(57)【要約】腎癌に対してより特異性の高い腫瘍マーカーを提供する。腎癌についての罹患を識別することができる方法を提供する。腎癌組織から同定されたタンパク質を含む、腎癌の腫瘍マーカー。当該腎癌の腫瘍マーカーを用いて腎癌の罹患を識別する方法。当該方法においては、前記タンパク質の、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも増加又は減少していることを、前記対象となる個人が腎癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする。
2008032868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガレクチン１、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２、レティキュロカルビン１、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）、プレクチン、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢからなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含む、腎癌の腫瘍マーカー。
【請求項２】
ウロモジュリン、アミノアシラーゼ１、アルドラーゼＢ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、アクアポーチン１、リポカイン７、及びＲａｆキナーゼインヒビターからなる群から選ばれるタンパク質を含む腎癌の腫瘍マーカー。
【請求項３】
ガレクチン１、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２、レティキュロカルビン１、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）、プレクチン、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢからなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を腎癌の腫瘍マーカーとして使用することによって、腎癌の罹患を識別する方法。
【請求項４】
前記タンパク質の、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも上昇していることを、前記対象となる個人が腎癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、請求の範囲第３項に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
【請求項５】
前記試料が血清又は尿であり、前記タンパク質のレベルは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される、請求の範囲第４項に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
【請求項６】
ウロモジュリン、アミノアシラーゼ１、アルドラーゼＢ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、アクアポーチン１、リポカイン７、及びＲａｆキナーゼインヒビターからなる群から選ばれるタンパク質を腎癌の腫瘍マーカーとして使用することによって、腎癌の罹患を識別する方法。
【請求項７】
前記タンパク質の、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも減少していることを、前記対象となる個人が腎癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、請求の範囲第６項に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
【請求項８】
前記試料が血清又は尿であり、前記タンパク質のレベルは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される、請求の範囲第７項に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床での診断・検診・経過観察、及び分類の技術に関し、具体的には、腫瘍マーカー及び癌疾病の罹患の識別方法に関する。とりわけ、本発明は、腎癌の腫瘍マーカー及び腎癌の罹患の識別方法に関する。より詳しくは、本発明は、明細胞型の腎癌の腫瘍マーカー及び明細胞型の腎癌の罹患の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍の早期発見、及び治療後の腫瘍に関するモニタリングを目的として、数多くの腫瘍マーカーが実用化されている。既に実用化されている腫瘍マーカーとしては、例えば、ＡＦＰ及びＢＣＡ２２５が挙げられる。それらは臨床現場において、それぞれ、肝細胞癌及び乳癌の診断に用いられている。
腫瘍マーカーを用いた血液、尿などの生化学検査は、患者に対する負担が少ないことから、近年さらに重要度が増している。そのため、遺伝子、タンパク質の両面から活発に研究開発が行われている。例えば、日本国特表２００４−５３１７１３号公報には、腎細胞癌のサブタイプのスクリーニング、診断、予後、及び同定のために使用できる腫瘍マーカーについて記載されている。
米国特許第５９９４０６２号明細書には、ヒト肺癌のセルライン（ＮＣｌ−Ｈ７２０，ＮＣｌ−１５７）におけるリボヌクレオプロテインＡ２の特異的発現が開示されているが、他の腫瘍との関連性の開示はない。
米国特許出願公開第２００４／００２９２００号明細書には、尿中における腎癌の腫瘍マーカーが開示されている。
日本国特表２００５−５３０８５６号公報には、腫瘍内皮細胞および正常内皮細胞で特徴的に発現する遺伝子としてヘパラン硫酸プロテオグリカンが報告されているが、腎癌腫瘍マーカー蛋白質（もしくは遺伝子）としての開示はない。
【特許文献１】日本国特表２００４−５３１７１３号公報
【特許文献２】米国特許第５９９４０６２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００２９２００号明細書
【特許文献４】日本国特表２００５−５３０８５６号公報
