(57)【要約】本発明により、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、前記架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体が、前記親水性多糖類誘導体（ここで、当該親水性多糖類誘導体は架橋形成が可能な基を有していてもよい）の存在下、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体の架橋形成反応により調製される前記組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、前記架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体が、前記親水性多糖類誘導体（ここで、当該親水性多糖類誘導体は架橋形成が可能な基を有していてもよい）の存在下、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体の架橋形成反応により調製される前記組成物。
【請求項２】
前記親水性多糖類誘導体が、１００単糖あたり０．５〜３０個の疎水性基を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記親水性多糖類誘導体が、前記疎水性基の会合により微粒子を形成する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記親水性多糖類誘導体が、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、およびデキストリンから選択される親水性多糖類またはその誘導体に疎水性基を導入して得ることができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記架橋形成が可能な基が、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基から選択される１以上の基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記疎水性基が、Ｃ８−５０炭化水素基を含む基またはステリル基を含む基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記疎水性基が、前記水溶性多糖類の１以上のヒドロキシ基を−ＯＸに変換することにより導入され、Ｘは、以下の基：
−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｒ３−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；および
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２
［式中、Ｒ１は、Ｃ８−５０炭化水素基であり；
Ｒ２は、Ｃ８−５０炭化水素基またはステリル基であり；
Ｒ３は、２価のＣ２−５０炭化水素基であり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、独立に、ＯおよびＮ（Ｒ４）から選択され；
Ｒ４は、水素原子またはＣ１−６アルキル基である］
から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ２がコレステリル基である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記水溶性多糖類またはその誘導体が、プルランまたはその誘導体、およびデキストリンまたはその誘導体から選択される、請求項４〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記架橋形成が可能な基が、ヒアルロン酸の１以上のカルボキシ基を−ＣＯ−Ｙに変換することにより導入され、Ｙ基は、以下の基：
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−ＣＯ−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−Ｃ（＝ＮＲ２４）−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−ＣＯ−Ｘ１３−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−ＣＯ−Ｘ１３−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−Ｙ２；
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−ＣＯＮ（Ｒ１５）Ｎ（Ｒ１６）ＣＯ−Ｒ１３−Ｙ２；および
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−ＣＯＮ（Ｒ１５）Ｎ（Ｒ１６）Ｃ（＝ＮＲ２４）−Ｒ１３−Ｙ２
［式中、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３は、独立に、ＯおよびＮ（Ｒ１１）から選択され：
Ｙ２は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、−ＣＯＮＨＮＨ２、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基から選択され；
Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ２４は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基から選択され；
Ｒ１２は、２価のＣ２−５０炭化水素基または２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基であり；
Ｒ１３は、２価のＣ１−５０炭化水素基、２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基または−ＣＨ（Ｒ２５）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−Ｒ２６−ＣＨ２−であり；ここで、Ｒ１２およびＲ１３が２価のＣ２−５０炭化水素基である場合、独立に、１〜１０の酸素原子が挿入されて当該炭化水素基が一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよく；または
−Ｒ１３−Ｙ２は、一緒になって、−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨもしくは−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨを表し；または
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｙ２は、一緒になって、システイン、ホモシステインまたはグルタチオンが末端のアミノ基で連結する基を表し；
Ｒ２５は、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ２６は、−（ＣＨ（Ｒ２７））ｍ−または１〜３の酸素原子が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよい２価のＣ２−１０炭化水素基であり；
ｍは、１〜１０の整数であり；
Ｒ２７は、独立に、水素原子、ヒドロキシ基またはＣ１−６アルキル基から選択される］
から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｙ基が、
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＳＨ；および
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ
［式中、Ｒ１７は、水素原子またはＣ１−６アルキル基である］
から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記架橋形成が可能な基が、親水性多糖誘導体、またはヒアルロン酸もしくはその誘導体の１以上のヒドロキシ基を−Ｏ−Ｚに変換することにより導入され、Ｚ基は、以下の基：
−ＣＯ−Ｃ（Ｒ２１）＝ＣＨ２；
−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ２２−Ｙ１；
−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−Ｒ２２−Ｙ１；
−ＣＯＮＨ−Ｒ２３−Ｙ１；
−ＣＯ−Ｒ２３−Ｙ１；
［式中、Ｙ１は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基から選択され；
Ｒ２１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基から選択され；
Ｒ２２およびＲ２３は、２価のＣ２−５０炭化水素基または２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基であり、前記２価のＣ２−５０炭化水素基は、１〜１０の酸素原子が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよい］
から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｙ１が、以下の基：
−Ｘ１４−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１８）＝ＣＨ２
［式中、Ｘ１４は、ＯおよびＮ（Ｒ１９）から選択され；Ｒ１８は水素原子またはＣ１−６アルキル基であり；Ｒ１９は水素原子またはＣ１−６アルキル基である］および
【化１】
2008136536.tif 000042
から選択される炭素−炭素二重結合を含む基である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記架橋形成反応が、前記溶液中に架橋剤を添加することにより行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体により、架橋性基を有さない親水性多糖類誘導体が封入されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
親水性多糖類誘導体が、分子内架橋性基、または親水性多糖類誘導体およびヒアルロン酸誘導体に連結する分子間架橋性基を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
親水性多糖類誘導体がヒアルロン酸誘導体にのみ連結する架橋性基を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ヒアルロン酸誘導体が、分子内架橋性基、またはヒアルロン酸誘導体に連結する分子間架橋性基を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ゲル状である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬として使用される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
タンパク質またはペプチドを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸誘導体と疎水性基を導入した多糖類またはその誘導体からなる新規なハイブリッドゲル、当該ハイブリッドゲルの製造方法、当該ハイブリッドゲルを含む医薬組成物、特に薬効を有するタンパク質またはペプチドを徐放する徐放性製剤における利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬効を持つタンパク質やペプチドの製剤が盛んに実用化されている。一般にタンパク質やペプチドは消化管内での安定性および腸管膜からの吸収性が低いため、経口投与製剤にすることは困難であり、大部分が注射剤として臨床使用されている。しかし、タンパク質やペプチドは一般に血中半減期も短いため、これらを薬物として使用する場合は頻回投与とならざるを得ず、患者の負担は過大なものとなっている。できるだけ少量で薬効を発揮させかつ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチドの実用的な徐放性製剤が望まれている。また、低分子化合物を薬物として投与する場合も、薬効を延長させるための持続製剤のニーズは高い。
また、タンパク質またはペプチドの徐放性製剤においては、製剤化工程中や生体内へ投与した後の製剤中でタンパク質またはペプチドの変性あるいは凝集が起こるという問題がある。このような変性あるいは凝集を防止し、回収率の低下を防ぐための手段は、生物学的利用率の向上の観点から非常に有益である。
ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性高分子を基材にした徐放性製剤化が試みられているが、基材の疎水性や製剤化のための操作（乳化、乾燥、酸性化など）に起因するタンパク質の変性、凝集が報告されている（非特許文献１および２を参照）。一方、こうした問題が低減される親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放性製剤も報告されているが、やはり実用化には至っていない。また、安全性の面からは、製剤に用いる素材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならず、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率および安全性の全てにおいて、実用化レベルに達している徐放性製剤の実現は難しい。
近年、多糖を薬物担体の基材として用いるという報告がある。その中でも、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドグリカンの一種である。ＨＡは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）の一つである。近年、微生物による高分子量ＨＡの大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。
非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持ち、安全性の面から好ましいと考えられるＨＡを化学架橋したゲルからタンパク質やペプチドを薬物として徐放させる試みについていくつか報告されている。ＨＡを化学架橋でゲル化させる方法としては、カルボジイミド（ＣＤＩ）法（特許文献１参照）、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）法（特許文献２参照）、グリシジルエーテル（ＧＥ）法（特許文献３参照）等が知られている。また、ＨＡに架橋性官能基としてヒドラジド（ＨＺ）基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＨＺ）を架橋剤で架橋する方法（非特許文献３参照）も知られている。
ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋によりＨＡゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する徐放性製剤についても報告されており（例えば、特許文献４参照）、このようなｉｎ  ｓｉｔｕ架橋徐放性製剤工程においては、薬物への影響が少ないことが望まれる。タンパク質およびペプチドの反応を極力抑えるため、穏和な条件下でのメルカプト基の酸化による架橋反応を利用した薬物封入ＨＡゲルの製造が報告されているが（特許文献５参照）、システイン残基を含むタンパク質やペプチドへの適用に改良の余地がある。同様にタンパク質またはペプチドとの反応を極力抑える方法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが（特許文献６参照）、反応選択性や汎用性に問題があり、また上述したとおり、生分解性でないＰＥＧ断片が生体内に残存する点が問題となる。
副反応によるタンパク質またはペプチドの変性は、生物活性の低下のみならず抗原性発現の原因になる等の問題があることから、ゲルを架橋する反応は、封入されるタンパク質やペプチドに影響を及ぼさない高選択的なものである必要性があるが、その反応の選択性、汎用性、安全性のすべてを解決したｉｎ  ｓｉｔｕ架橋方法は知られていない。
一方で、ゲルを架橋した後にタンパク質またはペプチドを封入する方法では、化学架橋時の薬剤と基材との副反応を完全に回避できる利点がある。また、ゲルを化学架橋後に洗浄することにより薬物非存在下で余剰の架橋剤を除去したり、未反応の架橋性官能基を別の反応性基により消失させることが可能なので、未反応の架橋性官能基や架橋剤の残存というコンタミネーションの問題を回避できる利点がある。しかし、ＨＡとタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその封入効率は低く、かつ徐放性をほとんど示さないことが問題である。
これまでに、親水性多糖類に疎水性基（例えば、コレステロール基やアルキル基などを含む基）を導入して得られる多糖類（以下、疎水化多糖、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＨＰとも称す）が、水溶液中において自発的に会合しヒドロゲル構造を有するナノサイズの微粒子（ナノゲル）を形成すること（非特許文献４、および５を参照）、このナノゲルは疎水性低分子、ペプチド、タンパク質などと複合化するホスト分子として機能すること（非特許文献４、６、および７を参照）、およびこのナノゲルはタンパク質の熱安定化やリフォールディングを促進する人工分子シャペロンとして機能することが報告されている（非特許文献８、および９を参照）。さらに、このナノゲルにメタクリロイル基などの重合性基を導入し、これを機能性モノマーで共重合反応することによって架橋したハイブリッドゲルが報告されている（特許文献８および非特許文献１０を参照）。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９４／０２５１７号パンフレット
【特許文献２】特開昭６１−１３８６０１号公報
【特許文献３】特開平５−１４０２０１号公報
【特許文献４】米国特許第５８２７９３７公報
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００４／０４６２００号パンフレット
【特許文献６】国際公開第ＷＯ２０００／４４８０８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第ＷＯ２００４／０５０７１２号パンフレット
【特許文献８】特開２００５−２９８６４４号公報
【特許文献９】国際公開第ＷＯ２００６／０２８１１０号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第ＷＯ００／１２５６４号パンフレット
【特許文献１１】欧州公開第０８４２６５７号公報
【特許文献１２】国際公開第ＷＯ２００５／０５４３０１号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．第８８巻、第１６６−１７３頁、１９９９年
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  第１５巻、第６９９−７１３頁、１９９８年
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１６巻、第７５１５−７５２２頁、１９９４年
【非特許文献４】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  第２６巻、第３０６２−３０６８頁、１９９３年
【非特許文献５】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  第３０巻、第８５７−８６１頁、１９９７年
【非特許文献６】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  第２７巻、第７６５４−７６５９頁、１９９４年
【非特許文献７】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１８巻、第６１１０−６１１５頁、１９９６年
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．第１０巻、第３２１−３２４頁、１９９９年
【非特許文献９】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第５３３巻、第２７１−２７６頁、２００３年
【非特許文献１０】Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  第６巻、第１８２９−１８３４頁、２００５年
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第４７巻  第１５２−１６９頁、１９９９年
【非特許文献１２】Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  第５４巻、第３１３−２３０頁、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これまでに、ｉｎ  ｓｉｔｕで安全性の高いヒアルロン酸を基剤として化学架橋することでゲルを調製し、薬物、特に薬効を有するタンパク質やペプチドをその生物活性を維持したまま効率的にそこへ封入して長期間の徐放を可能にする方法は知られていない。また、あらかじめ架橋されたＨＡゲルに効率的に薬物を封入し、長期間徐放することができるゲルおよびその製造方法、およびこれらを用いた薬物の徐放型製剤は知られていない。
発明が解決しようとする課題は、長時間の徐放が可能であり、安全性に優れた、徐放性製剤用の薬物担体を提供することであり、特に、薬効を有するタンパク質またはペプチドを薬物として含む徐放性製剤に使用する場合に、薬理活性を維持したまま薬物を効率よく封入することができる薬物担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意検討を進めたところ、ヒアルロン酸誘導体と、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を使用して調製されるハイブリッドゲルが、薬物、特に薬効を有するタンパク質またはペプチドを、その生物活性を維持したまま効率よく封入し、長期間徐放し、生分解性で安全性に問題のない薬物徐放担体となることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、薬物、特に薬効を有するタンパク質やペプチドを、その生物活性を維持したまま効率よく封入することができることを特徴とする、ヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含むハイブリッドゲルとその製造法、および薬物を該ハイブリッドゲルに封入することで得られる徐放性製剤とその製造方法に関する。
本発明の１つの側面によれば、ヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含むハイブリッドゲルが提供される。上記側面によれば、本発明のハイブリッドゲルは、ヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含み、化学結合による架橋構造と疎水的相互作用による物理架橋構造を併せ持つゲル状組成物である。
本明細書で言及するゲルには、ヒドロゲル（水を含んで膨潤しており、流動性が低下している、または無くなっている状態）、オルガノゲル（有機溶媒を含んで膨潤しており、流動性が低下している、または無くなっている状態）、キセロゲル（ヒドロゲル、オルガノゲルを乾燥した状態）などが含まれる。
また、ゲルを含む医薬組成物の調製法としては、薬物を封入してからもしくは薬物の封入と同時にヒドロゲル化もしくはオルガノゲル化し、その後乾燥してキセロゲル化する方法；ヒドロゲルもしくはオルガノゲルの状態で薬物を封入し、その後乾燥してキセロゲル化する方法；キセロゲルに水を加えてヒドロゲル化し、その後薬物を封入する方法、などが挙げられる。
本発明の１つの側面によれば、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、前記架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体が、前記疎水性基の会合により微粒子を形成する前記親水性多糖類誘導体（ここで、当該親水性多糖類誘導体は架橋形成が可能な基を有していてもよい）の存在下、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体の架橋形成反応により調製される前記組成物が提供される。
本発明の別の側面によれば、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、前記疎水性基の会合により微粒子を形成する前記親水性多糖類（ここで、当該親水性多糖類誘導体は架橋形成が可能な基を有していてもよい）を含む溶液（例えば、水溶液）中で、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体を架橋形成することにより、前記架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体を調製する、前記組成物が提供される。
本発明の組成物はゲル（例えば、ヒドロゲル、またはキセロゲル）を形成していてもよい。本発明の組成物がキセロゲルである場合、水分含有量は、例えば２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下である。したがって、１つの態様において、本発明はゲル状組成物である。
