(57)【要約】Ｃ−イオンＲＴ後における泌尿器の晩期有害反応の発症を予測するためのＤＮＡチップ及び予測方法を提供する。ＤＮＡチップは、ＤＮＡプローブを保持するための保持手段と、前記保持手段に保持された複数の遺伝子マーカーとを有する。予測方法は、遺伝子マーカーと、測定対象から調製した標識ＤＮＡとをハイブリダイズさせる第１ステップと、遺伝子マーカーとハイブリダイズさせた標識ＤＮＡの両対立遺伝子の塩基を特定する第２ステップと、特定した標識ＤＮＡの両対立遺伝子の塩基の組み合わせが特定の場合にリスク遺伝子型と判定し、当該リスク遺伝子型の数が３つ以上であれば放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し易いと予測し、２つ以下であれば放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し難いと予測する第３ステップとを含む。本発明によれば、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応となるか否かを予測することが可能となる。
2009008412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップであって、
合成されたＤＮＡプローブを保持するための保持手段と、
前記保持手段に保持された複数の遺伝子マーカーと、を有し、
前記複数の遺伝子マーカーは、
（ａ）rs2276015にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＧであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs2276015にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＡであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、
（ｂ）rs2742946にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs2742946にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、
（ｃ）rs1376264にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1376264にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、
（ｄ）rs1126758にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1126758にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、
（ｅ）rs2267437にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1126758にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＧであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、
を含んでいることを特徴とする放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップ。
【請求項２】
請求項１に記載の放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップを用いた放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法であって、
前記遺伝子マーカーと、測定対象から調製した、前記遺伝子マーカーとハイブリダイズするＤＮＡを標識物質で標識した標識ＤＮＡと、をハイブリダイズさせる第１ステップと、
前記遺伝子マーカーとハイブリダイズさせた標識ＤＮＡの両対立遺伝子の塩基を特定する第２ステップと、
前記第２ステップで特定した標識ＤＮＡの両対立遺伝子の塩基の組み合わせが、
rs2276015についてはＧＧである場合、
rs2742946についてはＴＴ又はＣＴである場合、
rs1376264についてはＣＣである場合、
rs1126758についてはＴＴ又はＣＴである場合、及び、
rs2267437についてはＧＧである場合
をリスク遺伝子型であると判定し、当該リスク遺伝子型の数が３つ以上である場合は放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し易いと予測し、当該リスク遺伝子型の数が２つ以下である場合は放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し難いと予測する第３ステップと、
を含むことを特徴とする放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップ、及びこれを用いた放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がん（ＰＣａ）は、先進国の男性のがんによる死亡の主要な原因のうちの一つである（非特許文献１）。
最近確立した照射量別療法による炭素イオン放射線治療（Ｃ−イオンＲＴ）は、局所の再発なしに、最小の有害反応で、医学的に満足できる無再発率をもたらすことが示された（非特許文献２〜５）。【０００３】
Ｃ−イオンＲＴのための適切な照射量を決めるために、フェーズI〜IIとフェーズIIにおける臨床研究が日本の放射線医学総合研究所で行われた（非特許文献４〜６）。これらの研究は、これが効果的で安全な治療法の選択肢になることを明らかにした。グレード３又はこれより大きい晩期有害反応も、直腸や泌尿生殖器系で観測されず、そして、グレード２の直腸の有害反応の発症率とグレード２の泌尿生殖器系の有害反応の発症率は、それぞれわずか１．０％と６．０％であった（非特許文献４）。【０００４】
これらの患者の中には元々放射線治療（ＲＴ）に感受性が高い患者が含まれていたかもしれないので、患者の遺伝要因を調査することは、個々の放射線感受性予測に重要な知見をもたらす。【０００５】
これは、たとえＲＴへの副作用がＣ−イオンＲＴを経験した少数の患者だけに起こったものであったとしても、Ｃ−イオンＲＴだけでなく、従来の光子ＲＴについても同様に副作用の危険性を予測することができる方法の開発を容易にすると考えられる。【０００６】
いくつかの報告によると、ＲＴで治療されたがん患者の正常組織の有害反応の多様性は、いくつかの異なった遺伝子多型の組み合わせによる効果から生じることが示されている（非特許文献７、８）。【０００７】
これまで、ＲＴ後のＰＣａ患者において有害反応が増加するリスクに関連している遺伝子マーカーについて報告している論文は僅かにある。
Cesarettiらは、ATMの配列変化が125Ｉ近接照射治療後の副作用の予測マーカーとなることを示した（非特許文献９）。また、Petersらは、TGFb1遺伝子の中の一塩基多型（以下、ＳＮＰ又はＳＮＰｓという。）が不利なクオリティ・オブ・ライフへの発展の予測となったことを証明した（非特許文献１０）。【０００８】
最近、Damarajuらは、大規模な候補遺伝子アプローチを行って２４個のＤＮＡ修復遺伝子とステロイド代謝遺伝子の中の４９個のＳＮＰｓを調べ、ＲＴ後におけるグレード２以上の晩期の膀胱又は直腸の有害反応のリスクが増加するLIG4遺伝子、ERCC2遺伝子、及びCYP2D6*4遺伝子の中のＳＮＰｓを特定した。しかし、ATM遺伝子やTGFb1遺伝子にはそのようなＳＮＰｓはなかった（非特許文献１１）。
これらの遺伝子マーカーの複合的な影響は、膀胱の放射線量、直腸の体積の３０％までの放射線量、及び患者の年齢などの臨床要因とともに報告されている（非特許文献１１）。【０００９】
また、Ｃ−イオンＲＴ後の泌尿生殖器の晩期有害反応を調べる、１１８個の候補遺伝子については非特許文献１２で報告されている。【００１０】
【非特許文献１】Jemal A, Seiegal R, Ward E, et al. “Cancer statistics, 2006.” CA Cancer J Clin, 2006, 56, p106-130.
【非特許文献２】Orecchia R, Zurlo A, Loasses A, et al. “Particle beam therapy (hadrontherapy): Basis for interest and clinical experience.” Eur J Cancer, 1998, 34, p459-468.
【非特許文献３】Nikoghosyan A, Schulz-Ertner D, Didinger B, et al. “Evaluation of therapeutic potential of heavy ion therapy for patients with locally advanced prostate cancer.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 58,p89-97.
