(57)【要約】  以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子を好気性細菌または通性嫌気性細菌に導入したことを特徴とする、イソプロパノール生産能を有する形質転換体。（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA acetyltransferase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ（Isopropanol dehydrogenase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子を好気性細菌または通性嫌気性細菌に導入したことを特徴とする、イソプロパノール生産能を有する形質転換体。
（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA acetyltransferase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ（Isopropanol dehydrogenase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
【請求項２】
（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１３の塩基配列若しくは配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１４の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１４の塩基配列若しくは配列番号１４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１５の塩基配列若しくは配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１６の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１６の塩基配列若しくは配列番号１６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる請求の範囲１記載の形質転換体。
【請求項３】
好気性細菌または通性嫌気性細菌が、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）である請求の範囲１記載の形質転換体。
【請求項４】
（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、及び（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子のそれぞれとして、クロストリジウム ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）、クロストリジウム アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム  サッカロアセトブチィリカム（Clostridium saccharoacetobutylicum）、クロストリジウム  パスツーリアウム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム  スポロゲンズ（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム  カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム テタノモルフュウム（Clostridium tetanomorphum）、及びラルストニア ユートロファ（Ralstonia eutropha）からなる群より選ばれる同一または異なる微生物由来のｔｈｌ遺伝子、ｃｔｆＡＢ遺伝子、ａｄｃ遺伝子及びａｄｈ遺伝子を用いる請求の範囲１記載の形質転換体。
【請求項５】
形質転換体が、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７８）またはエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７９）である請求の範囲１記載の形質転換体。
【請求項６】
請求の範囲１〜５のいずれか一項記載の形質転換体を糖類を含有する培地中で培養する工程と、培養物からイソプロパノールを回収する工程とを含むイソプロパノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロパノール生産技術に関する。さらに詳しくは、イソプロパノール生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施された好気性細菌または通性嫌気性細菌の形質転換体及びそれによる効率的なイソプロパノールの製造技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプロパノールは、塗料やインキ等の工業用溶剤、そして、各種の工業原料として、現在、世界的には凡そ年間１８０万トン、我国でも約１８万トンが生産されている。また、イソプロパノールは、簡単な脱水反応によりプロピレンに変換することができ、現在、年間３１０万トンが我国では製造されているポリプロピレンの原料となる。
しかし、これらの製品は何れも、化石原油資源由来のものである。
地球温暖化問題、化石資源枯渇問題、さらには、近年の原油価格の高騰問題等、地球環境的にも、また、重要な化学製品原料資源の海外依存度の低下の観点からも、ほぼ全量を輸入している原油資源とは異なる再生可能資源からのエネルギーや化学製品の製造法の開発が強く望まれている。バイオマス等再生可能資源からイソプロパノールへの高効率製造技術は、これらの諸問題を解決することが出来る方策の一つとなる。【０００３】
バイオマス原料からの微生物によるイソプロパノール生成としては、アセトン・ブタノール発酵を行うクロストリジウム細菌の一種が、ブタノールに加えて、イソプロパノールを共産することが報告されている（イソプロパノール・ブタノール発酵）。これは、該発酵パターンを示すクロストリジウム細菌が有するイソプロパノール  デヒドロゲナーゼの触媒反応によりアセトンが還元されてイソプロパノールが生産されることによる。【０００４】
近年、世界各国でのバイオ燃料生産利用の高まりの中で、アセトン・ブタノール発酵を利用したバイオ燃料としてのブタノール生産研究が再び注目されているが、これらはブタノール生産を主目的とした研究であり、イソプロパノールの生産を目的とした研究はほとんどない。【０００５】
これまでにイソプロパノールを生産する菌としては、イソプロパノール・ブタノール発酵菌として知られるクロストリディウム属細菌、クロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）などが報告されている（非特許文献１）。【０００６】
しかしながら、Clostridium属細菌を用いたイソプロパノール生産には以下のような課題が存在する。
（１）Clostridium属細菌によるイソプロパノール・ブタノール発酵は、ブタノールが主要発酵代謝産物であり、イソプロパノールの生産性が低い。具体的には、Clostridium属細菌によるイソプロパノール／ブタノール生成比はおよそ１／５〜１／１０である。
（２）Clostridium属細菌は、増殖、及びイソプロパノールの生産において絶対嫌気性条件を必要とする。従って、嫌気条件下での培養、すなわち、培養装置内を窒素ガスなどの不活性ガスで置換するなどの煩雑な培養操作が必要であり、かつ菌の増殖速度が極端に遅いために、それに伴うイソプロパノール生産速度が低い。これらの問題点を解決するには、高増殖速度の好気性微生物の利用が考えられるが、イソプロパノールを高効率に生産する好気条件下で増殖可能な微生物（好気性細菌または通性嫌気性細菌）は未だ知られていない。
（３）イソプロパノール・ブタノール発酵では、細胞増殖期において酢酸及び酪酸が生成され、細胞増殖が停止した定常期に発酵培養液のｐＨの酸性化が溶媒（イソプロパノール及びブタノール）生成期への移行の引き金となり代謝系が大幅に変化（代謝シフト）して、イソプロパノール及びブタノールが生成される。このように、イソプロパノール・ブタノール発酵においては発酵プロセスの厳密な制御が必要であり、発酵開始してからイソプロパノール及びブタノールが生成されるまでに時間を要する。また、これらのクロストリジウム菌においては、胞子形成期への移行によりイソプロパノール及びブタノール生成が停止し、イソプロパノールの生成が長時間持続しない等の課題がある。
従って、これらの課題を解決する新規イソプロパノール生産微生物の創製及びプロセスの開発が望まれている。【０００７】
Clostridium属細菌を用いたイソプロパノール生産技術としては、以下のような技術が開示されている。
非特許文献１では、クロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）が、ブタノールに加えてイソプロパノールを、クロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）が、ブタノール、アセトンに加えてイソプロパノールを生成することが開示されている。【０００８】
また、非特許文献２及び非特許文献３では、Clostridium属細菌を固定化してイソプロパノールを連続的に生産する技術、非特許文献４では、凝集性のClostridium属細菌を用いてイソプロパノールを生産する技術、非特許文献５では、Clostridium属細菌によるイソプロパノール・ブタノール発酵において、高分子樹脂を添加することにより、生産物であるイソプロパノールやブタノールを吸着させて生産物阻害を軽減する技術が開示されている。しかしながら、これらは、ブタノール生産に主眼をおいた技術であり、尚且つ、いずれもClostridium属細菌を用いる嫌気条件下でのイソプロパノール生産技術であり、上記の（１）、（２）、（３）等で指摘される課題については何ら根本的な解決となっていない。【０００９】
一方、イソプロパノール生産技術ではないが、Clostridium属細菌を用いたアセトン・ブタノール生産技術としては、以下のような技術が開示されている。
特許文献１では、胞子形成に関わる遺伝子を制御することにより、胞子形成期を遅らせ、結果としてブタノール生産を向上させる技術、特許文献２及び非特許文献６では、連続発酵法において、gas-stripping法により、連続的にブタノールを抽出する技術、非特許文献７及び非特許文献８では、Clostridium属細菌を固定化してブタノールを生産する技術、非特許文献９では、Clostridium属細菌を連続発酵法において高濃度菌体を用い、菌体をリサイクルする技術が開示されている。これらの技術は、Clostridium属細菌を用いたイソプロパノール・ブタノール発酵にも適応可能と考えられるが、いずれもClostridium属細菌を用いる嫌気条件下での生産技術である点では何ら変わりなく、上記の課題については何ら根本的な解決となっていない。
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology, Vol. 45, 1983, p1160-1163.
