【手続補正書】
【提出日】平成16年8月16日(2004.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することを特徴とする、脳梗塞を検出する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
前記のニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応しないが、ニックβ２グリコプロテインＩとは反応するモノクローナル抗体」（以下、抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体としては、好ましくは、（１）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する［特に、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８９２）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、あるいは、（２）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する［特に、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ−６０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８９３）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を挙げることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記のトータルβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応し、しかもニックβ２グリコプロテインＩとも反応するモノクローナル抗体」（以下、抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体としては、インタクトβ２グリコプロテインＩ（特には、ヒトインタクトβ２グリコプロテインＩ）、及びニックβ２グリコプロテインＩ［特には、第Ｖドメインに開裂を受けたヒトニックβ２グリコプロテインＩ］と反応し、好ましくはインタクトβ２グリコプロテインＩ及びニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域［例えば、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域］にエピトープを有するモノクローナル抗体が好ましく、ハイブリドーマＮＧＰＩ−２３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８９１）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３がより好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又は抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体の抗体フラグメントとしては、前記の各モノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとの各モノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントを用いることができる。抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定法は、例えば、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と体液試料とを接触させ、続いて、第１抗体とは別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体と接触させると、前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合した前記第２抗体又は前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を測定することができる（サンドイッチ法）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類とを不溶性担体に固定化し、これらの固定化したモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと体液試料とを接触させると、体液試料中のインタクトβ２グリコプロテインＩとは凝集反応を起こさず、ニックβ２グリコプロテインＩとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を測定することができる（凝集法）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
サンドイッチ法を利用するニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法では、具体的には、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、前記のモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９又はモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０）又はその抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、未希釈の体液試料を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、前記第１次抗体として用いたモノクローナル抗体とは別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３）若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を算出することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行うことも可能である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
前記の脳梗塞患者より採取された血漿検体及び健常人より採取された血漿検体を試料とし、以下の方法にてニックβ２グリコプロテインＩの測定を行った。
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０の断片Ｆ（ａｂ’）2を１０μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕１００μＬを９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、４℃で１８時間放置した。そのプレートを洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０：０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、ニックβ２グリコプロテインＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料１００μＬ、あるいは、検体血漿を同様のトリス緩衝液Ｂにて５倍に希釈した検体試料１００μＬを加え、２５℃で２時間反応させた。