(57)【要約】  本発明は、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体およびその製造方法、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識することができる、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１または２記載の抗体。
【請求項４】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１または２記載の抗体。
【請求項５】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１または２記載の抗体。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１または２記載の抗体。
【請求項７】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１または２記載の抗体。
【請求項８】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有するハイブリドーマにより産生される、請求項１または２記載の抗体。
【請求項９】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１１】
請求項９記載のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法。
【請求項１３】
ＥＬＩＳＡ法によるものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか記載の抗体を２種以上用いるものである、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項４記載の抗体と請求項７記載の抗体、請求項４記載の抗体と請求項８記載の抗体、請求項６記載の抗体と請求項７記載の抗体、または請求項６記載の抗体と請求項８記載の抗体を用いるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
関節リウマチの予後診断のための、請求項１２から１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか記載の抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキット。
【請求項１８】
ＥＬＩＳＡ法によるものである、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか記載の抗体を２種以上含むものである、請求項１７または１８記載のキット。
【請求項２０】
請求項４記載の抗体と請求項７記載の抗体、請求項４記載の抗体と請求項８記載の抗体、請求項６記載の抗体と請求項７記載の抗体、または請求項６記載の抗体と請求項８記載の抗体を含むものである、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
関節リウマチの予後診断のための、請求項１７〜２０のいずれか記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、かかる抗体を用いたＣ１ｑの存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットなどに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）患者は、将来重篤な関節破壊に陥る群と、そうでない群とに二分される。ＲＡ患者がいずれの群に属するかで必要な治療方法は異なるが、かかる予後を有効に診断する方法はない。【０００３】
ＲＡ患者の血中Ｃ１ｑタンパク質の量によって、関節破壊に陥るか否かの予後診断が可能であることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、臨床において、患者試料中のＣ１ｑタンパク質の定量に用いることができる抗Ｃ１ｑ抗体は確立されておらず、その開発が望まれていた。
【非特許文献１】Ochi T et al., Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-43
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の解決課題は、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる抗Ｃ１ｑ抗体を得ること、かかる抗体の製造方法、特異的かつ再現性のあるＣ１ｑタンパク質の定量方法、ならびにそのためのキットを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、Ｃ１ｑタンパク質量に依存して抗原と抗体の結合体量が増大する抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、
（２）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識することができる、（１）記載の抗体、
（３）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（４）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（５）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（６）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（７）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（８）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（９）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
（１０）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法、
（１１）（９）記載のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法、
（１２）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、
（１３）ＥＬＩＳＡ法によるものである、（１２）記載の方法、
（１４）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を２種以上用いるものである、（１２）または（１３）記載の方法、
