【手続補正書】
【提出日】平成17年2月3日(2005.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  ヒトキニノゲンＤ５ドメインポリペプチドおよびこれらの使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】  以下の特性：
（ａ）少なくとも約１μＭのＩＣ５０で新脈管形成を阻害する；
（ｂ）活性化された内皮細胞に対する直接的結合アッセイまたは精製されたＤ５レセプターに対する競合的結合アッセイにおいて測定されるような、約１μＭ未満のＫｄによって特徴付けられる親和性で、内皮細胞上のＤ５結合部位に結合する；
（ｃ）内皮細胞においてアポトーシスの誘導を生じる１つ以上のシグナル伝達経路を活性化する；または
（ｄ）内皮細胞生存度の維持に必要とされるシグナル伝達経路を阻害する、
の１つ以上を有する、ヒトキニノゲンのＤ５ドメインに対応する単離されたポリペプチド、またはその生物学的に活性なペプチドフラグメント、ホモログもしくはそれらの他の機能的誘導体。
【請求項２】  前記Ｄ５ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは他の誘導体。
【請求項３】  以下：
（ａ）ＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨ（配列番号４）；
（ｂ）ＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮ（配列番号５）；
（ｃ）ＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴ（配列番号６）；および
（ｄ）ＨＫＮＫＧＫＫＮ                （配列番号７）、
からなる群より選択される配列の１つ以上の反復を含む、約８と約３２の間または約１６と約３２の間のアミノ酸を有する、請求項１または２に記載のポリペプチドまたはペプチドフラグメント。
【請求項４】  以下：
（ａ）ＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨ（配列番号４）；
（ｂ）ＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮ（配列番号５）；
（ｃ）ＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴ（配列番号６）；および
（ｄ）ＨＫＮＫＧＫＫＮ                （配列番号７）、
からなる群より選択されるペプチドから本質的になる、請求項３に記載のフラグメント。
【請求項５】  配列ＨＫＸＫ（配列番号８）の１つ以上の反復を含み、ここで、Ｘが中性アミノ酸または芳香族アミノ酸である、約４と約１６の間のアミノ酸を有する、請求項１または２のいずれかに記載のポリペプチドまたはペプチドフラグメント。
【請求項６】  Ｄ５ドメインポリペプチドの全てもしくは一部を含む第１の融合パートナーを有するＤ５融合ポリペプチド、または該Ｄ５ポリペプチドのペプチドフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体であって、
（ｉ）第２のポリペプチドに直接融合されるか、または
（ｉｉ）必要に応じて、該第２のポリペプチドに融合されるリンカーペプチド配列に融合され、
該融合ポリペプチドが、以下の特性：
（ａ）少なくとも約１μＭのＩＣ５０で新脈管形成を阻害する；
（ｂ）活性化された内皮細胞に対する直接的結合アッセイまたは精製されたＤ５レセプターに対する競合的結合アッセイにおいて測定されるような、約１μＭ未満のＫｄによって特徴付けられる親和性で、内皮細胞上のＤ５結合部位に結合する；
（ｃ）内皮細胞においてアポトーシスの誘導を生じる１つ以上のシグナル伝達経路を活性化する；または
（ｄ）内皮細胞生存度の維持に必要とされるシグナル伝達経路を阻害する、
の１つ以上を有する、
Ｄ５融合ポリペプチド、または該Ｄ５ポリペプチドのペプチドフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体。
【請求項７】  第２のポリペプチドに融合された、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド、ペプチドフラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体を含む、Ｄ５融合ポリペプチド。
【請求項８】  請求項６または７に記載の融合ポリペプチドであって、ここで、前記結合パートナー分子が、Ｄ５ポリペプチド、フラグメントホモログまたは誘導体単独と比較した場合に、前記融合ポリペプチドの発現、安定性または生物学的活性もしくは薬理学的活性を増加させるタンパク質またはペプチドである、融合ポリペプチド。
【請求項９】  前記結合パートナー分子が、チオレドキシン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】  前記結合パートナー分子が、カルモジュリン結合タンパク質である、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】  前記第２のポリペプチドが、Ｉｇ重鎖定常領域の１つ以上のドメインである、請求項６〜８のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】  前記ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】  直接かまたはモノマー反復間に存在するリンカー配列を用いて、末端から末端に連結された前記第１の融合パートナーのモノマーの２つ以上の反復の直鎖状マルチマーを含む、請求項６〜１２のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】  請求項６〜１２のいずれかに記載の融合ペプチドの直列に連結した二量体または三量体である、二量体または三量体の融合ポリペプチド。
【請求項１５】  請求項６〜１３のいずれかに記載の融合ポリペプチドであって、前記リンカーが、腫瘍の近傍または腫瘍細胞において存在しかつ活性である酵素によって切断可能であり、その結果、前記第１の融合パートナーは、該酵素が該融合ポリペプチドに作用する場合、該融合ポリペプチドから放出される、融合ポリペプチド。
【請求項１６】  前記酵素が、腫瘍環境においてインビボ（またはインサイチュ）でＤ５を放出するための、マトリクスメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼ、カテプシン、プラスミンまたはトロンビンである、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】  前記リンカーが、配列ＶＰＲＧＳＤ（配列番号９）またはＤＤＫＤＷＨ（配列番号１０）を有するポリペプチドである、請求項１５または１６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】  請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１９】  配列番号３の配列を有する、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】  請求項６〜１７のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２１】  Ｄ５融合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号２のＤ５ドメインポリペプチドの全てまたは一部である第１のポリペプチドをコードするか、またはそのホモログまたは他の機能的誘導体をコードする、第１の核酸配列；
（ｂ）必要に応じて、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列である第１の核酸配列とインフレームで融合され；そして
（ｃ）該第１の核酸配列または該リンカー核酸配列にインフレームで連結され、そして第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
を含む、核酸分子。
【請求項２２】  請求項１８〜２１のいずれかに記載の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項２３】  請求項１７〜２１のいずれかに記載の核酸の組換え発現によって生成されるポリペプチド、または該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体。
【請求項２４】  以下：
（ａ）プロモーターおよび
（ｂ）必要に応じて真核生物細胞中の前記核酸の発現を調節するさらなる調節配列、
に作動可能に連結された、請求項１〜１７のいずれかに記載のポリペプチドまたは機能的誘導体をコードする該核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２５】  以下：
（ａ）プロモーターおよび
（ｂ）必要に応じて真核生物細胞中の前記核酸の発現を調節するさらなる調節配列、
に作動可能に連結された、請求項１８〜２２のいずれかに記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２６】  プラスミドである、請求項２４または２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】  ウイルスベクターである、請求項２４または２５に記載の発現ベクター。
【請求項２８】  請求項１８〜２２のいずれかに記載の核酸分子で形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞。
【請求項２９】  請求項２４〜７のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた細胞。
【請求項３０】  哺乳動物細胞である、請求項２８または２９に記載の細胞。
【請求項３１】  ヒト細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】  腫瘍細胞である、請求項２８〜３１のいずれかに記載の細胞。
【請求項３３】  哺乳動物Ｄ５ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体をコードする外因性核酸分子でトランスフェクトされた単離された哺乳動物腫瘍細胞であって、この結果、該タンパク質、フラグメント、ホモログまたは誘導体が該腫瘍細胞によって発現されるか、または該腫瘍細胞から分泌され、そして該腫瘍細胞が内皮細胞と接触される場合、該腫瘍細胞または該分泌産物が、
（ａ）該内皮細胞に結合する；または
（ｂ）該内皮細胞においてアポトーシスの誘導を生じる１つ以上のシグナル伝達経路を活性化する；または
（ｃ）内皮細胞生存度の維持に必要とされるシグナル伝達経路を阻害する、
単離された哺乳動物腫瘍細胞。
【請求項３４】  ヒトキニノゲンＤ５ドメインポリペプチドのエピトープに特異的である、抗体。
【請求項３５】  前記エピトープが、配列番号２のポリペプチドの直鎖状エピトープまたは構造エピトープである、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】  前記エピトープが、以下：
（ａ）ＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨ（配列番号４）；
（ｂ）ＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮ（配列番号５）；
（ｃ）ＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴ（配列番号６）；および
（ｄ）ＨＫＮＫＧＫＫＮ                （配列番号７）、
からなる群より選択されるペプチド中に存在する、請求項３４または３５に記載の抗体。
【請求項３７】  モノクローナル抗体である、請求項３４〜３６のいずれかに記載の抗体。
【請求項３８】  ヒト抗体モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】  腫瘍を有する被験体への投与の際に、腫瘍増殖または新脈管形成を阻害する、請求項３４〜３８のいずれかに記載の抗体。
【請求項４０】  以下：
（ａ）請求項１〜１７のいずれかに記載のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、脈管形成内皮細胞標的化薬学的組成物。
【請求項４１】  注射に適切な形態の請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】  以下：
（ａ）治療的に活性な部分に直接的または間接的に結合した、請求項１〜１７のいずれかに記載の有効量のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体；および
（ｂ）治療的に受容可能なキャリア、
を含む、脈管形成内皮細胞標的化治療的組成物。
【請求項４３】  注射に適切な形態の請求項２４に記載の組成物。
【請求項４４】  前記部分が放射性核種である、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４５】  前記放射性核種が、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｂｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、および１０９Ｐｄからなる群より選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】  内皮細胞の遊走、増殖、侵襲、もしくは新脈管形成を阻害するため、または内皮細胞アポトーシスを誘導するための方法であって、該方法は、請求項１〜１７のいずれかに記載の有効量のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体と、所望でない遊走、増殖、侵襲、もしくは新脈管形成に関与する内皮細胞を接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４７】  該被験体に投与する工程を包含する、所望でない内皮細胞の遊走、増殖、侵襲または新脈管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、請求項４０または４１に記載の有効量の薬学的組成物を包含する、方法。
【請求項４８】  請求項４７に記載の方法であって、ここで、前記疾患または状態が、固形腫瘍、白血病またはリンパ腫の原発性増殖；腫瘍浸潤、転移または腫瘍転移の増殖；良性過形成；アテローム硬化症；心筋新脈管形成；ポストバルーン血管形成血管再狭窄；血管外傷後の新内膜形成；血管移植片再狭窄；冠血管副枝形成；深い静脈血栓症；虚血性肢新脈管形成；毛細管拡張；化膿性肉芽腫；角膜疾患；ルベオーシス；血管新生緑内障；糖尿病網膜症および他の網膜症；水晶体後線維増殖；糖尿病性新生脈管形成；黄斑変性；子宮内膜症；関節炎；慢性炎症状態に関連する線維症、虚血、狼瘡または線維症を含む外傷性脊髄損傷；肺線維症、化学療法誘導性線維症；狼瘡および線維症を伴う創傷治癒；消化性潰瘍；骨折；ケロイド；あるいは病原性細胞浸潤または新脈管形成に関連する脈管形成、造血、排卵、月経、妊娠もしくは胎盤形成の障害である、方法。
【請求項４９】  前記疾患が、腫瘍増殖、腫瘍浸潤または腫瘍転移である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】  脈管形成内皮細胞を標的化するための診断的に有用な組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）診断的に標識された、請求項１〜１７のいずれかに記載のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体；および
（ｂ）診断的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項５１】  前記検出可能な標識が、放射性核種、ＰＥＴ画像化剤、蛍光剤、蛍光発生剤、発色団、色素原、リン光剤、化学発光剤または生物発光剤である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】  前記放射性核種が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒおよび２０１Ｔｌからなる群より選択される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】  前記蛍光剤または蛍光発生剤が、フルオロセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレサミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロードルグリーンまたはテキサスレッドである、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】  （ｉ）組織中、（ｉｉ）生物中、（ｉｉｉ）生物学的サンプル中の脈管形成内皮細胞の存在を検出するための方法であって、該組織、生物またはサンプルが脈管形成的に活性化された内皮細胞を有することが疑われ、該方法は、以下：
（ａ）請求項５０〜５３のいずれかに記載の診断組成物と、該組織、生物またはサンプルを接触させる工程；および
（ｂ）該組織、生物またはサンプルに関連した該標識の存在を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項５５】  前記接触させる工程がインビボである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】  前記接触させる工程および前記検出する工程がインビボである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】  固体支持体またはキャリアに固定された請求項１〜１７のいずれかに記載のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体を含む、脈管形成内皮細胞またはＤ５ドメイン結合部位への結合に有用な、親和性リガンド。
【請求項５８】  複合混合物からＤ５ドメイン結合分子を単離するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項５７に記載の親和性リガンドと該混合物を接触させる工程；
（ｂ）該結合分子のいずれかが該リガンドに結合するのを可能にする工程；
（ｃ）該リガンドから未結合の物質を取り除く工程；および
（ｄ）該結合したＤ５ドメイン結合物質を溶出させる工程、
を包含し、これにより、該Ｄ５ドメイン結合分子を単離する、方法。
【請求項５９】  細胞混合物からＤ５ドメイン結合部位を発現する細胞を単離または濃縮するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項５７に記載の親和性リガンド、または請求項１〜１７のいずれかに記載のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体と該細胞混合物を接触させる工程；
（ｂ）任意の結合部位発現細胞が、該リガンドまたは該ポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体に結合するのを可能にする工程；
（ｃ）該リガンド、ポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体に結合した細胞を未結合の細胞から分離する工程；および
（ｄ）該結合した細胞を取り除く工程、
を包含し、これにより、該Ｄ５ドメイン結合部位発現細胞を単離または濃縮する、方法。
【請求項６０】  Ｄ５ドメイン結合部位を発現する細胞を細胞混合物から単離または濃縮するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項５７に記載の親和性リガンドと該混合物を接触させる工程；
（ｂ）任意のＤ５発現細胞が該リガンドに結合するのを可能にする工程；
（ｃ）該リガンドおよび該結合した細胞から結合していない細胞を取り除く工程；および
（ｄ）該結合した細胞を放出する工程、
を包含し、これにより、該Ｄ５ドメイン結合部位発現細胞を単離または濃縮する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
生化学および医学の分野における本発明は、ヒトキニノゲンのＤ５ドメインの一部を含む新脈管形成阻害ペプチドおよびポリペプチド、ならびに内皮細胞遊走および増殖に関連する疾患の診断および治療におけるこれらの使用に関連する。詳細には、これらのポリペプチドは、癌を有する被験体を処置する際に有用である。
【０００２】
（背景技術の説明）
成体において、新しい血管は、新脈管形成のプロセスを介して形成され、ここで、新しい毛細血管が既存の血管系から出芽する（Ｒｉｓａｕ  Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：６７１−６７４，１９９７）。非脈管形成血管の内皮は、通常静止状態であるが、脈管形成内皮細胞（「ＥＣ」）は、活動的に増殖する。新脈管形成は、（１）脈管形成ＥＣによる下にある基底膜の分解、（２）ＥＣ接着の減少、（３）脈管形成刺激に対する剥離細胞の遊走および増殖、ならびに（４）これらの細胞が新しい血管を形成するように秩序だった再会合、を包含する複雑なプロセスである。成体における新脈管形成は、「病理学的」状態（例えば、創傷治癒、組織虚血または新生物形成に応答した）のみにおいて生じる。
【０００３】
腫瘍における最も徹底的に研究された脈管形成因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である（Ｐｅｐｐｅｒ  ＭＳら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１３（Ｐｔ２）：３１−６７，１９９６）。これらのタンパク質は、しばしば組織低酸素に応答して、新生物細胞またはこれらの間質によって生成され、そして内在性チロシンキナーゼ活性を有する特定の細胞表面レセプターとの相互作用を介して、ＥＣの遊走および増殖を促進する（Ｔｈｏｍａｓ  ＫＡ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：６０３−６０６，１９９６）。新生血管形成および腫瘍の増殖におけるこれらの因子の各々の重要性は、これらの増殖因子またはこれらの細胞表面レセプターを結合するかまたは不活化するかのいずれかの薬剤の使用を介して、動物モデルにおいて実証されている（Ｌｉｎ  Ｐら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆ．９：４９−５８，１９９７；Ｗａｎｇ  Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ３：８８７−８９３，１９９７；Ｓｋｏｂｅ  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ３：１２２２−１２２７，１９９７）。
【０００４】
新脈管形成は、腫瘍環境内のタンパク質分解により、より大きいタンパク質から放出された潜在性ポリペプチドによって、特定の条件下で調節されると考えられる。血漿タンパク質または細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質のタンパク質分解フラグメントは、重要な役割を果たし得ることが明らかになっている（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄら、Ｃｅｌｌ  ８６：３５３−３６４，１９９６）。現在までに、このような活性を有するいくつかのポリペプチドが同定されている：アンギオスタチン、エンドスタチン、ＰＥＸ（マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−２）のＣ末端ヘモペキシンドメイン（Ｂｒｏｏｋｓ  ＰＣら、Ｃｅｌｌ  ９２：３９１−４００，１９９８））、プロラクチンのＮ末端１６ｋＤフラグメント、およびフィブロネクチンの２９Ｄａフラグメント（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ＭＳら、Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−３２８，１９９４；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．２３０：１５０−１５４，１９９６）。インタクトなトロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）ならびにそのプロコラーゲンおよびプロパージン様１型反復の両方に由来するペプチドは、抗脈管形成である（Ｇｏｏｄ  ＤＪら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６６２４−６６２８，１９９０）。前臨床モデルにおいて、腫瘍増殖を阻害するかまたは腫瘍後退および／もしくは休止状態を誘導するいくつかのこれらのフラグメントの能力は、ヒト新生物の治療のための新脈管形成インヒビターの潜在的な使用について熱中させる。
【０００５】
原型インヒビターは、プラスミノーゲンのクリングル１〜４からなり、そしてマウスにおける実験的な腫瘍の増殖を阻害するアンギオスタチンである（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、前出）。アンギオスタチンは、セリンプロテアーゼ、ならびにマトリクスメタロプロテアーゼ７および９ならびにマクロファージメタロエラスターゼによって生成され得る。第２の抗脈管形成ポリペプチド（エンドスタチン）は、基底膜タンパク質（コラーゲンＸＶＩＩＩ）の２０ｋＤａのＣ末端フラグメントである。エンドスタチンはまた、腫瘍増殖を阻害し（Ｆｏｌｋｍａｎ、前出）、そして腫瘍が処置サイクル間に再増殖することが可能である動物において、腫瘍後退を繰り返し誘導するその効力は、この薬剤に対する耐性の発生がありそうにないことを示唆する。エンドスタチンを用いる治療の反復サイクルはまた、長期の腫瘍休止状態を誘導した。第３の抗脈管形成タンパク質フラグメントＰＥＸ（Ｂｒｏｏｋｓら、前出）。インテグリンαｖβ３（これは、脈管形成内皮細胞上で選択的に発現される）とのＭＭＰ−２の会合は、細胞表面コラーゲン分解活性および細胞侵襲性を促進する。ＭＭＰ−２の自己触媒は、ＰＥＸ（これは、非ＲＧＤ依存性機構を介してαｖβ３に結合し続ける）の放出を生じ、これにより、インテグリンに対する結合についてのその親分子と競合し、そして細胞コラーゲン分解活性を損なう。上昇したレベルのＰＥＸが腫瘍組織において生じ、そして組換えＰＥＸは、腫瘍増殖を阻害する（Ｂｒｏｏｋｓら、前出）。
【０００６】
（高分子量キニノゲンの生化学）
キニノゲンの２つの形態（高分子量キニノゲン（ＨＫ、Ｍｒ＝１２０ｋＤａ）（図１）および低分子量キニノゲン（ＬＫ、Ｍｒ＝６８ｋＤａ））が、ヒト血漿において同定されている（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  Ｓら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２９：２５−３６，１９６７）。ＨＫは、９０μｇ／ｍｌの血漿濃度を有するα−グロブリンであり（Ｐｒｏｕｄ  Ｄら、Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  ９５：５６３−５５７４，１９８０）（図１）、そしてＬＫは、２２０μｇ／ｍｌの血漿濃度を有するα−グロブリンである（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｓｔｅｒｌ  Ｗら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０６：１４５−１５２，１９８２）。これらのタンパク質は、単一遺伝子の選択的スプライシングから誘導され（Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０：８６１０−８６１７，１９８５）、そして共通の重（Ｈ）鎖を共有し、これは、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３と呼ばれるドメイン１、ドメイン２、およびドメイン３を含む（Ｃｏｌａｍａｎ  ＲＷら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３８１９−３８４３，１９９７）。しかし、ＬＫは、４ｋＤａの軽（Ｌ）鎖（Ｄ４Ｌ）のみを含むが、ＨＫの約４６ｋＤａのＬ鎖は、ドメイン５およびドメイン６を含む（それぞれＤ５およびＤ６）。
【０００７】
ＨＫの各ドメインは、固有の機能を有する。例えば、Ｄ１はカルシウムを結合し、そしてＤ２はカルパインを阻害する（Ｃｏｌｍａｎら、前出）。ＨＫの細胞結合領域は、Ｄ３およびＤ５内に含まれるが、Ｄ６は、血漿プレカリクレインおよび凝固因子ＸＩを結合する。Ｄ６は、ＨＫの細胞への結合後に遊離したままであり、このことは、Ｄ６が、因子ＸＩまたはカリクレインに対する「獲得（ａｃｑｕｉｒｅｄ）レセプター」として機能し得ることを示す。
【０００８】
インタクトなＨＫにおいて、Ｄ４は、Ｈ鎖およびＬ鎖を連結する；Ｄ４はまた、Ｌｙｓ３６２−Ａｒｇ３６３とＡｒｇ３７１−Ｓｅｒ３７２との間の切断を介して、カリクレインによってＨＫから放出される非ペプチドのブラジキニンを含み、６２ｋＤａのＨ鎖および５６〜６２ｋＤａのＬ鎖（これらは、Ｃｙｓ１０とＣｙｓ５９６との間の鎖内ジスルフィドによって結合される）からなる切断分子を生じる。Ｄ５のＮ末端付近の部位における引き続く切断は、Ｌ鎖のＭｒの約４５ｋＤａまでの減少を生じる（Ｋａｐｌａｎ  ＡＰら、Ｂｌｏｏｄ  ７０：１−１５，１９８７）。放出されたブラジキニンは、強力な血管拡張剤であり、そしてＥＣに対するアゴニストである。ＨＫのカリクレイン媒介切断は、ＥＣ表面において生じ、そして（ａ）血漿カリクレインによって直接的に媒介されるか、または（ｂ）細胞結合ＨＫへのプレカリクレインの結合後によって媒介され得、その後ＥＣシステインプロテアーゼによってカリクレインへ活性化される。従って、ＥＣは、ＨＫａ生成についての重要な部位である。ホルボールミリストイルアセテート（ＰＭＡ）刺激ＥＣは、増加量のＨＫを結合し（Ｃｏｌａｍａｎら、前出）、このことは、「活性化」ＥＣでのこのプロセスの促進を示唆する。ＥＣがＨＫ  ｍＲＮＡおよびタンパク質を生成するという観察は、このプロセスの生理学的重要性をさらに支持する（Ｓｃｈｍａｉｅｒ  ＡＨら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：１６３２７−１６３３３，１９８８）。
【０００９】
ＨＫからのブラジキニンの放出は、残りの２鎖のキニノゲン分子（ＨＫａ）における構造的な再配列およびいくつかの新規の特性の獲得によって達成される。例えば、ＨＫのＨＫａへの切断は、後者が人工的なアニオン表面に結合するのを可能にする（Ｃｏｌｍａｎら、前出）；ＨＫａのＤ５内のＨｉｓ−Ｇｌｙリッチ領域（アミノ酸４２０〜４５８）の残基によって媒介される相互作用（ＤｅＬａ
