(57)【要約】  植物の内在性遺伝子の発現が抑制された、新しい形質転換植物とその作成方法を提供することを目的とする。  本発明は、予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がDNAのメチル化、及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、DNAのメチル化、及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物、ならびに予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がDNAのメチル化、及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、DNAのメチル化、及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物の生産方法であって、標的遺伝子として内在性遺伝子を特定する工程１）、前記内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸と植物感染性ウイルス由来のジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質をコードする核酸を植物に導入する工程２）、及び工程２）によって得られる植物を自殖又は他殖させて子孫個体である形質転換植物を得る工程３）を含む、前記方法をそれぞれ提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がDNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、DNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物。
【請求項２】
内在性遺伝子のプロモーター領域のメチル化によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている、請求の範囲第１項に記載の形質転換植物。
【請求項３】
内在性遺伝子のプロモーター領域に結合するヒストン蛋白質の脱アセチル化によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている、請求の範囲第１項に記載の形質転換植物。
【請求項４】
予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がDNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、DNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物の生産方法であって、標的遺伝子として内在性遺伝子を特定する工程１）、前記内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸と植物感染性ウイルス由来のジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質をコードする核酸とを植物に導入する工程２）、及び工程２）によって得られる植物を自殖又は他殖させて子孫個体である形質転換植物を得る工程３）を含む、前記方法。
【請求項５】
工程１）における植物感染性ウイルス由来のジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質がキュウリモザイクウイルス由来の2b蛋白質である、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
ベクターがキュウリモザイクウイルスベクターである、請求の範囲第４項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内在性遺伝子の発現が抑制された、外来遺伝子を保持していない形質転換植物とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的手法によって植物の遺伝的形質を改変して有用な作物をつくり出すことは、食用作物の生産量の向上あるいは植物を用いた有用物質の効率的な生産という目的において植物の工業的利用を可能とする技術であり、現在も盛んに研究開発が行われている。【０００３】
遺伝子工学的手法による植物の遺伝的形質の改変操作として、これまでは植物に導入した外来遺伝子を植物内で発現させることによって該遺伝子産物による有用性を植物に獲得させる方法が主流であった。この方法で作成される植物は一般にトランスジェニック植物と呼ばれる。この方法は、外来の遺伝子を保持したままの植物を食用その他に利用することになるため、実用化に対する社会的な認知性という問題が指摘されている。【０００４】
近年、外来遺伝子を植物内で発現させるのではなく、外来遺伝子の導入によって植物遺伝子の発現を抑制することで植物に有用性を獲得させる方法が開発されつつある。この方法の一つが、いわゆるジーンサイレンシング（Gene silencing、以下GSと表す）を利用した方法である。GSは、組み換え的に導入した遺伝子が植物内、特に植物染色体上に存在するにも関わらず当該遺伝子の発現が抑制される、という現象であり、ウイルス等の感染による外来遺伝子発現に対する植物の自己防衛機能の一種であると考えられている。特にＧＳは、外来遺伝子の発現だけではなく、外来遺伝子を組み込んだ植物の当該外来遺伝子に相当する内在性の（染色体上に存在する）遺伝子の発現も抑制することから、この現象を利用して植物の内在性遺伝子の発現を制御しようとする試みも行われている（例えば非特許文献１、２）。【０００５】
このような、植物の染色体に外来遺伝子を組み込むことによる方法では、外来遺伝子が導入された形質転換植物中の一部の個体でしかGSが誘導されないという問題がある。一方、効率よくGSを誘導するため、植物に感染するウイルスをベクターとして用いてGSを誘導することが行われている。しかしながら、ウイルスは多くの場合、植物の生殖の過程で失われ、次世代の植物に伝達されない。したがって、次世代の植物においてはGSが継続されない、すなわちGSを遺伝させることができないという問題を有している。【０００６】
GSを効率よく誘導し、かつ、次世代の植物においてもGSを継続させる目的から、ウイルス由来の遺伝子を用いたGS用ベクターが開発されている（特許文献１）。しかし、このベクターを用いて得られる植物はベクター由来の外来遺伝子を染色体上に組み込んで複製保持することとなるので、上記の例と同様に、外来性の遺伝子を保持した形質転換植物体と言う点では通常のトランスジェニック植物と同じであり、従って実用化に対する社会的な認知性という問題が指摘され得る。
【特許文献１】国際特許出願公開WO2003／097841号
【非特許文献１】Sijen T et al.、Curr Biol.、2001年、第11巻、第436-440頁