本発明のヒアルロン酸誘導体とは、ヒアルロン酸の少なくとも１つ以上のカルボキシ基またはヒドロキシ基に置換基を導入したものまたは塩を形成したものである。特に限定されないが、置換基として架橋形成が可能な基、例えば、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、−ＣＯＮＨＮＨ２、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基が挙げられる。置換基はスペーサーを介して結合していてもよい。
前記架橋形成が可能な基は、ヒアルロン酸の１以上のカルボキシ基を−ＣＯ−Ｙに変換することにより導入されてもよく、Ｙ基としては、例えば以下の基：
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−ＣＯ−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−Ｃ（＝ＮＲ２４）−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−ＣＯ−Ｘ１３−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−ＣＯ−Ｘ１３−Ｒ１３−Ｙ２；
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−Ｙ２；
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−ＣＯＮ（Ｒ１５）Ｎ（Ｒ１６）ＣＯ−Ｒ１３−Ｙ２；および
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−ＣＯＮ（Ｒ１５）Ｎ（Ｒ１６）Ｃ（＝ＮＲ２４）−Ｒ１３−Ｙ２
［式中、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３は、独立に、ＯおよびＮ（Ｒ１１）から選択され：
Ｙ２は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、−ＣＯＮＨＮＨ２、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基から選択され；
Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ２４は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基から選択され；
Ｒ１２は、２価のＣ２−５０炭化水素基または２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基であり；
Ｒ１３は、２価のＣ１−５０炭化水素基、２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基または−ＣＨ（Ｒ２５）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−Ｒ２６−ＣＨ２−であり；ここで、Ｒ１２およびＲ１３が２価のＣ２−５０炭化水素基である場合、１〜１０の酸素原子が挿入されて当該炭化水素基が一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよく；または
−Ｒ１３−Ｙ２は、一緒になって、−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ、もしくは−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨを表し；または
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｙ２は、一緒になって、システイン、ホモシステインまたはグルタチオンが末端のアミノ基で連結する基を表し；
Ｒ２５は、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ２６は、−（ＣＨ（Ｒ２７））ｍ−または１〜３の酸素原子が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよい２価のＣ２−１０炭化水素基であり；
ｍは、１〜１０の整数であり；
Ｒ２７は、独立に、水素原子、ヒドロキシ基またはＣ１−６アルキル基から選択される］が挙げられる。
ここで、システイン、ホモシステインまたはグルタチオンが末端のアミノ基で連結する基とは、それぞれ以下の基：
−ＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）−ＳＨ
−ＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）２−ＳＨ
−ＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＳＨ
を意味する。
Ｙ２は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、−ＣＯＮＨＮＨ２、および炭素−炭素二重結合を含む基から選択されるか；または−Ｒ１３−と一緒になって、−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ、もしくは−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨを表し；または−Ｘ１１−Ｒ１２−と一緒になって、システイン、ホモシステインまたはグルタチオンが末端のアミノ基で連結する基を表すのが好ましい。
本発明の１つの態様において、Ｙ基は、以下の基：
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｙ１；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−ＣＯ−Ｒ１３−Ｙ１；
−Ｘ１１−Ｒ１２−ＣＯ−Ｘ１３−Ｒ１３−Ｙ１；
−Ｘ１１−Ｒ１２−Ｘ１２−ＣＯ−Ｘ１３−Ｒ１３−Ｙ１；
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−Ｙ１；および
−Ｎ（Ｒ１１）Ｎ（Ｒ１４）ＣＯ−Ｒ１２−ＣＯＮ（Ｒ１５）Ｎ（Ｒ１６）ＣＯ−Ｒ１３−Ｙ１；
［式中、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３は、独立に、ＯおよびＮ（Ｒ１１）から選択され：
Ｙ１は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基から選択され；
Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基から選択され；
Ｒ１２およびＲ１３は、２価のＣ２−５０炭化水素基または２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基であり、前記２価のＣ２−５０炭化水素基は、１〜１０の酸素原子が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよい］
から選択される基であってもよい。
Ｙ１は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、および炭素−炭素二重結合を含む基から選択されるのが好ましい。
Ｙ基の好ましいものとしては、例えば、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｒ−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｒ−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）２−ＳＨ；および
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、ｐは２〜１０の整数、ｑは１〜２００の整数、ｒは１〜３の整数を、それぞれ表す）
が挙げられる。特に、
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＳＨ；および
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子またはＣ１−６アルキル基である）が好ましい。
Ｒ１７としては、水素原子およびメチル基が好ましい。
前記架橋形成が可能な基は、親水性多糖誘導体がカルボキシ基を有する場合（例えば、親水性多糖誘導体がヒアルロン酸である場合）、その１以上のカルボキシ基を−ＣＯ−Ｙに変換することにより導入されてもよい。
前記架橋形成が可能な基は、親水性多糖誘導体あるいはヒアルロン酸またはその誘導体の１以上のヒドロキシ基を−Ｏ−Ｚに変換することにより導入されてもよく、Ｚ基としては、例えば以下の基：
−ＣＯ−Ｃ（Ｒ２１）＝ＣＨ２；
−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ２２−Ｙ１；
−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−Ｒ２２−Ｙ１；
−ＣＯＮＨ−Ｒ２３−Ｙ１；
−ＣＯ−Ｒ２３−Ｙ１；
−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｘ２１−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｙ１；
−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｘ２１−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｙ１；
［式中、Ｘ２１は、ＯおよびＳから選択され：
ｎは、１〜５０の整数を表し；
Ｙ１は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基から選択され；
Ｒ２１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基から選択され；
Ｒ２２およびＲ２３は、２価のＣ２−５０炭化水素基または２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基であり、前記２価のＣ２−５０炭化水素基は、１〜１０の酸素原子が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよい］
が挙げられる。
本発明の一つの態様において、Ｚ基は、以下の基：
−ＣＯ−Ｃ（Ｒ２１）＝ＣＨ２；
−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ２２−Ｙ１；
−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−Ｒ２２−Ｙ１；
−ＣＯＮＨ−Ｒ２３−Ｙ１；
−ＣＯ−Ｒ２３−Ｙ１；
［式中、Ｙ１は、アミノ基、メルカプト基、ホルミル基、炭素−炭素二重結合を含む基、および炭素−炭素三重結合を含む基から選択され；
Ｒ２１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基から選択され；
Ｒ２２およびＲ２３は、２価のＣ２−５０炭化水素基または２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基であり、前記２価のＣ２−５０炭化水素基は、１〜１０の酸素原子が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分を含んでいてもよい］
から選択される基であってもよい。
本明細書で言及する「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ１−４アルキル基」が含まれ、さらに、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチルなどが含まれる。
本明細書で言及する「Ｃ８−５０炭化水素基」は特に限定されず、その例として、炭素数８〜５０の直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基が挙げられ、当該基は芳香族環基であってもよく、または芳香族環を構造の一部に含んでいてもよい。
本明細書で言及する「２価のＣ１−５０炭化水素基」は特に限定されず、その例として、炭素数１〜５０の直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のアルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基が挙げられ、当該基は２価の芳香族環であってもよく、または芳香族環を構造の一部に含んでいてもよい。
本明細書で言及する「２価のＣ２−５０炭化水素基」は特に限定されず、その例として、炭素数２〜５０の直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のアルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基が挙げられ、当該基は２価の芳香族環であってもよく、または芳香族環を構造の一部に含んでいてもよい。
本明細書で言及する「２価のＣ２−１０炭化水素基」は特に限定されず、その例として、炭素数２〜１０の直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のアルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基が挙げられ、当該基は２価の芳香族環であってもよく、または芳香族環を構造の一部に含んでいてもよい。
本明細書で言及する「２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基」は特には限定されず、繰り返し単位のアルキレン基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。「２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ基」の例には、２価のＣ２−５０ポリエチレンオキシ基、Ｃ３−４８ポリプロピレンオキシ基、Ｃ３−４８ポリブチレンオキシ基などが含まれる。当該基は、酸素原子または炭素原子を介して他の基と連結していてよく、例えばＣ２−５０ポリエチレンオキシ基には、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２５−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２５−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１−２５−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２４−（ＣＨ２ＣＨ２）−などが含まれる。
本明細書において、炭化水素基に酸素原子が挿入される場合、１または２個の酸素原子は炭化水素基の任意の位置に挿入されてよく、３以上の酸素原子は当該基が一部にポリアルキレンオキシ部分を含むように挿入されてもよい。
本明細書において２価のＣ２−５０炭化水素基に１〜１０の酸素原子が挿入される場合、１または２個の酸素原子は炭化水素基の任意の位置に挿入されてよく、３〜１０の酸素原子は前記基が一部にポリアルキレンオキシ部分を含むように挿入されてもよい。前記基に含まれるポリアルキレンオキシ部分としては、Ｃ２−２０エチレンオキシ、Ｃ３−３０プロピレンオキシ、Ｃ４−４０ポリブチレンオキシなどが含まれる。
本明細書で言及する「炭素−炭素二重結合を含む基」は特には限定されないが、当該基には例えば、直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のＣ２−５０アルケニレン基、Ｃ２−３０アルケニレン基、Ｃ２−１０アルケニレン基などが含まれる。さらに前記炭素−炭素二重結合を含む基には、例えば、下式
−Ｘ１４−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１８）＝ＣＨ２
［式中、Ｘ１４は、ＯおよびＮ（Ｒ１９）から選択され；Ｒ１８は水素原子またはＣ１−６アルキル基であり；Ｒ１９は水素原子またはＣ１−６アルキル基である］
で表される基および下式：
【化１】
2008136536.tif 000002
で表される基などが含まれる。
本明細書で言及する「炭素−炭素三重結合を含む基」は特には限定されないが、当該基には例えば、直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のＣ２−５０アルキニレン基、Ｃ２−３０アルキニレン基、Ｃ２−１０アルキニレン基などが含まれる。
Ｚ基としては、−ＣＯ−Ｃ（Ｒ２１）＝ＣＨ２が好ましく、特にアクリロイル基およびメタクリロイル基が好ましい。
本発明の上記側面において、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、特には限定されないが、例えば、親水性多糖類に１００単糖あたり０．５〜３０個の疎水性基を導入することで得られた親水性多糖類であってもよい。当該疎水性基を導入した親水性多糖類は、水溶液中において疎水性相互作用により数分子が自発的に会合することでナノサイズ（１−１，０００ｎｍ）の微粒子を形成することなどにより、疎水性薬物や薬効を有するタンパク質やペプチドと複合化するものである。
前記親水性多糖類誘導体は、親水性多糖類およびその誘導体に疎水性基を導入して得ることができる。ここで、親水性多糖類には、水溶性多糖類が含まれ、特には限定されないが、例えば、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、デキストリンなどが含まれる。
本明細書で言及する架橋とは、共有結合などによる化学結合であっても、疎水性相互作用や静電的相互作用による物理結合（会合）であってもよく、また分子間、分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。本明細書で言及する架橋性基とは、上記の架橋を形成している基である。本明細書で言及する架橋形成が可能な基とは、架橋形成反応や一定の条件下におくことで架橋性基を形成することができる基である。
本発明の上記側面において、前記疎水性基は、特には限定されないが、例えば、Ｃ８−５０炭化水素基またはステリル基を含む基であってもよい。
前記疎水性基は、例えば、前記親水性多糖類またはその誘導体の１以上のヒドロキシ基を−ＯＸに変換することにより導入され、Ｘの例としては、以下の基：
−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｒ３−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；および
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２
［式中、Ｒ１は、Ｃ８−５０炭化水素基であり；
Ｒ２は、Ｃ８−５０炭化水素基またはステリル基であり；
Ｒ３は、２価のＣ２−５０炭化水素基であり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、独立に、ＯおよびＮ（Ｒ４）から選択され；
Ｒ４は水素原子またはＣ１−６アルキル基である］
などが挙げられる。
本発明の一つの態様において、Ｘは、以下の基：
−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｒ１；
−ＣＯ−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２；および
−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２
［式中、Ｒ１は、Ｃ８−５０炭化水素基であり；
Ｒ２は、Ｃ８−５０炭化水素基またはステリル基であり；
Ｒ３は、２価のＣ２−５０炭化水素基であり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、独立に、ＯおよびＮ（Ｒ４）から選択され；
Ｒ４は水素原子またはＣ１−６アルキル基である］
から選択される基であってもよい。
Ｘとしては、−ＣＯ−Ｒ３−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２および−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２が好ましく、−ＣＯ−Ｒ３−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２および−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ３−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２がさらに好ましく、−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ３−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２がなおさらに好ましい。
Ｒ３としては、直鎖もしくは分岐鎖状のＣ２−５０アルキレン基、直鎖もしくは分岐鎖状のＣ２−５０アルケニレン基、直鎖もしくは分岐鎖状のＣ２−５０アルキニレン基等が挙げられる。好ましくは直鎖状のＣ２−５０アルキレン基が挙げられる。その炭素数は、−ＣＯ−Ｒ３−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２におけるＲ３としては２〜２０が好ましく、２〜１０、更には２〜６が、より好ましい。−ＣＯ−Ｘ１−Ｒ３−Ｘ２−ＣＯ−Ｘ３−Ｒ２におけるＲ３としては２〜２０が好ましく、２〜１０、更には４〜８が、より好ましい。
Ｃ８−５０炭化水素基としては、直鎖もしくは分岐鎖状のＣ８−５０アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のＣ８−５０アルケニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のＣ８−５０アルキニル基等が挙げられ、好ましくは直鎖状のＣ８−５０アルキル基が挙げられる。その炭素数は、１０〜３０が好ましく、１０〜２０がより好ましく、例えば、ラウリル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基などが挙げられる。
ステリル基としては、ステロール骨格を有する基であれば特に制限されず、例えば、コレステリル基、スチグマステリル基、β−シトステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、好ましくはコレステリル基が挙げられる。
Ｒ２としては、コレステリル基、−（ＣＨ２）１１ＣＨ３、−（ＣＨ２）１５ＣＨ３および−（ＣＨ２）１９ＣＨ３が好ましく、コレステリル基がさらに好ましい。
Ｘの具体例としては、
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−Ｏ−コレステリル；
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）１１ＣＨ３；
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３；
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）１９ＣＨ３；
−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−コレステリル；
−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）１１ＣＨ３；
−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３；および
−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）１９ＣＨ３；
（ここで、ｔは２〜６の整数であり、ｕは４〜８の整数である）
が好ましく、特に、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−コレステリルが好ましい。
前記疎水性基は、例えば、前記親水性多糖類またはその誘導体の１以上のカルボキシ基を−ＣＯ−ＯＸに変換することにより導入されてもよい。
本発明の上記側面の１つの態様において、前記架橋形成反応は、前記溶液中に架橋剤を添加することにより行われる。
本発明の上記側面の１つの態様において、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体により、架橋性基を有さない親水性多糖類誘導体が封入されていてもよい。さらに、本発明の上記側面の１つの態様において、親水性多糖類誘導体が、分子内架橋性基、または親水性多糖類誘導体およびヒアルロン酸誘導体に連結する分子間架橋性基を有していてもよい。さらに、本発明の上記側面の１つの態様において、親水性多糖類誘導体がヒアルロン酸誘導体にのみ連結する架橋性基を有していてもよい。
１つの態様において、本発明の上記側面により提供される組成物は、医薬組成物として使用される。当該医薬組成物に含まれる薬剤は、特には限定されないが、例えば、タンパク質またはペプチドを薬剤として含有していてもよい。
本発明のさらなる側面によれば、本発明の上記側面により提供されるゲルに薬物溶液を添加することで薬物を吸収させる工程を含む、医薬品組成物の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の工程、
（ａ）架橋形成が可能な基を有するヒアルロン酸誘導体を製造する工程；
（ｂ）疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を製造する工程；
（ｃ）少なくとも１種類以上の工程（ａ）により生成するポリマーと、少なくとも１種類以上の工程（ｂ）により生成するポリマーから選択される、少なくとも２種類以上のポリマーをハイブリッドゲル化させる工程；
