(57)【要約】  本発明は、１−ケストースとニストースとの共存下で、ニストースを選択的に分解することができるβ−フラクトフラノシダーゼを提供することを目的とする。本発明によれば、ニストースに対する親和性が、１−ケストースに対する親和性よりも高いことを特徴とするβ−フラクトフラノシダーゼが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニストースに対する親和性が、１−ケストースに対する親和性よりも高いことを特徴とするβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項２】
ニストースに対する親和性が、１−ケストースに対する親和性の約２倍以上である、請求項１に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項３】
ニストースのＫｍ値が１−ケストースのＫｍ値の約２分の１以下である、請求項１または２に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項４】
オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、ビソチラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、パナエオロス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群から選択される属に属する微生物由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項５】
微生物が、オフィオボラス・グラミニス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ビソチラミス・ファルバ（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｆｕｌｖａ）、またはタラロマイセス・アシウテンシス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ａｓｓｉｕｔｅｎｓｉｓ）である、請求項４に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項６】
微生物が、オフィオボラス・グラミニス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）である、請求項４に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項７】
微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１の受託番号のもと寄託された菌株である、請求項４に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項８】
微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９２の受託番号のもと寄託された菌株である、請求項４に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項９】
微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９３の受託番号のもと寄託された菌株である、請求項４に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項１０】
微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９４の受託番号のもと寄託された菌株である、請求項４に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項１１】
微生物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９５の受託番号のもと寄託された菌株である、請求項４に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項１２】
Ｎ末端アミノ酸配列が、配列番号：１のアミノ酸配列である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
【請求項１３】
下記の理化学的性質を有する、請求項１に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ。
（１）作用
β２→１グリコシド結合に作用し、加水分解を行う。
（２）基質特異性
ニストースと１−ケストースに作用するが、１−ケストースと比較してニストースに選択的に作用する。
（３）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約７２ｋＤ。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、６５℃付近。
（５）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応で、ｐＨ６．０付近。
（６）ニストース分解活性の比活性
約６９．５Ｕ／ｍｇ（１Ｕ：１分間当たり１μＭのフラクトースを遊離する活性）
（７）基質親和性（Ｋｍ値）
ニストースのＫｍ値が約２．４ｍＭであり、１−ケストースのＫｍ値が約１７．５ｍＭである。
【請求項１４】
１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液と請求項１〜１３のいずれか一項に記載のβ−フラクトフラノシダーゼとを接触させる工程を含んでなり、接触後の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率が、接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率を超えることを特徴とする、１−ケストース溶液の製造方法。
【請求項１５】
接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率が約７倍以下であり、接触後の溶液における該重量比率が約１０倍以上である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１の受託番号のもと寄託された菌株。
