(57)【要約】本発明は、選択的スプライシングの対象となるあるタンパク質を規定する遺伝子のエクソンが、細胞中でどのようにして選択的スプライシング制御されているかを明らかにすることができる、ＤＮＡフラグメントまたはそれを含む発現ベクターなどのＤＮＡ構築物を提供することを課題とする。  本発明の発明者らは、リポータータンパク質のｃＤＮＡを分断する様に、選択的スプライシングの対象となるあるタンパク質を規定する遺伝子のエクソンを挿入することができるクローニング部位を含む介在フラグメントを挿入することにより、上記課題を解決することができることを明らかにした。
2008102903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメント；
前記第一のフラグメントおよび第二のフラグメントとの間に位置する介在フラグメントであって、スプライシングモチーフを有し、そしてクローニング部位を含む介在フラグメント；
前記クローニング部位に挿入された外来性の選択的スプライシングカセット；
を含む、ＤＮＡフラグメント。
【請求項２】
リポータータンパク質が、蛍光タンパク質または色素タンパク質である、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項３】
リポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＦ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項４】
リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメントが直接連結される場合に、リポータータンパク質をコードするＤＮＡが形成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項５】
クローニング部位が複数存在し、その内のいずれか一つのクローニング部位に外来性の選択的スプライシングカセットが挿入されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項６】
選択的スプライシングカセットが、選択的スプライシングを起こすことが知られているか、または予想されている遺伝子のうち、選択的スプライシングの対象となるエクソンおよびその上流および下流のイントロン部分から構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項７】
選択的スプライシングカセットが、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０およびその上流および下流のイントロン部分から構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメントを、タンパク質発現用ベクターのクローニング部位に挿入することにより作製された、真核細胞発現ベクター。
【請求項９】
タンパク質発現用ベクターが、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ４７１２０）、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ４７２９６）からなる群から選択される真核細胞発現用ベクターである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
真核細胞にトランスフェクトさせて発現させた場合に、選択的細胞内で選択的スプライシングが生じた結果、前記第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結されて機能的なリポータータンパク質が生成されるか、または前記第一のフラグメントと選択的スプライシングカセット中のエクソンと第二のフラグメントとから形成される、リポータータンパク質としての機能を有さない融合タンパク質が生成される、請求項８または９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
真核細胞に請求項８〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクターをトランスフェクトさせ、
当該トランスフェクトされた真核細胞を培養し、
細胞内において発現ベクター中に挿入されたＤＮＡフラグメントを発現させ、
選択的スプライシングの結果リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結することにより生成される機能的なリポータータンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕにてモニタリングすること、
を含む、真核細胞内での選択的スプライシングをｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングする方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント；
いずれかの真核細胞発現ベクター；
を含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキット。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の真核細胞発現ベクターを含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡスプライシング（選択的スプライシング）を検出するための新しいシステムを提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、選択的スプライシングをｉｎ  ｓｉｔｕにて定量的に検出するための新しいシステムを提供することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物においては、選択的スプライシングが、タンパク質の多様性に多大な役割を果たしていると考えられており、ヒトでは全遺伝子の少なくとも７４％が、選択的スプライシングを起こしていると報告されている（非特許文献１）。遺伝病として知られる疾患の中にも、選択的スプライシングの異常が原因となっているものや、選択的スプライシングに異常を来す変異が原因となっているものが知られている。
このような状況の下、生体内での選択的スプライシング機構の詳細が解明されることが望まれているが、これまでのところ、選択的スプライシングの制御機構の解明は十分には進んでいない。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける選択的スプライシング制御機構を明らかにする目的で、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を用いて、蛍光タンパク質をレポーターとして細胞と後の選択的スプライシングを可視化するトランスジェニック動物の作製方法が開発された（非特許文献２）。しかしながら、この方法では、文献中で開示された特定の遺伝子のスプライシング現象を特定することしかできず、他の遺伝子についての選択的スプライシングの制御機構を解析する際にも利用できるような一般的な解析ツールとしては、使用することができないという欠点があった。
【非特許文献１】Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３  ３０２：２１４１−２１４４
【非特許文献２】Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６  ３：９０９−９１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、選択的スプライシングの対象となるあるタンパク質を規定する遺伝子のエクソンが、細胞中でどのようにして選択的スプライシング制御されているかを明らかにすることができる、ＤＮＡフラグメントまたはそれを含む発現ベクターなどのＤＮＡ構築物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の発明者らは、リポータータンパク質のｃＤＮＡを分断する様に、選択的スプライシングの対象となる介在フラグメントを挿入することにより、上記課題を解決することができることを明らかにした。この介在フラグメントには、あるタンパク質を規定する遺伝子のエクソンを挿入することができるクローニング部位が含まれる。
本発明の具体的な一態様において、本発明の発明者らは、リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメント；前記第一のフラグメントおよび第二のフラグメントとの間に位置する介在フラグメントであって、スプライシングモチーフを有し、そしてクローニング部位を含む介在フラグメント；前記クローニング部位に挿入された外来性の選択的スプライシングカセット；を含む、ＤＮＡフラグメントを提供する。
この態様において、本発明は、上述したＤＮＡフラグメント；および、いずれかの真核細胞発現ベクター；を含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキットもまた、提供することができる。
本発明の別の態様において、本発明の発明者らは、リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメント；前記第一のフラグメントおよび第二のフラグメントとの間に位置する介在フラグメントであって、スプライシングモチーフを有し、そしてクローニング部位を含む介在フラグメント；前記クローニング部位に挿入された外来性の選択的スプライシングカセット；を含む、ＤＮＡフラグメントを、タンパク質発現用ベクターのクローニング部位に挿入することにより作製された、真核細胞発現ベクターを提供する。
この態様において、本発明は、上述したタンパク質発現用ベクターを含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキットもまた、提供することができる。
本発明のさらに別の態様において、本発明の発明者らは、リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメント；前記第一のフラグメントおよび第二のフラグメントとの間に位置する介在フラグメントであって、スプライシングモチーフを有し、そしてクローニング部位を含む介在フラグメント；前記クローニング部位に挿入された外来性の選択的スプライシングカセット；を含む、ＤＮＡフラグメントを、タンパク質発現用ベクターのクローニング部位に挿入することにより作製された、真核細胞発現ベクターを、真核細胞にトランスフェクトさせ；当該トランスフェクトされた真核細胞を培養し；細胞内において発現ベクター中に挿入されたＤＮＡフラグメントを発現させ；そして、選択的スプライシングの結果リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結することにより生成される機能的なリポータータンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕにてモニタリングすること；を含む、真核細胞内での選択的スプライシングをｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングする方法を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
発現ベクター中に挿入した上述した配列構造を有するＤＮＡフラグメントを利用して真核細胞をトランスフェクトし、ＤＮＡフラグメントを発現させることにより、細胞内で目的とするエクソンにおいて選択的スプライシングが生じるか否かを、ｉｎ  ｓｉｔｕでリアルタイムモニタリングすることができる。このモニタリング系は、ベクターを変更することにより、あらゆる生物について適用することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験のいずれにおいても利用することができる。また、リポーター遺伝子の発現は、従来の検出方法のいずれを用いても検出することができるため、新たな装置を用意することなく、選択的スプライシングが生じるか否かを、ｉｎ  ｓｉｔｕでリアルタイムモニタリングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、リポーター遺伝子を例にして、スプライシングの機序を示した図である。
【図２】図２は、本発明のＤＮＡフラグメントの具体的な構造および作用機構を示す図である。
【図３】図３は、ＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１の構築方法の第一段階である、フラグメントＡの調製方法を示すスキーム図である。
【図４】図４は、ＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１の構築方法の第一段階である、フラグメントＢの調製方法を示すスキーム図である。
【図５】図５は、ＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１の構築方法の第一段階である、フラグメントＣの調製方法を示すスキーム図である。
【図６】図６は、ＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１の構築方法の第二段階である、フラグメントＡ〜Ｃを結合させてＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１を調製する方法を示すスキーム図である。
【図７】図７は、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、またはｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターのいずれかによりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、ｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングした結果を示す、蛍光像および位相差像である。
【図８】図８は、ｐＣＩ−ＧＦＰベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、またはｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターのいずれかによりトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングした結果を示す、蛍光像および位相差像である。
【図９】図９は、発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターをトランスフェクトさせた細胞中でスプライシングの結果生じるＤＮＡフラグメントの構造と、プライマーセットにより増幅されるＤＮＡの位置関係を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例１において作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において発現されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲの結果の電気泳動像を示す図である。
【図１１】図１１は、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター、ＧＦＰ−ｎｅｏベクター、またはｐＣＩ−ｎｅｏベクター、のいずれかによりトランスフェクトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングした結果を示す蛍光像である。
【図１２】図１２は、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター、ＧＦＰ−ｎｅｏベクター、またはｐＣＩ−ｎｅｏベクター、のいずれかによりトランスフェクトされたＣＯＳ１細胞を、ｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングした結果を示す蛍光像である。
【図１３】図１３は、発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターをトランスフェクトさせた細胞中でスプライシングの結果生じるＤＮＡフラグメントの構造と、プライマーセットにより増幅されるＤＮＡの位置関係を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例４において作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターまたはｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞において発現されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲの結果の電気泳動像を示す図である。
