(57)【要約】  本発明は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌と、このイソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法及びそのための装置を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌。
【請求項２】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。
【請求項３】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。
【請求項４】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。
【請求項５】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。
【請求項６】
前記細菌が大腸菌（Escherichia coli）である請求項１記載の細菌。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のイソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【請求項８】
前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に、窒素を含む化合物を更に添加する請求項７に記載のイソプロピルアルコール生産方法。
【請求項９】
前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物に、水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物を、窒素原子の合計の質量％として混合物中の培養開始時の培養培地の全質量に対して０．０４％〜１０．６％（ｗ／ｗ）の量となるよう添加する請求項７に記載のイソプロピルアルコール生産方法。
【請求項１０】
前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産細菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを回収する回収工程と
を含む請求項７記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
【請求項１１】
前記気体が、酸素を含む気体である請求項１０に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
【請求項１２】
前記気体の供給量が、０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍである請求項１０記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
【請求項１３】
前記気体の供給量が、０．１ｖｖｍ〜１．５ｖｖｍである請求項１０記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
【請求項１４】
前記回収工程が、前記培養工程で得られた培養物から蒸散したイソプロピルアルコールを、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と接触させることを含む請求項１０に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
【請求項１５】
前記回収工程が、前記蒸散したイソプロピルアルコールを液化してから前記捕捉液と接触させることを含む請求項１０に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。
【請求項１６】
請求項１〜６に記載のイソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物を収容する培養部と、
前記培養部に接続すると共に前記培養部に収容された混合物中となる位置に開口し、前記混合物中に気体を供給する気体供給部と、
イソプロピルアルコールを捕捉する捕捉液を収容する捕捉部と、
前記培養部と前記捕捉部とを連結すると共に、前記培養部内に蒸散したイソプロピルアルコールを前記捕捉部へ移動可能にする連結部と、
を備えたイソプロピルアルコール生産装置。
【請求項１７】
前記連結部が、前記培養部内に蒸散したイソプロピルアルコールを液化して前記捕捉部へ供給する液化部である請求項１６記載のイソプロピルアルコール生産装置。
【請求項１８】
前記培養部内に収容された前記混合物を攪拌する攪拌部を更に備えた請求項１６記載のイソプロピルアルコール生産装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。【０００３】
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する菌は自然界に既に存在している（例えば、中国特許出願公開第ＣＮ１０４３９５６Ａ及び特開昭６１−６７４９３号公報参照）。しかしながら、イソプロピルアルコールの生産性が低いこと、更にはブタノールやエタノール等のアルコール類を副生することが知られている。ブタノール及びエタノールの水との共沸点はイソプロピルアルコールと水との共沸点と近いことから、単蒸留等の手法で容易にブタノールやエタノールとイソプロピルアルコールを分離することは困難である。このため、ブタノールやエタノールとイソプロピルアルコールが共存する既存菌の発酵液からイソプロピルアルコールを回収するためには精留塔等の設備を付加した蒸留が必要となると考えられ、その分精製プロセスが複雑になると予想される。【０００４】
中国特許出願公開第ＣＮ１０４３９５６には、Clostridium Butanoiacetonicus G.Vをトウモロコシと糖蜜を添加した培養液中で培養した後、得られた培養液を蒸留、再蒸留、分留して、ブタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノールを製造する方法が記載されている。しかしながら、本文献記載の実施例には、培養液中のブタノール、エタノール、アセトン、及びイソプロパノールの生成量が全く記載されておらず、最終的に分留により得られたはずのそれぞれの成分の量も記載されていない。このため、本文献からは実際にイソプロパノール、ブタノール、エタノール、アセトンが生産されたことが確認できない。【０００５】
特開昭６１−６７４９３号公報には、クロストリジウム属細菌を培養して得られる培養液中に、イソプロピルアルコールよりも多量のブタノールと、少量のエタノール及びアセトンが同伴することが記載されている。当該文献によれば、得られた培養液からイソプロピルアルコールを得る方法として、培養液を濾過し、数回蒸留し、濃縮し、塩析分離により油分を得た後、得られた油分を、分留塔を有する装置で分留する方法が一般的な分離精製方法であると記載されている。【０００６】
一方、クロストリジウム属細菌（クロストリジウム・アセトブチリカム：Clostridium Acetobutylicum）由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びチオラーゼの遺伝子を大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌を培養すると、アセトンが生産されることが知られている（例えば、Lourdes  L Bermejo et al.: Applied and Environmental Microbiology, Vol.64, N0.3, p.1079-1085, (1998）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のとおり、既存のイソプロピルアルコール生産菌はイソプロピルアルコールの生産性が低く、加えて培養液中に著量のブタノールやエタノール等のアルコール類を副生することから、培養液中からのイソプロピルアルコールの回収が困難であり、イソプロピルアルコールを工業的に生産する上で問題があった。【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、副生するアルコール類が少なく、副生アルコールを分離するための特別な工程を必要とせずにより精製されたイソプロピルアルコールを生産可能な細菌、この細菌を用いたイソプロピルアルコール生産方法及びイソプロピルアルコール生産装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産しうるイソプロピルアルコール生産細菌を提供する。【００１０】
本発明の第一の態様では、好ましくは、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである。【００１１】
本発明の第二の態様は、上記イソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法を提供する。【００１２】
本発明の第二の態様では、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産細菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを回収する回収工程とを含むものである。【００１３】
本発明の第三の態様は、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物を収容する培養部と、前記培養部に接続すると共に前記培養部に収容された混合物中となる位置に開口し、前記混合物中に気体を供給する気体供給部と、イソプロピルアルコールを捕捉する捕捉液を収容する捕捉部と、前記培養部と前記捕捉部とを連結すると共に、前記培養部内に蒸散したイソプロピルアルコールを前記捕捉部へ移動可能にする連結部と、を備えたイソプロピルアルコール生産装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のイソプロピルアルコール生産装置の一実施形態を示す概略概念図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のイソプロピルアルコール生産細菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産しうる。【００１６】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含む。【００１７】
本発明のイソプロピルアルコール生産装置は、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物を収容する培養部と、前記培養部に接続すると共に前記培養部に収容された混合物中となる位置に開口し、前記混合物中に気体を供給する気体供給部と、イソプロピルアルコールを捕捉する捕捉液を収容する捕捉部と、前記培養部と前記捕捉部とを連結すると共に、前記培養部内に蒸散したイソプロピルアルコールを前記捕捉部へ移動可能にする連結部と、を備えている。【００１８】
なお、本明細書において数値範囲を表記する場合、特に断らない限り、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を表す。
また、本明細書において「工程」とは、本工程の所期の作用が達成される段階を意味し、複数の段階が時間的に同時に進行する場合など、他の工程と明確にできない場合も、本明細書における工程の概念に含まれる。
本明細書において「ｖｖｍ」とは、１分間で、液容量の何倍の通気をするかということを示すものであり、例えば、１０リッターの培養液に対して、２ｖｖｍの通気を行ったとは、毎分２０リッターの通気を行ったということを意味するものである。
以下、本発明について説明する。【００１９】
［イソプロピルアルコール生産細菌］
本発明のイソプロピルアルコール生産細菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産しうるイソプロピルアルコール生産細菌である。【００２０】
