(57)【要約】  本発明の目的は、遺伝子診断又は血液診断による変形性関節症の診断方法及び診断用キットを提供することである。本発明によれば、被験者より採取されたＤＮＡ含有試料において、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列をコードする遺伝子（Dual Intracellular Von Willebrand factor A 遺伝子；DIVA遺伝子）内に存在する多型であって、一方のアレル頻度が、任意の変形性関節症非罹患集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において高い多型からなる群より選択される１以上の多型を検出することを特徴とする、該被験者の変形性関節症に対する遺伝的感受性の診断方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者より採取されたＤＮＡ含有試料において、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列をコードする遺伝子（Dual Intracellular Von Willebrand factor A 遺伝子；DIVA遺伝子）内に存在する多型であって、一方のアレル頻度が、任意の変形性関節症非罹患集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において高い多型からなる群より選択される１以上の多型を検出することを特徴とする、該被験者の変形性関節症に対する遺伝的感受性の診断方法。
【請求項２】
多型が、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される多型、及び該多型と連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs11718863の遺伝子型がＴであり、rs7639618の遺伝子型がＧである場合に、被験者の変形性関節症に対する遺伝的感受性が高いと判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
変形性関節症が、変形性膝関節症である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸がＡｓｎからＡｓｎ以外へのアミノ酸置換を起こすような遺伝子多型の有無を検出する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において２６０番目のアミノ酸がＴｙｒからＴｙｒ以外へのアミノ酸置換を起こすような遺伝子多型の有無を検出する、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を発現している細胞に、被験物質を投与し、該蛋白質の発現又は機能を阻害する物質を選択することを含む、変形性関節症の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現又は機能を阻害する薬剤を含む、変形性関節症の予防・治療剤。
【請求項９】
以下の何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において1個もしくは複数個のアミノ酸残基
の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつチューブリンと結合できるアミノ酸配列；
【請求項１０】
請求項９に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつチューブリンと結合できるアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列とストリンジェンな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつチューブリンと結合できるアミノ酸配列をコードする塩基配列：
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症に関連する遺伝子及び該疾患と相関する該遺伝子内の多型の同定、並びにそれらに基づく変形性関節症の予防・治療などに関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症は、関節（特に、膝関節と股関節）の痛みや可動域制限を生じさせる一般的な疾患である。30歳以上の成人の約6%では、膝痛が頻繁に起こっており、X線検査で変形性関節症と診断されている。高齢者では、変形性関節症によって身体の障害だけでなく経済的な問題も生じることが多い。変形性関節症の管理は世界的に緊急を要する課題である。【０００３】
変形性関節症に関する既知の危険因子には、年齢、性別、家族歴、関節の損傷歴、職業性因子、および肥満などが含まれる。Kellgrenらによって最初に報告されたように、変形性膝関節症における遺伝的素因の存在も明らかである（非特許文献１）。ASPN（非特許文献２）、FRZB（非特許文献３）、GDF5（非特許文献４）など、変形性関節症の感受性遺伝子がいくつか同定され、現在までに複数の母集団で確認されている。【０００４】
全ゲノム連鎖解析は、変形性関節症などのヒトの複雑な疾患を研究するための強力なアプローチである。全ゲノム連鎖解析により、いくつかの疾患の感受性遺伝子が同定されている（非特許文献５〜７）。【０００５】
【非特許文献１】Kellgren, J. H., J. S. Lawrence, et al. (1963). "GeneticFactors in Generalized Osteo-Arthrosis." Ann Rheum Dis 22: 237-55.
【非特許文献２】Kizawa, H., I. Kou, et al. (2005). "An aspartic acid repe at polymorphism in asporin inhibits chondrogenesis and increases susceptibility to osteoarthritis." Nat Genet 37(2): 138-44.
【非特許文献３】Loughlin, J., B. Dowling, et al. (2004). "Functional variants within the secreted frizzled-related protein 3 gene are associated with hip osteoarthritis in females." Proc Natl Acad Sci U S A 101(26): 9757-62.
【非特許文献４】Miyamoto, Y., A. Mabuchi, et al. (2007). "A functional polymorphism in the 5' UTR of GDF5 is associated with susceptibility to osteoarthritis." Nat Genet 39(4): 529-33.
【非特許文献５】Ozaki, K., Y. Ohnishi, et al. (2002). "Functional SNPs in the lymphotoxin-alpha gene that are associated with susceptibility to myocardial infarction." Nat Genet 32(4): 650-4.
【非特許文献６】Klein, R. J., C. Zeiss, et al. (2005). "Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration." Science 308(5720): 385-9.
【非特許文献７】Kubo, M., J. Hata, et al. (2007). "A nonsynonymous SNP in PRKCH (protein kinase C eta) increases the risk of cerebral infarction." Nat Genet.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
変形性関節症の診断方法としては、現在、X線検査やMRI(magnetic resonance imaging)などの画像診断以外には方法がない。しかしながら、画像診断は、発症前や発症初期には無効であることが多く、また客観性に乏しいという問題があった。本発明は、遺伝子診断又は血液診断による変形性関節症の診断方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、変形性関節症の予防・治療剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、変形性関節症の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、変形性膝関節症の全ゲノム連鎖解析を行い、従来報告のない新規遺伝子として、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子（Dual Intracellular Von Willebrand factor A 遺伝子；DIVA遺伝子）を同定することに成功した。さらに、本発明者らは、DIVAのミスセンスSNPは変形性膝関節症と有意に関連すること、DIVAタンパク質はチューブリンと結合するが、ミスセンスSNPの変形性関節症感受性アレルはチューブリンとの結合力が弱いことを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  被験者より採取されたＤＮＡ含有試料において、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列をコードする遺伝子（Dual Intracellular Von Willebrand factor A 遺伝子；DIVA遺伝子）内に存在する多型であって、一方のアレル頻度が、任意の変形性関節症非罹患集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において高い多型からなる群より選択される１以上の多型を検出することを特徴とする、該被験者の変形性関節症に対する遺伝的感受性の診断方法。【０００９】
（２）  多型が、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される多型、及び該多型と連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型からなる群より選択される、（１）に記載の方法。
（３）  NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs11718863の遺伝子型がＴであり、rs7639618の遺伝子型がＧである場合に、被験者の変形性関節症に対する遺伝的感受性が高いと判定する、請求項２に記載の方法。
（４）  変形性関節症が、変形性膝関節症である、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）  配列番号２に記載のアミノ酸配列において１６９番目のアミノ酸がＡｓｎからＡｓｎ以外へのアミノ酸（具体的にはＴｙｒ）置換を起こすような遺伝子多型の有無を検出する、（１）から（４）の何れかに記載の方法。
（６）  配列番号２に記載のアミノ酸配列において２６０番目のアミノ酸がＴｙｒからＴｙｒ以外へのアミノ酸（具体的にはＣｙｓ）置換を起こすような遺伝子多型の有無を検出する、（１）から（５）の何れかに記載の方法。【００１０】
（７）  配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を発現している細胞に、被験物質を投与し、該蛋白質の発現又は機能を阻害する物質を選択することを含む、変形性関節症の予防・治療剤のスクリーニング方法。
（８）  配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現又は機能を阻害する薬剤を含む、変形性関節症の予防・治療剤。【００１１】
（９）  以下の何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において1個もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつチューブリンと結合できるアミノ酸配列；【００１２】
（１０）  （９）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１１）  以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつチューブリンと結合できるアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列とストリンジェンな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつチューブリンと結合できるアミノ酸配列をコードする塩基配列：