【図１５】図１５は、ＤＮＡフラグメントＧＬ３ｉｎｔ１の構築方法の第一段階である、フラグメントＤおよびＥの調製方法を示すスキーム図である。
【図１６】図１６は、ＤＮＡフラグメントＧＬ３ｉｎｔ１の構築方法の第一段階である、フラグメントＦの調製方法を示すスキーム図である。
【図１７】図１７は、ＤＮＡフラグメントＧＬ３ｉｎｔ１の構築方法の第二段階である、フラグメントＤ〜Ｆを結合させてＤＮＡフラグメントＧＬ３ｉｎｔ１を調製する方法を示すスキーム図である。
【図１８】図１８は、（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞または（Ｂ）ＨＥｍｍｍｍｍｍＫ２９３細胞をｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトした場合に、細胞内において介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていることを示す図である（それぞれ図１８ＡまたはＢ）。
【図１９】図１９は、ＣＯＳ１細胞を、ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター、またはｐＣＩ−ｎｅｏベクター、のいずれかによりトランスフェクトした場合に、細胞内において介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていることを示す図である。
【図２０】図２０は、発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター（図２０Ａ）、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター（図２０Ｂ）、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター（図２０Ｃ）、をトランスフェクトさせた細胞中でスプライシングの結果それぞれにおいて生じるｍＲＮＡフラグメントの構造と、プライマーセットにより増幅されるｍＲＮＡの位置関係を示す図である。
【図２１】図２１は、実施例７において作製した発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞において発現されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲの結果の電気泳動像を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ＤＮＡフラグメントの構造
現在までに考えられている、一般的なスプライシングの機序の一例を、リポーター遺伝子を例にして、図１に示す。この図において、リポーター遺伝子の第一のフラグメントと第二のフラグメントとの間には、介在フラグメント（イントロン）が挿入されている。この介在フラグメントがスプライシングにより除去されるためには、介在フラグメント中、５’末端側にＧＵという配列（１）、３’末端側にＡＧという配列（２）、そして介在フラグメント内部にＹＹＲＡＹという配列が含まれていることが必要であることが知られており、このような配列の組合せをスプライシングモチーフと呼ぶ（図１に示すスプライシングモチーフは、現在知られているスプライシングモチーフのうちの一例である）。
このスプライシングモチーフは、５’末端側のＧＵ配列（１）と介在フラグメント内部のＹＹＲＡＹ配列との間で物理的にループ構造を形成し、その結果、５’末端側のＧＵ配列（１）と３’末端側のＡＧ配列（２）で介在フラグメントが切断され、そしてｍＲＮＡから除去されることにより、リポーター遺伝子の第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結されることにより、成熟ｍＲＮＡが形成されると考えられる。このような成熟ｍＲＮＡが形成されると、目的とするリポータータンパク質が機能的なリポータータンパク質として発現され、リポーターとしての役割を果たす。
本発明は、このようなスプライシングの制御機構を利用するものである。まず、本発明においては、リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメント；前記第一のフラグメントおよび第二のフラグメントとの間に位置する介在フラグメントであって、スプライシングモチーフを有し、そしてクローニング部位を含む介在フラグメント；前記クローニング部位に挿入された外来性の選択的スプライシングカセット；を含む、ＤＮＡフラグメントを作製する。このＤＮＡフラグメントの具体的な構造および作用機構を、図２に示す。
リポータータンパク質
本発明のＤＮＡフラグメントにおけるリポータータンパク質は、リポーターとしての機能を果たすことが知られているタンパク質であればどのようなものであってもよく、例えば、蛍光タンパク質、色素タンパク質、酵素タンパク質などを利用することができる。本発明においては、スプライシングをリアルタイムにモニタリングすることができることが好ましいため、蛍光タンパク質または色素タンパク質をリポータータンパク質として使用することが好ましい。さらに具体的には、リポータータンパク質として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＦ）、ＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質、またはフィトクローム、青色光吸収タンパク質（ＮＰＬ１）（Ｋａｇａｗａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９１，２１３８−２１４１）などの色素タンパク質を使用することが好ましい。
リポータータンパク質として蛍光タンパク質または色素タンパク質を利用する場合、細胞を生きたままで、発生される蛍光または発色若しくは蛍光の消光または光の吸収などをリアルタイムにモニタリングすることができる。その様な生細胞のリアルタイムモニタリングに利用することができる装置としては、蛍光タンパク質を利用する場合には、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、ＣＣＤカメラなどを例として、色素タンパク質を利用する場合には、顕微鏡、ＣＣＤカメラなどを例として、それぞれ挙げることができるが、蛍光または色素などの変化を測定できるものであればこれらのものに限定されない。
介在フラグメント
上述したＤＮＡフラグメント中に存在する介在フラグメントは、上述したようなスプライシングモチーフを有する限りにおいてどのような配列のものであってもよい。本発明においては例えば、リポーター遺伝子中のゲノムＤＮＡ配列中に含まれる天然のイントロン配列を介在フラグメントとして利用することができる。例えば、あるリポータータンパク質をコードする遺伝子領域のゲノムＤＮＡの塩基配列が、エクソン１とイントロン１とエクソン２からなる配列構造を有する場合、そのゲノムＤＮＡ領域をそのままＤＮＡフラグメントとして利用することができる。あるいは、３つ以上のエクソンを有するリポータータンパク質の場合、いずれかのイントロンを介在フラグメントとして利用することができ、その場合、当該イントロンとその両側のエクソンの部分はゲノムＤＮＡの塩基配列に由来し、その他の部分についてはｃＤＮＡの塩基配列に由来する、キメラ構造のＤＮＡフラグメントとすることができる。
本発明においてはまた、他の遺伝子におけるイントロン配列を介在フラグメントとして利用することもできる。この場合、リポータータンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列中に、他の遺伝子に由来するイントロン配列を介在フラグメントとして挿入することにより、本発明のＤＮＡフラグメントとすることができる。本発明においてはまた、人工イントロンを介在フラグメントとして利用することもできる。人工イントロンを利用してスプライシングを生じさせた事例は、ＵｍｅｋａｇｅおよびＫｉｋｕｃｈｉの文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏ．Ｓｅｒ，（５０）：３２３−３２４（２００６））などにおいて報告されているほか、スプライシングを利用したクローニングベクターｐＤＮＲ−Ｄｕａｌ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に利用されている。したがって、このような人工イントロンを、リポータータンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列中に、介在フラグメントとして挿入することにより、本発明のＤＮＡフラグメントとすることができる。
本発明のＤＮＡフラグメントの介在フラグメント中に存在するクローニング部位は、１つであっても複数が存在してもよい。このようなクローニング部位は、例えば介在フラグメントとしてイントロンを利用する場合にもともとイントロン中に存在する制限酵素部位を利用してもよく、または当該技術分野において利用されているクローニングベクターのマルチクローニング部位の核酸配列を切り出して転用してもよい。
選択的スプライシング現象
上述したＤＮＡフラグメントを利用するため、まずＤＮＡフラグメントのクローニング部位に対して、外来性の選択的スプライシングカセットを挿入する。この外来性の選択的スプライシングカセットには、あるタンパク質を規定する遺伝子のうち選択的スプライシングの対象となるエクソンを、そのエクソンの上流および下流のイントロン部分の配列と共に含むことを特徴とする（図２中段）。
本発明において、選択的スプライシングカセットとしてＤＮＡフラグメントのクローニング部位に挿入される、あるタンパク質を規定する遺伝子の選択的スプライシングの対象となるエクソンは、選択的スプライシングを起こすことが既に知られているエクソンであっても、または選択的スプライシングを起こすことが予想されているエクソンであっても利用することができる。選択的スプライシングを起こすことが既に知られているエクソンを挿入してそのスプライシング現象をモニターすれば、細胞中でのスプライシングの動向を検出することができる。
本発明においては例えば、選択的スプライシングを起こすことが知られているエクソンとして、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０を利用することができる。具体的には、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０およびその上流および下流のイントロン部分から構成されるＤＮＡ領域を、選択的スプライシングカセットとして利用することができる。ｔａｕ遺伝子のエクソン１０が選択的スプライシングを受けることにより、エクソン１０を含まない配列からなる構造（すなわち、〜エクソン９〜エクソン１１〜）を有する３Ｒｔａｕ、またはエクソン１０を含む配列からなる構造（すなわち、〜エクソン９〜エクソン１０〜エクソン１１〜）を有する４Ｒｔａｕが産生される。ヒト３Ｒｔａｕとヒト４Ｒｔａｕは、アルツハイマー病の病態に関連するタンパク質である。ヒトにおいては、アルツハイマー病、第１７番染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴った前頭側頭型痴呆（ＦＴＤＰ−１７）、ピック病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）など、変性神経細胞内におけるｔａｕ遺伝子産物の異常蓄積を特徴とする、痴呆を伴う疾患が知られている。３Ｒｔａｕおよび４Ｒｔａｕは、いずれも変性神経細胞内に異常に蓄積した構造物の主要な構成成分として認められるが、３Ｒｔａｕおよび４Ｒｔａｕいずれが蓄積するかは、各疾患によって異なっている。例えば、アルツハイマー病においては３Ｒｔａｕと４Ｒｔａｕが両方とも蓄積するのに対して、ピック病については３Ｒｔａｕのみが蓄積し、一方ＦＴＤＰ−１７のうち家族性の突然変異、ＰＳＰ、およびＣＢＤにおいては４Ｒｔａｕのみが蓄積することが知られている。このため、３Ｒｔａｕが産生されるのか、または４Ｒｔａｕが産生されるのかは、ｔａｕ遺伝子が関与する疾患の病態と強く関連している。したがって、選択的スプライシングの対象となるエクソンとして、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０およびその上流および下流のイントロン部分から構成されるＤＮＡ領域を利用して選択的スプライシングをモニタリングすると、細胞がどのような異常を有し、どのような疾患を生じうるかを予測することができる。
また、選択的スプライシングを起こすことが予想されているエクソンを挿入してそのスプライシング現象をモニターすれば、細胞中で対象となるエクソンが実際に選択的スプライシングに関与しているか否かを特定することができる。
このような選択的スプライシングカセットをクローニング部位に挿入することにより、ＤＮＡフラグメント中にもともと存在していた、リポーターの第一フラグメントの３’末端に存在するスプライシングモチーフ（１）および第二フラグメントの５’末端に存在するモチーフ（２）に加えて、外来性選択的スプライシングカセット由来のスプライシングモチーフ（３）および（４）が挿入されることになる（図２中段）。
このような構造を有するＤＮＡフラグメントを発現ベクター中に組み込んで細胞にトランスフェクトすると、細胞内では、（１）−（２）でのスプライシングが生じるか、または（１）−（３）および（４）−（２）での２箇所のスプライシングが生じるか、のいずれかが生じることになり、選択的スプライシングの機能を模倣することができる（図２下段）。
細胞内において（１）−（２）でのスプライシングが生じた場合、リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメントが直接連結されることになり、その結果形成された成熟ｍＲＮＡにより、機能的なリポータータンパク質が生成され、リポーター機能（例えば、蛍光の発生や色素の発現など）が生じることとなる（図２下段左）。
一方、細胞内において（１）−（３）および（４）−（２）での２箇所のスプライシングが生じた場合、リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントと第二のフラグメントとの間に選択的スプライシングカセット由来のエクソンが挿入されたＤＮＡにより規定される融合タンパク質が生成される。この融合タンパク質は、リポータータンパク質としての機能を有さないこととなり、このような細胞ではリポーター機能は生じないこととなる（図２下段右）。
発現ベクター
本発明の別の態様において、上述したリポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメント；前記第一のフラグメントおよび第二のフラグメントとの間に位置する介在フラグメントであって、スプライシングモチーフを有し、そしてクローニング部位を含む介在フラグメント；前記クローニング部位に挿入された外来性の選択的スプライシングカセット；を含む、ＤＮＡフラグメントを、選択的スプライシングを生じさせる細胞内において発現させることを目的として、当該ＤＮＡフラグメントをタンパク質発現用ベクターのクローニング部位に挿入することにより作製された、真核細胞発現ベクターを提供する。本発明においてモニタリングする「選択的スプライシング」現象は、真核細胞に特有の現象であることから、本発明において使用することができるタンパク質発現用ベクターは、真核細胞発現ベクターに限定される。
本発明のＤＮＡフラグメントを挿入するベクターとしては、当該技術分野において既知の真核細胞発現用ベクターであって、ＤＮＡフラグメントを挿入した発現ベクターをトランスフェクトする細胞と適合するものあればどのようなものであってもよい。例えば、発現ベクターをトランスフェクトする細胞が昆虫の細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞など）である場合、ｐＩＥｘベクター、バキュロウィルスベクターなどを例として挙げることができ、発現ベクターをトランスフェクトする細胞がマウスの細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＮ２細胞、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、マウスＥＳ細胞など）である場合、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター、アデノウィルスベクターなどを例として挙げることができ、発現ベクターをトランスフェクトする細胞がヒトの細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＨｅＬａ細胞など）である場合、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター、アデノウィルスベクターなどを例として挙げることができる。
