(57)【要約】  種々のヒトがん細胞の検出に使用できその発現の有無が細胞のがん化と緊密に相関するものである識別マーカー，及び該識別マーカーの発現抑制を通じてがん細胞の増殖を抑制することに基づく，ヒトのがん治療剤が開示されている。該マーカーは，ヒトのヘテロクロマチンタンパク質１γ（ＨＰ１γ）であり，該がん治療剤は，ヒトＨＰ１γに対するｓｉＲＮＡその他のヒトＨＰ１γ遺伝子発現抑制剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験細胞ががん細胞であるか非がん細胞であるかを識別する方法であって，被験細胞中におけるＨＰ１γの発現を検出するステップと，該被験細胞中にＨＰ１γの発現が検出された細胞をがん細胞と，検出されなかった細胞を非癌細胞と判定するステップとを含むものである，方法。
【請求項２】
該がん細胞が，ヒトを含む哺乳動物の上皮性がん細胞及び／又は非上皮性がん細胞であり，該ＨＰ１γが該哺乳動物のＨＰ１γである，請求項１の方法。
【請求項３】
該被験細胞がヒト細胞であり，該ＨＰ１γがヒトＨＰ１γである，請求項１又は２の方法。
【請求項４】
ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質よりなるがん細胞増殖阻害剤。
【請求項５】
該がん細胞が，ヒトを含む哺乳動物の上皮性がん細胞及び／又は非上皮性がん細胞であり，該ＨＰ１γが該哺乳動物のＨＰ１γである，請求項４のがん細胞増殖阻害剤。
【請求項６】
該ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質が，ＨＰ１γ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ，又はＨＰ１γ遺伝子特異的アンチセンスＤＮＡである，請求項４又は５のがん細胞増殖阻害剤。
【請求項７】
該がん細胞がヒトがん細胞であり，該ＨＰ１γ遺伝子がヒトＨＰ１γ遺伝子である，請求項４ないし６の何れかのがん細胞増殖阻害剤。
【請求項８】
請求項７のがん細胞増殖阻害剤であって，該該ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質が，次表１Ａ〜１Ｆに，５’末端から３’末端方向に表示された各ＲＮＡ鎖よりなる，＃１〜＃１０６の二本鎖ＲＮＡの何れか少なくとも１種を含んでなるｓｉＲＮＡである，請求項７のがん細胞増殖阻害剤。
【表１Ａ】
2008035692.tif 000021
【表１Ｂ】
2008035692.tif 000022
【表１Ｃ】
2008035692.tif 000023
【表１Ｄ】
2008035692.tif 000024
【表１Ｅ】
2008035692.tif 000025
【表１Ｆ】
2008035692.tif 000026
【請求項９】
該二本鎖ＲＮＡが，表１Ａ〜１Ｆにおける＃５，＃１７，＃３５，＃６２，＃８９，＃１０１，＃１０２，＃１０３，＃１０４，＃１０５，及び＃１０６として示された二本鎖ＲＮＡよりなる群より選ばれるものである，請求項８のがん細胞増殖阻害剤。
【請求項１０】
該二本鎖ＲＮＡが，表１Ａ〜１Ｆにおける＃１７，＃６２，及び＃８９として示された二本鎖ＲＮＡよりなる群より選ばれるものである，請求項８のがん細胞増殖阻害剤。
【請求項１１】
該ｓｉＲＮＡが，両端に各々２塩基のオーバーハングを有するものである，請求項８ないし１０の何れかのがん細胞増殖阻害剤。
【請求項１２】
該オーバーハングが，該二本鎖ＲＮＡを構成する各鎖の３’末端に存するものである，請求項８ないし１１の何れかのがん細胞増殖阻害剤。
【請求項１３】
薬剤学的に許容し得る担体中に，請求項６ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の１種又は２種以上を含んでなるものである，ヒトを含む哺乳動物のがん治療剤。
【請求項１４】
請求項１３のがん治療剤であって，該がんがヒトがんであり，該ＨＰ１γ遺伝子がヒトＨＰ１γ遺伝子であり，該ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質が，ヒトＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡである，がん治療剤。
【請求項１５】
薬剤学的に許容し得る担体中に，請求項８ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の１種又は２種以上を含んでなるものである，ヒトがん治療剤。
【請求項１６】
ヒトを含む哺乳類のがんの治療方法であって，薬剤学的に許容し得る担体に入れて，請求項６ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の１種又は２種以上の有効量を，これを必要とするヒトを含む哺乳類患者に投与することを含むものである，治療方法。
【請求項１７】
ヒトのがんの治療方法であって，薬剤学的に許容し得る担体中に，請求項８ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の有効量を，これを必要とするヒト患者に投与することを含むものである，治療方法。
【請求項１８】
ヒトがん治療剤を製造するための，請求項８ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の使用。
【請求項１９】
がん細胞増殖阻害物質のスクリーニング方法であって，がん細胞のうちの一部の細胞を候補物質に接触させるステップと，候補物質に接触させたがん細胞と候補物質に接触させなかったがん細胞とにおける細胞内のＨＰ１γ遺伝子の発現を，それぞれ検出するステップと，候補物質に接触させたがん細胞におけるＨＰ１γ遺伝子の発現量を，候補物質に接触させなかったと比較することにより，候補物質を接触させたがん細胞における細胞内のＨＰ１γ遺伝子の発現阻害の有無を判定するステップと，発現阻害の認められたがん細胞に接触させた候補物質をがん細胞増殖阻害剤として選択するステップとを含んでなるものである，スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，がん細胞識別マーカー，がん細胞識別方法，がん細胞増殖阻害剤，これを含むがん治療用医薬組成物，それを用いたがん細胞増殖阻害方法，ヒト及びヒト以外の哺乳類のがんの治療方法，及び，がん細胞増殖阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国における近年の死亡率は，昭和初期まで多かった肺炎や結核等の感染症に代わり，がん，心臓病，脳血管疾患等のいわゆる生活習慣病が占めるようになっている。中でも，がんによる死亡率は，急激に増加の一途をたどり，１９８０年頃から現在に至るまで死亡原因の第１位を占めている。またその発生は，性別，年齢等によって差はあるものの，脳，皮膚，血液，気管支，肺，胃，肝臓，結腸，子宮，乳房，膵臓，前立腺様々，身体のあらゆる器官・組織に及んでいる。【０００３】
この様な種々の器官・組織におけるがんの診断には，従来から，例えば，Ｘ線ＣＴ，ＭＲＩ，超音波検査等の方法が用いられているが，近年，がん細胞識別マーカーも臨床検査において使用されている。がん細胞識別マーカーは，各種のがん細胞がそれぞれ産生するタンパク質等であり，試料中にがん細胞が存在するか否か，またどの種類のがん細胞が存在するかを判定することができる。がん識別マーカーによるがんの診断方法では，診断対象器官・組織から細胞を採取して，がん識別マーカーの存在を抗体その他適宜な方法で検出するのみで足り，検査の簡便と確実性に資すると共に，患者にとっての負担も軽い。しかしながら，がん識別マーカーのうちには数種類程度の異なった細胞の検出に使用できるものがあるものの，多くは，各々固有ながん細胞専用のマーカーである。このため，診断対象である器官・組織が異なる毎に，異なった識別マーカーを用いることが通常必要となるため，種々の識別マーカーに対応した検出試薬を準備するためのコストがかかり，検出に際しても試薬の交換や手順の変更が必要となり，全体として見ると診断する側の負担も比較的大きくなってしまうという問題がある。【０００４】
がんの種類の多さは，更に，薬剤を投与することによるがんの治療方法（化学療法）という点においても問題となっている。すなわち，一般に，各がんは，その種類に応じて特有の発がんメカニズムを有しており，化学療法を行う場合，対象とするがんの種類に応じて最適な薬剤を選択する必要がある。このため，多種のがんに対応できるだけの幅広い薬剤の準備が必要であり，高コスト化，調剤や治療における負担が大きい（非特許文献１〜８参照）。更には，化学療法には，使用する薬剤に対するがん細胞の耐性獲得，それによる治療効果の低下という，より深刻な問題がある。がんの病因としては，細胞の分化の欠失が重要な要因と考えられており（非特許文献３），このため分化の欠失（脱分化）を阻止できれば，がん細胞の増殖を阻止できる可能性がある。【０００５】
一方，今日，植物，昆虫，原生動物，哺乳動物等の生物一般に，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という現象の存在が確認されている。ＲＮＡｉは，標的遺伝子から作り出されるｍＲＮＡと相同な短い配列とその相補配列とからなる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が，細胞内において当該ｍＲＮＡの分解を誘導し，それにより標的遺伝子の発現が阻害される現象である。【０００６】
遺伝子発現の調節は，エンドリボヌクレアーゼである酵素ダイサー（dicer）によりｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）及びｍｉＲＮＡ（microRNA，２１〜２３塩基よりなる一本鎖ＲＮＡ）が生成されることに基づくとされている（非特許文献９参照）。動物においてｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの切断に関与し（非特許文献１０参照），ｍｉＲＮＡは，標的ｍＲＭＡの翻訳を阻止するとされている（非特許文献１１参照）。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは，同一のタンパク質と複合体を形成し，これを活性型に変えることが見出されており，このタンパク質として，複数のタンパク質を含んで構成されるＲＮＡ誘導サイレング複合体（ＲＩＳＣ：RNA-induced silencing complex）が同定された（非特許文献１２参照）。これまで動物及び植物から数百種ものみｍｉＲＮＡが単離・同定され，そのうち少なくとも，４種の動物性ｍｉＲＮＡの生理的機能が解明されている。【０００７】
