【手続補正書】
【提出日】平成16年4月6日(2004.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローニングベクターにおける核酸であるか、またはクローニングおよび／もしくは発現に必要な少なくとも一つの機能的なヌクレオチド配列を有するクローニングベクターに組み込むために適切な核酸であって、それぞれのＲＥＩＩｓまたは“ホーミングヌクレアーゼ”の切断部位が前記機能的なヌクレオチド配列内に位置するように前記少なくとも該核酸の機能的なヌクレオチド配列が少なくとも一つのＲＥＩＩｓ認識配列もしくは“ホーミングヌクレアーゼ”認識配列とカップリングされることを特徴とする核酸。
【請求項２】
前記核酸または少なくとも該核酸の機能的なヌクレオチド配列は、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＩＩ）の認識配列および／または切断部位であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸は、数多のＲＥＩＩｓとカップリングされたＲＥＩＩ切断部位を有することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記核酸は、異なるＲＥＩＩ切断部位とカップリングされたＲＥＩＩｓを有するか、または一つのＲＥＩＩ切断部位とカップリングされた数多の異なるＲＥＩＩｓを有することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、ＲＥＩＩｓもしくは“ホーミングヌクレアーゼ”の認識配列であることを特徴とする請求項１乃至４に記載の核酸。
【請求項６】
前記核酸または前記少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列であることを特徴とする請求項１乃至５の一つに記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合タンパク質もしくはＲＮＰ粒子の認識配列であることを特徴とする請求項１乃至６の一つに記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、エンハンサー配列であることを特徴とする請求項１乃至７の一つに記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、サイレンサー配列であることを特徴とする請求項１乃至８の一つに記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、停止配列であることを特徴とする請求項１乃至９の一つに記載の核酸。
【請求項１１】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、ポリアデニレーション配列であることを特徴とする請求項１乃至１０の一つに記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、遺伝子もしくはオープンリーディングフレームであることを特徴とする請求項１乃至１１の一つに記載の核酸。
【請求項１３】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、別の調節配列であることを特徴とする請求項１乃至１２の一つに記載の核酸。
【請求項１４】
前記核酸または該核酸の少なくとも機能的なヌクレオチド配列は、前記クローニングされた断片から発現されたタンパク質の精製を容易にする配列であることを特徴とする請求項１乃至１３の一つに記載の核酸。
【請求項１５】
前記核酸はクローニングベクターの構成部分であることを特徴とする請求項１乃至１４の一つに記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸はキャリア物質に結合されたことを特徴とする請求項１乃至１５の一つに記載の核酸。
【請求項１７】
前記キャリア物質は、アガロース、シリカ化合物、ポリスチレン化合物、テフロン（登録商標）−アクリルアミド、ポリプロピレン、ナイロン、セファクリル、ラテックス、常磁性の粒子、ナノ粒子、およびセルロースの派生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
本発明による核酸による核酸断片の連続して線形のリンク方法であって、該方法は、
（ｉ）ＲＥＩＩｓの切断部位または“ホーミングヌクレアーゼ”がＲＥＩＩ認識および切断配列内に位置し、ＲＥＩＩ切断部位と任意に同一である際に、請求項１乃至４による核酸を提供することと、
（ｉｉ）それぞれのＲＥＩＩｓまたはＲＥＩＩを使用して本発明による前記核酸を開口することと、
（ｉｉｉ）本発明による前記核酸のＲＥＩＩと互換性のある末端を３´末端と同様に５´末端に有する第一の核酸断片の挿入と、
（ｉｖ）前記それぞれのＲＥＩＩｓ（ＲＥＩＩでない）を使用して本発明による前記核酸を開口することと、
