(57)【要約】  本発明は、従来公知のアグロバクテリウム法に比べて、植物の形質転換効率を上昇させる方法を提供することを課題とする。  本発明は、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程を含むことを特徴の１つとする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法。
【請求項２】
共存培地中に３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸以外のオーキシン類は含まない、請求項１の方法。
【請求項３】
共存培地中の３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸の濃度が０．５−３．０ｍｇ／ｌである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸のみを共存培地中のオーキシン類として使用する場合と比較して、植物の形質転換効率が少なくとも１．３倍上昇する、請求項１−３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
植物組織が単子葉植物の組織由来である、請求項１−４のいずれか１項の方法。
【請求項６】
植物組織が熱処理および／または遠心処理されている、請求項１−５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
共存培地が、硝酸銀および／または硫酸銅をさらに含む、請求項１−６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
以下の工程：
（ｉ）アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織をオーキシンを含む培地で培養し、形質転換体を薬剤選抜する選抜工程；および、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選抜された組織を選抜薬剤を含む再分化培地で培養し再分化させる再分化工程；
を含む、形質転換植物の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年２月２８日に出願された日本国特許出願２００７−４９１６１に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換効率を上昇させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
主要穀類であるトウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが知られている。しかし、これらの物理的遺伝子導入方法は多コピーの遺伝子が導入されてしまう、遺伝子の挿入がインタクトな形でなされない、形質転換植物に奇形や不稔が多くみられるなどの問題を有する。【０００４】
アグロバクテリウム細菌を用いた遺伝子導入法は、双子葉植物の形質転換法として普遍的に用いられている。アグロバクテリウム属細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には寄生しないとされている（非特許文献１）が、アグロバクテリウムにより単子葉植物を形質転換する試みがなされている。【０００５】
Ｇｒｉｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．はアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡの中にトウモロコシストリークウイルス（Ｍａｉｚｅ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ）のＤＮＡを挿入したものをトウモロコシ生長点に接種したところ、トウモロコシストリークウイルスの感染を確認したことを報告している。トウモロコシストリークウイルスのＤＮＡを接種しただけでは、このような感染症状が認められないことから、上の観察はアグロバクテリウムがトウモロコシにＤＮＡを導入することができることを示すものと解釈している（非特許文献２）。しかし、ウイルスは核ゲノムに組み込まれなくても増殖する可能性があるので、この結果はＴ−ＤＮＡが核に組み込まれたものを示すものではない。Ｇｒｉｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．はさらに感染効率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種したときが最も高く（非特許文献３）、感染にはアグロバクテリウムのプラスミドのＶｉｒ  Ｃ遺伝子が必須であることを示した（非特許文献４）。【０００６】
Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．はトウモロコシの生長点に針で傷を付けた後、カナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持った強病原性アグロバクテリウムＥＨＡ１を接種し、処理後の生長点をカナマイシンで選抜したところ、抵抗性を示す植物を得た。この後代の種子が導入した遺伝子を持つことを確認するためサザン分析を行ったところ、一部の種子で導入遺伝子が確認された（非特許文献５）。このことは、アグロバクテリウム処理された生長点からカナマイシン選抜により得られた植物体には形質転換細胞と非形質転換細胞が混在していたことを示す（キメラ現象）。【０００７】
Ｍｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．は、アグロバクテリウムを用いてコムギの胚にカナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試みた。まず、胚を酵素で処理することにより、細胞壁に傷を付け、その後アグロバクテリウムを接種した。処理したカルスのうち極めて少数のカナマイシン抵抗性と思われるカルスが増殖したが、このカルスから植物体の再生はできなかった。また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認したところ、全ての抵抗性カルスで導入遺伝子の構造変異がみられた（非特許文献６）。【０００８】
Ｒａｉｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．はイネの胚盤に傷を付けた後、強病原性のアグロバクテリウムＡ２８１（ｐＴｉＢｏ５４２）をイネの８品種に処理したところ、日本晴、藤坂５号の２品種で腫瘍状の組織の増殖がみられた。さらに、Ｔ−ＤＮＡからホルモン合成遺伝子を除いたＴｉプラスミドにカナマイシン抵抗性遺伝子とＧＵＳ遺伝子を挿入したプラスミドを持つアグロバクテリウムをイネの胚に接種したところカナマイシン抵抗性カルスの増殖がみられた。この抵抗性カルスでは、ＧＵＳ遺伝子の発現が認められたが、形質転換植物を得ることはできなかった。これらのことから、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡがイネの細胞に導入されたと解釈している（非特許文献７）。【０００９】
このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科の作物でもアグロバクテリウムによる遺伝子導入が可能であることを示唆する研究報告がなされているが、何れも再現性に問題があるほか、導入した遺伝子の確認についても不完全で、説得できる結果が示されていなかった（非特許文献８）。【００１０】
Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．は２，４−Ｄ共存下で２日間培養したイネ未熟胚に付傷後、ジャガイモ懸濁培養細胞を含む培地中でｎｐｔ  ＩＩ遺伝子とＧＵＳ遺伝子を持ったアグロバクテリウムを接種した。処理した未熟胚をＧ４１８添加培地上で培養したところ、誘導されたカルスから再分化植物体が得られた。再分化植物体およびその後代の植物体でのＧＵＳ遺伝子の所在をサザン分析で確認したところ、再分化当代、後代いずれの植物体でも導入遺伝子の存在が認められたことを報告している（非特許文献９）。この結果は、アグロバクテリウムによるイネの形質転換を支持するものであるが、形質転換効率は１．６％と非常に低く、供試した未熟胚数２５０に対し、正常な生長を示した再生植物体は１個体にすぎなかった。イネの未熟胚を摘出するには多大な労力を要するため、このように低い形質転換効率では実用的なレベルにあるとは言い難い。【００１１】
