【手続補正書】
【提出日】平成14年10月15日(2002.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
（発明の背景）
生物学のプロセスの多様性は、１つの化学物質種または生物学的種、巨大分子または微粒子（例えば、細胞、ウイルスまたはビリオン）の他の化学物質種または生物学的種、巨大分子または微粒子に対する結合によって媒介される。多くの場合において、結合価は、生物学のプロセスの媒介の機構の重要な局面であり得るという証拠がある。本発明は、多価のリガンドを用いているこのような相互作用の結合価を選択的に変化させるための化合物および方法に関し、このリガンドに関し、多様な化学物質種または生物学的種が、制御された方法に付随した他の化学物質種または生物学的種（概して、本明細書中で認識エレメント（ＲＥ）と称する）と結合することに関連し、ＲＥの数、ＲＥの配置およびＲＥの相対的な方向性の制御を伴う。ある種の認識エレメントは、生物的なシグナル伝達プロセスにおいて直接的または間接的に関与する。他方の認識エレメントは、単に生物的なプロセスに関連した結合に関与するに過ぎない。従って本発明は、概してそのような多価のリガンドの構造を制御することによる生物学的なプロセスの制御に関している。本発明の多価のリガンドは、具体的には細胞のシグナル伝達プロセスにおいて、およびより一般には、生物的なプロセスに関与する認識エレメントの巨大分子の組立てにおいて用途を有する。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、多価のリガンドを提供し、そのリガンドは直接的または間接的に細胞または他の生物的な粒子に結合するための、もしくはさらに一般的に任意の生物的な分子に結合するための、少なくとも１つの認識エレメント（ＲＥ）、および好ましくは多数の認識エレメントを保有または提示する。提供される多価のリガンドは、細胞凝集、および概して生物的な巨大分子の巨大分子の組立てに関して、最も一般的に、任意の生物的な粒子または生物的な分子に結合または標的にするために機能し得、そして特に、細胞または細胞の型またはウイルスを標的にするために機能し得る。本発明の多価のリガンドは、概して化学物質種または生物学的種（抗原、エピトープ、リガンド結合群、細胞レセプターのためのリガンド（細胞表面レセプター、膜貫通レセプターおよび細胞質レセプター）、および種々の巨大分子（核酸、炭水化物、サッカリド、タンパク質、ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）の足場（集合）を作製するために適用可能である。これらの足場において、認識エレメントの数、配置、相対的位置および相対的方向性が制御され得る。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の多価のリガンドの足場は、多数のＲＥ、ＳＲＥ、または随意的にＦＥと組合わせて両方を包含し、多様な診断的および臨床的な応用（特に血液型分類および病原体の検出）において用いられ得る。本明細書中の多価リガンドは、多様な生物的な分子および粒子（細胞およびウイルス）の検出ならびに多様なアッセイ方法（とりわけ組織学、ウエスタンブロット、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、凝集アッセイ）において用いられ得る。一般に、そのようなリガンドにおける結合価の増加は、アッセイまたは診断的な感受性における増加と関連される。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の多価のリガンドは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるシグナル伝達プロセス（すなわち、生物学的な系において、細胞の外側と内側との間、ならびに細胞と細胞との間の情報の伝達）を調製する方法において用いられ得る。その方法は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボ（細胞は、多細胞生物を包含する自然環境から取り除かれ、そしてその環境に戻させるためにいったん処理されることが意図される）で実行され得た。例えば、ＳＲＥに対する走化性、または遊走性の応答が改変され得る。そのような方法は、原核生物微生物（例えば、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌）または真核生物微生物（哺乳動物を包含する種々の生物の真核生物の寄生体および病原体を包含するが、これらに限定しない）、および哺乳動物の細胞、および特にヒトの細胞を包含する、真核生物細胞より大きな生物、（例えば、白血球、リンパ球、内皮細胞、上皮細胞）に適用可能である。細菌細胞、または真核生物細胞（真核生物の病原体、または寄生体を包含する）における応答を調製する多価のリガンドが使用されて、細菌、または真核生物の病原体または寄生体による増殖、コロニー化、遊走化、または生物膜の形成を阻害し得、結果として、そのような微生物による感染またはコロニー化を阻害し得る。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