（１５）（４）記載の抗体と（７）記載の抗体、（４）記載の抗体と（８）記載の抗体、（６）記載の抗体と（７）記載の抗体、または（６）記載の抗体と（８）記載の抗体を用いるものである、（１４）記載の方法、
（１６）関節リウマチの予後診断のための、（１２）から（１５）のいずれか記載の方法、
（１７）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキット、
（１８）ＥＬＩＳＡ法によるものである、（１７）記載のキット、
（１９）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を２種以上含むものである、（１７）または（１８）記載のキット、
（２０）（４）記載の抗体と（７）記載の抗体、（４）記載の抗体と（８）記載の抗体、（６）記載の抗体と（７）記載の抗体、または（６）記載の抗体と（８）記載の抗体を含むものである、（１９）記載のキット、
（２１）関節リウマチの予後診断のための、（１７）〜（２０）のいずれか記載のキット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識する抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体およびその製造方法、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットなどが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ハイブリドーマの培養上清を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃８を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃１０７を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３（三角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃１１２を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５（四角）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４（丸）、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６（菱形）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、固相抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃１１９を、感作抗体として抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３（三角）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体（以下、「抗Ｃ１ｑ抗体」ともいう）に関するものである。本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、Ｃ１ｑタンパク質と特異的に結合できるだけでなく、かかるタンパク質量に依存して、形成される抗原と抗体の結合体量が増大する点、すなわち、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる点で非常に優れている。本発明の抗体は、例えば、マウスのような哺乳動物をＣ１ｑタンパク質で免疫し、免疫動物のリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイブリドーマを作製し、これを培養することにより、得ることができる。他の既知の方法、例えば、遺伝子組換え法、化学合成法などを用いてかかる抗体を製造してもよい。【００１０】
Ｃ１ｑタンパク質のエピトープのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１〜７および配列番号８〜１６に示す。従って、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、好ましくは、（ａ）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号１〜７のアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および（ｃ）配列番号１〜７のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、例えば、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９３％の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択されるペプチドを特異的に認識することができるものである。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。上記ペプチドまたはそれを含むタンパク質などでマウスなどの動物を免疫し、かかる免疫マウスのリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイブリドーマを作製し、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を得てもよい。【００１１】
本発明の抗体の１の具体例は、マウス骨髄腫細胞株とマウスリンパ球との融合細胞であるハイブリドーマＫＳ−０１３１  ＃８、ＫＳ−０１３１  ＃３３、ＫＳ−０１３１  ＃３５、ＫＳ−０１３１  ＃４０、ＫＳ−０１３１  ＃５４、またはＫＳ−０１３１  ＃７６により産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体である。当該ハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、平成１８年８月２日付で受領され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を付与された。かかるハイブリドーマを、公知の培養条件、例えば、組成：ＲＰＭＩ  １６４０（Kohjin  16005005）  ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA  G7513）  ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA  S8636）  ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017）  １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA  P4333）  ２．