【手続補正書】
【提出日】平成16年1月23日(2004.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガストロカインと称される、単離された相同な細胞増殖刺激タンパク質の群であって、該タンパク質は、胃上皮細胞により生成され、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２５）、またはＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２６）、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、群。
【請求項２】
請求項１に記載の群より単離されるタンパク質であって、該タンパク質は、図８に示されるアミノ酸配列を含み、シグナルペプチド配列を構成する２０アミノ酸を欠いたプロセシングされた形態にてブタ胃上皮細胞に存在し、１６５アミノ酸であって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された場合に約１８ｋＤの予測分子量を有するとさらに特徴付けられ、該タンパク質は分泌され得る、タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の群からのタンパク質であって、該タンパク質は、図３に示されるアミノ酸配列を含み、該配列は、ヒトｃＤＮＡから推定されるとさらに特徴付けられる、タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の群からのタンパク質であって、該タンパク質は、図６に示されるアミノ酸配列を含み、該配列は、マウスＲＮＡおよびＤＮＡから推定されるとさらに特徴付けられる、タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質に由来する増殖刺激ペプチド。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）請求項１に記載のタンパク質に由来する非改変ペプチドにおいてアミノ酸置換または欠失により、該非改変ペプチドのアミノ酸配列における主要プロテアーゼ部位を排除する工程；および
（ｂ）必要に応じて、該非改変ペプチドにおけるアミノ酸のアミノ酸アナログを導入する工程、
を包含する方法により生成される、改変ペプチド。
【請求項７】
図３に示される７８位〜１１９位のアミノ酸の配列を有する、合成増殖刺激ペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の合成増殖刺激ペプチドであって、該ペプチドは、図３に示される９７位〜１１７位のアミノ酸の配列を有する、合成増殖刺激ペプチド。
【請求項９】
請求項７に記載の合成増殖刺激ペプチドであって、該ペプチドは、図３に示される９７位〜１２１位のアミノ酸の配列を有する、合成増殖刺激ペプチド。
【請求項１０】
請求項７に記載の合成増殖刺激ペプチドであって、該ペプチドは、図３に示される１０４位〜１１７位のアミノ酸の配列を有する、合成増殖刺激ペプチド。
【請求項１１】
ＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１１）、ＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１２）、またはＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹ（配列番号１３）からなる群より選択される配列を含む、単離された生物活性ペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載の群のタンパク質に対する抗体であって、該抗体は、図３に示される７８位〜１１９位のアミノ酸配列を有するタンパク質のペプチド内のエピトープを認識する、抗体。
【請求項１３】
図１に示されるヒトのヌクレオチド配列を有する、単離されたゲノムＤＮＡ分子。
【請求項１４】
ヒトタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子であって、該タンパク質が、図３に示されるアミノ酸配列を有する、ｃＤＮＡ分子。
【請求項１５】
哺乳動物の胃腸管における上皮細胞の増殖を刺激する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該上皮細胞と、請求項１に記載の群からのタンパク質または請求項１に記載のタンパク質に由来するペプチドを含む組成物とを接触させる工程；および
（ｂ）該上皮細胞の増殖を刺激するための環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、ガストロカインと呼ばれる単離された相同的細胞増殖刺激タンパク質のグループに関連し、それは胃上皮細胞によって産生され、そしてコンセンサスアミノ酸配列ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）を含む。ここでＸＸはＬＱまたは空白（結果として、各々、配列番号２５および配列番号２６を生じる）であり得る。そのグループの単離されたタンパク質は、図８に示したようなアミノ酸配列を有する。シグナルペプチド配列を構成する２０アミノ酸を欠く、処理された形式でブタ胃上皮に存在するタンパク質は、１６５アミノ酸およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された約１８ｋＤの推定分子量を有する。シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）を通過した後に切断される。そのタンパク質は分泌され得る。図３に示したアミノ酸配列は、ヒトｃＤＮＡ配列から導かれた。このタンパク質の１つの実施態様を、マウスＲＮＡおよびＤＮＡから予測される配列である、図６のアミノ酸配列で示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の１つの局面はまた、図１で示したヒトのヌクレオチド配列を有する単離されたゲノムＤＮＡ分子、およびアミノ酸配列が図３で示された、ヒトタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
