(57)【要約】  アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を接触させた場合の前立腺特異抗原産生量または細胞数と、試験化合物を接触させない場合の前立腺特異抗原産生量または細胞数を測定し、比較する工程を含む、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
連結されたＰＳＡプロモーターとレポーター遺伝子が組み込まれたアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を接触させた場合と試験化合物を接触させない場合のレポーター遺伝子の発現量を測定し、比較する工程を含む、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞がＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来の細胞である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞が、ＬＮＣａＰ−ｈｒである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
抗癌薬のスクリーニング方法である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺細胞を移植した動物モデルを用いることを特徴とする、抗腫瘍作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
モデル動物にアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を移植し、該モデル動物に試験化合物を投与した場合と投与しない場合の細胞増殖の状態を測定し、比較する工程を含む、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞がＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来の細胞である請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞が、ＬＮＣａＰ−ｈｒである請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
動物モデルがマウスまたはラットである請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を含んでなる、前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を含んでなる、抗腫瘍作用を有する化合物のスクリーニング用キット。
【請求項１４】
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞が、ＬＮＣａＰ−ｈｒである請求項１２又は１３記載のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンドロゲンは精巣および副腎皮質で合成され、標的臓器でアンドロゲン受容体に結合し、様々な生理活性を発揮する、いわゆる男性ホルモンである。天然のアンドロゲンは化学的にはすべてC19ステロイドに属する。その中で主要なアンドロゲンは、主として精巣で合成されるテストステロンであり、標的細胞への取り込み、生理活性が強い。女性では副腎皮質が主要なアンドロゲン供給源となっている。
アンドロゲンは生殖器官（前立腺、精嚢、副精巣、精管など）の発育・機能維持、胎生期の性分化、精子形成、二次性徴の発現（筋肉骨格、音声、脂肪分布などの雄性化の誘起など）、筋肉などでのタンパク質同化の促進作用、骨代謝への作用などがある。【０００３】
アンドロゲンが病態の進行に関わっている場合には、アンドロゲンを低下させる治療が行われる。例えば、アンドロゲン依存性の前立腺癌では、去勢術（外科的去勢術、薬物による去勢術）、アンドロゲン受容体拮抗薬投与などのホルモン療法等により、テストステロンおよびその活性代謝物であるジヒドロテストステロンを低下させるか、あるいはその作用に拮抗することで、治療効果を上げている。
アンドロゲンを低下させる治療療法によって増殖が一旦抑制された後、再び増殖能を獲得した前立腺癌は、アンドロゲン非依存性前立腺癌とよばれる。
アンドロゲン依存性前立腺癌の患者に対してホルモン療法等の治療を行うと、腫瘍マーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ、Prostate Specific Antigen）の血中濃度は低下する。しかしながらホルモン療法を続けても一定期間の後、一旦低下した血中ＰＳＡ濃度の持続的上昇が観察される。このようにホルモン療法に不応答になった前立腺癌もアンドロゲン非依存性前立腺癌とよばれる。
従来のアンドロゲン受容体拮抗薬は、アンドロゲン依存性前立腺癌モデル細胞に対しては拮抗薬として、アンドロゲン非依存性前立腺癌モデル細胞に対しては作動薬として働くか、あるいは作用がない。アンドロゲン依存性前立腺癌モデル細胞およびアンドロゲン非依存性前立腺癌モデル細胞の両者に対して拮抗薬としてはたらく化合物を見出すことができれば、該化合物はアンドロゲン非依存性前立腺癌の治療薬として使用できる可能性がある。【０００４】
アンドロゲン拮抗薬のスクリーニング方法は、特許文献１ないし４、および、非特許文献１ないし１２に記載されているが、いずれのスクリーニング方法も、アンドロゲン依存性前立腺癌モデル細胞およびアンドロゲン非依存性前立腺癌モデル細胞の両者に対して拮抗薬としてはたらく化合物を見出すことができるスクリーニング方法ではない。
株化されたヒト前立腺癌細胞としては、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ、ＬＮＣａＰ−ｈｒが知られている（非特許文献１３）。
【特許文献１】WO03/057669号パンフレット
【特許文献２】WO2004/016576号パンフレット
【特許文献３】WO2006/064944号パンフレット
【特許文献４】WO2007/015567号パンフレット
【非特許文献１】Journal of Medicinal Chemistry, 1973, 16(5), 512-516
【非特許文献２】J. Med. Chem., 1988, 31, 954-959
【非特許文献３】J. Med. Chem., 1991, 34, 447-455
【非特許文献４】J. Med. Chem., 1998, 41, 623-639
【非特許文献５】Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10, (2002), 1555-
