【手続補正書】
【提出日】平成17年2月8日(2005.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
【図１】種々のアスパルチル（アスパラギニル）β-ヒドロキシラーゼ（AAH）cDNAによるNIH-3T3細胞の一過性トランスフェクションにより誘導されたコロニー形成を示す棒グラフである。コロニー形成を、10μg DNAによる一過性トランスフェクションによって誘導した。対して、酵素活性を有さない変異体マウスAAH構築物は、形質転換活性を有さない。データは、形質転換病巣平均数±SEMとして示す。
【図２】種々のマウスAAH安定トランスフェクト細胞クローンにより産生されたタンパク質のウェスタンブロットアッセイのデンシトメトリー分析の結果を示す棒グラフである。クローン7および18において、HAAH遺伝子発現の穏やかな増加があり、クローン16においては、より低い程度であったが過剰発現があった。
【図３】図3A〜Bは、HAAH酵素活性に比較したHAAH安定トランスフェクトクローンにより示されたソフトアガーにおけるコロニー形成を示す棒グラフである。図3Aは、クローン7、16、および18におけるマウスAAH酵素活性の測定を示し、そして図3Bは、クローン7、16、および18により示されたコロニー形成を示す。データは、播種10日後のコロニー平均数±SEMとして示す。HAAH酵素活性において穏やかな増大があった（これは、タンパク質発現と相関した）3つのクローンは全て、足場非依存性増殖を示した。
【図４】マウスAAHを過剰発現するトランスフェクトクローンを注射したヌードマウスにおける腫瘍形成を示す棒グラフである。腫瘍増殖は、30日後に評価した。クローン7、16、および18を注射したマウスにおいて観察された平均腫瘍重量を偽DNAトランスフェクトクローンに対して比較した。HAAHを過剰発現するクローンを注射した全ての動物は、腫瘍を発達させた。
【図５】図5A〜Dは、腫瘍細胞侵襲の間に生じるようなニューライト成長（neurite outgrowth）を誘導するためにレチノイン酸（図5A、5B）およびホルボールエステルミリステート（PMA；図5C）で処置したPNET2（図5A、5C）およびSH-Sy5y（図5B）細胞におけるAAH発現の増大を示す棒グラフである。細胞を、0、1、2、3、4、または7日間、10Mレチノイン酸または100nM PMAで処理した。細胞溶解物を、HAAH特異的モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析によって分析し、85kDa AAHタンパク質を検出した。免疫反応性のレベルは、体積デンシトメトリー（任意単位）によって測定した。このグラフは、3つの別個の実験から得られた結果の平均±S.D.を示す。図5Dにおいては、PNET2細胞を、ニューライト収縮を誘導するために致死下濃度のH2O2で24時間処理した。細胞の90％より多くの生存度が、トリパンブルー染料排除によって示された。同様の結果が、SH-Sy5y細胞について観察された。
【図６】抗アポトーシス分子（Bcl-2）、細胞周期有糸分裂インヒビター分子（p16およびp21／Waf1）、および増殖分子（増殖細胞核抗原；PCNA）のレベルに関するAAH過剰発現の効果を示す棒グラフである。PNET2ニューロン細胞をAAHをコードする全長ヒトcDNA（pHAAH）または空ベクター（pcDNA）で安定にトランスフェクトした。AAH遺伝子発現は、CMVプロモーターの制御下にあった。ウェスタンブロット分析を、70〜80パーセントのコンフルエントである培養物から調製した細胞溶解物を用いて実施した。タンパク質ローディングは、各レーンにおいて等価であった。反復ブロットを、異なる抗体を用いてプローブした。棒グラフは、3つの実験において測定したタンパク質発現レベルの平均S.D.を示す。全ての差異は、スチューデントT検定分析によって統計学的に有意である（P＜0.01〜P＜0.001）。
【図７】IRS-1シグナル伝達経路の成分を示す図である。
【図８】GFPを発現するコントロールに比較したアンチセンスHAAH発現細胞において生じた増殖曲線を示す線グラフである。
【図９】hIRS-1タンパク質の機能的ドメインおよび点変異体の構造的構成を示す図である。全ての変異体および「野生型」hIRS-Iタンパク質構築物は、C末端にFLAG（F）エピトープ（DYKDDDDK；配列番号：7）を含む。PHおよびPTBは、それぞれ、プレックストリン（pleckstrin）相同性領域およびホスホチロシン結合領域を示す。
【図１０】AAH cDNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合する位置を示す図である。示した位置は、AAH cDNAのAUG開始部位に対してである。
【図１１】アンチセンスオリゴヌクレオチドDNA分子によるAAH遺伝子発現の阻害を示す電気泳動ゲルの写真である。
【図１２】神経芽細胞腫細胞におけるAAHアンチセンスオリゴヌクレオチド結合を示す線グラフである。
【図１３】神経芽細胞腫細胞へのAAHアンチセンスオリゴヌクレオチド送達の結果としてのAAH遺伝子発現の阻害を示す棒グラフである。
【図１４】図14Aは、NOTCHタンパク質のウェスタンブロットアッセイ発現の写真である。図14Bは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により測定されるようなHes-1遺伝子発現を示す電気泳動ゲルの写真である。図14Cは、IRS-1シグナル伝達が減少する条件下でのNOTCH-1およびJagged-1の発現を示すウェスタンブロットアッセイの写真である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING                               
<110> Rhode Island Hospital
<120> DIAGNOSIS AND TREATMENT OF MALIGNANT NEOPLASMS
<130> MF-A0305
<140> JP   2002-589650
<141> 2002-05-17
<150> US   09/859,604
<151> 2001-05-17
<160> 13                            
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Consensus
EGF-like domain
<220> 
<221> VARIANT
<222> (2)..(8)
<223> Wherein any  Xaa may be any amino acid
<220> 
<221> VARIANT
<222> (10)..(13)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (15)..(24)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (26)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (28)..(35)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<400> 1
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa  
1               5                  10                  15    
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa  
20                  25                  30        
Xaa Xaa Xaa Cys                                                  
35    
<210> 2
<211> 758
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Gln Arg Lys Asn Ala Lys Ser Ser Gly Asn Ser Ser Ser Ser  
1               5                  10                  15    
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Ala Gly Ser Ser Ser Pro Gly Ala  
20                  25                  30        
Arg Arg Glu Thr Lys His Gly Gly His Lys Asn Gly Arg Lys Gly Gly  
