(57)【要約】  新たな動脈硬化性疾患のマーカーを提供することにある。  哺乳動物から採取された試料中の可溶性ＬＲ１１を検出することを特徴とする、該動物における動脈硬化性疾患の存在・程度の評価方法、予防並びに治療効果の評価方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から採取された試料中の可溶性ＬＲ１１を検出することを特徴とする、該動物における動脈硬化性疾患の存在・程度の評価方法、予防並びに治療効果の評価方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性ＬＲ１１が、ＬＲ１１のＣ末端膜貫通領域が欠損したタンパク質である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
試料が、血液、血清、血漿、髄液又は尿のいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
可溶性ＬＲ１１の検出に可溶性ＬＲ１１に親和性を有する物質を用いる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
可溶性ＬＲ１１に親和性を有する物質が、抗可溶性ＬＲ１１抗体及び／又はＲＡＰである請求項５記載の方法。
【請求項７】
可溶性ＬＲ１１を検出できる物質を含むことを特徴とする、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価、予防、並びに治療効果の評価用キット。
【請求項８】
可溶性ＬＲ１１を検出できる物質が、抗可溶性ＬＲ１１抗体及び／又はＲＡＰである請求項７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価方法、予防並びに治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症に代表される動脈硬化性疾患は、動脈硬化病変の進展に伴い、脳梗塞、脳出血、大動脈病瘤、心筋梗塞等を引き起こす可能性が高い。従って、その存在・程度の評価、予防及び治療は極めて重要であり、従来、臨床検査では、例えば血中総コレステスール、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂肪、レムナント様リポ蛋白−コレステロール等のマーカーの測定が広く用いられている。【０００３】
しかしながら、これらのマーカーの測定においても未だ十分な動脈硬化の存在・程度の評価、予防、治療効果の評価がなされているとは言えなかった。従って、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価マーカーが望まれていた。【０００４】
ＬＲ１１（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  １１  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔｓ）は、ＬＤＬ受容体ファミリーに特徴的な構造を有する新規なＬＤＬ受容体類似タンパク質として同定された（特許文献１、非特許文献１）。同時期に、別グループからは、ＲＡＰ（Ｔｈｅ  ３９−４０ｋＤａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）アフィニティークロマトグラフィーを用いて、脳組織検体より、ＳｏｒＬＡ（ｓｏｒｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｌａｓｓ  ａ  ｒｅｐｅａｔｓ）が同定された（非特許文献２）が、これはＬＲ１１と同じタンパク質である。ＬＲ１１は、アポＥを共通のリガンドとする１１回の繰り返し構造のリガンド結合領域を有し、正常血管壁細胞ではほとんど発現が認められないが、肥厚内膜平滑筋細胞には特異的に発現が認められることが知られている（非特許文献３）。さらに、培養平滑筋細胞を用いた検討から、平滑筋細胞の細胞増殖に伴いＬＲ１１の発現量が亢進し、培養液中への分泌が認められ、また、カフ傷害マウスモデルにおいて、抗ＬＲ１１抗体を腹腔内投与することにより、平滑筋細胞の遊走及び増殖によって引き起こされる血管内膜の肥厚が阻害されたことが知られている（非特許文献４）。従って、ＬＲ１１が血管平滑筋細胞の増殖の指標として利用できる可能性が示唆されていた。一方、ＬＲ１１に結合能を有する物質は、アポリポプロテインＥ（ａｐｏ  Ｅ）やａｐｏＥリッチＶＬＤＬ（β−ＶＬＤＬ）、上述したＲＡＰに加え、ｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）やＰＡＩ−１（ｔｙｐｅ−１  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及びそれらの複合体（ｕＰＡ−ＰＡＩ−１）等が知られている（非特許文献５）。【０００５】
