【手続補正書】
【提出日】平成17年6月1日(2005.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法  
【特許請求の範囲】
【請求項１】  基板と、この基板内に被検体細胞及びこれと反応する薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つのウエルを有し、このウエルの底部に第一の開口部、第二の開口部及び空洞部を有し、第一の開口部と第二の開口部は空洞部を介して一直線上に連結されることで細胞トラップ孔を構成しており、上記第一の開口部の空洞部側に接続する径は空洞部の径より小さく、第二の開口部の空洞部側に接する径より大きく、なおかつ被検体細胞の大きさより小さい細胞外電位あるいは細胞の発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイス。
【請求項２】  基板がシリコンよりなる請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項３】  基板が少なくとも２種類の材料からなる積層体であり、２種類の材料は同一の溶液あるいはガスに対してそれぞれ異なるエッチングレートを持つ請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項４】  基板がシリコンと二酸化珪素もしくは二酸化珪素を含むガラス材料との積層体である請求項３に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項５】  第二の開口部の壁面と空洞部の一部においてのみ、導体材料が形成されており、これら導体はウエル側とは電気的に絶縁されている請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項６】  第一の開口部の壁面はウエル側の方が空洞部側より大きくなるテーパ構造である請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項７】  第一の開口部のウエル側の大きさは被検体細胞の大きさの２倍より小さい請求項６に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項８】  空洞部の形状は縦径より横径の方が大きい楕円形状であり、さらに縦径は被検体細胞より小さい形状とした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項９】  同一のウエルの底面に、第一の開口部、空洞部、第二の開口部からなる細胞トラップ孔を複数形成してなる請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項１０】  同一のウエルの底面に形成した細胞トラップ孔の第二の開口部の壁面に形成された導体は、ウエルの下面において互いに短絡されている請求項９に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項１１】  第一の開口部の空洞部に接続する側の大きさは１０〜５０マイクロメートルであり、第二の開口部は１〜５マイクロメートルであり、空洞部の横径が１０〜１００マイクロメートルであり、空洞部の縦径は５０マイクロメートル以下である請求項８に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項１２】  基板にキャビティをエッチングしてウエルを形成する工程と、このウエルの底面に第一の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第一の開口部用のマスクを用いて第一の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を経た後に、上記ウエルの下面に第二の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第二の開口部用のマスクを用いて第二の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を備え、さらにこの後、第二の開口部側からエッチングを促進するガスのみを用いてエッチングを行って第一の開口部と第二の開口部の連結部に空洞部を形成する工程からなる細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１３】  エッチングを促進するガスはＳＦ6，ＣＦ4，ＸｅＦ2のうちいずれか一つまたは混合であり、エッチングを抑制するガスはＣＨＦ3，Ｃ4Ｆ8のうちいずれか一つまたは混合である請求項１２に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１４】  第一の開口部をエッチングする工程において、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの割合を、エッチングがウエル側から空洞部側に進むに従ってエッチングを促進するガスの割合を減らしていく請求項１２に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１５】  第一の開口部をエッチングする工程において、エッチングを終了する直前においては、エッチングを抑制するガスのみを流して生成物を第一の開口部の壁面に形成する請求項１２に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１６】  