35                  40                  45            
Leu Ser Gly Thr Ser Phe Phe Thr Trp Phe Met Val Ile Ala Leu Leu  
50                  55                  60                
Gly Val Trp Thr Ser Val Ala Val Val Trp Phe Asp Leu Val Asp Tyr  
65                  70                  75                  80
Glu Glu Val Leu Gly Lys Leu Gly Ile Tyr Asp Ala Asp Gly Asp Gly  
85                  90                  95    
Asp Phe Asp Val Asp Asp Ala Lys Val Leu Leu Gly Leu Lys Glu Arg  
100                 105                 110        
Ser Thr Ser Glu Pro Ala Val Pro Pro Glu Glu Ala Glu Pro His Thr  
115                 120                 125            
Glu Pro Glu Glu Gln Val Pro Val Glu Ala Glu Pro Gln Asn Ile Glu  
130                 135                 140                
Asp Glu Ala Lys Glu Gln Ile Gln Ser Leu Leu His Glu Met Val His  
145                 150                 155                 160
Ala Glu His Val Glu Gly Glu Asp Leu Gln Gln Glu Asp Gly Pro Thr  
165                 170                 175    
Gly Glu Pro Gln Gln Glu Asp Asp Glu Phe Leu Met Ala Thr Asp Val  
180                 185                 190        
Asp Asp Arg Phe Glu Thr Leu Glu Pro Glu Val Ser His Glu Glu Thr  
195                 200                 205            
Glu His Ser Tyr His Val Glu Glu Thr Val Ser Gln Asp Cys Asn Gln  
210                 215                 220                
Asp Met Glu Glu Met Met Ser Glu Gln Glu Asn Pro Asp Ser Ser Glu  
225                 230                 235                 240
Pro Val Val Glu Asp Glu Arg Leu His His Asp Thr Asp Asp Val Thr  
245                 250                 255    
Tyr Gln Val Tyr Glu Glu Gln Ala Val Tyr Glu Pro Leu Glu Asn Glu  
260                 265                 270        
Gly Ile Glu Ile Thr Glu Val Thr Ala Pro Pro Glu Asp Asn Pro Val  
275                 280                 285            
Glu Asp Ser Gln Val Ile Val Glu Glu Val Ser Ile Phe Pro Val Glu  
290                 295                 300                
Glu Gln Gln Glu Val Pro Pro Glu Thr Asn Arg Lys Thr Asp Asp Pro  
305                 310                 315                 320
Glu Gln Lys Ala Lys Val Lys Lys Lys Lys Pro Lys Leu Leu Asn Lys  
325                 330                 335    
Phe Asp Lys Thr Ile Lys Ala Glu Leu Asp Ala Ala Glu Lys Leu Arg  
340                 345                 350        
Lys Arg Gly Lys Ile Glu Glu Ala Val Asn Ala Phe Lys Glu Leu Val  
355                 360                 365            
Arg Lys Tyr Pro Gln Ser Pro Arg Ala Arg Tyr Gly Lys Ala Gln Cys  
370                 375                 380                
Glu Asp Asp Leu Ala Glu Lys Arg Arg Ser Asn Glu Val Leu Arg Gly  
385                 390                 395                 400
Ala Ile Glu Thr Tyr Gln Glu Val Ala Ser Leu Pro Asp Val Pro Ala  
405                 410                 415    
Asp Leu Leu Lys Leu Ser Leu Lys Arg Arg Ser Asp Arg Gln Gln Phe  
420                 425                 430        
Leu Gly His Met Arg Gly Ser Leu Leu Thr Leu Gln Arg Leu Val Gln  
435                 440                 445            
Leu Phe Pro Asn Asp Thr Ser Leu Lys Asn Asp Leu Gly Val Gly Tyr  
450                 455                 460                
Leu Leu Ile Gly Asp Asn Asp Asn Ala Lys Lys Val Tyr Glu Glu Val  
465                 470                 475                 480
Leu Ser Val Thr Pro Asn Asp Gly Phe Ala Lys Val His Tyr Gly Phe  
485                 490                 495    
Ile Leu Lys Ala Gln Asn Lys Ile Ala Glu Ser Ile Pro Tyr Leu Lys  
500                 505                 510        
Glu Gly Ile Glu Ser Gly Asp Pro Gly Thr Asp Asp Gly Arg Phe Tyr  
515                 520                 525            
Phe His Leu Gly Asp Ala Met Gln Arg Val Gly Asn Lys Glu Ala Tyr  
530                 535                 540                
Lys Trp Tyr Glu Leu Gly His Lys Arg Gly His Phe Ala Ser Val Trp  
545                 550                 555                 560
