(57)【要約】植物の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することにより、花の形態が改変された植物体を生産する。より詳しくは、極性決定に関与する転写因子をコードするDNAと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするDNAとを融合させたキメラDNAを植物細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、前記形質転換細胞から形質転換植物体を再生させる工程により、花の形態が改変された植物体を生産する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することにより、植物体の花の形態を改変させることを特徴とする花の形態が改変された植物体の生産方法。
【請求項２】
前記転写因子をコードするDNAと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするDNAとを融合させたキメラDNAを植物細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、前記形質転換細胞から形質転換植物体を再生させる工程を含む、請求項１に記載の花の形態が改変された植物体の生産方法。
【請求項３】
前記転写因子をコードするDNAが、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号１に記載の塩基配列を含むDNA
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列をコードするDNA
（４）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNAから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の花の形態が改変された植物体の生産方法。
【請求項４】
前記転写因子をコードするDNAが、
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号３に記載の塩基配列を含むDNA
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列をコードするDNA
（４）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（５）配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNAから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の花の形態が改変された植物体の生産方法。
【請求項５】
前記転写因子をコードするDNAが、
（１）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号５に記載の塩基配列を含むDNA
（３）配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列をコードするDNA
（４）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（５）配列番号６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNAから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の花の形態が改変された植物体の生産方法。
【請求項６】
前記機能性ペプチドが、配列番号７から配列番号４６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか一項に記載の花の形態が改変された植物体の生産方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生産方法により生産された植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花の形態が改変された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体に関するものであり、特に極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することによる花の形態が改変された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
花の形態は園芸植物の観賞性における重要な要素の一つである。花の発生は、花序分裂組織から花原基として分化するところから始まり、花原基に含まれる花芽分裂組織から、がく片、花びら、雄しべ、雌しべの４種類の花器官が分化する。その後、分化した花器官を含む複合器官として成熟した花が形成される。花の形態が改変された植物は、新規な園芸植物の創出や、新規な形態を持つ果実の創出に利用できる等、農業上の有用性が高い。【０００３】
これまで、植物の花の形態の改変は、一般に植物の品種を掛け合わせる交配育種により行われている。しかし、従来の交配育種では、目的とする形態を有する植物を生産するためには、長い年月と、熟練者の経験が必要であるため、簡易かつ確実に花の形態を改変する方法が求められている。【０００４】
高等植物における花の形態の発生は一般にＡＢＣモデルによって説明されており、このモデルはMADSボックスファミリーに属するＡ、Ｂ、Ｃのクラスの遺伝子の転写制御を介して花の形態が変化すると考えられている（酒井一，花の形態形成の分子遺伝学，新版「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）150-163 (2000)）。MADSボックスファミリー遺伝子は、MADSボックスと呼ばれる保存性領域を含む転写因子をコードする遺伝子で、30以上の遺伝子からなる遺伝子ファミリーを形成している。例えばＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）、ＡＰＥＴＡＬＡ（ＡＰ２）などのＡクラス遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）、ＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）などのＢクラス遺伝子、そしてＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）のＣクラス遺伝子など転写因子が挙げられ、これらの変異体で花の形態の変化が確認されている。【０００５】
一方で、相対的に平坦な組織である被子植物の葉の基本構造は、一般に、近位−遠位、内側−外側、及び向軸性−背軸性という３つの軸に基づいて説明することができる。これらの極性を決定する転写因子としてＹＡＢＢＹ１（ＹＡＢ１）、ＹＡＢＢＹ３（ＹＡＢ３）などのＹＡＢＢＹグループ、ＰＨＡＢＵＬＯＳＡ（ＰＨＢ）などのＨＤグループ及びＫＡＮＡＤＩ（ＫＡＮ）などのＫＡＮＡＤＩグループなどが挙げられ、これらは葉身における極性決定に関与していることが知られている（非特許文献１〜３）。【０００６】
これまでに、遺伝子工学的に花の形態を改変する方法として本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを利用する方法を見出している（例えば、特許文献１〜７）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。そして、本発明者は、種々の転写因子と上記ペプチドとを融合させた融合タンパク質（キメラタンパク質）をコードする遺伝子を植物体内に導入することより、転写因子が転写抑制因子に転換され、該転写因子が転写を促進する標的遺伝子の発現が抑制された植物体を生産することに成功している。具体的には、上記のMADSボックスファミリー遺伝子であるシロイヌナズナのＡＰ３遺伝子やＡＧ遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子のプロモーター領域に結合するリプレッサーを用いて抑制し、雄性不稔体の生産方法や花の形態が改変する方法を確立している（特許文献８〜９）。
しかし、植物の葉の極性決定に関与する転写因子（YAB１、KAN、PHB）を転写抑制因子に転換したキメラリプレッサーを組換え植物内で過剰発現させることにより、植物器官の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することによって花の形態が改変されることは知られていない。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【特許文献８】特開２００５−１９２４８３公報（平成１７年（２００５）７月２１日公開）
【特許文献９】特開２００６−４２７２９公報（平成１８年（２００６）２月１６日公開）
【非特許文献１】Eshed Y, Baum SF, Perea JV, Bowman JL.Curr Biol. 2001 Aug 21;11(16):1251-60.
