(57)【要約】  広い範囲の脂質修飾酵素の活性を、簡便に測定できるアッセイ方法、そのアッセイ方法を利用した脂質修飾酵素の活性を制御する薬剤の提供に関する。  上記課題は、例えば、脂質修飾酵素の活性を測定する方法であって、下記工程(I)〜(III)：  (I)   ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルを調製する工程、  (II)  工程（I)で調製された脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、及び  (III) 工程(II)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する工程を含むアッセイ方法によって解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質修飾酵素の活性を測定する方法であって、下記工程(i)及び(ii)：
(i) ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素とを接触させる工程、及び
(ii) 工程(i)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して該脂質修飾酵素の活性を評価する工程
を含む方法。
【請求項２】
脂質修飾酵素の活性を測定する方法であって、下記工程(I)〜(III)：
(I)   ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルを調製する工程、
(II)  工程（I)で調製された脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、及び
(III) 工程(II)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して該脂質修飾酵素の活性を評価する工程
を含む方法。
【請求項３】
前記脂質修飾酵素が、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホイノシチドホスファターゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、スフィンゴミエリナーゼ又は脂質転移酵素である、前記請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビオチン化脂質が、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンである、前記請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記脂質修飾酵素基質が、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンである、前記請求項1〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記近接効果を利用した脂質修飾酵素活性評価法がSPA法、FRET法、TR-FRET法またはAlphascreen法である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記SPA法が、ストレプトアビジンを結合させたSPAビーズを用いる方法である、前記請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法であって、下記工程(a)〜(c)：
(a) 被検物質の存在下または非存在下、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、
(b) 上記工程(a)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して該脂質修飾酵素の活性を評価する工程、及び
(c) 該被検物質の存在下における該脂質修飾酵素の活性と、該被検物質の非存在下における該脂質修飾酵素の活性を比較して、該被検物質が該脂質修飾酵素の活性を阻害する物質であるか、あるいは、該脂質修飾酵素の活性を促進する物質であるかを判断する工程
を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
被検対象となる脂質修飾酵素の活性に対して制御作用を示す、脂質膜結合性蛋白質の存存下で、被検物質の酵素活性に対する阻害活性または促進活性を測定することを特徴とする、前記請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記脂質膜結合性蛋白質が、Ｇ蛋白質βγサブユニットである、前記請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記脂質修飾酵素が、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホイノシチドホスファターゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、スフィンゴミエリナーゼ又は脂質転移酵素である、前記請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ビオチン化脂質が、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンである、前記請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質修飾酵素基質が、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンである、前記請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記近接効果を利用した脂質修飾酵素活性評価法がSPA法、FRET法、TR-FRET法またはAlphascreen法である、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記SPA法が、ストレプトアビジンを結合させたSPAビーズを用いる方法である、前記請求項８〜１４のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項１６】
脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質のスクリーニング方法であって、下記工程(d)〜(f)：
(d) 被検対象となる脂質修飾酵素の活性に対して制御作用を示す、脂質膜結合性蛋白質の存存下または非存在下で、被検物質の存在下、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、
(e) 上記工程(d)で得られた生成物に近接効果を利用した評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する工程、
(f) 該脂質膜結合性蛋白質の存在下における該脂質修飾酵素の活性と、該脂質膜結合性蛋白質の非存在下における該脂質修飾酵素の活性を比較して、該被検物質が該脂質膜結合性蛋白質と該脂質修飾酵素との相互作用に影響を与えることにより、該脂質修飾酵素の活性を阻害する物質であるか、あるいは、該脂質修飾酵素の活性を促進する物質であるかを判断する工程
を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質修飾酵素の活性を測定する方法、この測定方法を利用した、脂質修飾酵素の阻害剤または活性化剤のスクリーニング方法、又これらの方法に用い得る、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホイノシチドホスファターゼ、ホスホリパーゼ等、細胞膜上の脂質分子の構造変化（修飾）を引き起こす、脂質修飾酵素は、細胞シグナルに関与する酵素であり、細胞への刺激に伴うこれら脂質修飾酵素の作用の変化により様々な細胞の応答性を引き起こす。これら脂質修飾酵素は様々な治療薬のターゲットとなっており、特に阻害剤、活性化剤のスクリーニング研究が広く行われている。例えばホスホイノシチドキナーゼのうち、ホスホイノシチド３-キナーゼγは、抗炎症薬のターゲット分子として、多くの研究がなされている（例えば、非特許文献１：T. Ruckle et al., Nat. Rev. Drug Discovery, 5, 903 (2006)）。【０００３】
これら脂質修飾酵素は、細胞シグナルにおいて、細胞膜上に存在する蛋白質との相互作用によりその活性が制御されていることが、近年明らかになってきている。【０００４】
脂質修飾酵素と、その活性を制御する細胞膜蛋白質の組み合わせの例を、表１に示した（非特許文献２：U. Maier et al., JBC, 274, 29311 (1999)、非特許文献３：Ref: E. Buck and R. R. Iyengar, J. Biol. Chem., 276, 36014 (2001)、および非特許文献４：N. Wittschureck and S. Offermanns, Physiol. Rev., 85, 1159 (2005)）。
【表１】
2008143127.tif 000002
【０００５】
従って、これら脂質修飾酵素の活性を制御することによって疾患を治療する薬剤は、その修飾反応を直接的にターゲットとする以外に（即ち脂質基質やATP等と酵素との相互作用をターゲットとする以外に）、これら酵素とそれを制御する細胞膜蛋白質との相互作用をターゲットとすることも可能である。しかし、これまでそのような薬剤の開発はほとんどなされていない。例えば、前述のホスホイノシチド３-キナーゼγについて、これに作用し抗炎症作用を示す薬剤の開発が精力的に行われているが、これらの薬剤は基本的にATP結合部位に結合する、修飾反応を直接的に阻害する化合物である（非特許文献１参照）。【０００６】
この理由の一つとして、脂質修飾酵素とそれを制御する細胞膜蛋白質との相互作用を測定するアッセイ方法が簡便でないことが挙げられる。すなわち、このような相互作用を測定するためには、基質としての脂質が脂質ミセルとして存在する必要があり、このような相互作用を検討する研究はいずれも脂質ミセルを用いて行われているが、脂質ミセルを基質とした酵素作用の研究の多くは反応後の脂質を溶媒抽出する方法を用いており、制御する薬剤を見出すためのスクリーニングには不適である。【０００７】