（ｖ）本発明による前記核酸のＲＥＩＩと互換性のある末端である、前記３´末端と同様に前記５´末端に有する第二の核酸断片の挿入と
からなり、さらなる核酸断片の挿入のための前記段階（ｉｖ）乃至（ｖ）は、所望であれば任意に繰り返されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
プロモーター配列の選択的な不活性方法であって、該方法は、
（ｉ）請求項６による核酸を提供する段階と、
（ｉｉ）任意にＲＥＩＩｓ−Ａおよび／またはＲＥＩＩｓ−Ｂで前記核酸を開口する段階と、
からなり、
前記（ｉ）の段階において、
ａ）ＲＥＩＩｓの切断部位または“ホーミングヌクレアーゼ”が前記プロモーター配列内に位置し、
ｂ）前記２つのプロモーター配列が同一であるか異なる際に、前記プロモーター配列が相対する方向で２回提供され、
ｃ）両プロモーター配列は、ＲＥＩＩｓ−ＡはＲＥＩＩｓ−Ｂと異なる各ＰＥＩＩｓ（ＲＥＩＩｓ−Ａ、ＲＥＩＩｓ−Ｂ）の少なくとも一つにカップリングされることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１４による核酸を含むクローニングベクター。
【請求項２１】
前記クローニングベクターは、前記核酸で生じる前記ＲＥＩＩｓまたは“ホーミングヌクレアーゼ”におけるさらなる認識もしくは切断部位を有しないことを特徴とする請求項２０に記載のクローニングベクター。
【請求項２２】
請求項２０もしくは２１によるクローニングベクターまたは請求項１乃至１５の一つによる核酸を含む細胞。
【請求項２３】
請求項１乃至１６の一つによる少なくとも一つの核酸と、一つ以上のＲＥＩＩとの任意な組み合わせにおける少なくとも一つの適切なＲＥＩＩｓと、リガーゼと、同様に、任意で追加的に適切な酵素および適切なバッファーとを包含するキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】クローニングベクターのための核酸
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クローニングベクター内の核酸またはクローニングベクターに組み込まれるために適切な核酸に関し、かかる核酸はクローニング／発現に必要な少なくとも一つの機能的な配列を有する。
【背景技術】
【０００２】
クローニングベクターは、ベクターの増殖または宿主細胞の生存のいずれかにとって必須ではない、ベクターの領域における制限エンドヌクレアーゼの独特な切断部位を含むことによって特徴とされる。従来技術において、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３等の特徴を有する元来のクローニングベクターは、マルチプルクローニングポイントもしくはポリリンカーと呼ばれる様々な制限エンドヌクレアーゼにおける複数の連続する切断部位を有する配列領域を含むベクターによってほとんど全体的に置き換えられる。頻繁には、それらクローニング部位／ポリリンカーは多機能の配列ユニットに構成され、かかる配列領域はさらに、他の機能的な配列を含み、例えば、クローニングされたターゲットのＤＮＡ断片の転写が実現できるＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（つまり、ベクター内にクローニングされたＤＮＡ断片）、停止配列およびポリアデニレーション信号もしくはクローニングされたターゲットのＤＮＡ断片から発現されたタンパク質の精製を容易にする配列を含む。
【０００３】
クローニングのために一般的に使用されるＩＩ型の制限エンドヌクレア−ゼ（以下、ＲＥＩＩと記載）は、特定のＤＮＡ認識配列（一般的に４−８塩基対）はさらに同時の特定の切断部位であり、かかる認識配列はそれらの中心に関するポイントと対称であり、さらに頻繁的にはパリンドロームである特徴を所有する。すなわち、２本鎖で考慮する場合、両鎖の読み取り方向から同一の読み取り配列の結果となり、ＤＮＡのソースと独立してそれぞれのＤＮＡ配列の切断を生じ、同一の互換性のＤＮＡ末端が生成される。
【０００４】
ＲＥＩＩの典型的な例は、ＥｃｏＲＩによって表される。その認識配列は、両鎖の６塩基対（５´ＧＡＡＴＴＣ３´）であり（パリンドロームを意味する）、その切断部位は、毎回Ｇの後でＡの前の５´から３´方向における二本鎖ＤＮＡの各鎖に位置される。
【０００５】
【化１】
2005503160.tif 000001
切断したオープンクローニングベクター（上の文字）およびクローニングされるターゲットのＤＮＡ断片（下の文字）の共なるスプライシングがＥｃｏＲＩで両者が生成された場合、この酵素の認識配列および切断部位は、特にそれぞれのターゲットのＤＮＡ断片の両端で、再び再合成される。
【０００６】
【化２】
2005503160.tif 000002