【非特許文献２】Enzyme and Microbial Technology, Vol. 5, 1983, p46-54.
【非特許文献３】Biotechnology and Bioengineering, Vol. 39, 1992, p148-156.
【非特許文献４】Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 32, 1989, p22-26.
【非特許文献５】Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 25, 1986, p29-31.
【非特許文献６】Bioprocess and Biosystems Engineering, Vol.27, 2005, p207-214.
【非特許文献７】Pakistan Journal of Biological Sciences, Vol.9, 2006, p1923-1928.
【非特許文献８】Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.113-116, 2004, p887-898.
【非特許文献９】Journal of Biotechnol, Vol.120, p197-206.
【特許文献１】PCT 公開公報 WO2006007530
【特許文献２】米国  公開特許公報 US 2005089979
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、再生可能資源を原料としてイソプロパノールを生産することができる組換え微生物、及び該微生物を用いて効率よくイソプロパノールを製造することができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は前記の課題を解決すべく研究を重ね、アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、アセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、及びイソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子を好気性細菌または通性嫌気性細菌に導入することにより創製される形質転換体がイソプロパノールを効率よく生産することを見出した。このような組換え微生物は、従来のイソプロパノール生産菌であるClostridium属細菌が、増殖、及びイソプロパノールの生産にて絶対嫌気性条件を必要とするため、その低増殖速度により、イソプロパノール生産速度が低いのに対して、好気条件下で増殖可能な微生物（好気性細菌または通性嫌気性細菌）であることから、増殖速度が速く、その分イソプロパノール生産速度が速くなるため、優れたイソプロパノール生産能を有する。このため、本発明の形質転換体を用いると、効率的なイソプロパノール生産が可能となることから、イソプロパノール生産プロセス設計及び運転が容易である。本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の微生物及びこの微生物を用いるイソプロパノールの製造方法を提供する。【００１２】
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子を好気性細菌または通性嫌気性細菌に導入したことを特徴とする、イソプロパノール生産能を有する形質転換体。
（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA acetyltransferase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ（Isopropanol dehydrogenase）活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子【００１３】
（２）（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１３の塩基配列若しくは配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１４の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１４の塩基配列若しくは配列番号１４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１５の塩基配列若しくは配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１６の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１６の塩基配列若しくは配列番号１６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる上記（１）記載の形質転換体。【００１４】
（３）好気性細菌または通性嫌気性細菌が、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）である上記（１）または（２）記載の形質転換体。
（４）(a)アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、(b)アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、(c)アセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子、及び(d)イソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子のそれぞれとして、クロストリジウム ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）、クロストリジウム アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム  サッカロアセトブチィリカム（Clostridium saccharoacetobutylicum）、クロストリジウム  パスツーリアウム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム  スポロゲンズ（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム  カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム テタノモルフュウム（Clostridium tetanomorphum）、及びラルストニア ユートロファ（Ralstonia eutropha）からなる群より選ばれる同一または異なる微生物由来のｔｈｌ遺伝子、ｃｔｆＡＢ遺伝子、ａｄｃ遺伝子及びａｄｈ遺伝子を用いる上記（１）記載の形質転換体。【００１５】
（５）形質転換体が、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７８）またはエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７９）である上記（１）記載の形質転換体。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか一項記載の形質転換体を糖類を含有する培地中で培養する工程と、培養物からイソプロパノールを回収する工程とを含むイソプロパノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の形質転換体は、糖類から極めて効率よくイソプロパノールを生産することができる。
本発明により、再生可能資源を原料とした効率的なイソプロパノール生産が可能となり、石油資源原料に依存しないイソプロパノール工業生産プロセスの新規な構築が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１（３）項において作製したプラスミドｐＣＲＣ２０１を示す図である。
【図２】図２は、実施例１（３）項において作製したプラスミドｐＣＲＣ２０２の作製方法を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）イソプロパノール生産能を有する形質転換体
本発明のイソプロパノール生産能を有する形質転換体は、以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子を好気性細菌または通性嫌気性細菌に導入した形質転換体である。
（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子
（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子【００１９】
宿主
本発明において形質転換の対象となる宿主は、イソプロパノール生産関連遺伝子群を含む組換えベクターにより形質転換され、これらの遺伝子がコードするイソプロパノール生産関連酵素が発現し、結果としてイソプロパノールを生産することができる好気性細菌または通性嫌気性細菌であれば特に限定されない。宿主としては、例えば大腸菌、コリネ型細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、バチルス(Bacillus)属（例えば、枯草菌等）、ストレプトミセス（Streptomyces）などの細菌；例えばアスペルギルス属菌などの真菌細胞；例えばパン酵母、メタノール資化性酵母などの酵母細胞；あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられる。
好ましくは大腸菌とコリネ型細菌である。大腸菌の中でも好ましい株として、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）B、W3110、W3100、CSH50、JM105、ＪＭ109、DH1、MC1060、HB101などが挙げられる。【００２０】
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌またはマイクロコッカス属菌等が挙げられる。【００２１】
さらにコリネ型細菌としては、具体的には、コリネバクテリウム属菌として、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R（FERM P-18976）、ATCC13032、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020またはATCC31831等が挙げられる。【００２２】
