【手続補正書】
【提出日】平成16年2月3日(2004.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
シュマン(Shuman)は、ワクシニアトポイソメラーゼは二本鎖DNAに結合し、一本鎖のホスホジエステル骨格を切断すると同時に、高いレベルの配列特異性を示すことを教示している。切断は、切断されやすい鎖のコンセンサスペンタピリミジン要素5'-(C/T)CCTT-3'または関連した配列で生じる。一態様において、切断されやすい結合は、二本鎖DNAの3'末端から2〜12 bpの範囲内に位置する。別の態様において、ワクシニアトポイソメラーゼによる切断可能な複合体形成は、切断部位の上流の二本鎖の6ヌクレオチドおよび下流の2ヌクレオチドを必要とする。ワクシニアトポイソメラーゼ切断可能な例には、+6/-6二本鎖（配列番号：29）
2004522428.tif 000001
、+8/-4二本鎖（配列番号：30）
2004522428.tif 000002
、+10/-2二本鎖（配列番号：31）
2004522428.tif 000003
、+11/-1二本鎖（配列番号：32）
2004522428.tif 000004
が含まれるが、これらに限定されない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０６】
第1のアダプターオリゴヌクレオチド（TOPO D1）は、EcoRI付着末端（3'-TTAA-5'）に相補性を示す。さらに、TOPO D1は3'末端の16bp上流に存在するトポイソメラーゼ・コンセンサス・ペンタピリミジン・エレメント5'-CCCTTを含むさらなる24bpを有する。TOPO D1アダプターオリゴの残存する配列およびサイズを変化させることができ、研究者の特定の要求に適合するように改変することができる。本発明のこの好ましい態様の1つのこのような局面によれば、
2004522428.tif 000005
（配列番号：33）は、使用したアダプターの全長配列である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０７】
第2のアダプターオリゴヌクレオチド（TOPO D2）は、TOPO D1に完全な相補性を示さなければならない。TOPO D2は、EcoRI付着フラップの5'を直接補って、線状ベクターの下の鎖(bottom strand)を伸長させる。さらに、TOPO D2は、定方向クローニングに必要なSSSである配列3'-GTGGを含む。この態様では、SSSを、mRNA上のリボソーム結合効率の増加によって真核細胞中のORFの発現を補助することが公知のKozac配列を補うために選択するが、配列および長さは各使用者の特定の要求を満たすように高度に変化させることができる。TOPO D2の完全な配列は、
2004522428.tif 000006
（配列番号：34）である。上記と類似して、オリゴヌクレオチドTOPO D4およびTOPO D5のアニーリングに起因するアダプター二重鎖は、一方の末端に一本鎖SacI突出を有し、他方の末端に12ヌクレオチドの一本鎖突出を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０８】
第3のアダプターオリゴヌクレオチド（TOPO D5）は、SacI付着末端3'-TCGA-5'に相補性を示す。TOPO D1と同様、TOPO D5は、一本鎖突出を作製するさらなる塩基を有する。長さおよび配列は、使用者の要求に基づいて変化し得る。本態様では、TOPO D5'の配列は、
2004522428.tif 000007
（配列番号：35）である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０９】
第4のアダプターオリゴヌクレオチド（TOPO D4）は、TOPO D5に完全な相補性を示し、線状化ベクターの上の鎖にわたるSacIの付着フラップの5'に直接的な相補性を示す。TOPO D4はまた、トポイソメラーゼコンセンサス配列5'-CCCTTを含む。TOPO D4アダプターオリゴの残存する配列およびサイズは変化させることができ、特定の要求に適合させるために改変することができる。本態様では、TOPO D4配列は、さらなる12bpの一本鎖突出を含む
2004522428.tif 000008
（配列番号：36）である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１３】