を含む、ゲル状組成物の製造方法が提供される。当該工程（ｃ）においてハイブリッドゲル化させる方法は、ポリマーを架橋することができる一般的に知られている方法を用いればよい。特に限定されないが、架橋形成が可能な基を有するヒアルロン酸誘導体と疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を架橋剤を用いて架橋してもよく、架橋形成が可能な基を有するヒアルロン酸誘導体を前記親水性多糖類誘導体の存在下で架橋してもよく、架橋形成が可能な基を有するヒアルロン酸誘導体と前記親水性多糖類誘導体に架橋形成が可能な基を導入した誘導体を架橋してもよい。当該工程は、バルクで行ってもよく、Ｗ／Ｏエマルション中や噴霧液滴中などの不連続相中で行ってもよい。当該工程中に、架橋反応を停止する操作を行ってもよい。工程（ｃ）の後に、粉砕、乾燥、洗浄工程などを行ってもよい。
さらに本発明の別の側面によれば、前記ゲルに薬物溶液を添加することで、薬物を封入する工程を含む、医薬品組成物の製造方法と当該製造方法によって得られる医薬品組成物が提供される。当該工程の後に粉砕、乾燥、洗浄工程などを行ってもよい。
さらに本発明の別の側面によれば、以下の工程
（ａ）ＨＰまたはその誘導体からなるナノゲルに薬物を複合化させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたナノゲルと薬物の複合体とＨＡまたはその誘導体をハイブリッドゲル化させる工程；
を含む医薬品組成物の製造方法と当該製造方法によって得られる医薬品組成物が提供される。ここで、必要であれば、工程（ｂ）の後に粉砕、乾燥、洗浄工程などを行ってもよい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のゲルを用いることで、薬物、特に薬効を有するタンパク質やペプチドの従来の徐放性製剤では達成できなかった、薬物をその生物活性を維持したまま効率よく封入し、長期間徐放し、安全性に問題のない実用的な徐放性製剤を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓの吸収後の、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの写真の１例である。
図２は、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓの吸収後の、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの緩衝液中における写真の１例である。
図３は、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓを吸収させた後に、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルにシクロデキストリンを添加した時の写真の１例である。
図４は、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓを吸収させた後に、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルにヒアルロニダーゼを添加した時の写真の１例である。
図５は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルに吸収されたインスリン量を示すグラフである。
図６は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのインスリン放出量を示すグラフである。
図７は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのインスリン放出量に対する、シクロデキストリンの影響を示すグラフである。
図８は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルに吸収されたＦＩＴＣ−Ｉｎｓ量を示すグラフである。
図９は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出量を示すグラフである。
図１０は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に対する、アルブミンの影響を示すグラフである。
図１１は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＳＨとの化学架橋によるハイブリッドゲル調製検討時の写真である。
図１２は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＳＨとの化学架橋によるハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出特性を示すグラフである。
図１３は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＭＡとの化学架橋によるハイブリッドゲル調製検討結果を示す図である。
図１４は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＭＡとの化学架橋によるハイブリッドゲルへのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ吸収量の経時変化を示すグラフである。
図１５は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＭＡとの化学架橋によるハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出量の経時変化を示すグラフである。
図１６は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＭＡとの化学架橋によるハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に与えるシクロデキストリンの影響を示すグラフである。
図１７は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＭＡとの化学架橋によるハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に与えるアルブミンの影響を示すグラフである。
図１８は、ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＭＡとの化学架橋によるハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に与えるヒアルロニダーゼの影響を示すグラフである。
図１９は、各種化学架橋ハイブリッドゲルのゲル密度を示すグラフである。
図２０は、ＣＨＰ−ＭＡとＭＰＣとの化学架橋によるハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に与えるアルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ）の影響を示すグラフである。
図２１は、ＣＨＰ−ＭＡ・ＭＰＣハイブリッドゲルとＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に対するアルブミンの影響の比較を示すグラフである。
図２２は、ＨＰ−ＭＡとＭＰＣとの化学架橋によるハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に与えるアルブミン（５０ｍｇ／ｍＬ）の影響を示すグラフである。
図２３は、ＣＨＰ−ＭＡとＭＰＣのハイブリッドゲルとＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＭＡとの化学架橋ハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動に対するアルブミンの影響の比較を示すグラフである。
図２４は、ＣＨＰを封入した各種化学架橋ハイブリッドゲルからのインスリン放出挙動を示すグラフである。
図２５は、ＣＨｃＤｅｘを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのインスリン放出挙動を示すグラフである。
図２６は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのＧＬＰ−１放出挙動を示すグラフである。
図２７は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのＥＰＯおよびＣＨＰの放出挙動を示すグラフである。
図２８は、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＡＭハイブリッドゲルからのＥＰＯ放出挙動を示すグラフである。
図２９は、ＥＰＯとＣＨＰの複合体、およびＥＰＯ共存下で化学架橋したハイブリッドゲルからのＥＰＯ回収率を示すグラフである。
図３０は、ＥＰＯとＣＨＰの複合体溶液、およびＥＰＯ溶液のラット皮下投与後のＥＰＯ血漿中濃度推移を示すグラフである。
図３１は、ＥＰＯを封入した各種ハイブリッドゲルのラット皮下埋め込み後のＥＰＯ血漿中濃度推移を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明の組成物（好ましくはゲル状組成物）は、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含むことを特徴とし、薬物徐放担体として以下のような優れた特徴を有している。
１．生分解性であり、また生体内における安全性を有する。
２．薬物、特に薬効を有するタンパク質やペプチドの封入工程、製剤中、生体内での変性を防ぐことができる。
３．架橋密度および分解性を制御することにより、徐放期間を制御することができる。
本発明に用いられるヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸の少なくとも１つ以上のカルボキシ基またはヒドロキシ（ＯＨ）基に置換基が結合したものである。置換基は１種類またはそれ以上のものであってもよい。製造方法は各種公知の方法により製造することができる。特に限定されないが、架橋性官能基は例えば、アミノ基（ＡＭ）、メルカプト基（ＳＨ）、不飽和結合を有する基、ホルミル基（ＡＬＤ）などが挙げられ、その調製法は、例えば特許文献５、特許文献９、非特許文献１１に開示がある。置換基はスペーサーを介して結合していてもよい。さらに生分解速度を制御するための修飾がされていてもよく、この調製法は、例えば特許文献９に開示がある。
本発明に用いられるヒアルロン酸およびその誘導体の分子量は、特に限定されないが、低分子量になるほど、ゲル化の架橋反応効率が低下し、高分子量になるほど溶液粘度が増大することに起因してＨＰまたはその誘導体や架橋剤と均一に混合することが困難となる。そのため、当該分子量は、１ｋＤａ〜１，０００ｋＤａが好ましく、１０ｋＤａ〜３００ｋＤａがさらに好ましい。
本発明に用いられるヒアルロン酸誘導体は、薬学的に許容される塩であってもよい。薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属類を挙げることができ、特に好ましい塩は、医薬品として汎用されているナトリウム塩である。ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、あるいは市販のものを購入して（例えば、株式会社資生堂、電気化学工業株式会社、生化学工業株式会社等から）入手することも可能である。
本発明に用いられる疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、親水性多糖類およびその誘導体に、多糖１分子あたり少なくとも１分子以上の疎水性基を導入して得ることができる親水性多糖類である。親水性多糖類としては特に限定されないが、好ましくはプルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、デキストリンであり、これらは市販されているか、文献記載の方法に従い、種々の平均分子量を有するものを入手することもできる。親水性多糖類として特に好ましいものは、プルラン、ヒアルロン酸、デキストリンである。デキストリンとしてはクラスターデキストリン（登録商標）が好ましい。クラスターデキストリン（登録商標）は、江崎グリコ株式会社から販売されているものを購入して使用することができる。疎水性基としては特に限定されないが、好ましくはＣ８−５０の炭化水素基、ステリル基、ポリ乳酸（ＰＬＡ）基、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）基などの基またはこれらの基を含む基であり、特に好ましくはコレステリル基を含む基、Ｃ８−３０の直鎖または分岐アルキル基または当該基を含む基である。疎水性基はスペーサーを介して導入されていてもよい。
疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は各種公知の方法により製造することができ、例えば親水性多糖類としてプルランのヒドロキシ基に、疎水性基としてＮ−［６−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシル］カルバモイル基を導入した親水性多糖類誘導体（以下、「コレステロールプルラン」、「ＣＨＰ」とも称する）の製造方法は、特許文献１０に開示があり、また市販のものを購入して（例えば、日本油脂株式会社）入手することも可能である。疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、水溶液中において疎水性相互作用により数分子が自発的に会合することでナノサイズ（１〜１，０００ｎｍ）のゲル構造を有する微粒子（以下、「ナノゲル」とも称する）を形成することなどにより、疎水性薬物や薬効を有するタンパク質やペプチドと複合化することがきるものであり、例えば非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７などで例示されているものである。疎水基の導入率は特に限定されないが、安定にナノゲルを形成すること、薬物を安定に複合化できること、薬物複合化可能量が多いこと、を成しえる範囲が好ましく、この範囲は親水性多糖類と疎水基の組み合わせによって変動する。例えば親水性多糖類としてプルランを用いた場合、１００単糖あたり１〜５個のＮ−［６−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシル］カルバモイル基で置換されていることが好ましい。
疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、１分子に少なくとも１つ以上の疎水性基が結合したものであり、その他にも置換基を導入することにより修飾されていてもよい。前記親水性多糖類誘導体が有する疎水性基および置換基は１種類またはそれ以上のものであってもよい。製造方法は各種公知の方法により製造することができる。特に限定されないが、置換基として架橋形成が可能な基が導入されているものであってもよい。架橋形成が可能な基としては、例えば、アミノ基、メルカプト基、不飽和結合（炭素−炭素二重結合、および炭素−炭素三重結合など）を有する基、およびホルミル基から選択される基など、または当該基を含む基が挙げられ、例えばメタクリロイル基を、ＣＨＰに導入した親水性多糖類誘導体の調製法は、特許文献８に開示がある。当該置換基はスペーサー部分を含んでいてもよい。
本発明に用いられる疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の分子量は、特に限定されないが、好ましくは１ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、さらに好ましくは１０ｋＤａ〜３００ｋＤａである。また前記親水性多糖類誘導体は、薬学的に許容される塩であってもよい。
本発明の組成物（好ましくはゲル状組成物）は、架橋形成が可能な基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体から選択される少なくとも２種類以上のポリマーを架橋したハイブリッドゲルであり、ポリマーの比率は、当事者が適宜選択できる。疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、薬効を有するタンパク質やペプチドおよび疎水性低分子薬物と複合化し、安定に保持する機能を有するもので、この組成比が高いほどハイブリッドゲル中への薬物封入量を増やすことができる。
タンパク質などの薬物を安定に保持するために、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体が、疎水性基の会合により水溶液中で形成する微粒子の内部に薬物を保持することにより、薬物と上記のハイブリッドゲルと複合化するのが好ましい。一方で、微粒子を形成せずとも、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体における複数の疎水性基が、水溶液中の複数の場所で会合し、その会合点の１つまたは複数により薬物が保持される場合もある。特に、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の水溶液中の濃度が高くなるに従い、当該水溶液がバルクでゲル化しやすくなるため、後者の形式で薬物が保持される割合が高くなる。
本発明の組成物（好ましくはゲル状組成物）は、複合的な架橋構造を有するハイブリッドゲルであってもよい。架橋とは、共有結合による化学結合であっても、疎水性相互作用や静電的相互作用などによる物理結合であってもよく、また分子間、分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。当該ハイブリッドゲルは、少なくとも１種類以上の化学結合による化学架橋構造と、１種類以上の疎水的相互作用による物理架橋構造を合わせ持つことを特徴としている。
また、本発明は、架橋形成が可能な基を有するヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体から選択される少なくとも２種類以上のポリマーをハイブリッドゲル化させる工程にも関する。本発明のハイブリッドゲルは、各種公知の架橋方法によって形成される。
本発明の組成物の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の存在下で、架橋形成が可能な基を導入したヒアルロン酸誘導体を架橋する方法が挙げられる。具体的には、アミノ基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＡＭ）を、Ｃ２−２０アルキレン基の両端にスクシンイミジルエステルやその他のイミドエステルを有する架橋剤（例えば、ビス［スルフォスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、エチレングリコール−ビス［スルフォスクシンイミジル］スクシネート（Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ）、ジメチルアジピミデート塩酸塩（ＤＭＡ）など）で縮合反応により架橋すればよい。または、ＨＡ−ＡＭを、Ｃ２−２０アルキレン基の両端にホルミル基を有する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）で架橋すればよい。または、ホルミル基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＡＬＤ）を、Ｃ２−２０アルキレン基の両端にアミノ基を有する架橋剤（例えば、エチレンジアミン（ＥＤＡ）など）で架橋すればよい。さらには、メルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＳＨ）を酸化条件下（例えば、テトラチオネートナトリウム（ＳＴＴ）存在下など）で酸化反応により架橋すればよい。さらには、ＨＡ−ＳＨをＣ２−２０アルキレン基の両端にマレイミド（ＭＡＬ）基やメタクリロイル基などの不飽和結合を有する架橋剤（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）など）でマイケル付加反応により架橋すればよい。さらには、ヒアルロン酸に不飽和結合を有する官能基（例えば、メタクリロイル基（以下「ＭＡ基」とも称する）、アクリロイル基など）を導入したヒアルロン酸誘導体を、Ｃ２−２０アルキレン基の両端にＳＨ基を有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）など）でマイケル付加反応により架橋すればよい。さらには前記不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体を各種重合開始剤（例えば、ペルオキソ二硫酸カリウム（ＫＰＳ）／Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９など）でラジカル重合により架橋すればよい。さらには、ヒアルロン酸ナトリウムとジアミン化合物（例えば、ＥＤＡ、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチレンジアミン）など）共存下、縮合剤（例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジハイドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジハイドロ−３−ハイドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ま���はＮ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）など）によって架橋すればよい。上記の架橋形成は、ヒアルロン酸誘導体の分子内であっても、複数のヒアルロン酸誘導体の分子間であってもよい。
または、本発明の組成物の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の存在下で、異なる架橋性官能基を導入した２種類のヒアルロン酸誘導体同士を化学架橋する方法が挙げられる。具体的には、ＨＡ−ＡＭと活性エステル基を導入したＨＡ誘導体を縮合反応により架橋すればよい。または、ＨＡ−ＡＭとＨＡ−ＡＬＤを架橋すればよい。さらには、ＨＡ−ＳＨとＨＡ−ＭＡをマイケル付加反応により架橋すればよい。
さらには、例えば、ヒアルロン酸またはその誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体に含まれるヒドロキシ基もまた架橋形成が可能な基として利用することができる。すなわち、ヒアルロン酸またはその誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を、特定の架橋剤、例えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、カルボジイミド、またはＣ２−２０アルキレン基の両端にグリシジルエーテル基を有する架橋剤などによって架橋すればよい。
さらには、本発明の組成物の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、架橋形成が可能な基を導入した疎水性基を有する親水性多糖類誘導体、および架橋形成が可能な基を導入したヒアルロン酸誘導体を架橋する方法が挙げられる。具体的には、アミノ基を導入した前記親水性多糖類誘導体誘導体（ＨＰ−ＡＭ）とＨＡ−ＡＭを、前例の架橋剤などで架橋すればよい。または、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体にホルミル基を導入した誘導体（ＨＰ−ＡＬＤ）とＨＡ−ＡＬＤを前例の架橋剤などで架橋すればよい。さらには、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体にメルカプト基を導入した誘導体（ＨＰ−ＳＨ）とＨＡ−ＳＨを、前例の方法などにより架橋すればよい。さらには、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体に不飽和結合を有する官能基（例えば、メタクリロイル基、アクリロイル基など）を導入した誘導体と不飽和結合を有する官能基を導入したヒアルロン酸誘導体を、前例の方法などにより架橋すればよい。上記の架橋形成は、ヒアルロン酸誘導体および親水性多糖類誘導体の分子内であっても、複数のヒアルロン酸誘導体または親水性多糖類誘導体の分子間であってもよい。
さらには、本発明の組成物の製造方法としては、特に限定されないが、例えば、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体およびヒアルロン酸誘導体の各々に異なる架橋形成が可能な基を導入した前記誘導体を化学架橋する方法が挙げられる。具体的には、ＨＰ−ＡＭと活性化エステル基を導入したヒアルロン酸誘導体を縮合反応により架橋すればよい。または、ＨＰ−ＡＭおよびＨＡ−ＡＬＤ、またはＨＰ−ＡＬＤおよびＨＡ−ＡＭを架橋すればよい。さらには、ＨＰ−ＭＡおよびとＨＰ−ＳＨや、ＨＰ−ＳＨおよびＨＡ−ＭＡをマイケル付加反応により架橋してもよい。
本発明の組成物（好ましくはゲル状組成物）が有する化学架橋構造は、架橋剤、ポリマーに導入した架橋形成が可能な基、結合様式などに、生体内で分解するものを用いてもよい。特に限定されないが、例えば置換基にエステル結合を有するメタクリロイル基などで修飾したＨＡ−ＭＡやＨＰ−ＭＡなどを用いてもよい。または、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳやＥＤＭＡなど、スペーサー領域にエステル結合を有する架橋剤を用いてもよい。生体内の酵素によって分解されるペプチドスペーサーを用いてもよい。また、メルカプト基の酸化によって形成するジスルフィド結合によって架橋したゲルはジスルフィド交換反応や還元反応によって生体で分解される。分解性の化学架橋構造を有することで、ハイブリッドゲルの生体内での分解速度を制御することができ、これによって薬物の放出速度も制御することが可能である。
本発明のハイブリッドゲル化させる工程は、適宜その条件を選択してもよい。架橋の条件とは、例えば、ヒアルロン酸誘導体と疎水性基を有する親水性多糖類誘導体から選択した２種類以上のポリマー、それらの架橋方法、ポリマー濃度、ポリマー比率、架橋剤濃度、溶媒、溶媒ｐＨ、塩濃度、温度、時間などがある。
