【手続補正書】
【提出日】平成16年9月30日(2004.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少細胞（rare cell）を単離および同定する方法における内部対照として用いるための安定化細胞の製法であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、
ａ）該対照細胞を同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識し；
ｂ）該標識細胞と細胞固定剤とを接触させ、該固定剤が該対照細胞上に存在する細胞構造および抗原部位の双方の安定性に影響し；
ｃ）過剰な固定剤を引き続いて除去して、該対照細胞の長期保存を促し、該対照細胞が、少なくとも６ヶ月までの期間物理的および生物学的に安定となることを含むことを特徴とする該製法。
【請求項２】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項３】
該蛍光標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項４】
該対照細胞が、該細胞上に存在する抗原に免疫学的に特異的な抗体で標識され、該抗体が、蛍光分子にコンジュゲートすることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項５】
該対照細胞の細胞成分が、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、アクリジンオレンジ、ローダミン誘導体、ニュートラルレッドおよび疎水性ＢＯＤＩＰＹＴＭよりなる群から選択される色素で標識されることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項６】
該細胞成分が、核酸、核、リソソーム、ゴルジ装置、ミトコンドリアおよび小胞体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項５記載の製法。
【請求項７】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いる安定化細胞の製法であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、
ａ）該対照細胞を同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して膜標識し；
ｂ）該標識細胞と細胞固定剤とを接触させ、該固定剤が該対照細胞上に存在する細胞構造および抗原部位の双方の安定性に影響し；
ｃ）過剰な固定剤を引き続いて除去して、該対照細胞の長期保存を促し、該対照細胞が、少なくとも６ヶ月までの期間物理的および生物学的に安定となり、ここに、該対照細胞が、その表面上で上皮細胞付着分子（ＥｐＣａｍ）を発現し、細胞内でサイトケラチンも発現することを含むことを特徴とする該製法。
【請求項８】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の製法。
【請求項９】
該膜色素が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の製法。
【請求項１０】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いる安定化細胞であって、該対照細胞が該希少細胞と共通した決定基を有し、ここに、該対照細胞は、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識され、該対照細胞の細胞成分および抗原部位は、固定剤に対する曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化される該安定化細胞。
【請求項１１】
浮遊密度媒体中で懸濁された請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１２】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１３】
該蛍光標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択される膜標識である請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１４】
該対照細胞が、該細胞上に存在する抗原に免疫学的に特異的な抗体で標識され、該抗体が、蛍光分子にコンジュゲートした請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１５】
該対照細胞の細胞成分が、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、アクリジンオレンジ、ローダミン誘導体、ニュートラルレッドおよび疎水性ＢＯＤＩＰＹＴＭよりなる群から選択される色素で標識された請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１６】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いられる安定化細胞であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、検出可能に標識された膜を含み、該細胞が、安定化細胞成分および抗原部位をさらに含み、該安定化が、固定剤に対する曝露により達成され、ここに、該対照細胞は、その表面上のＥｐＣａｍおよび細胞内でサイトケラチンを発現する腫瘍細胞である該安定化細胞。
【請求項１７】
浮遊密度媒体中で懸濁された請求項１６記載の対照細胞。
【請求項１８】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項１６記載の対照細胞。
【請求項１９】
該膜標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択される請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２０】
該膜が、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識された請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２１】
マモグロブリン（mammoglobulin）、ヒト乳脂グロブリン（human milk fat globulin）およびＨＥＲ−２／ｎｅｕよりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基をさらに含むＳＫＢＲ３乳癌細胞である請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２２】
ＭＣＦ−７乳癌細胞であって、さらに、エストロゲン受容体である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２３】
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞であって、さらに、ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびアンドロゲン受容体よりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２４】
ＣＥＭ  Ｔ細胞白血病癌細胞であって、さらに、ＣＤ４分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２５】
Ｒａｊｉ  Ｂ細胞白血病細胞であって、さらに、ＣＤ１９分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２６】
ＳＵ−ＤＨＬ非ホジキン白血病細胞であって、さらに、ＣＤ２０分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２７】