ベクター中へのＤＮＡフラグメントの挿入は、当該技術分野において公知または周知のいずれの方法を用いて行ってもよく、例えばＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１））、村松正實（ラボマニュアル遺伝子工学、第３版、丸善）などに記載されている周知の方法を使用することができる。具体的には、ベクター中のクローニング部位の一つを制限酵素を用いて開裂し、一方ＤＮＡフラグメントの両端を前記の制限酵素で開裂したクローニング部位の末端と結合可能な塩基配列に整え、クローニング部位に、ＤＮＡフラグメントをライゲーションすることにより、挿入することができる。
このようにして作製した発現ベクターを真核細胞にトランスフェクトさせて発現させた場合に、選択的細胞内で選択的スプライシングが生じた結果、前記第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結されたＤＮＡにより規定される、機能的なリポータータンパク質が生成されるか、または前記第一のフラグメントと選択的スプライシングカセット中のエクソンと第二のフラグメントとから形成されるＤＮＡにより規定される、リポータータンパク質としての機能を有さない融合タンパク質が生成されるか、のいずれかの発現様式をとる（図２下段）。
発現ベクターを利用した選択的スプライシングのｉｎ  ｓｉｔｕモニタリング
本発明においては、このような発現ベクターに基づく発現の結果生じる選択的スプライシングを、当該技術分野において周知の方法により、細胞中でｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングすることができる。具体的には、真核細胞内での選択的スプライシングのｉｎ  ｓｉｔｕモニタリングは：真核細胞に前述した発現ベクターをトランスフェクトさせ；当該トランスフェクトされた真核細胞を培養し；細胞内において発現ベクター中に挿入されたＤＮＡフラグメントを発現させ；選択的スプライシングの結果リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結することにより生成されたＤＮＡにより規定される機能的なリポータータンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕにてモニタリングすること；により行うことができる。このようなｉｎ  ｓｉｔｕでのモニタリングは、リポーターを選択することにより、リアルタイムに行うことも可能である。
その他の態様
本発明においては、上述したＤＮＡフラグメントといずれかの真核細胞発現ベクター；を含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキット、または上述したＤＮＡフラグメントを挿入したタンパク質発現用ベクターを含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキット、もまた、提供することができる。
【実施例】
【０００８】
本明細書の以下において、例示的な配列を利用して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は本発明をこの態様に限定することを目的としたものではない。
実施例１：ＤＮＡフラグメントおよび発現ベクターの構築（１）
本実施例においては、リポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰのキメラタンパク質を使用し、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ６２６５４）の開始コドンを含むエクソン２に相当する配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を第一のフラグメントとして、エクソン３およびエクソン４の一部（５’末端から終始コドンまで）を結合させた配列に相当する配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を第二のフラグメントとしてそれぞれ使用し、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ６２６５４）のイントロン２と相同なヌクレオチド配列を有するＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａゲノム由来領域（５３１ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を介在フラグメントとして使用し、そして選択的スプライシングを起こすことが知られているエクソンとして、ヒトｔａｕ遺伝子のエクソン１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびその上流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および下流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）から構成されるＤＮＡ領域を利用して、ＤＮＡフラグメントを構築した。
本発明のレポーター遺伝子（第一のフラグメントおよび第二のフラグメント）および介在フラグメントに含まれるＥＧＦＰの配列は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。また、これらに含まれるオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰおよびイントロンの配列は、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）から抽出したゲノムＤＮＡから入手した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。
具体的には以下の様に行った。まず、ＥＧＦＰ発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ５７６０９、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＥＧＦＰのｃＤＮＡ領域を含むＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ制限酵素断片を、真核細胞発現ベクターであるｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ４７１２０、Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニング部位ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位にライゲーションして挿入することにより構築したＥＧＦＰ発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰベクターを鋳型として、プライマーセット（ｐＣＩ−ｎｅｏベクター由来の配列にハイブリダイズするＰＣＩＦプライマー（ｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＥＧＦＰ  ｃＤＮＡにハイブリダイズするＥＧＦＰＥ１Ｒプライマー（ｔｇｃａｔｃａｃｃｔｔｃａｃｃｃｔｃｇｃｃｇｇａｃａｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０））を用いて、ＰＣＲによりフラグメントＡを調製した（図３）。このフラグメントＡは、５’側から順番に、ｐＣＩ−ＧＦＰベクター由来の８６ｂｐ、ＥＧＦＰの５’非翻訳領域４６ｂｐ、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド番号１〜９７の９７ｂｐ、およびＥＧＦＰＥ１Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の３’側１７ｂｐから構成される２４６ｂｐの長さを有する核酸である（図３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）。
次に、ｐＣＩ−ＧＦＰベクターを鋳型として、プライマーセット（ｐＣＩ−ｎｅｏベクター由来の配列にハイブリダイズするＰＣＩＲプライマー（ｃｔａｇｔｔｇｔｇｇｔｔｔｇｔｃｃａａａｃｔｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＥＧＦＰ  ｃＤＮＡにハイブリダイズするＥＧＦＰＥ２Ｆプライマー（ａｇｔｇｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇｇｔｔａｔｇｔｃｃａｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））を用いて、ＰＣＲによりフラグメントＢを調製した（図４）。このフラグメントＢは、５’側から順番に、ＥＧＦＰＥ２Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の５’側２１ｂｐ、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド番号２８０〜７２０の４４１ｂｐ、ＥＧＦＰの３’非翻訳領域９ｂｐ、およびｐＣＩ−ＧＦＰベクター由来の７５ｂｐから構成される５４６ｂｐの長さを有する核酸である（図４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセット（ＧＦＰ遺伝子のエクソン２にハイブリダイズするＧＦＰＩ１Ｆプライマー（ｔｇｔｃｃｇｇｃｇａｇｇｇｔｇａａｇｇｔｇａｔｇｃａａｃａｔａｃｇｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＧＦＰ遺伝子のエクソン３にハイブリダイズするＧＦＰＩ１Ｒプライマー（ｃｔｇｇａｃａｔａａｃｃｔｔｃｇｇｇｃａｔｇｇｃａｃｔｃｔｔｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））を用いて、ＰＣＲによりフラグメントＣを調製した（図５）。このフラグメントＣは、５’側から順番に、ＧＦＰＩ１Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の５’側９ｂｐ、ＧＦＰ遺伝子エクソン２に由来するＧＦＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド番号９５〜２０６に相同なオワンクラゲ・ゲノムＤＮＡ領域１１２ｂｐ、ＧＦＰ遺伝子イントロン２に相同なオワンクラゲ・ゲノムＤＮＡ領域（５３１ｂｐ）、ＧＦＰ遺伝子エクソン３に由来するＧＦＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド番号２０７〜２７６に相同なオワンクラゲ・ゲノムＤＮＡ領域７０ｂｐ、およびＧＦＰＩ１Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）由来の６ｂｐから構成される７２８ｂｐの長さを有する核酸である（図５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）。
このようにして調製したフラグメントＡ、ＢおよびＣの３つのフラグメントの混合溶液から、プライマーセット（ＰＣＩＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＰＣＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））を用いてＰＣＲを行うことにより（図６上段）、フラグメントＡ、ＢおよびＣを含むＤＮＡフラグメントを調製した（図６中段、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）。このＤＮＡフラグメントは５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ部位、３’末端側に制限酵素ＮｏｔＩ部位を持つ。
このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて消化することにより調製したＤＮＡフラグメントの具体的な塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のヌクレオチド番号８７〜１３９２からなる配列を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２をこの順番に並べたものを内部に含む。このＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のヌクレオチト番号８７〜１３９２からなる配列を有するＤＮＡフラグメントを、本明細書の以下においてＧＦＰｉｎｔ１と呼ぶ（図６下段）。
発現ベクターの構築のために利用する親ベクターとして、ｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター中のマルチクローニング部位にあるＥｃｏＲＩ部位およびＮｏｔＩ部位の間に、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩにより切断処理したＤＮＡフラグメント、ＧＦＰｉｎｔ１、をライゲーションして挿入して、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターを作製した（図６下段）。
これに対して、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０を含む選択的スプライシングカセットとしては、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびその上流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および下流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の順番に並べた配列から構成されるＤＮＡ領域を利用する。ｔａｕ遺伝子の所望の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４〜６）は、ヒト血液からＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単離精製したゲノムＤＮＡから入手した。
次いで、発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター中に挿入したＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１の介在フラグメント中のクローニング部位ＰｍａＣＩ部位に、上述したｔａｕ遺伝子のエクソン１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびその上流および下流イントロン部分（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からなる選択的スプライシングカセットを挿入して、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを作製した。発現ベクター中に挿入したＤＮＡフラグメント中の介在フラグメントであるイントロン２と相同な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）には、その３５８〜３６３番ヌクレオチドに制限酵素ＰｍａＣＩ部位（ＣＡＣＧＴＧ）が存在し、この制限酵素部位を酵素で切断すると平滑末端を形成する。本発明においては、この制限酵素部位を、クローニング部位として利用して、上述したｔａｕ遺伝子のエクソン１０を含む選択的スプライシングカセットを挿入した。
具体的には、５０ｎｇのベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターおよび６０ｎｇの上述の選択的スプライシングカセットを、それぞれＰｍａＣＩにて３７℃にて１７時間処理し、平滑末端を作製した。この処理により解裂したベクターをＣＩＡＰにて脱リン酸化した。このサンプルをあわせ、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１）を用い、１６℃にて１７時間反応させることにより発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター中に上述の選択的スプライシングカセットを挿入したＤＮＡフラグメントを組み込んだ。