【非特許文献４】Tsuji H, Yanagi T, Ishikawa H, et al. “Hypofractionated radiotherapy with carbon ion beams for prostate cancer.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2005, 63, p1153-1160.
【非特許文献５】Ishikawa H, Tsuji H, Kamada T, et al. “Risk factors of late rectal bleeding after carbon ion therapy for prostate cancer.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 66, p1084-1091.
【非特許文献６】Akakura K, Tsujii H, Morita S, et al. “Phase I/II clinical trials of carbon ion therapy for prostate cancer.” Prostate, 2004, 58, p252-258.
【非特許文献７】Andreassen CN, Alsner J, Overgaard J. “Dose variability in normal tissue reactions after radiotherapy have a genetic basis―Where and how to look for it?” Radiother Oncol, 2002, 64, p131-140.
【非特許文献８】Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, et al. “Prediction of normal tissue radiosensitivity from polymorphisms in candidategenes.” Radiother Oncol, 2003, 69, p127-135.
【非特許文献９】Cesaretti JA, Stock RG, Lehrer S, et al. “ATM sequence variants are predictive of adverse radiotherapy response among patients treated for prostate cancer.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2005, 61, p196-202.
【非特許文献１０】Peters CA, Stock RG, Cesaretti JA, et al. “TGFB1 Single nucleotide polymorphisms are associated with adverse quality of life in prostate cancer patients treated with radiotherapy.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2008, 70, p752-759.
【非特許文献１１】Damaraju S, Murray D, Dufour J, et al. “Association of DNA repair and steroid metabolism gene polymorphisms with clinical late toxicity in patients treated with conformal radiotherapy for prostate cancer.” Clin Cancer Res, 2006, 12, p2545-2554.
【非特許文献１２】Suga T, Ishikawa A, Kohda M, et al. “Haplotype-based analysis of genes associated with risk of adverse skin reactions after radiotherapy in breast cancer patients.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007, 69, p685-693.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
非特許文献１〜１２に報告された多型が全てのＰＣａ患者のＲＴの副作用のリスクに関連していたかどうかは不明である。
そのため、Ｃ−イオンＲＴ後における泌尿器の晩期有害反応の発症を予測する手段及び方法がなかった。【００１２】
本発明は前記した問題に鑑みてなされたものであり、Ｃ−イオンＲＴ後における泌尿器の晩期有害反応の発症を予測するためのＤＮＡチップ、及びこれを用いた放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記した課題を解決するため、Ｃ−イオンＲＴ後の泌尿生殖器の晩期有害反応について１１８個の候補遺伝子（Suga T, Ishikawa A, Kohda M, et al. “Haplotype-based analysis of genes associated with risk of adverse skin reactions after radiotherapy in breast cancer patients.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007, 69, p685-693.）上のＳＮＰｓと放射線感受性の関係について鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。【００１４】
［１］前記課題を解決した本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップは、合成されたＤＮＡプローブを保持するための保持手段と、前記保持手段に保持された複数の遺伝子マーカーと、を有し、前記複数の遺伝子マーカーは、（ａ）rs2276015にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＧであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs2276015にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＡであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、（ｂ）rs2742946にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs2742946にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、（ｃ）rs1376264にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1376264にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、（ｄ）rs1126758にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1126758にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、（ｅ）rs2267437にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1126758にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＧであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット、を含んでいることを特徴としている。【００１５】
