(57)【要約】  本発明は、テアフラビンを選択的に、大量に、高収率に、簡単に、安価に製造する方法を提供する。本発明は、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを含有する加工した植物の抽出物とペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養物を混合して選択的にテアフラビンを製造する、テアフラビンの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを含有する加工した植物の抽出物と、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養物を混合して選択的にテアフラビンを製造する、テアフラビンの製造方法。
【請求項２】
植物が、茶の葉および／または茎である、請求項１に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項３】
加工した植物が、不発酵茶である、請求項１に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項４】
植物細胞培養物が、茶細胞の培養物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項５】
さらに、過酸化水素を加えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項６】
さらに、エピカテキンを加えることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のテアフラビンの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のテアフラビン製造方法のための、培養植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テアフラビン（Theaflavin、ＴＦ）を選択的に製造する方法に関する。詳しくは、本発明は、植物抽出物中のエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養液の存在下に反応させて、選択的にテアフラビンを高率で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアフラビンは、もともと紅茶の赤色色素として知られた化合物であるが、近年あらたに、抗酸化作用、血糖降下作用、抗菌作用などさまざまな生理作用をも有することが知られるようになり、天然着色料としてだけではなく、生理活性物質としての有用性も注目され、その研究の展開が期待されている。【０００３】
テアフラビンには、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（Theaflavin-3-O-gallate、TF3-G）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（Theaflavin-3'-O-gallate、TF3'-G）、及びテアフラビン３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（Theaflavin-3,3'-di-O-gallate、TFDG）の３つのガロイルエステル体が存在する。これらの化学構造を以下の化学式ａ〜ｄに示す。【０００４】
【化１】
2009008503.tif 000002
【０００５】
紅茶中に含まれる上記４つの化合物のおよその比率は、ＴＦ；０．０８重量％、ＴＦ３−Ｇ；０．３重量％、ＴＦ３’−Ｇ；０．２重量％、ＴＦＤＧ；０．４重量％である。【０００６】
テアフラビンは、紅茶の製造工程中で茶葉中の酵素により生成されることが知られており、紅茶からの抽出操作によって取得するのが一般的であった。しかし、紅茶中の含有量は極めて少なく、例えば紅茶中には全量でも約０．０８重量％しか含まれていない。よって、紅茶葉からの抽出のみで十分に利用できるほどの量を得ることは容易ではなかった。【０００７】
テアフラビンの生合成経路は、以下の化学反応式（Ｉ）及び（ＩＩ）に示す通りエピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）とから生合成される（非特許文献１）。【０００８】
【化２】
2009008503.tif 000003
【０００９】
まず、エピカテキン（ＥＣ）がポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼによって酸化されてＥＣ−ｑｕｉｎｏｎｅとなり、次いでＥＣ−ｑｕｉｎｏｎｅはエピガロカテキン（ＥＧＣ）を酸化してＥＧＣ−ｑｕｉｎｏｎｅを生成させる。これらの酸化過程で得られたＥＧＣ−ｑｕｉｎｏｎｅのＥＣ−ｑｕｉｎｏｎｅへのマイケル付加、及びつづくカルボニル付加により、３員環中間体を生成し、続いて酸化、脱炭酸を経てトロボノイド骨格を形成し、テアフラビンが生成される。【００１０】
同様に、ＴＦ３−Ｇは、以下に示すとおりエピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）とから生合成される。【００１１】
【化３】
2009008503.tif 000004
【００１２】
同様に、ＴＦ３’−Ｇは、以下に示すとおりエピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）とから生合成される。【００１３】
【化４】
2009008503.tif 000005
【００１４】
同様に、ＴＦＤＧは、以下に示すとおりエピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）とエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）とから生合成される。【００１５】
【化５】
2009008503.tif 000006
【００１６】
エピカテキンとエピガロカテキンとの酸化反応によるテアフラビンの製造に関して、特許文献１は、緑茶抽出液にポリフェノール酸化酵素を含有する植物抽出液（各種植物の果実、未熟果実、葉、根茎、根、子実体、種子および芽の水抽出液）を混合して、テアフラビンおよび３つのガロイルエステル体を製造する方法を開示している。しかしながら、特許文献１の方法では、テアフラビンとその３つのガロイルエステル体が得られ、本発明のようにテアフラビンのみが選択的には得られていない。【００１７】
また、特許文献２は、緑茶（グリーンリーフティー）のスラリーをタンナーゼで処理した後、当該スラリーを発酵させテアフラビンを豊富に含む茶抽出物の製造方法を開示している。【００１８】
特許文献２の方法は、ガロイルエステル体（ＴＦ３−Ｇ、ＴＦ３’−Ｇ、ＴＦＤＧ）の生成を防ぐために、はじめにエピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）とエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）をタンナーゼにより、それぞれエピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）に変換し、次いで、ドール（液体に浸して柔らかくされ、しおれた緑茶葉）のスラリーに空気または酸素を拭き込んで発酵を行い、エピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）からテアフラビンを豊富に含む茶抽出物を製造するものである。【００１９】
しかしながら、特許文献２の方法は、タンナーゼにより、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）とエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）がエピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）に変換される前に、発酵により、テアフラビンのガロイルエステル体が製造されることを防ぐために、タンナーゼによる反応を窒素下で行う必要があった。また、ＴＦの生合成は１モルのＥＧＣと１モルのＥＣの反応であるけれども、酸化速度が異なるためＥＧＣ：ＥＣのモル比が３：１である緑茶を使うことが好ましいなどの制約もあった。また、タンナーゼの添加は、テアフラビン製造のコストを引き上げる要因となっていた。【００２０】
また、本発明者は、先に茶培養細胞が高いペルオキシダーゼ活性を有することを報告し、各種医薬品製造への応用を研究してきた（非特許文献２）。そして、この高いペルオキシダーゼ活性を有する茶培養細胞に代表される植物培養細胞と、エピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）を用いたテアフラビンの製造方法を開示している（特許文献３）。しかしながら、エピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）は高価なためこれらの利用は、テアフラビン製造のコストを引き上げる要因となっている。【００２１】
そのため、工業的大量生産にも適した、安価に、大量に、しかも簡単にテアフラビンを製造する方法の開発が求められている。【００２２】
【特許文献１】特開２００２−９５４１５
【特許文献２】特開平１１−２２５６７２
【特許文献３】特開２００７−１４３４６１
【非特許文献１】Takahashi Tanaka, Chie Mine, Kyoko Inoue, Miyuki Matsuda and Isao kouno, J. Agric. Food Chem. 2002, 50. 2142-2148.