Ｃ３２黒色腫癌細胞であって、さらに、ＣＤ１４６分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２８】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いる安定化細胞であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、重複して標識された膜を含み、該膜が、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で標識され、該細胞が、さらに安定化細胞成分および抗原部位を含み、該安定化が、固定剤に対する曝露により達成され、ここに、該対照細胞が、腫瘍細胞、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞、心筋細胞、循環系における内皮細胞、および母体循環系における胎児細胞よりなる群から選択される該安定化細胞。
【請求項２９】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項２８記載の対照細胞。
【請求項３０】
該蛍光標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素、ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択される膜標識である請求項２８記載の対照細胞。
【請求項３１】
該対照細胞が、該細胞上に存在する抗原に免疫学的に特異的な抗体で標識され、該抗体が、蛍光分子にコンジュゲートした請求項２８記載の対照細胞。
【請求項３２】
該対照細胞の細胞成分が、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、アクリジンオレンジ、ローダミン誘導体、ニュートラルレッドおよび疎水性ＢＯＤＩＰＹＴＭよりなる群から選択される色素で標識された請求項２８記載の対照細胞。
【請求項３３】
該細胞成分が、核酸、核、リソソーム、ゴルジ装置、ミトコンドリアおよび小胞体よりなる群から選択される請求項２８記載の対照細胞。
【請求項３４】
浮遊密度媒体中で懸濁された請求項２８記載の対照細胞。
【請求項３５】
混合細胞集団中で希少細胞を検出および計数する方法であって、該集団中の該希少細胞の存在が、疾患状態の重篤度を表し、
ａ）試験対象から血液試料を得、ここに、該試料は該希少細胞を含有すると疑われる混合細胞集団を含み；
ｂ）免疫磁気（immunomagnetic）試料を調製し、ここに、該生物学的標本が、他の試料成分の実質的な排除のために、希少細胞の決定基と特異的に反応するリガンドと結合した磁気粒子と混合され；
ｃ）該免疫磁気試料と該希少細胞の決定基を標識する少なくとも１つの試薬とを接触させ；次いで
ｄ）該標識された希少細胞を分析して、該免疫磁気試料中のいずれかの希少細胞の存在および細胞数を決定し、該試料中に存在する希少細胞数が大きくなるにつれ、該疾患の重篤度が大きくなり、ここに、改良は、該方法における内部対照細胞として用いる安定化細胞の添加を含み、該対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、該対照細胞の該膜を検出可能に標識し、該対照細胞の細胞成分および抗原部位が、固定剤に対する曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化されることを特徴とする該方法。
【請求項３６】
該希少細胞が癌細胞であって、該疾病状態が癌であることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
該膜が、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
該膜標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
該リガンドが抗−ＥｐＣａｍであって、該試薬が細胞内サイトケラチンを標識し、該ＥｐＣａｍおよび該サイトケラチンが、該希少細胞および該対照細胞の双方に存在することを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
対照細胞がＳＫＢＲ３乳癌細胞であって、さらに、マモグロブリン、ヒト乳脂グロブリンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕよりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
対照細胞がＭＣＦ−７乳癌細胞であって、さらに、エストロゲン受容体である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
対照細胞がＬＮＣａＰ前立腺癌細胞であって、さらに、ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびアンドロゲン受容体よりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
対照細胞がＣＥＭ  Ｔ細胞白血病癌細胞であって、さらに、ＣＤ４分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
対照細胞がＲａｊｉ  Ｂ細胞白血病細胞であって、さらに、ＣＤ１９分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
対照細胞がＳＵ−ＤＨＬ非ホジキン白血病細胞であって、さらに、ＣＤ２０分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
対照細胞がＣ３２黒色腫癌細胞であって、さらに、ＣＤ１４６分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
循環している腫瘍細胞の存在につき患者の試料をスクリーニングする改良キットであって、
ａ）磁心材料、蛋白質ベースのコーティング材料および該ベースのコーティング材料に直接または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭを含むコーティングされた磁気ナノ粒子；
ｂ）癌細胞決定基に結合特異性を有する少なくとも１つの抗体；
ｃ）分析から該腫瘍細胞以外の試料成分を排除する細胞特異的な色素を含み、
ここに、改良は内部対照として用いた安定化細胞を含む容器の付加を含み、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、ここに、該対照細胞の該膜は検出可能に標識され、かつ、該対照細胞の細胞成分および抗原部位が固定剤に対する曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化され、該安定化対照細胞が浮遊密度媒体中で懸濁される該改良キット。
【請求項４８】
対照細胞がＳＫＢＲ３乳癌細胞であって、マモグロブリン、ヒト乳脂グロブリンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕよりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基をさらに含む請求項４７記載のキット。
【請求項４９】
対照細胞がＭＣＦ−７乳癌細胞であって、さらに、エストロゲン受容体である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４７記載のキット。
【請求項５０】
対照細胞がＬＮＣａＰ前立腺癌細胞であって、さらに、ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびアンドロゲン受容体よりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４７記載のキット。
【請求項５１】
対照細胞がＣＥＭ  Ｔ細胞白血病癌細胞であって、さらに、ＣＤ４分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
対照細胞がＲａｊｉ  Ｂ細胞白血病細胞であって、さらに、ＣＤ１９分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。
【請求項５３】
対照細胞がＳＵ−ＤＨＬ非ホジキン白血病細胞であって、さらに、ＣＤ２０分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。
【請求項５４】
対照細胞が、Ｃ３２黒色腫癌細胞であって、さらに、ＣＤ１４６分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。