(57)【要約】  ＷＴトランスグルタミナーゼに、ジスルフィド結合（SS結合）を形成し得るシステイン残基への変異を導入することによって得られる、耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）のアミノ酸配列を有するタンパク質：
（Ａ）配列番号２において、下記ａ）〜ｉ）から選択される少なくとも１の変異を有するアミノ酸配列：
ａ）７位及び58位のシステインへの置換、
ｂ）46位及び318位のシステインへの置換、
ｃ）93位及び112位のシステインへの置換、
ｄ）106位及び213位のシステインへの置換、
ｅ）160位及び228位のシステインへの置換、
ｆ）２位及び282位のシステインへの置換、
ｇ）２位及び283位のシステインへの置換、
ｈ）３位及び283位のシステインへの置換、
ｉ）17位及び330位のシステインへの置換；
（Ｂ）（Ａ）の配列において、ａ）〜ｉ）の変異以外に１〜数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２のａ）〜ｉ）に対応する位置から選択される少なくとも１つの位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２のａ）〜ｉ）中に記載の位置に対応する位置の変異以外に１〜数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の宿主細胞を培養し、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質、請求項５に記載の方法によって製造されたタンパク質、又は請求項４に記載の宿主細胞を基質タンパク質に作用させる工程を含む、当該基質タンパク質の加工方法。
【請求項７】
基質タンパク質の加工が４０℃〜１００℃で行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
基質タンパク質の加工がｐＨ３〜４の条件下で行なわれることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放線菌由来トランスグルタミナーゼの変異体タンパク質に関する。トランスグルタミナーゼ（単にＴＧともいう）はタンパク質間に架橋結合を形成させることで、ゲル状物質を生じさせるので、食品加工等に幅広く利用されている。トランスグルタミナーゼの熱安定性、ｐＨ安定性が向上した変異体ＴＧは、ＴＧの保存安定性の向上、高温での反応、反応可能ｐＨの拡大等を可能にし、新しい分野への本酵素の適用を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼはタンパク質のペプチド鎖内にあるγ-カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素である。本酵素をタンパク質に作用させるとε-（γ-Glu）-Lys架橋形成反応、Glnの脱アミド化によるGluへの置換反応が起こりうる。トランスグルタミナーゼとしては、これまでに動物由来のものと微生物由来のものが知られている。前者は、Ｃａ２＋依存性の酵素で、動物の臓器、皮膚、血液などに分布している。例えば、モルモット肝臓トランスグルタミナーゼ（非特許文献１）、ヒト表皮ケラチン細胞トランスグルタミナーゼ（非特許文献２）、ヒト血液凝固因子XIII（非特許文献３）などがある。後者については、ストレプトマイセス属の菌から、Ｃａ２＋非依存性のものが発見されている。例えば、ストレプトマイセス・グリセオカルネウス（Streptomyces griseocarneus）NBRC 12776、ストレプトマイセス・シナモネウス（Streptomyces cinnamoneus）NBRC 12852、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）NBRC 13819等が挙げられる。そのうちストレプトマイセス・モバラエンシスのvariantの培養上清から見出されたトランスグルタミナーゼをＭＴＧ(Microbial Transglutaminase)と称する。更に、ストレプトマイセス・リジクス (Streptomyces lydicus) NRRL B-3446からも、Ｃａ２＋非依存性トランスグルタミナーゼが発見されている（特許文献１）。これらの微生物が生産するトランスグルタミナーゼの一次構造はペプチドマッピング及び遺伝子構造解析の結果、動物由来のものとは相同性を全く持たないことが判明している（特許文献２）。【０００３】
ＭＴＧは331個のアミノ酸からなる分子量約38,000の単量体タンパク質である（非特許文献４）。ＭＴＧは、上記菌類等の培養物から精製操作を経て製造されているため、供給量、効率等の点で問題があった。また、遺伝子工学的手法によるトランスグルタミナーゼの製造も試みられている。エシェリヒア・コリ（E.coli）、酵母等による分泌発現による方法（特許文献３）や、エシェリヒア・コリでＭＴＧをタンパク質封入体として発現させた後、この封入体をタンパク質変性剤で可溶化し、脱変性剤処理を経て再生させることにより活性をもつＭＴＧを生産する方法（特許文献４）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）でＭＴＧを分泌発現する方法（特許文献５）が報告されている。動物由来のトランスグルタミナーゼとは異なり、ＭＴＧをはじめとする微生物由来のトランスグルタミナーゼは、Ｃａ２＋非依存性であるため、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、あるいはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等に利用されている（特許文献６）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上利用可能性の高い酵素である。酵素反応条件については、例えば、ゲル化食品の場合、酵素反応時間が短いと固まらず、逆に反応時間が長過ぎると堅くなり過ぎて、商品とならない。そこで、ゼリー等のゲル化食品、ヨーグルト、チーズ、あるいはゲル状化粧品などの製造や食肉の肉質改善等にＭＴＧを利用する場合、基質及び酵素の濃度、反応温度、反応時間を調節することによって、目的物を作製している。しかしながら、ＭＴＧを利用した食品や試薬などが多岐にわたるにつれて、濃度、温度、時間等を調節するだけでは、目的とする製品を作製できない場合があり、ＭＴＧの酵素活性を改質する必要性が生じている。【０００４】
