(57)【要約】  本発明は、精製が可能であり、好ましくは更に、緩やかな条件下でリン酸基及び塩基の保護基の脱保護が可能な核酸合成用ダイマーアミダイド、及び前記核酸合成用ダイマーアミダイドを利用した核酸合成方法を提供することを目的とする。即ち、本発明は、二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなることを特徴とし、好ましくは更に、非プロトン性溶媒中で脱保護可能なリン酸基及び塩基の保護基を有する核酸合成用ダイマーアミダイド、及び、前記核酸合成用ダイマーアミダイドを利用した核酸合成方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二のヌクレオシド化合物が連結してなる核酸合成用ダイマーアミダイドであって、前記二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなることを特徴とする核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項２】
核酸合成時に、亜リン酸トリエステル結合が酸化によりリン酸トリエステル結合とされた後、該リン酸トリエステル結合におけるリン酸基の保護基が、非プロトン性溶媒中で脱保護可能である請求項１に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項３】
非プロトン性溶媒が、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ、及び、Ｎ−メチルピロリドンからなる群より選択される少なくともいずれかである請求項２に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項４】
核酸合成時に、亜リン酸トリエステル結合が酸化によりリン酸トリエステル結合とされた後、該リン酸トリエステル結合におけるリン酸基の保護基が、嵩高い塩基により脱保護可能である請求項１から３のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項５】
嵩高い塩基が、ＤＢＵ、ＤＢＮ、及び、テトラメチルグアニジンからなる群より選択される少なくともいずれかである請求項４に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項６】
リン酸基の保護基が、シアノエチル基及びその誘導体、フルオレニルメチル基及びその誘導体、フェネチル基及びその誘導体、並びに、ニトロエチル基及びその誘導体からなる群より選択されるいずれかである請求項２から５のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項７】
二のヌクレオシド化合物のうち少なくともいずれか一方のヌクレオシド化合物が、塩基の環外アミノ基に結合された保護基を有し、かつ、該保護基が非プロトン性溶媒中で脱保護可能である請求項１から６のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項８】
保護基が、直接、塩基の環外アミノ基に結合してなる請求項７に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項９】
保護基が、置換基を介して塩基の環外アミノ基に結合してなる請求項７に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項１０】
保護基が結合される塩基が、アデニン、グアニン、及び、シトシンのいずれかである請求項７から９のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項１１】
下記構造式（１）〜（１１）のいずれかで表される請求項１から１０のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【化２７】
2009028345.tif 000028
【化２８】
2009028345.tif 000029
【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
2009028345.tif 000038
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイドを用いることを特徴とする核酸合成方法。
【請求項１３】
核酸合成用ダイマーアミダイドの縮合反応の後、前記核酸合成用ダイマーアミダイドの保護基の脱保護が行われる請求項１２に記載の核酸合成方法。
【請求項１４】
非プロトン性溶媒中で脱保護が行われる請求項１２から１３のいずれかに記載の核酸合成方法。
【請求項１５】
嵩高い塩基により脱保護が行われる請求項１２から１４のいずれかに記載の核酸合成方法。
【請求項１６】
０．０１Ｍ  ＤＢＵ濃度以下で脱保護が行われる請求項１２から１５のいずれかに記載の核酸合成方法。
【請求項１７】
１５分以内に脱保護が行われる請求項１２から１６のいずれかに記載の核酸合成方法。
【請求項１８】
核酸自動合成装置を用いて行われる請求項１２から１７のいずれかに記載の核酸合成方法。
【請求項１９】
請求項１２から１８のいずれかに記載の核酸合成方法により得られることを特徴とする核酸。
【請求項２０】
置換基を有する修飾核酸である請求項１９に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾核酸等の核酸の合成に好適な核酸合成用ダイマーアミダイド、及びそれを用いた核酸合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の全遺伝子情報が既に明らかになった。その結果、研究者や科学者の興味の中心は遺伝子産物である蛋白質の解析に移行している。蛋白質の解析においては、対象となる個々の蛋白質に対してアフィニティー（結合性）を有する分子を得ることによって、初めて実質的な解析が可能になるといっても過言ではない。しかしながら、細胞中には非常に多種類の蛋白質が存在し、そのアミノ酸配列や構造が未知であるものも多い。
ある特定の蛋白質に対してアフィニティーを有する分子を得る最も一般的な手法は、動物の免疫系を用い、アフィニティー抗体を作製する方法である。しかし、この方法では動物を用いるため、多量の蛋白質や多大な工程、費用が必要となり、しかもある特定の物質に対するアフィニティー抗体は生成されないという欠点があった。【０００３】
このような問題を解決するために、生物に依存しないアプタマー法（別名：ＳＥＬＥＸ法）も提案されているが、この方法で得られる分子は、特定の蛋白質に対しては強い相互作用を示すものの、必ずしも全ての蛋白質に応用可能なものではなかった。そこで本発明者らは、前記アプタマー法を改良し、修飾核酸を用いた修飾アプタマー法を提案している（特許文献１参照）。しかしながら、このような修飾アプタマー法では、複数種の置換基を有する修飾核酸を用いるため、蛋白質とアフィニティーを有する修飾核酸を増幅しようとした際には、個々の置換基の特性を考慮しなくてはならず、良好なＰＣＲ増幅条件の選定が困難であった。また、標的物質に強く結合する機能性分子ほど、ＰＣＲで増幅しにくいという欠点もあった。【０００４】
このような問題を解決するために、本発明者らは既に、蛋白質との結合に関与する置換基の種類とダイマーアミダイドの配列情報とが一対一に対応しており、かつ、アンモニア処理により除去可能な結合で置換基を導入しておくことで、蛋白質と結合させた後にこれらの置換基を除去し、ＰＣＲ増幅を行うことが可能な修飾核酸の原料ダイマーアミダイドを提案している。しかしながら、これらのダイマーアミダイドでは、ダイマーアミダイド内に、酸に非常に不安定な部位、及び、塩基に非常に不安定な部位が共存しているため、精製によりほとんど分解されてしまうという欠点がある。そのため未精製で使用せざるをえず、特定のダイマーアミダイドでは、核酸自動合成装置による核酸合成収率が悪くなってしまう場合もあり、更なる改良が望まれている。【０００５】
一方で、核酸の固相合成は、２０年以上も前から行われており、自動合成装置もその時点で販売されている。核酸の固相合成は、例えば、ヌクレオシドを結合させた固相担体（例えば、ＣＰＧ）に核酸原料（アミダイド）を縮合反応させていくことにより行われるが、この縮合反応の際には、前記アミダイドのリン酸部分と他方の水酸基のみを縮合反応に関与させ、それ以外の反応性基は縮合反応に関与させずに行う必要がある。したがって、使用するアミダイドの塩基が有する環外アミノ基や、縮合反応に関与させないリン酸部分の反応性基等には、保護基を導入して縮合反応への関与を防止し、全縮合反応が終了した後、保護基を脱離する（脱保護する）ことが必要となる。従来から、塩基の環外アミノ基に導入する保護基としては、ベンゾイル基、イソブチリル基等が用いられており、これらの保護基の脱保護には、濃アンモニア水を、５５℃で８〜１５時間、作用させる方法が一般的であった。【０００６】
しかしながら、前記したような、蛋白質に対してアフィニティー（結合性）を有する修飾核酸の製造においては、このような従来の脱保護条件では、保護基の脱保護とともに、修飾核酸における修飾部分（蛋白質との結合性を有する置換基部分）までもが脱離してしまい、安定して修飾核酸を製造することができないという問題があった。したがって、このような修飾核酸を製造するにあたっては、保護基の脱保護とともに、蛋白質との結合性を有する置換基部分までもが外れてしまわないよう、より緩やかな条件下で保護基の脱保護が可能なアミダイドを用いることが求められている。
例えば、従来の技術において、嵩高い塩基、シアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）で脱保護可能な核酸アミダイドなどが報告されているが（非特許文献１〜２）、これらの核酸合成用アミダイドは、非プロトン性溶媒であるアセトニトリル中で不安定であり（非特許文献５）、実用には向かないものであった。また、ピリジン中、０．５Ｍ  ＤＢＵの条件下、１６時間で脱保護可能である核酸合成用アミダイドも報告されている（非特許文献３〜４）が、高濃度のＤＢＵ、長時間による脱保護のため、核酸塩基へのアルキル化が起こるという問題があった。また、メタノール中、Ｋ２ＣＯ３を用いた条件下で脱保護可能である核酸合成用アミダイドも報告されている（非特許文献５〜６）が、プロトン性溶媒であるメタノール中で塩基のＫ２ＣＯ３を使用するため、エステル等が分解するという問題があった。【０００７】
したがって、精製が可能であり、好ましくは更に、緩やかな条件下で保護基の脱保護が可能な核酸合成用ダイマーアミダイド、及び前記核酸合成用ダイマーアミダイドを利用した核酸合成方法の開発が、未だ望まれているのが現状である。【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００３／０７８６２３号パンフレット
【非特許文献１】Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ，Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３７，２６３（１９８３）
【非特許文献２】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，１６５７（１９８９）
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４０，４１７１（１９９２）
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｏｄｉｅｄ  ＆  Ｎｕｃｌｒｏｔｉｄｅｓ  １３，２０５９（１９９４）
【非特許文献５】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６，６７２９（１９９０）
【非特許文献６】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ２１，３４９３（１９９３）
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、精製が可能であり、好ましくは更に、緩やかな条件下でリン酸基及び塩基の保護基の脱保護が可能な核酸合成用ダイマーアミダイド、及び前記核酸合成用ダイマーアミダイドを利用した核酸合成方法を提供することを目的とする。
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドは、二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなることを特徴とする。前記核酸合成用ダイマーアミダイドは、二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなるため、リン酸トリエステル結合を介して連結してなるダイマーアミダイドと比較して、塩基性条件で安定性が高く、精製が可能である。そのため、精製が困難な、リン酸トリエステル結合を介して連結してなるダイマーアミダイドと比較して、高純度の核酸合成用ダイマーアミダイドとして得ることができる。また、前記核酸合成用ダイマーアミダイドは、好ましくは更に、非プロトン性溶媒中で脱保護可能なリン酸基及び塩基の保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能なリン酸基及び塩基の保護基を有するものであるため、例えば、塩基の保護基と塩基との間に、所望の置換基を安定に導入することも可能である。
【００１１】
本発明の核酸合成方法は、本発明の前記核酸合成用ダイマーアミダイドを用いることを特徴とする。前記したように、前記核酸合成用ダイマーアミダイドは精製が可能であるため、前記核酸合成方法においては、精製された高純度の核酸合成用ダイマーアミダイドを用いることができ、そのため、未精製のダイマーアミダイドを用いた場合と比較して、高い核酸合成収率を得ることが可能となる。また、前記核酸合成用ダイマーアミダイドは、好ましくは更に、緩やかな条件下でリン酸基及び塩基の保護基を脱保護可能であるため、例えば、塩基に導入された置換基を脱離させることなしに、塩基の保護基の脱保護を容易に行うことができ、即ち、所望の置換基を有する核酸を安定に製造することができる。
【００１２】
本発明の核酸は、本発明の前記核酸合成方法により得られることを特徴とする。前記核酸は、好ましくは所望の置換基を有する修飾核酸であり得、このような修飾核酸は、置換基を介して、蛋白質等の標的物質との結合が可能である。したがって、前記核酸は、例えば蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。
【００１３】
本発明によると、従来における前記問題を解決することができ、精製が可能であり、好ましくは更に、緩やかな条件下でリン酸基及び塩基の保護基の脱保護が可能な核酸合成用ダイマーアミダイド、及び前記核酸合成用ダイマーアミダイドを利用した核酸合成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなる本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドと、リン酸トリエステル結合を介して連結してなる比較対照のダイマーアミダイドとの違いを示した図である。
