(57)【要約】  エストロゲン受容体に結合し、かつ、ABCA1活性を活性化する物質、例えば、エストロゲン受容体に対する拮抗阻害物質又は選択的エストロゲン受容体作動物質を有効成分とすることを特徴とする動脈硬化抑制剤を提供する。本発明の動脈硬化抑制剤は、マクロファージ細胞においてABCA1の発現を増強するが、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させず、優れた動脈硬化抑制機能を有する動脈硬化抑制剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲン受容体に結合し、かつ、ABCA1活性を活性化する物質を有効成分とすることを特徴とする、動脈硬化抑制剤。
【請求項２】
上記動脈硬化抑制剤の有効成分が、エストロゲン受容体に対する拮抗阻害物質又は選択的エストロゲン受容体作動物質であることを特徴とする、請求項１記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項３】
前記動脈硬化抑制剤において、有効成分が結合するエストロゲン受容体が、エストロゲン受容体βであることを特徴とする、請求項１又は２記載の動脈硬化抑制剤。
【請求項４】
前記動脈硬化抑制剤の有効成分が、
(Z)-2-[p-(1,2-diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethylamine、
7-alpha-[9-(4,4,4,5,5-pentafluoropent-ylsulphinyl)nonyl]estra-1,3,5-(10)-triene-3,17beta-diol、及び、
［6-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）benzo［b］thien-3-yl］［4-（2-piperidin-1-ylethoxy）phenyl］methanone
からなる群から選ばれる１種以上の物質であることを特徴とする、請求項１記載の動脈硬化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈壁からのコレステロールの排出を即す生体内物質である、ABCA1の働きを活性化することにより、動脈硬化等の予防・治療を行うことが可能な動脈硬化抑制剤に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化を抑制するために高脂血症改善薬として現在使用されている薬剤の多くは、コレステロール合成に関与する酵素の阻害剤である。これらにより血中コレステロール値は低下するが、臨床知見より、血中コレステロール値と動脈硬化発症が必ずしも関連しないことが知られている。また、これらの動脈硬化への関与は直接的なものではなく、コレステロール合成を通じた間接的なものである。【０００３】
このことから、従来の高脂血症改善薬では動脈硬化に対する効果は限定的なものである可能性が強い。【０００４】
以上のことにより、直接的に動脈硬化を引き起こす現象に作用することで、その症状を低減させる薬が望まれる。【０００５】
動脈硬化は、（１）マクロファージ細胞が障害を受けた血管内皮に進入、（２）マクロファージ細胞内へのコレステロールの蓄積、（３）血管平滑筋の増殖等、が複合的に起きている病態である。【０００６】
これらの中でも、マクロファージ細胞内へのコレステロールの蓄積が症状の悪化に深く関与していると考えられている。【０００７】
マクロファージ細胞内へのコレステロールの蓄積を低減させる方法として、マクロファージ細胞においてコレステロール排出に関与することが知られているABCA1タンパク質の量を制御することが考えられる。【０００８】
ＡＴＰ結合タンパク質(ATP binding cassette)の一種であるABCA1タンパク質をコードする遺伝子の発現は、核内受容体ファミリーに属する肝臓X受容体（LXR）により制御されていることが知られており、LXRアゴニスト存在下で発現が増強することが知られている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2002,99,7604-7609：非特許文献１)。【０００９】
一方、LXRの活性化は、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させることも知られており(Mol. Cell. Biol.2006,26,6786-6798：非特許文献２)、LXRアゴニストは好ましくない作用を及ぼすことが考えられ、実用に供されていない。
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2002,99,7604-7609
【非特許文献２】Mol. Cell. Biol. 2006,26,6786-6798
【非特許文献３】J. Med. Chem.,2004,47,2171-2175
【非特許文献４】Bioorg. Med. Chem. Lett.,2005,15,1675-1681
【非特許文献５】J. Biol. Chem.,2002,277,5692-5697
【非特許文献６】EMBO Rep.,2000,1,190-196
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のことより、本発明は、マクロファージ細胞においてABCA1の発現を増強するが、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させない物質を有効成分とする動脈硬化抑制剤を提供することを課題とする発明である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、女性ホルモンの一種であるエストロゲン受容体に対する結合物質、特に、当該受容体に対する拮抗阻害物質（以下、エストロゲンアンタゴニストともいう）又は選択的エストロゲン受容体作動物質に、優れたABCA1の活性化能（ABCA1タンパク質の発現量を増大させる機能）が認められ、かつ、肝臓細胞において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させないことを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、エストロゲン受容体に結合し、かつ、ABCA1活性を活性化する物質、具体的には、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質を有効成分とすることを特徴とする、動脈硬化抑制剤（以下、本抑制剤ともいう）を提供する発明である。【００１３】
