(57)【要約】本発明により、シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する、配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、および配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列において、３６番目、４６番目、９４番目、１０２番目、１２１番目、１４１番目、１４３番目、１６７番目、および１９８番目のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有する蛋白質が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質の製造方法であって、下記工程を含む方法：
［１］ウラシルからウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上でＵＰＲＴａｓｅにおけるＵＭＰ結合部位にＣＭＰを適合させて作成されるＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させる、ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を１個以上選択する工程；
［２］工程［１］で選択された欠失、置換及び／又は付加を含むＵＰＲＴａｓｅの変異蛋白質を製造する工程。
【請求項２】
シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質の製造方法であって、下記工程を含む方法：
［１１］ウラシルからウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上でＵＰＲＴａｓｅにおけるＵＭＰ結合部位にＣＭＰを適合させて作成されるＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させる、ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を１個以上選択する工程；
［１２］前記複合体モデルの一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成される該複合体の多量体モデルを安定化させる、ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を１個以上選択する工程；
［１３］工程［１１］および［１２］で選択された欠失、置換及び／又は付加を含むＵＰＲＴａｓｅの変異蛋白質を製造する工程。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法により得られる蛋白質。
【請求項４】
配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されているアミノ酸配列を有し、
シトシンからＣＭＰを生成する活性を有し、かつ
下記アミノ酸置換を１個以上含む蛋白質：
表１に記載の三次元座標原子座標であらわされる配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなりかつウラシルからＵＭＰを生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成されるＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルにおいて、ＵＭＰのピリミジン環４位のオキソ基の酸素原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換であって、
前記複合体モデルのＵＭＰのオキソ基をアミノ基に変換することによりコンピュータ上で作成されるＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させるアミノ酸への置換。
【請求項５】
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０５位のグリシンの置換である請求項４に記載の蛋白質。
【請求項６】
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０５位のグリシンのアスパラギン酸又はグルタミン酸への置換である請求項４に記載の蛋白質。
【請求項７】
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０１位のチロシン及び２０４位のプロリンの置換である請求項４に記載の蛋白質。
【請求項８】
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０１位のチロシンのリジンへの置換及び２０４位のプロリンのロイシンへの置換である請求項４に記載の蛋白質。
【請求項９】
前記のＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルにおいてＵＭＰを構成するいずれかの原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換（ただしＵＭＰのピリミジン環４位のオキソ基の酸素原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換を除く）であって、前記のＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させるアミノ酸への置換を１個以上含む請求項４〜８のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項１０】
表１に記載の三次元座標原子座標であらわされる配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなりかつウラシルからＵＭＰを生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成されるＵＰＲＴａｓｅとホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）との複合体モデルにおいてＰＲＰＰを構成するいずれかの原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換であって、該複合体モデルを安定化させるアミノ酸への置換を１個以上含む請求項４〜８のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項１１】
前記のＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルの一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成される複合体の多量体モデルにおいて、隣接するＵＰＲＴａｓｅ単量体のいずれかの原子から５Å以内に構成原子が存在するアミノ酸  及び隣接するＵＰＲＴａｓｅ単量体の６６位Ｔｒｐのいずれかの構成原子から５Å以内に構成原子が存在するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸の置換であって、該多量体モデルを安定化させるアミノ酸への置換
を１個以上含む請求項４〜１０のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項１２】
シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する、配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項１３】
配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列において、３６番目、９４番目、１０２番目、１４１番目、１４３番目および１９８番目のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。
【請求項１４】
３６番目のアミノ酸残基がシステイン、９４番目のアミノ酸残基がチロシン、１０２番目のアミノ酸残基がシステイン、１４１番目のアミノ酸残基がロイシン、１４３番目のアミノ酸残基がバリン、または１９８番目のアミノ酸残基がグリシンに置換したアミノ酸配列を有する請求項１２記載の蛋白質。
【請求項１５】
配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列において、３６番目、４６番目、９４番目、１０２番目、１２１番目、１４１番目、１４３番目、１６７番目および１９８番目のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、３６番目、９４番目、１０２番目、１４１番目、１４３番目、１９８番目、２０１番目、２０４番目および２０５番目以外のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。
【請求項１７】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、３６番目、４６番目、９４番目、１０２番目、１２１番目、１４１番目、１４３番目、１６７番目、１９８番目、２０１番目、２０４番目および２０５番目以外のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。
【請求項１８】
以下の［１］または［２］記載のＤＮＡ。
［１］請求項３〜１７のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１９記載の組換え体ＤＮＡを保有する微生物。
【請求項２１】
微生物がエッシェリヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物である、請求項２０記載の微生物。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸基供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にＣＭＰを生成、蓄積させ、該媒体からＣＭＰを採取することを特徴とするＣＭＰの製造法。
【請求項２３】
請求項２０または２１に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物、コリネバクテリウム属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸基供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にＣＭＰを生成、蓄積させ、該媒体からＣＭＰを採取することを特徴とするＣＭＰの製造法。
【請求項２４】
コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請求項２３記載の製造法。
【請求項２５】
請求項２０または２１に記載の微生物の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に生成するＣＭＰを用いることを特徴とする、有用物質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する新規蛋白質の製造方法、該蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する微生物、および該微生物の培養物などを用いたＣＭＰの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＣＭＰは他のヌクレオチドであるアデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）、グアノシン５’−モノリン酸（ＧＭＰ）、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）とともに乳児用ミルクの添加物として用いられている。従来、ＣＭＰは酵母ＲＮＡの酵素的分解法により製造されてきた（非特許文献１）。しかしながら、このＲＮＡ分解法では４種のヌクレオチドが同時に作られるため、生産量と需要量との差により生産物に余剰がでる欠点がある。このことから、安価な個別のヌクレオチドの製造法の開発が望まれている。【０００３】  上記した４種のヌクレオチドのうち、ＧＭＰについてはＲＮＡ分解法に代替しうる工業的な個別製法が確立されている（特許文献１）。一方、ＣＭＰ，ＡＭＰ，ＵＭＰについては安価な個別製法はまだ確立されていない。これらヌクレオチドの個別製法としては、サルベージ合成経路を利用して、化学合成法で製造した対応する塩基を基質として用いる方法があり、この経路を利用した具体例として、アデニンを基質としたアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）の工業的製法があげられる（特許文献２）。【０００４】  サルベージ合成経路に関与する酵素としては、ウラシルとホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）からＵＭＰとピロリン酸を生成する反応を触媒するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）などの、塩基から対応するヌクレオチドを一段階で生産する酵素が知られている。しかしながら、ＣＭＰを生成するサルベージ合成経路の酵素は、すべての生物種にわたって知られていない。
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３，５５（１９５７）
【特許文献１】特開昭６２−２８５７９７号公報
【特許文献２】特開平２‐１３４３９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の目的は、シトシンからＣＭＰを生成する活性を有する新規蛋白質の製造方法、該蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する微生物、および該微生物の培養物などを用いたＣＭＰの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する、配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（２）配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列において、３６番目、９４番目、１０２番目、１４１番目、１４３番目および１９８番目のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。
（３）３６番目のアミノ酸残基がシステイン、９４番目のアミノ酸残基がチロシン、１０２番目のアミノ酸残基がシステイン、１４１番目のアミノ酸残基がロイシン、１４３番目のアミノ酸残基がバリン、または１９８番目のアミノ酸残基がグリシンに置換したアミノ酸配列を有する上記（２）の蛋白質。【０００７】（４）配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列において、３６番目、４６番目、９４番目、１０２番目、１２１番目、１４１番目、１４３番目、１６７番目および１９８番目のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの蛋白質のアミノ酸配列において、３６番目、９４番目、１０２番目、１４１番目、１４３番目、１９８番目、２０１番目、２０４番目および２０５番目以外のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。【０００８】（６）上記（１）〜（４）のいずれかの蛋白質のアミノ酸配列において、３６番目、４６番目、９４番目、１０２番目、１２１番目、１４１番目、１４３番目、１６７番目、１９８番目、２０１番目、２０４番目および２０５番目以外のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質。
（７）以下の［１］または［２］に記載のＤＮＡ。
［１］上記（１）〜（４）のいずれかの蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
（８）上記（７）のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。【０００９】（９）上記（８）の組換え体ＤＮＡを保有する微生物。
（１０）微生物がエッシェリヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物である、上記（９）の微生物。
（１１）上記（９）または（１０）の微生物の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸基供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にＣＭＰを生成、蓄積させ、該媒体からＣＭＰを採取することを特徴とするＣＭＰの製造法。【００１０】（１２）上記（９）または（１０）の微生物の培養物または該培養物の処理物、コリネバクテリウム属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸基供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にＣＭＰを生成、蓄積させ、該媒体からＣＭＰを採取することを特徴とするＣＭＰの製造法。
（１３）コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、上記（１２）の製造法。
（１４）上記（９）または（１０）の微生物の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に生成するＣＭＰを用いることを特徴とする、有用物質の製造法。【００１１】  本発明は、また、以下の（１５）〜（２４）に関する。
（１５）
シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質の製造方法であって、下記工程を含む方法：
［１］ウラシルからウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上でＵＰＲＴａｓｅにおけるＵＭＰ結合部位にＣＭＰを適合させて作成されるＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させる、ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を１個以上選択する工程；
［２］工程［１］で選択された欠失、置換及び／又は付加を含むＵＰＲＴａｓｅの変異蛋白質を製造する工程。【００１２】（１６）
シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質の製造方法であって、下記工程を含む方法：