【非特許文献６】Eur. J. Med. Chem., 37, (2002), 619-634
【非特許文献７】Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 15, (2005), 271-276
【非特許文献８】Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 15, (2005), 389-393
【非特許文献９】Chem. Pharm. Bull., 53(4), 402-409, (2005)
【非特許文献１０】Bioorganic & Medicinal Chemistry 13, (2005), 2837-2846
【非特許文献１１】Bioorganic & Medicinal Chemistry 13, (2005), 6414-6424
【非特許文献１２】J. Med. Chem., 2006, 49, 716-726
【非特許文献１３】J ancer Res. 2003 Jan 1;63(1):149-53
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アンドロゲン非依存性前立腺癌の前立腺特異抗原産生に対する阻害作用および／または同癌の増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることにより、簡便にアンドロゲン非依存性前立腺癌の前立腺特異抗原産生に対する阻害作用および／または同癌の増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニングが行えることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、
〔１〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法。
〔２〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を接触させた場合のＰＳＡ産生量または細胞数と、試験化合物を接触させない場合のＰＳＡ産生量または細胞数を測定し、比較する工程を含む、上記〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔３〕
連結されたＰＳＡプロモーターとレポーター遺伝子が組み込まれたアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を接触させた場合と試験化合物を接触させない場合のレポーター遺伝子の発現量を測定し、比較する工程を含む、上記〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔４〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞がＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来の細胞である上記〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔５〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞が、ＬＮＣａＰ−ｈｒである上記〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔６〕
抗癌薬のスクリーニング方法である上記〔１〕記載のスクリーニング方法。
〔７〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺細胞を移植した動物モデルを用いることを特徴とする、抗腫瘍作用を有する化合物のスクリーニング方法。
〔８〕
モデル動物にアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を移植し、該モデル動物に試験化合物を投与した場合と投与しない場合の細胞増殖の状態を測定し、比較する工程を含む、上記〔７〕記載のスクリーニング方法。
〔９〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞がＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来の細胞である上記〔７〕記載のスクリーニング方法。
〔１０〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞が、ＬＮＣａＰ−ｈｒである上記〔７〕記載のスクリーニング方法。
〔１１〕
動物モデルがマウスまたはラットである上記〔７〕記載のスクリーニング方法。
〔１２〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を含んでなる、前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング用キット。
〔１３〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を含んでなる、抗腫瘍作用を有する化合物のスクリーニング用キット。
〔１４〕
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞が、ＬＮＣａＰ−ｈｒである上記〔１２〕又は〔１３〕記載のスクリーニング用キット。
等に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、アンドロゲン非依存性前立腺癌の前立腺特異抗原産生に対する阻害作用および／または同癌の増殖抑制作用を有する化合物を簡便に選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１ａ】実施例１における化合物１を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｂ】実施例１における化合物２を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｃ】実施例１における化合物３を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｄ】実施例１における化合物４を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｅ】実施例１における化合物５を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｆ】実施例１における化合物６を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｇ】実施例１における化合物７を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｈ】実施例１における化合物８を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図１ｉ】実施例１における化合物９を用いた場合の細胞数の増減を示すグラフであり。縦軸に細胞数（細胞数／ウェル）、横軸に薬物濃度（μＭ）を示す
