(57)【要約】  フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素を用いて、ポテンショメトリーによる電位測定を行うことを特徴とする溶液中のグルコースの定量方法であり、糸状菌由来で、特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、または、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のグルコース脱水素酵素を用いて定量する事が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素を用いて、ポテンショメトリーによる電位測定を行うことを特徴とする溶液中のグルコースの定量方法。
【請求項２】
グルコース脱水素酵素が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
グルコース脱水素酵素が、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法：
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項５】
グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、少なくともアミノ酸置換が、Ｋ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、Ｓ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ａ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｑ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｌ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｔ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｙ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ａ１６６Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｍ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｐ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｆ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ａ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｅ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｓ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｔ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ３２９Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｄ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｌ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｖ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれかの位置におけるアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項４に記載のグルコースの定量方法。
【請求項６】
グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、１６３位、１６７位、５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項７】
グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、少なくともアミノ酸置換がＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれかの位置におけるアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項６に記載のグルコースの定量方法。
【請求項８】
グルコース脱水素酵素が、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上を示すことを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項９】
グルコース脱水素酵素が、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上を示すことを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項１０】
グルコース脱水素酵素が糸状菌由来であることを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項１１】
糸状菌がペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属することを特徴とする請求項１０に記載のグルコースの定量方法。
【請求項１２】
糸状菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）に属することを特徴とする請求項１１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項１３】
金属電極が絶縁基板上に形成されてなる印刷電極を用いて、フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素の溶液中の液間電位を測定することにより、グルコース反応を検出することを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項１４】
メディエーターによる電子移動がグルコース反応の検出に介在することを特徴とする請求項１３に記載のグルコースの定量方法。
【請求項１５】
ポテンショメトリーによる電位測定を行うための酵素反応組成物であって、組成物に含まれるフラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素が、以下のいずれか１つ以上の要件を満たすことを特徴とする酵素反応組成物：
（１）ＧＯＯＤ緩衝液に溶解されてなる；
（２）トリエタノールアミン、トリシン、イミダゾール及びコリジンよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物と共存されてなる；
（３）ハロゲン化合物と共存されてなる。
【請求項１６】
ＧＯＯＤ緩衝液が、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳ、ＢＥＳ、ＡＤＡ、ＰＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｉｒｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ及びＨＥＰＰＳＯからなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項１５に記載の酵素反応組成物。
【請求項１７】
ハロゲン化合物として、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、及びフッ化ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも１種の化合物が共存されてなることを特徴とする請求項１５に記載の酵素反応組成物。
【請求項１８】
グルコース脱水素酵素が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１５に記載の酵素反応組成物：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
グルコース脱水素酵素が、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１５に記載の酵素反応組成物：
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２０】
金属電極上にアルカンチオールもしくは親水性高分子を介して、グルコース脱水素酵素が共有結合により固定化されてなり、グルコース反応を電気化学的に検出することを特徴とするグルコース測定用電気化学センサー。
【請求項２１】
金属電極が絶縁基板上に形成されてなることを特徴とする請求項２０に記載のグルコース測定用電気化学センサー。
【請求項２２】
金属電極が円形であることを特徴とする請求項２０に記載のグルコース測定用電気化学センサー。
【請求項２３】
金属電極の半径が２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項２２に記載のグルコース測定用電気化学センサー。
【請求項２４】
親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする請求項２０に記載のグルコース測定用電気化学センサー。
【請求項２５】
グルコースを作用させることにより生じる電流変化を測定することを特徴とする請求項２０に記載のグルコース測定用電気化学センサー。
【請求項２６】
グルコース脱水素酵素が１ｍＭの１，１０−フェナントロリン存在下で活性が３０％以上阻害されることを特徴とする請求項１に記載のグルコースの定量方法。
