【手続補正書】
【提出日】平成16年11月30日(2004.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマー性被包化媒体および前記ポリマー性被包化媒体中に被包化された少なくとも１つの薬剤を含むドラッグデリバリーシステム。
【請求項２】  前記多数のポリペプチドが、
（ａ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（ｂ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が少なくとも１つの保存的置換を有し、かつ、前記ポリペプチドが自己集合してポリマーを形成することができるポリペプチド
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム。
【請求項３】  前記多数のポリペプチドが、配列比較アルゴリズムまたは目測による分析で決定したときに、配列の少なくとも約１００残基または２００残基を有する領域または配列の全長にわたって、配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム。
【請求項４】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマー性被包化媒体および前記ポリマー性被包化媒体中に被包化された少なくとも１つの薬剤を含むドラッグデリバリーシステムであって、前記多数のポリペプチドが、請求項２または３に記載のポリペプチドの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸フラグメントを含むドラッグデリバリーシステム。
【請求項５】  前記多数のポリペプチドが、以下からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム：
（ａ）配列番号：１、３、５、７および９の少なくとも１つの核酸配列または配列番号：２、４、６、８または１０をコードする核酸配列と、配列の少なくとも１００ヌクレオチドまたは少なくとも２００ヌクレオチドを有するサブ配列または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する核酸分子、または
配列番号：１、３、５、７および９に示される核酸配列または配列番号：２、４、６、８および１０のポリペプチドをコードする核酸配列の相補物と、３．５×０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウムおよび２ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むハイブリダイゼーション緩衝液中、６５℃でのハイブリダイゼーションを含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｂ）低、中等度および高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号：１、３、５、７または９の核酸配列または配列番号：２、４、６、８および１０をコードする核酸配列、（ii）（ｉ）の鎖の相補鎖または（iii）少なくとも１００ヌクレオチドの長さを有する（ｉ）または（ii）の核酸配列のサブ配列の少なくとも１つとハイブリダイズする核酸分子、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のサブ配列であって、自己集合してポリマーを形成するポリペプチドをコードするサブ配列、および
（ｄ）配列番号：２、４、６、８および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項６】  自己集合によってポリペプチドポリマーを製造する方法であって：
（ａ）二価陽イオンの存在下で自己集合することができる多数のポリペプチドを提供する工程および
（ｂ）前記多数のポリペプチドを、二価陽イオンおよび鋳型分子の存在下、モノマーポリペプチドが自己集合してポリペプチドポリマーを生成する条件下で重合させる工程、を含み
多数のモノマーポリペプチドの各モノマーポリペプチドが、（ｉ）配列番号：２、４、６、８または１０に示されるアミノ酸配列または（ii）少なくとも１つの保存的置換を有する配列番号：２、４、６、８または１０に示されるアミノ酸配列を有し、
多数のモノマーポリペプチドの少なくとも１つのモノマーポリペプチドが、酵素の結合、ヌクレオチドの結合もしくはヌクレオチド誘導体の結合、脂質の結合もしくは脂質誘導体の結合、標的分子の結合またはベクターの結合を含む改変を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項７】  前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が少なくとも１つの保存的置換を有し、かつ、前記ポリペプチドが自己集合してポリマーを形成することができるポリペプチド、および
（ｃ）配列番号：２、４、６、８および１０の少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが自己集合してポリマーを形成することができるポリペプチド
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】  前記ポリペプチドが、以下からなる群より選択される核酸分子によってコードされる、請求項６に記載の方法：
（ａ）配列番号：１、３、５、７および９の少なくとも１つの核酸配列または配列番号：２、４、６、８または１０をコードする核酸配列と、配列の少なくとも１００または２００残基を有するサブ配列または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する配列を含む核酸分子、