【図２−１】図２−１は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＩの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−２】図２−２は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＶＳｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−３】図２−３は、実施例１（スキーム１）における化合物ＶＳｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−４】図２−４は、実施例１（スキーム１）における化合物ＶＳｅｒの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−５】図２−５は、実施例１（スキーム１）における化合物ＶＩＩＩＳｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−６】図２−６は、実施例１（スキーム１）における化合物ＶＩＩＩＳｅｒの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−７】図２−７は、実施例１（スキーム１）における化合物ＶＩＩＩＳｅｒのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図２−８】図２−８は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＸＳｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−９】図２−９は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＸＳｅｒの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−１０】図２−１０は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＸＳｅｒのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図２−１１】図２−１１は、実施例１（スキーム１）における化合物ＶＩＩ’ Ｓｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−１２】図２−１２は、実施例１（スキーム１）における化合物ＶＩＩＩ’ Ｓｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−１３】図２−１３は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＸ’ Ｓｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−１４】図２−１４は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＸ’ Ｓｅｒの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２−１５】図２−１５は、実施例１（スキーム１）における化合物ＩＸ’ ＳｅｒのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図３−１】図３−１は、実施例１（スキーム２）における化合物ＶＩＩＩＬｅｕの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３−２】図３−２は、実施例１（スキーム２）における化合物ＶＩＩＩＬｅｕの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３−３】図３−３は、実施例１（スキーム２）における化合物ＶＩＩＩＬｅｕのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図３−４】図３−４は、実施例１（スキーム２）における化合物ＩＸＬｅｕの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３−５】図３−５は、実施例１（スキーム２）における化合物ＩＸＬｅｕの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３−６】図３−６は、実施例１（スキーム２）における化合物ＩＸＬｅｕのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図４−１】図４−１は、実施例１（スキーム３）における化合物ＶＩＩＩＰｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４−２】図４−２は、実施例１（スキーム３）における化合物ＶＩＩＩＰｈｅの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４−３】図４−３は、実施例１（スキーム３）における化合物ＶＩＩＩＰｈｅのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図４−４】図４−４は、実施例１（スキーム３）における化合物ＩＸＰｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４−５】図４−５は、実施例１（スキーム３）における化合物ＩＸＰｈｅのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図５−１】図５−１は、実施例１（スキーム４）における化合物ＶＩＩＩＧｌｕの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５−２】図５−２は、実施例１（スキーム４）における化合物ＶＩＩＩＧｌｕの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５−３】図５−３は、実施例１（スキーム４）における化合物ＶＩＩＩＧｌｕのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図５−４】図５−４は、実施例１（スキーム４）における化合物ＩＸＧｌｕの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５−５】図５−５は、実施例１（スキーム４）における化合物ＩＸＧｌｕの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５−６】図５−６は、実施例１（スキーム４）における化合物ＩＸＧｌｕのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図６−１】図６−１は、実施例１（スキーム５）における化合物ＶＩＩＩＡ−Ｌｙｓの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６−２】図６−２は、実施例１（スキーム５）における化合物ＶＩＩＩＡ−Ｌｙｓの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６−３】図６−３は、実施例１（スキーム５）における化合物ＶＩＩＩＡ−ＬｙｓのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図６−４】図６−４は、実施例１（スキーム５）における化合物ＩＸＡ−Ｌｙｓの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６−５】図６−５は、実施例１（スキーム５）における化合物ＩＸＡ−Ｌｙｓの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６−６】図６−６は、実施例１（スキーム５）における化合物ＩＸＡ−ＬｙｓのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図７−１】図７−１は、実施例１（スキーム６）における化合物ＶＩＩＩＧ−Ｌｙｓの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７−２】図７−２は、実施例１（スキーム６）における化合物ＶＩＩＩＧ−Ｌｙｓの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７−３】図７−３は、実施例１（スキーム６）における化合物ＶＩＩＩＧ−ＬｙｓのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図７−４】図７−４は、実施例１（スキーム６）における化合物ＩＸＧ−Ｌｙｓの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７−５】図７−５は、実施例１（スキーム６）における化合物ＩＸＧ−Ｌｙｓの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７−６】図７−６は、実施例１（スキーム６）における化合物ＩＸＧ−ＬｙｓのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図８−１】図８−１は、実施例１（スキーム７）における化合物ＩＶＴｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８−２】図８−２は、実施例１（スキーム７）における化合物ＶＴｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８−３】図８−３は、実施例１（スキーム７）における化合物ＶＴｈｅの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８−４】図８−４は、実施例１（スキーム７）における化合物ＶＴｈｅのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図８−５】図８−５は、実施例１（スキーム７）における化合物ＶＩＩＩＴｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８−６】図８−６は、実施例１（スキーム７）における化合物ＶＩＩＩＴｈｅの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８−７】図８−７は、実施例１（スキーム７）における化合物ＶＩＩＩＴｈｅのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図８−８】図８−８は、実施例１（スキーム７）における化合物ＩＸＴｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８−９】図８−９は、実施例１（スキーム７）における化合物ＩＸＴｈｅの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８−１０】図８−１０は、実施例１（スキーム７）における化合物ＩＸＴｈｅのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図９−１】図９−１は、実施例１（スキーム８）における化合物ＩＶＭｅｔの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−２】図９−２は、実施例１（スキーム８）における化合物ＶＭｅｔの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−３】図９−３は、実施例１（スキーム８）における化合物ＶＭｅｔの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−４】図９−４は、実施例１（スキーム８）における化合物ＶＩＭｅｔの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−５】図９−５は、実施例１（スキーム８）における化合物ＶＩＩＩＭｅｔの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−６】図９−６は、実施例１（スキーム８）における化合物ＶＩＩＩＭｅｔの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−７】図９−７は、実施例１（スキーム８）における化合物ＶＩＩＩＭｅｔのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図９−８】図９−８は、実施例１（スキーム８）における化合物ＩＸＭｅｔの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−９】図９−９は、実施例１（スキーム８）における化合物ＩＸＭｅｔの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図９−１０】図９−１０は、実施例１（スキーム８）における化合物ＩＸＭｅｔのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１０−１】図１０−１は、実施例１（スキーム９）における化合物Ｘの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−２】図１０−２は、実施例１（スキーム９）における化合物ＩＩＩＣの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−３】図１０−３は、実施例１（スキーム９）における化合物ＸＩの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−４】図１０−４は、実施例１（スキーム９）における化合物ＸＩＩＴｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−５】図１０−５は、実施例１（スキーム９）における化合物ＸＩＩＩの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−６】図１０−６は、実施例１（スキーム９）における化合物ＸＩＶＴｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−７】図１０−７は、実施例１（スキーム９）における化合物ＩＶＴｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−８】図１０−８は、実施例１（スキーム９）における化合物ＶＴｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−９】図１０−９は、実施例１（スキーム９）における化合物ＶＴｙｒの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−１０】図１０−１０は、実施例１（スキーム９）における化合物ＶＴｙｒのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１０−