【発明の開示】
【０００３】
発明の目的
腎癌は全悪性腫瘍の２〜３％を占める、泌尿器系では最も罹患者数の多い悪性腫瘍である。一般的に腎癌は自覚症状に乏しく発見が難しい上、進行した場合の予後が悪く、外科的切除以外の有効な治療法も確立されていない。しかし、腎癌の診断に有効な腫瘍マーカーは現在実用化されておらず、腹部超音波検査により偶然発見される場合が多数を占める。このようなことから、生化学検査による発症初期の腎癌診断法の確立が臨床現場で必要とされている。現状の生化学検査において腎癌の診断が可能なマーカーとしてＢＦＰが挙げられる。しかしながら、このマーカーは、癌化臓器に対する特異性が低い。このため、腎癌特異的マーカーではなく寧ろ広範囲の悪性腫瘍に対する腫瘍マーカーとして使用されている。
そこで、本発明は、腎癌に対してより特異性の高い腫瘍マーカーを提供することを目的とする。また本発明は、腎癌についての罹患を識別することができる方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、腎癌患者から採取した病理組織と正常組織とを試料とし、プロテオーム解析法としてＮＢＳ法を用い、両組織間で存在量に一定量以上の差が認められるタンパク質群を同定した。ＮＢＳ法は、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いる、タンパク質・ペプチドの相対定量に優れた手法である。ＮＢＳ法を用いるプロテオーム解析法は、二次元電気泳動法を用いる最も汎用的なプロテオーム解析法と、分離様式及び検出原理が根本的に異なる。このため、ＮＢＳ法を用いたプロテオーム解析法によると、現在までに腎癌マーカー候補として報告されているタンパク質群とは異なるマーカー候補タンパク質を見出すことができると考えられる。
本発明は、以下の発明を含む。
下記（１）及び（２）は、腎癌の腫瘍マーカーに関する。
下記（１）は、癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が多いタンパク質を含む腎癌の腫瘍マーカーに関する。
（１）
ガレクチン１、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２、レティキュロカルビン１、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）、プレクチン、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢからなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を含む、腎癌の腫瘍マーカー。
前記腎癌は、好ましくは明細胞型の腎癌である。
下記（２）は、癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が少ないタンパク質を含む腎癌の腫瘍マーカーに関する。
（２）
ウロモジュリン、アミノアシラーゼ１、アルドラーゼＢ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、アクアポーチン１、リポカイン７、及びＲａｆキナーゼインヒビターからなる群から選ばれるタンパク質を含む腎癌の腫瘍マーカー。
前記腎癌は、好ましくは明細胞型の腎癌である。
下記（３）〜（８）は、腎癌の罹患を識別する方法に関する。本発明において、罹患とは、広く病的状態をいい、腎癌の罹患を識別するとは、腎癌の検出、診断、モニタリング、ステージング及び予後判定を行うことを含む意味で用いる。
下記（３）〜（５）は、上記（１）に記載の腎癌の腫瘍マーカーを用いて腎癌の罹患を識別する方法に関する。
（３）
ガレクチン１、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２、レティキュロカルビン１、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）、プレクチン、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢからなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を腎癌の腫瘍マーカーとして使用することによって、腎癌の罹患を識別する方法。
（４）
前記タンパク質の、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも上昇していることを、前記対象となる個人が腎癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、（３）に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
前記タンパク質の正常レベルとは、癌性試料の対照となる試料における前記タンパク質のレベルであればよく、健康な個人に由来する正常試料におけるレベルであっても良いし、腎癌の罹患患者に由来する癌性でない正常試料におけるレベルであってもよい。
（５）
前記試料が血清又は尿であり、前記タンパク質のレベルは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される、（４）に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
前記腎癌は、好ましくは明細胞型の腎癌である。
下記（６）〜（８）は、上記（２）に記載の腎癌の腫瘍マーカーを用いて腎癌の罹患を識別する方法に関する。
（６）
ウロモジュリン、アミノアシラーゼ１、アルドラーゼＢ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、アクアポーチン１、リポカイン７、及びＲａｆキナーゼインヒビターからなる群から選ばれるタンパク質を腎癌の腫瘍マーカーとして使用することによって、腎癌の罹患を識別する方法。
（７）
前記タンパク質の、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料中におけるレベルを測定し、
得られた測定値レベルと、前記タンパク質の正常レベルとを比較し、
得られた測定値レベルが、前記正常レベルよりも減少していることを、前記対象となる個人が腎癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとする、（６）に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