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC13869、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233（FERM BP-1497）もしくはMJ-233AB-41（FERM BP-1498）、またはブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC6872等が挙げられる。【００２３】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）ATCC8010、ATCC4336、ATCC21056、ATCC31250、ATCC31738またはATCC35698等が挙げられる。【００２４】
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）ATCC19210またはATCC27289等が挙げられる。【００２５】
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）NO. 239（FERM P-13221）、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）NO. 240（FERM P-13222）または、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）IAM1010またはマイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）IFO3764等が挙げられる。【００２６】
また、これらの大腸菌及びコリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、このような大腸菌としては、ラクテート デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）、フマレート レダクターゼ（fumarate reductase）、フォルメート デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase）などの遺伝子破壊株が挙げられる。このようなコリネ型細菌としては、ラクテート デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）、フォスフォエノールピルベート カルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）、マレート デヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）等の遺伝子破壊株などが挙げられる。【００２７】
イソプロパノール生産関連遺伝子
上記（ａ）〜（ｄ）のイソプロパノール生産関連遺伝子としては、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成したＤＮＡ断片を使用することが出来る。ＤＮＡ配列が不明の場合であっても、イソプロパノール生産関連酵素タンパク質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のイソプロパノール生産関連遺伝子配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＰＣＲによって断片を取得することが可能である。【００２８】
上記（ａ）〜（ｄ）のイソプロパノール生産関連遺伝子はイソプロパノール生産活性が保持されている限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換されていてもよく、削除されていてもよく、また新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記の一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。【００２９】
上記（ａ）〜（ｄ）の遺伝子は、通常イソプロパノール生産菌が保有する。イソプロパノールを生産する菌としては、ブタノール・イソプロパノール発酵菌として知られるクロストリディウム属細菌、クロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）などが挙げられ〔Geprge, H.A. et al., Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl. Environ. Microbiol. 45:1160-1163 (1983)〕、アセチル-CoAから４ステップの反応によりイソプロパノールが生成されることがすでに報告されている〔Mitchell, W.J., Physiology of carbohydrate to solvent conversion by clostridia. Adv. Microb. Physiol. 39:31-130 (1998)〕。【００３０】
これらのクロストリジウム属細菌におけるイソプロパノール生成経路、すなわちアセチル-CoAからイソプロパノールへの代謝経路は、具体的にはアセチル-CoAからアセトアセチル-CoAの反応を触媒するアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA acetyltransferase）（別名チオーラゼ（Thiolase））（以下、遺伝子を「ｔｈｌ」、酵素を「ＴＨＬ」と記す）、アセトアセチル-CoAからアセトアセテートの反応を触媒するアセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase）（以下、遺伝子を「ｃｔｆＡＢ」、酵素を「ＣＴＦ」と記す）、アセトアセテートからアセトンの反応を触媒するアセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）（以下、遺伝子を「ａｄｃ」、酵素を「ＡＤＣ」と記す）、及びアセトンからイソプロパノールの反応を触媒するイソプロパノール デヒドロゲナーゼ（Isopropanol dehydrogenase）（別名プライマリー-セカンダリー アルコール デヒドロゲナーゼ（Primary-secondary alcohol dehydrogenase））（以下、遺伝子を「ａｄｈ」、酵素を「ＡＤＨ」と記す）から構成されている。
本発明では該代謝系を用いる。また、イソプロパノール生成機能を有する限り、上記（ａ）〜（ｄ）の遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は限定されない。【００３１】
さらに、上記（ａ）〜（ｄ）の遺伝子は、イソプロパノール生産能を有さない菌から取得してもよい。具体的には、以下の例が挙げられる。
クロストリディウム属細菌には、イソプロパノールは生産しないが、ブタノール・アセトン発酵を行うクロストリジウム アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム  サッカロアセトブチィリカム（Clostridium saccharoacetobutylicum）、クロストリジウム  パスツーリアウム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム  スポロゲンズ（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム  カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム テタノモルフュウム（Clostridium tetanomorphum）などが報告されている〔Geprge, H.A. et al., Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl. Environ. Microbiol. 45:1160-1163 (1983)〕。これらのブタノール・アセトン発酵を行うクロストリジウム属細菌は、アセトンを生成するため、アセチル-CoAからアセトンまでの３ステップの酵素（ＴＨＬ、ＣＴＦ及びＡＤＣ）をコードする遺伝子を有することが報告されている 〔Noelling, J. et al., Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. J. Bacteriol. 183:4823-4838〕。従って、ブタノール・イソプロパノール発酵行うクロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）及び／またはクロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）由来のＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子及びＡＤＣをコードする遺伝子の代わりに、またはこれらと共に、それぞれ、上述のブタノール・アセトン発酵を行うクロストリジウム細菌由来のＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子及びＡＤＣをコードする遺伝子を用いてもよい。【００３２】
また、現時点で６００種を超える生物種のゲノム解読が行われていることにより、遺伝子データベースとの相同性検索により、多種の生物種由来の目的遺伝子の情報の抽出と、該遺伝子の単離が容易に実施可能となってきた。従って、上述のクロストリジウム属細菌以外の生物種由来のＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子、ＡＤＣをコードする遺伝子及びＡＤＨをコードする遺伝子も容易に単離可能である。上述のクロストリジウム属細菌由来のイソプロパノール生産関連遺伝子と比較的相同性の高いものを例にとると、ＴＨＬをコードする遺伝子としては、クロストリジウム ペルフリンゲンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム テタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウム クリュイベリ（Clostridium kluyveri）、クロストリジウム ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム ノビイ（Clostridium novyi）、クロストリジウム ボツリウム（Clostridium botulinum）、サーモアナエロバクテリウム サーモサッカロリティカム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、サーモシナス カルボキシディボランス（Thermosinus carboxydivorans）、クロストリジウム ディフィシル（Clostridium difficile）、カルボキシドサーマス ハイドロゲノフォーマス（Carboxydothermus hydrogenoformans）、サーモアナエロバクター テングコンゲネシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）、ディスルフォトマキュラム レデュセンス（Desulfotomaculum reducens）、オーシャノスピリラム  スピーシーズ（Oceanospirillum sp.）