2001年には，哺乳動物内で，２１塩基の短鎖二本鎖ＲＮＡが他のものより効率的にＲＮＡｉ効果を引き起こすことが報告されており，ＲＮＡｉは，がん，ウイルス疾患，血管新生等，難治性疾患に対する治療剤として利用できるものと期待されている。特にｓｉＲＮＡは極めて低濃度（１ｎＭ）でも特定の効果的にｍＲＮＡを分解除去できることが見出され，このことは，酵素的な増幅のあることを示唆している。【０００８】
長い二本鎖ＲＮＡは，インターフェロン合成及び非特異的なｍＲＮＡ分解を誘導する（インターフェロン応答）。他方，短鎖ｄｓＲＮＡは，発現を阻害しようとする遺伝子以外の遺伝子由来のｍＲＮＡと同一か，又は極めて相同性の高い配列のものである場合には，その目的外の遺伝子の発現をも抑制する（オフターゲット効果）。【０００９】
これらのことから，二本鎖ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡ干渉により特定の遺伝子の発現を阻害し，且つその阻害作用が広範な他の遺伝子発現にできるだけ及ばないようにするには，１９〜２１塩基対のＲＮＡ分子であって，その発現を阻害しようとする遺伝子以外の遺伝子由来のｍＲＮＡのうちに当該ｓｉＲＮＡが強く結合をするものがないか，又はそのようなｍＲＮＡが存在したとしても，発現を阻害しようとする遺伝子と同様の機能を有する遺伝子のものであることが好ましい。そうすれば，ｓｉＲＮＡが，阻害しようと意図する機能以外に広範な非特異的な抑制作用をあらわすのを防ぐことができるからである。【００１０】
【非特許文献１】Zhang, C.L., McKinsey, T. A. & Olson, E. N. Association of class II histonedeacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histonemethylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol 22, 7302-12(2002)
【非特許文献２】Cammas, F., Herzog, M., Lerouge, T., Chambon, P. & Losson, R. Association of the transcriptional corepressor TIF1beta with heterochromatin protein 1 (HP1): an essential role for progression through differentiation. Genes Dev 18, 2147-60 (2004)
【非特許文献３】Tenen, D.G. Disruption of differentiation in human cancer: AML shows the way. Nat RevCancer 3, 89-101 (2003)
【非特許文献４】Gilbert,N. et al. Formation of facultative heterochromatin in the absence of HP1. EmboJ 22, 5540-50 (2003)
【非特許文献５】Olins, D.E. & Olins, A. L. Granulocyte heterochromatin: defining the epigenome. BMCCell Biol 6, 39 (2005)
【非特許文献６】Popova, E.Y., Claxton, D. F., Lukasova, E., Bird, P. I. & Grigoryev, S. A. Epigeneticheterochromatin markers distinguish terminally differentiated leukocytes fromincompletely differentiated leukemia cells in human blood. Exp Hematol 34,453-62 (2006)
【非特許文献７】Arney, K.L. & Fisher, A. G. Epigenetic aspects of differentiation. J Cell Sci 117,4355-63 (2004)
【非特許文献８】Fraga, M.F. et al. Loss of acetylation at Lys16 and trimethylation at Lys20 of histoneH4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet 37, 391-400 (2005)
【非特許文献９】Bernstein, E. et al., Nature 409:363-366(2001)
【非特許文献１０】Elbashir, S.M. et al., EMBO J 20:6877-6888(2001)
【非特許文献１１】Xu, P. et al., Curr Biol 13:790-795(2003)
【非特許文献１２】Martinet, J., et al., Cell 110:533-542(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の背景において，本発明の一目的は，広範な種々のがん細胞の検出に共通して使用できる手段を提供することである。
本発明の別の一目的は，広範な種々のがんに対し，共通して使用できるがん細胞増殖阻害剤及びがん治療剤を提供することである。
本発明の更なる別の一目的は，広範な種々のがんに作用する増殖阻害剤をスクリーニングするための新規の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは，がん細胞の識別方法や治療方法を検討するにあたって，クロマチンパッケージング及び遺伝子サイレンシングに関与するクロマチンタンパク質であるヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）ファミリーに着目した。このＨＰ１ファミリーは，哺乳類において３つの相同体（α，β，γ）が存在し，そのうちのＨＰ１α及びβはヘテロクロマチンに所在しているが，ＨＰ１γは，ヘテロクロマチン及びユークロマチンの両方に存在している。このため，ＨＰ１αとＨＰ１βとは機能的に異なると考えられているが，ＨＰ１γについては，いまだその機能が明らかとなっていない（非特許文献１，非特許文献２）。本発明者らは，細胞の分化におけるＨＰ１γとの関係に着目して研究を行った。【００１３】
その結果，未分化の正常細胞ではＨＰ１γタンパク質が確認されるが，分化の進行に伴ってその発現量が減少し，最終的に分化した正常細胞においてはＨＰ１γタンパク質が確認されないとの知見を得，更には，種々のがん細胞，すなわち未分化の異常細胞において，ＨＰ１γタンパク質が欠損することなく，発現していることを発見した。これに基づき，本発明者らは，ＨＰ１γタンパク質を識別マーカーとして利用することで，その発現の有無を指標としてがん細胞と正常細胞とを識別できること見出した。更には驚くべきことに，メカニズムは不明であるものの，本発明らは，がん細胞内でのＨＰ１γ遺伝子の発現を阻害することによって，がん細胞の増殖を強力に阻害できることを見出した。本発明は，これらの発見に基づいて完成されたものである。【００１４】
すなわち本発明は以下を提供する。
１．被験細胞ががん細胞であるか非がん細胞であるかを識別する方法であって，被験細胞中におけるＨＰ１γの発現を検出するステップと，該被験細胞中にＨＰ１γの発現が検出された細胞をがん細胞と，検出されなかった細胞を非癌細胞と判定するステップとを含むものである，方法。
２．該がん細胞が，ヒトを含む哺乳動物の上皮性がん細胞及び／又は非上皮性がん細胞であり，該ＨＰ１γが該哺乳動物のＨＰ１γである，上記１の方法。
３．該被験細胞がヒト細胞であり，該ＨＰ１γがヒトＨＰ１γである，上記１又は２の方法。
４．ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質よりなるがん細胞増殖阻害剤。
５．該がん細胞が，ヒトを含む哺乳動物の上皮性がん細胞及び／又は非上皮性がん細胞であり，該ＨＰ１γが該哺乳動物のＨＰ１γである，上記４のがん細胞増殖阻害剤。
６．該ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質が，ＨＰ１γ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ，又はＨＰ１γ遺伝子特異的アンチセンスＤＮＡである，上記４又は５のがん細胞増殖阻害剤。
７．該がん細胞がヒトがん細胞であり，該ＨＰ１γ遺伝子がヒトＨＰ１γ遺伝子である，上記４ないし６の何れかのがん細胞増殖阻害剤。
８．上記７のがん細胞増殖阻害剤であって，該該ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質が，表２Ａ〜１Ｆに，５’末端から３’末端方向に表示された各ＲＮＡ鎖よりなる，＃１〜＃１０６の二本鎖ＲＮＡの何れか少なくとも１種を含んでなるｓｉＲＮＡである，上記７のがん細胞増殖阻害剤。
９．該二本鎖ＲＮＡが，下記の表２Ａ〜１Ｆにおける＃５，＃１７，＃３５，＃６２，＃８９，＃１０１，＃１０２，＃１０３，＃１０４，＃１０５，及び＃１０６として示された二本鎖ＲＮＡよりなる群より選ばれるものである，上記８のがん細胞増殖阻害剤。
１０．該二本鎖ＲＮＡが，下記の表２Ａ〜１Ｆにおける＃１７，＃６２，及び＃８９として示された二本鎖ＲＮＡよりなる群より選ばれるものである，上記８のがん細胞増殖阻害剤。
１１．該ｓｉＲＮＡが，両端に各々２塩基のオーバーハングを有するものである，上記８ないし１０の何れかのがん細胞増殖阻害剤。
