(57)【要約】  グルコース残基数の多い、長鎖のイソマルトオリゴ糖を合成することのできる酵素タンパク質とそれを用いたイソマルトオリゴ糖の製造方法を提供する。  以下の酵素学的性質を有するイソマルトオリゴ糖合成酵素：ａ）バチルス属細菌によって生成される、ｂ）イソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させる活性を有する、及びｃ）グルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が５〜１２であるイソマルトオリゴ糖を合成する。本発明のイソマルトオリゴ糖合成酵素は、９０％以上、実際には９９％を越える極めて高い転移効率をもって、グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するイソマルトオリゴ糖合成酵素：
ａ）バチルス属細菌によって生成される、
ｂ）イソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させる活性を有する、及び
ｃ）グルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が５〜１２であるイソマルトオリゴ糖を合成する。
【請求項２】
α―１，６グルカン鎖の伸展がイソマルトオリゴ糖へグルコースをα―１，６結合で転移させる反応による、請求項１に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。
【請求項３】
９０％以上の転移効率でイソマルトオリゴ糖へグルコースを転移させる、請求項１又は２に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素をコードする核酸。
【請求項６】
配列番号２に示される塩基配列、又は配列番号２に示される塩基配列に相補する塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の核酸を含む組み換えベクター。
【請求項８】
請求項５若しくは６に記載の核酸、又は請求項７に記載の組み換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を製造する方法であって、１）請求項１〜４の何れかに記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素を用意する工程、２）グルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖と１）のイソマルトオリゴ糖合成酵素とを反応させる工程、及び３）グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列の２１２番目〜２２４番目のアミノ酸を除くその他の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコース残基数が３〜５のイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を合成する、請求項４に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。
【請求項１１】
配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列の２１７番目〜２２１番目のアミノ酸を除くその他の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコース残基数が３〜５のイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を合成する、請求項４に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。
【請求項１２】
グルコース残基数が６のイソマルトオリゴ糖を製造する方法であって、１）請求項１０又は１１に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素を用意する工程、２）グルコース残基数が３、４又は５であるイソマルトオリゴ糖と１）のイソマルトオリゴ糖合成酵素とを反応させる工程、及び３）グルコース残基数が６以下のイソマルトオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させて、５〜１２のグルコース残基数からなるイソマルトオリゴ糖を合成する酵素、及び該酵素を用いるイソマルトオリゴ糖の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ糖は、単糖類が２個以上グリコシド結合でつながった糖の総称である。２糖類の典型例は、スクロースやマルトースなどの消化性オリゴ糖であるが、この様なヒトが消化吸収してエネルギー源として利用できるオリゴ糖ではなく、例えば難消化性オリゴ糖であるキシロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等が有する、腸内細菌の一種であるビフィズス菌の割合を増加させるなどの生理機能が注目されている。中でも、イソマルトースやパノース (α−１，４−イソマルトシル−グルコース）、イソマルトトリオース 、α−１，４−イソマルトシル−マルトース、イソマルトテトラオース等のイソマルトオリゴ糖は、整腸作用等の機能性に優れたオリゴ糖として知られている。【０００３】
イソマルトオリゴ糖は、澱粉をα−アミラーゼで液化する際に、α−アミラーゼでは加水分解できないアミロペクチン由来のα−１, ６−グルコシド結合を有するオリゴ糖として生成される他、グルコアミラーゼの逆反応によっても生成されることが知られている。また、イソマルトオリゴ糖を積極的に製造する方法としては、澱粉をα−アミラーゼで液化した後、β−アミラーゼとプルラナーゼ及びα−グルコシダーゼと呼ばれる３種類の酵素を作用させ、イソマルトオリゴ糖を約５０％含有する糖化液を得、イオン交換樹脂を用いたクロマト分離により含有率を８５％以上に高める方法が知られている（非特許文献１）。また、糖ヌクレオチドを糖供与体とし、グリコシルトランスフェラーゼの転移活性を用いてイソマルトオリゴ糖を製造する方法、あるいはα−グルコシダーゼを用いて２乃至３糖のイソマルトオリゴ糖同士を転移反応により連結させて、より糖残基数の多いイソマルトオリゴ糖を製造する方法などが知られている（非特許文献２）。【０００４】
しかしながら、糖ヌクレオチドを利用する製造法では、それ自身を調製するためにまた別の酵素を必要とするためにコスト的に不利であり、またα−グルコシダーゼを用いた糖転移反応は、転移位置の特異性が低いために多種類のオリゴ糖が生じてしまい、所望のイソマルトオリゴ糖の単離精製が困難になるなどの問題が指摘されている（非特許文献３）。
【非特許文献１】谷村顕雄監修、「植物資源の生理活性物質ハンドブック」、１９９８年、第４１１−４１７頁、株式会社サイエンスフォーラム発行
【非特許文献２】糖鎖工学研究協議会監修、「糖鎖工学」、１９９２年、第５０６頁、産業調査会発行
【非特許文献３】新家 龍ら、「糖質の科学」、１９９８年、第６０頁、朝倉書店発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、イソマルトオリゴ糖の製造に利用することのできる、イソマルトオリゴ糖に対する糖転移活性の高い酵素タンパク質と、このタンパク質を用いてイソマルトオリゴ糖を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、新規なバチルス属細菌を土壌から単離することに成功し、このバチルス属細菌がイソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させる活性を有する新規な酵素タンパク質を生成することを見いだし、下記の各発明を完成した。【０００７】
（１）以下の酵素学的性質を有するイソマルトオリゴ糖合成酵素：
ａ）バチルス属細菌によって生成される、
ｂ）イソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させる活性を有する、及び
ｃ）グルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が５〜１２であるイソマルトオリゴ糖を合成する。【０００８】
（２）α―１，６グルカン鎖の伸展がイソマルトオリゴ糖へグルコースをα―１，６結合で転移させる反応による、（１）に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。【０００９】
（３）９０％以上の転移効率でイソマルトオリゴ糖へグルコースを転移させる、（１）又は（２）に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。【００１０】
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、（１）〜（３）のいずれかに記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。【００１１】
（５）（１）〜（４）の何れかに記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素をコードする核酸。【００１２】
（６）配列番号２に示される塩基配列、又は配列番号２に示される塩基配列に相補する塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる、（５）に記載の核酸。【００１３】