【請求項２７】
グルコース脱水素酵素が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項２６に記載のグルコースの定量方法：
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２８】
グルコース脱水素酵素が、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に由来することを特徴とする請求項２６に記載のグルコースの定量方法。
【請求項２９】
グルコース脱水素酵素が、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）に由来することを特徴とする請求項２６に記載のグルコースの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学的な方法により溶液中のグルコースを定量するための方法に関する。より詳細には、フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素を用いて溶液内の電極間の電位を測定することによりグルコース量を測定する方法、グルコース量を測定するためのグルコース脱水素酵素組成物に関する。
本発明はまた、電気化学的な方法によりグルコースを定量するための電気化学センサーに関する。より詳細には、グルコース脱水素酵素が金属電極上に共有結合により固定化されてなるグルコース測定用電気化学センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースの迅速測定としては、最も広く知られている目的としては、糖尿病患者の血糖値測定が挙げられる。また、一般産業界においても、食品工業などの分野では品質管理などの目的で、グルコース量を迅速かつ簡便に測定する技術が求められている。【０００３】
近年、糖尿病の発症率は年々増加傾向にあり、更にその予備軍といわれる潜在的な人の数も併せると、国内だけでも１０００万人以上の数になるといわれている。また、生活習慣病への関心が非常に高まってきていることもあり、血糖値のきめ細かな自己測定が行われる機会や必要性も多くなっている。こうした時代背景において、血糖自己測定モニター（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）のための技術開発は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖の測定技術に関しては、従来から多くの方法が報告されており、また実用化もなされている。ＳＭＢＧのための基本手法としては、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングによる方法が有利である。【０００４】
一般的に定着してきている血糖測定のためのセンシングの手法としては、グルコースを基質とする酵素を利用したセンサー技術が多数知られている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサー用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサーにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーター（電子受容体）を介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。【０００５】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．５．２（旧 ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサー用酵素として用いられている（特許文献１及び２）。これらは溶存酸素の影響を受けない点や反応が速い点では優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼは安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねる可能性があるという欠点がある。そこで、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型のグルコース脱水素酵素が着目されるようになってきた。【０００６】
特許文献３にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する）が開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。また、該ＦＡＤＧＤＨをグラッシーカーボン電極に固定化して、電流測定によりグルコースを測定する方法が開示されている。こうした酵素電極を用いた電気化学的な測定方法は一般的に広く用いられている方法ではあるが、酵素の固定化状態のコントロールが非常に困難であることが最大のネックであり、したがって、再現性よくデータを取得することが難しいという問題がある。【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５１２０４７号公報
【特許文献２】特開２０００−１７１４２８号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０５８９５８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素を用いたセンサー技術により、簡便な操作で、再現性よく迅速に安定したデータを得ることを可能にした、グルコースの定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。【００１０】
（１）フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素を用いて、ポテンショメトリーによる電位測定を行うことを特徴とする溶液中のグルコースの定量方法。
（２）グルコース脱水素酵素が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする（１）のグルコースの定量方法：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（３）グルコース脱水素酵素が、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることを特徴とする（１）のグルコースの定量方法：
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（４）グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有することを特徴とする（１）のグルコースの定量方法。
（５）グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、少なくともアミノ酸置換が、Ｋ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、Ｓ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ａ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｑ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｌ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｔ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｙ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ａ１６６Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｍ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｐ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｆ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ａ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｅ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｓ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｔ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ３２９Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｄ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｌ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｖ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれかの位置におけるアミノ酸置換を有することを特徴とする（４）のグルコースの定量方法。
（６）グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、１６３位、１６７位、５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有することを特徴とする（１）のグルコースの定量方法。
（７）グルコース脱水素酵素が、配列番号２において、少なくともアミノ酸置換がＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれかの位置におけるアミノ酸置換を有することを特徴とする（６）のグルコースの定量方法。
