(57)【要約】   本発明の目的は、揮発性の低い化学物質を用いてゼラチンなどから作製した構造物をゼラチンを溶解することなく化学修飾する方法、及び高強度（高架橋度）の生体高分子を作製するための生体高分子の架橋方法を提供することである。本発明によれば、生体高分子により作製した構造物を、融点が５０℃以上の化合物であって固体状態の化合物と、５０％以上の湿度下において反応させることを含む修飾された生体高分子の製造方法、及び生体高分子を架橋剤で処理することを含む生体高分子の架橋方法において、反応混合物中の架橋剤の濃度が1.0〜10重量％であり、かつ架橋を有機フッ素化合物の存在下で行うことを特徴とする生体高分子の架橋方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子により作製した構造物を、融点が５０℃以上の化合物であって固体状態の化合物と、５０％以上の湿度下において反応させることを含む、修飾された生体高分子の製造方法。
【請求項２】
融点が５０℃以上の化合物が架橋剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
架橋剤が、縮合剤又は酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、又はトランスグルタミナーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
生体高分子がタンパク質、又は多糖である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
生体高分子が、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、キトサン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種のタンパク質を含む、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質の由来がヒト、牛、豚、魚、又は遺伝子組み換えである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生体高分子により作製した構造物に、添加剤が含まれている、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
生体高分子を架橋剤で処理することを含む生体高分子の架橋方法において、反応混合物中の架橋剤の濃度が1.0〜10重量％であり、かつ架橋を有機フッ素化合物の存在下で行うことを特徴とする生体高分子の架橋方法。
【請求項１０】
反応前の混合温度が０℃〜３０℃である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
反応前の混合温度が０℃〜２５℃である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
生体高分子が、タンパク質、多糖、及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
生体高分子がタンパク質である、請求項９から１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、及びアンチトロンビンIIIからなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、請求項９から１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質の由来がヒト、牛、豚、魚、植物又は遺伝子組み換えである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
架橋剤がアルデヒド、縮合剤、又は酵素である、請求項９から１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
有機フッ素化合物の炭素数が１から８である、請求項９から１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
有機フッ素化合物が、アルコール、ケトンまたはカルボン酸である、請求項９から１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
有機フッ素化合物が１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、2,2,2−トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、トリフルオロ酢酸、またはペンタフルオロプロピオン酸である、請求項９から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
有機フッ素化合物が１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、又は2,2,2−トリフルオロエタノールである、請求項９から１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項９から２０の何れかに記載の方法を含む、架橋した生体高分子の製造方法。
【請求項２２】
ヤング率が200 KPa以上である架橋ゼラチン組成物。
【請求項２３】
ヤング率が300 KPa以上である架橋ゼラチン組成物。
