【手続補正書】
【提出日】平成16年11月4日(2004.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
（３）分子量５７キロダルトンの糖蛋白質によるVEGF産生促進の検討：ヒト頭髪毛乳頭細胞産生からのVEGF産生促進
分子量５７キロダルトンの糖蛋白質は、平滑筋系細胞（大動脈平滑筋細胞、気管支／気管平滑筋細胞、冠状動脈平滑筋細胞、肺動脈平滑筋細胞、臍帯動脈平滑筋細胞、子宮平滑筋細胞等）、上皮系細胞（乳腺上皮細胞、腎臓皮質上皮細胞、気管支／気管上皮細胞、前立腺上皮細胞、腎臓近位尿細管上皮細胞、肺胞上皮細胞、小気道上皮細胞 等）、マクロファージ、肝細胞、毛乳頭細胞等からのＶＥＧＦ（VEGF-A, VEGF１６５, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E）産生を著しく促進する。ここでは、ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＴＨＰＣ−００１）トータルキット（ＨＤＰＣトータルキット：ＴＨＰＣＫ−００１、製造元：セルアプリケイションズインク USA、輸入販売元：東洋紡績株式会社）を用いて、常法によりヒト毛乳頭細胞を培養し、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質によるVEGF産生促進活性を調べた。解凍した細胞を懸濁するためのＰＣＧＭ培地を１０ｍＬ、１５ｍＬ遠心チューブに分注し、氷冷しておく。即ち、凍結したヒト頭髪毛乳頭細胞（ＴＨＰＣ−００１）の入ったバイアル瓶を３７℃の恒温槽で急速に融解する。このバイアル瓶ににＰＣＧＭ培地を１ｍＬ程度徐々に滴下しＤＭＳＯを希釈後、全量をＰＣＧＭ培地が入った遠心チューブに移し懸濁させる。浮遊細胞を冷却低遠心機で４℃、１０００ｒｐｍ、５分間遠心する。沈殿した細胞を吸わないように注意しながら上清を吸引し、１ｍＬＰＣＧＭ培地に再懸濁させる。この全量を、コラーゲン液でコートしたＴ−７５フラスコに植え込み、５％ＣＯ2、加湿下で３７℃に保たれたインキュベーターに入れ静置培養を行う。１日後、培地の交換を行う。以後、１日おきに培地の交換を行い継代培養をする。尚、ＰＣＧＭ培地成分は、１％ＦＢＳを含有するＰＣＧＭ基礎培地２５０ｍＬに牛下垂体抽出液（ＢＰＥ）１００倍希釈液を２．５ｍＬ、牛胎児血清（ＦＣＳ）１００倍希釈液を２．５ｍＬ、インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン溶液（ＩＴＴ）２００倍希釈液を１．２５ｍＬ、サイロプロテイン溶液（Ｃｙｐ）２００倍希釈液を１．２５ｍＬを添加したものを用いた。尚、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の添加系及び無添加系によりＶＥＧＦ産生促進の検討を行った。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
（７）分子量５７キロダルトンの糖蛋白質による内皮細胞増殖促進の検討
分子量５７キロダルトンの糖蛋白質は、ウシ頸動脈由来内皮細胞、ヒト大動脈由来内皮細胞、ウシ大動脈由来内皮細胞、ヒト冠動脈由来内皮細胞、ラット冠動脈由来内皮細胞、ヒト臍帯動脈由来内皮細胞、ヒト臍帯静脈由来内皮細胞、ヒト腸骨動脈由来内皮細胞、ヒト肺動脈由来内皮細胞、ヒト肺静脈由来内皮細胞などの大血管由来内皮細胞、ヒト皮膚微小血管由来内皮細胞、ヒト肺微小血管由来内皮細胞、ヒト子宮筋層微小血管由来内皮細胞、ヒト角膜内皮細胞、ウシ角膜内皮細胞、肝類洞内皮細胞等の内皮細胞の増殖活性を示す。更に、ヒト大動脈由来内皮細胞（HAEC,Code: C2535,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト冠動脈由来内皮細胞（HCAEC,Code: C2585,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト腸骨動脈由来内皮細胞（HIAEC,Code: C2545,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト皮膚微小血管由来内皮細胞（HMVEC-d,Code:,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト肺微小血管由来内皮細胞（HMVEC-L,Code: C2527,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト肺動脈由来内皮細胞（HPAEC,Code: C2530,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト臍帯動脈由来内皮細胞（HUAEC,Code: C2520,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（HUVEC,Code:,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト子宮筋層微小血管由来内皮細胞（UtMVEC,Code: C2564,Bio Whittaker Co. Ltd.）、正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞トータルキット（製造元：セルアプリケイションズインク