アニーリングオリゴヌクレオチド（TOPO D3）は、TOPO D1およびTOPO D4の一本鎖DNA突出に相補性を示さなければならない。本態様では、突出は共に以下の配列
2004522428.tif 000009
（配列番号：37）を共有する。したがって、TOPO D3は、アダプターオリゴの一本鎖突出およびさらなる3bpの突出3'-AAC-5'に完全に相補的な以下の配列
2004522428.tif 000010
（配列番号：38）を有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２２】
第1のアダプターオリゴヌクレオチド（TOPO H）は、HindIII付着末端3'-TCGA-5'に相補的である。さらに、TOPO Hは、3'末端の19bp上流に存在するトポイソメラーゼコンセンサスペンタピリミジンエレメント5'-CCCTTを含むさらなる24bpを有する。TOPO Hアダプターオリゴの残存する配列およびサイズを変化させることができ、研究者の特定の要求に適合するように改変することができる。本態様では、
2004522428.tif 000011
（配列番号：39）は、使用したアダプターの全長配列である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２３】
第2のアダプターオリゴヌクレオチド（TOPO 16）は、TOPO Hに完全な相補性を示さなければならない。TOPO 16は、HindIII付着末端の5'を直接補って線状ベクターの下の鎖を伸長させる。さらに、TOPO 16は、定方向クローニング用に選択された一本鎖配列である配列3'-TAAGを含む。TOPO 16の完全な配列は、
2004522428.tif 000012
（配列番号：40）である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２４】
第3のアダプターオリゴヌクレオチド（TOPO 1）は、EcoRI付着末端3'-TTAA-5'に相補性を示す。TOP Hと同様、TOPO 1は、3'末端の12bp上流に存在するトポイソメラーゼIコンセンサス配列CCCTTを含むさらなる塩基を有する。TOPO1の長さおよび配列は、使用者の要求に基づいて変化し得る。本態様では、TOPO 1'の配列は、
2004522428.tif 000013
（配列番号：41）である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２９】
アニーリングオリゴヌクレオチド（TOPO 3）は、TOPO 1の一本鎖DNA突出に相補性を示さなければならない。本態様では、突出は以下の配列
2004522428.tif 000014
（配列番号：42）を有する。したがって、TOPO 3は、アダプターオリゴの一本鎖突出およびさらなる3bpの突出5'-CAA-3'に完全に相補的な以下の配列
2004522428.tif 000015
（配列番号：43）を有する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５４】
正方向プライマー設計の例
以下は、理論上のタンパク質のN末端のDNA配列および対応する正方向PCRプライマーの推定配列である。ATG開始コドンに下線を引いている。
DNA配列（配列番号：44）：
2004522428.tif 000016
推定正方向PCRプライマー（配列番号：45）：
2004522428.tif 000017
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６０】
逆方向プライマー設計の例A
以下は、理論上のタンパク質のC末端の配列である。タンパク質はC末端タグにインフレームで融合されるべきである（GATEWAY（商標）デスティネーションベクターでのエントリークローンの組換え後）。終止コドンに下線を引く。
DNA配列（配列番号：46）：
2004522428.tif 000018
1つの解決法は、終止コドンのすぐ上流から始まるが最後の2つのコドンは4bpの突出配列と同一であるGTGG（以下の下線部分）を含むように逆方向PCRプライマーを設計することである。結果として、PCR産物を反対方向にクローニングする可能性が高まり、4bpの突出配列に逆方向プライマーは相補的になり得る。この条件を回避すべきである。
DNA配列（配列番号：46）：
2004522428.tif 000019
推定逆方向PCRプライマー配列（配列番号：47）：
2004522428.tif 000020