なお、本発明で、「エストロゲン受容体」とは、特に断らない限り、エストロゲン受容体αとβの双方を含むこととする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、マクロファージ細胞においてABCA1の発現を増強するが、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させず、優れた動脈硬化抑制機能を有する動脈硬化抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、ＡＢＣＡ１タンパク質の細胞内量の増加をウエスタンブロット法にて検討した結果を示す図面である。
【図２】エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、ＡＢＣＡ１プロモーター遺伝子の活性化について検討した結果を示す図面である。
【図３】エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、コレステロールの細胞外排出の増加について検討した結果を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
［有効成分］
ABCA1の発現を増強する本抑制剤の有効成分であるエストロゲンアンタゴニストならびに選択的エストロゲン受容体作動物質は、既存の薬剤であっても、未知の薬剤であっても、エストロゲン受容体に結合して、生体内におけるABCA1タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する物質であれば特に限定されない。【００１７】
エストロゲンアンタゴニストとしては、例えば、ICI 182780(fulvestrant)を挙げることができる。また、選択的エストロゲン受容体作動物質としては、例えば、タモキシフェン(tamoxifen:TAM))、ラロキシフェン(Raloxifen:Ral)を挙げることが出来る。ここで、選択的エストロゲン受容体作動物質とは、臓器や組織の部位によって作用が異なり、ある部位ではエストロゲン様の作用を示すが、別の部位ではエストロゲンに対する拮抗作用を示す物質を意味する。【００１８】
エストロゲンアンタゴニストであるICI 182780は、タモキシフェン治療後に転移した閉経後の女性におけるホルモンレセプター陽性の乳がんの治療に用いられている物質で7-alpha-[9-(4,4,4,5,5-pentafluoropent-ylsulphinyl)nonyl]estra-1,3,5-(10)-triene-3,17beta-diolとして規定される化合物である。ICI 182780は、公知の方法により製造して、これを本抑制剤の有効成分とすることが可能である。また、ICI 182780は、癌治療薬として、アストラゼネカ社から入手することが出来る。【００１９】
選択的エストロゲン受容体作動物質のうち、タモキシフェンは、現在、乳ガン、卵巣癌等のエストロゲンの増加が癌の進行を助長する癌の治療剤として用いられている物質で、具体的には(Z)-2-[p-(1,2-diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethylamine。タモキシフェンは、公知の方法により製造して、これを本抑制剤の有効成分とすることが可能である。また、タモキシフェンは、癌治療薬として、アストラゼネカ社から入手することが出来る。【００２０】
また、ラロキシフェンは、閉経後女性における骨粗鬆症の治療に用いられている物質で、［6-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）benzo［b］thien-3-yl］［4-（2-piperidin-1-ylethoxy）phenyl］methanone。ラロキシフェンは、公知の方法により製造して、これを本抑制剤の有効成分とすることが可能である。ラロキシフェンは、骨粗鬆症治療薬として、中外製薬から入手することが出来る。【００２１】
また、エストロゲンアンタゴニスト作用ならびに選択的エストロゲン受容体作動作用が知られていない既存物質や、新たな合成物質ならびに天然物質のエストロゲンアンタゴニスト作用ならびにABCA1タンパク質発現の増強を検出して、当該物質を本抑制剤の有効成分として用いることも可能である。【００２２】
このようなエストロゲンアンタゴニストの検出には、被験物質に対して、エストロゲンアンタゴニストとして検出することができるスクリーニングアッセイならびにABCA1タン
パク質の発現量を検出することができるスクリーニングアッセイを施して、被験物質の一部又は全部をABCA1タンパク質の発現を増強することが出来るエストロゲンアンタゴニストとして選択することができる。【００２３】
エストロゲンアンタゴニストとして検出することができるスクリーニングアッセイ法としては、例えば、遺伝子の発現を検出する方法（J. Med. Chem., 2004, 47, 2171-2175：非特許文献３）や受容体とリガンドの結合を検出する方法（Bioorg. Med. Chem. Lett.,  2005, 15, 1675-1681：非特許文献４）を挙げることができる。典型的には、レポーターベクターとして、レポーター遺伝子としてホタル由来ルシフェラーゼを使用し、その上流にエストロゲン受容体結合領域を含む塩基配列を組み込んだベクターと、エストロゲン受容体発現ベクターとして、動物細胞用遺伝子発現ベクターに、エストロゲン受容体βをコードする遺伝子(配列番号１)、又は、エストロゲン受容体αをコードする遺伝子(配列番号２)、を組み込んだベクターを動物細胞に導入し、エストロゲン(和光純薬工業)のみ、あるいはエストロゲンと被験物質とを共存させた動物細胞の培地に添加し、ルシフェラーゼの発現量をルシフェラーゼで分解されると発光する物質を使用し発光量を比較することでエストロゲンアンタゴニストを検出することが可能である。【００２４】