脂質修飾酵素の活性測定方法として、例えば以下の方法が知られている。
ホスホイノシチド 3-キナーゼの活性測定には、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトール [4,5]-二リン酸（PIP2）等の基質となる分子を含む脂質ミセルを作成し、32P、33P-ATPを用いて反応した後、有機溶媒を用いて脂質を抽出し、精製したホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、あるいはホスファチジルイノシトール [3,4,5]-三リン酸（PIP3）を薄層クロマトグラフィー等を用いて分離、定量する方法が定法として用いられている（例えば、非特許文献５：T. M. Bonacci et al., Science, 312, 443 (2006)、非特許文献６：U. Maier et al., J. Biol. Chem., 274, 29311 (1999)、および非特許文献７：C. A. Parish et al., Biochemistry, 34, 7722 (1995)）。【０００８】
あるいは、可溶性のPIP2を基質として非ラジオアイソトープのATPを用いて反応し、反応により生じたPIP3を、ビオチン基を導入した可溶性のPIP3とPIP3結合蛋白質との結合に対する競合反応を指標に「間接的」に検出、定量する簡便な、近接効果を利用したアッセイ方法等（例えば、非特許文献８: A. Gray et al., Anal. Biochem., 313, 234 (2003)、特許文献１: B. E. Drees et al., US patent 7,067,269、および特許文献２: B. E. Drees et al., US patent 2005/0009124）も用いられている。しかし、基質は可溶性のPIP2であり、脂質ミセル化した基質を用いてこの方法を応用した例は報告されておらず、脂質ミセルを基質として用いた方法への適用は困難であると考えられる。【０００９】
近接効果を利用した簡便なアッセイ法としてこの他に、リン脂質を固相化したFlashPlateに基質であるPIP2を固相化し、33P-ATPからの33P取り込みを測定する方法（例えば、非特許文献９: Perkin Elmer Inc., Scientific Poster #H78394）、SPA（Scintillation Proximity Assay）ビーズに、基質を含む脂質ミセルを静電的にあるいは疎水結合的に結合し、同様に33P取り込みを測定する方法（例えば、非特許文献１０: GE Healthcare Life Science Inc., Scientific Poster #132）等も報告されている。しかし、FlashPlate へのPIP2の固相化や、SPAビーズへの脂質ミセル結合は静電的あるいは疎水結合的なものであるため、基質分子の導入率が低い、界面活性剤による作用を受けやすいなどの欠点が容易に推定され、実用としてほとんど使用されていないことが、文献等の報告がほとんどないことからも明らかである。【００１０】
また、ホスホリパーゼの活性測定法として、3H標識のPIP2を含む脂質ミセルを作成し、酵素反応によって加水分解されたイノシトール三リン酸（IP3）を有機溶媒抽出によって水層に残し、測定する方法が一般的に用いられている（例えば、非特許文献１１: B. Yoe-Sik et al., Mol. Pharm., 63, 1043 (2003)）。【００１１】
また、簡便なアッセイ方法として、分子内にビオチン基を含む[3H]-PIP2を含む脂質ミセルを作成し、ホスホリパーゼによる反応を行った後、ストレプトアビジンがコートされたSPAビーズを加え、脂質ミセル上に残った3H量を、溶媒抽出を行うことなく測定するキットが実用化されている（例えば、非特許文献１２: GE Healthcare社、製品番号TRKQ7040、添付プロトコール）。しかしながら、ビオチン残基と脂質修飾酵素によって反応を受ける基質残基を分子内に含む化合物を用いるこの方法は、基質残基部分を変えることにより、ホスホリパーゼ以外の脂質修飾酵素の活性測定に使用することが可能であると類推されるが、そのためには容易に入手可能な脂質修飾酵素基質ではなく、ビオチン残基を分子内に導入した化合物を酵素ごとに合成する必要があり、簡単に行うことを困難にしている。【００１２】
上記従来技術の問題点をまとめると、次のとおりである。
（１）脂質修飾酵素の制御物質をスクリーニングするためのアッセイ系としては、基質となる脂質を含む脂質ミセルを作成し、基質として用いることでのみ、制御する細胞膜蛋白質との相互作用を含めた評価が可能であるが、特に「制御する細胞膜蛋白質との相互作用を含めた」脂質修飾酵素の評価方法は、放射性同位体を用い、反応後溶媒抽出を行って反応により変化した基質量を測定する煩雑（ロースループット）なアッセイ法が一般的に使用されている。
（２）基質となる脂質を含む脂質ミセルを用いたホモジーニアス(homogeneous)なアッセイ法としては、
a)ホスホイノシチドキナーゼについては、ミセルを静電的あるいは疎水結合的な作用を利用してビーズ、プレートに固相化する方法が、
b)ホスホリパーゼについては、分子内にビオチン残基と酵素の基質となる残基を一分子内に両方含む化合物を用いた方法が、それぞれ知られている。しかし、a)の方法では固相効率の低さや、界面活性剤による影響の高さが容易に推定される。b)の方法では酵素にあった化合物を鋭意工夫して創出、合成する必要がある。いずれの方法も種々の「脂質修飾酵素」に対して簡単に適用することはできない。【００１３】
なおビオチン化ホスファチジルエタノールアミン等のビオチン化脂質を含む脂質ミセルについて、ミセル上にストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質が結合すること（例えば、非特許文献１３：J. Musti et al., Biochemistry, 40, 14869 (2001)）、及び、Streptavidin等のビオチン結合蛋白質を固相化した担体にミセルが結合すること（例えば、非特許文献１４：B. Peker et al., Biotechnol. Prog., 20, 262 (2004)）が知られている。この方法を利用して、ミセル上に結合する蛋白質の結合作用を測定する方法などは報告されている（例えば、非特許文献１５：W. S. Davidson et al., J. Lipid Res., 47, 440 (2006)）。【００１４】
【非特許文献１】T. Ruckle et al., Nat. Rev. Drug Discovery, 5, 903 (2006)
【非特許文献２】U. Maier et al., JBC, 274, 29311 (1999)
【非特許文献３】Ref: E. Buck and R. R. Iyengar, J. Biol. Chem., 276, 36014 (2001)
【非特許文献４】N. Wittschureck and S. Offermanns, Physiol. Rev., 85, 1159 (2005)
【非特許文献５】T. M. Bonacci et al., Science, 312, 443 (2006)
【非特許文献６】U. Maier et al., J. Biol. Chem., 274, 29311 (1999)
【非特許文献７】C. A. Parish et al., Biochemistry, 34, 7722 (1995)
【非特許文献８】A. Gray et al., Anal. Biochem., 313, 234 (2003)
【特許文献１】B. E. Drees et al., US patent 7,067,269
【特許文献２】B. E. Drees et al., US patent 2005/0009124
【非特許文献９】Perkin Elmer Inc., Scientific Poster #H78394
【非特許文献１０】GE Helthcare Life Science Inc., Scientific Poster #132
【非特許文献１１】B. Yoe-Sik et al., Mol. Pharm., 63, 1043 (2003)
【非特許文献１２】GE Healthcare社、製品番号TRKQ7040、添付プロトコール
【非特許文献１３】J. Musti et al., Biochemistry, 40, 14869 (2001)
【非特許文献１４】B. Peker et al., Biotechnol. Prog., 20, 262 (2004)
【非特許文献１５】W. S. Davidson et al., J. Lipid Res., 47, 440 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このような状況において、広い範囲の脂質修飾酵素に対し、その脂質修飾酵素の活性を簡便に測定できるアッセイ法、さらには、脂質修飾酵素の活性を制御することができる物質（阻害剤または促進剤）の簡易なスクリーニング方法が求められてきた。またさらには、これら脂質修飾酵素の活性を制御する細胞膜結合性蛋白質と脂質修飾酵素の相互作用を含めた評価を行うために、脂質ミセルを基質とする簡易なスクリーニング法が求められてきた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記の状況に鑑みて、脂質修飾酵素としてホスホイノシチド3-キナーゼを用い、ビオチン化脂質としてビオチン化ホスファチジルエタノールアミンを、脂質修飾酵素基質としてホスファチジルイノシトール [4,5]-二リン酸（PIP2）をモデル系として用いて鋭意検討を行った結果、A) 広い範囲の脂質修飾酵素に対し、B) 脂質ミセルを用いた反応の結果生じた酵素反応物を、C) 近接効果を利用したアッセイ方法を用いて簡便に測定できるアッセイ原理の開発に成功し、本発明を完成させた。【００１７】