本発明のゲルの製造において、架橋形成の反応条件の中で、例えば化学架橋時のポリマー濃度および架橋形成が可能な基の導入率を高くすることで、生成するハイブリッドゲルの架橋密度を高くすることが可能である。
また、本発明のハイブリッドゲル化工程におけるポリマー濃度は、ハイブリッドゲル化させる前にポリマーや架橋剤を均一に混合するのに適した範囲で適宜選択してもよい。この範囲はポリマー分子量、置換基、選択する溶媒などによっても変動する。例えば２０ｋＤａのヒアルロン酸誘導体を水中で用いる場合は、好ましくは１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖ、特に好ましくは４％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖである。２００ｋＤａのＨＡを水中で用いる場合は、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ、特に好ましくは０．５％ｗ／ｖ〜４％ｗ／ｖである。また、ＨＰとして１００ｋＤａのプルランに１００単糖あたり１．４個のコレステロール基が導入されたＣＨＰを水中で用いる場合、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜４．０％ｗ／ｖ、特に好ましくは０．５％ｗ／ｖ〜３．０％ｗ／ｖである。また、ＨＰとして１５０ｋＤａのクラスターデキストリン（登録商標）に１００単糖あたり３．８個のコレステロール基が導入されたＣＨｃＤｅｘを水中で用いる場合、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜１０．０％ｗ／ｖ、特に好ましくは０．５％ｗ／ｖ〜８．０％ｗ／ｖである。
本発明のハイブリッドゲル化工程における架橋剤濃度は、両端に架橋形成が可能な基を有するものを使用する場合、当該基が過不足なく速やかに架橋反応に関与できるような濃度で添加することが好ましい。例えば、メタクリロイル基を導入したポリマーをＤＴＴを用いてマイケル付加反応により架橋する場合は、ＭＡ基：ＳＨ基＝３：１〜１：３が好ましく、２：１〜１：２が特に好ましい。
本発明のハイブリッドゲル化工程において選択する溶媒は、ポリマーおよび架橋剤を充分に溶解することができるものが好ましく、特に限定されないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびこれらから選択される混合溶媒を用いることが好ましい。また、これらの溶媒に混和する有機溶媒を混合して使用することも可能である。特に限定されないが、混和する有機溶媒としては例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。なお、疎水性基を有する親水性多糖誘導体の疎水性基を会合させることで予め微粒子を形成しておくという観点では、水単独を溶媒として用いることが好ましい。
本発明のハイブリッドゲル化工程における溶媒ｐＨ、塩濃度、時間、温度などは、選択した架橋方法が速やかに進行する条件で、かつ選択したポリマーが化学的に安定である条件を用いることが好ましい。特に限定されないが、塩濃度が高いとポリマーの溶解性が悪くなったり、異種ポリマー間の相分離などが見られる場合があることから（実施例３および４参照）、塩濃度は低い方が好ましい。
本発明のハイブリッドゲル化させる工程は、バルクで行ってもよく、エマルション中や噴霧液滴中などの不連続相中で行ってもよい。例えば、Ｗ／Ｏエマルション中で行う場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相を、水に混和しない溶媒中に乳化し、ゲル化反応を行えばよい。水に混和しない溶媒とは、特に限定されないが、例えばヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、流動パラフィン、大豆油などが挙げられる。乳化を安定化するための界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、超臨界二酸化炭素中やＰＥＧ中など脱溶媒が可能な溶媒中で行ってもよい。この場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相や有機溶媒相を、前例の溶媒中に乳化、分散することで、脱溶媒（溶媒拡散）に伴うポリマーの濃縮が成されることから、より高い架橋密度のハイブリッドゲルを得ることが可能になる。この方法を利用した例として、デキストラン（Ｄｅｘ）にグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）を導入したＤｅｘ−ＧＭＡの水溶液をＰＥＧ水溶液中で脱水と同時に架橋する方法が、例えば特許文献１１に開示されている。乳化は、例えばメカニカルスターラー、回転型ホモジナイザー、膜乳化、超音波照射などを使用して行ってもよい。噴霧液滴中で行う場合は、例えば噴霧乾燥機を用いてゲル化させてもよい。この方法では、特許文献１２に開示があるように、ポリマーや架橋剤などを溶解した溶液を噴霧乾燥することで、濃縮、ゲル化、乾燥、微粒子化を同時に行うことができる。
本発明のハイブリッドゲル化させる工程およびその後に、架橋反応を停止する操作および残存した架橋性官能基を失活もしくは洗浄する操作を行ってもよい。反応に関与しなかった架橋性官能基、架橋剤の片端のみが結合した基、残存した架橋剤などは、安全性の観点、保存中安定性の観点、封入される薬物との副反応などの観点から除去した方が好ましい。特に限定されないが、例えば、未反応の架橋剤が残存している場合は、過剰の水などで洗浄することで除去してもよい。また、例えばポリマーに置換したメタクリロイル基が残存する場合は、過剰のメルカプトエタノールなどを添加し、メタクリロイル基を失活させた後、過剰の水などで余剰のメルカプトエタノールを洗浄することで除去してもよい。さらには、例えばメルカプト基が残存する場合は、過剰のプロピオン酸マレイミド、酢酸ヨウ素などを添加し、メルカプト基を失活させた後、過剰の水などで余剰のプロピオン酸マレイミド、酢酸ヨウ素を洗浄することで除去してもよい。
本発明のハイブリッドゲル化させる工程の後に、粉砕工程を行ってもよい。粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所）およびインパクトミル（株式会社ダルトン）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造株式会社）、サンプルミル（東京アトマイザー製造株式会社）、バンタムミル（東京アトマイザー製造株式会社）、およびＳＫミル（トッケン）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ−Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミルおよびリンレックスミルが好ましい。
本発明のハイブリッドゲル化させる工程の後に、乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥などが挙げられる。風速、乾燥時間、温度、圧力などは本発明のゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
また、本発明は、前記の本発明のハイブリッドゲルに薬物を封入することで得られる医薬組成物の製造方法に関する。
薬物封入方法として、あらかじめ架橋されたハイブリッドゲルに薬物溶液を添加する方法が挙げられる。当該方法では、まず、膨潤したゲル内部へ拡散によって薬物が吸収され、吸収された薬物は、ハイブリッドゲル中の疎水性相互作用による物理架橋ドメインに保持されることによって薬物が封入される。特に限定されないが、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、薬物が安定でかつ高収率で封入されるように適宜選択してよい。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ハイブリッドゲルの膨潤度や密度が変化し、薬物の電離状態なども変わるため、その組み合わせによって適宜、適した条件を使用すればよい。また、ＣＨＰナノゲルと種々タンパク質の複合化挙動は、例えばインスリン（非特許文献１２参照）やアルブミン（非特許文献７参照）などは常温において自発的に複合化するのに対して、炭酸脱水酵素Ｂ（非特許文献８参照）やクエン酸合成酵素（非特許文献９参照）などは熱変性や変性剤による変性条件において複合化するというように、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体と複合化することができる条件はタンパク質やペプチドによって異なる。そのため、本発明の組成物（好ましくはゲル状組成物）への薬物封入条件は、封入する薬物の特性によって温度や変性剤の添加などを行うなど適宜調整すればよい。変性剤を添加した場合は、薬物封入後、過剰の水などで洗浄して余剰の変性剤を除去すればよい。また、当該方法においては、本発明のハイブリッドゲルのサイズが小さくなる程、比表面積が広くなり、また薬物が疎水架橋ドメインに保持されるまでに本発明のゲル内を拡散する距離が短くなることから、薬物封入工程にかかる時間が短縮することができる。本発明のハイブリッドの架橋密度は、封入する薬物が拡散によって速やかに吸収される範囲であることが好ましく、架橋方法やハイブリッドゲル化させる条件によって封入される薬物の分子量やサイズなどに合わせて、その適した架橋密度のハイブリッドゲルを調製すればよい。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋の場合、未反応の架橋性官能基や架橋剤が製剤中に残存してしまうことから、医薬品としての安全性の観点から好ましくない。これは、洗浄工程や未反応の架橋性官能基を他の反応性試薬で消失させる工程により改善されるが、これらの工程は封入された薬物の共存下で行わなければならず、回収率の低下や薬物変性の原因となるが、当該方法では、薬物非存在下で洗浄工程などを行った後に薬物封入を行える点で大きな利点がある。また、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の疎水ドメインに保持されなかった薬物は、生体内に投与された場合に速やかに本発明のハイブリッドゲルから放出されてしまうため、洗浄工程によって除去することが好ましい。薬物封入後に必要に応じて粉砕、乾燥工程などを行ってもよく、粉砕工程の条件や乾燥工程の風速、乾燥時間、温度、圧力などは本発明のハイブリッドゲルや封入された薬物が分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
また、薬物封入方法として、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体が形成するナノゲルに薬物を複合化させた後、このナノゲル・薬物複合体とヒアルロン酸誘導体をｉｎ  ｓｉｔｕ架橋することでハイブリッドゲル化させる方法が挙げられる。特に限定されないが、複合化の際の溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加、前記親水性多糖類誘導体濃度、薬物濃度、ＨＰと薬物の比率などの条件は、薬物が安定でかつ高収率でナノゲルと複合化されるように適宜選択してもよい。複合化されなかったフリーの薬物は、透析法やサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法などで分離、除去すればよい。ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋の際は、ナノゲルに複合化された薬物が変性しない架橋条件を用いることが好ましい。一般にヒアルロン酸誘導体と薬物をｉｎ  ｓｉｔｕ架橋する場合、薬物と基材が反応しない選択的な架橋反応を利用する必要があるが、完全に選択性を得ることは難しい。当該方法において、ＨＰに複合化された薬物は、フリーの薬物と比較して反応性が抑えられているために、ＨＡまたはその誘導体とｉｎ  ｓｉｔｕ架橋しても、基材との副反応が起こりにくい利点がある。本発明者らは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をモデル薬物として、ＣＨＰと複合化したＥＰＯとフリーのＥＰＯの間に前記反応性の違いがあることを実施例３０で示している。当該方法においては、例えば疎水性基を有する親水性多糖類誘導体としてＣＨＰのようなノニオン性の骨格を持つポリマーを用いることが特に好ましい。これは、ノニオン性ポリマーとヒアルロン酸およびその誘導体のようなアニオン性ポリマー同士の相溶性がよくないために、ＣＨＰとヒアルロン酸誘導体の間ではミクロ相分離が起こり、ＣＨＰに複合化されたナノゲル内の薬物は、ヒアルロン酸誘導体の化学架橋反応から保護されるためである。ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋した後に必要に応じて粉砕、乾燥、洗浄工程などを行ってもよく、各条件は本発明のハイブリッドゲルや封入された薬物が分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
本発明のハイブリッドゲルからの薬物は、ハイブリッドゲル中の薬物および薬物と疎水性基を有する親水性多糖類誘導体との複合体の拡散、ハイブリッドゲルの分解、および生体成分と薬物の置換によって放出される。放出される薬物とは、フリーの薬物であっても疎水性基を有する親水性多糖類誘導体との複合体であってもよい。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＨＰ・インスリン複合体にアルブミンを添加すると速やかに置換が起こりフリーのインスリンが放出されること、また、そのまま静脈投与すると速やかに血液成分との置換が起こり、フリーのインスリン水溶液を投与した場合と比較してほぼ同等の薬効を示すことが非特許文献１２に例示されており、複合体としてハイブリッドゲルから放出された薬物は、生体内において速やかに複合体から解離すると考えられる。
薬物および複合体の拡散によって薬物放出がなされる場合には、本発明のハイブリッドゲルの架橋密度、および疎水架橋ドメインの量やその疎水性の強さによってその速度を制御することが可能である。特に薬物とナノゲルの結合定数が高い場合、複合体の拡散によって薬物は放出される。この場合、封入する薬物に依らず、ハイブリッドゲルからのナノゲルの拡散速度を制御することで薬物放出速度を制御することが可能である。
ハイブリッドゲルの分解とは、例えば、化学架橋ドメインの分解、ヒアルロン酸誘導体の骨格の分解、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体誘導体の骨格の分解などがある。これらの分解により、架橋密度の低下（膨潤率の増大）が生じる。またヒアルロン酸誘導体と疎水性基を有する親水性多糖類誘導体が化学的に結合している場合は、この結合が切れることになる。架橋密度が低下すると、ハイブリッドゲル中の薬物や複合体の拡散速度が加速されるため放出が促進され、また結合が切れることによっても放出が促進される。このため、化学架橋ドメインの分解性、ポリマー骨格の分解性、スペーサーの分解性などを制御することによって、薬物放出速度を制御することが可能である。
生体成分との置換とは、例えば、ハイブリッドゲルを皮下や血中などの生体内に投与した場合、アルブミンなどの血漿タンパク質や脂質などが存在し、これらがハイブリッドゲル中に浸潤、封入されている薬物と置換されることにより薬物が放出される場合を意味する。本発明のハイブリッドゲルは、ＣＨＰなどの疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を、架橋したヒアルロン酸誘導体中に封入することによって、生体成分の浸潤に伴う薬物との置換を抑制することが可能で、例えば、本発明者らは過剰のアルブミン存在下、非存在下のどちらにおいても薬物放出速度が変わらないことを実施例８に示している。生体成分の浸潤は、ハイブリッドゲルの架橋密度、ゲル中の電荷などによってその速度を制御することが可能である。なお、前記の架橋によりハイブリッドゲルを形成後に薬物溶液を添加して薬物封入をする場合は、封入時に薬物はハイブリッドゲル中に吸収されやすく、生体内では生体成分の浸潤が抑制されるように、その封入条件を適宜選択することができる。特に限定されないが、例えば、タンパク質を封入する場合、その等電点付近で封入工程行うことで、ヒアルロン酸誘導体と薬物の静電反発を抑制することができる。また、ヒアルロン酸に含まれるグルクロン酸由来のカルボン酸のｐＫａ（およそ４．０）以下で封入工程を行うことで、ハイブリッドゲルが持つ負電荷を弱めることができるので、その条件で負電荷に帯電しているタンパク質との静電反発が抑制され、封入効率の向上が可能となる。また、例えば生体内よりも低い塩濃度において封入工程を行うことで、生体内よりもハイブリッドゲルの膨潤率が高くなるため、封入が容易となる。
薬物を封入した前記ハイブリッドゲルに、さらに、２価の金属イオンや硫酸プロタミンなどの持続化剤を添加することで、更に徐放期間を長くすることが可能である。２価の金属イオンとしては、例えば亜鉛、マグネシウム、鉄、カルシウム、アルミニウムなどが挙げられる。
前記ハイブリッドゲルのサイズは、前記の不連続相中でゲル化を行う方法や粉砕方法を用いることで、用途によって調節することができる。インジェクタブルな医薬組成物とするためには通常、０．０１μｍ〜１５０μｍが好ましい。経皮投与の時は、０．０１μｍ〜１５０μｍが好ましく、経鼻、経肺投与の時は、０．０１μｍ〜５μｍが吸入効率の点で好ましく、静注投与の時には、０．０１μｍ〜０．２μｍ程度が血中動態の点から好ましい。
なお、本発明のハイブリッドゲルに封入する薬物（低分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸）の例としては、以下のものを挙げることができる。
低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤、等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤、等）などを挙げることができる。
タンパク質、ペプチドの例としては、例えば、貧血治療薬、臓器保護薬であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）、好中球減少症治療薬であるグラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、各種酵素補充療法薬、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体等を挙げることができる。
核酸の例としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、デコイ、リボザイム、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等を挙げることができる。
本発明のハイブリッドゲルは、薬物を封入して、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
薬物としては、タンパク質およびペプチドが好ましく、これらの薬物を封入することで、タンパク質およびペプチドを含有する、本発明の組成物を得ることができる。
本発明により、従来の徐放性製剤では得られない、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物といった薬物を長期間徐放できる安全性の高い徐放性製剤、医薬組成物を提供することが可能である。
【実施例】
【０００８】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明する。
以下の記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸を１ユニットとするの繰り返し単位を意味する。また、実験操作において使用した超純水は、超純水製造装置（例えば、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ＳＰ  ＴＯＣ（型番  ＺＤ２１ＴＯＣＳＰ）など）を用いて調製したものを使用した。
〔実施例１〕ＭＡ基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＭＡ）の合成
（実施例１−１）カチオン交換樹脂のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化
ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ−８−４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０ｗｔ％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ−ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間ほど撹拌した。余剰のＴＢＡ−ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
（実施例１−２）ＨＡのＴＢＡ塩化
分子量１６ｋＤａ、１００ｋＤａおよび２００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ、１００ｋＤａのものは資生堂株式会社製、その他は電気化学工業株式会社製）をそれぞれ１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。実施例１−１項でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニットのモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間ほど撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸ＴＢＡ塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。
得られたＨＡ−ＴＢＡを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲによる構造解析を行い（グルコサミンのアセチル基（３Ｈ：１．７５ｐｐｍ）の積分値を基準とし、ＴＢＡの二つのメチレン（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）４、２Ｈ：１．３５−１．３９ｐｐｍおよび２Ｈ：１．６４−１．６７ｐｐｍ）の積分値の比率より算出）、ＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、この塩比からＴＢＡ−ＨＡのユニット平均分子量を算出し、この値を次項の合成に使用した。
（実施例１−３）メタクリロイル基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＭＡ）の合成
実施例１−２で調製した各分子量のＨＡ−ＴＢＡを５ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯに溶解した。その後、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩（ＡＥＭＡ）（ポリサイエンス社製）をＨＡユニットに対して表１に記載した比率で各溶液に添加した。次に、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ試薬）をＨＡユニットに対して以下に示す表１に記載した比率で加え、穏やかな攪拌下、室温で一晩反応させた。反応溶液は０．３Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を使用して透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ、外液は４回交換した）し、次に外液を超純水に変え、引き続き透析（外液は６回交換した）して精製をした。得られた透析液を凍結乾燥してＨＡ−ＭＡを白色固体として得た。
得られたＨＡ−ＭＡを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行い（グルコサミンのアセチル基の積分値を基準とし、ＡＥＭＡのメチレン（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、５．６０ｐｐｍおよび６．００ｐｐｍの積分値の比率より算出）、ＨＡユニットに対するＭＡ基の導入率を算出し、導入率からＨＡ−ＡＭＥＡのユニット平均分子量を算出した（表１参照）。
この結果、縮合剤（ＢＯＰ試薬）およびＡＥＭＡの添加量によって、ＭＡ導入率を制御可能であることが示唆された。
【表１】
2008136536.tif 000003
上記表１のＨＡ−ＭＡ−９は、以後「ＨＡ−ＭＡ−２００ｋ−４３」とも称する。
〔実施例２〕化学架橋ＨＡ−ＭＡのゲルの調製条件検討
（実施例２−１）ゲル化反応の緩衝液調製
５００ｍＭ  リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ８．０）に５００ｍＭになるようにトリエタノールアミン（ＴＥＡ）を添加し、よく混合した。これを超純水で５倍に希釈してｐＨを測定したところ、ｐＨは９．２であった。
（実施例２−２）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液の調製
７５ｍｇ／ｍＬ（４８６．０７ｍＭ）になるようにＤＴＴを超純水に溶解させた。
（実施例２−３）化学架橋ＨＡ−ＭＡのゲルの調製
各サンプル調製（サンプル２−１〜２−１４）に使用したＨＡ−ＭＡ、最終濃度を表２に示した。
実施例１で合成した種々のＨＡ−ＭＡをマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して、表２に示す種々の濃度の溶液を得た。次に実施例２−１で調製したＴＥＡ／ＰＢ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。さらに、実施例２−２で調製したＤＴＴ水溶液をＭＡ基の最終濃度に対して１／２のモル数（ＭＡ基とＳＨ基の比率が１：１）になるように添加し、よく混合した。最終容量は、どの条件もおよそ１００μＬとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１４時間静置することによって化学架橋反応を行った。