【請求項２４】
該架橋ゼラチンの架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項２２および２３に記載の架橋ゼラチン組成物。
【請求項２５】
該ゼラチンが酸処理ゼラチンである、請求項２２から２４の何れかに記載の架橋ゼラチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子により作製された構造体を固体状態の化合物と高湿度下において化学反応させることによる、修飾された生体高分子の製造方法に関する。さらに本発明は、生体高分子の架橋方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子はそれぞれ固有の生物的に活性な性質を有することから、再生医療やドラッグデリバリーシステムにおける要素材料としての可能性が期待されている。しかし、それら単独では生理的温度で水に可溶のものが多い。従って、生体高分子を医療に利用するために、低分子化合物による化学修飾や架橋が施されている。通常、生体高分子を化学修飾するには、溶液中で化学反応を行い、成形・加工を施す、またはあらかじめ作製した構造物を化学修飾可能な化合物（例えば、架橋剤）を含む溶液中に浸漬させる方法が利用されている。【０００３】
一方、近年簡単にサブミクロンスケールのファイバーを作製できる技術として、エレクトロスピニング法が注目されている。該手法は高分子溶液に電圧をかけた状態で溶液を射出し、ファイバーを形成させるものである。ファイバーの太さは印加電圧、溶液濃度、スプレーの飛散距離に依存する。基板上に連続的にファイバーを作製することによって、立体的な網目をもつ3次元構造の薄膜が得られる。また、この手法では膜を布のように厚くすることが可能で、サブミクロンの網目をもつ不織布を作製することができる。この不織布は宇宙服や防護服への応用が研究されている。該手法は、生体高分子を利用して医療分野で用いる構造体構築にも用いられている（特表２００４−５３２８０２号公報、及び特開２００４−３２１４８４号公報）。【０００４】
特表２００４−５３２８０２号公報ではエレクトロスピニング法によりあらかじめ作製したコラーゲン構造体にグルタルアルデヒド蒸気を暴露させることで構造体の架橋を施している。しかし該手法では、揮発性のグルタルアルデヒドの気体をコラーゲン構造体に暴露させることにより架橋しているのみである。グルタルアルデヒドはコラーゲンやゼラチンの架橋剤として広く用いられているが、グルタルアルデヒドはそれ自体毒性があり、また、架橋構造物中にグルタルアルデヒド由来の構造が導入される。したがって、コラーゲンやゼラチン固有の有益な性質が失われる可能性や、毒性が新たに現れる可能性がある。【０００５】
他方、コラーゲンやゼラチンを酵素により架橋する手法がある。これらを架橋する酵素としてトランスグルタミナーゼが知られている。トランスグルタミナーゼはグルタミン残基とリジン残基を結合させる酵素である。一般に酵素は至適温度で特異的に活性が発生し、それ以外の温度では大幅に活性が低下する（例えば、味の素社製アクティバTG-Sの至適温度は50℃付近）。通常、トランスグルタミナーゼによるゼラチンの架橋では、ゼラチンが水に溶解する温度である30℃から60℃の範囲で行われている。したがって、ゼラチンによる構造物を水に溶解することなくトランスグルタミナーゼにより架橋する際には、ゼラチンが水に溶解しない20℃以下で反応させることが必要となる（特許第３０１２７４３号公報）。しかしながら、ゼラチンによる構造物を低温の水に浸漬させると、構造物の形状が大きく変化する恐れがあり、あらかじめ作製したゼラチン構造物を変形させずに効率良く架橋することが困難であった。【０００６】
また生体由来の高分子である生体高分子はそれぞれ特異な物理的および生物的な性質を有することから、医学および生物学用途で頻繁に利用されている。しかし、生体高分子は一般に水溶性であるため、固形物として利用する際には化学修飾や架橋を必要とする、物理的強度が不足していることから合成高分子や無機物へのコーティング（Brash, Trans. Am. Soc. Artif. Int.
Organs, p69, 1974）やそれらの材料とのハイブリッド化（複合化）が施されているが、生体への安全性を考慮した場合には生体高分子のみによる材料が好ましい。【０００７】
生体高分子の生体内分解特性および強度向上や水への不溶化には、生体高分子の一部の官能基を化学修飾する手法、および生体高分子間の架橋による手法が考案されている。特に、生体高分子間の架橋は精力的に研究されており、例えばグルタルアルデヒドや縮合剤によるゼラチンの架橋が広く利用されている。該手法により、再生医療分野およびドラッグデリバリー分野において有効性が示されている（特許第3639593号）。しかし、該架橋方法では、架橋度や強度が不十分であり、生体高分子の医療用途への応用が限定されている。【０００８】
ゼラチンの架橋では、通常ゼラチンをグルタルアルデヒドにより架橋する方法が用いられている。該手法では、ゼラチンが溶解している温度、すなわち30℃以上で攪拌する必要がある。しかし、該温度では、ゼラチンとグルタルアルデヒドの反応性が高いことから溶液全体の均一な攪拌が不可能となり、架橋剤を高濃度で使用することができず、高い架橋度を持つゼラチンの作製は困難であった。このことから、架橋度の高い高強度のゼラチンを作成することは困難であった。【０００９】
