【手続補正書】
【提出日】平成16年11月26日(2004.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
細菌細胞を乾燥させ、水分の進入を防止するために容器を密封することができ、これにより室温または冷蔵庫で数ヶ月または数年の保存が可能となることが知られている。Heckly（1961, Advances in Applied Microbiology, 3, pp1-76）は、フリーズドライおよび液体乾燥（liquid-drying）を、成功裏に細菌の長期保存に適用したことを記載している。また、細胞保存法としての液体状態からの乾燥（当該ケースでは、懸濁されたSalmonella ndoloを乾燥させ泡を生成するというもの）はAnnear, D. I., 1966 (Nature, 5050,761)に記載されている。かかる保存技術は、カルチャーコレクションに必須であり（概説としてMalik, K. A. & Claus, D., 1987, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 5, pp 137-166を参照）、そこでは、菌株がフリーズドライおよび液体乾燥によって保存および維持されている。別の乾燥戦略としては、限定されることなく、対流乾燥(Lievense, L. C. and van't Riet, K., 1994, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 51, pp71-89)、噴霧乾燥(Franks and Hatley, 1992, EP0520748)および生物の造粒（granulation of organisms）(Mueller, H., 1978, EP493761)が挙げられる。他の多くの技術が当業者に知られている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明にはグラム陰性およびグラム陽性の原核細胞（例えば細菌）の両方を用いることができる。好適な原核細胞の例としては、限定されることなく、エシェリキア属菌種、クレブシエラ属菌種、スタフィロコッカス属菌種およびシュードモナス属菌種が挙げられる。本発明で用いることができる、上記の各菌属内の非限定的な例としては、大腸菌、クレブシエラ属菌種、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、Streptomyces aureus、Streptococcus mutans、Streptococcus pneumoniaeおよびPseudomonas syringaeが挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
結果として、本方法は、以下の工程
ａ）乾燥非コンピテント細胞を提供する工程、
ｂ）該細胞をコンピテンシー溶液で再水和する工程、
ｃ）溶液のＤＮＡを混合液に加える工程、
ｄ）ＤＮＡを含む混合液のインキュベーション工程、
ｅ）当業者によく知られたさらなる形質転換手法
を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
上記のシードストックのバイアルを室温で解凍し、数回転到混和した。シードカルチャーのアリコット200μｌを、12.5μｇ/ｍlのテトラサイクリンを添加した100mlのLBブロス（10ｇ/ｌのトリプトン、5ｇ/ｌの酵母エキス、10ｇ/ｌのNaCl、pHはNaOHで7.5に調整）を含む500mlの三角フラスコ（Pyrex、商品番号1140/10）に移し、180rpmで振盪しながら37℃でインキュベートした。およそ16時間後、培養物は、OD600nm値1.13に達した。この培養物のアリコット2.5ｍｌを、100mlのＬＢブロス+12.5μｇ/ｍlのテトラサイクリンを含む1ｌのフラスコ（Pyrex、商品番号1140/14）を接種するのに用いた。フラスコを、250rpmで振盪しながら37℃で約3.5時間、のOD600nm値0.72になるまでインキュベートした。フラスコの内容物を50mlのアリコットずつ、事前に冷却した2本の遠心チューブ（Falcon、商品番号352070）にさらに分割した。細胞を含む遠心チューブは直ちに氷上に10分間静置した。細胞は、ローターアダプタ（Eppendorf、商品番号5804 775.007）で取り付けたF34-6-38型ローターを用いた5804R Eppendorf遠心分離機における、4000rpm、4℃での10分間の遠心分離によって回収した。遠心分離機、ローターおよびアダプタは、事前に+4℃に冷却した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
例2
以下の実験は、下記を例外として、例1と同様に行った。細胞は、ＯＤ600nm値0.8で採取した。保護剤への再懸濁後、細胞を、氷上で、事前に冷却した0．5ｍｌの遠心チューブ（Thermoquest Seg Ltd.、商品番号PC1007）に分注した。チューブのストッパーは、事前に切り取った。各チューブの下端を、次に、逆さにしたフリーズドライ用の栓（bung）（The West Company、1121, W1816、Laboratory Sales (UK) Ltdより部品番号700005で入手）の内孔に挿入し、こうしてチューブを垂直に保持した。事前に冷却したガラスバイアル（Schott Amphabel、336040111、Adelphi (Tubes) Ltdより注文番号VC005-20Cで入手）を逆さにし、遠心チューブ上に設置し、逆さにしたフリーズドライ用の栓に、中程度の位置まで押し込んだ。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
表2は、乾燥細胞の形質転換効率が、再水和中のコンピテンシー溶液での処置に左右されることを明白に示している。CaCl2を含有するコンピテンシー溶液で再水和した細胞は、代わりに例えば、水または生理食塩水（0.9％NaCl）中で再水和されたものより、極めて有意に高い形質転換効率を与えた。これは、乾燥前にそれをコンピテント化するために、細胞を塩化カルシウムで前処理するしないにかかわらず、正しいことである。換言すれば、もたらされる形質転換効率に関しては、乾燥コンピテント細胞は、非コンピテント細胞よりも利益はない。この結果は、WO 98/35018に記載の研究からは予測されなかったものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
表2：CaCl2で前処理されたまたは前処理されていない大腸菌JM109細胞の形質転換効率に対する、再水和液の組成の効果
【表２】
2004519223.tif 000001
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
上清をデカントし、残りの上清を全て除去するために、チューブを1分間逆さにした。ペレットをそれぞれ、+4℃に事前に冷却したショ糖ベースの保護剤（12％ショ糖）19.6ｍｌで再懸濁し、事前に冷却した50ｍｌの遠心チューブ（Falcon、商品番号352070）に移した。ローターアダプタ（Eppendorf、商品番号5804 775.007）で取付けたF34-6-38型ローターを用いた5804R Eppendorf遠心分離機での、6000rpm、4℃、12分の遠心分離により細胞を回収した。上清をデカントし、残りの上清を全て除去するために、チューブを1分間逆さにした。各チューブ中の細胞を、ショ糖ベースの保護剤2.7mlに再懸濁し、プールした。