サンプル２−７およびサンプル２−１３では、ＨＡ−ＭＡが完全には溶解しなかった。
【表２】
2008136536.tif 000004
（実施例２−４）化学架橋ＨＡ−ＭＡのゲルの特性評価
実施例２−３において調製したゲルをマイクロチューブより取り出し、全体がゲル化していないものを「−」、一部がゲル化したものを「±」、全体がゲル化したものを「＋」としてスコアをつけた。次に、全体がゲル化したゲルを過剰の超純水を用いて４℃で一晩膨潤させた。膨潤したゲルのそれぞれについて、キムワイプ（登録商標）で表面についた水分を吸い取り、重量を測定した（膨潤重量）。次に、膨潤したゲルを凍結乾燥し、重量を測定した（乾燥重量）。以下の式（１）により膨潤時のゲル密度を算出した（表３）。
式（１）  （膨潤時ゲル密度％ｗ／ｗ）＝｛（乾燥重量）／（膨潤重量）｝×１００
【表３】
2008136536.tif 000005
この結果、架橋性官能基であるＭＡ基の導入率が高いほどゲル密度が高くなること、架橋時のＨＡ−ＭＡ濃度が高いほどゲル密度が高くなること、ＨＡ分子量が高いほど、低い濃度でゲル化が起こることが示唆された。
〔実施例３〕コレステロール基導入プルラン（ＣＨＰ）を封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの調製−１
（実施例３−１）ＣＨＰ水溶液の調製
分子量１００ｋＤａのプルランの１００単糖あたり１．３８個のコレステロール基が置換されているＣＨＰ（ＣＨＰ−１００−１．３８と表記する；ＰＵＲＥＢＲＩＧＨＴ  ＣＰ−１００Ｔ、日本油脂株式会社製）を５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解させた。このＤＭＳＯ溶液を超純水に対して透析（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）し、得られた水溶液を０．２２μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥した。得られたＣＨＰ−１００−１．３８の白色粉末を３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように超純水に溶解させることで、ＣＨＰの水溶液を得た。
（実施例３−２）ゲル化反応の緩衝液調製
５００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ８．０）に５００ｍＭになるようにトリエタノールアミン（ＴＥＡ）を添加し、よく混合した。
（実施例３−３）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液の調製
２５ｍｇ／ｍＬ（１６２．０２ｍＭ）および１５０ｍｇ／ｍＬ（９７２．１３ｍＭ）になるようにＤＴＴを超純水に溶解させた。
（実施例３−４）ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡの調製
各調製（サンプル３−１〜３−１８）に使用したＨＡ−ＭＡ、最終濃度を表４に示した。
実施例１で合成したＨＡ−ＭＡ−３およびＨＡ−ＭＡ−８をマイクロチューブに秤取し、超純水および実施例３−１で調製したＣＨＰ水溶液を添加し、４℃で一晩静置して、表４に示す種々の濃度の溶液を得た。次に実施例３−２で調製したＴＥＡ／ＰＢ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。さらに、実施例３−３で調製したＤＴＴ水溶液をＭＡ基の最終濃度に対して１／２のモル数（ＭＡ基とＳＨ基の比率が１：１）になるように添加し（サンプル３−１〜３−９は１５０ｍｇ／ｍＬ溶液、サンプル３−１０〜３−１８は２５ｍｇ／ｍＬ溶液使用）、よく混合した。最終容量は、どの条件もおよそ１００μＬとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１４時間静置することによって化学架橋反応を行った。
【表４】
2008136536.tif 000006
（実施例３−５）ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの特性評価
実施例３−４において調製した化学架橋ＨＡ−ＭＡをマイクロチューブマイクロチューブより取り出し、全体がゲル化していないものを「−」、一部がゲル化したものを「±」、全体がゲル化したものを「＋」としてスコアをつけた。また、ゲルの外観（透明、不透明）について表５に記載した。次に、全体がゲル化したサンプルを過剰の超純水を用いて４℃で一晩膨潤させた。膨潤前のゲルの形状のまま膨潤したものを均一に膨潤したゲル、そうでないものを不均一に膨潤したゲルとした。膨潤したそれぞれのゲルは、キムワイプで表面についた水分を吸い取り、重量を測定した（膨潤重量）。次に、膨潤したゲルを凍結乾燥し、重量を測定した（乾燥重量）。前記の式（１）により膨潤時のゲル密度を算出した（表５）。
【表５】
2008136536.tif 000007
サンプル３−７〜３−９では完全ではなかったが、全てのサンプルにおいてゲル化の進行が確認された。サンプル３−７〜３−９では、ＨＡ−ＭＡのみではゲル化したのに対してＣＨＰ共存下ではゲル化が完全には進行しなかったのは、ＣＨＰを混合することでゲル化前の溶液粘度が増大し、ポリマー、架橋剤が均一に混合できなくなったことによるものと思われた。また、サンプル３−１６〜３−１８では、不均一な膨潤挙動が見られた。これは、サンプル３−７〜３−９と同様にＣＨＰを混合することでゲル化前の溶液粘度が増大し、ポリマー、架橋剤が均一に混合できなくなった結果、不均一な架橋となったと思われた。実施例２の結果と併せて、高濃度での化学架橋によるゲル化は、ＨＡ−ＭＡおよびＣＨＰ混合溶液の濃度や比率によって、その溶解性や粘度に起因する上限があるものと思われた。
また、ＣＨＰ濃度が上がるにつれて、ゲル化反応直後のゲルが不透明となる場合が確認されたが、超純水に対する膨潤後は透明になった。これは膨潤することによるゲル密度（ポリマー濃度）の低下、ｐＨの変動、ＴＥＡが除去されたことなどに起因すると考えられた。
膨潤時のゲル密度は、ＣＨＰ含量が高くなるにつれ増大していた。ＣＨＰはゲル化の化学架橋反応に関与しないことから、超純水に対して膨潤しても封入されたままになっていることが示唆された。本実施例により種々の組成およびゲル密度でＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルが得られることが示された。
〔実施例４〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの調製−２
（実施例４−１）ゲル化反応の緩衝液調製
５００ｍＭになるようにトリエタノールアミン（ＴＥＡ）を超純水に対して溶解させた。超純水で５倍に希釈してｐＨを測定したところ、ｐＨは９．２であった。
（実施例４−２）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）水溶液の調製
１５０ｍｇ／ｍＬ（９７２．１３ｍＭ）になるようにＤＴＴを超純水に溶解させた。
（実施例４−３）ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの調製
各ゲル調製（サンプル４−１および４−２）に使用したＨＡ−ＭＡ、最終濃度を表６に示した。
実施例１で合成したＨＡ−ＭＡ−３をマイクロチューブに秤取し、超純水および実施例３−１で調製したＣＨＰ水溶液を添加、４℃で一晩静置することで種々の濃度で溶解させた。次に実施例４−１で調製したＴＥＡ水溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。さらに、実施例４−２で調製したＤＴＴ水溶液をＭＡ基の最終濃度に対して１／２のモル数（ＭＡ基とＳＨ基の比率が１：１）になるように添加し、よく混合した。最終容量は、どの条件もおよそ１００μＬとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１４時間静置することによって化学架橋反応を行った。
【表６】
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（実施例４−４）ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの特性評価
実施例４−３において調製した化学架橋ＨＡ−ＭＡゲルおよびハイブリッドゲルをマイクロチューブより取り出し、ゲルの外観（透明、不透明）について表７に記載した。次に、ゲルを過剰の超純水を用いて４℃で一晩膨潤させた。膨潤したそれぞれのゲルは、キムワイプで表面についた水分を吸い取り、重量を測定した（膨潤重量）。次に、膨潤したゲルを凍結乾燥し、重量を測定した（乾燥重量）。前記の式（１）により膨潤時のゲル密度を算出した。
【表７】
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この結果から、反応溶液からＰＢを除去しても、化学架橋ＨＡ−ＭＡゲルは調製可能であり、むしろゲル密度が増大したことから、化学架橋の反応効率は高いことが示唆された。また、サンプル４−２においてゲルの不透明化は見られなかった。実施例３において不透明化したゲルを超純水に膨潤すると透明になったことと、本項の結果を合わせて、ＨＡ−ＭＡとＣＨＰの相分離は、溶液塩濃度を低減することで抑制できることが示唆された。
〔実施例５〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの薬物吸収性および放出性、ならびにゲル分解性の評価
（実施例５−１）ハイブリッドゲルへのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ封入
１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）に１００μｇ／ｍＬの濃度になるようにＦＩＴＣ−Ｉｎｓ（アルドリッチ社製）を溶解させた。実施例３において調製したサンプル３−１〜３−６のハイブリッドゲルの凍結乾燥品に５ｍＬのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液を添加し、４℃において２日間インキュベーションしたところ、実施例３における膨潤時は無色透明であったそれぞれのハイブリッドゲルは、周囲のＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液より濃い黄色を呈していた。このことから、ハイブリッドゲルはＦＩＴＣ−Ｉｎｓを自発的に吸収、保持したものと考えられた。ＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液を除去したハイブリッドゲルの外観を図１に示した。
（実施例５−２）ハイブリッドゲルのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出特性評価
実施例５−１でＦＩＴＣ−Ｉｎｓを封入したハイブリッドゲルに５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、３７℃において４日間インキュベーションした。そのときの外観を図２に示した。それぞれのハイブリッドゲルは黄色を呈したままで、水溶液は無色透明のままであったことから、自発的に吸収、保持されたＦＩＴＣ−Ｉｎｓは速やかに放出されないことが示唆された。次に、最終濃度で１０ｍＭになるように１００ｍＭ  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ、純正化学株式会社製）水溶液を添加し、３７℃においてインキュベーションした。経時的に外観を観察したところ、黄色を呈していたハイブリッドゲルは徐々に退色し、水溶液が徐々に黄色を呈した（ＨＰ−β−ＣＤ添加後２時間の外観、図３）。シクロデキストリンは、ＣＨＰのコレステロール基を包摂し、コレステロール基と疎水性相互作用によって結合していたタンパク質やペプチドを放出することが知られているが、このことから、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓはコレステロール基との疎水性相互作用により保持されていたことが示された。また、ＣＨＰナノゲルは水溶液中でインスリンと自発的に複合化することが知られているが、実施例３で調製したハイブリッドゲル中においても、その複合化能を保持していることが確認された。
（実施例５−３）ハイブリッドゲルの分解性評価
実施例５−２の放出特性を評価したサンプル（ＣＤ添加２時間後）に、それぞれ１２５ｍＵのヒアルロニダーゼＳＤ（ＨｙｄａｓｅＳＤ、生化学工業株式会社製）を添加し、３７℃で２日間インキュベーションした。そのときの外観を図４に示した。分子量１６ｋＤａのＨＡにＭＡ基を導入したＨＡ−ＭＡを５０ｍｇ／ｍＬ濃度でゲル化させたサンプル３−１〜３−３のハイブリッドゲルは、酵素添加により完全に分解され、均一に薄く黄色に呈色した溶液となっており、封入されていたＦＩＴＣ−Ｉｎｓは完全に放出されたと考えられた。一方、１００ｍｇ／ｍＬ濃度でゲル化させたサンプル３−４〜３−６のハイブリッドゲルは、大部分のゲルは分解されていたが、一部の薄く黄色に呈色したゲルが残存していた。このことから、実施例３で調製したハイブリッドゲルは、生分解性であるとともに、ゲル密度によってその分解速度が異なることが示唆された。また、コレステロール基をシクロデキストリンで包摂してＦＩＴＣ−Ｉｎｓとコレステロール基の疎水性相互作用を切ることによって、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓの放出が起こることが実施例５−２で示されたが、本実施例からハイブリッドゲルの分解に伴って薬物放出が起こることも示唆された。
〔実施例６〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルへのインスリン封入
（実施例６−１）ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの調製
実施例４に示した方法と同様の手順で表８に記載したハイブリッドゲルを調製した。
【表８】
2008136536.tif 000010
（実施例６−２）インスリン封入の経時変化、および封入量の算出
実施例６−１において調製したハイブリッドゲルをマイクロチューブより取り出し、過剰の超純水を用いて４℃で一晩膨潤させた。超純水をデカンテーションにより除去してから膨潤したゲルを凍結乾燥した。４ｍＬの１５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）をそれぞれの凍結乾燥ゲルに添加し、４℃で一晩膨潤させた後、ＰＢをデカンテーションにより除去した。インスリン（ウシ膵臓由来、シグマ社製）を１００μｇ／ｍＬになるように１５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）に溶解させた。インスリンの分子量を５，７３３．５として、ゲル調製の仕込み量を基準としたＣＨＰ４モルに対してインスリン分子１５モルが添加されるように、インスリン溶液をそれぞれのゲルに添加し４℃において静置した。インスリン溶液添加後、１日、３日、５日目に上澄みを７０μＬずつ回収し、上澄み中のインスリン濃度を液体クロマトグラフィーの逆相モード（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で定量した。上澄み中から減少したインスリン量（＝ゲル中に封入されたインスリン量、定量のために回収した上澄み中のインスリン減少分は補正）をプロットしたグラフを図５に示した（サンプル６−３はサンプル６−２と同条件なのでデータは省略）。ＲＰ−ＨＰＬＣの分析条件は以下に示した。また、添加したインスリン溶液はデカンテーションにより除去し、各ゲルは実施例７に供した。
ＲＰ−ＨＰＬＣ条件
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０／２４８７
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ１８−Ｃ（３μｍ）  ３．０ｍｍ×５０ｍｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製）
流速：０．７５ｍＬ／分
検出：  ＵＶ（２８０ｎｍ）
溶出液Ａ：  ０．０１％ｗ／ｖＴＦＡ含有超純水
溶出液Ｂ：  ０．０１％ｗ／ｖＴＦＡ含有アセトニトリル
溶出方法：  溶出液Ａ／溶出液Ｂ＝８０／２０から５０／５０のリニアーグラジエント
この結果、実施例５と同様にインスリンはハイブリッドゲルに自発的に封入された。サンプル６−１とサンプル６−２の比較から、ハイブリッドゲルに封入されるインスリン量はＣＨＰ含量に依存しており、ハイブリッドゲル中のＣＨＰがインスリンを保持するリザーバーとして機能していることが示唆された。また、サンプル６−２とサンプル６−４の比較から、封入される速度はゲルの架橋密度が高いほど遅く、ゲル中へのインスリンの拡散速度はゲルの架橋密度に依存することが示唆された。
〔比較例１〕ＨＡ−ＭＡ化学架橋ゲルへのインスリン封入
（比較例１−１）ＨＡ−ＭＡ化学架橋ハイブリッドゲルの調製
実施例４に示した方法と同様の手順で、表９に記載した化学架橋ＨＡ−ＭＡゲルを調製した。
【表９】
2008136536.tif 000011
（比較例１−２）インスリン封入の経時変化、および封入量の算出
比較例１−１で調製した化学架橋ＨＡ−ＭＡのゲルに、実施例６−２と同様の方法でインスリン封入を行った。インスリン溶液は、実施例６−２のサンプル６−２と同量添加した。ゲル中に封入されたインスリン量を図５に併せて記載した。この結果、ＣＨＰを含有しないＨＡゲルに封入されるインスリン量はハイブリッドゲルに対して極めて少なかった。本検討の化学架橋ＨＡ−ＭＡゲル自体にはインスリンを自発的に吸収する能力はほとんどないことが示唆された。
〔実施例７〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのインスリン放出挙動
ハイブリッドゲル中や表面のＣＨＰに保持されていないインスリンを除去するため、実施例６においてインスリンを封入したハイブリッドゲルに５ｍＬの１０ｍＭＰＢ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）を添加し、４℃において１時間静置した後、ＰＢＳをデカンテーションによって除去した。さらに、５ｍＬのＰＢＳを添加し、４℃で１日間静置後、ＰＢＳを除去した。再度この操作を繰り返した。
サンプル６−２、サンプル６−４、サンプル６−５のハイブリッドゲルには５００μＬのＰＢＳ、サンプル６−３のハイブリッドゲルには５００μＬの１０ｍＭのＨＰ−β−ＣＤを含むＰＢＳを添加し、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション開始後、１時間、３時間、１日、２日、５日、７日後に、４００μＬの上澄みを回収、新たに４００μＬの各リリースバッファー（ＣＤを含まないＰＢＳ（ＣＤ（−））、ＣＤを含むＰＢＳ（ＣＤ（＋）））を添加する操作を行った。回収した上澄み中のインスリン濃度をＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例６−２に記載の条件）で定量し、各測定時までにハイブリッドゲルからリリースされた累積のインスリン量を算出した。この値を封入されたインスリン量（実施例６−２で算出）に対するパーセント量としてプロットしたものを図６および図７に示した。
この結果、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルからのインスリン放出挙動は、初期バーストの少ない徐放性を有するものであり、サンプル６−２とサンプル６−４の比較から、その放出速度はゲル密度（架橋密度）に依存することが明らかとなった。このことから、架橋密度を制御することによって薬物放出速度を制御することが可能なことが示唆された。サンプル６−２とサンプル６−５のハイブリッドゲルからの放出速度はほぼ同様であった。この２つのサンプルはＨＡ分子量が異なるがゲル密度はほぼ同様であり、前記の結果と併せてゲル密度によって放出速度が規定されることがわかった。また、サンプル６−２とサンプル６−３の比較から、シクロデキストリンを添加することでインスリンの放出速度が大幅に加速された。実施例５の結果と同様、インスリンはコレステロール基との疎水性相互作用により保持されており、ＣＨＰナノゲルはハイブリッドゲル中においても、その複合化能を保持していることが示された。
また、リリース試験において回収した上澄みについて以下に示したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を行ったところ、放出された種として、サンプル６−３以外のサンプルではインスリン・ナノゲル複合体のみが検出され（保持時間６．２分）、サンプル６−３では複合体およびフリーのインスリン（保持時間１０．８分）が検出された。この結果、ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルは、インスリン・ナノゲル複合体を徐放すること、シクロデキストリンによって疎水性基（コレステロール基）を包摂すると、フリーのインスリンが放出されることがわかった。
ＳＥＣ分析条件
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０／２４８７
カラム：Ｇ２０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ検出（２８０ｎｍ）
溶出液：ＰＢＳ
インジェクション容量：１００μＬ
〔実施例８〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルへの封入特性および放出特性の評価
（実施例８−１）ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの調製
実施例４に示した方法と同様の手順で表１０に記載したハイブリッドゲルを調製した。得られたハイブリッドゲル溶液の最終容量が５０μＬになるように調製した。
【表１０】
2008136536.tif 000012
（実施例８−２）ＦＩＴＣ−Ｉｎｓ封入量の算出
実施例８−１において調製したハイブリッドゲルをマイクロチューブより取り出し、過剰の超純水を用いて４℃で一晩膨潤させた。超純水をデカンテーションにより除去してから膨潤したゲルを凍結乾燥した。４ｍＬの１５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）をそれぞれの凍結乾燥ゲルに添加し、４℃で一晩膨潤させた後、ＰＢをデカンテーションにより除去した。ＦＩＴＣ−Ｉｎｓ（アルドリッチ社製）を１００μｇ／ｍＬになるように１５０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）に溶解させた。ＦＩＴＣ−Ｉｎｓは分子量を６１２２．４９（インスリン１分子にＦＩＴＣが１分子結合していると仮定）として、ゲル調製の仕込み量を基準としたＣＨＰ４モルあたりＦＩＴＣ−Ｉｎｓ分子１５モルが添加されるように、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液をそれぞれのゲルに添加し４℃において静置した。インスリン溶液添加後、１時間、１日、３日、５日後に上澄みを１００μＬずつ回収し、上澄み中のＦＩＴＣ−Ｉｎｓ濃度を分光光度計（検出波長、４９４ｎｍ）で定量した。上澄み中から減少したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ量（＝ゲル中に封入されたＦＩＴＣ−Ｉｎｓ量、定量のために回収した上澄み中のＦＩＴＣ−Ｉｎｓ減少分は補正）を算出した。サンプル８−１〜８−３のゲル中に封入されたＦＩＴＣ−Ｉｎｓ量のハイブリッドゲル乾燥重量に対する重量パーセントをプロットしたグラフを図８に示した。また、添加したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液はデカンテーションにより除去し、各ゲルは実施例８−３に供した。
（実施例８−３）ＦＩＴＣ−Ｉｎｓのハイブリッドゲルからの放出挙動
実施例８−２でＦＩＴＣ−Ｉｎｓを封入したそれぞれのハイブリッドゲルに５ｍＬの１０ｍＭ  ＰＢ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）を添加し、４℃において１時間静置した後、ＰＢＳをデカンテーションによって除去した。さらに、５ｍＬのＰＢＳを添加し、４℃で１日間静置後、ＰＢＳを除去した。再度この操作を繰り返した。この操作により、ハイブリッドゲル中や表面のＣＨＰに保持されていないＦＩＴＣ−Ｉｎｓが除去されると考えられる。
サンプル８−１およびサンプル８−２のハイブリッドゲルには５００μＬのＰＢＳ、サンプル８−３のハイブリッドゲルには５００μＬの１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを添加し、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション開始後、１時間、３時間、１日、２日、５日、７日後に、４００μＬの上澄みを回収、新たに４００μＬの各リリースバッファー（ＢＳＡを含まないＰＢＳ（ＢＳＡ（−））、ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＢＳＡ（＋）））を添加する操作を行った。回収した上澄み中のＦＩＴＣ−Ｉｎｓ濃度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で定量し、各測定時までにハイブリッドゲルからリリースされた累積のＦＩＴＣ−Ｉｎｓ量を算出した。この値をハイブリッドゲル中に封入されたＦＩＴＣ−Ｉｎｓ量（実施例８−２で算出）に対するパーセント量としてプロットしたものを図９および図１０に示した。用いたＳＥＣ分析条件を以下に示す。
ＳＥＣ分析条件
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０／２４７５