基板にキャビティをエッチングしてウエルを形成する工程と、このウエルの下面に第二の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第二の開口部用のマスクを用いて第二の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を経た後に、上記ウエルの底面に第一の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第一の開口部用のマスクを用いて第一の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を備え、さらにこの後、第一の開口部側からエッチングを促進するガスのみを用いてエッチングを行って第一の開口部と第二の開口部の連結部に空洞部を形成する工程とからなる細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１７】  エッチングを促進するガスはＳＦ6，ＣＦ4，ＸｅＦ2のうちいずれか一つまたは混合であり、エッチングを抑制するガスはＣＨＦ3，Ｃ4Ｆ8のうちいずれか一つまたは混合である請求項１６に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１８】  第一の開口部をエッチングする工程において、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの割合を、エッチングがウエル側から空洞部側に進むに従ってエッチングを促進するガスの割合を減らしていく請求項１６に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項１９】  第二の開口部をエッチングする工程において、エッチングを終了する直前においては、エッチングを抑制するガスのみを流して生成物を第一の開口部の壁面に形成する請求項１６に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【請求項２０】  第一の開口部と、第二の開口部と、空洞部を形成した後、第一の開口部より蒸着法またはスパッタ法によって導体材料を第二の開口部と空洞部の一部に形成する請求項１６に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生体試料特に細胞の電気生理学的評価をこれら生体試料が発する電気化学的変化を指標にして、簡易に高速に行う細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法に関するものであり、たとえば高速薬品スクリーニング装置に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（たとえば、細胞の分子生物学、第三版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社）。
【０００４】
また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、パッチクランプ法ではマイクロピペットの作成及び操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要するため大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、細胞を染色する工程が必要で測定においては色素の影響によるバックグラウンドが高い上に時間とともに脱色するためＳ／Ｎ比が悪いという欠点がある。
【０００６】
本発明はこのような問題に鑑み、確実に被検体細胞を保持する手段を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の請求項１に記載の発明は、基板と、この基板内に被検体細胞及びこれと反応する薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つのウエルを有し、このウエルの底部に第一の開口部、第二の開口部及び空洞部を有し、第一の開口部と第二の開口部は空洞部を介して一直線上に連結されることで細胞トラップ孔を構成しており、上記第一の開口部の空洞部側に接続する径は空洞部の径より小さく、第二の開口部の空洞部側に接する径より大きく、なおかつ被検体細胞の大きさより小さい細胞外電位あるいは細胞の発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスであり、確実に被検体細胞を空洞部の中に閉じこめることができるので、細胞活動によって発生する電気的信号を確実に検出することができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、基板がシリコンよりなる請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、基板材料をシリコンとすることにより第一の開口部、第二の開口部、空洞部の形成が半導体技術を用いて容易になるという製造上の利点を有する。またシリコンの表面は容易に酸化できるので、空洞部を境にして第一の開口部側と第二の開口部側の電気的絶縁を容易に確保できるという利点も有する。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、基板が少なくとも２種類の基板よりなる積層体であり、２種類の材料は同一の溶液あるいはガスに対してそれぞれ異なるエッチングレートを持つ細胞外電位測定用デバイスであり、基板材料が異なるエッチングレートを持つ２種類の積層体となることにより、第一の開口部、第二の開口部、空洞部の形成が半導体技術を用いて容易になるという製造上の利点を有する。