Ｃａｄｅｎａ  ＲＡら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １：１５１−１６０，１９９２；Ｋｕｎａｐｕｌｉ  ＳＰら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２４８６−２４９２，１９９３）。
【００１０】
さらに、ＨＫではなくＨＫａが、抗接着性であり、ビトロネクチン上での骨肉腫細胞および黒色腫細胞の拡大、ならびにビトロネクチンおよびフィブロネクチン上でのＥＣ、血小板および単核細胞の拡大を阻害する（Ａｓａｋｕｒａ  Ｓら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１６：４６５−４７６，１９９２）。回転式シャドーイング電子顕微鏡によって、ＨＫａの構造的再配列が、互いに対するＨＫａドメインの配向における変化を含むことを実証した。
【００１１】
ＨＫは、薄い鎖によって連結される２つの末梢領域を有する、３つの連結した球状領域の線状配置として存在する（Ｃｏｌｍａｎ  ＲＷら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：１４８１−１４８７、１９９７）。この鎖は、Ｄ１とＤ６との間にジスルフィド架橋と示し得る。なぜなら、この鎖は、続く還元にもはや確認されなかったからである。エピトープ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた研究によって、ＨＫの末端の球状ドメインは、プレカリクレイン結合領域（Ｌ鎖のＤ６内）およびシステインプロテアーゼインヒビター領域（Ｈ鎖のＤ２およびＤ３）を示し得、一方、中央の小節がＤ５内のアニオン性表面結合領域を示すことを、実証した。
【００１２】
カリクレイン媒介切断の後、２つの鎖の分子（ＨＫａ）は、３つの小節領域が三角形の頂点に類似するパターンで再配置するにもかかわらず、３つの小節構造を保持する。この構造において、アニオン性表面結合領域およびプレカリクレイン結合領域は、より密接して並置している。ＨＫ内のＥＣ結合領域がＨ鎖のＤ３内の部位およびＬ鎖のＤ５内の部位にマッピングされ（（Ｒｅｄｄｉｇａｒｉ  ＳＲら、Ｂｌｏｏｄ  ８１：１３０６−１３１１、１９９３；Ｈｅｒｗａｌｄ  Ｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：１４６３４−１４６４２、１９９５；Ｈａｓａｎ  ＡＡＫら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：３１８２２−３１８３０、１９９４；Ｈａｓａｎ  ＡＡＫら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１９：７１７−７２５、１９９５）、そしてこの線状配列内の後者の領域がＨＫａのアニオン性表面結合領域と広範囲に重複するので、ＨＫおよびＨＫａ内の細胞性結合領域の配向は、異ならなければならない。この結論は、ＨＫおよびＨＫａが、おそらくＥＣと別々に相互作用するということを示し、この仮説は、ＨＫではなくＨＫａがＥＣにおける増殖の潜在的なインヒビターおよびアポトーシスの潜在的なインデューサーであることを実証する機能研究によって支持される。
【００１３】
（ＨＫのＥＣとの相互作用）
（Ａ．ＨＫ内の細胞結合領域の同定）
いくつかの報告は、ＨＫがヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）に高い親和異性で結合することを示す（Ｒｅｄｄｉｇａｒｉら、前出；ｖａｎ  Ｉｗａａｒｄｅｎ
Ｆら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：４６９８−４７０３、１９８８；Ｚｉｎｉ  ＪＭら、Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９３６−２９４６、１９９３；Ｈａｓａｎ  ＡＡＫら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：３１３４−３１４３、１９９５）。Ｚｎ２＋の存在は、結合に絶対に必要であるが、Ｃａ２＋は、結合を阻害するかまたは結合に対して影響を与えないかのいずれかである。ＨＫのインターナリゼーションもまた、報告されている（ｖａｎ  Ｉｗａａｒｄｅｎ  Ｆら、Ｂｌｏｏｄ  ７１：１２６８−１２７６、１９８８）。
【００１４】
ＨＫのＥＣへの結合は、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を含む相互作用を介して媒介され、そしていくつかの研究は、Ｄ３内で結合を媒介する特異的な領域の同定（Ｈｅｒｗａｌｄ  Ｈら、前出）、およびＤ５内で結合を媒介する特異的な領域の同定を導いている（Ｈａｓａｎ  ＡＡＫら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、前出）している（Ｄ３およびＤ５のうちの１つは、Ｄ４内のＢＲＡＤＹＫＩＮＩＮと重複する）。これらの領域は、ＨＵＶＥＣに対する結合について、インタクトな標識されたＨＫと競合する、対応する配列を有する合成ペプチドの能力によって同定された。
【００１５】
ＨＫと対照的に、ＨＫａのＥＣに対する結合に関する情報は、ほとんど入手不可能である。１つの研究において、カリクレインの量を増大させることによるビオチン化ＨＫの切断は、切断されたリガンドの結合の漸減を導く。対照的に、ＨＫａが、ＥＣに対する放射性標識されたＨＫの結合の阻害において、未標識ＨＫよりも強力であった（ＨＫａについてのＩＣ５０＝７３ｎＭ  対  ＨＫについてのＩＣ５０＝３３５ｎＭ）ことが、他で報告されている（Ｒｅｄｄｉｇａｒｉら、前出）。これらのＩＣ５０値は、ＥＣに対するＨＫの結合について報告されたＫｄ（３０〜４０ｎＭ）と照合することが困難であるが、それにもかかわらず、細胞とのそれらの相互作用におけるＨＫとＨＫａとの間の差異が示唆されている。
【００１６】
（Ｂ．内皮細胞のＨＫ／ＨＫａレセプター）
インビトロにおけるＨＫａのＥＣ増殖阻害は、ＨＫ（これは、ＥＣに結合するが、それにもかかわらず、抗増殖効果を欠く）のようにＨＫａの特有の特性である。さらに、ＨＫとＨＫａによって示された、ＥＣに対する結合における観察された差異は、機能における潜在的な差異を示唆する。ＨＫａは、いくつかの機構によってＥＣ増殖を阻害し得る。最初に、ＨＫａは、インテグリンとの直接的な相互作用を介してそれらのマトリックスからのＥＣの離脱を誘導し得、それによって、インテグリン媒介シグナル伝達、ＭＡＰキナーゼリン酸化、アポトーシスの誘導の妨害を誘導する。しかし、単鎖ＨＫが単球上のＭａｃ−１（αＭβ２またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）に結合するという１つの報告以外には、キニノゲンとインテグリンとの相互作用に関する証拠はない。
【００１７】
ＥＣに対するＨＫａの結合はまた、β３インテグリン鎖に対するブロッキング抗体によって阻害されず、このことは、ＨＫａがαＶβ３（新脈管形成に重要な役割を果たすインテグリン）と相互作用しないことを示唆する（Ｃｏｌｍａｎ  ＲＷら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：１４８１−１４８７、１９９７）。ＨＫａは、特異的様式かまたは非特異的様式のいずれかで、ＥＣＭタンパク質と相互作用し得、それによって、ＥＣインテグリンレセプターとのその相互作用を回避する。しかし、この仮説を支持するデータは存在しない。ＨＫａがフィブロネクチン、ゼラチン、およびＭａｔｒｉｇｅｌ上にプレートされたＨＵＶＥＣの増殖を阻害したという事実は、マトリックス正体に非依存性である影響を示唆した。ＨＫａは、細胞性グリコサミノグリカン（例えば、硫酸ヘパラン）または特異的な増殖因子レセプターに対する増殖因子の結合を阻害し得る。しかし、この説明は、見込みがない。なぜなら、増殖因子の排除は、６時間内（ＨＫａがアポトーシス変化を誘導する時間枠）でＥＣアポトーシスを導かないからである。
【００１８】
ＭｃＣｒａｅのグループは、ヒトＨＫａの切断形態がインビボにおいてｂＦＧＦ刺激新脈管形成を阻害したことを、最近報告した（Ｚｈａｎｇ  Ｊ−Ｃら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１４：２５８９−６００，２０００）。インビトロにおいて、ＨＫａは、ＥＣアポトーシスを誘導する、ＨＵＶＥＣおよびヒト皮膚微小血管ＥＣ（ＨＤＭＶＥＣ）の増殖を強力に阻害した。低いμＭ〜ｎＭの濃度でＥＣ増殖を阻害したＨＫａのＤ３およびＤ５内の結合領域に対応する配列を有するいくつかのペプチドが、同定された。これらの研究において使用した重複するペプチドの配列比較によって、この活性を媒介する４〜８アミノ酸のペプチドの同定を導いた。抗増殖効果と比較して、ＨＫａの抗接着効果は、それほど重要ではないようである。なぜなら、ＥＣ接着は、１００ｎＭより高い濃度のＨＫａにおいてのみ、わずかに阻害され、一方、抗増殖効果は、約１ｎＭの低い濃度において観察されたからである。
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、以下の特性のうちの１つ以上を有する、ヒトキニノゲンのＤ５ドメインに対応するペプチド、または、その生物学的に活性なペプチドフラグメント、相同体もしくは他の機能的誘導体に関する：
（ａ）少なくとも１μＭのＩＣ５０において新脈管形成を阻害する；
（ｂ）活性化内皮細胞に対する直接的な結合アッセイにおいてか、または精製Ｄ５レセプターに対する競合結合アッセイにおいて測定されるように、約１μＭ以下のＫｄによって特徴付けられる親和性で、内皮細胞のＤ５結合部位に結合する；
（ｃ）内皮細胞におけるアポトーシスの誘導を導く１つ以上のシグナル伝達経路を活性化する；または
（ｄ）内皮細胞生存性の維持に必要とされるシグナル伝達経路を阻害する。
【００２０】
Ｄ５ドメインは、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
別の実施形態において、上記のポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、約８と約３２との間または約１６と約３２との間のアミノ酸を有し、これらのアミノ酸配列は、以下：
（ａ）ＧＨＫＦＫＬＤＤＤＬＥＨＱＧＧＨ（配列番号４）；
（ｂ）ＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮ（配列番号５）；
（ｃ）ＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨＮＧＷＫＴ（配列番号６）；および
（ｄ）ＨＫＮＫＧＫＫＮ（配列番号７）
からなる群より選択される配列の１つ以上の反復を含むか、あるいはこれらからなる。
【００２２】
上記の別のポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、約４と約１６との間のアミノ酸を有し、かつ、配列ＨＫＸＫ（配列番号８）（ここで、Ｘは中性アミノ酸または芳香族アミノ酸である）の１つ以上の反復を含む。
【００２３】
本発明はまた、Ｄ５ドメインポリペプチド、またはＤ５ポリペプチドのペプチドフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体の全てもしくは一部を含む第１の融合パートナーを有するＤ５融合ポリペプチドを提供し、この融合ポリペプチドは、（ｉ）第２のポリペプチドに直接融合されるか、または（ｉｉ）必要に応じて、第２のポリペプチドに融合されたリンカーペプチド配列に融合され、ここで、融合ポリペプチドは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
（ａ）少なくとも１μＭのＩＣ５０で新脈管形成を阻害する；
（ｂ）活性化内皮細胞に対する直接的な結合アッセイにおいてか、または精製Ｄ５レセプターに対する競合結合アッセイにおいて測定されるように、約１μＭ以下のＫｄによって特徴付けられる親和性で、内皮細胞のＤ５結合部位に結合する；
（ｃ）内皮細胞におけるアポトーシスの誘導を導く１つ以上のシグナル伝達経路を活性化する；または
（ｄ）内皮細胞生存性の維持に必要とされるシグナル伝達経路を阻害する。
【００２４】
Ｄ５融合ポリペプチドは、第２のポリペプチドに融合された、上記のポリペプチド、ペプチドフラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体のうちのいずれかを含み得る。好ましくは、結合パートナー分子は、Ｄ５ポリペプチド、フラグメント、ホモログ、または誘導体単独と比較した場合に、融合ポリペプチドの発現、安定性または生物学的活性もしくは薬理学的活性を増大する、タンパク質またはペプチドである。好ましい結合パートナー分子は、チオレドキシン、カルシウム結合タンパク質、マルトース結合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。
【００２５】
上記の融合ポリペプチドにおいて、第２のポリペプチドは、Ｉｇ重鎖定常領域の１つ以上のドメインであり、好ましくはヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有する。
【００２６】
上記の融合ポリペプチドは、第１の融合パートナーのモノマーの、２以上の反復の末端間を連結した（直接的にか、またはモノマー反復間に存在するリンカー配列を用いて）線状マルチマーを含み得る。この例は、上記の融合ポリペプチドの縦列に連結した二量体融合ポリペプチドまたは三量体融合ポリペプチドである。
【００２７】
上記の様式中のリンカーは、好ましくは、腫瘍付近に存在し、かつ活性である酵素か、または腫瘍細胞中に存在し、かつ活性である酵素によって切断可能であり、その結果、この第１の融合パートナーは、酵素がこの融合ポリペプチドに対して作用した場合、融合ポリペプチドから放出される。好ましい酵素は、マトリックスメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼ、カテプシン、プラスミンまたはトロンビンである、これらは、腫瘍環境においてインビボ（またはインサイチュ）でＤ５を放出するように作用する。好ましいリンカーは、配列ＶＰＲＧＳＤ（配列番号９）またはＤＤＫＤＷＨ（配列番号１０）を有するペプチドである。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、上記のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体のいずれかをコードする、単離された核酸分子に関する。好ましい核酸は、配列番号３の配列を有する。別の好ましい核酸分子は、上記の融合ポリペプチドをコードする。例えば、この核酸分子は、以下を含む：（ａ）配列番号２のＤ５ドメインペプチドの全てまたは一部である第１のポリペプチドをコードするか、またはそのホモログもしくは他の機能的誘導体をコードする、第１の核酸配列；
（ｂ）必要に応じて、第１の核酸配列とインフレームで融合される、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列；および
（ｃ）上記第１の核酸配列またはリンカー核酸配列にインフレームで連結され、第２のポリペプチドをコードする、第２の核酸配列。
【００２９】
ストリンジェント条件下で上記の核酸分子のいずれかとハイブリダイズする単離された核酸分子もまた、含まれる。
【００３０】
上記のポリペプチドまたは生物学的に活性なフラグメント、ホモログまたは他の機能的誘導体は、上記の核酸分子の組換え発現によって生成され得る。
【００３１】
以下：
（ａ）プロモーター、および
（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞における核酸の発現を調節するさらなる調節配列、
に作動可能に連結された、上記のポリペプチドまたは機能的誘導体のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターもまた、提供される。
【００３２】
発現ベクターは、好ましくは、（ａ）プロモーター、および（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞における核酸の発現を調節するさらなる調節配列、に作動可能に連結された、上記の核酸分子を含む。
【００３３】
好ましい発現ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである。
【００３４】
上記の核酸分子または発現ベクターのいずれかで形質転換またはトランスフェクトされた細胞もまた、提供される。好ましい細胞は、哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【００３５】
哺乳動物Ｄ５ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコードする外因性核酸分子でトランスフェクトした、単離された哺乳動物腫瘍細胞もまた提供する。その結果、このタンパク質、フラグメント、ホモログもしくは誘導体がこの腫瘍細胞により発現されるか、またはこの腫瘍細胞から分泌され、この腫瘍細胞が内皮細胞と接触した場合、この腫瘍細胞または分泌産物は、
（ａ）内皮細胞に結合するか；または
（ｂ）内皮細胞のアポトーシスの誘導を導く１以上のシグナル伝達経路を活性化するか；または
（ｃ）内皮細胞生存性の維持に必要なシグナル伝達経路を阻害する。
【００３６】
本発明は、ヒトキニノゲンＤ５ドメインポリペプチドのエピトープ、好ましくは、配列番号２を有するポリペプチドの直鎖状エピトープまたは立体エピトープに特異的な抗体に関する。この抗体は、以下からなる群より選択されるペプチドに存在するエピトープに特異的であり得る：
【００３７】
【化１】
2004515222.tif 000001
好ましい抗体は、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である。前述の抗体は、好ましくは、腫瘍を有する被験体に投与する際に、腫瘍増殖または新脈管形成を阻害するものである。
【００３８】
好ましくは、以下を含む、注射に適切な形態で脈管形成性内皮細胞標的化薬学的組成物がまた本明細書中で提供される：（ａ）上記のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体；および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア。
【００３９】
別の実施形態において、脈管形成性内皮細胞標的化治療組成物は、以下を含む：（ａ）治療的に活性な部分（例えば、放射性核種）に直接的または間接的に結合する、いずれかの請求項に記載の上記ポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体の有効量；および（ｂ）治療的に受容可能なキャリア。放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｂｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、または１０９Ｐｄであり得る。
【００４０】
本発明は、内皮細胞の遊走、増殖、侵襲、または新脈管形成を阻害するか、または内皮細胞アポトーシスを誘導するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：所望でない遊走、増殖、侵襲または脈管形成に関与する内皮細胞と、上記のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体の有効量とを接触させる工程。
【００４１】
所望でない内皮細胞の遊走、増殖、侵襲もしくは新脈管形成（例えば、腫瘍増殖、腫瘍侵襲または腫瘍転移）と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法もまた提供し、この方法は、上記薬学的組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する。
【００４２】
別の実施形態は、脈管形成性内皮細胞を標的化するために診断的に有用な組成物である。この組成物は、以下を含む：（ａ）診断のために標識された上記のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体；および（ｂ）診断的に受容可能なキャリア。検出可能な標識としては、放射性核種、ＰＥＴ画像化剤、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、蛍光原（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）、発色団、色素原、リン光剤（ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）または生体発光剤（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）が挙げられる。好ましい診断用放射性核種は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒおよび２０１Ｔｌである。有用な蛍光剤または蛍光原は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロードルグリーンまたはテキサスレッドである。
【００４３】
上記の診断組成物は、以下における脈管形成性内皮細胞の存在を検出するための方法において有用である：（ｉ）組織、（ｉｉ）器官または（ｉｉｉ）生物学的サンプル。この組織、器官またはサンプルは、脈管形成するように活性化された内皮細胞を有すると疑われる。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）上記組織、器官またはサンプルと、診断組成物とを接触させる工程；および（ｂ）上記組織、器官またはサンプルと関連する標識の存在を検出する工程。好ましくは、この接触させる工程は、インビボで行われる。接触させる工程および検出する工程の両方は、インビボで行われ得る。本発明はまた、脈管形成性内皮細胞またはＤ５ドメイン結合部位に結合するに有用な親和性リガンドに関する。これらのリガンドは、固体支持体またはキャリアに固定化された上記ポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体を含む。このリガンドは、複雑な混合物からＤ５ドメイン結合分子を単離するための方法で使用される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この混合物と、親和性リガンドとを接触させる工程；（ｂ）この結合分子のいずれかをこのリガンドに結合させる工程；（ｃ）結合していない材料をリガンドから除去する工程；および（ｄ）結合したＤ５ドメイン結合材料を溶出する工程。
【００４４】
細胞混合物からＤ５ドメイン結合部位を発現する細胞を単離または富化するための方法もまた提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この細胞混合物と、親和性リガンドまたは上記のポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体とを接触させる工程；（ｂ）任意の結合部位発現細胞をこのリガンドまたはポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体に結合させる工程；（ｃ）リガンド、ポリペプチド、融合ポリペプチド、フラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体に結合した細胞を、これらに結合していない細胞から分離する工程；および（ｄ）結合した細胞を取り出し、それにより、Ｄ５ドメイン結合部位発現細胞を単離または富化する工程。
【００４５】
Ｄ５ドメイン結合部位を発現する細胞を細胞混合物から単離または富化するための方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この細胞混合物と、請求項５７に記載の親和性リガンドとを接触させる工程；（ｂ）任意のＤ５発現細胞をこのリガンドと結合させる工程；（ｃ）結合していない細胞を、リガンドおよび結合した細胞から除去する工程；ならびに（ｄ）この結合した細胞を遊離する工程。
【００４６】
（好適な実施形態の説明）
（一般的な参考文献）
他に示されない限り、本発明の多くの局面の実施は、分子生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の技術を用いる。これらの技術は、当業者の技術範囲内である。このような技術は、例えば、以下の科学文献により詳細に記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｖｏｌｕｍｅ；Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ，ＢＭ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｄａｒｎｅｌｌ，ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８６）；Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｈａｒｔｌｏｗ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
１９９１。タンパク質の構造および機能は、以下において議論されている：Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８，ａｎｄ  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＴＥ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３。
【００４７】
（タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド）
成熟形態のＨＫの全配列（配列番号１）は、以下に示される：
【００４８】
【化２】
2004515222.tif 000002
本発明者らは、ＨＫのＤ５ドメイン（成熟ＨＫ配列のアミノ酸残基３８４〜５０８；上記で下線を付した）に対応するポリペプチドが、新脈管形成のインヒビターとして、および細胞増殖を含む種々のＥＣ機能のインヒビターとして有用であることを発見した。
【００４９】
従って、１２５残基のＤ５ドメインは、配列番号２の配列を有する：
【００５０】
【化３】
2004515222.tif 000003
Ｔａｋａｇａｋｉ，Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８６０１−８６０９（１９８５）は、成熟形態のＨＫをコードするｃＤＮＡクローンを開示した。この分子のＤ５コード領域は、配列番号３である：
【００５１】
【化４】
2004515222.tif 000004
ネイティブなＤ５ドメインポリペプチド自体に加えて、フラグメント、改変体、融合ポリペプチド、またはＤ５の他の機能的誘導体（化学的誘導体およびペプチド模倣物を含む）が同じ目的で用いられる。簡潔にするために、この群全体の化合物を、本明細書中では「Ｄ５ポリペプチド」とまとめてよぶ。
【００５２】
Ｄ５ポリペプチドは、説明上、結合部位またはレセプターでＥＣに結合し、この結合部位またはレセプターは、「Ｄ５結合部位」または「Ｄ５ＢＳ」とよばれる。ＥＣ上のＤ５ＢＳへのＤ５ポリペプチドの結合は、
（１）ＥＣアポトーシスの誘導を導く１以上のシグナル伝達経路を活性化するか、または
（２）ＥＣ生存性の維持に必要なシグナル伝達経路を阻害する。
【００５３】
これらの経路の活性化または阻害は、直接的に（Ｄ５ＢＳへの結合の結果として）または間接的（マトリクス構築物からのＥＣの置換に起因した結果）であり得る。いずれにせよ、正味の効果は、ＥＣ生存性の喪失である。
【００５４】
Ｚｈａｎｇら（前出）に開示されたペプチドはまた、ペプチド模倣物設計についての足場および構造ベースの薬物設計、ならびに経口で活性な抗脈管形成性分子の開発（これらは、治療的抗脈管形成効果を達成する新規なアプローチを提供し得る）を提供する。従って、本発明の１つの目的は、ペプチドベースの薬物またはペプチド模倣物ベースの薬物としてのＨＫ由来ペプチドの開発である。
【００５５】
（Ｄ５の機能的誘導体）
「機能的誘導体」は、好ましくは、ＥＣ上のＤ５ＢＳに結合し、そしてＥＣのアポトーシスを誘導する生化学的プロセスを活性化するか、または本発明に従うその利用を可能にするＥＣの生存率の維持に必要なプロセスを阻害する、測定可能なＤ５活性を保持する。「機能的誘導体」は、この用語が本明細書中で接続的または代替的に使用されるか否かにかかわらず、本明細書中で定義されるＤ５の「変異体」、「改変体」、「フラグメント」、「アナログ」または「化学的誘導体」を包含する。
【００５６】
Ｄ５の「フラグメント」とは、分子の任意のサブセット、すなわちより短いペプチドをいう。
【００５７】
Ｄ５の「改変体」は、１以上のアミノ酸残基が置換されている（置換改変体）あるいは１もしくはいくつかの残基が欠失されている（欠失改変体）かまたは付加されている（付加改変体）、全長タンパク質またはそのフラグメントのいずれかに実質的に同一な分子をいう。Ｄ５の「フラグメント」は、分子の任意のサブセット、すなわち全長タンパク質のより短いポリペプチドをいう。当該分野で周知の多くのプロセス（化学および組換え）を使用して、単離されたＤＮＡ配列のフラグメント、変異体および改変体を生成し得る。Ｄ５タンパク質をコードする核酸の小さい下位領域またはフラグメント、例えば、１〜３０塩基長は、標準的な化学的合成によって調製され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプライマーは、より大きな合成フラグメントの生成において使用される。
【００５８】
用語「変異体」は、「改変体」と相互変換可能に使用される。
【００５９】
Ｄ５の「アナログ」は、分子全体またはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似した、非天然の分子をいう。
【００６０】
Ｄ５の「化学的誘導体」は、通常はそのペプチドの一部ではないさらなる化学的部分を含む。このペプチドの共有結合的改変は、本発明の範囲内に含まれる。このような改変は、このペプチドの標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、この分子に導入され得る。
【００６１】
好ましい機能的誘導体は、融合ポリペプチド、Ｄ５を含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントである。これらは、以下の別々の節に記載される。
【００６２】
Ｄ５の機能的「ホモログ」は、Ｄ５について上で記載される生化学的活性および生物学的活性を保有しなければならない。この機能的特徴の観点において、他種由来の、Ｄ５に対して相同なタンパク質（まだ発見されていないタンパク質を含む）の使用は、これらのタンパク質が配列類似性ならびに引用された生化学的活性および生物学的活性を有する場合に、本発明の範囲内である。
【００６３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を、最適の比較目的のために整列させる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために第一および第二のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列が、比較目的のために無視され得る）。アラインメントの好ましい方法において、Ｃｙｓ残基が整列される。