１２．該オーバーハングが，該二本鎖ＲＮＡを構成する各鎖の３’末端に存するものである，上記８ないし１１の何れかのがん細胞増殖阻害剤。
１３．薬剤学的に許容し得る担体中に，上記６ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の１種又は２種以上を含んでなるものである，ヒトを含む哺乳動物のがん治療剤。
１４．上記１３のがん治療剤であって，該がんがヒトがんであり，該ＨＰ１γ遺伝子がヒトＨＰ１γ遺伝子であり，該ＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質が，ヒトＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡである，がん治療剤。
１５．薬剤学的に許容し得る担体中に，上記８ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の１種又は２種以上を含んでなるものである，ヒトがん治療剤。
１６．ヒトを含む哺乳類のがんの治療方法であって，薬剤学的に許容し得る担体に入れて，上記６ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の１種又は２種以上の有効量を，これを必要とするヒトを含む哺乳類患者に投与することを含むものである，治療方法。
１７．ヒトのがんの治療方法であって，薬剤学的に許容し得る担体中に，上記８ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の有効量を，これを必要とするヒト患者に投与することを含むものである，治療方法。
１８．ヒトがん治療剤を製造するための，上記８ないし１２の何れかのがん細胞増殖阻害剤の使用。
１９．がん細胞増殖阻害物質のスクリーニング方法であって，がん細胞の一部を候補物質に接触させるステップと，候補物質に接触させたがん細胞と候補物質に接触させなかったがん細胞とにおける細胞内のＨＰ１γ遺伝子の発現を，それぞれ検出するステップと，候補物質に接触させたがん細胞におけるＨＰ１γ遺伝子の発現量を，候補物質に接触させなかったと比較することにより，候補物質を接触させたがん細胞における細胞内のＨＰ１γ遺伝子の発現阻害の有無を判定するステップと，発現阻害の認められたがん細胞に接触させた候補物質をがん細胞増殖阻害剤として選択するステップとを含んでなるものである，スクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
上記の構成のなる本発明は，特定の種類のがんに止まらず広範な種々のがん細胞を正常細胞から区別するために，病理検査，臨床診断において用いることができる。また，本発明は，特定の種類のがんに止まらず広範な種々のがん細胞の増殖を阻害し，ヒトを含む哺乳類がん，取り分けヒトのがんを治療するために使用することができる。本発明はまた，特定の種類のがんに止まらず，広範な種々のがん細胞の増殖を阻害する物質をスクリーニングすることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（Ａ）は，本発明の実施例において，分化誘導させた３Ｔ３−Ｌ１マウス前駆脂肪細胞及びヒト前駆脂肪細胞における各種タンパク質（ＨＰ１α，ＨＰ１β，ＨＰ１γ）発現の経時的変化を示すオートラジオグラフィー写真であり，図１（Ｂ）は，本発明の他の実施例において，３Ｔ３-Ｌ１におけるＨＰ１γタンパク質の発現を示すオートラジオグラフィー写真であり，図１（Ｃ）は，本発明のさらにその他の実施例いおいて，３Ｔ３-Ｌ１のオイルレッド染色の結果を示す写真である。
【図２】図２（Ａ）は，本発明のさらにその他の実施例において，細胞分化時の３Ｔ３-Ｌ１におけるヒストン修飾状態の経時的変化を示すオートラジオグラフィー写真であり，図２（Ｂ）は，ＨＰ１γタンパク質の発現及びヒストン修飾状態の経時的変化を示すオートラジオグラフィー写真であり，図２（Ｃ）は，各ＨＰ１遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡで処理した際の各ヒストン修飾レベルとＨＰ１γ発現とを示すオートラジオグラフィー写真である。
【図３】図３は，本発明の更にその他の実施例において，各組織における免疫染色の結果を示す写真である。
【図４−１】図４は，本発明の更にその他の実施例における，各悪性腫瘍細胞における免疫染色の結果を示す写真である。
【図４−２】図４は，本発明の更にその他の実施例における，各悪性腫瘍細胞における免疫染色の結果を示す写真である。
【図４−３】図４は，本発明の更にその他の実施例における，各悪性腫瘍細胞における免疫染色の結果を示す写真である。
【図５】図５は，本発明の更にその他の実施例における，各腫瘍細胞の生存細胞数（×１０4細胞）を示すグラフである。
【図６】図６は，ヒトがん細胞ラインに対する，本発明のｓｉｒＮＡのＨＰ１γ発現阻害効果を示すウエスタンブロット分析結果である。
【図７】図７は，ヒトがん移植ヌードマウスにおける，本発明のｓｉＲＮＡの治療効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜がん細胞識別マーカー及び識別方法＞
本発明のがん細胞識別マーカーは，ＨＰ１γタンパク質を含むことを特徴とする。そして，本発明のがん細胞の識別方法は，細胞中のＨＰ１γタンパク質を検出することを特徴とする。ＨＰ１γ遺伝子の塩基配列は，GenBank accession NM_016587（配列番号１２５）に登録されており，その１５２番〜７０３番の配列が，ＨＰ１γタンパク質をコードする配列（ＣＤＳ）であり，ＨＰ１γタンパク質の配列は，GenBank accession NP_057671.2（配列番号１２６）に登録されている。【００１８】
本発明によれば，細胞中のＨＰ１γタンパク質を検出でき，それによって，ＨＰ１γタンパク質が存在する細胞をがん細胞と判断し，例えば，がん細胞と正常細胞（正常分化細胞）とを識別することができる。【００１９】
本発明の方法により識別できるがん細胞の種類は，特に制限されず，上皮性がん細胞，非上皮性がん細胞が挙げられ，また固形がん及び非固形がんが含まれる。前記上皮性がん細胞からなる腫瘍としては，例えば，肺癌，乳癌，胃癌，大腸癌，子宮頸癌，子宮癌，卵巣癌，頭頸部の癌（例えば，喉頭癌，咽頭癌，舌癌等），結腸癌，扁平上皮癌（squamous cell carcinoma），腺癌（adenocarcinome）等が，前記非上皮性がん細胞からなる腫瘍（肉腫）としては，例えば，脂肪肉腫，骨肉腫，軟骨肉腫，横紋筋肉腫，平滑筋肉腫，線維肉腫，血管肉腫等が挙げられる。その他，基底細胞腫，メルケル細胞腫，粘液腫，非小細胞腫，燕麦細胞腫，乳頭腫，細気管支腫，気管支腫，白血病として，Ｂ細胞腫，混合細胞腫，ヌル細胞腫，Ｔ細胞腫；ＨＴＬＶ−ＩＩ関連腫として，リンパ急性急性白血病，リンパ球性慢性腫，肥満細胞腫，及び骨髄性腫，組織球症悪性腫として，ホジキン病腫，非ホジキンリンパ腫，悪性黒色種，中皮腫，ユーイング肉腫，骨膜腫，腺線維腫，腺様リンパ腫，頭蓋咽頭腫，未分化胚細胞腫，幹葉腫，中腎腫，エナメル上皮腫，セメント質腫，歯牙腫，胸腺腫，腺癌，胆管腫，コレステリン腫，円柱腫，嚢包腺腫，嚢包腫，顆粒膜細胞腫，卵巣腫瘍，肝癌，汗腺癌，膵島細胞腫，ライディッヒ細胞腫，セルトリア細胞腫，卵胞膜細胞腫，平滑筋腫，筋芽細胞腫，脳室上皮細胞腫，神経筋腫，グリオーマ，髄芽細胞腫，骨膜腫，神経鞘腫，神経芽細胞腫，神経上皮腫，神経線維腫，神経腫，傍神経節腫，非クロム親和性傍神経節腫，角化血管腫，血管リンパ系形成腫，硬化性血管腫，血管球腫，血管内皮腫，リンパ管腫，リンパ管筋腫，リンパ管肉腫，松果体腫，癌肉腫，，葉状嚢肉腫，結腸直腸肉腫，神経線維腫等が，本発明によるがん細胞の識別対象となる。【００２０】
細胞中のＨＰ１γタンパク質を検出する方法は，特に制限されず，例えば，従来公知のウェスタンブロット分析等があげられる。具体的には，例えば，生体より単離した目的の被検細胞からタンパク質を抽出し，ＨＰ１γタンパク質に特異的な抗体を反応させ，生成した抗原抗体複合体を検出する方法があげられる。この他にも，例えば，ＥＬＩＳＡ法，免役組織化学染色，フローサイトメトリー法等の分析方法があげられる。【００２１】
＜がん細胞増殖阻害剤＞
本発明の増殖阻害剤は，前述のように，がん細胞の増殖阻害剤であって，ＨＰ１γ遺伝子の発現阻害物質を含むことを特徴とする。なお，後述するように，ＨＰ１γタンパク質の発現欠損と細胞分化との間には密接な関係があり，ＨＰ１γタンパク質は細胞が分化へ向かうのを阻止するロックの役割を果たすと考えられることから，本発明の増殖阻害剤は，例えば，がん細胞の分化誘導にも有用と考えられる。【００２２】
本発明において，前記発現阻害物質としては，ＨＰ１γ遺伝子の発現プロセスを標的としてこれを阻害するものであれば特に制限されない。例えば，ＤＮＡからＲＮＡへの転写，ｐｒｅ−ｍＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）からｍＲＮＡへのスプライシング，ｍＲＮＡからＨＰ１γタンパク質への翻訳等，いずれのステップを阻害してもよい。そのような発現阻害物質の典型例としては，例えば，ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスが挙げられ，特に好ましくはｓｉＲＮＡである。【００２３】
「ｓｉＲＮＡ」（small interfering RNA)は，ＲＮＡ干渉を媒介する短鎖の二本鎖ＲＮＡ分子であって，例えば，通常，両端ある２塩基（２ｍｅｒ）程度のオーバーハングを含めた２１塩基〜２７塩基長の二本鎖低分子ＲＮＡである。【００２４】
ＨＰ１γの発現を阻害する上記ｓｉＲＮＡは，配列番号１２５に記載のＨＰ１γのトランスクリプト（transcript，転写物）に対合する配列を含んだｓｉＲＮＡであり，好ましくは，１９塩基対の二本鎖ＲＮＡ部分とその各鎖末端の２塩基（２ｍｅｒ）のオーバーハングとから構成された，各鎖が２１塩基よりなる二本鎖ｓｉＲＮＡである。それらオーバーハングは，通常好ましくは，３’末端のオーバーハングである。【００２５】