特表2002-531182号公報では該タンパク質およびヒアルロン酸のアルキルエステルをHFIPに溶解し、成形することによりタンパク質による組織構築用マトリックスを作製している。また、特表2004−532802号公報、特開2004-321484号公報では、エレクトロスピニング法によりタンパク質の構造体を作製している。しかしながら、該手法では、HFIP中での架橋は行われていない。また、HFIPを溶媒に用いエレクトロスピニング法により作製したファイバーのグルタルアルデヒドの架橋が行われている例（Biomaterials, 27(8), 452-1461, 2006）があるが、該手法では、構造体を作成後にグルタルアルデヒドの蒸気により架橋が施されている程度である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明では、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、揮発性の低い化学物質を用いて、ゼラチンなどの生体高分子から作製した構造物をゼラチンを溶解することなく化学修飾する方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、従来技術においては困難であった高強度（高架橋度）のゼラチンなどの生体高分子を作製するための生体高分子の架橋方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体高分子により作製した構造物を、融点が５０℃以上の化合物であって固体状態の化合物と、高湿度下において反応させることによって、修飾された生体高分子を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体高分子を架橋剤で処理する際に、反応混合物中の架橋剤の濃度を1.0〜10重量％とし、かつ架橋を有機フッ素化合物の存在下で行うことによって、高強度（高架橋度）の生体高分子を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明によれば、生体高分子により作製した構造物を、融点が５０℃以上の化合物であって固体状態の化合物と、５０％以上の湿度下において反応させることを含む、修飾された生体高分子の製造方法が提供される。【００１３】
好ましくは、融点が５０℃以上の化合物は架橋剤である。
好ましくは、架橋剤は、縮合剤又は酵素である。
好ましくは、架橋剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、又はトランスグルタミナーゼである。【００１４】
好ましくは、生体高分子はタンパク質、又は多糖（例えば、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン）である。
好ましくは、生体高分子は、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、キトサン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種のタンパク質を含む。
好ましくは、タンパク質の由来はヒト、牛、豚、魚、又は遺伝子組み換えである。
好ましくは、生体高分子により作製した構造物に、添加剤が含まれている。【００１５】
さらに本発明によれば、生体高分子を架橋剤で処理することを含む生体高分子の架橋方法において、反応混合物中の架橋剤の濃度が1.0〜10重量％であり、かつ架橋を有機フッ素化合物の存在下で行うことを特徴とする生体高分子の架橋方法が提供される。【００１６】
好ましくは、反応前の混合温度は０℃〜３０℃である。
好ましくは、反応前の混合温度は０℃〜２５℃である。
好ましくは、生体高分子は、タンパク質、多糖、及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
好ましくは、生体高分子はタンパク質である。【００１７】
好ましくは、タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、キトサン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、及びアンチトロンビンIIIからなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
好ましくは、タンパク質の由来はヒト、牛、豚、魚、植物又は遺伝子組み換えである。
好ましくは、架橋剤はアルデヒド、縮合剤、又は酵素である。
好ましくは、架橋剤はアルデヒドである。
好ましくは、架橋剤はグルタルアルデヒドである。【００１８】
好ましくは、有機フッ素化合物の炭素数は１から８である。
好ましくは、有機フッ素化合物は、アルコール、ケトンまたはカルボン酸である。
好ましくは、有機フッ素化合物は１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、トリフルオロ酢酸、またはペンタフルオロプロピオン酸である。
好ましくは、有機フッ素化合物は１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、又は2,2,2−トリフルオロエタノールである、【００１９】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法を含む、架橋した生体高分子の製造方法および高強度のゼラチン構造体が提供される。