Gln Arg Ser Leu Tyr Asn Val Asn Gly Leu Lys Ala Gln Pro Trp Trp  
565                 570                 575    
Thr Pro Lys Glu Thr Gly Tyr Thr Glu Leu Val Lys Ser Leu Glu Arg  
580                 585                 590        
Asn Trp Lys Leu Ile Arg Asp Glu Gly Leu Ala Val Met Asp Lys Ala  
595                 600                 605            
Lys Gly Leu Phe Leu Pro Glu Asp Glu Asn Leu Arg Glu Lys Gly Asp  
610                 615                 620                
Trp Ser Gln Phe Thr Leu Trp Gln Gln Gly Arg Arg Asn Glu Asn Ala  
625                 630                 635                 640
Cys Lys Gly Ala Pro Lys Thr Cys Thr Leu Leu Glu Lys Phe Pro Glu  
645                 650                 655    
Thr Thr Gly Cys Arg Arg Gly Gln Ile Lys Tyr Ser Ile Met His Pro  
660                 665                 670        
Gly Thr His Val Trp Pro His Thr Gly Pro Thr Asn Cys Arg Leu Arg  
675                 680                 685            
Met His Leu Gly Leu Val Ile Pro Lys Glu Gly Cys Lys Ile Arg Cys  
690                 695                 700                
Ala Asn Glu Thr Arg Thr Trp Glu Glu Gly Lys Val Leu Ile Phe Asp  
705                 710                 715                 720
Asp Ser Phe Glu His Glu Val Trp Gln Asp Ala Ser Ser Phe Arg Leu  
725                 730                 735    
Ile Phe Ile Val Asp Val Trp His Pro Glu Leu Thr Pro Gln Gln Arg  
740                 745                 750        
Arg Ser Leu Pro Ala Ile                                          
755            
<210> 3
<211> 2324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cggaccgtgc aatggcccag cgtaagaatg ccaagagcag cggcaacagc agcagcagcg 60    
gctccggcag cggtagcacg agtgcgggca gcagcagccc cggggcccgg agagagacaa 120   
agcatggagg acacaagaat gggaggaaag gcggactctc gggaacttca ttcttcacgt 180   
ggtttatggt gattgcattg ctgggcgtct ggacatctgt agctgtcgtt tggtttgatc 240   
ttgttgacta tgaggaagtt ctaggaaaac taggaatcta tgatgctgat ggtgatggag 300   
attttgatgt ggatgatgcc aaagttttat taggacttaa agagagatct acttcagagc 360   
cagcagtccc gccagaagag gctgagccac acactgagcc cgaggagcag gttcctgtgg 420   
aggcagaacc ccagaatatc gaagatgaag caaaagaaca aattcagtcc cttctccatg 480   
aaatggtaca cgcagaacat gttgagggag aagacttgca acaagaagat ggacccacag 540   
gagaaccaca acaagaggat gatgagtttc ttatggcgac tgatgtagat gatagatttg 600   
agaccctgga acctgaagta tctcatgaag aaaccgagca tagttaccac gtggaagaga 660   
cagtttcaca agactgtaat caggatatgg aagagatgat gtctgagcag gaaaatccag 720   
attccagtga accagtagta gaagatgaaa gattgcacca tgatacagat gatgtaacat 780   
accaagtcta tgaggaacaa gcagtatatg aacctctaga aaatgaaggg atagaaatca 840   
cagaagtaac tgctccccct gaggataatc ctgtagaaga ttcacaggta attgtagaag 900   
aagtaagcat ttttcctgtg gaagaacagc aggaagtacc accagaaaca aatagaaaaa 960   
cagatgatcc agaacaaaaa gcaaaagtta agaaaaagaa gcctaaactt ttaaataaat 1020  
ttgataagac tattaaagct gaacttgatg ctgcagaaaa actccgtaaa aggggaaaaa 1080  
ttgaggaagc agtgaatgca tttaaagaac tagtacgcaa ataccctcag agtccacgag 1140  
caagatatgg gaaggcgcag tgtgaggatg atttggctga gaagaggaga agtaatgagg 1200  
tgctacgtgg agccatcgag acctaccaag aggtggccag cctacctgat gtccctgcag 1260  
acctgctgaa gctgagtttg aagcgtcgct cagacaggca acaatttcta ggtcatatga 1320  
gaggttccct gcttaccctg cagagattag ttcaactatt tcccaatgat acttccttaa 1380  
aaaatgacct tggcgtggga tacctcttga taggagataa tgacaatgca aagaaagttt 1440  
atgaagaggt gctgagtgtg acacctaatg atggctttgc taaagtccat tatggcttca 1500  
tcctgaaggc acagaacaaa attgctgaga gcatcccata tttaaaggaa ggaatagaat 1560  
ccggagatcc tggcactgat gatgggagat tttatttcca cctgggggat gccatgcaga 1620  
gggttgggaa caaagaggca tataagtggt atgagcttgg gcacaagaga ggacactttg 1680  
catctgtctg gcaacgctca ctctacaatg tgaatggact gaaagcacag ccttggtgga 1740  
ccccaaaaga aacgggctac acagagttag taaagtcttt agaaagaaac tggaagttaa 1800  
tccgagatga aggccttgca gtgatggata aagccaaagg tctcttcctg cctgaggatg 1860  
aaaacctgag ggaaaaaggg gactggagcc agttcacgct gtggcagcaa ggaagaagaa 1920  
