【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年6月1日(2004.6.1)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の詳細な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の概要）
本発明は、屋内および屋外の供給源物質から精製され脱色された活性アレルギー蛋白質の制御された酵素切断方法に関し、該方法は、天然Ｔ−リンパ球刺激性エピトープを保持するが、ＩｇＥ−結合性Ｂ細胞エピトープおよび補体−活性化剤が除去されたアレルゲンの断片を生じる。また、本発明は、新しい医薬製品に関する。これらのアレルゲン断片は、免疫療法用の通常のアレルギー抽出物の不利を呈さず、アレルギー性のヒトにおいて特異的Ｔ細胞アネルギーの状態および免疫学的寛容性を誘導するのに使用するのに安全である。
【０００２】
（一般的背景）
家庭ダスト、動物皮膚の放出上皮夾雑物、草本、雑草、樹木の花粉粒、およびいくつかの他の物質のような種々の環境物質の水性抽出物は、病気素因をもったヒト、所謂「アトピー」患者における気管支喘息、血管運動鼻炎および花粉症のようなアレルギー疾患のイン・ビボおよびイン・ビトロ診断で広く使用される。ＮｏｏｎおよびＦｒｅｅｍａｎによる１９１１年の最初の臨床的報告以来、かかる抽出物は、これらの病気の「脱感作」、「低感作」または「免疫療法」のための皮下注射の方法においてアトピーアレルギー疾患の治療で適用されてきた。抽出物における原因および支配的アレルギー成分が１０〜７０ｋＤａの範囲の分子量の蛋白質骨格構造を含むという観察に基づいて、１０ｋＤａ公称カットオフの膜を通して水性抽出物を透析しまたは限外濾過して、１０ｋＤａ未満の分子量を持つより関連性の低い成分を除去し、それにより、１０〜１００ｋＤａの範囲の多価抗原蛋白質を保持して、臨床適用のためのアレルギー抽出物の質を改良することが、アレルギー抽出物の製造プロセスにおける通例となった。ある場合には、３ｋＤａまたは５ｋＤａのより低いカットオフ制限が選択される。
【０００３】
現在の理論によると、ヒトにおける環境アレルゲンに対する暴露は、ＩｇＧ−およびＩｇＥ−イソタイプのアレルゲン−特異的抗体の形成を引き起こす。従って、免疫学的意味において、アレルゲンは、特別な分子的特徴または適当なモジュレーターのアレルギー抽出物における同時存在いずれかに起因して、ＩｇＥクラスの抗体の生合成をさらに促進するための、補助的特性が付与された通常のＩｇＧ−抗体誘導外来性抗原とみなすことができる。従って、一時、かかる抗原は、より適当には「アトピー性アレルゲン」［１］と呼ばれた。遺伝的に病気素因をもった所謂「アトピー性」のヒトは、この点に関して特に、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の上昇したレベルに応答する傾向がある。最初の誘導または「感作」相の後、アレルゲンとの新たな接触は、究極の病気兆候の原因であるアレルゲン−（ＩｇＥ）抗体複合体の局所的形成を導くと考えられる。より詳細には、最終的にアレルギーの臨床的発現兆候の原因であるメディエーター物質の放出を導く生化学事象の系列をトリガーすると考えられるのは、細胞膜上の（すなわち、肥満細胞または好塩基性白血球の）ＩｇＥ−（ｅ）受容体に結合したその特異的ＩｇＥ−クラス固着抗体とアレルゲンとの相互作用である。免疫療法の間にアナフィラキシー副作用の危険を低下させるために、非常に多数のアプローチが記載されてきた。最近、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１７３３号が公開され（１９９６年、１１月７日）、ここにはアレルギー罹患者の脱感作療法で使用される新規医薬組成物が開示されている。この組成物は、チロシンおよび重合されたアレルゲンを含む。他のアプローチは８０年代初期に既に提示されているが、不適当であることが判明した。ＧＢ−Ａ−１，４９２，０７３号は、分子内架橋を引き起こす薬剤剤によって修飾されたチロシンおよびアレルゲンの共沈殿を記載している。ＥＰ−Ａ−０，３６７，３０６号は、重合されたアレルゲンを調製し、架橋を提供し、その結果アレルギー原性を低下することを目的としたプロセスを記載している。１９８１年に既に公開されたさらにもう１つの古い公開ＥＰ−Ｂ−０，０３８，１５４号には、そのアレルギー原性を低下させるためのアレルゲンのポリサルコシンでの処理が記載されている。この刊行物によれば、特に２，０００〜１２，０００の分子量を持つポリサルコシンが有用である。この明細書は、プロッキング抗体を誘導する能力を保持して、それを脱感作療法のためにより適したものにすることが示唆される。この特許はまた、グルタルアルデヒドでの処理によってアレルゲンのアレルギー原性が低下される改良された形態の療法を記載するＵＫ特許１，２８２，１６３に言及している。