（７）（５）又は（６）に記載の核酸を含む組み換えベクター。【００１４】
（８）（５）若しくは（６）に記載の核酸、又は（７）に記載の組み換えベクターによって形質転換された宿主細胞。【００１５】
（９）グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を製造する方法であって、１）（１）〜  （４）の何れかに記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素を用意する工程、２）グルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖と１）のイソマルトオリゴ糖合成酵素とを反応させる工程、及び３）グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。【００１６】
（１０）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列の２１２番目〜２２４番目のアミノ酸を除くその他の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコース残基数が３〜５のイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を合成する、（４）に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。【００１７】
（１１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列の２１７番目〜２２１番目のアミノ酸を除くその他の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコース残基数が３〜５のイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を合成する、（４）に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素。【００１８】
（１２）グルコース残基数が６以下のイソマルトオリゴ糖を製造する方法であって、１）（１０）又は（１１）に記載のイソマルトオリゴ糖合成酵素を用意する工程、２）グルコース残基数が３、４又は５であるイソマルトオリゴ糖と１）のイソマルトオリゴ糖合成酵素とを反応させる工程、及び３）グルコース残基数が６以下のイソマルトオリゴ糖を回収する工程を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のイソマルトオリゴ糖合成酵素は、９０％以上、実際には９９％を越える極めて高い転移効率をもって、グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を製造することができる。したがって、オリゴα−１，６−グルコシダーゼ等の既知の酵素タンパク質を用いた場合には製造が困難な、グルコース残基数の多い長鎖イソマルトオリゴ糖を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＫＭ−１３株を各種炭素源で培養したときの増殖の様子を示すグラフである。
【図２】ＫＭ−１３株を各種炭素源で培養したときのｐＮＰ−Ｇからｐ−ニトロフェノールを遊離させる活性の発現を表すグラフである。
【図３】２回目のフェニルトヨパール６５０で処理したＩＭＯＳ−ＳＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。図左レーンは分子量マーカーであり、図右レーンの矢印がＩＭＯＳ−ＳＴである。
【図４】ＩＭＯＳ−ＳＴによるｐＮＰ−Ｇの分解活性の測定において、ｐ−ニトロフェノールとグルコースの生成速度を示すグラフである。
【図５】ＩＭＯＳ−ＳＴのｐＮＰ−Ｇに対するグルコース残基の転移効率（％）を示すグラフである。
【図６】ＩＧ３とＩＭＯＳーＳＴをインキュベートして得られる反応生成物をＴＬＣ分析した結果を示す。図中の矢印がＩＧ３のスポット位置を示し、その上にＩＧ２のスポットが、ＩＧ３のスポットの下にＩＧ４〜ＩＧ７の各スポットが検出された。
【図７】ＩＧ４、ＩＧ７並びにデキストランＴ２０００とＩＭＯＳ−ＳＴをインキュベートして得られる反応生成物をＴＬＣ分析した結果を示す。図中、左がＩＧ４、中央がＩＧ７、右がデキストランＴ２０００であり、左端の矢印がＩＧ４のスポットの位置を、中央下にある矢印がＩＧ７のスポットの位置をそれぞれ示す。
【図８】ＩＧ３と、ＩＭＯＳ−ＳＴ、Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ又はＬｏｏｐ４−ｂａｃｋとをインキュベートして得られる反応生成物をＴＬＣ分析した結果を示す。図中の矢印がＩＧ３のスポット位置を示す。
【図９】ＩＧ５と、ＩＭＯＳ−ＳＴ、Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ又はＬｏｏｐ４−ｂａｃｋとをインキュベートして得られる反応生成物をＴＬＣ分析した結果を示す。図中の矢印がＩＧ５のスポット位置を示す。
【図１０】ＩＧ７と、ＩＭＯＳ−ＳＴ、Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ又はＬｏｏｐ４−ｂａｃｋとをインキュベートして得られる反応生成物をＴＬＣ分析した結果を示す。図中の矢印がＩＧ７のスポット位置を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のイソマルトオリゴ糖合成酵素は、以下のａ）〜ｃ）に示される酵素学的性質を有するイソマルトオリゴ糖合成酵素である。
ａ）バチルス属細菌によって生成される、
ｂ）イソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させる活性を有する、及び
ｃ）グルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖から、グルコース残基数が５〜１２であるイソマルトオリゴ糖を合成する。【００２２】
本発明のイソマルトオリゴ糖合成酵素を合成する微生物の例としては、北海道伊達市の土の中から、ブルーデキストランを含む寒天平板培地上にハロー（ｈａｌｏ）を形成する微生物の一つとして、さらにグルコース残基数が７以上のイソマルトオリゴ糖を合成する微生物として単離された微生物を挙げることができる。この微生物は桿菌で、運動性があり、胞子形成能を有しており、またグラム染色性は陽性であり、ＬＢ寒天培地上で増殖し、淡いピンク色のコロニーを呈することが確認された。【００２３】
さらに、この微生物の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を解析したところ、その塩基配列はバチルス属由来の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に対して高い相同性を示し、中でもＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓ ＴＦ１２株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列に対して９８．７％ の相同率を示した。しかしながら、この微生物由来の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓ ＴＦ１２株のそれとは完全に一致せず、簡易分子系統解析における検体とＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓの系統枝と周囲に形成されるＢａｃｉｌｌｕｓ各種の系統枝を比較した結果、同種となる可能性が低いと考えられること、さらにオキシダーゼ反応が陽性を示すこと、ｐH９で生育し、マンニトールおよびマンノースを酸化し、５−ケトグルコネートを酸化しないこと等がＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓ ＴＦ１２株と異なっていた。【００２４】
以上から、単離された微生物は既知のバチルス属細菌には分類されない、新規なバチルス属細菌であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１３株として同定した。以下、バチルス・エスピー．ＫＭ−１３株をＫＭ−１３株と表す。【００２５】
ＫＭ−１３株は、振盪培養法あるいは通気撹拌培養法等の、バチルス属細菌を好気的に培養する一般的な条件下で増殖させ得る。培地は、例えばペプトン、ポリペプトン、バクトトリプトン等のカゼイン分解物、ソイトン等の大豆タンパク質分解物又はカザミノ酸等の適当な窒素源と、例えばデキストラン、スクロース、グルコース、グリセリン等の適当な炭素源とを、さらに必要に応じてビタミン類やリン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナトリウム、微量金属等のミネラル類を含むことができる。【００２６】
このＫＭ−１３株は、上記の通り、比較的単純な選択方法によって土壌等から単離することができたことから、ＫＭ−１３株と分類学的な諸特徴が実質的に一致するバチルス属細菌や、幾つかの分類学的な特徴がＫＭ−１３株の対応する特徴と一致しないバチルス属細菌は、土壌等の天然資源から上記の選別法若しくはこれに類する方法によって単離され得るものと考えられ、その様なバチルス属細菌は、後述する特徴を有する本発明のイソマルトオリゴ糖合成酵素を合成することができる微生物であることが期待される。本発明は、この様なバチルス属細菌によって生成されるイソマルトオリゴ糖合成酵素を含む。【００２７】
