(57)【要約】  塩基配列の長さに影響されず、短いｍＲＮＡも長いｍＲＮＡも同じように効率よく増幅できる微量ｍＲＮＡの増幅方法およびその利用法を提供するために、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、微量ｍＲＮＡを含む溶液にダミーＲＮＡを添加して混合溶液を作製する第１工程と、混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応により、アンチセンスＤＮＡを合成する第２工程と、合成されたアンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成して、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを形成する第３工程と、形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖ＤＮＡを作製する第４工程と、ＲＮＡポリメラーゼによって、増幅用二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを増幅する第５工程と、を含む。
2008032574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量ｍＲＮＡを含む溶液にダミーＲＮＡを添加して混合溶液を作製する第１工程と、
混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスＤＮＡを合成する第２工程と、
合成されたアンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成して、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを形成する第３工程と、
形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖ＤＮＡを作製する第４工程と、
ＲＮＡポリメラーゼによって、増幅用二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを増幅する第５工程と、を含むことを特徴とする微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項２】
前記第４工程は、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡの両末端側にプロモーター配列を連結したあと、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結されたプロモーター配列のみを切断する第６工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項３】
前記第４工程は、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡの両末端にプロモーター配列を連結したとき、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結されたプロモーター配列のみを切断できるように、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に制限酵素サイトが形成されることを特徴とする請求項２に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項４】
前記第４工程は、切断されたプロモーター配列およびダミーＲＮＡを除去する第７工程を含むことを特徴とする請求項２または３に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項５】
前記ダミーＲＮＡの配列が、ポリＡ配列を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項６】
前記ダミーＲＮＡの配列が、配列番号４、配列番号６または配列番号１６によって示される塩基配列であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項７】
前記ダミーＲＮＡは、ビオチン化されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項９】
前記混合溶液中の前記ダミーＲＮＡの濃度が０．５〜１０μｇ／μＬであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むことを特徴とするｃＤＮＡライブラリーの作製方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むことを特徴とするプローブの作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むことを特徴とする段階的サブトラクション法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量ｍＲＮＡの増幅方法およびその利用に関するものであり、より詳細には、ｃＤＮＡライブラリーの作製、ｍＲＮＡのセンス鎖の増幅、ｍＲＮＡのセンス鎖をコードした標識プローブの作製、および段階的サブトラクション等に好適に用いることができる微量ｍＲＮＡの増幅方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子の解析手法として、例えば、ｃＤＮＡライブラリー等を解析する方法が知られている。ｃＤＮＡライブラリーは、生物の細胞からｍＲＮＡを精製し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成することにより作製される。このとき、細胞から精製されるｍＲＮＡは、通常、極微量である。生体内に多く存在する細胞種からｍＲＮＡを精製する場合には、ｍＲＮＡの精製に用いる細胞の数を多くすれば、ｃＤＮＡライブラリーを合成するために必要な十分量のｍＲＮＡを得ることができる。しかしながら、生体内に極僅かしか存在しない細胞（例えば、幹細胞、または生殖細胞など）からｍＲＮＡを精製する場合などには、ｃＤＮＡライブラリーを合成するために用いることができるｍＲＮＡの量に大きな制限が生じることになる。この場合、ｃＤＮＡを合成するためには、精製したｍＲＮＡを増幅する必要がある。そこで、従来から、極微量のｍＲＮＡを増幅する方法が開発されている。【０００３】
上述したようなｍＲＮＡの増幅方法としては、ＰＣＲを用いてｍＲＮＡを増幅する方法が一般的である。ｍＲＮＡの具体的な増幅手法は、以下の通りである。まず、ｍＲＮＡを細胞から精製する。次に、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製する。次いで、このｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡを調製する。そして、この二本鎖ＤＮＡを、ＰＣＲを利用して増幅する。最後に、増幅した二本鎖ＤＮＡに対してＲＮＡポリメラーゼを作用させてｍＲＮＡを調製し、増幅したｍＲＮＡを取得する（例えば、特許文献１参照）。
〔特許文献１〕
特開２００２−２３８５７５号公報（平成１４年８月２７日公開）
しかしながら、上記特許文献１に記載のような、ＰＣＲを利用してｍＲＮＡを増幅する方法では、短いｍＲＮＡと長いｍＲＮＡとを同じ効率で増幅することができないという問題点を有している。【０００４】
具体的に説明すると、ＰＣＲは、短い塩基配列を効率よく増幅できるが、長い塩基配列を効率よく増幅できないという特性を有している。このため、特許文献１のようなＰＣＲを利用してｍＲＮＡの鋳型となる増幅用二本鎖ＤＮＡを増幅する手法では、短い塩基配列を有する増幅用二本鎖ＤＮＡは効率よく増幅されるが、長い塩基配列を有する増幅用二本鎖ＤＮＡは効率よく増幅されない。つまり、ｍＲＮＡを合成する際の鋳型となる増幅用二本鎖ＤＮＡの増幅量が、増幅用二本鎖ＤＮＡの塩基配列の長さによって異なることになる。このため、上記ＰＣＲにて増幅した増幅用二本鎖ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを増幅する場合、短いｍＲＮＡは効率よく増幅できるが、長いｍＲＮＡは同じ効率では増幅できないという問題がある。この欠点は、多様性が高いｃＤＮＡライブラリーを作製しようとする場合に大きな問題となる。すなわち、上記従来の方法は、ｃＤＮＡライブラリーとして最も重要なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の量的な分布が増幅後に大きく崩れてしまうという問題点を有している。【０００５】
それゆえ、塩基配列の長さに影響されずに、短いｍＲＮＡも長いｍＲＮＡも同じように効率よく増幅できる微量ｍＲＮＡの増幅方法の開発が強く求められていた。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、塩基配列の長さに影響されることなく、短いｍＲＮＡも長いｍＲＮＡも同じように効率よく増幅できる微量ｍＲＮＡの増幅方法およびその利用法を提供することにある。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、増幅対象のｍＲＮＡが反応液中に極微量しか存在しない場合に、ダミーＲＮＡを反応液に添加して増幅用二本鎖ＤＮＡを合成することにより、ＲＮＡポリメラーゼの至適基質濃度（ミリモル（ｍＭ）程度）にまで増幅用二本鎖ＤＮＡ量を増加させることができ、これまで基質濃度が低いために反応速度が極めて遅かったＲＮＡ合成反応の反応速度を顕著に上昇させることが可能となり、ｍＲＮＡを効率的に増幅できることを見出した。そして、この技術によれば、ＰＣＲを用いて二本鎖ＤＮＡを増幅させる工程を経ることがないので、ｍＲＮＡをその塩基配列の長さに影響を受けずに効率よく増幅できることを実証し、本願発明を完成させるに至った。本発明は、かかる新規知見に基づいて完成されたものであり、以下の発明を包含する。
【０００８】
即ち、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、上記課題を解決するために、微量ｍＲＮＡを含む溶液にダミーＲＮＡを添加して混合溶液を作製する第１工程と、混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスＤＮＡを合成する第２工程と、合成されたアンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成して、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを形成する第３工程と、形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖ＤＮＡを作製する第４工程と、ＲＮＡポリメラーゼによって、増幅用二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを増幅する第５工程と、を含むことを特徴としている。
【０００９】
上記構成によれば、微量ｍＲＮＡにダミーＲＮＡを添加することによって、混合溶液中のＲＮＡ量を増加させることができる。その結果、混合溶液中のＲＮＡが微量ｍＲＮＡのみの場合と比較して、作製される増幅用二本鎖ＤＮＡの量が増す。このとき、増幅用二本鎖ＤＮＡの量は、ＲＮＡポリメラーゼの至適基質濃度に調製される。その結果、ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を進行させることができるため、塩基配列の長さに影響されることなく、短いｍＲＮＡも長いｍＲＮＡも同じように効率よく増幅できる。
【００１０】
つまり、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によれば、初発のＲＮＡの量が少ないために二本鎖ＤＮＡの量が少なくなり、転写反応が進行し難いという問題点を、ダミーＲＮＡを用いて初発のＲＮＡ濃度を増加させることにより解決し得る点に特徴があるといえる。
