(57)【要約】ＬＰＳ等のＴＬＲファミリーとＩＬ−１受容体ファミリーに共通のシグナル伝達に使用される細胞内因子アダプター分子ＭｙＤ８８の機能を細胞内でシグナル特異的に制御する手法を提供する。  以下の（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。（ａ）配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のアミノ酸及び２６９番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質（ｃ）配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
2009017255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、２１４番目のアミノ酸、２３８番目のアミノ酸及び２６９番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
（ｃ）配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
【請求項２】
（ａ）の他のアミノ酸がアラニンである請求項１記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
【請求項３】
ヒト由来の野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質の変異体である請求項１又は２記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
【請求項４】
ヒト以外の動物由来の野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質の変異体である請求項１又は２記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
【請求項５】
配列番号４又は６のアミノ酸配列からなる請求項１記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体蛋白質又はその塩。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項６記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質を採取することを含むＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質若しくはその塩又は請求項１記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡがベクターに組み込まれている請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
【請求項１３】
インターロイキン１８作用を特異的に修飾する薬剤をスクリーニングする方法であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲの２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と前記薬剤の候補物質との結合の有無を調べることを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体／インターロイキン１８シグナルの特異的制御を可能とするＭｙＤ８８のＴｏｌｌ／インターロイキン１受容体（Ｔｏｌｌ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＩＲ）ドメイン変異体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１（ＩＬ−１）は、自然免疫反応を迅速に活性化する主要な炎症誘発性サイトカインであり、そして獲得免疫系の強力な誘導物質である１（非特許文献１）。またインターロイキン１８（ＩＬ−１８）は最初ＩＬ−１ホモログの１つとして見い出され、そしてインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導因子として同定された２（非特許文献２）。ＩＬ−１同様、ＩＬ−１８も自然および獲得免疫反応において重要な役割を果たす。ＩＬ−１８およびＩＬ−１βは、中程度の配列相同性（１７％のアミノ酸が同一）を示すが、本発明者らはＩＬ−１８の立体構造がＩＬ−１βのそれに類似していることを明らかにしている３（非特許文献３）。ＩＬ−１およびＩＬ−１８のリガンド受容体複合体構造は、類似しているものと予測される。これらのシグナル伝達は、サイトカインリガンドおよびその受容体からなる高親和性複合体の形成によって開始される。細胞表面でこれらのリガンドがその受容体複合体に結合したとき、受容体分子の細胞質側末端が、Ｔｏｌｌ／インターロイキン１受容体ホモロジー（ＴＩＲ）ドメインを介して、ミエロイド分化８８（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８８：ＭｙＤ８８）に結合する４（非特許文献４）。ＭｙＤ８８を介するシグナル伝達は、一般に、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１転写因子の活性化をもたらす。【０００３】
ＴＩＲドメインは、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１８受容体、ＴｏｌｌおよびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ならびにＭｙＤ８８によって例示されるいくつかの細胞内タンパク質に見い出される。ショウジョウバエのＴｏｌｌファミリーおよび哺乳動物ＴＬＲファミリーは、細菌、真菌およびウイルスを含む多様な微生物リガンドの群に対する細胞膜上の認識受容体として知られている。最近、それらのＴＬＲファミリーメンバーは、微生物感染の重要なセンサーであることが立証された。今日までに少なくとも１３個のＴＬＲが発見されているが、それらのそれぞれは異物に由来する異なる種類のリガンド（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、等）に応答するように特殊化されている５（非特許文献５）。例えば、ＴＬＲ２はグラム陽性細菌ペプチドグリカンを認識し、またＴＬＲ４はグラム陰性細菌リポ多糖（ＬＰＳ）を認識する。【０００４】
今日までにＴＩＲドメインを含む細胞内蛋白分子が５個同定され、それらはＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ（Ｍａｌ）、ＴＲＩＦ（ＴＩＣＡＭ−Ｉ）、ＴＲＡＭ（ＴＩＣＡＭ−ＩＩ）およびＳ−ＡＲＭである６（非特許文献６）。これらの細胞内「アダプター」タンパク質は、ＴＬＲの細胞ドメインへリクルートされ、細胞内でシグナル伝達経路を媒介することが明らかになっている。アダプタータンパク質の多様性に関しては、別個のＴＬＲにリクルートされるアダプター分子の異なる組合せが下流シグナル伝達カスケードを決定すると考えられている７（非特許文献７）。【０００５】
ＭｙＤ８８は最初、肺条件培地または組換えＩＬ−６による活性化後、Ｍ１骨髄芽球性白血病細胞中に誘導された１２個の異なるｍＲＮＡ転写物の１つとして同定された８（非特許文献８）。ＭｙＤ８８のヒトホモログは、１９９７年に単離クローン化された９（非特許文献９）。アミノ酸配列分析は、ＭｙＤ８８が短いリンカーによってＣ末端ＴＩＲドメイン（約１５０アミノ酸残基）と隔てられたＮ末端ｄｅａｔｈドメイン（約９０アミノ酸残基）からなるモジュール構成を有することを予測した。ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８Ｒ／ＴＬＲのそれぞれは、それらの細胞質側末端に、ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインと結合することが公知である１個のＴＩＲドメインを有する。ここでＴＩＲ−ＴＩＲヘテロ二量体化が起こる。ＭｙＤ８８はさらに、ｄｅａｔｈドメインを含む下流因子であるＩＲＡＫと、ｄｅａｔｈドメイン−ｄｅａｔｈドメインヘテロ二量体化により結合する１０（非特許文献１０）。ＴＩＲドメインの２つの結晶構造（ＴＬＲ２およびＩＬ−１ＲＡＰＬ）がホモ二量体構造として決定されている１１，１２（非特許文献１１、１２）。これらは、ＴＩＲドメインのオリゴマー的性質をおそらく示している。これらのホモ二量体構造に基づいて、コンピュータでの（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）ドッキングシミュレーションを含むいくつかの実験を行って、ＭｙＤ８８とＴＬＲの間のＴＩＲ−ＴＩＲ相互作用が特徴付けられた１３−１５（非特許文献１３〜１５）。しかし、そのようなオリゴマー性相互作用の実際のところの詳細はまだ十分理解されていない。【０００６】
ＩＬ−１８を含むＩＬ−１ファミリーや病原体構成成分認識受容体であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のシグナル伝達経路のシグナルを修飾するような物質の開発がなされている（非特許文献１６〜１９）。しかし、この経路の細胞内因子であるアダプター分子ＭｙＤ８８の機能を制御することでシグナルの一部を遮断する手法は現在まで試みられていない。【０００７】
【非特許文献１】Ｓｉｍｓ，Ｊ．Ｅ．ＩＬ−１  ａｎｄ  ＩＬ−１８  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｆａｍｉｌｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４，１１７−２２（２００２）
【非特許文献２】Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，８８−９１（１９９５）．
【非特許文献３】Ｋａｔｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １０，９６６−７１（２００３）．
【非特許文献４】Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．＆  Ｇｒｅｅｎｅ，Ｃ．Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ：ａｎｃｉｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ，ｉｎｓｅｃｔｓ，ａｎｄ  ｐｌａｎｔｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６３，６５０−７（１９９８）．
【非特許文献５】Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．＆  Ｏｚｉｎｓｋｙ，Ａ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｋｅｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，１０３−１１０（２００２）
【非特許文献６】ＭｃＧｅｔｔｒｉｃｋ，Ａ．Ｆ．＆  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．Ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＭｙＤ８８−ｌｉｋｅ  ａｄａｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１，５７７−８２（２００４）．
【非特許文献７】Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．＆  Ａｋｉｒａ，Ｓ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７，９７９−８７；ｑｕｉｚ  ９８８（２００６）
【非特許文献８】Ｌｏｒｄ，Ｋ．Ａ．，Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｂ．＆  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ａ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＭｙＤ８８，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＩＬ６．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５，１０９５−７（１９９０）
【非特許文献９】Ｂｏｎｎｅｒｔ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＭｙＤ８８：ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｎ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｍｉｌｙ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４０２，８１−４（１９９７）．
【非特許文献１０】Ｗｅｓｃｈｅ，Ｈ．，Ｈｅｎｚｅｌ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｈｉｌｌｉｎｇｌａｗ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｓ．＆  Ｃａｏ，Ｚ．ＭｙＤ８８：ａｎ  ａｄａｐｔｅｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ＩＲＡＫ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７，８３７−４７（１９９７）．
【非特許文献１１】Ｔａｏ，Ｘ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｂｅｇ，Ａ．Ａ．＆  Ｔｏｎｇ，Ｌ．Ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ７１３Ｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＩＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＴＬＲ２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９９，２１６−２１（２００２）．
【非特許文献１２】Ｋｈａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．＆  Ｔｏｎｇ，Ｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１ＲＡＰＬ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，３１６６４−７０（２００４）