（ｂ）低、中等度または高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号：１、３、５、７および９の核酸配列または配列番号：２、４、６、８および１０をコードする核酸配列、（ii）（ｉ）の鎖の相補鎖または（iii）（ｉ）または（ii）の配列の少なくとも１００ヌクレオチドまたは２００残基を有する（ｉ）または（ii）のサブ配列または（ｉ）または（ii）の配列の全長の少なくとも１つとハイブリダイズする核酸分子、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のサブ配列であって、自己集合してポリマーを形成することができるポリペプチドをコードするサブ配列、および
（ｄ）配列番号：２、４、６、８および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項９】  多数のポリペプチドを提供する前記工程がさらに以下の工程を含む請求項６に記載の方法：
前記ポリペプチドをコードする核酸を結合させたベクターを調製し；
前記ベクターをホスト細胞に挿入し；
適切な培養で前記ホスト細胞を増殖させて核酸を発現させ、前記ポリペプチドを生成し；さらに
前記生成されたポリペプチドを前記ホスト細胞から単離する。
【請求項１０】  前記ポリペプチドを重合させる工程がさらに、前記多数のポリペプチドを溶液中に溶解させ；さらに鋳型分子およびアルカリ土類金属イオンを前記溶液に加えることを含む請求項６に記載の方法。
【請求項１１】  ヒトまたは動物の身体の部位へ薬剤を送達するための、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステムの使用。
【請求項１２】  以下の工程を含む分子を被包化する方法：
以下のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が少なくとも１つの保存的置換を有し、かつ、前記アミノ酸配列（ｂ）を含むポリペプチドが自己集合してポリマーを形成することができるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号：２、４、６、８および１０の少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメントを含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列（ｃ）を含むポリペプチドが自己集合してポリマーを形成することができるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号：１、３、５、７または９の少なくとも１つの核酸配列または配列番号：２、４、６、８または１０をコードする核酸と、配列の少なくとも１００残基又は２００残基有するサブ配列または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列、
（ｅ）低、中等度および高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号：１、３、５、７または９の核酸配列または配列番号：２、４、６、８または１０をコードする核酸配列、（ii）（ｉ）の相補鎖または（iii）（ｉ）または（ii）の配列の少なくとも１００または２００残基を有する（ｉ）または（ii）のサブ配列または（ｉ）または（ii）の配列の全長の少なくとも１つとハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列、
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）のサブ配列によりコードされるアミノ酸配列であって、前記サブ配列が自己集合してポリマーを形成することができるポリペプチドをコードするアミノ酸配列、および
（ｇ）配列比較アルゴリズムまたは目測による分析で決定したときに、配列番号：２、４、６、８または１０のアミノ酸配列の少なくとも１つと、配列の少なくとも約１００残基または２００残基を有する領域または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子によりコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む多数のポリペプチドの溶液を提供する工程；
さらに
前記分子の存在下で前記多数のポリペプチドを重合させて前記分子を前記ポリマー内に被包化する。
【請求項１３】  以下の工程を含む変種を生成する方法：
以下の核酸配列：
（ａ）配列番号：１、３、５、７および９の少なくとも１つの核酸配列または配列番号：２、４、６、８または１０をコードする核酸配列と、配列の少なくとも１００残基または２００残基を有するサブ配列または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する配列を含む核酸分子、
（ｂ）低、中等度および高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号：１、３、５、７および９の核酸配列または配列番号：２、４、６、８および１０をコードする核酸配列、（ii）（ｉ）の相補鎖または（iii）（ｉ）または（ii）の核酸配列の少なくとも１００残基または２００残基を有する（ｉ）または（ii）のサブ配列または（ｉ）または（ii）の配列の全長の少なくとも１つとハイブリダイズする核酸分子、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のサブ配列であって、自己集合してポリマーを形成することができるポリペプチドをコードするサブ配列、および
（ｄ）配列比較アルゴリズムまたは目測による分析で決定したときに、配列番号：２、４、６、８または１０のアミノ酸配列の少なくとも１つと、配列の少なくとも約１００残基または２００残基を有する領域または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子を入手し、
さらに、
前記配列中の１つまたは２つ以上のヌクレオチドの別のヌクレオチドへの改変、前記配列中の１つまたは２つ以上のヌクレオチドの欠失、および１つまたは２つ以上のヌクレオチドの前記配列への付加からなる群より選択される１つまたは２つ以上の工程によって前記配列を改変する。
【請求項１４】  以下を含むポリペプチド：