前記「３’末端のオーバーハング」とは，相補的な配列である２本のＲＮＡ鎖が対合して二本鎖を形成した時，塩基対の両端において３’末端側で突出した塩基部分をいう。前記３’末端オーバーハングの２塩基の配列としては，特に制限されないが，ＴＴ（-チミン・チミン），ＡＵ（-アデニン・ウラシル），ＡＧ（-アデニン・グアニン）等が挙げられる。また，ｓｉＲＮＡのセンス鎖（標的とするトランスクリプトの塩基配列と同一配列）とアンチセンス鎖（標的とするトランスクリプトの塩基配列に対する相補的配列）における各オーバーハング部分は，相互に同じ塩基配列でも，異なる塩基配列でもよい。例えば，センス鎖のオーバーハングがＡＧ，アンチセンス鎖のオーバーハングがＡＵでもよいし，センス鎖のオーバーハングがＡＵ，アンチセンス鎖のオーバーハングがＡＧでもよい。【００２６】
更に，３’オーバーハングの２塩基の配列は，上記に制限されず，ＲＮＡｉ効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば，任意の天然核酸塩基（アデニン，グアニン，チミン，シトシン，ウラシル），並びに，天然及び人工の公知の修飾塩基であってもよい。また，前記３’末端オーバーハング部分のヌクレオチドは，通常，リボヌクレオチドを使用できるがこれに制限されず，ＲＮＡｉ効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば，デオキシリボヌクレオチド，修飾リボヌクレオチド，その他の公知のヌクレオチド類似体を使用してもよい。なおも更には，本発明において，前記二本鎖ｓｉＲＮＡは，必要に応じて，前記３’末端オーバーハングに代えて，５’末端オーバーハングとしてもよい。【００２７】
限定するものではないが，前記１９塩基対部分として使用し得る候補配列として，例えば，表１に掲げた配列（但し，センス鎖のみを記載してある）が挙げられる。表中，「Gene」の欄は，配列番号１２５に示したＨＰ１γ遺伝子のトランスクリプト（ｍＲＮＡ）におけるｓｉＲＮＡの標的塩基（ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に相当する塩基）の位置（先頭の塩基番号を１とする）を示し，「CDS」の欄は，ＨＰ１γタンパク質のアミノ酸をコードする塩基配列（ＣＤＳ）部分の先頭塩基から数えた場合におけるｓｉＲＮＡの標的塩基の番号を示す。表においてGene 684で示した配列まではコード領域のもの，Gene 827で示した配列以降は非コード領域のものである。【００２８】
【表１】
2008035692.tif 000002
【００２９】
表１に掲げた塩基配列も含めた上で，ＨＰ１γのトランスクリプト（ｍＲＮＡ）の塩基配列中において，任意の位置から開始する１９塩基よりなる各部分配列につき，それらと同一配列の１９塩基対を有する短鎖ＲＮＡが，（ａ）これを用いてｓｉＲＮＡを作成したとき，ＨＰ１γｍＲＮＡに対し目的とする高いＲＮＡｉ効果を発揮すると予測されるか否か，且つ，（ｂ）オフターゲットの問題を回避するため，同短鎖ＲＮＡがＨＰ１γｍＲＮＡに対し高特異性の，すなわちＨＰ１γ以外の遺伝子の塩基配列への結合可能性の小さいもの否かを調べ，両目的に適う配列を選出した。【００３０】
上記において，各配列についてのＲＮＡ干渉効果の解析は，それらのＴｍ値，ＧＣ含有率及び特定塩基の分布状況に基づいて行った。Ｔｍ（melting temperature）は，二本鎖の核酸の５０％が一本鎖の核酸へと解離する温度であり，周知の方法で算出できる（例えば，Breslauer KJ et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 3746-3750.，Rychlik W et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412. 又はOwczarzy R et al. (1997)  Biopolymers 44: 217-239.を参照）。特定の塩基分布の考慮についてはWO 2006/060454 (発明の名称: "Methods of Designing Small Interfering RNAs, Antisense Polynucleotides, and Other Hybridizing Polynucleotides")の開示に従った。【００３１】
また，ＨＰ１γｍＲＮＡに対する高特異性の配列の選択は，それら各配列をセンス鎖としその相補配列をアンチセンス鎖とする１９塩基対部分を二本鎖部分として有するｓｉＲＮＡについて，それらセンス鎖，アンチセンス鎖の双方につき，GenBankに登録されて遺伝子配列〔実在が確認されている遺伝子及びコンピュータ上予測されているだけの（predicted）仮想的遺伝子の双方を含む〕を対象として，完全一致の配列（19/19），１塩基で不一致のある配列（18/19），２塩基で不一致のある配列（17/19）を含むものを検索することにより行った。ＨＰ１γ以外の遺伝子でそれらと完全一致（19/19）の配列を有するものがないことに最も重点を置き，１塩基で不一致のある配列（18/19）が存在すること，２塩基で不一致のある配列（17/19）が存在することの順に，考慮の比重を軽くした。一致しない塩基数の増加に伴い，対合の確率が急速に低下し，オフターゲットの効果が少なく，又は無視できるようになるからである。またＨＰ１γ遺伝子以外の遺伝子ではあっても，ＨＰ１γ遺伝子と類似のものとして登録されているものについても，ＨＰ１γと同様の機能を営んでいると考えられることから，考慮の比重を軽くした。更に，コンピュータ上予測されているだけの仮想遺伝子についても，存在が実証されていないものであることから，考慮の比重を軽くした。【００３２】
上記プロセスを経て選択された１０６個のｓｉＲＮＡ候補（の二本鎖部分）を次の表２Ａ〜２Ｆに示す。表中の各二本鎖ＲＮＡにおいて，上段はセンス配列，下段はアンチセンス配列であり，何れも各鎖の５’末端側を先頭にして記載してある。また，これらの表中，括弧内の数字は，同一遺伝子であるが異なった登録番号で登録されているものの登録件数を示している。【００３３】
表２Ａ〜２Ｆに示したＲＮＡ二本鎖の両端には２塩基程度の適宜のオーバーハング配列（例えば，ＴＴ，ＵＵその他）が付加され，こうして得られるｓｉＲＮＡは，オフターゲット効果を抑えつつ，高いＲＮＡ干渉効果を発揮する。【００３４】
【表２Ａ】
2008035692.tif 000003
【００３５】
【表２Ｂ】
2008035692.tif 000004
【００３６】
【表２Ｃ】
2008035692.tif 000005
【００３７】
【表２Ｄ】
2008035692.tif 000006
【００３８】
【表２Ｅ】
2008035692.tif 000007
【００３９】
【表２Ｆ】
2008035692.tif 000008
【００４０】
更に，上記表２Ａ〜Ｆに掲げた１９塩基のＲＮＡのうち，高いＲＮＡｉ効果及びＨＰ１γに対する高い特異性の双方において特に好ましいのは，＃５（センス鎖配列番号４１，アンチセンス鎖配列番号１９６），＃１７（センス鎖配列番号４９，アンチセンス鎖配列番号２０８），＃３５（センス鎖配列番号５６，アンチセンス鎖配列番号２２６），＃６２（センス鎖配列番号１，アンチセンス鎖配列番号２５３），＃８９（センス鎖配列番号７４，アンチセンス鎖配列番号２８０），＃１０１（センス鎖配列番号８３，アンチセンス鎖配列番号２９２），＃１０２（センス鎖配列番号８４，アンチセンス鎖配列番号２９３），＃１０３（センス鎖配列番号８８，アンチセンス鎖配列番号２９４），＃１０４（センス鎖配列番号８９，アンチセンス鎖配列番号２９５），＃１０５（センス鎖配列番号１９１，アンチセンス鎖配列番号２９６），及び＃１０６（センス鎖配列番号９５，アンチセンス鎖配列番号２９７）の１１個のｓｉＲＮＡである。【００４１】
すなわち，上記１１個の二本鎖ＲＮＡ部分に基づくｓｉＲＮＡは，それらと完全一致の配列（19/19），１塩基で不一致のある配列（18/19），２塩基で不一致のある配列（17/19）を含むものについての検索結果を示す下記の表３Ａ〜３Ｋに見られるように，ＨＰ１γｍＲＮＡに対する特異性が極めて高く，オフターゲット効果を示すおそれが特に低い。これらのｓｉＲＮＡは，何れか１種を単独で使用することもでき，２種以上のものを併用（例えば，混合物の形で，又は別製剤の同時投与の形で）してもよい。また，これら１１種のうちでも，ＨＰ１γｍＲＮＡに対する特異性が取り分け高いものは，＃１７（センス鎖配列番号４９，アンチセンス鎖配列番号２０８），＃６２（センス鎖配列番号１，アンチセンス鎖配列番号２５３），＃８９（センス鎖配列番号７４，アンチセンス鎖配列番号２８０）に基づくものであり，最も好ましい。【００４２】
なお，表３Ａ〜３Ｋ中，「Accession#」は，GenBankにおける配列の登録番号を示し，ヒトＨＰ１γの登録番号である「NM_016587」の下に，検索でヒットした各マッチング配列の登録番号が記載されている。「GeneID#」は，各遺伝子に付与されている識別番号であり，表中，「11335」は，ヒトＨＰ１γ遺伝子そのものである。「PREDICTED」は，コンピュータ上予測されている仮想的遺伝子であることを示す。また，「CBX3」及び「chromobox homolog 3  (HP1 gamma homolog, Drosophila)」は，それぞれ，NCBIによりＨＰ１γに対して付された正式記号及び正式名称である。【００４３】
【表３Ａ】
2008035692.tif 000009
【００４４】
【表３Ｂ】
2008035692.tif 000010
【００４５】
【表３Ｃ】
2008035692.tif 000011
【００４６】
【表３Ｄ】
2008035692.tif 000012
【００４７】
【表３Ｅ】
2008035692.tif 000013
【００４８】
【表３Ｆ】
2008035692.tif 000014
【００４９】
【表３Ｇ】
2008035692.tif 000015
【００５０】
【表３Ｈ】
2008035692.tif 000016
【００５１】
【表３Ｉ】
2008035692.tif 000017
【００５２】
【表３Ｊ】
2008035692.tif 000018
【００５３】
【表３Ｋ】
2008035692.tif 000019
【００５４】
