(57)【要約】  本発明は、エストロゲン応答遺伝子であるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかを標的とし、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することが可能なｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、並びに癌細胞増殖抑制剤及び医薬を提供することを目的とする。即ち本発明は、（ａ）配列番号：１〜配列番号：３８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子；前記二本鎖核酸分子を含む子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかに対する癌細胞増殖抑制剤；並びに、前記癌細胞増殖抑制剤を含む子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかに対する医薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：３８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖
とを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子。
【請求項２】
センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：５、及び、配列番号：１６〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３】
センス鎖が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、及び、配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である請求項２に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４】
センス鎖が、配列番号：１、配列番号：２、及び、配列番号：１６のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である請求項３に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５】
センス鎖が、配列番号：２、及び、配列番号：１６のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラの少なくともいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡの少なくともいずれかである請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤であって、請求項１から７のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、請求項８に記載のＤＮＡ、及び、請求項９に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
【請求項１１】
子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であって、請求項１０に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の予防乃至治療に好適な、ｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子を含む癌細胞増殖抑制剤、並びに、前記癌細胞増殖抑制剤を含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌及び子宮癌はともにホルモン依存性癌として知られており、性ステロイドホルモンであるエストロゲンがその発癌・増殖に深く関与している。これらの癌に対する従来の治療方法としては、例えば、転写因子であるエストロゲン受容体（ＥＲ）と結合してその転写活性を抑制する薬剤である抗エストロゲン製剤（タモキシフェン）を用いた乳癌の内分泌療法などが行われているが、治療過程において耐性を獲得し、再発することが問題となっている。また、この薬剤は子宮癌発症のリスクを増加させることが明らかにされており、重篤な副作用の問題も有している。また、子宮癌に対しては、ホルモンのプロゲステロンに似た合成薬であるプロゲスチンを投与し、子宮に対するエストロゲンの作用を阻害する療法などが行われているが、気分が不安定になったり、体重が増加するなどの副作用の問題も有している。
このような従来の治療方法における諸問題を克服するため、乳癌及び子宮癌におけるエストロゲンの作用機序を解明し、その機構に根ざした、新たな分子標的の開発が望まれている。【０００３】
また、膀胱は子宮などとともに泌尿生殖器系から分化する臓器であり、エストロゲン、アンドロゲンなどの性ホルモンによって制御されることが考えられる。また、エストロゲン欠乏による更年期障害では膀胱障害を発症しやすいことが知られている。膀胱癌と性ホルモンとの関与については今のところ明らかではないが、膀胱癌は一般的に男性に多く発症することが知られている。従来の膀胱癌の治療においては、外科的な膀胱全摘除術が多く行われているが、膀胱全摘除術を行うと尿路変更が必ず必要となり、ライフスタイルの変更が必要になることもあり、生活の質（ＱＯＬ）の著しい低下が問題となっている。そのため、最近では症例を選択して膀胱温存療法が試みられるようになってきているが、抗癌剤、放射線療法などの治療法が奏効しない症例も多く存在している。
このような従来の治療方法における諸問題を克服するため、これまでと異なる作用機序に基づいた、副作用の少ない膀胱癌の治療の開発が望まれている。【０００４】
一方で、近年、１８〜２９塩基程度の小分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を細胞内に導入することにより、配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制することのできるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の技術を、癌治療に応用する試みが広く行われている。実際に、癌に関与する遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡを用いることにより、癌細胞の増殖を抑制できることも多く報告されている（例えば、特許文献１〜２）。しかしながら、このようなＲＮＡｉの技術を実際の医療に応用するためには、標的遺伝子に対する高い発現抑制効果と高い特異性を有する、優れたｓｉＲＮＡを開発することが必要であり、更なる検討が望まれているのが現状である。【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５００９１６号公報
【特許文献２】特表２００６−５２８６１８号公報
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、エストロゲン応答遺伝子であるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかを標的として、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することが可能なｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子を含む癌細胞増殖抑制剤、及び前記癌細胞増殖抑制剤を含む医薬を提供することを目的とする。
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、本発明者らが作製した特定の配列を有するｓｉＲＮＡ、及び、そのＲＮＡ配列の一部をＤＮＡに変換したキメラｓｉＲＮＡが、エストロゲン応答遺伝子であるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子に対して顕著に優れた発現抑制効果を有しており、これらの遺伝子の発現抑制を介して、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することができるという知見である。また、このようなｓｉＲＮＡ、及び、キメラｓｉＲＮＡを、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌を予防乃至治療するための医薬の有効成分として好適に利用できるという知見である。
【０００８】
ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子は、ともにエストロゲンによってその発現が誘導されるエストロゲン応答遺伝子であり、子宮癌及び乳癌において過剰発現していることが知られている。本発明者らは、今回、これらの遺伝子の発現を効率よく、かつ特異的に消失させるｓｉＲＮＡ、及び、キメラｓｉＲＮＡを新たに見出した。また、本発明者らは、これらのｓｉＲＮＡ、及び、キメラｓｉＲＮＡを、乳癌細胞株（ＭＣＦ７）、子宮癌細胞株（Ｉｓｈｉｋａｗａ）、又は膀胱癌細胞株（ＥＪ）をヌードマウスに皮下移植した腫瘍増殖モデルにおいて形成された癌に投与することによって、それぞれの癌の増殖を著しく抑制することが可能となることを見出した（実施例参照、後述）。これらの結果は、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、Ｅｆｐ遺伝子が、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌における癌の増殖に深く関与しており、これらの癌に対する新たな分子標的となり得ることを示すものである。なお、膀胱癌におけるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、Ｅｆｐ遺伝子の発現、並びにそれらの機能については現在まで明らかにされておらず、本発明は、膀胱癌細胞においてＥｆｐ遺伝子の発現を確認し、さらに膀胱癌の増殖に関わることをはじめて解明したものである。本発明は膀胱癌の治療における新しい治療薬としての二本鎖核酸分子の可能性を示すものであり、これまでと異なる作用機序に基づいた、副作用の少ない膀胱癌の治療に応用できると考えられる。