【非特許文献２】Cigan AM et al.、Plant J.、2005年、第43巻、第929-940頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、植物の内在性遺伝子の発現が抑制された、新しい形質転換植物とその作成方法を提供することを目的とする発明である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、植物におけるGSに関する研究において、ウイルス由来のジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質が植物染色体上の遺伝子DNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化を促進して当該メチル化された遺伝子の発現を抑制すること、ならびにこのメチル化による遺伝子の抑制が子孫個体に遺伝されることを見いだし、下記の各発明を完成した。【０００９】
（１）予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がDNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、DNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物。【００１０】
（２）内在性遺伝子のプロモーター領域のメチル化によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている、（１）に記載の形質転換植物。【００１１】
（３）内在性遺伝子のプロモーター領域に結合するヒストン蛋白質の脱アセチル化によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている、（１）に記載の形質転換植物。【００１２】
（４）予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がDNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、DNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化のために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物の生産方法であって、標的遺伝子として内在性遺伝子を特定する工程１）、前記内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸と植物感染性ウイルス由来のジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質をコードする核酸とを植物に導入する工程２）、及び工程２）によって得られる植物を自殖又は他殖させて子孫個体である形質転換植物を得る工程３）を含む、前記方法。【００１３】
（５）工程１）における植物感染性ウイルス由来のジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質がキュウリモザイクウイルス由来の2b蛋白質である、（４）に記載の方法。【００１４】
（６）ベクターがキュウリモザイクウイルスベクターである、（４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の形質転換植物は、予め標的遺伝子として特定された内在性遺伝子の発現が抑制されているという特徴を子孫個体に遺伝させることのできる植物である。また本発明の形質転換植物は、上記の標的遺伝子として特定された内在性遺伝子の発現が抑制されているという特徴が遺伝されるにも拘わらず、当該内在性遺伝子の発現の抑制のために植物に導入された外来遺伝子は保持していない。そのため、一般的なトランスジェニック植物等で問題とされる、外来遺伝子を保持し続けることに起因する実用化に対する社会的な認知性という問題は有しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の形質転換植物は、予め標的遺伝子として特定した内在性遺伝子の発現がメチル化によって抑制されているが、メチル化のために該植物に導入された外来遺伝子は保持していないという特徴を有する形質転換植物である。【００１７】
一般的に、GSは外来遺伝子の転写によって生じるmRNAが分解等されることでその遺伝子発現による表現型の発現が抑制される転写後GS（post-transcriptional Gene Silencing、PTGS）と、外来遺伝子及び／又は内在性遺伝子の転写自体を抑制することでその遺伝子発現による表現型の発現が抑制される転写型GS（Transcriptional Gene Silencing、TGS）に分類される。本発明の形質転換植物は、外来遺伝子ではなく、内在性遺伝子の発現がTGSによって抑制されている植物である。以下、本発明の形質転換植物を、その生産方法に沿って詳細に説明する。【００１８】
本発明の形質転換植物の生産方法における工程１）は、植物の内在性遺伝子を特定する工程である。内在性遺伝子は、当該遺伝子の発現制御を司るプロモーター領域を含む塩基配列が特定されている遺伝子あるいは発現可能にクローニングされている植物由来の遺伝子、例えば植物染色体に保存されている遺伝子の中から任意に選択すればよい。本発明では、その発現を抑制することによって植物に有益な表現型の変化が期待される内在性遺伝子を選択することが、生産される植物の有用性の観点から見て好ましい。例えば、観賞用植物における色素合成に関連する遺伝子、花粉に蓄積する物質の生合成に関与する遺伝子、食用植物におけるアルカロイド等の不快な味を呈する成分の合成に関与する遺伝子、ヒトに対して毒性やアレルゲン性を持つ植物成分の産生に関与する遺伝子等を内在性遺伝子として特定することが好ましい。【００１９】
本発明の形質転換植物の生産方法における工程２）は、予め特定された内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸と植物感染性ウイルス由来のジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質をコードする核酸とを植物に導入する工程である。【００２０】
本発明は、GSによる内在性遺伝子の発現抑制が子孫個体に遺伝される植物を生産するために、内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸を外来遺伝子として植物に導入することを特徴の一つとする。ここでプロモーター領域とは、技術用語として一般的に理解されている通りの、遺伝子の発現を制御する機能を有する核酸領域を意味する。プロモーター領域は、その大きさ（塩基対数）、核酸配列ならびにその下流に位置するORFに対する相対的位置は遺伝子毎に異なるが、予め特定された内在性遺伝子の発現を制御しているプロモーター領域は、その遺伝子の発現を制御する機能を有する領域として、当業者によって適宜特定することが出来る。【００２１】