１１】図１０−１１は、実施例１（スキーム９）における化合物ＶＩＴｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−１２】図１０−１２は、実施例１（スキーム９）における化合物ＶＩＩＩＴｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−１３】図１０−１３は、実施例１（スキーム９）における化合物ＶＩＩＩＴｙｒの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−１４】図１０−１４は、実施例１（スキーム９）における化合物ＶＩＩＩＴｙｒのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１０−１５】図１０−１５は、実施例１（スキーム９）における化合物ＩＸＴｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−１６】図１０−１６は、実施例１（スキーム９）における化合物ＩＸＴｙｒの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０−１７】図１０−１７は、実施例１（スキーム９）における化合物ＩＸＴｙｒのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１１−１】図１１−１は、実施例１（スキーム１０）における化合物ＩＸ’Ｐｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１１−２】図１１−２は、実施例１（スキーム１０）における化合物ＩＸ’Ｐｈｅの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１１−３】図１１−３は、実施例１（スキーム１０）における化合物ＩＸ’ＰｈｅのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１２−１】図１２−１は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＸＩＶの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−２】図１２−２は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＩＶＤｉａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−３】図１２−３は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＶＤｉａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−４】図１２−４は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＶＤｉａの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−５】図１２−５は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＶＤｉａのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１２−６】図１２−６は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＶＩＩＩＤｉａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−７】図１２−７は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＶＩＩＩＤｉａの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−８】図１２−８は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＶＩＩＩＤｉａのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１２−９】図１２−９は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＩＸＤｉａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−１０】図１２−１０は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＩＸＤｉａの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２−１１】図１２−１１は、実施例１（スキーム１１）における化合物ＩＸＤｉａのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実施例２における比較対照のダイマーアミダイドＩＸ’ＳｅｒのＨＰＬＣ  ｃｈａｒｔ（ＨＰＬＣ  ｃｈａｒｔ  ａ）である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実施例２における本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドＩＸＳｅｒのＨＰＬＣ  ｃｈａｒｔ（ＨＰＬＣ  ｃｈａｒｔ  ｂ）である。
【図１４】図１４は、実施例３におけるＤＮＡ合成収率の確認方法を示した図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、実施例３において、比較対照のダイマーアミダイドＩＸ’Ｓｅｒを用いた場合のＤＮＡ合成収率を示したグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、実施例３において、本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドＩＸＳｅｒを用いた場合のＤＮＡ合成収率を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（核酸合成用ダイマーアミダイド）
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドは、二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなることを特徴とし、好ましくは更に、リン酸基及び塩基の保護基が、非プロトン性溶媒中で脱保護可能であることを特徴とする。【００１６】
＜ヌクレオシド化合物＞
本発明において、前記「ヌクレオシド化合物」とは、核酸の合成に用いられるヌクレオシド又はヌクレオシド誘導体のモノマーをいい、前記ヌクレオシド誘導体には、末端がアミダイド化された「核酸合成用アミダイド」が含まれる。以下、前記「核酸合成用アミダイド」を例に挙げ、前記「ヌクレオシド化合物」を説明するものとする。【００１７】
−核酸合成用アミダイド−
前記「核酸合成用アミダイド」は、核酸の合成に用いられる、末端がアミダイド化されたヌクレオシド誘導体のモノマーであり、その種類としては、特に制限はないが、例えば、下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に示す構造のものなどが挙げられる。【００１８】
【化１】
2009028345.tif 000002
【００１９】
【化２】
2009028345.tif 000003
【００２０】
【化３】
2009028345.tif 000004
【００２１】
ただし、前記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｘは塩基を表し、Ｙは置換基を表し、Ｚは塩基に直接（式（Ｉ））又は置換基を介して（式（ＩＩ））導入された保護基（本明細書中において、単に「塩基の保護基」と称することがある）を表し、Ｑは水素原子又は水酸基を表す。【００２２】
例えば、前記式（Ｉ）は、塩基Ｘの環外アミノ基が、保護基Ｚに保護されてなる核酸合成用アミダイドを示す。塩基が、環外アミノ基を有する塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン等）である場合には、核酸合成時の環外アミノ基の不要な反応を防ぐため、前記環外アミノ基に保護基を導入しておくことが好ましい。したがって、このような場合には、前記式（Ｉ）のような構造の核酸合成用アミダイドを用いることができる。
また、前記式（ＩＩ）は、塩基Ｘの環外アミノ基に置換基Ｙが導入されてなり、かつ、前記置換基が保護基Ｚに保護されてなる核酸合成用アミダイドを示す。例えば、蛋白質等の標的物質との結合性を有する修飾核酸を得ようとする場合には、塩基の環外アミノ基に、蛋白質等の標的物質との結合性を有する置換基を導入しておくことができる。この場合、核酸合成時の置換基の不要な反応を防ぐため、前記置換基に保護基を導入しておくことが好ましい。したがって、このような場合には、前記式（ＩＩ）のような構造の核酸合成用アミダイドを用いることができる。
また、前記式（ＩＩＩ）は、保護基Ｚ及び置換基Ｙのいずれをも有さない、核酸合成用アミダイドを示す。塩基が、環外アミノ基を有さない塩基（例えば、チミジン等）である場合には、核酸合成時の環外アミノ基の不要な反応を防ぐための保護基を塩基に導入する必要はなく、そのため、前記式（ＩＩＩ）のような構造の核酸合成用アミダイドを用いることができる。【００２３】
−−塩基−−
前記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｘで表される塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）などが挙げられる。また、前記塩基に保護基、若しくは置換基が導入される位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、アデニン塩基の６位、シトシン塩基の６位、グアニン塩基の２位などが好ましい。【００２４】
−−塩基の保護基−−
前記式（Ｉ）〜（ＩＩ）中、Ｚで表される塩基の保護基としては、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基を用いることが好ましい。
ここで、前記「緩やかな条件下で脱保護可能」とは、例えば、前記保護基が、非プロトン性溶媒中で、嵩高い塩基により脱保護可能であることをいう。前記非プロトン性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、Ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられる。また、前記嵩高い塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセン）、ＤＢＮ（１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]−５−ノネン）、テトラメチルグアニジンなどが挙げられる。これらの中でも、前記保護基は、前記アセトニトリル中、前記ＤＢＵにより脱保護されることが好ましい。また、この場合、前記保護基の脱保護に要するＤＢＵ濃度としては、０．５Ｍ以下が好ましく、０．１Ｍ以下がより好ましく、０．０１Ｍ以下が特に好ましい。また、前記保護基の脱保護に要する時間としては、８時間以内が好ましく、１時間以内がより好ましく、１５分間以内が特に好ましい。
中でも、前記塩基の保護基としては、３−アミノプロピオン酸誘導体、４−アミノ酪酸誘導体、５−アミノ吉草酸誘導体、アミノメチル炭酸誘導体、アミノエチル炭酸誘導体、アミノ安息香酸誘導体、アミノメチル安息香酸誘導体、アミノエチル安息香酸誘導体、アミノフェニル酢酸誘導体、アミノメチルフェニル酢酸誘導体、アミノフェニルプロピオン酸誘導体、及び、アミノメチルフェニルプロピロン酸誘導体のいずれかからなる保護基が好ましい。【００２５】
−−置換基−−
前記式（ＩＩ）中、Ｙで表される置換基としては、その構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記置換基は、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、下記式（１）〜（１０）で表される基などの構造を含むことができる。ここで、前記置換基は、前記塩基の保護基が緩やかな条件下で脱保護される際に、併せて脱離されてしまわないよう、前記塩基に導入されていることが好ましい。【００２６】
【化４】
2009028345.tif 000005
【００２７】
前記天然又は非天然のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリンなどが挙げられる。
前記金属錯体としては、金属イオンに配位子が配位した化合物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｕビピリジル錯体、フェロセン錯体、ニッケルイミダゾール錯体などが挙げられる。
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素などが挙げられる。
前記酸化還元色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロイコアニリン、ロイコアントシアニン等のロイコ色素などが挙げられる。
前記スピンラベル体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄Ｎ−（ジチオカルボキシ）サルコシン（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、ＴＥＭＰＯ（テトラメチルピペリジン）誘導体などが挙げられる。
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などが挙げられる。
これらは、置換基で更に置換されていてもよい。【００２８】
−−リン酸基の保護基−−
前記核酸合成用アミダイドにおいて、核酸合成時の縮合反応に関与させないリン酸部分の反応性基には、核酸合成時の不要な反応を防ぐため、保護基（本明細書中において、単に「リン酸基の保護基」と称することがある）が導入されていることが好ましい。前記リン酸基の保護基は、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基であることが好ましく、ここで、前記「緩やかな条件下で脱保護可能」とは、前記した塩基の保護基の項目に記載した通りである。核酸合成時に、前記核酸合成用アミダイドの亜リン酸トリエステル結合が酸化によりリン酸トリエステル結合とされた後、該リン酸トリエステル結合におけるリン酸基の保護基が、前記緩やかな条件下で脱保護されることが好ましい。
なお、前記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される核酸合成用アミダイドでは、前記リン酸基の保護基として、シアノエチル基が例示的に表記されているが、前記リン酸基の保護基としては、これに限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シアノエチル基及びその誘導体、フルオレニルメチル基及びその誘導体、フェネチル基及びその誘導体、並びに、ニトロエチル基及びその誘導体からなる群より選択されるいずれかであることが好ましい。【００２９】
