(57)【要約】  本発明者らは、閉塞性末梢血管疾患に対するミッドカインの治療効果について検討を行った。その結果、本発明者らは、ミッドカインには血管新生を促進する作用があり、ミッドカインを閉塞性末梢血管疾患の患部に導入することにより、血管を増生させ上下肢血流を改善できる、すなわち上下肢虚血性疾患の症状を改善できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカイン類を有効成分として含有する、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防するための薬剤。
【請求項２】
ハイドロキシアパタイト微粒子又はゼラチンを用いた徐放製剤であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
ミッドカイン類をコードするDNAを少なくとも一つ以上保持するウイルスベクターを有効成分として含有する、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防するための薬剤。
【請求項４】
閉塞性末梢血管疾患が、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、または糖尿病性血管障害に基づくものである、請求項１から請求項３のいずれか1項に記載の薬剤。
【請求項５】
ミッドカイン類を対象に投与する工程を含む、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防する方法。
【請求項６】
ハイドロキシアパタイト微粒子又はゼラチンを用いた徐放製剤として、ミッドカイン類を投与することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
静脈注射又は筋肉注射によりミッドカイン類を投与することを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ミッドカイン類をコードするDNAを少なくとも一つ以上保持するウイルスベクターを対象に投与する工程を含む、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防する方法。
【請求項９】
閉塞性末梢血管疾患が、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、または糖尿病性血管障害に基づくものである、請求項５から請求項８のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカインを有効成分として含有する閉塞性末梢血管疾患を治療または予防するための薬剤、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミッドカイン（以下MKと記載することもある）はヘパリン結合成長因子ファミリーに属し、レチノイン酸反応性遺伝子の産物として見出された低分子の非糖化タンパク質である。その受容体は受容体型チロシンフォスファターゼz、LRP（low density lipoprotein receptor-related protein）、ALK （anaplastic leukemia kinase） およびシンデカンからなる複合体と考えられている。MKは細胞遊走、血管新生に対する作用を持ち、癌化や炎症の誘導にも多様な生物活性を有することが明らかになっている。胃、大腸、乳癌など多くの癌組織でMKが過剰発現していることも報告されている（非特許文献１、２）。一方、MK欠損マウスでは血管内膜障害がおき、虚血性の腎障害が起こることも報告されている（非特許文献３、４）。 【０００３】
虚血(ischemia)とは、体の一部において、血流が完全に遮断されるか、著しく減少した状態であり、酸素不足、基質供給の減少、代謝産物の蓄積が同時に進行する病態と考えられる。虚血の程度は、血管閉塞の緩急、持続時間、あるいは組織の感受性、副血行路の発達の程度にも関係するが、虚血に陥った臓器ないし組織には機能障害が現れ、長く持続すれば、組織は萎縮、変性、壊死に至る。
動脈硬化を基礎疾患とする閉塞性動脈硬化症（ASO）やバージャー病（TAO）などに基づく下肢虚血性疾患は食生活の欧米化や高齢化の進行と共に近年増加しつつある（非特許文献５）。日本国での慢性虚血肢の発生率は年間10万人あたり50〜100人であり、60〜70歳男性のうち5％前後が間欠性跛行の症状を有している。そのうち50〜75％は無治療で経過観察が可能であるものの、年間1％が下肢切断の適応が必要であるとされている。【０００４】
近年、閉塞性末梢血管疾患に対する治療は、内科的薬物治療（非特許文献６、７）や手術治療（非特許文献８、９）、血管狭窄部位に対するカッティングバルーン、ロータブレータによるインターベンション治療（非特許文献１０、１１）等の血行再建術の発展によって救命率が向上している。しかしながら、その一方で、高齢かつ複雑な病変を有する重症虚血肢患者が近年増加しており、このような重症患者は下肢切断を余儀なくされる事により生活の質が著しく障害される上、生命予後も不良で5年生存率が50％との報告がある。
このような従来の内科・外科治療での症状改善を見込めない患者に対する治療として、遺伝子導入、細胞移植、成長因子蛋白導入を利用した血管新生療法が試みられ始めているが、いまだ決定的な治療効果が得られている訳ではない。【０００５】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Tsutsui, J. et al., Cancer Res., 53, 1281-1285 (1993)
【非特許文献２】Kadomatsu, K. et al., Brit. J. Cancer, 75, 354-359 (1997)
【非特許文献３】Horiba, M., et al. J. Clin. Invest., 105, 489-495 (2000)