【非特許文献２】Eshed Y, Izhaki A, Baum SF, Floyd SK, Bowman JL.Development.2004 Jun;131(12):2997-3006.
【非特許文献３】Kidner CA, Timmermans MC.Curr Opin Plant Biol. 2007 Feb;10(1):13-20
【発明の開示】
【０００７】
従来、花の形態に関与するMADSボックスファミリーに属するＡ、Ｂ、Ｃのクラスの転写因子以外の遺伝子を制御して花の形態を改変する技術は知られていなかった。一方、上述のように、植物の極性を決定する転写因子として知られているＹＡＢ１、ＹＡＢ３、ＰＨＢ及びＫＡＮなどの転写因子は花の形態に対する機能は未知であるものの、当該転写因子を転写抑制因子に転換したキメラタンパク質を組換え植物内で過剰発現させることにより、花の正常な形態形成に関与する転写因子の機能を抑制できれば、従来の一般的なMADSボックスファミリー転写因子の制御によるものとは異なった花の形態を効率的に改変することができるのではないかと考えた。
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することによって、簡易かつ確実に、新規な花の形態が改変された植物体を生産する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。そして後述される植物の極性決定に関与する転写因子をコードするDNAと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするDNAとを融合させたキメラDNAを植物細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、前記形質転換細胞から形質転換植物体を再生させる工程からなる、花の形態が改変された植物体の生産方法並びに花の形態が改変された形質転換体を得る事に成功した。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。本発明は、植物の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することにより、植物体の花の形態を改変させることを特徴とする花の形態が改変された植物体の生産方法を提供する。
さらに、本発明は、前記転写因子をコードするDNAと前記機能性ペプチドをコードするDNAとを融合させたキメラDNAを植物細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、前記形質転換細胞から形質転換植物体を再生させる工程を含む、花の形態が改変された植物体の生産方法を提供する。
また、さらに、本発明は、前記転写因子が、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号１に記載の塩基配列を含むDNA
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列をコードするDNA
（４）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNAから選択されることを特徴とする花の形態が改変された植物体の生産方法を提供する。
さらに、本発明は、前記転写因子が、
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号３に記載の塩基配列を含むDNA
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列をコードするDNA
（４）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（５）配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNAから選択されることを特徴とする花の形態が改変された植物体の生産方法を提供する。
さらに、本発明は、前記転写因子が、
（１）配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号５に記載の塩基配列を含むDNA
（３）配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列をコードするDNA
（４）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（５）配列番号６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNAから選択されることを特徴とする花の形態が改変された植物体の生産方法を提供する。
さらに、本発明は、前記機能性ペプチドが、配列番号７から配列番号４６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする花の形態が改変された植物体の生産方法を提供する。
また、本発明は、前記いずれかの生産方法により生産された植物体にも関する。
【００１０】
本発明に係る植物体の生産方法は、以上のように、植物の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することにより、植物体の花の形態を改変させる構成を備えているので、上記のYAB1及びKAN1、PHBなどの転写因子の機能が抑制され、簡便に花の形態を改変することができるという効果を奏する。より具体的には、花びらや雌しべ等に形態変化を持つ花卉植物を作製することができるため、新規な園芸品種を創出することができるという効果を有する。また、果樹においては果実の形態を変化させることができるため、新規な形態を持つ果実を創出することができるという効果を有する。さらに、本発明は、交配育種によるよりも簡易かつ確実に花の形態を改変することができるため、労働力を削減することができるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ATKAN1SRDX形質転換アサガオ（ｂ）または野生型アサガオ（ａ）を示す写真。
【図２】ATYAB1SRDX形質転換アサガオ（ｂ）または野生型アサガオ（ａ）を示す写真。
【図３】ATPHBSRDX形質転換アサガオ（ｂ）または野生型アサガオ（ａ）を示す写真。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
植物の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制する方法は特に限定されるものではなく、転写抑制因子を植物に導入して内在性の転写因子の活性を抑制する方法や、遺伝子破壊やRNA干渉（RNAi）などにより転写因子をコードする遺伝子の発現を抑制する方法が例示されるが、この中では、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることが好ましい。これによって得られる植物体では、上記転写因子の機能が抑制されるため、花の形態が改変された植物体を生産することができる。つまり、上記転写因子は、植物器官の極性、例えば葉の表裏、対称性など、正常な形態形成に不可欠なものであるため、上記転写因子が転写抑制因子に転換されることにより、花の形態形成に異常が引き起こされる。
なお、本方法においては、上記転写因子が標的とする遺伝子は特定される必要がない。結果として、花の形態が改変されることから、上記標的遺伝子は、花の形成過程において、花の形態に影響を与える機能を有する遺伝子であることが推定されるが、その機能や構造の特定がされていなくても、本方法においては、その転写抑制を有効に行うことができる。【００１３】
以降の説明では、本発明にかかる花の形態が改変された植物体の生産方法に用いられるキメラタンパク質、本発明にかかる植物体の生産方法の一例、これにより得られる植物体とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。【００１４】
（Ｉ）キメラタンパク質の構築
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。そこで、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。【００１５】
（Ｉ）−１  植物の極性決定に関与する転写因子
植物の極性決定に関与する転写因子としては、例えば、シロイヌナズナのKAN１タンパク質、KAN２タンパク質、KAN３タンパク質、KAN４タンパク質、YAB1タンパク質、YAB３タンパク質、PHBタンパク質等を挙げることができるが、植物の極性決定に関与する転写因子である限り、特に限定されるものではない。【００１６】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、好ましくは、シロイヌナズナのKAN１タンパク質またはYAB１タンパク質またはPHBタンパク質を挙げることができる。KAN１タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。YAB１タンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。PHBタンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