【非特許文献２】Masumi Takemoto, Youichi Aoshima, Nikolay Stoynov and James Peter Kutney, Tetrahedron Letters, 43, 6915-6917, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、テアフラビンを選択的に、大量に、高収率に、簡単に、安価に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者は、上述した課題に鑑み鋭意検討した結果、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを含有する加工した植物の抽出物と、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養物を混合させたとき、テアフラビンが選択的に製造されることを見いだした。さらに、前記植物抽出物にエピカテキンを補充するだけでテアフラビンの選択的製造が高収率になることを見いだした。【００２５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）に示すテアフラビンの製造方法を提供する。
（１）エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを含有する加工した植物の抽出物と、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞培養物を混合して選択的にテアフラビンを製造する、テアフラビンの製造方法。
（２）植物が、茶の葉および／または茎である、上記（１）記載のテアフラビンの製造方法。
（３）加工した植物の抽出物が、不発酵茶の抽出物である、上記（１）記載のテアフラビンの製造方法。
（４）植物細胞培養物が、茶細胞の培養物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のテアフラビンの製造方法。
（５）さらに、過酸化水素を加えることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のテアフラビンの製造方法。
（６）さらに、エピカテキンを加えることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のテアフラビンの製造方法。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載のテアフラビンの製造方法のための、培養植物細胞。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、エピカテキンとエピガロカテキン以外に、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートが存在している場合においても、植物細胞培養物を使うことによりタンナーゼの添加や窒素下での処理を行うことなく、酸素の存在下で、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを原料としてＴＦのみを短時間に選択的に製造することができる。そのため、テアフラビン製造の材料として、番茶のような安価な材料を用いることができ、高価なタンナーゼの添加や煩雑な窒素下での処理も不要であり、選択的にテアフラビンを製造できるので、安価にテアフラビンを製造することができる。【００２７】
さらに、エピカテキンを補充するだけでテアフラビンの製造量を上げることができるので、効率よく大量のテアフラビンを安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１における反応開始時（０分）の反応液のＨＰＬＣ分析である。ＨＰＬＣ分析条件は、実施例１に記載のとおりである。分析試料として、反応開始時（０分）の反応液の一部を直接ＨＰＬＣ分析に用いた。番茶の２４時間水抽出の間に、一部のＥＣＧおよびＥＧＣＧから加水分解により生じた没食子酸が認められる。
【図２】実施例１における反応開始後３５６分における反応液のＨＰＬＣ分析である。ＨＰＬＣ分析条件は、実施例１に記載のとおりである。分析試料として、反応開始後３５６分の反応液の一部を直接ＨＰＬＣ分析に用いた。
【図３】実施例２における反応開始後９分における反応液のＨＰＬＣ分析である。ＨＰＬＣ分析条件は、実施例１に記載のとおりである。分析試料として、反応開始後９分の反応液の一部を直接ＨＰＬＣ分析に用いた。ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣＧのピークはほとんど認められないが、ＴＦのピークが認められる。
【図４】実施例２における反応開始後２８分における反応液のＨＰＬＣ分析である。ＨＰＬＣ分析条件は、実施例１に記載のとおりである。分析試料には、反応開始後２８分の反応液を酢酸エチルで抽出した抽出液を用いた。テアナフトキノンのピークが認められると供に、テアフラビンのピークの減少が認められる。
【図５】実施例５における反応開始後５分の反応液のＨＰＬＣ分析である。分析試料として、反応開始後５分の反応液の一部を直接ＨＰＬＣ分析に用いた。
【図６】実施例５における反応終了後（１２分）の反応液の酢酸エチル抽出物のＨＰＬＣ分析である。分析試料には、反応終了後（１２分）の反応液を酢酸エチルで抽出した抽出液を用いた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
本発明で用いられる、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートとは、以下に示す化合物を意味する。【００３０】
【化６】
2009008503.tif 000007
【００３１】
本発明で用いられる植物は、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを含むものであれば、植物の種類は限定されないし、また、植物は、植物全体であっても各部位（実生、葉、子葉、茎、果実など）であってもよい。好ましい植物の種類は、茶（Camellia sinensis、Camellia assamica）である。好ましい植物の部位は、実生、葉、子葉、茎、果実、より好ましくは、葉、子葉、茎、特に好ましくは、葉、茎である。【００３２】