前記したような核酸合成用アミダイドに代表されるヌクレオシド化合物は、例えば、後述する実施例に記載の方法等により、合成することができる。【００３０】
＜二のヌクレオシド化合物の連結＞
前記したようなヌクレオシド化合物のうち、二のヌクレオシド化合物を亜リン酸トリエステル結合（Ｐ（ＯＲ）３）を介して連結させ、末端をアミダイド化することにより、前記核酸合成用ダイマーアミダイドを得ることができる。
前記二のヌクレオシド化合物を、亜リン酸トリエステル結合（Ｐ（ＯＲ）３）を介して連結させる方法としては、特に制限はなく、亜リン酸塩化物、亜リン酸ジ塩化物を用いても良いが、副反応を抑える意味で、後述する実施例に記載の方法が好適であると考えられる。【００３１】
また、前記二のヌクレオシド化合物としては、異なる種類のヌクレオシド化合物を使用してもよいし、同じ種類のヌクレオシド化合物を使用してもよい。ここで、前記二のヌクレオシド化合物のうち、少なくともいずれか一方のヌクレオシド化合物は、その塩基の環外アミノ基に、前記したような非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基を有していることが好ましい。また、前記二のヌクレオシド化合物のうち、両方のヌクレオシド化合物が、その塩基の環外アミノ基に、前記したような非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基を有していてもよい。前記塩基の保護基は、前記した式（Ｉ）のように、塩基に直接結合されてなるものであってもよいし、また、前記した式（ＩＩ）のように、置換基を介して、塩基に結合されてなるものであってもよい。なお、前記非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基の詳細としては、前記した通りである。【００３２】
＜具体例＞
前記核酸合成用ダイマーアミダイドの具体例としては、例えば、下記構造式（１）〜（１１）に示すものなどが挙げられるが、前記核酸合成用ダイマーアミダイドとしては、これらに限定されるものではない。【００３３】
【化５】
2009028345.tif 000006
【００３４】
【化６】
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【００３５】
【化７】
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【００３６】
【化８】
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【００３７】
【化９】
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【００３８】
【化１０】
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【００３９】
【化１１】
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【００４０】
【化１２】
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【００４１】
【化１３】
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【００４２】
【化１４】
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【００４３】
【化１５】
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【００４４】
前記核酸合成用ダイマーアミダイドは、亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなるため、精製が可能であり、そのため、高純度の核酸合成用ダイマーアミダイドとして得ることができる。
図１に、リン酸トリエステル結合を介して連結してなる比較対照のダイマーアミダイドと、亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなる本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドとの比較を示す。リン酸トリエステル結合（Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）３）を介して連結してなる比較対照のダイマーアミダイド（リン酸（リン５価）法；図１上段）では、酸に非常に不安定な部位、及び塩基に非常に不安定な部位を共に有しており、このため精製によりほとんど分解されてしまうという欠点がある。一方で、亜リン酸トリエステル結合（Ｐ（ＯＲ）３）を介して連結してなる本発明の核酸合成用ダイマーアミダイド（亜リン酸（リン３価）法；図１下段）では、塩基に非常に不安定な部位を有しておらず、このため精製が可能であり、高純度の核酸合成用ダイマーアミダイドとして得ることができる。【００４５】
更に好ましくは、前記核酸合成用ダイマーアミダイドは、緩やかな条件下で脱保護が可能な、リン酸基及び塩基の保護基を有するので、例えば、塩基に導入された置換基を脱離させない条件下で、前記塩基の保護基を脱保護することができる。そのため、前記塩基の保護基と塩基との間に、所望の置換基を、安定に導入することも可能である。【００４６】
（核酸合成方法）
本発明の核酸合成方法は、本発明の前記核酸合成用ダイマーアミダイドを用いることを特徴とする。前記核酸合成方法は、例えば、従来の核酸自動合成装置を用いて行うことができる。【００４７】
前記核酸合成方法においては、前記核酸合成用ダイマーアミダイドを、一種単独で使用してもよいし、二種以上を併用してもよい。また、前記核酸合成方法に用いるダイマーアミダイドとしては、前記核酸合成用ダイマーアミダイドのみならず、他のダイマーアミダイドを組み合わせて用いてもよい。この場合、前記他のダイマーアミダイドとしては、前記したような緩やかな条件下で脱保護可能なダイマーアミダイドを用いることが好ましく、このようなダイマーアミダイドとしては、例えば、特願２００７−０６９３７８号明細書に記載のダイマーアミダイドなどを用いることができる。【００４８】
前記核酸合成方法においては、前記核酸合成用ダイマーアミダイド（及び、前記他のダイマーアミダイド）の縮合反応の後、前記核酸合成用ダイマーアミダイド（及び、前記他のダイマーアミダイド）の、リン酸基及び塩基の保護基の脱保護を行う。前記脱保護の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記したような緩やかな条件下で行われることが好ましく、例えば、非プロトン性溶媒中で、嵩高い塩基により脱保護を行うことが好ましい。前記非プロトン性溶媒、前記嵩高い塩基としては、前記同様である。また、脱保護に要する濃度、時間としても、前記同様である。【００４９】
前記核酸合成方法では、本発明の前記核酸合成用ダイマーアミダイドを用いるため、精製後の高純度の核酸合成用ダイマーアミダイドを用いることができ、そのため、核酸の合成収率を高めることが可能である。また、前記核酸合成方法では、本発明の前記核酸合成用ダイマーアミダイドを用いるため、好ましくは、緩やかな条件下で脱保護を行うことができ、そのため、前記核酸合成用ダイマーアミダイドが置換基を有する場合であっても、前記置換基を脱離することなしに、容易に保護基の脱保護のみを行うことができる。そのため、前記核酸合成方法によれば、所望の置換基を有する核酸を、安定に製造することが可能である。【００５０】
（核酸）
本発明の核酸は、本発明の前記核酸合成方法により得られることを特徴とする。
前記核酸を構成するヌクレオチド単位の個数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１０〜２００個が好ましく、２０〜１００個がより好ましく、３０〜８０個が特に好ましい。なお、前記核酸を構成するヌクレオチド単位のうち、前記核酸合成用ダイマーアミダイドに由来するヌクレオチド単位の割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記核酸は、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列のいずれであってもよく、また、前記ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。【００５１】
前記核酸は、本発明の前記核酸合成方法により得られるものであるため、所望の置換基を安定に有する修飾核酸であり得る。前記修飾核酸は、置換基を介して、蛋白質等の標的物質との結合が可能であり、したがって、このような修飾核酸は、例えば蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。
より具体的には、例えば、予め各核酸合成用ダイマーアミダイドに導入させた置換基の種類をダイマーコード対応表（核酸合成用ダイマーアミダイドの塩基配列と、置換基の種類との対応表）等で定めておき、前記各核酸合成用ダイマーアミダイドを用いて合成した複数種の修飾核酸を、所望の標的物質と反応させる。次いで、複数種の修飾核酸の中から前記標的物質と高い結合性を有する修飾核酸を選別した後に、置換基を脱離し、ＰＣＲ増幅、及び、シーケンシング（塩基配列決定）を行う。最後に、前記修飾核酸に導入されていた置換基の種類を前記ダイマーコード対応表を用いて確認することにより、これらの情報に基づき、前記標的物質と高い結合性を有する修飾核酸と同様の修飾核酸を大量に複製等することができ、このような修飾核酸を、標的物質の解析に利用することが可能となる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００５３】
（実施例１：核酸合成用ダイマーアミダイドの合成）
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイド、ＩＸＳｅｒ、ＩＸＬｅｕ、ＩＸＰｈｅ、ＩＸＧｌｕ、ＩＸＡ−Ｌｙｓ、ＩＸＧ−Ｌｙｓ、ＩＸＴｈｅ、ＩＸＭｅｔ、ＩＸＴｙｒ、ＩＸ’Ｐｈｅ、ＩＸＤｉａを以下のようにして合成した。なお、前記核酸合成用ダイマーアミダイドＩＸＳｅｒ、ＩＸＬｅｕ、ＩＸＰｈｅ、ＩＸＧｌｕ、ＩＸＡ−Ｌｙｓ、ＩＸＧ−Ｌｙｓ、ＩＸＴｈｅ、ＩＸＭｅｔ、ＩＸＴｙｒ、ＩＸ’Ｐｈｅ、ＩＸＤｉａは、それぞれ前記した構造式（１）〜（１１）に対応する核酸合成用ダイマーアミダイドである。
なお、下記化合物Ｉ、ＩＩＩＡ、ＶＩＧ、ＶＬｅｕ、ＶＩＡ、ＶＰｈｅ、ＶＩＣ、ＶＧｌｕ、ＶＩＴ、ＶＩＡ−Ｌｙｓ、ＶＴ、ＶＧ−Ｌｙｓ、ＩＩＩＧ、ＶＧは、それぞれ特願２００７−０６９３７８号明細書に示された合成方法に従い合成した。【００５４】
【化１６】
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【００５５】
＜ＩＩの合成＞
Ｉ  １３．５８ｇ（４０ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２００ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、ピリジン３．８８ｍＬ（４８ｍｍｏｌ）及び硝酸銀６．７９ｇ（４０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、塩化ピバロイル４．９３ｍＬ（４０ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１５分間攪拌した。続いて、グリコール酸４．５６ｇ（６０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（１％酢酸、ジクロロメタン−エタノール１００：０→１９：１）にて精製し、目的物ＩＩ  １３．０３ｇ（８２％）を得た。【００５６】
＜ＩＶＳｅｒの合成＞
ＩＩＩＡ  １０．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン２．４０ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン２．２４ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間攪拌した、反応混合物にトリフロロ酢酸１．２７ｍＬ（１６．５ｍｍｏｌ）、ピリジン１．４５ｍｌ（１８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン１０ｍＬの混合溶液を加え、反応混合物Ａを得た。
ＩＩ  ４．９７ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を脱水トルエンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド１．５８ｇ（１３．８ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、ジシクロヘキシルカルボジイミド２．７１ｇ（１３．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて１時間攪拌した。続いてメタノール５ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→４７：３）にて精製し、目的物ＩＶＳｅｒ  １０．１１ｇ（９５％）を得た。【００５７】
＜ＶＳｅｒの合成＞
ＩＶＳｅｒ  １０．１１ｇ（９．４８ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３８ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン５７．９ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．８７ｍＬ（１１．４ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト２．３３ｍＬ（１０．４ｍｍｏｌ）の９．５ｍＬジクロロメタン溶液を５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃で１時間攪拌した。続いてメタノール９．５ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝２：１−２％ピリジン、３％エタノールｉｎ酢酸エチル１：０→０：１）にて精製し、目的物ＶＳｅｒ  １０．３１ｇ（８６％）を得た。【００５８】
＜ＶＩＩＩＳｅｒの合成＞