後述する実施例においては、このKAN1タンパク質およびYAB１タンパク質、PHBタンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるKAN1タンパク質およびYAB１タンパク質、PHBタンパク質を転写抑制因子に転換させている。【００１７】
ただし、上記転写因子は、配列番号２，４または６に限定されるものではなく、同等の機能を有するホモログであってもよい。具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、下記転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときに植物の花の形態を改変しうるものであれば本発明にて用いることができる。また、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、下記転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときに植物の花の形態を改変しうるものであれば本発明にて用いることができる。また、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、下記転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときに植物の花の形態を改変しうるものであれば本発明にて用いることができる。【００１８】
なお、上記の配列番号２および４、６に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。【００１９】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子が好適に用いることができる。【００２０】
例えば、転写因子としてKAN１タンパク質を用いる場合には、このKAN１タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、KAN１遺伝子と称する）を挙げることができる。KAN1遺伝子の具体的な一例としては、配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。また、例えば、転写因子としてYAB１タンパク質を用いる場合には、このYAB１タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、YAB１遺伝子と称する）を挙げることができる。YAB1遺伝子の具体的な一例としては、配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。また、例えば、転写因子としてPHBタンパク質を用いる場合には、このPHBタンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、PHB遺伝子と称する）を挙げることができる。PHB遺伝子の具体的な一例としては、配列番号５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。【００２１】
もちろん、本発明で用いられる転写因子をコードするDNAとしては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号１、３または５に示される塩基配列と相同性を有するDNAであってもよい。具体的には、例えば、配列番号１、３または５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、転写抑制転換ペプチドとのキメラタンパク質として植物に導入したときに植物の花の形態を改変しうるタンパク質をコードするDNA等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、好ましくは６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味し、より好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。また、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNA等を挙げることができる。【００２２】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（非特異DNAはハイブリダイズしがたくなる）。【００２３】
上記転写因子をコードするDNAを取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記DNAを得ることができる。また、上記転写因子をコードするDNAは、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。【００２４】
（Ｉ）−２  転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子の機能を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献１〜７）を挙げることができる。【００２５】
本発明者は、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、転写因子を転写抑制因子に転換して標的転写因子の機能を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードするDNAおよびこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に転写因子の機能を抑制することに成功した（例えば特許文献１〜４参照）。また、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献６参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、転写因子を転写抑制因子に転換して標的転写因子の機能を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、転写因子の機能を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。【００２６】
また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードするDNAを、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードするDNAに結合させたキメラDNAは、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している（Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M.,The Plant Cell, Vol.13,1959-1968,August,2001、Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters, 514, 351-354 (2002)）。【００２７】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Class II ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。【００２８】
上述した転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号７〜４６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである。【００２９】