【００１０】
請求項４に記載の発明は、基板がシリコンと二酸化珪素もしくはこれを含むガラス材料との積層体である細胞外電位測定デバイスであり、請求項３と同様の作用効果を有する。さらに、空洞部が二酸化珪素もしくはこれを含むガラス材料の層に形成されていると、これらの層はシリコンに比べて十分に電気絶縁性が高いので、第一の開口部側と第二の開口部側の電気的絶縁が十分に確保できるという利点も有する。
【００１１】
請求項５に記載の発明は、第二の開口部の壁面と空洞部の一部においてのみ、導体材料が形成されており、これら導体はウエル側とは電気的に絶縁されている細胞外電位測定デバイスであって、第二の開口部周辺で発生する電気を第一の開口部側に漏らすことなく、確実に検出することができる。
【００１２】
請求項６に記載の発明は、第一の開口部の壁面はウエル側の方が空洞部側より大きくなるテーパ構造である細胞外電位測定デバイスであり、上記のように第一の開口部の壁面がテーパ形状となっていることにより、ウエル側から被検体細胞がより進入しやすくなるという利点を有する。
【００１３】
請求項７に記載の発明は、第一の開口部のウエル側の大きさは被検体細胞の大きさの２倍より小さい細胞外電位測定デバイスであり、第一の開口部のウエル側の大きさが被検体細胞の大きさの２倍より小さいので、複数の細胞がウエルから同時に進入して第一の開口部の内部で詰まってしまうことがない。
【００１４】
請求項８に記載の発明は、空洞部の形状は縦径より横径の方が大きい楕円形状である細胞外電位測定デバイスであり、空洞部が楕円形状であることに加えて縦径の大きさが被検体細胞より小さいので、ウエル側より空洞部に被検体細胞が進入すると、被検体細胞は空洞部内において横径方向につぶれるようになり、また縦方向から押さえられるので、被検体細胞は確実に空洞部内に保持される。
【００１５】
請求項９に記載の発明は、同一のウエルの底面に第一の開口部、空洞部、第二の開口部からなる細胞トラップ孔を複数形成してなる細胞外電位測定デバイスであり、同一ウエルの底面に複数の細胞トラップ孔があるので、測定の際にはいずれかの細胞トラップ孔に被検体細胞が保持されれば測定が可能になるという利点を有する。
【００１６】
請求項１０に記載の発明は、同一のウエルの底面に形成した細胞トラップ孔の第二の開口部の壁面に形成された導体がウエルの下面において互いに短絡されている細胞外電位測定デバイスであり、第二の開口部の壁面に設けられた導体が短絡されているので、細胞トラップ孔にそれぞれ被検体細胞が保持されている場合において、これらの被検体細胞外の電位変化を並列に接続することとなり、一つ一つの被検体細胞の電位変化が少なくても確実に捉えることができる。
【００１７】
請求項１１に記載の発明は、第一の開口部の空洞部に接続する側の大きさは１０〜５０マイクロメートルであり、第二の開口部は１〜５マイクロメートルであり、空洞部の横径が１０〜１００マイクロメートルであり、空洞部の縦径は５０マイクロメートル以下である細胞外電位測定デバイスであり、このような形状は数十マイクロメートルの被検体細胞をウエル側から進入させ、空洞部内に保持するために最適である。
【００１８】
請求項１２に記載の発明は、基板にキャビティをエッチングしてウエルを形成する工程と、このウエルの底面に第一の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第一の開口部用のマスクを用いて第一の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を経た後に、上記ウエルの下面に第二の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第二の開口部用のマスクを用いて第二の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を備え、さらにこの後、第二の開口部側からエッチングを促進するガスのみを用いてエッチングを行って第一の開口部と第二の開口部の連結部に空洞部を形成する工程とからなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、被検体細胞を空洞部内に進入させ、確実に保持するための構造である第一の開口部、第二の開口部、空洞部によって構成される細胞トラップ孔の製造方法を提供することができる。
【００１９】
請求項１３に記載の発明は、エッチングを促進するガスはＳＦ6，ＣＦ4，ＸｅＦ2のうちいずれか一つまたは混合であり、エッチングを抑制するガスはＣＨＦ3，Ｃ4Ｆ8のうちいずれか一つまたは混合である細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、第一の開口部、第二の開口部、空洞部の製造方法をさらに容易にするための方法であり、請求項１２に記載の発明における効果を補完する。
【００２０】
