【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：無毒性シュードモナス属外毒素A配列、及び無毒性シュードモナス属外毒素A配列内に配置されたIV型ピリン・ループ配列を含むキメラ・タンパク質であって、ここで、上記キメラ・タンパク質は、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を減少させることができ、さらにここで、宿主内に導入されるとき、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を減少させるポリクローナル抗血清を産生することができる上記キメラ・タンパク質。
【請求項２】
前記キメラ・タンパク質が、宿主内に導入されるとき、シュードモナス属外毒素Aの細胞毒性を中和するポリクローナル抗血清を産生することもできる、請求項1に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項３】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、以下の：
(a)前記キメラ・タンパク質を細胞サイトゾルに移行させるために十分な移行ドメイン；及び
(b)前記キメラ・タンパク質をエンドソームから小胞体まで移動させるように働く小胞体保持ドメイン、
を含む、請求項1に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項４】
前記キメラ・タンパク質が、細胞表面レセプタのためのリガンドとして機能し、かつ、上記キメラ・タンパク質の細胞への結合を仲介する細胞認識ドメインをさらに含む、請求項3に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項５】
前記IV型ピリン・ループ配列が、移行ドメインと小胞体保持ドメインの間に配置されている、請求項4に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項６】
前記IV型ピリン・ループ配列が、上記IV型ピリン・ループ配列のN-及びC-末端の両方にシステイン残基を含む、請求項5に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項７】
前記IV型ピリン・ループ配列が、細菌又は酵母に由来する、請求項5に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項８】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザ、ナイセリア・メニンギチジス、ナイセリア・ゴノロエエ、ビブリオ・コレラ、パスツレラ・マルトサイダム又はカンジダ菌に由来する、請求項7に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項９】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項8に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１０】
前記IV型ピリン・ループ配列が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号:7、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10から成る群から選ばれる、請求項9に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１１】
前記移行ドメインが、シュードモナス属外毒素Aの第IIドメインの第280〜第364アミノ酸を含む、請求項5に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１２】
前記移行ドメインが、シュードモナス属外毒素Aの第IIドメインである、請求項5に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１３】
前記小胞体保持ドメインが、553位のアミノ酸Gluが欠失していることを除きシュードモナス属外毒素Aの第IIIドメインである、請求項5に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１４】
前記キメラ・タンパク質が、2以上のIV型ピリン・ループ配列を含む、請求項1に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１５】
前記細胞認識ドメインが、シュードモナス属外毒素Aの第Iaドメインである、請求項5に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１６】
前記細胞認識ドメインが、α2-マクログロブリン・レセプター、上皮成長因子レセプター、トランスフェリン・レセプター、インターロイキン-2レセプター、インターロイキン-6レセプター、インターロイキン-8レセプター、Fcレセプター、ポリIgGレセプター、アシアログリコプロテイン・レセプター、CD3、CD4、CD8、ケモカイン・レセプター、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFアルファ・レセプター、TOLLレセプター、M-CSFレセプター、GM-CSFレセプター、スカベンジャー・レセプター、VEGFレセプター、又はサイトカイン・レセプターに結合する、請求項5に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１７】
以下の：
(a)第Iaドメイン、第IIドメイン、及び第IIIドメインを含む、無毒性シュードモナス属外毒素A配列；並びに
(b)IV型ピリン・ループ配列、
を含むキメラ・タンパク質であって、上記IV型ピリン・ループ配列が、無毒性シュードモナス属外毒素A配列の第IIドメインと第IIIドメインの間に配置されている上記キメラ・タンパク質。
