【手続補正書】
【提出日】平成17年2月14日(2005.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｏｃｔ３／４陽性で、中胚葉性、外胚葉性および内胚葉性系統の少なくとも一つの細胞型に分化することができ、かつ臍帯血または胎盤から得られたものである、胚性幹細胞、胚性生殖細胞または生殖細胞ではない単離細胞。
【請求項２】
テロメラーゼ陽性で、中胚葉性、外胚葉性および内胚葉性系統の少なくとも一つの細胞型に分化することができ、かつ臍帯血または胎盤から得られたものである、胚性幹細胞、胚性生殖細胞または生殖細胞ではない単離細胞。
【請求項３】
哺乳類に由来することを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項４】
骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞および稀突起膠細胞の細胞型より成る群から選択される細胞に分化できることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項５】
前記哺乳類がマウスであることを特徴とする請求項３記載の細胞。
【請求項６】
前記哺乳類がラットであることを特徴とする請求項３記載の細胞。
【請求項７】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項３記載の細胞。
【請求項８】
分化がin vivoまたはex vivoで誘導されることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項９】
分化がin vivoまたはex vivoで誘導されることを特徴とする請求項４記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が構成的にoct４および高レベルのテロメラーゼを発現することを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞がCD44、MHCクラスIおよびMHCクラスII発現について陰性であることを特徴とする請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
遺伝子組み換えされていることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項１３】
多能性成体幹細胞（MASC）を単離する方法であって：
（ａ１）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現されない１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を除去する；または
（ａ２）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現される１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を選択する；または
（ａ３）前記工程（ａ１）および（ａ２）を組合せて実施する；そして
（ｂ）細胞を培養して、MASC細胞集団を得る；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
（a）MASCを胚盤胞と接触させる；
（b）出生までの適切な期間胎児の妊娠が続くように、前記工程（a）の胚盤胞を代理母に移植する；工程を含む、非ヒト動物を作る方法。
【請求項１５】
前記胎児がキメラであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
MASCを分化させる方法であって：
（ａ１）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現されない１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を除去する；または
（ａ２）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現される１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を選択する；または
（ａ３）前記工程（ａ１）および（ａ２）を組合せて実施する；
（ｂ）細胞を培養して、MASC細胞集団を得る；そして 
（ｃ）ジメチルスルホキシドおよびイソプロテレノールの存在下で前記細胞集団を培養する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
血液または個々の血液成分をex vivoで作成する方法であって：
（a）臍帯血または胎盤を含む組織試料からMASCを単離し；そして
（b）MASCをex vivoで分化させて血液または血液成分を形成させる；工程を含み、
前記血液成分が、赤血球、白血球または血小板であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む方法によって単離されたMASCを含む組成物であって、該組成物が、非経口投与、経口投与、またはカテーテル投与によって、あるいは医薬として許容される生分解性基材と共に哺乳類宿主に投与され、それによってMASCがin vivoで定着し、さらに必要に応じて分化することを特徴とする組成物：