（ｉ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群れより選択される配列であって、配列比較アルゴリズムまたは目測による分析で決定したときに、配列番号：２、４、６、８および１０からなる群れより選択される配列と、配列の少なくとも１００残基または２００残基を有するサブ配列または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する配列、または、
配列比較アルゴリズムまたは目測による分析で決定したときに、配列番号：１、３、５、７または９に示される核酸配列、または、配列番号：１、３、５、７または９と、配列の少なくとも約１００残基または２００残基の領域または配列の全長にわたって、少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する核酸によりコードされる配列、または
配列番号：１、３、５、７または９と、低、中等度および高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる配列、および
（ii）抗体、オリゴ糖、ポリヌクレオチドおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１つの官能基。
【請求項１５】  長さが約１０から５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含み、さらに配列番号：１、３、５、７または９または配列番号：２、４、６、８または１０に示されるポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する少なくとも１０個または１０〜１５塩基の連続したヌクレオチドのセグメントを有する核酸プローブであって、中等度または高度にストリンジェントな条件下で核酸標的領域とハイブリダイズして検出可能な標的：プローブデュープレックスを生成する核酸プローブ。
【請求項１６】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含む分離剤であって、
配列比較アルゴリズムまたは目測による分析で決定したときに、配列番号：２、４、６、８および１０からなる群れより選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有するポリペプチドを含む前記分離剤。
【請求項１７】  以下の工程を含む混合物からキラル化合物を単離する方法：
請求項１６に記載のポリマー性分離剤を提供し；さらに
キラル化合物を含む混合物を前記樹脂を通して溶出させ、前記キラル化合物を前記混合物中の残りの物質から分離させる。
【請求項１８】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含む繊維。
【請求項１９】  前記多数のポリペプチドの各々が配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも５０％の相同性を有する請求項１８に記載の繊維。
【請求項２０】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含む滑沢剤であって、前記多数のポリペプチドの各々が配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する前記滑沢剤。
【請求項２１】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含むコーティング組成物であって、前記多数のポリペプチドの各々が配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する前記コーティング組成物。
【請求項２２】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含むバイオチップであって、前記多数のポリペプチドの各々が配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する前記バイオチップ。
【請求項２３】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含む極小機械成分であって、前記多数のポリペプチドの各々が配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する前記極小機械成分。
【請求項２４】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含む光スイッチであって、前記多数のポリペプチドの各々が配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する前記光スイッチ。
【請求項２５】  多数のポリペプチドの自己集合によって生成されるポリマーを含む光導波管であって、前記多数のポリペプチドの各々が配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する前記光導波管。
【請求項２６】  以下のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が少なくとも１つの保存的置換を有し、かつ、前記アミノ酸配列（ｂ）を含むポリペプチドが自己集合してポリマーを形成することができるアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号：２、４、６、８および１０の少なくとも１０個のアミノ酸残基を有するフラグメントを含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列（ｃ）を含むポリペプチドが自己集合してポリマーを形成することができるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むタンパク質調製物。
【請求項２７】  以下の核酸分子：
（ａ）配列番号：１、３、５、７および９の少なくとも１つの核酸配列または配列番号：２、４、６、８または１０をコードする核酸配列と、配列の少なくとも１００残基または２００残基を有するサブ配列または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有する配列を含む核酸分子、
