(57)【要約】【課題】細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させるFoxP3遺伝子発現増強剤、細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤、それらの作用から免疫を抑制する免疫抑制剤及び過剰免疫疾患治療剤、細胞においてFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害剤、細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤、それらの作用から免疫抑制を解除する免疫抑制解除剤、腫瘍免疫賦活剤、及び抗腫瘍剤、などを提供すること。【解決手段】例えば、Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞、あるいは、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質、の少なくともいずれか一つを含有する薬剤をFoxP3遺伝子発現増強剤、制御性Ｔ細胞分化誘導剤、免疫抑制剤及び過剰免疫疾患治療剤として用い、抗MCP1抗体、抗FSTL1抗体、抗IL-13Ra2抗体を含有する薬剤をFoxP3遺伝子発現増強阻害剤、免疫抑制解除剤、腫瘍免疫賦活剤、及び抗腫瘍剤などとして用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤であって、
前記細胞のMCP1シグナルを活性化させることを特徴とする遺伝子発現増強剤。
【請求項２】
細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤であって、
Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有することを特徴とする遺伝子発現増強剤。
【請求項３】
細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤であって、
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有することを特徴とする遺伝子発現増強剤。
【請求項４】
Snailタンパク質を発現する細胞、またはMCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を分泌する細胞の培養上清を含有することを特徴とする請求項３に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項５】
前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項２または４に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項６】
細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤であって、
前記細胞のMCP1シグナルを活性化させることを特徴とする細胞分化誘導剤。
【請求項７】
細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤であって、
Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有することを特徴とする細胞分化誘導剤。
【請求項８】
細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤であって、
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有することを特徴とする細胞分化誘導剤。
【請求項９】
MCP1シグナルを活性化させることを特徴とする免疫抑制剤。
【請求項１０】
Snailタンパク質を発現する細胞、またはMCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有する免疫抑制剤。
【請求項１１】
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有する免疫抑制剤。
【請求項１２】
MCP1シグナルを活性化させることを特徴とする過剰免疫疾患治療剤。
【請求項１３】
Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有する過剰免疫疾患治療剤。
【請求項１４】
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有する過剰免疫疾患治療剤。
【請求項１５】
細胞においてFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害剤であって、
前記細胞のMCP1シグナルを抑制することを特徴とする遺伝子発現増強阻害剤。
【請求項１６】
細胞におけるFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害剤であって、
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制することを特徴とする遺伝子発現増強阻害剤。
【請求項１７】
MCP1阻害活性を有する抗MCP1抗体を含有することを特徴とする請求項１５または１６に記載の遺伝子発現増強阻害剤。
【請求項１８】
FSTL1タンパク質阻害活性を有する抗FSTL1抗体、膜型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗膜型IL-13Ra2抗体または分泌型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗分泌型IL-13Ra2抗体を含有することを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子発現増強阻害剤。
【請求項１９】
細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤であって、
前記細胞のMCP1シグナルを抑制することを特徴とする細胞分化誘導阻害剤。
【請求項２０】
細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤であって、
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制することを特徴とする細胞分化誘導阻害剤。
【請求項２１】
MCP1阻害活性を有する抗MCP1抗体を含有することを特徴とする請求項１９または２０に記載の細胞分化誘導阻害剤。
【請求項２２】
FSTL1タンパク質阻害活性を有する抗FSTL1抗体、膜型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗膜型IL-13Ra2抗体または分泌型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗分泌型IL-13Ra2抗体を含有することを特徴とする請求項２０に記載の細胞分化誘導阻害剤。
【請求項２３】
MCP1シグナルを抑制する免疫抑制解除剤。
【請求項２４】
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する免疫抑制解除剤。
【請求項２５】
IL-13タンパク質、CCR2タンパク質、IL-10タンパク質の機能を抑制する免疫抑制解除剤。
【請求項２６】
MCP1シグナルを抑制する腫瘍免疫賦活剤。
【請求項２７】
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する腫瘍免疫賦活剤。
【請求項２８】
IL-13タンパク質、CCR2タンパク質、IL-10タンパク質の機能を抑制する腫瘍免疫賦活剤。
【請求項２９】
MCP1シグナルを抑制する抗腫瘍剤。
【請求項３０】
MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する抗腫瘍剤。
【請求項３１】
IL-13タンパク質、CCR2タンパク質、IL-10タンパク質の機能を抑制する抗腫瘍剤。
【請求項３２】
MCP1シグナルまたはTSP1タンパク質の機能を抑制する腫瘍増殖抑制剤。
【請求項３３】
MCP1シグナルまたはFSTL1タンパク質の機能を抑制する腫瘍細胞浸潤抑制剤。
【請求項３４】
MCP1シグナルまたはFSTL1タンパク質の機能を抑制する腫瘍転移抑制剤。
【請求項３５】
細胞におけるFoxP3遺伝子、MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)遺伝子、TSP1(thrombospondin-1)遺伝子、FSTL1( Follistatin-like 1)遺伝子、またはIL-13Ra2(interleukin 13 alpha 2 receptor)遺伝子の遺伝子発現増強剤であって、
Snailタンパク質活性増強物質を含有することを特徴とする遺伝子発現増強剤。
【請求項３６】
Snailタンパク質活性増強物質が、snail遺伝子発現ベクターであることを特徴とする請求項３５に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項３７】
前記細胞がPanc-1細胞であることを特徴とする請求項３５に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項３８】
血液のがんに対する抗癌剤であって、Snailタンパク質の機能を阻害する阻害物質を含有する、抗癌剤。
【請求項３９】
前記阻害物質が、snail遺伝子の発現を阻害することを特徴とする請求項３８に記載の抗癌剤。
【請求項４０】
血液のがんが白血病であることを特徴とする請求項３８または３９に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞による免疫抑制の解除剤とそれを用いた抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
制御性Ｔ細胞は、病理学的にも生理的にも免疫反応を抑制し、self-toleranceやimmunological homeostasisの維持に関与していることが知られている（非特許文献１参照）。【０００３】
例えば、CD4+CD25+制御性Ｔ細胞は、初めCD4+CD25-であった細胞が、様々な因子の刺激を受けて活性化し、結果として末梢血のCD4+Ｔ細胞のうち、約５−１０％を占めるようになる。このCD4+CD25+制御性Ｔ細胞は、CD4+Ｔ細胞の分化とともにFoxP3タンパク質を発現するようになる（非特許文献２，３参照）。この過程には細胞間相互作用及びTGF-beta（本明細書ではTGF-bとも記される）やIL-10という液性因子が重要な役割を有していることが示されている（非特許文献４参照）。【０００４】
このFoxP3タンパク質は、CD4+ CD25+Ｔ細胞においてのみならず、CD8+ CD25+Ｔ細胞においても発現が観察されるため、制御性Ｔ細胞活性化の特異的マーカーであると考えられている（非特許文献５参照）。さらに、ナイーブＴ細胞においてFoxP3を強制発現させると、制御性Ｔ細胞様表現型を示すことから、制御性Ｔ細胞の機能発現に重要な役割を有していることが示された（非特許文献６参照）。このように、FoxP3遺伝子は、制御性Ｔ細胞の分化と機能を制御するマスター遺伝子である考えられている（非特許文献１参照）。【０００５】
これらの制御性Ｔ細胞は、その機能として、例外的に他の細胞の機能を抑制することにより（非特許文献７参照）、免疫反応を抑制することが知られている（非特許文献１参照）。そのメカニズムは明らかでないが、細胞間相互作用依存的であることやCTLA-4の関与が示唆されている（非特許文献８参照）。特に、CTLA-4は、制御性Ｔ細胞の分化にも関与していることが示された（非特許文献８参照）。【０００６】
一方、癌患者の生体内には、癌を攻撃して排除しようとする宿主免疫が存在するが、癌細胞の側でも、宿主免疫の監視から逃れようとするシステムを備えていることが知られており、例えば、癌細胞の存在下で制御性Ｔ細胞を除去すると、癌細胞に対する免疫反応が変化することがin vitroとin vivoで示されている（非特許文献１７参照）。また、胃癌（非特許文献９，１０参照）、直腸癌（非特許文献１１参照）、膵臓癌（非特許文献１２，１３参照）、肺癌（非特許文献１４参照）、グリオーマ（非特許文献１７参照）において、制御性Ｔ細胞が増加することから、癌細胞による免疫回避システムに制御性Ｔ細胞が関与していると考えられている。しかし、そのメカニズムは明らかでなく、制御性Ｔ細胞由来のサイトカインがどのように貢献しているのか、未だに議論がある（非特許文献１７参照）。【０００７】
さらに、制御性Ｔ細胞の欠損は重篤な自己免疫疾患を引き起こす（非特許文献１５参照）ことから、自己免疫と癌免疫には共通のメカニズムが存在することと考えられている（非特許文献１６参照）。このように、制御性Ｔ細胞は、免疫反応の抑制を通じ、癌細胞に対する免疫抑制だけでなく、自己免疫やアレルギー反応のような過剰免疫反応に関与していることが知られている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Miyara and Sakaguchi Trends Mol. Med. 13, 108-116, 2007