【請求項１８】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、ΔE553を伴う配列番号2のアミノ酸配列をもつ、請求項17に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項１９】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザ、ナイセリア・メニンギチジス、ナイセリア・ゴノロエエ、ビブリオ・コレラ、パスツレラ・マルトサイダム又はカンジダ菌に由来する、請求項17に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項２０】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項17に記載のキメラ・タンパク質。
【請求項２１】
以下の：無毒性シュードモナス属外毒素A配列、及び無毒性シュードモナス属外毒素A配列内に配置されたIV型ピリン・ループ配列を含むキメラ・タンパク質であって、ここで、上記キメラ・タンパク質は、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着の減少させることができ、さらにここで、宿主内に導入されるとき、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を妨げるポリクローナル抗血清を産生することができる上記キメラ・タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記キメラ・タンパク質が、宿主内に導入されるとき、シュードモナス属外毒素Aの細胞毒性を中和するポリクローナル抗血清を産生することもできる、請求項21に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、以下の：
(a)前記キメラ・タンパク質を細胞サイトゾルに移行させるために十分な移行ドメイン；及び
(b)前記キメラ・タンパク質をエンドソームから小胞体まで移動させるように働く小胞体保持ドメイン、
を含む、請求項21に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記キメラ・タンパク質が、細胞表面レセプタのためのリガンドとして機能し、かつ、上記キメラ・タンパク質の細胞への結合を仲介する細胞認識ドメインをさらに含む、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記IV型ピリン・ループ配列が、移行ドメインと小胞体保持ドメインの間に配置されている、請求項24に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記IV型ピリン・ループ配列が、上記IV型ピリン・ループ配列のN-及びC-末端の両方にシステイン残基を含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記IV型ピリン・ループ配列が、細菌又は酵母に由来する、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザ、ナイセリア・メニンギチジス、ナイセリア・ゴノロエエ、ビブリオ・コレラ、パスツレラ・マルトサイダム又はカンジダ菌に由来する、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項28に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記IV型ピリン・ループ配列が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号:7、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10から成る群から選ばれる、請求項29に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記移行ドメインが、シュードモナス属外毒素Aの第IIドメインの第280〜第364アミノ酸を含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記移行ドメインが、シュードモナス属外毒素Aの第IIドメインである、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記小胞体保持ドメインが、553位のアミノ酸Gluが欠失していることを除きシュードモナス属外毒素Aの第IIIドメインである、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記細胞認識ドメインが、シュードモナス属外毒素Aの第Iaドメインである、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記細胞認識ドメインが、α2-マクログロブリン・レセプター、上皮成長因子レセプター、トランスフェリン・レセプター、Fcレセプター、ポリIgGレセプター、アシアログリコプロテイン・レセプター、CD3、CD4、CD8、ケモカイン・レセプター、CD25、CD11B、CD11C、CD80、CD86、TNFアルファ・レセプター、TOLLレセプター、M-CSFレセプター、GM-CSFレセプター、スカベンジャ・レセプター、VEGFレセプター、又はサイトカイン・レセプターに結合する、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
以下の：
(a)第Iaドメイン、第IIドメイン、及び第IIIドメインを含む、無毒性シュードモナス属外毒素A配列；並びに
(b)IV型ピリン・ループ配列、
を含むキメラ・タンパク質であって、上記IV型ピリン・ループ配列が、無毒性シュードモナス属外毒素A配列の第IIドメインと第IIIドメインの間に配置されている上記キメラ・タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、ΔE553を伴う配列番号2のアミノ酸配列をもつ、請求項36に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザ、ナイセリア・メニンギチジス、ナイセリア・ゴノロエエ、ビブリオ・コレラ、パスツレラ・マルトサイダム又はカンジダ菌に由来する、請求項36に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項36に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項21に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項４１】