単離された生体活性ペプチドの実施形態は、以下の配列のうち１つを有する：ＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１１）、ＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１２）、ＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹ（配列番号１３）。インヒビターの実施形態は、ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫ（配列番号１４）またはＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫ（配列番号１５）である（表１もまた参照のこと）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
（７．Ｅ．ｃｏｌｉにおける活性組換えヒトＡＭＰ−１８の調製）
２０個のアミノ酸の疎水性シグナルペプチド配列を、６個のヒスチジン残基のストレッチを含むＮ末端の１２個のアミノ酸ペプチドで置換した、ヒトＡＭＰ−１８をコードするｃＤＮＡを設計した（図１３、左のパネル）。この改変ｃＤＮＡ配列の発現は、１７７個のアミノ酸タンパク質産物（Ｍｒ１９，６５３）を産生することが予測され、このアミノ酸タンパク質産物は、Ｈｉｓ−６タグ（配列番号１６）に結合するＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて容易に精製され得る。Ｎ−末端シグナルペプチドをコードする領域を欠くｃＤＮＡ配列（図１４を参照のこと）を、ＱＥ３０発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）のＢａｍＨＩ部位へ産物を挿入するのに適当なリンカーを提供するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって増幅した；組換えベクターの配列を確認した。Ｈｉｓ−６タグ（配列番号１６）で操作した組換えヒト（ｒｈ）ＡＭＰ−１８を、続いてＥ．ｃｏｌｉ細胞で発現した。それを回収するために、細菌を溶解し、そして可溶性および不溶性画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後ｒｈＡＭＰ−１８前駆体に対する特異的ウサギ抗血清を用いてイムノブロッティングした。発現したタンパク質は、溶解物の可溶性画分にはほとんど検出されなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
尿素（６Ｍ）を用いて、不溶性画分からタンパク質を放出し、Ｈｉｓ６−タグを（配列番号１６）含むｒｈＡＭＰ−１８を可溶化し、そしてＮｉ２＋荷電樹脂への結合に利用可能にして、続いてそれからイミダゾールの勾配（０〜２００ｍＭ）で溶出した。溶出されたｒｈＡＭＰ−１８の量を、ＢＣＡアッセイを用いて測定し、そして予測された１９−２０ｋＤの大きさの単一バンドの出現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてイムノブロッティングによって確認した。溶出されたｒｈＡＭＰ−１８が復元して分裂促進性の構造をとるかどうか決定するために、溶出物のアリコートを（透析によって尿素およびイミダゾールを除去した後）、ＩＥＣ−１８細胞の培養物に加え、そして細胞数を４日後に計測した。図１３（右のパネル）は、組換えタンパク質が、分裂促進性ＡＭＰペプチド７７−９７（または図１１に示されるブタ由来の可溶性幽門洞組織抽出物）を刺激するのと同じ最大程度細胞の増殖を刺激するが、ペプチド７７−９７より１オーダー低い程度の最大半減濃度で刺激することを示す。ＡＭＰペプチド７７−９７は成熟タンパク質を指す；表１におけるヒト前駆体タンパク質のペプチド９７−１１７と同じである。これらの観察は、多様な臨床的状況で利用し得る生物学的に活性な組換えヒトＡＭＰ−１８が入手可能であることを示す。ｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進能力は、インビボで胃の維持および修復に関与するネイティブな胃細胞増殖因子で予測されるナノモルの範囲である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
（３．発現されたタンパク質に対する抗体）
ヒトおよびブタｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、非常によく似た比較的低分子量（ＭＷ）のタンパク質を予測し、それはコンピューターデータベースの公知のタンパク質と近いホモログを有さず、従って可能性のある機能についてほとんど示さない。推定タンパク質の生物学的役割を研究するアプローチとして、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）もコードするベクターを用いて、全ｃＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉで発現させた。残念ながら、細菌で発現した場合、そのポリペプチド産物は不溶性であり、そして生化学的研究のために容易に従わない。しかし、ヒトｃＤＮＡの細菌産物を、抗血清を誘発するためにウサギで免疫原として使用したドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルで分離した。その血清を、多数の哺乳動物種由来の幽門洞組織のタンパク質抽出物に対してスクリーニングした。この手順は、免疫原と試験した哺乳動物の幽門洞で発現する約１８ｋＤａのタンパク質の両方を認識し得る、いくつかの高力価、低バックグラウンドの抗血清を産生するのに成功した。細菌で発現したタンパク質は、シグナルペプチド配列およびＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を含むので、よりゆっくり移動する。免疫前血清は、有意な１８ｋＤａ反応性を示さなかった。ヒトｃＤＮＡクローンから発現したタンパク質に対して惹起された抗血清の、様々な哺乳動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス；最後はＳＤＳゲルにおいて常にわずかにより速く移動する）由来の幽門洞抽出物の非常によく似たＭＷのタンパク質との交差反応性は、ヒトおよびブタｃＤＮＡのＯＲＦの比較によって予測されたアミノ酸配列の保存のレベルを支持する（図１０を参照のこと）。その後の実験において、シグナルペプチドを有するヒトＡＭＰ−１８を細菌で産生した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