（８）グルコース脱水素酵素が、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上を示すことを特徴とする（１）のグルコースの定量方法。
（９）グルコース脱水素酵素が、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上を示すことを特徴とする（１）のグルコースの定量方法。
（１０）グルコース脱水素酵素が糸状菌由来であることを特徴とする（１）のグルコースの定量方法。
（１１）糸状菌がペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属することを特徴とする（１０）のグルコースの定量方法。
（１２）糸状菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）に属することを特徴とする（１１）のグルコースの定量方法。
（１３）金属電極が絶縁基板上に形成されてなる印刷電極を用いて、フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素の溶液中の液間電位を測定することにより、グルコース反応を検出することを特徴とする（１）のグルコースの定量方法。
（１４）メディエーターによる電子移動がグルコース反応の検出に介在することを特徴とする（１３）のグルコースの定量方法。
（１５）ポテンショメトリーによる電位測定を行うための酵素反応組成物であって、組成物に含まれるフラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素が、以下のいずれか１つ以上の要件を満たすことを特徴とする酵素反応組成物：
（１）ＧＯＯＤ緩衝液に溶解されてなる；
（２）トリエタノールアミン、トリシン、イミダゾール及びコリジンよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物と共存されてなる；
（３）ハロゲン化合物と共存されてなる。
（１６）ＧＯＯＤ緩衝液が、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳ、ＢＥＳ、ＡＤＡ、ＰＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｉｒｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ及びＨＥＰＰＳＯからなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする（１５）の酵素反応組成物。
（１７）ハロゲン化合物として、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、及びフッ化ナトリウムよりなる群から選択される少なくとも１種の化合物が共存されてなることを特徴とする（１５）の酵素反応組成物。
（１８）グルコース脱水素酵素が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする（１５）の酵素反応組成物：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１９）グルコース脱水素酵素が、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることを特徴とする（１５）の酵素反応組成物：
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（２０）金属電極上にアルカンチオールもしくは親水性高分子を介して、グルコース脱水素酵素が共有結合により固定化されてなり、グルコース反応を電気化学的に検出することを特徴とするグルコース測定用電気化学センサー。
（２１）金属電極が絶縁基板上に形成されてなることを特徴とする（２０）のグルコース測定用電気化学センサー。
（２２）金属電極が円形であることを特徴とする（２０）のグルコース測定用電気化学センサー。
（２３）金属電極の半径が２ｍｍ以下であることを特徴とする（２２）のグルコース測定用電気化学センサー。
（２４）親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする（２０）のグルコース測定用電気化学センサー。
（２５）グルコースを作用させることにより生じる電流変化を測定することを特徴とする（２０）のグルコース測定用電気化学センサー。
（２６）グルコース脱水素酵素が１ｍＭの１，１０−フェナントロリン存在下で活性が３０％以上阻害されることを特徴とする（１）のグルコースの定量方法。
（２７）グルコース脱水素酵素が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする（２６）のグルコースの定量方法：
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（２８）グルコース脱水素酵素が、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に由来することを特徴とする（２６）のグルコースの定量方法。
（２９）グルコース脱水素酵素が、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）に由来することを特徴とする（２６）のグルコースの定量方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明における方法を用いることにより、簡便な操作でかつ再現性もよく、溶液中のグルコース濃度を定量することができる。血糖値センサーへの適用はもとより、食品分析の関係でも、非常に有用なものとして期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】グルコース脱水素酵素を用いた場合の、グルコースのセンシングに関する化学反応のスキームを示す図である。
【図２】実施例１において測定された、グルコースの添加による電位変化を測定した結果を示す図である。
【図３】実施例１において測定された、定常電位のグルコース濃度に対する検量線を示す図である。
【図４】実施例１における測定結果の再現性を検討した結果を示す図である。
【図５】実施例２において測定された、グルコースの添加による電位変化を測定した結果を示す図である。
【図６】実施例２において測定された、定常電位のグルコース濃度に対する検量線を示す図である。（Ａ）１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合（Ｂ）１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合
【図７】実施例２における測定結果の再現性を検討した結果を示す図である。
【図８】実施例３において測定された、グルコースの添加による電位変化を測定した結果の一例を示す図である。
【図９】実施例３において、各種添加剤の共存した条件において測定された、定常電位のグルコース濃度に対する検量線を示す図である。
【図１０】実施例４において、各種添加剤の共存した条件において、キシロースとの反応選択性を検討した結果を示す図である。
【図１１】実施例５において測定された、グルコースの添加による電位変化を測定した結果の一例を示す図である。
【図１２】実施例５において、各種添加剤の共存した条件において測定された電位変化を示す図である。
【図１３】実施例６において測定された、グルコースの添加による電位変化を測定した結果を示す図である。
【図１４】実施例６において測定された、定常電位のグルコース濃度に対する検量線を示す図である。
【図１５】実施例６における測定結果の再現性を検討した結果を示す図である。
【図１６】実施例７〜９で用いた電極の写真を示す図である。
【図１７】実施例７において、各フェロシアン化カリウム溶液／フェリシアン化カリウム溶液の比率と電位との関係をプロットした図である。
【図１８】実施例８において、ポテンショメトリーを行った結果を示す図である。
【図１９】実施例９において、ポテンショメトリーを行い、グルコース濃度と電位との関係をプロットした図である。
【図２０】（Ａ）実施例１０および１１で用いた電極の写真を示す図である。（Ｂ）実施例１０および１１において、金電極上に溶液をマウントした状態を示す写真である。
【図２１】実施例１０において、アンペロメトリーを行った結果を示す図である。
【図２２】実施例１１において、アンペロメトリーを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、フラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素を用いることを特徴とする。フラビンは、ジメチルイソアロキサジンの１０位に置換基をもつ一群の誘導体であり、フラビン分子種を補酵素とする酵素であれば特に限定されるものではない。フラビン化合物としては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などが挙げられるが、ＦＡＤが特に好ましい。【００１４】
グルコース脱水素酵素は、メディエーター（電子受容体）の存在下で、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。図１にセンシングに関するスキームを示した。ＦＡＤ依存型のグルコース脱水素酵素がグルコースに作用するに、補酵素ＦＡＤはＦＡＤＨ２となるが、メディエーターとしてフェリシアン化物（例えば、「Ｆｅ（ＣＮ）６」３−）を存在させると、ＦＡＤＨ２はこれをフェロシアン化物（この場合、「Ｆｅ（ＣＮ）６」４−）へと変換し、自らはＦＡＤへと戻る。フェロシアン化物は電位を与えると、電子を電極に渡してフェリシアン化物へと戻るので、こうした電子伝達物質をメディエーターとすることにより、電気化学的なシグナル検出が可能になる。【００１５】
