【手続補正書】
【提出日】平成15年8月19日(2003.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物であって：
【化１】
2003522247.tif 000001
式中、Ｄ１及びＤ２は、検出可能な分子であり、そして
Ｄ１は対照分子であり、
Ｄ２は環境感受性な分子であり、そして
Ｌはリンカー基である、化合物。
【請求項２】
式Ｉの化合物であって：
【化２】
2003522247.tif 000002
ここで、Ｄ１及びＤ２は検出可能なフルオロホアであり、そして
Ｄ１は対照分子であり、そして
Ｄ２は環境感受性な分子であり、
Ｌはリンカー基であり、そして
Ｄ１とＤ２の間のエネルギー転移が本質的にないことを特徴とする、化合物。
【請求項３】
Ｄ１及びＤ２が分光学特徴を有し、その結果放射スペクトルＤ１及びＤ２の吸収スペクトルの間のオーバーラップが本質的にない、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｄ２が、環境感受性のＣｙdye、Ｆｕｒａ２、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、Ｑｕｉｎ２、Sodium Green、Magnesium Green、Calcium Crimson、Mag-Fluo-4、Newport Green(K+)、Ｎ−（６−メトキシ−８−キノイル）−ｐトルエンスルホンアミド（Ｚｎ２＋のためのＴＳＱ）、PhenGreen PL(Cu2+)、ＳＰＱ（Ｃｌ−検出のための６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム）、１，２ジアミノアントラキノン及びＤｉＢＡＣ４から選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｌが、幾つかのアミン標識部位を含むアミノ酸から選択される、請求項１ないし４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ０が３０−６０オングストロームの範囲内である、請求項１ないし５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｌが、生物分子にコンジュゲートされることができる、反応性基をさらに含む、請求項１ないし６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
当該反応性基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、マレイミド、ヨードアセトアミドおよびヒドラジドから選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｌが切断可能基である、請求項１ないし８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
式ＩＩを有する請求項２に記載の化合物。
【化３】
2003522247.tif 000003
【請求項１１】
当該化合物が細胞透過性である、請求項１ないし１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の化合物を使用する環境条件の変化を検出する方法。
【請求項１３】
ａ）検出されるべき環境シグナルの存在又は想定される存在下での、式Ｉの化合物の蛍光放射を測定するステップ；及び
ｂ）当該環境シグナルの不存在下での、式Ｉの化合物の蛍光放射と比較するステップ
のステップを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）λ１及びλ２の２つの異なる波長の光で式Ｉの化合物を励起し、ここで該波長は、フルオロホアＤ１及びＤ２に対応するフルオロホアからの蛍光放射を発する（elicit）のに好適であるように選択されている、ステップ、
ｂ）波長λ３のＤ１からの蛍光放射及び波長λ４のＤ２からの蛍光放射を測定するステップ、
ｃ）式Ｉの化合物を適当な環境シグナルに導入するステップ、
ｄ）励起ステップａ）及び測定ステップｂ）を反復するステップ、
ｅ）λ３：λ４の強度の比率を決定し、そしてそれを、環境シグナルの不存在下での式Ｉの化合物のλ３：λ４比率と比較するステップ、
のステップを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光放射の測定が、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、ミクロプレートリーディング、ＣＣＤイメージング又はフローサイトメトリーによるものである、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
区別可能な波長でのＤ１及びＤ２の励起が、同時的に実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
環境条件の変化を追跡するために、蛍光放射を経時的に連続的に監視する、請求項１２ないし１６のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
好適には、対照分子又は環境感受性の分子は、任意の好適な検出方法、例えば、比色、蛍光、りん光、発光、ＩＲ，ラマン、ＮＭＲ又はスピンラベル検出によって検出可能であり得る。別の実施態様では、Ｄ１及びＤ２のための適当な検出方法は同じである必要はない。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
検出可能な環境条件は、ｐＨの変化、イオン濃度の変化及び酵素の存在を含む。