【非特許文献４】Sato, W., et al. J. immunol., 167, 3463-3469 (2001)
【非特許文献５】Dormandy J. A. et al., J.Vasc Surg., 31, S1-S296 (2000)
【非特許文献６】Bendermacher B. L. et al., J.Thromb. Haemost., 3(8), 1628-1637 (2005)
【非特許文献７】Hankey G. J. et al., JAMA., 295(5), 547-553 (2006)
【非特許文献８】Willigendael E. M. et al., J.Vasc.Surg., 42, 67-74 (2005)
【非特許文献９】Lauterbach S. R. et al., Arch. Surg., 140(5), 487-493 (2005)
【非特許文献１０】Cejna M., Cardiovasc. Intervent. Radiol., 28, 400-408 (2005)
【非特許文献１１】Dormal P. A. et al., Acta Chir. Belg., 105(2), 231-234 (2005)
【非特許文献１２】Isner J. M. et al., Lancet, 348, 370-374 (1996)
【非特許文献１３】Lederman R. J. et al., Lancet, 359, 2053-2058 (2002)
【非特許文献１４】Rajagopalan S. et al., Am Heart J., 145, 1114-1118 (2003)
【非特許文献１５】Tateishi-Yuyama E. et al., Lancet, 360, 427-435 (2002)
【非特許文献１６】Morishita R. et al., Hypertension, 44(2), 203-209 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ミッドカインを有効成分として含有する閉塞性末梢血管疾患を治療または予防するための薬剤を提供することにある。また、ミッドカインを対象に投与する工程を含む、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防する方法の提供も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、閉塞性末梢血管疾患に対するミッドカイン投与の治療効果について検討を行った。
まず、成長因子であるミッドカインが血管新生作用を示すか否かについて検討した。具体的には、マウス皮下へミッドカインをマトリゲル注入することにより、血管新生作用の比較を行った。その結果、コントロールに比べ、ミッドカイン添加により著しい血管増生が観察された（図１）。また、投与7日後の血管数を測定したところ、何も添加を行っていないコントロールと比較し、有意な血管数の増加を示した (図2)。【０００８】
次に、培養血管内皮細胞において、ミッドカインが管腔形成作用を有するか否かについて検討した。成長因子を欠損させたマトリゲル上で培養したHUVEC（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）に対し、ミッドカインを添加し、管腔形成に対する影響を観察した。その結果、ポジティブコントロールのｂFGFと同様に、ミッドカインにより管腔形成が促進されることが明らかとなった（図３）。これら結果より、ミッドカインが血管新生作用を有することが強く裏付けられた。
次に、閉塞性末梢血管疾患モデルマウスにおける、ミッドカインの治療効果の検討を行った。具体的には、下肢虚血性疾患モデルマウスを作成し、ミッドカインノックアウトマウスおよび野生型マウスそれぞれにおける下肢血流測定を行った。その結果、術後１４日目において、野生型マウスと比較して、ミッドカインノックアウトマウスの血流が有意に低下していることが明らかとなった（図５）。この結果より、ミッドカインが末梢血管再生に関与していることが明らかとなった。【０００９】
さらに、アデノウイルスベクターを用いて、下肢虚血性疾患モデル野生型マウスの虚血下肢筋肉に対しミッドカインを導入した。その結果、非治療群（アデノウイルスベクターのみを注射した群）と比較して、ミッドカインを導入した群においては、有意な血流改善が認められた（図６）。
また、ハイドロキシアパタイト微粒子またはゼラチンを用いた徐放製剤によりミッドカインをラット虚血下肢に導入し、下肢虚血性疾患の治療効果を確認したところ、血管新生及び著明な血流改善が認められ、下肢の壊死を予防できることが明らかとなった（図７〜１０）。【００１０】
さらに、ミッドカインによる血管新生の形態評価を行ったところ、ミッドカインによって新生された微小血管の形態異常（血管奇形）は、VEGF連続投与群と比べてわずかであることがわかった（図１１）。
即ち、本発明者らは、ミッドカインには血管新生を促進する作用があり、ミッドカインを下肢虚血性疾患の患部に導入することにより、血管を増生させ下肢血流を改善できる、すなわち下肢虚血性疾患の症状を改善できることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。【００１１】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
〔１〕ミッドカイン類を有効成分として含有する、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防するための薬剤。
〔２〕ハイドロキシアパタイト微粒子又はゼラチンを用いた徐放製剤であることを特徴とする〔１〕に記載の薬剤。
〔３〕ミッドカイン類をコードするDNAを少なくとも一つ以上保持するウイルスベクターを有効成分として含有する、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防するための薬剤。
