【手続補正書】
【提出日】平成17年2月7日(2005.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  ＶＩＰアンタゴニストを用いる併用療法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  以下：
ａ）血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストであって、該ＶＩＰアンタゴニストが、以下のアミノ酸配列：
【化１】
2003530297.tif 000001
を含み、ここで：
Ｒ1およびＲ2は、少なくとも１つのＲ1またはＲ2が水素である条件で、独立して、水素、Ｃ1〜Ｃ20のアルキルおよびＣ1〜Ｃ20のアシルからなる群より選択されるメンバーであり；そして
Ｘ1およびＸ2は、独立して、天然に存在するアミノ酸、アミノ酸アナログ
およびアミノ酸模倣物からなる群より選択されるメンバーであり；
ただし、該ＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【化２】
2003530297.tif 000002
を有さない、ＶＩＰアンタゴニスト；
ｂ）化学療法剤；ならびに
ｃ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、薬学的組成物。
【請求項２】  請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、Ｘ1およびＸ2が、独立して、疎水性特性の天然に存在するアミノ酸、アミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物からなる群より選択されるメンバーである、薬学的組成物。
【請求項３】  請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、Ｒ1がＨであり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基である、薬学的組成物。
【請求項４】  請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基である、薬学的組成物。
【請求項５】  請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がメチオニン残基であり；そしてＸ2がバリン残基である、薬学的組成物。
【請求項６】  請求項１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記化学療法剤が、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイドおよびジフルオロヌクレオシドからなる群より選択されるメンバーである、薬学的組成物。
【請求項７】  前記化学療法剤が白金配位化合物である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】  請求項７に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記白金配位化合物が、シスプラチン、シス−ジアンミンジアクオ白金（ＩＩ）イオン、クロロ（ジエチレントリアミン）−白金（ＩＩ）クロリド、ジクロロ（エチレンジアミン）−白金（ＩＩ）、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、ジアンミン（２−エチルマロナート）−白金（ＩＩ）、エチレンジアミンマロナート白金（ＩＩ）、アクア（１，２−ジアミノシクロヘキサン）−スルフェート白金（ＩＩ）、（１，２−ジアミノシクロヘキサン）マロナート白金（ＩＩ）、（４−カロキシフタレート）（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、（１，２−ジアミノシクロヘキサン）−（イソシトラート）白金（ＩＩ）、（１，２−ジアミノシクロヘキサン）シス（ピルベート）白金（ＩＩ）；（１，２−ジアミノシクロヘキサン）オキサラート白金（ＩＩ）、オルマプラチンおよびテトラプラチンからなる群より選択されるメンバーである、薬学的組成物。
【請求項９】  前記白金配位化合物がシスプラチンである、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】  前記化学療法剤がトポイソメラーゼインヒビターである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】  請求項１０に記載の薬学的組成物であって、前記トポイソメラーゼが、トポテカン、イリノテカンおよび９−アミノカンプトテシンからなる群より選択されるメンバーである、薬学的組成物。
【請求項１２】  前記トポイソメラーゼがイリノテカンである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】  前記化学療法剤が抗生物質である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】  請求項１３に記載の薬学的組成物であって、前記抗生物質が、ドキソルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシンおよびストレプトゾシンからなる群より選択されるメンバーである、薬学的組成物。
【請求項１５】  前記抗生物質がドキソルビシンである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】  前記化学療法剤が抗有糸分裂性アルカロイドである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】  請求項１６に記載の薬学的組成物であって、前記抗有糸分裂性アルカロイドが、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タキソールおよびビンデシンからなる群より選択されるメンバーである、薬学的組成物。
【請求項１８】  前記前記抗有糸分裂性アルカロイドがビノレルビンである、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】  前記化学療法剤がジフルオロヌクレオシドである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】  前記ジフルオロヌクレオシドがゲムシタビンである、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】  腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、以下の工程：
該腫瘍細胞を、有効量の化学療法剤および血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストと接触させる工程であって、該ＶＩＰアンタゴニストが以下のアミノ酸配列：
【化３】
2003530297.tif 000003
を含み、ここで：
Ｒ1およびＲ2は、少なくとも１つのＲ1またはＲ2が水素である条件で、独立して、水素、Ｃ1〜Ｃ20のアルキルおよびＣ1〜Ｃ20のアシルからなる群より選択されるメンバーであり；そして
Ｘ1およびＸ2は、独立して、天然に存在するアミノ酸、およびアミノ酸模倣物からなる群より選択されるメンバーであり；
ただし、該アンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【化４】
2003530297.tif 000004
を有さない、工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】  請求項２１に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストおよび前記化学療法剤が、同時に該腫瘍細胞と接触する、方法。
【請求項２３】  請求項２１に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基である、方法。
【請求項２４】  請求項２１に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記化学療法剤が、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイドおよびジフルオロヌクレオシドからなる群より選択されるメンバーである、方法。
【請求項２５】  前記白金配位物がシスプラチンである、請求項２４に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２６】  前記トポイソメラーゼがイリノテカンである、請求項２４に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２７】  前記抗生物質がドキソルビシンである、請求項２４に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２８】  前記抗有糸分裂性アルカロイドがビノレルビンである、請求項２４に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２９】  前記ジフルオロヌクレオシドがゲムシタビンである、請求項２４に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３０】  請求項２１に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記腫瘍細胞が、肺細胞、結腸細胞、乳房細胞、卵巣細胞、前立腺細胞および肝細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項３１】  請求項２１に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記化学療法剤および前記ＶＩＰアンタゴニストが、賦形剤またはキャリアとともに薬学的に受容可能な形態中に処方される、方法。
【請求項３２】  請求項２１に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、さらに、該腫瘍細胞の増殖における低減について観察する工程を包含する、方法。
【請求項３３】  哺乳動物被験体において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、以下の工程：
化学療法剤および血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストの組合せの有効量を該被験体に投与する工程であって、該ＶＩＰアンタゴニストが以下のアミノ酸配列：
【化５】
2003530297.tif 000005
を含み、ここで：
Ｒ1およびＲ2は、少なくとも１つのＲ1またはＲ2が水素である条件で、独立して、水素、Ｃ1〜Ｃ20のアルキルおよびＣ1〜Ｃ20のアシルからなる群より選択されるメンバーであり；
ここで：
Ｘ1およびＸ2は、独立して、天然に存在するアミノ酸、アミノ酸アナログ
およびアミノ酸模倣物からなる群より選択されるメンバーであり；
ただし、該アンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【化６】
2003530297.tif 000006
を有さない、工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】  請求項３３に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストおよび前記化学療法剤が、同時に投与される、方法。
【請求項３５】  請求項３３に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基である、方法。
【請求項３６】  前記哺乳動物被験体がヒトである、請求項３３に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３７】  請求項３３に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記化学療法剤が、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイドおよびジフルオロヌクレオシドからなる群より選択されるメンバーである、方法。
【請求項３８】  前記白金配位物がシスプラチンである、請求項３７に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３９】  前記トポイソメラーゼがイリノテカンである、請求項３７に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項４０】  前記抗生物質がドキソルビシンである、請求項３７に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項４１】  前記抗有糸分裂性アルカロイドがビノレルビンである、請求項３７に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項４２】  前記ジフルオロヌクレオシドがゲムシタビンである、請求項３７に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項４３】  請求項３３に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、該腫瘍細胞が、肺細胞、結腸細胞、乳房細胞、卵巣細胞、前立腺細胞および肝細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項４４】  請求項３３に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記化学療法剤および前記ＶＩＰアンタゴニストが、賦形剤またはキャリアとともに薬学的に受容可能な形態中に処方される、方法。
【請求項４５】  請求項３３に記載の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、さらに、該腫瘍細胞の増殖における低減について観察する工程を包含する、方法。
【請求項４６】  腫瘍細胞の増殖を阻害するためまたは癌を処置するための医薬の製造における、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項４７】  患者における腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬の製造における、請求項１に記載の組成物の使用であって、ここで、該腫瘍細胞が、肺細胞、結腸細胞、乳房細胞、卵巣細胞、前立腺細胞および肝細胞からなる群より選択されるメンバーである、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願番号６０/１０４，４７２（１９９８年１０月１６日出願）、および米国仮特許出願番号６０/１０４，９０７（１９９８年１０月２０日出願）（これらの開示の両方は、本明細書によって、全ての目的のためにそれらの全体において参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、癌の処置に関する。より詳細には、本発明は、血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）のアンタゴニストであるポリペプチドおよび化学療法剤を、好ましくは、薬学的組成物において使用する、併用療法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）は、広範に分布するペプチドホルモンであり、これは、胃腸分泌、胃腸血管筋および呼吸平滑筋の弛緩、肥満細胞の脂肪溶解、下垂体ホルモン分泌、および中枢神経系への注入後の興奮および高体温を含む、種々の生理学的応答を媒介する。血管作用性腸ペプチドは、アミド化されたＣ末端を有する２８アミノ酸のペプチドであり、このペプチドは、１７０アミノ酸残基から構成されるホルモンの翻訳後プロセシングから生じる。このＶＩＰペプチドは、少なくとも２つの機能的な領域（レセプター特異的結合に関与する領域および生物学的活性に関与する領域）を含むことが示されている（ＧｏｚｅｓおよびＢｒｅｎｎｅｍａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３：２０１〜２３６（１９８９））。
