【手続補正書】
【提出日】平成16年4月1日(2004.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法。
【請求項２】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびピルビン酸を含有する反応系に、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）およびＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）を添加してＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を合成し、続けて、この反応系にシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）、酵母菌体およびシチジン５’−モノリン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成する、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃリアーゼ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼとして、細胞（形質転換体を含む）またはその処理物を使用する、請求項１記載の製造法。
【請求項４】
ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃリアーゼのそれぞれの活性を増強させた形質転換体とＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌体処理物を使用する、請求項１記載の製造法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法。
【請求項６】
ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンセターゼ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼとして、細胞（形質転換体を含む）またはその処理物を使用する、請求項１記載の製造法。
【請求項７】
ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃシンセターゼのそれぞれの活性を増強させた形質転換体とＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌体処理物を使用する、請求項１記載の製造法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
すなわち、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）、およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するものである。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
また、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するものである。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応経路を模式的に示すと、以下の（Ａ）ＮｅｕＡｃリアーゼを用いた方法と（Ｂ）ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いた方法である。なお、（Ｂ）の反応系に必須のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、培地中のグルコースから酵母並びに大腸菌の生体（代謝）反応により合成、供給されるので、反応系にホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を添加する必要はない。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
（１）酵素等の調製
上記（Ａ）及び（Ｂ）の反応系に添加するＮ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）とは、上記丸１のＧｌｃＮＡｃ ６−リン酸からＭａｎＮＡｃ ６−リン酸への変換反応を触媒する活性を有するものを意味し、上記（Ａ）の反応系に添加するＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）とは、上記丸２のＭａｎＮＡｃとピルビン酸を基質としてＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、上記（Ｂ）の反応系に添加するＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）とは、上記丸４のＭａＮＡｃとホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を基質としてＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、上記（Ａ）及び（Ｂ）の反応系に添加するＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）とは、上記丸３のＮｅｕＡｃとＣＴＰを基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味する。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
これらの酵素活性を有するものとしては、当該活性を有する細胞（形質転換体を含む）またはその処理物を例示でき、調製の簡便性などの点から、微生物由来のものを使用するのが好都合である。微生物由来のＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼは公知の酵素であり、常法により調製することができる。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、当該酵素活性を増強させるための手段として、該酵素遺伝子群（J.Bacteriol.,181,47-54,1999、J.Bacteriol.,181,4526-4532,1999、Nucleic Acids.Res.,13,8843-8852,1985、Agric.Biol.Chem.,50,2155-2158,1986、FEMS Microbiol.Lett.,75,161-166,1992、J.Biol.Chem.,271,15373-15380,1996、J.Biol.Chem.,264,14769-14774,1989、J.Bacteriol.,177,312-319,1995、Mol.Microbiol.,35,1120-1134,2000）をクローン化し、菌体内でこれを大量発現させた微生物種を用いる、いわゆる組換えＤＮＡ手法を用いるのが好適である。その際に、２つ以上の遺伝子を共発現させて得られる菌体またはその処理物を用いることもでき、特に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼのそれぞれの酵素活性を増強させた形質転換体、またはＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼのそれぞれの酵素活性を増強させた形質転換体の使用が好適であるが、これに限定されない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
（ＮｅｕＡｃリアーゼを用いた方法）
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ、ＣＭＰおよびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃリアーゼ、およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを反応液１ｍＬ当たりそれぞれ０．２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵母を１〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好ましくは１５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
また、上記反応においては、ＧｌｃＮＡｃおよびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼおよびＮｅｕＡｃリアーゼを添加し、５０℃以下、好ましくは１５〜４０℃で１〜５０時間程度反応させてＮｅｕＡｃを合成し、次いでＣＭＰ、酵母菌体およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加し、５〜５０時間程度反応させてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する２段階の反応を行うことでＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成収率を向上させることができる。なお、ＣＭＰはあらかじめＮｅｕＡｃ合成時に反応系に添加しておいてもかまわない。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
（ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いた方法）
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ及びＣＭＰを含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンセターゼ、およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを反応液１ｍＬ当たりそれぞれ０．２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵母を１〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好ましくは１５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
（５）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼをコードするｎｅｕＡ遺伝子のクローニング
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ株の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（ｎｅｕＡ）遺伝子を増幅した。
プライマー（Ｅ）：5’- TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA -3’
プライマー（Ｆ）：5’- AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC -3’


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（６）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの調製
プラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１０8個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
（７）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
上記（３）で構築したプラスミドｐＴｒｃＡＥを保持する大腸菌  Ｋ−１２株  ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８４７：平成１１年８月１８日  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にさせ、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が４×１０8個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で８．５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９、０００×ｇ、１０分）により２５ｍＬ培養液分の菌体５０ｍｇを回収し、これに５０ｍＭ  ＣＭＰ、１００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ  塩化マグネシウム、５０ｍＭ  グルコース、２５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬを添加し、２８℃で攪拌しながら反応を行った。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
反応開始２４時間後に乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社製）２５０ｍｇ、上記（６）で調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（３．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬ反応液）及び１Ｍ  塩化マグネシウム溶液  １００μＬを添加し、合計６２時間反応させた。なお、反応開始１４時間後に１１０ｍｇのピルビン酸ナトリウムを、２４、３８時間後に１１０ｍｇピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグルコースを、４８時間後に５５ｍｇピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグルコースをそれぞれ添加した。
反応液上清をＨＰＬＣにより分析したところ、２１．４ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが生成することが認められた。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（２）ｃｍｋ、ｎｅｕＡ遺伝子共発現プラスミドの構築
実施例１で得られたｐＴｒｃｓｉａＢＮＰプラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、ｎｅｕＡ遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて回収した。これを同じくＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで消化した上記比較例（１）のｐＴｒｃＣＭＫＡＢプラスミドとＴ４ライゲースを用いて連結した。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＳＢＣＫを単離した。ｐＴｒｃＳＢＣＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎｅｕＡ遺伝子及び大腸菌のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｎｅｕＢ１を単離した。ｐＴｒｃｎｅｕＢ１は、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ切断部位にＣ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９０５：平成１４年６月２５日  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）；なお、平成１４年１１月２２日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４８に変更）。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
（３）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
上記（２）で調製したプラスミドｐＴｒｃＮＥＮＢを保持する大腸菌ＭＣ１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の２５ｍｌ培養液分の菌体５０ｍｇに５０ｍＭ  ＣＭＰ、１００ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、３０ｍＭ  塩化マグネシウム、２００ｍＭ  グルコース、１００ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレン、４％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社製）、並びに実施例１の（６）で調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（１．７ｕｎｉｔｓ／ｍＬ反応液）を含有する１７５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬを添加し、２８℃で攪拌しながら７２時間反応を行った。なお、反応開始１４、２４、３８、４８、６２時間後に１８０ｍｇグルコースをそれぞれ添加した。
反応液上清をＨＰＬＣにより分析したところ、２５．６ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ生成が認められた。