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、DIVA遺伝子の疾患感受性多型を検査（遺伝子診断、血液診断等）することによって、変形性関節症の疾患感受性の診断が可能になる。即ち、変形性関節症の発症前診断、リスク診断、早期診断が可能にする。さらに本発明によれば、DIVA遺伝子の発現・生理活性を調節することによる変形性関節症の予防・治療。変形性関節症の原因治療が可能にする。さらに本発明によれば、DIVA遺伝子の発現を調節する薬剤をスクリーニングすることにより、変形性関節症の予防・治療剤の開発が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による変形性関節症に対する遺伝的感受性の診断方法は、被験者より採取されたＤＮＡ含有試料において、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列をコードする遺伝子（Dual Intracellular Von Willebrand factor A 遺伝；DIVA遺伝子）内に存在する多型であって、一方のアレル頻度が、任意の変形性関節症非罹患集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において高い多型からなる群より選択される１以上の多型を検出することを特徴とする方法である。即ち、本発明の変形性関節症に対する遺伝的感受性の診断方法は、被験者のDIVA遺伝子における多型を検出することを特徴とする。【００１５】
本明細書において「（遺伝子）多型」とは、ゲノムDNA上の１または複数の塩基の変化（置換、欠失、挿入、転位、逆位等）であって、その変化が集団内に１％以上の頻度で存在するものをいい、例えば、１個の塩基が他の塩基に置換されたもの（SNP）、１〜数十塩基が欠失もしくは挿入されたもの（DIP）、２〜数十塩基を１単位とする配列が繰り返し存在する部位においてその繰り返し回数が異なるもの（繰り返し単位が２〜４塩基のものをマイクロサテライト多型、数〜数十塩基のものをvariable number of tandem repeat（VNTR）という）等が挙げられる。本発明の診断方法に利用することができる多型は、下記の条件を満たす限りいずれのタイプのものであってもよいが、好ましくはSNPである。【００１６】
本発明の診断方法において利用することができる多型は、
（1）DIVA遺伝子内に存在する多型であって、
（2）その一方のアレル頻度が、任意の変形性関節症非罹患者集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において有意に高いものであれば特に制限されない。【００１７】
DIVA遺伝子内に存在する多型としては、例えば、NCBI SNPデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)、JSNPデータベース
(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/)、Applied Biosystemsホームページ(http://www.appliedbiosystems.com/index.cfm)等に登録された公知の多型が挙げられる。NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される多型、及び該多型と連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型からなる群より選択される多型を挙げることができる。【００１８】
本発明の診断方法において利用することができる多型としては、好ましくは、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される多型、及び該多型と連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型からなる群より選択される多型である。ここで「連鎖不平衡係数D'」は、２つのSNPについて第一のSNPの各アレルを（A，a）、第二のSNPの各アレルを（B，b）とし、４つのハプロタイプ（AB，Ab，B，ab）の各頻度をPAB，PAb，PaB，Pabとすると、下記式により得られる。
D'＝（PABPab-PAbPaB）/Min[（PAB+PaB）（PaB+Pab），（PAB+PAb）（PAb+Pab）]
[式中、Min[（PAB+PaB）（PaB+Pab），（PAB+PAb）（PAb+Pab）]は、（PAB+PaB）（PaB+Pab）と（PAB+PAb）（PAb+Pab）とのうち、値の小さい方をとることを意味する。]
好ましくは、D'が0.95以上、より好ましくは0.99以上、最も好ましくは１である多型が挙げられる。【００１９】
上記多型のうち、一方のアレル頻度が任意の変形性関節症非罹患者集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において有意に高いものが、本発明の診断方法に利用することができる。本明細書においては、以下、かかる多型を変形性関節症マーカー多型という場合もある。【００２０】
変形性関節症患者集団および変形性関節症非罹患者集団は、それぞれ統計学上信頼し得る結果を与えるに十分な数からなる集団であれば、その大きさ（サンプル数）、各サンプルの背景（例えば、出身地、年齢、性別、疾患等）などに特に制限はない。
変形性関節症としては、例えば、変形性膝関節症等が挙げられる。また、倫理上、試料提供者のインフォームド・コンセントを必要とすることから、変形性関節症非罹患者集団としては、通常、ある医療機関における変形性関節症以外の患者群、あるいはある地域における集団検診において変形性関節症に罹患していないと診断された被験者群などが好ましく用いられる。【００２１】
本発明においては、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される多型、及び該多型と連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型からなる群より選択される多型を診断に用いることができる。本発明の診断方法において検出される多型は、上記した多型のうちのいずれか１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。【００２２】
本発明の診断方法において、多型の検出は公知のSNP検出方法のいずれも使用することができる。古典的な検出方法としては、例えば、被験者の細胞等から抽出したゲノムDNAを試料とし、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はs11718863で示される多型部位の塩基を含む約15〜約500塩基の違続した塩基配列を含有してなる核酸をプローブとして用い、例えばWallaceら（Proc. Nat1. Acad. Sci. USA，80，278-282（1983））の方法に従って、ストリンジェンシーを正確にコントロールしながらハイブリダイゼーションを行い、プローブと完全相補的な配列のみを検出する方法や、上記核酸と上記核酸において多型部位の塩基が他の塩基に置換された核酸のいずれか一方を標識し、他方を未標識としたミックスプローブを用い、変性温度から徐々に反応温度を低下させながらハイブリダイゼーションを行い、一方のプローブと完全相補的な配列を先にハイブリダイズさせ、ミスマッチを有するプローブとの交差反応を防ぐ方法などが挙げられる。ここで標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。【００２３】
好ましくは、多型の検出は、例えば、WO 03/023063に記載された種々の方法、例えば、RFLP法、PCR-SSCP法、ASOハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RNaseA切断法、化学切断法、DOL法、TaqMan PCR法、インベーダー法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、UCAN法、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびECA法などにより実施することができる（WO 03/023063，第17頁第５行〜第28頁第20行を参照）。以下、代表的な方法として、TaqMan PCR法とインベーダー法について、より詳細に説明する。【００２４】
（ａ）TaqMan PCR法
TaqMan PCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（TaqManプローブ）とTaq DNAポリメラーゼによるPCRとを利用した方法である。TaqManプローブとしては、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される多型部位の塩基を含む約15〜約30塩基の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。該プローブは、その5'末端がFAMやVICなどの蛍光色素で、3'末端がTAMRAなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されており、そのままの状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは双方のアレルについて調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色素（例えば、一方のアレルをFAM、他方をVIC）で標識することが好ましい。また、TaqManプローブからのPCR伸長反応が起こらないように3'末端はリン酸化されている。TaqManプローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムDNAの部分配列を増幅するように設計されたプライマーおよびTaq DNAポリメラーゼとともにPCRを行うと、TaqManプローブが鋳型DNAとハイブリダイズし、同時にPCRプライマーからの伸長反応が起こるが、伸長反応が進むとTaq DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたTaqManプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大する。【００２５】
（ｂ）インベーダー法
インベーダー法では、TaqMan PCR法と異なり、アレル特異的オリゴヌクレオチド（アレルプローブ）自体は標識されず、多型部位の塩基の5'側に鋳型DNAと相補性のない配列（フラップ）を有し、3'側には鋳型に特異的な相補配列を有する。インベーダー法では、さらに鋳型の多型部位の3'側に特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチド（インベーダープローブ；該プローブの5'末端である多型部位に相当する塩基は任意である）と、5'側がヘアピン構造をとり得る配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に5'末端の塩基と対をなす塩基から3'側に連続する配列がアレルプローブのフラップと相補的な配列であることを特徴とするFRET（fluorescence resonance energy transfer）プローブとが用いられる。FRETプローブの5'末端は蛍光標識（例えば、FAMやVICなど）され、その近傍にはクエンチャー（例えば、TAMRAなど）が結合しており、そのままの状態（ヘアピン構造）では蛍光は検出されない。【００２６】
鋳型であるゲノムDNAにアレルプローブおよびインベーダープローブを反応させると、三者が相補結合した際に多型部位にインベーダープローブの3'末端が侵入する。この多型部位の構造を認識する酵素（cleavase）を用いてアレルプローブの一本鎖部分（即ち、多型部位の塩基から5'側のフラップ部分）を切り出すと、フラップはFRETプローブと相補的に結合し、フラップの多型部位がFRETプローブのヘアピン構造に侵入する。この構造をcleavaseが認識して切断することにより、FRETプローブの末端標識された蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなって蛍光が検出される。多型部位の塩基が鋳型とマッチしないアレルプローブはcleavaseによって切断されないが、切断されないアレルプローブもFRETプローブとハイブリダイズすることができるので、同様に蛍光が検出される。但し、反応効率が異なるため、多型部位の塩基がマッチするアレルプローブでは、マッチしないアレルプローブに比べて蛍光強度が顕著に強い。【００２７】
通常、３種のプローブおよびcleavaseと反応させる前に、鋳型DNAはアレルプローブおよびインベーダープローブがハイブリダイズする部分を含む領域を増幅し得るプライマーを用いてPCRにより増幅しておくことが好ましい。【００２８】
上記のようにして多型を調べた結果、任意の変形性関節症非罹患者集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において有意に高いアレルを保有していると判定された場合、特に該アレルについてホモ接合体であると判定された場合には、被験者は当該変形性関節症に対する遺伝的感受性が高いと診断することができる。例えば、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs7639618の遺伝子型がＴであり、rs7639618の遺伝子型がＧである場合に、被験者の変形性関節症に対する遺伝的感受性が高いと判定することができる。【００２９】