本発明の別の側面によれば、ヤング率が200 KPa以上である架橋ゼラチンが提供される。
好ましくは、ヤング率が300 KPa以上である架橋ゼラチンが提供される。
好ましくは、該架橋ゼラチンの架橋剤はグルタルアルデヒドである。
好ましくは、該ゼラチンは酸処理ゼラチンである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、化学修飾操作中での溶媒量を最小限に抑えることができるため、生体高分子により作製した構造物を溶媒に溶解させずに架橋させることができる。従って、本発明の方法によれば、生体高分子により作製した構造物の形状を保持できる。さらに、化学修飾操作中に封入した薬剤の溶出を最小限に防ぐことができる。
また本発明を実施することにより、（１）水系に比べて効率の良い反応、（２）水溶液中では低温でゲル形成するゼラチンのような基質でかつ反応性の高い試薬を用いる場合にハンドリングが容易になる。それらの結果、高強度の架橋生体高分子を作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）修飾された生体高分子の製造方法
本発明で用いる生体高分子は、生体由来の高分子であれば特に限定されないが、好ましくは、タンパク質、糖、又はその誘導体である。生体高分子は、より好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、キトサン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、又はヒアルロン酸エステルである。生体高分子は、さらに好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、又はフィブロインであり、最も好ましくはコラーゲンまたはゼラチンである。生体高分子がタンパク質である、タンパク質の由来は特に限定せず、ヒト、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体のいずれを用いてもよい。また、遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えばＥＵ1014176Ａ２、ＵＳ6992172に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。【００２２】
生体高分子の形態は特に規定しないが、未架橋体、物理的、化学的架橋体、化学修飾体およびそれらの混合体のいずれでも構わない。また、生体高分子により作製した構造物内には、生体高分子が単独で存在する必要はなく、構造物中に該生体高分子が一部含まれていればよい。【００２３】
生体高分子により作製した構造物は、通常、固体である。構造物の形態は特に限定されないが、例えばゲル、スポンジ、フィルム、不織布、ファイバー（チューブ）、粒子などが挙げられる。構造物の形状はいずれの形状でも適用可能であるが、例えば角錐、円錐、角柱、円柱、球、紡錘状の構造物および任意の型により作成した構造物が挙げられる。好ましくは、角柱、円柱、紡錘状の構造物および任意の型により作成した構造物である。より好ましくは、角錐、円錐、角柱、円柱である。最も好ましくは角柱、円柱である。【００２４】
構造物の大きさは特に限定されないが、ゲル、スポンジ、不織布であれば好ましくは500 cm四方以下である。好ましくは100 cm以下である。特に好ましくは50 cm以下である。最も好ましくは10 cm以下である。ファイバー（チューブ）であれば、ファイバーまたはチューブの直径（または一辺）は1 nm以上10 cm以下である。好ましくは1 nm以上1 cm以下である。より好ましくは1nm以上100 μmである。特に好ましくは1 nm以上1μm以下である。最も好ましくは1 nm以上10 nm以下である。また、長さは特に限定されるものではないが、好ましくは10 μm以上100m以下である。より好ましくは100 μm以上10
m以下である。さらに好ましくは1 mm以上1 m以下である。最も好ましくは1cm以上30 cm以下である。粒子であれば、好ましくは直径1 nmから1 mm、より好ましくは直径10 nmから200 μm、さらに好ましくは直径50 nmから100 μm、特に好ましくは直径100 nmから10μmである。【００２５】
構造物の厚さについては特に限定されないが、好ましくは1 nm以上である。より好ましくは、10 nm以上である。より好ましくは100 nm以上である。より好ましくは1 μm以上である。さらに好ましくは10 μm以上である。最も好ましくは100 μm以上である。【００２６】
本発明においては、生体高分子により作製した構造物と、融点が５０℃以上の化合物とを、該化合物を固体の状態において、反応させる。【００２７】
本発明で用いる化合物の融点は５０℃以上であり、好ましくは100℃以上である。また、本発明で用いる化合物の２０℃での蒸気圧は1.5 KPa以下であることが好ましい。また、本発明で用いる化合物の沸点は２００℃以上であることが好ましい。【００２８】
