(57)【要約】【課題】本発明は、膜タンパク質、特に、トランスポーター（例えば、ＡＢＣトランスポーター）の細胞膜上における安定化を維持、促進するための薬剤及び方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、４−フェニルブチル酸を含むカルボン酸及びその誘導体で細胞を処理することで、細胞膜上に存在するタンパク質の分解を抑制し、膜上におけるタンパク質の安定性を維持促進する方法、及び、４−フェニルブチル酸を含むカルボン酸及びその誘導体を含有する膜タンパク質の安定化剤を提供する。【選択図】図８
2009008120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2009008120.tif 000009
（式中、Ｒは水素原子、メチル基、又は無置換若しくは置換基を有していてもよいフェニル基を表し、Ｘは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、ｎは１〜８の整数である）
で表される化合物、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、膜タンパク質の安定化剤。
【請求項２】
前記Ｒがメチル基であることを特徴とする請求項１に記載の安定化剤。
【請求項３】
ｎが１、２、６又は８であることを特徴とする請求項２に記載の安定化剤。
【請求項４】
前記Ｒが以下の置換基、
【化２】
2009008120.tif 000010
（ただし、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基を表す）であることを特徴とする請求項１に記載の安定剤。
【請求項５】
前記Ｒ１が水素原子、ｎが３であることを特徴とする請求項４に記載の安定化剤。
【請求項６】
前記膜タンパク質がトランスポーターであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の安定化剤。
【請求項７】
前記トランスポーターがＡＢＣトランスポーターであることを特徴とする請求項６に記載の安定化剤。
【請求項８】
前記ＡＢＣトランスポーターがＢＳＥＰであることを特徴とする請求項７に記載の安定化剤。
【請求項９】
前記ＡＢＣトランスポーターがＭＲＰ２であることを特徴とする請求項７に記載の安定化剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の安定化剤を含む利胆剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質の安定化剤及び安定化方法に関する。より詳細には、本発明はトランスポーターの安定化剤及び安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜タンパク質は、生体膜に存在し、受容体、トランスポーター（輸送体）、膜酵素として機能する他、膜の構造や運動を維持及び促進する働きを行っている。
膜タンパク質のうち、例えば、トランスポーターは細胞内環境の維持において重要な役割を担っており、その機能的変異は様々な疾患の原因となることが知られている。トランスポーターは、広義には、生体膜に存在し、生体膜を横切る物質輸送の仲介を行うタンパク質のことである。特に、薬物の取り込み及び排出に関与するトランスポーターは、有機アニオンや有機カチオンの輸送を行い、薬物の吸収、排泄など、生体にとって欠くことのできない役割を果たしており、肝臓、腸管、腎臓、脳などの各種臓器を形成する細胞に存在する。【０００３】
薬物の取り込みや排出に関与するトランスポーターの機能が低下すると、毒性を有する物質が細胞内に蓄積して、重篤な疾患の発症への契機になる場合がある。例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２（ＰＦＩＣ２）は、胆管側膜に存在する胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ／ＡＢＣＢ１１）の発現における遺伝的欠損が原因の遺伝性疾患で、肝移植などの外科的処置を施さない場合、肝硬変を発症し、生命の危険を招来せしめる難病の１つである。
ＢＳＥＰは、胆管側膜上に局在するＡＴＰ結合カセット膜透過トランスポーター（ＡＢＣトランスポーター）に分類され、胆汁酸（タウロコール酸）の排出を行っている。ＢＳＥＰの機能に何らかの障害が発生すると、肝細胞に胆汁酸が蓄積し、その結果、高濃度の胆汁酸の毒性により肝細胞が大きなダメージを受けることになる。ＰＦＩＣ２患者の遺伝子解析の結果から、ＢＳＥＰ遺伝子変異として、様々なミスセンス、未成熟ターミネーション、フレームシフト、及びスプライシングジャンクションにおける変異の存在が明らかとなってきた。中でも、２番目の細胞内ループ及び最初のＡＴＰ結合ドメイン中における２つのミスセンス変異であるＥ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇは、ＰＦＩＣ２患者においてしばしば見出されている（非特許文献１）。【０００４】
ＢＳＥＰ以外のトランスポーターにおいても、その機能異常による活性の低下が疾患の発症へとつながる例は多く、トランスポーターの活性を有効に維持することは、関連疾患の有効な治療法の開発に寄与する可能性が考えられている。これまでに、細胞膜上における発現が著しく低下する特徴を持つ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ／ＡＢＣＣ７；塩素イオンチャンネル）の変異体（ＣＦＴＲΔＦ５０８）が、４−フェニルブチル酸（４ＰＢＡ）により、細胞膜上発現を回復することが報告されている（非特許文献２）。しかし、トランスポーターの細胞膜上への回復を含む、膜上における安定性を維持するメカニズムについては、まだ明らかにされていない。【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓｈｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１：９１６−９２４，２００５
【非特許文献２】Ｒｏｎａｌｄら，Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．，１５７：４８４−４９０，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、膜タンパク質、特に、トランスポーター（例えば、ＡＢＣトランスポーター）の細胞膜上における安定化剤及び安定化方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、トランスポーターの機能維持及び機能促進を目的として、鋭意研究を重ねた結果、４−フェニルブチル酸（４ＰＢＡとも記する）を含むカルボン酸が胆管側膜上に存在するＢＳＥＰの分解を抑制することを見出し、本発明を完成させた。即ち本発明は、   一般式（１）：
【化３】
2009008120.tif 000003