［１１］ウラシルからウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上でＵＰＲＴａｓｅにおけるＵＭＰ結合部位にＣＭＰを適合させて作成されるＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させる、ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を１個以上選択する工程；
［１２］前記複合体モデルの一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成される該複合体の多量体モデルを安定化させる、ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を１個以上選択する工程；
［１３］工程［１１］および［１２］で選択された欠失、置換及び／又は付加を含むＵＰＲＴａｓｅの変異蛋白質を製造する工程。
（１７）
（１５）又は（１６）に記載の方法により得られる蛋白質。【００１３】（１８）
配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されているアミノ酸配列を有し、
シトシンからＣＭＰを生成する活性を有し、かつ
下記アミノ酸置換を１個以上含む蛋白質：
表１に記載の三次元座標原子座標であらわされる配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなりかつウラシルからＵＭＰを生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成されるＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルにおいて、ＵＭＰのピリミジン環４位のオキソ基の酸素原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換であって、
前記複合体モデルのＵＭＰのオキソ基をアミノ基に変換することによりコンピュータ上で作成されるＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させるアミノ酸への置換。
（１９）
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０５位のグリシンの置換である（１８）に記載の蛋白質。【００１４】（２０）
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０５位のグリシンのアスパラギン酸又はグルタミン酸への置換である（１８）に記載の蛋白質。
（２１）
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０１位のチロシン及び２０４位のプロリンの置換である（１８）に記載の蛋白質。
（２２）
前記のアミノ酸置換が配列番号１５に記載のアミノ酸配列の２０１位のチロシンのリジンへの置換及び２０４位のプロリンのロイシンへの置換である（１８）に記載の蛋白質。
（２３）
前記のＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルにおいてＵＭＰを構成するいずれかの原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換（ただしＵＭＰのピリミジン環４位のオキソ基の酸素原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換を除く）であって、前記のＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させるアミノ酸への置換を１個以上含む（１８）〜（２２）のいずれか一項に記載の蛋白質。【００１５】（２４）
表１に記載の三次元座標原子座標であらわされる配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなりかつウラシルからＵＭＰを生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の三次元構造情報の一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成されるＵＰＲＴａｓｅとホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）との複合体モデルにおいてＰＲＰＰを構成するいずれかの原子から１０Åの範囲に構成原子が存在するアミノ酸の置換であって、該複合体モデルを安定化させるアミノ酸への置換を１個以上含む（１８）〜（２２）のいずれか一項に記載の蛋白質。
（２５）
前記のＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルの一部又は全体を用いてコンピュータ上で作成される複合体の多量体モデルにおいて、隣接するＵＰＲＴａｓｅ単量体のいずれかの原子から５Å以内に構成原子が存在するアミノ酸  及び隣接するＵＰＲＴａｓｅ単量体の６６位Ｔｒｐのいずれかの構成原子から５Å以内に構成原子が存在するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸の置換であって、該多量体モデルを安定化させるアミノ酸への置換
を１個以上含む（１８）〜（２４）のいずれか一項に記載の蛋白質。
本発明はさらに、上記いずれかのＣＰＲＴａｓｅの製造方法により得られる蛋白質；該蛋白質をコードするＤＮＡ；該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ；該組換え体ＤＮＡを保有する微生物；該微生物を用いたＣＭＰおよびＣＭＰを基質としてまたはＣＭＰを経由して生産される有用物質の製造法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各種ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列のアラインメント結果を示す図である。
【図２】Ｇ２０５Ｄ、Ｍ１４１Ｌ、Ａ１４３Ｖのアミノ酸置換を有する変異型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを示す図である。
【図３】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体の四量体のモデルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  本発明のシトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質（ＣＰＲＴａｓｅ）は、ウラシルからウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質（ＵＰＲＴａｓｅ）の変異蛋白質として得ることができる。ＵＰＲＴａｓｅの変異蛋白質とはＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されているアミノ酸配列を有する蛋白質を有する。なお、数個とは、３０個であればよく、２０個であることが好ましく、５個であることがより好ましい。【００１８】  本明細書において、シトシンからシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を生成する活性（ＣＰＲＴａｓｅ活性）とは、シトシンとＰＲＰＰとからＣＭＰとピロリン酸を合成する活性を意味する。本明細書において、ＣＰＲＴａｓｅはウラシルとＰＲＰＰからＵＭＰを合成する活性（ＵＰＲＴａｓｅ活性）を同時に有していてもよいが、後述の実施例で行う方法などにより確認できる方法で比較した場合に、ＣＰＲＴａｓｅ活性がＵＰＲＴａｓｅ活性よりも高いことが好ましく、ＣＰＲＴａｓｅ活性がＵＰＲＴａｓｅ活性よりも１０倍高いことがより好ましく、ＵＰＲＴａｓｅ活性を実質的に有しないことがさらに好ましい。【００１９】  ＣＰＲＴａｓｅの製造のための、ＵＰＲＴａｓｅに加えるアミノ酸変異の選択は、ランダムに変異蛋白質を作成し、後述の方法によりそれらの変異蛋白質の活性を確認してスクリーニングを行うことが可能である。アミノ酸変異又は変異とは、ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列に加える、アミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を意味する。
スクリーニング方法は、特に限定されないが、例としては、任意の変異を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて、ＰｙｒＧ（ＣＴＰシンセターゼ）、ｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）、ｃｄｄ（シチジンデアミナーゼ）の３つの酵素活性を喪失しているエッシェリヒア・コリを形質転換し、得られた形質転換体が、シトシン含有最少培地中で生育するか否かを指標に行う方法をあげることができる。また、任意の変異を有する蛋白質を製造し、生成するＣＭＰ量を定量し、ＣＰＲＴａｓｅ活性を確認することによって行ってもよい。【００２０】  また、ＣＰＲＴａｓｅの製造のためにＵＰＲＴａｓｅに加えるアミノ酸変異の選択の別の方法としては、ＵＰＲＴａｓｅの三次元構造情報に基づいて作成されるコンピューター上のモデルを利用した方法を挙げることができる。【００２１】  ＵＰＲＴａｓｅの三次元構造情報としては、当業者が入手可能ないずれの情報を用いてもよく、結晶構造解析により得られた構造又はＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）等のデータベースから取得できる構造情報を用いてもよいし、該構造を鋳型としてＩｎｓｉｇｈｔ  ９７等の蛋白質ホモロジーモデル作成プログラムを用いて作成される構造情報を用いてもよい。また、三次元構造情報はＵＰＲＴａｓｅ単量体の情報であってもよく、二量体または四量体などの多量体の情報であってもよい。さらに、三次元構造情報はＵＰＲＴａｓｅ単量体又は多量体の一部に関するものであってもよいが、後述のＵＭＰ結合部位の情報を含んでいることが好ましい。また、多量体モデルの作成に上記三次元情報が用いられる際には単量体同士の境界部分の情報を含むことが好ましい。【００２２】  ＵＰＲＴａｓｅに加えるアミノ酸変異の選択のために、例えば、上記のＵＰＲＴａｓｅの三次元構造情報を用いてＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを作成することができる。このモデルの作成には、三次元構造情報の全体を用いてもよく、一部を用いてもよい。一部を用いる場合は少なくとも後述のＵＭＰ結合部位を含む部位を選択することが好ましい。また、ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体の安定化に関与すると考えられる部位を予め選択し、該部位を含む複合体モデルを作成してもよい。【００２３】三次元構造情報を用い、かつ変異の基となるＵＰＲＴａｓｅとしては、ウラシルからウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を生成する活性を有する蛋白質であればよく、由来する生物については特に限定されない。由来する微生物の例としては、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５６：１９２−７．）、Ｃｒｉｔｈｉｄｉａｌｕｃｉｌｉａｅ（Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ．（１９９０）９５：１５９−６３．）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．（１９８６）８８１：２６８−７５．、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５７１０４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９４）１７６：３６９８−７０７．、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ９９５４５）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（１９９５）９２：５７４９−５３．、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ１０２４６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．（１９９６）１２９６：１６−２２．）を挙げることができる。【００２４】  ＵＰＲＴａｓｅにおけるＵＭＰ結合部位については、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ由来のＵＰＲＴａｓｅについて既に報告されている（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８）１７：３２１９−３２３２）。この、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ由来のＵＰＲＴａｓｅにおいては、２３６番目のフェニルアラニンのアミド水素原子においてピリミジン環２位のカルボニル基酸素原子と、２３４番目のグリシンのカルボニル基の酸素原子においてピリミジン環３位の水素原子と、また２２９番目のイソロイシンのアミド水素原子においてピリミジン環４位のカルボニル基酸素原子と水素結合を形成することにより、ＵＭＰのピリミジン環との結合を安定化させている。【００２５】  上記文献に記載のＵＭＰ結合部位に関する情報をもとに他の種のＵＰＲＴａｓｅについても、ＵＭＰ結合部位を決定することができる。具体的には、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ由来のＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列と、三次元構造情報を用いるＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列のアラインメントを行って（ＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，４６７３，（１９９４）］（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗより利用することができる）、遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフト）三次元構造情報におけるＵＭＰ結合部位を決定することができる。アライメントを行う際の解析ソフトのパラメーターとしては、デフォルト値を用いることができる。Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＵＰＲＴａｓｅを含む各種ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列のアラインメントを行った例を図１に示す。この結果からＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＵＰＲＴａｓｅにおいては、２０２位のイソロイシン、２０７位のグリシン、２０９位のアラニン等が、ＵＭＰのピリミジン環の結合に関与すると考えられる。【００２６】  ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルの作成のために、上記のＵＭＰ結合部位に、コンピュータ上でＣＭＰを適合させることができる。
ＵＭＰ結合部位にＣＭＰを適合させる方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＵＰＲＴａｓｅにＵＭＰをドッキングさせ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ由来のＵＰＲＴａｓｅに関してすでに報告されている、ＵＭＰのピリミジン環とＵＰＲＴａｓｅの水素結合が保たれている配座をとっている構造を選択後、複合体に対しエネルギー極小化させて作成したＵＭＰ複合体モデルを用いる。上記複合体モデルにおけるＵＭＰのピリミジン環４位カルボニル基の酸素をアミノ基に置換して、ピリミジン環３位の水素を削除することによって、ＣＭＰとして、ＵＭＰをＣＭＰに変換する。さらに、該モデルについて再びエネルギー極小化計算を行う。
このようにＵＭＰ結合部位にＣＭＰを適合させてＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを作成することができる。【００２７】  上述のように作成したＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを利用した、ＣＰＲＴａｓｅ製造のためのＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸変異の選択は、該モデルを安定化させるＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸変異の選択をすることにより行えばよい。