本発明で用いる融点が５０℃以上の化合物としては、好ましくは水に溶解する物質である。より好ましくは、水酸基、アミノ基、カルボキシル基と反応する化学物質である。より好ましくは、縮合剤（例えば、カルボジイミドなど）、酵素、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）である。より好ましくは、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ））、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又は酵素である。さらに好ましくは、酵素であり、最も好ましくはトランスグルタミナーゼである。また、構造物に作用させる化合物は、化学修飾に用いる化合物の単独であってもよいし、他の化合物と混合して用いてもよい。例えば、ゼラチン構造物、WSCに加えてドデシルアミンを加え、ゼラチン構造物にドデシル基を導入することができる。【００２９】
本発明においては、構造物を、固体状態の化合物と、５０％以上の湿度下において反応させる。湿度は５０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、特に好ましくは８０％以上である。さらに、系中には水以外の溶媒の気体が混じっていても構わない。また、系中の温度は特に規定はないが、好ましくは２５℃以上２００℃以下であり、より好ましくは３０℃以上１００℃以下であり、最も好ましくは３５℃以上８０℃以下である。特に酵素を用いる場合は、温度を、酵素の活性温度付近とすることが望ましい。【００３０】
本発明においては、構造物を、固体状態の化合物と、５０％以上の湿度下において反応させることによって、修飾された生体高分子を製造することができる。ここで言う生体高分子の修飾としては、低分子化合物との化学結合反応、又は分子内架橋反応を挙げることができ、より好ましくは分子内架橋反応である。分子内架橋反応は、縮合剤、又は酵素を用いて行うことができる。【００３１】
本発明により作製する組成物には必要に応じて添加剤が含まれていても良い。添加剤の例としては、薬剤、色素剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、保湿剤、界面活性剤、防腐剤、香料、pH調整剤が挙げられる。薬剤としては、例えば抗癌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗血栓剤、抗精神剤、抗うつ剤、増殖因子、ホルモン、サプリ成分、化粧品成分が挙げられる。【００３２】
該組成物の用途は特に限定することはないが、経皮吸収剤、局所治療剤、貼付剤、ハップ剤、経口治療剤、化粧品、サプリメント、食品、および色素材である。好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、化粧品である。さらに好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤、貼付剤、ハップ剤、経口治療剤である。最も好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤である。【００３３】
（２）生体高分子の架橋方法
本発明による生体高分子の架橋方法は、生体高分子を架橋剤で処理することを含み、反応混合物中の架橋剤の濃度が1.0〜10重量％であり、かつ架橋を有機フッ素化合物の存在下で行うことを特徴とする方法である。【００３４】
本発明を実現可能である限りは、生体由来の高分子である生体高分子に特に規定はないが、好ましくはタンパク質、多糖、又はそれらの誘導体、塩類である。タンパク質の場合は、球状、繊維状等のタンパク質のいずれでもよい。本発明でいう生体高分子には合成のポリペプチドも含まれる。生体高分子は、より好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、キトサン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンIIIおよびヒアルロン酸エステルである。さらに好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、フィブロインである。最も好ましくはコラーゲンまたはゼラチンである。タンパク質の由来は特に限定せず、ヒト、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体のいずれを用いても良い。遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えばＥＵ1014176Ａ２、ＵＳ6992172に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、該生体高分子は部分的に加水分解されていてもよい。【００３５】
本発明で用いる有機フッ素化合物については生体高分子を溶解する限りは特に限定はないが、好ましくは炭素数１から８の有機フッ素化合物である。より好ましくは炭素数１から６の有機フッ素化合物である。より好ましくは炭素数１から３の有機フッ素化合物である。さらに好ましくは、有機フッ素化合物はアルコール、ケトン、またはカルボン酸である。特に好ましくは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（HFIP）2,2,2-トリフルオロエタノール（TFE）、ヘキサフルオロアセトン、トリフルオロ酢酸、またはペンタフルオロプロピオン酸である。最も好ましくは1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロパノールまたは2,2,2−トリフルオロエタノールである。該有機フッ素化合物は単独または該有機フッ素化合物と相溶性の溶媒との混合で用いても構わない。有機フッ素化合物の含有率は特に限定はないが、好ましくは0.0001％以上である。より好ましくは、0.1％以上である。より好ましくは10％以上である。さらに好ましくは50％以上である。最も好ましくは８０％以上である。【００３６】