別のアプローチがＵＫ特許第１，５７８，３４８号で提供され、そこでは、アレルゲン−ポリエチレングリコールコンジュゲートがアレルゲン特異的ＩｇＥ生産を抑制する所望の治療効果を誘導できると述べられている。これらの物質は非アレルギー原性で且つ非免疫原性であると述べられている。寛容原性アレルゲン断片によるアレルギー病の意図した免疫療法については、選択された生成物は、生理学条件下での酸性ヒドロラーゼおよび他の酵素による所謂「抗原−提示細胞」（ＡＰＣ）内で生じた天然Ｔ細胞エピトープに非常に近いはずである。この特別のアプローチは、米国特許第４，４６９，６６７号および欧州特許ＥＰ０１１３７１２  Ｂ１（文献６および７も参照）において先行技術に採用されている。かかる天然要素は、可能なペプチド結合ハプテン化学構造を含み、制御された条件下で蛋白質分解切断に対してアレルゲン抽出物成分を付すことにより、実験室において模倣することができる。この分野における多くの研究経路のうちの１つは、ヒトにおけるアレルギーの治療は、特異的ＩｇＥ抗体を誘導しないアレルゲン誘導体、すなわち、その所謂ＩｇＥ−結合性「Ｂ細胞エピトープ」を欠如したアレルゲン誘導体を用いて行われるべきことを示唆する。
【０００４】
かくして、アレルギー原性の低下によって脱感作用の組成物を提供する種々の非常に多数の方法が、過去２０年間にわたって提案されてきた。かなりの努力が種々の方法における問題に向けられているが、これまで殆ど成功していない。治療の要件の良好な理解を得るためには、アレルギー応答の誘導または惹起の間に、現実に何が起こるかを評価することが必須である。
【０００５】
外来性抗原に対する免疫応答の誘導は、単純な形態の種々のカテゴリーの細胞の協働、即ち、所謂「抗原−提示細胞」（ＡＰＣ）およびＴ−およびＢ−リンパ球集団の協働を要する。ＡＰＣおよびＴ−リンパ球の間の最初のシグナルは、ＡＰＣ、例えば、マクロファージによって内部化された外来性抗原の（蛋白質分解切断による）細胞内プロセッシングの間に生起する抗原性ペプチド断片よりなる。（「Ｔ細胞エピトープ」としても知られている）（外来性）抗原断片はＡＰＣの外方膜に実質的にリサイクルされ、次いで、それらは主要組織化学複合体（ＭＨＣ）の膜−結合クラスＩＩ抗原と会合したリガンドの形態で暴露されるようになる。ＡＰＣ上のかかるＴ細胞エピトープを認識し、それ自体がＢ−リンパ球を分泌する免疫グロブリンと協力するＴ−（ヘルパー）リンパ球（Ｔｈ１−およびＴｈ２−細胞）の集団のうち、特にアレルゲン特異的Ｔｈ２細胞クローンが、ヒトアトピー疾患の発症において中枢的役割を果たすと考えられる。Ｔｈ１細胞とは異なり、その表面上の適当なＴ細胞エピトープを発現するＡＰＣとの接触によって活性化されたＴｈ２細胞は、比較的大量のインターロイキン４（ＩＬ−４）および５（ＩＬ−５）を生じ、これは、とりわけ、Ｂリンパ球または血漿細胞によるサイトカインシグナル促進ＩｇＥ生合成として作用できる。これに基づいて、「即時型Ｉ」（アトピー）アレルギーの一時的理論は、アトピーヒトにおいて、Ｔｈ１リンパ球よりもＴｈ２が比較的優勢になり、その結果、ＩｇＥ合成が増加する。従って、活性な療法は、Ｔｈ２＞Ｔｈ１〜Ｔｈ１＞Ｔｈ２へのアレルゲン特異的Ｔ細胞活性のバランスを回復させることを目論む。アレルギー原性分子に由来するＴ細胞エピトープによるアレルゲン特異的Ｔ細胞クローンの考慮された操作は、それにより、それ自体を成功した免疫療法に対する潜在的に新しいアプローチとして提案されたが、かかるエピトープはアレルゲン−特異的ＩｇＥ抗体に結合もしないしそれを誘導もしないという制限がある［２，３］。しかしながら、分子クローニングおよび組換え技術に由来する選択されたＩｇＥ−結合抗原のアミノ酸配列から構造的に規定されるいくつかの合成Ｔ細胞ペプチドエピトープでの最近の臨床テストは、これまでのところ、所望の便宜な効果を達成しておらず［４，５］、従って、この最近採られた経路は結果に至るようには見えない。
【０００６】
理論に拘束されるつもりはないが、ＡＰＣおよびＴｈ細胞の間の相互作用は、いくつかの膜受容体を含む共刺激因子を要することはよく確立されているようである。また、もし最初のシグナル、すなわち、Ｔ細胞エピトープ認識のみが起こるならば、Ｔ細胞アネルギーが起こり得るという証拠も存在する。刺激のこれら初期相の後、これらＴｈ２細胞はアレルゲン−パルストＡＰＣによるさらなる刺激に応答しなくなる。よって、アレルゲン由来ペプチドでの刺激に続いてＴ細胞アネルギーがアレルゲン−特異的Ｔｈ２細胞クローンで誘導され得る。かかるアネルギーＴｈ細胞はＩｇＥ−生産Ｂ細胞に対する助けを提供せず、ＩｇＥレベルを下方調節するに至る。超最適用量の予備形成されたＭＨＣ適合Ｔ細胞エピトープの提示または投与が、共刺激シグナルの不存在下で、および恐らくは予備存在免疫状態においてさえＴ細胞アネルギーおよび免疫寛容性を誘導するという考えを支持するいくつかの予備的臨床データがある［６，７］。
【０００７】
