【誤訳訂正書】
【提出日】平成15年8月26日(2003.8.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の２２位のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニット。
【請求項２】
２２位のアミノ酸置換がアルギニンである請求項１のミュータントαサブユニット。
【請求項３】
精製されている請求項１のミュータントαサブユニット。
【請求項４】
図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットの位置 11-21のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基における１以上のアミノ酸置換をさらに含む請求項１のミュータントαサブユニット。
【請求項５】
１以上のアミノ酸置換が図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の位置11, 13, 14, 16, 17及び20の中から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項４のミュータントαサブユニット。
【請求項６】
αサブユニットのβヘアピンL1ループ中での１以上のアミノ酸置換をさらに含む請求項１のミュータントαサブユニット.
【請求項７】
１以上の置換がアルギニン及びリシンからなる群から選ばれるアミノ酸である請求項４又は６のミュータントαサブユニット
【請求項８】
１以上の置換がαT11K, αQ13K, αE14K, αP16K, αF17R及びαQ20Kからなる群から選ばれる請求項４のヒトαサブユニット
【請求項９】
唯一の突然変異が図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の２２位のアミノ酸置換であるミュータントαサブユニット。
【請求項１０】
２２位の置換がアルギニンである請求項９のミュータントαサブユニット。
【請求項１１】
精製されている請求項９のミュータントαサブユニット。
【請求項１２】
図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の２２位のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニット及びβサブユニットを含み、ミュータントＴＳＨヘテロダイマーの生物活性が野生型ＴＳＨヘテロダイマーの生物活性よりも大きい、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項１３】
２２位のアミノ酸置換がアルギニンである請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項１４】
精製されている請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項１５】
βサブユニットがヒトβサブユニットである請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項１６】
図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットの位置 11-21のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基における１以上のアミノ酸置換をさらに含む請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項１７】
１以上のアミノ酸置換がαサブユニットのアミノ酸配列の位置11, 13, 14, 16, 17及び20の中から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項１８】
αサブユニットのβヘアピンL1ループ中での１以上のアミノ酸置換をさらに含む請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項１９】
１以上の置換がアルギニン及びリシンからなる群から選ばれるアミノ酸である請求項１６又は１８のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２０】
１以上の置換がαT11K, αQ13K, αE14K, αP16K, αF17R及びαQ20Kからなる群から選ばれる請求項１６のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２１】
唯一の突然変異が図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の２２位のアミノ酸置換であるミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２２】
２２位の置換がアルギニンである請求項２１のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２３】
精製されている請求項２１のミュータントヘテロダイマー。
【請求項２４】
(a)ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシル末端伸長ペプチドのアミノ末端にそのカルボキシル末端でペプチド結合により結合したTSH βサブユニット; 及び
(b) αサブユニットを含み、少なくともTSH βサブユニット又はTSH αサブユニットが少なくとも１つのアミノ酸置換を含み及び、ミュータントＴＳＨヘテロダイマーの生物活性が野生型ＴＳＨヘテロダイマーの生物活性よりも大きい、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２５】
少なくとも１つのアミノ酸置換が、図２（配列番号:1）に示されるヒトαサブユニットのアミノ酸配列の位置 11-21の中から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２６】
少なくとも１つのアミノ酸置換が、図２（配列番号:２）に示されるTSH βサブユニットのアミノ酸配列の位置 58-69の中から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２７】
少なくとも１つのアミノ酸置換がβI58R, βE63R及びβL69Rからなる群から選ばれる請求項２６のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２８】
ミュータントヒトαサブユニットは図２（配列番号:1）に示されるヒトαサブユニットの位置 11-22のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基における少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ミュータントヒトTSH βサブユニットは図３（配列番号:２）に示されるヒトTSH βサブユニットの位置 58-69のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ミュータントヒトαサブユニット及びミュータントヒトTSH βミュータントサブユニットを含む請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項２９】
ヒトTSHヘテロダイマーのミュータントである請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項３０】
少なくとも１つのサブユニットがそのアミノ酸配列中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、及び前記ＴＳＨアナローグの生物活性が野生型ＴＳＨβサブユニットに共有結合した野生型αサブユニットを含むＴＳＨアナローグの生物活性よりも大きいTSH βサブユニットに共有結合しているαサブユニットを含むTSHアナローグ。
【請求項３１】
少なくとも１つのアミノ酸置換が図２（配列番号:1）に示されるαサブユニットの位置 11-22のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項３０のＴＳＨアナローグ。
【請求項３２】
少なくとも１つのアミノ酸置換が、図３（配列番号:２）に示されるヒトTSH βサブユニットのアミノ酸配列の位置 58-69の中から選ばれるアミノ酸残基中にある請求項３０のＴＳＨアナローグ。
【請求項３３】
αサブユニット及びβTSHサブユニットの両方が１以上のアミノ酸置換を含む請求項３０のＴＳＨアナローグ。
【請求項３４】
αサブユニット及びβTSHサブユニットの両方がL1及びL3サブユニット中に１以上のアミノ酸置換を含む請求項３０のＴＳＨアナローグ。
【請求項３５】
αサブユニットが図２（配列番号:1）に示されるヒトαサブユニットの位置 11-22のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸残基中の少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、及びTSH βサブユニットは図３（配列番号:２）に示されるヒトTSH βサブユニットの位置 58-69のアミノ酸配列の中から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する請求項３３のＴＳＨアナローグ。
【請求項３６】
TSH βサブユニットがヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシル末端伸長ペプチドのアミノ末端にカルボキシル末端でペプチド結合により結合され、カルボキシル末端伸長ペプチドのカルボキシル末端がαサブユニットのアミノ末端にペプチド結合により結合されている請求項３０のＴＳＨアナローグ。
【請求項３７】
TSH βサブユニットがαサブユニットのアミノ末端にカルボキシル末端でペプチド結合により結合されている請求項３０のＴＳＨアナローグ。
【請求項３８】
ミュータントＴＳＨヘテロダイマーのin vivoにおける循環中のホルモンの半減期が野生型ＴＳＨより大きい請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー。
【請求項３９】
ミュータントＴＳＨアナローグのin vivoにおける循環中のホルモンの半減期が野生型ＴＳＨより大きい請求項３０のミュータントＴＳＨアナローグ。
【請求項４０】
請求項１のミュータントαサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４１】
αサブユニットがペプチド結合によりβサブユニットに結合している請求項３０のＴＳＨアナローグをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項４２】
そのような治療又は予防が要望されている被験者に甲状腺機能低下症を治療又は予防するための十分量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーを投与することを含む甲状腺機能低下症を治療又は予防する方法。
【請求項４３】
そのような治療又は予防が要望されている被験者に甲状腺機能低下症を治療又は予防するための十分量の請求項３０のＴＳＨアナローグを投与することを含む甲状腺機能低下症を治療又は予防する方法。
【請求項４４】
そのような治療又は予防が要望されている被験者にヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーを投与し、次いで前記被験者に甲状腺癌を治療するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与することを含む甲状腺癌を治療する方法。
【請求項４５】
そのような治療又は予防が要望されている被験者にヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項３０のＴＳＨアナローグを投与し、次いで前記被験者に甲状腺癌を治療するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与することを含む甲状腺癌を治療する方法。
【請求項４６】
被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー及び甲状腺癌を診断するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与すること；および前記放射標識されたヨウ素を検出することを含み、放射標識されたヨウ素の取り込みにおける甲状腺疾患を有しない被験者に対する増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す、甲状腺癌の診断方法。
【請求項４７】
非癌性甲状腺細胞を欠く被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー及び甲状腺癌を診断するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与すること；および前記放射標識されたヨウ素を検出することを含み、放射標識されたヨウ素の取り込みにおける増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す、甲状腺癌の診断方法。
【請求項４８】
第１の被験者にin vivoでサイログロブリンの放出を刺激するのに十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーを投与し及び前記第１の被験者のサイログロブリンのレベルを測定することを含み、甲状腺癌を有しない第２の被験者のサンプル中のサイログロブリンレベルに対するサイログロブリンレベルの増加は前記第１の被験者が甲状腺癌を有することを示す甲状腺癌の診断方法。
【請求項４９】
被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項３０のＴＳＨアナローグ及び甲状腺癌を診断するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与すること；および前記放射標識されたヨウ素を検出することを含み、放射標識されたヨウ素の取り込みにおける甲状腺疾患を有しない被験者に対する増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す、甲状腺癌の診断方法。
【請求項５０】
非癌性甲状腺細胞を欠く被験者に甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項３０のミュータントＴＳＨヘテロダイマー及び甲状腺癌を診断するのに十分な量の放射標識されたヨウ素を投与すること；および前記放射標識されたヨウ素を検出することを含み、放射標識されたヨウ素の取り込みにおける増加が、被験者が甲状腺癌を有することを示す、甲状腺癌の診断方法。
【請求項５１】
第１の被験者にin vivoでサイログロブリンの放出を刺激するのに十分な量の請求項３０のＴＳＨアナローグを投与し及び前記第１の被験者のサイログロブリンのレベルを測定することを含み、甲状腺癌を有しない第２の被験者のサンプル中のサイログロブリンレベルに対するサイログロブリンレベルの増加は前記第１の被験者が甲状腺癌を有することを示す甲状腺癌の診断方法。
【請求項５２】
培養細胞又はＴＳＨ受容体を含む単離された膜を第１の被験者からの抗体を推定的に含むサンプル及び診断的有効量の放射標識された請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーと接触させること；及び放射標識されたミュータントＴＳＨの培養細胞又は単離された膜に対する結合を測定することを含み、前記サンプルの非存在下または前記疾患又は障害を有しない第２の被験者のサンプルの存在下での結合に対する放射標識されたＴＳＨの結合の減少が前記第１の被験者における前記の疾患又は障害の存在を示す、ＴＳＨ受容体に対する抗体の存在により特徴付けられる疾患又は障害の診断又はスクリーニング方法。
【請求項５３】
疾患又は障害がグレーヴズ病である請求項５２の方法。
【請求項５４】
培養細胞又はＴＳＨ受容体を含む単離された膜を第１の被験者からの抗体を推定的に含むサンプル及び診断的有効量の放射標識された請求項３０のＴＳＨアナローグと接触させること；及び放射標識されたミュータントＴＳＨの培養細胞又は単離された膜に対する結合を測定することを含み、前記サンプルの非存在下または前記疾患又は障害を有しない第２の被験者のサンプルの存在下での結合に対する放射標識されたＴＳＨの結合の減少が前記第１の被験者における前記の疾患又は障害の存在を示す、ＴＳＨ受容体に対する抗体の存在により特徴付けられる疾患又は障害の診断又はスクリーニング方法。
【請求項５５】
疾患又は障害がグレーヴズ病である請求項５４の方法。
【請求項５６】
請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマーの治療的有効量；及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５７】
請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマーの治療的有効量；及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５８】
請求項３０のＴＳＨアナローグの治療的有効量；及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５９】
甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項１２のミュータントＴＳＨヘテロダイマー；及び薬学的に許容される担体を含む診断的組成物。
【請求項６０】
甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー；及び薬学的に許容される担体を含む診断的組成物。
【請求項６１】
甲状腺癌細胞によるヨウ素取り込みを刺激するのに十分な量の請求項３０のＴＳＨアナローグ；及び薬学的に許容される担体を含む診断的組成物。
【請求項６２】
請求項１２または２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー または請求項３０のＴＳＨアナローグの治療的有効量を１以上の容器に含むキット。
【請求項６３】
請求項１２または２４のミュータントＴＳＨヘテロダイマー または請求項３０のＴＳＨアナローグの診断的有効量を１以上の容器に含むキット。
【請求項６４】
単離された請求項４０又は４１の核酸。
【請求項６５】
ＴＳＨが精製されている請求項５６，５７または５８の組成物。
【請求項６６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異をβヘアピンループ構造に含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリーをもたらすヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７】
蛋白質がヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(CG)βサブユニットである請求項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 1-37からなる群から選ばれる位置でのL1βヘアピンループ中にある請求項６７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S1B, P4B, L5B, P7B, R8B, R10B, P11B, I12B, N13B, A14B, T15B, L16B, A17B, V18B, G22B, P24B, V25B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, I33B, A35B, G36B及びY37B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む、請求項６８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 58-87からなる群から選ばれる位置でのL3βヘアピンループ中にある請求項６７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、N58B, Y59B, V62B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, G79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む、請求項７０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７２】
サブユニットがもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項６７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７３】
蛋白質がヒト黄体形成ホルモン(LH)βサブユニットである請求項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 1-33からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項７３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、W8B, P11B, I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A17B, V18B, G22B, P24B, V25B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, 及び I33B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 58-87からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項７３のヒト 糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、N58B, Y59B, V62B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, G79B, V79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７８】
サブユニットがもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項７３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項７９】
蛋白質がヒト卵胞刺激ホルモン (FSH)βサブユニットである請求項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項８０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 4-27からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項７９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項８１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L5B, T6B, N7B, I8B, T9B, I10B, A11B, I12B, F19B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T26B, 及び W27B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項８２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 65-81からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項７９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項８３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A65B, A68B, S70B, L71B, Y72B, T73B, Y74B, P75B, V76B, A77B, T78B, 及び Q79B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項８４】
サブユニットがもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項７９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項８５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異をβヘアピンループ構造に含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質をもたらすヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項８６】
蛋白質がヒト血小板由来増殖因子-Aモノマーである請求項８５のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項８７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 11-36からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項８６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項８８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E18B 及び D25B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項８９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K11Z, R13Z, 及び R21Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K11U, R13U, E18U, R21U, 及び D25U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T12Z, T14Z, V15Z, I16Z, Y17Z, I19Z, P20Z, S22Z, Q23Z, V24Z, P26Z, T27Z, S28Z, A29Z, N30Z, F31Z, L32Z, I33Z, W34Z, P35Z, P36Z, T12B, T14B, V15B, I16B, Y17B, I19B, P20B, S22B, Q23B, V24B, P26B, T27B, S28B, A29B, N30B, F31B, L32B, I33B, W34B, P35B, 及び P36B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項８７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 58-88からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項８６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E70B, E80B, E86B及びE87B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項９２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R58Z, H60Z, H61Z, R62Z, K65Z, K68Z, R73Z, K74Z, K75Z, K77Z, K79Z, R84Z, 及び H88Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項９２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R58U, H60U, H61U, R62U, K65U, K68U, E70U, R73U, K74U, K75U, K77U, K79U, E80U, R84U, E86U, E87U, 及び H88U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項９２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、V59Z, S63Z, V64Z, V66Z, A67Z, V69Z, Y71Z, V72Z, P76Z, L78Z, V81Z, Q82Z, V83Z, L85Z, V59B, S63B, V64B, V66B, A67B, V69B, Y71B, V72B, P76B, L78B, V81B, Q82B, V83B, 及び L85B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項９２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９７】
ヒト血小板由来増殖因子-Aモノマーがもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項８６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９８】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピンループ構造と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項８６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項９９】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-9, 38-57, 及び 89-125からなる群から選ばれる位置である請求項９８のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１００】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、S1J, I2J, E3J, E4J, A5J, V6J, P7J, A8J, V9J, V38J, E39J, V40J, K41J, R42J, C43J, T44J, G45J, C46J, C47J, N48J, T49J, S50J, S51J, V52J, K53JJ, C54J, Q55J, P56J, S57J, L89J, E90J, C91J, A92J, C93J, A94J, T95J, T96J, S97J, L98J, N99J, P100J, D101J, Y102J, R103J, E104J, E105J, D106J, T107J, G108J, R109J, P110J, R111J, E112J, S113J, G114J, K115J, K116J, R117J, K118,J, R119J, K120J, R121J, L122J, K123J, P124J, 及び T125J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項９８のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０１】
前記蛋白質はヒト血小板由来増殖因子-Bモノマーである請求項８５のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 17-42からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１０１のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E21B, E24B, 及び D31B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１０２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K17Z, R19Z, R27Z, R28Z, 及び R32Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１０２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K17U, R19U, E21U, E24U, R27U, R28U, D31U, 及び R32U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１０２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T18Z, T20Z, V22Z, F23Z, I25Z, S26Z, L29Z, I30Z, T33Z, N34Z, A35Z, N36Z, F37Z, L38Z, V39Z, W40Z, P41Z, P42Z, T18B, T20B, V22B, F23B, I25B, S26B, L29B, I30B, T33B, N34B, A35B, N36B, F37B, L38B, V39B, W40B, P41B, 及び P42B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１０２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 64-94からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１０１のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E76B, E92B, 及び D93B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１０７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１０９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R68Z, R73Z, K74Z, R79Z, K80Z, K81Z, K85Z, K86Z, 及び H94Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１０７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R68U, R73U, K74U, E76U, R79U, K80U, K81U, K85U, K86U, E92U, D93U, 及び H94U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１０７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Q64Z, V65Z, Q66Z, L67Z, P69Z, V70Z, Q71Z, V72Z, I75Z, I77Z, V78Z, P82Z, I83Z, F84Z, A87Z, T88Z, V89Z, T90Z, L91Z, Q64B, V65B, Q66B, L67B, P69B, V70B, Q71B, V72B, I75B, I77B, V78B, P82B, I83B, F84B, A87B, T88B, V89B, T90B, 及び L91B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１０７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１２】
ヒト血小板由来増殖因子-Bモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１０１のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１３】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１０１のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１４】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-15, 44-63, 及び 95-160からなる群から選ばれる位置である請求項１１３のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１５】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、S1J, L2J, G3J, S4J, L5J, T6J, I7J, A8J, E9J, P10J, A11J, M12J, I13J, A14J, E15J, V44J, E45J, V46J, Q47J, R48J, C49J, S50J, G51J, C52J, C53J, N54J, N55J, R56J, N57J, V58J, Q59J, C60J, R61J, P62J, T63J, L95J, A96J, C97J, K98J, C99J, E100J, T101J, V102J, A103J, A104J, A105J, R106J, P107J, V108J, T109J, R110J, S111J, P112J, G113J, G114J, S115J, Q116J, E117J, Q118J, R119J, A120J, K121J, T122J, P123J, Q124J, T125J, R126J, V127J, T128J, I129J, R130J, T131J, V132J, R133J, V134J, R135J, R136J, P137J, P138J, K139J, G140J, K141J, H142J, R143J, K144J, F145J, K146J, H147J, T148J, H149J, D150J, K151J, T152J, A153J, L154J, K155J, E156J, T157J, L158J, G159J, 及び A160J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１１３のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１６】
前記蛋白質はヒト血管内皮成長因子モノマーである請求項８５のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 27-50からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１１６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E30B, D34B, E38B, D41B, E42B, 及び E44B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１１７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１１９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H27Z 及び K48Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１１７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H27U, E30U, D34U, E38U, D41U, E42U, E44U, 及び K48U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１１７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P28Z, I29Z, T31Z, L32Z, V33Z, I35Z, F36Z, Q37Z, Y39Z, P40Z, I43Z, Y45Z, I46Z, F47Z, P49Z, S50Z, P28B, I29B, T31B, L32B, V33B, I35B, F36B, Q37B, Y39B, P40B, I43B, Y45B, I46B, F47B, P49B, 及び S50B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１１７のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 73-99からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１１６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E73B 及び E93B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１２２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R82Z, K84Z, H86Z, H90Z, 及び H99Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１２２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E73U, R82U, K84U, H86U, H90U, E93B, 及び H99U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１２２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S74Z, N75Z, I76Z, T77Z, M78Z, Q79Z, I80Z, M81Z, I83Z, P85Z, Q87Z, G88Z, Q89Z, I91Z, G92Z, M94Z, S95Z, F96Z, L97Z, Q98Z, S74B, N75B, I76B, T77B, M78B, Q79B, I80B, M81B, I83B, P85B, Q87B, G88B, Q89B, I91B, G92B, M94B, S95B, F96B, L97B, 及び Q98B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１２２のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２７】
ヒト血管内皮成長因子モノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１１６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２８】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１１６のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１２９】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-25, 51-72, 及び 100-189からなる群から選ばれる位置である請求項１２８のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１３０】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, P2J, M3J, A4J, E5J, G6J, G7J, G8J, Q9J, N10J, H11J, H12J, E13J, V14J, V15J, K16J, F17J, M18J, D19J, V20J, Y21J, Q22J, R23J, S24J, Y25J, V52J, P53J, L54J, M55J, R56J, C57J, G58J, G59J, C60J, C61J, N62J, D63J, E64J, G65J, L66J, E67J, C68J, V69J, P70J, T71J, E72J, N100J, K101J, C102J, E103J, C104J, R105J, P106J, K107J, K108J, D109J, R110J, A111J, R112J, Q113J, E114J, K115J, K116J, S117J, V118J, R119J, G120J, K121J, G122J, K123J, G124J, Q125J, K126J, R127J, K128J, R129J, K130J, K131J, S132J, R133J, Y134J, K135J, S136J, W137J, S138J, V139J, P140J, C141J, G142J, P143J, C144J, S145J, E146J, R147J, R148J, K149J, H150J, L151J, F152J, V153J, Q154J, D155J, P156J, Q157J, T158J, C159J, K160J, C161J, S162J, C163J, K164J, N165J, T166J, D167J, S168J, R169J, C170J, K171J, A172J, R173J, Q174J, L175J, E176J, L177J, N178J, E179J, R180J, T181J, C182J, R183J, C184J, D185J, K186J, P187J, R188J, 及び R189J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１２９のヒト血小板由来増殖因子ファミリー蛋白質。
【請求項１３１】
βヘアピンループ構造に少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異を含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質をもたらすヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３２】
蛋白質はヒト神経成長因子モノマーである請求項１３１のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 16-57からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１３２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D16B, D24B, D30B, E35B, E41B, E55B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１３３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K25Z, K32Z, K34Z, K50Z, 及び K57Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１３３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D16U, D24U, K25U, D30U, K32U, K34U, E35U, E41U, K50U, E55U, 及び K57U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１３３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S17Z, V18Z, S19Z, V20Z, W21Z, V22Z, G23Z, T26Z, T27Z, A28Z, T29Z, I31Z, G33Z, V36Z, M37Z, V38Z, L39Z, G40Z, V42Z, N43Z, N44Z, I45Z, N46Z, S47Z, V48Z, F49Z, Q51Z, Y52Z, F53Z, F54Z, T56Z, S17B, V18B, S19B, V20B, W21B, V22B, G23B, T26B, T27B, A28B, T29B, I31B, G33B, V36B, M37B, V38B, L39B, G40B, V42B, N43B, N44B, I45B, N46B, S47B, V48B, F49B, Q51B, Y52B, F53B, F54B, 及び T56B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１３３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 81-107からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１３２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１３９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D93B 及び D105B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１３８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H84Z, K88Z, K95Z, R100Z, 及び R103Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１３８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H84U, K88U, D93U, K95U, R100U, R103U, 及び D105U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１３８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T81Z, T82Z, T83Z, T85Z, F86Z, V87Z, A89Z, M90Z, L91Z, T92Z, G94Z, Q96Z, A97Z, A98Z, W99Z, F101Z, I102Z, I104Z, T106Z, A107Z, T81B, T82B, T83B, T85B, F86B, V87B, A89B, M90B, L91B, T92B, G94B, Q96B, A97B, A98B, W99B, F101B, I102B, I104B, T106B, 及び A107B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１３８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４３】
ヒトニュートロフィンモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１３２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４４】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１３２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４５】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-14, 59-79, 及び 109-120からなる群から選ばれる位置である請求項１４４のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、S1J, S2J, S3J, H4J, P5J, I6J, F7J, H8J, R9J, G10J, E11J, D12J, S13J, V14J, R59J, D60J, P61J, N62J, P63J, V64J, D65J, S66J, G67J, C68J, R69J, G70J, I71J, D72J, S73J, K74J, H75J, W76J, N77J, S78J, Y79J, V109J, C110J, V111J, L112J, S113J, R114J, K115J, A116J, V117J, R118J, R119J, 及び A120J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１４５のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４７】
蛋白質がヒト脳由来成長因子モノマーである請求項１３１のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 14-57からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１４７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１４９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D14B, E18B, D24B, D30B, E40B, 及び E55B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１４８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K25Z, K26Z, K41Z, K46Z, K50Z, 及び K57Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１４８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D14U, E18U, D24U, K25U, K26U, D30U, E40U, K41U, K46U, K50U, E55U, 及び K57U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１４８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S15Z, I16Z, S17Z, W19Z, V20Z, T21Z, A22Z, A23Z, T27Z, A28Z, V29Z, M31Z, S32Z, G33Z, G34Z, T35Z, V36Z, T37Z, V38Z, L39Z, V42Z, S43Z, P44Z, V45Z, G47Z, Q48Z, L49Z, Q51Z, Y52Z, F53Z, Y54Z, T56Z, S15B, I16B, S17B, W19B, V20B, T21B, A22B, A23B, T27B, A28B, V29B, M31B, S32B, G33B, G34B, T35B, V36B, T37B, V38B, L39B, V42B, S43B, P44B, V45B, G47B, Q48B, L49B, Q51B, Y52B, F53B, Y54B, 及び T56B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１４８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置81-108からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１４７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D93B, 及び D106B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１５３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R81Z, R88Z, K95Z, K96Z, R97Z, R101Z, R104Z, 及び D106B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１５３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R81U, R88U, D93B, K95U, K96U, R97U, R101U, R104Z, 及び D106U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１５３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T82Z, T83Z, Q84Z, S85Z, Y86Z, V87Z, A89Z, M90Z, L91Z, T92Z, S94Z, I98Z, G99Z, W100Z, F102Z, I103Z, I105Z, T107Z, S108Z, C109Z, V110Z, T82B, T83B, Q84B, S85B, Y86B, V87B, A89B, M90B, L91B, T92B, S94B, I98B, G99B, W100B, F102B, I103B, I105B, T107B, S108B, C109B, 及び V110B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１５３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５８】
ヒトニュートロフィンファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１４７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１５９】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１４７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６０】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-12, 59-79, 及び 110-119からなる群から選ばれる位置である請求項１５９のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、H1J, S2J, D3J, P4J, A5J, R6J, R7J, G8J, E9J, L10J, S11J, V12J, N59J, P60J, M61J, G62J, Y63J, T64J, K65J, E66J, G67J, C68J, R69J, G70J, I71J, D72J, K73J, R74J, H75J, W76J, N77J, S78J, Q79J, V110J, C111J, I112J, L113J, T114J, I115J, K116J, R117J, G118J, 及び E119J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１６０のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６２】
蛋白質はヒトニューロトロフィン-3モノマーである請求項１３１のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置15-56からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１６２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D15B, E17B, D23B, D29B, E40B, 及び E54B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K24Z, R31Z, H33Z, K43Z, K49Z, 及び R56Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D15U, E17U, D23U, K24U, D29U, R31U, E40U, K43U, K49U, E54U, 及び R56U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S16Z, S18Z, L19Z, W20Z, V21Z, T22Z, S25Z, S26Z, A27Z, I28Z, I30Z, G32Z, Q34Z, V35Z, T36Z, V37Z, L38Z, G39Z, I41Z, G42Z, T44Z, N45Z, S46Z, P47Z, V48Z, Q50Z, Y51Z, F52Z, Y53Z, T55Z, R56Z, S16B, S18B, L19B, W20B, V21B, T22B, S25B, S26B, A27B, I28B, I30B, G32B, Q34B, V35B, T36B, V37B, L38B, G39B, I41B, G42B, T44B, N45B, S46B, P47B, V48B, Q50B, Y51B, F52B, Y53B, T55B, 及び R56B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１６３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置80-107からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１６２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１６９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E92B, 及び D105B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１６８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K80Z, R87Z, K95Z, R100Z, 及び R103Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１６８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K80U, R87U, E92U, K95U, R100U, R103U, 及び D105U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１６８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T81Z, S82Z, Q83Z, T84Z, Y85Z, V86Z, A88Z, S89Z, L90Z, T91Z, N93Z, N94Z, L96Z, V97Z, G98Z, W99Z, W101Z, I102Z, I104Z, T106Z, S107Z, T81B, S82B, Q83B, T84B, Y85B, V86B, A88B, S89B, L90B, T91B, N93B, N94B, L96B, V97B, G98B, W99B, W101B, I102B, I104B, T106B, 及び S107B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１６８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７３】
ヒトニュートロフィンファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１６２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７４】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１６２のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７５】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-13, 58-78, 及び 109-119からなる群から選ばれる位置である請求項１７４のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、Y1J, A2J, E3J, H4J, K5J, S6J, H7J, R8J, G9J, E10J, Y11J, S12J, V13J, K58J, E59J, A60J, R61J, P62J, V63J, K64J, N65J, G66J, C67J, R68J, G69J, I70J, D71J, D72J, R73J, H74J, W75J, N76J, S77J, Q78J, V109J, C110J, A111J, L112J, S113J, R114J, K115J, I116J, G117J, R118J, 及び T119J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１７５のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７７】
蛋白質はヒトニューロトロフィン-4モノマーである請求項１３１のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置18-60からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１７７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１７９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D18B, D26B, D32B, E37B, E39B, E43B, 及び E58B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R27Z, R28Z, R34Z, R36Z, R53Z, 及び R60Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D18U, D26U, R27U, R28U, D32U, R34U, R36U, E37U, E39U, E43U, R53U, E58U, 及び R60U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A19Z, V20Z, S21Z, G22Z, W23Z, V24Z, T25Z, T29Z, A30Z, V31Z, L33Z, G35Z, V38Z, V40Z, L41Z, G42Z, V44Z, P45Z, A46Z, A47Z, G48Z, G49Z, S50Z, P51Z, L52Z, Q54Z, Y55Z, F56Z, F57Z, T59Z, A19B, V20B, S21B, G22B, W23B, V24B, T25B, T29B, A30B, V31B, L33B, G35B, V38B, V40B, L41B, G42B, V44B, P45B, A46B, A47B, G48B, G49B, S50B, P51B, L52B, Q54B, Y55B, F56B, F57B, 及び T59B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１７８のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置91-118からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１７７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D103B 及び D116B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１８３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K91Z, K93Z, R98Z, R107Z, R111Z, 及び R114Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１８３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K91U, K93U, R98U, D103U, R107U, R111U, R114U, 及び D116U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１８３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A92Z, Q94Z, S95Z, Y96Z, V97Z, A99Z, L100Z, T101Z, A102Z, A104Z, Q105Z, G106Z, V108Z, G109Z, W110Z, W112Z, I113Z, I115Z, T117Z, A118Z, A92B, Q94B, S95B, Y96B, V97B, A99B, L100B, T101B, A102B, A104B, Q105B, G106B, V108B, G109B, W110B, W112B, I113B, I115B, T117B, 及び A118B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１８３のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８８】
ヒトニュートロフィンファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１７７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１８９】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１７７のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１９０】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-16, 62-89, 及び 120-130からなる群から選ばれる位置である請求項１８９のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１９１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、G1J, V2J, S3J, E4J, T5J, A6J, P7J, A8J, S9J, R10J, R11J, G12J, E13J, L14J, A15J, V16J, K62J, A63J, D64J, N65J, A66J, E67J, E68J, G69J, G70J, P71J, G72J, A73J, G74J, G75J, G76J, G77J, C78J, R79J, G80J, V81J, D82J, R83J, R84J, H85J, W86J, V87J, S88J, E89J, V120J, C121J, T122J, L123J, L124J, S125J, R126J, T127J, G128J, R129J, 及び A130J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトニュートロフィンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１９０のヒトニュートロフィンファミリー蛋白質。
【請求項１９２】
βヘアピンループ構造に少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異を含み、前記突然変異が増大した生物活性を有する前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質をもたらすヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項１９３】
蛋白質はヒトトランスフォーミング成長因子β１モノマーである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項１９４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置 21-40からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項１９３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項１９５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23B, D27B, 及び E35B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項１９６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR25Z, K26Z, K31Z, H34Z, K37Z, 及び H40Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項１９７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23U, R25U, K26U, D27U, K31U, H34U, E35U, K37U, 及び H40U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項１９８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, I22Z, F24Z, L28Z, G29Z, W30Z, W32Z, I33Z, P36Z, G38Z, Y39Z, Y21B, I22B, F24B, L28B, G29B, W30B, W32B, I33B, P36B, G38B, 及び Y39B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項１９９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置82-102からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項１９３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２００】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E84B 及び E99B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項１９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR94Z, K95Z, 及び K97Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項１９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E84U, R94U, K95U, K97U, 及び E99U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項１９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A82Z, L83Z, P85Z, L86Z, P87Z, I88Z, V89Z, Y90Z, Y91Z, V92Z, G93Z, P96Z, V98Z, Q100Z, L101Z, S102Z, A82B, L83B, P85B, L86B, P87B, I88B, V89B, Y90B, Y91B, V92B, G93B, P96B, V98B, Q100B, L101B, 及び S102B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項１９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０４】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項１９３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０５】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項１９３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20, 41-81, 及び 103-112からなる群から選ばれる位置である請求項２０５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, L2J, D3J, T4J, N5J, Y6J, C7J, F8J, S9J, S10J, T11J, E12J, K13J, N14J, C15J, C16J, V17J, R18J, Q19J, L20J, A41J, N42J, F43J, C44J, L45J, G46J, P47J, C48J, P49J, Y50J, I51J, W52J, S53J, L54J, D55J, T56J, Q57J, Y58J, S59J, K60J, V61J, L62J, A63J, L64J, Y65J, N66J, Q67J, H68J, N69J, P70J, G71J, A72J, S73J, A74J, A75J, P76J, C77J, C78J, V79J, P80J, Q81J, N103J, M104J, I105J, V106J, R107J, S108J, C109J, K110J, C111J, 及び S112J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２０６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０８】
蛋白質はヒトヒトトランスフォーミング成長因子β２モノマーである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２０９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-40からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23B, D27B, 及び E35B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK25Z, R26Z, K31Z, H34Z, E35Z, 及び K37Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23U, K25U, R26U, D27U, K31U, H34U, 及び K37U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, I22Z, F24Z, L28Z, G29Z, W30Z, W32Z, I33Z, P36Z, G38Z, Y39Z, N40Z, Y21B, I22B, F24B, L28B, G29B, W30B, W32B, I33B, P36B, G38B, Y39B, 及び N40B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置82-102からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82B, E84B, 及び E99B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK94Z 及び K97Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82U, E84U, K94U, K97U, 及び E99U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L83Z, P85Z, L86Z, T87Z, I88Z, L89Z, Y90Z, Y91Z, I92Z, G93Z, T95Z, P96Z, I98Z, Q100Z, L101Z, S102Z, L83B, P85B, L86B, T87B, I88B, L89B, Y90B, Y91B, I92B, G93B, T95B, P96B, I98B, Q100B, L101B, 及び S102B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２１９】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２０】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20, 41-81及び103-112からなる群から選ばれる位置である請求項２２０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, L2J, D3J, A4J, A5J, Y6J, C7J, F8J, R9J, N10J, V11J, Q12J, D13J, N14J, C15J, C16J, L17J, R18J, P19J, L20J, A41J, N42J, F43J, C44J, A45J, G46J, A47J, C48J, P49J, Y50J, L51J, W52J, S53J, S54J, D55J, T56J, Q57J, H58J, S59J, R60J, V61J, L62J, S63J, L64J, Y65J, N66J, T67J, I68J, N69J, P70J, E71J, A72J, S73J, A74J, S75J, P76J, C77J, C78J, V79J, S80J, Q81J, N103J, M104J, I105J, V106J, K107J, S108J, C109J, K110J, C111J, 及び S112J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２２１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２３】
蛋白質はヒトトランスフォーミング成長因子β３モノマーである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-40からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23B, D27B, 及び E35B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２２４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR25Z, K31Z, H34Z, 及び K37Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２２４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D23U, R25U, D27U, K31U, H34U, E35U, 及び K37U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２２４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, I22Z, F24Z, Q26Z, L28Z, G29Z, W30Z, W32Z, V33Z, P36Z, G38Z, Y39Z, Y40Z, Y21B, I22B, F24B, Q26B, L28B, G29B, W30B, W32B, V33B, P36B, G38B, Y39B, 及び Y40B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２２４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２２９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置82-102からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82B, E84B, 及び E99B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR94Z 及び K97Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D82U, E84U, R94U, K97U, 及び E99U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L83Z, P85Z, L86Z, T87Z, I88Z, L89Z, Y90Z, Y91Z, V92Z, G93Z, T95Z, P96Z, V98Z, Q100Z, L101Z, S102Z, L83B, P85B, L86B, T87B, I88B, L89B, Y90B, Y91B, V92B, G93B, T95B, P96B, V98B, Q100B, L101B, 及び S102B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３４】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３５】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20, 41-81, 及び 103-112からなる群から選ばれる位置である請求項２３５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、A1J, L2J, D3J, T4J, N5J, Y6J, C7J, F8J, R9J, N10J, L11J, E12J, E13J, N14J, C15J, C16J, V17J, R18J, P19J, L20J, A41J, N42J, F43J, C44J, S45J, G46J, P47J, C48J, P49J, Y50J, L51J, R52J, S53J, A54J, D55J, T56J, T57J, H58J, S59J, T60J, V61J, L62J, G63J, L64J, Y665J, N66J, T67J, L68J, N69J, P70J, E71J, A72J, S73J, A74J, S75J, P76J, C77J, C78J, V79J, P80J, Q81J, N103J, M104J, V105J, V106J, K107J, S108J, C109J, K110J, C111J, 及び S112J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２３６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３８】
蛋白質はヒトトランスフォーミング成長因子(TGF)-β4/ebafサブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２３９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置267-287からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D269B 及び E282B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２３９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK274Z 及び K277Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２３９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D269U, K274U, K277U, 及び E282（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２３９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y267Z, I268Z, L270Z, Q271Z, G272Z, M273Z, W275Z, A276Z, N278Z, W279Z, V280Z, L281Z, P283Z, P284Z, G285Z, F286Z, L287Z, Y267B, I268B, L270B, Q271B, G272B, M273B, W275B, A276B, N278B, W279B, V280B, L281B, P283B, P284B, G285B, F286B, 及び L287B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２３９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置318〜337からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E318B 及び E330B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK329Z, R333Z, 及び R335Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E318U, K329U, E330U, 及び R333U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T319Z, A320Z, S321Z, L322Z, P323Z, M324Z, I325Z, V326Z, S327Z, I328Z, G331Z, G332Z, T334Z, P336Z, Q337Z, T319B, A320B, S321B, L322B, P323B, M324B, I325B, V326B, S327B, I328B, G331B, G332B, T334B, P336B, 及び Q337B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２４９】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５０】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-266, 288-317及び338-370からなる群から選ばれる位置である請求項２５０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, W2J, P3J, L4J, W5J, L6J, C7J, W8J, A9J, L10J, W11J, V12J, L13J, P14J, L15J, A16J, G17J, P18J, G19J, A20J, A21J, L22J, T23J, E24J, E25J, Q26J, L27J, L28J, A29J, S30J, L31J, L32J, R33J, Q34J, L35J, Q36J, L37J, S38J, E39J, V40J, P41J, V42J, L43J, D44J, R45J, A46J, D47J, M48J, E49J, K50J, L51J, V52J, I53J, P54J, A55J, H56J, V57J, R58J, A59J, Q60J, Y61J, V62J, V63J, L64J, L65J, R66J, R67J, D68J, G69J, D70J, R71J, S72J, R73J, G74J, K75J, R76J, F77J, S78J, Q79J, S80J, F81J, R82J, E83J, V84J, A85J, G86J, R87J, F88J, L89J, A90J, S91J, E92J, A93J, S94J, T95J, H96J, L97J, L98J, V99J, F100J, G101J, M102J, E103J, Q104J, R105J, L106J, P107J, P108J, N109J, S110J, E111J, L112J, V113J, Q114J, A115J, V116I, L117J, R118J, L119J, F120J, Q121J, E122J, P123J, V124J, P125J, Q126J, G127J, A128J, L129J, H130J, R131J, H132J, G133J, R134J, L135J, S136J, P137J, A138J, A139J, P140J, K141J, A142J, R143J, V144J, T145J, V146J, E147J, W148J, L149J, V150, R151J, D152J, D153J, G154J, S155J, N156J, R157J, T158J, S159J, L160J, I161J, D162J, S163J, R164J, L165J, V166J, S167J, V168J, H169J, E170J, S171J, G172J, W173J, K174J, A175J, F176J, D177J, V178J, T179J, E180J, A181J, V182J, N183J, F184J, W185J, Q186J, Q187J, L188J, S189J, R190J, P191J, P192J, E193J, P194J, L195J, L196J, V197J, Q198J, V199J, S200J, V201J, Q202J, R203J, E204J, H205J, L206J, G207J, P208J, L209J, A210J, S211J, G212J, A213J, H214J, K215J, L216J, V217J, R218J, F219J, A220J, S221J, Q222J, G223J, A224J, P225J, A226J, G227J, L228J, G229J, E230J, P231J, Q232J, L233J, E234J, L235J, H236J, T237J, L238J, D239J, L240J, R241J, D242J, Y243J, G244J, A245J, Q246J, G247J, D248J, C249J, D250J, P251J, E252J, A253J, P254J, M255J, T256J, E257J, G258J, T259J, R260J, C261J, C262J, R263J, Q264J, E265J, M266J, A288J, Y289J, E290J, C291J, V292J, G293J, T294J, C295J, Q296J, Q297J, P298J, P299J, E300J, A301J, L302J, A303J, F304J, N305J, W306J, P307J, F308J, L309J, G310J, P311J, R312J, Q313J, C314J, I315J, A316J, S317J, V338J, V339J, S340J, L341J, P342J, N343J, M344J, R345J, V346J, Q347J, K348J, C349J, S350J, C351J, A352J, S353J, D354J, G355J, A356J, L357J, V358J, P359J, R360J, R361J, L362J, Q363J, H364J, R365J, P366J, W367J, C368J, I369J, 及び H370J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２５１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５３】
蛋白質はヒトニュールツリン(neurturin)である請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置104-129からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２５３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E107B, E109B, E114B, D122B, 及び E123B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２５４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR106Z, R111Z, 及び R128Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２５４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R106U, E107U, E109U, R111U, E114U, D122U, E123U, 及び R128U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２５４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、G104Z, L105Z, L108Z, V110Z, V112Z, S113Z, L115Z, G116Z, L117Z, G118Z, Y119Z, A120Z, S121Z, T124Z, V125Z, L126Z, F127Z, Y129Z, G104B, L105B, L108B, V110B, V112B, S113B, L115B, G116B, L117B, G118B, Y119B, A120B, S121B, T124B, V125B, L126B, F127B, 及び Y129B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２５４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２５９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置167-191からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２５３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E171B, D172B, E173B, D178B, 及び E188B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH180Z, R182Z, H184Z, 及び H187Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R166U, E171U, D172U, E173U, D178U, H180U, R182U, H184U, H187U, E188U, 及び R192U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P167Z, T168Z, A169Z, Y170Z, V174Z, S175Z, F176Z, L177Z, A179Z, S181Z, Y183Z, T185Z, V186Z, L189Z, S190Z, A191Z, P167B, T168B, A169B, Y170B, V174B, S175B, F176B, L177G, A179B, S181B, Y183B, T185B, V186B, L189B, S190B, 及び A191B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６４】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２５３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６５】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２５３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-103, 130-165及び194-197からなる群から選ばれる位置である請求項２６５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, Q2J, R3J, W4J, K5J, A6J, A7J, A8J, L9J, A10J, S11J, V12J, L13J, C14J, S15J, S16J, V17J, L18J, S19J, I20J, W21J, M22J, C23J, R24J, E25J, G26J, L27J, L28J, L29J, S30J, H31J, R32J, L33J, G34J, P35J, A36J, L37J, V38J, P39J, L40J, H41J, R42J, L43J, P44J, R45J, T46J, L47J, D48J, A49J, R50J, I51J, A52J, R53J, L54J, A55J, Q56J, Y57J, R58J, A59J, L60J, L61J, Q62J, G63J, A64J, P65J, D66J, A67J, M68J, E69J, L70J, R71J, E72J, L73J, T74J, P75J, W76J, A77J, G78J, R79J, P80J, P81J, G82J, P83J, R84J, R85J, R86J, A87J, G88J, P89J, R90J, R91J, R92J, R93J, A94J, R95J, A96J, R97J, L98J, G99J, A100J, R101J, P102J, C103J, C130J, A131J, G132J, A133J, C134J, E135J, A136J, A137J, A138J, R139J, V140J, Y141J, D142J, L143J, G144J, L145J, R146J, R147J, L148J, R149J, Q150J, R151J, R152J, R153J, L154J, R155J, R156J, E157J, R158J, V159J, R160J, A161J, Q162J, P163J, C164J, C165J, C194J, A195J, C196J, 及び V197J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２６６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６８】
蛋白質はヒトインヒビン(inhibin) A αサブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２６９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置266-286からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２６８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E273B及びE277B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR278Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E273U, E277U, 及び R278U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A266Z, L267Z, N268Z, I269Z, S270Z, F271Z, Q272Z, L274Z, G275Z, W276Z, W279Z, I280Z, V281Z, Y282Z, P283Z, P284Z, S285Z, F286Z, A266B, L267B, N268B, I269B, S270B, F271B, Q272B, L274B, G275B, W276B, W279B, I280B, V281B, Y282B, P283B, P284B, S285B, 及び F286B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２６９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置332-359からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２６８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D345B 及び E353B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR336Z, H339Z, R341Z, 及び K351Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R336U, H339U, R341U, D345U, K351U, 及び E353U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P332Z, G333Z, T334Z, M335Z, P337Z, L338Z, V340Z, T342Z, T343Z, S344Z, G346Z, G347Z, Y348Z, S349Z, F350Z, Y352Z, T354Z, V355Z, P356Z, N357Z, L358Z, L359Z, P332B, G333B, T334B, M335B, P337B, L338B, V340B, T342B, T343B, S344B, G346B, G347B, Y348B, S349B, F350B, Y352B, T354B, V355B, P356B, N357B, L358B, 及び L359B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２７９】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２６８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８０】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２６８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-265, 287-331及び360-366からなる群から選ばれる位置である請求項２８０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, V2J, L3J, H4J, L5J, L6J, L7J, F8J, L9J, L10J, L11J, T12J, P13J, Q14J, G15J, G16J, H17J, S18J, C19J, Q20J, G21J, L22J, E23J, L24J, A25J, R26J, E27J, L28J, V29J, L30J, A31J, K32J, V33J, R34J, A35J, L36J, F37J, L38J, D39J, A40J, L41J, G42J, P43J, P44J, A45J, V46J, T47J, R48J, E49J, G50J, G51J, D52J, P53J, G54J, V55J, R56J, R57J, L58J, P59J, R60J, R61J, H62J, A63J, L64J, G65J, G66J, F67J, T68J, H69J, R70J, G71J, S72J, E73J, P74J, E75J, E76J, E77J, E78J, D79J, V80J, S81J, Q82J, A83J, I84J, L85J, F86J, P87J, A88J, T89J, D90J, A91J, S92J, C93J, E94J, D95J, K96J, S97J, A98J, A99J, R100J, G101J, L102J, A103J, Q104J, E105J, A106J, E107J, E108J, G109J, L110J, F111J, R112J, Y113J, M114J, F115J, R116J, P117J, S118J, Q119J, H120J, T121J, R122J, S123J, R124J, Q125J, V126J, T127J, S128J, A129J, Q130J, L131J, W132J, F133J, H134J, T135J, G136J, L137J, D138J, R139J, Q140J, G141J, T142J, A143J, A144J, S145J, N146J, S147J, S148J, E149J, P150J, L151J, L152J, G153J, L154J, L155J, A156J, L157J, S158J, P159J, G160J, G161J, P162J, V163J, A164J, V165J, P166J, M167J, S168J, L169J, G170J, H171J, A172J, P173J, P174J, H175J, W176J, A177J, V178J, L179J, Hl80J, L181J, A182J, T183J, S184J, A185J, L186J, S187J, L188J, L189J, T190J, H191J, P192J, V193J, L194J, V195J, L196J, L197J, L198J, R199J, C200J, P201J, L202J, C203J, T204J, C205J, S206J, A207J, R208J, P209J, E210J, A211J, T212J, P213J, F214J, L215J, V216J, A217J, H218J, T219J, R220J, T221J, R222J, P223J, P224J, S225J, G226J, G227J, E228J, R229J, A230J, R231J, R232J, S233J, T234J, P235J, L236J, M237J, S238J, W239J, P240J, W241J, S242J, P243J, S244J, A245J, L246J, R247J, L248J, L249J, Q250J, R251J, P252J, P253J, E254J, E255J, P256J, A257J, A258J, H259J, A260J, N261J, C262J, H263J, R264J, V265J, I287J, F288J, H289J, Y290J, C291J, H292J, G293J, G294J, C295J, G296J, L297J, H298J, I299J, P300J, P301J, N302J, L303J, S304J, L305J, P306J, V307J, P308J, G309J, A310J, P311J, P312J, T313J, P314J, A315J, Q316J, P317J, Y318J, S319J, L320J, L321J, P322J, G323J, A324J, Q325J, P326J, C327J, C328J, A329J, A330J, L331J, T360J, Q361J, H362J, C363J, A364J, C365J, 及び l366J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２８１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８３】