【非特許文献１３】Ｄｕｎｎｅ，Ａ．，Ｅｊｄｅｂａｃｋ，Ｍ．，Ｌｕｄｉｄｉ，Ｐ．Ｌ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．＆  Ｇａｙ，Ｎ．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｏｒｓ  Ｍａｌ  ａｎｄ  ＭｙＤ８８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，４１４４３−５１（２００３）．
【非特許文献１４】Ｌｉ，Ｃ．，Ｚｉｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．＆  Ｈａｗｉｇｅｒ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＩＬ１ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，２６１５２−９（２００５）．
【非特許文献１５】Ｊｉａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔａｉｌｓ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａｄａｐｔｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，１０９６１−６（２００６）．
【非特許文献１６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｎｏｖ  ２９；２７１（４８）：３０５１７−２３．
【非特許文献１７】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．２００５  Ｏｃｔ；１３８（４）：４３３−４２
【非特許文献１８】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６  Ｊｕｎ  ２８；７２（１）：６２−９
【非特許文献１９】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５  Ａｐｒ  ２２；２８０（１６）：１５８０９−１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＬＰＳ等のＴＬＲファミリーとＩＬ−１受容体ファミリーに共通のシグナル伝達に使用される細胞内因子アダプター分子ＭｙＤ８８の機能を細胞内でシグナル特異的に制御する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＩＬ−１／ＩＬ−１８／ＴＬＲシグナル伝達におけるＴＩＲドメインの重要な役割にもかかわらず、本願の優先日（２００７年８月１日）の時点で、構造データは受容体のＴＩＲに関するものしか利用できなかった。細胞内アダプター分子のＴＩＲについては、そのいずれについても原子構造の決定はなされていなかった。したがって、これらのアダプターのＴＩＲドメインの構造情報は、相互作用機構をより正確に理解するために必須である。そこで、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８Ｒ／ＴＬＲシグナル伝達のより良い理解への一歩として、本発明者らは、溶液ＮＭＲ分光法を用いてヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの溶液構造を決定した。この構造は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８Ｒ／ＴＬＲシグナル伝達におけるＴＩＲ含有アダプタータンパク質の生物学的機能をさらに研究するために必要な基礎を提供する。また、本発明者らは、培養細胞を用いてＭｙＤ８８  ＴＩＲの一連の機能分析を実施した。これらの分析は、ＭｙＤ８８がＩＬ−１８およびＴＬＲ４シグナル伝達経路で機能するために決定的な数個のアミノ酸残基を決定することを可能とした。興味深いことに、ＭｙＤ８８  ＴＩＲの３つの共通な相互作用部位が同定され、そして１つのさらなる部位はＩＬ−１８シグナル伝達にのみ機能した。【００１０】
ＭｙＤ８８はｄｅａｔｈドメインとＴｏｌｌ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＴＩＲ）ドメインからなる２ドメイン蛋白であるが、ｄｅａｔｈドメインを欠失させＴＩＲドメイン（１４８−２９６）のみ細胞に発現させると、ＩＬ−１８を含むＩＬ−１ファミリーやＴＬＲのシグナル非特異的ドミナントネガティブインヒビターとして働くことが知られている。このＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインのリシン２１４とリシン２３８とアルギニン２６９をアラニンに置換した変異体ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２１４ＡとＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２３８ＡとＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｒ２６９Ａを作製し、その機能を培養細胞上において、ＮＦ−κＢ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙで検討した結果、ＴＬＲ４を介するＬＰＳからのシグナルは遮断できるが、ＩＬ−１８からのシグナルは遮断できないことがわかった。本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。なお、本願の優先日（２００７年８月１日）以降に、Ｒｏｓｓｉらにより解析されたヒトＭｙＤ８８ＴＩＲの構造がＰＲＯＴＥＩＮ  ＤＡＴＡ  ＢＡＮＫに登録された（登録日：２００７年６月２９日、公開日：２００７年１０月２３日、登録番号：２ｊｓ７）が、その公開は本願の優先日の後であった。
本発明の要旨は以下の通りである。【００１１】
（１）以下の（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、２１４番目のアミノ酸、２３８番目のアミノ酸及び２６９番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
（ｃ）配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質【００１２】
（２）（ａ）の他のアミノ酸がアラニンである（１）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
（３）ヒト由来の野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質の変異体である（１）又は（２）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
（４）ヒト以外の動物由来の野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質の変異体である（１）又は（２）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩。
（５）配列番号４又は６のアミノ酸配列からなる（１）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体蛋白質又はその塩。【００１３】
（６）（１）記載のタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。
（７）（６）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（８）（７）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（９）（６）記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質を採取することを含むＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質の製造方法。
（１０）（１）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質若しくはその塩又は（１）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する医薬組成物。【００１４】
（１１）（１）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡがベクターに組み込まれている（１０）記載の医薬組成物。
（１２）（１）記載のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
（１３）インターロイキン１８作用を特異的に修飾する薬剤をスクリーニングする方法であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲの２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と前記薬剤の候補物質との結合の有無を調べることを含む前記方法。【００１５】
本発明は、細胞内シグナル伝達タンパクの機能的変異導入箇所の情報を提供する。
ＩＬ−１８は、ＩＦＮ−γの産生を誘発する等、細胞性免疫機能において重要な分子であることがわかっているが、そのシグナル伝達経路は図８のようにＬＰＳを認識する受容体であるＴＬＲ４等と共通している。ＬＰＳは、グラム陰性菌の細胞膜に由来する物質であるが、生体内においてエンドトキシンショックを誘発する等、毒性を発揮する物質である。本発明者らが作製したＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２１４Ａ、Ｋ２３８Ａ、Ｒ２６９Ａ変異体は、ＩＬ−１８シグナル伝達は阻害しないが、ＬＰＳによるＴＬＲ４シグナル伝達は阻害する。従って、この変異体分子は、ＩＬ−１８による細胞性免疫機能を保持したまま、ＬＰＳによる直接のエンドトキシンショック等の病態発症を抑えることが期待できる。
【発明の効果】
【００１６】
従来では、ＬＰＳによる毒性の治療には、エンドトキシン除去や抗炎症薬等での治療が行われていたが、新たな治療アプローチとして、遺伝子レベルで細胞に組換え蛋白を発現させることで、ＩＬ−１８による細胞性免疫機能を維持したままＬＰＳによる炎症性サイトカインの産生を制御することが可能となった。
また、逆に、このＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインのＫ２１４Ａ、Ｋ２３８及びＲ２６９を標的とする低分子やペプチドは、ＩＬ−１８に特異的な作用をもたらす可能性がある。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００７−２００７７６の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒトＭｙＤ８８、ＩＬ−ＩＲ類、およびＴＬＲ類のＴＩＲドメインタンパク間のアミノ酸配列アライメント。
【図２Ａ】ヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの溶液構造。２Ａ）計算された２０個の最終構造の最もよく収束した主鎖を重ね合わせた立体図。残基１５７−１８５，１８８−１９４および２０３−２９５の主鎖原子を重ね合わせている。
【図２Ｂ】ヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの溶液構造。２Ｂ）Ｍｏｌｍｏｌを用いて描いた、ＭｙＤ８８のＮＭＲ構造の代表的リボン図。二次構造の表示（βＡ−βＥ，αＡ−αＣおよびαＥ）は、ＴＬＲ  ＴＩＲに従う。
【図２Ｃ】ヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの溶液構造。２Ｃ）および２Ｄ）ＭｙＤ８８  ＴＩＲと、ＴＬＲ２のＴＩＲドメインの結晶構造（１ＦＹＷ）を重ね合わせて示したもの。βシートコアは類似しているが（ＲＭＳＤ＝０．９０オングストローム）、いくつかの領域に相違がある。
【図２Ｄ】ヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの溶液構造。２Ｃ）および２Ｄ）ＭｙＤ８８  ＴＩＲと、ＴＬＲ２のＴＩＲドメインの結晶構造（１ＦＹＷ）を重ね合わせて示したもの。ＢＢループ部分をクローズアップしている。βシートコアは類似しているが（ＲＭＳＤ＝０．９０オングストローム）、この領域において両者は大きく相違がある。
【図３】ＴＩＲドメインの表面静電ポテンシャル。４つのＴＩＲドメインの静電ポテンシャルを表したもの。赤は陰性荷電領域を示し、青は陽性荷電領域を示す。矢印は、各ＴＩＲドメインのＢＢ−ループを示す。ＴＩＲドメインの左側の図は、それぞれ図２Ａと同一の配向である。
【図４Ａ】ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメイン野生型および変異体群のレポーターアッセイの結果。４Ａ：ＩＬ−１８Ｒβを同時トランスフェクションしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を用いてＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激した際のＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイ。このグラフにおいて、各棒グラフは刺激されていない細胞あたりの刺激された細胞の相対的ルシフェラーゼ発光単位を示す。野生型と各変異体グループの間の有意差は、ダネットの多重比較検定により分析した。グラフ上のカラーコード：野生型群と比較したＮＦ−κＢ活性が黒の棒グラフは統計的に有意なもの；白の棒グラフは、変異導入が重大な影響をなんら示さなかったことを示す。
【図４Ｂ】ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメイン野生型および突然変異体のレポーターアッセイの結果。４Ｂ：補助分子ＭＤ２を同時トランスフェクションした２９３−ｈＴＬＲ４Ａ−ＨＡ細胞を用いてＬＰＳ（１．０μｇ／ｍＬ）で刺激した際のＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイ。このグラフにおいて、各棒グラフは刺激されていない細胞あたりの刺激された細胞の相対的ルシフェラーゼ発光単位を示す。野生型と各変異体グループの間の有意差は、ダネットの多重比較検定により分析した。カラーコード：野生型群と比較したＮＦ−κＢ活性が黒の棒グラフは統計的に有意なもの；白の棒グラフは、変異導入が重大な影響をなんら示さなかったことを示す。