本発明において用いられるグルコース脱水素酵素の起源は特に限定されないが、糸状菌由来のものが好ましく、なかでも、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するものが例示される。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に由来するものが特に好ましく、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）に由来するものが更に好ましい。グルコース脱水素酵素は天然に由来するものを抽出・精製して得てもよいし、これらの遺伝子情報に基づき、公知の遺伝子工学的な手法により生産されたものであっても構わない。【００１６】
本発明において用いられるグルコース脱水素酵素は、具体例としては、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列（５９３アミノ酸残基）からなるものが挙げられる。アミノ酸配列としては、配列番号１と完全に一致するものだけに限定されるものではなく、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質も包含するものである。【００１７】
本発明において用いられるグルコース脱水素酵素は、熱安定性に優れるものが特に好ましい。具体的には、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上を示すものが挙げられる。好ましくは５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が４０％以上、より好ましくは５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が８０％以上を示すものが挙げられる。【００１８】
本発明において用いられるグルコース脱水素酵素は、ｐＨ安定性に優れるものが特に好ましい。具体的には、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上を示すものが挙げられる。好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が９０％以上を示すものが挙げられる。【００１９】
上述したような熱安定性やｐＨ安定性を付与するために、配列番号１のアミノ酸配列を基本として遺伝子工学的な手法を駆使して、変異導入することも好ましい。例えば、配列番号１からシグナルペプチドを切断した配列番号２のアミノ酸配列を用いるのがよい。変異の導入は公知の方法を適用して行うことができる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。【００２０】
例えば、熱安定性を向上されたグルコース脱水素酵素としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有するものが例示される。上記のうち、１６２位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有するものが例示される。【００２１】
より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、Ｓ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ａ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙからなる群から選ばれるものが例示される。ここで、「Ｋ１２０Ｅ」は、１２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。【００２２】
特に、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換が好ましい態様として例示される。【００２３】
また、ｐＨ安定性の向上されたグルコース脱水素酵素としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１６３位、１６７位、５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有するものが挙げられる。より具体的には、配列番号２において、少なくともアミノ酸置換がＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれかの位置におけるアミノ酸置換を有するものが例示される。【００２４】
なお、本発明において用いられるグルコース脱水素酵素に関しては、変異導入の基本となる配列は、配列番号２に示したアミノ酸配列と完全に一致するものに限定されるものではなく、配列番号２のアミノ酸配列との高い相同性のアミノ酸配列を有する他のアスペルギルス・オリゼ由来のグルコース脱水素酵素を、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を変異する場合も含む。具体的には、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を示す場合が挙げられる。【００２５】
本発明において、酵素反応に用いる溶液の種類の選択は、グルコース脱水素酵素の反応性や安定性の点で非常に重要である。
本発明に用いるグルコース脱水素酵素は、以下のいずれか１つ以上の要件を満たすことを特徴とするものであっても良い。
（１）ＧＯＯＤ緩衝液に溶解されてなる。
（２）トリエタノールアミン、トリシン、イミダゾール及びコリジンよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物と共存されてなる
（３）ハロゲン化合物と共存されてなる。【００２６】
酵素反応に用いる溶液の種類の選択は、グルコース脱水素酵素の反応性や安定性の点で非常に重要である。本発明においては、特にＧＯＯＤの緩衝液を用いることを特徴とする。ＧＯＯＤの緩衝液は、生化学の領域で頻繁に用いられているもので、Ｚｗｉｔｔｅｒ  ｉｏｎ構造をもつ各種のアミノエタンスルホン酸、アミノプロパンスルホン酸誘導体をもちいるものである。以下のような特長を有する。
（１）水に良く溶け、濃厚な緩衝液が作成できる、
（２）生体膜を透過しにくい、
（３）酸解離平衡が濃度、温度、イオン組成の影響を受けにくい、
（４）金属イオンとの錯形成能が小さい、
（５）化学的に安定で、再結晶による高純度精製が可能、
（６）可視、紫外部に吸収を持たないために、目的成分の検出が容易である【００２７】
ＧＯＯＤの緩衝液の種類としては、例えば、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳ、ＢＥＳ、ＡＤＡ、ＰＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｉｒｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＥＰＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯなどが例示される。ＧＯＯＤの緩衝液の種類は、特に限定されるものではないが、特にＰＩＰＥＳが好ましい。緩衝液のｐＨとしては４．０〜９．０程度が好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは５．５〜７．５程度である。濃度としては、１〜２００ｍＭ程度が好ましく、より好ましくは１０〜１５０ｍＭ程度、更に好ましくは２０〜１００ｍＭ程度である。また、酵素反応液においては、保存安定性を向上させるために、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、フタル酸、イミダゾール、トリエタノールアミン、コリジンおよびそれらの塩などを、必要に応じて共存させてもよい。また、糖類を添加することも可能である。【００２８】
本発明においては、グルコース脱水素酵素の反応組成中に、トリエタノールアミン、トリシン、イミダゾール及びコリジンよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物と共存されてなることを特徴とする。これらの化合物を共存されることにより、定量性、及び基質選択性が向上するものである。また、グルコース脱水素酵素の基質特異性、特にキシロースに対する反応選択性が向上されるという効果もある。これらの添加は、それぞれ単独で行ってもよいし、いくつかを併せて共存させてもよい。【００２９】
酵素反応に用いる溶液の種類は、特に限定されるものではないが、ＰＢＳのようなリン酸緩衝液、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝液等が例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０以上９．０以下程度が好ましく、より好ましくは５．０以上８．０以下程度、更に好ましくは５．５以上７．５以下程度である。濃度としては、１ｍＭ以上２００ｍＭ以下程度が好ましく、より好ましくは１０ｍＭ以上〜１５０ｍＭ以下程度、更に好ましくは２０ｍＭ以上１００ｍＭ以下程度である。【００３０】
本発明においては、グルコース脱水素酵素の反応組成中に、ハロゲン化合物と共存されてなることを特徴とする。ハロゲン化合物とは、ハロゲン原子である臭素、塩素、ヨウ素、フッ素を含有する化合物のことであり、この構造は特に限定されるものではない。ハロゲン原子としては、ヨウ素、フッ素を含有するものが特に好ましい。具体的な化合物としては、ヨード酢酸（ＭＩＡ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）などが例示されるが、特に限定されるものではない。共存させる濃度としては、１μＭから１０ｍＭ程度であり、１０μＭから１ｍＭ程度がより好ましい。これらの化合物を共存されることにより、特に酵素反応の初期速度を高めることが可能になり、測定の迅速性が向上するものである。これらの添加は、それぞれ単独でもよいし、いくつかを併せて共存させてもよい。【００３１】