請求項１４に記載の発明は、第一の開口部をエッチングする工程において、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの割合を、エッチングがウエル側から空洞部側に進むに従ってエッチングを促進するガスの割合を減らしていく細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、エッチングを促進するガスの割合を減らすことにより第一の開口部は、ウエル側より空洞部側の開口部の方が小さいテーパ形状とすることができ、ウエルからの被検体細胞の進入を促進させやすくするものである。
【００２１】
請求項１５に記載の発明は、第一の開口部をエッチングする工程において、エッチングを終了する直前においてはエッチングを抑制するガスのみを用いて、保護膜を第一の開口部壁面に形成する細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、後の工程で第二の開口部側からエッチングを促進するガスのみを用いて空洞部を形成する際にも、第一の開口部の壁面には保護膜が形成されているので、エッチングを促進するガスによって第一の開口部壁面がエッチングされない製造方法を実現することができる。
【００２２】
請求項１６に記載の発明は、基板にキャビティをエッチングしてウエルを形成する工程と、このウエルの下面に第二の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第二の開口部用のマスクを用いて第二の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を経た後に、上記ウエルの底面に第一の開口部をエッチングするためのマスクをフォトリソによって形成する工程と、この第一の開口部用のマスクを用いて第一の開口部をエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いてドライエッチングによって形成する工程を備え、さらにこの後、第一の開口部側からエッチングを促進するガスのみを用いてエッチングを行って第一の開口部と第二の開口部を連結部に空洞部を形成する工程とからなる細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、被検体細胞を空洞部内に進入させ、確実に保持するための構造である第一の開口部、第二の開口部、空洞部によって構成される細胞トラップ孔の製造方法を提供することができる。
【００２３】
請求項１７に記載の発明は、エッチングを促進するガスはＳＦ6，ＣＦ4，ＸｅＦ2のうちいずれか一つまたは混合であり、エッチングを抑制するガスはＣＨＦ3，Ｃ4Ｆ8のうちいずれか一つまたは混合である細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、第一の開口部、第二の開口部、空洞部の製造方法をさらに容易にするための方法であり、請求項１６記載の発明における効果を補完する。
【００２４】
請求項１８に記載の発明は、第一の開口部をエッチングする工程において、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの割合を、エッチングがウエル側から空洞部側に進むに従ってエッチングを促進するガスの割合を減らしていく細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、エッチングを促進するガスの割合を減らすことにより第一の開口部はウエル側より空洞部側の開口部の方が小さいテーパ形状とすることができ、ウエルからの被検体細胞の進入を促進させることができる。
【００２５】
請求項１９に記載の発明は、第二の開口部をエッチングする工程において、エッチングを終了する直前においては、エッチングを抑制するガスのみを用いて保護膜を第二の開口部壁面に形成する細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、後の工程で第一の開口部側からエッチングを促進するガスのみを用いて空洞部を形成する際にも、第二の開口部の壁面には保護膜が形成されているのでエッチングを促進するガスによって第二の開口部壁面がエッチングされることはないのである。
【００２６】
請求項２０に記載の発明は、第一の開口部と、第二の開口部と、空洞部を形成した後、第一の開口部より蒸着法またはスパッタ法によって導体材料を第二の開口部と空洞部の一部に形成する細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、この方法により、空洞部の上部には導体が形成されないので、空洞部を境に第一の開口部側と第二の開口部側の電気的絶縁を確実に確保する製造方法を提供することができる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造法について実施の形態および図面を用いて説明する。
【００２８】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１及び図１〜図２２、図２９により請求項１，２、および請求項５〜２０に記載の発明を説明する。図１は本発明の実施の形態における細胞外電位測定デバイスの一実施の形態を示した斜視図であり、図２はその断面図、図３は同断面図の拡大図である。
【００２９】
図１〜図３の細胞外電位測定デバイスは、シリコンよりなる基板１にウエル２が設けられ、このウエル２の底面３には第一の開口部４と第二の開口部５が空洞部６を介してこれらは一直線上に連結されており、これらにより細胞トラップ孔が複数個構成されている。第一の開口部４の径は空洞部６より小さく、第二の開口部５より大きい。
【００３０】