【００１１】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、上記第４工程は、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡの両末端側にプロモーター配列を連結したあと、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結されたプロモーター配列のみを切断する第６工程を含むことが好ましい。
【００１２】
上記構成によれば、微量ｍＲＮＡおよびダミーＲＮＡのセンス鎖のみを選択的に転写することができ、結果としてセンス鎖のみを増幅することができる。
【００１３】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、上記第４工程は、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡの両末端にプロモーター配列を連結したとき、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結されたプロモーター配列のみを切断できるように、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に制限酵素サイトが形成されることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、上記第４工程は、切断されたプロモーター配列およびダミーＲＮＡを除去する第７工程を含むことが好ましい。
【００１５】
上記構成によれば、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡを増幅するとき、切断されたプロモーター配列にＲＮＡポリメラーゼが結合することがなく、上記二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側に連結されたプロモーター配列からのみ、ＲＮＡを転写することができる。したがって、センス鎖の微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを効率よく転写することができる。
【００１６】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、上記ダミーＲＮＡの配列が、ポリＡ配列を含むことが好ましい。
【００１７】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、上記ダミーＲＮＡの配列が、配列番号４、配列番号６または配列番号１６によって示される塩基配列であることが好ましい。
【００１８】
上記構成によれば、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとは、共にポリＡ配列を有する。従って、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを逆転写するとき、オリゴｄＴ配列を含む同じプライマーを用いて同時に逆転写することができる。
【００１９】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、前記ダミーＲＮＡは、ビオチン化されていることが好ましい。
【００２０】
上記構成によれば、ビオチン化されたダミーＲＮＡは、ストレプトアビジンに対して特異的に結合することができる。したがって、ストレプトアビジンカラムなどを用いることによって、反応溶液からダミーＲＮＡのみを特異的に除去することができる。
【００２１】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、上記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼであることが好ましい。
【００２２】
上記構成によれば、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを効率よく転写することができる。
【００２３】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、上記混合溶液中のダミーＲＮＡの濃度が０．５〜１０μｇ／μＬであることが好ましい。
【００２４】
上記構成によれば、ＲＮＡポリメラーゼの反応に適した濃度の増幅用二本鎖ＤＮＡを作製することができる。その結果、本来、転写反応速度が遅いために増幅することができなかった微量ｍＲＮＡを増幅することができる。
【００２５】
本発明のｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、上記課題を解決するために、上記微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むことを特徴としている。
【００２６】
上記構成によれば、初発のｍＲＮＡ量が微量でも効率的にｍＲＮＡを増幅できる。それゆえ、微量ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００２７】
本発明のプローブの作製方法は、上記課題を解決するために、上記微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むことを特徴としている。
【００２８】
上記構成によれば、初発のｍＲＮＡ量が微量でも効率的にｍＲＮＡを増幅できる。それゆえ、微量ｍＲＮＡからプローブを作製することができる。
【００２９】
本発明の段階的サブトラクション法は、上記課題を解決するために、上記微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むことを特徴としている。
【００３０】
上記構成によれば、初発のｍＲＮＡ量が微量でも効率的にｍＲＮＡを増幅できる。それゆえ、微量ｍＲＮＡから段階的サブトラクション法を実施することができる。
【００３１】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１（ａ）】本発明の特徴点を示す図である。
【図１（ｂ）】本発明の特徴点を示す図である。
【図２】本発明の実施形態を示すものであり、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法の各工程を示すフローチャートである。
【図３】本発明の実施形態を示すものであり、ダミーＲＮＡの作製方法を示す図である。
【図４】本発明の実施形態を示すものであり、本発明のｃＤＮＡライブラリーの作製方法の各ステップを示すフローチャートである。
【図５】実施例において作製されたダミーＲＮＡ作製用ベクターの模式図である。
【図６（ａ）】実施例における、ダミーＲＮＡの最適量を検討した結果を示す電気泳動図である。
【図６（ｂ）】実施例における、ダミーＲＮＡの最適量を検討した結果を示すグラフである。
【図７（ａ）】実施例における、増幅可能な微量ｍＲＮＡの量を示す電気泳動図である。
【図７（ｂ）】実施例における、増幅可能な微量ｍＲＮＡの量を示す電気泳動図である。
【図７（ｃ）】実施例における、増幅可能な微量ｍＲＮＡの量を示す電気泳動図である。
【図８】実施例における、ｃＤＮＡライブラリーのインサートの長さの分布を示すグラフである。
【図９（ａ）】増幅されたｍＲＮＡのサイズ分布を示すグラフである。
【図９（ｂ）】増幅されたｍＲＮＡのサイズ分布を示すグラフである。
【図１０（ａ）】増幅されたｍＲＮＡのサイズ分布の比較を示すグラフである。
【図１０（ｂ）】増幅されたｍＲＮＡのサイズ分布の比較を示すグラフである。
【図１１】実施例における、１種類のＲＮＡに対する増幅効果を示す電気泳動図である。
【図１２】実施例における、異なる塩基配列を有するダミーＲＮＡを用いた場合のｍＲＮＡの増幅効果を示す電気泳動図である。
【図１３】実施例における、蛍光色素交換実験の結果を示すグラフである。
【図１４】実施例における、ｃＤＮＡライブラリーの作製工程を示すフローチャートである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について図１（ａ）、図１（ｂ）、２および５に基づいて説明すれば、以下の通りである。まず、本願発明の基本原理について、従来技術と比較しながら概説する。【００３４】
上述したように、従来のＲＮＡを増幅する方法として、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が連結された増幅用二本鎖ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼとを用いてＲＮＡを増幅する方法が用いられている。しかしながら、上記方法には、増幅用二本鎖ＤＮＡの量が多ければＲＮＡを増幅することができるが、増幅用二本鎖ＤＮＡの量が少なければＲＮＡを増幅することができないという問題点があった。【００３５】
このように増幅用二本鎖ＤＮＡの量が少ないときにＲＮＡを増幅することができない理由は、ミカエリス−メンテン式から容易に理解することができる。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いられるＲＮＡポリメラーゼなどの酵素の至適基質濃度はミリモル（ｍＭ）程度であることが知られている。上記至適基質濃度（Michaelis定数：Ｋｍ値）は、ミカエリス−メンテン式（（Ｉ）式参照）から得られる。なお、（Ｉ）式において、Ｋｍ＝（Ｋ２＋Ｋ３）／Ｋ１であり、Ｖｍａｘは最大反応速度、[Ｓ]は基質濃度を示す。
Ｖ＝Ｖｍａｘ[Ｓ]／（Ｋｍ＋[Ｓ]）・・・・・（Ｉ）
[Ｓ]＝Ｋｍであるとき、Ｖ＝Ｖｍａｘ／２である。このとき、Ｖｍａｘは、全ての酵素が、基質との複合体を形成したときの反応速度である。上記（Ｉ）式から、[Ｓ]が極端に少ない場合には、酵素反応がほとんど進まないことが理解できる。なお、上記（Ｉ）式における[Ｓ]が、増幅用二本鎖ＤＮＡの濃度に相当し、上記（Ｉ）式にて反応速度が算出される酵素が、ＲＮＡポリメラーゼに相当する。【００３６】
そこで、特許文献１のような従来の方法では、ＰＣＲを用いて増幅用二本鎖ＤＮＡを増幅し、その後、当該増幅用二本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて微量ｍＲＮＡを増幅することにより上記問題点を解決している。【００３７】
しかしながら、上記ＰＣＲを用いる方法では、短いｍＲＮＡと長いｍＲＮＡとを同じように効率よく増幅することができない。この点について、図１（ａ）を参考にして具体的に説明する。図１（ａ）には、鋳型として３種類の長さを有する増幅用二本鎖ＤＮＡを用い、それにＤＮＡポリメラーゼを作用させるＰＣＲが例示されている。このようなＰＣＲでは、所定の時間内に、最も長い鋳型は１回増幅され、次に長い鋳型は３回増幅され、最も短い鋳型は６回増幅されることになる。その結果、上記ＰＣＲによって増幅される増幅用二本鎖ＤＮＡは、短い二本鎖ＤＮＡが多く、かつ長い二本鎖ＤＮＡが少ないものになる。このような配列の長さによって量に偏りがあるように増幅された増幅用二本鎖ＤＮＡに対してＲＮＡポリメラーゼを作用させてｍＲＮＡを調製すると、結果として得られるｍＲＮＡも、短いｍＲＮＡが多く、かつ長いｍＲＮＡが少ないものになってしまうという不利益がある。【００３８】
一方、本発明では、増幅用二本鎖ＤＮＡを調製する際に、予めダミーＲＮＡと増幅対象のｍＲＮＡとを混在させている。その結果、増幅対象のｍＲＮＡが少ない場合でも逆転写酵素の反応速度を増加させることになり、効果的に増幅用二本鎖ＤＮＡを合成できることを特徴としている。より具体的に説明すると、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法では、まず、微量ｍＲＮＡにダミーＲＮＡを加えることによって、全ＲＮＡの量を多くすることで、見かけ上の基質濃度（Michaelis定数：Ｋｍ値）を上昇させる。この基質ＲＮＡを用いて増幅用二本鎖ＤＮＡを作製するので、結果として作製される増幅用二本鎖ＤＮＡの量が、ＲＮＡポリメラーゼの至適基質濃度に調製され得る。その結果、ｍＲＮＡの量が少ない場合であっても、本来進まない転写反応を進めることができる。【００３９】