（式中、Ｒは水素原子、メチル基、又は無置換若しくは置換基を有していてもよいフェニル基を表し、Ｘは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、ｎは１〜８の整数である）
で表される化合物、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、膜タンパク質の安定化剤である。【０００８】
あるいは、
一般式（２）：
【化４】
2009008120.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｘは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、ｎは１〜８の整数である）
で表される化合物、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、膜タンパク質の安定化剤である。
また、上記安定化剤を用いた膜タンパク質の安定化方法である。
さらに、上記安定化剤を含む利胆剤である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る安定化剤を用いることにより、膜タンパク質、特に、トランスポーター（例えば、ＡＢＣトランスポーター）の膜上における安定性を維持又は促進することができる。
また、本発明の安定化剤を含む薬剤により、トランスポーター（例えば、ＡＢＣトランスポーター）（例えば、ＢＳＥＰ）の機能異常により発症する疾患（例えば、胆汁うっ滞性疾患）の治療剤及び治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞に対する４ＰＢＡ処理の時間及び濃度依存的な効果を示す。  Ａは、ＢＳＥＰの発現に対する４ＰＢＡの時間依存的な効果を示す。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を図に示す時点において１ｍＭ４ＰＢＡ処理を行い、粗膜画分を調製した。得られた試料（４０μｇ）を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロッティングを行った。Ｂは、ＢＳＥＰの発現に対する４ＰＢＡの濃度依存的な効果を示す。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を図に示す濃度の４ＰＢＡで２４時間処理を行い、粗膜画分を調製した。得られた試料（４０μｇ）を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロッティングを行った。
【図２】図２は、ＢＳＥＰのＭＤＣＫＩＩ細胞表面上での発現に対する４ＰＢＡ処理の効果を示す。実験の行う前に、野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ及びＧＦＰを発現する細胞を１ｍＭ  ４ＰＢＡの存在下又は非存在下において２４時間処理を行った。ＢＳＥＰの細胞表面上での発現は経細胞輸送アッセイ及び細胞表面ビオチン化法により測定した。  Ａは、ＭＤＣＫＩＩの単層培養を横切る［３Ｈ］ＴＣの経細胞輸送の経時変化を示す。黒丸、黒四角及び白丸、白四角は、各々、４ＰＢＡ存在下及び非存在下で処理したＭＤＣＫＩＩ細胞を示す。丸と四角は、基底側から頂端側方向、及び頂端側から基底側方向の経細胞輸送を示す。各点及び垂直のバーは、３回の測定値の平均値±標準誤差である。  Ｂは、ＭＤＣＫＩＩ単層培養の頂端膜を横切る［３Ｈ］ＴＣの経細胞輸送の様子を示す。野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ及びＧＦＰを発現するＭＤＣＫＩＩ単層培養の頂端膜を横切る［３Ｈ］ＴＣ輸送のクリアランスを測定した。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）
【図３】図３は、ビオチン化分析による細胞表面発現の測定結果を示す。細胞尿面画分をビオチン化法により単離し、得られた試料に対し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロッティングを行った。
【図４】図４は、ＭＤＣＫＩＩ細胞でのＢＳＥＰ発現に対する、４ＰＢＡの転写及び翻訳への影響を検討した結果を示す。  Ａは、ＢＳＥＰｍＲＮＡの発現レベルのリアルタイムＰＣＲによる測定結果である。各反応におけるＢＳＥＰの発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量により標準化した。各バーは、３回の測定の平均値±標準誤差を表す。  Ｂ及びＣは、アクチノマイシンＤによる転写阻害（Ｂ）及びシクロヘキシミドによる翻訳阻害（Ｃ）条件下での、４ＰＢＡによるＢＳＥＰの上方制御について検討した結果である。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を、１ｍＭ  ４ＰＢＡの存在下又は非存在下において、アクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）の有無、又はシクロヘキシミド（２０μｇ／ｍｌ）の有無の条件下にて、６時間（Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ）又は８時間（野生型ＢＳＥＰ）処理を行った。４０μｇの試料を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後、ウェスタンブロッティングを行った。
【図５】図５は、ＭＤＣＫＩＩ細胞中のＢＳＥＰの成熟過程に対する４ＰＢＡ処理の影響を調べた結果である。  Ａは、ＢＳＥＰの成熟経過を調べた結果である。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を、５μｇ／ｍｌＢＦＡの存在下又は非存在において、１ｍＭ  ４ＰＢＡの添加又は非添加で処理を行った。ＢＦＡによって蓄積した未成熟の低分子量ＢＳＥＰが、成熟型の高分子量ＢＳＥＰへ変換される様子を確認するために、１ｍＭ  ４ＰＢＡの存在下又は非存在下においてＢＦＡを経時的に洗い流し、粗膜画分を調製した。得られた試料の４０μｇを６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロッティングを行った。  Ｂは、Ａに示す成熟型ＢＳＥＰのバンド密度を定量した結果を示す。バンド強度は、Ｉｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅで定量化した。黒丸及び白丸は、各々、４ＰＢＡの存在下及び非存在下において、成熟型ＢＳＥＰのバンドから得られるシグナルの強度を示す。