酵素反応に用いる溶液の種類は、特に限定されるものではないが、リン酸緩衝液、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝液等が例示される。緩衝液のｐＨとしては４．０〜９．０程度が好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは５．５〜７．５程度である。濃度としては、１〜２００ｍＭ程度が好ましく、より好ましくは１０〜１５０ｍＭ程度、更に好ましくは２０〜１００ｍＭ程度である。【００３２】
本発明において用いられるフラビン化合物を補酵素として必要とするグルコース脱水素酵素は、１ｍＭの１，１０−フェナントロリン存在下で活性が３０％以上阻害されるものであってもよい。好ましくは１ｍＭの１，１０−フェナントロリン存在下で活性が４０％以上、更に好ましくは５０％以上阻害される事を特徴とする。１，１０−フェナントロリンは、遷移金属に対するキレート性配位子として用いられることが多い縮合芳香化合物であるが、本発明においては、１，１０−フェナントロリンにより阻害される性質を有するグルコース脱水素酵素を用いることが重要である。【００３３】
上記の、１ｍＭの１，１０−フェナントロリン存在下で活性が３０％以上阻害されるグルコース脱水素酵素の起源は特に限定されないが、糸状菌由来のものが好ましく、なかでも、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するものが例示される。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に由来するものが特に好ましく、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）に由来するものが更に好ましい。グルコース脱水素酵素は天然に由来するものを抽出・精製して得てもよいし、これらの遺伝子情報に基づき、公知の遺伝子工学的な手法により生産されたものであっても構わない。【００３４】
上記の、１ｍＭの１，１０−フェナントロリン存在下で活性が３０％以上阻害されるグルコース脱水素酵素は、具体例としては、例えば配列番号３に示されるアミノ酸配列（５６８アミノ酸残基）からなるものが挙げられる。アミノ酸配列としては、配列番号３と完全に一致するものだけに限定されるものではなく、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質も包含するものである。【００３５】
なお、上記の、１ｍＭの１，１０−フェナントロリン存在下で活性が３０％以上阻害されるグルコース脱水素酵素に関しては、変異導入の基本となる配列は、配列番号３に示したアミノ酸配列と完全に一致するものに限定されるものではなく、配列番号３のアミノ酸配列との高い相同性のアミノ酸配列を有する他のアスペルギルス・テレウス由来のグルコース脱水素酵素を、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を変異する場合も含む。具体的には、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を示す場合が挙げられる。【００３６】
本発明においては、電気化学的な測定手法のなかでも、特にポテンショメトリー（ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｙ）による電位測定を行うことを特徴とする。ポテンショメトリーとは、溶液の中に作用電極と参照電極を入れ、両電極間の電位差を測定することにより、参照電極に対する作用電極の電位を知ることによって、酵素反応が起こる系の物理・化学的な情報を得る方法をいう。溶液中のイオンや分子と電極電位との間にはＮｅｒｎｓｔの関係式が成立し、この関係式よりイオンや分子の同定ができ、更に溶液中のイオンや分子の濃度が変化すると電極電位も対応して変化するので、測定された電位の値から逆にイオンや分子の濃度を推定することができる。この方法は、溶液中での酵素反応を行った際の電位測定を行うことで足りるため、非常にシンプルな系であり、操作も簡単である。また、酵素電極を用いる測定法のように、酵素を固定化する必要がないので、それに要する手間が不要であるだけではなく、固定化状態の再現性の困難さを考慮する必要がなくなり、データを安定して再現性よく得ることができる点で非常に有用である。【００３７】
電位測定の方法は特に限定されないが、一般的なポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることができる。一般的なテスターを用いてもよい。測定システムとしては、三電極系であってもあってもよいが、通常は二電極のみで行うことが可能である。電極の種類も特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができる。作用電極としては、白金、金、グラッシーカーボン、カーボンペースト、ＰＦＣ（Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｆｏｒｍｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ）などを用いることができる。参照電極としては、飽和カロメル電極、銀−塩化銀などが用いられる。【００３８】
酵素反応に用いる溶液としては、特に限定されるものではないが、グルコース脱水素酵素の反応性や安定性の点で有利な組成の緩衝液を用いるのが好ましい。緩衝液の種類としては、例えば、リン酸、クエン酸、酢酸、ホウ酸、トリス、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳなどが例示される。ｐＨとしては４．０〜９．０程度が好ましく、より好ましくは５．０〜８．０程度、更に好ましくは５．５〜７．５程度である。濃度としては、１〜２００ｍＭ程度が好ましく、より好ましくは１０〜１５０ｍＭ程度、更に好ましくは２０〜１００ｍＭ程度である。酵素反応液においては、保存安定性を向上させるために、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、フタル酸、イミダゾール、トリエタノールアミン、コリジンおよびそれらの塩などを、必要に応じて共存させてもよい。また、糖類を添加することも可能である。【００３９】
電位測定の方法は、金属電極を有する印刷電極を用いて、グルコース脱水素酵素を用いたポテンショメトリーにより、溶液中のグルコースを測定する方法であってもよい。【００４０】
上記方法の場合、作用電極としては、白金、金、ニッケル、パラジウムなどの金属を用いることを特徴とする。金属電極を用いることにより、特に電子移動速度の速さの点で有利である。【００４１】
上記方法の場合、印刷電極は、金属電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものがより好ましい。また、本発明において、金属電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられる。【００４２】
上記方法の場合、印刷電極は、可能な限りで小スケールなものが好ましい。作用極である金属電極の面積としては、３〜５ｍｍ２程度であることが好ましい。作用極が円形の形状である場合には、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。【００４３】
本発明はまた、電気化学センサーに関するものであり、金属電極上にアルカンチオールもしくは親水性高分子を介してグルコース脱水素酵素が共有結合により固定化されてなり、かつ該固定化されたグルコース脱水素酵素に対する基質であるグルコースの反応を電気化学的に検出することを特徴とするものである。電気化学的に検出される方法は、特に限定されるものではないが、例えば、基質を作用させることによる酸化もしくは還元反応により生じる電流の変化をアンペロメトリーにより測定する方法が挙げられる。【００４４】
上記センサーにおいて、電気化学測定の方法は特に限定されないが、一般的なポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることができる。一般的なテスターを用いてもよい。測定システムとしては、二電極であっても三電極系であってもよい。本発明においては、作用電極には白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属を用いることを特徴とする。なかでも、金が特に好ましい。参照電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができるが、例えば飽和カロメル電極、銀−塩化銀などが挙げられる。【００４５】
チオール基は金属と特異的に反応して、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成することが知られている。作用電極に金属を用いると、この原理を適用して、容易に表面に官能基を導入することが可能になる。こうして、酵素の電極表面への固定化が可能になる。この固定化方法では、特に物理的な吸着による酵素の固定化と比較して、酵素の固定化密度をコントロールしやすくなり、再現性の点で有利になる。金属電極は、このように容易にＳＡＭ形成を行うことができる点で扱いやすいというメリットがある。【００４６】
本発明においては、金属電極上において、特にアルカンチオールもしくは親水性高分子を介してグルコース脱水素酵素が共有結合により固定化されていることを特徴とする。このような構成を有することで、酵素の安定性が向上するだけでなく、基質との反応性も向上することができる。したがって、精度の高い測定を実現することができるものである。【００４７】