個々のアレルギー源物質の抽出物は、非常に多様な区別されるＩｇＥ−結合蛋白質アレルゲンを具体化することが知られている。さらに、単一源からのいずれの個々の蛋白質アレルゲンも、ある範囲の多様な非ＩｇＥ結合Ｔ細胞エピトープを呈することができるＴ細胞活性化エピトープの豊富さおよびそれらからの適切な寛容原性ペプチドの困難性を考慮するとＴ細胞エピトープでの効果的な広スペククトル免疫療法は、最良には、少しの選択された合成ペプチドまたは組換えアレルゲンでよりもむしろ、供給源物質におけるアレルゲンの天然ライブラリーの非ＩｇＥ結合性断片のコレクションで達成することができると推定するのが合理的である。これは、優性エピトープの可能な化学的性質においてより激しくなる。現在の見解はＴ細胞エピトープが線形アミノ酸配列のペプチドであることをことを指示しており、これは一旦同定されれば、合成により生産できる。しかしながら、この論点は、天然に生じるアレルゲンは、しばしば蛋白質骨格に化学的に結合した糖鎖または他の有機化合物よりなる翻訳後側鎖を担持することを全く否定する。しかしながら、かかる化学的に結合した構造または酵素により生産されたアレルゲンの断片は、合成ペプチドまたは組換えアレルゲン転写体が無い。最後に、アレルゲンの科学および技術は、最も重要な現実的論点、すなわち、分解生成物および非生理学的分子複合体の形成に至る、未精製アレルギー抽出物における多数の成分の間で起こる化学的および物理的相互作用に関しては、未だ沈黙したままである。前記組成物での現実的結果の欠如と組み合わせたこれらの理由により、アレルギーの治療についてのより適切な調製物を開発する別のアプローチが採られた。
【０００８】
（発明の背景）
前記より、通常なされるように、免疫系は、丁度それが通常の外来性抗原を扱うようにアレルギーを扱うと推定した。しかしながら、この推定は、アレルゲンが何故通常の蛋白質抗原とは異なり、ＩｇＧ−抗体と縦列にて特異的ＩｇＥ−抗体の形成を誘導するかを説明せず、また、なぜヒト集団の少ない部分のみ（「アトピー」の人々）が、上昇したレベルのかかるＩｇＥ−抗体を生産するのみならず、臨床的発現アレルギー疾患を発症する傾向にあるのかを理解する助けとはならない。アレルギー疾患の病理メカニズムを逆調節するための最も適したアレルゲン調製物または断片を設計する前に、さらなる因子が考慮されなければならないのは明らかであり、これら因子のうちの１つは、補体系およびアレルギー抽出物の成分によるその活性化に関する。
【０００９】
アレルギー原性「屋内」起源物質の水性調製物は、イン・ビトロにて、ヒト血清で溶血補体（ｈｕＣ）を消費することが長い間知られていた［８］。膨大なアレルギー抽出物の化学的研究が、炭水化物を持つ蛋白質またはペプチドの＞１０ｋＤａメイラード型の反応生成物（すなわち、メラノイジン）、ならびにハウスダストおよび動物のふけの抽出物中の可溶性（eu-）メラニンを含む、有機分解生成物のほとんど普遍的な存在を発見した。これらの成分は、補体活性化および部分的にはアトピーアレルギー対象におけるイン・ビボ陽性皮膚反応の原因であることが示されてきた。他方、植物花粉のような典型的な「屋外」アレルゲンの水性抽出物において、補体活性化に関与する主要な物質＋が、最近、本発明者らによって、遊離もしくは蛋白質が吸着された縮合または加水分解可能タンニン、またはハプテン形態の蛋白質担体分子に高密度でコンジュゲートしたフラボノシドおよび他のポリフェノールであると同定された。メラノイジン、メラニンまたはタンニン分解生成物はそれ自体が免疫原性であるが、それ自体は抽出物中で蛋白質抗原と物理的に会合した存在し得、それにより、ＩｇＥクラスの抗体の優先的な誘導に至ると１９８３年に既に記載されている［９］。
【００１０】
アレルゲン原性抽出物のこれら特別の成分による非抗体媒介性補体活性化のメカニズムは、成分Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２および特別の条件下での古典的経路のＣ３を含む。かくして、アレルゲン抽出物中の化合物を変調することによる補体の局所的活性化は、強力なヒスタミン−遊離アナフィラキシーＣ３ａおよび断片Ｃ３ｂ（細胞性免疫系の調節における鍵となる因子）の生成に至り得る。さらに、「アトピー」個体の血清中の補体は、健康な対照個人の血清で観察された活性化因子に対してより感受性である傾向にあることが示されている［８］。
【００１１】
本発明者らは、予期せぬことに、アレルゲン抽出物中のタンニンおよびメラノイジンが、抗原の不存在下においてさえ補体系を活性化できることを観察した。よって、これらの物質は、Ｂ−リンパ球の増殖および抗体合成の刺激のための適当な「第２」シグナルを提供する（多価）Ｃ３ｂのような補体因子を生成することによってアジュバント特性を真に呈する。Ｂ細胞自体上の区別されるＣ３ｂ外方膜受容体ＣＤ２１は、Ｂ−リンパ球上のレクチンＣＤ２３に対するリガンドであり、これは、低親和性ＩｇＥ（Ｆｃ）−受容体として認識されてきたＴ細胞／Ｂ細胞の鎖および補体受容体相互作用の詳細は本明細書の範囲を超えているが、アレルゲン−特異的ＩｇＥ抗体合成に対するおよび非アレルゲン特異的補体活性化に対する刺激は密接に連結し得ることは明らかなようである［１０］。高められた抗アレルゲンＩｇＥ生産は、一般に、臨床的発現アレルギー反応をトリガーオフすると考えられるので、かくして、それは、免疫療法および寛容性誘導を意図したアレルゲン抽出物中の補体−、ＣＤ２１−およびＣＤ２３−活性化剤が望ましくなく、Ｔ細胞アネルギーの成功した誘導が一度に試みることができる前に出来る限り排除されなければならないことになる。この前提要件およびその現実的実行の認識は全く新しく、先行技術では提案されていない。