、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）など由来のＴＨＬをコードする遺伝子が挙げられる。ＣＴＦをコードする遺伝子としては、サーモアナエロバクター テングコンゲネシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）K12など由来のＣＴＦをコードする遺伝子が挙げられる。ＡＤＣをコードする遺伝子としては、サッカロポリスポラ エリスラエラ（Saccharopolyspora erythraea）、ストレプトミセス ノガレイター（Streptomyces nogalater）、シュードモナス アエロギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ストレプトミセス アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）など由来のＡＤＣをコードする遺伝子が挙げられる。ＡＤＨをコードする遺伝子としては、サーモアナエロバクター エサノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）、サーモアナエロバクター テングコンゲネシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）、サーモアナエロバクター ブロッキー（Thermoanaerobacter brockii）、サーモシナス カルボキシディボランス（Thermosinus carboxydivorans）、メタノサシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）など由来のＡＤＨをコードする遺伝子が挙げられる。従って、上述のブタノール・イソプロパノール発酵やブタノール・アセトン発酵を行うクロストリジウム属細菌由来のＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子、ＡＤＣをコードする遺伝子及びＡＤＨをコードする遺伝子の代わりに、またはこれらと共に、それぞれ、同じ酵素触媒反応を示す限り、例えばここに挙げた他の生物種由来のＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子、ＡＤＣをコードする遺伝子及びＡＤＨをコードする遺伝子を用いてもよい。【００３３】
本発明においては、上記（ａ）〜（ｄ）の遺伝子のそれぞれとして、クロストリジウム ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）、クロストリジウム アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム  サッカロアセトブチィリカム（Clostridium saccharoacetobutylicum）、クロストリジウム  パスツーリアウム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム  スポロゲンズ（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム  カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム テタノモルフュウム（Clostridium tetanomorphum）、及びラルストニア ユートロファ（Ralstonia eutropha）からなる群より選ばれる同一または異なる微生物由来のｔｈｌ遺伝子、ｃｔｆＡＢ遺伝子、ａｄｃ遺伝子及びａｄｈ遺伝子を用いることが好ましい。【００３４】
本発明では、上記（ａ）〜（ｄ）の遺伝子として、クロストリジウム アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来するＴＨＬ、ＣＴＦ及びＡＤＣをコードする各遺伝子、及びクロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）に由来するＡＤＨをコードする遺伝子を使用することが最も好ましい。【００３５】
本発明では、（ａ）アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１３の塩基配列若しくは配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｂ）アセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１４の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１４の塩基配列若しくは配列番号１４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトアセチル-CoA：アセテート CoA-トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１５の塩基配列若しくは配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトアセテート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い；
（ｄ）イソプロパノール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする外来性遺伝子として、配列番号１６の塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１６の塩基配列若しくは配列番号１６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイソプロパノール  デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いるのが好ましい。【００３６】
配列番号１３〜１５の塩基配列のＤＮＡは、クロストリジウム アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する遺伝子である。また、配列番号１３は、ｔｈｌ遺伝子の塩基配列であり、配列番号１４は、ｃｔｆＡＢ遺伝子の塩基配列であり、配列番号１５は、ａｄｃ遺伝子の塩基配列である。配列番号１６の塩基配列のＤＮＡは、クロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）に由来する遺伝子であり、ａｄｈ遺伝子の塩基配列である。【００３７】
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、J.Sambrookら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。【００３８】
ここで、より好ましい「ストリンジェントな条件」とは、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性が配列間に存在するときにハイブリダイゼーションが起こることを意味する。このような「ストリンジェントな条件」については、J.Sambrookら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、特に11.45節”Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。
本発明において、塩基配列間の相同性は、計算ソフトＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）Ｖｅｒ．８（ジェネティックス社製）を用いて計算した値である。【００３９】
また、本発明においては、例えば、配列番号１３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと約９０％以上の配列相同性を有するものであることが好ましい。より好ましくは、約９５％以上、特に好ましくは約９８％以上の配列相同性を有するものである。【００４０】
種々の生物由来のＴＨＬ、ＣＴＦ、ＡＤＣ及びＡＤＨそれぞれをコードする外来性遺伝子の配列をＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットとしては、以下のものが挙げられる。このようなプライマーセットとしては、例えば、ＴＨＬをコードする遺伝子を増幅するための配列番号１及び２の塩基配列で表されるプライマーセット；ＣＴＦをコードする遺伝子を増幅するための配列番号３及び４の塩基配列で表されるプライマーセット；ＡＤＣをコードする遺伝子を増幅するための配列番号５及び６で表されるプライマーセット；ＡＤＨをコードする遺伝子を増幅するための配列番号７及び８で表されるプライマーセットなどが挙げられる。【００４１】
ＰＣＲ法は、公知のＰＣＲ装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用することができる。ＰＣＲのサイクルは、公知の技術にしたがって行なわれてよく、例えば、変性、アニーリング、伸張を１サイクルとし、通常１０〜１００サイクル、好ましくは、約２０〜５０サイクルである。ＰＣＲの鋳型としては、上述のイソプロパノール生成経路の酵素活性を示す微生物から単離したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子、ＡＤＣをコードする遺伝子及びＡＤＨをコードする遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲ法によって得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターに導入することができる。クローニング法としては、pGEM-T easy vector system（Promega社製）、TOPO TA-cloning system（Invitrogen社製）、Mighty Cloning Kit（Takara社製）などの商業的に入手可能なＰＣＲクローニングシステムなどを使用することもできる。また、方法の１つの例を実施例で詳記するが、該領域を含むＤＮＡ断片を、既知のＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子、ＡＤＣをコードする遺伝子及びＡＤＨをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて適当に設計された合成プライマーを鋳型として用いたハイブリダイゼーション法により取得することもできる。【００４２】