当然のこととして、これはＥｃｏＲＩだけに適用しないだけでなく、パリンドローム認識および切断部位を有するすべてのＲＥＩＩにも適用しない。
【０００７】
一般的なＲＥＩＩの欠点の一つは、同一末端を有するクローニングする数多のターゲットのＤＮＡ断片がベクター内に配列を確定する場合に実証される。第一のターゲットのＤＮＡ断片において、それぞれのＲＥＩＩの認識配列および切断部位が２回生成され、つまりターゲットのＤＮＡ断片の両端で、第二のターゲットのＤＮＡ断片を挿入するために、さらなる後の切断なしで、２つの切断部位の一つのみによって特異的に再度開くことは可能ではない。この場合、当業者は、通常、部分的な消化を導くことを試す。しかしながら、このアプローチは望ましくない切断産物を生じ、したがって、後に望ましくないクローニング産物を生じる。
【０００８】
ＲＥＩＩの手段によるそれら従来のクローニング方法の原理は、図１に概略して例示されており、望ましくないクローニング産物は影付けされて示す。
【０００９】
図１による概略図から、第二のターゲットのＤＮＡ断片にクローニングした場合でも、所望の正確なクローニング産物の検索は、時間と入力に関して非能率的であることを証明する。３つ、４つもしくはそれら以上のターゲットのＤＮＡ断片がクローニングされる場合、たとえ当業者が、例えばオーバーラッピングＰＣＲ、二本鎖の消化および同様の補足の方法を使用したとしても、従来の方法は実際問題として実行できない。
【００１０】
より利用されはしないが、従来技術で知られている制限エンドヌクレアーゼのさらなるグループはまた、ＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼである（以下、ＲＥＩＩｓとして記す）。それらの制限エンドヌクレアーゼは、ＲＥＩＩとは異なり、一方で、それらの認識配列（通常４−８塩基対）は通常は対称的でなく、したがってパリンドロームではない、また一方で、それらは切断部位が異なり、認識配列は同一である必要性はないが、切断部位は認識配列から定義された距離で位置される。下記は、切断部位の位置および型において可能である。
【００１１】
ａ）両ＤＮＡ鎖は、認識配列の定義された塩基の距離の外側で切断される（“アウトサイドカッター”）である。
【００１２】
前述の“アウトサイドカッター”において従来技術で周知の典型的な例は、ＲＥＩＩｓのＡａｒｌである。その認識配列は、ＤＮＡ鎖の一つの７塩基の配列の５´ＣＡＣＣＴＧＣ３´、相補鎖のＤＮＡ鎖の５´ＧＣＡＧＧＴＧ３´であり、その切断部位は４番目と５番目のオプションの塩基間に位置し、認識配列の前の５´から３´方向で位置する８番目と９番目のオプションの塩基間で５´から３´方向で認識配列５´ＣＡＣＣＴＧＣ３´に続く。
【００１３】
【化３】
2005503160.tif 000003
ｂ）切断は、認識配列の外側の定義された塩基の距離の一本鎖で実行され、一方で、認識配列内の定義された位置で実行される（“部分的なアウトサイドカッター”）。
【００１４】
従来からの例は、ＲＥＩＩｓのＢｓｅＮＩである。
【００１５】
【化４】
2005503160.tif 000004
ｃ）両鎖は認識配列内の定義されたポイントで切断される。
【００１６】
従来からのこの例はＲＥＩＩｓのＢｓｓＳＩである。
【００１７】
【化５】
2005503160.tif 000005
ＲＥＩＩｓに属しはしないが、制限エンドヌクレアーゼのさらなるグループは、特に、“ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）ヌクレアーゼ”であるＲＥＩＩｓとして同様の特質を表す。一般的に８−２０塩基対のより長い認識配列によって、それらは主要なＲＥＩＩｓとは異なる。
【００１８】
一般的に従来技術の“ホーミングヌクレアーゼ”における典型的な例は、２４塩基の認識配列を有するＩ型酵素のＨｍｕＩＩ（“アウトサイドニッカー”）である。
【００１９】
【化６】
2005503160.tif 000006
そのような酵素の少なくとも２つの組み合わせを活用することによって、一般的に“アウトサイドニッカー”がその切断部位でのみ一本鎖の破壊を生成するので、両核酸鎖を切断するための新規で有利な切断部位は実現できる。
【００２０】
“アウトサイドカッター”または“インサイドカッター”でＤＮＡを切断する場合、前述のようにして得られたＤＮＡ断片の一つにおけるそれぞれの酵素の認識配列は、完全なままであり（一方、切断するためにＲＥＩＩを活用する際にアナログで破壊される）、切断によって得られた断片の２つの端は、同一の酵素で得られた別の断片と一般的には互換性はなく、したがって、互いに対してのみ直接的に再度リンクできる（直接相互）。この理由において、それら“アウトサイドカッター”／“アウトサイドニッカー”は、従来のクローニングにおいて不安定であり、現在まで、使用する他の分野はほとんど知られていない。
【００２１】