【００６４】
好ましい実施形態において、比較される配列の長さは、参照配列（本明細書の場合はヒトＤ５タンパク質（配列番号２））の長さの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。次いで、対応するアミノ酸位置（またはヌクレオチド位置）でのアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が、比較される。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）によって占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。
【００６５】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリスムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して決定される。なお別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）を使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して、決定される。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＯＩＳ、４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定される。
【００６６】
本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、公開データベースに対する検索を実行するための「問い合わせ配列」としてさらに使用されて、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら(１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行され、ヒトまたはマウスのＤ５核酸分子に相同なヌクレオチド配列を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行され、本発明のヒトまたはマウスのＤ５タンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を獲得し得る。比較目的のためのギャップ付アラインメントを獲得するために、Ｇａｐｐｅｄ
ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００６７】
従って、上記のＤ５タンパク質のホモログは、（ａ）参照Ｄ５の機能的活性および（ｂ）上で決定される場合に、「ネイティブの」Ｄ５タンパク質（例えば、配列番号２）に対する、（アミノ酸レベルで）少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の配列類似性を有するとして、特徴づけられる。
【００６８】
Ｄ５の開示された配列に基づいたＤＮＡプローブを使用して、このようなタンパク質を獲特し、そして発現させることは、当該分野の範囲内である。次いで、タンパク質の生化学的活性および生物学的活性を、本明細書中に開示されるような当該分野で認識された方法を使用して、容易に試験し得る。生物学的アッセイは、ホモログが、「機能的」ホモログとして適当であるために必要な活性を有するか否かを示す。
【００６９】
Ｄ５改変体の好ましい群は、少なくとも１つのアミノ酸残基、そして好ましくは１つのみのアミノ酸残基が異なる残基によって置換されたものである。タンパク質化学およびタンパク質構造の詳細な記載については、本明細書中で参考として援用される、Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８３を参照のこと。本発明のＤ５ポリペプチド分子中に作製され得る置換の型は、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度の分析（例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚら（前出）の表１〜２およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（前出）の図３〜９に示されるもの）に基づき得る。このような分析に基づいて、保存的置換は、以下の群のうち１つの中での交換として、本明細書中で定義される：
少なくとも１つのアミノ酸残基、そして好ましくは１つのみのアミノ酸残基が、除去され、かつその場所で異なる残基が挿入されているＤ５ペプチド改変体がまた、本発明に含まれる。タンパク質化学およびタンパク質構造の詳細な記載については、本明細書中で参考として援用される、Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８４を参照のこと。本発明のペプチド分子中に作製され得る置換の型は、保存的置換であり、そして以下の群の１つの中での交換として、本明細書中で定義される：
１．小さい脂肪族の、非極性または僅かに極性の残基：例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ；
２．極性の、負に荷電した残基およびそれらのアミド：例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の、正に荷電した残基：例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
Ｐｒｏは、その異常な構造に起因して、鎖を密に制約する。機能的特性における実質的な変化は、例えば、（ａ）置換領域のペプチド骨格の構造（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性あるいは（ｃ）側鎖の大きさを維持することに対するその影響が有意に異なる上記の群（または上に示されていない２つの他のアミノ酸群）の内部ではなく間の、あまり保存的でない置換を選択することによって作製される。本発明に従うほとんどの置換は、ペプチド分子の特徴に極端な変化を生成しない置換である。そうする前に置換の正確な影響を予測することが困難な場合であっても、当業者は、この影響が、慣用的なスクリーニングアッセイ、好ましくは本明細書中に記載される生物学的アッセイおよび生化学的アッセイによって評価され得ることを理解する。酸化還元安定性もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質溶解性分解に対する感受性またはキャリアと凝集する傾向もしくはマルチマーへ凝集する傾向を含むペプチドの特性の改変は、当業者に周知の方法によってアッセイされる。
【００７０】
好ましい改変体は、安定性の増大した改変体である。これらの変化は、ＮＭＲおよび分子の動力学的分析に基づき、ここで、Ｄ５の活性部位によって規定される領域を試験する。これらの構造における動きのための潜在能力は、その分子の硬さおよび生物学的活性に対する、特定の部位での動きの抑制の付与と共に考慮される。タンパク質操作の従来のアプローチが適用される。１つの実施形態において、安定性は、有利な位置へ１以上のＣｙｓ残基を導入することによって増大され、ここで、２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド結合の形成が、安定性を増大させる。別のアプローチは、ポリペプチドの生物学的活性を妨げない部位（例えば、Ｎ末端およびＣ末端）での、αヘリックスを形成する残基の導入に基づく。これらのヘリックスは、荷電表面および疎水性表面を有し、このポリペプチドの高度に荷電した性質に起因して、ヘリックス中の疎水性残基は、ポリペプチドをさらに安定化するヘリックス−ヘリックス相互作用によって、内部に入る。
【００７１】
（Ｄ５の化学的誘導体）
Ｄ５の「化学的誘導体」は、通常はそのペプチドの一部ではない、さらなる化学的部分を含む。このペプチドの共有結合的改変は、本発明の範囲内に含まれる。このような改変は、このペプチドの標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、この分子に導入され得る。
【００７２】
以下で考察されるキャップされたポリペプチドは、「天然の」キャップなしのポリペプチドの好ましい化学的誘導体の例である。本発明の置換改変体または付加改変体の組み合わせのいずれかは、本明細書中に開示される任意のキャップ基でキャップされ得る。
【００７３】
このポリペプチドの化学的誘導体の他の例は、以下である。
【００７４】
リジニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物を用いて誘導体化される。環状カルボン酸無水物を用いた誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする影響を有する。αアミノ含有残基を誘導体化するために適切な他の試薬としては、イミドエステル（例えば、メチルピコリニミデート（ｐｉｃｏｌｉｎｉｍｉｄａｔｅ））；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼ触媒されたグリオキシル酸との反応物が挙げられる。
【００７５】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド））との反応によって、選択的に改変され得る。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニアとの反応によって、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換され得る。
【００７６】
他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジンのアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出、７９−８６頁）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００７７】
（マルチマーペプチド）
本発明はまた、Ｄ５由来の配列またはその改変体が、介在するスペーサーまたはリンカーありまたはなしで約２〜約１００回繰り返される、より長いペプチドも含む。ペプチドのマルチマーは、この節においてＤ５と記号的に言及され、以下の式：
（Ｄ５−Ｘｍ）ｎ−Ｄ５
によって示され、ここで、ｍ＝０または１、ｎ＝１〜１００である。Ｘは、スペーサー基であり、１〜２０個のグリシン残基または化学的架橋剤からなる。
【００７８】
このようなマルチマーが、本明細書中に記載の任意のペプチド改変体から構築され得ることが理解される。さらに、ペプチドマルチマーは、ペプチドモノマーおよびその開示された置換改変体の異なる組み合わせを含み得る。このようなオリゴマーペプチドまたはマルチマーペプチドは、化学的合成または本明細書中で考察されるような組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。化学的に作製される場合、オリゴマーは、好ましくは、塩基性ポリペプチド配列の２〜８個の反復を有する。組換え的に作製される場合、マルチマーは、発現系が許容する限り多くの反復（例えば、約２〜約１００個の反復）を有し得る。
【００７９】
Ｄ５配列のマルチマーは、別のポリペプチドとさらに融合され、Ｄ５配列の単一反復よりも多くの反復を含む融合ポリペプチドを生じ得る。
【００８０】
（キャップされたポリペプチド）
任意のＤ５ポリペプチドは、そのアミノ末端およびカルボキシル末端で、好ましくは、それぞれ、アミノ末端Ｎ（「Ａｃ」）およびアミド（Ｃ末端カルボキシル基に結合した−ＮＨ２（「Ａｍ」））に結合したアセチルを用いて、ブロックまたはキャップされ得る。Ｎ末端キャップ官能基は、好ましくは、末端アミノ官能基に連結され、そして以下からなる群より選択され得る：
ホルミル；１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル（例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル）；１〜１０個の炭素原子を有するアルケノイル（例えば、ｈｅｘ−３−エノイル）；１〜１０個の炭素原子を有するアルキノイル（例えば、ｈｅｘ−５−イノイル）；アロイル（例えば、ベンゾイルまたは１−ナフトイル）；ヘテロアロイル（例えば、３−ピロイルまたは４−キノロイル）；アルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル）；アリーススルホニル（例えば、ベンゼンスルホニルまたはスルファニリル）；ヘテロアリールスルホニル（例えば、ピリジン−４−スルホニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルカノイル（例えば、４−アミノブチリル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケノイル（例えば、６−ヒドロキシ−ｈｅｘ−３−エノイル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキノイル（例えば、３−ヒドロキシ−ｈｅｘ−５−イノイル）；
置換アロイル（例えば、４−クロロベンゾイルまたは８−ヒドロキシ−ナフト−２−オイル）；
置換へテロアロイル（例えば、２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−メチル−キナゾリン−６−オイル）；
置換アルキルスルホニル（例えば、２−アミノエタンスルホニル）；
置換アリールスルホニル（例えば、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル）；
置換へテロアリールスルホニル（例えば、１−メトキシ−６−イソキノリンスルホニル；カルバモイルまたはチオカルバモイル；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）、ここで、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールまたは置換へテロアリールである；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）、ここで、Ｒ’は、全て上に定義されたように、アルカノイル、アルケノイル、アルキノイル、アロイル、ヘテロアロイル、置換アルカノイル、置換アルケノイル、置換アルキノイル、置換アロイル、または置換ヘテロアロイルである。
【００８１】
Ｃ末端キャップ官能基は、末端カルボキシルに結合したアミドまたは末端カルボキシルに結合したエステルのいずれかであり得る。アミド結合を提供するキャップ官能基は、ＮＲ１Ｒ２と称され、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、以下の群から引き出され得る：
水素；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルケニル（例えば、ｐｒｏｐ−２−エニル）；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキニル（例えば、ｐｒｏｐ−２−イニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキル（例えば、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、ハロゲノアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルカノイルアルキル、カルボキシアルキル、カルバモイルアルキル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケニル（例えば、ヒドロキシアルケニル、アルコキシアルケニル、メルカプトアルケニル、アルキルチオアルケニル、ハロゲノアルケニル、シアノアルケニル、アミノアルケニル、アルキルアミノアルケニル、ジアルキルアミノアルケニル、アルカノイルアルケニル、カルボキシアルケニル、カルバモイルアルケニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキニル（例えば、ヒドロキシアルキニル、アルコキシアルキニル、メルカプトアルキニル、アルキルチオアルキニル、ハロゲノアルキニル、シアノアルキニル、アミノアルキニル、アルキルアミノアルキニル、ジアルキルアミノアルキニル、アルカノイルアルキニル、カルボキシアルキニル、カルバモイルアルキニル）；
１０個までの炭素原子を有するアロイルアルキル（例えば、フェナシルまたは２−ベンゾイルエチル）；
アリール（例えば、フェニルまたは１−ナフチル）；
ヘテロアリール（例えば、４−キノリル）；
１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル（例えば、アセチルまたはブチリル）；
アロイル（例えば、ベンゾイル）；
ヘテロアロイル（例えば、３−キノロイル）；
ＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’’、ここで、Ｒ’およびＲ’’は、独立して水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アロイル、スルホニル、スルフィニル、またはＳＯ２−Ｒ’’’もしくはＳＯ−Ｒ’’’、ここで、Ｒ’’’は、置換または非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニルまたはアルキルニルである。
【００８２】
（ペプチド模倣物）
この点に関して有用な他のクラスの化合物は、Ｄ５ポリペプチドとＤ５ＢＳとの間の相互作用に影響する低分子量ペプチド模倣化合物である。このようなペプチド模倣物は、遊離Ｄ５またはＤ５ＢＳに結合したＤ５のいずれかの構造に由来し得る。
【００８３】
Ｄ５のペプチド模倣物は、Ｄ５ポリペプチドの生物学的効果を模倣し、そしてＤ５ポリペプチドの立体化学的特性を有する非天然のペプチドまたは非ペプチド剤であり得、その結果、これは、このペプチドの結合活性または生物学的活性を有する。従って、本発明は、ペプチド模倣化合物が別のペプチドと結合される化合物を含む。
【００８４】
ペプチド模倣剤は、Ｄ５の結合エレメントの立体空間的特性を再現する非天然のペプチドまたは非ペプチド剤であり得、その結果、これは、Ｄ５の結合活性または生物学的活性を有する。Ｄ５に対応する直線形ペプチド同様に、ペプチド模倣物は、（Ｄ５ＢＳと相互作用する）結合表面および非結合表面を有する。また、Ｄ５の直線形ペプチド同様に、ペプチド模倣物の非結合表面は、このペプチド模倣物の結合表面を改変することなく、種々の治療部分によって改変され得る官能基を含む。ペプチド模倣物の好ましい実施形態は、この分子の非結合表面にアニリンを含む。アニリンのＮＨ２基は、約４．５のｐＫａを有し、従って、このペプチド模倣物の結合表面上の任意のＮＨ２官能基を改変することなく、任意のＮＨ２選択的試薬によって改変され得る。他のペプチド模倣物は、その結合表面上にいずれのＮＨ２官能基をも有さず、従って、ｐＫａにかかわらず、任意のＮＨ２は、結合体化のための部位として非結合表面上に提示され得る。他の改変可能な官能基に加えて、−ＳＨおよび−ＣＯＯＨのような官能基は、結合体化の部位として、ペプチド模倣物の非結合表面に取り込まれ得る。治療的部分もまた、ペプチド模倣物の合成の間に直接取り込まれ得、この分子の非結合表面上に優先的に提示される。
【００８５】
本発明はまた、部分的ペプチド特徴を保持する化合物を含む。例えば、本発明のペプチド内の、任意のタンパク質分解的に不安定な結合は、非ペプチドエレメント（例えば、アイソスター（特定部位でのＮ−メチル化；Ｄ−アミノ酸））または還元されたペプチド結合によって選択的に置換されるが、この分子の残りは、ペプチドの性質を保持する。
【００８６】
ペプチド模倣化合物、いずれかのアゴニスト、基質またはインヒビターは、多くの生物活性ペプチド（例えば、オピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼなど）について記載されている。ペプチド模倣化合物を設計および調製するための方法は、当該分野で公知である（その全体が参考として本明細書中で援用される、Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３−１０８２（１９９３）；Ｗｉｌｅｙ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７−３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３：９１−１４１（１９９５）；Ｇｉａｎｎｉｓら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１−７８（１９９７））。これらの方法は、環状ペプチドの少なくとも結合能力および特異性を保有し、そして好ましくは、生物学的活性をも保有するペプチド模倣物を作製するために使用される。当業者に利用可能なペプチド化学および一般有機化学の知識は、本発明の開示を考慮して、このような化合物を設計および合成するために十分である。
【００８７】
例えば、このようなペプチド模倣物は、遊離かまたはＤ５ＢＳとの複合体において結合したかのいずれかである本発明のペプチドの、結晶学的に得られた３次元構造の調査によって同定され得る。あるいは、Ｄ５ＢＳに結合する本発明のペプチドの構造は、核磁気共鳴分光法を使用することによって獲得され得る。ペプチドのその結合パートナーとの相互作用の立体化学についてのより十分な知識は、このようなペプチド模倣剤の合理的な設計を可能にする。
【００８８】
（脈管形成を阻害するＤ５融合ポリペプチド）
Ｄ５の融合ポリペプチドは、調製され、そして抗脈管形成活性について試験されてきた。チオレドキシン、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合物を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて調製し、そして発現させた。
【００８９】
少量の各ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体画分から精製され得る可溶性の活性形態で発現される。
【００９０】
本発明者らは、封入体から融合ポリペプチドを抽出および再折り畳みするための高収率の方法を開発し、従って、この方法を、治療的使用のためにＤ５融合ポリペプチドを調製するために有用にした。
【００９１】
０．６ＯＤ単位／ｍＬの濃度まで増殖した１リットルのＥ．ｃｏｌｉ培養物は、５０〜１００ｍｇの範囲の活性な再折り畳みされたポリペプチドである。細菌は、遠心分離によってペレットに沈殿され、そしてこのペレットを、細胞膜を破壊する超音波処理の前にリゾチームを使用して溶解させた。封入体を、溶解物から精製し、そして６Ｍ  グアニジン  ＨＣｌ含有のＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の２０ｍＭ中で抽出する。抽出されたポリペプチドを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）へのゆっくりとした希釈（３００ｍＬ中に０．１ｍＬ／分）によって再折り畳みさせ、その後４℃で２４時間攪拌する。再折り畳みされたポリペプチドは、これらの条件下で溶液中に留まり、そして誤って折りたたまれたポリペプチドおよび変性ポリペプチドは沈殿し、そして濾過または遠心分離によって除去され得る。Ｄ５のさらなる精製は、融合パートナーの性質に依存し、そしてアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用して達成され得る。例えば、ＣＢＰ−Ｄ５融合物は、９．０のｐＩを有すると予測され、従って、カチオン交換（例えば、ｐＨ８．５で展開されるＳＰ（スルホプロピル）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用して精製され得る。ＣＢＰ−Ｄ５と同じｐＩの塩基性を有するタンパク質はほとんどなく、従って、ＣＢＰ−Ｄ５のみが、そのｐＨで正に荷電し、そしてカラムに付着し得る。このプロトコールは、ＣＢＰ−Ｄ５融合物の、均質に至る一工程精製のために使用されている。
【００９２】
活性なＤ５融合ポリペプチドは、融合パートナーに関わらず、この様式で発現かつ精製され得る。融合ポリペプチドおよびこの融合ポリペプチドから切断された純粋Ｄ５は、ＥＣの増殖を阻害し（ＩＣ５０＝６０ｎＭ）、そしてこれらの細胞においてアポトーシスの迅速な誘導を導く（ＤＮＡラダー化まで約４時間）。
【００９３】
Ｄ５融合ポリペプチドは、他の細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞および肝臓細胞（ＨｅｐＧ２））の増殖に対して測定可能な影響を有さないという点で、脈管形成ＥＣ選択的である。このＤ５融合ポリペプチドは、刺激されていない（静止状態の）ＥＣの増殖に影響しない。
【００９４】
Ｄ５はまた、ＣＡＭアッセイにおいて血管形成を阻害する。
【００９５】
これらの活性に基づいて、ＥＣ上のＤ５ＢＳに結合し、かつＥＣに対する上記の阻害作用のいずれかを有するＤ５融合ポリペプチドは、腫瘍増殖のために必要な脈管形成を予防し、従って、被験体において抗腫瘍活性を発揮する。
【００９６】
好ましいＤ５融合パートナーにおいて、この結合パートナーは、Ｄ５のＮ末端に融合される。
【００９７】
好ましいＤ５融合ポリペプチドは、Ｄ５部分と融合パートナーとの間に切断可能なリンカーを有する。切断可能なリンカーの例としては、ＶＰＲＧＳＤ（配列番号９）およびＤＤＫＤＷＨ（配列番号１０、トロンビンによって切断可能；ＤＤＫＤＷＨ、エンテロキナーゼによって切断可能）が挙げられる。Ｐ１部分中に塩基性残基（ＫまたはＲ）を有する任意の配列は、潜在的に、トロンビン、エンテロキナーゼ、トリプシンまたはプラスミンによって切断可能である。しかし、トロンビンは、これらの酵素の中で最も無差別でなく、そして好ましい。
【００９８】
１つの実施形態において、この融合ポリペプチドは、Ｄ５由来の配列および１つよりも多いさらなるタンパク質を含む。従って、上記のような融合ポリペプチドにおいて、融合パートナーは、診断的標識または治療的部分として働くなお別の配列への架橋として働く。このような標識または部分をＤ５構造から離すことによって、この融合ポリペプチドのＤ５部分がＤ５ＢＳに結合する能力を増大させる可能性は、インタクトなままである。診断的標識および治療的部分は、以下により詳細に開示される。
【００９９】
全ての先のポリペプチドならびにその改変体および化学的誘導体（ペプチド模倣物を含む）は、好ましくはＩＣ５０≦１０μＭ、より好ましくは≦１μＭで、内皮細胞またはＤ５ＢＳを含むこれらの細胞画分に結合するはずである。この活性は、以下により詳細に特徴付けられる。
【０１００】
全ての先のポリペプチド、融合ポリペプチドまたは他の機能的誘導体および科学的誘導体（ペプチド模倣物およびマルチマーペプチドを含む）は、以下のようなＨＫのネイティブなＤ５ドメインポリペプチドの生物学的活性または生化学的活性（例えば、結合活性）を有するはずである：内皮細胞増殖もしくは細胞生存率、または脈管形成のインビトロアッセイにおいて、ネイティブのＤ５の活性の少なくとも約２０％の活性。あるいは、またはさらに、これらの誘導体は、内皮細胞全体または細胞画分、単離されたＤ５ＢＳ含有ポリペプチドもしくはペプチド、または任意の他のこのような結合分子を用いた結合アッセイにおいて試験される場合、リガンドまたは結合パートナー（好ましくは、Ｄ５ＢＳ）に対する結合について、標識されたＤ５ポリペプチドと（ＩＣ５０≦１０μＭで、より好ましくは≦１μＭで）競合するはずである。
（Ｄ５およびその融合ポリペプチドの組換え発現）
Ｄ５ポリペプチドおよびＤ５融合ポリペプチドは、好ましくは、従来の組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。
（発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されるＤ５ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを包含する。「作動可能に連結される」とは、コード配列が、このコード配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結することを意味する。公知の調節配列が、適切な宿主細胞において所望のタンパク質の発現を指向するために選択される。従って、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントを含む。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｍｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。
【０１０１】
当業者は、本発明の発現ベクターの特定の設計が、トランスフェクトされる宿主細胞および／または発現されるタンパク質の型のような検討材料に依存することを理解する。
【０１０２】
本発明発現ベクターは、以下のＤ５の種々の実施形態をコードする核酸分子の全範囲を包含する：全長タンパク質、およびポリペプチドフラグメント、改変体、融合ポリペプチドなどを含む（本明細書中で定義される）その機能的誘導体。従って、１つの実施形態において、この発現ベクターは、単独か、または別のタンパク質に融合される、Ｄ５の少なくとも一部分をコードする核酸を含む。
【０１０３】
このような発現ベクターを使用して、このＤＮＡの発現のためにおよび融合ポリペプチドまたはペプチドを含む、このＤＮＡにコードされるポリペプチドの産生のために宿主細胞をトランスフェクトする。Ｄ５ポリペプチドを発現する、遺伝的に改変された細胞が、この細胞が上述した目的について有用であるために十分な時間にわたって、外因性ＤＮＡを一過的に発現し得ることが理解される。発現に要求される時間の長さ、または細胞が生存する時間の長さは、細胞がその刺激性機能または阻害性機能を及ぼすために必要な時間である。例えば、Ｄ５を発現する形質導入された細胞の場合、Ｄ５の発現は、６時間ほどの短さであり得、好ましくは２４時間ほどの短さであり得、より好ましくは少なくとも２〜４日間のほどの短さであり得る。当然、発現はまた、安定であり得る（すなわち、細胞の寿命の間）。以下に議論される適切な発現ベクターおよび調節エレメント（例えば、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーター）が、所望されるか、または必要とされる発現の安定性に従って、選択される。
【０１０４】
本発明は、Ｄ５ポリペプチド、Ｄ５フラグメント、およびＤ５誘導体を産生するための方法を提供する。例えば、Ｄ５タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸ベクターでトランフェクトされた宿主細胞は、Ｄ５ポリペプチドの発現を可能にする適切な条件下で、培養される。
【０１０５】
宿主細胞はまた、Ｄ５タンパク質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡおよび第二のタンパク質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡを単独または組み合わせて含む１以上の発現ベクターでトランフェクトされ得、その結果、この宿主細胞は、これらの両方のタンパク質を含む融合タンパク質を生成する。
【０１０６】