【０００９】
本発明者らが作製したｓｉＲＮＡ、及び、キメラｓｉＲＮＡは、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌を予防乃至治療するための新たな医薬の有効成分として好適に利用可能であると考えられる。また、これらのｓｉＲＮＡ、及び、キメラｓｉＲＮＡは、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌における癌細胞増殖のメカニズムを解き明かし、これらの病態の更なる解明に役立つことも期待される。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：３８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖
とを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞  センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：５、及び、配列番号：１６〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜３＞  センス鎖が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、及び、配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜２＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜４＞  センス鎖が、配列番号：１、配列番号：２、及び、配列番号：１６のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜３＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜５＞  センス鎖が、配列番号：２、及び、配列番号：１６のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜４＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜６＞  二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜７＞  ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡの少なくともいずれかである前記＜６＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜８＞  キメラｓｉＲＮＡが、３’側の８塩基がＤＮＡであり、その他の塩基がＲＮＡであるセンス鎖と、５’側の６塩基がＤＮＡであり、その他の塩基がＲＮＡであるアンチセンス鎖との組合せからなる前記＜７＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜９＞  センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端が、それぞれ２〜６塩基突出した構造を有する前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜１０＞  修飾を有する前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜１１＞  前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜１２＞  前記＜１１＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜１３＞  プラスミドベクター及びウイルスベクターのいずれかである前記＜１２＞に記載のベクターである。
＜１４＞  タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターである前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のベクターである。
＜１５＞  ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターである前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のベクターである。
＜１６＞  子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤であって、前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜１１＞に記載のＤＮＡ、及び、前記＜１２＞から＜１５＞のいずれかに記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜１７＞  子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための方法であって、子宮癌細胞及び乳癌細胞の少なくともいずれかに、前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜１１＞に記載のＤＮＡ、及び、前記＜１２＞から＜１５＞のいずれかに記載のベクターの少なくともいずれかを作用させることを特徴とする方法である。
＜１８＞  子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であって、前記＜１６＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬である。
＜１９＞  子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための方法であって、個体に、前記＜１６＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を投与することを特徴とする方法である。
【００１１】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、エストロゲン応答遺伝子であるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかを標的として、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の癌細胞の増殖を効果的に抑制することが可能なｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子を含む癌細胞増殖抑制剤、及び前記癌細胞増殖抑制剤を含む医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＣＯＸ７ＲＰ蛋白質発現に対する、各ｓｉＣＯＸ７ＲＰの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＣＯＸ７ＲＰ蛋白質発現に対する、各ｓｉＣＯＸ７ＲＰの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞及びＭＣＦ７細胞におけるＣＯＸ７ＲＰ蛋白質発現に対する、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞及びＭＣＦ７細胞におけるＥｆｐ蛋白質発現に対する、各ｓｉＥｆｐの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＥｆｐ蛋白質発現に対する、各ｓｉＥｆｐの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図３】図３は、ＥＪ細胞におけるＥｆｐ蛋白質発現に対する、ｓｉＥｆｐ＃１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＣＯＸ７ＲＰ蛋白質発現に対する、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＥｆｐ蛋白質発現に対する、キメラｓｉＥｆｐ＃１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＭＣＦ７細胞におけるＣＯＸ７ＲＰ蛋白質発現に対する、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＭＣＦ７細胞におけるＥｆｐ蛋白質発現に対する、キメラｓｉＥｆｐ＃１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図６Ａ】図６Ａは、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の、ＭＣＦ７細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、ｓｉＥｆｐ＃１の、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｓｉＥｆｐ＃１の、ＭＣＦ７細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図８】図８は、ｓｉＥｆｐ＃１の、ＥＪ細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の、ＭＣＦ７細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、キメラｓｉＥｆｐ＃１の、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、キメラｓｉＥｆｐ＃１の、ＭＣＦ７細胞に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、各ｓｉＲＮＡの増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の移植後７．