［２］また、本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法は、前記［１］に記載の放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップを用いた放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法であって、前記遺伝子マーカーと、測定対象から調製した、前記遺伝子マーカーとハイブリダイズするＤＮＡを標識物質で標識した標識ＤＮＡと、をハイブリダイズさせる第１ステップと、前記遺伝子マーカーとハイブリダイズさせた標識ＤＮＡの両対立遺伝子の塩基を特定する第２ステップと、前記第２ステップで特定した標識ＤＮＡの両対立遺伝子の塩基の組み合わせが、rs2276015についてはＧＧである場合、rs2742946についてはＴＴ又はＣＴである場合、rs1376264についてはＣＣである場合、rs1126758についてはＴＴ又はＣＴである場合、及び、rs2267437についてはＧＧである場合をリスク遺伝子型であると判定し、当該リスク遺伝子型の数が３つ以上である場合は放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し易いと予測し、当該リスク遺伝子型の数が２つ以下である場合は放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し難いと予測する第３ステップと、を含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップによれば、５つのリスク遺伝子マーカーを含んでいるので、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応となり易いリスク遺伝子型を３つ以上有するか否か、的確且つ容易に判断することができる。そのため、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応となるか否かを予測することが可能となる。【００１７】
本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法によれば、本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップを用いているので、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応となり易いリスク遺伝子型を３つ以上有するか否か、的確且つ容易に判断することができる。そのため、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応となるか否かを予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実線で示すトレーニングセット（ｎ＝１３２人）と、破線で示すテストセット（ｎ＝６５人）における５つの遺伝子マーカー（SART1、ID3、EPDR1、PAH、及びXRCC6）の組み合わせにおけるＲＯＣ（receiver operating characteristic）を示すグラフである。
【図２】リスク遺伝子型数別の度数分布を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
なお、本発明におけるＤＮＡの取り扱いやその他の必要な操作について、発明を実施するための最良の形態および実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いることができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載および前記した標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。【００２０】
以下、本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップ、及びこれを用いた放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法について詳細に説明する。【００２１】
まず、本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測用ＤＮＡチップ（以下、単に「ＤＮＡチップ」という。）について説明する。
ここで、泌尿器の有害反応としては、例えば、排尿障害を挙げることができる。【００２２】
本発明に係るＤＮＡチップは、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症を予測するためのものである。放射線治療としては、炭素イオン放射線治療（Ｃ−イオンＲＴ）などの重粒子線放射線治療を挙げることができる。なお、放射線治療はこれに限定されるものではなく、例えば光子線や電子線を用いた放射線治療（以下、単に「光子ＲＴ」ということがある。）なども挙げることができる。
放射線治療の放射線量としては、例えば、６６．０ＧｙＥなどとすることができ、患者には必要に応じて複数回に分けて（例えば、５週間以内に２０画分）照射することができる。【００２３】
本発明に係るＤＮＡチップは、ＤＮＡプローブを保持するための保持手段と、この保持手段に保持された複数の遺伝子マーカーとを有している。
ここで、保持手段としては、ＤＮＡプローブを固定することができるものであればよく、例えばガラス基板やプラスチック基板などを挙げることができる。【００２４】
そして、複数の遺伝子マーカーは、以下の（ａ）〜（ｅ）に示されるＤＮＡプローブのセットを挙げることができる。なお、これらのＤＮＡプローブのセットをＤＮＡチップに保持させる場合、以下のrs SNP IDにコードされた塩基を含む２０〜８０basesのＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とするとよい。これらのＤＮＡプローブは、フォトリソグラフィーと固相反応化学技術を用いた所謂Affimetrix社型式、又は予め調製されたＤＮＡ断片を１０μＬから数百μＬの大きさで予め決められた位置に定量的にスポッターで打ち付ける所謂Stanford型式で保持手段に保持させることもできる。【００２５】
（ａ）rs2276015にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＧであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs2276015にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＡであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット
（ｂ）rs2742946にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs2742946にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット
（ｃ）rs1376264にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1376264にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット
（ｄ）rs1126758にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1126758にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＴであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット
（ｅ）rs2267437にコードされる一方の対立遺伝子の塩基がＣであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブと、rs1126758にコードされる他方の対立遺伝子の塩基がＧであるＤＮＡプローブ又はこれの相補鎖ＤＮＡプローブのセット【００２６】
ここで、rs2276015はSART1遺伝子（１１番染色体）の中又はその周辺領域に位置するＳＮＰであり、rs2742946はID3遺伝子（１番染色体）の中又はその周辺領域に位置するＳＮＰであり、rs1376264はEPRD1遺伝子（７番染色体）の中又はその周辺領域に位置するＳＮＰであり、rs1126758はPAH遺伝子（１２番染色体）の中又はその周辺領域に位置するＳＮＰであり、rs2267437はXRCC6遺伝子（２２番染色体）の中又はその周辺領域に位置するＳＮＰである。【００２７】
（ａ）〜（ｅ）に規定したＤＮＡプローブのセットは、放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症のリスクを予測するため全てを含んでいることを要する。（ａ）〜（ｅ）に規定したＤＮＡプローブのセットが４つ以下であると、統計学的に不確実性が大きくなるので好ましくない。【００２８】