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６２】
逆方向プライマー設計の例B
以下は、理論上のタンパク質のC末端配列（配列番号：48）である。終止コドンに下線を引いている。
2004522428.tif 000021
ORFをインフレームでC末端タグ（組換え後のデスティネーションベクターから得た）と融合するために、最後のコドン（TGC）に相同なヌクレオチドからの開始によって終止コドンを除去し、上流に繋げる。逆方向プライマー（配列番号：49）は以下である。
2004522428.tif 000022
これは、終止コドンを使用せずにC末端を増幅し、ORFをインフレームでC末端タグに結合させる。ORFをインフレームでC末端タグに結合することが望ましくない場合、終止コドンを含むように逆方向プライマー（配列番号：50）を単純に設計する。
2004522428.tif 000023
重要：pENTR TOPO（登録商標）ベクターが平滑末端のPCR産物を受け入れることに留意すべきである。pENTR TOPO（登録商標）ベクターへのライゲーションを妨げるので、PCRのために5'リン酸をプライマーに付加すべきではない。さらに、オリゴヌクレオチドが長い場合（30ヌクレオチド超）に使用前にゲル精製することが推奨される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６４】
実施例10
二次PCR法を使用しない哺乳動物発現カセットの構築
関心対象のエレメントおよび遺伝子の調製
以下のプライマー組（以下の表4を参照のこと）および鋳型を、関心対象のエレメントおよび遺伝子のPCR増幅に使用した。
（A）プライマー組：配列番号：51および配列番号：52；鋳型：pcDNA 4/TetO。
PCR産物：5'エレメント。
（B）プライマー組：配列番号：53および配列番号：54；鋳型：pcDNA 3.2/V5。
PCR産物：3'エレメント。
（C）プライマー組：配列番号：55および配列番号：56；鋳型：pcDNA 3.1/CAT。
PCR産物：CAT挿入物。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６５】
（表４）  発現カセットの構築に使用したプライマー
2004522428.tif 000024
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６９】
反応を室温で5分間〜15分間行った。配列番号：51および配列番号：54のプライマー組を使用した第2ラウンドのPCRの鋳型として、反応物の半分を使用した。PCR条件は、伸長時間が2分間であること以外は、上記と同一である。PCR後、上記のようにDNAを精製した。精製DNAを、トランスフェクションに使用した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７４】
実施例11
Topoツール法を使用したゲートウェイ適合カセットの作製
アダプターの調製
等量の配列番号：57および配列番号：58（上記の表4を参照のこと）を、40mM NaClと混合し、混合物を95℃で5分間変性させ、室温にゆっくり冷却してattB1アダプターを形成した。等量の配列番号：59および配列番号：60（上記の表4を参照のこと）を、40mM NaClと混合し、混合物を95℃で5分間変性させ、室温にゆっくり冷却してattB2アダプターを形成した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８０】
形質転換
処理した混合物をTOP10コンピテント細胞（化学的）に形質転換するか、ElectroMaxコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。細胞をLP-カナマイシンプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートする。コロニーを計数する。挿入物を確実にこれらのコロニー中に存在させるために、コロニーPCRを行うためのプライマー組（配列番号：61および配列番号：62）を設計した。挿入物が存在する場合、約700bpのバンドのPCR産物が産生され、しかし挿入物が存在しない場合、PCR産物のバンドは2.2kbのサイズである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８７】
【図１】基本的組換えクローニング反応の略図である。
【図２】LR組換え反応の実施により2つの核酸セグメントをクローニングするための本発明の使用を示す略図である。
