【手続補正書】
【提出日】平成16年7月7日(2004.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物であって、該第１の核酸配列が動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される、発現構築物。
【請求項２】
前記第２の核酸配列のポリペプチド産物が酵素である、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項３】
前記融合タンパク質が膜に局在化する、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項４】
前記膜がミトコンドリア膜である、請求項３に記載の発現構築物。
【請求項５】
転写を調節する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項６】
前記転写を調節するさらなる核酸配列が、前記プロモーターのリプレッサーをコードする、請求項５に記載の発現構築物。
【請求項７】
前記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項８】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ１である、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項９】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ２である、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１０】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ３である、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１１】
前記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、プロテアーゼにより切断可能なポリペプチドをコードする第２の核酸配列の少なくとも１つの産物との融合タンパク質として発現され、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該プロテアーゼを用いる切断により該融合タンパク質から分離可能である、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換え発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記真核生物細胞が、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターの少なくとも１つのアイソフォームを欠く、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が実質的に損傷している、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記発現構築物が、組換えウイルス発現構築物である、請求項１または請求項１のいずれかに記載の、組換え発現構築物。
【請求項２０】
組換えアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを生成する方法であって：
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養する工程であって、該第１の核酸配列が動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される工程を包含する、方法。
【請求項２１】
組換えアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを生成する方法であって：
請求項１９に記載の組換えウイルス発現構築物で感染された宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２０から２１のいずれかに記載の方法により生成される、ＡＮＴポリペプチド。
【請求項２３】
単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチド。
【請求項２４】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、組換えＡＮＴ１またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、組換えＡＮＴ２またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、組換えＡＮＴ３またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含む、単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項２８】
前記１つのさらなるポリペプチド配列が、酵素配列またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が膜に局在化する、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記膜がミトコンドリア膜である、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
プロテアーゼにより切断可能な少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含み、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該プロテアーゼを用いた切断により該融合タンパク質から分離可能である、単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項３２】
少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合した動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドである、第１のポリペプチドを含む、単離されたアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項３３】
前記１つのさらなるポリペプチド配列が、酵素配列またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
膜に局在化する、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記膜がミトコンドリア膜である、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
プロテアーゼにより切断可能な少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含み、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該プロテアーゼを用いた切断により該融合タンパク質から分離可能である、単離された組換え動物アデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項３７】
前記さらなるポリペプチド配列が、リガンドに対する親和性を有するポリペプチドである、請求項２７または請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
生物学的試料中のＡＮＴポリペプチドの存在を決定する方法であって：
ＡＮＴポリペプチドを含むと疑われる生物学的試料を、ＡＮＴリガンドと、該ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を検出し、そしてそこから、該生物学的試料におけるＡＮＴポリペプチドの存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ１である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ３である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＮＴリガンドが、６’ヒドロキシルで置換されたアトラクチロシドを含み、アトラクチロシド誘導体を形成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記アトラクチロシドが、６’ヒドロキシルで検出可能に置換され、検出可能なアトラクチロシド誘導体を形成する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、放射標識置換基を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記放射標識置換基が、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃおよび35Ｓからなる群から選択される
、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、蛍光置換基を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＡＮＴリガンドが、前記アトラクチロシド誘導体に複合体化したＥｕ3+原子をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、共有結合したビオチンを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルにおいてアミンまたはアミン含有官能基で置換され、アミン改変アトラクチロシド誘導体を形成する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルで置換され、カルボキシアトラクチロシド誘導体であるアトラクチロシド誘導体を形成するカルボキシアトラクチロシド分子である、請求項４３から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