【図６】図６は、ＭＤＣＫＩＩ細胞表面上に存在するＢＳＥＰの分解速度に対する４ＰＢＡの効果を調べた結果である。Ａは、細胞表面に存在する野生型とＥ２９７Ｇ  ＢＳＥＰの分解速度について検討した結果を示す。野生型及びＥ２９７Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を１ｍＭ  ４ＰＢＡの存在下又は非存在下において処理を行った。細胞表面をビオチン化した後、１ｍＭ  ４ＰＢＡの存在下又は非存在下にて、図中に示す時間、３７℃で培養した。残存したビオチン化タンパク質は、ストレプタビジンビーズを用いて単離し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。  Ｂは、Ａに示される野生型及びＥ２９７Ｇ  ＢＳＥＰのバンド密度を定量した結果である。バンド強度は、Ｉｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅで定量化し、０時間の強度に対する比率で示した。黒丸及び白丸は、各々、４ＰＢＡで処理したＭＤＣＫＩＩ細胞及び処理しなかったＭＤＣＫＩＩ細胞の表面上に残存する各ＢＳＥＰの値を示す。各バーは、３回の実験の平均値±標準誤差を表す。同様な方法により、Ｐ−ｇｐ及びＤＰＰＩＶについても測定した。
【図７】図７は、ＭＤＣＫＩＩ細胞表面上に存在するＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの分解速度に対する４ＰＢＡの効果を調べた結果である。  Ａは、低温（２７℃）条件下におけるＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの細胞表面上における発現について検討した結果である。Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を２７℃、２４時間培養した後、細胞表面をビオチン化した。ビオチン化したタンパク質は、ストレプタビジンビーズを用いて単離し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。  Ｂは、細胞表面に存在するＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの分解速度を調べた結果である。Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞は、１ｍＭ  ４ＰＢＡの存在下又は非存在下において、２７℃で２４時間培養した。Ａと同じ方法により、調製した試料を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。  Ｃは、Ｄに示されるＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰのバンド密度を定量した結果である。Ｂと同様な方法で定量化し、グラフ化した。
【図８】図８は、ＳＤラットの胆管側膜上のＢＳＥＰの発現に対する４ＰＢＡの影響を検討した結果である。実験の行う前に、雄のＳＤラット（６−７週齢）に、チューブを介して０．６ｇ／ｋｇ／日用量で１０日間４ＰＢＡ又はビークルを与えた。４ＰＢＡ又はビークルは３回に分けて与えた。  Ａは、ＣＭＶｓによる時間依存的な［３Ｈ］ＴＣの取り込みを示す。４ＰＢＡ処理（黒丸）及びビークル処理（白丸）のＳＤラットから調製したＣＭＶｓを５ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ又はＡＭＰの存在下、３７℃でインキュベートした。［３Ｈ］ＴＣの濃度は１μＭであった。［３Ｈ］ＴＣの取り込みは、ＡＴＰ存在下の値からＡＭＰ存在下での値を差し引いて算出した。各点及び水平のバーは、３回の実験の平均値±標準誤差を表す。  Ｂは、［３Ｈ］ＴＣのＣＭＶｓによる取り込みのホフスティープロットを示す。４ＰＢＡ処理（黒丸）及びビークル処理（白丸）のＳＤラットから調製したＣＭＶｓを５ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ又はＡＭＰの存在下、３７℃で０．５分間又は１分間インキュベートした。［３Ｈ］ＴＣの濃度は１μＭであった。［３Ｈ］ＴＣの取り込みは、ＡＴＰ存在下の値からＡＭＰ存在下での値を差し引いて算出した。各点及び水平のバーは、３回の実験の平均値±標準誤差を表す。  Ｃは、ＣＭＶｓに対するウェスタンブロッティングの結果を示す。４ＰＢＡ処理及びビークル処理のＳＤラットから調製したＣＭＶｓ（１０μｇ）は、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタンブロッティングを行った。
【図９】図９は、ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞に対する４ＰＢＡ又はオクタン酸（Ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）処理の効果を示す。  野生型ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を１ｍＭ４ＰＢＡ又はオクタン酸で、２４時間処理を行い、細胞表面画分をビオチン化法により単離し、得られた試料に対し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロッティングを行った。
【図１０】図１０は、野生型ＢＳＥＰを発現したＭＤＣＫＩＩ単層培養の頂端膜を横切る［３Ｈ］ＴＣの経細胞輸送に対する、４ＰＢＡ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（プロピオン酸）、Ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（ブタン酸）、Ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（オクタン酸）及びＤｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（デカン酸）処理の効果を示す。野生型ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ単層培養細胞を、１ｍＭ  ４ＰＢＡ、プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸及びデカン酸の存在下又は非存在下において２４時間処理のち、頂端膜を横切る［３Ｈ］ＴＣ輸送のクリアランスを測定した。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）
【図１１】図１１は、ＭＤＣＫＩＩ細胞表面上に存在するＢＳＥＰの分解速度に対するオクタン酸（Ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の効果を調べた結果である。Ａは、細胞表面に存在する野生型ＢＳＥＰの分解速度について検討した結果を示す。野生型ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞を１ｍＭ  オクタン酸の存在下又は非存在下において処理を行った。細胞表面をビオチン化した後、１ｍＭ  オクタン酸の存在下又は非存在下にて、図中に示す時間、３７℃で培養した。残存したビオチン化タンパク質は、ストレプタビジンビーズを用いて単離し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。  Ｂは、Ａに示される野生型ＢＳＥＰのバンド密度を定量した結果である。バンド強度は、Ｉｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅで定量化し、０時間の強度に対する比率で示した。黒丸は、カルボン酸無処理のＭＤＣＫＩＩ細胞表面上に残存する各ＢＳＥＰの値（コントロール）、白丸及び黒四角は、各々、４ＰＢＡ又はオクタン酸で処理したＭＤＣＫＩＩ細胞表面上に残存する各ＢＳＥＰの値を示す。各バーは、３回の実験の平均値±標準誤差を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
