【手続補正書】
【提出日】平成16年7月6日(2004.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  電気重合開始剤としての作用と、核酸中の事前に選択された塩基の酸化のための媒介物質としての作用とをしうる金属錯体と、該核酸が付着することができる官能化された部分とを含む薄膜を含んでなる核酸の電気化学的検出に有用な電極。
【請求項２】  前記金属錯体が、ポリ[Ru (vbpy)32+]とポリ[Ru (vbpy)32+/vba]からなるグループから選択され、vbpyが4-ビニル-4'メチル-2,2'-ビピリジンであり、vbaがp-ビニル安息香酸である請求項１に記載の電極。
【請求項３】  （ａ）電極上で薄膜を電気的に重合する工程であって、該薄膜が、媒介物質とカルボキシレート基を有する官能化された部分との共重合体を含むことを特徴とする工程と、
（ｂ）該薄膜に共有結合的にオリゴヌクレオチドプローブを付着させる工程と
を含む核酸の電気化学的検出に有用な電極を作製する方法。
【請求項４】  前記オリゴヌクレオチドプローブが、カルボジイミド反応を介して付着され、それに続いて、アミノ結合した一本鎖DNAのアミド化が行われる請求項３に記載の方法。
【請求項５】  前記媒介物質がRu(vbpy)32+であり、前記官能化された部分がp-ビニル安息香酸である請求項３に記載の方法。
【請求項６】  （ａ）導電性作用表面を有する基板と、
（ｂ）該導電性作用表面上で電気的に重合された薄膜であって、該電気的に重合された薄膜が、媒介物質とカルボキシレート基を有する官能化された部分との共重合体を含むことを特徴とする薄膜と
を含む核酸の事前に選択された塩基の電気化学的検出に有用な電極。
【請求項７】  前記媒介物質がRu(vbpy)32+であり、また前記官能化された部分がp-ビニル安息香酸である請求項６に記載の電極。
【請求項８】  （ａ）媒介物質とカルボキシレート基を有する官能化された部分との共重合体を含む電気的に重合された薄膜を、標的核酸を含有していることが推測されるサンプルおよびオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程であって、それにより該核酸と該オリゴヌクレオチドプローブとが該薄膜上にハイブリダイズされた核酸を形成する工程と、
（ｂ）酸化還元反応を検出する工程と、
（ｃ）検出された該酸化還元反応から該核酸の有無を判定する工程と
を含むサンプル中の標的核酸の存在を判定する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
＜関連先行技術の記載＞
表面修飾技術における最近の進歩により、とくに高性能の蛍光検出技術と組み合わせる場合、バイオアッセイ技術に関する数多くの新しい方法の創出が容易になった。例えば、遺伝子発現分析（Schena, M.ら、Science, 1995,270, 467）、高密度アレイ上でのゲノムDNAの配列決定(Chee, M.ら、Science, 1996, 274, 610)および感染性生物を識別する核酸の検出（Spargo,C.A.ら、Molecular and Cellular Probes, 1993, 7, 395; Mullis, K.B.,Ferre, F. Gibbs, R. A. 編『ポリメラーゼ鎖反応（The Polymerase Chain Reaction）』の中のMartin, W. J.の執筆部分406〜417頁、1994年刊、Berkhauser社、ボストン）は、現存する先行技術の培養あるいは免疫測定に基づく諸方法と比較すると、優れた選択性と感受性とを潜在的に有している。こうしたシステムは著しい進歩を示しているが、それらシステムには、いまだに高価な前処理工程と高価な蛍光顕微鏡の使用が必然的に含まれる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
親出願であるＴｈｏｒｐら（米国特許番号5,871,918号）の中で述べられているように、ハイブリダイズされたDNAは固体支持体上、および酸化物質上に固定される。その後に、同じ固体支持体の上にその酸化物質を固定し、溶液中にその固体支持体を浸漬することにより、その酸化物質と事前に選択された塩基との酸化還元反応が発生することを可能にするのに十分な条件下で、酸化物質はそのハイブリダイズされたDNAと反応する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
親出願であるＴｈｏｒｐら（米国特許番号5,968,745号）の中で述べられているように、ポリ（エチレンテレフタレート）（PET）あるいはPET膜およびDNAプローブ上に固定されたDNAがインジウム−スズ酸化物（ITO）電極に直接取り付けられるという付加的なスキームが、PCR増幅バイオアッセイとしての適用とともに、相補的DNAの検出に使用される（Napier, M.E.ら、Langmuir 1997, 13, 6342; Napier, M. E. ら、H. H. Bioconjugate Chem. 1997, 8, 906）。基本的には、従前の研究内容は2つのシナリオに焦点を当てるものであった。すなわち、1) 溶液DNAと溶液媒介物質、および、2) 固定されたDNAと溶液媒介物質である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
一般的には、本発明の電気重合可能な薄膜をその上に有する本発明の電極    を作製するための方法は、（ａ）電極上の薄膜を電気的に重合する工程であ    って、ここで、該薄膜が電気重合の開始剤としての作用および電子伝達媒介    物質としての作用の両方の作用をする金属錯体と、カルボン酸基を有する官 能化部分との共重合体を有することを特徴とする工程と、（ｂ）アミノ結合    した一本鎖DNAのアミド化が、その後に起こるカルボジイミド反応を介して    カルボネート基にDNAプローブを共有結合により付着する工程とを含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
親出願であるＴｈｏｒｐら（米国特許番号5,871,918号）に記載されている方法では、一本鎖および二本鎖核酸から電気化学的な電流を得るために、金属錯体が使用される。グアニンなどの事前に選択された塩基は電気化学的信号を与える。また、この信号は二本鎖DNAではずっと弱いものになる。こうした諸方法は、有利なことには構造的な感受性が高く、また、単一塩基ミスマッチを解決することができる。したがって、DNAの配列決定ではこうした諸方法はとくに有利である。しかし、こうした諸方法の2つの欠点は、以下のとおりである。すなわち、(a) プローブ鎖からハイブリッドまで進行する際に信号があり、(b) その信号を制限する事前に選択された塩基類の数が限定されている。本出願で述べられている技術はこうした問題に対する解決策を提供する。さらに、こうした技術はとくに、診断測定に有用であり、特に核酸の定量的な検出に有用である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
これらを考慮して、本出願及び親出願であるＴｈｏｒｐら（米国特許番号5,871,918号）に開示されているのは、標的核酸を含むことが推測される試験サンプルにおいて、標的核酸の有無を検出する方法であり、標的核酸は少なくとも一つの事前に選択された塩基を含む。この方法では、事前に選択された塩基は、オリゴヌクレオチドプローブ上ではなく、標的核酸上に位置している。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】削除
【補正の内容】