【００１２】
アレルゲン抽出物中の有機化合物の少なくとも２つの機能的に区別される群、すなわち、補体活性化タンニンおよびメラノイジン（または「アジュバント」）の認識は、一方では、抗原性（糖）蛋白質成分と相乗的に作用し、他方では、ヒトにおけるＩｇＥ−媒介アレルギー疾患の理解における新しくて予期せぬ突破口を表し、これは、新規な医薬のデザインおよび生産にとって重要な技術的反響を有する。例えば、ＩｇＥ−抗体誘導に至らない寛容性Ｔ細胞エピトープ組成物の製造では、アレルゲン出発物質は、補体活性化因子が可能な限り一掃されなければならない。
【００１３】
その補体活性化特性とは別に、タンニンおよびメラノイジンは多くの他の望ましくない効果を発揮する。これらの化合物は、多数の水素結合および疎水性相互作用によってほとんどの蛋白質に密に吸着され、それにより、酵素攻撃から蛋白質を保護する。逆に、タンニンおよびメラノイジンは、セリンプロテイナーゼトリプシン、キモトリプシンおよびカリクレインを含めた、中性もしくはわずかにアルカリ性の生理学的ｐＨ値で働く非常に多様な酵素を阻害する［１１］。タンニン／メラノイジン−蛋白質相互作用に関与する物理的力は２．５未満のｐＨ値でゼロに可逆的に降下するので、アレルゲンマクロ分子からのＴ細胞エピトープの酵素生産についての選択プロテイナーゼは、ｐＨ２でその最適活性を持つ胃酵素ペプシンである。このｐＨ値では、（約５ｋＤａの最大分子サイズを有する）タンニンおよびメラノイジンは、蛋白質から解離し、透析または限外濾過によって除去することができる。従って、アレルゲン断片化についてのペプシンでの酵素消化プロセスに、酵素不存在下で酸性（ｐＨ２．５未満）媒体からの透析工程が先行させて、アレルゲン蛋白質構造に影響することなく干渉タンニンおよび／またはメラノイジンを除去するのは絶対的に重要である。もしこれらの補体−活性化ポリヒドロキシ物質がペプシン消化プロセスに先だって除去されなければ、それらは、中和に際して所望のＴ細胞ペプチドと再会合せず、最終医薬生成物においてこれらを利用できなくするであろう。酵素断片化についての候補出発物質は、従って、酵素の不存在下でｐＨ２で調製された「脱色された」アレルゲンを含むことができ、これは、欧州特許番号ＥＰ０  ６６２  ０８０  Ｂ１号に記載されている。タンニンおよび／またはメラノイジンは５ｋＤａ膜を介して透析工程で除去することができる。
【００１４】
ＥＰ０  ６６２  ０８０  Ｂ１号に詳細に記載されているごとく、ｐＨ２．０±０．１における希塩酸または硫酸溶液中でのアレルゲン蛋白質の脱色プロセスは、１０ｋＤａカットオフ膜を介して酸性媒体から直接的に透析または限外濾過によってアレルゲン抽出物中の溶解した＞１０ｋＤａ成分の実質的割合（起源物質に依存して、１５〜６０重量％）を除去する。従って、遊離の成分の分子サイズは１０ｋＤａ未満であり、５ｋＤａあたりの分子質量を通常は有する天然タンニン、（ｅｕ−）メラニンおよびメラノイジンを含む。米国特許第４，４６９，６６７号および欧州特許ＥＰ０１１３７１２Ｂ１号に記載された手法に取り入られなかったように、もしこの注意した酸透析工程が消化相、例えば、ペプシンが添加された消化相に先だって採られなかったら、ｐＨ２での加水分解後のペプシンの場合に酸性溶液の中和は、前記したタンニン−ペプチド複合体の再会合を引き起こし、それにより、細胞性免疫系による引き続いての認識から所望のＴ細胞エピトープを保護する。酵素消化に先だってタンニンおよびメラノイジンを除去しないと、最終生成物の補体−活性化力を影響させず、ヒト適用に際してＩｇＥ合成の望まない刺激に至る。
【００１５】
正しく実行された脱色プロセスにも拘わらず、化学的に結合したポリフェノールおよびメイラード型構造は、しばしば、適当に脱色されたアレルゲン蛋白質上でさえ化学的および分光学的に同定することができる［１２］。かかるコンジュゲートしたポリフェノールおよび炭水化物誘導体は、蛋白質アレルゲンの分子構造の一体的一部を形成し、酸性媒体中では除去することができない。事実、かかる非蛋白質側鎖は、ハプテンでさえ、米国特許第５，３８４，３９５号および欧州特許ＥＰ  Ａ  ０，３８７，９５２号に概説されているように、特異的ＩｇＥ−およびＩｇＧ−抗体によって認識されるＢ細胞エピトープ部位の一部を形成する。事実的観点では、ＥＰ０  ６６２  ０８０  Ｂ１号の脱色プロセスによる吸着されたタンニンおよびメラノイジンの排除は、これらの蛋白質接合ハプテン構造のマスク解除を助け、ほとんどのアレルゲンにおいて、特異的ＩｇＥ抗体の結合のわずかな増加に至る。