アルカンチオールを用いる場合、炭素数が３〜２０程度のアルキル鎖の末端にチオール基を有するものが好ましい。そして、他方の末端に酵素を固定化するための官能基が導入されたものが好ましい。該官能基としては、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、スクシンミド基などが挙げられる。例えば、チオール基と官能基を併せ持ったアルカンチオールを架橋剤として用いると、１ステップで金属電極表面に官能基を導入することができる。【００４８】
本発明において、親水性高分子とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のＯＨ基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはＰＥＧである。【００４９】
こうした親水性高分子を介した形で、酵素を固定化するには、例えばＰＥＧを用いるのであれば、官能基等で修飾されたＰＥＧ誘導体を用いることが可能である。特に金属電極を用いる場合、チオール基を末端に有するＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。更には、蛋白質の一種である酵素をカップリングすることが可能であるような官能基を他方のＰＥＧ末端に有することがより好ましい。該官能基としては、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、スクシンミド基などが挙げられる。例えば、チオール基とスクシンミド基を併せ持ったＰＥＧ誘導体を架橋剤として用いると、１ステップで金属電極表面にスクシンミド基を導入することができる。また、チオール基とカルボキシル基を併せ持ったＰＥＧ誘導体を架橋剤として用い、水溶性カルボジミドを用いた縮合反応による固定化を行ってもよい。また、これらの場合のＰＥＧ架橋剤におけるエチレングリコールの繰り返しは、３〜２５程度の長さであることが好ましい。【００５０】
また、チオール基の場合、安定性が比較的劣るため、チオール基が保護されてなる架橋財、好ましくはＰＥＧ誘導体からなる架橋剤を簡単な化学的処理を行うことにより、チオール基を要時調製により形成させて、金属電極の表面処理を施してもよい。具体的には、Ｓ−アセチル基を末端に有する化合物が挙げられる。これを脱アセチル処理を施すことによりチオール基を形成することができる。より好ましくは、Ｓ−アセチル基とともにスクシンミド基も併せ持ったＰＥＧ誘導体を用いることが好ましい。【００５１】
本発明において、金属電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものがより好ましい。【００５２】
本発明において、金属電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられるが、円形であることが、固定化する酵素溶液のマウントのしやすさの点から特に好ましい。また、円形の形状である場合、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。酵素溶液の容量としては１〜５μｌ程度で十分であり、２−３μｌ程度の量で行うのがより好ましい。酵素溶液をマウントした後の固定化反応は、湿潤条件下で静置して行うのが好ましい。【００５３】
本発明においては、酵素反応と電極間の電子移動を仲介するためのメディエーター（電子受容体）を用いることも効果的である。適用できるメディエーターの種類は特に限定されるものではないが、フェリシアン化化合物、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどが例示される。別の表現方法で例示すると、電子対として、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシアン／フェロシアン、フェリシニウム／フェロセンなどが挙げられる。フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどを用いてもよい。その他にも、鉄以外の化合物を含んでなる各種錯体も用いることができる。例えばオスミウムやルテニウムなどの金属錯体を用いることも可能である。水溶性の低い化合物をメディエーターとして用いる場合、有機溶媒を用いると、酵素自体の安定性を損なったり、酵素活性を失活させてしまう可能性がある。そこで、水溶性を高めるために、ＰＥＧのような親水性高分子で修飾されたものを用いてもよい。反応系におけるメディエーター濃度は、１ｍＭから１Ｍ程度の範囲が好ましく、５ｍＭから５００ｍＭがより好ましく、１０ｍＭから３００ｍＭが更に好ましい。またメディ−ターについても種々の官能基による修飾体を用いて、酵素とともに金属電極上に固定化させて用いてもよい。【００５４】
酵素反応は、所望の容量の反応溶液中に、所望の量の酵素とメディエーターを加えて混合された状態において、基質を含有する試料溶液を所定量加えると同時に測定を開始する。電気化学的な検出とは、特に限定されるものではないが、酵素反応が進行するとメディエーターを介在した電子の移動に伴って生ずる電流の変化をシグナルとして測定することが好ましい。酵素反応が進行すると、電位が低下し始め、やがて定常化する。その定常化された電位の値がグルコース量に依存して変動する。測定に供する試料の種類は特に制約されるものではなく、酵素の基質を成分として含有する化含有する可能性のある水溶液はもとより、血液、体液、尿などの生体試料であってもよい。また、測定に際しては、酵素反応は、スターラー等を用いて、低速で攪拌しながら行うのが好ましい。また、可能な範囲で反応温度を一定にして行う方が好ましい。また、電位ができるだけ早く定常化するような酵素を用いることが好ましい。また、マイクロ流路デバイス等を用いた微量解析に展開することも可能である。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。【００５６】
［実施例１］
２ｍｌ容量のウォータージャケット型ガラスセル（ビー・エー・エス製）に、５００ｍＭ  フェリシアン化カリウム溶液２００μｌ（終濃度は１００ｍＭ）及び１０．６ｋＵ／ｍｌのＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素１１．４μｌ（１２０Ｕ分）を、１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を、後から加える１Ｍ  グルコース溶液の添加量を合わせて、総量が１．２ｍｌになるように加えて、スターラーでゆっくりと攪拌した。ＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素としては、配列番号２においてＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ変異を加えたものを用いた。ウォータージャケット部に恒温槽中で３０℃に保った水を循環させながら、温度を３０℃で一定にして酵素反応を行った。【００５７】
作用電極にはＰＴＥ白金電極（６．０×１．６ｍｍ；ビー・エー・エス製）、参照電極にはＲＥ−１Ｃ飽和ＫＣｌ銀塩化銀参照電極（ビー・エー・エス製）を用いた。これらの電極が上記溶液中に浸るようにセッティングして、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。そして、１Ｍ  グルコース溶液６，１２，２４，３６，４８μｌを加えて、それぞれの場合に、それと同時に電位の値の経時変化の測定を行った。反応系におけるグルコース濃度は、それぞれ５，１０，２０，３０，４０ｍＭとなる。グルコースを加えないブランク測定も実施した。測定した結果を図２に示した。酵素反応の進行により、電位が経時的に低下され、やがて一定になる様子が観察されている。基質であるグルコースの添加量が多くなるほど、電位の低下が大きくなることが確認される。【００５８】
図２において定常化された電位の値をグルコース濃度に対してプロットすることにより、検量線を作成した。結果を図３に示した。縦軸の電位の値は反応から３００秒の時点の値をプロットした。回帰計算処理を行ったところ、相関係数Ｒ２＝０．９５２９となり、４０ｍＭまでの広い濃度範囲において、非常に良好な相関性を示した。本発明の方法により、定常化される電位を測定することによって、溶液中のグルコース量を精度よく定量できることが示唆された。【００５９】
また、上述の測定に関する再現性の確認を行った。上述の測定を再度行った結果を図４に示した。その結果、図３とほぼ同じ検量線が得られ、再現性に非常に優れていることが確認された。【００６０】
同じＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を炭素電極に固定化してアンペロメトリーによる電流測定を、各種グルコース濃度で行い、キャリブレーションを試みた。しかし、この場合は、データの再現性が悪く、信頼性の高い結果を得ることはできなかった。【００６１】
［実施例２］
実施例１において、１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のかわりに、１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、同様に酵素反応を行った。【００６２】
実施例１と同様に、作用電極および参照電極をセッティングして汎用電気化学測定器に接続した。そして、１Ｍ  グルコース溶液２．４，４．８，７．２，９．６，１２，２４，３６，４８μｌを加えて、それぞれの場合に、それと同時に電位の値の経時変化の測定を行った。反応系におけるグルコース濃度は、それぞれ２，４，６，８，１０，２０，３０，４０ｍＭとなる。グルコースを加えないブランク測定も実施した。測定した結果を図５に示した。酵素反応の進行により、電位が経時的に低下され、やがて一定になる様子が観察されている。基質であるグルコースの添加量が多くなるほど、電位の低下が大きくなることが確認される。【００６３】