本明細書において、「モデルを安定化させる」とは、例えばΔΔＧを下げることを意味する。ここで、ΔＧ（フリーエネルギー変化）は、ＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰの複合体のエネルギーから、蛋白質単体のエネルギーとＵＭＰ単体のエネルギーを差し引いたものを意味し、ΔΔＧは、ここではＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰの複合体構造から算出されるΔＧから、変異型ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰの複合体構造から算出されるΔＧを引いたものを意味する。例えば、モデルを安定化させるアミノ酸置換等の変異の選択は、コンピュータ上で、変異前と変異後のモデルのΔＧの差異を算出し、アミノ酸変異後エネルギーレベルが、５ｋＪ／ｍｏｌ、好ましくは２０ｋＪ／ｍｏｌ、さらに好ましくは５０ｋＪ／ｍｏｌ以上の低下する変異を選択することにより行うことができる。このような計算はドッキングプログラムＧｌｉｄｅ  などで行うことができる。【００２８】  また、モデルを安定化させるアミノ酸置換等の変異の選択は、モデルの構成要素間（ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルにおけるＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの間、又は多量体モデルにおける単量体間など）の親和性を指標に行うことができる。すなわち、構成要素間の親和性を上昇させる変異を選択すればよい。【００２９】  親和性を上昇させる変異の選択は、例えばモデルの目視による観察で行うことができる。モデルにおける構成要素間（ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰ、単量体間など）の疎水相互作用、・静電相互作用・水素結合・π／π相互作用（芳香環の環電流が発生する磁場同士の相互作用）・ＣＨ／π相互作用（芳香環の環電流とメチル基の電子が発生する磁場の相互作用）が、増加、又は増強する変異を選択すればよい。【００３０】  ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルにおいて、具体的には、モデルの安定化のためにまず、ＵＭＰとＣＭＰの構造上の差異に着目して変異を選択することができる。ＵＭＰとＣＭＰはピリミジン環４位につき、ＵＭＰはオキソ基、ＣＭＰはアミノ基である点が異なっている。従って例えば、ＣＭＰのピリミジン環４位アミノ基の近傍（アミノ基の窒素原子の中心から１０Å程度好ましくは８Å程度、より好ましくは５Å程度）に構成原子の中心が存在するＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸残基をＣＭＰのアミノ基と親和的に相互作用するアミノ酸残基に変更することによりＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの間の親和性を上昇させうる。なお、本明細書において、原子間の距離を示す場合は原子の中心同士の距離を示す。原子間の距離はＩｎｓｉｇｈｔ９７によりグラフィックス上に表示させたモデルにおいて、測定したい２つの原子同士をクリックし選択することにより測定することができる。また、ＵＭＰとＣＭＰはピリミジン環３位の窒素原子が水素原子を有するか否かにおいて異なっている。従って、例えば、ＣＭＰのピリミジン環３位の窒素原子の近傍（該窒素原子の中心から１０Å程度好ましくは８Å程度、より好ましくは５Å程度）に構成原子の中心が存在するＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸残基をＣＭＰのアミノ基と親和的に相互作用するアミノ酸残基に変更することによりＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの間の親和性を上昇させうる。さらに、上記のピリミジン環４位及び３位の近傍のＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸残基を総合的に判断して変異を選択することも好ましい。これは、ＵＭＰとＣＭＰではピリミジン環２位、３位の水素結合のドナー、アクセプターの関係が逆になると考えることができるためなどによる。
このようなＵＭＰとＣＭＰの構造上の差異に着目して選択される変異はＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルの安定化に最も寄与しやすく、ＵＰＲＴａｓｅの活性変化の要になる変異であると考えられる。【００３１】  例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴａｓｅでは２０５位Ｇｌｙを例えばＡｓｐ又はＧｌｕ、にすることによって、このＡｓｐ又はＧｌｕ残基と、シトシンのアミノ基との間に静電的相互作用が生じ、複合体モデルを安定化しうる。また、２０１位ＴｙｒをＬｙｓとすることによって、結合部位の形状が、ピリミジン環が結合しうるのに適した、平らな形状となり、複合体モデルを安定化しうる。なお、本明細書において、例えば２０５位ＧｌｙをＡｓｐに置換することはＧ２０５Ｄとするように、変異位置を示す数値の前に変異前のアミノ酸、後に変異後のアミノ酸を１文字略号を用いて示すことがある。【００３２】  ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させる変異の選択のために、ＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルを用いることもできる。ＵＭＰとＣＭＰの結合位置はほぼ同じであると考えられるため、上記の三次元構造情報から直接的に作成されるＵＭＰとＵＰＲＴａｓｅとの複合体モデルを用いることで、実質的にＣＭＰとＵＰＲＴａｓｅ相互作用に関与するアミノ酸を選択することができるからである。このモデルにおいて、例えば、ＵＭＰのピリミジン環４位オキソ基の近傍のアミノ酸残基（オキソ基の酸素原子の中心から１０Å程度好ましくは８Å程度、より好ましくは５Å程度に構成原子の中心が存在するアミノ酸残基）を選択することができる。変異後のアミノ酸は、ピリミジン環４位オキソ基がアミノ基におきかわることを想定して選択すればよい。また、ＵＭＰのピリミジン環３位窒素原子の近傍のアミノ酸残基（該窒素原子の中心から１０Å程度好ましくは８Å程度、より好ましくは５Å程度に構成原子の中心が存在するアミノ酸残基）を選択することができる。変異後のアミノ酸は、ピリミジン環３位窒素原子に結合する水素原子が無くなることを想定して選択すればよい。【００３３】  また、ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを安定化させる変異の選択のために、ＵＰＲＴａｓｅとシトシン又はウラシルとの複合体モデルを用いることもできる。上述のＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８）１７：３２１９−３２３２においてはＵＰＲＴａｓｅにおけるウラシルの結合について報告されている。上記のＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデル又はＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルと同様にＵＰＲＴａｓｅとシトシン又はウラシルとの複合体モデルを作成し、前述の方法でこれらの複合体モデルを安定化させる変異を選択すればよい。【００３４】  ＣＰＲＴａｓｅの製造のためには、上記のように選択された変異を有する変異ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを上記と同様に作成し、該モデルを安定化させる追加のアミノ酸変異を選択してもよい。または、上記いずれかの複合体モデルを用いて選択された変異を有する変異ＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸配列をもとにして、ランダムスクリーニングを行い、さらに活性の高いＣＰＲＴａｓｅを得ることもできる。
例えば、上記のスクリーニング方法に準じて、上記で選択された変異を有する変異ＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ法などによりランダムな変異を有するＤＮＡを作成し、これらのＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて作成した形質転換体を利用してスクリーニングを行うことができる。【００３５】  上記のＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルやＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルを用いて、ＵＭＰとＣＭＰの構造上の差異に着目して選択される変異以外にも、その他のモデルを安定化させる変異を選択することができる。その他の変異は、上記のＵＭＰとＣＭＰの構造上の差異に着目して選択される変異と並存させることが好ましい。その他の選択としては例えばＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルにおいて、ＣＭＰを構成するいずれかの原子の中心から１０Å程度好ましくは８Å程度、より好ましくは５Å程度の範囲に構成原子の中心が存在するＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸残基をＣＭＰのアミノ基と親和的に相互作用するアミノ酸残基に変更することが挙げられる。同様に、ＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰとの複合体モデルにおいて、ＵＭＰを構成するいずれかの原子の中心から１０Å程度好ましくは８Å程度、より好ましくは５Å程度の範囲に構成原子の中心が存在するＵＰＲＴａｓｅのアミノ酸残基を変異させるアミノ酸残基として選択することができる。【００３６】  また、その他の変異の選択のために、ＣＰＲＴａｓｅのもう一つの基質であるＰＲＰＰとＵＰＲＴａｓｅとの複合体モデルを作成し、該モデルを安定化させる変異を選択することも可能である。このように選択される変異は上記のＵＭＰとＣＭＰの構造上の差異に着目して選択される変異と並存させることが好ましい。【００３７】ＵＰＲＴａｓｅは通常はダイマーを形成するが、ＧＴＰが結合し四量体を形成することによって、ＰＲＰＰと相互作用するアミノ酸が増加し、ＵＰＲＴａｓｅ活性が高まることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９：７８−８３．）。ＣＰＲＴａｓｅについても同様の傾向が予測できるため、多量体を安定化する変異によっても、ＣＰＲＴａｓｅ活性があがると予測できる。したがって、ＣＰＲＴａｓｅの製造のためにＵＰＲＴａｓｅに加えるアミノ酸変異は、ＵＰＲＴａｓｅの、または、前述のいずれかの複合体の多量体モデルを安定化する変異を選択して行うこともできる。【００３８】  多量体モデルを安定化させる変異としては、それぞれの単量体同士の境界部分のアミノ酸をコンピューターグラフィクス上で調べ、それらの間にエネルギー的に不安定な要素（例えば静電的反発、立体的反発など）がある場合には不安定な要素を除くまたは相互作用を強めるような変異を行うことができる。例えば隣接するＵＰＲＴａｓｅの単量体のいずれかの原子から１０Å程度好ましくは８Å程度、より好ましくは５Å程度の範囲に構成原子の中心が存在するアミノ酸を前記の隣接するＵＰＲＴａｓｅの単量体と親和的に相互作用するアミノ酸残基に変更することができる。【００３９】  また、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８）１７：３２１９−３２３２．に記載されているように、２番目と３番目のβストランド（Ｂ２、Ｂ３）からなるβアームと、もう一方の単量体の２番目、３番目、４番目のαヘリックス（Ａ２，Ａ３，Ａ４）の間の相互作用によって、二量体が形成されている。したがって、βアームを含むこれらの領域（Ｂ２，Ｂ３，Ａ２，Ａ３，Ａ４）に着目した変異を選択することが考えられる。
多量体モデルは、ＵＰＲＴａｓｅの三次元構造情報、または、好ましくは前述のいずれかの複合体モデルを基に作成すればよい。特に多量体構造は、基質との結合部位を増加させることに寄与すると考えられるため、多量体モデルはＵＰＲＴａｓｅとＰＲＰＰとの複合体モデルの全体又は一部を用いて作成することも好ましい。【００４０】  上記のように選択された変異を有するＵＰＲＴａｓｅの変異蛋白質を基に、ランダムスクリーニングを行って、さらに活性の高いＣＰＲＴａｓｅを得ることもできる。
また、ＣＰＲＴａｓｅとして得られるＵＰＲＴａｓｅの変異蛋白質は上記のように選択される変異とは別に、副次的に導入される変異や、後述のように相互に変換可能なアミノ酸への置換などのその他の変異を含んでいてもよい。変異蛋白質の製造方法は特に限定されないが、後述の具体的な蛋白質の製造で説明する遺伝子組み換えを用いた方法により製造することができる。【００４１】  １．本発明の蛋白質（ＣＰＲＴａｓｅ）
本発明のＣＰＲＴａｓｅの例として、以下の（ａ）〜（ｄ）に記載の蛋白質を挙げることができる。
（ａ）シトシンからＣＭＰを生成する活性を有する、配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（ｂ）配列番号１、２、または３０で表されるアミノ酸配列において、３６番目、９４番目、１０２番目、１４１番目、１４３番目および１９８番目のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質、
（ｃ）３６番目のアミノ酸残基がシステイン、９４番目のアミノ酸残基がチロシン、１０２番目のアミノ酸残基がシステイン、１４１番目のアミノ酸残基がロイシン、１４３番目のアミノ酸残基がバリン、または１９８番目のアミノ酸残基がグリシンに置換したアミノ酸配列を有する上記（ｂ）の蛋白質、および
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの蛋白質のアミノ酸配列において、３６番目、９４番目、１０２番目、１４１番目、１４３番目、１９８番目、２０１番目、２０４番目および２０５番目以外のアミノ酸残基から選ばれる１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有し、かつシトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。【００４２】  上記（ｂ）および（ｄ）における「他のアミノ酸残基」は天然型、非天然型のいずれのアミノ酸であってもよい。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００４３】  好ましくは上記（ｂ）の他のアミノ酸残基としては、３６番目のアミノ酸残基はシステイン、９４番目のアミノ酸残基はチロシンまたはフェニルアラニン、１０２番目のアミノ酸残基はシステイン、１４１番目のアミノ酸残基はロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニンから選ばれるアミノ酸、１４３番目のアミノ酸残基はバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニンから選ばれるアミノ酸、１９８番目のアミノ酸残基はグリシンをあげることができる。【００４４】  また上記（ｄ）の蛋白質において、相互に置換可能なアミノ酸の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
上記（ｂ）および（ｄ）の蛋白質が、シトシンからＣＭＰを生成する活性を有していることは、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ用いて、ＰｙｒＧ（ＣＴＰシンセターゼ）、ｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）、ｃｄｄ（シチジンデアミナーゼ）の３つの酵素活性を喪失しているエッシェリヒア・コリを形質転換し、得られた形質転換体が、シトシン含有最少培地中で生育できることにより確認することができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、以下の（ｅ）および（ｆ）に記載のＤＮＡ
（ｅ）上記１の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（ｆ）配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
などをあげることができる。
３．本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。
（１）エッシェリヒア・コリ由来のＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡの取得
エッシェリヒア・コリ由来のＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡを取得する方法としては、エッシェリヒア・コリから斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］に従い調製できる染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５で表される塩基配列に基づき設計、合成することができるプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ等により取得する方法等をあげることができる。【００４５】  具体的には、エッシェリヒア・コリＷ３１１０株から染色体ＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを鋳型として、例えば配列番号６および７で表される塩基配列を有するＤＮＡを化学合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより取得できる。上記方法により取得できる具体的なＤＮＡとしては、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。【００４６】  また、配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法によってもエッシェリヒア・コリ由来のＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡを取得することができる。ハイブリダイゼーション法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年（以下、モレキュラー・クローニングと略す）に記載されている方法に準じて行うことができる。【００４７】  さらに、エッシェリヒア・コリ由来のＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡは、配列番号５で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによっても取得できる。
（２）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、上記（１）で得られるエッシェリヒア・コリ由来のＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡに、モレキュラー・クローニングおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載された方法に従い、部位特異変異を導入することにより取得することができる。また、エラープローンＰＣＲ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５６１８（１９８２）］により、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡにランダム変異を導入することによっても取得することができる。【００４８】  また、各種生物由来の既知のＵＰＲＴａｓｅ、例えばＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓなどのＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰの複合体構造を鋳型とし、エッシェリヒア・コリのホモロジーモデルを作成し、このモデルを基にＵＭＰ結合部位付近のアミノ酸残基を抽出し、その中から本来の基質であるウラシルからシトシンへ基質特異性を変換するのに重要な役割を果たすと推定されるアミノ酸残基を選び出し、部位特異的変異を導入してシトシンをＣＭＰへ変換する活性を有する蛋白質を選択することもできる。詳細は上記の「ＣＰＲＴａｓｅの設計」の項目の記載を参照することができる。