（Ｉ）−３  キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ）−２で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ）−１で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードするDNAとのキメラDNAを得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。【００３０】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードするDNAとを連結することによりキメラDNAを構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラDNAを植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（ＩＩ）の項で詳細に説明する。【００３１】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子DNAと連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子DNAの読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。【００３２】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードするDNAと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラDNAから得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子と、上記転写抑制転換ペプチドとが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。なお、キメラタンパク質において、転写因子と転写抑制転換ペプチドの順番は特に制限されず、いずれをアミノ末端側にしてもよい。【００３３】
（ＩＩ）植物体の生産方法  
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、花の形態を改変する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。【００３４】
（ＩＩ）−１  発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ）−１で説明した転写因子をコードするDNAと、上記（Ｉ）−２で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。【００３５】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。【００３６】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。【００３７】
上記プロモーターは、転写因子をコードするDNAと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラDNAを発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。【００３８】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラDNAに加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。【００３９】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。【００４０】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。【００４１】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。【００４２】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードするDNA、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードするDNAと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラDNAを構築し、次に、このキメラDNAとプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。【００４３】
キメラDNAの構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラDNA、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。【００４４】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。【００４５】
（ＩＩ）−２  形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ）−１で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。【００４６】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。【００４７】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、不定胚、懸濁培養細胞等を挙げることができる。【００４８】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。【００４９】
（ＩＩ）−３  選抜及び植物体再生工程
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。【００５０】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのものの花の形態から選抜してもよい。例えば、花の形態から選抜する例としては、形質転換体の花の形態を、形質転換していない植物体の花の形態と比較する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。特に花の形態は、単に比較するだけでも選抜が可能になるとともに、花の形態の改変という本発明の効果そのものも確認することができる。【００５１】
上記の選抜工程で選抜された細胞、不定芽、不定胚などの組織を育成して生育させることにより目的の形質転換植物体を得ることができる。【００５２】
上記の工程で得られた形質転換植物体に目的とする転写因子をコードするDNAと転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラDNAが組み込まれていることの確認は、これらの組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法もしくはサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。【００５３】
本発明において「花の形態」が改変されているとは、花の形態に関する形質が改変されていれば、特に限定されるものではない。花の形態としては、例えば、花柄の長さ、花びらの形状、花びらの模様、花びらの色、がくの形状、さやの形状、雄しべの形状、雌しべの形状等を挙げることができ、果実の形態も含まれるが、これらに限定されるものではない。また、花の形態が改変されるとは、単独の形態が改変される場合と、複数の形態が同時に改変される場合を含む。【００５４】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラDNAを植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により花の形態が改変された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。【００５５】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。【００５６】
ここで、本発明にかかる花の形態が改変された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、花の形態の改変によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目、モクレン目、クスノキ目、コショウ目、ウマノスズクサ目、シキミ目、スイレン目、キンポウゲ目、ケシ目、ヤマグルマ目、マンサク目、ユズリハ目、ブナ目、ナデシコ目、タデ目、バラ目、マメ目、ヤマモガシ目、カワゴケソウ目、アリノトウグサ目、フトモモ目、ミズキ目、ビャクダン目、ラフレシア目、ニシキギ目、トウダイグサ目、クロウメモドキ目、アマ目、ムクロジ目、フウロソウ目、セリ目等を挙げることができる。【００５７】