（ａ）〜（ｅ）に規定したＤＮＡプローブのセットは、Ｃ−イオンＲＴ後の泌尿生殖器の晩期有害反応を発症した患者を１１８個の候補遺伝子（Suga T, Ishikawa A, Kohda M, et al. “Haplotype-based analysis of genes associated with risk of adverse skin reactions after radiotherapy in breast cancer patients.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007, 69, p685-693.）から探究したものである。１１８個の候補遺伝子は主に、インビトロにおける放射線感受性のある非常に可変的なヒト細胞株（Ishikawa K, Koyama-Saegusa K, Otsuka Y, et al. “Gene expression profile changes correlating with radioresistance in human cell lines.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 65, p234-245.、Ban S, Ishikawa K, Kawai S, et al. “Potential in a single cancer cell to produce heterogeneous morphology, radiosensitivity and gene expression.” J Radiat Res (Tokyo), 2005, 46, p43-50.）と、異なる放射線感受性を持つマウス株とについての本発明者らの以前の包括的な遺伝子発現解析を通して特定された（Iwakawa M, Noda S, Ohta T, et al. “Different radiation susceptibility among five strains of mice detected by a skin reaction.” J Radiat Res (Tokyo), 2003, 44, p7-13.、Ohta T, Iwakawa M, Oohira C, et al. “Fractionated irradiation augments inter-strain variation of skin reactions among three strains of mice.” J Radiat Res (Tokyo), 2004, 45, p515-519.、Iwakawa M, Noda S, Ohta T, et al. “Strain dependent differences in a histological study of CD44 and collagen fibers with an expression analysis of inflammatory response-related genes in irradiated murine lung.” J Radiat Res (Tokyo), 2004, 45, p423-433.、Noda S, Iwakawa M, Ohta T, et al. “Inter-strain variance in late phase of erythematous reaction or leg contracture after local irradiation among three strains of mice.” Cancer Detect Prev, 2005, 29, p376-382.）。【００２９】
候補遺伝子は、放射線感受性についての他の論文からも採用された（Sugaらの補足表を参照（Suga T, Ishikawa A, Kohda M, et al. “Haplotype-based analysis of genes associated with risk of adverse skin reactions after radiotherapy in breast cancer patients.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007, 69, p685-693.））。【００３０】
これらの候補遺伝子を対象とした評価は、例えば、Ｃ−イオンＲＴを受けたＰＣａ患者達を、ＳＮＰの遺伝子型と泌尿器の有害反応との関係、及び泌尿器の有害反応のリスクへの遺伝的変異の複合的な影響の確認を行うためのトレーニングセット（グループ）と、トレーニングセットで得られた結果を確認するためのテストセット（グループ）に分け、さらにこれらからコントロール（グレード０（泌尿器の晩期有害反応を発症せず））とケース（グレード１（泌尿器の晩期有害反応を軽く発症した）以上）のグループに分類して行うことができる。なお、トレーニングセットとテストセットの比率は例えば２：１などとすることができる。【００３１】
ＳＮＰの遺伝子型と泌尿器の有害反応発症との関係は、例えばフィッシャーの直接確率検定を使用することで評価することができる。フィッシャーの直接確率検定によれば有害反応発症者と未発症者の間で遺伝子型頻度に統計学的有意な関連があるかどうか検定することができる。なお、ＳＮＰの遺伝子型と泌尿器の有害反応発症との関係の評価は、フィッシャーの直接確率検定に限定されるものではない。例えば、サンプル数が十分に大きいときにはカイ二乗検定なども適用することができる。【００３２】
また、泌尿器の有害反応のリスクへの遺伝的変異の複合的な影響を確認し、ＳＮＰの遺伝子型と泌尿器の有害反応との関係を評価するために、ＡＵＣ−ＲＯＣ（ＲＯＣ曲線の下の面積）曲線解析を適用した。これによればマーカーの感度と偽陽性率を同時に評価できるので好ましい。なお、泌尿器の有害反応のリスクへの遺伝的変異の複合的な影響の確認は、ＡＵＣ−ＲＯＣ曲線解析に限定されるものではない。【００３３】
これまでに泌尿器の有害反応の予測方法は存在していないので、本発明においては、ＡＵＣ−ＲＯＣ曲線解析におけるＡＵＣが０．５より大きい値を示すＳＮＰ（又はＳＮＰの組み合わせ）、より好ましくは０．７７以上のＳＮＰ（又はＳＮＰの組み合わせ）を「リスク遺伝子型」と定義している。なお、ＡＵＣが０．５ということは、有害反応の発症予測率が５０％であるということを意味する。【００３４】
また、リスク遺伝子型の解析はどのような遺伝子タイピングシステムを用いてもよい。例えば、MassARRAYシステムを用いた遺伝子タイピングにより行うことができる。MassARRAYシステムを用いた遺伝子タイピングの手順は、例えば、Suga T, Ishikawa A, Kohda M, et al. “Haplotype-based analysis of genes associated with risk of adverse skin reactions after radiotherapy in breast cancer patients.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007, 69, p685-693.に記載されている。【００３５】
そして、統計的有意性と排尿障害のグレードの間の関係とＰＣａ患者のＳＮＰｓのタイピング結果は、例えば、フィッシャーの直接確率検定（Fisher’s exact test）で評価することができる。
また、統計的な分析は、例えば、ＳＮＰＡｌｙｚｅソフトウェア（バージョン６．０、 http://www.dynacom.co.jp/e/products/package/snpalyze/index.html; Dynacom、千葉県、日本国）を使用することで行うことができる。【００３６】
次に、本発明に係る放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症予測方法（以下、単に「発症予測方法」という。）について説明する。【００３７】
本発明に係る発症予測方法は、本発明に係るＤＮＡチップを用いた発症予測方法である。本発明に係る発症予測方法は、以下の第１ステップから第３ステップを含んでいる。【００３８】
第１ステップは、本発明に係るＤＮＡチップに保持された複数の遺伝子マーカー（即ち、前記した（ａ）〜（ｅ）に示したＤＮＡプローブのセット）と、測定対象から調製した、前記遺伝子マーカーとハイブリダイズするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）を標識物質で標識した標識ＤＮＡと、をハイブリダイズさせるステップである。【００３９】
測定対象から調製したＤＮＡとは、例えば、測定対象であるＰＣａ患者の全血や任意の細胞株等から採取したゲノムＤＮＡをいう。
例えば、全血からのゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、クラボウ社製のＮＡ３０００Ｓなどの自動核酸分離システムや、例えば、QIAamp DNA血液キット（Qiagen社、ヒルデン、ドイツ国）などの市販の抽出キットを用いることで容易に行うことができる。
ＤＮＡ濃度の測定もPicoGreen試薬などの市販の試薬を使用することで測定することができる。【００４０】
そして、遺伝子マーカーとハイブリダイズするＤＮＡは、例えば、任意に設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと、鋳型となる抽出したゲノムＤＮＡとを用いたＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などによって遺伝子マーカーと相補的な塩基配列を有するＤＮＡを選択的に増幅させることにより得ることができる。なお、かかるＤＮＡは、例えば１００〜２００bases程度とするとよい。遺伝子マーカーとのハイブリダイズを好適に行わせるためである。