すなわち、本発明は、以下に示す、脂質修飾酵素の活性を測定する方法、脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法などを提供する。
（１）脂質修飾酵素の活性を測定する方法であって、下記工程(i)及び(ii)：
(i) ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素とを接触させる工程、及び
(ii) 工程(i)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して該脂質修飾酵素の活性を評価する工程
を含む方法。
（２）脂質修飾酵素の活性を測定する方法であって、下記工程(I)〜(III)：
(I)   ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルを調製する工程、
(II)  工程（I)で調製された脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、及び
(III) 工程(II)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する工程
を含む方法。
（３）前記脂質修飾酵素が、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホイノシチドホスファターゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、スフィンゴミエリナーゼ又は脂質転移酵素である、前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記ビオチン化脂質が、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  前記脂質修飾酵素基質が、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンである、前記（1）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記近接効果を利用した脂質修飾酵素活性評価法がSPA法、FRET法、TR-FRET法またはAlphascreen法である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記SPA法が、ストレプトアビジンを結合させたSPAビーズを用いる方法である、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。【００１８】
（８）脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法であって、下記工程(a)〜(c)：
(a) 被検物質の存在下または非存在下、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、
(b) 上記工程(a)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する工程、及び
(c) 該被検物質の存在下における該脂質修飾酵素の活性と、該被検物質の非存在下における該脂質修飾酵素の活性を比較して、該被検物質が該脂質修飾酵素の活性を阻害する物質であるか、あるいは、該脂質修飾酵素の活性を促進する物質であるかを判断する工程を含むスクリーニング方法。
（９）被検対象となる脂質修飾酵素の活性に対して制御作用を示す、脂質膜結合性蛋白質の存存下で、被検物質の酵素活性に対する阻害活性または促進活性を測定することを特徴とする、前記（８）記載の方法。
（１０）前記脂質膜結合性蛋白質が、Ｇ蛋白質βγサブユニットである、前記（９）記載の方法。
（１１）前記脂質修飾酵素が、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホイノシチドホスファターゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、スフィンゴミエリナーゼ又は脂質転移酵素である、前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記ビオチン化脂質が、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンである、前記（８）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記脂質修飾酵素基質が、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンである、前記（８）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記近接効果を利用した脂質修飾酵素活性評価法がSPA法、FRET法、TR-FRET法またはAlphascreen法である、（８）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）前記SPA法が、ストレプトアビジンを結合させたSPAビーズを用いる方法である、前記（８）〜（１４）のいずれかに記載のアッセイ方法。
（１６）脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質のスクリーニング方法であって、下記工程(d)〜(f)：
(d) 被検対象となる脂質修飾酵素の活性に対して制御作用を示す、脂質膜結合性蛋白質の存存下または非存在下で、被検物質の存在下、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、
(e) 上記工程(d)で得られた生成物に近接効果を利用した脂質修飾酵素活性評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する工程、
(f) 該脂質膜結合性蛋白質の存在下における該脂質修飾酵素の活性と、該脂質膜結合性蛋白質の非存在下における該脂質修飾酵素の活性を比較して、該被検物質が該脂質膜結合性蛋白質と該脂質修飾酵素との相互作用に影響を与えることにより、該被検物質が該脂質修飾酵素の活性を阻害する物質であるか、あるいは、該脂質修飾酵素の活性を促進する物質であるかを判断する工程
を含むスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、脂質修飾酵素の活性を簡便に測定できる新規アッセイ方法が提供される。また、本発明によれば、このアッセイ方法を利用して、脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質を効率よくスクリーニングする方法が提供される。更に、本発明によればこれらの方法に用いうるビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルが提供される。【００２０】
また当該アッセイ方法は、脂質修飾酵素の活性を制御する蛋白質（制御蛋白質）の共存下で脂質修飾酵素の活性を測定することができるので、脂質修飾酵素の活性を直接的に阻害または促進する物質だけでなく、その酵素と制御蛋白質との相互作用に対し影響を与える化合物をもスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のアッセイ法の概念図である。
【図２】ストレプトアビジンSPAビーズと33P-ATPを用いた、ビオチン化脂質添加あるいは非添加のホスホイノシチド３-キナーゼ（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseβ活性の測定と、Ｇ蛋白質βγ（Gβγ）添加の影響を示した図であり、(a)はPIP2ミセル（ビオチン化脂質非添加）を用いたPI3-kinaseβによる反応(b)はPIP2/Biotin-PEミセル（ビオチン化脂質添加）を用いたPI3-kinaseβによる反応、を用いて得られた値を示す。
【図３】ストレプトアビジンSPAビーズと125I-標識GRP-PHを用いた、ビオチン化脂質およびホスホイノシチド３-キナーゼ（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseα活性の測定を示した図である。
【図４】AlphaScreen法を用いた、ビオチン化脂質およびホスホイノシチド３-キナーゼ（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseα活性の測定を示した図である。
【図５】TR-FRET法を用いた、ビオチン化脂質およびホスホイノシチド３-キナーゼ（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseα活性の測定を示した図である。
【図６】AlphaScreen法を用いた、ビオチン化脂質およびホスホイノシチド３−キナーゼ基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseβ活性の測定と、Ｇ蛋白質βγ（Gβγ）添加の影響の測定を示した図である。
【符号の説明】
【００２２】
１      ビオチン化脂質
２      脂質修飾酵素基質（PIP2）
３      脂質ミセル
４      脂質修飾酵素（PI3K）
５      33P 標識
６      反応性生物（PIP3）
７      制御蛋白質（Ｇβγ）
８      SPAビーズ
8a     ストレプトアビジン
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の脂質修飾酵素の活性を測定する方法、脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法などを詳細に説明する。
まず、本発明の第1の態様は、下記工程(i)及び(ii)又は下記工程(I)〜(III)を含む、脂質修飾酵素の活性を測定する方法に関する：
(i) ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素とを接触させる工程、及び
(ii) 工程(i)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して該脂質修飾酵素の活性を評価する工程。