【０００４】
この２８アミノ酸のペプチドである血管作用性腸ペプチドの最も重要な機能は、胚の増殖を促進する能力である（Ｇｒｅｓｓｅｎｓ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：１５５８〜８（１９９３）を参照のこと）。ＶＩＰは、神経末端、免疫細胞、によって、およびいくつかの腫瘍性細胞によって分泌される（Ｇｏｚｅｓ，Ｉ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（印刷中）（１９９９）を参照のこと）。その生理学的作用とともに、ＶＩＰは、フィードバック機構によってその独自のレセプターを誘導する、神経芽細胞腫（Ｗｏｌｌｍａｎ，Ｙ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６２４：３３９〜４１（１９９３）を参照のこと）、乳房（Ｚｉａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３４８６〜９（１９９６））、肺（Ｍｏｏｄｙ，Ｔ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４３４５〜９（１９９３）を参照のこと）、および結腸癌（Ｇｏｚｅｓ，Ｉ．ら、Ｃ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ
１５ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｅｇｉｕｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｃｈｉｒｕｇｉａｅ  ８１９（１９９６）を参照のこと）からの腫瘍性細胞に対する刺激効果および栄養性効果を発揮し得る。神経芽細胞腫（幼い子供における最も一般的な固形の悪性疾患）では、ＶＩＰは、細胞株および適用の時間に依存して、分化の誘導および細胞分裂の刺激のいずれかの二重の効果を有することが示されている。１つのヒト神経芽細胞腫細胞株（ＮＭＢ）では、ＶＩＰは、有糸分裂の用量依存性刺激を生じた（Ｗｏｌｌｍａｎ，Ｙ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６２４：３３９〜４１（１９９３）を参照のこと）。対照的に、マウス神経芽細胞腫細胞株ニューロ２ａ（Ｎｅｕｒｏ２ａ）では、ＶＩＰは、それぞれ、１０-13Ｍおよび１０-10Ｍ程度の低さでの濃度で増殖を阻害した。同様に、肺癌において、癌増殖の指標としてのソフトアガーにおける増殖を使用して、ＶＩＰは、増殖を誘導し、そしてＶＩＰアンタゴニストは、小細胞肺癌および非小細胞肺癌の増殖を阻害した（Ｍｏｏｄｙ，Ｔ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｄａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４３４５〜９（１９９３）；Ｍｏｏｄｙ，Ｔ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１１９２、１３（補遺２）１３１を参照のこと）。
【０００５】
Ｇｏｚｅｓらは、血管作用性腸ペプチドの機能を変更させるために有用であると証明されたＶＩＰアンタゴニストを発見した。（Ｇｏｚｅｓ（１９９３）に対して発行された米国特許第５，２１７，９５３号を参照のこと）。このＶＩＰアンタゴニストは、そのレセプターについてのＶＩＰの結合特性を保持するが、生物学的活性に必要なアミノ酸配列を欠失するように設計された。他の因子のうち、生物学的活性は、６位にフェニルアラニン残基を必要とすると考えられている。従って、ネイティブなＶＩＰのアミノ酸１〜６は、ネイティブなＶＩＰの生物学的活性を変更させ、かつこのペプチドの膜透過性を変化させるために、ニューロテンシンのセグメントによって置換された。ニューロテンシンのセグメントに付加された６つのアミノ酸のうちの３つは、塩基性である。これは、この領域内に塩基性残基を含まず、かつ１つの酸性残基のみを含むネイティブなＶＩＰとは対照的である。実際、両末端に塩基性アミノ酸およびＮ末端アミノ酸に隣接してプロリン残基を有するテトラペプチドが膜透過性の高い活性に必須であるという概念は、ニューロテンシンおよび他のペプチドについて正しいと証明された。このように、Ｇｏｚｅｓらによって発見されたＶＩＰアンタゴニストは、ＶＩＰレセプター結合い必要なアミノ酸配列（すなわち、ＶＩＰのアミノ酸７〜２８）、およびニューロテンシンの一部に対応するＮ末端アミノ酸配列を含むハイブリッド分子である。
【０００６】
研究は、このＶＩＰアンタゴニストがＶＩＰ関連活性を効果的にアンタゴナイズすることを示した。このＶＩＰアンタゴニストは、例えば、肺腫瘍細胞のようなＶＩＰレセプター保有腫瘍細胞（すなわち、ＮＳＣＬＣ細胞）の増殖を阻害することが報告されている（米国特許第５，２１７，９５３号を参照のこと）。
【０００７】
米国特許第５，５６５，４２４号（Ｇｏｚｅｓらに対して１９９６日１０月１５日に発行）は、血管作用性腸ポリペプチドのアンタゴニストであるポリペプチドの別のファミリーを開示する。その中に開示されたＶＩＰアンタゴニストは、以前のＶＩＰアンタゴニストよりもＶＩＰ関連活性を阻害する際に１０〜１０００倍より効率的（すなわち、より強力）である。これらの著しく活性なＶＩＰアンタゴニストは、肺細胞および神経膠芽細胞腫細胞における癌増殖を阻害することが示された。著しく活性なＶＩＰアンタゴニストの例としては、「ＮＬハイブリッドＶＩＰアンタゴニスト」、「Ｓ−ＮＬハイブリッドＶＩＰアンタゴニスト」および「ＳハイブリッドＶＩＰアンタゴニスト」といわれるアミノ酸配列が挙げられる。
【０００８】
前述のＶＩＰアンタゴニストおよび著しく活性なＶＩＰアンタゴニストは、貴重であるが、なおより効果的な癌の処置に対して、当該分野における必要性がなお残っている。さらに、固形腫瘍に対して、および癌のより進行した段階に対して、癌の広範な範囲にわたって効果的である処置が、必要とされる。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニスト、化学療法剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関する。本発明の血管作用性腸ポリペプチドアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００１０】
【化７】
2003530297.tif 000007
。上記の式では、Ｒ1およびＲ2は、独立して選択され、そして水素、Ｃ1〜Ｃ20のアルキルおよびＣ1〜Ｃ20のアシルを含むがこれらに限定されず、但しＲ1またはＲ2の少なくとも１つが水素である官能基である。上記の式においてＸ1およびＸ2は、天然に存在するアミノ酸およびアミノ酸アナログまたはアミノ酸模倣物からなる群より独立して選択されるが、但しＸ2はメチオニンではない。
【００１１】
上記の式の範囲内では、特定の血管作用性腸ポリペプチドアンタゴニスト（すなわち、Ｒ1がＨであり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基であるもの）が、好ましい（本明細書中以降、「ＮＬ−ハイブリッドＶＩＰアンタゴニスト」といわれる）。Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基であるＶＩＰアンタゴニストが、同じく好ましい（本明細書中以降、「Ｓ−ＮＬハイブリッドＶＩＰアンタゴニスト」といわれる）。Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がメチオニン残基であり；そしてＸ2がバリン残基であるＶＩＰアンタゴニストもまた、同じく好ましい（本明細書中以降、「Ｓ−ハイブリッドＶＩＰアンタゴニスト」といわれる）。さらに、Ｒ1がＣ1〜Ｃ20アルキルであり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基であるＶＩＰアンタゴニストが、同じく好ましい。さらに、他の好ましいＶＩＰアンタゴニストは、Ｘ1およびＸ2が疎水性特徴のアミノ酸およびアミノ酸アナログまたは模倣物であるものである。
【００１２】
しかし、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は、本発明のＶＩＰアンタゴニストが以下のアミノ酸配列以外を有するように選択されることに留意されるべきである：
【化８】
2003530297.tif 000008
本発明の薬学的組成物はまた、化学療法剤を含む。特定の局面では、本発明の化学療法剤は、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイド、およびジフルオロヌクレオシドを含むがこれらに限定されない。
【００１３】
他の局面では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。この方法は、腫瘍細胞と、有効量の化学療法剤および血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストの組合せとを接触させる工程を包含し、このＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【００１４】
【化９】
2003530297.tif 000009
を含み、ここでＲ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は、上記で定義されているが、但しこのＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【００１５】
【化１０】
2003530297.tif 000010
を有しない。
【００１６】
この方法において、適切な化学療法剤は、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイドおよびジフルオロヌクレオシドが挙げられるがこれらに限定されない。この方法は、併用療法において、同時の様式において送達される化学療法剤とのＶＩＰアンタゴニストの併用を含み、ここでこのＶＩＰアンタゴニストは、最初に投与され、次いで、化学療法剤が投与され、そして化学療法剤が最初に送達され、次いで、ＶＩＰアンタゴニストが送達される。本発明は、投与し、かつ腫瘍細胞を接触させる全てのこのような方法を含む。
【００１７】
さらなる局面では、本発明は、哺乳動物被験体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、有効量の化学療法剤および血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストの組合せを、この被験体に投与する工程を包含し、ここでこのＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ配列：
【００１８】
【化１１】
2003530297.tif 000011
を含み、ここでＲ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は、上記で定義されており、但しこのＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【００１９】
【化１２】
2003530297.tif 000012
を有しない。
【００２０】
この局面では、適切な化学療法剤は、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイド、およびジフルオロヌクレオシドを含むがこれらに限定されない。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する処置および癌の治療のための医薬品の製造のための使用を提供する。本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中以降に詳細に記載される。
【００２２】
（定義）
用語「独立して選択される」とは、マーカッシュ群において、例えば、Ｒ1およびＲ2が同一であり得るか、または異なり得ること（例えば、Ｒ1およびＲ2が、両方とも、水素であり得るか、またはＲ1が水素であり得、かつＲ2がＣ20アルキルであり得ることなど）を示すために本明細書中で使用される。
【００２３】
用語「接触する」は、本明細書中で、以下：〜と組み合わされて、〜に添加されて、〜と混合して、〜に対して通過して、〜とともにインキュベートされて、〜に対して流されて、などと交換可能に使用される。さらに、本発明の組成物は、本明細書中に記載されるように、例えば、非経口経路、経口経路、局所経路、および吸入経路のような任意の従来の方法によって「投与」され得る。
【００２４】
用語「薬学的に受容可能な塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、かつ無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）との反応によって得られる化合物の塩をいう。薬学的に受容可能な塩には、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属塩ならびにアンモニウム塩が挙げられる。本発明の化学療法剤は、それらの薬学的に受容可能な塩として存在し得る。
【００２５】
「十分な組合せ量」、「有効な組合せ量」、「治療的に有効な組合せの量」、または「〜の組合せの有効量」は全て、悪性細胞の増殖を抑圧するか、抑制するか、または退行させるに効果的であるか、あるいは癌性疾患と関連する症状の寛解を生じる、ＶＩＰアンタゴニストおよび化学療法剤の両方の組み合わせた量をいう。本明細書中で使用される場合、用語、化学療法剤とのＶＩＰアンタゴニストの「組合せ」は、併用療法において、同時様式にて送達され得る２つの化合物を意味し、ここでこのＶＩＰアンタゴニストが最初に投与され、続いて化学療法剤が投与され、そしてここで化学療法剤が最初に送達され、続いてＶＩＰアンタゴニストが送達される。この所望の結果は、症状の主観的な軽減、あるいはこの投薬のレシピエントにおける客観的に同定可能な改善、腫瘍サイズにおける減少、または臨床医もしくは他の認定された観察者によって留意される癌細胞の増殖速度における減少のいずれかであり得る。
【００２６】
用語「相乗効果的な量」とは、相乗効果を生じるのに有効である、ＶＩＰアンタゴニストおよび化学療法剤の両方の併用量をいう。相乗作用とは、混合物中の２つの活性成分の有効性が、加法的な有効性を超える（すなわち、有効性が、いずれかの成分単独に相当する濃度を超える）化学現象である。ＶＩＰアゴニストおよび化学療法剤の併用療法の有効性は、相乗的である。従って、相乗作用は、結果（すなわち、個々の要素の機能）の合計を超える、結果（すなわち、機能）である。