“アウトサイドカッター”などの適用における数少ない例のうちの一つは、ファーメンタスエービー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＡＢ）社（ビルニス、ラトビア）の２０００／０１カタログの１９６／１９７ページに記載されている。従来のベクターでのダイレクショナルクローニングの末端を得るために、ＰＣＲにおけるプライマー配列の切断のための“アウトサイドカッター”は、そこに適用される。ＲＥＩＩｓの手段によって核酸分子の導かれた合成における従来の周知の方法は、数多の欠点が問題となる。多くの方法は、例えば、ポリメラーゼの手段によって反応を満たす、ヌクレアーゼの手段による特定のある核酸領域の切断もしくは修正、例えば、ホスファターゼなど当該技術で周知の修飾酵素の手段による核酸の修飾などのさらなるコンプレックスの酵素反応の適用を必要とする。さらに、周知の方法で、導かれた方法で数多の核酸を共にリンクすることは頻繁には可能ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、ＲＥＩＩｓの非特異的な切断と同様に数多のターゲットのＤＮＡ断片をスプライシングするためのＲＥＩＩｓを利用する場合に前述した欠点を伴わずにクローニングおよび／または発現のための有用で機能的な配列を提供することである。さらなる目的は、コンプレックスの酵素反応を必要とせずに核酸合成のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上述の目的を達成するために、核酸はクローニングベクターまたはクローニングベクターに組み込まれるために最適なものに提供され、核酸は、クローニングおよび／または発現のために少なくとも一つの機能的なヌクレオチド配列を有し、機能的な核酸配列が、それぞれの“ホーミングヌクレアーゼ”認識配列の少なくとも一つのＲＥＩＩｓ認識配列と結合され、それはそれぞれの“ホーミングヌクレアーゼ”、それぞれのＲＥＩＩｓの切断部位が機能的なヌクレオチド配列内に位置するように結合される。この核酸を用いて、当業者にとって同じＲＥＩＩの存在する認識配列の少なくとも一つおよび／または単一で繰り返された連続で他に存在する機能的な配列の少なくとも一つを選択することが可能である。核酸は、特にＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００２４】
用語“クローニングおよび発現に必要な機能的なヌクレオチド配列”は、ここではＲＥＩＩ切断部位の特定の任意の型を含むが、加えて、さらにＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、ＲＥＩＩｓの機能的な配列もしくは“ホーミングヌクレアーゼ”自体および他の配列または、ある特定の周知の機能を有する部分的な配列が当業者に周知であり、例えば、
−プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、停止配列、ポリアデニレーション配列（制御的な配列）
−遺伝子、オープンリーディングフレーム
−タンパク質およびＲＮＰ結合部位
−クローニングされた断片から発現したタンパク質の精製を容易にする配列
である。
【００２５】
ここで使用される状況で“結合された”の用語は、下記の意味を含み、
−ＲＥＩＩｓの認識配列および切断部位、それぞれの“ホーミングヌクレオチド”は、クローニングおよび／または発現のために必要な機能的な配列エリア内であり、つまり、核酸配列の部分的な配列は、機能的な配列エリア内でターゲットのＤＮＡ断片をクローニングするために適するか、またそうでなければ機能的である。
【００２６】
−切断部位はクローニングおよび／または発現のために必要な機能的な配列エリア内に位置する。つまり、ヌクレオチド配列の部分的な配列はＤＮＡ断片をクローニングするために適するか、またそうでなければ機能的であるが、認識配列はクローニング／発現のために必要な機能的な配列外に位置する（ベクターシークエンス内）。
【００２７】
必要であれば、認識配列または切断部位あるいは他の機能的なヌクレオチド配列が断片化された形態でのみ存在し、本発明にしたがって核酸を生成するために当業者にとって周知の方法によって特定の適用において共に結合されることは重要でない。
【００２８】
本発明による核酸の好ましい実施態様において、特に、ＲＥＩＩおよびＲＥＩＩｓの特徴は、各々が選択的にアクセスできる機能的なユニットに結合される。複数のＲＥＩＩにさらに存在できる認識配列の各々（特に、それぞれの核酸）は、ＲＥＩＩｓにおいて共通としての認識配列は制限処理中または後に保存されて、切断部位はそれぞれのＲＥＩＩ認識および切断配列内に位置し、所望であれば、ＲＥＩＩ切断部位と同一にできる、ＲＥＩＩｓの一つ以上を選定できる。結果として、このＲＥＩＩの切断部位は特異的となることができ、選択的にアクセスでき、これはＲＥＩＩおよびＲＥＩＩｓの切断部位が同一である場合にそれぞれの酵素（ＲＥＩＩｓ）の手段によって開口でき、次いで、かかる開口（切断開口部）はＲＥＩＩに典型的であるＤＮＡの付着末端を通常は生成することを意味する。