ABCA1タンパク質の発現量を検出することができるスクリーニングアッセイ法としては、例えばタンパク質を膜に固定し検出する方法(J. Biol. Chem., 2002, 277, 5692-5697：非特許文献５)やタンパク質をプラスチックに固定し検出する方法(EMBO Rep., 2000, 1, 190-196：非特許文献６) を挙げることができる。典型的には、タンパク質を還元、変性後、ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、ニトロセルロース膜あるいはポリフッ化ビニリデン膜に電気的に固定後、ABCA1タンパク質を認識する抗体と、この抗体を認識する西洋わさび由来パーオキシダーゼが結合した抗体を使用し、パーオキシダーゼにより分解されると発光する物質を使用し発光量を比較することでABCA1タンパク質の発現量を比較、検出することが可能である。【００２５】
上記のようなスクリーニング方法により選別された新たなABCA1タンパク質発現の増強能を有するエストロゲンアンタゴニストを、本抑制剤の有効成分として用いることができる。【００２６】
本抑制剤による、有効成分に換算した投与量は、具体的に選択されたエストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質、により異なり、適宜決定されるものであるが、例えば、タモキシフェン又はラロキシフェンの場合には、大人１日あたり20mg〜40mg程度であり、ICI 182780の場合には、大人１日あたり4mg〜8mg程度である。また、投与経路は限定されず、例えば、経口であっても、皮下であってもよい。【００２７】
本抑制剤の剤型は、特に限定されず、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤等が例示可能である。【００２８】
また、本抑制剤には、各種の添加剤をその剤型等に応じて添加することが可能である。当該添加剤としては、例えば、基礎剤として、溶剤、基剤、賦形剤を添加することが可能である。また、補助剤として、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、可塑剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保湿剤等の補助剤を添加することが可能である。また、緩衝剤、等張化剤、安定剤、無痛化剤、保存剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、着色剤等を添加することも可能である。【００２９】
これらの製剤組成物中のエストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の配合量は、具体的な当該アンタゴニスト等に応じて適宜選択可能であるが、概ね、製剤組成物全体に対して１〜４０質量％程度である。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明を、実施例を用いてさらに具体的に説明するが、この記載により、本発明が限定的に解釈されるべきものではない。【００３１】
［試験例１］エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、ＡＢＣＡ１タンパク質の細胞内量に対する影響の検討
ヒト単球細胞株であるTHP-1細胞を、PMA処理によりマクロファージ化させ、エストロゲンアンタゴニストであるICI 182780（ICI）、選択的エストロゲン受容体作動物質であるタモキシフェン(TAM)及びラロキシフェン（Ral）を、100nMとなるよう添加して、以後、37℃、湿度100%、CO2濃度 5%の条件にてインキュベーションを行った。T0901317［N-Ethyl-N-[4-(1-hydroxy-1-methyl-ethyl)-phenyl]-benzenesulfonamide：Liver X Receptor(LXR)に対するアゴニスト］は、ABCA1の発現が増加するポジティブコントロールとして用いた。図１では、各被験物質を添加後、24時間培養したTHP-1細胞より得られた細胞抽出液を、抗ABCA1モノクローナル抗体（AB.H10、abcam社）を用いたウェスタン解析法にてABCA1タンパク質を検出した結果、エストロゲン受容体βのアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加により、当該タンパク質量が増加していることが確認されたことを示している。【００３２】
［試験例２］エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、ＡＢＣＡ１プロモーター遺伝子の活性化についての検討
ヒト繊維芽細胞株である293細胞に、ABCA1プロモーターのレポータープラスミドとエストロゲン受容体α、βの発現プラスミドを共に導入し、上記試験例１と同様の被験物質を100nMとなるよう添加し、以後、37度、湿度100%、CO2濃度 5%の条件にてインキュベーションを行った。ABCA1プロモーターのレポータープラスミドは、ABCA1遺伝子の上流-176―+37の領域をPCR法にて増幅し、pGL3ベクター(Promega)のマルチクローニングサイトに導入することで得た。図２は、各被験物質を添加後、24時間培養した293細胞より得られた細胞抽出液に含まれるルシフェラーゼ活性を、エストロゲン受容体α、βを導入していない場合（図中「−」）を１とした、相対的な活性を各被験物質毎に示している。ルシフェラーゼ活性はDual luciferase reporter assay system(Promega)を用いてルミノメーターにて測定した。これにより、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質は、ABCA1プロモーターの転写能を強く活性化することが明らかとなった。【００３３】
