファターゼが強く発現した。他方、デキサメサゾンを含むが誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない分化因子産生培地のみを添加してもヒト間葉系幹細胞はアルカリホスファターゼを発現するが、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加したものとくらべるとわずかなものであった。図８等の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清には従来型の低分子量の成分（デキサメサゾンを含む）は含まれていないと考えられ、誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清の効果は、誘導骨芽細胞分化誘導因子自体の効果であると考えられることから、本実施例の結果から、誘導骨芽細胞分化誘導因子は、従来型骨芽細胞分化誘導成分であるデキサメサゾンよりも骨芽細胞への分化誘導能力が高いと考えられる。
（実施例２１Ｂ：肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した上清が、ヒト未分化間葉系幹細胞に与える影響）
本比較例では、比較例１Ａと同様の方法を用いて、ラット由来肥大化能を有する軟骨細胞を、ＭＥＭ増殖培地中で培養した培地の上清を回収した。
ヒト未分化間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ：ＰＴ−２５０１）をＣａｍｂｒｅｘ社から購入し、実施例２１Ａと同様の方法を用いてＭＳＣＧＭ培地（増殖培地）中で培養した。
（試料の添加およびアルカリホスファターゼ活性の測定）
上記ヒト間葉系幹細胞のＭＳＣＧＭ培地（増殖培地）での培養開始から１８時間後に、下記試料液（各１ｍｌ）をヒト間葉系幹細胞に添加した。さらに、７２時間培養し、実施例１と同様の方法によりアルカリホスファターゼ活性を測定した。
（添加した試料）
ＧＣ／分化：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した上清
ＧＣ／増殖：添加した試料液が、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した上清
増殖：添加した試料液が、ＭＥＭ増殖培地
結果を以下に示す。
肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ分化因子産生培地で培養した上清には、ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させる因子が存在するが、肥大化能を有する軟骨細胞をＭＥＭ増殖培地で培養した上清には、ヒト間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼ活性を上昇させる因子は存在しないことが確認された。
【表１９】
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ＨＡＭ分化因子産生培地で培養したラット由来肥大化能を有する軟骨細胞が、ヒト間葉系幹細胞に与える影響についても、本実施例と同様の方法を用いることにより、確認することができる。
（実施例２２．ラット骨髄由来未分化細胞に対する誘導骨芽細胞分化誘導因子の影響）
（肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子の調製）
実施例１〜３（ラット）、４〜５（ヒト）、７（ラット）、９（マウス）、１０（ウサギ）と同様の方法により誘導骨芽細胞分化誘導因子を調製する。
（ラット骨髄由来未分化細胞の調製）
ラット大腿骨を採取し、軟部組織を取り除いた後、両骨端部を切離する。培地を注射筒に取り、大腿骨の両端から骨髄内に注射針を通して、骨髄を培地で流し出す。培地は、１５％ＦＢＳを含むＭＥＭを用いる。
得られた細胞混液をピペッティングした後、Ｔ−７５フラスコに播種し（大腿骨１本をＴ−７５フラスコ１個）、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで培養する。培地交換は週３回、半量ずつ交換する。培養から７〜１０日後に、接着した細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡではがす。
本実施例において調製した誘導骨芽細胞分化誘導因子を、ラット骨髄由来未分化細胞の培養物にそれぞれ添加し、さらに培養する。その後、実施例１と同様の方法を用いて、誘導骨芽細胞分化誘導因子の、ラット骨髄由来未分化細胞を誘導骨芽細胞に誘導する能力について評価する。
従来法により骨髄由来未分化幹細胞から誘導させた骨芽細胞を用いた。具体的には、Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８に記載される方法に従ってラット大腿骨髄から未分化幹細胞を採取し、この未分化幹細胞を遠心分離（１７０〜２００×ｇで３〜５分間）することによりペレットにして、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター中で２週間、Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓによって提案された培地（本明細書において分化因子産生培地ともいう。）で培養したもの（Ｂｐ）を用いた。
実施例１と同様の方法を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行い、リアルタイムＰＣＲ機器（ＡＢＩ社、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）にて各細胞マーカーの発現量の測定を行った。ＰＣＲ反応後、しきい値の設定および到達サイクルの算出を、機器（ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）内蔵の解析ソフトにより実施した。各細胞マーカーの値を、ＧＡＰＤＨの値で除して発現量の平均値を算出した。その結果、肥大化能を有さない軟骨細胞はＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンを発現するが、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンはいずれも発現しなかった（比較例１Ｂ、表ＩＩ）。
他方、従来法により骨髄由来未分化幹細胞から誘導させた骨芽細胞では、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンは発現するが、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンはいずれも発現しなかった（表ＩＩＩ）。
【表ＩＩＩ】
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Ｂｐ：大腿骨髄から採取した未分化幹細胞のペレットを、骨芽細胞分化培地で培養したもの
（比較例２２Ａ．誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響）
誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清のかわりに、肥大化能を有する軟骨細胞を増殖培地で培養した上清（誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）を培地に添加すること以外、実施例２２と同様の方法を用いる。ラット骨髄由来未分化細胞の培養物に添加し、さらに培養する。その後、実施例１と同様の方法を用いて、肥大化能を有する軟骨細胞を増殖培地で培養した上清（誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響について評価する。
（比較例２２Ｂ．誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響）
比較例１Ｂ（ラット）、１Ｄ（ラット）、３Ｂ（ラット）、４Ｂ（ヒト）、５Ｂ（ヒト）、９Ｂ（マウス）および１０Ｂ（ウサギ）により調製された肥大化能を有さない軟骨細胞を用いる。これらの細胞を分化因子産生培地で培養した上清（誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）を、ラット骨髄由来未分化細胞の培養物に添加し、さらに培養する。その後、実施例１と同様の方法を用いて、肥大化能を有さない軟骨細胞を分化因子産生培地で培養した上清（誘導骨芽細胞分化誘導因子を含まない上清）がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響について評価する。
（比較例２２Ｃ．分化因子産生培地および増殖培地がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響）
誘導骨芽細胞分化誘導因子を含む上清を添加していない、分化因子産生培地のみおよび増殖培地のみを添加した培地を用いて、ラット骨髄由来未分化細胞を培養する。その後、実施例１と同様の方法を用いて、分化因子産生培地および増殖培地がラット骨髄由来未分化細胞に与える影響について評価する。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発することができる、肥大化能を有する軟骨細胞の産生する誘導骨芽細胞分化誘導因子と足場とを含む複合材料ならびにその製造法およびその利用法が提供することにより、周辺に骨がない部位にまで骨形成を導くことができるようになった。このような複合材料は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。
【図２】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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