また、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡを増幅する前段階として、ＰＣＲを用いる必要性がなくなる。このため、塩基配列の長さによらず、短いｍＲＮＡと長いｍＲＮＡとを同じように効率よく増幅することができる。この点について、図１（ｂ）を用いて説明する。図１（ｂ）には、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを増幅する工程が図示されている。本図では、鋳型として３種類の長さを有する増幅用二本鎖ＤＮＡを用い、当該増幅用二本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させてＲＮＡを増幅している。このとき、所定の時間内に、最も長い鋳型は６回増幅され、次に長い鋳型も６回増幅され、最も短い鋳型も６回増幅されることになる。つまり、本発明に係るｍＲＮＡの増幅方法では、所定の時間内に増幅する回数は、増幅用二本鎖ＤＮＡの長さに依存しない。それゆえ、短いｍＲＮＡと長いｍＲＮＡとを同じように効率よく増幅することができる。【００４０】
以上のように、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、従来のｍＲＮＡの増幅方法とは全く異なる原理により、塩基配列の長さに影響されることなく、短いｍＲＮＡと長いｍＲＮＡとを同じように効率よく増幅できる画期的な手法である。以下に、本発明に係る微量ｍＲＮＡの増幅方法の各工程について詳細に説明する。【００４１】
〔微量ｍＲＮＡの増幅方法〕
本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、微量ｍＲＮＡを含む溶液にダミーＲＮＡを添加して混合溶液を作製する第１工程と、混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスＤＮＡを合成する第２工程と、合成されたアンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成して、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを形成する第３工程と、形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖ＤＮＡを作製する第４工程と、ＲＮＡポリメラーゼによって、増幅用二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを増幅する第５工程と、を含む方法であればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。以下に各工程について詳細に説明する。【００４２】
＜第１工程＞
上記第１工程は、微量ｍＲＮＡを含む溶液にダミーＲＮＡを添加して混合溶液を作製する工程である。【００４３】
本明細書中にて「微量ｍＲＮＡ」の「微量」とは、当該ｍＲＮＡから増幅用二本鎖ＤＮＡを合成した場合、後段の第５工程において、上記増幅用二本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を行ったときに転写反応速度が極めて遅い程度のｍＲＮＡの量を意図する。また、比較的ｍＲＮＡの量が多くＲＮＡポリメラーゼによる転写反応が進む場合であっても、ダミーＲＮＡを用いることによって、さらに転写反応速度を増すことができることは、本明細書から容易に理解できるであろう。【００４４】
また、本明細書中にて「ダミーＲＮＡ」とは、増幅したいＲＮＡに対して加えることによって、少なくとも逆転写反応時および後段のリガーゼ反応時に、逆転写酵素の基質となるＲＮＡの量、およびリガーゼの基質となるＤＮＡの量を増加させことができるＲＮＡが意図される。【００４５】
上記ｍＲＮＡは、動物、植物または微生物などの細胞または組織などから精製されたｍＲＮＡであってもよいし、あるいは、合成されたｍＲＮＡであってもよく、特に限定されるものではない。また、微量ｍＲＮＡの精製方法も特に限定されるものではなく、適宜、公知の方法を用いて精製することができる。【００４６】
ダミーＲＮＡの配列は、特に限定されるものではないが、ポリＡ配列を含むことが好ましい。ダミーＲＮＡがポリＡ配列を有することによって、ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを、同じプライマーを用いて逆転写することができる。例えば、上記プライマーとしては、オリゴｄＴプライマーを挙げることができる。【００４７】
また、上記ポリＡ配列の長さは、オリゴｄＴプライマーが特異的にアニーリングして逆転写し得る長さであればよく、特に限定されるものではない。例えば、上記ポリＡ配列は、少なくとも１８個のアデニル酸からなることが好ましい。【００４８】
さらに具体的には、ダミーＲＮＡの配列は、配列番号４、配列番号６または配列番号１６によって示される塩基配列であることが好ましい。以上のようにダミーＲＮＡがポリＡ配列を有することによって、オリゴｄＴ配列を含む同じプライマーを用いて微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを同時に逆転写することができる。【００４９】
ダミーＲＮＡの作製方法は、特に限定されるものではなく、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ダミーＲＮＡは、ダミーＲＮＡの配列を含む二本鎖ＤＮＡを組み込んだベクターから、ダミーＲＮＡを発現させることによって作製することができる。ベクターを用いてダミーＲＮＡを作製する方法は、一度ベクターを構築すれば、何度でもダミーＲＮＡを作製することができるので、安価に大量のダミーＲＮＡを作製できるという利点を有する。具体的には、ダミーＲＮＡの塩基配列をコードするセンス鎖ＤＮＡとアンチセンス鎖ＤＮＡとを合成したあと、アニーリングさせて二本鎖ＤＮＡを形成する。その後、当該二本鎖ＤＮＡを発現ベクターなどに組み込んで、公知のＲＮＡポリメラーゼによって転写して作製することができる。なお、上記発現ベクターは、特に限定されるものではなく、組み込まれた二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを転写できるようにＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであればよい。【００５０】
また、ダミーＲＮＡは、公知の方法によって、合成して作製することもできる。合成によってダミーＲＮＡを作製する方法は、ベクターを用いて作製する方法と比較してコストがかかるが、ダミーＲＮＡに対してビオチン化などの様々な化学修飾を施すことができるという利点を有する。例えば、ダミーＲＮＡをビオチン化すれば、当該ダミーＲＮＡは、ストレプトアビジンに対して特異的に結合することができる。つまり、ビオチン・ストレプトアビジン法によって、反応混合液などの中から、上記ダミーＲＮＡのみを特異的に除去することが可能になる。【００５１】
また、ダミーＲＮＡはビオチン化されていることが好ましい。ダミーＲＮＡがビオチン化されていることによって、例えば反応溶液中からダミーＲＮＡのみを特異的に除去することができる。例えば、ダミーＲＮＡをビオチン化した場合、ビオチン・ストレプトアビジン法によって、ダミーＲＮＡのみを特異的に除去することができる。ダミーＲＮＡをビオチン化する方法は特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。【００５２】
上記混合溶液中のダミーＲＮＡの濃度は、０．５〜１０μｇ／μＬであることが好ましい。また、上記混合溶液中のダミーＲＮＡの濃度は、０．５〜２．５μｇ／μＬであることがより好ましく、１μｇ／μＬであることが最も好ましい。なお、これらの好ましい濃度範囲は、後述する実施例において、発明者らが鋭意検討して独自に決定した濃度範囲である。ダミーＲＮＡの濃度が上記濃度であることによって、混合溶液中の全ＲＮＡ量をミリモル（ｍＭ）程度に調製することができる。その結果、混合溶液から作製される増幅用二本鎖ＤＮＡの濃度もミリモル（ｍＭ）程度になる。ＲＮＡポリメラーゼの至適基質濃度はミリモル（ｍＭ）程度であるので、その結果、本来、増幅用二本鎖ＤＮＡの量が少ないために進行し難い転写反応をより効率よく進行させることができる。【００５３】
上記微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを含む混合溶液の溶媒は、後段の逆転写反応を阻害しないものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、水またはＴｒｉｓ−ＨＣｌなど、緩衝液に用いる好適な材料を適宜使用することができる。【００５４】
＜第２工程＞
第２工程は、混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスＤＮＡを合成する工程である。【００５５】
本工程を図２のステップ１に模式的に示す。本工程では、図２のステップ１に示されるように、混合溶液中の微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを鋳型として用いた逆転写反応によって、上記微量ｍＲＮＡおよび上記ダミーＲＮＡのアンチセンスＤＮＡが合成される。本工程で用いられる逆転写酵素は、特に限定されるものではなく、公知の逆転写酵素を適宜用いればよい。【００５６】
また、プライマーとしては、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとにアニーリングし得るものであれば良く、特に限定されるものではないが、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとが共にポリＡ配列を有する場合には、オリゴｄＴプライマーを用いることが好ましい。オリゴｄＴプライマーによって両方のＲＮＡを同時に逆転写することができ、その結果、操作の煩雑さや経費を削減することができる。【００５７】
＜第３工程＞
第３工程は、第２工程にて合成されたアンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成して、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを形成する工程である。【００５８】
本工程を図２のステップ２に模式的に示す。本工程では、図２のステップ２に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼは、アンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成し得るものであればよく、適宜公知のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。【００５９】
また、第３工程は、ＤＮＡポリメラーゼがセンスＤＮＡを合成する前段階として、ＲＮａｓｅによって、上記第２工程にてアンチセンスＤＮＡを合成するときに鋳型として用いられた微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを分解するステップが含まれていることが好ましい。上記ＲＮａｓｅは、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを分解することができればよく、特に限定されるものではない。例えば、上記ＲＮａｓｅとしてＲＮａｓｅ  Ｈを用いることができる。【００６０】
＜第４工程＞
第４工程は、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖ＤＮＡを作製する工程である。【００６１】
上記第４工程は、結果として、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側のみにＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を連結する工程であればよく、その方法は、特に限定されるものではない。【００６２】