【００２７】
用語「癌を処置する」、「治療（療法）」などは、癌を有する哺乳動物における任意の改善を一般にいい、ここで、この改善に基づいて、本発明の組成物を用いて処置し得る。この改善は、主観的または客観的のいずれかであり得る。例えば、哺乳動物がヒトである場合、患者は、療法に対する改善または応答の主観的症状として、改善された活力もしくは生命力、または低下した痛みに注目し得る。あるいは、臨床家は、身体検査、検査値、腫瘍マーカー、またはＸ線所見に基づいて、腫瘍サイズもしくは腫瘍負荷量の減少に注目し得る。臨床家が、療法に対する応答を観察し得るいくつかの検査徴候としては、白血球計数、赤血球計数、血小板計数、赤血球沈降速度、および種々の酵素レベルのような試験の正常値が挙げられる。さらに、臨床家は、検出可能な腫瘍マーカーの減少を観察し得る。あるいは、他の試験を用いて、音波検査図、核磁気共鳴試験および陽子放出試験（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ）のような客観的改善を評価し得る。
【００２８】
「腫瘍細胞の増殖を阻害する」ことは、腫瘍細胞の増殖が、遅くなっているか、減少しているかを測定する任意の一般に認められた方法によって、評価され得る。このことは、上記で議論されるような、主観的症状または客観的徴候のような、直接的観察および間接的評価を含む。
【００２９】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるそれらのアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、α−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素に結合されるα−炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ−基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシドおよびメチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、一般化学構造のアミノ酸とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似の様式で機能する化学化合物をいう。
【００３０】
本明細書中で参照されるいくつかのアミノ酸は、以下の速記命名法によって記載される：
【００３１】
【表１】
2003530297.tif 000013
（発明の詳細な説明および好ましい実施形態）
（Ｉ．薬学的組成物）
１つの局面において、本発明は、血管作用性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニスト、化学療法剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。驚くべきことに、本発明の組成物は、相乗的結果を達成した（すなわち、相乗的である）。このことは、混合物（すなわち、ＶＩＰアンタゴニストおよび化学療法剤）におけるような、２つの活性成分の有効性が、加法的な有効性を超える（すなわち、有効性が、いずれかの成分単独に相当する濃度を超える）化学事象である。
【００３２】
（Ａ．ＶＩＰアンタゴニスト）
アンタゴニストは、以下のアミノ酸配列を含む：
Ｒ1−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ1−Ａｌａ−Ｘ2−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＡｓｎＮＨ−Ｒ2。
【００３３】
上記の式において、Ｒ1およびＲ2は、独立して選択され、そして以下を含むが、それらに限定されない、官能基であり得る：水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキルおよびＣ1〜Ｃ20アシル、但し、Ｒ1またはＲ2の少なくとも１つは、水素である。用語、「独立して選択される」とは、２つのＲ基（Ｒ1およびＲ2）が、同一であり得るか、あたは異なり得る（例えば、Ｒ1およびＲ2の両方は、水素であり得、Ｒ1は、Ｃ１６アシルラジカルであり得、そしてＲ2は水素であり得るなど）ことをを示すために本明細書中で用いられる。用語「アルキル」は、一価の脂肪族炭化水素ラジカルである置換基をいうために、本明細書中で用いられる。このアルキル基は、直鎖または分枝鎖であり得、好ましくは直鎖アルキル基（すなわち、Ｃ1〜Ｃ20）を有する。適切なアルキルラジカルの例としては、以下があげられるが、それらに限定されない：メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、およびイコシル。
【００３４】
用語「アシル」は、水酸基の除去によって、有機酸から誘導される有機ラジカルをいうために、本明細書中で用いられる。例えば、アシルラジカルまたは基「ブチリル」は、水酸基の除去によって、ブタン酸から誘導される。同様に、アシル基「ステアリル」は、水酸基の除去によってステアリン酸から誘導される。本発明に従って、アシル基は、好ましくは、１〜２０の炭素原子（すなわち、Ｃ1〜Ｃ20）を有するアシル基を用いて飽和または不飽和され得る。「飽和（した）」アシル基は、二重結合または三重結合を有さないものであり、一方「不飽和（した）」アシル基は、二重結合または三重結合を有するものである。適切なアシル基としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ブチリル、ヘキサノイル、オクタノイル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラシジル（ａｒａｃｉｄｙｌ）、リノセリルなど。先に加えて、多数の他のアシル基は、水酸基の除去によって種々の有機酸から誘導され得ることは当業者に容易に明らかである。
【００３５】
上記式において、Ｘ1およびＸ2は、天然に存在するアミノ酸、アミノ酸アナログまたはアミノ酸模倣物からなる群から独立して選択される（但し、Ｘ2は、メチオニンではない）。用語「独立して選択される」とは、２つのＸ基（Ｘ1およびＸ2）が、同一であってもよいし、異なってもよい（例えば、Ｘ1およびＸ2の両方はバリンであっても良い、など）ことを示すために本明細書中で用いられる。Ｘ1およびＸ2は、以前に述べたように、天然に存在するアミノ酸、アミノ酸アナログ、もしくはアミノ酸模倣物またはアミノ酸に類似する様式で機能する分子を表す。本発明のアンタゴニストを形成するために用いられ得る、適切なアミノ酸は、表Ｉに列挙されるアミノ酸を含むが、それらに限定されない。
【００３６】
上記式の範囲内において、特定の血管作用性腸管ポリペプチドアンタゴニストが好ましい。すなわち、Ｒ1がＨであり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基である。同様に好ましいのは、Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；およびＸ2がバリン残基である、ＶＩＰアンタゴニストである。同様に好ましいのはまた、Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ−であり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がメチオニン残基であり；およびＸ2がバリン残基である、ＶＩＰアンタゴニストである。さらに同様にこのましいのは、Ｒ1がＣ1〜Ｃ20のアルキルであり；Ｒ2がＨであり；Ｘ1がノルロイシン残基であり；そしてＸ2がバリン残基である、ＶＩＰアンタゴニストである。さらに、他の好ましいＶＩＰアンタゴニストは、Ｘ1およびＸ2が、疎水性特性のアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはアミノ酸模倣物である。このようなアミノ酸としては、ロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、およびバリンが挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Ｘ1がロイシン、バリン、またはフェニルアラニンであり、そしてＸ2がロイシン、ノルロイシン、またはフェニルアラニンである）。
【００３７】
しかし、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2が選択され、その結果、本発明のＶＩＰアンタゴニストが、以下のアミノ酸配列以外を有することに注意するべきである：
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ。
【００３８】
さらに、本発明のＶＩＰアンタゴニストが、様々な変化（例えば、保存または非保存のいずれかでの、挿入、欠失、および置換）に供され得ることが当業者に容易に理解され、ここでこのような変化は、それらの用途における特定の利点（すなわち、生物学的活性を低下させる）を提供し得る。保存的置換によって、アミノ酸残基の生物学的および／または化学的に類似する別のアミノ酸残基との置換（例えば、疎水性残基対別の残基、または極性残基対別の残基）が意味される。置換としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせが挙げられる。ＶＩＰアンタゴニストの生物学的活性を失わずに修飾され得る残基は、当業者に公知の従来技術を用いて単一アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって同定され得る。特に本発明のＶＩＰアンタゴニストは、それらが相対的に長さが短いことがある。さらに、残基の側鎖によってなされる寄与は、特定のアミノ酸（例えば、Ａｌａ）を用いる系統的走査を介してプローブされ得る。
【００３９】
本発明のＶＩＰアンタゴニストは、相対的に長さが短く、代表的には、２８アミノ酸以下の長さである。このように、溶液法および固相法（固相合成を用いることが好ましい）の両方を含む当業者に周知の多数の化学ペプチド合成技術のいずれかを用いて、このようなＶＩＰアンタゴニストを調製することが可能である。（Ｇｏｚｅｓら、に対して、１９９６年１０月１５日に発行された、米国特許第５，５６５，４２４号を参照のこと）。
【００４０】
固相合成は、適切な固体支持体に保護アミノ酸のカルボキシル基を介して保護アミノ酸をカップリングすることによって、ペプチドのカルボキシル末端（すなわち、Ｃ末端）から開始される。用いられる固体支持体は、本発明の重要な特徴ではない。但し、ペプチド合成手順において利用される薬剤を、実質的に不活性なままにする間に、カルボキシル基に結合し得る。例えば、開始物質は、クロロメチレート化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に対するベンジルエステル連結を介して、あるいはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂、もしくはｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂に対するアミド結合を介して、アミノ保護アミノ酸に付着させることによって、調製され得る。固体支持体としての使用に適切な物質は、当業者に周知であり、そして以下を含むが、それらに限定されない：ハロメチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂）；ヒドロキシメチル樹脂；フェノール樹脂（例えば、４−（α−［２，４−ジメトキシフェニル］−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂；ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジデート化樹脂、など）。このような樹脂は、市販されており、そしてそれらの調製の方法は、当業者に公知である。
【００４１】
本発明のペプチドの酸性形態は、固相ペプチド合成手順によって、固体支持体としてベンジルエステル樹脂を使用して調製され得る。対応するアミドは、固体支持体として、ベンズヒドリルアミン樹脂またはメチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用することによって生成され得る。当業者は、ＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ樹脂を使用した場合、固体支持体からペプチドを切断するための無水フッ化水素酸での処理が、末端アミド基を有するポリペプチドを生成することを認識する。
【００４２】
合成に使用した各アミノ酸のα−アミノ基は、カップリング反応の間に保護されて、反応性α−アミノ官能基に関与する副反応が防止されるべきである。特定のアミノ酸もまた、反応性側鎖官能基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシルなど）を含み、これはまた、適切な保護基で保護されて、ポリペプチド合成の間に化学反応をこれらの部位にて生じることから防止するべきである。保護基は、当業者に周知である。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３巻：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８１））（この教示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００４３】
適切に選択されたα−アミノ保護基は、カップリング反応の間にα−アミノ官能基を不活性にし、側鎖保護基が除去されない条件下でのカップリング後に容易に除去され、ペプチドフラグメントの構造を変更せず、そしてカップリングの直前に、活性化の際のラセミ化を防止する。同様に、側鎖保護基は、合成の間に側鎖官能基を不活性にするように選択されなければならず、使用される条件下で安定化してα−アミノ保護基を除去しなければならず、そしてポリペプチドの構造を変更しない条件下でのポリペプチド合成の完了後に除去されなければならない。
【００４４】
α−アミノ基についての保護基の例示的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：芳香族ウレタン型基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンズオキシ（Ｃｂｚ）、および置換型ベンジルオキシカルボニル（ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｏ−クロルベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニル、などを含む）；脂肪族ウレタン型基、例えば、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（ｐ−ビフェニルイル）−イソプロピルオキシカルボニル。アリルオキシカルボニル、など；ならびにシクロアルキルウレタン型基、例えば、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロへキシルオキシカルボニル、シクロヘプチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル（Ａｄｏｃ）、など。現在好ましい実施形態において、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が、使用されるα−アミノ保護基である。