上記のｓｉＲＮＡは，例えば，インビトロで化学的又は酵素的に合成してもよく，また，インビボで合成してもよく，特に制限されないが，従来公知の方法により化学合成して製造することが好ましい。合成ｓｉＲＮＡであれば，例えば，濃度調節が容易であり，また，コンタミネーションの防止が容易であるため，安全性においても利点がある。例えば，配列番号１に示す配列を含むオーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡを製造する場合，まず，配列番号１の配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えたＲＮＡ鎖と，前記配列番号１の配列と相補的な配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えたＲＮＡ鎖とをそれぞれ化学合成する。次に，前記２本のＲＮＡ鎖を対合させ，オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。使用に際しては，必要に応じて，従来公知の方法により適宜精製することが好ましい。【００５５】
また，上記とは別に，本発明において，ＨＰ１γ遺伝子の発現抑制にアンチセンス（一本鎖ＤＮＡ）を用いる場合，そのアンチセンスは，ＨＰ１γ遺伝子の塩基配列に対して，相補的な塩基配列を有し，且つ，ＨＰ１γ遺伝子発現を阻害するものであればよく，それ以外に特段の制限はない。アンチセンスは，前述のように，例えば，ｍＲＮＡへのスプライシングを阻害してもよいし，ＨＰ１γタンパク質への翻訳を阻害してもよい。このようなアンチセンスの長さは，特に制限されないが，例えば，１０〜４０ｍｅｒが好ましく，より好ましくは１７〜３０ｍｅｒ，さらに好ましくは２０〜３０ｍｅｒである。本発明において使用できるアンチセンスの例を以下に示す。【００５６】
【表４】
2008035692.tif 000020
【００５７】
本発明のがん細胞増殖阻害剤，特に本発明のｓｉＲＮＡは，各種のがん細胞に共通する「分化の欠失」に対してこれを強力に阻止するように作用することから，その治療対象となるがんの種類は特に制限されず，前述のような上皮性がん，非上皮性がんを問わず，また固形がん，非固形がんかを問わず，幅広く増殖阻害及び治療の対象となる。また，本発明のがん細胞増殖阻害剤は，ヒトを含む哺乳動物のがん，取り分けヒトのがんに適用することができる。増殖阻害対象となるがん細胞は特に制限されず，本発明の方法により識別できるがん細胞の種類として前述したものと同様である。【００５８】
＜がん治療剤＞
本発明のがん治療剤は，がん治療用の医薬組成物であって，薬剤学的に許容し得る当業者周知の適宜の担体に，前記本発明のがん細胞増殖阻害剤，特にＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡを含んでなる。当該医薬組成物を患者に投与することにより，がん細胞の増殖を阻害し，がんの進行を強く抑えることができる。治療対象対象となるがんは特に制限されず，本発明の方法により識別できるがん細胞の種類として前述したものと同様である。また，本発明のがん細胞増殖阻害剤，特にＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡは，従来の他の薬剤に比してがん細胞に対する特異性が極めて高いため，正常細胞（非がん細胞）に影響を及ぼす虞を最小限にし，又は無くし，副作用リスクを顕著に減らすことが可能である。【００５９】
本発明の医薬組成物は，さらに，細胞の分化誘導剤を含んでもよい。さらに，分化誘導剤を添加することによって，例えば，前記増殖阻害剤によりがん細胞の増殖を抑制し，且つ，がん細胞の分化をより一層促進して，アポトーシスを効率よく誘導することができる。前記分化誘導剤としては，特に制限されず，従来公知のものが使用でき，例えば，チアゾリジン（thiazolidine）誘導体(ＰＰＡＲγリガンド)等の脂肪分化誘導剤があげられる。また，がん細胞の増殖をさらに抑制し，がん細胞の死滅を促進できることから，従来公知の抗がん剤をさらに含んでもよく，例えば，タキソール，シスプラチン，ハーセプチン，５−ＦＵ，グリベック，リツキサン，イレッサ等があげられる。【００６０】
また，本発明の医薬組成物は，さらに，薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては，特に制限されないが，例えば，前記発現阻害剤が，標的の部位，組織，細胞等に侵入する効率を高めることができるキャリア（例えば，リポソーム，カチオンリポソーム等）があげられる。本発明の医薬組成物の剤形は，特に制限されず，例えば，注射剤，クリーム剤，軟膏，錠剤，懸濁剤等があげられる。また，投与方法も特に制限されず，例えば，注射，経口，局所，鼻内，直腸投与等があげられる。【００６１】
＜増殖阻害方法＞
本発明は，がん細胞の増殖阻害方法であって，がん細胞に本発明の増殖阻害剤を接触させることを特徴とする。また，がん細胞に本発明の医薬組成物を接触させてもよい。【００６２】
がん細胞に対する本発明の増殖阻害剤の適用量は，特に制限されず，例えば，前記増殖阻害剤に含まれる発現阻害物質の種類や量に応じて適宜決定できる。前記発現阻害物質がｓｉＲＮＡの場合，例えば，細胞１×１０4個あたり，１〜１００ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを添加することが好ましく，より好ましくは５〜５０ｎｍｏｌであり，特に好ましくは５〜１０ｎｍｏｌである。また，前記発現阻害物質がアンチセンスの場合，例えば，細胞１×１０4個あたり，１〜１００μｍｏｌのアンチセンスを添加することが好ましく，より好ましくは５〜５０μｍｏｌであり，特に好ましくは５〜２０μｍｏｌである。【００６３】
本発明の増殖阻害方法においては，前記増殖阻害剤をがん細胞に接触させればよく，その方法は特に制限されないが，例えば，前記増殖阻害剤に含まれる発現阻害物質の種類に応じて適宜決定できる。前記増殖阻害剤がｓｉＲＮＡの場合には，例えば，従来公知の導入剤とともにがん細胞に接触させて，前記がん細胞にｓｉＲＮＡを導入させればよい。また，アンチセンスの場合も同様である。なお，本発明の医薬組成物も同様にして使用できる。【００６４】
＜治療方法＞
また，本発明の増殖阻害剤ならびに医薬組成物は，例えば，インビトロにおいてがん細胞やがん組織に適用するだけでなく，がん患者の治療にも適用できる。すなわち，がん患者に本発明の増殖阻害剤または医薬組成物を投与して，そのがん細胞に前記発現阻害物質を接触させればよい。この方法によれば，例えば，最終分化した正常細胞に対する副作用も軽減できると考えられる。これは以下の理由による。分化した正常細胞は，後述する実施例でも示すように，ＨＰ１γタンパク質を検出することはできない。つまり，本発明の増殖阻害剤を添加しても，正常な分化細胞は，すでにＨＰ１γタンパク質の発現が欠失している。したがって，正常な分化細胞に，本発明の増殖阻害剤が接触しても，ＨＰ１γタンパク質の発現抑制による影響は受け難いと考えられるためである。【００６５】
患者としては，例えば，ヒトやヒトを除く哺乳類，その他の動物があげられる。本発明の増殖阻害剤や医薬組成物の投与方法は，特に制限されず，目的部位に応じて，例えば，患部への注射，局所投与，患部や皮下へ埋め込む外科的処置等による投与が選択できる。また，投与部位に応じた従来公知のデリバリーシステムを利用してもよい。さらに，必要に応じて，前述のｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し，遺伝子治療技術を利用したデリバリーシステムを利用することもできる。【００６６】
＜スクリーニング方法＞
つぎに，本発明のスクリーニング方法は，がん細胞の増殖阻害剤のスクリーニング方法であって，ＨＰ１γ遺伝子に物質を接触させる工程，ＨＰ１γ遺伝子の発現の有無を検出する工程，及び，ＨＰ１γ遺伝子の発現を阻害した物質を増殖阻害剤として選択する工程を含むことを特徴とする。このような方法により，ＨＰ１γ遺伝子に対する新たな発現阻害物質を構築することができる。前記物質としては，ＨＰ１γ遺伝子の発現（ＨＰ１γタンパク質の発現）を阻害できる物質であれば特に制限されず，例えば，ポリヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド），タンパク質，低分子化合物等があげられる。
【実施例】
【００６７】
つぎに，本発明の実施例について，比較例と併せて説明する。ただし，本発明は下記の実施例及び比較例により制限されない。特に記載しない限り，「％」は，ｗ/ｖ％である。【００６８】
＜細胞培養方法＞
３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪前駆細胞は，１０％ウシ血清（ＢＳ）を添加したDulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ；Sigma社製）で培養した。結腸癌細胞ＤＬＤ−１，ＨＣＴ１１６及びＨＴ−２９；肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２３；胃癌細胞ＭＫＮ１及びＭＫＮ２８は，１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したRPMI 1640 medium（Sigma社製）で培養し，子宮頸癌細胞ＨｅＬａ及びＳｉＨａは，１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。なお，実施例で使用する全ての培地には，さらに，１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを添加し，培養条件は，３７℃，５％ＣＯ2雰囲気とした。【００６９】
＜抗体＞
抗体として，ＨＰ１α，ＨＰ１β及びＨＰ１γのそれぞれに対するマウスモノクローナル抗体（Chemicon社製）；Ｍｅｔ3Ｈ４Ｋ２０に対するウサギポリクローナル抗体（Upstate社製）；ＡｃｅＨ３Ｋ１８，Ｍｅｔ2Ｈ３Ｒ１７，Ｍｅｔ2Ｈ３Ｋ４，ＡｃｅＨ４Ｋ１２，ＡｃｅｔＨ４Ｋ１６，ＡｃｅＨ３Ｋ９，Ｍｅｔ2Ｈ３Ｋ９及びＡｃｅＨ４Ｋ８に対するウサギポリクローナル抗体（Abcam社製）；コントロールであるＧＡＰＤＨに対する抗ＧＡＰＤＨ抗体（Santacruz社製）を使用した。【００７０】