一般式（１）において、Ｒは、水素原子、メチル基、又は無置換若しくは置換基を有していてもよいフェニル基を表し、Ｘは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、ｎは１〜８の整数を表す。この場合、好ましくは、Ｒはメチル基であり、ｎは１、２、６又は８である。
あるいは、一般式（１）において、Ｒは下記式で表され（ただし、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基を表す）、Ｘは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、ｎは１〜８の整数を表す。
【化５】
2009008120.tif 000005
この場合、好ましくは、Ｒ１は水素原子であり、ｎは３である。
本発明の一般式（１）で表される化合物は、当業者にとって公知の方法により製造することができるが、市販のものを購入することも可能である（例えば、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ  Ｉｎｃ．）。【００１２】
本発明は、膜タンパク質の細胞膜上での安定性の維持又は促進のための薬剤及び方法を提供するものである。
ここで、膜タンパク質とは、生体膜を構成するタンパク質のことで、好ましくは、トランスポーター、特に好ましくは、ＡＢＣトランスポーターであり、例えば、ＭＤＲ１、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５、ＭＲＰ６、ＢＣＲＰ、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴＮ２、ＯＡＴ−Ｋ１、ＯＡＴＰ−Ａ、ＯＡＴＰ−２、ＬＳＴ１、ＢＳＥＰなどを挙げることができる。最も好ましくは、ＢＳＥＰ（ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｅｘｐｏｒｔ  ｐｕｍｐ）（例えば、ヒトＢＳＥＰの配列として、配列番号１及び配列番号２を参照のこと）である。あるいは、ＢＳＥＰと同様に肝細胞毛細胆管側膜上に発現しているＡＢＣトランスポーターであるＭＲＰ２も、本発明のトランスポーターとして好適である。ＭＲＰ２は、フェニルブチル酸により安定化が起こり、その機能異常は、黄疸を惹起し、肝機能障害を引き起こす。【００１３】
本発明に係る薬剤は、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で膜タンパク質、特に、トランスポーターの機能異常に関連する疾患の治療薬として使用することができる。通常、そのような組成物には、本発明の化合物の他、薬剤上許容される担体が含まれる。
「薬剤上許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、コラーゲン、ヒト血清アルブミン、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等などが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明の化合物の活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。【００１４】
本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入なども含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。【００１５】
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。【００１６】
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液を調製するための滅菌的パウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。【００１７】
経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。【００１８】
本発明の化合物は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。【００１９】
本発明の化合物による特定の疾患の予防又は治療において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。【００２０】
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。【００２１】
本発明の医薬組成物はキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。【００２２】
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。【００２３】
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。【００２４】
さらに、本発明には、膜タンパク質、特にトランスポーターの機能異常に関連した疾患に罹患した、又は罹患する危険性のある哺乳動物の該疾患に関する予防又は治療方法も含まれる。
ここで「治療」とは、前記疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行を阻止又は緩和することを意味し、治療的処置のみならず予防的処置をも含む広い意味として使用される。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明につき、式（３）に示すフェニルブチル酸塩の他、プロピオン酸塩、ブタン酸塩、オクタン酸塩及びデカン酸塩を用い、トランスポータータンパク質であるＢＳＥＰの胆管側膜上における安定性の維持、促進を例として、以下に詳細に説明する。
なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【化６】
2009008120.tif 000006
【００２６】
方法及び試薬類
１．試薬類