【図３】LR反応を使用してセグメントを接続することおよび、その後BP組換え反応を使用して接続された断片をデスティネーションベクターに挿入することによる、2つの核酸セグメントをクローニングするための本発明の使用を示す略図である。
【図４】LR反応の前にBP反応を行うことにより2つの核酸セグメントをクローニングするための本発明の使用を示す略図である。
【図５】第1のBP反応を行って、一方のセグメント上にattL部位を、他方にattRを作製し、その後LR反応によりセグメントを組み合わせることによってクローニングされたattB部位を有する2つの核酸セグメントの略図である。このプロセスの変法では、P1、P2、および/またはP3は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドの線状伸長物であり得る。
【図６】LR反応を使用したデスティネーションベクター中の2つの異なる部位への2つの核酸セグメントのクローニングの略図である。
【図７】BP反応を使用したデスティネーションベクター中の2つの異なる部位への2つの核酸セグメントのクローニングの略図である。
【図８】図8Aおよび図8Bは、本発明の方法による各末端にエレメントを含む共有結合二本鎖ヌクレオチド配列の作製を示す。「PCR」とは、ポリメラーゼ連鎖反応を示す；「TOPO」とは、トポイソメラーゼを示す；丸で示されたトポイソメラーゼは、配列に結合した；「P1」および「P2」とは、PCRプライマーを示す。トポイソメラーゼ認識部位を、太字で示す。
【図９】図9A〜図9Cは、サイトメガロウイルスプロモーターエレメント（「CMV」）、緑色蛍光タンパク質エレメント（「GFP」）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（「BGH」）エレメントの代表例であるPCR産物の末端を示す。図9A、図9B、および図9CのPCR産物の構築に使用したプライマーを、「F」ナンバーで示す（図9Dを参照のこと）。トポイソメラーゼ認識部位（CCCTT）を含む片方または両方の末端部分を示す。太字は、突出配列を示す。図9Aおよび図9Bにおいては、突出配列の一方（図9B）または両方（図9A）は、本来回文配列である。配列を、従来の方向（上の鎖は左から右に5'→3'方向、下の鎖は左から右に3'→5'方向）で示す。
【図１０】図10Aおよび図10Bは、ツーハイブリッドアッセイ実施のためにポリペプチドをコードする共有結合ds組換え核酸分子を使用する能力を試験する実験の構築物（図10A）および結果（図10B）を示す。図10Aは、トランスフェクションに使用した各構築物の量を示す。反応物の量または体積の前の「p」とは、プラスミド形態を示し、「l」とは、線状形態を示し、「PCR」とは、PCR増幅反応混合物を示す。図10Bは、各トランスフェクション試料に関連するβガラクトシダーゼ活性（「LacZ活性」）レベルを示す。LacZ活性の増加は、陽性相互作用の指標である。
【図１１】図11A〜図11Fは、1つの鎖に共有結合したds組換え核酸分子を作製するための組成物および方法の種々の態様を示す。図11B〜図11F記載の分子の片方または両方の鎖のニックに留意されたい。
【図１２】図12A〜図12Dは、共有結合したds組換え核酸分子を作製するための本発明の組成物および方法の種々の態様を示す。トポイソメラーゼは黒丸で示され、これは基質核酸分子の末端に結合するか結合反応後に遊離される。例示のように、基質核酸分子は5'突出を有するが、これらは同様に3'突出または平滑末端を有し得る。さらに、トポイソメラーゼが結合した（トポイソメラーゼ付加）例示核酸分子を示す一方で、トポイソメラーゼ認識部位を有するトポイソメラーゼが結合した1つまたは複数の末端も示すことができ、この場合、結合反応には必要に応じて1つまたは複数の部位特異的トポイソメラーゼの添加がさらに必要である。図12Aは、1つの末端の5'末端および3'末端それぞれに結合するトポイソメラーゼを有する第1の核酸分子を示し、第2の核酸分子への第1の核酸分子の結合も更に示す。図12Bは、1つの末端の3'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第1の核酸分子および1つの末端の3'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第2の核酸分子を示し、トポイソメラーゼ付加基質核酸分子を含む末端の接触によって作製された共有結合ds組換え核酸分子をさらに示す。