【非特許文献２】Fontenot et al. Nat. Immunol. 4, 330-336, 2003
【非特許文献３】Fontenot et al. Immunity 22, 329-341, 2005
【非特許文献４】Zheng et al. J. Immunol. 172, 5213-5221, 2004
【非特許文献５】Bisikirska et al. J. Clin.Invest. 115, 2904-2913, 2005
【非特許文献６】Hori et al. Science 299, 1057-1061, 2003
【非特許文献７】Jiang and Chess J. Clin. Invest. 114, 1198-1208, 2004
【非特許文献８】Atabani et al. Eur. J. Immunol. 35, 2157-2162, 2005
【非特許文献９】Ichihara et al. Clin.Cancer Res. 9, 4404-4408, 2003
【非特許文献１０】Wolf et al. Clin.Cancer Res. 9, 606-612, 2003
【非特許文献１１】Hicky et al. Semin. Immunol. 11, 125-137, 1999
【非特許文献１２】Liyanage et al. J. Immunol. 169, 2756-2761, 2002
【非特許文献１３】Sasada et al. Cancer 98, 1098-1099, 2003
【非特許文献１４】Woo et al. Cancer Res. 61, 4766-4772, 2001
【非特許文献１５】Sakaguchi et al. Immunol. Rev. 182, 18-32, 2001
【非特許文献１６】Turk et al. Immunol. Rev.  188, 122-135, 2002
【非特許文献１７】Andaloussi and Lesniak Neuro-Oncology 8, 234-243, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
制御性Ｔ細胞による免疫抑制の作用機序を分子レベルで明らかにし、制御性Ｔ細胞が関与する疾患の治療のターゲットとすることにより、制御性Ｔ細胞が関与する疾患に対する効果的な治療が開発できることが期待されている。【０００９】
そこで、本発明は、細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤、細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤、それらの作用から免疫を抑制する免疫抑制剤及び過剰免疫疾患治療剤、細胞においてFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害剤、細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤、それらの作用から免疫抑制を解除する免疫抑制解除剤、腫瘍免疫賦活剤、及び抗腫瘍剤、などを提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
Zinc-finger転写因子Snailは、癌の悪性化因子であり、Snailの発現が高くなるほど、癌が悪性化することが知られていた（Nature Rev Cancer 7, 415-428, 2007）。【００１１】
その理由の一つとして、Snailが、E-cadherinなどの細胞間接着分子の発現を抑制することにより、個体発生における原腸陥入や組織および器官の発生過程、正常組織や細胞が失われた際の修復過程、癌細胞が転移する転移過程などが起きる際の上皮-間充織転換（EMT: Epithelial-mesenchymal transition)を制御するためであると考えられている（Nature Rev Cancer 7, 415-428, 2007）。【００１２】
そこで、本発明者らは、培養細胞でSnailを強制発現し、Snailによる癌の悪性化のメカニズムの解明を試みて鋭意努力していたところ、癌細胞において、Snailタンパク質がMCP1(monocyte chemoattractant protein-1)遺伝子、TSP1(thrombospondin-1)遺伝子、FSTL1( Follistatin-like 1)遺伝子、またはIL-13Ra2(interleukin 13 alpha 2 receptor)遺伝子の発現を増強し、それらの遺伝子産物が、CD4+Ｔ細胞やCD8+Ｔ細胞に対し、制御性Ｔ細胞の活性化マーカーであるFoxP3の発現を増強することを見出し、本発明の完成に至った。【００１３】
このようにして、本発明にかかる実施態様は以下の通りとなる。【００１４】
（１）細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤であって、前記細胞のMCP1シグナルを活性化させることを特徴とする遺伝子発現増強剤。  
（２）細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤であって、Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有することを特徴とする遺伝子発現増強剤。  
（３）細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤であって、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有することを特徴とする遺伝子発現増強剤。  
（４）Snailタンパク質を発現する細胞、またはMCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を分泌する細胞の培養上清を含有することを特徴とする（３）に記載の遺伝子発現増強剤。  
（５）前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする（２）または（４）に記載の遺伝子発現増強剤。【００１５】
（６）細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤であって、前記細胞のMCP1シグナルを活性化させることを特徴とする細胞分化誘導剤。  
（７）細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤であって、Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有することを特徴とする細胞分化誘導剤。  
（８）細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤であって、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有することを特徴とする細胞分化誘導剤。【００１６】
（９）MCP1シグナルを活性化させることを特徴とする免疫抑制剤。  
（１０）Snailタンパク質を発現する細胞、またはMCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有する免疫抑制剤。  
（１１）MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有する免疫抑制剤。【００１７】
（１２）MCP1シグナルを活性化させることを特徴とする過剰免疫疾患治療剤。  
（１３）Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を含有する過剰免疫疾患治療剤。  
（１４）MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有する過剰免疫疾患治療剤。【００１８】
（１５）細胞においてFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害剤であって、前記細胞のMCP1シグナルを抑制することを特徴とする遺伝子発現増強阻害剤。  
（１６）細胞におけるFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害剤であって、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制することを特徴とする遺伝子発現増強阻害剤。  
（１７）MCP1阻害活性を有する抗MCP1抗体を含有することを特徴とする（１５）または（１６）に記載の遺伝子発現増強阻害剤。  
（１８）FSTL1タンパク質阻害活性を有する抗FSTL1抗体、膜型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗膜型IL-13Ra2抗体または分泌型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗分泌型IL-13Ra2抗体を含有することを特徴とする（１６）に記載の遺伝子発現増強阻害剤。【００１９】
（１９）細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤であって、前記細胞のMCP1シグナルを抑制することを特徴とする細胞分化誘導阻害剤。  
（２０）細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤であって、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制することを特徴とする細胞分化誘導阻害剤。  
（２１）MCP1阻害活性を有する抗MCP1抗体を含有することを特徴とする（１９）または（２０）に記載の細胞分化誘導阻害剤。  
（２２）FSTL1タンパク質阻害活性を有する抗FSTL1抗体、膜型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗膜型IL-13Ra2抗体または分泌型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗分泌型IL-13Ra2抗体を含有することを特徴とする（２０）に記載の細胞分化誘導阻害剤。【００２０】
（２３）MCP1シグナルを抑制する免疫抑制解除剤。  
（２４）MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する免疫抑制解除剤。【００２１】
（２５）MCP1シグナルを抑制する腫瘍免疫賦活剤。  
（２６）MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する腫瘍免疫賦活剤。【００２２】
（２７）MCP1シグナルを抑制する抗腫瘍剤。  
（２８）MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する抗腫瘍剤。【００２３】
（２９）MCP1シグナルまたはTSP1タンパク質の機能を抑制する腫瘍増殖抑制剤。【００２４】
（３０）MCP1シグナルまたはFSTL1タンパク質の機能を抑制する腫瘍細胞浸潤抑制剤。【００２５】
（３１）MCP1シグナルまたはFSTL1タンパク質の機能を抑制する腫瘍転移抑制剤。【００２６】
（３２）細胞におけるFoxP3遺伝子、MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)遺伝子、TSP1(thrombospondin-1)遺伝子、FSTL1( Follistatin-like 1)遺伝子、またはIL-13Ra2(interleukin 13 alpha 2 receptor)遺伝子の遺伝子発現増強剤であって、Snailタンパク質活性増強物質を含有することを特徴とする遺伝子発現増強剤。  
（３３）Snailタンパク質活性増強物質が、snail遺伝子発現ベクターであることを特徴とする（３２）に記載の遺伝子発現増強剤。  
（３４）前記細胞がPanc-1細胞であることを特徴とする（３２）に記載の遺伝子発現増強剤。【００２７】
（３５）血液のがんの抗癌剤であって、Snailタンパク質の機能を阻害する阻害物質を含有する抗癌剤。  
（３６）前記阻害物質が、snail遺伝子の発現を阻害することを特徴とする（３５）に記載の抗癌剤。  
（３７）血液のがんが白血病であることを特徴とする（３５）または（３６）に記載の抗癌剤。【００２８】
（３８）細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強方法であって、前記細胞のMCP1シグナルを活性化させる工程を含む遺伝子発現増強方法。  
（３９）細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強方法であって、前記細胞を、Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質及び分泌型IL-13Ra2タンパク質からなる群から選択される一以上のタンパク質を発現する細胞と接触させる工程を含む遺伝子発現増強方法。  
（４０）前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする（３９）に記載の遺伝子発現増強方法。  
（４１）細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強方法であって、前記細胞を、Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質及び分泌型IL-13Ra2タンパク質からなる群から選択される一以上のタンパク質と接触させる工程を含む遺伝子発現増強方法。  