これらの具体的な大きさは、被検体細胞の大きさによって最適に決められるものであるが、大きさの順番は変わるものではない。たとえば被検体細胞の径を２５マイクロメートルであるとすると、第一の開口部４は２５マイクロメートルより小さい２０マイクロメートルとし、空洞部６の径は被検体細胞の大きさより大きい３５マイクロメートルとし、第二の開口部５は被検体細胞より小さい１０マイクロメートル程度としておけばよい。この他、被検体細胞の大きさは小さいもので数マイクロメートル、大きいもので数十マイクロメートルであるので、第一の開口部４は１０〜５０マイクロメートル、第二の開口部５は１〜５マイクロメートル程度とし、空洞部６の大きさはこれらの大きさによって１０〜１００マイクロメートルの間で最適な値とすることが望ましい。
【００３１】
さらに、図３に示すように少なくとも第二の開口部５の内壁面と空洞部６の下方には金よりなる検出電極７が形成されており、基板１の下面側には金よりなる引き出し電極８が設けられている。検出電極７と引き出し電極８は第二の開口部５で電気的に接続されている。一方、空洞部６の側面および上方には導体は設けられていないので、検出電極７はウエル２側と電気的に絶縁されている。
【００３２】
さて、この細胞外電位測定用デバイスの使用方法について図面を用いて少し説明する。図４は細胞外電位測定用デバイスに被検体細胞１０と培養液１１をウエル２に投入したときの様子を断面図で示しており、図５〜図９は第一の開口部４、第二の開口部５、空洞部６の部分の拡大断面図である。
【００３３】
さて、図４にあるようにウエル２内に培養液１１と被検体細胞１０を入れると、当初、この被検体細胞１０は培養液１１中に浮遊している。また、培養液１１はウエル２内だけでなく、第一の開口部４、空洞部６、第二の開口部５を満たした後、第二の開口部５側にも流れ出す。このようにすると、浮遊している被検体細胞１０はウエル２内の圧力によって、図６に示すように第一の開口部４へ引き込まれる。引き込みの圧力が足りない場合には、第二の開口部５側から吸引ポンプなどの手段により吸引すると、より確実に浮遊している被検体細胞１０は第一の開口部４側に吸引される。
【００３４】
さて、第一の開口部４の大きさは被検体細胞１０より小さくなるよう設計しているので、図７に示すように被検体細胞１０は第一の開口部４を通るときに抵抗を受けるが吸引によって力を受けているので、空洞部６へ到達することができる。図８に示すように、空洞部６内に到達した被検体細胞１０は、吸引を止めてもウエル２側より培養液１１の圧力を受けている上、第一の開口部４を通るにはサイズが大きく、第一の開口部４はほぼ垂直なため、ウエル２側から吸引されるなどの外力がない限り、簡単にはウエル２側に戻ることができなくなり、空洞部６内に保持される。
【００３５】
さらに、空洞部６の形状を図のように縦径より横径が大きい楕円形状にし、縦径が被検体細胞１０より小さくなるようにしておけば、被検体細胞１０は確実に空洞部６内に保持される。このような状態で、ウエル２内の培養液１１に薬剤（図示せず）を投与すれば、薬剤は培養液１１内に浸透し、図９のように被検体細胞１０が活性化した場合に、第二の開口部５で発生した電気信号は、第二の開口部５に満たされている培養液１１の電位を変化させることになるので、この電位の変化は培養液１１に接している検出電極７及び引き出し電極８によって外部に取り出される。
【００３６】
このように、本発明の細胞外電位測定用デバイスでは、検出電極７はウエル２側とは電気的に絶縁されており、測定の際には被検体細胞１０は確実に空洞部６内に保持されている。つまり、第二の開口部５側の培養液１１とウエル２側の培養液１１とは電気的に絶縁された状態にあるので、細胞の活動により発生する電気信号は、ウエル２側の培養液１１に漏れることなく、第二の開口部５側に設けた検出電極７によって検出されるのである。
【００３７】
さらに、第一の開口部４は図２９に示すように、ウエル２側の方が穴径が広いテーパ形状となっていても良い。この場合は、ウエル２側から被検体細胞１０の進入をより容易にする。一方で、第一の開口部４の空洞部６側の大きさを空洞部６より小さくしておけば、ウエル２側へ被検体細胞１０が戻ることも防げる。これにより、空洞部６へ入った被検体細胞１０はウエル２側へは戻らず保持されるので、より細胞の保持率の高い細胞外電位測定デバイスとすることができる。なお、この場合の開口部の大きさの関係は、大きいものから順に空洞部６の大きさ、第一の開口部４の空洞部側の大きさ、第二の開口部５の大きさとすればよい。
【００３８】
なお、本発明の細胞外電位測定デバイスでは、被検体細胞１０が細胞トラップ孔の中に進入すると、ウエル２側に戻ることはできなくなるが、一度、被検体細胞１０の測定を行うとウエル２および細胞トラップ孔内部が汚染されるため、再利用はせず使い捨てになるので被検体細胞１０を取り出す必要はない。
【００３９】
次に本発明の細胞外電位測定用デバイスを製造する手順について図面を用いて説明する。図１０〜図１９はこの製造手順を説明するための細胞外電位測定用デバイスの断面図である。
【００４０】
まず、図１０に示すように、シリコン基板１にフォトリソグラフィーによってウエル２を形成するためのレジストマスク１２を形成し、次に図１１に示すように所定の深さになるまでエッチングを行いウエル２を形成する。このときのエッチング方法にはウェットエッチングとドライエッチングがあるが、ウェットエッチングの場合はＫＯＨやＴＭＡＨ（水酸化テトラ・メチル・アンモニウム液）などのエッチング液、ドライエッチングの場合にはＳＦ6，ＣＦ4などのエッチングガスを用いることができる。
