(57)【要約】  本発明の目的は、α−ガラクトオリゴ糖以外の夾雑オリゴ糖を含有しない、簡便でかつ安価なα−ガラクトオリゴ糖の製造方法を提供することである。本発明によれば、ガラクトースを含む糖類を原料とするα−ガラクトオリゴ糖の製造方法において、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに属する微生物を触媒として利用することを特徴とするα−ガラクトオリゴ糖の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトースを含む糖類を原料とするα−ガラクトオリゴ糖の製造方法において、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに属する微生物を触媒として利用することを特徴とするα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
スクロースとガラクトースを原料とすることを特徴とする請求項１に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
α−ガラクトオリゴ糖がラフィノースおよび／またはプランテオースを含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
触媒として利用する微生物が培養時の培養液pHを6.5以下に低下させることで得られたものであることを特徴とする、請求項１から３の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率が３５％以上である、請求項２から４の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率が８０％以上である、請求項２から５の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
ガラクトースおよびグルコースを原料とすることを特徴とする請求項１に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項８】
α−ガラクトオリゴ糖がメリビオースであることを特徴とする請求項１又は７に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項９】
生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が５０％以上である、請求項７又は請求項８の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が７０％以上である、請求項７から９の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項１１】
微生物触媒がＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株、およびＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株を親株として得られる変異株由来のものであることを特徴とする、請求項１から１０の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトースを含む糖類を原料とするα−ガラクトオリゴ糖の製造方法に関するものであり、より詳しくは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに属する微生物由来のα−ガラクトシダーゼを、酵素精製といった煩雑な工程を経ることなく、培養して得られた微生物をそのまま利用して行われるα−ガラクトオリゴ糖の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活・社会生活が多様化する中で、健康に対する意識向上から消費者の食品や食品素材等への関心が高まっている。その中で、メリビオースやラフィノース、プランテオース、スタキオース、ベルバスコースなどの、末端にα−ガラクトシル結合を有するオリゴ糖、すなわち、α−ガラクトオリゴ糖が、腸内細菌叢を改善する等の機能を有することが認められ、飲食品や医薬品、香粧品等あるいは、その原料として注目を集めている。最近では、いくつかのα−ガラクトオリゴ糖について、免疫腑活作用やアトピー性皮膚炎に対しても有用であるだけではなく、制ガン効果やナチュラルキラー細胞活性化作用を有することが報告されており、非常に有用なオリゴ糖として期待されている。【０００３】
これらα-ガラクトオリゴ糖は豆類、ナタネ、ゴマ、綿実など植物の種子、キュウリやメロンなどウリ科植物の他、さとうきび、蜂蜜、キャベツ、じゃがいも、ぶどう、麦類、とうもろこしなど天然に広く分布しており、現在、市販されている殆どのα−ガラクトオリゴ糖は上記の植物から抽出されている。例えば、ラフィノースは、ビート糖製造の際の副産物として回収されているが、ビート中のラフィノース含有量は０．１％程度に過ぎず、生産量は、主生産物である砂糖の生産量にも関わってくるため、ラフィノース増産には限界がある。【０００４】
また、ラフィノース以外のα−ガラクトオリゴ糖に関しても、天然界の植物中存在比率は低く、スタキオースはダイズの成熟種子中に約５〜１５％程度含まれる炭水化物のうち約４％、プランテオースは黒ゴマ中に存在するが、含有量は約０．２３％と非常に低い。メリビオースについても同様に、大豆オリゴ糖中にごく少量存在するのみである。従って、このような有用特性をもつα−ガラクトオリゴ糖を安価に安定的に市場へ供給するためには、天然からの抽出品のみでなく、安価な原料からの合成品が求められている。【０００５】
これまでに報告されているα−ガラクトオリゴ糖の合成方法としては、例えば、ラフィノースをβ−フラクトシダーゼや酸、イオン交換樹脂等を用いて加水分解しメリビオースを得る方法（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１）、ラフィノースにＰｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ由来のα−ガラクトシダーゼを作用させることによりスタキオース、ベルバスコース、アジュゴースといったα−ガラクトオリゴ糖を合成する方法（例えば、非特許文献２参照）、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓやＣａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のα−ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用して、スクロースをガラクトース受容体とし、メリビオースやラフィノースをガラクトース供与体として用いてラフィノースやスタキオース、ベルバスコースなどのα−ガラクトオリゴ糖を得る方法（例えば、特許文献３、非特許文献３、非特許文献４参照）が挙げられる。【０００６】
また、α−ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用するその他の方法としては、例えば、ガラクトース供与体としてｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを利用する方法（例えば、非特許文献５参照）、ガラクチノールを利用する方法（例えば、特許文献４参照）、ＵＤＰ−ガラクトースを利用する方法（例えば、特許文献５参照）、ガラクトビオースを利用する方法（例えば、特許文献６参照）などが報告されている。【０００７】