（１３．組換えタンパク質の発現）
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ。組換え構築物を、一般的に、ＰＴ／ＣＥＢＰベクター中の全長ｃＤＮＡ配列の適当な領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、操作し、そして標準的なベクターポリリンカーへの容易な挿入を可能にするのに便利な制限酵素部位まで伸長する。細菌システムにおけるＡＭＰ  ＯＲＦの発現を用いた最初の実験は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）における発現タンパク質の精製の促進を意図して、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）を含む（Ｊｅｏｎら、１９９４）、発現ベクターＰＴ／ＣＥＢＰを採用した。宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳにおけるこのベクター中の全長ヒトｃＤＮＡの発現は、不溶性タンパク質の高い収率を与え、それは変性条件下の電気泳動後に、特異的高力価抗体を得るためにウサギで免疫原として使用するために適当であったが、それはそのタンパク質のネイティブ構造および機能を分析するために有用ではなかった。この不溶性は、おそらく発現タンパク質における、疎水性シグナルペプチドの上流にＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を有する、非天然Ｎ−末端の存在のためである。疎水性シグナルペプチド配列なしにＯＲＦを発現するエンジニアリングベクターも有用である。これらをＮ−またはＣ−末端Ｈｉｓタグありおよびなしで、細菌発現ベクターを用いて構築する。２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を含むヒトＡＭＰ−１８配列も、細菌で発現させた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
（ｃ）バキュロウイルス／昆虫細胞。代替の、多くの場合成功する、非哺乳動物真核生物発現システムは、昆虫細胞培養システムにおいてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのような組換えバキュロウイルスを使用するものである。Ｐｉｃｈｉａと同様に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＨｉｓ６タグ（配列番号１６）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を両方含む、簡便なベクターの大きなレパートリーがこのシステムにおいて利用可能である。トランスフェクションをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞に対して行なう；これらの細胞を、分泌タンパク質の精製に有利なように、タンパク質を含まない培地にゆっくりと適応させ得る。内因性のシグナルペプチドがこれらの細胞で機能しない場合は、クローニング部位の上流にウイルスｇｐ６７分泌シグナルを含むベクターを用いて、外来性タンパク質の分泌も強要し得る。組換えタンパク質を、全細胞タンパク質の０．１−５０％の範囲のレベルで発現し得る。いくつかのタンパク質修飾が、酵母と比較してこの昆虫細胞システムにおいてより有利であり得るが、依然として哺乳動物システムを再現し得ない。昆虫発現システムはＰｉｃｈｉａよりいくらか面倒であり、そして哺乳動物細胞における発現の完全な代用にはならないようである。２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を含むヒトＡＭＰ−１８配列を、バキュロウイルスで発現した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
プラスミドｐｃＤＮＡ３／ヒト腎臓２９３システム：ｐｃＤＮＡ３は、強力な構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナルに隣接するポリリンカークローニング部位を含む（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。実験室での経験では、６０−９０％の一過性トランスフェクションレベルを達成し得る。このために、ヒトプレＡＭＰｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅を、開始コドンおよびネイティブリボソーム結合部位（コザック配列）ならびにｐｃＤＮＡ３への正しい方向性のために適当な制限酵素リンカーを含むオリゴヌクレオチドを用いて行なう。強力な抗生物質ブラストサイジンＳおよび耐性遺伝子を含むベクターを用いた一過性アッセイにおいて好ましい構築物を同定し、安定な哺乳動物トランスフェクタント細胞株を「１週間足らずで」確立し得る（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。利用可能なベクターはまた、構成的ＣＭＶプロモーター、ポリリンカークローニング部位、選択的Ｖ５−エピトープ／Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）およびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含む（ＰｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