野生型ＭＴＧ（野生型ＭＴＧとは、天然に存在し、アミノ酸配列の改変がおこなわれていないＭＴＧを意味する）はｐＨ約４〜１０の間で安定であることが知られており、比較的幅広いｐＨで安定と言えるが、極端な酸性やアルカリ性条件下での反応は困難である。また、野生型ＭＴＧの至適温度は約５５℃であり、あまりに高い温度での反応も困難である。また、この至適温度より低い温度であっても、長時間のインキュベーションによって酵素活性の低下が生じ得る。従って、ｐＨ安定性、熱安定性などが向上した変異体トランスグルタミナーゼが存在すれば、トランスグルタミナーゼを新規な用途で使用することが可能になると考えられる。【０００５】
ＭＴＧはこれまで、主に食品分野で利用されてきた。繊維、化成品（写真フィルム、皮なめし）、飼料、香粧品、医薬など様々な用途での応用可能性が示唆されている。【０００６】
繊維分野では、トランスグルタミナーゼによるウールの改質が知られている。すなわち、ウールをトランスグルタミナーゼで処理することによって、風合いを維持したまま防縮性、抗ピリング性及び疎水性を付与できることが知られている（特許文献８）。トランスグルタミナーゼをウールに使用する場合、ケラチンへの反応を高温短時間で実施できると、単位時間あたりの処理量の増大がはかられ、生産効率が向上するので産業上有用であると考えられる。【０００７】
皮なめしとは、動物の皮（hide/skin）に、複数の工程からなる処理、加工を施し、皮を、耐久性、柔軟性のある革にする加工のことであるが、この加工は、６価クロムで皮のコラーゲンを架橋することによって行われる。６価クロムは、有害で環境中への放出が好ましくないため、代替法の開発が強く求められている。皮なめしへのトランスグルタミナーゼの利用については、特許文献９で微生物由来トランスグルタミナーゼが皮なめしに使用できることが開示されているが、実際に皮に作用させた実施例はなく、いまだ実用化されていない。６価クロムでの架橋は、ｐＨ３〜４で行われるので、トランスグルタミナーゼもこのｐＨで反応することができれば好ましいと思われるが、ＭＴＧは酸性に弱いため、実際の適用は困難である。【０００８】
以上、繊維加工、皮なめし等の用途の場合、トランスグルタミナーゼの熱安定性（即ち耐熱性）を向上させ、高温短時間で反応を終了させること、また、ｐＨ安定性を向上させ、酸性領域での反応を可能とすることが望まれている。【０００９】
上記したように、トランスグルタミナーゼの酵素活性を改質、向上させる手段としては、反応条件の検討に加え、トランスグルタミナーゼ自体の改質、即ち、トランスグルタミナーゼの熱安定性の向上、ｐＨ安定性の向上などが挙げられる。例えば、熱安定性を向上させることにより、より適用対象が広がり、反応速度の向上などが期待できる。また、ｐＨ安定性を向上させることにより、より広いｐＨ範囲での酵素反応や保存が可能となろう。これは、工業化においても有利であろう。【００１０】
ＭＴＧの耐熱性及び／又はｐＨ安定性を改質するためには、ＭＴＧの変異体を作製し、その活性等を評価し、優良な変異体、即ち耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上した変異体を探し出す必要がある。変異体を作製するには、野生型の遺伝子を操作する必要があり、したがって、遺伝子組換えタンパク質が調製可能なことが必要条件となる。ＭＴＧの場合は、コリネバクテリウム・グルタミカムを用いての分泌発現系が確立されている（特許文献５）。【００１１】
コリネバクテリウムの分泌発現系は、Sec系とTat系が知られている。Sec系ではタンパク質が高次構造形成する前の状態で分泌されるのに対し、Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌されることが特徴的である（J. Biol. Chem. 25; 273(52): 34868-74, 1998）。Sec系は、エシャリヒア・コリやバチルス・ズブチリス等の原核生物から、酵母、カビ、そしてヒト等の真核生物に至まで幅広く存在し、最も主要で且つ一般的なタンパク質分泌経路である。Tat系では、Sec系で分泌させることが困難であった異種タンパク質を効率よく分泌させることも可能である（特許文献１０）。ＭＴＧの場合、Sec系、Tat系のどちらを使っても分泌できるので、改変によってSec系での分泌が難しくなった場合、Tat系での分泌を試みることもできる。【００１２】
タンパク質の安定性を高めるためには、一般的には、水素結合、静電的相互作用、疎水相互作用などの非共有結合、ジスルフィド結合などの共有結合を導入して、分子内部の疎水性コアのパッキングを強化したり、二次構造のαヘリックスを安定化したりするなどの方法、あるいは、タンパク質の構造を不安定化させる因子を除去する方法を用いることができる。ジスルフィド結合の導入によってタンパク質の安定性を向上させるためには、システインを導入するのに適した位置を探索することが必要である。
【特許文献１】特表平10-504721号公報
【特許文献２】欧州特許公開公報0 481 504 A1
【特許文献３】特開平5-199883号公報
【特許文献４】特開平6-30771号公報
【特許文献５】国際公開第2002/081694号パンフレット
【特許文献６】特開昭64-27471号公報
【特許文献７】特開2001-321192号公報
【特許文献８】特開平3-213574号公報
【特許文献９】米国特許6,849,095号明細書
【特許文献１０】国際公開第2005/103278号パンフレット
【非特許文献１】K．Ikura et al., Biochemistry, 27, 2898, 1988
【非特許文献２】M.A. Phillips et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A, 87, 9333,1990
【非特許文献３】A. Ichinose et al., Biochemistry, 25, 6900, 1986
【非特許文献４】T. Kanaji et al., Journal of Biological Chemistry. 268, 11565, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、野生型（以下単にＷＴとも略す）トランスグルタミナーゼと比較して耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を提供し、高温で短時間での酵素反応及び／又はより広いｐＨ範囲での酵素反応を可能とし、繊維加工、皮なめしなどに好適なトランスグルタミナーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＷＴトランスグルタミナーゼタンパク質のアミノ酸配列中の特定の位置に、ジスルフィド結合の形成を可能にするシステインへの変異を導入することによって、耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を作製し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