蛋白質はヒトインヒビン(inhibin) A βサブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置326-346からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２８３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D332B 及び D337B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK331Z 及び H346Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K331U, D332U, D337U, 及び H346U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F326Z, F327Z, V328Z, S329Z, F330Z, I333Z, G334Z, W335Z, N336Z, W338Z, I339Z, I340Z, A341Z, P342Z, S343Z, G344Z, Y345Z, F326B, F327B, V328B, S329B, F330B, I333B, G334B, W335B, N336B, W338B, I339B, I340B, A341B, P342B, S343B, G344B, 及び Y345B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２８４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２８９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置395-419からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２８３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D405B, D406B, 及び D414B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK395Z, R397Z, K412Z, 及び K413Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K395U, R397U, D405, D406, K412U, K413U, 及び D414U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L396Z, P398Z, M399Z, S400Z, M401Z, L402Z, Y403Z, Y404Z, G407Z, P408Z, N409Z, I410Z, I411Z, I415Z, Q416Z, N417Z, M418Z, I419Z, L396B, P398B, M399B, S400B, M401B, L402B, Y403B, Y404B, G407B, P408B, N409B, I410B,I411B,I415B, Q416B, N417B, M418B, 及び I419B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９４】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２８３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９５】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２８３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-325, 347-394, 及び 420-426からなる群から選ばれる位置である請求項２９５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, P2J, L3J, L4J, W5J, L6J, R7J, G8J, F9J, L10J, L11J, A12J, S13J, C14J, W15J, I16J, I17J, V18J, R19J, S20J, S21J, P22J, T23J, P24J, G25J, S26J, E27J, G28J, H29J, S30J, A31J, A32J, P33J, D34J, C35J, P36J, S37J, C38J, A39J, L40J, A41J, A42J, L43J, P44J, K45J, D46J, V47J, P48J, N49J, S50J, Q51J, P52J, E53J, M54J, V55J, E56J, A57J, V58J, K59J, K60J, H61J, I62J, L63J, N64J, M65J, L66J, H67J, L68J, K69J, K70J, R71J, P72J, D73J, V74J, T75J, Q76J, P77J, V78J, P79J, K80J, A81J, A82J, L83J, L84J, N85J, A86J, I87J, R88J, K89J, L90J, H91J, V92J, G93J, K94J, V95J, G96J, E97J, N98J, G99J, Y100J, V101J, E102J, I103J, E104J, D105J, D106J, I107J, G108J, R109J, R110J, A111J, E112J, M113J, N114J, E115J, L116J, M117J, E118J, Q119J, T120J, S121J, E122J, I123J, I124J, T125J, F126J, A127J, E128J, S129J, G130J, T131J, A132J, R133J, K134J, T135J, L136J, H137J, F138J, E139J, I140J, S141J, K142J, E143J, G144J, S145J, D146J, L147J, S148J, V149J, V150J, E151J, R152J, A153J, E154J, V155J, W156J, L157J, F158J, L159J, K160J, V161J, P162J, K163J, A164J, N165J, R166J, T167J, R168J, T169J, K170J, V171J, T172J, I173J, R174J, L175J, F176J, Q177J, Q178J, Q179J, K180J, H181J, P182J, Q183J, G184J, S185J, L186J, D187J, T188J, G189J, E190J, E191J, A192J, E193J, E194J, V195J, G196J, L197J, K198J, G199J, E200J, R201J, S202J, E203J, L204J, L205J, L206J, S207J, E208J, K209J, V210J, V211J, D212J, A213J, R214J, K215J, S216J, T217J, W218J, H219J, V220J, F221J, P222J, V223J, S224J, S225J, S226J, I227J, Q228J, R229J, L230J, L231J, D232J, Q233J, G234J, K235J, S236J, S237J, L238J, D239J, V240J, R241J, I242J, A243J, C244J, E245J, Q246J, C247J, Q248J, E249J, S250J, G251J, A252J, S253J, L254J, V255J, L256J, L257J, G258J, K259J, K260J, K261J, K262J, K263J, E264J, E265J, E266J, G267J, E268J, G269J, K270J, K271J, K272J, G273J, G274J, G275J, E276J, G277J, G278J, A279J, G280J, A281J, D282J, E283J, E284J, K285J, E286J, Q287J, S288J, H289J, R290J, P291J, F292J, L293J, M294J, L295J, Q296J, A297J, R298J, Q299J, S300J, E301J, D302J, H303J, P304J, H305J, R306J, R307J, R308J, R309J, R310J, G311J, L312J, E313J, C314J, D315J, G316J, K317J, V318J, N319J, I320J, C321J, C322KJ, 323J, K324J, Q325J, A347J, N348J, Y349J, C350J, E351J, G352J, E353J, C354J, P355J, S356J, H357J, I358J, A359J, G360J, T361J, S362J, G363J, S364J, S365J, L366J, S367J, F368J, H369J, S370J, T371J, V372J, I373J, N374J, H375J, Y376J, R377J, M378J, R379GJ, 380J, H381J, S382J, P383J, F384J, A385J, N386J, L387J, K388J, S389J, C390J, C391J, V392J, P393J, T394J, V420J, E421J, E422J, C423J, G424J, C425J, 及び S426J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２９６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９８】
蛋白質はヒトインヒビン(inhibin) B βサブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項２９９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置308-328からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項２９８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３００】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311B及びD319B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR313Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311U, R313U, 及びD319U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F308Z, F309Z, I310Z, F312Z, L314Z, I315Z, G316Z, W317Z, N318Z, W320Z, I321Z, I322Z, A323Z, P324Z, T325Z, G326Z, Y327Z, Y328Z, F308B, F309B, I310B, F312B, L314B, I315B, G31６B, W317B, N318B, W320B, I321B, I322B, A323B, P324B, T325B, G326B, Y327B, 及び Y328B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項２９９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置376-400からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項２９８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D386B, D387B, E388B及びD395B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK376Z, K393Z, 及び K394Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K376U, D386U, D387U, E388U, K393U, R394U, 及び D395U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L377Z, S378Z, T379Z, M380Z, S381Z, M382Z, L383Z, Y384Z, F385Z, Y389Z, N390Z, I391Z, V392Z, V396Z, P397Z, N398Z, M399Z, I400Z, L377B, S378B, T379B, M380B, S381B, M382B, L383B, Y384B, F385B, Y389B, N390B, I391B, V392B, V396B, P397B, N398B, M399B, 及び I400B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３０９】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項２９８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１０】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項２９８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-307, 329-375及び401-407からなる群から選ばれる位置である請求項３１０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, D2J, G3J, L4J, P5J, G6J, R7J, A8J, L9J, G10J, A11J, A12J, C13J, L14J, L15J, L16J, L17J, A18J, A19J, G20J, W21J, L22J, G23J, P24J, E25J, A26J, W27J, G28J, S29J, P30J, T31J, P32J, P33J, P34J, T35J, P36J, A37J, A38J, P39J, P40J, P41J, P42J, P43J, P44J, P45J, G46J, S47J, P48J, G49J, G50J, S51J, Q52J, D53J, T54J, C55J, T56J, S57J, C58J, G59J, G60J, F61J, R62J, R63J, P64J, E65J, E66J, L67J, G68J, R69J, V70J, D71J, G72J, D73J, F74J, L75J, E76J, A77J, V78J, K79J, R80J, H81J, I82J, L83J, S84J, R85J, L86J, Q87J, M88J, R89J, G90J, R91J, P92J, N93J, I94J, T95J, H96J, A97J, V98J, P99J, K100J, A101J, A102J, M103J, V104J, T105J, A106J, L107J, R108J, K109J, L110J, H111J, A112J, G113J, K114J, V115J, R116J, E117J, D118J, G119J, R120J, V121J, E122J, I123J, P124J, H125J, L126J, D127J, G128J, H129J, A130J, S131J, P132J, G133J, A134J, D135J, G136J, Q137J, E138J, R139J, V140J, S141J, E142J, I143J, I144J, S145J, F146J, A147J, E148J, T149J, D150J, G151J, L152J, A153J, S154J, S155J, R156J, V157J, R158J, L159J, Y160J, F161J, F162J, I163J, S164J, N165J, E166J, G167J, N168J, Q169J, N170J, L171J, F172J, V173J, V174J, Q175J, A176J, S177J, L178J, W179J, L180J, Y181J, L182J, K183J, L184J, L185J, P186J, Y187J, V188J, L189J, E190J, K191J, G192J, S193J, R194J, R195J, K196J, V197J, R198J, V199J, K200J, V201J, Y202J, F203J, Q204J, E205J, Q206J, G207J, H208J, G209J, D210J, R211J, W212J, N213J, M214J, V215J, E216J, K217J, R218J, V219J, D220J, L221J, K222J, R223J, S224J, G225J, W226J, H227J, T228J, F229J, P230J, L231J, T232J, E233J, A234J, I235J, Q236J, A237J, L238J, F239J, E240J, R241J, G242J, E243J, R244J, R245J, L246J, N247J, L248J, D249J, V250J, Q251J, C252J, D253J, S254J, C255J, Q256J, E257J, L258J, A259J, V260J, V261J, P262J, V263J, F264J, V265J, D266J, P267J, G268J, E269J, E270J, S271J, H272J, R273J, P274J, F275J, V276J, V277J, V278J, Q279J, A280J, R281J, L282J, G283J, D284J, S285J, R286J, H287J, R288J, I289J, R290J, K291J, R292J, G293J, L294EJ, 295CJ, 296J, D297J, G298J, R299J, T300J, N301J, L302J, C303J, C304J, R305J, Q306J, Q307J, G329J, N330J, Y331J, C332J, E333J, G334J, S335J, C336J, P337J, A338J, Y339J, L340J, A341J, G342J, V343J, P344J, G345J, S346J, A347J, S348J, S349J, F350J, H351J, T352J, A353J, V354J, V355J, N356J, Q357J, Y358J, R359J, M360J, R361J, G362J, L363J, N364J, P365J, G366J, T367J, V368J, N369J, S370J, C371J, C372J, I373J, P374J, T375J, V401J, E402J, E403J, C404J, G405J, C406J, 及び A407J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３１１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１３】
蛋白質はヒトアクチビン(activin) A サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置326-346からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３１３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D332B 及び D337B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK331Z 及び H346Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K331U, D332U, D337U, 及び H346U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F326Z, F327Z, V328Z, S329Z, F330Z, I333Z, G334Z, W335Z, N336Z, W338Z, I339Z, I340Z, A341Z, P342Z, S343Z, G344Z, Y345Z, F326B, F327B, V328B, S329B, F330B, I333B, G334B, W335B, N336B, W338B, I339B, I340B, A341B, P342B, S343B, G344B, 及び Y345B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３１９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置395-419からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３１３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D405B, D406B, 及び D414B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３１９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK395Z, R397Z, K412Z, 及び K413Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３１９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K395U, R397U, D405U, D406U, K412U, K413U, 及び D414U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３１９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L396Z, P398Z, M399Z, S400Z, M401Z, L402Z, Y403Z, Y404Z, G407Z, Q408Z, N409Z, I410Z, I411Z, I415Z, Q416Z, N417Z, M418Z, I419Z, L396B, P398B, M399B, S400B, M401B, L402B, Y403B, Y404B, G407B, Q408B, N409B, I410B, I411B, I415B, Q416B, N417B, M418B, 及び I419B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３１９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２４】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３１３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２５】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３１３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-325, 347-394及び420-426からなる群から選ばれる位置である請求項３２５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, P2J, L3J, L4J, W5J, L6J, R7J, G8J, F9J, L10J, L11J, A12J, S13J, C14J, W15J, I16J, I17J, V18J, R19J, S20J, S21J, P22J, T23J, P24J, G25J, S26J, E27J, G28J, H29J, S30J, A31J, A32J, P33J, D34J, C35J, P36J, S37J, C38J, A39J, L40J, A41J, A42J, L43J, P44J, K45J, D46J, V47J, P48J, N49J, S50J, Q51J, P52J, E53J, M54J, V55J, E56J, A57J, V58J, K59J, K60J, H61J, I62J, L63J, N64J, M65J, L66J, H67J, L68J, K69J, K70J, R71J, P72J, D73J, V74J, T75J, Q76J, P77J, V78J, P79J, K80J, A81J, A82J, L83J, L84J, N85J, A86J, I87J, R88J, K89J, L90J, H91J, V92J, G93J, K94J, V95J, G96J, E97J, N98J, G99J, Y100J, V101J, E102J, I103J, E104J, D105J, D106J, I107J, G108J, R109J, R110J, A111J, E112J, M113J, N114J, E115J, L116J, M117J, E118J, Q119J, T120J, S121J, E122J, I123J, I124J, T125J, F126J, A127J, E128J, S129J, G130J, T131J, A132J, R133J, K134J, T135J, L136J, H137J, F138J, E139J, I140J, S141J, K142J, E143J, G144J, S145J, D146J, L147J, S148J, V149J, V150J, E151J, R152J, A153J, E154J, V155J, W156J, L157J, F158J, L159J, K160J, V161J, P162J, K163J, A164J, N165J, R166J, T167J, R168J, T169J, K170J, V171J, T172J, I173J, R174J, L175J, F176J, Q177J, Q178J, Q179J, K180J, H181J, P182J, Q183J, G184J, S185J, L186J, D187J, T188J, G189J, E190J, E191J, A192J, E193J, E194J, V195J, G196J, L197J, K198J, G199J, E200J, R201J, S202J, E203J, L204J, L205J, L206J, S207J, E208J, K209J, V210J, V211J, D212J, A213J, R214J, K215J, S216J, T217J, W218J, H219J, V220J, F221J, P222J, V223J, S224J, S225J, S226J, I227J, Q228J, R229J, L230J, L231J, D232J, Q233J, G234J, K235J, S236J, S237J, L238J, D239J, V240J, R241J, I242J, A243J, C244J, E245J, Q246J, C247J, Q248J, E249J, S250J, G251J, A252J, S253J, L254J, V255J, L256J, L257J, G258J, K259J, K260J, K261J, K262J, K263J, E264J, E265J, E266J, G267J, E268J, G269J, K270J, K271J, K272J, G273J, G274J, G275J, E276J, G277J, G278J, A279J, G280J, A281J, D282J, E283J, E284J, K285J, E286J, Q287J, S288J, H289J, R290J, P291J, F292J, L293J, M294J, L295J, Q296J, A297J, R298J, Q299J, S300J, E301J, D302J, H303J, P304J, H305J, R306J, R307J, R308J, R309J, R310J, G311J, L312J, E313J, C314J, D315J, G316J, K317J, V318J, N319J, I320J, C321J, C322J, K323J, K324J, Q325J, A347J, N348J, Y349J, C350J, E351J, G352J, E353J, C354J, P355J, S356J, H357J, I358J, A359J, G360J, T361J, S362J, G363J, S364J, S365J, L366J, S367J, F368J, H369J, S370J, T371J, V372J, I373J, N374J, H375J, Y376J, R377J, M378J, R379J, G380J, H381J, S382J, P383J, F384J, A385J, N386J, L387J, K388J, S389J, C390J, C391J, V392J, P393J, T394J, V420J, E421J, E422J, C423J, G424J, C425J, 及び S426J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３２６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２８】
蛋白質はヒトアクチビン(activin) B サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３２９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置308-328からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３２８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311B及びD319B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR313Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D311U, R313U及びD319U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F308Z, F309Z, I310Z, F312Z, L314Z, I315Z, G316Z, W317Z, N318Z, W320Z, I321Z, I322Z, A323Z, P324Z, T325Z, G326Z, Y327Z, Y328Z, F308B, F309B, I310B, F312B, L314B, I315B, G316B, W317B, N318B, W320B, I321B, I322B, A323B, P324B, T325B, G326B, Y327B, 及び Y328B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置376-400からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３２８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D386B, D387B, E388B及びD395B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK376Z, K393Z及びR394Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K376U, D386U, D387U, E388U, K393U, R394U及びD395U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L377Z, S378Z, T279Z, M380Z, S381Z, M382Z, L383Z, Y384Z, F385Z, Y389Z, N390Z, I391Z, V392Z, V396Z, P397Z, N398Z, M399Z, I400Z, L377B, S378B, T279B, M380B, S381B, M382B, L383B, Y384B, F385B, Y389B, N390B, I391B, V392B, V396B, P397B, N398B, M399B及びI400B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３３９】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３２８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４０】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３２８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-307, 329-375及び401-407からなる群から選ばれる位置である請求項３４０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, D2J, G3J, L4J, P5J, G6J, R7J, A8J, L9J, G10J, A11J, A12J, C13J, L14J, L15J, L16J, L17J, A18J, A19J, G20J, W21J, L22J, G23J, P24J, E25J, A26J, W27J, G28J, S29J, P30J, T31J, P32J, P33J, P34J, T35J, P36J, A37J, A38J, P39J, P40J, P41J, P42J, P43J, P44J, P45J, G46J, S47J, P48J, G49J, G50J, S51J, Q52J, D53J, T54J, C55J, T56J, S57J, C58J, G59J, G60J, F61J, R62J, R63J, P64J, E65J, E66J, L67J, G68J, R69J, V70J, D71J, G72J, D73J, F74J, L75J, E76J, A77J, V78J, K79J, R80J, H81J, I82J, L83J, S84J, R85J, L86J, Q87J, M88J, R89J, G90J, R91J, P92J, N93J, I94J, T95J, H96J, A97J, V98J, P99J, K100J, A101J, A102J, M103J, V104J, T105J, A106J, L107J, R108J, K109J, L110J, H111J, A112J, G113J, K114J, V115J, R116J, E117J, D118J, G119J, R120J, V121J, E122J, I123J, P124J, H125J, L126J, D127J, G128J, H129J, A130J, S131J, P132J, G133J, A134J, D135J, G136J, Q137J, E138J, R139J, V140J, S141J, E142J, I143J, I144J, S145J, F146J, A147J, E148J, T149J, D150J, G151J, L152J, A153J, S154J, S155J, R156J, V157J, R158J, L159J, Y160J, F161J, F162J, I163J, S164J, N165J, E166J, G167J, N168J, Q169J, N170J, L171J, F172J, V173J, V174J, Q175J, A176J, S177J, L178J, W179J, L180J, Y181J, L182J, K183J, L184J, L185J, P186J, Y187J, V188J, L189J, E190J, K191J, G192J, S193J, R194J, R195J, K196J, V197J, R198J, V199J, K200J, V201J, Y202J, F203J, Q204J, E205J, Q206J, G207J, H208J, G209J, D210J, R211J, W212J, N213J, M214J, V215J, E216J, K217J, R218J, V219J, D220J, L221J, K222J, R223J, S224J, G225J, W226J, H227J, T228J, F229J, P230J, L231J, T232J, E233J, A234J, I235J, Q236J, A237J, L238J, F239J, E240J, R241J, G242J, E243J, R244J, R245J, L246J, N247J, L248J, D249J, V250J, Q251J, C252J, D253J, S254J, C255J, Q256J, E257J, L258J, A259J, V260J, V261J, P262J, V263J, F264J, V265J, D266J, P267J, G268J, E269J, E270J, S271J, H272J, R273J, P274J, F275J, V276J, V277J, V278J, Q279J, A280J, R281J, L282J, G283J, D284J, S285J, R286J, H287J, R288J, I289J, R290J, K291J, R292J, G293J, L294J, E295J, C296J, D297J, G298J, R299J, T300J, N301J, L302J, C303J, C304J, R305J, Q306J, Q307J, G329J, N330J, Y331J, C332J, E333J, G334J, S335J, C336J, P337J, A338J, Y339J, L340J, A341J, G342J, V343J, P344J, G345J, S346J, A347J, S348J, S349J, F350J, H351J, T352J, A353J, V354J, V35J, 5N356J, Q357J, Y358J, R359J, M360J, R361J, G362J, L363J, N364J, P365J, G366J, T367J, V368J, N369J, S370J, C371J, C372J, I373J, P374J, T375VJ, 401J, E402J, E403J, C404J, G405J, C406J, 及び A407J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３４１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４３】
蛋白質はヒトミュラー管抑制物質(MIS)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置465-484からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３４３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E466B, D470B, E474B及びE481B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR465, R472及びR475（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R465U, E466U, D470U, R472U, E474U, R475U及びE481U（式中Ｕは中性アミノ酸残である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L467Z, S468Z, V469Z, L471Z, A473Z, S476Z, V477Z, L478Z, I479Z, P480Z, T482Z, Y483Z, Q484Z, L467B, S468B, V469B, L471B, A473B, S476B, V477B, L478B, I479B, P480B, T482B, Y483B及びQ484B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３４９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置530-553からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３４３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E541B及びE542B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK534Z, R543Z, H547Z, 及び H548Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K534U, E541U, E542U, R543U, H547U及びH548U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A530Z, Y531Z, A532Z, G533Z, L535Z, L536Z, I537Z, S538Z, L539Z, S540Z, I544Z, S545Z, A546Z, V549Z, P550Z, N551Z, M552Z, V553Z, A530B, Y531B, A532B, G533B, L535B, L536B, I537B, S538B, L539B, S540B, I544B, S545B, A546B, V549B, P550B, N551B, M552B, 及び V553B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５４】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３４３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５５】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３４３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-464, 485-529及び554-560からなる群から選ばれる位置である請求項３５５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, R2J, D3J, L4J, P5J, L6J, T7J, S8J, L9J, A10J, L11J, V12J, L13J, S14J, A15J, L16J, G17J, A18J, L19J, L20J, G21J, T22J, E23J, A24J, L25J, R26J, A27J, E28J, E29J, P30J, A31J, V32J, G33J, T34J, S35J, G36J, L37J, I38J, F39J, R40J, E41J, D42J, L43J, D44J, W45J, P46J, P47J, G48J, I49J, P50J, Q51J, E52J, P53J, L54J, C55J, L56J, V57J, A58J, L59J, G60J, G61J, D62J, S63J, N64J, G65J, S66J, S67J, S68J, P69J, L70J, R71J, V72J, V73J, G74J, A75J, L76J, S77J, A78J, Y79J, E80J, Q81J, A82J, F83J, L84J, G85J, A86J, V87J, Q88J, R89J, A90J, R91J, W92J, G93J, P94J, R95J, D96J, L97J, A98J, T99J, F100J, G101J, V102J, C103J, N104J, T105J, G106J, D107J, R108J, Q109J, A110J, A111J, L112J, P113J, S114J, L115J, R116J, R117J, L118J, G119J, A120J, W121J, L122J, R123J, D124J, P125J, G126J, G127J, Q128J, R129J, L130J, V131J, V132J, L133J, H134J, L135J, E136J, E137J, V138J, T139J, W140J, E141J, P142J, T143J, P144J, S145J, L146J, R147J, F148J, Q149J, E150J, P151J, P152J, P153J, G154J, G155J, A156J, G157J, P158J, P159J, E160J, L161J, A162J, L163J, L164J, V165J, L166J, Y167J, P168J, G169J, P170J, G171J, P172J, E173J, V174J, T175J, V176J, T177J, R178J, A179J, G180J, L181J, P182J, G183J, A184J, Q185J, S186J, L187J, C188J, P189J, S190J, R191J, D192J, T193J, R194J, Y195J, L196J, V197J, L198J, A199J, V200J, D201J, R202J, P203J, A204J, G205J, A206J, W207J, R208J, G209J, S210J, G211J, L212J, A213J, L214J, T215J, L216J, Q217J, P218J, R219J, G220J, E221J, D222J, S223J, R224J, L225J, S226J, T227J, A228J, R229J, L230J, Q231J, A232J, L233J, L234J, F235J, G236J, D237J, D238J, H239J, R240J, C241J, F242J, T243J, R244J, M245J, T246J, P247J, A248J, L249J, L250J, L251J, L252J, P253J, R254J, S255J, E256J, P257J, A258J, P259J, L260J, P261J, A262J, H263J, G264J, Q265J, L266J, D267J, T268J, V269J, P270J, F271J, P272J, P273J, P274J, R275J, P276J, S277J, A278J, E279J, L280J, E281J, E282J, S283J, P284J, P285J, S286J, A287J, D288J, P289J, F290J, L291J, E292J, T293J, L294J, T295J, R296J, L297J, V298J, R299J, A300J, L301J, R302J, V303J, P304J, P305J, A306J, R307J, A308J, S309J, A310J, P311J, R312J, L313J, A314J, L315J, D316J, P317J, D318J, A319J, L320J, A321J, G322J, F323J, P324J, Q325J, G326J, L327J, V328J, N329J, L330J, S331J, D332J, P333J, A334J, A335J, L336J, E337J, R338J, L339J, L340J, D341J, G342J, E343J, E344J, P345J, L346J, L347J, L348J, L349J, L350J, R351J, P352J, T353J, A354J, A355J, T356J, T357J, G358J, D359J, P360J, A361J, P362J, L363J, H364J, D365J, P366J, T367J, S368J, A369J, P370J, W371J, A372J, T373J, A374J, L375J, A376J, R377J, R378J, V379J, A380J, A381J, E382J, L383J, Q384J, A385J, A386J, A387J, A388J, E389J, L390J, R391J, S392J, L393J, P394J, G395J, L396J, P397J, P398J, A399J, T400J, A401J, P402J, L403J, L404J, A405J, R406J, L407J, L408J, A409J, L410J, C411J, P412J, G413J, G414J, P415J, G416J, G417J, L418J, G419J, D420J, P421J, L422J, R423J, A424J, L425J, L426J, L427J, L428J, K429J, A430J, L431J, Q432J, G433J, L434J, R435J, V436J, E437J, W438J, R439J, G440J, R441J, D442J, P443J, R444J, G445J, P446J, G447J, R448J, A449J, Q450J, R451J, S452J, A453J, G454J, A455J, T456J, A457J, A458J, D459J, G460J, P461J, C462J, A463J, L464J, A485J, N486J, N487J, C488J, Q489J, G490J, V491J, C492J, G493J, W494J, P495J, Q496J, S497J, D498J, R499J, N500J, P501J, R502J, Y503J, G504J, N505J, H506J, V507J, V508J, L509J, L510J, L511J, K512J, M513J, Q514J, A515J, R516J, G517J, A518J, A519J, L520J, A521J, R522J, P523J, P524J, C525J, C526J, V527J, P528J, T529J, A554J, T555J, E556J, C557J, G558J, C559J, 及び R560J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３５６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５８】
蛋白質はヒト骨形成因子-2 (BMP-2)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３５９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置302-321からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３５８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D304B, D307B, 及び D312B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH321Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D304U, D307U, D312U及びH321U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y302Z, V303Z, F305Z, S306Z, V308Z, G309Z, W310Z, N311Z, W313Z, I314Z, V315Z, A316Z, P317Z, P318Z, G319Z, Y320Z, Y302B, V303B, F305B, S306B, V308B, G309B, W310B, N311B, W313B, I314B, V315B, A316B, P317B, P318B, G319B, 及び Y320B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置365-389からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３５８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E365B, D375B, E376B, E378B及びD387B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK379Z 及び K383Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E365U D375U, E376U E378U, K379U K383U及びD387U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L366Z, S367Z, A368Z, I369Z, S370Z, M371Z, L372Z, Y373Z, L374Z, N377Z, V380Z, V381Z, L382Z, N384Z, Y385Z, Q386Z, M388Z, V389Z, L366B, S367B, A368B, I369B, S370B, M371B, L372B, Y373B, L374B, N377B, V380B, V381B, L382B, N384B, Y385B, Q386B, M388B及びV389B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３６９】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３５８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７０】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３５８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-301, 322-364及び390-396からなる群から選ばれる位置である請求項３７０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、M1J, V2J, A3J, G4J, T5J, R6J, C7J, L8J, L9J, A10J, L11J, L12J, L13J, P14J, Q15J, V16J, L17J, L18J, G19J, G20J, A21J, A22J, G23J, L24J, V25J, P26J, E27J, L28J, G29J, R30J, R31J, K32J, F33J, A34J, A35J, A36J, S37J, S38J, G39J, R40J, P41J, S42J, S43J, Q44J, P45J, S46J, D47J, E48J, V49J, L50J, S51J, E52J, F53J, E54J, L55J, R56J, L57J, L58J, S59J, M60J, F61J, G62J, L63J, K64J, Q65J, R66J, P67J, T68J, P69J, S70J, R71J, D72J, A73J, V74J, V75J, P76J, P77J, Y78J, M79J, L80J, D81J, L82J, Y83J, R84J, R85J, H86J, S87J, G88J, Q89J, P90J, G91J, S92J, P93J, A94J, P95J, D96J, H97J, R98J, L99J, E100J, R101J, A102J, A103J, S104J, R105J, A106J, N107J, T108J, V109J, R110J, S111J, F112J, H113J, H114J, E115J, E116J, S117J, L118J, E119J, E120J, L121J, P122J, E123J, T124J, S125J, G126J, K127J, T128J, T129J, R130J, R131J, F132J, F133J, F134J, N135J, L136J, S137J, S138J, I139J, P140J, T141J, E142J, E143J, F144J, I145J, T146J, S147J, A148J, E149J, L150J, Q151J, V152J, F153J, R154J, E155J, Q156J, M157J, Q158J, D159J, A160J, L161J, G162J, N163J, N164J, S165J, S166J, F167J, H168J, H169J, R170J, I171J, N172J, I173J, Y174J, E175J, I176J, I177J, K178J, P179J, A180J, T181J, A182J, N183J, S184J, K185J, F186J, P187J, V188J, T189J, R190J, L191J, L192J, D193J, T194J, R195J, L196J, V197J, N198J, Q199J, N200J, A201J, S202J, R203J, W204J, E205J, S206J, F207J, D208J, V209J, T210J, P211J, A212J, V213J, M214J, R215J, W216J, T217J, A218J, Q219J, G220J, H221J, A222J, N223J, H224J, G225J, F226J, V227J, V228J, E229J, V230J, A231J, H232J, L233J, E234J, E235J, K236J, Q237J, G238J, V239J, S240J, K241J, R242J, H243J, V244J, R245J, I256J, S247J, R248J, S249J, L250J, H251J, Q252J, D253J, E254J, H255J, S256J, W257J, S258J, Q259J, I260J, R261J, P262J, L263J, L264J, V265J, T266J, F267J, G268J, H269J, D270J, G271J, K272J, G273J, H274J, P275J, L276J, H277J, K278J, R279J, E280J, K281J, R282J, Q283J, A284J, K285J, H286J, K287J, Q288J, R289J, K290J, R291J, L292J, K293J, S294J, S295J, C296J, K297J, R298J, H299J, P300J, L301J, A322J, F323J, Y324J, C325J, H326J, G327J, E328J, C329J, P330J, F331J, P332J, L333J, A334J, D335J, H336J, L337J, N338J, S339J, T340J, N341J, H342J, A343J, I344J, V345J, Q346J, T347J, L348J, V349J, N350J, S351J, V352J, N353J, S354J, K355J, I356J, P357J, K358J, A359J, C360J, C361J, V362J, P363J, T364J, V390.J, E391J, G392J, C393J, G394J, C395J及びR396J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３７１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７３】
蛋白質はヒト骨形成因子-3 (BMP-3)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置373-395からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３７３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D378B, D381B, E386B及びD395B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR373Z, K376Z及びK392Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R373U, K376U, D378U, D381U, E386U, K392U及びD395U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y374Z, L375Z, V377Z, F379Z, A380Z, I382Z, G383Z, W384Z, S385Z, W387Z, I388Z, I389Z, S390Z, P391Z, S393Z, F394Z, Y374B, L375B, V377B, F379B, A380B, I382B, G383B, W384B, S385B, W387B, I388B, I389B, S390B, P391B, S393B, 及び F394B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３７４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３７９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置441-465からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３７３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D451B及びE452B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK441Z, K454Z 及び K459Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K441U, D451U, E452U, K454U及びK459U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M442Z, S443Z, S444Z, L445Z, S446Z, I447Z, L448Z, F449Z, F450Z, N453Z, N455Z, V456Z, V457Z, L458Z, V460Z, Y461Z, P462Z, N463Z, M464Z, T465Z, M442B, S443B, S444B, L445B, S446B, I447B, L448B, F449B, F450B, N453B, N455B, V456B, V457B, L458B, V460B, Y461B, P462B, N463B, M464B及びT465B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８４】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３７３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８５】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３７３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-372, 396-440及び466-472からなる群から選ばれる位置である請求項３８５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がMlJ, A2J, G3J, A4J, S5J, R6J, L7J, L8J, F9J, L10J, W11J, L12J, G13J, C14J, F15J, C16J, V17J, S18J, L19J, A20J, Q21J, G22J, E23J, R24J, P25J, K26J, P27J, P28J, F29J, P30J, E31J, L32J, R33J, K34J, A35J, V36J, P37J, G38J, D39J, R40J, T41J, A42J, G43J, G44J, G45J, P46J, D47J, S48J, E49J, L50J, Q51J, P52J, Q53J, D54J, K55J, V56J, S57J, E58J, H59J, M60J, L61J, R62J, L63J, Y64J, D65J, R66J, Y67J, S68J, T69J, V70J, Q71J, A72J, A73J, R74J, T75J, P76J, G77J, S78J, L79J, E80J, G81J, G82J, S83J, Q84J, P85J, W86J, R87J, P88J, R89J, L90J, L91J, R92J, E93J, G94J, N95J, T96J, V97J, R98J, S99J, F100J, R101J, A102J, A103J, A104J, A105J, E106J, T107J, L108J, E109J, R110J, K111J, G112J, L113J, Y114J, I115J, F116J, N117J, L118J, T119J, S120J, L121J, T122J, K123J, S124J, E125J, N126J, I127J, L128J, S129J, A130J, T131J, L132J, Y133J, F134J, C135J, I136J, G137J, E138J, L139J, G140J, N141J, I142J, S143J, L144J, S145J, C146J, P147J, V148J, S149J, G150J, G151J, C152J, S153J, H154J, H155J, A156J, Q157J, R158J, K159J, H160J, I161J, Q162J, I163J, D164J, L165J, S166J, A167J, W168J, T169J, L170J, K171J, F172J, S173J, R174J, N175J, Q176J, S177J, Q178J, L179J, L180J, G181J, H182J, L183J, S184J, V185J, D186J, M187J, A188J, K189J, S190J, H191J, R192J, D193J, I194J, M195J, S196J, W197J, L198J, S199J, K200J, D201J, I202J, T203J, Q204J, F205J, L206J, R207J, K208J, A209J, K210J, E211J, N212J, E213J, E214J, F215J, L216J, I217J, G218J, F219J, N220J, I221J, T222J, S223J, K224J, G225J, R226J, Q227J, L228J, P229J, K230J, R231J, R232J, L233J, P234J, F235J, P236J, E237J, P238J, Y239J, I240J, L241J, V242J, Y243J, A244J, N245J, D246J, A247J, A248J, I249J, S250J, E251J, P252J, E253J, S254J, V255J, V256J, S257J, S258J, L259J, Q260J, G261J, H262J, R263J, N264J, F265J, P266J, T267J, G268J, T269J, V270J, P271J, K272J, W273J, D274J, S275J, H276J, I277J, R278J, A279J, A280J, L281J, S282J, I283J, E284J, R285J, R286J, K287J, K288J, R289J, S290J, T291J, G292J, V293J, L294J, L295J, P296J, L297J, Q298J, N299J, N300J, E301J, L302J, P303J, G304J, A305J, E306J, Y307J, Q308J, Y309J, K310J, K311J, D312J, E313J, V314J, W315J, E316J, E317J, R318J, K319J, P320J, Y321J, K322J, T323J, L324J, Q325J, A326J, Q327J, A328J, P329J, E330J, K331J, S332J, K333J, N334J, K335J, K336J, K337J, Q338J, R339J, K340J, G341J, P342J, H343J, R344J, K345J, S346J, Q347J, T348J, L349J, Q350J, F351J, D352J, E353J, Q354J, T355J, L356J, K357J, K358J, A359J, R360J, R361J, K362J, Q363J, W364J, I365J, E366J, P367J, R368J, N369J, C370J, A371J, R372J, A396J, Y397J, Y398J, C399J, S400J, G401J, A402J, C403J, Q404J, F405J, P406J, M407J, P408J, K409J, S410J, L411J, K412J, P413J, S414J, N415J, H416J, A417J, T418J, I419J, Q420J, S421J, I422J, V423J, R424J, A425J, V426J, G427J, V428J, V429J, P430J, G431J, I432J, P433J, E434J, P435J, C436J, C437J, V438J, P439J, E440J, V466J, E467J, S468J, C469J, A470J, C471J, 及び R472J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３８６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８８】
蛋白質はヒト形成因子(BMP-3b)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３８９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置379-402からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項３８８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D384B, D387B, E392B, 及び D401（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR379Z, K382Z及びK398Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R379U, K382U, D384U, D387U, E392U, K398U及びD401U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y380Z, L381Z, V383Z, F385Z, A386Z, I388Z, G389Z, W390Z, N391Z, W393Z, I394Z, I395Z, S396Z, P397Z, S399Z, F400Z, A402Z, Y380B, L381B, V383B, F385B, A386B, I388B, G389B, W390B, N391B, W393B, I394B, I395B, S396B, P397B, S399B, F400B及びA402B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３８９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置447-471からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項３８８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D457B 及び E458B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項３９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK447Z, R460Z, 及び K465Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項３９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K447U, D457U, E458U, R460U, 及び K465（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項３９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M448Z, N449Z, S450Z, L451Z, G452Z, V453Z, L454Z, F455Z, L456Z, N459Z, N461Z, V462Z, V463Z, L464Z, V466Z, Y467Z, P468Z, N469Z, M470Z, S471Z, M448B, N449B, S450B, L451B, G452B, V453B, L454B, F455B, L456B, N459B, N461B, V462B, V463B, L464B, V466B, Y467B, P468B, N469B, M470B, 及び S471B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項３９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項３９９】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項３８８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４００】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項３８８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-378, 403-446及び472-478からなる群から選ばれる位置である請求項４００のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, A2J, H3J, V4J, P5J, A6J, R7J, T8J, S9J, P10J, G11J, P12J, G13J, P14J, Q15J, L16J, L17J, L18J, L19J, L20J, L21J, P22J, L23J, F24J, L25J, L26J, L27J, L28J, R29J, D30J, V31J, A32J, G33J, S34J, H35J, R36J, A37J, P38J, A39J, W40J, S41J, A42J, L43J, P44J, A45J, A46J, A47J, D48J, G49J, L50J, Q51J, G52J, D53J, R54J, D55J, L56J, Q57J, R58J, H59J, P60J, G61J, D62J, A63J, A64J, A65J, T66J, L67J, G68J, P69J, S70J, A71J, Q72J, D73J, M74J, V75J, A76J, V77J, H78J, M79J, H80J, R81J, L82J, Y83J, E84J, K85J, Y86J, S87J, R88J, Q89J, G90J, A91J, R92J, P93J, G94J, G95J, G96J, N97J, T98J, V99J, R100J, S101J, F102J, R103J, A104J, R105J, L106J, E107J, V108J, V109J, D110J, Q111J, K112J, A113J, V114J, Y115J, F116J, F117J, N118J, L119J, T120J, S121J, M122J, Q123J, D124J, S125J, E126J, M127J, I128J, L129J, T130J, A131J, T132J, F133J, H134J, F135J, Y136J, S137J, E138J, P139J, P140J, R141J, W142J, P143J, R144J, A145J, L146J, E147J, V148J, L149J, C150J, K151J, P152J, R153J, A154J, K155J, N156J, A157J, S158J, G159J, R160J, P161J, L162J, P163J, L164J, G165J, P166J, P167J, T168J, R169J, Q170J, H171J, L172J, L173J, F174J, R175J, S176J, L177J, S178J, Q179J, N180J, T181J, A182J, T183J, Q184J, G185J, L186J, L187J, R188J, G189J, A190J, M191J, A192J, L193J, A194J, P195J, P196J, P197J, R198J, G199J, L200J, W201J, Q202J, A203J, K204J, D205J, I206J, S207J, P208J, I209J, V210J, K211J, A212J, A213J, R214J, R215J, D216J, G217J, E218J, L219J, L220J, L221J, S222J, A223J, Q224J, L225J, D226J, S227J, E228J, E229J, R230J, D231J, P232J, G233J, V234J, P235J, R236J, P237J, S238J, P239J, Y240J, A241J, P242J, Y243J, I244J, L245J, V246J, Y247J, A248J, N249J, D250J, L251J, A252J, I253J, S254J, E255J, P256J, N257J, S258J, V259J, A260J, V261J, T262J, L263J, Q264J, R265J, Y266J, D267J, P268J, F269J, P270J, A271J, G272J, D273J, P274J, E275J, P276J, R277J, A278J, A279PJ, 280J, N281J, N282J, S283J, A284J, D285J, P286J, R287J, V288J, R289J, R290J, A291J, A292J, Q293J, A294J, T295J, G296J, P297J, L298J, Q299J, D300J, N301J, E302J, L303J, P304J, G305J, L306J, D307J, E308J, R309J, P310J, P311J, R312J, A313J, H314J, A315J, Q316J, H317J, F318J, H319J, K320J, H321J, Q322J, L323J, W324J, P325J, S326J, P327J, F328J, R329J, A330J, L331J, K332J, P333J, R334J, P335J, G336J, R337J, K338J, D339J, R340J, R341J, K342J, K343J, G344J, Q345J, E346J, V347J, F348J, M349J, A350J, A351J, S352J, Q353J, V354J, L355J, D356J, F357J, D358J, E359J, K360J, T361J, M362J, Q363J, K364J, A365J, R366J, R367J, K368J, Q369J, W370J, D371J, E372J, P373J, R374J, V375J, C376J, S377J, R378J, Y403J, Y404J, C405J, A406J, G407J, A408J, C409J, E410J, F411J, P412J, M413J, P414J, K415J, I416J, V417J, R418J, P419J, S420J, N421J, H422J, A423J, T424J, I425J, Q426J, S427J, I428J, V429J, R430J, A431J, V432J, G433J, I434J, I435J, P436J, G437J, I438J, P439J, E440J, P441J, C442J, C443J, V444J, P445J, D446J, V472J, D473J, T474J, C475J, A476J, C477J, 及び R478J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４０１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０３】
蛋白質はヒト骨形成因子(BMP-4)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置312-333からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４０３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D316B, D319B及びD324B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D316U, D319U及びD324U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S312Z, L313Z, Y314Z, V315Z, F317Z, S318Z, V320Z, G321Z, W322Z, N323Z, W325Z, I326Z, V327Z, A328Z, P329Z, P330Z, G331Z, Y332Z, Q333Z, S312B, L313B, Y314B, V315B, F317B, S318B, V320B, G321B, W322B, N323B, W325B, I326B, V327B, A328B, P329B, P330B, G331B, Y332B, 及び Q333B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４０４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置377-401からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４０３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４０９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E377B, D387B, E388B, D390B, 及び E399B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK391Z 及び K395Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E377U, D387U, E388U, D390U, K391U, K395U及びE399U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L378Z, S379Z, A380Z, I381Z, S382Z, M383Z, L384Z, Y385Z, L386Z, Y389Z, V392Z, V393Z, L394Z, N396Z, Y397Z, Q398Z, M400Z, V401Z, L378B, S379B, A380B, I381B, S382B, M383B, L384B, Y385B, L386B, Y389B, V392B, V393B, L394B, N396B, Y397B, Q398B, M400B, 及び V401B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４０８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１３】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４０３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１４】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４０３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１５】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-311, 334-376及び402-408からなる群から選ばれる位置である請求項４１４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, I2J, P3J, G4J, N5J, R6J, M7J, L8J, M9J, V10J, V11J, L12J, L13J, C14J, Q15J, V16J, L17J, L18J, G19J, G20J, A21J, S22J, H23J, A24J, S25J, L26J, I27J, P28J, E29J, T30J, G31J, K32J, K33J, K34J, V35J, A36J, E37J, I38J, Q39J, G40J, H41J, A42J, G43J, G44J, R45J, R46J, S47J, G48J, Q49J, S50J, H51J, E52J, L53J, L54J, R55J, D56J, F57J, E58J, A59J, T60J, L61J, L62J, Q63J, M64J, F65J, G66J, L67J, R68J, RG9J, R70J, P71J, Q72J, P73J, S74J, K75J, S76J, A77J, V78J, I79J, P80J, D81J, Y82J, M83J, R84J, D85J, L86J, Y87J, R88J, L89J, Q90J, S91J, G92J, E93J, E94J, E95J, E96J, E97J, Q98J, I99J, H100J, S101J, T102J, G103J, L104J, E105J, Y106J, P107J, E108J, R109J, P110J, A111J, S112J, R113J, A114J, N115J, T116J, V117J, R118J, S119J, F120J, H121J, H122J, E123J, E124J, H125J, L126J, E127J, N128J, I129J, P130J, G131J, T132J, S133J, E134J, N135J, S136J, A137J, F138J, R139J, F140J, L141J, F142J, N143J, L144J, S145J, S146J, I147J, P148J, E149J, N150J, E151J, A152J, I153J, S154J, S155J, A156J, E157J, L158J, R159J, L160J, F161J, R162J, E163J, Q164J, V165J, D166J, Q167J, G168J, P169J, D107J, W171J, E172J, R173J, G174J, F175J, H176J, R177J, I178J, N179J, I180J, Y181J, E182J, V183J, M184J, K185J, P186J, P187J, A188J, E189J, V190J, V191J, P192J, G193J, H194J, L195J, I196J, T197J, R198J, L199J, L200J, D201J, T202J, R203J, L204J, V205J, H206J, H207J, N208J, V209J, T210J, R211J, W212J, E213J, T214J, F215J, D216J, V217J, S218J, P219J, A220J, V221J, L222J, R223J, W224J, T225J, R226J, E227J, K228J, Q229J, P230J, N231J, Y232J, G233J, L234J, A235J, I236J, E237J, V238J, T239J, H240J, L241J, H242J, Q243J, T244J, R245J, T246J, H247J, Q248J, G249J, Q250J, H251J, V252J, R253J, I254J, S255J, R256J, S257J, L258J, P259J, Q260J, G261J, S262J, G263J, N264J, W265J, A266J, Q267J, L268J, R269J, P270J, L271J, L272J, V273J, T274J, F275J, G276J, H277J, D278J, G279J, R280J, G281J, H282J, A283J, L284J, T285J, R286J, R287J, R288J, R289J, A290J, K291J, R292J, S293J, P294J, K295J, H296J, H297J, S298J, Q299J, R300J, A301J, R302J, K303J, K304J, N305J, K306J, N307J, C308J, R309J, R310J, H311J, A334J, F335J, Y336J, C337J, H338J, G339J, D340J, C341J, P342J, F343J, P344J, L345J, A346J, D347J, H348J, L349J, N350J, S351J, T352J, N353J, H354J, A355J, I356J, V357J, Q358J, T359J, L360J, V361J, N362J, S363J, V364J, N365J, S366J, S367J, I368J, P369J, K370J, A371J, C372J, C373J, V374J, P375J, T376J, V402J, E403J, G404J, C405J, G406J, C407J, 及び R408J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４１５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１７】
蛋白質はヒト骨形成因子-5(BMP-5)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置357-378からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４１７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４１９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E357B, D364B, D369B及びE375B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４１８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR363Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４１８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E357U, R363U, D364U, D369U及びE375U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４１８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L358Z, Y359Z, V360Z, S361Z, F362Z, L365Z, G366Z, W367Z, Q368Z, W370Z, I371Z, I372Z, A373Z, P374Z, G376Z, Y377Z, A378Z, L358B, Y359B, V360B, S361B, F362B, L365B, G366B, W367B, Q368B, W370B, I371B, I372B, A373B, P374B, G376B, Y377B, 及び A378B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４１８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置423-447からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４１７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D433B及びD434B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK423Z, K441Z, K442Z, 及び R444Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K423U, D433U, D434U, K441U, K442U及びR444U（式中Ｕは中性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L424Z, N425Z, A426Z, I427Z, S428Z, V429Z, L430Z, Y431Z, F432Z, S435Z, S436Z, N437Z, V438Z, I439Z, L440Z, Y443Z, N445Z, M446Z, V447Z, L424B, N425B, A426B, I427B, S428B, V429B, L430B, Y431B, F432B, S435B, S436B, N437B, V438B, I439B, L440B, Y443B, R444B, N445B, M446B, 及び V447B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４２３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２８】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４１７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４２９】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４１７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３０】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-356, 379-422及び448-454からなる群から選ばれる位置である請求項４２９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３１】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, H2J, L3J, T4J, V5J, F6J, L7J, L8J, K9J, G10J, I11J, V12J, G13J, F14J, L15J, W16J, S17J, C18J, W19J, V20J, L21J, V22J, G23J, Y24J, A25J, K26J, G27J, G28J, L29J, G30J, D31J, N32J, H33J, V34J, H35J, S36J, S37J, F38J, I39J, Y40J, R41J, R42J, L43J, R44J, N45J, H46J, E47J, R48J, R49J, E50J, I51J, Q52J, R53J, E54J, I55J, L56J, S57J, I58J, L59J, G60J, L61J, P62J, H63J, R64J, P65J, R66J, P67J, F68J, S69J, P70J, G71J, K72J, Q73J, A74J, S75J, S76J, A77J, P78J, L79J, F80J, M81J, L82J, D83J, L84J, Y85J, N86J, A87J, M88J, T89J, N90J, E91J, E92J, N93J, P94J, E95J, E96J, S97J, E98J, Y99J, S100J, V101J, R102J, A103J, S104J, L105J, A106J, E107J, E108J, T109J, R110J, G111J, A112J, R113J, K114J, G115J, Y116J, P117J, A118J, S119J, P120J, N121J, G122J, Y123J, P124J, R125J, R126J, I127J, Q128J, L129J, S130J, R131J, T132J, T133J, P134J, L135J, T136J, T137J, Q138J, S139J, P140J, P141J, L142J, A143J, S144J, L145J, H146J, D147J, T148J, N149J, F150J, L151J, N152J, D153J, A154J, D155J, M156J, V157J, M158J, S159J, F160J, V161J, N162J, L163J, V164J, E165J, R166J, D167J, K168J, D169J, F170J, S171J, H172J, Q173J, R174J, R175J, H176J, Y177J, K178J, E179J, F180J, R181J, F182J, D183J, L184J, T185J, Q186J, I187J, P188J, H189J, G190J, E191J, A192J, V193J, T194J, A195J, A196J, E197J, F198J, R199J, I200J, Y201J, K202J, D203J, R204J, S205J, N206J, N207J, R208J, F209J, E210J, N211J, E212J, T213J, I214J, K215J, I216J, S217J, I218J, Y219J, Q220J, I221J, I222J, K223J, E224J, Y225J, T226J, N227J, R228J, D229J, A230J, D231J, L232J, F233J, L234J, L235J, D236J, T237J, R238J, K239J, A240J, Q241J, A242J, L243J, D244J, V245J, G246J, W247J, L248J, V249J, F250J, D251J, I252J, T253J, V254J, T255J, S256J, N257J, H258J, W259J, V260J, I261J, N262J, P263J, Q264J, N265J, N266J, L267J, G268J, L269J, Q270J, L271J, C272J, A273J, E274J, T275J, G276J, D277J, G278J, R279J, S280J, I281J, N282J, V283J, K284J, S285J, A286J, G287J, L288J, V289J, G290J, R291J, Q292J, G293J, P294J, Q295J, S296J, K297J, Q298J, P299J, F300J, M301J, V302J, A303J, F304J, F305J, K306J, A307J, S308J, E309J, V310J, L311J, L312J, R313J, S314J, V315J, R316J, A317J, A318J, N319J, K320J, R321J, K322J, N323J, Q324J, N325J, R326J, N327J, K328J, S329J, S330J, S331J, H332J, Q333J, D334J, S335J, S336J, R337J, M338J, S339J, S340J, V341J, G342J, D343J, Y344J, N345J, T346J, S347J, E348J, Q349J, K350J, Q351J, A352J, C353J, K354J, K355J, H356J, A379J, F380J, Y381J, C382J, D383J, G384J, E385J, C386J, S387J, F388J, P389J, L390J, N391J, A392J, H393J, M394J, N395J, A396J, T397J, N398J, H399J, A400J, I401J, V402J, Q403J, T404J, L405J, V406J, H407J, L408J, M409J, F410J, P411J, D412J, H413J, V414J, P415J, K416J, P417J, C418J, C419J, A420J, P421J, T422J, V448J, R449J, S450J, C451J, G452J, C453J, 及び H454J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４３０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３２】
蛋白質はヒト骨形成因子-6/Vgrl成長因子モノマーである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-40からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４３２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D26B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK36Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D26U 及び K36U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, V22Z, S23Z, F24Z, Q25Z, L27Z, G28Z, W29Z, Q30Z, W31Z, I32Z, I33Z, A34Z, P35Z, G37Z, Y38Z, A39Z, A40Z, Y21B, V22B, S23B, F24B, Q25B, L27B, G28B, W29B, Q30B, W31B, I32B, I33B, A34B, P35B, G37B, Y38B, A39B, 及び A40B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４３３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置81-102からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４３２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４３９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D91B 及び D92B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK81Z, K98Z, K99Z及びR101Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K81U, D91U, D92U, K98U, K99U及びR101U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L82Z, N83Z, A84Z, I85Z, S86Z, V87Z, L88Z, Y89Z, F90Z, N93Z, S94Z, N95Z, V96Z, I97Z, Y100Z, N102Z L82B, N83B, A84B, I85B, S86B, V87B, L88B, Y89B, F90B, N93B, S94B, N95B, V96B, I97B, Y100B, 及び N102B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４３８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４３】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４３２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４４】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４３２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４５】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20, 41-80及び103-111からなる群から選ばれる位置である請求項４４４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がS1J, S2J, A3J, S4J, D5J, Y6J, N7J, S8J, S9J, E10J, L11J, K12J, T13J, A14J, C15J, R16J, K17J, H18J, E19J, L20J, N41J, Y42J, C43J, D44J, G45J, E46J, C47J, S48J, P49J, P50J, L51J, N52J, A53J, H54J, T55J, N56J, H57J, A58J, I59J, V60J, Q61J, T62J, L63J, V64J, H65J, L66J, M67J, N68J, P69J, E70J, Y71J, V72J, P73J, K74J, P75J, C76J, C77J, A78J, P79J, T80J, M103J, V104J, V105J, R106J, A107J, C108J, G109J, C110J, 及び H111J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４４５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４７】
蛋白質はヒト骨形成因子-7/骨形成性蛋白質-1因子モノマーである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置21-40からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４４７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４４９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D26B 及び E36B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異か、またはＲ２５Ｚ（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４４８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R25U, D26U 及びE36U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４４８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y21Z, V22Z, S23Z, F24Z, L27Z, G28Z, W29Z, Q30Z, W31Z, I32Z, I33Z, A34Z, P35Z, G37Z, Y38Z, A39Z, A40B, Y21B, V22B, S23B, F24B, L27B, G28B, W29B, Q30B, W31B, I32B, I33B, A34B, P35B, G37B, Y38B, A39B, 及び A40B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４４８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置81-102からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４４７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D91B及びD92B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK98Z, K99Z及びR101Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D91U, D92U, K98U, K99U及びR101U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Q81Z, L82Z, N83Z, A84Z, I85Z, S86Z, V87Z, L88Z, Y89Z, F90Z, N93Z, S94Z, N95Z, V96Z, I97Z, Y100Z, N102Z, Q81B, L82B, N83B, A84B, I85B, S86B, V87B, L88B, Y89B, F90B, N93B, S94B, N95B, V96B, I97B, Y100B, 及び N102B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４５２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５７】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４４７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５８】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４４７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４５９】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-20, 41-80及び103-111からなる群から選ばれる位置である請求項４５８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６０】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がA1J, N2J, V3J, A4J, E5J, N6J, S7J, S8J, S9J, D10J, Q11J, R12J, Q13J, A14J, C15J, K16J, K17J, H18J, E19J, L20J, Y41J, Y42J, C43J, E44J, G45J, E46J, C47J, A48J, F49J, P50J, L51J, N52J, S53J, A54J, T55J, N56J, H57J, A58J, I59J, V60J, Q61J, T62J, L63J, V64J, H65J, F66J, I67J, N68J, P69J, E70J, T71J, V72J, P73J, K74J, P75J, C76J, C77J, A78J, P79J, T80J, M103J, V104J, V105J, R106J, A107J, C108J, G109J, C110J, 及び H111J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４５９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６１】