（１５．発現したおよびネイティブガストロカイン（ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ）タンパク質の生化学的および免疫親和性分画）
ガストロカインＡＭＰ−１８のいくつかの発現形式の場合に、組換えタンパク質は、可溶性タンパク質の迅速な精製を可能にするペプチドタグを含む。これらのタグの存在は、もしそれらがタンパク質の通常の機能を著しく阻害しなければ、他の関連する高分子との相互作用の分析も可能にする。Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）は、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂ビーズへ結合させることによって精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１；ＱｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡ樹脂）。タグ化タンパク質は、ほとんどの抗原−抗体複合体よりも高い親和性で結合し、そしてＮｉ２＋−ヒスチジンキレート化複合体を過剰なイミダゾールで分裂させて精製タンパク質を放出する前に激しく洗浄され得る。ＧＳＴ−タグ化組換えタンパク質を、グルタチオン−アガロースで精製し、洗浄し、次いで還元グルタチオンで溶出する（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８）。全ての提案された発現システムと同様に、各タンパク質調製物を、その増殖因子活性に関してできるだけ早い段階で試験し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
ヒトタンパク質の中央領域に相当する合成４２アミノ酸ペプチドは、部分的に分画された幽門洞粘膜抽出物の増殖因子活性を模倣し得るという発見は、ＡＭＰ−１８機能の分析に近道を提供した。リシン対におけるいくつかの潜在的なタンパク質プロセシング部位に加えて、このペプチド（ペプチド５８−９９と呼ばれる；アミノ酸は、シグナルペプチドを除去した後の成熟タンパク質の５８位−９９位である）は、拡大したヘリックス形成可能な領域の１つおよびグリシン−プロリンループを含む。このペプチドのさらなる利点は、それは本明細書中で開示される抗血清の両方によって認識されるエピトープを含むことである。この配列由来のいくつかのより小さいペプチドを合成し、生物活性領域に焦点をあわせた。それらはこの領域の抗原性によって見られるように、タンパク質の表面に露出されることによって、タンパク質構造内の区別できるドメインを示し得るので、そしてインビボで生物活性ペプチドへの切断部位であり得るので、まずリシン残基が境界となる配列を研究した。グリシン−プロリン領域が重要である（ＡＭＰ−１８の生物活性ドメインを示す表１を参照のこと）。グリシン−プロリン配列は、ＳＨ３（ｓｒｃ相同性ドメイン３型）リガンドに関与することが知られている（Ｃｏｈｅｎら、１９９５；Ｎｇｕｙｅｎら、１９９８を参照のこと）；ＳＨドメインはタンパク質−タンパク質相互作用に関与するので、ＡＭＰ−１８のＧＰ領域はタンパク質の細胞表面レセプターとの相互作用に関与し得る。ＡＭＰ−１８で見出される正確なＧＰＧＧＰＰＰ配列（配列番号２４）は、細胞内で作用するＳＨ３ドメインで報告されていないので、それは細胞外リガンドのための新規タンパク質相互作用ドメインに相当するという興味深い可能性が存在する。成熟配列の９７位−１１７位のアミノ酸から得られた２１マーは、４２マーと同様の活性を有する。このより短いペプチドは、様々な上皮細胞系統における増殖アッセイに有用である。このペプチドは、本明細書中で開示される抗血清によって認識されるエピトープを発現しない。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
架橋研究に加えて、抗体、またはｈｉｓ６タグ（配列番号１６）化ＡＭＰ−１８もしくはペプチドを使用して、ＡＭＰ−１８に結合する細胞タンパク質もしくは粘膜タンパク質を単離する。さらなるアプローチとして、固定化ＡＭＰ−１８アフィニティーマトリクスは、ＣＮＭＢｒ活性化セファロースを使用することにより作製され得る。任意の細胞レセプターにより媒介されるシグナル伝達経路の分析の単なる取りかかりとして、アフィニティー単離物においてプロテインチロシンキナーゼ活性をアッセイする試験が利用可能である（Ｙａｒｄｅｎ  ａｎｄ  Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９８８；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
【図１−１】図１−１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；推定プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続きである。
【図１−３】図１−３は、図１−２の続きである。
【図１−４】図１−４は、図１−３の続きである。
【図１−５】図１−５は、図１−４の続きである。
【図１−６】図１−６は、図１−５の続きである。
【図１−７】図１−７は、図１−６の続きである。
【図２】図２は、ヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２）である；このＤＮＡクローンを、ヒト胃ｃＤＮＡライブラリーから差次的発現クローニングによって得た。
【図３】図３は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づき、そして本発明者によって修正された、ｃＤＮＡクローンから予測されたヒトプレＡＭＰ−１８タンパク質配列（配列番号３）である；Ｎ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である。