ベクターの構築
次いで、ＰＣＲ法で得られた遺伝子を含むクローニングベクターを、微生物、例えばエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例えばアンピシリン、クロラムフェニコールなど）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の技術によって行なうことができ、また市販のプラスミド抽出キットを用いて簡便に抽出することもできる。市販のプラスミド抽出キットとしては、キアクイックプラスミド精製キット（商品名：Qiaquick plasmid purification kit、キアゲン社製）などが挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子、ＡＤＣをコードする遺伝子及びＡＤＨをコードする遺伝子の配列を確認することができる。ＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えばジオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用いて、検出には多蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシーケンサー、例えばABI PRISM 3730xl DNA Analyzer（アプライドバイオシステム社製）などを使用して決定することもできる。【００４３】
上記の方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行なうことができる。種々の微生物のベクターや外来遺伝子の導入及び発現法は、多くの実験書に記載されているので〔例えば、Sambrook, J. & Russel, D. W. Molecular Cloning： A Laboratory Manual（3rd Edition）CSHL Press（2001）、またはAusubel, F. et al. Current protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）等〕、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、及び発現を行なうことができる。【００４４】
広範囲の種類のプロモーターが本発明に使用するのに適している。そのようなプロモーターは、酵母、細菌及び他の細胞供給源を含む多くの公知の供給源から得られ、好気性細菌または通性嫌気性細菌において目的遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればいかなるものであってもよい。そのようなプロモーターの適当な例としては、例えば、大腸菌及びコリネ型細菌においてはｌａｃ、ｔｒｃ、ｔａｃプロモーター等を用いることができる。本発明に使用されるプロモーターは、必要に応じて、修飾して、その調節機構を変更することができる。また、目的遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネーターについても、好気性細菌または通性嫌気性細菌においてその遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなるものであってもよい。【００４５】
次に、ＴＨＬをコードする遺伝子、ＣＴＦをコードする遺伝子、ＡＤＣをコードする遺伝子及びＡＤＨをコードする遺伝子を、前述した好気性細菌または通性嫌気性細菌において、プラスミド上または染色体上で発現させる。例えば、プラスミドを用いて、これらの遺伝子は発現可能な制御配列下に導入される。ここで「制御配列下」とはこれらの遺伝子が、例えば、プロモーター、インデューサー、オペレーター、リボソーム結合部位及び転写ターミネーター等との共同作業により、転写翻訳できることを意味する。このような目的で使用されるプラスミドベクターとしては、好気性細菌または通性嫌気性細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、例えば、大腸菌に用いるプラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＣｏｌｄ、ｐＧＥＸ及びそれらの誘導体などが挙げられる。コリネ型細菌に用いるプラスミドベクターとしては、ブレブバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報； Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）及びYamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985））；コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のｐＨＭ１５１９ (Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）)及びｐＣＲＹ３０ (Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）)；コリネバクテリウム グルタミカムＴ２５０由来のｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９、Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984））、ｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４、ｐＡＧ５０（特開昭６２−１６６８９０号公報）、ｐＥＫ０、ｐＥＣ５及びｐＥＫＥｘ１（Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991））、並びにそれらの誘導体などが挙げられる。更には酵母プラスミド（ＹＥｐ型、ＹＣｐ型など）、ファージＤＮＡなどが挙げられ、宿主において複製可能である限り、他のいかなるベクターも用いることができる。また、ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつマルチクローニングサイトを含んでいる、または単一の制限酵素部位を含んでいることが好ましい。【００４６】
本発明の形質転換された好気性細菌または通性嫌気性細菌の創製に使用されるプラスミドベクターは、例えば、クロストリジウム  アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のｔｈｌ遺伝子、ｃｔｆＡＢ遺伝子及びａｄｃ遺伝子並びにクロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）由来のａｄｈ遺伝子を用いる場合では、塩基配列が確認された該遺伝子を、適当なプロモーター、ターミネーター等の制御配列に連結後、これを上記例示されているいずれかのプラスミドベクターの適当な制限酵素部位に挿入することにより、構築することが出来る。詳細は、実施例に記載している。【００４７】
形質転換
目的遺伝子を含むプラスミドベクターの好気性細菌または通性嫌気性細菌への導入方法としては、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。具体的には、例えば大腸菌の場合、塩化カルシウム法や電気穿孔法〔例えば、Sambrook, J. & Russel, D. W. Molecular Cloning： A Laboratory Manual（3rd Edition）CSHL Press（2001）、またはAusubel, F. et al. Current protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York （1987）等〕などやエシェリヒア・コリ  ＪＭ109のコンピテントセル（宝酒造株式会社製）を用いる方法を同社プロトコールに従い行うことができる。コリネ型細菌の場合、電気パルス法を、公知の方法〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 （1990）〕及び〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 （1993）〕により行うことができる。【００４８】
上記方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入及び発現法は、多くの実験書に記載されているので（例えば、Sambrook、J.、Russel、D.W.、Molecular Cloning  A  Laboratory  Manual、3rd  Edition、CSHL  Press、2001；HopwoodにD.A.、Bibb、M.J.、Chater、K.F.、Bruton、C.J.、Kieser、H.M.、Lydiate、D.J.、Smith、C.P.、Ward、J.M.、Schrempf、 H．Genetic  manipulation  of  Streptomyces：A  laboratory  manual、The  John  lnnes  institute、Norwich、UK、1985等)、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入及び発現を行うことができる。【００４９】
上記の方法により創製される好気性細菌または通性嫌気性細菌の形質転換体としては、具体的には、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７８として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託済み。受託日：２００７年８月１３日）及びエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７９として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託済み。受託日：２００７年８月１３日）が挙げられる。
さらに、上述と同様の方法により、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属菌においてもイソプロパノール生産能を有する形質転換体の創製が可能である。【００５０】
本発明の形質転換体は、イソプロパノール生産性を向上させるために、解糖系の流量の増加、イソプロパノール浸透圧または有機酸に対する耐性の増加、及び副生物（目的とする生成産物以外の炭素含有分子を意味する）生産の減少、からなる群から選択された特徴の一つまたはそれ以上を生じる遺伝子修飾をさらに含むことができる。そのような遺伝子修飾は、具体的には、外来性遺伝子の過剰発現及び／または内在性遺伝子の不活化、古典的突然変異誘起、スクリーニング及び／または目的変異体の選別等を行なうことにより導入することができる。【００５１】