５ｍＬ、ＦＢＳ  ７５ｍＬの培地中、３７±０．１℃、５±０．１５％  ＣＯ２にて培養し、産生された抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を公知の手段・方法にて回収・精製することにより、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を製造することができる。本明細書において、ハイブリドーマＫＳ−０１３１  ＃８、ＫＳ−０１３１  ＃３３、ＫＳ−０１３１  ＃３５、ＫＳ−０１３１  ＃４０、ＫＳ−０１３１  ＃５４、およびＫＳ−０１３１  ＃７６により産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体をそれぞれ、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃８、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３５、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４、および抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６と表す。【００１２】
本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、そのフラグメント、およびそのキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体を含む。これらのフラグメント、改変抗体または変異抗体もまた、元の抗体と同様のＣ１ｑタンパク質に対する特異性を有するものである。これらは、当業者に既知の手段・方法により製造され得る。【００１３】
本発明は、別の態様において、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関するものである。本発明のハイブリドーマは、Ｃ１ｑタンパク質で免疫されたマウス由来のリンパ球とマウス骨髄腫細胞株を融合させて得られた細胞である。【００１４】
本発明は、別の態様において、配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。本発明のこの態様の製造方法において、（ａ）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号１〜７のアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、または（ｃ）配列番号１〜７のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、例えば、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９３％の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを用いてもよい。【００１５】
本発明のこの態様の製造方法は、上記ペプチドでマウスなどの動物を免疫する工程、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を精製する工程などを含んでいてもよい。ペプチドでの免疫、および抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の精製は、当業者に既知の方法により行われ得る。【００１６】
本発明は、さらに別の態様において、本発明のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法に関するものでる。ハイブリドーマの培養は、インビトロ培養、およびインビボ培養の両方を含む。インビトロ培養は、公知の培養条件にて、例えば、組成：ＲＰＭＩ  １６４０（Kohjin  16005005）  ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA  G7513）  ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA  S8636）  ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017）  １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA  P4333）  ２．５ｍＬ、ＦＢＳ  ７５ｍＬの培地中、３７±０．１℃、５±０．１５％  ＣＯ２にて行うことができる。インビボ培養は、例えば、マウスのごとき動物の腹腔に本発明のハイブリドーマを移植することで、達成される。本発明の製造方法は、得られた抗体を精製する工程をさらに含んでいてもよい。精製方法を当業者は適宜選択して用いることができる。【００１７】
本発明は、さらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法に関するものである。本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、Ｃ１ｑタンパク質の量に依存して、抗原と抗体の結合体量が増大するという特性を有するので、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在ばかりでなく、量を決定することができる。本発明の決定方法において用いられる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は２種以上であってもよい。２種以上の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いることで、決定感度および特異性が増大し、精度が向上する。好ましくは、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３と抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃３３と抗Ｃ１ｑ抗体  ＃７６、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０と抗Ｃ１ｑ抗体  ＃５４、抗Ｃ１ｑ抗体  ＃４０と抗Ｃ１ｑ抗体７６とが本発明の決定方法において用いられる。本発明の決定方法において用いられる抗体は、標識されたものであってもよい。