なお、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは必要に応じて作製することができる。
標識物質としては、ＤＮＡマイクロアレイシステムにて検出が容易な蛍光色素を用いることもできる。蛍光色素は、例えば、Ｃｙ３やＣｙ５などの従来公知のものを用いることができる。また、例えば、標識物質としては放射性物質も用いることができる。さらに、例えば、ビオチン（biotin）を使って可視的に検出することもできる。【００４１】
このようにすると遺伝子マーカーとハイブリダイズする標識ＤＮＡを作製することができる。
かかる標識ＤＮＡは、前記したように遺伝子マーカーと相補的な塩基配列を有するため、遺伝子マーカーとハイブリダイズさせることができる。
遺伝子マーカーと標識ＤＮＡとのハイブリダイズは、これらの塩基の長さ（個数）やＡＴＧＣの存在比率などによって変動するため適宜設定するのが好ましい。例えば、これらの塩基の長さが１００〜２００basesの場合、１Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液中で４２〜６０℃の条件でハイブリダイズさせることができる。【００４２】
もちろん、この第１ステップにはハイブリダイズしなかったＤＮＡやハイブリダイズの強度が十分でなかったＤＮＡを常法により洗浄する工程が含まれることはいうまでもない。例えば、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む溶液中で室温〜６０℃の条件で洗浄することができる。【００４３】
第２ステップは、遺伝子マーカーとハイブリダイズさせた標識ＤＮＡの遺伝子型を判定するステップである。例えば、ビオチンで標識しておけば可視的に判定することができる。また、蛍光色素で標識しておけば従来公知のＤＮＡアレイスキャナーによって測定することができる。【００４４】
第３ステップは、第２ステップで特定した標識ＤＮＡの両対立遺伝子の組み合わせがrs2276015についてはＧＧである場合、rs2742946についてはＴＴ又はＣＴである場合、rs1376264についてはＣＣである場合、rs1126758についてはＴＴ又はＣＴである場合、及び、rs2267437についてはＧＧである場合をリスク遺伝子型であると判定し、当該リスク遺伝子型を３つ以上持つ場合は放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し易いと予測し、当該リスク遺伝子型の数が２つ以下である場合は放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応が発症し難いと予測するステップである。
なお、リスク遺伝子型の組み合わせは、本発明者らの研究により明らかとなったものである。
【実施例】
【００４５】
１．方法と材料
この研究に含まれる１９７人の患者は、放射線医学総合研究所（千葉県、日本国）におけるＰＣａのためのＣ−イオンＲＴの臨床試験に参加者である。全ての患者と２２７人の健康なドナーは、この研究に参加するために書面によるインフォームド・コンセントを提供した。放射線医学総合研究所の倫理委員会はこの研究を承認した。全ての個人情報は、放射線医学総合研究所の重粒子線治療のための研究センター病院の医療情報課によって管理されている。【００４６】
はじめの患者のグループ（ｎ＝１３２人）は、２００２年１月から２００６年３月の間に参加した。２つめの患者のグループ（ｎ＝６５人）は２００６年３月から２００６年１２月の間に参加した。
対象は、トレーニングセットとテストセットの２つのセットに、およそ２：１の割合で分けられた。【００４７】
トレーニングセットでは、１０９人の対象（８２．６％）がグレード０の排尿障害と診断された。そして、２３人の対象（１７．４％）には、ＲＴの３カ月後に、グレード１の排尿障害があった。【００４８】
テストセットでは、５６人の対象（８６．２％）がグレード０の排尿障害があった。そして、９人の対象（１３．８％）には、グレード１かグレード２の排尿障害があった。【００４９】
患者の適格性、Ｃ−イオンＲＴとホルモンの処置を含む研究計画は、以前に詳細に説明されている（Tsuji H, Yanagi T, Ishikawa H, et al. “Hypofractionated radiotherapy with carbon ion beams for prostate cancer.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2005, 63, p1153-1160.、Ishikawa H, Tsuji H, Kamada T, et al. “Risk factors of late rectal bleeding after carbon ion therapy for prostate cancer.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 66, p1084-1091.）。【００５０】
患者の大部分がPhase IIの研究に登録されて６６．０ＧｙＥの放射線量を受けた。６６．０ＧｙＥの放射線量は、５週間以内に２０画分に分けて供給された。ホルモン療法を除いて、ＰＣａに関する前処置を患者は誰も受けていなかった。【００５１】
泌尿器の晩期有害反応（排尿障害）は、Late Effects of Normal Tissue-Subjective, Objective, Management, and Analysis scoring systemを使用して判定した（LENT-SOMA tables. Radiother Oncol, 1995, 35, p17-60.）。主に“subjective（主観的）”カテゴリーと“management（管理）”カテゴリーを重要視した。【００５２】
排尿障害のスコアリングは次の通りであった。グレード０は、ＲＴ前の状態と比較して主観的に認識ができない。グレード１は、α1−ブロッカーの時々の投与の有無に関わらず軽い（時折且つごく小さい）認識がある。グレード２は、α1−ブロッカーの定期的な投与で、穏やかな（断続的且つ許容できる）認識がある。遅発性の反応のためのスコアはＣ−イオンＲＴ後３ヶ月に観察された最も大きなグレードである。【００５３】
２．候補遺伝子及びＳＮＰｓ
放射線感受性における多型を含む候補遺伝子を選ぶための本発明者らの概念、候補遺伝子のリスト、及びMassARRAYシステム（Sequenom社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いた遺伝子タイピング手順は、以前詳述した（Suga T, Ishikawa A, Kohda M, et al. “Haplotype-based analysis of genes associated with risk of adverse skin reactions after radiotherapy in breast cancer patients.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007, 69, p685-693.）。
ＰＣａ患者に対するこの研究では、１１８の遺伝子座で４５０のＳＮＰｓが遺伝子解析にかけられた。
全血からのゲノムＤＮＡの抽出は、自動核酸分離システム（ＮＡ３０００Ｓ、クラボウ社、大阪府、日本国）かQIAamp DNA血液キット（Qiagen社、ヒルデン、ドイツ国）で行った。
ＤＮＡ濃度は、PicoGreen試薬を使用して測定した（Singer VL, Jones LJ, Yue ST, et al. “Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.” Anal Biochem, 1997, 249, p228-238.）。
遺伝子タイピングのために使用されるプライマー配列は、必要に応じて作製した。【００５４】
３．統計学的解析
各多型について対立遺伝子頻度と遺伝子型頻度を計算した。そして、ハーディー・ワインベルグ平衡は、健康なドナーと全ＰＣａ患者グループそれぞれでカイ二乗検定を使って推定した。【００５５】
排尿障害のグレードとＰＣａ患者のＳＮＰｓの各々の統計学的関連は、それぞれ両側フィッシャーの直接確率検定（two-tailed Fisher’s exact test）を使って推定した。
これらの統計的な分析は、ＳＮＰＡｌｙｚｅソフトウェア（バージョン６．０、 http://www.dynacom.co.jp/e/products/package/snpalyze/index.html; Dynacom、千葉県、日本国）を使用して実行した。【００５６】