本発明では、上記本発明の診断方法に用いるためのキットを提供することができる。即ち、本発明の診断用キットは、DIVA遺伝子内に存在する多型であって、一方のアレル頻度が、任意の変形性関節症非罹患者集団におけるよりも任意の変形性関節症患者集団において高い多型からなる群より選択される１以上の多型の各々を検出し得る１組以上の核酸プローブおよび／またはプライマーを含むことを特徴とする。【００３０】
具体的には、本発明の診断用キットに用いられる核酸プローブは、上記本発明の診断方法において検出すべき多型部位の塩基を含む領域でゲノムDNAとハイブリダイズする核酸であり、標的部位に対して特異的であり且つ多型性を容易に検出し得る限りその長さ（ゲノムDNAとハイブリダイズする部分の塩基長）に特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約15〜約500塩基、より好ましくは約15〜約200塩基、いっそう好ましくは約15〜約50塩基である。【００３１】
該プローブは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムDNAと相補的でない配列）を含んでいてもよい。例えば、上記インベーダー法に用いられるアレルプローブは、多型部位の塩基の5'末端にフラップと呼ばれる付加的配列を有する。【００３２】
また、該プローブは、適当な標識剤、例えば、例えば、放射性同位元素（例：125I、131I、3H、14C等）、酵素（例：β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。【００３３】
好ましくは、本発明の診断用キットに用いられる核酸プローブは、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される多型、及び該多型と連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型からなる群より選択される多型部位の塩基を含む、約15〜約500塩基、好ましくは約15〜約200塩基、より好ましくは約15〜約50塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸である。【００３４】
本発明の診断用キットに用いられる核酸プライマーは、上記本発明の診断方法において検出すべき多型部位の塩基を含むゲノムDNAの領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。該プライマーは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムDNAと相補的でない配列）、例えばリンカー配列を含んでいてもよい。【００３５】
また、該プライマーは、適当な標識剤、例えば、例えば、放射性同位元素（例：125I、131I、3H、14C等）、酵素（例：β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。【００３６】
本発明の診断用キットに用いられる核酸プローブまたはプライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッドのいずれであってもよい。従って、本明細書においてある塩基配列を有する核酸について記載する場合、特に断らない限り、該塩基配列を有する一本鎖核酸、該塩基配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸、それらのハイブリッドである二本鎖核酸をすべて包含する意味で用いられていると理解されるべきである。【００３７】
上記核酸プローブまたはプライマーは、例えば、NCBI SNP Databaseにおける登録番号rs9864422、rs7639618、又はrs11718863で示される塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。【００３８】
上記核酸プローブおよび／またはプライマーは、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファーなど）中に適当な濃度（例：２×〜20×濃度で１〜50μMなど）となるように溶解し、約-20℃で保存することができる。【００３９】
本発明の診断用キットは、多型検出法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、該キットがTaqMan PCR法による多型検出用である場合には、該キットは、10×PCR反応緩衝液、10×MgCl2水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNAポリメラーゼ（5U/μL）等をさらに含むことができる。【００４０】
本発明の診断用キットは、変形性関節症、例えば、変形性膝関節症等に対する遺伝的感受性の診断に使用することができる。【００４１】
本発明はまた、DIVAの発現および／または活性を調節（例えば、抑制）することによる、変形性関節症の予防および／または治療に関する。【００４２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約50％以上、好ましくは約60％以上、より好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列を有する蛋白質が配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有するような配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science，247:1306-1310（1990）を参照）。【００４３】
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877（1993）に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschu1ら，Nucleic Acids Res，25:3389-3402（1997））]、Needlemanら，J. Mol. Biol., 48:444-453（1970）に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、MyersおよびMiller，CABIOS,4:11-17（1988）に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている]、Pearsonら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448（1988）に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている]等が挙げられるが、それらに限定されない。【００４４】
実質的に同質の活性における「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に（例：生理学的に、または薬理学的に）同等であることを意味する。【００４５】
また、本発明におけるDIVAとしては、例えば、（1）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜30個程度、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（2）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜30個程度、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（3）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜30個程度、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（4）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜30個程度、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（5）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も含まれる。上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、当該蛋白質の活性を損なわない限り、特に限定されない。【００４６】
本発明のDIVA蛋白質は、DIVAをコードする核酸を含有する発現ベクターを導入した形質転換体を培養してDIVA蛋白質を生成せしめ、得られる培養物からDIVA蛋白質を分離・精製することによって製造することができる。【００４７】
DIVAをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるDIVAのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものでもよい。該核酸は、DNA、RNA、あるいはDNA/RNAキメラでもよいが、好ましくはDNAである。【００４８】
DIVAをコードするDNAは、ゲノムDNA、ヒトもしくは他の温血動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリなど）の細胞[例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など]またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官[例えば、脳、脳の各部位（例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、椎間板、脂肪組織（例：褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など]由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。DIVAをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、DIVAをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。【００４９】
DIVAをコードするDNAとしては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質又はそれと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするDNAなどが挙げられる。また、上記DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAを使用することもできる。例えば、上記DNAの塩基配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。【００５０】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第2版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。【００５１】
ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約19〜約40mM、好ましくは約19〜約20mMで、温度が約50〜約70℃、好ましくは約60〜約65℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダイゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【００５２】
DIVAをコードするDNAは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、DIVAの一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。【００５３】
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunke1法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。【００５４】
DIVAをコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸（センスDIVA）、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸（アンチセンスDIVA）は、プローブ等として便用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）におけるDIVAをコードするDNAまたはmRNAの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該DNAの損傷もしくは突然変異やmRNAのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該DNAの増幅やmRNAの発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。DIVAをコードする塩基配列の一部を含有する核酸は、プローブとして必要な長さ（例えば、約15塩基以上）を有する限り特に制限されず、また、DIVAの部分ペプチドをコードしている必要もない。【００５５】