【図２ａ】実施例１における化合物１を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｂ】実施例１における化合物２を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｃ】実施例１における化合物３を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｄ】実施例１における化合物４を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｅ】実施例１における化合物５を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｆ】実施例１における化合物６を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｇ】実施例１における化合物７を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｈ】実施例１における化合物８を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図２ｉ】実施例１における化合物９を用いた場合のＰＳＡ産生量を示すグラフである。縦軸にＰＳＡ産生量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸に薬物濃度を示す。
【図３ａ】実施例３における化合物６を用いた場合のレポーター活性を示すグラフである。縦軸にレポーター活性（％）、横軸に薬物濃度を示す。
【図３ｂ】実施例３における化合物８を用いた場合のレポーター活性を示すグラフである。縦軸にレポーター活性（％）、横軸に薬物濃度を示す。
【図３ｃ】実施例３における化合物９を用いた場合のレポーター活性を示すグラフである。縦軸にレポーター活性（％）、横軸に薬物濃度を示す。
【図３ｄ】実施例３における陰性対照化合物 ビタルカミドを用いた場合のレポーター活性を示すグラフである。縦軸にレポーター活性（％）、横軸に薬物濃度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のアンドロゲン非依存性前立腺癌の前立腺特異抗原産生に対する阻害作用および／または同癌の増殖抑制作用を有する化合物のスクリーニング方法は、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とする。
ここで、「アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞」とは、ステロイド（例えば、野生型または変異型アンドロゲン受容体に結合する分子、具体的には、例えば、アンドロゲン、プロゲステロン、グルココルチコイド、エストロゲン）が実質的に存在しない培養条件において増殖能を示すヒト前立腺癌細胞を意味する。
アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては、例えば、（i）ステロイドが実質的に存在しない培養条件において増殖が抑制されるヒト前立腺癌細胞（親株）を由来とし、ステロイドが実質的に存在しない培養条件における増殖能が親株よりも高いヒト前立腺癌細胞、（ii）ホルモン療法によって一旦血中ＰＳＡ濃度が低下した後に再度ＰＳＡ濃度が上昇した前立腺癌患者由来のヒト前立腺癌細胞等が挙げられる。なお、(i)記載の親株には、ステロイドが実質的に存在しない培養条件において増殖速度が抑制されるヒト前立腺癌細胞、及び該条件において増殖することができない細胞が含まれる。
好ましいアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては、例えば、(i)記載の性質に加えて、(iii)親株よりもＰＳＡの基礎産生量が上昇している及び／又は(iv) 親株の場合よりも低濃度のアンドロゲン刺激よって親株と同程度のＰＳＡ産生量を示す細胞、が挙げられる。(iii)の細胞としては、親株よりも１.２倍以上、好ましくは１.２倍〜３０倍のＰＳＡの基礎産生量を示す細胞が挙げられる。また、(iv)の細胞としては、親株の場合の１／３以下、好ましくは１／３〜１／３０の濃度のアンドロゲン刺激によって、親株と同程度のＰＳＡ産生量を示す細胞が挙げられる。
上記(i)の細胞は、例えば、ステロイドが実質的に存在しない培養条件において増殖が抑制されるヒト前立腺癌細胞（親株）をステロイドが実質的に存在しない培養条件において培養し、親株よりも高い増殖能を獲得した亜株を選択することにより得られる。親株として使用できるヒト前立腺癌細胞とは、例えば、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ（ATCC CRL-1740）である。
本発明のアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては、例えば、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣを由来とする細胞、具体的には、参考例記載のヒト前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ−ｈｒ等があげられる。ＬＮＣａＰ−ＦＧＣを由来とする細胞は、例えば次の方法により得られる。まず、親株であるＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞をチャコールデキストランによりステロイドを除去した血清をふくむ培地（例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地等、特に、ＲＰＭＩ１６４０培地）で培養する。細胞が、一旦増殖が抑制された後増殖を再開した後も同じ条件で培養を続け、増殖速度、ＰＳＡ産生量、細胞形状等の形質を安定させた細胞を得る。
ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞においては、アンドロゲン反応性の蛋白質であるＰＳＡの基礎産生量が、親株（ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞）よりも上昇している。また、ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞は、親株の場合よりも低濃度のアンドロゲン刺激によって、親株と同程度のＰＳＡ産生量を示す。したがって、ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞は、親株よりもアンドロゲン刺激に高反応性の細胞と考えられる。ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞においては、従来のアンドロゲン受容体拮抗薬のビカルタミドは高濃度ではＰＳＡ産生にアゴニストとして作用し、ビカルタミドによる細胞増殖の抑制も、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣの場合よりはるかに弱い。これは臨床でのホルモン療法抵抗性癌の性質と類似する。【００１１】
また、本発明のスクリーニング方法は、
（１）アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を接触させたときのＰＳＡ産生量または細胞数と、試験化合物を接触させない場合のＰＳＡ産生量または細胞数を測定し、比較する工程を含むこと；
（２）連結されたＰＳＡプロモーターとレポーター遺伝子が組み込まれたアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を試験化合物と接触させる工程を含むこと；または
（３）モデル動物にアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を移植し、該モデル動物に試験化合物を投与した場合と投与しない場合の細胞増殖の状態を測定し、比較する工程を含むこと
を特徴とする。
以下、（１）〜（３）について、詳細に説明する。【００１２】
（１）アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を接触させたときのＰＳＡの産生量または細胞数と、試験化合物を接触させない場合のＰＳＡ産生量または細胞数を測定し、比較する工程を含むスクリーニング方法：
（１）の方法は、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物（例えば抗癌薬）のスクリーニング方法として使用できる。アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては、例えば、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来の細胞、具体的には、例えばＬＮＣａＰ−ｈｒが使用できる。
ＰＳＡ産生量の測定は、試験化合物を含む（または含まない）培地を用いてアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を培養した後、培養上清に分泌されたＰＳＡをＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等によって測定することにより実施可能である。細胞数は、試験化合物を含む（または含まない）培地を用いてアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を培養した後に測定すればよい。細胞数は、例えば、コールターカウンターを用いる細胞数のカウント、細胞内のＡＴＰ含量の定量、ミトコンドリアにより還元されて発色する色素を用いる方法によって測定することができる。
（１）記載の工程の結果に基づいて、(i)アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に接触させたときに該細胞のＰＳＡ産生量を減少させる試験化合物を選抜する、または(ii)アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に接触させたときに該細胞の増殖が抑制される試験物質を選択することにより、前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有することが期待される化合物を得ることができる。
（１）のスクリーニング方法は、例えば、下記のように実施することができる。
ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来のアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞をマルチウェルプレートあるいはシャーレに播き、翌日、化合物を添加する。化合物は化合物を溶解する適当な溶媒（ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、生理食塩水、水、エタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなど）に溶解し、そのままあるいは培地で希釈し、細胞を播種したマルチウェルプレートあるいはシャーレに添加する。一定期間培養後培養上清中のＰＳＡ濃度を、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測定し、コントロール群を１００％、化合物添加前のＰＳＡ量を０％としたときのＰＳＡ産生抑制率を算出する。また細胞増殖をコールターカウンターによる計数、細胞内のＡＴＰ含量測定、ＢｒｄＵ取り込み、［３Ｈ］−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ取り込み、色素法（ＭＴＴ、alamar blue,resazurin、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８など）により評価する。【００１３】
（２）連結されたＰＳＡプロモーターとレポーター遺伝子が組み込まれたアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を試験化合物と接触させる工程を含むスクリーニング法：
（２）の方法は、連結されたＰＳＡプロモーターとレポーター遺伝子が組み込まれたアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に試験化合物を接触させた場合と試験化合物を接触させない場合のレポーター遺伝子の発現量を測定し、比較する工程を含むことが好ましい。
（２）の方法は、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を用いることを特徴とする前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物（例えば抗癌薬）のスクリーニング方法として使用できる。アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては、例えば、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来の細胞、具体的には、例えばＬＮＣａＰ−ｈｒが使用できる。