前記タンパク質の正常レベルとは、癌性試料の対照となる試料における前記タンパク質のレベルであればよく、健康な個人に由来する正常試料におけるレベルであってもよいし、腎癌の罹患患者に由来する癌性でない正常試料におけるレベルであってもよい。
（８）
前記試料が血清又は尿であり、前記タンパク質のレベルは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される、（７）に記載の腎癌の罹患を識別する方法。
前記腎癌は、好ましくは明細胞型の腎癌である。
本発明はまた、下記（９）及び（１０）に記載の癌の処理のための薬剤組成物に向けられる。癌の処理とは、癌細胞を死滅させること、及び癌細胞の成長を抑制することを含む。
（９）
腎癌細胞に対して供給することによって、腎癌細胞の死滅及び／又は腎癌細胞成長の抑制を促進する反応を誘発するための薬剤組成物であって、（１）に記載の腎癌の腫瘍マーカーに免疫特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む、薬剤組成物。
前記腎癌は、とりわけ明細胞型の腎癌である。
（１０）
免疫刺激量で、腎癌細胞に対して供給することによって、免疫応答を促進するための薬剤組成物であって、（１）に記載の腎癌の腫瘍マーカーを含む、薬剤組成物。
前記腎癌は、とりわけ明細胞型の腎癌である。
上記（９）及び（１０）の薬剤組成物は、腎癌の処理に用いられる潜在的な治療剤として特定されうる。或いは、上記（９）及び（１０）の薬剤組成物は、腎癌の処理に用いられる治療剤として用いられうる。
本発明によると、腎癌に対してより特異性の高い腫瘍マーカーを提供することができる。また本発明によると、腎癌についての罹患を識別することができる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、候補タンパク質ガレクチン１について、ウェスタンブロッティングを行うことによって得られた電気泳動図（ａ）及び定量結果（ｂ）、及び、ＮＢＳ法を行うことによって得られた定量結果（ｃ）である。
図２は、候補タンパク質ＣＮＤＰジペプチダーゼ２について、ウェスタンブロッティングを行うことによって得られた電気泳動図（ａ）、定量結果（ｂ）及び、ＮＢＳ法を行うことによって得られた定量結果（ｃ）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
＜腫瘍マーカー＞
本発明は、腫瘍マーカーを提供する。本発明の腫瘍マーカーは、腎癌において用いられる。さらに本発明の腫瘍マーカーは、腎癌として明細胞型の腎癌において特に有用である。
本発明の腎癌の腫瘍マーカーは、ガレクチン１（ｇａｌｅｃｔｉｎ  １）、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２（ＣＮＤＰ  ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２）、レティキュロカルビン１（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃａｌｂｉｎ  １）、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１）、アルドラーゼＡ（ａｌｄｏｌａｓｅ  Ａ）、エノラーゼ１（ｃ−ｍｙｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅｎｏｌａｓｅ  Ｉ））、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＭＡＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ  ６ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５  ｖａｒｉａｎｔ）、プレクチン（ｐｌｅｃｔｉｎ）、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２Ｂ１））、グルコシダーゼ２ベータサブユニット（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ２  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ，ｐ９０，８０Ｋ−Ｈ＝ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、クリスタリンαＢ（ａｌｐｈａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ｃｈａｉｎ  Ｂ）；ウロモジュリン（ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）、アミノアシラーゼ１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ  １）、アルドラーゼＢ（ａｌｄｏｌａｓｅ  Ｂ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、アクアポーチン１（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｗａｔｅｒ  ｃｈａｎｎｅｌ；ｈＵＷＣ、Ａｑｕａｐｏｒｔｉｎ  １）、リポカイン７（ＬＣＮ７  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ７））、及びＲａｆキナーゼインヒビター（ｎｅｕｒｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｈ３（Ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ））からなる群から選ばれるタンパク質を含む。