加工した植物とは、植物中の酸化酵素を失活させるために、植物に加熱などの処理を施したものを意味し、限定されないが、好ましくは、熱処理を施した茶、より好ましくは飲料のために用いられる不発酵茶などの茶の加工物が挙げられる。
ここで、処理は、植物中の酸化酵素を失活させることができる処理であれば、方法や条件は限定されないが、蒸すおよび／または炒る等が好ましい。
ここで、酸化酵素とは、ＥＣとＥＧＣからＴＦを、ＥＣとＥＧＣＧからＴＦ３−Ｇを、ＥＣＧとＥＧＣからＴＦ３’−Ｇを、ＥＣＧとＥＧＣＧからＴＦＤＧを合成する酵素を意味し、限定されないが、好ましくはポリフェノールオキシダーゼおよび／ポリフェノールオキシダーゼ又はペルオキシダーゼを意味する。【００３３】
不発酵茶とは、茶葉や茎などに蒸すおよび／または炒る等の熱処理を施し、茶中の酸化酵素を失活させた、茶葉や茎などを意味し、例えば、緑茶などが挙げられる。緑茶には、限定されないが、例えば、茶葉や茎などに蒸す等の熱処理を施し、茶中の酸化酵素を失活させて作る、日本で飲料用に供される日本緑茶と、茶葉や茎などに炒る等の熱処理を施して茶中の酸化酵素を失活させて作る、中国で飲料用に供される中国緑茶などがある。日本緑茶には、さらに茶原料（栽培方法、葉、茎）、製法の違いにより煎茶、かぶせ茶、玉露、抹茶、ヨンコン茶、番茶、焙じ茶などが挙げられる。エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートには、カテキン、ガロカテキン、カテキン−３−Ｏ−ガレートおよびガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（これらを異性化体とよぶ）が存在することが知られている。テアフラビンの選択的製造のためには、これら異性化体を含まないことが好ましい。本発明に用いる好ましい緑茶は、中国緑茶、日本緑茶である。より好ましいのは、日本緑茶の煎茶や番茶である。番茶は、異性化体の含有率が低く、価格も安いことから特に好ましい緑茶である。【００３４】
煎茶とは、日本で４月下旬〜５月上旬に摘み取られる茶の葉（１年のうちで最初の新芽または若葉のことを指し１番茶葉という）と、摘み取られた後に成長してくる茶の葉（新芽または若葉のことを指し２番茶葉という）のみを原料とした茶の加工物をいう。番茶とは、１番茶葉や２番茶葉以外の茶葉や茎などを原料とした茶の加工物を意味するが、１番茶葉や２番茶葉が原料に含まれていても良い。したがって、本発明で用いる茶の葉および／または茎とは、好ましくは煎茶や番茶の原料として用いられる茶の葉および／または茎を意味する。
例えば、日本で煎茶と呼ばれる緑茶は、摘み取った１番茶葉と２番茶葉のみを、茶葉中の酸化酵素が失活するまで蒸し、次いで茶葉を冷やし、茶葉を揉み、茶葉を乾燥させて作られる。日本で番茶と呼ばれる緑茶は、煎茶と同様な手順で製造されるが、原料に１番茶葉と２番茶葉以外の茶葉や茎なども用いるので、酸化酵素を失活させるための蒸しが煎茶のそれより強くなる（蒸し時間が長くなる）。なお、酸化酵素を失活させるための蒸し時間は、使用する茶の質（すなわち、新芽、若葉、成長した葉や茎）や量によって左右されるので、特に限定されない。
本発明には、煎茶や番茶と等価な緑茶も含まれる。また、本発明には、中国緑茶と等価な緑茶も含まれる。【００３５】
本発明で用いられる植物の抽出物とは、植物を水性溶媒、有機溶媒またはそれらの混合溶媒を用いて抽出したものを意味する。したがって、加工した植物の抽出物とは、加工した植物を水性溶媒、有機溶媒またはそれらの混合溶媒を用いて抽出したものを意味する。【００３６】
抽出に用いる水性溶媒は、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを植物から抽出できる水を含む溶媒であれば限定されないが、好ましくは、水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等である。より好ましくは、水である。【００３７】
抽出に用いる有機溶媒は、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを抽出でき、有機溶媒であれば限定されないが、好ましくは、酢酸エチル；メタノール、エタノールなどのアルコール；アセトン；ジエチルエーテルなどのエーテルである。より好ましくは酢酸エチル；メタノール、エタノールなどのアルコール；アセトンである。【００３８】
抽出方法は、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートが溶媒中に溶出される方法であれば、いずれの方法でもよく、温度、時間等の条件も限定されない。【００３９】
本発明で用いられる、植物細胞培養物とは、植物成体から人工的に誘導される不均一な未分化増殖性細胞塊（カルス）を液体培養に移し、安定に且つ迅速に増殖する培養細胞の培養懸濁物（細胞及び／又は培養液）としたものである。
本発明で用いる植物細胞培養物は、植物培養細胞を継体して用いるため、反応にいつでも供給することができて機動性に優れており、しかも安価であるという利点を有する。【００４０】
一般に、植物細胞には、ペルオキシダーゼが含まれており、ペルオキシダーゼ活性を有する植物細胞であればいずれも本発明の植物細胞培養物のための植物として使用することができるが、本発明で用いる植物細胞培養物において好ましい植物としては、タバコ（N. tabacum）、にんじん（D. carota）、日日草（C. roseus）、茶（Camellia sinensis、 Camellia assamica）、ポドフィルム（P. peltatum）などが挙げられる。その他に、ダイコン、キュウリ、ナス、ワサビ、大豆などを用いることもできる。【００４１】
これらのうち、特にペルオキシダーゼ活性が高く本発明の方法に適しているのは茶（Camellia sinensis、Camellia assamica）由来の細胞である。さらに、茶の品種としては、やぶきた、おくひかり、山の息吹、さやまかおり、かなやみどり、するがわせなどがあり、品種によってペルオキシダーゼ活性が異なる。これらは、日本で飲料用のために栽培されている品種であり、市場より入手できる。特に好ましいのは、やぶきた子葉、さやまかおり子葉、するがわせ茎などである。【００４２】
植物細胞培養物のための植物細胞は、各部位の組織（実生、葉、子葉、茎、根など）を使用できる。好ましくは、実生、葉、子葉、茎、より好ましくは実生、子葉である。【００４３】