４．本発明の蛋白質の製造
上記１の本発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニングやカレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記２の本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて製造することができる。【００４９】  即ち、上記３の方法で取得できるＤＮＡを基にして、必要に応じて本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を作製することができる。【００５０】  また該ＤＮＡ断片の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製することにより、本発明の蛋白質を効率的に製造することもできる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる細菌であればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００５１】  細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有している組換えベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば宿主細胞にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物を用いる場合には、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ８２Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができ、宿主細胞にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物を用いる場合には、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９号公報）、ｐＲＩ１０９（再表２０００−４４８８６号公報：ＷＯ００／４４８８６）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等をあげることができる。【００５２】  プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００５３】  リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は���ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等をあげることができ、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ６８７２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ２１１７１、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９等をあげることができ、さらに好ましくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ２１１７１をあげることができる。【００５４】  組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭５７−１８６４９２号公報、特開昭５７−１８６４９号公報）、電気穿孔法［例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５，４０９６（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１（１９９９）］、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。【００５５】  本発明の蛋白質の生産形態としては、そのままの構造で生産する以外に、モレキュラー・クローニングに記載さ���ている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質として生産することもできる。
本発明の蛋白質は、上記方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より本発明の蛋白質を採取することで得ることができる。【００５６】  該形質転換体の培養は、通常の培養法によって実施することができる。
培養に供する培地としては、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。濃度は５〜４００ｇ／ｌが好ましい。【００５７】  窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。濃度は１〜１００ｇ／ｌが好ましい。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。【００５８】  その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の天然物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は２０℃〜５０℃、好ましくは３０℃〜４２℃が好ましく、培地中のｐＨは、４〜１０、好ましくは５〜８に維持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養時間は１２時間〜６日間、好ましくは１〜３日間である。また、培養中必要に応じて、カナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００５９】  プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００６０】  本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法がある。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３号公報、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００６１】  すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００６２】  本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００６３】  また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収することができる。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化すればよい。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質を正常な立体構造に戻すことができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。【００６４】  本発明の蛋白質、あるいは該蛋白質に糖鎖の付加された蛋白質等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいは該蛋白質の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００６５】  このようにして取得される蛋白質として、上記１の蛋白質をあげることができる。
５．本発明のＣＭＰの製造法
上記４の方法で得られる形質転換体の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸基供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にＣＭＰを生成、蓄積させ、該媒体中からＣＭＰを採取することによりＣＭＰを取得することができる。【００６６】  また、上記４の方法で得られる形質転換体の培養物または該培養物の処理物、コリネバクテリウム属に属する微生物の培養物または該培養物の処理物、シトシン、リン酸基供与体およびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にＣＭＰを生成、蓄積させ、該媒体からＣＭＰを採取することよってもＣＭＰを取得することができる。
形質転換体を培養する方法としては、上記４の形質転換体の培養法と同様の方法を用いればよい。該形質転換体は、湿菌体として０．５〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５〜２００ｇ／ｌの濃度で用いられる。【００６７】  基質として用いるシトシンは、合成品でも天然品でもよい。またシトシンを含有するものであれば精製品、天然物から得られたシトシン含有粗精製物などいずれでもよい。シトシンは１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
エネルギー供与体としてはグルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸、α−ケトグルタル酸などの有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸等の上記した形質転換体が代謝し、細胞内でＡＴＰなどを生成することができる物質であれば、いずれでもよい。これらは５〜２００ｇ／ｌの濃度で用いられる。【００６８】  リン酸基供与体としては正リン酸、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、テトラポリメタリン酸などのポリリン酸、ポリメタリン酸、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムなどの無機のリン酸塩などをあげることができる。これらは１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等をあげることができ、より好ましくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ６８７２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ２１１７１等をあげることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物は、上記４と同様の方法で培養することができる。コリネバクテリウム属に属する微生物は、湿菌体として０．５〜５００ｇ／ｌ、好ましくは５〜２００ｇ／ｌの濃度で用いられる。【００６９】  水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液などＣＭＰ生産反応を阻害しない塩類を含む水溶液があげられる。また形質転換体またはコリネバクテリウム属に属する微生物を培養して得られる培養物の上清をそのまま水性媒体として用いることもできる。
また上記水性媒体には必要に応じて界面活性剤または有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤または有機溶媒を添加することにより、ＣＭＰの生産効率をあげることができる。【００７０】  界面活性剤としては、ポリエチレングリコールステアリルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（例えばサニゾールＢ−５０、花王社製）などのカチオン性界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム（例えばパーソフトＳＬ、日本油脂社製）などのアニオン性界面活性剤、ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート（例えばノニオンＳＴ２２１、日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤、ジメチルラウリルベタイン（例えばニッサンアノンＢＬ、日本油脂社製）などの両性界面活性剤などがあげられ、これらは通常０．１〜２０ｇ／ｌ、好ましくは１〜１０ｇ／ｌの濃度で用いられる。【００７１】  有機溶媒としては、トルエン、キシレン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、これらは通常０．１〜５０ｍｌ／ｌ、好ましくは１〜２０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ＣＭＰの生産反応は通気撹拌等により好気的条件下で行う。反応温度は２０℃〜５０℃、好ましくは３０℃〜４２℃、培地中のｐＨは、４〜１０、好ましくは５〜８に維持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。反応時間は通常１〜４８時間である。【００７２】  反応終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた反応液より、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することによりＣＭＰを単離精製することができる。
また、ＣＭＰを基質として又はＣＭＰを経由して生産される有用物質の製造法において、本発明のＣＭＰの製造法により水性媒体中に生成、蓄積するＣＭＰ又は水性媒体中から採取したＣＭＰを用いることができる。
上記のようにして生産される有用物質としては例えば、シチジン−５’−トリリン酸、ＣＭＰ−シアル酸、ＣＤＰ−コリン等を挙げることができる。
ＣＭＰを基質としてシチジン−５’−トリリン酸を製造する方法としては、例えば特開２００２−０８５０８７号公報および特開２０００−２１７５９３号公報に記載の方法があげることができ、ＣＭＰ−シアル酸を製造する方法としては、例えば特開平５−２７６９７３号公報、ＷＯ２００４００９８３０および特開２００２−０８５０８７号公報に記載の方法をあげることができ、ＣＤＰ−コリンを製造する方法としては、例えば特開昭６３−３１３５９４号公報および特公昭４８−２３５８号公報に記載の方法をあげることができる。
【実施例】  以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７３】例１
活性検出用宿主菌の造成
シトシンとホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）からＣＭＰを生成する酵素活性を検出するための宿主菌ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株を以下のようにして造成した。
（１）シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子（ｃｏｄＡ遺伝子）およびシチジンデアミナーゼをコードする遺伝子（ｃｄｄ遺伝子）欠損株の調製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００の染色体ＤＮＡ上のｃｏｄＡ遺伝子及びｃｄｄ遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０−６６４５（２０００））に準じて作製した。【００７４】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００の染色体ＤＮＡは、該微生物を公知の方法によって培養し、培養後カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により単離精製した。プラスミドｐＫＤ４６、ｐＫＤ３、ｐＫＤ４およびｐＣＰ２０は、エシェリヒア・コリ  ジェネティックストックセンター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、該大腸菌から抽出したものを用いた。【００７５】  配列番号６に表されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのｃｏｄＡ遺伝子を含む塩基配列のうち、塩基番号１‐１０３１番目および２０９４‐３１０５番目で表される塩基配列部分をＰＣＲ反応により増幅した。これらの増幅断片を、ｐＫＤ４を鋳型とし、配列番号７および８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いて増幅して得られた両端にＦＲＴ（ＦＬＰ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔ）サイトを持つａｐｈ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子断片と連結した。【００７６】  該連結断片を、あらかじめｐＫＤ４６を導入し、λ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを誘導発現させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００株にエレクトロポレーション法により導入した。カナマイシン耐性を指標に形質転換体を選択し、染色体上のｃｏｄＡ遺伝子にａｐｈ遺伝子が挿入されたことにより該遺伝子が破壊された株を取得した。
次に配列番号９で表されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのｃｄｄ遺伝子を含む塩基配列のうち、塩基番号１−１０１１番目および１６５６−２５７２番目で表される塩基配列部分をＰＣＲ反応により増幅した。これらの増幅断片を、ｐＫＤ３を鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いて増幅して得られた両端にＦＲＴサイトを持つｃａｔ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子断片を連結した。【００７７】  該連結断片を、λ  Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを誘導発現させた上記で取得したカナマイシン耐性株にエレクトロポレーション法により導入した。カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択し、さらに染色体上のｃｄｄ遺伝子にｃａｔ遺伝子が挿入されたことにより該遺伝子が破壊された株を取得した。