このようなα−ガラクトオリゴ糖そのものを加水分解する方法や、α−ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用する方法は、反応が進行しやすく、高いα−ガラクトオリゴ糖の生成収率が期待できる。しかし、これらの方法はα−ガラクトオリゴ糖そのものや、高価な誘導体原料を使用する必要があるため、工業生産を考慮した場合、目的物を安価に安定的に製造供給することは困難である。【０００８】
一方、脱水縮合反応を利用した場合、熱力学的には不利な反応であるものの、糖転移反応に比べ安価な基質が利用できるため工業的に有利であり、例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａ由来のα−ガラクトシダーゼを用いたα−ガラクトオリゴ糖の製造方法（例えば、非特許文献６）が報告されている。しかし、脱水縮合反応を効率的に進行させるためには、高温での反応が好ましく、酵素の耐熱性が要求されるが、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａ由来のα−ガラクトシダーゼは耐熱性がなく、高温反応では酵素の失活を見越して反応系に大量に酵素を添加する必要があり、大量の酵素を得る為に微生物の大量培養が必要となる。また、酵素活性の低下を抑制するために低温で反応させようとすると、脱水縮合反応が進行しにくくなるため、反応時間が反応速度を上げるためには、やはり、酵素を大量に添加する必要性が生じ、微生物の大量培養の為の大掛かりな設備的が必要となる。【０００９】
耐熱性を有するα−ガラクトシダーゼとしては、例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが耐熱性を有することが知られているが、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ属に属する微生物由来のα−ガラクトシダーゼはについては、これまでにいくつか報告されているものの、全て、α−ガラクトオリゴ糖のガラクトシル結合の分解に関するものであり（例えば、特許文献７）、メリビオースやラフィノース、プランテオース等のα−ガラクトオリゴ糖の製造に関する報告はこれまでなかった。【００１０】
さらに、これまでに報告されているα−ガラクトオリゴ糖の製造方法は、“精製酵素”を利用した例であり、酵素を精製するための工程が必要となり、工程が煩雑になるだけでなく、酵素生成のための設備を設ける必要が生じる。工程の煩雑さという問題を解決するために未精製の酵素を利用すると、微生物内の夾雑酵素の影響により、生成物中に目的とするα−ガラクトオリゴ糖以外の夾雑オリゴ糖が生成してしまい、最終製品からの夾雑オリゴ糖の分離が困難になるだけでなく、夾雑酵素による原料の浪費といった問題が生じる。従って、従来の技術においては、酵素の精製あるいは、回収後の生成物から目的物のみを取り出すといった、複雑なプロセス工程を経なければ、α−ガラクトオリゴ糖のみを選択的に合成することは不可能であった。【００１１】
【特許文献１】特開平６−２２８１８０
【特許文献２】ＣＳ２３９５９７
【特許文献３】特許第２６８８８５４号
【特許文献４】特開平１０−８４９７３
【特許文献５】特開２００１−３２１１７９
【特許文献６】特公平８−２４５９２
【特許文献７】特開平５−２３１７５
【非特許文献１】Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｙ  ｓｔｒ．１２０，Ｐｒａｈａ  １９６２
【非特許文献２】Ｂｕｌｌ． Ｆａｃ． Ａｇｒ．， ｓａｇａ Ｕｎｉｖ．， ６９， ５５−６１(１９９０)
【非特許文献３】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２（９），２３０５−２３１１，１９８８
【非特許文献４】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（４），６１９−６２３，１９９５
【非特許文献５】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，３５−３８，１９７９
【非特許文献６】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ.，  １８５，  １３９−１４６，  １９８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、こうした状況のもとに、高価な原料を必要とせず、耐熱性を有するα−ガラクトシダーゼを産生するＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに属する微生物を触媒として利用し、かつ、微生物そのものを触媒として用いることにより、煩雑な酵素精製を必要としない製造方法でα−ガラクトオリゴ糖を製造する方法を提供するものである。さらには、微生物そのものを触媒として利用するにもかかわらず、選択的にα−ガラクトオリゴ糖を合成することができるα−ガラクトオリゴ糖の製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、α−ガラクトオリゴ糖を選択的に合成可能な耐熱性α−ガラクトシダーゼを用いて、酵素の精製工程を経ることなく、微生物そのものを触媒として利用し、目的α−ガラクトオリゴ糖以外の夾雑オリゴ糖の生成を抑制したα−ガラクトオリゴ糖の製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）に示すα−ガラクトオリゴ糖の製造方法である。
（１）ガラクトースを含む糖類を原料とするα−ガラクトオリゴ糖の製造方法において、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに属する微生物を触媒として利用することを特徴とするα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（２）スクロースとガラクトースを原料とすることを特徴とする（１）に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（３）α−ガラクトオリゴ糖がラフィノースおよび／またはプランテオースを含有することを特徴とする、（1）又は（２）に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（４）触媒として利用する微生物が培養時の培養液pHを6.5以下に低下させることで得られたものであることを特徴とする、（１）から（３）の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（５）生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率が３５％以上である、（２）から（４）の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（６）生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率が８０％以上である、（２）から（５）の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（７）ガラクトースおよびグルコースを原料とすることを特徴とする（１）に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（８）α−ガラクトオリゴ糖がメリビオースであることを特徴とする（１）又は（７）に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（９）生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が５０％以上である、（７）又は（８）に記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（１０）生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が７０％以上である、（７）から（９）の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