【図４−１】図４−１は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  推定プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−２】図４−２は、図４−１の続きである。
【図４−３】図４−３は、図４−２の続きである。
【図４−４】図４−４は、図４−３の続きである。
【図４−５】図４−５は、図４−４の続きである。
【図４−６】図４−６は、図４−５の続きである。
【図４−７】図４−７は、図４−６の続きである。
【図５】図５は、プレＡＭＰ−１８のマウスｃＤＮＡ配列（配列番号５）である。
【図６】図６は、マウスプレＡＭＰ−１８アミノ酸配列（配列番号６）である；マウス胃幽門洞から単離されたＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行なった；Ｙ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である；．．によって示される空間は、図１１の他の配列と整列するヌクレオチドがそこに存在しないことを意味する。
【図７】図７は、ブタＡＭＰ−１８を発現するｃＤＮＡ（配列番号７）である。
【図８】図８は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づいてｃＤＮＡクローンから予測されたブタプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）タンパク質配列（配列番号８）である。Ｄ−２１は、成熟タンパク質のＮ−末端である−ブタ胃から単離されたタンパク質の配列決定によって確認された。
【図９】図９は、ヒトプレ−ガストロカインのアミノ酸配列（配列番号３）  対  ブタプレ−ガストロカインのアミノ酸配列（配列番号８）の比較である。
【図１０】図１０は、ヒトおよびブタＡＭＰ−１８のｃＤＮＡクローンの配列決定から、そしてマウスＲＮＡおよびＤＮＡのプレＡＭＰ−１８特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって決定された、ヒト予測タンパク質配列（配列番号３）、ブタ予測タンパク質配列（配列番号８）およびマウス予測タンパク質配列（配列番号６）のコンピューターによる整列比較を示す；各場合において、最初の２０アミノ酸はシグナルペプチドを構成し、小胞体膜の通過後切断される。
【図１１】図１１は、ブタ胃幽門洞粘膜抽出物、（成熟タンパク質の）ヒトＡＭＰペプチド７７−９７（ヒト前駆体タンパク質のペプチド９７−１１７と同じ：表１）、およびＥＧＦの、胃上皮細胞の増殖に対する効果を示す；ＡＧＳ細胞を、６０ｍｍディッシュで胎児ウシ血清（５％）を含むＤＭＥＭ中で増殖させた；異なる量のブタ幽門洞抽出物、ＨＰＬＣ精製ペプチド７７−９７、および／またはＥＧＦを加えた；４日後細胞を分散し、そして血球計算器で計測した；幽門洞抽出物およびペプチドはそれぞれ濃度依存的な様式で細胞増殖を刺激した；棒グラフは飽和用量でペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は分裂促進性であったことを示す；あわせるとそれらは相加的であり、２つの分裂促進因子は異なるレセプターおよび／またはシグナル伝達経路を使用して作用することを示唆した；抗ＡＭＰ抗体は幽門洞抽出物を阻害したがペプチド７７−９７を阻害しなかった。
【図１２】図１２は、ヒトおよびマウスプレＡＭＰ−１８遺伝子の構造を示す；イントロン中の塩基対の数をバーの上に示す；エキソンはＥ１〜Ｅ６およびイントロンはＩ１〜Ｉ５で示す；イントロンの長さにわずかな違いが存在する。
【図１３】図１３は以下を示す。左のパネル。Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えヒトＡＭＰ−１８（配列番号３の残基２１〜残基１８５）のアミノ酸配列。Ｎ−末端の１２アミノ酸ドメイン（配列番号９）内のＨｉｓ６タグ（配列番号１６）が推定疎水性シグナルペプチドを置換したことに留意のこと。右のパネル。ＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養物の増殖に対するｒｈＡＭＰ−１８およびＡＭＰペプチド７７−９７の効果。最大の増殖刺激は同様であるが、ｒｈＡＭＰ−１８（約３０ｎＭ）の最大半減濃度（Ｋ１／２）はペプチド（約３００ｎＭ）より約１オーダー程度低い。
【図１４】図１４は以下を示す。左のパネル。ヒト幽門洞前駆体タンパク質（配列番号３）およびブタ幽門洞前駆体タンパク質（配列番号８）のＡＭＰ−１８ｃＤＮＡクローンから得られたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の整列。類似性は７８．５０％、および同一性は７５．２７％であった。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（ＧＣＧ）のＧＡＰおよびＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラムを用いてコンピューター分析を行なった。右のパネル。ヒトプレＡＭＰ  ＯＲＦの予測された二次構造のモデル。アスパラギンリッチなＮ−末端ドメイン、短いトリプトファン（Ｗ）−リッチ領域およびグリシン−プロリン（ＧＰ）領域、ならびに４つのシステイン（Ｃ）残基の保存された位置に留意のこと。可能性のある両親媒性ヘリックスが示される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【表１】
2004532037.tif 000001
表１：ヒトおよびマウスプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）配列から得た分裂促進ペプチドの分析。１４アミノ酸の分裂促進ドメインは太字である。＊ペプチドはプレ−ガストロカイン（プレＡＭＰ−１８）のアミノ酸配列におけるその位置によって同定される。＃ＡＡ；ペプチド中のアミノ酸の数。Ｋ１／２；最大半減増殖刺激の濃度。