ハプテンという用語は、当該分野において、抗原の少なくとも１つ決定された基を有する低分子としてその一般に認められた意味をとり、、ハプテンは抗体と結合し得るが、ハプテンが担体分子との接合において作用しなければ、免疫原性ではない。ハプテンとしては、とりわけ、ヘモシアニン、およびニトロ−置換の芳香族環化合物（例えば、ジニトロフェニル基、トリニトロベンゼンスルフォニル基、およびジニトロフルオロフェニル基）が挙げられる。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本明細書中で使用される抗体という用語は、抗体として機能する任意のタンパク質またはタンパク質フラグメントを包含することが意図され、任意のタンパク質またはタンパク質フラグメントは抗体として機能し、そして具体的には、とりわけ、Ｆａｂフラグメントを含む抗体フラグメントを包含することが意図される。  レクチンは、主に植物種子中で見出された赤血球凝集タンパク質の大きな群のいづれかである。ある種のレクチンは、ある種の血液の赤血球の凝集を起こし、他のものは、リンパ球の増殖を刺激する。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明の多価のリガンドは、原核生物または真核生物におけるシグナル伝達を調製するために使用され得る。そのリガンドは、多様なシグナル伝達プロセスにおいて機能する。原核生物は、高度に保存された細胞内シグナル伝達のシステム（二成分系（ｔｗｏ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ））を有する。この系の主要な成分は、交互のヒスチジン−アスパラギン酸キナーゼ媒介のリン酸化事象（例えば、毒性、抗生物質に対する抵抗性、環境ストレスに対する応答、および環境感知に対する応答）の数量を変化している。二成分系の成分は、原核生物において高度に保存されている。対照的に、真核生物は、シグナル伝達のための二成分系をほとんど有していないようである。この直交性は、二成分シグナル伝達経路を細菌感染の制御のための治療設計における開発の第一標的とする。真核生物の主要なシグナル伝達系は、Ｇタンパク質結合レセプター、および酵素結合レセプターによって媒介される（レセプターグアニリルシクラーゼ、レセプターチロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連レセプター、レセプターチロシンリン酸化酵素、およびレセプターセリン／スレオニンキナーゼを包含する）。これらの経路においてシグナル伝達を調製または調節するための能力は、真核生物細胞、および真核生物（哺乳動物、特にヒトを包含する）における広く多様な生物的なプロセスの制御を可能にし、そして治療剤の設計のための重要な機会を提供する。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
図１は、本発明の多価のリガンドが生物的な応答のエフェクターとして機能し得ることによるいくつかの機構を例証する。多価のリガンドは、シグナル伝達に直接関与し得るので、多価のリガンド上のＳＲＥは、細胞表面レセプターモノマーリガンドに類似に結合し、そして応答を直接的に誘導（または阻害）する。ＳＲＥが、分子の足場に結合される本発明の多価のリガンドの使用は、細胞表面上のレセプターのクラスター形成、または細胞表面上のレセプターの再局在化、セカンドメッセンジャーの局在を増加し得るが、セカンドメッセンジャーの局在を促進し得るが、または単にＳＲＥ（リガンド）の濃度の局所的な増加により親和性を増加し得る。直接的なシグナルを経て機能する多価のリガンドは、多様な適用（生物膜形成の妨害、または細胞移行の妨害に基づくものを包含する）において用いられ得、ワクチン、ならびに他の治療剤（癌の処置および抗生物質）のために特に興味深いものである。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