上記で取得したカナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性株からｐＫＤ４６を除去した後、ｐＣＰ２０を導入してＦＬＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを誘導発現させ培養した後、染色体ＤＮＡからａｐｈ、ｃａｔ遺伝子が取り除かれた株を、カナマイシンおよびクロラムフェニコール感受性を指標に選択した後、ｐＣＰ２０を除去した。【００７８】  上記操作で得られた株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００株の染色体ＤＮＡ上の配列番号６で表される塩基配列中の１０３２‐２０９３番目、および配列番号９で表される塩基配列中の１０１２‐１６５５番目で表される塩基配列に相当する部分が欠失している、すなわちｃｏｄＡ遺伝子およびｃｄｄ遺伝子が欠損しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００株であり、該株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００△ｃｏｄＡ△ｃｄｄと命名した。
（２）ＣＴＰシンターゼをコードする遺伝子（ｐｙｒＧ遺伝子）破壊株の調製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４株の染色体ＤＮＡから、ｐｙｒＧ遺伝子の一部である配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡを常法に従って調製し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に連結した。【００７９】  得られた組換えプラスミドＤＮＡをＢｓｔＸＩで消化した後平滑化し、ｐＵＣ４Ｋ（アマシャムバイオサイエンス社から購入）をＢａｍＨＩで消化した後平滑化して得た、ｐＵＣ４Ｋ由来のａｐｈ遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片と連結した。
得られたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化した後精製することで、ｐｙｒＧ遺伝子中にａｐｈ遺伝子が挿入されたことにより該遺伝子が破壊された欠損型ｐｙｒＧ遺伝子断片を取得した。【００８０】  該ＤＮＡ断片をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＣ７６２３株にエレクトロポレーション法により導入し、カナマイシン耐性を指標にして形質転換株を選択し、さらにシチジン要求性を示す株を単離した。
常法に従い、単離した株からＰ１  ｌｙｓａｔｅを調製し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４株に感染させ、カナマイシン耐性を示す株を選択することにより、ｐｙｒＧ遺伝子にａｐｈ遺伝子が挿入されたことにより染色体ＤＮＡ上の該遺伝子が破壊された株を取得し、該株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４△ｐｙｒＧ：：Ｋｍと命名した。
（３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株の調製
常法に従って、上記（２）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４  ｐｙｒＧ：：Ｋｍ株からＰ１  ｌｙｓａｔｅを調製し、上記（１）で得られたＭＣ１０００△ｃｏｄＡ△ｃｄｄ株に感染させ、カナマイシン耐性を指標に形質導入株を選択した。得られた形質導入株はｃｏｄＡ遺伝子およびｃｄｄ遺伝子が欠損し、かつｐｙｒＧ遺伝子が破壊された株であり、該株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００△ｃｏｄＡ△ｃｄｄ△ｐｙｒＧ：：Ｋｍと命名した。【００８１】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株はシチジン要求性で、５０ｍｇ／ｌのシトシンを含むＭ９最少寒天培地［グルコース  １．８ｇ、リン酸一水素ナトリウム  ６ｇ、リン酸二水素カリウム  ３ｇ、塩化ナトリウム  ０．５ｇ、塩化アンモニウム  １ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物  ０．２５ｇ、塩化カルシウム・２水和物  １５ｍｇ、チアミン塩酸塩  １０ｍｇ、Ａｇａｒ−Ｎｏｂｌｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）２０ｇを水１１に含む］では生育できないことを確認した。すなわち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株に変異型ＵＰＲＴａｓｅを発現するプラスミドを導入して得られる形質転換体は、該変異型酵素がシトシンからＣＭＰを生成する活性を有している場合にのみ、シトシンを含むＭ９最少培地で生育可能となる。【００８２】例２
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の野生型ＵＰＲＴａｓｅのクローニング
まず、公知の方法によりエッシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡを調製し、次いで、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３および１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を使用してＰＣＲを行った。【００８３】  ＰＣＲにより得られた約０．７ｋｂの増幅産物をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。該制限酵素処理物をアガロースゲル電気泳動した後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出、精製した。
該ＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）と、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて結合し、得られた結合物を用いてエッシェリヒア・コリ  ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。【００８４】  アンピシリン耐性を指標に形質転換株を選択し、得られた該形質転換株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養した。得られた培養物からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列を解析することで、該プラスミドは、目的とするエッシェリヒア・コリのＵＰＲＴａｓｅ遺伝子を含む約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認し、該プラスミドをｐＥＵＰ１と命名した。【００８５】例３
ＵＰＲＴａｓｅの三次元構造情報の例
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の野生型ＵＰＲＴａｓｅの結晶構造解析を下記に示す通り行った。
＜結晶化用リコンビナント野生型ＵＰＲＴａｓｅの調製＞
Ｘ線結晶構造解析のための結晶調製に用いたリコンビナント野生型ＵＰＲＴａｓｅは以下のように調製した。ＵＰＲＴａｓｅをコードするｕｐｐ遺伝子の読み枠（オープンリーディングフレーム）のアミノ末端はＭｅｔ−１０から開始するものとし、Ｃｙｓ−１６０は分子表面に位置することが予想され精製酵素の濃縮時に凝集の原因となる可能性があったため、これをＳｅｒに置換した。以上の形に対応する遺伝子領域を増幅するため、以下の４種類のプライマーを用い、プラスミドｐＱＥ８２Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社）にクローニングされた野生型ｕｐｐ遺伝子を鋳型として、フュージョンＰＣＲを行なった。【００８６】  配列番号３４および３５で表される塩基配列を有するｐＱＥ＿Ｃ１６０Ｓ＿Ｎ１とｐＱＥ＿Ｃ１６０Ｓ＿Ｎ２、配列番号３６および３７で表される塩基配列を有するｐＱＥ＿Ｃ１６０Ｓ＿Ｃ１とｐＱＥ＿Ｃ１６０Ｓ＿Ｃ２をそれぞれプライマーとしたＰＣＲを別々に行い、それぞれの産物をアガロース電気泳動により精製した。引き続き、それらを混合し鋳型として、ｐＱＥ＿Ｃ１６０Ｓ＿Ｎ１とｐＱＥ＿Ｃ１６０Ｓ＿Ｃ２をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲを行なった。これにより増幅された断片を制限酵素ＢａｍＨＩにより消化し、アガロース電気泳動により精製した後、あらかじめ、制限酵素ＢａｍＨＩにより消化し、それをアルカリフォスファターゼ処理したプラスミドｐＱＥ８２ＬとライゲーションしＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を形質転換した。形質転換株よりプラスミドを単離し塩基配列解析を行なうことにより、アミノ末端にヒスチジンタグを持つ融合蛋白質として配列番号３８で表されるアミノ酸配列を有するＵＰＲＴａｓｅを発現させる構造であることを確認した。このプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株を形質転換し、得られた形質転換株を、以下のＵＰＲＴａｓｅ発現株として用いた。なお、Ｃ１６０Ｓの置換は、酵素の比活性にほとんど影響を与えなかった（データ示さず）。【００８７】  ２Ｌバッフル付きフラスコに入れた５０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを含む２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ培地（１２ｇ／Ｌ  トリプトン、２４ｇ／Ｌ  酵母エキス、９．４ｇ／Ｌ  リン酸水素カリウム、２．２ｇ／Ｌ  リン酸２水素カリウム、４ｍＬ／Ｌ  グリセロール、ｐＨ７．２に調整）に植菌し、３７℃で４時間培養した後、ＯＤ６６０が約２．０になった時点で、最終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃でさらに１２時間培養した。得られた培養液を遠心分離することにより集菌し、沈澱した菌体を破砕緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に再懸濁し、氷浴により冷却しながら超音波処理により菌体を破砕した。これを１００００ｒｐｍで一時間遠心し上清に細胞抽出物を得た。ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製にはＴＡＬＯＮレジン（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いた。５０ｍＬの培養液あたり２００μＬのＴＡＬＯＮレジンを使用した。洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．０、１５ｍＭ  イミダゾール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で洗浄した後、溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｎ���−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  イミダゾール、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で溶出した。以上の操作は室温で行なった。以下の操作は４℃で行なった。この回収画分を陰イオンクロマトグラフィーの平衡化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５）に対して１晩透析した。透析内液を１００００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心分離した後、上清画分のみを回収した。陰イオン交換カラム（ｍｏｎｏＱカラム、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）に添加した。上記緩衝液により十分に平衡化した後、波長２８０ｎｍでのＵＶ吸収を指標に０→０．５Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配によって溶出した。活性画分は２５０〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌの範囲に溶出した。この活性画分に、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＧＴＰの濃度となるよう、ストック溶液を添加した後、ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ−１５を用いて濃縮し、さらに濃縮緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＧＴＰ）を添加し、もとの緩衝液を交換しながら、１８ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。【００８８】＜ＵＰＲＴａｓｅのＸ線結晶構造解析＞
シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行なった。上記で調製したリコンビナントＵＰＲＴａｓｅ濃縮溶液と、０．２ｍＭ  ｄｉ−ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅおよび１５−２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０を含む溶液とを等量ずつ混合し、約１週間静置する事により、０．０５×０．０５×０．１５ｍｍ３程度の柱状結晶が析出した。【００８９】  高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所放射光科学研究施設のビームラインＢＬ５Ａにおいて、ＡＤＳＣ製Ｑｕａｎｔｕｍ  ３１５検出器を用いてＸ線回折データを収集した。波長は１．００００Åに設定し、結晶から検出器までの距離は３５２．４ｍｍに設定した。測定温度は１００Ｋで行なった。１フレーム当たり振動角１°で２０秒間露光した。ＣＣＰ４パッケージのプログラムＭｏｓｆｌｍを用いてデータを処理した結果、Ｒｍｅｒｇｅの値は、１００−２．３Å分解能で１０．８％、最外殻シェルの２．４２−２．３０Å分解能で６１．１％となった。データの完全性は、１００−２．３Å分解能で９２．９％、最外殻シェルの２．４２−２．３０Å分解能で８９．６％となった。結晶は、三方晶系に属し、空間群Ｐ３２２１、格子定数ａ＝ｂ＝７３．１Å、ｃ＝２７９．９Å、α＝β＝９０．０Å、γ＝１２０．０Åであった。結晶の非対称単位中には、４分子のＵＰＲＴａｓｅ分子が含まれ、結晶の溶媒含有率は約４５％であった。【００９０】  ＜立体構造決定＞
構造決定は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ  ＵＰＲＴａｓｅ（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ  １０５０）の単量体構造をサーチモデルとした分子置換法により行った。構造解析プログラムはＭｏｌＲｅｐ（ＣＣＰ４  ｐａｃｋａｇｅ）を、構造精密化プログラムはＣＮＸ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を、構造表示プログラムはＣｏｏｔ（ＣＣＰ４  ｐａｃｋａｇｅ）を、それぞれ用いた。繰り返し精密化作業を行い、水分子、ＧＴＰ分子を含む２．３Å分解能の精密化構造を決定し、Ｒｆａｃｔｏｒは２１．０％（Ｒｆｒｅｅ  ２８．３％）となった。プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫを用いてラマチャンドランプロットを作製したところ、グリシン以外の残基のうち、９０．６％が最も好ましい領域に位置し、全体の９９．９％の残基が許容され得るペプチド結合の二面角を有することが示された。
得られた三次元構造情報（構造座標）を表１に示す。【００９１】
【表１】
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【００９２】例４
ａ）複合体モデルの作成
例３で得られた結晶構造解析結果を用いて、コンピューターグラフィクス上で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴａｓｅのＵＭＰ結合部位にＣＭＰをフィットさせ、結合様式を
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グラムＧｌｉｄｅを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴａｓｅにＵＭＰをドッキングさせ、既知の相互作用様式をもつＵＭＰの配座を選択後、ＵＭＰより８Å以内のアミノ酸残基に対しＭＭＧＢＳＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ−Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ）計算し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴａｓｅとＵＭＰの結合様式モデルを構築させた。次にＵＭＰをＣＭＰにそのまま置き換えて、ＣＭＰより８Å以内のアミノ酸残基に対し、ＭＭＧＢＳＡ計算を行い、ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰとの複合体モデルを作成した。以降の変異型酵素のデザインにはこのモデルを用いることとした。
この複合体モデルをよく観察し、シトシンとの親和性を増大させる変異を設計した。この観察から、まず、シトシンのアミノ基の窒素原子から７．３Åの位置にα炭素原子が存在する２０５位グリシンを、該アミノ基との親和性を上昇させるアミノ酸に置換することが有効であると考えられた。またシトシンのピリミジン環５位の炭素原子）から３．８Åの位置にε炭素原子が存在する１４１位メチオニン、シトシンのピリミジン環６位の炭素原子から４．３Åの位置にβ炭素原子）が存在する１４３位アラニンを、それぞれピリミジン環との親和性を上昇させるアミノ酸に置換することが有効であると考えられた。