（ａ１）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現されない１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を除去する；または
（ａ２）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現される１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を選択する；または
（ａ３）前記工程（ａ１）および（ａ２）を組合せて実施する；
（ｂ）細胞を培養して、MASC細胞集団を得る。
【請求項１９】
治療上有効な量のMASCまたはその子孫細胞を含み、非経口投与、経口投与、またはカテーテル投与によって、あるいは医薬として許容される生分解性基材と共に、必要とする患者に投与されることを特徴とする治療用組成物。
【請求項２０】
MASCまたはその子孫細胞を含む、口、食道、膣および肛門を含む粘膜組織の細胞構成を助けるための組成物であって、患者に投与され、それによって前記MASCまたはその子孫細胞が前記組織の構成成分になることを特徴とする組成物。
【請求項２１】
治療上有効な量のMASCまたはその子孫細胞を含む、虚血を治療するための組成物であって、必要とする患者に投与され、それによって前記MASCまたは子孫細胞が、虚血のせいで欠陥が生じた患者の体の一以上の領域にホーミングし、そこに定着してその領域の虚血を軽減させることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
治療上有効な量のMASCまたはその子孫細胞を含む、炎症を治療するための組成物であって、必要とする患者に投与され、それによって前記MASCまたは子孫細胞が、炎症のせいで欠陥が生じた患者の体の一以上の領域にホーミングし、そこに定着してその領域の炎症が軽減させることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
治療上有効な量のMASCまたはその子孫細胞を含み、人工血管を含む三次元マトリクスを介して、必要とする患者に投与されることを特徴とする治療用組成物。
【請求項２４】
腹部大動脈瘤、心臓バイパス手術、末梢血管疾患または冠血管疾患の治療用であることを特徴とする請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１記載のMASCと、医薬として許容される担体とを含む治療用組成物。
【請求項２６】
異種MASCに対する拒絶を生じさせることなく患者に異種MASCを移植するための組成物であって、プロモーターに機能的に結合した前記患者のMHC抗原をコードする核酸配列がex vivoで導入されそしてMASCが移植された該患者においてMASCの拒絶を阻害するのに十分なレベルでMHC抗原が発現されるMASCを含み、非経口投与、経口投与、またはカテーテル投与によって、あるいは医薬として許容される生分解性基材と共に移植されることを特徴とする組成物。
【請求項２７】
異種MASCに対する拒絶を生じさせることなく患者に異種MASCを移植するための組成物であって、移植されたMASCの拒絶が阻害されるようにMHC抗原の発現が遺伝子導入によってノックアウトされて該MHC抗原が発現されないMASCを含み、非経口投与、経口投与、またはカテーテル投与によって、あるいは医薬として許容される生分解性基材と共に移植されることを特徴とする組成物。
【請求項２８】
中胚葉性、外胚葉性および内胚葉性起源の少なくとも一つの細胞型を形成するように分化することができる、単離されたラット多能性成体幹細胞（MASC）。
【請求項２９】
骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞および稀突起膠細胞の細胞型より成る群から選択される細胞に分化できることを特徴とする請求項２８記載の細胞。
【請求項３０】
ラットMASCを単離する方法であって：
（ａ１）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現されない１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を除去する；または
（ａ２）哺乳類の臍帯血または胎盤由来の組織から、MASCによって発現される１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を選択する；または
（ａ３）前記工程（ａ１）および（ａ２）を組合せて実施する；
（ｂ）細胞を培養して、MASC細胞集団を得る；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記ラット組織が、骨髄、筋、脳、臍帯血および胎盤より成る群から選択されることを特徴とする請求項３０記載の細胞。
【請求項３２】
所望の分化因子の存在下で細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞をex vivoで分化させる方法。
【請求項３３】