センスもしくはアンチセンスDIVAを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。【００５６】
上記のDIVAをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはペプチドを製造することができる。DIVAをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、DIVAをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。【００５７】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例：pBR322, pBR325, pUC12,pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例：pUB110, pTP5, pC194）；酵母由来プラスミド（例：pSH19, pSH15）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス,
ワクシニアウイルス, バキュロウイルスなどの動物ウイルス；pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。【００５８】
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、HSV-TKプロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、Ippプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。【００５９】
宿主がバチルス属菌である場合、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。【００６０】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン（以下、SV40oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、dhfrと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（MTX）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。【００６１】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル（もしくはプレプロ）配列をコードする塩基配列を、DIVAまたはその部分ペプチドをコードするDNAの5'末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α-アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、MFα・シグナル（プレプロ）配列、SUC2・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル（プレプロ）配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。【００６２】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）,60巻, 160（1968）〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，3091981）〕，JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）, 120巻, 517（1978）〕, HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，41巻, 459（1969）〕,C600〔ジェネティックス（Genetics）, 39巻, 440（1954）〕などが用いられる。【００６３】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114〔ジーン（Gene）, 24巻, 255（1983）〕, 207-21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal Biochemistry）, 95巻, 87（1984）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosacc haromyces pombe）NCYC1913, NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichiapastoris）KM71などが用いられる。【００６４】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、TrichoPlusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea申来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（以上、Vaughn, J. L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）, 13, 213-217（1977））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature）, 315巻, 592（1985）〕。【００６５】
動物細胞としては、例えば、サル細胞COS-7, Vero、チャイニーズハムスター細胞CHO（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO（以下、CHO（dhfr-）細胞と略記）, マウスL細胞, マウスAtT-20, マウスミエローマ細胞, ラットGH3, ヒトFL細胞などが用いられる。【００６６】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.USA）,69巻, 2110（1972）やジーン（Gene）, 17巻, 107（1982）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular & General Genetics）, 168巻, 111（1979）などに記載の方法に従って形質転換することができる。【００６７】
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）, 194巻，182-187（1991）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Nat1. Acad. Sci. USA）,75巻, 1929（1978）などに記載の方法に従って形質転換することができる。【００６８】
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 4
7-55（1988）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール, 263-267（1
995）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology）,52巻, 456（1973）に記載の方法
に従って形質転換することができる。【００６９】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約５〜８である。【００７０】
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー（Miller）, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics）, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。【００７１】
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜43℃で、約３〜24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約30〜40℃で、約６〜24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。【００７２】
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Nat1. Acad. Sci. USA）, 77巻, 4505（1980）〕や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter、G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, 81巻, 5330（1984）〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約20℃〜35℃で、約24〜72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。【００７３】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium（Grace, T. C. C.,ネイチャー（Nature）,195, 788（1962））に非動化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2〜6.4である。培養は、通常約27℃で、約３〜５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。【００７４】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス（Science）、122巻, 501（1952）〕, DMEM培地〔ヴィロロジー（Virology）,８巻, 396（1959）〕, RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）, 199巻, 519（1967）〕, 199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine）,73巻、１（1950）〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約30℃〜40℃で、約15〜60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にDIVA蛋白質を生成させることができる。前記形質転換体を培養して得られる培養物から、DIVA蛋白質を自体公知の方法に従って分離精製することができる。【００７５】
さらに本発明では、DIVAまたはその部分ペプチドに対する抗体（以下、「抗DIVA抗体」と略記する場合がある）を製造することができる。抗DIVA抗体は、DIVAまたはペプチドに対して特異的親和性を有するものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。該抗体は、DIVAまたはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。【００７６】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（a）モノクローナル抗体産生細胞の作製
DIVAまたはその部分ペプチドを、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜10回程度行われる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。【００７７】
例えば、抗原で免疫された哺乳動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化DIVAと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495（1975）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。【００７８】
骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1などの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１:１〜20:１程度であり、PEG（好ましくはPEG1000〜PEG6000）が10〜80％程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で１〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。【００７９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したDIVAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；などによりスクリーニングすることができる。【００８０】