排尿障害のリスクに関連している適切なＳＮＰマーカーを選択するために、トレーニングセットを使用してマーカーの検出感度と特異性をＡＵＣ−ＲＯＣ曲線分析（Hanley JA, McNeil BJ. “The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve.” Radiology, 1982, 143, p29-36.）を使って推定した。
ＡＵＣ−ＲＯＣ値に貢献するマーカーの選択手順は、以下の通りである：
（１）有意なＳＮＰｓをＫと仮定する。
（２）Ｋ指標変数ｘk（ｋ＝１，…，Ｋ）を定義する。
（３）ｘkが｛ｘ1，…，ｘk｝の中の平均ＡＵＣ−ＲＯＣが最大となるようにＰＳ1＝ｘkを設定する。
（４）ＰＳ1として選定される変数を除いて、ｘk（ｋ＝１、…、Ｋ１−１）を再定義する。
（５）ＰＳ1＋ｘkが｛ＰＳ1＋ｘ1，…，ＰＳ1＋ｘk-1｝の中の平均ＡＵＣ−ＲＯＣが最大となるようにＰＳ2＝ＰＳ1＋ｘkを設定する。
（６）ｘk（ｋ＝１，…，Ｋ−２）を再定義する…同じ方法で繰り返す。【００５７】
次に、排尿障害に対する感受性を予測するために選ばれたマーカーの能力は、テストセットを用いてＡＵＣ−ＲＯＣ曲線分析でさらに推定した。【００５８】
４．結果
１１８個の遺伝子座における合計４５０個のＳＮＰｓがＰＣａ患者の放射線感受性に変異を与える候補として選定され、さらなる遺伝子解析を行った。その結果、４５０個のＳＮＰｓのうち１２個は今回のＰＣａ患者グループにおいて多型ではなかった。さらに、２７個のＳＮＰｓは、対立遺伝子頻度が低かった（マイナーな対立遺伝子頻度（＜５％））ため、今回の関連研究から除外した。また、９個のＳＮＰｓは、健康な提供者のグループにおいてハーディー・ワインベルク平衡から外れていた（ｐ＜０．００１）ので分析しなかった。また、２９個のＳＮＰｓは遺伝子型がそれぞれの隣接するＳＮＰｓのものと同一であったので、さらなる分析から除外した。
従って、１０９個の遺伝子座の３７３個のＳＮＰｓをさらに分析した。
これらのＳＮＰｓの位置的特性を表１に示す。【００５９】
【表１】
2009008412.tif 000003
【００６０】
表１中の略語：ＳＮＰは一塩基多型（single nucleotide polymorphism）、ＵＴＲは非翻訳領域（untranslated region）、ｃＳＮＰは非同義置換ＳＮＰ（nonsynonymous SNP）、ｓＳＮＰは同義置換ＳＮＰ（synonymous SNP）、ｉＳＮＰはイントロンＳＮＰ（intron SNP）を示す。【００６１】
トレーニングセットにおけるケースの患者（グレード１以上）とコントロールの患者（グレード０）の臨床的特徴を表２に示す。【００６２】
【表２】
2009008412.tif 000004
【００６３】
表２中の略語：ＲＴは放射線治療（radiotherapy）、ＳＤは標準偏差（standard deviation）、ＧｙＥは放射線量（Gray equivalent）を示す。
排尿障害をもつ患者の分布は、グレード０の患者が１０９人、グレード１の患者が２３人であった。
また、括弧内のデータはパーセンテージである。
＊は、フィッシャーの直接確率検定で分析された２つのグループの間の統計的有意性を示す。
†は、対応のないｔ検定である。
‡は、数字を丸めたため、パーセンテージの合計が１００％にはならない。【００６４】
１４個の遺伝子座のＳＮＰｓは、対立遺伝子型又は遺伝子型（優性のモデルであるか劣性のモデル（表３））によって排尿障害と関連していた。【００６５】
【表３】
2009008412.tif 000005
【００６６】
表３中の略号：ＳＮＰは一塩基多型（single nucleotide polymorphism）、ＩＤは識別表示（identification）、Ｃｈｒは染色体（chromosome）、Ｍはメジャーアレル（major allele）、ｍはマイナーアレル（minor allele）、ＮＣは計算していない（計算を実行するにはサンプル数が不十分であることによる）ことを示す。また、ｐはｐ値（有意確率）、ＯＲはオッズ比、ＣＩは信頼区間を示す。
また、表３では、フィッシャーの直接確率検定で分析された２つのグループの間の統計的有意性を示している。【００６７】
タイピングデータの集計結果によると、表３に示すように、rs2276015 (SART1)のメジャーアレル（対立遺伝子）とマイナーアレルはそれぞれＧとＣであり、rs2742946 (ID3)のメジャーアレルとマイナーアレルはそれぞれＣとＴであり、rs1376264 (EPDR1)メジャーアレルとマイナーアレルはそれぞれＣとＴであり、rs1126758 (PAH)メジャーアレルとマイナーアレルはそれぞれＣとＴであり、rs2267437 (XRCC6)メジャーアレルとマイナーアレルはそれぞれＣとＧであることが分かった。【００６８】
排尿障害の発症のリスクが高い患者とリスクのない患者とを区別できるＳＮＰマーカーは、従前のＡＵＣ−ＲＯＣ曲線分析を使用した変数増減法によって分離した。そして、ＲＯＣ曲線の下の面積を最も増加させたマーカーを段階的に選択した。
この方法を用いて選択されたマーカーは、rs2276015（SART1）、rs2742946（ID3）、rs1376264（EPDR1）、rs1126758（PAH）とrs2267437（XRCC6）の多型であった。
ＡＵＣ−ＲＯＣ曲線は、これらの５つのマーカーを使用することで０．８６に達した（表４）。【００６９】
【表４】
2009008412.tif 000006
【００７０】
表４中の略号：ＳＮＰは一塩基多型（single nucleotide polymorphism）、ＡＵＣ−ＲＯＣはＲＯＣ曲線の下の面積（area under curve of receiver operating characteristic）を示す。【００７１】
統計学的手法を用いた結果によると、表３及び表４から、両対立遺伝子の組み合わせが、rs2276015 (SART1)についてはＧＧである場合、rs2742946 (ID3)についてはＴＴ及びＣＴである場合、rs1376264 (EPDR1)についてはＣＣである場合、rs1126758 (PAH)についてはＴＴ及びＣＴである場合、及びrs2267437 (XRCC6)についてはＧＧである場合にリスク遺伝子型と判定できることが分かった。【００７２】
排尿障害のリスクを予測するこれらの遺伝子マーカーの有効性をテストするために、これらの遺伝子マーカーをテストセットでさらに分析した。
表５は、テストセットにおける患者背景と患者の処置の詳細を示している。【００７３】
【表５】
2009008412.tif 000007
【００７４】
表５中の略号については表２と同じである。
排尿障害をもつ患者の分布は、グレード０の患者が５６人、グレード１の患者が５人、グレード２の患者が４人であった。
＊は、フィッシャーの直接確率検定で分析された２つのグループの間の統計的有意性を示す。
†は、対応のないｔ検定である。
‡は、数字を丸めたため、パーセンテージの合計が１００％にはならない。【００７５】
テストセットはグレード２の排尿障害に伴う４個の対象を含んでいた。統計的有意差は、特徴のいずれにおいてもケースの患者とコントロールの患者の間で観測されなかった５つの選択されたマーカーからなるモデルのＡＵＣ−ＲＯＣ曲線値は０．７７の値に達した。これらの５つのマーカーには排尿障害の増加するリスクとの有意な関係があったことを示している（図１）。なお、図１は、実線で示すトレーニングセット（ｎ＝１３２人）と、破線で示すテストセット（ｎ＝６５人）における５つの遺伝子マーカー（SART1、ID3、EPDR1、PAH、及びXRCC6）の組み合わせにおけるＲＯＣ（receiver operating characteristic）を示すグラフである。同図中横軸は、１−Specificity（特異度）を示し、縦軸はSensitivity（感度）を示す。【００７６】
また、リスク遺伝子型あたりの患者数を図２に示す。なお、図２は、リスク遺伝子型の度数分布を示すヒストグラムである。図２には、合計で１６５人の患者のグレード０の排尿障害（白いバー）と、３２人のグレード１以上の排尿障害（黒いバー）とが示されている。
排尿障害を伴う３２人の患者のうちの２９人（９０．６％）には、３つ以上のリスク遺伝子型があった。
しかしながら、排尿障害のない５２人の患者（３１．５％）にも、３つ以上のリスク遺伝子型があった。【００７７】
５．考察