本発明で用いる架橋剤は本発明を実施可能である限りは特に限定はなく、化学架橋剤でも酵素でもよい。化学架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミドなどが挙げられる。好ましくは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドである。タンパク質の架橋に水よりも求核性の低い溶媒を用いることが望ましい。HFIPやTFEはアルコールであるが、水酸基の酸性度が高く、求核性が低い。従って、該溶媒による求核攻撃を伴う反応の阻害が少ないことが考えられる。【００３７】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、生体高分子の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies,  Inc. 社）などが挙げられる。【００３８】
本発明では、生体高分子と有機フッ素化合物と架橋剤とを含む反応混合物中の架橋剤の濃度は1.0〜10重量％であり、好ましくは1.0〜5.0重量％である。【００３９】
生体高分子の架橋には生体高分子の溶液と架橋剤を混合する過程とそれらの均一溶液の反応する過程の２つの過程を有する。
本発明において生体高分子を架橋剤で処理する際の混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは０℃〜３０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
生体高分子と架橋剤を攪拌した後は温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、生体高分子の変性や分解を考慮すると実質的には０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。【００４０】
本発明により得られる架橋した生体高分子からなる構造物の形態は特に規定はないが、例えばスポンジ、フィルム、不織布、ファイバー（チューブ）、粒子などが挙げられる。形状はいずれの形状でも適用可能であるが、例えば角錐、円錐、角柱、円柱、球、紡錘状の構造物および任意の型により作成した構造物が挙げられる。好ましくは、角柱、円柱、紡錘状の構造物および任意の型により作成した構造物である。より好ましくは、角錐、円錐、角柱、円柱である。最も好ましくは角柱、円柱である。さらに、該組成物は用途に応じて防水シート等の各種シートで被覆しても良い。該シートとしては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニリデン等が挙げられる。【００４１】
該構造物の大きさは特に限定されないが、スポンジ、不織布であれば好ましくは500 cm四方以下である。好ましくは100 cm以下である。特に好ましくは50 cm以下である。最も好ましくは10 cm以下である。ファイバー（チューブ）であれば、ファイバーまたはチューブの直径（または一辺）は1 nm以上10 cm以下である。好ましくは1 nm以上1 cm以下である。より好ましくは1nm以上100 μmである。特に好ましくは1 nm以上1μm以下である。最も好ましくは1 nm以上10 nm以下である。また、長さは特に限定されるものではないが、好ましくは10 μm以上100m以下である。より好ましくは100 μm以上10m以下である。さらに好ましくは1 mm以上1 m以下である。最も好ましくは1cm以上30 cm以下である。粒子であれば、好ましくは1 nmから1 mm、より好ましくは10 nmから200 μm、さらに好ましくは50 nmから100 μm、特に好ましくは100 nmから10μmである。【００４２】
構造物の厚さについては特に限定されないが、好ましくは1 nm以上である。より好ましくは、10 nm以上である。より好ましくは100 nm以上である。より好ましくは1 μm以上である。さらに好ましくは10 μm以上である。最も好ましくは100 μm以上である。【００４３】
該生体高分子はその他の合成高分子との混合物としても利用することができる。該合成高分子としては有機フッ素化合物に溶解可能である限りは得に限定はないが、より好ましくはウレタン結合、エステル結合、エーテル結合、およびカーボネート結合を有する高分子、またはビニル重合体、およびそれらの共重合体である。より好ましくは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらの共重合体、ポリ（ε―カプロラクトン）、ポリウレタン、セグメント化ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸ベンジルエステル、ヒアルロン酸エチルエステル、アセチルセルロースである。さらに好ましくは、ポリ（ε―カプロラクトン）、ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、セグメント化ポリウレタン、PETである。【００４４】