組換え発現ベクターが、Ｄ５の一部分をコードするＤＮＡおよび別のタンパク質をコードするＤＮＡを包含する場合、得られた融合ポリペプチドは、改変された溶解度、結合親和性および／または価数を有し得る。例えば、Ｄ５  Ｉｇ融合ポリペプチドは、好ましくは培養物中のトランスフェクトされた宿主細胞によって分泌され、従って、培養培地から単離される。あるいは、タンパク質が細胞質で保持される場合、この細胞は収集され、そして溶解され、そしてこれらの溶解物からタンパク質が単離される。
【０１０７】
培養は、代表的には、宿主細胞、適切な増殖培地、および他の副産物を含む。適切な培養培地は、当該分野で周知である。Ｄ５タンパク質は、タンパク質およびペプチドを精製するための従来の技術（硫酸アンモニウム沈澱、分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーなど）および／または電気泳動（一般的には、「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｉｉｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２：２３３−５７７（１９７１）を参照のこと）を含む）を使用して培地または細胞溶解物から単離され得る。一旦、部分的に、または均質になるまで、精製されると、本明細書中により詳細に記載されるように、この本発明の組換えＤ５ポリペプチドが、薬学的組成物中で使用され得る。
【０１０８】
Ｄ５またはそのホモログもしくは機能的誘導体を発現するように、形質転換されたか、またはトランスフェクトされた、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞は、本発明の範囲内にある。例えば、Ｄ５は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母細胞、または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞）の中で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）（前出）で見出され得るか、さもなければ、当業者に公知である。
【０１０９】
真核生物細胞における発現は、この組換えタンパク質の部分的な、または完全な、グリコシル化および／または関連する鎖間または鎖内のジスルフィド結合の形成を生じる。
【０１１０】
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉら，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：２２９−２３４），ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３），ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３），およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。培養された昆虫細胞（ＳＦ  ９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。一般に、ＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２）は、哺乳動物における一過性の増幅／発現のために、ｐＣＤＭ  ８（Ａｒｕｆｆｏ  Ａ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．，前出）のようなベクターと関連して使用され、その一方で、哺乳動物細胞における安定な増幅／発現のために、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−ネガティブＣＨＯ）細胞は、ｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）のようなベクターと共に使用される。ＮＳ０骨髄腫細胞株（グルタミン合成発現系）が、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．から利用可能である。
【０１１１】
しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、この２つの融合パートナーポリペプチドの接合部に導入され、この融合タンパク質の精製後にパートナー配列からのこの標的タンパク質の分離を可能にする。本明細書中で議論されるように、このような切断のためのタンパク質分解酵素およびこれらの認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１１２】
代表的な融合発現ベクターとしては、標的組換えタンパク質に対して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ融合させる、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１１３】
誘導性非融合発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。標的遺伝子発現は、ｐＴｒｃ中のハイブリットｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に基づくが、ｐＥＴ  １１ｄに挿入された標的遺伝子の発現は、同時発現されたウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）によって媒介される、Ｔ７  ｇｎ１０−ｌａｃＯ融合プロモーターからの転写に基づく。このウイスル性ポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下でＴ７ｇｎｌを保有するレジデントλプロファージ由来である宿主細胞株のＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって提供される。
【０１１４】
本発明の１つの実施形態が、Ｄ５を新たに（ｄｅ  ｎｏｖｏ）発現するトランスフェクションされた細胞である。Ｄ５をすでに発現している細胞の場合、このトランスフェクトされた細胞は、Ｄ５タンパク質またはそのフラグメントの量を増大して発現する。例えば、腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、癌種または神経芽細胞腫）が、腫瘍細胞表面におけるＤ５の発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトされる。
（ベクター構築）
所望のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築は、当該分野で周知の標準的な連結および制限の技術を使用する。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、切断され、調整され、そして所望の形態で再連結される。
【０１１５】
ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多くの供給源から利用可能である。骨格ベクターおよび制御系は、一般に構築物中の大量の配列について使用される利用可能な「宿主」ベクター上で見出される。適切なコード配列のために、初期の構築物は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー由来の適切な配列の検索したものであり得、そして通常はそうである。しかし、一旦、配列が開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から出発して、インビトロでこの遺伝子配列全体を合成することは可能である。かなりの長さ（例えば、５００−１０００ｂｐ）の遺伝子に対する遺伝子配列全体が、個々のオーバーラップする相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、そしてｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使用して一本鎖のオーバーラップしていない部分を満たすことによって、調製され得る。このアプローチは、公知配列のいくつかの遺伝子の構築物において首尾良く使用される。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ，Ｋ．Ｐ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；およびＪａｙ，Ｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
【０１１６】
合成オリゴヌクレオチドは、上で引用された参考文献によって記載されるようなリン酸トリエステル法またはＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ならびにＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ（１９８１）２２：１８５９；およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．，およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ  Ａｍ
Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３１８５によって記載されるようなホスホロアミダイト法のいずれかによって調製され、そして市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製され得る。アニーリング前の、または標識のための、一本鎖のキナーゼ処理は、適切な緩衝液、塩などおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、１ｎｍｏｌの基質に対して過剰のポリヌクレオチドキナーゼを使用して達成される。
【０１１７】
従って、一旦、所望されるベクターの成分が利用可能になると、標準的な制限および連結の手順を使用して、これらは切出され得、そして連結され得る。部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で通常理解される条件下で適切な制限酵素によって処理することによって実施され、ここで特別なものは、これらの市販される制限酵素の製造者によって、特定される。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。一般的に、約１ｍｇのプラスミド配列またはＤＮＡ配列は、約２０ｍｌの緩衝溶液中の１単位の酵素によって切断され；本明細書中の実施例において、代表的には、過剰の制限酵素が使用され、ＤＮＡ基質の完全な消化を確保する。約３７℃における約１時間〜約２時間のインキュベーション時間は、機能するが、変更が許容され得る。各インキュベーション後に、タンパク質は、フェノール／クロロホルムを用いた抽出によって取り出され、その後に、エーテル抽出され得、そして核酸が、エタノール沈澱によって水性画分から回収される。所望される場合、切断されたフラグメントのサイズ分離は、標準的な技術を使用してポリアクリルアミドゲル電気泳動またはアガロースゲル電気泳動によって、実施され得る。サイズ分離の一般的な説明が、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５：４９９−５６０に見出される。
【０１１８】
制限切断されたフラグメントは、既知の濃度、インキュベーション時間および条件を使用する４つのｄＮＴＰの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理することによって平滑末端化され得る。このＫｌｅｎｏｗフラグメントは、５’で一本鎖オーバーハングを覆い、この４つのｄＮＴＰが存在してはいるが、突き出た３’の一本鎖を切り落とす（ｃｈｅｗ  ｂａｃｋ）。所望される場合、選択的な修復が、このオーバーハングの性質によって決定付けられる限定の内で、これらのｄＮＴＰのうちの１つまたは選択されたｄＮＴＰのみを提供することによって実施され得る。Ｋｌｅｎｏｗで処理した後に、この混合物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させる。適切な条件下でのＳ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１での処理によって、任意の一本鎖部分の加水分解が生じる。
【０１１９】
連結は、代表的には、「接着末端」または「平滑末端」での連結について適切であることが公知である条件および温度の下にて１５−５０ｍｌの容積中で実施される。
【０１２０】
「ベクターフラグメント」を使用するベクター構築において、このフラグメントは、通常は、細菌性アルカリホスファターゼまたは仔ウシ腸性アルカリホスファターゼで処理され、この５’リン酸を取り除き、そして、自己リン酸化を防止する。再連結は、さらなる制限酵素および望まないフラグメントの分離によって二重に消化されるベクター内で、妨げられ得る。
【０１２１】
多数の方法を使用して、変異をこのコード配列に導入し、本発明の改変体を生成する。これらの変異としては、単純欠失もしくは単純挿入、系統的欠失、挿入、または塩基のクラスターの置換、または一塩基の置換が挙げられる。
【０１２２】
例えば、Ｄ５  ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の改変は、部位特異的変異誘発、プロトコルおよび試薬が市販されている周知の技術（Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７−６５００およびＡｄｅｌｍａｎ，ＪＰら、ＤＮＡ（１９８３）２：１８３−１９３））によって生成される。プラスミド構築のための正確な連結は、例えば、はじめにＥ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１（Ｃａｓａｄａｂａｎ，Ｍ．ら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９８０）１３８：１７９−２０７）または他の適切な宿主を連結混合物で形質転換することによって確認される。従来の方法を使用して、形質転換体は、プラスミド構築物の様式に依存して、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、または他の抗生物質耐性遺伝子（あるいは他の選択マーカー）の存在に基づいて選択される。次いで、プラスミドは、必要に応じたクロラムフェニコール増幅後の任意のクロラムフェニコール増幅を使用して、形質転換体から調製される（（Ｃｌｅｗｅｌｌ，ＤＢら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９６９）６２：１１５９；Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９７２）１１０：６６７）。いくつかのミニＤＮＡプレップが、通常使用される。例えば、Ｈｏｌｍｅｓ，ＤＳら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８１）１１４：１９３−１９７；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，ＨＣら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）７：１５１３−１５２３を参照のこと。この単離されたＤＮＡは、制限により分析され、そして／または、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８１）９：３０９によってさらに記載されるサンガーのジデオキシヌクレオチド法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）によってあるいはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５：４９９の方法によって配列決定される。
【０１２３】
ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウム共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーションのような従来の技術を介して哺乳動物細胞に導入され得る。宿主を形質転換する適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出および他の標準的な教科書に見出され得る。
しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位が、レポーター群と標的タンパク質との接合部に導入され、この融合タンパク質の精製後に、このレポーター群からの標的タンパク質の分離を可能にする。このような切断のためのタンパク質分解酵素およびその認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１２４】
代表的な融合発現ベクターとしては、標的組換えタンパク質に対して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ融合させる、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ），ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
誘導性非融合発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。標的遺伝子発現は、ｐＴｒｃにおけるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に基づくが、ｐＥＴ  １１ｄに挿入された標的遺伝子の発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）によって媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃＯ融合プロモーターからの転写に基づく。このウイスル性ポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下でＴ７ｇｎｌを保有するレジデントλプロファージ由来である宿主細胞株のＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって提供される。
（プロモーターおよびエンハンサー）
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして「作動的可能に結合された」核酸配列の転写を促進する。本明細書中で使用される場合、「プロモーター配列」は、このＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡまたはＲＮＡのその鎖において見出されるプロモーターのヌクレオチド配列である。核酸分子の２つの配列（例えば、プロモーターおよびコード配列）は、これらの両方の配列が同じＲＮＡ転写物中に転写されることを可能にするか、または１つの配列中で開始されたＲＮＡ転写物が第二の配列に伸長されることを可能にする様式で、互いに連結される場合に「作動可能に連結」される。従って、２つの配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのプロモーター配列およびコード配列）は、このプロモーター配列における転写開始によって、この作動可能に連結されたコード配列のＲＮＡ転写物が産生される場合に、作動可能に連結される。「作動可能に連結される」ために、二つの配列が直鎖状で互いに近接している必要はない。
【０１２５】
本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳動物細胞において作動可能でなければならず、そして、真核生物性プロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかであり得る。適切なプロモーターは、誘導性、抑制性、または構成性であり得る。構成性プロモーターの例は、ウイルスプロモーターＭＳＶ−ＬＴＲであり、これは、種々の型の細胞において効率的であり、そして活性であり、そしてほとんどの他のプロモーターとは対照的に、停止（静止）細胞および増殖細胞においても、同じ増強活性を有する。他の好ましいウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルス由来）（Ｂａｓｈａｒｔ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５））またはＲＳＶ−ＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルス由来）（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２））に存在するプロモーターが挙げられる。または有用であるのは、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））である。プロモーター領域に関連する転写因子および別個の活性ならびに転写因子のＤＮＡ結合の他の例示的な説明としては、以下が挙げられる：Ｋｅｅｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）２３１：６９９；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４０：２４５；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：９；Ｌｅｗｉｎ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：１１６１；Ｐｔａｓｈｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：３２９；Ａｄａｍｓら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：３０６。これら上に列挙した参考文献の全ての関連する開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０１２６】
このプロモーター領域は、オクタマー領域をさらに含み得、この領域はまた、特定の組織において見出される特定のタンパク質と相互作用することによって組織特異的エンハンサーとしてさらに機能し得る。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトされるべき標的細胞にとって特異的であるか、またはこのような標的細胞の細胞因子によって高度に活性化される、ドメインである。ベクター（プラスミドまたはレトロウイルス）の例は、（Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎら、米国特許第５，１１２，７６７号）に開示される。エンハンサーおよび転写におけるこれらの作用の一般的な議論については、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９９０），ｐｐ．５５２−５７６を参照のこと。特に有用なのは、レトロウイルスエンハンサー（例えば、ウイルスＬＴＲ）である。このエンハンサーは、好ましくは、このエンハンサーが遺伝子発現を刺激するために相互作用するプロモーターより上流に位置する。レトロウイルスベクターの使用について、この内因性ウイルスＬＴＲは、エンハンサーなしであり得、そして組織特異性または他の所望の特性（例えば、本発明のＤ５コードＤＮＡ分子における転写効率の良さ）を与える他の所望のエンハンサー配列で置換され得る。
【０１２７】
本発明の核酸配列はまた、標準的な技術を使用して化学的に合成され得る。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する種々の方法は、公知であり、これらとしては、固相合成（これは、ペプチド合成のように、市販のＤＮＡ合成機を用いて完全自動化されている（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号；およびＩｔａｋｕｒａ、米国特許第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））が挙げられる。
【０１２８】
ハイブリダイゼーションは、好ましくは、「ストリンジェントな条件」の下で、実施され、これは、以下を意味する：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温を使用すること（例えば、５０℃において、０．０１５塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ酢酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）、または（２）ハイブリダイゼーションの間に、変性剤（例えば、ホルムアミド（例えば、４２℃で７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと一緒に、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を伴った、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド））を使用すること。別の例は、４２℃における、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランの使用であり、これは、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中の４２℃での洗浄を伴う。さらに別の例は、５５℃で１０％硫酸デキストラン緩衝液、２×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド緩衝液を使用するハイブリダイゼーション、その後の、高度にストリンジェントな洗浄（５５℃での０．１×ＳＳＣ含有ＥＤＴＡからなる）である。
【０１２９】
本発明はまた、本発明のＤ５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有および／または発現する細胞を含み、これは、原核生物細胞、および真核生物細胞を含み、そして、特に、種々の型および系統の、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、寄生虫細胞、昆虫細胞、マウス細胞または他の齧歯類細胞、および他の哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）を含み、これらは，静止していても活発に増殖していてもよく、培養物中にあっても、またこれらを含む生物の全体であっても良い。
【０１３０】
好ましい哺乳動物細胞は、霊長類、特にヒトであり得るが、目的の任意の動物、特に、家畜（例えば、ウマ、ウシ、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコなど）に関連し得る。これらの種の中で、種々の型の細胞（例えば、造血、神経、間葉，皮膚，粘膜，間質，筋肉，脾臓，細網内皮細胞、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺など）が、使用され得る。造血細胞は、リンパ系統または骨髄単球系統であり得、これらは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、および単球、筋芽細胞および線維芽細胞を含む。目的のものはまた、幹細胞および前駆細胞である。
【０１３１】
（細胞および動物へのＤ５  ＤＮＡの送達）
例えば、所謂「遺伝子治療」としてまた公知である効果を達成するための、ＤＮＡ送達は、細胞、および最終的には生きた動物への「外来」ＤＮＡの導入を含む。遺伝子治療についてのいくつかの一般的なストラテジーが、研究され、そして広く概説されている（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｈｏｌ．１２：３３５−３５６（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（補遺６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）；Ｚｗｉｅｂｅｌ，Ｊ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６１８：３９４−４０４（１９９１）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３８：９１−１３５（１９９０）；Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．７：１７９−１９２（１９８９）（これらの参考文献は、本明細書中で全体が参考として援用される））。
【０１３２】
一つのアプローチは、培養中の一次細胞への核酸移入、その後の、宿主（全身あるいは、特定の器官または組織のいずれか）へのエキソビボ形質転換細胞の自系移植を包含する。
【０１３３】
本発明の目的を達成するために、核酸治療は、インビボでの哺乳動物の身体組織または器官への、機能的に活性なＤＮＡの直接的な移入によって達成され得る。ＤＮＡ移入は、以下に記載の多くのアプローチを使用して達成され得る。これらの系は、選択マーカー（例えば、Ｇ４１８耐性）の使用によるインビトロでの首尾よい発現について試験され得、このＤＮＡを発現するトランスフェクトされたクローンを選択し、その後Ｄ５発現産物の存在を、適切な免疫アッセイにおいて、この産物に対する抗体を使用して、検出する（誘導性の系の場合、そのインデューサーでの処置の後に）。この手順の効果（ＤＮＡ取り込み、プラスミド組み込み、および組み込まれたプラスミドの安定性を含む）が、公知の方法を使用するプラスミドＤＮＡの鎖状化によって、および高分子量哺乳動物ＤＮＡを「キャリア」として使用する同時トランスフェクトによって、改善され得る。
【０１３４】
当該分野で報告された首尾よい「遺伝子移入」の例としては、以下が挙げられる：（ａ）不確定期間にわたってマーカー遺伝子の発現を生じるマウス筋肉組織へのプラスミドＤＮＡの直接的な注入（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）；Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３：７１（１９９１））；（ｂ）レトロウイルスベクターは、血管組織のインビボおよびインサイチュの感染について効果的である；（ｃ）肝臓へのレトロウイルス調節物の門脈注射および直接注射は、遺伝子移入およびインビボでの発現をもたらした（Ｈｏｒｚａｇｌｏｕ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７２８５（１９９０）；Ｋｏｌｅｋｏ，Ｍ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２７（１９９１）；Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３８７（１９９１））；（ｄ）肺組織への組換えアデノウイルスの気管内注入は、肺気道上皮における外来遺伝子のインビボ移入および長期の発現について効率的である（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１（１９９１））；（ｅ）単純疱疹ウイルスベクターは、脳組織へのインビボ遺伝子移入を達成した（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ら編、Ｍｉａｍｉ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ−Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ  １，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ，１９９１）。