本発明で用いられる植物細胞培養物は、上記植物細胞の生組織を含む切片を用いて、従来から知られる一般的なカルス作成方法に基づいてカルスを誘導し、それを培地に移植して培養することにより、調製される。本発明の細胞培養物としては、固体培地でカルスを培養して得られる細胞培養物、及び液体培地を用いて得られる培養細胞の培養懸濁物のいずれも使用可能である。【００４４】
切片の培養は、まず、切片を滅菌処理しこれを寒天培地などの固体培地上で培養してカルスを誘導させる。誘導されたカルスを同様の固体培地上又は液体培地内で十分に増殖させる。切片の滅菌は、エタノール表面殺菌、次亜塩素酸塩による処理、滅菌した蒸留イオン交換水による洗浄などにより行う。【００４５】
培地は、ムラシゲ・スクーグ（Murashige-Skoog；ＭＳ）培地、またはガンボルグＢ５（Gamborg's B5；Ｂ５）培地、ニッチ・ニッチ（Nitch+Nitch）などのような無機塩、ビタミン類を含有する基礎培地に、炭素源としてショ糖、マルトース、グルコースなどの糖類、窒素源として硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、その他カザミノ酸、アミノ酸、ペプトン、酵母菌体、イーストエキストラクト、麦芽エキストラクト等を添加する。【００４６】
また、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、サイアミン、葉酸、ビオチン等のビタミン類、イノシトール、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸、サイクリックＡＭＰ等、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、ヨウ素、カリウム、コバルト、マグネシウム、モリブデン、リン、銅等のミネラルも添加することができる。【００４７】
上記基礎培地には、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、ベンジルアデニン、カイネチンなどの植物ホルモンが適宜使用される。植物ホルモンとして特に好ましいものは、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）である。
さらに、必要に応じて寒天などを添加して構成したものを用いることもできる。【００４８】
培養条件は、用いる培地や添加物の種類等に応じて適宜決定されるが、暗条件下で、好ましくは１５〜４０℃程度、より好ましくは２５〜２７℃程度で約１０〜１４日間程度実施するのが好ましい。この場合、寒天が添加された固体培地を用いて静置状態で培養することも可能であるが、培養細胞が均一になるようにするために、液体培地を用いて５０〜１７０rpm程度、より好ましくは１００〜１１０rpm程度の回転数で振とうしながら培養し、培養細胞の培養懸濁物とするのが望ましい。【００４９】
また、植物ホルモンや炭素源などの添加物の便用量も、用いる培地や培養条件等に応じて適宜決定されるが、植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）を用いる場合の濃度は、好ましくは０．０５〜２０mg／Ｌ、より好ましくは０．２〜１０mg／Ｌである。２，４Ｄの濃度が低すぎるとぺルオキシダーゼ活性が低下する傾向にある。【００５０】
炭素源としてショ糖を使用する場合のショ糖濃度は、好ましくは１０，０００〜１３０，０００mg／Ｌ、より好ましくは３０，０００〜７０，０００mg／Ｌである。ショ糖の濃度が低すぎるとペルオキシダーゼ活性が低下する傾向にある。【００５１】
このようにして得られる植物細胞培養物には、上述した植物の培養細胞及び培養液が含まれる。ペルオキシダーゼは、植物培養細胞から培養液へ浸出する場合があるため、植物培養細胞と同様に、培養液もペルオキシダーゼ活性を有する。本発明では、植物細胞培養物から植物培養細胞を取り除いた培養液のみの形でもテアフラビンの製造に有効に利用することができる。このため、本発明の製造方法の工業的利用可能性が大幅に拡大される。【００５２】
本発明では、培養細胞を固定化して用いることもできる。固定化培養細胞の培養物は、一般的な試薬と同様に適宜使用量を調整して反応系に添加し、且つ簡便な操作で回収し、再利用することができるという利点がある。また、固定化培養細胞の培養物を用いると、一般的には反応が遅くなる傾向にあるが、再利用するたびに酵素活性が向上し、転換率も上昇するため、最終的には収率及び選択率が向上し、純度の高いテアフラビンが得られる。【００５３】
固定化担体としては、限定されないが、寒天、アガロース、κ−カラギーナン、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、光架橋性樹脂、感光性樹脂等を用いることができる。固定化担体の形状もビーズ状、ブロック状、シリンダー状、フィルム状等とすることができる。固定化方法としては、従来公知の方法を用いることができる。【００５４】
固定化培養細胞のペルオキシダーゼ活性を高めるためには、固定化培養細胞を作成したのち培地中で一定期間、好ましくは５日以上振とうさせるのが望ましい。より好ましくは、ショ糖濃度を高くした培地中、具体的にはショ糖濃度０．４Ｍ以上を含む培地中で５日以上振とうさせる。また、固定化剤（Calcium Alginate）の濃度を高くし、具体的には１．１重量％以上で作成することも有効である。また、固定化剤（Calcium AlginateまたはStrontium Alginate）の濃度を０．６重量％以上で作成したのち、２０容量％ジメチルスルホキシド水溶液中に一定時間（約３０分間程度）放置させるごとも有効である。さらに、固定化剤の濃度を０．６重量％以上で作成したのち１０容量％ジメチルスルホキシド水溶液中に一定時間（約３０分間程度）放置させ、その後ヘキサン溶媒中で反応を行うことも有効である。【００５５】
本発明で用いられる、ペルオキシダーゼ活性とは、以下に示すように、ピロガロールをプルプロガリンに変換する活性として定義される。【００５６】
【化７】
2009008503.tif 000008
【００５７】
本発明で用いる植物細胞培養物のペルオキシダーゼ活性の強さに特に制限はないが、好ましくは０．５unit／mL以上、より好ましくは６〜２０unit／mLである。【００５８】