（１１）  微生物触媒がＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株、およびＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株を親株として得られる変異株由来のものであることを特徴とする、（１）から（１０）の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明を用いることにより、安価な基質を原料とし、酵素精製といった煩雑な工程を経ることなく、α−ガラクトオリゴ糖以外の夾雑オリゴ糖を含有しないα−ガラクトオリゴ糖を製造することが可能である。また、本発明で使用する微生物Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−ガラクトシダーゼは、日本において食品添加物としてその安全性が確認され、使用が認められているものであるため、技術・安全の両面からも、実際の工業生産に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明は、ガラクトースを含む糖類に、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに属する微生物を触媒として作用させることを含む、α−ガラクトオリゴ糖の製造方法に関するものである。
本発明におけるガラクトースを含む糖類としては、ガラクトースおよびガラクトース以外の糖類からなる混合物が挙げられ、ガラクトース以外の糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース等の単糖やスクロース、マルトース、イソマルトース、メリビオース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、ニゲロース等の二糖、ラフィノース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、ケストース、プランテオース、ラクトスクロース、メレジトース、エルロース等の三糖やそれ以上の分子量を有するオリゴ糖から選ばれる物質を少なくとも１つ含有することができるが、単糖としてはグルコース、二糖としてはスクロースを含有することが好ましい。【００１７】
また、本発明におけるα−ガラクトオリゴ糖とは、α−ガラクトシル基を分子内に有するオリゴ糖であり、例えば、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース、アジュゴース、プランテオースなどが挙げられるが、本発明を利用した場合、特にメリビオース、ラフィノース、プランテオースを選択的に製造することができる。【００１８】
また、原料にガラクトースとスクロースを利用した場合、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を３５％以上に向上することができ、より好ましい条件では８０％以上に向上することができる。原料にガラクトースとグルコースを利用した場合、生成オリゴ糖中のメリビオース含有率を５０％以上に向上することが可能であり、より好ましい条件では７０％以上に、さらに好ましい条件では９０％以上に向上することが可能である。生成物オリゴ糖中のα−ガラクトオリゴ糖含有率が低い場合、生成物からのα−ガラクトオリゴ糖の精製が著しく困難となるだけでなく、基質であるガラクトース、あるいは、その他の単糖、二糖等の無駄な消費も重大な問題となる。本発明において使用されるガラクトースは、ガラクトースそのものを利用しても良いし、ＵＤＰ−ガラクトースや、その他ガラクトシル基を有する化合物等から製造されるガラクトースを利用することもできる。【００１９】
また、本発明における夾雑オリゴ糖とは、分子内にα−ガラクトシル基を有しないオリゴ糖であって、例えば、マルトース、イソマルトース、セロビオース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、メレジトース、パノース、イソパノース、セロトリオース、ゲンチアノース、ケストース、エルロース、ラクトシルスクロースなどが挙げられる。【００２０】
α−ガラクトオリゴ糖の製造に用いる微生物触媒は、通常行われる培養方法によって得られる微生物そのものを利用することができ、α−ガラクトオリゴ糖の合成酵素を微生物から精製する必要はない。また、場合によっては、微生物培養液、微生物培養上清を利用することもできる。一方、培養法により得られた微生物は必要に応じて、水や緩衝液等で洗浄した後、利用することもできる。例えば、培養した微生物の培養液、または遠心分離、バッファーによる洗浄等により得た微生物懸濁液、微生物または微生物の処理物(例えば微生物の破砕物等)を懸濁または溶解させた水溶液、あるいは微生物または微生物処理物を包括法、架橋法、又は担体結合法によって固定化したものを用いることができる。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００２１】
本発明に用いる微生物としては、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに属する微生物であればどのようなものを用いてもよく、α−ガラクトオリゴ糖を選択的に合成する活性を有する任意の微生物を用いることができる。好ましくは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株、およびＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株を親株として得られる変異株由来があげられる。【００２２】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＫＣ−００１株及びＡＫＣ−００２株はそれぞれ、２００６年１１月１４日に、ＡＫＣ−０１０株は２００７年３月１４日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されており、その受託番号は以下の通りである。
ＡＫＣ−００１株(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０８９)
ＡＫＣ−００２株(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９０)
ＡＫＣ−０１０株(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５２)【００２３】
上記のＡＫＣ−００１株(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０８９)、ＡＫＣ−００２株(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１０９０)、及びＡＫＣ−０１０株(ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２５２)は、２００７年１１月３０日に国際寄託に移管された。国際寄託の受領番号は、以下の通りである。