ＰＳＡプロモーターとは、アンドロゲン受容体によって転写が調節されるＰＳＡ遺伝子のプロモーターであって、6ｋ−PSAプロモーター（文献名：Mol. Endocrinol., 1997, 11, 148-161）、PSAR-PCPSA-P（文献名：Cancer Res., 1997, 57, 495-499）等が使用可能である。レポーター遺伝子としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が使用できる。
（２）の方法は、例えば、下記のように実施することができる。まず、ＰＳＡプロモーターを、レポーター遺伝子を連結した後、これをアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞に組み込んで変異株を作製し、該変異株と試験化合物を接触させる。変異株と接触させた場合にレポーター遺伝子の発現を低下させる試験化合物、すなわちアンドロゲン受容体による転写促進に対する抑制作用を有する化合物を選別することで、前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物（例えば抗癌薬）を得ることができる。
（３）モデル動物にアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を移植し、該モデル動物に試験化合物を投与した場合と投与しない場合の細胞増殖の状態を測定し、比較する工程を含むスクリーニング方法：
（３）の方法は、抗腫瘍作用を有する化合物のスクリーニング方法として使用できる。アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては、例えば、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ由来の細胞、具体的には、例えばＬＮＣａＰ−ｈｒが使用できる。モデル動物としては、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、特に好ましくはマウスまたはラットが使用できる。モデル動物は、免疫不全動物であることが好ましい。細胞増殖の状態の測定としては、例えば、腫瘍体積の測定が挙げられる。
上記（３）の工程の結果に基づいて、モデル動物の腫瘍体積を縮小させる、または腫瘍体積の増加を抑制する試験化合物を選抜することにより、抗腫瘍作用を有することが期待される化合物を得ることができる。
（２）の方法は、例えば、下記のように実施することができる。
ＬＮＣａＰ−ＦＧＣに由来するアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞をＰＢＳ、ＨＢＳＳ、生理食塩水あるいはマトリゲル中に浮遊させ、そのうち０．５−１０Ｘ１０６細胞に相当する浮遊液をヌードマウス皮下、腹腔内、静脈内、心室内、骨内あるいは前立腺内に移植する。雄ヌードマウスあるいは雄ヌードラットにおいては場合により去勢した動物を使用する。腫瘍体積がある程度以上（例えば１００ｍｍ３）になった段階で腫瘍体積をもとに群分けし、化合物を１日１〜４回１〜８週間経口投与を行い、コントロール群の体積を１００％、投与開始時の体積を０％として投与群の腫瘍体積を計算する（Ｔ／Ｃ％）。【００１４】
本発明のスクリーニング方法に供される試験化合物には特に制限はなく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等があげられる。【００１５】
本発明はまた、上記のスクリーニング方法を実施するのに好適なキットをも提供する。本発明のスクリーニング用キットは、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞を含んでなることを特徴とする。アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞としては、本発明のスクリーニング方法の説明において上記したものが使用できる。
本発明のスクリーニング用キットは、ＰＳＡを測定するための試薬類をさらに含んでいてもよい。例えば、下記の試薬類を含むことができる。
タンデム−ＲフリーＰＳＡ、高感度ＰＳＡタンデム、アクセス・ハイブリテック・フリーＰＳＡ、ＳＴ  Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＰＳＡ  ＩＩ）、ナノピアＰＳＡ、ＬＴオートワコーＰＳＡ、ランリームＰＳＡ  ＩＩ、マーキットＭ  ＰＡ、アーキテクトR（登録商標）・ＰＳＡ、イノテック  ＰＳＡ、  ＤＰＣ・イムライズ（Ｒ）ＨＳ−ＰＳＡ、  Ｅ−テスト  ＰＳＡ、エクルーシス試薬ＰＳＡＩＩ、エクルーシス試薬ＦＰＳＡ、ＡｘＳＹＭR  ＰＳＡ・ダイナパックR、ＡｘＳＹＭR  フリーＰＳＡ・ダイナパックR、ルミパルス  ＰＳＡ−Ｎ、ルミスポットＡＬ−１０００用ＰＳＡ測定試薬、  Unicel Dx  Ｉ  ８００用測定試薬、日立７０７０分析装置用ＰＳＡ測定試薬【００１６】
本発明はまた、本発明のスクリーニング法で得られた前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物を含有してなる癌（特に前立腺癌）の予防・治療薬を提供する。該予防・治療薬は、必要に応じて薬理学的に許容される担体を含有することができる。
ここで、「薬理学的に許容される担体」としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。【００１７】
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、デキストリン、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素（例、食用赤色２号および３号、食用黄色４号および５号、食用青色１号および２号などの食用色素）、水不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例、β−カロチン、クロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。【００１８】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤が挙げられ、これらはそれぞれ経口的あるいは非経口的に安全に投与できる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の本発明のスクリーニング方法により得られる化合物の含量は、剤形、該化合物の投与量などにより異なるが、例えば約０．１ないし１００重量％である。【００１９】