ライゲーション反応液により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９より抽出した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを鋳型としてプライマーセット（ＰＣＩＦプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＰＣＩＲプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））を用いて行ったＰＣＲおよびプライマーＰＣＩＦプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）あるいはＰＣＩＲプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いて行ったＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるジデオキシ法により確認したところ、図２の中段に示す様な構造を有するＤＮＡフラグメントが、発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター中に発現可能に挿入されていることが示され、目的とする真核細胞発現ベクターが構築されたことが示された。
実施例２：タウ遺伝子エクソン１０についての選択的スプライシング
本実施例においては、実施例１において作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを使用して真核細胞にトランスフェクトし、タウ遺伝子エクソン１０について実際に選択的スプライシングが生じるか否かを確認することを目的として行った。
本実施例においては、実施例１で作製した発現ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターをトランスフェクトするために、ＨＥＫ２９３細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（共に理研から入手した）を使用した。この、ＨＥＫ２９３細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、馬胎児血清を終濃度１０％になるように添加したＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）中で継代培養することができる。このようにして継代培養した、２×１０４個のＨＥＫ２９３細胞および５×１０４個のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して、実施例１において作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター、０．８μｇを、カチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを用いてトランスフェクトした。発現ベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、目的とする選択的スプライシングカセットが挿入されたＤＮＡフラグメントから合成されたＲＮＡのスプライシングによりが機能可能な緑色蛍光タンパク質が発現しているかどうかを、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いた観察に基づいて確認した（図７および図８）。
比較対照として、親ベクターであり本発明のＤＮＡフラグメントを全く含まないベクターであるｐＣＩ−ｎｅｏベクター、ｐＣＩ−ｎｅｏベクターにＥＧＦＰのｃＤＮＡを組み込んだが、イントロンは含まないベクターであるｐＣＩ−ＧＦＰベクター、または本発明のＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１を組み込んだが選択的スプライシングカセットを含まないｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターのいずれかによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用した（図７および図８）。
この結果、ＨＥＫ２９３細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の両方において、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトした場合およびｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした場合に、共に一部の細胞において緑色の蛍光を発生していることが明らかになった。この結果は、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトした細胞内において介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていること、そして、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした細胞内においてｔａｕ遺伝子のエクソン１０を含まないように介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていることを示す。
一方、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトした場合と比較して、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした場合には緑色蛍光を発生する細胞数が減少していることが明らかになった。この現象は、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした場合に、本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）をコードする配列からなるｍＲＮＡが生成されるスプライシングと、本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン１０が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成されるスプライシングとが、両方とも生じていることが原因と考えられた。このことはすなわち、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした細胞内において、選択的スプライシングが行われていることを示す。
次に、このようにして細胞内においてそれぞれの発現ベクターを発現させた各４種類のＨＥＫ２９３細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、上述した培養液中で、３７℃、湿潤条件下にて２日間培養した後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、細胞内から発現されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。回収した５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用したＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液中（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ２５μｌ）には、本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第一のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）上の配列にハイブリダイズするＥＧＦＰ−Ｆ−６５プライマー（ａｃｇｔａａａｃｇｇ  ｃｃａｃａａｇｔｔｃ  ａｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）および本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第二のフラグメント上の配列にハイブリダイズするＥＧＦＰ−Ｒ−３９１プライマー（ｇｃｇｇｇｔｃｔｔｇ  ｔａｇｔｔｇｃｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）（各１０ｐｍｏｌ）プライマーセットが含有された。このプライマーセットは、細胞内において本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）をコードするｍＲＮＡが形成される場合（すなわち介在配列がエクソンとともに完全にスプライスアウトされる場合）には２６６ｂｐのＰＣＲ産物を生成し、細胞内において本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン１０が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成される場合には、３５９ｂｐのＰＣＲ産物を生成する。このＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５９．６℃にて３０秒−７２℃にて１分、３０サイクル）、さらに７２℃にて５分で反応させた（図９）。
上記とは別に、プライマーセットとしてヒトｔａｕ遺伝子のエクソン１０にハイブリダイズするＴＥＸ１０−Ｆプライマー（ｇｔｇｃａｇａｔａａ  ｔｔａａｔａａｇａａ  ｇｃｔ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）およびＴＥＸ１０−Ｒプライマー（ａｃｔｇｃｃｇｃｃｔ  ｃｃｃｇｇｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を加えたＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５２．３℃にて３０秒−７２℃にて３０秒、３０サイクル）、さらに７２℃にて１分で反応させた（図９）。
ｐＣＩ−ｎｅｏベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、またはｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターのいずれかによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から得たｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルについて、ＥＧＦＰ−Ｆ−６５プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）とＥＧＦＰ−Ｒ−３９１プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）のプライマーセットによりＰＣＲを行ったサンプルおよびＴＥＸ１０−Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）とＴＥＸ１０−Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）のプライマーセットによりＰＣＲを行ったサンプルについて、電気泳動を行った結果を図１０（Ａ）および（Ｂ）としてそれぞれ示す。この図において、レーン１はｐＣＩ−ｎｅｏベクター、レーン２はｐＣＩ−ＧＦＰベクター、レーン３はｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、そしてレーン４はｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターにより、それぞれトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から採取したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをサンプルとして用いた。
ＲＴ−ＰＣＲを行った結果、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを用いてトランスフェクトした細胞からは、３５９ｂｐと２６６ｂｐの２本のｍＲＮＡが産生されていることが明らかになった。ＲＴ−ＰＣＲ法で調製した増幅断片を鋳型としてＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたジデオキシ法により塩基配列を確認したところ、長いｍＲＮＡは、選択的スプライシングの結果ｔａｕ遺伝子のエクソン１０が取り込まれた３５９ｂｐのＤＮＡ、すなわち、ＧＦＰのエクソン２に相当する配列からなる第一のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、およびＧＦＰのエクソン３および４の一部を結合させた配列に相当する配列からなる第二のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が連結された、非機能的融合タンパク質をコードする核酸配列であることが明らかになり、一方短いｍＲＮＡは、選択的スプライシングの結果ｔａｕ遺伝子のエクソン１０が取り除かれた２６６ｂｐのＤＮＡ、すなわち、ＧＦＰのエクソン２に相当する配列からなる第一のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＧＦＰのエクソン３および４の一部を結合させた配列に相当する配列からなる第二のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とが直接連結され機能的リポータータンパク質としてのＧＦＰを規定する核酸配列であることが明らかになった（図１０（Ａ）、レーン４）。また、２本のバンドが増幅されたレーン４のサンプルでは、ＴＥＸ１０−Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）とＴＥＸ１０−Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）のプライマーセットによりＰＣＲにより、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０の９３ｂｐが増幅されていることが明らかになった（図１０（Ｂ））。
一方、ｐＣＩ−ＧＦＰベクターおよびｐＣＩ−ＧＦＰ  ｉｎｔ１ベクターをそれぞれトランスフェクトした場合には、２６６ｂｐのフラグメントのみが特異的に増幅されたことから、これらの細胞中では、それぞれＥＧＦＰ、本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）のｍＲＮＡが発現したことが示された（それぞれ、図１０（Ａ）、レーン２および３）。これらの増幅産物について配列解析を行った結果、レーン２および３の両方とも、増幅された配列は２６６ｂｐの本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の部分であることが確認された。
実施例３：ＤＮＡフラグメントおよび発現ベクターの構築（２）
本実施例においては、実施例１において作製したｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターを使用し、そして選択的スプライシングを起こすことが知られているエクソンとして、ヒトｔａｕ遺伝子のエクソン２およびその上流イントロン部分および下流イントロン部分から構成されるＤＮＡ領域を利用して、ＤＮＡフラグメントを構築した。
ｔａｕ遺伝子のエクソン２を含む選択的スプライシングカセットとしては、ｔａｕ遺伝子のエクソン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびその上流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）および下流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の順番に並べた配列から構成されるＤＮＡ領域を利用する。ｔａｕ遺伝子の所望の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２１〜２３）は、ヒト血液からＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単離精製したゲノムＤＮＡから入手した。