【請求項１７】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９２の受託番号のもと寄託された菌株。
【請求項１８】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９３の受託番号のもと寄託された菌株。
【請求項１９】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９４の受託番号のもと寄託された菌株。
【請求項２０】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９５の受託番号のもと寄託された菌株。
【請求項２１】
１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液と、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の菌株、チエラビア・テレストリス  ＩＦＯ  ９７３２（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＩＦＯ  ９７３２）、またはパナエオロス・レテルギア  ＩＦＯ  ３１８６７（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｒｅｔｉｒｕｇｉｓ  ＩＦＯ  ３１８６７）を培養して得られた培養液とを接触させる工程を含んでなり、接触後の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率が、接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率を超えることを特徴とする、１−ケストース溶液の製造方法。
【請求項２２】
接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率が約７倍以下であり、接触後の溶液における該重量比率が約１０倍以上である、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１−ケストースと比較してニストースを選択的に分解するβ−フラクトフラノシダーゼおよび該β−フラクトフラノシダーゼの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラクトオリゴ糖は、スクロースに１個以上のフルクトースが連鎖的に付加したオリゴ糖類であり、その結合様式は、スクロースのフラクトース部分における１位の炭素に、付加するフルクトースの２位の炭素がβ型で結合し（β２→１結合）、これが繰り返されるというものである。スクロースに１個のフルクトース残基が付加されたものを１−ケストース、２個のフルクトース残基が付加されたものをニストース、３個のフラクトース残基が付加されたものをフラクトシルニストースとそれぞれ命名されている。フラクトオリゴ糖は難う蝕性や、ビフィズス菌増殖促進作用、コレステロールなどの脂質の代謝改善作用、免疫調節作用など様々な生理機能を有することが明らかになっており、機能性食品素材として産業上極めて有用である。【０００３】
近年、微生物由来のフラクトース転移活性を有する酵素を利用してスクロースからフラクトオリゴ糖を大量に製造する技術が確立され、フラクトオリゴ糖は工業的に生産されている。この工業的生産に使用されているカビ由来のフラクトース転移活性を有する酵素は、転移活性が高いこと、および異性体の生成が少ないことが特徴であるが、重合度２〜６のオリゴ糖類の混合物しか製造できない。このため、フラクトオリゴ糖は、液体あるいは非結晶性の粉末として利用されており、これらは混合物であるため、結晶性の食品材料と比較すると、吸湿性が高く加工適性が悪いなどの問題点があった。【０００４】
一方で、フラクトオリゴ糖の1成分である１−ケストースは結晶化できるため、フラクトオリゴ糖の生理機能を保持したまま優れた物性および加工適性を有している。本性質により、結晶１−ケストースは、キャンディ、錠菓、チョコレート等に利用することができる。結晶１−ケストースは、例えば、フラクトース転移活性を有する酵素をショ糖に作用させて１−ケストースに変換し、クロマト分離法により１−ケストースを純度８０％以上に分画した後、これを結晶化原液として純度が９５％以上の結晶１−ケストースを得る方法により得ることができる。（国際公開ＷＯ９７／２１７１８号公報）。この方法においては、結晶化原液に単糖、二糖が存在しても、１−ケストースの結晶化に大きな影響を及ぼさないが、ニストースが存在すると、１−ケストースの結晶化が阻害される。【０００５】
これまでに、１−ケストース含量が多く、ニストース含量の少ない結晶化原液を得るための方法としては、フラクトース転移活性を有する酵素として、ショ糖から１−ケストースへの変換率が高く、かつニストースの生成が低い性質のものを使用する方法が知られていた。しかしながら、結晶化工程において結晶が析出するに従い、結晶化原液中には１−ケストースが少なくなるため、相対的にニストースの比率が高まり、ある時点までニストースの比率が高まると結晶化が不可能となってしまう。このような１−ケストースとニストースとが共存する水溶液において、ニストースのみを除去してニストースに対する１−ケストースの比率を高めることができれば、再び１−ケストースの結晶化に供することが可能となる。ニストース比率を低減させる方法としては、例えば、この水溶液に対しクロマト分離処理を行うことが知られているが、この方法は廃液が発生し、また１−ケストースとニストースを完全に分離させることが難しいため効率が悪い。また、ニストース比率の少ない結晶化原液を得る方法として、１−ケストースとニストースとが共存する水溶液に、ニストースを選択的に分解する酵素を作用させ、ニストース含量を低減させる方法が知られている。これまでに、ニストースを分解する酵素として、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ由来のβ−フラクトフラノシダーゼ（Applied and Environmental Microbiology 71(7):2005,p3475-3482）やＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来のβ−フラクトフラノシダーゼ（Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 57(11)：1993,p1811-1815）が知られている。しかし、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ由来のβ−フラクトフラノシダーゼはニストースと同程度に１−ケストースも分解してしまい、また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来のβ−フラクトフラノシダーゼはニストースよりも１−ケストースを４倍速く分解してしまう。【０００６】