（ｂ）低、中等度および高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号：１、３、５、７および９の核酸配列または配列番号：２、４、６、８または１０をコードする核酸配列、（ii）（ｉ）の相補鎖または（iii）（ｉ）または（ii）の核酸配列の少なくとも１００残基または２００残基を有する（ｉ）または（ii）のサブ配列または（ｉ）または（ii）の核酸配列の全長の少なくとも１つとハイブリダイズする核酸分子、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のサブ配列であって、自己集合してポリマーを形成することができるポリペプチドをコードするサブ配列、および
（ｄ）配列比較アルゴリズムまたは目測による分析で決定したときに、配列番号：２、４、６、８または１０のアミノ酸配列の少なくとも１つと、配列の少なくとも約１００残基または２００残基を有する領域または配列の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％または完全な配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子
の配列を有するポリヌクレオチドを含む、ホスト細胞で複製することができる発現ベクター。
【請求項２８】  請求項２７に記載の発現ベクターを含むホスト細胞。
【請求項２９】  多数のモノマーポリペプチドユニットを含むポリマーであって、前記ポリマーが請求項６、７、８、９又は１０に記載の方法により製造されるポリマー。
【請求項３０】  多数のモノマーポリペプチドユニットを含むナノチューブであって、前記ナノチューブが請求項６、７、８、９又は１０に記載の方法により製造されるナノチューブ。
【請求項３１】  ポリマー及び少なくとも１つの分子を含む組成物であって、前記分子が前記ポリマーにより被包化され、前記ポリマーが多数のモノマーポリペプチドユニットを含み、かつ、前記ポリマーが請求項６、７、８、９又は１０に記載の方法により製造される組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
2004523219.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
2004523219.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
特に優れたアプローチの１つは、いわゆる単鎖フラグメント可変（ｓｃｆｖ）ライブラリーの使用であった（Marks et al., 1992, p.779; Winter & Milstein, 1991; Clackson et al., 1991; Marks et al., 1991, p.581; Chaudhary et al., 1990; Chiswell et al., 1992; McCafferty et al., 1990; Huston et al., 1988）。バクテリオファージコートタンパク質上でディスプレーされたｓｃＦｖライブラリーの多様な実施態様が報告された。
１９８８年の初めに、Ｆｖフラグメントの単鎖類似体およびそれらの融合タンパク質が抗体工学的方法によって確実な態様で生成された。一般的には第一の工程は、所望の結合特性を有するＶＨおよびＶＬドメインをコードする遺伝子を得ることを必要とする。前記Ｖ遺伝子は特定のハイブリドーマ細胞株から単離するか、組合せＶ遺伝子ライブラリーから選別するか、またはＶ遺伝子合成によって生成することができる。単鎖Ｆｖは、適切にデザインしたリンカーペプチド、例えば（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号１３）または同等なリンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドとＶ遺伝子成分を連結することにより形成される。前記リンカーは第一のＶ領域のＣ末端と第二のもののＮ末端を、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ´のいずれかの順序で架橋する。原則として、ｓｃｆｖ結合部位は、親抗体の結合部位の親和性と特異性の両方を忠実に複製することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
相対的に頻度の低い制限部位の選別マーカーとしての使用には、非限定的な例として例えば以下が含まれる：好ましくは少なくとも４ヌクレオチド配列を含む部位、より好ましくは少なくとも５ヌクレオチド配列を含む部位、より好ましくは少なくとも６ヌクレオチドを含む部位（例えばＢａｍＨＩ部位またはＧ／ＧＡＴＣＣ、ＢｇｌＩＩ部位またはＡ／ＧＡＴＣＴ、ＰｓｔＩ部位またはＣＴＧＣＡ／Ｇ、ＸｂａＩ部位またはＴ／ＣＴＡＧＡ）、より好ましくは少なくとも７ヌクレオチド配列を含む部位、より好ましくは少なくとも８ヌクレオチド配列を含む部位（例えばＡｓｃＩ部位またはＧＧ／ＣＧＣＧＣＣ、ＮｏｔＩ部位またはＧＣ／ＧＧＣＣＧＣ、ＰａｃＩ部位またはＴＴＡＡＴ／ＴＡＡ、ＰｍｅＩ部位またはＧＴＴＴ／ＡＡＡＣ、ＳｒｆＩ部位またはＧＣＣＣ／ＧＧＧＣ、Ｓｓｅ８３８Ｉ部位またはＣＣＴＧＣＡ／ＧＧ、およびＳｗａＩ部位またはＡＴＴＴ／ＡＡＡＴ）、より好ましくは少なくとも９ヌクレオチド配列を含む部位、さらにより好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド配列を含む部位（例えばＢｓｐＧＩ部位またはＣＧ／ＣＧＣＴＧＧＡＣ；配列番号１４）が含まれる。さらに、いくつかの制限部位（例えばＩＩＳ酵素類の場合）は、比較的高い特異性を有する部分（すなわち制限部位の出現頻度の主要な決定要素を含む部分）および比較的低い特異性を有する部分を含み、さらに、切断部位は比較的低い特異性を有する部分内に含まれる場合も、含まれない場合もあることは理解されよう。例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ部位またはＣＴＧＡＡＧ（１６／１４）には、比較的高い特異性を有する部分（すなわちＣＴＧＡＡＧ部分）および、切断部位を含む比較的低い特異性を有する部分が存在する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