蛋白質はヒト骨形成因子-8(BMP-8)/ヒト骨形成性蛋白質-２(OP-2)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置305-326からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４６２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E305B, D312B, 及び D317B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４６２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E305U, D312U, 及び D317U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４６２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L306Z, Y307Z, V308Z, S309Z, F310Z, Q311Z, L313Z, G314Z, W315Z, L316Z, W318Z, V319Z, I320Z, A321Z, P322Z, Q323Z, G324Z, Y325Z, S326Z, L306B, Y307B, V308B, S309B, F310B, Q311B, L313B, G314B, W315B, L316B, W318B, V319B, I320B, A321B, P322B, Q323B, G324B, Y325B及びS326B（式中Ｚは酸性アミノ酸残基であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４６３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置371-395からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４６１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D381B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４６６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK371Z, R389Z, K390Z, H391Z及びR392Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４６６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４６９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K371U, D381U, R389U, K390U, H391U及びR392U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４６６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L372Z, S373Z, A374Z, T375Z, S376Z, V377Z, L378Z, Y379Z, Y380Z, S382Z, S383Z, N384Z, N385Z, V386Z, I387Z, L388Z, N393Z, M394Z, V395Z, L372B, S373B, A374B, T375B, S376B, V377B, L378B, Y379B, Y380B, S382B, S383B, N384B, N385B, V386B, I387B, L388B, N393B, M394B, 及び V395B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４６６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７１】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４６１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７２】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４６１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-304, 327-370及び396-402からなる群から選ばれる位置である請求項４７２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７４】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, T2J, A3J, L4J, P5J, G6J, P7J, L8J, W9J, L10J, L11J, G12J, L13J, A14J, L15J, C16J, A17J, L18J, G19J, G20J, G21J, G22J, P23J, G24J, L25J, R26J, P27J, P28J, P29J, G30J, C31J, P32J, Q33J, R34J, R35J, L36J, G37J, A38J, R39J, E40J, R41J, R42J, D43J, V44J, Q45J, R46J, E47J, I48J, L49J, A50J, V51J, L52J, G53J, L54J, P55J, G56J, R57J, P58J, R59J, P60J, R61J, A62J, P63J, P64J, A65J, A66J, S67J, R68J, L69J, P70J, A71J, S72J, A73J, P74J, L75J, F76J, M77J, L78J, D79J, L80J, Y81J, H82J, A83J, M84J, A85J, G86J, D87J, D88J, D89J, E90J, D91J, G92J, A93J, P94J, A95J, E96J, R97J, R98J, L99J, G100J, R101J, A102J, D103J, L104J, V105J, M106J, S107J, F108J, V109J, N110J, M111J, V112J, E113J, R114J, D115J, R116J, A117J, L118J, G119J, H120J, Q121J, E122J, P123J, H124J, W125J, K126J, E127J, F128J, R129J, F130J, D131J, L132J, T133J, Q134J, I135J, P136J, A137J, G138J, E139J, A140J, V141J, T142J, A143J, A144J, E145J, F146J, R147J, I148J, Y149J, K150J, V151J, P152J, S153J, I154J, H155I, L156J, L157J, N158J, R159J, T160J, L161J, H162J, V163J, S164J, M165J, F166J, Q167J, V168J, V169J, Q170J, E171J, Q172J, S173J, N174J, R175J, E176J, S177J, D178J, L179J, F180J, F181J, L182J, D183J, L184J, Q185J, T186J, L187J, R188J, A189J, G190J, D191J, E192J, G193J, W194J, L195J, V196J, L197J, D198J, V199J, T200J, A201J, A202J, S203J, D204J, C205J, W206J, L207J, L208J, K209J, R210J, H211J, K212J, D213J, L214J, G215J, L216J, R217J, L218J, Y219J, V220J, E221J, T222J, E223J, D224J, G225J, H226J, S227J, V228J, D229J, P230J, G231J, L232J, A233J, G234J, L235J, L236J, G237J, Q238J, R239J, A240J, P241J, R242J, S243J, Q244J, Q245J, P246J, F247J, V248J, V249J, T250J, F251J, F252J, R253J, A254J, S255J, P256J, S257J, P258J, I259J, R260J, T261J, P262J, R263J, A264J, V265J, R266J, P267J, L268J, R269J, R270J, R271J, Q272J, P273J, K274J, K275J, S276J, N277J, E278J, L279J, P280J, Q281J, A282J, N283J, R284J, L285J, P286J, G287J, I288J, F289J, D290J, D291J, V292J, H293J, G294J, S295J, H296J, G297J, R298J, Q299J, V300J, C301J, R302J, R303J, H304J, A327J, Y328J, Y329J, C330J, E331J, G332J, E333J, C334J, S335J, F336J, P337J, L338J, D339J, S340J, C341J, M342J, N343J, A344J, T345J, N346J, H347J, A348J, I349J, L350J, Q351J, S352J, L353J, V354J, H355J, L356J, M357J, K358J, P359J, N360J, A361J, V362J, P363J, K364J, A365J, C366J, C367J, A368J, P369J, T370J, V396J, K397J, A398J, C399J, G400J, C401J, 及び H402J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４７３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７５】
蛋白質はヒト骨形成因子-10 (BMP-10)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置327-353からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４７５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D331B, E334B, D338B, E348B及びE351B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４７６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK333Z 及び R353Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４７６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４７９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D331U, K333U, E334U, D338U, E348U, E351U及び R353U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４７６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P327Z, L328Z, Y329Z, I330Z, F332Z, I335Z, G336Z, W337Z, S339Z, W340Z, I341Z, I342Z, A343Z, P344Z, P345Z, G346Z, Y347Z, A349Z, Y350Z, C352Z, P327B, L328B, Y329B, I330B, F332B, I335B, G336B, W337B, S339B, W340B, I341B, I342B, A343B, P344B, P345B, G346B, Y347B, A349B, Y350B, 及び C352B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４７６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置393-416からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４７５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E395B, D403B及びE414B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK393Z, K404Z, K410Z及びK412Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K393U, E395U, D403U, K404U, K410U, K412U及びE414U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L394Z, P396Z, I397Z, S398Z, I399Z, L400Z, Y401Z, L402Z, G405Z, V406Z, V407Z, T408Z, Y409Z, F411Z, Y413Z, G415Z, M416Z, L394B, P396B, I397B, S398B, I399B, L400B, Y401B, L402B, G405B, V406B, V407B, T408B, Y409B, F411B, Y413B, G415B, 及び M416B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４８１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８６】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４７５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８７】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４７５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８８】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-326, 354-392及び417-424からなる群から選ばれる位置である請求項４８７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４８９】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, G2J, S3J, L4J, V5J, L6J, T7J, L8J, C9J, A10J, L11J, F12J, C13J, L14J, A15J, A16J, Y17J, L18J, V19J, S20J, G21J, S22J, P23J, I24J, M25J, N26J, L27J, E28J, Q29J, S30J, P31J, L32J, E33J, E34J, D35J, M36J, S37J, L38J, F39J, G40J, D41J, V42J, F43J, S44J, E45J, Q46J, D47J, G48J, V49J, D50J, F51J, N52J, T53J, L54J, L55J, Q56J, S57J, M58J, K59J, D60J, E61J, F62J, L63J, K64J, T65J, L66J, N67J, L68J, S69J, D70J, I71J, P72J, T73J, Q74J, D75J, S76J, A7J, K78J, V79J, D80J, P81J, P82J, E83J, Y84J, M85J, L86J, E87J, L88J, Y89J, N90J, K91J, F92J, A93J, T94J, D95J, R96J, T9J, S98J, M99J, P100J, S101J, A102J, N103J, I104J, I105J, R106J, S107J, F108J, K109J, N110J, E111J, D112J, L113J, F114J, S115J, Q116J, P117J, V118J, S119J, F120J, N121J, G122J, L123J, R124J, K125J, Y126J, P127J, L128J, L129J, F130J, N131J, V132J, S133J, I134J, P135J, H136J, H137J, E138J, E139J, V140J, I141J, M142J, A143J, E144J, L145J, R146J, L147J, Y148J, T149J, L150J, V151J, Q152J, R153J, D154J, R155J, M156J, I157J, Y158J, D159J, G160J, V161J, D162J, R163J, K164J, I165J, T166J, I167J, F168J, E169J, V170J, L171J, E172J, S173J, K174J, G175J, D176J, N177J, E178J, G179J, E180J, R181J, N182J, M183J, L184J, V185J, L186J, V187J, S188J, G189J, E190J, I191J, Y192J, G193J, T194J, N195J, S196J, E197J, W198J, E199J, T200J, F201J, D202J, V203J, T204J, D205J, A206J, I207J, R208J, R209J, W210J, Q211J, K212J, S213J, G214J, S215J, S216J, T217J, H218J, Q219J, L220J, E221J, V222J, H223J, I224J, E225J, S226J, K227J, H228J, D229J, E230J, A231J, E232J, D233J, A234J, S235J, S236J, G237J, R238J, L239J, E240J, I241J, D242J, T243J, S244J, A245J, Q246J, N247J, K248J, H249J, N250J, P251J, L252J, L253J, I254J, V255J, F256J, S257J, D258J, D259J, Q260J, S261J, S262J, D263J, K264J, E265J, R266J, K267J, E268J, E269J, L270J, N271J, E272J, M273J, I274J, S275J, H276J, E277J, Q278J, L279J, P280J, E281J, L282J, D283J, N284J, L285J, G286J, L287J, D288J, S289J, F290J, S291J, S292J, G293J, P294J, G295J, E296J, E297J, A298J, L299J, L300J, Q301J, M302J, R303J, S304J, N305J, I306J, I307J, Y308J, D309J, S310J, T311J, A312J, R313J, I314J, R315J, R316J, N317J, A318J, K319J, G320J, N321J, Y322J, C323J, K324J, R325J, T326J, G354J, V355J, C356J, N357J, Y358J, P359J, L360J, A361J, E362J, H363J, L364J, T365J, P366J, T367J, K368J, H369J, A370J, I371J, I372J, Q373J, A374J, L375J, V376J, H377J, L378J, K379J, N380J, S381J, Q382J, K383J, A384J, S385J, K386J, A387J, C388J, C389J, V390J, P391J, T392J, A417J, V418J, S419J, E420J, C421J, G422J, C423J, 及び R424J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４８８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９０】
蛋白質はヒト骨形成因子-11 (BMP-11)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置318-337からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項４９０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D321B, E323B及びD328B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４９１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK334Z, R335Z及びK337Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４９１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D321U, E323U, D328U, K334U, R335U及びK337U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４９１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L318Z, T319Z, V320Z, F322Z, A324Z, F325Z, G326Z, W327Z, W329Z, I330Z, I331Z, A332Z, P333Z, Y336Z, L318B, T319B, V320B, F322B, A324B, F325B, G326B, W327B, W329B, I330B, I331B, A332B, P333B及びY336B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４９１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置376-400からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項４９０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D387B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項４９６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK376Z, K388Z及びK395Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項４９６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項４９９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K376U, D387U, K388U及びK395（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項４９６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５００】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M377Z, S378Z, P379Z, I380Z, N381Z, M382Z, L383Z, Y384Z, F385Z, N386Z, Q389Z, Q390Z, I391Z, I392Z, Y393Z, G394Z, I396Z, P397Z, G398Z, M399Z, V400Z, M377B, S378B, P379B, I380B, N381B, M382B, L383B, Y384B, F385B, N386B, Q389B, Q390B, I391B, I392B, Y393B, G394B, I396B, P397B, G398B, M399B, 及び V400B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項４９６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０１】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項４９０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０２】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項４９０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-317, 338-375及び401-407からなる群から選ばれる位置である請求項５０２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０４】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, V2J, L3J, A4J, A5J, P6J, L7J, L8J, L9J, G10J, F11J, L12J, L23J, L24J, A25J, L26J, E27J, L28J, R19J, P20J, R21J, G22J, E23J, A24J, A25J, E26J, G27J, P28J, A29J, A30J, A31J, A32J, A33J, A34J, A35J, A36J, A37J, A38J, A39J, A40J, A41J, G42J, V43J, G44J, G45J, E46J, R47J, S48J, S49J, R50J, P51J, A52J, P53J, S54J, V55J, A56J, P57J, E58J, P59J, D60J, G61J, C62J, P63J, V64J, C65J, V66J, W67J, R68J, Q69J, H70J, S71J, R72J, E73J, L74J, R75J, L76J, E77J, S78J, I79J, K80J, S81J, Q82J, I83J, L84J, S85J, K86J, L87J, R88J, L89J, K90J, E91J, A92J, P93J, N94J, I95J, S96J, R97J, E98J, V99J, V100J, K101J, Q102J, L103J, L104J, P105J, K106J, A107J, P108J, P109J, L110J, Q111J, Q112J, I113J, L114J, D115J, L116J, H117J, D118J, F119J, Q120J, G121J, D122J, A123J, L124J, Q125J, P126J, E127J, D128J, F129J, L130J, E131J, E132J, D133J, E134J, Y135J, H136J, A137J, T138J, T139J, E140J, T141J, V142J, I143J, S144J, M145J, A146J, Q147J, E148J, T149J, D150J, P151J, A152J, V153J, Q154J, T155J, D156J, G157J, S158J, P159J, L160J, C161J, C162J, H163J, F164J, H165J, F166J, S167J, P168J, K169J, V170J, M171J, F172J, T173J, K174J, V175J, L176J, K177J, A178J, Q179J, L180J, W181J, V182J, Y183J, L184J, R185J, P186J, V187J, P188J, R189J, P190J, A191J, T192J, V193J, Y194J, L195J, Q196J, I197J, L198J, R199J, L200J, K201J, P202J, L203J, T204J, G205J, E206J, G207J, T208J, A209J, G210J, G211J, G212J, G213J, G214J, G215J, R216J, R217J, H218J, I219J, R220J, I221J, R222J, S223J, L224J, K225J, I226J, E227J, L228J, H229J, S230J, R231J, S232J, G233J, H234J, W235J, Q236J, S237J, I238J, D239J, F240J, K241J, Q242J, V243J, L244J, H245J, S246J, W247J, F248J, R249J, Q250J, P251J, Q252J, S253J, N254J, W255J, G256J, I257J, E258J, I259J, N260J, A261J, F262J, D263J, P264J, S265J, G266J, T267J, D268J, L269J, A270J, V271J, T272J, S273J, L274J, G275J, P276J, G277J, A278J, E279J, G280J, L281J, H282J, P283J, F284J, M285J, E286J, L287J, R288J, V289J, L290J, E291J, N292J, T293J, K294J, R295J, S296J, R297J, R298J, N299J, L300J, G301J, L302J, D303J, C304J, D305J, E306J, H307J, S308J, S309J, E310J, S311J, R312J, C313J, C314J, R315J, Y316J, P317J, A338J, N339J, Y340J, C341J, S342J, G343J, Q344J, C345J, E346J, Y347J, M348J, F349J, M350J, Q351J, K352J, Y353J, P354J, H355J, T356J, H357J, L358J, V359J, Q360J, Q361J, A362J, N363J, P364J, R365J, G366J, S367J, A368J, G369J, P370J, C371J, C372J, T373J, P374J, T375J, V401J, D402J, R403J, C404J, G405J, C406J, 及び S407J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５０３のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０５】
蛋白質はヒト骨形成因子-15 (BMP-15)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置295-316からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５０５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D306B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR301Z 及び H307Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５０９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R301U, D306U及びH307U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P295Z, F296Z, Q297Z, I298Z, S299Z, F300Z, Q302Z, L303Z, G304Z, W305Z, W308Z, I309Z, I310Z, A311Z, P312Z, P313Z, F314Z, Y315Z, T316Z, P295B, F296B, Q297B, I298B, S299B, F300B, Q302B, L303B, G304B, W305B, W308B, I309B, I310B, A311B, P312B, P313B, F314B, Y315B, 及び T316B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５０６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置361-385からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５０５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E371B, E380B及びE382B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５１１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK361Z 及び K379Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５１１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K361U, E371U, K379U, E380U及びE382U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５１１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y362Z, V363Z, P364Z, I365Z, S366Z, V367Z, L368Z, M369Z, I370Z, A372Z, N373Z, G374Z, S375Z, I376Z, L377Z, Y378Z, Y381Z, G383Z, M384Z, I385Z, Y362B, V363B, P364B, I365B, S366B, V367B, L368B, M369B, I370B, A372B, N373B, G374B, S375B, I376B, L377B, Y378B, Y381B, G383B, M384B及びI385B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５１１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１６】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５０５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１７】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５０５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１８】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-294, 317-360及び386-392からなる群から選ばれる位置である請求項５１７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５１９】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, V2J, L3J, L4J, S5J, I6J, L7J, R8J, I9J, L10J, F11J, L12J, C13J, E14J, L15J, V16J, L17J, F18J, M19J, E20J, H21J, R22J, A23J, Q24J, M25J, A26J, E27J, G28J, G29J, Q30J, S31J, F32J, I33J, A34J, L35J, L36J, A37J, E38J, A39J, P40J, T41J, L42J, P43J, L44J, I45J, E46J, E47J, M48J, L49J, E50J, E51J, S52J, P53J, G54J, E55J, Q56J, P57J, R58J, K59J, P60J, R61J, L62J, L63J, G64J, H65J, S66J, L67J, R68J, Y69J, M70J, L71J, E72J, L73J, Y74J, R75J, R76J, S77J, A78J, D79J, S80J, H81J, G82J, H83J, P84J, R85J, E86J, N87J, R88J, T89J, I90J, G91J, A92J, T93J, M94J, V95J, R96J, L97J, V98J, K99J, P100J, L101J, T102J, S103J, V104J, A105J, R106J, P107J, H108J, R109J, G110J, T111J, W112J, H113J, I114J, Q115J, I116J, L117J, G118J, F119J, P120J, L121J, R122J, P123J, N124J, R125J, G126J, L127J, Y128J, Q129J, L130J, V131J, R132J, A133J, T134J, V135J, V136J, Y137J, R138J, H139J, H140J, L141J, Q142J, L143J, T144J, R145J, F146J, N147J, L148J, S149J, C150J, H151J, V152J, E153J, P154J, W155J, V156J, Q157J, K158J, N159J, P160J, T161J, N162J, H163J, F164J, P165J, S166J, S167J, E168J, G169J, D170J, S171J, S172J, K173J, P174J, S175J, L176J, M177J, S178J, N179J, A180J, W181J, K182J, E183J, M184J, D185J, I186J, T187J, Q188J, L189J, V190J, Q191J, Q192J, R193J, F194J, W195J, N196J, N197J, K198J, G199J, H200J, R201J, I202J, L203J, R204J, L205J, R206J, F207J, M208J, C209J, Q210J, Q211J, Q212J, K213J, D214J, S215J, G216J, G217J, L218J, E219J, L220J, W221J, H222J, G223TJ, 224J, S225J, S226J, L227J, D228J, I229J, A230J, F231J, L232J, L233J, L234J, Y235J, F236J, N237J, D238J, T239J, H240J, K241J, S242J, I243J, R244J, K245J, A246J, K247J, F248J, L249J, P250J, R251J, G252J, M253J, E254J, E255J, F256J, M257J, E258J, R259J, E260J, S261J, L262J, L264J, R264J, R265J, T266J, R267J, Q268J, A269J, D270J, G271J, I272J, S273J, A274J, E275J, V276J, T277J, A278J, S279J, S280J, S281J, K282J, H283J, S284J, G285J, P286J, E287J, N288J, N289J, Q290J, C291J, S292J, L293J, H294J, P317J, N318J, Y319J, C320J, K321J, G322J, T323J, C324J, L325J, R326J, V327J, L328J, R329J, D330J, G331J, L332J, N333J, S334J, P335J, N336J, H337J, A338J, I339J, I340J, Q341J, N342J, L343J, I344J, N345J, Q346J, L347J, V348J, D349J, Q350J, S351J, V352J, P353J, R354J, P355J, S356J, C357J, V358J, P359J, Y360J, A386J, E387J, S388J, C389J, T390J, C391J, 及び R392J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５１８のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２０】
蛋白質はヒトノリエ病蛋白質サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置43-62からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５２０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、塩基性残基を導入する突然変異D46B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）を含む、請求項５２１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH43Z, H50Z, K54Z, 及び K58Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５２１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H43U, D46U, H50U, K54U, 及び K58U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５２１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y44Z, V45Z, S47Z, I48Z, S49Z, P51Z, L52Z, Y53Z, C55Z, S56Z, S57Z, M59Z, V60Z, L61Z, L62Z, Y44B, V45B, S47B, I48B, S49B, P51B, L52B, Y53B, C55B, S56B, S57B, M59B, V60B, L61B, 及び L62B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５２１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置100-123からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５２０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK102Z, K104Z, R107Z, R109Z, R115Z, 及び R121Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５２６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K102U, K104U, R107U, R109U, R115U及びR131U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５２６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５２９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T100Z, S101Z, L103Z, A105Z, L106Z, L108Z, C110Z, S111Z, G112Z, G113Z, M114Z, L116Z, T117Z, A118Z, T119Z, Y120Z, Y122Z, I123Z, T100B, S101B, L103B, A105B, L106B, L108B, C110B, S111B, G112B, G113B, M114B, L116B, T117B, A118B, T119B, Y120B, Y122B, 及び I123B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５２６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３０】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５２０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３１】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５２０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-42, 63-99, 124-133からなる群から選ばれる位置である請求項５３１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, R2J, K3J, H4J, V5J, L6J, A7J, A8J, S9J, F10J, S11J, M12J, L13J, S14J, L15J, L16J, V17J, I18J, M19J, G20J, D21J, T22J, D23J, S24J, K25J, T26J, D27J, S28J, S29J, F30J, I31J, M32J, D33J, S34J, D35J, P36J, R37J, R38J, C39J, M40J, R41J, H42J, A63J, R64J, C65J, E66J, G67J, H68J, C69J, S70J, Q71J, A72J, S73J, R74J, S75J, E76J, P77J, L78J, V79J, S80J, F81J, S82J, T83J, V84J, L85J, K86J, Q87J, P88J, F89J, R90J, S91J, S92J, C93J, H94J, C95J, C96J, R97J, P98J, Q99J, L124J, S125J, C126J, H127J, C128J, E129J, E130J, C131J, N132J, 及び S133J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５３２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３４】
蛋白質はヒト成長分化因子-1（human growth differentiation factor-1）(GDF-1)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置271-292からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E278B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５３５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR271Z, R277Z, H282Z, R283Z, 及び R289Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５３５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R271U, R277U, E278U, H282U, R283U及びR289U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５３５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５３９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L272Z, Y273Z, V274Z, S275Z, F276Z, V279Z, G280Z, W281Z, W284Z, V285Z, I286Z, A287Z, P288Z, G290Z, F291Z, L292Z, L272B, Y273B, V274B, S275B, F276B, V279B, G280B, W281B, W284B, V285B, I286B, A287B, P288B, G290B, F291B, 及び L292B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５３５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置341-365からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D351B, D354B, E362B, 及び D363B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５４０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR341Z 及び R359Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５４０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R341U, D351U, D354U, R359U, E362U, 及び D363U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５４０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L342Z, S343Z, P344Z, I345Z, S346Z, V347Z, L348Z, F349Z, F350Z, N352Z, S353Z, N355Z, V356Z, V357Z, L358Z, Q360Z, Y361Z, M36Z, V365Z, L342B, S343B, P344B, I345B, S346B, V347B, L348B, F349B, F350B, N352B, S353B, N355B, V356B, V357B, L358B, Q360B, Y361B, M36B, 及び V365B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５４０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４５】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４６】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５３４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-270, 293-340及び366-372からなる群から選ばれる位置である請求項５４６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４８】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, P2J, P3J, P4J, Q5J, Q6J, G7J, P8J, C9J, G10J, H11J, H12J, L13J, L14J, L15J, L16J, L17J, A18J, L19J, L20J, L21J, P22J, S23J, L24J, P25J, L26J, T27J, R28J, A29J, P30J, V31J, P32J, P33J, G34J, P35J, A36J, A37J, A38J, L39J, L40J, Q41J, A42J, L43J, G44J, L45J, R46J, D47J, E48J, P49J, Q50J, G51J, A52J, P53J, R54J, L55J, R56J, P57J, V58J, P59J, P60J, V61J, M62J, W63J, R64J, L65J, F66J, R67J, R68J, R69J, D70J, P71J, Q72J, E73J, T74J, R75J, S76J, G77J, S78J, R79J, R80J, T81J, S82J, P83J, G84J, V85J, T86J, L87J, Q88J, P89J, C90J, H91J, V92J, E93J, E94J, L95J, G96J, V97J, A98J, G9J, N100J, I101J, V102J, R103J, H104J, I105J, P106J, D107J, R108J, G109J, A110J, P111J, T112J, R113J, A114J, S115J, E116J, P117J, V118J, S119J, A120J, A121J, G122J, H123J, C12J, P125J, E126J, W127J, T128J, V129J, V130J, F131J, D132J, L133J, S134J, A135J, V136J, E137J, P138J, A139J, E140J, R141J, P142J, S143J, R144J, A145J, R146J, L147J, E148J, L149J, R150J, F151J, A152J, A153J, A154J, A155J, A156J, A157J, A158J, P159J, E160J, G161J, G162J, W163J, E164J, L165J, S166J, V167J, A168J, Q169J, A170J, G171J, Q172J, G173J, A174J, G175J, A176J, D177J, P178J, G179J, P180J, V181J, L182J, L183J, R184J, Q185J, L186J, V187J, P188J, A189J, L190J, G191J, P192J, P193J, V194J, R195J, A196J, E197J, L198J, L199J, G200J, A201J, A202J, W203J, A204J, R205J, N206J, A207J, S208J, W209J, P210J, R211J, S212J, L213J, R214J, L215J, A216J, L217J, A218J, L219J, R220J, P221J, R222J, A223J, P224J, A225J, A226J, C227J, A228J, R229J, L230J, A231J, E232J, A233J, S234J, L235J, L236J, L237J, V238J, T239J, L240J, D241J, P242J, R243J, L244J, C245J, H246J, P247J, L248J, A249J, R250J, P251J, R252J, R253J, D254J, A255J, E256J, P257J, V258J, L52J, G260J, G261J, G262J, P263J, G264J, G265J, A266J, C267J, R268J, A269J, R270J, A293J, N294J, Y295J, C296J, Q297J, G298J, Q299J, C300J, A301J, L302J, P303J, V304J, A305J, L306J, S307J, G308J, S309J, G310J, G311J, P312J, P313J, A314J, L315J, N316J, H317J, A318J, V319J, L320J, R321J, A322J, L323J, M324J, H325J, A326J, A327J, A328J, P329J, G330J, A331J, A332J, D333J, L334J, P335J, C336J, C337J, V338J, P339J, A340J, V366J, D367J, E368J, C369J, G370J, C371J, 及び R372J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５４７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５４９】
蛋白質はヒト成長分化因子-5（human growth differentiation factor-5）(GDF-5)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置404-425からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D411B, D415B, D416B, E423B及びE425（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５５０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がH406Z 及び K410Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５５０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H406U, K410U, D411U, D415U, D416U, E423U, 及び E425U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５５０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A404Z, L405Z, V407Z, N408Z, F409Z, M412Z, G413Z, W414Z, W417Z, I418Z, I419Z, A420Z, P421Z, L422Z, Y424Z, A404B, L405B, V407B, N408B, F409B, M412B, G413B, W414B, W417B, I418B, I419B, A420B, P421B, L422B, 及び Y424B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５５０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置470-494からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D480B, E491B, 及び D492B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５５５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR470Z 及び K488Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５５５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R470U, D480U, K488U, E491U, 及び D492U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５５５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５５９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L471Z, S472Z, P473Z, I474Z, S475Z, I476Z, L477Z, F478Z, I479Z, S481Z, A482Z, N483Z, N484Z, V485Z, V486Z, Y487Z, Q489Z, Y490Z, M493Z, V494Z, L471B, S472B, P473B, I474B, S475B, I476B, L477B, F478B, I479B, S481B, A482B, N483B, N484B, V485B, V486B, Y487B, Q489B, Y490B, M493B, 及び V494B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５５５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６０】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６１】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５４９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-403, 426-469及び495-501からなる群から選ばれる位置である請求項５６１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, R2J, L3J, P4J, K5J, L6J, L7J, T8J, F9J, L10J, L11J, W12J, Y13J, L14J, A15J, W16J, L17J, D18J, L19J, E20J, F21J, I22J, C23J, T24J, V25J, L26J, G27J, A28J, P29J, D30J, L31J, G32J, Q33J, R34J, P35J, Q36J, G37J, S38J, R39J, P40J, G41J, L42J, A43J, K44J, A45J, E46J, A47J, K48J, E49J, R50J, P51J, P52J, L53J, A54J, R55J, N56J, V57J, F58J, R59J, P60J, G61J, G62J, H63J, S64J, Y65J, G66J, G67J, G68J, A69J, T70J, N71J, A72J, N73J, A74J, R75J, A76J, K77J, G78J, G79J, T80J, G81J, Q82J, T83J, G84J, G85J, L86J, T87J, Q88J, P89J, K90J, K91J, D92J, E93J, P94J, K95J, K96J, L97J, P98J, P99J, R100J, P101J, G102J, G103J, P104J, E105J, P106J, K107J, P108J, G109J, H110J, P111J, P112J, Q113J, T114J, R115J, Q116J, A117J, T118J, A119J, R120J, T121J, V122J, T123J, P124J, K125J, G126J, Q127J, L128J, P129J, G130J, G131J, K132J, A133J, P134J, P135J, K136J, A137J, G138J, S139J, V140J, P141J, S142J, S143J, F144J, L145J, L146J, K147J, K148J, A149J, R150J, E151J, P152J, G153J, P154J, P155J, R156J, E157J, P158J, K159J, E160J, P161J, F162J, R163J, P164J, P165J, P166J, I167J, T168J, P169J, H170J, E171J, Y172J, M173J, L174J, S175J, L176J, Y177J, R178J, T179J, L180J, S181J, D182J, A183J, D184J, R185J, K186J, G187J, G188J, N189J, S190J, S191J, V192J, K193J, L194J, E195J, A196J, G197J, L198J, A199J, N200J, T201J, I202J, T203J, S204J, F205J, I206J, D207J, K208J, G209J, Q210J, D211J, D212J, R213J, G214J, P215J, V21J, V217J, R218J, K219J, Q220J, R221J, Y222J, V223J, F224J, D225J, I226J, S227J, A228J, L229J, E230J, K231J, D232J, G233J, L234J, L235J, G236J, A237J, E238J, L239J, R240J, I241J, L242J, R243J, K244J, K245J, P246J, S247J, D248J, T249J, A250J, K251J, P252J, A253J, V254J, P255J, R256J, S257J, R258J, R259J, A260J, A261J, Q262J, L263J, K264J, L265J, S266J, S267J, C268J, P269J, S270J, G271J, R272J, Q273J, P274J, A275J, A276J, L277J, L278J, D279J, V280J, R281J, S282J, V283J, P284J, G285J, L286J, D287J, G288J, S289J, G290J, W291J, E292J, V293J, F294J, D295J, I296J, W297J, K298J, L299J, F300J, R301J, N302J, F303J, K304J, N305J, S306J, A307J, Q308J, L309J, C310J, L311J, E312J, L313J, E314J, A315J, W316J, E317J, R318J, G319J, R320J, T321J, V322J, D323J, L324J, R325J, G326J, L327J, G328J, F329J, D330J, R331J, A332J, A333J, R334J, Q33J, 5J, V336J, H337J, E338J, K339J, A340J, L341J, F342J, L343J, V344J, F345J, G346J, R347J, T348J, K349J, K350J, R351J, D352J, L353J, F354J, F355J, N356J, E357J, I358J, K359J, A360J, R361J, S362J, G363J, Q364J, D365J, D366J, K367J, T368J, V369J, Y370J, E371J, Y372J, L373J, F374J, S375J, Q376J, R377J, R378J, K379J, R380J, R381J, A382J, P383J, S384J, A385J, T386J, R387J, Q388J, G389J, K390J, R391J, P392J, S393J, K394J, N395J, L396J, K397J, A398J, R399J, C400J, S401J, R402J, K403J, A426J, F427J, H428J, C429J, E430J, G431J, L432J, C433J, E434J, F435J, P436J, L437J, R438J, S439J, H440J, L441J, E442J, P443J, T444J, N445J, H446J, A447J, V448J, I449J, Q450J, T451J, L452J, M453J, N454J, S455J, M456J, D457J, P458J, E459J, S460J, T461J, P462J, P463J, T464J, C465J, C466J, V467J, P468J, T469J, V495J, E496J, S497J, C498J, G499J, C500J, 及び R501J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５６２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６４】
蛋白質はヒト成長分化因子（human growth differentiation factor）(GDF)-8サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置286-305からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D289B, E291B, 及び D296（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５６５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK302, R303, 及びK305（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５６５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D289U, E291U, D296U, K302U, R303U及びK305U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５６５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５６９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L286Z, T287Z, V288Z, F290Z, A292Z, F293Z, G294Z, W295Z, W297Z, I298Z, I299Z, A300Z, P301Z, Y304Z, L286B, T287B, V288B, F290B, A292B, F293B, G294B, W295B, W297B, I298B, I299B, A300B, P301B, 及び Y304B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５６５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置344-368からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E357B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５７０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK344Z, K356Z, 及び K363Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５７０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K344U, K356U, E357U, 及び K363U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５７０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、M345Z, S346Z, P347Z, I348Z, N349Z, M350Z, L351Z, Y352Z, F353Z, N354Z, G355Z, Q358Z, I359Z, I360Z, Y361Z, G362Z, I364Z, P365Z, A366Z, M367Z, V368Z, M345B, S346B, P347B, I348B, N349B, M350B, L351B, Y352B, F353B, N354B, G355B, Q358B, I359B, I360B, Y361B, G362B, I364B, P365B, A366B, M367B, 及び V368B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５７０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７５】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７６】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５６４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-285, 306-343及び369-375からなる群から選ばれる位置である請求項５７６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７８】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, Q2J, K3J, L4J, Q5J, L6J, C7J, V8J, Y9J, I10J, Y11J, L12J, F13J, M14J, L15J, I16J, V17J, A18J, G19J, P20J, V21J, D22J, L23J, N24J, E25J, N26J, S27J, E28J, Q29J, K30J, E31J, N32J, V33J, E34J, K35J, E36J, G37J, L38J, C39J, N40J, A41J, C42J, T43J, W44J, R45J, Q46J, N47J, T48J, K49J, S50J, S51J, R52J, I53J, E54J, A55J, I56J, K57J, I58J, Q59J, I60J, L61J, S62J, K63J, L64J, R65J, L66J, E67J, T68J, A69J, P70J, N71J, I72J, S73J, K74J, D75J, V76J, I77J, R78J, Q79J, L80J, L81J, P82J, K83J, A84J, P85J, P86J, L87J, R88J, E89J, L90J, I91J, D92J, Q93J, Y94J, D95J, V96J, Q97J, R98J, D99J, D100J, S101J, S102J, D103J, G104J, S105J, L106J, E107J, D108J, D109J, D110J, Y111J, H112J, A113J, T114J, T115J, E116J, T117J, I118J, I119J, T120J, M121J, P122J, T123J, E124J, S125J, D126J, F127J, L128J, M129J, Q130J, V131J, D132J, G133J, K134J, P135J, K136J, C137J, C138J, F139J, F140J, K141J, F142J, S143J, S144J, K145J, I146J, Q147J, Y148J, N149J, K150J, V151J, V152J, K153J, A154J, Q155J, L156J, W157J, I158J, Y159J, L160J, R161J, P162J, V163J, E164J, T165J, P166J, T167J, T168J, V169J, F170J, V171J, Q172J, I173J, L174J, R175J, L176J, I177J, K178J, P179J, M180J, K181J, D182J, G183J, T184J, R185J, Y186J, T187J, G188J, I189J, R190J, S191J, L192J, K193J, L194J, D195J, M196J, N197J, P198J, G199J, T200J, G201J, I202J, W203J, Q204J, S205J, I206J, D207J, V208J, K209J, T210J, V211J, L212J, Q213J, N214J, W215J, L216J, K217J, Q218J, P219J, E220J, S221J, N222J, L223J, G224J, I225J, E226J, I227J, K228J, A229J, L230J, D231J, E232J, N233J, G234J, H235J, D236J, L237J, A238J, V239J, T240J, F241J, P242J, G243J, P244J, G245J, E246J, D247J, G248J, L249J, N250J, P251J, F252J, L253J, E254J, V255J, K256J, V257J, T258J, D259J, T260J, P261J, K262J, R263J, S264J, R265J, R266J, D267J, F268J, G269J, L270J, D271J, C272J, D273J, E274J, H275J, S276J, T277J, E278J, S279J, R280J, C281J, C282J, R283J, Y284J, P285J, A306J, N307J, Y308J, C309J, S310J, G311J, E312J, C313J, E314J, F315J, V31GJ, F317J, L318J, Q319J, K320J, Y321J, P322J, H323J, T324J, H325J, L326J, V327J, H328J, Q329J, A330J, N331J, P332J, R333J, G334J, S335J, A336J, G337J, P338J, C339J, C340J, T341J, P342J, T343J, V369J, D370J, R371J, C372J, G373J, C374J, 及び S375J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５７7のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５７９】
蛋白質はヒト成長分化因子-９（human growth differentiation factor-9）(GDF-9)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置357-378からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D357B及びD368B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５８０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR359Z, K366Z, H375Z及びR376Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５８０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D357U, R359U, K366U, D368U, H375U及びR376U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５８０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、F358Z, L360Z, S361Z, F362Z, S363Z, Q364Z, L365Z, W367Z, N369Z, W370Z, I371Z, V372Z, A373Z, P374Z, Y377Z, N378Z, F358B, L360B, S361B, F362B, S363B, Q364B, L365B, W367B, N369B, W370B, I371B, V372B, A373B, P374B, Y377B, 及び N378B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５８０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置423-447からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E433B, D435B, E442B, E444B及びD445B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５８５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK423Z 及び K441Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５８５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K423U, E433U, D435U, K441U, E442U, E444U, 及び D445U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５８５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５８９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y424Z, S425Z, P426Z, L427Z, S428Z, V429Z, L430Z, T431Z, I432Z, P434Z, G436Z, S437Z, I438Z, A439Z, Y440Z, Y443Z, M446Z, I447Z, Y424B, S425B, P426B, L427B, S428B, V429B, L430B, T431B, I432B, P434B, G436B, S437B, I438B, A439B, Y440B, Y443B, M446B, 及び I447B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５８５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９０】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９１】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５７９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-356, 379-422及び448-454からなる群から選ばれる位置である請求項５９１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, A2J, R3J, P4J, N5J, K6J, F7J, L8J, L9J, W10J, F11J, C12J, C13J, F14J, A15J, W16J, L17J, C18J, F19J, P20J, I21J, S22J, L23J, G24J, S25J, Q26J, A27J, S28J, G29J, G30J, E31J, A32J, Q33J, I34J, A35J, A36J, S37J, A38J, E39J, L40J, E41J, S42J, G43J, A44J, M45J, P46J, W47J, S48J, L49J, L50J, Q51J, H52J, I53J, D54J, E55J, R56J, D57J, R58J, A59J, G60J, L61J, L62J, P63J, A64J, L65J, F66J, K67J, V68J, L69J, S70J, V71J, G72J, R73J, G74J, G75J, S76J, P77J, R78J, L79J, Q80J, P81J, D82J, S83J, R84J, A85J, L86J, H87J, Y88J, M89J, K90J, K91J, L92J, Y93J, K94J, T95J, Y96J, A97J, T98J, K99J, El00J, G101J, I102J, P103J, K104J, S105J, N106J, R107J, S108J, H109J, L110J, Y111J, N112J, T113J, V114J, R115J, L116J, F117J, T118J, P119J, C120J, T121J, R122J, H123J, K124J, Q125J, A126J, P127J, G128J, D129J, Q130J, V131J, T132J, G133J, I134J, L135J, P136J, S137J, V138J, E139J, L140J, L141J, F142J, N143J, L144J, D145J, R146J, I147J, T148J, T149J, V150J, E151J, H152J, L153J, L154J, K155J, S156J, V157J, L158J, L159J, Y160J, N161J, I162J, N163J, N164J, S165J, V166J, S167J, F168J, S169J, S170J, A171J, V172J, K173J, C174J, V175J, C176J, N177J, L178J, M179J, I180J, K181J, E182J, P183J, K184J, S185J, S186J, S187J, R188J, T189J, L190J, G191J, R192J, A193J, P194J, Y195J, S196J, F197J, T198J, F199J, N200J, S201J, Q202J, F203J, E204J, F205J, G206J, K207J, K208J, H209J, K210J, W211J, I212J, Q213J, I214J, D215J, V216J, T217J, S218J, L219J, L220J, Q221J, P222J, L223J, V224AJ, 225J, S226J, N227J, K228J, R229J, S230J, I231J, H232J, M233J, S234J, I235J, N236J, F237J, T238J, C239J, M240J, K241J, D242J, Q243J, L244J, E245J, H246J, P247J, S248J, A249J, Q250J, N251J, G252J, L253J, F254J, N255J, M256J, T257J, L258VJ, 259J, S260J, P261J, S262J, L263J, I264J, L265J, Y266J, L267J, N268J, D269J, T270J, S271J, A272J, Q273J, A274J, Y275J, H276J, S277J, W278J, Y279J, S280J, L281J, H282J, Y283J, K284J, R285J, R286J, P287J, S288J, Q289J, G290J, P291J, D292J, Q293J, E294J, R295J, S296J, L297J, S298J, A299J, Y300J, P301J, V302J, G303J, E304J, E305J, A306J, A307J, E308J, D309J, G310J, R311J, S312J, S313J, H314J, H315J, R316J, H317J, R318J, R319J, G320J, Q321J, E322J, T323J, V324J, S325J, S326J, E327J, L328J, K329J, K330J, P331J, L332J, G333J, P334J, A335J, S336J, F337J, N338J, L339J, S340J, E341J, Y342J, F343J, R344J, Q345J, F346J, L347J, L348J, P349J, Q350J, N351J, E352J, C353J, E354J, L355J, H356J, P379J, R380J, Y381J, C382J, K383J, G384J, D385J, C386J, P387J, R388J, A389J, V390J, G391J, H392J, R393J, Y394J, G395J, S396J, P397J, V398J, H399J, T400J, M401J, V402J, Q403J, N404J, I405J, I406J, Y407J, E408J, K409J, L410J, D411J, S412J, S413J, V414J, P415J, R416J, P417J, S418J, C419J, V420J, P421J, A422J, A448J, T449J, K450J, C451J, T452J, C453J, 及び R454J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９４】
蛋白質はヒトアルテミン(artemin)(GDNF)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置144-163からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項５９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D159B及びE160B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項５９５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR150Z, H156Z, R157Z, 及び R163Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項５９５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R150U, H156U, R157U, D159U, E160U, 及び R163U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項５９５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項５９９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S144Z, Q145Z, L146Z, V147Z, P148Z, V149Z, A151Z, L152Z, G153Z, L154Z, G155Z, S518Z, L161Z, V162Z, S144B, Q145B, L146B, V147B, P148B, V149B, A151B, L152B, G153B, L154B, G155B, S518B, L161B, 及び V162B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項５９５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６００】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置209-229からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項５９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E211B, D217B, 及び D226B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６００のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR209Z, R223Z, 及び R227Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６００のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R209U, E211U, D217U, R223U, D226U, 及び R227U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６００のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y210Z, A212Z, V213Z, S214Z, F215Z, M216Z, V218Z, N219Z, S220Z, T221Z, W222Z, T224Z, V225Z, L228Z, S229Z, Y210B, A212B, V213B, S214B, F215B, M216B, V218B, N219B, S220B, T221B, W222B, T224B, V225B, L228B, 及び S229B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６００のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０５】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項５９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０６】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項５９４のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０７】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-143, 164-208及び230-237からなる群から選ばれる位置である請求項６０６のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０８】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, P2J, G3J, L4J, I5J, S6J, A7J, R8J, G9J, Q10J, P11J, L12J, L13J, E14J, V15J, L16J, P17J, P18J, Q19J, A20J, H21J, L22J, G23J, A24J, L25J, F26J, L27J, P28J, E29J, A30J, P31J, L32J, G33J, L34J, S35J, A36J, Q37J, P38J, A39J, L40J, W41J, P42J, T43J, L44J, A45J, A46J, L47J, A48J, L49J, L50J, S51J, S52J, V53J, A54J, E55J, A56J, S57J, L58J, G59J, S60J, A61J, P62J, R63J, S64J, P65J, A66J, P67J, R68J, E69J, G70J, P71J, P72J, P73J, V74J, L75J, A76J, S77J, P78J, A79J, G80J, H81J, L82J, P83J, G84J, G85J, R86J, T87J, A88J, R89J, W90J, C91J, S92J, G93J, R94J, A95J, R96J, R97J, P98J, P99J, P100J, Q101J, P102J, S103J, R104J, P105J, A106J, P107J, P108J, P109J, P110J, A111J, P112J, P113J, S114J, A115J, L116J, P117J, R118J, G119J, G120J, R121J, A122J, A123J, R124J, A125J, G126J, G127J, P128J, G129J, S130J, R131J, A132J, R133J, A134J, A135J, G136J, A137J, R138J, G139J, C140J, R141J, L142J, R143J, F164J, R165J, F166J, C167J, S168J, G169J, S170J, C171J, R172J, R173J, A174J, R175J, S176J, P177J, H178J, D179J, L180J, S181J, L182J, A183J, S184J, L185J, L186J, G187J, A188J, G189J, A190J, L191J, R192J, P193J, P194J, P195J, G196J, S197J, R198J, P199J, V200J, S201J, Q202J, P203J, C204J, C205J, R206J, P207J, T208J, A230J, T231J, A232J, C233J, G234J, C235J, L236J, 及び G237J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６０７のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６０９】
蛋白質はヒトグリア細胞由来因子(human glial cell derived factor)(GDNF)/ペルセフィン(Persephin)サブユニットである請求項１９２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置70-89からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項６０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E77B, E85B及びE86B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がK87Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E77U, E85U, E86U及びK87U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S70Z, L71Z, T72Z, L73Z, S74Z, V75Z, A76Z, L78Z, G79Z, L80Z, G81Z, Y82Z, A83Z, S84Z, V88Z, I89Z, S70B, L71B, T72B, L73B, S74B, V75B, A76B, L78B, G79B, L80B, G81B, Y82B, A83B, S84B, V88B, 及び I89B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６１０のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置128-148からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項６０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D131B, D136B及びD137B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６１５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異がR128Z, R138Z, H139Z, R140Z及びR143Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６１５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R128U, D131U, D136U, D137U, R138U, H139U, R140U及びR143U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６１５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６１９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、Y129Z, T130Z, V132Z, A133Z, F134Z, L135Z, W141Z, Q142Z, L144Z, P145Z, Q146Z, L147Z, S148Z, Y129B, T130B, V132B, A133B, F134B, L135B, W141B, Q142B, L144B, P145B, Q146B, L147B, 及び S148B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６１５のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６２０】
ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリーモノマーはもう１つのシスチンノット成長因子モノマーに連結されている請求項６０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６２１】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６０９のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６２２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-69, 90-127及び149-156からなる群から選ばれる位置である請求項６２１のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６２３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がM1J, A2J, V3J, G4J, K5J, F6J, L7J, L8J, G9J, S10J, L11J, L12J, L13J, L14J, S15J, L16J, Q17J, L18J, G19J, Q20J, G21J, W22J, G23J, P24J, D25J, A26J, R27J, G28J, V29J, P30J, V31J, A32J, D33J, G34J, E35J, F36J, S37J, S38J, E39J, Q40J, V41J, A42J, K43J, A44J, G45J, G46J, T47J, W48J, L49J, G50J, T51J, H52J, R53J, P54J, L55J, A56J, R57J, L58J, R59J, R60J, A61J, L62J, S63J, G64J, P65J, C66J, Q67J, L68J, W69J, F90J, R91J, Y92J, C93J, A94J, G95J, S96J, C97J, P98J, R99J, G100J, A101J, R102J, T103J, Q104J, H105J, G106J, L107J, A108J, L109J, A110J, R111J, L112J, Q113J, G114J, Q115J, G116J, R117J, A118J, H119J, G120J, G121J, P122J, C123J, C124J, R125J, P126J, T127J, A149J, A150J, A151J, C152J, G153J, C154J, G155J, 及び G156J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６２２のヒトトランスフォーミング成長因子ファミリー蛋白質。
【請求項６２４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E3B, E19B, 及びE21B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６２５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K2Z, K6Z, K8Z, K10Z及びK20Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６２６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K2U, E3U, R6U, R8U, R10U, E19U, K20U 及び E21U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６２７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S1Z, P4Z, L5Z, P7Z, C9Z, P11Z, I12Z, N13Z, A14Z, T15Z, L16Z, A17Z, V18Z, G22Z, C23Z, P24Z, V25Z, C26Z, I27Z, T28Z, V29Z, N30Z, T31Z, T32Z, I33Z, C34Z, A35Z, G36Z, Y37Z, S1B, P4B, L5B, P7B, C9B, P11B, I12B, N13B, A14B, T15B, L16B, A17B, V18B, G22B, C23B, P24B, V25B, C26B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, I33B, C34B, A35B, G36B及びY37B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６２８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D61B 及び E65B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６２９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60Z, R63Z, R68Z, 及び R73Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項７０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60U, D61U, R63U, E65U, R68U, 及び R74U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項７０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、N58Z, Y59Z, V62Z, F64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, N77Z, P78Z, V79Z, V80Z, S81Z, Y82Z, A83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, N58B, Y59B, V62B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, V79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項７０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３２】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置38-57及び88-140からなる群から選ばれる位置である請求項６３２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３４】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がC38J, P39J, T40J, M41J, T42J, R43J, V44J, L45J, Q46J, G47J, V48J, L49J, P50J, A51J, L52J, P53J, Q54J, V55J, V56J, C57J, C88J, Q89J, C90J, A91J, L92J, C93J, R94J, R95J, S96J, T97J, T98J, D99J, C100J, G101J, G102J, P103J, K104J, D105J, H106J, P107J, L108J, T109J, C110J, D111J, D112J, P113J, R114J, F115J, Q116J, D117J, S118J, S119J, S120J, Sl21J, K122J, A123J, P124J, P125J, P126J, S127J, L128J, P129J, S130J, P131J, S132J, R133J, L134J, P135J, G136J, P137J, S138J, D139J, 及び T140J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６３３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E3B, E19B, 及び E21B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R2Z, R6Z, H10Z, 及び K20Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項７４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R2U, E3U, R6U, E19U, K20U 及び E21U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項７４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、S1Z, P4Z, L5Z, P7Z, W8Z, C9Z, P11Z, I12Z, N13Z, A14Z, I15Z, L16Z, A17Z, V18Z, G22Z, C23Z, P24Z, V25Z, C26Z, I27Z, T28Z, V29Z, N30Z, T31Z, T32Z, I33Z, S1B, P4B, L5B, P7B, W8B, C9B, P11B, I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A17B, V18B, G22B, C23B, P24B, V25B, C26B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, 及び I33B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項７４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６３９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D61B, E65B, 及び D77B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60Z, R63Z, R68Z, 及び R74Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R60U, D61U, R63U, E65U, R68U, R74U, 及び D77U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T58Z, Y59Z, V62Z, I64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, P78Z, V79Z, V80Z, S81Z, F82Z, P83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, T58B, Y59B, V62B, I64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, P78B, V79B, V80B, S81B, F82B, P83B, V84B, A85B, L86B, 及び S87B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４３】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項７３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４４】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置34-57及び88-121からなる群から選ばれる位置である請求項６４３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４５】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がA35J, G36J, Y37J, C38J, P39J, T40J, M41J, M42J, R43J, V44J, L45J, Q46J, A47J, V48J, L49J, P50J, P51J, L52J, P53J, Q54J, V55J, V56J, C57J, C88J, R89J, C90J, G91J, P92J, C93J, R94J, R95J, S96J, T97J, S98J, D99J, C100J, G101J, G102J, P103J, K104J, D105J, H106J, P107J, L108J, T109J, C110J, D111J, H112J, P113J, Q114J, L115J, S116J, G117J, L118J,J, L119J, F120J, 及び L121J（式中Ｊは任意のアミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６４４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E4B, El3B, El5B及びEl6B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K14Z 及び R18Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E4U, E13U, K14U, E15U, E16U 及び Rl8U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６４９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、L5Z, T6Z, N7Z, I8Z, T9Z, I10Z, A11Z, I12Z, C17Z, F19Z, C20Z, I21Z, S22Z, I23Z, N24Z, T25Z, T26Z, W27Z, L5B, T6B, N7B, I8B, T9B, I10B, A11B, I12B, C17B, F19B, C20B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T26B, 及び W27B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項８０のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D69B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H66Z, H67Z, 及び H81Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H66U, H67U, D69U及びH81U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、A66Z,H67Z, H68Z, A69Z, D70Z, S71Z, L72Z, Y73Z, T74Z, Y75Z, P76Z, V77Z, A78Z, T79Z, Q80Z, A66B, H67B, H68B, A69B, D70B, S71B, L72B, Y73B, T74B, Y75B, P76B, V77B, A78B, T79B, 及び Q80B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５４】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項７９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５５】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-3, 28-64及び82-109からなる群から選ばれる位置である請求項６５４のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５６】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がN1J, S2J, C3J, A29J, G30J, Y31J, C32J, Y33J, T34J, R35J, D36J, L37J, V38J, Y39J, K40J, D41J, P42J, A43J, R44J, P45J, K46J, i47J, t48J, C49J, T50J, F51J, K52J, E53J, L54J, V55J, Y56J, E57J, T58J, V59J, R60J, V61J, P62J, G63J, C64J, C82J, G83J, K84J, C85J, D86J, S87J, D88J, S89J, T90J, D91J, C92J, T93J, V94J, R95J, G96J, L97J, G98J, P99J, S100J, Y101J, C102J, S103J, F104J, G105J, E106J, M107J, K108J, 及び E109J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６５５のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５７】