本発明で用いられる、加工した植物の抽出物と植物細胞培養物を混合するとは、植物抽出物に含まれているエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを植物細胞培養物と一緒に存在させることによりテアフラビンを選択的に製造することを意味する。【００５９】
本発明で用いられる、加工した植物の抽出物と植物細胞培養物の混合は、水性溶媒中で実施されることが好ましい。植物抽出物が水性溶媒で抽出されていた場合、その植物抽出物と植物細胞培養物（細胞および／または培養液）を直接混合することができる。一方、植物抽出物が、有機溶媒で抽出されていた場合、有機溶媒を留去後、水性溶媒に溶解して、植物細胞培養物（細胞および／または培養液）と混合することができる。また、植物細胞培養物が培養液を含む場合には、有機溶媒を留去後の植物抽出物を植物細胞培養物の培養液に加えて混合してもよい。【００６０】
混合後および／または混合中、混合物を振とうすることが好ましい。限定されないが、好ましい振とう数は５０〜１７０rpm程度、より好ましくは１００〜１１０rpm程度である。
加工した植物の抽出物と植物細胞培養物の混合における水性溶媒は、ペルオキシダーゼが活性である水性溶媒であれば限定されないが、水、植物細胞培養用培地、植物細胞を培養した培養液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。好ましくは、水、植物細胞培養用培地、植物細胞を培養した培養液、より好ましくは水である。水の場合、工業化において、廃液中のリン酸等の処理が不要となり廃液の処理が容易となるためである。なお、緩衝液の濃度は、０．３Ｍ〜０．００１Ｍ、好ましくは０．２Ｍ〜０．０１Ｍ、より好ましくは０．１Ｍ〜１／１５Ｍ程度である。【００６１】
本発明で用いられる、加工した植物の抽出物と植物細胞培養物の混合の割合は、特に限定されないが、好ましくは、植物抽出物中のＥＣとＥＣＧの合計量６mgまたはＥＧＣとＥＧＣＧの合計量６mgに対して、植物細胞培養物中のペルオキシダーゼ  ５〜２５０ユニット、より好ましくは１０〜１００ユニット、特に好ましくは３０〜４０ユニットである。【００６２】
本発明で用いられる混合は、好ましくは１５〜７０℃、より好ましくは２５〜４０℃の温度で、好ましくは５〜５４０分間、より好ましくは６〜３０分間、特に好ましくは７〜１５分間行うことが望ましいが、これらの混合温度及び混合時間は、原料量や酵素量などの他の条件を考慮して適宜選択することができる。なお、本発明で用いられる、混合中におけるエピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）からのテアフラビンの合成反応は、ＥＣとＥＧＣＧからのテアフラビン−３−Ｏ−ガレート（ＴＦ３−Ｇ）合成反応、ＥＣＧとＥＧＣからのテアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ３’−Ｇ）合成反応、ＥＣＧとＥＧＣＧからのテアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦＤＧ）合成反応と比較して迅速であるので、反応時間を短くすることで、より選択的にテアフラビンを製造することができる。これは、本発明で用いられる茶培養細胞物が、過酸化水素の存在下において、テアフラビンガロエステル体の生成よりも、迅速にテアフラビンを生成できるペルオキシダーゼ活性を有しているからである。また、反応時間を短くすることで、生成したテアフラビンの分解も防ぐことができる。【００６３】
本発明において、テアフラビンを選択的に製造するとは、材料としてエピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）およびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）が存在しながら、ＥＣとＥＧＣＧとから合成されるテアフラビン−３−Ｏ−ガレート（ＴＦ３−Ｇ）、ＥＣＧとＥＧＣとから合成されるテアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ３’−Ｇ）、ＥＣＧとＥＧＣＧとから合成されるテアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（ＴＦＤＧ）がほとんど合成されることなく、ＥＣとＥＧＣとから合成されるテアフラビン（ＴＦ）が特異的に合成されるということを意味する。具体的には、反応終了後の生成物（ＴＦ、ＴＦ３−Ｇ、ＴＦ３’−ＧおよびＴＦＤＧの合計）中に占めるＴＦの割合が９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９９重量％以上であることを意味する。【００６４】
本発明では、加工した植物の抽出物と植物細胞培養物（細胞及び／または培養液）の混合物に、必要に応じて過酸化水素を加えてもよい。【００６５】
エピカテキン（ＥＣ）とエピガロカテキン（ＥＧＣ）からのテアフラビンの合成は、ペルオキシダーゼによる酸化反応であるから、反応系に過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を同時に存在させるのが好ましい。ただし、必ずしも過酸化水素を存在させなくてもよい場合もある。植物細胞のなかには、過酸化水素を自ら産生しているものもあるため、本発明の培養細胞としてそのような植物細胞を用いる場合は、過酸化水素を添加しなくてもテアフラビンの合成が可能となる。【００６６】
植物細胞培養物とともに過酸化水素を存在させる場合、混合系に植物細胞培養物とともに、適切な濃度に調整した過酸化水素水を添加する。添加のために使用する過酸化水素水の濃度は、好ましくは０．１〜３０容量％、より好ましくは０．３〜１０容量％である。【００６７】
また、混合中の好ましい過酸化水素の総量が、混合中の、ＥＣとＥＣＧとの合計量０．０６９mmolに対して１〜３０mg、より好ましくは３〜１０mgとなるようにするのがよい。【００６８】
本発明で用いられる、茶葉中には、エピカテキン０．９重量％、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート０．８重量％、エピガロカテキン３．５重量％、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート３．８重量％が含まれている。一方、テアフラビンが合成される際には、等モル量のエピカテキンとエピガロカテキンが反応するので、エピガロカテキンに対してエピカテキンの不足が生じる。【００６９】