よって、１−ケストースとニストースとの共存下でニストースを選択的に分解することができる酵素についてはこれまで知られていなかった。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、数多くの菌株に対し、ニストースを選択的に分解しうる酵素を分泌する菌株のスクリーニングを行ったところ、１−ケストースと比較してニストースを選択的に分解するβ−フラクトフラノシダーゼを見出した（実施例１および２）。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は、１−ケストースとニストースとの共存下で、ニストースを選択的に分解することができるβ−フラクトフラノシダーゼを提供することを目的とする。
【０００９】
本発明によれば、ニストースに対する親和性が、１−ケストースに対する親和性よりも高いことを特徴とするβ−フラクトフラノシダーゼが提供される（以下、「本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼ」ということがある）。
【００１０】
本発明によれば、１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液と本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼとを接触させる工程を含んでなり、接触後の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率が、接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率を超えることを特徴とする、１−ケストース溶液の製造方法が提供される（以下、「本発明による製造方法」ということがある）。
【００１１】
本発明によれば、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１の受託番号のもと寄託された菌株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９２の受託番号のもと寄託された菌株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９３の受託番号のもと寄託された菌株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９４の受託番号のもと寄託された菌株、およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９５の受託番号のもと寄託された菌株が提供される（以下、「本発明による新菌株」ということがある）。
【００１２】
本発明によれば、１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液と、本発明による新菌株、チエラビア・テレストリス  ＩＦＯ  ９７３２（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＩＦＯ  ９７３２）、またはパナエオロス・レテルギア  ＩＦＯ  ３１８６７（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｒｅｔｉｒｕｇｉｓ）を培養して得られた培養液とを接触させる工程を含んでなり、接触後の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率が、接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率を超えることを特徴とする、１−ケストース溶液の製造方法が提供される。
【００１３】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを用いることにより、１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液において、ニストースに対する１−ケストースの重量比率を高めることが可能となり、ニストースに対する１−ケストースの重量比率の高まった該溶液は、１−ケストースの結晶化原液として使用することができる点で有利である。
【００１４】
また、結晶化原液として使用される該溶液は、ニストース含量が低減されることから、結晶化後の残液を再利用しやすくなり、結晶１−ケストースを効率的に製造することができる点で有利である。
【発明の具体的説明】
【００１５】
［β−フラクトフラノシダーゼ］
β−フラクトフラノシダーゼは、（１）ニストースを分解して1-ケストースを生成し、さらに（２）1−ケストースを分解してショ糖を生成する、作用を有する酵素であるが、本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼは、１−ケストースとニストースとの共存下で、ニストースを選択的に分解することができること、すなわち、（１）の反応が（２）の反応よりも反応速度が速いこと、を特徴とする。
【００１６】
ここで、（１）の反応が（２）の反応よりも反応速度が速いか否かは、ニストースに対する親和性と１−ケストースに対する親和性とを比較することにより判定することができる。
【００１７】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼは、ニストースに対する親和性が、１−ケストースに対する親和性よりも高ければよいが、好ましくは、ニストースに対する親和性が、１−ケストースに対する親和性の約２倍以上、より好ましくは、約５倍以上である。