発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター中に挿入したＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１の介在フラグメント中のクローニング部位に、上述したｔａｕ遺伝子のエクソン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびその上流および下流イントロン部分（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）からなる選択的スプライシングカセットを挿入して、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターを作製した。発現ベクター中に挿入したＤＮＡフラグメント中の介在フラグメントであるイントロン２と相同な配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）には、その３５８〜３６３番ヌクレオチドに制限酵素ＰｍａＣＩ部位（ＣＡＣＧＴＧ）が存在し、この制限酵素部位を酵素で切断すると平滑末端を形成する。本発明においては、この制限酵素部位を、クローニング部位として利用して、上述したｔａｕ遺伝子のエクソン２を含む選択的スプライシングカセットを挿入した。
具体的には、５０ｎｇの発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターおよび６０ｎｇの上述の選択的スプライシングカセットを、それぞれＰｍａＣＩにて３７℃にて１７時間処理し、平滑末端を作製した。この処理により解裂したベクターをＣＩＡＰにて脱リン酸化した。このサンプルをあわせ、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１）を用い、１６℃にて１７時間反応させることにより発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター中に上述の選択的スプライシングカセットを挿入したＤＮＡフラグメントを組み込んだ。
ライゲーション反応液により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９より抽出した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターを鋳型としてプライマーセット（ＰＣＩＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＰＣＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））を用いて行ったＰＣＲおよびプライマーＰＣＩＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）あるいはＰＣＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いて行ったＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるジデオキシ法により確認したところ、図２の中段に示す様な構造を有するＤＮＡフラグメントが、発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター中に発現可能に挿入されていることが示され、目的とする真核細胞発現ベクターが構築されたことが示された。
実施例４：タウ遺伝子エクソン２についての選択的スプライシング
本実施例においては、実施例３において作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターおよび実施例１において作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを使用して真核細胞にトランスフェクトし、ｔａｕ遺伝子エクソン２について実際に選択的スプライシングが生じるか否かを確認することを目的として行った。
本実施例においては、実施例３で作製した発現ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターおよび実施例１において作製した発現ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターをトランスフェクトするために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＣＯＳ１細胞（理研）を使用した。この、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＣＯＳ１細胞（理研）は、馬胎児血清を終濃度１０％になるように添加したＤＭＥＭ培地中で継代培養することができる。このようにして継代培養した、５×１０４個のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞および１×１０４個個のＣＯＳ１細胞に対して、実施例３で作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターまたは実施例１において作製した発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター０．８μｇを、カチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを混合した溶液を用いてトランスフェクトした。発現ベクターによりトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＣＯＳ１細胞は、目的とする選択的スプライシングカセットが挿入されたＤＮＡフラグメントから合成されたＲＮＡのスプライシングにより機能可能な緑色蛍光タンパク質が発現しているかどうかを、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いた観察に基づいて確認した（図１１および図１２）。
比較対照として、ＥＧＦＰのｃＤＮＡを組み込むがイントロンは含まないベクターであるｐＣＩ−ＧＦＰベクター、または本発明のＤＮＡフラグメントＧＦＰｉｎｔ１を組み込んだが選択的スプライシングカセットを含まないｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターのいずれかによりトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＣＯＳ１細胞を使用した（図１１および図１２）。
この結果、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＣＯＳ１細胞の両方において、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトした場合およびｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした場合に、共に一部の細胞において緑色の蛍光を発生していることが明らかになった。この結果は、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトした細胞内において介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていること、そして、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした細胞内においてｔａｕ遺伝子のエクソン１０を含まないように介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていることを示す（図１１および図１２）。
これに対してｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターによりトランスフェクトした場合には、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターの場合と比較して、緑色の蛍光を発生する細胞数が有意に少ないことが明らかになった。この結果は、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターによりトランスフェクトした細胞内では、主としてｔａｕ遺伝子エクソン２の両端２箇所ともでスプライシングが生じた結果、エクソン２を２つのリポーターフラグメント間に残存させるようにエクソン２の両側の介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が多く生じていることを示す（図１１および図１２）。  次に、このようにして細胞内において発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターおよびｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを発現させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＣＯＳ１細胞を、上述した培養液中で、３７℃、湿潤条件下にて２日間培養した後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、細胞内から発現されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。回収した５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用したＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液中（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ２５μｌ）には、本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第一のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）上の配列にハイブリダイズするＥＧＦＰ−Ｆ−６５プライマー（ａｃｇｔａａａｃｇｇ  ｃｃａｃａａｇｔｔｃ  ａｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）および本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第二のフラグメント上の配列にハイブリダイズするＥＧＦＰ−Ｒ−３９１プライマー（ｇｃｇｇｇｔｃｔｔｇ  ｔａｇｔｔｇｃｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８ｍ）（各１０ｐｍｏｌ）プライマーセットが含有された。このプライマーセットは、細胞内において本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）をコードするｍＲＮＡが形成される場合（すなわち介在配列がエクソンとともに完全にスプライスアウトされる場合）には２６６ｂｐのＰＣＲ産物を生成し、細胞内において本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン２またはエクソン１０が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成される場合には、それぞれ３５３ｂｐまたは３５９ｂｐのＰＣＲ産物を生成する。このＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５９．６℃にて３０秒−７２℃にて１分、３０サイクル）、さらに７２℃にて５分で反応させた（図１３）。
上記とは別に、プライマーセットとしてヒトｔａｕ遺伝子のエクソン２にハイブリダイズするＴＥＸ２−Ｆプライマー（ａａｔｃｔｃｃｃｃｔｇｃａｇａ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）およびＴＥＸ２−Ｒプライマー（ｃｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔｇｇａｇｔｇｃｔ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）を加えたＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５２．３℃にて３０秒−７２℃にて３０秒、３０サイクル）、さらに７２℃にて１分で反応させた（図１３）。細胞内において本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）の第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン２が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成される場合には、ＴＥＸ２−Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）およびＴＥＸ２−Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）のプライマーセットにより、６１ｂｐのＰＣＲ産物を生成する（図１３）。
ｐＣＩ−ｎｅｏベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターまたはｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターのいずれかによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞から得たｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルについて、ＥＧＦＰ−Ｆ−６５プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）とＥＧＦＰ−Ｒ−３９１プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）のプライマーセットによりＰＣＲを行ったサンプルについて、電気泳動を行った結果を図１４として示す。この図において、レーン１はｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクター、レーン２はｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、レーン３はｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター、レーン４はｐＣＩ−ＧＦＰベクター、そしてレーン５はｐＣＩ−ｎｅｏベクターにより、それぞれトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞から採取したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをサンプルとして用いた。
ＲＴ−ＰＣＲを行った結果、３５９ｂｐと２６６ｂｐの２本のｍＲＮＡが産生されていたｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを用いてトランスフェクトした細胞（図１４、レーン３）とは対照的に、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターを用いてトランスフェクトした細胞では、２６６ｂｐのｍＲＮＡ発現が非常に微弱であることが明らかになった（図１４、レーン２）。
ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターを用いてトランスフェクトした細胞のｍＲＮＡに基づいてＲＴ−ＰＣＲ法で増幅・調製した増幅断片を鋳型としてＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたジデオキシ法により塩基配列を確認したところ、選択的スプライシングの結果ｔａｕ遺伝子のエクソン２が取り込まれた３５３ｂｐのＤＮＡ、すなわち、ＧＦＰのエクソン２に相当する配列からなる第一のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｔａｕ遺伝子のエクソン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、およびＧＦＰのエクソン３および４の一部を結合させた配列に相当する配列からなる第二のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が連結された、非機能的融合タンパク質をコードする核酸配列が、主として生成されていることが明らかになり、一方、わずかに増幅が確認されたｍＲＮＡ生成物は、選択的スプライシングの結果ｔａｕ遺伝子のエクソン２が取り除かれた２６６ｂｐのＤＮＡ、すなわち、ＧＦＰのエクソン２に相当する配列からなる第一のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＧＦＰのエクソン３および４の一部を結合させた配列に相当する配列からなる第二のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とが直接連結され機能的リポータータンパク質としてのＧＦＰを規定する核酸配列であることが明らかになった（図１４、レーン２）。