本発明のもう一つの特徴は、予め特定された内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸と共に、植物感染性ウイルス由来のGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸を植物に導入することである。GSは外来遺伝子に対する植物の防御機構の一つでもあるが、植物感染性ウイルスの中には、植物のこの防御機構を抑制して自身の感染と複製を果たそうとするものもある。その様なウイルス、例えばポティウイルスやタバコモザイクウイルス（CMV）は、そのウイルスゲノムにGSサプレッサー蛋白質であるHC-Proや2b蛋白質をコードしている。【００２２】
従来のGSサプレッサー蛋白質の利用法としては、当該蛋白質のGS抑制機能を解除したウイルス抵抗性植物を作成する、あるいはGSサプレッサー蛋白質を植物内で発現させることで外来遺伝子の発現を植物のGS機構から防御する、などが提唱されてきた。本発明は、このGSサプレッサー蛋白質を、従来の利用法とは異なり、植物の内在性遺伝子の発現が継代的に抑制された形質転換植物を作成するために利用するものである。【００２３】
本発明で使用するGSサプレッサー蛋白質は、植物ゲノムDNAのメチル化、及び／又はヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導する機能を有する蛋白質であり、好ましくはCMVゲノムにコードされている2b蛋白質である。CMVは非常に幅広い宿主域を持つRNAウイルスの一種で、１種類の外被タンパク質と１本鎖ゲノミックRNAからなる正20面体ウイルス粒子の形態を有する。ゲノミックRNAはRNA1、RNA2、RNA3に分節されており、2b蛋白質はRNA2の3’末端側にコードされている。その塩基配列並びに当該塩基配列から演繹推定される2b蛋白質のアミノ酸配列は公知であり、その配列及び核への移行を含むその機能はＣＭＶの系統間で保存されている（Lucy,A.P.,et al.EMBO J.、2000年、第19巻、第1672−1680頁）。本発明では、ＣＭＶの如何なる系統に由来する2b蛋白質も利用可能である。【００２４】
本発明では、内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸とGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸とは、同一のベクター上に配置されることが好ましく、特にGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸の上流あるいは下流に内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸を隣接させて配置することが好ましい。本発明の好適な具体例は、内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸をCMVの2b蛋白質をコードする核酸の3'末端側に隣接させた組み換え核酸を有するCMVベクターである。【００２５】
2b蛋白質をコードするCMVベクターは、Otagakiら（Otagaki S., et al., Plant Biotechnol.、2006年、第23巻、第259-265頁）に開示されている。当該ベクターは、CMVウイルスのRNA1、RNA2、RNA3に相当する核酸を有し、RNA2上の2b蛋白質をコードしている領域にクローニングサイトが存在している。このクローニングサイトに内在性遺伝子のプロモーター配列を組み込むことで、ウイルス由来のGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸の下流に内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸を隣接させて配置することができる。【００２６】
内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸とGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸とを有するベクターの植物への導入は、当該ベクターが感染性ウイルスベクターである場合は、これをそのまま植物に感染させればよい。また内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸とGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸とを持つRNA2、及びRNA1とRNA3を転写するDNA構築物を、アグロバクテリウム  ツムファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)を利用して植物に導入してもよい。その他、このDNA構築物をパーティクルガン等を用いて植物へ直接導入する従来公知の方法（Gal-On, A., et al., J. Virol. Methods.、1997年、第64巻、第103-110頁）等も利用可能である。【００２７】
本発明を適用してジーンサイレンシングを生じさせるべき植物は特に限定されないが、例えば、ナス科、キク科、ウリ科、マメ科、アカザ科、ユリ科に属する植物を挙げることができ、好ましくは、ナス科、ウリ科、マメ科に属する植物である。特に好ましくはタバコ、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、ペチュニア、キュウリ、メロン、カボチャ、エンドウ、ダイズ、ササゲ、インゲン、ホウレンソウ、シュンギク、チシャ、レタス、トウモロコシ、ユリである。【００２８】
本発明の形質転換植物の生産方法における工程３）は、上記の工程２）によって得られる植物を自殖又は他殖させて子孫個体である形質転換植物を得る工程である。上記の工程２）で得られる植物は、内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸とGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸を内部に有しているが、これら核酸はいずれも子孫個体（次世代植物、後代植物とも表記される）には引き継がれることはない。そのため、工程２）で得られる植物を通常の方法によって自殖又は他殖させることで生産される本願発明の形質転換植物は、導入された内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸とGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸を失い、外来性遺伝子を保持しない植物となる。その一方で、本願発明の植物は親と同様にその内在性遺伝子の発現が抑制されているという表現形質は引き継いでいるのである。【００２９】