近年、強病原性アグロバクテリウムの病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクターの利用により、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても、安定して、高効率で形質転換のなされることが報告された（非特許文献１０および１１）。これらの報告では、アグロバクテリウムによる形質転換は、安定して、高効率で形質転換がなされる他に、得られた形質転換植物に変異が少なく、導入された遺伝子はコピー数が少なく、かつインタクトな形のものが多いという利点をもつとしている。イネ、トウモロコシでの成功に続いて、主要な穀類であるコムギ（非特許文献１２）、オオムギ（非特許文献１３）およびソルガム（非特許文献１４）でのアグロバクテリウムによる形質転換の報告がなされた。【００１２】
Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）は、トウモロコシインブレッドを材料にアグロバクテリウムによる形質転換を行った。その後、引き続きアグロバクテリウムによるトウモロコシの形質転換の報告がなされている（非特許文献１５−２１）。アグロバクテリウムによるトウモロコシ形質転換の効率を改善する試みとしては、Ｎ６基本培地での形質転換細胞の選抜（非特許文献２０）、培地へのＡｇＮＯ3およびカルベニシリンの添加（非特許文献２０、２２）、共存培地へのシステインの添加（非特許文献２１）などがなされてきた。Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）（非特許文献２２）は共存培養後のトウモロコシ未熟胚をＡｇＮＯ3およびカルベニシリンを含む培地で選抜することによりトウモロコシの形質転換効率が向上することを報告した。【００１３】
このように培地組成や選抜マーカー遺伝子の改変により、アグロバクテリウムによるトウモロコシの形質転換においても効率の向上および適応品種の拡大がなされている。しかし、その効率はトウモロコシと同じ単子葉作物のイネに比べるとまだ低く、単離した新規な遺伝子の効果を調べる試験研究や新規なトウモロコシ品種を遺伝子組換えにより作出する場合など、さらに高い効率で形質転換のなされる方法の開発が望まれている。【００１４】
ダイカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸）は２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）と同様に植物ホルモンのオーキシンとして植物の組織培養に用いられている。トウモロコシの組織培養においてもダイカンバは使用されている。Ｄｕｎｃａｎらは４．５μＭの２，４−Ｄと１５μＭのダイカンバをそれぞれ含む培地でトウモロコシの未熟胚を培養し、２，４−Ｄに比べダイカンバを含む培地では再分化能を有するカルスの形成率が高まることを報告した（非特許文献２３）。しかし、近年報告されているアグロバクテリウムによるトウモロコシの形質転換ではそのほとんどが未熟胚の培養は２，４−Ｄを含む培地で行われている（非特許文献１５−２１、２４および２５）。Ｆｒａｍｅらは２，４−Ｄとダイカンバをそれぞれ含む培地でアグロバクテリウムによるトウモロコシの形質転換を行い、ダイカンバを含む培地の方が形質転換効率の高まることを報告した。しかし、Ｆｒａｍｅらの比較した培地は２，４−Ｄの濃度は６．７５μＭであるのに対し、ダイカンバの濃度は１５μＭと２倍以上異なり、さらに２，４−Ｄとダイカンバ以外にも組成の異なる点がある。そして、形質転換効率に差の生じたのはダイカンバを含む培地の硝酸銀の濃度が２，４−Ｄを含む培地に比べ高いことが原因であると考察しており、オーキシンの違いによる効果に関する記述はない（非特許文献２６）。【００１５】
以上のように、アグロバクテリウムによるトウモロコシの形質転換においてこれまでになされている方法は安定して形質転換植物が得られるものの、同じ単子葉作物のイネに比して形質転換効率は低く、さらに高い効率で形質転換体の得られる方法の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開２０００−３４２２５５
【特許文献２】特開２０００−３４２２５６
【特許文献３】特開２０００−２３６７５
【特許文献４】特開２０００−３４２２５３
【特許文献５】ＷＯ２００５／０１７１６９
【特許文献６】ＷＯ２００５／０１７１５２
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｃｌｅｅｎｅ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｌｅｙ，  Ｊ．  （１９７６）  Ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ｃｒｏｗｎ  ｇａｌｌ．    Ｂｏｔ．  Ｒｅｖ．  ４２：３８９−４６６．
【非特許文献２】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，  Ｎ．，  Ｈｏｒｎ，  Ｔ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｊ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｈｏｒｎ，  Ｂ．  （１９８７）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｍａｉｚｅ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｉｚｅ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：１７７−１７９．
【非特許文献３】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，  Ｎ．Ｈ．，  Ｒａｍｏｓ，  Ｃ．，  Ｈｅｉｎ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｈｏｒｎ，  Ｂ．  （１９８８）  Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｐｌａｎｔｓ  ａｒｅ  ｍｏｓｔ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  Ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍａｉｚｅ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ．  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１８５−１８９．
【非特許文献４】Ｇｒｉｍｓｌｅｙ，  Ｎ．，  Ｈｏｒｎ，  Ｂ．，  Ｒａｍｏｓ，  Ｃ．，  Ｋａｄｏ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｒｏｇｏｗｓｋｙ，  Ｐ．  （１９８９）  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｒｏｍ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｂｙ  ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１７：３０９−３１６．
【非特許文献５】Ｇｏｕｌｄ，  Ｊ．，  Ｄｅｖｅｙ，  Ｍ．，  Ｈａｓｅｇａｗａ，  Ｏ．，  Ｕｌｉａｎ，  Ｅ．Ｃ．，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｒ．Ｈ．  （１９９１）  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．  ｕｓｉｎｇ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ａｎｄ  ｓｈｏｏｔ  ａｐｅｘ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９５：４２６−４３４．
【非特許文献６】Ｍｏｏｎｅｙ，  Ｐ．Ａ．，  Ｇｏｏｄｗｉｎ，  Ｐ．Ｂ．，  Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｅ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９１）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｗｈｅａｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ２５：２０９−２１８．