図５において定常化された電位の値をグルコース濃度に対してプロットすることにより、検量線を作成した。結果を図６（Ａ）に示した。縦軸の電位の値は反応から２００秒の時点の値をプロットした。回帰計算処理を行ったところ、相関係数Ｒ２＝０．９３８６となり、４０ｍＭまでの広い濃度範囲において、非常に良好な相関性を示した。本発明の方法により、定常化される電位を測定することによって、溶液中のグルコース量を精度よく定量できることが示唆された。【００６４】
また、１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに、１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、その他の条件は実施例１と同様にして検討を行った。得られた検量線を図６（Ｂ）に示した。この場合は、相関係数Ｒ２＝０．８６３となり、あまり良好な直線性は確認できなかった。【００６５】
また、上述の測定に関する再現性の確認を行った。上述の測定を再度行った結果を図７に示した。その結果、図６とほぼ同じ検量線が得られ、再現性に非常に優れていることが確認された。同じＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を炭素電極に固定化してアンペロメトリーによる電流測定を、各種グルコース濃度で行い、キャリブレーションを試みた。しかし、この場合は、データの再現性が悪く、信頼性の高い結果を得ることはできなかった。【００６６】
［実施例３］
実施例１において、更に、添加剤として、トリエタノールアミン、トリシン、イミダゾール、コリジンのいずれかを終濃度が７ｍＭになるように加えて、同様に酵素反応を行った。【００６７】
実施例１と同様に、作用電極および参照電極をセッティングして汎用電気化学測定器に接続した。そして、１Ｍ  グルコース溶液２．４，４．８，７．２，９．６，１２μｌを加えて、それぞれの場合に、それと同時に電位の値の経時変化の測定を行った。反応系におけるグルコース濃度は、それぞれ２，４，６，８，１０ｍＭとなる。グルコースを加えないブランク測定も実施した。例として、トリシンを加えた場合に測定した結果を図８に示した。酵素反応の進行により、電位が経時的に低下され、やがて一定になる様子が観察されている。基質であるグルコースの添加量が多くなるほど、電位の低下が大きくなることが確認される。グルコースを加えないブランク測定も実施したが、電位の変化は見られなかった。【００６８】
上記４種の添加剤の存在する条件で測定を行い、定常化された電位の値をグルコース濃度に対してプロットすることにより、検量線を作成した。結果を図９に示した。縦軸の電位の値は反応から１２０秒の時点の値をプロットした。回帰計算処理を行ったところ、それぞれの場合相関係数Ｒ２の値を図９に示したが、いずれの場合も非常に高い値を示し、非常に良好な相関性を示した。本発明の方法により、定常化される電位を測定することによって、溶液中のグルコース量を精度よく定量できることが示唆された。【００６９】
［実施例４］
また、それぞれの条件により、キシロースとの反応選択性を検討した。実施例３と同様にして、グルコース、キシロースをいずれも終濃度が５ｍＭになるように加えて測定を行った。キシロース、グルコースで測定した際の低下した電位低下分の比を算出し、図１０に示した。特に、トリエタノールアミンや、イミダゾールを用いた場合に、キシロースとの反応選択性が向上する効果が示されている。【００７０】
［実施例５］
２ｍｌ容量のウォータージャケット型ガラスセル（ビー・エー・エス製）に、５００ｍＭ  フェリシアン化カリウム溶液２００μｌ（終濃度は１００ｍＭ）及び１０．６ｋＵ／ｍｌのＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素１０μｌ（１０６Ｕ分）を、１５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６５０μｌを、後から加える１Ｍ  グルコース溶液の添加量を合わせて、総量が１ｍｌになるように加えて、スターラーでゆっくりと攪拌した。ＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素としては、配列番号２においてＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ変異を加えたものを用いた。更に、添加剤として、ヨード酢酸（ＭＩＡ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）をいずれも１００ｍＭ溶液を１００μｌ（終濃度は０．１ｍＭ）加えた。ウォータージャケット部に恒温槽中で３０℃に保った水を循環させながら、温度を３０℃で一定にして酵素反応を行った。【００７１】
実施例１と同様に、作用電極および参照電極をセッティングして汎用電気化学測定器に接続した。そして、１Ｍ  グルコース溶液４０μｌを加えて、それぞれの場合に、それと同時に電位の値の経時変化の測定を行った。反応系におけるグルコース濃度は、４０ｍＭとなる。例として、ヨード酢酸（ＭＩＡ）を加えた場合と、添加剤の加えられていない場合に測定した結果を図１１に示した。酵素反応の進行により、電位が経時的に低下され、やがて一定になる様子が観察されている。ＭＩＡを加えると、電位の下がる速度が速くなる様子が確認される。なお、グルコースを加えないブランク測定も実施したが、電位の変化は見られなかった。【００７２】
上記３種のハロゲン化合物を添加して測定した結果を図１２に示した。ＩＡＡ，ＭＩＡ，ＮａＦのいずれかを添加された系では、無添加の場合と比べて電位の下がる速度が速くなっている。このように、ハロゲン化合物を共存させることにより、酵素反応の初期速度を高めることができ、その結果として、グルコースの測定時間を短縮することが可能となるものである。本発明の方法により、定常化される電位を測定することによって、溶液中のグルコース量を精度よく定量できることが示唆された。【００７３】
なお、上記実施例１、２、３および５に関して、配列番号２においてＫ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、Ｓ１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ａ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｑ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｌ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｔ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｙ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ａ１６６Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｍ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｐ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｆ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ａ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｅ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｓ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｔ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ３２９Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｄ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｌ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｖ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）変異を加えたそれぞれのグルコース脱水素酵素を用いて、各実施例と同様の方法で測定を行ったところ、それぞれ同等の結果が得られた。【００７４】
［実施例６］
実施例１において、ＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるもののかわりに、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるものを用いて、同様に酵素反応を行った。【００７５】
実施例１と同様に、作用電極および参照電極をセッティングして汎用電気化学測定器に接続した。そして、１Ｍ  グルコース溶液６，１２，２４，３６，４８μｌを加えて、それぞれの場合に、それと同時に電位の値の経時変化の測定を行った。反応系におけるグルコース濃度は、それぞれ５，１０，２０，３０，４０ｍＭとなる。グルコースを加えないブランク測定も実施した。測定した結果を図１３に示した。酵素反応の進行により、電位が経時的に低下され、やがて一定になる様子が観察されている。基質であるグルコースの添加量が多くなるほど、電位の低下が大きくなることが確認される。【００７６】
図１３において定常化された電位の値をグルコース濃度に対してプロットすることにより、検量線を作成した。結果を図１４に示した。縦軸の電位の値は反応から３００秒の時点の値をプロットした。回帰計算処理を行ったところ、相関係数Ｒ２＝０．９４７８となり、４０ｍＭまでの広い濃度範囲において、非常に良好な相関性を示した。本発明の方法により、定常化される電位を測定することによって、溶液中のグルコース量を精度よく定量できることが示唆された。【００７７】