ＶＳｅｒ  １０．３１ｇ（８．１４ｍｍｏｌ）及びＶＩＧ  ５．８７ｇ（８．５５ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４１ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール２．８５ｇ（４０．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。続いてメタノール３．３ｍＬを加え、３０分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を４３ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１２．８ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＳｅｒの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液４．３ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン３０ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＳｅｒ  １１．０７ｇ（７８％）を得た。【００５９】
＜ＩＸＳｅｒの合成＞
ＶＩＩＩＳｅｒ  １０．０３ｇ（６．２９ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２５ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３８ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．２５ｍＬ（７．５５ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．５４ｍＬ（６．９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン６．３ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を０℃で１２時間攪拌した後、室温で２時間攪拌した。続いてメタノール２．５ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→３：１）にて精製し、目的物ＩＸＳｅｒ  ８．８３ｇ（７１％）を得た。【００６０】
＜ＶＩＩ’Ｓｅｒの合成＞
ＶＳｅｒ  ４．１４ｇ（３．２７ｍｍｏｌ）及びＶＩＧ  ２．２５ｇ（３．２７ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３２ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール１．１６ｇ（１６．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。続いて水１．０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を０．１Ｍヨウ素ｉｎＴＨＦ：水：ピリジン＝７：２：１溶液１１４ｍＬに溶解し、室温で３０分間攪拌した。反応混合物に２９０ｍＬのジクロロメタンを加え、亜硫酸ナトリウム７．２ｇを加え、室温で１５分間攪拌した。反応混合物に約２５ｇの硫酸ナトリウムを加え、よく攪拌した後、不溶物を濾過した。濾液を減圧濃縮し、得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール４９：１→８：１）にて精製し、目的物ＶＩＩ’Ｓｅｒ  ４．８６ｇ（８０％）を得た。【００６１】
＜ＶＩＩＩ’Ｓｅｒの合成＞
ＶＩＩ’Ｓｅｒ  ４．７４ｇ（２．６０ｍｍｏｌ）を２６ｍＬのピリジンに溶解し、ヒドラジン１水和物１．２６ｍＬ（２６．０ｍｍｏｌ）の希釈溶液２６ｍＬ（ピリジン：酢酸＝３：２）を加え、室温で５分間攪拌した。氷冷下、アセトン２６ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール４９：１→１７：３）にて精製し、目的物ＶＩＩＩ’Ｓｅｒ  ３．５９ｇ（７８％）を得た。【００６２】
＜ＩＸ’Ｓｅｒの合成＞
ＶＩＩＩ’Ｓｅｒ  ３．１４ｇ（１．７７ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を１８ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン１２．７ｍｇ（０．０８９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン４０１μＬ（２．３０ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト４７１μＬ（２．１２ｍｍｏｌ）を加えた。混合溶液を０℃で１時間攪拌した後、室温で２時間攪拌した。続いてメタノール１．８ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を２５ｍＬの酢酸エチル及び１０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、−６０℃で１７７ｍＬのヘキサンに滴下した。不溶物をろ過し、冷ヘキサンで洗浄し、濾物から減圧下溶媒を除くことにより目的物ＩＸ’Ｓｅｒ  ２．９８ｇ（８６％）を得た。【００６３】
【化１７】
2009028345.tif 000018
【００６４】
＜ＶＩＩＩＬｅｕの合成＞
ＶＬｅｕ  ７．３９ｇ（７．５１ｍｍｏｌ）及びＶＩＡ  ５．７９ｇ（８．６３ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３８ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール２．６５ｇ（３７．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。続いてメタノール１．７ｍＬを加え、３０分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を４３ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１２．９ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＬｅｕの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液４．３ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン３０ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＬｅｕ  ８．２２ｇ（７５％）を得た。【００６５】
＜ＩＸＬｅｕの合成＞
ＶＩＩＩＬｅｕ  ７．０８ｇ（４．８６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を１９ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３０ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン９６４μＬ（７．５５ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．１９ｍＬ（５．３５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン４．９ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を４℃で一晩攪拌した。続いてメタノール１．９ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジンｉｎジクロロメタン−２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→３：１）にて精製し、目的物ＩＸＬｅｕ  ３．８６ｇ（４８％）を得た。【００６６】
【化１８】
2009028345.tif 000019
【００６７】
＜ＶＩＩＩＰｈｅの合成＞
ＶＰｈｅ  ７．０９ｇ（７．０５ｍｍｏｌ）及びＶＩＣ  ４．７９ｇ（７．４１ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３５ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール２．４７ｇ（３５．３ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で４５分間攪拌した。続いてメタノール１．４ｍＬを加え、１５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を３８ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１１．１ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＰｈｅの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液３．７ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン３０ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９２：８）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＰｈｅ  ７．０７ｇ（６９％）を得た。【００６８】
＜ＩＸＰｈｅの合成＞
ＶＩＩＩＰｈｅ  ５．１７ｇ（３．５６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を１４ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン２２ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン７０６μＬ（５．３４ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト８７３μＬ（３．９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン３．６ｍＬ希釈溶液を加え、０℃で５時間攪拌した。続いてメタノール１．４ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジンｉｎジクロロメタン−２％ピリジン，２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→３：１）にて精製し、目的物ＩＸＰｈｅ  ４．０１ｇ（６８％）を得た。【００６９】
【化１９】
2009028345.tif 000020
【００７０】
＜ＶＩＩＩＧｌｕの合成＞
ＶＧｌｕ  ６．５２ｇ（５．５３ｍｍｏｌ）及びＶＩＴ  １．９８ｇ（５．８１ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２８ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール１．９４ｇ（２７．７ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で１時間攪拌した。続いてメタノール２．２ｍＬを加え、５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を２９ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液８．７ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＧｌｕの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液２．９ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン２３ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９１：９）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＧｌｕ  ６．１７ｇ（８５％）を得た。【００７１】
＜ＩＸＧｌｕの合成＞
ＶＩＩＩＧｌｕ  ６．１７ｇ（４．６７ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を１９ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン２９ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン０．９３ｍＬ（５．３３ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．１５ｍＬ（５．１４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン４．８ｍＬ希釈溶液を加え、０℃で２時間攪拌した。続いてメタノール１．９ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジンｉｎジクロロメタン−２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→３：１）にて精製し、目的物ＩＸＧｌｕ  ４．７９ｇ（６７％）を得た。【００７２】
【化２０】
2009028345.tif 000021
【００７３】
＜ＶＩＩＩＡ−Ｌｙｓの合成＞
ＶＩＡ−Ｌｙｓ  ６．８９ｇ（９．７７ｍｍｏｌ）及びＶＴ  ８．０ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を５０ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール３．４２ｇ（４８．９ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で１時間攪拌した。続いてメタノール３．９ｍＬを加え、５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を４９ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１４．６ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＡ−Ｌｙｓの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液４．９ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン１５ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＡ−Ｌｙｓ  ９．０９ｇ（７４％）を得た。【００７４】
＜ＩＸＡ−Ｌｙｓの合成＞