しかしながら、ＬＲ１１は本来細胞表面に発現する蛋白質であり、哺乳動物から採取された試料中、特に血液中に可溶性ＬＲ１１が存在することは報告されておらず、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価や予防及び治療の効果判定に応用する試みは行われていなかった。
【特許文献１】特開平９−１６３９８８号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１，２４７６１−２４７６８
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１，３１３７９−３１３８３
【非特許文献３】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９，２６８７−２６９５
【非特許文献４】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００４；９４；７５２−７５８
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００４；３８１，２０３−２１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、新たな動脈硬化性疾患のマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血中におけるＬＲ１１の存在についてＬＲ１１に親和性を有する物質を用いて検討した結果、ＲＡＰを担持した樹脂によって血中の可溶性ＬＲ１１を抽出することで、正常血管壁細胞では殆どＬＲ１１の発現が認められないにもかかわらず、意外にも正常哺乳動物由来の血中、特にヒト健常者の血中においても、可溶性ＬＲ１１が存在することを見出した。さらに、その抽出された可溶性ＬＲ１１の分子量は、細胞表面に発現したＬＲ１１タンパク質と比較して僅かに小さくなっていたことから、可溶性ＬＲ１１は、Ｃ末端膜貫通領域が欠損した構造を有していると考えられた。本発明者らは、この知見を基にさらに検討を進め、動脈硬化性疾患患者の血中の可溶性ＬＲ１１の量を比較した結果、健常者に比べ有意に高値に存在していることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）哺乳動物から採取された試料中の可溶性ＬＲ１１を検出することを特徴とする、該動物における動脈硬化性疾患の存在・程度の評価方法、予防並びに治療効果の評価方法；
（２）哺乳動物がヒトである（１）の方法；
（３）可溶性ＬＲ１１が、ＬＲ１１のＣ末端膜貫通領域が欠損したタンパク質である、（１）又は（２）の方法；
（４）試料が、血液、血清、血漿、髄液又は尿のいずれかである、（１）から（３）のいずれかの方法；
（５）可溶性ＬＲ１１の検出に可溶性ＬＲ１１に親和性を有する物質を用いる（１）から（４）のいずれかの方法；
（６）可溶性ＬＲ１１に親和性を有する物質が、抗可溶性ＬＲ１１抗体及び／又はＲＡＰである（５）の方法；
（７）可溶性ＬＲ１１を検出できる物質を含むことを特徴とする、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価、予防、並びに治療効果の評価用キット；及び
（８）可溶性ＬＲ１１を検出できる物質が、抗可溶性ＬＲ１１抗体及び／又はＲＡＰである（８）のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明において、血管平滑筋細胞の肥厚を亢進する作用を有するＬＲ１１が、ヒトのみならず哺乳動物の血中に可溶性ＬＲ１１の形態で存在することが明らかにされた。本発明により、動脈硬化性疾患患者のみならず、健常者の血中の可溶性ＬＲ１１の濃度を測定することにより、早期の動脈硬化性疾患の存在・程度の評価が可能となり、また、動脈硬化性疾患患者において、薬剤等による動脈硬化の進行の予防又は治療効果のモニタリングも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例３において、各種正常哺乳動物血清中の可溶性ＬＲ１１を、ウェスタンブロッティング法により解析した図である。
【図２】実施例４において、ヒト血清中の可溶性ＬＲ１１とヒト神経芽細胞株（ＩＭＲ３２）由来ＬＲ１１、それぞれを、ウェスタンブロッティング法により解析した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、「動脈硬化性疾患」とは、動脈硬化病変の進展に付随して引き起こされる疾患を含む意味で用いられる。該疾患としては、例えば、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後の再狭窄、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、閉塞性動脈硬化症等が挙げられるが、これらに限定されない。また、「存在・程度の評価」とは、既に動脈硬化性疾患に罹患している場合に限らず、将来的に罹患する可能性があるか否かを判定する場合も包含する。【００１２】