医薬品グレードのフェニルブチル酸（４ＰＢＡ）及び他のカルボン酸（プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸及びデカン酸）は、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ  Ｉｎｃ．から購入した。［３Ｈ］タウロコール酸（２Ｃｉ／ＰＡ）はＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社から購入した。ヒトＢＳＥＰ、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）（Ｃ２１９）、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）に対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｓｉｇｎｅｔ社及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社ＣＡ）からそれぞれ購入した。ｒＢＳＥＰに対する抗血清はオリゴペプチド（ｒＢＳＥＰのＣ末端、ＡＹＹＫＬＶＩＴＧＡＰＩＳ（配列番号３））に関し、ウサギを用いて作成した。その他すべての試薬類は分析用グレードを用いた。ＭＤＣＫＩＩ細胞は、１０％  ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度の条件下で培養した。
２．リコンビナントアデノウィルスの調製
ヒト野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰのリコンビナントアデノウィルスを調製するために、ＢＤ  Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１：９１６−９２４，２００５、を参照のこと）。ウィルスの力価はＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）でチェックした。コントロールとして、ＧＦＰを保持するリコンビナントアデノウィルスを用いた。【００２７】
３．４ＰＢＡ、オクタン酸処理
ＭＤＣＫＩＩ細胞を６ウェルプレートに２．５×１０５細胞／ウェルの密度となるように播いた。２４時間培養後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ、及びＧＦＰのｃＤＮＡを保持するリコンビナントアデノウィルスで、２００ＭＯＩにて感染させた。４ＰＢＡ又はオクタン酸処理は、処理期間及び処理濃度を変えて行った。４ＰＢＡ又はオクタン酸処理の終了後、粗膜画分を調製した（Ｍｉｔａら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９０：Ｇ５５０−Ｇ５５６，２００６を参照のこと）。得られた試料を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロッティングを行った（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１：９１６−９２４，２００５、を参照のこと）。抗体反応は、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で検出した。成熟型ＢＳＥＰを示すバンドの強度をＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ  ２．０（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ社）で定量した。
４．経細胞輸送アッセイ
ＭＤＣＫＩＩ細胞を、２４ウェルプレートのトランスウェルメンブレンインサート（ポアサイズ３μＭ、Ｆａｌｃｏｎ）上に、１．５×１０５細胞／インサートの密度になるように播いた。培養２日後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ、及びＧＦＰのｃＤＮＡを保持するリコンビナントアデノウィルスで、５０ＭＯＩにて感染させた。感染後、細胞を２４時間培養し、次いで、１ｍＭ  ４ＰＢＡ又は他のカルボン酸（プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸及びデカン酸）で処理した。２４時間処理後、経細胞輸送アッセイを行った（Ｍｉｔａら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９０：Ｇ５５０−Ｇ５５６，２００６を参照のこと）。
頂端膜を横切る見かけの排出値（ＰＳａｐｉｃａｌ）は、２時間の［３Ｈ］ＴＣの経細胞輸送に対する定常速度を実験の終了時（２時間後）の［３Ｈ］ＴＣの細胞内濃度で割ることにより算出した。【００２８】
５．細胞表面のビオチン化と細胞表面発現タンパク質の分解速度の測定
ＭＤＣＫＩＩ細胞を６ウェルプレートに２．５×１０５細胞／ウェルとなるように播いた。培養２４時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ、及びＧＦＰのｃＤＮＡを保持するリコンビナントアデノウィルスで、２００ＭＯＩにて感染させた。感染後、細胞を２４時間培養し、次いで、１ｍＭ  ４ＰＢＡ又はオクタン酸で処理した。２４時間処理後、ビオチン化を行った（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１：９１６−９２４，２００５、を参照のこと）。
細胞表面に存在するタンパク質の分解速度を測定する場合、ビオチン化したＭＤＣＫＩＩ細胞は、可溶化前、１ｍＭの４ＰＢＡ又はオクタン酸の存在下又は非存在下にて、３７℃で、一定時間インキュベーションした。残存したビオチン化タンパク質を単離し、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロッティングを行った。
６．ＢＳＥＰｍＲＮＡレベルの測定
ＭＤＣＫＩＩ細胞を６ウェルプレートに２．５×１０５細胞／ウェルとなるように播いた。培養２４時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ、及びＧＦＰのｃＤＮＡを保持するリコンビナントアデノウィルスで、５０ＭＯＩにて感染させた。感染後、細胞を２４時間培養し、次いで、１ｍＭ  ４ＰＢＡで処理した。２４時間処理後、ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）を用いて添付の説明書に従い単離した。３７℃で１時間、ＤＮａｓｅＩ処理をした後、逆転写反応を行った（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１：９１６−９２４，２００５、を参照のこと）。ＢＳＥＰｍＲＮＡレベルはリアルタイム定量ＰＣＲにより、定法に従い測定した。定量ＰＣＲは以下のプライマーを用いて行った。
ＢＳＥＰ  ：５’−ｄＡＧＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＣＡＡ−３’（配列番号４）
５’−ｄＣＣＡＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴ−３’（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ：５’−ＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣ−３’ （配列番号６）