本発明のイソプロピルアルコール生産細菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの４種のイソプロピルアルコール生成酵素をすべて付与されている。本イソプロピルアルコール生産細菌を用いてイソプロピルアルコールを生産すると、ブタノールやエタノール等のアルコール類が副生しないことを本発明者らは見いだした。これにより、従来のイソプロピルアルコール生産微生物に比してイソプロピルアルコールの回収を格段に簡便にすることができる。【００２１】
本発明において植物由来原料とは、植物から得られる炭素源であり、細菌が代謝し、イソプロピルアルコールに変換しうるものであれば特に限定はされない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。【００２２】
このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、グルコース、フルクトース、シュークロース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物やセルロース加水分解物などが例示できる。更には植物油由来のグリセリンや脂肪酸も、本発明における炭素源に該当する。
本発明における植物由来原料としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等を好ましく用いることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。【００２３】
本発明のイソプロピルアルコール生産細菌は、これらの植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成する能力を有するものであればよく、例えば培養によって植物由来原料を資化し、一定時間後に培養液中にイソプロピルアルコールを分泌する細菌が例示できる。【００２４】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産細菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の４種類の酵素活性を付与されている。【００２５】
本発明における活性の「付与」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものを含む。【００２６】
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。【００２７】
本発明の宿主細菌に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００２８】
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。【００２９】
本発明の宿主細菌に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００３０】
本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Faecalibacterium prausnitzii）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Coprococcus）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli：大腸菌）等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。【００３１】
本発明の宿主細菌に導入されるＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００３２】
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種（Halobacterium sp.）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）等のズーグロア属細菌、ガルス・ガルス（Gallus gallus）等のガルス属、リゾビウム種（Rhizobium sp.）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）等のブラディリゾビウム属細菌、ラタス・ノルベギカス（Rattus norvegicus）等のラタス属細菌、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等のカンジダ属細菌、サス・スクロファ（Sus scrofa）等のサス属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Streptomyces collinus）等のストレプトマイセス属細菌、ヘリアンサス・アンス（Helianthus annuus）等のヘリアンサス属細菌、ボス・ターラス（Bos taurus）等のボス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス（Enterococcus faecalis）等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。【００３３】
本発明の宿主細菌に導入されるチオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、ガルス・ガルス等のガルス属、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、ラタス・ノルベギカス等のラタス属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、サス・スクロファ等のサス属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、ヘリアンサス・アンス等のヘリアンサス属細菌、ボス・ターラス等のボス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００３４】
このうち、上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合と、これら４種類の酵素がいずれもクロストリジム属細菌由来である場合が更に好ましい。【００３５】
なかでも本発明にかかる４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記４種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。【００３６】
本発明おけるこれらの酵素の活性は、菌体外から菌体内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。【００３７】
酵素活性の導入は、例えばそれら４種類の酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook,  J.,  et.al.,  ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。【００３８】
プロモーター活性を強化するため又は酵素遺伝子を強発現させるために用いられるプロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。また本発明実施例に記載のようにグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ（ｇａｄＡ）プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）プロモーターを用いてもよい。これらは用いる酵素の由来や種類によって適宜選択することができる。【００３９】
例えばエシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ又はＣｏＡトランスフェラーゼの活性を強化するためには、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよいが、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ｔａｃプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ（ｇａｄＡ）プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）プロモーター等からなる群の例示プロモーターから１つ以上を適宜選択することができる。また、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ｔａｃプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ（ｇａｄＡ）プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）プロモーター等のプロモーターは、エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ又はＣｏＡトランスフェラーゼのプロモーターと置換するために用いることができる。【００４０】
これらのプロモーターは、対象となる酵素遺伝子が発現可能となるように、通常の方法に従って宿主細胞へ導入すればよく、例えば、対象となる酵素遺伝子と同一のベクターに連結し、酵素遺伝子と共に宿主細胞へ導入すればよい。【００４１】
本発明において宿主細菌とは、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びチオラーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子を導入する為に使用される又はプロモーター活性を強化もしくはプロモーターを置換する対象となる原核生物を指す。そのようなものとしては、エシェリヒア属（Escherichia）細菌、バチルス属（Bacillus）細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等が例示され、特に利便性が高く、工業的な使用の実績が豊富なエシェリヒア・コリ（Escherichia coli：大腸菌）が好適に使用される。【００４２】
［イソプロピルアルコールの生産方法］
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、上述した本発明のイソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含む。
これにより、他のアルコール類を副生せずに高い純度でイソプロピルアルコールを生産することができる。このため本発明によれば、副生アルコールを分離するための複雑な工程を必要とせずに、簡便に効率よくイソプロピルアルコールを生産することができる。【００４３】
この生産方法は、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む混合物中でイソプロピルアルコール生産細菌を培養することにより植物由来原料を資化し、一定時間後に培養液中に分泌されたイソプロピルアルコールを蒸留、膜分離、抽出等の公知技術を用いて精製する方法を包含する。【００４４】
イソプロピルアルコールの生産方法における混合物は、細菌類の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とするものであればよく、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じて通常用いられる培地であればいずれでも使用することができる。【００４５】
このような基本培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の微量成分を含有する培地であれば特に制限は無い。炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。
窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、硝酸体窒素、アンモニアガス、アンモニア水、蛋白質加水分解物等の無機及び有機の窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。【００４６】
有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