【００４１】
次に図１２に示すように、第一の開口部４を形成するためのレジストマスク１３と、第二の開口部を形成するためのレジストマスク１４をそれぞれ、ウエル２の底面およびシリコン基板１の下面に形成する。このとき、第一の開口部４と第二の開口部５の大きさは被検体細胞１０の大きさによって変える必要があるが、少なくとも第一の開口部４の方が第二の開口部５より大きくなるようにする。
【００４２】
次に図１３に示すように、ウエル２側から第一の開口部４のエッチングを所定の深さになるまで行う。このときエッチングの方法としては、ドライエッチングが望ましく、なおかつエッチングガスとしてエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いる。エッチングを促進するガスにはＳＦ6、ＣＦ4などを用いるが、これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけではなく、横方向へも促進する作用がある。そこで、ＣＨＦ3，Ｃ4Ｆ8等のエッチングを抑制するガスを混合させておくことで、エッチングの壁面にＣＦ2のポリマーである保護膜を作成するので、エッチングをエッチングマスクの下方のみに進行させることが可能なのである。
【００４３】
また、別の方法として、エッチング形状をさらに垂直なものにしたい場合には、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができる。実験では、大きさ２０マイクロメートルの第一の開口部４を形成するのに、ＳＦ6を１３０ｓｃｃｍ流して１３秒間プラズマ発生させることで約１マイクロメートルのエッチングを行い、その後Ｃ4Ｆ8を８５ｓｃｃｍ流して７秒間プラズマ発生させて約０．０１マイクロメートルの保護膜を形成し、またエッチングを行うということを約６０回繰り返した結果、６０マイクロメートルの深さのほぼ垂直なエッチング形状とすることができた。
【００４４】
なお、エッチングを抑制するガスによって保護膜は第一の開口部４の壁面だけでなく、底面にも形成されるが、底面に形成された保護膜は壁面に形成された保護膜に比べてエッチングを促進するガスによって容易に除去されるので、エッチングは下方のみに進むのである。
【００４５】
さらに、このときのエッチング工程においては、エッチングを終了する直前はエッチングを抑制するガスによって保護膜を形成することで終了しておけば、第一の開口部４の壁面には確実に保護膜が形成されるので、後の工程において、空洞部６を形成する際にも第一の開口部４の壁面が侵されることがない。
【００４６】
次に、図１４に示すように、ウエル２の下面側から第二の開口部５を形成するためのエッチングを行う。ここでも第一の開口部４を形成する際と同様、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスの切り替えによるエッチングを行って壁面をほぼ垂直になるよう形成しておく。
【００４７】
さらに、第一の開口部４の場合と同様、エッチングを終了する直前にはエッチングを抑制するガスによって保護膜を形成して終了しておく。これにより、第二の開口部５の壁面にも保護膜が確実に形成されるので、後の工程において空洞部６を形成する際にも第二の開口部５壁面が侵されることがない。
【００４８】
次に、図１５に示すように第一の開口部４側から、エッチングを促進するガスのみを用いてエッチングを行う。先ほどの工程で、第一の開口部４の壁面には保護膜が形成されているので、壁面はエッチングによって侵されることなく、下方にエッチングが進むが、新しくエッチングされたところには保護膜が形成されないので、横方向にもエッチングが進むことになり、結果的に図１５に示すように、第一の開口部４と第二の開口部５の間に第一の開口部４より広がった空洞部６が形成されるのである。このエッチング量を適当な量行えば、空洞部６の形状は横径の方が大きい楕円形状となるのである。
【００４９】
なお、空洞部６のエッチングの際には第二の開口部５側に貫通された後も第二の開口部５の壁面にも保護膜が形成されているので、空洞部６の大きさが所望の大きさとなるまでしばらくエッチングを続けても、第二の開口部５の壁面が侵されることはない。ここで、あまりエッチングを続けると、横方向のみではなく、図１５の点線に示すように全体に広がった形状となるので、適当なところで止める必要がある。
【００５０】
なお、この工程におけるエッチングを促進するガスはＳＦ6，ＣＦ4が利用できるが、望ましくはＸｅＦ2がもっとも適している。これはこのガスでは保護膜がほとんどエッチングされないので、壁面をほとんど侵すことなく空洞部６を形成することが可能なのである。ただし、このガスの場合は、前工程で形成されたエッチング底面の保護膜をエッチングする速度も遅くなるので、これを回避するため、ＸｅＦ2によるエッチングをする前にＳＦ6，ＣＦ4，Ａｒガスなどを用いて底面の保護膜のみをエッチングすればよい。
【００５１】
なお、本実施の形態１では第一の開口部４、第二の開口部５、空洞部６の順番でエッチングを行ったが、この順番は、第二の開口部５、第一の開口部４、空洞部６の順番、あるいは第一の開口部４、空洞部６、第二の開口部５の順番でも可能である。また、空洞部６のエッチングは第二の開口部５側よりエッチングすることも可能であるが、この場合は、空洞部６が第一の開口部４より大きくなるようにエッチング量に注意する必要がある。
【００５２】