【図５Ａ】ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの構造表面のマッピング。ＩＬ−１８刺激による機能分析に用いた極性アミノ酸のみを反映する。オレンジ色のアミノ酸残基は、ルシフェラーゼアッセイの結果、重要であると判断されたもの。茶色のアミノ酸残基は、ドミナントネガティブ作用が不活性化しなかったものを示す
【図５Ｂ】ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの構造表面のマッピング。ＬＰＳ刺激による機能分析に用いた極性アミノ酸のみを反映する。赤色のアミノ酸残基は、ルシフェラーゼアッセイの結果、重要であると判断されたもの。茶色のアミノ酸残基は、ドミナントネガティブ作用が不活性化しなかったものを示す。特にＬＰＳ刺激と比較してＩＬ−１８刺激系では、Ｋ２１４Ａ，Ｋ２３８Ａ，Ｒ２６９Ａの３つの残基が特異的に重要である。
【図６】ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインに含まれる、保存性の高い残基に対するアラニンあるいはヒスチジン置換変異体のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における発現レベルの評価。Ｐ２００Ｈ、Ｆ２８５Ａの発現レベルは、野生型やＫ２３８Ａと同等であったが、Ｗ２８６Ａは他のものより有意に低く、かつシクロヘキシミド（２５μｍｏｌ／Ｌ）と共にインキュベートしたところ、４８時間のインキュベーション後、Ｗ２８６Ａのタンパク質発現はほぼ完全に消失した。
【図７】細胞に一過性発現させた、ＦＬＡＧタグを付加したＴＩＲＡＰとｍｙｃタグを付加したＭｙＤ８８タンパク質の免疫沈降実験による相互作用の検出。ＭｙＤ８８は、ＴＩＲＡＰと相互作用を示し、かつＭｙＤ８８  ＴＩＲのＫ２１４Ａ、Ｋ２３８Ａ、Ｒ２６９Ａ変異体もＴＩＲＡＰと相互作用可能であった。
【図８】ＩＬ−１８とＬＰＳがそれぞれ関与する細胞内シグナル伝達経路を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
１．ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質
本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩を提供する。【００１９】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、２３８番目のアミノ酸及び２６９番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
（ｃ）配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質【００２０】
（ａ）のタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸（例えば、アラニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）に置換されたものを例示することができる。２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンと置換する他のアミノ酸は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲの立体構造を破壊しないものであるとよい。例えば、アラニンの他、セリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、トレオニンで置換することが好ましい。【００２１】
（ｂ）のタンパク質は、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、２１４番目のアミノ酸、２３８番目のアミノ酸及び２６９番目のアミノ酸以外の１若しくは数個（好ましくは、２個以上２０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質である。【００２２】
本明細書において、「リポ多糖刺激のシグナルを阻害する」とは、ほ乳類細胞において、リポ多糖刺激による転写因子の活性化及び、その結果としてのサイトカイン産生等の細胞の反応の抑制を意味する。リポ多糖刺激のシグナルを阻害するか否かは、リポ多糖を認識する受容体を持ったほ乳類細胞に転写因子の結合認識部位の配列を組み込んだレポーター遺伝子ベクターを形質転換により導入した後、リポ多糖刺激を加え、レポーター遺伝子の発現量を比較検討することにより、調べることができる。例えば、リポ多糖を認識する受容体を持ったほ乳類細胞に、目的のタンパク質をコードする配列と転写因子の結合認識部位の配列を組み込んだレポーター遺伝子ベクターを形質転換により導入した後、リポ多糖刺激を加え、レポーター遺伝子の発現量を測定し、目的のタンパク質をコードする配列を組み込んでいない形質転換細胞におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、発現量が減少していれば、リポ多糖刺激のシグナルを阻害すると判定することができる。【００２３】
また、「インターロイキン１８刺激のシグナルを阻害する」とは、ほ乳類細胞において、インターロイキン１８による転写因子の活性化及び、その結果としてのサイトカイン産生（特にインターフェロンγ）等の細胞の反応の抑制を意味する。インターロイキン１８刺激のシグナルを阻害するか否かは、インターロイキン１８を認識する受容体を持ったほ乳類細胞に転写因子の結合認識部位の配列を組み込んだレポーター遺伝子ベクターを形質転換により導入した後、リポ多糖刺激を加え、レポーター遺伝子の発現量を比較検討することにより、調べることができる。例えば、インターロイキン１８を認識する受容体を持ったほ乳類細胞に、目的のタンパク質をコードする配列と転写因子の結合認識部位の配列を組み込んだレポーター遺伝子ベクターを形質転換により導入した後、リポ多糖刺激を加え、レポーター遺伝子の発現量を測定し、目的のタンパク質をコードする配列を組み込んでいない形質転換細胞におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、発現量が減少していれば、インターロイキン１８刺激のシグナルを阻害すると判定することができる。【００２４】
（ｃ）のタンパク質について、配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡの全部又は一部と少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Ｔｍ（プローブが標的ＤＮＡから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。１％のミスマッチによりＴｍが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと９５％以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、１％のミスマッチにつき、０．５〜１．５℃の間でＴｍが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、５ｘ  ＳＳＣ／５ｘデンハルト溶液／１．０％  ＳＤＳ中６８℃でハイブリダイズさせ、０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、３ｘ  ＳＳＣ中４２℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｎ．Ｙ．）ａｔ  Ｕｎｉｔ  ２．１０を参照されたい。【００２５】
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質としては、配列番号８のアミノ酸からなるタンパク質（ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２１４Ａ）、配列番号４のアミノ酸からなるタンパク質（ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２３８Ａ）、配列番号６のアミノ酸からなるタンパク質（ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｒ２６９Ａ）などが好ましい。
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質は、ヒト由来の野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質の変異体であっても、ヒト以外の動物由来の野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質の変異体であってもよい。【００２６】
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質の塩は、薬理学的に許容される塩であるとよく、特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例示することができる。【００２７】
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質及びその塩は、ＩＬ−１８の作用は遮断せずに、ＬＰＳの作用を特異的に遮断することが可能である。従って、本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質及びその塩は、Ｔｏｌｌ様受容体及びＩＬ−１／１８シグナル伝達に関与する疾患、具体的には、ＬＰＳが誘発する疾患（例えば、エンドトキシンショック、ＳＩＲＳ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）等の予防及び／又は治療に用いることができる。また、Ｔｏｌｌ様受容体及びＩＬ−１／１８シグナル伝達の研究などを目的とする試薬として利用することもできる。【００２８】
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質及びその塩は、公知の方法によって製造することができる。例えば、後述の２に記載のようにしてＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることにより、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。【００２９】
あるいはまた、本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質及びその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
また、当業者であれば、本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をドメインとして含む機能性タンパク質（例えば、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ（Ｍａｌ）、ＴＲＩＦ（ＴＩＣＡＭ−Ｉ）、ＴＲＡＭ（ＴＩＣＡＭ−ＩＩ）、ＳＡＲＭなど）を製造することが可能であり、このようなタンパク質も本発明の範囲に含まれるものとする。【００３０】
２．ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードする単離されたＤＮＡは、本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするヌクレオチド配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡとしては、配列番号７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、配列番号８のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシンがアラニンに置換されているアミノ酸配列）を有するＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）に相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、配列番号４のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列において、２３８番目のリシンがアラニンに置換されているアミノ酸配列）を有するＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）に相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、配列番号６のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列において、２６９番目のアルギニンがアラニンに置換されているアミノ酸配列）を有するＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）に相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質をコードするＤＮＡなどを例示することができる。【００３１】
配列番号４、６又は８のアミノ酸配列を有するＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号４、６又は８のアミノ酸配列を有するＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）に相補的なＤＮＡの全部又は一部と少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Ｔｍ（プローブが標的ＤＮＡから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。１％のミスマッチによりＴｍが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと９５％以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、１％のミスマッチにつき、０．５〜１．５℃の間でＴｍが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、５ｘ  ＳＳＣ／５ｘデンハルト溶液／１．０％  ＳＤＳ中６８℃でハイブリダイズさせ、０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、３ｘ  ＳＳＣ中４２℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｎ．Ｙ．）ａｔ  Ｕｎｉｔ  ２．１０を参照されたい。【００３２】
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードする単離されたＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造することができる。