【０１３５】
レトロウイルス媒介ヒト治療は、両栄養性複製欠損レトロウイルス系を使用する（Ｔｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１１１（１９９０）；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；Ｗｉｌｌｓ，Ｊ．Ｗ．米国特許第５，１７５，０９９号；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，米国特許第４，８６１，７１９号）。このようなベクターを使用して、ヒトの細胞または組織に機能性ＤＮＡを導入する（例えば、リンパ細胞へのアデノシンデアミナーゼ遺伝子の導入、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子および腫瘍壊死因子の遺伝子の腫瘍浸潤リンパ球への導入）。レトロウイルス媒介遺伝子送達は、一般に、遺伝子移入のための標的細胞増殖を必要とする（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０）。この条件は、本発明のＤＮＡ分子が導入される特定の好ましい標的細胞、すなわち活発に増殖している腫瘍細胞によって満たされる。多くの方法のいずれかを用いるプラスミドおよびレトロウイルスベクターによるトランスフェクションを使用する嚢胞性線維症の遺伝子治療が、Ｃｏｌｌｉｎｓら、米国特許第５，２４０，８４６号によって記載される。
【０１３６】
Ｄ５配列をコードするＤＮＡ分子は、当該分野で周知のように、複製欠損レトロウイルスを産生するパッケージ化細胞株を使用してレトロウイルスベクターにパッケージされ得る（例えば、Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９−６３５３（１９８４）；Ｍａｎｎ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−１５９（１９８３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７（１９８５），；Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｈｏｃｋ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：２５７（１９８６）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２（１９８６）を参照のこと）。遺伝子移入に対して効率的および安全な、より新規のパッケージ化細胞はまた、記載される（Ｂａｎｋら、米国特許第５，２７８，０５６号）。
【０１３７】
このアプローチは、選択された組織または器官にレトロウイルスベクターを送達するための部位特異的な特定の様式で使用され得る。従って、例えば、カテーテル送達系が使用され得る（Ｎａｂｅｌ，ＥＧら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１３４２（１９８９））。このような方法は、レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターのいずれかを使用し、血管壁で発現される核酸を送達するか、または腫瘍の血液循環内に送達するために特に有用である。
【０１３８】
他のウイルスベクターもまた利用され得、これらとしては、ニューロン特異的送達および持続性のための組換えアデノウイルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐ．１６７９；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６  ９１９１９８８），Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ＨＳ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４，第１１章），単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）が挙げられる。ヒトの遺伝子治療についてのアデノウイルスベクターの利点としては、組換えがまれであり、このようなウイルスに関連するヒトの悪性腫瘍が知られておらず、このアデノウイルスゲノムが二本鎖ＤＮＡであり（これは、７．５ｋｂのサイズまでの外来遺伝子を受け入れるように操作され得る）、そして生きたアデノウイルスが安全なヒトワクチン生物体であるという事実が挙げられる。アデノ随伴ウイルスもまた、本発明に従うヒト治療に有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９４１（１９９１）。
【０１３９】
本発明のＤＮＡ分子を発現し得、そして本発明の治療設定（特に、ヒトにおける）において有用である別のベクターは、ワクチンウイルスであり、これは、複製できないようにされ得る（米国特許第５，２２５，３３６号；同第５，２０４，２４３号；同第５，１５５，０２０号；同第４，７６９，３３０号；Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０８４７−１０８５１；Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：２５４９−２５５３；Ｆａｌｋｎｅｒ  Ｆ．Ｇ．ら；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：７１９２；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３４０３−３４０９）。組換えワクチンウイルスおよび異種ＤＮＡを含む他のウイルス、ならびに免疫化およびＤＮＡ治療におけるそれらの使用についての説明は、以下において総説される：Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（１９９３）３：８６−９０；Ｍｏｓｓ，Ｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）２０：３４５−３６２；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：２５−３８；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６６２−１６６７；Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａら，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）３４：４３−６４；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら，Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆ  Ａｎａｌ（１９８３）３：２０１−２１３。
【０１４０】
裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはウイルスベクターに加えて、操作された細菌は、ベクターとして使用され得る。多くの細菌株としては、以下が挙げられる：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＢＣＧおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）（Ｈｏｉｓｅｔｈ＆Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９１，２３８−２３９（１９８１）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，ＴＰら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８，２５−３２（１９８８）；（Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，３３６−３３８（１９８８）；Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４５６−４６０（１９９１）；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４７９−４８２（１９９１）；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，５３−５９（１９９２）；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，２２０９−２２１８（１９９４））。
【０１４１】
インビボでのウイルス媒介遺伝子移入に加えて、当該分野で周知の物理的手段が、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆら，１９９０，前出）および微粒子ボンバードメント媒介遺伝子移入（Ｙａｎｇ，Ｎ．−Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２７２６（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８０：９４（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４４：６５（１９８９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１１（１９９１））を含むＤＮＡの直接移入のために使用され得る。さらに、エレクトロポレーション（インビトロで細胞中に遺伝子を移入するための周知の手段）が、本発明に従ってインビボで組織にＤＮＡ分子を移入するために使用され得る（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，Ａ．Ｖ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：１３１（１９９１））。
【０１４２】
「キャリア媒介遺伝子移入」もまた、記載されている（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）；Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７１２８（１９８３）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１（１９８２）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２））。好ましいキャリアは、イムノリポソームのような標的化リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１０６８（１９８３）；Ｓｏｒｉａｎｏら，前出）であり、これは、脂質二重層中にアシル化されたｍＡｂを取り込み得る（Ｗａｎｇら，前出）。アシアログリコプロテイン／ポリリジンのようなポリカチオン（Ｗｕら，１９８９，前出）が使用され得、ここで、この結合体は、標的組織を認識する分子（例えば、肝臓についてのアシアロオロソムコイド）、およびトランスフェクトされるべきＤＮＡに結合するためのＤＮＡ結合化合物を含む。ポリリジンは、ＤＮＡを損傷することなくこのＤＮＡに結合するＤＮＡ結合分子の例である。次いで、この結合体は、移入のために、本発明に従うプラスミドＤＮＡと複合体化される。
【０１４３】
トランスフェクションまたはマイクロインジェクションのために使用されるプラスミドＤＮＡは、例えばＱｕｉａｇｅｎ手順（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して、当該分野で周知の方法を使用して調製され得、続いて公知の方法を使用してＤＮＡ精製される。
【０１４４】
ここでも、上記のように、本発明に従う形質導入されたＤ５分子の有用性のために、安定な発現は必要とされなくてもよい。むしろ、形質導入された細胞がその生物学的／薬理学的な機能を行うためには、このポリペプチドの一過性の発現で十分であり得る。
【０１４５】
（アッセイ方法）
Ｄ５ポリペプチドの生物学的活性および薬理学的活性を評価するために有用な多くの従来の技術を、以下に記載する。
【０１４６】
（内皮細胞増殖）
ＨＵＶＥＣまたはＨＤＭＶＥＣ（Ｃｅｌｌ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはＣｌｏｎｅｔｉｃｓから購入）を、ゼラチンコーティングした９６ウェルプレート中に、１ウェル当たり３，０００細胞の密度でプレートする。この細胞を、接着および増殖させる（３７℃で４〜６時間）。次いで、この培地を除去し、そして新しいＭ１９９（２％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトｂＦＧＦおよび種々濃度の試験ペプチドを含む）で置換する。
【０１４７】
選択した研究において、類似濃度の他のＥＣ増殖因子（例えばＶＥＧＦ）を使用する。
【０１４８】
次いで、細胞を、３７℃でさらに４８時間培養し、この時点で、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して各ウェル中の相対的細胞数を決定する。手短に言うと、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメチルフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）とフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）との１９：１（Ｖ／Ｖ）混合物２０μｌを各ウェルに添加し、そしてさらなる１時間のインキュベーション後、Ａ４９０を測定する。
【０１４９】
本発明者らは、ＨＫａを用いるインキュベーション後に、この方法および手動の細胞計数の両方を使用してＥＣを定量化し、そして直接的な線形相関を観察する。
【０１５０】
増殖の阻害パーセントを、以下の式：
【０１５１】
【数１】
2004515222.tif 000005
を使用して、以前に記載されるように算出する（Ｚｈａｎｇら，前出）。
【０１５２】
（内皮細胞の遊走）
これらの研究を、９６ウェル遊走装置（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ）を使用して行う。手短に言うと、９６ウェルマイクロプレートのウェルを、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＭ１９９で満たす。次いで、このマイクロプレートを、アクリルチャンバ中に配置し、そしてフィブロネクチンまたはＩ型コラーゲンで予めコーティングしたポリカーボネートフィルター（０．８μＭの細孔サイズ）をこのマイクロプレートの頂部の上に配置する（このフィルターは、プレート全体を覆う）。次いで、この遊走チャンバのヒンジ付きの蓋（これは、マイクロプレートのウェルと直接整列する９６個の孔を備える）を、このフィルター上で閉じ、そして厳重にクランプする。ＨＤＭＶＥＣ（これは、遊走アッセイにおいて、ＨＵＶＥＣよりも有意により活性である）を、５０，０００細胞／ウェルの濃度でこの蓋の「ウェル」に添加する。次いで、この遊走装置を、３７℃で６時間インキュベートし、この時点でフィルターを取り除き、そしてギームザで染色する。洗浄後、このフィルターをマイクロプレートリーダーに直接配置し、そしてＯＤ５４０を測定する。
【０１５３】
カルセインアセトキシメチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて細胞をプレロードすることによって、このアッセイの感度は増大され得、そして遊走に必要とされる時間は減少され得る。この親油性化合物は、細胞膜を横断し、ここで細胞内加水分解によって蛍光性の荷電したカルセイン部分が放出される。細胞からの後者の漏出のみが遅いので、これは蛍光プレートリーダーを使用して細胞を定量化するために使用され得る。阻害のパーセントは、以下：
【０１５４】
【数２】
2004515222.tif 000006
のように算出される。
【０１５５】
（内皮細胞のアポトーシス）
これらの研究は、ＥＣの増殖を阻害するペプチドを同定した後に、親分子を用いる場合に、これらの効果がＥＣのアポトーシスの誘導を反映するか否かを決定するために行う。アポトーシスを、ＤＡＰＩ染色、ＤＮＡ断片化、または標的細胞へのアネキシン５の結合を用いて検出する。これらの方法は、以前に記載されたように行う（Ｚｈａｎｇら，前出）。Ｄ５融合物またはＤ５由来のペプチドで処理した細胞を、迅速にアポトーシスに起こさせる（ｃｏｍｍｉｔ）（４〜８時間以内）。ＨＵＶＥＣまたはＨＤＭＶＥＣ（Ｃｅｌｌ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはＣｌｏｎｅｔｉｃｓから購入）を、１ウェル当たり３，０００細胞の密度で、ゼラチンコーティングした９６ウェルプレートにプレートする。この細胞を、接着および増殖させる（３７℃で４〜６時間）。次いで、この培地を取り除き、そして新しいＭ１９９（２％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトｂＦＧＦおよび種々の濃度の試験ペプチドまたはＤ５融合物を含む）で置換する。処置の４〜８時間後に、この細胞を収集する（ＤＮＡ断片化のために）か、またはＤＡＰＩ（これは、断片化したＤＮＡを有する細胞中でより明るく蛍光を発する）で染色する。あるいは、蛍光性アネキシン５結合（これは、アポトーシス細胞において細胞表面の細胞外面に曝露されるホスファチジルセリンに結合する）の量を、蛍光プレートリーダーにおいて測定する。定量化は、ＤＡＰＩまたはアネキシン５プロトコルを使用して最良に達成され、そしてコントロールと比較して試験因子を含むウェルにおいて蛍光の増大として測定され得る。ウルソル酸およびＴＮＰ４７０のような、内皮細胞のアポトーシスを誘導することが公知の因子を、ポジティブコントロールとして含める。蛍光におけるＤＡＰＩの増加は、高度に蛍光を発する核を手動で計測することによって、アポトーシス細胞数と直接相関し得る。
【０１５６】
（管形成アッセイ）
ＥＣは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に毛細管様の管を形成するために誘導され得る。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、９６ウェルプレート中に分散し、そしてゲルにする。ＨＵＶＥＣＳまたはＨＭＶＥＣ（３〜６，０００細胞／ウェル）を、任意の試験因子に加えてｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＰＭＡ（７５ｎＭ）の存在下でこのプレートに添加する。１ウェル当たりに形成された管の数を、少なくとも２つの異なるリーダーによって視覚的にスコアリングする。この値は、試験因子を受け入れないコントロールウェルのパーセンテージとして表現される。
【０１５７】
（Ｄ５ポリペプチドのインビボ評価）
（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイ）
このアッセイは、本質的にＰａｓｓａｎｉｔｉらによって記載されるように行う（Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−５２８（１９９２））。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、使用するまで４℃で維持する。注射の直前に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、脈管形成因子（１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ）と混合し、次いでマウスに皮下注射する（マウスあたり０．５ｍＬ）。注射したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、１０日間持続する触知可能な固体ゲルを形成し、この時点でこの動物を安楽死させる。このＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグを取り除き、そしてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグ中のヘモグロビンの量を測定することによって、またはこのプラグから調製した切片中の新脈管（ｎｅｏｖｅｓｓｅｌ）を計数することによって、新脈管形成を定量化する。抗ＣＤ３１染色を、このプラグにおける新脈管の形成および微小血管の密度を確認するために使用し得る。いくつかの実験において、腫瘍細胞を、特定の脈管形成因子の代わりにＭａｔｒｉｇｅｌと混合して、この試験因子の能力を調査し得る。いずれの構成においても、この試験因子を直接Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、そしてまた、この実験の過程にわたってプラグ中に毎日直接注射し得る。このモデルの１つの配向において、Ｄ５または融合Ｄ５  ｃＤＮＡを、分泌可能な発現系において腫瘍細胞にトランスフェクトする。このタンパク質の発現および分泌を、細胞培養物中で確認する。次いで、Ｄ５を発現する腫瘍細胞をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、そしてＭａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイにおいて抗脈管形成活性について評価する。
【０１５８】
（ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）新脈管形成アッセイ）
このアッセイを、本質的にＮｇｕｙｅｎらによって記載されるように行う（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．４７：３１−４０（１９９４））。脈管形成因子（ｂＦＧＦ）または腫瘍細胞およびインヒビターのいずれかを含むメッシュを、８日齢のニワトリ胚のＣＡＭ上に配置し、そしてこのＣＡＭを、このサンプルの移植後３〜９日にわたって観察する。新脈管形成を、このメッシュ中の血管を含む正方形のパーセンテージを決定することによって定量化する。
【０１５９】
（ヒト腫瘍の動物モデルにおける組成物のインビボ試験）
ペプチド、ペプチド模倣物、および結合体を、いくつかの十分に確立されたげっ歯類モデル（これは、ヒト腫瘍の広いスペクトルを高度に代表するとみなされる）における治療効果について試験する。このアプローチは、Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．ら，「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｕｍｏｒｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（第３版）」，Ｃａｎｃ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｐａｒｔ  ３，３：１−１１２（これらは、本明細書中でその全体において参考として援用される）において詳細に記載される。全ての一般的な試験評価手順、測定および計算（平均生存時間、生存時間の中央値、ノギスを用いた腫瘍直径の測定からのおおよその腫瘍質量の計算；腫瘍直径の計算；個々の切除した腫瘍からの平均腫瘍質量の計算；および任意の基準についての処置群とコントロール群との間の比（Ｔ／Ｃ比）を含む）を、この参考文献に従って行う。
【０１６０】
（Ａ．ＨＴ１０８０異種移植片モデル）
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫腫瘍細胞を、インビトロで継代する。ヌードＢａｌｂ／ｃマウスを、右側腹部に１０５〜１０６個の腫瘍細胞を皮下接種する。原発性腫瘍増殖を、カリパス測定を使用して評価する。抗腫瘍効力について試験するペプチドまたはポリペプチドを、ＰＢＳに溶解し得、そして連続的な注入によってか、または毎日の静脈内、皮下、または腹腔内注射によって投与する。コントロール動物に、ＰＢＳのみを与える。このモデルの別の実施形態において、まず、腫瘍細胞をＤ５ポリペプチドにトランスフェクトする。これらのトランスフェクトした細胞を動物に接種し、そしてこのトランスフェクトした腫瘍細胞の増殖を、非トランスフェクト細胞あるいは空またはコントロール発現ベクターでトランスフェクトした細胞と比較する。この実施形態は、試験因子の局所送達を模倣し、これは、遺伝子送達アプローチをモデル化し、ここでＤ５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが被験体に投与された。
【０１６１】
（Ｂ．３ＬＬ  Ｌｅｗｉｓ肺癌：原発性腫瘍増殖）
この腫瘍株は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、肺の癌として１９５１年に自然発生した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：３９，１９５５。Ｍａｌａｖｅ，Ｉ．ら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６２：８３−８８（１９７９）もまた参照のこと）。これを、皮下（ｓｃ）接種によるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける継代によって増殖させ、そして半同種異系のＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２  Ｆ１マウスにおいて、または同種異系のＣ３Ｈマウスにおいて試験する。代表的に、皮下（ｓｃ）インプラントのためにグループあたり６匹の動物、または筋内（ｉｍ）インプラントについて１０匹の動物を使用する。腫瘍を、２〜４ｍｍの断片として皮下移植するか、または約０．５〜２×１０６個の細胞の懸濁細胞の接種として皮下移植し得る。処置を、インプラントの２４時間後に開始するか、またはこの処置を、特定のサイズの腫瘍（通常、約４００ｍｇ）が触診され得るまで遅らせる。この試験化合物を、１１日間にわたって毎日腹腔内投与する。
【０１６２】
続いて、動物を秤量し、触診し、そして腫瘍サイズを測定する。腹腔内接種後１２日での未処置コントロールレシピエントにおける代表的な腫瘍質量は、５００〜２５００ｍｇである。代表的な生存時間中央値は、１８〜２８日である。ポジティブコントロール化合物（例えば、シクロホスファミド）を、１〜１１日目に、１日あたり２０ｍｇ／ｋｇ／注射で使用する。計算した結果は、平均の動物体重、腫瘍サイズ、腫瘍質量、生存時間を含む。確認した治療活性について、この試験組成物を２回の複数用量アッセイにおいて試験すべきである。
【０１６３】
（Ｃ．  ３ＬＬ  Ｌｅｗｉｓ肺癌：一次増殖および転移モデル）
このモデルは、多くの研究者らによって利用されている。例えば、Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６５：１２５７−１２６４（１９８０）；Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｅ．ら，Ｒｅｃ．Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．７５：２０−２８（１９８０）；Ｉｓａｋｏｖ，Ｎ．ら，Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓ．２：１２−３２（１９８２）；Ｔａｌｍａｄｇｅ  Ｊ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６９：９７５−９８０（１９８２）；Ｈｉｌｇａｒｄ，Ｐ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５：７８−８６（１９７７）を参照のこと。試験マウスは、２〜３月齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスである。皮下、筋内、または足蹠内の移植後に、この腫瘍は、優先的に肺に転移を生じる。この腫瘍のいくつかの株を用いると、この原発性腫瘍は、抗転移性効果を及ぼし、そして転移期の研究の前に最初に切除しなければならない（米国特許第５，６３９，７２５号もまた参照のこと）。
【０１６４】
単一細胞懸濁液を、刻んだ腫瘍組織を０．３％のトリプシン溶液で処理することによって、固形腫瘍から調製する。細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そして  ＰＢＳ中に懸濁させる。このように調製した３ＬＬ細胞の生存度は、一般に約９５〜９９％である（トリパンブルー色素排除により）。０．０５ｍｌのＰＢＳ中に懸濁した生存可能な腫瘍細胞（例えば、３×１０４〜５×１０６）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背側の領域または片方の後足蹠のいずれかに、皮下注射する。生存可能腫瘍は、１０６細胞の背側皮下注射の３〜４日後に現れる。腫瘍出現の日および樹立した腫瘍の直径を、カリパスによって２日毎に測定する。
【０１６５】
この処置を、１週間当たり、１または２用量のペプチドまたは誘導体として与える。別の実施形態において、このペプチドを、浸透圧ミニポンプによって送達する。
【０１６６】
背側の腫瘍の腫瘍切除を含む実験において、腫瘍が約１５００ｍｍ３のサイズに達した場合に、マウスを２つのグループに無作為化する：（１）原発性腫瘍は完全に切除される；または（２）偽手術（ｓｈａｍ  ｓｕｒｇｅｒｙ）を行い、そして腫瘍をインタクトなまま残す。５００〜３０００ｍｍ３の腫瘍は転移の増殖を阻害するが、１５００ｍｍ３の原発性腫瘍が、高い生存度で局所的に増殖することなく安全に切除し得る最も大きなものである。２１日後、全てのマウスを屠殺し、そして剖検する。
【０１６７】
肺を取り出し、秤量し、ブワン溶液に固定し、そして可視転移の数を記録する。この転移の直径をまた、微小計器を含む接眼レンズを備える両眼ステレオスコープを用いて、８×の拡大率で測定する。記録した直径に基づいて、各転移の容量を計算することが可能である。肺当たりの転移の総容量を決定するために、可視転移の平均数を、転移の平均容量で乗算する。転移の増殖をさらに決定するために、肺細胞への１２５ＩｄＵｒｄの取り込みを測定することが可能である（Ｔｈａｋｕｒ，Ｍ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８９：２１７−２２８（１９７７））。腫瘍切除の１０日後に、２５μｇのフルオロデオキシウリジンを、腫瘍保有（および、使用する場合、腫瘍切除マウス）腹膜に接種する。３０分後、マウスに、１μＣｉの１２５ＩｄＵｒｄ（ヨードデオキシウリジン）を与える。１日後、肺および脾臓を取り出し、そして秤量し、そしてγ線計測器を使用して１２５ＩｄＵｒｄ取り込みの程度を測定する。
【０１６８】