ＡＫＣ−００１株(ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７)
ＡＫＣ−００２株(ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８)
ＡＫＣ−０１０株(ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９)【００２４】
ＡＫＣ−００１株はＤＳＭ２３５８株を、ＡＫＣ−００２株はＤＳＭ６７９０株を、ＡＫＣ−０１０株はＤＳＭ２３１３株をそれぞれ、本発明者らが独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに再寄託したものである。【００２５】
また、上記に記載したＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株は菌株寄託機関 Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）  （http://www.dsmz.de/microorganisms/bacteria#catalogue.php）より、入手可能である。ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株について、他のコレクション番号を以下に記載する。【００２６】
ＤＳＭ ２３５８株：ＮＣＩＢ １０２８０
ＤＳＭ ２０２７株：ＡＴＣＣ ７９５４, ＮＣＩＢ ８９２４
ＤＳＭ２３１３株：ＮＣＩＢ  １０２７８
ＤＳＭ２２株：ＡＴＣＣ １２９８０, ＣＣＭ ２０６２, ＣＣＵＧ ２６２４１, ＩＡＭ １１０６２, ＩＦＯ １２５５０, ＮＢＲＣ １２５５０, ＮＣＩＢ ８９２３, ＮＣＴＣ １０３３９, ＶＫＭ Ｂ−２２３１
ＤＳＭ ６７９０株：ＡＴＣＣ １０１４９【００２７】
本発明に用いる微生物の培養方法としては、通常の通気攪拌培養あるいは固体培養が用いられ、一般的に行われている微生物の培養方法が適応できる。培地としては、当該微生物が良好に生育し且つ、微生物中のα−ガラクトオリゴ糖合成酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセロール、スクロース、ガラクトース、ラクトース、メリビオース、ラフィノース、スタキオース、セロビオース、エルロース、有機酸、大豆粕、澱粉、オリーブ油、大豆油等を用いることができる。窒素源としては、例えば、硫安、硝安、尿素、アミノ酸、アミン類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、綿実粕、コーンスティープリカー、および大豆粕等があげられる。また、無機塩類としては、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸鉄、炭酸カルシウム等が用いられる。培養温度は２５〜８０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃、さらに好ましくは５０〜６０℃である。培養温度が２５℃未満あるいは８０℃より高い場合は生育性が悪く好ましくない。また、培地の初期ｐＨは３〜９が好ましく、より好ましくは４．５〜７．５である。さらに、培養中のｐＨは広範囲で調整可能であり、ｐＨ３〜９で培養可能である。培地のｐＨが３未満あるいは９より高い場合は生育性が悪く好ましくない。培養中のｐＨに関わらず、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ に属する微生物は、一般的な微生物のα-ガラクトオリゴ糖含有率(約３０％以下)と比べて、非常に高いα-ガラクトオリゴ糖含有率（約３５〜１００％）を示すが、特に三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖を製造する場合には、より高いα-ガラクトオリゴ糖含有率を得るためには、培養中のｐＨを７未満にすることが好ましく、より好ましくは６．５以下、さらに好ましくは６．０以下、特に好ましくは５．５以下にすることができる。培養中のｐＨを低下させる手法としては、微生物から培養中に生成される酸性物質の利用や、塩酸、燐酸、硫酸、硝酸、酢酸等の酸性物質の添加が挙げられる。【００２８】
本発明におけるα−ガラクトオリゴ糖を製造するには、脱水縮合反応の性質上、原料濃度は高い方が好ましいが、ガラクトース濃度が高くなりすぎるとガラクトースの分子内縮合によりガラクトースとガラクトース以外の糖類間の脱水縮合反応が抑制されるため好ましくない。ガラクトース濃度は２％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、より好ましくは、５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。グルコースを基質として利用する場合、グルコース濃度は３０％（ｗ／ｖ）〜９０％（ｗ／ｖ）にするのが好ましい。また、スクロースを基質として利用する場合には、スクロース濃度は３０％（ｗ／ｖ）〜８０％（ｗ／ｖ）にするのが好ましく、より好ましくは４５％（ｗ／ｖ）〜７０％（ｗ／ｖ）にするのが良い。【００２９】
反応温度は、２０〜９０℃、より好ましくは４０〜８０℃であり、さらに好ましくは５０〜７０℃である。反応温度が２０℃未満である場合、反応速度が極めて小さく、９０℃を超える温度領域では酵素活性の失活が早く大量の微生物触媒を要するため好ましくない。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、好ましくはｐＨ３〜１０、より好ましくはｐＨ４.５〜８.５、さらに好ましくはｐＨ５．０〜６．０である。反応ｐＨが３未満、あるいは１０より大きい場合、触媒の失活が著しく早くなるため好ましくない。反応時間は微生物触媒の使用量によっても異なるが、工業的利用を考慮した際、好ましくは通常２０分〜２００時間、より好ましくは、６〜８０時間である。しかしながら、本発明は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。【００３０】
本発明において得られるα−ガラクトオリゴ糖は以下の方法により測定される。
[生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率の測定方法] 
反応終了後、反応液を２５倍希釈して、９９℃で１０分間保持することで反応を停止した。反応停止後、遠心分離により微生物を除去し、得られた反応溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）にはＨｙｐｅｒｃａｒｂカラム（サーモエレクトロン社製）を用い、カラム温度６０℃、流量０．５ｍｌ／ｍｉｎ、ＲＩ検出器を用いて実施した。溶離液には蒸留水／アセトニトリル／蟻酸＝９５０／５０／５の組成からなる混合液を用いた。
生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率（％）は、ＨＰＬＣ分析チャートに検出された各々のピーク面積比から（三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖のピーク面積）／（生成物オリゴ糖のピーク面積）×１００により算出した。【００３１】
[生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率の測定方法] 