カラム：Ｇ２０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：蛍光検出（励起波長４９４ｎｍ、検出波長５１８ｎｍ）
溶出液：１０ｍＭ  ＨＰ−β−ＣＤ含有ＰＢＳ
各サンプルは０．０５％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳで２０倍に希釈してから、１０μＬずつＨＰＬＣにアプライした。
この結果、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓのハイブリッドゲルからの放出速度は、実施例７と同様にゲル密度に依存しており、ゲル密度による放出速度制御が可能なことが示唆された。
また、溶液状態において、ＣＨＰナノゲルとインスリンの複合体にＢＳＡを添加すると、速やかに（数時間以内に）インスリンの放出が起こることが知られているが、ハイブリッドゲルからの放出速度は、１〜２日の間はほぼ変化がなかった。このことから、ハイブリッドゲル中へＢＳＡが急速には拡散しないことが示唆された。５日以降の放出量はＢＳＡ（＋）で多くなっていた。これは、化学架橋点の加水分解が進行することで、ゲル密度がより低くなった結果、ＢＳＡがハイブリッドゲル中に拡散しやすくなったためと推察される。
〔実施例９〕ＳＨ基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＳＨ）の合成
（実施例９−１）ＨＺ基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＨＺ）の合成
分子量２０ｋＤａおよび２００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ−Ｎａ、電気化学工業）それぞれ５３６．９ｍｇ、５２４．８ｍｇを超純水に２ｍｇ／ｍＬになるように溶解させた後、同量のエタノール（ＥｔＯＨ）を加え、５０％ｖ／ｖ  ＥｔＯＨ溶液とした。ＨＡユニット／１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、同仁堂社製）／アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ、東京化成工業社製）＝１／０．２５／４０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比で添加し、反応させた。５Ｎ  ＨＣｌ水溶液によりｐＨは４．７−４．８を維持し、２時間反応させた後、１００ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液、２５％ｖ／ｖ  ＥｔＯＨ水溶液、超純水の順に透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過濃縮（ＹＭ−１０、ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ、ミリポア社製）の後、凍結乾燥することでＨＡ−ＨＺを白色粉末として得た。収量は２０ｋＤａのＨＡを原料に用いたもので４９０．９３ｍｇ、２００ｋＤａで３７５．７７ｍｇであった。
得られたＨＡ−ＨＺを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行い（グルコサミンのアセチル基の積分値を基準とし、ＡＤＨの４つのメチレン（１．５、２．１および２．２５ｐｐｍの積分値の比率より算出）、ＨＡユニットに対するＨＺ基の導入率を算出したところ、２０ｋＤａのＨＡを原料に用いたもので２０．３％および２００ｋＤａで３２．０％であった。また、この導入率からＨＡ−ＨＺのユニット平均分子量を算出し、この値を次項の合成に使用した。
（実施例９−２）ＳＨ基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＳＨ）の合成
実施例９−１で得られた分子量の異なるＨＡ−ＨＺ（それぞれ４８０．５４ｍｇ、３６５．２１ｍｇ）を２０ｍｇ／ｍＬになるよう超純水に溶解させた後、ＨＺ基に対して約２倍当量のイミノチオレイン塩酸塩（ピアス社製）を加え、室温で３時間反応させた。反応後、１００ｍＬのＥｔＯＨを加えることで目的生成物を沈殿させた。沈殿は遠心分離により回収し、ＥｔＯＨで洗浄後、減圧乾燥にすることでＨＡ−ＳＨを白色固体として得た。収量は２０ｋＤａのＨＡを原料に用いたもので５１３．７２ｍｇ、２００ｋＤａで３７１．５８ｍｇであった。
得られたＨＡ−ＳＨを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行い（グルコサミンのアセチル基の積分値を基準とし、ＳＨ基の隣のメチレン（２．８５ｐｐｍの積分値の比率より算出）、ＨＡユニットに対するＳＨ基の導入率を算出したところ、２０ｋＤａのＨＡを原料に用いたもので１８．０％（以下、このＨＡ−ＳＨを「ＨＡ−ＳＨ−２０ｋ−１８」とも称する）および２００ｋＤａで２７．０％（以下、このＨＡ−ＳＨを「ＨＡ−ＳＨ−２００ｋ−２７」とも称する）であった。また、この導入率からＨＡ−ＳＨのユニット平均分子量を算出し、この値を実施例１１のハイブリッドゲル調製に使用した。
〔実施例１０〕ＭＡ基を導入したＣＨＰ（ＣＨＰ−ＭＡ）の合成および水溶液中での会合挙動
（実施例１０−１）ＣＨＰ−ＭＡの合成−１
ＣＨＰ（コレステロール置換度１．５／１００単糖、Ｍｗ＝１０８ｋＤａ、日本油脂株式会社より入手）を６０℃にて２日間、減圧乾燥した。減圧乾燥した１００ｍＬの三口フラスコをフレームドライした後ゴム栓をして、窒素気流下、１ｇ（９．２６μｍｏｌ）のＣＨＰおよび２５７．５ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を加えた。ガラスシリンジを用いて２５ｍＬのＤＭＳＯを加え、完全に溶解するまで室温で約１時間攪拌した後、９２．６μＬ（０．７ｍｍｏｌ）のグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）を注入し、室温で２４時間反応させた。１Ｍ塩酸を数滴滴下して反応を停止した後、総量が約１００ｍＬとなるように蒸留水を加えた。透析チューブ（スペクトラポア６、ＭＷＣＯ：３５００）に反応溶液を入れ、蒸留水に対して１週間透析を行い、凍結乾燥することにより目的物を白色固体として得た。
得られたＣＨＰ−ＭＡをＤＭＳＯ−ｄ６およびＤ２Ｏの混合溶媒（容量比で２０対１）に溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行った。プルランに含まれるα１→６結合を形成するグルコースユニット１位炭素上のプロトン（アノメリックプロトン（α１−６）、４．６０−７．７５ｐｐｍ）の積分値と、ＭＡ基のメチレン（５．６５ｐｐｍおよび６．１５ｐｐｍ）の積分値の比較により、グルコースユニットに対するＭＡ基の導入率を算出したところ、２．４％（以下、このＣＨＰ−ＭＡを「ＣＨＰ−ＭＡ−２．４」とも称する）であった。
（実施例１０−２）ＣＨＰ−ＭＡの合成−２
添加したＧＭＡを２７７．８μＬ（２．１１ｍｍｏｌ）として、他は実施例１０−１と同様の方法により、ＣＨＰ−ＭＡの白色固体を得た。ＮＭＲによる構造解析を行ったところ、グルコースユニットに対するＭＡ基の導入率は、１８．７％（以下、このＣＨＰ−ＭＡを「ＣＨＰ−ＭＡ−１８．７」とも称する）であった。
（実施例１０−３）ＣＨＰ−ＭＡ−２．４の水溶液中での会合挙動
ＣＨＰ−ＭＡ−２．４の水中での会合挙動をＳＥＣの多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出により行った。ＳＥＣは東ソー製のＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷカラム、溶離液として５０ｍＭのＮａＣｌを含む超純水を用い、０．５ｍＬ／分の流速にてＭＡＬＳ（ＤＡＷＮ  ＤＳＰ，Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に接続した。屈折率定数（ｄｎ／ｄｃ）を０．１４３として分子量、多分散度、ｚ−平均慣性二乗半径を求めた。ＣＨＰ−ＭＡ−２．４水溶液は、１ｍｇ／ｍＬとなるように超純水に溶解させた後、プローブ型ソニケーター（ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて４０Ｗで１５分間超音波照射を行い、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過してから、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定に供した。
この結果、ＣＨＰ−ＭＡ−２．４の水溶液中における会合体（ナノゲル）は、Ｍｗ＝５８３ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４、Ｒｇ＝１３．８ｎｍであり、ＣＨＰと同様にナノメートルオーダーでサイズのそろった微粒子を形成すること、また、多糖約５．４分子が会合して１つの会合体が形成していることが確認された。
〔実施例１１〕ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＳＨとの化学架橋によるハイブリッドゲルの調製
（実施例１１−１）ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＳＨとの化学架橋によるハイブリッドゲルの調製−１
各ゲル調製（サンプル１１−１〜１１−６）に使用したＨＡ−ＳＨ、ＣＨＰ−ＭＡおよびこれらの最終濃度を表１１に示す。
【表１１】
2008136536.tif 000013
実施例９および実施例１０において合成したＨＡ−ＳＨ−２０ｋ−１８、ＨＡ−ＳＨ−２００ｋ−２７、ＣＨＰ−ＭＡ−２．４、ＣＨＰ−ＭＡ−１８．７に、それぞれ４０ｍｇ／ｍＬになるように、２０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む超純水を添加し、一晩攪拌することで溶解させた。これらのサンプルを遠心チューブに注入した。最終容量は、どの条件もおよそ１０００μＬとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で静置することによって化学架橋反応を行った。各時間におけるゲル化の確認をＴｉｌｔ法にて行った。７２時間後の外観を図１１に示した。
この結果、サンプル１１−１およびサンプル１１−２では、２４時間後には粘度上昇が確認されたが、７２時間後まで観察したところゲル化は起こっていなかった。サンプル１１−３およびサンプル１１−４では、１０時間後には粘度上昇が確認されたが、７２時間後には相分離が観察された。サンプル１１−５およびサンプル１１−６では、相分離しないゲルの調製が確認された。
本項の化学架橋反応は、ＭＡ基とＳＨ基のマイケル付加による架橋とＳＨ基同士の酸化反応（ジスルフィド結合の形成）の二つの反応が起こると考えられるが、同様の条件でＨＡ−ＳＨのみでゲル化の有無を検討したところ、粘度の上昇は見られたものの、ゲル化は起こらなかった。このことから、少なくともマイケル付加反応により架橋が起こっていることが示唆され、本項のハイブリッドゲル中ではＣＨＰとＨＡが化学的に結合していると思われた。
（実施例１１−２）ＣＨＰ−ＭＡとＨＡ−ＳＨとの化学架橋によるハイブリッドゲルの調製−２
各ゲル調製（サンプル１１−７〜１１−８）に使用したＨＡ−ＳＨ、ＣＨＰ−ＭＡおよびこれらの最終濃度を表１２に示す。
【表１２】
2008136536.tif 000014
実施例９および実施例１０において合成したＨＡ−ＳＨ−２００ｋ−２７、ＣＨＰ−ＭＡ−１８．７をそれぞれ４０ｍｇ／ｍＬになるように、２０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む超純水を添加し、一晩攪拌することで溶解させた。これらのサンプルを遠心チューブに注入した。次に最終濃度で１００ｍＭになるようにＴＥＡを添加した。最終容量は、どの条件もおよそ１０００μＬとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で５日間静置することによって化学架橋反応を行った。各サンプルは５日後に相分離が観察されないゲルとなっていた。未反応のＭＡ基を消失させるため、メルカプトエタノールを仕込みのＭＡ基に対して１０モル倍量加え、一晩反応させた。この反応液を除去し、過剰の超純水によって洗浄した後に、未反応のＳＨ基を消失させるためヨードエタノールを仕込みのＳＨ基に対して１０モル倍量加え、さらに一晩反応させた。この反応液を除去、過剰の超純水によって洗浄後、凍結乾燥した。
〔実施例１２〕化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＳＨのハイブリッドゲルへのＦＩＴＣラベル化インスリン封入
実施例１１において調製したサンプル１１−４のハイブリッドゲル５ｍｇを１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）により平衡膨潤させた。これをＵＶ用のセルに移し、１５００ｒｐｍ、１分間遠心分離して上清を除去し、ここに３ｍＬの５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−Ｉｎｓを含むＰＢ溶液を加え、２０℃で静置した。０時間から２４時間の間、経時的に吸光度（４９２ｎｍ）を測定し、検量線からＦＩＴＣ−ＩｎｓのＨＡ−ＣＨＰハイブリッドゲル内への取込み量の定量を行った。
この結果、ハイブリッドゲルへのＦＩＴＣ−Ｉｎｓの取込みは徐々に進行し、２０時間でほぼ平衡に達していた。吸光度は０．１１７減少し、ここから乾燥ハイブリッドゲルの単位重量あたりのＦＩＴＣ−Ｉｎｓｌｉｎの取込み量は０．７７５ｎｍｏｌ／ｍｇ（０．４７％ｗ／ｗ）と算出された。
〔実施例１３〕化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＳＨのハイブリッドゲルからのＦＩＴＣラベル化インスリン放出挙動
実施例１２において、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液を添加したハイブリッドゲルサンプルを遠心処理して、上澄みをデカンテーションにより除去し、１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）を加え洗浄した（３ｍＬ、２回）。ここに３ｍＬの１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）を加え２０℃にて４９２ｎｍの波長をＵＶ−ＶＩＳ分光光度計でモニターすることで放出挙動を評価した。その結果を図１２に示した。
これより本項の化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＳＨのハイブリッドゲルは、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出の初期バーストが非常に小さく、リザーバー型の徐放性を示すことが明らかとなった。
〔実施例１４〕化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＭＡのハイブリッドゲルの調製
（実施例１４−１）ＣＨＰ−ＭＡ−２およびＣＨＰ−ＭＡ−７の合成
実施例１０のＧＭＡ添加量を変え、他は同様の方法によりグルコースユニットに対するＭＡ基の導入率が２．０％（以下、「ＣＨＰ−ＭＡ−２」とも称する）および７．０％（以下、「ＣＨＰ−ＭＡ−７」とも称する）のＣＨＰ−ＭＡを合成した。
（実施例１４−２）化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＭＡのハイブリッドゲルの調製条件検討
各ゲル調製（サンプル１４−１〜１４−１０）に使用したＣＨＰ−ＭＡ、ＨＡ−ＭＡ、最終濃度を表１３に示した。
【表１３】
2008136536.tif 000015
実施例１で合成したＨＡ−ＭＡ−９（「ＨＡ−ＭＡ−２００ｋ−４３」とも称する）および実施例１４−１で合成したＣＨＰ−ＭＡ−７をそれぞれ４０ｍｇ／ｍＬになるように超純水に溶解させた。表１３に示した組成になるように２種類のポリマー溶液を混合した後、最終濃度で１００ｍＭになるようにＴＥＡを添加し、よく混合した。さらに、ＤＴＴ水溶液を系中のＭＡ基の最終濃度に対して１／２のモル数（ＭＡ基とＳＨ基の比率が１：１）になるように添加し、よく混合した。最終容量は、どの条件もおよそ１０００μＬとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で２４時間静置することによって化学架橋反応を行い、Ｔｉｌｔ法によりゲル化の判定を行った。結果の模式図を図１３に示した。
この結果、系中に含まれる全ＭＡ基の増加によりゲル化が進行した。サンプル１４−３〜１４−５の結果から、単独ではゲル化が進行しなかったＨＡ−ＭＡ１０ｍｇ／ｍＬの条件下、ナノゲルを添加していくと、ナノゲル含量が１０ｍｇ／ｍＬで粘度上昇が観察され、２０ｍｇ／ｍＬ加えた場合においてゲル化が確認された。このことから、ナノゲルのＭＡ基がゲル化に寄与していると考えられた。これらのゲル化はいずれも反応開始後２時間以内に確認された。これらのゲルは調製後すぐに超純水に膨潤させると、ゲル化直後相分離が起こり不透明なゲルであったサンプル１４−５、サンプル１４−７であっても透明なゲルが得られた。また、ＣＨＰ−ＭＡ−２を用いて同様の検討を行ったところ、ほとんど同様のゲル化挙動を示した。
（実施例１４−３）化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＭＡのハイブリッドゲルの調製
各ゲル調製（サンプル１４−１１〜１４−１４）に使用したＣＨＰ−ＭＡ、ＨＡ−ＭＡ、最終濃度を表１４に示した。実施例１４−２と同様の方法でゲル化させた後、系中に仕込んだＭＡ基に対して過剰のメルカプトエタノールを添加し反応させることで、残存していると思われる未反応のＭＡ基を消失させ、さらに過剰の超純水で洗浄することで余剰のメルカプトエタノールを除去し、凍結乾燥してから次項に供した。
【表１４】
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〔実施例１５〕ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＭＡ化学架橋ハイブリッドゲルへのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ封入
実施例１４−３において調製したサンプル１４−１１〜１４−１４のハイブリッドゲル５ｍｇに５ｍＬの５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−Ｉｎｓを含む１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）を加え、２０℃で静置した。０時間から７２時間の間、経時的に吸光度（４９４ｎｍ）を測定した。サンプル１４−１３およびサンプル１４−１４についての吸光度の経時変化を図１４に示した。
この結果、ハイブリッドゲルへのＦＩＴＣ−Ｉｎｓの取込みは添加するだけで自発的に進行し、７２時間でほぼ平衡に達していた。検量線から７２時間後のＦＩＴＣ−Ｉｎｓのハイブリッドゲル内への取込み量の定量を行った結果を表１５に示した。
【表１５】
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封入されたＦＩＴＣ−Ｉｎｓ量はナノゲル含有量が多いほど増加するが、ＭＡ基の置換度には依存していなかった。このことからナノゲルの含有量がＦＩＴＣ−Ｉｎｓ取込量の増減に寄与することが示唆された。
〔実施例１６〕化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＭＡのハイブリッドゲルからのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ放出挙動
（実施例１６−１）緩衝液中での放出特性
実施例１５において調製したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液を添加したハイブリッドゲルサンプルから、上澄みを遠心、デカンテーションにより除去し、１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）を加え洗浄した（３ｍＬ、２回）。ここに３ｍＬの１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）を加え３７℃にて４９４ｎｍの波長をＵＶ−ＶＩＳ分光光度計でモニターすることで放出の経時変化を測定した。その結果を図１５に示す。
この結果いずれのゲルからも３日間程度までは持続的にＦＩＴＣ−Ｉｎｓが放出されることが明らかとなった。放出開始より１２時間以降に観察された放出の遅い相は、ＣＨＰ−ＭＡの置換基導入率が高いほど、またナノゲル含有量が多いほど、より遅い放出速度を示しており、置換基導入率やナノゲル含有量により徐放速度を制御可能なことが示唆された。
（実施例１６−２）シクロデキストリン存在下における放出挙動
実施例１５と同様の方法で調製したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液を添加したハイブリッドゲルサンプルについて、洗浄操作を１回として、その他は実施例１６−１と同様の方法で放出挙動を評価した。また、放出開始から５日後に１０ｍＭになるようにβ−ＣＤを添加し、さらに放出挙動を評価した。結果を図１６に示す。
まず、洗浄操作を２回した場合（実施例１６−１）と比較すると、ＣＨＰ含量の低いサンプル１４−１１およびサンプル１４−１３では初期バーストが約３０％増加したが、ＣＨＰ含量の高いサンプル１４−１２およびサンプル１４−１４ではほとんど初期バースト量に変化はなかった。これはナノゲル含量が少ないハイブリッドゲルでは、ＨＡマトリクスに封入されていたＦＩＴＣ−Ｉｎｓの割合が高かったことを示唆した。また、実施例５や実施例７のＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルでの結果と同様に、シクロデキストリン添加により放出速度は加速され、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓはコレステロール基との疎水性相互作用によってハイブリッドゲル中に保持されていることが示唆された。
（実施例１６−３）アルブミン存在下における放出特性
実施例１５と同様の方法で調製したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液を添加したハイブリッドゲルサンプルについて、リリースバッファーを５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）に変更し、その他は実施例１６−１と同様の方法で放出挙動を評価した。結果を図１７に示す。
この結果、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓの２４時間までの放出速度は、ゲルの組成にかかわらずＢＳＡ未添加の場合（実施例１６−１）と比較してほとんど変化は確認されなかった。これはＣＨＰを封入したハイブリッドゲル（実施例８）の結果と同様、化学架橋ＨＡゲルによる効果と考えられた。５０ｍｇ／ｍＬというアルブミン濃度は、ほぼ血液中濃度に等しいことから、血液中においても緩衝液と同様の放出特性が期待された。
（実施例１６−４）ヒアルロニダーゼ存在下における放出特性
実施例１５と同様の方法で調製したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液を添加したハイブリッドゲルサンプルについて、リリースバッファーを２８５ｍＵ／ｍＬのヒアルロニダーゼＳＤおよび５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ６．２）に変更し、その他は実施例１６−１と同様の方法で放出挙動を評価した。結果を図１８に示した。
この結果、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓの２４時間までの放出速度は、ヒアルロニダーゼＳＤ未添加の場合（実施例１６−１）と比較して加速された。これはＣＨＰを封入したハイブリッドゲル（実施例５）の結果と同様、ハイブリッドゲルの分解（化学架橋したＨＡ部分の分解）に伴って、薬物放出が起こることが示唆された。
〔比較例２〕化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＭＰＣハイブリッドゲルの調製および薬物放出性評価
（比較例２−１）化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＭＰＣハイブリッドゲルの調製
実施例１４において合成したＣＨＰ−ＭＡ−７と２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）をそれぞれ３０ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬになるように超純水に溶解させ、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］（ＶＡ−０４４、和光純薬製）を系中のＭＡ基に対してモル比で０．００５倍量添加し、アルゴン脱気後、５０℃で５時間重合反応を行った。得られたハイブリッドゲルを、過剰の水に対して１週間膨潤させることで精製を行い、凍結乾燥して白色個体を得た。
以下、本比較例で調製したハイブリッドゲルを「サンプルＣ−２」とも称する。
（比較例２−２）ハイブリッドゲルへのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ封入
比較例２−１において作製したハイブリッドゲル１０ｍｇを用いた他は実施例１５と同様の手順でＦＩＴＣ−Ｉｎｓを封入した。
〔実施例１７〕各種ハイブリッドゲルの膨潤率と薬物放出性比較
（実施例１７−１）凍結乾燥ハイブリッドゲルの膨潤率評価