atgaaaatgc ctgcaaagga gctcctaaaa cctgtacctt actagaaaag ttccccgaga 1980  
caacaggatg cagaagagga cagatcaaat attccatcat gcaccccggg actcacgtgt 2040  
ggccgcacac agggcccaca aactgcaggc tccgaatgca cctgggcttg gtgattccca 2100  
aggaaggctg caagattcga tgtgccaacg agaccaggac ctgggaggaa ggcaaggtgc 2160  
tcatctttga tgactccttt gagcacgagg tatggcagga tgcctcatct ttccggctga 2220  
tattcatcgt ggatgtgtgg catccggaac tgacaccaca gcagagacgc agccttccag 2280  
caatttagca tgaattcatg caagcttggg aaactctgga gaga                  2324  
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: EGF-like
cysteine-rich repeat
<220> 
<221> VARIANT
<222> (2)..(5)
<223> Wherein any Xaa may be any amino acid
<220> 
<221> VARIANT
<222> (7)..(8)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (10)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (14)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (17)..(18)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (25)..(26)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<220> 
<221> VARIANT
<222> (29)
<223> Wherein Xaa is any amino acid.
<400> 4
Cys Asp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Lys Xaa Gly Asn Gly Xaa Cys Asp  
1               5                  10                  15    
Xaa Xaa Cys Asn Asn Ala Ala Cys Xaa Xaa Asp Gly Xaa Asp Cys      
20                  25                  30    
<210> 5
<211> 1242
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Ala Ser Pro Pro Glu Ser Asp Gly Phe Ser Asp Val Arg Lys Val  
1               5                  10                  15    
Gly Tyr Leu Arg Lys Pro Lys Ser Met His Lys Arg Phe Phe Val Leu  
20                  25                  30        
Arg Ala Ala Ser Glu Ala Gly Gly Pro Ala Arg Leu Glu Tyr Tyr Glu  
35                  40                  45            
Asn Glu Lys Lys Trp Arg His Lys Ser Ser Ala Pro Lys Arg Ser Ile  
50                  55                  60                
Pro Leu Glu Ser Cys Phe Asn Ile Asn Lys Arg Ala Asp Ser Lys Asn  
65                  70                  75                  80
Lys His Leu Val Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Glu His Phe Ala Ile Ala  
85                  90                  95    
Ala Asp Ser Glu Ala Glu Gln Asp Ser Trp Tyr Gln Ala Leu Leu Gln  
100                 105                 110        
Leu His Asn Arg Ala Lys Gly His His Asp Gly Ala Ala Ala Leu Gly  
115                 120                 125            
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Ser Ser Gly Leu Gly Glu  
130                 135                 140                
Ala Gly Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Val Pro Pro Gly Pro Ala Phe  
145                 150                 155                 160
Lys Glu Val Trp Gln Val Ile Leu Lys Pro Lys Gly Leu Gly Gln Thr  
165                 170                 175    
Lys Asn Leu Ile Gly Ile Tyr Arg Leu Cys Leu Thr Ser Lys Thr Ile  
180                 185                 190        
Ser Phe Val Lys Leu Asn Ser Glu Ala Ala Ala Val Val Leu Gln Leu  
195                 200                 205            
Met Asn Ile Arg Arg Cys Gly His Ser Glu Asn Phe Phe Phe Ile Glu  
210                 215                 220                
Val Gly Arg Ser Ala Val Thr Gly Pro Gly Glu Phe Trp Met Gln Val  
225                 230                 235                 240
Asp Asp Ser Val Val Ala Gln Asn Met His Glu Thr Ile Leu Glu Ala  
245                 250                 255    
Met Arg Ala Met Ser Asp Glu Phe Arg Pro Arg Ser Lys Ser Gln Ser  
260                 265                 270        
Ser Ser Asn Cys Ser Asn Pro Ile Ser Val Pro Leu Arg Arg His His  
275                 280                 285            
Leu Asn Asn Pro Pro Pro Ser Gln Val Gly Leu Thr Arg Arg Ser Arg  
290                 295                 300                
Thr Glu Ser Ile Thr Ala Thr Ser Pro Ala Ser Met Val Gly Gly Lys  
305                 310                 315                 320