（４２）細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強方法であって、前記細胞をSnailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質及び分泌型IL-13Ra2タンパク質からなる群から選択される一以上のタンパク質を発現する細胞の培養上清と接触させる工程を含む（４０）に記載の遺伝子発現増強方法。  
（４３）前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする（４２）に記載の遺伝子発現増強方法。【００２９】
（４４）細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導方法であって、前記細胞のMCP1シグナルを活性化させる工程を含む細胞分化誘導方法。  
（４５）細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導方法であって、前記細胞を、Snailタンパク質、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞と接触させる工程を含む細胞分化誘導方法。  
（４６）細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導する細胞分化誘導方法であって、前記細胞を、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質と接触させる工程を含む細胞分化誘導方法。【００３０】
（４７）過剰免疫を生じている患者の治療方法であって、前記患者に、MCP1シグナルを活性化させる活性化剤を投与する工程を含む方法。  
（４８）過剰免疫を生じている患者の治療方法であって、前記患者に、Snailタンパク質を発現する細胞、またはMCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞を投与する工程を含む方法。  
（４９）過剰免疫を生じている患者の治療方法であって、前記患者に、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を投与する工程を含む方法。【００３１】
（５０）MCP1シグナルを活性化させることを特徴とする過剰免疫疾患治療剤。【００３２】
（５１）細胞においてFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害方法であって、前記細胞のMCP1シグナルを抑制する工程を含む遺伝子発現増強阻害方法。  
（５２）細胞におけるFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害方法であって、前記細胞において、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する工程を含む遺伝子発現増強阻害方法。  
（５３）前記細胞を、MCP1阻害活性を有する抗MCP1抗体と接触させることを特徴とする（５１）に記載の遺伝子発現増強阻害方法。  
（５４）前記細胞を、FSTL1タンパク質阻害活性を有する抗FSTL1抗体、膜型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗膜型IL-13Ra2抗体または分泌型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗分泌型IL-13Ra2抗体と接触させることを特徴とする（５２）に記載の遺伝子発現増強阻害方法。【００３３】
（５５）細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害方法であって、前記細胞のMCP1シグナルを抑制する工程を含む細胞分化誘導阻害方法。  
（５６）細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤であって、前記細胞において、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する工程を含む細胞分化誘導阻害方法。  
（５７）前記細胞を、MCP1阻害活性を有する抗MCP1抗体と接触させることを特徴とする（５５）に記載の細胞分化誘導阻害方法。  
（５８）前記細胞を、FSTL1タンパク質阻害活性を有する抗FSTL1抗体、膜型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗膜型IL-13Ra2抗体または分泌型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗分泌型IL-13Ra2抗体と接触させることを特徴とする（５６）に記載の細胞分化誘導阻害方法。【００３４】
（５９）免疫が抑制されている患者の免疫抑制を解除する免疫抑制解除方法であって、前記患者においてMCP1シグナルを抑制する工程を含む方法。  
（６０）免疫が抑制されている患者の免疫抑制を解除する免疫抑制解除方法であって、前記患者において、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する工程を含む方法。【００３５】
（６１）腫瘍免疫が抑制されている患者において、腫瘍免疫を賦活する方法であって、前記患者においてMCP1シグナルを抑制する工程を含む腫瘍免疫賦活方法。  
（６２）腫瘍免疫が抑制されている患者において、腫瘍免疫を賦活する方法であって、MCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する工程を含む腫瘍免疫賦活方法。【００３６】
（６３）腫瘍患者の治療方法であって、前記患者においてMCP1シグナルを抑制する工程を含む方法。  
（６４）腫瘍患者の治療方法であって、前記患者においてMCP1タンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制する方法。  
（６５）腫瘍患者の治療方法であって、前記患者においてTSP1タンパク質の機能を抑制する方法。【００３７】
（６６）細胞におけるFoxP3遺伝子、MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)遺伝子、TSP1(thrombospondin-1)遺伝子、FSTL1( Follistatin-like 1)遺伝子、またはIL-13Ra2(interleukin 13 alpha 2 receptor)遺伝子の遺伝子発現増強方法であって、前記細胞にSnailタンパク質活性増強物質を接触させる工程を含む遺伝子発現増強方法。  
（６７）Snailタンパク質活性増強物質が、snail遺伝子発現ベクターであることを特徴とする（６６）に記載の遺伝子発現増強方法。  
（６８）前記細胞がPanc-1細胞であることを特徴とする（６６）に記載の遺伝子発現増強方法。【００３８】
（６９）血液のがんを有する患者の治療方法であって、前記患者にSnailタンパク質の機能を阻害する阻害物質を投与する工程を含む治療方法。  
（７０）前記阻害物質が、snail遺伝子の発現を阻害することを特徴とする（６９）に記載の治療方法。  
（７１）血液のがんが白血病であることを特徴とする（６９）に記載の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の一実施例において、snail遺伝子を強制発現したPanc-1細胞の表現型を示す表である。
【図２Ａ】本発明の一実施例において、TGF-betaで処理したHs294T細胞との共培養による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導を示す図である。
【図２Ｂ】本発明の一実施例において、Panc-1細胞及びＦ３細胞との共培養による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導を示す図である。
【図２Ｃ】本発明の一実施例において、Panc-1細胞、Ｆ３細胞、及びＤ１０細胞との共培養したCD4+細胞による、Ｔ細胞増殖の抑制を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、HCT116細胞との共培養による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、snail遺伝子強制発現クローンの細胞上清による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、Panc-1、HCT116、Hs294T各細胞株におけるSnailタンパク質強制発現によって発現亢進する遺伝子を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、抗MCP1抗体、抗TSP1抗体、抗FSTL1抗体、及び抗IL-13Ra2抗体による、Ｆ３クローンのCD4+細胞におけるFoxP3タンパク質発現増強の抑制を示す図である。
【図７Ａ】本発明の一実施例において、抗MCP1抗体または抗TSP1抗体による、Ｆ３クローンのCD4+細胞、CD4+CD25+細胞、及びCD4+CD25-細胞におけるFoxP3タンパク質発現増強の抑制を示す図である。
【図７Ｂ】本発明の一実施例において、抗FSTL1抗体による、Ｆ３クローンのCD4+細胞、CD4+CD25+細胞、及びCD4+CD25-細胞におけるFoxP3タンパク質発現増強の抑制を示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、抗IL-13Ra2抗体によるFoxP3タンパク質発現増強の抑制を示す図である。
【図９】本発明の一実施例において、抗MCP1抗体、及び抗IL-13Ra2抗体による、マウスメラノーマB16-F10のFoxP3タンパク質発現増強の抑制を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例において、MCP1、TSP1、FSTL1、または分泌型IL-13Ra2のFoxP3タンパク質の発現増強作用を示す図である。
【図１１】本発明の一実施例において、Snail発現細胞によるFoxP3タンパク質の直接的発現増強作用と間接的発現増強作用を示す図である。
【図１２】本発明の一実施例において、snail遺伝子強制発現クローンの細胞上清による、CD8+細胞におけるFoxP3発現の誘導を示す図である。
【図１３】本発明の一実施例において、CD8+細胞におけるＦ３細胞によるFoxP3タンパク質発現増強作用の、抗MCP1抗体及び抗TSP1抗体による抑制を示す図である。
【図１４】本発明の一実施例において、CD8+細胞におけるB１１細胞によるFoxP3タンパク質発現増強作用の、抗IL-13Ra2抗体による抑制を示す図である。
【図１５】本発明の一実施例において、抗MCP1抗体及び抗TSP1抗体によるSnail発現腫瘍細胞の増殖抑制を示す図である。
【図１６】本発明の一実施例において、抗MCP1抗体及び抗FSTL1抗体によるSnail発現腫瘍細胞の浸潤抑制を示す図である。
【図１７Ａ】本発明の一実施例において、白血病細胞株におけるsnailの発現をRT-PCRで調べた結果を示す図である。
【図１７Ｂ】本発明の一実施例において、snail遺伝子特異的siRNAによる白血病細胞の浸潤抑制を示す図である。
【図１８】本発明の一実施例において、抗MCP1抗体、抗IL-13Ra2抗体、抗IL-13抗体、抗IL-4抗体、抗CCR2抗体、及び抗IL-10抗体が、Snail発現腫瘍細胞による腫瘍免疫阻害を抑制することを示す図である。
【図１９】snail遺伝子またはMCP1遺伝子に特異的なsiRNAを用いたin vivo 治療実験の結果（Ａ：測定した腫瘍体積、Ｂ：肺転移結節数、Ｃ：腫瘍内浸潤細胞のフローサイトメトリー解析）を示す図である。
【図２０】抗TSP1抗体を用いたin vivo 治療実験の結果（Ａ：測定した腫瘍体積、Ｂ：肺転移結節数、Ｃ：腫瘍内浸潤細胞のフローサイトメトリー解析）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００４１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されている。従って、本発明は記載された実施例に限定されるものではなく、当業者が当然のこととして把握する態様は、全て本発明に含まれる。また、本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかであり、それらの改変態様や修飾態様も本発明に含まれる。【００４２】
＝＝遺伝子発現増強剤I．MCP1、TSP1、FSTL1、及びIL-13Ra2の各遺伝子＝＝
本発明にかかる、対象とする細胞において、MCP1(monocyte chemoattractant protein-1)遺伝子、TSP1(thrombospondin-1)遺伝子、FSTL1( Follistatin-like 1)遺伝子、及びIL-13Ra2(interleukin 13 alpha 2 receptor)遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤は、Snailタンパク質活性増強物質を含有することを特徴とする。【００４３】