本発明を概説すれば、以下に列挙するとおりである。
［１］  トランスグルタミナーゼ活性を有し、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）のアミノ酸配列を有するタンパク質：
（Ａ）配列番号２において、下記ａ）〜ｉ）から選択される少なくとも１の変異を有するアミノ酸配列：
ａ）７位及び58位のシステインへの置換、
ｂ）46位及び318位のシステインへの置換、
ｃ）93位及び112位のシステインへの置換、
ｄ）106位及び213位のシステインへの置換、
ｅ）160位及び228位のシステインへの置換、
ｆ）２位及び282位のシステインへの置換、
ｇ）２位及び283位のシステインへの置換、
ｈ）３位及び283位のシステインへの置換、
ｉ）17位及び330位のシステインへの置換；
（Ｂ）（Ａ）の配列において、ａ）〜ｉ）の変異以外に１〜数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２のａ）〜ｉ）に対応する位置から選択される少なくとも１つの位置に変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２のａ）〜ｉ）中に記載の位置に対応する位置の変異以外に１〜数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列。
［２］  上記［１］に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［３］  上記［２］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［４］  上記［３］に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
［５］  上記［４］に記載の宿主細胞を培養し、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、上記［１］に記載のタンパク質の製造方法。
［６］  上記［１］に記載のタンパク質、上記［５］に記載の方法によって製造されたタンパク質、又は上記［４］に記載の宿主細胞を基質タンパク質に作用させる工程を含む、当該基質タンパク質の加工方法。
［７］  基質タンパク質の加工が４０℃〜１００℃で行われることを特徴とする、上記［６］に記載の方法。
［８］  基質タンパク質の加工がｐＨ３〜４の条件下で行なわれることを特徴とする、上記［６］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＷＴトランスグルタミナーゼの改変によって、耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上したトランスグルタミナーゼを提供することができる。更に、耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上したトランスグルタミナーゼを用いることにより、新規製品、及び新規技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】各変異体について、示した温度で１０分間加熱した後の残存活性（％）を示す図である。
【図２】50℃で１、２及び３時間加熱後のT7-E58（7/58）変異体の残存活性（％）を示す図である。
【図３】各ｐＨ領域におけるT7-E58（7/58）変異体の残存活性（％）を示す図である。
【図４】ＭＴＧと各種放線菌由来ＴＧのアミノ酸配列のアラインメントを表した図である。保存されているアミノ酸残基を*で示した。
【図５】各変異体について、６０℃で１０分間加熱した後の残存活性（％）を示す図である。
【図６】各変異体について、６０℃で１０分間加熱した後の残存活性（％）を示す図である。
【図７】ｐＨ３、ｐＨ６、ｐＨ１２で1時間保持後の各変異体の残存活性（％）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を具体的に説明する。トランスグルタミナーゼは、ゼラチン、チーズ、ヨーグルト、豆腐、蒲鉾、ハム、ソーセージ、麺類などの食品の製造や食肉の肉質改善等に広く利用されている（特開昭64-27471号）。また、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定化酵素の担体などの製造に利用されているなど、産業上種々の目的に使用されている酵素である。トランスグルタミナーゼは、タンパク質分子のペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する。タンパク質分子中のリジン残基のε−アミノ基がアシル受容体として作用するとタンパク質分子中及び分子間においてε−（γ−Glu）−Lys結合が形成される。【００１９】
トランスグルタミナーゼは、動物由来のＣａ２＋依存性のものと微生物由来のＣａ２＋非依存性のものとに大別される。微生物由来のＴＧとしては、放線菌由来のものが知られている。各種放線菌由来のＴＧのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の代表例を、下記表に示す。【００２０】
【表１】
2008099898.tif 000002
【００２１】
これら以外のトランスグルタミナーゼホモログを用いても、本明細書中に記載される方法に従って、耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上した変異体タンパク質を得ることができる。すなわち、トランスグルタミナーゼは、微生物種や株によってその配列が若干異なる場合もあるため、本発明の変異体タンパク質を得るために改変され得るトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列は、上記アミノ酸配列２、４、６、８、１０及び１２に限定されず、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質であれば、配列番号２、４、６、８、１０又は１２と７０％、好ましくは８０％、更に好ましくは９０％、とりわけ好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質であれば、後述する方法と同様にしてアラインメントを実施し、対応するアミノ酸残基を特定することによって、当該アミノ酸残基に変異を導入し、本発明の変異体を得ることができる。なお、ここにいう「相同性」とは同一性をいう。
相同性の解析は、例えば、「Genetyx ver. 7（Genetyx Corporation）」のデフォルトパラメーターを用いて計算することができる。
