【手続補正書】
【提出日】平成17年1月21日(2005.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のカルシウムチャンネルのα−１サブユニットのペプチドフラグメントであって、該α−１サブユニットのＩ−IIループおよび／もしくはIII−IVループに対応しているか、または、
特に一つ以上のアミノ酸の置換および／もしくは欠失および／もしくは付加によってこのＩ−IIループもしくはIII−IVループから派生したペプチド配列に対応しているか、または、該Ｉ−IIループもしくはIII−IVループもしくは派生した配列のペプチド部分、特に少なくとも５個程度のアミノ酸を有するペプチド部分に対応しており、
Ｉ−IIループの該部分並びに該派生したペプチド配列が、該カルシウムチャンネルのβサブユニット並びにIII−IVループに結合する該Ｉ−IIループの特性を有し、III−IVループの該部分並びに該派生したペプチド配列が、該Ｉ−IIループに結合する該III−IVループの特性を有するペプチドフラグメントの使用、または
−膜面でカルシウムチャンネルが発現した状況下で、突然変異もしくは突然変異群が必須アミノ酸に影響を与える範囲まで、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループの該上記ペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の該突然変異によって派生した突然変異型ペプチド配列の使用、および／またはカルシウムチャンネルが不活性化した状況下で、突然変異もしくは突然変異群が必須アミノ酸に影響を与える範囲まで、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのIII−IVループの該上記ペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の使用、あるいは
−カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループおよび／もしくはIII−IVループの上記ペプチドフラグメントをコードする、または上記突然変異型ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の使用であって、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、すなわち癲癇や神経細胞変性といったカルシウムチャンネルの数の異常な減少に結びつく病気の治療に利用可能なβ様分子の選択、および／または、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を増加させる分子、すなわち原形質膜内のカルシウムチャンネルの数の増加が有益な効果をもたらす、パーキンソン病、インスリン依存性糖尿病、もしくはLambert-Eaton筋無力症候群といった病気の治療に利用可能なβ様分子の選択、および／または、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、すなわち心臓肥大といったカルシウムチャンネルの数の異常な増加に結びつく病気の治療に利用可能な分子の選択、および／または、
−細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を減少させる分子、すなわち原形質膜内のカルシウムチャンネルの数の減少が有益な効果をもたらす、癲癇、高血圧症、狭心症、もしくは脳虚血といった病気の治療に利用可能な分子の選択、および／または、
−神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子、すなわち神経伝達を刺激または阻止し、特に、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節が有益な効果をもたらす、癲癇、運動失調症、偏頭痛、パーキンソン病、もしくは脳虚血といった病気の治療に利用可能な分子を選択するための方法を実現化することを目的とした使用。
【請求項２】
α−１サブユニットのＩ−IIループ、もしくは派生したペプチド配列、もしくは当該Ｉ−IIループの１部分に対応するペプチドフラグメントの、または請求項１に定義されるフラグメントをコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の、請求項１に記載の使用であって、
−請求項１に定義される、細胞膜内のカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合にその数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を増加させる分子を選択するための方法を実現化することを目的とした使用。
【請求項３】
−ウサギの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号２の配列：
【表１】
2005508310.tif 000001
に対応する配列の、または、
−ヒト神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのＩ−IIループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号４の配列：
【表２】
2005508310.tif 000002
に対応する配列の、または、
−少なくとも下記配列番号１５の配列：
【表３】
2005508310.tif 000003
を含む、上記配列番号２および配列番号４の配列のフラグメントの、または、
−上記ペプチド配列番号２および配列番号４の配列をそれぞれコードする下記ヌクレオチド配列番号１および配列番号３の配列によって形質転換された細胞の、または、配列番号１および配列番号３の配列に含まれ、上記配列番号１５をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の、
配列番号１：
【表４】
2005508310.tif 000004
配列番号３：
【表５】
2005508310.tif 000005
請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントであって、Ｎ末端側で膜貫通ペプチド配列、すなわち下記配列番号５の配列
【表６】
2005508310.tif 000006
に含まれているヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列といった、細胞膜内に該ペプチドフラグメントを保持する効果を有するペプチド配列と融合するフラグメントの、
または、
上に定義される、膜貫通ペプチド配列をコードする外生的組み換えヌクレオチド配列であって、膜貫通ペプチド配列が、α−１サブユニットの上記ペプチドフラグメントをコードする配列の上流に位置している配列によって形質転換した細胞の使用。
【請求項５】
請求項１に定義される、細胞膜内のカルシウムチャネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子、および／または請求項１に定義される細胞膜内のカルシウムチャンネルの数を増加させる分子を選択するための方法であって、下記段階、すなわち