蛋白質は甲状腺刺激ホルモン(TSH)βサブユニットである請求項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置1-30からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項６５７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６５９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E6B, E12B, 及びE15B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、H10Z, R13Z, 及びR14Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６１】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E6U, H10U, E12U, R13U, R14U 及び E15U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、I1Z, C2Z, I3Z, P4Z, T5Z, Y7Z, T8Z, M9Z, I11Z, C16Z, A17Z, Y18Z, C19Z, L20Z, T21Z, I22Z, N23Z, T24Z, T25Z, I26Z, C27Z, A28Z, G29Z, Y30Z, I1B, C2B, I3B, P4B, T5B, Y7B, T8B, M9B, I11B, C16B, A17B, Y18B, C19B, L20B, T21B, I22B, N23B, T24B, T25B, I26B, C27B, A28B, G29B, 及び Y30B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６５８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置53-87からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項６５７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、D56B 及び D69B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６６３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R55Z, R60Z, H70Z, K84Z及びK87Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６６３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、R55U, D56U, R60U, E63U, H70U, K84U及びK87U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６６３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、T53Z, Y54Z, F57Z, I58Z, Y59Z, T61Z, V62Z, I64Z, P65Z, G66Z, C67Z, P68Z, L69Z, V71Z, A72Z, P73Z, Y74Z, F75Z, S76Z, Y77Z, P78Z, V79Z, A80Z, L81Z, S82Z, C83Z, C85Z, G86Z, T53B, Y54B, F57B, I58B, Y59B, T61B, V62B, I64B, P65B, G66B, C67B, P68B, L69B, V71B, A72B, P73B, Y74B, F75B, S76B, Y77B, P78B, V79B, A80B, L81B, S82B, C83B, C85B, 及び G86B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６６３のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６８】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６５７のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６６９】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置31-52 及び 88-118からなる群から選ばれる位置である請求項６６８のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７０】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がC31J, M32J, T33J, R34J, D35J, I36J, N37J, G38J, K39J, L40J, F41J, L42J, P43J, K44J, Y45J, A46J, L47J, S48J, Q49J, D50J, V51J, C52J, C88J, N89J, T90J, D91J, Y92J, S93J, D94J, C95J, I96J, H97J, E98J, A99J, I100J, K101J, T102J, N103J, Y104J, C105J, T106J, K107J, P108J, Q109J, K110J, S111J, Y112J, L113J, V114J, G115J, F116J, S117J, 及び V118J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６６９のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７１】
蛋白質はヒト糖蛋白質αサブユニットである請求項６６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７２】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置8-30からなる群から選ばれる位置でのL1 βヘアピンループ中にある請求項６７１のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７３】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E9B及びE14B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６７２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７４】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E9U 及び E14U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６７２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７５】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、P8Z, C10Z, T11Z, L12Z, Q13Z, N15Z, P16Z, F17Z, F18Z, S19Z, Q20Z, P21Z, G22Z, A23Z, P24Z, I25Z, L26Z, Q27Z, C28Z, M29Z, G30Z, P8B, C10B, T11B, L12B, Q13B, N15B, P16B, F17B, F18B, S19B, Q20B, P21B, G22B, A23B, P24B, I25B, L26B, Q27B, C28B, M29B, 及び G30B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６７２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７６】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、位置61-85からなる群から選ばれる位置でのL3 βヘアピンループ中にある請求項６７１のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７７】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、E77B（式中Ｂは塩基性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの塩基性残基を導入する突然変異を含む請求項６７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７８】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K63Z, R67Z, K75Z, H79Z及びH83Z（式中Ｚは酸性アミノ酸残基である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸性残基を導入する突然変異を含む請求項６７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６７９】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、K63U, R67U, K75U, E77U, H79U及びH83U（式中Ｕは中性アミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つの中性残基を導入する突然変異を含む請求項６７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６８０】
少なくとも１つの静電的電荷を変更する突然変異が、V61Z, A62Z, S64Z, Y65Z, N66Z, V68Z, T69Z, V70Z, M71Z, G72Z, G73Z, F74Z, V76Z, N78Z, T80Z, A81Z, C82Z, C84Z, S85Z, V61B, A62B, S64B, Y65B, N66B, V68B, T69B, V70B, M71B, G72B, G73B, F74B, V76B, N78B, T80B, A81B, C82B, C84B, 及び S85B（式中Ｚは酸性アミノ酸であり、及びＢは塩基性アミノ酸である。）からなる群から選ばれる少なくとも１つの荷電した残基を導入する突然変異を含む請求項６７６のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６８１】
前記βヘアピンループ構造の外側の突然変異をさらに含み、それにより前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異は前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６７１のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６８２】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異が、位置1-7, 31-60及び86-92からなる群から選ばれる位置である請求項６８１のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【請求項６８３】
前記βヘアピンループ構造の外側の前記突然変異がA1J, P2J, D3J, V4J, Q5J, D6J, C7J, C31J, C32J, F33J, S34J, R35J, A36J, Y37J, P38J, T39J, P40J, L41J, R42J, S43J, K44J, K45J, T46J, M47J, L48J, V49J, Q50J, K51J, N52J, V53J, T54J, S55J, E56J, S57J, T58J, C59J, C60J, T86J, C87J, Y88J, Y89J, H90J, K91J, 及び S92J（式中Ｊは任意のアミノ酸である）からなる群から選ばれる少なくとも１つのコンフォーメーションを変更する突然変異を含み、それは前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質の前記βヘアピン構造と前記ヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質に親和性を有する受容体との間の静電的相互作用の増大をもたらす請求項６８２のヒト糖蛋白ホルモンファミリー蛋白質。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の詳細な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的にタンパク質成長因子の分野に関する。特に具体的には、本発明は、所望の薬理的な性質を有するシステインノット成長因子（ＣＫＧＦ）ミュータントに関する。本発明は、更に、これらミュータントを製造する方法、薬学的な組成物、及びこれらに基づく治療及び診断方法にも関する。
【０００１】
発明の背景
成長因子は、細胞の成長、分化及び細胞−細胞伝達を調節するタンパク質の多様な群である。成長因子−媒介プロセスを支配する分子的なメカニズムはほとんど未知のままであるが、成長因子を構造的及び機能的な類似に基づいていくつかのスーパーファミリーの一つに分類できることが知られている。
【０００２】
４つの別々のタンパク質ファミリーを示す、４種の異なる成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の結晶構造から、ファミリーのメンバーが構造的に関係し、共通の全体的なトポロジーを共有していることが明らかになった。これら４種のタンパク質はほとんど配列のホモロジーを共有しないが、"システイン−ノット"コンホメーション中に結合する６個のシステインの特徴的な配列が存在していた。これらタンパク質の活性型は、ホモダイマー又はヘテロダイマーのいずれかのダイマーである。変異の分析によって、６個いずれの保存されたシステイン残基の変異が成長因子活性を失わせる結果を招くことが判明した（Brunner et al., 1992, Mol. Endocrinol. 6:1691-1700;, Glase et al., 1987, Science 236:1315-18）。
【０００３】
システインノット成長因子間で共有する著しい構造的な類似は、共通の祖先の遺伝子からの進化を示唆する。ＣＫＧＦスーパーファミリーの構造的及び機能的な性質、及びＴＧＦ−β、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ及びｈＣＧの結晶構造については、Ｓｕｎ及びＤａｖｉｅｓ（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995, 24:269-291）、ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ（Cell, 1993, 73:421-424）及びＭｕｒｒａｙ−Ｒｕｓｔら（Structure, 1993, 1:153-159）によって総説されている。
【０００４】
糖タンパク質ホルモン
糖タンパク質ホルモンは、再生及び代謝の調節に関与する進化的に保存されたホルモンの群である（Pierce 及び Parsons, 1981, Endocr. Rev. 11:354-385）。このホルモンのファミリーは卵胞−刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）を含む。構造的には、糖タンパク質ホルモンは、共通のα−サブユニット及びホルモン−特異的なβ−サブユニットからなるヘテロダイマーである。
【０００５】
ヒト糖タンパク質ホルモン内の構造−機能関係は、ゴナドトロピン群のモデル、特にヒトＣＧに、実質的に基づいている。近年、部分的な脱グリコシル化したｈＣＧの結晶構造によって、他の糖タンパク質ホルモンに関連する２つの鍵となる構造的な特徴が明らかとなった（Lapthorn et al., 1994, Nature 369:455-461; Wu et al., 1994, Structure 2:548-558）。共通のα−サブユニットは、全てがジスルフィド結合中にある１０個の半−シスチン残基を含む９２個のアミノ酸のアポタンパク質のコアを含む。提案される対は、１０−６０、２８−８２、３２−８４、７−３１及び５９−８７である。結合２８−８２及び３２−８４は、システイン残基１０及び６０を架橋する結合によって貫通された環構造を形成し、その結果、コア内に、３種のヘアピン構造を形成する−システインノット−を作る。α−サブユニット及びｈＣＧβ−サブユニットは全体的に類似のトポロジーを有し、各サブユニットは、（３つのジスルフィド結合によって形成される）中心のシステインノットの一方の側上に２つのβ−ヘアピンループ（Ｌ１及びＬ３）及び他方上に長いループ（Ｌ２）を有する。
【０００６】
ＴＳＨは、脳下垂体前葉の甲状腺刺激ホルモン分泌細胞中に産生される２８−３０ｋＤａのヘテロダイマーの糖タンパク質である。このホルモンは、Ｇタンパク質−結合ＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ）（Vassant 及び Dumont, 1992, Endocr. Rev. 13:596-611）と相互作用することによって、甲状腺の機能を支配し、結果としてサイクリック  アデノシン３'５'−モノフォスフェート（ｃＡＭＰ）等の第２のメッセンジャー分子に関与する経路の刺激を導き、結果として究極的に甲状腺の遺伝子発現の調節を招く。ＴＳＨの生理学的な役割は、ヨウ素取り込み等の分化した甲状腺機能の刺激、該腺からの甲状腺ホルモンの遊離、及び甲状腺の成長の促進を含む（Wondisford et al., 1996, Thyrotropin. In: Braverman et al(eds.), Werner 及び Ingbar's The Thyroid, Lippencott-Raven, Philadelphia, pp190-207）。
【０００７】
構造的には、糖タンパク質ホルモンは共通のα−サブユニット及びホルモンの特異的なβ−サブユニットからなる関連したヘテロダイマーである。上述したように、共通のヒトα−サブユニットは、全てがジスルフィド結合中にある１０個の半−シスチン残基を含む９２個のアミノ酸のアポタンパク質のコアを含む。該α−サブユニットは、ヒトにおいては染色体６上に位置する単一の遺伝子によってコードされており、与えられた種の範囲内においてアミノ酸配列は同一である（Fiddes 及び Goodman, 1981, J. Mol. Appl. Gen. 1:3-18）。ホルモン特異的なβ−サブユニット遺伝子は、長さ、構造的な組織及び染色体上での位置が異なる（Shupnik et al., 1989, Endocr. Rev. 10:459-475）。該ヒトＴＳＨβ−サブユニット遺伝子は、１１８アミノ酸残基を有する成熟したタンパク質であると予測され、染色体１上に位置する（Wondisford et al.,上記）。種々のβ−サブユニットは、６個のジスルフィド結合を形成する１２個の不変の半−シスチン残基によって整列化できる。３０〜８０％のアミノ酸配列がホルモン間で同一であるにもかかわらず、β−サブユニットは、高い特異性を有する異なるレセプター結合を示す（Pierce 及び Parsons,上記）。
【０００８】
重要的には、糖タンパク質ホルモンの糖質の部分は、ホルモン重量の１５―３５％を構成する。共通のα−サブユニットは２個のアスパラギン（Ｎ）−結合オリゴサッカライドを有し、β−サブユニットは（ＴＳＨ及びＬＨでは）１個、（ＣＧ及びＦＳＨでは）２個を有する。加えて、ＣＧβ−サブユニットは４個のセリン（Ｏ）−結合グリコシル化部位と共に、特有の３２残基のカルボキシル−末端延長ペプチド（ＣＴＥＰ）を有する。（Baenziger, 1994, Glycosylation 及び glyco蛋白質 hormone function, in Lustbander et al. (eds.) Glyco蛋白質 Hormones: Structure, Function 及び Clinical Implications. Springer-Verlag, New York, pages 167-174）。
【０００９】
ヒトＴＳＨにおける分子的な研究が、ＴＳＨβ−サブユニットｃＤＮＡ及び遺伝子のクローニング（Joshi et al., 1995, Endocrinol. 136:3839-3848）、ＴＳＨレセプターｃＤＮＡのクローニング（Parmentier et al., 1989,  Science, 246:1620-1622; Nagayama et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 166:394-403）、及び組換えＴＳＨの発現（Cole et al., 1993, Bio/Technol. 11:1014-1024; Grossmann et al., 1995, Mol. Endocrinol. 9:948-958; Szkudlinski et al, 1996 上記）によって容易になった。これまでの構造−機能研究は、一次的に高く保存された領域に集中したＴＳＨ及びキメラのサブユニットの創造に向けられた。しかしながら、これらアプローチは、インビトロでの生物学的活性を有するミュータントホルモンを導かなかった（Grossmann et al., 1997, Endocr. Rev. 18:476-501）。
【００１０】
循環における糖タンパク質ホルモンの半減期の延ばす方法も、また展開された。遺伝子融合実験において、数個のＯ−結合糖質を有するｈＣＧ  βサブユニットのカルボキシル−末端延長ペプチド（ＣＴＥＰ）が、ヒトＴＳＨβサブユニットに結合した（Joshi et al., 1995, Endocrinol., 136:3839-3848; Grossmann et al., 1997, J. Biol. Chem. 277:21312-21316）。これらキメラのインビトロでの活性は、変化無かったが、それらの循環の半減期は、延び、インビボの生物学的活性において増強された。加えて、単一鎖の融合タンパク質としてのβ及びαサブユニット発現が、安定性を増強させ、野生型の糖タンパク質ホルモンに比して血漿の半減期を延ばした（Sugahara et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2041-2045; Grossmann et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:21312-21316）。
【００１１】
甲状腺癌の診断及びモニタリングにおけるＴＳＨの使用
組換えＴＳＨを、分化した甲状腺癌を有する１９人の被験者の診断及びフォローアップにおける131Ｉ取り込み及びサイログロブリンを分泌を刺激するために試験し、甲状腺ホルモンの中止の副作用を阻止した（Meier et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 78:188-196）。最初の試みの予備的な結果は、高く奨励できる。米国における甲状腺癌の発生率は１年につき約14000ケースである。これらのほとんどは分化しており、乳頭又は卵胞の癌がほぼ共通のサブタイプである。そのような分化した甲状腺癌の１０−及び２０−歳の生存率は、各々９０％及び６０％であり、長期のモニタリングで局所的な再発を検出しており、そのような被験者、特に癌が第１回目の治療後に１０年後再発した被験者の管理において遠い転移が必須となっている。フォロー−アップに使用される主要な方法は、全身の放射性ヨウ素のスキャンニング及び血清サイログロブリン測定である。これら診断の手段の最適の感受性においては、131Ｉ取り込み及びサイログロブリンを分泌を促進させるためのＴＳＨによる残りの甲状腺組織への刺激が要求される。しかしながら、甲状腺摘出術後の甲状腺癌被験者は、甲状腺ホルモンで治療され、甲状腺機能正常を維持すると共に、内因性のＴＳＨを抑制して残りの甲状腺組織での潜在的なＴＳＨの刺激効果を避ける。それゆえ、通常、Levo-Ｔ4又はほとんど一般的でないＴ3が、内因性のＴＳＨ分泌を刺激するために、放射性ヨウ素のスキャンニング及びサイログロブリンの決定の４−６及び２週間前に回収される。付随の一次的だが深刻な甲状腺機能低下症が、相当に生命の質を低下させ、働く能力を干渉する。更に、ＴＳＨは、悪性の甲状腺組織における成長因子として作用することができるが、増大した内因性のＴＳＨ分泌の延長した期間が、そのような被験者において潜在的な危険性を引き起こす。
【００１２】
１９６０年代においては、ウシＴＳＨ（ｂＴＳＨ）が残りの甲状腺組織を刺激するために使用され、内因性のＴＳＨを上昇させるための必要性を打開した（Blahd et al., 1960, Cancer 13:745-756）。しかしながら、臨床的な実行においていくつかの不都合がその使用を中断させた。ホルモンの中断に比して、ｂＴＳＨは、残りの悪性の甲状腺組織の検出及び転移において、あまり効果がないことが判明した。加えて、アレルギー反応及び中和抗体の開発が、次のｂＴＳＨの投与の効果を限定し、内因性のＴＳＨの決定を干渉した（Braverman et al., 1992, J. Clin. Endocrinol. Metab. 74:1135-1139）。
【００１３】
以下に、所望の薬理学的な特徴を有する新規なミュータントＣＫＧＦｓの製造方法及び使用方法を示す。より具体的には、ホルモンの延長した半減期又は増大した内因性の活性を有するアゴニストとして有用なホルモン組成物を以下に示す。また、ホルモン組成物は、減少したホルモン性の活性を示し、その結果潜在的なアンタゴニストを示す。
（発明の概要）
野生型ホルモン／成長因子に対するアミノ酸置換を含む、ミュータント・シスチンノット成長因子(Cystine Knot Growth Factors: CKGFs)に基づく組成物および方法。甲状腺刺激ホルモン(TSH)および絨毛性ゴナドトロピン(CG)を含む突然変異された糖タンパク質ホルモンが、例示的なミュータントCKGFsとして開示されている。ミュータントTSHヘテロダイマーおよびhCHヘテロダイマーは、スーパーアゴニスト活性を含む、修飾された生物活性を有した。さらに、様々なミュータントCKGFファミリータンパク質が開示されている。例えば、開示されるミュータントCKGFタンパク質は、ミュータントＰＤGFホモおよびヘテロダイマーのようなミュータント血小板由来成長因子(PDGF)ファミリータンパク質、およびミュータント血管上皮細胞成長因子(VEGF)タンパク質；ミュータント神経成長因子(NGF)、ミュータント脳由来神経栄養因子(BDNF)タンパク質、およびミュータントニューロトロフィン-3(NT-3)およびミュータントニューロトロフィン-4(NT-4)タンパク質のようなミュータントニューロトロフィンファミリータンパク質；ミュータントTGF-β1、ミュータントTGF-β2、ミュータントTGF-β3、ミュータントTGF-β4/ebaf、ミュータントニュールチュリン(neurturin)、ミュータントインヒビンA(inhibin A)、ミュータントインヒビンB、ミュータントアクチビンA(Activin A)、ミュータントアクチビンB、ミュータントアクチビンAB、ミュータントMullerian阻害物質(MIS)、ミュータント骨形態形成タンパク質-2(BMP-2)、ミュータント骨形態形成タンパク質-3(BMP-3)/オステオゲニン、ミュータント骨形態形成タンパク質-3b(BMP-3b)、ミュータント骨形態形成タンパク質-4(BMP-4)、ミュータント骨形態形成タンパク質-5(BMP-5)(前駆体のみ)、ミュータント骨形態形成タンパク質-6(BMP-6)/Vgrl、ミュータント骨形態形成タンパク質-7(BMP-7)/骨形成タンパク質(OP)-1、ミュータント骨形態形成タンパク質-8(BMP-8)/骨形成タンパク質(OP)-2、ミュータント骨形態形成タンパク質-10(BMP-10)、ミュータント骨形態形成タンパク質-11(BMP-11)、ミュータント骨形態形成タンパク質-15(BMP-15)、ミュータントノリエ病タンパク質(NDP)、ミュータント成長/分化因子-1(GDF-1)、ミュータント成長/分化因子-5(GDF-5)(前駆体のみ)、ミュータント成長/分化因子-8(GDF-8)、ミュータント成長/分化因子-9(GDF-9)、ミュータントグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)/アルテミン(Artemin)、およびミュータントグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)/ペルセフィン(Persephin)タンパク質のようなミュータントトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)ファミリータンパク質を含む。従って、本発明は、疾病を治療または予防するための、ミュータントCKGFs、CKGFアナローグ、フラグメント、およびその誘導体を使用するための方法を提供する。代謝性および生殖性疾患の治療および予防に有用性を有する、TSHヘテロダイマーおよびTSHアナローグを含むミュータントCKGFタンパク質を使用する薬学的および診断的組成物、方法も提供する。
【００１４】
定義
本明細書で使用されるとき、下記の用語は、示された意味を有する：
用語TSHは、甲状腺刺激ホルモンを意味する。
【００１５】
用語TSHRは、甲状腺刺激ホルモンレセプターを意味する。
【００１６】
用語hCGは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを意味する。
【００１７】
用語CTEPは、hCGβサブユニットのカルボキシル末端伸張ペプチドを指す。
【００１８】
用語末梢ループは、逆平行βシートおよび実際のループで構成されるCKGFタンパク質のβヘアピンループを意味する。代表的なCKGFサブユニット中には、２つの末梢ループがある。
【００１９】
用語「電荷逆転技術」は、野生型CKGFタンパク質中に存在する残基の逆電荷の荷電した残基を導入することによる、ミュータントCKGFタンパク質の生成を意味する。
【００２０】
慣用されている１文字コードは、アミノ酸残基を指定するために使用される。
【００２１】
本明細書中で使用されるとき、TSHサブユニットのようなCKGFサブユニット内の突然変異は、野生型CKGFタンパク質アミノ酸、その後にアミノ酸位置、および続いて、ミュータントアミノ酸残基によって示される。例えば、I58Rは、58位でのイソロイシンからアルギニンへの突然変異を意味する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１つ以上のミュータントサブユニットを含む新規なシスチンノット成長因子(CKGF)タンパク質に関する。これらのミュータントサブユニットは、新規なミュータントCFGFタンパク質に変化した結合特性を担わせるアミノ酸の置換、付加、または欠失を含む。本発明は、さらに、ミュータントCKGFサブユニットをコードするポリヌクレオチド、タンパク質およびポリヌクレオチドを作製する方法ならびにそれに基づく診断および治療方法に関する。
【００２３】
本発明の新規なミュータントCKGFsは、代替的に、(a)天然に生じるまたは野生型CKGFsにはない新規な特性、或いは(b)野生型CKGFsを特徴付ける所望の薬理学的特性の改善を有する。好ましくは、野生型CKGFsと比較したとき、本明細書中に開示される新規なミュータントCKGFsは、それらの同族のレセプターに関するより高い親和性を有する。さらに、新規なミュータントCKGFsは、レセプター仲介シグナル変換を生じることにおいて、より活性な又はより活性が乏しいかのいずれかであり得る。特定の実施態様では、新規なミュータントCKGFsは、インビボで半減期を延長させた。
【００２４】
ミュータントCKGFタンパク質に保持される新規な特性は、リガンドとしてのCKGFタンパク質とその生物学的レセプターとの間に起こる静電的相互作用を変化させるアミノ酸置換、付加、または欠失から生じる。CKGFタンパク質の末梢ループ中の正に荷電した残基は、レセプター相互作用において重要な役割を果たす。CKGFスーパーファミリーのタンパク質に共通する末梢ループの特性を変化させることにより、野生型形態の分子と比較して増大した生物学的活性を発揮するミュータントCKGFタンパク質が作製される。それらのタンパク質は、本発明の１局面である。
【００２５】
シスチンノット成長因子
CKGFスーパーファミリーは、細胞の増殖、分化および生存をコントロールするタンパク質を含む。今日まで、タンパク質の４つの異なるファミリーが、そのスーパーファミリー内に同定された。これらは、糖タンパク質ホルモン、血小板由来成長因子および関連するタンパク質、ニューロトロフィン類(neurotrophins)および関連するタンパク質、並びにトランスフォーミング成長因子タイプβ(TGF-β)および関連するタンパク質である(第１表を参照)。
【００２６】
本発明のCKGFスーパーファミリー内のタンパク質ファミリーは、機能およびポリペプチド配列において互いに異なる。CKGFスーパーファミリー内では、１ファミリーのメンバーは、必ずしも、他のファミリーのメンバーと重要な配列同一性を共有する必要はない。にもかかわらず、スーパーファミリーメンバーの３次元構造は、シスチンノット(cystine knot)トポロジーを含む。さらに、シスチンノットトポロジーは、CKGFスーパーファミリーメンバーおよびそれらのレセプターのリガンド-レセプター相互作用を決定するのに重要な役割を果たす、CKGFスーパーファミリーメンバー内に様々なヘアピンループ構造の作製をもたらす。従って、CKGFスーパーファミリーメンバーをリンクする共通の構造的特徴がある。
【００２７】
興味深いことに、スーパーファミリーメンバーは、それらの活性なダイマー形態中に異なる数のシスチンジスルフィドを有し、異なる細胞表面レセプターを介して作用する。例えば、NGFおよびPDGFは、それぞれ、チロシンキナーゼドメインを介して機能するレセプターを有するが、TGF-βは、セリン/トレオニンキナーゼを包含する複雑なシグナリングシステムを有する。糖タンパク質ホルモンに関するレセプターは、Gタンパク質仲介シグナリング経路に結合する。
【００２８】
生物学的活性を調節するループ構造の同定
本発明は、CKGFヘアピンループ中の特定の位置での突然変異が、アセンブリーされたCKGFsの生物学的活性を有意に変化させるという発見に基づく。１クラスの突然変異は、CKGFタンパク質のヘアピンループの静電特性を変化させることに向けられる。
【００２９】
突然変異誘発されるアミノ酸を選択するために、CKGFファミリー内の様々なCKGFsメンバータンパク質のアミノ酸配列を比較した。この比較は、様々な動物種から選択された、メンバータンパク質からのアミノ酸配列を調べた。比較は、CKGFファミリーのメンバー間に存在する特定の非同類(non-conservative)アミノ酸置換の存在を発見した。例えば、ヒトおよびウシの甲状腺刺激ホルモン(それぞれ、hTSHおよびbTSH)は、それらのαサブユニット間で70%ホモロジー、およびそれらのβサブユニット間で89%ホモロジーを共有する。さらに、bTSHは、hTSHよりも6-10倍効力が大きい(Yamazakiら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 80: 473-479(1995))。
【００３０】
これらのアミノ酸置換の更なる調査は、多くのこれらの非同類アミノ酸置換が、これらのタンパク質のヘアピンループ中で起こることを示した。さらに、調べられたタンパク質のアミノ酸配列中の変化は、これらのタンパク質のヘアピンループの静電特性を変化させることが見い出された。部位指定突然変異誘発を用いて、これらの領域に現れる突然変異の機能的重要性が研究された。CKGFsの生物学的活性に影響する重要な位置は、CKGFサブユニットのβヘアピンL1ループおよびβヘアピンL3ループを構成するポリペプチドのセグメント近くまたは内部に位置する。
【００３１】
従って、これらのβヘアピンループを構成するアミノ酸配列中に突然変異を有する、CKGFsのミュータントサブユニット、CKGF誘導体、CKGFアナローグ、およびそれらのフラグメントが、作製され、本明細書に記載された。突然変異は、CKGFサブユニットのβヘアピンL1ループおよび／またはL3ループの静電特性を変化させて、野生型CKGFサブユニットの特定の所望の特性を増強させる、アミノ酸残基の挿入および／または欠失、および好ましくはアミノ酸置換を含み得る。
【００３２】
生物活性を増加させる本明細書に記載される突然変異が、互いに相乗効果を発揮し得、その結果、多重突然変異を有するミュータントサブユニットが、突然変異それぞれによって個々に付与される更なる活性の総計から予想されるであろうよりも、かなりより高い生物活性を有することも見い出された。
【００３３】
本発明は、当業者に公知であるCKGFsのサブユニット中の突然変異を含まない。
【００３４】
ミュータントCKGFsを合理的にデザインする方法
本発明の１つの局面に従うと、ミュータントCKGFサブユニットを合理的にデザインする方法は、CKGFのサブユニットのアミノ酸配列中の１つ以上の候補となる位置を同定する工程、候補位置中に突然変異を含むミュータントサブユニットを作製する工程、およびミュータントサブユニットが修飾された生物学的活性を有することを確認するインビトロおよびインビボでのアッセイを用いて、ミュータントサブユニットおよびアセンブリーされたダイマー分子の機能的特性を研究する工程を包含する。タンパク質データベースは、CKGFの構造の３次元モデルを作製するのに使用される、必要な物理的および化学的パラメーターを提供する。
【００３５】
本明細書の開示では、CKGFサブユニットを修飾する方法に特異的に適用され得る１セットのガイドラインが開発された。１つの実施態様では、デザインのガイドラインは、CKGFsの末梢ループに焦点を当てる。これらのガイドラインの１つの目標は、末梢ヘアピンループの静電特性を変化させる、そのそれぞれのレセプター等価物に関する、CKGFスーパーファミリーメンバーの親和性を増大することである。ヘアピンループの静電特性を変化させることは、選択されたヘアピンループ領域中のアミノ酸残基を選択すること、および野生型残基を、より望ましい静電特性を有するアミノ酸残基で置換するまたは欠失することである。
【００３６】
一般に、末梢ヘアピンループの静電特性が、酸性または中性状態からより塩基性状態に変化されるとき、CKGFタンパク質は、増大した生物学的活性を発揮する。この観察に照らして、この領域中のアミノ酸置換は、突然変異誘発されたCKGFタンパク質の塩基性性質または正電荷を増加する本発明のデザインガイドライン下で作製される。例えば、ヘアピンループ中の酸性残基は、構造領域の静電特性を変化させるように、中性または塩基性残基に突然変異誘発され得る。また、弱い塩基性残基ヒスチジンは、より塩基性の残基に突然変異誘発され得る。さらに、中性アミノ酸は、構造的領域の静電特性を変化させるように塩基性残基に突然変異誘発され得る。ガイドラインは更に、興味ある領域の正の静電的電荷の一般的増加を創出するために、ヘアピンループの一般的領域中の残基を欠失させることにより、ヘアピンループ領域を突然変異させることを包含する。
【００３７】
本発明は、末梢ループの塩基性または正電荷を増大させることを指向する突然変異誘発ガイドラインに限定されないことが注目されるべきである。本発明は、さらに、末梢ヘアピンループを塩基性の静電的電荷から酸性のものに変化させることを包含する。そのようなデザイン下では、ヘアピンループ領域中のアミノ酸置換は、突然変異誘発されたCKGFタンパク質の酸性状態または負電荷を増大させるデザインガイドライン下で為される。例えば、ヘアピンループ領域中の塩基性残基は、構造領域の静電特性を変化させるために、中性または酸性残基に突然変異誘発され得る。さらに、中性アミノ酸は、構造領域の静電特性を変化させるために、酸性残基に突然変異誘発され得る。ガイドラインは、さらに、興味ある領域の負の静電的電荷中の一般的増加を創出するために、ヘアピンループの一般的領域中の残基を欠失することにより、ヘアピンループ領域を突然変異させることを包含する。
【００３８】
末梢ヘアピンループ中の置換のために選択される残基は、多くのファクターを用いて選択される。先に議論したように、標的CKGFタンパク質のアミノ酸配列中の突然変異は、様々な異なる種の相同性CKGFタンパク質からのアミノ酸配列を比較するアミノ酸配列整列によって、一部導かれる。
【００３９】
可能性のある突然変異誘発部位の位置は、好ましくは、末梢ループの高度に変化する領域中にあるが、しかしながら、得られたミュータントCKGFタンパク質が、所望の生物学的活性を有するならば、保存(conserved)領域も突然変異誘発され得る。さらに、可能性のある突然変異誘発部位は、末梢ループの溶媒にさらされる残基中に位置し得る、というのも、これらの領域中の残基は、一般にアミノ酸欠失または置換に、より耐性であると一般に考えられるからである。得られたミュータントCKGFタンパク質が、所望の生物学的活性を有するならば、「埋もれた」または溶媒にさらされないアミノ酸残基は、突然変異誘発の部位であり得る。さらに、可能性のある突然変異誘発部位は、好ましくは、実際のヘアピンループ内から選択される。にもかかわらず、突然変異誘発の可能性のある部位は、ヘアピンループの末梢に位置し得る。
【００４０】
本発明は、さらに、末梢ヘアピンループの静電特性を変化させる多重突然変異の導入を包含する。
【００４１】
本発明の突然変異誘発ガイドラインは、本発明のデザインプロセスを用いて実施される。このプロセスは、先述の標的CKGFタンパク質中の可能性のある突然変異誘発部位の選択、および当分野で周知の種々のコンピューターモデリング法を用いる、これらの可能性のある突然変異部位の評価を包含する。これらの方法は、オペレーター者によってモデル化され、評価され、およびランク付けされるように、サブユニット中のそれぞれの突然変異の構造および活性を予測するために使用される。可能性のある有用性を有するものとして評価される可能性のある突然変異は、将来の使用のために貯蔵され、有害であると評価されるそれらの突然変異は、考慮から省かれる。
【００４２】
デザインプロセスの各サイクル後に集められた情報は、CKGFサブユニットに関する構造的および機能的データのデータベースを発展させるように付加される。プロセスは、ミュータントCKGFのデザインを更に洗練し、分子の新規な特性を探索するために、繰返される。
【００４３】
一旦、ミュータントCKGFサブユニットのアミノ酸配列が上記のプロセスによってデザインされると、ミュータントCKGFタンパク質が作製される。当業者に周知である標準的な分子生物学的技術が、ミュータントサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を調製するために使用される。このポリヌクレオチド配列の調製では、全体的配列を新規に合成することにより、合成DNAを活用することが可能である。或いは、野生型CKGFサブユニットをコードするコーディング配列を得て、その後、部位指定突然変異誘発によりヌクレオチド置換を生じることが可能である。得られた配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅して、周知の容易に利用可能なクローニングベクターおよび宿主を利用して増殖される。これらのベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得、宿主は、真核または原核生物の宿主であり得る。
【００４４】
さらに、ミュータントCKGFサブユニットをコードする突然変異されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが、作製され得る。これらの発現ベクターは、突然変異ポリペプチド配列を好適な発現ベクターに挿入して構築され、真核または原核生物のような宿主に形質転換される。様々な発現ベクターが、当分野で周知であり、容易に利用可能である。そのようなベクターは、ミュータントCKGF単独、または融合タンパク質の形態で発現し得、そこでは、ミュータントCKGFタンパク質および融合パートナー配列は、発現ベクター内で遺伝子連結している。細菌、酵母(または他の真菌)または哺乳動物細胞が、発現構築物のための宿主として、利用され得る。一旦、突然変異されたCKGF配列を含む発現ベクターが構築され宿主細胞に挿入されると、ミュータントCKGFタンパク質が発現される。
【００４５】
CKGFダイマー形成は、ミュータントCKGFタンパク質の組換え発現後に、促進される。組換えタンパク質は、その天然配列として又は融合ポリペプチドとしてのいずれかで、折り畳まれ、等価物サブユニットとアセンブリーされてダイマーを形成する。一般に、ダイマー化は、好適な条件のpH、イオン強度、温度、およびレドックス電位で、生理学的溶液中で起こる。その後、ダイマー化された組換えCKGFタンパク質は回収され、必要に応じて、標準的分離手順を用いて精製される。好適な分離手順は、クロマトグラフィーを含む。
【００４６】
少なくとも１つのミュータントサブユニットを含む、このようにして得られた新規なミュータントCKGFタンパク質は、様々な形態で利用され得る。ミュータントCKGFタンパク質は、それ自身で、検出可能な形態で、固定化形態で、または薬剤もしくは他の好適な治療剤と複合体化されて、使用され得る。新規なミュータントCKGFタンパク質は、診断的、画像化、ならびに治療的手順および組成物中で使用され得る。融合タンパク質、アナローグ、誘導体、並びにそのようなタンパク質およびアナローグをコードする核酸分子、並びに、例えば、組換えDNA法による上記のタンパク質およびアナローグの産生も、提供される。
【００４７】
特定の局面では、本発明は、他の場合に機能的に活性であるCKGFsのミュータントサブユニットのアミノ酸配列を提供する。本明細書中で使用される「機能的に活性な」ミュータントサブユニットは、野生型サブユニットと関連する１つ以上の公知の機能的活性を発揮する物質を指す。これらの活性は、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する他のサブユニットとの会合、サブユニットとして若しくはアセンブリーされたダイマー分子としての分泌、そのレセプターへの結合、レセプター仲介シグナル変換のトリガー、抗原性および免疫原性を含み得る。
【００４８】
特定の実施態様では、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸、６アミノ酸、10アミノ酸、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなるCKGFsのミュータントサブユニットのフラグメントを提供する。様々な実施態様では、ミュータントサブユニットは、突然変異したL1ループドメインおよび／または突然変異したL3ループドメインを含むか又は実質的にそれからなる。
【００４９】
開示を明確にするために、および限定せず、本発明の詳細な説明を、以下のサブセクションに分ける。
【００５０】
【表１】
2003524381.tif 000001
【００５１】
【表２】
2003524381.tif 000002
シスチンノット成長因子の構造的特徴
前記のように、シスチンノット成長因子(CKGF)スーパーファミリーは、成長因子の少なくとも４つのファミリー：糖タンパク質ホルモン、PDGFファミリー、ニューロトロフィン、およびTGF-βファミリーを含む。上記の４つのファミリーに属さないが、シスチンノットトポロジーおよびβヘアピンループを含む構造を有する他のタンパク質も、CKGFスーパーファミリーのメンバーであり、本発明の範囲内にある。
【００５２】
４つの成長因子ファミリー中の構造的類似性は、３次元構造または代表的ファミリーメンバーの溶解前に予測された。この結論は、個々のCKGFスーパーファミリーメンバーのポリペプチド配列中のホモロジーの欠如に基づく。にもかかわらず、成長因子の全ての４つのファミリーが、共通の折り畳み又はトポロジー的構造を共有することが今日明らかである。NGF(McDonaldら、1991, Nature, 354: 411-414)、TGF-β2(Schluneggerら、1993, J. Mol. Biol., 231: 445-458)、PDGF-BB(Osfnerら、1992, EMBO J., 11: 3921-3926)およびhCG(Lapthornら、1994, 369: 455-461)の結晶構造は、それぞれのタンパク質が、３つの保存された分子内ジスルフィド結合の非常に類似のクラスターを含むことを明示する。さらに、CKGFスーパーファミリーのメンバーの骨格コンホメーションは、第４ストランドの中間にある保存された捻れ(twist)を含む、シスチンノット近くの領域で特に、極めて類似している。
【００５３】
シスチンノット構造のシステインの比較は、解像されたシスチン構造中で同一であるこれらのハーフ-システインの連結のみならず、これらのシステインの中の６つのCα原子の位置もまた、容易にスーパーインポーズ可能であり、スーパーファミリーの異なるメンバー中で0.5〜1.5Åの二乗平均平方根(rms)一致を生じることを、明らかに示す。例えば、当価のCα原子の対のスーパーポジションは、次の二乗平均平方根(rms)距離数値を生じる；NGF対PDGF-BBに関しては、0.88Å；PDGF-BB対TGF-β2に関しては、0.65ÅおよびNGF対TGF-β2に関しては、0.93Å。
【００５４】
それぞれのシスチンノット構造は、３つの保存システインが対：I-IV、II-V、およびIII-VIになるように形態化される(第２表)。ジスルフィド結合II-VおよびIII-VIは、それらの結合残基により環を形成し、それを介して、I-VIジスルフィド結合は、同じトポロジーと共に、殆ど正しい角度で通過し、こうしてジスルフィドクラスターを形成する(図１)。環サイズは、配列Cys(II)-X-Gly-X-Cys(III)およびCys(V)-Lys-cys(VI)を有するTGF-β2およびPDGF-BB中で同一である。それぞれの場合、Cys(II)とCys(III)との間のグリシンは、正のφコンホメーションである。これは、グリシン上の側鎖の欠如とカップリングして、環を介したジスルフィド結合I-IVの通過を促進する。NGFでは、Cys(II)とCys(III)との間の配列は、一連のタイトな曲がり(turn)中の９アミノ酸からなり、グリシンは、Cys(III)に先んずる位置で正のφコンホメーション中で起こるけれども、いずれの場合も、より長いループは、Cys(I)-Cys(IV)結合を収容するのに充分である。
【００５５】
幾つかの一般的特徴は、構造的スーパーポジションにより提供される配列整列から生じる。例えば、最後の２つのシステインのスペーシングは、常に、Cys VとCys VIとの間に１個のみの残基を有するCXCであり；シスチン環のサイズは、Cys IIとCys IIIとの間のスペーシングに依存し、それは3〜15変化する。TGF-β2、PDGF-BB、β-NGF、およびhCGの構造中の５つのペプチド鎖中で、４つは、8員シスチン環を有し、および１つのβ-NGFは、14員シスチン環を有する。TGF-βおよびPDGFファミリーおよび糖タンパク質ホルモンの全てのメンバーに関する場合のように、３つの残基のみがCys IIとCys IIIとの間にある場合、２つのシステイン間の中間残基は、常にグリシンであり、CXGXC(配列番号５)パターンを生じる。
【００５６】
シスチンノット構造は、おおよそ60×20×15Åの全体的寸法を有する、カールしたシート様の非球状形態をとる。シートの面は、４つの不規則な(irregular)、歪んだ(distorted)逆平行のβシートによって、形成される。３つの分子内ジスルフィドは、疎水性コアの中心を形成し、該コアは、分子の最も硬く最も露出されない部分である。シスチン残基に結合するβストランドループは、サイズおよび配列変位に関して重要な範囲を示し、コアの基本的構造を妨害することなしに、異なるレセプター結合特異性を提供する。
【００５７】
CKGFメンバータンパク質中で共有される全体的トポロジー中の類似性は、Cys(I)とCys(II)との間、およびCys(IV)とCys(V)との間、およびよりオープンな結合ではCys(III)とCys(VI)との間での、歪んだβヘアピンループも包含する。３つのループは、長さにおいて異なるけれども、特にシステインのクラスター周囲の水素結合パターンは、極めて類似している。それぞれのメンバー中では、Cys(I)とCys(II)周囲の逆平行ストランド間に水素結合があり、その結果、Cys(I)後の残基(NGF中のAsp16)は、Cys(II)後の残基(NGF中のAsp59)への水素結合を作製する。２つのβストランド間には水素結合の伸張したβヘアピンラダーがあるが、それらの間のループは、ファミリー中の長さ、コンホメーションおよび水素結合パターンにおいて異なる。
【００５８】
Cys(IV)、Cys(V)およびCys(IV)周囲の逆平行βストランド間の水素結合も、類似している。水素結合は、Cys(IV)(NGF中のTyr79)前でCys(VI)後の残基(例えば、NGF中のVal111)の間；cys(IV)後の残基(NGF中のThr81)の間；およびCys(V)とCys(VI)との間にある残基(NGF中のVal109)；およびCys(IV)から３番目の残基(NGF中のThr83)とCys(V)前のもの(NGF中のAla107)との間、に存在する。ヘアピンのβラダーは、第１βヘアピン中よりもかなり広く、Cys(V)直前には常にβバルジ(β-bulge)がある。NGFおよびPDGF-B中の捻れた(twisted)ヘアピンは、類似しているが、後者の方が長い。TGF-β2では、このヘアピンは、さらに、２つの残基(Asn103およびMet104)の挿入によって歪み、それは、より広い範囲にわたって、ヘアピンの折り畳みを生じる。Cys(III)とCys(IV)との間の結合は、NGF、TGF-β2およびPDGF-BBの間で、長さにおいて異なる。PDGF-Bでは、最も短いループが、起こる。NGFでは、それは、より長いシリーズのβターン(β-meander)で置き換えられ、TGF-β2では、12残基αヘリックスを含むさらにより長い結合が起こる。しかしながら、全ては、２つのヘアピンおよびジスルフィドクラスターを形成するストランドの不変(fixed)のフレームワーク内に収容される。
【００５９】
CKGFスーパーファミリーのメンバーは、全てが前記の所望のものでないとしても、最適のトポロジー的および構造的特徴を有することが示された。これらの特徴を有する他のタンパク質も、CKGFスーパーファミリーのメンバーであると考えられる。本明細書中に開示される、CKGFsに適用され得る合理的デザインの方法も、それらのタンパク質に適用され得る。
【００６０】
【表３】
2003524381.tif 000003
CKGFサブユニットの構造および機能分析
本発明は、１つ以上のミュータントサブユニットを含む新規なミュータントCKGFタンパク質の合理的なデザインのための体系的(systematic)なアプローチも提供する。本明細書に記載されるのは、野生型およびミュータントCKGFサブユニット、CKGFダイマーおよびCKGFアナローグの構造を分析する方法、およびこれらの分子のインビトロ活性およびインビボでの生物学的機能を測定する方法である。
【００６１】
CKGFタンパク質中の突然変異誘発されたアミノ酸の位置を特定するための幾つかの配慮がある。特定の領域中の特定の残基の耐性(tolerance)を予測し、アナローグ特異性または安定性における望ましくない変化を回避するための多くの配慮もある。３次元構造モデリングと組合せた相同性タンパク質の配列比較は、タンパク質間の構造-機能関係を解釈するのに有用な情報の豊富なソースを提供する。
【００６２】
hTSHの分子モデルは、Brookhaven Protein Data Bank(PDB)からの結晶学データ由来のhCGモデルを、テンプレートとして使用して構築された。このモデルは、必要な置換の数を限定するアナローグデザインに関する重要なリードを提供する。ミュータントのモデリングも、機能的データの解釈に極めて重要である。我々は、組合せられた配列-構造に基づく予測が、アナローグで観察された機能的変化によってしばしば証明されることを見出している。
【００６３】
デザイン配慮の中の第１は、それぞれのタンパク質が、機能的により重要な領域(酵素のレセプター結合部位または活性部位のような)およびより重要でない領域を含むことである。タンパク質の機能的により重要な部分中の進化の速度は、例えば、糖タンパク質ホルモンの末梢βヘアピンループのような、機能的により窮屈(constrained)でない部分の分子よりも、かなり短いことが、一致して見い出されている。従って、末梢ループ中でのもののような、溶媒にさらされる残基は、タンパク質コア内に埋もれた残基よりも、保存されていない。最も保存されたアミノ酸の保存的変化は、最も有害になり易い。対照的に、タンパク質のより機能的に窮屈でない部分における類似の変化は、自然選択に好まれる「ファインチューニング(fine-tuning)」タイプの改善を示す、より高いチャンスを有し得る。タンパク質の全体的折り畳みは、通常は、多重アミノ酸置換の後であっても、高度に保存されることが、一般に公知である。従って、hTSHの末梢ループ中に位置する突然変異は、hTSHの全体的折り畳みを変化させることは予測されない。そのような予測は、アナローグのホモロジー・モデリング、並びに「機能の獲得」突然変異の存在によって、支持される。
【００６４】
デザイン配慮の中の第２は、糖タンパク質ホルモン・スーパーアゴニストの最新の開発が、タンパク質進化の特定の段階で既に最大化された、活性またはレセプター結合特異性を有するドメインの組合せは、ヒトタンパク質アナローグを工作する普遍的戦略を提供し得るという予測を支持することである。ヒト糖タンパク質ホルモンの場合、異なる脊椎動物種中の相同性配列の大きなライブラリーからの置換の選択は、極めて有害で非最終的な突然変異の確率を大きく減少させる。この観察は、異なる種からの糖タンパク質ホルモンサブユニットが、機能的に活性なホルモンに再会合する公知の能力と一致する。
【００６５】
デザイン配慮の中の第３は、ホルモン特異性の変化が、意図された修飾の一部でない場合、タンパク質特異性を付与することが公知の領域は、アナローグデザイン中で一般に回避されるべきであるということである。例えば、βサブユニット・キメラを包含する最近の研究は、「シートベルト」領域が、恐らく、異種リガンド-レセプター相互作用を制限することにより、および／または複合体結合ドメインのコンホメーションに影響することにより、糖タンパク質ホルモン特異性を付与するのに決定的てあることを示した。さらに、hCG/hFSHキメラの予想外に高い甲状腺刺激活性は、特異性が、アミノ酸配列からは容易に予測され得ないこと、および全キメラに関して実証されるべきであることを示唆する。
【００６６】
デザイン考慮の中の第４は、哺乳動物の糖タンパク質ホルモンが、低い程度の種特異性を有することが示されたことである。例えば、哺乳動物TSHタンパク質は、特定の魚を例外として全ての脊椎動物で、甲状腺機能を刺激することが示された。さらに、高度に精製された哺乳動物LHも、真骨魚類と遠く関連するだけの種を含む他の種において、甲状腺刺激活性を有する。更に、我々は、異なる哺乳動物種からのTSHレセプターを用いて、ヒトTSHのレセプター結合親和性と生物学的活性との間の相関関係を見い出した。同様に、他の種または相同性ホルモンに存在する残基およびドメインの導入は、多くの場合、ホルモン特異性の変化なしに、耐性である。
【００６７】
最後に、部位指定突然変異誘発に関する主要な標的は、配列比較によって予測され得る修飾許容ドメインである。これらのドメインは、非保存的(nonconservative)アミノ酸変化の導入を可能にし、サブユニット合成またはアセンブリーを危うくすることなしに、機能の調節を可能にする分子の領域として定義される。重要なこととして、進化の間に多重および／または非保存的変化を受けるアミノ酸残基の突然変異誘発は、通常は、ホルモン発現の機能損失または減少をもたらさない。
【００６８】
CKGFミュータントをデザインするための機能獲得方法は、先ず、タンパク質合成を危うくすることなしに、非保存的置換の導入に耐えるCKGFタンパク質の「修飾許容ドメイン」を同定することを包含する。修飾許容ドメイン中の更なる突然変異誘発は、増大したホルモン生物活性をもたらす置換の同定を可能にする。その後の多重残基置換は、個々の残基の協調的効果を説明するのに使用され得、多重ホルモンドメインの同時的突然変異誘発に拡大され得る。機能獲得突然変異の同定は、１ドメイン中の修飾により生じたhTSH活性の部分的または全体的損失が、完全に代償され得、それにより、TSHレセプターは「アナローグに誘発されるフィット」により、有意な構造的修飾を有するリガンドを収容し得ることを示すという発見を導く。さらにシグナルを伝達し得るアナローグおよびレセプターの代替的接触ドメインを創ることさえ可能である。
【００６９】
さらに、協調的、非協調的および相互に排他的なホルモンドメインの同定は、治療的に有用なホルモンアナローグの開発のための重要なリードを提供し得る。そのようなアプローチを用いると、CKGFsの生物学的特性を個別に調節したり分離することが、究極的に可能であるはずである。
【００７０】
３次元構造および配列整列に基づく方法
CKGFサブユニットの構造を分析する方法は、ポリペプチド配列データおよび３次元タンパク質構造データの分析に基づく。当業者は、他の生物学的データも、分析において使用され得ることを容易に認識する。
【００７１】
タンパク質のポリペプチド配列は、タンパク質配列決定、またはタンパク質をコードする遺伝子配列の理論的翻訳の標準的技術的のような、当業者に周知の方法によって決定され得る。ポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列は、GenBankのような配列データベース中で、一般に利用可能である。Entrezのようなコンピュータープログラムが、更なる分析のために、データベースをブラウズし、興味ある任意のアミノ酸配列および遺伝子配列データを検索するのに使用され得る。アミノ酸配列および遺伝子配列は、受付番号により、データベースから検索し得る。これらのデータベースはまた、FASTAおよびBLASTのようなプログラムを用いて質問配列に様々な程度の類似性を有する配列を同定するためにサーチされ得、該プログラムは、整列スコアおよび統計によって類似の配列をランクしている。CKGFスーパーファミリー内の異なるファミリーのメンバー間の配列類似性の程度は低いので、質問配列を用いるサーチは、同じファミリー内のメンバーを同定するために主として為される。
【００７２】
CKGFサブユニットのタンパク質配列は、親和性分析(Hopp, T.およびWoods, K., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824)を用いても、特徴付けされ得る。親和性プロフィールは、サブユニットの疎水性および親水性領域を同定するために使用され得る。当業者に知られているこの情報および手順を用いると、これらの領域をコードする対応するポリヌクレオチド配列が、続いて、決定され得る。
【００７３】
二次構造分析(Chou, P.およびFasman, G.、1974, Biochemistry 13: 222)も、特異的な二次構造をとるサブユニットの領域を同定するためにCKGFサブユニットのタンパク質配列を用いて、為され得る。
【００７４】
X線結晶学(Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13)およびコンピューターモデリング(Fletterick, R.およびZoller, M.(編), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)を含む構造分析の方法も、使用され得る。構造予測、結晶学データの分析、配列整列、並びにホモロジー・モデリングは、BLAST、ConvexのためのCHARMmリリース21.2、およびQUANTA v.3.3(Molecular Simulations, Inc.、ヨーク、英国)のような当分野で容易に利用可能な市販されているコンピューターソフトウェアを用いて、達成され得る。
【００７５】
コンピューターにアシストされる方法
CKGFサブユニットの３次元(3D)構造のコンピューターモデルは、ポリペプチド配列データに基づき構築され得る。他のCKGFサブユニットのポリペプチド配列および3D構造を含む他の情報も、コンピューターモデリング中で使用され得る。CKGFまたはCKGFサブユニットのモデルは、シスチン残基の同じ結合性を有する分子の３D構造を示すために構築される。
【００７６】
コンピューターモデルは、エネルギーを最小化し、疎水性、静電性、ファンデルワールス、および水素結合相互作用のような分子内折り畳みを決定する力を最適化するための、当分野で公知のソフトウェアアルゴリズムを用いて、考案され得る。それぞれ他の原子に対する分子内の各原子の配置は、全体的なシスチンノットトポロジーに一致するように最適化される。最適化プロセスは、コンピューターソフトウェアおよび／または熟練したオペレーター者によって、自動的に形成され得る。トポロジー内の水素結合およびストランドコンホメーションの視覚上の比較は、インテラクティブコンピューターグラフィックスディスプレーシステムの援助を得て為され得る。
【００７７】
現在、2.0Åまたはそれ以上の解像度で測定されるCKGFサブユニットの少なくとも５つのタンパク質構造が、公に利用可能である。これら及び他のCKGFsの構造は、X線結晶学、中性子回折、および核磁気共鳴(NMR)のような技術を用いて、測定または洗練され得る。
【００７８】
X線結晶学による構造決定は、タンパク質に関するデータのファイルを生み出す。Brookhaven Protein Data Bank(BPDB)は、タンパク質構造情報の貯蔵所を例示し、それは、ニューヨーク州ロングアイランド、アップトンにある、Brookhaven National Laboratoryによって作成され補充される。下記のデータを暗示的にまたは明示的に含む任意の他のデータベースは、本明細書に記載される方法と関連して有用である：(1)それぞれのポリペプチド鎖のアミノ酸配列；(2)ジスルフィドの結合性；(3)任意の補欠分子族(prothetic group)の名称および結合性；(4)それぞれの観察されるコンフィギュレーション中の各原子の座標(x, y, z)；(5)各原子のフラクション占有；および(6)原子の温度ファクター。座標が決定される、各原子に関する少なくとも１つの記録がある。座標は、長方形のデカルト格子上に、オングストローム単位(100,000,000=1 cm)で示される。タンパク質の幾つかの部分は、１以上の空間的コンフィギュレーションを採り得るので、幾つかの原子に関して２以上の座標があり得る。そのような場合、フラクション占有は、それぞれの代替的位置に関して報告される。X線結晶学データは、温度または"Debye-Waller"ファクターとして示される原子運動の推定を示し得る。
【００７９】
タンパク質座標は、結晶のタンパク質に関して最も一般的に測定されるけれども、タンパク質の溶液構造がマイナーな詳細においてのみ、結晶構造から異なることが、現在、一般に受け入れられている。従って、原子の座標を与えられると、それぞれの原子の溶媒接近可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を計算し得る。分子の表面接近可能性も測定され得、溶媒と接触する疎水性残基に基づくスコアが測定され得る。さらに、座標は、タンパク質全体を通して、電荷分布を暗示的に示す。これは、ミュータントサブユニットが、折り畳み、および／または会合してダイマーを形成するかどうか推定するのに有用である。
【００８０】
本発明の合理的なデザインプロセスの特定の工程は、アミノ酸配列、構造データベース、並びに配列比較および構造モデリングを行なうのに使用される様々なアプリケーションプログラムを貯蔵可能なストレージデバイスを有する慣用されているコンピューターシステム上で、為される。インテラクティブコンピューターグラフィックスディスプレーシステムは、本発明のデザインプロセス中で評価される化学的構造を、オペレーター者が視ることを可能にする。グラフィックスおよびソフトウェアプログラムは、野生型およびミュータントサブユニットをモデルし、候補をランクするために、使用される。
【００８１】
例えば、コンピューターグラフィックスインテラクティブディスプレーシステムは、オペレーター者に、CKGFファミリーのメンバーの１つ以上の構造または部分的構造を視覚的にディスプレーすることを可能にする。複数のポリペプチド鎖およびアミノ酸の側鎖の視覚的表示は、望まれるように操作されスーパーインポーズされ得、それは、構造的デザインプロセスを行なう能力を増加させる。コンピューターグラフィックスディスプレーシステムは、ズーミング、クリッピング、強度深度クーイング(intensity depth queuing)のような、それに限定されない１セットの機能(そこでは、ビューアーからさらに遠い対象物がダイマーにされて、イメージがディスプレーされる所望の深度効果を提供する)；座標システムの３つの軸の何れかにおいてイメージの翻訳および回転を行ない得る。本発明は、他のコンピュータープログラム、作動システムおよびプログラム原語を用いて行われ得る。任意の好適なタイプのソフトウェアおよびハードウェアは、これらの分子の構造のコンピューター表示をディスプレーおよび操作するために、使用され得る。
【００８２】
コンピュータープログラムは、野生型およびミュータント構造のそれぞれに関するエネルギーを計算し、エネルギーを最小にするために理論的構造物中に局所的調節物を作製するために、利用され得る。最後に、プログラムは、分子の不安定な部分を同定し、ミュータントCKGFダイマーの形成(他のサブユニットの構造は、ヘテロダイマーに関して要求され得る)およびミュータントCKGFダイマーのそのレセプターへの結合(レセプターの構造が、既存のデータから決定または予測可能である場合)を刺激するように、使用され得る。
【００８３】
データベースからの構造的データは、３次元対象物を確定する。CKGFスーパーファミリーの多くのメンバーのために、シスチンノットの３つのジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基が同定された。そのような情報が公知でない場合、シスチンノットを形成するシステイン残基は、分子中のシステイン残基の体系的な突然変異誘発によって、容易に同定され得る。
【００８４】
一旦、シスチンノットを形成するシステイン残基の全てが同定されると、CKGFサブユニットのこれらの残基は、他のCKGFsのものと共に整列され、ポリペプチドのどのセグメントがCKGFサブユニット中のβヘアピンL1およびL3ループを最も好ましく形成するかが予測され得る。
【００８５】
最小自乗分析が、１つのCKGFサブユニットからの原子を、他からの原子に適合させるよう適用される。この最小自乗適合は、空間中の２つの３次元対象物をスーパーインポーズする自由度を可能にする。もし、二乗平均平方根(RMS)エラーが、幾つかのプリセット閾値より小さいなら、その構造は、考慮されるモデルに関して優れた適合である。プロセス中の最終工程は、もっともらしいものからもっともらしくないものへ、もっともらしい候補をランキングし、熟練したオペレーター者および／または専門のコンピューターシステムにより利用される基準に基づき、もっともらしいとは見えないそれらの候補を排除することを包含する。
【００８６】
例えば、水素結合は、CysIV前の残基とcysVIとの間；cysIV後の残基と、cysVとcysVIIの間の残基との間；CysIVから沿って第３残基とcysVの前のものとの間、に存在することが好ましい。エキスパート者は、CKGFサブユニットのヒト構造物の視覚的比較、および構造物の可能な／最適な予測をランキングすることによりコンピューターモデルを洗練することが好ましい。
【００８７】
置換、挿入、または欠失のための候補は、オペレーター者に提供され、その者は、コンピューターグラフィックスディスプレーシステムを利用して、それらを３次元でディスプレーする。オペレーター者は続いて、全体的シスチンノットトポロジーおよびレセプター結合に関する変化したアミノ酸残基の、タンパク質の化学的および物理的関係に関する知識に基づいて、候補についての決定を下し得る。この分析は、最も最適／もっともらしいものから、最も最適／もっともらしくないものへ、候補をランク付けするのに使用され得る。これらのランキングに基づき、最も最適な候補が、部位指定突然変異誘発および産生に関して選択され得る。先のモデリングおよび／または実際の遺伝子工学実験から引き出された先の経験に基づき、ランキング選択の作成および候補排除をすることにおいて、コンピューターはオペレーター者をアシストすることも望ましい。
【００８８】
ミュータントCKGFの任意の原子が、最小に可能な分離よりも、天然タンパク質構造の任意の保持された原子により近くなる場合、候補は拒否され得る。例えば、最小に可能な分離は、2.0オングストロームでセットされ得た。任意の他の数値が選択され得ることに注目のこと。この工程は、所望ならば、オペレーター者が、この排除プロセスを手動で行なわないように、自動化され得る。
【００８９】
候補は、疎水性残基が、溶媒に高度の露出を有する場合、ペナルティー適用され得る。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンの側鎖は、疎水性である。
【００９０】
候補は、親水性残基が、溶媒に低度の露出を有する場合、ペナルティー適用され得る。セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、およびプロリンの側鎖は、親水性である。
【００９１】
候補は、得られたミュータントポリペプチドが、６個のシステイン近くの残基間に存在する水素結合を形成し得ない、または任意の６個のシステイン間のジスルフィド結合を崩壊させる傾向がある水素結合を形成する場合、ペナルティー適用され得る。
【００９２】
他のデザインルールは、ミュータントポリペプチドに沿った望ましくない位置で、立体配置的にバルキーな側鎖を有する候補にペナルティー適用する。さらに、バルキーな側鎖を余りバルキーでないもので置換することによって、バルキーな側鎖を有する候補をスイッチすることが可能である。例えば、側鎖は、ロイシンまたはイソロイシンのようなバルキーな置換基を有し、可能性のあるデザイン工程は、このアミノ酸を、最もバルキーでない側鎖であるグリシンで置換する。
【００９３】
他のルールおよび／または基準は、選択プロセスにおいて利用され得、本発明は議論されたルールおよび／または基準に限定されない。
【００９４】
このように、本発明のトポロジーに基づくアプローチおよび方法は、ランダム選択プロセスを用いて得られるであろうよりも、増大した生物活性を有する非常に増大された確率を有するミュータントCKGFsを工作するために、利用され得る。これは、作製されテストされなければならない候補の数が減少するので、所望のミュータントを作製する遺伝子工学的局面が有意に減少することを意味する。最ももっともらしい候補は、実際の分子を遺伝子的に工作するために使用され得る。
【００９５】
糖タンパク質ホルモンのミュータント
下記でより充分に詳論されるように、本発明の１つの局面は、αおよび／またはβサブユニットのβヘアピンL1ループおよびβヘアピンL3ループ内に位置するアミノ酸位置で突然変異を有する少なくとも１つのサブユニットを含む糖タンパク質ホルモンであるCKGFsを提供する。本発明に関連して、糖タンパク質ホルモンβサブユニットは、hCGβサブユニット、LHβサブユニット、FSHβサブユニットおよびTSHβサブユニットを含む。
【００９６】
ミュータントサブユニットは、１つのサブユニット内の個々の突然変異を組合せ、ミュータントサブユニットを複合化することによって二重のミュータントヘテロダイマーを作製して、作製され得る。特に、本発明者は、ミュータントαおよびミュータントβのミュータントサブユニットを含むヘテロダイマーをデザインし、そこでは、ミュータントサブユニットは、特定のドメイン中に突然変異を有する。これらのドメインは、共通αサブユニットのβヘアピンL1ループおよびL3ループ(図２に示されるように)、および糖タンパク質ホルモンβサブユニットのβヘアピンL1ループおよびL3ループを含む。１つの実施態様では、本発明は、ミュータントαサブユニット、ミュータントTSHβサブユニット、ミュータントhCGβサブユニット、並びに１つのミュータントαサブユニットまたは１つのミュータントβサブユニットのいずれかを含むTSHおよびhCGヘテロダイマーを提供し、そこでは、ミュータントαサブユニットは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ内または近くに位置して含み、および、ミュータントβサブユニットは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ内または近くに位置して含む。好ましくは、これらの突然変異は、ミュータントサブユニットを含む糖タンパク質ホルモンヘテロダイマーの生物活性を増加し、ミュータントサブユニットを有するTSHヘテロダイマーは、野生型TSHヘテロダイマーに対して血清半減期を増大させるように修飾もされた。
【００９７】
αサブユニットは、５つのジスルフィド結合を含み、そのうちの３つ、Cys10-Cys60、Cys28-Cys82、およびCys32-Cys84は、ノットされたコンフィギュレーションを採る(第２表)。残基40および47間に位置する短い３つの曲がり(turn)のαヘリックスを除いて、αサブユニット中の二次構造の殆どは、不規則(irregular)なβストランドおよびβヘアピンループである。βサブユニットは、６つのジスルフィド結合を含む；その中で、Cys9-Cys57、Cys34-Cys88、およびCys38-Cys90は、トポロジカルなシスチンノットを形成する。
【００９８】
ダイマー化は、Lapthornら(Lapthornら、1994, Nature, 369:455-61)によると、トータルで4525平方オングストロームの表面積、およびWuら(1994, Structure, 2:545-58)によると、3860Å2を埋める。
【００９９】
本発明者は、ヒトαサブユニットのL1およびL3βヘアピンループ領域(図２(配列番号１)に示されるように)の静電的電荷を変化させる１つ以上のアミノ酸置換が、野生型形態の分子と比較して、ミュータントタンパク質の生物活性の増加を生じることも見い出した。１つの実施態様では、リシンまたはアルギニンのような塩基性アミノ酸、より好ましくはアルギニンの置換は、野生型TSHに比較してTSHの生物活性を増加する。
【０１００】
他の実施態様では、本発明は、図３に示される(配列番号２)ように、６位でアミノ酸置換を有するミュータントTSHβサブユニットであるミュータントCKGFサブユニットを提供する。本発明は、図４に示される(配列番号３)ように、75および／または77位でアミノ酸置換を有するミュータントhCGβサブユニットであるミュータントCKGFサブユニットも提供する。
【０１０１】
好ましい実施態様では、本発明は、上記のミュータント糖タンパク質ホルモンαおよび／またはβサブユニットの少なくとも１つを含む、ミュータントhCGまたはミュータントTSHのようなヘテロダイマー性糖タンパク質ホルモンであるミュータントCKGFを提供する。
【０１０２】
本発明に従うと、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近くに位置して含むミュータントβサブユニットは、CTEPに対してそのカルボキシル末端で融合され得る。そのようなミュータントβサブユニット-CTEPサブユニットは、同時発現および／または野生型もしくはミュータントαサブユニットとアセンブリーされて、野生型TSHよりも大きい生物活性および血清半減期を有する機能的TSHヘテロダイマーを形成し得る。
【０１０３】
他の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近くに位置して含むミュータントβサブユニット、および１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近くに位置して含むミュータントαサブユニットが融合され、一本鎖TSHアナローグを形成する。そのようなミュータントβサブユニット-ミュータントαサブユニットの融合物は、野生型TSHよりも大きい生物活性および血清半減期を有する。
【０１０４】
更に他の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近くに位置して含み、更にカルボキシル末端にCTEPを含むミュータントβサブユニット、および１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近くに位置して含むミュータントαサブユニットが融合され、一本鎖TSHアナローグを形成する。
【０１０５】
共通αサブユニットのミュータント
糖タンパク質ホルモンの共通ヒトαサブユニットは、92アミノ酸を含む。このアミノ酸配列は、10個のハーフ-システイン残基を含み、その全てはジスルフィド結合である。本発明は、ヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのミュータントに関し、そこでは、サブユニットは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近くに位置して含む。図２に示されるように8-30位置から始まる、αL1ループ内または近くに位置するアミノ酸残基は、レセプター結合およびシグナル変換を発生させるのに重要であることが見い出されている。11-22位でのもののように、αL1ループ内に位置するアミノ酸残基は、ヒト科を除く全ての脊椎動物で塩基性残基のクラスターを形成し、レセプター結合およびシグナル伝達を増進する能力を有する。
【０１０６】
本発明に従うと、ミュータントαサブユニットは、野生型タンパク質において、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【０１０７】
ヒト糖タンパク質βサブユニットのミュータント
ヒト糖タンパク質ホルモンのβサブユニット中のアミノ酸の数は、図６(配列番号５)に示されるFSH中の109から、図４(配列番号３)に示されるhCG中の140アミノ酸の範囲である。本発明は、TSH、CG、LHおよびFSHを含むヒト糖タンパク質のβサブユニットのミュータントに関し、そこでは、これらのタンパク質ホルモンの１つのミュータントサブユニットは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはこれらのβサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ内または近くに位置して含み、そこでは、そのようなミュータントβサブユニットは、hCGのような別のヒト糖タンパク質のβサブユニットのCTEPに融合されるか、又は22位置でアミノ酸置換を有する(図２に示される(配列番号１)ように)ミュータントαサブユニットを有するCKGFヘテロダイマーの一部である、またはαサブユニット-βサブユニット融合物である。本発明のミュータントβサブユニットは、野生型サブユニットと比較して、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【０１０８】
PDGFファミリーのミュータント
血小板由来成長因子(PDGF)は、間葉起源の細胞に関する主要なマイトジェン因子である。それは、発生および胚形成の間、線維芽細胞および平滑筋細胞の増殖および分化を促進する。それは、傷治癒の間、炎症細胞に関する走化性試薬としても機能する(Heldin, 1992, EMBO J., 11:4251-59)。PDGF遺伝子の２つの形態である、PDGF-AおよびPDGF-Bが発現され、ダイマー性成長因子の３つのイソ型、PDGF-AA、PDGF-AB、およびPDGF-BBを生じる。PDGFファミリーの他のメンバーは、血管内皮成長因子(VEGF)およびp28ｖ−ｓｉｓのv-sisオンコジーン産物、αおよびβPDGFレセプターの両方に結合し活性化するサル肉腫ウイルス(SSV)のトランスフォーミングタンパク質(LeeおよびDonoghue, 1991, J. Cell. Biol., 113: 361-70)を含む。
【０１０９】
Oefnerら(1992, EMBO J. 11: 3921-26)は、ヒト血小板由来成長因子の成熟ホモダイマー性イソ型、PDGF-BBの結晶構造を、3.0-Å解像度で決定した。シスチンノット構造は、109アミノ酸を含み、４つの不規則な逆平行βストランドおよび17残基N末端テールからなる。８つのジスルフィド結合されたシステインのうちの６つ、Cys16-Cys60、Cys49-Cys97、およびCys53-Cys99は、ノットされたアレンジメントを形成し、２つ、Cys43-Cys52は、２つの鎖内ジスルフィド結合を形成する(第２表)。４ストランドのβシートの縁は、ダイマーを形成し、それは、βシートの最初の２つのストランドおよびN末端テール間であるサブユニット間接触の大部分を生じる。埋もれたトータルの表面積は、2200平方オングストロームであると推定され、埋もれた残基の殆どは、天然には疎水性である。
【０１１０】
血小板由来成長因子(PDGF)ファミリーは、図７−９(配列番号６−８)に示されるように、様々な数のアミノ酸を有するタンパク質で構成される。しばしば、このファミリーのタンパク質のメンバーの活性形態は、ダイマー、ホモもしくはヘテロダイマーのいずれかである。本発明は、これらのタンパク質のモノマー性サブユニット中の突然変異に関し、そこでは、ミュータントモノマーは、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を、好ましくはβヘアピンL1またはL3ループ内または近くに位置して含む。ヘアピンループの構造を変化させ、その結果、リガンドとその同族レセプターとの間の静電的相互作用が増加される、これらのヘアピンループ領域の外側の突然変異も、包含される。融合タンパク質およびキメラ型モノマー性サブユニットも、本発明に包含される。本発明のミュータントPDGFモノマーは、野生型サブユニットと比較したとき、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【０１１１】
ニューロトロフィンファミリーのミュータント
ニューロトロフィンは、末梢神経系(PNS)および中枢神経系(CNS)の両方で特定のニューロンの発生および生存をコントロールする成長因子のファミリーを示す。このファミリーのメンバーは、神経成長因子(NGF)(Levi-Montalcini, 1987, EMBO J. 6: 1145-54)、脳由来神経栄養因子(BDNF)(Hohnら、1990, Nature, 344: 339-41;およびLeibrockら、1989, Nature, 341: 149-52)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン-4(NT-4)、およびニューロトロフィン-5(NT-5)(Barde, 1989, Neuron, 2: 1525-34; Berkemeierら、1991, Neuron, 7: 857-66; およびHallbookら、1991, Neuron, 6: 845-58)を含む。
【０１１２】
ニューロトロフィンファミリーのプロトタイプメンバー、β-NGFのシスチンノット構造は、第１と第２ストランド間に２つのより短いストランドの挿入を有する、４つの不規則な逆平行βストランド(McDonaldら、1991, Nature, 354: 411-14；およびHollandら、1994, J. Mol. Biol. 239: 385-400)から主としてなる。分子の全体的寸法は、おおよそ、60×25×15Åである。各モノマー中の６つのシステインは、全てのβストランドの一端でクラスター化されたノットされたジスルフィド結合(Cys15-Cys80、Cys58-Cys108、およびCys68-Cys110、第２表を参照)を形成する。ダイマーは、トータル2300平方オングストロームの表面積を埋めている、４ストランドのβシートの２つの平たい面の間で形成される。界面は、非常に疎水性のものとして特徴付けられる。
【０１１３】
ニューロトロフィンファミリーは、図１０−１３(配列番号９−１２)に示されるように、様々な数のアミノ酸を有するタンパク質で構成される。しばしば、このファミリーのタンパク質のメンバーの活性形態は、ダイマー、ホモもしくはヘテロダイマーのいずれかである。本発明は、これらのタンパク質のモノマー性サブユニット中の突然変異に関し、そこでは、ミュータントモノマーは、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を、好ましくはβヘアピンL1またはL3ループ内または近くに位置して含む。ヘアピンループの構造を変化させ、その結果、リガンドとその同族レセプターとの間の静電的相互作用が増加される、これらのヘアピンループ領域の外側の突然変異も、包含される。融合タンパク質およびキメラ型モノマー性サブユニットも、本発明に包含される。本発明のミュータントニューロトロフィンモノマーは、野生型サブユニットと比較したとき、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【０１１４】
TGF-βファミリーのミュータント
TGF-βファミリーは、それらの成熟アミノ酸配列中で少なくとも25%の配列同一性を共有する１セットの成長因子からなる。この遺伝子ファミリー中のメンバーは、トランスフォーミング成長因子、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4およびTGF-β5(Assoanら、1983, J. Biol. Chem., 258: 7155-60; Cheifetzら、1987, Cell, 48: 409-15; Derynckら、1988, EMBO J., 7: 3737-43; Jakowlewら、1988, J. Mol. Biol., 239; 385-400; Jakowlewら、1988, Mol. Endocrinol, 2: 1186-95; Kondaiahら、1990, J. Biol. Chem., 265: 1089-93; およびTen Dikjeら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 85: 4715-19)；インヒビンおよびアクチビン(インヒビンA、インヒビンB、アクチビンA、およびアクチビンB)(Forageら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83: 301-95; Lingら、1986, Nature, 321: 779-82; Masonら、1985, Nature, 318: 659-63;およびValeら、1986, Nature, 321: 776-79)；骨形態形成タンパク質(bone morphogenic proteins)、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6およびBMP-7(Celesteら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 9843-47; Ozkaynakら、1992, J. Biol. Chem., 267: 25220-27;およびWozneyら、1988, Science, 242: 1528-34)；デカペンタプレジック遺伝子コンプレックス(decapentaplegic gene complex)、DPP-C(Padgettら、1987, Nature, 325: 81-84)；Vgl(WeeksおよびMelton, 1987, Cell, 51: 861-67); vgr-1(Lyonsら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 4554-58)；Mullerian阻害物質(MIS)(Cateら、1986, Cell, 45: 685-98)；成長分化因子、GDF-1(Lee, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 88: 4250-54)；およびドルサリン-1(dorsalin-1)、dsl-1(Centrellaら、1988, FASEB J., 2: 3066-73)を含むが、それらに限定されない。このファミリー中の殆どのタンパク質は、ホモもしくはヘテロダイマーとして存在する。
【０１１５】
細胞増殖および調節におけるTGF-βの種々の生物学的活性は、(a)後期G1期の間に細胞サイクルを妨害し、DNA合成の誘導およびS期への進行を妨げるその能力(Thompsonら、1989, J. Cell. Biol., 108: 661-69; Centrellaら、1988, FASEB J. 2: 3066-73; およびHeineら、1987, J. Cell Biol., 105: 2861-76)、(b)細胞蓄積、ならびにタイプI、III、IVおよびVコラーゲン；テナスチン(tenascin)；およびエラスチンを含む細胞外マトリックス成分へのそれらの反応(LiuおよびDavidson, 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun., 154: 895-901; Pearsonら、1988, EMBO J., 7: 2677-81; およびVargaら、1987: Biochem J., 247: 597-604)、および(c)他の成長因子、例えば、PDGFの分泌を調節することによる細胞成長の促進または阻害(Robertsら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 119-23)を含む。
【０１１６】
TGF-β2のシスチンノット構造は、４つの不規則な逆平行βストランドおよび第２と第３ストランド間の11残基のαヘリックスから主としてなる。各モノマー中の９個のシスチンのうち、８個は、４つの鎖内ジスルフィドを形成する。３つの鎖内ジスルフィド結合Cys15-Cys78、Cys44-Cys109、およびCys48-Cys111は、トポロジカルなシスチンノットを明示し、そこでは、Cys15-Cys78ジスルフィドは、連結ポリペプチド骨格である残基44-48および109-111と共に、Cys44-Cys109およびCys48-Cys11ジスルフィドによって結合された環を通って通過する。
【０１１７】
２つのモノマーは、βシートの末端近くの残基に対してパックされた長いヘリックス(残基58-68)上の残基と共に、ヘッドからテールへのダイマーを形成する。TGF-β2成長因子は、ジスルフィド連結されたダイマーとして存在し、そこでは、各モノマーの全体的寸法は、60×20×15Åである。
【０１１８】
トランスフォーミング成長因子-βファミリーは、図１４−４２(配列番号１３−４１)に示されるように、様々な数のアミノ酸を有するタンパク質で構成される。しばしば、TGF-βファミリーのタンパク質のメンバーの活性形態は、ダイマー、ホモもしくはヘテロダイマーのいずれかである。本発明は、これらのタンパク質のモノマー性サブユニット中の突然変異に関し、そこでは、ミュータントモノマーは、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を、好ましくはβヘアピンL1またはL3ループ内または近くに位置して含む。ヘアピンループの構造を変化させ、その結果、リガンドとその同族レセプターとの間の静電的相互作用が増加される、これらのヘアピンループ領域の外側の突然変異も、包含される。融合タンパク質およびキメラ型モノマー性サブユニットも、本発明に包含される。本発明のミュータントTGF-βモノマーは、野生型サブユニットと比較したとき、１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【０１１９】
ミュータントCKGFおよびアナローグをコードするポリヌクレオチド
本発明は、CKGFsのミュータントサブユニットおよびCKGFアナローグをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関し、そこでは、野生型CKGFに対して１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失および置換を生じる少なくとも１つの塩基の挿入、欠失または置換、あるいはそれらの組合せを含む。本明細書で使用されるとき、２つのコーディング領域が融合されると言われるとき、１つの核酸分子の3'末端は、他の核酸分子の5'末端に連結されて、その結果、１つの核酸分子のコーディング領域から他へと、フレームシフトなしに翻訳が進む。
【０１２０】
ヌクレオチド・コーディング配列の同義性により、ミュータントサブユニットに関する同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列は、本発明の実践において使用され得る。これらは、配列内で同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変化され、その結果、サイレントな変化を生じる、CKGFサブユニットのコーディング領域の全部または部分を含むヌクレオチド配列を含むが、それらに限定されない。
【０１２１】
更に他の実施態様では、本発明は、一本鎖の糖タンパク質ホルモンアナローグをコードする配列を含む核酸分子を提供し、そこでは、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくは共通のαサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ内または近くに位置して含むミュータントαサブユニットのコーディング領域は、１つ又は複数のアミノ酸置換を、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL1および／またはL3ループ内または近くに位置して含むミュータント糖タンパク質ホルモンβサブユニットのコーディング領域に融合される。さらに、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグをコードする核酸分子も提供され、そこでは、ミュータント糖タンパク質ホルモンβサブユニットのカルボキシル末端は、hCGのβサブユニットのCTEPを介してミュータント共通αサブユニットのアミノ末端に連結される。好ましい実施態様では、核酸分子は、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグをコードし、そこでは、ミュータントβサブユニットのカルボキシル末端はCTEPのアミノ末端に共有結合的に結合され、CTEPのカルボキシル末端は、シグナルペプチド無しに、ミュータントαサブユニットのアミノ末端に共有結合的に結合される。
【０１２２】
本発明の一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグは、ミュータントαおよびβサブユニットをコードする核酸配列を、当分野で公知の方法によって、適切なコーディングフレームで互いに連結し、当分野で公知の方法により融合タンパク質を発現することによって、作製され得る。或いは、そのような融合タンパク質は、ペプチドシンセサイザーを使用するタンパク質合成技術によって作製され得る。
【０１２３】
本発明のミュータントサブユニット、ミュータントダイマー、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、その誘導体およびフラグメントの作製および使用は、本発明の範囲内にある。
【０１２４】
CKGF遺伝子クローニング
CKGFサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、生物学的クローンの「ライブラリー」によって示されるように、クローン化されたDNAのソースから、化学的合成により、cDNAクローニングにより、または所望の細胞タイプから精製されたゲノムDNAのクローニングによって、標準的手順によって得ることができる。これらの手順を行なうための有用な方法は、Sambrookら、Molecular Cloning, A laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)；およびGlover, M.D.(編)、DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., オックスフォード、英国(1985)に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ゲノムまたはcDNAライブラリー中のCKGFサブユニットをコードする配列を増幅するために、使用され得る。合成オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドテンプレートのソースとして、RNAまたはDNA、好ましくはcDNAライブラリーを用いて、PCRプロトコール中でプライマーとして利用され得る。増幅されるDNAは、任意のヒトからのcDNAまたはゲノムDNA含み得る。CKGFサブユニットのセグメントをコードするポリヌクレオチドの成功した単離または増幅の後、そのセグメントは、分子的にクローン化され、配列決定され、完全なcDNAまたはゲノムクローンを単離するプローブとして利用され得る。これは、続いて、CKGFをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の特徴付け、および機能的分析および／または治療的もしくは診断的使用のためのCKGFタンパク質の産生を可能にする。
【０１２５】
サブユニットに関するコーディング領域を単離する代替物は、公開された配列からの遺伝子配列それ自身を化学的に合成することを含む。他の方法が可能であり、本発明の範囲にある。上記の方法は、それによってホルモンサブユニットのミュータントが得られ得る方法の、下記の一般的説明を限定することを意味しない。
【０１２６】
同定され単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子配列の増幅のために、適切なクローニングベクター中に挿入され得る。当分野で公知の多くのベクター-宿主システムが、この目的のために使用され得る。可能なベクターは、プラスミドまたは修飾されたウイルスを含むが、それに限定されない。勿論、ベクターシステムは、これらの手順で使用される宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターは、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、pBR322のようなプラスミドもしくはpUCプラスミド誘導体あるいはpBLUESCRIPTベクター(Stratagene)を含むが、それらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補性の付着末端を有するクローニングベクターにDNAフラグメントを連結することによって、達成され得る。しかしながら、DNAをフラグメント化するのに使用される相補性制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合、DNA分子の末端は、酵素的に修飾され得る。或いは、任意の所望の部位は、ヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端上に連結することによって作製され得る；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含み得る。代替的方法では、開裂されたベクターおよびミュータントサブユニット遺伝子は、ホモポリマー製テーリングによって修飾され得る。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染またはエレクトロポレーションを介して宿主細胞に導入され得、その結果、遺伝子配列の多くのコピーが生成され得る。
【０１２７】
代替的方法では、所望の遺伝子が、「ショットガン」アプローチにおいて、好適なクローニングベクターへの挿入後に、同定され単離され得る。例えば、サイズ分画による、所望の遺伝子の豊富化は、クローニングベクターに挿入する前に、為され得る。
【０１２８】
特定の実施態様では、ミュータントサブユニット遺伝子、cDNA、または合成DNA配列を含む組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数コピーの生成を可能にする。従って、CKGFをコードするポリヌクレオチドは、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えDNA分子を単離し、必要な場合、単離された組換えDNAから挿入遺伝子を回収することによって、多量に得られ得る。遺伝子のコピーは、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントダイマーおよびCKGFアナローグの構造および機能を研究するための突然変異誘発実験において、使用される。
【０１２９】
突然変異誘発
本発明のミュータントCKGFサブユニット、ミュータントダイマー、アナローグ、フラグメントおよび誘導体中に存在する突然変異は、当分野で公知の様々な方法によって作製され得る。それらの作製をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで起こり得る。例えば、サブユニットのクローン化されたコーディング領域は、当分野で公知の多くの戦略のいずれかによって修飾され得る(Sambrookら、1990、Molecular Cloning, A laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)。ポリヌクレオチド配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて、好適な部位で開裂され、続いて、さらに所望ならば酵素的修飾が為され、単離され、インビトロで連結され得る。ミュータントサブユニットの作製では、修飾遺伝子が同じ翻訳リーディングフレーム内に残り、サブユニットがコードされる遺伝子領域中の翻訳停止シグナルによって妨害されないように、注意が払われなければならない。
【０１３０】
さらに、サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、インビトロまたはインビボで突然変異され、コーディング領域中の変異を創出し(例えば、アミノ酸置換)、および／または翻訳、開始、および／または停止配列を創出および／または破壊し、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成または既存のものを破壊して、さらにインビトロでの修飾を促進し得る。当分野で公知の突然変異誘発のための任意の技術が使用され得、化学的突然変異誘発、インビトロ部位指定突然変異誘発(Hutchinson, C.ら、1978, J. Biol. Chem 253: 6551)、PCRに基づくオーバーラップ伸張(Hoら、1998, Gene 77: 51-59)、PCRに基づくメガプライマー突然変異誘発(Sarkarら、1990, Biotechniques, 8: 404-407)、または類似の方法を含むが、それらに限定されない。突然変異の存在は、二本鎖ジデオキシDNA配列決定によって確認され得る。
【０１３１】
サブユニット内の１つ以上のアミノ酸残基は、好ましくは異なる特異性を有する別のアミノ酸によって置換されて、或る範囲の機能的な差異を生じ得る。配列内のアミノ酸に関する置換は、それにアミノ酸が属する異なるクラスのメンバーから選択され得る。非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【０１３２】
ミュータントサブユニット配列の操作は、タンパク質レベルでも為され得る。本発明の範囲に含まれるのは、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基、タンパク質分解性開裂、抗体分子または他の細胞性リガンドへの連結による誘導体化による、翻訳の間または後で区別的に修飾される、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントダイマー、CKGFアナローグである。任意の多くの化学的修飾が、公知の技術によって為され得、それには、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH４による特異的な化学的開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；またはツニカマイシンの存在下での代謝的合成を含むが、それらに限定されない。
【０１３３】
さらに、ミュータントCKGFサブユニットおよびアナローグは、化学的に合成され得る。例えば、所望の突然変異されたドメインを含むミュータントサブユニットの一部に対応するペプチドが、自動化されたペプチドシンセサイザーを用いて、合成され得る。必要に応じて、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナローグが、ミュータントサブユニット配列への置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸は、共通アミノ酸のD-異性体、αアミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、βアラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、Cαメチルアミノ酸、Nαメチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸アナローグを含むが、それらに限定されない。さらに、アミノ酸は、D(右旋性)またはL(左旋性)であり得る。
【０１３４】
ミュータントCKGFをコードするポリヌクレオチドの発現
CKGFのミュータントサブユニットまたは機能的に活性なアナローグもしくはそのフラグメントまたは他の誘導体をコードするポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターに挿入され得る。本発明に関連して、好適な発現ベクターは、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含む。必要な転写および翻訳のシグナルは、天然CKGFサブユニットcDNAまたは遺伝子、および／またはサブユニット遺伝子のそれぞれをフランキングするゲノム配列によっても供給され得る。様々な宿主-ベクターシステムが、タンパク質をコードする配列を発現するために、利用され得る。これらは、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのような組換えウイルスで感染された哺乳動物細胞システム；組換えバキュロウイルスのようなウイルスで感染された昆虫細胞システム；および酵母中で複製が可能なベクターを含む酵母のような微生物を含む。
【０１３５】
ベクターの発現エレメントは、それらの強さ及び特異性において、様々である。利用される宿主-ベクターシステムに依存して、多くの好適な転写および翻訳エレメントの任意の１つが、使用され得る。特定の実施態様では、ミュータントサブユニットコーディング領域または、それぞれのミュータントサブユニットの突然変異された及び機能的に活性な部分をコードする配列が、発現される。
【０１３６】
DNAフラグメントの挿入に関して先に記載された方法のいずれも、好適な転写／翻訳のコントロールシグナルおよびタンパク質コーディング配列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するために、使用され得る。これらの方法は、インビトロでの組換えDNA合成技術ならびにインビボでの組換えを含み得る。ミュータントCKGFサブユニットまたはそのペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の発現は、ミュータントサブユニットまたはペプチドが、組換えDNA分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第２ポリヌクレオチド配列によって制御され得る。例えば、ミュータントCKGFサブユニットまたはそのペプチドフラグメントの発現は、当分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー・エレメントによってコントロールされ得る。使用され得るプロモーターは、SV40早期プロモーター領域(BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290: 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長い末端繰返しに含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78: 1441-1445)、およびメタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinsterら、1982, Nature 296: 39-42)を含むが、それらに限定されない。
【０１３７】
特定の実施態様では、ミュータントCKGFサブユニットのコーディング領域に作動可能に連結された１つ以上のプロモーター、１つ以上の複製起源、および必要に応じて、１つ以上の選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターが使用される。ヘテロダイマーとして天然に存在するそれらのCKGFsのために、同じ真核宿主細胞内の２つのサブユニットの発現が好ましい、というのも、そのような同時発現は、機能的ヘテロダイマー性CKGFの適切なアセンブリーおよびグリコシル化に好都合であるからである。従って、好ましい実施態様では、そのようなベクターは、宿主細胞中で第１のミュータントサブユニットおよび第２のミュータントサブユニットを共に発現するために、使用される。ミュータントサブユニットのそれぞれのコーディング領域は、別々のベクターにクローン化され得る；ベクターは、宿主細胞に、連続的または同時に導入される。或いは、両方のサブユニットのコーディング領域は、好適なプロモーターがそれに作動可能に連結された１つのベクター中に挿入され得る。
【０１３８】
挿入された配列の発現を調節し、または遺伝子産物を所望の特定の方法で修飾およびプロセッシングする、宿主細胞株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質の存在下で増加され得る。この様に、遺伝子操作されたミュータントサブユニットの発現は、コントロールされ得る。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳および翻訳後のプロセッシングおよび修飾(例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化)のための特徴的な特殊なメカニズムを有する。好適な細胞系または宿主システムは、発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセッシングを確実にするように、選択され得る。哺乳動物細胞中での発現は、異種タンパク質の「天然の」グリコシル化を確実にするように、使用され得る。さらに、異なるベクター／宿主発現システムは、プロセッシング反応を様々な範囲にまで、影響し得る。