以下、本発明のイソマルトオリゴ糖合成酵素をＩＭＯＳ−ＳＴと表し、ＩＭＯＳ−ＳＴの調製及びその酵素学的特徴を、ＭＴ−１３株とこれが生成するＩＭＯＳ−ＳＴを例として説明する。【００２８】
ＩＭＯＳ−ＳＴは、α―１，６結合を有するパノース、パラチノース、デキストラン及びイソマルトース、特にイソマルトースを特異的に加水分解する活性を示すが、マルトースやスクロース等のα―１，６結合以外の結合を有する２糖類は殆ど加水分解しない。また、ＩＭＯＳ−ＳＴは、人工基質であるｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコシド（ｐＮＰ−Ｇと表す）に作用させると、一方のｐＮＰ−Ｇからグルコース残基を他方のｐＮＰ−Ｇに転移させてｐＮＰ−Ｇ２とｐ−ニトロフェノールを生成する。すなわち、ＩＭＯＳ−ＳＴはグルコース残基の転移活性を示す。ｐ−ニトロフェノールとグルコースの遊離速度の差から、ｐＮＰ−Ｇを基質としたときグルコース残基の転移効率（％）は９９．５％と計算された。【００２９】
ＩＭＯＳ−ＳＴのもっとも有用な特徴は、ＩＧ２以上のイソマルトオリゴ糖、例えばグルコース残基数が３であるイソマルトトリオース（ＩＧ３）、グルコース残基数が４であるイソマルトテトラオース（ＩＧ４）、又はグルコース残基数が７であるイソマルトヘプタオース（ＩＧ７）に作用させると、それぞれのα―１，６グルカン鎖を伸展させて、グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を合成する点にある。この反応は、基質となるイソマルトオリゴ糖にグルコース残基をα―１，６結合で転移させる活性によって進行するものと推察される。特に、ＩＭＯＳ−ＳＴをＩＧ４及びＩＧ７に作用させると、それぞれから最終的にグルコース残基数が１１及び１２であるイソマルトオリゴ糖を合成することができる。【００３０】
ＩＭＯＳ−ＳＴのかかる特徴は、グルコース残基数が４のイソマルトテトラオースしか合成できない公知のα―グルコシダーゼ（Ｗ．Ｓａｂｕｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００６年、第１７６４巻、第６８８―６９８頁）やオリゴ１，６グルコシダーゼ（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９８２年、第７０４巻、第４７６―４８３頁、並びにＹ．Ｓｕｚｕｋｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８６年、第１５８巻、第７７―８３頁）の利用では達成することのできない、グルコース残基数が１０を越える長鎖のイソマルトオリゴ糖の合成を可能にする。【００３１】
ＩＭＯＳ−ＳＴの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分析によれば、約６６ｋＤａと推定される。またｐＮＰ−Ｇに対するグルコース残基の転移活性及びα―１，６グルカン鎖を伸展させる活性に関する最適ｐＨは、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中で７．８であり、同活性はｐＨ６．７〜１０．５の間で、また４０℃以下の温度でそれぞれ安定に保持される。また反応生成物であるイソマルトオリゴ糖は、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、質量分析その他の公知の方法を用いて検出、あるいは分離することができる。【００３２】
ＫＭ−１３株にＩＭＯＳ−ＳＴを生成させるためには、ＫＭ−１３株が増殖することのできる培地例えば、ペプトン、ポリペプトン、バクトトリプトン等のカゼイン分解物、ソイトン等の大豆タンパク質分解物又はカザミノ酸等の適当な窒素源と、デキストラン、スクロース、グルコース、グリセリン等の適当な炭素源と、さらに必要に応じてビタミン類やリン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナトリウム、微量金属等のミネラル類とを含む培地、好ましくはｐＨ３〜８、特に好ましくはｐＨ５〜７の液体培地を用いて、２０〜４０℃で１６時間〜７２時間、好ましくは３０℃で４８時間培養すればよい。特に培地中の最終濃度が０．１〜２重量％のトリプトン、培地中の最終濃度が０．１〜１重量％のデキストランを含む液体培地の使用が好ましい。デキストランは、ＫＭ−１３株によるＩＭＯＳ−ＳＴの生産量を、グルコース、フラクトースあるいはスクロースの使用したとき生産量を５０倍にまで高める。【００３３】
かかるＫＭ−１３株の培養によって、ＩＭＯＳ−ＳＴは主に培地中に生成される。従ってＩＭＯＳ−ＳＴは、ＫＭ−１３を培養した培地から遠心分離あるいは膜濃縮等により除菌して得られる上澄の形態で利用することが可能であるが、必要に応じてこれを一般的なタンパク質精製法を用いて精製して利用することが好ましい。ＩＭＯＳ−ＳＴの精製は、種々のカラムクロマトグラフィー法を当業者が適宜組み合わせることによって行うことができるが、例えば後の実施例に示されるようなカラムクロマトグラフィーの利用、特にフェニルトヨパール６５０Ｍの様な疎水性クロマトグラフィーカラムの利用が好ましい。【００３４】
ＫＭ−１３株由来のＩＭＯＳ−ＳＴは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、このタンパク質をコードするｃＤＮＡを遺伝子組み換え技術によって適当な宿主細胞に導入することで、ＩＭＯＳ−ＳＴを組み換えタンパク質としても製造することができる。配列番号１に示されるアミノ酸配列はＫＭ−１３株由来のＩＭＯＳ−ＳＴのアミノ酸配列であるが、本発明には、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、イソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させてグルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を合成する活性を有するタンパク質も含まれる。【００３５】
この様なタンパク質は、ＫＭ−１３株とは分類学的な特徴が一部相違するバチルス属微生物によっても精製され得るほか、配列番号１に示されるアミノ酸配列を人為的に改変した変異体として組み換え的に製造することもできる。本発明におけるアミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は付加に関する「１若しくは数個」とは、１〜数十アミノ酸以内、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、更に好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸残基の変化を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）で表せば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として表すことができる。【００３６】
タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。【００３７】
また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。従って、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、イソマルトオリゴ糖のα―１，６グルカン鎖を伸展させてグルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を合成する活性を有する場合もあり、この様なタンパク質は本発明の一態様として理解される。【００３８】
上記の配列番号１に示されるアミノ酸配列を人為的に改変した変異体の例として、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１２番目〜２２４番目のアミノ酸配列の全部又はその一部を他のアミノ酸配列に置換した変異体を挙げることができる。その具体例は、配列番号１７又は１８に示されるアミノ酸配列からなるＩＭＯＳ−ＳＴの変異体である。以下、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＩＭＯＳ−ＳＴの変異体をＬｏｏｐ４−Ａｌｌと、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＩＭＯＳ−ＳＴの変異体をＬｏｏｐ４−ｂａｃｋと、それぞれ表すこととする。【００３９】
Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１２番目〜２２４番目のアミノ酸配列ＳＴＰＧＧＫＫＹＤＷＧＧＤを、ＴＶＥＴＥＥＥＧＹＶＳＧＨＫに置換して得られるＩＭＯＳ−ＳＴの変異体である。この置換後のアミノ酸配列は、バチルス  セレウス由来の既知のイソマルトオリゴ糖加水分解酵素であるオリゴα−１，６−グルコシダーゼ（ＯＧａｓｅ、アミノ酸配列のアクセッションＮｏ．ＮＰ＿９８０３６０）における、活性ポケットの入り口を形成すると推定されるループ４を構成するアミノ酸配列である。また、Ｌｏｏｐ４−ｂａｃｋは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１７番目〜２２１番目のアミノ酸配列の一部であるＫＫＹＤＷを、前記ＯＧａｓｅのループ４を構成するアミノ酸配列の一部であるＥＧＹＶＳに置換した変異体である。なお、前記ＯＧａｓｅは、その全アミノ酸配列がＩＭＯＳ−ＳＴの全アミノ酸配列に対して約８０％の相同性を示す一方、ＯＧａｓｅがイソマルトオリゴ糖の加水分解を触媒する酵素であるのに対して、ＩＭＯＳ−ＳＴはイソマルトオリゴ糖の糖鎖伸展を触媒する酵素である点で、触媒機能が著しく相違する別種の酵素タンパク質である。【００４０】
Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ及びＬｏｏｐ４−ｂａｃｋは、イソマルトオリゴ糖の糖鎖伸展を触媒する活性は失わないが、ＩＭＯＳ−ＳＴと異なり、グルコース残基数が７であるイソマルトオリゴ糖を基質とせず、グルコース残基数が３〜５であるイソマルトオリゴ糖からグルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を合成する。したがって、グルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を選択的に製造する必要がある場合には、Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ又はＬｏｏｐ４−ｂａｃｋはより有利な選択肢となり得る。【００４１】
飽くまで推論であるが、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１２番目〜２２４番目のアミノ酸配列は基質となるイソマルトオリゴ糖に対する酵素タンパク質の結合ポケットの形成に関与しており、この部分のアミノ酸残基の置換によって前記結合ポケットの構造が変化し、そこに結合し得るイソマルトオリゴ糖のグルコース残基数が最大で６に制限されるようになったものと考えられる。【００４２】
この様に、ＩＭＯＳ−ＳＴは、そのアミノ酸配列の一部を置換、欠失又はアミノ酸を付加させることで、イソマルトオリゴ糖の糖鎖伸展を触媒する活性を維持しつつ、新たな機能を付加させることができる酵素タンパク質であり、こうした新たな機能が付加されたＩＭＯＳ−ＳＴの変異体も、本発明の一態様である。  【００４３】
本発明のＩＭＯＳ−ＳＴは、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、ＩＭＯＳ−ＳＴ以外の機能性タンパク質又はポリペプチドを付加させた、いわゆる融合タンパク質として製造し、又利用してもよい。この様な融合タンパク質も、本発明の一態様である。かかる融合タンパク質は、機能性タンパク質が示す機能が付加される点で、ＩＭＯＳ−ＳＴを単独で製造し、あるいは使用する場合に比べて、高められた有用性を有する。機能性タンパク質の例としては、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼその他の、融合蛋白質の製造に汎用されるタンパク質を挙げることができる。また、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ又はキチン結合配列のように、組み換えタンパク質の製造、特に組み換えタンパク質の精製を容易にする機能性ポリペプチドを利用すれば、ＩＭＯＳ−ＳＴの製造をより有利に行うことができる。【００４４】
さらに、ＩＭＯＳ−ＳＴには、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付加したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子を結合させたりすることが可能であり、あるいはＩＭＯＳ−ＳＴを不溶性担体へ結合させたりすることも可能である。こうしたタンパク質を対象とした化学的修飾法は当業者に広く知られており、本発明で使用されるタンパク質の機能を損なわない限り、どの様に修飾し、利用してもよい。【００４５】
本発明は、ＩＭＯＳ−ＳＴをコードする核酸を提供する。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡを含み、その形態としてはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。また本発明の核酸は１本鎖であっても、それに相補的な配列を有する核酸やＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該核酸は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。【００４６】
本発明の好ましい核酸はＤＮＡであり、ＫＭ−１３株が生成するＩＭＯＳ−ＳＴをコードするｃＤＮＡの塩基配列の例が、配列番号２に示される塩基配列である。また、配列番号２に示される塩基配列と相補する塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＭＯＳ−ＳＴをコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。本発明におけるストリンジェントな条件とは、塩濃度１．５Ｍを含む６５℃の緩衝液中で配列番号４に相補的な塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、５０℃の２×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）でＤＮＡを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でハイブリダイズが維持される条件をいう。また、塩基配列の同一性（％）で示せば、配列番号２の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸であればよい。【００４７】
配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、当該塩基配列情報を基に、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により、あるは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて製造することもできる。またＫＭ−１３株あるいはＩＭＯＳ−ＳＴを生成する他のバチルス属細菌から、配列番号２に示される塩基配列情報を利用したクローニング方法によって調製してもよい。例えば、バチルス属細菌から単離したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対して、配列番号２に示された塩基配列又はそれらに相補する塩基配列からなるＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーションによるスクリーニング、又はＩＭＯＳ−ＳＴに対する特異抗体を用いたイムノスクリーニング法その他の方法によって、目的の核酸を有するクローンを増幅すればよい。【００４８】
ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号２に示された塩基配列又はそれらに相補する塩基配列からなる核酸を３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）に従って行うことができる。また、イムノスクリーニング法で用いる抗体は、前記した本発明のタンパク質に対する特異抗体を使用して行うことができる。【００４９】
配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、ＩＭＯＳ−ＳＴを生成するバチルス属細菌のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。例えば、配列番号２示される塩基配列情報を基にＰＣＲプライマーを設計、合成し、ｃＤＮＡライブラリーに対して公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）に従ってＰＣＲ反応を行えばよい。【００５０】
ＩＭＯＳ−ＳＴをコードするＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み込むことができ、かかるベクターはＩＭＯＳ−ＳＴの組換え的生産に利用される。この様なタンパク質の生産用の組み換えベクターや、遺伝子治療用ベクターも本発明に含まれる。【００５１】
ＩＭＯＳ−ＳＴをコードする核酸を有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、ＩＭＯＳ−ＳＴをコードする核酸に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。【００５２】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンをＩＭＯＳ−ＳＴをコードする核酸に付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者はＩＭＯＳ−ＳＴをコードする核酸を基に任意かつ容易に加工することができる。【００５３】
またＩＭＯＳ−ＳＴをコードする核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であるが、細菌、特にエシェリヒア属細菌あるいはバチルス属細菌を用いた宿主発現系に利用可能なベクターが好ましい。利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐＥＴ―２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＥＴ―２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、等を例示することができる。【００５４】