さらに、前記配列番号１、３、５、７、９もしくは１１に記載のヌクレオチド配列と相補的な配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、トランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた本発明の変異体タンパク質の作成に用いることが出来る。
ここに、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、相同性が高いヌクレオチド配列同士、例えば８０、９０、９５、９７又は９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、１xＳＳＣ，0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1xＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、さらに好ましくは、68℃、0.1xＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件などが挙げられる。
プローブとして、配列番号１、３、５、７、９又は１１のヌクレオチド配列の部分配列を用いることもできる。そのようなプローブは、該ヌクレオチド配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１、３、５、７、９又は１１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗浄条件としては、50℃、２xＳＳＣ、0.1％ＳＤＳが挙げられる。【００２２】
トランスグルタミナーゼは、例えば微生物等（後述の形質転換体を含む）で発現・分泌されたものを、分離・回収・精製等の工程に付すことによって得ることができる。また、微生物等に発現させた状態で用いてもよい。【００２３】
「トランスグルタミナーゼ活性」とは、上記のように、タンパク質中のグルタミン残基とリジン残基との間に架橋を形成する活性を意味する。当該トランスグルタミナーゼ活性は、微生物等から分離・精製したＴＧの形態の他、微生物等に発現させた状態で測定することもできる。【００２４】
トランスグルタミナーゼ活性は、ハイドロキサメート法（J.Biol.Chem., 241, 5518-5525,1966）でアッセイすることができる。【００２５】
ハイドロキサメート法におけるトランスグルタミナーゼの活性単位は、次のように定義される。すなわち、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロル酢酸存在下で鉄錯体に変換させた後、525ｎｍの吸光度で、その量を測定する。このようにしてヒドロキサム酸の量より検量線を作製し、１分間に１μモルのハイドロキサメートを生成させる酵素量をトランスグルタミナーゼの活性単位、１ユニットと定義する。この測定法の詳細は既に報告されている通り（例えば、特開昭64-27471号公報等参照）である。【００２６】
「ＷＴ（野生型）トランスグルタミナーゼ」とは、アミノ酸配列の変異が導入されていない天然に存在するトランスグルタミナーゼを意味する。ＷＴトランスグルタミナーゼの耐熱性及び／又はｐＨ安定性と比較して、トランスグルタミナーゼ変異体タンパク質の耐熱性及び／又はｐＨ安定性が「向上」したとき、この変異体タンパク質は本発明の好ましい変異体である。【００２７】
本明細書中で、「耐熱性（即ち熱安定性）の向上」とは、長時間（例えば、約１０分以上）にわたってＷＴトランスグルタミナーゼを用いることが不適当な温度範囲（長時間にわたるインキュベーションにより、ＷＴトランスグルタミナーゼの活性が著しく低下する温度）、例えば約５０℃以上、好ましくは約５５℃以上、好ましくは約６０℃以上、より好ましくは約６５℃以上、さらに好ましくは約６８℃以上の温度でも、酵素がその活性をより長時間保持できるようになることを意味する。即ち、「耐熱性の向上」とは、トランスグルタミナーゼを、このような範囲内の温度（例えば、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約６８℃）で長時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間）インキュベートした場合の活性低下の割合が、ＷＴと比較して小さくなることを意味する。【００２８】
本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、例えば６５℃で、１０分間加熱した後に、残存活性が１％以上、３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上あるタンパク質である。【００２９】
本明細書中で、「ｐＨ安定性の向上」とは、ＷＴトランスグルタミナーゼを用いることが不適当なｐＨ領域（ＷＴトランスグルタミナーゼの活性が著しく低下するｐＨ）、例えば、約４以下のｐＨの酸性領域（好ましくは約３〜４のｐＨ）、又は例えば、約１０以上のｐＨのアルカリ性領域でも、酵素がその活性を保持できるようになることを意味する。本発明の好ましい変異体トランスグルタミナーゼは、特に酸性領域での安定性が向上したトランスグルタミナーゼである。【００３０】
本発明においては、ＭＴＧの耐熱性及び／又はｐＨ安定性を向上させるために、ＭＴＧ遺伝子に、ジスルフィド結合（SS結合）を形成し得るシステイン残基への変異を導入する。変異を導入する位置については、以下のように決定する。ＭＴＧの成熟体領域の一次配列上10残基以上離れている２つの残基に関して、その立体構造におけるCβ原子間の距離を計算し、５Å以内、好ましくは4.5Å以内の距離に収まっているペアを抽出する。それらについて、どちらか一方の側鎖が、水素結合で他の残基と相互作用しているか、疎水性コアを形成するようなものは、SS結合を形成させる改変により本来の安定性を損なう可能性があるので、対象から除外する。【００３１】
変異導入後、塩基配列を確認する。変異の導入は、各種公知の方法により可能であるが、例えばStratagene社のQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitなどを用いることによって簡便に行うことができる。【００３２】
本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、配列番号２において、（Ａ）下記ａ）〜i）から選択される少なくとも１の変異を有するアミノ酸配列：
ａ）７位及び58位のシステインへの置換、
ｂ）46位及び318位のシステインへの置換、
ｃ）93位及び112位のシステインへの置換、
ｄ）106位及び213位のシステインへの置換、
ｅ）160位及び228位のシステインへの置換、
ｆ）２位及び282位のシステインへの置換、
ｇ）２位及び283位のシステインへの置換、
ｈ）３位及び283位のシステインへの置換、