上記の３つのアミノ酸残基の位置をよく観察し、置換後のアミノ酸としてそれぞれ、アスパラギン酸（Ｇ２０５Ｄ）、ロイシン（Ｍ１４１Ｌ）、バリン（Ａ１４３Ｖ）を選択して、これら３つのアミノ酸置換を有する変異型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴａｓｅとＣＭＰの複合体モデルを、ＣＭＰより８Å以内のアミノ酸残基に対しＭＭＧＢＳＡ計算を行って、構築した（図２）。【００９３】ＣＭＰと変異型ＵＰＲＴａｓｅの結合様式モデルでは４位のアミノ基の水素原子とＧｌｙ２０７のバックボーンのカルボニル基の酸素原子、および、３位の窒素とＡｌａ２０９のバックボーンのアミド水素原子、２位のカルボニル酸素とＧｌｙ２１０のアミド水素原子との間に水素結合が生じている。
シトシン認識の鍵になる変異であるＡｓｐ２０５とシトシンは、４位アミノ基の水素原子とＡｓｐの側鎖カルボン酸の酸素原子との間に静電相互作用で結合している。したがって、Ａｓｐ２０５は同じ負電荷をもつグルタミン酸でも相互作用できる。
ＣＭＰのピリミジン環は、Ｌｅｕ１４１のメチル基との間でＣＨ／π相互作用で結合している。ＣＭＰとＣＨ／π相互作用で結合するには、Ｌｅｕ１４１がメチル基を持つＩｌｅ、Ｖａｌでもよいと考えられる。さらに、ＣＭＰの５位、６位の水素付近では、Ｖａｌ１４３との間に疎水相互作用で結合していると考えられる。この部位にはもともと空隙が少なく、Ｖａｌより嵩高いアミノ酸であるＬｅｕ、Ｉｌｅでは立体障害が生じる可能性がある。【００９４】また、ＣＭＰと野生型ＵＰＲＴａｓｅの複合体構造解析より、Ｔｙｒ２０１は、Ａｓｐ２０８と水素結合を作ることによって、Ｍｅｔ１４１と共にピリミジン環をサンドイッチし、シトシン結合部位の一部を形成している。この部位はＡｓｐ２０８と相互作用できる、ＬｙｓやＡｒｇでもよいと思われる。【００９５】また、他の種のＵＰＲＴａｓｅの構造解析より、ＰＲＰＰのリン酸基と相互作用すると知られているＡｒｇ１１２がＢ５（５番目のベータストランド）とＢ６（６番目のベータストランド）の間の非常に運動性が高い、フレキシブルループにある（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８）１７：３２１９−３２３２）。フレキシブルループの運動性を制限すれば、Ａｒｇ１１２と基質との親和性が強められる可能性がある。具体的には、Ｂ６上にあるＰｒｏ１２１をＰｒｏより嵩高いＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌなどの疎水アミノ酸に置換すれば、Ｂ６近傍のＡ５（５番目のαヘリックス）上のＬｅｕ１５４やＡｌａ１５０との疎水結合が強まるものと期待される。また、Ｐｒｏ１２１をＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓなどの芳香族アミノ酸に置換すれば、ＣＨ／π相互作用によって、Ｂ６とＡ５の親和性が高まると予想される。【００９６】ｂ）四量体モデルの作成
Ｘ線結晶構造解析の構造情報をもとにそれぞれの単量体同士の境界部分を含む四量体モデルをＩｎｓｉｇｈｔ９７によりグラフィクスで作成した（図３）。グラフィックス上の構造をよく観察し、単量体間の親和性を増大させる変異を設計した。四量体インターフェースに位置する（隣接するＵＰＲＴａｓｅ単量体のいずれかの原子から５Å以内に構成原子が存在する）Ａｒｇ３６においては、もう一方の二量体由来のＡｒｇ３６’と距離的に近く、静電的反発が生じていると思われる。従ってこのアミノ酸を、電荷を持たず、かつ立体障害がない程度の大きさのアミノ酸、例えばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌなどに置換すると、このような反発が除かれ、四量体構造の安定化が期待できる。同じく、Ａｓｐ９４においても同様の理由で静電的反発が生じていると考えられ、これらを電荷のないＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐなどに置換すれば四量体構造が安定化する。また四量体中の静電的反発を除くだけではなく、積極的に四量体間の相互作用を強めることによっても、同様の活性向上が期待できる。例えば、Ｓｅｒ４６をさらに長鎖のアミノ酸、たとえばＡｓｎに置換すると、二量体を形成しているもう一方の単量体のＥ９８’との間に水素結合が生じ、ＣＰＲＴａｓｅ活性向上に繋がると考えられる。
また、相手側の単量体に向かって伸びるβアームが構造上重要であると考えられるが、中でもＴｒｐ６６近傍のアミノ酸に変異を加えることによりＣＰＲＴａｓｅ活性向上につながる可能性がある【００９７】例５
変異型酵素の取得とその評価（その１）
配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＵＰＲＴａｓｅの１４１番目のメチオニン残基を他のアミノ酸に置換することを目的に、配列番号１６で表される塩基配列からなるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡに基づき、配列番号１７で表される塩基配列からなるメチオニン残基をコードする領域を任意の塩基（ｎｎｎ）に置換したＤＮＡ、および該塩基配列と相補的な配列番号１８で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。【００９８】  また、２０１番目のチロシン残基を他のアミノ酸に置換することを目的に、上記と同様に、該領域を任意の塩基に置換した配列番号１９で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および該塩基配列と相補的な配列番号２０で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。
さらに、プラスミドｐＥＵＰ１上において、ＵＰＲＴａｓｅ遺伝子の上流側に相当する配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および下流側の逆鎖に相当する配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡを合成した。【００９９】  配列番号１８および２１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１７および２２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号２０および２１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、並びに配列番号１９および２２で表される塩基配列を有するＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ｐＥＵＰ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して、それぞれＰＣＲを行った。【０１００】  ＰＣＲにより得られた約０．５ｋｂ、約０．３ｋｂ、約０．７ｋｂ、および約０．１ｋｂの増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
得られた約０．５ｋｂと約０．３ｋｂの増幅産物、および約０．７ｋｂと約０．１ｋｂの増幅産物をそれぞれ混合し、この２種類の混合物をそれぞれ鋳型として、配列番号９および１０で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。【０１０１】  上記ＰＣＲにより、それぞれ約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られたので、該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動した後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を抽出、精製した後、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、上記と同様の方法で精製した。
得られたＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａとそれぞれ結合し、該結合体を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株を形質転換した。【０１０２】  アンピシリン耐性を指標にしてそれぞれ形質転換体を選択し、該形質転換体を５０ｍｇ／ｌのシトシンと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９最少寒天培地上にレプリカしたところ、それぞれ１個のシングルコロニーが得られたので、１４１番目のアミノ酸残基の置換体をＲ１株、２０１番目のアミノ酸残基の置換体をＲ２株と命名した。
Ｒ１およびＲ２株が保持するプラスミド中のＵＰＲＴａｓｅ構造遺伝子部分の塩基配列を常法により決定したところ、Ｒ１株では１４１番目のアミノ酸残基がロイシンに、２０５番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）をコードするＤＮＡ、Ｒ２株では２０１番目のアミノ酸残基がリジンに、２０４番目のアミノ酸残基がロイシンに置換した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｙ２０１Ｋ  Ｐ２０４Ｌ）をコードするＤＮＡが見いだされた。【０１０３】  次に、上記で見いだされた４つのアミノ酸残基の置換変異を単独で有する変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ、Ｇ２０５Ｄ、Ｙ２０１Ｋ、Ｐ２０４Ｌ）をコードするＤＮＡを、上記と同様に置換したいアミノ酸に対応するコドンを有するプライマーＤＮＡを用いたＰＣＲ法により取得した。得られた変異型ＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡは、それぞれｐＴｒｃ９９Ａと結合し、該結合体を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株を形質転換した。【０１０４】  形質転換体を、５０ｍｇ／ｌのシトシンと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９最少寒天培地上で培養したところ、２０５番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換した変異体（Ｇ２０５Ｄ）のみが生育した。
次にＲ１およびＲ２株が有する変異型ＵＰＲＴａｓｅのＣＭＰ生成活性を測定することを目的に、ヒスチジンタグを付加した変異型酵素を以下のようにして取得した。【０１０５】  配列番号１６で表される、ＵＰＲＴａｓｅ遺伝子の５’末端領域の塩基配列に相当する、配列番号２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、Ｒ１が保持するプラスミドＤＮＡ、Ｒ２株が保持するプラスミドＤＮＡおよびｐＥＵＰ１をそれぞれ鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。【０１０６】  得られた約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動した後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。
上記で得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した発現ベクターｐＱＥ８２Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）とそれぞれ結合し、該結合体を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換体をアンピシリン耐性を指標に選択した。【０１０７】  得られた３種の形質転換体をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３０℃にて一晩種培養した後、得られた培養物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴｅｒｉｆｆｉｃ培地〔バクトトリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール４ｍｌを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に１％植菌して３０℃にて８時間培養した。ＩＰＴＧを終濃度１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加し、さらに６時間培養した後、培養物を遠心分離して菌体を取得した。【０１０８】  該菌体を超音波破砕して粗酵素液を調製し、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ  Ｃｏｕｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてヒスチジンタグが付加した酵素をそれぞれ精製した。
該精製酵素を反応液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／ｌ  リン酸一カリウム、５ｍｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウム、５ｍｍｏｌ／ｌ  シトシン、１ｍｍｏｌ／ｌ  グアノシン５’−トリリン酸、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＲＰＰ〕に添加し、３１℃にて反応を行い、生成するＣＭＰを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。タンパク濃度はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて測定した。【０１０９】  一方、ＵＭＰ生成活性については、ヒスチジンタグを付加していない酵素の発現株（宿主はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株）より調製した粗酵素抽出液を反応液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／ｌ  リン酸一カリウム、５ｍｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウム、５ｍｍｏｌ／ｌ  ウラシル、１ｍｍｏｌ／ｌ  グアノシン５’−トリリン酸、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＲＰＰ〕に添加し、３１℃にて反応を行い、生成するＵＭＰをＨＰＬＣにより定量した。結果を表２に示す。【０１１０】
【表２】
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【０１１１】  表２から明らかなように、野生型酵素ではＣＭＰ生成活性は検出されなかったのに対し、Ｒ１およびＲ２株が生産する変異型酵素（Ｙ２０１Ｋ  Ｐ２０４ＬおよびＭ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）では明らかな生成活性が認められた。
またＣＭＰ生成活性の上昇に応じて本来の活性であるＵＭＰ生成活性は顕著に減少していたことから、ウラシルからシトシンへの基質特異性の変換が起きていることが明らかとなった。【０１１２】  ４種の単独変異体の活性を比較するとＧ２０５Ｄ変異体のみがシトシン添加Ｍ９最少培地での生育が見られ、ＵＭＰ生成活性が大幅に減少していたことから、Ｇ２０５Ｄ変異が特にシトシンの認識に重要な役割を果たしていると考えられた。【０１１３】例６
変異型酵素の取得とその評価（その２）
例５で得られたＭ１４１Ｌのアミノ酸置換変異を有するＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡをベクターｐＴｒｃ９９Ａに連結したプラスミドを鋳型として、配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号２３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、例５と同様にしてＭ１４１Ｌのアミノ酸置換変異を有するＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡがｐＱＥ８２Ｌに連結したプラスミドを得た。【０１１４】  得られたプラスミドを鋳型として、例５と同様に２０５番目のアミノ酸残基に対応するコドンにグルタミン酸をコードするコドンを有するプライマーＤＮＡを用いたＰＣＲを行ない、１４１番目のアミノ酸残基がロイシンに、２０５番目のグリシンがグルタミン酸に置換した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｅ）をコードするＤＮＡ断片を取得した。【０１１５】  該ＤＮＡ断片をＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断しｐＱＥ８２Ｌと連結し、１４１番目のアミノ酸残基がロイシンに、２０５番目のグリシンがグルタミン酸に置換した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｅ）をヒスチジンタグが付加した状態で発現するプラスミドを取得した。
該変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１ｌ  Ｇ２０５Ｅ）を発現するプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換体をアンピシリン耐性を指標に選択した。
上記で得られた変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｅ）を発現する形質転換体および例５で得られた変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）を発現する形質転換体を用いて例５と同様の手順により、それぞれヒスチジンタグが付加した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｅ）および変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）を精製した。【０１１６】  該精製酵素を反応液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ  シトシン、１ｍｍｏｌ／ｌ  グアノシン５’−トリリン酸、３ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＲＰＰ〕に添加し、３２℃にて反応を行い、生成するＣＭＰを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。タンパク質濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて測定した。結果を表３に示す。【０１１７】