【０１３９】
一旦、ミュータントサブユニット遺伝子配列を発現する組換え宿主細胞が同定されると、遺伝子産物は、分析され得る。これは、産物の放射性標識、その後に、ゲル電気泳動、イムノアッセイまたはミュータントサブユニットの生物学的活性を検出するのに有用な他の技術を含む、産物の物理的または機能的特性に基づくアッセイによって達成される。
【０１４０】
ミュータントサブユニットおよびそのアナローグに対する抗体の作製
本発明に従うと、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマー、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、そのフラグメントまたは他の誘導体は、そのような免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。好ましくは、抗体は、野生型サブユニットまたは野生型サブユニットを含むダイマーに結合しない。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーを含むが、それらに限定されない。他の実施態様では、ミュータントサブユニットのドメインに対する抗体が、作製される。特定の実施態様では、TSHのようなミュータント糖タンパク質ホルモンに対する抗体が、作製される。
【０１４１】
当分野で公知の様々な手順が、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマー、アナローグ、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、そのフラグメントまたは他のその誘導体に対するポリクローナル抗体の作製のために、使用され得る。抗体の作製のために、サブユニット、ヘテロダイマー、一本鎖アナローグ、およびその誘導体で注射することによって、様々な宿主動物が、免疫され得る。好適な宿主動物は、ウサギ、マウス、ラット、他の哺乳動物ならびにニワトリのような鳥を含む。様々なアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的反応を増大させるために使用され得、それらには、フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような金属ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、スカシガイ・ヘモシアニン、ジニトロフェノールのような表面活性物質、およびBCG（カルメット−ゲラン桿菌）およびcorynebacterium parvumのような可能性として有用なヒトアジュバントを含むが、それらに限定されない。
【０１４２】
ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマー、アナローグ、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、そのフラグメントまたは他のその誘導体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養中で連続的細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術が、使用され得る。例えば、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技術(1975, Nature 256: 495-497)、並びにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983, Immunology Today 4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp.77-96)である。本発明の更なる実施態様では、最近の技術(PCT/US90/02545)を用いて、細菌を含まない動物中で、モノクローナル抗体が作製され得る。本発明に従うと、ヒト抗体は使用され得、ヒトハイブリドーマを用いることにより(Coteら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 2026-2030)、またはヒトB細胞をインビトロでEBVウイルスで形質転換することによって(Coleら、1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96)、得られ得る。事実、エピトープに特異的であるマウス抗体分子からの遺伝子を、好適な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術(Morrisonら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 81: 6851-6855；Neubergerら、1984, Nature 312: 604-608；Takedaら、1985, Nature 314: 452-454)が、使用され得る。これらの技術による抗体産生は、本発明の範囲内にある。
【０１４３】
本発明に従うと、一本鎖抗体を作製するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)は、CKGFサブユニット、ヘテロダイマー、一本鎖アナローグ、又はそのフラグメントもしくは誘導体に対する特異的な一本鎖抗体を作製するために、適合され得る。本発明の更なる実施態様は、Fab発現ライブラリーの構築のために記載された技術(Huseら、1989, Science 246: 1275-1281)を利用して、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能にする。
【０１４４】
イデオタイプの分子を含む抗体フラグメントは、公知の技術により、生成され得る。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化よって作製され得るF(ab')２フラグメント、F(ab')２フラグメントのジスルフィド結合を減少させて生成され得るFab'フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理して作製され得るFabフラグメント、およびFvフラグメントを含むが、それらに限定されない。
【０１４５】
抗体の作製において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で公知の標準的技術を用いて為され得る。例えば、ELISA(酵素連結イムノソルベントアッセイ)は、好適なスクリーニング技術である。例えば、ミュータントサブユニットの特異的ドメインを認識する抗体を選択するために、そのようなドメインを含むミュータントサブユニットのフラグメントに結合する産物に関して、ハイブリドーマをアッセイし得る。ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマーまたは一本鎖アナローグに特異的に結合するが、野生型タンパク質には特異的に結合しない抗体を選択するために、ミュータントへの正の結合および野生型タンパク質への結合の欠如に基づいて選択することができる。ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマーまたは一本鎖アナローグのドメインに特異的である抗体も、本発明により提供される。
【０１４６】
上記の抗体は、本発明のミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマーまたは一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグの局在および活性に関する、当分野で公知の方法の中で使用され得る。これらの方法は、タンパク質のイメージング、診断方法における適切な生理学的サンプル中のタンパク質のレベルを測定することを包含する。
【０１４７】
ミュータントCKGFサブユニットの構造および機能分析
本明細書に記載されるのは、ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマーおよびCKGFアナローグの構造を決定する方法、および上記のインビトロ活性およびインビボでの生物学的機能を分析する方法である。
【０１４８】
一旦、ミュータントCKGFサブユニットが同定されると、それは、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、分別溶解性、またはタンパク質を精製するのに有用な任意の他の標準的技術を含む標準的方法によって、単離され精製され得る。タンパク質の機能的特性は、野生型またはミュータントCKGFタンパク質による刺激への反応として、細胞によりそれが作製した産物を検出するイムノアッセイまたは生物学的アッセイを含む、任意の好適なアッセイを用いて、評価され得る。
【０１４９】
或いは、一旦、組換え宿主細胞によって作製されたミュータントCKGFサブユニットが同定されると、サブユニットのアミノ酸配列は、自動化アミノ酸シークエンサーの使用を含む、タンパク質配列決定のための標準的技術を用いて、決定され得る。
【０１５０】
ミュータントCKGFサブユニット、ミュータントCKGFダイマーアナローグ、一本鎖糖タンパク質ホルモンアナローグ、その誘導体およびフラグメントの機能的活性は、当分野で公知の様々な方法により、アッセイされ得る。
【０１５１】
例えば、ミュータントCKGFサブユニットまたはミュータントCKGFダイマーが、対応する野生型CKGFへの結合または競合する能力に関してアッセイされる場合、またはCKGFサブユニットが、抗体結合に関してアッセイされる場合、当分野で公知の様々なイムノアッセイが、使用され得る。これらのイムノアッセイは、放射性イムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(例えば、コロイド金、酵素または放射性アイソトープ標識を用いる)、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集反応アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる、競合的および非競合的アッセイシステムを含む。抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより、検出され得る。或いは、一次抗体は、二次抗体が標識される場合は特に、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することによって、検出され得る。
【０１５２】
ミュータントCKGFsの診断的および治療的使用
本発明は、本発明の治療的化合物(本明細書では「治療薬」と称する)の投与による、様々な疾患および疾病の治療または予防を提供する。
【０１５３】
CKGFレセプターシグナル変換の不存在または減少に関与する疾患は、CKGFシグナル変換を促進する治療薬の投与によって治療または予防され得る。構成的または増大したCKGFレセプターシグナル変換が不十分または望ましい疾患は、CKGFレセプターシグナル変換に拮抗または阻害する治療薬の投与によって、治療または予防される。
【０１５４】
薬学的組成物
本発明は、有効量の本発明の治療薬を被験体に投与することによる、診断方法および治療方法を提供する。好ましい局面では、治療薬は、実質的に精製されている。被験体は、好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどのような動物を含むが、それらに限定されない動物であり、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトである。特定の実施態様では、非ヒトの哺乳動物が、被験体である。従って、特に好ましい実施態様では、ミュータントおよび／または修飾されたヒトCKGFホモダイマー、ヘテロダイマー、誘導体またはアナローグ、または核酸が、ヒト患者に、治療的または予防的または診断的に投与される。
【０１５５】
本発明のCKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、所望ならばヒトでの使用に先立って、好ましくは、インビトロで、続いて、インビボで試験される。様々な特定の実施態様では、インビトロアッセイは、患者の疾患に関与する細胞タイプ(例えば、甲状腺細胞)の代表的細胞を用いて行われ、ミュータントタンパク質が、そのような細胞タイプに対して所望の効果を有するかどうか決定され得る。
【０１５６】
治療に使用される化合物は、ヒトでのテストに先立って、好適な動物モデルシステムでテストされ得、それらには、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むが、それらに限定されない。インビボでのテストのために、ヒトへの投与に先立って、当分野で公知の任意の動物システムが、使用され得る。
【０１５７】
様々なデリバリーシステムが、公知であり、本発明のCKGFミュータント、誘導体またはアナローグを投与するために使用され得、例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグを発現可能な組換え細胞、レセプター仲介エンドサイトーシス(例えば、WuおよびWu、1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432)などである。投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むが、それらに限定されない。化合物は、任意の慣用されている経路、例えば、注入またはボーラス注入により、上皮または粘膜皮膚のライニング(例えば、口内粘膜、直腸および腸の粘膜など)を介する吸収により投与され得、および他の生物学的活性剤と共に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的組成物を、脳室内および硬膜下腔注射を含む任意の好適な経路により、中枢神経系に導入することが望ましいかもしれない；脳室内注射は、例えば、Ommaya容器のような容器に連結された脳室内カテーテルによって、促進され得る。肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザーの使用により、およびエーロゾル剤による剤形化により、使用され得る。
【０１５８】
特定の実施態様では、治療が必要な領域に局所的に、本発明の薬学的組成物を投与することも所望され得る；これは、例えば、カテーテルにより、坐剤により、インプラントにより、手術の間に局所的に注入することによって為され得、インプラントは、多孔性、非多孔性、またはシアル酸膜もしくはファイバーのような膜を含む、ゼラチン材料のものである。
【０１５９】
他の実施態様では、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、ビヒクル、特にリポソーム中でデリバリーされ得る(Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)；Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (編), Liss、ニューヨーク、pp. 353-365 (1989)；Lopez-Berestein、同上、pp. 317-327を参照。
【０１６０】
更に他の実施態様では、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、制御放出システムを用いてデリバリーされ得る。１つの実施態様では、ポンプが使用され得る(Langer、上記；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987)；Buchwaldら、Surgery 88: 507 (1980)；Saudekら、N. Engl. J. Med. 321: 574(1989)を参照)。他の実施態様では、ポリマー製材料が、使用され得る(Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise(編), CRC Press., Boca Raton, (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall(編), Wiley, ニューヨーク(1984)；RangerおよびPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61(1983)を参照；およびLevyら、Science 228: 190 (1985)；Duringら、Ann. Neurol. 25: 351(1989)；Howardら、J. Neurosurg. 71: 105 (1989)も参照)。更に他の実施態様では、制御放出システムは、治療標的の近くに設置され得、こうして、全身投与量のフラクションのみを要求する(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release、上記、第２巻、pp. 115-138(1984)を参照)。他の制御放出システムは、Langer (Science 249: 1527-1533 (1990))の概説中で考察されている。
【０１６１】
特定の実施態様では、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグをコードする核酸は、それを好適な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを投与することにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するためにインビボで投与され得、その結果、レトロウイルスベクターの使用により(米国特許第4,980,286号を参照)、または直接注入により、または微粒子ボンバードメントの使用により(例えば、遺伝子ガン；Biolistic, Dupont)、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコートすることにより、または核に進入することが公知のホメオボックス様ペプチド(例えば、Joliotら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868を参照)に連結してそれを投与することなどにより、それは細胞内のものになる。或いは、CKGFミュータント、誘導体またはアナローグをコードする核酸分子は、細胞内に導入され、相同組換えにより、発現のための宿主細胞DNA内に組込まれ得る。
【０１６２】
本発明は、薬学的組成物も提供する。そのような組成物は、治療的に有効量のCKGFミュータント、誘導体またはアナローグ、および薬学的に許容される担体を含む。具体的な実施態様では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制機関(regulatory agency)によって承認された、又は米国薬局方にリストされている若しくは他の一般的に認証されている動物用により好ましくはヒト用に使用される薬局方にリストされていることを意味する。用語「担体」は、治療剤がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、滅菌された液体、例えば、水およびオイルであり、石油製、動物性、植物性または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などを含む。薬学的組成物が静脈内に投与されるとき、水が好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、特に注射液用の液体担体としても使用され得る。好適な薬学的賦形剤は、スターチ、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望ならば、少量の湿潤化剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤などの形態をとり得る。組成物は、トリグリセリドのような伝統的結合剤および担体とともに、坐剤として剤型化され得る。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的担体を含み得る。好適な薬学的担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。そのような組成物は、治療的有効量のCKGFミュータント、誘導体、またはアナローグを好ましくは精製形態で、好適な量の担体とともに含み、患者への好適な投与のための形態を提供する。剤型は、投与モードに適合すべきである。
【０１６３】
好ましい実施態様では、組成物は、人間への静脈内投与に適合した薬学的組成物としてルーチンの手順に従い、剤型化される。代表的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌された等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤およびリグノカインのような局所麻酔剤も含み、注射部位での痛みを軽減する。一般に、成分は、別々に又は混合のいずれかで、単位投与量形態、例えば、凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、活性剤の量を表示するアンプルまたはサチェットのような気密シールされた容器中で、供給される。組成物が、注入により投与される場合、滅菌された薬学的グレードの水または生理食塩水を含む注入ビンとともに分配され得る。組成物が注射で投与される場合、注射用滅菌液または生理食塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るようにして提供され得る。
【０１６４】
本発明のミュータントCKGFミュータント、誘導体またはアナローグは、中性または塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたもののような遊離アミノ基とともに形成されたもの、並びに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたもののような遊離カルボキシル基とともに形成されたものを含む。
【０１６５】
特定の疾患または状態の治療に有効である本発明のCKGFミュータント、誘導体またはアナローグの量は、その疾患または状態の性質に依存し、標準的な臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビトロ・アッセイおよび動物モデルは、最適な投与量範囲を同定するのを援助するために、必要に応じて使用され得る。製剤中で使用される正確な用量は、投与経路、疾患または疾病の重篤度にも依存し、開業医およびそれぞれの患者の環境の判断に応じて決定されるべきである。
【０１６６】
具体的な実施態様では、本発明の治療剤は、筋肉内に投与される。筋肉内投与のための好適な範囲は、一般に、投与量当り約10μg〜1 mg、好ましくは投与量当り約10μg〜100μgである。一般に、ヨウ素取込みを刺激するためにCKGFミュータント（例えば、ミュータントTSHヘテロダイマー）が投与される診断的および治療的方法のために、ミュータントタンパク質は、１−３注射のレジメで投与され得る。１つの実施態様では、治療剤は、２用量で投与され、ここで、第２用量は第１用量の24時間後に投与される；他の実施態様では、治療剤は、３用量で投与され、１用量は、７日間レジメの第１、４および７日目に投与される。
【０１６７】
有効な用量は、インビトロまたは動物モデルのテスト・システムから誘導した用量応答曲線から外挿され得る。
【０１６８】
坐剤は、一般に、0.5重量％〜10重量％の範囲で活性成分を含む；経口製剤は、一般に、10重量％〜95重量％の活性成分を含む。
【０１６９】
本発明は、本発明の薬学的組成物の１種以上の成分で満たされた１種以上の容器を含む、治療的または診断的使用のためのパックまたはキットも提供する。そのような容器と必要に応じて関連するのは、薬品または診断用製品の製造、使用または販売を規制している政府機関によって記載された注意書であり得、該注意書は、ヒトへの投与に関する製造、使用または販売について機関の承認を反映している。
【０１７０】
甲状腺刺激ホルモンのミュータント
上記のように、本発明の１つの局面は、新規なミュータントTSHタンパク質、ミュータントTSHタンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらのタンパク質およびポリヌクレオチドの作製方法、並びにその診断および治療方法に関する。本発明者は、特にミュータント甲状腺刺激ホルモン(TSH)、TSH誘導体、TSHアナローグ、およびそのフラグメントをデザインして作製し、両方は、αおよびβサブユニットからなるTSHヘテロダイマーの生物活性を野生型TSHの生物活性に対して増加させ、循環中のホルモン半減期を増加するために修飾されたαおよびβサブユニット中の突然変異(好ましくは、アミノ酸置換)を有する。本発明者は、生物活性を増大するこれらの突然変異およびホルモン半減期を増大する戦略は、超活性突然変異および長く作用する修飾を共に有するTSHヘテロダイマーが、超活性突然変異および長く作用する修飾により個々に付与された追加の活性の総計から予測されたであろうよりはるかに高い生物活性を有するように、相乗作用を示すことを見い出した。
【０１７１】
本発明者は、ヒトαサブユニットのアミノ酸22でのアミノ酸置換、好ましくは、リシンまたはアルギニン、より好ましくはアルギニンのような塩基性アミノ酸の置換が、野生型TSHに対して、TSHの生物活性を増加させることも見い出した。
【０１７２】
本発明者は、インビボでヘテロダイマーの半減期を増加するように、単一サブユニット内で個々の突然変異を組合せ、サブユニットとヘテロダイマーを修飾することによって、ミュータントサブユニットをデザインした。特に、本発明者は、突然変異、特に特定ドメイン中に突然変異を有する、突然変異α、突然変異βのミュータントTSHヘテロダイマーをデザインした。これらのドメインは、共通のαサブユニットのβヘアピンL1ループ、およびTSHβサブユニットのβヘアピンL3ループを含む。１つの実施態様では、本発明は、ミュータントαサブユニット、ミュータントTSHβサブユニット、および１つのミュータントαサブユニットまたは１つのミュータントβサブユニットのいずれかを含むTSHヘテロダイマーを提供し、ここで、ミュータントαサブユニットは、好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含み、およびミュータントβサブユニットは、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含む(好ましくは、これらの突然変異は、ミュータントサブユニットを含むTSHヘテロダイマーの生物活性を増加させ、ミュータントサブユニットを有するTSHヘテロダイマーも野生型TSHヘテロダイマーに対して血清半減期を増加するように修飾された)。
【０１７３】
本発明によれば、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含むミュータントβサブユニットは、そのカルボキシル末端でCTEPに融合され得る。そのようなミュータントβサブユニット-CTEPサブユニットは、共同発現され、および／または野生型もしくはミュータントαサブユニットのいずれかと組立てられて機能的TSHヘテロダイマーを形成し得、該ヘテロダイマーは、野生型TSHよりも大きい生物活性および血清半減期を有する。
【０１７４】
他の実施態様では、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含むミュータントβサブユニット、および好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニットは、融合されて、単一鎖のTSHアナローグを形成する。そのようなミュータントβサブユニット-ミュータントαサブユニットの融合物は、野生型TSHよりも大きい生物活性および血清半減期を有する。
【０１７５】
さらに他の実施態様では、好ましくはβサブユニットのβヘアピンL3ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含み、さらにカルボキシル末端にCTEPを含むミュータントβサブユニット、および好ましくはαサブユニットのβヘアピンL1ループ内または近傍に位置した単一または複数のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニットは、融合されて、単一鎖のTSHアナローグを形成する。
【０１７６】
融合タンパク質、アナローグ、並びにそのようなタンパク質およびアナローグをコードする核酸分子、並びに例えば組換えDNA法による上記タンパク質およびアナローグの作製も提供される。
【０１７７】
特定の局面では、本発明は、突然変異αおよびβサブユニットのアミノ酸配列、ならびに特に機能的に活性であるそのフラグメントおよび誘導体を、提供する。本明細書中で使用される「機能的に活性な」ミュータントTSHαおよびβサブユニットは、野生型サブユニットと関係して１種以上の公知の機能的な活性、例えば、TSHRへの結合、TSHRシグナル変換のトリガリング、抗原性(抗TSH抗体への結合)、免疫原性などを発揮する材料を指す。
【０１７８】
具体的な実施態様では、本発明は、少なくとも６アミノ酸、10アミノ酸、50アミノ酸または少なくとも75アミノ酸からなる突然変異αおよびTSHβサブユニットのフラグメントを提供する。様々な実施態様では、ミュータントαサブユニットは、突然変異したαL1ループドメインを含む又は本質的にそれからなり；ミュータントβサブユニットは、突然変異したαL3ループドメインを含む又は本質的にそれからなる。
【０１７９】
本発明はさらに、突然変異αおよびミュータントβサブユニットならびに修飾されたミュータントαサブユニットおよびβサブユニット(例えば、ミュータントβサブユニット-CTEP融合物またはミュータントβサブユニット-ミュータントαサブユニット融合物)をコードする核酸配列、および該核酸配列を使用する方法を提供する。αサブユニットおよびβサブユニット中の突然変異は、下記の５．１節および５．２節において、それぞれより詳細に説明される。
【０１８０】
本発明は、ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントTSHヘテロダイマー、およびTSHアナローグ、その誘導体およびフラグメントに基づく、治療的および診断的方法および組成物にも関する。本発明は、野生型TSHよりも活性で循環中でより長い半減期を有するミュータントTSHおよびアナローグを投与することによる、甲状腺癌の診断および治療における、本発明のミュータントTSHおよびアナローグの使用を提供する。本発明はさらに、TSHレセプター結合阻害アッセイで本発明のミュータントTSHヘテロダイマーおよびアナローグを用い、TSHレセプターに対する自己抗体の存在によって特徴付けられる疾患および疾病を診断する方法を提供する。診断用キットも、本発明によって提供される。
【０１８１】
本発明は、甲状腺癌のような甲状腺の疾患を治療する方法も提供する。
【０１８２】
開示を明確にするために、また限定されないために、TSH、その誘導体およびアナログのミュータントに関する発明の詳細な説明を以下の副節に分ける。
【０１８３】
TSHαサブユニットのミュータント
上記したように、糖タンパク質ホルモンの共通の(common)ヒトαサブユニットは、図２（配列番号１）に示す９２個のアミノ酸を含むものであって、１０のハーフ−システイン残基(half-cysteine residues)を含み、その全てがジスルフィド結合の形態である。一つの実施態様において、本発明は、ヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのミュータントに関するものであって、該サブユニットは、好ましくは該αサブユニットのβヘアピンL1及び／又はL3ループの中又は近傍に位置する1又は複数のアミノ酸置換を含む。図２に示すように、位置８〜３０から始まるαL1ループ及び位置６１〜８５から始まるαL3ループの中又は近傍に位置するアミノ酸残基が、レセプター結合(receptor binding)及びシグナル伝達を行うのに重要であることが見出された。例えば、位置11-22のようなαL1ループ内に存在するアミノ酸配列は、ヒト科(hominoids)を除く全ての脊椎動物において塩基残基のクラスターを形成し、レセプター結合及びシグナル伝達をプロモートする能力を有する。特に、位置２２のアミノ酸残基は、TSHの効力（potency）に影響を与える残基の一つであることが見出された。本発明によると、上記ミュータントαサブユニットは、野生型タンパク質における１，２，３，４，又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有している。
【０１８４】
一つの実施態様において、上記ミュータントαサブユニットは、本発明の野生型αサブユニットに比し、アミノ酸残基の一又はそれ以上の置換を有し、好ましくは位置8-30及び61-85の残基から選ばれるアミノ酸残基における一又はそれ以上の置換を有している。
【０１８５】
この実施態様の一つの側面において、TSHのαサブユニットにおける一連の変異は、本発明の方法を用いて発生させる。該変異操作のゴールは、野生型TSHダイマーに比し、増大した生物活性を有するミュータントTSHタンパク質αサブユニットを製造することである。これらミュータントTSHタンパク質は、以下のアミノ酸の置換の少なくとも1つを有する、αL1サブユニットに関する配列番号１のアミノ酸配列を有する：P8X、E9X、T11X, L12X,  Q13X、E14X, N15X,  P16X, F17X,  F18X, S19X,  Q20X, P21X,  G22X, A23X,  P24X, I25X,  Q26X, M28X,  又はG30X。"X"は、野生型残基を置換するのに使用されたアミノ酸を表す。
【０１８６】
ここで述べられる全ての変異におけるように、"X"が対応するアミノ酸は、本発明の方法を用いて当業者によって要求された静電荷改変の性質に基く。外縁のループのオーバーオール（overall）の正の又は塩基性の静電荷の増加が要求される時、"X"はリジン（K）、アルギニン（R）又はヒスチジン（H）のような塩基性残基に対応する。外縁のループのオーバーオールの負の又は酸性の静電荷の増加が要求される時、"X"はアスパラギン酸（D）又はグルタミン酸（E）のような酸性残基に対応する。脂肪族アミノ酸のような他のアミノ酸は、ここで述べられる方法において用いることが企図される。
【０１８７】
本発明の1つの側面において、TSHのαサブユニットにおける中性又は酸生アミノ酸残基は、L1ループの静電荷を改変するために突然変異される。静電荷の変化は、野生型のTSHに比しミュータントの生物活性を上昇させるために設計される。これらミュータントTSHタンパク質は、少なくとも1つの、以下のアミノ酸置換を有するαL1サブユニットに関する配列番号１のアミノ酸配列を有する：E9B, T11B, Q13B, E14B, N15B, P16B, F17B, F18B, S19B, Q20B, G22B, P24B, 又はQ26B。"B"は野生型の残基を置換するために用いられる塩基性アミノ酸を表す。塩基性アミノ酸残基はリジン（K）、アルギニン（R）及びヒスチジン（H）からなる群から選ばれる。
【０１８８】
本発明はまた、電荷残基を中性残基に突然変異させることによりL1へアピンループにおける正の又は負の電荷を減少させようとするものでもある。例えば、1つ又はそれ以上の中性アミノ酸は、可変"X"が中性アミノ酸に対応する、上述したL1配列に導入され得る。他の例において、1又はそれ以上の中性残基は、E9U及びE14Uで導入され得る。ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０１８９】
非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL1へアピンループアミノ酸配列中に1又はそれ以上の静電荷改変変異を含む、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットモノマータンパク質が提供される。中性アミノ酸残基を電荷残基に変える変異の例は、P8Z, C10Z, T11Z, L12Z, Q13Z, N15Z, P16Z, F17Z, F18Z, S19Z, Q20Z, P21Z, G22Z, A23Z, P24Z, I25Z, L26Z, Q27Z, C28Z, M29Z, G30Z, P8B, C10B, T11B, L12B, Q13B, N15B, P16B, F17B, F18B, S19B, Q20B, P21B, G22B, A23B, P24B, I25B, L26B, Q27B, C28B, M29B, 及びG30Bを含む。ここで、"Z"は酸性アミノ酸であり、"B"は塩基性アミノ酸である。
【０１９０】
他の実施態様において、本発明は、Cys残基を除いて（Cys残基を除いて）61から85のどの位置にでもアミノ酸置換を有するミュータントヒト糖タンパク質ホルモンαサブユニットL3へアピンループであるミュータントCKGFサブユニットを提供する。この配列もまた図2に示されている。これらのミュータントTSHタンパク質は、少なくとも1つの以下のアミノ酸置換を有するαL3サブユニットに関する配列番号１のアミノ酸配列を有する：V61X, A62X, K63X, S64X, Y65X, N66X, R67X, V68X, T69X, V70X, M71X, G72X, G73X, F74X, K75X, V76X, E77X, N78X H79X, T80X, A81X, H83X, 又はS85X。"X"は野生型の残基を置換するために用いられるアミノ酸を表す。
【０１９１】
この実施態様の1つの側面において、TSHのαサブユニット中の中性又は酸性アミノ酸残基が突然変異させられる。得られた変異サブユニットは、以下のアミノ酸の位置で配列番号１のアミノ酸配列中の少なくとも1つの変異を含む：S64B, N66B, M71B, G72B, G73B, V76B, E77B, 又はA81B。
【０１９２】
本発明は更に、1又はそれ以上の酸性残基を、ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのL3へアピンループのアミノ酸配列中に導入することを企図するものである。例えば、1又はそれ以上の酸性アミノ酸が、上述したものの中に導入され得る。ここで可変"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体的な例は、K63Z、R67Z、K75Z、H79Z及びH83Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０１９３】
本発明はまた、L3ヘアピンループ中において、この領域中の電荷残基を中性残基に突然変異させることにより、正の又は負の静電荷を減少させることを企図するものでもある。例えば、1又はそれ以上の中性アミノ酸が、可変"X"が中性アミノ酸に対応する上述のL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入され得る。例えば、1又はそれ以上の中性残基が、K63U、R67U、K75U、E77U、H79U、及びH83Uにおいて導入され得る。ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０１９４】
非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL3へアピンループアミノ酸配列中の1又はそれ以上の静電荷改変変異を含む、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットタンパク質が提供される。中性アミノ酸残基を電荷残基に変える変異の例は、V61Z, A62Z, S64Z, Y65Z, N66Z, V68Z, T69Z, V70Z, M71Z, G72Z, G73Z, F74Z, V76Z, N78Z, T80Z, A81Z, C82Z, C84Z, S85Z, V61B, A62B, S64B, Y65B, N66B, V68B, T69B, V70B, M71B, G72B, G73B, F74B, V76B, N78B, T80B, A81B, C82B, C84B,及びS85Bを含む。ここで、"Z"は酸性アミノ酸であり、"B"は塩基性アミノ酸である。
【０１９５】
本発明はまた、上記βヘアピンループ構造の外側で、それらのヘアピンループの構造又は形態を変える変異を含むヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットも企図する。これらの構造改変は、二量体分子中に含まれるヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのβヘアピンループ構造の領域と、該二量体タンパク質に親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させるのに役立つ。これらの変異は、ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットモノマーの1-7、31-60、及び86-92の位置からなる群から選ばれる位置で見出される。
【０１９６】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の外側のこれらの変異の具体的な例は、A1J, P2J, D3J, V4J, Q5J, D6J, C7J, C31J, C32J, F33J, S34J, R35J, A36J, Y37J, P38J, T39J, P40J, L41J, R42J, S43J, K44J, K45J, T46J, M47J, L48J, V49J, Q50J, K51J, N52J, V53J, T54J, S55J, E56J, S57J, T58J, C59J, C60J, T86J, C87J, Y88J, Y89J, H90J, K91J, 及びS92Jを含む。可変"J"は、導入によってヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットモノマーを含む二量体タンパク質に親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用の増加が得られるようなアミノ酸なら何でもよい。
【０１９７】
本発明はまた、修飾された形の多くのヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットを企図するものでもある。これらの修飾された形は、他のシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合されたヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットを含む。
【０１９８】
特定の実施態様において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上述した一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのアナログを含む、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットヘテロダイマーは機能的に活性がある、つまり、ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットレセプター結合、ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのタンパク質ファミリーのレセプターシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットと関連した1又はそれ以上の機能活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットヘテロダイマー又は一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのアナログは、好ましくは野生型ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットよりも大きな親和力で、ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットヘテロダイマー又は一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのアナログは、シグナル伝達を引き起こすことが好ましい。最も好ましくは、少なくとも1つのミュータントサブユニットを含むミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットヘテロダイマー、又は本発明の一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのアナログは、野生型ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットよりも大きなインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型BMP-11よりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットヘテロダイマー及び一本鎖ヒト糖タンパク質ホルモンの共通のアルファ−サブユニットのアナログは、当業者に公知の操作に従い、所望の活性について試験され得る。
【０１９９】
好ましい実施態様において、本発明のミュータントαサブユニットは、22の位置に1つのアミノ酸置換を有しており、そこではグリシン残基がアルギニンに置換されている。つまりαG22R。αG22R変異を有するミュータントαサブユニットは、少なくとも1又はそれ以上の付加的なアミノ酸置換、例えば、αT11K、αQ13K、αE14K、αP16K、αF17R、及びαQ20K等（これに限定されない）を有していてもよい。他の好ましい実施態様において、ミュータントαサブユニットは、αT11K、αQ13K、αE14K、αP16K、αF17R、αQ20K、及びαG22Rからなる群から選ばれる1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。例えば、（ミュータントαサブユニットを有するTSHヘテロダイマーの血清半減期を増加させるための修飾と共に用いられる）好ましいミュータントαサブユニットのうちの1つは、ここではまたα4Kとも言われるが、4つの変異を含む：αQ13K+αE14K+αP16K+αQ20K。
【０２００】
本発明のミュータントαサブユニットは機能的に活性であり、つまり、野生型αサブユニットに関連する1又はそれ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントαサブユニットは、TSHRに結合するTSHヘテロダイマーを形成する野生型又はミュータントβサブユニットに非共有的に結合することができる。好ましくは、そのようなTSHヘテロダイマーもまたシグナル伝達を引き起こす。最も好ましくは、ミュータントαサブユニットを含むそのようなTSHヘテロダイマーは、野生型TSHよりも大きなインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有する。本発明においては、野生型又はミュータントβサブユニットと共に、野生型TSHに比し生物活性の著しい上昇を有するTSHヘテロダイマーを形成するスーパーアクティブ（superactive）αミュータントを作るために、1を超える変異をミュータントαサブユニット内で組合わせることが企図される。また、ミュータントαサブユニットを有するTSHヘテロダイマー（つまり、βサブユニット−CTEP融合又はβサブユニット−αサブユニット融合を有するTSHヘテロダイマー）の血清半減期を上昇させるための戦略（strategies）として、複数のαサブユニット変異を組合わせることが企図される。サブユニット内の変異及び長く作用する修飾は相乗的に作用し、生物活性の予想外の上昇を生ずる。
【０２０１】
他の例として、望ましい免疫原性又は抗原性を有するそのようなミュータントαサブユニットは、例えば、イムノアッセイ、免疫感作及びTSHレセプター（TSHR）のシグナル伝達の阻害に用いることができる。
TSHβサブユニットのミュータント
糖タンパク質ホルモンの共通のヒトβサブユニットは、図3（配列番号2）に示すように118個のアミノ酸を含む。本発明は、TSHのβサブユニットのミュータントに関するものであって、該サブユニットは、好ましくは該βサブユニットのβヘアピンL3ループの中又は近傍に位置する１又は複数のアミノ酸置換を含み、そのようなミュータントβサブユニットは、hCGのβサブユニットのCTEPのようなタンパク質の半減期を増加させるために他のCKGFタンパク質又はポリペプチドに融合されるか、又は22の位置（図2（配列番号1）に示される）にアミノ酸置換を有するミュータントαサブユニットを有するTSHヘテロダイマーの部分であるか、又はαサブユニット−βサブユニット融合体である。ヒトTSHβサブユニットの53-87の位置のβL3ループの中又は近傍に位置するアミノ酸残基は、結晶構造における周縁に位置し、そして表面に曝されているように見えるhCGのアミノ酸残基に写像（map to）される。TSH中に存在しないｈCG中の塩基性残基のクラスター（位置58-69から始まる）は特に興味深い。塩基性の又は正電荷を有する残基をヒトTSHのこのドメインへ置換すると、固有活性(intrinsic activity)だけでなくTSHR結合親和力の付加的な(additive)且つ本質的な上昇がもたらされる。
【０２０２】
本発明は、本発明の方法を用いて作られた、TSHβサブユニット中の一連の変異を提供する。本発明のミュータントTSHヘテロダイマーは、野生型サブユニット中の1、2、3、4、又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有しているβサブユニットを有する。このサブユニットのL1ループにおける変異は、Cys残基を除いて1-30のアミノ酸残基において企図される。該変異操作のゴールは、野生型TSHダイマーに比し、二量体のときに増大した生物活性を有するミュータントTSHタンパク質βサブユニットを製造することである。
【０２０３】
本発明の1つの実施態様は、以下のアミノ酸置換の少なくとも1つを有する配列番号2のアミノ酸配列によってコードされた、ミュータントTSHαサブユニットのL1ヘアピンループのサブユニットを提供する：F1X, I3X, P4X, T5X, E6X, Y7X, T8X, M9X, H10X, I11X, E12X, R13X, R14X, E15X, A17X, Y18X, L20X, T21X, I22X, N23X, T24X, T25X, I26X, A28X, G29X, 又はY30X 。"X"は、その置換がL1ループの静電的性質を改変する全てのアミノ酸残基を表す。
【０２０４】
この実施態様の1つの側面において、αサブユニットL1ヘアピンループのサブユニット中の中性又は酸性アミノ酸残基は、このタンパク質ドメインの正の静電的性質を増加させるために突然変異させられる。得られた変異サブユニットは、以下のアミノ酸の位置で配列番号2のアミノ酸配列中の少なくとも1つの変異を含む：F1B, I3B, T5B, E6B, T8B, M9B, E12B, E15B, A17B, T21B, N23B, T24B, T25B, I26B, A28B, G29B, 及び Y30B。"B"は塩基性アミノ酸残基を表す。
【０２０５】
酸性アミノ酸残基を、hTSHのβサブユニットモノマーの配列中の塩基性アミノ酸が存在する所に導入することもまた考えられる。この実施態様において、可変"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電的性質をより負の状態に改変するのに役立つ。そのようなアミノ酸置換の例は、以下のH10Z、R13Z及びR14Zのうちの1又はそれ以上を含む。ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０２０６】
本発明はまた、電荷残基を中性残基に変異させることによりL1ヘアピンループ中の正のまたは負の電荷を減少させることも企図する。例えば、1又はそれ以上の中性アミノ酸が、可変"X"が中性アミノ酸に対応する上述のL1配列に導入され得る。他の例では、1又はそれ以上の中性残基が、E6U、H10U、E12U、R13U、R14U及びE15Uに導入され得る。ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０２０７】
非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL1へアピンループアミノ酸配列中の1又はそれ以上の静電荷改変変異を含むミュータントhTSHベータサブユニットモノマータンパク質が提供される。中性アミノ酸残基を電荷残基に変える変異の例は、I1Z, C2Z, I3Z, P4Z, T5Z, Y7Z, T8Z, M9Z, I11Z, C16Z, A17Z, Y18Z, C19Z, L20Z, T21Z, I22Z, N23Z, T24Z, T25Z, I26Z, C27Z, A28Z, G29Z, Y30Z, I1B, C2B, I3B, P4B, T5B, Y7B, T8B, M9B, I11B. C16B, A17B, Y18B, C19B, L20B, T21B, I22B, N23B, T24B, T25B, I26B, C27B, A28B, G29B, 及び Y30Bの。ここで、"Z"は酸性アミノ酸であり、"B"は塩基性アミノ酸である。
【０２０８】
βサブユニットのL3ループ中の変異はまた、Cys残基を除いて53-87のアミノ酸残基において企図される。これらミュータントTSHタンパク質は、以下のアミノ酸置換の少なくとも1つを有する配列番号2のアミノ酸配列を有する：T53X, Y54X, R55X, D56X, F57X, I58X, Y59X, R60X, T61X, V62X, E63X, I64X, P65X, G66X, P68X, L69X, H70X, V71X, A72X, P73X, Y74X, F75X, S76X, Y77X, P78X, V79X, A80X, L81X, S82X, K84X, G86X, 又はK87X。
【０２０９】
この実施態様の1つの側面において、TSHのβサブユニット中の中性又は酸性アミノ酸残基が、突然変異される。得られるサブユニットは、以下のアミノ酸の位置で配列番号2のアミノ酸配列中の少なくとも1つの変異を含む：I58B, Y59B, T61B, V62B, E63B, S64B, P65B, G66B, P68B, L69B, V71B, 及びA72B。ここで"B"は塩基性アミノ酸残基を表す。
【０２１０】
本発明は更に、1又はそれ以上の酸性残基を、hTSHβサブユニットL3へアピンループのアミノ酸配列に導入することも企図する。例えば、1又はそれ以上の酸性アミノ酸が、上述の配列中に導入され得る。ここで可変"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体的な例はR55Z、R60Z、H70Z、K84Z、及びK87Zを含み、"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０２１１】
本発明はまた、L3へアピンループにおいて、この領域中の電荷残基を中性残基に突然変異させることによって、正の又は負の静電荷を減少させることも企図する。例えば、1又はそれ以上の中性アミノ酸が、可変"X"が中性アミノ酸に対応する上述のL3へアピンループのアミノ酸配列に導入され得る。例えば、1又はそれ以上の中性残基が、R55U、D56U、R60U、E63U、H70U、K84U、及びK87Uにおいて導入され得る。ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０２１２】
非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷残基に変えるL3へアピンループアミノ酸配列における1又はそれ以上の静電荷改変変異を含むミュータントhTSHβサブユニットタンパク質が提供される。中性アミノ酸残基を電荷残基に変える変異の例は、
【０２１３】
【化１】
2003524381.tif 000004
を含む。ここで、"Z"は酸性アミノ酸であり、"B"は塩基性アミノ酸である。
【０２１４】
本発明はまた、上記βへアピンループ構造の外側でそれらへアピンループの構造または形態を改変する変異を含むhTSHベータサブユニットを企図するものでもある。これらの構造改変は、二量体分子中に含まれるhTSHベータサブユニットのβへアピンループ構造の領域と、該二量体タンパク質に親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させるのに役立つ。これらの変異は、hTSHのベータサブユニットモノマーの31-52及び88-118の位置からなる群から選ばれる位置で見出される。
【０２１５】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の外側のこれら変異の具体的な例は、
【０２１６】
【化２】
2003524381.tif 000005
を含む。可変"J"は、その導入によってhTSHのベータサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントhTSHのベータサブユニットモノマーを含む二量体タンパク質に親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用の増加が得られるようなアミノ酸なら何でもよい。
【０２１７】
本発明はまた、修飾された形で多くのhTSHベータサブユニットも企図する。これらの修飾された形は、他のシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したhTSHベータサブユニットを含む。
【０２１８】
特定の実施態様において、上述したような少なくとも1つのミュータントサブユニット又は一本鎖hTSHベータサブユニットアナログを含む、ミュータントhTSHベータサブユニットヘテロダイマーは、機能的に活性がある、つまり、hTSHベータサブユニットレセプター結合、hTSHベータサブユニットのタンパク質ファミリーのレセプターシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型hTSHベータサブユニットと関連した1又はそれ以上の機能活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントhTSHベータサブユニットヘテロダイマー又は一本鎖hTSHのベータサブユニットのアナログは、好ましくは野生型hTSHベータサブユニットよりも大きな親和力で、hTSHベータサブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントhTSHベータサブユニットヘテロダイマー又は一本鎖hTSHベータサブユニットのアナログは、シグナル伝達を引き起こすことが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも1つのミュータントサブユニット又は一本鎖hTSHベータサブユニットのアナログを含むミュータントhTSHベータサブユニットへテロダイマーは、野生型hTSHベータサブユニットよりも大きなインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型hTSHベータサブユニットよりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントhTSHベータサブユニットヘテロダイマー及び一本鎖hTSHベータサブユニットのアナログは、当業者に公知の操作によって、所望の活性の試験を行うことができる。
【０２１９】
1つの実施態様において、ミュータントβサブユニットは、野生型βサブユニットに比し、1又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、好ましくは、図3（配列番号2）に示すβサブユニットの53−87の位置の残基から選ばれるアミノ酸残基中に1又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。
【０２２０】
好ましい実施態様において、ミュータントβサブユニットは、βI58R、βE63R、及びβL69Rからなる群から選ばれる1、2、3、又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。例えば、ここでβ3Rとも言われる好ましいミュータントβサブユニットに１つは、3つの変異：βI58R＋βE63R＋βL69Rを含む。
【０２２１】
ミュータントβサブユニットを有する本発明のミュータントTSH、TSHアナログ、誘導体、及びそれらのフラグメントはまた、22の位置（図2（配列番号1）に示す）にアミノ酸置換を有する1つのミュータントαサブユニットを有し、且つ／又は野生型TSHよりも大きな血清半減期を有する。1つの実施態様において、野生型βサブユニットに比し、1又はそれ以上のアミノ酸残基の置換を含むミュータントβサブユニットは、他のCKGFタンパク質のカルボキシル末端部分（その1つの例はhCGのカルボキシル末端部分伸張ペプチド（CTEP）である）に共有結合されている。CTEPは、hCGβサブユニットのカルボキシル末端の32アミノ酸を含み（図4に示す）、ミュータントβサブユニットに共有結合され、好ましくは、ミュータントβサブユニットのカルボキシル末端はCTEPのアミノ末端に共有結合される。βサブユニット及びCTEPは、当業者に公知の任意の方法、例えば、ペプチド結合によって又はタンパク質のアミノ末端及びカルボキシル末端の間の共有結合を形成することができるヘテロ二官能試薬、例えば限定されないがペプチドリンカーによって共有結合され得る。好ましい実施態様において、ミュータントβサブユニット及びCTEPはペプチド結合によって結合される。種々の好ましい実施態様において、ミュータントβサブユニット−CTEPの融合体は、βI58R、βE63R、及びβL69Rからなる群から選ばれる1、2、3、又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。
【０２２２】
他の実施態様において、ミュータントβサブユニットは融合される、つまりαサブユニット、好ましくはミュータントαサブユニットに共有結合される。
【０２２３】
本発明のミュータントβサブユニットは機能的に活性である、つまり、野生型βサブユニットに関連した1又はそれ以上の機能的な活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントβサブユニットは、野生型又はミュータントαサブユニットに非共有的に結合することができ、TSHRに結合するTSHヘテロダイマーを形成する。好ましくは、そのようなTSHヘテロダイマーもまたシグナル伝達を引き起こす。最も好ましくは、ミュータントβサブユニットを含むそのようなTSHヘテロダイマーは、野生型TSHの生物活性よりも大きなインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有する。本発明において、1を超えるの変異をミュータントβサブユニット内で結合することができ、こうして野生型TSHに比し生物活性の著しい上昇を有するTSHヘテロダイマーを製造することが企図される。本発明者らは、サブユニット内の多数の変異及びTSHヘテロダイマーの半減期を増加させる修飾（つまりβサブユニット−CTEP融合及び／又はβサブユニット−αサブユニット融合）が相乗的に作用して、変異及び長く作用している修飾の上昇の合計よりも大きい生物活性を達成し得ることを発見した。
【０２２４】
ミュータントβサブユニットは、当業者によく知られた手法によって所望の活性について試験することができる。
ミュータントＴＳＨヘテロダイマー及びＴＳＨアナログ
本発明は、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットを含むミュータントヒトＴＳＨヘテロダイマー及びヒトＴＳＨアナログであって、該ミュータントαサブユニットは、該αサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍にしばしば位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含み、該ミュータントβサブユニットは、該βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものであり、また、該ヘテロダイマー又はアナログは、（例えば、ＣＴＥＰ融合等のβサブユニット−ＣＫＧＦ融合又はαサブユニット−βサブユニット融合によって）血清半減期が増加するように変性されている、ミュータントヒトＴＳＨヘテロダイマー及びヒトＴＳＨアナログを提供する。ミュータントαサブユニットでの一個又は複数のアミノ酸置換は、ヒトαサブユニットのアミノ酸配列の８−３０位及び６１−８５位から選ばれたアミノ酸残基で行うことができる。ミュータントＴＳＨβサブユニットでの一個又は複数のアミノ酸置換は、ヒトＴＳＨβサブユニットのアミノ酸配列の１−３０位及び５３−８７位から選ばれたアミノ酸残基で行うことができる。特に限定されるものではないが、この様なミュータントＴＳＨの具体例は、上記したミュータントαサブユニット、α４Ｋ、及びミュータントβサブユニット、β３Ｒのヘテロダイマーを含む。
【０２２５】
一つの実施態様として、本発明は、αサブユニット、好ましくはミュータントαサブユニット、及びβサブユニット、好ましくはヒトβサブユニットを含むＴＳＨヘテロダイマーであって、該ミュータントα又はミュータントβサブユニットの何れかが、ｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰ等の他のＣＫＧＦタンパクの一部に融合している、ＴＳＨヘテロダイマーを提供する。本明細書では、用語融合タンパクとは、２個のペプチドの共有結合の生成物であるタンパクを意味する。融合は、全体又はそのタンパクの一部として、他のＣＫＧＦに対してでよい。共有結合とは、そのアミノ−及びカルボキシル末端のそれぞれで、共有結合的に２個のペプチドを結合する公知の方法を含むものであり、この様な方法は、特に限定的ではないが、ペプチド結合、又は限定的ではないが、例えば、ペプチドリンカー等のヘテロ二官能性試薬を介して結合することを含む。好ましい具体例としては、ミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、ミュータントヒトαサブユニット及びミュータントヒトＴＳＨβサブユニットを含んでもよく、該ミュータントヒトＴＳＨβサブユニットは、ＣＴＥＰのアミノ末端にそのカルボキシル末端で共有結合している。
【０２２６】
本発明は、また、ミュータントヒトＴＳＨβサブユニットに共有結合（上記したβサブユニット−ＣＴＥＰ融合の様に）したミュータントヒトαサブユニットを含む単鎖ヒトＴＳＨアナログであって、該ミュータントαサブユニット及びミュータントヒトＴＳＨβサブユニットは、それぞれ各サブユニットのアミノ酸配列に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む単鎖ヒトＴＳＨアナログに関する。好ましい具体例では、ミュータントβサブユニットは、ミュータントαサブユニットにペプチドリンカーを介して結合している。より好ましい具体例では、高いセリン／プロリン含量を有し、有効な二次構造を欠いたｈＣＧのＣＴＥＰが、ペプチドリンカーである。
【０２２７】
αサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニットは、βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントβサブユニットに共有結合することが好ましい。
【０２２８】
一つの実施態様として、ヒトＴＳＨβサブユニットのアミノ酸配列の１−３０位、好ましくは５３−８７位から選ばれたアミノ酸残基に少なくとも一個のアミノ酸置換を含むミュータントヒトＴＳＨβサブユニットは、野生型ヒトＴＳＨαサブユニット、又は少なくとも一個のアミノ酸置換を含むミュータントＴＳＨαサブユニットのアミノ末端とそのカルボキシル末端で共有結合しており、１個又は二個以上の置換がヒトαサブユニットのアミノ酸配列の８−３０位及び６１−８５位から選ばれたアミノ酸残基にある。
【０２２９】
ミュータントαサブユニット又はミュータントヒトＴＳＨβサブユニットは、それぞれ、そのシグナル配列を欠いても良い。
【０２３０】
本発明は、また、ミュータントαサブユニットに共有結合しているＣＴＥＰに共有結合したミュータントヒトＴＳＨβサブユニットを含むヒトＴＳＨアナログであって、該ミュータントαサブユニット及びミュータントヒトＴＳＨβサブユニットが、それぞれ、各サブユニットのアミノ酸配列に少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、ヒトＴＳＨアナログを提供する。
【０２３１】
具体例としては、ミュータントβサブユニット−ＣＴＥＰ融合体は、ミュータントαサブユニットに共有結合し、ミュータントβサブユニットのカルボキシル末端は、ｈＣＧのＣＴＥＰを介してミュータントαサブユニットのアミノ末端に結合する。好ましくは、ミュータントβサブユニットのカルボキシル末端はＣＴＥＰのアミノ末端に共有結合し、ＣＴＥＰのカルボキシル末端は、シグナルペプチド無しに、ミュータントαサブユニットのアミノ末端に共有結合する。
【０２３２】
従って、具体例として、ヒトＴＳＨアナログは、一個又は二個以上の置換がヒトαサブユニットのアミノ酸配列の８−３０位及び６１−８５位から選ばれたアミノ酸残基に存在する、少なくとも一個のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニットのアミノ末端とカルボキシル末端エクステンションペプチドのカルボキシル末端で共有結合しているＣＴＥＰのアミノ末端とミュータントヒトＴＳＨβサブユニットのカルボキシル末端で共有結合しているヒトＴＳＨβサブユニットのアミノ酸配列の１−３０位及び５３−８７位から選ばれたアミノ酸残基に少なくとも一個のアミノ酸置換を含むミュータントヒトＴＳＨβサブユニットを含むものである。
【０２３３】
他の好ましい実施態様としては、ミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、ヒトαサブユニット配列（図２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）参照）の２２位にアミノ酸置換、好ましくは塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、多少好ましくないがヒスチジン）、より好ましくはアルギニンによる置換を有するミュータントαサブユニットを含む。
【０２３４】
具体的な実施態様として、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントＴＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、機能的に活性、即ち、ＴＳＨＲ結合、ＴＳＨＲシグナリング、及び細胞外分泌等の野生型ＴＳＨに関連する一種又は二種以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、好ましくは野生型ＴＳＨよりも強い親和力で、ＴＳＨＲに結合することができる。また、この様なミュータントＴＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーすることが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントＴＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＴＳＨアナログは、野生型ＴＳＨよりも高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ＴＳＨよりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマー及び単鎖ＴＳＨアナログは、公知の方法によって、所望の活性をテストすることができる。
【０２３５】
ミュータントＴＳＨ及びアナログをコードするポリヌクレオチド
また、本発明は、本発明のヒトＴＳＨ及びＴＳＨアナログのミュータントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによって野生型ＴＳＨと比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせているものである、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを変更することのない塩基突然変異が好ましい。ここでは、２つのコード領域が融合されているという場合には、核酸分子の３'末端が他の核酸分子の５'（又はペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０２３６】
遺伝コードの同義性により、ミュータントα又はβサブユニットに同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、本発明を実施するために使用できる。これらは、特に限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変化を生じる、α又はβサブユニットのコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【０２３７】
一つの実施態様では、本発明は、ミュータントαサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該ミュータントαサブユニットが、好ましくは該αサブユニットのβヘアピンＬ１ループ又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供する。具体的な実施態様としては、本発明は、図２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に示されたαサブユニットのアミノ酸配列の２２位にアミノ酸置換、好ましくは塩基性アミノ酸、より好ましくはアルギニンとの置換を有するミュータントαサブユニットをコードする核酸を提供する。本発明は、更に、βサブユニットのβヘアピンＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含み、及び／又はＣＴＥＰに共有結合しているミュータントβサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０２３８】
更に他の実施態様としては、本発明は、単鎖ＴＳＨアナログをコードする配列を含む核酸分子であって、αサブユニットのβヘアピンＬ１ループ又はその近傍に位置することが好ましい一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントαサブユニットのコード領域が、βサブユニットのβヘアピンＬ３ループ又はその近傍に位置することが好ましい一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントβサブユニットのコード領域と融合している、核酸分子を提供する。更に、ミュータントβサブユニットのカルボキシル末端がｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰを介してミュータントαサブユニットのアミノ末端に結合している単鎖ＴＳＨアナログをコードする核酸分子も提供する。好ましい実施態様としては、該核酸分子は単鎖ＴＳＨアナログをコードし、ここでミュータントβサブユニットのカルボキシル末端はＣＴＥＰのアミノ末端に共有結合し、ＣＴＥＰのカルボキシル末端はシグナルペプチド無しにミュータントαサブユニットのアミノ末端に共有結合している。
【０２３９】
本発明の単鎖アナログは、適切なコーディングフレーム内で、ミュータントα及びβサブユニットをコードする核酸配列を、公知の方法によって互いに連結し、当業者に通常知られている方法によって、融合タンパクを発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用などのタンパク合成方法によって作製できる。
【０２４０】
ミュータントＴＳＨサブユニット及びアナログの作製
本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの作製及び使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータントサブユニット又はＴＳＨアナログは、これに限定はされないが、例えば、ミュータントβサブユニットとｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰを含むか、又はミュータントβサブユニットとミュータントαサブユニットを含む融合タンパクである。一つの実施態様としては、この様な融合タンパクは、これに限定されるものではないが、リシン又はジフテリア毒素等の毒素類の様な他のタンパクのコード配列にフレーム内で結合されたミュータント又は野生型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパクは、適切なコードフレーム内で、公知の方法によって、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結し、公知の方法によって融合タンパクを発現させることによって作製できる。或いは、この様な融合タンパクは、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用のような、タンパク合成方法によって作製できる。ミュータントα及び／又はβサブユニットの部分を含み、異種タンパク−コード配列に融合されたキメラ遺伝子も構成できる。具体的な実施態様は、好ましくはミュータントαサブユニットとミュータントβサブユニットの間にペプチドリンカーを介して、ミュータントβサブユニットに融合されたミュータントαサブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
【０２４１】
ミュータントＴＳＨサブユニットの構造及び機能解析
以下に、ミュータントＴＳＨサブユニット、ミュータントヘテロダイマー及びＴＳＨアナログの構造決定方法、及びこれらのインビトロ活性及びインビボ生物学的機能の解析方法を記載する。
【０２４２】
ミュータントα又はＴＳＨβサブユニットが一旦確認されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等の標準的な方法、又はタンパク精製のための他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述する免疫検定法等）を用いて評価できる。
【０２４３】
或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントαサブユニット及び／又はＴＳＨβサブユニットが確認されれば、そのサブユニットのアミノ酸配列は、例えば、自動アミノ酸シークエンサーなどにより、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０２４４】
ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824）によって特徴付けることができる。親水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びその領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０２４５】
二次的な構造解析（Chou, P. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）も、特別な二次構造をとるサブユニットの領域を同定するために行うことができる。
【０２４６】
構造解析のための他の方法を利用しても良い。これらの方法は、特に限定的ではないが、Ｘ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13）及びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling , in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）等である。ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントも、ＢＬＡＳＴ、ＣＨＡＲＭＭｍリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ  ｖ．３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国）等の当業界で利用できるコンピューターソフトウエアープログラムを用いて行うことができる。
【０２４７】
ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの機能的活性についても、各種の公知の方法で評価することができる。
【０２４８】
例えば、ミュータントサブユニット又はミュータントＴＳＨについて、抗体に結合する能力或いは結合するために野生型ＴＳＨ又はそのサブユニットと競合する能力を評価する場合には、公知の各種のイムノアッセイ法を用いることができ、これに限定されるものではないが、これには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、"サンドウィッチ"イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えば、コロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することによって認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされている場所を検出することによって認められる。免疫検定法で結合を検出するための多くの手段が公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０２４９】
ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）への結合は、例えば、これに限定されないが、Szkudlinski他（1993, Endocrinol. 133:1490-1503）によって記載された子ウシＴＳＨ等の他の種の放射腺ラベルしたＴＳＨのＴＳＨＲからの置換に基づく、インビトロアッセイ等の当該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性も、例えば、Grossmann 他（1995, Mol. Endocrinol. 9:948-958）によって開示された方法等のＴＳＨＲを発現する細胞における環状ＡＭＰ刺激；及び、例えば、これに限定されないが、Szkudlinski他（1993, Endocrinol. 133:1490-1503）に記載された、甲状腺細胞で摂取されたチミジンの刺激に基づくアッセイ等によって測定できる。
【０２５０】
インビボ生物活性は、例えば、East-Palmer他（1995, Thyroid 5:55-59）によって記載されたミュータントＴＳＨヘテロダイマー、ＴＳＨアナログ、又は単鎖アナログの注射後、マウスのＴ４分泌物の測定などの動物モデルにおけるＴＳＨＲ結合の生理的相関性によって決定できる。例えば、野生型ＴＳＨは及びミュータントＴＳＨは、６日間飲料水中に入れた３μｇ／ｍｌ  Ｔ３を投与して、予め抑制された内生的ＴＳＨを有する雄のアルビノSwiss Crl:CF-1マウスに腹腔内投与される。６時間後、血液サンプルを眼窩腔及び血清Ｔ４から採取し、ＴＳＨレベルをそれぞれの化学ルミネセンス検定（Nichols Institute）により測定する。
【０２５１】
タンパクの半減期は、タンパク安定性の大きさであり、タンパク濃度が１／２に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＴＳＨの半減期は、例えば、これに限定されるものではないが、抗−ＴＳＨ抗体を用いて、ミュータントＴＳＨの投与後一定期間後に採取したサンプルにおけるミュータントＴＳＨレベルを測定する免疫検定法、又は放射線ラベルしたミュータントＴＳＨを投与後に被験体から採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータントＴＳＨの検出等、一定期間後の被験体からのサンプルにおけるＴＳＨレベルを測定するいかなる方法によっても決定できる。
【０２５２】
他の方法が当業者には公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０２５３】
診断及び治療における使用
本発明は、本発明の治療用物質（ここでは、治療薬という）の投与による各種の病気及び障害の治療又は予防法を提供する。該治療薬は、図２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に示されたαサブユニットの２２位に少なくとも一個のアミノ酸置換を有するミュータントαサブユニット及びミュータント又は野生型βサブユニットを有するＴＳＨヘテロダイマー；好ましくはＬ１ループ（図２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に示されたアミノ酸８−３０）又はその近傍に一個又は２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントαサブユニット及び好ましくはＬ３ループ（図３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に示されたアミノ酸５２−８７）又はその近傍に一個又は２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントβサブユニットを有し、ｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰに共有結合したＴＳＨヘテロダイマー；好ましくはＬ１ループ又はその近傍に一個又は２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントαサブユニット及び好ましくはＬ３ループ又はその近傍に一個又は２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントβサブユニットを有し、該ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットは共有結合して単鎖アナログを形成するＴＳＨヘテロダイマー、例えば、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット及びｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰが単鎖アナログに共有結合しているＴＳＨヘテロダイマー、他の誘導体、これらのアナログ及びフラグメント（例えば、上記したもの）、並びに本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマー、及びその誘導体、アナログ及びフラグメントをコードする核酸等を含む。
【０２５４】
該治療薬を投与する被験者は、これに限定されるものではないが、好ましくは雌ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物であり、好ましくは哺乳動物である。好ましい例として、被験者は、ヒトである。一般的に、被験者と同じ種である種起源の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、ヒトミュータント及び／又は改変されたＴＳＨヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与される。
【０２５５】
好ましい局面において、本発明の治療薬は、実質的に精製される。
【０２５６】
甲状腺機能低下症として示される多くの障害は、本発明の方法によって治療することができる。ＴＳＨが欠如又は通常若しくは好ましいレベルと比べて減少している障害は、本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマー又はＴＳＨアナログの投与によって治療又は予防される。ＴＳＨレセプターが欠如若しくは通常のレベルより減少しているか、或いは野生型ＴＳＨに対して無反応若しくは通常のＴＳＨＲより反応性が低い障害も、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー又はＴＳＨアナログの投与によって治療できる。構成的に活性なＴＳＨＲは、甲状腺機能亢進症に導くことができ、ミュータントＴＳＨヘテロダイマー及びＴＳＨアナログが拮抗薬として使用できることが予想される。
【０２５７】
具体例として、分化した甲状腺機能を刺激できるミュータントＴＳＨヘテロダイマー及びＴＳＨアナログが、予防を含む治療のために投与される。治療又は予防できる病気及び障害としては、これに限定されるものではないが、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、甲状腺発生、甲状腺癌、良性甲状腺腫、拡大甲状腺、アポトーシスからの甲状腺細胞保護などがある。
【０２５８】
ＴＳＨタンパク若しくはその機能、又はＴＳＨＲタンパク及びその機能の不存在又はレベルの低下は、例えば、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）得て、ＴＳＨ若しくはＴＳＨＲの発現したＲＮＡ又はタンパクのＲＮＡ若しくはタンパクレベル、構造及び／又は活性をインビトロでアッセイするこによって容易に検出できる。従って、特に限定的ではないが、ＴＳＨ又はＴＳＨＲタンパクを検出及び／又は視覚化する免疫検定（たとえなウエスタンブロット（Western blot）、免疫沈降を行い、次いで、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等による）及び／又はＴＳＨ又はＴＳＨＲ  ｍＲＮＡを検出及び／又は視覚化することによって、ＴＳＨ又はＴＳＨＲ発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ等（ノーザンアッセイ（Northern assay), ドットブロット（dot blots)、in situハイブリッド形成など）、この分野で標準的な多くの方法を利用できる。
【０２５９】
具体的な態様としては、本発明の治療薬は、甲状腺癌の治療に使用される。ミュータントＴＳＨヘテロダイマー及びアナログは、放射性ヨウ素を用いた治療としての切除の前に、甲状腺及び転移組織の刺激に有用である。例えば、本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、放射線切除のための放射線ラベルされたヨウ素の投与の前に、甲状腺癌の患者に投与することができる。また、本発明の治療薬は、多結節性甲状腺腫の治療としての放射線切除に先だって、良性の多結節性甲状腺腫によるヨウ素摂取の刺激、又は拡大甲状腺の治療のための放射線切除に先だって、甲状腺組織によるヨウ素摂取の刺激に使用できる。
【０２６０】
特に、放射線切除療法は、本発明の治療薬の投与、好ましくは該治療薬を筋肉内に、例えば、これに限定されるものではないが、一日一回の投与を二日間、又は７日間養生法において一日目、４日目及び７日目に一回投与する１〜３回投与法によって行われる。投与量は、任意の適切な投与量、例えば、特に限定的では無いが、約１０μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜１００μｇの投与量である。上記養生法による最後の投与後一日目に、放射線ラベルヨウ素、好ましくは131Ｉを、癌、非癌性甲状腺腫又は拡大甲状腺を治療するために充分な量を患者に投与する。投与すべき放射線ラベルヨウ素の量は、疾患の種類及び激しさに依存する。一般に、３０〜３００ｍＣｉの131Ｉが甲状腺腫瘍の治療のために投与される。
【０２６１】
他の具体例としては、本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、甲状腺又は甲状腺癌細胞への治療薬の標的放出、例えば、遺伝子治療のための核酸の標的放出（例えば、甲状腺癌細胞に向けた腫瘍抑制遺伝子の標的放出）又は、例えば、これに限定されないが、リシン、ジフテリア毒素等の毒素類の標的放出に使用することができる。
【０２６２】
本発明は、更に、甲状腺癌、好ましくは甲状腺カルシノーマの診断、予知、スクリーニング方法、及び、例えば、本発明のＴＳＨヘテロダイマーの投与による、甲状腺癌治療のモニタリング方法を提供する。具体的な態様として、本発明の治療薬は、甲状腺細胞（甲状腺癌細胞を含む）のヨウ素摂取（特に限定的ではないが、好ましくは131Ｉ又は125Ｉ等の放射線ラベルヨウ素）を刺激するため、及び／又は甲状腺細胞（甲状腺癌細胞を含む）からの甲状腺グロブリンの分泌を刺激するために患者に投与される。該治療薬の投与に続いて、放射線ラベルヨウ素を患者に投与し、ついで、患者における放射線ラベルヨウ素の存在及び局所化（すなわち、甲状腺細胞）を検出し（例えば、限定的ではないが、全身スキャニングによって）、及び／又は患者における甲状腺グロブリンのレベルを測定又は検出する。ここで、甲状腺癌又は甲状腺疾患の無い患者のレベル又は標準的なレベルと比べて、放射性ヨウ素摂取量のレベルの増加、又は甲状腺グロブリン分泌のレベルの増加は、この患者が甲状腺癌を持つことを示す。ある種の患者は甲状腺除去又は甲状腺組織切除療法を受けたことがあるようであり、残存する甲状腺組織がほとんど又は全く存在しない。このような患者、又は非癌性甲状腺細胞を欠如する他のいかなる患者も、どのようなヨウ素摂取又は甲状腺グロブリン分泌の検出（甲状腺除去若しくは切除療法の後、又は他の理由による甲状腺組織の喪失の後に残る残存レベルを上回る）であっても、甲状腺癌細胞の存在を示す。患者に導入された放射線ラベルヨウ素の局在化は、疾患又は悪性腫瘍の広がり又は転移を検出するために使用できる。更に、本発明の診断方法は、治療の過程に応じて放射線ラベルヨウ素又は甲状腺グロブリンレベルの変化を測定するか、又は甲状腺腫瘍の退化若しくは成長又は転移を検出することによって、甲状腺癌の治療をモニターするために使用できる。
【０２６３】
特に、診断方法は、本発明の治療薬の投与、好ましくは該治療薬を筋肉内に、例えば、これに限定されるものではないが、一日一回の投与を二日間、又は７日間養生法において一日目、４日目及び７日目に一回投与する１〜３回投与法で投与することによって行われる。投与量は、任意の適切な投与量、例えば、特に限定的では無いが、約１０μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜１００μｇの投与量である。上記養生法による最後の投与後一日目に、放射線ラベルヨウ素、好ましくは１３１Ｉを、甲状腺細胞（ガン細胞を含む）の検出に充分な量だけ患者に投与する。一般に、１〜５ｍＣｉの１３１Ｉが、甲状腺カルシノーマを診断するために投与される。放射線ラベルヨウ素の投与の２日後に、患者における放射線ラベルヨウ素の摂取は、例えば、これには限定されないが、全身放射性ヨウ素スキャニングによって、患者において検出及び／又は局所化される。あるいは、甲状腺細胞の全て又はほとんどが取り除かれている場合には（例えば、既に甲状腺除去若しくは甲状腺組織切除療法を行った患者）、甲状腺グロブリンレベルは、本発明の治療薬の最終投与後、２〜７日目に測定できる。甲状腺グロブリンは、当業界に公知の甲状腺グロブリンに特有の免疫放射線検定法の利用を含む、当業者に公知のあらゆる方法で測定できる。
【０２６４】
また、本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーは、例えばKakinurma他（1997, J. Clin., Endo. Met. 82 ; 2129-2134）に記載された、ＴＳＨレセプター自己抗体に対するＴＳＨ結合抑制アッセイで使用できる。ＴＳＨレセプターに対する抗体は、例えば、特に限定的ではないが、グレイブ疾患（Graves' disease）及び橋本甲状腺炎（Hashimoto' s thyroiditis）等のある種の甲状腺疾患に関与し、従って、これらの結合抑制アッセイは、グレイブ疾患及び橋本甲状腺炎等の甲状腺疾患の診断として使用できる。簡単に言えば、該ＴＳＨレセプターを含む細胞又は膜を、ＴＳＨＲ抗体に対して試験されるべきサンプル及び本発明の放射線ラベルミュータントＴＳＨと接触させ、試験されるサンプルと接触させることなく、放射線ラベルミュータントＴＳＨと接触させた細胞又は膜に対する結合と比べて、本発明の放射線ラベルミュータントＴＳＨの結合が抑制されることは、試験すべきサンプルがＴＳＨレセプターに結合する抗体を有することを示すものである。野生型ＴＳＨより高い生物活性を有する本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーを使用した結合抑制アッセイは、野生型ＴＳＨを用いた結合抑制アッセイを行うよりも、抗−ＴＳＨレセプター抗体に対する高い感受性を有する。
【０２６５】
従って、本発明の実施態様は、ＴＳＨレセプターを含む培養された細胞又は単離された膜を、患者からの抗体を含むと思われるサンプル及び診断のための有効量の放射線ラベルされた本発明のミュータントＴＳＨヘテロダイマーと接触させ、放射線ラベルされたミュータントＴＳＨの培養された細胞又は単離された膜に対する結合を測定することを含む方法であって、この場合、該サンプルの非存在下又はこの病気若しくは障害を有さない類似サンプルの存在下での結合と比べて、放射線ラベルされたＴＳＨの結合が減少することは、この病気又は障害が存在することを示すものである、ＴＳＨＲに対する抗体の存在によって特徴づけられる病気又は障害、好ましくは、グレイブ疾患を診断又はスクリーニングする方法を提供する。
【０２６６】
また、ミュータントヘテロダイマー及びアナログは、自律性過機能甲状腺結節又は外因性甲状腺ホルモン療法による患者における抑制されているが、機能的である甲状腺組織を検出する診断方法においても使用できる。ミュータントＴＳＨヘテロダイマー及びＴＳＨアナログは、限定的ではないが、中枢性及び結合された一次性及び中枢性甲状腺機能低下、甲状腺の片側萎縮、及びＴＳＨ作用に対する抵抗性の診断に関連するその他の応用を有することができる。
【０２６７】
ｈＣＧβサブユニットのミュータント
繊毛性性腺刺激ホルモンのヒトβサブユニットは、図４（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ：２）に示される１４５個のアミノ酸を含む。本発明は、ｈＣＧのβサブユニットが、βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである該サブユニットのミュータントであって、該ミュータントが、全体又は一部について、例えば、ＴＳＨへの融合等、他のＣＫＧＦタンパクに融合されているか、又はｈＣＧヘテロダイマーの一部であるものを意図する。本発明のミュータントｈＣＧヘテロダイマーは、野生型サブユニットと比べて、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むβサブユニットを有する。
【０２６８】
また、本発明は、Ｃｙｓ残基を除き、図４（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３）に示されたものを含む、１及び３７位の間に１個又は２個以上のアミノ酸置換を有するＬ１ヘアピンループを有するミュータントｈＣＧβサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：S1X, K2X, E3X, P4X, L5X, R6X, P7X, R8X, R10X, P11X, I12X, N13X, A14X, T15X, L16X, A17X, V18X, E19X, K20X, E21X, G22X, P24X, V25X, I27X, T28X, V29X, N30X, T31X, T32X, I33X, A35X, G36X, 及びY37X。
【０２６９】
この具体例の他の態様では、ｈＣＧβサブユニット、Ｌ１ヘアピンループにおける中性又は酸性アミノ酸残基が、突然変異している。得られた突然変異したサブユニットは、次のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列に少なくとも一個の突然変異を含む：S1B, E3B, P4B, L5B, P7B, R8B, R10B, P11B, I12B, N13B, A14B, T15B, L16B, A17B, V18B, E19B, E21B, G22B, P24B, V25B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, I33B, A35B, G36B, 及び Y37B。
【０２７０】
また、塩基性残基がｈＣＧβサブユニットモノマー配列に存在する場所に酸性アミノ酸残基を導入することも意図されている。この例では、変数"Ｘ"は、酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をよりネガティブ状態に変化させる働きをする。この様なアミノ酸置換の例は、K2Z, K6Z, K8Z, K10Z, 及びK20Z（"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である）を一個又は二個以上含む。
【０２７１】
又、本発明は、電荷を有する残基を中性残基に突然変異させることによって、Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数"Ｘ"が中性アミノ酸に対応する上記したＬ１配列に導入することができる。他の具体例としては、一個又は二個以上の中性残基を、K2U, E3U, R6U, R8U, R10U, E19U, K20U 及びE21U（"Ｕ"は中性アミノ酸である）に導入することができる。
【０２７２】
無電荷又は中性アミノ酸残基を電荷を有する残基に変換するＬ１ヘアピンループアミノ酸配列における一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミュータントｈＣＧβサブユニットモノマータンパクが提供される。中性のアミノ酸残基を電荷を有する残基に変換する突然変異の例は次のものである：
【０２７３】
【化３】
2003524381.tif 000006
（ここで、"Ｚ"は、酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である）。
【０２７４】
本発明は、また、Ｃｙｓ残基を除き、図４（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３）に示されたものを含む、Ｌ３ヘアピンループが５８及び８７位の間に１個又は２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントｈＣＧβサブユニットであるミュータントＣＫＧＦサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：N58X, Y59X, R60X, D61X, V62X, R63X, F64X, E65X, S66X, I67X, R68X, L69X, P70X, G71X, C72X, P73X, R74X, G75X, V76X, N77X, P78X, V79X, V80X, S81X, Y82X, A83X, V84X, A85X, L86X及びS87X（"Ｘ"はアミノ酸残基であり、該置換は、ヘアピンループの静電的性質を変更する。）。
【０２７５】
本発明の他の例では、ｈＣＧβサブユニット、Ｌ３ループにおける中性又は酸性アミノ酸残基が突然変異している。得られた突然変異したサブユニットは、次のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列に少なくとも一個の突然変異を含む：N58B, Y59B, D61B, V62B, F64B, E65B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, G79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及びS87B（"Ｂ"は塩基性アミノ酸である）。
【０２７６】
本発明は、更に、ｈＣＧβサブユニットＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に一個又は二個以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば一個又は２個以上の酸性アミノ酸を、変数"Ｘ"が酸性アミノ酸に対応する上記した配列に導入することができる。この様な突然変異の具体例は、R60Z, R63Z, R68Z及びR73Z（"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である）である。
【０２７７】
本発明は、また、電荷を有する残基をこの領域において中性残基に突然変異させることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数"Ｘ"が中性アミノ酸に対応する上記したＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入することができる。例えば、一個又は二個以上の中性残基をR60U, D61U, R63U, E65U, R68U, 及びR74U（"Ｕ"は中性アミノ酸である）に導入することができる。
【０２７８】
Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列において非電荷又は中性アミノ酸残基を電荷を有する残基に変換する一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミュータントｈＣＧβサブユニットタンパクが提供される。中性のアミノ酸残基を電荷を有する残基に変換する突然変異の例は下記の通りである：N58Z, Y59Z, V62Z, F64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, N77Z, P78Z, V79Z, V80Z, S81Z, Y82Z, A83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, N58B, Y59B, V62B, F64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, V79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及びS87B（"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である）。
【０２７９】
また、本発明は、これらのヘアピンループの構造又は配置を変換するβヘアピンループ構造の外部の突然変異を含むｈＣＧβサブユニットも意図する。これらの構造変化は、二量体分子に含まれるｈＣＧβサブユニットのβヘアピンループ構造の領域と該二量体タンパクに対する親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させる働きをする。これらの突然変異は、ｈＣＧβサブユニットモノマーの３８−５７位及び８８−１４０位からなるグループから選ばれた位置において見られる。
βヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外部の突然変異の具体例は、次の通りである。
【０２８０】
【化４】
2003524381.tif 000007
変数"Ｊ"は、その導入が、ｈＣＧβサブユニットのＬ１及びＬ３βヘアピンループ構造とミュータントｈＣＧβサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対する親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させる何れかのアミノ酸である。
【０２８１】
本発明は、また、改変された形態の多くのｈＣＧβサブユニットも意図する。これらの改変された形態は、他のシスチンノット成長要因又は該モノマーのフラクションに結合されたｈＣＧβサブユニットを含む。
【０２８２】
具体的な態様としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧβサブユニットアナログが、機能的に活性、即ち、ｈＣＧβサブユニットレセプター結合、ｈＣＧβサブユニットタンパク族レセプターシグナリング及び細胞外分泌などの野生型ｈＣＧβサブユニットに関連する一又は二以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧβサブユニットアナログは、ｈＣＧβサブユニットレセプターと、好ましくは野生型ｈＣＧβサブユニットより大きい親和性をもって、結合することができる。また、ミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧβサブユニットアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーすることが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧβサブユニットアナログは、野生型ｈＣＧβサブユニットより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ｈＣＧβサブユニットよりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントｈＣＧβサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ｈＣＧβサブユニットアナログは、公知の方法によって、所望の活性をテストすることができる。
【０２８３】
一つの実施態様として、本発明は、ミュータントＴＳＨ又はミュータントｈＣＧ等の、上記したミュータントα及び／又はβサブユニットを少なくとも一個含むヘテロダイマータンパクであるミュータントｈＣＧを提供する。該ミュータントサブユニットは、一個又は二個以上のアミノ酸置換を含む。
【０２８４】
具体例としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントｈＣＧヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、機能的に活性、即ち、ｈＣＧＲ結合、ｈＣＧＲシグナリング及び細胞外分泌などの野生型ｈＣＧβサブユニットと関連する一又は二以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、該ミュータントｈＣＧヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、ｈＣＧＲに、好ましくは野生型ｈＣＧより大きい親和性をもって、結合することができる。また、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーすることが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントｈＣＧヘテロダイマー又は単鎖ｈＣＧアナログは、野生型ｈＣＧより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ｈＣＧよりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントｈＣＧヘテロダイマー及び単鎖ｈＣＧアナログは、公知の方法によって、所望の活性をテストすることができる。
【０２８５】
ミュータントｈＣＧサブユニット及びアナログをコードするポリヌクレオチド
また、本発明は、本発明のヒトｈＣＧβサブユニット及びｈＣＧサブユニット及びアナログのミュータントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによって野生型タンパクと比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを変更することのない塩基突然変異が好ましい。ここでは、２つのコード領域が融合されているという場合には、核酸分子の３'末端が他の核酸分子の５'（又はペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０２８６】
遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーに同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、本発明を実施するために使用できる。これらは、特に限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変化を生じる、サブユニット又は分子のコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【０２８７】
一つの実施態様では、本発明は、ミュータントｈＣＧサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該ミュータントｈＣＧサブユニットサブユニットが、標的タンパクのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供する。本発明は、また、それらのループとｈＣＧサブユニット全タンパクの同族レセプターの間の静電的相互作用が増加するように、Ｌ１及び／又はＬ３ループの外部にアミノ酸置換を有するミュータントｈＣＧサブユニットサブユニットをコードする核酸分子も提供する。本発明は、更に、ｈＣＧサブユニットサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に好ましくは位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含み、及び／又はＣＴＥＰ又は他のＣＫＧＦタンパクに共有結合しているミュータントｈＣＧサブユニットサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０２８８】
更に他の実施態様としては、本発明は、ｈＣＧサブユニットアナログをコードする配列を含む核酸分子であって、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントｈＣＧサブユニットサブユニットのコード領域が対応する二量体単位のコード領域と融合し、これは野生型サブユニット又は他の突然変異したモノメリックサブユニットであることができる、核酸分子を提供する。更に、ミュータントｈＣＧサブユニットモノマーのカルボキシル末端が、ｈＣＧのβサブユニットのＣＴＥＰ等、他のＣＫＧＦタンパクのアミノ末端に結合している、単鎖ｈＣＧサブユニットアナログをコードする核酸分子も提供する。更に、他の実施態様としては、核酸分子は、単鎖ｈＣＧサブユニットアナログをコードするものであり、ここでミュータントｈＣＧサブユニットモノマーのカルボキシル末端がＣＴＥＰのアミノ末端等の他のアミノ末端ＣＫＧＦタンパクに共有結合し、結合したアミノ酸配列のカルボキシル末端がシグナルペプチド無しにミュータントｈＣＧサブユニットモノマーのアミノ末端に共有結合している。