以下に、本発明の実施例の例示により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「モレキュラー クローニング（Molecular Cloning）  第2版」（J．Sambrookら、Cold  Spring  Habor Laboratory press，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【００５８】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。【００５９】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号４７）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号４８）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号４９）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号５０）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。【００６０】
（２）クローンテック社製（Clontech社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ（β-グルクロニダーゼ）遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。【００６１】
（３）以下の配列番号５１、５２の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号５１、５２の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'（配列番号５１）
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'（配列番号５２）【００６２】
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。【００６３】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ：配列番号２３）をコードし、３’末端に終止コドンTAAを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5'-gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag-3'（配列番号５３）
5'-tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc-3'（配列番号５４）【００６４】
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。【００６５】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。【００６６】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。【００６７】
（２）インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標）ベクターコンバージョンシステムのFragmentＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、FragmentＡ断片を回収した。【００６８】
（３）回収したFragmentＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。【００６９】
＜構築用ベクターへのKAN1遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子KAN1タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
（１）シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナKAN1遺伝子（遺伝子ID No.  AT5G16560）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＫＡＮ１−Ｆ）
5'-atgtctatgg aaggtgtttt tcagagaa-3'（配列番号５５）
プライマー２
（ＫＡＮ１−Ｒ stopless）5'- tttctcgtgccaatctggtctgcctaatgt -3'（配列番号５６）
ＫＡＮ１遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。【００７０】
（２）得られたKAN1コード領域のＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。【００７１】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったｐ３５ＳＫＡＮ１ＳＲＤＸＧを得た。【００７２】
＜構築用ベクターへのＹＡＢ1遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＹＡＢ1タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。【００７３】
（１）シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナＹＡＢ1遺伝子（遺伝子ID No.AT2G45190）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＹＡＢ１−Ｆ）
5'-atgtctatgt cgtctatgtc cccttc-3'（配列番号５７）
プライマー２（ＹＡＢ１−Ｒ stopless）
5'- ataagga gtcacaccaacgttagcagctgc -3'（配列番号５８）
ＹＡＢ１遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。【００７４】
（２）得られたＹＡＢ１コード領域のＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。【００７５】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったｐ３５ＳＹＡＢ１ＳＲＤＸＧを得た。【００７６】
＜構築用ベクターへのPHB遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子PHBタンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。【００７７】
（１）シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナPHB遺伝子（遺伝子ID No.AT2G34710）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（PHB−Ｆ）
5'- atgatgatgg tccattcgatgagcagaga -3'（配列番号５９）
プライマー２（PHB−Ｒ stopless）
5'- aacgaacgaccaattcacgaacatgaaagc -3'（配列番号６０）
PHB遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。【００７８】
（２）得られたPHBコード領域のＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。【００７９】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったｐ３５ＳPHBＳＲＤＸＧを得た。【００８０】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記の構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway（登録商標）ＬＲ clonase（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。【００８１】
（１）まず、ｐ３５ＳKAN1ＳＲＤＸＧまたはｐ３５ＳYAB1ＳＲＤＸＧまたはｐ３５ＳPHBＳＲＤＸＧの各々１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ buffer ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ TrisCl pH7.0、１ｍＭ EDTA）５．５μＬを加えた。【００８２】
（２）この溶液にＬＲ clonase４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、proteinaseＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。【００８３】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５α等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