ＶＩＩＩＡ−Ｌｙｓ  ９．０９ｇ（７．２７ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２９ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン４４ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．４４ｍＬ（８．２７ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．７８ｍＬ（７．９９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン７．３ｍＬ希釈溶液を加え、０℃で４時間攪拌した。続いてメタノール２．９ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジンｉｎジクロロメタン−２％ピリジン，２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→３：１）にて精製し、目的物ＩＸＡ−Ｌｙｓ  ６．６４ｇ（６３％）を得た。【００７５】
【化２１】
2009028345.tif 000022
【００７６】
＜ＶＩＩＩＧ−Ｌｙｓの合成＞
ＶＧ−Ｌｙｓ  ９．４７ｇ（７．９２ｍｍｏｌ）及びＶＩＣ  ５．３７ｇ（８．３１ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を５０ｍＬの脱水アセトニトリル：脱水ジクロロメタン＝４：１に溶解し、氷冷下テトラゾール２．７７ｇ（３９．６ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で２時間攪拌した。続いてメタノール３．２ｍＬを加え、５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を４１．６ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１２．４ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＧ−Ｌｙｓの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液２．９ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン２５ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９６：４→９２：８）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＧ−Ｌｙｓ  １０．３ｇ（７９％）を得た。【００７７】
＜ＩＸＧ−Ｌｙｓの合成＞
ＶＩＩＩＧ−Ｌｙｓ  ９．９３ｇ（６．０４ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２４ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３７ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．１２ｍＬ（６．８８ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．４８ｍＬ（６．６５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン６ｍＬ希釈溶液を加え、０℃で５時間攪拌した。続いてメタノール２．４ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジンｉｎジクロロメタン−２％ピリジン，２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→３：１）にて精製し、目的物ＩＸＧ−Ｌｙｓ  ６．５８ｇ  （５９％）を得た。【００７８】
【化２２】
2009028345.tif 000023
【００７９】
＜ＩＶＴｈｅの合成＞
ＩＩＩＧ  １０．３５ｇ（１２ｍｍｏｌ）を２４ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン２．８８ｍＬ（１８ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン２．６９ｍＬ（１８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応混合物にトリエチルアンモニウム塩酸塩３．３０ｇ（２４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物Ａを得た。
３−テノイルクロリド２．２０ｇ（１５ｍｍｏｌ）を３６ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール２．２３ｇ（１６．５ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、ピリジン１．８２ｇ（２２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９２：８→８８：１２）にて精製し、目的物ＩＶＴｈｅ  ７．２３ｇ（８０％）を得た。【００８０】
＜ＶＴｈｅの合成＞
ＩＶＴｈｅ  ７．２６ｇ（９．６６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン５９ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．９２ｍＬ（１１．０ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト２．３７ｍＬ（１０．６ｍｍｏｌ）の９．７ｍＬジクロロメタン溶液を、５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃で１晩攪拌した。続いてメタノール１．９ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝２：１−２％ピリジン、５％エタノールｉｎ酢酸エチル１：０→０：１）にて精製し、目的物ＶＴｈｅ  ７．６９ｇ（８４％）を得た。【００８１】
＜ＶＩＩＩＴｈｅの合成＞
ＶＴｈｅ  ７．４８ｇ（７．８７ｍｍｏｌ）及びＶＩＴ  ２．８１ｇ（８．２６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３９ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール２．７５ｇ（３９．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。続いてメタノール３．１ｍＬを加え、５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を４１ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１２．４ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＴｈｅの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液４．１ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン２８ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９５：５→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＴｈｅ  ５．４４ｇ（６４％）を得た。【００８２】
＜ＩＸＴｈｅの合成＞
ＶＩＩＩＴｈｅ  ５．４９ｇ（５．０３ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３１ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．００ｍＬ（５．７２ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．２３ｍＬ（５．５３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン５．０ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を０℃で１日攪拌した。続いてメタノール１．０ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→４：１）にて精製し、目的物ＩＸＴｈｅ  ４．３０ｇ（６６％）を得た。【００８３】
【化２３】
2009028345.tif 000024
【００８４】
＜ＩＶＭｅｔの合成＞
ＩＩＩＡ  １５．７８ｇ（１５ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン３．５９ｍＬ（２２．５ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン３．３７ｍＬ（２２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間攪拌した。反応混合物にトリフロロ酢酸１．２７ｍＬ（１６．５ｍｍｏｌ）、ピリジン１．４５ｍｌ（１８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン１０ｍＬの混合溶液を加え、反応混合物Ａを得た。
トリフォスゲン２．２３ｇ（７．５ｍｍｏｌ）を３３ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下、ピリジン２．０ｍＬ（２４．８ｍｍｏｌ）及び２−（メチルチオ）エタノール１．９６ｍＬ（２２．５ｍｍｏｌ）の１５ｍＬジクロロメタン溶液を滴下した。反応混合物を室温にて１５分間攪拌した。Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド３．１１ｇ（２７．０ｍｍｏｌ）及びピリジン２．０ｍＬ（２４．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間攪拌し、反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて８時間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９８：２→９３：７）にて精製し、目的物ＩＶＭｅｔ  ８．３７ｇ（６９％）を得た。【００８５】
＜ＶＭｅｔの合成＞
ＩＶＭｅｔ  ８．２５ｇ（１０．２５ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４１ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン６３ｍｇ（０．５１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン２．０３ｍＬ（１１．７ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト２．５１ｍＬ（１１．３ｍｍｏｌ）の１０ｍＬジクロロメタン溶液を５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃で４５分間攪拌した。続いてメタノール２．０ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎ酢酸エチル１：０→０：１）にて精製し、目的物ＶＭｅｔ  ８．１０ｇ（７９％）を得た。【００８６】
＜ＶＩＭｅｔの合成＞
ＩＶＭｅｔ  １５．３ｇ（１９．３ｍｍｏｌ）を脱水ジオキサンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を９６ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、ジメチルアミノピリジン１８９ｍｇ（１．５５ｍｍｏｌ）、シシクロヘキシルカルボジイミド７．９６ｇ（３５．６ｍｍｏｌ）及びレブリン酸３．９６ｍＬ（３５．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合溶液を室温で１時間攪拌した。続いてメタノール３．９ｍＬを加え、１５分間攪拌した。不要物をろ過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタン１８０ｍＬに溶解し、氷冷下でトリフロロ酢酸９．６５ｍＬを加え、０℃で３０分間攪拌した。続いて、メタノール７７ｍＬ及びピリジン２１ｍＬを加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９８：２→９５：５）にて精製し、目的物ＶＩＭｅｔ  １０．０ｇ（８６．３％）を得た。【００８７】
＜ＶＩＩＩＭｅｔの合成＞
ＶＩＭｅｔ  ６．０１ｇ（１０ｍｍｏｌ）及びＶＧ  １１．４６ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を５０ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール３．５０ｇ（５０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。続いてメタノール２．０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を５０ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１５ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＭｅｔの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液５．０ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン３０ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＭｅｔ  ８．０９ｇ（５４％）を得た。【００８８】
＜ＩＸＭｅｔの合成＞
ＶＩＩＩＭｅｔ  ７．９４ｇ（５．３２ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２１ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３２ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．０６ｍＬ（６．０６ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．３１ｍＬ（５．８５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン５．３ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を０℃で２日間攪拌した。続いてメタノール１．１ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→８５：１５）にて精製し、目的物ＩＸＭｅｔ  ５．６４ｇ（６３％）を得た。【００８９】
【化２４】
2009028345.tif 000025
【００９０】
＜Ｘの合成＞