〔４〕閉塞性末梢血管疾患が、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、または糖尿病性血管障害に基づくものである、〔１〕から〔３〕のいずれか1項に記載の薬剤。
〔５〕ミッドカイン類を対象に投与する工程を含む、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防する方法。
〔６〕ハイドロキシアパタイト微粒子又はゼラチンを用いた徐放製剤として、ミッドカイン類を投与することを特徴とする、〔５〕に記載の方法。
〔７〕静脈注射又は筋肉注射によりミッドカイン類を投与することを特徴とする、〔５〕または〔６〕に記載の方法。
〔８〕ミッドカイン類をコードするDNAを少なくとも一つ以上保持するウイルスベクターを対象に投与する工程を含む、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防する方法。
〔９〕閉塞性末梢血管疾患が、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、または糖尿病性血管障害に基づくものである、〔５〕から〔８〕のいずれか1項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】皮下マトリゲルにおける、ミッドカインの血管新生作用を示す写真である。
【図２】皮下マトリゲルにおける血管数の測定結果を示す、写真および図である。
【図３】培養血管内皮細胞に対する、ミッドカインの管腔形成作用を示す写真である。
【図４】下肢虚血性疾患モデルマウスの血管除去部位を示す図である。
【図５】2種類の下肢虚血性疾患モデルマウス群（ミッドカインノックアウトマウス群および野生型マウス群）における下肢血流の比較を示す図である。
【図６】2種類の下肢虚血性疾患モデルマウス（ミッドカイン遺伝子搭載アデノウイルスベクター投与群、非治療群）における下肢血流の比較を示す写真および図である。
【図７】MK 投与による虚血下肢の治療効果を示す写真である。MK治療群ではコントロールで多く見られる虚血下肢の壊死・切断が抑制された（ゼラチン使用）。
【図８】MK投与群およびコントロールにおける虚血下肢の残存期間および残存数を示す図である。虚血下肢の残存期間および残存数はMK治療にて改善した（ゼラチン使用）。
【図９】血流計によるMK 治療効果の判定の結果を示す写真および図である。MK治療により血流の改善が認められる（ゼラチン使用）。
【図１０】ラット虚血下肢内転筋の von Willebrand factor による免疫染色の結果を示す写真および図である。MK治療による新生血管の増加が確認できる（Hap使用）。
【図１１】マウス耳介に対するMK蛋白およびVEGF蛋白の連続投与の結果を示す写真および図である。MK投与群ではコントロールと比較して毛細血管の増加が認められる。VEGF投与群においても同様に血管数の増加が認められるが、MKと比較して血管異常が多く認められた。
【００１３】
〔発明の実施の形態〕
本発明者らは、ミッドカインには血管新生を促進する作用があり、ミッドカインを閉塞性末梢血管疾患の患部に投与することにより、血管を増生させ末梢血管の血流を改善できる、すなわち閉塞性末梢血管疾患の症状を改善できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。【００１４】
本発明は、ミッドカイン類を有効成分として含有する、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防するための薬剤に関する。【００１５】
本発明において「ミッドカイン類」とは、ミッドカイン及びミッドカインと機能的に同等なタンパク質のことである。ミッドカインとしては、例えば、ヒト由来のミッドカインとして、配列番号：１に示したｃDNA塩基配列によりコードされ、又は、配列番号：２に示したアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、マウス由来のミッドカインとして、配列番号：３に示したｃDNA塩基配列によりコードされ、又は、配列番号：４に示したアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
また、ミッドカインと機能的に同等なタンパク質としては、例えば、ミッドカインの変異体、ホモログ、ミッドカインの部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のミッドカインとは、本来の生物活性を有する限り、全てのこのような修飾および変化を有する「ミッドカインファミリー」に属するタンパク質（例えば、プレイオトロフィン）等も挙げることが出来る。
上記のミッドカインと機能的に同等なタンパク質は、通常、ミッドカインとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸配列において、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)などによって決定することができる。【００１６】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸、塩基含有側鎖を有するアミノ酸、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸を挙げることができる。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。【００１７】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、ミッドカインと同等又はそれ以上の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、ミッドカインの生物学的機能や生化学的機能としては、細胞の増殖促進（繊維芽細胞、ケラチノサイト、または腫瘍細胞の増殖促進）、細胞の生存促進（胎児神経細胞、または腫瘍細胞の生存促進）、細胞の移動促進（神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞、または血管平滑筋細胞の移動促進）、ケモカインの発現促進、血管新生促進、またはシナプス形成促進等を挙げることができる。本発明におけるミッドカインの生物学的機能や生化学的機能として、好ましくは、血管新生促進である。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。