Pro Gly Ser Phe Arg Val Arg Ala Ser Ser Asp Gly Glu Gly Thr Met  
325                 330                 335    
Ser Arg Pro Ala Ser Val Asp Gly Ser Pro Val Ser Pro Ser Thr Asn  
340                 345                 350        
Arg Thr His Ala His Arg His Arg Gly Ser Ala Arg Leu His Pro Pro  
355                 360                 365            
Leu Asn His Ser Arg Ser Ile Pro Met Pro Ala Ser Arg Cys Ser Pro  
370                 375                 380                
Ser Ala Thr Ser Pro Val Ser Leu Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly His  
385                 390                 395                 400
Gly Ser Thr Ser Asp Cys Leu Phe Pro Arg Arg Ser Ser Ala Ser Val  
405                 410                 415    
Ser Gly Ser Pro Ser Asp Gly Gly Phe Ile Ser Ser Asp Glu Tyr Gly  
420                 425                 430        
Ser Ser Pro Cys Asp Phe Arg Ser Ser Phe Arg Ser Val Thr Pro Asp  
435                 440                 445            
Ser Leu Gly His Thr Pro Pro Ala Arg Gly Glu Glu Glu Leu Ser Asn  
450                 455                 460                
Tyr Ile Cys Met Gly Gly Lys Gly Pro Ser Thr Leu Thr Ala Pro Asn  
465                 470                 475                 480
Gly His Tyr Ile Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gly His Arg Cys Thr Pro  
485                 490                 495    
Gly Thr Gly Leu Gly Thr Ser Pro Ala Leu Ala Gly Asp Glu Ala Ala  
500                 505                 510        
Ser Ala Ala Asp Leu Asp Asn Arg Phe Arg Lys Arg Thr His Ser Ala  
515                 520                 525            
Gly Thr Ser Pro Thr Ile Thr His Gln Lys Thr Pro Ser Gln Ser Ser  
530                 535                 540                
Val Ala Ser Ile Glu Glu Tyr Thr Glu Met Met Pro Ala Tyr Pro Pro  
545                 550                 555                 560
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Leu Pro Gly His Arg His Ser Ala Phe  
565                 570                 575    
Val Pro Thr Arg Ser Tyr Pro Glu Glu Gly Leu Glu Met His Pro Leu  
580                 585                 590        
Glu Arg Arg Gly Gly His His Arg Pro Asp Ser Ser Thr Leu His Thr  
595                 600                 605            
Asp Asp Gly Tyr Met Pro Met Ser Pro Gly Val Ala Pro Val Pro Ser  
610                 615                 620                
Gly Arg Lys Gly Ser Gly Asp Tyr Met Pro Met Ser Pro Lys Ser Val  
625                 630                 635                 640
Ser Ala Pro Gln Gln Ile Ile Asn Pro Ile Arg Arg His Pro Gln Arg  
645                 650                 655    
Val Asp Pro Asn Gly Tyr Met Met Met Ser Pro Ser Gly Gly Cys Ser  
660                 665                 670        
Pro Asp Ile Gly Gly Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala  
675                 680                 685            
Val Pro Ser Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Trp Thr Asn Gly Val Gly  
690                 695                 700                
Gly His His Ser His Val Leu Pro His Pro Lys Pro Pro Val Glu Ser  
705                 710                 715                 720
Ser Gly Gly Lys Leu Leu Pro Cys Thr Gly Asp Tyr Met Asn Met Ser  
725                 730                 735    
Pro Val Gly Asp Ser Asn Thr Ser Ser Pro Ser Asp Cys Tyr Tyr Gly  
740                 745                 750        
Pro Glu Asp Pro Gln His Lys Pro Val Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Pro  
755                 760                 765            
Arg Ser Phe Lys His Thr Gln Arg Pro Gly Glu Pro Glu Glu Gly Ala  
770                 775                 780                
Arg His Gln His Leu Arg Leu Ser Thr Ser Ser Gly Arg Leu Leu Tyr  
785                 790                 795                 800
Ala Ala Thr Ala Asp Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Asp Ser Leu  
805                 810                 815    