【０２８９】
本発明の単鎖アナログは、適切なコーディングフレーム内で、ｈＣＧサブユニットのモノメリックサブユニットをコードする核酸配列を、公知の方法によって互いに連結し、公知の方法によって、融合タンパクを発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用などのタンパク合成方法によって作製できる。
【０２９０】
ミュータントｈＣＧサブユニット及びアナログの作製
本発明のミュータントｈＣＧβサブユニット、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー、ｈＣＧアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの作製及び使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータントサブユニット又はｈＣＧアナログは、これに限定はされないが、例えば、ミュータントβサブユニットと他のＣＫＧＦタンパク若しくはそのフラグメントを含むか、又はミュータントβサブユニットとミュータントαサブユニットを含む融合タンパクである。一つの実施態様としては、この様な融合タンパクは、これに限定されるものではないが、リシン又はジフテリア毒素等の毒素類の様な他のタンパクのコード配列にフレーム内で結合されたミュータント又は野生型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパクは、適切なコードフレーム内で、公知の方法によって、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結し、公知の方法によって融合タンパクを発現させることによって作製できる。或いは、この様な融合タンパクは、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用のような、タンパク合成方法によって作製できる。ミュータントα及び／又はβサブユニットの部分を含み、異種タンパク−コード配列に融合されたキメラ遺伝子も構成できる。具体的な実施態様は、好ましくはミュータントαサブユニットとミュータントβサブユニットの間にペプチドリンカーを介して、ミュータントβサブユニットに融合されたミュータントαサブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
【０２９１】
ミュータントｈＣＧサブユニットの構造及び機能解析
以下に、ミュータントｈＣＧサブユニット、ミュータントヘテロダイマー及びｈＣＧアナログの構造決定方法、及びこれらのインビトロ活性及びインビボ生物学的機能の解析方法を記載する。
【０２９２】
ミュータントｈＣＧβサブユニットが一旦確認されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等の標準的な方法、又はタンパク精製のための他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述する免疫検定法等）を用いて評価できる。
【０２９３】
或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントｈＣＧサブユニットが一旦確認されれば、そのサブユニットのアミノ酸配列は、例えば、自動アミノ酸シークエンサーなどにより、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０２９４】
ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824）によって特徴付けることができる。親水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びその領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０２９５】
二次構造解析（Chou, P. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）も、特別な二次構造をとるサブユニットの領域を同定するために行うことができる。
【０２９６】
構造解析のための他の方法を利用しても良い。これらの方法は、特に限定的ではないが、Ｘ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13）及びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling , in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）等である。ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントも、ＢＬＡＳＴ、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ  ｖ．３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国）等の当業界で利用できるコンピューターソフトウエアープログラムを用いて行うことができる。
【０２９７】
ミュータントｈＣＧβサブユニット、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー、ｈＣＧアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの機能的活性についても、各種の公知の方法で評価することができる。
【０２９８】
例えば、ミュータントｈＣＧβサブユニット又はミュータントｈＣＧについて、抗体に結合する能力或いは結合するために野生型ｈＣＧ又はそのサブユニットと競合する能力を評価する場合には、公知の各種のイムノアッセイ法を用いることができ、例えば、これに限定されるものではないが、これには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、"サンドウィッチ"イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えば、コロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することによって認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされている場所を検出することによって認められる。免疫検定法で結合を検出するための多くの手段が公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０２９９】
ミュータントｈＣＧβサブユニット、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー、ｈＣＧアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントのヒト絨毛性性腺刺激ホルモンレセプター（ｈＣＧＲ）への結合は、これに限定されないが、例えば、野生型ｈＣＧによる放射線ラベルされたミュータントｈＣＧのｈＣＧＲからの置換に基づく、インビトロアッセイ等の当該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントｈＣＧヘテロダイマー、ｈＣＧアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性も、細胞に基づくアッセイ（cell-based assay）で測定できる。例えば、形質転換されたライディッヒ腫瘍細胞系ＭＡ−１０（Dr. Mario Ascoli, University of Iowa, Iowa City, IA）が、本発明のミュータントｈＣＧタンパクの生物活性の測定に使用される。この細胞は、１５％ウマ血清（Hyclone Laboratory, Park City, UT）、４．７７ｇ／Ｌヘペス（Hepes）、２．２４ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１．０μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（増殖培地）を追加されたウエイマウス（Waymouth）ＭＢ７５２／１培地で増殖される。細胞は、５％ＣＯ２中で３７℃に維持され、継代５と１５の間でアッセイに使用される。細胞は、増殖培地１ｍｌ中でウェルについて２．５×１０５細胞の濃度で２４−ウエルプレート中にプレートされる。最初の４８時間の培養に続いて、培地は、ウマ血清に代えて１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む増殖培地１ｍｌで置き換えられる。ほぼ１８時間後、ｈＣＧ又はＬＨ誘発プロゲステロン生成のレベルが、２時間アッセイにおいて測定される。
【０３００】
野生型ｈＣＧタンパクの標準ラインは、プロゲステロン生成が最大５０％（ＥＣ５０）で刺激される濃度を決定する各アッセイで含まれる。ｈＣＧのＥＣ５０は、０．１２５ｎＭである。各２４−ウエルプレートは、改変された増殖培地（ウマ血清を含まない１０μｇ／ｍｌＢＳＡ）４５０μｌ及び無菌の脱イオン蒸留水５０μｌからなる３個の参照ウエルを含む。また、各プレートは、５００μｌ中に０．１２５ｍＭの最終濃度のｈＣＧ野生型タンパクを含む参照ウエルと同様の培地を含む２個のウエルを有する。テストウエルは、５００μｌ中にミュータントｈＣＧタンパク０．１２５ｎＭを含有した。ホルモン添加２時間後、培地を取り入れ、後でプロゲステロンを解析するために冷凍保存する。次いで、細胞単層を塩水で一回洗浄し、５００μｌデタージェント（Triton X-100）でインキュベートし、タンパク濃度分析のために冷凍保存する。プロゲステロン濃度は、放射線免疫検定キット（Diagnostic Pruducts, Los Angels, CA）を用いて決定される。プロゲステロン値の大きな変化が、細胞数の相違に依存するのであれば、タンパクレベルが決定される。
【０３０１】
プロゲステロンの生成量が、テストされるタンパクの野生型形態を含むウエルとミュータントタンパクを含むウエルとの間で比較される。テストされるミュータントタンパクの生物活性が、ミュータントタンパクによって示された野生型プロゲステロン生成のパーセンテージとして表される。このアッセイの例は、Morbeck, 他., Mole. and Cell. Endocrinol., 97:173-181(1993)に見られる。
【０３０２】
タンパクの半減期は、タンパク安定性の大きさであり、タンパク濃度が１／２に減少するために必要な時間を示す。ミュータントｈＣＧの半減期は、例えば、これに限定されるものではないが、抗−ｈＣＧ抗体を用いて、ミュータントｈＣＧの投与後一定期間後に採取したサンプルにおけるミュータントｈＣＧレベルを測定する免疫検定法、又は放射線ラベルしたミュータントｈＣＧの投与後に被験体から採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータントｈＣＧの検出等、一定期間後の被験体からのサンプルにおけるｈＣＧレベルを測定するいかなる方法によっても決定できる。
【０３０３】
他の方法が当業者には公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０３０４】
診断及び治療における使用
本発明は、本発明の治療用物質（ここでは、治療薬という）の投与による各種の病気及び障害の治療又は予防法を提供する。該治療薬は、ミュータントα及びミュータント又は野生型のいずれかのｈＣＧβサブユニットを有するｈＣＧヘテロダイマー；Ｌ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に一個又は二個以上のアミノ酸置換を好ましくは有するミュータントαサブユニット及びＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に一個又は二個以上のアミノ酸置換を好ましくは有するミュータントβサブユニットを有し、全体又は部分的に他のＣＫＧＦタンパクに共有結合しているｈＣＧヘテロダイマー；ミュータントαサブユニット、及びミュータントβサブユニットを有し、ここでミュータントαサブユニットとミュータントβサブユニットは共有結合して単鎖アナログを形成するｈＣＧヘテロダイマー、例えば、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット及び他のＣＫＧＦタンパクが単鎖アナログに共有結合しているｈＣＧヘテロダイマー、他の誘導体、これらのアナログ及びフラグメント（例えば、上記したもの）、並びに本発明のミュータントｈＣＧヘテロダイマー、及びその誘導体、アナログ及びフラグメントをコードする核酸等を含む。
【０３０５】
該治療薬を投与する被験者は、これに限定されるものではないが、好ましくは雌ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物であり、好ましくは哺乳動物である。好ましい例として、被験者は、ヒトである。一般的に、被験者と同じ種である種起源の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、ヒトミュータント及び／又は改変されたｈＣＧヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与される。
【０３０６】
好ましい局面において、本発明の治療剤は、実質的に精製される。
【０３０７】
ヒト繊毛性性腺刺激ホルモンは、妊娠期間に胎盤から大量に分泌される。このホルモンは、胎児の検査において、ライディッヒ細胞（Leydig cell）の形成を刺激し、テストステロンの分泌を引き起こす。胎児の発育中にテストステロン分泌は男性生殖器の形成を促進するために重要なので、不十分なｈＣＧは男性における性機能低下につながる。この状態の一つの形態が、低ゴナドトロピン性性機能低下である。ｈＣＧが不存在であるか、又は正常若しくは望まれるレベルより低い低ゴナドトロピン性性機能低下などの障害は、本発明のミュータントｈＣＧヘテロダイマー又はｈＣＧアナログの投与によって治療又は予防することができる。ｈＣＧレセプターが欠如若しくは通常のレベルより低い、或いは野生型ｈＣＧに対して無反応若しくは正常なｈＣＧＲより反応性が低い障害も、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー又はｈＣＧアナログの投与によって治療できる。構成的に活性なｈＣＧＲは、性機能亢進に導くことができ、ミュータントｈＣＧヘテロダイマー及びｈＣＧアナログが拮抗薬として使用できることが予想される。
【０３０８】
また、ｈＣＧの投与は、黄体期欠損の治療に有効であることも示されている。Blumenfeld & Nahhas, Fertil. Steril., 50(3):403-7(1988)。従って、本発明のミュータントｈＣＧタンパクは、黄体期欠損の治療に使用できる。
【０３０９】
更に、本発明は、卵巣、膵臓、胃及び肝細胞の癌の診断、予知、スクリーニング方法、及び睾丸癌の治療のモニタリング方法を提供する。
【０３１０】
ｈＬＨβサブユニットのミュータント
ヒト黄体化ホルモン（ｈＬＨ）のヒトβサブユニットは、図５（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ：４）に示される１２１個のアミノ酸を含む。本発明は、ｈＬＨのβサブユニットが、該βサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである該βサブユニットのミュータントであって、該ミュータントが、ＴＳＨ又は他のＣＫＧＦタンパクに融合されているか、又はｈＬＨヘテロダイマーの一部であるものを意図する。
【０３１１】
本発明のミュータントｈＬＨヘテロダイマーは、野生型サブユニットと比べて、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むβサブユニットを有する。更に、本発明は、Ｃｙｓ残基を除き、図５（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４）に示されたものを含む、１及び３３位の間に１個又は２個以上のアミノ酸置換を有するＬ１ヘアピンループを有するミュータントｈＬＨβサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：W8X, H10X, P11X, I12X, N13X, A14X, I15X, L16X, A17X, V18X, E19X, K20X, E21X, G22X, P24X, V25X, I27X, T28X, V29X, N30X, T31X, T32X, 及びI33X。
【０３１２】
この具体例の他の態様では、ｈＬＨβサブユニット、Ｌ１ヘアピンループにおける中性又は酸性アミノ酸残基が、突然変異している。得られた突然変異したサブユニットは、次のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列に少なくとも一個の突然変異を含む：W8B, P11B, I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A17B, V18B, E19B, E21B, G22B, P24B, V25B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B, 及びI33B。
【０３１３】
また、塩基性残基がｈＬＨβサブユニットモノマー配列に存在する場所に酸性アミノ酸残基を導入することも意図されている。この例では、変数"Ｘ"は、酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をよりネガティブ状態に変化させる働きをする。この様なアミノ酸置換の例は、下記の１個又は二個以上を含む：R2Z, R6Z, H10Z, 及びK20Z（"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である）。
【０３１４】
又、本発明は、電荷を有する残基を中性残基に突然変異させることによって、Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数"Ｘ"が中性アミノ酸に対応する上記したＬ１配列に導入することができる。他の具体例としては、一個又は二個以上の中性残基を、R2U, E3U, R6U, E19U, K20U 及びE21U（"Ｕ"は中性アミノ酸である）で導入することができる。
【０３１５】
無電荷又は中性アミノ酸残基を電荷を有する残基に変換するＬ１ヘアピンループアミノ酸配列における一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミュータントｈＬＨβサブユニットモノマータンパクが提供される。中性のアミノ酸残基を電荷を有する残基に変換する突然変異の例は次のものである：S1Z, P4Z, L5Z, P7Z, W8Z, C9Z, P11Z, I12Z, N13Z, A14Z, I15Z, L16Z, A17Z, V18Z, G22Z, C23Z, P24Z, V25Z, C26Z, I27Z, T28Z, V29Z, N30Z, T31Z, T32Z, I33Z, S1B, P4B, L5B, P7B, W8B, C9B, P11B, I12B, N13B, A14B, I15B, L16B, A17B, V18B, G22B, C23B, P24B, V25B, C26B, I27B, T28B, V29B, N30B, T31B, T32B,及びI33B（"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である）。
【０３１６】
本発明は、また、Ｃｙｓ残基を除き、図５（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４）に示されたものを含む、Ｌ３ヘアピンループが５８及び８７位の間に１個又は２個以上のアミノ酸置換を有するミュータントｈＬＨβサブユニットであるミュータントＣＫＧＦサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：N58X, Y59X, R60X, D61X, V62X, R63X, F64X, E65X, S66X, I67X, R68X, L69X, P70X, G71X, C72X, P73X, R74X, G75X, V76X, N77X, P78X, V79X, V80X, S81X, Y82X, A83X, V84X, A85X, L86X, 又はS87X。
【０３１７】
本発明の他の例では、ｈＬＨβサブユニット、Ｌ３ヘアピンループにおける中性又は酸性アミノ酸残基が突然変異している。得られた突然変異したサブユニットは、次のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列に少なくとも一個の突然変異を含む：N58B, Y59B, D61B, V62B, F64B, E65B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, P73B, G75B, V76B, N77B, P78B, G79B, V79B, V80B, S81B, Y82B, A83B, V84B, A85B, L86B, 及びS87B。
【０３１８】
本発明は、更に、ｈＬＨβサブユニットＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に一個又は二個以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば一個又は２個以上の酸性アミノ酸を、変数"Ｘ"が酸性アミノ酸に対応する上記した配列に導入することができる。この様な突然変異の具体例は、R60Z, R63Z, R68Z, 及びR74Z（"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である）である。
【０３１９】
本発明は、また、電荷を有する残基をこの領域において中性残基に突然変異させることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又は二個以上の中性アミノ酸を、変数"Ｘ"が中性アミノ酸に対応する上記したＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入することができる。例えば、一個又は二個以上の中性残基を、R60U, D61U, R63U, E65U, R68U, R74U, 及びD77U（"Ｕ"は中性アミノ酸である）で導入することができる。
【０３２０】
無電荷又は中性アミノ酸残基を電荷を有する残基に変換するＬ３ヘアピンループアミノ酸配列において一又は二以上の静電電荷を変化させる突然変異を含むミュータントｈＬＨβサブユニットタンパクが提供される。中性のアミノ酸残基を電荷を有する残基に変換する突然変異の例は下記の通りである：T58Z, Y59Z, V62Z, I64Z, S66Z, I67Z, L69Z, P70Z, G71Z, C72Z, P73Z, G75Z, V76Z, P78Z, V79Z, V80Z, S81Z, F82Z, P83Z, V84Z, A85Z, L86Z, S87Z, T58B, Y59B, V62B, I64B, S66B, I67B, L69B, P70B, G71B, C72B, P73B, G75B, V76B, P78B, V79B, V80B, S81B, F82B, P83B, V84B, A85B, L86B, 及びS87B（"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である）。
【０３２１】
また、本発明は、これらのヘアピンループの構造又は配置を変換するβヘアピンループ構造の外部の突然変異を含むｈＬＨβサブユニットも意図する。これらの構造変化は、二量体分子に含まれるｈＬＨβサブユニットのβヘアピンループ構造の領域と該二量体タンパクに対する親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させる働きをする。これらの突然変異は、ｈＬＨβサブユニットモノマーの３４−５７位及び８８−１２１位からなるグループから選ばれた位置において見られる。
βヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外部の突然変異の具体例は、次の通りである：
【０３２２】
【化５】
2003524381.tif 000008
変数"Ｊ"は、その導入が、ｈＬＨβサブユニットのＬ１及びＬ３βヘアピンループ構造とミュータントｈＬＨβサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対する親和性を有するレセプターとの間の静電的相互作用を増加させる何れかのアミノ酸である。
【０３２３】
本発明は、また、改変された形態の多くのｈＬＨβサブユニットも意図する。これらの改変された形態は、他のシスチンノット成長要因（cystine not growth factor）又は該モノマーのフラクションに結合されたｈＬＨβサブユニットを含む。
【０３２４】
具体的な態様としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＬＨβサブユニットアナログが、機能的に活性、即ち、ｈＬＨβサブユニットレセプター結合、ｈＬＨβサブユニットタンパク族レセプターシグナリング及び細胞外分泌などの野生型ｈＬＨβサブユニットに関連する一又は二以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＬＨβサブユニットアナログは、ｈＬＨβサブユニットレセプターと、好ましくは野生型ｈＬＨβサブユニットより大きい親和性をもって、結合することができる。また、ミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＬＨβサブユニットアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーすることが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＬＨβサブユニットアナログは、野生型ｈＬＨβサブユニットより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ｈＬＨβサブユニットよりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントｈＬＨβサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ｈＬＨβサブユニットアナログは、公知の方法によって、所望の活性をテストすることができる。
【０３２５】
一つの実施態様として、本発明は、ミュータントＴＳＨ又はミュータントｈＬＨ等の、上記したミュータントα及び／又はβサブユニットを少なくとも一個含むヘテロダイマータンパクであるミュータントＣＫＧＦを提供する。該ミュータントサブユニットは、一個又は二個以上のアミノ酸置換を含む。
【０３２６】
具体例としては、上記した少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントＬＨヘテロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、機能的に活性、即ち、ＬＨＲ結合、ＬＨＲシグナリング及び細胞外分泌などの野生型ＬＨと関連する一又は二以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、該ミュータントＬＨヘテロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、ＬＨＲに、好ましくは野生型ＬＨより大きい親和性をもって、結合することができる。また、ミュータントＬＨヘテロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、シグナルトランスダクションをトリガーすることが好ましい。最も好ましくは、本発明の少なくとも一個のミュータントサブユニットを含むミュータントＬＨヘテロダイマー又は単鎖ＬＨアナログは、野生型ＬＨより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性を有し、野生型ＬＨよりも長い血清半減期を有する。本発明のミュータントＬＨヘテロダイマー及び単鎖ＬＨアナログは、公知の方法によって、所望の活性をテストすることができる。
【０３２７】
ミュータントＬＨサブユニット及びアナログをコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のヒトＬＨβサブユニット及びＬＨアナログのミュータントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによって野生型タンパク質と比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを変更することのない塩基ミューテーションが好ましい。ここでは、２個のコード領域が融合されているという場合には、核酸分子の３'末端が他の核酸分子の５'（又はペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０３２８】
遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施において使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変化を生じる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【０３２９】
一つの実施態様では、本発明は、ミュータントＬＨサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該ミュータントＬＨサブユニットが、好ましくは該標的タンパク質のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供する。本発明はまた、Ｌ１及び／又はＬ３ループの外側にアミノ酸置換を有し、これによりこれらのループとＬＨサブユニットホロタンパク質の同族体レセプターとの間の静電相互作用が高められた、ミュータントＬＨサブユニットをコードする核酸分子を提供する。本発明は更に、好ましくはＬＨサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置し、及び／又はＣＴＥＰ或いは別のＣＫＥＰタンパク質に共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントＬＨサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０３３０】
更に別の実施態様として、本発明は、ＬＨサブユニットアナログをコードする配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントＬＨサブユニットのコード領域は、野生型サブユニット又は別の突然変異モノマーサブユニットであり得る、対応するダイマーユニットのコード領域と融合している。更に、ミュータントＬＨサブユニットモノマーのカルボキシル末端が、ＬＨβサブユニットのＣＴＥＰのような、別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に結合している、単鎖ＬＨサブユニットアナログをコードする核酸分子も提供する。更に別の実施態様として、該核酸分子は単鎖ＬＨサブユニットアナログをコードし、ここでミュータントＬＨサブユニットモノマーのカルボキシル末端はＣＴＥＰのアミノ末端のような別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に共有結合しており、該結合アミノ酸配列のカルボキシル末端はシグナルペプチドのないミュータントＬＨサブユニットモノマーのアミノ末端と共有結合している。
【０３３１】
本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ＬＨサブユニットのモノマーサブユニットをコードする核酸配列どうしを公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる。
【０３３２】
ミュータントＬＨサブユニット及びアナログの作製
本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントＬＨβサブユニット、ミュータントＬＨヘテロダイマー、ＬＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータントサブユニット又はＬＨアナログは融合タンパクであり、これに限定はされないが例えばミュータントＬＨβサブユニット及び別のＣＫＧＦタンパク質又はそのフラグメントを含むか、或いはミュータントβサブユニット及びミュータントαサブユニットを含む。一つの実施態様として、この様な融合タンパクは、これに限定されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン等の毒素類の様な他のタンパクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュータント又は野生型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパクは、適当なコーディングフレームにおいて、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列どうしを公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用のようなタンパク合成方法によって作製できる。ミュータントα及び／又はβサブユニットの一部分を含む、いかなる異種タンパクコード配列と融合したキメラ遺伝子をも構築しうる。具体的な実施態様は、好ましくはミュータントαサブユニットとミュータントβサブユニットとの間にペプチドリンカーを介して、ミュータントβサブユニットと融合したミュータントαサブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
【０３３３】
ミュータントＬＨサブユニットの構造及び機能解析
ここに示すのは、ミュータントＬＨサブユニット、ミュータントヘテロダイマー及びＬＨアナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビボ生物機能の解析方法である。
【０３３４】
ひとたびミュータントＬＨβサブユニットが確認されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又はタンパク精製のための他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法等）を用いて評価できる。
【０３３５】
或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントＬＨサブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列は、例えば自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０３３６】
ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824）によって特徴付けることができる。親水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０３３７】
二次構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる。
【０３３８】
他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13）及びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。ＢＬＡＳＴ、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ  ｖ．３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国）等の当業界で利用できるコンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０３３９】
ミュータントＬＨβサブユニット、ミュータントＬＨヘテロダイマー、ＬＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの機能的活性も、各種の公知の方法で分析することができる。
【０３４０】
例えば、ミュータントＬＨβサブユニット又はミュータントＬＨについて、抗体に結合するために野生型ＬＨ又はそのサブユニットと結合又は競合する能力を評価する場合には、公知の各種イムノアッセイ法を用いることができ、限定されないが、これにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、"サンドウィッチ"イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することにより認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされた箇所を検出することにより認められる。イムノアッセイで結合を検出するための技術においては多くの手段が公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０３４１】
ミュータントＬＨβサブユニット、ミュータントＬＨヘテロダイマー、ＬＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの絨毛膜刺激ホルモンレセプター（ＬＨＲ）への結合は、限定されないが、例えばＬＨＲからの放射線ラベルミュータントＬＨの野生型ＬＨへの置換に基づくインビトロアッセイ等、該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントＬＨヘテロダイマー、ＬＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性もまた、Morbeck, et al., Mole. and Cell. Endocrinol., 97:173-181 (1993)における研究をモデルとする、hCG生物活性のため用いられる細胞ベースアッセイにおいて測定できる。
【０３４２】
タンパクの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパクの濃度が１／２に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＬＨの半減期は、限定されないが、例えば、抗−ＬＨ抗体を用いてミュータントＬＨの投与後一定期間後に採取したサンプルにおけるミュータントＬＨレベルを測定するイムノアッセイ、又は放射線ラベルしたミュータントＬＨの投与後採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータントＬＨの検出等、一定期間後の被験体からのサンプルにおけるＬＨレベルを測定するためのいかなる方法によっても決定できる。
【０３４３】
他の方法が当業者に公知になるであろうが、それらは本発明の範囲に含まれる。
【０３４４】
診断及び治療における使用
本発明は、本発明の治療用化合物（ここでは"治療剤"という）の投与による各種の疾患及び障害の治療又は予防法を提供する。このような治療剤は以下を含む；ミュータントα及びミュータント或いは野生型いずれかのＬＨβサブユニットを有するＬＨヘテロダイマー；好ましくは１又はそれ以上のアミノ酸置換をＬ１及び／又はＬ３ループ或いはその近傍に有するミュータントαサブユニット及び好ましくは１又はそれ以上のアミノ酸置換をＬ１及び／又はＬ３ループ或いはその近傍に有し別のＣＫＧＦタンパク質と全部又は一部共有結合しているミュータントβサブユニットを有するＬＨヘテロダイマー；ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット及び別のＣＫＧＦタンパク質が単鎖アナログに共有結合したＬＨヘテロダイマー、他の誘導体、アナログ及びそのフラグメント（例えば上述のような）及び本発明のミュータントＬＨヘテロダイマー、及び誘導体、アナログ、及びそのフラグメントをコードする核酸を含み、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットが共有結合して単鎖アナログを形成している、ミュータントαサブユニット、及びミュータントβサブユニットを有するＬＨヘテロダイマー。
【０３４５】
該治療薬を投与する被験体は、これに限定されるものではないが、好ましくはウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であり、好ましくは哺乳動物である。好ましい例として、対象はヒトである。一般的に、被験体と同種である種に由来する生産物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、ヒトのミュータント及び／又は修飾されたＬＨヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与される。
【０３４６】
好ましい局面において、本発明の治療剤は実質的に精製されたものである。
【０３４７】
黄体期疾患として知られる生殖疾患は、黄体の発達に影響を及ぼす。ＬＨの投与は、１段階として黄体期を有する排卵メカニズムを正常機能へ戻すことができる。ＬＨが欠乏或いは正常又は所望のレベルに比して減少している状態は、本発明のミュータントＬＨヘテロダイマー又はＬＨアナログの投与により治療或いは予防される。ＬＨレセプターが欠乏もしくは正常レベルに比して減少している、又は野生型ＬＨに対して無反応もしくは正常ＬＨＲに比べ反応性が低い疾患もまた、ミュータントＬＨヘテロダイマー又はＬＨアナログの投与により治療できる。構成的に活性なＬＨＲは甲状腺機能亢進症につながり、ミュータントＬＨヘテロダイマー及びＬＨアナログをアンタゴニストとして用い得ることが意図される。
【０３４８】
具体例として、黄体又は性特有発達機能を刺激できるＬＨヘテロダイマー又はＬＨアナログは、予防を含む治療のために投与される。治療又は予防できる病気及び疾患としては、これに限定されるものではないが、生殖機能不全、性機能亢進症、黄体期疾患、原因不明の不妊等を含む。
【０３４９】
ＬＨタンパク若しくは機能、あるいはＬＨＲタンパク及び機能の欠如又は減少は、例えば、患者の組織サンプルを（例えば生検細胞から）得て、ＲＮＡ若しくはタンパクレベル、又はＬＨ若しくはＬＨＲの発現したＲＮＡ又はタンパクの構造及び／又は活性をインビトロでアッセイすることによって容易に検出できる。従って、特に限定的ではないが、ＬＨ又はＬＨＲタンパクを検出及び／又は視覚化するイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に先立つ免疫沈降、免疫細胞化学等）及び／又はＬＨ又はＬＨＲ  ｍＲＮＡを検出及び／又は視覚化することによって、ＬＨ又はＬＨＲ発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション）等、この分野で標準的な多くの方法を利用できる。
【０３５０】
ＦＳＨβサブユニットのミュータント
ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のヒトβサブユニットは、図６（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ：５）に示される１０９個のアミノ酸を含む。本発明は、サブユニットがβサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に一個又は複数のアミノ酸置換を含む、ｈＦＳＨのβサブユニットのミュータントであって、このような該ミュータントの全部又は一部がＴＳＨ又はｈＦＳＨヘテロダイマーの一部のような別のＣＫＧＦタンパクと融合したものを意図する。野生型サブユニットと比べると、本発明のミュータントｈＦＳＨヘテロダイマーは、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むβサブユニットを有する。
【０３５１】
本発明は更に、図６（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５）に示すように、Ｃｙｓ残基を除き４位から２７位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＬ１ヘアピンループをもつ、ミュータントｈＦＳＨβサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：E4X, L5X, T6X, N7X, I8X, T9X, I10X, A11X, I12X, E13X, K14X, E15X, E16X, R18X, F19X, I21X, S22X, I23X, N24X, T25X, T26X,及びW27X。
【０３５２】
本実施例の別の態様では、ｈＦＳＨβサブユニット、Ｌ１ヘアピンループにおける中性又は酸性アミノ酸残基は突然変異している。得られた突然変異したサブユニットは、以下のアミノ酸位置において、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列中に少なくとも一個の突然変異を含む：E4B, L5B, T6B, N7B, I8B, T9B, I10B, A11B, I12B, E13B, E15B, E16B, F19B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T26B,及びW27B。
【０３５３】
また、塩基性残基がｈＦＳＨβサブユニットモノマー配列に存在する箇所に酸性アミノ酸残基を導入することも意図されている。本実施例では、変数"Ｘ"は酸性アミノ酸に対応する。これらアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をより負の状態に変化させる働きをする。このようなアミノ酸置換の例には下記のＫ１４Ｚ及びＲ１８Ｚが１又はそれ以上含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である。
【０３５４】
本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入することができ、変数"Ｘ"は中性アミノ酸に対応する。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、Ｅ４Ｕ、Ｅ１３Ｕ、Ｋ１４Ｕ、Ｅ１５Ｕ，Ｅ１６Ｕ及びＲ１８Ｕに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸に対応する。
【０３５５】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントｈＦＳＨβサブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例には以下が含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である：L5Z, T6Z, N7Z, I8Z, T9Z, I10Z, A11Z, I12Z, C17Z, F19Z, C20Z, I21Z, S22Z, I23Z, N24Z, T25Z, T26Z, W27Z, L5B, T6B, N7B, I8B, T9B, I10B, A11B, I12B, C17B, F19B, C20B, I21B, S22B, I23B, N24B, T25B, T26B,及びW27B。
【０３５６】
本発明はまた、図６（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５）に示すように、Ｌ３ヘアピンループがＣｙｓ残基を除き６５位から８１位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有するミュータントｈＦＳＨβサブユニットである、ミュータントＣＫＧＦサブユニットも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含む：A65X, H66X, H67X, A68X, D69X, S70X, L71 X, Y72X, T73X, Y74X, P75X, V76X, A77X, T78X, Q79X, 及びH81X。
【０３５７】
本実施例の別の態様では、ｈＦＳＨβサブユニット、Ｌ３ヘアピンループにおける中性又は酸性アミノ酸残基は突然変異している。得られた突然変異したサブユニットは、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列中、以下のアミノ酸位置において少なくとも１個の突然変異を含む：A65B, A68B, D69B, S70B, L71B, Y72B, T73B, Y74B, P75B, V76B, A77B, T78B, 及びQ79B。
【０３５８】
更に本発明は、ｈＦＳＨβサブユニットＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列中に１又はそれ以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば、一個又はそれ以上の酸性アミノ酸を上述の配列に導入することができ、ここで変数"Ｘ"は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例にはＨ６６Ｚ、Ｈ６７Ｚ、及びＨ８１Ｚが含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である。
【０３５９】
本発明はまた、該領域において荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入することができ、ここで変数"Ｘ"を中性アミノ酸に対応する。例として、１又はそれ以上の中性残基を、Ｈ６６Ｕ、Ｈ６７Ｕ、Ｄ６９Ｕ、及びＨ８１Ｕに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸である。
【０３６０】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントｈＦＳＨβサブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例には以下が含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である。A66Z, H67Z, H68Z, A69Z, D70Z, S71Z, L72Z, Y73Z, T74Z, Y75Z, P76Z, V77Z, A78Z, T79Z, Q80Z, A66B, H67B, H68B, A69B, D70B, S71B, L72B, Y73B, T74B, Y75B, P76B, V77B, A78B, T79B, 及びQ80B。
【０３６１】
本発明はまた、該βヘアピンループの外側にこれらヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ｈＦＳＨβサブユニットも意図する。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるｈＦＳＨβサブユニットのβヘアピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、ｈＦＳＨβサブユニットモノマーの１−３位、２８−６４位、及び８２−１０９位からなる群より選ばれる位置にみられる。
【０３６２】
このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には以下のものが含まれる：
【０３６３】
【化６】
2003524381.tif 000009
変数"Ｊ"は、その導入が、ｈＦＳＨβサブユニットのＬ１及びＬ３βヘアピンループ構造とミュータントｈＦＳＨβサブユニットモノマーを含むダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいずれのアミノ酸でもよい。
【０３６４】
本発明はまた、修飾された形態での多数のｈＦＳＨβサブユニットを意図する。これらの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したｈＦＳＨβサブユニットが含まれる。
【０３６５】
具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログを少なくとも１つ含むｈＦＳＨβサブユニットヘテロダイマーは機能的に活性であり、すなわち、ｈＦＳＨβサブユニットレセプター結合、ｈＦＳＨβサブユニットタンパクファミリーレセプターシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型ｈＦＳＨβサブユニットに関連した１又はそれ以上の機能活性を呈することができる。好ましくは、ミュータントｈＦＳＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログは、ｈＦＳＨβサブユニットレセプターに結合でき、好ましくは野生型ｈＦＳＨβサブユニットより大きい親和性を有する。また、そのようなミュータントｈＦＳＨβサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログは、シグナルトランスダクションを引き起こすのが好ましい。最も好ましくは、本発明のミュータントサブユニット又は単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログを少なくとも１つ含むミュータントｈＦＳＨβサブユニットヘテロダイマーは、野生型ｈＦＳＨβサブユニットより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性をもち、野生型ｈＦＳＨβサブユニットより長い血清半減期をもつ。本発明のミュータントｈＦＳＨβサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ｈＦＳＨβサブユニットアナログは、該分野において公知の手順により所望の活性についてテストされ得る。
【０３６６】
１実施例として、本発明は、ミュータントｈＦＳＨ又はミュータントｈＦＳＨのような、少なくとも１つの上記ミュータントα及び／又はβサブユニットを含むヘテロダイマータンパクであるミュータントＣＫＧＦを提供する。該ミュータントサブユニットは１又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。
【０３６７】
具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ＦＳＨアナログを少なくとも１つ含むミュータントＦＳＨヘテロダイマーは機能的に活性であり、すなわち、ＦＳＨＲ結合、ＦＳＨＲシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型ＦＳＨに関連した１又はそれ以上の機能活性を呈することができる。好ましくは、該ミュータントＦＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＦＳＨアナログは、ＦＳＨＲに結合でき、好ましくは野生型ＦＳＨより大きい親和性を有する。また、そのようなミュータントＦＳＨヘテロダイマー又は単鎖ＦＳＨアナログは、シグナルトランスダクションを引き起こすのが好ましい。最も好ましくは、本発明のミュータントサブユニット又は単鎖ＦＳＨアナログを少なくとも１つ含むミュータントＦＳＨヘテロダイマーは、野生型ＦＳＨより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性をもち、野生型ＦＳＨより長い血清半減期をもつ。本発明のミュータントＦＳＨヘテロダイマー及び単鎖ＦＳＨアナログは、該分野において公知の手順により所望の活性についてテストされ得る。
【０３６８】
ミュータントＦＳＨ及びアナログをコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のヒトＦＳＨ及びＦＳＨアナログのミュータントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによって野生型タンパク質と比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失および置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを変更することのない塩基ミューテーションが好ましい。ここでは、２個のコード領域が融合されているという場合には、１つの核酸分子の３'末端が他の核酸分子の５'（又はペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０３６９】
遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施において使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変化を生じる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【０３７０】
一つの実施態様では、本発明は、ミュータントＦＳＨサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該ミュータントＦＳＨサブユニットが、好ましくは該標的タンパク質のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供する。本発明はまた、Ｌ１及び／又はＬ３ループの外側にアミノ酸置換を有し、これによりこれらのループとＦＳＨダイマーの同族体レセプターとの間の静電相互作用が高められた、ミュータントＦＳＨサブユニットをコードする核酸分子を提供する。本発明は更に、好ましくはＦＳＨサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置し、及び／又はＣＴＥＰ或いは別のＣＫＥＰタンパク質に共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントＦＳＨサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０３７１】
更に別の実施態様として、本発明は、ＦＳＨアナログをコードする配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントＦＳＨサブユニットのコード領域は、野生型サブユニット又は別の突然変異モノマーサブユニットであり得る、対応するダイマーユニットのコード領域と融合している。更に、ミュータントＦＳＨモノマーのカルボキシル末端が、ｈＬＨのβサブユニットのＣＴＥＰのような、別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に結合している、単鎖ＦＳＨアナログをコードする核酸分子も提供する。更に別の実施態様として、該核酸分子は単鎖ＦＳＨサブユニットアナログをコードし、ここでミュータントＦＳＨモノマーのカルボキシル末端はＣＴＥＰのアミノ末端のような別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に共有結合しており、該結合アミノ酸配列のカルボキシル末端はシグナルペプチドのないミュータントＦＳＨモノマーのアミノ末端と共有結合している。
【０３７２】
本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ＦＳＨサブユニットのモノマーサブユニットをコードする核酸配列どうしを当該分野で公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを当該分野で一般的に公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる。
【０３７３】
ミュータントＦＳＨサブユニット及びアナログの作製
本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントＦＳＨβサブユニット、ミュータントＦＳＨヘテロダイマー、ＦＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータントサブユニット又はＦＳＨアナログは融合タンパクであり、これに限定はされないが例えばミュータントＦＳＨβサブユニット及びｈＬＨのβサブユニットのＣＴＥＰを含むか、或いはミュータントβサブユニット及びミュータントαサブユニットを含む。一つの実施態様として、この様な融合タンパクは、これに限定されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン等の毒素類の様な他のタンパクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュータント又は野生型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパクは、適当なコーディングフレームにおいて、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列どうしを当該分野で公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを当該分野で一般的に公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用のようなタンパク合成方法によって作製できる。ミュータントα及び／又はβサブユニットの一部分を含む、いかなる異種タンパクコード配列と融合したキメラ遺伝子をも構築しうる。具体的な実施態様は、好ましくはミュータントαサブユニットとミュータントβサブユニットとの間にペプチドリンカーを介して、ミュータントβサブユニットと融合したミュータントαサブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
【０３７４】
ミュータントＦＳＨサブユニットの構造及び機能解析
ここに示すのは、ミュータントＦＳＨサブユニット、ミュータントヘテロダイマー及びＦＳＨアナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビボ生物機能の解析方法である。
【０３７５】
ミュータントα又はＦＳＨβサブユニットがひとたび確認されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又はタンパク精製のための任意の他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法等）を用いて評価できる。
【０３７６】
或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントαサブユニット及び／又はＦＳＨβサブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列は、例えば自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０３７７】
ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824）によって特徴付けることができる。親水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０３７８】
二次構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる。
【０３７９】
他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13）及びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。ＢＬＡＳＴ、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ  ｖ．３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国）等の当業界で利用できるコンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０３８０】
ミュータントαサブユニット、ミュータントβサブユニット、ミュータントＦＳＨヘテロダイマー、ＦＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの機能的活性も、各種の当該分野で公知の方法で分析することができる。
【０３８１】
例えば、ミュータントサブユニット又はミュータントＦＳＨについて、抗体に結合するために野生型ＦＳＨ又はそのサブユニットと結合又は競合する能力を評価する場合には、当該分野で公知の各種イムノアッセイ法を用いることができ、限定されないが、これにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、"サンドウィッチ"イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することにより認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされた箇所を検出することにより認められる。イムノアッセイで結合を検出するための技術においては多くの手段が公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０３８２】
ミュータントαサブユニット、ミュータントＦＳＨβサブユニット、ミュータントＦＳＨヘテロダイマー、ＦＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの卵胞刺激ホルモンレセプター（ＦＳＨＲ）への結合は、限定されないが、例えばＦＳＨＲからのウシＦＳＨのような別種の放射線ラベルＦＳＨの置換に基づくインビトロアッセイ等、該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントＦＳＨヘテロダイマー、ＦＳＨアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性もまた、例えば、ヒトＦＳＨレセプター及びｃＡＭＰ反応性ヒト糖タンパクホルモンαサブユニットルシフェラーゼリポーターコンストラクトを安定して発現する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における測定に基づくアッセイにより測定できる。このアッセイでは、テスト細胞群から誘導されたルシフェラーゼ活性の総計を確証し、その値を該タンパクの野生型によって誘導されたルシフェラーゼ活性と比較することにより、ミュータントＦＳＨタンパクの生物活性を決定する。
【０３８３】
チャイニーズハムスター卵巣細胞（American Type Culture Collection, Rockville, MD）を、Albanese et al., Mole. Cell. Endocrinol., 101: 211-219 (1994)により示されるように、ヒトＦＳＨレセプターでトランスフェクションする。これらの細胞もまた、Albanese et al.に示されるようにリポーター遺伝子コンストラクトでトランスフェクションする。手短に言えば、指数関数的に分裂するCHO細胞を、100mmプレート当たりコンストラクトを発現するＦＳＨレセプターを10μg及びリポーター遺伝子コンストラクトを2μg使用し、３０％の融合度でリン酸カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクションする。Geneticin (GIBCO/BRL, Grand Island, NY)を用いて安定な形質転換体を選抜する。耐性細胞をサブクローニングし、細胞系ＣＨＯ／ＦＳＨ−Ｒをルシフェラーゼリポーター活性のＦＳＨ刺激により選抜する。24ウェルの組織培養プレートにウェル当たり5×105細胞を、或いは96ウェルの培養プレートにウェル当たり4×104細胞を分配することにより、レセプター刺激アッセイを行う。16-20時間後、３−イソブチル−１−メチルザンシン、表示の添加に加えIBMX (Sigma, St.Louis, MO)を含むそれぞれ300μlまたは100μlの0.25mMの培養培地中、37℃で細胞をインキュベートする。
【０３８４】
Albanese et al., Mole. Cell. Endocrinol., 5: 693-702 (1991)に示されるようにルシフェラーゼアッセイを行う。手短に言うと、インキュベーション後、組織培養培地を吸引し、25mMのEGTA、1%のTriton X-100及び1mMのDTTを含む200μlの溶解溶液を各ウェルに加え、10分間放置する。攪拌後、25mMのグリシルグリシン（pH7.8）、15mMのMgSO4、4mMのEGTA、16.5mMのKPO4、1mMのDTT及び2.2mMのATPを含む365μlのアッセイバッファーに細胞ライゼートを加える。室温で100μlの250μMルシフェリン及び10mMのDTTの注入し、ルミノメーター(Monolight2010, Analytical Luminescensce Laboratory, San Diego, CA)で反応最初の10秒間に放射された光を測定することにより、ルシフェラーゼ活性をアッセイする。本アッセイの例はAlbanese et al., Mole. Cell. Endocrinol., 101: 211-219 (1994)に見られる。
【０３８５】
タンパクの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパク濃度が１／２に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＦＳＨの半減期は、限定されないが、例えば、抗−ＦＳＨ抗体を用いてミュータントＦＳＨの投与後一定期間後に採取したサンプルにおけるミュータントＦＳＨレベルを測定するイムノアッセイ、又は放射線ラベルしたミュータントＦＳＨの投与後に被験体から採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータントＦＳＨの検出等、一定期間後の被験体からのサンプルにおけるＦＳＨレベルを測定するためのいかなる方法によっても決定できる。
【０３８６】
他の方法が当業者に公知になるであろうが、それらは本発明の範囲に含まれる。
【０３８７】
診断及び治療における使用
本発明は、本発明の治療用化合物（ここでは"治療剤"という）の投与による各種の疾患及び障害の治療又は予防法を提供する。このような治療剤は以下を含む；ミュータントαサブユニット及びミュータント或いは野生型いずれかのβサブユニットを有するＦＳＨヘテロダイマー；ｈＬＨのβサブユニットのＣＴＥＰのような、ミュータントαサブユニット及び別のＣＫＧＦタンパクに全部又は一部共有結合したミュータントβサブユニットを有するＦＳＨヘテロダイマー；ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット及びＣＫＧＦタンパク又はフラグメントが単鎖アナログに共有結合したＦＳＨヘテロダイマー、他の誘導体、アナログ及びそのフラグメント（例えば上述のような）及び本発明のミュータントＦＳＨヘテロダイマー、及び誘導体、アナログ、及びそのフラグメントをコードする核酸を含み、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットが共有結合して単鎖アナログを形成している、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットを有するＦＳＨヘテロダイマー。
【０３８８】
該治療薬を投与する被験体は、これに限定されるものではないが、好ましくはウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であり、好ましくは哺乳動物である。好ましい例として、対象はヒトである。一般的に、被験体と同種である種に由来する生産物の投与が好ましい。従って、好ましい具体例としては、ヒトのミュータント及び／又は修飾されたＦＳＨヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログ、又は核酸が、治療又は予防又は診断のために、ヒトの患者に投与される。
【０３８９】
好ましい局面において、本発明の治療剤は実質的に精製される。
【０３９０】
本発明の方法により、不妊症或いは性機能不全として表れる多くの疾患を治療できる。ＦＳＨが欠乏或いは正常又は所望のレベルに比して減少している疾患は、本発明のミュータントＦＳＨヘテロダイマー又はＦＳＨアナログの投与により治療或いは予防される。ＦＳＨレセプターが欠乏もしくは正常レベルに比して減少している、又は野生型ＦＳＨに対して無反応もしくは正常ＦＳＨＲに比べ反応性が低い疾患もまた、ミュータントＦＳＨヘテロダイマー又はＦＳＨアナログの投与により治療できる。アンタゴニストとしての使用のためのミュータントＦＳＨヘテロダイマー及びＦＳＨアナログが本発明により意図される。
【０３９１】
具体例として、生物活性をもつミュータントＦＳＨヘテロダイマー又はＦＳＨアナログは、卵巣機能不全、黄体期欠陥、原因不明の不妊症、期間の限られた妊娠、及び援助生殖を治療するため、予防を含む治療のために投与される。
【０３９２】
ＦＳＨタンパク若しくは機能、あるいはＦＳＨＲタンパク及び機能の欠如又は減少は、例えば、患者の組織サンプルを（例えば生検組織から）得て、ＲＮＡ若しくはタンパクレベル、又はＦＳＨ若しくはＦＳＨＲの発現したＲＮＡ又はタンパクの構造及び／又は活性をインビトロでアッセイすることによって容易に検出できる。従って、特に限定的ではないが、ＦＳＨ又はＦＳＨＲタンパクを検出及び／又は視覚化するイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に先立つ免疫沈降、免疫細胞化学等）及び／又はＦＳＨ又はＦＳＨＲ  ｍＲＮＡを検出及び／又は視覚化することによって、ＦＳＨ又はＦＳＨＲ発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション等）等、この分野で標準的な多くの方法を利用できる。
【０３９３】
ＰＤＧＦファミリーのミュータント
本発明は、ＰＤＧＦモノマーのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループの血小板由来増殖因子配列の至る箇所に変異を導入し、これによりこれらの構造の静電電荷を変化させることを意図する。本発明は、ＰＤＧＦモノマー鎖のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループはその近傍に１つ又は複数のアミノ酸置換、又はアミノ酸欠失或いは挿入を含み、この結果これらタンパクのβヘアピンループの静電的特徴が変化する、ＰＤＧＦモノマー鎖のミュータントを意図する。本発明はさらに、該タンパクのβヘアピンループのコンフォメーションを変化させてＰＤＧＦダイマーとその同族体レセプターとの間の相互作用を高める、ＰＤＧＦモノマー鎖への変異を意図する。さらには、本発明は別のＣＫＧＦタンパクと結合しているミュータントＰＤＧＦモノマーを意図する。
【０３９４】
ＰＤＧＦ−Ａ（ＰＤＧＦ Ａ−鎖）のミュータント
ヒト血小板由来増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）のヒトＡ鎖は、図７（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ：６）に示される１２５個のアミノ酸を含む。本発明は、野生型サブユニットと比べると、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むＰＤＧＦ−Ａ鎖のミュータントを意図する。更に、本発明は別のＣＫＧＦタンパクと結合しているミュータントＰＤＧＦ−Ａ鎖分子を意図する。
【０３９５】
本発明は、図７（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）に示すように、Ｃｙｓ残基を除き１１位から３６位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する、ミュータントＰＤＧＦ−Ａ鎖Ｌ１ヘアピンループも提供する。該アミノ酸置換は、次のものを含み、ここで"Ｘ"はいずれのアミノ酸残基をも表わす。：K11X, T12X, R13X, T14X, V15X, I16X, Y17X, E18X, I19X, P20X, R21X, S22X, Q23X, V24X, D25X, P26X, T27X, S28X, A29X, N30X, F31X, L32X, I33X, W34X, P35X, 及びP36X。
【０３９６】
本発明の突然変異誘発型の具体例は、酸性アミノ酸残基が存在する箇所への塩基性アミノ酸残基の導入を含む。これらの塩基性残基の導入は、導入された各塩基性アミノ酸について、より正の特性をもつようＬ１ヘアピンループの静電電荷を変化させる。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ−ＡモノマーのＬ１ループに導入した場合、変数"Ｘ"はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）よりなる群から選ばれる塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＰＤＧＦ−Ａモノマーに導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のうち１つ又はそれ以上を含む：Ｅ１８Ｂ及びＤ２５Ｂ、ここで"Ｂ"は塩基性アミノ酸残基である。
【０３９７】
また、塩基性残基がＰＤＧＦ−Ａモノマー配列に存在する箇所に酸性アミノ酸残基を導入することも意図されている。本実施例では、変数"Ｘ"はアスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）のような酸性アミノ酸に対応する。これらアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をより負の状態に変化させる働きをする。このようなアミノ酸置換の例には下記のものが１又はそれ以上含まれる：Ｋ１１Ｚ、Ｒ１３Ｚ、及びＲ２１Ｚ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である。
【０３９８】
本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入することができ、変数"Ｘ"は中性アミノ酸に対応する。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、Ｋ１１Ｕ、Ｒ１３Ｕ、Ｅ１８Ｕ、Ｒ２１Ｕ、及びＤ２５Ｕに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸である。本発明の目的のためには、中性アミノ酸はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、又はＨ以外のいずれかのアミノ酸である。従って、中性アミノ酸はＡ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群より選ばれる。
【０３９９】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ−Ａ鎖モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例には以下が含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である：T12Z, T14Z, V15Z, I16Z, Y17Z, I19Z, P20Z, S22Z, Q23Z, V24Z, P26Z, T27Z, S28Z, A29Z, N30Z, F31Z, L32Z, I33Z, W34Z, P35Z, P36Z, T12B, T14B, V15B, I16B, Y17B, I19B, P20B, S22B, Q23B, V24B, P26B, T27B, S28B, A29B, N30B, F31B, L32B, I33B, W34B, P35B, 及びP36B。
【０４００】
Ｌ３ヘアピンループ中にミュータントを含むミュータントＰＤＧＦ−Ａ鎖モノマーもまた示される。これらのミュータントタンパクは、図７（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）に示すように、Ｃｙｓ残基を除きＬ３ヘアピンループの５８位から８８位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次のものを含む：R58X, V59X, H60X, H61X, R62X, S63X, V64X, K65X, V66X, A67X, K68X, V69X, E70X, Y71X, V72X, R73X, K74X, K75X, P76X, K77X, L78X, K79X, E80X, V81X, Q82X, V83X, R84X, L85X, E86X, E87X, 及び H88X。ここで"Ｘ"はいずれかのアミノ酸残基を表わし、その置換はＬ３ループの静電特性を変化させる。
【０４０１】
Ｌ３ヘアピンループの変異の１セットには、酸性アミノ酸残基を置換する、ＰＤＧＦ−Ａ鎖Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中への塩基性アミノ酸残基の導入が含まれる。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ−ＡモノマーのＬ３ループに導入した場合、変数"Ｘ"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＰＤＧＦ−Ａモノマーに導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のＥ７０Ｂ、Ｅ８０Ｂ、Ｅ８６Ｂ及びＥ８７Ｂを１つ又はそれ以上を含み、ここで"Ｂ"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４０２】
更に本発明は、ＰＤＧＦＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列中塩基性アミノ酸残基の存在箇所に１又はそれ以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば、一個又はそれ以上の酸性アミノ酸を上述５８−８８の配列に導入することができ、ここで変数"Ｘ"は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例にはR58Z, H60Z, H61Z, R62Z, K65Z, K68Z, R73Z, K74Z, K75Z, K77Z, K79Z, R84Z, 及びH88Zが含まれる。
【０４０３】
本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入することができ、ここで変数"Ｘ"を中性アミノ酸に対応する。例として、１又はそれ以上の中性残基をR58U, H60U, H61U, R62U, K65U, K68U, E70U, R73U, K74U, K75U, K77U, K79U, E80U, R84U, E86U, E87U, 及びH88Uに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸である。
【０４０４】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ Ａ−鎖タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例にはV59Z, S63Z, V64Z, V66Z, A67Z, V69Z, Y71Z, V72Z, P76Z, L78Z, V81Z, Q82Z, V83Z, L85Z, V59B, S63B, V64B, V66B, A67B, V69B, Y71B, V72B, P76B, L78B, V81B, Q82B, V83B, 及びL85Bが含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である。
【０４０５】
本発明はまた、該βヘアピンループ構造の外側にこれらヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーも意図する。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーのβヘアピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、ＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーの１−９位、３８−５７位、及び８９−１２５位からなる群より選ばれる位置にみられる。
【０４０６】
このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には、
【０４０７】
【化７】
2003524381.tif 000010
が含まれる。変数"Ｊ"は、その導入が、ＰＤＧＦ Ａ−鎖のＬ１及びＬ３βヘアピンループ構造とミュータントＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーを含むダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいずれのアミノ酸でもよい。
【０４０８】
本発明はまた、修飾された形態での多数のＰＤＧＦ Ａ−鎖モノマーを意図する。これらの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したＰＤＧＦ Ａ−モノマーが含まれる。
【０４０９】
ＰＤＧＦ−Ｂ（ＰＤＧＦ Ｂ−鎖）のミュータント
ヒト血小板由来増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）のヒトＢ鎖は、図８（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ：７）に示される１６０個のアミノ酸を含む。本発明は、野生型サブユニットと比べて１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むＰＤＧＦ−Ｂ鎖のミュータントを意図する。更に、本発明は別のＣＫＧＦタンパクと結合しているミュータントＰＤＧＦ−Ｂ鎖分子を意図する。
【０４１０】
本発明は、図８（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：７）に示すように、Ｃｙｓ残基を除き１７位から４２位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する、ミュータントＰＤＧＦ−Ｂ鎖Ｌ１ヘアピンループも提供する。該アミノ酸置換は次のものを含む：K17X, T18X, R19X, T20X, E21X, V22X, F23X, E24X, I25X, S26X, R27X, R28X, L29X, I30X, D31X, R32X, T33X, N34X, A35X, N36X, F37X, L38X, V39X, W40X, P41X, 及びP42X。ここで"Ｘ"はいずれかのアミノ酸残基であり、それによる置換はヘアピンループの静電特性を変化させる。
【０４１１】
本発明の突然変異誘発型の具体例は、酸性残基が存在する箇所への塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ"Ｂ"モノマーのＬ１ループに導入した場合、変数"Ｘ"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＰＤＧＦ"Ｂ"モノマーに導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のうち１つ又はそれ以上を含む：Ｅ２１Ｂ、Ｅ２４Ｂ及びＤ３１Ｂ、ここで"Ｂ"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４１２】
また、塩基性残基がＰＤＧＦ"Ｂ"モノマー配列に存在する箇所に酸性アミノ酸残基を導入することも意図されている。本実施例では、変数"Ｘ"は酸性アミノ酸に対応する。これらアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をより負の状態に変化させる働きをする。このようなアミノ酸置換の例には下記のものが１又はそれ以上含まれる：Ｋ１７Ｚ、Ｒ１９Ｚ、Ｒ２７Ｚ、Ｒ２８Ｚ、及びＲ３２Ｚ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸である。
【０４１３】
本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入することができ、変数"Ｘ"は中性アミノ酸に対応する。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、Ｋ１７Ｕ、Ｒ１９Ｕ、Ｅ２１Ｕ、Ｅ２４Ｕ、Ｒ２７Ｕ、Ｒ２８Ｕ、Ｄ３１Ｕ、及びＲ３２Ｕに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸に対応する。
【０４１４】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ−Ｂ鎖タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例には以下が含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である：T18Z, T20Z, V22Z, F23Z, I25Z, S26Z, L29Z, I30Z, T33Z, N34Z, A35Z, N36Z, F37Z, L38Z, V39Z, W40Z, P41Z, P42Z, T18B, T20B, V22B, F23B, I25B, S26B, L29B, I30B, T33B, N34B, A35B, N36B, F37B, L38B, V39B, W40B, P41B, 及びP42B。
【０４１５】
Ｌ３ヘアピンループ中にミュータントを含むミュータントＰＤＧＦ−Ｂ鎖モノマーもまた示される。これらのミュータントタンパクは、図８（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：７）に示すように、Ｃｙｓ残基を除きＬ３ヘアピンループの６４位から９４位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次のものを含む：Q64X, V65X, Q66X, L67X, R68X, P69X, V70X, Q71X, V72X, R73X, K74X, I75X, E76X, I77X, V78X, R79X, K80X, K81X, P82X, I83X, F84X, K85X, K86X, A87X, T88X, V89X, T90X, L91X, E92X, D93X, 及びH94X、ここで"Ｘ"はいずれかのアミノ酸残基を表わし、その置換はＬ３ループの静電特性を変化させる。
【０４１６】
Ｌ３ヘアピンループの変異の１セットには、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中への１個又はそれ以上の塩基性アミノ酸残基の導入が含まれる。例えば、塩基性残基をＰＤＧＦ"Ｂ"モノマーのＬ３ループに導入した場合、上記配列の変数"Ｘ"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＰＤＧＦ"Ｂ"モノマー中酸性残基の存在箇所に導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、以下が１つ又はそれ以上含まれ：Ｅ７６Ｂ、Ｅ９２Ｂ、及びＤ９３Ｂ、ここで"Ｂ"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４１７】
更に本発明は、ＰＤＧＦＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に１又はそれ以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば、一個又はそれ以上の酸性アミノ酸を上述６４−９４配列の塩基性残基存在箇所に導入することができ、ここで変数"Ｘ"は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例にはR73Z, K74Z, R79Z, K80Z, K81Z, K85Z, K86Z, 及びH94Zが含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である。
【０４１８】
本発明はまた、該領域において荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入することができ、ここで変数"Ｘ"を中性アミノ酸に対応する。例として、１又はそれ以上の中性残基をR68U, R73U, K74U, E76U, R79U, K80U, K81U, K85U, K86U, E92U, D93U, 及びH94Uに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸である。
【０４１９】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＰＤＧＦ Ｂ−鎖タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例にはQ64Z, V65Z, Q66Z, L67Z, P69Z, V70Z, Q71Z, V72Z, I75Z, I77Z, V78Z, P82Z, I83Z, F84Z, A87Z, T88Z, V89Z, T90Z, L91Z, Q64B, V65B, Q66B, L67B, P69B, V70B, Q71B, V72B, I75B, I77B, V78B, P82B, I83B, F84B, A87B, T88B, V89B, T90B, 及びL91Bが含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である。
【０４２０】
本発明はまた、該βヘアピンループ構造の外側にこれらヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーも意図する。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーのβヘアピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、ＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーの１−１５位、４４−６３位、及び９５−１６０位からなる群より選ばれる位置にみられる。
【０４２１】
このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には、
【０４２２】
【化８】
2003524381.tif 000011
が含まれる。変数"Ｊ"は、その導入が、ＰＤＧＦ Ｂ−鎖のＬ１及びＬ３βヘアピンループ構造とミュータントＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーを含むダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいずれのアミノ酸でもよい。
【０４２３】
本発明はまた、修飾された形態での多数のＰＤＧＦ Ｂ−鎖モノマーを意図する。これらの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したＰＤＧＦ Ｂ−モノマーが含まれる。
【０４２４】
具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ＰＤＧＦアナログを少なくとも１つ含むＰＤＧＦ（Ａ又はＢ−鎖）ヘテロダイマーは機能的に活性であり、すなわち、ＰＤＧＦＲ結合、ＰＤＧＦＲシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型ＰＤＧＦに関連した１又はそれ以上の機能活性を呈することができる。好ましくは、該ミュータントＰＤＧＦヘテロダイマー又は単鎖ＰＤＧＦアナログは、ＰＤＧＦＲに結合でき、好ましくは野生型ＰＤＧＦより大きい親和性を有する。また、そのようなミュータントＰＤＧＦヘテロダイマー又は単鎖ＰＤＧＦアナログは、シグナルトランスダクションを引き起こすのが好ましい。最も好ましくは、本発明のミュータントサブユニット又は単鎖ＰＤＧＦアナログを少なくとも１つ含むミュータントＰＤＧＦヘテロダイマーは、野生型ＰＤＧＦより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性をもち、野生型ＰＤＧＦより長い血清半減期をもつ。本発明のミュータントＰＤＧＦヘテロダイマー及び単鎖ＰＤＧＦアナログは、該分野において公知の手順により所望の活性についてテストされ得る。
【０４２５】
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のミュータント
ヒトＶＥＧＦタンパク質は、図９（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ：８）に示される１９７個のアミノ酸を含む。本発明は、野生型サブユニットと比べて１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸残基の、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むヒトＶＥＧＦタンパクのミュータントを意図する。更に、本発明は別のＣＫＧＦタンパクと結合しているミュータントヒトＶＥＧＦタンパクを意図する。
【０４２６】
本発明は、図９（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）に示すように、Ｃｙｓ残基を除き２７位から５０位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する、ミュータントＶＥＧＦタンパクＬ１ヘアピンループも提供する。該アミノ酸置換H27X, P28X, I29X, E30X, T31X, L32X, V33X, D34X, I35X, F36X, Q37X, E38X, Y39X, P40X, D41X, E42X, I43X, E44X, Y45X, I46X, F47X, K48X, P49X, 及びS50X。 "Ｘ"はいずれかのアミノ酸残基であり、それによる置換はヘアピンループの静電特性を変化させる。
【０４２７】
本発明の突然変異誘発型の具体例は、酸性残基が存在する箇所への塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、塩基性残基をＶＥＧＦタンパクのＬ１ループ中酸性残基存在箇所に導入した場合、変数"Ｘ"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がＶＥＧＦタンパクに導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、次のうち１つ又はそれ以上を含む：Ｅ３０Ｂ、Ｄ３４Ｂ、Ｅ３８Ｂ、Ｄ４１Ｂ、Ｅ４２Ｂ、及びＥ４４Ｂ、ここで"Ｂ"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４２８】
また、塩基性残基がＶＥＧＦタンパク配列に存在する箇所に酸性アミノ酸残基を導入することも意図されている。本実施例では、変数"Ｘ"は酸性アミノ酸に対応する。これらアミノ酸の導入は、Ｌ１ヘアピンループの静電特性をより負の状態に変化させる働きをする。このようなアミノ酸置換の例には下記のものが１又はそれ以上含まれる：Ｈ２７Ｚ及びＫ４８Ｚ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である。
【０４２９】
本発明はまた、荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ１ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ１配列に導入することができ、変数"Ｘ"は中性アミノ酸に対応する。別の実施例としては、１又はそれ以上の中性残基を、Ｈ２７Ｕ、Ｅ３０Ｕ、Ｄ３４Ｕ、Ｅ３８Ｕ、Ｄ４１Ｕ、Ｅ４２Ｕ、Ｅ４４Ｕ、及びＫ４８Ｕに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸に対応する。
【０４３０】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ１ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＶＥＧＦタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例には以下が含まれる：P28Z, I29Z, T31Z, L32Z, V33Z, I35Z, F36Z, Q37Z, Y39Z, P40Z, I43Z, Y45Z, I46Z, F47Z, P49Z, S50Z, P28B, I29B, T31B, L32B, V33B, I35B, F36B, Q37B, Y39B, P40B, I43B, Y45B, I46B, F47B, P49B, 及びS50B、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である。
【０４３１】
Ｌ３ヘアピンループ中にミュータントを含むミュータントＶＥＧＦタンパクもまた示される。これらのミュータントタンパクは、図９（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）に示すように、Ｃｙｓ残基を除きＬ３ヘアピンループの７３位から９９位までの間に１個又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次のものを含む：E73X, S74X, N75X, I76X, T77X, M78X, Q79X, I80X, M81X, R82X, I83X, K84X, P85X, H86X, Q87X, G88X, Q89X, H90X, I91X, G92X, E93X, M94X, S95X, F96X, L97X, Q98X, 及びH99X、ここで"Ｘ"はいずれかのアミノ酸残基を表わし、その置換はＬ３ループの静電特性を変化させる。
【０４３２】
Ｌ３ヘアピンループの変異の１セットには、ＶＥＧＦタンパクＬ３ヘアピンループアミノ酸配列中への１個又はそれ以上の塩基性アミノ酸残基の導入が含まれる。例えば、塩基性残基をＶＥＧＦタンパクのＬ３ループに導入した場合、上記配列の変数"Ｘ"は塩基性アミノ酸残基に対応する。ＶＥＧＦタンパク中に塩基性残基が導入された、静電電荷を変化させる変異の具体例には、以下が１つ又はそれ以上含まれ：Ｅ７３Ｂ及びＥ９３Ｂ、ここで"Ｂ"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４３３】
更に本発明は、ＶＥＧＦタンパクＬ３ヘアピンループのアミノ酸配列に１又はそれ以上の酸性残基を導入することも意図する。例えば、一個又はそれ以上の酸性アミノ酸を上述１６６−３１９３の配列に導入することができ、ここで変数"Ｘ"は酸性アミノ酸に対応する。そのような変異の具体例にはＲ８２Ｚ、Ｋ８４Ｚ、Ｈ８６Ｚ、Ｈ９０Ｚ，及びＨ９９Ｚが含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸残基である。
【０４３４】
本発明はまた、該領域において荷電残基を中性残基に変異させることにより、Ｌ３ヘアピンループにおける正又は負の静電電荷を減少させることも意図する。例えば、一個又はそれ以上の中性アミノ酸を上述のＬ３ヘアピンループアミノ酸配列に導入することができ、ここで変数"Ｘ"を中性アミノ酸に対応する。例として、１又はそれ以上の中性残基をE73U, R82U, K84U, H86U, H90U, E93B, 及びH99Uに導入することができ、ここで"Ｕ"は中性アミノ酸である。
【０４３５】
非電荷又は中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する静電電荷変換突然変異を、Ｌ３ヘアピンループアミノ酸配列中に１又はそれ以上含むミュータントＶＥＧＦタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を荷電残基に変換する変異の例にはS74Z, N75Z, I76Z, T77Z, M78Z, Q79Z, I80Z, M81Z, I83Z, P85Z, Q87Z, G88Z, Q89Z, I91Z, G92Z, M94Z, S95Z, F96Z, L97Z, Q98Z, S74B, N75B, I76B, T77B, M78B, Q79B, I80B, M81B, I83B, P85B, Q87B, G88B, Q89B, I91B, G92B, M94B, S95B, F96B, L97B, 及びQ98Bが含まれ、ここで"Ｚ"は酸性アミノ酸、"Ｂ"は塩基性アミノ酸である。
【０４３６】
本発明はまた、該βヘアピンループ構造の外側にこれらヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変化させる突然変異を含む、ＶＥＧＦタンパクも意図する。こうした構造の変化は順に、ダイマー分子に含まれるＶＥＧＦタンパクのβヘアピンループ構造領域と、ダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用を増加させる働きをする。こうした変異は、ＶＥＧＦタンパクの１−２６位、５１−７２位、及び１００−１８９位からなる群より選ばれる位置にみられる。
【０４３７】
このようなβヘアピンＬ１及びＬ３ループ構造の外側の変異の具体例には、
【０４３８】
【化９】
2003524381.tif 000012
が含まれる。変数"Ｊ"は、その導入が、ＶＥＧＦタンパクのＬ１及びＬ３βヘアピンループ構造とミュータントＶＥＧＦタンパクモノマーを含むダイマータンパクへの親和性を有するレセプターとの間の静電相互作用の増加につながるいずれのアミノ酸でもよい。
【０４３９】
本発明はまた、修飾された形態での多数のＶＥＧＦタンパクを意図する。これらの修飾形態には、別のシスチンノット増殖因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したＶＥＧＦタンパクが含まれる。
【０４４０】
具体例として、上記のようなミュータントサブユニット又は単鎖ＶＥＧＦタンパクアナログを少なくとも１つ含むミュータントＶＥＧＦタンパクヘテロダイマーは機能的に活性であり、すなわち、ＶＥＧＦタンパクレセプター結合、ＶＥＧＦタンパクファミリーレセプターシグナリング及び細胞外分泌のような、野生型ＶＥＧＦタンパクに関連した１又はそれ以上の機能活性を呈することができる。好ましくは、該ミュータントＶＥＧＦタンパクヘテロダイマー又は単鎖ＶＥＧＦタンパクアナログは、ＶＥＧＦタンパクレセプターに結合でき、好ましくは野生型ＶＥＧＦタンパクより大きい親和性を有する。また、そのようなミュータントＶＥＧＦタンパクヘテロダイマー又は単鎖ＶＥＧＦタンパクアナログは、シグナルトランスダクションを引き起こすのが好ましい。最も好ましくは、本発明のミュータントサブユニット又は単鎖ＶＥＧＦタンパクアナログを少なくとも１つ含むミュータントＶＥＧＦタンパクヘテロダイマーは、野生型ＶＥＧＦタンパクより高いインビトロ生物活性及び／又はインビボ生物活性をもち、野生型ＶＥＧＦタンパクより長い血清半減期をもつ。本発明のミュータントＶＥＧＦタンパクヘテロダイマー及び単鎖ＶＥＧＦタンパクアナログは、該分野において公知の手順により所望の活性についてテストされ得る。
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパク及びアナログをコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のヒトＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット及びＰＤＧＦファミリータンパクアナログのミュータントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによって野生型タンパク質と比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを変更することのない塩基ミューテーションが好ましい。ここでは、２個のコード領域が融合されているという場合には、核酸分子の３'末端が他の核酸分子の５'（又はペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０４４１】
遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施において使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換され、従ってサイレント変化を生じる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【０４４２】
一つの実施態様では、本発明は、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットが、好ましくは該標的タンパク質のβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置する一個又は複数のアミノ酸置換を含むものである、核酸分子を提供する。本発明はまた、Ｌ１及び／又はＬ３ループの外側にアミノ酸置換を有し、これによりこれらのループとＰＤＧＦファミリータンパクダイマーの同族体レセプターとの間の静電相互作用が高められた、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットをコードする核酸分子を提供する。本発明は更に、好ましくはＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットのβヘアピンＬ１及び／又はＬ３ループ又はその近傍に位置し、及び／又は別のＣＫＥＰタンパク質に全体又は一部が共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０４４３】
更に別の実施態様として、本発明は、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログをコードする配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットのコード領域は、野生型サブユニット又は別の突然変異モノマーサブユニットであり得る、対応するダイマーユニットのコード領域と融合している。更に、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクモノマーのカルボキシル末端が、別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に結合している、単鎖ＰＤＧＦファミリータンパクアナログをコードする核酸分子も提供する。更に別の実施態様として、該核酸分子は単鎖ＰＤＧＦファミリータンパクアナログをコードし、ここでミュータントＰＤＧＦファミリータンパクモノマーのカルボキシル末端は別のＣＫＧＦタンパク質のアミノ末端に共有結合しており、該結合アミノ酸配列のカルボキシル末端はシグナルペプチドのないミュータントＰＤＧＦファミリータンパクモノマーのアミノ末端と共有結合している。
【０４４４】
本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ＰＤＧＦファミリータンパクのモノマーサブユニットをコードする核酸配列どうしを当該分野で公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを当該分野で一般に公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる。
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット及びアナログの作製
本発明のミュータントαサブユニット、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクβサブユニット、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクヘテロダイマー、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータントサブユニット又はＰＤＧＦアナログは融合タンパクであり、これに限定はされないが例えばミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット及び別のＣＫＧＦタンパク又は２つのミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットを含むか、或いは１つのミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット及び１つの対応する野生型ＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットを含む。一つの実施態様として、この様な融合タンパクは、これに限定されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン等の毒素類の様な他のタンパクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュータント又は野生型サブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパクは、適当なコーディングフレームにおいて、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列どうしを当該分野で公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを当該分野で一般に公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用のようなタンパク合成方法によって作製できる。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットの一部分を含む、いかなる異種タンパクコード配列と融合したキメラ遺伝子をも構築しうる。具体的な実施態様は、好ましくは２つのサブユニット間にペプチドリンカーを介して、別のＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットと融合したミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットの構造及び機能解析