また、レーン２における主として増幅されたＤＮＡは、ＴＥＸ２−Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）とＴＥＸ２−Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）のプライマーセットによりＰＣＲにより、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０の９３ｂｐが増幅されていることが明らかになった（データは示さず）。
一方、ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを用いた場合には、選択的スプライシングの結果ｔａｕ遺伝子のエクソン１０が取り除かれ、２６６ｂｐのＤＮＡが発現されることが明らかになった（図１４、レーン３）。
なお、レーン２および３において４５０ｂｐ付近に非特異的増幅によるバンドが現れたが、これらの配列は、本発明の緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−ＧＦＰキメラタンパク質）をコードする配列とは全く関係がない配列であることを確認した（データは示さない）。
実施例５：ＤＮＡフラグメントおよび発現ベクターの構築（３）
本実施例においては、リポーター遺伝子として発光タンパク質ホタルルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｕ４７２９６、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）ルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ１５０７７）のエクソン１〜３を結合させた配列（６６８塩基対）に相当する配列をもつ核酸（６６８塩基対、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を第一のフラグメントとして、エクソン４〜６およびエクソン７にある終始コドンまでを結合させた配列（９８５塩基対）に相当する配列を結合させた核酸（９８５塩基対、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を第二のフラグメントとしてそれぞれ使用し、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ６２６５４）のイントロン２と相同なヌクレオチド配列を有するＡｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａゲノム由来領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の５’末端６塩基および３’末端６塩基をそれぞれＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）ルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ１５０７７）のエクソン３および４に挟まれたイントロンＣ（４８塩基対）の５’末端６塩基（ｇｔａｔｇｔ）および３’末端６塩基（ｔｔｇｔａｇ）と置換した配列を持つ核酸（５３１塩基対、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を介在フラグメントとして使用し、スプライシングカセットを挿入するためのＤＮＡフラグメント、ＧＬ３ｉｎｔ１、を構築した。
本発明のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子のエクソン１〜３およびエクソン４〜６および７は、それぞれ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）。また、イントロンＣの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ１５０７７）から入手した。
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクターであるｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ４７２９６、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、プライマーセット（ＰＧＬ３−３８７Ｆプライマー（ｇｃａｇｃｃｔａｃｃｇｔｇｇｔｇｔｔｃｇ  ｔｔｔｃｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびＰＧＬ３−ｉｎｔ５Ｒプライマー（ｇａｇｔａｔａａａｇｔｇｃａｃａｔａｃｃ  ｔｇｇｃａｔｇｃｇａ  ｇａａｔｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４））を用いて、ＰＣＲによりフラグメントＤを調製した。このフラグメントＤは、５’側から順番に、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌのルシフェラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド番号３６３〜６６８由来の３０６ｂｐ、ＰＧＬ３−ｉｎｔ５Ｒプライマーの３’側１９ｂｐから構成される、３２５ｂｐの長さを有する核酸である（図１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）。このうち、ＰＧＬ３−ｉｎｔ５Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）の５’側１３ｂｐはｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターの介在フラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の５’末端（ヌクレオチド番号７〜１９）に由来し、そしてその隣の６ｂｐはホタルルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ１５０７７）のイントロンＣに由来する配列（ｇｔａｔｇｔ）である。
一方、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクターであるｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ４７２９６、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、プライマーセット（ＰＧＬ３−ｉｎｔ３Ｆプライマー（ｇｇａａｔｔａｃｇｔｔｇｔｃｔｃｔｔｇｔ  ａｇａｇａｔｃｃｔａ  ｔｔｔｔｔｇｇｃａａ  ｔｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）およびＰＧＬ３−１２４９Ｒプライマー（ｃｃｃａｇｔａａｇｃ  ｔａｔｇｔｃｔｃｃａ  ｇａａｔｇｔａｇｃｃ  ａ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０））を用いて、ＰＣＲによりフラグメントＥを調製した。このフラグメントＥは、５’側から順番に、ＰＧＬ３−ｉｎｔ３Ｆプライマーの５’側２２ｂｐ、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌのルシフェラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド番号６６９〜１２７９由来の６１１ｂｐから構成される６３３ｂｐの長さを有する核酸である（図１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）。このうち、ＰＧＬ３−ｉｎｔ３Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）の５’側１６ｂｐはｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターの介在フラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の３’末端（ヌクレオチド番号５１０〜５２５）に由来し、そしてその隣の６ｂｐはホタルルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  Ｍ１５０７７）のイントロンＣに由来する配列（ｔｔｇｔａｇ）である。
実施例１で作製したｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１ベクターを鋳型としてプライマーセット（ＰＧＬ３−ｉｎｔ５Ｆプライマー（ｇａｔｔｃｔｃｇｃａ  ｔｇｃｃａｇｇｔａｔ  ｇｔｇｃａｃｔｔｔａ  ｔａｃｔｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）およびＰＧＬ３−ｉｎｔ３Ｒプライマー（ｇａｔｔｇｃｃａａａ  ａａｔａｇｇａｔｃｔ  ｃｔａｃａａｇａｇａ  ｃａａｃｇｔａａｔｔ  ｃｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２））を用いて、ＰＣＲにより５６７ｂｐの長さを有するフラグメントＦを調製した（図１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）。
フラグメントＤおよびＦの混合溶液から、プライマーセット（ＰＧＬ３−３８７Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびＰＧＬ３−ｉｎｔ３Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２））を用いて、ＰＣＲによりフラグメントＤ、Ｆを含む８５７ｂｐの長さを有するフラグメントＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を調製した（図１７上から２段目を参照）。次に、フラグメントＧおよびＥの混合溶液から、プライマーセット（ＰＧＬ３−３８７Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびＰＧＬ３−１２４９Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０））を用いて、ＰＣＲにより１４４８ｂｐの長さを有するフラグメントＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）を調製した（図１７上から３段目を参照）。
この様にして調製したフラグメントＨの具体的な塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に示す通りであり、５’末端側に制限酵素ＢｓｒＧＩ部位、３’末端側に制限酵素ＰｐｕＭＩ部位を持つ。
発現ベクターの構築のために利用する親ベクターとして、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクターのルシフェラーゼｃＤＮＡ中にあるＢｓｒＧＩ部位（ＴＧＴＡＣＡ：４９１〜４９７番ヌクレオチド）およびＰｐｕＭＩ部位（ＡＧＧＴＣＣＴ：１１７９〜１１８５番ヌクレオチド）の間に、制限酵素ＢｓｒＧＩおよびＰｐｕＭＩにより切断処理したフラグメントＨをライゲーションして挿入して、発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターを構築した。この発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７をこの順番に並べたＤＮＡフラグメントを内部に含む。このＤＮＡフラグメントを本明細書の以下においてＧＬ３ｉｎｔ１と呼ぶ（図１７、最下段）。
発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター中に挿入したＤＮＡフラグメントＧＬ３ｉｎｔ１中の介在フラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）には、その３５８〜３６３番ヌクレオチドに制限酵素ＰｍａＣＩ部位（ＣＡＣＧＴＧ）が存在し、この制限酵素部位を酵素で切断すると平滑末端を形成する。本発明においては、この制限酵素部位を、クローニング部位として利用して、上述したｔａｕ遺伝子のエクソン１０を含む選択的スプライシングカセットを挿入した。
ライゲーション反応液により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９より抽出した発現ベクターを鋳型としてプライマーセット（ＰＧＬ３−３８７Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）およびＰＧＬ３−１２４９Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０））を用いて行ったＰＣＲ、およびプライマーＰＧＬ３−３８７Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ＰＧＬ３−１２４９Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）およびＰＧＬ３−ｉｎｔ５Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を用いて行ったＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるジデオキシ法により確認したところ、図２の上段に示す様な構造を有するＤＮＡフラグメントが、ベクター中に発現可能に挿入されていることが示され、目的とする真核細胞発現ベクターが構築されたことが示された。
実施例６：ルシフェラーゼを利用した発現ベクターにおけるスプライシング
本実施例においては、実施例５において作製した発現ベクターを使用して真核細胞にトランスフェクトし、介在フラグメントが挿入されたルシフェラーゼ遺伝子において実際にスプライシングが生じるか否かを確認することを目的として行った。
実施例５において作製した発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターが、細胞中でスプライシングを生じるかどうかを検討するため、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＨＥＫ２９３細胞（理研）にｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターをトランスフェクトし、細胞内でスプライシングが生じるかどうかを化学発光を検出することにより確認した。この、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＨＥＫ２９３細胞（理研）は、馬胎児血清を終濃度１０％になるように添加したＤＭＥＭ培地中で継代培養することができる。このようにして継代培養した、３．１×１０４個のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞および３．１×１０４個のＨＥＫ２９３細胞に対して、実施例５において作製した発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター０．２７μｇおよびトランスフェクション効率を補正するためのｃｏ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｖｅｃｔｅｒｐＲＬ−ＣＭＶベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃  ＡＦ０２５８４３、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）２０ｎｇを、カチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．３４μｌと混合した溶液を用いてトランスフェクトした。
発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＨＥＫ２９３細胞は、介在配列が挿入されたルシフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントから合成されたＲＮＡのスプライシングにより機能可能な発光タンパク質が発現しているかどうかを、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた測定に基づいて確認した。すなわち、このようにして細胞内において発現ベクターを発現させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＨＥＫ２９３細胞を、上述した培養液中で、３７℃、湿潤条件下にて１日間培養した後、培地を除去後Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔにて溶解し、ルミネッセンサー（アトー（株））で発光を測定した。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔで細胞を処理後にホタルルシフェラーゼによる発光を測定し、ｐＲＬ−ＣＭＶにより発現したウミシイタケ・ルシフェラーゼによる発光をＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔによる処理により測定した。それぞれの発光の積算値を記録し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼによる発光量で除することで、トランスフェクション効率の誤差を補正した後、ホタルルシフェラーゼによる発光量を比較した（図１８ＡおよびＢ）。