４−（ＦＭＯＣ−アミノメチル）安息香酸３７．３ｇ（１００ｍｍｏｌ）を４００ｍＬの脱水ジクロロメタンに懸濁し、アルゴン雰囲気下、オキサリルクロリド１２．９ｍＬ（１５０ｍｍｏｌ）及びジメチルホルムアミド０．１５ｍＬ（１．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で７時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残渣に脱水トルエンを加えた後、減圧濃縮し、４００ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、溶液Ａを得た。
デオキシシチジン塩酸塩２９．０ｇ（１１０ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで懸濁し、減圧濃縮する操作を３回行った。残渣を３７５ｍＬの脱水ピリジンで懸濁し、０℃でトリメチルクロロシラン４６．４ｍＬ（３９６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、再び０℃に冷却し、本溶液を氷冷下、溶液Ａに導入した。反応混合物を室温で１時間攪拌した。氷冷下１００ｍＬの水を加え、室温で８時間攪拌した。本溶液を減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル５００ｍＬ及び水５００ｍＬを加え、よく攪拌し、ろ過することにより粗製の目的物Ｘ  ６１．６ｇを得た。【００９１】
＜ＩＩＩＣの合成＞
粗製のＸ  ６１．６ｇを脱水ピリジンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を５００ｍＬの脱水ピリジンに溶解し、氷冷下４，４’−ジメトキシトリチルクロリド３３．９２ｇ（１００ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて８時間攪拌した。続いてメタノール２０ｍＬを加え、３０分間攪拌した。溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール１：０→１９：１）にて精製し、目的物ＩＩＩＣ  ７６．２ｇ（９０％  ２ｓｔｅｐ）を得た。【００９２】
＜ＸＩの合成＞
ＩＩＩＣ  ２３．１１ｇ（２６．１ｍｍｏｌ）を脱水ジオキサンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を１３０ｍＬの脱水ジオキサンに溶解し、ジメチルアミノピリジン２２６ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド１０．７８ｇ（５２．２ｍｍｏｌ）及びレブリン酸５．３６ｍＬ（５２．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液に５ｍＬのメタノールを加え、３０分間攪拌した。不溶物をろ過し、濾液を減圧濃縮し、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール１：０→１９：１）にて精製し、目的物ＸＩ  ２５．２ｇ（９８％）を得た。【００９３】
＜ＸＩＩＴｙｒの合成＞
ＸＩ  １７．８６ｇ（１５ｍｍｏｌ）を３８ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン４．５３ｍＬ（２８．３ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン４．２３ｍＬ（２８．３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間攪拌した。反応混合物にトリフロロ酢酸２．３９ｍＬ（３１．１ｍｍｏｌ）、ピリジン２．７４ｍｌ（３４．０ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン１９ｍＬの混合溶液を加え、反応混合物Ａを得た。
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸５．７４ｇ（３７．７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシこはく酸イミド５．２１ｇ（４５．３ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、氷冷下、ジシクロヘキシルカルボジイミド８．１７ｇ（３９．６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて１時間攪拌した。続いてピペリジン３．７ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール１９：１→９：１）にて精製し、目的物ＸＩＩＴｙｒ  ５．０３ｇ（６４％）を得た。【００９４】
＜ＸＩＩＩの合成＞
ＦＭＯＣ−Ｓｕｃ  ３３．７４ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下、２−（メチルアミノ）エタノール８．２５ｍＬ（１０５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン１：１→１：０）にて精製し、目的物ＸＩＩＩ  ２８．７２ｇ（９７％）を得た。【００９５】
＜ＸＩＶＴｙｒの合成＞
ＸＩＩＴｙｒ  １０．３８ｇ（１１．６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２６ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、ピリジン２．３６ｍＬ（２９．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物Ａを得た。
トリフォスゲン１．３８ｇ（４．６４ｍｍｏｌ）を１６ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下、ピリジン１．２ｍＬ（１４．６ｍｍｏｌ）及びＸＩＩＩ  ４．１４ｇ（１３．９２ｍｍｏｌ）の１６ｍＬジクロロメタン溶液を滴下した。反応混合物を室温にて１５分間攪拌した。本反応混合物を反応混合物Ａに０℃で加えた。反応混合物を室温にて１５分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール９４：６→９１：９）にて精製し、目的物ＸＩＶＴｙｒ  １２．０ｇ（８５％）を得た。【００９６】
＜ＩＶＴｙｒの合成＞
ＸＩＶＴｙｒ  ９．１４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）を７５ｍＬのピリジンに溶解し、ヒドラジン１水和物３．１１ｍＬ（６４．３ｍｍｏｌ）の希釈溶液９０ｍＬ（ピリジン：酢酸＝２：１）を加え、室温で５分間攪拌した。氷冷下、アセトン５３ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール１：０→１９：１）にて精製し、目的物ＩＶＴｙｒ  ６．２６ｇ（７５％）を得た。【００９７】
＜ＶＴｙｒの合成＞
ＩＶＴｙｒ  ５．７２ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３１ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．０１ｍＬ（５．８１ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．２５ｍＬ（５．６１ｍｍｏｌ）の５．１ｍＬジクロロメタン溶液を、５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃で９０分間攪拌した。続いてメタノール１．０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎ酢酸エチル０→１００％、続けて２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→１７：３）にて精製し、目的物ＶＴｙｒ  ５．７２ｇ（８５％）を得た。【００９８】
＜ＶＩＴｙｒの合成＞
ＸＩＶＴｙｒ  １２．０ｇ（９．８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン９８ｍＬに溶解し、氷冷下でトリフロロ酢酸４．９１ｍＬを加え、０℃で４５分間攪拌した。続いて、メタノール４９ｍＬ及びピリジン１１ｍＬを加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール９３：７→８６：１４）にて精製し、目的物ＶＩＴｙｒ  ８．２４ｇ（９２％）を得た。【００９９】
＜ＶＩＩＩＴｙｒの合成＞
ＶＩＴｙｒ  ８．２４ｇ（９．００ｍｍｏｌ）及びＶＴ  ６．７５ｇ（９．０６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４５ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、氷冷下テトラゾール３．１５ｇ（４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。続いてメタノール１．８ｍＬを加え、１５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を４５ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液１３．５ｍＬを加え、０℃で１時間攪拌し、ＶＩＩＴｙｒの消失が確認できるまで、３０分毎に、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液４．５ｍＬを加えた。氷冷下、アセトン２３ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＴｙｒ  １１．２５ｇ（８５％）を得た。【０１００】
＜ＩＸＴｙｒの合成＞
ＶＩＩＩＴｙｒ  １０．７２ｇ（７．３４ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２９ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン４５ｍｇ（０．４０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．４６ｍＬ（８．３５ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．８０ｍＬ（８．０７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン７．３ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を０℃で２時間攪拌した。続いてメタノール１．５ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジン，２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→８０：２０）にて精製し、目的物ＩＸＴｙｒ  ７．３６ｇ（６０％）を得た。【０１０１】
【化２５】
2009028345.tif 000026
【０１０２】
＜ＩＶＰｈｅの合成＞
ＩＩＩＣ  ３５．４ｇ（４０ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン９．５８ｍＬ（６０．０ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン８．９７ｍＬ（６０．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間攪拌した。反応混合物にトリエチルアミン塩酸塩４．１３ｇ（３０．０ｍｍｏｌ）、を加え、反応混合物Ａを得た。
Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド６．３３ｇ（５５．０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン９．０９ｍＬ（５５．０ｍＬ）をアセトニトリルに溶解し、氷冷下、フェニルアセチルクロリド６．６１ｍＬ（５０．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて２０分間攪拌した。続いてピペリジン１．１９ｍＬを加え、１０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジロロメタン−エタノール４９：１→９：１）にて精製し、目的物ＩＶＰｈｅ  ２９．４４ｇ（９４％）を得た。【０１０３】
＜ＶＩＰｈｅの合成＞
ＩＶＰｈｅ  １３．７３ｇ（１７．５８ｍｍｏｌ）を脱水ジオキサンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を９０ｍＬの脱水ジオキサンに溶解し、ジメチルアミノピリジン１７２ｍｇ、ジシクロヘキシルカルボジイミド７．２６ｇ（３５．２ｍｍｏｌ）及びレブリン酸３．６１ｍＬ（３５．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶液に３．５ｍＬのメタノールを加え、１時間攪拌した。不溶物をろ過し、濾液を減圧濃縮し、得られた残渣をジクロロメタン１７０ｍＬに溶解し、氷冷下、トリフロロ酢酸８．７９ｍＬを加え０℃で４５分間攪拌した。反応混合物にメタノール７０ｍＬ、ピリジン３８．７ｍＬを加え室温で４時間攪拌した。得られた反応混合物を、水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル１５０で懸濁し、不溶物であるＶＩＰｈｅを濾別により得た。目的物ＶＩＰｈｅ  ８．９２ｇ（８５％、約５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）ジシクロヘキシルカルボジウレア（ＤＣＵ）含有）を得た。【０１０４】
＜ＶＩＩＩ’Ｐｈｅの合成＞
ＶＩＰｈｅ  ６．２４ｇ（１０ｍｍｏｌ（ＤＣＵ込み））及びＶＡ  １０．７５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル／脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４０ｍＬの脱水アセトニトリル及び１０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下、テトラゾール３．５０ｇ（５０．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。続いてメタノール２．０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を５０ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝５：２溶液５１ｍＬを加え、０℃で２時間攪拌した。氷冷下、アセトン１０ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９５：５→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩ’ｐｈｅ  ８．９９ｇ（６２％）を得た。【０１０５】
＜ＩＸ’Ｐｈｅの合成＞