【表３】
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【０１１８】  表３から明らかなように、２０５番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｅ）でも、２０５番目のアミノ酸がアスパラギン酸に置換した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）と同様に、明らかなＣＭＰ生成活性が認められた。【０１１９】例７
変異型酵素の取得とその評価（その３）
例５で得られたＧ２０５Ｄのアミノ酸置換変異を有するＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡをベクターｐＴｒｃ９９Ａに連結したプラスミドを鋳型として、配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号２３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、例５と同様にしてＧ２０５Ｄのアミノ酸置換変異を有するＵＰＲＴａｓｅをコードするＤＮＡがｐＱＥ８２Ｌに連結したプラスミドを得た。
該変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｇ２０５Ｄ）を発現するプラスミドを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換体をアンピシリン耐性を指標に選択した。
上記で得られた変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｇ２０５Ｄ）を発現する形質転換体および例５で得られた変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）を発現する形質転換体を用いて例５と同様の手順により、それぞれヒスチジンタグが付加した変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｇ２０５Ｄ）および変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）を精製した。
該精製酵素を反応液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウム、４ｍｍｏｌ／ｌ  シトシン、１ｍｍｏｌ／ｌ  グアノシン５’−トリリン酸、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＲＰＰ〕に添加し、３２℃にて反応を行い、生成するＣＭＰを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。タンパク質濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて測定した。結果を表４に示す。【０１２０】
【表４】
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【０１２１】  表４から明らかなように、２０５番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換のみを有する変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｇ２０５Ｄ）も、１４１番目のアミノ酸のロイシンへの置換および２０５番目のアミノ酸のアスパラギン酸への置換を有する変異型ＵＰＲＴａｓｅ（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）と同様に、明らかなＣＭＰ生成活性を有することがわかった。【０１２２】例８
活性上昇変異酵素の取得とその評価
例５で取得したＲ２株が保持するプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して、０．３ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２の共存下でエラープローンＰＣＲを行った。【０１２３】  得られた約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動した後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した後、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。該ＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａと結合し、得られた結合体を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株を形質転換した。【０１２４】  アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択し、得られた形質転換体を７ｍｇ／ｌの５−フルオロシトシンまたは７ｍｇ／ｌの２，５，６−トリアミノ４−ヒドロキシピリミジンを含むＭ９最少寒天培地（シトシン５０ｍｇ／Ｌと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）上に約１５０００株ずつそれぞれレプリカして生育を調べた。
その結果、５−フルオロシトシンを含むプレート上で２株（ＦＣ３５−１、ＦＣ３５−２と命名）、２，５，６−トリアミノ４−ヒドロキシピリミジンを含むプレート上で１株（ＴＡ３５−１と命名）がコロニーを形成した。【０１２５】  ＦＣ３５−１、ＦＣ３５−２およびＴＡ３５−１株よりそれぞれプラスミドＤＮＡを抽出し、ＵＰＲＴａｓｅ構造遺伝子部分の塩基配列を決定したところ、ＦＣ３５−１株が保持する変異型酵素遺伝子は１０２番目のアミノ酸残基がシステイン、１９８番目のアミノ酸残基がグリシンに、ＦＣ３５−２株が保持する変異型酵素遺伝子は９４番目のアミノ酸残基がチロシンに、ＴＡ３５−１株が保持する変異型酵素遺伝子は３６番目のアミノ酸残基がシステインに、１９８番目のアミノ酸残基がグリシンにそれぞれ置換した酵素をコードしていた。【０１２６】  また、該プラスミドＤＮＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換して得られた３種の形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養後、培養物から粗酵素抽出液を調製してＣＭＰ生成活性を測定した。結果を表５に示す。【０１２７】
【表５】
2008038149.tif 000193
【０１２８】  表５から明らかなように、シトシンアナログである５−フルオロシトシンまたは２，５，６−トリアミノ４−ヒドロキシピリミジンに対する耐性を指標として取得した３株（ＦＣ３５−１、ＦＣ３５−２、ＴＡ３５−１）の生産するＵＰＲＴａｓｅ変異酵素には、鋳型とした変異酵素が有する２個のアミノ酸残基の置換変異（Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ）に加えて、新たに１または２個のアミノ酸残基の置換変異が見いだされ、該変異酵素のＣＭＰ生成活性は鋳型とした変異酵素発現株と比較して１．８から４０倍に上昇していた。【０１２９】例９
部位特異的変異による活性上昇変異酵素の取得と評価
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＵＰＲＴａｓｅのホモロジーモデルを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＵＰＲＴａｓｅのＵＭＰ複合体構造（ＰＤＢコード１Ｉ５Ｅ）を鋳型とし、プログラムＩｎｓｉｇｈｔ９７によって作成した。
次にプログラムＣＨＡＲＭＭ２２の分子力場を用い、エネルギー極小化させたＵＭＰ結合体モデルを作成した。該モデルを基に、Ｍ１４１Ｌ  Ｇ２０５Ｄ変異酵素のＣＭＰ複合体モデルを作成し、エネルギー極小化を行った。この複合体モデルでは、ＣＭＰのＨ５／Ｈ６付近に空隙が見られたことから、この空隙を埋めるために１４３番目のアラニン残基をバリン、ロイシン、イソロイシンなどの嵩高い疎水性アミノ酸に置換することによりＣＭＰとの結合の上昇が期待された。【０１３０】  そこで、部位特異的変異導入により１４３番目のアラニン残基をバリンに置換する目的で、配列番号１６で表される塩基配列に基づき、アラニン残基をコードするコドン（ＧＣＡ）をバリン残基をコードするコドン（ＧＴＴ）に置換した塩基配列（配列番号２４で表される塩基配列）を有するＤＮＡ、および該塩基配列と相補的な相補配列（配列番号２５で表される塩基配列）からなるＤＮＡを合成した。【０１３１】  配列番号２５および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、並びに配列番号２４および２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、ＴＡ３５−１株が保持するプラスミドＤＮＡを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲで得られた約０．５ｋｂおよび約０．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片産物をアガロースゲル電気泳動した後、精製した。【０１３２】  次に上記で得られた２種の増幅ＤＮＡ断片を混合したものを鋳型とし、配列番号２１および２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲで得られた約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動した後、精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。【０１３３】  該ＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａと結合し、得られた結合産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして形質転換体を選択した。
該形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＵＰＲＴａｓｅ構造遺伝子部分の塩基配列を常法により決定することにより、１４３番目のアラニン残基がバリンに置換した変異酵素をコードするＤＮＡが取得されていることを確認し、該プラスミドＤＮＡをｐＡ１４３ＶＴＡ３５−１と命名した。【０１３４】  次に、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、培養物から粗酵素抽出液を調製してＣＭＰ生成活性を測定したところ、もとのＴＡ３５−１株が生産する変異酵素と比較して約２．５倍比活性が上昇していた。【０１３５】例１０
活性上昇変異酵素の取得とその評価（その２）
例９で取得したＡ１４３ＶＴＡ３５−１株が保持するプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して、０．３ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２の共存下でエラープローンＰＣＲを行った。【０１３６】  例８と同様に、得られた約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動した後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した後、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。
該ＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａと結合し、得られた結合体を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００  ΔｃｏｄＡ  Δｃｄｄ  ΔｐｙｒＧ：：Ｋｍ株を形質転換した。【０１３７】  アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択し、得られた形質転換体を４０ｍｇ／ｌの５−フルオロシトシンまたは５０ｍｇ／ｌの５−メチルシトシンを含むＭ９最少寒天培地（シトシン４０ｍｇ／Ｌと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）上に約１５０００株ずつそれぞれレプリカして生育を調べた。
その結果、５−フルオロシトシンを含むプレート上で１株（ＦＣ−５と命名）、５−メチルシトシンを含むプレート上で２株（ＭＣ−８、ＭＣ−２１と命名）がコロニーを形成した。【０１３８】  ＦＣ−５、ＭＣ−８およびＭＣ−２１株よりそれぞれプラスミドＤＮＡを抽出し、ＵＰＲＴａｓｅ構造遺伝子部分の塩基配列を決定したところ、ＦＣ−５株が保持する変異型酵素遺伝子は１６７番目のアミノ酸残基がアラニンに、ＭＣ−８株が保持する変異型酵素遺伝子は４６番目のアミノ酸残基がアスパラギンに、ＦＣ−５株が保持する変異型酵素遺伝子は１２１番目のアミノ酸残基がイソロイシンに、それぞれ置換した酵素をコードしていた。【０１３９】  また、該プラスミドＤＮＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換して得られた３種の形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養後、培養物から粗酵素抽出液を調製してＣＭＰ生成活性を測定した。結果を表６に示す。【０１４０】
【表６】
2008038149.tif 000194
【０１４１】  表６から明らかなように、シトシンアナログである５−フルオロシトシンまたは５−メチルシトシンに対する耐性を指標として取得した３株（ＦＣ−５、ＭＣ−８およびＭＣ−２１）の生産するＵＰＲＴａｓｅ変異酵素には、鋳型とした変異酵素が有する４個のアミノ酸残基の置換変異（Ｍ１４１Ｌ、Ｇ２０５Ｄ、Ｒ３６Ｃ、Ｅ１９８Ｇ）に加えて、新たに１個のアミノ酸残基の置換変異が見いだされ、該変異酵素のＣＭＰ生成活性は鋳型とした変異酵素発現株と比較して１．３から２．３倍に上昇していた。【０１４２】例１１
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスを宿主としたＣＭＰ生産菌の造成
塩基からヌクレオチドへのサルベージ合成を行う場合、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスはＰＲＰＰ供給能力が高く、工業化実績も豊富であることから、生産反応の宿主として好適である。そこでコリネバクテリウム・アンモニアゲネスでＵＰＲＴａｓｅ変異酵素を発現するプラスミドを以下のようにして構築した。【０１４３】  例９で取得したプラスミドｐＡ１４３ＶＴＡ３５−１を鋳型とし、配列番号２６で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
得られた約０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断した。【０１４４】  また、コリネ型細菌で発現するプロモーター配列ｐ５４−６（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ１３２５８２）を含む、配列番号２７で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＣＳ２９９Ｐ（特願平１１−１１０４３７：ＷＯ００／６３３８８）のＳｓｅ８３８７Ｉ−ＢａｍＨＩ部位に挿入して取得した発現ベクターｐＲＩ１０９を、同じくＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断し、上記したＤＮＡ断片と結合した。得られた結合物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を形質転換し、カナマイシン耐性を指標として形質転換体を選択した。【０１４５】  得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素切断解析および塩基配列解析を行い、目的とする変異型ＵＰＲＴａｓｅ遺伝子を含む約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡが取得されていることを確認し、該プラスミドＤＮＡをｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１と命名した。
次にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０株にプラスミドｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１を、電気穿孔法〔ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ，６５，２９９（１９８９）〕により導入し、カナマイシン耐性を指標にして形質転換体を選択し、得られた形質転換体をコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１と命名した。【０１４６】例１２
ＣＭＰ生産試験（１）
例１１で取得したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む種培地１〔グルコース５０ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ、イーストエキス（日本製薬社製）１０ｇ、尿素５ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物１ｇ、硫酸鉄・七水和物１０ｍｇ、硫酸亜鉛・七水和物１０ｍｇ、塩化カルシウム・二水和物１００ｍｇ、硫酸マンガン・五水和物２０ｍｇ、Ｌ−システイン２０ｍｇ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１０ｍｇ、ビタミンＢ１５ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇおよびビオチン３０μｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕が１０ｍｌの入った大型試験管に一白金耳接種し、３０℃、２４時間、３００ｒｐｍにて往復振盪培養した。【０１４７】  次に、得られた培養物４ｍｌを上記と同一組成の液体培地が２５０ｍｌ入った２Ｌ容バッフル付三角フラスコに接種し、３０℃、２４時間、１９０ｒｐｍにて回転振盪培養した。
