【手続補正書】
【提出日】平成16年5月12日(2004.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
（２）ＰＣＲ法
２週齢のラットの大脳皮質からグアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム法により調製した全ＲＮＡ（２０μｇ）を鋳型とし、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡの一本鎖を合成し（全量４０μｌ）、これを逆転写反応混合液としてＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ反応液は、２μｌの上記逆転写反応混合液、１００ｐｍｏｌの末端プライマーpr.1-s及びpr.1-aoの混合物（又はpr.2-so及びpr.2-a）、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、及び１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン エルマー(Perkin Elmer)製）を含む混合液２５μｌとした。増幅は以下のように行った。解離反応は９４℃で３０秒、アニーリングは４５℃で６０秒、伸長反応は７２℃で９０秒の条件で３５サイクル行った。この操作によって生じた増幅物質１μｌに対し、プライマーとしてpr.1-s及びpr.1-aiの混合物（又はpr.2-si及びpr.2-a）を用いて再度ＰＣＲを行った。増幅は、９４℃で３０秒、４５℃で６０秒、７２℃で９０秒のサイクルを２０回繰り返して行った。この操作によって生じた増幅物質を常法によりアガロースゲル電気泳動を行い解析すると、pr.1-s及びpr.1-aiを用いて作製した増幅物質では約２６０ｂｐ（Ａ１）、pr.2-si及びpr.2-aを用いて作製した増幅物質では約２１０ｂｐ（Ａ２）のＤＮＡのバンドが検出された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
＜３＞ＧｌｃＡＴ−Ｐ完全長ｃＤＮＡ
（１）ハイブリダイゼーション用プローブの作成
上記Ａ１及びＡ２の増幅物質を常法によりｐＣＲＩＩ（インビトロゲン(Invitrogen)製）にサブクローンし、塩基配列を解析した。塩基配列はABI PRISM Dyeterminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit（パーキン エルマー(PERKIN ELMER)製）を使用して解析した。解析結果に基づいて、Ａ１増幅時に使用したプライマーpr.1-sの隣に位置する配列（pr.a（配列番号１２））及びＡ２増幅時に使用したプライマーpr.2-siの隣に位置する配列（pr.b（配列番号１３））を合成した。２０ｐｍｏｌのpr.a及びpr.b、２μｌの逆転写反応混合液、ならびに５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む最終量２５μｌの溶液でＰＣＲを行い増幅物質を調製した（gf.a）。ＰＣＲは上記同様、９４℃３０秒、４７℃６０秒、７２℃５０秒のサイクルを３５回繰り返すことによって行った。このようにして増幅されたgf.aをｐＣＲIIへサブクローニングし、塩基配列を決定した
（配列番号１６）。また、このプラスミドを大量に調製後、ＥｃｏＲＩで消化して切り出し、大量のgf.aを得て、スクリーニングに使用した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
（１０）Ｌｅｃ２細胞におけるＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
ＣＨＯ細胞の変異体であり、グルクロン酸の受容体である糖タンパク質のＮ−アセチルラクトサミン残基を有するＬｅｃ２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７３６）に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを接続したｐＥＦ−ＢＯＳベクターをトランスフェクションした。Ｌｅｃ２はＣＭＰ−シアル酸の輸送系を欠き、細胞表面にＮ−ラクトサミン残基の末端のシアル酸を欠く糖タンパク質を発現している。その為、ＧｌｃＡＴ−ＰによるＮ−ラクトサミン構造へのグルクロン酸転移活性が、内在性のシアル酸転移酵素活性との競争による阻害が起こらないため、よりＧｌｃＡＴ−Ｐの生理活性が顕著に表れやすいと考えられる。６０ｍｍの培養皿に２４時間上記細胞を培養し、完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結、または何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。７２時間後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で回収し、抗パラグロボシド抗体であるＨ１１（Taki,T(東京医科歯科大学)より入手）、ＨＮＫ−１エピトープ中のグルクロン酸を認識するＭ６７４９（Tanaka,H.(熊本大学)より入手）、硫酸化されたグルクロン酸を認識するＨＮＫ−１抗体（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−２００）及び対照のマウスＩｇＭ抗体をそれぞれ一次抗体として４℃で１時間反応させた。ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇＭ抗体を二次抗体としてそれぞれの一次抗体により処理した細胞に反応させ、ＦＡＣＳで解析した。その結果を図３に示す。完全長ＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを導入してもＨ１１抗体による染色が変化しないことから、ＧｌｃＡＴ−Ｐは糖脂質性のグルクロン酸受容体であるパラグロボシドにはグルクロン酸を転移しないことが明らかであり、ＨＮＫ−１抗体による染色が変化しないことから、Ｌｅｃ２には転移されたグルクロン酸を硫酸化する酵素が欠損していることが明らかである。Ｍ６７４９による染色量が増加していることから、当該ｃＤＮＡから生じるＧｌｃＡＴが正常にグルクロン酸を転移していることが明らかである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（１１）ＣＯＳ−１細胞におけるＧｌｃＡＴ−Ｐのトランジェントな発現
ラミニンコートした６０ｍｍ培養皿にＣＯＳ−１細胞を培養し、２４時間後に完全長のＧｌｃＡＴ−ＰｃＤＮＡを連結したｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフ テクノロジー(Life Technologies)製）を用いトランスフェクションした。対照としては何も連結していない対照のｐＥＦ−ＢＯＳベクターを用いた。７２時間後、３％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液で上記トランスフェクションした細胞を固定し、１０μｇ／ｍｌのＭ６７４９又はＨＮＫ−１抗体により室温で２時間インキュベートし、ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇＭで上記抗体を染色した。対照の細胞は全く染色されなかったが、ＧｌｃＡＴ−Ｐをトランスフェクションした細胞は、Ｍ６７４９及びＨＮＫ−１双方の抗体によって染色された。また、ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ−１細胞は対照と比較して大きな形態の変化が見られた。ＧｌｃＡＴ−Ｐを発現させたＣＯＳ−１細胞は多数のマイクロスパイクを有する長く伸長した突起を有していた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
配列番号：18
配列の長さ：560
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
鎖の数：二本鎖
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
GCGCGCGCAT CGCAGGGCAG CAGCCCTGGG TCTCTGGGGC CAGGGCATAG GACTGCCACC     60
CGCTATGGAC CGCGCCAGGG ACGATATGGA CTCGCTGCCG CAGGTATCAA CCTCCGAAGG    120
TTCCTGACCC TGCGCTGGAC TACTTCCCCT TCGCAGACTC CCATCAGGCC GGACTCTGCA    180
AACCTGCTGC CACAATGGGT AATGAGGAGC TGTGGGCGCA GCCAGCCTTG GAGATGCCGA    240
AGAGAAGGGA CATCCTCGCG ATTGTCCTCA TTGTGCTTCC CTGGACACTG CTCATCACCG    300
TCTGGCACCA GAGCAGCCTC GCACCTCTGC TTGCTGTGCA CAAGGATGAG GGAAGTGACC    360
CCCGCCATGA GGCACCACCC GGTGCGGACC CTAGGGAGTA CTGCATGTCC GACCGTGACA    420
TCGTGGAGGT GGTGCGCACA GAGTACGTGT ACACGAGGCC GCCACCGTGG TCCGACACGC    480
TGCCCACCAT CCATGTGGTG ACGCCCACCT ACAGTAGACC GGTGCAGAAG GCAGAGCTGA    540
CGCGAATGGC CAACACGCTA                                                560