【手続補正書】
【提出日】平成16年10月14日(2004.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実施例1
尿試料中のMMP活性の基質ゲル電気泳動
尿試料に含まれるMMP活性は、基質ゲル電気泳動を用いてアッセイされた。新たに解凍された尿試料50 μlを分析のために使用した。これらの尿試料において少なくとも4つの主なMMP活性が容易に検出され、見かけの分子量は200,000、125,000、92,000、および72,000であった（図2A）。92 kDaおよび72 kDaのMMP活性は、それぞれMMP-9およびMMP-2であることが以前に判定されている。200 kDa MMP活性は、MMP-9二量体の推定分子量と一致している。125 kDa MMPの同一性は不明である。好中球由来の精製されたヒトMMP-9/NGAL複合体と共に分析された場合、125 kDa尿MMP活性は、ヒト好中球MMP-9/NGALのそれと同じ位置に移動した（図1A）。この125 kDa尿MMPは、MMP-9およびNGALの活性複合体である。MMPであるというこれらのゼラチン分解活性の同一性は、最終濃度10 mMで1,10-フェナントロリンを使用する阻害研究により確認された（データは未表示）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
実施例2
抗NGAL抗体による尿試料のウエスタンブロット分析
MMP-9およびNGALの複合体としての125 kDaの尿MMPの同一性をさらに示すために、濃縮尿試料を、ヒトNGALに対する精製抗体を用いるウエスタンブロット分析に供した（Kjeldsen, L.（1993））。非還元条件下で、125 kDaのタンパク質バンドが、125 kDa MMP活性を含む尿試料中で検出された（図2B）。癌患者由来の尿試料のスクリーニングにより、MMP-9/NGALタンパク質複合体の検出と125 kDa MMP活性の存在との間の相関関係が確立された（図2B）。精製抗NGAL抗体を用いて、125 kDaタンパク質バンドが125 kDa MMP活性を含む尿試料中に一貫して検出された。抗体はまた、分析されたすべての尿試料中で、NGAL単量体型（25 kDa）、二量体型（50 kDa）、および三量体型（75 kDa）の存在を検出した。NGAL抗体の特異性は、精製されたヒト好中球MMP-9/NGAL複合体を用いて確認された。非還元条件下で、抗体は、好中球から精製されたMMP-9/NGAL複合体と同様に、濃縮された尿試料中の125 kDa MMP-9/NGAL複合体を認識した（図1B）。MMP-9/NGAL複合体ならびにNGAL単量体、二量体および三量体の複合体に加えて、見かけの分子量150 kDaのいくつかの微量タンパク質バンドもまた、濃縮された尿試料中に検出された。それらの同一性は現在不明であるが、抗NGAL抗体と非特異的に交差反応したタンパク質である可能性が最も高い。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例5
インビトロでのNGALによるMMP-9分解の調節
インビトロにおいてNGALがMMP-9分解に与える影響は、インキュベーション前に、MMP-9（0.1μM）およびNGAL（1.0μM）を混合することにより試験された。MMP-9分解は、NGALの存在下で阻害され、その結果として単独でインキュベートされたMMP-9と比較した各時点での酵素残存量の増加により証明されるように、酵素的分解速度の減少がもたらされた。免疫的に枯渇したNGALは、明らかなMMP-9の保護を示さなかった。NGALの増加量の存在下で、MMP-9の分解が減少し、残存するMMP-9活性の増加がもたらされた。NGALは用量依存的様式でMMP-9を分解から保護できると考えられ、その結果として、MMP-9活性の保存がもたらされた。これらのデータは、MMP-9活性の調節におけるNGALについての潜在的な調節的役割を、例えばNGALがMMP-9との相互作用により腫瘍進行に関与しうることを示唆している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  尿試料および精製されたヒト好中球MMP-9/NGAL複合体のウエスタンブロットおよび基質ゲル電気泳動を示す。A. 基質ゲル電気泳動：同じ尿試料および精製されたヒト好中球MMP-9/NGAL複合体を基質ゲル電気泳動で分析した。MMP-9二量体（200 kDa）、MMP-9/NGAL（125 kDa）、MMP-9（92 kDa）、およびMMP-2（72 kDa）の位置は、右の矢印で示されている。分子量マーカーは、大きさ150 kDa、100 kDa、75 kDa、および50 kDa（左の矢印）のパーフェクトプロテインマーカーズ（Perfect Protein Markers）（Novagen、Madison、WI）である。B. NGALウエスタンブロット分析：125 kDaのMMP活性を含む濃縮尿試料を、精製されたヒト好中球MMP-9/NGALと共に、非還元条件下で4％〜15％のSDS-ゲル電気泳動により分離し、その後、ヒトNGALに対するポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析に供した。125 kDaのMMP-9/NGAL複合体をマークしている（右の矢印）。
【図２】  尿試料の基質ゲル電気泳動およびNGALウエスタンブロット分析を示す。A. 尿試料中のMMPの基質ゲル電気泳動：未処理の尿試料50 μlをMMP活性について分析した。4つの主なゼラチナーゼ活性を、約200,000、125,000、92,000、および72,000の見かけの分子量で検出した。それらの同一性を右の矢印でマークした。分子量マーカーは、大きさ150 kDa、100 kDa、75 kDa、および50 kDa（左の矢印）のパーフェクトプロテインマーカーズ（Perfect Protein Markers）（Novagen、Madison、WI）である。B. 濃縮尿試料の20 μgを非還元条件下で4％〜15％のSDS-PAGEゲル上で分離した。ヒトNGALに対するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。分子量マーカーは、大きさ126 kDa、90 kDa、44 kDa、34 kDa、および17 kDa（左の矢印）のカレイドスコーププレステインドスタンダード（Kaleidoscope Prestained Standards）（Bio-Rad、Hercules、CA）である。
【図３】  抗NGAL抗体を用いた125 kDaのMMP活性の免疫沈降を示す。125 kDaのMMP活性を含む尿試料（RIPAにより1:1 v/v希釈）50 μlを1.0 μl、0.1 μl、または0.01 μlの抗NGAL抗体または対照抗体混合した。氷上で30分間インキュベートした後、抗体-抗原複合体をザイソルビン（Zysorbin）を用いて除去した。残存MMP活性を検出するために上清を基質ゲル電気泳動に供した。対照抗体1.0 μlで処理された試料中で観察された、増大したMMP-2活性の増加は、血清由来の内因性MMP-2活性であった。
【図４】  インビトロでのMMP-9/NGAL複合体の再構成を示す。A. 組換えヒトMMP-9およびNGALをpH値の異なるゼラチナーゼ緩衝液に希釈し、続いて、1:10（proMMP-9対NGAL）のモル比で混合した。37℃で1時間、インビトロでの再構成を行った。10 μM  proMMP-9を各レーンにロードした。精製されたヒト好中球MMP-9/NGALを、対照として含めた。B. 組換えヒトMMP-9およびNGALを、MMP活性を含まない正常な尿に希釈し、続いて、異なるモル比（proMMP-9対NGAL = 2:1、1:5、1:10、1:20）で混合した。37℃で1時間インキュベーションを行った後、MMP-9/NGAL複合体形成を、基質ゲル電気泳動を用いて分析した。125 kDaおよび115 kDaのMMP-9/NGAL活性の位置は、それぞれ、右の矢印および矢じりで示されている。分子量マーカーは150 kDa、100 kDa、75 kDa、および50 kDa（左の矢印）パーフェクトプロテインマーカーズ（Perfect Protein Markers）（Novagen、Madison、WI）である。