【００２９】
この好ましい実施態様は、さらなる酵素的段階を必要としないで任意のタイプの連続の数多の所望の核酸断片を共に連続的で線形にスプライスするために使用される。挿入された核酸断片の方向は、例えば、非対称の制限分析または配列決定など当業者にとって周知の方法によって決定できる。
【００３０】
本発明はまた、本発明による核酸を使用することによって核酸断片の連続して線形な結合のための方法を含み、かかる方法は下記の段階、
（ｉ）ＲＥＩＩｓの切断部位、それぞれの“ホーミングヌクレアーゼ”がＲＥＩＩ認識および切断配列内に位置し、ＲＥＩＩ切断部位と同一である際に、本発明による核酸を提供することと、
（ｉｉ）それぞれのＲＥＩＩｓまたはＲＥＩＩを使用して本発明による核酸を開口することと、
（ｉｉｉ）本発明による核酸のＲＥＩＩと互換性のある末端を３´末端と同様に５´末端に提供される第一の核酸断片の挿入と、
（ｉｖ）それぞれのＲＥＩＩｓ（ＲＥＩＩでない）を使用して本発明による核酸を開口することと、
（ｖ）本発明による核酸のＲＥＩＩと互換性のある末端を有する３´末端と同様に５´末端に提供される第二の核酸断片の挿入と
からなり、さらなる核酸断片の挿入のための段階（ｉｖ）乃至（ｖ）は、所望であれば繰り返しできる。
【００３１】
本発明による方法は、実施例１でさらに例証される。
【００３２】
本発明にしたがって、一つまたは数多のかかるＲＥＩＩｓと結合したＲＥＩＩの切断部位は、全く同一の核酸に組み込むことができ、多くの適用において、各単一のＲＥＩＩｓ／ＲＥＩＩの組み合わせは核酸に一度だけ存在する。特定の適用（ダイレクショナルクローニングなど）において、複数のカップリングは有利であり、つまり、様々なＲＥＩＩ切断部位を有するＲＥＩＩｓのカップリング、一つのＲＥＩＩ切断部位と様々なＲＥＩＩｓのそれぞれのカップリングである。
【００３３】
したがって、本発明の目的は、特に、ＲＥＩＩｓの認識配列およびＲＥＩＩの切断配列からの異なる組み合わせを各々備える、機能的なＤＮＡクローニングおよび発現の配列の群である。
【００３４】
ＲＥＩＩｓ／ホーミングヌクレアーゼの制限配列は、（多機能なポリリンカーの）多機能配列ユニットの他の機能的で部分的な配列を用いるような同様の手法で、ＲＥＩＩの認識配列の補足として、またはＲＥＩＩの認識配列のカップリングとの組み合わせのいずれかで代わりにカップリングされてよく、“機能的で部分的な配列”は、機能的な配列（プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、タンパク質結合部位など）を任意に選択できる。
【００３５】
したがって、本発明はさらに、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＲＥＩＩｓのカップリングにおいて適用できる。ＲＮＡポリメラーゼのそれらのプロモーター配列が生じ、すべての場合に、通常は多機能なポリリンカーは複数となり、多数の適用において、特定の目的の活性のための唯一のものとなるべきである。本発明と一致して、ＲＥＩＩｓの各々で切断することまたはそこに結合された“ホーミングヌクレアーゼ”によって単一のターゲットプロモーターの配列を不活性することが可能であり、それによって唯一の所望のプロモーター配列は、それぞれのＲＮＡポリメラーゼの適用において機能的なままである。特に、一つの利点は、数多の連続してカップリングされたターゲットのＤＮＡ断片（理想的には全体の遺伝子から）のセンスおよびアンチセンスの両者の転写物は、同一のＲＮＡポリメラーゼで全く同一の構造から生成できる。
【００３６】
この状況において、本発明は、下記の段階からなるプロモーター配列の選択的な不活性方法を含み、かかる段階は、
（ｉ）本発明による核酸の提供段階と、
（ｉｉ）任意にＲＥＩＩｓ−Ａおよび／またはＲＥＩＩｓ−Ｂで核酸を開口する段階と、
からなり、（ｉ）の段階において
ａ）ＲＥＩＩｓそれぞれの切断部位、“ホーミングヌクレアーゼ”がプロモーター配列内に位置し、
ｂ）２つのプロモーター配列が同一であるか異なる際に、プロモーター配列が相対する方向で２回存在し、
ｃ）両プロモーター配列は、ＲＥＩＩｓ−ＡおよびＲＥＩＩｓ−Ｂが異なる際に、ＰＥＩＩｓの少なくとも各々（ＲＥＩＩｓ−Ａ、ＲＥＩＩｓ−Ｂ）にカップリングされることを特徴とする。
【００３７】
本発明による方法はさらに、実施例３に例示される。プロモーター配列の成功した不活性を試験する場合、多数の方法は当業者にとって利用可能であり、例えばインビトロ転写などである。
【００３８】
機能的な核酸の配列はまた、ＲＥＩＩｓまたは“ホーミングヌクレアーゼ”の認識配列になり得る。本発明によるそのような核酸の手段によって、完全な切り換えシステムを構成することは当業者にとって可能である。
【００３９】
ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る本発明による核酸は、直接的に（本来の構成として）生成するだけでなく、間接的に生成でき、例えば、ＲＮＡからの逆転写酵素の手段によるＤＮＡなどである。
【００４０】
さらなる好ましい実施態様において、本発明の核酸はキャリア物質にカップリングされる。特に、利点は、そのように得られたクローニングおよび／または発現産物がさらなる自動化された処理または他の分析において直接的に利用可能であることである。本発明は、核酸にカップリングするために最適なすべてのキャリア物質を含む。かかるキャリア物質の例は、アガロース、シリカ化合物、ポリスチレン化合物、テフロン（登録商標）−アクリルアミド、ポリプロピレン、ナイロン、セファクリル、ラテックス、常磁性の粒子、ナノ粒子、およびセルロースの派生物である。核酸のカップリングは、当業者に周知の方法によって実行され、共有結合または非共有結合のいずれかで実行できる。所望であれば、末端産物はキャリア物質から分離できる。キャリア物質とある酵素とは独立して、所定の波長と温度に依存する光の影響と同様に、化学的で高分子および低分子の物質は、この目的に適する。
【００４１】
すでに記載の核酸とは別に本発明の目的はまた、一つ以上の上述のようなクローニングベクターを含む細胞と同様に、上述のような核酸を含むクローニングベクターである。
【００４２】
本発明による核酸に組み込むために活用されたクローニングベクターは、核酸に含まれるＲＥＩＩｓまたは“ホーミングヌクレアーゼ”におけるさらなる認識若しくは切断部位を含まないことが本発明にとって望ましい。
【００４３】
本発明はまた、本発明による少なくとも一つの核酸と、任意にカップリングされたキャリア物質と、一つ以上のＲＥＩＩで任意に組み合わせにおける少なくとも一つの適切なＲＥＩＩｓと、リガーゼと、応用可能であれば、他の適切な酵素および適切なバッファーとを包含するキットをも含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
添付図の詳細な説明
図１は、ＩＩ型制限ヌクレアーゼの手段による核酸断片のクローニングを示す。
【００４５】
ａ部分では断片Ａのクローニングが記載され、ｂ部分では断片Ｂの追加的な挿入が記載される。閉じたハサミは任意の種類のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを表し、黒い矢印の黒いボックスはＲＥＩＩの認識する切断配列を表す。ボックスＡおよびＢは、クローニングされるターゲットＤＮＡを表す。
【００４６】
図２は、ＩＩ型およびＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの組み合わせによるクローニングまたは核酸断片を示す。
【００４７】
ａ部分では断片Ｂのクローニングが記載され、ｂ部分では断片Ａの追加的な挿入が記載される。閉じたハサミは任意のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを表し、開いたハサミは任意の種類のＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼまたは“ホーミングヌクレアーゼ”を表す。黒い矢印の影付け／黒の組み合わせのボックスは、任意の種類のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（黒いボックス）の切断配列とカップリングされた“ホーミングヌクレアーゼ”（影付けボックス）、それぞれのＲＥＩＩｓの認識配列を表す。ボックスＡおよびＢはクローニングされるターゲットＤＮＡである。
【００４８】
図３は、機能的な配列でカップリングされたＲＥＩＩｓ／ホーミングヌクレアーゼを示す。
【００４９】
参照番号１および２は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列を示し、ここで１および２は同一または異なることができる。Ａは、機能的な配列（つまり、プロモーター配列、実施例３を参照）を表し、Ｂは挿入された配列（例えば、遺伝子）である。
【００５０】
図４は、ＲＥＩＩｓ／ＲＥＩＩのカップリングとの組み合わせにおけるＲＥＩＩｓでカップリングされた機能的な配列を示す。
【００５１】
参照番号１および２は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列を示し、ここで１および２は同一または異なることができ、Ａは機能的な配列（つまり、プロモーター配列、実施例３を参照）を表し、ＢはＲＥＩＩｓの切断配列とカップリングされたＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”の認識配列からのポリリンカーとなることができる。
【００５２】
図５は、数多のＲＥＩＩｓ／ＲＥＩＩのカップリングとの組み合わせにおけるＲＥＩＩｓでカップリングされた数多の機能的な配列を示す。