健常なヒトの血液リンパ球からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。ヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメイン（１４８−２９６）のコード領域（４４７塩基）をＰＣＲによって増幅する。得られたＰＣＲ産物が野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質をコードするＤＮＡである。野生型ＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質をコードするＤＮＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の一例をそれぞれ配列番号２および１に示す。【００３３】
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、ＭｙＤ８８  ＴＩＲのコード領域（４４７塩基）を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。変異させたＭｙＤ８８  ＴＩＲのコード領域（４４７塩基）をＰＣＲによって増幅する。得られたＰＣＲ産物がＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡである。配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の一例を配列番号７、３及び５に示す。【００３４】
配列番号７のヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、配列番号８のアミノ酸配列において、２１４番目のリシンがアラニンに置換されているアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードする。
配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列において、２３８番目のリシンがアラニンに置換されているアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードする。
配列番号５のヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列において、２６９番目のアルギニンがアラニンに置換されているアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードする。【００３５】
３．組換えベクター
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の方法）により、本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。【００３６】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを付加してもよい。
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、ｐＧＥＸシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、ｐＥＴ  ＣＢＤ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３４ｂ−３８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＥＴ  Ｄｓｂ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３９ｂ  ａｎｄ  ４０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＥＴ  ＧＳＴ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４１  ａｎｄ  ４２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などを例示することができる。【００３７】
組換えベクターを遺伝子ワクチン（プラスミドワクチン・ウイルスベクターワクチン）として使用する場合には、すでに遺伝子ワクチン用に開発されているプラスミドベクター又はウイルスベクター（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎＴＭ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ等：ＶｉｒｏＭｅｄｉｃａ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に標的遺伝子を導入してワクチンを作製するとよい。【００３８】
４．形質転換体
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞、Ｓｆ細胞など）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、植物細胞などを例示することができる。【００３９】
組換えベクターを宿主に導入するには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。【００４０】
形質転換体を培地で培養し、培養物からＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質を採取することができる。ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、ＦａｃｔｏｒＸａや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質を得ることができる。【００４１】
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。【００４２】
５．医薬組成物
本発明は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質若しくはその塩又は前記ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、Ｔｏｌｌ様受容体及びＩＬ−１／１８シグナル伝達に関与する疾患、具体的には、ＬＰＳが誘発する疾患（例えば、エンドトキシンショック、ＳＩＲＳ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の予防及び／又は治療に用いることができる。本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質は、ＩＬ−１８シグナル伝達は阻害しないが、ＬＰＳによるＴＬＲ４シグナル伝達は阻害することができるので、本発明の医薬組成物は、ＩＬ−１８による細胞性免疫機能を保持したまま、ＬＰＳによる直接のエンドトキシンショック等の病態発症を抑えるのに効果的である。【００４３】
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質をコードするＤＮＡはベクターに組み込まれていてもよい。
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体及びその塩、前記ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ、並びに前記ＤＮＡを含有するベクターは前述の通りである。【００４４】
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体若しくはその塩、前記ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含有するベクターは、例えば、ＰＢＳなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与されるとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、不活化剤、保存剤、アジュバント、乳化剤など）などを添加してもよい。ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体、前記ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含有するベクターは、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内などに投与することができ、また、経鼻、経口投与してもよい。ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含有するベクターを投与する場合には、遺伝子ワクチンの投与に適した製剤形態（例えば、水溶液、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）や導入方法（例えば、注射器、シリンジ、カテーテル、遺伝子銃などを用いる方法）などを採用するとよい。【００４５】
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体、前記ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含有するベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体を、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含有するベクターを投与する場合には、例えば、通常、成人一人当たり０．１〜１００ｍｇ、好ましくは、１〜１０ｍｇの投与量で少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。ベクターがウイルスの場合には、成人一人当たり１０９〜１０１４ウイルス粒子、好ましくは１０１１〜１０１２ウイルス粒子の投与量で少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。上記の投与量は適宜変更しうる。【００４６】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。【００４７】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわちＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。【００４８】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。投薬単位の製剤中における有効成分の含量は、製剤の種類により異なるが、通常１〜１００重量％であり、好ましくは５０〜１００重量％である。
また、上記の医薬組成物は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体若しくはその塩、前記ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体をコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡを含有するベクターとの配合により好ましくない相互作用を生じない限り、他の有効成分を含有してもよい。【００４９】
６．抗体
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩の検出及び／又は定量に利用することができる。
本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、本発明のＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩またはそのエピトープを含む断片を動物に投与することにより得られる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。【００５０】
ポリクローナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、動物に投与（免疫）を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。【００５１】
モノクローナル抗体は、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２０８：６９２−に記載されている、Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法により作製することができる。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞と融合させることによりモノクローナル抗体産生細胞を調製する。さらに、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ変異体タンパク質又はその塩と特異的に反応するが、他の抗原タンパク質とは実質的に交差反応しない抗体を産生する細胞系を単離するとよい。この細胞系を培養し、培養物から所望のモノクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。【００５２】
一本鎖抗体を作製する技法は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
ヒト化抗体を作製する技法は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，１１２１−，１９９２；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，１６９−，１９９２に記載されている。【００５３】
７．スクリーニング方法
本発明は、インターロイキン１８作用を特異的に修飾する薬剤をスクリーニングする方法であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲの２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と前記薬剤の候補物質との結合の有無を調べることを含む前記方法も提供する。【００５４】