例えば、上記第４工程は、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡの両末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む増幅アダプターを連結したあと、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結された増幅アダプターのみを切断する第６工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結された増幅アダプターのみを切断する方法は、特に限定されるものではないが、制限酵素を用いて切断することが好ましい。制限酵素を用いて切断する場合には、第３工程にて形成された二本鎖ＤＮＡの両末端にプロモーター配列を連結したとき、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結されたプロモーター配列のみを切断できるように、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に制限酵素サイトが形成されるようにすることが好ましい。このとき上記制限酵素は、二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側に存在しないものであればよく、特に限定されるものではない。また、上記制限酵素サイトはオリゴｄＴプライマー内に組み込んでおくことが好ましい。【００６３】
本工程を図２のステップ３に模式的に示す。ステップ３では、まず、ステップ２にて形成された二本鎖ＤＮＡの両末端側に、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む増幅アダプターを連結している。このとき、上記二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に増幅アダプターが連結されたときにのみ、当該３’末端側にＮｏｔＩサイトが形成されるようにオリゴｄＴプライマーを作製している。したがって、増幅アダプターが連結された後の二本鎖ＤＮＡをＮｏｔＩにて処理すれば、上記二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの３’末端側に連結した増幅アダプターのみを切断することができる。また、上記二本鎖ＤＮＡの５’末端側に連結された増幅アダプターのみが切断されるようにしてもよい。このように、連結された増幅アダプターの一方を切断することによって、センスＲＮＡのみ、またはアンチセンスＲＮＡのみを選択的に増幅することが可能になる。【００６４】
また、上記第４工程は、切断された増幅アダプターおよびダミーＲＮＡを除去する第７工程を含むことが好ましい。第７工程にて、切断された増幅アダプターおよびダミーＲＮＡを除去することによって、後段の第５工程においてＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡを増幅するとき、切断された増幅アダプターおよびダミーＲＮＡにＲＮＡポリメラーゼが結合することがなく、上記二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側に連結された増幅アダプターにのみ、ＲＮＡポリメラーゼが結合することができる。したがって、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを効率よく転写することができるとともに、微量ｍＲＮＡの増幅工程にて発生し易い様々なノイズを減少させることができる。【００６５】
上記第７工程は、切断された増幅アダプターおよびダミーＲＮＡを除去し得るものであればよく、特に限定されることはない。例えば、上記第７工程としては、ゲル濾過カラムを用いたサイズ分画法を用いることができる。なお、上記ゲル濾過カラムは特に限定されず、分画したいサイズに応じて適宜公知のカラムを用いればよい。上記ゲル濾過カラムを用いたサイズ分画法を用いれば、切断された増幅アダプターおよびダミーＲＮＡの両方を同時に除去することができる。また、ダミーＲＮＡがビオチン化されている場合、上記第７工程には、ビオチン・ストレプトアビジン法などによるダミーＲＮＡ除去工程が含まれていても良い。ビオチンは、ストレプトアビジンに対して特異的に結合することが知られている。したがって、反応溶液をストレプトアビジンカラムなどに通せば、ビオチン化されたダミーＲＮＡを特異的に除去することができる。【００６６】
上記増幅アダプターには、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が含まれている。上記プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、かつ当該プロモーター配列の下流に位置する塩基配列を転写し得るものであればよく、特に限定されるものではない。例えば上記プロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列またはＳＰ６プロモーター配列を含む塩基配列を挙げることができるが、これらに限定されない。上記各プロモーター配列の具体的な塩基配列を例示すると、
Ｔ７プロモーター配列  ：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’（配列番号１）
Ｔ３プロモーター配列  ：5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’   （配列番号２）
ＳＰ６プロモーター配列：5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3’（配列番号３）
を挙げることができる。【００６７】
上記プロモーター配列を二本鎖ＤＮＡに連結する場合、上記プロモーター配列を含む配列と当該配列の相補鎖ＤＮＡとをアニーリングさせて増幅アダプターを形成させたあと、当該増幅アダプターを二本鎖ＤＮＡに連結させることが好ましい。なお、上記プロモーター配列と当該プロモーター配列の相補ＤＮＡ鎖の作製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて合成することができる。【００６８】
また、上記増幅アダプターを二本鎖ＤＮＡに連結させる場合、ＤＮＡリガーゼを用いて連結することが好ましい。上記ＤＮＡリガーゼとしては、増幅アダプターを二本鎖ＤＮＡに連結し得るものであればよく、特に限定されるものではない。【００６９】
＜第５工程＞
第５工程は、ＲＮＡポリメラーゼによって、増幅用二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを増幅する工程である。【００７０】
上記第５工程は、図２のステップ４に示されるように、上記第４工程にて形成された増幅用二本鎖ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼとを用いて、微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを増幅する工程である。上記ＲＮＡポリメラーゼは、増幅用二本鎖ＤＮＡに連結された増幅アダプター中のプロモーター配列に結合し、かつ当該プロモーター配列の下流に位置するＤＮＡからＲＮＡを転写し得るものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、上記ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼであることが好ましい。また、上記プロモーター配列としては、各ＲＮＡポリメラーゼによって転写制御を受け得るプロモーター配列を用いることが好ましい。【００７１】
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製方法〕
本発明のｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むものであればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。【００７２】
具体的に、本発明のｃＤＮＡライブラリーの作製方法は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によって得られる増幅されたｍＲＮＡから二本鎖ＤＮＡを作製し、その後、当該二本鎖ＤＮＡをベクターに導入する工程を含むことが好ましい。その作成方法も特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜用いて作製することができる（例えば、「バイオマニュアルシリーズ２  遺伝子ライブラリーの作成法」（野島博・編）羊土社、1994、または「基礎生化学実験法」（大島泰郎・編）第４巻、核酸・遺伝子実験II、東京化学同人、2000参照）。【００７３】
本発明のｃＤＮＡライブラリーの作成方法の一例を、図４に模式的に示す。なお、本発明は以下の説明に限られるものではないことを念のため付言しておく。【００７４】
図５のステップ１は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法の第５工程にて増幅されたｍＲＮＡを鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスＤＮＡを合成するステップである。その方法は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法の第２工程に従えばよい。なお、上記第５工程にて増幅されるｍＲＮＡには、増幅された微量ｍＲＮＡと増幅されたダミーＲＮＡとが含まれている。【００７５】
図５のステップ２は、上記ステップ１にて合成されたアンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成して、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを形成するステップである。その方法は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法の第３工程に従えばよい。【００７６】
図５のステップ３は、上記ステップ２にて形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側にＤＮＡリガーゼを用いて連結アダプターを連結するステップである。上記ＤＮＡリガーゼとしては、連結アダプターを二本鎖ＤＮＡの両末端側に連結し得るものであればよく、特に限定されるものではない。【００７７】
また、上記連結アダプターは、二本鎖ＤＮＡの両末端側に連結し得るものであればよく、特に限定されるものではない。上記オリゴｄＴプライマーの塩基配列は、連結アダプターが二本鎖ＤＮＡの両末端側に連結された場合に、一方の連結アダプターのみが制限酵素によって切断され得るような塩基配列を有するものであることが好ましい。上記制限酵素としては、特に限定されるものではない。例えば、図５のステップ３では、上記制限酵素が、ＮｏｔＩである場合を例示している。また、上記連結アダプターは、二本鎖ＤＮＡに連結されない側が、制限酵素サイトであるように作製されていることが好ましい。上記制限酵素サイトとしては、特に限定されるものではない。例えば、図５のステップ３では、上記制限酵素サイトが、ＢｇｌＩＩサイトである場合を例示している。この結果、ステップ３にてＮｏｔＩによって処理された後の二本鎖ＤＮＡの両末端には、ＢｇｌＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが存在するため、容易にベクターに組み込むことができる。【００７８】
上記ステップ３のあと、切断された連結アダプターと増幅されたダミーＲＮＡとを除去するためにステップ４が含まれていることが好ましい。ステップ４は、切断された連結アダプターと増幅されたダミーＲＮＡとが除去され得るものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、ステップ４として、ゲル濾過カラムを用いたサイズ分画法を用いることができる。なお、上記ゲル濾過カラムは特に限定されず、分画したいサイズに応じて適宜公知のカラムを用いればよい。また、上記ステップ４は、複数回行うことが好ましい。ステップ４を複数回行うことによって、切断された連結アダプターと増幅されたダミーＲＮＡとを、より効率よく除去することができる。【００７９】