具体的な実施形態において、本発明の直線状の多価のリガンドは、環式開口複分解重合（ＲＯＭＰ）によって調製される（例えば、（５４）を参照のこと）。この方法は、細胞機能の多価のインヒビターを調製するために使用されている（２７，２８）。ＲＯＭＰ法は、ポリグリコマーである多価のリガンドに関連する米国特許５，５８７，４２２号により詳細に記載されている。ブロックポリマー（および、オリゴマー）を生成させるため、ならびにＲＯＭＰポリマー（および、オリゴマー）上の末端基を導入するためのＲＯＭＰ法の改善は、両方が１９９９年６月１７日に出願された米国特許出願第０９／３３５，４２０号、および同第０９／３３６，１２１号において記載されている（これらの米国特許文書は、特にＲＯＭＰ法の説明に関して、米国特許文書の全体が、本明細書中に参考として援用される）。スキーム６は、ＲＯＭＰの基幹の改変のための例示的な方法を例証し、その方法は、本発明の多価のリガンドを合成するための上記の列挙される特許、および特許出願において記載される合成方法と組合わせて適用され得る。スキーム６は、ＲＯＭＰの足場の基幹において二重結合を還元するために用いられ得るジイミド還元（２３，９８，９９）を例証する。スキーム６はまた、ＯｓＯ４が触媒したジヒドロキシル化（１００，１０１）を使用したＯＨ基でのＲＯＭＰの足場の基幹の置換を例証する。当業者は、本明細書中での記載、および当該分野で周知の方法を用いて、本発明の多価のリガンド、特に本明細書中の式で具体的に示される多価のリガンドを調製し得る。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
【化９】
2004512258.tif 000001
ここで、ｍは、第一のＳＲＥ（ＳＲＥ１）を保持するモノマーの数であり、ｎは、第二のＳＲＥ（ＳＲＥ２）を保持するモノマーの数である。Ｌ１およびＬ２は、上記のようなリンカーであり、これらは、同じであっても異ってもよい。すべて他の変数は、以前の式で定義されたとおりであり、破線は、任意の二重結合を示す。ｍおよびｎの両方は、最も一般的には、１〜約１０，０００までの範囲にあり得る整数であるが、これらは、より代表的には、１〜数百または数千の範囲にある。ｍの値は、ｎの値と同じであっても異なってもよい。好ましいリガンドにおいて、ｎ＋ｍは、５以上から約２００の範囲にある。本発明の多価リガンドとしては、ｎ＋ｍが、約１０と２５との間の範囲にあるリガンド、ｎ＋ｍが２５以上であるリガンド、ｎ＋ｍが５０以上であるリガンド、およびｎ＋ｍが１００以上であるリガンドが挙げられる。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
細菌の膜のケモレセプターの組織化を変える多価リガンドの能力を確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉを、蛍光標識を有するガラクトース保有多価リガンドである化合物８で処理した（スキーム１）。Ｅ．ｃｏｌｉを化合物８またはフルオレセイン標識−抗Ｔｓｒ抗体１４で処理した場合、観察された蛍光パターンは類似していた。両物質は細菌の極で結合することが観察され、これは、ＲＯＭＰ由来のリガンドが細菌性のケモレセプターに特異的に結合することを示している。レセプター１５を再構築するこれらの多価リガンドの能力に直接取り組むために、ＣｈｅＷ変異体を両化合物で処理した。図６で例示するように、化合物８と共存する抗Ｔｓｒ抗体標識化ケモレセプターの斑点を観察した。この結果は、多価リガンド８は細胞レセプター組織化において観察された変化を担うことを示している。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
Ｃ３ｄ補体フラグメントは、Ｂ細胞のＣＲ２レセプタ−（ＣＤ２１／ＣＤ１９複合体）に結合する。クローン化されたＣ３ｄ遺伝子フラグメントと鶏卵リゾチーム遺伝子のＣ末端領域の融合による融合産物の発現は、免疫原性を、強力なアジュバンドと組み合わせられたリゾチームで達成されたレベルよりも有意に（１，０００倍）増加させ得た［６２］。スキーム４は、異なるシグナルを選択的に共有結合させることによって、ＲＯＭＰポリマー２９から調製された二つの異なるシグナル群３０を含む例示的な多価リガンドを例示する。シグナルの一つは、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ペプチド（Ａ２０細胞株に特異的）：１０３〜１１７ＮＧＭＮＡＷＶＡＷＲＮＲＣＫＧ（配列番号：１）［６３］であり、もう一方は、ＣＲ２への結合に関与する１６マーのＣ３ｄペプチド：ＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡ（配列番号：２）［６２］である。このＨＥＬペプチドは、このペプチドの末端付近のリジン側鎖［４１］、またはこのペプチドのＮ末端のアミンに位置するこのポリマーの骨格［４０］に結合し得る：