５週の腫瘍におけるＣＯＸ７ＲＰ、Ｅｆｐ蛋白質発現に対する、各ｓｉＲＮＡの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の移植後４週及び６．５週における、各ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＭＣＦ７細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、各ｓｉＲＮＡの増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＭＣＦ７細胞の移植後７．５週の腫瘍におけるＣＯＸ７ＲＰ、Ｅｆｐ蛋白質発現に対する、各ｓｉＲＮＡの発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＭＣＦ７細胞の移植後４週及び６．５週における、各ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの写真である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＥＪ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、ｓｉＥｆｐ＃１の増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＥＪ細胞の移植後４．５週における、各ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの写真である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の移植後５．５週の腫瘍におけるＣＯＸ７ＲＰ蛋白質発現に対する、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の移植後４．５週における、各キメラｓｉＲＮＡ投与群のマウスの写真である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞を皮下に移植したマウスにおける腫瘍体積の増加に対する、キメラｓｉＥｆｐ＃１の増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の移植後５．５週の腫瘍におけるＥｆｐ蛋白質発現に対する、キメラｓｉＥｆｐ＃１の発現抑制効果を示したウエスタンブロット像である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の移植後４．５週における、各キメラｓｉＲＮＡ投与群のマウスの写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（二本鎖核酸分子）
本発明の二本鎖核酸分子は、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であり、（ａ）配列番号：１〜配列番号：３８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。
なお、本発明において「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子をいう。【００１４】
＜ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、Ｅｆｐ遺伝子＞
前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、前記Ｅｆｐ遺伝子は、前記したように、ともにエストロゲンによってその発現が誘導されるエストロゲン応答遺伝子であり、子宮癌及び乳癌において過剰発現していることが知られている。なお、膀胱癌におけるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、Ｅｆｐ遺伝子の発現、並びにそれらの機能については、これまで明らかにされていない。
本発明において、前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、前記Ｅｆｐ遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、本明細書中において前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、前記Ｅｆｐ遺伝子を、前記二本鎖核酸分子の「標的遺伝子」と称することがある。
なお、参考として、ヒトの前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子配列を配列番号：４１に、ヒトの前記Ｅｆｐ遺伝子配列を配列番号：４２に示す。【００１５】
＜センス鎖、アンチセンス鎖＞
前記したように、本発明者らは、鋭意検討の結果、前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、前記Ｅｆｐ遺伝子のｍＲＮＡ配列の中でも、ある特定の標的配列（配列番号：１〜配列番号：３８）に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子が、前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、前記Ｅｆｐ遺伝子に対して顕著に優れた発現抑制効果を有することを見出した。したがって、本発明の二本鎖核酸分子は、（ａ）配列番号：１〜配列番号：３８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むものである。
ここで、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよいし、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ鎖であってもよい。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とは、互いにハイブリダイズすることで前記二本鎖核酸分子を形成することができる。
なお、前記配列番号：１〜配列番号：３８のうち、配列番号：１〜配列番号：１５はヒトＣＯＸ７ＲＰ遺伝子配列（配列番号：４１）の一部であり、配列番号：１６〜配列番号：３８はヒトＥｆｐ遺伝子配列（配列番号：４２）の一部である。【００１６】
中でも、前記二本鎖核酸分子としては、前記センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：５、及び、配列番号：１６〜配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることが好ましく、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、及び、配列番号：２１のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることがより好ましく、配列番号：１、配列番号：２、及び、配列番号：１６のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることが更に好ましく、配列番号：２、及び、配列番号：１６のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることが特に好ましい。
前記センス鎖が、前記好ましいセンス鎖以外のセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の前記標的遺伝子に対する発現抑制効果が弱くなる場合がある。一方で、前記センス鎖が、前記特に好ましいセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の使用量が少量であっても、前記標的遺伝子に対する強い発現抑制効果が得られる点で、有利である。【００１７】
＜種類＞
前記二本鎖核酸分子の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラなどが挙げられる。
ここで、「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいい、「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。【００１８】
前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であることが特に好ましい。ここで、ｓｉＲＮＡとは、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、前記したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、かつ前記標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。【００１９】
また、前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であってもよい。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
前記ｓｈＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。【００２０】
また、前記二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラは、キメラｓｉＲＮＡであることが特に好ましい。ここで、キメラｓｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列の一部がＤＮＡに変換された、１８〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラをいう。中でも、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’側の８塩基、及び、アンチセンス鎖の５’側の６塩基がＤＮＡに変換された、２１〜２３塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラであることが好ましい。前記キメラｓｉＲＮＡは、前記ｓｉＲＮＡと同様に、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記キメラｓｉＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