５’−ＴＣＣＡＣＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＣＡＣ−３’ （配列番号７）
なお、各反応におけるＢＳＥＰ遺伝子の発現はＧＡＰＤＨの発現により標準化した。【００２９】
７．アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）及びシクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理
ＭＤＣＫＩＩ細胞を６ウェルプレートに２．５×１０５細胞／ウェルとなるように播いた。培養２４時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ、及びＧＦＰのｃＤＮＡを保持するリコンビナントアデノウィルスで、２００ＭＯＩにて感染させた。感染後３６時間細胞を培養し、その後、ｍＲＮＡ合成を阻害するために５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤの存在下（Ｓｉｇｍａ社）又は非存在下で、あるいは、タンパク質合成を阻害するために２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドの存在下（Ｓｉｇｍａ社）又は非存在下で処理を行った。２時間の処理後、アクチノマイシンＤ又はシクロヘキシミドの存在下又は非存在下において、１ｍＭとなるように４ＰＢＡを添加した。４ＰＢＡ処理後６時間（Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ）又は８時間（野生型  ＢＳＥＰ）の時点で、粗膜画分を調製した。得られた画分を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウェスタンブロッティングを行った。
８．ブレフェルジンＡ洗浄実験
ＭＤＣＫＩＩ細胞を６ウェルプレートに２．５×１０５細胞／ウェルとなるように播いた。培養２４時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、Ｅ２９７Ｇ、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰ、及びＧＦＰのｃＤＮＡを保持するリコンビナントアデノウィルスで、２００ＭＯＩにて感染させた。感染後１２時間細胞を培養し、その後、小胞体からゴルジ体へのＢＳＥＰの輸送を阻害するために５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下（Ｓｉｇｍａ社）又は非存在下で処理を行った。２時間の処理後、ブレフェルジンＡの存在下又は非存在下において、１ｍＭとなるように４ＰＢＡを添加した。４ＰＢＡ処理後１２時間の時点で、粗膜画分を調製した。得られた画分を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウェスタンブロッティングを行った。【００３０】
９．動物実験
雄のＳＤラット（６−７週齢）をＮｉｐｐｏｎ  ＳＬＣから購入した。全ての動物は昼夜を逆転させ、標準的な条件下、動物愛護の精神にて取り扱った。食餌及び水は制限することなく与えた。
なお、本研究は学内の動物実験委員会の定めるガイドラインに従って行った。
ＳＤラットに対し、チューブを介して４ＰＢＡ又はビークルを一定の期間（５、１０、１５日間）、種々の用量（０．２、０．６、２．４ｋｇ／日）で与えた。４ＰＢＡ処理後、インビボにおける［３Ｈ］ＴＣ注入実験を行った（Ｈｉｒａｎｏら，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６８：８００−８０７．２００５を参照のこと）。生理食塩水に溶解させた［３Ｈ］ＴＣを大腿静脈へ挿入したカニューレを介して、９０分間に７０ｎｇ／分／ｋｇの速度で注入した。血液及び胆汁を特定の時間で採取した。血漿、胆汁及び肝臓からの放射活性を測定した。
１０．薬物動態解析
血漿の総クリアランス（ＣＬｔｏｔａｌ）、循環する血漿で標準化した胆汁のクリアランス（ＣＬｂｉｌｅ，ｐｌａｓｍａ）、及び肝臓における濃度で標準化した胆汁のクリアランス（ＣＬｂｉｌｅ，ｌｉｖｅｒ）を以下の式で算出した；
ＣＬｔｏｔａｌ＝Ｉ／Ｃｓｓ，  ｐｌａｓｍａ 
ＣＬｂｉｌｅ，  ｐｌａｓｍａ＝Ｖｓｓ，  ｂｉｌｅ／Ｃｓｓ，  ｐｌａｓｍａ
ＣＬｂｉｌｅ，  ｌｉｖｅｒ＝Ｖｓｓ，  ｂｉｌｅ／Ｃｓｓ，  ｌｉｖｅｒ
（Ｉ、Ｃｓｓ，  ｐｌａｓｍａ、Ｖｓｓ，  ｂｉｌｅ及びＣｓｓ，  ｌｉｖｅｒは、各々、注入速度（ｎｇ／分／ｋｇ）、定常状態の血漿濃度（ｎｇ／分／ｋｇ）、定常状態の胆汁排出速度（ｎｇ／分／ｋｇ）及び平均肝臓濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す）。定常状態の血漿濃度（Ｃｓｓ，  ｐｌａｓｍａ）は、１５，３０、６０及び９０分の時点における血漿［３Ｈ］ＴＣ濃度の平均値である。胆汁排出速度（Ｖｓｓ，  ｂｉｌｅ）は、１０〜１５分、２５〜３０分、５５〜６０分及び８５〜９０分間における、［３Ｈ］ＴＣの胆汁排出速度の平均値である。Ｃｓｓ，  ｌｉｖｅｒは、インビボの実験の終了時点における肝臓［３Ｈ］ＴＣ濃度の平均値である。【００３１】
１１．胆管側膜ベジクルによる輸送アッセイ
雄のＳＤラット（６−７週齢）に対し、０．６ｋｇ／日の４ＰＢＡ又はビークを、１０日間、３回に分けて与えた。胆管側膜ベジクルをラットの肝臓から調製し（Ａｋｉｔａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１５１１：７−１６，２００１）、ウェスタンブロッティング及び輸送アッセイに用いた。トランスポートアッセイは迅速濾過法により行った（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７３８：５４−６２，２００５）。【００３２】
結果
１．４ＰＢＡ又はオクタン酸を介した細胞表面上におけるＢＳＥＰの上方制御
野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞に対し、４ＰＢＡ処理を行った（図１Ａ及びＢ）。発明者らは、これまでに膜表面上の成熟型ＢＳＥＰと小胞体に存在する未成熟型ＢＳＥＰの分子量が、各々、１７３ｋＤａと１５０ｋＤａであることを報告している（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１：９１６−９２４，２００５）。粗膜画分に対するウェスタンブロッティングにより、成熟型ＢＳＥＰの発現レベルを調べることにより、４ＰＢＡの効果を検討した。４ＰＢＡ処理により、成熟型ＢＥＳＰの発現レベルは、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇのみならず、野生型の発現レベルも変化した。処理の至適条件は、１ｍＭ  ４ＰＢＡによる２４時間処理（臨床適用量）で、この条件の処理により、野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの発現量が２．５倍〜３倍に上昇した。