これにより、植物形質転換用ベクターｐ３５SATKAN1SRDXおよびｐ３５SATYAB1SRDX、ｐ３５SATPHBSRDXを得た。【００８４】
＜アサガオの組織へのキメラ遺伝子の導入＞
アサガオ（品種：ムラサキ）の開花後２週間目の未熟果を有効塩素濃度が２％の次亜塩素酸ナトリウム液で１５分間浸漬し滅菌後、長さが２ｍｍ〜８ｍｍの未熟胚をとりだして、MS基本培地、ショ糖６％、ナフタレン酢酸（NAA）３ｍｇ／L、ゲランガム０．２％（ｐH５．８）に置床して、２５℃、明所で培養することにより、不定胚の形成を行い、遺伝子導入用組織とした。【００８５】
上記で得られた形質転換用ベクターｐ３５SATKANSRDXおよびｐ３５SATYABSRDX、ｐ３５SATPHBSRDXを包含するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ｐ３５SLBA４４０４−ATKAN1SRDX、ｐ３５SLBA４４０４−ATYAB1SRDX、ｐ３５SLBA４４０４−ATPHBSRDX）をLB培地で２８℃で一晩培養した培養液に上記に記載のアサガオの不定胚１００個を５分間浸漬処理した。浸漬処理後、MS基本培地にショ糖６％、植物ホルモンとしてNAA０．５ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐH５．８として、ゲルライト０．２％を加えた固体培地に置床した。２５℃の温度条件下で暗所にて２日間共存培養を行った。【００８６】
共存培養後の不定胚１００個を、MS培地にショ糖６％、植物ホルモンとしてNAA０．５ｍｇ／ｌ、オーグメンチン（（スミスクライン・ビーチャム、田辺社製) アモキシシリン２５０ｍｇ／ｌ、クラブラン酸カリウム ５０ｍｇ／ｌを含有する）、カナマイシン２５ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐH５．８として、ゲルライト０．２％を加えた固体選抜培地に置床した。２５℃の温度条件下で暗所にて１ヶ月毎に新しい選抜培地に移植した。【００８７】
＜形質転換アサガオの再生＞
上記選抜培地に移植後、１ヶ月後に上記の不定胚をMS培地にショ糖３％、植物ホルモンとしてIAA ２ｍｇ／ｌ、BA ２ｍｇ／ｌ、オーグメンチン（（スミスクライン・ビーチャム、田辺社製) アモキシシリン ２５０ｍｇ／ｌ、クラブラン酸カリウム ５０ｍｇ／ｌを含有する）、カナマイシン２５ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐH５．８として、寒天１．２％を加えた固体再生培地に置床した。【００８８】
再生培地に移植後、約２ヶ月で形質転換不定胚から形質転換された植物体を再生させた。これらの再生植物体は、１／２無機塩濃度のMS培地にオーグメンチン（（スミスクライン・ビーチャム、田辺社製) アモキシシリン ２５０ｍｇ／ｌ、クラブラン酸カリウム ５０ｍｇ／ｌを含有する）、カナマイシン２５ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐH５．８として、寒天１．２％を加えた育成培地に置床した。
２５℃の温度条件下で明所（１０００ルックス、１６時間照明）培養した。その結果、ATKAN1SRDXが形質転換されたアサガオ植物体が25個体、ATYAB1SRDXが形質転換されたアサガオ植物体が11個体、ATPHBSRDXが形質転換されたアサガオ植物体が25個体得られた。
これらの植物体はすべて、順化、鉢上げを行った。【００８９】
上記で得られた形質転換植物の葉を遺伝子解析用の材料とし、PCR法によりATKAN1SRDX、ATYAB1SRDX、ATPHBSRDX遺伝子が導入されていることを確認した。
また、上記で鉢上げされたATKAN1SRDXが形質転換されたアサガオ植物体が25個体、ATYAB1SRDXが形質転換されたアサガオ植物体が11個体、ATPHBSRDXが形質転換されたアサガオ植物体が25個体の葉を用いて、各々のキメラ遺伝子の植物体内での発現についてリバーストランスクリプションPCR（RT-PCR：  公知の方法）によって解析した結果、すべての形質転換体において発現が確認できた。【００９０】
ATKAN1SRDXで形質転換されたアサガオの表現型を野生型の表現型と比較した結果を図1に示す。図1は、花びらの形態を示したものである。図１の（a）は野生型の植物体、
（ｂ）はATKAN1SRDXで形質転換された植物体である。図１から明らかなように、ATKAN1SRDXで形質転換されたアサガオは、野生型に比べて花弁の凹凸が激しくなり、星咲きを有していた。【００９１】
ATYAB1SRDXで形質転換されたアサガオの表現型を野生型の表現型と比較した結果を図２に示す。図２は、花びらの形態と大きさを示したものである。図２の（a）は野生型の植物体、（ｂ）はATYAB1SRDXで形質転換された植物体である。図２から明らかなように、ATYAB1SRDXで形質転換されたアサガオは、野生型に比べて花弁の凹凸が激しくなり、星咲きを有していた。さらに、ATYAB1ＳＲＤＸで形質転換されたアサガオは、野生型に比べて花弁の大きさが縮小されて小型化していた。【００９２】
ATPHBSRDXで形質転換されたアサガオの表現型を野生型の表現型と比較した結果を図３に示す。図３は、花びらの形態を示したものである。図３の（a）は野生型の植物体、（ｂ）はATPHBSRDXで形質転換された植物体である。図３から明らかなように、ATPHBSRDXで形質転換されたアサガオは、野生型に比べて花弁の凹凸が激しくなり、星咲きを有していた。【００９３】
［配列表の説明］
配列番号１：KAN１タンパク質をコードする塩基配列
配列番号２：KAN１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：YAB１タンパク質をコードする塩基配列
配列番号４：YAB１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：PHBタンパク質をコードする塩基配列
配列番号６：PHBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号８：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号９：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１０：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１１：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１２：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１３：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１４：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１５：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１６：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１７：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１８：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１９：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２０：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２１：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２２：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２３：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２４：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２５：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２６：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２７：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２８：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