トポイソメラーゼまたはニッキング酵素（例えばＮ．ＢＳＴＮＢＩを用いて）導入された粘着末端の張出しはライゲーション環境下で固有であるようにデザインして、望ましくないフラグメントの再アッセンブリー（例えば自家二量体形成および他の望ましくないコンカテマー形成）を防止することができることは理解されよう。
本発明のある特徴にしたがえば、ポリメラーゼによる反応でオリゴを用いることによって末端選別可能なポリヌクレオチドの末端領域に、複数の配列（前記は必ずしもオーバーラップする必要はない）を導入することができる。非限定的な関連する例では、そのようなオリゴを用いて、トポイソメラーゼＩによる末端選別に有用な好ましい５’末端領域を提供することができる。前記オリゴは１から１０塩基の配列を含み、前記配列は、粘着末端に（好ましくはワクシニアトポイソメラーゼによって変換できる）、リボソーム結合部位に（すなわち“ＲＢＳ”、前記は好ましくは発現クローニングに有用である）、および場合によってリンカー配列に（前記リンカー配列の後にＡＧＴ開始部位および０から１００塩基の鋳型特異的配列（ポリメラーゼ使用反応で鋳型とのアニーリングを促進するために）が続く）に変換することができる。したがって、この実施例にしたがえば、有用なオリゴ（前進プライマーと称される）は以下の配列を有することができる：５’［末端配列＝（Ｎ）1-10］［トポイソメラーゼＩ部位およびＲＢＳ＝ＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧ］［リンカー＝（Ｎ）1-100］［開始コドンおよび鋳型特異的配列＝ＡＴＧ（Ｎ）0-100］３’（配列番号１５）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
第二のプライマーセットと前記のようにして増幅された親分子とのアニーリングは、第一のプライマーセットの配列（すなわち親分子セットを増幅させるために用いたプライマー）を混合することによって促進される（前記配列はトポイソメラーゼＩ認識部位と類似し、しかも機能的トポイソメラーゼＩ酵素の認識を防止するために十分相違を有する）。例えば、ＡＡＧＧＧで１塩基から５塩基全てののいずれかが多様化した配列を、（突然変異誘発に付す前に親鋳型の増幅に用いられるべき）第一のプライマーセットに含ませることができる。非限定的な具体例では、親分子は以下の非限定的で典型的な前進および逆方向プライマーセットを用いて増幅することができる：
前進プライマー：  ５’CTAGAAGAGAGGAGAAAACCATG（N）10-100３’（配列番号１６）、および
逆方向プライマー：５’GATCAAAGGCGCGCCTGCAGG（N）10-100３’（配列番号１７）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
第一のプライマーセットの本具体例にしたがえば、（Ｎ）10-100は、好ましくは１０から１００ヌクレオチドの長さの鋳型特異的配列、より好ましくは１０から５０ヌクレオチドの長さの鋳型特異的配列、さらに好ましくは１０から３０ヌクレオチドの長さの鋳型特異的配列、さらに好ましくは１５から２５ヌクレオチドの長さの鋳型特異的配列である。
非限定的な具体例にしたがえば、（真のトポイソメラーゼＩ認識部位を欠く第一の開示プライマーセットを用いた）この増幅の後で、続いて増幅された親分子は、真のトポイソメラーゼＩ認識部位をもつ前進方向および逆方向プライマーの１つまたは２つ以上のセットを用いて突然変異誘発に付すことができる。具体的な非限定的特徴にしたがえば、親分子は変異子孫分子生成のための鋳型として用いられ、以下の典型的であるが非限定的な第二の前進および逆方向プライマーセットが用いられる：
前進プライマー：  5’CTAGAAGGGAGGAGAAAACCATG3’（配列番号１８）
逆方向プライマー：5’GATCAAAGGCGCGCCTGCAGG3’ （配列番号１９）（ＡｓｃＩ認識配列を含む）
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
いずれの酵素も（現在存在しているものであろうとこれから開発されるものであろうと）本発明の末端選別で有用であることを強調することは重要であろう。例えば、本発明のある特徴では、ニッキング酵素（例えばＮ．ＢｓｔＮＢＩ、これは一方の鎖のみを５’．．．ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ／Ｎ．．．３’（配列番号２０）で切断する）をポリヌクレオチドライゲーション活性の供給源と併用して用いて末端選別を達成することができる。本実施態様にしたがえば、（末端選別が突然変異誘発子孫分子の選別に用いられようと、末端選別がいずれかの突然変異誘発方法とはまた別に用いられようと関係なく）、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識部位を、トポイソメラーゼＩの認識部位の代わりに末端選別可能ポリヌクレオチドに取り込むことができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
表６
下記実施例で使用するオリゴヌクレオチド
2004523219.tif 000003
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
発現プライマー
CAN-EX-FA/B: 5'-TAGCAGGCCATATGACCACCCAGAGCCCCC-3'(配列番号33)
CAN-EX-FC:   5'-CTAGCAGGCCATATGACGACCCAGAGCC-3'(配列番号34)
CAN-EX-RA:   5'-GGAGGACTGGCGGCCGCTGTTAGCCTAC-3'(配列番号35)
CAN-EX-RB:   5'-AGTAGCTAGCGGCCGCTTTAGCTGACGC-3'(配列番号36)
CAN-EX-RC:   5'-GGCCGTGGCGGCCGCTGCTTCACC-3'(配列番号37)