グルコースとガラクトースを原料としたα−ガラクトオリゴ糖合成反応終了後、反応液を２５倍希釈して、９９℃で１０分間保持することで反応を停止した。反応停止後、さらに糖合成液を２０倍希釈し、イオンクロマト分析により、メリビオース蓄積濃度％（ｗ／ｖ）を算出した。また、反応停止後の糖合成液を２倍希釈して、ＨＰＬＣ分析（Ｓｕｇａｒカラム）を行い、全二糖蓄積濃度を算出した。イオンクロマト分析には、Ｃａｒｂｐａｃ  ＰＡ１カラム（ダイオネクス社製）を用い、カラム温度３５℃、流量１ｍＬ／ｍｉｎ．で行った。検出器には、パルスドアンペロメトリ検出器を用いた。溶離液としては、水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を利用し、０−２０分、２０−４０分、４０−４５分の各々の段階で水、１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液の比率が４９／５０／１、３０／５０／２０、０／１００／０となるようなグラジエント条件で行った。ＨＰＬＣ分析（Ｓｕｇａｒカラム）には、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＣＬＧガードカラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＣ１０１１カラム（昭和電工社製）、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０カラム（昭和電工社製）を連結して使用し、カラム温度８０℃、流量０．６ｍＬ／ｍｉｎ．、ＲＩ検出器で行った。溶離液には蒸留水を使用した。生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率（％）はメリビオース蓄積濃度／全二糖蓄積濃度×１００により算出した。【００３２】
[α−ガラクトシダーゼ活性の測定方法]
α−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、２．６７ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液４５０μＬに適宜調整した酵素液１５０μＬを混合し、４０℃で１０分間程度反応させた後、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液１ｍＬに添加して酵素を失活させ、反応を停止する。得られた溶液の着色度を波長４２０ｎｍの吸収を測定し、各濃度のｐ−ニトロフェノールで作製した検量線を用いて濃度を算出する。また、酵素活性は上記条件下で１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして評価する。
また、α−ガラクトシダーゼの熱安定性は各温度条件下に一定時間さらした後に、α―ガラクトシダーゼ活性を測定することにより評価することができる。【００３３】
本発明の方法により製造されるα−ガラクトオリゴ糖は、必要に応じて一般に用いられている方法により、精製・分離等の処理を行うことができる。すなわち、例えば、遠心分離、ＭＦ膜やＵＦ膜等による膜処理、フィルタープレス等により微生物触媒を除き、陽イオン交換クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマト処理や透析等の脱塩処理により緩衝液や培地等から持ち込まれる塩類等を除去し、さらに、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や溶解度の差等を利用した結晶化処理、その他の常法に従ってα−ガラクトオリゴ糖を分離、精製することができる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良く、移動層方式や擬似移動層方式、多成分分離擬似移動層方式、多成分分離循環方式等を適宜利用することができる。これらの分離、精製方法を利用した場合、α−ガラクトオリゴ糖をその他の夾雑オリゴ糖成分から分離することができるだけではなく、様々な結合形態あるいは異なる分子量を有する複数のα−ガラクトオリゴ糖類を分離することもできる。これらのα−ガラクトオリゴ糖の精製、分離処理方法は、バッチ式で行っても良いしカラムを利用するなどして連続的に行っても良い。【００３４】
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ-００１株(受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ(Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ)プレート (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（ｐＨ７．２）（表.３参照)より緩衝能の低い培地−Ａ(ｐＨ７．２)(表.２参照) ３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。本培養を開始して２日後、培養液のｐＨは初期の７．２から４．９と酸性側にシフトしていた。【００３６】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ５)を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液(Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ５))を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析(Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム)した結果を、図１に示した。図１におけるＰｅａｋ−１およびＰｅａｋ−２に対応する画分を分取し、１３Ｃ−ＮＭＲで解析した結果、Ｐｅａｋ−１はプランテオース、Ｐｅａｋ−２がラフィノースに対応することを確認した。菌体回収時のｐＨは４．９、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は１００％であった。本結果を表１に示す。【００３７】
実施例２
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０２７株(寄託機関;  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ)をＴＢＡＢ(Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ)プレート  (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ (表.３参照)より緩衝能の低い培地−Ａ(ｐＨ７．２)(表.２参照) ３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。本培養を開始して２日後、培養液のｐＨは初期の７．２から５．０と酸性側にシフトしていた。【００３８】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ５)を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始３９時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは５．０、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は９８％であった。本結果を表１に示す。【００３９】
実施例３