また、形質転換体は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異導入方法により変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の目的とするイソプロパノール生産能を有するかぎり、本発明の形質転換された微生物として使用することができる。【００５２】
かくして創製された本発明の好気性細菌または通性嫌気性細菌の形質転換体（以下、単に形質転換体という）は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等を用いることができる。【００５３】
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質及び糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）、好ましくは約０．５〜５％（ｗｔ）である。【００５４】
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機もしくは有機アンモニヴム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）、好ましくは約０．５〜５％（ｗｔ）である。【００５５】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）、好ましくは約０．０５〜０．５％（ｗｔ）である。【００５６】
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）、好ましくは約０．５〜５％（ｗｔ）である。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。【００５７】
培地のｐＨは約５〜８が好ましい。
好ましい微生物培養培地としては、大腸菌用培地として、ＬＢ（Luria−Bertani）培地、ＳＤ８培地、ＮＺＹＭ培地、ＴＢ（Terrific  Broth）培地、ＳＯＢ培地、２×ＹＴ培地、Ｍ９培地等が、コリネ型細菌用培地として、Ａ培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、ＢＴ培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。【００５８】
培養温度は、約１５〜４５℃、好ましくは約２５〜４０℃とすればよく、培養時間は、約１〜７日間、好ましくは約１〜３日間とすればよい。
次いで、形質転換体の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。【００５９】
回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものであればよく、例えば、菌体をアクリルアミドまたはカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。【００６０】
（ＩＩ）イソプロパノールの製造方法
上記の如くして得られる培養物から回収分離された形質転換体の培養菌体またはその菌体処理物は、好気条件下または嫌気条件下の反応培地でのイソプロパノール生成反応に供せられる。上記の形質転換体を糖類を含有する培地（反応培地）中で培養する工程と、培養物からイソプロパノールを回収する工程とを含むイソプロパノールの製造方法も、本発明の１つである。
イソプロパノール生成方式は、回分式、流加式、連続式いずれの生成方式も可能である。【００６１】
反応培地（反応液）には、イソプロパノールの原料となる有機炭素源（例えば、糖類等）が含まれていればよい。有機炭素源としては、本発明の形質転換体が生化学反応に利用できる物質であればよい。
具体的には、糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖類；セロビオース、ショ糖、ラクトース、もしくはマルトースなどの二糖類；またはデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。特に、Ｃ６糖やＣ５糖などの単糖類が好ましいが、コリネ型細菌にはキシロース、アラビノース等のＣ５単糖類を資化できない場合もある。そのような場合には、それらの単糖を資化できる機能を細菌に付与すればよい。なお、本発明においては、２種以上の糖の混合糖を用いることもできる。【００６２】
より好ましくは、有機化合物の生成反応に用いられる反応培地は、形質転換体またはその処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源；蛋白質合成に必要な窒素源；その他リン、カリウムまたはナトリウム等の塩類；さらに鉄、マンガンまたはカルシウム等の微量金属塩を含む。これらの添加量は所要反応時間、目的有機化合物生産物の種類または用いられる形質転換体の種類等により適宜定めることが出来る。用いる形質転換体によっては特定のビタミン類の添加が好ましい場合もある。炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、微量金属塩は、公知のもの、例えば増殖培養工程につき例示したものを用いることができる。
培地のｐＨは、通常約６〜８が好ましい。
形質転換体またはその菌体処理物と糖類との反応は、本発明の形質転換体またはその菌体処理物が活動できる温度条件下で行なわれることが好ましく、形質転換体またはその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。通常、約２５〜３５℃とすればよい。【００６３】
最後に、上述のようにして反応培地で生成したイソプロパノールを採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることが出来る。そのような公知の方法として、イソプロパノール生成液の蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等があり、反応液組成や副生物等に応じてその分離精製採取法は適宜定めることが出来る。【００６４】
本発明はまた、前記の条件下における反応により糖類等よりイソプロパノールを生産するのに著しい改善を有する組換えイソプロパノール生産形質転換体を提供する。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６６】
実施例１  （エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201及びエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202の創製）
（１）イソプロパノール生産遺伝子群のクローニング
クロストリジウム属細菌におけるイソプロパノール生合成経路（アセチル-CoAからイソプロパノール）は、アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA acetyltransferase）、アセトアセチル-CoA：アセテートCoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate CoA transferase）、アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）、及びイソプロパノール デヒドロゲナーゼ（Isopropanol dehydrogenase）の４ステップ（４つの酵素）により構成されている。これらの４種の酵素をコードする遺伝子を以下のＰＣＲ法により増幅した。【００６７】
クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ATCC824株の染色体及びプラスミドＤＮＡ（American Type Culture Collection (ATCC)より入手；ＡＴＣＣ  ８２４Ｄ−５）を鋳型とし、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｈｌ）、アセトアセチル-CoA：アセテートCoA-トランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆＡＢ）、及びアセトアセテート デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ）をそれぞれプライマー１及び２（配列番号１及び２）、プライマー３及び４（配列番号３及び４）、プライマー５及び６（配列番号５及び６）を用いＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、GeneAmp PCR System 9700 (アプライドバイオシステムス社製) を用い、ＰＣＲ反応１（９４℃  ３０秒、５８℃  ３０秒、７２℃  １．５分、３０サイクル；鋳型ＤＮＡ  １０ｎｇ、反応液、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、Prime Star DNA polymerase (TAKARA社製）２Ｕ、５× Prime Star buffer  ６μｌ、及びプライマー各０．２μＭ、最終液量３０μｌ）の条件で行った。上記で増幅した反応液３μｌを用いて０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ｔｈｌ遺伝子の場合約１．２ｋｂ、ｃｔｆＡＢ遺伝子の場合約１．３ｋｂ、ａｄｃ遺伝子の場合約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。増幅されたＤＮＡ断片は、Minelute PCR Purification Kit（キアゲン社製）を用い精製した。【００６８】