実施例８−１のサンプル８−２と同一条件においてサンプル１７−１のハイブリッドゲルを調製し、凍結乾燥した（表１６に記載）。また、実施例１４−３のサンプル１４−１１〜１４と同一条件においてサンプル１７−２〜５（表１７に記載）のハイブリッドゲルを調製し、凍結乾燥した。サンプル１７−１〜５およびサンプルＣ−２について、凍結乾燥ハイブリッドゲルをそれぞれ５〜１０ｍｇ程度秤取して（乾燥重量）、過剰のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃で２４時間膨潤させ、デカンテーションによって溶媒を除去した後、キムワイプ（登録商標）で表面についた水分を吸い取り、重量を測定し（膨潤重量）、前記の式（１）によりＰＢＳ中における膨潤時のゲル密度を算出した。この結果をグラフにしたものを図１９に示した。
【表１６】
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【表１７】
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（実施例１７−２）ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルと化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＭＰＣハイブリッドゲルの薬物放出性比較
比較例２−２において調製したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ封入ＣＨＰ−ＭＡ・ＭＰＣハイブリッドゲルについて、実施例１６−１および実施例１６−３で示した方法とＢＳＡ濃度以外は同一の手順で、リリースバッファーにＢＳＡを含まない場合（ＢＳＡ（−））と１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む場合（ＢＳＡ（＋））の薬物放出性を評価した。その結果を図２０に示した。また、この結果および実施例８−３で実施したＦＩＴＣ−Ｉｎｓの放出挙動について、リリースバッファーにＢＳＡを含まない条件でのリリース量に対するＢＳＡを含む条件でのリリース量の比率（ＢＳＡ（＋）／ＢＳＡ（−））を経時的にプロットしたものを図２１に示した。
（実施例１７−３）化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルと化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＭＰＣハイブリッドゲルの薬物放出性比較
比較例２−２において調製したＦＩＴＣ−Ｉｎｓ封入ＣＨＰ−ＭＡ・ＭＰＣハイブリッドゲルについて、実施例１６−１および実施例１６−３で示した方法と同一の手順で、リリースバッファーにＢＳＡを含まない場合（ＢＳＡ（−））とＢＳＡを含む場合（ＢＳＡ（＋））の薬物放出性を評価した。その結果を図２２に示した。また、この結果および実施例１６で実施したＦＩＴＣ−Ｉｎｓの放出挙動について、リリースバッファーにＢＳＡを含まない条件でのリリース量に対するＢＳＡを含む条件でのリリース量の比率（ＢＳＡ（＋）／ＢＳＡ（−））を経時的にプロットしたものを図２３に示した。
本実施例に用いたＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルおよび化学架橋ＣＨＰ−ＭＡ・ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルの膨潤時ゲル密度は、サンプルＣ−２と比較して低かったにも関らず、アルブミンによる薬物リリース速度の加速は有意に抑制されていた。
〔実施例１８〕ＡＭ基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＡＭ）の合成
分子量２１ｋＤａ、２７ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（資生堂株式会社製）を用いて実施例１−２と同様の方法で調製したＨＡ−ＴＢＡを５ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯに溶解した。その後、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ）（アルドリッチ社製）をＨＡユニットに対してモル比で５０倍量を各溶液に添加した。次に、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対してモル比で０．４倍量を添加し、穏やかな攪拌下、室温で一晩反応させた。反応溶液は０．３Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を使用して透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ、外液は４回交換した）し、次に外液を超純水に変え、引き続き透析（外液は６回交換した）することにより精製した。得られた透析液を凍結乾燥してＨＡ−ＡＭを白色固体として得た。
得られたＨＡ−ＡＭを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行い、ＨＡユニットに対するＡＭ基の導入率を算出し（グルコサミンのアセチル基の積分値を基準とし、ＥＤＯＢＥＡのメチレン（ＮＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）２−ＣＨ２−ＮＨ−）、３．２２ｐｐｍ付近の積分値の比率より算出）、導入率からＨＡ−ＡＭのユニット平均分子量（未修飾ＨＡユニットはナトリウム塩、ＨＡ−ＡＭユニットは塩酸塩として）を算出した（表１８参照）。
【表１８】
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〔実施例１９〕ＳＨ基（イミノチオレイン、ＩＴＬ）を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＩＴＬ）の合成
実施例１８で得られたＨＡ−ＡＭ−２を１０ｍｇ／ｍＬで１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）に溶解した。その後、２−イミノチオレイン塩酸塩（ピアス社製）をＨＡユニットに対してモル比で０．３５倍量を添加し、穏やかな攪拌下、室温で２時間反応させた。次に、無水コハク酸（ＳＵＣ）をＨＡユニットに対してモル比で４０倍量添加し、室温で２時間反応させた。反応溶液は０．３Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を使用して透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ、外液は４回交換した）し、次に外液を超純水に変え引き続き透析（外液は６回交換した）、さらに外液を１ｍＭ塩酸水溶液に変え引き続き透析（外液は３回交換した）することで精製を行った。得られた透析液を凍結乾燥してＨＡ−ＩＴＬを白色固体として得た。
得られたＨＡ−ＩＴＬを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行い、ＨＡユニットに対するＩＴＬ基およびＳＵＣ基の導入率を算出し（グルコサミンのアセチル基の積分値を基準とし、ＩＴＬのメチレン（ＳＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（＝ＮＨ２＋）−）、２．４０ｐｐｍ付近の積分値の比率、およびＳＵＣのエチレン（ＣＯＯＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）、２．７０ｐｐｍ付近の積分値の比率より算出）、導入率からＨＡ−ＩＴＬのユニット平均分子量（未修飾ＨＡユニットはフリーカルボン酸体、ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニットはフリーカルボン酸体、ＨＡ−ＡＭ−ＩＴＬユニットのイミノ基は塩酸塩として）を算出した（表１９参照）。
【表１９】
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〔実施例２０〕ＳＨ基（チオグリコール酸、ＴＧＡ）を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＴＧＡ）の合成
（実施例２０−１）ＨＡ−ＡＭへのＳＡＴＡ基の導入
実施例１８で得られたＨＡ−ＡＭ−３を１０ｍｇ／ｍＬで１００ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ７．４）に溶解した。その後、Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）（ピアス社製）をＡＭ基が導入されたＨＡユニットに対してモル比で３倍量（ＨＡユニットに対してモル比で０．８５倍量）を添加し、穏やかな攪拌下、室温で２時間反応させた。次に、無水コハク酸（ＳＵＣ）をＨＡユニットにたいして４０倍等量添加し、室温で２時間反応させた。反応溶液は０．３Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を使用して透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ、外液は４回交換した）し、次に外液を超純水に変え引き続き透析（外液は６回交換した）することで精製をした。得られた透析液を凍結乾燥してＳＡＴＡが導入されたＨＡ誘導体（ＨＡ−ＳＡＴＡ）を白色固体として得た。
（実施例２０−２）Ｓ−アセチル基の脱保護によるＨＡ−ＴＧＡの合成
本実施例に使用した全ての溶媒は窒素バブリングしてから以下の検討に供した。
実施例２０−１で得られたＨＡ−ＳＡＴＡの白色粉末を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で５００ｍＭヒドロキシアミン（ＮＨ２−ＯＨ）および１０ｍＭＴＣＥＰを含む５０ｍＭ塩酸水溶液（ｐＨ７．０）に溶解させ、室温で１時間攪拌した。得られた溶液をあらかじめ１ｍＭ塩酸水溶液で平衡化した脱塩カラム（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライし、回収した溶液を１ｍＭ塩酸水溶液に対して透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ、外液は２回交換した）することで精製を行った。得られた透析液を凍結乾燥してＴＧＡが導入されたＨＡ誘導体（ＨＡ−ＴＧＡ）を白色固体として得た。
得られたＨＡ−ＴＧＡを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行い、ＨＡユニットに対するＴＧＡ基およびＳＵＣ基の導入率を算出し（グルコサミンのアセチル基の積分値を基準とし、ＴＧＡのＳＨ基隣のメチレン（ＳＨ−ＣＨ２−ＣＯ−）、３．２６ｐｐｍ付近の積分値の比率、およびＳＵＣのエチレン（ＣＯＯＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）、２．７０ｐｐｍ付近の積分値の比率より算出）、導入率からＨＡ−ＴＧＡのユニット平均分子量（未修飾ＨＡユニットはフリーカルボン酸体、ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニットはフリーカルボン酸体として）を算出した（表２０参照）。
【表２０】
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〔実施例２１〕ＳＨ基（ジチオトレイトール、ＤＴＴ）を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＤＴＴ）の合成
（実施例２１−１）ＨＡ−ＭＡの合成
実施例１のＨＡ−ＭＡ−２〜４と同様の条件でＨＡ−ＭＡを合成したところ、ＭＡ基の導入率は３５．２％、ユニット平均分子量は４３２．７であった。
以下、本実施例で合成したＨＡ−ＭＡをＨＡ−ＭＡ−１１とも称する。
（実施例２１−２）ＨＡ−ＤＴＴの合成
本実施例に使用した全ての溶媒は窒素バブリングしてから以下の検討に供した。
実施例２１−１において得られたＨＡ−ＭＡを２０ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。ここに最終濃度でＨＡ−ＭＡが５ｍｇ／ｍＬ、ＴＥＡが１０ｍＭ、ＤＴＴがＭＡ基に対してモル比で２５倍量になるように、ＴＥＡ、超純水、ＤＴＴの順に各試薬を添加し、室温で一晩反応させた。得られた溶液をあらかじめ１ｍＭ塩酸水溶液で平衡化した脱塩カラム（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライし、回収した溶液に１０ｍＭになるようにＴＣＥＰを添加し、室温で１時間反応させた。再度、脱塩カラムによる精製を行った後、１ｍＭ塩酸水溶液に対して透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ、外液は２回交換した）することで精製を行った。得られた透析液を凍結乾燥してＤＴＴが導入されたＨＡ誘導体（ＨＡ−ＤＴＴ）を白色固体として得た。
得られたＨＡ−ＤＴＴを約１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ２Ｏに溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行った。反応によりＨＡ−ＭＡのＭＡ基由来のピーク（１．９１ｐｐｍ、５．７３ｐｐｍおよび６．１３ｐｐｍ）が消失したことから、未反応ＭＡ基はなく、すべてのＭＡ基がＤＴＴのＳＨ基とマイケル付加したことが示唆された。また、２．６９ｐｐｍ〜２．８６ｐｐｍの間に検出された数本の重なったピークは、ＤＴＴのＳＨ基隣のメチレン（４Ｈ／ＤＴＴ基）、付加反応を受けたＭＡ基由来のメチレン（ＤＴＴ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２）−ＣＯＯ−）およびメチン（ＤＴＴ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯ−）由来のピークと帰属された。この積分値の和（７Ｈ／ＭＡ−ＤＴＴ基）と付加反応を受けたＭＡ基由来のメチル（１．２３ｐｐｍ、ＤＴＴ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯ−）の積分値の比率から、ＭＡ基に対してＤＴＴが過不足なく導入されたものと推察された。以上より、ＨＡユニットに対するＤＴＴ基の導入率はＨＡ−ＭＡ−１１のＭＡ基導入率と同一であるとし、ＨＡ−ＤＴＴのユニット平均分子量（未修飾ＨＡユニットはフリーカルボン酸体として）を算出した（表２１参照）。
【表２１】
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〔実施例２２〕コレステロール基を導入したクラスターデキストリン誘導体（ＣＨｃＤｅｘ）の合成
分子量１５０ｋＤａのクラスターデキストリン（ｃＤｅｘ）（江崎グリコ株式会社より入手）を１００ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯに溶解した。その後、無水ピリジンに溶解させたコレステリル−Ｎ−（６−イソシアネートヘキシル）カーバメート（ＣＨＩ）（日油株式会社より入手）をｃＤｅｘユニットに対してモル比で０．０５倍量を添加し、窒素雰囲気下、８０℃で９．５時間反応させた。反応溶液を過剰のエタノール・ジエチルエーテル混合溶媒（容量比３：１７）に供し、再沈殿により白色沈殿を得た。得られた沈殿を減圧乾燥後、ＤＭＳＯに溶解させ、超純水に対して透析（スペクトラポア６、分画分子量（ＭＷＣＯ）：３．５ｋＤａ、外液は６回交換した）することによって精製を行った。得られた透析液をフィルター（０．８μｍ）濾過した後、凍結乾燥してＣＨｃＤｅｘを白色固体として得た。
得られたＣＨｃＤｅｘをＤＭＳＯ−ｄ６・Ｄ２Ｏ混合溶媒（容量比９：１）に溶解させ、ＮＭＲにより構造解析を行い、ｃＤｅｘユニットに対するコレステロール基の導入率を算出（ｃＤｅｘ中に９４％含まれるα１−４結合由来のアノメリックプロトン（４．９−５．３ｐｐｍ付近）の積分値を基準とし、コレステロール由来のピーク（０．２−２．４ｐｐｍ付近）の積分値の比率より算出）したところ、１００グルコースユニットあたり３．８個であった。
〔比較例３〕各種化学架橋ＨＡゲルの調製
各サンプル調製（サンプルＣ３−１〜１１）に使用したＨＡ誘導体、最終濃度、架橋剤、反応条件等を表２２に示した。
（比較例３−１）ＨＡ−ＭＡをマイケル付加反応によって架橋したＨＡゲルの調製
ゲル化反応の緩衝液を５００ｍＭＴＥＡ／１００ｍＭ塩酸水溶液（最終濃度は１／５、希釈後のｐＨは８．１）に変更した他は実施例２で示した方法と同様の手順で、表２２に示したサンプルＣ３−１〜３の化学架橋ＨＡゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−２）ＨＡ−ＭＡをラジカル重合によって架橋したＨＡゲルの調製
５００ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは７．３であった。
超純水に５０ｍｇ／ｍＬ（１８５．０ｍＭ）になるようにペルオキソ二硫酸カリウム（ＫＰＳ）を溶解させた。
実施例１で合成したＨＡ−ＭＡ−２をマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。前記で調製したＴＥＭＥＤ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。さらに前記で調製したＫＰＳ溶液を最終濃度で２０ｍＭになるように添加し、よく混合した。最終容量は１００μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、室温で１時間静置することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルＣ３−４について、実施例２−４で示した方法と同様の手順で膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−３）ＨＡ−ＭＡを光重合したＨＡゲルの調製
１００ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＴＥＡを溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは８．１であった。
エタノールに５０ｍｇ／ｍＬ（２２３．０ｍＭ）になるように２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチルプロピオフェノン（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解させた。
実施例１で合成したＨＡ−ＭＡ−２をマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。前記で調製したＴＥＡ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。さらに前記で調製したＩｎｉｔｉａｔｏｒ溶液を最終濃度で２０ｍＭになるように添加し、よく混合した。最終容量は１００μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、ＵＶランプで１０分間ＵＶ光を照射（３６５ｎｍ、〜４Ｗ／ｃｍ２）することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルＣ３−５について、実施例２−４で示した方法と同様の手順で膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−４）ＨＡとＥＤＯＢＥＡを縮合反応によって架橋したＨＡゲルの調製
２５０ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＴＥＡを溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは７．４であった。
１０００ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＥＤＯＢＥＡを溶解させた。溶液ｐＨは７．５であった。
超純水に４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）（国産化学株式会社製）を５００ｍｇ／ｍＬ（試薬に予め含まれている水分量（１１．７％）を補正すると１５９５．５ｍＭ）になるように溶解させた。
２１ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（資生堂株式会社製）をマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。前記で調製したＴＥＡ溶液を最終容量の１／５、前記で調製したＥＤＯＢＥＡ溶液をＨＡユニットに対してモル比で０．２８倍になるように添加し、よく混合した。さらに前記で調製したＤＭＴ−ＭＭ溶液をＨＡユニットに対してモル比で２倍量になるように添加し、よく混合した。最終容量は１００μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１６時間静置することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルＣ３−６について、実施例２−４で示した方法と同様の手順で膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−５）ＨＡ−ＡＭを縮合反応によって架橋したＨＡゲルの調製
２５０ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＴＥＡを溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは７．４であった。
超純水にＤＭＴ−ＭＭを６５０ｍｇ／ｍＬ（試薬に予め含まれている水分量（１１．７％）を補正すると２０７４．１ｍＭ）になるように溶解させた。
実施例１８で合成したＨＡ−ＡＭ−１をマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。前記で調製したＴＥＡ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。さらに前記で調製したＤＭＴ−ＭＭ溶液をＨＡユニットに対してモル比で２倍量になるように添加し、よく混合した。最終容量は１００μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１６時間静置することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルＣ３−７について、実施例２−４で示した方法と同様の手順で膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−６）ＨＡ−ＩＴＬを酸化反応によって架橋したＨＡゲルの調製
本比較例に使用した超純水は窒素バブリングしてから以下の検討に供した。
超純水に５００ｍＭになるようにＴＥＡを溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは９．２であった。
３０％の過酸化水素（ＯＸ）水溶液を超純水で希釈することで１％ＯＸ水溶液を調製した。
実施例１９で合成したＨＡ−ＩＴＬをマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。前記で調製したＴＥＡ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。さらに前記で調製した１％ＯＸ水溶液をＳＨ基に対してモル比で等量になるように添加し、よく混合した。最終容量は１００μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１６時間静置することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルＣ３−８について、実施例２−４で示した方法と同様の手順で膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−７）ＨＡ−ＴＧＡを酸化反応によって架橋したＨＡゲルの調製
実施例２０で合成したＨＡ−ＴＧＡを用いた他は、比較例３−６で示した方法と同様の手順でサンプルＣ３−９を調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−８）ＨＡ−ＭＡとＨＡ−ＤＴＴをマイケル付加反応によって架橋したＨＡゲルの調製
本比較例に使用した超純水は窒素バブリングしてから以下の検討に供した。
１００ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＴＥＡを溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは８．１であった。
実施例２１−１で合成したＨＡ−ＭＡ−１１および実施例２１−２で合成したＨＡ−ＤＴＴをそれぞれ別のマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。ＨＡ−ＭＡ−１１およびＨＡ−ＤＴＴ溶液を系中のＭＡ基とＨＡ基の比率が１になるように混合した後、前記で調製したＴＥＡ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。最終容量は１００μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１６時間静置することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルＣ３−１０について、実施例２−４で示した方法と同様の手順で膨潤時のゲル密度を算出した。
（比較例３−９）ＨＡ−ＭＡとＨＡ−ＴＧＡをマイケル付加反応によって架橋したＨＡゲルの調製
本比較例に使用した超純水は窒素バブリングしてから以下の検討に供した。
１００ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＴＥＡを溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは８．１であった。