ここに示すのは、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット、ミュータントファミリータンパクヘテロダイマー及びＰＤＧＦファミリータンパクアナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビボ生物機能の解析方法である。
【０４４５】
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットがひとたび確認されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又はタンパク精製のための他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法等）を用いて評価できる。
【０４４６】
或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列は、例えば自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０４４７】
ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824）によって特徴付けることができる。親水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０４４８】
二次構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる。
【０４４９】
他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13）及びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。ＢＬＡＳＴ、ＣＨＡＲＭＭリリース２１．２（コンベックス用）、及びＱＵＡＮＴＡ  ｖ．３．３（Molecular Simulations, Inc., York, 英国）等の当業界で利用できるコンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０４５０】
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクヘテロダイマー、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントも、各種の当該分野で公知の方法で分析することができる。
【０４５１】
例えば、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパク又はサブユニットについて、抗体に結合するために野生型ＰＤＧＦファミリータンパク又はそのサブユニットと結合又は競合する能力を評価する場合には、当該分野で公知の各種イムノアッセイ法を用いることができ、限定されないが、これにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、"サンドウィッチ"イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することにより認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされた箇所を検出することにより認められる。イムノアッセイで結合を検出するための技術においては多くの手段が公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０４５２】
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクサブユニット、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクヘテロダイマー、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの血小板由来増殖因子ファミリータンパクレセプター（ＰＤＧＦＲ）への結合は、限定されないが、例えばＰＤＧＦＲからのウシＰＤＧＦのような別種の放射線ラベルされたＰＤＧＦファミリータンパクの置換に基づくインビトロアッセイ等、該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクヘテロダイマー、ＰＤＧＦファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性もまた、種々のバイオアッセイにより測定できる。タンパクの血小板由来増殖因子ファミリー（ＰＤＧＦ）は、様々なタイプの細胞の増殖に影響を与える。タンパクチロシンキナーゼレセプターと結合することで多数の細胞系を活性化することにより、ＰＤＧＦタンパクは細胞増殖への刺激的影響を及ぼす。細胞応答アッセイ（例えば細胞増殖及びＤＮＡ合成アッセイ）、ホルモン刺激タンパク発現アッセイ、及び結合アッセイは全て、本発明で示されるミュータントＰＤＧＦタンパクの生物活性を測定するために用い得るアッセイ系の例である。
アンドロゲン代謝バイオアッセイ
慢性的炎症性歯肉組織由来のヒト歯肉繊維芽細胞を用いて、ＰＤＧＦミュータントタンパクの生物活性を測定及び野生型の分子と比較する。本アッセイの１つの実施例として、炭素１４（14Ｃ）ラベルした前駆体分子を用いて本発明のミュータントＰＤＧＦ増殖因子の生物活性を測定する。繊維芽細胞では、テストステロンがＤＨＴと４−アンドロスタンジオンに代謝される。繊維芽細胞はまた、４−アンドロスタンジオンをＤＨＴとテストステロンに代謝する。これら２つの代謝経路における生成物の合成速度はＰＤＧＦ刺激に敏感である。従って、放射線ラベルした基質分子を用いて、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクによる刺激の結果として生成したラベルされた生成物の量を測定し、野生型ＰＤＧＦファミリータンパクに刺激された生成物合成のレベルと比較することができる。
【０４５３】
本アッセイ系の１つの実施例として、14Ｃ−テストステロン及び14Ｃ−４−アンドロスタンジオンを用いてミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの生物活性を測定することができる。これらの試薬はAmersham International (Princeton, NJ)から市販されている。本アッセイでの使用のため、放射線ラベルした基質を十分な濃度準備する。例えば、50μCi/mlのテストステロンを本アッセイで用い得る。本発明に示す方法に従って、ミュータント及び野生型のＰＤＧＦファミリータンパクを発現し、精製する。一連の希釈液を準備し、各ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクについてアンドロゲン代謝のための刺激性濃度を確立する。例えば、0.5ng/mlの野生型ＰＤＧＦは刺激性濃度であると報告されている（Kasasa et al., J. Clin. Periodontal., 25: 640-646 (1998)）。
【０４５４】
治療初期段階完了後の患者３−７人の歯周ポケット由来の慢性炎症性歯肉組織より５−９経代のヒト歯肉繊維芽細胞を得て、ポケット除去（執刀時出血なし、深さ６−８mm）のための歯周手術中に単離する。炎症供給源より得られた繊維芽細胞は、ベースラインにおいてアンドロゲンに対する代謝応答が高く、そして健康なコントロールに比べ炎症性刺激に応答する代謝応答が高いと報告されている。よって、このタイプの供給源からの細胞を本アッセイに用いる。
【０４５５】
３−７細胞系より得られた単層培地中のコンフルエントの歯肉繊維芽細胞を、アンドロゲン基質である１４Ｃ−テストステロン／１４Ｃ−４−アンドロスタンジオンを加えたEagle's MEM培地でマルチウェルディッシュ中、二連でインキュベートし、増殖因子の活性をテストする。野生型タンパクのED50値に近い濃度範囲を用いて、個々のＰＤＧＦファミリータンパクインキュベーションに応答する、アンドロゲン代謝のための最適な刺激濃度を確立する。
【０４５６】
インキュベーションは24時間37℃でCO2が5%の加湿組織培養インキュベーター内で行う。インキュベーション過程の最後に、酢酸エチル（2ml×3）を用いて代謝物を培地より分離し、ロータリーエバポレーター（Gyrovap, V.A. Howe Ltd., Banbury, Oxon, UK）でエバポレートし、ベンゼン：アセトン溶媒系（4:1 v/v）にて薄層クロマトグラフィーにより分離する。分離した代謝物は放射線同位体スキャナー（Berthold linear analyzer, Victoria, Australia）を用いて定量する。生物的に活性な代謝物ＤＨＴを評価してミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの生物活性を決定する。
【０４５７】
ＤＨＴは、抽出後、ガスクロマトグラフィー及びマススペクトルのような標準的な技術を用いて特徴づけられる。これらの技術はSoory, M., J. Periodontal Res., 30:124-131 (1995)に示される。
ＤＮＡ合成アッセイ
別の実施例として、ミュータントタンパクの存在下増殖中の繊維芽細胞に組み込まれた3Ｈ−ヒスチジンの量を測定することによりミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの生物活性をアッセイする。上胸部にケロイドのある患者より得たケロイド繊維芽細胞を採取することにより本アッセイを行う。これらの細胞をＴ75フラスコ内、最小必須培地（ＭＥＭ）を含むウシ胎児血清（ＦＣＳ）中、37℃、95%の空気及び5%のCO2中で培養する。第５継代の細胞を本アッセイに用いる。24ウェルプレート内、10%FCSを加えたＭＥＭ中に準備した細胞（2×104/ウェル）を入れ、コンフルエントになるまで増殖させる。該細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で一度洗浄し、次に0.1%のウシ血清アルブミンを加えたＭＥＭ中で（無血清培地）24時間インキュベーションする。次に血清の非存在下で、増殖因子により24時間該細胞に刺激を加える。次に最終濃度1μCi/mlの3Ｈ−ヒスチジン（NEN, Boston, MA）の存在下で該細胞を2時間増殖させ、冷リン酸緩衝化生理食塩水で３度、5%のトリクロロ酢酸で４度洗浄する。５００マイクロリットルの0.1N NaOH/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを添加し、液体シンチレーションシステムを用いて5mlのACS II (Amersham Corp., Arlington Heights, IL)中で放射能を測定する。実験は全て３連で行う。
【０４５８】
ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの刺激を受けた細胞中の3Ｈ−ヒスチジン取り込み量を野生型ＰＤＧＦファミリータンパクの刺激を受けた細胞中のものと比較すると、ＰＤＧＦアミノ酸配列に対するどの変異が結果として生物活性を高めるかを決定することができる。本アッセイの例はKikuchi et al., Dermatology, 190: 4-8 (1995)に見られる。
細胞外Ｐ１ＣＰアッセイ
別の実施態様においては、培養中の繊維芽細胞がＰＤＧＦファミリータンパク刺激に応答して生産するＩ型プロコラーゲンカルボキシル末端ペプチド（Ｐ１ＣＰ）量を測定することにより、ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの生物活性を野生型タンパクの生物活性と比較する。Ｐ１ＣＰの生産は、ＰＤＧＦファミリータンパク及び他のタイプの増殖因子への露出により刺激されるＩ型コラーゲン代謝を反映する。本アッセイにおいては、3Ｈ−ヒスチジンアッセイで述べた方法を用いて培養された繊維芽細胞を、ウェル当たり1×104細胞で24ウェル培養プレートに入れる。一晩のインキュベーションの後、該ウェルを洗浄して新たに調製した無血清培地をＰＤＧＦファミリータンパクと共に或いは伴わずに加える。72時間のインキュベーション後、上清を集めて4℃で保存する。Takara Shuzo (Kyoto, Japan)から得られる酵素結合免疫溶媒アッセイキットを用い、Ryan, et al., Hum., Pathol., 4: 55-67 (1974)に示すようにして上清中のＰ１ＣＰ量を測定する。実験は全て２連で行う。Ｐ１ＣＰ量の値は2×104繊維芽細胞当たりで表わされる。本アッセイの例はKikuchi et al., Dermatology, 190: 4-8 (1995)に見られる。
【０４５９】
ＶＥＧＦバイオアッセイ系
血管内皮増殖因子サブファミリータンパクはＰＤＧＦファミリーのメンバーである。それでも、本発明で示すミュータントＶＥＧＦタンパクの結合特性及び生物活性を分析するために得られる特定のバイオアッセイ系がある。そのような２つの系は、ミュータントＶＥＧＦタンパクについて行う直接的な結合研究およびミュータントＶＥＧＦタンパクにより誘導される細胞増殖の測定である。
ＶＥＧＦレセプター結合アッセイ
96ウェルイムノプレート（Immunlon-1, DYNEX TECHNOLOGIES, Chantilly, VA）中で結合アッセイを行う；50mMの炭酸ナトリウムバッファー（pH9.6）中に10μgのウサギIgG抗−ヒトIgG (Fc-特異的)を含む100μlの溶液、4℃で一晩各ウェルを覆う。上清を捨てた後、洗浄バッファー（PBS中0.01%のTween 80）中でウェルを３度洗浄する。プレートを１時間アッセイバッファー（PBS中0.5%BSA、0.03%Tween80、0.01%Thimerosal）中でブロックする（300μl/ウェル）。次に上清を捨て、ウェルを洗浄する。野生型又はミュータントのいずれかのＶＥＧＦファミリータンパクを種々の濃度で（100μl）及び125I−放射線ラベル野生型ＶＥＧＦファミリータンパク（50ml中5×103 cpm）を含む馴化培地について混合液を調製し、これをマイクロチューブに50μl、最終濃度3-15ng/mlのＶＥＧＦレセプター特異的抗体と混合する。無関係な抗体を、放射線ラベルしたＶＥＧＦファミリータンパクの非特異的結合のためのコントロールとして用いる。これらの溶液のアリコート（100μl）をプレコートしたマイクロタイタープレートに加え、25℃で4時間インキュベートする。上清を捨て、プレートを洗浄し、個々のウェルをγシンチグラフィー（LKB model 1277）で計数する。ラベルされていない野生型又はミュータントＶＥＧＦファミリータンパクとラベルされた野生型ＶＥＧＦとの間のＶＥＧＦファミリータンパクレセプターへの競合的結合をプロットし、４パラメーターフィッティング（Kaleidagraph. Abelbeck Software）にて分析する。50%の阻害（IC50）に要する濃度から、各ミュータントＶＥＧＦファミリータンパクについて見かけの解離定数を求める。本アッセイの例はKeyt, et al., J. Biol., Chem., 271(10):5638-5646 (1996)に見られる。
ＶＥＧＦ誘導性血管内皮細胞増殖アッセイ
別の実施例として、Ferra&Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851-859 (1989)に示されるように、標的細胞としてウシ副腎皮質内皮細胞を用いてミュータントＶＥＧＦファミリータンパクのマイトジェン活性を測定する。手短に言えば、12ウェルプレートに細胞をまばらにプレーティングし（7000細胞/ウェル）、10%の子ウシ血清、2mMのグルタミン、及び抗生物質を加えたDulbecco's modified Eagle's培地で一晩インキュベートする。該培地を次の日に交換し、培養培地中100ng/mlから10pg/mlに希釈された野生型又はミュータントＶＥＧＦファミリータンパクを、播種された細胞上に２連で重ねる。37℃で５日のインキュベーション後、該細胞をトリプシンで解離し、Coulterカウンターを用いて定量する。本アッセイの例はKeyt, et al., J. Biol., Chem., 271(10):5638-5646 (1996)に見られる。
ＶＥＧＦマイトジェン活性
標的細胞のマイトジェン活性に対するミュータントＶＥＧＦファミリータンパクの影響は、これらタンパクの生物活性を測定し野生型分子と比較するための付加的なアッセイである。マイトジェンアッセイはMizazono et al., J. Biol. Chem., 262:4098-4103 (1987)に示されるように行う。手短に言えば、ウェル当たり1×104細胞のヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞を、ＢＴＳからの内皮増殖培地中24ウェルプレートに播種する。該細胞を37℃で一晩接着させる。培地を5%の子ウシ胎児血清及び1.5μMのチミジンを加えた内皮基礎培地（ＢＴＳ）で置換し、野生型又はミュータントＶＥＧＦファミリータンパクを24時間後に添加する。インキュベーションを更に18時間続け、その後1μCi [3H]−メチルチミジン（56.7 Ci/mmol, NEN, Boston, MA）を加える。細胞を37℃で更に6時間放置する。細胞単層をメタノールで固定し、5%のトリクロロ酢酸で洗浄し、0.3MのNaOHに溶解し、液体シンチレーションで計数する。[3H]−メチルチミジン取り込みのレベルを、野生型またはミュータントＶＥＧＦファミリータンパクで処理した細胞群間で比較する。本アッセイの例はFiebich, et al., Eur. J. Biochem. 211:19-26 (1993)に見られる。
【０４６０】
タンパクの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパク濃度が１／２に減少するために必要な時間を示す。ミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの半減期は、限定されないが、例えば、抗−ＰＤＧＦファミリータンパク抗体を用いてミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの投与後一定期間後に採取したサンプルにおけるミュータントＰＤＧＦファミリータンパクレベルを測定するイムノアッセイ、又は放射線ラベルしたミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの投与後被験体から採取したサンプルにおける放射線ラベルしたミュータントＰＤＧＦファミリータンパクの検出等、一定期間後の被験体からのサンプルにおけるＰＤＧＦファミリータンパクレベルを測定するためのいかなる方法によっても決定できる。
【０４６１】
他の方法が当業者に公知になるであろうが、それらは本発明の範囲に含まれる。
【０４６２】
診断的及び治療的使用
本発明は、本発明の治療化合物（ここでは"治療薬"（"Therapeutic"）という）の投与による各種疾患及び障害の治療又は予防を提供する。そのような治療薬は次のものを含む：ミュータントサブユニット及びワイルドタイプ又はミュータントサブユニットの何れか一方を有するPDGFファミリータンパクヘテロダイマー；ミュータントサブユニット及びミュータント又はワイルドタイプサブユニットの何れか一方を有し、全部又は一部がもう一つのCKGFタンパクと共有結合的に結合するPDGFファミリータンパクヘテロダイマー；ミュータントサブユニット及びワイルドタイプサブユニットを有し、ミュータントサブユニットは単鎖アナログを形成するために共有結合的に結合し、ミュータントサブユニット及びワイルドタイプ又はミュータントサブユニット並びにCKGFタンパク又はフラグメントが、単鎖アナログ、他の誘導体、アナログ及びそのフラグメント（すなわち、上記したように）並びに本発明のミュータントPDGFファミリータンパクヘテロダイマーをコードする核酸及び誘導体、アナログ及びそのフラグメント中で共有結合的に結合するPDGFファミリープロテインヘテロダイマーを含む。
【０４６３】
治療薬が投与される被験体は、好適には動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含むがこれに限定されず、好適には哺乳類である。好適な例としては対象はヒトである。一般に、対象の種と同種を起源とする種の生産物の投与が好ましい。従って、好ましい例において、ヒトミュータント及び／又は修飾されたPDGFファミリータンパクヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログ、又は核酸は、ヒト患者に治療的又は予防的又は診断的に投与される。
【０４６４】
好ましい側面において、本発明の治療薬は実質的に精製されている。
【０４６５】
タンパクのPDGFファミリーは、細胞成長を刺激する活動的な役割を果たす。PDGFのアイソフォームは、創傷治癒において重要な役割を果たす。この創傷治癒機能は、本発明の方法によって増強され得る。PDGFファミリープロテインが、通常又は所望のレベルと比較して欠乏又は減少する障害は、本発明のミュータントPDGFファミリープロテインヘテロダイマー又はPDGFファミリープロテインアナログの投与によって治療又は予防される。PDGFファミリープロテインレセプターが通常のレベルと比較して欠乏又は減少する、あるいはワイルドタイプPDGFファミリープロテインに対して通常のPDGFファミリープロテインレセプターより非応答性又は低応答性である障害は、ミュータントPDGFファミリープロテインヘテロダイマー又はPDGFファミリープロテインアナログの投与によってもまた治療され得る。ミュータントPDGFファミリープロテインヘテロダイマー及びPDGFファミリープロテインアナログのアンタゴニストとしての使用は本発明によって意図される。
【０４６６】
具体例において、生物活性を有するミュータントPDGFファミリータンパクヘテロダイマー又はPDGFファミリータンパクアナログは、創傷治癒の促進を含む多くの細胞成長及び発生状態を治療するために、予防的を含む治療的に投与される。
【０４６７】
PDGFファミリータンパク又は機能あるいはPDGFファミリータンパクレセプター及び機能の欠乏又は減少は、容易に、例えば患者組織サンプルを（例えば生検組織から）得ること及びそれをインビトロで、RNA又はタンパクレベル、PDGFファミリータンパク又はPDGFファミリータンパクレセプターの発現したRNAまたはタンパクの構造及び／又は活性についてアッセイすることによって、検出され得る。このようにして、当分野で標準的な多くの方法は使用され得、ここで、PDGFファミリータンパク又はPDGFファミリータンパクレセプタータンパクを検出及び／又は可視化するための免疫アッセイ（すなわち、ウエスタンブロット、後にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う免疫沈降、免疫細胞化学、その他）、及び／又はPDGFファミリータンパク又はPDGFファミリータンパクレセプターmRNAの検出及び／又は可視化によって、PDGFファミリータンパク又はPDGFファミリータンパクレセプター発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（すなわち、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、その他）、その他が含まれるがこれらに限定されない。
【０４６８】
ヒト神経成長因子モノマーのミュータント
ヒト神経成長因子モノマーは、図10（SEQ ID No:9）に示されるように120個のアミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場合、1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を包含する、ヒト神経成長因子モノマーのミュータントを意図する。さらに、本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュータントヒト神経成長因子モノマーを意図する。
【０４６９】
本発明は、図10（SEQ ID NO:9）に表されるように、ミュータント神経成長因子モノマーに、16位から57位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1又はそれ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミノ酸置換は次のものを包含する：D16X、S17X、V18X、S19X、V20X、W21X、V22X、G23X、D24X、K25X、T26X、T27X、A28X、T29X、D30X、I31X、K32X、G33X、K34X、E35X、V36X、M37X、V38X、L39X、G40X、E41X、V42X、N43X、N44X、I45X、N46X、S47X、V48X、F49X、K50X、Q51X、Y52X、F53X、F54X、E55X、T56X、及びK57X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特性を変化させる。
【０４７０】
本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、神経成長因子モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。神経成長因子モノマーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体例は次の１つ以上を含む：D16B、D24B、D30B、E35B、E41B及びE55B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４７１】
神経成長因子モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた意図される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以上を含む：K25Z、K32Z、K34Z、K50Z及びK57Z、ここで、"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０４７２】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD16U、D24U、K25U、D30U、K32U、K34U、E35U、E41U、K50U、E55U、及びK57Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０４７３】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含むミュータント神経成長因子モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S17Z、V18Z、S19Z、V20Z、W21Z、V22Z、G23Z、T26Z、T27Z、A28Z、T29Z、I31Z、G33Z、V36Z、M37Z、V38Z、L39Z、G40Z、V42Z、N43Z、N44Z、I45Z、N46Z、S47Z、V48Z、F49Z、Q51Z、Y52Z、F53Z、F54Z、T56Z、S17B、V18B、S19B、V20B、W21B、V22B、G23B、T26B、T27B、A28B、T29B、I31B、G33B、V36B、M37B、V38B、L39B、G40B、V42B、N43B、N44B、I45B、N46B、S47B、V48B、F49B、Q51B、Y52B、F53B、F54B、及びT56B、ここで、"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０４７４】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータント神経成長因子モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図10(SEQ ID NO:9)に描かれているように、L3ヘアピンループの81位〜107位の間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：T81X、T82X、T83X、H84X、T85X、F86X、V87X、K88X、A89X、M90X、L91X、T92X、D93X、G94X、K95X、Q96X、A97X、A98X、W99X、R100X、F101X、I102X、R103X、I104X、D105X、T106X、及びA107X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０４７５】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基を、酸性アミノ酸残基が存在する神経成長因子L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、神経成長因子モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基が神経成長因子モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D93B及びD105B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４７６】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基を神経成長因子L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の81〜107の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、H84Z、K88Z、K95Z、R100Z及びR103Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０４７７】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はH84U、K88U、D93U、K95U、R100U、R103U及びD105Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０４７８】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータント神経成長因子モノマーが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、T81Z、T82Z、T83Z、T85Z、F86Z、V87Z、A89Z、M90Z、L91Z、T92Z、G94Z、Q96Z、A97Z、A98Z、W99Z、F101Z、I102Z、I104Z、T106Z、A107Z、T81B、T82B、T83B、T85B、F86B、V87B、A89B、M90B、L91B、T92B、G94B、Q96B、A97B、A98B、W99B、F101B、I102B、I104B、T106B、及びA107Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０４７９】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、神経成長因子モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれる神経成長因子モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、神経成長因子モノマーの1位〜14位、59位〜79位、及び109位〜120位からなる群から選択される位置で見出される。
【０４８０】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、S1J、S2J、S3J、H4J、P5J、I6J、F7J、H8J、R9J、G10J、E11J、D12J、S13J、V14J、R59J、D60J、P61J、N62J、P63J、V64J、D65J、S66J、G67J、C68J、R69J、G70J、I71J、D72J、S73J、K74J、H75J、W76J、N77J、S78J、Y79J、V109J、C110J、V111J、L112J、S113J、R114J、K115J、A116J、V117J、R118J、R119J、及びA120Jを含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、神経成長因子のL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータント神経成長因子モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加する。
【０４８１】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くの神経成長因子モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合した神経成長因子モノマーを含む。
【０４８２】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖神経成長因子アナログを含むミュータント神経成長因子ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、神経成長因子レセプター結合、神経成長因子レセプターシグナル伝達、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプ神経成長因子に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータント神経成長因子ヘテロダイマー又は単鎖神経成長因子アナログは、好ましくはワイルドタイプ神経成長因子より大きいアフィニティーを有する神経成長因子レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータント神経成長因子ヘテロダイマー又は単鎖神経成長因子アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖神経成長因子アナログを含むミュータント神経成長因子ヘテロダイマーは、ワイルドタイプ神経成長因子より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプ神経成長因子より長い血清半減期を有する。本発明のミュータント神経成長因子ヘテロダイマー及び単鎖神経成長因子アナログは、該技術において知られている手順により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０４８３】
ヒト脳由来神経栄養因子のミュータント
ヒト脳由来神経栄養因子モノマーは、図11（SEQ ID No:10）に示されるように119個のアミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場合、1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を包含する、ヒト脳由来神経栄養因子モノマーのミュータントを意図する。さらに、本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュータントヒト脳由来神経栄養因子モノマーを意図する。
【０４８４】
本発明は、図11（SEQ ID NO:10）に表されるように、脳由来神経栄養因子モノマーに、14位から57位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1又はそれ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミノ酸置換は次のものを包含する：D14X、S15X、I16X、S17X、E18X、W19X、V20X、T21X、A22X、A23X、D24X、K25X、K26X、T27X、A28X、V29X、D30X、M31X、S32X、G33X、G34X、T35X、V36X、T37X、V38X、L39X、E40X、K41X、V42X、S43X、P44X、V45X、K46X、G47X、Q48X、L49X、K50X、Q51X、Y52X、F53X、Y54X、E55X、T56X、及びK57X。"X"はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特性を変化させる。
【０４８５】
本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。脳由来神経栄養因子モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。脳由来神経栄養因子モノマーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体例は次の１つ以上を含む：D14B、E18B、D24B、D30B、E40B、E55B及びE57B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４８６】
脳由来神経栄養因子モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた意図される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以上を含む：K25Z、K26Z、K41Z、K46Z、K50Z及びK57Z、ここで、"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０４８７】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD14U、E18U、D24U、K25U、K26U、D30U、E40U、K41U、K46U、K50U、E55U、及びK57Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０４８８】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含むミュータント脳由来神経栄養因子モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S15Z、I16Z 、S17Z、W19Z、V20Z、T21Z、A22Z、A23Z、T27Z、A28Z、V29Z、M31Z、S32Z、G33Z、G34Z、T35Z、V36Z、T37Z、V38Z、L39Z、V42Z、S43Z、P44Z、V45Z、G47Z、Q48Z、L49Z、Q51Z、Y52Z、F53Z、Y54Z、T56Z、S15B、I16B、S17B、W19B、V20B、T21B、A22B、A23B、T27B、A28B、V29B、M31B、S32B、G33B、G34B、T35B、V36B、T37B、V38B、L39B、V42B、S43B、P44B、V45B、G47B、Q48B、L49B、Q51B、Y52B、F53B、Y54B、及びT56B、ここで、"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０４８９】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータント脳由来神経栄養因子モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図11(SEQ ID NO:10)に描かれているように、L3ヘアピンループの81位〜108位の間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：R81X、T82X、T83X、Q84X、S85X、Y86X、V87X、R88X、A89X、M90X、L91X、T92X、D93X、S94X、K95X、K96X、R97X、I98X、G99X、W100X、R101X、F102X、I103X、R104X、I105X、D106X、T107X、及びS108X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０４９０】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基を、脳由来神経栄養因子L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、脳由来神経栄養因子モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基が脳由来神経栄養因子モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D93B及びD106B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０４９１】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基を脳由来神経栄養因子L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の81〜108の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R81Z、R88Z、K95Z、K96Z、R97Z、R101Z及びR104Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０４９２】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はR81U、R88U、D93B、K95U、K96U、R97U、R101U及びR104Zで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０４９３】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータント脳由来神経栄養因子タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、T82Z、T83Z、Q84Z、S85Z、Y86Z、V87Z、A89Z、M90Z、L91Z、T92Z、S94Z、I98Z、G99Z、W100Z、F102Z、I103Z、I105Z、T107Z、S108Z、C109Z、V110Z、T82B、T83B、Q84B、S85B、Y86B、V87B、A89B、M90B、L91B、T92B、S94B、I98B、G99B、W100B、F102B、I103B、I105B、T107B、S108B、及びV110Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０４９４】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、脳由来神経栄養因子モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれる脳由来神経栄養因子モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、脳由来神経栄養因子モノマーの1位〜12位、59位〜79位、及び110位〜119位からなる群から選択される位置で見出される。
【０４９５】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、H1J、S2J、D3J、P4J、A5J、R6J、R7J、G8J、E9J、L10J、S11J、V12J、N59J、P60J、M61J、G62J、Y63J、T64J、K65J、E66J、G67J、C68J、R69J、G70J、I71J、D72J、K73J、R74J、H75J、W76J、N77J、S78J、Q79J、V110J、C111J、I112J、L113J、T114J、I115J、K116J、R117J、G118J、及びE119Jを含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、脳由来神経栄養因子のL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータント脳由来神経栄養因子モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加する。
【０４９６】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くの脳由来神経栄養因子モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合した脳由来神経栄養因子モノマーを含む。
【０４９７】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖脳由来神経栄養因子アナログを含むミュータント脳由来神経栄養因子ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、脳由来神経栄養因子レセプター結合、脳由来神経栄養因子レセプターシグナル伝達、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプ脳由来神経栄養因子に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータント脳由来神経栄養因子ヘテロダイマー又は単鎖脳由来神経栄養因子アナログは、好ましくはワイルドタイプ脳由来神経栄養因子より大きいアフィニティーを有する脳由来神経栄養因子レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータント脳由来神経栄養因子ヘテロダイマー又は単鎖脳由来神経栄養因子アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖脳由来神経栄養因子アナログを含むミュータント脳由来神経栄養因子ヘテロダイマーは、ワイルドタイプ脳由来神経栄養因子より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプ脳由来神経栄養因子より長い血清半減期を有する。本発明のミュータント脳由来神経栄養因子ヘテロダイマー及び単鎖脳由来神経栄養因子アナログは、該技術において知られている手順により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０４９８】
ヒトニュートロフィン-3モノマーのミュータント
ヒトニュートロフィン-3モノマーは、図12（SEQ ID No:11）に示されるように119個のアミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場合、1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を包含する、ヒトニュートロフィン-3モノマーのミュータントを意図する。さらに、本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュータントヒトニュートロフィン-3モノマーを意図する。
【０４９９】
本発明は、図12（SEQ ID NO:11）に表されるように、ミュータントニュートロフィン-3モノマーに、15位から56位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1又はそれ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミノ酸置換は次のものを包含する：D15X、S16X、E17X、S18X、L19X、W20X、V21X、T22X、D23X、K24X、S25X、S26X、A27X、I28X、D29X、I30X、R31X、G32X、H33X、Q34X、V35X、T36X、V37X、L38X、G39X、E40X、I41X、G42X、K43X、T44X、N45X、S46X、P47X、V48X、K49X、Q50X、Y51X、F52X、Y53X、E54X、T55X、及びR56X。"X"はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特性を変化させる。
【０５００】
本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、ニュートロフィン-3モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ニュートロフィン-3モノマーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体例は次の１つ以上を含む：D15B、E17B、D23B、D29B、E40B及びE54B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５０１】
ニュートロフィン-3モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた意図される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以上を含む：K24Z、R31Z、H33Z、K43Z、K49Z及びR56Z、ここで、"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５０２】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD15U、E17U、D23U、K24U、D29U、R31U、H33U、E40U、K43U、K49U、E54U、及びR56Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５０３】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含むミュータントニュートロフィン-3モノマーが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：S16Z、S18Z、L19Z、W20Z、V21Z、T22Z、S25Z、S26Z、A27Z、I28Z、I30Z、G32Z、Q34Z、V35Z、T36Z、V37Z、L38Z、G39Z、I41Z、G42Z、T44Z、N45Z、S46Z、P47Z、V48Z、Q50Z、Y51Z、F52Z、Y53Z、T55Z、R56Z、S16B、S18B、L19B、W20B、V21B、T22B、S25B、S26B、A27B、I28B、I30B、G32B、Q34B、V35B、T36B、V37B、L38B、G39B、I41B、G42B、T44B、N45B、S46B、P47B、V48B、Q50B、Y51B、F52B、Y53B、及びT55B、ここで、"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５０４】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントニュートロフィン-3モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図12(SEQ ID NO:11)に描かれているように、L3ヘアピンループの80位〜107位の間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：K80X、T81X、S82X、Q83X、T84X、Y85X、V86X、R87X、A88X、S89X、L90X、T91X、E92X、N93X、N94X、K95X、L96X、V97X、G98X、W99X、R100X、W101X、I102X、R103X、I104X、D105X、T106X、及びS107X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５０５】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基を、ニュートロフィン-3 L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ニュートロフィン-3モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がニュートロフィン-3モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E92B及びD105B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５０６】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をニュートロフィン-3 L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の80〜107の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K80Z、R87Z、N93Z、K95Z、L96Z、R100Z及びR103Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５０７】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はK80U、R87U、E92U、K95U、R100U、R103U及びD105Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５０８】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントニュートロフィン-3タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、T81Z、S82Z、Q83Z、T84Z、Y85Z、V86Z、A88Z、S89Z、L90Z、T91Z、N93Z、N94Z、L96Z、V97Z、G98Z、W99Z、W101Z、I102Z、I104Z、T106Z、S107Z、T81B、S82B、Q83B、T84B、Y85B、V86B、A88B、S89B、L90B、T91B、N93B、N94B、L96B、V97B、G98B、W99B、W101B、I102B、I104B、T106B、及びS107Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５０９】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ニュートロフィン-3モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるニュートロフィン-3モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ニュートロフィン-3モノマーの1位〜13位、58位〜78位、及び109位〜119位からなる群から選択される位置で見出される。
【０５１０】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、Y1J、A2J、E3J、H4J、K5J、S6J、H7J、R8J、G9J、E10J、Y11J、S12J、V13J、K58J、E59J、A60J、R61J、P62J、V63J、K64J、N65J、G66J、C67J、R68J、G69J、I70J、D71J、D72J、R73J、H74J、W75J、N76J、S77J、Q78J、V109J、C110J、A111J、L112J、S113J、R114J、K115J、I116J、G117J、R118J、及びT119Jを含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ニュートロフィン-3のL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントニュートロフィン-3モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加する。
【０５１１】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのニュートロフィン-3モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したニュートロフィン-3モノマーを含む。
【０５１２】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖ニュートロフィン-3アナログを含むミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ニュートロフィン-3レセプター結合、ニュートロフィン-3レセプターシグナル伝達、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプニュートロフィン-3に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマー又は単鎖ニュートロフィン-3アナログは、好ましくはワイルドタイプニュートロフィン-3より大きいアフィニティーを有するニュートロフィン-3レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマー又は単鎖ニュートロフィン-3アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ニュートロフィン-3アナログを含むミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマーは、ワイルドタイプニュートロフィン-3より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプニュートロフィン-3より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントニュートロフィン-3ヘテロダイマー及び単鎖ニュートロフィン-3アナログは、該技術において知られている手順により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５１３】
ヒトニュートロフィン-4モノマーのミュータント
ヒトニュートロフィン-4モノマーは、図13（SEQ ID No:12）に示されるように130個のアミノ酸を含む。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した場合、1、2、3、4又はそれ以上のアミノ酸残基の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を包含する、ヒトニュートロフィン-4モノマーのミュータントを意図する。さらに、本発明は、もう一つのCKGFプロテインと結合したミュータントヒトニュートロフィン-4モノマーを意図する。
【０５１４】
本発明は、図13（SEQ ID NO:12）に表されるように、ミュータントニュートロフィン-4モノマーに、18位から60位までの間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1又はそれ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。アミノ酸置換は次のものを包含する：D18X、A19X、V20X、S21X、G22X、W23X、V24X、T25X、D26X、R27X、R28X、T29X、A30X、V31X、D32X、L33X、R34X、G35X、R36X、E37X、V38X、E39X、V40X、L41X、G42X、E43X、V44X、P45X、A46X、A47X、G48X、G49X、S50X、P51X、L52X、R53X、Q54X、Y55X、F56X、F57X、E58X、T59X、及びR60X。"X"はあらゆるアミノ酸残基を示し、その置換はヘアピンループの静電特性を変化させる。
【０５１５】
本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。ニュートロフィン-4モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ニュートロフィン-4モノマーへ塩基性残基が導入される変異を変える静電荷の具体例は次の１つ以上を含む：D18B、D26B、D32B、E37B、E39B、E43B及びE58B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５１６】
ニュートロフィン-4モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた意図される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入はL1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の１つ以上を含む：R27Z、R28Z、R34Z、R36Z、R53Z及びR60Z、ここで、"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５１７】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD18U、D26U、R27U、R28U、D32U、R34U、R36U、E37U、E39U、E43U、R53U、E58U、及びR60Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５１８】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変換する、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変更する、1つ以上の静電荷を含むミュータントニュートロフィン-4タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：A19Z、V20Z、S21Z、G22Z、W23Z、V24Z、T25Z、T29Z、A30Z、V31Z、L33Z、G35Z、V38Z、V40Z、L41Z、G42Z、V44Z、P45Z、A46Z、A47Z、G48Z、G49Z、S50Z、P51Z、L52Z、Q54Z、Y55Z、F56Z、F57Z、T59Z、A19B、V20B、S21B、G22B、W23B、V24B、T25B、T29B、A30B、V31B、L33B、G35B、V38B、V40B、L41B、G42B、V44B、P45B、A46B、A47B、G48B、G49B、S50B、P51B、L52B、Q54B、Y55B、F56B、F57B、及びT59B、ここで、"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５１９】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントニュートロフィン-4モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図13(SEQ ID NO:12)に描かれているように、L3ヘアピンループの91位〜118位の間で境界位置を含め、Cys残基を除いて、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：K91X、A92X、K93X、Q94X、S95X、Y96X、V97X、R98X、A99X、L100X、T101X、A102X、D103X、A104X、Q105X、G106X、R107X、V108X、G109X、W110X、R111X、W112X、I113X、R114X、I115X、D116X、T117X、及びA118X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５２０】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基を、酸性残基が存在するニュートロフィン-4 L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ニュートロフィン-4モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がニュートロフィン-4モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D103B及びD116B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５２１】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をニュートロフィン-4 L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の91〜118の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K91Z、K93Z、Q94Z、R98Z、A104Z、Q105Z、G106Z、R107Z、V108Z、R111Z及びR114Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５２２】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この領域において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はK91U、K93U、R98U、D103U、R107U、R111U、R114U及びD116Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５２３】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントニュートロフィン-4タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、A92Z、Q94Z、S95Z、Y96Z、V97Z、A99Z、L100Z、T101Z、A102Z、A104Z、Q105Z、G106Z、V108Z、G109Z、W110Z、W112Z、I113Z、I115Z、T117Z、A118Z、A92B、Q94B、S95B、Y96B、V97B、A99B、L100B、T101B、A102B、A104B、Q105B、G106B、V108B、G109B、W110B、W112B、I113B、I115B、T117B、及びA118Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５２４】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ニュートロフィン-4モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるニュートロフィン-4モノマーのβヘアピンループ構造の領域、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ニュートロフィン-4モノマーの1位〜16位、62位〜89位、及び120位〜130位からなる群から選択される位置で見出される。
【０５２５】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、G1J、V2J、S3J、E4J、T5J、A6J、P7J、A8J、S9J、R10J、R11J、G12J、E13J、L14J、A15J、V16J、K62J、A63J、D64J、N65J、A66J、E67J、E68J、G69J、G70J、P71J、G72J、A73J、G74J、G75J、G76J、G77J、C78J、R79J、G80J、V81J、D82J、R83J、R84J、H85J、W86J、V87J、S88J、E89J、V120J、C121J、T122J、L123J、L124J、S125J、R126J、T127J、G128J、R129J、及びA130Jを含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ニュートロフィン-4のL1及びL3βヘアピンループ構造と、ミュータントニュートロフィン-4モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプターとの間の静電相互作用が増加する。
【０５２６】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのニュートロフィン-4モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したニュートロフィン-4モノマーを含む。
【０５２７】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖ニュートロフィン-4アナログを含むミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ニュートロフィン-4レセプター結合、ニュートロフィン-4レセプターシグナル伝達、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプニュートロフィン-4に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマー又は単鎖ニュートロフィン-4アナログは、好ましくはワイルドタイプニュートロフィン-4より大きいアフィニティーを有するニュートロフィン-4レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマー又は単鎖ニュートロフィン-4アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ニュートロフィン-4アナログを含むミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマーは、ワイルドタイプニュートロフィン-4より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプニュートロフィン-4より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントニュートロフィン-4ヘテロダイマー及び単鎖ニュートロフィン-4アナログは、該技術において知られている手順により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５２８】
ミュータントニュートロトロフィン（Neutrotrophin）ファミリータンパク
及びアナログをコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のヒトニューロトロフィンファミリータンパク及びニューロトロフィンファミリータンパクアナログのミュータントサブユニットをコードする配列を含む核酸分子であって、該配列が、少なくとも一個の塩基挿入、欠失、若しくは置換、又はこれらの組み合わせを含み、これによってワイルドタイプタンパクと比べて一個又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換を生じさせている、核酸分子にも関する。コード領域のリーディングフレームを変更することのない塩基ミューテーションが好ましい。ここでは、２個のコード領域が融合されている場合には、核酸分子の３'末端が他の核酸分子の５'（又はペプチドリンカーをコードする核酸を介して）末端に連結され、翻訳は、フレームシフト無しに、一個の核酸分子のコード領域から他に進行する。
【０５２９】
遺伝コードの同義性により、ミュータントサブユニット又はモノマーのための同じアミノ酸配列をコードする他のいずれのＤＮＡ配列をも、本発明の実施において使用できる。これらは、限定されるものではないが、同一のアミノ酸残基を配列中にコードする異なるコドンの置換によって変換された、このようなサイレント変化を生ずる、サブユニット又はモノマーのコード領域の全て又は一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【０５３０】
一つの実施態様では、本発明は、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供し、該ミュータントニューロトロフィンサブユニットは一個又は複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは標的タンパク質のβヘアピンL1及び／又はL3ループ又はその近傍に位置する。本発明はまた、L1及び／又はL3ループの外側にアミノ酸置換を有し、これによりこれらのループとニューロトロフィンファミリータンパクダイマーの同族レセプターとの間の静電相互作用が高められた、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットをコードする核酸分子を提供する。本発明は更に、好ましくはニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットのβヘアピンL1及び／又はL3ループ又はその近傍に位置し、及び／又はCKGFタンパクに共有結合した、一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【０５３１】
更に別の実施態様として、本発明は、ニューロトロフィンファミリータンパクアナログをコードする配列を含む核酸分子を提供し、ここで一個又は複数のアミノ酸置換を含むミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットのコード領域は、ワイルドタイプサブユニット又は別の突然変異モノマーサブユニットであり得る、対応するダイマーユニットのコード領域と融合している。更に、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクモノマーのカルボキシル末端が、別のCKGFタンパクのアミノ末端に結合している、単鎖ニューロトロフィンファミリータンパクアナログをコードする核酸分子も提供する。更に別の実施態様として、該核酸分子は単鎖ニューロトロフィンファミリータンパクアナログをコードし、ここでミュータントニューロトロフィンファミリータンパクモノマーのカルボキシル末端はCTEPのアミノ末端のような別のCKGFタンパクのアミノ末端に共有結合しており、該結合アミノ酸配列のカルボキシル末端はシグナルペプチドのないミュータントニューロトロフィンファミリータンパクモノマーのアミノ末端と共有結合している。
【０５３２】
本発明の単鎖アナログは、適当なコーディングフレームにおいて、ニューロトロフィンファミリータンパクのモノマーサブユニットをコードする核酸配列どうしを当該分野で公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを当該分野で一般に公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用によるなどのタンパク質合成方法によって作製できる。
【０５３３】
ミュータント神経成長因子サブユニット及びアナログの作製
本発明のミュータントニューロトロフィンファミリータンパク、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィンファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの作製と使用は、本発明の範囲に含まれる。具体的な実施態様としては、ミュータントサブユニット又はニューロトロフィンファミリータンパクアナログは、これに限定はされないが例えばミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニット及び別のCKGF、全部又は一部が二つのミュータント神経成長サブユニットを含む融合タンパクである。一つの実施態様として、この様な融合タンパクは、これに限定されるものではないがリシン又はジフテリアトキシン等の毒素類の様な他のタンパクをコードする配列にフレーム内で結合した、ミュータント又はワイルドタイプサブユニットをコードする核酸の組み替え発現によって作製される。この様な融合タンパクは、適当なコーディングフレームにおいて、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列どうしを当該分野で公知の方法で互いに連結し、融合タンパクを当該分野で一般に公知の方法で発現させることによって作製することができる。或いは、この様な融合タンパクは、例えばペプチドシンセサイザーの使用のようなタンパク合成方法によって作製できる。いかなる異種タンパクコード配列と融合した、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットの一部を含むキメラ遺伝子をも構築しうる。具体的な実施態様は、好ましくは二つのミュータントとの間にペプチドリンカーを介して、別のミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットと融合したミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットを含む単鎖アナログに関するものである。
【０５３４】
ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットの
構造及び機能解析
ここに示すのは、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニット、ミュータントヘテロダイマー及びニューロトロフィンファミリータンパクアナログの構造決定方法、及び前記のインビトロ活性及びインビボ生物機能の解析方法である。
【０５３５】
ひとたびミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットが確認されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差等を含む標準的な方法、又はタンパク精製のための任意の他の標準的な方法によって、単離及び精製することができる。機能的特性は、適当なアッセイ（後述するイムノアッセイ法を含む）を用いて評価できる。
【０５３６】
或いは、組み替え宿主細胞が生産したミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニットがひとたび確認されれば、該サブユニットのアミノ酸配列は、例えば自動アミノ酸シークエンサーによるなど、タンパク配列決定の標準的な方法によって決定できる。
【０５３７】
ミュータントサブユニット配列は、親水性解析（Hopp,T. 及びWoods,K.,1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824）によって特徴付けることができる。親水性プロフィルは、サブユニットの疎水性及び親水性領域、及びそれら領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定するために利用することができる。
【０５３８】
二次構造解析（Chou, p. 及びFasman,G., 1974, Biochemistry 13:222）も、特異的二次構造をとるサブユニット領域を同定するために行うことができる。
【０５３９】
他の構造解析方法を用いても良い。限定しないが、これらはＸ線結晶学（Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13）及びコンピューターモデリング（Fletterick, R. 及びZoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を含む。BLAST、CHARMMリリース21.2（コンベックス用）、及びQUANTA v.3.3（Molecular Simulations, Inc., York, 英国）等の当業界で利用できるコンピューターソフトウェアプログラムを用いて、ホモロジーモデリングと共に、構造予想、結晶学データ解析、配列アラインメントもまた行うことができる。
【０５４０】
ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニット、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィンファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの機能的活性は、各種の当該分野で公知の方法で分析することができる。
【０５４１】
例えば、ミュータントサブユニット又はミュータントニューロトロフィンファミリータンパクについて、抗体に結合するためにワイルドタイプニューロトロフィンファミリータンパク又はそのサブユニットと結合又は競合する能力を評価する場合には、当該分野で公知の各種イムノアッセイ法を用いることができ、限定されないが、これにはラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、"サンドウィッチ"イムノアッセイ、イムノ放射線アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、イムノ拡散アッセイ、（例えばコロイドゴールド、酵素又は放射線同位体ラベルを用いた）in situイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ等の方法を用いた競合的及び非競合的アッセイシステムが含まれる。抗体結合性は、一次抗体のラベルを検出することにより認められる。或いは、一次抗体は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合、特に二次結合がラベルされた箇所を検出することにより認められる。イムノアッセイで結合を検出するための技術においては多くの手段が公知であり、これらは本発明の範囲に含まれる。
【０５４２】
ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクサブユニット、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィンファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントのニューロトロフィンファミリータンパクレセプターへの結合は、限定されないが、例えば放射ラベルされた別の種、例えばウシニューロトロフィンファミリータンパク、のニューロトロフィンファミリータンパクのニューロトロフィンファミリータンパクレセプターからの置換に基づくインビトロアッセイ等、該技術分野で公知の方法によって決定できる。ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、ニューロトロフィンファミリータンパクアナログ、単鎖アナログ、これらの誘導体及びフラグメントの生物活性もまた、ミュータントニューロトロフィンタンパクの機能を検出する当該分野で公知の各種バイオアッセイによって測定することができる。例えば、自己リン酸化研究、架橋研究及びリガンド結合研究は、当該分野で公知であり、本発明のミュータントニューロトロフィンファミリータンパク機能的態様を評価するために使用される。更に、試験細胞の集団において表現型の変更を誘導する、ミュータント及びワイルドタイプの活性を比較するバイオアッセイ。
【０５４３】
自己リン酸化
ミュータントニューロトロフィンタンパクが生物学的活性を示すか否かを測定するため、興味深いニューロトロフィンタンパクのレセプター分子を作成する。あるアッセイシステムにおいて、trkCのcDNAを生産させ、発現ベクター中でサブクローニングし、形質移入しNIH 3T3線維芽細胞中で安定に発現する、ここで細胞はあらゆるtrkファミリープロテインを正常に発現しない。形質移入したレセプターの発現は、その分野で知られた標準的な技術を用いて確認される。（Tsoulfas et al., Neuron, 10: 975-990 (1993)参照。）
形質移入処置に次いで、修飾されたNIH 3T3細胞の、本発明のミュータントニューロトロフィンタンパクに応答する能力について試験する。形質移入した線維芽細胞を、様々な量の精製、部分精製又は粗組み換えミュータントニューロトロフィンに継続的にさらし、結果を評価する。あるアッセイにおいて、濃度約0〜1000ng/mlの範囲にわたってミュータントNT-3タンパクは、試験細胞から生物学的応答を誘発するに十分な時間の間、trkC発現細胞系に適用される。ある試験において、この時間は概ね5分間である。ミュータントプロテインにさらし、次いで細胞を溶解し、全てのTrkファミリーレセプターの高度に保存されたC末端を認識する抗血清で溶菌液を免疫沈降させる。そのような抗体の一例はうさぎ抗血清443である。（Soppet, et al., Cell 1991 May 31 65:5 895-903参照）。ゲル電気泳動及びニトロセルロースへ転移の後、フィルターを、リン酸化チロシン残基の存在を検出するために他の抗体でプローブする。モノクローナル抗体4G10はそのようなリン酸化残基に特異なモノクローナル抗体である。（Kaplan et al., Tsoulfas et al. 参照。）。TrkCチロシン残基のリン酸化はレセプターの触媒作用的な活性を示し、試験したミュータントニューロトロフィンタンパクの機能性もまた示す。
【０５４４】
架橋アフィニティー
化学的な架橋実験は本発明の各種ミュータントニューロトロフィンタンパクとの結合親和性を測定することにより行われる。この技術の一例は、細胞系を発現するニューロトロフィンレセプターから単離した細胞膜の調製を包含する。これら膜を125I-標識化ニューロトロフィン（ミュータント又はワイルドタイプ形態のどちらか一方）とインキュベートし、次いでEDACのような化学的な架橋剤で処理する。次いで細胞膜に存在するニューロトロフィンレセプターを単離し、結合及び架橋したニューロトロフィンの存在を測定する。例えば、抗血清443は細胞溶液からTrkレセプターを免疫沈降するために使用され得る。次いで、免疫沈降した材料をポリアクリルアミドゲルに使用し、標準的な技術を用いてオートラジオグラフを作成する。標識化リガンドと結合及び架橋したレセプターのみがオートラジオグラフに検出されるであろう。該アッセイは、各々同族のレセプターと結合することが可能なミュータントニューロトロフィンタンパクを決定する簡便な方法を提供する。
【０５４５】
リガンド結合速度
放射標識化ミュータントニューロトロフィンタンパクを用いる平衡結合実験はニューロトロフィンレセプターを発現する細胞のリガンド結合速度を測定することにより行われる。そのような方法論の一例は、L1又はL3ループのどちらか一方あるいは両方におけるミューテイションを変える少なくとも一つの静電荷を含むミュータントNT-3プロテインのグループを利用する。これらプロテインは放射標識され、本研究においてリガンドである。
【０５４６】
ミュータントニューロトロフィンタンパクを、ここに記載の方法に従って調製及び精製する。ミュータントニューロトロフィンタンパクの精製された調製物を当分野でよく知られた標準的な技術に従って放射標識化する。図示するように、ミュータントニューロトロフィンタンパクを、エンチモビード（Enzymobead）放射ヨウ素標識試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）手順の改法を用いたラクトペルオキシダーゼ処理により125Iで標識化する。通常、2μg量のリガンドを、2500〜3500 cpm/fmolの比活性でヨウ素化する。125I-標識化因子を4℃で保存し、調製から2週間以内に使用する。ヨウ素化手順がリガンドに損傷を与えないことを確認するために結合の研究が行われるが、その前に、放射標識化ミュータントニューロトロフィンタンパクの生物活性はしばしばテストされる。
【０５４７】
行われた実験のあるシリーズは、ヨウ素化リガンドの固定濃度の利用及び膜調製を含む。これらの置換研究において、非標識化ワイルドタイプニューロトロフィンは、特定の濃度及び様々な濃度で、タンパクの結合特性に依存して、標識化ミュータントニューロトロフィンを置換する。半分の標識化プロテインが置換される濃度は、阻害定数又はIC50として知られている。ミュータントニューロトロフィンプロテインのIC50を計算し、ワイルドタイププロテインの値と比較することにより、本発明のミューテイションがミュータントリガンドプロテインによってレセプターとの親和性が増強される結果となることを確認することが可能である。
【０５４８】
このタイプの実験から集められたデータはスキャッチャードプロットの作成を可能にもし、これから、ミュータントニューロトロフィンプロテインの分離定数が測定され得る。さらに、この値はミュータントニューロトロフィンリガンドのそのレセプターに対する親和性を示し、測定された値は、ミューテイション又はミューテイション併用の価値を評価するために、ワイルドタイプの値と比較され得る。
【０５４９】
PC12細胞生物アッセイ
PC12細胞を、当分野でよく知られた標準的な技術を用いて、過渡的にニューロトロフィンレセプター発現ベクターで形質移入する。発現ベクターは、対象のワイルドタイプニューロトロフィンプロテインに対する活性でニューロトロフィンレセプターをコードする。このレセプターは、ワイルドタイププロテインのそれと比較してミュータントプロテインの生物学的活性に対する、対象のワイルドタイプニューロトロフィンタンパクのアミノ酸配列に導入された、有効ミューテイションを測定するために使用される。例えば、PC12バイオアッセイは、NGF分析（Patterson & Childs, Endocrinology, 135:1697-1704(1994)）；BDNF（Suter, et al., J. Neuroscience, 12:306-318(1992)）；NT-3（Tsoulfas, et al., Neuron, 10:975-990(1993)）；及びNT-4（Tsoulfas, et al., Neuron, 10:975-990(1993)）に適用される。
【０５５０】
ワイルドタイプ及びミュータントニューロトロフィンタンパク生物活性を比較して、PC12細胞は、コラーゲンコートディッシュで増殖され、緩やかな粉砕によりPC12増殖培地中に再懸濁され、10cmコラーゲンコートディッシュ上に10%〜20%密度で播種される。次の日、細胞をDMEMで4回洗浄し、5mlのDMEM、3μg/mlインシュリン、100μgのリポフェクチン（Lipofectin）（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）及び50μgのニューロトロフィン含有発現ベクターで洗浄する。8時間後にリポフェクチン混合物は新鮮なPC12培地で置き換えられる。次の日、細胞に、10ng/mlのニューロトロフィンミュータントプロテイン又はワイルドタイプタンパクを含み又は含まないPC12培地を与える。この処理の3日後、プレート上で、細胞直径長＞2である神経突起プロセスを示す細胞を計測する。計測は、＞1000ランダム1.2mm2視野をカウントすることにより行う。結果は、100/計測された視野数により乗算された神経突起関連細胞の数として報告される。神経突起誘導は、ミュータントタンパクとワイルドタイプニューロトロフィンたんぱくとの間で比較される。
【０５５１】
プロテインの半減期は、タンパク安定性の測定であり、タンパクの濃度が二分の一になるのに要する時間を示す。ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクの半減期は、ある期間にわたって被験体由来のサンプル中のニューロトロフィンファミリータンパクレベルを測定するあらゆる方法によって決定されうる。例えば、限定されないが、抗ニューロトロフィンファミリータンパク抗体を用いて、ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクの投与後の期間にサンプル中のミュータントニューロトロフィンファミリータンパクレベルを測定する免疫アッセイ又は放射標識化ミュータントニューロトロフィンファミリープロテインの投与後、被験体から採取したサンプル中の放射標識化ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクの検出である。
【０５５２】
他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０５５３】
診断的及び治療的使用
本発明は、本発明の治療化合物（ここでは"治療薬"（"Therapeutic"）という）の投与による各種疾患及び障害の治療又は予防を提供する。そのような治療薬は、ミュータントαサブユニット及びミュータント又はワイルドタイプβサブユニットの何れか一方を有するニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー；ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットを有し、全部又は一部がhLHのβサブユニットのCTEPのようなもう一つのCKGFタンパクと共有結合的に結合するニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー；ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットを有し、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニットは単鎖アナログを形成するために共有結合的に結合し、ミュータントαサブユニット及びミュータントβサブユニット並びにCKGFタンパク又はフラグメントは、単鎖アナログ、他の誘導体、アナログ及びそのフラグメント（すなわち、上記したように）並びに本発明のミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマーをコードする核酸及び誘導体、アナログ及びそのフラグメント中で共有結合的に結合するニューロトロフィンファミリープロテインヘテロダイマーを含む。
【０５５４】
治療薬が投与される被験体は、好適には動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含むがこれに限定されず、好適には哺乳類である。好適な例としては対象はヒトである。一般に、対象の種と同種を起源とする種の生産物の投与が好ましい。従って、好ましい例において、ヒトミュータント及び／又は修飾ニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー、誘導体若しくはアナログ、又は核酸は、ヒト患者に治療的又は予防的又は診断的に投与される。
【０５５５】
好ましい側面において、本発明の治療薬は実質的に精製されている。
【０５５６】
神経変性の疾患又は障害として明白な多くの障害が本発明の方法によって治療され得る。ニューロトロフィンファミリータンパクが通常又は所望のレベルと比較して欠乏又は減少する神経変性疾患は、本発明のミュータントニューロトロフィンファミリータンパクへテロダイマー又はニューロトロフィンファミリータンパクアナログの投与によって治療又は予防される。これら疾患又は障害の例はパーキンソン病及びアルツハイマー病を含む。ニューロトロフィンファミリータンパクレセプターが、通常レベルと比較して欠乏又は減少する、又は通常のニューロトロフィンファミリータンパクレセプターよりワイルドタイプニューロトロフィンファミリータンパクに対して非応答性若しくは低応答性である、障害もまたミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー又はニューロトロフィンファミリータンパクアナログの投与によって治療され得る。ミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー及びニューロトロフィンファミリータンパクアナログのアンタゴニストとしての使用は本発明によって意図される。
【０５５７】
具体例において、生物活性を持つミュータントニューロトロフィンファミリータンパクヘテロダイマー又はニューロトロフィンファミリータンパクアナログは、血管形成を促進するために、予防的を含めて治療的に投与される。例えば、VEGF、PDGF及びTGF-βは、全て内皮性の分裂促進因子である。血管形成が促進される状況において、増強された生物活性を有するミュータントPDGFファミリープロテインの施用は有利であろう。
【０５５８】
他の例において、PDGFファミリーレセプターアンタゴニストの施用は血管形成を阻害するであろう。血管形成阻害は、当業者が新規又は増強された血管新生を阻害したい条件では有用である。そのような状況の例は、次のものを含む：腫瘍、ここで腫瘍成長は血管形成活性の増強された速度に対応する；目のガラス体液に対する新血管新生である糖尿病性網膜症；長期月経出血；不妊症及び血管腫。
【０５５９】
ニューロトロフィンファミリータンパクタンパク又は機能、あるいはニューロトロフィンファミリータンパクレセプタータンパク及び機能の欠乏又は減少は、容易に、例えば患者組織サンプル（例えば、生検組織）を得ること及びそれをインビトロでRNA又はタンパクレベル、ニューロトロフィンファミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータンパクレセプターの発現したRNAまたはタンパクの構造及び／又は活性についてアッセイすることによって、検出され得る。このようにして、当分野で標準的な多くの方法は使用され得、ここで、ニューロトロフィンファミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータンパクレセプタータンパクを検出及び／又は可視化するための免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、後にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う免疫沈降、免疫細胞化学、その他）、及び／又はニューロトロフィンファミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータンパクレセプター発現を、ニューロトロフィンファミリータンパク又はニューロトロフィンファミリータンパクレセプターmRNAの検出及び／又は可視化によるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、その他）、その他が含まれるがこれらに限定されない。
【０５６０】
TGF-βタンパクファミリーのミュータント
上記のように、TGF-βタンパクファミリーはタンパクサブファミリーを多数を包含する。TGF-βタンパクファミリーのミュータントを以下に述べる。
ヒトトランスフォーミング成長因子β1モノマーのミュータント
ヒトトランスフォーミング成長因子β1モノマーは、図14(SEQ ID No: 13)に示されるように、112個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトトランスフォーミング成長因子β1モノマーのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトトランスフォーミング成長因子β1モノマーを意図している。
【０５６１】
本発明は図14(SEQ ID NO: 13)に表されているように、ミュータントトランスフォーミング成長因子β1モノマーに、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：Y21X、I22X、D23X、F24X、R25X、K26X、D27X、L28X、G29X、W30X、K31X、W32X、I33X、H34X、E35X、P36X、K37X、G38X、Y39X、及びH40X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０５６２】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、トランスフォーミング成長因子β1モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。トランスフォーミング成長因子β1モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D23B、D27B、及びE35B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５６３】
トランスフォーミング成長因子β1モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：R25Z、K26Z、K31Z、H34Z、K37Z、及びH40Z、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５６４】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD23U、R25U、K26U、D27U、K31U、H34U、E35U、K37U、及びH40Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５６５】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントトランスフォーミング成長因子β1モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y21Z、I22Z、F24Z、L28Z、G29Z、W30Z、W32Z、I33Z、P36Z、G38Z、Y39Z、Y21B、I22B、F24B、L28B、G29B、W30B、W32B、I33B、P36B、G38B、及びY39B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５６６】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントトランスフォーミング成長因子β1モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図14(SEQ ID NO: 13)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて82位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：A82X、L83X、E84X、P85X、L86X、P87X、I88X、V89X、Y90X、Y91X、V92X、G93X、R94X、K95X、P96X、K97X、V98X、E99X、Q100X、L101X、及びS102X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５６７】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をトランスフォーミング成長因子β1L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β1モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がトランスフォーミング成長因子β1モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E84B及びE99B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５６８】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をトランスフォーミング成長因子β1L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の82〜102の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R94Z、K95Z、及びK97Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５６９】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はE84U、R94U、K95U、K97U、及びE99Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５７０】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントトランスフォーミング成長因子β1タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、A82Z、L83Z、P85Z、L86Z、P87Z、I88Z、V89Z、Y90Z、Y91Z、V92Z、G93Z、P96Z、V98Z、Q100Z、L101Z、S102Z、A82B、L83B、P85B、L86B、P87B、I88B、V89B、Y90B、Y91B、V92B、G93B、P96B、V98B、Q100B、L101B、及びS102Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５７１】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、トランスフォーミング成長因子β1モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるトランスフォーミング成長因子β1モノマーのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、トランスフォーミング成長因子β1モノマーの1位〜20位、41位〜81位、及び103位〜112位からなる群から選択される位置で見出される。
【０５７２】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０５７３】
【化１０】
2003524381.tif 000013
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、トランスフォーミング成長因子β1のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントトランスフォーミング成長因子β1モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０５７４】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのトランスフォーミング成長因子β1モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したトランスフォーミング成長因子β1モノマーを含む。
【０５７５】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、TGF- レセプター結合、TGF- タンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプTGF- に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- より大きいアフィニティーを有するTGF- レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは、ワイルドタイプTGF- より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプTGF- より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントTGF- ヘテロダイマー及び単鎖TGF- アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５７６】
ヒトトランスフォーミング成長因子β2モノマーのミュータント
ヒトトランスフォーミング成長因子β2モノマーは、図15(SEQ ID No: 14)に示されるように、112個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトトランスフォーミング成長因子β2モノマーのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトトランスフォーミング成長因子β2モノマーを意図している。
【０５７７】
本発明は図15(SEQ ID NO: 14)に描かれているように、ミュータントトランスフォーミング成長因子β1モノマーに、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：Y21X、I22X、D23X、F24X、K25X、R26X、D27X、L28X、G29X、W30X、K31X、W32X、I33X、H34X、E35X、P36X、K37X、G38X、Y39X、及びN40X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０５７８】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β2モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。トランスフォーミング成長因子β2モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D23B、D27B、及びE35B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５７９】
トランスフォーミング成長因子β2モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：K25Z、R26Z、K31Z、H34Z、及びK37Z、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５８０】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD23U、K25U、R26U、D27U、K31U、H34U、E35U、及びK37Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５８１】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含む、ミュータントトランスフォーミング成長因子β2モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y21Z、I22Z、F24Z、L28Z、G29Z、W30Z、W32Z、I33Z、P36Z、G38Z、Y39Z、N40Z、Y21B、I22B、F24B、L28B、G29B、W30B、W32B、I33B、P36B、G38B、Y39B、及びN40B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５８２】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントトランスフォーミング成長因子β2モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図15(SEQ ID NO: 14)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて82位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換はD82X、L83X、E84X、P85X、L86X、T87X、I88X、L89X、Y90X、Y91X、I92X、G93X、K94X、T95X、P96X、K97X、I98X、E99X、Q100X、L101X、及びS102Xを含み、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５８３】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をトランスフォーミング成長因子β2L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β2モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がトランスフォーミング成長因子β2モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D82B、E84B、及びE99B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５８４】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をトランスフォーミング成長因子β1L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の82〜102の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K94Z及びK97Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５８５】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はD82U、E84U、K94U、K97U、及びE99Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５８６】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントトランスフォーミング成長因子β2タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L83Z、P85Z、L86Z、T87Z、I88Z、L89Z、Y90Z、Y91Z、I92Z、G93Z、T95Z、P96Z、I98Z、Q100Z、L101Z、S102Z、L83B、P85B、L86B、T87B、I88B、L89B、Y90B、Y91B、I92B、G93B、T95B、P96B、I98B、Q100B、L101B、及びS102Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５８７】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、トランスフォーミング成長因子β2モノマーも意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるトランスフォーミング成長因子β2モノマーのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、トランスフォーミング成長因子β2モノマーの1位〜20位、41位〜81位、及び103位〜112位からなる群から選択される位置で見出される。
【０５８８】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０５８９】
【化１１】
2003524381.tif 000014
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、トランスフォーミング成長因子β2のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントトランスフォーミング成長因子β2モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０５９０】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのトランスフォーミング成長因子β2モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したトランスフォーミング成長因子β2モノマーを含む。
【０５９１】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、TGF- レセプター結合、TGF- タンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のような、ワイルドタイプTGF- と関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- より大きいアフィニティーを有するTGF- レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは、ワイルドタイプTGF- より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプTGF- より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントTGF- ヘテロダイマー及び単鎖TGF- アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０５９２】