「ミッドカインと機能的に同等なタンパク質」を取得する方法としては、当業者によく知られた方法としては、例えば、天然物由来のタンパク質又は人工的に改変を導入したタンパク質から、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用して類似の塩基配列を有するタンパク質を取得する方法が挙げられる。また、ミッドカインをリードタンパク質として、人工的に突然変異を導入することにより、ミッドカインと機能的に同等なタンパク質を得ることができる。これらの技術により単離しうるミッドカインと同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAは、本発明のミッドカイン類をコードするDNAに含まれる。【００１８】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。【００１９】
本発明のミッドカイン類の由来となる生物種は、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシなどが挙げられる。
本発明のミッドカイン類の製造のために、任意の産生系を使用することができる。ミッドカイン製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。【００２０】
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、あるいは(2)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。真菌細胞としては、pichia pastoris, S. pombe、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。【００２１】
これらの細胞に、目的とするミッドカイン遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりミッドカインが得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、ミッドカイン遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにてミッドカインを産生してもよい。【００２２】
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物にミッドカイン遺伝子を導入し、動物又は植物の体内でミッドカインタンパク質を産生させ、回収する。【００２３】
前記のように産生、発現されたミッドカインは、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用されるミッドカインの分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
上記で得られたミッドカインの濃度測定は吸光度の測定又はELISA等により行うことができる。【００２４】
本発明において、「閉塞性抹消血管疾患」としては、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、または糖尿病に基づく疾患（合併症として発症する疾患）を挙げることができる。また、閉塞部位としては、抹消血管であれば特に限定は無いが、好ましくは下肢抹消血管である。
本発明の薬剤は重症の閉塞性抹消血管疾患の対象（患者）だけでなく、進行中の軽度の対象（患者）にも使用することができる。【００２５】
本発明においてミッドカインを有効成分とする薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の閉塞性末梢血管疾患の治療効果を有する材料であってもよいし、当該治療効果を有さない材料であってもよく、上記の治療剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、閉塞性末梢血管疾患の治療効果を有さない材料であって、ミッドカインと併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。【００２６】
製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタン脂肪酸エステル；グリセリン脂肪酸エステル；ポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。【００２７】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；アルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；フィンゴリン脂質；ショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。【００２８】
本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液等  他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることが出来る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。【００２９】