ｉ）17位及び330位のシステインへの置換；
或いは（Ｂ）これらの変異以外に１〜数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、を有するタンパク質である。さらに、（Ｃ）配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列中の、配列番号２のａ）〜ｉ）に対応する位置から選択される少なくとも１つの位置に変異（システインへの置換）を有するアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、とりわけ好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有しトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列中の、配列番号２のａ）〜ｉ）に対応する位置から選択される少なくとも１つの位置に変異（システインへの置換）を有するアミノ酸配列；或いは（Ｄ）（Ｃ）の配列において、配列番号２のａ）〜ｉ）中に記載の位置に対応する位置の変異（システインへの置換）以外に１〜数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、を有するタンパク質もまた、本発明の範囲内である。【００３３】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列は、具体的には、ａ）〜ｉ）から選択される少なくとも１の変異に加えて、ａ）〜ｉ）中に示された個々の位置及び／又はこれら以外の位置に、１〜数残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列である。これは、上記（Ｄ）のアミノ酸配列についても同様に当てはまる。【００３４】
本明細書において、配列番号４、６、８、１０及び１２から選択されるアミノ酸配列中の、上記位置に「対応する」位置は、これらの配列と配列番号２のアミノ酸配列とをアラインさせて決定される。また、本明細書中に示されたもの以外のトランスグルタミナーゼホモログのアミノ酸配列を配列番号２のアミノ酸配列とアラインメントさせて「対応する」位置を決定し、その位置に変異を導入することも可能である。例えば、配列番号２と他の配列とをアラインさせる際にギャップが導入される場合は、上で言及した位置は前後にずれる可能性があることに留意すべきである。対応する位置については、例えば図４を参照のこと。【００３５】
アミノ酸配列のアラインメントに使用されるアルゴリズムとしては、NCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers及びMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］などが挙げられる。【００３６】
ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）以外でも、本酵素とアミノ酸配列の相同性が認められるトランスグルタミナーゼ活性を有する酵素、あるいは、本酵素と類似の立体構造を持つと予想されるトランスグルタミナーゼ活性を有する酵素の改変を、ＭＴＧの立体構造を基に行うことは十分可能である。ＭＴＧにおいて、基質特異性等の改変に有効であるアミノ酸置換は、ストレプトマイセス・シナモネウスやストレプトマイセス・リジクス（特表平10-504721号）等の微生物に由来する類縁酵素においても有効であることが予測される。【００３７】
本発明の変異体タンパク質は、得られるトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有している限り、特にその耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上している限り、上記システインへの変異を１対だけ又は複数対組み合わせて有していてもよい。このようなタンパク質は、当該分野で公知の方法に従って作製できる。【００３８】
上述の置換、欠失、付加及び／又は挿入は、得られるトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有している限り、特にその耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上している限り、特に限定されない。このような変異体タンパク質が有する置換、欠失、付加及び／又は挿入の数は、１〜数残基（１〜３０、好ましくは１〜１５、更に好ましくは１〜５、３若しくは２残基）であることが望ましいが、その変異体タンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有している限り、特にその耐熱性及び／又はｐＨ安定性が向上している限り、任意の数のアミノ酸の置換、挿入、付加、欠失を含んでもよい。例えば、この変異が置換の場合、類似アミノ酸による置換（即ち、保存的アミノ酸置換）はタンパク質の機能に影響を与え難いことが予測されるので、類似アミノ酸による置換が好ましい。ここで「類似アミノ酸」とは、物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知である。【００３９】
本発明はまた、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチドと呼ぶ）を提供する。このようなポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法（例えば、本明細書中に記載した方法）を用いて取得可能である。適切な制限酵素を用いて、このポリヌクレオチドをベクターに挿入し、組換えベクターを得ることができる。【００４０】
本発明の組換えベクターに使用するベクター骨格は、その目的（例えば、クローニング、タンパク質の発現）に応じて、或いはこのベクターを導入すべき宿主細胞、好ましくは微生物に適したものを適宜選択し、使用することができる。この組換えベクターが発現ベクターである場合、この発現ベクターは、適切なプロモーターに機能可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含み、好ましくは本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。また、発現したタンパク質の分離・精製に有用なタグ配列をコードする配列等を含んでもよい。また、ベクターは、対象宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。【００４１】