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプン、Ｄ−マンニトールなど）、崩壊剤（例、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、結合剤（例、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングすることにより製造される。【００２０】
該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる。
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる１種または２種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＥ〔オイドラギットＥ（商品名）、ロームファルマ社〕、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース  フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  アセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマーＬ〔オイドラギットＬ（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーＬＤ〔オイドラギットＬ−３０Ｄ５５（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーＳ〔オイドラギットＳ（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子；セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばエチルセルロースなどのセルロース系高分子；アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＲＳ〔オイドラギットＲＳ（商品名）、ロームファルマ社〕、アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギットＮＥ（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、その２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい。【００２１】
注射剤は、有効成分を分散剤（例、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０など、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例、ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。【００２２】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該予防・治療薬の投与量は、対象疾患、重篤度、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、前立腺癌に罹患している成人患者（体重６０ｋｇ）においては、有効成分である化合物の量として、一日あたり約０.１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇであり、この量を１回または数回に分けて投与することができる。
以下に、参考例、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［参考例］【００２３】
ヒト前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ−ＦＧＣを親株として用い、本発明のアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞「ＬＮＣａＰ−ｈｒ」を得た。
まず、ステロイドが実質的に存在しない培地を用いて、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞（ATCCCRL-1740）を培養した。ステロイドが実質的に存在しない培地とは、アンドロゲンが除去された牛胎児血清を10%含有する、RPMI1640培地（GIBCO社 11835-030, phenol red free）である。
牛胎児血清からのアンドロゲンの除去は、牛胎児血清のＤＣＣ（Dextran coated charcoal）処理により行った。まず、「Charcoal, activated, USP」(SIGMA社, C7606-500G) 25g、 「デキストランT70」(EXTRASYNTHESE社, 4445) 250mgおよびD-PBS(GIBCO社, 14190-144) 500mLを混合した後にオートクレーブ（121℃, 20分）し、これをＤＣＣとした。次に、牛胎児血清500mLにＤＣＣ 25mLを混合し、45℃の温浴中で30分間振とう撹拌した。その後、4℃, 3000rpmでの遠心を2回行い、得られた上清をろ過滅菌（CORNING 430773, 0.2um Nylon）し、アンドロゲンが除去された牛胎児血清を得た。アンドロゲンが除去された牛胎児血清と、RPMI1640培地（GIBCO社 11835-030, phenol red free）を混合し、ステロイドが実質的に存在しない培地とした。
ステロイドが実質的に存在しない培地を用いて培養すると、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞の増殖は、一旦抑制された後、再開された。再増殖開始後も同じ条件で培養を続け、増殖速度及び細胞形状が安定した細胞を選択した。得られた細胞を「ＬＮＣａＰ−ｈｒ」と名づけた。
なお、「ＬＮＣａＰ−ｈｒ」は、Cancer Res. 2003 Jan 1;63(1):149-53（非特許文献１３）にも記載された細胞である。
ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞のＰＳＡの基礎産生量を、ELISA法で測定した。その結果、ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞においては、アンドロゲン反応性の蛋白であるＰＳＡの基礎産生量は、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞の約１．２倍〜３０倍であった。