上記の工程２）によって得られる植物を自殖又は他殖させて子孫個体である形質転換植物を得る操作それ自体は、実際の植物毎に知られているそれぞれ適切な栽培方法、交配方法その他の農業的な方法によって行うことが出来、本発明における工程２）で得られる植物に固有の特殊な方法というものはないが、表現形質の遺伝を確実に行うとの目的からすれば、自家繁殖によって子孫個体を生産することが好ましい。【００３０】
以下に述べる本発明におけるGSの仕組み、特にメチル化に関する上記の説明は飽くまでも推論に過ぎず、従って上記の説明は本発明の内容あるいは技術的範囲を制限するものではない。CMVを含む植物感染性ウイルスの多くは1本鎖のRNAゲノムを持つが、このRNAゲノムは複製時などにおいては2本鎖の構造をとる。そのためウイルスの感染時には、ウイルスに組み込まれた内在性遺伝子のプロモーター領域の配列をもつ2本鎖RNAが植物細胞内で形成される。また、ウイルス感染時にはウイルスゲノムにコードされるGSサプレッサー蛋白質が生産される。この状況において、植物ゲノムに存在する予め特定された内在性遺伝子のプロモーター領域の塩基（シトシン）がメチル化され、あるいは当該プロモーター領域に結合するヒストン蛋白質の脱アセチル化やメチル化を含む修飾状態の変化がおき、当該プロモーター領域によって制御される内在性遺伝子の転写、発現が抑制される。DNAのメチル化及び／又はヒストン蛋白質の修飾状態の変化は、導入された内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸とGSサプレッサー蛋白質をコードする核酸を持つウイルスが感染した植物一代だけに存在するものではなく、当該植物から通常の方法で作成される子孫個体の当該内在性遺伝子においても、その親世代の植物の内在性遺伝子と同じ箇所がメチル化されている。また、この内在性遺伝子のプロモーター領域を含むDNAが結合しているヒストン蛋白質が脱アセチル化された状態もウイルスが感染した植物と同様に子孫個体においても継続される。すなわちメチル化された内在性遺伝子及び／又は当該遺伝子に結合するヒストン蛋白質の脱アセチル化が親植物から子孫個体に遺伝され、その結果内在性遺伝子の発現が抑制されているという特徴も遺伝されることになる。その一方、植物に導入された核酸あるいは当該核酸を持つウイルスは、これらが導入された植物一代限りで消失し、当該植物から作成される子孫個体には受け継がれることはない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、CHS-A遺伝子プロモーター配列のウイルスベクターへのクローン化の手順を模式的に示した図である。
【図２】図２は  CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアにおける花弁の模様の変化を示す写真である。左は通常のペチュニアを、中図及び右図はウイルスを接種したペチュニアをそれぞれ示す。
【図３】図３は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体における花弁の模様の変化を示す写真である。
【図４】図４は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体における花粉形成の阻害を示す写真である。左が通常の個体の花粉を、右がウイルスを接種したペチュニアの子孫個体の花粉を示す。
【図５】図５は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体の花粉管の形成を示すグラフである。左が通常の花粉、右がウイルスを接種したペチュニアの子孫個体の花粉を示す。
【図６】図６は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体の花粉発芽率を示すグラフである。
【図７】図７は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体の葯におけるCHS-A遺伝子のmRNA量の測定結果を示すグラフである。
【図８】図８上は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアにおけるCHS-Aプロモーター配列中のシトシンのメチル化の頻度を示すグラフである。また図８下はCHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種していない、通常の個体におけるCHS-Aプロモーター配列中のシトシンのメチル化の頻度を示すグラフである。横軸はCHS-Aの転写開始点を＋１としたときのプロモーター配列の塩基の位置を、縦軸はメチル化の頻度を表す。
【図９】図９上は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体におけるCHS-Aプロモーター配列中のシトシンのメチル化の頻度を示すグラフである。また図９下はCHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種していない、通常の個体におけるCHS-Aプロモーター配列中のシトシンのメチル化の頻度を示すグラフである。図の横軸はCHS-Aの転写開始点を＋１としたときのプロモーター配列の塩基の位置を、縦軸はメチル化の頻度を表す。
【図１０】図１０は、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体におけるCHS-Aプロモーター領域に位置するヒストン蛋白質がアセチル化されていることを示すＰＣＲ実験の結果である。図中の「H3 Ac」は抗アセチル化ヒストンH3抗体によって免疫沈降を行った後、沈降した蛋白質とDNAの複合体から精製したDNAを鋳型として用いて行ったPCRを示し、「Input」は免疫沈降を行う前の蛋白質とDNAの複合体から精製したDNAを鋳型として用いたPCRを示す。
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を例示する目的で提供するものであり、請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。また、実施例における各実験操作とその条件は、特別に断らない限り、Otagakiら（Otagaki, S., et al.、 前述）の記載ならびに各種市販キットに添付された取扱説明書の記載に従って行った。
【実施例】
【００３３】
１）内在性遺伝子の特定
供試植物としてペチュニア（Petunia hybrida）を選び、アントシアニン色素生合成の鍵酵素であるカルコーン合成酵素（CHS-A）遺伝子（Koes, R. E., et al.、Gene、1989年、第81巻、第245-257頁)を予め特定された植物の内在性遺伝子として選択した。CHS-A遺伝子は、ペチュニアにおけるフラボノイド類の含有量を決定する遺伝子であり、花粉稔性にも影響を与える。【００３４】