【非特許文献７】Ｒａｉｎｅｒｉ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｂｏｔｔｉｎｏ，  Ｐ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｍ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｎｅｓｔｅｒ，  Ｅ．Ｗ．  （１９９０）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）．  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３３−３８．
【非特許文献８】Ｐｏｔｒｙｃｕｓ，  Ｉ  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｃｅｒｅａｌｓ：  ａｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５３５−５４２．
【非特許文献９】Ｃｈａｎ，  Ｍ−Ｔ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ−Ｈ．，  Ｈｏ，  Ｓ−Ｌ．，  Ｔｏｎｇ，  Ｗ−Ｆ．  ａｎｄ  Ｙｕ，  Ｓ−Ｍ．  （１９９３）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ／  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ．    Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２：４９１−５０６．
【非特許文献１０】Ｈｉｅｉ，  Ｙ．，  Ｏｈｔａ，  Ｓ．，  Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，  Ｔ．  （１９９４）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ＤＮＡ．  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２．
【非特許文献１１】Ｉｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｈ．，  Ｏｈｔａ，  Ｓ．，  Ｈｉｅｉ，  Ｙ．，  Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，  Ｔ．  （１９９６）  Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  （Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０．
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎｇ，  Ｍ．，  Ｆｒｙ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｐａｎｇ，  Ｓ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｈ．，  Ｈｉｒｏｎａｋａ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｄｕｎｃａｎ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｃｏｎｎｅｒ，  Ｔ．  Ｗ．，    Ｗａｎ，  Ｙ．  （１９９７）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１５：  ９７１−９８０．
【非特許文献１３】Ｔｉｎｇａｙ，  Ｓ．，  ＭｃＥｌｒｏｙ，  Ｄ．，  Ｋａｌｌａ，  Ｒ．，  Ｆｉｅｇ，  Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｍ．，  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｓ．，  Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，  Ｒ．  （１９９７）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂａｒｌｅｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１：  １３６９−１３７６．
【非特許文献１４】Ｚｈａｏ，  Ｚ．−Ｙ．，  Ｃａｉ，  Ｔ．，  Ｔａｇｌｉａｎｉ，  Ｌ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｗａｎｇ，  Ｎ．，  Ｐｅｎｇ，  Ｈ．，  Ｒｕｄｅｒｔ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｏｅｄｅｒ，  Ｓ．，  Ｈｏｎｄｒｅｄ，  Ｄ．，  Ｓｅｌｔｚｅｒ，  Ｊ．，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｄ．  （２０００）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４４：  ７８９−７９８．
【非特許文献１５】Ｄｅｊｉ，  Ａ．，  Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，  Ｈ．，  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  Ｙａｍａｄａ，  Ｓ．，  Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．，  Ｋｕｂｏ，  Ｔ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｔ．  （２０００）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ＺｍＲＲ１  ａｎｄ  ＺｍＲＲ２  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４９２：  ２１６−２２０．
【非特許文献１６】Ｎｅｇｒｏｔｔｏ，  Ｄ．，  Ｊｏｌｌｅｙ，  Ｍ．，  Ｂｅｅｒ，  Ｓ．，  Ｗｅｎｃｋ，  Ａ．  Ｒ．，  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｇ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍａｉｚｅ  ｐｌａｎｔｓ  （Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）  ｖｉａ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：  ７９８−８０３．
【非特許文献１７】Ｎｏｍｕｒａ，  Ｍ．，  Ｓｅｎｔｏｋｕ，  Ｎ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ａ．，  Ｌｉｎ，  Ｊ−Ｈ．，  Ｈｏｎｄａ，  Ｃ．，  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  Ｏｈｔａ，  Ｓ．，  Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．，  Ｍｉｙａｏ−Ｔｏｋｕｍｏｒｉ，  Ｍ．，  Ｋｏｎｏ−Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｙ．，  Ｔａｊｉｍａ，  Ｓ．，  Ｋｕ，  Ｍ．  Ｓ．  Ｂ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｍ．  （２０００ａ）  Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ４  ｐｌａｎｔｓ：  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  Ｃ４−ｔｙｐｅ  ｐｙｒｕｖａｔｅ，  ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２２：  ２１１−２２１．