他方、蛋白質抗原担体上のハプテン分布および密度は、Ｐａｒｔｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａの花粉からのアレルゲンで報告されているように、特定の＞１０ｋＤａ脱色調製物（ＨＭＷ−Ｄ）が酵素により容易には加水分解できないようになものにできる［１２］。欧州特許ＥＰ０１１３７１２Ｂ１号で示されているものとは対照的に、ペプシンによる酵素消化の容易性は、区別される脱色された＞１０ｋＤａアレルゲン調製物の中では異なることが判明し、これは、酵素加水分解の条件がアレルゲン源に依存して適合されなければならないことを意味する。本特許出願の図１の例に示されているように、ペプシン消化の間にニンヒドリン試薬で測定された遊離ペプチドアミノ基の出現率は、事実、種々のアレルゲン花粉調製物の中では顕著な変化を示す。
【００１６】
アレルゲン蛋白質骨格に取り込まれて見出される優性ハプテン構造は、ポリヒドロキシルフラボノイドおよび他のポリフェノールの群に属し、これは、酸化的条件下では、蛋白質マクロ分子におけるシステイン残基との強力なチオエーテル結合を形成するか、あるいはリシン側鎖のｅ−アミノ基に連結したヘキソースまたはペントースの化学的転移生成物を表す［１］。Ｓ−結合およびＮ（ｅ）−結合の両ハプテン構造は、純粋な蛋白質吸収が無視できる３００〜３５０ｎｍの範囲の紫外光を吸収する。図２の例で示したように、事実、遊離されたニンヒドリン反応性遊離アミノ基の項で測定されたごとく、ＵＶ−スペクトロスコピーによって近似されたハプテン密度およびペプシンによるアレルゲンハプテン−蛋白質複合体の消化の間で逆の関係が観察される。
【００１７】
高度にペプシン耐性のＨＭＷ−Ｄ調製物のいくつかの場合には、遊離された遊離アミノ基の不足にも拘わらず（図１）、断片化はそれにも拘わらず検出可能蛋白質成分の喪失によって明らかであることが、電気泳動方法によって示すことができる。Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ花粉の例では、明瞭なカット断片化が、少なくとも１００倍だけ、酵素（Ｆｂ−Ｄ）断片において、ＩｇＥ−結合ではなく補体−活性化力の喪失によって示すことができる。ポリフェノール−またはリシン−糖構造要素の強く還元する特性に鑑みると、ある場合には、酸化は、ＩｇＥ−結合および補体活性化部位双方を十分に排除するのに必須の前提要件であり得る。断片化前のＨＭＷ−Ｄ調製物の酸化は、種々の化学剤を用いて、例えば、過ヨウ素酸塩で行うことができる（後記参照）。しかしながら、可能な炭水化物Ｔ細胞エピトープを保護するには、選択された方法は、紫外線照射による酸化であり、これは、補体活性化およびＩｇＥ−結合能双方をなくすることが示されている（１３）。いくつかの雑草、樹木および薬草の花粉からのＨＭＷ−Ｄ調製物の場合、従って、補足的酸化工程を脱色の後であるが断片化の前に導入することができる（後記参照）。
【００１８】
本発明による酵素断片化および（所望の）酸化手法は、ダニ、昆虫、黴、草本、雑草および樹木の科の花粉、職場環境における有機ダスト等を含めた、全ての公知のアレルゲン環境、屋内および屋外物質に適用することができる。これらの物質は抽出され、例えば、本明細書の一部をなすものとして援用するＥＰ  ０  ６６２  ０８０  Ｂ１号に記載された脱色工程に付される。抽出物中のアレルゲン物質の蛋白質分解を得るための断片化条件（予備酸化、基質に対する酵素の比率、酵素加水分解の時間等）の引き続いての正しい選択は、源物質の性質による予備的実験的証明に依存し得る。かかる選択は、当業者にとってルーチン的事項であり、過度の負担なくして実施することができる。
【００１９】
天然Ｔ細胞エピトープの提案されている調製は、実施例に記載される手法で例示される一連の工程に従う。一般に、本発明の方法は、アレルゲン性物質に対して寛容性を供するために個体への適用されるための寛容性提供抽出物の製法であって、該製法は、
ａ）アレルギー源物質を抽出し、
ｂ）３．５ｋＤａよりも低い分子量を持つ物質を除去してＨＭＷ−Ｎ画分を得、所望によりＨＭＷ−Ｎを凍結乾燥し、
ｃ）該画分からのＨＭＷ−Ｎ中のアレルギー物質に物理的に付着したタンニンおよびメラノイジンを除去して、タンニンおよびメラノイジンを含まない脱色ＨＭＷ−Ｄ画分ならびに非コンジュゲーテッドタンニンおよびメラノイジンを得、所望によりＨＭＷ−Ｄを凍結乾燥し、
ｄ）ＨＭＷ−Ｄ画分に存在する蛋白質を分解して１および１０ｋＤａの間の分子量を持つ断片を得ることを含み、
ここに、工程ｄ）の該生成物はＦｂ−Ｄであり、工程ａ−ｄの操作は該工程用の自体公知の方法で行うことを含む。
【００２０】
また、本発明は、補体−活性化剤が最大限に枯渇し、その天然Ｔ−リンパ球刺激エピトープを保持するが、ＩｇＥ−結合エピトープを含まず、アレルギー性ヒトにおいて特異的Ｔ細胞アネルギーおよび免疫学的寛容性を誘導するための組成物として使用される安全なアレルゲンの断片を含むアレルギー源物質の抽出物を含む。本発明による抽出物は、公知のアレルギー環境、昆虫、ダニ、黴、草木、雑草、花、低木および樹木の花粉を含めた屋内および屋外アレルギー物質から、および職場環境中の有機ダストから選択されるアレルゲン源に由来し得る。