足蹠腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍が約８〜１０ｍｍの直径に達するときに、マウスを２つのグループに無作為化する：（１）腫瘍を有する脚を、結紮後に膝関節の上で切断する；または（２）マウスを、非切断腫瘍保有コントロールとしてインタクトなまま残す。（腫瘍保有マウスにおける腫瘍を有さない脚の切断は、感覚脱失、ストレスまたは手術の可能な効果を除いて、引き続く転移に対して公知の効果を有さない）。マウスを、切断の１０〜１４日後に殺傷する。転移を、上記のように評価する。
【０１６９】
（統計学：）腫瘍保有マウスの肺における転移およびその増殖の発生率を表す値は、通常分布しない。従って、非パラメータ統計学（例えば、マン・ホイットニーのＵ検定）を、分析のために使用し得る。
【０１７０】
Ｇｏｒｅｌｉｋら（１９８０，前出）によるこのモデルの研究は、腫瘍細胞菌種のサイズが、転移の増殖の程度を決定したことを示した。手術したマウスの肺における転移の割合は、原発性腫瘍保有マウスとは異なった。従って、３ＬＬ細胞（１〜５×１０６）のより大きな用量の接種、続く外科的除去によって原発性腫瘍が誘導されるマウスの肺において、転移数は、手術していない腫瘍保有マウスの転移数よりも小さかったが、転移の容量は、手術していないコントロールよりも高かった。１２５ＩｄＵｒｄ取り込みを肺転移の基準として使用すると、腫瘍切除マウスの肺と最初に１×１０６個の３ＬＬ細胞を接種した腫瘍保有マウスの肺との間において有意な差異は見出されなかった。１×１０５個の腫瘍細胞の接種後の、産生した腫瘍の切断は、転移の増殖を劇的に促進した。これらの結果は、局所腫瘍の切除後のマウスの生存度と一致した。局所腫瘍の切除後の、転移増殖の促進という現象は、繰り返し観察された（例えば、米国特許第５，６３９，７２５号を参照のこと）。これらの観察は、癌手術を受ける患者の予後についての暗示を有する。
【０１７１】
本発明に従って有用であるべき化合物について、この化合物は、本明細書中に記載のインビトロまたはインビボアッセイ系のうちの少なくとも１つにおいて、生物学的または薬理学的な活性を実証するはずである。
【０１７２】
（診断および予後の組成物）
本発明のＤ５ポリペプチドは、これらが、例えば細胞の表面または内部のＤ５ＢＳを検出するために検出可能に標識されそして使用され得るように、設計される。結合の間および結合後のＤ５ポリペプチドの運命が、インビトロまたはインビボでのこの標識を検出するための適切な方法の使用によって追跡され得る。標識されたＤ５ポリペプチドは、インビボで診断および予後のために利用され得る。
【０１７３】
これらのポリペプチドは、「活性化された」かまたは脈管形成の内皮細胞に結合するので、そして大部分の内皮が静止状態であるので、これらは、静止状態の内皮には結合せず、これによってバックグラウンドの可能性が減少する。腫瘍関連内皮は、脈管形成性であり、従ってこれらのポリペプチドによって認識される。さらに、内皮の「活性化」は同じセットの表面マーカーを誘導するので、これらのポリペプチドを使用する任意のイメージングは、任意の特定の腫瘍に対して特異的ではなく、むしろ任意の新脈管形成依存性腫瘍に対して一般的に使用され得る。このことは、標的腫瘍マーカーであるイメージング因子（この多くは腫瘍型特異的である）とは対照的である。
【０１７４】
適切な検出可能標識としては、放射活性標識、蛍光標識、蛍光発生標識、発色標識、または他の化学的標識が挙げられる。有用な放射標識（これは、γ線計測器、シンチレーションカウンター、ＰＥＴ走査またはオートラジオグラフィーによって簡単に検出される）としては、３Ｈ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび１４Ｃが挙げられる。さらに、１３１Ｉは、有用な治療的同位体である（以下を参照のこと）。
【０１７５】
通常の蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレスカミンが挙げられる。発蛍光団（例えば、ダンシル基）は、蛍光を発するために特定の波長の光で励起されなければならない。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．，１９９６を参照のこと。フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、およびフルオレセイン様分子（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭおよびその誘導体、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭならびにＲｈｏｄｏｌ  ＧｒｅｅｎＴＭ）は、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステルまたはジクロロトリアジニル−反応性基を使用して、アミン基とカップリングされる。同様に、発蛍光団はまた、マレイミド、ヨードアセトアミド、およびアジリジン−反応性基を使用して、チオールとカップリングされ得る。長波長ローダミン（これは、基本的に、その窒素上に置換基を有するＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ誘導体である）は、公知の最も光安定性の蛍光標識試薬のうちの１つである。そのスペクトルは、４と１０との間でのｐＨの変化によって影響されず、多くの生物学的用途についてフルオレセインを超える重要な利点である。このグループとしては、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミンおよびＴｅｘａｓ  ＲｅｄＴＭ誘導体が挙げられる。本発明に従うペプチドを誘導体化するための他の好ましい発蛍光団は、紫外光によって励起される発蛍光団である。例としては、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン（このダンシルクロリドがメンバーである）、ピレンおよびピリジルオキサゾール誘導体が挙げられる。標識としては、最近記載されている２種の関連無機材料もまた含まれる：例えば硫酸カドミウムを含む半導体ナノクリスタル（Ｂｒｕｃｈｅｚ，Ｍ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１３−２０１６（１９９８））および量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）を含む半導体ナノクリスタル（例えば、亜鉛−スルフィド−キャップしたセレン化カドミウム）（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１６−２０１８（１９９８））。
【０１７６】
なお別のアプローチにおいて、Ｄ５ポリペプチドのアミノ基は、蛍光性生成物（例えば、フルオレスカミン、ジアルデヒド（例えば、ｏ−フタルジアルデヒド、ナフタレン−２，３−ジカルボキシレート、およびアントラセン−２，３−ジカルボキシレート））を生じる試薬と反応される。７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）誘導体（塩化物およびフッ化物の両方）は、アミンを修飾して蛍光性生成物を生じるのに有用である。
【０１７７】
Ｄ５ポリペプチドはまた、検出のために、蛍光発光金属（例えば、１５２Ｅｕ）またはランタニド系列の他の金属を使用して標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を使用して、ペプチドに結合され得る。無水形態のＤＴＰＡは、ＮＨ２保有Ｄ５ポリペプチドを容易に修飾し得る。
【０１７８】
インビボでの診断または治療のために、放射性核種は、ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡのようなキレート化剤を使用して、直接的または間接的にのいずれかで、Ｄ５ポリペプチドに結合され得る。このような放射性核種の例は、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙおよび２０１Ｔｌである。一般に、診断用途における検出可能性のために必要な標識Ｄ５ポリペプチドの量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度、禁忌（存在する場合）、ならびに他の変量のような考慮に依存して変化し、そしてこれは個々の医師または診断医によって調整されるべきである。用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇで変化し得る。
【０１７９】
このＤ５ポリペプチドはまた、リン光化合物または化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能にされ得る。次いで、化学発光タグ化ペプチドの存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。同様に、生物発光化合物は、ペプチドを標識するために使用され得る。生物発光は、生物系において見出される化学発光の１つの型であり、ここで、触媒的タンパク質は、化学発光反応の効率を増大する。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１８０】
なお別の実施形態において、高い吸光率を有する発色団を有するか、またはこの発色団を生じる発色化合物に基づいて、比色検出が使用される。
【０１８１】
標識されたＤ５ポリペプチドのインサイチュ検出は、被験体から組織学的試料を取り出し、そして標識を検出するための適切な条件下で顕微鏡によってこれを試験することによって、達成され得る。当業者は、広範な種々の組織学的方法のいずれか（例えば、染色手順）が、このようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを容易に理解する。
【０１８２】
用語「診断上、標識された」とは、Ｄ５ポリペプチドが，診断上で検出可能な標識に結合していることをいう。当業者に公知の、多くの標識および標識方法が存在する。本発明において使用されエアロゾルる標識型の例としては、放射性同位元素、常磁性同位元素および陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）により画像化され得る化合物が挙げられる。当業者は、本発明に用いられるＤ５ポリペプチドに結合する適切な標識について、知っているか、または例えば、日常的実験により確認し得る。
【０１８３】
診断的インビボ放射線画像化（ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ）のために、利用可能な検出手段の型は、放射性核種を選択するのに、重要な要因である。選択された放射性核種は、特定の手段により検出可能な崩壊の型を有さなければならない。一般に、診断的画像を可視化する従来の任意の方法は、本発明に従って利用され得る。インビボ診断のための放射性核種を選択する他の因子は、標識が、宿主に有害な照射が最小限になるのに十分短いが、標的組織に最大限に取りこまれる場合になお検出可能であるのに、十分な半減期の長さである。１つの好ましい実施形態において、インビボ画像化に使用される放射性核種は、粒子を放射しないが、多数の光量子を１４０〜２００ｋｅＶの範囲で産生し、これらは、従来のγカメラにより容易に検出可能であり得る。
【０１８４】
（試薬組成物）
別の実施形態において、本発明のＤ５ポリペプチドまたは誘導体は、アッセイにおいて、Ｄ５ＢＳに結合する親和性リガンドとして使用され、アフィニティークロマトグラフィーを調製し、そしてＤ５ＢＳを有する分子（例えば、Ｄ５レセプター）の固相分離に使用される。このような組成物はまた、好ましくは特異的レセプター−リガンド相互作用を介する、フローサイトメトリー法および／または固相法を用いて、Ｄ５５ポリペプチドが結合する細胞を、同定、濃縮、精製もしくは単離するのために使用され得る。Ｄ５ポリペプチド（または誘導体）は、従来の方法（例えば、以下にビオチン化Ｄ５ポリペプチドを共に結合する方法：ＣＮＢｒ活性化セファロース（登録商標）もしくはＣＮＢｒ活性化アガロース（登録商標）、ＮＨＳ−アガロース（登録商標）もしくはＮＨＳ−セファロース（登録商標）、エポキシ活性化セファロース（登録商標）もしくはエポキシ活性化アガロース（登録商標）を用いて、ＥＡＨ−セファロース（登録商標）もしくはＥＡＨ−アガロース（登録商標）、ストレプトアビジンセファロース（登録商標）もしくはストレプトアビジンアガロース（登録商標））を用いて固定化される。一般に、本発明のＤ５ポリペプチドまたは誘導体は、示された目的のために、これらの化合物を固相に結合し得る、他の任意の方法によって固定化され得る。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を参照のこと。従って、１つの実施形態は、本明細書に記載されるＤ５ポリペプチド、Ｄ５誘導体またはＤ５ペプチド模倣物のいずれかを含む組成物であり、これは、固体支持体または樹脂に結合する。この化合物は、直接またはスペーサー（好ましくは約２〜１２炭素原子を有する脂肪族鎖）を介して、結合され得る。
【０１８５】
「固相」または「固体支持体」または「キャリア」は、Ｄ５ポリペプチドまたはＤ５誘導体に結合し得る任意の支持体もしくはキャリアを意図する。上記のセファロース（登録商標）もしくはアガロース（登録商標）に加え、周知の支持体またはキャリアは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース（例えば、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニリデンジフルオリド、他のアガロース、ならびに磁鉄鉱（磁気ビーズを含む）である。このキャリアは、全体的に不溶性であるか、部分的に可溶性であり得る。結合した分子が、レセプター物質に結合し得る限り、支持物質は、可能な任意の構造構成を有し得る。従って、支持体の構成は、ビーズのような球状、あるいは試験管もしくはマイクロプレートウェルの内部表面、またはロッドの外部表面のような円柱状であり得る。あるいは、この表面は、シート、試験紙、マイクロプレートの底表面などのように平らであり得る。
【０１８６】
本発明の組成物は、所望される動物種の任意の適切な細胞、組織、器官もしくは生物学的サンプルと関連して、診断的、予後的または研究行程において使用され得る。用語「生物学的サンプル」とは、正常被験体または罹患した被験体の身体に由来する任意の流体または他の物質（例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、乳液、羊水、胆汁、腹水、膿など）をいう。この用語の意味としてはまた、器官または組織抽出物、および被験体由来の任意の細胞または組織調製物をインキュベートした培養液が挙げられる。
【０１８７】
（薬学的組成物および治療組成物ならびにこれらの投与）
本発明の薬学的組成物に使用され得るＤ５ポリペプチドとしては、上記全ての化合物およびこれらの化合物の薬学的に受容可能な塩が挙げられる。塩基性基を有する、本発明の薬学的に受容可能な酸付加塩は、適切な強酸、中程度の強酸、無毒性酸、有機酸または無機酸で、当業者に公知の方法で形成される。本発明に挙げられる酸付加塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩塩、リン酸塩および硝酸塩が挙げられる。
【０１８８】
酸性基を有する、本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩基付加塩は、公知の方法により、有機塩基および無機塩基から調製されて、例としては、無毒性のアルカリ金属塩基およびアルカリ土類塩基（例えば、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウム）；および無毒性の有機塩基（例えば、トリエチルアミン、ブチルアミン、ピペラジンおよびトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミンが挙げられる。
【０１８９】
上記のように、本発明のＤ５ポリペプチドは、新脈管形成を阻害する能力、すなわち、癌（特に転移性癌）の処置に用いられる特性を有する。本発明の組成物は、それ自体で活性であり得るか、またはインビボで活性体に変換される「プロドラッグ」として作用し得る。
【０１９０】
本発明の範囲内の組成物としては、Ｄ５ポリペプチドが、意図される目的を達成するのに有効な量で含まれる、全ての組成物が挙げられる。個々の必要性が変化する限り、各構成成分の有効量の最適範囲を決定することは、当業者の範囲内である。典型的な投与量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／体重を網羅するが、より好ましい投与量は、特定の使用（以下）について記載される。
【０１９１】
本発明のＤ５ポリペプチドおよびこれらの薬学的に受容可能な塩は、従来の投与形態（例えば、カプセル剤、浸透性のカシェ剤、錠剤または注射用処方物）中に取りこまれ得る。薬学的に受容可能な固体または液体のキャリアを用い得る。
【０１９２】
好ましくは、本発明の化合物は、全身投与される（例えば、注射または輸液により）。使用される場合、任意の既知の経路（好ましくは静脈内、皮下、筋肉内、脳内または腹腔内）により注射され得る。他の適切な経路としては、直腸（例えば、坐剤）、膣内；陰茎内、鼻腔内；気管支内；耳内；または眼内が挙げられる。好ましい投与経路は、全身性であるが、薬学的組成物は、経皮的または局所的に投与され得る（例えば、軟膏剤、クリーム剤またはゲル）。さらに、この組成物は、当該分野で周知の、放出調節されたビヒクル中に取りこまれ得る。吸入経路もまた考慮される。注射剤は、従来の形態（溶液もしくは懸濁液、溶液もしくは懸濁液に適した注射前の固体形態、または乳剤のいずれかとして）中に調製され得る。
【０１９３】
あるいは（または同時に）、経口経路で投与され得る。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、必要な場合、同時に処置される種類、処置の頻度および所望される影響の性質に依存する。
【０１９４】
注射または経口投与のために適した溶液は、約０．０１〜９９％の活性化合物を、希釈剤と共に含み得る。
【０１９５】
固体キャリアとしては、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、石膏、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸が挙げられる。液体キャリアとしては、シロップ剤、ピーナッツ油、オリーブ油、食塩水、水、デキストロース、グリセリン等が挙げられる。同様に、キャリアまたは希釈剤は、任意の放出遅延物質（例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン）を単独または蝋と共に含む。液体キャリアを用い場合、調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、軟質ゼラチンカプセル、滅菌注射用液（例えば、溶液）（例えば、アンプル剤）、または水性または非水性の液体懸濁物の形態中にあり得る。このような薬学的組成物の概説は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｇｅｎｎａｒｏ  第１８版  １９９０）に見出され得る。
【０１９６】
この薬学的調製物は、薬学的化学の従来技術（錠剤形態が必要な場合、混合、顆粒化および圧縮のような工程、または混合、充填、および適宜成分を溶解する工程を含む）に従って作られて、所望の経口投与、非経口投与、局所的投与、経皮的投与、直腸投与などのための産物を提供する。この薬学的組成物はまた、無毒の補助剤（例えば、湿潤剤または乳化剤）およびｐＨ緩衝化剤などを少量含み得る。
【０１９７】
肺注入のために、エアロゾル溶液が使用される。スプレー可能なエアロゾル調製物において、活性タンパク質は、固体または液体の不活性キャリア物質と共に組み合わせられ得る。これはまた、圧縮ビン中に詰められ得るか、または圧縮揮発物（通常は、気体噴霧剤）と混合され得る。このエアロゾル調製物は、溶媒、緩衝液、界面活性剤および抗酸化剤を、本発明のタンパク質に添加して含み得る。鼻投与が、ペプチドおよびタンパク質の送達のための非常に実現可能な経路となっているので、本発明者らはまた、鼻投与について簡潔に言及すべきである。
【０１９８】
局所投与のために、この化合物は、局所的に適用されるビヒクル（例えば、軟膏剤（ｓａｌｖｅまたはｏｉｎｔｍｅｎｔ）中に取りこまれ得る。活性成分のためのキャリアは、スプレー可能形態またはスプレー可能でない形態のいずれかであり得る。スプレー可能でない形態は、局所的適用のための固有キャリアを含み、好ましくは水より大きい動的粘度を有する半固体または固体形態であり得る。適切な処方剤としては、溶液、懸濁物、乳剤、クリーム剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、リニメント剤、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）などが挙げられるがこれらに限定されない。必要な場合、これらは、滅菌され、補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝化剤または浸透圧に影響する塩など）と混合され得る。スプレー可能でない局所的調製物に好ましいビヒクルとしては、基礎剤（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００））；従来のクリーム剤（例えば、ＨＥＢクリーム）；ゲル：およびワセリンなどが挙げられる。
【０１９９】
スプレー可能なエアロゾル調製物もまた局所適用に適しており、ここで活性化合物は、好ましくは、固体または液体の不活性なキャリア物質を組み合わされ、圧縮ビン中に詰められるか、または圧縮揮発物（通常、気体噴霧剤）に混合される。エアロゾル調製物は、溶媒、緩衝液、界面活性剤、芳香剤および／または抗鎖酸化剤を、本発明の化合物に添加して含み得る。
【０２００】
好ましい局所的適用のために（特にヒトに対して）、この化合物を罹患した領域（例えば、皮膚表面、粘膜、眼など）に、有効量を投与することが好ましい。この量は、適用につき約０．００１ｍｇ〜約１ｇの範囲が一般的であり、これは、処置される領域、症状の重篤度および用いる局所的ビヒクルの状態に依存する。  本発明に記載のＤ５ポリペプチドのための他の薬学的に受容可能なキャリアは、リポソームであり、活性化タンパク質が含まれる薬学的組成物は、脂質層に接着した水性の同心性層からなる小体中に、分散されるかまたは多様に存在する。活性タンパク質は、好ましくは、水性層および脂質層の内側または外側に存在するか、あるいは、いずれにしても、リポソーム懸濁物として一般に公知の非同種系中に存在する。
【０２０１】
疎水性層（すなわち脂質層）は、排他的ではないにしても、一般に、リン脂質（例えば、レシチンおよびスフィンゴミエリン）、ステロイド（例えば、コレステロール）、イオン性表面活性物質（例えば、ジセチルホスフェート、ステアリルアミンまたはスファチジン酸）および／または他の疎水性状態物質を含む。
【０２０２】
本発明の治療的組成物は、Ｄ５ポリペプチドに加えて、１つ以上のさらなる抗腫瘍剤（例えば、分裂阻害剤（例えば、ビンブラスチン）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）；葉酸阻害剤（例えば、メトトレキサート、ピリトレキシムまたはトリメトレキサート）；代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシド）；インターカレート抗生剤（例えば、アドリアマイシンおよびブレオマイシン）；酵素または酵素インヒビター（例えば、アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼインヒビター（例えば、エトポシド））；またはサイトカインもしくは「生物学的応答修飾因子」（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン）を含み得る。実際に、任意の公知の癌治療剤を本明細書で開示されるＤ５ポリペプチドと組み合わせて含む薬学的組成物は、本発明の範囲内である。この薬学的組成物はまた、１つ以上の他の医薬（例えば、抗感染剤（抗細菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤および抗コクシジウム剤）、鎮痛剤など）を含み、リスクに面している標的患者のさらなる症状を処置し得る。
【０２０３】
本発明は、多くの動物属および種のいずれかの診断または処置に使用され得、ヒトの医学または獣医学の実施において、等価に適用され得る。従って、この薬学的組成物を用いて、家畜および市販の動物（鳥を含む）ならびにより好ましくは哺乳動物およびヒトを処置し得る。
【０２０４】
（他の治療組成物）
別の実施例において、本発明のＤ５ポリペプチド化合物は、「治療的に抱合され」、治療剤を、この化合物が目指すところでありかつ結合する部位（例えば、腫瘍転移部位または感染／炎症部位）に送達するために使用される。用語「治療的に抱合され」とは、修飾Ｄ５ポリペプチドまたはペプチド模倣物が、腫瘍浸潤、新脈管形成または炎症の根本にある原因または「成分」のいずれかを指向する、他の治療剤に結合することである。
【０２０５】
本明細書における、有用な治療的放射性同位元素の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｂｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃおよび１０９Ｐｄが挙げられる。これらの原子は、Ｄ５ポリペプチド化合物に、キレートの一部として直接的、間接的に結合し得、またはヨードの場合、ヨード化Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ基の一部として間接的に結合し得る。放射性ヨードは、これらの基がＤ５ポリペプチド化合物に結合される前か後のいずれかで導入され得る。
【０２０６】
放射性ヌクレオチド抱合体の好ましい用量は、標的部位に送達されるべき比放射能に相関するものであり、これは、腫瘍型、腫瘍部位および血管新生、Ｄ５ポリペプチドキャリアの反応速度および体内分布、核種による放射性排出物のエネルギーなどで変化する。放射線治療の当業者は、Ｄ５ポリペプチドの用量を、特定の核種の用量に合わせて、容易に調節し得て、過度の実験をせずに所望される治療的利益を及ぼし得る。例えば、１３１Ｉ−Ｄ５の有効量は、脳内腫瘍について、腫瘍１グラムあたり約１〜１０００μＣｉである。
【０２０７】
本明細書に挙げられる別の治療的アプローチは、ホウ素中性子捕捉治療の使用であり、ここで、ホウ素化ポリペプチドは、所望される標的部位（例えば、腫瘍、最も好ましくは脳内腫瘍）に送達される（Ｂａｒｔｈ、Ｒ．Ｆ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．１４：５３４−５５０（１９９６）；Ｍｉｓｈｉｍａ、Ｙ．（編）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、１９９６；Ｓｏｌｏｗａｙ、Ａ．Ｈ．ら（編）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ．３３：１−１８８（１９９７））。安定な同位体１０Ｂは、低エネルギー（＜０．０２５ｅＶ）熱中性子で照射され、生じる核捕捉は、高い線エネルギー付与およびそれぞれ約９および５μｍの経路長を有するα粒子および７Ｌｉ核を生じる。この方法は、血中、内皮細胞および正常組織（例えば、脳）で低レベルである、腫瘍内の１０Ｂ集積に基づいて断定する。このような送達は、上皮増殖因子を用いて達成される（Ｙａｎｇ．Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：４３３３−４３３９（１９９７））。
【０２０８】
本発明の方法に従うＤ５ポリペプチド化合物に結合し得る他の治療剤は、薬物、プロドラッグ、プロドラッグを活性化する酵素、光感受性剤、遺伝子治療剤、アンチセンスベクター、ウイルスベクター、レクチンおよび他の毒素である。
【０２０９】
投与される治療用量は、公知であるかまたは当業者に容易に確認可能であるような量である。この用量はまた、レシピエントの年齢、健康および体重、必要な場合に、同時にされる治療の種類、治療の頻度、および所望される効果の性質（例えば、抗炎症効果または抗細菌効果）に依存する。
【０２１０】
レクチンは、タンパク質であり、一般に植物に由来し、炭水化物に結合する。他の活性物のなかで、いくつかのレクチンは毒性である。最も細胞傷害性である公知の物質のいくつかは、細菌または植物起源のタンパク質毒素である（Ｆｒａｎｋｅｌ、Ａ．Ｅ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３７：１２５−１４２（１９８６））。これらの分子は、細胞表面に結合し、タンパク質合成を阻害する。最も一般に使用される植物性毒素は、リシンおよびアブリンであり；最も一般に使用される細菌性毒素は、ジフテリア毒素およびシュードモナス属の細胞外毒素Ａ（または毒性鎖もしくはこれらのフラグメント）である。リシンおよびアブリンにおいて、結合機能および毒性能は、２つの別々のタンパク質サブユニット（ＡおよびＢ鎖）に含まれる。リシンＢ鎖は、細胞表面炭水化物に結合して、Ａ鎖の細胞内への取りこみを促進する。一旦、細胞内に入ると、リシンＡ鎖は、真核生物のリボソームの６０Ｓサブユニットを不活化することにより、タンパク質合成を阻害する（Ｅｎｄｏ、Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５９０８−５９１２（１９８７））。他の植物由来の毒素で、単鎖リボソーム阻害タンパク質であるものとしては、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、麦芽タンパク質、ゲロニン、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎｓ）、モノルカリン（ｍｏｎｏｒｃｈａｒｉｎｓ）、トリコサンチン（ｔｒｉｃｈｏｓｎｔｈｉｎ）および他多数が挙げられる（Ｓｔｒｉｐ、Ｆ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９５：１−８（１９８６））。ジフテリア毒素およびシュードモナス属の細胞外毒素Ａはまた、単鎖タンパク質であり、これらの結合機能および毒性能は、２つのドメイン間でのタンパク質性切断に必要な十分な毒性活性を有する同じタンパク質鎖の別々のドメイン中に存在する。シュードモナス属の細胞外毒素Ａは、ジフテリア毒素と同じ触媒活性を有する。リシンは、その毒性α鎖を、標的分子（例えば、毒性効果の部位特異的送達を可能にする抗体）に結合することにより、治療的に使用される。細胞性毒素はまた、抗腫瘍抱合体として使用される。本明細書において意図されるように、毒性ペプチド鎖またはドメインは、本明細書の化合物に結合されて、部位特異的様式で、毒性活性が必要とされる標的部位（例えば、転移病巣）に送達される。タンパク質（例えば、抗体または他のリガンド）への毒素の結合は、当該分野で公知であり、本発明に直接適用され得る。例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４５３９−４３（１９８０）（ジフテリア毒素）；Ｋｒｏｌｉｃｋ、Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：５４１９−２３（１９８０）（リシン）；米国特許第４，３５０，６２６号（リシンＡ鎖）；Ｔｈｏｒｐｅ、Ｐ．Ｅ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：４４７−４５４（１９８１）（ゲロニン）；Ｔｈｏｒｐｅ、Ｐ．Ｅ．ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ａ．Ｊ．ら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８２、１６７−２０１頁；Ｔｈｏｒｐｅ、Ｐ．Ｅ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ、Ａ．ら編、Ｅｄｉｔｒｉｃｅ  Ｋｕｒｔｉｓ  ｓ．ｒ．ｌ．、１９８５、４７５−５０６頁；Ｖｉｔｅｔｔａ、Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６４４−６５０（１９８３）；Ｖｉｔｅｔｔａ、Ｅ．Ｓ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１９７−２１２（１９８５）；Ｐａｓｔａｎ、Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ  ４７：６４１−６４８（１９８６）；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｄ．ら、ＪＮＣＩ  ８１：１４５５−６３（１９８９）；Ｄｉｌｌｍａｎ、Ｒ．Ｏ．、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１１：５９２−６０３（１９８９）；Ｏｌｓｎｅｓ、Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １０：２９１−２９５（１９８９））；Ｌｏｒｄ、Ｊ．ら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  １１：１９３−２１１（１９８９）；Ｏｅｌｔｍａｎｎ、Ｔ．Ｎ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．５：２３３４−２３３７（１９９１）を参照のこと。