実施例２１−１で合成したＨＡ−ＭＡ−１１および実施例２０で合成したＨＡ−ＴＧＡをそれぞれ別のマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。ＨＡ−ＭＡ−１１およびＨＡ−ＤＴＴ溶液を系中のＭＡ基とＨＡ基の比率が１になるように混合した後、前記で調製したＴＥＡ溶液を最終容量の１／５添加し、よく混合した。最終容量は１００μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１６時間静置することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルＣ３−１１について、実施例２−４で示した方法と同様の手順で膨潤時のゲル密度を算出した。
【表２２】
2008136536.tif 000024
〔実施例２３〕ナノゲル（ＣＨＰ、ＣＨｃＤｅｘ）を封入した各種化学架橋ＨＡハイブリッドゲルの調製
各サンプル調製（サンプル２３−１〜１５）に使用したＨＡ誘導体、ナノゲル、最終濃度、架橋剤、反応条件等を表２３に示した。
（実施例２３−１）ＨＡ−ＭＡをマイケル付加反応によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−１で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−１〜３のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−２）ＨＡ−ＭＡをラジカル重合によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−２で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−４のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−３）ＨＡ−ＭＡを光重合したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−３で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−５のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−４）ＨＡとＥＤＯＢＥＡを縮合反応によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−４で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−６のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−５）ＨＡ−ＡＭを縮合反応によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−５で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−７および２３−８のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−６）ＨＡ−ＩＴＬを酸化反応によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−６で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−９のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−７）ＨＡ−ＴＧＡを酸化反応によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−７で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−１０のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−８）ＨＡ−ＭＡとＨＡ−ＤＴＴをマイケル付加反応によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に７．５ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−８で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−１１のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−９）ＨＡ−ＭＡとＨＡ−ＴＧＡをマイケル付加反応によって架橋したＣＨＰ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に７．５ｍｇ／ｍＬのＣＨＰを含む他は比較例３−９で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−１２のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
（実施例２３−１０）ＨＡ−ＭＡをマイケル付加反応によって架橋したＣＨｃＤｅｘ封入ハイブリッドゲルの調製
化学架橋する前のサンプル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのＣＨｃＤｅｘを含む他は比較例３−１で示した方法と同様の手順で、表２３に示したサンプル２３−１３のＣＨＰ封入ハイブリッドゲルを調製し、膨潤時のゲル密度を算出した。
前記、比較例３−１〜９および実施例２３−１〜１０において算出したゲル密度の結果を表２４に示した。凍結乾燥ゲル重量から理論収量に対する収率を算出すると、全てのゲルの収率はほぼ１００％であったこと、および、ナノゲル（ＣＨＰおよびＣＨｃＤｅｘ）共存下、各種化学反応によって架橋したハイブリッドゲルのゲル密度は、ナノゲル非共存下と比較して増大していたことから、本実施例において調製した種々ハイブリッドゲル中にナノゲルが封入されたことが示唆された。
【表２３】
2008136536.tif 000025
【表２４】
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〔実施例２４〕ＣＨＰを封入した各種化学架橋ＨＡハイブリッドゲルへのインスリン封入特性および放出特性の評価
（実施例２４−１）各種ハイブリッドゲルの調製
表２５に示したサンプル２４−１〜５をそれぞれ２個ずつ、実施例２３で示した方法と同様の手順で各種凍結乾燥ハイブリッドゲルを調製し、それぞれマイクロチューブに入れた。
【表２５】
2008136536.tif 000027
（実施例２４−２）インスリンの封入、および封入量の算出
インスリン（ウシ膵臓由来）を２５０μｇ／ｍＬになるように３００ｍＭＰＢ（ｐＨ７．０）に溶解させた。
インスリン溶液をハイブリッドゲルが入ったマイクロチューブに１ｍＬずつ添加し、４℃で３日間静置した後、デカンテーションによってインスリン溶液を除去し、過剰のＰＢＳ（ＰＢＳタブレットを超純水に溶解することにより調製、シグマ社製）を添加し、４℃で静置、数時間後に添加したＰＢＳをデカンテーションによって除去した。この操作を数回繰り返した後、ゲル表面の水分をキムワイプで吸い取り、一方は以下の封入量評価の検討に、他方は実施例２４−３のインスリン放出挙動評価の検討に供した。
インスリンを封入した各ハイブリッドゲルに２５ｍＭのＨＰ−β−ＣＤおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＣＴＢ）を５００μｌ添加し、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション開始後、２時間、１日、２日、４日後に、４００μＬの上澄みを回収、新たに４００μＬのＣＴＢを添加する操作を行った。回収した上澄み中のインスリン濃度をＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例６−２に記載の条件）で定量し、各測定時までにハイブリッドゲルからリリースされた累積のインスリン量を算出した。すべてのサンプルで２日後から４日後まで間、インスリンのリリースが止まっていたことから、４日後までの累積リリース量をハイブリッドゲルへのインスリンの封入量とした。その結果を表２６に示した。
【表２６】
2008136536.tif 000028
（実施例２４−３）インスリンの放出挙動
実施例２４−２においてインスリンを封入した各ハイブリッドゲルに０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＳＡＢ）を５００μｌ添加し、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション開始後、２時間、１日、２日、４日、７日、１０日、１５日後（サンプル２５−５は１０日まで）に、４００μＬの上澄みを回収、新たに４００μＬのＳＡＢを添加する操作を行った。回収した上澄み中のインスリン濃度をＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例６−２に記載の条件）で定量し、各測定時までにハイブリッドゲルからリリースされた累積のインスリン量を算出した。この値を封入されたインスリン量（実施例２４−２で算出）に対するパーセント量としてプロットしたものを図２４に示した。
この結果、本検討に用いた全てのハイブリッドゲルからのインスリン放出挙動は徐放性を有していた。放出挙動が異なっているのは、それぞれのゲル密度や分解速度が異なるためと推察された。
〔実施例２５〕ＣＨｃＤを封入した各種化学架橋ＨＡハイブリッドゲルへのインスリン封入特性および放出特性の評価
（実施例２５−１）インスリンの封入、および封入量の算出
表２７に示したサンプル２５−１を２個、実施例２３で示した方法と同様の手順で凍結乾燥ハイブリッドゲルを調製し、それぞれマイクロチューブに入れた。
実施例２４−２で示した方法と同様の手順でインスリンを封入し、封入量を算出したところ、ＣＨｃＤｅｘの仕込み量に対する重量比で３．４％ｗ／ｗ、乾燥ゲルに対する重量比で１．０％ｗ／ｗであった。
【表２７】
2008136536.tif 000029
（実施例２５−２）インスリンの放出挙動
実施例２５−１でインスリン封入したサンプル２５−１について、実施例２４−３で示した手順と同様の方法でインスリンの放出挙動を評価し、結果を図２５に示した。
この結果、骨格多糖の異なる疎水化多糖（ナノゲル）であるＣＨｃＤｅｘを封入したハイブリッドゲルからのインスリンの放出挙動は徐放性を有するものであった。
〔実施例２６〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルへのグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の封入特性および放出特性評価
（実施例２６−１）ＧＬＰ−１の封入、および封入量の算出
表２８に示したサンプル２６−１を２個、実施例２３で示した方法と同様の手順で各種凍結乾燥ハイブリッドゲルを調製し、それぞれマイクロチューブに入れた。
天然型ＧＬＰ−１［７−３７］（アメリカンペプチド社製）をペプチド濃度として５００μｇ／ｍＬになるように３００ｍＭＰＢ（ｐＨ７．０）に溶解させた。
実施例２４−２で示した方法と同様の手順でＧＬＰ−１を封入し、サンプル２６−１について封入量を算出したところ、ＣＨＰの仕込み量に対する重量比で２０．６％ｗ／ｗ、乾燥ゲルに対する重量比で５．９％ｗ／ｗであった。
【表２８】
2008136536.tif 000030
（実施例２６−２）ＧＬＰ−１の放出挙動
実施例２６−１でＧＬＰ−１封入したサンプル２６−１について、実施例２４−３で示した手順と同様の方法でＧＬＰ−１の放出挙動を評価し、結果を図２６に示した。この結果、本検討に用いたハイブリッドゲルからのＧＬＰ−１放出挙動は徐放性を有していた。
〔実施例２７〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＭＡハイブリッドゲルへのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の封入特性および放出特性評価
（実施例２７−１）ＥＰＯの封入、および封入量の算出
表２９に示したサンプル２７−１を２個、実施例２３で示した方法と同様の手順で各種凍結乾燥ハイブリッドゲルを調製し、それぞれマイクロチューブに入れた。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）原薬溶液（中外製薬株式会社製）をポリペプチド濃度として５００μｇ／ｍＬになるように５０ｍＭＰＢ（ｐＨ６．５）で希釈した。
各ハイブリッドゲルに添加した薬物溶液量を０．５ｍＬに、静置した温度および時間を３７℃、４日間に変更した他は、実施例２４−２で示した方法と同様の手順でＥＰＯを封入した。また、以下に示すＳＥＣ分析条件において定量を行った他は実施例２４−２で示した方法と同様の手順でＥＰＯおよびＣＨＰの封入量を算出した。（本ＳＥＣ分析において、ＥＰＯ・ＣＨＰ複合体からＥＰＯは完全に解離しフリーのＥＰＯとして定量的に検出されることをあらかじめ検証した。）この結果、ＥＰＯ封入量はＣＨＰの仕込み量に対する重量比で６．８％ｗ／ｗ、乾燥ゲルに対する重量比で２．０％ｗ／ｗであった。また、ＣＨＰの仕込み量に対する放出量比（ゲル化、洗浄、封入工程などにおける収率）は６１．３％であった。
ＳＥＣ分析条件
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０／２４８７
カラム：Ｇ２０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＵＶ検出（２８０ｎｍ）
溶出液：１０ｍＭ  ＨＰ−β−ＣＤ含有ＰＢＳ
インジェクション容量：５０μＬ
【表２９】
2008136536.tif 000031
（実施例２７−２）ＥＰＯおよびＣＨＰの放出挙動
実施例２７−１でＥＰＯを封入したハイブリッドゲルからのＥＰＯおよびＣＨＰの放出挙動を以下に示すＳＥＣ分析条件で定量した他は、実施例２４−３で示した手順と同様の方法で経時的なＥＰＯおよびＣＨＰの放出挙動を評価し、結果を図２７に示した。
本検討に用いたハイブリッドゲルからのＥＰＯ放出挙動は徐放性を有していた。また、ＣＨＰについて徐放性が観察されたとともに、その放出挙動はＥＰＯのそれとほぼ同様であった。実施例７において、ハイブリッドゲルから放出された種はインスリン・ＣＨＰ複合体のみであったこと、本検討において、ＥＰＯとＣＨＰの放出挙動がほぼ同様であったことから、ハイブリッドゲルからの薬物放出は、ナノゲルが放出されることに伴って生じることが示唆された。
ＳＥＣ分析条件
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０／２４８７／２４１４
カラム：Ｇ２０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社製）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：ＥＰＯについてはＵＶ検出（２８０ｎｍ）
ＣＨＰについては示唆屈折率（ＲＩ）検出
溶出液：１０ｍＭ  ＨＰ−β−ＣＤ含有ＰＢＳ
インジェクション容量：５０μＬ
〔実施例２８〕ＣＨＰを封入した化学架橋ＨＡ−ＡＭハイブリッドゲルへのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の封入特性および放出特性評価
（実施例２８−１）ＥＰＯの封入、および封入量の算出
表３０に示したサンプル２８−１および２８−２をそれぞれ２個ずつ、実施例２３で示した方法と同様の手順で各種凍結乾燥ハイブリッドゲルを調製し、それぞれマイクロチューブに入れた。
実施例２７−１で示した方法と同様の手順でＥＰＯを封入し、封入量を算出した。この結果を表３１に示した。
【表３０】
2008136536.tif 000032
【表３１】
2008136536.tif 000033
（実施例２８−２）ＥＰＯの放出挙動
実施例２８−１でＥＰＯを封入したハイブリッドゲルからのＥＰＯ放出挙動を実施例２７−２で示した手順と同様の方法で経時的なＥＰＯ放出挙動を評価し、結果を図２８に示した。
本検討に用いたハイブリッドゲルからのＥＰＯ放出挙動は徐放性を有していた。また、実施例６と同様に、ゲル密度（実施例２３で算出したサンプル２３−７および２３−８のゲル密度を参照）に依存してリリース速度が異なっていた。
〔実施例２９〕ナノゲルとＥＰＯの複合体共存下でＨＡ誘導体を化学架橋したハイブリッドゲルの調製
本比較例に使用した超純水は窒素バブリングしてから以下の検討に供した。
１００ｍＭ塩酸水溶液に５００ｍＭになるようにＴＥＡを溶解させた。超純水で１／５に希釈したところ溶液ｐＨは８．１であった。
実施例２１−１で合成したＨＡ−ＭＡ−１１および実施例２１−２で合成したＨＡ−ＤＴＴをそれぞれ別のマイクロチューブに秤取し、超純水を添加し、４℃で一晩静置して溶解させた。
ＤＴＴを５０ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解させた。
ＣＨＰを３０ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解させた。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）原薬溶液（中外製薬株式会社製）、前記ＣＨＰ溶液および超純水を混合することで、ＥＰＯポリペプチド濃度として４５０μｇ／ｍＬ、ＣＨＰ濃度１５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、３７℃で一晩静置した。実施例７に示したＳＥＣ分析条件においてＳＥＣ分析を実施したところ、フリーのＥＰＯ（保持時間７．１分）は検出されず、ＥＰＯ・ＣＨＰ複合体（保持時間５．６分）のみが検出され、系中のＥＰＯ全量がＣＨＰと複合体を形成していることが確認された。
各種ＨＡ誘導体溶液、ＥＰＯ・ＣＨＰ複合体溶液、超純水、ＤＴＴ溶液（サンプル２９−２のみ）、ＴＥＡ溶液を表３２に示した割合になるように混合した。最終容量は５０μｌとした。遠心操作により混合時に発生した気泡を除去し、３７℃で１６時間静置することによって化学架橋反応を行った。ここで調製したサンプルは実施例３０に供した。
【表３２】
2008136536.tif 000034
〔比較例４〕ＥＰＯ共存下でＨＡ誘導体を化学架橋したハイブリッドゲルの調製
エリスロポエチン（ＥＰＯ）原薬溶液（中外製薬株式会社製）に超純水を混合することで、ＥＰＯポリペプチド濃度として４５０μｇ／ｍＬになるように希釈した。
前記ＥＰＯ溶液を用いた他は、実施例２９に示した方法と同様の手順で表３３に示したハイブリッドゲルを調製し、実施例３０に供した。
【表３３】
2008136536.tif 000035
〔実施例３０〕ＥＰＯおよびナノゲル・ＥＰＯ複合体共存下で化学架橋により薬物封入したハイブリッドゲル中の薬物安定性評価
実施例２９および比較例４で調製したそれぞれのサンプルに２５ｍＭのＨＰ−β−ＣＤおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを２５０μｌ添加し、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション開始後、２時間、１０時間、２日、３日、５日、７日、１１日後に、２００μＬの上澄みを回収、新たに、５ｍＭのＨＰ−β−ＣＤおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを２００μＬ添加する操作を行った。回収した上澄み中のＥＰＯ濃度をＲＰ−ＨＰＬＣ（分析条件は以下に記載）および実施例２７−１で示したＳＥＣ分析条件で定量し、各測定時までにリリースされた累積のＥＰＯ量を算出した。ＲＰ−ＨＰＬＣとＳＥＣによる定量結果に有意な差は見られなかった。すべてのサンプルで７日後から１１日後まで間、ＥＰＯのリリースが止まっていた。仕込んだＥＰＯ量に対する１１日後までの累積リリース量をＥＰＯ回収率とし、その値（ＲＰ−ＨＰＬＣ定量値）を図２９に示した。
この結果、あらかじめＥＰＯをナノゲルと複合化させておくことで、ゲルから回収されたＥＰＯ量は有意に増加し、特にサンプル２９−１では仕込んだＥＰＯのほぼ全量が回収された。これは、ナノゲルに複合化したＥＰＯはフリーのＥＰＯと比較して、ＨＡ誘導体や架橋剤との反応性が著しく低下しているためと推察された。よって実施例２９で示した方法は、化学架橋ＨＡゲルに薬物共存下で化学架橋して薬物封入する場合に、不本意な副反応を回避するために有効な手法であると考えられた。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析条件
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９０／２４８７
カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００  Ｃ４（３．５μｍ）  ２．１ｍｍ×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
流速：０．７５ｍＬ／分
検出：  ＵＶ（２８０ｎｍ）
溶出液Ａ：  ０．１％ｗ／ｖＴＦＡ含有超純水
溶出液Ｂ：  ０．１％ｗ／ｖＴＦＡ含有アセトニトリル
溶出方法：  溶出液Ａ／溶出液Ｂ＝９０／１０から４０／６０のリニアーグラジエント
〔実施例３１〕ラットにおける薬物動態試験用各種ハイブリッドゲルの調製
表３４に示したサンプル３１−１、３１−２をそれぞれ１５個ずつ、サンプル３１−３を２７個、実施例２３に示した方法と同様の手順で調製し、ゲル密度を算出した。その結果を表３５に示した。
【表３４】
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【表３５】
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〔実施例３２〕薬物動態試験用各種ハイブリッドゲルへのＥＰＯ封入および封入量評価
実施例３１で調製したサンプル３１−１〜３のそれぞれの凍結乾燥ハイブリッドゲルについて、実施例２７−１で示した方法と同様の手順でＥＰＯを封入した。ＥＰＯを封入した各サンプルのなかから無作為に選択したそれぞれ３個について実施例２７−１で示した方法と同様の手順でゲルサンプル１個あたりに封入されたＥＰＯ量を算出した。その結果を表３６に示した。
【表３６】
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〔比較例５〕エリスロポエチン・ＣＨＰ複合体のラットにおける薬物動態試験
（比較例５−１）ＥＰＯ・ＣＨＰ複合体溶液およびＥＰＯ溶液の調製
ＣＨＰを１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）原薬溶液（中外製薬株式会社製）、前記ＣＨＰ溶液およびＰＢＳを混合することで、ＥＰＯポリペプチド濃度として２５μｇ／ｍＬ、ＣＨＰ濃度３ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、３７℃で一晩静置した。実施例７に示したＳＥＣ分析条件においてＳＥＣ分析を実施したところ、フリーのＥＰＯ（保持時間７．１分）は検出されず、ＥＰＯ・ＣＨＰ複合体（保持時間５．６分）のみが検出され、系中のＥＰＯ全量がＣＨＰと複合体を形成していることが確認された。
別に、ＥＰＯポリペプチド濃度として２５μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した。
（比較例５−２）薬物動態試験
表３７に示した用量で、比較例５−１で調製したＥＰＯ・ＣＨＰ複合体溶液およびＥＰＯ溶液を正常ラット（ＳＤ、７週齢、雄）の皮下に単回投与した。投与後、経時的にヘパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行った。得られた血液は血漿分離し、ＥＰＯ血漿中濃度をＥＬＩＳＡキットにて測定した。ＥＰＯの血漿中濃度推移（平均値）を図３０に示した。
この結果、ＥＰＯ・ＣＨＰ複合体とフリーのＥＰＯはほぼ同様の血漿中濃度推移を示し、ナノゲルと複合体を形成することによって有意な徐放性は観察されなかった。これは、皮下に投与されたＥＰＯ・ＣＨＰ複合体から生体成分（アルブミンなど）との置換により速やかにＥＰＯが放出されたと考えられ、ＣＨＰと複合化を形成することによってＥＰＯの皮下からの吸収過程や体内消失過程にほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。
【表３７】
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〔実施例３３〕ラットにおけるハイブリッドゲルからのエリスロポエチン徐放性評価
実施例３２でＥＰＯを封入したサンプルを表３８に示した用量で正常ラット（ＳＤ、７週齢、雄）の皮下に埋め込んだ。投与後、経時的にヘパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行った。得られた血液は血漿分離し、ＥＰＯ血漿中濃度をＥＬＩＳＡキットにて測定した。各種ハイブリッドゲル投与時のＥＰＯの血漿中濃度推移（平均値）および比較例５のＥＰＯ・ＣＨＰ複合体溶液投与時の血漿中濃度推移（平均値）を併せて図３１に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度−時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞）および平均滞留時間（ＭＲＴ））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｖｅｒ．５．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表３９に示した。
この結果、ハイブリッドゲルからのＥＰＯ放出挙動はｉｎ  ｖｉｖｏにおいても徐放性を有するものであり、その放出速度は架橋密度やゲルを架橋する反応の種類により制御可能なことが示唆された。
【表３８】
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【表３９】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１９】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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