ポリペプトンは蛋白質を酵素や酸で加水分解したもので、その窒素源は、例えば、日本製薬（株）によるポリペプトンＬｏｔＯ５８６Ａの分析値により僅かながらアンモニア性窒素が生じる例があるものの、全て蛋白質に由来するものであるといえる。ポリペプトンの成分としては、ポリペプトンの全質量に対して、全窒素量１２．５質量％〜１４．５質量％、アミノ窒素５．０質量％〜６．５質量％、強熱残留物４．０質量％〜７．０質量％、乾燥ロス３．５質量％〜５．５質量％のものが例示される。培地中では通常０．０２〜２％（ｗ／ｗ）の範囲で使用され、好ましくは０．１〜１％（ｗ／ｗ）の範囲で使用される。
コーンスティープリカーはとうもろこしの浸漬工程で溶出した可溶性成分と乳酸発酵で生成した成分を含む浸漬液を濃縮したもので、Microbiol. Mol. Biol. Rev., Dec 1948; Vol.12: pp297 - 311.によると、成分としては、コーンスティープリカー全質量に対して、水分４５質量％〜５５質量％、全窒素量２．７質量％〜４．５質量％、アミノ窒素１．０質量％〜１．８質量％、揮発性窒素０．１５質量％〜０．４０質量％、還元糖分０．１質量％〜１１．０質量％、乳酸５質量％〜１５質量％、灰分９質量％〜１０質量％、揮発性酸類０．１質量％〜０．３質量％、二酸化硫黄０．００９質量％〜０．０１５質量％のものが例示される。上記成分によれば揮発性窒素として水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物が最大０．４０％（ｗ／ｗ）含まれる可能性があるが、もし仮にこの全てがアンモニウムイオンだったとしても、コーンスティープリカーを２％含む培地中ではアンモニウムイオンの含有量は０．００８％にしかならない。コーンスティープリカーは培地中では通常０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲で使用され、好ましくは０．５〜７％（ｗ／ｗ）の範囲で使用される。
酵母エキスはアミノ酸およびその重合体、核酸、ビタミン、有機酸、無機塩からなることが開示されており、BD（Becton, Dickinson and Company）社の酵母エキス分析データ（Ｃａｔａｌｏｇ＃２１１９２９、２１１９３１、２１１９３０）によれば、無機塩としてはカルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、クロライド、硫酸、燐酸からなるものが記載されており、アンモニウムイオンを生じうる化合物の記載はない。成分としては、酵母エキス全質量に対して、全窒素量１１．４質量％、アミノ窒素６．９質量％、灰分１３．１質量％、乾燥ロス１．０質量％、塩化ナトリウム０．２質量％、全無機塩１０．５質量％のものが例示される。【００４７】
混合物中の植物由来原料の量は、その種類や混合物に含まれるイソプロピルアルコール生産細菌の活性及び数によって異なるが、一般に、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、細菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。【００４８】
イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物には、イソプロピルアルコールの生産性を向上させる観点から、窒素を含む化合物を更に添加することが好ましい。「更に添加する」とは、水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物が、一般的な培養培地に含まれる含有量よりも高い含有量で混合物中に含まれていることをいう。これにより、イソプロピルアルコールの生産細菌は、通常の培養条件よりも高い濃度のアミノ酸以外の含窒素化合物を含む培養培地中で培養されうる。アミノ酸以外の含窒素化合物を培養培地中に加える時期は、培養を始める前でもよいし培養途中でもよい。【００４９】
水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物とは、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を含む無機及び有機化合物、アンモニアガス、アンモニア水が例示される。水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物は、細菌用の一般的な培地Ｍ９では０．０２％（ｗ／ｗ）、他の一般的な培地ＭＳでは０．０２％（ｗ／ｗ）の含量で含まれているが、本発明では、イソプロピルアルコールの生成量を増加させるために、これらの量よりも多く含むことができる。本発明では、イソプロピルアルコールの生産性を上げる観点から好ましくは、水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物の窒素原子の質量が合計で、混合物の培養開始時の培養培地の全質量に対して０．０４％〜１０．６％（ｗ／ｗ）の量となるよう添加して培養することが好ましい。更に好ましくは０．０４％〜５．３０％（ｗ／ｗ）であり、特に好ましくは０．０４％〜４．２４％（ｗ／ｗ）である。この時、液体１ｍＬは１ｇと換算する。【００５０】
また、通常微生物の培地に添加される他の添加成分、例えば抗生物質等を、通常用いられる量で含むものであってもよい。なお、反応時の発泡を抑制するために消泡剤を適量添加することが好ましい。
本発明に使用される培地としては、水性媒体を基本とする液体培地や、寒天等の固相を基本とする固体培地を挙げることができるが、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。液体培地を構成する水性媒体としては、蒸留水、緩衝液等、通常用いられるものを使用することができる。【００５１】
本発明の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば好気条件下でｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４２℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。【００５２】
培養液中に蓄積したイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。【００５３】
なお、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産細菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。【００５４】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産細菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを混合物から分離し回収する回収工程とを含む。【００５５】
この方法によれば、混合物に気体を供給しながら生産細菌を培養する（通気培養）。この通気培養により、生産されたイソプロピルアルコールは混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、この結果、生成したイソプロピルアルコールを混合物（培地）から容易に分離することができる。また、生成したイソプロピルアルコールが混合物から連続的に分離するため、混合物中のイソプロピルアルコールの濃度の上昇を抑制することができる。これにより、イソプロピルアルコール生産細菌のイソプロピルアルコールに対する耐性を特に考慮する必要がない。【００５６】
培養工程において混合物に供給される気体としては、酸素を含む気体であればよく、酸素もしくは空気、又はこれらの一方と不活性ガスとの混合気体を用いることができる。これらの気体は除菌されていることが好ましい。
前記不活性ガスとしては、Ｎ２ガスや、希ガス（例えば、Ａｒ、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｋｒ、又はＸｅ）を、用いることができ、中でも、取り扱いの観点から、Ｎ２ガス又はＡｒガスが好ましく、Ｎ２ガスがより好ましい。【００５７】
混合気体を用いる場合には、培養対象となる細菌が生理活性を損なわなければ如何なる混合比であってもよいが、イソプロピルアルコール生産細菌の活性を適度に抑制して長期間の処理を可能にするために、不活性ガスの混合比は混合気体全質量に対して１０％〜９０％とすることが好ましい。【００５８】
また、混合物中への通気を確保するために、セラミックス体等の多孔体を特定混合物中に投入してもよい。【００５９】
前記混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）であり、細菌への物理的ダメージを抑制する観点から０．１ｖｖｍ〜１．５ｖｖｍで行うことが好ましい。【００６０】
なお、培養工程は、混合物全体を攪拌しながら行うことが好ましい。これにより、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料との混合が良好に行われると共に、混合物中に供給された気体が混合物全体に効率よく行き渡るようにすることができる。【００６１】
培養工程は、培養開始から混合物中の植物由来原料が消費されるまで、又はイソプロピルアルコール生産細菌の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のイソプロピルアルコール生産細菌の数及び活性並びに、植物由来原料の量により異なるが、一般に、１時間以上、好ましくは４時間以上であればよい。一方、植物由来原料又はイソプロピルアルコール生産細菌の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に５日間以下、好ましくは５５時間以下とすることができる。【００６２】
回収工程では、培養工程で生成され、混合物から分離したイソプロピルアルコールを回収する。この回収方法としては、通常培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを収集することができるものであればよい。このような方法としては、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容すること等を挙げることができるが、なかでも、イソプロピルアルコールのみを純度高く回収できる観点から、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と、混合物から分離したイソプロピルアルコールとを接触することを含むものであることが好ましい。【００６３】
イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液としては、水又は有機溶媒を挙げることができる。捕捉液としての有機溶媒は、イソプロピルアルコールが容易に溶解することができ、また捕捉後の捕捉液を、含水または非含水状態で蒸留したときにイソプロピルアルコールと容易に分離できる沸点を有するものであれば特に制限はない。このような有機溶媒としては、例えば、トルエン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。捕捉液としての有機溶媒は、適宜、水と混合して用いてもよい。【００６４】
捕捉液としては、水が好ましい。イソプロピルアルコールと共に生成されることが想定される揮発性の夾雑物は、イソプロピルアルコールよりも水に難溶であるため、イソプロピルアルコールを、夾雑物から効率よく分離し回収することができる。
イソプロピルアルコールと捕捉液との接触は、イソプロピルアルコールが捕捉液に溶解するのに充分な時間行えばよい。イソプロピルアルコールの捕捉液への溶解は水又は上述したような有機溶媒であれば長時間になることはなく、通常２時間程度であれば充分である。
イソプロピルアルコールの捕捉液への溶解を促進させるために、混合物から分離した気体状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを、捕捉液中に直接注入することが好ましい。この注入によりバブリングが生じて、混合物へのイソプロピルアルコールの溶解速度を促進させることができる。【００６５】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法では、より回収効率を高めるために、混合物から分離したイソプロピルアルコールを、捕捉液と接触する前に液化する液化工程を含むことが好ましい。