(I)   ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルを調製する工程、
(II)  工程（I)で調製された脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、及び
(III) 工程(II)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する工程。【００２４】
本明細書中、「ビオチン化脂質」は、脂質分子にビオチン残基が共有結合によって結合した化合物を意味する。ビオチン化脂質の一例としては、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミン（N-Biotinyl-phosphatidyl ethanolamine）、ビオチン化ホスファチジルエタノールセリン(N-Biotinyl-phosphatidyl serine)、ビオチン化ホスファチジルコリン(N-Biotinyl-phosphatidyl choline)、ビオチン化スフィンゴミエリン（N-Biotinyl-sphingomyelin)、ビオチン化ジアシルグリセロール(N-Biotinyl-diacyl glycerol)、ビオチン化トリアシルグリセロール(N-Biotinyl-triacyl glycerol)、ビオチン化脂肪酸、ビオチン化アルキル等が挙げられる。これら以外の化合物でも、基本的にＣ4以上のアルキル基等の脂溶性部分を含む化合物であって、脂質ミセルに結合する、あるいは他の脂質化合物とともに脂質ミセルを形成する化合物であればよい。【００２５】
本明細書中、「脂質修飾酵素基質」は、脂質修飾酵素によって実質的に構造変化を起す化合物を意味する。脂質修飾酵素基質の具体例としては、下記に示した化合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００２６】
本発明において用いられる脂質修飾酵素基質としては、例えば、ホスホイノシチドキナーゼ（Phosphoinositide kinase)に対してはホスファチジルイノシトール(Phosphatidyl inositol)（PI）、ホスファチジルイノシトールリン酸(Phosphatidyl inositol- monophosphate)（PIP）、ホスファチジルイノシトール二リン酸(Phosphatidyl inositol-diophosphate)（PIP2）、ホスファチジルイノシトール三リン酸(Phosphatidyl inositol-triphosphate)（PIP3）等、イノシトール(Inositol)の水酸基にリン酸基が導入される化合物が挙げられる。その他の化合物でも実質的に、ホスホイノシチドキナーゼによって構造変化を受ける化合物であれば良い。【００２７】
また、ホスホイノシチドホスファターゼ（Phosphoinositide phosphatase）に対する脂質修飾酵素基質としては、例えば、ホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）等、Inositol残基上のリン酸基が脱リン酸化される化合物が挙げられる。その他の化合物でも実質的にホスホイノシチドホスファターゼによって構造変化を受ける化合物であれば良い。また、分子内に放射性同位体を有する化合物も含まれる。【００２８】
また、ホスホリパーゼ（Phospholipase）に対する脂質修飾酵素基質としては、例えば、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）、ホスファチジルコリン(Phosphatidyl choline)、ホスファチジルエタノールアミン(Phosphatidyl ethanolamine)及びホスファチジルセリン(Phosphatidyl serine)等、イノシトール三リン酸(Inositol triphosphate)、脂肪酸などが切断によって生成される化合物が挙げられる。その他の化合物でも実質的にホスホリパーゼによって構造変化を受ける化合物であれば良い。また、分子内に放射性同位体を有する化合物も含まれる。【００２９】
本明細書中、「脂質修飾酵素」は、脂質化合物に対して酵素作用によって構造的変化を与える酵素を意味する。脂質修飾酵素の具体例としては、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホイノシチドホスファターゼ(Phosphoinositide phosphatase)、ホスホリパーゼ(Phospholipase)、リパーゼ(Lipase)、スフィンゴミエリナーゼ(Sphingomyelinase)、脂質転移酵素等が挙げられるが、その他の酵素であっても実質的な上記酵素作用を有する蛋白質であれば良い。また、ホスホイノシチドキナーゼのさらなる具体例としては、ホスホイノシチド３−キナーゼ（Phosphoinositide 3-kinase）、ホスホイノシチド４−キナーゼPhosphoinositide 4-kinase）、ホスホイノシチド５−キナーゼ（Phosphoinositide 5-kinase）等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。さらにホスホイノシチド３−キナーゼの具体例としては、ホスホイノシチド３−キナーゼα(Phosphoinositide 3-kinaseα）、ホスホイノシチド３−キナーゼβ（Phosphoinositide 3-kinaseβ）、ホスホイノシチド３−キナーゼγ（Phosphoinositide 3-kinaseγ）、ホスホイノシチド３−キナーゼδ（Phosphoinositide 3-kinaseδ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００３０】
次に、本発明の工程(I)〜(III)をそれぞれ説明する。
（工程(I)：脂質ミセル調製工程）
まず、本発明の工程(I)においては、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルを調製する。【００３１】
本明細書中、「脂質ミセル」とは、主に脂質の集合により形成されたミセルであり、通常、脂質の親水部を水相側に、疎水部を内側に向けて配向することによって形成される集合体である。脂質ミセルには、その脂質が１重層膜を形成しているものも２重層膜を形成しているものも含まれる。又、脂質ミセルの形状は特に限定されず、例えば球状のものも平面状のものも含まれる。ただし、脂質２重層膜が閉鎖小胞を形成しているものが好ましい。【００３２】
脂質ミセルは、一定濃度以上の脂質を含む緩衝液等に、超音波照射、ホモジナイズ、攪拌、振とう、凍結融解、噴霧等の物理的処理を施すことにより作成することが可能であり、又、界面活性剤処理などの方法を用いて作成することも可能である。【００３３】
脂質ミセルを形成する脂質は、脂質の分子内に親水性基と疎水性基を持つ、両親媒性の脂質であり、具体的にはリン脂質、単純脂質（トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等）、糖脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ脂質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの脂質に加えて、脂質ミセルは更に、脂肪酸、脂肪酸エステル、スフィンゴシン、コレステロール等のステロールあるいはそのエステル等を含む場合もある。【００３４】
本発明においては、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルを調製するために、適宜、脂質の種類が選択される。本発明の具体的な態様においては、例えば、ビオチン化脂質としてのビオチン化ホスファチジルエタノールアミンと、脂質修飾酵素基質としてのホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）を用いて、公知の脂質ミセル調製方法（例えば、Ref: U. Maier et al., J. Biol. Chem., 274, 29311 (1999)などの文献参照）に準じて脂質ミセルを調製する。なお、脂質のビオチン化は、例えばホスファチジルエタノールアミンに対しては、アミノ基に反応するビオチン化試薬あるいはリンカーを含むビオチン化試薬を反応させて、そのエタノールアミン残基にビオチン部を結合することにより行い得る。また、ホスファチジルエタノールセリン、ホスファチジルエタノールコリンなどに対しては、例えばその脂肪酸部をビオチン残基を有する脂肪酸により置換することによる行い得る。また、種々のビオチン化脂質は、例えばAvanti Polar Lipids社のカタログ（2007年1月）に記載されており、購入して入手することも可能である。その代表例としては、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンとして、カタログ番号870282、870273、870285、870277等が挙げられ、また代表的なその他のビオチン化脂質としてはカタログ番号860560、860566等が挙げられるが、これらはあくまでも一例であり、これらに限られるものではない。【００３５】
ここで、図１に、本発明のアッセイ方法の概念図を、ホスホイノシチドキナーゼの活性測定をSPAを用いて測定する場合を例に示す。図1の工程(I)に示すように、ビオチン化脂質１と脂質修飾酵素基質２（例えば、PIP2）を、脂質ミセル生成条件下で混合すると、脂質ミセル３が調製される。図1においては、簡略化のために、ビオチン化脂質１と脂質修飾酵素基質２を1個ずつのみ示しているが、実際には、複数のビオチン化脂質１と複数の脂質修飾酵素基質２を混合する。なお、ビオチン化脂質１中、[Ｂ]はビオチン基を示し、脂質修飾酵素基質２中、5角形の部分はリン酸化部位を示す。このようにして調製される脂質ミセル３は、その表面に、ビオチン化脂質１のビオチン基と脂質修飾酵素基質２のリン酸化部位を有している。【００３６】
（工程(II)：脂質ミセルと脂質修飾酵素の接触工程）
次に、本発明の工程(II)においては、工程（I)で調製された脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させて、脂質ミセル中の脂質修飾酵素基質と脂質修飾酵素を反応させる。【００３７】