また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいpH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、あるいは中性アミノ酸、あるいは芳香族アミノ酸を使用することもできる。【００３０】
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース等を挙げることができる。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。【００３１】
本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸等を挙げることができる。
また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール等のキレート剤を挙げることが出来る。【００３２】
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。【００３３】
また、本発明は、ミッドカインを対象に投与する工程を含む、閉塞性末梢血管疾患を治療または予防する方法に関する。
本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に（閉塞性末梢血管疾患の患部に直接）投与することができる。例えば、本発明における薬剤の投与方法として、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口投与などを挙げることができる。また、本発明における薬剤の投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.001mgから1000mgの範囲で選ぶことができ、好ましくは、0.005mgから100mgの範囲であり、より好ましくは、0.01mgから50mgである。好ましい投与量、投与方法は、たとえばミッドカインタンパク質の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり１ヶ月（４週間）に0.5mgから40mg、好ましくは1mgから20mgを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射などの方法で、投与する方法などである。【００３４】
本発明において、「閉塞性末梢血管疾患の患部」とは、虚血患部及びその周辺を含む部位を指す。虚血患部においては、具体的には血管内や筋肉内などへの投与が可能であるが、特に、虚血患部の筋肉内に投与することが好ましい。すなわち閉塞性末梢血管疾患においては、上下肢虚血患部の骨格筋内に投与することにより、虚血患部の血管新生を促進させ血流量の改善を図り、虚血患部の機能の回復正常化を行うことが出来る。【００３５】
また、本発明の薬剤は、血管新生作用を有する公知の因子と供に投与されても良い。血管新生作用を有する公知の因子としては、VEGF、FGF、HGF、またはEGF等の因子を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の薬剤は対象に対し、持続的に投与されても良い。本発明の薬剤を持続投与する方法としては、ミッドカインタンパク質を注入したハイドロキシアパタイト微粒子による徐放カプセル（徐放製剤）を皮下に埋め込む方法、ミッドカインタンパク質を注入したゼラチンによる徐放製剤を皮下に埋め込む方法、ミッドカイン遺伝子を搭載したウイルスベクターを冠血管に流入するように投与する方法、浸透圧ポンプを用いてミッドカインタンパク質を直接注入する方法等を挙げることが出来る。【００３６】
上記に記載のハイドロキシアパタイト微粒子による徐放カプセルは、当業者に公知の方法で作製することができる。具体的には、特開2004- 75662に記載されているように、多孔性ハイドロキシアパタイト微粒子に存在する細孔にミッドカインタンパク質、ヒト血清タンパク質、ムコ多糖類を充填し、さらに２価金属イオンを加え栓塞することにより作製することが出来る。上記に記載のゼラチンによる徐放製剤は、当業者に公知の方法で作製することができる。具体的には、特許第３６３９５９３号に記載されているように、生体内分解吸収性天然高分子であるゼラチンを架橋処理することにより水不溶性とした架橋ゼラチンゲルに、ミッドカインタンパク質が含まれる水溶液を滴下して含浸させることにより徐放製剤を作製することができる。また、架橋ゼラチンゲルをミッドカインタンパク質が含まれる水溶液中に懸濁して再膨潤させて、徐放製剤を作製してもよい。本発明の徐放カプセルは、さらに上記に記載の保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。【００３７】
上記に記載のウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを挙げることが出来る。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス（HIV）等のDNAウイルスまたはＲＮＡウイルスにミッドカイン遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内にミッドカイン遺伝子を導入することが可能である。本発明において、ウイルスベクターによる薬剤の対象への導入法としては、ウイルスベクターによる薬剤を直接体内に導入するin vivo法、及び、対象から細胞を取り出して体外でウイルスベクターによる薬剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕ミッドカインの血管新生作用
まず、成長因子であるミッドカインが血管新生作用を有するか否かについて検討した。
具体的には、マウス皮下へ、ミッドカインをマトリゲル注入することにより、血管新生作用の比較を行った。500 ng/mlの濃度のミッドカインまたは500 ng/mlの濃度の血管新生因子ｂFGF（ポジティブコントロール）をマウス皮下へマドリゲル注入し、血管新生作用を観察した。また、皮下マトリゲルの切片をHE（ヘマトキシリン・エオジン）染色し、血管数の測定を行った。