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ２２株（寄託機関;  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート  （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ （表.３参照）より緩衝能の低い培地−Ａ（ｐＨ７．２）（表２参照） ３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。本培養を開始して２日後、培養液のｐＨは初期の７．２から５．０と酸性側にシフトしていた。【００４０】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始３９時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは５．０、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は９３%であった。本結果を表１に示す。【００４１】
実施例４
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＫＣ−００２ 株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート（Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ （表.３参照）より緩衝能の低い培地−Ａ（ｐＨ７．２）（表２参照） ３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。本培養を開始して２日後、培養液のｐＨは初期の７．２から４．９と酸性側にシフトしていた。【００４２】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始３９時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析(Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム)し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは４．９、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は９９%であった。本結果を表１に示す。【００４３】
実施例５
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＳＭ４５７株（寄託機関; Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表３参照）より緩衝能の低い培地−Ａ（ｐＨ７．２）（表２参照） ３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。本培養を開始して２日後、培養液のｐＨは初期の７．２から５．０と酸性側にシフトしていた。【００４４】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始３９時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは５．０、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は９４%であった。本結果を表１に示す。【００４５】
実施例６
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ-０１０株(受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ(Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ)プレート (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（ｐＨ７．２）（表.３参照）より緩衝能の低い培地−Ａ(ｐＨ７．２)(表.２参照) ３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。本培養を開始して２日後、培養液のｐＨは初期の７．２から５．０と酸性側にシフトしていた。【００４６】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ５)を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液(Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ５))を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析(Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム)し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは５．０、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は１００％であった。本結果を表１に示す。【００４７】
実施例７
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＡＫＣ−００１株 (受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート  （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表３参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで１日間培養した。本培養を開始して１日後の培養液ｐＨは６．７であり、ほぼ培養初期のｐＨと変化がなかった。【００４８】
本培養１日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは６．７、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は４９％であった。本結果を表１に示す。【００４９】
実施例８
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＳＭ ２０２７株（寄託機関; Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート  （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表３参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで１日間培養した。本培養を開始して１日後の培養液ｐＨは６．７であり、ほぼ培養初期のｐＨと変化がなかった。【００５０】
本培養１日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは６．７、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は５１%であった。本結果を表１に示す。【００５１】
実施例９
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＳＭ２２株（寄託機関; Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート  （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表３参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで１日間培養した。本培養を開始して１日後の培養液ｐＨは６．７であり、ほぼ培養初期のｐＨと変化がなかった。【００５２】