該合成高分子の分子量は特に限定することはないが、実質的には1KDa以上10MDa以下である。好ましくは5 KDa以上500 KDa以下である。最も好ましくは10KDa以上100 KDa以下である。さらに、該合成高分子は架橋および化学修飾が施されていても構わない。【００４５】
1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP）や2,2,2−トリフルオロエタノール（TFE）に代表される有機フッ素化合物はコラーゲンやゼラチンといったタンパク質を溶解する。さらに、例えば、ゼラチンを含むHFIP溶液を4℃としてもゲル形成しない。【００４６】
上記した本発明による生体高分子の架橋方法を用いることによって、架橋した生体高分子を製造することができる。本発明の方法により製造される架橋した生体高分子には、必要に応じて添加剤を加えても良い。添加剤の例としては、薬剤、色素剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、保湿剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、香料、pH調整剤が挙げられる。【００４７】
薬剤の具体例としては、例えば抗癌剤（例えば、パクリタキセル、トポテシン、タキソテール、5-フルオロウラシル、シスプラチン）、免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン、タクロリムス、シクロスポリン）、抗炎症剤、抗血栓剤、抗精神剤（例えば、塩酸アミトリプチリン）、抗うつ剤、抗酸化剤、抗アレルギー剤、増殖因子（例えば、繊維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経増殖因子）、ホルモン、サプリメント成分、化粧品成分が挙げられる。【００４８】
本発明の方法により製造される架橋した生体高分子の用途は特に限定することはないが、経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、化粧品、サプリメント、食品、および色素材である。好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、化粧品である。さらに好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤である。最も好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤である。【００４９】
本発明により製造される架橋した生体高分子の用途として、例えば、抗癌剤を含有する皮膚外用剤が挙げられる。皮膚外用剤の適用疾患としては、例えば、皮膚癌、角化症、悪性黒色腫、菌状息肉症、乳癌、前立腺癌、子宮癌、膣癌、陰茎癌、大腸癌である。好ましくは、皮膚癌、角化症である。【００５０】
本発明により製造される架橋した生体高分子は、生体組織中への埋め込み材として利用できる。例えば、細胞を包埋した架橋した生体高分子を損傷部位に埋め込み、組織を修復することができる。また、別の形態によると、増殖因子や各種薬剤を封入した架橋した生体高分子を生体組織中に埋め込み、組織を修復することができる。
架橋した生体高分子に封入する細胞の種類は特に限定されないが、例えば、骨髄細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、上皮細胞が挙げられる。
生体組織中への埋め込み部位として特に強度が求められる部位としては、例えば、骨、軟骨、心臓、血管などが挙げられる。【００５１】
生体組織中への埋め込み材としての利用の別の形態として、生体内での治療器具へのコーティングが挙げられる。例えば、人工血管、人工心臓等の人工臓器、血管内治療用のステントが挙げられる。ステントに用いる場合、抗癌剤や免疫抑制剤を架橋した生体高分子に封入し、ステント表面にコーティングすることが挙げられる。【００５２】
架橋ゼラチンの強度はゼラチンの濃度、架橋の割合により大きく異なる。従来技術で作製する架橋ゼラチンでは、ゼラチンが低温でゲル化するため、高濃度のゼラチンに高濃度の架橋剤を同時に混ぜることが困難である。本発明で製造する架橋ゼラチンの強度としては好ましくは200 KPa以上である。より好ましくは、250KPa以上である。さらに好ましくは300 KPa以上である。さらに好ましくは400 KPa以上である。また、別の形態として、厚さ4 mmの架橋ゼラチンについて、破断荷重が150 KPa以上である。より好ましくは200 KPa以上である。さらに好ましくは300 KPa以上である。【００５３】
架橋ゼラチンの強度は山電製クリープメーター（RE2-33005B、プランジャーのφ＝5 mm、押し込み速度：0.1 mm/s）を用いた。架橋ゼラチンの強度として、架橋ゼラチンのヤング率と破断荷重を測定した。ヤング率は架橋ゼラチンを押し込む際に得られる応力から応力―ひずみ曲線を作成し、低歪み領域（歪みが0.3以下）の直線部分の傾きにより求めた。また、破断荷重は、架橋ゼラチンをプランジャーで貫通させ、架橋ゼラチンが破断する際の荷重とした。【００５４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：ゼラチンフィルムのトランスグルタミナーゼ架橋
酸処理ゼラチン（5％または20％、ＰＳＰゼラチン、ニッピ社製）およびパクリタキセル（1 mg/mL）を含むHFIP溶液をポリプロピレン製の基板上に塗布した（サイズ：20 cm x 20 cm、塗布厚：1 mm）。該パクリタキセル封入ゼラチンフィルムを3日間自然乾燥し、パクリタキセル封入ゼラチンフィルムを得た。【００５６】