Gly Gly Gly Tyr Cys Gly Ala Arg Leu Glu Pro Ser Leu Pro His Pro  
820                 825                 830        
His His Gln Val Leu Gln Pro His Leu Pro Arg Lys Val Asp Thr Ala  
835                 840                 845            
Ala Gln Thr Asn Ser Arg Leu Ala Arg Pro Thr Arg Leu Ser Leu Gly  
850                 855                 860                
Asp Pro Lys Ala Ser Thr Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gln Gln Gln Gln  
865                 870                 875                 880
Gln Gln Pro Leu Leu His Pro Pro Glu Pro Lys Ser Pro Gly Glu Tyr  
885                 890                 895    
Val Asn Ile Glu Phe Gly Ser Asp Gln Ser Gly Tyr Leu Ser Gly Pro  
900                 905                 910        
Val Ala Phe His Ser Ser Pro Ser Val Arg Cys Pro Ser Gln Leu Gln  
915                 920                 925            
Pro Ala Pro Arg Glu Glu Glu Thr Gly Thr Glu Glu Tyr Met Lys Met  
930                 935                 940                
Asp Leu Gly Pro Gly Arg Arg Ala Ala Trp Gln Glu Ser Thr Gly Val  
945                 950                 955                 960
Glu Met Gly Arg Leu Gly Pro Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ser Ile Cys  
965                 970                 975    
Arg Pro Thr Arg Ala Val Pro Ser Ser Arg Gly Asp Tyr Met Thr Met  
980                 985                 990        
Gln Met Ser Cys Pro Arg Gln Ser Tyr Val Asp Thr Ser Pro Ala Ala  
995                1000                1005            
Pro Val Ser Tyr Ala Asp Met Arg Thr Gly Ile Ala Ala Glu Glu Val  
1010                1015                1020                
Ser Leu Pro Arg Ala Thr Met Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala  
1025               1030                1035                1040
Ser Ala Ser Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ala Ala Glu Leu Ala Ala His  
1045                1050                1055    
Ser Ser Leu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Met Ser Ala Phe  
1060                1065                1070        
Thr Arg Val Asn Leu Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ser Ala Lys Val Ile  
1075                1080                1085            
Arg Ala Asp Pro Gln Gly Cys Arg Arg Arg His Ser Ser Glu Thr Phe  
1090                1095                1100                
Ser Ser Thr Pro Ser Ala Thr Arg Val Gly Asn Thr Val Pro Phe Gly  
1105               1110                1115                1120
Ala Gly Ala Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Glu  
1125                1130                1135    
Asp Val Lys Arg His Ser Ser Ala Ser Phe Glu Asn Val Trp Leu Arg  
1140                1145                1150        
Pro Gly Glu Leu Gly Gly Ala Pro Lys Glu Pro Ala Lys Leu Cys Gly  
1155                1160                1165            
Ala Ala Gly Gly Leu Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp Leu  
1170                1175                1180                
Val Lys Asp Phe Lys Gln Cys Pro Gln Glu Cys Thr Pro Glu Pro Gln  
1185               1190                1195                1200
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Gln Pro Leu Gly Ser Gly Glu Ser  
1205                1210                1215    
Ser Ser Thr Arg Arg Ser Ser Glu Asp Leu Ser Ala Tyr Ala Ser Ile  
1220                1225                1230        
Ser Phe Gln Lys Gln Pro Glu Asp Arg Gln                          
1235                1240        
<210> 6
<211> 5828
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
cggcggcgcg gtcggagggg gccggcgcgc agagccagac gccgccgctt gttttggttg 60    
gggctctcgg caactctccg aggaggagga ggaggaggga ggaggggaga agtaactgca 120   
gcggcagcgc cctcccgagg aacaggcgtc ttccccgaac ccttcccaaa cctcccccat 180   
cccctctcgc ccttgtcccc tcccctcctc cccagccgcc tggagcgagg ggcagggatg 240   
agtctgtccc tccggccggt ccccagctgc agtggctgcc cggtatcgtt tcgcatggaa 300   
aagccacttt ctccacccgc cgagatgggc ccggatgggg ctgcagagga cgcgcccgcg 360   