ベクターは、例えば、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、ポリエチレングリコール法、リチウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、パーティクル・ガン法等の、公知の形質転換技術を用いて、対象宿主細胞内に導入することができる。【００４２】
本発明は、このような組換えベクターで形質転換された宿主細胞（以下、本発明の形質転換体ともいう）もまた提供する。宿主細胞としては、大腸菌及び放線菌等の原核細胞並びに酵母等の真核細胞が挙げられる。タンパク質を発現させることを所望する場合、この宿主細胞は、タンパク質の産生に適し、且つ本発明の変異体タンパク質を機能的な形態で発現できる宿主細胞である。本発明の形質転換体は、上記形質転換技術を使用して得ることができる。使用可能な組換えベクター系の開発された微生物であれば、いずれの微生物であっても宿主細胞として利用可能であるが、好ましい宿主細胞としては、E. coli、コリネバクテリウム・グルタミカム、酵母、バチルス属細菌、各種放線菌などが挙げられるがこれらに限定されない。【００４３】
本発明の形質転換体は、当該分野で通常使用されている条件で培養することができる。例えば、培養の温度、時間、培地組成、ｐＨ、攪拌条件などは、培養する形質転換体に応じて適宜選択できる。【００４４】
本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、本発明の形質転換体によって発現される。トランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、当該形質転換体から分泌されるか、当該形質転換体から分離・精製して使用してもよく、当該変異体タンパク質を含んだ形質転換体としてそのまま使用してもよい。タンパク質の分離・精製は自体公知の方法に従って実施され得る。【００４５】
また、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質は、プロ体として発現させ、その後適切なプロテアーゼ（例、サチライシン）で処理して成熟体としてもよく、或いはプロ体とプロテアーゼとを対象宿主細胞中で同時に発現させて成熟体を得てもよい。【００４６】
得られた形質転換体の培養、トランスグルタミナーゼ変異体タンパク質の分離・精製は、例えば以下のように行うことができる。カナマイシンを含むCM2G培地を試験管に分注する。形質転換体を植菌し、30℃、24時間前培養する。カナマイシンとCaCO3を含むMM培地を50ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、前培養液を継代し、培養する。培養液を遠心後、上清をフィルター濾過し、Sephadex G25(M)を用いて、溶媒を20 mM リン酸緩衝液，ｐＨ7.0に置換する。サチライシンをトランスグルタミナーゼの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、トランスグルタミナーゼを活性化する。活性化した溶液を、Sephadex G25(M)を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化用緩衝液に交換する。次に、同緩衝液で十分平衡化された陽イオン交換カラム（リソースS  6 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に全量を負荷する。同緩衝液で再平衡化後、波長280nmでのUV吸収を指標に0→0.5 M NaClの直線濃度勾配により溶出される、NaCl濃度が200 mM近辺に溶出してくるタンパク質画分を分画する。画分の活性、タンパク量を測定し、比活性が低い画分を除いた比活性がほぼ同等なピークトップ近傍の画分を回収する。回収した画分をSephadex G25(M)を用いて、溶媒を20 mM リン酸緩衝液, ｐＨ6.0に置換する。得られたサンプルは濃度を20mM リン酸緩衝液, ｐＨ6.0で約1mg/mlに希釈し、使用時まで-80℃で保存する。【００４７】
本発明は、本発明のトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質、又は当該タンパク質を発現している形質転換体を使用して、基質タンパク質を加工する方法もまた提供する。トランスグルタミナーゼの基質となり得るタンパク質としては、トランスグルタミナーゼがアクセス可能なグルタミン残基及び／又はリジン残基を有するタンパク質が挙げられる。この方法は、タンパク質の架橋反応を、ＷＴトランスグルタミナーゼを用いることが不適当な温度範囲及び／又はｐＨ領域で実施することが所望される種々の用途（繊維加工、皮なめし等）に適用できる。【００４８】
例えば、本発明の変異体タンパク質は、約４０℃〜約１００℃、好ましくは約５０℃〜約１００℃、より好ましくは約５５℃〜約１００℃、さらに好ましくは約６０℃〜約１００℃、なおより好ましくは約６５℃〜約１００℃で実施される反応において使用することができる。特に、繊維加工で使用される高温処理は、少なくとも約６５℃の温度で実施されるため、本発明の変異体タンパク質は当該繊維加工での使用に適している。【００４９】
また、本発明の変異体タンパク質は、約４以下、好ましくは約３〜約４のｐＨで実施される反応において使用することができる。特に、皮なめしでは、３〜４のｐＨで酵素反応を実施することが好ましく、本発明の変異体タンパク質は当該皮なめしでの使用に適している。【００５０】
本発明のジスルフィド結合の形成を可能にする変異を導入した変異体（ジスルフィド結合導入変異体）は、リジルエンドペプチダーゼによるペプチドマッピングを行うことによって、システイン残基が導入されていることを確認することができる。ペプチドマッピングは文献（J. Biol. Chem., 268, 16, 11565-11572, 1993）に記載の方法を参考にして実施することができる。ジスルフィド結合の形成は、ジチオスレイトールなどの還元剤で還元すると変異体の耐熱性が低くなること、MS分析による分子量変化などから確認することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。【００５２】
本明細書及び図面において、アミノ酸等を略号で表示する場合、各表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号或いは当該分野における慣用略号に基づくものである。【００５３】
実施例１  ＭＴＧのジスルフィド（SS）結合導入変異体タンパク質の作成