イソプロピルアルコールの液化は、気化又は飛沫化したイソプロピルアルコールの状態を液化することができる方法であればよく、例えばイソプロピルアルコールの相変化に充分な程度の冷却を挙げることができる。このような冷却方法としては、空冷、または冷却した水もしくはアルコール類を用いる方法を挙げることができる。【００６６】
また、混合物から分離したイソプロピルアルコールは、吸着剤を用いて回収してもよい。このような吸着剤としては、液体又は気体を吸着するために通常用いられるゼオライトやシリカゲル等の多孔体を用いることができる。【００６７】
本イソプロピルアルコールの生産方法によれば、イソプロピルアルコールは、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、ＨＰＬＣ等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、必要に応じて更に精製することができる。このような精製方法としては、蒸留等をあげることができる。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。【００６８】
図１は、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法に適用可能な生産装置１０の一例を概念的に図示したものである。本イソプロピルアルコールの生産方法を、図１を参照しながら説明する。
生産装置１０は、培養槽１２とトラップ槽４０とを備えており、培養槽１２とトラップ槽４０とは連結管３０で連結されている。培養槽１２及びトラップ槽４０は、内部の雰囲気が槽の外部へ漏れ出ないように密閉可能とされている。【００６９】
培養槽１２の内部には、イソプロピルアルコール生産細菌Ｂと植物由来原料Ｍとを含む混合物１４が収容されている。混合物１４の量は、培養槽１２の容量の約半量となる量で充填されていればよく、培養槽１２の容量や生産装置１０の規模に応じて適宜調整すればよい。培養槽１２は、微生物を用いて工業的に物質を生産するために通常用いられる物質で構成されていればよく、特に限定されない。また本生産装置１０は、常温常圧で処理可能であればよいが、必要に応じて加熱加圧も可能なように加熱装置又は加圧装置を備えたものであってもよい。【００７０】
培養槽１２には、装置外部から気体を注入するための注入管１６が連結されている。注入管１６の一端は生産装置１０の外部に備えられた図示しないエアレーション装置に接続されている。注入管１６の他端は、培養槽１２の内部の底部周辺に開口している。培養槽１２に収容される混合物１４の液面は、注入管１６の開口部よりも上方となるように混合物１４の容量は予め調整されている。【００７１】
また培養槽１２には、培養槽１２の外部に設けられたモータ部２２と、モータ部２２に連結した攪拌部２４とを備えた攪拌装置２０が備えられている。攪拌部２４は、プロペラ羽根などの形状を採り、培養槽１２の底部周辺に配置されている。【００７２】
モータ部２２には、図示しない駆動制御装置が接続されており、攪拌部２４を所定の回転数で回転させるようにモータ部２２の駆動を制御している。攪拌部２４の回転数は、特に制限はないが、一般的に１００ｒｐｍ〜１，０００ｒｐｍであり、２００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍで行うことが好ましい。【００７３】
トラップ槽４０の内部には、捕捉液としてのトラップ液４２が収容されている。トラップ槽４０の上部には、トラップ槽４０内の気体をトラップ槽４０外部へ排出するための排出管４４が取り付けられている。【００７４】
連結管３０の一端は、培養槽１２の上部で開口しており、培養槽１２内に充填した気体を培養槽１２外部へ誘導可能にしている。また連結管３０の他端は、トラップ槽４０の底部周辺に延伸して開口しており、トラップ槽４０に収容される捕捉液の液面は、連結管３０の開口部よりも上方となるように予め調整されている。
なお、連結管３０には、積極的に連結管３０の内部を冷却する冷却器が備えられていてもよい。これにより連結管３０を気体が通過する際に、気体を積極的に液化することができる。【００７５】
次に、本生産装置１０の作用について説明する。
本生産装置１０の培養槽１２に、イソプロピルアルコール生産細菌Ｂと植物由来原料Ｍを含む混合物１４を、混合物１４の液面が注入管１６の端部よりも充分に上となる位置まで注入する。攪拌装置２０のモータ部２２の電源をオンにして、攪拌部２４を所定の回転数で回転させる。なお、培養槽１２に予め所定量の培地を収容しておき、適温に調整しておいてから、所定の合計量となるように混合物１４を添加してもよい。【００７６】
所定量の混合物１４を培養槽１２に収容し、図示しないエアレーション装置の電源をオンにして培養槽１２へ気体を注入する。これにより、培養槽１２の内部において、混合物中に気体が注入されて、通気培養を開始する。【００７７】
通気培養を開始すると、混合物１４中では、イソプロピルアルコール生産細菌Ｐが植物由来原料を資化しながらイソプロピルアルコールの生産を開始する。生産されたイソプロピルアルコールは菌体から混合物中に放出されるが、その一部は混合物に溶解し、大部分は混合物から蒸散する。これにより、イソプロピルアルコールが混合物から分離する。混合物から分離したイソプロピルアルコールは、培養槽１２上部から、通気培養の排気として連結管３０に進入して、トラップ槽４０へ移動する。
連結管３０を通過する際に、排気中のイソプロピルアルコールの一部は冷やされて液化する。【００７８】
トラップ槽４０へ移動した排気中のイソプロピルアルコールは、トラップ槽４０の底部に開口する連結管３０の他端からトラップ槽４０に進入し、トラップ液４２中へ注入される。このときトラップ液４２では、排気の注入によりバブリングが生じる。このときイソプロピルアルコールは、トラップ液４２に溶解する。一方、イソプロピルアルコールと共に培養槽１２からトラップ槽４０へ移動した排気中の揮発性の夾雑物は、トラップ液４２に難溶のため、トラップ液４２から放出し、トラップ槽４０上部に開口した排出管４４を通して、最終排気としてトラップ槽４０の外部へ排出される。【００７９】
培養槽１２内で発生するイソプロピルアルコールの量を、図示しない採取機構で採取しながら確認し、イソプロピルアルコールの生産が終了もしくは低下したことが確認できた場合、又は所定時間の経過後に、処理を終了する。【００８０】
処理終了後のトラップ液４２には、高濃度のイソプロピルアルコールが溶解されているため、高濃度イソプロピルアルコール溶液として回収することができる。また、このトラップ液４２を回収して、必要に応じてイソプロピルアルコールを更に単離精製してもよい。また、培養槽１２の混合物１４にもイソプロピルアルコールが一部溶解しているため、必要に応じて混合物１４を回収して、イソプロピルアルコールを単離精製する。【００８１】
このように、本生産装置１０を用いることによって、イソプロピルアルコール生産細菌を用いて生産されたイソプロピルアルコールを、常温常圧（例えば、２５℃、１０１，３２５Ｐａ）で容易に分離回収することができる。このため、複雑な分離工程や精製工程を設ける必要がなく、生産装置を簡単な構成とすることができる。【００８２】
図１における符号について説明する。１０は本生産装置（イソプロピルアルコール生産装置）、１２は培養槽（培養部）、１４は混合物、１６は注入管（気体供給部）、２０は攪拌装置（攪拌部）、３０は連結管（連結部）、４０はトラップ槽（捕捉部）、４２はトラップ液（捕捉液）、４４は排出管を、それぞれ示す。【００８３】
なお、本実施形態の生産装置１０に設けられた培養槽１２、トラップ槽４０、連結管３０等の各部品、部材の形状は、初期の作用を損なわない限り適宜変更することができる。
また、本実施形態の生産装置１０に、混合物１４又はイソプロピルアルコール生産細菌を培養槽１２へ連続的に投入するための投入部や排出部を設けてもよい。これにより、イソプロピルアルコールの連続的な生産が可能となる。【００８４】
本発明では、上述したように、副生するアルコール類が少なく、副生アルコールの分離工程を必要とせずにより精製されたイソプロピルアルコールを生産することができる。
また、本発明の好ましい実施形態では、より精製されたイソプロピルアルコールを連続的に且つ簡便に生産することができる。
【実施例】
【００８５】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。
［実施例１］
＜クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
クロストリジウム属細菌のイソプロピルアルコール生成酵素４種のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ００１４３７に記載のゲノム配列の相補鎖３００５９６３〜３００７３６４に記載されている。またＣｏＡトランスフェラーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ７２８３１に、アセト酢酸デカルボキシラーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ１５７３０７に記載されている。さらにこれら４種の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列は、上記チオラーゼの塩基配列中に存在するチオラーゼプロモーターの配列を使用することができる。【００８６】
チオラーゼプロモーターとチオラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＴＧＣ  Ａ（配列番号１）、及びＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＣＣ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することでチオラーゼプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含む約１．５ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。【００８７】
またＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＣＴＴ（配列番号３）  、及びＴＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＴＴＣ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化することで約１．４ｋｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼフラグメントを得た。【００８８】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子とターミネーター配列を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＴＡＡ  ＡＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧ（配列番号５）、及びＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＧ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することでターミネーターをコードするＤＮＡ配列を含む約８８０ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。【００８９】
なお、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００９０】
更に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＧ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧ（配列番号７）、及びＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＧＣ（配列番号８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩで消化することで約１．４ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。【００９１】