ggcggcggca gcagcagcag cagcagcagc agcaacagca acagccgcag cgccgcggtc 420   
tctgcgactg agctggtatt tgggcggctg gtggcggctg ggacggttgg ggggtgggag 480   
gaggcgaagg aggagggaga accccgtgca acgttgggac ttggcaaccc gcctccccct 540   
gcccaaggat atttaatttg cctcgggaat cgctgcttcc agaggggaac tcaggaggga 600   
aggcgcgcgc gcgcgcgcgc tcctggaggg gcaccgcagg gacccccgac tgtcgcctcc 660   
ctgtgccgga ctccagccgg ggcgacgaga gatgcatctt cgctccttcc tggtggcggc 720   
ggcggctgag aggagacttg gctctcggag gatcggggct gccctcaccc cggacgcact 780   
gcctccccgc cggcgtgaag cgcccgaaaa ctccggtcgg gctctctcct gggctcagca 840   
gctgcgtcct ccttcagctg cccctccccg gcgcgggggg cggcgtggat ttcagagtcg 900   
gggtttctgc tgcctccagc cctgtttgca tgtgccgggc cgcggcgagg agcctccgcc 960   
ccccacccgg ttgtttttcg gagcctccct ctgctcagcg ttggtggtgg cggtggcagc 1020  
atggcgagcc ctccggagag cgatggcttc tcggacgtgc gcaaggtggg ctacctgcgc 1080  
aaacccaaga gcatgcacaa acgcttcttc gtactgcgcg cggccagcga ggctgggggc 1140  
ccggcgcgcc tcgagtacta cgagaacgag aagaagtggc ggcacaagtc gagcgccccc 1200  
aaacgctcga tcccccttga gagctgcttc aacatcaaca agcgggctga ctccaagaac 1260  
aagcacctgg tggctctcta cacccgggac gagcactttg ccatcgcggc ggacagcgag 1320  
gccgagcaag acagctggta ccaggctctc ctacagctgc acaaccgtgc taagggccac 1380  
cacgacggag ctgcggccct cggggcggga ggtggtgggg gcagctgcag cggcagctcc 1440  
ggccttggtg aggctgggga ggacttgagc tacggtgacg tgcccccagg acccgcattc 1500  
aaagaggtct ggcaagtgat cctgaagccc aagggcctgg gtcagacaaa gaacctgatt 1560  
ggtatctacc gcctttgcct gaccagcaag accatcagct tcgtgaagct gaactcggag 1620  
gcagcggccg tggtgctgca gctgatgaac atcaggcgct gtggccactc ggaaaacttc 1680  
ttcttcatcg aggtgggccg ttctgccgtg acggggcccg gggagttctg gatgcaggtg 1740  
gatgactctg tggtggccca gaacatgcac gagaccatcc tggaggccat gcgggccatg 1800  
agtgatgagt tccgccctcg cagcaagagc cagtcctcgt ccaactgctc taaccccatc 1860  
agcgtccccc tgcgccggca ccatctcaac aatcccccgc ccagccaggt ggggctgacc 1920  
cgccgatcac gcactgagag catcaccgcc acctccccgg ccagcatggt gggcgggaag 1980  
ccaggctcct tccgtgtccg cgcctccagt gacggcgaag gcaccatgtc ccgcccagcc 2040  
tcggtggacg gcagccctgt gagtcccagc accaacagaa cccacgccca ccggcatcgg 2100  
ggcagcgccc ggctgcaccc cccgctcaac cacagccgct ccatccccat gccggcttcc 2160  
cgctgctcgc cttcggccac cagcccggtc agtctgtcgt ccagtagcac cagtggccat 2220  
ggctccacct cggattgtct cttcccacgg cgatctagtg cttcggtgtc tggttccccc 2280  
agcgatggcg gtttcatctc ctcggatgag tatggctcca gtccctgcga tttccggagt 2340  
tccttccgca gtgtcactcc ggattccctg ggccacaccc caccagcccg cggtgaggag 2400  
gagctaagca actatatctg catgggtggc aaggggccct ccaccctgac cgcccccaac 2460  
ggtcactaca ttttgtctcg gggtggcaat ggccaccgct gcaccccagg aacaggcttg 2520  
ggcacgagtc cagccttggc tggggatgaa gcagccagtg ctgcagatct ggataatcgg 2580  
ttccgaaaga gaactcactc ggcaggcaca tcccctacca ttacccacca gaagaccccg 2640  
tcccagtcct cagtggcttc cattgaggag tacacagaga tgatgcctgc ctacccacca 2700  
ggaggtggca gtggaggccg actgccggga cacaggcact ccgccttcgt gcccacccgc 2760  
tcctacccag aggagggtct ggaaatgcac cccttggagc gtcggggggg gcaccaccgc 2820  
ccagacagct ccaccctcca cacggatgat ggctacatgc ccatgtcccc aggggtggcc 2880  
ccagtgccca gtggccgaaa gggcagtgga gactatatgc ccatgagccc caagagcgta 2940  
tctgccccac agcagatcat caatcccatc agacgccatc cccagagagt ggaccccaat 3000  
ggctacatga tgatgtcccc cagcggtggc tgctctcctg acattggagg tggccccagc 3060  
agcagcagca gcagcagcaa cgccgtccct tccgggacca gctatggaaa gctgtggaca 3120  
aacggggtag ggggccacca ctctcatgtc ttgcctcacc ccaaaccccc agtggagagc 3180  
agcggtggta agctcttacc ttgcacaggt gactacatga acatgtcacc agtgggggac 3240  
tccaacacca gcagcccctc cgactgctac tacggccctg aggaccccca gcacaagcca 3300  
gtcctctcct actactcatt gccaagatcc tttaagcaca cccagcgccc cggggagccg 3360  
gaggagggtg cccggcatca gcacctccgc ctttccacta gctctggtcg ccttctctat 3420  
gctgcaacag cagatgattc ttcctcttcc accagcagcg acagcctggg tgggggatac 3480  
tgcggggcta ggctggagcc cagccttcca catccccacc atcaggttct gcagccccat 3540  
ctgcctcgaa aggtggacac agctgctcag accaatagcc gcctggcccg gcccacgagg 3600  