図１の工程(II)に示すように、脂質修飾酵素基質２(PIP2)を含む脂質ミセル３に、33P標識５のATP存在下、脂質修飾酵素（PI3K）４を反応させると、PI3Kが活性化された状態であれば、PIP2がリン酸化され、33Pで標識された（５）PIP3に変換される。この接触工程（反応工程）は、通常、Mg2+イオン存在下において、0〜50℃好ましくは10〜40℃において、pH4〜11好ましくは6〜8のバッファー中で、1秒から1日間好ましくは1〜300分間行われる（Ref: U. Maier et al., J. Biol. Chem., 274, 29311 (1999)などの文献参照）。【００３８】
（工程(III)：脂質修飾酵素活性評価工程）
次に、本発明の工程(III)においては、工程(II)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して該脂質修飾酵素の活性を評価する。【００３９】
本発明において、近接効果（proximity effect）を利用した脂質修飾酵素活性評価法は、SPA（Scintillation proximity assay）法、FRET（Fluorescence resonance energy transfer）法、TR-FRET（Time-resolved fluorescence resonance energy transfer）法、アルファスクリーン（AlphaScreen）法等の近接効果を利用して脂質修飾酵素の活性を評価法する方法である。ここで、「近接効果」とは、例えば、脂質ミセル中に含まれるビオチン残基に結合する物質（Ｘ）と、脂質修飾酵素によって脂質修飾酵素基質中に取り込まれた（あるいは基質中から解離された）放射性同位元素（Ｙ１）、あるいは脂質修飾酵素によって変換された脂質修飾酵素基質に親和性を持つ物質（Ｙ２）、あるいは脂質修飾酵素によって変換される前の脂質修飾酵素基質に親和性を持つ物質（Ｙ３）について、ＸとＹの距離が近いとシグナル（例えば、発光、蛍光など）が得られる効果のことをいう。したがって、このような近接効果を利用する方法であればいかなる方法も本発明において利用することができる。【００４０】
上記Ｙ２、Ｙ３の具体的な１例としては、脂質修飾酵素としてフォスフォイノシチドキナーゼあるいはフォスフォイノシチドフォスファターゼの基質あるいは生成物であるフォスファチジルイノシトールあるいはそのリン酸化体を検出するために、pleckstrin homology（PH）ドメインを分子内に含む蛋白質（PKB/AKT、BTK、GRP1、CH1、DAPP1、PLCδ1、Tih1、Ipl）あるいはそれらのPHドメインを含む部分蛋白質を用いることが可能である（A. Saxena et al., J. Biol. Chem., 277, 49935-49944 (2002)）。さらに具体的にはホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）を検出するためにGRP1のPHドメインを含む部分蛋白質を用いることが可能である。【００４１】
SPA法とは、シンチレーション近接アッセイ(Scintillation Proximity Assay)法（Ref: P. B. Fernandes et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1998, 597 (1998)）を意味し、放射性同位体から放出されるβ線、電子線が、近傍にあるSPAビーズに衝突することにより生じる光を測定することを原理とする。上記Ｘとしてはストレプトアビジン（Streptavidin）等のビオチンに結合する蛋白質等を結合したSPAビーズ、イメージングビーズ(Imaging beads)、FlashPlate等を利用できる。本発明の好ましい態様では、上記Ｘがストレプトアビジンを結合させたSPAビーズで、Ｙ１〜Ｙ３のいずれかが放射性同位元素を含む物質である。例えば上記Ｙ１の場合では、脂質修飾酵素の酵素反応によって放射性同位体を含む分子が脂質ミセル上に結合する、あるいは放射性同位体を含む分子が結合している基質から放射性同位体を含む分子が解離することを利用できる。上記Ｙ２、Ｙ３の場合では、酵素反応によって変化した基質分子、あるいは変化する前の基質分子に特異的に結合する蛋白質、抗体等を放射性同位体標識したものを利用できる。【００４２】
図１を参照して、SPA法を説明すると、工程(III)に示されるように、ストレプトアビジン8aを結合させたSPAビーズ８を脂質ミセル３に接触させると、ビオチン化脂質１のビオチンとストレプトアビジン8aがその親和性によって結合し、結果としてSPAビーズ８が脂質ミセル３に結合する。このとき、SPAビーズとPIP2からの生成物である33P標識PIP3が近接した状態となると、SPAビーズが発光する。この発光を検知することによって、PIP2がPIP3に変換されたこと、つまり、PI3Kが活性化されていたことを検知することができる。【００４３】
本発明における、SPA法を用いて活性を評価する方法を以下に一例としてより具体的に説明する。【００４４】
ストレプトアビジンを固相化したSPAビーズと、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミン及びPIP2を含む脂質ミセルとを混合したものを基質として、33P標識のATP存在下、ホスホイノシチド３-キナーゼによる酵素反応を行う。反応後、ビーズを洗浄してシンチレーションカウンターを用いて測定することにより、酵素活性を測定する。上記方法ではホスホイノシチド３-キナーゼの活性を脂質ミセル存在下で亢進することが知られているＧ蛋白質βγサブユニット(G-protein βγ subunits)による、酵素活性の亢進を検出することができる。【００４５】
あるいは、ストレプトアビジンを固相化したSPAビーズと、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミン及びPIP2を含む脂質ミセルとを混合したものを基質として、非放射性のATP存在下、ホスホイノシチド ３-キナーゼによる酵素反応を行う。反応後、酵素反応によってPIP2から生じるPIP3に特異的に結合することが知られているGRP-PH domain（Ref:J. K. Klarlund et al., Science, 275, 1927 (1997)、Ref: M. P. Czech et al., US patent 6,2210841、Ref: B. E. Drees et al., US patent 7,067,269、B. E. Drees et al., US patent 2005/0009124）の125I標識物を反応させた後、シンチレーションカウンターを用いて測定することにより、酵素活性を測定できる。【００４６】
FRET法とは、２種の蛍光物質、蛍光蛋白質等が空間的に近接した場合に生じる蛍光ドナーから蛍光アクセプターへの蛍光共鳴エネルギー転移(Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法を意味し、例えば上記Ｙ２、Ｙ３の場合では、酵素反応によって変化した基質分子、あるいは変化する前の基質分子に特異的に結合する蛋白質、抗体等を蛍光標識したものを利用できる。Ｘとしてはストレプトアビジン等のビオチンに結合する蛋白質等を結合した蛍光物質、蛍光蛋白質等を利用できる。蛍光ドナーと蛍光アクセプターの組み合わせは、例えばフルオレセイン(Fluorescein)とテトラメチルローダミン(Tetramethylrhodamine)；テトラメチルローダミンとテキサスレッド(Texas Red)；EuキレートとCy5、アロフィコシアニン(Allophycocyanine)、AlexaFluor 647；Tbキレートとフルオレセイン、ローダミン、BODIPY-TMR、BODIPY-FL；等の組み合わせがその一例として挙げられるがこれに限定されるものではない。【００４７】
また、TR-FRET法とは、上記FRET法のうち、時間分解蛍光（Time-resolved fluorescence）を利用した方法を意味し、上記のうちEu、Tb、Sm等のランタノイドイオンキレートを利用した方法がその一例として挙げられる。蛍光ドナーと蛍光アクセプターの組み合わせは、例えばEuキレートとCy5、アロフィコシアニン、AlexaFluor 647；Tbキレートとフルオレセイン、ローダミン、BODIPY-TMR、BODIPY-FL；等の組み合わせがその一例として挙げられるがこれに限定されるものではない。【００４８】
本発明における、TR-FRET法を用いて活性を評価する方法を以下に示すが、この例に限定されるものではない。【００４９】
ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンとPIP2を含む脂質ミセルを基質として、非放射性のATP存在下、ホスホイノシチド3-キナーゼによる酵素反応を行う。反応後、Euキレート標識したGRP-PH、さらにビオチンに結合するストレプトアビジン標識のアロフィコシアニンを加え、340nmの光照射により665nm/615nmの蛍光強度比を測定することにより、酵素活性を測定できる。【００５０】
AlphaScreen法とは、２種のビーズ（ドナー・ビーズ、アクセプター・ビーズ）の近接効果によって、光照射によってドナー・ビーズより生じた一重項酸素がアクセプター・ビーズに到達することによって発光が生じるアッセイ方法（Ref: A. Von Leoprechting
et al., J. Biomol. Screen., 9, 719 (2004)）を意味し、例えば上記Ｙ２、Ｙ３の場合では、酵素反応によって変化した基質分子、あるいは変化する前の基質分子に特異的に結合する蛋白質、抗体等をビオチン以外の標識物で標識したものを利用でき、その標識を利用して一方のビーズを結合させる。又、抗体を用いてビーズを結合させたり、直接結合したビーズを利用することもできる。ＸとしてはStreptavidin等のビオチンに結合する蛋白質等を結合したもう一方のビーズを利用できる。上記２種のビーズのいずれか一方がドナー・ビーズ、他方がアクセプター・ビーズであれば良い。【００５１】