これらのタンパク質は、明細胞型の腎癌患者から採取された腎癌組織と正常組織とから、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳＣｌ）を用いた同位体標識法（ＮＢＳ法）とＨＰＬＣを用いた分離法とによるプロテオーム解析技術によって同定された。ＮＢＳ法は、２種類の状態のタンパク質試料のうち一方を重い試薬（２−ニトロ［１３Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド）で修飾し、他方を軽い試薬（２−ニトロ［１２Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド）で修飾し、得られたＮＢＳ修飾タンパク質試料双方を互いに混合し、トリプシン消化など当業者による適切な処理を行い、質量分析装置でペプチド量の違いを測定することにより、２種類の状態のタンパク質試料におけるタンパク質含有量の相対的な差を調べることができる方法である。ＮＢＳ法は、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００３，１７，１６４２−１６５０及び国際公報第２００４／００２９５０号パンフレットなどに記載されている。
従来から汎用されてきた二次元電気泳動法では、塩基性の等電点を示すタンパク質及び１００ＫＤａ前後の大きな分子量を持つタンパク質の分離と検出とに難があった。本発明で用いたＮＢＳ法では、組織に含まれるタンパク質をトリプシン消化することによって得られるペプチド断片を直接的な解析対象とし、分離にはＨＰＬＣを用いるため、分子量と等電点とに関する制約はない。このことから、従来得られてきた知見と異なるものが得られる可能性がある。
これらのタンパク質は、当業者によって選択されるあらゆるタンパク質精製技術によって単離及び精製することができる。例えば、イオン交換、アフィニティ、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、遠心分離、溶解度差、及び電気泳動などを含む技術を用いることができる。
本発明が腎癌の腫瘍マーカーとして提供するタンパク質のうち、腎癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が多いタンパク質として、ガレクチン１、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２、レティキュロカルビン１、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）、プレクチン、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢを提供する。
上記タンパク質は、例えば、腎癌患者数の約５０％以上で、腎癌組織において、正常組織におけるよりも約８０％以上、好ましくは約１００％以上（物質量基準）大きい発現量を示す傾向にある。
本発明が腎癌の腫瘍マーカーとして提供するタンパク質のうち、腎癌患者体内で、正常レベルに
比べて発現量が少ないタンパク質として、ウロモジュリン、アミノアシラーゼ１、アルドラーゼＢ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、アクアポーチン１、リポカイン７、及びＲａｆキナーゼインヒビターを提供する。
上記タンパク質は、例えば、腎癌患者数の約５０％以上で、正常組織において、腎癌組織におけるよりも約８０％以上、好ましくは約１００％以上（物質量基準）大きい発現量を示す傾向にある。
＜腎癌の罹患を識別する方法＞
本発明はまた、上記タンパク質群、具体的にはガレクチン１（ｇａｌｅｃｔｉｎ  １）、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２（ＣＮＤＰ  ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２）、レティキュロカルビン１（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃａｌｂｉｎ  １）、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１）、アルドラーゼＡ（ａｌｄｏｌａｓｅ  Ａ）、エノラーゼ１（ｃ−ｍｙｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅｎｏｌａｓｅ  Ｉ））、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＭＡＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ  ６  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５  ｖａｒｉａｎｔ）、プレクチン（ｐｌｅｃｔｉｎ）、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２Ｂ１））、グルコシダーゼ２ベータサブユニット（Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ２  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ，ｐ９０，８０Ｋ−Ｈ＝ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈｏｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、クリスタリンαＢ（ａｌｐｈａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ｃｈａｉｎ  Ｂ）；ウロモジュリン（ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）、アミノアシラーゼ１（Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ  １）、アルドラーゼＢ（ａｌｄｏｌａｓｅ  Ｂ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、アクアポーチン１（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｗａｔｅｒ  ｃｈａｎｎｅｌ；ｈＵＷＣ、Ａｑｕａｐｏｒｔｉｎ  １）、リポカイン７（ＬＣＮ７  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ７））、及びＲａｆキナーゼインヒビター（ｎｅｕｒｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｈ３（Ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ））からなる群、から選ばれる少なくとも１種のタンパク質を腎癌の腫瘍マーカーとして使用することにより、腎癌の罹患を識別する方法を提供する。本発明の方法は、腎癌の罹患の識別において用いられる。さらに、本発明の方法は、腎癌としては明細胞型の腎癌において特に有用である。