USA、輸入販売元：東洋紡績株式会社）を用いるのが市販されていて便利である。ここでは、正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞トータルキット（製造元：セルアプリケイションズインクUSA、輸入販売元：東洋紡績株式会社）を用いて、常法により正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞を培養し、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の増殖活性を調べた。凍結正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞入りのアンプルを、３７℃の恒温槽に一分間浸し細胞を素早く解凍する。アンプルの細胞浮遊液５００μＬをイクストラセルラーマトリックスプロテインコートフラスコ（７．５ｍＬのＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを入れてあったもの）に入れ、細胞が均一分散するように揺らす。このフラスコをインキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2、加湿条件下）中で、ガス交換ができるようにフラスコのキャップを緩め静置培養する。８時間又は一晩培養後に、培地中のＤＭＳＯの影響をなくす為に培地交換をする。尚、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質添加系及び無添加系により内皮細胞増殖促進の検討を行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（８）正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞に対する増殖促進作用の測定方法
分子量５７キロダルトンのタンパク質を最大９５％濃度まで、正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞の培養培地であるＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍに添加し、発明の実施の形態の（７）に示した通りに正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞を培養し、４８時間後の正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞に対する増殖促進作用をＭＴＴ法により分析した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
（１１）分子量５７キロダルトンの糖蛋白質のウシ頸動脈由来内皮細胞に対する管腔形成促進作用の測定方法： コラーゲンゲル間サンドイッチ培養法（Atherosclerosis, 92, 141,1992又は、Virchows Arch. B Cell Pathol., 60, 245, 1991)
分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を以下の管腔形成実験系の細胞に無菌的に投与し管腔形成を観察した。ウシ頸動脈由来内皮細胞は、１０％ＦＢＳ添加のイーグルズ最小培地
（ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ）、３７℃、５％ＣＯ2の条件下でインキュベーターで培養された。この実験で用いた細胞は、継代６〜１０回培養されたものを用いた。管腔形成実験は、直径２２ｍｍの１２ウェルプレートを用い、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中にウシ頸動脈由来内皮細胞密度が１×１０5細胞／１．５ｍＬが、Ｖｉｔｒｏｇｅｎ１００（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＣＯ．,ＣＡ）が８、０．１Ｎ ＮａＯＨが１，×１０ＭＥＭ（ｐＨ ７．４）が１の体積比の混合物からなる０．７５ｍＬのコラーゲンゲルの入ったウェルプレートに播種され、２４時間インキュベートされた。この培地は、吸引され、ウシ頸動脈由来内皮細胞上を０．５ｍＬのコラーゲンゲルにより積層し、そこに２％ＦＢＳを添加及び、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を加えたＭＥＭ１．５ｍを加えインキュベートされ、３日に一度培地を交換し培養された。これにより、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の管腔形成の影響を観た。尚、ネガティブコントロールとして、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を加えない系を、ポジティブコントロールとしてインスリン１００μＵ／ｍＬを加えた。形態学的変化は、位相差光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ＩＭＴ２）により観察し、顕微鏡写真を３３倍で撮った。各培養容器から無差別に５箇所選択し、管状構造は１０個の写真からトレースして、管の長さが組織分析システム（ＴＡＳ ｐｌｕｓ、Ｅｒｎｓｔ Ｌｅｉｔｚ Ｗｅｔｚｌａｒ ＧｍｂＨ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）により決定された。管の長さは、次式に示させる。
特異的長さ（ｍｍ-1）＝合計管の長さ（ｍｍ）／合計面積（ｍｍ2）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
＜実施例１３〜１６＞
ウシ頸動脈由来内皮細胞に対する分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の管腔形成の影響
実施の形態の（１１）のウシ頸動脈由来内皮細胞に対する管腔形成促進作用の測定方法に従って、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を各濃度１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、添加し、ウシ頸動脈由来内皮細胞に対する管腔形成促進作用を求めた。（尚、ネガティブコントロールとして、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を加えない系を、ポジティブコントロールとしてインスリン１００μＵ／ｍＬを加えた。）結果を表４に示す。分子量５７キロダルトンの糖蛋白質は、ウシ頸動脈由来内皮細胞に対して著しい管腔形成促進作用を示した。分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の１０ｎｇ／ｍＬ添加系が最もウシ頸動脈由来内皮細胞に対して管腔形成を促進した。（尚、表４の結果は、３回の実験結果の平均値とS.E.M.を示す）