CHS-A遺伝子のプロモーター領域としては、同遺伝子の転写開始点（van der Meer, I. M., et al.、Plant Mol. Biol.、1990年、第15巻、第95-109頁）を＋１とした場合の5'上流-244〜-2に相当する領域（配列番号１）を選択した。【００３５】
２）CHS-A遺伝子のプロモーター領域と2b蛋白質をコードするDNAを有するCMVベクターの調製
ペチュニアよりクローン化したCHS-A遺伝子を含むプラスミドDNAを構築し、これを鋳型として、下記の塩基配列からなるプライマーDNAを用いたPCRを行なった。反応後、PCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけて、約250bpの増幅DNA断片を単離、精製した。【００３６】
プライマーF：5′-AGGCCTGATGCTAGAGGTGACAGAAATC-3′（配列番号２）
プライマーR：5′-ACGCGTGGTTTGCATGGGGATTGTAG-3′（配列番号３）
この増幅DNA断片は、5'末端に制限サイトStuIを、3'末端に制限サイトMluIをそれぞれ有する。単離した増幅DNA断片をpGEM-T Easy Kit（Promega社製）に組み込んで大腸菌を宿主としてTAクローニングを行った。挿入断片の塩基配列をABI PRISM（Applied Biosystems社）を用いて確認した。【００３７】
CMVのY系統（以下、CMV-Y）の RNA2のcDNA感染性クローンであるpCY2の2b蛋白質のORF内にあるStuIサイトから終止コドンまでの領域を欠失させたプラスミドCMV2-A1（Otagaki et al., 前述、図１）を用いた。【００３８】
TAクローニング後のベクターから制限酵素StuIとMluIを用いて切り出したDNA断片を、制限酵素StuIとMluIで開環させたプラスミドCMV2-A1に組み込んで、CHS-A遺伝子のプロモーター領域の配列からなるDNAと、CMVの2b蛋白質をコードするDNAを有する、感染性クローンプラスミドであるCMVベクターを得た。【００３９】
３）植物へのウイルス感染
ａ）感染性RNAの調製
1.5mlチューブに下記の組成からなる制限酵素反応ミックスを調製し、制限酵素の最適温度で2時間静置して、感染性クローンプラスミドを直鎖化した。感染性クローンプラスミドは２）で調製したCMVベクターであるCMV-Y RNA2、CMV-L RNA1及びCMV-L RNA3をそれぞれ用意した。また、run-off転写用の制限酵素は、CMV2-A1にはNotIを、CMV-L RNA1にはClaIを、CMV-L RNA3にはBamHIを、それぞれ用いた。【００４０】
感染性クローンプラスミド            5μl
10×制限酵素添付バッファー         2μl
run-off 転写用の制限酵素           0.5μl
滅菌水                           13.5μl
20μl
上記反応液からクロロホルム法で精製したDNA（DNAテンプレート）を含む下記の組成からなる転写反応ミックスを37℃で1時間静置し、0.5μlのT7 RNA  polymeraseを加え、さらに37℃で1時間静置して、感染性RNAを合成した。【００４１】
10×T7RNA polymerase buffer      2μl
50mM DTT                         2μl
20×rNTP mix                     1 μl
T7 polymerase                    0.5μl
10mM capping analogue             2μl
RNase inhibiter                   0.5μl
DNAテンプレート                  3μl
滅菌水                             9μl
20μl
（rNTP mixは、ATP、UTP、CTPの最終濃度がそれぞれ各0.5ｍM、GTP の最終濃度が 50μMになるように使用した）
10μlの0.1Mリン酸緩衝液0.1Mリン酸二ナトリウム水溶液（pH9.0-9.4）に0.1Mリン酸一カリウム水溶液（pH4.2-4.6）を混ぜてpH7.1に調製し、使用直前にDIECA(N,N-ジエチルチオカルバミド酸ナトリウム)を最終濃度10mMになるように加えて、感染性クローンからの転写産物をそれぞれ5μlずつ加えて混合溶液を得た。【００４２】
ｂ）Nicotiana benthamianaへの感染
N. benthamianaを三共培養土（三共）とタキイソイル（タキイ種苗）と黒土を4：4：1の割合で混合したものの上にバーミキュライトをまいた土に播種し、2〜3cm程度の大きさに成長し、子葉が十分展開した個体を、底に穴を開けたディスポカップ200ml（アズワン）に新たに入れた同じ組成の土に移植した。土はオートクレーブ滅菌後に使用した。移植後1週間ほど経過し、本葉が3〜6枚展開したN. benthamianaの葉数枚に、上記の感染性RNAを含む混合溶液を塗布して接種した。【００４３】
ｃ）ペチュニア（Petunia hybrida）への感染
上記ｂ）の様にして栽培し、接種を行ったN. benthamiana個体の上葉0.1 gを、0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.1) 1 ml 、および、DIECA [N, Nジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム(Wako)]とともに乳鉢で磨砕して粗汁液を調製した。【００４４】
ペチュニア（Petunia hybrida）品種F1カーニバルレッドスター（タキイ種苗）をゴールデンピートバン（サカタノタネ）に播種し、1ヶ月後、子葉が十分展開した個体を、底に穴を開けたディスポカップ200ml（アズワン）に入れた三共培養土（三共）とタキイソイル（タキイ種苗）を１：１の割合で混ぜた土に移植した。土はオートクレーブ滅菌後に使用した。移植後1週間ほど経過し、本葉が5〜8枚展開した個体の葉全てにN. benthamianaの粗汁液を塗布し、ただちに水道水で洗い流した。【００４５】
４）子孫個体の作成とＧＳの確認
ａ）自殖
前記３）のｃ）で粗汁液を塗布した後に洗い流した葉を有するペチュニアを通常の栽培方法によってさらに栽培し、葯が開裂して葯の表面に生じた少量の花粉をピンセットを用いて柱頭へ付着させることにより自家受粉を行い、さらに栽培を続けて種子を回収した。  【００４６】
ｂ）ウイルス接種当代および子孫個体におけるCHS-A遺伝子のGSの確認