ＩＭＯＳ−ＳＴの発現は、該タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、ＩＭＯＳ−ＳＴをコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。その様な発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主がエシェリヒア属細菌、好ましくは大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属細菌、好ましくはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓである場合にはＰ４３プロモーター，ｖｅｇＩプロモーター，ｘｙｌｏｓｅ―ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ プロモーター，ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ プロモーター等を挙げることができる。また、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに組み込む等の操作は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）を初めとする、種々の遺伝子組み換え操作を詳細に解説した実験操作マニュアル書の指示に基づいて行うことができる。【００５５】
ＩＭＯＳ−ＳＴは、例えばＦｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)やｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできるが、遺伝子組換え技術によって、前記の核酸、特に発現ベクターに組み込まれたＤＮＡを原核生物もしくは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた好適な発現系に導入することによって製造することが好ましい。【００５６】
宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の他に、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エルウニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等の微生物を挙げることができる。またカイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等の動物細胞も利用可能である。【００５７】
宿主細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記のＳａｍｂｒｏｏｋらを初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞の利用については、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）やＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８年、第６巻、第４７頁等に記載されている。【００５８】
ＩＭＯＳ−ＳＴは、前記の発現ベクターを上記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。先に述べたとおり、ＩＭＯＳ−ＳＴの精製には、疎水性クロマトグラフィー、特にフェニルトヨパール６５０Ｍの使用が好ましい。【００５９】
また、ＩＭＯＳ−ＳＴを他の機能性タンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質として発現させた場合には、その機能性タンパク質やポリペプチドに特徴的な精製法を採用することが好ましい。融合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて切断し、本発明のタンパク質を回収することができる。また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（前出のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら）で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。【００６０】
この様にＩＭＯＳ−ＳＴは、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本発明で使用されるタンパク質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。【００６１】
また、ＩＭＯＳ−ＳＴに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を挙げることができるが、特にモノクローナル抗体が好ましい。かかる抗体は、本発明で使用されるタンパク質を抗原として用いた通常の操作により、非ヒト動物を免疫し、血清を回収して、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を誘導して製造することができる。また、定法に従って、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）やテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、放射性同位元素、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素タンパク質で  標識してもよい。【００６２】
なお、上記の記載は全てＩＭＯＳ−ＳＴの変異体、例えばＬｏｏｐ４−ＡｌｌやＬｏｏｐ４−ｂａｃｋなどに対しても適用されることはいうまでもない。【００６３】
ＩＭＯＳ−ＳＴは、グルコース残基数が５〜１２であるイソマルトオリゴ糖を製造する方法に利用することができる。本発明の一態様であるこの方法は、グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を製造する方法であって、１）前記に説明したＩＭＯＳ−ＳＴを用意する工程、２）グルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖と１）のイソマルトオリゴ糖合成酵素とを反応させる工程、及び３）グルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を回収する工程を含む。【００６４】
上記の工程１）は、前記したＩＭＯＳ−ＳＴを用意する工程であり、ここでＩＭＯＳ−ＳＴはバチルス属細菌を培養した培養上澄の形態であってもよく、また精製された形態であってもよい。さらには、ＩＭＯＳ−ＳＴは単独であっても他のタンパク質との融合タンパク質の形態であってもよく、また遊離の形態でも適当な固相担体に固定化された形態であってもよい。【００６５】
上記の工程２）におけるグルコース残基数が３、４又は７であるイソマルトオリゴ糖とＩＭＯＳ−ＳＴとの反応は、バッチ式で行っても連続式で行ってもよい。反応条件はｐＨ６．７〜１０．５の間で、また４０℃以下の温度で、好ましくはｐＨ７．０〜７．５、３０℃である。【００６６】
また上記の工程３）は、上記の反応によって精製されるグルコース残基数が５〜１２のイソマルトオリゴ糖を回収する工程であり、この回収は反応液の回収、濃縮その他のイソマルトオリゴ糖を分離、精製する公知の方法によって行うことができる。【００６７】
また本発明は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＬｏｏｐ４−Ａｌｌ、又はその２１２番目〜２２４番目のアミノ酸を除くその他の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコース残基数が３〜５のイソマルトオリゴ糖からグルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を合成するイソマルトオリゴ糖合成酵素を用いてグルコース残基数が６以下のイソマルトオリゴ糖を製造する方法、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＬｏｏｐ４−ｂａｃｋ、又はその２１７番目〜２２１番目のアミノ酸を除くその他の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコース残基数が３〜５のイソマルトオリゴ糖からグルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖を合成するイソマルトオリゴ糖合成酵素を用いてグルコース残基数が６以下のイソマルトオリゴ糖を製造する方法も、提供する。【００６８】
Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ及びＬｏｏｐ４−ｂａｃｋの至適ｐＨ、ｐＨ安定性及び温度安定性は、ＩＭＯＳ−ＳＴのそれにほぼ等しく、したがってＩＭＯＳ−ＳＴを利用したイソマルトオリゴ糖の製造に関する条件は、ほぼそのままＬｏｏｐ４−Ａｌｌ及びＬｏｏｐ４−ｂａｃｋを用いたグルコース残基数が６以下であるイソマルトオリゴ糖の製造方法に適用することができる。【００６９】