号２９：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３０：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３１：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３２：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３３：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３４：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３５：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３６：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３７：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３８：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３９：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４０：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４１：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４２：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４３：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４４：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４５：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４６：転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４７：ａｔｔＬ１領域増幅用フォワードプライマー
配列番号４８：ａｔｔＬ１領域増幅用リバースプライマー
配列番号４９：ａｔｔＬ２領域増幅用フォワードプライマー
配列番号５０：ａｔｔＬ２領域増幅用リバースプライマー
配列番号５１：ＢａｍＨＩ制限酵素部位、タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩを含むオリゴヌクレオチド（センス鎖）
配列番号５２：ＢａｍＨＩ制限酵素部位、タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩを含むオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）
配列番号５３：転写抑制転換ペプチドSRDXをコードするオリゴヌクレオチド（センス鎖）
配列番号５４：転写抑制転換ペプチドSRDXをコードするオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）
配列番号５５：ＫＡＮ１増幅用フォワードプライマー
配列番号５６：ＫＡＮ１増幅用リバースプライマー
配列番号５７：ＹＡＢ１増幅用フォワードプライマー
配列番号５８：ＹＡＢ１増幅用リバースプライマー
配列番号５９：ＰＨＢ増幅用フォワードプライマー
配列番号６０：ＰＨＢ増幅用リバースプライマー
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明では、KAN１、YAB１、PHBなどの転写因子の機能を抑制することによって花の形態が改変された植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業や園芸、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図１】
2009020101.tif 000002
【図２】
2009020101.tif 000003
【図３】
2009020101.tif 000004
【配列表】
2009020101000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月26日(2009.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することにより、花の形態が改変された双子葉植物の生産方法であって、
前記生産方法は、前記転写因子をコードするＤＮＡと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするＤＮＡとを融合させたキメラＤＮＡを双子葉植物細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、前記形質転換細胞から形質転換植物体を再生させる工程を含み、
前記転写因子をコードするＤＮＡが、
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、
欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（４）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（５）配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡから選択されることを特徴とする、
方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記機能性ペプチドが、配列番号７から配列番号４６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１、６、８、９又は１０に記載の生産方法により生産された植物。
【請求項８】
前記双子葉植物が合弁花亜綱である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記合弁花亜綱がアサガオである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記花の形態が、花弁の形態である、請求項１、６、８及び９に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月30日(2009.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の極性決定に関与する転写因子の機能を抑制することにより、花の形態が改変された双子葉植物の生産方法であって、
前記生産方法は、前記転写因子をコードするＤＮＡと転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするＤＮＡとを融合させたキメラＤＮＡを双子葉植物細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、前記形質転換細胞から形質転換植物体を再生させる工程を含み、
前記転写因子をコードするＤＮＡが、
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、
欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（４）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（５）配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡから選択されることを特徴とする、
方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記機能性ペプチドが、配列番号７から配列番号４６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記双子葉植物が合弁花亜網である、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記合弁花亜網がアサガオである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記花の形態が、花弁の形態である、請求項１、６、８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１、６、８、９又は１０に記載の生産方法により生産された植物。
【国際調査報告】
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