様々な標識が公知であり、当業者は適宜選択して用いることができる。例えば、horseradish peroxidase（HRP）、ALP、Glucose oxidase、β-galactosidaseなどの酵素、FITC、Rhodamine、Cy3、Cy5、Texas Red、Alexa Fluor類、BODIPY類、IRDye類、MFP類、Quantum Dot類、AMCA、Allophycocyanin、BMP、Cy2、Cy3.5、Cy5.5、DTAF、DyLight 547、DyLight 647、FluoroNanogold、Phycoerythrin、Phycocyanin、R-PE、Saporin、TRITCなどの蛍光標識、Biotin、Digoxigenin（DIG）、Acridium Ester、Flashlightなどの化学物質、60mm Microbeadなどのビーズ、MagCellect Ferrofluid［登録商標］などの磁気ビーズ、125Iなどの放射標識、金粒子、Agaroseなどの標識が用いられる。かかる標識を付すことで、本発明の決定方法を効率よく行うことができる。【００１８】
試料は、Ｃ１ｑタンパク質が含まれる可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血清、関節液、軟骨や骨及び各組織などが挙げられる。本発明の決定方法を用いることで、かかる試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができる。【００１９】
本発明の決定方法は、例えば、上記試料を本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体とインキュベーションし、該抗Ｃ１ｑ抗体と試料中のＣ１ｑタンパク質との結合体を形成させ、次に該結合体を測定することにより、行われてもよい。例えば、サンドイッチELISA法などのELISA法、イムノブロット法、Radioimmunoassay（RIA）法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）、生物発光酵素免疫測定法（BLEIA）、毛細管現象によって輸液可能な展開器材（免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いて本発明の決定方法を実施することができる。ＥＬＩＳＡ法は、特殊な設備等を必要とせず、実際の医療現場においてＣ１ｑタンパク質の存在または量の決定を迅速かつ容易に行うことが可能であるので、好ましく用いられる。【００２０】
本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いて、Ｃ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができるので、本発明の決定方法をＲＡの予後診断に用いることもできる。【００２１】
本発明は、なおさらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いて試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定することを特徴とする、患者におけるＲＡの予後の診断方法に関するものである。Ｃ１ｑタンパク質の存在または量は上述の方法にて決定されてもよい。【００２２】
本発明は、もう１つの態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、患者におけるＲＡの治療方法に関するものである。【００２３】
本発明は、さらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキットに関するものである。本発明のキットに含まれる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は２種以上であってもよい。２種以上の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を含むことで、本発明のキットを用いて行われるＣ１ｑタンパク質の存在または量の決定の感度、特異性、精度を向上させることができる。本発明のキットは、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の他に、例えば、試料採取手段、標識、反応容器、決定用試薬等を含んでいてもよい。一般的に、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットにおいて、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は標識されたものであってもよい。【００２４】
本発明のキットにおいて、例えば、サンドイッチELISA法などのELISA法、イムノブロット法、Radioimmunoassay（RIA）法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）、生物発光酵素免疫測定法（BLEIA）、毛細管現象によって輸液可能な展開器材（免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いてもよい。本発明のキットを用いて、Ｃ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができるので、臨床現場においてＲＡ患者の予後診断が可能になる。また、本発明のキットを用いてＲＡの病理学的研究等を行うこともできる。【００２５】
以下に実施例を示して本発明を詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス４匹にＣ１ｑ精製タンパク質（純度９９％以上、Calbiochem  204876）０．１ｍｇをアジュバント（タイターマックス、SIGMA）と共に２週間おきに２〜３回、フットパットおよび背中皮下に投与し、免疫した。マウスの脾臓からリンパ球を回収し、抗原３０μｇを含む培地にて３日間培養した。培養後、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｕ１細胞を、ＰＥＧ１５００を用いて常法に従い融合させた。融合後、細胞を組成：ＲＰＭＩ  １６４０（Kohjin  16005005）  ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA  G7513）  ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA  S8636）  ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017）  １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA  P4333）  ２．