Snailタンパク質活性増強物質は、Snailタンパク質分子の固有の活性を増強させる物質だけでなく、細胞内で全体としてSnailタンパク質活性を増強する物質であれば何でも良く、一例として、Snailタンパク質の発現増強をもたらすNBS1の強制発現ベクター（Yang et al. Oncogene, 26, 1459-1467, 2007）や、snail遺伝子の強制発現ベクターなどが挙げられる。【００４４】
この遺伝子発現増強剤の使用方法は、有効成分であるSnailタンパク質活性増強物質の性質によって決めればよく、対象とする細胞の細胞膜に作用するものであれば、細胞に投与すればよく、細胞内で発現することによって作用するものであれば、細胞内に導入する必要がある。【００４５】
ここで、遺伝子発現増強の対象とする細胞は特に限定されないが、腫瘍細胞、特にPanc-1細胞であることが好ましい。【００４６】
＝＝遺伝子発現増強剤II．FoxP3遺伝子＝＝
本発明にかかる、対象とする細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤は、Snailタンパク質活性増強物質を含有することを特徴とする。【００４７】
Snailタンパク質活性増強物質は、Snailタンパク質分子の固有の活性を増強させる物質だけでなく、細胞内で全体としてSnailタンパク質活性を増強する物質であれば限定されず、一例として、Snailタンパク質の発現増強をもたらすNBS1の強制発現ベクター（Yang et al. Oncogene, 26, 1459-1467, 2007）や、snail遺伝子の強制発現ベクターなどが挙げられる。【００４８】
この遺伝子発現増強剤の使用方法は、Snailタンパク質活性増強物質によってSnailタンパク質活性を増強させた細胞や、その細胞の培養上清を、FoxP3遺伝子の発現を増強させる対象の細胞に投与する。例えば、それらの細胞をin vivoあるいはin vitroで共培養してもよく、対象の細胞が生体内にある場合、Snailタンパク質活性を増強させた細胞やその細胞の培養上清を、対象の細胞付近に注入すればよい。  
ここで、対象とする細胞は特に限定されないが、Ｔ細胞であることが好ましく、ナイーブＴ細胞、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞であることがより好ましい。【００４９】
＝＝遺伝子発現増強剤III．FoxP3遺伝子＝＝
本発明にかかる、対象とする細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤は、対象とする細胞及び／又は対象とする細胞と共存する他の細胞においてMCP1シグナルを活性化させることを特徴とする。【００５０】
遺伝子発現増強剤が含有する有効成分として、例えば、Snailタンパク質を発現している細胞、MCP1を発現している細胞、MCP1タンパク質、MCP1受容体活性化物質などが考えられ、具体的には、MCP1を分泌している腫瘍細胞、MCP1遺伝子の強制発現ベクターを導入した細胞、MCP1タンパク質を分泌する細胞の培養上清、高純度MCP1タンパク質、MCP1受容体を活性化する抗MCP1受容体抗体、などが挙げられる。【００５１】
また、本発明にかかる、対象とする細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤は、Snailタンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現する細胞や、FSTL1タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を含有してもよい。【００５２】
この場合、遺伝子発現増強剤として具体的には、Snailタンパク質、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を発現している腫瘍細胞、Snail、FSTL1、膜型IL-13Ra2または分泌型IL-13Ra2をコードする遺伝子の強制発現ベクターを導入した細胞、Snailタンパク質を発現している細胞の培養上清や、FSTL1タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質を分泌する細胞の培養上清や、高純度のFSTL1タンパク質、または分泌型IL-13Ra2タンパク質を用いることができる。【００５３】
なお、遺伝子発現増強剤は、上記物質のうち一つを含有していても、複数を含有していてもよい。【００５４】
これら遺伝子発現増強剤の使用方法は、例えば、対象とする細胞に遺伝子発現増強剤を直接投与すればよい。その際、他の細胞を共存させてもよく、共存させる細胞としては、Ｔ細胞に抗原を提示して増殖させる作用を有する樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞が好ましい。また、遺伝子発現増強剤を、対象とする細胞以外の他の細胞に投与し、その細胞の培養上清を対象とする細胞に投与してもよい。ここで用いる細胞としては、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞が好ましい。  
ここで、対象とする細胞は特に限定されないが、Ｔ細胞であることが好ましく、ナイーブＴ細胞、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞であることがより好ましい。【００５５】
＝＝細胞分化促進剤、免疫抑制剤＝＝
FoxP3タンパク質は、免疫抑制機能を有する制御性Ｔ細胞の分化と機能を制御するマスター遺伝子である（Miyara and Sakaguchi Trends Mol. Med. 13, 108-116, 2007; Hori et al. Science 299, 1057-1061, 2003; Jiang and Chess J. Clin. Invest. 114, 1198-1208, 2004; ）。従って、上述したFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強剤は、対象とする細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導するための細胞分化誘導剤、及び免疫抑制剤として用いることができる。実際、snail遺伝子を発現している細胞を含有するFoxP3遺伝子発現増強剤は、共培養したCD4+細胞に対し、Ｔ細胞の増殖抑制能を獲得させることも、FoxP3遺伝子発現増強剤が細胞分化誘導剤及び免疫抑制剤として用いることができることを示している。【００５６】
なお、対象とする細胞は特に限定されないが、Ｔ細胞であることが好ましく、ナイーブＴ細胞、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞であることがより好ましい。なお、これらの細胞分化促進剤及び免疫抑制剤は、in vivo でもin vitroでも用いることができる。また、免疫抑制剤は、過剰免疫であっても正常免疫であっても抑制することができる。【００５７】
＝＝過剰免疫疾患治療剤＝＝
制御性Ｔ細胞の機能低下は、自己免疫やアレルギー疾患などの過剰免疫疾患を引き起こす（Miyara and Sakaguchi Trends Mol. Med. 13, 108-116, 2007; Turk et al. Immunol. Rev. 188, 122-135, 2002）。従って、対象とするＴ細胞を制御性Ｔ細胞に分化誘導し、それにより免疫を抑制することによって、これらの過剰免疫疾患を治療することができる。従って、上述の細胞分化誘導剤及び免疫抑制剤は、自己免疫やアレルギー疾患などの過剰免疫疾患治療剤として用いることができる。ここで、過剰免疫疾患とは、制御性Ｔ細胞の機能低下が原因になる疾患であればよく、自己免疫やアレルギー疾患に限定されない。なお、対象とする細胞は特に限定されないが、Ｔ細胞であることが好ましく、ナイーブＴ細胞、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞であることがより好ましい。【００５８】
過剰免疫疾患治療剤の使用方法は適宜決定されればよいが、患者において、全身投与または過剰免疫が生じている部位に直接投与されることが好ましい。【００５９】
＝＝FoxP3遺伝子発現増強阻害剤＝＝
本発明にかかる、対象とする細胞においてFoxP3遺伝子の発現増強を阻害するFoxP3遺伝子発現増強阻害剤は、対象とする細胞及び／又は対象とする細胞と共存する細胞のMCP1シグナルを抑制することを特徴とする。  
この遺伝子発現増強阻害剤が含有する有効成分は、例えばMCP1タンパク質やMCP1受容体の機能を抑制すればよく、具体的には、それらの機能を阻害する阻害抗体や、その阻害抗体を分泌するハイブリドーマ、阻害活性を示す低分子化合物などが挙げられる。【００６０】
また、本発明にかかるFoxP3遺伝子発現増強阻害剤は、FSTL1タンパク質、膜型IL-13Ra2タンパク質または分泌型IL-13Ra2タンパク質の機能を抑制することを特徴としてもよい。  
この遺伝子発現増強阻害剤が含有する有効成分は、例えばFSTL1タンパク質阻害活性を有する抗FSTL1抗体、膜型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗膜型IL-13Ra2抗体または分泌型IL-13Ra2タンパク質阻害活性を有する抗分泌型IL-13Ra2抗体などが挙げられる。【００６１】
これら遺伝子発現増強阻害剤の使用方法は、in vivoまたはin vitroにおいて、対象とする細胞またはその近辺に投与すればよい。ただし、FoxP3遺伝子発現増強阻害剤が、FoxP3遺伝子発現増強阻害の対象とする細胞と共存する細胞のMCP1シグナルを抑制することにより効果を示す場合、遺伝子発現増強阻害剤は、当該共存する細胞に対し作用するように投与される。ここで、当該共存する細胞は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞等であると考えられる。  
ここで、対象とする細胞は特に限定されないが、Ｔ細胞であることが好ましく、ナイーブＴ細胞、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞であることがより好ましい。【００６２】
＝＝細胞分化誘導阻害剤、免疫抑制解除剤＝＝
上述したように、FoxP3タンパク質は、免疫抑制機能を有する制御性Ｔ細胞の分化と機能を制御するマスター遺伝子である（Miyara and Sakaguchi Trends Mol. Med. 13, 108-116, 2007; Hori et al. Science 299, 1057-1061, 2003; Jiang and Chess J. Clin. Invest. 114, 1198-1208, 2004; ）。従って、FoxP3タンパク質の発現増強を抑制すると、対象とする細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害することができ、ひいては、制御性Ｔ細胞による免疫抑制を解除することができる。このように、上述したFoxP3遺伝子の発現増強を抑制する遺伝子発現増強阻害剤は、対象とする細胞の制御性Ｔ細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤、及び免疫抑制解除剤として用いることができる。【００６３】
細胞分化誘導阻害剤及び免疫抑制解除剤の使用方法は、in vivoまたはin vitroにおいて、制御性Ｔ細胞への分化誘導阻害の対象とする細胞またはその近辺に投与すればよい。ただし、細胞分化誘導阻害剤及び免疫抑制解除剤が、対象とする細胞と共存する細胞のMCP1シグナルを抑制することにより効果を示す場合、当該共存する細胞に対して作用するように投与される。ここで、当該共存する細胞は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞等であると考えられる。【００６４】
なお、対象とする細胞は特に限定されないが、Ｔ細胞であることが好ましく、ナイーブＴ細胞、CD4+Ｔ細胞またはCD8+Ｔ細胞であることがより好ましい。また、これらの細胞分化誘導阻害剤及び免疫抑制解除剤は、in vivo でもin vitroでも用いることができる。【００６５】
＝＝腫瘍免疫賦活剤、抗腫瘍剤＝＝
本発明者らは、腫瘍細胞において、Snailタンパク質がMCP1遺伝子、TSP1遺伝子、FSTL1遺伝子、及びIL-13Ra2遺伝子の発現を増強し、それらの遺伝子産物が、CD4+Ｔ細胞やCD8+Ｔ細胞に対し、直接的及び間接的に作用し、制御性Ｔ細胞の活性化マーカーであるFoxP3の発現を増強することを見出した。即ち、腫瘍細胞は、MCP1タンパク質、TSP1タンパク質、FSTL1タンパク質、IL-13Ra2タンパク質、IL-13タンパク質、IL-4タンパク質、CCR2タンパク質、IL-10タンパク質などの腫瘍免疫抑制介在タンパク質によって、周囲の免疫細胞に働きかけ、その免疫細胞を制御性Ｔ細胞に分化させることにより、宿主の癌免疫を抑制すること明らかにした。この事実から、これらの介在タンパク質の作用を阻害する、本発明のFoxP3遺伝子発現増強阻害剤は、腫瘍細胞による腫瘍免疫抑制を解除し、腫瘍免疫を賦活することができる。患者自身の腫瘍免疫を賦活化すれば、患者において腫瘍の治療効果が得られる。従って、本発明のFoxP3遺伝子発現増強阻害剤は、腫瘍免疫賦活剤及び抗腫瘍剤として用いることができる。ここで、腫瘍免疫抑制介在タンパク質の機能を阻害する阻害物質としては、腫瘍免疫抑制介在タンパク質の抗体や競合阻害分子（ドミナントネガティブ変異体）などが例示できる。【００６６】