上記ステップ１〜４を経て精製された二本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼを用いてベクターに組み込むことにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。上記ベクターは、特に限定されるものではなく、適宜公知のベクターを用いることができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターまたはファージベクターなど公知のベクターを用いることができる。【００８０】
〔プローブの作製方法〕
本発明のプローブの作製方法は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むものであればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。【００８１】
具体的に、本発明のプローブの作製方法は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によって増幅されたｍＲＮＡを用いて、プローブを作製する方法である。本明細書において「プローブ」とはＲＮＡプローブ、およびＤＮＡプローブを指す。ｍＲＮＡからＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブを作製する方法は特に限定されるものではなく適宜公知の方法（例えば、「バイオマニュアルシリーズ２  遺伝子ライブラリーの作成法」（野島博・編）羊土社、1994、または「基礎生化学実験法」（大島泰郎・編）第４巻、核酸・遺伝子実験II、東京化学同人、2000参照）にしたがって作製することができる。【００８２】
本願発明のプローブの作製方法は、例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイ用のプローブを作製することができる。【００８３】
〔段階的サブトラクション法〕
本発明の段階的サブトラクション法（別名：多段差引法）は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法を一工程として含むものであればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。【００８４】
具体的に、本発明の段階的サブトラクション法は、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によって増幅されたｍＲＮＡを被検対象として用いて行われる段階的サブトラクション法である。上記段階的サブトラクション法は、特に限定されるものではなく適宜公知の方法（例えば、「バイオマニュアルシリーズ２  遺伝子ライブラリーの作成法」（野島博・編）羊土社、1994、または「基礎生化学実験法」（大島泰郎・編）第４巻、核酸・遺伝子実験II、東京化学同人、2000参照）にしたがって行うことができる
〔実施例〕
本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。【００８５】
〔１：ダミーＲＮＡ作製用ベクターの作製〕
まず、本発明のダミーＲＮＡ作製用ベクターの作製方法について、図４を用いて説明する。【００８６】
まず、ダミーＲＮＡのセンス鎖（Sense）とアンチセンス鎖（Antisense）とがアニーリングしてなるダミーＲＮＡユニットを作製した。ダミーＲＮＡユニットを作製するために、ダミーＲＮＡのセンス鎖（Sense）とアンチセンス鎖（Antisense）とをそれぞれ合成した。なお、上記センス鎖の５’末端は、ベクターへの組み込みのためにリン酸化した。以下に、センス鎖およびアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
Sense    ：5’-AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGC-3’（配列番号４）
Antisense：5’-GGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTATCCAGACG-3’（配列番号５）
上記センス鎖とアンチセンス鎖とを、それぞれの濃度が等しく、かつセンス鎖とアンチセンス鎖との全量が０．３５μｇ／μＬとなるように、アニーリングバッファー（10mM Tris-HCl（pH7.5）,1mM EDTA,10mM MgCl2）中に溶解した。その後、６５℃にて２分間、３７℃にて１０分間、および室温にて５分間の条件下において順に保温することによってセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせ、ダミーＲＮＡユニットを作製した。なお、上記ダミーＲＮＡユニットの両末端には、ＥｃｏＲＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが形成されており、両制限酵素サイトを用いて、発現ベクターに組み込むことができる。【００８７】
次いで、上記ダミーＲＮＡユニットを組み込むためのベクターを作製した。当該ベクターとしてはｐＡＰ３ｎｅｏ（タカラバイオ社製）を用いた。ｐＡＰ３ｎｅｏをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩにて切断した後、アガロースゲルに電気泳動し、当該アガロースゲルからｐＡＰ３ｎｅｏを精製した。次いで、上記ｐＡＰ３ｎｅｏに、上記ダミーＲＮＡカセットを組み込むことによってダミーＲＮＡ作製用ベクター（ｐＤｕｒｉｎ−１）を作製した。【００８８】
〔２：ダミーＲＮＡの調整〕
上記ｐＤｕｒｉｎ−１を用いてダミーＲＮＡを作製する方法は、以下の１）〜１１）に従った。また、上記ｐＤｕｒｉｎ−１を用いてダミーＲＮＡを作製する方法について、図３に模式的に示す。【００８９】
１）まず１０μｇのｐＤｕｒｉｎ−１に２０μＬの10×Not I Buffer（100mM Tris-HCl（pH7.5）,1.5M NaCl,70mM MgCl2,10mM DTT,0.1% BSA,0.1% Triton X-100）を加え、更に水を加えて全量を２００μＬにした。【００９０】
２）５ユニットのＮｏｔＩを加え、３７℃にて２時間保温した。反応後、ｐＤｕｒｉｎ−１が切断されていることを、アガロース電気泳動にて確認した。【００９１】
３）上記反応液に反応液と等量（２１０μＬ）のフェノール・クロロホルム溶液（１：１）を加えて攪拌した。【００９２】
４）マイクロフュージにて１分間の遠心分離を行った。【００９３】
５）遠心分離の後、上清を新しいマイクロフュージチューブに移し、上清の約０．０８倍量（１７μＬ）の３Ｍ  酢酸ナトリウムと上清の約２倍量（４２０μＬ）のエタノールとを加え、ドライアイス中で１５分間冷却した。【００９４】
６）マイクロフュージにて１５分間遠心し、得られた沈殿を５００μＬの７０％エタノールを用いて軽く洗った後、２秒間遠心を行った。上清を取り除いた後、再び２秒間遠心を行った。マイクロチューブの底に溜まった少量の７０％エタノールを取り除いた後、沈殿を乾燥させることなく、湿ったままの状態にて次の操作へ進んだ。【００９５】
７）ＮｏｔＩにて切断されたｐＤｕｒｉｎ−１を含む上記沈殿物に、２０μｌの10×T7 Pol Buffer（400mM Tris-HCl（pH8.0）,80mM MgCl2,20mM spermidin,50mM DTT）、１６μＬの25mM NTP mixを加え、更に水を加えて全量を２００μＬにした。【００９６】
８）５０ユニット（約１〜５μＬ）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃にて６０分間保温した。【００９７】
９）更に、５ユニット（約１μＬ）のDNase I（RNase活性の混入のないもの）を加え、３７℃にて２０分間保温した。【００９８】
１０）上記３）〜６）と同様の操作を行い、沈殿を得た。【００９９】
１１）１０）にて得られた沈殿に、１００μＬのＴＥ（10mM Tris-HCl（pH7.5）,0.1mM EDTA）を加え、ダミーＲＮＡの濃度をＵＶメーターによって測定した。なお、溶液がＯＤ２６０＝１．０であれば、当該溶液中のダミーＲＮＡの濃度は４０μｇ／μＬである。ダミーＲＮＡの濃度を測定した後、ダミーＲＮＡの濃度が５μｇ／μＬとなるように、ＴＥを加えた。その後、ダミーＲＮＡをマイクロフュージチューブなどに分注して、−２０℃または−８０℃にて保存した。以上のようにして、ダミーＲＮＡ作製用ベクターを用いてダミーＲＮＡを作製した。【０１００】
また、上記以外の方法として、化学合成によってダミーＲＮＡを作製した。このとき、ダミーＲＮＡを化学合成するとともに、その３’末端側をビオチン化した。ビオチン化したダミーＲＮＡを、ＨＰＬＣによって精製した。なお、このようなビオチン化されたダミーＲＮＡは、購入することも可能である。以下に上記ダミーＲＮＡの塩基配列を示す。
ダミーＲＮＡ：5’-AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（配列番号６）
合成されたダミーＲＮＡを、１μｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶かした後、−２０℃または−８０℃にて保存した。なお、以下の実験には、ビオチン化されたダミーＲＮＡを用いた。【０１０１】
〔３：二本鎖ＤＮＡの作製〕
二本鎖ＤＮＡの作製方法は、以下の１）〜１０）に従った。【０１０２】
１）まず、１ｎｇ程度のライブラリー化したい微量ｍＲＮＡ（およそ１００個の細胞由来）に、ダミーＲＮＡを０、０．５、１．０、２．５、５．０または１０．０μｇ加え、それぞれ全量が７．５μＬとなるように５ｍＭ  Tris-HCl（pH7.5）を加えた。次いで、６５℃にて５分間の加熱処理を行った後、氷冷した。なお、微量ｍＲＮＡの取得方法は、公知のｍＲＮＡ取得方法に従った。具体的には、QuickPrep Micro mRNA Purification Kit（Amersham Biosciences社製）を用いて微量ｍＲＮＡを取得した。なお、具体的な操作は、添付のプロトコールに従った。なお、ｍＲＮＡ抽出の時にダミーＲＮＡを加えておけば、ＲＮａｓｅによるｍＲＮＡの分解を最小限に抑えることができる。また、本実施例では、微量ｍＲＮＡとして、２９３Ｔ細胞由来またはＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡを用いた。【０１０３】
２）上記微量ｍＲＮＡとダミーＲＮＡとの混合物に、２．５μＬの10×First Strand Buffer（500mM Tris-HCl（pH8.3）,750mM KCl,30mM MgCl2）、２．５μＬの0.1M DTT、１．５μＬの10×First Strand Mixture（10mM dATP,10mM dGTP,10mM dTTP,5mM 5-methyl-dCTP）、１．０μＬ（１．６μｇ）の（T7）Linker Primer、および０．５μＬ（２０ユニット）のRNase Inhibitor（Promega社製）を順次加えた。その後、水を加えて全量を２５μＬとした。なお、以下に、（T7）Linker Primerの配列を示す。なお、上記（T7）Linker PrimerはＨＰＬＣにて精製されたものを用いた。
（T7）Linker Primer：5’-GAGAGAGAGAGAGAGATAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号７）
３）室温にて１０分間放置することによって、ｍＲＮＡと（T7）Linker Primerとをアニーリングさせた。【０１０４】
４）１μＬ（５０ユニット）のStrataScript RT（Stratagene社製、Stratagene cDNA Synthesis Kit）と０．５μＬのSuperScript III（Invitrogen社製）とを加え、４２℃にて４５分間反応させた。その後、更に０．５μＬのSuperScript IIIを加え、５０℃にて３０分間反応させた。その後、更に５５℃にて３０分間反応させた。【０１０５】
５）反応終了後、反応液を氷中に移した。【０１０６】