４０：＊ＧＤＧＮＧＭＮＡＷＶＡＷＲＮＲ−ＣＯＮＨ２（配列番号：３）または、
４１：ＤＧＮＧＭＮＡＷＶＡＷＲＮＲＧＫ＊−ＣＯＮＨ２（配列番号：４）
ここで、＊は接着部位を示す。Ｃ３ｄペプチドは、ペプチド（４２および４３）のいずれかの末端に位置するシステインのチオールを介して多価リガンドに結合し得る：
４２：＊ＣＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡ（配列番号：５）または
４３：ＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡＣ＊（配列番号：６）。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
図２Ａは、ビデオ顕微鏡動作解析実験の結果である。細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を、緩衝液のみ、ガラクトース、または示されたサッカリド濃度で化合物１または３（スキーム１）を用いて処理した。その結果を、３連で実行される少なくとも５回の独立実験からの平均で示す。エラー棒を、１０秒の間隔中での毎秒の平均の間の偏差を示す。
図２Ｂ−Ｅは、緩衝液のみ（Ｂ）；１ｍＭガラクトース（Ｃ）；または１ｍＭ化合物１（Ｄ）；または１ｍＭ化合物３（Ｅ）で処理された細菌（グラム陰性菌、Ｅ．ｃｏｌｉ）のために選択されたサンプル経路である。サンプル経路は、処理された細菌集団からのそれぞれの細菌の運動に由来する。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
図３Ａおよび３Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉのキャピラリー累積アッセイの結果である。累積した細菌の数を、サッカリド残基上で計算された誘引物（ガラクトースまたは化合物１−４、スキーム１）の濃度に対してプロットした。（Ａ）：結果を、示された濃度で緩衝液のみ、化合物１、および化合物２、または（Ｂ）：緩衝液のみ、化合物３、および化合物４で満たされたキャピラリーに関して示した。１ｍＭでの垂直線は、モノマーの化合物１に関する最大の走化性の濃度を示す。このアッセイにおいて使用される濃度は、運動分析実験（図２Ａを参照のこと）において使用されるこれらと直接的には比較可能でない、なぜならキャピラリーアッセイにおいて形成される勾配は規定されないからである。結果を、２連で実行される３から６回の実験の平均とし、そしてエラー棒を、単一の標準偏差で示した。部分的な透過化処理が、４に対する走化性を得るために必要であり、そして全ての実験に関して利用した［５７］。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
図４は、ＲＯＭＰ誘導グルコースリガンド（化合物５−７、スキーム１）を使用するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのキャピラリー累積アッセイの結果である。緩衝液のみ、グルコース、またはグルコース伴有化合物５−７を、キャピラリー累積アッセイにおいて誘引物として使用した。結果を、グルコース、化合物５、化合物６、および化合物７で示した。結果を、２連で実行される少なくとも４回の試みの平均とし、エラー棒を、単一の標準偏差で示す。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５Ａ】
図５Ａは、（Ａ）：細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、緩衝液のみ（黒四角）もしくは１０μＭ誘引物：ガラクトース（黒丸）、化合物１（１０マー、黒三角）、または化合物３（２５マー、黒ひし形）を用いた最初の処理（その後、２分の適応期間が続く）後、セリンの漸増濃度（μＭ）で処理した；ビデオ顕微鏡動作解析実験の結果である。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５Ｂ】
図５Ｂは、（Ｂ）セリン濃度１μＭで図６Ａからとられた角平均速度のデータに関する棒グラフ。化合物３を用いた最初の処理は、セリンに対する細菌応答の有用な増強をもたらす。角平均速度は、異なる日に実行された実験間で約１４％変化したビデオ顕微鏡動作解析実験の結果である。