実際、通常の腫瘍細胞であれば、樹状細胞などの抗原提示細胞を含む貪食細胞によって貪食され、消化・排除されるが、Snail発現腫瘍細胞は、その貪食作用を阻害するにもかかわらず、介在タンパク質の作用を阻害する阻害物質は、Snail発現腫瘍細胞による貪食作用阻害を抑制できる。【００６７】
腫瘍免疫賦活剤及び抗腫瘍剤の使用方法は適宜決定されればよいが、患者において、腫瘍部位またはその近辺に直接投与されることが好ましい。【００６８】
＝＝腫瘍増殖抑制剤＝＝
本発明にかかる腫瘍増殖抑制剤は、MCP1シグナルまたはTSP1タンパク質の機能を抑制することにより、その腫瘍細胞の増殖を抑制する。腫瘍増殖抑制剤は、有効成分として、例えば、MCP1タンパク質、MCP1受容体、またはTSP1タンパク質の機能を阻害する阻害抗体や、その阻害抗体を分泌するハイブリドーマを含有する。【００６９】
腫瘍増殖抑制剤の使用方法は適宜決定されればよいが、患者において、全身投与または腫瘍部位やその近辺に直接投与されることが好ましい。【００７０】
＝＝腫瘍細胞浸潤抑制剤、腫瘍転移抑制剤＝＝
本発明にかかる腫瘍細胞浸潤抑制剤は、MCP1シグナルまたはFSTL1タンパク質の機能を抑制することにより、その腫瘍細胞の浸潤を抑制する。  
腫瘍細胞が転移を起こす際、正常細胞間や血管壁を形成する細胞間を浸潤する。従って、腫瘍細胞の浸潤を抑制することにより、腫瘍の転移を抑制することができる。従って、腫瘍細胞浸潤抑制剤は腫瘍転移抑制剤として利用することができる。【００７１】
本発明の腫瘍細胞浸潤抑制剤及び腫瘍転移抑制剤は、有効成分として、例えば、MCP1タンパク質、MCP1受容体、またはFSTL1タンパク質の機能を阻害する阻害抗体や、その阻害抗体を分泌するハイブリドーマ、MCP1のドミナントネガティブ変異体（７ＮＤ）を含有する。【００７２】
腫瘍転移抑制剤の使用方法は適宜決定されればよいが、患者において、全身投与または腫瘍部位やその近辺に直接投与されることが好ましい。【００７３】
なお、上記本発明にかかる全ての薬剤について、治療対象となる腫瘍は特に限定されず、固形癌でも血液のがんでも構わないし、上皮性の癌やそれ以外の悪性腫瘍でも構わない。【００７４】
＝＝血液のがんに対する抗癌剤＝＝
本発明にかかる血液のがんに対する抗癌剤は、Snailタンパク質の機能を阻害する阻害物質を含有する抗癌剤である。ここで、Snailタンパク質の機能を阻害する阻害物質とは、Snailタンパク質分子の固有の活性を阻害させる低分子化合物やたんぱく質（ドミナントネガティブ型変異体）等だけでなく、細胞内で全体としてSnailタンパク質の機能を阻害する物質であれば限定されず、一例として、Snailタンパク質の発現を阻害する核酸（アンチセンスRNA、siRNA、shRNA等）や、それら核酸の強制発現ベクター、競合阻害たんぱく質などが挙げられる。この抗癌剤は、癌化した血液細胞の浸潤を阻害することにより、その機能を発揮することが望ましい。【００７５】
なお、これまで、血液のがんとSnailとの関係は、全く知られていなかった。たとえ、Snailの発現が腫瘍の転移に関係することが考えられていても、それは固型癌などで見られるE-cadherinなどの細胞間接着分子を制御するからであって、浮遊系である血液細胞の癌については、Snailの関与は当業者の予想できないことであった。【００７６】
ここで、血液のがんとしては限定されないが、例えば、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫が挙げられる。
【実施例】
【００７７】
[１] Panc-1細胞におけるsnail遺伝子の強制発現
＜目的＞
ヒト膵癌細胞株Panc-1細胞において、snail遺伝子を強制発現し、Snailの発現が増強している細胞クローンＤ６、Ｄ１０、Ｆ３、Ｆ５について、細胞の形状、Snail及びＥ−カドヘリンについてのmRNAとタンパク質の発現レベル、細胞増殖能、細胞接着能、細胞移動能、細胞浸潤能に関する表現型を調べた。【００７８】
＜実験方法＞
（１）snail遺伝子の強制発現ベクターの作製ならびにその導入
EMT誘導剤の一つとして知られるTGF-betaで刺激したPanc-1細胞からsnail cDNA (CDS 71-865, 795 bp)をPCRで増幅し、G418耐性遺伝子を有するpcDNA3.1(+)プラスミドベクター（Invitrogen社）の制限酵素EcoR I-Xho Iサイトに挿入した。これを腫瘍細胞株にエレクトロポレーションによって導入し、2週間培養した後、G418（２mg／mL）で薬剤耐性細胞を選択し、細胞をクローニングした。【００７９】
（２）snail遺伝子導入細胞株におけるRT-PCRによる遺伝子発現解析
ヒト腫瘍細胞株からRNeasy（QIAGEN社）でRNAを抽出し、AMVで逆転写（42℃・50分→70℃・15分）して得たcDNAを用いて、PCRを行った（iCycler, BIO-RAD社）。snail cDNAに対するプライマーの配列は以下の通りである。  
Forward 5'-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG-3'（配列番号１）
Reverse 5'-ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG-3'（配列番号２）【００８０】
（３）snail遺伝子導入細胞株における免疫組織化学的染色によるタンパク質発現解析
腫瘍細胞におけるタンパク質の発現レベルを調べるため、腫瘍細胞（5x104個）をスライドチャンバー内で一晩培養し (37℃, 5%CO2)、4%パラホルムアルデヒドで固定した。正常ヤギ血清による非特異的染色のブロッキング処理後、細胞内染色のためにCytofix/Cytoperm（BD Phermingen社）で処理し（4℃、20分）、その後各種抗体（例えば、抗Snail抗体（SANTA CRUZ社）+ Alexa488標識抗goat IgG（Molecular Probes社 ）、または、抗E-cadherin抗体（BD Bioscience社）+ Alexa568標識抗mouse IgG（Molecular Probes社 ））で1時間4℃で染色した。その後、Vecter Shield（Vector Laboratories 社）で細胞を封入し、蛍光顕微鏡 （LSM 5 PASCAL, Carl Zeiss社）で観察・撮影した。【００８１】
＜結果＞
図１Ａに、snail遺伝子導入細胞株の表現型を表にまとめた。  
親細胞株であるPanc-1細胞においてもSnailタンパク質の固有の発現は観察されるが、snail遺伝子の強制発現ベクターを導入することにより、表に示したクローンでSnailタンパク質の発現レベルが亢進した。その結果として、いずれのクローンにおいても、細胞形状は球状(round)から扁平な紡錘形(spindle/spreading)に変化し、in vitro 及びin vivoにおいて細胞増殖能(proliferation)は低下し、Ｅ−カドヘリン(E-cadherin)のタンパク質レベル及び細胞接着能(Adhesion)が低下し、細胞移動能(migration)及び細胞浸潤能(Invasion)は亢進した。特に、クローンＦ３において、上皮-間充織転換（EMT）に関する顕著な効果が観察されたので、以下の実施例においてＦ３を用いた。【００８２】
[２] Hs294T細胞との共培養による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導
＜目的＞
TGF-beta処理したヒト・メラノーマHs294T細胞をPBMCと共培養することにより、PBMC中のCD4+細胞においてFoxP3タンパク質の発現増強が生じること、FoxP3タンパク質の発現がsnail遺伝子のノックダウンにより消失することを示す。【００８３】
＜実験方法＞
（１）腫瘍細胞のTGF-beta処理
６穴プレートを用いて、ヒト・メラノーマHs294T細胞の培地に、下記のsnail遺伝子特異的なsiRNA（Invitrogen社）、または、ネガティブコントロールとして、そのスクランブル配列のオリゴヌクレオチドを2μg/3×105個/2mL添加して培養した。2日後、それらの細胞を洗浄後、TGF-beta（5 ng/mL）を添加して、さらに3日間培養した。【００８４】
snail遺伝子特異的siRNA#1の配列
Forward 5'- GCGAGCUGCAGGACUCUAA-3'（配列番号３）
Reverse 5'- UUAGAGUCCUGCAGCUCGC-3'（配列番号４）
snail遺伝子特異的siRNA#2の配列
Forward 5'- CCCACUCAGAUGUCAAGAA-3'（配列番号５）
Reverse 5'- UUCUUGACAUCUGAGUGGG-3'（配列番号６）
siRNAコントロールの配列
Forward 5'-GCGCGUCAGGACUCGAUAA-3'（配列番号７）
Reverse 5'-UUAUCGAGUCCUGACGCGC-3'（配列番号８）【００８５】
（２）腫瘍細胞におけるRT-PCRによる遺伝子発現解析
腫瘍細胞を回収し、[１]と同様にしてRT-PCRでsnail遺伝子の発現を測定した。同時に、下記プライマーを用いて、発現定量のためのコントロールとしてGAPDH遺伝子の発現を測定した。  
Forward 5'- GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3'（配列番号９）
Reverse 5'- ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3'（配列番号１０）【００８６】
（３）ヒト末梢血細胞（PBMC）の単離
健常人から1/10量の4％クエン酸ナトリウムを加えて採血後、フィコール（比重1.090）に重層して遠心分離（1500rpm、20分、室温）し、中間層に存在する細胞分画を「（bulk）PBMC」として使用した。【００８７】
（４）PBMCと腫瘍細胞（Hs294T細胞）の共培養
得られた腫瘍細胞は、予め、MMC（100μg/mL、2時間、37℃）で処理するか、あるいはX線（20K rad）を照射することにより不活化した。PBMCは腫瘍細胞と1:10の割合（例えば、96穴プレートの場合は、1x105個のPBMCと1x104個の腫瘍細胞、24穴プレートの場合は、5x105個のPBMCと5x104個の腫瘍細胞）でプレートに播種して、37℃、5％CO２で共培養し、3〜5日後にPBMCを回収した。【００８８】
（５）FoxP3タンパク質の発現解析
得られたPBMCは、まず、市販されている抗CD4抗体 (BD PharMingen社)と抗CD25抗体 (BD PharMingen社)で1時間反応させた。次に、細胞内染色のためにCytofix/Cytoperm（BD Phermingen社）で処理（4℃、20分）し、抗FoxP3抗体 (eBioscience社)を用いて4℃、1時間反応させ、その後で、フローサイトメーターFACScan（Becton Dickinson社）を使用してCD4+またはCD4+CD25+の細胞分画にゲーティングし、FoxP3の発現レベルを調べた。【００８９】
＜結果＞
図２Ａにsnail遺伝子の発現及びFoxP3の発現を調べた結果を示す。ヒト・メラノーマHs294T細胞をTGF-beta処理すると、snail遺伝子の発現が亢進する（図ではControl）が、snail遺伝子特異的siRNAにより、その発現は抑制された。その時、CD4+細胞分画中でFoxP3を発現している細胞の割合は、TGF-betaで処理をしないとき（25％）に比べ、処理をすると増加する（31％）が、snail遺伝子特異的siRNAによってsnail遺伝子の発現を抑制すると、TGF-beta処理の有無にかかわらず、減少した（処理無：25％→17％、処理有：31％→20％）。このことは、CD4+細胞におけるFoxP3の発現の亢進が、Hs294T細胞におけるsnail遺伝子の発現の亢進によるものであることを示している。【００９０】
[３] Panc-1細胞及びＦ３細胞またはＤ１０細胞との共培養による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導及びT細胞増殖抑制活性の獲得
＜目的＞
PBMCとＦ３細胞またはＤ１０細胞を共培養することにより、PBMC中のCD4+細胞においてFoxP3タンパク質の発現増強が生じ、かつCD4+細胞がＴ細胞の増殖を抑制する活性を獲得することを示す。【００９１】
＜実験方法＞
（１）PBMCと腫瘍細胞（Panc-1細胞またはＦ３細胞）の共培養
Panc-1細胞またはＦ３細胞を用いて、[２]と同様の方法でPBMCとの共培養を行った。【００９２】
（２）CD4+細胞と新鮮T細胞との共培養
腫瘍細胞と3〜5日間共培養したPBMCをフィコール（比重1.090）に重層して遠心分離（1500rpm、20分、室温）し、中間層に存在する細胞分画を採取・洗浄後、磁気ビーズ結合抗CD4抗体（MACS抗体、Miltenyi Biotec社）を加えて４℃、30分間反応させ、MACS細胞自動分離機（Miltenyi Biotec社）を使用してCD4+細胞を分離した。【００９３】