【００１８】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼのニストースまたは１−ケストースに対する親和性については、ミカエリス定数（Ｋｍ値）を指標として判定することができる。
【００１９】
Ｋｍ値は、例えば、公知の方法に従って、各基質の分解活性を測定し、得られた結果をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットし、算出することができる。
【００２０】
ここで、親和性が高くなるということは、Ｋｍ値が小さくなるということを意味する。例えば親和性が５倍になるということは、Ｋｍ値が５分の１になることを意味する。
【００２１】
例えば、結晶１−ケストースの製造を容易にするため、１−ケストースとニストースとが共存する状況で、ニストースを選択的に分解（除去）して、ニストースに対する１−ケストースの比率を効率的に高めるためには、ニストースに対する親和性が、１−ケストースに対する親和性の約２倍以上、より好ましくは約５倍以上、すなわち、ニストースのＫｍ値が、１−ケストースのＫｍ値の約２分の１以下、より好ましくは約５分の１以下であることが好ましい。
【００２２】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼであるか否かは、合成培地または天然培地で菌株を培養し、その培養上清のニストース分解活性および1−ケストース分解活性を調べることにより判定することができる。例えば、選抜された菌株を培養し得られた酵素を、１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液に添加して酵素反応を行い、ニストースを選択的に高く分解するものかどうかを確認することができる。
【００２３】
ここで、培養上清中の酵素は、菌体のみ、もしくは除菌液のいずれも粗酵素液として採取することができ、また、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。菌体から酵素を抽出して、その抽出液を粗酵素液として用いることもできる。それらを濃縮、精製して用いることもできる。
【００２４】
得られた酵素についてＫｍ値を算出し、ニストースのＫｍ値が１−ケストースのＫｍ値より小さい、好ましくは、約２分の１以下である場合に、本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼであると判定することができる。
【００２５】
本発明によるβ−フラクトフラノシターゼの由来としては、例えば、オフィオボラス（Ophiobolus）属、ビソチラミス（Byssochlamys）属、タラロマイセス（Talaromyces）属、チエラビア（Thielavia）属、パナエオロス（ Panaeolus ）属、ペニシリウム（Penicillium）属、バチルス（Bacillus）属等の属に属する微生物（カビ）が挙げられるが、好ましくは、オフィオボラス・グラミニス（Ophiobolus graminis）、ビソチラミス・  ファルバ（Byssochlamys fulva）、タラロマイセス・アシウテンシス（Talaromyces assiutensis）であり、特に好ましくは、オフィオボラス・グラミニス（Ophiobolus graminis）である。
【００２６】
オフィオボラス・グラミニス（Ophiobolus graminis）由来のβ−フラクトフラノシダーゼとしては、２００６年６月３０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９４６より移管）の菌株由来のβ−フラクトフラノシダーゼが挙げられる。
【００２７】
ビソチラミス・ファルバ（Byssochlamys fulva）由来のβ−フラクトフラノシダーゼとしては、２００６年６月３０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９４７より移管）の菌株由来のβ−フラクトフラノシダーゼが挙げられる。
【００２８】
タラロマイセス・アシウテンシス（Talaromyces assiutensis）由来のβ−フラクトフラノシダーゼとしては、２００６年６月３０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９４８より移管）の菌株由来のβ−フラクトフラノシダーゼが挙げられる。
【００２９】
バチルス（Bacillus）属由来のβ−フラクトフラノシダーゼとしては、２００７年８月２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９４の菌株由来のβ−フラクトフラノシダーゼが挙げられる。
【００３０】
ペニシリウム（Penicillium）属由来のβ−フラクトフラノシダーゼとしては、２００７年８月２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９５の菌株由来のβ−フラクトフラノシダーゼが挙げられる。
【００３１】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼは、それを生産する菌株を培養することによって生産できる。
【００３２】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを生産することができる菌株は、常法に従って、培地、培養条件などを適宜選択することにより培養することができる。
【００３３】
培地としては、本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを生産することができる菌株が同化し得る炭素源、資化し得る窒素源、無機塩類、各種ビタミン、グルタミン酸またはアスパラギンなどの各種アミノ酸、ヌクレオチドなどの微量栄養素、抗生物質などの選抜薬剤を添加することができる。また、本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを生産することができる菌株の発育を助け、本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することもできる。
【００３４】