請求項40に記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項４２】
以下の：無毒性シュードモナス属外毒素A配列、及び無毒性シュードモナス属外毒素A配列内に配置されたIV型ピリン・ループ配列を含むキメラ・タンパク質であって、ここで、上記キメラ・タンパク質は、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を減少させることができ、さらにここで、宿主内に導入されるとき、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を妨げるポリクローナル抗血清を産生することができる上記キメラ・タンパク質を含む組成物。
【請求項４３】
前記キメラ・タンパク質が、宿主内に導入されるとき、シュードモナス属外毒素Aの細胞毒性を中和するポリクローナル抗血清を産生することもできる、請求項42に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、医薬として許容される担体をさらに含む、請求項42に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物が、経鼻又は経口スプレーとして処方される、請求項42に記載の組成物。
【請求項４６】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、以下の：
(a)前記キメラ・タンパク質を細胞サイトゾルに移行させるために十分な移行ドメイン；及び
(b)前記キメラ・タンパク質をエンドソームから小胞体まで移動させるように働く小胞体保持ドメイン、
を含む、請求項42に記載の組成物。
【請求項４７】
前記キメラ・タンパク質が、細胞表面レセプタのためのリガンドとして機能し、かつ、上記キメラ・タンパク質の細胞への結合を仲介する細胞認識ドメインをさらに含む、請求項46に記載の組成物。
【請求項４８】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項47に記載の組成物。
【請求項４９】
以下の：無毒性シュードモナス属外毒素A配列、及び無毒性シュードモナス属外毒素A配列内に配置されたIV型ピリン・ループ配列を含むキメラ・タンパク質であって、ここで、上記キメラ・タンパク質は、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を減少させることができ、さらにここで、宿主内に導入されるとき、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を妨げるポリクローナル抗血清を産生することができる上記キメラ・タンパク質を含む組成物の免疫学的な有効量を含む、宿主の免疫応答の誘発のための医薬組成物。
【請求項５０】
前記キメラ・タンパク質が、宿主内に導入されるとき、シュードモナス属外毒素Aの細胞毒性を中和するポリクローナル抗血清を産生することができる、請求項49に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記宿主がヒトである、請求項49に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、以下の：
(a)前記キメラ・タンパク質を細胞サイトゾルに移行させるために十分な移行ドメイン；及び
(b)前記キメラ・タンパク質をエンドソームから小胞体まで移動させるように働く小胞体保持ドメイン、
を含む、請求項49に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記キメラ・タンパク質が、細胞表面レセプタのためのリガンドとして機能し、かつ、上記キメラ・タンパク質の細胞への結合を仲介する細胞認識ドメインをさらに含む、請求項52に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項53に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
以下の：無毒性シュードモナス属外毒素A配列、及び無毒性シュードモナス属外毒素A内に配置されたIV型ピリン・ループ配列を含むキメラ・タンパク質であって、ここで、上記キメラ・タンパク質は、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を減少させることができ、さらにここで、宿主内に導入されるとき、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を妨げるポリクローナル抗血清を産生することができる上記キメラ・タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットの免疫学的な有効量を含む、宿主の免疫応答の誘発のための医薬組成物。
【請求項５６】
前記キメラ・タンパク質が、宿主内に導入されるとき、シュードモナス属外毒素Aの細胞毒性を中和するポリクローナル抗血清を産生することができる、請求項55に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記宿主がヒトである、請求項55に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、以下の：
(a)前記キメラ・タンパク質を細胞サイトゾルに移行させるために十分な移行ドメイン；及び
(b)前記キメラ・タンパク質をエンドソームから小胞体まで移動させるように働く小胞体保持ドメイン、