以下、非限定的な実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。
【実施例】
【００７０】
＜実施例１＞
１）ＫＭ−１３株の単離
北海道伊達市の土を採取し、この土に精製水を加えて攪拌した後の上澄みを適当に希釈した後、０．４重量％のブルーデキストランＴ２０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むＴＹＰ平板培地（１重量％のトリプトン、０．５重量％の酵母エキス、０．５重量％のポリペプトン、０．５重量％のＮａＣｌを含む寒天平板培地、ｐＨ７．８）に播いて３０℃で２４時間培養した。培養後、平板培地上でハローを形成しているコロニーが２０個得られた。【００７１】
各コロニーの微生物をＴＹＰ液体培地（１重量％のトリプトン、０．５重量％の酵母エキス、０．５重量％のポリペプトン、０．５重量％のＮａＣｌを含む液体培地、ｐＨ７．８）１００ｍＬで３０℃２４時間培養した。この培養上澄の２０μＬを、１０ｍＭのＩＧ４を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加えて、３７℃で２４時間インキュベートした後、反応液をＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ社）を塗布したＴＬＣプレートにスポットし、アセトニトリル：酢酸エチル：水：１−プロパノール＝８５：２０：７０：５０（体積比）の混合溶媒を展開溶媒とし、５％硫酸を含むエタノールをＴＬＣプレートに噴霧して１１０℃で加熱することにより、グルコース残基が５以上のイソマルトオリゴ糖のスポットの有無を調べた。この作業から、グルコース残基数が１１のイソマルトオリゴ糖に相当するスポットを与えた微生物を単離した。【００７２】
２）ＫＭ−１３株の同定
１）で単離した微生物をｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ(Ｏｘｏｉｄ社)を用いて３７℃で一晩培養して得られた菌体を光学顕微鏡で肉眼観察したところ、桿菌で運動性があり、また平板培地上で淡いピンク色のコロニーを呈した。また同培地上で２４時間培養することによって菌体内に胞子を形成することが確認された。またグラム染色性は陽性であった。さらにこの微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡとして解析）の塩基配列を解析したところ、その塩基配列はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓ ＴＦ１２株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列（アクセッションＮｏ．ＡＦ４８３６２５）に対して９８．７％ の相同率を示した。この微生物由来の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓ ＴＦ１２株のそれとは完全に一致せず、簡易分子系統解析における検体とＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓの系統枝と周囲に形成されるＢａｃｉｌｌｕｓ各種の系統枝を比較した結果、同種となる可能性が低いと考えられること、さらにオキシダーゼ反応が陽性を示すこと、ｐＨ９で生育し、マンニトールおよびマンノースを酸化し、５−ケトグルコネートを酸化しないこと等がＢａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓ ＴＦ１２株と異なっていた。【００７３】
以上から、１）で単離した微生物を、既知の種に属さないバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１３株として同定した。【００７４】
３）ＫＭ−１３株の培養とＩＭＯＳ−ＳＴの精製
グルコース、フラクトース、スクロース、ＩＧ４又はデキストランをそれぞれ０．５重量％含むＴＹＰ液体培地（１重量％のトリプトン、０．５重量％の酵母エキス、０．５重量％のポリペプトン、０．５重量％のＮａＣｌを含む液体培地、ｐＨ７．８）１００ｍＬにＫＭ−１３株を接種し、３０℃で８４時間培養を行い、菌体の増殖（ＯＤ６００ｎｍ）及びｐＮＰ−Ｇの分解活性を１２時間おきに測定した。その結果、デキストランを加えたＴＹＰ液体培地で、菌体の増殖及びｐＮＰ−Ｇの分解活性が最も高くなることが確認された（図１、図２）。ｐＮＰ−Ｇの分解活性は、試料、２ｍＭのｐＮＰ−Ｇ、及び０．０２％ＢＳＡを含む４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）５０μＬを３７℃に１０分間保持し、ここに１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3 １００μＬを加えて反応を停止させ、反応液のＡ４００を測定し、遊離したｐ−ニトロフェノールを定量し、1分間に １μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離するのに要する酵素量を１Ｕとした。【００７５】
０．２重量％のデキストランを含むＴＹＰ液体培地１００ｍＬにＫＭ−１３株を接種し、３０℃で４８時間培養を行った後、培養上澄を表１に示すステップでクロマトグラフィー処理を行い、ＩＭＯＳ−ＳＴを精製した。表中の活性は上記の方法によって測定したｐＮＰ−Ｇの分解活性を表す。【００７６】
【表１】
2009011125.tif 000002
【００７７】
２回目のフェニルトヨパール６５０で処理したＩＭＯＳ−ＳＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、約６６ｋＤａ付近に単一のバンドが検出され（図３）、精製ＩＭＯＳ−ＳＴが調製されたことを確認した。【００７８】
４）ＩＭＯＳ−ＳＴの酵素学的性質
３）で行ったｐＮＰ−Ｇの分解活性の測定条件において、ｐ−ニトロフェノールとグルコースの遊離速度の差を測定した結果、ＩＭＯＳ−ＳＴのｐＮＰ−Ｇに対するグルコース残基の転移効率（％）は９９．５％と計算された（図４、図５）。【００７９】
次に、Ｂｒｉｔｔｏｎ―Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液をｐＨ２．５〜１２．０の範囲で用意して、３）で精製したＩＭＯＳ−ＳＴの各ｐＨにおけるｐＮＰ−Ｇの分解活性を測定した結果、当該分解活性の至適ｐＨは約７．８であり、至適ｐＨにおける同活性の９０％以上がｐＨ６．７〜１０．５の範囲で保持されることが確認された。また、所定の温度で精製ＩＭＯＳ−ＳＴを１５分間インキュベーションした後の残存ｐＮＰ−Ｇの分解活性を測定した結果、氷上で１５分間インキュベートしたときのｐＮＰ−Ｇの分解活性の９０％以上が４０℃以下の温度において保持されることが確認された。【００８０】
また、２ｍＭのｐＮＰ−Ｇを等量のイソマルトース、マルトース、ニゲロース、コージビオース、トレハロース、スクロース、パノース、パラチノース、デキストランそれぞれに置き換えた反応液に精製ＩＭＯＳ−ＳＴを加えて各糖に対する分解活性を測定した。この結果を表２に示す。【００８１】
【表２】
2009011125.tif 000003
【００８２】
さらに、３）で精製したＩＭＯＳ−ＳＴの７．１ｎｇを、３０ｍＭのＩＧ３を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ 緩衝液（ｐＨ７．８）に加えて、３７℃で６０分間インキュベーションした後、反応液を３分間煮沸して反応を停止させ、Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ社）を塗布したＴＬＣプレートを用い、アセトニトリル：酢酸エチル：水：１−プロパノール＝８５：２０：７０：５０（体積比）の混合溶媒を展開溶媒とし、５％硫酸を含むエタノールをＴＬＣプレートに噴霧して１１０℃で加熱することにより、イソマルトオリゴ糖を検出した。この結果、ＩＧ２、ＩＧ４〜ＩＧ７の経時的な生成が確認された（図６）。さらに、ＩＧ３を同量のＩＧ４に代え、反応時間を１５時間まで延長したところ、ＩＧ３と同様に経時的にＩＧ２、ＩＧ４〜ＩＧ７の生成が確認されたが、ＩＧ３をデキストランＴ２０００に代えた場合には、イソマルトオリゴ糖の生成は確認されなかった（図７）。さらにＩＧ３を同量のＩＧ４又はＩＧ７に代えた場合の反応液については、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ａｍｉｄｏ−８０（カラムサイズ：４．２ｍｍ×２５０ｍｍ、５０％アセトニトリルで１ｍＬ／分、５０℃）を用いたＨＰＬＣとＥＬＳＤ検出器（ＳｏｆｔＴＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）によって、ＩＧ１２までのイソマルトオリゴ糖が生成されていることが確認された。【００８３】
＜実施例２＞