図12Cは、1つの末端の5'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第1の核酸分子および1つの末端の5'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第2の核酸分子を示し、トポイソメラーゼ付加基質核酸分子を含む末端の接触によって作製された共有結合ds組換え核酸分子をさらに示す。図12Dは、両末端の5'末端および3'末端それぞれに結合したトポイソメラーゼを有する核酸分子を示し、2つの核酸分子（各末端に1つ）へのトポイソメラーゼ付加核酸分子の結合をさらに示す。各5'末端および/または各3'末端のトポイソメラーゼは、同一であっても異なっていてもよい。
【図１３】発現可能なds組換え核酸分子の作製および発現可能なds組換え核酸分子の増幅を示す。発現可能なds組換え核酸分子を、プロモーターを含むヌクレオチド配列、コード配列を含むヌクレオチド配列、およびポリアデニル化シグナルを含むヌクレオチド配列を含む、3つの核酸分子から作製する。核酸分子の作製を、結合するdsヌクレオチド配列の末端での相補的な5'および/または3'の突出配列の組み込みによって容易にすることができる。発現可能なds組換え核酸分子を、第1の末端の5'末端にIA型トポイソメラーゼを有し、第2の末端の3'末端にIB型トポイソメラーゼを有する第1の核酸分子と、第2の核酸分子および第3の二本鎖ヌクレオチド配列との接触によって作製する。発現可能なds組換え核酸分子を、プロモーターの上流の第2のds組換え核酸分子とハイブリダイズする第1のプライマーおよびポリアデニル化シグナルの下流の第3のds組換え核酸分子とハイブリダイズする第2のプライマーを使用して増幅する。
【図１４】分子の同一の末端が3'突出をさらに含む（本図の（4）を参照のこと）、分子の1つの末端の5'末端に結合したトポイソメラーゼ（例えば、IA型トポイソメラーゼ）を含む二本鎖核酸分子の調製プロセスの一例を示す。
【図１５】一本鎖または二本鎖のDNAヌクレオチド配列が一本鎖RNAヌクレオチド配列に結合した、本発明の2つの態様を示す。
【図１６】TOPO-Gateway（商標）または標準的なGateway（商標）クローニング技法を使用したPCRクローニング用の侵入点における柔軟性を示す模式図である。
【図１７】Gateway（商標）システムおよび定方向TOPO-Gateway（商標）発現ベクターを使用した発現クローンの産生の略図である。
【図１８】プラスミドpcDNAGW-DT(sc)およびpENTR-DT(sc)中のマルチクローニング部位の地図である。
【図１９】プラスミドpcDNAGW-DTの物理（physical）地図である。
【図２０】プラスミドpcDNA-DEST41の物理地図である。
【図２１】プラスミドpENTR-DTの物理地図である。
【図２２】プラスミドpENTR/D-TOPO中のTOPOクローニング部位、およびそのヌクレオチド配列（図22B）を示す物理地図（図22A）の図である。物理地図は、アダプター付加スーパーコイル型のベクターを示す一方で、ヌクレオチド配列は開始コドンおよびオープンリーディングフレーム（atgnnnnnn...）を含むベクターを示す。実際の切断部位を示すために制限酵素部位を標識する。四角で囲んだ領域は、組換え後のデスティネーションベクターに導入されるエントリークローン中のattL配列を示す。図22Bで示したpENTR/D-TOPO配列はまた、Invitrogen Corporationのウェブサイトhttp://www.invitrogen.com./content/vectors/pentr dtopo seq.text.からのダウンロードによっても入手可能である。
【図２３】プラスミドpENTR/SD/D-TOPO中のTOPOクローニング部位、およびそのヌクレオチド配列（図23B）を示す、物理地図（図23A）の図である。物理地図は、アダプター付加スーパーコイル型のベクターを示す一方で、ヌクレオチド配列は開始コドンおよびオープンリーディングフレーム（atgnnnnnn...）を含むベクターを示す。実際の切断部位を示すために制限酵素部位を標識する。四角で囲んだ領域は、組換え後のデスティネーションベクターに導入されるエントリークローン中のattL配列を示す。図23Bで示したpENTR/SD/D-TOPOヌクレオチド配列はまた、http://www.invitrogen.com./content/vectors/pentrsd_dtopo_seq.text.からのダウンロードによっても入手可能である。