該フィルム（1ｃｍｘ5ｃｍ、厚さ：100μm）の上にトランスグルタミナーゼ粉末（アクティバＴＧ−Ｓ、味の素社製）100 mgを載せ、以下の条件（１）から（３）で7日間静置した。
（１）温度50℃、湿度95％
（２）温度50℃、湿度10％
（３）温度40℃、湿度80％
なお、上記トランスグルタミナーゼの融点は５０℃以上であり、４０℃又は５０℃では固体である。【００５７】
該フィルムを4℃の水にて洗浄、乾燥後、パクリタキセル封入ゼラチンフィルムを得た。いずれのフィルムも明らかな体積変化を伴わず、形状を保持した。温度50℃、湿度95％の条件（１）、および温度40℃、湿度80％の条件（３）で処理したゼラチンフィルムを50℃の水に3時間浸漬すると、フィルムは溶解しなかった。さらに、該フィルムのゲル化率を測定すると、約70％であった。従って、該フィルムはトランスグルタミナーゼにより架橋されたといえる。一方、温度50℃、湿度10％の条件（２）で処理したフィルムは50℃の水に即座に溶解した（ゲル化率：0％）。【００５８】
上記の結果より、固体状態の架橋剤（本実施例ではトランスグルタミナーゼ）の存在下において加湿することでゼラチンの形状を保持したまま架橋することができた。【００５９】
比較例１：溶液中でのゼラチンフィルムのトランスグルタミナーゼ架橋
実施例１に用いたパクリタキセル封入ゼラチンフィルム（3 cm x 3 cm、厚さ：100μm）を1％トランスグルタミナーゼ水溶液（10ｍＬ）に浸漬させ、25℃あるいは50℃で15時間静置した。25℃の水溶液に浸漬させたパクリタキセル封入ゼラチンフィルムは架橋したが、面積が２倍程度に膨潤した。一方、50℃のトランスグルタミナーゼ水溶液に浸漬させたパクリタキセル封入ゼラチンフィルムは架橋前に、水に溶解し、架橋体を作製できなかった。【００６０】
実施例２：１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（HFIP）中でのゼラチンの架橋 
所定濃度の酸処理ゼラチン（PSPゼラチン、ニッピ社製）を含むHFIP又はPBS水溶液を４℃、２５℃又は４０℃とし、それぞれの温度の２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液を表１に記載の濃度になるように加え、ピペッティングした（表１参照）。該溶液（3.6ｍＬ）を角型ディッシュ（3 cm x 3 cm x 1 cm）に流し込み（液厚：4 mm）、それぞれの温度で１７時間静置した。得られたゲルを５Ｍグリシン水溶液中に一晩浸漬した。該ゲルをミリＱ水にて洗浄し、強度測定用のサンプルとした。【００６１】
HFIPとPBS中でのゼラチンのゲル化に対する影響を調べると、低いグルタルアルデヒド濃度（0.06％）では、HFIPではゼラチンがゲル化するのに対し、PBS中ではゲル化しなかった。グルタルアルデヒド濃度を0.25％に増加すると、いずれの溶媒でもゲル化した。【００６２】
PBS中ではゼラチンがゲルを形成する4℃でHFIP中での架橋を試みると、グルタルアルデヒド濃度が2.0％までは均一に攪拌でき、またグルタルアルデヒド濃度5.0％まで容易に攪拌できた（表１）。HFIPをゲル化の溶媒に用いることで、低温での攪拌・ゲル化が可能となり、架橋度の高いゼラチン構造体が作成できたといえる。溶媒をHFIPの代わりに、2,2,2-トリフルオロエタノールを用いても同様の結果を得た。猶、ゼラチンのPBS溶液は２５℃とするとゼラチンがゲル化したため、溶液の混合、反応には４０℃を用いた。【００６３】
架橋ゼラチンの強度は山電製クリープメーター（RE2-33005B、プランジャーの直径φ＝5 mm、押し込み速度：0.1 mm/s、サンプルの厚さ：4 mm）を用いた。架橋ゼラチンの強度として、架橋ゼラチンのヤング率と破断荷重を測定した。ヤング率は架橋ゼラチンを押し込む際に得られる応力から応力−ひずみ曲線を作成し、低歪み領域（歪みが0.3以下）の直線部分の傾きにより求めた。また、破断荷重は、架橋ゼラチンをプランジャーで貫通させ、架橋ゼラチンが破断する際の荷重とした。いずれの混合割合においても、溶媒にHFIPを用いた場合の架橋ゼラチンの強度がPBSを用いた場合よりも大きかった。さらに、ゼラチン20％、GA2.0％の組成のものについて、溶媒にPBSを用いた場合にはハンドリングができず測定不能であったのに対し、HFIP中ではハンドリングが可能であり、かつ高強度の架橋ゼラチンを作製できた。溶媒をHFIPとすることで、同条件のPBSに比べて架橋ゼラチンの強度を高めることができ、高濃度のゼラチンおよび架橋剤を用いてもハンドリングが可能であり、それらの結果、高強度の架橋ゼラチンを作製できたといえる。【００６４】
【表１】
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【００６５】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、化学修飾操作中での溶媒量を最小限に抑えることができるため、生体高分子により作製した構造物を溶媒に溶解させずに架橋させることができる。また、本発明によれば、高強度の架橋生体高分子を作製することができる。
【国際調査報告】
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