一方、T細胞増殖反応を見るための材料として、[２]と同様の方法で同一健常人より新たにPBMCを調製し、前述と同様の方法でMACS抗体（抗CD4抗体または抗CD8抗体）を用いて、T細胞（CD4+細胞またはCD8+細胞）を分離した。この新鮮T細胞（2x105個）に、抗CD3抗体（最終濃度1μg/mL）と、事前に腫瘍細胞と培養したPBMCより分離したCD4+細胞（2x105個）を加え、96穴プレートにて4日間培養した。1/10量のPremix WST-1溶液（タカラバイオ社）を加えてさらに24時間培養し、その後、マイクロプレートリーダーで吸光度（450-655 nm）を測定して、その数値をT細胞の増殖量とした。【００９４】
（３）FoxP3タンパク質の発現解析
［２］に記載の方法と同様に、FoxP3タンパク質の発現を調べた。【００９５】
＜結果＞
（１）FoxP3タンパク質の発現解析
図２ＢにFACS解析の結果を示す。  
上段(CD4+CD25+ in lymphocytes)は、CD4及びCD25の発現により細胞を分画した結果であり、図中の数字は、リンパ球分画中のCD4+CD25-（左）またはCD4+CD25+（右）の細胞が占める割合（％）を示している。下段（FoxP3+ in CD4+ fraction）は、CD4+細胞分画中でのFoxP3+タンパク質の発現レベルを示しており（各グラフでｘ軸に沿ってFoxP3+タンパク質の発現レベルが高くなる）、グラフ中の数字は使用したFoxP3抗体のIsotype control (rat IgG2a)との比較解析によって、発現陽性と判断された範囲に存在するCD4+細胞分画におけるFoxP3+細胞が占める割合（％）を示している。【００９６】
CD4+細胞は、腫瘍細胞と共培養しない場合（図ではNo tumor：FoxP3の発現レベルは14.56）と比べ、snail遺伝子を強制発現させていないPanc-1細胞と共培養することにより（図ではParent：30.83）、FoxP3の発現増強が観察された。しかし、snail遺伝子を強制発現させたＦ３細胞と共培養させると（図ではＦ３：43.44）、FoxP3の発現がさらに増強した。この結果から、snail遺伝子の発現レベルと、FoxP3の発現増強能は相関していることが示された。【００９７】
このように、snail遺伝子を発現している細胞は、共培養したCD4+細胞に対し、FoxP3タンパク質の発現を増強させる。また、snail遺伝子を強制発現させ、Snailタンパク質の発現レベルを亢進させると、FoxP3タンパク質の発現増強能も亢進する。【００９８】
なお、Ｆ３細胞に対してsnail遺伝子に特異的なsiRNAを導入し、snail遺伝子の発現を抑制すると、FoxP3の発現増強能が低下することから、FoxP3の発現増強能が、クローン差などによるアーティファクトでなく、実際にsnail遺伝子の強制発現の結果であることが確認されている。【００９９】
（２）CD4+細胞とT細胞の共培養
図２Ｃに、各T細胞の増殖測定の結果を示す（左図がCD4+T細胞、右図がCD８+T細胞）。なお、Noneは、抗CD3抗体もCD4+細胞も加えないT細胞増殖の純粋なバックグランド値を示す。また、ポジティブコントロールとして、CD4+細胞を加えずに抗CD3抗体のみを加えたT細胞の増殖は、CD4+細胞、CD8+細胞ともに2.0以上の値を示した（図中には表示していない）。【０１００】
Panc-1細胞と共培養してもT細胞の増殖は強く抑制されたが（図中PrtまたはMock で1〜1.5）、T細胞をＤ１０細胞及びＦ３細胞と共培養した場合にはさらに強く抑制され、有意な抑制効果が観察された（P＜0.001）。【０１０１】
このように、snail遺伝子を発現している細胞は、共培養したCD4+細胞に対し、T細胞の増殖抑制能を獲得させる、すなわち、制御性Ｔ細胞に分化誘導させることができる。【０１０２】
［４] HCT116細胞との共培養による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導
＜目的＞
Panc-1細胞の代わりに、ヒト大腸癌細胞株HCT116細胞を用いて、[１][２]と同様の実験を行った。実験方法は[１][２]と同様である。【０１０３】
＜結果＞
図３にFACS解析の結果を示す。  
腫瘍細胞と共培養しない場合（図ではNo tumor：FoxP3の発現レベルは20.42）と比べ、Snailを強制発現させていないHCT116細胞と共培養しても、FoxP3の発現は増強しない（図ではParent：18.30）。しかし、snail遺伝子を強制発現させたB11クローンと共培養させると、FoxP3の発現が増強した（図ではB11：44.79）。このように、snail遺伝子の発現レベルとFoxP3の発現増強能の相関は、複数の癌種で観察された。【０１０４】
[５] snail遺伝子強制発現クローンの細胞培養上清による、CD4+細胞におけるFoxP3発現の誘導
＜目的＞
Ｆ３細胞だけでなく、Ｆ３細胞の細胞培養上清も、CD4+細胞に対してFoxP3タンパク質発現を増強することを示す。【０１０５】
＜方法＞
（１）培養上清の調製方法
1x105個の腫瘍細胞を25cm2のフラスコで3〜4日間培養し、その培養上清を別の試験管に移して高速遠心（3000 rpm、20分間、4℃）分離後、その上清を培養上清とした。実験に使用するまでは、4℃で保存した。【０１０６】
（２）培養上清による処置方法
２４穴プレートを用いて、5x105個のPBMC（またはその一分画）の浮遊液と腫瘍細胞の培養上清を等容量比で、つまり、2倍に希釈した腫瘍細胞の培養上清で37℃、5％CO２で3〜4日間培養し、その後、そのPBMCを回収した。なお、ネガティブコントロールとして、腫瘍細胞の培養上清の代わりに、培養を行っていない培地を用いて、同様の実験を行った。【０１０７】
（３）その他
FoxP3タンパク質の発現解析は、[２]と同様に行った。【０１０８】
＜結果＞
図４にFACS解析の結果を示す。  
CD4+細胞（図Ａ上段）、CD4+CD25-細胞（図Ａ下段）、CD4+CD25+細胞（図Ｂ）のいずれに対しても、親細胞株（図ＡではPrt-sup、図ＢではParent）及びSnail導入細胞（図ＡではD6-snail+など、図ＢではSnail-Tr）の培養上清は、培地のみの場合（図ＡではMedium、図ＢではNo stimulant）と比較して、FoxP3タンパク質の発現を増強した。このことは、Snailタンパク質の発現によるFoxP3タンパク質発現の増強作用は、液性因子を介していることを示す。  
このように、Snailタンパク質を発現している細胞の培養上清も、FoxP3タンパク質発現の増強剤として用いることができる。【０１０９】
なお、CD4+CD25+細胞は、制御性T細胞への分化が進んでおり、最大限のFoxP3タンパク質発現を有している場合もあるため、Snail発現細胞の上清の効果が得られないこともある（後述の図６参照）。【０１１０】
[６] Panc-1、HCT116、Hs294T各細胞株におけるSnailタンパク質強制発現によって発現亢進する遺伝子
＜目的＞
Panc-1、HCT116、及びHs294Tにおいて、Snailタンパク質の強制発現により、MCP1、TSP1、FSTL1、または分泌型IL-13Ra2の発現が亢進することを示す。【０１１１】
＜方法＞
（１）MCP1、TSP1、FSTL1、またはIL-13Ra2の発現レベルの測定方法
MCP1（ELISAキット：ENDOGEN社製 #EHMCP1）、TSP1（同：CHEMICON社製 #CYT168）、分泌型IL-13Ra2（同：ABCAM社製 #ab46112）のタンパク質の発現については、市販のELISAキットを使用して、その添付プロトコールに従って検出した。なお、ネガティブコントロールとして、細胞培養を行っていない培地を用いて、同様の実験を行った。【０１１２】
また、FSTL1の遺伝子発現は、[１]に示したRT-PCR法に準じて測定した。プライマーには以下のオリゴヌクレオチドを用いた。なお、ネガティブコントロール（NC）として、mRNAを添加しないで同様の実験を行った。  
Forward2 5'-GCACAGGCAACTGTGAGAAA-3'  （配列番号１１）
Reverse2 5'-CATAGTGTCCAAGGGCTGGT-3'   (配列番号１２）【０１１３】
（２）IL-13Ra2タンパク質の細胞内局在の検出方法
腫瘍細胞における膜型ならびに細胞内／核内に存在するIL-13Ra2の発現は、Snailタンパク質の発現と同様にして、 [１]（３）に示した免疫染色法に準じて行った。【０１１４】
＜結果＞
図５に結果を示す。（Ａ）には、MCP1、TSP1、及びsIL-13Ra2（分泌型）のタンパク質発現レベルの比較、（Ｂ）には、FSTL-1のmRNA発現レベルの比較の結果を示す。また、（Ｃ）には、各腫瘍細胞におけるIL-13Ra2の局在を示す。  
いずれのSnail強制発現クローン(Ｄ６, Ｄ１０, Ｆ３, Ｆ５)においても、親株(Prt)より上記サイトカインの発現が亢進していることが示された。また、IL-13Ra2は、分泌型（図５Ａ）だけでなく、図５Ｃに示すように、いずれのクローンにおいても、細胞膜や細胞質内、核内でも発現が亢進していることが示された。  
このように、Snailタンパク質の活性を増強させることにより、MCP1、TSP1、IL-13Ra2、FSTL-1の発現を増強させることができる。【０１１５】
[７] MCP1、TSP1、FSTL1、IL13Ra2の各タンパク質に対する抗体による、Ｆ３クローンによるFoxP3タンパク質発現増強の抑制
＜目的＞
MCP1、TSP1、FSTL1、IL13Ra2の各タンパク質に対する抗体が、Ｆ３クローンによるFoxP3タンパク質発現増強作用を阻害することを示す。【０１１６】
＜方法＞
（１）本実施例で使用した抗体
市販されている抗MCP1抗体（BD PharMingen社製 #551226）、抗TSP1抗体（ABCAM社製 #ab3131）、抗FSTL1抗体（R&D社製 #MAB1694）、抗TGF-beta1抗体（R&D社製 #MAB246）、抗IL-10抗体（R&D社製 #MAB2171）、抗IL-13Ra2抗体（R&D社製 #AF146）、マウスIgG抗体（BD Pharmingen #557273）を用いた。【０１１７】
（２）抗体を添加した培養上清の回収
抗MCP1抗体、抗TSP1抗体、抗FSTL1抗体、抗IL13Ra2抗体を最終濃度1〜5μg/mLで不活性化した腫瘍細胞に直接またはその培養培地に添加してPBMCと3日間培養し、そのPBMCを回収した。ポジティブコントロールとして、抗TGF-beta1抗体、抗IL-10抗体を用い、ネガティブコントロールとして、マウスIgG抗体を用いた。【０１１８】
（３）その他
腫瘍細胞の培養上清の調製方法やFoxP3タンパク質の発現解析は[５]と同様に行った。【０１１９】
＜結果＞
図６には、各抗体を用いたときのCD4+細胞におけるFoxP3タンパク質の発現レベルの測定結果を示す。また、図７には、各抗体を用いたときのCD4+細胞、CD4+CD25+細胞、CD4+CD25-細胞におけるFoxP3タンパク質の発現レベルの測定結果を示す。【０１２０】
TGF-b及びIL-10は、FoxP3タンパク質の発現誘導に関与することが知られており、ここでも、抗TGF-b抗体及び抗IL-10抗体は、CD4+細胞、CD4+CD25+細胞、CD4+CD25-細胞のいずれに対しても、Ｆ３クローンの培養上清のFoxP3タンパク質の発現増強能を抑制した。例えば、抗TGF-b抗体投与（図ではAnti-TGF-b）により、CD4+細胞に対しては、35.34から23.43（図６）または38.39から30.63（図７）に、CD4+CD25+細胞に対しては、38.39から28.86に、CD4+CD25-細胞に対しては、35.66から28.41にFoxP3タンパク質の発現レベルが低下した。また、抗IL-10抗体の場合（図ではAnti-IL-10）も同様に、それぞれ、11.42（図６）または30.88（図７）（CD4+細胞）、29.89（CD4+CD25+細胞）、28.05（CD4+CD25-細胞）に低下した。【０１２１】
一方、抗MCP1抗体投与（図ではAnti-MCP1）でも、それぞれ、16.27（図６）または22.89（図７）（CD4+細胞）、22.08（CD4+CD25+細胞）、19.02（CD4+CD25-細胞）に低下し、抗TSP1抗体（図ではAnti-TSP1）も同様に、それぞれ、9.26（図６）または21.35（図７）（CD4+細胞）、27.78（CD4+CD25+細胞）、16.56（CD4+CD25-細胞）に低下した。抗FSTL1抗体投与（図ではAnti-FSTL1）では、その効果は弱かったが、それでも、それぞれ、14.86（図６）または34.67（図７）（CD4+細胞）、29.85（CD4+CD25+細胞）、32.64（CD4+CD25-細胞）に低下した。抗IL13Ra2抗体投与（図ではAnti-IL13Ra2）では、35.34から11.86に低下した（図６）（CD4+細胞）。このように、抗MCP1抗体、抗TSP1抗体抗FSTL1抗体、及び抗IL13Ra2抗体は、培養上清のFoxP3タンパク質発現増強能を抑制することが示された。【０１２２】
また、抗MCP1抗体、抗TSP1抗体、抗FSTL1抗体、抗IL13Ra2抗体を同時に用いたところ、CD4+細胞における抑制効果が最も強くなり（35.34が8.54に低下）（図６）、これらのサイトカインのいずれもが冗長的に（redundantに）Ｆ３クローンの培養上清の中のFoxP3タンパク質の発現増強作用に貢献していることが示された。【０１２３】