本明細書において、「インターロイキン１８作用を特異的に修飾する」とは、インターロイキン１８受容体の発現しているほ乳類細胞において、インターロイキン１８による転写因子の活性化及び、その結果としてのサイトカイン産生（特にインターフェロンγ）等の細胞の反応量の増減を意味する。インターロイキン１８作用を特異的に修飾するか否かは、インターロイキン１８受容体の発現しているほ乳類細胞において、細胞培養培地中にインターロイキン１８を添加し、細胞を刺激することによる転写因子ＮＦ−κＢの活性化やインターフェロンγの産生量を測定することにより、調べることができる。例えば、インターロイキン１８受容体の発現しているほ乳類細胞において、細胞培養培地中にインターロイキン１８と薬剤の候補物質を添加し、細胞を刺激することによる転写因子ＮＦ−κＢの活性化やインターフェロンγの産生量を測定し、薬剤の候補物質を添加しなかった場合と比較して、転写因子ＮＦ−κＢの活性化やインターフェロンγの産生量が変化していれば、その候補物質はインターロイキン１８作用を特異的に修飾すると判定することができる。【００５５】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲの２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と前記薬剤の候補物質との結合の有無を調べるには、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、中性子回折などの立体構造解析、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などの複合体の形状を観察する方法や配列番号２のアミノ酸配列からなるＭｙＤ８８  ＴＩＲの立体構造に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式をコンピュータでシミュレートするドッキングスタディなどの手法などを用いることができる。【００５６】
候補物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）などを例示することができる。
インターロイキン１８作用を特異的に修飾する薬剤は、クローン病や関節リウマチ、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、劇症肝炎などの疾患の予防及び／又は治療に利用することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５８】
〔実施例１〕
材料および方法
サンプルの調製
ヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメイン（１４８−２９６）をコードする遺伝子は、ヒトリンパ球からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成し、さらにＰＣＲ法を利用して増幅した。これをｐＧＥＸ−５Ｘ−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）プラスミドベクター中にクローン化した。このプラスミドを大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。この大腸菌のシングルコロニーを選択し、安定同位体元素で標識した栄養豊富な増殖培地（Ｓｉｌａｎｔｅｓ）に接種した。Ａ６００が０．４５−０．５に達するまで大腸菌を３７℃で培養した。次に培養物の温度を２５℃まで下げ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭとなるように添加することによりタンパク質発現を誘導した。誘導１６時間後に４℃で６，０００ｘｇで１０分間遠心して集菌し、細胞ペレットを精製まで−８０℃で保存した。この細胞ペレットを溶菌バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ；０．４Ｍ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．０５％  ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｒｏｃｈｅ）］に再懸濁し、超音波処理によって溶菌した。細胞破砕物および不溶物を遠心（４℃、６，０００ｘｇ、１０分間）により除去した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現したＭｙＤ８８のＴＩＲドメインをまずアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた消化によりＧＳＴタグを除去した。次に、ＧＳＴタグとＭｙＤ８８のＴＩＲドメインに分離したタンパク質をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ  ２６／６０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ：６．０）（１５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＤＴＴ含有）を用いてゲル濾過した。ＭｙＤ８８タンパク質の単量体性ＴＩＲドメインをプールし、１０ｋＤａ  Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過により濃縮した。Ｍｏｎｏ−Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製を行った。この精製プロトコールを用いて、１５Ｎで標識した、および１３Ｃ、１５Ｎで二重標識した、ＭｙＤ８８タンパク質の野生型ＴＩＲドメインを調製した。タンパク質収量は、栄養豊富な増殖培地１リットルから約１．０ｍｇであった。これらのタンパク質サンプルは凝集体を形成する傾向があるように思われたので、これらのタンパク質のサンプルバッファーを２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ：６．０）（０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，５０ｍＭ重水素化Ｌ−アルギニンおよび５０ｍＭ重水素化Ｌ−グルタミン酸含有）と置換した（引用文献＃１）。最終的にＮＭＲ実験に用いたタンパク質サンプルの最終濃度は、約０．３ｍＭであった。【００５９】
ＮＭＲ分光法
全てのＮＭＲスペクトルは、ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００またはＤＲＸ８００分光計を用いて２５℃で記録した。タンパク質の主鎖および側鎖１Ｈ，１３Ｃおよび１５Ｎ共鳴の帰属を決定するため、三重共鳴ＮＭＲを実施した。構造計算のための距離拘束は、３Ｄ  １５Ｎ  ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹおよび３Ｄ  １３Ｃ  ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ実験（混合時間１５０ｍｓｅｃ）より得た。ＮＭＲＰｉｐｅソフトウエアパッケージ（引用文献＃２）を用いてＮＭＲスペクトルをプロセシングし、Ｓｐａｒｋｙ（引用文献＃３）を用いて分析した。１Ｈ−１５Ｎ定常状態ヘテロＮＯＥ値を得るために用いたパルスシーケンスは、以前に記述されている（引用文献＃４）。【００６０】
定常状態の１Ｈ−１５ＮヘテロＮＯＥ値は、実験開始に先立って、３秒間の１Ｈ飽和（ａ  ｔｈｒｅｅ−ｓｅｃｏｎｄ１Ｈ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）を有する及び有しないスペクトルを記録することにより決定した。ＮＯＥ測定のため、合計６４のスキャンを行い、データを積算した。全てのデータはＮＭＲＰｉｐｅを用いてプロセシングし、Ｓｐａｒｋｙを用いてピーク強度を計測した。定常状態ＮＯＥ値は、プロトン飽和を有するピーク強度と有しないピーク強度の比より決定した：ＮＯＥ＝Ｉｓａｔ／Ｉｕｎｓａｔ。【００６１】
構造計算
自動化されたＮＯＥＳＹクロスピーク帰属および反復構造計算は、ＣＹＡＮＡバージョン２．１を用いて実施した（引用文献＃５）。１３Ｃ  ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹおよび１５Ｎ  ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルのピークピッキング（ｐｅａｋ−ｐｉｃｋｉｎｇ）は、Ｓｐａｒｋｙを用いて実施した。あいまいでないＮＯＥＳＹクロスピークを手作業で帰属し、距離拘束としてＣＹＡＮＡによる構造計算に含めた。手作業で帰属決定したＮＯＥ値は、強い、中程度の、および弱いＮＯＥクロスピーク強度にそれぞれ対応する３つの距離範囲１．８−２．７オングストローム（ＮＨプロトンを含むＮＯＥについては、１．８−２．９オングストローム）、１．８−３．３オングストローム（ＮＨプロトンを含むＮＯＥについては、１．８−３．５オングストローム）、および１．８−５．０オングストロームに分類された。水素結合拘束および二面角拘束もまたＣＹＡＮＡによる構造計算に含めた。水素結合拘束（ｒＮＨ−Ｏ＝１．８−２．２オングストロームおよびｒＮ−Ｏ＝２．２−３．３オングストロームである場合は、水素結合１個あたり２）は、ＮＯＥＳＹパターンに基づくタンパク質の標準的二次構造および主鎖の二次ケミカルシフトから作製された。主鎖二面角拘束（φおよびψ角度）は、３Ｄ  ＨＮＨＡ実験から得た３ＪＨＮα結合定数および主鎖ケミカルシフト分析プログラムＴＡＬＯＳに由来する（引用文献＃６）。【００６２】
ＮＯＥ帰属および構造計算手順の各サイクルにおいて、２００個のランダムな配座異性体を３０，０００ステップでアニーリングし、最も低い標的関数を有する２０個の配座異性体を次のＮＯＥ帰属サイクルに選択した。最後に、ＣＹＡＮＡプログラムにより作製された距離拘束を用いて、ＣＮＳバージョン１．１による構造精密化計算を行った（引用文献＃７）。作製した２００個の配座異性体のうち、全エネルギーが最も低い２０個の配座異性体を統計分析に用いた（表１）。【００６３】
ラマチャンドランプロットは、プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ−ＮＭＲ（引用文献＃８）を用いて計算した。表面静電ポテンシャルは、ソフトウエアＭＯＬＭＯＬ  ２Ｋ．２（引用文献＃９）を用いて計算した。【００６４】
細胞およびベクターの調製
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞２９３ＦＴをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入し、また２９３−ｈＴＬＲ４Ａ−ＨＡ細胞をＩｎｖｉｖｏｇｅｎより購入した。これらの細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｐｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース含有Ｄ−ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。全ての細胞は３７℃で５％  ＣＯ２の混合気下でインキュベートした。Ｎ末端にｃ−ｍｙｃタグを付加したＭｙＤ８８のＴＩＲドメイン（１４６−２９６）をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１＋ｐｌａｓｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローン化した。ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの突然変異させた配列は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて作製し、配列分析をして突然変異の存在を確認した。Ｃ末端にＡＵ１タグを付加したＩＬ−１８ＲβおよびＭＤ２をコードする遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｐｌａｓｍｉｄベクターにクローン化した。４個のｋＢ結合部位を含むｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）であるＮＦ−κＢルシフェラーセレポーターベクター、およびｐｃＤＮＡ３−Ｒｌｕｃである細胞数を補正するためのコントロールルシフェラーゼベクターは、Ｓｅｗｏｎ  Ｋｉ博士および古久保哲朗教授（横浜市立大学）から寄贈を受けた。【００６５】
作製したＭｙＤ８８  ＴＩＲの突然変異の説明は以下の通りである。極性残基からアラニンへ：全ての荷電アミノ酸（Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，ＡｒｇおよびＨｉｓ）をそれぞれアラニンに置換した。Ｐｈｅ２８５，Ｔｒｐ２８６からＡｌａへ：Ｐｈｅ２８５およびＴｒｐ２８６は保存されたＢｏｘ（ボックス）３配列中に存在し、機能的に重要であることが示唆されているので（引用文献＃１０、１１）、アラニンに置換した。ＭｙＤ８８のＰｒｏ２００からＨｉｓへ：マウスＴＬＲ４のＴＩＲドメインのこの位置における点突然変異（Ｐｒｏ７１２Ｈｉｓ：Ｌｐｓｄ突然変異）は宿主のリポ多糖（ＬＰＳ）への免疫応答にとって決定的であることが示されたので（引用文献＃１２）、この置換体を作製した。ＴＬＲ２のＴＩＲドメインにおけるこの部位のプロリンの重要性もまた指摘されている（引用文献＃１３）。【００６６】
一過性トランスフェクションおよびＮＦ−κＢレポーター遺伝子ルシフェラーゼアッセイ
ＭｙＤ８８  ＴＩＲの機能的アミノ酸を検索するため、本発明者らはＨＥＫ２９３細胞系を用いて、ＮＦ−κＢの活性化がレポータータンパク質ルシフェラーゼの発現と結びついているアッセイ系を設計した。ＩＬ−１８またはＬＰＳを用いた刺激の結果、細胞中のＮＦ−κＢはＭｙＤ８８の下流で活性化され、これは細胞中にルシフェラーゼの発現をもたらす。ＭｙＤ８８は、Ｎ末端ｄｅａｔｈドメインおよびＣ末端ＴＩＲドメインを含んでなる。ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインのみが単独で外因性に発現されると、それは内因性ＭｙＤ８８と競合してＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−１８ＲおよびＴＬＲと相互作用することが可能であり、細胞中でドミナントネガティブな阻害剤として働くことが知られている（引用文献＃１４）。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞または２９３−ｈＴＬＲ４Ａ−ＨＡ細胞を１．０×１０５個／ｍＬの密度で６−ウエルプレートＳＵＭＩＬＯＮ  ＣＥＬＬＴＩＧＨＴ  Ｃ−１（ＳＵＭＩＴＯＭＯ  ＢＡＫＥＬＩＴＥ）に播いた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用方法に従って用いて、１．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋コントロールベクターまたは１．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ｍｙｃ−ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメイン野生型または突然変異体、１．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ＩＬ−１８Ｒβ−ＡＵ１または１．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ＭＤ２−ＡＵ１、０．５μｇのＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターベクター、および０．