【００２１】
かかる抽出物は、好ましくは、標準的なアッセイ条件下でＩｇＥ−結合の５０％阻害に必要な凍結乾燥物質の量として表されるアレルゲン断片のＩｇＥ−結合能が、同一溶媒中、同一条件下で、未処理抽出物のそれの少なくとも１００倍低いものである。別法として、あるいは前記と組み合わせて、本発明の抽出物は、例えば、ヒト溶血補体の５０％喪失を引き起こすための凍結乾燥物質の量として表したアレルゲン断片の補体−活性化能が、同一溶媒中、同一条件下で、未処理抽出物のそれの少なくとも１００倍低いものである。
【００２２】
前記具体例のいずれかにおける本発明の抽出物は、アレルゲン断片のＴ−リンパ球刺激指標が、同一溶媒中、同一条件下、未処理抽出物のそれに対して５０〜１５０％であるものであり得る。特に、本発明の抽出物は、かかる公称カットオフ値の膜を通してｐＨ７．０の水溶液の透析によって測定して、アレルゲン断片が１ｋＤａおよび１０ｋＤａの間の分子量を有するものである。本発明の抽出物は、遊離および／または蛋白質吸着タンニン、メラノイジンおよび他の色素が除去されている。
【００２３】
すなわち、開示された本発明の方法により得ることができる調製物は、本発明の範囲内に入る。本発明によるかかる調製物は、適当には、ヒトおよび／または動物への適用ができるために医薬上許容される投与形態とされるであろう。
【００２４】
調製物がそれから由来する天然アレルゲン物質に対する寛容性を誘導する目的での、アレルゲン個体の治療用の医薬の有効成分としての本発明の調製物の使用も、本発明の適当な具体例と考えられる。
【００２５】
本発明の製法における抽出、脱色および断片化を説明する例
Ａ．ＨＮＷ−Ｎの調製
脱脂植物花粉粉末、動物のふけ、消費ダニ培養または清浄ダニの乾燥体または他の昆虫体のような乾燥されたアレルゲン源物質を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０に懸濁させる（ＰＢＳ）。最初の４時間の実行において、＋４℃の冷い部屋で撹拌しつつ抽出を２回行い、その際、遠心後の残渣を１８時間再抽出し、遠心する。合わせた調製物を、１０ｋＤａ公称カットオフの膜（参照；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＰＬＢＳ  ０００  ０５）を装備したＰｅｌｌｉｃｏｎ系を用い、５容量の蒸留水に対して透析する。透析された＞１０ｋＤａ保持物を、次いで、凍結乾燥によって乾燥して、＞１０ｋＤａの粗製アレルゲン生成物ＨＭＷ−Ｎを得る。１０ｋＤａ未満の「小量」アレルゲンが存在することが知られている選択された場合、該１０ｋＤａ膜を３．５ｋＤａ透析シートで置き換えることができる。
【００２６】
Ｂ．ＨＮＷ−Ｄの調製
脱色手法の詳細は、ＥＰ０  ６６２  ０８０  Ｂ１号で公開されている。略言すれば、凍結乾燥したＨＭＷ−Ｎ生成物サブＡ）を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の蒸留水に室温で溶解させる。室温でこの溶液に、一定撹拌しつつ、２Ｎ  ＨＣｌを添加し、終点に近づくと、ｐＨを２．０±０．１まで下降させるために０．１Ｎ  ＨＣｌを添加する；次いで、少なくとも１５分間撹拌を継続する。ＨＭＷ−Ｎからの酸性媒体中で吸着された色原体物質または「色素」を、次いで、１０ｋＤａカットオフ膜を通しての蒸留水の数回の交換に対して少なくとも１７時間、４℃の冷たい部屋での反復された透析または限外濾過によって排除し、それにより、＞１０ｋＤａ保持体溶液のｐＨは約３．５の値まで上昇する。透析終了後の保持体溶液を、１．０〜０．１Ｎ  ＮａＯＨの添加によってｐＨ７．０±０．１とする。中和した溶液を最後に遠心し、０．２μｍ滅菌フィルターを通し、凍結乾燥によって乾燥して、脱色されたアレルゲン生成物ＨＭＷ−Ｄを得る。
【００２７】
Ｃ．ＨＭＷ−Ｄｏｘの調製
プロトタイプの手法において、凍結乾燥ＨＭＷ−Ｄの試料をｐＨ５．３の０．０５Ｍ（５０ｍＭ）メタ過ヨウ素酸ナトリウムに溶解させ、雰囲気温度で１時間撹拌しつつ放置する。次いで、溶液を蒸留水中でセファデックスＧ２５の小さなカラムを通し、カラムを出てくる最初の溶出物画分をプールし、凍結乾燥して酸化された調製物ＨＭＷ−Ｄｏｘを得る。酸化された調製物の能力は、溶血補体消費によって、および確立された技術による特異的ＩｇＥ抗体−結合の阻害によって、元のＨＭＷ−Ｄ生成物と比較して決定される。Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ花粉からのＨＭＷ−Ｄの場合についての例は表Ｉに示す。残存する化学物質または望まない分裂生成物での汚染を回避するには、しかしながら、先行技術に記載されているごとく紫外光での照射によって水溶液中でのＨＭＷ−Ｄの酸化に選択を与えるべきである。
【００２８】
Ｄ．酵素断片Ｆｂ−Ｄの調製