〔実施例１〕
１．細胞の分化におけるＨＰ１γタンパク質の発現
細胞分化とＨＰ１γタンパク質の発現との関係を確認した。【００７１】
（１）細胞の分化誘導にともなうＨＰ１γタンパク質の発現
３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪前駆細胞は，１０％ＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで培養し，さらに，下記条件での培養によって脂肪細胞への分化を誘導した。まず，前記培養細胞を第１分化誘導培地（１０％ＦＣＳ，０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン及び１μＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ培地）に移して２日間培養した。続いて，第２分化誘導培地（１０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍｌインシュリンを含有するＤＥＭＥ培地）に移して２日間培養した後，第３分化誘導培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＥＭＥ培地）に移して所定の期間（分化誘導処理０日，３日，６日，９日，１４日）培養を行った。なお，３−イソブチル−１−メチルキサンチン，デキサメタゾン及びインシュリンは，分化誘導剤（adipose  reagent）であり，これらの分化誘導剤の存在下で培養することによって，３Ｔ３-Ｌ１は，通常，繊維芽細胞表現型から丸い表現型に変化し，脂肪摘を形成，細胞内に蓄積するようになる。また，ヒト前駆脂肪細胞（preadipocyte）は，Preadipocyte medium（DMEM/Ham's F12 (1：1) Gibco BRL，10%FBS）でコンフルエントになるまで培養し，その後，第４分化誘導培地（３％ＦＢＳ，１ｎＭデキサメタゾン，１００ｎＭヒトインシュリン，０．２５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン，１０μＭ  ＰＰＡＲγアゴニスト）にて，２日間培養した後，第５分化誘導培地（３％ＦＢＳ，１ｎＭデキサメタゾン，１００ｎＭヒトインシュリン）に移して，所定の期間（分化誘導処理０日，３日，６日，９日，１４日）培養を行った。なお，分化誘導処理期間，３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪前駆細胞については，第１分化誘導培地を添加した時点，ヒト前駆脂肪細胞については，第４分化誘導培地をそれぞれ添加した時点を０日とする。【００７２】
このようにして得られた各種培養細胞について，ウェスタンブロット分析により，ＨＰ１タンパク質（α，β，γ）の発現を確認した。【００７３】
まず，培養細胞から従来公知の方法によりタンパク質を抽出してＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液に懸濁した。この懸濁液を熱処理してタンパク質を変性させた後，タンパク質量が１０μｇとなるように１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用して電気泳動を行った。つぎに，泳動したタンパク質を半乾式法によりメンブラン（商標Immobilon membrane;Millipore社製）に移し，前記メンブランに検出対象タンパク質（ＨＰ１α，ＨＰ１β，ＨＰ１γ）に対する抗体を添加して，前記メンブランに固定されたタンパク質と前記抗体とを抗原抗体反応させた。得られた抗原抗体複合体は，酵素標識化二次抗体と蛍光試薬とを含む検出キット（商品名ECL  plus：Amersham社製）を用いた化学発光を行い，オートラジオグラフィー用フィルムを感光させ，検出器（商品名LAS-3000 mini：Fuji Film社製）により検出した。なお，コントロールとして，ＧＡＰＤＨタンパク質についても同様に発現を確認した。【００７４】
この結果を，図１（Ａ）に示す。図１（Ａ）は，分化誘導させた３Ｔ３−Ｌ１マウス前駆脂肪細胞及びヒト前駆脂肪細胞における各種タンパク質（ＨＰ１α，ＨＰ１β，ＨＰ１γ）発現の経時的変化を示すオートラジオグラフィー写真である。同図において，左側が３Ｔ３−Ｌ１細胞（3T3-L1 cells）の結果であり，右側がヒト脂肪前駆細胞（human preadipose）の結果である。【００７５】
同図に示すように，ＨＰ１タンパク質の中でもＨＰ１αタンパク質及びＨＰ１βタンパク質は，脂肪細胞へ分化する際，全ての段階において（０〜１４日）発現が確認された。これに対して，ＨＰ１γタンパク質は，分化誘導処理９日目に発現が減少し，１４日目には検出が不可能となった。このように，ＨＰ１γタンパク質は，分化の過程においてその発現量が減少し，分化細胞において検出し難いことから，細胞分化にＨＰ１γタンパク質の発現減少が関与していることが示唆された。なお，従来は，最終分化細胞（例えば，血球細胞）において３つのＨＰ１相同体全てが減少するとの報告があるが（非特許文献４，非特許文献５，非特許文献６），前述のように，３つのＨＰ１相同体の中でもＨＰ１γのみが分化に関与すると考えられ，この点は本発明者が初めて見出したものである。【００７６】
（２）ＨＰ１γタンパク質の異所性（Etopic）発現の細胞分化への影響
ＨＰ１γタンパク質の異所性発現が細胞分化に影響するか否かを確認した。【００７７】
（２−１）ＨＰ１γ発現系セルラインの作製
３Ｔ３-Ｌ１から，ミフェプリストン（mifepristone）によりＨＰ１γタンパク質発現が安定に誘導されるセルラインを以下のようにして作成した。【００７８】
結腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞のtotal ＲＮＡを鋳型として，逆転写（reverse transcription）ＰＣＲにより，ＨＰ１γのｃＤＮＡを増幅させた。増幅したＨＰ１γのｃＤＮＡを，直接，ｐＣＲ２．１ベクター（Invirogen社製）にサブクローニングして，組換えプラスミドｐＣＲＨＰ１γを作製した。このｐＣＲＨＰ１γをＥｃｏＲＩで切断し，ＨＰ１γのｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ断片をｐＧｅｎｅ−Ｖ５（Invitrogen社製）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングしてｐＧＨＰ１γを作製した。そして，直径１００ｍｍの細胞培養皿中の３Ｔ３-Ｌ１に，３μｇの制御プラスミド（ｐＳｗｉｔｃｈベクター）及び７μｇのｐＧＨＰ１γを導入した。また，コントロールとしては，ｐＧＨＰ１γに代えてemptyベクターpGene−V5を導入した。なお，これらの導入は，商品名DoFect GT1 トランスフェクション試薬（Dojin社製）を使用し，使用説明書にしたがって行った。これらのプラスミドを導入した細胞の選択は，４００μｇ／ｍｌのZeocin（登録商標，Invitrogen社製）及び５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（商品名，Invitrogen）で選択した。これをフェプリストン誘導‐ＨＰ１γ遺伝子発現系セルライン（以下，「プラスミド導入細胞」ともいう）とした。【００７９】
（２−２）異所性ＨＰ１γタンパク質発現の確認
得られたセルライン及びプラスミドを導入していない３Ｔ３-Ｌ１（以下，「プラスミド非導入細胞」ともいう）を，それぞれ誘導剤である１×１０-7Ｍミフェプリストンの存在下で培養し，ＨＰ１γタンパク質の発現を誘導した。培養は，前記「１.（１）」と同様に各種分化誘導培地を用いて行い，前記ミフェプリストンは，すべての培地に添加した。また，分化誘導の影響ならびに遺伝子発現の誘導による影響を確認するために，ミフェプリストン非存在下，分化誘導剤（adipose reagents）非存在下での培養を行った。そして，これらの培養細胞について，前記「１.（１）」と同様にしてウェスタンブロット分析を行い，ＨＰ１γタンパク質の発現誘導を確認した。コントロールとしてＧＡＰＤＨタンパク質についても同様に検出を行った。【００８０】
この結果を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）は，３Ｔ３-Ｌ１におけるＨＰ１γタンパク質の発現を示すオートラジオグラフィーの写真である。同図において，ｔｒが，ミフェプリストン誘導‐ＨＰ１γ発現系３Ｔ３-Ｌ１（プラスミド導入細胞）の結果であり，ｗｔが，組換えプラスミドｐＧＨＰ１γを導入していない３Ｔ３-Ｌ１（プラスミド非導入細胞）の結果である。また，「mifepristone（＋）（−）」は，ミフェプリストン存在下，非存在下での培養を示し，「adipose reagents（＋）（−）」は，分化誘導剤の存在下又は非存在下での培養を示す。【００８１】
同図に示すように，プラスミド導入細胞は，非導入細胞と異なり，ミフェプリストンの存在により，ＨＰ１γ遺伝子の発現が誘導されＨＰ１γタンパク質の発現量が増加していることが確認できた。【００８２】
（３）ＨＰ１γ発現の細胞分化への影響
前記（２）の方法で培養したプラスミド導入細胞とプラスミド非導入細胞について，細胞内における脂肪蓄積を確認した。前述のように，３Ｔ３-Ｌ１は，分化誘導されると表現型が変化し，これによって細胞内での脂肪滴の生成ならびに蓄積が行われる。したがって，細胞内の脂肪蓄積を確認することによって，細胞分化の有無を評価できる。なお，培養細胞の分化の有無は，分析キット（商品名Adipogenesis Assay kit；Chemicon社製）を用いたオイルレッド染色により確認した。【００８３】
これらの結果を図１（Ｃ）に示す。同図は，３Ｔ３-Ｌ１のオイルレッド染色の結果を示す写真である。同図において，transfectantが，ミフェプリストン誘導‐ＨＰ１γ発現系３Ｔ３-Ｌ１（プラスミド導入細胞）の結果であり，ｗｔが，組換えプラスミドｐＧＨＰ１γを導入していない３Ｔ３-Ｌ１（プラスミド非導入細胞）の結果である。また，「mifepristone（＋）（−）」は，ミフェプリストン存在下，非存在下での培養を示し，「adipose reagents（＋）（−）」は，分化誘導剤存在下，非存在下での培養を示す。【００８４】