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。このような培地としては、例えば、１〜20％、好ましくは10〜20％のウシ胎仔血清を含むRPMI 1640培地、１〜10％のウシ胎仔血清を含むGIT培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（SFM-101、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常５目〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。【００８１】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って分離精製することができる。【００８２】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
DIVAまたはその部分ペプチドに対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（DIVAまたはその部分ペプチド）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体を作製し、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から抗DIVA抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。【００８３】
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約0.1〜20、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。【００８４】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル碁を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜10回程度行われる。【００８５】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。  抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。【００８６】
DIVAの部分ペプチドを抗原として用いる場合、そのDIVA上の位置は特に限定されないが、例えば、各種温血動物間でよく保存された領域の部分アミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドが挙げられる。特に目的の抗体が中和抗体である場合には、抗原として用いる部分ペプチドは、DIVAのN末側81kDaの全部もしくは一部を含むものであることが好ましい。【００８７】
前記した抗DIVA抗体は、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）におけるDIVAまたはその塩の量を測定することができるので、例えば、該蛋白質の発現低下または発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。例えば、イムノアッセイの結果、該試料中のDIVAの増大が検出された場合は、変形性関節症の疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。【００８８】
DIVAの活性を調節（例えば、抑制）し得る物質は、変形性関節症の予防・治療に有効である。従って、本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を発現している細胞に、被験物質を投与し、該遺伝子の発現を抑制する物質を選択することを含む、変形性関節症の予防・治療剤のスクリーニング方法が提供される。【００８９】
例えば、本発明によれば、DIVAを産生する能力を有する細胞におけるDIVAの発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、変形性関節症の予防・治療剤のスクリーニング方法が提供される。【００９０】
被験物質としては、例えば蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。【００９１】
上記のスクリーニング法において、DIVAの発現を抑制させる被験物質を「DIVA発現抑制物質」として選択することができる。DIVA発現抑制物質は、変形性関節症の予防・治療剤として用いることができる。【００９２】
DIVAの発現量は、DIVAをコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（即ち、前記したDIVAをコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸（以下、「センスDIVA」ともいう）またはDIVAをコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部（アンチセンスDIVA））を用いてそのmRNAを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、前記した抗DIVA抗体を用いて蛋白質（ペプチド）を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。【００９３】
従って、より具体的には、本発明は、
（１）DIVAを産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるDIVAをコードするmRNAの量を、センスもしくはアンチセンスDIVAを用いて測定、比較することを特徴とする、変形性関節症の予防・治療剤のスクリーニング方法、および
（２）DIVAを産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるDIVAの蛋白質（ペプチド）量を、抗DIVA抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、変形性関節症の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。【００９４】
例えば、DIVAのmRNA量または蛋白質（ペプチド）量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（i）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して、薬剤あるいは物理的刺激などを与える一定時間前（30分前〜24時間前、好ましくは30分前〜12時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（30分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜24時間後）、または薬剤あるいは物理的刺激と同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後、随核、椎間板組織などを採取する。得られた生体試料に含まれる細胞において発現したDIVAのmRNAは、例えば、通常の方法により細胞等からmRNAを抽出し、例えば、RT-PCRなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、DIVA蛋白質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳細する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ii）DIVAまたはその部分ペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後、該形質転換体に含まれるDIVAのmRNA量または蛋白質（ペプチド）量を定量、解析することにより行うことができる。【００９５】
上記のスクリーニング方法におけるDIVAの量の測定は、具体的には、例えば、（ｉ）抗DIVA抗体と、試料液および標識化されたDIVAとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたDIVAを検出することにより試料液中のDIVAを定量する方法や、（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した抗DIVA抗体および標識化された別の抗DIVA抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のDIVAを定量する方法等が挙げられる。【００９６】
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体はDIVAの異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がDIVAのN端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてDIVAのC端部と反応するものを用いることができる。【００９７】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。【００９８】
試料液としては、DIVAが細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、DIVAが細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清からDIVAを分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。【００９９】
抗DIVA抗体を用いるDIVA類の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体-抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。【０１００】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。【０１０１】
サンドイッチ法においては不溶化した抗DIVA抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の抗DIVA抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のDIVAを定量することができる。１次反応と2次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。【０１０２】
抗DIVA抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。【０１０３】
競合法では、試料液中のDIVAと標識したDIVAとを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（F）と、抗体と結合した標識抗原（B）とを分離し（B/F分離）、B、Fいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のDIVAを定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてB/F分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。【０１０４】
イムノメトリック法では、試料液中のDIVAと固相化したDIVAとを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のDIVAと過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したDIVAを加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。【０１０５】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のDIVAの量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。【０１０６】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてDIVAの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。【０１０７】
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江寛編「統ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70（Immunochemical Techniques（PartA））、同書Vol. 73（Immunochemical Techniques（Part B））、同書Vol. 74（Immunochemical Techniques（Part C））、同書Vol. 84（Immunochemical Techniques（Part D:Selected Immunoassays））、同書Vol. 92（ImmunochemicalTechniques（Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods））、同書Vol. 121（Immunochemical Techniques（Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、抗DIVA抗体を用いることによって、細胞におけるDIVA類の生産量を感度よく定量することができる。【０１０８】