【図２４】プラスミドpcDNA3.2/V5/GWD-TOPO（登録商標）の物理地図（図24A）およびヌクレオチド配列（図24B〜図24C）の図である。物理地図は、アダプター付加スーパーコイル型のベクターを示す一方で、ヌクレオチド配列は開始コドンおよびオープンリーディングフレーム（atgnnnnnn...）を含むベクターを示す。
【図２５】プラスミドpcDNA6.2/V5/GWD-TOPO（登録商標）の物理地図（図25A）およびヌクレオチド配列（図25B〜図25C）の図である。物理地図は、アダプター付加スーパーコイル型のベクターを示す一方で、ヌクレオチド配列は開始コドンおよびオープンリーディングフレーム（atgnnnnnn...）を含むベクターを示す。
【図２６】pENTR/SD-dTopo、pENTR-dTopo、およびpcDNAGW-dTopoに対する例示的アダプター付加ストラテジーの図である。
【図２７】COS細胞中で発現したHLAおよびCATのウェスタンブロット分析の写真である。CAT（26kDa）およびHLA（41kDa）をコードする遺伝子を、PCRおよび、pENTR-dTopoへクローニングされかつpcDNA-DEST40へ導入されたTopo（それぞれレーン2および5）またはpcDNAGW-dTopoに直接的にクローニングされたTopo（それぞれレーン3および6）のいずれかを用いて増幅した。これらの構築物を使用してCOS細胞をトランスフェクトし、溶解物をV5-HRP抗体結合物を使用したウェスタンブロットによって組換えV5タグ化タンパク質について探索した。レーン1および4は、細胞のみの対照を示す。
【図２８】大腸菌におけるHLA発現およびCAT発現を示すゲルの写真である。HLA（41kDa）およびCAT（26kDa）をコードする遺伝子を、PCRおよび、pENTR/SD-dTopoにクローニングされかつpET-DEST42へ導入されたTopo（それぞれレーン3および6）またはpET101-dTopoへ直接的にクローニングされたTopo（それぞれレーン4および7）のいずれかによって増幅した。これらの構築物を使用して、BL21（DE3）細胞を形質転換し、37℃で3時間、1mMのIPTG添加によって発現を誘導した。細胞溶解物をNuPageで泳動し、SafeStain（商標）で染色した。レーン2および5は、各pET-DEST42培養物由来の非誘導細胞溶解物を示す。
【図２９】標的核酸分子の3'末端付近の認識部位へのトポイソメラーゼ結合の略図である。トポイソメラーゼの結合の際、下流配列（切断部位に対する3'）を解離して、新規に作製された3'末端に共有結合したトポイソメラーゼを有する核酸分子を遊離させることができる。
【図３０】発現エレメントおよび関心対象の遺伝子（CATまたはV5）のPCR増幅ならびにその後の二次PCR有りまたは無しで行ったTOPO結合反応によって構築した哺乳動物発現カセットのタンパク質発現の結果（ウエスタンブロット）を示す。懸濁TRex-CHO細胞（図30A）、接着TRex-CHO細胞（図30B）、および接着TRex-293細胞（図30C）にトランスフェクトした発現カセット由来のタンパク質発現データ。ウェスタンブロットに対して、検出のために抗V5または抗CAT抗体を使用した。矢印は、V5またはCATタンパク質に対応するバンドの位置を示す。
【図３１】Gateway適合カセットが推定サイズの挿入物を含むことを示す、PCR産物を含む臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。Gateway適合カセットを、PCRによりCAT挿入物を第1に作製することならびにTOPO結合反応を用いてattB1およびattB2アダプターを導入することによって構築した。精製DNA産物を、BP反応を使用してpDONR222に挿入した。大腸菌への形質転換後、コロニーに対してPCRを行い、PCR産物を臭化エチジウム染色アガロースゲルでチェックした。
【図３２】本発明の方法によるpDONRベクターに対するトポイソメラーゼ付加およびBxP GATEWAYクローニング反応の実施による、トポイソメラーゼ付加pENTRベクターの調製を示す略図である。
【図３３】本発明の方法によるpDESTベクターに対するトポイソメラーゼ付加およびLxR GATEWAYクローニング反応の実施およびpEXPベクターの切断末端へのTOPOアダプターの付加によるトポイソメラーゼ付加pEXPベクターの調製を示す略図である。