５ｍＬ、ＦＢＳ  ７５ｍＬの培地に懸濁し、あらかじめマウス胸腺細胞を播種した９６ウェルプレートに分注した。８日後、上清中の抗体の有無をＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ法の手順は以下の通りである。１μｇ／ｍｌ  Ｃ１ｑのＰＢＳ中溶液を調製し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（３９１２  ファルコン）に添加し、室温にて２時間インキュベーションすることで結合させた。次に、１％  スキムミルク／ＰＢＳを用いてブロッキングを行い、抗原プレートとした。抗原プレートに培養上清を添加して反応させ、洗浄後、ＡＬＰ標識ヤギ抗ＩｇＧ（ザイメット）を結合させた。ＡＬＰ基質を添加して、酵素反応させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、抗体陽性ウェルを選択した。対照として、同様に免疫したウサギの血清から分離したポリクローナル抗体を用いた。結果を図１に示す。抗原を結合させていないＥＬＩＳＡ用マイクロプレートを用い、非特異的反応を除去し、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＳ−０１３１  ＃８、ＫＳ−０１３１  ＃２５、ＫＳ−０１３１  ＃３３、ＫＳ−０１３１  ＃３５、ＫＳ−０１３１  ＃４０、ＫＳ−０１３１  ＃５４、ＫＳ−０１３１  ＃７６、ＫＳ−０１３１  ＃１００、ＫＳ−０１３１  ＃１０２、ＫＳ−０１３１  ＃１０７、ＫＳ−０１３１  ＃１１２、およびＫＳ−０１３１  ＃１１９などを得た。
【実施例２】
【００２７】
Ｃ１ｑエピトープの同定
ヒトＣ１ｑのサブユニットＡ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖のアミノ酸配列を配列番号１７〜１９に、ヌクレオチド配列を配列番号２０〜２２に示す。それぞれのアミノ酸配列をもとにして、各サブユニットのアミノ酸配列を１５アミノ酸（残基）ずつ３アミノ酸の間隔でずらした配列を合成ペプチド（順に、ペプチド番号１〜７８、９７〜１１７、１９３〜２７０番）としてガラスアレイ上に合成した。それぞれのペプチドの合成はアレイ上の特定の位置で行い、Ｃ１ｑのサブユニットの全アミノ酸配列を網羅する合成ペプチド含むペプチドアレイを作製した。尚、アレイの作製はＪＰＴ社に委託して行った。【００２８】
得られた抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから産生された抗Ｃ１ｑ抗体  ＃８、＃３３、＃４０、＃５４、および＃７６をProtein Gカラムを用いて精製した。精製した抗体のＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）での１，０００倍希釈液  ３３０μｌをペプチドアレイ上に塗布し、シールをした後、４℃で１２時間インキュベートした。その後メタノール１回、Ｍｉｌｉ−Ｑ水で５分間×５回洗浄した。遠心してアレイスライドを乾燥させ、蛍光スキャナー（Agilent DNAマイクロアレイスキャナ；アジレント社製）で、スキャンし、ソフトウェア（Feature Extractionソフトウェア；アジレント社製）を用いてアレイ上のそれぞれのペプチドスポットの蛍光強度を数値化した。強い蛍光強度を示すいくつかのスポットを検出した。このうち、バックグラウンドレベルより１３，０００以上高い蛍光強度を示すペプチドスポットを表１に示す（ペプチド番号１４９、１５０、２４４〜２４６番のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３〜７に示す）。【００２９】
【表１】
2008035527.tif 000002
【００３０】
１４９番および１５０番のペプチドはＣ１ｑＢサブユニット（Ｂ鎖）由来の配列であり、２４４番〜２４６番のペプチドはＣ１ｑＣサブユニット（Ｃ鎖）由来の配列である。これらの配列から、Ｃ１ｑエピトープのアミノ酸配列はＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基あるいはその一部を含むと予測した。【００３１】
「１４９番、１５０番、２４４〜２４６番のペプチドに共通するのは９個のアミノ酸からなる配列ＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）であることから、かかる配列自体、あるいはかかる配列内に抗Ｃ１ｑ抗体のエピトープが存在すると考えられる。このアミノ酸配列に由来するより短いペプチドを使用することによって、エピトープとして必要な配列をさらに特定することができる。そのような配列を有するペプチドとしては、例えば、８アミノ酸（ＣＫＶＰＧＬＹＹ（配列番号２３）、ＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２４））、７アミノ酸（ＣＫＶＰＧＬＹ（配列番号２５）、ＫＶＰＧＬＹＹ（配列番号２６）、ＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２７））、６アミノ酸（ＣＫＶＰＧＬ（配列番号２８）、ＫＶＰＧＬＹ（配列番号２９）、ＶＰＧＬＹＹ（配列番号３０）、ＰＧＬＹＹＦ（配列番号１））、５アミノ酸（ＣＫＶＰＧ（配列番号３１）、ＫＶＰＧＬ（配列番号３２）、ＶＰＧＬＹ（配列番号３３）、ＰＧＬＹＹ（配列番号３４）、ＧＬＹＹＦ（配列番号３５））、４アミノ酸（ＣＫＶＰ（配列番号３６）、ＫＶＰＧ（配列番号３７）、ＶＰＧＬ（配列番号３８）、ＰＧＬＹ（配列番号３９）、ＧＬＹＹ（配列番号４０）、ＬＹＹＦ（配列番号４１））からなるペプチド、またはそれ以下のアミノ酸からなるペプチドが挙げられる。【００３２】
ＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基のペプチドがＣ１ｑエピトープであるかどうかを決定するため、さらに以下の実験を行った。配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｒ２）、およびかかるペプチドより短いアミノ酸配列ＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）を有するペプチド（Ｒ１）をＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。これらのペプチドを表２に示す。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようジメチルスルホキシドに溶解し、保存した。【００３３】