【非特許文献１８】Ｎｏｍｕｒａ，  Ｍ．，  Ｋａｔａｙａｍａ，  Ｋ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ａ．，  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  Ｏｈｔａ，  Ｓ．，  Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．，  Ｍｉｙａｏ−Ｔｏｋｕｔｏｍｉ，  Ｍ．，  Ｔａｊｉｍａ，  Ｓ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｍ．  （２０００ｂ）  Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｒｂｃＳ  ｉｎ  ａ  Ｃ３  ｐｌａｎｔ  （ｒｉｃｅ）  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，  ｌｉｇｈｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｃ４  ｐｌａｎｔ  （ｍａｉｚｅ），  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｂｕｎｄｌｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４４：  ９９−１０６．
【非特許文献１９】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｉｚａｗａ，  Ｋ．，  Ｋｕ，  Ｍ．  Ｓ．  Ｂ．，  Ｌｉｎ，  Ｊ−Ｈ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｈ．，  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  Ｏｈｔａ，  Ｓ．，  Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｍ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｔ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｉｚｅ  Ｃ4  ｐｙｒｕｖａｔｅ，  ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｃｅｌｌ−  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍａｉｚｅ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４１：  ４２−４８．
【非特許文献２０】Ｚｈａｏ，  Ｚ．−Ｙ．，  Ｇｕ，  Ｗ．，  Ｃａｉ，  Ｔ．，  Ｔａｇｌｉａｎｉ，  Ｌ．，  Ｈｏｎｄｒｅｄ，  Ｄ．，  Ｂｏｎｄ，  Ｄ．，  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，  Ｓ．，  Ｒｕｄｅｒｔ，  Ｍ．，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｄ．  （２００１）  Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ．  Ｍｏｌ．  Ｂｒｅｅｄ．  ８：  ３２３−３３３．
【非特許文献２１】Ｆｒａｍｅ，  Ｂ．Ｒ．，  Ｓｈｏｕ，  Ｈ．，  Ｃｈｉｋｗａｍｂａ，  Ｒ．Ｋ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｘｉａｎｇ，  Ｃ．，  Ｆｏｎｇｅｒ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｐｅｇｇ，  Ｓ．Ｅ．Ｋ．，  Ｌｉ，  Ｂ．，  Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｐｅｉ，  Ｄ．，  Ｗａｎｇ，  Ｋ．  （２００２）  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２９：  １３−２２．
【非特許文献２２】Ｉｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｈ．，  Ｈｉｅｉ，  Ｙ．，  Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．  （２００３）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  （Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：５７−６６．
【非特許文献２３】Ｄｕｎｃａｎ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｚｅｈｒ，  Ｂ．Ｅ．，  Ｗｉｄｈｏｌｍ，  Ｊ．Ｍ．  （１９８５）  Ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｌｕｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｏｆ  ｎｕｍｅｒｏｕｓ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．  Ｐｌａｎｔａ  １６５：  ３２２−３３２．
【非特許文献２４】Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．，  Ｓｕｂｂａｒａｏ，  Ｓ．，  Ａｄｄａｅ，  Ｐ．，  Ｓｈｅｎ，  Ａ．，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｐｅｓｃｈｋｅ，  Ｖ．，  Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｌ．  （２００３）  Ｃｒｅ／ｌｏｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍａｉｚｅ  （Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）  ｐｌａｎｔｓ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０７：  １１５７−１１６８．
【非特許文献２５】Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．  ａｎｄ  Ｗｅｉ，  Ｚ．  （２００５）  Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｅｌｉｔｅ  ｉｎｂｒｅｄ  ｌｉｎｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ８３：１８７−２００．
【非特許文献２６】Ｆｒａｍｅ，  Ｂ．Ｒ．，  ＭｃＭｕｒｒａｙ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｆｏｎｇｅｒ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｍａｉｎ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｋ．Ｗ．，  Ｔｏｒｎｅｙ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｐａｚ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｗａｎｇ，  Ｋ．  （２００６）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｍａｉｚｅ  ｉｎｂｒｅｄ  ｌｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭＳ  ｓａｌｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ２５：  １０２４−１０３４．
【非特許文献２７】Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．，  Ｈｉｅｉ，  Ｙ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｙ．，  Ｍｕｒａｉ，  Ｎ．，  Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，  Ｔ．  （１９９６）  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｗｏ  ｓｅｐａｒａｔｅ  Ｔ−ＤＮＡｓ  ｆｏｒ  ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ  ｆｒｅｅ  ｆｒｏｍ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：１６５−１７４．