６）上記反応液を氷中にて冷却した状態で、２０μＬの10×Second Strand Buffer（188mM Tris-HCl（pH8.3）,906mM KCl,46mM MgCl2）、７．５μＬの0.1M DTT、および３μＬのSecond Strand Nucleotide Mixture（10mM dATP,10mM dGTP,10mM dTTP,25mM dCTP）を加えた。その後、氷冷した水を加えて全量を２００μＬとした。【０１０７】
７）更に、氷中にて５分間保冷した。【０１０８】
８）１．５μＬ（２ユニット）のRNase H（タカラバイオ社製）と１０μＬ（５０ユニット）のE. coli DNA Polymerase I（タカラバイオ社製）とを加えた。【０１０９】
９）１６℃にて１５０分間反応させた。【０１１０】
１０）２００μＬのフェノール／クロロホルム溶液を加えて良く攪拌した後、遠心分離（15,000rpm,3min,4℃）を行った。上清液を新しいチューブに移してエタノール沈殿（−８０℃にて１０分以上）を行った後、沈殿物を７０％エタノールにて洗浄した。沈殿物は、乾燥させることなく以下の工程に用いた。【０１１１】
〔４：ダミーＲＮＡの最適量に関する検討〕
二本鎖ＤＮＡの作製時におけるダミーＲＮＡの量と、二本鎖ＤＮＡの作製効率との関係を検討した。【０１１２】
上記沈殿物を８５ｍＬの水に溶解し、そのうちの１μＬをテンプレートとして用いた。当該テンプレートに対して、１μＬの10×Ex Buffer、０．８μＬのdNTP mix.、下記のプライマー（hsGAPDH-FおよびhsGAPDH-R）をそれぞれ１μＬ、０．１μＬのEx taq、５．１μＬの水を加えて、全量を１０μＬとした。そして、９５℃にて５分間の変性の後、９５℃にて３０秒間の変性反応、５５℃にて３０秒間のアニーリング反応および７２℃にて１分間間の伸長反応からなるサイクルを３０〜５０サイクル行うＰＣＲ反応を行った。なお、微量ｍＲＮＡが約１細胞由来である場合には、上記サイクル数は５０サイクルであることが好ましく、微量ｍＲＮＡが約１０細胞由来である場合には、上記サイクル数は４０サイクルであることが好ましく、微量ｍＲＮＡが約１００細胞由来である場合には、上記サイクル数は、３０サイクルであることが好ましい。
hsGAPDH-F：5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’（配列番号８）
hsGAPDH-R：5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’（配列番号９）
ＰＣＲ反応の後、ＰＣＲ反応産物（５μＬ）を２％アガロースゲルにて電気泳動した。電気泳動後、各バンドの蛍光強度（intensity）を「Socion Image（NIH Image）」にて測定した。なお、結果については後述する〔結果１〕にて説明する。【０１１３】
〔５：微量ｍＲＮＡ量に関する検討〕
２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞から抽出したｍＲＮＡ（約０．１ｎｇ（約１０細胞に相当）、または約０．０１ｎｇ（約１細胞に相当））に１．０μｇのダミーＲＮＡを添加したサンプルと、ダミーＲＮＡを添加しないサンプルとを調整した。【０１１４】
当該サンプルを用い、上述した方法にしたがって、２本鎖ＤＮＡを作製した。そして、上記〔４：ダミーＲＮＡの最適量に関する検討〕に記載した方法にしたがって、本願発明の増幅方法によって増幅可能な微量ｍＲＮＡの量について検討した。なお、微量ｍＲＮＡが０．０１ｎｇの場合には、ＰＣＲ反応のサイクル数を５０サイクルとし、微量ｍＲＮＡが０．１ｎｇの場合には、ＰＣＲ反応のサイクル数を４０サイクルとした。結果については後述する〔結果２〕にて説明する。【０１１５】
〔６：増幅用二本鎖ＤＮＡの作製〕
増幅用二本鎖ＤＮＡの作製方法は、以下の１）〜１３）に従った。【０１１６】
１）増幅アダプターを作製するために、センス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ合成した。なお、上記センス鎖には、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター配列が含まれている。以下に、センス鎖およびアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
Sense T7    ：5’-CACTAGTACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAATTCCCCGGG-3’（配列番号１０）
Antisense T7：5’-CCCGGGGAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTACTAGTGAGCT-3’（配列番号１１）
上記Sense T7とAntisense T7とを、それぞれの濃度が等しく、かつSense T7とAntisense T7との全量が０．３５μｇ／μＬとなるように、アニーリングバッファー（10mM Tris-HCl（pH7.5）,1mM EDTA,10mM MgCl2）中に溶解した。その後、６５℃にて２分間、３７℃にて１０分間、および室温にて５分間の条件下にて順に保温することによってSense T7とAntisense T7とをアニーリングさせ、増幅アダプターを作製した。上記増幅アダプターを、−２０℃にて保存した。【０１１７】
２）〔３：二本鎖ＤＮＡの作製〕にて精製した沈殿物に、１０μＬの10×T4 DNA Polymerase Buffer、５μＬの2.5mM dNTP mixture、および水を加えて全量を１００μＬとした。当該溶液に３．５μＬ（約５ユニット）のT4 DNA Polymeraseを加えて、３７℃にて３０分間反応させた。次いで、１００μＬのフェノール／クロロホルム溶液を加えて攪拌した後、遠心分離を行った。その後、上清液を新しいチューブに移してエタノール沈殿（−８０℃にて１０分以上）を行った後、沈殿物を７０％エタノールにて洗浄した。当該工程によって、平滑末端化された二本鎖ＤＮＡを得た。【０１１８】
３）上記平滑末端化された二本鎖ＤＮＡ（沈殿物）に、２μＬの10×Ligase Buffer（500mM Tris-HCl（pH7.5）,70mM MgCl2,10mM DTT）、２μＬの１０ｍＭ  ｒＡＴＰ、および１μＬの増幅アダプター（０．３５μｇ）を加え、その後、水を加えて全量を１８．５μＬとした。【０１１９】
４）１．５μＬ（約４ユニット）のT4 DNA Ligaseを加えた後、８℃にて一晩反応させた。【０１２０】
５）７０℃にて３０分間の加熱処理を行うことによって、Ligaseを失活させた。次いで、５秒間の遠心分離を行って上清を精製した。【０１２１】
６）このとき、〔３：二本鎖ＤＮＡの作製〕にて沈殿として精製された二本鎖ＤＮＡの両端には増幅アダプターが接続されている。この場合、当該二本鎖ＤＮＡにT7 RNA Polymeraseを作用させれば、微量ｍＲＮＡのセンス鎖のみならずアンチセンス鎖も転写されてしまう。したがって、ＮｏｔＩによって処理することによって、微量ｍＲＮＡのアンチセンス鎖の転写を制御する増幅アダプターのみを除去した。まず、上記上清に、２７μＬのNotI Buffer Supplement（278mM NaCl,8mM MgCl2,1.8mM DTT,0.018% Triton X-100）および３μＬのＮｏｔＩを加え、３７℃にて９０分間反応させた。反応後、５μＬの10×STEおよび２μｇのｔＲＮＡを加えた。以上のようにして、ｍＲＮＡを増幅するための増幅用二本鎖ＤＮＡを作製した。【０１２２】
７）次いで、制限酵素によって切断された増幅アダプターを除くためにＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００（Clontech社製）を用いてサイズ分画を行った。まず、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００を均一に懸濁（カラムを上下して混ぜること）してから上下の蓋を取り除いた。ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００を付属のチューブ（または蓋を取り除いた１．５ｍＬマイクロフュージチューブ）にのせ、１０分間静置してカラム中に余剰に存在する１×ＴＥ（100mM NaCl,10mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA）を排出した。更に、上記ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００と１．５ｍＬマイクロフュージチューブとを１５ｍＬのプラスチックチューブに入れ、その状態にて低速遠心を行った。なお、低速遠心機（BECKMAN J2-21）を用い、１８００ｒｐｍ、３分間の条件（７００×ｇ）にて遠心を行った。【０１２３】
８）低速遠心後、１．５ｍＬマイクロフュージチューブに出てきたバッファーを取り除き、再び１８００ｒｐｍにて３分間の条件にて、遠心を行った。【０１２４】
９）低速遠心後、１．５ｍＬマイクロフュージチューブに出てきたバッファーを取り除いた。【０１２５】
１０）上記ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００を新しい１．５ｍＬマイクロフュージチューブに差し込み、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００の中心の樹脂上に、６）にて作製した増幅用二本鎖ＤＮＡを１０μＬ加えた。新しいマイクロフュージチューブに差し込まれたＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００を１５ｍLのプラスチックチューブに入れ、低速遠心機を用い、１８００ｒｐｍ、５分間の条件にて遠心を行った。【０１２６】
１１）マイクロフュージチューブに出てきたサンプル（約５０μＬ）に、１３０μＬのＴＥ、２０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、および等量のフェノール・クロロホルム溶液を加えてよく攪拌した後、２分間遠心した。【０１２７】
１２）上層の水層を新しいチューブに移し、４００μＬの１００％エタノールを加えて攪拌した後、−８０℃にて１０分間、または−２０℃にて一晩静置した。【０１２８】
１３）上記水層を１５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件にて遠心して沈殿物を回収した。その後、当該沈殿物を７０％エタノールによって洗浄した。【０１２９】
以上の工程によって、増幅用二本鎖ＤＮＡを作製した。【０１３０】
〔７：ダミーＲＮＡの除去〕
１）上記〔６：増幅用二本鎖ＤＮＡの作製〕にて回収した沈殿物を水に溶解した後、ストレプトアビジンを加え、十分に攪拌した後、室温にて５分間静置した。【０１３１】
２）反応溶液にフェノール・クロロホルム溶液を加えて攪拌し、水層を回収した。なお、ダミーＲＮＡ／ストレプトアビジン複合体はフェノール・クロロホルム層に移動するので、水層を回収することによって、ダミーＲＮＡを除去することができる。【０１３２】
３）２）にて残ったフェノール・クロロホルム層に、ＴＥを加えて攪拌した後、再び水槽を回収した。【０１３３】
４）上記２）および３）の工程にて回収した水層に対してストレプトアビジンを加え、上記１）〜３）の工程を繰り返し行った。【０１３４】
５）ミニセント−３０フィルター（東ソー製）（ＭＩＮＩＣＥＮＴ−３０（Cat.#08627））を用いて、回収した水層から増幅用二本鎖ＤＮＡを精製した。なお、精製方法は、添付のプロトコールに従った。【０１３５】
〔８：ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーの作製工程を図１４に示すとともに、その詳細について以下に説明する。【０１３６】
１）作製した増幅用二本鎖ＤＮＡ（沈殿物）に、１μＬのダミーＲＮＡ（５μｇ／μＬ）、１０μＬの10×T7 Pol Buffer、８μＬの25mM NTP mix、および水を加えて全量を９５μＬ〜９９μＬとした。【０１３７】