好適には、環境感受性の分子であるＤ２は、ｐＨ変化により蛍光が変化する色素、例えばｐＨ感受性Ｃｙdyes（Cooper et al. J. Chem. Soc. Chem. Comm. 2000, 2323-2324）、酵素活性により蛍光が変化する色素、イオン濃度により蛍光が変化する色素（例えばキレート化色素、Ｆｕｒａ２、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、Ｑｕｉｎ２、Sodium Green、Magnesium Green、Calcium Crimson、Mag-Fluo-4、Newport Green(K+)、Ｎ−（６−メトキシ−８−キノイル）−ｐトルエンスルホンアミド（Ｚｎ２＋のためのＴＳＱ）、PhenGreen PL(Cu2+)、ＳＰＱ（Ｃｌ−検出のための６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム）、１，２ジアミノアントラキノン及びＤｉＢＡＣ４及び共有的修飾、例えば、ホスホリル化、脂質修飾及びその他により蛍光が変化する色素、から選択される。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
リンカー基Ｌは、Ｄ１及びＤ２の両方を共有的に連結する化学的付加として特徴付けられ得る。
好ましくはこれは、２つの色素を有限の距離内であるが、色素の分光学的特性に影響がない様に、保持する基として作用し得る。有限の距離内にプローブを保つことは、濃度の関数としてなされるべきプローブ間のスペクトル比較を可能とし、そしてこうしてレシオメトリック測定を可能とする。
リンカー基は、２つの色素の双極分子−双極分子相互作用、その結果のエネルギー転移が最小化され、そして色素が互いに独立的に作用するように、特定の配向のエネルギー転移が可能である２つの区別できる色素を保持するために作用し得る。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
エネルギー転移は、互いに短い距離内にある、２つのプローブの間の励起状態エネルギーの転移である。エネルギー転移が電子的に励起された分子から基底状態分子に起こる場合、又は短い範囲内の２つの分子、例えば２つの隣接する色素の間で光量子が放射されそして再吸収される場合、これは、衝突転移によってFoesterエネルギー転移によって起こり得る。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
好ましい実施態様では、式Ｉの化合物はｐＨ感受性でそして、したがって酸小胞を介して容易化される細胞表面レセプターのアゴニスト誘導性インターナリゼーションの測定に好適であり得る。これは幾つかのやり方で実施することができる。これらやり方のひとつは、（特定のレセプターを発現している細胞の）細胞表面を式Ｉの化合物で、反応性エステル、例えば、ＮＨＳを介して、又は他の手段によって標識し、それから細胞をレセプターのインターナリゼーションを誘導するアゴニスト又は他のリガンドによって処理することによるものである。式Ｉの化合物は、こうしてアゴニスト処理するとインターナリゼーション、そして該インターナリゼーションは構成要素Ｄ２の蛍光特性への修飾につながるｐＨの変化を経由して評価される。Ｄ１の蛍光測定は、任意の濃度（又は他の）依存性の蛍光の変化を監視し、そして収集されるべきレシオメトリック測定を可能とする。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
別の好ましい実施態様では、式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、細胞に透過可能である。好ましくは、式Ｉ又は式ＩＩの化合物は、さらに、細胞膜透過基を含む。膜透過化合物は、より疎水性化合物を提供するために親水性基をマスクすることによって生成する事ができる。該マスキング基は、細胞内でフルオロ発生性基質から切断され、細胞内的に誘導される基質を生成するように設計することができる。基質が、膜透過誘導体よりもより親水性であるから、それはついで細胞でトラップされる。好適な細胞膜透過基は、内在性哺乳動物細胞内エステラーゼによって容易に切断されるアセトキシメチルエステル（Jansen, A.B.A.and Russell, T.J.,J. Chem Soc.2127-2132(1965)and Daehne W. et al. J. Med- Che,.13,697-612(1970))）及びピバロイルエステル（Madhu et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 1998, 14,5,pp389-399）から選択され得るが、他の好適な基が当業者によって認識される。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
蛍光の測定を、蛍光顕微鏡（例えば、ＬＳＭ４１０, Zeiss）、ミクロプレートリーダー（例えば、CytoFluor 4000,Perkin Elmer）、共焦点顕微鏡、ＣＣＤイメージングシステム（例えば、LEADseeker（登録商標）, Amersham Pharmacia Biotech）及びフローサイトメーター（例えば、FACScalibur,Becton Dickinson）を含む検出装置の範囲の使用によって容易に達成し得る。検出技術の最近の発展により、迅速で同時的な放射及び励起測定（例えばＷＯ９９／４７９６３参照）を可能とする。ある例は、LEADseeker(登録商標)Cell Analysis System(Amersham Pharmacia Biotech)であって、細胞又はビーズと会合される、区別可能な波長の多重色素の同時的な励起を可能とするものである。