１μｇのｐｃＤＮＡ３−Ｒｌｕｃをトランスフェクションした。全てのプラスミドベクターは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。１２時間後、各培養培地を組換えＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍＬ：本研究室で自作したもの（引用文献＃１５））またはＬＰＳ  Ｏ１２７（１．０μｇ／ｍＬ，ＳＩＧＭＡ）を含有する新鮮な培地と交換し、６時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、受動的溶菌バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて集菌した。Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性化アッセイを実施した。そして、ＴＥＣＡＮ  ＩＮＦＩＮＩＴ  ２００マルチウェルプレートリーダーを用いて、これらのルシフェラーゼ活性を測定した。ＮＦ−κＢ依存性ホタル・ルシフェラーゼ活性を細胞数で補正するためのコントロールの活性（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性）に対して規準化した。コントロール、野生型およびＭｙＤ８８の全て突然変異体について、これらの各アッセイを４回以上実施した。このレポーターアッセイにおいて観察されたドミナントネガティブ抑制作用の喪失は、アラニンまたはヒスチジン置換によって引き起こされたタンパク質の不安定性によるものでも起こりうる。これらの可能性を除外するため、本発明者らは次に突然変異体タンパク質の発現レベルをチェックした。同量のタンパク質を含む細胞抽出物をＬｏｗｒｙ法によってチェックし、そしてＭｙＤ８８  ＴＩＲタンパク質の全突然変異体は培養細胞中におけるそれらの発現レベルを、抗ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたウエスタンブロッティングによって確認した。ＥＣＬ−ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および発光撮影機ＡＥ６９７０ＣＰ（ＡＴＴＯ）によって検出を実施した。ｍｙｃタグを付加したＭｙＤ８８タンパク質の定量には、濃度測定スキャニングを用いた。そして、細胞中で発現が乏しいものはこれらのアッセイから除外した。また、決定された構造情報から考えて側鎖がこのタンパク質表面に露出され得ないアミノ酸残基もこれらのアッセイから除外した。これらの実験に用いた全ての試薬およびサンプルは、Ｅｎｄｏｓｐｅｃｙ  ＥＳ−２４Ｓ（生化学工業）を用いてエンドトキシン汚染をチェックした。これらの実験に用いた全ての装置は、パイロジェンを含んでいなかった。【００６７】
統計学的分析
ＮＦ−κＢレポーター遺伝子ルシフェラーゼアッセイにおける野生型と各突然変異体群との間の有意差は、ダネットの多重比較検定によって分析した。Ｐ＜０．０５で統計学的に有意と推定した。【００６８】
アミノ酸配列分析
ＭｙＤ８８タンパク質の等電点（ｐＩ）は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒ．９．０（Ａｃｃｅｒｌｙｓ）を用いて計算した。ＭａｃＶｅｃｔｏｒに含まれているＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖｅｒ．１．４プログラムをを用いて得た、ＭｙＤ８８、ＩＬ−１受容体ファミリーおよびＴＬＲファミリー間の配列アライメントを図１に示す。相同性および同一性スコアもまた、このプログラムを用いて計算した。【００６９】
シクロヘキシミドを用いた、ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメイン突然変異体のタンパク質発現および安定性の評価
トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞１．０×１０５個／ｍＬの密度で６−ウエルプレートに播いた。１．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋コントロールベクターまたは１．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１＋ｍｙｃ−ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメイン野生型または突然変異体を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてトランスフェクションした。２４時間後、各培養培地を２５μｍｏｌ／Ｌシクロヘキシミドを含有する新鮮な培地と交換し、３７℃で、５％  ＣＯ２の混合気下で、０または４８時間インキュベートした（引用文献＃１６）。これらの細胞を、ＣｙｔｏＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。細胞抽出物の全タンパク質濃度をＬｏｗｒｙ法によって決定した。同量のタンパク質を含む細胞抽出物を、抗ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたウエスタンブロッティングでチェックした。ＥＣＬ−ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および発光撮影機ＡＥ６９７０ＣＰ（ＡＴＴＯ）を用いて検出を実施し、Ｍｙｃタグを付加したＭｙＤ８８タンパク質の発現量を評価した。【００７０】
結果
溶液ＮＭＲを用いたＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの構造決定
ＴＩＲドメイン間の配列保存は、３個の短いモチーフ（図１のＢｏｘ１、２および３２９）に絞られ、そしてこれらのモチーフに焦点をあてた機能研究が各ＴＩＲドメインについて行われている（引用文献＃１０、１１、１７、１８、１９、２０）。ＴＩＲドメインの構造的コアは、保存された（Ｆ／Ｙ）ＤＡアミノ酸モチーフから始まる（引用文献＃１９）。本研究においては、溶液ＮＭＲによる構造決定のために、ヒトＭｙＤ８８の残基１４８−２９６からなる構築物が作製された。ヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメイン（残基１５７−２９６）の立体構造を図２に示す。最も低い全エネルギーを有する２０個の構造の統計値を表１に要約する。上記２０個の構造の主鎖重原子（Ｎ、ＣαおよびＣ’）の距離二乗平均根偏差値（ｒｍｓｄ）は０．４５オングストロームである（残基１５７−１８５、１８８−１９４および２０３−２９５を用いて重ね合わせた）。Ｎ末端の９個のアミノ酸（１４８−１５６）は、この領域における中程度〜長距離範囲のＮＯＥＳＹクロスピークの欠失によって示される、ランダムコイル傾向を示した。よって、これらの残基は図から除外した。２Ｄ  １Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペルトルにおいて、Ｇ２０１を除くＤ１９５からＣ２０３までの残基についてアミドクロスピークが欠失しており、これはＢＢ−ループと対応している（図１）。側鎖プロトンの一部が観察され、このＢＢ−ループ領域に帰属されたが、ＮＯＥＳＹクロスピークの数は不十分で、この領域については構造収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）が比較的悪かった。１Ｈ−１５Ｎヘテロ核ＮＯＥ実験は、これらの欠失した残基Ｇ２０１、Ｖ２０４およびＳ２０６の近くに存在する残基のアミド基が比較的低いＮＯＥ値を示す（それぞれ０．６７、０．５５および０．６７）ことを示した。これは、ＢＢ−ループがおそらく堅固なコンホメーションをとっておらず、溶液状態では緩やかに構造が保たれていることを意味する（図２Ａ）。【００７１】
ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの構造説明および他のＴＩＲとの比較
ＭｙＤ８８  ＴＩＲ（１５７−２９６）の構造は、４本のαヘリックス（αＡ−αＣ、およびαＥ）に囲まれた、中心部に位置する５本のストランドからなるパラレルβシート（βＡ−βＥ）を構成する。予測されたように、全体的な折りたたみは、以前に決定されたＴＩＲドメインの結晶構造と本質的に同一であった（ＰＤＢコード：１ＦＹＶ，１ＦＹＷおよび１Ｔ３Ｇ）（図２Ｂ）。ＭｙＤ８８  ＴＩＲは、他のＴＩＲタンパク質と比較して、ＴＬＲ２  ＴＩＲのアミノ酸配列と最も相同性が高い（ＭｙＤ８８  ＴＩＲおよびＴＬＲ２  ＴＩＲ間の同一性スコアは２２％で、相同性スコアは４８％である）。図２Ｃおよび２Ｄは、ＭｙＤ８８  ＴＩＲおよびＴＬＲ２  ＴＩＲを重ね合わせて表したものである（ＰＤＢコード：１ＦＹＷ）。βシートコアの構造は、相互に類似している（この部分の主鎖Ｎ、ＣαおよびＣ’に対するｒｍｓｄ値は０．９０オングストロームである）が、いくつかの領域では注目すべき非類似性が示された。ＢＢ−ループ（ＭｙＤ８８  ＴＩＲのＳｅｒ１９４−Ｃｙｓ２０３）およびそれに続くαＢまでの残基には、大きな構造的不一致が存在する（図２Ｄ）。ＭｙＤ８８およびＴＬＲ２の両方においてＢＢ−ループは溶液に露出されているが、ループが向いている方向は大きく異なる。これは、ＭｙＤ８８のαＢに先行する残基（ＭｙＤ８８のＴｒｐ２０５−Ｓｅｒ２０９）の構造的相違によって主として引き起こされる。これらの残基は、ＭｙＤ８８において伸長されたβストランド様構造をとっているが、他方ＴＬＲ２において対応する残基はαヘリックス（αＢ）内に存在し、ＭｙＤ８８のαＢを有意に短くしている。このβストランドは、ＢＢ−ループをＴＬＲ２  ＴＩＲにおいて見られる方向とは全く異なる方向へ向けることになる。【００７２】
この伸長されたβストランドは、１５Ｎ  ｅｄｉｔｅｄ  ３Ｄ  ＮＯＳＥＹスペクトルにおけるクロスピークのパターンによって十分支持される。この３Ｄ  ＮＯＳＥＹスペクトルにおいて、一連のＮＯＥクロスピークの強度（Ｈα（ｉ）からＨＮ（ｉ＋１））は、残基内強度（Ｈα（ｉ）からＨＮ（ｉ））よりも有意に強かった。ＣαおよびＣβのケミカルシフト値もまた、この二次構造を支持した。【００７３】
ＭｙＤ８８はＴＬＲ２に存在するαＤヘリックスの代わりに長いループ（ＤＤ−ＤＥロングループ）を有する。配列アライメントにおいて、αＤが存在する領域に多数のギャップが見い出されたため、αＤの欠失は予測された。（図１）。しかし、この長いループには、αヘリックスに類似した短いヘリックスコイルコンホメーション（Ｐ２６５−Ｉ２７１）が存在する。【００７４】
ＴＩＲドメインの表面特性の比較：ＭｙＤ８８  ＴＩＲおよび他のＴＩＲ
図３は、ＴＩＲドメインの表面静電ポテンシャルを示す。ＭｙＤ８８  ＴＩＲの全体的な蛋白構造の折りたたみは他のＴＬＲ  ＴＩＲドメインに類似しているにもかかわらず、表面静電ポテンシャルには顕著な相違が見られる。特に、ＭｙＤ８８  ＴＩＲのＢｏｘ３には大きな陽性ポテンシャル領域が認められる。実際、ＭｙＤ８８（１４８−２９６）ＴＩＲドメインの計算された等電点（ｐＩ）は９．２５（全長ＭｙＤ８８では５．７９）なので、このドメイン自体が陽性に荷電されている。ＭｙＤ８８は細胞の細胞質に存在する（引用文献＃２１）。ＭｙＤ８８  ＴＩＲの大きい陽性ポテンシャル領域は、このドメインが陰性に荷電された細胞膜を標的とするのを容易にするであろう。それは、シグナルリガンドがＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８Ｒ／ＴＬＲ等の膜受容体と結合したときに、このドメインがそれら膜受容体と結合するのを促進するであろう。Ｂｏｘ３とは対照的に、ＢＢ−ループを含むＢｏｘ２領域は、狭い陰性ポテンシャルに覆われる領域を形成している。【００７５】
ＮＦ−κＢ活性化アッセイ
ＭｙＤ８８  ＴＩＲの機能に関する洞察を得るため、本発明者らはＩＬ−１８およびＬＰＳで刺激した後にＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイを実施した。本発明者らは、以前に刊行されたデータに基づいて、ｍｙｃ−ＭｙＤ８８  ＴＩＲに単一アミノ酸置換を組織的に導入し、ＩＬ−１８またはＬＰＳ刺激後のルシフェラーゼ活性を定量した。ＮＦ−κＢ活性は、細胞中のＭｙＤ８８の機能に対する突然変異の作用を反映するであろう。選択された２５個の荷電極性アミノ酸と３個の疎水性アミノ酸からなるアラニン置換突然変異体を評価した（表２）。ＩＬ−１８を用いたＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を図４Ａに示す。この図に示すように、ドミナントネガティブ遺伝子をトランスフェクトしなかった対照細胞では、ＩＬ−１８刺激の結果、ルシフェラーゼ活性が約３倍に増大した。対照的に、野生型ｍｙｃ−ＭｙＤ８８  ＴＩＲを細胞中で過剰発現させると、ＮＦ−κＢ活性の重大な増加は見られず、これは当該タンパク質のドミナントネガティブ阻害作用を示している。いくつかの突然変異体（例えば、Ｒ１９６Ａ，Ｋ２３８Ａ，Ｒ２８８Ａ）は、ＮＦ−κＢ活性の重大な増加を示した。これは、ドミナントネガティブ阻害作用の喪失を意味し、突然変異させた残基のタンパク質−タンパク質相互作用における重要性を示している。突然変異体のドミナントネガティブ阻害作用は、統計学的分析により野生型と各変異体とを比較してから有意と判定された。ＭｙＤ８８は一般に、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８Ｒ／ＴＬＲシグナル伝達およびさらに多種類の分子（ただし、ＭｙＤ８８に結合可能なＩＲＦファミリー等のＴＩＲドメイン含有受容体を除く）にリクルートされる（引用文献＃２２、２３、２４）。【００７６】
ひとつの分子が複数の蛋白と相互作用可能であることおよびそのようなシグナル多様性の土台をなす機構は、非常に興味深い。ＩＬ−１８の場合と同様に、ＬＰＳ／ＴＬＲ４シグナル伝達もまたＭｙＤ８８によって媒介され、ＮＦ−κＢ活性化をもたらす。それゆえ、本発明者らのレポーターアッセイ系をＴＬＲ４シグナル伝達の研究に適用することができる。レポーターアッセイの結果を図４Ｂに示す。ドミナントネガティブ阻害作用は、ＩＬ−１８で刺激した場合もＬＰＳで刺激した場合も、突然変異体Ｒ１９６Ａ、Ｄ１９７Ａ（ＢＢ−ループの突然変異）、Ｒ２１７Ａ（ＢＣ−ループ）およびＫ２８２Ａ、Ｒ２８８Ａ（αＥ）において共通して消失した。さらに、ＩＬ−１８に特異的なドミナントネガティブ阻害作用の消失は、Ｋ２１４Ａ（ＢＣ−ループ）、Ｋ２３８Ａ（αＣ’）およびＲ２６９Ａ（ＤＤ−ＤＥ長ループ）に観察された。これらのレポーターアッセイの結果およびＴＩＲタンパク質の機能に関する以前のリポートを以下に要約する。【００７７】
Ｂｏｘ１：保存されたＢｏｘ１領域は、ＩＬ−１８およびＴＬＲ４シグナル伝達の両方において重要な役割を果たすものではない。なぜなら、レポーターアッセイにおいて何ら重要な変化が検出されなかったからである。最近、ＩＲＦ−１／４／５とのある相互作用が、この領域を含むＭｙＤ８８の一部分について報告された（引用文献＃２２、２３、２４）。この領域はＮＦ−κＢではなく、インターフェロン産生のシグナル伝達系に寄与しているのかもしれない。また、Ｂｏｘ１領域に隣接して、Ｒ２１７Ａは顕著なドミナントネガティブ阻害作用の喪失を示し、機能的に重要である。【００７８】