本発明における、Alpha screen法を用いて活性を評価する方法を以下に示すが、この例に限定されるものではない。【００５２】
ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンとPIP2を含む脂質ミセルを基質として、非放射性のATP存在下、ホスホイノシチド3-キナーゼによる酵素反応を行う。反応後、GRP-PH（Glutathion S-Transferase: GSTを付加したもの）、抗GST抗体結合アクセプター(Acceptor)ビーズ、ストレプトアビジン結合Donorビーズを加え、AlphaScreen法に従った測定をすることにより、酵素活性を測定できる。【００５３】
また、上記方法ではホスホイノシチド3-キナーゼの活性を脂質ミセル存在下で亢進することが知られているＧ蛋白質βγサブユニットによる、酵素活性の亢進を検出することができる。【００５４】
本発明の第２の態様は、脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法であって、下記工程(a)〜(c)：
(a) 被検物質の存在下または非存在下、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルと脂質修飾酵素を接触させる工程、
(b) 上記工程(a)で得られる生成物に近接効果を利用した評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する工程、及び
(c) 該被検物質の存在下における該脂質修飾酵素の活性と、該被検物質の非存在下における該脂質修飾酵素の活性を比較して、該被検物質が該脂質修飾酵素の活性を阻害する物質であるか、あるいは、該脂質修飾酵素の活性を促進する物質であるかを判断する工程
を含むスクリーニング方法に関する。【００５５】
本発明のスクリーニング方法においては、上記本発明の第1の態様に係るアッセイ方法を利用して、脂質修飾酵素の活性を阻害または促進する物質をスクリーニングする方法である。具体的には、工程(a)においては、上記工程(II)の脂質ミセルと脂質修飾酵素の反応を、被検物質の存在下または非存在下に行う。次いで、上記工程(III)と同様にして、近接効果を利用した評価法を適用して、該脂質修飾酵素の活性を評価する。そして、その評価結果に基づいて、該被検物質の存在下における該脂質修飾酵素の活性と、該被検物質の非存在下における該脂質修飾酵素の活性を比較して、該被検物質が該脂質修飾酵素の活性を阻害する化合物であるか、あるいは、該脂質修飾酵素の活性を促進する物質であるかを判断する。【００５６】
被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。【００５７】
なお、このスクリーニング方法は、図１の工程(II)に示すように、被検対象となる脂質修飾酵素の活性に対して制御作用を示す、脂質膜結合性蛋白質（以下、「制御蛋白質」ともいう）を脂質ミセルに結合させることができるので、そのような脂質膜結合性蛋白質の存存下で、被検物質の酵素活性に対する阻害活性または促進活性を測定することが可能となる。【００５８】
本発明において用いられる制御蛋白質としては、具体的には表１に例として挙げた、チロシン-リン酸化レセプター(Tyr-phosphorylated receptor)、 チロシン-リン酸化蛋白質(Tyr-phosphorylated proteins)、Ｇ蛋白質βγサブユニットなど目的とする脂質修飾酵素に対応した制御蛋白質が挙げられるが、これらは一例であり、これらに限定されるものではない。また、制御蛋白質の他に、制御蛋白質と脂質修飾酵素の相互作用を制御するような更なる蛋白質、たとえばアダプター蛋白質と呼ばれるような蛋白質、あるいはその部分ペプチドを加えることも可能である（Ref:T. Pawson and J. D. Scott, Science, 278, 2075 (1997)）。【００５９】
また、制御蛋白質は全長を有する蛋白質でも良いが、その一部配列を含む部分ペプチドでも良い。部分ペプチドの一例としては、PDGF（Platelet-derived growth factor）受容体の細胞内部分配列の一部を有する
Cys-Gly-Gly-Tyr(P)-Met-Asp-Met-Ser-Lys-Asp-Glu-Ser-Val-Asp-Tyr(P)-Val-Pro-Met-Leu-Asp-Met（配列番号9：非特許文献６参照)、
IRS-1（Insulin receptor substrate-1）の部分配列である
Asn-Gly-Asp-Tyr(P)-Met-Pro-Met-Ser-Pro-Lys-Ser（配列番号10：Ref:H. Kurosu et al., J. Biol. Chem., 272, 24252 (1997)）
等が挙げられる。また、２種以上の制御蛋白質あるいはその部分ペプチドを組み合わせて使用することも可能である。【００６０】
本発明においては、制御蛋白質は自然界に存在するアミノ酸配列のものを用いることが出来るが、アミノ酸の変異が起こっているものでも、実質的な活性を保っているものであれば構わず、アミノ酸が欠失・置換・付加したアミノ酸配列を有する蛋白質なども本発明において使用可能である。また、遺伝子工学的手法を用いて取得した、報告されているアミノ酸配列のものをそのまま使用することも出来るが、遺伝子変異により適宜アミノ酸配列の変異を行ったものであっても、実質の活性を保っているものであれば使用可能である。さらに、アミノ末端、カルボキシ末端あるいはアミノ酸配列の途中部分に、検出あるいは精製を容易にするためのアミノ酸配列、具体例としてヒスチジン残基あるいはその連続配列（Poly-His）、c-Myc部分ペプチド（Myc-tag）、血球凝集(Hemagglutinin)部分ペプチド（HA-tag）、Flag部分ペプチド（Flag-tag）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合蛋白質（MBP）等の配列を有するアミノ酸配列を挿入したものでも構わない。また、遺伝子工学的手法を用いて制御蛋白質（例えば３量体GTP結合蛋白質βサブユニット等）を得る際には、動物細胞、昆虫細胞、大腸菌等の細菌等の細胞を用い、適切なプロモーターを有するベクターに当該遺伝子を導入し、細胞に導入、培養を行うことにより得ることが可能である。あるいは、大腸菌抽出物、小麦胚芽抽出物などを用いた無細胞系の蛋白質発現系を用いることも可能である。また、合成されたペプチドであっても構わない。【００６１】
制御蛋白質のより具体的な１例としては、Ｇ蛋白質β1サブユニット（配列番号４）とＧ蛋白質γ2サブユニット（配列番号８）を共発現させて得た蛋白質（Gβ1γ2-His）等が挙げられる。【００６２】
なお、上記スクリーニング方法において、該脂質膜結合性蛋白質の存在下における該脂質修飾酵素の活性と、該脂質膜結合性蛋白質の非存在下における該脂質修飾酵素の活性を比較することによって、該被検物質が該脂質膜結合性蛋白質と該脂質修飾酵素との相互作用に影響を与えるか否かを判断することができ、結果として該被検物質が該脂質修飾酵素の活性を阻害する化合物であるか、あるいは、該脂質修飾酵素の活性を促進する物質であるかを判断することができる。【００６３】
本発明の第３の態様は、上記の脂質修飾酵素の活性測定方法やスクリーニング方法に用いられうる、ビオチン化脂質及び脂質修飾酵素基質を含む脂質ミセルに関する。ここで、ビオチン化脂質としてはビオチン化ホスファチジルエタノールアミンやビオチン化フォスファチジルセリンが好ましく、脂質修飾酵素基質としてはホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）が好ましい。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例等をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。【００６５】
実施例１
Streptavidin SPAビーズと33P-ATPを用いた、ビオチン化脂質及びPhosphoinositide  3-kinase（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とする、PI3-kinaseβ活性の測定と、Ｇ蛋白質βγ（Gβγ）添加の影響の測定
Phosphoinositide 3-kinase基質であるPhosphatidyl inositol [4,5] - diphosphate（PIP2）を含む脂質ミセルと33P-ATP、およびSPAビーズと同様の原理であるImagingビーズを用いてPI3-kinaseの活性を測定する方法（Ref: GE Helthcare Life Science Inc., Scientific Poster #132）が報告されている。この報告の中ではポリエチレンイミンで処理したビーズ（PS-PEI）で活性が測定可能であるのと同時に、Streptavidinビーズでもシグナルが確認できることが報告されている。そこで、この方法と同様にPIP2を含む脂質ミセル（PIP2ミセル）、および本発明であるビオチン化脂質添加の効果を確認するためにPIP2およびビオチン化脂質をともに含む脂質ミセル（PIP2/Biotin-PEミセル）をそれぞれ作成し、Streptavidin SPAビーズと混合した後、33P-ATPを用いたPI3-kinaseで反応による33Pのシグナルが確認できるかを検討した。本実験では、さらにＧ蛋白質βγを添加した際のそれぞれの条件におけるPI3-kinaseβ活性に対する影響についても検討を行った。【００６６】
（１）脂質ミセルの作成