同図に示すように，プラスミド非導入細胞については，分化誘導剤の存在下（ajipose reagents ＋）で培養すると，ミフェプリストンの有無にかかわらず，染色（すなわち脂肪滴の蓄積）が確認された。このことから，プラスミド非導入細胞は，分化誘導剤の存在下であれば，確実に，細胞分化が誘導されていることが証明できた。これに対して，ＨＰ１γ発現系に形質転換した３Ｔ３-Ｌ１（プラスミド導入細胞）は，分化誘導剤存在下の場合，ミフェプリストンが非存在であれば染色が確認されるものの，ミフェプリストンが存在すると染色が確認できなかった。つまり，ミフェプリストン存在下では，分化誘導剤の有無にかかわらず，細胞の分化が誘導されなかった。この結果から，ミフェプリストンにより誘導されたＨＰ１γタンパク質によって，細胞分化が阻害されており，細胞分化には，ＨＰ１γタンパク質の発現抑制が必要であることがわかる。【００８５】
２．ＨＰ１発現とヒストン修飾との相関
（１）細胞分化時におけるヒストン修飾状態の変化
クロマチンの構成成分であるヒストンの修飾は，エピジェネティックな機構の１つであり，細胞分化に重要であることが知られている（非特許文献７）。そこで，細胞分化時における３Ｔ３-Ｌ１のヒストン修飾状態の経時的変化を確認した。まず，前記第３分化誘導培地による培養を所定の期間（０日，１日，２日，３日，４日，６日，８日，１０日，１４日）に設定した以外は，前記「１．（１）」と同じ方法により，３Ｔ３−Ｌ１マウス脂肪前駆細胞の培養を行った。そして，前述の各種抗体を用いた以外は，前記「１．（２）」と同様にウェスタンブロット分析を行い，ＨＰ１γ，ＡｃｅＨ３Ｋ９，ＡｃｅＨ３Ｋ１８，Ｍｅｔ2Ｈ３Ｋ４（ＤｉＭｅｔＨ３Ｋ４），Ｍｅｔ2Ｈ３Ｋ９（ＤｉＭｅｔＨ３Ｋ９），Ｍｅｔ2Ｈ３Ｒ１７（ＤｉＨ３Ｒ１７），ＡｃｅＨ４Ｋ８，ＡｃｅＨ４Ｋ１２，ＡｃｅｔＨ４Ｋ１６，Ｍｅｔ3Ｈ４Ｋ２０（ＴｒｉＭｅｔＨ４Ｋ２０）ならびにコントロールＧＡＰＤＨの検出を行った。【００８６】
これらの結果を，図２（Ａ）に示す。同図は，細胞分化時の３Ｔ３-Ｌ１におけるヒストン修飾状態の経時的変化を示すオートラジオグラフィー写真である。同図に示すように，ヒストンＨ３におけるＫ９及びＫ１８，ヒストンＨ４におけるＫ１２及びＫ１６のアセチル化レベルは，細胞分化に伴うＨＰ１γタンパク質発現の減少にしたがって同様に減少した。これに対して，ヒストンＨ３のＫ４，アルギニン９（Ｒ９）及びＫ１７のメチル化は，細胞分化に伴うＨＰ１γタンパク質発現の減少とは逆に，経時的に増加した。【００８７】
（２）分化におけるＨＰ１γタンパク質発現とヒストン修飾レベルとの関係
さらに，ＨＰ１γタンパク質の発現が，これらのヒストン修飾レベルに直接影響するか否かを確認した。これは，前記「１．（２）」で作製したミフェプリストン誘導‐ＨＰ１γ発現系３Ｔ３-Ｌ１（プラスミド導入細胞）を使用し，ミフェプリストン処理開始から７２時間の間，４時間ごとのヒストン修飾状態をウェスタンブロット分析することによって行った。なお，細胞の培養条件は，前記「１．（１）」と同様であり，ウェスタンブロット分析の方法は前述と同様である。【００８８】
これらの結果を，図２（Ｂ）に示す。同図は，ＨＰ１γタンパク質の発現及びヒストン修飾状態の経時的変化を示すオートラジオグラフィー写真である。同図に示すように，ＨＰ１γタンパク質の過剰発現に伴って，ヒストンＨ４のＫ１８のアセチル化及びヒストンＨ４のＫ２０のトリメチル化レベルが亢進し，他方，ヒストンＨ４のＫ１２のアセチル化及びヒストンＨ３のＫ４のジメチル化レベルが低下した。【００８９】
（３）ＨＰ１γ遺伝子の発現抑制とヒストン修飾レベルとの関係
ＨＰ１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により，ヒストンＨ４Ｋ２０のトリメチル化レベルとＨＰ１γタンパク質の発現との関係を確認した。【００９０】
３Ｔ３-Ｌ１マウス前駆脂肪細胞に，試薬の使用説明書にしたがって，直径６０ｍｍの培養皿あたり１２μｌのHiPerFect reagent（商品名，Qiagen社製）とともに，マウスのＨＰ１α，ＨＰ１β及びＨＰ１γ遺伝子のそれぞれに特異的なｓｉＲＮＡを含む５０ｎＭ siTrio（登録商標）Full Set（B-Bridge社製）をトランスフェクトした。ＨＰ１αに特異的なｓｉＲＮＡの配列（センス鎖のみ示す）は，5'-GGGAGAAAUCAGAAGGAAATT-3’（配列番号１１４），5'-GCGAAGAGCUAAAGGAGGATT-3’ （配列番号１１５）及び5'-GGAUACAGUCUGAGAGUUATT-3'（配列番号１１６），ＨＰ１βに特異的なｓｉＲＮＡの配列は，5'−GGUACUAGAAGAAGAGGAATT-3'（配列番号１１７），5'-GGCGAGUUGUCAAGGGCAATT-3'（配列番号１１８）及び5'-GAAAACAGCUCAUGAGACATT-3' （配列番号１１９），ＨＰ１γに特異的なｓｉＲＮＡの配列は，5'-GGACCGUCGUGUAGUGAAUTT-3'（配列番号１２０），5'-CCGACUUGGUGCUGGCAAATT-3'（配列番号１２１），5'-GGAAAAUGGAAUUAGACUATT-3'（配列番号１２２）である。なお，各配列において，３’末端のＴＴは，オーバーハングである。ｓｉＲＮＡトランスフェクト後，３Ｔ３-Ｌ１を７２時間培養し，全細胞の溶解物を用いて，前述と同様にウェスタンブロット分析を行った。ネガティブコントールとして，ｓｉＲＮＡ（配列番号１２３：5'-AUCCGCGCGAUAGUACGUAdTdT-3'）（B-Bridge社製）も同様に３Ｔ３Ｌ１にトランスフェクトした。【００９１】
これらの結果を，図２（Ｃ）に示す。同図は，各ＨＰ１遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡで処理した際の各ヒストン修飾レベルとＨＰ１γ発現とを示すオートラジオグラフィー写真である。同図に示すように，ヒストンＨ４Ｋ２０のトリメチル化とＨＰ１γタンパク質の発現とが密接に関係していることがわかった。【００９２】
３．各組織の最終分化細胞における傾向
ＨＰ１γタンパク質及びヒストンＨ４のトリメチル化Ｋ２０が，分化した脂肪細胞だけでなく，様々な組織の最終分化細胞（terminal differentiated cells）で消失しているか否かを確認した。【００９３】
組織は，脂肪（fat），食道粘膜（esophageal mucosa），皮膚組織（skin tissues），結腸（colon）を選択した。これらの組織について，免疫組織化学法により，ＨＰ１γタンパク質及びトリメチル化されたヒストンＨ４Ｋ２０（Ｍｅｔ3Ｈ４Ｋ２０）の局在を検出した。具体的には，従来公知の方法により，前記各組織についてホルマリン固定パラフィン包埋切片を作製し，自動免疫染色装置（商品名Ventana HX System Benchmark：Ventana Medical Systems社製）を用いて行った。抗体としては，抗ヒトＨＰ１γモノクローナル抗体及び抗−Ｍｅｔ3Ｈ４Ｋ２０ポリクローナル抗体を，それぞれ１：８００及び１：２００の割合（抗体：希釈液）で希釈してアプライした。また，あわせて，各組織についてヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を行い，組織構造の確認を行った。【００９４】
これらの結果を，図３に示す。同図は，各組織における免疫染色の結果を示す写真である。同図において，（ａ〜ｃ）は脂肪組織，（ｄ〜ｆ）は食道粘膜，（ｇ〜ｉ）は皮膚組織，（ｊ〜ｌ）は結腸の正常細胞の結果であり，左列は，各組織のＨ＆Ｅ染色の結果，中央列は，各組織についてＨＰ１γの局在を示す免疫染色の結果，右列は，各組織についてＭｅｔ3Ｈ４Ｋ２０の局在を示す免疫染色の結果である。【００９５】
ＨＰ１γタンパク質は，各組織の未成熟細胞においては確認された（図示せず）。しかしながら，同図ｂ及びｃに示すように，脂肪組織の成熟脂肪細胞（最終分化細胞）において，ＨＰ１γタンパク質及びＭｅｔ3Ｈ４Ｋ２０は確認されず，同図ｅ，ｆ，ｈ及びｉに示すように，食道粘膜及び皮膚組織の最終分化細胞においても，同様に，ＨＰ１γタンパク質及びＭｅｔ3Ｈ４Ｋ２０は確認されなかった。また，結腸組織についても，同図ｋ及びｌに示すように，分化した粘膜表面部において，ＨＰ１γタンパク質及びＭｅｔ3Ｈ４Ｋ２０は確認されなかった。以上の結果から，組織の種類にかかわらず，細胞の分化には，ＨＰ１γタンパク質ならびにＭｅｔ3Ｈ４Ｋ２０の消失が関係していることがわかる。なお，ＨＰ１γタンパク質は，ヒストンＨ４のメチル化されたＫ２０残基に結合していると考えられ，Ｓｕｖ４−２０ｈ１，Ｓｕｖ４−２０ｈ２及び／またはヒストンメチルトランスフェラーゼに結合すると考えられる。以上のことから，ＨＰ１γ遺伝子及びヒストンＨ４Ｋ２０の間の分子相互作用は，細胞分化のキーとなる一つのメカニズムであると予測される。【００９６】
４．ヒト悪性腫瘍におけるＨＰ１γタンパク質の発現増加
様々なヒト悪性腫瘍（がん）におけるＨＰ１γタンパク質発現及びヒストンＨ４Ｋ２
０のトリメチル化レベルを確認した。【００９７】
悪性腫瘍組織としては，食道癌，子宮頸癌，大腸癌，乳癌，肺癌，粘液型脂肪肉腫の手術検体（ｎ＝２６）を用いた。これらの細胞について，前記「３．」と同様に，免疫組織化学法により，ＨＰ１γタンパク質及びトリメチル化されたヒストンＨ４Ｋ２０（Ｍｅｔ3Ｈ４Ｋ２０）の局在を検出した。【００９８】
これらの結果のうち代表的な例を図４−１，図４−２及び図４−３に示す。これらの図は，各悪性腫瘍細胞における免疫染色の結果を示す写真である。これらの図において，「Ｈ＆Ｅ」は，Ｈ＆Ｅ染色の結果であり，「ＨＰ１γ」は，ＨＰ１γタンパク質の局在を示す染色の結果であり，「ＴｒｉＭｅＨ４Ｋ２０」は，ＴｒｉＭｅＨ４Ｋ２０（Ｍｅｔ3Ｈ４Ｋ２０）の局在を示す染色の結果である。同図に示すように，全ての悪性腫瘍細胞サンプルの細胞核においてにＨＰ１γタンパク質が検出され，図示していない他のサンプルについても同様の結果であった（ｎ＝２６）。また，これらのサンプル２６ケースのうち１７ケースについてヒストンＨ４のトリメチル化Ｋ２０が検出された。【００９９】