２）上記溶液に５０ユニット（約１〜５μＬ）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃にて６０分間保温した。【０１３８】
３）ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００を用いて、上述した方法にしたがって、増幅された過剰量のダミーＲＮＡを除去した。なお、ダミーＲＮＡが除去されたあとの増幅されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿によって沈殿物として回収した。なお、本実施例では、ここで得られたｍＲＮＡを用いて、〔３：二本鎖ＤＮＡの作製〕〜〔８：ｃＤＮＡライブラリーの作製〕の３）の工程を合計４回繰り返して増幅したｍＲＮＡを、以後の工程に用いた。【０１３９】
４）上記３）にて回収されたｍＲＮＡに７．５μＬの5mM Tris-HCl（pH7.5）を加え、６５℃にて５分間の加熱処理の後、氷冷した。【０１４０】
５）上記溶液に、２．５μＬの10×First Strand Buffer、２．５μＬの0.1M DTT、１．５μＬの10×First Strand Mixture、１．０μＬ（１．６μｇ）の（T7）Linker Primer（配列番号７）、および０．５μＬ（２０ユニット）のRNase Inhibitor（Promega社製）を順次加えた。その後、水を加えて全量を２５μＬとした。【０１４１】
６）上記溶液を室温にて１０分間放置することによって、ｍＲＮＡと（T7）Linker Primerとをアニーリングさせた。【０１４２】
７）上記溶液に１μＬ（５０ユニット）のStrataScript RT（Stratagene社製、Stratagene cDNA Synthesis Kit）と０．５μＬのSuperScript III（Invitrogen社製）とを加え、４２℃にて４５分間反応させた。その後、更に０．５μＬのSuperScript IIIを加え、５０℃にて３０分間反応させた。その後、更に５５℃にて３０分間反応させた。【０１４３】
８）反応終了後、上記溶液を氷中に移した。【０１４４】
９）上記溶液を氷中にて冷却した状態で、２０μＬの10×Second Strand Buffer、７．５μＬの0.1M DTT、および３μＬのSecond Strand Nucleotide Mixtureを加えた。その後、氷冷した水を加えて全量を２００μＬとした。【０１４５】
１０）上記溶液を、更に氷中にて５分間保冷した。【０１４６】
１１）上記溶液に、１．５μＬ（２ユニット）のRNase H（タカラバイオ社製）と１０μＬ（５０ユニット）のE. coli DNA Polymerase I（タカラバイオ社製）とを加えた。【０１４７】
１２）上記溶液を、１６℃にて１５０分間反応させた。【０１４８】
１３）上記溶液に対して２００μＬのフェノール／クロロホルム溶液を加えて良く攪拌した後、遠心分離（15,000rpm,3min,4℃）を行った。上清液を新しいチューブに移してエタノール沈殿（−８０℃にて１０分以上）を行った後、沈殿物を７０％エタノールにて洗浄した。【０１４９】
１４）上記沈殿物に、１０μＬの10×T4 DNA Polymerase Buffer、５μＬの2.5mM dNTP mixture、および水を加えて全量を１００μＬとした。当該溶液に３．５μＬ（約５ユニット）のT4 DNA Polymeraseを加えて、３７℃にて３０分間反応させた。次いで、１００μＬのフェノール／クロロホルム溶液を加えて攪拌した後、遠心分離を行った。その後、上清液を新しいチューブに移してエタノール沈殿（−８０℃にて１０分以上）を行った後、沈殿物を７０％エタノールにて洗浄した。当該工程によって、平滑末端化された二本鎖ＤＮＡを得た。【０１５０】
１５）上記平滑末端化された二本鎖ＤＮＡ（沈殿物）に、２μＬの10×Ligase Buffer、２μＬの１０ｍＭ  ｒＡＴＰ、および２種類のアダプター（全量１μＬ、０．３５μｇ）を加え、その後、水を加えて全量を２０μＬとした。なお、上記アダプターの一方は、以下の配列番号１２にて示すBamHI（BglII）-SmaI断片が複数連結された配列を有する二本鎖ＤＮＡからなるアダプターである。また、上記アダプターの他方は、以下の配列番号１３にて示すSmaI断片が複数連結された配列を有する二本鎖鎖ＤＮＡからなるアダプターである。
BamHI（BglII）-SmaI断片：5’-GATCCCCGGG-3’（配列番号１２）
SmaI断片               ：5’-CCCGGG -3’   （配列番号１３）
なお、当該アダプターの作製方法は、上述したSense T7とAntisense T7とからなる増幅アダプターの作製方法に従った。【０１５１】
１６）上記溶液に１．５μＬ（約４ユニット）のT4 DNA Ligaseを加えた後、８℃にて一晩反応させた。【０１５２】
１７）上記溶液に対して７０℃にて３０分間の加熱処理を行うことによって、Ligaseを失活させた。次いで、５秒間の遠心分離を行って上清を精製した。【０１５３】
１８）上記溶液に、２７μＬのNotI Buffer Supplementおよび３μＬのＮｏｔＩを加え、３７℃にて９０分間反応させた。反応後、５μＬの10×STEおよび２μｇのｔＲＮＡを加えた。その後、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−４００を用いて、上述した方法にしたがって、残存するダミーＲＮＡ等を除去した。なお、ダミーＲＮＡ等が除去されたあとの二本鎖ＤＮＡは、エタノール沈殿によって沈殿物として回収した。【０１５４】
１９）上記沈殿物に、３μＬの10×Ligase Buffer、３μＬの１０ｍＭ  ｒＡＴＰ、および１μＬ（１００ｎｇ〜３００ｎｇ）のｐＡＰ３ｎｅｏベクター（ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩにて切断済み）を加え、その後、水を加えて全量を３０μＬとした。【０１５５】
２０）上記溶液に１μＬ（４ユニット）のT4 DNA Ligaseを加えた後、１２℃にて一晩反応させた。【０１５６】
２０）上記溶液を、７０℃にて３０分間加熱した。【０１５７】
２１）加熱後、上記溶液に７０μＬのＴＥ、および１００μＬのフェノール／クロロホルム溶液を加えて攪拌後、１分間の遠心分離（15000rpm）を行った。遠心分離後、１００μＬの上清を回収した。フィルター（ミリポア社製のUFCP3TK50）を用いて、上記上清を無菌化した。【０１５８】
２２）上記無菌化した溶液（５μＬ）を、エレクトロポレーション法にて大腸菌（GIBCO-BRL社製のElectroMAX DH12S Cells）に導入した。なお、エレクトロポレーション法は、２．５ｋｖ、１２９オームの条件下にて行った。電圧を加えた後の大腸菌を、ＳＯＣ培地中にて、３７℃で１時間培養した。【０１５９】
２３）上記大腸菌を１００ｍＬのＬＢ培地（アンピシリンを５０ｍｇ／Ｌの濃度にて含む）に移した。１０μＬまたは１００μＬの大腸菌含有ＬＢ培地を、それぞれアンピシリンを含有するＬＢ培地（固体培地）上にまき、３７℃にて一夜培養して、大腸菌の形質転換効率を算出した。また、残りの大腸菌含有ＬＢ培地は、ＯＤ６００＝１．０に達するまで３７℃にて数時間、培養した。培養後、大腸菌含有ＬＢ培地にＤＭＳＯを加え、当該溶液を−８０℃にて凍結保存した。【０１６０】
なお、ライブラリーの作製にあたっては、通常のｃＤＮＡライブラリー作製プロトコール（例えば、「バイオマニュアルシリーズ２  遺伝子ライブラリーの作成法」（野島博・編）羊土社、1994、または「基礎生化学実験法」（大島泰郎・編）第４巻、核酸・遺伝子実験II、東京化学同人、2000参照）を参考にして作製することも可能である。なお、結果については後述する〔結果３〕にて説明する。【０１６１】
〔結果１〕
図６（ａ）および図６（ｂ）に、ダミーＲＮＡの最適量を検討した結果を示す。なお、本実施例では、ダミーＲＮＡの効果を検討するにあたって、ＧＡＰＤＨのｃＤＮＡ化の効率を指標にしている。しかしながら、ＧＡＰＤＨは単なる指標の一例であって、ダミーＤＮＡは、その他の遺伝子のｃＤＮＡ化についてもＧＡＰＤＨと同様の効果を有することは当業者であれば容易に理解するであろう。【０１６２】
図６（ａ）および図６（ｂ）に示すように、約１ｎｇのライブラリー化したい微量ｍＲＮＡ（およそ１００個の細胞由来）に、ダミーＲＮＡを０．５、１．０、２．５、５．０または１０．０μｇ加えた場合は、いずれも、ダミーＲＮＡを加えなかった場合と比較して、ｃＤＮＡが効率よく合成されていることが確認できた。【０１６３】
また、図６（ａ）および図６（ｂ）に示すように、微量ｍＲＮＡにダミーＲＮＡを１μｇ加えた場合が、最も効率よくｃＤＮＡを合成することができた。【０１６４】
〔結果２〕
図７（ａ）、図７（ｂ）および図７（ｃ）に、増幅可能な微量ｍＲＮＡの量を検討した電気泳動図を示す。【０１６５】
図７（ａ）および図７（ｂ）に示すように、微量ｍＲＮＡ（２９３Ｔ細胞由来）の量が約０．１ｎｇの場合であっても、微量ｍＲＮＡの量が約０．０１ｎｇであっても、ともにｃＤＮＡが効率よく合成されていることが確認できた。【０１６６】
また、図７（ｃ）に示すように、Ｈｅｌａ細胞由来の微量ｍＲＮＡ（０．０１ｎｇ）であっても、ｃＤＮＡが効率よく合成されていることが確認できた。【０１６７】
〔結果３〕
図８に、ｃＤＮＡライブラリーのインサートの長さの分布を示す。なお、上記実施例においては、６．６×１０５ｃｆｕのコロニーを得た。当該コロニーについて、インサート挿入率を検討したところ３８．３％（２３クローン／６０クローン）であった。また、２３クローンのうち、ヒトの遺伝子が挿入されているものは１５クローンであり、当該１５クローンのうち、２クローンのみが、同じ遺伝子（表１のサンプル３）を挿入していた。【０１６８】
図８に示すように、本願発明の方法にて作製したｃＤＮＡライブラリーには、長いインサートが挿入されていることが確認できた。なお、上記インサートの平均長は、０．７５ｋｂであった。【０１６９】
また、ｃＤＮＡライブラリーのインサートの配列を読んだ結果を表１に示す。【０１７０】
【表１】
2008032574.tif 000003
【０１７１】
さらに、本願発明の方法にて作製されたｃＤＮＡライブラリーの品質と、１００万個の２９３Ｔ細胞から抽出したｍＲＮＡを用いて従来の方法（Kobori M et al.,Genes Cells,1998;3:459-475）にて作製したｃＤＮＡライブラリーの品質とを比較した。【０１７２】
具体的には、任意に選択した２８遺伝子について、当該遺伝子が上記ライブラリーに含まれているか否かについてＰＣＴ法を用いて検討した。【０１７３】
表２に、本願発明の方法にて作製されたｃＤＮＡライブラリー、および従来の方法にて作製されたｃＤＮＡライブラリーの両方に含まれていた遺伝子を示す。【０１７４】
【表２】
2008032574.tif 000004
【０１７５】
表２に示すように、２８遺伝子中の２５遺伝子は、両方のライブラリーに含まれていた。【０１７６】
また表３に、従来の方法にて作製したｃＤＮＡライブラリーにのみ存在した遺伝子を示す。【０１７７】
【表３】
2008032574.tif 000005
【０１７８】
表１〜表３からも明らかなように、本願発明の方法にて作製したｃＤＮＡライブラリーには、多様性に富んだインサートが挿入されていることが確認できた。また、本願発明の方法にて作製したｃＤＮＡライブラリーには、細胞内の発現量が低い遺伝子も挿入されていることが確認できた。【０１７９】
つまり、本願発明の方法によって作製されたライブラリーは、多量のｍＲＮＡを用いて作製されたライブラリーと比較しても遜色のない複雑度、挿入効率および平均鎖長を有するものであった。【０１８０】
〔結果４〕
ダミーＲＮＡによって増幅されたｃＤＮＡプールのサイズの偏り、およびｍＲＮＡ増幅効率の上昇効果について、微量ＲＮＡの正確な分析が可能なアジレント（Agilent）社製のバイオアナライザー（Bioanalyzer2100）を用いて評価した。【０１８１】
具体的には、ダミーＲＮＡを用いて１回目のｍＲＮＡの増幅を行い、その後、ＧＡＰＤＨの増幅をＰＣＲ法によって確認した。そして、増幅されたｍＲＮＡとダミーＲＮＡとを用いて、２回目のｍＲＮＡの増幅を行い、その後、ダミーＲＮＡのｍＲＮＡ増幅効果を調べた。【０１８２】