陽性対照としてルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを含むｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター、陰性対照としてルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡを含まないｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターをそれぞれトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＨＥＫ２９３細胞内での化学発光を同様にして検出した。結果を図１８ＡおよびＢに示す。
この図においても示されるように、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターをトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内では化学発光がほとんど検出されず、一方ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクターをトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内では強い化学発光が検出された。これに対して、ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターをトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内では、陽性対照よりも弱いが明確な化学発光を生じることが明らかになった。したがって、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内においては、ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターは、トランスフェクトした細胞内において介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じ、機能可能なルシフェラーゼを発現しうることが示された。
一方、ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞内では、実質的にルシフェラーゼ活性しか生じないことが明らかになった。従って、ＨＥＫ２９３細胞内において、ルシフェラーゼのエクソン３とエクソン４のあいだでのスプライシングが生じず、結果としてｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターでは、トランスフェクトした細胞内において介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が、生じないことが示された。
次に、このようにして細胞内において発現ベクターを発現させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、上述した培養液中で、３７℃、湿潤条件下にて１日間培養した後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、細胞内から発現されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。回収した１ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用したＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液中（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  １０μｌ）には、プライマーセットＥＧＦＰ−Ｆ−６５およびＥＧＦＰ−Ｒ−３９１（各終濃度０．６μＭ）が含有された。このＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５０℃にて３０秒−７２℃にて９０秒、３５サイクル）、さらに７２℃にて１０分で反応させた。
上記とは別に、あるいはプライマーセットとしてＴＥＸ１０−ＦおよびＴＥＸ１０−Ｒを加えたＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５２．３℃にて３０秒−７２℃にて３０秒、３０サイクル）、さらに７２℃にて１分で反応させた。
ＲＴ−ＰＣＲ法で調製した増幅断片を鋳型としてＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたジデオキシ法により塩基配列を確認した。
実施例７：ＤＮＡフラグメントおよび発現ベクターの構築（４）
本実施例においては、実施例５において作製したｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターを使用し、そして選択的スプライシングを起こすことが知られているエクソンとして、ヒトｔａｕ遺伝子のエクソン２およびその上流イントロン部分および下流イントロン部分から構成されるＤＮＡ領域を利用して、実施例３に記載の方法と実質的に同様な方法により、ＤＮＡフラグメントを構築した。
ｔａｕ遺伝子のエクソン２を含む選択的スプライシングカセットとしては、ｔａｕ遺伝子のエクソン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）およびその上流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）および下流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の順番に並べた配列から構成されるＤＮＡ領域を利用する。ｔａｕ遺伝子の所望の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２１〜２３）は、ヒト血液からＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単離精製したゲノムＤＮＡから入手した。
ｔａｕ遺伝子のエクソン３を含む選択的スプライシングカセットとしては、ｔａｕ遺伝子のエクソン３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）およびその上流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）および下流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２の順番に並べた配列から構成されるＤＮＡ領域を利用する。ｔａｕ遺伝子の所望の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４０〜４２）は、ヒト血液からＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単離精製したゲノムＤＮＡから入手した。
ｔａｕ遺伝子のエクソン１０を含む選択的スプライシングカセットとしては、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）およびその上流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および下流イントロン部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の順番に並べた配列から構成されるＤＮＡ領域を利用する。ｔａｕ遺伝子の所望の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４〜６）は、ヒト血液からＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単離精製したゲノムＤＮＡから入手した。
発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター中に挿入した介在フラグメントＧＬ３ｉｎｔ１中のクローニング部位に、上述したｔａｕ遺伝子のエクソン２選択的スプライシングカセット、エクソン３選択的スプライシングカセット、またはエクソン１０選択的スプライシングカセット、のいずれかを挿入することにより、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを作製した。発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター中に挿入したＤＮＡフラグメント中の介在フラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）には、その３５８〜３６３番ヌクレオチドに制限酵素ＰｍａＣＩ部位（ＣＡＣＧＴＧ）が存在し、この制限酵素部位を酵素で切断すると平滑末端を形成する。本発明においては、この制限酵素部位を、クローニング部位として利用して、上述したｔａｕ遺伝子のいずれかのエクソンを含む選択的スプライシングカセットを挿入した。
具体的には、５０ｎｇの発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターおよび６０ｎｇの上述のいずれかの選択的スプライシングカセットを、それぞれＰｍａＣＩにて３７℃にて１７時間処理し、平滑末端を作製した。この処理により解裂したベクターをＣＩＡＰにて脱リン酸化した。このサンプルをあわせ、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１）を用い、１６℃にて１７時間反応させることにより発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター中に上述の選択的スプライシングカセットを挿入したＤＮＡフラグメントを組み込んだ。
ライゲーション反応液により形質転換した大腸菌ＪＭ１０９より抽出した発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを鋳型として、それぞれプライマーセット（ＰＣＩＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびＰＣＩＲ（ＳＥＱ  ＴＤ  ＮＯ：８））を用いて行ったＰＣＲおよびプライマーＰＣＩＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）あるいはＰＣＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を用いて行ったＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるジデオキシ法により確認したところ、図２の中段に示す様な構造を有するＤＮＡフラグメントが、発現ベクターｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターのいずれの中にも、発現可能に挿入されていることが示され、目的とする真核細胞発現ベクターが構築されたことが示された。
実施例８：タウ遺伝子エクソン２、エクソン３、およびエクソン１０についての選択的スプライシング
本実施例においては、実施例７において作製した３種の発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを使用して真核細胞にトランスフェクトし、ｔａｕ遺伝子エクソン２、エクソン３、またはエクソン１０について実際に選択的スプライシングが生じるか否かを確認することを目的として行った。
本実施例においては、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターをトランスフェクトするために、ＣＯＳ１細胞（理研）を使用した。この、ＣＯＳ１細胞（理研）は、馬胎児血清を終濃度１０％になるように添加したＤＭＥＭ培地中で継代培養することができる。このようにして継代培養した、２×１０３個のＣＯＳ１細胞に対して、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター０．８μｇを、カチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを混合した溶液を用いてトランスフェクトした。発現ベクターによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞は、目的とする選択的スプライシングカセットが挿入されたＤＮＡフラグメントから合成されたＲＮＡのスプライシングによりが機能可能な発光タンパク質（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が発現しているかどうかを、化学発光測定装置（Ａｓｃｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  ＣＦ）を用いた観察に基づいて確認した（図１９）。
比較対照として、実施例５において作製した陽性対照ベクターｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ、または本発明のＤＮＡフラグメントＧＬ３ｉｎｔ１を組み込んだが選択的スプライシングカセットを含まないｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター、または陰性対照であるｐＣＩ−ｎｅｏベクター、のいずれかによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞を使用した（図１９）。
この実験の詳細な結果を、以下の表１に示す。この実験の結果、ＣＯＳ１細胞において、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトした場合には、ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトした場合よりもやや低いルシフェラーゼ活性を有すること、そしてｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクターによりトランスフェクトした場合には顕著に高いルシフェラーゼ活性を有することが示された。これに対して、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターによりＣＯＳ１細胞をトランスフェクトした場合には、ルシフェラーゼ活性がほとんど示されなかった（図１９）。
【表１】
2008102903.tif 000003
これらの結果から、
ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクターによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内において介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていること；
ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクターによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内では、主としてｔａｕ遺伝子エクソン２の両端２箇所ともでスプライシングが生じた結果、エクソン２を２つのリポーターフラグメント間に残存させるようにエクソン２の両側の介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が多く生じていること；
ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ３ベクターによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内では、エクソン３を２つのリポーターフラグメント間に残存させるようにエクソン３の両側の介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じるとともに、ｔａｕ遺伝子のエクソン３を含まないように介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じていること；そして