【表２】
2008035527.tif 000003
【００３４】
ヒトＣ１ｑタンパク質（Carbiochem社製）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０％  グリセロール（ｐＨ７．２）に溶解し、２００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ  ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を５ｍｍ×１５ｍｍの大きさのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ；アマシャム社製）に表３の通りスポットし、室温にて約１時間風乾した。ニトロセルロース膜をＴＢＳに浸し、５分ほどなじませてから５％ブロッキング剤（Amersham ECL blocking reagent；GE Healthcare社製）を含むＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて室温にて１時間ブロッキングを行った。ブロッキングを行ったニトロセルロース膜をＴＢＳで軽く洗浄し、各抗Ｃ１ｑ抗体および合成ペプチドを含む溶液（２０μｌ）に浸して室温にて１時間反応させた。ＴＴＢＳ（ＴＢＳに最終濃度０．０５％で  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたもの）にてニトロセルロース膜を一度軽く洗浄した後、十分量のＴＴＢＳで１０分×３回振盪しながら洗浄した。結合の検出を以下の通り行った。【００３５】
【表３】
2008035527.tif 000004
【００３６】
ＡＬＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体を用いた場合の検出方法
ニトロセルロース膜をＡＬＰ発色バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２入りＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５）で軽く洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（プロメガ社製）を含むＡＬＰ発色バッファー３０μｌに浸し、室温で１０分間発色させた。染色像が得られたところでニトロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してエプソン社製デジタルスキャナＧＴ−８３００ＵＦを用いて染色像の取り込みを行った。【００３７】
ＨＲＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体を用いた場合の検出方法
ニトロセルロース膜をAmersham ECL Advance Western Blotting Detectionキット（GE healthcare社製）中のＡ液・Ｂ液等量混合液に浸し、室温にて１分間反応させた。その後、反応液を軽く振り払い、ニトロセルロース膜をプラスチックフィルムで挟み、ポラロイドフィルムに感光させることで膜上の化学発光の検出を行った。【００３８】
ＡＬＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体（１／１０００希釈）とＣ１ｑの結合が、ペプチドにより阻害されるかどうかを検討した。ペプチドＲ１およびＲ２を添加した系は、ペプチドを添加していない対照と比べて、色濃度が低く、Ｃ１ｑへの結合が大幅に阻害されていることがわかった。９残基のアミノ酸からなるペプチドＲ２だけでなく、６残基のアミノ酸からなるペプチドＲ１でも結合が阻害されていることから、Ｃ１ｑのエピトープは、９残基のアミノ酸、または６残基のアミノ酸からなることが確認できた。【００３９】
次に、ＨＲＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体（１／２０，０００希釈）とＣ１ｑの結合の阻害に必要なペプチドの濃度を検討した。１２５、６２．５、３１．３、および１５．６μｇ／ｍｌ  ペプチドＲ１を抗Ｃ１ｑ抗体と混合し、Ｃ１ｑとの結合を発色強度で評価した。１５．６μｇ／ｍｌの濃度のペプチドを用いた場合に、抗Ｃ１ｑ抗体とＣ１ｑの結合が見られたが、それ以上の濃度のペプチドを用いた場合には、抗Ｃ１ｑ抗体とＣ１ｑの結合が阻害され、発色強度が下がっていることを確認した。この結果から、抗Ｃ１ｑ抗体とＣ１ｑとの結合は抗体濃度にも依存するが、１５．６〜３１．３μｇ／ｍｌの濃度範囲のＲ１ペプチドで阻害されることがわかった。
【実施例３】
【００４０】
サンドイッチＥＬＩＳＡによるＣ１ｑタンパク質の定量
５μｇ／ｍＬ  抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体（固相抗体）溶液１００μｌをＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに結合させた。１％  スキムミルク／ＰＢＳ  １００μｌを添加し、室温にて３０〜６０分間インキュベーションした。次に、１０μｇ／ｍＬ  Ｃ１ｑタンパク質抗原２倍連続希釈溶液  １００μｌを添加して、３７℃で１〜２時間反応させた。純水で２回洗浄後、５μｇ／ｍＬ  Ｃ１ｑモノクローナル抗体（感作抗体）溶液１００μｌを添加し、４℃にて一晩反応させた。次に、２次抗体（アビジン化ＡＬＰ抗体）を１００μｌ／ウェルにて添加し、４℃〜室温で１〜２時間反応させた。純水で４回洗浄後、ＡＬＰ基質発色液を添加して発色させた。マイクロプレートリーダにて４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した（参照波長：６６０ｎｍ）。結果を図２〜１０に示す。Ｃ１ｑタンパク質濃度と吸光度との間に正の相関関係が認められ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、試料中のＣ１ｑタンパク質を定量できることが分かった。図示してはいないが、濃度〜４００μｇ／ｍＬのＣ１ｑタンパク質について定量可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、かかる抗体を用いたＣ１ｑタンパク質の検出および／または定量方法、およびそのためのキットなどが得られるので、ＲＡ患者の予後診断、（ＲＡの病理学的）研究等の分野において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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