得られた培養物全量を種培地２〔グルコース１００ｇ、エルリッヒカツオエキス（極東製薬工業社製）１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物１ｇ、硫酸鉄・七水和物２０ｍｇ、硫酸亜鉛・七水和物１０ｍｇ、塩化カルシウム・二水和物１００ｍｇ、硫酸マンガン・五水和物４．１ｍｇ、β−アラニン１５ｍｇ、Ｌ−システイン２０ｍｇ、ビオチン１００μｇ、尿素２ｇ（別殺菌）およびビタミンＢ１５ｍｇ（別殺菌）を水０．９Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕が２．２５Ｌ入った５Ｌ容発酵槽に接種し、３２℃、通気量２．５Ｌ／分、６００ｒｐｍにて、濃アンモニア水でｐＨ６．８に調整しつつ通気攪拌培養した。【０１４８】  培養液上清中のグルコースが消費された時点で培養液２５０ｍｌを無菌的に採取し、生産培地〔グルコース１５０ｇ、リン酸二水素カリウム１０ｇ、リン酸水素二カリウム１０ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物５ｇ、硫酸鉄・七水和物２０ｍｇ、硫酸亜鉛・七水和物１０ｍｇ、塩化カルシウム・二水和物１００ｍｇ、硫酸マンガン・五水和物２０ｍｇ、硫酸銅・五水和物５ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇ、β−アラニン１５ｍｇ、グルタミン酸１ｇ、Ｌ−システイン２０ｍｇ、ビオチン１００μｇ、尿素２ｇ（別殺菌）およびビタミンＢ１５ｍｇ（別殺菌）を水０．９Ｌに含み、ｐＨ６．８に調整した培地〕２．２５Ｌが入った５Ｌ容発酵槽に接種し、３２℃、通気量２．５Ｌ／分、６００ｒｐｍにて、濃アンモニア水でｐＨ６．８に調整しつつ通気攪拌培養した。【０１４９】  培養液上清中のグルコースが消費された時点で、培養物４０ｍｌを採取し２５０ｍｌ容マイクロジャー（エイブル社製、ＢＭＪ−２５）に入れ、これにグルコース５．２ｇ、シトシン３００ｍｇ、サニゾールＢ−５０  １２０ｍｇを添加し、３２℃、通気量２０ｍｌ／分、１１００ｒｐｍにて、４ｍｏｌ／ｌ  ＫＯＨでｐＨ７．６に調整しつつＣＭＰ生産反応を行った。その結果、反応開始から２４時間でＣＭＰが２１．５ｇ／Ｌ（５８．７ｍｍｏｌ／ｌ）生成した。このときＣＤＰ，ＣＴＰの副生はそれぞれ１．６ｍｍｏｌ／ｌ、０ｍｍｏｌ／ｌであり、添加したシトシンからＣＭＰへの転換率は約８７％であった。【０１５０】例１３
ＣＭＰ生産試験（２）
例９で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＡ１４３ＶＴＡ３５−１株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地が１０ｍｌ入った大型試験管に一白金耳接種し、３０℃、１８時間、３００ｒｐｍにて往復振盪培養した。次に、得られた培養物３ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地が３００ｍｌ入った２Ｌ容バッフル付三角フラスコに接種し、３０℃、２０時間、１９０ｒｐｍにて回転振盪培養した。培養終了後、培養物を遠心分離して菌体を取得した。【０１５１】  一方、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０株をカナマイシンを含まない条件下で例９と同じ方法で５Ｌ容発酵槽にて培養した。得られた培養物４０ｍｌを２５０ｍｌ容マイクロジャーに入れ、これに上記で取得したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＡ１４３ＶＴＡ３５−１株の菌体６００ｍｇ（湿重量）、グルコース４．０ｇ、シトシン４００ｍｇ、サニゾールＢ−５０  １２０ｍｇを添加し、３２℃、通気量２０ｍｌ／分、１１００ｒｐｍにて、４ｍｏｌ／ｌ  ＫＯＨでｐＨ７．６に調整しつつＣＭＰ生産反応をおこなった。その結果、反応開始から２４時間でＣＭＰが１４ｇ／Ｌ（４０ｍｍｏｌ／ｌ）生成した。【０１５２】例１４
ＣＴＰ生産試験
（１）オロット酸からのＣＴＰ生産
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４株にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＣｈｏｌｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｙｔｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅおよびＣｈｏｌｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ遺伝子とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＣＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＫＧ５５を導入したＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株（特開平５−２７６９７４号公報、ＦＥＲＭ  ＢＰ−３７１７）をアンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含むＬ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌを含みｐＨを７．２に調整した培地］２００ｍｌの入った２Ｌバッフル付き三角フラスコに接種し、２５℃にて２４時間２２０ｒｐｍにて回転振とう培養した。この培養液２０ｍｌを、グルコース５ｇ／Ｌ（別殺菌）、ペプトン（極東製薬工業社製）５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物２５０ｍｇ／Ｌ（別殺菌）およびビタミンＢ１  ４ｍｇ／Ｌ（別殺菌）の組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの培養条件下、１４％アンモニア水を用いてｐＨ７．０に調整しつつ培養を行った。【０１５３】  上記種培養液の上清中のグルコースが消費された時点で、培養液を２５０ｍｌ無菌的に採取し、グルコース５ｇ／Ｌ（別殺菌）、ペプトン（極東製薬工業社製）５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物２５０ｍｇ／Ｌ（別殺菌）およびビタミンＢ１  ４ｍｇ／Ｌ（別殺菌））の組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの培養条件下、１４％アンモニア水を用いてｐＨ７．０に調整しつつ培養を行った。
培養中、培養１１時間目から２４時間目までの間、グルコース１６７ｇ／Ｌ、ペプトン１６７ｇ／Ｌの組成からなるフィード液をペリスタポンプにより３０ｍｌ／ｈの速度にて添加した。【０１５４】  例１１で得られたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株培養液５００ｍｌおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株培養液１８５ｍｌをそれぞれ２Ｌ容培養槽に入れ、グルコース４８ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物６．２５ｇ、リン酸二水素カリウム４０ｇ、キシレン１４ｍｌ、オロット酸５ｇを添加し反応液とした。この反応液を、３０℃にて攪拌８００ｒｐｍ、通気量０．３Ｌ／ｍｉｎの条件下、１０ｍｏｌ／ｌのＫＯＨにてｐＨを７．４に保ちつつＣＴＰ生産反応を行い、生成したＣＴＰをＨＰＬＣにより定量した。その結果、反応開始から２０時間でＣＴＰが４．０ｇ／Ｌ（７．２７ｍｍｏｌ／ｌ）生成した。【０１５５】（２）シトシンからのＣＴＰ生産
例１１と同様にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１株を培養し、上清中のグルコースが消費された時点で培養を終了した。２Ｌ容培養槽にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１株の培養液５００ｍｌ、グルコース４８ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物６．２５ｇ、リン酸二水素カリウム４０ｇ、キシレン１４ｍｌ、シトシン５ｇを添加し反応液とした。この反応液を、３０℃にて攪拌８００ｒｐｍ、通気量０．３Ｌ／ｍｉｎの条件下、１０ｍｏｌ／ｌのＫＯＨにてｐＨを７．４に保ちつつＣＴＰ反応を行い、生成したＣＴＰをＨＰＬＣにより定量した。その結果、反応開始から２０時間でＣＴＰが１４．０ｇ／Ｌ（２５．４ｍｍｏｌ／ｌ）生成した。【０１５６】例１５
ＣＤＰ−コリン生産試験
例１１と同様にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１株を培養し、上清中のグルコースが消費された時点で培養を終了した。２Ｌ容培養槽にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１株の培養液５００ｍｌ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４／ｐＣＫＧ５５株培養液１８５ｍｌ、グルコース４８ｇ、塩化コリン８．４ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物６．２５ｇ、リン酸二水素カリウム４０ｇ、キシレン１４ｍｌ、シトシン５ｇを添加し、反応液とした。この反応液を、３０℃にて攪拌８００ｒｐｍ、通気量０．３Ｌ／ｍｉｎの条件下、１０ｍｏｌ／ｌのＫＯＨにてｐＨを７．４に保ちつつＣＤＰ−コリン生産反応を行い、生成したＣＤＰ−コリンをＨＰＬＣにより定量した。その結果、反応開始から２０時間でＣＤＰ−コリンが０．５ｇ／Ｌ（１．０２ｍｍｏｌ／ｌ）生成した。【０１５７】例１６
ＣＭＰ−シアル酸生産試験
（１）  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ発現株の調製
発現ベクターｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで酵素消化し、３．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、同様にｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで酵素消化し、１．０ｋｂの断片を回収した。該３．５ｋｂと１．０ｋｂの断片を連結し、４．５ｋｂのｐＴｒＳ３１を取得した。
ｐＴｒＳ３１をＣｌａＩおよびＰｓｔＩで酵素消化し得られた３．５ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＰＡＣ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０５４，ＷＯ  ９８／１２３４３）をＣｌａＩおよびＰｓｔＩで酵素消化して得られた２．３ｋｂのＤＮＡ断片とを連結し、５．８ｋｂのｐＮＴ２２を取得した。【０１５８】  配列番号２８および２９で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ２３５株（ＡＴＣＣ１３０２７）の染色体ＤＮＡより、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ遺伝子ｎｅｕＡを含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／ｖｏｌ）を添加し、混合した。【０１５９】  該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を取得し、該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、１．３ｋｂの断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０１６０】  該１．３ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２を公知の方法に従って形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。【０１６１】  得られたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定したところ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｊ０５０２３に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＣＭＰ−シアル酸シンターゼをコードするｎｅｕＡと同じ塩基配列であった。
該プラスミドをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＮＴ２２  ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０１６２】  該１．３ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２を公知の方法に従って形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養して得られた培養物から、ＰＩ５０を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化によって確認し、該プラスミドをｐＴＡ２３と命名した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２をｐＴＡ２３を用いて再度形質転換し、得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＴＡ２３と命名した。【０１６３】  （２）ＣＭＰ−シアル酸生産試験
一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＴＡ２３をアンピシリン５０μｇ／Ｌを含むＬ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌを含みｐＨを７．２に調整した培地］２００ｍｌの入った２Ｌバッフル付き三角フラスコに接種し、２５℃にて２４時間２２０ｒｐｍにて回転振とう培養した。この培養液２０ｍｌを、グルコース５ｇ／Ｌ（別殺菌）、ペプトン（極東製薬工業社製）５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物２５０ｍｇ／Ｌ（別殺菌）およびビタミンＢ１  ４ｍｇ／Ｌ（別殺菌）の組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの培養条件下、１４％アンモニア水を用いてｐＨ７．０に調整しつつ培養を行った。
上記種培養液の上清中のグルコースが消費された時点で、培養液を２５０ｍｌ無菌的に採取し、グルコース５ｇ／Ｌ（別殺菌）、ペプトン（極東製薬工業社製）５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物２５０ｍｇ／Ｌ（別殺菌）およびビタミンＢ１  ４ｍｇ／Ｌ（別殺菌））の組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、培養温度２８℃、攪拌６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの培養条件下、１４％アンモニア水を用いてｐＨ７．０に調整しつつ培養を行った。
培養中、培養１１時間目から２４時間目までの間、グルコース１６７ｇ／Ｌ、ペプトン１６７ｇ／Ｌの組成からなるフィード液をペリスタポンプにより３０ｍｌ／ｈの速度にて添加した。【０１６４】  例１１と同様にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１株を培養し、上清中のグルコースが消費された時点で培養を終了した。２Ｌ容培養槽にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０／ｐＲＡ１４３ＶＴＡ３５−１株の培養液５００ｍｌとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２／ｐＴＡ２３株の培養液１８５ｍｌ、フラクトース４８ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物６．２５ｇ、リン酸二水素カリウム４０ｇ、キシレン１４ｍｌ、シトシン５ｇ、シアル酸１４ｇを添加した。これら混合液を、３０℃にて攪拌８００ｒｐｍ、通気量０．３Ｌ／ｍｉｎの条件下、１０ｍｏｌ／ｌのＫＯＨにてｐＨを７．４に保ちつつＣＭＰ−シアル酸反応を行い、生成したＣＭＰ−シアル酸をＨＰＬＣにより定量した。その結果、反応開始から２０時間でＣＭＰ−シアル酸が４．５ｇ／Ｌ（７．０７ｍｍｏｌ／ｌ）生成した。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】  本発明により、シトシンからＣＭＰを生成する活性を有する蛋白質を得ることができる。この蛋白質を用いてＣＭＰを安価、かつ効率よく生産することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１６６】配列番号１−人工配列の説明：変異蛋白質
配列番号２−人工配列の説明：変異蛋白質
配列番号３−人工配列の説明：変異ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：変異ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：変異ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：変異蛋白質
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：変異蛋白質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月21日(2008.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】追加
【補正の内容】
【０１６７】
【配列表】
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