【００４５】
リジン（Ｌｙｓ）に存在する側鎖アミノ基について、α−アミノ基の保護についての上記の保護基のいずれかが適切である。さらに、他の適切な保護基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジル−オキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロへキシルオキシカルボニル、シクロヘプチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−トルエンスルホニル、など。現在好ましい実施形態において、Ｌｙｓについての側鎖アミノ保護基は、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）である。
【００４６】
アルギニン（Ａｒｇ）のグアニジノ基の保護について、適切な保護基の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ニトロ、トシル（Ｔｏｓ）、カルボベンゾキン（Ｃｂｚ）、アダマンチルオキシカルボニル（Ａｄｏｃ）、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）および２，２，５，７，８−ペンタメチルクロロマン−６−スルホニル（ＰＭＣ）。現在好ましい実施形態において、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニルおよび２，２，５，７，８−ペンタメチルクロロマン−６−スルホニルが、Ａｒｇについて使用される保護基である。
【００４７】
セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）またはチロシン（Ｔｙｒ）の側鎖におけるヒドロキシル基は、例えば、メチル、エチルおよびｔ−ブチルのようなＣ1−Ｃ4アルキルによって、または例えば、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｏ−クロロベンジルおよび２，６−ジクロロベンジルのような置換ベンジルによって保護され得る。Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒについての好ましい脂肪族ヒドロキシル保護基は、ｔ−ブチルである。
【００４８】
アスパラギン酸（Ａｓｐ）のカルボキシル基は、例えば、ベンジル、ｔ−ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなどのような基を使用して、エステル化によって保護され得る。Ａｓｐについて、ｔ−ブチルが、現在好ましい保護基である。ヒスチジン（Ｈｉｓ）における塩基性イミダゾール環は、例えば、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｏｍ）、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）およびフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）によって保護され得る。好ましい実施形態において、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｏｍ）が、使用される保護基である。
【００４９】
アミノ酸のカップリングは、当業者に公知に種々の化学によって達成され得る。代表的なアプローチは、カルボキシル基にペプチドフラグメントの遊離Ｎ−末端アミノ基との反応に対するさらなる感受性を付与する誘導体へのアミノ酸の変換、あるいは例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）のような適切なカップリング剤の使用のいずれかを含む。頻繁には、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）が、これらのカップリング反応における触媒として使用される。適切な合成化学は、以下に開示される：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８１））；およびＩｚｕｍｉｙａら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｍａｒｕｚｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，（１９７５））（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）。
【００５０】
一般には、ＶＩＰポリペプチドの合成は、まずＣ−末端アミノ酸（これは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような保護基によってＮ−αアミノ位で保護される）を、固体支持体にカップリングすることによって開始される。Ｆｍｏｃ−Ａｓｎのカップリングの前に、Ｆｍｏｃ残基は、ポリマーから除去されなければならない。Ｆｍｏｃ−Ａｓｎは、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を使用して、約２６μＣにて約２時間攪拌しながら、４−（α−［２，４−ジメトキシフェニル］−Ｆｍｏｃ−アミノ−メチル）フェノキシ樹脂にカップリングされ得る。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の樹脂支持体へのカップリングの後、α−アミノ保護基は、室温にてＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して除去される。
【００５１】
α−アミノ保護基の除去の後、残りのＦｍｏｃ保護アミノ酸は、所望の順序で段階的にカップリングされる。適切に保護されたアミノ酸は、多数の供給業者から市販されている（例えば、Ｎｏｖａ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＢａｃｈｅｍ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））。各々の保護アミノ酸またはアミノ酸配列は、過剰で、固相リアクターに導入され、そしてそのカプリングは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）、またはそれらの混合物の媒体中で行われる。カップリングが不完全な場合、そのカップリング反応は、Ｎ−α−アミノ基の脱保護および次のアミノ酸の付加の前に反復され得る。カップリング効率は、当業者に周知の多数の手段によってモニターされ得る。カップリング効率をモニターする好ましい方法は、ニンヒドリン反応による。ポリペプチド合成反応は、多数の市販のペプチド合成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９５００、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ  Ｒａｐｈａｅｌ，ＣＡ）を使用して、自動的に行われる。
【００５２】
このペプチドは、切断され得、そして保護基は、無水液体フッ化水素（ＨＦ）中で不溶性キャリアまたは固体支持体を、アニソールおよびジメチルスルフィドの存在下で、約０℃にて、約２０〜９０分間、好ましくは６０分間攪拌することによって；トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で樹脂の１ｍｇ／ｍＬ懸濁物を連続的に通して６０〜３６０分間ほぼ室温（選択される保護基に依存する）にて臭化水素（ＨＢｒ）を通気することによって；あるいは固相合成に使用される反応カラムの内側の固体支持体を、９０％トリフルオロ酢酸、５％水および５％トリエチルシランとともに約３０〜６０分間インキュベートすることによって、除去され得る。当業者に周知の他の脱保護方法もまた使用され得る。
【００５３】
本発明のポリペプチド（すなわち、ＶＩＰアンタゴニスト）は、単離され、そして反応混合物から、当業者に周知のペプチド精製の手段によって精製され得る。例えば、このポリペプチドは、逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透、イオン交換、サイズ排除、アフィニティー、分配、または向流分布のような公知のクロマトグラフィー手順を使用して精製され得る。
【００５４】
（Ｂ．化学療法剤）
本発明の薬学的組成物はまた、化学療法剤を含む。適切な化学療法剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイド、およびジフルオロヌクレオシド。
【００５５】
本発明の１つの実施形態において、化学療法剤は、白金配位化合物である。用語「白金配位化合物」とは、イオンの形態で白金を提供する、任意の腫瘍細胞増殖阻害白金配位化合物をいう。好ましい白金配位化合物としては、以下が芽得られるがこれらに限定されない：シス−ジアンミンジアクオ白金（ＩＩ）イオン；クロロ（ジメチレントリアミン）−白金（ＩＩ）クロリド；ジクロロ（エチレンジアミン）−白金（ＩＩ）；ジアミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラート）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）；スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）；イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）；ジアンミン（２−エチルマロナート）−白金（ＩＩ）；エチレンジアンミンマロナート白金（ＩＩ）；アクア（１，２−ジアミノシクロヘキサン（ｄｉａｍｉｎｏｄｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）−スルフェート白金（ＩＩ）；（１，２−ジアミノシクロヘキサン）マロナート白金（ＩＩ）；（４−カルボキシフタラート）（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）；（１，２−ジアミノシクロヘキサン）−イソシトラート）白金（ＩＩ）；（１，２−ジアミノシクロヘキサン）シス（ピルベート）白金（ＩＩ）；（１，２−ジアミノシクロヘキサン）オキサラート白金（ＩＩ）；オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；およびテトラプラチン（ｔｅｔｒａｐｌａｔｉｎ）。
【００５６】
特定の実施形態において、シスプラチンが、本発明の組成物および方法において使用される、現在好ましい白金配位化合物である。シスプラチンは、ＰＬＡＴＩＮＯＬTMの名前で、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されており、そして水、滅菌生理食塩水、または他の適切なビヒクルを用いる構築のための粉末として利用可能である。本発明における使用に適切な他の白金配位化合物は公知であり、そして市販されており、そして／または従来の技術によって調製され得る。シスプラチン、すなわち、シス−ジクロロジアンミン白金ＩＩは、様々なヒト固形悪性腫瘍の処置において、化学療法剤として、長年にわたって首尾良く使用されてきた。より最近では、他のジアミノ−白金複合体もまた、様々なヒト固形悪性腫瘍の処置における化学療法剤としての有効性を示した。このようなジアミノ−白金複合体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：スピロ白金およびカルボ白金。シスプラチンおよび他のジアミノ−白金複合体は、ヒトにおいて化学療法剤として広範に使用されているが、それらは、腎臓損傷のような毒性問題をもたらし得る高投薬量レベルで送達されなければならなかった。
【００５７】
有利なことには、シスプラチンが本発明のＶＩＰアンタゴニストと組み合わせて使用される場合、得られる結果は、相乗的である。換言すれば、ＶＩＰアンタゴニストおよび白金配位化合物の併用療法の有効性は、相乗的である。すなわち、この有効性はいずれかの成分単独の等価な濃度よりも高い。それゆえ、白金配位化合物の投薬量は減少され得、従って、毒性問題および他の副作用の危険性は、同時に減少される。
【００５８】
別の局面において、本発明の化学療法剤は、トポイソメラーゼインヒビターである。トポイソメラーゼは、真核生物細胞におけるＤＮＡトポロジーを変更し得る酵素である。それらは、細胞機能および細胞増殖について重要である。一般には、真核生物細胞において２つのクラスのトポイソメラーゼ（Ｉ型およびＩＩ型）が存在する。トポイソメラーゼＩは、約１００，０００分子量のモノマー酵素である。この酵素はＤＮＡに結合し、そして一過性の一本鎖の切断を導入し、二重ヘリックスを巻き戻し（または巻き戻すことを可能にし）、そして続いて、ＤＮＡ鎖から解離する前にその切断を再び接着（ｒｅｓｅａｌ）する。様々なトポイソメラーゼインヒビターは、近年、卵巣癌、食道癌、または非小細胞肺癌腫に罹患したヒトの処置において臨床的な効力を示した。
【００５９】
本発明の１つの特に好ましいトポイソメラーゼインヒビターは、カンプトセシンおよびカンプトセシンアナログである。カンプトセシンは、中国原産のＣａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｃｕｍｉｎａｔａ樹およびインド原産のＮｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ  ｆｏｅｔｉｄａ樹によって産生される、水不溶性の細胞傷害性アルカロイドである。カンプトセシンは、多数の腫瘍細胞に対して腫瘍細胞増殖阻害活性を示す。カンプトセシンアナログのクラスの化合物は、代表的には、ＤＮＡトポイソメラーゼＩの特異的インヒビターである。用語「トポイソメラーゼのインヒビター」によって、カンプトセシンに構造的に関連する任意の腫瘍細胞増殖阻害化合物が意味される。カンプトセシンアナログのクラスの化合物としては、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカンおよび９−アミノ−カンプトセシンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