クロストリジウム ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）NRRL B593株は、Reinforced clostridial 培地（Difco社製）により３０℃、嫌気条件下培養した。培養１６時間後、５ｍｌの培養液を遠心分離（微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０１、トミー精工社製、５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、沈殿した菌体を染色体ＤＮＡの抽出に供した。染色体ＤＮＡの抽出は、以下の手順で行った。すなわち、菌体を０．３ｍｌのＴＥＳＳ  ｂｕｆｆｅｒ [25mM Tris-HCl（ｐＨ  ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５％  Sucrose]に懸濁し、これに０．３ｍｌのリゾチーム溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加し、氷上で３０ｍｉｎ静置した。次に２％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を０．６ｍｌ、及び１０ｍｇ／ｍｌ Proteinase K（Sigma社製）溶液４０μｌを添加し、５０℃で保温した。２時間後、これに等量のフェノール・クロロホルム溶液を加え、室温で１０分撹拌した。この溶液を、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分）し、上静液を回収した。これに１２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液及び７２０μｌのイソプロパノールを加えた。これをよく混合した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）により染色体ＤＮＡを沈殿させ、上静液を除き、分離された染色体ＤＮＡを７０％エタノール溶液１ｍｌにより洗浄した。再度遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）を行い、染色体ＤＮＡを回収した。室温下、１０分放置することで染色体ＤＮＡを乾燥させた後、１００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解させた。イソプロパノール  デヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）は、クロストリジウム ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）NRRL B593株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー７及び８（配列番号７及び８）を用い、上述のＰＣＲ反応１の条件により増幅した。増幅した反応液３μｌを用いて０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行ったところ、ａｄｈ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。増幅されたＤＮＡ断片は、Minelute PCR Purification Kitを用い精製した。【００６９】
遺伝子発現プロモーター（tac promoter）を得る為に、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）を鋳型とし、プライマー９及び１０（配列番号９及び１０）を用い、上述のＰＣＲ反応１の条件によりtac promoterを含む約０．２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。反応終了後、増幅されたＤＮＡ断片は、Minelute PCR Purification Kit（キアゲン社製）を用い精製した。【００７０】
上述のＰＣＲ反応１により得られた約１．３ｋｂのｃｔｆＡＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片、約０．７ｋｂのａｄｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片及び約１．１ｋｂのａｄｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片それぞれとtac promoterとの連結は、以下の手順で行った。すなわち、上記３種のＤＮＡ断片のいずれか及びtac promoterを含むＤＮＡ断片をそれぞれ約１００ｎｇずつ混合し、これにｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、Prime Star DNA polymerase（ＴＡＫＡＲＡ社製）２Ｕ及び５×Prime Star buffer ６μｌを加えて最終液量３０μｌとなるように各試薬を混合した。この反応液を、ＰＣＲ反応２（９４℃  ３０秒、５２℃  ３０秒、７２℃  １．５分、３０サイクル）の条件でGeneAmp PCR System 9700を用い、反応させた。反応終了後、tac promoterと各遺伝子（ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ、及びａｄｈのいずれか）とを連結したＤＮＡ断片を得るために、該反応液０．５μｌを鋳型とし、それぞれプライマー４及び９（配列番号４及び９）、プライマー６及び１１（配列番号６及び１１）、プライマー８及び１２（配列番号８及び１２）を用い、上述のＰＣＲ反応１の条件に従いＰＣＲにより増幅した。増幅した反応液３μｌを用いて０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行ったところ、tac promoterにｃｔｆＡＢ遺伝子が連結した約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−ｃｔｆＡＢ）、tac promoterにａｄｃ遺伝子が連結した約０．９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−ａｄｃ）、及びtac promoterにａｄｈ遺伝子が連結した約１．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−ａｄｈ）が検出できた。これらのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により分離し、Minelute Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いてゲルから回収した。【００７１】
上述のtac promoterを連結していない約１．２ｋｂのｔｈｌ  ＤＮＡ断片、tac promoterを連結した約１．５ｋｂのＰｔａｃ−ｃｔｆＡＢ、約０．９ｋｂのＰｔａｃ−ａｄｃ及び約１．３ｋｂのＰｔａｃ−ａｄｈを含むＤＮＡ断片それぞれをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega社製)に取扱説明書に従い連結し、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア  コリＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に塗布した。各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断することにより、挿入断片を確認した。さらに該挿入断片を、シークエンスすることで目的のＤＮＡ配列の構築を確認した。ｔｈｌ遺伝子（配列番号１３）、ｃｔｆＡＢ遺伝子（配列番号１４）、ａｄｃ遺伝子（配列番号１５）、またはａｄｈ遺伝子（配列番号１６）を含むプラスミドを、それぞれｐＧＥＭ−ｔｈｌ、ｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ｃｔｆＡＢ、ｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ａｄｃ、及びｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ａｄｈと命名した。尚、ＤＮＡシークエンサーとしてはABI PRISM3100 (Applied Biosystems社製)を用い、シークエンス反応はABI PRISM Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems社製)を用いて行った。このようにして調製したプラスミドｐＧＥＭ−ｔｈｌ、ｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ｃｔｆＡＢ、ｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ａｄｃ及びｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ａｄｈを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ、ＳｐｈＩ及びＳｍａＩ、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断後、アガロースゲル電気泳動により分離し、Minelute Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いてゲルから回収することにより、tac promoterを連結していないｔｈｌ遺伝子を含む約１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片と、tac promoterを連結したＰｔａｃ−ｃｔｆＡＢ遺伝子を含む約１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ  ＤＮＡ断片、Ｐｔａｃ−ａｄｃ遺伝子を含む約０．９ｋｂのＳｐｈＩ−ＳｍａＩ  ＤＮＡ断片及びＰｔａｃ−ａｄｈ遺伝子を含む約１．３ｋｂのＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片をそれぞれ取得した。【００７２】
（２）発現ベクターｐＣＲＣ２００の構築
遺伝子発現ベクターｐＣＲＣ２００の調製は、以下の手順に従って行った。すなわち、ｐＫＫ２２３−３を鋳型とし、プライマー１３及び１４（配列番号１７及び１８）を用い、上記（１）項のＰＣＲ反応１の条件によりtac promoter-rrnB terminator領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。次に大腸菌ベクターｐＣＲＢ１〔Nakata, K. et al. Vectors for the genetics engineering of corynebacteria; in Saha, B.C.(ed.): Fermentation Biotechnology, ACS Symposium Series 862. Washington, American Chemical Society, pp. 175-191(2003)〕をＥｃｏＲＩにより消化し、これをDNA Blunting Kit（ＴＡＫＡＲＡ社製）により取扱説明書に従ってＤＮＡ末端を平滑し、セルフライゲーションさせた。次に得られたプラスミドをHindIIIにより消化し、これを同様にDNA Blunting KitによりＤＮＡ末端を平滑し、セルフライゲーションさせた。こうして得られたプラスミドを、ＳａｃＩ及びＳｐｈＩにより消化し、同様にtac promoter-rrnB terminator領域を含むＤＮＡ断片をＳａｃＩ及びＳｐｈＩにより消化した後、これら２つのＤＮＡ断片をDNA ligation kit（ＴＡＫＡＲＡ社製）により取扱説明書に従ってライゲーション反応を行った。該反応液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に塗布した。該培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断することにより、挿入断片を確認した。目的の遺伝子断片を含むプラスミドをｐＣＲＣ２００（配列番号１９）と命名した。【００７３】