本発明の対象とする哺乳動物は、可溶性ＬＲ１１が産生される動物であれば特に制限されず、例えば、ヒト、サル、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、マウス、ウサギ、ラットなどが挙げられる。好ましくは、ヒトである。試料となる哺乳動物由来の生体試料は、可溶性ＬＲ１１を含有するものであれば特に制限されず、例えば、血液、血清、血漿、髄液又は尿等が挙げられるが、血清、または血漿がより好ましい。【００１３】
生体試料中の可溶性ＬＲ１１の検出は、可溶性ＬＲ１１に親和性のある物質を用いて行われる。該親和性物質は、可溶性ＬＲ１１に結合能を有する物質であれば特に制限されず、例えば、ａｐｏ  Ｅ、β−ＶＬＤＬ、ＲＡＰ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、それらの複合体（ｕＰＡ−ＰＡＩ−１）、及び抗可溶性ＬＲ１１抗体等が挙げられるが、ＲＡＰ及び抗可溶性ＬＲ１１抗体が好ましく、抗可溶性ＬＲ１１抗体がより好ましい。【００１４】
抗可溶性ＬＲ１１抗体としては、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれでも良く、当該抗体は、周知の方法にて作製できる。また、これらの抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明にも利用できる。例えば、Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＬＲ１１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＬＲ１１  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）などが挙げられる。【００１５】
ＬＲ１１に対する抗体の作製に用いられる免疫原としては、ＬＲ１１タンパク質、又はその一部断片（ペプチド）等を利用することができ、生体由来試料から精製しても良いし、組換えタンパク質を用いてもよい。
免疫する動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどが用いられる。免疫方法は、公知の手法に従って行われる。例えば、免疫原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁させたもの、あるいは免疫原と完全フロイントアジュバンドなどの補液との混合物を、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。免疫原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定される。【００１６】
例えば、ポリクローナル抗体の場合、免疫された動物を所定の期間飼育した後、当該動物から採血した血液から、ポリクローナル抗体を含む抗血清を調製することができる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、長宗香明、寺田弘共著、「単クローン抗体」、廣川書店、１９９０年や、Ｊａｍｅ  Ｗ．Ｇｏｌｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６年に従い作製することができる。【００１７】
当該モノクローナル抗体は、常法に従い作成したハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、該ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。
抗体は、必要に応じてそれをより精製して使用することができる。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィ法、プロテインＡカラムなどによるアフィニティ精製法などがある。【００１８】
哺乳動物より採取された試料中の可溶性ＬＲ１１の検出方法は特に限定されないが、抗可溶性ＬＲ１１抗体を用いた免疫学的方法、ＲＡＰ等の親和性を利用した方法、並びにそれらを組み合わせた方法により検出することが望ましい。免疫学的方法としては、例えば免疫染色（ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどが挙げられる。又、抗体とＲＡＰ等のＬＲ１１に親和性を有する物質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡも利用できる。又、予め、ＲＡＰ等の親和性物質を担持させた不溶性担体に、試料中の可溶性ＬＲ１１を吸着させた後、適当な緩衝液を用いて洗浄並びに溶出させるような前処理を組み合わせれば、試料中に含まれる夾雑蛋白質が除去でき、可溶性ＬＲ１１を精度よく測定できることから、好ましい。