前記キメラｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ）は、血中安定性が高い、免疫応答誘導性が低い、製造コストが低いなどの点で、有利である。【００２１】
＜修飾＞
また、前記二本鎖核酸分子は、目的に応じて、適宜修飾を有していてもよい。例えば、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を付与し、培養液中や生体中における安定性を向上させる等の目的から、前記二本鎖核酸分子に、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾や、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾等を施すことができる。また、例えば、細胞への導入効率を高める等の目的から、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。なお、前記二本鎖核酸分子にこのような修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。【００２２】
＜入手方法＞
前記二本鎖核酸分子の入手方法としては、特に制限はなく、それぞれ従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、前記ｓｉＲＮＡは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８〜２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、アニーリング済の二本鎖ｓｉＲＮＡの市販品を入手することもできるし、ｓｉＲＮＡ合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
また、前記キメラｓｉＲＮＡは、例えば、キメラ核酸分子であるセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ化学合成し、それらをアニーリングすることにより、作製することができる（例えば、特許第３８０３３１８号参照）。【００２３】
（ＤＮＡ、ベクター）
本発明のＤＮＡは、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡを含むベクターである。【００２４】
＜ＤＮＡ＞
前記ＤＮＡとしては、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ  ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。また、更に、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。【００２５】
＜ベクター＞
前記ベクターは、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、その種類としては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。また、前記ベクターは、前記二本鎖核酸分子を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。前記二本鎖核酸分子の発現様式としては、特に制限はなく、例えばｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）や、ｓｈＲＮＡとしての一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等を選択することができる。
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。【００２６】
前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸分子を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。【００２７】
（癌細胞増殖抑制剤）
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤（腫瘍増殖抑制剤）であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含んでなり、更に必要に応じてその他の成分を含んでなる。【００２８】
＜二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター＞
前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とするＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現を効果的に抑制することができるので、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための前記癌細胞増殖抑制剤の有効成分として好適である。また、前記ＤＮＡ、ベクターの詳細としても、前記した本発明のＤＮＡ、ベクターの項目に記載した通りである。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞増殖抑制剤としては、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかそのものであってもよい。【００２９】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００３０】
＜子宮癌細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞＞
前記癌細胞増殖抑制剤の適用対象となる細胞は、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかであり、これらの癌細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、子宮癌、乳癌、膀胱癌を患う患者の体内に存在する細胞であってもよい。前記体外で培養されている子宮癌細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記子宮癌細胞としては、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞（ヒト子宮内膜癌由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚癌由来）などが挙げられ、前記乳癌細胞としては、例えば、ＭＣＦ細胞（ヒト乳癌由来）などが挙げられ、前記膀胱癌細胞としては、ＥＪ細胞（ヒト膀胱癌由来）などが挙げられる。これらの細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）や、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手することができる。【００３１】
＜作用＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、例えば、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかに導入（トランスフェクト）することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかに対して作用させる前記癌細胞増殖抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、１ｘ１０６個の細胞数に対し、有効成分（二本鎖核酸分子）の量として、０．１μｇ程度が好ましく、５μｇ程度がより好ましく、１５μｇ程度が特に好ましい。【００３２】
＜癌細胞増殖抑制方法＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかに作用させることにより、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかに作用させることを特徴とする、癌細胞の増殖抑制方法（腫瘍増殖抑制方法）にも関する。【００３３】
（医薬）
本発明の医薬は、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であり、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤を含み、更に必要に応じてその他の成分を含んでなる。【００３４】
＜癌細胞増殖抑制剤＞
前記癌細胞増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤の項目に記載した通りである。前記癌細胞増殖抑制剤は、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、標的とするＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかの増殖を効果的に抑制することができる。即ち、前記癌細胞増殖抑制剤は、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬として好適に利用可能である。
前記医薬中の前記癌細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬としては、前記癌細胞増殖抑制剤そのものであってもよい。【００３５】
ここで、前記医薬の有効成分となる前記二本鎖核酸分子としては、非修飾の状態の二本鎖核酸分子そのものを用いてもよいが、適切に予防乃至治療効果が得られるよう、生体への投与に適した形態の二本鎖核酸分子を用いることが好ましい。