ＭＴＧは、SS結合を有しない。そこで、ＭＴＧにSS結合を導入して、耐熱性が向上するかどうか検討した。SS結合を導入する箇所については以下のように決定した。ＭＴＧの成熟体領域の一次配列上10残基以上離れている２つの残基に関して、そのCβ原子間の距離を計算し、4.5Å以内の距離に収まっているペアを抽出した。それらについて、どちらか一方の側鎖が、水素結合で他の残基と相互作用しているか、疎水性コアを形成するようなものは、SS結合を形成させる改変により本来の安定性を損なう可能性があるので、対象から除外した。その中からSS結合を形成しうると推測される残基ペアとして、６組を選出した。６組は、3個ずつ２種類に分かれる。すなわち、D46-S318、E93-V112、A106-D213の３つのペアは、温度因子が比較的大きな値（Cβ原子の値で約40Å2以上）になっている。T7-E58、A140-P190、A160-G228の３つのペアは、温度因子は特に高くないが、比較的分子の外側に存在している。変異導入法については、ＭＴＧの成熟体領域の２ヶ所をCysに置換した。【００５４】
置換方法は、Stratagene社のQuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、業者の推奨する方法に従い、プロＴＧ発現プラスミドｐPSPTG11（App. Env. Micro., 2003, 69, 3011-3014）に変異を導入した。変異が導入されているかどうかは、ABI PRISM Cycle Sequencing Kitを用い、業者の推奨する方法に従い、塩基配列の解析を行うことによって確認した。目的の変異が入ったプラスミドを、コリネ菌（コリネバクテリウム・グルタミカム）にエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーションは、文献（FEMS Microbiol. Lett., 53, 299-303, 1989）記載の方法で実施した。25μg／mlカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地を３ｍｌ試験管に分注した。変異株を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシン、5mM DTTと50g/LのCaCO3を含むMM培地を50ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、前培養液2.5ｍｌを継代し、30℃で48時間培養した。A140-P190、A160-G228のペアの変異体ではＴＧの分泌が微量であった。ＴＧの分泌がみられた残りの４つのペアの培養液を遠心（10,000rpm、10分間）後、上清をフィルター濾過し、SephadexG25(M)を用いて、溶媒を20mM リン酸緩衝液，ｐＨ7.0に置換した。サチライシンをＭＴＧの1/100量添加し、30℃、16時間反応させ、ＭＴＧを活性化した。活性化した溶液を、SephadexG25(M)を用いて、陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化用緩衝液（20mM 酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ5.5）に交換した。次に、同緩衝液で十分平衡化された陽イオン交換カラム（リソースS  6 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に全量を負荷した。同緩衝液で再平衡化後、波長280nmでのUV吸収を指標に0→0.5 M NaClの直線濃度勾配により溶出される、NaCl濃度が200 mM近辺に溶出してくるタンパク質画分を分画した。画分の活性、タンパク量を測定し、比活性が低い画分を除いた比活性がほぼ同等なピークトップ近傍の画分を回収した。活性、タンパク量は、文献（Prot. Exp. Puri., 2002, 26, 329-335）記載の方法で測定した。回収した画分をSephadexG25(M)を用いて、溶媒を20 mM リン酸緩衝液, ｐＨ6.0に置換した。なお、クロマトグラフィーは全て室温で行った。得られたサンプルは濃度を20 mM リン酸緩衝液, ｐＨ6.0で約1mg/mlに希釈し、使用時まで-80℃で保存した。【００５５】
ＴＧの分泌が微量であったA140-P190、A160-G228変異体は、Tat系での分泌を試みた。すなわち、TorAシグナルを用いたプロテイングルタミナーゼ分泌発現プラスミドpPKT-PPG（特許文献１０）を鋳型とし、配列番号13（5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’）と配列番号14（5’-CTTCCCCCGCGCCATTGTCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG-3’）に示した配列のプライマーにより、TorAシグナル配列とその５’上流域のCspBプロモーターを含んだ領域を増幅した。配列番号14に記載の配列はTorAシグナル配列のC末端側をコードする遺伝子配列とＭＴＧのプロ配列のＮ末端側をコードする配列を含んでいる。また、前述のプロＴＧ発現プラスミドpPSPTG11を鋳型とし、配列番号15（5’-GACAATGGCGCGGGGGAAG-3’）と配列番号16（5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTA-3’）に示した配列のプライマーを用いてPCRを行い、プロＴＧをコードする遺伝子配列を増幅した。配列番号13と配列番号14に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物と配列番号15と配列番号16に示した配列のプライマーで増幅されたPCR産物を1:1で混合して鋳型とし、配列番号13と配列番号16に示した配列のプライマーよりクロスオーバーPCRを行い、CspBプロモーターとTorAシグナルとプロＭＴＧをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅した。このPCR産物をScaIおよびEcoO65Iにおいて切断し、アガロースゲル電気泳動において約700bpの遺伝子断片を回収した。この回収したDNA断片をpPKSPTG1（WO01／23591記載）のScaI-EcoO65I領域に挿入することによりプロＴＧ発現プラスミドpPKT-PTG11を作製した。作製した塩基配列は前述の方法により決定し、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。【００５６】