【０２１１】
重大な細胞内行程（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質合成を含む）に介入する細胞傷害性薬物は、抗体に結合され、続いてインビボ治療に使用される。このような薬物（ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびマイトマイシンＣが挙げられるが、これらに限定されない）もまた、本発明の化合物に結合されて、この形態で治療的に使用される。
【０２１２】
本発明の別の実施形態において、光感受性剤は、腫瘍へ直接送達するために、本発明の化合物に、結合され得る。
【０２１３】
上記のように、裸のＤＮＡの形態または物理学的もしくは「生物学的」送達ビヒクルにおけるｃＤＮＡのようなＤＮＡもまた、治療組成物として意図される。
【０２１４】
（治療方法）
本発明の方法を使用して、被験体における腫瘍増殖および腫瘍浸潤を阻害し得るか、または腫瘍により誘導される新脈管形成を、内皮細胞増殖および遊走を阻害することにより抑制し得る。腫瘍増殖もしくは腫瘍浸潤または新脈管形成を阻害することにより、この方法は、腫瘍転移の阻害をもたらす。脊椎動物被験体（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）に、腫瘍増殖、腫瘍浸潤または新脈管形成を阻害するのに有効な量の化合物を投与する。この化合物またはこれらの薬学的に受容可能な塩は、好ましくは上記のような薬学的組成物の形態で投与される。
【０２１５】
化合物の用量は、好ましくは、Ｄ５ポリペプチドの有効量を含む、薬学的用量単位を含む。有効量とは、インビボでの定常状態濃度に達するのに十分な量を意味し、これは、任意の疾患関連パラメーター（原発性または転移性腫瘍の増殖、任意の受容された炎症応答性インデックスまたは疾患のない間欠期もしくは生存の適度な延長を含み得る）において、適度な減少を生じる。例えば、２０％の患者における腫瘍増殖の減少は、有効である（Ｆｒｅｉ  ＩＩＩ、Ｅ．、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：１２７−１３６（１９９７））。しかし、この程度の効果は、本発明に従う有効な用量に対して、最小限必要であるとは考えない。
【０２１６】
１つの実施形態において、有効量は、本明細書に記載されるインビボアッセイにおいての、化合物の５０％有効量（ＥＤ５０）よりも、好ましくは１０倍高く，より好ましくは、１００倍高い。
【０２１７】
投与される活性化合物量は、正確なＤ５ポリペプチド、融合ポリペプチドまたは選択された誘導体、疾患または状態、投与経路、レシピエントの健康状態および体重、必要な場合は、他の同時処置の存在、処置の頻度、所望される効果の性質（例えば、腫瘍転移阻害）、ならびに熟練した開業医の判断に依存する。
【０２１８】
腫瘍に罹患した被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒト）を処置する好ましい用量は、体重１キログラムあたり、活性化合物約１００ミリグラムの量までである。Ｄ５ポリペプチドまたはペプチド模倣物の典型的な単回用量は、約１ｎｇと約１００ｍｇ／体重ｋｇとの間である。局所的投与のために、約０．０１〜２０％濃度（体重による）の範囲の化合物用量（好ましくは１〜５％）が示唆される。約０．１ミリグラム〜約７グラム（？？）の範囲の毎日の用量合計が静脈内投与に好ましい。しかし、前述の範囲は、個々の処置レジメンにおける変数の数が多いことを示唆し、これらの好ましい値からの考慮され得る排除が予期される。
【０２１９】
インビトロでの浸潤を阻害するためのＤ５ポリペプチドの有効量または投与量は、細胞あたり約１ピコグラム〜０．５ナノグラムの範囲である。有効量または最適な投与量範囲は、本明細書に記載される方法を用いて、インビトロで決定され得る。
【０２２０】
上記のように、本発明のＤ５ポリペプチドをコードするＤＮＡは、記載される経路および手段で投与され得て、その結果、ポリペプチド産物は、インビボで、被験体中で産生され、このことによりその薬理学的効果を媒介することが可能になる。
【０２２１】
本発明の化合物は、細胞の遊走および浸潤、腫瘍細胞および内皮細胞の増殖、新脈管形成、腫瘍転移または炎症応答における阻害効果を産生すうように特徴付けられ得る。この化合物は特に、腫瘍を有する哺乳動物宿主（好ましくはヒト）における抗腫瘍効果を生じるのに有用である。
【０２２２】
前述の組成物および処置方法は、所望されない遊走、増殖、新脈管形成または転移に関連する任意の疾患もしくは状態に罹患した被験体における内皮細胞の遊走および増殖を阻害するのに有用である。このような疾患または状態は、上記に挙げられる。
【０２２３】
さらに最近、新脈管形成インヒビターは、外傷性脊髄損傷後の炎症性の新脈管形成およびグリオーシスを予防する働きをし、このことにより、ニューロンの結合の回復を促進し得ることが明らかになった（Ｗａｍｉｌ、Ａ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３１８８−１３１９３（１９９８））。従って、本発明の組成物は、外傷性脊髄損傷後、速やかに投与され、その後数日間から約２週間まで投与されて、ニューロンの結合回復を立体的に妨げる新脈管形成およびグリオーシスを阻害する。この処置は、脊髄損傷部位の損傷領域を減少して、ニューロンの機能の再生を促進し、このことにより麻痺を予防する。本発明の化合物はまた、ウォーラー変性、逆性アミノ酪酸媒介性脱分極（ニューロンの損傷で生じる）から軸索を保護し、単離された中枢神経系細胞および組織の培養中でのニューロン伝導率の回復を改善することが予期される。
【０２２４】
本発明の組成物により生じる新脈管形成阻害は、種々の疾患（癌、網膜症、炎症およびアテローム性動脈硬化が挙げられる）の処置において、所望される効果である。従って、本発明の新脈管形成インヒビターの適用は、広範囲であり、以下の処置が挙げられる：原発性および転移性の固形腫瘍の増殖、良性高血圧、アテローム性動脈硬化、心筋の新脈管形成、バルーン血管形成術後血管再狭窄、血管傷害後の新内膜形成、血管移植片再狭窄、冠状動脈側副枝形成、深在静脈血栓症、虚血性四肢新脈管形成、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、角膜疾患、ルベオーシス、血管新生緑内障、糖尿病性もしくは他の網膜症、水晶体後線維増殖症、糖尿病性新生血管形成、黄斑変性、子宮内膜症、関節炎、慢性炎症状態に関連した線維症（乾癬強皮症を含む）、肺線維症、化学療法誘導性線維症、瘢痕性脱毛症および線維症を伴う創傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、および脈管形成障害、造血障害、排卵障害、月経障害、妊娠障害および胎盤形成障害、または内被細胞の遊走もしくは新脈管形成が病因もしくは所望されない任意の他の疾患もしくは状態。いくつかの特定の疾患のカテゴリー（上に挙げられるいくつかの状態が挙げれられる）を以下に記載する。
【０２２５】
（脳腫瘍）
最も高度な新生血管形成腫瘍のうちで公知である特定の脳腫瘍は、脈管形成刺激により影響を受け、それゆえ新脈管形成のインヒビターにとって適切な標的である。例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．７４：９０〜９４（２０００）；Ｍｏｈａｎａｍら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１４：１６９〜７４（１９９９）；Ｇｌａｄｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１１５０〜６０（１９９５）；Ｋｉｎｄｅｒら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．５：４０９〜１４（１９９３）を参照のこと。それゆえ、本発明の薬学的組成物は、以下を含む多くの脳腫瘍のいずれかの処置のために意図されるが、これらに限定されない：星状細胞種、未分化星状細胞腫、膠芽腫、多形性膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫、上衣下巨細胞星状細胞腫、線維性星状細胞腫、大円形細胞性星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、乏突起膠腫、退形成型乏突起膠腫、上衣腫、退形成型上衣腫、粘液乳頭型脳室上衣腫、上衣下腫、混合性星状細胞腫および悪性乏突起星状細胞腫。
【０２２６】
（子宮内膜組織の障害）
子宮内膜症は、異所性の子宮内膜が異常な位置に存在する状態であり、卵巣が最も一般的な部位である。腺筋症は、子宮内膜組織が子宮の子宮筋層を貫通するのと類似の状態である。子宮内膜症の組織は、その移植および浸潤する能力において、新生物組織に似ている。Ｓｉｌｌｅｍ  Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．３：１１０１〜１１０５（１９９７）を参照のこと。したがって、本発明の薬学的組成物は、子宮内膜症、腺筋症、子宮内膜癌および卵巣の類内膜腫瘍の処置のために意図される。
【０２２７】
（眼性新生血管形成）
眼性新生血管形成は、世界中で主要な失明の原因である（Ｌｅｅら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｈｍｏｌ．４３：２４５〜２６９（１９９８））。この過程によって引き起こされる最も共通の疾患は、増殖性糖尿病網膜症、血管新生の年齢関連黄斑変性（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、および未熟網膜症である（ＮｅｅｌｙおよびＧａｒｄｎｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５３：６６５〜６７０（１９９８））。新生血管形成に起因する視覚の喪失を生じる他の疾患は、鎌状赤血球網膜症、網膜静脈の閉鎖、および目における特定の炎症性状態である。また、Ｄａｓら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：８０９〜８１３（１９９９）を参照のこと。したがって、本発明の薬学的組成物は、眼性新生血管形成、それらのうちの主要なもの、増殖性糖尿病網膜症、血管新生の年齢関連黄斑変性、未熟網膜症、鎌状赤血球網膜症および網膜静脈閉鎖に関する疾患または障害のいずれかを処置するために意図される。
【０２２８】
（Ｄ５のエピトープに特異的な抗体）
Ｄ５のエピトープ、好ましくは、全長ＨＫａにおいて非存在のエピトープに特異的な抗体もまた、本発明の範囲内に含まれる。このようなエピトープの存在は、多くの抗血清がＤ５に応答しないＨＫａに対して調製されるという事実によって支持される。全長ＨＫタンパク質由来のＤ５の切断は、新しいエピトープを曝露する。（実際に抗体と相互作用する抗原の領域は、抗原決定基または「エピトープ」と呼ばれる。概略をいうと、エピトープの効果的な大きさは、抗体の結合部位の大きさ：例えば、直鎖状ペプチド抗原の約５〜６アミノ酸の大きさに対応する。本明細書中で使用されるように、「エピトープ」は、抗体による結合により認識される能力のあるＤ５ポリペプチドの一部分をいう。）
用語「抗体」は、Ｄ５エピトープを含む免疫原で免疫された動物の血清に由来するモノクローナル抗体ｍＡｂ、ポリクローナル抗血清中の抗体の両方をいう。当業者に公知の方法により得られ得るｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスおよびそれらの任意のサブクラスであり得る。抗体としてはまた、以下に記載されるキメラ抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられる。
【０２２９】
用語「抗体」はまた、インタクトな４鎖Ｉｇ分子およびそれらのフラグメント（例えば、抗原を結合する能力のあるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、ならびにＦｖおよび単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のような）の両方を含むことが意味される。ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に澄み、そしてインタクトな抗体よりも非特異的でない組織結合性を有する（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５（１９８３））。本発明において有用な抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖのフラグメントまたは形態が、インタクトな抗体と同様の様式でＤ５ポリペプチドの決定および定量のために用いられ得ることが理解される。慣用的なフラグメントは、代表的に、パパイン（Ｆａｂフラグメントに対して）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントに対して）のような酵素を用いるタンパク質分解的な切断によって生成される。Ｆｖフラグメントは、（Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｊ．ら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０〜１１３５；Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ，ら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：１５９１〜１５９４）において記載される。ｓｃＦｖポリペプチドは、目的のＩｇに由来する超可変領域を含み、そしてインタクトなＩｇの大きさの断片ではあるが、天然のＩｇの抗原結合部位を再現する（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８〜１０４１；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７〜５１５；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３〜２９９）；Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９；米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，８５３，８７１号、同第４，９４，６７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号。
【０２３０】
キメラ抗体はＩｇ分子であり、ここで、この分子の異なる部分は異なる動物種から由来する。１つの例は、マウスｍＡｂおよびヒトＩｇ定常領域に由来する可変領域を有するＩｇである。キメラ抗体およびそれらの生成方法は、当該分野において公知である（Ｃａｂｉｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３〜３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３〜６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日に公開された）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８〜２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許１７１４９６号（１９８５年２月１９日に公開された）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許第１７３４９４号（１９８６年３月５日に公開された）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日に公開された）；Ｋｕｄｏら、欧州特許１８４１８７号（１９８６年６月１１日に公開された）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許第１７３４９４号（１９８６年３月５日に公開された）；Ｓａｈａｇａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６〜１０７４（１９８６）；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９〜３４４３（１９８７）；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４〜２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３（１９８８））。これらの参考文献は、参考として本明細書中に援用される。
【０２３１】
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、他の抗体の抗原結合部位に一般的に関連する特有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されているｍＡｂを有するｍＡｂの供給源として、同種および同遺伝型（例えば、マウス系）の動物を免疫することによって調製され得る。免疫動物は、これらのイディオタイプの決定基（抗Ｉｄ抗体）に対する抗体を産生することにより、免疫抗体のイディオタイプエピトープを認識し、そして応答する。この抗Ｉｄ抗体は、さらに別の動物において免疫応答を誘導するための「免疫原」として用いられ得る（いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生する）。抗抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導する本来のｍＡｂに対して、エピトープ的に同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一な特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【０２３２】
したがって、本発明のＤ５ポリペプチドに対して産生されるｍＡｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのような適切な動物において抗Ｉｄ抗体を誘導するために用いら得る。このように免疫したマウス由来の脾臓細胞は、抗Ｉｄ  ｍＡｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを作製するために用いられる。さらに、抗Ｉｄ  ｍＡｂは、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のようなキャリアに結合し、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスをさらに免疫するために用いられ得る。これらのマウス由来の血清は、Ｄ５エピトープに対して特異的な本来のｍＡｂの結合特性を有する抗抗Ｉｄ抗体を含む。したがって、この抗Ｉｄ  ｍＡｂは、それらの自体のイディオタイプエピトープを有するか、またはＤ５エピトープのような評価されているエピトープに構造的に類似した「イディオトープ」を有する。
【０２３３】
本発明において有用な抗体または抗体のフラグメントは、Ｄ５ポリペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために用いられ得る。例えば、これは、治療用量のポリペプチドを受けている被験体の、循環または組織におけるＤ５ポリペプチドのレベルをモニタリングするために設計され得る。したがって、本発明において有用な抗体（またはそれらのフラグメント）は、Ｄ５の存在を検出するために組織学的に使用され得る。
【０２３４】
Ｄ５ポリペプチドについてのアッセイは、代表的に被験体由来の生物学的サンプルを、検出可能に標識した特異的抗体または抗体フラグメントの存在下においてインキュベートする工程、およびサンプルにおいて結合される抗体を検出する工程を包含する。したがって、本発明のこの局面において、生物学的サンプルは、ニトロセルロース、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定する能力のある他の固体支持体を用いて処置され得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄された後に、検出可能に標識された特異的抗体を用いて処置される得る。次いで、固相支持体を緩衝液で２回洗浄し、結合していない抗体を取り除き得る。次いで、上記の固体支持体上に結合した標識の量は、慣用的な手段によって検出され得る。
【０２３５】
「固相支持体」または「キャリア」とは、Ｄ５ポリペプチドまたはＤ５抗体に結合する能力のある任意の支持体を意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁鉄鉱が挙げられる。この支持体材料は、この結合分子が抗原または抗体に結合する能力のある限りは、任意の実質的に可能性のある構造的位置を有し得る。
【０２３６】
Ｄ５ポリペプチドに対して特異的な抗体の結合活性は、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、特に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような周知の方法に従って決定され得る。このようなアッセイは、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｈｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ（第１１章）：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＴＩＧＥＮＳ，第一巻（Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  １９９２，２０９頁〜２５９頁；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ＥＬＩＳＡ（第２９章），：ｖａｎ  Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ら、（編），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９９４，７５９頁〜８０３頁；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１；Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ  ５３：５５〜６５（１９７６）；Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７〜５２０（１９７８）；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，３月，１９８６，１〜５頁，４６〜４９頁および６８〜７８頁；Ｃｈａｒｄ，Ｔ．，”Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎ：Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，（１９７８）に記載されている。
【０２３７】
当業者は、慣用的な実験を実施することにより、各々の決定に対して効果的なおよび至適なアッセイ条件を決定し得る。ＥＩＡについて、抗体は酵素に連結することにより検出可能に標識される。言い換えると、その基質に後に曝露された場合、この酵素は、例えば、分光光度的手段、蛍光定量的手段または視覚的手段によって検出され得る化学的部分を生成するような様式において、この基質と反応する。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ。
【０２３８】
抗体またはフラグメントを放射活性標識することにより、本発明のタンパク質への結合をＲＩＡの使用を介して検出することが可能である。例えば：Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，３月，１９８６，１頁〜５頁，４６頁〜４９頁および６８頁〜７８頁；Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，１９７８を参照のこと。放射活性アイソトープは、γカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【０２３９】
蛍光化合物を用いて抗体を標識することもまた可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に曝露される場合、次いでその存在は、蛍光発光に起因して検出され得る。蛍光標識化合物は上に記載されている。抗体はまた、１５２Ｅｕまたは他のランタン系列のような蛍光を放出する金属を用いて検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を用いて抗体に接着され得る。
【０２４０】
抗体はまた、化学発光化合物に抗体が結合することにより、検出可能に標識され得る。次いで、この化学発光標識化抗体の存在は、化学反応の経過の間に現れるルミネセンスの存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。
【０２４１】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識するために使用され得る。標識にとって有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
【０２４２】
Ｄ５エピトープに対する抗体はまた、腫瘍を処置するために用いられる。これらは、内皮細胞とＥＣＭとの間の相互作用を阻害し得、その結果、これらのＤ５への結合はＤ５ペプチドおよび融合タンパク質を用いる処置に対するのと同様な結果を生じる。
【０２４３】
本発明を今まで一般的に記載してきたが、本発明は続く実施例を参照とすることにより、より容易に理解される。この実施例は、特定されない限り、説明の方法によって提供され、そして本発明を制限することを意図していない。
【０２４４】
（実施例Ｉ）
(ＨＫａの抗脈管形成特性）
ＨＫａは、（１）低濃度（１〜１０ｎＭ）でＥＣ増殖を阻害した；（２）細胞特異的様式においてＥＣ増殖を阻害する；そして（３）ＥＣにアポトーシスを誘導したことが示された。これらの特徴は、ＨＫａがインビボで抗脈管形成活性を有し得ることを示唆した。これを試験するために、研究をＭａｔｒｉｇｅｌ「プラグ」アッセイを用いて実施した。
【０２４５】
手短には、マウスを、５０μｇのヘパリンおよび４００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを含む０．２５ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌで左側腹部に注射した。マウスを、２０μｇ  ＨＫａもまた含む同一の混合物で右側腹部に注射した。４日後、動物を屠殺し、そしてＭａｔｒｉｇｅｌプラグを新生血管形成について試験した。これらの研究は、コントロールプラグにおいて内に伸びる新血管を豊富に示したが、ＨＫａを含む場合では新生血管形成は完全に欠損した。組織学的分析は、ＥＣがＨＫａ含有プラグにほとんど浸潤せず、そしてこれらは丸いアポトーシスの様相を呈することを示した。対照的に、コントロールプラグにおける細胞は伸長し、そして紡錘状であり、遊走性の表現型を示唆した。
【０２４６】
（実施例ＩＩ）
（内皮細胞増殖を阻害するＤ５由来ペプチドの同定）
ＥＣ上のＨＫａの抗増殖活性が、Ｄ５内の公知のＥＣ結合領域内に含まれるという仮設を立てた。この仮定を、全分子の活性の少なくとも一部分を有するペプチドを同定することを目的として、これらのドメイン（各々８アミノ酸残基まで重複する）の各々に対応する１６アミノ酸残基の配列を有する３０ペプチドを合成することにより試験した。最初のスクリーニングにおいて、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦに応答するＥＣの増殖を阻害するための、これらのペプチドの各々の能力（最初に５０μＭで使用）を評価した。
【０２４７】
これらの研究は、ＨＵＶＥＣの増殖を５０％以上まで阻害した８ペプチドの同定を導いた。これらの結果に基づき、８ペプチド（Ｈ３−２、Ｈ３−６、Ｈ３−７、Ｈ３−１０Ａ、Ｈ３−１３Ａ、Ｈ５−１３およびＨ５−１４）を選択し、そしてこれらに関係する抗増殖活性を、ＥＣ増殖を５０％以上（ＩＣ５０）阻害するペプチドの濃度を決定することにより評価した（表１）。
【０２４８】
【表１】
2004515222.tif 000007
ＥＣ増殖の阻害において最も活性なペプチドは、Ｈ５−１３およびＨ５−１４であり、これらはおよそ１０〜５０μＭの濃度でＥＣ増殖を完全に阻害したことが結論付けられた。これらのペプチドの各々は、あらかじめ記載されたＨＫ結合部位内である（表１）。
【０２４９】
ＥＣ増殖の強力なインヒビターでもあるＨ５−１３およびＨ５−１４の配列、および増殖をあまり強力に阻害しないＨ５−１０の配列は、以下の通りである：
【０２５０】
【化５】
2004515222.tif 000008