【００５３】
参照番号１乃至５は、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列を示し、ここで１乃至５は部分的にもしくは完全に同一であるか、または部分的にもしくは完全に異なることができ、Ａ乃至Ｅは任意の機能的な配列であり、ａ乃至ｃは異なるポリリンカーである。
【００５４】
図６は、数多のＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”の制御可能なＲＥＩＩ切断部位を有する多機能なＤＮＡのクローニング部位（ポリリンカー）の典型的な構造を示す。
【００５５】
各ＲＥＩＩｓの認識配列はフレーム化されて、そのようにカップリングされたＲＥＩＩの認識および切断配列は影付けしたグレーであり、フレームから開始する矢印はＲＥＩＩｓの切断部位を示す。
【実施例】
【００５６】
下記の実施例により本発明をさらに例証する。
【００５７】
例１：ＥｃｏＲＩ（ＲＥＩＩ）の切断部位とカップリングされたＲＥＩＩｓのＡａｒｌを有するそれぞれのクローニングベクターにおける核酸の構成。
【００５８】
開始物質は、少なくとも一つのＥｃｏＲＩの切断部位およびＲＥＩＩｓのＡａｒｌを有する任意の種類のプラスミドである。ＲＥＩＩｓのＡａｒｌは、５´ＣＡＣＣＴＧＣ３´である一つの鎖の認識配列および相補鎖の対応する５´ＧＣＡＧＧＴＧ３´によって特徴とされることが周知であり、第一のストランドの切断部位が、５´から３´の方向で５´ＣＡＣＣＴＧＣ３´に続く認識配列の４番目と５番目の塩基との間に位置し、相補鎖では５´から３´の方向での認識配列５´ＧＣＡＧＧＴＧ３´の前の８番目と９番目の塩基との間に位置する。
【００５９】
Ａａｒｌ：
【００６０】
【化７】
2005503160.tif 000007
プラスミドにおいて、ＥｃｏＲＩの切断部位／認識配列が配置される。ＥｃｏＲＩの認識配列から開始して、ＲＥＩＩｓのＡａｒｌにおける認識配列は３塩基の距離でＥｃｏＲＩの認識配列の前に挿入される。この組み込みは、当業者に周知の方法で実行される。組み込みの後、それぞれのＥｃｏＲＩとＡａｒｌの切断部位は重ねられて、すなわち、局所的に同一である。重ね合わせにより、それぞれのＥｃｏＲＩの切断部位はＲＥＩＩのＥｃｏＲＩで特異的に開かれ、さらにＥｃｏＲＩの切断における典型的な付着末端に帰着するＲＥＩＩｓのＡａｒｌで特異的に開かれる。
【００６１】
本発明による核酸のＡａｒｌおよびＥｃｏＲＩ
ＡａｒｌまたはＥｃｏＲＩで切断
【００６２】
【化８】
2005503160.tif 000008
ターゲットのＤＮＡ断片は、特異的なＥｃｏＲＩの切断末端を表し、例えば、別のソースからＥｃｏＲＩでの切断により得られた、上述の開いた切断部位にクローニングされる。このターゲットのＥｃｏＲＩ断片は、下方の例の文字によって下記の図で表される。
【００６３】
【化９】
2005503160.tif 000009
このＥｃｏＲＩのターゲットのＤＮＡ断片の前に第二のＥｃｏＲＩのターゲットのＤＮＡ断片を選択的に挿入するために、切断はＡａｒｌで実行されるべきであり、ＲＥＩＩｓを適用する場合だけの理由で、唯一の切断部位の特異的な開口部、つまりＡａｒｌ認識配列（概略図において左に）と関連するＥｃｏＲＩの切断部位が認識され、一方でＥｃｏＲＩを用いて、両者の利用可能な切断部位は開口されているだろう。
【００６４】
Ａａｒｌで切断
【００６５】
【化１０】
2005503160.tif 000010
同一の手法で、第三、第四、およびさらなるＥｃｏＲＩ断片は選択的に挿入可能であり、原理的に、任意の所望の配列でＥｃｏＲＩ末端を有する任意の数のＤＮＡ断片は核酸にクローニング可能であるか、または結果としての発現のためにそこに提供されるクローニングベクターにそれぞれクローニングできる。
【００６６】
ここに実施例として挙げられた制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＡａｒｌの代わりに、原理的にＲＥＩＩｓおよびＲＥＩＩの任意の種類の組み合わせが活用できる。本発明による構成の原理の概略図が図２に例示される。
【００６７】
図１および図２による図面の比較は、本発明の直接的な利点を示し、つまり、望ましくない切断およびクローニング産物であり、それによって、２つより多くのターゲットのＤＮＡ断片がリンクする場合、時間を節約し、所望の産物の検索に努める。
【００６８】
例２：数多のＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”で制御されるＲＥＩＩ切断部位を有する多機能なＤＮＡクローニング部位（ポリリンカー）の構造
ＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”によって制御される数多のＲＥＩＩ切断部位を有する多機能なＤＮＡクローニング部位（ポリリンカー）として実施態様において本発明による核酸の一つの構造は、図６に概略して例示される。各ＲＥＩＩの認識配列はフレーム化されて、そこにカップリングされたＲＥＩＩの認識および切断配列は影付けされて、フレームから開始する矢印はＲＥＩＩの切断部位を示す。