また、野生型のＢＳＥＰを１ｍＭ  オクタン酸（Ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で２４時間処理した場合にも、発現量の上昇が認められた（図９）。【００３３】
次に、４ＰＢＡ又は他のカルボン酸によるＢＳＥＰの細胞表面での発現上昇を、経細胞輸送アッセイ及び細胞表面ビオチン化法を用いて検討した。
経細胞輸送アッセイについては、頂端側への［３Ｈ］ＴＣの排出をメディエートするＢＳＥＰの機能に関し、ＭＤＣＫＩＩの単層培養の横切る［３Ｈ］ＴＣの経細胞輸送を測定した（図２）。頂端側への方向性のある［３Ｈ］ＴＣ輸送は、野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するいずれの細胞において観察されたが、ＧＦＰを発現する細胞ではほとんど観察されなかった。
野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ単層細胞を横切る［３Ｈ］ＴＣの基底側から頂端側への排出は、４ＰＢＡ処理（１ｍＭ、２４時間）により、各々、１．５倍、２．５倍及び３倍に増大した。一方、ＧＦＰを発現する細胞では、このような効果は見られなかった。また、４ＰＢＡは、いずれのＭＤＣＫＩＩ細胞においても頂端側から基底側への排出には影響を与えなかった。
また、４ＰＢＡと同様に他のカルボン酸（プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸、デカン酸）で野生型ＢＳＥＰを処理した場合にも、基底側から頂端側への［３Ｈ］ＴＣの排出が増大した（図１０）。【００３４】
ＢＳＥＰの機能に対する４ＰＢＡ処理の効果を直接確認するため、ＢＳＥＰの機能に必須な動力学的パラメーターである、ＰＳａｐｉｃａｌ（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１：９１６−９２４，２００５；Ｍｉｔａら，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ，３４：１５７５−１５９１，２００６）を算出した（図２Ｂ）。ＰＳａｐｉｃａｌは、４ＰＢＡ処理により、野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞において増加したが、ＧＦＰを発現する細胞では変化を示さなかった。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩにおけるＢＳＥＰ依存性ＰＳａｐｉｃａｌ（ＰＳａｐｉｃａｌ，ＢＳＥＰ）を、野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩのＰＳａｐｉｃａからＧＦＰを発現するＭＤＣＫＩＩのＰＳａｐｉｃａを差し引いて算出した。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩのＰＳａｐｉｃａｌ，ＢＳＥＰは、至適条件下（１ｍＭ、２４時間）での４ＰＢＡ処理によって、各々、１．７倍、３．０倍及び２．８倍増加した。
さらに、野生型及び変異型ＢＳＥＰの細胞表面での発現を、ＭＤＣＫＩＩ細胞における細胞表面ビオチン化法により検討した（図３Ａ）。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの細胞表面での発現は、至適条件下（１ｍＭ、２４時間）での４ＰＢＡ処理によって、各々、１．８倍、３．１倍及び２．６倍増加した。一方、外来性のＰ−ｇｐ及び内在性のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）の発現は影響を受けなかった（図３Ｂ）。４ＰＢＡ処理によりＢＳＥＰの細胞表面発現の増加レベルとＰＳａｐｉｃａｌ，ＢＳＥＰの増加レベルが同等であったことから、臨床適用濃度での４ＰＢＡ処理は、細胞表面における野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの発現を増加させることにより、ＢＳＥＰの輸送能力を促進することが示唆された。【００３５】
２．ＢＳＥＰの細胞表面発現の増加に対する４ＰＢＡの転写及び翻訳への影響
４ＰＢＡ処理がＢＳＥＰの細胞表面上での発現を増加させるメカニズムについて検討した。４ＰＢＡがＢＳＥＰタンパク質の転写あるいは翻訳レベルを上昇させることにより、細胞表面での発現が増加している可能性が考えられた。４ＰＢＡ処理の有無によるＭＤＣＫＩＩ細胞中でのＢＳＥＰｍＲＮＡの発現を定量的ＰＣＲにより測定した。ＢＳＥＰｍＲＮＡの発現量は、４ＰＢＡによって影響を受けないＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現量により標準化した。野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰｍＲＮＡの発現量は４ＰＢＡ処理により、僅かに上昇したが、その上昇値は統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．１０（野生型）、０．２０（Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ）、図４Ａ）。
次に、アクチノマイシンＤ及びシクロヘキシミドで前処理したＭＤＣＫＩＩ細胞を用いて、ＢＳＥＰの発現増加に関し、４ＰＢＡ処理の転写及び翻訳への影響について検討した（図４Ｂ及びＣ）。アクチノマイシンＤによる転写阻害及びシクロヘキシミドによる翻訳阻害は、野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞における、４ＰＢＡを介したＢＳＥＰ成熟型の発現増加に対して影響を与えなかった。これらの結果から、主として、翻訳後のメカニズムが４ＰＢＡを介するＢＳＥＰの細胞表面での発現増加に寄与していることが示された。【００３６】
３．ＢＳＥＰの成熟に対する４ＰＢＡ処理の影響
成熟型ＢＳＥＰの細胞表面での発現増加に関与する可能性のある翻訳後メカニズムの１つとして、小胞体に存在する未成熟型ＢＳＥＰから細胞表面上の成熟型ＢＳＥＰへの変換過程の促進が考えられる。ＢＳＥＰの成熟に対する４ＰＢＡ処理の効果を評価するため、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を用いて、小胞体からゴルジ体へのＢＳＥＰの輸送を阻害し、ＢＦＡを洗い流した後、ＭＤＣＫＩＩ細胞上における成熟速度を測定した。ＢＦＡは、未成熟な小胞体存在型ＢＳＥＰの蓄積を引き起こす薬剤である(図５Ａ及びＢ)。成熟速度は、ＢＦＡを洗い流した後、成熟型ＢＳＥＰのバンド密度の増加量を経時的にウェスタンブロッティングにより測定することで評価した。成熟型のバンド密度は、各測定時におけるバンド密度から０時間における密度を差し引いて算出した（図５Ｂ）。ＭＤＣＫＩＩ細胞中での、ＢＦＡを洗い流した直後の野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの未成熟な小胞体存在型の発現レベルは、４ＰＢＡ処理の有無にかかわらずほぼ同じであった（図５Ａ；０時間）。また、成熟型については、ＢＦＡの洗い流し後３時間までは４ＰＢＡの有無にかかわらず発現レベルに変化はなかったが、３時間後から直線的に増加し始めた。ＢＦＡの洗い流し後８時間の時点において、４ＰＢＡで処理しないＭＤＣＫＩＩ細胞と比較すると、４ＰＢＡで処理したＭＤＣＫＩＩ細胞では、成熟型の発現レベルがより高かった。この結果から、４ＰＢＡ処理は、野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの成熟を促進せずに、これら成熟型を安定化することが示唆された。