ヒトトランスフォーミング成長因子β3モノマーのミュータント
ヒトトランスフォーミング成長因子β3モノマーは、図16(SEQ ID No: 15)に示されるように、112個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトトランスフォーミング成長因子β3モノマーのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトトランスフォーミング成長因子β3モノマーを意図している。
【０５９３】
本発明は図16(SEQ ID No: 15)に表されているように、ミュータントトランスフォーミング成長因子β3モノマーに、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：Y21X、I22X、D23X、F24X、R25X、Q26X、D27X、L28X、G29X、W30X、K31X、W32X、V33X、H34X、E35X、P36X、K37X、G38X、Y39X、及びY40X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０５９４】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β3モノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。トランスフォーミング成長因子β3モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D23B、D27B、及びE35B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０５９５】
トランスフォーミング成長因子β3モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：R25Z、K31Z、H34Z、及びK37Z、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０５９６】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD23U、R25U、D27U、K31U、H34U、E35U、及びK37Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０５９７】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントトランスフォーミング成長因子β3モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y21Z、I22Z、F24Z、Q26Z、L28Z、G29Z、W30Z、W32Z、V33Z、P36Z、G38Z、Y39Z、Y40Z、Y21B、I22B、F24B、Q26B、L28B、G29B、W30B、W32B、V33B、P36B、G38B、Y39B、及びY40B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０５９８】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントトランスフォーミング成長因子β3モノマーについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図16(SEQ ID No: 15)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて82位〜102位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：D82X、L83X、E84X、P85X、L86X、T87X、I88X、L89X、Y90X、Y91X、V92X、G93X、R94X、T95X、P96X、K97X、V98X、E99X、Q100X、L101X、及びS102X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０５９９】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をトランスフォーミング成長因子β3L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、トランスフォーミング成長因子β3モノマーのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がトランスフォーミング成長因子β3モノマーに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D82B、E84B及びE99B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６００】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をトランスフォーミング成長因子β3L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の82〜102の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R94Z及びK97Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６０１】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はD82U、E84U、R94U、K97U、及びE99Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６０２】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントトランスフォーミング成長因子β1タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L83Z、P85Z、L86Z、T87Z、I88Z、L89Z、Y90Z、Y91Z、V92Z、G93Z、T95Z、P96Z、V98Z、Q100Z、L101Z、S102Z、L83B、P85B、L86B、T87B、I88B、L89B、Y90B、Y91B、V92B、G93B、T95B、P96B、V98B、Q100B、L101B、及びS102Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６０３】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、トランスフォーミング成長因子β3モノマーを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるトランスフォーミング成長因子β3モノマーのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、トランスフォーミング成長因子β3モノマーの1位〜20位、41位〜81位、及び103位〜112位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６０４】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０６０５】
【化１２】
2003524381.tif 000015
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、トランスフォーミング成長因子β1のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントトランスフォーミング成長因子β3モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６０６】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのトランスフォーミング成長因子β3モノマーについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したトランスフォーミング成長因子β3モノマーを含む。
【０６０７】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、TGF- レセプター結合、TGF- タンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプTGF- に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- より大きいアフィニティーを有するTGF- レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントTGF- ヘテロダイマー又は単鎖TGF- アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖TGF- アナログを含むミュータントTGF- ヘテロダイマーは、ワイルドタイプTGF- より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプTGF- より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントTGF- ヘテロダイマー及び単鎖TGF- アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６０８】
ヒトトランスフォーミング成長因子-β4 (TGF-β4)/ebafサブユニットのミュータント
ヒトトランスフォーミング成長因子-β4 (TGF-β4)/ebafサブユニットは、図17(SEQ ID No: 16)に示されるように、370個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、TGF- 4のミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントTGF- 4を意図している。
【０６０９】
本発明は図17(SEQ ID NO: 16)に表されているように、ミュータントTGF- 4に、Cys残基を除いて、境界を含めて267位〜287位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：Y267X、I268X、D269X、L270X、Q271X、G272X、M273X、K274X、W275X、A276X、K277X、N278X、W279X、V280X、L281X、E282X、P283X、P284X、G285X、F286X、及びL287X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０６１０】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、TGF- 4のL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。TGF- 4へ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D269B及びE282B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６１１】
TGF- 4配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：K274Z及びK277Z、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６１２】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD269U、K274U、K277U、及びE282Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６１３】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントTGF- 4タンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y267Z、I268Z、L270Z、Q271Z、G272Z、M273Z、W275Z、A276Z、N278Z、W279Z、V280Z、L281Z、P283Z、P284Z、G285Z、F286Z、L287Z、Y267B、I268B、L270B、Q271B、G272B、M273B、W275B、A276B、N278B、W279B、V280B、L281B、P283B、P284B、G285B、F286B、及びL287B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６１４】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントTGF- 4についても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図17(SEQ ID NO: 16)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて318位〜337位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：E318X、T319X、A320X、S321X、L322X、P323X、M324X、I325X、V326X、S327X、I328X、K329X、E330X、G331X、G332X、R333X、T334X、R335X、P336X、及びQ337X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０６１５】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をTGF- 4 L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、TGF- 4のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がTGF- 4に導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E318B及びE330B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６１６】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をTGF- 4 L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の318〜337の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K329Z、R333Z、及びR335Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６１７】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はE318U、K329U、E330U、R333U、及びR335Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６１８】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントTGF- 4タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、T319Z、A320Z、S321Z、L322Z、P323Z、M324Z、I325Z、V326Z、S327Z、I328Z、G331Z、G332Z、T334Z、R335Z、P336Z、Q337Z、T319B、A320B、S321B、L322B、P323B、M324B、I325B、V326B、S327B、I328B、G331B、G332B、T334B、R335B、P336B、及びQ337Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６１９】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、TGF- 4を意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるTGF- 4のβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、TGF- 4の1位〜266位、288位〜317位、及び338位〜370位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６２０】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０６２１】
【化１３】
2003524381.tif 000016
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、TGF- 4のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントTGF- 4を含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６２２】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのミュータントTGF- 4サブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したミュータントTGF- 4を含む。
【０６２３】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖TGF- 4サブユニットアナログを含むミュータントTGF- 4ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、TGF- 4レセプター結合、TGF- 4タンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプTGF- 4に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントTGF- 4ヘテロダイマー又は単鎖TGF- 4アナログは、好ましくはワイルドタイプTGF- 4より大きいアフィニティーを有するTGF- 4レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントTGF- 4ヘテロダイマー又は単鎖TGF- 4アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖TGF- 4アナログを含むミュータントTGF- 4ヘテロダイマーは、ワイルドタイプTGF- 4より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプTGF- 4より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントTGF- 4ヘテロダイマー及び単鎖TGF- 4アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６２４】
ヒトNeurturinのミュータント
ヒトNeurturinタンパクは、図18(SEQ ID No: 17)に示されるように、197個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトNeurturinタンパクのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトNeurturinタンパクを意図している。
【０６２５】
本発明は図18(SEQ ID NO: 17)に表されているように、ミュータントNeurturinタンパクに、Cys残基を除いて、境界を含めて104位〜129位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：G104X、L105X、R106X、E107X、L108X、E109X、V110X、R111X、V112X、S113X、E114X、L115X、G116X、L117X、G118X、Y119X、A120X、S121X、D122X、E123X、T124X、V125X、L126X、F127X、R128X、及びY129X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０６２６】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、NeurturinタンパクのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。Neurturinタンパクへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E107B、E109B、E114B、D122B、及びE123B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６２７】
Neurturinタンパク配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR106Z、R111Z、及びR128Zの1つ以上を含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６２８】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はR106U、E107U、E109U、R111U、E114U、D122U、E123U、及びR128Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６２９】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントNeurturinタンパクタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：G104Z、L105Z、L108Z、V110Z、V112Z、S113Z、L115Z、G116Z、L117Z、G118Z、Y119Z、A120Z、S121Z、T124Z、V125Z、L126Z、F127Z、Y129Z、G104B、L105B、L108B、V110B、V112B、S113B、L115B、G116B、L117B、G118B、Y119B、A120B、S121B、T124B、V125B、L126B、F127B、及びY129B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６３０】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントNeurturinタンパクについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図18(SEQ ID NO: 17)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて166位〜193位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：R166X、P167X、T168X、A169X、Y170X、E171X、D172X、E173X、V174X、S175X、F176X、L177X、D178X、A179X、H180X、S181X、R182X、Y183X、H184X、T185X、V186X、H187X、E188X、L189X、S190X、A191X、R192X、及びE193X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０６３１】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をNeurturinタンパクL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、NeurturinタンパクのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がNeurturinタンパクに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E171B、D172B、E173B、E188B、及びE193B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６３２】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をNeurturinタンパクL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の166〜3193の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R166Z、H180Z、R182Z、H184Z、H187Z、及びR192Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６３３】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はR166U、E171U、D172U、E173U、H180U、R182U、H184U、H187U、E188U、R192U、及びE193Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６３４】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントNeurturinタンパクタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、P167Z、T168Z、A169Z、Y170Z、V174Z、S175Z、F176Z、L177Z、A179Z、S181Z、Y183Z、T185Z、V186Z、L189Z、S190Z、A191Z、P167B、T168B、A169B、Y170B、V174B、S175B、F176B、L177B、A179B、S181B、Y183B、T185B、V186B、L189B、S190B、及びA191Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６３５】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、Neurturinタンパクを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるNeurturinタンパクのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、Neurturinタンパクの1位〜103位、130位〜165位、及び194位〜197位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６３６】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０６３７】
【化１４】
2003524381.tif 000017
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、NeurturinタンパクのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントNeurturinタンパクモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６３８】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのNeurturinタンパクについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したNeurturinタンパクを含む。
【０６３９】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖Neurturinタンパクアナログを含むミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、Neurturinタンパクレセプター結合、Neurturinタンパクタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプNeurturinタンパクに関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマー又は単鎖Neurturinタンパクアナログは、好ましくはワイルドタイプNeurturinタンパクより大きいアフィニティーを有するNeurturinタンパクレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマー又は単鎖Neurturinタンパクアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖Neurturinタンパクアナログを含むミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマーは、ワイルドタイプNeurturinタンパクより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプNeurturinタンパクより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントNeurturinタンパクヘテロダイマー及び単鎖Neurturinタンパクアナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６４０】
ヒトインヒビンAタンパクのミュータント
ヒトインヒビンAタンパクは、図19(SEQ ID No: 18)に示されるように、366個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトインヒビンAタンパクのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトインヒビンAタンパクを意図している。
【０６４１】
本発明は図19(SEQ ID NO: 18)に表されているように、ミュータントインヒビンAタンパクに、Cys残基を除いて、境界を含めて266位〜286位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：A266X、L267X、N268X、I269X、S270X、F271X、Q272X、E273X、L274X、G275X、W276X、E277X、R278X、W279X、I280X、V281X、Y282X、P283X、P284X、S285X、及びF286X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０６４２】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、インヒビンAタンパクのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。インヒビンAタンパクへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E273B及びE277B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６４３】
インヒビンAタンパク配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR278Z の1つ以上を含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６４４】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はE273U、E277U、及びR278Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６４５】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントインヒビンAタンパクタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：A266Z、L267Z、N268Z、I269Z、S270Z、F271Z、Q272Z、L274Z、G275Z、W276Z、W279Z、I280Z、V281Z、Y282Z、P283Z、P284Z、S285Z、F286Z、A266B、L267B、N268B、I269B、S270B、F271B、Q272B、L274B、G275B、W276B、W279B、I280B、V281B、Y282B、P283B、P284B、S285B、及びF286B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６４６】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントインヒビンAタンパクについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図19(SEQ ID NO: 18)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて332位〜359位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：P332X、G333X、T334X、M335X、R336X、P337X、L338X、H339X、V340X、R341X、T342X、T343X、S344X、D345X、G346X、G347X、Y348X、S349X、F350X、K351X、Y352X、E353X、T354X、V355X、P356X、N357X、L358X、及びL359X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０６４７】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をインヒビンAタンパクL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、インヒビンAタンパクのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がインヒビンAタンパクに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D345B及びE353B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６４８】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をインヒビンAタンパクL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の332〜359の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、R336Z、H339Z、R341Z、及びK351Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６４９】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はR336U、H339U、R341U、D345U、K351U、及びE353Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６５０】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントインヒビンAタンパクタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、P332Z、G333Z、T334Z、M335Z、P337Z、L338Z、V340Z、T342Z、T343Z、S344Z、G346Z、G347Z、Y348Z、S349Z、F350Z、Y352Z、T354Z、V355Z、P356Z、N357Z、L358Z、L359Z、P332B、G333B、T334B、M335B、P337B、L338B、V340B、T342B、T343B、S344B、G346B、G347B、Y348B、S349B、F350B、Y352B、T354B、V355B、P356B、N357B、L358B、及びL359Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６５１】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、インヒビンAタンパクを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるインヒビンAタンパクのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、インヒビンAタンパクの1位〜265位、287位〜331位、及び360位〜366位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６５２】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０６５３】
【化１５】
2003524381.tif 000018
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、インヒビンAタンパクのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントインヒビンAタンパクモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６５４】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのインヒビンAタンパクについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したインヒビンAタンパクを含む。
【０６５５】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖インヒビンAタンパクアナログを含むミュータントインヒビンAタンパクヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、インヒビンAタンパクレセプター結合、インヒビンAタンパクタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプインヒビンAタンパクに関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントインヒビンAタンパクヘテロダイマー又は単鎖インヒビンAタンパクアナログは、好ましくはワイルドタイプインヒビンAタンパクより大きいアフィニティーを有するインヒビンAタンパクレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントインヒビンAタンパクヘテロダイマー又は単鎖インヒビンAタンパクアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖インヒビンAタンパクアナログを含むミュータントインヒビンAタンパクヘテロダイマーは、ワイルドタイプインヒビンAタンパクより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプインヒビンAタンパクより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントインヒビンAタンパクヘテロダイマー及び単鎖インヒビンAタンパクアナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６５６】
ヒトインヒビンAサブユニットのミュータント
ヒトヒトインヒビンAサブユニットは、図20(SEQ ID No: 19)に示されるように、426個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトヒトインヒビンAサブユニットのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトヒトインヒビンAサブユニットを意図している。
【０６５７】
本発明は図20 (SEQ ID NO: 19)に表されているように、ミュータントヒトインヒビンAサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて326位〜346位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：F326X、F327X、V328X、S329X、F330X、K331X、D332X、I333X、G334X、W335X、N336X、D337X、W338X、I339X、I340X、A341X、P342X、S343X、G344X、Y345X、及びH346X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０６５８】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトインヒビンAサブユニットのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ヒトインヒビンAサブユニットへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D332B及びD337B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６５９】
ヒトインヒビンAサブユニット配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のK331Z及びH346Zの1つ以上を含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６６０】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はK331U、D332U、D337Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６６１】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトインヒビンAサブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、F326Z、F327Z、V328Z、S329Z、F330Z、I333Z、G334Z、W335Z、N336Z、W338Z、I339Z、I340Z、A341Z、P342Z、S343Z、G344Z、Y345Z、F326B、F327B、V328B、S329B、F330B、I333B、G334B、W335B、N336B、W338B、I339B、I340B、A341B、P342B、S343B、G344B、及びY345Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６６２】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトインヒビンAサブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図20 (SEQ ID NO: 19)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて395位〜419位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：K395X、L396X、R397X、P398X、M399X、S400X、M401X、L402X、Y403X、Y404X、D405X、D406X、G407X、Q408X、N409X、I410X、I411X、K412X、K413X、D414X、I415X、Q416X、N417X、M418X、及びI419X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０６６３】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をヒトインヒビンAサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ヒトインヒビンAサブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がヒトインヒビンAサブユニットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D405B、D406B、及びD414B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６６４】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトインヒビンAサブユニットL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の395〜419の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K395Z、R397Z、K412Z、及びK413Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６６５】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はK395U、R397U、D405、D406、K412U、K413U、及びD414Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６６６】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトインヒビンAサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L396Z、P398Z、M399Z、S400Z、M401Z、L402Z、Y403Z、Y404Z、G407Z、P408Z、N409Z、I410Z、I411Z、I415Z、Q416Z、N417Z、M418Z、I419Z、L396B、P398B、M399B、S400B、M401B、L402B、Y403B、Y404B、G407B、P408B、N409B、I410B、I411B、I415B、Q416B、N417B、M418B、及びI419Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６６７】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトインヒビンAサブユニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるヒトインヒビンAサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトインヒビンAサブユニットモノマーの1位〜325位、347位〜394位、及び420位〜426位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６６８】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０６６９】
【化１６】
2003524381.tif 000019
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトインヒビンAサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒトインヒビンAサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６７０】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトインヒビンAサブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したヒトインヒビンAサブユニットを含む。
【０６７１】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナログを含むミュータントヒトインヒビンAサブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトインヒビンAサブユニットレセプター結合、ヒトインヒビンAサブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプヒトインヒビンAサブユニットに関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントヒトインヒビンAサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプヒトインヒビンAサブユニットより大きいアフィニティーを有するヒトインヒビンAサブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントヒトインヒビンAサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナログを含むミュータントヒトインヒビンAサブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプヒトインヒビンAサブユニットより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプヒトインヒビンAサブユニットより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒトインヒビンAサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ヒトインヒビンAサブユニットアナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６７２】
ヒトヒトインヒビンBサブユニットのミュータント
ヒトヒトインヒビンBサブユニットは、図21(SEQ ID No: 20)に示されるように、407個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトヒトインヒビンBサブユニットのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトヒトインヒビンBサブユニットを意図している。
【０６７３】
本発明は図21 (SEQ ID NO: 20)に表されているように、ミュータントヒトインヒビンBサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて308位〜328位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：F308X、F309X、I310X、D311X、F312X、R313X、L314X、I315X、G316X、W317X、N318X、D319X、W320X、I321X、I322X、A323X、P324X、T325X、G326X、Y327X、及びY328X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０６７４】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトインヒビンBサブユニットのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ヒトインヒビンBサブユニットへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D311B及びD319B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６７５】
ヒトインヒビンBサブユニット配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次のR313Zの1つ以上を含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６７６】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD311U、R313U、及びD319Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６７７】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトインヒビンBサブユニットタンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：F308Z、F309Z、I310Z、F312Z、L314Z、I315Z、G316Z、W317Z、N318Z、W320Z、I321Z、I322Z、A323Z、P324Z、T325Z、G326Z、Y327Z、Y328Z、F308B、F309B、I310B、F312B、L314B、I315B、G316B、W317B、N318B、W320B、I321B、I322B、A323B、P324B、T325B、G326B、Y327B、及びY328B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６７８】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトインヒビンBサブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図21 (SEQ ID NO: 20)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて376位〜400位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：K376X、L377X、S378X、T379X、M380X、S381X、M382X、L383X、Y384X、F385X、D386X、D387X、E388X、Y389X、N390X、I391X、V392X、K393X、R394X、D395X、V396X、P397X、N398X、M399X、及びI400X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０６７９】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をヒトインヒビンＢサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ヒトインヒビンBサブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がヒトインヒビンBサブユニットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D386B、D387B、E388B、及びD395B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６８０】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトインヒビンBサブユニットL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の376〜400の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K376Z、K393Z、及びK394Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６８１】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はK376U、D386U、D387U、E388U、K393U、R394U、及びD395Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６８２】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトインヒビンBサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L377Z、S378Z、T379Z、M380Z、S381Z、M382Z、L383Z、Y384Z、F385Z、Y389Z、N390Z、I391Z、V392Z、V396Z、P397Z、N398Z、M399Z、I400Z、L377B、S378B、T379B、M380B、S381B、M382B、L383B、Y384B、F385B、Y389B、N390B、I391B、V392B、V396B、P397B、N398B、M399B、及びI400Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６８３】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトインヒビンBサブユニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるヒトインヒビンBサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトインヒビンBサブユニットモノマーの1位〜307位、329位〜375位、及び401位〜407位からなる群から選択される位置で見出される。
【０６８４】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０６８５】
【化１７】
2003524381.tif 000020
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトインヒビンBサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒトインヒビンBサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０６８６】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトインヒビンBサブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子モノマー又はそのようなモノマーのフラクションに結合したヒトインヒビンBサブユニットを含む。
【０６８７】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖ヒトインヒビンBアナログを含むミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトインヒビンBレセプター結合、ヒトインヒビンBタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプヒトインヒビンBに関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマー又は単鎖ヒトインヒビンBアナログは、好ましくはワイルドタイプヒトインヒビンBより大きいアフィニティーを有するヒトインヒビンBレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマー又は単鎖ヒトインヒビンBアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ヒトインヒビンBアナログを含むミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマーは、ワイルドタイプヒトインヒビンBより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプヒトインヒビンBより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒトインヒビンBヘテロダイマー及び単鎖ヒトインヒビンBアナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０６８８】
ヒトアクティビンAサブユニットのミュータント
ヒトアクティビンAサブユニットは、図22(SEQ ID No: 21)に示されるように、426個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトアクティビンAサブユニットのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトアクティビンAサブユニットを意図している。
【０６８９】
本発明は図22(SEQ ID NO: 21)に表されているように、ミュータントヒトアクティビンAサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて326位〜346位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：F326X、F327X、V328X、S329X、F330X、K331X、D332X、I333X、G334X、W335X、N336X、D337X、W338X、I339X、I340X、A341X、P342X、S343X、G344X、Y345X、及びH346X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０６９０】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトアクティビンAサブユニットモノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ヒトアクティビンAサブユニットモノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：K331B及びH346B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６９１】
ヒトアクティビンAサブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：D332Z及びD337Z、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６９２】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はK331U、D332U、D337U、及びH346Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６９３】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトアクティビンAサブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：F326Z、F327Z、V328Z、S329Z、F330Z、I333Z、G334Z、W335Z、N336Z、W338Z、I339Z、I340Z、A341Z、P342Z、S343Z、G344Z、Y345Z、F326B、F327B、V328B、S329B、F330B、I333B、G334B、W335B、N336B、W338B、I339B、I340B、A341B、P342B、S343B、G344B、及びY345B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６９４】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトアクティビンAサブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図22(SEQ ID NO: 21)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて395位〜419位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：K395X、L396X、R397X、P398X、M399X、S400X、M401X、L402X、Y403X、Y404X、D405X、D406X、G407X、Q408X、N409X、I410X、I411X、K412X、K413X、D414X、I415X、Q416X、N417X、M418X、及びI419X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０６９５】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をヒトアクティビンAサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ヒトアクティビンAサブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がヒトアクティビンAサブユニットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D405B、D406B、及びD414B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０６９６】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトアクティビンAサブユニットL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の395〜419の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K395Z、R397Z、K412Z、及びK413Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０６９７】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はK395U、R397U、D405U、D406U、K412U、K413U、及びD414Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０６９８】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトアクティビンAサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L396Z、P398Z、M399Z、S400Z、M401Z、L402Z、Y403Z、Y404Z、G407Z、Q408Z、N409Z、I410Z、I411Z、I415Z、Q416Z、N417Z、M418Z、I419Z、L396B、P398B、M399B、S400B、M401B、L402B、Y403B、Y404B、G407B、Q408B、N409B、I410B、I411B、I415B、Q416B、N417B、M418B、及びI419Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０６９９】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトアクティビンAサブユニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるヒトアクティビンAサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトアクティビンAサブユニットモノマーの1位〜325位、347位〜394位、及び420位〜426位からなる群から選択される位置で見出される。
【０７００】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０７０１】
【化１８】
2003524381.tif 000021
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトアクティビンAサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒトアクティビンAサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０７０２】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトアクティビンAサブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したヒトアクティビンAサブユニットを含む。
【０７０３】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖ヒトアクティビンAサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトアクティビンAサブユニットレセプター結合、ヒトアクティビンAサブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプヒトアクティビンAサブユニットに関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトアクティビンAサブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプヒトアクティビンAサブユニットより大きいアフィニティーを有するヒトアクティビンAサブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトアクティビンAサブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ヒトアクティビンAサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプヒトアクティビンAサブユニットより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプヒトアクティビンAサブユニットより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒトアクティビンAサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ヒトアクティビンAサブユニットアナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７０４】
ヒトアクティビンBサブユニットのミュータント
ヒトアクティビンBサブユニットは、図23(SEQ ID No: 22)に示されるように、407個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ヒトアクティビンBサブユニットのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントヒトアクティビンBサブユニットを意図している。
【０７０５】
本発明は図23(SEQ ID NO: 22)に表されているように、ミュータントヒトアクティビンBサブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて308位〜328位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：F308X、F309X、I310X、D311X、F312X、R313X、L314X、I315X、G316X、W317X、N318X、D319X、W320X、I321X、I322X、A323X、P324X、T325X、G326X、Y327X、及びY328X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０７０６】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ヒトアクティビンBサブユニットモノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ヒトアクティビンBサブユニットモノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D311B及びD319B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０７０７】
ヒトアクティビンBサブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、R313Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０７０８】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD311U、R313U、及びD319Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０７０９】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトアクティビンBサブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：F308Z、F309Z、I310Z、F312Z、L314Z、I315Z、G316Z、W317Z、N318Z、W320Z、I321Z、I322Z、A323Z、P324Z、T325Z、G326Z、Y327Z、Y328Z、F308B、F309B、I310B、F312B、L314B、I315B、G316B、W317B、N318B、W320B、I321B、I322B、A323B、P324B、T325B、G326B、Y327B、及びY328B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０７１０】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントヒトアクティビンBサブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図23(SEQ ID NO: 22)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて376位〜400位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：K376X、L377X、S378X、T379X、M380X、S381X、M382X、L383X、Y384X、F385X、D386X、D387X、E388X、Y389X、N390X、I391X、V392X、K393X、R394X、D395X、V396X、P397X、N398X、M399X、及びI400X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７１１】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をヒトアクティビンBサブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ヒトアクティビンBサブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がヒトアクティビンBサブユニットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D386B、D387B、E388B、及びD395B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０７１２】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をヒトアクティビンBサブユニットL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の376〜400の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K376Z、K393Z、及びR394Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０７１３】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はK376U、D386U、D387U、E388U、K393U、R394U、及びD395Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０７１４】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントヒトアクティビンBサブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L377Z、S378Z、T279Z、M380Z、S381Z、M382Z、L383Z、Y384Z、F385Z、Y389Z、N390Z、I391Z、V392Z、V396Z、P397Z、N398Z、M399Z、I400Z、L377B、S378B、T279B、M380B、S381B、M382B、L383B、Y384B、F385B、Y389B、N390B、I391B、V392B、V396B、P397B、N398B、M399B、及びI400Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０７１５】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ヒトアクティビンBサブユニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるヒトアクティビンBサブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ヒトアクティビンBサブユニットモノマーの1位〜307位、329位〜375位、及び401位〜407位からなる群から選択される位置で見出される。
【０７１６】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０７１７】
【化１９】
2003524381.tif 000022
を含み、ここでJは、前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリータンパクの前記βヘアピン構造及び前記ヒトトランスフォーミング成長因子ファミリータンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を結果として増加させるあらゆるアミノ酸である。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ヒトアクティビンBサブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントヒトアクティビンBサブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０７１８】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのヒトアクティビンBサブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したヒトアクティビンBサブユニットを含む。
【０７１９】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖ヒトアクティビンBサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ヒトアクティビンBサブユニットレセプター結合、ヒトアクティビンBサブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプヒトアクティビンBサブユニットに関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトアクティビンBサブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプヒトアクティビンBサブユニットより大きいアフィニティーを有するヒトアクティビンBサブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマー又は単鎖ヒトアクティビンBサブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ヒトアクティビンBサブユニットアナログを含むミュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプヒトアクティビンBサブユニットより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプヒトアクティビンBサブユニットより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントヒトアクティビンBサブユニットヘテロダイマー及び単鎖ヒトアクティビンBサブユニットアナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７２０】
ミュラー阻害物質のミュータント
ミュラー阻害物質は、図24(SEQ ID No: 23)に示されるように、560個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、ミュラー阻害物質のミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントミュラー阻害物質を意図している。
【０７２１】
本発明は図24(SEQ ID NO: 23)に表されているように、ミュータントミュラー阻害物質に、Cys残基を除いて、境界を含めて21位〜40位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：R465X、E466X、L467X、S468X、V469X、D470X、L471X、R472X、A473X、E474X、R475X、S476X、V477X、L478X、I479X、P480X、E481X、T482X、Y483X、及び484X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０７２２】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、ミュラー阻害物質モノマー(substancemonomer)のL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。ミュラー阻害物質モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E466B、D470B、E474B、及びE481B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０７２３】
ミュラー阻害物質モノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：R465、R472、及びR475、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０７２４】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はR465U、E466U、D470U、R472U、E474U、R475U、及びE481Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０７２５】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントミュラー阻害物質モノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：L467Z、S468Z、V469Z、L471Z、A473Z、S476Z、V477Z、L478Z、I479Z、P480Z、T482Z、Y483Z、Q484Z、L467B、S468B、V469B、L471B、A473B、S476B、V477B、L478B、I479B、P480B、T482B、Y483B、及びQ484B、ここで "Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０７２６】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントミュラー阻害物質についても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図24(SEQ ID NO: 23)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて530位〜553位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：A530X、Y531X、A532X、G533X、K534X、L535X、L536X、I537X、S538X、L539X、S540X、E541X、E542X、R543X、I544X、S545X、A546X、H547X、H548X、V549X、P550X、N551X、M552X、及びV553X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７２７】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をミュラー阻害物質L3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、ミュラー阻害物質のL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がミュラー阻害物質に導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E541B及びE542B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０７２８】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をミュラー阻害物質L3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の530〜553の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K534Z、R543Z、H547Z、及びH548Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０７２９】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はK534U、E541U、E542U、R543U、H547U、及びH548Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０７３０】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントミュラー阻害物質タンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、A530Z、Y531Z、A532Z、G533Z、L535Z、L536Z、I537Z、S538Z、L539Z、S540Z、I544Z、S545Z、A546Z、V549Z、P550Z、N551Z、M552Z、V553Z、A530B、Y531B、A532B、G533B、L535B、L536B、I537B、S538B、L539B、S540B、I544B、S545B、A546B、V549B、P550B、N551B、M552B、及びV553Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０７３１】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、ミュラー阻害物質を意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるミュラー阻害物質のβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、ミュラー阻害物質モノマーの1位〜464位、485位〜529位、及び554位〜560位からなる群から選択される位置で見出される。
【０７３２】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０７３３】
【化２０】
2003524381.tif 000023
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、ミュラー阻害物質のL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントミュラー阻害物質モノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０７３４】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのミュラー阻害物質についても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したミュラー阻害物質を含む。
【０７３５】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖ミュラー阻害物質アナログを含むミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、ミュラー阻害物質レセプター結合、ミュラー阻害物質タンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプミュラー阻害物質に関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマー又は単鎖ミュラー阻害物質アナログは、好ましくはワイルドタイプミュラー阻害物質より大きいアフィニティーを有するミュラー阻害物質レセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマー又は単鎖ミュラー阻害物質アナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖ミュラー阻害物質アナログを含むミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマーは、ワイルドタイプミュラー阻害物質より大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプミュラー阻害物質より長い血清半減期を有する。本発明のミュータントミュラー阻害物質ヘテロダイマー及び単鎖ミュラー阻害物質アナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７３６】
ヒト骨形態形成タンパク-2 (BMP-2)サブユニットのミュータント
ヒト骨形態形成タンパク-2 (BMP-2)サブユニットは、図25(SEQ ID No: 24)に示されるように、396個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較した時、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、BMP-2サブユニットのミュータントを意図している。さらに、本発明はもう1つのCKGFタンパクに結合したミュータントBMP-2サブユニットを意図している。
【０７３７】
本発明は図25(SEQ ID NO: 24)に表されているように、ミュータントBMP-2サブユニットに、Cys残基を除いて、境界を含めて302位〜321位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するL1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：Y302X、V303X、D304X、F305X、S306X、D307X、V308X、G309X、W310X、N311X、D312X、W313X、I314X、V315X、A316X、P317X、P318X、G319X、Y320X、及びH321X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０７３８】
本発明の突然変異誘発プログラム(regime)の具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-2サブユニットモノマーのL1ループに塩基性残基を導入する時、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応するだろう。BMP-2サブユニットモノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：D304B、D307B、及びD312B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０７３９】
BMP-2サブユニットモノマー配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた熟考される。この具体例において、可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：H321Z、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０７４０】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はD304U、D307U、D312U、及びH321Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０７４１】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える、1つ以上の静電荷を含むミュータントBMP-2サブユニットモノマータンパクが提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は次を含む：Y302Z、V303Z、F305Z、S306Z、V308Z、G309Z、W310Z、N311Z、W313Z、I314Z、V315Z、A316Z、P317Z、P318Z、G319Z、Y320Z、Y302B、V303B、F305B、S306B、V308B、G309B、W310B、N311B、W313B、I314B、V315B、A316B、P317B、P318B、G319B、及びY320B、ここで"Z"は酸性アミノ酸、及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０７４２】
L3ヘアピンループにおけるミュータントを含むミュータントBMP-2サブユニットについても述べられる。これらのミュータントタンパクは、図25(SEQ ID NO: 24)に描かれているように、Cys残基を除いて、L3ヘアピンループの境界を含めて365位〜389位間に、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。該アミノ酸置換は次を含む：E365X、L366X、S367X、A368X、I369X、S370X、M371X、L372X、Y373X、L374X、D375X、E376X、N377X、E378X、K379X、V380X、V381X、L382X、K383X、N384X、Y385X、Q386X、D387X、M388X、及びV389X、ここで"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換はL3ループの静電特性を変える。
【０７４３】
L3ヘアピンループのミューテイションの1セットは、1つ以上の塩基性アミノ酸残基をBMP-2サブユニットL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入することを含む。例えば、BMP-2サブユニットのL3ループに塩基性残基を導入する時、上記の配列の可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に対応する。塩基性残基がBMP-2サブユニットに導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は次の1つ以上を含む：E365B、D375B、E376B、E378B、及びD387、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０７４４】
本発明はさらに、1つ以上の酸性残基をBMP-2サブユニットL3ヘアピンループのアミノ酸配列に導入することを意図している。例えば、1つ以上の酸性アミノ酸は上記の365〜389の配列に導入されることができ、ここで可変の"X"は酸性アミノ酸に対応する。そのようなミューテイションの具体例は、K379Z及びK383Zを含み、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０７４５】
本発明はまた、L3ヘアピンループにおける正又は負の静電荷を、この範囲において電荷を帯びた残基を中性残基に変えることによって、減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に対応する上記のL3ヘアピンループアミノ酸配列に導入されることができる。例えば、1つ以上の中性残基はE365U、D375U、E376U、E378U、K379U、K383U及びD387Uで導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０７４６】
非電荷つまり中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L3ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える1つ以上の静電荷を含むミュータントBMP-2サブユニットタンパクは提供される。中性アミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変えるミューテイションの例は、L366Z、S367Z、A368Z、I369Z、S370Z、M371Z、L372Z、Y373Z、L374Z、N377Z、V380Z、V381Z、L382Z、N384Z、Y385Z、Q386Z、M388Z、V389Z、L366B、S367B、A368B、I369B、S370B、M371B、L372B、Y373B、L374B、N377B、V380B、V381B、L382B、N384B、Y385B、Q386B、M388B、及びV389Bを含み、ここで、"Z"は酸性アミノ酸及び"B"は塩基性アミノ酸である。
【０７４７】
本発明はまた、βヘアピンループ構造の他に、それらのヘアピンループの構造又はコンフォメーションを変えるミューテイションを含む、BMP-2サブユニットを意図している。これらの構造的変化は、言いかえると、二量体分子に含まれるBMP-2サブユニットのβヘアピンループ構造の範囲、及び、二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用を増加させるように働く。これらのミューテイションは、BMP-2サブユニットモノマーの1〜301、322〜364、及び390〜396からなる群から選択される位置で見出される。
【０７４８】
βヘアピンL1及びL3ループ構造の他に、これらのミューテイションの具体例は、
【０７４９】
【化２１】
2003524381.tif 000024
を含む。可変の"J"はあらゆるアミノ酸であり、その導入の結果、BMP-2サブユニットのL1及びL3βヘアピンループ構造、及びミュータントBMP-2サブユニットモノマーを含む二量体タンパクに対するアフィニティーを有するレセプター間の静電相互作用が増加する。
【０７５０】
本発明はまた、モディファイされた形態における多くのBMP-2サブユニットについても意図している。これらのモディファイされた形態は、もう1つのシスチンノット成長因子又はそのようなモノマーのフラクションに結合したBMP-2サブユニットを含む。
【０７５１】
具体例において、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は上記のような単鎖BMP-2サブユニットアナログを含むミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマーは機能上活性であり、すなわち、BMP-2サブユニットレセプター結合、BMP-2サブユニットタンパクファミリーレセプターシグナル、及び細胞外分泌のようなワイルドタイプBMP-2サブユニットに関連する、1つ以上の機能的活性を示すことができる。好ましくは、ミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマー又は単鎖BMP-2サブユニットアナログは、好ましくはワイルドタイプBMP-2サブユニットより大きいアフィニティーを有するBMP-2サブユニットレセプターに結合することができる。また、そのようなミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマー又は単鎖BMP-2サブユニットアナログがシグナル伝達を引き起こすことも好ましい。最も好ましくは、本発明の、少なくとも1つのミュータントサブユニット又は単鎖BMP-2サブユニットアナログを含むミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマーは、ワイルドタイプBMP-2サブユニットより大きいインビトロ生物活性及び/又はインビボ生物活性を有し、ワイルドタイプBMP-2サブユニットより長い血清半減期を有する。本発明のミュータントBMP-2サブユニットヘテロダイマー及び単鎖BMP-2サブユニットアナログは、該技術において知られている処置により、望まれる活性に対してテストされることができる。
【０７５２】
ヒト骨形態形成タンパク-3(BMP-3)サブユニットのミュータント
ヒト骨形態形成タンパク-3(BMP-3)サブユニットは、図26(SEQ ID No: 25)に示されるように、472個のアミノ酸を含んでいる。本発明は、ワイルドタイプモノマーと比較したとき、1、2、3、4、又はより多いアミノ酸残基の1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、BMP-3のミュータントを意図している。さらに、本発明は、もう一つのCKGFタンパクに結合したミュータントBMP-3を意図している。
【０７５３】
本発明は、図26(SEQ ID NO: 25)に表されているように、Cys残基を除いて、境界を含めて373位〜395位間に、1つ以上のアミノ酸置換を有するミュータントBMP-3L1ヘアピンループを提供する。該アミノ酸置換は次を含む：R373, Y374X, L375X, K376X, V377X, D378X, F379X, A380X, D381X, I382X, G383X, W384X, S385X, E386X, I387X, I388X, S389X, P390X, K391X, S392X, F393X, 及びD394X。"X"はあらゆるアミノ酸残基であり、その置換でヘアピンループの静電特性を変える。
【０７５４】
本発明の突然変異誘発プログラムの具体例は、酸性残基が存在する塩基性アミノ酸残基の導入を含む。例えば、酸性残基が存在する、BMP-3モノマーのL1ループに塩基性残基を導入するとき、可変の"X"は塩基性アミノ酸残基に相当するだろう。BMP-3モノマーへ塩基性残基が導入されるミューテイションを変える静電荷の具体例は、次の1つ以上を含む：D378B、D381B、E386B、及びD395B、ここで"B"は塩基性アミノ酸残基である。
【０７５５】
BMP-3配列に塩基性残基が存在する酸性アミノ酸残基を導入することもまた意図している。この態様において、可変の"X"は酸性アミノ酸に相当する。これらのアミノ酸の導入は、L1ヘアピンループの静電特性をより負の状態へ変えるように働く。そのようなアミノ酸置換の例は、次の1つ以上を含む：R373Z、K376Z、及びK392Z、ここで"Z"は酸性アミノ酸残基である。
【０７５６】
本発明はまた、電荷を帯びた残基を中性残基に変化させることによって、L1ヘアピンループにおける正又は負の電荷を減らすことについても意図している。例えば、1つ以上の中性アミノ酸は、可変の"X"が中性アミノ酸に相当する上記のL1配列に導入されることができる。もう1つの例において、1つ以上の中性残基はR373U、K376U、D378U、D381U、E386U、K392U、及びD395Uにおいて導入されることができ、ここで"U"は中性アミノ酸である。
【０７５７】
非電荷又は中性のアミノ酸残基を電荷を帯びた残基に変える、L1ヘアピンループアミノ酸配列におけるミューテイションを変える胣ㆁ臣ꖻ룤꺁鷩뮛跨銂郥肂菣ꖃ菣뾂菣袃䵂ⵐꊃ菣麃菣뾂菣醃苣貁迦鮾臣貂苣芀룤Ꞁ苣龃菣뢅껦몟苣뮛跨銂룥뎁臣议鿥ꮁꓥ袁苣龃菣벃菣ꒂ苣ꞃ菣꺁뻤꾁곦銂郥肂볯妚㜳娴‬㍌㔷ⱚ嘠㜳娷‬㍆㤷ⱚ䄠㠳娰‬㍉㈸ⱚ䜠㠳娳‬㍗㐸ⱚ匠㠳娵‬㍗㜸ⱚ䤠㠳娸‬㍉㤸ⱚ匠㤳娰‬㍐ㄹⱚ匠㤳娳‬㍆㐹ⱚ夠㜳䈴‬㍌㔷ⱂ嘠㜳䈷‬㍆㤷ⱂ䄠㠳䈰‬㍉㈸ⱂ䜠㠳䈳‬㍗㐸ⱂ匠㠳䈵‬㍗㜸ⱂ䤠㠳䈸‬㍉㤸ⱂ匠㤳䈰‬㍐ㄹⱂ匠㤳䈳‬迥뎁䘠㤳䈴胣鎁臣ꞁ胣⊁≚臣뢅胦ꊂ菣躃藩膀迥뎁䈢꾁ꇥ몟胦ꊂ菣躃藩ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯閼볯醀戼㹲 䰠颃苣钃菣ꮃ菣鞃臣誁臣讂菣ꖃ菣뾂菣袃苣ꮐ苣龃菣벃苣뎃菣䊈偍㌭臣ꒁ臣ꚁ苣낿臣讂胣鎁苣覂臣龃菣벃苣뎃菣뾂菣醃苣꾁胣뎛㘲匨充䤠⁄低›㔲ꮁ迦讁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀祃议鿥銂駩蒁臣膀㍌菣ꊂ菣뎃菣벃菣꺁ꋥ貕苣ꮐ苣ꚁ㐴趽胣㒜㔶뷤鎖臣膀ꒁ믤誸臣ꊂ菣躃藩꺁뷧鮏胣㲁⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢곦놤⼼㹵迥꾁賦ꖅ苣覜臣讂胣늩苣龃菣뢅뷧鮏臣ꆬ苣ꮐ苣骼㑋ㄴⱘ䴠㐴堲‬㑓㌴ⱘ匠㐴場‬㑌㔴ⱘ匠㐴堶‬㑉㜴ⱘ䰠㐴堸‬㑆㤴ⱘ䘠㔴堰‬㑄ㄵⱘ䔠㔴堲‬㑎㌵ⱘ䬠㔴場‬㑎㔵ⱘ嘠㔴堶‬㑖㜵ⱘ䰠㔴堸‬㑋㤵ⱘ嘠㘴堰‬㑙ㄶⱘ倠㘴堲‬㑎㌶ⱘ䴠㘴場‬迥뎁吠㘴堵胣鎁臣ꞁ堢꾁臣覂苣讂苣龃菣뢅껦몟臣芁苣膀臣꺁뷧鮏臣䲯ꮃ菣鞃臣馝鯩릉胦銂ꓥ袁苣芀戼㹲邀볯鞼볯馼胣㲑牢ਾ†㍌菣ꊂ菣뎃菣벃菣꺁菣ꖃ菣蚃苣랂菣뎃臣ㆮ苣莃菣꾁胣ㆁ臣ꖻ룤꺁ꇥ몟胦ꊂ菣躃藩议鿥銂䵂ⵐ䰳颃苣钃菣ꮃ菣鞃苣龃菣뢅藩鞈臣躰藥馁苣鎁臣銂郥肂胣设臣낁胣䊁偍㌭臣䲮ꮃ菣鞃臣ꦡ鿥Ꞁ껦몟苣躰藥馁苣ꢁ臣膀룤風藩鞈臣꾏ꓥ꺁堢꾁ꇥ몟胦ꊂ菣躃藩议鿥ꮁ鯧鎽臣讂胣ꦡ鿥Ꞁ껦몟臣䊌偍㌭臣躰藥閁苣讂菣ꖃ菣蚃苣랂菣뎃苣覤臣讂鷩뮛跨꺁藥鎽뻤꾁곦꺁ꒁ믤誸苣ꮐ苣骼㑄ㄵ誏臣䖳㔴䈲胣鎁臣ꞁ䈢꾁ꇥ몟胦ꊂ菣躃藩议鿥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲 겜駧躘臣閁苣ꮁ胣ㆁ臣ꖻ룤꺁藩Ꞁ껦몟苣䊒偍㌭㍌菣ꊂ菣뎃菣벃菣꺁苣龃菣뢅藩鞈臣躰藥馁苣鎁臣銂蓦뎛臣ꚁ臣讂胣设臣낁胣ㆁ臣ꖻ룤꺁藩Ꞁ苣龃菣뢅臣誸꣨꺁㐴鲀㘴趽臣超裥ꮁ냥ꖅ臣貂苣鎁臣貁臣趁胣鎁臣ꞁ迥覤臣⊮≘臣뢅胦ꊂ菣躃藩ꮁ鯧鎽臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ菣ꖃ菣蚃苣랂菣뎃臣랅뷤设臣膀㑋ㄴ膀㑋㐵誏臣䮳㔴娹苣ꮐ臣膀臣鎁臣⊧≚臣뢅胦ꊂ菣躃藩议鿥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲 겜駧躘臣뺁臣膀㍌菣ꊂ菣뎃菣벃菣ꮁ臣醁苣ꎭ迥꾁단꺁鷩뮛跨銂胣鎁臣颠鿥ꮁ臣蒁臣뮛跨銂룥뎁臣议鿥銂룤Ꞁ껦몟臣覤臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣鮸苣馁臣ꢁ臣ꒁ臣ꚁ苣���鯥鞁臣蒁苣芀뻤袁臣膀ꒁ믤誸臣궸胦ꊂ菣躃藩꾁胣꾏ꓥ꺁堢貁룤Ꞁ苣龃菣뢅臣뢛뷥馁苣誸꣨꺁㍌菣ꊂ菣뎃菣벃菣ꊂ菣躃藩超裥ꮁ냥ꖅ臣貂苣鎁臣貁臣趁苣芀뻤袁臣膀ꒁ믤誸臣궸胦议鿥꾁胣䮁㐴唱胣䒁㔴唱胣䖁㔴唲胣䮁㔴唴胣誏臣䮳㔴唹臣躰藥閁苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣鎁臣⊧≕臣궸胦ꊂ菣躃藩ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲 麝鯩랍迥꾁룤Ꞁ臣ꊂ菣躃藩议鿥銂鯩랍苣꾸臣龁껦몟臣覤臣讂胣䲁颃苣钃菣ꮃ菣鞃苣龃菣뢅藩鞈臣誁臣讂菣ꖃ菣蚃苣랂菣뎃苣覤臣讂ꒁ믤誸臣馝鯩랍苣ꮐ苣龃菣벃苣뎃菣䊈偍㌭苣뎃菣꾂臣邏뻤閁苣讂胣궸胦ꊂ菣躃藩议鿥銂鯩랍苣꾸臣龁껦몟臣覤臣讂菣ꖃ菣蚃苣랂菣뎃臣设臣膀㑍㈴ⱚ匠㐴娳‬㑓㐴ⱚ䰠㐴娵‬㑓㘴ⱚ䤠㐴娷‬㑌㠴ⱚ䘠㐴娹‬㑆〵ⱚ丠㔴娳‬㑎㔵ⱚ嘠㔴娶‬㑖㜵ⱚ䰠㔴娸‬㑖〶ⱚ夠㘴娱‬㑐㈶ⱚ丠㘴娳‬㑍㐶ⱚ吠㘴娵‬㑍㈴ⱂ匠㐴䈳‬㑓㐴ⱂ䰠㐴䈵‬㑓㘴ⱂ䤠㐴䈷‬㑌㠴ⱂ䘠㐴䈹‬㑆〵ⱂ丠㔴䈳‬㑎㔵ⱂ嘠㔴䈶‬㑖㜵ⱂ䰠㔴䈸‬㑖〶ⱂ夠㘴䈱‬㑐㈶ⱂ丠㘴䈳‬㑍㐶ⱂ迥뎁吠㘴䈵苣ꮐ臣膀臣鎁臣膀娢꾁藩Ꞁ苣龃菣뢅迥뎁䈢꾁ꇥ몟胦ꊂ菣躃藩ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲 겜駧躘臣뺁臣膀닎菣ꊂ菣뎃菣벃菣讧胩꺁믤ꮁ胣鶁苣覂臣颃苣钃菣ꮃ菣鞃臣讧胩袏臣뎂菣閃苣ꆃ菣랂菣뎃苣覤臣讂菣ꖃ菣蚃苣랂菣뎃苣ꮐ苣膀䵂ⵐ銂蓦뎛臣ꚁ臣讂胣鎁苣覂臣讧胩蒚ꓥ隌臣膀꣨蒁臣袁苣ꢁ胣貺蟩鎽裥邭臣ꮐ臣貂苣䊋偍㌭臣캮颃苣钃菣ꮃ菣鞃꟦ꂀ臣颠鿥ꢁ胣貺蟩鎽苣뎃菣꾂臣뺯臣讂苣閃苣讃菣ꎂ菣銂鳦馁苣것苣鞃苣벃臣꺁雩꺁鷩뮛鯧銺뷤ꢔ苣鞢諥閁臣讂苣蚁臣趃臣芀臣貂苣꺁菣ꖃ菣蚃苣랂菣뎃臣膀䵂ⵐ꺁趽胣㎜㈷뷤膀㤳趽胣㒜〴뷤膀迥뎁㘴趽胣㒜㈷뷤讁苣ꪁ苣꒾臣覂臩麊臣貂苣趽뷧ꞁꛨ몇臣貂苣芀戼㹲邀볯鞼볯钼胣㲑牢ਾ†닎菣ꊂ菣뎃ㅌ迥뎁㍌菣벃菣讧胩꺁믤ꮁ胣鎁苣覂臣龃菣벃菣ꒂ苣ꞃ菣꺁藥鎽뻤꾁胣㲁牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲邀賥銼볯醀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔳㐲㠳⸱楴≦㈾〰㔳㐲㠳⸱楴쉦゠〰㈰㰵愯㰾䐯噉ਾ苣ꮐ苣芀迥覤臣⊮≊臣芁苣蚂苣ꊂ菣躃藩ꞁ臣誂胣鶁臣躰藥꺁뗧鲞胣䊁偍㌭臣䲮誏臣䲳츳颃苣钃菣ꮃ菣鞃꟦ꂀ臣膀菣ꖃ菣뾂菣袃䵂ⵐꊃ菣麃菣銂郥肂뫤辇뷤뾂菣醃苣ꮁ꿥馁苣ꊂ菣ꎂ菣蚃苣벃苣覜臣讂菣뮂菣뾂菣ꢁ臣鎖臣馝鯩뢛뫤鲽铧貁ꋥꂊ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲 겜駧躘臣뺁臣膀菣螃苣閃苣ꒂ臣貂臣ꊽ藦ꮁ臣醁苣骤臣꺁䵂ⵐꮁ臣蒁臣节蓦뎛臣ꚁ臣讂胣鎁苣覂臣ꊃ菣ꎂ菣ꆂ苣閁苣龁뷥讅臣膀苣蚁ꒁ臣랂苣膃菣躃菣袃裦랕鯥邭迥꾁臣꺁苣蚁臣ꊃ菣麃菣꺁菣ꦃ苣랂菣뎃臣邵郥鞁臣䊟偍㌭苣ꮐ苣芀戼㹲邀���鞼볯鞼胣㲑牢ਾ†藥鎽髧讅꟦ꮁ臣蒁臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣ㆂ臣꺁룤風臣袂臣ꪁ菣ꖃ菣뾂菣袃苣隃菣讃菣袃迥꾁跥階䵂ⵐꊂ菣궃苣銂郥肂菣ꖃ菣뾂菣袃䵂ⵐ颃菣궃菣ꒂ菣벃臣龩菨誸듦Ꞁ臣芁苣膀臣ꪁ苣ꆁ胣䊁偍㌭菣뮂菣뾂菣邵郥膀䵂ⵐ뾂菣醃苣閃苣龃菣벃菣뮂菣뾂菣랂苣誃菣誏臣내菨隤裥貳臣袂臣ꪁ菣ꒂ菣覃苣ꒂ菣䊗偍㌭臣ꊖ胩馁苣膀ꒁ믤誸臣龩菨蒚듦Ꞁ苣몤臣鎁臣貁臣趁苣芀ꗥ뺁臣辁臣膀菣ꖃ菣뾂菣袃䵂ⵐ颃菣궃菣ꒂ菣벃迥꾁跥階䵂ⵐꊂ菣궃苣꾁胣붥臣鞁臣꾁菣ꒂ菣覃苣ꒂ菣䊗偍㌭苣誂ꓥ趁臣ꊂ菣ꎂ菣蚃苣벃苣覜臣讂䵂ⵐ것苣鞃苣벃臣邵郥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣龁胣鶁臣袂臣ꪁ菣ꖃ菣뾂菣袃䵂ⵐ颃菣궃菣ꒂ菣벃迥꾁跥階䵂ⵐꊂ菣궃苣貁苣낂菣ꮃ볤钁苣閼臣략臣馁臣ꢁ苣붥臣鞁臣芀鳦节ꗥ뺁臣辁臣膀鳦몙飦꺁胣醰臣辁臣节ꒁ臣龃菣벃苣뎃菣떂菣ꚃ菣莃菣袏臣颍軩䊖偍㌭苣誃菣낂苣ꮐ苣龃菣벃苣뎃菣䊈偍㌭菣蚃菣肃苣麃菣꾁胣꾃苣ꮃ菣뾂苣鞃䵂ⵐ袂苣Ꞥ臣蒁苣뎃菣袃菣龔觧뮴胦誏臣⾳迥꾁苣뎃菣鲃铧ꦉ듦Ꞁ苣覜臣膀菣ꒂ菣覃苣ꒂ菣䊗偍㌭苣誂闩蒁ꇨ薸跥鮸鳦銂鳦馁苣芀鳦몙飦꺁菣ꖃ菣뾂菣袃䵂ⵐ颃菣궃菣ꒂ菣벃迥뎁跥階䵂ⵐꊂ菣궃苣꾁胣鎽ꧨ肊ꇨꮁ臣蒁臣ꖟ苣貂臣蒁苣ꖷ꣧ꮁ苣誂胣鮜臣貂苣뮴胦ꮁ꿥鞁臣蚃苣袃臣貂苣鎁臣貁臣趁苣芀戼㹲邀볯鞼볯颼胣㲑牢ਾ†甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銃菣ꢪ뷥讅뷥邈苣뎃菣꾂⼼㹵甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ⴾ戳䈨偍㌭⥢⼼㹵甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰떂菣ꚃ菣莃菣꺁菣ꖃ菣뾂菣袃⼼㹵戼㹲 銃菣ꢪ뷥讅뷥邈苣뎃菣꾂㌭⡢䵂ⵐ戳⤠苣隃菣讃菣袃臣膀鯥㊳⠷䕓⁑䑉丠㩯㈠⤶臣몤臣貂苣袂臣ꮁ胣㒁㠷胥꺁苣龃菣뢅苣ꮐ苣ꞁ臣讂胣겜駧躘臣膀菣ꒂ菣覃苣ꒂ菣ꊃ菣麃菣ꢁ꿦莼臣龁臣趁胣ㆁ胣㊁胣㎁胣㒁胣袏臣袂苣骤臣ꊂ菣躃藩议鿥꺁ꒁ迥꾁ꓨ낕臣ꊂ菣躃藩꺁뷧鮏胣㲁⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢곦놤⼼㹵迥꾁賦ꖅ苣ꮐ苣膀䵂ⵐ戳苣隃菣讃菣袃臣龃菣벃苣뎃菣銂蓦뎛臣ꚁ臣讂胣閁苣ꮁ胣겜駧躘臣膀苣蚁룤ꒁ臣䎮䝋뾂菣醃苣ꮁ뗧袐臣龁菣ꖃ菣뾂菣袃䵂ⵐ戳苣隃菣讃菣袃苣辄鯥鞁臣蒁苣芀戼㹲邀볯鞼볯馼胣㲑牢ਾ†鳦몙飦꾁胣뎛㜲匨充䤠⁄低›㘲ꮁꇨ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀祃议鿥銂駩蒁臣膀ꋥ貕苣ꮐ苣ꚁ㜳趽胣㒜㈰뷤鎖臣膀ꒁ믤誸臣ꊂ菣躃藩꺽迦銂鳦馁苣龃菣벃苣뎃菣䊈偍㌭떂菣ꚃ菣莃菣䲈颃苣钃菣ꮃ菣鞃苣邏뻤馁苣芀ꧨꊂ菣躃藩꺽迦꾁곦銂郥肂볯劚㜳堹‬㍙〸ⱘ䰠㠳報‬㍋㈸ⱘ嘠㠳堳‬㍄㐸ⱘ䘠㠳堵‬㍁㘸ⱘ䐠㠳堷‬㍉㠸ⱘ䜠㠳堹‬㍗〹ⱘ丠㤳報���㍅㈹ⱘ圠㤳堳‬㍉㐹ⱘ䤠㤳堵‬㍓㘹ⱘ倠㤳堷‬㍋㠹ⱘ匠㤳堹‬㑆〰ⱘ䐠〴報‬迥뎁㑁㈰芀堢꾁臣覂苣讂苣龃菣뢅껦몟臣芁苣膀臣꺁뷧鮏臣颃苣钃菣ꮃ菣鞃臣馝鯩릉胦銂ꓥ袁苣芀戼㹲邀볯鞼볯邼胣㲑牢ਾ†鳦몙飦꺁ꫧ뚄ꓥ낕ꫨ몙菣궃苣ꦃ菣꺁藥鎽뻤꾁胣뢅胦议鿥貁귥ꢜ臣讂ꇥ몟胦ꊂ菣躃藩议鿥꺁냥ꖅ苣ꮐ苣芀뻤袁臣膀藩Ꞁ껦몟臣颭鳥馁苣膀䵂ⵐ戳苣隃菣讃菣袃菣躃菣벃臣䲮ꮃ菣鞃臣ꦡ鿥Ꞁ껦몟苣躰藥馁苣ꢁ臣膀迥覤臣⊮≘臣ꦡ鿥Ꞁ苣龃菣뢅껦몟臣뢛뷥馁苣ꂁ苣蚁胣䊂偍㌭떂菣ꚃ菣莃菣ꊃ菣麃菣뢁ꇥ몟胦议鿥貁냥ꖅ臣貂苣龃菣벃菣ꒂ苣ꞃ菣銂ꓥ袁苣馝鯩랍臣랅뷤设臣膀곦꺁ꒁ믤誸苣ꮐ苣骼㍄㐸膀㍄㜸膀㍅㈹膀迥뎁㑄㄰胣鎁臣ꞁ䈢꾁ꇥ몟胦ꊂ菣躃藩议鿥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲 䈠偍㌭떂菣ꚃ菣莃菣ꊃ菣麃菣超裥ꮁꇥ몟胦议鿥貁귥ꢜ臣讂藩Ꞁ苣龃菣뢅껦몟苣躰藥馁苣鎁臣节臣龁蓦뎛臣ꚁ臣讂胣鎁臣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀迥覤臣⊮≘臣뢅胦ꊂ菣躃藩ꮁ鯧鎽臣讂胣鎁苣覂臣ꊂ菣躃藩꺁냥ꖅ臣膀ㅌ菣ꊂ菣뎃菣벃菣꺁鷩뮛觧Ꞁ苣袂苣ꂲ臣뚊藦뢁ꓥ袁苣袂臣ꮁ菥辁胣鶁臣袂臣ꪁ苣龃菣뢅뷧鮏臣设臣膀곦꺁ꒁ믤誸苣ꮐ苣骼㍒㤷膀㍋㈸膀迥뎁㍋㠹膀臣鎁臣⊧≚臣뢅胦ꊂ菣躃藩议鿥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲 겜駧躘臣뺁臣膀鯩랍苣꾸臣龁껦몟苣궸胦议鿥ꮁꓥ隌臣鮁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀ㅌ菣ꊂ菣뎃菣벃菣ꮁ臣醁苣ꎭ迥꾁단꺁鯩랍苣鮸苣馁臣ꢁ臣ꒁ臣ꚁ苣辄鯥鞁臣蒁苣芀뻤袁臣膀ꒁ믤誸臣궸胦ꊂ菣躃藩꾁胣꾏ꓥ꺁堢貁룤Ꞁ苣龃菣뢅臣뢛뷥馁苣誸꣨꺁ㅌ藩鞈臣躰藥閁苣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣节臣ㆆ臣꺁뻤ꮁ臣蒁臣膀ꒁ믤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