例えば、前記二本鎖核酸分子は、生体内における二本鎖核酸分子の安定性を高めることができる点で、修飾が施されていることが好ましい。前記二本鎖核酸分子に施し得る修飾の種類としては、特に制限はなく、例えば、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾などが挙げられる。また、標的細胞への導入効率を高める等の目的から、例えば、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともまた好ましい。前記二本鎖核酸分子に前記修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
また、前記二本鎖核酸分子は、標的細胞への導入効率を高めることができる点で、リポソームや高分子マトリックス等と複合体を形成していることも好ましい。前記複合体を形成する方法としても、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。【００３６】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００３７】
＜剤型＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。【００３８】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。【００３９】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。【００４０】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。【００４１】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。【００４２】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。【００４３】
＜投与＞
前記医薬は、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかの予防乃至治療に好適である。なお、前記子宮癌とは、子宮内膜癌（子宮体癌、子宮体部癌）、及び、子宮頸癌（子宮頸部癌）のいずれをも含むものとする。したがって、前記医薬は、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかに罹患した患者に投与することにより好適に使用することができる。【００４４】
前記医薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。【００４５】
前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬の有効成分（二本鎖核酸分子）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分（二本鎖核酸分子）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。【００４６】
前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分（二本鎖核酸分子）の量として、１〜１００ｍｇが好ましい。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。【００４７】
前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。中でも、前記医薬は、子宮癌細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞の増殖を阻害し、前記癌細胞の増殖による腫瘍の増大を防ぐ効果に優れることから、前記医薬は前記疾患の出来る限り早期の段階に投与されることが望ましいと考えられる。【００４８】
＜予防／治療方法＞
前記医薬は、前記癌細胞増殖抑制剤を含むので、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを患う個体に投与することにより、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌細胞の増殖を効果的に抑制し、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記癌細胞増殖抑制剤を投与することを特徴とする、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかに対する予防乃至治療方法にも関する。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【００５０】
（実施例１：二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）の作製）
ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための本発明の二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を、以下のようにして準備した。
ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＸ７ＲＰ）＃１〜４と、Ｅｆｐ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥｆｐ）＃１〜５は、それぞれのｓｉＲＮＡのターゲットとする遺伝子配列（以下に記載）とその相補的な配列を、３’末端が２塩基オーバーハングするようなＲＮＡの二本鎖として合成した（ＲＮＡｉ社）。ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃５は、ターゲットとする遺伝子配列（以下に記載）とその相補的な配列を、３’末端が２塩基オーバーハングするように合成したＲＮＡの二本鎖であるが、オーバーハングする２塩基をＤＮＡで作製した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）。ｓｉＥｆｐ＃６は、ターゲットとする遺伝子配列（以下に記載）とその相補的な配列からなるＲＮＡの二本鎖であり、３’末端にウラシル２塩基のオーバーハングを有するもので、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のｓｉＧＥＮＯＭＥＴＭ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌより入手した。
また、コントロールとして、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＧＬ２  Ｄｕｐｌｅｘ（ｓｉＬＵＣ）はＤｈａｒｍａｃｏｎ社が、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌはＲＮＡｉ社が作製したものを使用した。【００５１】
それぞれのｓｉＲＮＡのターゲットとする遺伝子配列、及び対応する配列番号を以下に示す。
ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃１    ５’−ｃｔｃｃｇａｔｔｃｃａｃａｇｔｇｔａｔｇａ−３’（配列番号：１）
ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２    ５’−ｇｔｇｇｇａｇｇｇａｃｃａｔｃｔａｃｔｇｃ−３’（配列番号：２）
ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃３    ５’−ｇｃｔｇａａｃａｃａｇｇｃｔｔｇｔｔａａｔ−３’（配列番号：３）
ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃４    ５’−ｇｔｇｇｃｔｔｃａｃｇｃａｇａａｇｔｔｇｇ−３’（配列番号：４）
ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃５    ５’−ｃｔｇａｃｃｔｃｃｇａｔｔｃｃａｃａｇｔｇ−３’（配列番号：５）
ｓｉＥｆｐ＃１    ５’−ｇｇｇｔｇｇｇｃｇｔｇｃｔｔｃｔｃａａｃｔ−３’（配列番号：１６）
ｓｉＥｆｐ＃２    ５’−ｇｔｃｃａｃｃｔｇａｔｇｔａｔａａｇｔｔｃ−３’（配列番号：１７）
ｓｉＥｆｐ＃３    ５’−ｇｇｇａｔｇａｇｔｔｃｇａｇｔｔｔｃｔｇｇ−３’（配列番号：１８）
ｓｉＥｆｐ＃４    ５’−ｃｇｇｔｇｔｃａｔｃｔｃｃｔａａｃａａｇｇ−３’（配列番号：１９）
ｓｉＥｆｐ＃５    ５’−ｇｃｃｃｇａｔｔｃｃｔｃｔｔａｇａｇａａａ−３’（配列番号：２０）
ｓｉＥｆｐ＃６    ５’−ｇａｃｃｇｃａｇｃｔｇｃａｃａａｇａａ−３’（配列番号：２１）
ｓｉＬＵＣ    ５’−ｃｇｔａｃｇｃｇｇａａｔａｃｔｔｃｇａ−３’（配列番号：３９）
ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ    ５’−ｇｕａｃｃｇｃａｃｇｕｃａｕｕｃｇｕａｕｃ−３’（配列番号：４０）【００５２】
（実施例２：二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）の作製）
ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための本発明の二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）を、以下のようにして準備した。
ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子に対するキメラｓｉＲＮＡ（ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２）とＥｆｐ遺伝子に対するキメラｓｉＲＮＡ（ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＥｆｐ＃１）を、それぞれｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２とｓｉＥｆｐ＃１に同一の塩基配列で、一部をＤＮＡに置換することにより作製した。具体的には、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端より８塩基のＲＮＡと、アンチセンス鎖の５’端より６塩基のＲＮＡとをＤＮＡに置換し、それぞれのキメラｓｉＲＮＡを作製した。