また、上述の測定に関する再現性の確認を行った。上述の測定を再度行った結果を図１５に示した。その結果、図１４とほぼ同じ検量線が得られ、再現性に非常に優れていることが確認された。同じＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素を炭素電極に固定化してアンペロメトリーによる電流測定を、各種グルコース濃度で行い、キャリブレーションを試みた。しかし、この場合は、データの再現性が悪く、信頼性の高い結果を得ることはできなかった。【００７８】
［実施例７］
１０ｍＭ  フェロシアン化カリウム溶液および１０ｍＭ  フェリシアン化カリウム溶液（いずれもＰＢＳ溶液）を、混合比を変えながら、トータル容量が６０μｌになるように調製し、各組成の溶液に、図１６に示すような、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（金・角型；バイオデバイステクノロジー製）を浸した。ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。その際の電位を測定した。組成比と電位をプロットした結果を、図１７に示した。横軸のＫ４／Ｋ３は、フェロシアン化カリウム溶液／フェリシアン化カリウム溶液の比率をパーセントで示したものである。【００７９】
図１７に示したように、Ｋ４／Ｋ３と電位との間に高い相関が認められた。ＦＡＤ依存型のグルコース脱水素酵素がグルコースに作用することで、図１で示したような電子の流れが生じ、その反応量に応じて、Ｋ４／Ｋ３が変動する。したがって、広範囲なグルコースの反応量における定量性が示唆される。【００８０】
［実施例８］
図１６に示すような、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（金・角型；バイオデバイステクノロジー製）を用いて、ポテンショメトリによるグルコースのセンシングを行った。反応溶液の組成として、ＰＢＳ  ５０μｌ、５００ｍＭ  フェリシアン化カリウム  ２μｌ、ＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素（２７．６ｋＵ／ｍｌ；以下、ＦＡＤ−ＧＬＤとも示す。）５μｌの混合溶液として、電極部分をＦＡＤ−ＧＬＤ溶液中に浸し、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。ＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素としては、配列番号２においてＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ変異を加えたものを用いた。【００８１】
上記の溶液中に、１００ｍＭ  グルコース溶液  １０μｌを加えて、電位変化を測定した。結果を図１８に示した。約４０秒で電位が一定化する様子が確認されている。【００８２】
［実施例９］
実施例８と同様にして、グルコース溶液とＰＢＳの比率を変えて、ポテンショメトリーを行った。グルコース濃度と定常化された電位との関係をプロットした結果を図１９に示した。図１９に示すように、優れた相関性が示され、この検量線を用いることによりグルコースの定量が可能であることが確認された。【００８３】
［実施例１０］
図２０（Ａ）に示すような、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（金・丸型；バイオデバイステクノロジー製）上に、１ｍＭの７−ｃａｒｂｏｘｙ−１−ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（以下、ＭＨＡともいう；同仁化学製；式（Ｉ）を参照）溶液（エタノール：水／１：９９容量比）２μＬをマウント（図２０（Ｂ）参照）して、湿潤環境下、室温で２時間静置して、カルボキシル基表面を形成させた。ＭＨＡは、アルキル鎖の末端にカルボキシル基とスクシンミド基を併せ持った炭素数７のアルカンチオールである。【００８４】
電極を水及びエタノールで十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、５０ｍＭ  Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）／２００ｍＭ  １−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で２時間静置して活性化させた。更に、電極を水及びエタノールで十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、２５ｋＵ／ｍｌのＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素（以下、ＦＡＤ−ＧＬＤとも示す。）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で３時間静置して、固定化反応を行った。ＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素としては、配列番号２においてＧ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ変異を加えたものを用いた。金表面に導入されたカルボキシル基とＦＡＤ−ＧＬＤ蛋白質が有するアミノ基とがカップリングすることにより固定化することができる。【００８５】
【化１】
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【００８６】
この電極を水で十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、１ｍｇ／ｍｌ濃度の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で１時間静置して、未反応のカルボキシル基のブロッキングを行った。【００８７】
上記のように調製された電極を、８０μｌのＰＢＳ中に、５００ｍＭ  フェリシアン化カリウム溶液５μｌを加えた溶液中に入れて、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。上記のフェリシアン化カリウム溶液中に、１００ｍＭ  グルコース水溶液５μｌを添加して、その際に生ずる電流測定を行った。図１に本測定系に関する概念を示した。ポテンショ／ガルバノスタットの電位は３５０ｍＶに設定して測定を行った。【００８８】
図２１に上記のアンペロメトリーによる測定結果を示した。ＰＢＳを加えても、電流値はほとんど変動しないが、グルコースが添加されることにより電流値が上昇する様子が確認できている。【００８９】
［実施例１１］
図２０（Ａ）に示すような、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（金・丸型；バイオデバイステクノロジー製）上に、２ｍＭ  ＰＥＧ６−ＣＯＯＮＨＳ  ａｌｋａｎｅｔｈｉｏｌ（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製ＳＰＴ−００１２Ｃ；式（ＩＩ）を参照）溶液（エタノール：水／１：９９容量比）２μＬをマウント（図２０（Ｂ）参照）して、湿潤環境下、室温で２時間静置して、スクシンミド基表面を形成させた。ＰＥＧ６−ＣＯＯＮＨＳ  ａｌｋａｎｅｔｈｉｏｌはＰＥＧ末端にチオール基とスクシンミド基を併せ持ったＰＥＧ誘導体である。電極を水及びエタノールで十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、実施例１０と同じＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で３時間静置して、固定化反応を行った。金表面に導入されたスクシンミド基とＦＡＤ依存型グルコース脱水素酵素蛋白質が有するアミノ基とが反応することにより固定化することができる。【００９０】
【化２】
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【００９１】
この電極を水で十分に洗浄して、エアーブローにより乾燥させた後、２ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥＰＡ−２０Ｈ（日本油脂製）溶液（ＰＢＳ溶液）２μＬをマウントして、湿潤環境下、室温で１時間静置して、未反応のスクシンミド基のブロッキングを行った。ＭＥＰＡ−２０Ｈは、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体であり、分子量は２，０００である。【００９２】
上記のように調製された電極を、実施例１０と同様の条件のフェリシアン化カリウムのＰＢＳ溶液中に入れて、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、汎用電気化学測定器ポテンショ／ガルバノスタット１１１２型（扶桑製作所製）に接続した。フェリシアン化カリウム溶液中に、１００ｍＭ  グルコース水溶液５μｌを添加して、その際に生ずる電流測定を行った。【００９３】
図２２に上記のアンペロメトリーによる測定結果を示した。この場合も、グルコースが添加されることにより電流値が上昇する様子が確認された。したがって、金電極にグルコース脱水素酵素を固定化することにより、優れたグルコースに対する応答を見出すことができた。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明を利用することにより、簡便にかつ再現性に優れた溶液中のグルコースの定量を実現することができる。特に、酵素反応の初期速度を高める作用により、近年要求されている迅速な定量を実現させるうえで有用な技術である。したがって、医療現場での血糖値センサー、食品分野等でのグルコース量の品質管理などの分野における応用展開が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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