まず上述したプロトコールにしたがって増幅用二本鎖ＤＮＡを作製した後、蛍光色素（Ｃｙ５）を用いてラベル化ｃＲＮＡの増幅を行った。その後、実験結果をエレクトロフェログラム（重ね合わせ）を用いて表示させた。【０１８３】
その結果、図９（ａ）に示すように、ダミーＲＮＡを用いて増幅を行ったｃＲＮＡは、ダミーＲＮＡを加えない増幅に比べて６倍以上の増幅の上昇が観察された。念のため、別の蛍光色素（Ｃｙ３）を用いて同様の実験を行った場合でもダミーＲＮＡを用いた場合（青線）において３０倍以上の増幅効果が認められた（図９（ｂ）参照）。【０１８４】
緑線はＲＮＡラダーのピークを示しており、ダミーＲＮＡを加えた２本の青線はダミーＲＮＡを加えないものに比べ、４ｋｂ以上にわたり効率よく転写増幅されていることがわかる。この結果はダミーＲＮＡを添加することで少数のｍＲＮＡに対する逆転写酵素によるｃＤＮＡ化とＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅における酵素反応が、偏ることなく幅広いｍＲＮＡに対して満遍なく行われていることが示された。この点は、増幅の偏りが避けられないＰＣＲ法に比べてダミーＲＮＡを用いる技術が優れていることを示唆する。【０１８５】
〔結果５〕
ダミーＲＮＡを用いて作製したナノｃＤＮＡライブラリーのｍＲＮＡの種類について、増幅が偏った遺伝子を含まないかを調べるため、アジレント（Agilent）社のｃＤＮＡマイクロアレイ（２色法、Dyeswap法）を用いて検証した。【０１８６】
具体的には、１０個のＨｅＬａ細胞相当の極微量ＲＮＡからダミーＲＮＡを用いて増幅したナノｃＤＮＡライブラリー（＋ｄＲＮＡ）と、１００万個程度のＨｅＬａ細胞由来の大量のｍＲＮＡを用いて従来の方法にしたがって作製したｃＤＮＡライブラリー（−ｄＲＮＡ）とを比較した。【０１８７】
まず、両方のｃＤＮＡライブラリー由来のプラスミドＤＮＡを用いてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡを転写させ、その後ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅを用いて上記ｍＲＮＡを処理した。【０１８８】
上記ｍＲＮＡを試料とし、上述したプロトコールにしたがって増幅用二本鎖ＤＮＡを作製した後、蛍光色素（Ｃｙ５）を用いてラベル化ｃＲＮＡの増幅を行った。これらそれぞれのＲＮＡ濃度を測定したところナノｃＤＮＡライブラリーが０．６０ｍｇ／ｍｌ、通常のナノｃＤＮＡライブラリーが０．５３ｍｇ／ｍｌであった。またそれらのサイズ分布をバイオアナライザー（Bioanalyzer2100）を用いて評価したところ、Ｃｙ５標識（図１０（ａ）参照）においても、Ｃｙ３標識（図１０（ｂ）参照）においても、ともに同程度の取り込み率とサイズ分布を示した。【０１８９】
次に、これらの標識ＲＮＡをプローブとして、４４，０００個のｃＤＮＡが搭載されているｃＤＮＡマイクロアレイ（Agilent社製の「agilent Hu44K」）を用いて蛍光色素交換実験（DyeSwap）を行った。なお、当該蛍光色素交換実験の実験結果は、（−ｄＲＮＡ／Ｃｙ３  ｖｓ  ＋ｄＲＮＡ／Ｃｙ５）／（＋ｄＲＮＡ／Ｃｙ３  ｖｓ  −ｄＲＮＡ／Ｃｙ３）にて求めた。具体的には、１枚のアレイ上に、Ｃｙ３およびＣｙ５によって各々標識された２種類のサンプルを競合的にハイブリダイズさせて実験結果を求めた。【０１９０】
図１３に、蛍光色素交換実験の結果を示す。なお、図１３では、同じ蛍光強度を有する遺伝子群は中央領域の黒色にて示し、ダミーＲＮＡ（ｄＲＮＡ）を加えた場合にハイブリダイズ強度が増す遺伝子群は、上側の濃い灰色にて示し、ダミーＲＮＡを加えることによってハイブリダイズ強度が減少する遺伝子群は、下側の薄い灰色にて示した。【０１９１】
各々のプローブがハイブリダイズしたｃＤＮＡの強度分布を比較したところ、両者はわずかに数個の遺伝子が異なる以外は、パターンが概ね一致した。このことは両方のｃＤＮＡライブラリーの品質がほとんど同じｃＤＮＡ分子種を持つことを示唆する。すなわち、ダミーＲＮＡを用いて、１０個のＨｅＬａ細胞相当の極微量のＲＮＡを出発点として作製したナノｃＤＮＡライブラリーが、高品質であることが明らかになった。【０１９２】
〔結果６〕
上述した例は、細胞から精製したｍＲＮＡ、つまり様々な種類のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ混合物を増幅した場合について検討したものである。そこで、本願発明の方法が、一種類のｍＲＮＡをも効率よく増幅することができるか否かについて検討した。【０１９３】
一種類のｍＲＮＡとしては、ヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを用いた。ヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡは、下記のGAPDH SプライマーおよびGAPDH ASプライマーを用いたＰＣＲ法によって、ＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。
GAPDH S     ：5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’（配列番号１４）
GAPDH AS    ：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3’（配列番号１５）
ヒトＧＡＰＤＨの相当するＤＮＡ断片（約１３００ｂｐ）を抽出した後、当該ＤＮＡ断片をＴＡ−クローニング法によってpT7Blueベクター（invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA）に挿入した。【０１９４】
得られたベクターをＢａｍＨＩ処理によって直鎖状にした後、精製した。精製後、MEGAscript（Ambion社製）を用いてＲＮＡを転写した（３７℃にて４時間）。その後、TURBO DNA-free（Ambion社製）を加え、３７℃にて１時間のＤＮａｓｅ処理を行った。その後、転写されたＲＮＡを精製した。【０１９５】
上記ヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを用いて、上述した〔３：二本鎖ＤＮＡの作製〕〜〔６：増幅用二本鎖ＤＮＡの作製〕にしたがって増幅用二本鎖ＤＮＡを作製した。なお、本実施例に用いたヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの量は、４．９、０．４９、０．０４９または０．００４９ｆｇであった。また、本実施例に使用したダミーＲＮＡは、配列番号６に示すダミーＲＮＡであった。【０１９６】
図１１に示すように、本実施例の方法であれば、０．４９ｆｇ／ｍＬという微量濃度のｍＲＮＡをも増幅することができた。なお、図１１では、ＰＣＲ法を用いてヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの増幅を確認しており、このときＰＣＲ法の増幅回数は４０回であった。【０１９７】
〔結果７〕
異なる配列を有するダミーＲＮＡも同様のｍＲＮＡ増幅効果を有するか否か検討した。【０１９８】
上述した〔３：二本鎖ＤＮＡの作製〕〜〔６：増幅用二本鎖ＤＮＡの作製〕にしたがって、１μｇの配列番号１６に示すダミーＲＮＡを用いて、１０個の２９３Ｔ細胞から精製したｍＲＮＡ（約０．１ｎｇ）を増幅した。以下に、ダミーＲＮＡの塩基配列を示す。なお、図１２中、ダミーＲＮＡは、「NotI-dRNA」にて示す。
ダミーＲＮＡ：5’-AATCTGTCGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（配列番号１６）
図１２に示すように、本実施例の方法であれば、異なる配列を有するダミーＲＮＡを用いた場合であっても、ｍＲＮＡをも増幅することができた。なお、図１２では、ＰＣＲ法を用いてヒトＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの増幅を確認しており、このときＰＣＲ法の増幅回数は４０回であった。【０１９９】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用の可能性】
【０２００】
本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、微量ｍＲＮＡを含む溶液にダミーＲＮＡを添加して混合溶液を作製する第１工程と、混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスＤＮＡを合成する第２工程と、合成されたアンチセンスＤＮＡに対して相補的なセンスＤＮＡを合成して、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを形成する第３工程と、形成された二本鎖ＤＮＡのセンスＤＮＡの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖ＤＮＡを作製する第４工程と、ＲＮＡポリメラーゼによって、増幅用二本鎖ＤＮＡからＲＮＡを増幅する第５工程と、を含むものである。
【０２０１】
上記の方法によれば、二本鎖ＤＮＡを増幅させるためにＰＣＲを用いていないため、増幅する微量ｍＲＮＡの塩基配列の長さに影響を受けることなく、短いｍＲＮＡも長いｍＲＮＡも同じように効率よく増幅することができるという効果を奏する。それゆえ、ｃＤＮＡライブラリー、プローブの作製や、段階的サブトラクションの実施等に利用することができる。
【０２０２】
以上のように、本発明では、微量ｍＲＮＡをダミーＲＮＡと共に増幅させるため、微量ｍＲＮＡを効率よく増幅させることができ、かつ増幅されるｍＲＮＡに偏りがない。そのため、本発明は、ＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、ｃＤＮＡライブラリーの作製、ｍＲＮＡの増幅（例えば、ＳＰＩＡなど）、ｍＲＮＡを用いた標識プローブの作製、および段階的サブトラクションに利用することができるのみならず、微量ｍＲＮＡの増幅工程を必要とする分野に広く応用することができる。
【０２０３】
また、現在の研究の流れは１細胞から数細胞を対象としたナノレベルの解析に進んでおり、極少量のｍＲＮＡからｃＤＮＡを効率よく合成できれば、それだけ詳細なデータを得ることができる。したがって、本発明は、少数の細胞しか採取できないために遺伝子レベルの解析が遅れていた幹細胞の研究や、患者の患部組織を用いた病因解析に利用することができる。また、本発明と多段差引法とを組み合わせることによって、１個の細胞で特異的に発現している遺伝子の包括的な単離が可能となる。
【図１（ａ）】
2008032574.tif 000006
【図１（ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ｂ）】
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【図８】
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【図９（ａ）】
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【図９（ｂ）】
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【図１０（ａ）】
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【図１０（ｂ）】
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【図１４】
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【図６（ａ）】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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