本発明の方法においては、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料を用意し、当該試料中において、上記タンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質のレベルを測定する。得られた測定値レベルは、正常レベルを比較される。正常レベルとは、上記タンパク質群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質の、癌性試料の対照となる試料における前記タンパク質レベルである。ここで、癌性試料の対照となる試料は、癌性でない試料であれば特に限定されず、健康な個人に由来する試料でも良いし、腎癌の罹患患者に由来する正常試料でもよい。
本発明において、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する試料としては、特に限定されない。例えば、細胞や組織、体液、及び組織抽出物などが挙げられる。細胞や組織には、組織生検材料及び検死解剖材料などが含まれる。体液としては、血液、尿、及び体分泌物などが含まれる。血液としては、全血、血漿、血清などが含まれる。組織抽出物とは、当業者に公知の方法によってホモジネート又は可溶化された組織をいう。これら例示された試料の中でも、血清及び／又は尿を試料とすることが好ましい。また、細胞や組織、体液、及び組織抽出物は、腎臓由来であることが好ましい。
対象となる個人の細胞や組織、体液、及び組織抽出物を含む試料において測定された腎癌の腫瘍マーカーの測定値は、好ましくは同種の細胞や組織、体液、及び組織抽出物を含む、癌性でない試料におけるレベルと比較される。すなわち、測定された腎癌の腫瘍マーカーが、対象となる個人の血清中のものである場合、このレベルは、好ましくは、癌性でない血清中のレベルと比較される。
上記タンパク質群が、ガレクチン１、ＣＮＤＰジペプチダーゼ２、レティキュロカルビン１、細胞骨格ＬＩＭ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＨＬ１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（ＧＴＲＡＰ３−１８）、プレクチン、リボヌクレオプロテインＡ２Ｂ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢからなる群である場合、得られた測定値レベルが、正常レベルよりも上昇していることを、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人が、腎癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとすることができる。側定値レベルにおける上昇の度合いとしては、測定値レベルが正常レベルの８０％以上、好ましくは１００％以上（物質量基準）となる程度を１つの目安にすると良い。
上記タンパク質群が、ウロモジュリン、アミノアシラーゼ１、アルドラーゼＢ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、アクアポーチン１、リポカイン７、及びＲａｆキナーゼインヒビターからなる群である場合、得られた測定値レベルが、正常レベルより減少していることを、腎癌の罹患を識別すべき対象となる個人が、腎癌に罹患している可能性が高いことの指標の１つとすることができる測定値レベルにおける減少の度合いとしては、正常レベルが測定値レベルの８０％以上、好ましくは１００％（物質量基準）以上となる程度を１つの目安にすると良い。
上記タンパク質のレベルは、好ましくは、生体特異的親和性に基づく検査によって測定される。生体特異的親和性に基づく検査は当業者に良く知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集測定、補体結合分析検定、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、個体の試料中の腫瘍マーカーに結合する抗体の存在を検出する。具体的には、アッセイ倍地中において、測定すべき腫瘍マーカータンパク質及び当該タンパク質の抗体からなる免疫複合体を形成しうる条件のもと、試料を当該抗体に接触させることによって行われる。より具体的なイムノアッセイプロトコルは、当業者であれば容易に選択することができる。
上記タンパク質のレベルは、上記のように、生体特異的親和性に基づく検査によって測定されることが好ましいが、その他のタンパク質定量法によって測定することもできる。例えば、既に述べたＮＢＳ法は、定量性に優れた方法である。この場合、上記タンパク質を既知レベルで調製した試料や、正常試料などの適当な試料を対照試料として、対象となる個人の試料との間における前記タンパク質の存在量の差を調べることによって、測定を行うことができる。
本発明の方法は、本発明の腎癌の腫瘍マーカーを単独で測定してもよいし、他のいかなる腫瘍マーカーと組み合わせて測定しても良い。従って、本発明の方法は、本発明の腎癌の腫瘍マーカーのレベルと同様に他の腫瘍マーカーのレベルを測定することを含んでいてよい。
本発明の腎癌の腫瘍マーカーは、腎癌の検出、診断、モニタリング、ステージング及び予後判定を目的として用いられるとよい。好ましくは、腫瘍の動態の把握に用いられるとよい。例えば、腫瘍に対して化学療法や放射線療法が行われている場合、その治療がどれくらいの効果を奏しているかを判断することに用いられるとよい。また、腫瘍マーカー値が高い腫瘍に対して切除手術が行われた場合、術後の経過観察のために用いられるとよい。
＜薬剤組成物＞
本発明はまた、本発明の腎癌の腫瘍マーカーのうち、腎癌患者体内で、正常レベルに比べて発現量が多いタンパク質を含む腫瘍マーカーを用いることによって腎癌を処理するための薬剤組成物に向けられる。