生物学的試料からＡＮＴを単離する方法であって：
ＡＮＴポリペプチドを含むと疑われる生物学的試料を、ＡＮＴリガンドと、該ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該ＡＮＴポリペプチドを回収し、そしてそれによって生物学的試料からＡＮＴを単離する工程
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記ＡＮＴリガンドが、固相に共有結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＮＴリガンドが、固相に非共有結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法であって：
候補薬剤を、少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを発現する宿主細胞と、該薬剤の該組換えＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該薬剤の該組換えＡＮＴへの結合を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項５６】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記原核生物細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項５６に記載の方法。
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記真核生物細胞が、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記宿主細胞が、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターの少なくとも１つのアイソフォームを欠く、請求項５５から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする少なくとも１つの遺伝子の宿主細胞発現が実質的に損傷している、請求項５５から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法であって：
候補薬剤を、少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを含む生物学的試料と、該薬剤の該ＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該薬剤の該ＡＮＴポリペプチドへの結合を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項６４】
ＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定する方法であって：
組換えＡＮＴを含む生物学的試料を、候補薬剤の存在下で、検出可能なＡＮＴリガンドと接触させる工程；および
該薬剤の非存在下における該検出可能なＡＮＴリガンドの組換えＡＮＴへの結合を、該薬剤の存在下における該検出可能なＡＮＴリガンドの組換えＡＮＴへの結合と比較し、そしてそこからＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項６５】
６’ヒドロキシルで置換され、アトラクチロシド誘導体を形成するアトラクチロシドを含む、ＡＮＴリガンド。
【請求項６６】
前記アトラクチロシドが、６’ヒドロキシルで検出可能に置換され、検出可能なアトラクチロシド誘導体を形成する、請求項６５に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項６７】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、放射標識置換基を含む、請求項６６に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項６８】
前記放射標識置換基が、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃおよび35Ｓからなる群から選択される
、請求項６７に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項６９】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、蛍光置換基を含む、請求項６６に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７０】
前記アトラクチロシド誘導体に複合体化したＥｕ3+原子をさらに含む、請求項６９に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７１】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、共有結合したビオチンを含む、請求項６６に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７２】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルにおいてアミンまたはアミン含有官能基で置換され、アミン改変アトラクチロシド誘導体を形成する、請求項６５に記載のＡＮＴ誘導体。
【請求項７３】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルで置換され、カルボキシアトラクチロシド誘導体であるアトラクチロシド誘導体を形成するカルボキシアトラクチロシド分子である、請求項６５から９２のいずれかに記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７４】
以下の構造を有するＡＮＴリガンド：
【化１】
2004154139.tif 000001
またはその立体異性体またはそれらの薬学的に受容可能な塩：
ここで、
Ｒ1はヒドロキシル、ハロゲン、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ4または−ＮＨＲ4であり；
Ｒ2は水素または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5であり；
Ｒ3は−ＣＨ3または＝ＣＨ2であり；
Ｒ4は−Ｘ−アリール、−Ｘ−置換アリール、−Ｘ−アリールアルキル、−Ｘ−置換ア
リールアルキル、Ｘ−ヘテロアリール、または−Ｘ−ヘテロアリールアルキルであり、
ここで、Ｘは随意のアミドまたはアルキルアミドリンカー部分であり；そして
Ｒ5はアルキルである。
【請求項７５】
Ｒ1がヒドロキシルである、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７６】
Ｒ1が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ4である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７７】
Ｒ1が−ＮＨＲ4である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７８】
Ｒ2が水素である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７９】
Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８０】
Ｒ3が−ＣＨ3である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８１】
Ｒ3が＝ＣＨ2である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８２】
Ｒ4が−Ｘ−アリール、−Ｘ−置換アリール、−Ｘ−アリールアルキルまたは−Ｘ−置換
アリールアルキルである、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８３】
Ｒ5が−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2である、請求項７５に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８４】
少なくとも１つのＡＮＴポリペプチドに結合する候補薬剤の高スループットスクリーニングのためのアッセイプレートであって：
複数のウェルを有するアッセイプレートであって、該ウェルの各々が、少なくとも１つの固定化組換えＡＮＴポリペプチドまたはその改変体またはそのフラグメントをさらに含むアッセイプレートを備える、アッセイプレート。
【請求項８５】
請求項６５に記載のＡＮＴリガンドを含む、薬学的組成物。
【請求項８６】
請求項７４に記載のＡＮＴリガンドを含む、薬学的組成物。
【請求項８７】
請求項５５に従って同定されるＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項８８】
請求項６３に従って同定されるＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項８９】
請求項６４に従って同定されるＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項９０】
目的のポリペプチドをミトコンドリア膜に標的付ける方法であって：
宿主細胞において、融合タンパク質をコードする組換え発現構築物を発現する工程であって、該構築物が、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含み、該第１の核酸配列が、該第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで、該第２の核酸配列が、目的のポリペプチドをコードする工程
を包含する、方法。