【手続補正書】
【提出日】平成17年7月7日(2005.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
この得られたアミノ酸配列を用いてgene bankを検索した結果、大腸菌のＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列（Ichikawaら 1989, J. Biol. Chem., 264: 20054-20059）と非常に高い相同性を有していることが分かった。また他にもこの遺伝子のアミノ酸配列や大腸菌ＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列と非常に高い相同性を有するアミノ酸配列も見つかり、特にDaucus carota(GenBank accession number X72384）のglycine-rich nuclear located protein(NLP）やHaemophiles influenzae(Fleischmannら1995, Science, 269: 496-512)、Mycoplasma genitalium(Fraserら1995, Science, 270: 397-403)、Synechocystis sp. PCC6803(Cyanobase accession number sll0145)の３種の原核生物のＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列と比べ良く保存されていた。大腸菌ＲＲＦ遺伝子のアミノ酸配列と比べこのホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のアミノ酸配列のＣ末端部（アミノ酸８７から２７１残基）のみを比べると４６％の同一性（６６％の相同性）となっているがＮ末端が異なっているので細菌特異的又は植物特異的な抗ＲＲＦ剤の創造は充分可能性があると考えられる。従ってこの発見は産業上非常に重要であると考えられる。ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のアミノ酸配列とニンジンのＲＲＦのアミノ酸配列は７４％の同一性（８９％の相同性）を有している。また、酵母真菌のＲＲＦと予想されている遺伝子（Ouzounisら1995, Protein Sci, 4: 2424-2428)のアミノ酸配列は大腸菌ＲＲＦのアミノ酸配列と比較して２５％の同一性（４６％の相同性）を有し、ホウレン草のＲＲＦ様遺伝子のアミノ酸配列と比較して２１％の同一性（４５％の相同性）を有している（配列表２）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
［実験例２］
（特に光合成を行なう組織において）単一のホウレン草ＲＲＦ様遺伝子の検出を行った実験例
得られたｃＤＮＡをもとにしたプローブを用いてホウレン草ゲノムＤＮＡについてサザンブロッティングを行ったところ、単一の遺伝子が検出された（図１のＢ）。さらにホウレン草のさまざまな組織から得た全ＲＮＡを用いてノーザンブロッティングを行った結果、子葉と葉においてはその発育のあいだ恒常的にこの遺伝子を発現していることが分かった（図１のＣ）。古い葉や子葉における発現は、若い葉における発現と比べると若干少ないことも観察され、hypocotylsと根においては明らかに発現していないことが観察された。これらのことから、このＲＲＦ様の遺伝子の発現は特に光合成を行なう組織に制限されていると考えられる。しかし暗所にて育てたホウレン草の葉においても発現が観察されたこと（図１のＤ）は、この発現が組織特異的ではあるが光の刺激とは無関係に起こるものであることを示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
配列表１  
ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子のｃＤＮＡとアミノ酸配列
終止コドンは＊で示してある。下線は、後述するホウレン草クロロプラストより精製し解析した天然のホウレン草ＲＲＦ様蛋白のＮ末端１０アミノ酸残基の位置を示してある。太字は、これらより予想される成熟ホウレン草ＲＲＦ様蛋白に相当する部分を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
配列表２
予想されるホウレン草ＲＲＦ様アミノ酸配列と他種ＲＲＦを含むアミノ酸配列との比較を示す。
ＮＬＲＲＦＨ：Daucus carotaの核蛋白D2(GenBank accession number X72384）ＥｃｏＲＲＦ：大腸菌ＲＲＦ(J. Biol. Chem., 264, 20054-20059, 1989)
ＨｉｎＲＲＦ:Haemophilus influenzae RRF(Science, 1995, 269, 496-512)
ＳｙｎＲＲＦ:Synechocystis sp. PCC6803(Cyanobase accession number s110145)
ＭｇｅＲＲＦ:Mycoplasma genitalium RRF(Science, 1995, 270, 397-403)
ＳｃＲＲＦＨ：酵母様真菌ミトコンドリアＲＲＦ(Protein Sci., 1995, 4, 2424-2428)
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
配列表３
ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子とDaucus carotaのglycine-nuclear located proteinとの遺伝子配列とアミノ酸配列の比較を示す。
Ｓｏ：ホウレン草ＲＲＦ様遺伝子
Ｄｃ：Daucus carotaのglycine -nuclear located protein
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】  
大腸菌株Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて発現ベクターｐＥＴ−１５ｂを用いて、リコンビナントホウレン草ＲＲＦ様蛋白を過剰発現させ解析した図。  Ａ：大腸菌全抽出液と過剰発現されたホウレン草ＲＲＦ様蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した。
レーン１：ＩＰＴＧによる発現誘導前の大腸菌全抽出液、
レーン２：ＩＰＴＧによる発現誘導２時間３０分後の大腸菌全抽出液、
レーン３，４：ＩＰＴＧで誘導を行った大腸菌全細胞抽出液からニッケルアフィニティークロマトグラフィーにて精製したもの（レーン４）とそのフロースルー（レーン３）、
レーン５：分子量マーカー
Ｂ：ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌクロマトグラフィーにてホウレン草ＲＲＦ様蛋白を精製しＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した図である。
レーン１から４：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む分画、
レーン５から８：ホウレン草ＲＲＦ様蛋白を含む分画。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
ホウレン草クロロプラストより天然のホウレン草クロロプラストＲＲＦ様蛋白を精製し、ウエスタンブロットにより解析した図。
Ａ：ホウレン草ストローマ抽出液のＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌクロマトグラフィーによる分画を示す図である。
Ｂ：全ての分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析図。
レーン１：ストローマ抽出液（Ｓ）
レーン２から８：それぞれＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌクロマトグラフィー精製における溶出分画３５，３７，３９，４１，４３，４５
レーン９：大腸菌中において一過性発現させて精製したヒスチヂンタグーホウレン草ＲＲＦ様蛋白（Ｃ）（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥについて、抗ホウレン草ＲＲＦ様蛋白ポリクローナル抗体を用いて行ったウエスタンブロッティングによる解析図。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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