前述のトポイソメラーゼインヒビターに加え、このような化合物としては、以下に特許請求または記載される、任意の腫瘍細胞増殖阻害カンプトセシンアナログ（特に、ＣＰＴ−１１と呼ばれる化合物）が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第５，００４，７５８号（１９９１年４月２日発行）および欧州特許出願番号８８３１１３６６．４（公開番号ＥＰ  ０  ３２１  １２２として１９８９年６月２１に公開）；米国特許第４，６０４，４６３号（１９８６年８月５日発行）および欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０  １３７  １４５（１９８５年４月１７日公開）；米国特許第４，４７３，６９２号（１９８４年９月２５日発行）および欧州特許出願公開番号０  ０７４  ２５６（１９８３年３月１６日公開）；米国特許第４，５４５，８８０号（１９８５年１０月８日発行）および欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０  ０７４  ２５６（１９８３年３月１６日公開）；欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ０８８  ６４２（１９８３年９月１４日公開）；Ｗａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９，２３５８−２３６３（１９８６）；Ｎｉｔｔａら、Ｐｒｏｃ．１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｋｙｏｔｏ，１９８５，Ｔｏｋｙｏ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １、２８〜３０頁。ＣＰＴ−１１は、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトセシンのＣ−１０でカルバメート連結を介して結合される、４−（ピペリジノ）−ピペリジン側鎖を有するカンプトセシンアナログである。ＣＰｔ−１１は、現在ヒト臨床試験を受けており、そしてまたイリノテカンとも称される；Ｗａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３，５５４（１９８０）；Ｗａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０，１７７４（１９８７）；米国特許第４，３４２，７７６号（１９８２年８月３日発行）；米国特許出願番号５８１，９１６（１９９０年９月１３日出願）および欧州特許出願公開番号ＥＰ  ４１８  ０９９（１９９１年３月２０日公開）；米国特許第４，５１３，１３８号（１９８５年４月２３日発行）および欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０  ０７４  ７７０（１９３年３月２３日公開）；米国特許第４，３９９，２７６号（１９８３年８月１６日発行）および欧州特許出願公開番号０  ０５６  ６９２（１９８２年７月２８日公開）；これら各々の全体の開示は、参考して本明細書によって援用される。カンプトセシンアナログクラスの上記に列挙された化合物の全ては、市販されているか、そして／または上記に列挙された文献に記載の技術を含む、従来技術によって調製され得る。好ましくは、トポイソメラーゼインヒビターは、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカンおよび９−アミノカンプトセシンからなる群より選択される。好ましくは、本発明のトポイソメラーゼインヒビターは、イリノテカンである。
【００６１】
有利には、トポイソメラーゼインヒビターが、本発明のＶＩＰアンタゴニストと組み合わせて使用される場合、得られた結果は、相乗的である。つまり、ＶＩＰアンタゴニストとトポイソメラーゼインヒビターの併用療法の効果は、相乗的であり、すなわち、この効果は、等価濃度のいずれかの成分単独よりも大きい。従って、トポイソメラーゼインヒビターの投薬量は減少され得、従って、毒性の問題および他の副作用の危険性が、同時に減少される。
【００６２】
カンプトセシンアナログクラスの多くの化合物の調製物（その薬学的に受容可能な塩、水和物および溶媒和物を含む）、ならびにこのようなカンプトセシンアナログクラスの化合物および不活性な薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、経口および非経口の薬学的組成物の調製物は、米国特許第５，００４，７５８号（１９９１年４月２日公開）および欧州特許出願番号８８３１１３６６．４（公開番号ＥＰ  ０  ３２１  １２２として１９８９年６月２１に公開）（これらの教示は、参考として本明細書中に援用される）に広範に記載される。
【００６３】
本発明のさらになお別の実施形態において、化学療法剤は、抗生物質化合物である。適切な抗生物質としては、ドキソルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシンおよびストレプトゾシンが挙げられるが、これらに限定されない。抗生物質ドキソルビシンは、本発明の好ましい実施形態において使用される抗生物質である。
【００６４】
有利には、抗生物質が、本発明のＶＩＰアンタゴニストと組み合わせて使用される場合、得られた結果は、相乗的である。つまり、ＶＩＰアンタゴニストと抗生物質化合物の併用療法の効果は、相乗的であり、すなわち、この効果は、等価濃度のいずれかの成分単独よりも大きい。従って、抗生物質化合物の投薬量は減少され得、従って、毒性の問題および他の副作用の危険性が、同時に減少される。
【００６５】
別の実施形態において、化学療法剤は、抗有糸分裂性アルカロイドである。一般に、抗有糸分裂性アルカロイドは、Ｃａｎｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓから抽出され得、そして抗癌化学療法剤として効果的であることが示されている。多くの半合成誘導体が、化学的および薬理学的の両方で研究されている（Ｏ．Ｖａｎ  Ｔｅｌｌｉｎｇｅｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，１２，１６９９−１７１６（１９９２）を参照のこと）。本発明の抗有糸分裂性アルカロイドとしては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールおよびビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。後者の２つの抗有糸分裂性アルカロイドは、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、およびＰｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、それぞれ市販されている（米国特許第５，６２０，９８５号（１９９７年４月１５日発行）を参照のこと）。本発明の好ましい局面において、抗有糸分裂性アルカロイドは、ビノレルビンである。
【００６６】
有利には、抗有糸分裂性アルカロイドが、本発明のＶＩＰアンタゴニストと組み合わせて使用される場合、得られた結果は、相乗的である。つまり、ＶＩＰアンタゴニストと抗有糸分裂性アルカロイド化合物の併用療法の効果は、相乗的であり、すなわち、この効果は、等価濃度のいずれかの成分単独よりも大きい。従って、抗有糸分裂性アルカロイドの投薬量は減少され得、従って、毒性の問題および他の副作用の危険性が、同時に減少される。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、化学療法剤は、ジフルオロヌクレオシドである。２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロヌクレオシドは、抗ウイルス活性を有するとして当該分野で公知である。このような化合物は、米国特許第４，５２６，９８８号および同第４，８０８６１４号に開示および教示される。欧州特許出願公開１８４，３６５は、これらの同じジフルオロヌクレオシドが、腫瘍崩壊活性を有することを開示する。好ましくは、本発明の組成物および方法において使用される２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロヌクレオシドは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン塩酸塩（ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ）塩酸塩としてもまた公知である）である。ゲンシタビンは、市販されているか、または米国特許第４，５２６，９８８号、同第４，８０８，６１４号および同第５，２２３，６０８号（これらの教示は、参考として本明細書中に援用される）において開示および教示されるような、多工程プロセスで合成され得る。
【００６８】
有利には、ジフルオロヌクレオシドが、本発明のＶＩＰアンタゴニストと組み合わせて使用される場合、得られた結果は、相乗的である。つまり、ＶＩＰアンタゴニストとジフルオロヌクレオシド化合物の併用療法の効果は、相乗的であり、すなわち、この効果は、等価濃度のいずれかの成分単独よりも大きい。従って、ジフルオロヌクレオシドの投薬量は減少され得、従って、毒性の問題および他の副作用の危険性が、同時に減少される。
【００６９】
（ＩＩ．使用、投薬およびスケジュール）
本発明の組成物は、広範な種々の癌および癌性腫瘍の処置に有用である。好ましい実施形態において、癌性組織および癌性腫瘍は、ＶＩＰレセプターを含む。このような癌としては、例として、例えば、咽頭癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮癌および膀胱癌、白血病、リンパ腫、神経膠腫、神経膠芽細胞、網膜芽腫、および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
このように、別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：腫瘍細胞を化学療法剤および血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストの組み合わせの有効量を接触させる工程であって、このＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【００７１】
【化１３】
2003530297.tif 000014
を含み、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は、上記に定義されているが、ただし、このＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【００７２】
【化１４】
2003530297.tif 000015
を有さない、工程。
【００７３】
本明細書中で説明されるように、適切な化学療法剤としては、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイドおよびジフルオロヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体における腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：被験体に化学療法剤および血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）アンタゴニストの組み合わせの有効量を投与する工程であって、このＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【００７５】
【化１５】
2003530297.tif 000016
を含み、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1およびＸ2は、上記に定義されているが、ただし、このＶＩＰアンタゴニストは、以下のアミノ酸配列：
【００７６】
【化１６】
2003530297.tif 000017
を有さない、工程。
【００７７】
この局面において、適切な化学療法剤としては、白金配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイドおよびジフルオロヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物被験体としては、ヒト、実験動物、家庭用ペットおよび家畜動物が挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、ＶＩＰアンタゴニストの、化学療法剤との組み合わせの投与を包含し、ここで、この２つの成分は、ＶＩＰアンタゴニストが最初に投与され、その後化学療法剤が投与される併用療法、ならびに化学療法剤が最初に送達され、その後ＶＩＰアンタゴニストが送達される併用療法において、同時様式で送達され得る。
【００７８】
上記の方法に従って、腫瘍細胞としては、肺、結腸、乳房、卵巣、前立腺および肝臓の腫瘍細胞および扁平上皮細胞癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、腫瘍細胞は、哺乳動物被験体に存在する。さらに好ましい実施形態において、上記方法は、さらに、腫瘍細胞の増殖の減少について観察する工程を包含する。
【００７９】
本発明の方法における使用に適切な組成物は、インビトロおよびインビボでのスクリーニングアッセイを使用して、容易に同定され得る。このようなアッセイは、特定の組成物が、インビトロまたはインビボにおいて、悪性腫瘍細胞の増殖を阻害するか、または悪性細胞の腫瘍形成を消失させる能力についてスクリーニングし得る。例えば、腫瘍細胞株は、可変濃度の目的の組成物に曝露され得、そしてこの細胞の生存度を、アラマー（ａｌａｍｅｒ）Ｂｌｕｅ（登録商標）（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販される）アッセイを使用して、設定された時点で測定し得る。アラマーＢｌｕｅ色素を培養培地に添加する場合、この色素は、実質的に増強された蛍光を有する可溶性産物を生じる、細胞性ミトコンドリア酵素によって還元される。この蛍光は、蛍光定量計で測定され得、これによって、シグナルは、細胞数に直接的に比例する。この情報を使用して、目的の組成物に対するＩＣ50（コントロール培養物と比較して、５０％の細胞培養物に致死的な組成物濃度）値は、容易に計算され得る。一般的に、本発明の方法において有用な組成物は、このアッセイで測定した場合、約０．１〜２０μＭの範囲のＩＣ50を示す。
【００８０】
当業者に理解されるように、多くの種々の悪性腫瘍細胞培養物および細胞株が、以下を含むが、これらに限定されない活性についてスクリーニングするために使用され得る：ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１（乳房）、ＭＣＦ−７（乳房）、ＭＤＡ  ＭＢ  ４６８（乳房）、Ｓｉｈａ（扁平上皮細胞癌腫）、Ａ５４９（非小細胞肺）、ＨＬ−６０（白血病）、Ｏｖｃａｒ−３（卵巣）など。もちろん、当業者に公知であり、そして使用される、抗腫瘍活性および／または抗癌活性についてスクリーニングするための、他のインビトロアッセイおよび／またはインビボアッセイもまた、本発明の方法において有用な効果的な化合物を同定するために使用され得る。
【００８１】
多様な範囲の腫瘍の処置が、本発明の組成物を使用して得られ得る。さらに、本発明の組成物および方法は、標準のＮＩＨ推奨モデルに対して試験され得る。例えば、Ｄｉｓｃｏｌｌ、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，６８：６３−７６（１９８４）を参照のこと。ヒト新生物に対する有用性を同定するためのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに提供される薬物スクリーニング評価において慣用的に使用される、さらなるインビボおよびインビトロモデルは、本発明の有用性を確証するために使用され得る（Ｍ．Ｂｏｙｄ，Ｔｈｅ  ＮＣＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｃｒｅｅｎ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ」（Ｂ．Ｔｅｉｃｈｅｒ編、１９９５、Ｈｕｍｍｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔａｗａ，Ｎ．Ｊ．）を参照のこと）。さらに、本発明の組成物は、６０のヒト腫瘍細胞株のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのパネルにおいてスクリーニングされ得る。
【００８２】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬物送達系における使用に適切である。本発明における使用のために適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５））（これは、参考として本明細書中に援用される）において見出される。さらに、薬物送達のための方法の簡単な総説について、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２９−１５３３（１９９０）（これは、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、非経口投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与または局所（ｌｏｃａｌ）投与が意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、皮内、または節内）投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは水性キャリア）中に溶解または懸濁された、ＶＩＰアンタゴニストの溶液および上述のような化学療法剤を含有する、非経口投与のための組成物を提供する。様々な水性キャリアが使用され得、例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが挙げられる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得るか、またはこれらは滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得、この凍結乾燥した調製物は、投与の前に滅菌溶液と組み合わせられる。この組成物は、生理学的条件に近似させることが要求される場合に、薬学的に受容可能な補助的物質を含有し得、これには、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤などが挙げられ、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどである。
【００８４】
固体組成物については、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、これには、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与については、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、通常利用される任意の賦形剤（上に列挙したキャリアなど）を、一般に活性成分の１０〜９５％、より好ましくは２５％〜７５％の濃度で組み込むことにより、形成される。
【００８５】
エアロゾル投与については、ＶＩＰアンタゴニストおよび化学療法剤は、好ましくは、細分した形態で、界面活性剤および噴霧剤と共に供給される。この界面活性剤は、もちろん、非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶である。このような薬剤の代表例は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸およびオレイン酸）と、脂肪族多価アルコールもしくはその環状無水物との、エステルまたは部分エステルである。混合グリセリドまたは天然グリセリドなどの混合エステルが、利用され得る。キャリアもまた、所望ならば、鼻孔内送達のためのレシチンなどと共に含有され得る。
【００８６】
治療応用においては、本発明のＶＩＰアンタゴニストおよび化学療法剤は、腫瘍増殖を阻害するに十分な併用量で、患者に投与される。これを達成するに十分な量を、「治療的に有効な併用用量」と定義する。この方法は、ＶＩＰアンタゴニストと化学療法剤との組み合わせを投与する工程を包含し、ここでこれら２つの成分は、同時の様式で送達され、ＶＩＰアンタゴニストが先に投与され続いて化学療法剤が投与される併用療法において送達され、ならびに化学療法剤が先に送達され続いてＶＩＰアンタゴニストが送達される様式で併用療法において送達される。
【００８７】
この使用のために有効な併用量は、例えば、特定の化学療法剤、利用されるＶＩＰアンタゴニスト、阻害もしくは拮抗されるべきＶＩＰ関連活性（例えば、腫瘍増殖）、投与の様式、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。例えば、腫瘍増殖（例えば、ＮＳＬＣまたは神経芽腫）の阻害のためには、固形腫瘍に直接注射される、１００ｇ腫瘍あたり０．３５μｇ〜３．５μｇの範囲内に入る量のＶＩＰアンタゴニストが、治療的に有効な併用量である。化学療法剤の量は、その化学等級（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌａｓｓ）に部分的に依存する。固形腫瘍に直接注射される、１００ｇ腫瘍あたり０．０１μｇ〜１ｇの範囲が、治療的に有効な併用量である。
【００８８】
用語「腫瘍細胞の増殖を阻害する」とは、本明細書中で使用する場合、本発明の方法（すなわち、有効量のＶＩＰアンタゴニストと化学療法剤との組み合わせの、その腫瘍細胞に苦しむヒトへの投与を包含する治療）に感受性の腫瘍細胞の増殖の阻害である。好ましくは、このような処置はまた、腫瘍増殖の後退（すなわち、測定可能な腫瘍の大きさの減少）をもたらす。最も好ましくは、このような処置は、腫瘍の完全な後退をもたらす。用語「投与する」または「投与される」は、本明細書中で使用する場合、非経口および／または経口投与を意味する。「非経口」は、静脈内、皮下および筋内投与を意味する。本発明の方法において、ＶＩＰアンタゴニストは、化学療法剤と同時に投与され得るか、またはＶＩＰアンタゴニストは、いずれかの順序で連続して投与され得る。
【００８９】
実際に好ましい投与の方法および順序が、とりわけ、利用されるＶＩＰアンタゴニストの特定の処方、利用される化学療法剤（シスプラチンなど）の特定の処方、処置される特定の腫瘍細胞、および処置される特定の宿主によって変動することが、理解される。所与のセットの条件のための併用療法の、最適な方法および順序は、従来の技術を使用し、そして本明細書中に記載の情報を考慮して、当業者により突き止められ得る。
【００９０】
例えば、実際に好ましい治療経過は、とりわけ、ＶＩＰアンタゴニストの投与の様式、利用される化学療法剤の特定の処方、化合物の投与の様式、処置される特定の腫瘍細胞および処置される特定の宿主によって変動することが、理解される。所与のセットの条件のための治療の最適な経過は、従来の治療決定試験の経過を使用し、そして本明細書中に記載の情報を考慮して、当業者により突き止められ得る。
【００９１】
本発明を、特定の実施例によってさらに詳細に記載する。以下の実施例は、例示の目的のために提供され、本発明をいかなる様式でも限定することを意図されない。
【００９２】
（ＩＩＩ．実施例）
（実施例１）
この実施例は、ＶＩＰアンタゴニストが様々な化学療法剤の抗増殖活性を増大させ得たことを示す。
【００９３】
結腸癌および前立腺癌由来の細胞株を用いて、アッセイを実施した。増殖を、生存細胞についてのミトコンドリア機能のＭＴＳ比色アッセイを使用して、評価した。ＶＩＰアンタゴニスト（ステアリル−Ｎｌｅ  １７−ニューロテンシス（ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｓ）６−１１  ＶＩＰ  ７−２８）を使用した。この実施例は、親油性アンタゴニストが、様々な化学療法剤（すなわち、ドキソルビシン；ビノレルビン；ゲムシタビン；イリノテカン；およびシスプラチン）の抗増殖活性を増大させ得たことを示す。
【００９４】
効果は、ドキソルビシン；ビノレルビン；イリノテカンおよびシスプラチンに関して、相乗的であった。非小細胞肺癌株（ｎｏｎｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｌｉｎｅ）の、１５〜２０％増殖阻害を提供した２ｍＭのアンタゴニストは、試験した大部分の化学療法剤について、ＩＣ50を２〜４倍減少させた。より高いアンタゴニスト濃度がさらにより効力があり、相乗効果を維持した。進行した固形腫瘍（非小細胞肺癌、結腸癌または前立腺癌など）の化学療法による処置は、有意な毒性を有して１０〜３０％の間の応答率を達成する。親油性ＶＩＰアンタゴニストと好ましい化学療法剤との組み合わせは、応答率を大いに増大させ得る。用量の減少を可能にすることによって、副作用もまた減少される。
【００９５】
（実施例２）
この実施例は、ＳＮＶＩＰｈｙｂの、癌の阻害における効果を示す。
【００９６】
ＳＮＶＩＰｈｙｂが癌増殖を阻害する能力を、研究した。ＭＴＴアッセイを使用すると、１０μＭのＳＮＶＩＰｈｙｂは、ＭＣＦ−７乳癌増殖に対してほとんど影響を有さなかった。次いで、ＳＮＶＩＰｈｙｂの影響を、タキソール（これは微小管に影響する）の存在下で研究し、これは、分裂細胞の増殖の有糸分裂（Ｍ）期の停止を引き起こした。タキソールは、１μｇ／ｍＬにおいてはＭＣＦ−７細胞に対してほとんど影響を有さず、そして１２μｇ／ｍＬにおいては増殖の最大値の半分を阻害した（ＩＣ50）。３μＭのＳＮＶＩＰｈｙｂの存在下では、タキソールの用量応答曲線は左に移動し、そしてＩＣ50は２μｇ／ｍＬであった。これらの結果は、ＳＮＶＩＰｈｙｂがＭＣＦ−７乳癌細胞株を使用してタキソールの細胞傷害性を増加させることを示す。同様の結果が、ドキソルビシンを使用して得られた。
【００９７】
ＳＮＶＩＰｈｙｂの効果を、他の上皮癌細胞株において研究した。表２は、タキソールに対するＩＣ50値が、肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１５７およびＮＣＩ−Ｈ１２９９）、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）、膵臓癌細胞株（ＣＡＰＡＮ）および前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）において、８〜１５μｇ／ｍＬであったことを示す。１０μＭのＳＮＶＩＰｈｙｂの存在下においては、ＩＣ50値は、２．５〜５μｇ／ｍＬに減少した。従って、タキソールの効力は、ＳＮＶＩＰｈｙｂの存在下で、上皮癌細胞において、３〜６倍増加した。ＳＮＶＩＰｈｙｂは、Ｇ１〜Ｓ期において増殖を阻害し得、一方でタキソールはＭ期において増殖を阻害する。従って、ＳＮＶＩＰｈｙｂおよびタキソールは、癌細胞増殖の阻害において相乗的である。その結果として、ＳＮＶＩＰｈｙｂの存在下では、より少ないタキソールが、癌細胞を殺傷するために必要とされる。図１は、様々な濃度のタキソールおよびＳＮＶＩＰｈｙｂの併用療法を使用した、ＭＣＦ−７細胞における用量応答曲線を示す。
【００９８】
【表２】
2003530297.tif 000018
８回の決定の平均のＩＣ50値（μｇ／ｍＬ）を示す。
【００９９】
（実施例３）
この実施例は、神経膠芽腫細胞株に対するＶＩＰレセプターアンタゴニストの効果を示す。
【０１００】
膠芽腫細胞株に対するＶＩＰレセプターアンタゴニストの効果を研究した。ニューロテンシス6-11ＶＩＰ7-28（ＶＩＰハイブリッド）、（Ｎ−ステアリル−ノルロイシン17）ＶＩＰハイブリッド（ＳＮＶＩＰハイブリッド）およびＰＴＣ４４９５は、Ｕ−８７細胞に対する125Ｉ−ＶＩＰの結合を、それぞれ７０，５００ｎＭおよび７０００ｎＭのＩＣ50値で阻害した。分子生物学技術を使用して、ＶＩＰ1レセプターｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロットにより、膠芽腫細胞において検出した。（ＳＮ）ＶＩＰハイブリッド（１μＭ）は、基礎ｃＡＭＰに対して影響を有さなかったが、１０ｎＭのＶＩＰにより引き起こされるｃＡＭＰの増加を強力に阻害し、そしてペプチド効力の順序は、（ＳＮ）ＶＩＰハイブリッド＞ＶＩＰハイブリッド＞ＰＴＣ４４９５であった。（ＳＮ）ＶＩＰハイブリッドは、軟寒天を使用するインビトロでのＵ−８７コロニー形成の阻害において、ＶＩＰハイブリッドより効力があった。ＭＴＴアッセイを使用すると、１μＭの（ＳＮ）ＶＩＰハイブリッドは、基礎増殖に対してはほとんど影響を有さなかったが、タキソールと相乗的に相互作用して、増殖を阻害した。これらのデータは、ＶＩＰレセプターアンタゴニストが化学療法剤の効力を増大させて、膠芽腫の増殖を阻害し得ることを示す。
【０１０１】
（実施例４）
この実施例は、効力のある親油性ＶＩＰアンタゴニスト、ステアリル−ｎｌｅ−ＶＩＰ−ハイブリッド（ＳＮＨ）および化学療法の間のインビトロでの相互作用を示す。
【０１０２】
（材料および方法）
Ａ．細胞株
ＮＣＩ−Ｈ７２７  非小細胞肺癌（カルチノイド）
ＬＮＣａＰ  前立腺癌
ＨＴ−２９  ヒト結腸癌
ＣＴ−２６  マウス結腸癌。
【０１０３】
ＮＣＩ−Ｈ７２７およびＬＮＣａＰを、１０％熱不活性化ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質で補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で増殖した。ＨＴ−２９およびＣＴ−２６を、１０％熱不活性化ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質で補充したＤＭＥＭ培地中で増殖した。これらの細胞を、５％ＣＯ2／９５％空気中３７μＣで培養し、それらの対数増殖期の間を使用した。慣用的に、接着性の細胞は、サブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）単層が形成すると、分離された。異なる実験において、様々な濃度のＦＣＳを使用した。
【０１０４】
Ｂ．薬物
タキソール（Ｍｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、イリノテカン−ＣＰＴ11（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）、ドキソルビシン（Ｆａｒｍｉｔａｌｉａ）、ゲムシタビン（Ｌｉｌｌｙ）、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ−Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）、シスプラチン（Ａｂｉｃ−Ｉｓｒａｅｌ）および５−フルオロウラシル（Ａｂｉｃ−Ｉｓｒａｅｌ）を、最初に製造業者の指示に従って溶解し、そしてさらにＰＢＳで希釈した。
【０１０５】
Ｃ．ペプチド
親油性ＶＩＰアンタゴニスト：  ＳＮＨを、以前に記載されたように合成した（ＧｏｚｅｓおよびＦｒｉｄｋｉｎ、１９９２）。このアンタゴニストを、最初にＤＭＳＯに溶解し、そしてさらにＰＢＳで希釈した。培養物に添加したＤＭＳＯの最大量は０．０２％であり、癌細胞の増殖に対して影響を有さなかった。
【０１０６】
ＶＩＰ：  Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＡｓｎＮＨ2。
【０１０７】
ＳＮＨ：  ステアリル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＡｓｎＮＨ2。
【０１０８】
（Ｄ．インビトロ細胞傷害性）