［試験例３］エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、コレステロールの細胞外排出についての検討
上述した要領でマクロファージ化したTHP-1細胞に、エストロゲンアンタゴニストであるICI 182780、選択的エストロゲン受容体作動物質であるタモキシフェン、ラロキシフェンを、100nMとなるように添加して（ネガティブコントロールは、被験物質の配合なし）、以後、37℃、湿度100%、CO2濃度 5%の条件にてインキュベーションを行い、これらの細胞内におけるコレステロールの蓄積を検討した。図３（Ａ）は、THP-1細胞におけるコレステロールの蓄積が、上記被験物質の添加により減少することを示す、oil red O染色を行った細胞の顕微鏡写真である。これにより、THP-1細胞内のコレステロール（ネガティブコントロールにおいては斑点として認められる）が、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質により減少することが明らかになった。図３（Ｂ）は、THP-1細胞からのコレステロールの排出を、コレステロールフラックスアッセイにより測定した結果、コレステロールの排出が、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加により増加していることが明らかになった。コレステロールエフラックスアッセイは培養培地及び細胞抽出液に含まれるコレステロール量をコレステロールアッセイキット(Cayman)とプレートリーダーを用いて測定することで行った。【００３４】
上記の試験例１〜３の結果から、驚くべきことに、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質とは、動脈硬化の原因となる、マクロファージにおけるコレステロールの蓄積を、コレステロールを外部に排出することにより防御し得ることが明らかとなった。また、このような減少は、本抑制剤のABCA1活性化作用に基づくものであることが強く示唆された。このようにして、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質は、動脈硬化抑制剤の有効成分として用いることができることが明らかになった。【００３５】
以下に本抑制剤の製剤例を記載する。なお、下記の製剤例において、ICI 182780を成分１と記載し、タモキシフェンを成分２と記載し、ラロキシフェンを成分３と記載する。【００３６】
［製剤例１］  錠剤
（配合成分）                                                （質量部）
成分１                                                            ２．０
結晶セルロース                                              ９８．９
ショ糖脂肪酸エステル                                        １．０【００３７】
上記の配合で常法に従い錠剤を製造する。【００３８】
［製剤例２］  カプセル剤
（配合成分）                                                （質量部）
成分１                                                            １．５
ラクトース                                                      ８５．０
コーン・スターチ                                             ５８．０
ステアリン酸マグネシウム                                    ２．０【００３９】
上記で示される各成分の粉末を良く混合し、60メッシュの篩（メッシュの基準はTyler基準による）を通す。得られる粉末をはかり分け、ゼラチンカプセル(No. 3)に充填し、カプセル剤を調製する。【００４０】
［製剤例３］  錠剤
（配合成分）                                                （質量部）
成分２又は成分３                                                ２０．０
ラクトース                                                          ３５．０
コーン・スターチ                                                  ３４．０
微結晶セルロース                                                ２０．０
ステアリン酸マグネシウム                                        １．０  【００４１】
上記で示される各成分の粉末を良く混合し、錠剤に圧縮成型する。必要ならば、これらの錠剤は糖またはフィルムで被覆してもよい。
【図１】
2008078420.tif 000002
【図２】
2008078420.tif 000003
【図３】
2008078420.tif 000004
【配列表】
2008078420000001.app
【国際調査報告】
2008078420.tif 000005
2008078420.tif 000006
2008078420.tif 000007
2008078420.tif 000008
2008078420.tif 000009
2008078420.tif 000010