【非特許文献２８】Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｋｉｄｏ，  Ｆ．，  Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，  Ｔ．  （１９８９）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｓ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｒｋｅｒｓ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ７７：５４７−５５２．
【非特許文献２９】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
【非特許文献３０】Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ，  Ｅ．，  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  （１９６５）  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １８：１００−１２７．
【非特許文献３１】Ｃｈｕ，  Ｃ．−Ｃ．  （１９７８）  Ｔｈｅ  Ｎ６  ｍｅｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ａｎｔｈｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｅｒｅａｌ  ｃｒｏｐｓ．  Ｉｎ：  Ｐｒｏｃ．  Ｓｙｍｐ．  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｐｅｋｉｎｇ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ  ４３−５０．
【非特許文献３２】Ｗａｔｓｏｎ，  Ｂ．，  Ｃｕｒｒｉｅｒ，  Ｔ．Ｃ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｃｈｉｌｔｏｎ，  Ｍ．−Ｄ．  ａｎｄ  Ｎｅｓｔｅｒ，  Ｅ．  Ｗ．（１９７５）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １２３，  ２５５−２６４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、従来公知のアグロバクテリウム法に比べて、植物の形質転換効率を上昇させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ダイカンバ）を含む共存培地で培養する共存工程を含む形質転換方法により、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を使用する従来法に比べて、植物の形質転換効率が上昇することを見いだし、本発明を想到した。本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。【００１８】
本発明は、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法を提供する。【００１９】
本発明の好ましい態様において、共存培地中には３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸以外のオーキシン類は含まない。【００２０】
また、本発明の好ましい態様において、共存培地中の３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸の濃度は０．５−３．０ｍｇ／ｌである。【００２１】
また、本発明の好ましい態様において、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸のみを共存培地中のオーキシン類として使用する場合と比較して、植物の形質転換効率は１．３倍以上、さらに好ましくは２．４倍以上上昇する。【００２２】
また、本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウム菌が接種される植物組織が単子葉植物の組織由来であり、さらに好ましい態様において、アグロバクテリウム菌が接種される植物は、トウモロコシ、コムギまたはオオムギである。アグロバクテリウム菌が接種される単子葉植物の組織は、未熟胚、カルス、花芽または完熟種子の発芽部位であり、最も好ましくは未熟胚である。【００２３】
さらに、本発明の好ましい態様において、植物組織は熱処理および／または遠心処理されている。【００２４】
また、本発明の好ましい態様において、共存培地は硝酸銀および／または硫酸銅をさらに含む。【００２５】
本発明の別の態様において、本発明は、以下の工程：
（ｉ）アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織をオーキシンを含む培地で培養し、形質転換体を薬剤選抜する選抜工程；および、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選抜された組織を選抜薬剤を含む再分化培地で培養し再分化させる再分化工程；を含む、形質転換植物の作成方法を提供する。【００２６】
以下に、本発明の構成を具体的に説明する。【００２７】
本発明は、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法を提供する。【００２８】
アグロバクテリウム菌を用いた植物組織の形質転換は、通常以下の工程により行われる。即ち、（ｉ）植物組織へアグロバクテリウム菌を接種する接種工程、（ｉｉ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含む共存培地で培養する共存工程、（ｉｉｉ）２，４−Ｄおよび選抜薬剤を含む選抜培地で培養する選抜工程、および（ｉｖ）選抜薬剤を含む再分化培地で培養する再分化工程である。【００２９】
上記のような従来の形質転換方法では、共存工程においてオーキシン類としては２，４−Ｄが多くの場合使用されており、その他のオーキシン類が２，４−Ｄの代わりに、または２，４−Ｄと同時に共存培地中で使用することはほとんど行われていなかった。なお、本明細書において、「オーキシン」および「オーキシン類」とは、当該技術分野において公知である天然に由来するオーキシンおよび人工的に合成されたオーキシンのいずれをも含み、例えば、２，４−Ｄ、ダイカンバ、４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸（ｐｉｃｌｏｒａｍ；ピクロラム）、２，３，５−トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、およびインドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびナフタレン酢酸（ＮＡＡ）等が含まれる。【００３０】
本発明においては、共存培地中に３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ダイカンバ）が含まれることを特徴の１つとし、これにより植物の形質転換効率が上昇する。本発明のさらに好ましい態様においては、共存培地中には３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ダイカンバ）以外のオーキシン類は含まない。【００３１】
植物が形質転換されたか否かは、公知の種々の方法により決定可能である。例えば、形質転換する遺伝子をＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子あるいはＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子とすることにより、簡便な公知の方法でこれらのレポーター遺伝子の発現部位を目視により形質転換の有無について確認することが可能である。また、抗生物質抵抗性遺伝子や除草剤抵抗性遺伝子などの選抜マーカー遺伝子の発現を抗生物質あるいは除草剤を含む培地で植物細胞を培養することにより、あるいは抗生物質溶液や除草剤溶液を植物に処理することにより、その抵抗性の発現を指標に形質転換の有無を確認することも可能である。【００３２】