ctgtccctgg gggatcccaa ggccagcacc ttacctcggg cccgagagca gcagcagcag 3660  
cagcagccct tgctgcaccc tccagagccc aagagcccgg gggaatatgt caatattgaa 3720  
tttgggagtg atcagtctgg ctacttgtct ggcccggtgg ctttccacag ctcaccttct 3780  
gtcaggtgtc catcccagct ccagccagct cccagagagg aagagactgg cactgaggag 3840  
tacatgaaga tggacctggg gccgggccgg agggcagcct ggcaggagag cactggggtc 3900  
gagatgggca gactgggccc tgcacctccc ggggctgcta gcatttgcag gcctacccgg 3960  
gcagtgccca gcagccgggg tgactacatg accatgcaga tgagttgtcc ccgtcagagc 4020  
tacgtggaca cctcgccagc tgcccctgta agctatgctg acatgcgaac aggcattgct 4080  
gcagaggagg tgagcctgcc cagggccacc atggctgctg cctcctcatc ctcagcagcc 4140  
tctgcttccc cgactgggcc tcaaggggca gcagagctgg ctgcccactc gtccctgctg 4200  
gggggcccac aaggacctgg gggcatgagc gccttcaccc gggtgaacct cagtcctaac 4260  
cgcaaccaga gtgccaaagt gatccgtgca gacccacaag ggtgccggcg gaggcatagc 4320  
tccgagactt tctcctcaac acccagtgcc acccgggtgg gcaacacagt gccctttgga 4380  
gcgggggcag cagtaggggg cggtggcggt agcagcagca gcagcgagga tgtgaaacgc 4440  
cacagctctg cttcctttga gaatgtgtgg ctgaggcctg gggagcttgg gggagccccc 4500  
aaggagccag ccaaactgtg tggggctgct gggggtttgg agaatggtct taactacata 4560  
gacctggatt tggtcaagga cttcaaacag tgccctcagg agtgcacccc tgaaccgcag 4620  
cctcccccac ccccaccccc tcatcaaccc ctgggcagcg gtgagagcag ctccacccgc 4680  
cgctcaagtg aggatttaag cgcctatgcc agcatcagtt tccagaagca gccagaggac 4740  
cgtcagtagc tcaactggac atcacagcag aatgaagacc taaatgacct cagcaaatcc 4800  
tcttctaact catgggtacc cagactctaa atatttcatg attcacaact aggacctcat 4860  
atcttcctca tcagtagatg gtacgatgca tccatttcag tttgtttact ttatccaatc 4920  
ctcaggattt cattgactga actgcacgtt ctatattgtg ccaagcgaaa aaaaaaaatg 4980  
cactgtgaca ccagaataat gagtctgcat aaacttcatc ttcaacctta aggacttagc 5040  
tggccacagt gagctgatgt gcccaccacc gtgtcatgag agaatgggtt tactctcaat 5100  
gcattttcaa gatacatttc atctgctgct gaaactgtgt acgacaaagc atcattgtaa 5160  
attatttcat acaaaactgt tcacgttggg tggagagagt attaaatatt taacataggt 5220  
tttgatttat atgtgtaatt ttttaaatga aaatgtaact tttcttacag cacatctttt 5280  
ttttggatgt gggatggagg tatacaatgt tctgttgtaa agagtggagc aaatgcttaa 5340  
aacaaggctt aaaagagtag aatagggtat gatccttgtt ttaagattgt aattcagaaa 5400  
acataatata agaatcatag tgccatagat ggttctcaat tgtatagtta tatttgctga 5460  
tactatctct tgtcatataa acctgatgtt gagctgagtt ccttataaga attaatctta 5520  
attttgtatt ttttcctgta agacaatagg ccatgttaat taaactgaag aaggatatat 5580  
ttggctgggt gttttcaaat gtcagcttaa aattggtaat tgaatggaag caaaattata 5640  
agaagaggaa attaaagtct tccattgcat gtattgtaaa cagaaggaga tgggtgattc 5700  
cttcaattca aaagctctct ttggaatgaa caatgtgggc gtttgtaaat tctggaaatg 5760  
tctttctatt cataataaac tagatactgt tgatctttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5820  
aaaaaaaa                                                          5828  
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: FLAG epitope
<400> 7
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys                                  
1               5            
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:Mutagenesis
primer
<400> 8
gggggaattt gtcaata                                                17    
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:Mutagenesis
primer
<400> 9
gaatttgtta atattg                                                 16    
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:Location (-1)
oligonucleotide
<400> 10
cattcttacg ctgggccatt                                             20    
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:Location (-6)
oligonucleotide
<400> 11
ttacgctggg ccattgcacg                                             20    
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:Locations (-11)
oligonucleotide
<400> 12
ctgggccatt gcacggtccg                                             20    
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:Sense
Oligonucleotide
<400> 13
atcatgcaat ggcccagcgt aa                                          22