プロＴＧ発現プラスミドpPKT-PTG11により発現させたＭＴＧの成熟体領域の２ヶ所をCysに置換することによって、A140-P190変異体とA160-G228変異体を作製した。置換方法は前述に記載の方法に準じて行った。目的の変異が入ったプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムにエレクトロポレーションにより導入した。Tat分泌装置発現プラスミドpVtatABCをこの菌株にエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーションは前述の方法で実施した。カナマイシン25μg／mlおよびクロラムフェニコール5μg／mlを含むＣＭ２Ｇ培地を３ｍｌ試験管に分注した。変異株を植菌し、30℃、24時間前培養した。25μg／mlカナマイシン、クロラムフェニコール5μg／mlと50g/LのCaCO3を含むMM培地を50ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、前培養液2.5ｍｌを継代し、30℃で48時間培養した。培養液の上清から。前述の方法に従って、サチライシンによる活性化、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行なった。得られた変異体は、溶媒を20 mM リン酸緩衝液、ｐＨ6.0に置換し、使用時まで-80℃で保存した。【００５７】
実施例２  ジスルフィド（SS）結合導入変異体の耐熱性評価
耐熱性の評価は、加熱後の残存活性で評価した。D46-S318（46/318）、E93-V112（93/112）、A106-D213（106/213）、T7-E58（7/58）を0.5mg/mlに濃度調整後、55℃、60℃、65℃及び68℃で10分加熱後の残存活性（％）で評価した。これらの変異体はいずれも、65℃、68℃の加熱でも活性が残っていたが、野生型ＭＴＧは失活した（図１）。T7-E58（7/58）変異体に関しては、50℃で１、２、３時間加熱し、残存活性をハイドロキサメート法で評価したところ、図２で示すように、大きな耐熱性の向上が見られた。さらに、A140-P190（140/190）、A160-G228（160/228）を0.1 mg/mlに濃度調整後、60℃で10分加熱後の残存活性（％）で評価した。A160-G228のみ耐熱性の向上が見られた（図５）。【００５８】
実施例３  ＭＴＧのジスルフィド（SS）結合導入変異体タンパク質の作成２
実施例２において、T7-E58(7/58)変異体の耐熱性が大きく向上したことから、ジスルフィド結合導入をさらに検討した。SS結合を導入する箇所については以下のように決定した。ＭＴＧの成熟体領域の一次配列上10残基以上離れている２つの残基に関して、そのCβ原子間の距離を計算し、5.0Å以内の距離に収まっているペアを抽出した。それらについて、どちらか一方の側鎖が、水素結合で他の残基と相互作用しているか、疎水性コアを形成するようなものは、SS結合を形成させる改変により本来の安定性を損なう可能性があるので、対象から除外した。その中からSS結合を形成しうると推測される残基ペアとして、Ｎ末端近傍を安定化する４組、S2-N282、S2-G283、D3-G283、P17-W330を選出した。変異導入法については、ＭＴＧの成熟体領域の２ヶ所をCysに置換した。目的変異の入ったプラスミドの作製方法、目的変異を持つプラスミドを保持したコリネバクテリウム・グルタミカムの作製法、培養方法は、実施例１と同様に行なった。S2-N282、S2-G283、D3-G283は、実施例１と同様、培養上清から、サチライシンによる活性化、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行なった。P17-W330は、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製は行なわず、SephadexG25(M)を用いて、溶媒を20 mM リン酸緩衝液, pH 6.0に置換したものをサンプルとした。【００５９】
実施例５  ジスルフィド（SS）結合導入変異体の耐熱性評価２
耐熱性の評価は、加熱後の残存活性で評価した。S2-N282（2/282）、S2-G283（2/283）、D3-G283（3/283）を0.1mg/mlに濃度調整後、60℃で10分加熱後の残存活性（％）で評価した。これらの変異体はいずれも、野生型に較べ大幅な耐熱性の向上が見られた（図６）。P17-W330は、未精製のため、0.1mg/mlに濃度調整後、60℃で10分加熱後の残存活性が、野生型に較べてどの程度上昇したか（％）で評価した。野生型に較べ、16％の残存活性の上昇し、耐熱性が向上したことが確認された。【００６０】
実施例６  ジスルフィド（SS）結合導入変異体のｐＨ安定性評価
ｐＨ安定性は、所定のｐＨで4℃、１時間保持後の残存活性で評価した。具体的には、2mg/mlのMTG及びT7-E58（7/58）変異体を、所定の緩衝液〔0.1Mグリシン緩衝液（ｐＨ3,4,9及び10）、20mMリン酸緩衝液（ｐＨ6）〕で４倍に希釈し、４℃で１時間保持後、20mMリン酸緩衝液，ｐＨ６で５倍に希釈し、ハイドロキサメート法で活性を測定した。結果は、ｐＨ６での活性を100％とし、図３に示した。酸性領域において、MTGよりT7-E58変異体の方がｐＨ安定性が高いことが分かった。
さらに、0.4mg/mlのMTG及びT7-E58（7/58）、S2-N282（2/282）、S2-G283（2/283）、D3-G283（3/283）を所定の緩衝液（0.1Mグリシン緩衝液pH3、0.1M燐酸ナトリウム緩衝液pH12）で４倍に希釈し、室温、１時間保持後、0.4M燐酸緩衝液pH6で２倍に希釈し、ハイドロキサメート法で活性測定した。結果は、ｐＨ６での活性を100％とし、図７に示した。全ての変異体で、pH３での耐酸性が向上し、2/282以外の変異体でpH12での耐アルカリ性が向上した。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号13：PCRプライマー
配列番号14：PCRプライマー
配列番号15：PCRプライマー
配列番号16：PCRプライマー
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、ＷＴタンパク質と比較して耐熱性が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を提供することができるので、酵素反応にかかる時間を短縮し、大量に処理を行なうことが可能となり、また、ｐＨ安定性（特に酸性ｐＨ領域での安定性）が向上したトランスグルタミナーゼ変異体タンパク質を提供することができるので、繊維加工や皮なめし等で要求される高温及び／又は酸性条件下での酵素処理が可能となる。【００６３】
本出願は、日本で出願された特願2007-034916を基礎としており、その内容は本明細書中に全て包含される。また、本明細書中で引用した特許文献及び非特許文献は、引用したことによってその内容の全てが開示されたと同程度に本明細書中に組み込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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