【００６９】
例３：ＲＥＩＩｓおよびＥｃｏ５７１を有する特定の制御におけるＤＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
開始の化合物は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＴ７がＲＥＩＩｓのＡａｒｌおよびＥｃｏ５７１における認識配列と同様に反対方向で２回形態化される、ＲＮＡポリメラーゼにおけるプロモーター配列を有するプラスミドである。Ａａｒｌの特質は、実施例１に広く記載される。ＲＥＩＩｓのＥｃｏ５７１は、一つの鎖の認識配列は５´ＣＴＧＡＡＧ３´であり、相補鎖は対応して５´ＣＴＴＣＡＧ３´であり、その切断部位は、認識配列５´ＣＴＧＡＡＧ３´に続く１６番目と１７番目との間で５´から３´方向での第一の鎖にあり、相補鎖は、認識配列５´ＣＴＴＣＡＧ３´の前の５´から３´の方向で第１４番目と第１５番目との間に位置される。
【００７０】
Ａａｒｌ：
【００７１】
【化１１】
2005503160.tif 000011
Ｅｃｏ５７１：
【００７２】
【化１２】
2005503160.tif 000012
プラスミド：
【００７３】
【化１３】
2005503160.tif 000013
プロモーター配列から開始して、ＲＥＩＩｓのＡａｒｌおよびＥｃｏ５７１における認識配列は当業者に周知の方法によって適切な距離で挿入される。挿入後、プロモーター配列および制限の切断部位は、下図にしたがって、各酵素がそれぞれの一つのプロモーター配列でＤＮＡを開き、“左”のプロモーターがＡａｒｌによって排他的に制御可能であり、“右”のプロモーターがＥｃｏ５７１によって排他的に制御可能であるようにオーバーラップし、それによってプロモーターの活性を破壊し、したがって他のプロモーターの各々の一つの転写だけを可能にする。
【００７４】
【化１４】
2005503160.tif 000014
Ａａｒｌで切断
【００７５】
【化１５】
2005503160.tif 000015
Ｅｃｏ５７１で切断
【００７６】
【化１６】
2005503160.tif 000016
機能的なＤＮＡ配列を有するＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”の本発明によるカップリングは、図３に示されるように一般的な手法で示すことができる。
【００７７】
他の機能的な配列を有するＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”のカップリングと同様に単一ユニットの形態であるか、または多機能なＤＮＡクローニング部位（ポリリンカー）の形態でのＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”のカップリングは、図４に概略して表される例としての単一のベクターをさらに有する本発明と一致してリンクできる。
【００７８】
対応する手法として、本発明はまた、ＤＮＡクローニングおよび発現配列の構成を提供し、機能的な配列は複数回カップリングされるか、異なる機能的な配列は異なるＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”を有し、前述のＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”がカップリングされた機能的な配列は様々なＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”がカップリングされた切断部位と関連する。したがって、所望の構成に依存して、多数の組み合わせは図５の概略図と一致して示されるように可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＩＩ型制限ヌクレアーゼの手段による核酸断片のクローニングを示す図である。
【図２】ＩＩ型およびＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの組み合わせによるクローニングまたは核酸断片を示す図である。
【図３】機能的な配列でカップリングされたＲＥＩＩｓ／ホーミングヌクレアーゼを示す図である。
【図４】ＲＥＩＩｓ／ＲＥＩＩのカップリングとの組み合わせにおけるＲＥＩＩｓでカップリングされた機能的な配列を示す図である。
【図５】数多のＲＥＩＩｓ／ＲＥＩＩのカップリングとの組み合わせにおけるＲＥＩＩｓでカップリングされた数多の機能的な配列を示す図である。
【図６】数多のＲＥＩＩｓ／“ホーミングヌクレアーゼ”の制御可能なＲＥＩＩ切断部位を有する多機能なＤＮＡのクローニング部位（ポリリンカー）の典型的な構造を示す図である。