請求項１または２記載の細胞を含む、患者において定着および分化細胞を形成するための組成物。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法によって得られた分化細胞。
【請求項３５】
MASCによって発現されない１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞がCD４５＋細胞であることを特徴とする請求項１３、１６または３０記載の方法。
【請求項３６】
MASCによって発現されない１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞がCD４５＋細胞であることを特徴とする請求項１８記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
46から>80PD後に得られたマウスMASCを、ES細胞の未分化状態を維持するのに重要な二つの転写因子であるOct4およびRex1の発現レベルについて、定量的（Q）-RT-PCRによって試験した。マウスMASC、神経外胚葉性に分化した子孫（bFGFの添加後1〜7日目）およびマウスES細胞からRNAを抽出した。RNAを逆転写し、結果として得られたCDNAを下記の反応条件で40回増幅した（ABI PRISM 7700, Perkin Elmer/Applied Biosystems）: 2μLのDNA溶液と、1X TaqMan SYBR Green Universal Mix PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。プライマーは表1に列記する（配列番号１−１２）。
【表１】
2004529621.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
免疫蛍光評価は、培養中の細胞の5〜10%が5-アザシチジンでeGFPおよび骨格筋アクチンについて染色陽性に分化するよう誘導され、細胞の5〜10%がeGFPおよびvWFについて同時染色される内皮に分化するよう誘導され、そして細胞の5〜10%が、eGFP、およびNF-200かGFAPかMBPのいずれかについて同時染色される神経外胚葉に分化するよう誘導されたことを示した。レトロウイルス挿入部位を定義するため、MASCおよび分化した子孫の宿主ゲノム隣接領域を配列決定した。別々の集団におけるレトロウイルス挿入配列の数は１から７の間であった。表2（配列番号１３−２４）に示す通り、集団A16で染色体7にマッピングされた、筋、内皮および神経外胚葉性細胞でレトロウイルス挿入配列に隣接する、単一の同一の配列が同定された。
【表２】
2004529621.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
3'LTRに特異的なプライマーを設計し、また隣接するゲノム配列に特異的なプライマーは表３に示す通りで、そしてリアルタイムPCRを用いて、レトロウイルス挿入部位は未分化細胞と分化した細胞とで同一であることが確認された。これらの結果は、隣接配列とeGFP DNA配列とが同様の量で存在することを証明した。クローンA12はそれぞれ染色体1と7に位置する２個のレトロウイルス挿入配列を含み、両方の隣接配列をhMASCだけでなく筋、内皮および神経外胚葉性系統にも検出することができた。これが２個のレトロウイルス要素を有する単一細胞の子孫かまたは２個の細胞の子孫のどちらを示すのか判定するため、リアルタイムPCRを用いて染色体1および7のeGFP隣接配列の相対量を比較した。hMASC、筋、内皮および神経外胚葉性細胞に両方の隣接配列が同様の量存在したことが見出され、２個のレトロウイルス挿入配列を有する単一細胞がeGFP陽性hMASCおよび分化した子孫の元になった可能性が高いことを示唆した。3個以上のレトロウイルス挿入配列を含む他の集団においては、我々は挿入配列が単一細胞の複数の挿入部位に由来するのかそれともeGFP陽性画分に寄与する複数の細胞に由来するのか判定することはできなかった。にもかかわらず、2個の集団において筋、内皮および神経外胚葉に分化した子孫細胞は単一のBM由来前駆細胞に由来するという我々の発見は、中胚葉性系統および神経外胚葉の３つの異なる系統の細胞において単一細胞レベルで分化するBMから原始細胞を培養することが可能であることを初めて決定的に証明する。
【表３】
2004529621.tif 000003
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
レトロウイルス挿入配列のPCR分析: PCRを用いて、ヒトゲノムDNA中のMFGベクターの3' LTRから隣接配列3'を増幅した。106個のMASCまたは内皮か筋芽細胞か神経外胚葉に分化した子孫からDNAを、細胞から標準法によって調製した。300ngのゲノムDNAをAscIで消化し、splinkeretteリンカーを5'末端に結合させた（Devon R. S. et al., 1995）。splinkeretteリンカーに用いた２種のオリゴヌクレオチドは下記の通りであった: aattTAGCGGCCGCTTGAATTtttttttgcaaaaa（配列番号３０）（ヘアピンループ形成配列は小文字で、大文字は第二のsplinkeretteオリゴヌクレオチドの相補部分である）、およびagtgtgagtcacagtagtctcgcgttcgAATTAAGCGGCCGCTA（配列番号３１）（下線の配列はPCRおよびRT工程で用いたリンカー特異的プライマー（LSプライマー）の配列でもある）。