Ｂｏｘ２（ＢＢ−ループおよびＰｒｏ２００）：初期の研究は、ＴＬＲのＴＩＲドメインのＢＢ−ループに存在する保存されたプロリンの重要性を示した（引用文献＃１２、１８）。Ｌｉらもまた、ＭｙＤ８８のＢｏｘ２における突然変異が、ＴＩＲドメインを介する同型なＭｙＤ８８オリゴマー化を阻止したと報告している（引用文献＃１０）。ＢＢ−ループの重要性は、本発明者らのレポーターアッセイで確認された。なぜなら、Ｒ１９６ＡおよびＤ１９７Ａにおいて重大な効果が観察されたからである（図５Ａ）。また、この領域がＴＩＲドメイン蛋白の機能に重要であることを示唆する情報として、ＴＬＲ２のＡｒｇ６７７（ＭｙＤ８８のＲ１９６に対応する）は、ハンセン病患者においてＴｒｐに変わることが見い出されたからである（引用文献＃１３）。ＭｙＤ８８  ＴＩＲのＢＢ−ループ領域の構造は、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２のＴＩＲドメインの結晶構造に見られるものとは全く異なっていた（図２Ｃおよび２Ｄ）。ＮＭＲ実験は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインのＢＢ−ループにおけるフレキシビリティーの存在を提案した。このことが当該ドメインに機能的多様性をもたらすのかもしれない。なぜなら、フレキシブルな構造は、相互作用のパートナーに比較的広い特異性を許すからである。実際、ＭｙＤ８８  ＴＩＲは多数の異なるＴＩＲドメインと相互作用することが知られている。Ｐ２００Ｈ突然変異の効果もまた、われわれの研究で試験した。興味深いことに、この突然変異はＩＬ−１８シグナル伝達に特異的に影響するが（Ｒ．Ｌ．Ｕ．値：ｍｅａｎ±ｓ．ｄ．，１．７９±０．２１）、ＴＬＲ４シグナル伝達には影響しない（Ｒ．Ｌ．Ｕ．値：ｍｅａｎ±ｓ．ｄ．，１．２４±０．２６）。このことは、この保存されたプロリンが、ＴＩＲタンパク質間の相互作用に必要ではあるが十分ではないことを意味する。ＢｒｏｗｎおよびＤｕｎｎｅは、このプロリンがＴＩＲ相互作用に常に必須な訳ではないと述べた（引用文献＃１７、２５）。【００７９】
αＢ  ａｎｄ  ＢＣ  ｌｏｏｐ：この領域に存在する数個のアミノ酸の重要性もまたＲｏｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（引用文献＃２０）によってＴＬＲ４  ＴＩＲについて提案されている。この領域では、ＭｙＤ８８の詳細な構造は、他のＴＩＲ構造と比較して特徴的である。αＢヘリックスは他のＴＩＲ構造と比較して短く（構造説明の項を参照）、そしてこのヘリックスに続くＢＣ−ループはより長い。本発明者らはＢＣ−ループ領域で、Ｋ２１４Ａ、Ｒ２１５ＡおよびＲ２１７Ａについてアラニン置換変異体を作製した。この領域で、Ｋ２１４ＡはＩＬ−１８シグナル伝達に特異的な効果を示した。Ｒ２１７Ａは、上記刺激の両方に対して重大な効果を示した。古典的には、Ｂｏｘ１、Ｂｏｘ２およびＢｏｘ３と呼ばれるＴＩＲドメインの間で保存されたアミノ酸配列は、ＴＩＲドメインの機能的に重要な部位であると言われていた。Ｒ２１７は、Ｂｏｘ１のＦ／ＹＤＡモチーフを構成するＤ１６２の隣接アミノ酸であるが、本発明者らはこのＢＣ−ループ領域が、ＭｙＤ８８  ＴＩＲの新しい相互作用部位の１つであることを決定した。さらに、この領域におけるこれらのアミノ酸の選択性は、ＭｙＤ８８と直接相互作用する膜受容体におけるアミノ酸残基の違いに由来するかもしれない。【００８０】
αＣ’：ＴＬＲ２のＢＢ−ループ、αＣ’およびＤＤ−ループに突然変異を数個導入すると、ペプチドグリカンによって刺激されたＮＦ−κＢ活性が失われると報告されている（引用文献＃２６）。さらに、ヒトＩＬ−１ＲＡＰＬのＴＩＲドメインの二量体構造において、ＴＬＲ２のＣｙｓ７１３に対応するＳｅｒ４８８は、二量体界面の中心に位置する他の一量体の等価なＳｅｒ４８８’と堅固な水素結合を形成する（引用文献＃２７）。本発明者らの研究において、αＣ’におけるＫ２３８からＡｌａへの置換の効果は、ＩＬ−１８シグナル伝達に特異的な効果を示し、ＬＰＳシグナル伝達には影響しなかった（図５）。ただし、Ｋ２３１Ａ、Ｅ２３２ＡおよびＤ２３４ＡはＮＦ−κＢ活性の重大な効果を示すことが出来なかった。【００８１】
αＤ：他のＴＩＲドメインのαＤに対応するαヘリックスは、ＭｙＤ８８  ＴＩＲには認められなかった。このヘリックスの欠如は、ＴＩＲドメインの配列アライメント（図１）によれば驚くにあたらない。このアライメントでは、βＤとβＥ間の領域の多数のギャップが見い出される。ＤＤ−ＤＥロングループのＡｒｇ２６９をＡｌａに置換した場合、ドミナントネガティブ作用の喪失がＩＬ−１８刺激に特異的に観察されたが、ＬＰＳ刺激に対しては観察されなかった（図５Ｂ）。ＴＬＲ２において同じ部分に相当するＡｒｇがＧｌｎに置換された突然変異は、ブドウ球菌感染に対する免疫不全を引き起こすことが報告されている（引用文献＃２８）。【００８２】
Ｂｏｘ３（αＥ  ｈｅｌｉｘ）：αＥもまた、ＴＩＲドメインの間でアダプター−アダプターおよび受容体−受容体オリゴマー化を媒介することが報告されている（引用文献＃１０、１１）。αＥに含まれる極性残基をアラニンに置換させた場合（Ｋ２８２ＡおよびＲ２８８Ａ）、本発明者らの研究ではＩＬ−１８刺激およびＬＰＳ刺激の両方とも重大な効果をきたした（図５）。Ｆ２８５およびＷ２８６はＴＩＲドメインの間で保存されており、ＦＷモチーフと呼ばれている。このＦＷモチーフにおけるアラニン置換は二量体形成にとって決定的であると以前に報告されていることは注目に値する。しかし、Ｆ２８５Ａはレポーターアッセイにおいて、ドミナントネガティブ作用に対して何ら影響を示さなかった（Ｒ．Ｌ．Ｕ．値：ｍｅａｎ±ｓ．ｄ．，ＩＬ−１８：１．０４±０．１０，ＬＰＳ：１．１７±０．１３）。そして、本発明者らはＷ２８６について全く情報を得ることができなかった。なぜなら、Ｗ２８６Ａ変異体タンパクは細胞中で非常に不安定だったからである。本発明者らは、シクロヘキシミド法を用いて、Ｗ２８６Ａタンパク質発現レベルおよび安定性を確認した（図６）。【００８３】
考察
ＴＬＲ  ＴＩＲおよびＭｙＤ８８  ＴＩＲの構造
ＴＩＲドメインは、典型的には１３５〜１６０アミノ酸によって構成される。ＴＩＲドメイン間の配列保存は一般に２０から３０％の間であり、そして保存された残基のほとんどは、５本のストランドからなるパラレルβシートによって構成される疎水性コア内に存在する。その長さの違い、およびＴＩＲドメイン間のアミノ酸配列におけるかなりの変化は、このドメインの構造的および機能的多様性を示唆する。現在、ＴＩＲドメインについて３つの構造（ＴＬＲ１，ＴＬＲ２およびＩＬ−１ＲＡＰＬ）が入手可能であるが、これらはすべて受容体のものである。本研究は、細胞アダプタータンパク質由来のＴＩＲドメインの最初の構造決定である。ＭｙＤ８８  ＴＩＲは、受容体ＴＩＲに対しかなりの類似性を示す（図２Ｃおよび２Ｄ）。しかし、「結果」の項に記述したように、構造には相違点が認められる。ＢＢ−ループに認められる構造上の不一致は、顕著でかつ興味深い（図２Ｄ）。これはＴＩＲドメインの機能的多様性を意味する。なぜなら、多数の研究がこれらの領域（Ｂｏｘ２に対応する（引用文献＃１０、１１、１８、１９、２０））の機能的重要性を提案しているからである。他の構造不一致領域（αＢ，ＢＣ−ループおよびＤＤ−ＤＥ長ループ）もまた、機能的に重要である。さらに、ＭｙＤ８８  ＴＩＲの表面における大きい陽性荷電領域の存在は興味をそそるものであり、これはＭｙＤ８８の機能と関連しているのかもしれない。【００８４】
ＭｙＤ８８のマルチ相互作用部位およびＭｙＤ８８  ＴＩＲ：ＩＬ−１８  ｖｓ  ＬＰＳ／ＴＬＲ４  ＭｙＤ８８に関して示された受容体特異的シグナル伝達
ＭｙＤ８８は、細胞中のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８Ｒ／ＴＬＲ媒介シグナル伝達経路に通常使用されている。しかし、細胞の応答はどの受容体が刺激されたかによって異なる。したがって、ＭｙＤ８８のもとで細胞の運命を分ける、ある種の作用機構が存在するはずである。ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１８Ｒ／ＴＬＲ媒介シグナル伝達におけるＭｙＤ８８のシグナル伝達機構を解明する目的で、本発明者らは培養細胞を用いてＭｙＤ８８の機能分析を実施した。その結果に基づいて、本発明者らはＩＬ−１８刺激およびＬＰＳ刺激の両方にとって重要な数個の残基を同定することができた。図５においては、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ構造の表面にレポーターアッセイの結果がマッピングされている。この図には荷電残基のみをマッピングしたことに注意されたい。緑色に着色したアミノ酸残基は、ＩＬ−１８およびＬＰＳシグナル伝達に重要であると判断された。茶色に着色したアミノ酸残基は、活性に何ら影響を及ぼさない残基を示す。３つの相互作用部位（保存されたＢｏｘ２、Ｂｏｘ３およびＢＣ−ループの終末）は、ＩＬ−１８およびＬＰＳ／ＴＬＲ４経路の両方で同定された。さらに、ＩＬ−１８シグナル伝達において１つの特異的な表面が同定された。ＢＣ−ループの一部、αＣ’ヘリックスおよびＤＤ−ＤＥロングループは、ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの分子表面でごく近位に存在した。ＴＬＲ２  ＴＩＲに関する別の研究もまた、Ｃ７１３Ｓ、Ｌ７１７Ｅ（これらはαＣ’に存在する）およびＲ７４８Ｅ、Ｒ７４８Ｓ（これらはＤＤループに存在する）がＮＦ−κＢ活性をダウンレギュレーションすることを示した。その著者らは、このダウンレギュレーションは変異導入によって引き起こされるこの領域でのＴＬＲ２ホモ二量体化の抑制によるものであると提案した（引用文献＃２６）。本発明者らのレポーターアッセイは、これらの報告とよく一致した。αＣ’近傍に群がる３個の塩基性残基（Ｌｙｓ２１４，Ｌｙｓ２３８，およびＡｒｇ２６９）は、ＩＬ−１８シグナルに対して重大な効果を示した。しかし、これらの残基はＬＰＳ−ＴＬＲ４シグナル伝達には関与しない。本発明者らは、ＩＬ−１８またはＬＰＳに対する特定の細胞応答は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの異なる相互作用表面と関連しているらしいと推定する。ＭｙＤ８８下のシグナル多様性の理由の一部は、この表面パッチに帰するかもしれない。【００８５】
本研究において、本発明者らは溶液ＮＭＲ分光法を用いて、ヒトＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの溶液構造を決定した。これは、細胞アダプター分子のＴＩＲドメインとして初めて明らかにされた構造である。本発明者らはまた、培養細胞系を用いてＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの機能アッセイを実施した。これらのデータは、このドメインの保存されたＢｏｘ１、Ｂｏｘ２およびＢｏｘ３領域は、ＩＬ−１８およびＬＰＳ経路の両方にとって重要な相互作用部位であることを明らかにするものである。さらに、αＣ’およびその近傍に群がる３個の塩基性残基からなる１つの表面は、もっぱらＩＬ−１８シグナル伝達のために機能しており、ＴＬＲ４シグナル伝達のためには機能しない。最近、ＩＬ−１８の広範な免疫調節機能（ＩＦＮ−γの誘導およびＴｈ１分化の増強のみならず、ＩｇＥ抗体の誘導およびアレルギー性反応との関連を含む（引用文献＃２９、３０、３１、３２、３３））が報告されている。特に興味深いのは、ＩＬ−１８シグナル伝達を正確にコントロールすることである。なぜなら、それは慢性炎症性疾患およびアレルギー性疾患の治療に寄与すると考えられるからである。本研究によりＭｙＤ８８について得られた構造情報および機能情報は、受容体とＭｙＤ８８との相互作用を調節することができる、免疫不全疾患のための薬剤の開発に寄与する。種々のＴＩＲドメインの複合体の構造決定に関して今後さらなる研究が期待される。さらに、ＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインと他の分子（ＩＲＦ−１，ＩＲＦ−４，ＩＲＦ−５およびＩＦＮ−γＲ１）との相互作用が最近報告されている（引用文献＃２２、２３、２４、３４）。これらの相互作用の解明もまた将来期待されている。【００８６】
【表１】
2009017255.tif 000003
【表２】
2009017255.tif 000004
【００８７】
〔引用文献〕
１．  Ｇｏｌｏｖａｎｏｖ，Ａ．Ｐ．，Ｈａｕｔｂｅｒｇｕｅ，Ｇ．Ｍ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓ．Ａ．＆  Ｌｉａｎ，Ｌ．Ｙ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６，８９３３−９（２００４）．
２．  Ｄｅｌａｇｌｉｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ＮＭＲＰｉｐｅ：ａ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＵＮＩＸ  ｐｉｐｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ  ６，２７７−９３（１９９５）．
３．  Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｔ．Ｄ．＆  Ｋｎｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９９）．
４．  Ｆａｒｒｏｗ，Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｆｒｅｅ  ａｎｄ  ａ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ−Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−２  Ｄｏｍａｉｎ  Ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  Ｎ−１５  Ｎｍｒ  Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，５９８４−６００３（１９９４）．
５．  Ｇｕｎｔｅｒｔ，Ｐ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＮＭＲ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＹＡＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７８，３５３−７８（２００４）．