また、アンドロゲン刺激による細胞のＰＳＡの産生量を、ELISA法で測定した。その結果、ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞は、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞の場合の１／３〜１／３０の濃度のアンドロゲン刺激によって、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞と同程度のＰＳＡ産生量を示した。したがって、ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞は、親株よりもアンドロゲン刺激に高反応性の細胞と考えられる。
この細胞では従来のＡＲ拮抗薬のビカルタミドは高濃度ではＰＳＡ産生にアゴニストとして作用し、ビカルタミドによる細胞増殖の抑制もＬＮＣａＰ−ＦＧＣの場合よりはるかに弱かった。これは臨床でのホルモン療法抵抗性癌の性質と類似していた。
この細胞を用いてin vitroでのＰＳＡ産生の産生阻害および増殖阻害ならびにこの細胞をヌードマウスに移植して作成した癌に対する抗腫瘍作用で化合物を評価した。
【実施例１】
【００２４】
ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞での化合物によるＰＳＡ産生阻害試験：
表１記載の化合物１〜化合物９を被験化合物としてＰＳＡ産生阻害試験をおこなった。まず、ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞を２４穴プレートに４００００細胞／５００μＬ／ウエルで播き、翌日、化合物を添加した。添加３日後の培養上清中のＰＳＡ濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、コントロール群を１００％、化合物添加前のＰＳＡ量を０％としたときのＰＳＡ産生抑制率を算出した。また細胞数をコールターカウンターで計数した。
細胞数およびＰＳＡ産生量ともに無添加時よりも低下する化合物を選択した。
なお、表１記載の化合物は、WO2006/064944号パンフレットおよび特願2006-163992号明細書の記載に基づいて合成した。
結果を図１および図２に示す。化合物３〜９にＰＳＡ産生抑制作用が認められた。【００２５】
【表１】
2008153091.tif 000002
【実施例２】
【００２６】
ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞移植ヌードマウスを用いた抗腫瘍試験：
表１記載の化合物１、６及び９を被験化合物として抗腫瘍試験をおこなった。ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞をマトリゲル中に浮遊させ、５Ｘ１０６細胞を去勢したヌードマウス側腹部皮下に移植した。腫瘍体積が１００ｍｍ３程度になった段階で腫瘍体積をもとに群分けし、化合物15mg/kg体重を１日２回３週間経口で投与し、コントロール群の体積を１００％、投与開始時の体積を０％として投与群の腫瘍体積を計算した（Ｔ／Ｃ％）。結果を表２に示す。化合物６、８及び９のいずれにも抗腫瘍活性が認められた【００２７】
【表２】
2008153091.tif 000003
【実施例３】
【００２８】
ＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞を用いたレポーターアッセイ：
表１記載の化合物６，８，９を試験化合物としてレポーターアッセイをおこなった。陰性対照化合物として、従来のＡＲ拮抗薬であるビカルタミドを使用した。ＰＳＡプロモーターとして6ｋ−PSA プロモーターを、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を使用した。
連結されたＰＳＡプロモーターとレポーター遺伝子が組み込まれたＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞を、９６穴プレートに５００００細胞／１００μＬ／ウエルで播き、８時間培養後に試験化合物を添加した。添加２４時間後にレポーター活性を測定した。試験化合物を添加していない細胞のレポーター活性を１００％（コントロール群）、レポーター遺伝子を組み込んでいない無処置のＬＮＣａＰ−ｈｒ細胞のレポーター活性を０％として、試験化合物のレポーター抑制活性を算出した。
結果を図３に示す。試験化合物６、８及び９のいずれにも、濃度依存的なレポーター抑制活性が認められた。各試験化合物が、アンドロゲン受容体による転写促進に対する抑制作用を有することが示された。一方、陰性対照であるビカルタミドは、濃度依存的なレポーター抑制活性を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、前立腺特異抗原産生阻害作用および／またはアンドロゲン非依存性前立腺癌増殖抑制作用を有する化合物を簡便に選別することができる。
【図１ａ】
2008153091.tif 000004
【図１ｂ】
2008153091.tif 000005
【図１ｃ】
2008153091.tif 000006
【図１ｄ】
2008153091.tif 000007
【図１ｅ】
2008153091.tif 000008
【図１ｆ】
2008153091.tif 000009
【図１ｇ】
2008153091.tif 000010
【図１ｈ】
2008153091.tif 000011
【図１ｉ】
2008153091.tif 000012
【図２ａ】
2008153091.tif 000013
【図２ｂ】
2008153091.tif 000014
【図２ｃ】
2008153091.tif 000015
【図２ｄ】
2008153091.tif 000016
【図２ｅ】
2008153091.tif 000017
【図２ｆ】
2008153091.tif 000018
【図２ｇ】
2008153091.tif 000019
【図２ｈ】
2008153091.tif 000020
【図２ｉ】
2008153091.tif 000021
【図３ａ】
2008153091.tif 000022
【図３ｂ】
2008153091.tif 000023
【図３ｃ】
2008153091.tif 000024
【図３ｄ】
2008153091.tif 000025
【国際調査報告】
2008153091.tif 000026
2008153091.tif 000027
2008153091.tif 000028
2008153091.tif 000029
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