増殖阻害実験のために、サブコンフルエントの接着細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてトリプシン／ベルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）で処理した。細胞をペレット化し、そして培地中に、ＮＣＩ−Ｈ７２７について７５，０００細胞／ｍＬ、ＬＮＣａＰおよびＨＴ−２９について５０，０００細胞／ｍＬ、およびＣＴ−２６について２５０００細胞／ｍＬ最終濃度に再懸濁した。実験の最後においてウェル中でのコンフルエンスを避け、そして細胞株の異なる倍加時間に対応するためにこれらの異なる濃度を使用した。
【０１０９】
０日目に、９６ウェル組織培養プレート（Ｎｕｎｃｉｏｎ，Ｎｕｎｃ  Ｂｒａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の個々のウェルにマルチチャンネルピペットを使用して細胞懸濁物（１００ｍＬ）を分配した。各プレートは、培地のみを含むブランクカラムおよびコントロールカラムを有した。細胞を、処理前に、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ2の加湿した大気中で２４時間インキュベートした。１日目に、細胞を、異なる薬物およびスケジュールで処理し、そして同じ条件下で維持した。
【０１１０】
４日目に、生存細胞数を、改変ＭＴＴアッセイ（すなわち、ＭＴＳ非放射活性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって決定した。手短には、２５ｍＬの新鮮に調製したＭＴＳ／ＰＭＳ溶液を各個々のウェルに添加し、そして１〜３時間のインキュベーションの後（最適な時間は各細胞株について決定した）、４９０ｎｍにおける吸光度を、マルチスキャンプレートリーダーを用いて測定した。結果を、最終的に、薬物処理なしのサンプルから得たコントロールのパーセンテージとして表現した。用量応答曲線を、Ｓｉｇｍａ−Ｐｌｏｔソフトウェアを使用してプロットし、そしてスチューデント検定を使用して統計学的に分析した。
【０１１１】
（Ｅ．ＳＮＨによる細胞増殖の阻害）
親油性ＶＩＰアンタゴニストＳＮＨの細胞増殖に対する効果を決定するために、記載したように、９６ウェルマイクロプレート中に２４時間プレーティングした細胞を、種々の濃度のＳＮＨで処理した。ペプチドをＰＢＳ中で希釈し、そして１０ｍＬのペプチド溶液を、ペプチドの最終濃度１０-5〜１０-9Ｍの間で各ウェルに添加した。溶媒をコントロールウェルに添加した。このアッセイにおいて、１０ｍＭのＳＮＨは、癌細胞の増殖を有意に阻害する。用量応答曲線を、２μＭ〜１０μＭの範囲の濃度で得た（図２を参照のこと）。その効果は、ＦＣＳ濃度に依存し、２％より低いＦＣＳの濃度では、ＳＮＨの８〜１０ｍＭ濃度は、癌細胞の完全なまたはほぼ完全な死滅を生じる。同様の結果を、２４時間処理（培地を、ペプチドの添加から２４時間後に交換し、そして細胞を培地のみとさらに４８時間インキュベートした）および７２時間の処理（培地交換なし）のＳＮＨの１用量を用いて得た。８時間処理の効果はわずかに弱かった。このことは、その効果の大部分が、曝露の最初の何時間かにあり、そして時間依存的であるよりはより用量依存的であることを示す。これは、親油性化合物がよりいっそう安定であったとしても、それらはＦＣＳの存在下でなお分解を受け得るという事実によって説明され得る。８μＭ  ＳＮＨでの６時間、続いて６６時間の新鮮培地のインキュベート時間は、生存細胞の４０％の減少を生じた（表３を参照のこと）。これらの結果は、ＳＮＨ効果の大部分が非常に迅速であることを示唆する。
【０１１２】
（Ｆ．ＳＮＨおよび化学療法剤の組み合わせ効果）
ＶＩＰアンタゴニストおよび化学療法剤の組み合わせを用いる実験のために、０日目に、５％  ＦＣＳを補充した培地中で、細胞を２４時間プレーティングした。１日目に、ペプチドをウェルに添加し、続いて１時間後に化学療法剤を添加した。各々の場合において、対応する容量の溶媒をコントロールに添加し、その結果、各プレートは、以下を含むブランクカラムを有した：１）培地のみ、２）細胞を含むが薬物を含まないコントロールカラム、３）ＳＮＨのみで処理した少なくとも三連、４）化学療法剤のみ、および５）ＳＮＨおよび化学療法の組み合わせ。化学療法剤を、７つの濃度にわたって試験した。これは、各個々の薬物の用量応答曲線の可能性を網羅する。２４時間後、培地を交換し、そして細胞をさらに４８時間、同じ条件下でインキュベートした。４日目に、生存細胞の数をＭＴＳアッセイによって決定した。４時間のペプチドへの曝露、続いて４時間の化学療法への曝露からなるより短い処理を使用して、同様の結果を得た。
【０１１３】
図４および図５は、シスプラチン（アルキル化剤）とＳＮＨとの、そしてナベルビン（ｎａｖｅｂｉｎｅ）（抗微生物剤）とＳＮＨとの、それぞれの相乗効果を示す。５μＭのＳＮＨは、シスプラチンのＩＣ50を４倍、そしてナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）のＩＣ50を少なくとも２倍減少させた。ドキソルビシン（抗生物質）の場合には、その効果はより明白ではなく（図６を参照のこと）、そしてゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（代謝拮抗剤、図７を参照のこと）の場合に相加的であるのみであった。ＣＰＴ−１１（イリノテカン、トポイソメラーゼＩインヒビター）の場合において、ＳＮＨ効果は、５μＭ  ＳＮＨと相乗的であり、ＩＣ50を少なくとも２倍減少させた（図８を参照のこと）。タキソールとの組み合わせは、非常に効果的であった（図９を参照のこと）。増強効果もまた、ＣＴ−２６（マウス結腸癌）およびＨＴ−２９（ヒト結腸癌細胞株）を用いて観察された（それぞれ図１０および図１１を参照のこと）。
【０１１４】
異なるスケジュールの処理を使用して、組み合わせの相乗効果を保った。例えば、ＨＴ−２９を用いて、ＳＮＨでの４時間の処理、続いてアンタゴニストでの２４時間の処理もまた、有効であることが示された（図１１を参照のこと）。別の実験において（図３を参照のこと）、８μＭ  ＳＮＨを、２時間のインキュベーションの間、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞に添加し（２４時間の培養時間の後に）、続いて、さらなる４時間のインキュベーションの間、タキソールを添加した（０．００３〜１μｇ／ｍｌ、黒丸）。次いで、薬物を除去し、そして次の６６時間の間、新鮮な培地で置換した。結果は、ＳＮＨ添加がタキソール（抗微生物剤）のＩＣ50を約６倍減少したことを示し、このことは、相乗効果を示した。
【０１１５】
（実施例５）
この実施例は、ＮＣＩ−Ｈ７２７中でのＶＰＡＣ１レセプター（以前に腫瘍増殖に関連したレセプターである）の発現を例証する。
【０１１６】
（Ａ．ＲＮＡ抽出）
培養細胞由来の総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ試薬（Ｂｉｏｔｅｃ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって抽出した。手短に言えば、ＰＲＭＩを補充した１０％ＦＣＳ中で１００ｍｍペトリディッシュ上に生育した細胞を、５ｍｌのＲＮＡｚｏｌ試薬に溶解した。次いで、細胞を収集し、０．１容量のクロロホルムを添加し、そして混合物を遠心分離した（１２，０００×ｇで１５分間）。上層の水相を新しいチューブに移し、次いで等量のイソプロパノールを添加し、混合し、そして遠心分離した（１２，０００×ｇで１０分間）。ペレットを２回７０％エタノールで洗浄し，１／１０容量の３Ｍ  酢酸ナトリウムおよび２．５容量のＥｔＯＨに溶解し、−２０℃で保存した。
【０１１７】
（Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲ）
相補ＤＮＡを、最初に、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、ランダムヘキサマーをプライマーとして使用して、２μｇの総ＲＮＡの逆転写（３７℃で１時間、９５℃で５分間）によって得た。この反応の後、Ｒｅｄ  Ｈｏｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ、Ａｄｖｅｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を使用して、サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、３０〜４５のＰＣＲ増幅サイクル（９４℃で１分間、６０℃で１分間のプライマーアニーリング、７２℃で１分間の伸長）を行った。異なるサンプルのＲＮＡの量を制御するために、ｃＤＮＡの２μｌサンプルを、ヒトグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーを用いて試験プライマーに対して並行に増幅した。種々のＶＩＰレセプター（例えば、Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．Ｂ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：２６６２−８０（１９９４）、Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：２９３９−４３（１９９５）、およびＨａｒｍａｒ，Ａ．Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５０：２６５−２７０（１９９８）に概説される通り）についての特異的プライマーは、表１にもまた概略が説明される。ＶＩＰ  ｍＲＮＡについての特異的プライマー（Ｉｔｏｈ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：５４７−５４９（１９８３）；Ｂｏｄｎｅｒ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：３５４８−５１（１９８５））もまた、表１に概説が示される。ＰＣＲ産物を、２％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭＥ，ＵＳＡ）上の電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ光によって可視化した。
【０１１８】
ＲＴ−ＰＣＲデータは、ＮＣＩ−Ｈ７２７中でＶＰＡＣ１レセプターの発現を示し、このレセプターは、以前に腫瘍増殖に関連していた（Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：２９３９−４３（１９９５）を参照のこと）。
【０１１９】
（実施例６）
この実施例は、インビトロで研究された乳癌細胞の増殖を変化させる、ＶＩＰレセプターアンタゴニストの能力を例証する。
【０１２０】
ＶＩＰレセプターアンタゴニストの、乳癌細胞の増殖を変化させる能力を、ＭＴＴ比色定量を使用してインビトロで研究した。半自動ＭＴＴアッセイは、腫瘍細胞によるテトラゾリウム化合物の、ホルマザンへの還元を測定する。５７０ｎｍにおける光学密度を、各インヒビター濃度で８ウェルについて決定した。播種密度は、５×１０４細胞／ウェルであり、そして細胞を９６ウェルプレートで５日間増殖させた。
【０１２１】
表３は、ＶＩＰｈｙｂが、ＭＴＴアッセイにおいて濃度依存的な様式でＭＣＦ−７増殖を阻害したことを示す。１０μＭのＶＩＰｈｙｂは、ＭＣＦ−７増殖を有意に阻害した。（ＳＮ）ＶＩＰｈｙｂは、ＶＩＰｈｙｂよりもより強力なインヒビターであり、それを、ＮＣＩ「比較分析」において、５６癌細胞株のパネルを使用して試験した。（ＳＮ）ＶＩＰｈｙｂは、試験された５６細胞株のうちの５１の増殖を有意に阻害した。これには、６／６の白血病、７／７の非小細胞肺癌、６／７の結腸癌、５／５のＣＮＳ癌、８／８のメラノーマ、５／６の卵巣癌、６／７の腎臓癌、２／２の前立腺癌、および６／８の乳癌細胞株が含まれる（表３、説明文）。
【０１２２】
【表３】
2003530297.tif 000019
８つの定量の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す；*、スチューデントのｔ−検定を使用してｐ＜０．０５。（ＳＮ）ＶＩＰｈｙｂは、白血病（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）、ＨＬ−６０（ＴＢ）、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、ＲＰＭＩ−８２２６、ＳＲ）、非小細胞肺癌（Ａ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、Ｈ２３、Ｈ３２２Ｍ、Ｈ４６０、およびＨ５２２）、結腸癌（ＣＯＬＯ２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、ＫＭ１２、ＳＷ−６２０）、ＣＮＳ癌（ＳＦ−２６８、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＮＢ−１９、Ｕ２５１）、メラノーマ（ＬＯＸ  ＩＭＶＩ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、Ｍ１４、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＵＡＣＣ−２５７、ＵＡＣＣ−６２）、卵巣癌（ＩＧＲＯＶ１、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫ−ＯＶ−３）、腎臓癌（７８６−０、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＲＸＦ  ３９３、ＳＮＩ２Ｃ、ＴＫ−１０）、前立腺癌（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５）ならびに乳癌（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ  ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＮおよびＴ−４７Ｄ）の増殖を阻害した。
【０１２３】
（実施例７）
この実施例は、インビボのＶＩＰハイブリッドアナログの増殖局面を例証する。
【０１２４】
インビボのＶＩＰハイブリッドアナログの増殖局面を試験するために、乳癌異種移植片を有するヌードマウスを利用した。雌性無胸腺症Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（４〜５週齢）を、病原体フリーの温度制御された隔離室に収容した。そして、オートクレーブした齧歯類用の固形飼料およびオートクレーブした水からなる食餌を自由に与えた。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（１×１０7）を、各マウスの右の側腹部に皮下注射した。触知可能な腫瘍を、２週間後に約９０％のマウスで観察した。ＰＢＳ（１００μｌ）またはＶＩＰｈｙｂアナログ（１０μｇ／日）を、腫瘍に隣接して皮下注射した。タキソールを、２週間後に１回注射した（１．５ｍｇ  ｉ．ｐ．）。腫瘍体積（高さ×幅×奥行き）を、週に２回、カリパスによって測定し、そして記録した。
【０１２５】
図１２は、すべてのマウスにおける２週間後に形成された小さい腫瘍を示す。ＰＢＳを注射されたコントロールマウスにおいて、異種移植片は、指数関数的に増殖し、そして大きな腫瘍（１１２１ｍｍ3）が４週間後に存在した。ＶＩＰｈｙｂまたはタキソールを注射された動物において、腫瘍は小さなサイズであった（それぞれ、５０８ｍｍ3および６１３ｍｍ3）。ＶＩＰｈｙｂおよびタキソールを注射された動物において、腫瘍は、有意に小さなサイズであった（２３４ｍｍ3）。これらの結果は、タキソール＋ＶＩＰｈｙｂがインビボで相乗効果的に異種移植片の増殖を阻害することを示唆する。