ウイルス接種当代の植物を人工気象室において25℃、16時間日長の条件下で栽培し、開花させた。ウイルス接種当代の植物においては、図２に示すとおり、花弁の着色部分が著しく現象し、白色の部分が多いものが得られた。また、花粉の形成が著しく阻害された。CHS-A遺伝子の発現抑制は花色の変化に加え、花粉形成を阻害することが知られている（Mo, Y., et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1992年、第89巻、第7213-7217頁）。したがって、ウイルス接種によりCHS-A遺伝子のGSが接種当代において誘導されたものと考えられた。【００４７】
ａ）で得た種子を同じ条件下で栽培し、子孫個体であるペチュニア植物体を開花させた。花弁は、図３に示すように着色している部分の中に白い筋が入る表現型を示し、少なくとも筋の入った部分の細胞において色素生合成系の遺伝子の発現に変化が生じていることが確認できた。花粉の形成の阻害は子孫個体であるペチュニア植物体においても著しかった（図４）。また、スクロース溶液（1gスクロース／10ml, pH6.2）に寒天0.1gを含む培地上における花粉の発芽を顕微鏡下で観察したところ、CHS-Aプロモーター配列のRNAを持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体において、接種当代の植物と同様、花粉管の伸長が抑制された（図５）。さらに、培地上における花粉の発芽率を花粉の置床後16時間後に測定したところ、CHS-Aプロモーター配列を持つウイルスを接種したペチュニアの子孫個体において、接種当代の植物と同様、花粉の発芽率が低下し、通常の個体に比べて数分の一であった（図６）。【００４８】
葯におけるCHS-A遺伝子の発現を調べるため、子孫個体であるペチュニア植物体の開花直前の葯を乳鉢に入れ、液体窒素を加えて粉砕した。20ｍM EDTA、200mM NaCl、4％N-laurylsarcosineを含む100mM  Tris-HCl緩衝液（pH8.8）500μlと25μlのメルカプトエタノールを加え、さらによくすりつぶした後、1.5mlチューブに移し、500μlのPCI(フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール=25：24：1)を加えボルテックスでよく混ぜた。13000rpm、4℃、5分遠心し、上清を氷上で回収し、1.5mlチューブに1/4量の10M塩化リチウムを加え、氷上で一晩静置した。15,000rpm、4℃、20分間遠心し、上清を80％エタノールでリンスした後、133.5μlの滅菌水に溶解した。さらに15μlの10×DNase buffer（80ｍM MgCl2、50ｍM DTTを含む400ｍM Tris-HCl緩衝液、pH7.5）、2μlのRNase フリーのDNase I（TaKaRa）、0.5μlのRNaseOUT inhibitor（TOYOBO）を加え37℃で15分間処理した。その後、PCIを等量加えて12,000 rpm、20℃、10分間遠心した。上清を回収し2.5倍量のエタノールを加え、1時間以上−20℃で静置後、12,000rpm、4℃、15分間遠心し、上清を80％エタノールでリンスした。ペレットは100μlの滅菌水に溶解させた。【００４９】
上記により抽出した1 μg RNA、および10 nmol dNTP、100 pmol oligo dT (20) primerを含む反応液(12.5 μl)をサーマルサイクラーによって65℃で5分間処理し、急冷した。これに5×First-strand buffer 4μl、0.1M DTT2μl、RNaseOUT inhibitor（Invitrogen）0.5μl、逆転写酵素M-MLV Reverce Transcriptase（Invitrogen）1μlを加え、42℃で60分間、99℃で1分間処理しcDNA合成を行った。DNAの混入がないことを確認するために逆転写酵素を入れない反応液もそれぞれのサンプルで作製した。【００５０】
上記のように合成したcDNAを鋳型とし、CHS-Aのコード領域を増幅させる下記の一組のプライマーDNAを用いてPCRを行った。【００５１】
プライマー4246：5′-GGCGCGATCATTATAGGTTC-3′（配列番号４）
プライマー5003：5′-TTTGAGATCAGCCCAGGAAC-3′（配列番号５）
α-tubulinのmRNA蓄積量を内部標準として用いるため、α-tubulinの配列を増幅させる下記のプライマーを用いたPCRも同時に行った。【００５２】
プライマー tubulin F：5′-GCCACCATCAAGACCAAGC-3′（配列番号６）
プライマー tubulin R：5′-ACCTCAGCAACACTGGTTGA-3′（配列番号７）
PCR産物が１本であることをアガロース電気泳動によって確認した後、RT-PCRに要したcDNAとプライマーセットを用い、DNA Engine Opticon 2 System (MJ research）によりリアルタイムPCRを行った。また、増幅産物の特異性確認のためにメルティングカーブ解析を行った。反応液はDyNAmo SYBR Green qPCR Kit (FINNZYMES)の方法に従って調整した。cDNAは滅菌水で5倍に希釈して用いた。コントロールとしてα-tubulinを用い、mRNAの相対量を求めた。【００５３】
その結果、葯のCHS-A mRNA量は子孫個体であるペチュニア植物体において、通常の個体の数十分の一になっており、子孫個体であるペチュニア植物体におけるCHS-A遺伝子の発現が著しく抑制されていることが明らかとなった（図７）。【００５４】
以上のことから、ウイルスを接種した植物を自殖することにより得た子孫個体においてもCHS-A遺伝子のGSが確認された。【００５５】
５）子孫個体の解析
ａ）ウイルスの確認
実施例で調製した子孫個体であるペチュニア植物体の植物組織0.1gを乳鉢にいれ、500μlのTE飽和フェノールと500μlのRNA抽出緩衝液（25ｍM MgCl2、25ｍM KCl、1% SDSを含む25ｍM Tris-HCl緩衝液、pH7.5）を加えて、乳棒で磨砕した。これを1.5mlのチューブに移し、ボルテックスして10,000rpmで2分間遠心した。水層を400μl回収し、200μlのTE飽和フェノールと200μlのクロロホルムを加えた。ボルテックスし、14,000rpmで5分間遠心した。水層を400μl回収し、この操作を水層とフェノール層の間の界面が白くならなくなるまで繰り返した。最後に200μlの水層を回収し、1/10量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と3倍量のエタノールを加えた。ボルテックスし、-20℃に30分静置した。14,000rpmで20分間冷却遠心した。上清を捨て、80％エタノールでリンスした。減圧乾燥し、滅菌水50μlに懸濁した。このうち2μlを1.5％アガロースゲルで電気泳動し、RNAが抽出されていることを確認した。【００５６】