さて、次に、図１６に示すように、すべてのレジストマスクを除去した後、第一の開口部４側から金を蒸着法により付着させ検出電極７を形成する。このように第一の開口部４側から金を蒸着により付着させるターゲットより放出された金粒子は直進性があるので第一の開口部４を通って、図１７に示すように第一の開口部４の内壁、空洞部６部の下方及び第二の開口部５の内壁のみに蒸着される。つまり、検出電極７は第二の開口部５の内壁と空洞部６の下方にしか形成されないのである。
【００５３】
そして、次に図１８に示すように、第二の開口部５側より金よりなる引き出し電極８を蒸着によって形成する。このように形成すると、第二の開口部５は第一の開口部４より十分小さいので、やはり金粒子の直進性によって、第二の開口部５の内壁と第一の開口部４の内壁の一部にしか金は付着しない。つまり、図１９でも明らかなように、空洞部６の下方と第二の開口部５に形成された検出電極７と第一の開口部４の内壁に形成された金は電気的に絶縁されているのである。ここで、金のみでは基板１への密着性が悪い場合はクロム、チタンなどをバッファ層として積層することができる。また、ウエル２の底面へ金が蒸着されると不都合がある場合には、少なくとも第一の開口部４を形成するために設けたレジストマスク１２を除去する前に金を蒸着すれば、その後レジストマスク１２を除去した後には金はウエル２の底部には形成されないことになる。なお、ここでは金の形成は蒸着法としたが、スパッタ法でも同様の効果は得られる。
【００５４】
このようにして、本実施の形態による製造方法によれば、シリコンよりなる基板１に、ウエル２と、ウエル２内に第一の開口部４と第二の開口部５と空洞部６を有し、これら構造によって被検体細胞を確実に空洞部６内に保持することのできる信頼性の高い細胞外電位測定用デバイスを得ることができるのである。
【００５５】
なお、本実施の形態１では基板１をシリコンとしたが、ドライエッチングが可能で、ガスの切り替えによって直進性エッチングと横方向エッチングが実現できる基板材料であれば本発明の方法は適用できる。たとえばガラス基板や石英基板はＳＦ6、ＣＦ4などのガスにより直進性エッチングが可能で、ＨＦガラスによって横方向のエッチングが可能である。
【００５６】
なお、本実施の形態１では、第一の開口部４はほぼ垂直な穴となるようにしたが、第一の開口部４の壁面を空洞部６側の径よりウエル２側の径の方が大きいテーパ形状にしたい場合には、第一の開口部４をエッチングする工程において、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの割合を、エッチングがウエル２側から空洞部６側に進むに従って、エッチングを促進するガスの割合を減らしていけばよい。これによって、図２０のように第一の開口部４の壁面がテーパ形状となり、図２１のように空洞部６を形成した後には被検体細胞１０の進入をしやすく、空洞部６に入った被検体細胞１０はウエル２側へ戻りにくい形状とすることができる。
【００５７】
なお、第一の開口部４の壁面がテーパ形状となるようにするには、この他、エッチングを促進するガスのみでエッチングすることでも可能である。この場合は図２２のようにレジストマスク１３で作成した径よりウエル２側の第一の開口部４の大きさが広がるので、最適なテーパ形状となるようあらかじめレジストマスク１３の大きさを決めておく必要がある。
【００５８】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２及び図２３〜図２８により請求項３，４に記載の発明を説明する。実施の形態２では、基板の材料としてシリコンと二酸化珪素もしくはこれを含むガラス材料との積層体である場合について説明する。
【００５９】
図２３は本発明の実施の形態２における細胞外電位測定用デバイスの斜視図であり、図２４はそれの断面図、図２５は同拡大断面図である。実施の形態１と違うところは、基板２１が第一のシリコン層２２と二酸化珪素層２３と第二のシリコン層２４の積層体となっているところである。そして、第一の開口部２６は第一のシリコン層２２に、第二の開口部２７は第二のシリコン層２４に、空洞部２８は二酸化珪素層２３にそれぞれ形成されている。
【００６０】
また、検出電極２９は第二の開口部２７の内壁と、空洞部２８の下方のみに形成されており、引き出し電極３０はウエル２５の下面に形成されており、検出電極２９と引き出し電極３０は第二の開口部２７付近で電気的に接続されている。
【００６１】
これらによって構成された細胞外電位測定デバイスの動作は、実施の形態１で述べたものと同じになるので省略するが、二酸化珪素層２３が第一のシリコン層２２と第二のシリコン層２４の間に挟まれているので、二酸化珪素層２３は両者間の電気的絶縁を高め、第二の開口部２７側で発生する細胞活動による電気的信号は、第一の開口部２６側に漏れることなく確実に、検出電極２９によって検出できるのである。
【００６２】
次に実施の形態２の細胞外電位測定用デバイスを製造するための手順について説明する。ここでは、実施の形態１と同じ方法による工程は説明を省略し、第一の開口部２６、第二の開口部２７、空洞部２８を形成する工程のみについて説明する。また、基板材料はシリコン層、二酸化珪素層、シリコン層の順番で積層されたものを使用するが、これはＳＯＩ基板として一般に販売されているものであるから特段の説明はしない。
【００６３】