より確実な形質転換がされたか否かの決定は、例えば、サザンハイブリダイゼーション法による植物染色体への導入遺伝子の組み込み、および後代植物での導入遺伝子の発現確認（後代への遺伝）などにより行うことができる。サザンハイブリダイゼーション法は広く知られた方法により行うことができ、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （非特許文献２９）に記載される方法により行われる。また、後代植物における発現の確認はＧＵＳ遺伝子などレポーター遺伝子の発現や除草剤耐性遺伝子など選抜マーカー遺伝子の発現を調査する方法により実行可能である。具体的には、非特許文献１１に記載されている方法により行われるが、これに限定されるものではない。【００３３】
形質転換効率は、当業者に一般に使用されている計算方法により決定することができる。例えば、形質転換された植物数を、アグロバクテリウム菌を接種した外植片数で除することにより算出した値により求めることが可能である。【００３４】
本発明において、「植物の形質転換効率が上昇」とは、上記のような共存培地中に２，４−Ｄのみをオーキシンとして含む従来のアグロバクテリウム菌による形質転換方法と比較して、形質転換効率が上昇することをいう。本発明の方法を使用すると、実施例１においては２，４−Ｄを用いる方法に比べて１．３倍、実施例２においては２．４倍形質転換効率が上昇している。したがって、本発明によれば、好ましくは１．３倍以上、より好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．４倍以上、形質転換効率が上昇する。【００３５】
以下において、本発明の植物の形質転換効率を上昇させる方法の各工程について説明する。【００３６】
（１）アグロバクテリウム菌の接種工程
本発明において使用される植物組織はアグロバクテリウム菌を接種される。本明細書で使用する「接種する」とは、アグロバクテリウム菌を植物組織に接触させることをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウム菌を接種する方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム菌を液体培地に懸濁した懸濁液に植物組織を加える方法、共存培地上の植物組織にアグロバクテリウム菌の懸濁液を直接滴下する方法、植物組織中にアグロバクテリウム菌懸濁液を注入する方法、およびアグロバクテリウム菌懸濁液中に植物組織を浸漬し減圧する方法等があげられる。しかしながら、本発明において使用されるアグロバクテリウム菌を接種された植物組織は、これらの方法によりアグロバクテリウム菌を接種された植物組織に限定されない。【００３７】
当該アグロバクテリウム菌の接種工程においては、アグロバクテリウム菌による形質転換効率を改善するために、例えば、アセトシリンゴン、界面活性剤、多孔性セラミックス等の種々の添加剤をアグロバクテリウム菌の懸濁液中に含ませることが可能である。【００３８】
本発明に使用可能なアグロバクテリウム菌は公知のいずれのアグロバクテリウム菌であってよい。本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウム菌は、例えば、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１およびＡＧＬ１、Ｃ５８Ｃ１等であるが、これに限定はされない。ベクターにスーパーバイナリーベクター（非特許文献１０および１１）を使用しない場合には、形質転換効率の観点から、アグロバクテリウムＡ２８１(非特許文献３１)が有するＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２を含む菌株を用いることが好ましい。【００３９】
アグロバクテリウム菌は、アグロバクテリウム菌内のプラスミドのＴ−ＤＮＡの中に挿入された遺伝子を植物のゲノム中に導入する性質を有することが公知である。そのため、本発明で使用可能なアグロバクテリウム菌は、発現させることを意図する遺伝子をＴ−ＤＮＡ中に挿入したプラスミドを有する。そして、当該プラスミドを有するアグロバクテリウム菌を植物組織に接種することにより植物を形質転換可能である。これにより、組織中の植物細胞に好ましい形質が付与される。本発明において使用可能なアグロバクテリウム菌用のプラスミドは、例えば、ｐＳＢ１３１、Ｕ０００９Ｂ、Ｕ００１７Ｓ、ｐＳＢ１３４、ｐＮＢ１３１およびｐＩＧ１２１Ｈｍ等があげられるが、これに限定される訳ではない。アグロバクテリウム菌株にＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２を含む菌株を使用しない場合には、形質転換効率の観点から、スーパーバイナリーベクター（非特許文献１０および１１）を使用することが好ましい。【００４０】
本発明において使用可能な植物組織が由来する植物は、単子葉植物および双子葉植物であり、好ましくは単子葉植物であり、さらに好ましくはトウモロコシ、コムギ、オオムギであり、最も好ましくはトウモロコシである。また、本発明において使用可能な植物組織は、例えば、植物の細胞、葉、根、茎、実、未熟胚、カルス、花芽、完熟種子の発芽部位、その他いずれの部位の植物組織であってよく、好ましくは未熟胚、花芽および完熟種子の発芽部位であり、最も好ましくは未熟胚である。本明細書において、未熟胚とは受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも受粉後７から１４日後のものが好ましい。【００４１】
上記のような植物組織は、形質転換効率を上昇させるために様々な処理をされていることもまた可能である。そのような処理としては、例えば、加熱処理（特許文献１）、遠心処理（特許文献２）、熱および遠心処理（特許文献４）、並びに加圧処理（特許文献５）などがあげられる。【００４２】
（２）共存工程
本工程は、上記のようにアグロバクテリウム菌を接種した植物細胞を、アグロバクテリウム菌の共存下にて、オーキシン類を含む培地で培養することにより、植物細胞へのアグロバクテリウム菌からＤＮＡの導入を確実にする工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「共存培地」という。共存培地は、植物細胞を培養するために通常使用されるものでよく、例えば、ＬＳ無機塩類（非特許文献３０）やＮ６無機塩類（非特許文献３１）を基本とする培地、具体的にはＬＳ−ＡＳ培地等があげられる。【００４３】
共存培地中には、従来の形質転換法によれば、オーキシン類として２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−D）が添加される。本発明では、共存培地中に３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ダイカンバ）を含むことを特徴の１つとする。本発明の好ましい態様においては、共存培地中にはダイカンバ以外のオーキシン類は含まない。【００４４】
ダイカンバの共存培地中における量は、従来の方法における２，４−Ｄの量と同様であってよく、好ましくは、０．５−３．０ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは、０．５−２．５ｍｇ／ｌ、より好ましくは、１．０−２．０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは、１．５ｍｇ／ｌである。【００４５】
共存培地中には、ダイカンバ以外にも、形質転換効率を上昇させるために種々の添加剤を加えることも可能である。このような添加剤は、例えば、硝酸銀（特許文献３）、硫酸銅（非特許文献６）、およびシステイン（非特許文献２１）等があげられる。【００４６】
本工程においては、共存培地中にはオーキシン類としてはダイカンバのみであるか、あるいはダイカンバおよびその他のオーキシン類を含む。オーキシン類は一般に植物組織を脱分化させる作用を有するために、本工程および続く選抜工程において、ほとんどの植物組織は一部または全部が脱分化組織（カルス）となる。本明細書で使用する、「脱分化組織」または「カルス」の用語は、分化した植物組織の一部（外植片）をオーキシン、サイトカイニン等の植物生長調節物質を含む培地で培養することにより得られる組織で、元来の植物組織としての形態を有さない無定形で未分化状態の細胞塊をいう。したがって、脱分化組織の状態で共存工程を開始する場合、および分化している植物組織が共存工程中または続く選抜工程中にすべてが脱分化および一部が脱分化する場合等の、脱分化組織が関係するいかなる態様も本発明の範囲内である。【００４７】
本工程における「培養」とは、固化した共存培地の上または液体状の共存培地の中に植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。共存培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日−１０日、より好ましくは７日である。【００４８】
（３）選抜工程