蛋白質消化に由来する天然Ｔ細胞エピトープペプチドまたはハプテン−ペプチドを得るための提案されている手法において、出発物質は、サブＢ）に記載されているおよび欧州特許ＥＰ０  ６６２  ０８０  Ｂ１号におけるプロセスに従って得られる脱色調製物ＨＭＷ−ＤまたはサブＣ）に記載されているＨＭＷ−Ｄｏｘである。両出発物質から酵素断片Ｆｂ−Ｄを得るための手法は同一であり、以下に詳細に記載することができる。
【００２９】
凍結乾燥脱色物質ＨＭＷ−Ｄ（またはＨＭＷ−Ｄｏｘ）を１０容量のビ−蒸留水に溶解させ、二重壁容器に運び入れ、消化の間、ペリスタポンプによって、外方および内方壁を通して、３７±１℃の水を循環させる。この溶液に一定撹拌しつつ２Ｎ  ＨＣｌを添加して、ｐＨを約２．５に下降させる。次いで、４％架橋セファロース（セファロース−ペプシン、米国セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＵＳＡ）のシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）；参照、カタログＰ−３２８６）にカップリングさせた固定化形態の蛋白質分解酵素ペプシンを、ＨＭＷ−Ｄ１ｍｇ当たり４ユニット（すなわち、アレルゲン源に依存して、約１：５酵素／基質ｗ／ｗまたはその他）のペプシン活性の比率にて、乾燥粉末として添加する。次いで、懸濁液を、０．１Ｎ  ＨＣｌの滴下によって、ｐＨ２．０±０．１に調整し、３７±１℃で少なくとも６時間撹拌を継続し、混合物のｐＨ−値を、自動ｐＨ−スタット制御によって２．０±０．１に維持する。消化時間の最後に、２．０Ｎ−０．１Ｎ  ＮａＯＨで混合物をｐＨ７．０に中和し、次いで、０．４μｍ膜を通して濾過して、酵素粒子を除去する。次いで、蒸留水を添加して、元の溶液の容量の２倍の最終容量とし、続いて、１０ｋＤａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜を装備したＭｉｎｉｔａｎ接線流システム中で透析する。外方液体（分子サイズＭ＜１０ｋＤａ）を収集し、＞１０ｋＤａエンド断片Ｆａ−Ｄを含有する内方液体を捨てる。説明の目的で、主としてヘテロ多糖よりなるエンド断片Ｆａ−Ｄ＞１０ｋＤａを本明細書の表Ｉで示す。次いで、Ｍ＜１０ｋＤａ物質を、１ｋＤａ膜を用い、さらなるＭｉｎｉｔａｎ透析を介してサイクルさせ、それにより、＞１ｋＤａ保持物を保持し、外方液体を捨てる。保持体溶液を０．２２μｍフィルター膜を通して最後に滅菌濾過し、凍結乾燥して所望の１ｋＤａ＞Ｆｂ−Ｄ＜１０ｋＤａ断片生成物を得る。
【００３０】
出発生成物ＨＭＷ−Ｎ、中間調製物ＨＭＷ−Ｄ（またはＨＭＷ−Ｄｏｘ）、未消化（ほとんどは、＞１０ｋＤａヘテロ多糖）副産物Ｆａ−Ｄ、および所望の目的生成物Ｆｂ−Ｄの収率および分光学的特徴は、表ＩＩの一連の代表的なアレルゲン源物質につき示す。
【００３１】
プロセス制御
酵素消化の進行は、遊離アミノ基の遊離によってモニターされる。酵素加水分解のプロセスの間の規則的間隔で、０．５ｍｌ試料をペプシン／蛋白質混合物から捨て、４Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に調整し、次いで、酢酸緩衝メチルセロソルブ中の５０μｌの２％ニンヒドリンにて、１００℃で１５分間加熱する。冷却した後、試薬ブランクに対して５４１ｎｍで吸光度を読む。遊離アミノ基の遊離に基づく消化反応速度曲線の代表的な例を集合的に図１に示す。
【００３２】
図１で観察されるごとく、いくつかのアレルゲン調製物での検出可能な遊離アミノ基の放出はかなり低い（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ，Ａｒｔｅｍｉｓｉａ，Ａｍｂｒｏｓｉａ）。しかしながら、これは、ペプシンの影響下の断片化が起こることを意味しない。何故ならば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ［１２］の花粉を除き、これらのアレルゲン生成物の酵素断片Ｆｂ−Ｄは、かなりの程度、特異的ＩｇＥ−抗体、すなわち、そのＢ細胞エピトープに対するその結合能力を失った（表ＩＩ）。ニンヒドリン試薬は、時々、ポリフェノールペプチド側鎖によってブロックされるようになることができる。しかしながら、生成物制御における重要な点は、最終断片生成物Ｆｂ−Ｄが、低下されないＴ細胞刺激特性と共に、ＩｇＥ−結合および補体−活性化能力の喪失につきスクリーニングされなければならないことである。
【００３３】
目的生成物制御
アレルゲン−特異的ＩｇＥ抗体の結合
特異的ＩｇＥ−クラス抗体と組み合わせるＦｂ−Ｄ目的生成物のイン・ビトロ能力は、特異的に感作されたアレルギー患者の血清を用い、確立された阻害手法のいずれかによってチェックされる。標準的なアッセイ条件下で結合の５０％阻害を引き起こす乾燥物質の量として表した断片のＩｇＥ−結合能は、同一条件下での親ＨＭＷ−ＤまたはＨＭＷ−Ｄｏｘ調製物のそれの少なくとも１００倍低いにちがいない、すなわち、断片化前の出発物質に対して等しいまたはそれの１％未満の低下である。非酸化調製物ＨＭＷ−Ｄで得られたいくつかの代表的なデータをまとめて表ＩＩＩに示す。