検出された可溶性ＬＲ１１を定量、半定量的に評価するためには、基準となるＬＲ１１と比較することが好ましい。この場合、基準となるＬＲ１１としては、既知濃度の血清可溶性ＬＲ１１、平滑筋細胞や神経芽細胞株の培養細胞または培養上清より回収したＬＲ１１、リコンビナントＬＲ１１、あるいは抗体作製において免疫原として使用した合成ペプチド等の使用が好ましい。【００１９】
（ヒト体液試料中のＬＲ１１測定法の例）
本発明のヒト体液試料中のＬＲ１１測定法としては、例えば、次のような方法がある。まず、ＬＲ１１と親和性を有するＲＡＰ或いは抗ＬＲ１１モノクローナル抗体を結合させた不溶性担体と、ヒト体液試料とを反応させる。次に、この不溶性担体を還元条件下でＳＤＳ処理し、遠心分離を行い、その遠心上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかける。その後、常法のウエスタンブロット法に従い、これをＰＶＤＦ膜に転写した後、抗ＬＲ１１モノクローナル抗体を反応させる。次に、酵素などで標識した抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後、ウェスタンブロッティングで検出する。【００２０】
本発明の動脈硬化性疾患の存在・程度の評価方法としては、例えば、動脈硬化性疾患が疑われる哺乳動物から生体試料を採取し可溶性ＬＲ１１濃度を測定し、別に予め動脈硬化性疾患の疑いのない健常哺乳動物集団から同様に採取した生体試料中の可溶性ＬＲ１１濃度を算出しておき、両者の濃度レベルを比較することによって、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価を行うことが望ましい。さらに、例えば、動脈硬化性疾患を患っている哺乳動物から、生体試料を経時的に採取し、可溶性ＬＲ１１濃度の経時変化をモニターすることによって、治療の効果判定を行うことも可能である。判定は、可溶性ＬＲ１１の濃度変化によってすることが出来、例えば、増加傾向を示す場合は動脈硬化性疾患の進展、減少又は横ばい傾向を示す場合は動脈硬化性疾患の進展が抑制されていると考えられる。
本発明において、「健常」とは、動脈硬化性疾患を有さない個体をいう。動脈硬化性疾患の有無の客観的な指標としては、ヒトにおいては、冠動脈の閉塞等の動脈硬化性疾患の既往歴がなく、例えば、日本高血圧学会の高血圧治療ガイドライン２００４による正常血圧（収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ未満、拡張期血圧８５ｍｍＨｇ未満）、日本糖尿病学会の糖尿病の分類と診断基準に関する委員会報告（１９９９）に基づく正常型（空腹時血糖が１１０ｍｇ／ｄｌ未満）、及び２００２年の日本動脈硬化学会の高脂血症の診断基準に該当しない（即ち空腹時採血の血清脂質値が総コレステロール２２０ｍｇ／ｄｌ未満、ＬＤＬコレステロール１４０ｍｇ／ｍｌ未満、ＨＤＬコレステロール４０ｍｇ／ｄｌ以上、及びトリグリセリド１５０ｍｇ／ｄｌ未満）ことをいう。
本発明の別の態様として、より精度よく動脈硬化病変の進展並びに動脈硬化性疾患の罹患リスク、そして薬剤等の治療効果を判定するために、可溶性ＬＲ１１を検出することに加え、他の１つ以上の動脈硬化性疾患関連マーカーを検出し、それらの結果を組み合わせて判定することも有用である。そのような他のマーカーとしては、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、酸化ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ、レムナント様リポ蛋白−コレステロール、中性脂肪、ＣＲＰ等の炎症マーカー、アディポサイトカイン（アディポネクチン、ＰＡＩ−１、ＴＮＦ−α）等の公知のマーカーが挙げられる。これらのマーカーの検出には、公知の検出方法をそれぞれ用いることができる。判定方法としては、例えば、各マーカーに設定されている基準範囲と比較することが好ましい。可溶性ＬＲ１１を含めた各マーカーの検出数値は、それぞれ単独で判定される以外に、２項目以上を組み合わせて判定することも可能である。該組み合わせて判定する方法としては、可溶性ＬＲ１１の値と他のマーカーの値を関連付ける方法が挙げられる。関連付ける方法の具体的な例としては、可溶性ＬＲ１１の値と他のマーカーの値の両方が基準を超えることを指標とする方法、可溶性ＬＲ１１の値を他のマーカーの値で除し、あるいは逆に他のマーカーの値を可溶性ＬＲ１１の値で除し比率を求める方法、可溶性ＬＲ１１の値及び他のマーカーの値をスコア化しスコア合計で評価する方法などがある。組み合わせるための他のマーカーの種類、数は存在・程度の評価目的、精度など重視する事項にあわせ適宜選択することが可能である。【００２１】
本発明はまた、可溶性ＬＲ１１を検出できる物質を含むことを特徴とする動脈硬化性疾患の存在・程度の評価、予防、並びに治療効果の評価用キットを提供する。可溶性ＬＲ１１を検出できる物質としては、可溶性ＬＲ１１に親和性を有する物質、例えば抗可溶性ＬＲ１１抗体やＲＡＰが好ましく挙げられるが、それらに限定されるものではなく、該キットは、可溶性ＬＲ１１の検出に必要な他の構成要素、例えば、反応緩衝液や反応容器を含むことができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２３】