培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養法としては、好気条件での振とう培養法、通気攪拌培養法または深部好気培養法により行うことができる。
培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２６℃〜３７℃付近で生育する。
【００３５】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼの生産は、培地、培養条件、または使用した宿主により異なるが、何れの培養法においても通常１〜１０日間でその蓄積が最高に達する。本発明のβ−フラクトフラノシダーゼの量が、最高になった時に培養を停止し、該培養液を「本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼ」として用いることができる。
【００３６】
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は、使用する菌株および外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。
【００３７】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼは、上述した菌株の培養除菌液から、硫安沈殿、疎水クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ等を用いて精製することができる。
【００３８】
具体例として、オフィオボラス・グラミニス（Ophiobolus graminis）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）の培養除菌液から精製されたβ−フラクトフラノシダーゼについて、以下に説明する。
【００３９】
（１）作用
酵素の存在下、（ｉ）ニストースのβ２→１グリコシド結合に作用して加水分解を行い、1-ケストースを生成し、さらに（ｉｉ）1−ケストースのβ２→１グリコシド結合に作用して加水分解を行い、ショ糖を生成する酵素である。
（２）基質特異性
ニストースおよび１−ケストースに作用するが、１−ケストースと比較してニストースに選択的に作用する。
【００４０】
（３）分子量
本酵素の分子量は、ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で測定した結果、約７２ｋＤであった。
【００４１】
（４）至適温度
ＤＮＳ法を用いて、反応温度を変えて酵素活性を測定した結果、本酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で、６５℃付近であった。
【００４２】
（５）至適ｐＨ
ＤＮＳ法において、緩衝液を、各種ｐＨを有する緩衝液に変更して酵素活性を測定した結果、本酵素の至適ｐＨは、４０℃、３０分間反応で、ｐＨ６．０付近であった。
【００４３】
（６）ニストース分解活性の比活性
ＤＮＳ法を用いて得られた本発明の酵素活性と本酵素を含んでなる溶液のタンパク質含量とから、本酵素の比活性を算出した結果、約６９．５Ｕ／ｍｇ（１Ｕ：１分間当たり１μＭのフラクトースを遊離する活性）であった。
【００４４】
（７）基質親和性（Ｋｍ値）
Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットより（条件：反応温度を４０℃、ニストースの濃度を０．１６−２．５０％）、親和性（Ｋｍ値）を算出した結果、ニストースが約２．４ｍＭであり、１−ケストースが約１７．５ｍＭであった。
【００４５】
（８）Ｎ末端アミノ酸配列
Ｎ末端アミノ酸配列の解析を行った結果、Ｎ末端のアミノ酸配列は配列番号：１で表される配列であった。
【００４６】
［１−ケストース高含量溶液の製造方法］
本発明による製造方法によれば、１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液と本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼとを接触させる工程を含んでなり、接触後の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率が、接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率を超えることを特徴とする、１−ケストース溶液の製造方法が提供される。
【００４７】
ここで「１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液」は、接触前の溶液を意味し、使用される溶媒としては、水、有機溶媒（例えば、エタノール等）等が挙げられるが、好ましくは、水である。
【００４８】
「１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液」におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率は、特に限定されるものではなく、例えば、約７倍以下とすることができるが、好ましくは、約５倍以下である。
【００４９】
ここで「１−ケストース溶液」は、接触後の溶液を意味し、ニストースに対する１−ケストースの重量比率が、接触前の溶液におけるニストースに対する１−ケストースの重量比率を超える溶液であれば特に限定されるものではないが、１−ケストースの結晶化が容易となる点で、例えば、約１０倍以上、好ましくは、約１４倍以上とすることができる。
【００５０】
本発明による製造方法の好ましい態様としては、接触前の溶液中のニストースに対する１−ケストースの重量比率が約７倍以下であっても、接触後の溶液中の該重量比率が約１０倍以上となるような製造方法である。
【００５１】
本発明による製造方法においては、本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを生産することができる菌株を培養して得られた培養液を、１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液に接触させる「本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼ」として用いることができる。この場合、本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを生産することができる菌株の培養液に１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液を添加して培養を行ってもよい。