【図３４】本発明の方法の概略を示す。第1の段階では、構築されるべき核酸分子を、例えばPCRを使用して作製する。第2の段階では、第1の段階の核酸分子を、本発明の方法（例えば、別の核酸セグメントへの1つの核酸セグメントの少なくとも1つの鎖の共有結合に対するトポイソメラーゼの使用を伴う方法）を使用して構築する。第3の段階では、第2の段階で作製した構築核酸分子を、直接使用するかまたは増幅した後使用することができる。構築分子の使用例は、本明細書中の別の箇所に記載されている。
【図３５】2つの核酸セグメントを結合させ、その後1つの部位の組換えによって別の核酸セグメントで結合核酸セグメントを組換えるためのトポイソメラーゼの使用プロセスの略図である。第1の段階では、attL1組換え部位を含むトポイソメラーゼアダプター付加核酸セグメントを、本明細書中で挿入物（「I」とする）と呼ばれる別の核酸セグメントに、核酸分子の連結のための本明細書記載の任意のトポイソメラーゼ媒介法を使用して結合させる。トポイソメラーゼ構築核酸セグメントを次に、2つの組換え部位間の組換えを可能にする条件下で、プロモーター（「P」とする）を含む別の核酸セグメントおよびattR1組換え部位と、LR CLONASE（商標）の存在下で接触させる。組換えにより、プロモーターと機能的に連結した挿入物核酸セグメントを含む核酸分子が形成される。さらに、attB1組換え部位は、最終産物中のプロモーターと挿入物との間に存在する。本図に示す組換え部位は、attL部位およびattB部位であるが、任意の適切な組換え部位を使用することができる。
【図３６】5つの異なる核酸セグメントを組換えるためおよび/または結合させるため、ならびに得られた産物を環状化するための、トポイソメラーゼおよび組換えの使用プロセスの略図である。第1の段階では、attL1およびattL2組換え部位ならびに負の選択マーカー（「NM」とする）を含むトポイソメラーゼアダプター付加核酸セグメントを、核酸分子の連結のための本明細書記載の任意のトポイソメラーゼ媒介法を使用して、本明細書において挿入物（「I」とする）と呼ばれる別の核酸セグメントに結合させる。次いで、トポイソメラーゼ構築核酸セグメントを、種々の組換え部位間の組換えがを可能にする条件下にて、LR CLONASE（商標）（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）の存在下で、2つのさらなる核酸セグメント（それぞれ少なくとも1つのattR組換え部位を含む）と接触させる。このような方法の一つでは、例えば、TOPOアダプター付加ベクターを、1つまたは複数の核酸セグメント（例えば1つまたは複数のPCR産物）と室温（例えば、約20〜20℃）で約5〜30分間（好ましくは約10分間）インキュベートし、次いで、反応物を、約80℃で約20分間のインキュベーションによって熱処理し、その後、LR反応のインキュベーション時間を約3時間に増加させること以外は製造者（Invitrogen Corporation）の説明書に従って標準的なLR反応で反応混合物を使用する。組換え反応により、プロモーターが（1）挿入分子および（2）複製起点（「ori」とする）に結合した、産物分子が形成される。この産物分子を次に、両末端でトポイソメラーゼアダプター付加され、かつ正の選択マーカー（「PM」とする）を含む核酸セグメントに連結する。さらに、最終トポイソメラーゼ結合段階により、環状核酸分子が形成される。本図中に示した組換え部位はattL部位およびattB部位であるが、任意の適切な組換え部位を使用することができる。
【図３７】相同組換え実施のための核酸分子の調製プロセスの略図を示す。この例において、3つの核酸セグメントを、各セグメントの核酸鎖のトポイソメラーゼ媒介共有結合を伴う方法を使用して、互いに連結する。これらの核酸セグメントのうちの2つは、それぞれ正の選択マーカーおよび、負の選択マーカーに隣接する2つのattL部位を含む。したがって、第1の段階に起因する核酸分子は、本明細書中で挿入物と呼ばれる核酸セグメントを含む。挿入物の両端には（1）正の選択マーカーおよび（2）負の選択マーカーに隣接する2つの組換え部位が存在する。核酸末端産物を組み込むように設計された染色体遺伝子座に対して共に相同的な領域を含む2つの核酸セグメント（「HR1」および「HR2」とする）の存在下でのLR CLONASE（商標）媒介組換えにより、末端産物核酸分子が形成される。当業者が認識するように、任意の適切な組換え部位を、本図に記載のプロセスで使用することができる。