実施例１  抗ＬＲ１１抗体の作製
（１）ハイブリドーマの調製
ＬＲ１１の一部アミノ酸配列［４３２−４４７］の合成ペプチド（ＳＭＮＥＥＮＭＲＳＶＩＴＦＤＫＧ）のＣ末端にシステイン残基を導入し、架橋剤のＮＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｙｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）のリジン残基を介して両者を結合させ免疫原とした。この免疫原を完全フロイントアジュバンド（ＧＩＢＣＯ社製）と１対１で混和乳化し、０．１ｍｇ／０．１ｍＬ（エマルジョン）で６週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に１週間間隔で１０回投与後、最終免疫の３日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４とを６対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０（和光純薬工業社製）存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として２．５×１０６／ｍＬになるようにＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて培養し、おおよそ２週間後に、ハイブリドーマの生育してきたウェルの培養上清について、次に示すＥＬＩＳＡ法にしたがって、ＬＲ１１の一部アミノ酸配列［４３２−４４７］の合成ペプチド（ＳＭＮＥＥＮＭＲＳＶＩＴＦＤＫＧ）に対する抗体の有無を確認し、抗体産生が有望なハイブリドーマ株を選択した。【００２４】
具体的には、まず、マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）にＬＲ１１の一部アミノ酸配列［４３２−４４７］の合成ペプチド（ＳＭＮＥＥＮＭＲＳＶＩＴＦＤＫＧ）を固相化した。これに、各培養上清中のＩｇＧを反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧヤギ抗体を反応させ、次いでオルトフェニレンジアミン（東京化成社製）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加え発色させ、１．５Ｎ硫酸を加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）で測定し、前記の合成ペプチドに反応性を示したハイブリドーマ株を選択した。このハイブリドーマについて限界希釈法によるクローン化を行った。ＬＲ１１に対する最終的な反応性は、後述するヒト神経芽細胞株（ＩＭＲ３２）の培養上清中のＬＲ１１を、ＲＡＰ−セファロース樹脂に吸着させて回収し、電気泳動後にＰＶＤＦ膜に転写してウェスタンブロッティングを行うことにより確認した。こうして、抗ヒトＬＲ１１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（Ａ２−２−３）を樹立した。【００２５】
（２）モノクローナル抗体の調製
２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、上記で得られたハイブリドーマを細胞数０．５×１０６個の量で腹腔内に投与した。約１４日後に腹水を採取し、遠心分離して上清を得た。該上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ−１．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．５）と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）に通して抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でカラムより溶出させ、抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３抗体）を精製した。【００２６】
実施例２  ＲＡＰ／ＧＳＴ融合タンパク質の作製
ヒトＲＡＰ遺伝子を組み込んだｐＧＥＸ２Ｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）ベクターにより形質転換した大腸菌ＤＨ５αを培養して、遠心分離により菌体を回収した。３Ｌの培養液から回収した菌体を、リゾチーム及び界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液の遠心上清中のＲＡＰ／ＧＳＴ融合タンパク質をＧｌｕｔａｔｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）１０ｍＬに通し吸着させた後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で洗浄しＲＡＰ−セファロース樹脂を調製した。【００２７】