−細胞表面でカルシウムチャンネルの数が有意に減少するのに十分な時間、請求項２〜４のいずれか１項に定義される、α−１サブユニットのペプチドフラグメントと、カルシウムチャンネルを発現する該細胞、次いで被験分子を一緒にする段階、または、
−請求項２〜４のいずれか１項に定義される、α−１サブユニットのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を使用して形質転換した細胞であって、細胞の表面におけるカルシウムチャンネルの数を減少している細胞と被験分子を一緒にする段階、
−形質転換した細胞の表面でカルシウムチャンネルの増加を検出して、細胞膜の表面でカルシウムチャンネルの数を増加させる被験分子の効果を実証する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の、請求項１に記載の使用であって、膜面でカルシウムチャンネルが発現した状況下で、突然変異が原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を増加あるいは減少させる効果を与える範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与え、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を減少させる分子
を選択する方法を実現することを目的とした使用。
【請求項７】
原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を増加させる効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、ウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８３、３９５、３９６、３９８、４２７、および４２８の位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列、すなわち位置２４のＱ、位置３６のＷ、位置３７のＩ、位置３９のＫ、位置６８のＫ、および位置６９のＫのうちの少なくとも１つが、天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられた、配列番号２または配列番号４の配列に対応するペプチド配列の、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
原形質膜の表面におけるカルシウムチャンネルの発現を減少させる効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、ウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８７、４２２、および４２３の位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列、すなわち位置２８のＲ、位置６３のＲ、および位置６４のＲのうちの少なくとも１つが、天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられた、配列番号２または配列番号４に対応するペプチド配列の、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に減少した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を増加させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数が異常に増加した場合に、その数を正常な数に回復させる分子および／または、
−請求項１に定義される、細胞膜におけるカルシウムチャンネルの数を減少させる分子を選択する方法であって、
−請求項１、６、もしくは７に定義される、α−１サブユニットのＩ−IIループから派生したペプチド配列と、該Ｉ−IIループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−上記Ｉ−IIループには特異的に結合するが、上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にさせ、該細胞の表面におけるカルシウムチャンネルの数の増減に対する選択した分子の効果を観察する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
−請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節を行う分子を選択するための方法を実現化することを目的とした、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのＩ−IIループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の請求項１に記載の使用であって、膜面でのカルシウムチャンネルが活性化した状況下で、突然変異がカルシウムチャンネルの活性を調節する効果を有する範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与えることを特徴とする使用。
【請求項１１】
カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、ウサギまたはヒトの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットの３８７と３８８の位置にあるアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生する配列、すなわち位置２８のＲおよび位置２９のＥの少なくとも１つが、天然または非天然のアミノ酸によって置き換えられている、特にＲ２８がアラニンまたはＥによって、Ｅ２９がアラニンによって置き換えられている配列番号２または配列番号４の配列に対応するペプチド配列の、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、
−請求項１０または１１に定義される、α−１サブユニットのＩ−IIループから派生したペプチド配列と、該Ｉ−IIループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−上記Ｉ−IIループには特異的に結合するが、上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にし、該細胞からの神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節に対する選択した分子の効果を観察する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
−請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法の実現を目的とした、α−１サブユニットのIII−IVループもしくは派生したペプチド配列もしくは当該III−IVの１部分に対応するペプチドフラグメントの、または請求項１に定義される、該フラグメントをコードするヌクレオチド配列によって形質転換した細胞の、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