薬剤組成物の一形態は、腎癌細胞に対して供給することによって、腎癌細胞の死滅及び／又は腎癌細胞成長の抑制を促進する反応を誘発するための薬剤組成物であって、本発明の腎癌の腫瘍マーカーに免疫特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む、薬剤組成物である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び、分子生物学的技術により調製した抗体を含む。ここで抗体とは、広く免疫特異的に結合する物質であればよく、抗体フラグメントや抗体融合タンパク質も用いられてよい。いずれの場合も、抗体の調製は、当業者に良く知られた方法によって行われる。
薬剤組成物の他の一形態は、免疫刺激量で、腎癌細胞に対して供給することによって、免疫応答を促進するための薬剤組成物であって、本発明の腎癌の腫瘍マーカーを含む、薬剤組成物である。ここで、免疫刺激量とは、癌の処理のために所望する免疫反応を惹起することが可能な抗原の量をいい、当業者によって良く知られた方法で決定されるものである。この形態によると、いわゆる癌ワクチン療法として知られている、当業者に良く知られた方法を用いて癌の処理が行われる。
上記薬剤組成物は、上記抗体或いは腫瘍マーカーを有効成分として含み、薬剤として許容される希釈剤、担体、賦形剤などをさらに含んでよい。上記薬剤組成物は、腎癌の処理に用いられる潜在的な治療剤として特定されうる。或いは、上記薬剤組成物は、腎癌の処理に用いられる治療剤として適用されうる。
【実施例】
【０００６】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、％で示される量は、特に断りの無い限り、体積を基準にした量である。
＜実施例１＞
［１］腎癌患者からの組織摘出
腎細胞癌と診断され、インフォームドコンセントが得られた１４人の患者より摘出された１４種の腎癌組織であって、それぞれＷＨＯ分類により淡明細胞癌（ｃｌｅａｒ）との所見を下されたものを試料とした。患者の年齢、性別、摘出時の癌進行度は下記表に示すとおりである。
【表１】
2008032868.tif 000003
一方、同一患者から採取した腎臓の正常組織（以下、単に、正常組織、と記載する。）をそれぞれ対照試料とした。
実験に用いた試料は摘出後すぐに切除し、液体窒素中で凍結した後、速やかに−８０℃冷凍庫に移して使用時まで保管した。
［２］組織試料からのタンパク質抽出
同一患者から採取した癌組織及び正常組織それぞれについて、以下の操作を行い、「可溶性画分」及び「不溶性画分」を得た。
組織２０ｍｇをチューブに移し、下記の「可溶性タンパク質抽出試薬」２００μｌとジルコニアビーズ５粒とを加え、破砕機にて５分間破砕した。試料の入ったローターを冷却した後、もう一度同様の破砕を行った。組織片が分散した溶液を別のチューブに移し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１５分）を行うことにより、上清画分と沈殿画分とに分離した。上清画分はそのまま別のチューブに移して「可溶性画分」とした。一方、沈殿画分は前記「可溶性タンパク質抽出試薬」で３回洗浄した後、下記「不溶性タンパク質可溶化試薬」を２００μｌ加えることによって可溶化し、これを「不溶性画分」とした。
＜可溶性タンパク質抽出試薬＞
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ＝８．８
０．１Ｍ  ＮａＣｌ
１００ｍＭ  ＰＭＳＦ
上記に１／１００溶のｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ）を添加した。
６Ｍ  Ｕｒｅａ
２Ｍ  Ｔｈｉｏｕｒｅａ
３％  ＣＨＡＰＳ
１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
上記に１／１００溶のｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ）を添加した。
癌組織から得られた「可溶性画分」及び「不溶性画分」、及び、正常組織から得られた「可溶性画分」及び「不溶性画分」をそれぞれ１００μｌから、２Ｄ−ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質成分を沈殿させた。生じた沈殿に、それぞれ１３Ｃ  ＮＢＳ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｎ（島津製作所）の溶解液１（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、６Ｍグアニジン塩酸）５０μｌを添加し、完全に溶解させた。こうして得られた試料それぞれのタンパク質濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）で定量し、タンパク質濃度が１００μｇ／２５μｌとなるように調整した。
［３］タンパク質のラベル化、トリプシン消化、及びラベル化ペプチドの濃縮
タンパク質濃度を調整した試料のうち、正常組織の可溶性画分に由来するものと正常組織の不溶性画分に由来するものとについては、１２Ｃ  ＮＢＳ（Ｌｉｇｈｔ  ＮＢＳ）でラベル化し、癌組織の可溶性画分に由来するものと癌組織の不溶性画分に由来するものとについては、１３Ｃ  ＮＢＳ（Ｈｅａｖｙ  ＮＢＳ）でラベル化し、それぞれ、ラベル化タンパク質試料を得た。Ｌｉｇｈｔ  ＮＢＳ及びＨｅａｖｙ  ＮＢＳによるラベル化は、１３Ｃ  ＮＢＳ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｎ（島津製作所）の推奨プロトコルに従った。その後、正常組織の可溶性画分に由来するラベル化タンパク質試料と、癌組織の可溶性画分に由来するラベル化タンパク質試料とを混合し、可溶性画分に由来するタンパク質混合試料とし、一方、正常組織の不溶性画分に由来するラベル化タンパク質試料と、癌組織の不溶性画分に由来するラベル化タンパク質試料とを混合し、不溶性画分に由来するタンパク質混合試料とした。
可溶性画分に由来するタンパク質混合試料と、不溶性画分に由来するタンパク質混合試料とのそれぞれについて、引き続き、脱塩、還元、アルキル化、トリプシン消化の工程を行った。これらの工程も、同キットの推奨プロトコルに従った。このようにして、可溶性画分に由来するタンパク質混合試料からは、可溶性画分に由来する消化物試料を得て、不溶性画分に由来するタンパク質混合試料からは、不溶性画分に由来する消化物試料を得た。