４．細胞表面存在型ＢＳＥＰの半減期の４ＰＢＡ又はオクタン酸による延長
細胞表面に存在するＢＳＥＰは、胆管側膜と細胞内コンパートメントとの間を循環し、最終的にはタンパク質分解経路によって除去される。従って、分解経路へのエントリーのブロックにより、細胞表面におけるＢＳＥＰの発現の増加が誘導される可能性も考えられた。そこで、細胞表面に存在するＢＳＥＰが分解経路に入ることが、４ＰＢＡ処理により阻害されるかどうか検討するため、野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰを発現するＭＤＣＫＩＩ細胞表面のＢＳＥＰの分解速度を、ビオチン標識法を用いて測定した。細胞表面に存在する野生型及びＥ２９７  ＢＳＥＰの半減期は、４ＰＢＡ処理によって、各々、１．８倍及び２．５倍長くなった（図６Ａ及びＢ）。また、野生型ＢＳＥＰについては、４ＰＢＡに代えてオクタン酸を用いた場合にも同様の結果が得られた（図１１）。
一方、外来性のＰ−ｇｐ及び内在性のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）は影響を受けなかった（図６Ａ及びＢ）。細胞表面に存在するＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの分解速度は、発現量が少なかったため、野生型及びＥ２９７Ｇと同じ測定条件下では検出することができなかった。そこで、Ｄ４８２Ｇ  ＢＳＥＰに関し、変異型のミスフォールドされたタンパク質の輸送を正しく補正することが知られている低温処理の効果について検討を行った（Ｄｅｎｎｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：７６１−７６４，１９９２；Ｐｌａｓｓら，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ４０：２４−３０，２００４）（図７Ａ）。低温条件下（２７℃）で細胞を２４時間培養すると、細胞表面上での発現が４倍増加した。その後、３７℃で細胞表面に存在するＤ４８２ＧＢＳＥＰの分解速度を測定したところ、４ＰＢＡ処理により細胞表面上での半減期が３．３倍になった（図７Ｂ及びＣ）。この結果から、４ＰＢＡの処理によってＢＳＥＰの成熟型が安定化されることが明らかとなった（図５Ａ及びＢ）【００３７】
５．インビボ条件下での胆管側膜上で発現するＢＳＥＰの４ＰＢＡによる上方制御
４ＰＢＡの処理により、ＭＤＣＫＩＩ細胞表面での野生型、Ｅ２９７Ｇ及びＤ４８２Ｇ  ＢＳＥＰの機能的な発現を増加させることができる（図２及び３）。そこで、インビボにおいても４ＰＢＡが同じ効果を示すか検討するために、ＳＤラットを用いて実験を行った。ＳＤラットに対する４ＰＢＡの適量は、子供に対して承認されている用量（０．４５−０．６ｇ／ｋｇ／日）に従って決定した。０．６ｇ／ｋｇ／日の用量の４ＰＢＡで１０日間繰り返し処理した後に［３Ｈ］ＴＣ注入実験を行った。ビークル処理と４ＰＢＡ処理のＳＤラットとの間で、［３Ｈ］ＴＣのＣｓｓ，  ｐｌａｓｍａ、Ｖｓｓ，  ｂｉｌｅに有意差はみられなかったが、４ＰＢＡ処理のＳＤラットにおける［３Ｈ］ＴＣのＣｓｓ，  ｌｉｖｅｒは、ビークル処理のラットのＣｓｓ，  ｌｉｖｅｒの１／２であった（表１及び２）。従って、ビークル処理と４ＰＢＡ処理のＳＤラットとの間で、［３Ｈ］ＴＣに対するＣＬｔｏｔａｌ及びＣＬｂｉｌｅ，ｐｌａｓｍａに有意差はみられなかった。逆に、４ＰＢＡ処理のラットの［３Ｈ］ＴＣに対するＣＬｂｉｌｅ，ｌｉｖｅｒは、ビークル処理のラットと比べて２倍大きかった。これらの結果から、胆管側膜を介する［３Ｈ］ＴＣの胆汁排出は促進されていることが示唆された。
４ＰＢＡの至適な処理条件を検討するために、種々の時間及び用量に関して［３Ｈ］ＴＣ注入実験を行った（表１及び２）。至適条件は、４ＰＢＡによる０．６ｇ／ｋｇ／日用量での１０〜１５日間処理であった。全ての条件下において明らかな副作用はみとめられなかった。【００３８】
【表１】
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【００３９】
【表２】
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【００４０】
胆管側膜上でのＢＳＥＰの発現増加が胆管側膜を介した［３Ｈ］ＴＣの胆汁排出の促進と関連するかどうか検討するため、胆管側膜ベジクル（ＣＭＶｓ）を用いてベジクルの取り込み実験及びウェスタンブロッティングを行った。ＣＭＶｓは０．６ｇ／ｋｇ／日用量で４ＰＢＡ又はビークル処理を１０日間繰り返し行ったＳＤラットから調製した。４ＰＢＡ処理ラット由来のＣＭＶｓによるＡＴＰ依存的な［３Ｈ］ＴＣの取り込みは、０．５分間直線的に上昇し、ビークル処理ラットのＣＭＶｓの０．５分後の取り込み量と比較すると、３倍であった（図８Ａ）。４ＰＢＡ処理ラット及びビークル処理ラット由来のＣＭＶｓへの［３Ｈ］ＴＣの取り込みの初期速度は、各々、１３．５±２．４及び９．５±１．０μＭのＫｍ値を持つ単一の飽和成分で表された（図８Ｂ）。［３Ｈ］ＴＣのＶｍａｘ値は、４ＰＢＡ処理により２７０±２０から１，０００±１１０に増大した（図８Ｂ）。さらに、ＣＭＶｓのウェスタンブロッティングにより、ＢＳＥＰの発現レベルが４ＰＢＡ処理によって３．２倍増加したのに対し、Ｐ−ｇｐ及びＤＰＰＩＶの発現レベルは変化がなかったことも明らかとなった（図８Ｃ）。これらの結果から、ＳＤラットにおいて、ヒトに対する臨床適用量の４ＰＢＡ処理によって、胆管側膜上の機能的なＢＳＥＰの発現レベルが増加し、胆管膜を介した胆汁酸の輸送が促進されることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の安定化剤及び安定化方法は、膜タンパク質、特に、トランスポーター（例えば、ＡＢＣトランスポーター）の細胞膜上における安定性を維持、促進することから、トランスポーター（例えば、ＡＢＣトランスポーター）の活性の促進を実現することができる。従って、該トランスポーターの機能異常に関連する疾患の治療剤及び治療方法の開発に大いに貢献するものである。
【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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