ホスファチジルエタノールアミン（0.13μmol）、ホスファチジルセリン（0.12μmol）、ホスファチジルコリン（0.056μmol）、スフィンゴミエリン（0.048μmol）、ホスファチジルイノシトール [4,5]-２リン酸（0.016μmol）に、1,2-Dipalmitoyl -sn -glycerol -3-phospho ethanolamine -N-(Cap Biotinyl)（0.10μmol）（Avanti Polar Lipids社、製品番号870277P）を添加しない（PIP2ミセル）あるいは添加した（PIP2/Biotin-PEミセル）ものの混合液をガラスチューブ中でアルゴンガス乾燥させた。該ガラスチューブに、氷温のPI3Kバッファー（0.3ml）を加え、氷中で超音波をかけることにより、２種類のリピッドミセル（PIP2ミセルおよびPIP2/Biotin-PEミセル）溶液を作成した。PI3Kバッファーの組成は下記の通りである。PI3Kバッファー（40mM HEPES-Na (pH7.4)、120mM NaCl、1mM EGTA、1mMジチオスレイトール、1mMβグリセロリン酸、10mM MgCl2、0.1% BSA）【００６７】
（２）Ｇ蛋白質βγ（Gβ1γ2-His）の調製
昆虫細胞を用いたGβ1の発現系の構築は下記のように行った。配列番号１、２の合成DNAをプライマーとし、ヒトGβ1の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1051bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号３で示した塩基配列（配列番号４はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB1を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ1蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。【００６８】
昆虫細胞を用いた6xHis-Gγ2の発現系の構築は以下のように行った。配列番号５、６の合成DNAをプライマーとし、ヒトGγ2の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた0.3kbpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、Cat No.K2875）にサブクローニングした後、配列番号７で示した塩基配列（配列番号８はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システム（インビトロジェン社、Cat No.10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-6xHis-GNG2を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAをカイコ細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、6xHis-Gγ2蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞ライゼートについて6xHisタグ配列特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。【００６９】
昆虫細胞を用いたGβ1γ2-Hisの生産は以下の方法で行った。昆虫細胞Sf21株を用いたGβ1γ2-His蛋白質の発現、生産は、上記記載のGβ1、およびGγ1-His遺伝子を含むバクミドDNAを用い、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）添付のマニュアル（Instruction Manual）記載の方法に従って行った。具体的には、Gβ1、およびGγ1-His遺伝子を含むバキュロウイルスそれぞれMOI=2以上となるように、250ml容の三角フラスコを用い、108細胞/100mlのSF900IISFM培地（Invitrogen社、製品番号10902-096）中で、65時間、28℃で振とう培養を行った。培養後、遠心（1000rpm、5分）により細胞を回収し、Insect Cell PBS（7.3mM NaH2PO4 (pH6.2)、58mM KCl、47mM NaCl、5mM CaCl2）で洗浄した後、さらに遠心（1000rpm、5分）によって細胞を回収し凍結保存した。【００７０】
Gβ1γ2-Hisの調製は以下のように行った。上記のように得た2.5x108細胞を、10ml Lysis Buffer（20mM HEPES (pH8.0)、150mM NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、プロテアーゼインヒビターカクテル（Rosch Diagnostics社、11-697-498-001）、1mM EDTA）を用いて細胞をけん濁した後、超音波破砕し、2600G、10分の遠心を行い、上清12mlを得た。上清に5％ Lubrol 3mlを加え、1％Lubrolとし、4℃、1時間の攪拌を行った後、100000G、20分の遠心を行い、その上清を抽出液（15ml)として得た。抽出液を500μlのNi-NTA agarose（QIAGEN社、製品番号30210）カラムに通し、1% Lubrol を含むlysis Buffer 1mlで洗浄した後、洗浄バッファー１（2ml）（20mM HEPES(pH8.0)、0.4M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、0.5％ Lubrol、0.15% コール酸ナトリウム、10mM イミダゾール）、洗浄バッファー2（2ml）（20mM  HEPES(pH8.0)、0.1M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、0.25％ Lubrol、0.3%コール酸ナトリウム、10mMイミダゾール）、洗浄バッファー３(1ml)（20mM HEPES(pH8.0)、0.1M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、0.5%コール酸ナトリウム、10mM イミダゾール）で洗浄後、溶出バッファー（1ml）（20mM HEPES (pH8.0)、0.01M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、1％ コール酸ナトリウム、50mM イミダゾール）を用いて溶出を行った。この溶出液をGβ1γ2-His溶液とした。Gβ1γ2-His蛋白質の濃度の測定は、ウェスタンブロット法を行いた市販のGβγ標品（ウシ脳由来精製品、Calbiochem社、製品番号371768）との比較により、約100μg/mlとし、以下精製Gβ1γ2-Hisと表した。【００７１】
（３）酵素反応
上記（１）で作成した２種のリピッドミセル溶液（200μl）それぞれにStreptavidin SPA（Scintillation proximity assay）ビーズ（Streptavidin SPA beads、GEヘルスケア社、製品番号RPNQ0009）の40mg/mlけん濁液（200μl）を加え、混合後氷温で2hr静置した（リピッド/SPA混合液）。25μlのリピッド/SPA混合液に、5μlの精製Gβ1γ2-His溶液（40μg/ml）（あるいはGβ1γ2-Hisを含まない溶液）、5μlのPI3Kバッファー、5μlのPI3-kinaseβ溶液（8μg/ml）（PI3 Kinase (p110β/p85α), active、Upstate社、製品番号14-603）（あるいはPI3-kinaseβを含まない溶液）を順次加え、さらに33P-γ-ATPを含む20μM ATP溶液（10μl）を加え、反応を開始した。33P-γ-ATPは１反応につき約74kBq添加した。反応は室温で40分間行い、SPAビーズを洗浄した後、100μlのPI3KバッファーにSPAビーズをけん濁し、白色の96穴プレートでトップカウント（パッカード社）を用いて33Pを測定した。【００７２】
（４）酵素反応の測定結果
図２(a)にビオチン化脂質を加えていないPIP2ミセルを用いた結果、(b)にビオチン化脂質を加えたPIP2/Biotin-PEミセルを用いた結果を示した。PIP2ミセルを用いた反応では、Gβ1γ2-Hisの有無にかかわらず、PI3-kinaseβによるシグナルが全く認められなかったが、PIP2/Biotin-PEミセルを用いた反応では、PI3-kinaseβ添加によるシグナルの増加、さらにGβ1γ2-His存在下でのPI3-kinaseβ添加によるさらに大きなシグナルの増加が認められ、ビオチン化脂質とPIP2を含む脂質ミセルを用いた本方法で、PI3-kinaseβの活性、およびGβγによる活性の亢進が測定可能であることが明らかとなった。同時に、既知の方法（GE Helthcare Life Science Inc., Scientific Poster #132）に比べ明らかにその検出性が改善していることが明らかとなった。【００７３】
実施例２
Streptavidin SPAビーズと125I-標識GRP-PHを用いた、ビオチン化脂質及びPhosphoinositide  3-kinase（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseα活性の測定
（１）GRP-PHの125I標識
GRP-PHはPhosphatidyl inositol [4,5]-diphosphate（PIP2）には結合せず、Phosphoinositide 3-kinase（PI3-kinase）によってPIP2から生じるPhosphatidyl inositol-[3,4,5] triphosphate（PIP3）に選択的に結合する蛋白質であり、PI3-kinaseの反応の検出に使用可能であることがすでに知られている（Ref: J. K. Klarlund et al., Science, 275, 1927 (1997)、Ref: M. P. Czech et al., US patent 6,2210841、Ref: B. E. Drees et al., US patent 7,067,269、Ref: B. E. Drees et al., US patent 2005/0009124）。本実施例では市販のGRP-PH（Cell Biolabs社、製品番号STA-200）のIodogen法を用いた125I標識をまず行った。【００７４】
