【手続補正書】
【提出日】平成17年2月9日(2005.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原とし、該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定することによりヒトのう蝕リスクを検査することを特徴とするう蝕リスク検査方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のアミノ酸配列から成るタンパクを抗原とし、この抗原に対するヒトの唾液中に含まれる分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）の抗体価を免疫学的方法により測定して行うう蝕リスクの検査方法に関するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
近年、ミュータンス連鎖球菌の一種であるS.mutansの菌体表層物質の中で、分子量約１９万のPAc（Protein Antigen serotype C）と呼ばれるタンパク質抗原がミュータンス連鎖球菌の歯面への初期付着に関連があることがそれを抗原としたモノクローナル抗体を利用した研究から確認された。このような確認に基づいて、ミュータンス連鎖球菌の代わりにその菌体表層物質の一部であるPAcを抗原として血漿の抗体価を測定すれば、う蝕リスクとの関連性が見出せるのではないかとの期待が持たれた。しかしながら、この場合もう蝕の罹患状況や唾液中のミュ−タンス連鎖球菌の量などとの間に有意な相関が見付からず、リスク判定の指標とすることはできなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特定のアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原とし、その抗原に対するヒト免疫グロブリンの抗体価の違いからう蝕リスクを正確に且つ短時間で検査することができるう触リスク検査方法を提供することを課題とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【発明の実施の形態】
即ち本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原とし、該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定することによりヒトのう蝕リスクを検査することを特徴とするう蝕リスク検査方法である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明において抗原として使用する配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを得るには、このようなアミノ酸配列を得ることができる手法であれば特に限定されないが、一般的にはアミノ酸シンセサイザーを用いるのが便利である。合成タンパクの合成に際しては配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列以外に余計なアミノ酸配列を有していないことが重要である。余計なアミノ酸配列部位があると、本来ミュ−タンス連鎖球菌に関連しない免疫グロブリンの抗体価も測定することになり検査の精度が低下してしまう。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明方法においては、検体にはヒト唾液を用い、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原としてヒトの唾液が含有する分泌型免疫グロブリンＡの抗体価を測定する。実際には、検体は生理食塩水，燐酸緩衝食塩水などで任意の倍率に希釈して検査に用いられる。検体の希釈倍率が高くても抗原抗体反応が得られた検体を有していた人は、う蝕の発症リスクが低いという判定もできる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明方法では、通常の酵素抗体法（ミュータンス連鎖球菌に対する抗体価測定法の一つ、Enzyme Linked immunosorbent Assay，以下「ＥＬＩＳＡ」と記す）を用いても十分実用可能な感度が得られるが、抗原抗体反応で得られる測定値の感度向上のために一般的に用いられる技術、例えば唾液中の分泌型免疫グロブリンＡを一旦ビオチン化抗ヒト免疫グロブリンＡなどと反応させ定量時の測定感度を増すこともできる。抗体価の測定には一般的な抗原抗体反応に基づく手法がそのまま応用できる。その他にも、イムノクロマト，イムノコンセントレ−ション，ラテックス凝集法などがいずれも好適に使用できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
抗体価の測定に当っては配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを固体表面に固相化し、これに任意に希釈した検体と標識した抗体とを反応させればう蝕リスク診断を行うことができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
＜実施例１＞
＜ELISAによる唾液分泌抗体の測定＞
（１）抗原としての合成タンパクの合成
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクをステップワイスの固相ペプチド合成法から得た。合成器には、Model 350 Multiple Peptide Synthesizer（製品名：Advanced Chemitech, Louisville社製）を使用し、TSK-GEL カラム（30×１）を用いた逆相の高速液体クロマトグラフィー法（10〜45％アセトニトリルをカラムとし、グラジエントを0.1％TFA）にて合成ペプチドの確認を行った。最終精製度は95％以上であった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
Ｃ）唾液の調整
パラフィンワックスを３分間噛むことにより分泌される刺激唾液を検体とした。唾液検体は回収後、測定開始まで氷中で保存した。実験には、唾液を０.５％スキムミルク含有ＰＢＳで２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４倍に希釈したものを作製し、上記のプレートに各１００μＬ添加した。添加後、３７℃で１時間静置した後、ＰＢＳＴで洗浄した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
Ｄ）標識抗体
アルカリフォスファターゼ標識（商品名：Anti-Human-IgA，Chemicon International社製）を０.５重量％スキムミルク含有ＰＢＳにて０.３μg/ｍＬの濃度に調整し、各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、１時間３７℃で反応させた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【発明の効果】
以上に詳述したように本発明に係るう触リスク検査方法は、特定抗原であるミュータンス連鎖球菌に特有な配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原として用い、その抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の違いからう蝕リスクを正確にしかも短時間で検査することができるう触リスク検査方法であり、歯科医療に貢献する価値の大なるものである。