Ｈ５−１３およびＨ５−１４は、配列ＨＫＮＫＧＫＫＮ（配列番号７）を共有するが、Ｈ５−１０は密接に関連したＨＫＦＫ配列を含んでいる。これらの比較に基づいて、これらのペプチドの抗増殖活性が、ＨＫＸＫ（配列番号８）コンセンサス配列を通して媒介される（ここでＸは中性アミノ酸または芳香族アミノ酸である（Ｈ５−１３またはＨ５−１４ではＡｓｎおよびＨ５−１０ではＰｈｅ））ことを結論付ける。Ｈ５−１０の相対的に低い活性は、アスパラギンに対するフェニルアラニンの置換、または後者２つのペプチドにおけるＨＫＮＫに対してＣ末端側の−ＧＫＫＮ配列の強力な増強効果を反映し得る。このＨＫＮＫ配列は、Ｈａｓａｎら；１９９５（前出）により報告されたＨＫ  Ｄ５のＥＣ結合領域内に位置する。
【０２５１】
（実施例ＩＩＩ）
（ヒトキニノゲンＤ５のクローニング、発現、再折りたたみおよび精製）
Ｄ５ポリペプチドをコードするＤＮＡを、プライマー５’ｃｇｇｇａｔｃｃｇｔａａｇｔｃｃａｃｃｃｃａｃａｃｔｔｃ３’（配列番号１１）および５’ｃｇａａｔｔｃｔｃａｇｃｔｔｇｃｃａａａｔｇｃｔｃ３’（配列番号１２）を用いて、ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、ＨＫ  ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。増幅産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて二重消化し、精製目的のためのＮ末端のタグとしてカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）を含むＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ直鎖状発現ベクターｐＣＡＬ−ｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し、サブクローンを増殖させ、そして３７℃で４時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、発現したＣＢＰ−Ｄ５の大部分が封入体中に存在したことを示した。５００ｍｌの細胞調製物を増殖させ、回収し、そしてペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０（ＴＥ緩衝液）で１回洗浄した。細胞懸濁液を０．２５ｍｇ／ｍｌリソチームを含むＴＥ緩衝液で溶解した。この溶解物を４％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌでホモジナイズし、そして１０，０００×ｇで４５分間遠心分離した。封入体ペレットをＴＥ緩衝液で数回洗浄した。精製した封入体を、７ＭグアニジンＨＣｌを含むＴＥ緩衝液に再懸濁した。３×３０秒の超音波処理、そして氷上で１時間のインキュベート後に、変性したタンパク質を２０，０００×ｇで１時間で精澄化した。次いで、精澄化した懸濁液を１０００ｍｌの氷冷の５０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．８に添加した。再折りたたみされたＣＢＰ−Ｄ５を、ＨｉＴｒａｐ  Ｓ  ５ｍｌカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精製し、そして０．１５〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で抽出した。最後に、この分画をプールし、濃縮し、そして塩を交換した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０中の融合タンパク質を、α−トロンビン（２．５μｇトロンビン／ｍｇのＣＢＰ−Ｄ５）で３７℃で９０分間消化した。この反応を最終濃度が１ｍＭになるまでＰＭＳＦを添加することによって停止させ、次いで、Ｄ５をＭｏｎｏ  Ｓ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製し、そして０．１５〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配を用いて抽出した。
【０２５２】
結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。
ＣＢＰ−Ｄ５融合タンパク質の配列（配列番号１３）は、
【０２５３】
【化６】
2004515222.tif 000009
である。
【０２５４】
ＣＢＰ配列を太文字で示し、そしてＤ５配列に下線を引いた。遺伝子操作したトロンビンの切断部位は、Ｄ５のＮ末端のＧｌｙで終わるＰ−Ｒ−Ｇであり、その結果、インビトロで、ＡｒｇとＧｌｙとの間でのトロンビンの切断は、インタクトなＤ５ポリペプチドを残す。
【０２５５】
（実施例ＩＩＩ）
（Ｄ５はＭａｔｒｉｇｅｌプラグにおいて新脈管形成を阻害する）
ｂＦＧＦ（１０ｎｇ）または腫瘍細胞（Ｄ５  ｃＤＮＡでトランスフェクトした３ＬＬ、ＨＴ１０８０、ＨＴ１０８０）のいずれかを含むＭａｔｒｉｇｅｌプラグを、ヌードマウス（Ｂｃｌｂ／ｃ）に皮下移植する。次いで、このプラグを４日後に回収し、そして組織学的および市販のＥＬＩＳＡを用いる新血管形成の代理マーカーとしてプラグのヘモグロビン含量を測定することによって評価する。Ｄ５（２０μｇ）は、このアッセイにおいて少なくとも４０％までｂＦＧＦにより刺激される新脈管形成を阻害した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込んだ腫瘍細胞はまた、新脈管形成を効率よく刺激し、そしてこれを局所的にＤ５を発現することにより阻害し得る。このことを、Ｄ５  ｃＤＮＡ構築物で腫瘍細胞をトランスフェクトすることにより、このモデル系において達成した。これは、インビボでの腫瘍細胞の増殖に影響を与えなかったが、インビボでのＭａｔｒｉｇｅｌプラグにおける腫瘍細胞により刺激される新血管形成を４０％まで阻害した。
【０２５６】
(実施例ＩＶ）
（Ｄ５は腫瘍において局部的に発現される場合、新脈管形成を阻害する）
Ｄ５のｃＤＮＡをいくつかの腫瘍細胞株中（３ＬＬ、ＨＴ１０８０）にトランスフェクトし、腫瘍の増殖に対する局所的な発現の影響を評価する。これらのモデルを上に記載する。腫瘍細胞によるＤ５の発現は、原発性のＨＴ１０８０腫瘍および３ＬＬ腫瘍の増殖率を５０％阻害する。新脈管形成の測定単位である微小血管密度もまた、２５％減少した。転移性の３ＬＬモデルにおいて、転移の発症率および増殖を５０％阻害する。
【０２５７】
（実施例Ｖ）
（Ｄ５に対して指向されたｍＡｂは、インビボで腫瘍増殖を阻害する）
ＨＴ１０１８０および３ＬＬモデルを、腫瘍増殖に対するＤ５に対して産生したｍＡｂの効果を評価するために使用する。ＨＴ１０８０モデルにおいて、腫瘍を触診できるまで増殖させ（４〜６週間）、このとき、抗体を用いる処置を開始する（０．１  ｍｇ／マウス、一週間当たり３回のＩＰ）。動物をさらに４週間処置し、そして腫瘍体積を、増殖率を決定するために２×／週で測定する。腫瘍増殖の阻害は、少なくとも３０％であり、使用される抗体に依存する。
【０２５８】
３ＬＬモデルにおいて、抗体処置を、上記と同じレジメンを用いて腫瘍接種をした日に始める。腫瘍体積をカリパス測定を用いて、３×／週で２８日間決定し、このとき、動物を屠殺し、そして肺転移を評価する。
【０２５９】
Ｄ５の局所発現は、原発性腫瘍増殖において３０％の減少、そして目に見える肺転移の数において２０％の減少を生じる。
【０２６０】
上記に引用した参考文献は、詳細に援用されるか否かにかかわらず、全て本明細書中に参考として援用される。
【０２６１】
本発明を今まで十分に記載してきたが、同様のことを、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、そして過度の実験を用いずに、広範な同等のパラメーター、濃度、および状態の範囲内で実施し得ることは当業者により理解される。
【０２６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、高分子量キニノゲンの一次配列および遺伝子構造を示す。１〜６２６という数は、リーダー配列−１８〜−１とともにアミノ酸（ａａ）位置である。文字Ａ〜Ｊは、イントロン／エキソン接合部の位置である。ドメイン１（アミノ酸１〜１１３）は、エキソン１、２および３によりコードされる。ドメイン２（アミノ酸１１４〜２３４）は、エキソン４、５および６によりコードされる。ドメイン３（アミノ酸２３５〜３５７）は、エキソン７、８および９によりコードされる。ドメイン４（アミノ酸３５８〜３８３）は、エキソン１０ＢＫによりコードされる。ドメイン５（アミノ酸３８４〜５０２）は、エキソン１０ＨＫの５’部分によりコードされる。ドメイン６（アミノ酸５０３〜６２６）は、エキソン１０ＨＫの３’部分によりコードされる。湾曲した矢印は、カリクレイン切断部位を示す。ボックスで囲んだ「Ｏ」および「Ｎ」は、それぞれ、Ｏ結合型糖質鎖およびＮ結合型糖質鎖の位置である。ＸＩは、推定第ＸＩ因子結合配列である。ＰＫは、推定プレカリクレイン結合配列である（ＤｅＬａ  Ｃａｄｅｎａ４７による）。
【図２】
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されたＣＢＰ−Ｄ５の同定および精製を示すゲルおよびブロットのセットである。Ｅ．ｃｏｌｉを、ＣＢＰ−Ｄ５のｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換した。小規模培養物を３０℃で増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。細胞を抽出し、上清および封入体を、以前にＤ５に対して惹起させた抗体およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ｂ）を用いてウェスタンブロット（図２Ａ）により分析した。ＣＢＰ−Ｄ５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ｂ）により示されるように、封入体中のタンパク質の大部分を構成した。実施例に記載のように、封入体を抽出し、タンパク質を再折り畳みさせ、精製した。純粋タンパク質を含むカルモジュリンカラム（ＣＡＭ）から溶出した画分を、図２Ｃに示す。
【図３】
図３は、Ｄ５およびＣＢＰ−Ｄ５によるＥＣ増殖の阻害を示す。ＥＢＭ培地中のＨＵＶＥＣ（３，０００細胞／ウェル）を、ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレートに添加した。この細胞を、４時間接着させ、この時点でＥＢＭ培地を、ＥＢＭ＋ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋インヒビターと交換した。このプレートを４８時間インキュベートし、この時点で、各ウェルあたりの総細胞数を、ＭＴＳアッセイを用いて決定した（インヒビターの各濃度につきｎ＝３）
【図４】
図４は、種々のＤ５融合構築物を用いたＣＡＭモデルにおける新脈管形成の阻害を示す。受精卵（ｃｈｉｃｋ  ｅｇｇ）を７日間インキュベートし、その時点で卵の上部を注意深く取り除いて、漿尿膜（ＣＡＭ）を曝した。ｂＦＧＦ単独（３０ｎｇ）またはｂＦＧＦ＋ＨＫａ（ＡＴＮ−２３４）またはｂＦＧＦ＋ＨＫａ
Ｄ５（ＡＴＮ−２３５）のいずれかを染み込ませたディスクをＣＡＭ上に置き、卵をさらに４日間インキュベートした。新血管形成（新脈管形成）を解剖顕微鏡下でディスクに隣接する血管数を計数することにより評価した（各条件に対してｎ＝３）。
【図５】
図５は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上のＥＣ管形成の阻害を示す。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、９６ウェルプレートに配置した。ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１ｎｇ／ｍＬ）およびＰＭＡ（２０ｎＭ）を合わせて、ＨＵＶＥＣ（３０００細胞／ウェル）の存在下で管形成を刺激した。ＨＫａ  Ｄ５（ＡＴＮ−２３５）を、アッセイの始めに等モル量の低分子量ヘパリン（これは、ＡＴＮ−２３５の活性を刺激する）の存在下で添加した。このプレートを、３７℃で２４時間インキュベートした後に、２名の独立した読み取り者が評価した。
【０２６３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  ATTENUON LLC
<120>  HUMAN KININOGEN D5 DOMAIN POLYPEPTIDES AND THEIR USE
<130>  FI03H92050
<140>  JP2002−519506
<141>  2001-07-24
<150>  US 60/220,194
<151>  2000-07-24
<160>  13
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  626
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Gln Glu Ser Gln Ser Glu Glu Ile Asp Cys AsnAsp Lys Asp Leu Phe
1              5                  10                 15
Lys Ala Val Asp Ala Ala Leu Lys Lys Tyr AsnSer Gln Asn Gln Ser
20                 25                 30
Asn Asn Gln Phe Val Leu Tyr Arg Ile Thr GluAla Thr Lys Thr Val
35                  40                 45
Gly Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Lys Tyr GluIle Lys Glu Gly Asp
50                 55                 60
Cys Pro Val Gln Ser Gly Lys Thr Trp Gln AspCys Glu Tyr Lys Asp
65                 70                 75                 80
Ala Ala Lys Ala Ala Thr Gly Glu Cys Thr AlaThr Val Gly Lys Arg
85                 90                 95
Ser Ser Thr Lys Phe Ser Val Ala Thr Gln ThrCys Gln Ile Thr Pro
100                105                110
Ala Glu Gly Pro Val Val Thr Ala Gln Tyr AspCys Leu Gly Cys Val
115                120                125
His Pro Ile Ser Thr Gln Ser Pro Asp Leu GluPro Ile Leu Arg His
130                135                140
Gly Ile Gln Tyr Phe Asn Asn Asn Thr Gln HisSer Ser Leu Phe Met
145                150                155                160
Leu Asn Glu Val Lys Arg Ala Gln Arg Gln ValVal Ala Gly Leu Asn
165                170                175
Phe Arg Ile Thr Tyr Ser Ile Val Gln Thr AsnCys Ser Lys Glu Asn
180                185                190
Phe Leu Phe Leu Thr Pro Asp Cys Lys Ser LeuTrp Asn Gly Asp Thr
195                200                205
Gly Glu Cys Thr Asp Asn Ala Tyr Ile Asp IleGln Leu Arg Ile Ala
210                215                220
Ser Phe Ser Gln Asn Cys Asp Ile Tyr Pro GlyLys Asp Phe Val Gln
225                230                235                240
Pro Pro Thr Lys Ile Cys Val Gly Cys Pro ArgAsp Ile Pro Thr Asn
245                250                255
Ser Pro Glu Leu Glu Glu Thr Leu Thr His ThrIle Thr Lys Leu Asn
260                265                270
Ala Glu Asn Asn Ala Thr Phe Tyr Phe Lys IleAsp Asn Val Lys Lys
275                280                285
Ala Arg Val Gln Val Val Ala Gly Lys Lys TyrPhe Ile Asp Phe Val
290                295                300
Ala Arg Glu Thr Thr Cys Ser Lys Glu Ser AsnGlu Glu Leu Thr Glu
305                310                315                320
Ser Cys Glu Thr Lys Lys Leu Gly Gln Ser LeuAsp Cys Asn Ala Glu
325                330                335
Val Tyr Val Val Pro Trp Glu Lys Lys Ile TyrPro Thr Val Asn Cys
340                345                350
Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser Leu Met Lys ArgPro Pro Gly Phe Ser
355                360                365
Pro Phe Arg Ser Ser Arg Ile Gly Glu Ile LysGlu Glu Thr Thr Val
370                375                380
Ser Pro Pro His Thr Ser Met Ala Pro Ala GlnAsp Glu Glu Arg Asp
385                390                395                400
Ser Gly Lys Glu Gln Gly His Thr Arg Arg HisAsp Trp Gly His Glu
405                410                415
Lys Gln Arg Lys His Asn Leu Gly His Gly HisLys His Glu Arg Asp
420                425                430
Gln Gly His Gly His Gln Arg Gly His Gly LeuGly His Gly His Glu
435                440                445
Gln Gln His Gly Leu Gly His Gly His Lys PheLys Leu Asp Asp Asp
450                455                460
Leu Glu His Gln Gly Gly His Val Leu Asp HisGly His Lys His Lys
465                470                475                480
His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn LysGly Lys Lys Asn Gly
485                490                495
Lys His Asn Gly Trp Lys Thr Glu His Leu AlaSer Ser Ser Glu Asp
500                505                 510
Ser Thr Thr Pro Ser Ala Gln Thr Gln Glu LysThr Glu Gly Pro Thr
515                520                525
Pro Ile Pro Ser Leu Ala Lys Pro Gly Val ThrVal Thr Phe Ser Asp
530                535                540
Phe Gln Asp Ser Asp Leu Ile Ala Thr Met MetPro Pro Ile Ser Pro
545                550                555                560
Ala Pro Ile Gln Ser Asp Asp Asp Trp Ile ProAsp Ile Gln Thr Asp
565                570                575
Pro Asn Gly Leu Ser Phe Asn Pro Ile Ser AspPhe Pro Asp Thr Thr
580                585                590
Ser Pro Lys Cys Pro Gly Arg Pro Trp Lys SerVal Ser Glu Ile Asn
595                600                605
Pro Thr Thr Gln Met Lys Glu Ser Tyr Tyr PheAsp Leu Thr Asp Gly
610                615                620
Leu Ser
625
<210>  2
<211>  125
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Val Ser Pro Pro His Thr Ser Met Ala Pro AlaGln Asp Glu Glu Arg
1              5                  10                 15
Asp Ser Gly Lys Glu Gln Gly His Thr Arg ArgHis Asp Trp Gly His
20                 25                 30
Glu Lys Gln Arg Lys His Asn Leu Gly His GlyHis Lys His Glu Arg
35                  40                 45
Asp Gln Gly His Gly His Gln Arg Gly His GlyLeu Gly His Gly His
50                 55                 60
Glu Gln Gln His Gly Leu Gly His Gly His LysPhe Lys Leu Asp Asp
65                 70                 75                 80
Asp Leu Glu His Gln Gly Gly His Val Leu AspHis Gly His Lys His
85                 90                 95
Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys AsnLys Gly Lys Lys Asn
100                105                110
Gly Lys His Asn Gly Trp Lys Thr Glu His LeuAla Ser
115                120                125
<210>  3
<211>  375
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  3
gtaagtccac cccacacttc catggcacct gcacaagatgaagagcggga ttcaggaaaa    60
gaacaagggc atactcgtag acatgactgg ggccatgaaaaacaaagaaa acataatctt   120
ggccatggcc ataaacatga acgtgaccaa gggcatgggcaccaaagagg acatggcctt   180
ggccatggac acgaacaaca gcatggtctt ggtcatggacataagttcaa acttgatgat   240
gatcttgaac accaaggggg ccatgtcctt gaccatggacataagcataa gcatggtcat   300
ggccacggaa aacataaaaa taaaggcaaa aagaatggaaagcacaatgg ttggaaaaca   360
gagcatttgg caagc                                                    375
<210>  4
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Gly His Lys Phe Lys Leu Asp Asp Asp Leu GluHis Gln Gly Gly His
1              5                  10                 15
<210>  5
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys AsnLys Gly Lys Lys Asn
1              5                  10                 15
<210>  6
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  6
His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys HisAsn Gly Trp Lys Thr
1              5                  10                 15
<210>  7
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  7
His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn
1              5
<210>  8
<211>  4
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa can be Gly, Ala, Ser, Thr, Gly, Met,Leu, Ile, Val, Cys, Phe,
Tyr,Trp or Asn
<400>  8
His Lys Xaa Lys
1
<210>  9
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Val Pro Arg Gly Ser Asp
1              5
<210>  10
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Asp Asp Lys Asp Trp His
1              5
<210>  11
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  11
cgggatccgt aagtccaccc cacacttc                                       28
<210>  12
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  12
cgaattctca gcttgccaaa tgctc                                          25
<210>  13
<211>  158
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile AlaVal Ser Ala Ala Asn
1              5                  10                 15
Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala LeuLeu Val Pro Arg Gly
20                 25                 30
Ser Val Ser Pro Pro His Thr Ser Met Ala ProAla Gln Asp Glu Glu
35                 40                 45
Arg Asp Ser Gly Lys Glu Gln Gly His Thr ArgArg His Asp Trp Gly
50                 55                 60
His Glu Lys Gln Arg Lys His Asn Leu Gly HisGly His Lys His Glu
65                 70                 75                 80
Arg Asp Gln Gly His Gly His Gln Arg Gly HisGly Leu Gly His Gly
85                 90                 95
His Glu Gln Gln His Gly Leu Gly His Gly HisLys Phe Lys Leu Asp
100                105                110
Asp Asp Leu Glu His Gln Gly Gly His Val LeuAsp His Gly His Lys
115                120                125
His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His LysAsn Lys Gly Lys Lys
130                135                140
Asn Gly Lys His Asn Gly Trp Lys Thr Glu HisLeu Ala Ser
145                150                155