RNA LA PCRTM KIT (AMV) Ver.１（TaKaRa社）を使用し、取扱説明書に記載の方法に従って上記RNAよりcDNAを合成し、このcDNAを鋳型としてRT-PCR反応をTaKaRa PCR Thermal Cycler  MP(TaKaRa BIOMEDICAL社)を用いて行った。なお、cDNAの合成は、プライマーとして下記の配列を用いて、実施例4) b)に記載した方法により行った。【００５７】
プライマー RNA2 2814R：5′-AGCAATACTGCCAACTCAGC-3′（配列番号８）
また、PCRは下記のプライマーを用いて行った。【００５８】
プライマー RNA2 2327F：5′-ATTCAGATCGTCGTCAGTGC-3′（配列番号９）
プライマー RNA2 2814R：（上記）
PCR産物を1％アガロースゲルで電気泳動し、子孫個体であるペチュニア植物体において目的の断片が増幅されないことを確認した。【００５９】
ｂ）ELISA検定によるウイルス感染の確認
96穴マイクロタイタープレート（MicroWell Nunc）に、0.05M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）で1000倍に希釈した抗CMV-Y γ-グロブリンを1ウェルあたり200μlずつ分注し、パラフィルムで密封し、37℃で3-4時間静置した。γ-グロブリン液を捨てた後、PBS-Tを1ウェルあたり300μlずつ分注し室温で5分静置してから捨てる操作を４回繰り返した。【００６０】
次に、実施例で調製した子孫個体であるペチュニア植物体の植物組織0.1gと10倍量のPBS-Tを乳鉢に入れて磨砕し、1.5mlチューブに磨砕液を移して14,000rpmで10分間冷却遠心した。試料粗汁液を1ウェルあたり200μlずつ分注し、パラフィルムで密封し、4℃で一晩静置した。試料粗汁液を捨てた後、PBS-Tを1ウェルあたり300μlずつ分注して室温で5分間静置してから液を捨てる操作を４回繰り返した。【００６１】
PBS-Tで1000倍に希釈した抗CMV-Y γ-グロブリンアルカリフォスファターゼコンジュゲートを1ウェルあたり200μlずつ分注し、パラフィルムで密封し、37℃で3-4時間静置した。コンジュゲート液を捨てた後、PBS-Tを1ウェルあたり300μlずつ分注して室温で5分間静置してから液を捨てる操作を４回繰り返した。 10％ジエタノールジアミンで基質のp-ニトロフェニルフォスフェイトを1mg/mlに溶かし、1ウェルあたり200μlずつ分注し、室温で30-60分静置し、マイクロプレートリーダー（Emax和光純薬(株)）でO.D. 405の値を測った。【００６２】
以上の実験を行うことにより、子孫個体であるペチュニア植物体にウイルスが存在していないことが確認された。【００６３】
ｃ）ゲノムDNAのメチル化の確認
DNAをsodium bisulfite（亜硫酸水素ナトリウム）で処理すると、DNA配列上のメチル化されていないシトシンは脱アミノ化されウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシンは変換されない。このbisulfite処理したDNAのPCR産物をTAクローニングし、クローニング産物を用いて大腸菌を形質転換して得られるコロニーからプラスミドを抽出して塩基配列を解読し、シトシンからウラシルへの変換を読み取ることでメチル化されている場所と頻度を調べた。【００６４】
子孫個体であるペチュニア植物体を栽培して開花させた花0.1gを液体窒素を用いてパウダー状にすりつぶし、冷やしたスパチュラを用いて1.5mlチューブに移し、Nucleon PhytoPure（Amersham）とその取扱説明書の記載に従ってDNAの抽出を行った。【００６５】
抽出したゲノムDNA（7μg）を解析予定の領域に認識部位が存在しない制限酵素HindIIIで消化し、クロロホルム法で精製した後、純水に3.5μg／50μlとなるように溶解した。このDNA 500 μｇに3M NaOHを5.5μl加え、37℃、20〜30分処理した。10ｍM hydoroquinoneを30μl加え、さらに3.6Mのsodium bisulfite（pH5.0）を520μl加えた。ミネラルオイルを上層に加え、チューブをアルミホイルでふたをし、ヒートブロックで60℃、30時間処理した。反応後、DNAをPCR prep kit（QIAGEN）により精製し、最終的に滅菌水によりDNAを溶出し、50 μlのDNA溶液を得た。この溶液に3M NaOHを5.5μl加え（最終濃度0.3M）、37℃、20分処理した。グリコーゲン（5μg/μl）を4μl加え、さらに5M酢酸アンモニウムを66μl加えた。エタノールを300μl加え、-20℃、5分静置後、10,000gで15分遠心した。ペレットを70％エタノールでリンスし、65℃に温めておいた20μlのTE bufferに溶解し、吸光度を測定した。【００６６】
回収されたDNAの10〜100ngをPCRテンプレートとし、下記のプライマーセットを用いてTaKaRa Thermal Cycler MP (TaKaRa  BIOMEDICAL)を用いてPCRを行ない、CHS-Aプロモーター配列を増幅した。【００６７】
プライマー CHS -336F bisulfite T：
5′-TAATGAGATGGTTTATATAGTATTT-3′（配列番号１０）
プライマー CHS +107R bisulfite A：
5′-CCTTACAATACTCCTCAACTATC-3′（配列番号１１）
プライマーCHS -298F bisulfite T：
5′-ATTTAAAAAGGATATTATAATTTGGTATT-3′（配列番号１２）
プライマーCHS +34R bisulfite A：
5′-CATAACAAATATAAATATCTTTTATATTAT-3′（配列番号１３）
PCR産物をアガロースゲル電気泳動して目的の大きさのバンドをゲルから切り出し、pGEM-T Easy vector (Promega)にTAクローニングし大腸菌を形質転換した。1サンプルにつき10個以上の大腸菌のコロニーからおのおのプラスミド抽出を行い、シークエンスを解読しDNAのメチル化を判定した。【００６８】
その結果、通常の個体においてはCHS-Aプロモーター領域のメチル化は検出されなかった。一方、CHS-A遺伝子のプロモーター配列のRNAを持つウイルスを感染させた個体では、非常に高い頻度でメチル化が検出された（図８）。また、ウイルス感染個体を自殖することによって得た子孫個体であるペチュニア植物体でも、ウイルス接種当代より低い頻度ではあるものの、メチル化が検出された（図９）。このことは、CHS-Aプロモーターのメチル化状態が子孫個体に伝達されたことを示している。【００６９】
ｄ）ヒストンタンパク質の修飾状態の変化の確認