実施例１で生成したＩＭＯＳ−ＳＴ８９．４ｎｇをＬｙｓｙｌ ｅｎｄｏ―ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｌｙｓ−ｃ、和光純薬）を用いて切断し、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ（資生堂社）を用いて０−８０％の濃度勾配を有するアセトニトリル／０．１％ＴＦＡを溶出液とし、１ｍＬ／分、カラム温度５０℃でペプチドを分離した。ＭｅｔをＮ末端に有するペプチド断片をＩＭＯＳ−ＳＴのＮ末端由来の断片とし、そのアミノ酸配列を決定した。また、Ｎ末端由来のペプチド以外に３種類のペプチドを選び、それぞれのアミノ酸配列を決定した後、その中からバチルス  セレウス由来の既知のオリゴα−１，６−グルコシダーゼのアミノ酸配列（アクセッションＮｏ．ＮＰ＿９８０３６０）と高い相同性を示したアミノ酸配列を選択した。【００８４】
上記のＮ末端のアミノ酸配列及びバチルス  セレウス由来の既知のオリゴα−１，６−グルコシダーゼのアミノ酸配列と高い相同性を示したアミノ酸配列から、下記の２組のプライマーＤＮＡを設計し、合成した。【００８５】
プライマー１  CATTCCAATTTCTTCTCCTTGATAAAT（配列番号３）
プライマー２  GAAAGTGTAGTATATCAAATTTAT（配列番号４）
プライマー３  AAAGGAATTGATGGCTTCCGTATGG（配列番号５）
プライマー４  ATCCCACTGCATCGGTGTTCT（配列番号６）【００８６】
ＫＭ−１３株からＣＴＡＢ／ＮａＣｌ方法に従って調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記各組のプライマー及び０．０１Ｕ／ｍＬ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用い、９６℃に３分間保持したのち、９６℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７４℃で２分間のサイクルを２７回繰り返してＰＣＲを行い、最後に７４℃に３分間保持した。プライマー１とプライマー２の組合せ及びプライマー３とプライマー４の組合せから、それぞれ約７５０ｂｐと約５６０ｂｐの増幅断片が得られた。これらの増幅断片の塩基配列を決定したところ、互いに重複している部分が認められたので、この重複部分をもって両増幅断片の塩基配列を連結して、１２０６ｂｐの塩基配列情報を構築した。【００８７】
この１２０６ｂｐの塩基配列情報を基に下記のプライマー５と６を作製し、上記ＫＭ−１３株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約６４４ｂｐの増幅断片を得た。ＰＣＲの反応条件はプライマー１〜４を用いたＰＣＲの反応条件と同じである。【００８８】
プライマー５  ATGTGATCAACCTGATCTCAAAAGAGG（配列番号７）
プライマー６  GTTGTCCCGTCCCTTACGGTAAATGGC（配列番号８）【００８９】
得られた約６４４ｂｐの増幅断片をプローブとして、ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩそれぞれで消化したＫＭ−１３株のゲノムＤＮＡに対しサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩで消化した断片から、それぞれ単一のシグナルが得られた。【００９０】
次に、ＣｌａＩで消化したＫＭ−１３株のゲノムＤＮＡをセルフライゲーションしたものを鋳型とし、１２０６ｂｐの塩基配列情報を基に作製した下記のプライマー７、８を用いてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。【００９１】
プライマー７  TGATTGACCACAAGATCCATCATCATCAGC（配列番号９）
プライマー８  CATGGAAGCCATTTACCGTAAGGGACGGG（配列番号１０）【００９２】
ＰＣＲは、０．０１Ｕ／ｍＬのＥＸＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製)を用い、９６℃に３分間保持したのち、９６℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１．５分間のサイクルを２８回繰り返して行い、最後に７４℃に５分間保持した。この結果，約３１７ｂｐの増幅断片が得られた。この増幅断片に塩基配列を決定したところ、同配列中には５’上流の開始コドン及び３’下流の終止コドンは見出されなかったので、３’および５’末端領域を取得するために、アダプターＰＣＲ（ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製））を行った。【００９３】
ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、Ｋｉｔに添付されたカセット配列を消化断片に連結したものをＰＣＲの鋳型とした。３’領域を取得するために、カセット配列に相補的な下記のプライマーを設計し、合成した。【００９４】
プライマー９    GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA（配列番号１１）
プライマー１０  CGGAGGAAAATGCGACATTTACATTGC（配列番号１２）【００９５】
また、５’領域を取得するために、下記のプライマーを設計し、合成した
プライマー１１  GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA（配列番号１３）
プライマー１２  TCCCGTCTCCGTTACTGTCTTTGAAGC（配列番号１４）【００９６】
３’領域の取得のためのＰＣＲはＥｃｏＲＩ消化断片を、５’領域取得のためのＰＣＲはＢａｍＨＩ消化断片をそれぞれ鋳型とし、上記各プライマー及び０．０１Ｕ／ｍＬ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用い、９６℃に３分間保持したのち、９６℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で２分間のサイクルを３０回繰り返してＰＣＲを行い、最後に７４℃に３分間保持した。増幅された２種類のＤＮＡ断片をそれぞれ精製し、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、同じくＥｃｏＲＶで消化したマルチクローニングサイトを有するベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）に組み込み、大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換した。プラスミドＤＮＡを精製後、クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、ＩＭＯＳ−ＳＴをコードするｃＤＮＡがクローニングされたことを確認した。ｃＤＮＡのＯＲＦの塩基配列を配列番号２に、またこの塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号１に示す。【００９７】
＜実施例３＞
下記のプライマーセットを設計し、合成した。【００９８】
プライマー１３  CCGCCATGGAGAAAAAATGGTGGAAAG（配列番号１５） 
プライマー１４  TGCCTCGAGATTGAATCTATAAACTCTCG（配列番号１６）【００９９】
実施例２で作製したＭＯＳ−ＳＴをコードするｃＤＮＡ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（＋）を鋳型とし、上記のプライマー及び０．０１Ｕ／ｍＬ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用い、９４℃に３分間保持したのち、９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で２．５分間のサイクルを２５回繰り返してＰＣＲを行い、最後に６８℃に３分間保持した。このＰＣＲで増幅されるＤＮＡ断片は、５’末端にＮｃｏＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトをそれぞれ有するＩＭＯＳ−ＳＴをコードするｃＤＮＡである。得られた増幅断片をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、同酵素で開環させたｐＥＴ−２３ｄ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションした反応液を用いて大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、Ｃ末端に６残基のヒスチジンからなるＨｉｓタグが付加されたＩＭＯＳ−ＳＴをコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＥＴ−２３ｄを回収した。【０１００】