本発明では、ＰＣａ患者のＣ−イオンＲＴ後に排尿障害を発症するというリスクを階層化するのに使用できる５つの新しい遺伝子マーカーを特定することができた。これらの遺伝子マーカーは、主に本発明者らが以前行った包括的な遺伝子発現解析（Suga T, Ishikawa A, Kohda M, et al. “Haplotype-based analysis of genes associated with risk of adverse skin reactions after radiotherapy in breast cancer patients.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007, 69, p685-693.、Ishikawa K, Koyama-Saegusa K, Otsuka Y, et al. “Gene expression profile changes correlating with radioresistance in human cell lines.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 65, p234-245.、Ban S, Ishikawa K, Kawai S, et al. “Potential in a single cancer cell to produce heterogeneous morphology, radiosensitivity and gene expression.” J Radiat Res (Tokyo), 2005, 46, p43-50.、Iwakawa M, Noda S, Ohta T, et al. “Different radiation susceptibility among five strains of mice detected by a skin reaction.” J Radiat Res (Tokyo), 2003, 44, p7-13.、Ohta T, Iwakawa M, Oohira C, et al. “Fractionated irradiation augments inter-strain variation of skin reactions among three strains of mice.” J Radiat Res (Tokyo), 2004, 45, p515-519.、Iwakawa M, Noda S, Ohta T, et al. “Strain dependent differences in a histological study of CD44 and collagen fibers with an expression analysis of inflammatory response-related genes in irradiated murine lung.” J Radiat Res (Tokyo), 2004, 45, p423-433.、Noda S, Iwakawa M, Ohta T, et al. “Inter-strain variance in late phase of erythematous reaction or leg contracture after local irradiation among three strains of mice.” Cancer Detect Prev, 2005, 29, p376-382.）に基づいて選択された１１８個の候補遺伝子の中の４５０個のＳＮＰｓから選択された。【００７８】
本発明では、高い識別力で、より良い検出感度とより良い特異性を得るためにＡＵＣ−ＲＯＣ曲線を最大化することを指標としてリスクアレルの数を加算することによって予測スコアを計算した。排尿障害に対する感受性を予測するために選択された遺伝子マーカーの能力は、ケースの患者とコントロールの患者のテストセットにより確認された。【００７９】
従って、これらの結果は、これらの複数の遺伝子座のこれらの遺伝的多型の組み合わせが、個人の複雑な放射線感受性を決定することを示唆している。
Andreassenらが複数のＳＮＰを用いて乳房の線維症のリスクの評価のための簡単な推定モデルを確立しているが（Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, et al. “Prediction of normal tissue radiosensitivity from polymorphisms in candidategenes.” Radiother Oncol, 2003, 69, p127-135.）、本発明者らは排尿障害のリスクに関する評価のパラメータとしてリスクアレルの総数を使用した。【００８０】
この研究に含まれる全てのＰＣａ患者は、同じ病院でＣ−イオンＲＴを受けている。排尿障害はＲＴ後の遅発性の正常組織有害反応として起こる可能性がある。また、排尿障害は複雑な多因子性の症候であるかもしれない。【００８１】
排尿障害は通常、慢性の尿道炎又は尿道狭窄症の結果として発症する。一つの病院から登録した一団の患者を分析することの１つの利点は、例えば、治療手順の差異や複数の機関における試験者の間の判定が異なる可能性などの非遺伝的なファクターが結果に関わらないことである（この考えは、本発明者らの以前の複数の機関からの乳がん患者の統計分析の間に起こったものである（Iwakawa M, Noda S, Yamada S, et al. “Analysis of non-genetic risk factors for adverse skin reactions to radiotherapy among 284 breast cancer patients.” Breast Cancer, 2006, 13, p300-307.）。）。本発明におけるサンプル数は少なかったが、これらの非遺伝的な臨床要因が統計学的に排尿障害発症に関わらなかったことを示した（表２及び表５参照）。【００８２】
最終的に選択されたＳＮＰｓは、SART1、ID3、EPDR1、PAH、及びXRCC6の遺伝子の中、又はこれらの遺伝子に隣接して存在していた。
これらのうちの３つ（SART1、ID3、及びXRCC6）は、核タンパク質をコードしている。【００８３】
SART1は、tri-snRNPのスプライシングの触媒として、また、腫瘍特異的免疫で機能する（Shichijo S, Nakao M, Imai Y, et al. “A gene encoding antigenic peptides of human squamous cell carcinoma recognized by cytotoxic T lymphocytes.” J Exp Med, 1998, 187, p277-288.、Kawamoto M, Shichijo S, Imai Y, et al. “Expression of the SART-1 tumor rejection antigen in breast cancer.” Int J Cancer, 1999, 80, p64-67.、Makarova OV, Makarov EM, Luhrmann R. “The 65 and 110kDa SR-related proteins of the U4/U6.U5 tri-snRNP are essential for the assembly of mature spliceosomes.” EMBO J, 2001, 20, p2553-2563.）。【００８４】
ID3（inhibitor of DNA binding3）は、ある基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス転写調節因子のＤＮＡ結合を抑制することによって細胞分化を負に調節する（Deed RW, Bianchi SM, Atherton GT, et al. “An immediate early human gene encodes an Id-like helix-loop-helix protein and is regulated by protein kinase C activation in diverse cell types.” Oncogene, 1993, 8, p599-607.）。【００８５】
XRCC6（X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6）はKU70としても知られていて、ＤＮＡヘリカーゼIIサブユニットとして機能し、ＤＮＡ修復、アポトーシス、及び薬剤耐性に関係している（Reeves WH, Sthoeger ZM. “Molecular cloning of cDNA encoding the p70 (Ku) lupus autoantigen.” J Biol Chem, 1989, 264, p5047-5052.、Chan JY, Lerman MI, Prabhakar BS, et al. “Cloning and characterization of a cDNA that encodes a 70-kDa novel human thyroid autoantigen.” J Biol Chem, 1989, 264, p3651-3654.、Tuteja N, Tuteja R, Ochem A, et al. “Human DNA helicase II: A novel DNA unwinding enzyme identified as the Ku autoantigen.” EMBO J, 1994, 13, p4991-5001.、Gu Y, Jin S, Gao Y, et al. “Ku70-deficient embryonic stem cells have increased ionizing radiosensitivity, defective DNA endbinding activity, and inability to support V(D)J recombination.” Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94, p8076-8081.）。【００８６】