−ヒトまたはウサギの神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループに対応するペプチド配列であって、下記配列番号７の配列
【表７】
2005508310.tif 000007
に対応する配列の、または、
−ヒト神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループをコードするヌクレオチド配列であって、下記配列番号６の配列
【表８】
2005508310.tif 000008
に対応する配列によって形質転換された細胞の、または、
−ウサギ神経細胞のカルシウムチャンネルのＣａｖ２．１サブユニットのIII−IVループをコードするヌクレオチド配列であって、下記配列番号８の配列
【表９】
2005508310.tif 000009
に対応する配列によって形質転換した細胞の、請求項１または１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１、１３、または１４のいずれか１項に記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントであって、Ｎ末端側で膜貫通ペプチド配列、すなわち下記配列番号５の配列
【表１０】
2005508310.tif 000010
に含まれているヒトＣＤ８レセプターのα鎖の膜貫通配列といった、細胞膜内に該ペプチドフラグメントを保持する効果を有するペプチド配列と融合するフラグメントの、または、
上に定義される、膜貫通ペプチド配列をコードする外生的組み換えヌクレオチド配列であって、膜貫通ペプチド配列がα−１サブユニットの上記ペプチドフラグメントをコードする配列の上流に位置している配列によって形質転換した細胞の使用。
【請求項１６】
請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、下記段階、
−カルシウムチャンネルの不活性状態が修飾されるだけの十分な時間、請求項１３〜１５のいずれか１項記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントと、カルシウムチャンネルを発現する細胞、次いで被験分子を一緒にする段階、または
−請求項１３〜１５のいずれか１項記載のα−１サブユニットのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を使用して形質転換した細胞と被験分子を一緒にする段階、
−神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態に対する被験分子の効果を検出する段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
−請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節を行う分子を選択するための方法を実現化することを目的とした、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのIII−IVループのペプチドフラグメントの１つ以上のアミノ酸の突然変異によって派生したペプチド配列の請求項１に記載の使用であって、膜面でのカルシウムチャンネルが不活性化した状況下で、突然変異がカルシウムチャンネルを活性化または不活性化する効果を有する範囲まで、当該突然変異または突然変異群が必須アミノ酸に影響を与えることを特徴とする使用。
【請求項１８】
カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、配列番号７の配列に対応するペプチド配列の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列の、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
カルシウムチャンネルを不活性化する効果を有する１つ以上の突然変異を含むペプチド配列であって、配列番号７の配列に対応するペプチド配列の位置８と１９の間にあるアミノ酸の少なくとも１つ、すなわち配列
【表１１】
2005508310.tif 000011
に含まれているアミノ酸の少なくとも１つの突然変異によって派生するペプチド配列の、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１に定義される、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択する方法であって、
−請求項１７〜１９のいずれか１項に定義される、α−１サブユニットのIII−IVループから派生したペプチド配列と、該III−IVループに対応する突然変異していないペプチド配列に特異的に結合する能力に対して事前に選択された被験分子を一緒にする段階、
−III−IVループには特異的に結合するが、上記派生したペプチド配列には結合しない上記分子を選択する段階、
−場合により、前段階で選択した分子と、カルシウムチャンネルを発現する細胞を一緒にし、該細胞からの神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態の調節に対する選択した分子の効果を観察する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
−位置２４のＱ、位置３６のＷ、位置３７のＩ、位置３９のＫ、位置６８のＫ、および位置６９のＫのうち少なくとも１つが天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられる配列番号２及び配列番号４の配列、
−位置２８のＲ、位置６３のＲ、および位置６４のＲが天然もしくは非天然のアミノ酸、特にアラニンによって置き換えられる配列番号２及び配列番号４の配列、
−位置２８のＲおよび位置２９のＥの少なくとも１つが、天然または非天然のアミノ酸によって置き換えられている、特にＲ２８がアラニンまたはＥによって、Ｅ２９がアラニンによって置き換えられている配列番号２及び配列番号４の配列、
−下記配列番号１５の配列、
【表１２】
2005508310.tif 000012
から選択されたペプチド配列。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明の１つの主題は、上に定義されているように、神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態を調節する分子を選択するための方法であって、
−カルシウムチャンネルの不活性状態が修飾されるだけの十分な時間、上記のようなα−１サブユニットのペプチドフラグメントとカルシウムチャンネルを発現する細胞と、さらには被験分子を一緒にする段階、または
−上に定義されているように、α−１サブユニットのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を使用して形質転換した細胞と被験分子を一緒にする段階、
−神経伝達物質の放出に関与する神経細胞のカルシウムチャンネルの不活性化状態に対する被験分子の効果を、特に電気生理学的検査を使用して検出する段階を含むことを特徴とする方法でもある。