実施例３  各種正常哺乳動物血清中の可溶性ＬＲ１１の検出
各種哺乳動物より採取された正常血清３ｍＬに、実施例２で調製されたＲＡＰ−セファロース樹脂を３０μＬ添加し、室温で２時間攪拌後、樹脂をＰＢＳ液にて洗浄した。洗浄した樹脂３０μＬに、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むトリス緩衝液を同量添加して１００℃で５分加熱後の遠心上清を２−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。これをＰＶＤＦ膜に転写し免疫染色を行った。転写膜を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ液（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ，ｐＨ７．２）でブロッキング後、実施例１で作製した抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３）を室温で１時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ，ｐＨ７．２）で膜を十分に洗浄後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｍｏｕｓｅ）（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてペルオキシダーゼ標識し、過酸化水素とジアミノベンチジンを用いて発色させた。その結果、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギなどの哺乳動物の血清中に、分子量２００ｋＤａ以上の可溶性ＬＲ１１が存在していることが確認された（図１）。【００２８】
実施例４  ヒト神経芽細胞株（ＩＭＲ３２）膜ＬＲ１１と遊離ＬＲ１１、及びヒト血清中の可溶性ＬＲ１１の分子量比較
（１）ＩＭＲ３２細胞膜ＬＲ１１とＩＭＲ３２細胞培養上清中の遊離ＬＲ１１の比較
７５ｃｍ２の培養皿を用い、フルシートまで培養したＩＭＲ３２細胞の培養上清と細胞を回収した。７５ｃｍ２のフルシート状態の細胞を、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ，ｐＨ７．２）１０ｍＬに懸濁して超音波処理により破砕した。細胞培養上清４０ｍＬ、或いは細胞破砕液の遠心上清１０ｍＬに別個に実施例２で調製されたＲＡＰ−セファロース樹脂５０μＬを添加し、室温で２時間攪拌後、樹脂をＰＢＳ液にて洗浄した。洗浄した樹脂５０μＬに、βメルカプトエタノール及びＳＤＳを含むトリス緩衝液を同量添加して１００℃で１０分加熱後の遠心上清を２−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。これをＰＶＤＦ膜に転写し免疫染色を行った。転写膜をＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロッキング後、実施例１で作製した抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３）を室温で１時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧヤギ抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで膜を十分に洗浄後、ウェスタンブロッティング検出試薬ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を反応させＸ線フィルムで検出した。【００２９】
（２）ＩＭＲ３２細胞培養上清中の遊離ＬＲ１１とヒト血清中可溶性ＬＲ１１の比較
７５ｃｍ２の培養皿を用い、フルシートまで培養したＩＭＲ３２細胞の培養上清４０ｍＬ、或いは正常ヒト血清５ｍｌに別個に実施例２で調製されたＲＡＰ−セファロース樹脂５０μＬを添加し、室温で２時間攪拌後、樹脂をＰＢＳ液にて洗浄した。洗浄した樹脂５０μＬに、βメルカプトエタノール及びＳＤＳを含むトリス緩衝液を同量添加して１００℃で１０分加熱後の遠心上清を２−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。これをＰＶＤＦ膜に転写し免疫染色を行った。転写膜をＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロッキング後、実施例１で作製した抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３）を室温で１時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧヤギ抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで膜を十分に洗浄後、ウェスタンブロッティング検出試薬ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を反応させインスタントカメラ用フィルムを感光させて検出した。【００３０】