その結果、コントロールに比べ、ミッドカイン添加により著しい血管増生が観察された（図１）。また、投与7日後の血管数を測定したところ、何も添加を行っていないコントロールと比較し、有意な血管数の増加を示した (図2、3.31±0.18 fold vs. コントロール, n=7, p<0.05)。いずれも、ポジティブコントロールとして使用したｂFGFと同様の結果を示した。【００３９】
〔実施例２〕ミッドカインの管腔形成作用
次に、培養血管内皮細胞において、ミッドカインが管腔形成作用を有するか否かについて検討した。
非血清下において成長因子を欠損させたマトリゲル上で6時間培養したHUVEC（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）に対し、100 ng/mlの濃度でミッドカインを添加し、管腔形成に対する影響を観察した。
その結果、ポジティブコントロールのｂFGFと同様に、ミッドカインにより管腔形成が促進されることが明らかとなった（図３）。これら結果より、ミッドカインが血管新生作用を有することが強く裏付けられた。【００４０】
〔実施例３〕下肢虚血性疾患モデルマウスにおける、ミッドカインの治療効果の検討
次に、下肢虚血性疾患モデルマウスにおける、ミッドカインの治療効果の検討を行った。具体的には、下肢虚血性疾患モデルマウスを作成し、ミッドカインノックアウトマウスおよび野生型マウスそれぞれにおける下肢血流測定を行った。
ミッドカインノックアウトマウス（Mdk-/-マウス）は、Nakamuraらによる文献（Genes Cells 3:811-822,1998）に記載された方法により育種されたものを用いた。野生型マウス（Mdk+/+マウス）もミッドカインノックアウトマウス（Mdk-/-マウス）も共にC57BL／6の遺伝背景を持ち、また試験には同年齢のマウスを用いた。
下肢虚血性疾患モデルマウスは図４に示す通り、ミッドカインノックアウトマウス（MKKO）および野生型マウス（WT）それぞれについて、外腸骨動脈から大腿動脈にかけて血管の除去を行うことにより作成した。
血管除去の術後14日目に、それぞれのマウスの下肢血流をレーザードップラー血流計により測定し、虚血性後肢血流／非虚血性後肢血流の割合（L/R率）を算出した。
その結果、術後１４日目において、野生型マウスと比較して、ミッドカインノックアウトマウスの血流が有意に低下していることが明らかとなった（図５、0.19±0.01 in MKKO vs. 0.41±0.03 in WT, n=9, p<0.05）。
この結果より、ミッドカインが末梢血管再生に関与していることが明らかとなった。【００４１】
〔実施例４〕虚血下肢へのミッドカインの導入
次に、アデノウイルスベクターを用いて、下肢虚血性疾患モデル野生型マウスの虚血下肢筋肉に対しミッドカインを導入した。血管除去の術後、ミッドカインをコードするDNAを搭載したアデノウイルスベクターを5×109 pfu/mlの濃度で10μl ずつ大腿の内転筋に10箇所注射し、実施例３と同様の方法で、下肢血流を測定した。
その結果、非治療群（アデノウイルスベクターのみを注射した群）と比較して、ミッドカインを導入した群においては、有意な血流改善が認められた（図６）。【００４２】
〔実施例５〕ハイドロキシアパタイト微粒子またはゼラチンを用いた徐放製剤によるミッドカインの導入
ハイドロキシアパタイト微粒子またはゼラチンを用いた徐放製剤により、ラット下肢虚血モデルの虚血下肢筋肉に対しミッドカインを導入した。血管除去の術後、ミッドカイン入りヘパリンアパタイト（MK-Hap、ミッドカイン含有率２％）0.5gをラット虚血下肢大腿部内転筋10か所に注射した。対照（コントロール）にはヘパリンアパタイトのみ0.5gを同様に注射した。
また、ゼラチン2mgとMK10μgを混合後37℃にて２時間インキュベートし、ラット虚血下肢大腿部内転筋10か所に注射した。対照（コントロール）にはゼラチンのみ2mgを同様にインキュベート後注射した。下肢血流は実施例３と同様の方法で測定した。
その結果、ミッドカイン蛋白質は、ヘパリンアパタイト、ゼラチンと混合して徐放させることにより血管新生を促進し、下肢の壊死を予防できることが明らかとなった（図７、図８、図１０）。
また、ラット下肢虚血モデルに対して、いずれの徐放製剤を用いても、ミッドカイン蛋白質40μg/kgにて著しい血流改善効果を示すことが明らかとなった（図９）。【００４３】
〔実施例６〕ミッドカインによる血管新生の形態評価
次に、ミッドカインによる新生血管の形態評価を行った。マウスの左耳に、ミッドカイン蛋白（MK投与群）およびVEGF蛋白（VEGF投与群）をそれぞれ10μg/ml、20μlを3日連続皮下注射した。マウスの右耳には対照（コントロール）として、生理食塩水20μlを3日連続皮下注射した。
その結果、マウス耳介へのミッドカイン連続投与により微小血管数が増加することが明らかになった（図１１）。また、ミッドカインによって新生された微小血管の形態異常（血管奇形）は、VEGF連続投与群と比べてわずかであることがわかった（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明においてミッドカインの投与により、閉塞性末梢血管疾患の患部において血管新生が促進し、四肢虚血性疾患の症状を改善できることが明らかとなった。
ミッドカインによる血管新生作用を治療へ応用することで、従来技術の治療に抵抗を示す、あるいは適応外となる重症虚血肢患者に対しても、上下肢の切断に至るまでの病態を予防することができる。それによって慢性虚血肢患者のquality of life（生活の質）は著しく改善し、ひいては生命予後を向上させることが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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