なお、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３は細胞・微生物バンクであるＶＴＴカルチャーコレクションより入手することができる。【００９２】
上記の４つのＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ/ｍＬを含み、４０ｍｇ/ｍＬのＸ−ｇａｌと２０％ＩＰＴＧを各々４０μＬずつ表面に塗布したＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡを回収した。【００９３】
このプラスミドｐＩＰＡをエシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター形質転換体ｐＩＰＡ／Ｂ株を得た。【００９４】
なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００９５】
［実施例２］
＜エシェリヒア・コリｐＩＰＡ／Ｂ株、エシェリヒア・コリＢ野生株によるイソプロピルアルコール生産＞
前培養として１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）にアンピシリン０．１ｇ／Ｌ、グルコース２ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液を５ｍＬ入れ、実施例１において得られたエシェリヒア・コリｐＩＰＡ／Ｂ株を植菌し、一晩、培養温度３７℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。またアンピシリンを含まない以外は同様の培地組成並びに培養条件でエシェリヒア・コリＢ野生株を振とう培養した。各々の前培養液全量を、アンピシリン０．１ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液を６０ｍＬ入れた３００ｍＬ容の三角フラスコに移し、培養を行った。培養は攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３７℃で行った。培養開始４８時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノール、アセトンの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表１に示す。エシェリヒア・コリｐＩＰＡ／Ｂ株において、培養４８時間後で２．１ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。【００９６】
【表１】
2009008377.tif 000002
【００９７】
［実施例３］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＩＰＡ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（１）＞
本実施例では、図１に示される生産装置１０を用いて処理を行った。培養槽１２には１リットル容のものを使用し、トラップ槽４０には５００ｍＬ容のものを使用した。培養槽１２、トラップ槽４０、注入管１６、連結管３０、排出管４４は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽４０には、トラップ液４２としての水（トラップ水）が４００ｍＬの量で注入されている。【００９８】
前培養として、試験管にアンピシリン０．１ｇ／Ｌ、グルコース２ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液を４ｍＬ入れ、実施例１において得られたエシェリヒア・コリｐＩＰＡ／Ｂ株を接種して、１８時間、培養温度３７℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、アンピシリン０．１ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、アデカノール1滴を含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液５００ｍＬを入れた１Ｌ培養槽に接種し、培養を行った。培養は攪拌速度５００ｒｐｍ、培養温度３７℃で行い、１２．５％アンモニア溶液を用いて培養液のｐＨを７．０にコントロールした。また、培養開始から２５時間目に０．５ｇ／ｍＬ濃度のグルコースを２０ｍＬ添加した。培養開始から４８時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノール、アセトンの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表２に示す。エシェリヒア・コリｐＩＰＡ／Ｂ株において、培養４８時間後で３．０ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。なお、表２中の各測定値は、培養後の培養液とトラップ水（４００ｍＬ）中の合算値である。【００９９】
【表２】
2009008377.tif 000003
【０１００】
［実施例４］
＜エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２４１３１〜２３２５３１５に記載されている。またＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２７８１に記載されている。これらと共に実施例１記載のクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。【０１０１】
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号９）、及びＣＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号１０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。【０１０２】
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＡＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧ（配列番号１１）、及びＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣ（配列番号１２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを回収した。【０１０３】
エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＧ（配列番号１３）、及びＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＴＣ（配列番号１４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１.２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを回収した。【０１０４】
エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣ（配列番号１５）、及びＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣＧ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを回収した。【０１０５】
さらにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧ（配列番号１７）、及びＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＡＡＴＣＡＣＣＣＣＧＴＴＧＣ（配列番号１８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを回収した。【０１０６】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＣＡＧＧＴＡＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＡＧＣ（配列番号１９）、及びＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣ（配列番号２０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａａａを回収した。【０１０７】
このプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａａａをエシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株を得た。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４、エシェリシア・コリＢ株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１０８】
［実施例５］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（１）＞
実施例３と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、前培養として三角フラスコに入れたアンピシリン０．１ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液２５ｍＬを用い、実施例４において得られたエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株を接種して、１６時間、培養温度３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、グルコース５０ｇ／Ｌ、アデカノール1滴を含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液４７５ｍＬを入れた１Ｌ培養槽に接種し、培養を行った。培養は攪拌速度５００ｒｐｍ、培養温度３５℃で行い、２４ｗｔ／ｗｔ％水酸化ナトリウム溶液を用いて培養液のｐＨを７．０にコントロールした。培養開始から２４時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。培養２４時間後で５．５ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。また４８時間後のイソプロピルアルコールの蓄積量は５．０ｇ／Ｌであった。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬに変更）中の合算値である。【０１０９】
［実施例６］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（２）＞
実施例５と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、１Ｌ培養槽での培養において表３に示す組成の培地４７５ｍＬを用いた。この時の硫安由来の窒素原子の質量％は、培養開始時の培養培地全質量に対して０．０４質量％である。また５０ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を１０ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。その結果、培養２４時間後で７.４ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。また４８時間後のイソプロピルアルコールの蓄積量は６.２ｇ／Ｌであった。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬ）中の合算値である。【０１１０】
【表３】
2009008377.tif 000004
【０１１１】
［実施例７］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（３）＞
