【手続補正書】
【提出日】平成17年2月25日(2005.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明で得られる結果は、化合物 (I ‐ VI)、その薬学的に有用な塩、特に Na-塩の大規模な合成についての技術を開発に導く。本発明化合物 (I-VI) の合成は、Na2CO3 を含有する水-有機溶媒中で混合カルボン酸−カルボン酸無水物によるL-システイン酸、L-ホモシステインおよび L-システインスルフィン酸のアミノ基の直接的アシル化を包含する。2-プロパノール-水の混合物中での化合物 (I ‐ VI) のナトリウム塩の溶解性が、不溶性の夾雑物(無機塩および出発のアミノ酸) を分離するのを可能にする。純粋の化合物 (I ‐ VI)を、メタノール-2-プロパノール混合物を用いて、その 2-プロパノール-水の濃縮溶液からの沈澱により得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
MDA-MB-231 細胞の培養基中、10-11 M 〜 10-6 M の濃度範囲でナトリウム塩の形態において発明化合物 I 〜 VI の細胞毒性を検討した試験で、下記の従属性を認めた：発明化合物の濃度増加で細胞成長阻害が高まり、化合物 I および II について 50% に近い値に、化合物 III および IV について 35% に近い値に、化合物 V および VI について 30% に近い値に達した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
パクリタキセル/化合物 (I-VI) 製剤をつくるために、化合物 I 〜 VI のナトリウム塩を対応の酸形態に転換し、メタノールに溶解した。同じパクリタキセル濃度で、パクリタキセル と化合物 I またはパクリタキセルと化合物 II の製剤は、70% に近い高細胞成長阻害（ポジティブ対照のパクリタキセル単独に比して 45%に近い)を示した;パクリタキセルと化合物 III またはパクリタキセルと化合物 IV の製剤は、60% に近い高細胞成長阻害（ポジティブ対照のパクリタキセル単独に比して 30%に近い)を示した;パクリタキセルと化合物 V またはパクリタキセルと化合物 VI の製剤は、55% に近い高細胞成長阻害（ポジティブ対照のパクリタキセルに比して 25%に近い)を示した。パクリタキセル : 化合物 (I-VI) の分子（モル）比率は 1:7 であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
化合物 (I-VI) /パクリタキセルの混合ミセル系を最適にするのに、異なる分子比率のパクリタキセル: 化合物 (I-VI) およびビヒクルを用いる。本発明の混合ミセル系は、水溶液中で稀釈 100 倍まで薬剤の沈澱を生じない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
パクリタキセルと化合物 (I-VI) のメタノール溶液をパクリタキセル: 化合物 (I-VI) の異なる分子比率 1:3、1:5、1:7 で混合した。減圧で有機溶媒を蒸発し、得られた乾燥フィルムを、蒸留水または0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6 または 10% エタノール溶液または 0.15 M NaCl 溶液または 10 % エタノール溶液中の0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6 の添加により溶解させ、化合物 (I - VI)/パクリタキセル の混合ミセル溶液を得た。これらの溶液を 0.22 μm 無菌フィルターでろ過し、4 ℃で保存する。これらの原型系のすべてが有意の抗腫瘍活性をインビトロで 3 週間示した。 沈澱などの大きい変化を保存中に認めなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
さらに、本発明は、患者に投与用のパクリタキセルの製剤を調製する方法を使用可能にする。これは、第１溶媒にパクリタキセルを溶解する工程、第２溶媒に化合物 (I-VI) を溶解する工程、得られたパクリタキセル溶液および該化合物のアリコートを所望のモル比率で混合する工程、得られた混合物を蒸発乾固してパクリタキセルおよび該化合物の残渣を形成する工程、該残渣を水溶液に溶解し、形成した溶液を凍結乾燥し、患者への投与に適したビヒクルを用いて凍結乾燥産物を再構築する工程を含む。
本発明を下記の非限定的な実施例で詳細に説明する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
腫瘍細胞 (60 × 103 細胞/mL) の懸濁液を、5% FBS および抗生物質を有する MEM 中で調製した。細胞懸濁液 (200 μL) を Nunclon 96-ミクロウエルプレート (Nunc A/S, Denmark) のウエルに密度12 × 103 細胞/ウエルで播いた。試験する薬物の溶液を培養基に 0 日または 1 日目に用量 2 μL を加えた。すべての場合、細胞を 3 日間インキュベートした。
インキュベーションの終りに、固着細胞をトリプシン処理により剥がし、生細胞数をトリパンブルー排除試験および血球計で数えた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） および改善製剤 (Taxol（登録商標） ＋ 化合物 I) の細胞毒性の評価、パクリタキセル : 化合物 I の分子比率に関連
発明製剤の最初の溶液をパクリタキセル/化合物Ｉの分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で調製した。これらの溶液から、培養基に加えるため 5% FBS を有する MEM 中で作業溶液を調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
発明製剤 (Taxol（登録商標） ＋ 化合物 I) の溶液で、5% FBS を含有する MEM 中 パクリタキセル/化合物 I の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20で処理した培養基は下記の生細胞数を有した：
1:1:   (26.9 ± 1.60) × 103, 細胞成長阻害が 48.6% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 17.2% (p < 0.05);
1:3:   (22.2 ± 1.79) × 103, 細胞成長阻害が 57.6% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 31.7% (p < 0.002);
1:6:   (17.5 ± 1.34) × 103, 細胞成長阻害が 66.5% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 46.2% (p < 0.001);
1:10:  (15.8 ± 1.38) × 103, 細胞成長阻害が 69.8% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 51.4% (p < 0.001);