【図３８】末端付近に存在する組換え部位（「L1」および「L2」とする）を有する線状核酸分子を作製するためのトポイソメラーゼを使用した4つの核酸セグメントの結合の略図を示す。核酸鎖のトポイソメラーゼ媒介結合の際、連結点にニックは存在しない。第2の段階では、トポイソメラーゼ構築核酸セグメントを、組換え部位間の組換えを可能にする条件下、LR CLONASE（商標）の存在下で、複製起点（「ori」とする）、正の選択マーカー（「PM」とする）、attR1組換え部位、およびattR2組換え部位を含む別の核酸セグメントに接触させる。組換えにより、記載のように環状核酸分子が形成される。本図中に示した組換え部位はattL部位およびattB部位であるが、任意の適切な組換え部位を使用することができる。
【図３９】環状核酸分子を作製するためのトポイソメラーゼおよび組換え部位を使用した1段階プロセスにおける2つの核酸セグメントの結合の略図である。核酸セグメントの1つは、attL1組換え部位（「L1」とする）、プロモーター（「P」とする）、および1つの末端に共有結合したトポイソメラーゼ分子を含む。他の核酸セグメントは、attR1組換え部位（「R1」とする）、オープンリーディングフレーム（「ORF」とする）、複製起点（「ORI」とする）、正の選択マーカー（「PM」とする）、および1つの末端に共有結合したトポイソメラーゼ分子を含む。したがって、これら2つの核酸セグメントがattL組換え部位およびattR組換え部位間の組換えならびに核酸鎖のトポイソメラーゼ媒介性結合を可能にする条件下、LR CLONASE（商標）の存在下で互いに接触する場合、示された構造を有する環状分子が形成される。図中に示した組み換え部位は、attL部位およびattB部位であるが、任意の適切な組換え部位を使用することができる。
【図４０】環状核酸分子を作製するためのトポイソメラーゼ媒介法を使用した2つの核酸セグメントの結合の略図である。この環状分子は、attL1組換え部位とattL2組換え部位（「L1」および「L2」とする）との間に存在するオープンリーディングフレーム（「ORF」とする）を含む。次いで、トポイソメラーゼ構築産物を、attR1組換え部位およびattR2組換え部位を含む別の環状分子で組換えて、attB1組換え部位とattB2組換え部位との間に存在するオープンリーディングフレームを含む第3の環状核酸分子を作製する。さらにオープンリーディングフレームは、プロモーターに機能的に連結される。本図中に示した組換え部位はattL部位およびattB部位であるが、任意の適切な組換え部位を使用することができる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ａ】
2004522428.tif 000025
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｂ】
2004522428.tif 000026
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ａ】
2004522428.tif 000027
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｂ】
2004522428.tif 000028
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｃ】
2004522428.tif 000029
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2004522428.tif 000030
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２Ｂ】
2004522428.tif 000031
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３Ｂ】
2004522428.tif 000032
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４Ｃ】
2004522428.tif 000033
【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ｃ】
2004522428.tif 000034
【手続補正３０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６】
2004522428.tif 000035
【手続補正３１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２９】
2004522428.tif 000036