本発明は、以上に記載した共存工程を特徴とするものである。以下に記載する選抜工程および再分化工程は、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換方法において一般に行われている方法である。したがって、以下の記載は例示のためのものであり、本発明は以下の記載により限定されるものではない。【００４９】
本工程は、上記工程により得られた組織を、オーキシン類を含む培地で培養し、形質転換体を遺伝子の導入の有無により選抜する工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「選抜培地」という。選抜培地として使用可能な培地は、例えば、ＬＳ無機塩類（非特許文献３０）やＮ６無機塩類（非特許文献３１）を基本とする培地、例えば具体的にはＬＳＤ１．５培地等があげられる。選抜培地中には、定法によればオーキシン類、好ましくは２，４−Ｄが添加される。本発明においても、本選抜工程で使用されるオーキシン類は特に限定はされず、好ましくは２，４−Ｄである。さらに、必要に応じて、種々の添加物を加えることが可能である。【００５０】
形質転換植物の選抜は、例えば、適当な選抜薬剤を含む選抜培地で、上記共存工程を経た植物を培養し、選抜薬剤に対する耐性の有無により行うことができる。本工程に使用可能な選抜薬剤は、当該技術分野で通常使用されるものを用いることが可能である。例えば、選抜薬剤としては、抗生物質および／または除草剤を使用可能である。抗生物質としては、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、またはブラストサイジンＳ等が使用可能である。さらに、除草剤としては、例えば、フォスフィノスライシン、ビアラフォス、またはグリホセート等が使用可能である。【００５１】
本選抜工程のために、アグロバクテリウム菌中のＴ−ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、例えば、選抜薬剤に対する耐性遺伝子等を含むことが必要である。このような選抜薬剤に対する耐性遺伝子は当該技術分野においては公知である。本工程において、例えばハイグロマイシンを含む選抜培地において選抜が行われる場合、植物にはアグロバクテリウム菌からハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていることが必要である。【００５２】
あるいは、形質転換植物の選抜は、植物細胞の糖要求性に基づいて行うことが可能である。植物細胞が利用できる糖はシュークロース、グルコースなどがあるが、マンノースは利用できないことが知られている。したがって、マンノースのみを炭素源とする培地で植物組織を培養すると、利用できる糖がないために植物組織は枯死する。糖要求性に基づく選抜はこの原理を利用するものである。即ち、この選抜方法を利用するためには、アグロバクテリウム菌中のＴ−ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、リン酸化マンノースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ：ＰＭＩ）遺伝子を含むことが必要となる。ここで、ＰＭＩ遺伝子を導入された植物細胞は、マンノースを炭素源として利用できるようになる。したがって、上記のようなアグロバクテリウム菌により形質転換された植物組織のみが、マンノースのみを炭素源とする培地で生育することが可能となり、これにより形質転換植物組織のみを選抜することが可能となる（非特許文献１６）。このような方法は、他の糖についても行うことができる。例えば、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入された植物細胞は炭素源としてキシロースを利用することが可能となるため、このような方法に適用可能である。【００５３】
したがって、糖要求性に基づき形質転換植物の選抜を行う場合には、植物組織には、アグロバクテリウム菌から通常植物細胞が利用できない糖類を利用可能にする遺伝子が導入されている。このような遺伝子は当該技術分野において公知であり、例えば、ＰＭＩ遺伝子、キシロースイソメラーゼ遺伝子等が使用可能である。また、選抜培地においては、植物細胞が通常使用可能であり、培地中に通常含まれるシュークロースおよびグルコース等が除かれており、代わりに炭素源としては通常の植物細胞が利用できない糖類のみを含む。ここで、「通常の植物細胞が利用できない糖類」とは、野生型の植物細胞には代謝酵素をコードする遺伝子がないために栄養源とすることのできない糖類をいい、例えば、マンノース、キシロース等が含まれる。【００５４】
また、容易に検出可能な遺伝子をスクリーニングの指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無により選抜することも可能である。このようなスクリーニングの指標となる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子等があげられる。これらの遺伝子を発現する細胞・組織を検出する方法は当該技術分野において公知である。上記のような遺伝子の発現部位をモニターし、発現部位を切り分けるなどして選抜することも可能である。【００５５】
本工程は、培地の成分組成を変更して、複数回繰り返して行うことも可能である。例えば、複数回の選抜工程では、選抜薬剤の濃度を各選抜工程で上昇させることにより、薬剤選抜の確実性が増し、形質転換をした植物体を得られる可能性を上昇させることが可能となる。本選抜工程は、好ましくは少なくとも２回、より好ましくは３回行われる。また、複数回選抜工程を行う場合には、選抜薬剤を含む培地で培養した組織のうち増殖した部分を切り取り、当該増殖部分のみを次の選抜工程に供することにより、効率よく形質転換組織を獲得することも可能である。【００５６】
本工程における「培養」とは、固化した選抜培地の上または液体状の選抜培地の中に植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。選抜培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、例えば、３回選抜工程が行われる場合には、１次選抜は２週間、２次選抜は３週間、そして３次選抜は３週間の計８週間行われる。また、複数回の選抜工程全体では好ましくは６−１０週間、より好ましくは７−９週間行われる。また、複数回の選抜を行う場合には、各回毎に培養期間、温度および明暗条件を変更することも可能である。【００５７】
（４）再分化工程
本工程は、上記選抜工程により選抜された組織を、培地で培養し再分化させる工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」という。再分化培地は、オーキシン類は含まない。再分化培地として使用可能な培地は、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＬＳＺ培地等があげられる。【００５８】
本工程は一般に、再分化培地は選抜薬剤を含む。本工程において使用可能な選抜薬剤は、選抜工程において定義したものと同様である。しかしながら、本工程において必ずしも選抜工程で用いた選抜薬剤と同じ選抜薬剤を用いなくとも良い。その場合には、植物にはアグロバクテリウム菌から、２種類以上の選抜薬剤に対する耐性遺伝子が導入されている必要がある。【００５９】
本発明における「再分化」とは、全部または一部が脱分化していた植物組織が、再び元の植物組織または植物体の性質を獲得することをいう。本発明においては、共存工程および選抜工程中のオーキシン類の作用により、ほとんどのアグロバクテリウム菌を接種した植物組織の全部または一部において脱分化している。したがって、本工程に供することにより、脱分化組織が再分化することにより、完全な形質転換植物体を得ることが可能となる。【００６０】
本工程における「培養」とは、固化した再分化培地の上または液体状の再分化培地の中に植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。再分化培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃−３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは１６−２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日−２１日、より好ましくは１４日である。【００６１】
本工程の後においては、当該技術分野において公知の方法を用いることにより容易に完全な形質転換植物体を得ることが可能である。したがって、以下の工程：