を含む、請求項55に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記キメラ・タンパク質が、細胞表面レセプタのためのリガンドとして機能し、かつ、上記キメラ・タンパク質の細胞への結合を仲介する細胞認識ドメインをさらに含む、請求項58に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項59に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
以下の：無毒性シュードモナス属外毒素A配列、及び無毒性シュードモナス属外毒素A内に配置されたIV型ピリン・ループ配列を含むキメラ・タンパク質であって、ここで上記キメラ・タンパク質は、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を減少させることができ、さらにここで、宿主内に導入されるとき、上記IV型ピリン・ループ配列を発現する微生物の上皮細胞への接着を妨げるポリクローナル抗血清を産生することができる上記キメラ・タンパク質を含む組成物を含む、IV型ピリン・ループ配列に特異的な抗体を産生させるための医薬組成物。
【請求項６２】
前記キメラ・タンパク質が、宿主内に導入されるとき、シュードモナス属外毒素Aの細胞毒性を中和するポリクローナル抗血清を産生することができる、請求項61に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記宿主がヒトである、請求項61に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記無毒性シュードモナス属外毒素A配列が、以下の：
(a)前記キメラ・タンパク質を細胞サイトゾルに移行させるために十分な移行ドメイン；及び
(b)前記キメラ・タンパク質をエンドソームから小胞体まで移動させるように働く小胞体保持ドメイン、
を含む、請求項61に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記キメラ・タンパク質が、細胞表面レセプタのためのリガンドとして機能し、かつ、上記キメラ・タンパク質の細胞への結合を仲介する細胞認識ドメインをさらに含む、請求項64に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記IV型ピリン・ループ配列が、シュードモナス・アエルギノーザに由来する、請求項65に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
具体的には、プラスミドでpPE64及びpPE64Δ553を、以下のとおり構築する。PEをコードするプラスミドpMOA1A2VK352(Ogata et al., J. Biol. Chem．267, 25396-401(1992))SfiIとApaIで消化し(それぞれ第1143及び第1275残基)、次に新規PstI部位を含む2本鎖と再連結した。2本鎖のコード鎖は以下の配列：
5'-tggccctgac cctggccgcc gccgagagcg agcgcttcgt ccggcagggc accggcaacg acgaggccgg cgcggcaaac ctgcagggcc-3'（配列番号31）、
を有する。得られたプラスミドは、PEよりわずかに小さな変異体をコードして、そして第Ibドメインの多くを欠いていた。次に、PstI部位を、システイン残基によって両側を挟まれたピリン・ループ配列をコードする2本鎖を導入するために使用した。非毒素タンパク質を作製するために、ベクターをpVC45ΔE553からの酵素的に不活な第IIIドメイン中にサブクローニングすることによって修飾した。pJH4(Hwang et. al., Cell 48:129-136(1987))からのさらなるサブクローニングを、シグナル配列を欠くベクターを産生するために必要とした。プラスミドpPE64とpPE64Δ553の構築は、FitzGerald et al., J. Biol. Chem．273(16):9951-8(1998)に記載されてもいる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
ピリン・ループ配列挿入をもつpPE64pilとpPE64Δ553pilプラスミドを、それぞれpPE64とpPE64Δ553プラスミドに基づいて構築した。PstIに関する突出末端をもち、そしてPAK株の12アミノ酸のピリン・ループをコードする54bpのセンス・オリゴヌクレオチドを、10 mMのTris/HCl、50 mMのNaCl pH7.4中で54bpのアンチセンス・オリゴヌクレオチドとアニールさせた。センス・及びアンチセンス・オリゴヌクレオチドには以下の配列：
センス5'-TTGTACTAGTGATCAGGATGAACAGTTTATTCCGAAAGGTTGTTCACGTATGCA-3'（配列番号32）；
アンチセンス5'-TACGTGAACAACCTTTCGGAATAAACTGTTCATCCTGATCACTAGTACAATGCA-3'（配列番号33）、
が存在した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
D．結果
上皮細胞へのピリン仲介接着は、P.アエルギノーザが感染を開始するのを可能にする。従って、接着を妨げる薬剤が、細菌による悩みを減少させる。以下の3つのペプチド：PAK株の第128〜142アミノ酸に対応する、長いC末端ペプチド(ペプチド1：アセチル-KCTSDQDEQFIPKGCSK-NH2；配列番号34)(ジスルフィド結合の形成を可能にするためにこのペプチドは酸化された)、第134〜140アミノ酸に対応する、コア・ペプチド(ペプチド2：アセチル-DEQFIPK-NH2；配列番号35)、及びコアと同じアミノ酸組成だが、ごちゃ混ぜにされた配列をもつ、スクランブルされたペプチド(ペプチド3：アセチル-QIDPEFK-NH2；配列番号36)を合成した。安定性を高めるために、これらの合成ペプチドのN末端を、アセチル化し、一方でC末端をアミド化した。これらのペプチドを、Sigma社のGenosysによって注文して合成した。同一ペプチドを、ビオチン標識を伴って合成もした。