この発現ベクターｐＥＴ−２３ｄを用いて、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）をＨａｎａｈａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８３年、第１６６巻、第５５７−５８０頁）に従って形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン及び３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３００ｍＬに植菌し、３７℃で１２時間培養した。培養液から遠心分離で回収した菌体を２０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に懸濁し、超音波処理により破砕した後、遠心分離後によって上澄（粗酵素液）を得た。０．１ＭのＮｉＳＯ４に懸濁することによりＮｉ２＋をキレートしたＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｉｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）５ｍＬを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化してから内径１．４ｃｍのガラスカラムに充填し、ここに粗酵素液を供し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で洗浄し、さらに１０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で洗浄した。洗浄後のカラムを、１０−２００ｍＭのイミダゾールの直線濃度勾配により、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。タンパク質を含む溶出液５５ｍＬを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．８に対して透析を行った。透析後のタンパク質溶液８５ｍＬをＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ＹＭ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた限外濾過によって５ｍＬに濃縮して、組み換えタンパク質としてＩＭＯＳ−ＳＴを調製した。【０１０１】
＜実施例４＞
１）Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌをコードする組み換えベクターの構築
実施例２でクローニングされたＩＭＯＳ−ＳＴをコードするＤＮＡを鋳型とし、以下の二組のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行なった。【０１０２】
Ｌｏｏｐ4−ＡｌｌのＣ末端側をコードするＤＮＡの増幅用プライマーセット
プライマー１５：5’-TGCCTCGAGATTGAATCTATAAACTCTCG（配列番号１９）
プライマー１６：5'-GAAGAGGGGTATGTTTCAGGTCAGGTCATAAGTAT（配列番号２０）
Ｌｏｏｐ4−ＡｌｌのＮ末端側をコードするＤＮＡの増幅用プライマーセット
プライマー１７：5’-CCGCCATGGAGAAAAAATGGTGGAAAG（配列番号２１）
プライマー１８：5’-ATACCCCTCTTCTTCTGTTTCAACAGTCGG（配列番号２２）【０１０３】
得られた２種の増幅断片を精製後、両者を混合して９６℃に１分間保持し、１秒に０．０２℃ずつ温度を３７℃まで下げ、アニーリングさせた。ここに、上記プライマー１５及びプライマー１７及びＫＯＤポリメラーゼを加えて、９４℃で３０秒間−５５℃で３０秒間−７４℃で１分１５秒間のサイクルを２５回繰り返し、最後に７４℃に２分間保持することで、ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲを行った。【０１０４】
この反応で得られた増幅断片を精製し、生成された増幅断片及びｐＥＴ−２３ｄをそれぞれＮｃｏＩおよびＸｈｏＩにより消化した後にライゲーションして、Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ（配列番号１７）をコードする組み換えベクターを作製した。【０１０５】
２）Ｌｏｏｐ４−ｂａｃｋをコードする組み換えベクターの構築
上記（１）の操作において使用した二組のプライマーセットを下記の二組のプライマーセットに置き換える他は、（１）と同様の操作を行って、Ｌｏｏｐ４−ｂａｃｋ（配列番号１８）をコードする組み換えベクターを作製した。【０１０６】
Ｌｏｏｐ４−ｂａｃｋのＣ末端側をコードするＤＮＡの増幅用プライマーセット
前記プライマー１５（配列番号１９）
プライマー１９：5’-GAGGGGTATGTTTCAGGCGGGGATTATTTC（配列番号２３）
Ｌｏｏｐ４−ｂａｃｋのＮ末端側をコードするＤＮＡの増幅用プライマーセット
前記プライマー１７（配列番号２１）
プライマー２０：5’-TGAAACATACCCCTCCCCGCCCGGTGTACT（配列番号２４）【０１０７】
３）組換え酵素の生産と精製
（１）及び（２）で作製した組み換えベクターを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉＤＥ３株を用いて、実施例３と同様の培養を行い、粗酵素液を回収した。【０１０８】
０．２ＭのＮｉＳＯ４に懸濁することによりＮｉ２＋をキレートしたＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｉｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）１０ｍＬを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化してから内径２．０ｃｍのガラスカラムに充填し、ここに粗酵素液を供し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で洗浄し、さらに１０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で洗浄した。洗浄後のカラムを、１０−２００ｍＭのイミダゾールの直線濃度勾配により、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。タンパク質を含む溶出液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．８に対して透析を行った。透析後のタンパク質溶液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ３０により濃縮し、組み換えタンパク質としてＬｏｏｐ４−Ａｌｌ及びＬｏｏｐ４−ｂａｃｋを調製した。【０１０９】
実施例３で精製されたＩＭＯＳ−ＳＴ、及び上記の精製されたＬｏｏｐ４−Ａｌｌ及びＬｏｏｐ４−ｂａｃｋそれぞれについて、２ｍＭのｐＮＰ−Ｇ／０．０２％ＢＳＡを含む４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）からなる反応液において３７℃で１０分間反応させたときの４００ｎｍの吸光度から算出される、１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離するのに要する酵素量を１ユニット（Ｕ）としたときの比活性は、次の通りである。【０１１０】
【表３】
2009011125.tif 000004
【０１１１】
また、ｐＮＰ遊離速度とグルコース遊離速度から算出される糖転移率は、ＩＭＯＳ−ＳＴが９９％であるのに対して、Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ及びＬｏｏｐ４−ｂａｃｋはいずれも９０％であった。【０１１２】
さらに、ｐＮＰ−Ｇを用いた上記の反応条件における各酵素の至適ｐＨ、ｐＨ安定性（所定のｐＨの下で４℃で２４時間保存したときの残存活性が９０％以上として評価）及び温度安定性（所定の温度の下で１５分間保存した後の残存活性が９０％以上として評価）を測定したところ、下記表の結果を得た【０１１３】
【表４】
2009011125.tif 000005
【０１１４】
４）イソマルトオリゴ糖の伸展反応
ＩＧ３、ＩＧ５、ＩＧ７それぞれ２０ｍＭを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．８）に３）で精製した酵素・・・Ｕを加えて反応液を１５０μＬとし、３７℃で０分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分反応させた。各時間に反応液２０μＬを回収し、３分間煮沸して反応を停止させた。【０１１５】
反応停止後の２μＬを、Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ社）を塗布したＴＬＣプレートを用い、アセトニトリル：酢酸エチル：水：１−プロパノール＝８５：２０：７０：５０（体積比）の混合溶媒を展開溶媒としてＴＬＣを行い、５％硫酸を含むエタノールをＴＬＣプレートに噴霧して１１０℃で加熱することにより、イソマルトオリゴ糖を検出した。ＩＧ３を基質とした反応におけるＴＬＣプレートを図８に、ＩＧ５を基質とした反応におけるＴＬＣプレートを図９に、ＩＧ７を基質とした反応におけるＴＬＣプレートを図１０に、それぞれ示す。【０１１６】
その結果、ＩＭＯＳ−ＳＴではＩＧ３、ＩＧ５、ＩＧ７の何れを基質としてもＩＧ７又はそれ以上のイソマルトオリゴ糖の生成が確認されるが、Ｌｏｏｐ４−Ａｌｌ及びＬｏｏｐ４−ｂａｃｋでは、ＩＧ３を基質とするとＩＧ４、ＩＧ５及びＩＧ６の生成が、ＩＧ５を基質とするとＩＧ６の生成が、それぞれ確認されるが、何れの場合にもＩＧ７を基質とすると、ＩＧ７以上のイソマルトオリゴ糖の生成は確認されなかった。
【図１】
2009011125.tif 000006
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009011125.tif 000018
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