上記のスクリーニング法において、DIVAの発現量（mRNA量または蛋白質（ペプチド）量）を抑制させた物質をDIVA発現抑制物質として選択することができる。DIVA発現抑制物質は、変形性関節症（例えば、変形性膝関節症）の予防・治療剤として用いることができる。【０１０９】
さらに本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列からなるタンパク質（DIVA）の阻害剤を含む、変形性関節症の予防・治療剤が提供される。【０１１０】
本発明で用いるDIVAの阻害剤としては、DIVAの発現を阻害する物質、又はDIVAに作用してDIVAの活性又は機能を阻害する物質等が含まれる。
DIVAの発現を抑制する物質としては、RNAi、アンチセンス法又はリボザイム法を利用した物質等が挙げられ、特に限定されないが、RNAiを利用したsiRNAsが好ましい。
DIVA に作用してDIVAの活性及び機能を阻害する物質としては、低分子化合物及び抗体等が挙げられる。【０１１１】
RNAi（RNA interference）は、細胞に導入された2本鎖RNAが、同じ配列を持つ遺伝子の発現を抑制する現象を言う。RNAiによりDIVAの発現を阻害する物質の具体例としては、下記に説明するようなsiRNA又はshRNA等が挙げられる。【０１１２】
siRNA とはshort interfering RNAの略称であり、約２１〜２３塩基程度の長さの二本鎖RNAをいう。siRNAはRNAiを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよく、例えば、化学合成もしくは生化学的合成、又は生物体内の合成で得られたsiRNA、あるいは約４０塩基以上の二本鎖RNAが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖RNA等であればよい。siRNA の配列と、DIVAのmRNAの部分配列とは１００％一致することが好ましいが、必ずしも１００％一致していなくてもよい。【０１１３】
siRNAの塩基配列と、DIVA遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、DIVA遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。相同性を有する配列は、DIVA遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、７０塩基離れていることがより好ましい。相同性を有する配列としては、例えば、DIVA遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。【０１１４】
RNAiによりDIVAの発現を阻害する物質としては、siRNA を生成する約４０塩基以上のdsRNA等を用いてもよい。例えば、DIVA遺伝子の核酸配列の一部に対して約７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む、二本鎖部分を含むRNA又はその改変体を使用することができる。相同性を有する配列部分は、通常は、少なくとも１５ヌクレオチド以上であり、好ましくは約１９ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは２１ヌクレオチド以上である。【０１１５】
RNAiによりDIVAの発現を阻害する物質としては、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るshRNA（short hairpin RNA）を使用することもできる。shRNAとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことである。また、shRNAとしては３'突出末端を有するのが好ましい。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはDNAであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のDNAであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのDNAである。【０１１６】
RNAiによりDIVAの発現を阻害する物質は、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖及びアンチセンス鎖のDNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造のDNAをT7 RNAポリメラーゼによってインビトロでRNAを合成することによって作製してもよい。インビトロで合成する場合は、T7 RNAポリメラーゼ及びＴ７プロモーターを用いて、鋳型DNAからアンチセンス及びセンスのRNAを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、RNAiが引き起こされ、DIVAの発現が抑制される。細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamine及びlipofection等）を用いた方法等により行うことができる。【０１１７】
RNAiによりDIVAの発現を阻害する物質としては上述のsiRNA又はshRNAをコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いてもよい。さらに該発現ベクターを含む細胞を用いてもよい。上記した発現ベクターや細胞の種類は特に限定されないが、既に医薬として用いられている発現ベクターや細胞が好ましい。【０１１８】
本発明による配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれと実質的に相同のアミノ酸配列からなるタンパク質の阻害剤を含む変形性関節症の予防・治療剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、患部への局所投与、皮膚投与等）のいずれの投与経路により投与してもよい。経口投与に適する製剤形態としては、固形又は液体の形態が挙げられ、非経口投与に適する製剤形態としては、注射剤、点滴剤、坐剤、外用剤等の形態が挙げられる。本発明の変形性関節症の予防・治療剤は、その製剤形態により必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤が加えられていてもよい。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、着色剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤及び／又は薬学的アジュバント等が挙げられる。【０１１９】
経口用の固形製剤形態の本発明の変形性関節症の予防・治療剤は、例えば、有効成分であるDIVA阻害剤に賦形剤を加え、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、又は矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。経口用の液体製剤形態の本発明の変形性関節症の予防・治療剤は、有効成分であるDIVA阻害剤に矯味剤、安定化剤、又は保存剤など製剤用添加物の１種又は２種以上を加え、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等として調製することができる。【０１２０】
本発明の変形性関節症の予防・治療剤を液体製剤として処方するために使用される溶媒は、水性又は非水性のいずれでもよい。液体製剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を用いてもよい。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。【０１２１】
DIVAのsiRNAまたはsiRNA発現ベクターなど遺伝子送達の種類に関しては、適用される組織内でDIVAのsiRNAをコードするRNAまたはsiRNA発現ベクターの発現を得る限り特に方法は限定されるものではなく、例えば、ウイルスベクター、リポソームを用いた遺伝子導入を用いる事が可能である。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、シンリンセムリキウイルス等の動物ウイルスが挙げられる。
RNAiによりDIVAの発現を阻害する物質は、生体の器官や組織等に直接注入してもよい。【０１２２】
本発明の変形性関節症の予防・治療剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分の種類等を考慮して、当業者が決定することができる。本発明の変形性関節症の予防・治療剤の投与量は、有効成分がRNAiによりDIVAの発現を阻害する物質である場合、例えば、有効成分量として、成人一人当たり、約0.1 ng〜約100 mg/kg、好ましくは約1 ng〜約10 mgであり、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターとして投与される場合は、通常、0.0001〜100 mg、好ましくは0.001〜10 mg、より好ましくは0.01〜1 mgである。【０１２３】
本発明の変形性関節症の予防・治療剤の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよい。RNAiによりDIVAの発現を阻害する物質を用いる場合は一般に投与後１〜３日間効果が見られるので、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合には１週間に１回程度の投与が適する場合もある。  以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１２４】
（Ａ）材料および方法
（１）被験者
変形性膝関節症患者および対照被験者（セットA、セットB）、ならびに変形性股関節症患者を登録した。変形性関節症の診断は、臨床所見およびX線検査の所見に基づいて行った。変形性膝関節症および変形性股関節症の診断基準は既報に従った（Ikeda, T., A. Mabuchi, et al. (2001). J Hum Genet 46(9): 538-43；及びMabuchi,A., T. Ikeda, et al. (2001). J Hum Genet 46(8): 456-62）。これらの変形性膝関節症集団には、JSN（関節裂隙狭小化）グレードが2以上の被験者を含めた。セットCとして、三重県大台町（旧宮川村）および南伊勢町（旧南勢町）の住民を患者集団ベースのコホートに登録した。X線検査の所見に基づいて、このコホートの被験者を変形性膝関節症集団、または対照集団に分類した。これらのコホートでの変形性膝関節症の診断基準は、大台町住民についてはKellgren-Lawrenceグレード（Kellgrenら1957）が2以上、南伊勢町住民についてはJSNグレードが2以上であることとした。被験者数、男女比、平均年齢、および平均体格指数（BMI）など、本試験での各集団の臨床パラメーターを表１１に示す。標準プロトコールに従い、患者および対照被験者の末梢血白血球からゲノムDNAを抽出した。【０１２５】
変形性関節症軟骨は、人工膝関節全置換術中に膝関節から採取した（7サンプル）。正常軟骨は、大腿骨頚部骨折の手術中に対照被験者の大腿骨頭から採取した（8サンプル）。変形性股関節症の病歴またはX線検査での徴候があった対照被験者はいなかった。同意文書は、理化学研究所遺伝子多型研究センターおよび参加医療機関の倫理委員会の承認に従い、各被験者から取得した。【０１２６】
（２）SNPの遺伝子型解析
マルチプレックスPCRインベーダー法（Ohnishi, Y., T. Tanaka, et al. (2001). J Hum Genet 46(8): 471-7.）（Third Wave Technologies社製）、TaqMan SNPジェノタイピングアッセイ（アプライドバイオシステムズ社製）、またはABI 3700 DNAアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いたPCR産物のダイレクトシーケンスにより、メーカーのプロトコールに従ってSNPの遺伝子型を解析した。【０１２７】
（３）統計解析
EMアルゴリズムによりハプロタイプ頻度を推定した（Excoffier, L. and M. Slatkin (1995). Mol Biol Evol 12(5): 921-7）。Haploview software 3.32（Barrettら2005）およびExcel 2004（Microsoft社製）を用いて、連鎖、ハプロタイプ頻度、およびハーディ・ワインベルグ平衡について統計解析を行い、連鎖不平衡係数（D'、r2）を算出した。【０１２８】
（４）細胞培養およびRNA抽出