（ｉ）アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織をオーキシンを含む培地で培養し、形質転換体を薬剤選抜する選抜工程；および、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選抜された組織を選抜薬剤を含む再分化培地で培養し再分化させる再分化工程；を含む、形質転換植物の作成方法もまた、本発明により提供される。
【発明の効果】
【００６２】
本発明により、植物の形質転換効率を上昇させることが可能となった。これにより、効率よく形質転換した植物体を得ることが可能となり、当該植物体を得るためのコストを削減することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１はトウモロコシ形質転換効率に及ぼす共存培地中のオーキシンの種類の影響を示すグラフである。各区３３−３５未熟胚を供試した。縦軸は形質転換効率（各区で得られたＧＵＳ陽性植物数を接種未熟胚数で除した）を、横軸は共存培養培地に含まれるオーキシンの種類を示す。共存培地中のオーキシンの濃度はいずれも１．５ｍｇ／ｌとした。
【図２】図２はアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４（Ｕ０００９Ｂ）が保持するプラスミドＵ０００９Ｂの構造を示す図である。
【００６４】
プラスミド名：  Ｕ０００９Ｂ．ｐｒｊ
プラスミドサイズ：  １２３４７ｂｐ
【図３】図３は滴下接種法によるトウモロコシ形質転換効率に及ぼす共存培地中のオーキシンの種類の影響を示すグラフである。各区２５−２６未熟胚を供試した。縦軸は形質転換効率（各区で得られたＧＵＳ陽性植物数を接種未熟胚数で除した）を、横軸は共存培養培地に含まれるオーキシンの種類を示す。共存培地中のオーキシンの濃度はともに１．５ｍｇ／ｌとした。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
実施例１
種々のオーキシンを添加した共存培地の形質転換効率に及ぼす効果
材料および方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５  ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地（非特許文献１１）で１回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および１５，０００  ｒｐｍ、１０分間の遠心処理）を行った。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地に約１．０ｘ１０9ｃｆｕ／ｍｌでアグロバクテリウム菌系  ＬＢＡ４４０４  （ｐＳＢ１３１）  （非特許文献１１）を懸濁し接種源とした。熱・遠心処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。２，４−Ｄを除き、５μＭ  ＡｇＮＯ3および５μＭ  ＣｕＳＯ4を含むＬＳ−ＡＳ培地（非特許文献１１、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度で２，４，５−Ｔ（２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸）、ピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸）、ＴＩＢＡ（２，３，５−トリヨード安息香酸）、ダイカンバをそれぞれ添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。対照の培地は５μＭ  ＡｇＮＯ3および５μＭ  ＣｕＳＯ4を含むＬＳ−ＡＳ培地（固化剤は８ｇ／ｌアガロース）とした。【００６６】
２５℃、暗黒下で７日間培養した未熟胚を５μＭ  ＡｇＮＯ3、５ｍｇ／ｌフォスフィノスライシン（ＰＰＴ）、２５０ｍｇ／ｌ  カルベニシリン、１００ｍｇ／ｌ  セフォタキシムを含むＬＳＤ１．５培地（非特許文献１１）に置床し、２５℃、暗黒下で１０日間培養した。ＰＰＴの濃度を１０ｍｇ／ｌとした同培地に未熟胚を移し、同条件で３週間培養した。増殖のみられたカルスをメスで切り取り、同組成の培地に置床し、条件で３週間培養した。増殖したカルスを切り取り、１０μＭ  ＣｕＳＯ4、５ｍｇ／ｌ  ＰＰＴを含むＬＳＺ培地（非特許文献１１）に置床し、２５℃、照明下で約２週間培養した。植物体の再分化のみられた未熟胚の数を調査するとともに、再分化した植物の葉の一部を切り取り、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。【００６７】
結果
２，４−Ｄをオーキシンとした対照の共存培地で培養した未熟胚からは２０．６％の効率で形質転換植物が得られた。これに対し、ダイカンバをオーキシンとして添加した共存培地で培養した未熟胚の形質転換効率は２７．３％と高く、共存培地のオーキシンをダイカンバにすることにより、形質転換効率の向上することが明らかとなった。したがって、共存培地にオーキシンとしてダイカンバを含ませることにより、２，４−Ｄを使用する従来法に比べ、２７．３／２０．６＝１．３３倍形質転換効率が上昇することが明らかとなった。一方、２，４，５−Ｔおよびピクロラムをオーキシンとした培地での形質転換効率は対照に比べ劣った。ＴＩＢＡを添加した培地で共存培養を行った未熟胚からは形質転換植物は得られなかった（図１）。
実施例２
滴下接種法での形質転換効率に及ぼす共存培地中のダイカンバと２，４−Ｄの影響
材料および方法
ｐＳＢ１１（非特許文献２７）を基本骨格とするベクターに必要なエレメントを付加し、図２、配列番号１のベクターＵ０００９Ｂを構築した。実施例１と同様の方法で調整したアグロバクテリウム菌系ＬＢＡ４４０４（Ｕ０００９Ｂ）の接種源１ｍｌに約８０ｍｇのハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理）を行った未熟胚（品種Ａ１８８）を２，４−Ｄを除き、５μＭ  ＡｇＮＯ3および５μＭ  ＣｕＳＯ4を含むＬＳ−ＡＳ培地（非特許文献１１、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に１．５ｍｇ／ｌの濃度ダイカンバを添加した共存培地に胚盤が上になるように置床した。対照の培地は５μＭＡｇＮＯ3および５μＭＣｕＳＯ4を含むＬＳ−ＡＳ培地（固化剤は８ｇ／ｌアガロース）とした。接種源中のハイドロキシアパタイトが均等に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌した後、５μｌの接種源を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の別の場所に移動した。培養器をシールした後、２５℃、暗黒下で７日間共存培養を行った。共存培養後の未熟胚を実施例１と同様の方法で培養し、再分化植物を得るとともに再分化植物の葉でのＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。【００６８】
結果
２，４−Ｄをオーキシンとした対照の共存培地で培養した未熟胚からは１１．５％の効率で形質転換植物が得られた。これに対し、ダイカンバをオーキシンとして添加した共存培地で培養した未熟胚の形質転換効率は２８．０％と高く、共存培地のオーキシンをダイカンバにすることにより、滴下接種法による形質転換においても効率の向上することが明らかとなった（図３）。本方法によれば、共存培地にダイカンバを添加することにより、２，４−Ｄを使用する従来法に比べ、２８．０／１１．５＝２．４３倍形質転換効率が上昇した。
実施例３
サザン分析  
材料および方法
実施例１で得られたＧＵＳ遺伝子の発現を示す形質転換植物の葉から小鞠らの方法（非特許文献２８）に従いＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡに制限酵素ＢａｍＨＩを処理し、ＧＵＳ遺伝子をプローブとしたサザン法による導入遺伝子の検出を行った。サザン法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（非特許文献２９）に記載の方法に従って行った。【００６９】
結果
いずれの形質転換体もＧＵＳプローブにハイブリダイズするバンドを示した。そのパターンは形質転換体ごとに異なり、導入遺伝子が植物の染色体上にランダムに挿入されていることが示された。ＧＵＳ陽性を示した個体のバンド数は１−３本で、挿入された導入遺伝子のコピー数はいずれも少ないことが明らかとなった（表１）。【００７０】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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