まず、図２６はウエル２５を第一のシリコン層２２に形成した後に、第一の開口部２６、第二の開口部２７を形成するためのレジストマスク３１，３２を形成したところである。そして次に図２７の拡大断面図に示すように、ウエル２５の底面および下面側よりドライエッチングによって壁面が垂直になるように、二酸化珪素層２３に達するまでエッチングを行う。このとき、エッチングは実施の形態１と同様、エッチングを促進するガスと抑制するガスを用いる。さて、このように、二酸化珪素層２３が挟まれていることにより、第一の開口部２６と第二の開口部２７のエッチング時に、二酸化珪素層２３に到達するまでエッチングすればよいので、所定のエッチング深さになるようエッチング時間を管理する必要が無いという製造上の利点がある。
【００６４】
次に、ＨＦ溶液に浸けると、ＨＦ溶液はシリコン層をエッチングせず、二酸化珪素層２３のみをエッチングするので、図２８に示すように空洞部２８が形成される。このときエッチング時間は、空洞部２８が必要な横方向の大きさになるまでエッチングすればよい。そして、この後の工程は、実施の形態１と同様、検出電極２９と引き出し電極３０を形成すればよい。また、二酸化珪素層２３をエッチングする方法としては、他にＨＦガスを用いてプラズマエッチングを行っても良い。この場合はＨＦ溶液の場合と同様、シリコン層をエッチングせず、二酸化珪素層２３のみをエッチングできるので、実施の形態１にあるようにエッチングを長くしすぎると、楕円形状ではなくなってしまうということがない。
【００６５】
以上のように、シリコンと二酸化珪素の２種類の層を積層した基板２１を用いることにより、少なくとも第二の開口部２７の深さと、空洞部２８の高さがあらかじめ決まっているので、製造がより容易になることに加え、第一の開口部２６側と第二の開口部２７側は二酸化珪素層２３によって電気的に完全に分離されているので、より信頼性の高い細胞外電位測定用デバイスを提供することができるのである。
【００６６】
なお、本実施の形態２では、シリコン層と二酸化珪素層の２種類の材料層を用いて第一のシリコン層２２、二酸化珪素層２３、第二のシリコン層２４の３層構造の基板２１を用いたが、たとえばシリコン層、二酸化珪素層、シリコン層、二酸化珪素層のように４層構造以上にしてもよい。
【００６７】
また、シリコン層、二酸化珪素層、シリコン層の順番で積層させた基板２１を用いたが二酸化珪素層、シリコン層、二酸化珪素層の順番に積層されたものでも可能である。さらに基板２１を構成する材料としてはシリコンと二酸化珪素の組み合わせの他にシリコンとガラス、アルミとアルミナ、ガラスと樹脂など多数の組み合わせがある。また、基板２１を構成する材料は２種類ではなく３種類とし、それぞれの層を変えても同様の効果が得られることが期待される。
【００６８】
なお、実施の形態１と同様、第一の開口部２６の壁面をテーパ形状にすることが可能であるが、効果、方法は実施の形態１で述べたものと同じであるので説明を省略する。
【００６９】
【発明の効果】
以上のように本発明では、基板と、この基板内に被検体細胞及びこれと反応する薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つのウエルを有し、このウエルの底部に第一の開口部、第二の開口部及び空洞部を有し、第一の開口部と第二の開口部は空洞部を介して連結され、第一の開口部の径は空洞部の径より小さく、第二の開口部より大きい構造である細胞外電位測定デバイスを提供する。これによって、被検体細胞は第一の開口部を介して空洞部内に進入可能で、進入後は確実に被検体細胞を空洞部の中に閉じこめることができるので、細胞活動によって発生する電気的信号を確実に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の実施の形態１による細胞外電位測定用デバイスの斜視図
【図２】
同断面図
【図３】
同断面拡大図
【図４】
同使用方法を示す断面図
【図５】
同拡大断面図
【図６】
同拡大断面図
【図７】
同拡大断面図
【図８】
同拡大断面図
【図９】
同拡大断面図
【図１０】
同細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す断面図
【図１１】
同断面図
【図１２】
同断面図
【図１３】
同拡大断面図
【図１４】
同拡大断面図
【図１５】
同拡大断面図
【図１６】
同拡大断面図
【図１７】
同拡大断面図
【図１８】
同拡大断面図
【図１９】
同拡大断面図
【図２０】
同他の製造方法の例を示す拡大断面図
【図２１】
同拡大断面図
【図２２】
同他の例を示す拡大断面図
【図２３】
本発明の実施の形態２による細胞外電位測定用デバイスの斜視図
【図２４】
同断面図
【図２５】
同拡大断面図
【図２６】
同製造方法を示す断面図
【図２７】  
同拡大断面図
【図２８】
同拡大断面図
【図２９】
本発明の実施の形態１による他の例の細胞外電位測定デバイスの断面図
【符号の説明】
１  シリコン基板
２  ウエル
３  底面
４  第一の開口部
５  第二の開口部
６  空洞部
７  検出電極
８  引き出し電極
１０  被検体細胞
１１  培養液
１２  レジストマスク
１３  レジストマスク
１４  レジストマスク
１５  金粒子
１６  金粒子
２１  基板
２２  第一のシリコン層
２３  二酸化珪素層
２４  第二のシリコン層
２５  ウエル
２６  第一の開口部
２７  第二の開口部
２８  空洞部
２９  検出電極
３０  引き出し電極
３１  レジストマスク
３２  レジストマスク
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３０
【補正方法】削除
【補正の内容】