従って、MCP1、TSP1、FSTL1の機能を阻害する物質は、Snail発現細胞が有するFoxP3タンパク質の発現増強能を阻害することができる。【０１２４】
[８] 抗IL-13Ra2抗体によるFoxP3タンパク質発現増強の抑制
＜目的＞
抗IL-13Ra2抗体が、B11クローンによるFoxP3タンパク質発現増強活性を阻害することを示す。【０１２５】
＜方法＞
抗体として、抗MCP1抗体及び抗IL-13Ra2抗体を用い、腫瘍細胞としてB11クローンを用いた以外は、[７]と同様に実験を行った。ここでは、FoxP3発現増強活性を阻害するポジティブコントロールとして、抗IL-13抗体を用いた。【０１２６】
＜結果＞
図８に抗MCP1抗体及び抗IL-13Ra2抗体を用いた結果を示す。【０１２７】
抗MCP1抗体は、B11クローンの培養上清によって増強されたFoxP3タンパク質発現を23.69(抗体なし；図ではNo mAbs)から4.69（抗体投与；図ではAnti-MCT）に低下させ、また、抗IL-13Ra2抗体は、7.60（抗体投与；図ではAnti-IL13Ra2）に低下させた。このように、これらの抗体は、B11クローンの培養上清による発現増強活性を阻害することができた。なお、親細胞のHCT116細胞に対する抗IL-13Ra2抗体の効果が認められないのは、HCT116細胞がSnailを発現していないためである。【０１２８】
このように、MCP1のみならずIL-13Ra2の機能を阻害する物質は、Snail発現細胞が有するFoxP3タンパク質の発現増強能を阻害することができる。【０１２９】
[９] 抗MCP1抗体、及び抗IL-13Ra2抗体による、マウスメラノーマB16-F10のFoxP3タンパク質発現増強の抑制
＜目的＞
抗MCP1抗体、及び抗IL-13Ra2抗体が、マウスメラノーマB16-F10のFoxP3タンパク質発現増強活性を阻害することを示す。【０１３０】
＜方法＞
（１）脾臓細胞の調整方法
免疫細胞としてはbulk PBMCの代わりに、マウス脾臓細胞を用いた。まず、マウスから脾臓を採取し、ホモゲナイズ後、細胞浮遊液をヒトbulk PBMCと同様にフィコールで分離し、中間層にある細胞分画を使用した。【０１３１】
（２）その他
基本的には、ヒト培養細胞と同様に行ったが、共培養あるいは培養上清存在下での培養は、ヒト細胞が3〜4日間であるのに対し、マウスメラノーマでは5〜6日間行った。【０１３２】
＜結果＞
図９（上段）に抗MCP1抗体、抗TSP1抗体、及び抗IL-13Ra2抗体を用いた結果を示す。ネガティブコントロールとしてマウスIgGを、ポジティブコントロールとして抗TGF-b抗体、及び抗IL-10抗体を用いた。  
抗TSP1抗体では、マウスメラノーマB16-F10のFoxP3タンパク質発現増強作用を抑制できなかったが、抗MCP1抗体及び抗IL-13Ra2抗体は、図に示されているように28〜45％程度、FoxP3タンパク質発現増強作用を抑制した。  
このように、FoxP3タンパク質発現増強作用の抑制は、ヒト腫瘍細胞に限らず、マウス腫瘍細胞でもその効果が観察される。【０１３３】
[１０] MCP1、TSP1、FSTL1、または分泌型IL-13Ra2の各サイトカインの、FoxP3タンパク質の発現増強作用
＜目的＞
MCP1、TSP1、FSTL1、または分泌型IL-13Ra2の各サイトカインがCD4+細胞に対し、FoxP3タンパク質の発現を増強させることを示す。【０１３４】
＜方法＞
培養上清に代えて、各サイトカインを1ng/mLの濃度で添加した培地を用いる以外は、[５]と同様に実験を行った。ポジティブコントロールとして、Panc-1細胞及びＦ３クローンの培養上清、TGF-b及びIL-10のサイトカインを用いた。各サイトカインは市販されているものを使用した（MCP1: R&D社 #279-MC, TSP1: R&D社 #3074-TH, FSTL1: R&D社 #669-FO, 分泌型IL-13Ra2: Abcam社 #ab46112, TGF-b: R&D社 #100-B, IL-10: eBioscience社 #34-8109）。【０１３５】
＜結果＞
図１０にFoxP3タンパク質の発現の測定結果を示す。  
何も添加しない培地（図ではMediumと表示；発現レベルは2.55）と比較して、MCP1タンパク質(発現レベルは17.35)、TSP1タンパク質(発現レベルは18.40)、FSTL1タンパク質(発現レベルは16.00)、分泌型IL-13Ra2タンパク質(発現レベルは20.21)のいずれもが、Ｆ３クローンの培養上清(発現レベルは17.08)と同程度のFoxP3タンパク質発現増強作用を示した。  
このように、MCP1、TSP1、FSTL1、及び分泌型IL-13Ra2の各サイトカインは、FoxP3タンパク質発現増強剤として有用である。【０１３６】
[１１] Snail発現細胞によるFoxP3タンパク質の直接的発現増強作用と間接的発現増強作用
＜目的＞
Snail発現細胞によるFoxP3タンパク質の発現増強作用には、直接的作用と間接的作用があり、間接的作用には少なくとも樹状細胞が関与していることを示す。【０１３７】
＜方法＞
免疫細胞として、bulk PBMCの代わりに、単離したCD4+細胞を用い、（１）CD4+細胞単独にＦ３細胞を加えた場合（２）CD4+細胞＋樹状細胞（DC）にＦ３細胞を加えた場合（３）CD4+細胞＋他の細胞（others＝bulk PBMCから CD4+細胞と樹状細胞を除去した残りの細胞）にＦ３細胞を加えた場合（４）CD4+細胞単独にＦ３細胞培養上清を加えた場合（５）CD4+細胞単独にＦ３細胞／DCの共培養上清を加えた場合（６）CD4+細胞単独にＦ３細胞／他の細胞の共培養上清を加えた場合（７）CD4+細胞単独にＦ３細胞／DC／他の細胞の共培養上清を加えた場合、のそれぞれにおいて、CD4+細胞におけるFoxP3タンパク質の発現レベルを調べた。  
CD4+細胞及びCD11c+細胞（樹状細胞）は、（２）と同様の方法でMACS抗体（Miltenyi Biotec社）を用いてbulk PBMCから単離した。その他の実験方法もまた上記に準じる。【０１３８】
＜結果＞
図１１にFoxP3タンパク質の発現の測定結果を示す。図中、中段は細胞を添加した場合の実験結果、下段は培養上清を添加した場合の実験結果を示す。【０１３９】
Bulk PBMCをCD4+細胞単独に変えてＦ３細胞に加えると、FoxP3タンパク質発現レベルは低下する（Bulk＋Ｆ３ cells は35.34、CD4＋Ｆ３ cellsは10.93）。そこに、DCや他の細胞を加えると、FoxP3タンパク質発現レベルが上昇する（CD4＋DC＋Ｆ３ cellsは25.72、CD4＋others＋Ｆ３ cellsは16.15）ことから、bulk PBMC内でのCD4+細胞におけるFoxP3タンパク質発現レベルの上昇には、CD4+細胞以外の細胞（DCまたはDC以外の細胞）が関与していることが示された。【０１４０】
しかし、CD4+細胞単独にＦ３細胞を加えると（CD4＋Ｆ３は10.93）、bulk PBMCを何も刺激しない場合（Bulk(no stim)は2.55）と比べ、FoxP3タンパク質発現レベルが上昇することから、Ｆ３細胞またはその培養上清中の液性因子が直接CD4+細胞に作用する機序も存在することが示された。【０１４１】
また、細胞を添加した場合と上清を添加した場合を比較した場合、いずれにおいても細胞を加えた場合でFoxP3タンパク質発現レベルが２倍程度高い。例えば、CD4＋Ｆ３ cellsは10.93であるのに対しCD4+Ｆ３supは5.48であり、CD4＋DC＋Ｆ３ cellsは25.72であるのに対しCD4+sup(Tu＋DC)は14.98であり、CD4＋others＋Ｆ３ cellsは16.15であるのに対しCD4+sup(Tu＋others)は6.37である。従って、液性因子による作用だけでなく、細胞間の直接的な相互作用もFoxP3タンパク質発現増強に貢献していると考えられる。【０１４２】
[１２] snail遺伝子強制発現クローンの細胞上清による、CD8+細胞におけるFoxP3発現の誘導
＜目的＞
CD8+細胞においても、CD4+細胞と同様に、snail遺伝子強制発現クローンＦ３の細胞上清によってFoxP3タンパク質発現が誘導されることを示す。【０１４３】
＜方法＞
対象とする細胞をCD4+細胞からCD8+細胞に変えた以外は、[５]と同様の方法で実験を行った。【０１４４】
＜結果＞
図１２にFoxP3タンパク質の発現の測定結果を示す。  
CD4+細胞で得られた結果と同様、腫瘍細胞の上清を加えない場合（図ではNo Tumor）に比べ、親細胞株であるPanc-1の細胞上清（図ではParent(Snail-)）では、FoxP3タンパク質発現は少ししか上昇しないが、Ｆ３の細胞上清を加えると（図ではＦ３(Snail+)）、CD8+細胞においてもFoxP3タンパク質発現の増強が観察された。  
このように、CD8+細胞に対しても、Snail発現細胞の培養上清は、FoxP3タンパク質発現を増強させる。【０１４５】
[１３] 抗TSP1抗体及び抗IL-13Ra2抗体による、CD8+細胞のFoxP3タンパク質発現増強の抑制
＜目的＞
CD8+細胞においても、CD4+細胞と同様に、抗TSP1抗体及び抗IL-13Ra2抗体によって、CD8+細胞におけるFoxP3タンパク質発現増強が抑制されることを示す。【０１４６】
＜方法＞
対象とする細胞をCD4+細胞からCD8+細胞に変えたこと以外は、[７]と同様の方法で実験を行った。なお、Ｆ３細胞に対しては抗MCP1抗体及び抗TSP1抗体を用い、B11細胞に対しては抗IL-13Ra2抗体を用いた。ネガティブコントロールには、マウスIgG抗体を用いて同様の実験を行った。【０１４７】
＜結果＞
図１３には、Ｆ３細胞に対して抗MCP1抗体及び抗TSP1抗体を用いた場合、図１４には、B11細胞に対しては抗IL-13Ra2抗体を用いた場合のFoxP3タンパク質の発現の測定結果を示す。【０１４８】
抗MCP1抗体（図１３；培養上清のみ(ｍIgG)では14.71、抗MCP1抗体(Anti-MCP1)は11.97）、抗TSP1抗体（図１３；培養上清のみ(ｍIgG)では14.71、抗TSP1抗体(Anti-TSP1)では5.28）、及び、抗IL-13Ra2抗体（図１４；B11培養上清(No mAbs)では14.87、抗IL-13Ra2抗体(Anti- IL-13Ra2)では10.21）を用いた場合、培養細胞上清によるFoxP3タンパク質の発現増強作用が阻害された。従って、培養細胞上清によるFoxP3タンパク質の発現増強作用は、少なくともMCP1、TSP1及びIL-13Ra2が主要な原因分子であることが示された。【０１４９】
このように、CD8+細胞に対しても、少なくともMCP1、TSP1及びIL-13Ra2は、FoxP3タンパク質の発現増強作用を有する。【０１５０】
[１４] 抗MCP1抗体及び抗TSP1抗体によるSnail発現腫瘍細胞の増殖抑制
＜目的＞
snail遺伝子を発現している腫瘍細胞に対し、抗MCP1抗体及び抗TSP1抗体を添加すると、腫瘍細胞の増殖が抑制されることを示す。【０１５１】
＜方法＞
（１）細胞増殖測定方法
Panc-1細胞及びＦ３細胞の培地に、抗MCP1抗体、抗TSP1抗体、または、コントロールとして抗TGF-b抗体を2μg/mLの濃度で添加して3日間培養後、1/10量のPremix WST-1溶液（タカラバイオ社）を加えてさらに4時間培養し、その後、マイクロプレートリーダーで吸光度（450-655nm）を測定して、その数値を細胞の増殖量とした。測定結果は、コントロールのmIgGで得られたときの値を100％として増殖阻害率も表示した。【０１５２】
＜結果＞
結果を図１５に示す。抗MCP1抗体及び抗TSP1抗体は、Panc-1細胞（図ではParent-snail(-)）及びＦ３細胞（図ではＦ３-snail(+)）の両方に対し、34％〜77％まで増殖を阻害する。このように、MCP1またはTSP1の機能を阻害することにより、腫瘍細胞の増殖能を低下させることができる。【０１５３】
[１５]  抗MCP1抗体及び抗FSTL1抗体によるSnail発現腫瘍細胞の浸潤抑制
＜目的＞
snail遺伝子を発現している腫瘍細胞に対し、抗MCP1抗体及び抗FSTL1抗体を添加すると、腫瘍細胞の浸潤が抑制されることを示す。【０１５４】
＜方法＞
5x104個のＦ３細胞をメンブレンがmatrigelでコートされたTranswell Chamber（ポアサイズ8μm, BD bioscience社）の上層に入れて一晩培養した (37℃, 5%CO2)。抗MCP1抗体または抗FSTL1抗体は上層と下層の両方に1μg/mLの濃度で添加して培養した。メンブレン上の細胞を完全に除去後、下層へ浸潤した細胞をクリスタルバイオレット溶液で固定・染色して顕微鏡下で計数することにより、細胞浸潤能を測定した。ネガティブコントロール(mIgG)で得られた結果を100％とし、浸潤した細胞の個数の割合も表示した。なお、ポジティブコントロールとして、抗IL-10抗体と抗TGF-b抗体を用いた。【０１５５】
＜結果＞
細胞浸潤能の測定結果を図１６に示す。  
親株のPanc-1細胞（図ではparentと示した）に比べ、Ｆ３細胞（図ではmIgGと示した）は細胞浸潤能が増強していた。そのＦ３細胞に対し、抗TSP1抗体を投与した場合では、細胞の浸潤能は変化が無かったが、抗MCP1抗体または抗FSTL1抗体を用いたときは、細胞の浸潤能が約４５％に低下した。このように、抗MCP1抗体及び抗FSTL1抗体は、Snail発現腫瘍細胞の細胞浸潤能を低下させる作用を有する。【０１５６】