EPDR1は、推定II型膜貫通カルシウム依存性細胞接着分子である（Nimmrich I, Erdmann S, Melchers U, et al. “The novel ependymin related gene UCC1 is highly expressed in colorectal tumor cells.” Cancer Lett, 2001, 165, p71-79.、Gregotio-King CC, McLeod JL, Collier FM, et al. “MERP1: a mammalian epenymin-related protein gene differentially expressed in hematopoietic cells.” Gene, 2002, 286, p249-257.）。【００８７】
PAH（phenylalanine hydroxylase）は、フェニルアラニンをチロシンに変換するサイトゾルタンパク質をコードしている（Woo SL, Lidsky AS, Guttler F, et al. “Cloned hu phenylalanine hydroxylase gene allows prenatal diagnosis and carrier detection of classical phenylketonuria.” Nature, 1983, 306, p151-155.）。【００８８】
現在のところ、XRCC6を除いて、放射線感受性と関連している遺伝子産物の機能はよく知られていない。また、本発明において特定されたＳＮＰマーカーが単に代理マーカーとして働いている可能性もある。【００８９】
しかしながら、この研究によって選択された遺伝子のうちの４つ（SART1、ID3、PAH、及びXRCC6）は、ヒト細胞株を用いたインビトロでの放射線感受性と関連した包括的遺伝子発現解析で特定されたものである（Ishikawa K, Koyama-Saegusa K, Otsuka Y, et al. “Gene expression profile changes correlating with radioresistance in human cell lines.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 65, p234-245.）。そして、これらの遺伝子の転写は、放射線抵抗性細胞株で大きくなり、比較的、放射線感受性である細胞株において下がる傾向があった。これらの遺伝子の転写活性における変化が個々の放射線感受性の違いの原因になることが強く示唆されている。【００９０】
ATM、TGFb1、LIG4、ERCC2、及びCYP2D6*4における遺伝的変異は、光子ＲＴで処置されるＰＣａ患者の泌尿器、膀胱、直腸、又は生殖器の有害反応発症のリスクに関係している（Cesaretti JA, Stock RG, Lehrer S, et al. “ATM sequence variants are predictive of adverse radiotherapy response among patients treated for prostate cancer.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2005, 61, p196-202.、Peters CA, Stock RG, Cesaretti JA, et al. “TGFB1 Single nucleotide polymorphisms are associated with adverse quality of life in prostate cancer patients treated with radiotherapy.” Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2008, 70, p752-759.、Damaraju S, Murray D, Dufour J, et al. “Association of DNA repair and steroid metabolism gene polymorphisms with clinical late toxicity in patients treated with conformal radiotherapy for prostate cancer.” Clin Cancer Res, 2006, 12, p2545-2554.）。
これらの遺伝子の中では、TGFb1の１つのＳＮＰとATMの５つのＳＮＰｓが対象に含まれていた。しかし、TGFb1のrs1800469(C-509T)は排尿障害のリスクと関係していなかった（ｐ＝０．６７）。
また、rs1800057、rs1801516、rs1801673、rs2234997、及びrs3218673の５つのATMのＳＮＰｓは、本発明においては多型ではなかった。【００９１】
さらに、今回の研究で特定された遺伝的差異が、副作用の発症が線エネルギー付与の質的な違いに起因するものかどうかを研究するため、従来の光子ＲＴ又は従来の陽子線治療を受けたＰＣａ患者でも見つかるかどうかを詳しく調べることは重要である。【００９２】
なお、図２に示すように、排尿障害はケースの９０％で予測することができたが、３つのリスク遺伝子型をカットオフ値として用いたとき、患者のおよそ３０％に偽陽性の結果が出た。しかし、偽陽性の結果（すなわちＲＴの３ヵ月後に排尿障害のない患者）をもつ患者の間で、６人の患者（１１．５％）は次の３ヶ月の間に排尿障害を発症していた。従って、３ヶ月で偽陽性の結果となっていても、将来、泌尿器の有害反応を発症する可能性がないとは言い切れない。
別の可能性はまた、リスク遺伝子型をコードする患者が現在の分析で検出されなかったリスク遺伝子型を持っている可能性がある。
本発明では１１８個の候補遺伝子から排尿障害を増加させるリスクに関連している５つの多型マーカーを選ぶことができたが、排尿障害に関連しているより多くの遺伝的多型がヒトゲノムに存在する可能性がある。
より多くの候補遺伝子を解析するためにゲノム規模での関連研究を行う大規模な研究が必要である。また、ＲＴを受けているＰＣａ患者のより大きな集団を調査することが重要である。【００９３】
６．結論
本発明では、Ｃ−イオンＲＴ後に排尿障害を発症するリスクを増加させるのに関連している新規なＳＮＰｓを特定して、５つのリスク遺伝子型を明らかにすることができた。より多くの患者がこれらの結果の正当性を立証するのに必要であるが、本発明者らの研究結果は複数の遺伝子座が泌尿器の有害反応発症リスクの要因となる、という仮説を支持するものである。
副作用発症のリスクが予測できれば、患者の副作用についての理解がより深まり、安全な治療が受けられ、治療後も高いクオリティ・オブ・ライフを保つことに貢献すると考えられる。
本発明の結果は、３つ以上のリスク遺伝子型をもっているＰＣａ患者が排尿障害の治療のための特定のケアを必要とすることを予測することができる。つまり、リスク遺伝子型であると結論付けられたrs2276015 (SART1)のＧＧ、rs2742946 (ID3)のＴＴ及びＣＴ、rs1376264 (EPDR1)のＣＣ、rs1126758 (PAH)のＴＴ及びＣＴ、rs2267437 (XRCC6)のＧＧのうちの３つ以上を測定対象が有するか否かを判定することのできるＤＮＡチップなどを開発することにより、前記した予測を的確且つ容易に行うことができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は、rs2276015 (SART1)のＧＧ、rs2742946 (ID3)のＴＴ及びＣＴ、rs1376264 (EPDR1)のＣＣ、rs1126758 (PAH)のＴＴ及びＣＴ、rs2267437 (XRCC6)のＧＧのうちの３つ以上を有するか否かを判定するためのＤＮＡチップとすることができ、当該ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析を行うことで放射線治療後における泌尿器の晩期有害反応の発症を予測することが可能となる。
【図１】
2009008412.tif 000008
【図２】
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【国際調査報告】
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