1mg/mlのIodogen（Pierce社、製品番号28600）のクロロホルム溶液0.5mlを5ml用ポリプロピレンチューブに入れアルゴンガスで乾燥した。上記GRP-PH（20μg）を含むTBS（Tris-buffered saline: 20mM Tris-HCl (pH7.4)、150mM NaCl）0.5mlを、このポリプロピレンチューブに入れ、Na125I（PerkinElmer社、製品番号NEZ033A）5μl（18.5MBq）を加え、室温で２分間反応した。反応液を、10% BSA（ウシ血清アルブミン）を含むTBS溶液でブロッキング後TBSで良く洗浄したPD10カラム（GEヘルスケア社、製品番号17-0851-01）にかけ、3mlのTBSで洗浄後、次の1mlの溶出液を125I標識GRP-PH溶液として分取、凍結保存した。【００７５】
（２）PI3-kinaseαを用いた反応の検出
実施例１に記載の方法と同様にPIP2/Biotin-PEミセルを調製した。けん濁するPI3Kバッファー量は400μlに変更した。本ミセル溶液に同容のStreptavidin SPAビーズ（Streptavidin SPA beads、GEヘルスケア社、製品番号RPNQ0009）の40mg/mlけん濁液を加えリピッド/SPA混合液を作成した。110μlのリピッド/SPA混合液に、2.2μlのPI3-kinaseα（PI3 Kinase (p110α/p85α), active、Upstate社、製品番号14-602）（0、100、200μg/ml、それぞれ終濃度0、2、4μg/ml）、1.1μlの40mM ATPを順次加え、室温で1時間反応を行った。反応後、白色96穴プレートに、0.5% BSA、2.5μMワートマニンを含むPI3Kバッファー50μl、反応液25μl、さらに0.2μg/mlに希釈した上記125I標識GRP-PH溶液を25μl加え、混合した後、室温で終夜静置し、トップカウント（パッカード社）を用いて125Iを測定した。図３に示したように、酵素添加による125Iカウントの上昇、すなわちPI3-kinaseの反応が検出された。【００７６】
実施例３
AlphaScreen法を用いた、ビオチン化脂質及びPhosphoinositide  3-kinase（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseα活性の測定
実施例１に記載の方法と同様にPIP2/Biotin-PEミセルを調製した。けん濁するPI3Kバッファー量は360μlに変更した。本ミセル溶液49μlに、49μlのPI3Kバッファー（BSA濃度を0.01%に変更）を加え、さらに1μlのPI3-kinaseα（200μg/ml）（PI3 Kinase (p110α/p85α), active、Upstate社、製品番号14-602）（あるいはPI3-kinaseαを含まない溶液）、1μlの40mM ATPを順次加え、室温で反応を行い、1時間後に100μMワートマニン、1%BSAを含むPI3Kバッファー（11μl）を加え、反応を停止した。反応後、白色384穴プレートに、GRP-PH（Cell Biolabs社、製品番号STA-200）の0.1% BSAを含むPI3Kバッファー溶液（10nM）5μl、0.1% BSAを含むPI3Kバッファーで段階的に反応液を希釈した反応希釈液10μlを加えて室温、30分間静置した。さらにAlphaScreen GST detection kit（PerkinElmer社、製品番号6760603C）の添付マニュアルに従って0.1% BSAを含むPI3Kバッファーで50倍に希釈したanti GST Acceptor Beads 5μlを加え、室温、30分間静置した。さらに同様に50倍に希釈したStreptavidin Donor Beads 5μlを加え、室温、2時間放置後、EnVision（PerkinElmer社）を用いて、AlphaScreenの測定プロトコールを用いて測定を行った。図４に、各反応希釈液中にもともと含まれるPIP2濃度と測定されたシグナル値の関係を示した。図４に示したとおり、PI3-kinaseαを添加したサンプルでは、反応によって生じたPIP3によるシグナルが観察され、本方法を用いてPI3-kinaseの活性が測定可能であることが分かった。【００７７】
実施例４
TR-FRET法を用いた、ビオチン化脂質及びPhosphoinositide  3-kinase（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseα活性の測定
実施例３の方法と同様に、PI3-kinaseα（終濃度2μg/ml）あるいは酵素無添加で反応を行い、同様に反応希釈液を作成した。【００７８】
又、ビオチン化PIP3及びPIP3に結合する蛍光donor（PIP3結合蛋白質（GST付加）、Euキレート標識抗GST抗体）と、ビオチンに結合する蛍光acceptor（Streptavidin標識APC）とを含む、TR-FRET法でのPIP3の検出を可能とする、PI3-Kinase (human) HTRF Assayキット（Upstate Biotechnology社、製品番号33-016）の「Detection Mixture」を、キット添付の方法に従って作成した。【００７９】
白色384穴プレートに、0.1% BSAを含むPI3Kバッファー10μl、上記反応希釈液10μl、上記作成した「Detection Mixture」5μlを順次加え、室温で約3時間静置した後、EnVision（PerkinElmer社）を用いて、HTRFに適した測定プロトコールを用いて615nm、665nmの時間分解蛍光を測定した。図５に、各反応希釈液中にもともと含まれるPIP2濃度と測定されたシグナル値の関係を示した。図５に示したとおり、PI3-kinaseαを添加したサンプルでは、反応によって生じたPIP3によるシグナルが観察され、本方法を用いてPI3-kinaseの活性が測定可能であることが分かった。【００８０】
実施例５
AlphaScreen法を用いた、ビオチン化脂質及びPhosphoinositide  3-kinase（PI3-kinase）基質を含有する脂質ミセルを基質とするPI3-kinaseβ活性の測定と、Ｇ蛋白質βγ（Gβγ）添加の影響の測定
（１）脂質ミセルの作成
ホスファチジルエタノールアミン（0.26μmol）、ホスファチジルセリン（0.24μmol）、ホスファチジルコリン（0.11μmol）、スフィンゴミエリン（0.096μmol）、ファスファチジルイノシトール-[4,5]-２リン酸（0.032μmol）に1,2-Dipalmitoyl -sn -glycerol -3-phospho ethanolamine -N-(Cap Biotinyl)（0.20μmol）（Avanti Polar Lipids社、製品番号870277P）の混合液をアルゴンガスで乾燥させたガラスチューブに、氷温のPI3Kバッファー（0.8ml）を加え、氷中で超音波をかけることにより、PIP2/Biotin-PEミセル溶液を作成した。PI3Kバッファーの組成は下記の通りである。PI3Kバッファー（40mM HEPES-Na (pH7.4)、120mM NaCl、1mM EGTA、1mMジチオスレイトール、1mMβグリセロリン酸、10mM MgCl2、0.01% BSA）【００８１】
（２）PI3-kinaseβ活性の測定と、Ｇ蛋白質βγ（Gβγ）添加の影響の測定
上記PIP2/Biotin-PEミセル溶液をPI3Kバッファーを用いて100倍に希釈した希釈液に、実施例１に記載の方法と同様に精製したGβ1γ2-His（終濃度0、0.25、1μg/ml）、PI3-kinaseβ（終濃度0、1、2μg/ml）（PI3 Kinase (p110β/p85α), active、Upstate社、製品番号14-603）を加えた溶液20μlに、5μlの2.4mM ATPを加え、室温で1時間反応した。15μlの30μMワートマニン、10nM GRP-PH（Cell Biolabs社、製品番号STA-200）、0.3% BSAを含むPI3Kバッファーを加えて反応を停止し30分室温で静置した。白色384穴プレートに、AlphaScreen GST detection kit（PerkinElmer社、製品番号6760603C）の添付マニュアルに従って0.1% BSAを含むPI3Kバッファーで50倍に希釈したanti GST Acceptor Beads 5μl、上記反応液15μlを加え、室温、30分間静置、さらに同様に50倍に希釈したStreptavidin Donor Beads 5μlを加え、室温、1.5時間放置後、EnVision（PerkinElmer社）を用いて、AlphaScreenの測定プロトコールを用いて測定を行った。図６に、各Gβγ添加濃度におけるシグナル値を示した。値はPI3-kinaseβ、Gβ1γ2-Hisともに添加しないサンプルのシグナル値を差し引いた値を、酵素活性に由来するシグナル値として表した。図６に示した通り、PI3-kinaseβの活性が、反応によって生じたPIP3によるシグナル値として観察され、Gβγ添加量に依存したPI3-kinaseβの活性の亢進が認められた。本方法を用いてPI3-kinaseβのGβγによる活性の亢進を測定することが可能であることが分かり、本方法を用いてPI3-kinaseβ/Gβγ相互作用に対して影響を与える（亢進する、あるいは阻害する）化合物のスクリーニングが可能であることが示された。【００８２】
なお脂質修飾酵素活性の阻害物質や亢進物質のスクリーニングは、例えば、披検物質の存在下または非存在下で上記実施例１〜５に準じて脂質修飾酵素の活性を評価することにより行うことができる。【００８３】
更に例えば実施例５のように脂質修飾酵素の活性に対して制御作用を示す脂質膜結合性蛋白質の存存下または非存在下で、披検物質の脂質修飾酵素活性の阻害／亢進作用を評価することにより、該脂質膜結合性蛋白質と該脂質修飾酵素との相互作用に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、脂質修飾酵素の阻害剤、あるいは活性亢進剤を得ることが可能である。例えばphosphoinositide kinaseの阻害剤は、抗炎症薬、抗がん剤等に使用可能であり、活性亢進剤は糖尿病治療薬等に使用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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