【０１２６】
本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、各々個々の刊行物、特許、または特許出願が、あたかも具体的かつ個別に本明細書中に参考として援用されることが示されるかのようにと同程度に、本明細書中に参考として援用される。前述の発明は、理解の明確さの目的のために、例証および実例のためにいくぶん詳細に記載してきたが、特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲内で実行され得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＭＭＴアッセイにおける、可変濃度のタキソールおよびＳＮＶＩＰＰｈｙｂの併用療法を用いるＭＣＦ−７細胞における用量応答曲線を示す。
【図２】
図２は、２μＭ〜１０μＭの範囲の濃度での、ＳＮＨの用量応答曲線を示す。
【図３】
図３は、ＳＮＨおよびタキソールの併用療法を用いる、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞株（非小細胞肺癌）における用量応答曲線を示す。
【図４】
図４は、ＳＮＨおよびシスプラチンの併用療法を用いる、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞株（非小細胞肺癌）における用量応答曲線を示す。
【図５】
図５は、ＳＮＨおよびナベルビン（ｎａｖｅｒｂｉｎｅ）の併用療法を用いる、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞株（非小細胞肺癌）における用量応答曲線を示す。
【図６】
図６は、ＳＮＨおよびドキソルビシンの併用療法を用いる、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞株（非小細胞肺癌）における用量応答曲線を示す。
【図７】
図７は、ＳＮＨおよびゲムシタビンの併用療法を用いる、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞株（非小細胞肺癌）における用量応答曲線を示す。
【図８】
図８は、ＳＮＨおよびＣＰＴ−１１の併用療法を用いる、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞株（非小細胞肺癌）における用量応答曲線を示す。
【図９】
図９は、タキソールおよびＳＮＨの可変濃度の併用療法を用いる、用量応答曲線を示す。
【図１０】
図１０は、ＳＮＨおよびＣＰＴ−１１の併用療法を用いる、ＣＴ−２６細胞株（マウス結腸癌）における用量応答曲線を示す。
【図１１】
図１１は、ＳＮＨおよびＣＰＴ−１１の併用療法を用いる、ＨＴ−２９細胞株（ヒト結腸癌）における用量応答曲線を示す。
【図１２】
図１２は、ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植片に対する、本発明の組成物のインビボでの使用を示す。明白な塊が１週間後に形成され、そして動物に、引き続き以下を注射した：１００μｌのＰＢＳ、毎日、ｓ．ｃ．（黒三角）１０μｇのＶＩＰｈｙｂ、毎日、ｓ．ｃ．、１．５ｍｇタキソール、ｉ．ｐ．（白丸）；および１０μｇのＶＩＰｈｙｂ  ｓ．ｃ．毎日＋１．５ｍｇタキソールｉ．ｐ．（黒四角）；ｐ＜０．０５、*。５回の測定の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。
【０１２７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING                              
<110> The Government of the United States of America,
represented by The Secretary of the
Department of Health and Human Services
<120> Combination Therapy With VIP Antagonist
<130> F101984765
<140> JP P2000-576869
<141> 1999-10-15
<150> US 60/104,472
<151> 1998-10-16
<150> US 60/104,907
<151> 1998-10-20
<160> 8                            
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:vasoactive
intestinal polypeptide (VIP) antagonist
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa = Lys modified by 1-R, where 1-R = H, C-1 to
C-20 alkyl or C-1 to C-20 acyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)
<223> Xaa = any naturally ocurring amino acid or amino
acid analog or mimetic, provided Xaa is not Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)
<223> Xaa = any naturally occurring amino acid or amino
acid analog or mimetic
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)
<223> Xaa = asparaginamide modified by 2-R, where 2-R =
H, C-1 to C-20 alkyl or C1- C20 acyl
<400> 1
Xaa Pro Arg Arg Pro Tyr Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1               5                  10                  15    
Xaa Ala Xaa Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile LeuXaa                 
20                 25           
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:vasoactive
intestinal polypeptide (VIP) antagonist, NL-hybrid
VIP antagonist
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)
<223> Xaa = Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)
<223> Xaa = asparaginamide
<400> 2
Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1               5                  10                  15    
Xaa Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Xaa                 
20                  25            
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:lipophilic
vasoactive intestinal polypeptide (VIP)
antagonist, S-NL-hybrid VIP antagonist,
stearyl-Nle-VIP-hybrid (SNH)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa = stearyl-Lys, Lys modified by
CH-3(CH-2)-16CO-
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)
<223> Xaa = Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)
<223> Xaa = asparaginamide
<400> 3
Xaa Pro Arg Arg Pro Tyr Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1               5                  10                  15    
Xaa Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Xaa                 
20                 25            
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:vasoactive
intestinal polypeptide (VIP) antagonist, S-hybrid
VIP antagonist
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa = stearyl-Lys, Lys modified by
CH-3(CH-2)-16CO-
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)
<223> Xaa = asparaginamide
<400> 4
Xaa Pro Arg Arg Pro Tyr Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1               5                  10                  15    
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Xaa                 
20                 25            
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:vasoactive
intestinal polypeptide (VIP) antagonist
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa = Lys modified by C-1 to C-20 alkyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)
<223> Xaa = Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)
<223> Xaa = asparaginamide
<400>5
Xaa Pro Arg Arg Pro Tyr Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1               5                  10                  15    
Xaa Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Xaa                 
20                  25            
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:vasoactive
intestinal polypeptide (VIP) antagonist
<400> 6
Lys Pro Arg Arg Pro Tyr Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1               5                  10                  15    
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn                 
20                  25            
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:vasoactive
intestinal polypeptide (VIP)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)
<223> Xaa = asparaginamide
<400>7
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1               5                  10                  15    
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Xaa                 
20                  25           
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:vasoactive
intestinal polypeptide (VIP) antagonist
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa = Lys modified by 1-R, where 1-R = H, C-1 to
C-20 alkyl or C-1 to C-20 acyl
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)
<223> Xaa = Leu, Val or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)
<223> Xaa = Leu, Nle or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)
<223> Xaa = asparaginamide modified by 2-R, where 2-R =
H, C-1 to C-20 alkyl or C1- C20 acyl
<400>8
Xaa Pro Arg Arg Pro Tyr Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln  
1              5                   10                  15    
Xaa Ala Xaa Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Xaa                 
20                  25