ヒストンタンパク質のアセチル化の状態の変化をクロマチン免疫沈降法により解析した。子孫個体であるペチュニア植物体の開花直前の花より葯を採取し、実験に用いた。氷冷したBuffer A (0.4 M sucrose、10 mM Tris−HCl pH 8.0、1 mM EDTA、1 mM PMSF、1％ formaldehyde) を１サンプル当たり10 ml加えて減圧乾燥機内に10分間おき、溶液を組織へ浸透させ、DNAとヒストンタンパク質のクロスリンクの反応を行った。反応を停止させるため、終濃度が0.1 Mになるように1.5 Mのグリシン溶液を加え、再び減圧乾燥機内で５分間おき、溶液を浸透させた。その後、溶液をよく切り、冷やしておいた滅菌水で5回洗った。サンプルを液体窒素に入れ、乳鉢と乳棒によりすりつぶした。組織の粉末を2mlチューブに移し、１サンプル当たり1mlのlysis buffer (50mM HEPES−KOH pH7.5、0.1% SDS、10mM Na butyrate、150mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X−100、0.1% deoxycholate、1 mM PMSF、1 μg/ml aprotinin、1 μg/ml pepstatin A) を加え、Branson Sonifier 250を用いて超音波処理を行った。これを４℃、13,000 rpmで10分間遠心し、上清のうち180μlを新しいチューブに移した。Chromatin Immunoprecipitation Assay Kit (Upstate)を用いて、上清を希釈後、免疫沈降反応を行い、反応後、沈降物の洗浄、溶出、脱クロスリンク、ならびにDNAの精製を行った。これらの過程は、Chromatin Immunoprecipitation Assay Kit (Upstate)のプロトコールにしたがって行った。免疫沈降用の抗体には、抗アセチル化ヒストンH3 (Upstate) を用いた。精製後、DNAはエタノールにより沈殿させ、20μlの滅菌水に溶解した。その2μlをテンプレートとして、以下のプライマーを用いてCHS-A遺伝子のプロモーター領域を増幅するPCRを行った。【００７０】
プライマー CHS −273F：5′-GGTATTACGTGTCAAATTCCTG-3′（配列番号１４）
プライマー CHS −2R：5′-GGTTTGCATGGGGATTGTAG-3′（配列番号１５）
その結果、CHS-A遺伝子のプロモーター配列からなる核酸を含むウイルスを感染させた個体の子孫個体であるペチュニア植物体では、通常の個体に比べて、PCRの増幅産物量が顕著に減少していた。このことから、CHS-Aプロモーター領域に位置するヒストンH3が子孫個体において脱アセチル化されていることが明らかとなった（図１０）。この結果は、一般にヒストンタンパク質の脱アセチル化が遺伝子の転写不活性化と関連していることと矛盾しないものである。CHS-A遺伝子の転写抑制がヒストンH3の脱アセチル化を含む、ヒストンタンパク質の修飾状態の変化を伴い、これが子孫個体に伝達されていることを示唆している。
【図１】
2008035462.tif 000002
【図２】
2008035462.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月17日(2008.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、ヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
内在性遺伝子のプロモーター領域に結合するヒストン蛋白質の脱アセチル化によって当該内在性遺伝子の発現が抑制されている、請求の範囲第１項に記載の形質転換植物。
【請求項４】
予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、ヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された外来遺伝子は保持していない形質転換植物の生産方法であって、標的遺伝子として内在性遺伝子を特定する工程１）、前記内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸と植物感染性ウイルス由来の核移行能を有するジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質をコードする核酸とを植物に導入する工程２）、及び工程２）によって得られる植物を自殖又は他殖させて子孫個体である形質転換植物を得る工程３）を含む、前記方法。
【請求項５】
工程２）における核移行能を有するジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質がキュウリモザイクウイルス由来の２ｂ蛋白質である、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
核移行能を有するジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質をコードする核酸が、２ｂ蛋白質をコードするキュウリモザイクウイルスベクターである、請求の範囲第４項に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月5日(2009.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
予め特定された植物の内在性遺伝子の発現がヒストン蛋白質の脱アセチル化によって抑制されているが、ヒストン蛋白質の脱アセチル化を誘導するために該植物に導入された遺伝子を含む外来遺伝子は保持していない形質転換植物の生産方法であって、標的遺伝子として内在性遺伝子を特定する工程１）、前記内在性遺伝子のプロモーター領域の配列からなる核酸と植物感染性ウイルス由来の核移行能を有するジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質であるキュウリモザイクウイルス由来の２ｂ蛋白質をコードする核酸とを植物に導入する工程２）、及び工程２）によって得られる植物を自殖又は他殖させて子孫個体である形質転換植物を得る工程３）を含む、前記方法。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
核移行能を有するジーンサイレンシングサプレッサー蛋白質であるキュウリモザイクウイルス由来の２ｂ蛋白質をコードする核酸がキュウリモザイクウイルスベクターである、請求の範囲第４項に記載の方法。
【国際調査報告】
2008035462.tif 000012
2008035462.tif 000013
2008035462.tif 000014
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