また、ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２に対するネガティブコントロールとしてのキメラｓｉＲＮＡ（ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−ＣＯＸ７ＲＰ）を、ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２の配列をランダムに並び変えて一部をＤＮＡに置換することにより作製した。ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＥｆｐ＃１に対するネガティブコントロールとしてのキメラｓｉＲＮＡ（ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−Ｅｆｐ）を、ｃｈｉｍｅｒａ  ｓｉＥｆｐ＃１の配列をランダムに並び変えて一部をＤＮＡに置換することにより作製した。
なお、これらのキメラｓｉＲＮＡは、いずれもＲＮＡｉ社が作製したものを使用した。【００５３】
それぞれのキメラｓｉＲＮＡのセンス鎖配列、及び対応する配列番号を以下に示す。
キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２    ５’−ｒＧＵｒＧｒＧｒＧｒＡｒＧｒＧｒＧｒＡｒＣｒＣｒＡＴＣＴＡＣＴＧＣ−３’（配列番号：４３）
キメラｓｉＥｆｐ＃１    ５’−ｒＧｒＧｒＧＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＧＵｒＧｒＣＵＴＣＴＣＡＡＣＴ−３’（配列番号：４４）
キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−ＣＯＸ７ＲＰ    ５’−ＣＴＴｒＧＵｒＧｒＧｒＧｒＡｒＧｒＧｒＧｒＡｒＣｒＡｒＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号：４５）
キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−Ｅｆｐ    ５’−ＣＴＡｒＧｒＧｒＧＵｒＧｒＧｒＧｒＣｒＧＵＵｒＣｒＧＴＡＣＣＴ−３’（配列番号：４６）
（Ｕ、及びｒＧ、ｒＣ、ｒＡはＲＮＡ塩基、Ｔ、Ｇ、Ｃ、ＡはＤＮＡ塩基を示す。）【００５４】
（実施例３：ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける標的遺伝子発現抑制効果の検討）
前記実施例１で得られた各ｓｉＲＮＡ、及び、前記実施例２で得られた各キメラｓｉＲＮＡを、ヒト子宮癌、乳癌、膀胱癌由来の培養細胞（Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＥＪ細胞）にトランスフェクションし、４８時間後に蛋白質サンプルを回収してウエスタンブロット解析を行うことにより、各ｓｉＲＮＡ及び各キメラｓｉＲＮＡの、各培養細胞におけるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。実験方法の詳細は以下の通り。【００５５】
［細胞培養］
ヒト子宮内膜癌由来Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞３Ｈ１２  Ｎｏ．７４は、国立霞ヶ浦病院  西田正人氏より供与いただいた。ヒト子宮頚癌由来ＨｅＬａ細胞、及びヒト乳癌由来ＭＣＦ７細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手した。ヒト膀胱癌由来ＥＪ細胞はＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。これらの細胞は１０％  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（Ｒｏｃｈｅ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂａｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）で、５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。【００５６】
［トランスフェクション］
トランスフェクションの前日に、６穴プレートに５×１０５／ｗｅｌｌの密度で各細胞をまいた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＮ（Ｇｉｂｃｏ）２５０μｌ／ｗｅｌｌとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μｌ／ｗｅｌｌとを混合し、５分間、３７℃でインキュベートした。これをＯｐｔｉ−ＭＥＮ  ２５０μｌ／ｗｅｌｌとｓｉＲＮＡ（最終濃度１５０ｎＭ）又はキメラｓｉＲＮＡ（最終濃度１５０ｎＭ）との混合液に加え、さらに３７℃で２０分間インキュベートし、ウェルに添加した。なお、ＥＪ細胞の場合にはｓｉＥｆｐ＃２を最終濃度５０ｎＭで使用した。また、ｓｉＲＮＡのみ除いたものを溶媒コントロール（Ｖｅｈｉｃｌｅ）とした。
ｓｉＲＮＡ又はキメラｓｉＲＮＡ添加４８時間後に、４×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．５、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、４％  ＳＤＳ、４％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）にて細胞を回収し、１００℃で１５分間ボイルした。得られたサンプルのＯＤ２８０ｎｍを測定し、ＢＳＡの検量線を用いて蛋白質濃度を算出した。【００５７】
［ウエスタンブロット解析］
蛋白質サンプル１０００μｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へブロッティングした。蛋白質の検出は、１次抗体として、Ｅｆｐ或いはＣＯＸ７ＲＰ抗体（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．誌９０巻２３号  １１１１７−１１１２１ページ  １９９３年、及び、埼玉医科大学雑誌３１巻４号  １９９−２０６ページ  ２００４年  参照）を、２次抗体として、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により行った。その後、Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．７、２％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）にて抗体を除去後、ローディングコントロールとして、一次抗体β−ａｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ）、二次抗体ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。【００５８】
本実施例３の結果を、図１Ａ〜１Ｃ、図２Ａ〜２Ｂ、図３、図４Ａ〜４Ｂ、及び、図５Ａ〜５Ｂに示す。【００５９】
ＣＯＸ７ＲＰの蛋白質発現については、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞では、配列＃１、＃２において特にノックダウン効果が高く、次いで＃５の効果が高く、＃３は比較的その効果に乏しかった（図１Ａ）。ＨｅＬａ細胞では、試験した＃１〜＃４の４種の配列全てにおいて高いノックダウン効果が認められた（図１Ｂ）。これらの中でも、配列＃２は特にノックダウン効果が高く、ＭＣＦ７細胞では、１５０ｎＭにおいてのみＣＯＸ７ＲＰの発現を示すバンドは完全に消失したが、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞では、１ｎＭでもバンドが完全に消失し、強力なノックダウン効果を認めた（図１Ｃ）。
Ｅｆｐの蛋白質発現については、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＭＣＦ７細胞において、配列＃１、＃５、＃３、＃２の順に高いノックダウン効果が認められた（図２Ａ）。ＨｅＬａ細胞においても、やはり配列＃１のノックダウン効果が高く、＃４、＃６は、＃２ほど効果は低くないものの、＃１よりはやや劣っていた（図２Ｂ）。
また、ｓｉＥｆｐ＃１は、膀胱癌細胞であるＥＪ細胞においても、Ｅｆｐの蛋白質発現を効率良く抑制し、高いノックダウン効果を示した（図３）。【００６０】
また、ｓｉＲＮＡにおいて高いノックダウン効果を示したｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２、ｓｉＥｆｐ＃１に対応するキメラｓｉＲＮＡ（キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２、キメラｓｉＥｆｐ＃１）についても、それぞれＣＯＸ７ＲＰの蛋白質発現及びＥｆｐの蛋白質発現を効果的に抑制することが、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞とＭＣＦ７細胞の双方の細胞において示された（Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞：図４Ａ〜４Ｂ、ＭＣＦ７細胞：図５Ａ〜５Ｂ）。【００６１】
（実施例４：ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
前記実施例１で得られた各ｓｉＲＮＡ、及び、前記実施例２で得られた各キメラｓｉＲＮＡを、ヒト子宮癌、乳癌、膀胱癌由来の培養細胞（Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＥＪ細胞）にトランスフェクションし、各ｓｉＲＮＡ及び各キメラｓｉＲＮＡの、各培養細胞に対する増殖抑制効果を検討した。実験方法の詳細は以下の通り。なお、細胞培養は前記実施例３と同様の手法により行った。【００６２】