HEK293細胞、軟骨を形成するHCS-2/8細胞、およびOUMS-27細胞を、10%ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地中で37℃、5% CO2の条件で培養した。正常ヒト関節軟骨（NHAC-kn；Cambrex社製）を購入し、キットに付属の培地で培養した。RACE法、RT-PCR法、およびノーザンブロット法に用いるmRNAはFastTrack 2.0キットInvitrogen社製）を用いて培養細胞から抽出した。total RNAはIsogen（ニッポンジーン社製）およびSV Total RNA Isolation System（プロメガ社製）を用いて培養細胞から抽出した。軟骨組織のtotal RNAはRNeasy Lipid Tissueキット（Qiagen社製）を用いて抽出した。プロトコールはすべて、メーカーの説明書に従った。【０１２９】
（５）RACE法、RT-PCR法、およびリアルタイムPCR法
SMART RACE cDNA Amplificationキット（Clontech社製）を用いてメーカーのプロトコールに従い5'-RACEおよび3'-RACEを行った。正常ヒト関節軟骨から抽出したmRNA 1μgをRACEの鋳型として使用した。多組織cDNAパネル（Clontech社製）から軟骨以外のさまざまな組織のcDNAを取得した。Multiscribe逆転写酵素およびオリゴdTプライマー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、RT-PCR法およびリアルタイムPCR法で使用する軟骨および細胞株由来のcDNAを合成した。ABI PRISM 7700 sequence detectorとQuantitect SYBR Green PCRキット（Qiagen社製）を用いて、メーカーの説明書に従い、リアルタイム定量PCRを行った。【０１３０】
本実験で使用したプライマーを以下に示す。
5'-RACE：  ctcactgctgacgttgaagctgtttacc  （配列番号３）
Nested 5'-RACE：gtgtccaccagaaacacaacatctccc  （配列番号４）
3'-RACE：tgggcagagctcagggaaattgccagta  （配列番号５）
Nested 3'-RACE：agaagctgcggcaggaactctgtgatac  （配列番号６）
Real-time PCR, forward：gcggcaggaactctgtgata  （配列番号７）
Real-time PCR, reverse：atgtcaagccccaagatgac  （配列番号８）【０１３１】
（６）ルシフェラーゼアッセイ
プロモーター活性を測定するため、ゲノムDNAを鋳型として用いてDIVAの−342〜＋34番目の塩基（転写開始点を＋１とする）に相当するDNAフラグメントをPCRで増幅し、pGL3 basicベクター（プロメガ社製）に5'→3'の向きで挿入した。TranslT-293（HEK293細胞)またはTranslT-LT1（その他の細胞）試薬（Mirus社製）を用いて、構築したpGL3ベクター0.4 μg、およびpRL-TKベクター4 ng（内部コントロールとして）を細胞（5 × 104個）にトランスフェクトした。48時間後に細胞を回収し、ピッカジーンDual Sea Pansyシステム（東洋インキ社製）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１３２】
（７）ノーザンブロット
DIVAの510〜1517番目の塩基に相当するcDNAフラグメントをpCR2.1 TOPOベクター（Invitrogen社製）に挿入した。DIG RNA標識キット（Roche社製）を用い、構築したベクターからDIG標識プローブを合成した。正常ヒト関節軟骨、HCS-2/8、およびOUMS-27のmRNA各4 (gの電気泳動を行った。メンブレンへの転写、ハイブリダイゼーション、およびバンドの検出は、DIG Easy HybとDIG Wash and Block Bufferセット（Roche社製）を用い、メーカーの説明書に従って行った。【０１３３】
（８）免疫沈降
DIVAの全コード領域をpTriEx4ベクター（Novagen社製）に挿入した。このベクターは、アミノ末端にS-tagを融合したDIVAを哺乳類細胞で発現する。このベクターまたはインサートを含まないpTriEx4（コントロールのS-tag融合人工タンパク質を発現する）を、HCS-2/8細胞またはHEK293細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞のライセートを回収し、S-proteinアガロース（Novagen社製）を用い、メーカーの説明書に従って免疫沈降を行った。SDS-PAGE後、アプロサイエンス社でのMALDI/TOF質量分析法により、または、抗(チューブリン抗体（Santa Cruz社製）およびS-protein-HRP（Novagen社製）を用いたウエスタンブロット法により、目的とするタンパク質のバンドを分析した。【０１３４】
（９）遺伝子組換えタンパク質および固相結合実験
Rosetta (DE3) pLacI（Novagen社製）をpTriEx4-DIVAで形質転換し、Overnight Express Autoinduction System（Novagen社製）で培養した。BugBuster Protein Extraction Reagent（Novagen社製）を用いて遺伝子組換えDIVAタンパク質を抽出し、Protein Refoldingキット（Novagen社製）を用いて非可溶性画分をリフォールディングした。50 μg/mL S-tag融合遺伝子組換えDIVAタンパク質を含む50 mM NaHCO3バッファー（pH 9.6）100 μlでMaxisorp ELISAプレート（Nunc社製）のウェルを4℃で一晩処理し、コーティングした。その後、5%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS溶液100μlでウェルを1時間ブロッキングした後、ウシ・チューブリン（Cytoskeleton社製）5μgを添加した5% BSAを含むPBS溶液（全量100μl）中で4℃で一晩インキュベートした。ウェルをTBST（20 mM Tris-HCl［pH 7.5］、137 mM NaCl、0.05% Tween 20）で3回洗浄し、抗βチューブリン-HRP抗体（Santa Cruz社製）と1時間インキュベートした。TBSTで5回洗浄した後、TMB Peroxidase EIA Substrateキット（Biorad社製）を用い、結合したチューブリンを測定した。【０１３５】
（１０）DIVA抗体の作製
（９）のDIVA大腸菌組み換えタンパクの全長もしくは部分タンパクを抗原として，抗体の作製を行った．まずジーンフロンティア社に委託して，HuCALファージライブラリーを用いたスクリーニングによるモノクローナル抗体の作製を行った．また，ペプチド研究所に委託して，ウサギに免疫する手法によるポリクローナル抗血清の作製を行った．いずれの抗体・抗血清も抗原タンパクに対してELISAにて反応する事は、各委託会社にて確認された。【０１３６】
（Ｂ）結果
（１）全ゲノムスクリーニング
変形性膝関節症群94例および対照群658例（セットA）について全ゲノム連鎖解析を行った（Ozaki, K., Y. Ohnishi, et al. (2002). Nat Genet 32(4): 650-4）。JSNPデータベースから抽出した99,295個の一塩基多型（SNP）の遺伝子型を解析した（Haga, H., R. Yamada, et al. (2002). J Hum Genet 47(11): 605-10）。データの質を確認した後、79,763個のSNPの結果を症例群と対照群で比較した。遺伝子型、優性、劣性、およびアレル頻度のモデルでχ2検定を行い、4つのモデルすべてでP値が0.01未満となる2,153個のSNPを同定した。次いで、変形性膝関節症群646例および対照群631例からなる独立した集団（セットB）を用いて2,153個のSNPの遺伝子型を解析したところ、SH3BP5のイントロン領域のrs3773472が強い関連性を示すことが明らかになった（アレル頻度のモデルでP = 0.000017；表1）。ボンフェローニ補正後に多重比較しても、この結果は依然として有意であった（0.000017 ( 2,153 = 0.037）。そこで、rs3773472周辺領域のSNPについて検討することとした。【０１３７】
（２）連鎖不平衡解析およびタグ付け
国際ハップマッププロジェクトのデータベース（http://hapmap.org、release #21a）を検索し、rs3773472とのD'値が0.7を超え、マイナーアレル頻度が0.1を超えるSNPを選択した。rs3773472周辺の連鎖不平衡（LD）のブロックには、HapMap SNP 40個、バリデーション済みの遺伝子2個（SH3BP5、CAPN7）、および予測遺伝子1個（LOC344875）が含まれていた。次いで、r2値が0.9を超えるSNP 40個すべてをカバーするタグSNP 12個（rs3773472を含む）を選択した。セットB集団を用いてタグSNPの遺伝子型を解析し、rs3773472よりも変形性膝関節症と強く関連しているSNPを明らかにした（rs7639618、アレル頻度のモデルでP = 7.3 ( 10-8；表2）。感受性アレルrs7639618のオッズ比は1.54（95%信頼区間 = 1.32〜1.81）であった。【０１３８】
（３）交絡因子の検討
年齢、体格指数（BMI）、および性別などの交絡因子が変形性膝関節症と見かけ上の相関を示す可能性があるか否かを検討するため、年齢、体格指数（BMI）、および性別などの交絡因子の影響について検討した。平均年齢、BMI、および性別の分布に関して、rs7639618の遺伝子型によって有意な差はみられなかった（表3）。ゲノム対照法（Pritchard, J. K. and N. A. Rosenberg (1999). Am J Hum Genet 65(1): 220-8；及びFreedman, M. L., D. Reich, et al. (2004). Nat Genet 36(4): 388-93）を用いて集団の層別化の影響についても検討したが、rs7639618が正の相関を示す原因であるとは考えられなかった（表4）。【０１３９】
（４）反復試験
相関を確認するために、膝関節のX線検査で変形性膝関節症集団または対照集団に分類した独立コホートを用いて反復試験を行った。変形性膝関節症群242例および対照群485例（セットC）を用いてrs7639618の遺伝子型を解析したが、その結果も有意であった（P = 0.038；表5）。次いで、rs7639618が変形性膝関節症だけでなく変形性股関節症とも関連しているかを検討した。変形性股関節症803例を登録してrs7639618の遺伝子型を解析し、セットBの対照群の結果と比較した。rs7639618の変形性股関節症との関連は、有意差に関して境界域であった（P = 0.062；表6）。日本では股関節臼蓋形成不全が変形性股関節症の主な素因であるので（Nakamuraら1989）、臼蓋形成不全の存在により層別化して解析したところ、臼蓋形成不全がみられなくてもrs7639618と変形性股関節症は有意に関連していることが明らかになった（P = 0.037）。【０１４０】
（５）DIVAの同定
NCBIのゲノムデータベース（build 36.2）によると、rs7639618はLOC344875遺伝子内にある。LOC344875のRefSeq転写産物（XM#497913）は、コンピューターでシミュレーションした予想とESTのみに基づく。したがって、正常ヒト関節軟骨cDNAを鋳型として用いたRACE法およびRT-PCR法により転写産物の完全配列を決定することにし、その結果、XM#497913以外の新規な転写産物を同定した（図1）。PROMOTER SCANプログラム（Prestridge 1995）によると、図１に示した転写開始部位（TSS）上流の1,000塩基対がプロモーター領域であると予想された。したがって、5'-RACE法によって複数のTSSを発見したが、図1に示したTSSが主要な転写開始部位であった。ルシフェラーゼアッセイにより、このTSSの上流領域がプロモーター活性を有することも確認した（図2）。この転写産物の長さは2,250塩基対であり、1,098塩基対のオープン・リーディング・フレーム（ORF）が含まれていた。この塩基配列から予想されるタンパク質は276アミノ酸から構成される。タンパク質のモチーフ解析用プログラム、Pfam（Finnら2006）およびPSORT（Nakaiら1999）から、このタンパク質はシグナルペプチドを持たないが、フォンウィルブランド因子ドメインA（VWAドメイン）とホモロジーを有する2つのドメインを持つことが予想された。本発明者らは、Dual Intracellular Von Willebrand（2個の細胞内フォンウィルブランド）因子ドメインAにちなんでこの新規遺伝子をDIVAと命名した。r2 > 0.9でrs7639618と関連していたHapMap SNP 17個すべてがDIVA内部またはDIVA周辺に位置していたので、DIVAはSH3BP5およびCAPAN7よりも変形性関節症の関連遺伝子である可能性が高い。DIVA転写産物の発現およびサイズを確認するために軟骨細胞mRNAを用いたノーザンブロットを行ったところ、
バンドが予想サイズと一致することが示された（図3a）。【０１４１】
（６）DIVAの発現プロファイル
DIVAの特徴を明らかにするため、リアルタイムPCRにより、各種ヒト組織でのDIVAの発現を検討した。DIVAは正常な軟骨組織および変形性関節症の軟骨組織で最も高発現していた（図3b）。この結果はDIVAの機能が軟骨組織と関連していることを示唆している。【０１４２】