ｐＣＩ−ＧＦＰｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内では、エクソン１０を２つのリポーターフラグメント間に残存させるようにエクソン１０の両側の介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象が生じるとともに、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０を含まないように介在フラグメント（イントロンに相当）が除去されるスプライシング現象も生じていること；
が明らかになった。
次に、このようにして細胞内において発現ベクターｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクターおよびｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターを発現させたＣＯＳ１細胞を、上述した培養液中で、３７℃、湿潤条件下にて２日間培養した後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、細胞内から発現されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。回収した５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用したＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液中（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ２５μｌ）には、本発明のルシフェラーゼタンパク質の第一のフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）上の配列にハイブリダイズするＰＧＬ３−５２０Ｆプライマー（ｃｇｔｃａｃａｔｃｔ  ｃａｔｃｔａｃｃｔｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）および本発明のルシフェラーゼタンパク質の第二のフラグメント上の配列にハイブリダイズするＰＧＬ３−８２０Ｒプライマー（ｔａａｔｃｃｔｇａａ  ｇｇｃｔｃｃｔｃａｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）（各１０ｐｍｏｌ）プライマーセットが含有された。このプライマーセットは、細胞内において本発明のルシフェラーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡが形成される場合（すなわち介在配列がエクソンとともに完全にスプライスアウトされる場合）には３３９ｂｐのＰＣＲ産物を生成し、細胞内において本発明のルシフェラーゼタンパク質の第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン２、エクソン３、またはエクソン１０が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成される場合には、それぞれ４２６ｂｐ、４２６ｂｐまたは４３２ｂｐのＰＣＲ産物を生成する。このＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５９．６℃にて３０秒−７２℃にて１分、３０サイクル）、さらに７２℃にて５分で反応させた（図２０）。
上記とは別に、プライマーセットとしてヒトｔａｕ遺伝子のエクソン２にハイブリダイズするプライマーペア（すなわち、ＴＥＸ２−Ｆプライマー（ａａｔｃｔｃｃｃｃｔｇｃａｇａ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）およびＴＥＸ２−Ｒプライマー（ｃｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔｇｇａｇｔｇｃｔ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５））、エクソン３にハイブリダイズするプライマーペア（すなわち、ＴＥＸ３−Ｆプライマー（ａｔｇｔｇａｃａｇｃａｃｃｃｔｔａｇｔ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）およびＴＥＸ３−Ｒプライマー（ｃｔｇｔｇｇｔｔｃｃ  ｔｔｃｔｇｇｇａ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６））、またはエクソン１０にハイブリダイズするプライマーペア（すなわち、ＴＥＸ１０−Ｆプライマー（ｇｔｇｃａｇａｔａａ  ｔｔａａｔａａｇａａ  ｇｃｔ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）およびＴＥＸ１０−Ｒプライマー（ａｃｔｇｃｃｇｃｃｔ  ｃｃｃｇｇｇ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））、のいずれかを加えたＲＴ−ＰＣＲ反応溶液を５０℃にて３０分（逆転写反応）、９５℃にて１５分に続くＰＣＲ（９４℃にて３０秒−５２．３℃にて３０秒−７２℃にて３０秒、３０サイクル）、さらに７２℃にて１分で反応させた（図２０）。細胞内において本発明のルシフェラーゼタンパク質の第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン２が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成される場合には、ＴＥＸ２−Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）およびＴＥＸ２−Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）のプライマーセットにより、ｔａｕ遺伝子のエクソン２の８７ｂｐのＰＣＲ産物を（図２０Ａ）；第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン３が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成される場合には、ＴＥＸ３−Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）およびＴＥＸ３−Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）のプライマーセットにより、ｔａｕ遺伝子のエクソン３の８７ｂｐのＰＣＲ産物を（図２０Ｂ）；そして第一のフラグメントと第二のフラグメントの間にｔａｕ遺伝子のエクソン１０が挿入された配列からなるｍＲＮＡが生成される場合には、ＴＥＸ１０−Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）とＴＥＸ１０−Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）のプライマーセットによりＰＣＲにより、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０の９３ｂｐのＰＣＲ産物を（図２０Ｃ）、それぞれ生成する。
ｐＣＩ−ｎｅｏベクター、ｐＧＬ３ｃｏｎｔｒｏｌベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、またはｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクターのいずれかによりトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞から得たｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルについて、ＰＧＬ３−５２０Ｆプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）とＰＧＬ３−８２０Ｒプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のプライマーセットによりＰＣＲを行ったサンプルについて、電気泳動を行った結果を図２１として示す。この図において、レーン１はｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター、レーン２はｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター、レーン３はｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター、レーン４はｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター、レーン５はｐＧＬ３ｃｏｎｔｒｏｌベクター、そしてレーン６はｐＣＩ−ｎｅｏベクターにより、それぞれトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞から採取したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをサンプルとして用いた。
ＲＴ−ＰＣＲを行った結果、ｐＧＬ３ｉｎｔ１ベクター（レーン１）およびｐＧＬ３ｃｏｎｔｒｏｌベクター（レーン５）をトランスフェクトした場合には３３９ｂｐのｍＲＮＡ生成物のみが得られたが、これに対して、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ２ベクター（レーン２）では４２６ｂｐのｍＲＮＡのみが、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ３ベクター（レーン３）では実質的に３３９ｂｐのｍＲＮＡのみが、そして、ｐＧＬ３ｉｎｔ１−ＴＥ１０ベクター（レーン４）では３３９ｂｐと４３２ｂｐの２本のｍＲＮＡが、それぞれ産生されていることが確認された（図２１）。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
発現ベクター中に挿入した上述した配列構造を有するＤＮＡフラグメントを利用して真核細胞をトランスフェクトし、ＤＮＡフラグメントを発現させることにより、細胞内で目的とするエクソンにおいて選択的スプライシングが生じるか否かを、ｉｎ  ｓｉｔｕでリアルタイムモニタリングすることができる。このモニタリング系は、ベクターを変更することにより、あらゆる生物について適用することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験のいずれにおいても利用することができる。また、リポーター遺伝子の発現は、従来の検出方法のいずれを用いても検出することができるため、新たな装置を用意することなく、選択的スプライシングが生じるか否かを、ｉｎ  ｓｉｔｕでリアルタイムモニタリングすることができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2008102903.tif 000036
【図１４】
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【図１９】
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【図２１】
2008102903.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月2日(2008.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメント；
前記第一のフラグメントおよび第二のフラグメントとの間に位置する介在フラグメントであって、スプライシングモチーフを有し、そしてクローニング部位を含む介在フラグメント；
前記クローニング部位に挿入された、選択的スプライシングを起こすことが知られているか、または予想されている遺伝子のうち、選択的スプライシングの対象となるエクソンおよびその上流および下流のイントロン部分から構成される外来性の選択的スプライシングカセット；
を含む、選択的スプライシングカセット内の配列が細胞内で選択的スプライシングを生じさせるか否かを検出するためのＤＮＡフラグメント。
【請求項２】
リポータータンパク質が、蛍光タンパク質または色素タンパク質である、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項３】
リポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＦ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項４】
リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントおよび第二のフラグメントが直接連結される場合に、リポータータンパク質をコードするＤＮＡが形成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項５】
クローニング部位が複数存在し、その内のいずれか一つのクローニング部位に外来性の選択的スプライシングカセットが挿入されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
選択的スプライシングカセットが、ｔａｕ遺伝子のエクソン１０およびその上流および下流のイントロン部分から構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項８】
請求項１〜５および７のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメントを、タンパク質発現用ベクターのクローニング部位に挿入することにより作製された、真核細胞発現ベクター。
【請求項９】
タンパク質発現用ベクターが、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ４７１２０）、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃：Ｕ４７２９６）からなる群から選択される真核細胞発現用ベクターである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
真核細胞にトランスフェクトさせて発現させた場合に、細胞内で選択的スプライシングが生じた結果、前記第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結されて機能的なリポータータンパク質が生成されるか、または前記第一のフラグメントと選択的スプライシングカセット中のエクソンと第二のフラグメントとから形成される、リポータータンパク質としての機能を有さない融合タンパク質が生成される、請求項８または９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
真核細胞に請求項８〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクターをトランスフェクトさせ、
当該トランスフェクトされた真核細胞を培養し、
細胞内において発現ベクター中に挿入されたＤＮＡフラグメントを発現させ、
選択的スプライシングの結果リポータータンパク質をコードするＤＮＡのコード領域の第一のフラグメントと第二のフラグメントとが直接連結することにより生成される機能的なリポータータンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕにてモニタリングすること、
を含む、真核細胞内での選択的スプライシングをｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングする方法。
【請求項１２】
請求項１〜５および７のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント；
いずれかの真核細胞発現ベクター；
を含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキット。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の真核細胞発現ベクターを含む、所望の外来性エクソンの選択的スプライシングを検出するためのキット。
【国際調査報告】
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2008102903.tif 000041
2008102903.tif 000042
2008102903.tif 000043
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