eGFP遺伝子中の配列を認識する5'-ビオチン-T7結合プライマー[ビオチン-ggc-cag-tga-att-gta-ata-cga-ctc-act-ata-ggc-tgg-CAC-ATG-GTC-CTG-CTG-GAG-TTC-GTG-AC（配列番号３２）；下線部は効率的なin vitro転写に必要な最小のプロモーター配列を示し、大文字はeGFP特異的配列である]およびLSプライマーを用いて、隣接領域を10回、Advantage2ポリメラーゼ（Clontech）を使用して増幅した。ビオチン標識増幅産物はストレプトアビジン-磁性ビーズ（ストレプトアビジン磁性粒子； Roche）を用いて捕捉し、結果として生じる産物をさらにT7RNAポリメラーゼを用いて約1,000倍に増幅し、それからDNAase1処理した。結果として生じる産物をagtgtgagtcacagtagtctcgcgttc（配列番号３３）splinkeretteプライマーを用いてsuperscriptIIの説明書（Gibco）に従って逆転写し、続いて30回のnested PCRによって3'LTR用のプライマー[ggc caa gaa cag atg gaa cag ctg aat atg（配列番号８９）]を用いて増幅した。内皮、筋、および神経外胚葉に分化した細胞と未分化のMASC由来のヒトゲノム中の隣接配列を配列決定した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
複数の分化した子孫に同一の挿入部位が存在することを実証するため、宿主隣接ゲノム中に特異的プライマーを作成した。リアルタイムPCR増幅（ABI PRISM 7700, Perkin Elmer/Applied Biosystems）を、eGFP配列と比較して隣接配列を定量するために用いた。増幅のための反応条件は下記の通りであった: 2μLのDNA溶液、1X TaqMan SYBR Green Universal Mix(Perkin Elmer/Applied Biosystems）PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。使用したプライマーは下記の通りであった:クローンA16:LTRプライマー＝CCA-ATA-AAC-CCT-CTT-GCA-GTT-G（配列番号３４）；隣接配列染色体7＝TCC-TGC-CAC-CAG-AAA-TAA-CC（配列番号３５）；クローンA12染色体7配列:LTRプライマー＝GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T（配列番号３６）、隣接配列＝CAG-TGG-CCA-GAT-CTC-ATC-TCA-C（配列番号３７）；クローンA12染色体1配列:LTR＝GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T（配列番号３８）；隣接配列＝GCA-GAC-GAG-GTA-GGC-ACT-TG（配列番号３９）。隣接配列の相対量は、eGFP配列と比較して取扱説明書に従って7700 ABI PRISM検出ソフトウェア1.6を用いて計算した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
hMASCへのeGFPの形質導入はレトロウイルス含有eGFP-CDNAを用いて行い、>5X106細胞に拡大した。20%は筋、内皮、神経外胚葉および内胚葉に分化するよう誘導された。クローンA16については単一のレトロウイルス挿入部位が未分化のMASCならびに中胚葉性と神経外胚葉性の分化した細胞に存在し、またEGFP＋クローンA16MASCはCK18およびアルブミン陽性細胞に分化した。同じ挿入部位が、同じ細胞集団から作成したFGF4処理MASCに存在し（5'-TAG CGGCCGCTTGAATTCGAACGCGAGACTACTGTGACT CACACT-3'（配列番号４０）、染色体7）、単一のhMASCが、中胚葉および神経外胚葉以外に、内胚葉に分化することを証明した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
定量的RT-PCRはFGF4およびHGFが肝細胞決定および分化を誘導することを示す。
定量的RT-PCRによって肝細胞分化は肝細胞分化の初期（HNFSp, GATA4, CK1 9, αFP）および（CK18、アルブミン、HNF1α、シトクロムP450）マーカーについて確認された。RNAを3xl05個のMASCまたは肝細胞に分化するよう誘導されたMASCから抽出した。mRNAを逆転写し、CDNAを下記の通り増幅した:ABI PRISM 7700 （Perkin Elmer/Applied Biosystems）を使用して、2μLのDNA溶液、1X TaqMan SYBR Green Universal Mix PCR反応緩衝液を用いた最初の変性（95℃で10分間）後、二段階PCR（95℃で15秒間、60℃で60秒間）を40サイクル。増幅に用いたプライマーは表9（配列番号４１−８８）に列記する。
【表９】
2004529621.tif 000004