（７）疾患原因SNPの探索
変形性関節症と関連している機能性SNPを同定するため、変形性膝関節症患者48例のゲノムDNAを使ったダイレクトシーケンスにより、DIVAの全エクソン内およびその周辺のSNPを探索した。HapMapデータベースの21個のSNP以外に、この実験ではさらに4個のSNPを発見した（表7）。DIVA領域内のこれらSNP 25個すべてを用いた対比較でr2値を算出し、r2 > 0.95であるタグSNPを選択した。既に遺伝子型が解析されていた4個のSNP（rs826428、rs353093、rs7639618、rs618762）以外に3個のSNPを選択し、遺伝子型を解析した。これらのタグSNPのうち、rs9864422はrs7639618よりも変形性膝関節症と強く関連していた（アレル頻度のモデルでP =2.4 ( 10-8；表8）。それ以外にrs9864422とr2 > 0.95で関連しているSNPはなかった。【０１４３】
（８）ハプロタイプ解析
連鎖不平衡ブロック全体のSNP 12個を含む第一のタグSNPのセット、およびDIVA領域内のSNP 7個を含む第二のタグSNPのセットを用いてハプロタイプ関連解析を行った（表9）。rs9864422またはrs7689618よりも低いP値を示したハプロタイプは存在しなかった。この結果は、これまでに遺伝子型が解析されたSNPの中にはrs9864422またはrs7689618よりも変形性膝関節症と強く関連しているSNPは存在しないことを示唆する。アレルの機能的な違いをさらに解析するため、変形性関節症と関連しているSNPの候補として、最も強く関連しているSNP（rs9864422）および強く関連している2つのミスセンスSNPrs7639618、rs11718863）を選択した。【０１４４】
（９）チューブリンとの結合、およびミスセンスSNPのアレルによる違い
まず、ミスセンスSNPの機能について検討した。rs11718863およびrs7639618は3つのハプロタイプを生じさせたが、そのうち2つが強く関連していた（表10）。DIVAの結合相手を明らかにするため、免疫沈降を行った。DIVAをトランスフェクトしてS-tagを用いて精製した後、S-tag-DIVAが発現しているときにみられる特異的なバンドを確認した（図4a）。MALDI/TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型）質量分析法により、このバンドはβチューブリンに相当することが明らかになった。免疫沈降およびウエスタンブロット法により、DIVAとチューブリンの結合を確認した（図4b）。次いで、チューブリンとDIVAの各アイソフォームの結合力を検討した。2個のミスセンスSNPの組み合わせからなる4種のハプロタイプに相当するS-tag融合遺伝子組換えタンパク質を作製し（図4c）、チューブリンを用いて固相結合実験を行った。DIVAのアイソフォームは4種すべてがチューブリンと結合した。DIVA-169Y-260C型の結合力は、他の3種のアイソフォームよりも有意に弱かった（図4d）。DIVA-169Y-260C型は、変形性膝関節症患者集団で過剰発現しているアイソフォームでもあった（表10）。【０１４５】
（１０）ヒト軟骨細胞におけるDIVA遺伝子の機能
ヒト軟骨細胞におけるDIVA遺伝子の機能を調べるために、ヒト軟骨細胞株OUMS-27細胞を用いて、２型コラーゲン（COL2A1）やアグリカン(AGC1)など軟骨の初期分化マーカー遺伝子の発現に対するDIVA遺伝子の作用を検討した。【０１４６】
まず、DIVA特異的siRNAを用いて、内在性のDIVAの機能を調べた。DIVA特異的siRNA（Si3: GUAGACAGUUCAACUAGCATT (sense) （配列番号９）とUGCUAGUUGAACUGUCUACTT (antisense) （配列番号１０） をアニーリングしたもので、3'のTTはオーバーハング）は宝酒造ホームページ内siRNA design support system（http://www.takara-bio.co.jp/rnai/intro.htm）を用いて設計した。コントロールsiRNAはDIVAやそれ以外の遺伝子のいずれともマッチしない配列を設計して使用した。細胞を12-well plateに5 x 105 cells/wellになるように蒔き、10% FBS、penicillin/streptomycinを含む培地中で24時間培養し、siRNAをTransIT-TKO (宝酒造) を用いてトランスフェクションした。24時間培養後の細胞からtotal RNAを抽出し、2型コラーゲン、アグリカン遺伝子の発現をリアルタイムPCR法にて定量した。その結果、DIVA特異的siRNAは2型コラーゲン、アグリカン遺伝子の発現を有意に上昇させた（図５）。したがって、内在性のDIVAはOUMS-27における軟骨分化を負に制御していると考えられた。【０１４７】
上記のDIVA機能の確認のために、OUMS-27細胞にDIVA遺伝子を強制発現させ、２型コラーゲン（COL2A1）やアグリカン(AGC1)など軟骨の初期分化マーカー遺伝子の発現に対するDIVA遺伝子の作用を検討した。DIVA、及び軟骨マーカー遺伝子の発現は、10μgのベクターのトランスフェクション後のタイムコースを検討し至適化した後、24時間後にリアルタイムPCR法にて定量した。その結果、DIVA遺伝子の発現により、軟骨マーカー遺伝子の発現は有意に低下した（図６）。【０１４８】
以上より、DIVAは軟骨分化を負に制御する機能を持つことがわかった。以上の結果より、DIVAの発現や作用を抑制する化合物が関節軟骨における軟骨分化を促進させることで、変形性関節症治療薬となる可能性があることが示された。【０１４９】
（１１）DIVA抗体を用いたウエスタンブロッティング
DIVA大腸菌組み換えタンパクを抗原として作成したモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。抗原タンパク 100ngをSDS-PAGEで泳動し、PVDF膜にトランスファーした後に10% BSAもしくはブロックエースにてブロッキングし、モノクローナル抗体は5 mg/mlで、ポリクローナル抗体は10000倍希釈で反応させた。結果を図７に示す。いずれも予想されるサイズにバンドを得る事ができ、目標とする抗原に対する抗体を作成できた事が示された。【０１５０】
（Ｃ）考察
（１）DIVAの予想される機能
DIVAタンパク質はVWAドメインとホモロジーを有する2つのドメインを持つ。通常、VWAドメインは細胞接着およびタンパク質間相互作用に関与する。MATN3（OMIM 602109）のVWAドメインに突然変異が生じると、変形性関節症および骨軟骨異形成症が引き起こされる。VWAドメインを持つタンパク質の大部分は細胞外に存在するが、細胞内に存在するものもあり、転写、DNA修復、リボソーム輸送、および膜輸送などの機能に関与する（Whittakerら2002）。上記から、DIVAはチューブリンなどのタンパク質と結合して、細胞内輸送を支援する機能を担っていると考えられる。【０１５１】
（２）DIVAとチューブリンの結合
上記実施例においては、DIVAはチューブリンと相互作用すること、並びに強く相関している2つのミスセンスSNPのアレルによってその結合力が異なることが示された。これらのSNPはVWAドメインであると予想される領域内に存在するので、これらのSNPがDIVAの結合に影響を及ぼす可能性が高い。変形性関節症患者で過剰発現しているDIVAのアイソフォームはチューブリンとの結合力が弱いことが示されたことから、DIVAとチューブリンの間の相互作用によって、変形性関節症の発症から関節が保護されている可能性がある。チューブリンとの相互作用は、DIVA の169Y-260C型アイソフォームだけが弱く、他の3種のアイソフォームは同等であった。したがって、DIVAとチューブリンとの結合ではSNP 2個が共同で機能し、SNP 1個だけでは機能しないと考えられる。【０１５２】
（３）チューブリンおよび変形性関節症
タンパク質の輸送と分泌では、チューブリンおよび微小管が不可欠な役割を果たす。微小管は軟骨細胞の分化を調節することも報告されている。微小管を脱重合させる化合物であるコルヒチンを添加すると、軟骨細胞のコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの量が減少する（Farquharson, C., D. Lester, et al. (1999). Bone 25(4): 405-12）。ラット変形性関節症誘発モデルの軟骨では、チューブリンの有意な減少がみられる（Capin-Gutierrez, N., P. Talamas-Rohana, et al. (2004). Histol Histopathol 19(4): 1125-32.）。これらの論文では、チューブリンおよび微小管が変形性関節症の発症機序に関与している可能性があることが示唆されている。DIVAはチューブリンの軟骨形成能を調節することにより変形性関節症の発症のしやすさに影響を及ぼす可能性がある。【０１５３】
【表１】
2009017052.tif 000002
【０１５４】
【表２】
2009017052.tif 000003
【０１５５】
【表３】
2009017052.tif 000004
【０１５６】
【表４】
2009017052.tif 000005
【０１５７】
【表５】
2009017052.tif 000006
【０１５８】
【表６】
2009017052.tif 000007
【０１５９】
【表７】
2009017052.tif 000008
【０１６０】
【表８】
2009017052.tif 000009
【０１６１】
【表９】
2009017052.tif 000010
【０１６２】
【表１０】
2009017052.tif 000011
【０１６３】
【表１１】
2009017052.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明によれば、DIVA遺伝子の疾患感受性多型を検査（遺伝子診断、血液診断等）することによって、変形性関節症の疾患感受性の診断が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、ヒトDIVA遺伝子の塩基配列、および推定アミノ酸配列を示す。フォンウィルブランド因子ドメインAとホモロジーを有する2つのドメインを下線で示す。終止コドンは＊印、polyAシグナルは四角で示す。
【図２】図２は、HEK293細胞 (a) およびHCS-2/8細胞 (b) でのDIVAプロモーターの転写活性を示す。
【図３】図３は、DIVAの発現を示す。(a)はヒト軟骨細胞のノーザンブロットを示す。(b)は各ヒト組織におけるDIVAの発現を示す。DIVAは軟骨特異的に発現している。データはDIVA mRNAとグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAの発現量の比の平均値 ( 標準誤差で示してある。
【図４】図４は、DIVAとチューブリンとの結合を示す。(a)は、S-proteinでサンプルを免疫沈降し、SDS-PAGE後に銀染色して検出した結果を示す。矢印はMALDI/TOF質量分析法で確認したβチューブリンのバンドの位置を示す。(b)は、DIVAとチューブリンとの結合をウエスタンブロット法で確認した結果を示す。(c) は、予想されるサイズの遺伝子組換えDIVAタンパク質が発現していることをSDS-PAGE後のクマシー染色で確認した結果を示す。「Y-C」は169番目がTyr、260番目がCysであることを意味する。(d)は、DIVAアイソフォームの結合力を固相結合実験で測定した結果を示す。マイクロプレートのウェルを遺伝子組換えDIVAタンパク質またはコントロールのタンパク質でコーティングし、ウシチューブリンの存在下または非存在下でインキュベートした。データは２回のアッセイでの平均値 ( 標準偏差で示してある。実験は３回繰り返したが、同様の結果が得られた。*P < 0.01（Studentのt検定）
【図５】図５は、DIVA特異的siRNAを用いて、DIVA、2型コラーゲン、及びアグリカン遺伝子の発現をリアルタイムPCR法で定量したその結果を示す。
【図６】図６は、OUMS-27細胞にDIVA遺伝子を強制発現させ、２型コラーゲン（COL2A1）及びアグリカン(AGC1)の発現に対するDIVA遺伝子の作用を検討した結果を示す。
【図７】図７は、DIVA抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図１】
2009017052.tif 000013
【図２】
2009017052.tif 000014
【図３】
2009017052.tif 000015
【図５】
2009017052.tif 000016
【図６】
2009017052.tif 000017
【図４】
2009017052.tif 000018
【図７】
2009017052.tif 000019
【配列表】
2009017052000001.app
【国際調査報告】
2009017052.tif 000020
2009017052.tif 000021
2009017052.tif 000022
2009017052.tif 000023
2009017052.tif 000024
2009017052.tif 000025
2009017052.tif 000026