また、本発明においては、テアフラビン製造の原料となるエピカテキンとエピガロカテキンは植物抽出物中にはじめから存在するエピカテキンとエピガロカテキンだけでなく、スキーム１に示すようにエピカテキン−３−Ｏ−ガレートおよびエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートもそれぞれのガレート基が加水分解されてエピカテキンおよびエピガロカテキンとなりテアフラビン製造のための原料になっている。【００７０】
【化８】
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【００７１】
そのため、エピカテキンとエピカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量（１．７重量％）は、エピガロカテキンとエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量（７．３重量％）に対してかなり少ないことになる。【００７２】
したがって、本発明でエピカテキンを加えるのは、植物抽出物中においてエピガロカテキン（または、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）に対して不足しているエピカテキンを外から補充することで、未反応のエピガロカテキン（または、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）をテアフラビン合成に参加させ、植物抽出物からのテアフラビンの製造量を上げるためである。補充するエピカテキンの量は、植物抽出物と植物細胞培養物との混合中において、エピカテキンとエピカテキン−３−Ｏ−ガレートとの合計量が、エピガロカテキンとエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートとの合計量に対して、当モル量以上、好ましくは、エピカテキンとエピカテキン−３−Ｏ−ガレートとの合計量（モル量）：エピガロカテキンとエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートとの合計量（モル量）＝１．０〜２．０：１．０、より好ましくは１．１〜１．５：１．０になる量である。【００７３】
合成反応が終了したのち、反応混合物から目的とするテアフラビンを分離・精製する。分離は、抽出操作により行うことができる。最初の抽出には、カフェイン類および脂質類を除去するためにクロロホルムを用い、次いでテアフラビンの抽出には、酢酸エチル等のエステル類、ジエチルエーテル等のエーテル類等の一般的に用いられる抽出溶媒を用いることができる。【００７４】
抽出操作後、抽出溶媒に溶解したテアフラビンは、該溶媒を硫酸マグネシウム等により脱水後、減圧濃縮等により留去して分離する。これにより、テアフラビンを含む抽出残渣が得られる。【００７５】
上記抽出操作後のテアフラビンを含む抽出残渣は、更に分子ふるいカラムクロマトグラフィーやイオン交換樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィー等の公知の技術によって、分離精製することができる。これにより、精製されたテアフラビンを得ることができる。テアフラビンが生成したかどうかは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、マススペクトロメトリー等を用いて分析することができる。【００７６】
本発明の方法では、ほとんどテアフラビンしか生成しないため、反応液を溶媒抽出することにより、高純度で目的物を得ることができる。【００７７】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００７８】
植物細胞培養物の調製
本実験では、植物細胞として茶の成体細胞（茶の品種；さやまかおり、茶の使用部位；実生）を用い、以下のように茶細胞培養物を調製した。すなわち、寒天培地上で作成した茶培養細胞のカルスを、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及び蔗糖を含むGamborg's B5（Ｂ５）培地（フラスコ１個あたりに１００mL）に移植した。次いで、培養細胞が均一になるまで２５℃、暗条件下において約１０日間、１１０rpmでふりまぜながら培養し、茶細胞培養物（Camellia sinensis cell culture）を調製した。この茶細胞培養物のペルオキシダーゼ活性は１５．５unit／mLであった。【００７９】
また、茶の代わりに、タバコ（N. tabacum）、及び、にんじん（D. carota）の成体細胞を用い、それぞれ表１に示す組成の培地で培養した他は、実施例１と同様にして該培養細胞を含む植物細胞培養物を調製した。
なお、これら細胞培養物のペルオキシダーゼ活性はタバコ（N. tabacum）＝９．６unit／mL、にんじん（D. carota）＝８．０unit／mLである。【００８０】
Ｂ５培地の組成を表１に示す。【００８１】
【表１】
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【００８２】
ペルオキシダーゼ活性の測定
５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール（和光純薬（株））２ml、Ｈ２Ｏ  １４ml、０．５％  Ｈ２Ｏ２  １．０ml、０．１Ｍ  ｐＨ６．０リン酸緩衝液２．０mlに、酵素を含む試料１mlを、約２５℃の雰囲気下で加え、２０秒間激しく振とう後、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １．０mlを加えて反応をとめる。反応液を、ジエチルエーテル２５mlで２回抽出し、ジエチルエーテルで１００mlにする。４２０nmで吸光度を測定する。プルプロガリンの生成量は、あらかじめ作成しておいたプルプロガリンの検量線より求めた。この条件下でプルプロガリン１mgを生成する酵素量が、ペルオキシダーゼ活性の１ユニットとして定義されるので、生成されたプルプロガリン量から試料１ml中のペルオキシダーゼ活性（ユニット）が計算される。【００８３】
ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣＧ、ＴＦの分析
ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣＧ、ＴＦの分析には、ＨＰＬＣ装置（ＪＡＳＣＯ（株）、ＰＵ−９８０、ＵＶ−９７０）とＯＤＳ１２０Ａ（ＴＯＳＨＯ、４．６mm×２５０mm）カラムを用いた。分析試料には、番茶水抽出液そのもの；番茶水抽出液の酢酸エチル抽出物；番茶の酢酸エチル抽出物；反応液そのもの；反応液の酢酸エチル抽出物；またはメタノール溶出フラクションを用いた。ＨＰＬＣの条件は、溶媒；アセトニトリル：酢酸エチル：０．０５％Ｈ３ＰＯ４＝２１：３：７６、流速；１．０ml／min、温度；２５℃である。検出は、ＵＶ２８０nmでおこなった。標準のＥＣ（ＷＡＫＯ（株））、ＥＣＧ（ＷＡＫＯ（株））、ＥＧＣ（ＷＡＫＯ（株））、ＥＧＣＧ（ＷＡＫＯ（株））、ＴＦ（長良サイエンス（株））を用いて、検量線を作成し、検量線から、試料中のＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣＧ、ＴＦの量を計算により求めた。【００８４】
番茶抽出物からのテアフラビン（ＴＦ）の製造
乾燥番茶（お茶のミズイ園製の番茶）７５ｇを１５００mlの水に２４時間浸して抽出後、茶葉を濾去した濾液を番茶抽出液として１８４０ml得た（なお、濾過の際、茶葉を洗う操作がはいったため、抽出液は１８４０mlとなった。）。この番茶抽出液中のＥＣ量は４８８．５mg、ＥＣＧ量は１２２．４mg、ＥＧＣ量は５５６．５mg、ＥＧＣＧ量は６１０．５mgであった。この番茶抽出液中に、上記のように調製した茶細胞培養物４５mlと３％過酸化水素水９mlを加え１１０rpmにて振とうしながら反応を開始した。反応開始４時間後にさらに茶細胞培養物２５mlと３％過酸化水素水４．５ml、さらに反応開始５時間後に茶細胞培養物５mlと３％過酸化水素水１mlを加え、反応開始９時間後に反応を終了した。反応後酢酸エチルで３回抽出した。得られた酢酸エチル抽出液をロータリーエバポレーターレーターにて濃縮後、あらかじめメタノールで平衡化しているＳｅｐａｄｅｘＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（GE healthcare Bio-Sciences AB）に添加してメタノールで溶出することにより、赤色のフラクションを集めた。テアフラビンは赤色しているので、肉眼によりテアフラビンのフラクションの回収が可能である。結果として、テアフラビン１９３mgを得た。【００８５】
図１は、反応開始時（０分）の反応液のＨＰＬＣ分析を示す。ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣＧのピークが認められるが、テアフラビン（ＴＦ）のピークは認められない。【００８６】
図２は、反応開始後３５６分における反応液のＨＰＬＣ分析を示す。テアフラビン（ＴＦ）のピークが認められるが、ガロイルエステル体のピークは認められない。これより、テアフラビン（ＴＦ）が選択的に製造されることが明らかとなった。また、反応液中のＥＧＣＧおよびＥＣＧのピークの減少、特にＥＧＣＧのピークの大きな減少が認められた。そして、没食子酸のピークの増加が認められた。没食子酸は、ＥＧＣＧが加水分解を受けてＥＧＣに変換されるとき、またはＥＣＧが加水分解を受けてＥＣに変換されるときに生じるので、没食子酸の増加は、反応中にＥＧＣＧからＥＧＣ、およびＥＣＧからＥＣへの変換が生じていることを示唆している。これより、テアフラビン（ＴＦ）の生成によりＥＣとＥＧＣが消費されていながら、ＥＣとＥＧＣのピークに大きな変化が認められなかったのは、消費されたＥＣとＥＧＣが、ＥＣＧとＥＧＣＧからそれぞれ供給されたためと推測される。
【実施例２】
【００８７】
本実験では、反応開始材料を番茶の水抽出液から酢酸エチル抽出物に代え、反応開始材料の量を減らしてテアフラビンの製造を検討した。【００８８】
番茶抽出液７００ml（乾燥番茶５ｇを６００mlの水で２４時間抽出後、茶葉を濾去した濾液。濾過の際、茶葉を洗う操作がはいったため、抽出液は７００mlとなった。）を酢酸エチルで３回抽出した。
酢酸エチル抽出液を濃縮して、１．８２ｇの番茶抽出物を得た。番茶抽出物２４．１mg（この番茶抽出物２４．１mg中のＥＣ量は４．３mg、ＥＣＧ量は１．１mg、ＥＧＣ量は４．９mg、ＥＧＣＧ量は５．４mgであった）を水１８．５mlに溶解後、３％過酸化水素０．３ml、茶培養細胞１．２mlを加え２８分間反応させた。【００８９】
図３は、反応開始９分後の反応液のＨＰＬＣ分析を示す。図４は、反応終了時（２８分）の反応液のＨＰＬＣ分析を示す。
反応開始９分後のＨＰＬＣ分析において、テアフラビンのピークが認められた。これより、水抽出液ではなく酢酸エチル抽出物を用いても、合成反応は可能であることから、原料を濃縮することで反応容量を小さくできることが明らかとなった。また、テアフラビンの酸化により生じるテアナフトキノンのピークが、反応終了時（２８分）のＨＰＬＣ分析において認められた。これより、生成されたテアフラビンはさらに酸化され、テアナフトキノンに変換されることが明らかとなった。
【実施例３】
【００９０】
本実験では、実施例２と比較して反応開始材料の量を１０倍増やし、反応時間９分間でのテアフラビンの製造を検討した。
実施例２で得られた番茶抽出物の２４１mg（この番茶抽出物２４１mg中のＥＣ量は４３mg、ＥＣＧ量は１１mg、ＥＧＣ量は４９mg、ＥＧＣＧ量は５４mgであった）を水１８５mlに溶解後、３％過酸化水素３ml、茶細胞培養物２４mlを加え９分間反応させた。反応後酢酸エチルで３回抽出した。ＳｅｐａｄｅｘＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにてメタノールで溶出してテアフラビン１７．２mgを得た。【００９１】
これより、反応開始材料の量を増やしても、短い反応時間（９分）でテアフラビンの製造が可能であることが明らかとなった。
【実施例４】
【００９２】