前述の「３．」に示すように，正常分化細胞においては，ＨＰ１γタンパク質発現とヒストンＨ４Ｋ２０のトリメチル化との間には相関関係が見られ，例えば，未分化細胞では，ＨＰ１γタンパク質がポジティブ，トリメチル化がポジティブという相関関係が見られ，分化細胞では，ＨＰ１γタンパク質がネガティブ，トリメチル化がネガティブという相関関係が見られた。これに対して，悪性腫瘍細胞については，図４に示すように，ＨＰ１γタンパク質は検出されたが（ポジティブ），ヒストンＨ４Ｋ２０のトリメチル化はネガティブであるケースが多く見られた。つまり，正常細胞においてみられるようなＨＰ１γタンパク質発現とヒストンＨ４Ｋ２０トリメチル化との間での関係が解離することが，悪性腫瘍細胞の特徴と考えられる。この結果から，ＨＰ１γタンパク質を検出することによって，正常分化細胞と腫瘍細胞とを識別することができる。【０１００】
また，すでに，トリメチル化されたヒストンＨ４Ｋ２０のロスががん細胞の顕著な特徴であることが報告されている（非特許文献８）。この点と前述の正常分化細胞の結果を考慮すると，ヒストンＨ４Ｋ２０のトリメチル化を検出しても，それのみで正常分化細胞であるか悪性腫瘍細胞であるかを判断することは困難である。しかし，ＨＰ１γタンパク質は，前述のように正常分化細胞においてネガティブ，悪性腫瘍細胞においてポジティブという傾向にある。したがって，従来報告されているヒストンＨ４Ｋ２０のトリメチル化のロスのみでは腫瘍細胞か否かを識別できないが，さらにＨＰ１γ発現を検出することによって，ＨＰ１γ発現低下なら正常細胞であり，ＨＰ１γ発現増加なら腫瘍細胞であると識別することが可能である。【０１０１】
〔実施例２〕  ＲＮＡ干渉を用いたＨＰ１γ発現抑制による，悪性腫瘍細胞増殖の阻害
本発明のｓｉＲＮＡの，悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制効果の有無を調べた。【０１０２】
悪性腫瘍細胞としては，ヒトがんセルラインＤＬＤ−１，ＨＣＴ１１６及びＨＴ−２９（結腸癌，colon cancer）；ＭＫＮ１及びＭＫＮ２８（胃癌，gastric cancer）；ＨｅＬａ及びＳｉＨａ（子宮頸癌, uterine cervical cancer）；ＮＣＩ−Ｈ２３（肺癌, lung cancer）；４０２／９１及び２６４５／９４（粘液型脂肪肉腫, myxoid liposarcoma）を使用した。これらの細胞に，試薬の使用説明書にしたがって，HiPerFect reagent（商品名，Qiagen社製）とともに，ヒトＨＰ１γ遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１２４：5'-UGACAAACCAAGAGGAUUUdTdT-3'；B-Bridge社製）の５ｎＭまたは５０ｎＭをトランスフェクトした。同配列番号１２４のｓｉＲＮＡは，表２Ｄにおける＃６２（センス鎖配列番号１，アンチセンス鎖配列番号２５３）の３’末端に２個のチミジン塩基（Ｔ）よりなるオーバーハングを取り付けたものである。なお，ネガティブコントールとして，前記「２．（３）」のｓｉＲＮＡ（配列番号１２３：5'-AUCCGCGCGAUAGUACGUAdTdT-3'）（B-Bridge社製）についても同様に３Ｔ３-Ｌ１にトランスフェクトした。トランスフェクト後，各細胞の種類に応じて前述のように培養を４日間行い，細胞染色用色素（商品名trypan）で処理を行い，血球計算盤（商品名erythrometer）にて生存細胞算出した。なお，腫瘍細胞の種類ごとに，３回の分析を行った。なお，コントロールとして，ｓｉＲＮＡ未導入の各種腫瘍細胞についても同様に生存細胞数の算出を行った。【０１０３】
これらの結果を図５のグラフに示す。同図は，各腫瘍細胞の生存細胞数（×１０4細胞）を示すグラフであり，同図において，「ＵＴ」とは，ｓｉＲＮＡ未処理の結果であり，「Ａ」は，ヒトＨＰ１γ遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡを導入した結果であり，「Ｃ」は，ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入した結果である。同図に示すように，ヒトＨＰ１γ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入してＨＰ１γ遺伝子の発現を抑制することによって，腫瘍細胞の増殖が阻害された。すなわち，腫瘍細胞のＨＰ１γ遺伝子の発現（ＨＰ１γタンパク質の発現）を抑制することによって，腫瘍細胞の増殖が阻害されることから，ＨＰ１γ遺伝子はがん治療のターゲット遺伝子として極めて有用である。【０１０４】
〔実施例３〕  悪性腫瘍細胞中のＨＰ１γ遺伝子発現に対する，ｓｉＲＮＡの抑制効果の検討
ヒトＨＰ１γに特異的なｓｉＲＮＡの，ヒトＨＰ１γ遺伝子発現抑制効果を調べた。ｓｉＲＮＡとして，表２Ａ〜Ｆ中の＃１７（センス鎖配列番号４９，アンチセンス鎖配列番号２０８），＃６２（センス鎖配列番号１，アンチセンス鎖配列番号２５３），＃８９（センス鎖配列番号７４，アンチセンス鎖配列番号２８０）に基づくもの（３’オーバーハング配列は何れも２個のデオキシチミジン「ｄＴｄＴ」である）。（図６において，それぞれｇ−１〜ｇ−３  ｓｉＲＮＡとして示す。），およびそれら３種の混合物（Ｍｉｘ）について，それらをヒト悪性腫瘍細胞にトランスフェクトしたときのヒトＨＰ１γの発現抑制の有無につき調べた。すなわち，悪性腫瘍細胞としては，ヒトがん細胞ラインＤＬＤ−１を用い，実施例２と同様の手順で各ｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）又はそれらの混合物（それぞれ５ｎＭ）をトランスフェクトした。ネガティブコントロールとしては，前記「２．（３）」に記載のｓｉＲＮＡ（配列番号１２３）（B-Bridge社製）を用いた。トランスフェクト後，実施例２におけると同様に培養を行い，培養開始３日後及び５日後におけるＨＰ１γの発現の強さをウエスタンブロット分析により調べた。結果を図６に示す。【０１０５】
図６から明らかなように，ｇ−１〜ｇ−３の何れのヒトＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡも，ＨＰ１γの発現を同程度に強力に阻害すること，及び，日数の経過と共にその効果が極めて顕著に現われることがわかる。更に，これらのｓｉＲＮＡの混合物（合計濃度は３倍）については，より一層顕著な阻害効果が認められた。他方，ネガティブコントロールであるマウスｓｉＲＮＡには阻害効果は全く認められなかった。これらのことは，ヒトＨＰ１γに特異的な上記ｓｉＲＮＡが，それらにつき期待したとおりヒトＨＩ１γ遺伝子特異的に作用していること，及び，それらのＨＰ１γ発現阻害効果が極めて強力であることを示している。なお，図中「UT DLD-1」は無処置コントロールを示す。【０１０６】
〔実施例４〕  in vivoでのがん治療効果の検討
ヌードマウスにヒト悪性腫瘍細胞を移植し，その増殖に対する本発明のｓｉＲＮＡの阻害効果を確認した。すなわち，ヌードマウス（各群３匹）の皮下にヒト大腸癌由来培養細胞ＤＬＤ−１を１×１０6個移植した。移植後１週間後、がん細胞が皮下で増殖し腫瘍が十分に大きくなったところで、（ａ）対照群の動物の腫瘍部分には，１０μＭのネガティブコントロールｓｉＲＮＡ１μＬと２μＬのOligofectamine (Invitrogen社) 及び８９μＬのOpti-MEM I(Invitrogen ) を混合した溶液を注射し，（ｂ）被験薬剤注射群の動物には１０μＭのヒトＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１２４）１μＬと２μＬのOligofectamine (Invitrogen社)及び８９μＬのOpti-MEM I (Invitrogen ) を混合した溶液を注射し，そして（ｃ）被験薬剤塗布群には，ヒトＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡ（配列番号１２４）をクリームに配合して製した製剤を塗布した。当該クリームは，同ｓｉＲＮＡ水溶液と，これにほぼ等しい重量中性油脂とを混ぜ合わせ，微量の界面活性剤存在下に加温しつつ均質化するまで撹拌することにより調製した。その後，これらの薬剤を３日おきに同様にして投与した。動物の癌細胞植部の観察は，移植後２２日間行った。結果を図７に示す。【０１０７】
図７に見られるとおり，対照注射剤を投与した動物の皮下において腫瘍の急激な増殖が認められたのに対し，被験注射剤投与群及び被験クリーム剤投与群の何れにおいても，腫瘍増殖が顕著に抑制された。また，観察開始から２２日後に腫瘍の切片をＨＥ染色で顕微鏡観察したところ、クリームを塗布した腫瘍では腫瘍細胞が壊死を起こしていることが確認された。これに対し，ネガティブコントロールを注射したコントロールでは細胞死が確認されなかった。【０１０８】
上記一連の結果は，がん細胞識別マーカーとしてのＨＰ１γタンパク質の有用性を，更に，本発明のヒトＨＰ１γ特異的ｓｉＲＮＡが，種々のヒトがん細胞の増殖阻害剤として及びがん治療剤として有用であることを明らかにするものである。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明のがん細胞の識別方法によれば，識別マーカーであるＨＰ１γタンパク質の細胞内での存在の有無を検出することによって，がん細胞と正常細胞とを識別することができる。また，本発明の識別マーカーによれば，従来とは異なり，がん細胞の種類によらず，検査対象細胞ががん細胞か否かを判断することを可能にする。更に，本発明のＨＰ１γ遺伝子発現阻害物質で，取り分けヒトＨＰ１γ特異的なｓｉＲＮＡは，がんの種類に関わりなく広くその増殖を阻害するため，広範な種々のヒトがんの治療に用いることができる。
【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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