ＶＩＩＩ’ｐｈｅ  ８．６１ｇ（５．９３ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２４ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３６ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．２４ｍＬ（７．１２ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．４６ｍＬ（６．５２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン６．０ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を０℃で２時間攪拌した。続いてメタノール１．２ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎジクロロメタン；ヘキサン＝１：１−２％ピリジンｉｎジクロロメタン０→１００％、続けて２％ピリジン，２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→８０：２０）にて精製し、目的物ＩＸ’ｐｈｅ  ７．４５ｇ（７６％）を得た。【０１０６】
【化２６】
2009028345.tif 000027
【０１０７】
＜ＸＩＶの合成＞
Ｌ−α，βジアミノプロピオン酸塩化物７．０３ｇ（５０ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬの蒸留水に溶解し、炭酸水素ナトリウム４．２２ｇ（５２．５ｍｍｏｌ）を加え、５分間攪拌した後、ジメトキシエタン３００ｍＬ及びＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）スクシンイニド３５．４ｇ（１１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１週間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、蒸留水２５０ｍＬ、３６％塩酸及びジクロロメタン２５０ｍＬに懸濁し、ろ過により目的物ＸＩＶ  ２４．５７ｇ（９０％）を得た。【０１０８】
＜ＩＶＤｉａの合成＞
ＩＩＩＣ  ２２．１２ｇ（２５ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン４．３９ｍＬ（２７．５ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン５．６１ｍＬ（３７．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間攪拌した、反応混合物にトリエチルアミン塩酸塩６．２０ｇ（４５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物Ａを得た。
ＸＩＶ  １６．４６ｇ（３０．０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの脱水ジメチルホルムアミドに溶解し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール３．８１ｇ（３３．０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、ジシクロヘキシルカルボジイミド６．５０ｇ（３１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて１時間攪拌した。続いてピペリジン０．６ｍＬを加え、５分間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮した後、酢酸エチル１５０ｍＬ、蒸留水１５０ｍＬに懸濁し、ろ過により目的物ＩＶＤｉａを含む固体（粗ＩＶＤｉａ）２７．５１ｇを得た。【０１０９】
＜ＶＤｉａの合成＞
粗ＩＶＤｉａ  ２７．５１ｇを脱水ピリジンに懸濁し、減圧濃縮を３回行った。残渣を９０ｍＬの脱水ジクロロメタンに懸濁し、氷冷下ジメチルアミノピリジン１３１ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン４．５７ｍＬ（２７．７ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト５．８９ｍＬ（２５．３ｍｍｏｌ）の２３ｍＬジクロロメタン溶液を５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃で１時間攪拌した。続いてメタノール４．７ｍＬを加え、１５分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝１：１−２％ピリジン、２％エタノールｉｎ酢酸エチル１：０→０：１）にて精製し、目的物ＶＤｉａ  １６．１１ｇ（４６％  ２ｓｔｅｐ）を得た。【０１１０】
＜ＶＩＩＩＤｉａの合成＞
ＶＤｉａ  １６．０６ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）及びＶＩＧ  ８．７１ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン、脱水アセトニトリル混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３５ｍＬの脱水アセトニトリル及び３５ｍＬ脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下テトラゾール４．０４ｇ（５７．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。続いてメタノール２．３ｍＬを加え、３０分間攪拌した。溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。残渣を５８ｍＬのピリジンに溶解し、氷冷下、１Ｍヒドラジン１水和物、ピリジン：酢酸＝３：２溶液３４．６ｍＬを加え、０℃で１．５時間攪拌した。氷冷下、アセトン６ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→９：１）にて精製し、目的物ＶＩＩＩＤｉａ  １３．４６ｇ（６２％）を得た。【０１１１】
＜ＩＸＤｉａの合成＞
ＶＩＩＩＤｉａ  １２．９８ｇ（６．９０ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタン混合溶液に溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を４４ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン４２ｍｇ（０．３４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン２．１８ｍＬ（１３．２ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト２．７０ｍＬ（１２．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン１１ｍＬ希釈溶液を加えた。混合溶液を０℃で１２時間攪拌した後、室温で２時間攪拌した。続いてメタノール２．２ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎ酢酸エチル０→１００％、続けて２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎ酢酸エチル１：０→１：１）にて精製し、目的物ＩＸＤｉａ  １０．５２ｇ（７３％）を得た。【０１１２】
＜各化合物の構造確認＞
前記スキーム１〜スキーム１１の各化合物（本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドであるＩＸＳｅｒ、ＩＸＬｅｕ、ＩＸＰｈｅ、ＩＸＧｌｕ、ＩＸＡ−Ｌｙｓ、ＩＸＧ−Ｌｙｓ、ＩＸＴｈｅ、ＩＸＭｅｔ、ＩＸＴｙｒ、ＩＸ’Ｐｈｅ、ＩＸＤｉａを含む）の構造確認を以下のようにして行った。結果を図２−１〜図１２−１１に示す。
［１Ｈ−ＮＭＲ］
各サンプル約５ｍｇを重溶媒に溶解し、測定した。内部標準は重溶媒ピークを基準とした。
［３１Ｐ−ＮＭＲ］
外部標準としてＰＰｈ３を用い、−６．２ｐｐｍを基準として測定した。ＢＣＭにて測定を行った。【０１１３】
（実施例２：純度の確認）
実施例１で得られた本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドＩＸＳｅｒに対して精製を行い、精製後のＩＸＳｅｒと、未精製の比較対照のダイマーアミダイドＩＸ’Ｓｅｒとの純度比較を行った。【０１１４】
結果、図１３Ａ及び図１３Ｂに示す通り、未精製の比較対照のダイマーアミダイドＩＸ’Ｓｅｒ（ＨＰＬＣ  Ｃｈａｒｔ  ａ、図１３Ａ）に比べ、精製後の本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドＩＸＳｅｒ（ＨＰＬＣ  Ｃｈａｒｔ  ｂ、図１３Ｂ）は純度が高く、核酸合成に好適であることが確認できた。
なお、比較対照のダイマーアミダイドＩＸ’Ｓｅｒでは、ＩＸＳｅｒと同様の条件(ピリジン含有)でシリカゲルクロマト精製を行ったところ、ほとんどが分解され、回収率は３％以下であった。なお、逆相ＨＰＬＣでは４０％程度が回収できたが、核酸自動合成収率の改善はほとんどみられなかった。【０１１５】
（実施例３：核酸合成収率の確認）
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドＩＸＳｅｒ（精製後）を用いてＤＮＡを合成した場合のＤＮＡ合成収率と、比較対照のダイマーアミダイドＩＸ’Ｓｅｒ（未精製）を用いてＤＮＡを合成した場合のＤＮＡ合成収率を比較した。ＤＮＡ合成はジーンワールド社のＨ−８ＤＮＡ合成機を用い、カップリング、脱トリチル(合成収率確認)プログラムをそのまま利用した（図１４）。【０１１６】
結果、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す通り、比較対照のダイマーアミダイドＩＸ’Ｓｅｒ（未精製）を用いてＤＮＡを合成した場合の総収率は約４０％であり、一段階収率は約８３．３％であった（図１５Ａ）。これに対し、本発明の核酸合成用ダイマーアミダイドＩＸＳｅｒ（精製後）を用いてＤＮＡを合成した場合の総収率は約９６％であり、一段階収率は約９９．６％であった（図１５Ｂ）。
したがって、亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなる本発明の核酸合成用ダイマーアミダイド（精製可能）を用いることにより、リン酸トリエステル結合を介して連結してなる本発明の核酸合成用ダイマーアミダイド（精製不可能）を用いるよりも、結果的に高い核酸合成収率が得られることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明の核酸合成用ダイマーアミダイド、及び本発明の核酸合成方法によれば、例えば、置換基を有する修飾核酸（本発明の核酸の一態様）を、安定に、かつ効率的に得ることができる。得られた修飾核酸は、置換基を介して蛋白質等の標的物質との結合が可能であり、したがって、前記修飾核酸は、例えば、蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【図１０−１３】
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【図１０−１４】
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【図１０−１５】
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【図１０−１６】
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【図１０−１７】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年3月26日(2010.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二のヌクレオシド化合物が連結してなる核酸合成用ダイマーアミダイドであって、前記二のヌクレオシド化合物が亜リン酸トリエステル結合を介して連結してなり、かつ前記亜リン酸トリエステル結合におけるリン酸基の保護基を有してなり、
核酸合成時に、前記亜リン酸トリエステル結合が酸化によりリン酸トリエステル結合とされた後、前記リン酸トリエステル結合におけるリン酸基の保護基が、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ、及び、Ｎ−メチルピロリドンからなる群より選択される少なくともいずれかである非プロトン性溶媒中で、ＤＢＵ、ＤＢＮ、及び、テトラメチルグアニジンからなる群より選択される少なくともいずれかである嵩高い塩基により脱保護可能であり、
前記リン酸基の保護基が、シアノエチル基及びその誘導体、フルオレニルメチル基及びその誘導体、フェネチル基及びその誘導体、並びに、ニトロエチル基及びその誘導体からなる群より選択されるいずれかであり、
前記二のヌクレオシド化合物のうち少なくともいずれか一方のヌクレオシド化合物が、塩基の環外アミノ基に結合された保護基を更に有することを特徴とする核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項２】
保護基が、直接、塩基の環外アミノ基に結合してなる請求項１に記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項３】
保護基が、置換基を介して塩基の環外アミノ基に結合してなる請求項１から２のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項４】
保護基が結合される塩基が、アデニン、グアニン、及び、シトシンのいずれかである請求項１から３のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【請求項５】
下記構造式（１）〜（１１）のいずれかで表される請求項１から４のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイド。
【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の核酸合成用ダイマーアミダイドを用いることを特徴とする核酸合成方法。
【請求項７】
核酸合成用ダイマーアミダイドの縮合反応の後、前記核酸合成用ダイマーアミダイドの保護基の脱保護が行われる請求項６に記載の核酸合成方法。
【請求項８】
非プロトン性溶媒中で脱保護が行われる請求項７に記載の核酸合成方法。
【請求項９】
嵩高い塩基により脱保護が行われる請求項７から８のいずれかに記載の核酸合成方法。
【国際調査報告】
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2009028345.tif 000154
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