上記の検出結果を図２に示す。既に、非特許文献４でも報告されているように、ＩＭＲ３２細胞培養上清中の遊離ＬＲ１１（図２の２）は、ＩＭＲ３２細胞膜表面に発現したＬＲ１１（図２の１）と比較して僅かに小さく、一方ヒト血清から抽出された可溶性ＬＲ１１（図２の４）とは同等の分子量であることが示された。従って、ＩＭＲ３２細胞培養上清中の遊離ＬＲ１１とヒト血清中の可溶性ＬＲ１１は、細胞上に発現する全長のＬＲ１１のＣ末端膜貫通領域が欠損した構造を有していると考えられた。【００３１】
実施例５  動脈硬化性疾患との関係
虚血性心疾患を疑われ冠動脈造影検査を行った９６名を対象に検討を実施した。尚、冠動脈造影検査を行った９６名については、米国心臓病学会（ＡＣＣ）及び米国心臓協会（ＡＨＡ）の分類に従い、３本の冠動脈（右冠動脈、左冠動脈前下行枝、左冠動脈回旋枝）の何れかに、冠動脈造影上５０％以上の狭窄（有意狭窄病変）を認める患者もしくは急性心筋梗塞の既往患者（６２名）を冠動脈疾患（ＣＡＤ）群とし、冠動脈造影上有意狭窄病変を認めない患者（３４名）を正常冠動脈（ＮＣＡ）群と分類した。さらに、３本の冠動脈中で病変の認められる冠動脈の数（冠動脈病変枝数）により、０枝群（３４名、全てＮＣＡ群）、１枝群（４６名）、２枝群（９名）、３枝群（７名）に分類した。
血清中の可溶性ＬＲ１１の測定は、次に示す通りに実施した。可溶性ＬＲ１１の抽出は、血清５０μＬとＲＡＰ−セファロースゲル３５μＬを用いて実施例３の方法に準じて行った。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ膜へ転写し、実施例４（１）に記載の方法を用いて検出し、検出したバンドをＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトによって定量化した。濃度単位は、健常者の血漿２０μＬを用いた時の可溶性ＬＲ１１の検出バンドの濃度の平均値を１ユニット（Ｕ）として、ＣＡＤ群及びＮＣＡ群の検体中の可溶性ＬＲ１１の濃度を算出した。【００３２】
その結果、ＣＡＤ群及びＮＣＡ群の血清中可溶性ＬＲ１１濃度は、それぞれ、５．０±２．８Ｕ、及び３．８±１．６Ｕであり、ＣＡＤ群はＮＣＡ群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）高値だった。さらに、冠動脈病変枝数に基づく分類でみると、可溶性ＬＲ１１濃度は、２枝までは有意に増加する傾向を示した（０枝群３．８±１．６Ｕ、１枝群５．１±２．６Ｕ、２枝群６．７±４．２Ｕ、３枝群３．１±１．７Ｕ）。一方、３枝群に関しては逆に可溶性ＬＲ１１濃度は低下したが、高度の動脈硬化状態に進行した場合では、逆に血管平滑筋細胞の増殖が低下し、それに伴い可溶性ＬＲ１１の濃度が減少した可能性が考えられる。
この結果から、可溶性ＬＲ１１の検出は、動脈硬化性疾患の存在・程度の評価を可能にするだけでなく、動脈硬化の進展の指標になる可能性が示された。【００３３】
実施例６  頚動脈肥厚（ＩＭＴ）との関係
異常脂質血症（ＬＤＬ-コレステロール＞１６０ｍｇ／ｄＬ、または  中性脂肪＞２００ｍｇ/ｄＬ  または  ＨＤＬ-コレステロール  ＜３５ｍｇ／ｄＬで、糖尿病、甲状腺疾患、及び内分泌学的な疾患ではない）４０２名を対象に検討を実施した。
血清中の可溶性ＬＲ１１の測定は、次に示す通りに実施した。可溶性ＬＲ１１の抽出は、血清５０μＬとＲＡＰ−セファロースゲル３５μＬを用いて実施例３の方法に準じて行った。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ膜へ転写し、実施例４（１）に記載の方法を用いて検出し、検出したバンドをＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトによって定量化した。濃度単位は、健常者の血漿２０μＬを用いた時の可溶性ＬＲ１１の検出バンドの濃度の平均値を１ユニット（Ｕ）として、検体中の可溶性ＬＲ１１の濃度を算出した。
頚動脈肥厚の測定は、超音波スキャナー（ＳＳＤ−１２００ＣＶ、アロカ）で実施した。
その結果、ＩＭＴと血清中可溶性ＬＲ１１濃度は、相関係数Ｒ＝０．４８と有意に（ｐ＜０．００１）関連した。この結果から、可溶性ＬＲ１１の検出は、異常脂質血症の人の頚動脈肥厚の存在・程度の評価を可能とし、動脈硬化の進展の指標になる可能性が示された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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