【００５２】
本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを生産することができる菌株としては、例えば、本発明による新菌株、チエラビア・テレストリア  ＩＦＯ  ９７３２（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＩＦＯ  ９７３２）、パナエオロス・レテルギア  ＩＦＯ  ３１８６７（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｒｅｔｉｒｕｇｉｓ  ＩＦＯ  ３１８６７）等が挙げられる。本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼを生産することができる菌株の培養は、前述の条件に従って行うことができる。
【００５３】
本発明による製造方法は、１−ケストースとニストースとを含んでなる溶液と本発明によるβ−フラクトフラノシダーゼとを接触させる工程の後に、さらに、不純物除去処理、脱色脱塩処理、クロマト分離処理等を行う工程を含んでいてもよい。
【００５４】
本発明による製造方法により得られた１−ケストース高含量溶液を濃縮し、１−ケストースの結晶化に供すことができる。
【実施例】
【００５５】
実施例１：β−フラクトフラノシダーゼ生産菌株のスクリーニング
まず、３１７種のカビ（公知の菌株および本発明による新菌株）を、アビセル５．０重量％、酵母エキス２．０重量％、ペプトン０．１重量％、塩化カルシウム０．０３重量％、塩化マグネシウム０．０３重量％、ｐＨ６．８の培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。７日間培養の後、得られた培養液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより菌体を除き、得られた培養上清液を粗酵素液とした。得られた粗酵素液  １０ｍｌを、２０重量％  ニストース水溶液  ７５ｍｌ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）  １５ｍｌと混合し、３７℃で１６時間反応を行った。得られた反応液をＨＰＬＣ分析し糖組成を調べ、主要な分解物として１−ケストースを生成した３１菌株を選抜した。【００５６】
次に、１次選抜された菌株を対象に、１−ケストースおよびニストースの共存下において、ニストースを選択的に分解する酵素活性を有する菌株を選抜するために、１−ケストースとニストースが７：１の重量比率で含まれた糖液（Ｂｒｉｘ７５）２０ｍｌ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）  １５ｍｌ、上記粗酵素液１０ｍｌ、脱イオン水  ５０ｍｌを混合し、３７℃で１６時間反応を行った。得られた反応液の糖組成をＨＰＬＣ分析し糖組成を調べ、反応後にニストースに対する１−ケストースの重量比率が上がっている菌株、すなわち１−ケストースよりもニストースをより多く分解している菌株を選抜した。選抜の基準としては、ニストースに対しての１−ケストースの反応後の重量比率が１０倍以上に高まった菌株を選抜することした。【００５７】
その結果、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ ｇｒａｍｉｍｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）（反応後の水溶液中のニストースに対する１−ケストースの重量比率  １４．７倍）、  Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｆｕｌｖａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９２）  （同  １４．２倍）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ａｓｓｉｕｔｅｎｓｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９３）（同  １２．３倍）、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（ＩＦＯ  ９７３２（財団法人  発酵研究所より入手））（同  １１．４倍）、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｒｅｔｉｒｕｇｉｓ（ＩＦＯ  ３１８６７（財団法人  発酵研究所より入手））（同  １０．１倍）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９４）  （同  ２０．２倍）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９５）（同  １２．５倍）が、１−ケストースと比較してニストースを選択的に高く分解するβ−フラクトシルフラノシターゼを生産する菌株として選抜された。【００５８】
従って、上記の菌株が産生するβ−フラクトフラノシダーゼを１−ケストースおよびニストースが共存する水溶液に反応させることにより、ニストースに対する１−ケストースの重量比率を高めることができることが明らかとなった。【００５９】
実施例２：Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓの生産するβ−フラクトフラノシダーゼの精製
Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）を、実施例１で使用した培地に植菌し、３７℃で振とう培養した。７日間培養の後、得られた培養液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより菌体を除き、培養上清液を得た。本上清液を粗精製β−フラクトフラノシダーゼ液とした。この、粗精製β−フラクトフラノシダーゼ液１７０ｍｌに対して硫酸アンモニウムを６０％飽和となるように加え、４℃で６０分間攪拌した後、１５０００ｒｐｍで遠心し、沈澱を除去し上清を得た。得られた上清に対して硫酸アンモニウムを８０％飽和となるように加え、４℃で６０分間攪拌した後、１５０００ｒｐｍで遠心し、沈澱を得た。この沈澱を２０ｍｌの蒸留水に溶解し、最終濃度１Ｍ硫酸アンモニウムの溶液になるように調整した後、あらかじめ１Ｍの硫酸アンモニウム液で平衡化させた、Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰカラム（ゲル体積５ｍｌ、Amersham Pharmacia Biotech社製）に流速２ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。ニストース分解活性を有するβ−フラクトフラノシダーゼは、カラムに吸着しなかったため、非吸着画分５０ｍｌを回収した。得られた非吸着画分をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社）を用いて、脱塩濃縮を行い、１ｍｌの溶液を回収した。得られた溶液を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）になるように調整した後、あらかじめ５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させた、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ゲル体積１ｍｌ、Amersham Pharmacia Biotech社製）に流速１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。【００６０】
次に、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）から５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中、１Ｍ  ＮａＣｌに対して、直線勾配溶出法により流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、ＮａＣｌ濃度が約０．１０−０．１７Ｍのときに得られた画分にニストース分解活性が強く認められた。そこで、この画分６ｍｌを分取し、得られた活性画分全量をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社）を用いて、脱塩濃縮を行い、１ｍｌの溶液を回収した。得られた溶液を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）になるように調整した後、あらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させた、Ｍｏｎｏ  Ｓカラム（ゲル体積１ｍｌ、Amersham Pharmacia Biotech社製）に流速１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。【００６１】
次に、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中、１Ｍ  ＮａＣｌに対して、直線勾配溶出法により流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、ＮａＣｌ濃度が約０．２０−０．３０Ｍのときに得られた画分にニストース分解活性が強く認められた。そこで、この活性画分４ｍｌを分取した。更に得られた活性画分全量をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社）を用いて、脱塩濃縮を行い、１ｍｌの溶液を回収した。得られた溶液を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）になるように調整した後、再びＭｏｎｏ  Ｓカラムによる分画を行い、４ｍｌの溶液を回収した。得られた活性画分全量をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社）を用いて、脱塩濃縮を行い、１ｍｌの溶液を回収した。得られた溶液を精製β−フラクトフラノシダーゼ溶液とした。【００６２】
この精製β−フラクトフラノシダーゼ溶液について、テフコ社のシステムを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。すなわち、電気泳動槽（Ｎｏ．０３−１０１）、電源（Ｍｏｄｅｌ：３５４０）、ゲル１０％（０１−０７２）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーキット（０６−０３０１）を用いた。泳動条件は、１８ｍＡ／９０分であった。泳動後のタンパク質の検出には、クマジーブリリアントブルーＲ２５０（ナカライテスク社製）を用いて行った。マーカーとしての標準タンパク質は、バイオ・ラッド社のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量標準タンパク質・Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（１６１−０３７４）を用いた。【００６３】
その結果、この精製β−フラクトフラノシダーゼ液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて７２ｋＤの位置に単一なバンドを示した。【００６４】
実施例３：Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）の培養液から精製されたβ−フラクトフラノシダーゼのＮ末アミノ酸配列