［トランスフェクション及び細胞数測定］
トランスフェクションの前日に、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＥＪ細胞を２４ウェルプレートにそれぞれ８，０００個、８，０００個、６，０００個ずつまいた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＮ（Ｇｉｂｃｏ）２５０μｌ／ｗｅｌｌとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μｌ／ｗｅｌｌを混合し、５分間、３７℃でインキュベートした。それをＯｐｔｉ−ＭＥＮ  ２５０μｌ／ｗｅｌｌとｓｉＲＮＡ（最終濃度５０ｎＭ）との混合液に加え、さらに３７℃で２０分間インキュベートし、ウェルに添加した。なお、キメラｓｉＲＮＡの場合には、最終濃度１５０ｎＭとして用いた。ｓｉＲＮＡ又はキメラｓｉＲＮＡ添加１日後から７日後に、生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ、ナカライテスク）を用いて呈色反応を行い、吸光度（４５０ｎｍ）を測定して細胞数を定量化した。【００６３】
本実施例４の結果を、図６Ａ〜６Ｂ、図７Ａ〜７Ｂ、図８、図９Ａ〜９Ｂ、及び、図１０Ａ〜１０Ｂに示す。【００６４】
Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞及びＭＣＦ７細胞にｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２、ｓｉＥｆｐ＃１、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクションし、その後の細胞増殖速度を解析したところ、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞においては２日後からｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２及びｓｉＥｆｐ＃１投与によって有意に細胞増殖が抑制され、ＭＣＦ７細胞においては１日後からｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２及びｓｉＥｆｐ＃１投与によって有意に細胞増殖が抑制された（ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２：図６Ａ〜６Ｂ、ｓｉＥｆｐ＃１：図７Ａ〜７Ｂ）。
また、ＥＪ細胞にｓｉＥｆｐ＃１、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌをトランスフェクションし、その後の細胞増殖速度を解析したところ、４日後にｓｉＥｆｐ＃１投与によって有意に細胞増殖が抑制された（図８）。【００６５】
また、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞及びＭＣＦ７細胞に各キメラｓｉＲＮＡ（キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２、キメラｓｉＥｆｐ＃１）をトランスフェクションし、その後の細胞増殖速度を解析したところ、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２及びキメラｓｉＥｆｐ＃１投与によって有意に細胞増殖が抑制された（キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２：図９Ａ〜９Ｂ、キメラｓｉＥｆｐ＃１：図１０Ａ〜１０Ｂ）。【００６６】
（実施例５：ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果の検討）
前記実施例１で得られた各ｓｉＲＮＡ、及び、前記実施例２で得られた各キメラｓｉＲＮＡについて、ヌードマウスの皮下に移植した腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を検討した。実験方法の詳細は以下の通り。なお、細胞培養やウエスタンブロット解析は、前記実施例３と同様の手法により行った。【００６７】
［ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験（ｓｉＲＮＡ／Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞・ＭＣＦ７細胞）］
４週齢、メスのヌードマウスＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ（日本クレア）を各群１２匹ずつ用意し、皮下に腫瘍細胞を移植した。移植する細胞は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞（２×１０７ｃｅｌｌｓ／匹）若しくはＭＣＦ７細胞（１×１０７ｃｅｌｌｓ／匹）と、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを混合し、合計１５０μｌ／匹となるように調整した。腫瘍径を週２回計測し、腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ；３ ｒ３／４，ｒ＝長径×短径×短径／８）を算出した。
移植後１．５週目から週２回、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ若しくはｓｉＥｆｐを皮下の腫瘍に直接注入した。なお、ここで、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐとしては、前記実施例２でノックダウン効果が高かったｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２、ｓｉＥｆｐ＃１をそれぞれ使用した。注入するｓｉＲＮＡ  ５μｇ／匹に、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）４μｌ／匹、及び、ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭを混合し、ｔｏｔａｌ  ５０μｌ／匹に調整した。
移植から７．５週後にヌードマウスを屠殺し、皮下の腫瘍をＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｎＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．４、２５０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にてホモジナイズした。さらに、４×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと混合した後、１０５℃で１５分間ボイルし、蛋白質サンプル１０００μｇ分をウエスタンブロット解析した。【００６８】
［ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験（ｓｉＲＮＡ／ＥＪ細胞）］
４週齢、オスのヌードマウスＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ（日本クレア）を各群１０匹ずつ用意し、皮下にＥＪ細胞を移植した。移植する細胞は、ＥＪ細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／匹）とＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合し、合計１５０μｌ／匹となるように調整した。移植後１週目から週２回、ｓｉＥｆｐ＃１、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを、前記と同様の処理にて調整し、皮下の腫瘍に直接注入した。腫瘍径を週２回計測し、腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ；３ ｒ３／４，ｒ＝長径×短径×短径／８）を算出した。【００６９】
［ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験（キメラｓｉＲＮＡ／Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞）］
４週齢、メスのヌードマウスＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ（日本クレア）を各群１０匹ずつ用意し、皮下に腫瘍細胞を移植した。移植する細胞は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞（４×１０６ｃｅｌｌｓ／匹）とＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合し、合計１５０μｌ／匹となるように調整した。移植後１週目から週２回、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２、キメラｓｉＥｆｐ＃１、キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−ＣＯＸ７ＲＰ、キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−Ｅｆｐを、前記と同様の処理にて調整し、皮下の腫瘍に直接注入した。腫瘍径を週２回計測し、腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ；３ ｒ３／４，ｒ＝長径×短径×短径／８）を算出した。
移植から５．５週後にヌードマウスを屠殺し、皮下の腫瘍をＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｎＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．４、２５０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）にてホモジナイズした。さらに４×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと混合した後、１００℃で１５分間ボイルし、蛋白質サンプル１０００μｇ分をウエスタンブロット解析した。【００７０】