６．  Ｃｏｒｎｉｌｅｓｃｕ，Ｇ．，Ｄｅｌａｇｌｉｏ，Ｆ．＆  Ｂａｘ，Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｎｇｌｅ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ  １３，２８９−３０２（１９９９）．
７．  Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ＆ＮＭＲ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４，９０５−２１（１９９８）．
８．  Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，Ｒｕｌｌｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．Ｃ．，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｋａｐｔｅｉｎ，Ｒ．＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．ＡＱＵＡ  ａｎｄ  ＰＲＯＣＨＥＣＫ−ＮＭＲ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｓｏｌｖｅｄ  ｂｙ  ＮＭＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｍｒ  ８，４７７−４８６（１９９６）．
９．  Ｋｏｒａｄｉ，Ｒ．，Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．ＭＯＬＭＯＬ：Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  １４，５１−＆（１９９６）．
１０．  Ｌｉ，Ｃ．，Ｚｉｅｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．＆  Ｈａｗｉｇｅｒ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＩＬ１ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，２６１５２−９（２００５）．
１１．  Ｊｉａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔａｉｌｓ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａｄａｐｔｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，１０９６１−６（２００６）．
１２．  Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＬＰＳ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒｍｉｃｅ：ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｌｒ４  ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０８５−８（１９９８）．
１３．  Ｋａｎｇ，Ｔ．Ｊ．＆  Ｃｈａｅ，Ｇ．Ｔ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＴＬＲ２）ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅｐｒｏｍａｔｏｕｓ  ｌｅｐｒｏｓｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３１，５３−８（２００１）．
１４．  Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＩＬ−１−ａｎｄ  ＩＬ−１８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，１４３−５０（１９９８）．
１５．  Ｋａｔｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １０，９６６−７１（２００３）．
１６．  Ｆｕｋａｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＡＴＭ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９４，１９９８−２００６（１９９９）．
１７．  Ｄｕｎｎｅ，Ａ．，Ｅｊｄｅｂａｃｋ，Ｍ．，Ｌｕｄｉｄｉ，Ｐ．Ｌ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．＆  Ｇａｙ，Ｎ．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｏｒｓ  Ｍａｌ  ａｎｄ  ＭｙＤ８８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，４１４４３−５１（２００３）．
１８．  Ｘｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，１１１−５（２０００）．
１９．  Ｓｌａｃｋ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍａｊｏｒ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，４６７０−８（２０００）．
２０．  Ｒｏｎｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３，２５４３−５５（２００３）．
２１．  Ｎｉｓｈｉｙａ，Ｔ．，Ｋａｊｉｔａ，Ｅ．，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ａ．＆  Ｍｉｗａ，Ｓ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＴＩＲ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ＴＩＲ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＭｙＤ８８．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（２００７）．
２２．  Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ＩＲＦ−４．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，１５９８９−１５９９４（２００５）．
２３．  Ｔａｋａｏｋａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＲＦ−５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３４，２４３−９（２００５）．
２４．  Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＩＦＮ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ＭｙＤ８８  ｉｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，１５１３６−４１（２００６）．
２５．  Ｂｒｏｗｎ，Ｖ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ａ．，Ｏｚｉｎｓｋｙ，Ａ．，Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ，Ｊ．Ｒ．＆  Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６，７４２−５３（２００６）．
２６．  Ｔａｏ，Ｘ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｂｅｇ，Ａ．Ａ．＆  Ｔｏｎｇ，Ｌ．Ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ７１３Ｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＩＲ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＴＬＲ２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９９，２１６−２１（２００２）．
２７．  Ｋｈａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．＆Ｔｏｎｇ，Ｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１ＲＡＰＬ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，３１６６４−７０（２００４）．
２８．  Ｌｏｒｅｎｚ，Ｅ．，Ｍｉｒａ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｋ．Ｌ．，Ａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｃ．＆  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ａ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８，６３９８−４０１（２０００）．
２９．  Ｈｉｄｅｎｏｒｉ  Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｚ．Ｋ．，Ｍｉｚｕｈｏ  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｏｓａｍｕ  Ｆｕｋｕｔｏｍｉ，＆  Ｒｙｏｓｕｋｅ  Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．Ｔ．ａ．Ｎ．Ｋ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ５２，１２３−１３０（２００３）．
３０．  Ｔａｎａｋａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−１８  ｍｉｇｈｔ  ｒｅｆｌｅｃｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｌｄ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｒａｔｅ  ａｓｔｈｍａ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７，３３１−６（２００１）．
３１．  Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−１８  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＩｇＥ／ｓｔａｔ６  ｕｎｄｅｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１１３４０−５（２００２）．
３２．  Ｐｉｚａｒｒｏ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−１８，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２，６８２９−３５（１９９９）．
３３．  Ｇｒａｃｉｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＩＬ−１８  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４，１３９３−４０１（１９９９）．
３４．  Ｓｕｎ，Ｄ．＆  Ｄｉｎｇ，Ａ．ＭｙＤ８８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｍＲＮＡ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，３７５−８１（２００６）．
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、抗エンドトキシンショック療法の一つとしての臨床応用の可能性がある。
また、本発明は、研究目的の遺伝子試薬として、Ｔｏｌｌ様受容体及びＩＬ−１／１８シグナル伝達の研究を行う上で有益である。
さらに、タンパク立体構造に基づいた変異導入部分の情報は、ＩＬ−１８作用を特異的に修飾する創薬ターゲットとしても有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２３８Ａのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２３８Ａのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｒ２６９Ａのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｒ２６９Ａのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２１４Ａのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、ＭｙＤ８８  ＴＩＲ  Ｋ２１４Ａのアミノ酸配列を示す。
［配列表］
2009017255.tif 000005
2009017255.tif 000006
2009017255.tif 000007
2009017255.tif 000008
【図１】
2009017255.tif 000009
【図２Ａ】
2009017255.tif 000010
【図４Ａ】
2009017255.tif 000011
【図４Ｂ】
2009017255.tif 000012
【図２Ｂ】
2009017255.tif 000013
【図２Ｃ】
2009017255.tif 000014
【図２Ｄ】
2009017255.tif 000015
【図３】
2009017255.tif 000016
【図５Ａ】
2009017255.tif 000017
【図５Ｂ】
2009017255.tif 000018
【図６】
2009017255.tif 000019
【図７】
2009017255.tif 000020
【図８】
2009017255.tif 000021
【国際調査報告】
2009017255.tif 000022
2009017255.tif 000023
2009017255.tif 000024
2009017255.tif 000025
2009017255.tif 000026