実施例２で得られたβ−フラクトフラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定するため、精製β−フラクトフラノシダーゼ溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ（テフコ社製）を行った後、ＰＶＤＦ膜へエレクトロブロッティングし、クマジーブリリアントブルーＲ２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、脱色し、水で洗浄し、風乾した。ここから分子量約７２  ｋＤａのタンパク質がブロットされた部分を切り出した。切り出したＰＶＤＦ膜を還元アルキル化した。つまり、チューブにてＰＤＶＦ膜を５００μＬの還元アルキル化用緩衝液（０．５Ｍトリス、７Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ２）に浸けた後、ＤＴＴ１ｍｇを加えた。チューブ中の空気を窒素で置換し、室温で５時間保持し、タンパク質の還元を行った。還元反応の後、モノヨード酢酸２．５ｍｇを加え、遮光中、室温で３０分間、アルキル化反応を行った。還元アルキル化したＰＤＶＦ膜をプロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（PE Applied Biosystems社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列の解析を行った。得られた配列は以下の通りであった。【００６５】
Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ
（配列番号：１）
本配列について、ホモロジー検索プログラムＢＬＡＳＴによりサーチを行った。【００６６】
その結果、本配列は新規であることが確認された。なお、本配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  Ａｆ２９３由来の１−スクローススクローストランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）と７５％の類似性を示し、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ由来のフラクトシルトランスフェラーゼと７０％の類似性を示した。【００６７】
実施例４：Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）の培養液から精製されたβ−フラクトフラノシダーゼの比活性
実施例２で得られたβ−フラクトフラノシダーゼの比活性を測定するために、精製β−フラクトフラノシダーゼ溶液のタンパク質含量とニストース分解活性を測定した。【００６８】
タンパク質含量は、２８０ｎｍの吸光度を測定し、モル吸光度係数を１３３８５５として吸光度からタンパク質含量を算定した。その結果、精製β−フラクトフラノシダーゼ溶液の２８０ｎｍの吸光度は０．６９３であり、算定されたタンパク質含量は０．３６３ｍｇ／ｍｌであった。【００６９】
ニストース分解活性は、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にニストースを１０重量％になるように溶解した溶液１００μｌに精製β−フラクトフラノシダーゼ３６．３ｐｇを添加し、６５℃で３０分間反応した後にニストースから遊離されるフラクトースをＤＮＳ試薬で定量することで測定した。活性値は、１分間当たり１μＭのフラクトースを遊離する活性を１Ｕと定義して算出した。その結果、精製β−フラクトフラノシダーゼ溶液の活性は２５．２Ｕ／ｍｌであった。【００７０】
以上の結果から、本β−フラクトフラノシダーゼの比活性は、２５．２Ｕ／ｍｌ÷０．３６３ｍｇ／ｍｌ＝６９．５Ｕ／ｍｇと算出された。【００７１】
実施例５：Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）の培養液から精製されたβ−フラクトフラノシダーゼの至適ｐＨ
実施例２で得られたβ−フラクトフラノシダーゼの至適ｐＨを測定するために、試験例４に記載したニストース分解活性の測定法のうち、反応温度を４０℃に、緩衝液を酢酸緩衝液（ｐＨ４、５、６）、リン酸緩衝液（ｐＨ６、７）、トリス緩衝液（ｐＨ８、９）に変更してニストース分解活性を測定した。反応時間は試験例４と同様に３０分間とした。【００７２】
その結果、ｐＨ６．０が本β−フラクトフラノシダーゼの至適ｐＨであることが明らかとなった。【００７３】
実施例６：Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）の培養液から精製されたβ−フラクトフラノシダーゼの至適温度
実施例２で得られたβ−フラクトフラノシダーゼの至適温度を測定するために、試験例４に記載したニストース分解活性の測定法のうち、反応温度を３０−７５℃に変更してニストース分解活性を測定した。反応時間および反応ｐＨは試験例４と同様に３０分間およびｐＨ６．０とした。【００７４】
その結果、６５℃付近が本β−フラクトフラノシダーゼの至適温度であることが明らかとなった。【００７５】
実施例７：Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９１）の培養液から精製されたβ−フラクトフラノシダーゼのニストースおよび１−ケストースへの親和性
試験例２で得られたβ−フラクトフラノシダーゼのニストースへの親和性を測定するために、試験例４に記載したニストース分解活性の測定法のうち、反応温度を４０℃、ニストースの濃度を０．１６−２．５０％に変更してニストース分解活性を測定した。得られた結果をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットし、親和性（Ｋｍ）を算出した。その結果、本β−フラクトフラノシダーゼのニストースへの親和性を示すＫｍ値は２．４ｍＭであった。更に本β−フラクトフラノシダーゼの１−ケストースへの親和性を測定するために、上記の方法のうち基質をニストースから１−ケストースに変更し、Ｋｍ値を算出した。その結果、本β−フラクトフラノシダーゼの１−ケストースへのＫｍは１７．５ｍＭであった。【００７６】
これらの結果から、本β−フラクトフラノシダーゼのニストースへの親和性は、１−ケストースへの親和性と比較して約７．３倍高いことが明らかとなり、この性質が、本β−フラノシダーゼが１−ケストースと比較してニストースを選択性高く分解する事の重要な要因であると考えられた。
【配列表】
2008047674000001.app
【国際調査報告】
2008047674.tif 000002
2008047674.tif 000003
2008047674.tif 000004
2008047674.tif 000005
2008047674.tif 000006