本実施例５の結果を、図１１Ａ〜１１Ｃ、図１２Ａ〜１２Ｃ、図１３Ａ〜１３Ｂ、図１４Ａ〜１４Ｃ、図１５Ａ〜１５Ｃに示す。【００７１】
Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞においては、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群では腫瘍体積は指数関数的な増加を示したのに対し、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐの両群では、ともに移植後２．５週でいったん腫瘍は縮小した後、穏やかに増大し、最終的に移植後７．５週での腫瘍体積は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群の体積のおよそ三分の一ほどにまで抑制された。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群に対するｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐの各群の腫瘍体積につきＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを行うと、移植後２．５週からｐ＜０．０５と有意差を認め、移植後３．５週以降ではｐ＜０．０１であった（図１１Ａ）。また、移植から７．５週後の皮下腫瘍におけるＣＯＸ７ＲＰ、Ｅｆｐの蛋白質発現量をウエスタンブロットにて解析すると、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐの両群ともに発現量の低下を認めた（図１１Ｂ、各群２サンプルずつ示した）。また、図１１Ｃに、移植後４週と６．５週において撮影した実際のヌードマウスの写真を各群一匹ずつ掲載した。ｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐの両群では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群に対して、明らかに腫瘍の増大が抑制されていることがわかる。【００７２】
同様の解析をＭＣＦ７細胞においても行った。移植後２．５週でｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐの両群ともに腫瘍体積は縮小し、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ群では、以後あまり増大を認めなかった。ｓｉＥｆｐ群でも、移植後７．５週時点での腫瘍体積は、移植後１．５週時点と大差なかった。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔでは、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ群では移植後２．５週から、ｓｉＥｆｐ群では移植後３．５週から、有意に（ｐ＜０．０１）ノックダウン効果を認めた（図１２Ａ）。また、移植から７．５週後の皮下腫瘍におけるＣＯＸ７ＲＰ、Ｅｆｐの蛋白質発現量は、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐによりそれぞれ低下していた（図１２Ｂ）。図１２Ｃに、移植後４．５週と７．５週において撮影した実際のヌードマウスの写真を各群一匹ずつ掲載した。ｓｉＣＯＸ７ＲＰ、ｓｉＥｆｐの両群では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群に対して、明らかに腫瘍の増大が抑制されていることがわかる。【００７３】
同様の解析をＥＪ細胞についても行った。その結果、ｓｉＥｆｐ＃１群では移植後２週から有意に（ｐ＜０．０１）ノックダウン効果が認められ、ｓｉＥｆｐ＃１は膀胱癌細胞であるＥＪ細胞を用いたヌードマウスにおける腫瘍増殖モデルにおいても、腫瘍の増大を効果的に抑制することが明らかになった（図１３Ａ）。図１３Ｂに、移植後４．５週において撮影した実際のヌードマウスの写真を各群一匹ずつ掲載した。ｓｉＥｆｐ＃１群では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ群に対して、明らかに腫瘍の増大が抑制されていることがわかる。【００７４】
また、キメラｓｉＲＮＡを用いて同様の解析を行ったところ、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞において、キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−ＣＯＸ７ＲＰ群では、腫瘍体積は指数関数的な増加を示したのに対し、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２群では、有意に腫瘍体積の増加が抑制された（図１４Ａ）。また、移植から５．５週後の皮下腫瘍におけるＣＯＸ７ＲＰの蛋白質発現量は、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２投与により低下していることが認められた（図１４Ｂ）。また、図１４Ｃに、移植後４．５週において撮影した実際のヌードマウスの写真を各群一匹ずつ掲載した。キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２群では、キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−ＣＯＸ７ＲＰ群に対して、明らかに腫瘍の増大が抑制されていることがわかる。
また、同様に、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞において、キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−Ｅｆｐ群では腫瘍体積は指数関数的な増加を示したのに対し、キメラｓｉＥｆｐ＃１群では、有意に腫瘍体積の増加が抑制された（図１５Ａ）。また、移植から５．５週後の皮下腫瘍におけるＥｆｐの蛋白質発現量は、キメラｓｉＥｆｐ＃１投与により低下していることが認められた（図１５Ｂ）。また、図１５Ｃに、移植後４．５週において撮影した実際のヌードマウスの写真を各群一匹ずつ掲載した。キメラｓｉＥｆｐ＃１群では、キメラｓｉＣｏｎｔｒｏｌ−Ｅｆｐ群に対して、明らかに腫瘍の増大が抑制されていることがわかる。【００７５】
以上の実施例１〜実施例５により、本発明の二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）が、子宮癌、乳癌、膀胱癌細胞におけるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子、Ｅｆｐ遺伝子の発現に対して高い抑制効果を有することが示された。更に、これらの二本鎖核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示されたことから、子宮癌、乳癌、膀胱癌を予防乃至治療するための医薬の有効成分として好適に利用可能であると考えられる。特に、ｓｉＣＯＸ７ＲＰ＃２は、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞において１ｎＭという低い濃度でも十分なノックダウン効果が得られたことから（図１Ｃ）、子宮内膜癌をはじめとした、子宮癌への臨床応用が大いに期待される。【００７６】
また、これらの実施例の結果から、ｓｉＲＮＡの配列を基に設計したキメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ、キメラｓｉＥｆｐについても、共にｋｎｏｃｋｄｏｗｎ効果の高いｓｉＲＮＡとして機能することが明らかになった。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖の抑制効果を確認した結果でも、腫瘍形成は、キメラｓｉＣＯＸ７ＲＰ及びキメラｓｉＥｆｐ投与群においてコントロール群より有意に小さかった。したがって、これらのキメラｓｉＲＮＡについても、ｓｉＲＮＡ同様、子宮癌、乳癌、膀胱癌の治療に臨床応用できる可能性が示唆された。二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラであるこれらのキメラｓｉＲＮＡは、血中安定性が高い、免疫応答誘導性が低い、製造コストが低いなどの観点から、臨床応用への実用化に有利であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の二本鎖核酸分子は、エストロゲン応答遺伝子であるＣＯＸ７ＲＰ遺伝子及びＥｆｐ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介し、子宮癌細胞、乳癌細胞、及び膀胱癌の増殖を効果的に抑制することができるので、子宮癌や乳癌、膀胱癌に対する優れた医薬の有効成分として有用である。また、本発明の二本鎖核酸分子を有効成分とする医薬は、エストロゲン受容体に作用するタモキシフェン等の従来の薬剤と比較して、よりエストロゲン作用経路の下流において作用するため、より副作用の少ない医薬となり得ることが期待される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2008156172.tif 000010
【図５Ｂ】
2008156172.tif 000011
【図６Ａ】
2008156172.tif 000012
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2008156172.tif 000019
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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