可溶性画分に由来する消化物試料と、不溶性画分に由来する消化物試料のそれぞれについて、さらに引き続き、ラベル化ペプチドの濃縮工程を行った。この工程は、同キットの推奨プロトコルに記載の、ステップワイズ法に従って行った。このようにして、それぞれの試料につき、アセトニトリル１０％画分（ｆｒ１）、１５％画分（ｆｒ２）、２０％画分（ｆｒ３）、２５％画分（ｆｒ４）、３０％画分（ｆｒ５）、３５％画分（ｆｒ６）、４０％画分（ｆｒ７）、及び５０％画分（ｆｒ８）を得た。
［４］ＨＰＬＣによるラベル化ペプチドの分離
前記ステップワイズ法による濃縮後の各画分を、遠心濃縮乾燥機を用いて乾固した。得られた乾固物それぞれに、０．１％ＴＦＡを含む１０％アセトニトリル水溶液１０μｌを加えることによって溶解することにより、ｆｒ１〜ｆｒ８各々の溶液を調製した。その後、ｆｒ１溶液とｆｒ２溶液、ｆｒ３溶液とｆｒ４溶液、ｆｒ５溶液とｆｒ６溶液、ｆｒ７溶液とｆｒ８溶液、をそれぞれ混合することにより、４種の溶液を調製した。
得られた４種の溶液について、ＨＰＬＣによる分離を行った。ＨＰＬＣの初期条件は、アセトニトリル１４％、０．１％ＴＦＡとし、流量は１０μｌ／分、ペプチド溶出のためのグラジエントは２．９％／分で２０分間アセトニトリル濃度７２％となるまで行った。ＨＰＬＣからの溶出ペプチドはＡｃｃｕＳｐｏｔ（島津製作所）を用いてＡｘｉｍａ用３８４ウェルサンプルプレートに分取した。分取開始時間は、ｆｒ１溶液＋ｆｒ２溶液については７分後、ｆｒ３溶液＋ｆｒ４溶液については７．５分後、ｆｒ５溶液＋ｆｒ６溶液については８分後、ｆｒ７溶液＋ｆｒ８溶液については９分後とした。マトリックス溶液は、ＣＨＣＡ（α−シアノヒドロキシ桂皮酸）及びＨＮＢＡ（ヒドロキシニトロ安息香酸）各々を終濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製して用いた。
［５］質量分析と候補ペプチドの絞込み
サンプルプレートに、分取した試料をスポットし、Ａｘｉｍａ−ＣＦＲ  ｐｌｕｓ（島津製作所）のリフレクトロンモードにて質量分析を行った。質量校正はＡＣＴＨ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９（Ｓｉｇｍａ）とＢｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １−７（Ｓｉｇｍａ）とを標準試料として、外部標準法によって行った。得られたマススペクトルより、Ｍａｓｃｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ（Ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてモノアイソトピックピークを選別し、６Ｄａ或いは１２Ｄａの質量差を有するＮＢＳラベル化ペプチドのペアピークを、ソフトウェアＮＢＳ  ａｎａｌｙｓｉｓ（島津製作所）により抽出した。各試料から得られたペアピーク群のうち、正常組織と癌組織との間でピーク強度に差が見られたものについてピックアップした。
ピックアップされたペアピーク群からのマーカー候補特定は、以下のように行った。まず、１４名の患者のうち７名以上において、正常組織に比べて存在量が増加傾向或いは減少傾向を示したものを選出基準とした。なおかつ、増加或いは減少の度合いとしては、次の量を基準にした。すなわち、癌組織において、正常組織におけるより存在量が増加したペプチドについては、癌組織における存在量が、正常組織における存在量よりも８０％以上大きいものを選出した。また、癌組織において、正常組織におけるより存在量が減少したペプチドについては、正常組織における存在量が、癌組織における存在量よりも８０％以上大きいものを選出した。なお、ここで示される％の量は、ピーク面積を基準とする。
［６］マーカー候補タンパク質のＭＳ／ＭＳ解析とデータベースサーチによる同定
発現量に上記の差が見られたピークのうち、癌組織で発現が亢進したペプチドは６２個、減少したペプチドは１６３個であった。癌組織で存在量が増加する傾向が示された６２個のペプチド中、３９個について以下のように同定を行った。また、癌組織で存在量が減少する傾向が示された１６３個のペプチド中、７６個について以下のように同定を行った。
マーカー候補として選出されたペプチドについて、Ａｘｉｍａ−ＱＩＴ（島津製作所）によるＭＳ／ＭＳイオンサーチを行った。得られたマススペクトルは、Ｍａｓｃｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ（Ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｉｅｎｃｅ）で処理し、Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｉｅｎｃｅ）によりタンパク質同定を行った。Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈのＭＳ／ＭＳイオンサーチによるスコアが２０以上のものをマーカー候補タンパク質とした。
表２〜表１３は、癌組織において、正常組織におけるよりも存在量が大きい傾向が示されたペプチド群についての、両組織における存在量の定量結果とタンパク質同定結果とを示す。表２〜表１３においては、同定されたタンパク質のＮＣＢＩ  Ｈｏｍｅ  Ｐａｇｅにおけるデータ番号及び名称、上記表１に対応する患者番号、質量分析で検出された６Ｄａ或いは１２Ｄａの質量差を有するラベル化ペプチドに相当するペアピークの（質量／電荷）値、及び、ラベル化ペプチドのピーク面積から算出した各患者の両組織における当該タンパク質の存在量の比を示している。各患者の両組織における当該タンパク質の存在量の比は、正常組織と癌組織とで存在量が少ないほうの量を１００とした場合の量として示している。また、癌組織において検出され、正常組織では検出されなかった場合は、“癌組織のみ”と示し、正常組織及び癌組織のいずれにおいても検出されなかった場合は、“ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ”と示す。
なお、本請求の範囲第１項に示したタンパク質は、この表２〜表９及び表１１〜表１３において示されている。
【表２】