実施例６と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、１Ｌ培養槽での培養において３０時間後に（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．２質量％（２ｇ／Ｌ）追加した。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量％の合計は、培養開始時の培養培地全質量に対して０．０８質量％である。その結果、培養２４時間後で７.２ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。この時ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった。また４８時間後のイソプロピルアルコールの蓄積量は１３．４ｇ／Ｌであった。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬ）中の合算値である。硫酸アンモニウムといった窒素源を適当量加えることで生産性が向上することが示された。【０１１２】
［実施例８］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（４）＞
実施例６と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、１Ｌ培養槽での培養における培地組成の内、（ＮＨ４）２ＳＯ４の量を０．４質量％（４ｇ／Ｌ）とした。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量％は、培養開始時の培養培地全質量に対して０．０８質量％である。その結果、培養２４時間後で１１．６ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬ）中の合算値である。硫酸アンモニウムといった窒素源を適当量加えることで生産速度が向上することが示された。【０１１３】
［実施例９］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（５）＞
実施例６と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、１Ｌ培養槽での培養における培地組成の内、（ＮＨ４）２ＳＯ４の量を０．５質量％（５ｇ／Ｌ）とした。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量％は、培養開始時の培養培地全質量に対して０．１１質量％である。その結果、培養２４時間後で１１．２ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。また５５時間後には２１．３ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬ）中の合算値である。【０１１４】
［実施例１０］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（６）＞
実施例６と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、ｐＨ調整剤は１２．５質量％のアンモニア水を使用した。その結果、培養２４時間後で１３．３ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。また５５時間後には２８．４ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。培養５５時間後までに添加した１２．５質量％アンモニア水の質量は６９．０ｇであり、本実施例におけるアンモニア水由来の窒素原子の質量％の合計は、培養開始時の培養培地全質量に対して０．７３質量％である。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬ）中の合算値である。【０１１５】
［実施例１１］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（７）＞
実施例６と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし、１Ｌ培養槽での培養における培地組成の内、ポリペプトン２ｇ／Ｌにかわりコーンスティープリカー（日本食品化工製）を２０ｇ／Ｌ加え、（ＮＨ４）２ＳＯ４の量を５ｇ／Ｌとした。その結果、培養２４時間後で１０．９ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。また５５時間後には１７．８ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量％の合計は、培養開始時の培養培地全質量に対して０．１１質量％である。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬ）中の合算値である。培地栄養源として幅広い成分を利用できることが示された。【０１１６】
［実施例１２］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＩＰＡ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産（２）＞
実施例３と同様な条件で、１Ｌ培養槽を使用したｐＩＰＡ／Ｂ株のイソプロピルアルコール培養検討を行った。ただし、培養開始時に（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５％（５ｇ／Ｌ）添加した。本実施例における硫安由来の窒素原子の質量％は、培養開始時の培養培地全質量に対して０．１１質量％である。その結果、培養４８時間後で４．５ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。【０１１７】
［実施例１３］
＜蒸留法による培養液からのイソプロピルアルコールの回収＞
蒸留に供する培養液として、実施例３の方法に準じてｐＩＰＡ／Ｂ株を培養し、培養液１８０ｇを得た。これを培養液Ａとした。培養液Ａ１７８．６ｇを２００ｍＬ容量のナスフラスコに入れ、オイルバスで攪拌しながら加温し、定法に従って単蒸留を行った。培養液Ａの各工程における塔頂温度と液量を表４に示す。蒸留前の培養液と蒸留により分取した液及び残液の中に含まれるイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノールの含有量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表５に示す。本実施例にかかるｐＩＰＡ／Ｂ株を培養した培養液からは、塔頂温度９９．１〜９９．５℃で含有するイソプロピルアルコールの殆ど全てを回収することができた。この時、分取した液からブタノール及びエタノールは検出されなかった。【０１１８】
［比較例１］
特開昭６１−６７４９３号公報に記載のクロストリジウム・ｓｐ.１７２ＣＹ−０２株の培養液組成を模し、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液にｎ−ブタノール９．９ｇ／Ｌ、エタノール０．６ｇ／Ｌ、イソプロピルアルコール７．２ｇ／Ｌを加えた培養液を１８０ｇ調製し、これを比較培養液Ｂとした。比較培養液Ｂ１７７．９ｇを２００ｍＬ容量のナスフラスコに入れ、オイルバスで攪拌しながら加温し、定法に従って単蒸留を行った。比較培養液Ｂの各工程における塔頂温度と液量を表４に示す。蒸留前の液と蒸留により分取した液及び残液の中に含まれるイソプロピルアルコール、ブタノール、エタノールの含有量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表５に示す。比較培養液Ｂでは、３種の混合アルコール成分のうち特にイソプロピルアルコールとブタノールが同じ留出挙動を示し、イソプロピルアルコールのみを分離して回収することはできなかった。【０１１９】
実施例１３と比較例１の結果から、本発明にかかる培養液はイソプロピルアルコール以外の副生アルコール類を含まないために容易にイソプロピルアルコールを回収することができる。このため、本発明にかかる培養液からは単蒸留等の簡易な精製プロセスでイソプロピルアルコールを回収することが可能である。【０１２０】
一方、既存菌による培養液ではイソプロピルアルコールと副生アルコール類の分離が難しくイソプロピルアルコールを容易に回収できないことが分かった。既存菌による培養液からイソプロピルアルコールを回収するためには、精留塔等の設備を付加した蒸留が必要となると考えられ、その分精製プロセスが複雑になると予想される。【０１２１】
これらのことから、本発明にかかるイソプロピルアルコール生産細菌は植物由来イソプロピルアルコール生産の実用化において従来技術と比べて格段に優れているといえる。【０１２２】
【表４】
2009008377.tif 000005
【０１２３】
【表５】
2009008377.tif 000006
【０１２４】
［実施例１４］＜試験例＞
本実施例では、図１に示される生産装置１０を用いて処理を行った。培養槽１２には１リットル容のものを使用し、トラップ槽４０には５００ｍＬ容のものを使用した。培養槽１２、トラップ槽４０、注入管１６、連結管３０、排出管４４は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽４０には、トラップ液４２としての水（トラップ水）が４００ｍＬの量で注入されている。【０１２５】
１０ｇ／Ｌのイソプロピルアルコール水溶液を処理液として５００ｍＬ培養槽１２に注入した。攪拌速度５００ｒｐｍ、処理温度３７℃で処理を行った。
次いで、注入管１６から、空気を０．５Ｌ／ｍｉｎ（１ｖｖｍ）の速度でイソプロピルアルコール水溶液に注入し、処理を開始した。培養槽１２からの排気は、トラップ槽４０中のトラップ液４２にバブリングさせた。トラップ槽４０からの排気は装置系外の空気中に放出した。処理開始から０，２，４，８，２４時間後に培養槽１２内の処理液とトラップ槽４０内のトラップ液４２を各々サンプリングし、ＨＰＬＣ測定によりサンプル中のイソプロピルアルコールの蓄積量を測定した。なお、ＨＰＬＣ測定は、信和化工社製、ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ（８．０ｍｍ  ＩＤ、３００ｍｍ  Ｌ）を用い、溶離液として０．１％  ＨＣｌＯ４を用い、流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を５０℃とし、検出器は示差屈折率検出器（ＲＩ）を用いて行った。結果を表６に示す。【０１２６】
【表６】
2009008377.tif 000007
【０１２７】
表６に示されるように、培養槽１２内のイソプロピルアルコールの濃度は時間の経過と共に減少し、トラップ液４２中のイソプロピルアルコール濃度は徐々に増加した。２４時間経過時点で培養槽内のイソプロピルアルコールの７０％が培養槽から水ボトルへ移動していることが分かった。また、その時の総イソプロピルアルコール量は１０．１ｇでマテリアルバランスもほぼ一致していた。
従って、培養槽１２内での通気培養の排気をトラップ槽４０内のトラップ液４２にバブリングさせることにより、処理液中のイソプロピルアルコールを処理液から分離して、トラップ液４２に溶解させることが可能であるとわかった。【０１２８】
［実施例１５］
＜イソプロピルアルコールの生産＞
本実施例では、実施例３で使用したものと同一の生産装置１０を用いてイソプロピルアルコールを生産した。なお、トラップ槽４０には、トラップ液４２としての水（トラップ水）が４００ｍＬの量で注入されている。【０１２９】
前培養として、φ１９ｍｍ×長さ１７５ｍｍの試験管に、アンピシリン０．１ｇ／Ｌと、グルコース２ｇ／Ｌとを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液を４ｍＬ入れ、実施例１で得たｐＩＰＡ／Ｂ株を接種し、培養温度３７℃、１２０ｒｐｍで１８時間振とう培養を行った。【０１３０】
アンピシリン０．１ｇ／Ｌと、グルコース２０ｇ／Ｌと、アデカノール１滴を含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液５００ｍＬを含む培養槽１２に、４ｍｌの前培養液を接種し、培養を開始した。培養は、攪拌速度５００ｒｐｍ、培養温度３７℃で行い、培養液のｐＨは、１２．５％アンモニア水を用いて７．０に調整した。