番茶抽出物中における、エピカテキンとエピカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量は、エピガロカテキンとエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量に対して少ないので、本実験では、番茶抽出物に、（エピカテキンとエピカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量）：（エピガロカテキンとエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量）の比率が当モル量になるようにエピカテキンを補充してテアフラビンの製造を検討した。【００９３】
番茶抽出液７００ml（乾燥番茶５ｇを６００mlの水で２４時間抽出後、茶菓を濾去した濾液である。濾過の際、茶菓を洗う操作がはいったため、抽出液は７００mlとなった。）を酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を濃縮後、１．８２ｇの番茶抽出物を得た。この番茶抽出物２０３．７mg（この番茶抽出物中のＥＣ量は３６．５mg、ＥＣＧ量は９．２mg、ＥＧＣ量は４１．６mg、ＥＧＣＧ量は４５．５mgであった）とエピカテキン（シグマ）１６．７mgを水１８５mlに溶解後、３％過酸化水素３ml、茶細胞培養物１２mlを加え１２分間反応させた。反応後酢酸エチルで３回抽出した。ＳｅｐａｄｅＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにてメタノールで溶出することによりテアフラビンを５２．５mg得た。【００９４】
番茶抽出物中のＥＧＣ量（４１．６mg）から次のように計算された収率は、６８．６％であった。【００９５】
番茶抽出物中のＥＧＣ量に基づく収率（％）：
製造されたＴＦの量５２．５mg÷（番茶抽出物中のＥＧＣの含有量４１．５５mg÷ＥＧＣの分子量３０６×ＴＦの分子量５６４）×１００＝６８．６％【００９６】
番茶抽出物中で不足していると考えられるエピカテキンのみを補充することで、短時間の反応でかつ高い収率で選択的にテアフラビンを得ることができた。
【実施例５】
【００９７】
本実験では、（エピカテキンとエピカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量）：（エピガロカテキンとエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートの合計量）の比率が１．３：１になるようにさらに補充するエピカテキンの量を増加させて、テアフラビンの製造を検討した。
番茶抽出液７００ml（乾燥番茶５ｇを６００mlの水で２４時間抽出後、茶葉を濾去した濾液である。濾過の際、茶葉を洗う操作がはいったため、抽出液は７００mlとなった。）を酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出液を濃縮後、１．８２ｇの番茶抽出物を得た。番茶抽出物２４．１mg（この２４．１mgの番茶抽出物中のＥＣ量は４．３mg、ＥＣＧ量は１．１mg、ＥＧＣ量は４．９mg、ＥＧＣＧ量は５．４mgであった）、エピカテキン４mgを水１８．５mlに溶解後、３％過酸化水素０．３ml、茶細胞培養物１．２mlを加え１２分間反応させた。反応後酢酸エチルで３回抽出した。ＳｅｐａｄｅｘＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにてメタノールで溶出することによりテアフラビンを１３．８mg得た。【００９８】
番茶抽出物中のＥＧＣ量（４．９mg）から次のように計算された収率は、１５２．２％であった。これは、番茶抽出物中にはじめから存在しているＥＧＣ量から製造可能なテアフラビン量を超えてテアフラビンが製造されたことを意味しており、ＥＣに対して不足したＥＧＣがＥＧＣＧから供給されたことを示唆している。【００９９】
番茶抽出物中のＥＧＣ量（４．９mg）に基づく収率：
製造されたＴＦの量１３．７５mg÷（番茶抽出物中のＥＧＣの量４．９mg÷ＥＧＣの分子量３０６×ＴＦの分子量５６４）×１００）＝収率１５２．２％【０１００】
そこで、番茶抽出物中のＥＧＣＧが１００％の変換効率でＥＧＣに変換され、ＴＦの製造に参加していると仮定した場合、収率（％）は次のように８７．５％と計算された。番茶抽出物中で不足していると考えられるエピカテキンのみを過剰に補充することで、番茶抽出物中のＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣＧのすべてをテアフラビンの原料にすることが可能であることが示唆された。【０１０１】
番茶抽出液中のＥＧＣ量（４．９mg）とＥＧＣＧ量（５．４３mg）に基づく収率：
番茶抽出液中のＥＧＣの含有量４．９mg÷ＥＧＣの分子量３０６＝０．０１６mmol
番茶抽出液中のＥＧＣＧの含有量５．４３mg÷ＥＧＣＧの分子量４５８＝０．０１１８６mmol
製造されたＴＦの量１３．７５mg÷（（番茶抽出液中のＥＧＣの含有量０．０１６mmol＋番茶抽出液中のＥＧＣＧの含有量０．０１１８６mmol）×ＴＦの分子量５６４）×１００）＝収率８７．５％【０１０２】
図５は、反応開始後５分の反応液のＨＰＬＣ分析を示す。ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣＧのピークと供にテアフラビン（ＴＦ）のピークも認められる。これより、テアフラビン（ＴＦ）の合成反応は非常に早い反応であることが示された。【０１０３】
図６は、反応終了時（１２分）における反応液の酢酸エチル抽出物のＨＰＬＣ分析を示す。テアフラビン（ＴＦ）の合成により、ＥＧＣおよびＥＧＣＧが消費されている。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の方法によれば、種々の優れた生理活性を有するテアフラビンを高選択率・高収率で製造することができるので、紅茶からの抽出に頼ることなく効率よく取得することができる。また、番茶のような安価な材料を用いて、短時間かつ簡便な操作でテアフラビンを製造できるので、安価にテアフラビンを製造することができる。よって、本発明の方法は今後のテアフラビン研究の発展への貢献が期待されるとともに、テアフラビン類の工業的な大量生産を可能にする点でも産業への貢献が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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