1:15:  (15.1 ± 1.47) × 103, 細胞成長阻害が 71.1% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 53.5% (p < 0.001);
1:20:  (14.4 ± 1.16) × 103, 細胞成長阻害が 72.5% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 55.7% (p < 0.001)。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-８ M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価した。
培養３日後で対照培養基は(54.4 ± 2.51) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は(29.3 ± 1.13) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 46.1% (p < 0.001)であった。. 
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-８ M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、試験溶液の細胞毒性を評価した。
培養３日後で対照培養基は(54.0 ± 1.60) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセル濃度 10 nM の Taxol（登録商標） で処理した培養基は (29.0 ± 0.91) × 103 細胞を含有した。細胞成長阻害は 46.3% (p < 0.001) であった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
化合物 II の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:     (42.3 ± 2.32) × 103, 細胞成長阻害 27.9% (p < 0.001);
10-10 mol/L:     (38.1 ± 1.18) × 103, 細胞成長阻害 35.1% (p < 0.001);
10-9 mol/L:      (34.5 ± 1.94) × 103, 細胞成長阻害 41.2% (p < 0.001);
10-8 mol/L:      (31.4 ± 1.62) × 103, 細胞成長阻害 46.5% (p < 0.001);
4 × 10-8 mol/L:  (31.2 ± 2.33) × 103, 細胞成長阻害 46.8% (p < 0.001);
10-7 mol/L:      (31.7 ± 1.54) × 103, 細胞成長阻害 46.0% (p < 0.001);
10-6 mol/L:      (28.4 ± 1.02) × 103, 細胞成長阻害 51.6% (p < 0.001)。
このように、化合物 II が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮した。細胞成長阻害の程度は、化合物 II の濃度の増加により 51.6%  (p < 0.001) 増加した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
表３．ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-2W および OF-2SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表３】
2005508287.tif 000001
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
OF-3W および OF-3SAB の調製物を 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5,6 (OF-3W/SAB) または蒸留水 (OF-3SAB/W) で再製した。溶液 OF-3W/SAB および OF-3SAB/W の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞系で、保存後に試験した (結果を表４に示す)。細胞培養基中のパクリタキセルおよび 化合物 III の最終濃度はそれぞれ 1・10-8 M および 7・10-8 M であった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
表４．ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-3W および OF-3SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表４】
2005508287.tif 000002
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
表５．ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-4W および OF-4SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表５】
2005508287.tif 000003
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
表６．ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-5W および OF-5SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表６】
2005508287.tif 000004
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
実施例４２
乾燥化合物 VI/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF-6) の調製および長期間保存
乾燥化合物 VI/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-6W) および乾燥化合物 VI/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-6SAB) を、乾燥化合物 I/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-1) について記載したように得た。OF-6W および OF-6SAB の調製物を粉末として 1 または 180 日間 4℃で保存した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
表７．ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-6W および OF-6SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表７】
2005508287.tif 000005