[１６]白血病細胞における、Snail発現抑制による浸潤抑制。【０１５７】
＜目的＞
白血病細胞において、Snail発現を抑制することにより、白血病細胞の浸潤能を低下させることができることを示す。【０１５８】
＜方法＞
まず、白血病細胞株（Molt-3、Molt-4、UF1、KT1、K562、MC3）において、Snail、MCP-1、FSTL-1の発現をRT-PCRで調べた。方法は、[１][２][６]に記載の通りであるが、MCP-1に対しては、以下の配列を有するプライマーを用いた。  
Forward 5'-GTGTTTGACATCTTTGAACTC-3'（配列番号１３）
Reverse 5'-CCAAAGACAAACCTCACATTC-3'（配列番号１４）【０１５９】
次に、6穴プレートを用いて、白血病細胞株（Molt-4、EL4、Daudi、KT1）の培地に、[２]（１）で使用したものと同様のsnai1遺伝子特異的なsiRNAまたはsiRNAコントロールをそれぞれ添加して培養した(2μg／1x106個／2mL, Invitrogen社)。【０１６０】
２日間の培養後、マトリジェルコートのTranswell  Chamber（ポアサイズ8μm, BD bioscience社）を用いて４時間培養し、filterに浸潤した細胞を計数した。【０１６１】
＜結果＞
図１７Ａに示したRT-PCRの結果から、調べた限り、全ての白血病細胞株でSnailの高発現が検出された。  
また、図１７Ｂに、各白血病細胞株に対して測定した浸潤細胞数を示す。いずれの白血病細胞株においても、snail遺伝子に特異的なsiRNAで処理しない白血病細胞（図ではNoneまたはControl）に比べ、snai1遺伝子特異的なsiRNAで処理した場合に浸潤能が有意に抑制された（P＜0.001〜0.05）。  
このように、白血病細胞において、Snail発現を抑制することにより、白血病細胞の浸潤能を低下させることができる。従って、Snailの機能を抑制する物質は、抗白血病薬として有用である。【０１６２】
[１７] Snail発現腫瘍細胞が生成する介在タンパク質の作用を阻害することによる、腫瘍細胞による腫瘍免疫阻害の抑制
＜目的＞
腫瘍細胞は、貪食細胞によって貪食されて消化・排除されるが、Snail発現腫瘍細胞は、その貪食作用を阻害し、さらに、MCP1タンパク質、IL-13Ra2タンパク質、IL-13タンパク質、IL-4タンパク質、CCR2タンパク質、IL-10タンパク質に対する抗体が、Snail発現腫瘍細胞による貪食阻害作用を抑制することを示す。【０１６３】
＜用いた抗体＞
抗MCP-1抗体:BD Phamingen社、抗CCR2抗体:Abcam社:、抗IL-13抗体:Abcam社:、抗IL-13Ra2抗体:R&D社:、抗IL-4抗体:BD Biosciences社:、抗IL-10抗体:R&D社
＜方法＞
ヒト大腸癌HCT116細胞またはsnail遺伝子を強制発現させたB11クローンとヒトPBMCとを、各抗体（1μg/mL）の存在下で3日間共培養して接触させ、そのPBMCをPKH26赤色蛍光でラベルした。このPBMCにCSFE緑色蛍光でラベルしたHCT116細胞を1:1で加え、2時間、37℃で培養後に、フローサトメトリー(FCM)で赤色と緑色の両方の蛍光でラベルされた細胞（即ち、癌細胞を貪食しているPBMC中の細胞）の割合を解析した。なお、自然に生じる貪食（バックグランド）を見るため、低温（4℃）で2時間培養した。 
＜結果＞
snail遺伝子を発現していないHCT116細胞で処理したPBMC（図１８ではMock-treated PBMCs）は、約25％の細胞が両方の蛍光でラベルされていた。しかし、B11クローンで処理したPBMC（図１８ではB11-treated PBMCs）は、PBMC中約10％の細胞のみが両方の蛍光でラベルされていた。このように、Snail発現腫瘍細胞は、PBMCに含まれる貪食細胞の作用を抑制する機能を有する。【０１６４】
しかし、PBMCがB11クローンと接触する際に各抗体を添加しておくと、両方の蛍光でラベルされた細胞の割合が15％〜35％に上昇し、Snail発現腫瘍細胞との接触による、両方の蛍光でラベルされた細胞の割合の低下が阻害された。このように、腫瘍免疫抑制介在タンパク質の機能を阻害することにより、腫瘍細胞による腫瘍免疫抑制を解除し、腫瘍免疫を賦活することができる。【０１６５】
[１８] snail遺伝子またはMCP1遺伝子に特異的なsiRNAを用いたin vivo 治療実験
＜目的＞
Snailタンパク質の機能あるいはMCP1シグナルをin vivoで抑制することにより、腫瘍細胞による腫瘍免疫抑制が解除できることを示す。【０１６６】
＜方法＞
マウスメラノーマB16-F10に対し、snail遺伝子を強制発現させた細胞(H6-snail+)を[１]と同様に作製し、C57BL/6Nマウスに移植(1x106個の皮下接種と2x105個の静脈内接種を１匹の個体に両方同時に行った)した。7日後に、PEI(Polyplus Transfection社)を用いて脂質複合体を形成させたSnailまたはMCP1遺伝子に特異的なsiRNAまたはコントロールsiRNA(5μg/匹，Invitrogen社)をその皮下移植した腫瘍内へそれぞれ注入した。  
マウスsnail遺伝子特異的siRNAの配列：
Sense     5'-GGAAGAUCUUCAACUGCAA-3'（配列番号１５）
Antisense 5'-UUGCAGUUGAAGAUCUUCC-3'（配列番号１６）
マウスMCP1遺伝子特異的siRNAの配列：
Sense     5'-CCAGCAAGAUGAUCCCAAU-3'（配列番号１７）
Antisense 5'-AUUGGGAUCAUCUUGCUGG-3'（配列番号１８）
マウスsiRNA用コントロールの配列：
Sense     5'-CCAGAAGUACUACCGCAAU-3'（配列番号１９）
Antisense 5'-AUUGCGGUAGUACUUCUGG-3'（配列番号２０）【０１６７】
その１週間後、移植マウスから腫瘍と肺を摘出して腫瘍体積と肺転移結節数を測定し、腫瘍内浸潤細胞をフローサイトメーターFACScanで解析した。腫瘍内浸潤細胞は、固形腫瘍を培養液内でホモジェナイズして採取し、マウス抗原に対する各種抗体（抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD11c抗体および抗I-A(b)抗体はBD Phamingen社、抗FoxP3抗体はeBioscience社）またはH-2K(b)拘束性gp70テトラマー（ペプチド配列：KSPWFTTL，MBL社、配列番号２１）と4℃、1時間反応させた後で解析した。【０１６８】
＜結果＞
図１９に、測定した腫瘍体積（Ａ）、肺転移結節数（Ｂ）、および、腫瘍内浸潤細胞のフローサイトメトリー解析（Ｃ）の結果を示す。【０１６９】
図１９Ａ及び図１９Ｂに示すように、B16-F10を移植したマウス（図ではMock）では、腫瘍の増殖は著しかったが、肺への転移は少なかった。それに対し、H6-snail+を移植したマウス（図ではCont）では、腫瘍の増殖はMockほどではなかったが、肺への転移は著しく促進された。しかし、snail遺伝子またはMCP1遺伝子に特異的なsiRNAを注入すると（図では、それぞれ、Snail及びMCP1）、細胞増殖も肺への転移も抑制された。【０１７０】
また、図１９Ｃに示すように、腫瘍内への浸潤細胞数は、B16-F10（図ではMock）に比べsnail遺伝子を強制発現させたH6-snail+では有意に減少するが、snail遺伝子またはMCP1遺伝子に特異的なsiRNAを注入すると、腫瘍内への浸潤細胞数がB16-F10の場合以上に増加した。【０１７１】
このように、snail遺伝子またはMCP1遺伝子に特異的なsiRNA によって、Snailタンパク質の機能あるいはMCP1シグナルをin vivoで抑制することにより、腫瘍細胞による腫瘍免疫抑制が解除され、腫瘍体積増加の抑制、腫瘍転移抑制、腫瘍内への細胞浸潤の増強などの抗腫瘍効果が生じる。【０１７２】
[１９] 抗TSP1抗体を用いたin vivo 治療実験
＜目的＞
TSP1タンパク質の機能をin vivoで抑制することにより、腫瘍細胞による腫瘍免疫抑制が解除できることを示す。【０１７３】
＜方法＞
マウスメラノーマB16-F10及びH6-snail+をC57BL/6Nマウスに1x106個を皮下移植した7日後、抗TSP-1抗体(5μg／匹、Calbiochem社)をその皮下接種腫瘍内へ注入し、1週間後に以下のアッセイを行った。  
（１）腫瘍体積を測定した。  
（２）各臓器(LG 肺; SP 脾臓; PB 末梢血; BM 骨髄)において、腫瘍細胞の微少転移を検出するために、B16-F10細胞が特異的に発現する癌抗原gp100の遺伝子発現をRT-PCRによって調べた。なお、下記のプライマーを用いた以外、RT-PCRは[１]と同様に行った。  
gp100に特異的なプライマー配列：
Forward 5'-ACAGCCAGTGTATCCACAGG-3'（配列番号２２）
Reverse 5'-ACTTCCATTGTGTGTGTGCC-3'（配列番号２３）
コントロールであるGAPDHに特異的なプライマー配列：
Forward 5'-TTGACCTCAACTACATGGTCTA-3'（配列番号２４）
Reverse 5'-ACCAGTAGACTCCACGACATAC-3'（配列番号２５）
（３）腫瘍内浸潤細胞を、[１８]と同様にしてフローサイトメーターFACScanで解析した。【０１７４】
＜結果＞
図２０に、測定した腫瘍体積（Ａ）、肺転移結節数（Ｂ）、および、腫瘍内浸潤細胞のフローサイトメトリー解析（Ｃ）の結果を示す。【０１７５】
（１）図２０Ａに示すように、B16-F10を移植した場合（図ではMock）でも、H6-snail+を移植した場合でも（図ではH6-snail+）、抗TSP-1抗体を投与することにより（図ではAnti-TSP1+）、腫瘍体積は有意に減少した。【０１７６】
（２）図２０Ｂに示すように、H6-snail+を移植し、抗体のコントロールとしてマウスIgGを投与した場合（図ではH6+Control mIgG）、B16-F10を移植した場合（図ではMock）よりも、各組織で高レベルのgp100の発現が検出され、腫瘍転移が促進されていたが、抗TSP-1抗体を投与すること（図ではH6+Anti-TSP1）により、各組織でgp100の発現が低下し、組織への転移は著しく抑制された。【０１７７】
（３）図２０Ｃに示すように、瘍細胞内への浸潤細胞数は、B16-F10（図ではMock;mIgG）に比べ、snail遺伝子を強制発現させたH6-snail+（図ではH6-snail+;mIgG）では有意に減少するが、抗TSP-1抗体を投与することにより（図ではAnti-TSP1+）、腫瘍内への浸潤細胞数がB16-F10の場合（図ではMock;mIgG）以上に増加した。【０１７８】
このように、抗TSP-1抗体によって、TSP-1の作用を阻害することにより、腫瘍細胞による腫瘍免疫抑制が解除され、腫瘍体積増加の抑制、腫瘍転移抑制、腫瘍内への細胞浸潤の増強などの抗腫瘍効果が生じる。
【産業状の利用可能性】
【０１７９】
本発明により、細胞においてFoxP3遺伝子の発現を増強させる遺伝子発現増強方法、細胞を制御性T細胞に分化誘導する細胞分化誘導剤、それらの作用から免疫を抑制する免疫抑制剤及び過剰免疫疾患治療剤、細胞においてFoxP3遺伝子の発現増強を阻害する遺伝子発現増強阻害剤、細胞の制御性T細胞への分化誘導を阻害する細胞分化誘導阻害剤、それらの作用から免疫抑制を解除する免疫抑制解除剤、腫瘍免疫賦活剤、及び抗腫瘍剤、などを提供することができるようになった。
【図１】
2009028411.tif 000002
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2009028411.tif 000004
【図２Ｃ】
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【図３】
2009028411.tif 000006
【図４】
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【図５】
2009028411.tif 000008
【図６】
2009028411.tif 000009
【図７Ａ】
2009028411.tif 000010
【図７Ｂ】
2009028411.tif 000011
【図８】
2009028411.tif 000012
【図９】
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【図１０】
2009028411.tif 000014
【図１１】
2009028411.tif 000015
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2009028411.tif 000019
【図１６】
2009028411.tif 000020
【図１７Ａ】
2009028411.tif 000021
【図１７Ｂ】
2009028411.tif 000022
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
2009028411000001.app
【国際調査報告】
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