【００３４】
補体活性化
補体系を活性化するＦｂ−Ｄ目的生成物のイン・ビトロ能力は、公表された手法に従った溶血−または酵素免疫アッセイによって確立される（８，１３）。例えば溶血補体の５０％喪失を引き起こす乾燥物質の量として表した断片の補体−活性化能力は、同一条件下でアッセイした親ＨＭＷ−ＤまたはＨＭＷ−Ｄｏｘ調製物のそれよりも少なくとも１００倍低いにちがいない、すなわち、断片化前の出発物質に対して等しいまたはそれの１％未満の低下である。
【００３５】
Ｔ細胞刺激
本質的Ｔ細胞エピトープを保有する活力のある調製物としての目的生成物Ｆｂ−Ｄの適用性を示すために、Ｆｂ−Ｄ断片を、確立された免疫学的手法に従って特異的アレルギー患者の血液から単離されたＴ−リンパ球の増殖を誘導するその能力につき調べる。最終断片のＴ細胞刺激指標は、親ＨＭＷ−Ｄ調製物に対して５０−１５０％の間にあるはずである。図３は、高度にアレルギー性の熱帯ダニＢｌｏｍｉａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの培養から単離したＨＭＷ−Ｄ調製物の断片化によって得られるペプシン断片Ｆｂ−Ｄに関するいくつかの代表的なデータをまとめる。
【００３６】
Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ方法論
全ての目的生成物Ｆｂ−Ｄは、例えば、ｐＨ３〜１０の範囲のＡｍｐｈｏｌｉｎｅｓの存在下、ポリアクリルアミドゲルでの等電点電気泳動によって、さらなる制御手法に付され、これは、ＨＭＷ−Ｄ親調製物とは対照的に、慣用的蛋白質株で検出可能ないずれの成分バンドも明らかにしない。トリシン（Ｎ−２−ヒドロキシ−１，１−ビス［ヒドロキシメチルエチル］グリシン）に存在下における電気泳動分離は、親ＨＭＷ−Ｄ調製物で観察されたものとは全く異なり、生成プロセスの再現性を証明するのに使用できるクーマシーブルー染色可能バンドの分布パターンを明らかにする。
【００３７】
いくつかの代表的なアレルギー原性調製物についての分析データのリストを表ＩＩおよびＩＩＩに示す。
【表１】
2001521907.tif 000001
【００３８】
【表２】
2001521907.tif 000002
【００３９】
表Ｉ
Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａの花粉からの脱色されたアレルギー原性調製物ＨＭＷ−ＤのＩｇＥ−結合および補体−活性化能力に対するメタ過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化の効果
【表３】
2001521907.tif 000003
【００４０】
表ＩＩ  ペプシンアレルゲン断片の分析
【表４】
2001521907.tif 000004
【００４１】
（＊）該Ｆａ−Ｄ画分は消化できない＞１０ｋＤａ残渣を含む。
１ｋＤａ＜Ｍ＜１０ｋＤａの該Ｆｂ−Ｄ断片は所望の最終生成物を含む。
【００４２】
表ＩＩ  ペプシンアレルゲン断片の分析
【表５】
2001521907.tif 000005
【００４３】
（＊）該Ｆａ−Ｄ画分は消化できない＞１０ｋＤａ残渣を含む。
１ｋＤａ＜Ｍ＜１０ｋＤａの該Ｆｂ−Ｄ断片は所望の最終生成物を含む。
【００４４】
表ＩＩＩ
ペーパーディスクに臭化シアンで化学的にコンジュゲートさせた個々のアレルゲン生成物についての特異的ヒト血清からのＩｇＥ結合の阻害によって測定されたＩｇＥ−結合能（Ｂ細胞エピトープての反応性）についての還元因子（「ＲＡＳＴ−阻害」）。ＨＭＷ−Ｄ＝１の相対的能力につき再計算。
【表６】
2001521907.tif 000006
【００４５】
＊非酸化脱色調製物
＊＊ウェルの表面にコートされたＨＭＷ−Ｄにて、マイクロタイタープレート中の酵素免疫アッセイから計算された還元因子
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：ペプシンによって酵素的に加水分解された代表的な一連のＨＭＷ−Ｄアレルゲン調製物の放出のキネティックス。条件：テキスト参照
【図２】
図２：ペプシンによる花粉のＨＭＷ−Ｄ調製物の消化性（すなわち、３７℃およびｐＨ２における加水分解の６時間後におけるニンヒドリン発色）と０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０中の紫外スペクトルからとった３２５ｎｍにおける吸光係数Ｅ（１％、１ｃｍ）との間の逆関係
【図３】
図３：脱色調製物ＨＭＷ−ＤおよびＢｌｏｍｉａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの抽出物から調製した断片Ｆｂ−Ｄによる刺激に際しての、（ａ）特異的アレルギー患者および（ｂ）皮膚−テスト陰性の健康な対照の血液からの末梢リンパ球の培養におけるＴ細胞の増殖（放射性チミジンの取り込み、相対的単位）