（３）発現プラスミドｐＣＲＣ２０１及びｐＣＲＣ２０２の構築とエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201及びエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202の創製
上記（１）項で取得したtac promoterを連結していないｔｈｌ遺伝子を含む約１．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片、tac promoterを連結したＰｔａｃ−ｃｔｆＡＢ遺伝子を含む約１．５ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ  ＤＮＡ断片、Ｐｔａｃ−ａｄｃ遺伝子を含む約０．９ｋｂ  ＳｐｈＩ−ＳｍａＩ  ＤＮＡ断片及びＰｔａｃ−ａｄｈ遺伝子を含む約１．３ｋｂ  ＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片をそれぞれ１００ｎｇと、予めＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化したｐＫＫ２２３−３  １０ｎｇとをすべて混合し、DNA ligation kitによりライゲーション反応を行った。この反応により、ｔｈｌ遺伝子にもtac promoterが連結されることになる。尚、ｐＫＫ２２３−３は、エシェリヒア  コリ内でのコピー数が１５〜２０であるｐＢＲ３２２由来の複製オリジンを有している〔Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕。このライゲーション液を用いて塩化カルシウムの方法によりエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミドＤＮＡを保持した大腸菌株を選抜することで、プラスミドｐＣＲＣ２０１を得た（図１、配列番号２０）。このプラスミドを保持した形質転換株エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号305-8566））に寄託されている（受託日：２００７年８月１３日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７８）。【００７４】
上記のプラスミドｐＣＲＣ２０１をＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化し、ｔｈｌ遺伝子、Ｐｔａｃ−ｃｔｆＡＢ遺伝子、及びＰｔａｃ−ａｄｃ遺伝子を含む約３．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ  ＤＮＡ断片を調製した。次に得られたＤＮＡ断片を、予めＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩにより消化した上記（２）項で構築のｐＣＲＣ２００に連結し、プラスミドｐＣＡＣを得た。この構築により、ｔｈｌ遺伝子にもtac promoterが連結されることになる。尚、ｐＣＲＣ２００は、エシェリヒア  コリ内でのコピー数が５００〜７００であるｐＵＣベクター由来の複製オリジンを有している〔Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕。次にｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ａｄｈ（配列番号１６）を含むプラスミドを鋳型とし、プライマー１２及び１５（配列番号２１）を用いて上記（１）項のＰＣＲ反応条件１によりＳａｌＩ認識配列を付加したＰｔａｃ−ａｄｈ遺伝子を増幅した。この結果得られた該反応液を、Minelute PCR Purification Kit（キアゲン社製）を用い精製し、該ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega社製)に取扱説明書に従い連結しプラスミドｐＧＥＭ−Ｐｔａｃ−ａｄｈｓを得た。こうして調製したプラスミドを、ＳｍａＩ及びＳａｌＩにより消化し、Ｐｔａｃ−ａｄｈ遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を、予めＳｍａＩ及びＳａｌＩにより消化したｐＣＡＣに連結し、プラスミドｐＣＲＣ２０２を得た（図２、配列番号２２）。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ導入し、形質転換株エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202株を得た。この形質転換株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号305-8566））に寄託されている（受託日：２００７年８月１３日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９７９）。【００７５】
実施例２  （形質転換株エシェリヒア・コリJM109/ｐCRC201によるイソプロパノールの生産）
エシェリヒア コリJM109/ｐCRC201をアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地（ポリペプトン1０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ及びＮａＣｌ  ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）により３７℃で、約１６時間振とう培養した。この培養液５００μｌを、アンピシリン２００μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌのＳＤ８培地〔NH4Cl 7g、KH2PO4 7.5g、Na2HPO4 7.5g、K2SO4 0.85g、MgSO4 7H2O 0.17g、イーストエキストラクト 10g、グルコース 20g、及びtrace elements ０．８ｍｌ（FeSO4 7H2O 40g、MnSO4 H2O 10g、Al2(SO4)3 28.3g、CoCl 6H2O 4g、ZnSO4 7H2O 2g、Na2MoO4 2H2O 2g、CuCl2 2H2O 1g及びH3BO4 0.5gを１Ｌの５M HClに溶解)を含む１Ｌの水溶液〕に植菌した。培養は、５００ｍｌ容量のバッフル付三角フラスコを用い、３７℃で振とう培養により行った。グルコースは、培地に適宜追加された。培養液中のイソプロパノールは、Sunpak-A 50/80 Thermon-1000（２．１ｍ×３．２ｍｍ Ｉ．Ｄ．、信和化工社製）を装着したガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所社製）により分析した。分析条件は、窒素３５ｍｌ／ｍｉｎ、水素６０ｋＰａ、空気６０ｋＰａ、インジェクション温度２００℃、ＦＩＤ検出器温度２００℃であり、カラム温度制御条件は、１３０℃で１３分保持後、昇温速度１０℃／ｍｉｎで１６０℃まで上昇させた。所定時間培養後、培養液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、得られた上清液をガスクロマトグラフによりイソプロパノール生成量を分析した。
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201を培養開始から２４時間後及び４８時間後の反応液を遠心分離（４℃、１５，０００×ｇ、１０分）し、得られた上清液を用いてガスクロマトグラフィーによりイソプロパノールを分析したところ、イソプロパノールが１４ｍＭ（２４時間後）及び１１ｍＭ（４８時間後）生成していた。【００７６】
比較例１
実施例２で使用したエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201に代えて、エシェリヒア コリJM109を用い、ＬＢ培地及びＳＤ８培地にアンピシリンを添加しないこと以外は、実施例２と同様の条件、方法にてイソプロパノール生産実験を行った。
その結果、エシェリヒア コリJM109は、イソプロパノールを生成しなかった。
実施例２の結果との比較において、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201は、イソプロパノール生成能を有することが明らかとなった。【００７７】
実施例３  （形質転換株エシェリヒア・コリJM109/ｐCRC202によるイソプロパノールの生産）
実施例２で使用したエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201に代えて、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202を用いたこと以外は、実施例２と同様の条件、方法にてイソプロパノール生産実験を行った。
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202を培養開始から２４時間後及び４８時間後の反応液を遠心分離（４℃、１５，０００×ｇ、１０分）し、得られた上清液を用いてガスクロマトグラフィーによりイソプロパノールを分析したところ、イソプロパノールが７５ｍＭ（２４時間後）及び１６２ｍＭ（４８時間後）生成していた。
実施例２のエシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC201の結果との比較において、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）JM109/pCRC202は、より高いイソプロパノール生成能を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の形質転換体は、糖類から極めて効率よくイソプロパノールを生産することができるため有用である。
本発明により、再生可能資源を原料とした効率的なイソプロパノール生産が可能となり、石油資源原料に依存しないイソプロパノール工業生産プロセスの新規な構築が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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