本培養１日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは６．７、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は４２%であった。本結果を表１に示す。【００５３】
実施例１０
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＡＫＣ−００２株 (受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート（Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表３参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで１日間培養した。本培養を開始して１日後の培養液ｐＨは６．８であり、ほぼ培養初期のｐＨと変化がなかった。【００５４】
本培養１日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは６．８、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は５３％であった。本結果を表１に示す。【００５５】
実施例１１
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ４５７株（寄託機関; Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート（Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表３参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで１日間培養した。本培養を開始して１日後の培養液ｐＨは６．６であり、ほぼ培養初期のｐＨと変化がなかった。【００５６】
本培養１日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは６．６、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は５０％であった。本結果を表１に示す。【００５７】
実施例１２
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＡＫＣ−０１０株 (受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート  （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表３参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで１日間培養した。本培養を開始して１日後の培養液ｐＨは６．７であり、ほぼ培養初期のｐＨと変化がなかった。【００５８】
本培養１日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出した。菌体回収時のｐＨは６．７、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は４９％であった。本結果を表１に示す。【００５９】
実施例１３
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ−０１０株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ）プレート (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、２４時間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｃ（表７参照）１００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２８時間培養した。【００６０】
本培養２８時間後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース８０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始２８５時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析した結果を図２に、ＨＰＬＣ分析（Ｓｕｇａｒカラム）した結果を図３に示した。メリビオース糖蓄積濃度は１．６％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は８４．４％であった。【００６１】
実施例１４
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ−０１０株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ）プレート (ＤＩＦＣＯ)で、５５℃、２４時間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｃ（表７参照）１００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２８時間培養した。【００６２】
本培養２８時間後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１０，０００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液にグルコース５０．０％、ガラクトース１０％を含む）を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始１７．５時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、イオンクロマト分析し、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率を算出した。メリビオース糖蓄積濃度は０．９３％（ｗ／ｖ）であり、生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率は８８．９％であった。【００６３】
実施例１５
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ）プレート (Ｄｉｆｃｏ)で、５５℃、２４時間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ(表.２参照) １００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２８時間培養した。
上記で得られた菌体を１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）に懸濁して、４℃および５０℃で２時間インキュベートを行い、それぞれα−ガラクトシダーゼ活性測定を行った。活性測定は、１００ｍＭ酢酸Ｎａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）に溶解させた２.６７ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド４５０μＬに、各温度でインキュベートした菌液１５０μＬを混合し、４０℃で１０分間反応させた。反応後、遊離されたｐ−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、４℃および５０℃でインキュベートした菌液の活性を算出した。４℃でインキュベートした菌体活性を１００とすると、５０℃でインキュベートした菌体の活性は８０という高い値を示した。【００６４】