次いで、注入管１６から、空気を０．５Ｌ／ｍｉｎ（１ｖｖｍ）の速度で培養液中に注入して通気培養を開始した。培養槽１２からの排気は、トラップ槽４０中のトラップ液４２にバブリングさせた。
培養開始から２３時間経過した時点で、培養槽内に０．５ｇ／Ｌのグルコース溶液を２０ｍＬ添加した。【０１３１】
＜サンプル中のイソプロピルアルコールの検出＞
培養開始から０、７、２３、３０、４７、及び５２時間後に、培養槽１２中の処理後の培養液とトラップ槽４０中の処理後のトラップ液４２とをサンプリングした。サンプリングした培養液については、遠心操作を行うことによって、培養液中の菌体等固形物を除いた。【０１３２】
サンプリングした培養液及び水中の、イソプロピルアルコールの蓄積量を、それぞれＨＰＬＣで測定した。結果を表７に示す。
更に、培養開始４７時間後の培養液及びトラップ水について、ＨＰＬＣ測定したときに検出されたピークの数、Ｒｔ時間（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ；保持時間）及び化合物名を、培養液について表８、トラップ水について表９にそれぞれ示す。【０１３３】
なお、表８及び表９において「ＩＰＡ」は、イソプロピルアルコールを示す。また、表８において「不明」として示されるものは、イソプロピルアルコールの通気培養により生成した夾雑物であるものと推測される。【０１３４】
【表７】
2009008377.tif 000008
【０１３５】
【表８】
2009008377.tif 000009
【０１３６】
【表９】
2009008377.tif 000010
【０１３７】
表７〜表９に示されるように、イソプロピルアルコール生産細菌を用いた生産されたイソプロアルコールが、通気培養によって培養液とトラップ水に蓄積されていることが確認された。
また、培養開始から４７時間後の培養液については、グルコースと酢酸の他に、夾雑物と推測される１１個のピークが確認されたが、このときのトラップ水について、イソプロピルアルコールに相当するピーク以外のピークはなかった。従って、本生産方法によれば、培養槽１２からの排気をトラップ液４２にバブリングさせることにより、夾雑物とイソプロアルコールとを容易に分離することができることがわかった。【０１３８】
これにより、培養開始からイソプロピルアルコールの回収まで、操作が簡便で、効率がよくイソプロピルアルコールを回収することができた。さらにイソプロピルアルコールの回収に水を用いることで夾雑物の無いイソプロピルアルコール水溶液を得ることができることがわかった。このことから、本発明は、微生物の培養によるイソプロピルアルコール生産の実用化において、精製工程負荷の少ない生産プロセス構築を可能にする画期的な方法であるといえる。【０１３９】
［比較例２］
＜チオラーゼ遺伝子欠失ｐＩＰＡプラスミドの構築及び該プラスミド形質転換体の構築＞
実施例１に記載のプラスミドｐＩＰＡからチオラーゼ遺伝子を取り除いたプラスミドｐＩＰＡΔｔｈｉｏを作製した。
ｐＩＰＡからチオラーゼプロモーターを単離するために、ｐＩＰＡをテンプレートに用いてＴＴＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＡＧ ＧＧＧ ＧＴＴ ＡＧＣ ＡＴＡ ＴＧＣ Ａ（配列番号２１）、及びＴＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＡＣ ＴＡＡ ＣＣＴ ＣＣＴ ＡＡＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＴＡＣ ＧＧＧ（配列番号２２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化することで約２４０ｂｐのチオラーゼプロモーターフラグメントを得た。【０１４０】
更にｐＩＰＡからイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を単離するために、ｐＩＰＡをテンプレートに用いてＴＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣ（配列番号２３）、及びＴＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣ（配列番号２４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化することで約１．４ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子フラグメントを得た。【０１４１】
上記の２つのＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＩＰＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで得られる４．９ｋｂｐのフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡΔｔｈｉｏを回収した。ｐＩＰＡΔｔｈｉｏの塩基配列を定法に従って決定し、チオラーゼプロモーターとイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列に誤りがないことを確認した。【０１４２】
このプラスミドｐＩＰＡΔｔｈｉｏをエシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、形質転換体ｐＩＰＡΔｔｈｉｏ／Ｂ株を得た。【０１４３】
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産＞
実施例３と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産試験を行った。前培養として、試験管にアンピシリン０．１ｇ／Ｌ、グルコース２ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液を４ｍＬ入れ、エシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏ／Ｂ株を接種して、１８時間、培養温度３７℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、グルコース２０ｇ／Ｌ、アデカノール1滴を含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液５００ｍＬを入れた１Ｌ培養槽に接種し、培養を行った。培養は攪拌速度５００ｒｐｍ、培養温度３７℃で行い、１２．５％アンモニア溶液を用いて培養液のｐＨを７．０にコントロールした。また、培養開始から７２時間目までに０．５ｇ／ｍＬ濃度のグルコースを２０ｍＬ添加した。培養開始から経時的に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表１０に示す。なお、表１０中のイソプロピルアルコール量は、培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。【０１４４】
エシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏ／Ｂ株には、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及びＣｏＡトランスフェラーゼの各遺伝子が導入されているが、チオラーゼ遺伝子が導入されていないため、この酵素の活性は生来のものに由来している。しかしながら、エシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏ／Ｂ株では、培養７２時間後であってもイソプロピルアルコールの蓄積はなかった。【０１４５】
【表１０】
2009008377.tif 000011
【０１４６】
［比較例３］
＜チオラーゼ遺伝子及びＣｏＡトランスフェラーゼ欠失ｐＩＰＡプラスミドの構築及び該プラスミド形質転換体の構築＞
実施例１に記載のプラスミドｐＩＰＡからチオラーゼ遺伝子とＣｏＡトランスフェラーゼを取り除いたプラスミドｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢを作製した。【０１４７】
ｐＩＰＡΔｔｈｉｏを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてＤＮＡの末端を平滑化して結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢを回収した。【０１４８】
このプラスミドｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢをエシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、形質転換体ｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢ／Ｂ株を得た。【０１４９】
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産＞
実施例３と同様に１Ｌ培養槽を使用したイソプロピルアルコール生産試験を行った。前培養として、試験管にアンピシリン０．１ｇ／Ｌ、グルコース２ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液を４ｍＬ入れ、エシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢ／Ｂ株を接種して、１８時間、培養温度３７℃、１２０ｒｐｍで培養を行った。前培養液全量を、グルコース２０ｇ／Ｌ、アデカノール1滴を含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液５００ｍＬを入れた１Ｌ培養槽に接種し、培養を行った。培養は攪拌速度５００ｒｐｍ、培養温度３７℃で行い、１２．５％アンモニア溶液を用いて培養液のｐＨを７．０にコントロールした。また、培養開始から７２時間目までに０．５ｇ／ｍＬ濃度のグルコースを２０ｍＬ添加した。【０１５０】
培養開始から経時的に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表１１に示す。なお、表１１中のイソプロピルアルコール量は、培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。【０１５１】
エシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢ／Ｂ株には、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子が導入されているが、チオラーゼ遺伝子及びＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子が導入されていないため、これらの酵素活性は生来のものに由来している。しかしながら、エシェリヒア・コリｐＩＰＡΔｔｈｉｏΔｃｔｆＡＢ／Ｂ株では、培養７２時間後でイソプロピルアルコールの蓄積はなかった。【０１５２】
【表１１】
2009008377.tif 000012
【０１５３】
実施例１、２、３と比較例２及び３の結果から、本発明によって得られる大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの活性のみでなく、本来大腸菌のゲノムに存在するチオラーゼ遺伝子及びＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子でコードされるこれらの酵素の活性も付与しなければイソプロピルアルコールを生産しないことがわかる。【０１５４】
［実施例１６］
＜ｇｌｙＡプロモーターを用いたエシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
実施例４のＧＡＰＤＨプロモーターに代わり、エシェリヒア・コリ由来のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｌｙＡ）プロモーターを用いた。
エシェリヒア・コリのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｖ００２８３ に記載されている。このプロモーターを用い、イソプロピルアルコールの生産に必要な遺伝子群を発現させることができる。【０１５５】
ｇｌｙＡプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＴＣＧＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＴＴＣＧ（配列番号２５）、及びＣＴＧＴＣＧＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号２６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩで消化することで約８５０ｂｐのｇｌｙＡプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ処理の後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端化し、さらにＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇｌｙＰを回収した。【０１５６】
以下、実施例４と同様にして、チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼのそれぞれをコードする遺伝子を順次導入し、プラスミドｐＧｌｙ-Ｉａａａを回収した。
このプラスミドｐＧｌｙ-Ｉａａａをエシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧｌｙ-Ｉａａａ／Ｂ株を得た。【０１５７】
［実施例１７］
＜ｇａｄＡプロモーターを用いたエシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
実施例４のＧＡＰＤＨプロモーターに代わり、エシェリヒア・コリ由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼＡ遺伝子（ｇａｄＡ）プロモーターを用いた。
エシェリヒア・コリのグルタミン酸デカルボキシラーゼＡのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ８４０２４に記載されている。このプロモーターを用い、イソプロピルアルコールの生産に必要な遺伝子群を発現させることができる。【０１５８】
ｇａｄＡプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＣＴＣＧＣＡＴＡＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＡＧＧ（配列番号２７）、及びＣＡＧＴＣＧＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＧＣ（配列番号２８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１３０ｂｐのｇａｄＡプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｄＰを回収した。【０１５９】
以下、実施例４と同様にして、チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼのそれぞれをコードする遺伝子を順次導入し、プラスミドｐＧａｄ-Ｉａａａを回収した。
このプラスミドｐＧａｄ-Ｉａａａをエシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧａｄ-Ｉａａａ／Ｂ株を得た。【０１６０】
［実施例１８］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧｌｙ-Ｉａａａ／Ｂ株およびｐＧａｄ-Ｉａａａ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産＞
実施例５と同様に１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧｌｙ-Ｉａａａ／Ｂ株およびｐＧａｄ-Ｉａａａによるイソプロピルアルコール生産検討を行った。その結果、培養２４時間後でｐＧｌｙ-Ｉａａａ／Ｂ株では３．１ｇ／Ｌ、ｐＧａｄ-Ｉａａａ／Ｂ株では２．６ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（５００ｍＬ）中の合算値である。
[実施例１９]
＜通気量１ｖｖｍ又は２ｖｖｍでｐＧＡＰ−Ｉａａａ／Ｂ株を培養したときのイソプロピルアルコールの生産性＞
本実施例では、実施例５で使用したものとトラップ槽の容量を除いて同一の生産装置１０を２台用いてイソプロピルアルコールを生産した。なお、それぞれのトラップ槽４０は２０００ｍＬ容量であり、トラップ液４２としての水（トラップ水）が２０００ｍＬの量で注入されている。【０１６１】
前培養として三角フラスコに入れたアンピシリン０．１ｇ／Ｌを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液２５ｍＬを用い、実施例４において得られたエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株を接種して、１６時間、培養温度３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、グルコース５０ｇ／Ｌ、アデカノール1滴を含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液４７５ｍＬを入れた１Ｌ培養槽に接種し、培養を行った。培養は、攪拌速度５００ｒｐｍ、培養温度３５℃で行い、培養液のｐＨは、ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。【０１６２】
次いで、１台目の生産装置では、注入管１６から、空気を１ｖｖｍとなるように培養液中に注入して通気培養を開始した。２台目の生産装置では、注入管１６を２本用い、空気と窒素ガスを各々１ｖｖｍ、総通気量が２ｖｖｍとなるように培養液中に注入して通気培養を開始した。培養槽１２からの排気は、トラップ槽４０中のトラップ液４２にバブリングさせた。
その結果、培養２４時間後で、通気量１ｖｖｍでは５．５ｇ／Ｌ、２ｖｖｍでは３．３ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。トラップ水中のイソプロピルアルコール量は、水中のイソプロピルアルコール濃度を４倍し培養液量相当に換算して算出した。【０１６３】
[実施例２０]
＜通気量１ｖｖｍ又は０．７５ｖｖｍでｐＩＰＡ／Ｂ株を培養したときのイソプロピルアルコールの生産性＞
実施例３と同様にｐＩＰＡ／Ｂ株の培養検討を行った。ただし、グルコースは４０ｇ／Ｌとし、ｐＨ調整剤はアンモニア水を用いた。なお、それぞれのトラップ槽４０は５００ｍＬ容量であり、トラップ液４２としての水（トラップ水）が５００ｍＬの量で注入されている。気体は空気を用い、通気量は１ｖｖｍ又は０．７５ｖｖｍとした。その結果、培養５４時間後で、通気量１ｖｖｍでは２．８ｇ／Ｌ、０．７５ｖｖｍでは２．８ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。【０１６４】
実施例１９と実施例２０の結果より、本願発明者らは、イソプロピルアルコールの生産に適する通気量があることを見出した。培養槽へ注入する総通気量は２ｖｖｍよりも０．７５〜１ｖｖｍの方がイソプロピルアルコールの生産に好ましいことを見出した。【０１６５】
以上のように、本発明の実施形態によれば、副生するアルコール類が少なく、副生アルコールの分離工程を必要とせずに簡単な精製を行うだけで、より精製されたイソプロアルコールを簡便に且つ効率よく生産することができる。
本発明により得られたイソプロピルアルコールは、種々の用途に利用することができ、例えばプロピレンの製造原料として好適に使用することができる。【０１６６】
日本出願番号２００７−１８１５７１の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
2009008377.tif 000013
【配列表】
2009008377000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月27日(2010.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌。  
【請求項２】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。  
【請求項３】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。  
【請求項４】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。  
【請求項５】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載の細菌。  
【請求項６】
前記細菌が大腸菌（Escherichia coli）である請求項１記載の細菌。  
【請求項７】
請求項１〜６に記載のイソプロピルアルコール生産細菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。  
【請求項８】
前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に、窒素を含む化合物を更に添加する請求項７に記載のイソプロピルアルコール生産方法。  
【請求項９】
前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物に、水中でアンモニウムイオンを生じうる含窒素化合物を、窒素原子の合計の質量％として混合物中の培養開始時の培養培地の全質量に対して０．０４％〜１０．６％（ｗ／ｗ）の量となるよう添加する請求項７に記載のイソプロピルアルコール生産方法。  
【請求項１０】
前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産細菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを回収する回収工程と
を含む請求項７記載のイソプロピルアルコールの生産方法。  
【請求項１１】
前記気体が、酸素を含む気体である請求項１０に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。  
【請求項１２】
前記気体の供給量が、０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍである請求項１０記載のイソプロピルアルコールの生産方法。  
【請求項１３】
前記気体の供給量が、０．１ｖｖｍ〜１．５ｖｖｍである請求項１０記載のイソプロピルアルコールの生産方法。  
【請求項１４】
前記回収工程が、前記培養工程で得られた培養物から蒸散したイソプロピルアルコールを、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と接触させることを含む請求項１０に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。  
【請求項１５】
前記回収工程が、前記蒸散したイソプロピルアルコールを液化してから前記捕捉液と接触させることを含む請求項１４に記載のイソプロピルアルコールの生産方法。  
【請求項１６】
請求項１〜６に記載のイソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物を収容する培養部と、
前記培養部に接続すると共に前記培養部に収容された混合物中となる位置に開口し、前記混合物中に気体を供給する気体供給部と、
イソプロピルアルコールを捕捉する捕捉液を収容する捕捉部と、
前記培養部と前記捕捉部とを連結すると共に、前記培養部内に蒸散したイソプロピルアルコールを前記捕捉部へ移動可能にする連結部と、
を備えたイソプロピルアルコール生産装置。  
【請求項１７】
前記連結部が、前記培養部内に蒸散したイソプロピルアルコールを液化して前記捕捉部へ供給する液化部である請求項１６記載のイソプロピルアルコール生産装置。  
【請求項１８】
前記培養部内に収容された前記混合物を攪拌する攪拌部を更に備えた請求項１６記載のイソプロピルアルコール生産装置。
【国際調査報告】
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