2008032868.tif 000004
【表３】
2008032868.tif 000005
【表４】
2008032868.tif 000006
【表５】
2008032868.tif 000007
【表６】
2008032868.tif 000008
【表７】
2008032868.tif 000009
【表８】
2008032868.tif 000010
【表９】
2008032868.tif 000011
【表１０】
2008032868.tif 000012
【表１１】
2008032868.tif 000013
【表１２】
2008032868.tif 000014
【表１３】
2008032868.tif 000015
表１４〜表２０は、正常組織において、癌組織におけるよりも存在量が大きい傾向が示されたペプチド群についての両組織における存在量の定量結果とタンパク質同定結果とを、上記表２〜表１３と同様に示す。表１４〜表２０では、正常組織において検出され、癌組織では検出されなかった場合は、“正常組織のみ”と示している。
なお、本請求の範囲第３項に示したタンパク質は、この表１４〜表２０において示されている。
【表１４】
2008032868.tif 000016
【表１５】
2008032868.tif 000017
【表１６】
2008032868.tif 000018
【表１７】
2008032868.tif 000019
【表１８】
2008032868.tif 000020
【表１９】
2008032868.tif 000021
【表２０】
2008032868.tif 000022
［７］ウェスタンブロッティングによる確認
上記同定されたマーカー候補タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、当該タンパク質が患者の組織中にあることの確認を、以下のようにして行った。ここでは、上記［５］のように行われたＮＢＳ法によって、正常組織におけるより癌組織において増加を示した候補タンパク質のうち、ガレクチン１、ＣＮＤＰ  ジペプチダーゼ２、レティキュロカルビン１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢについてウェスタンブロッティングを行った。
まず、患者より抽出した可溶性画分（上記［２］に記載のもの）を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、セミドライ方式のブロッティング法でＰＶＤＦ膜に転写した。５重量％スキムミルクを添加した２０ｍＭのＴＢＳを用いてＰＶＤＦ膜をブロッキングし、一次抗体として、ウサギ由来の抗ヒトガレクチン１、抗ＣＮＤＰ２など、マーカー候補タンパク質それぞれに対する抗体を用いて３０分間処理した。二次抗体処理移行の操作は、Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、メーカー推奨の方法に従った。ペルオキシダーゼ用基質及び発色反応試薬は、イムノステインＨＲＰ（Ｋｏｎｉｃａ−Ｍｉｎｏｌｔａ）を用いた。
図１に、候補タンパク質ガレクチン１についての結果を示す。
図１（ａ）は、ウェスタンブロッティングによって得られた電気泳動図を示す。図１（ａ）中、Ｍは分子量マーカー、Ｎは正常組織由来試料、Ｔは癌組織由来試料であることを示す。また、番号（Ｎｏ．）は、上記表１に記載した患者番号に相当する（図１（ｂ）及び（ｃ）においても同じ）。
図１（ｂ）は、上記図１（ａ）で検出されたシグナルを数値化し、正常組織由来試料（Ｎ）と癌組織由来試料（Ｔ）とにおけるタンパク質量の定量比較を行った結果を示す。図１（ｂ）において、縦軸はシグナル強度（Ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。
さらに、図１（ｃ）は、上記［５］におけるＮＢＳ法で検出されたシグナルを数値化し、正常組織由来試料（Ｎ）と癌組織由来試料（Ｔ）とにおけるタンパク質量の定量比較を行った結果を示す。図１（ｃ）において、縦軸はシグナル強度（Ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。
図２に、候補タンパク質ＣＮＤＰジペプチダーゼ２についての結果を示す。
図２（ａ）は、ウェスタンブロッティングによって得られた電気泳動図を、上記図１（ａ）と同様に示す。
図２（ｂ）は、上記図２（ａ）で検出されたシグナルを数値化し、正常組織由来試料（Ｎ）と癌組織由来試料（Ｔ）とにおけるタンパク質量の定量比較を行った結果を、上記図１（ｂ）と同様に示す。
さらに、図２（ｃ）は、上記［５］におけるＮＢＳ法で検出されたシグナルを数値化し、正常組織由来試料（Ｎ）と癌組織由来試料（Ｔ）とにおけるタンパク質量の定量比較を行った結果を、上記図１（ｃ）と同様に示す。
図１及び図２が示すように、ＮＢＳ法による定量結果において、正常組織におけるより癌組織において増加を示した候補タンパク質ガレクチン１及びＣＮＤＰ  ジペプチダーゼ２は、ウェスタンブロッティングによる定量結果においても、実際にそのような増加を示している。さらに、図示していないが、ガレクチン１及びＣＮＤＰ  ジペプチダーゼ２以外の、レティキュロカルビン１、アルドラーゼＡ、エノラーゼ１、グルコシダーゼ２ベータサブユニット、及びクリスタリンαＢにおいても、同様に、正常組織におけるより癌組織において増加を示したことが実際に確認された。
このように、ＮＢＳ法による定量結果と、ウェスタンブロッティングによる定量結果とは、良い相関を示している。
このことから、ＮＢＳ法による定量結果において、癌組織におけるより正常組織において増加を示した候補タンパク質は、ウェスタンブロッティングによる定量結果においても、同様に、実際にそのような増加を示すことが容易に推定される。
上記のように、請求の範囲第１項に記載のタンパク質は、正常組織におけるよりも癌組織においてより多く発現し、請求の範囲第３項に記載のタンパク質は、正常組織におけるよりも癌組織において少なく発現するものである。そして、これらのタンパク質は、上述したＮＳＢ法を用いた解析によって示されたように、腎癌の腫瘍マーカーとして使用できることが明らかである。
【図１】
2008032868.tif 000023
【図２】
2008032868.tif 000024
【国際調査報告】
2008032868.tif 000025
2008032868.tif 000026