比較例１
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １３１４７株（寄託機関; Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート  （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を表２に示した培地−Ａ（表２参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。【００６５】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始３９時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）した結果を、図４に示した。図４におけるＰｅａｋ−１およびＰｅａｋ−２をα−ガラクトオリゴ糖、Ｐｅａｋ−３、Ｐｅａｋ−４およびＰｅａｋ−５を夾雑オリゴ糖として、各ピーク面積から生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出したところ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １３１４７株の生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率は２７（％）であった。【００６６】
比較例２
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓＤＳＭ １３１４７株（寄託機関; Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ Ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）をＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ）プレート  （Ｄｉｆｃｏ）で、５５℃、１日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地−Ｂ（表２参照）３０ｍＬを１５０ｍＬ容三角フラスコに分注したものに接種して、５５℃、１５０ｒｐｍで２日間培養した。【００６７】
本培養２日後、培養菌体１０ｍＬ分を１５ｍＬ容チューブに回収した。培養液を回収した１５ｍＬ容チューブを１００００ｒｐｍで遠心後、上清を除去した。次に、１００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５）を１ｍＬ添加し、再懸濁した後、懸濁液を２ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに移した。再度、チューブを遠心し、上清を除去した後、糖液（Ｓｕｃｒｏｓｅ ６２．５%, Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １２．５% ｉｎ １００ｍＭ酢酸Ｎａ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５））を３００μＬ添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度６０℃、回転数１２００ｒｐｍで行った。糖合成反応開始４７時間後に、反応液４０μＬを回収し、蒸留水９６０μＬとよく混合し、９９℃で１０分間酵素の熱失活を行った。本希釈糖液を常温に戻した後、ＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）し、生成物オリゴ糖中の三糖以上のα−ガラクトオリゴ糖含有率を算出したところ２１（％）であった。【００６８】
比較例３
Ｇｒｅｅｎ  ｃｏｆｆｅｅ  ｂｅａｎｓ由来α−ガラクトシダーゼ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて実施例１３に記載した方法で、熱安定性試験を行ったと。実施例１５と同様に、４℃でインキュベートしたα−ガラクトシダーゼの活性を１００とすると、５０℃でインキュベートしたα−ガラクトシダーゼの活性は５０であった。【００６９】
【表１】
2008081817.tif 000002
【００７０】
【表２】
2008081817.tif 000003
【００７１】
【表３】
2008081817.tif 000004
【００７２】
【表４】
2008081817.tif 000005
【００７３】
【表５】
2008081817.tif 000006
【００７４】
【表６】
2008081817.tif 000007
【００７５】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明を用いることにより、煩雑な酵素精製工程を必要とせず、且つ安価な基質を原料として用いて、α−ガラクトオリゴ糖以外の夾雑オリゴ糖を含まないα−ガラクトオリゴ糖の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＫＣ−００１株を用いた糖合成反応（実施例１）の反応液をＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）したリテンションタイム０〜２０分の結果を示す。
【図２】図２は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＫＣ−０１０株を用いた糖合成反応（実施例１３）の反応液をイオンクロマト分析したリテンションタイム０〜２０分の結果を示す。
【図３】図３は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＫＣ−０１０株を用いた糖合成反応（実施例１３）の反応液をＨＰＬＣ(Ｓｕｇａｒカラム)分析したリテンションタイム０〜４５分の結果を示す。
【図４】図４は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １３１４７株を用いた糖合成反応（比較例１）の反応液をＨＰＬＣ分析（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム）したリテンションタイム０〜２０分の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月26日(2008.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
微生物触媒がＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株、およびＡＫＣ−００１株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３７）、ＡＫＣ−００２株（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３８）、ＡＫＣ−０１０（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３９）、ＤＳＭ２３５８株、ＤＳＭ２０２７株、ＤＳＭ２３１３株、ＤＳＭ２２株、ＤＳＭ６７９０株、ＤＳＭ４５７株を親株として得られる変異株であって、α−ガラクトオリゴ糖を合成する活性を有する変異株由来のものであることを特徴とする、請求項１から１０の何れかに記載のα−ガラクトオリゴ糖の製造方法。
【国際調査報告】
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