(57)【要約】本発明により、より無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、抑制または安定した抵抗性が付与されたイネ萎縮ウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が得られる。イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、イネ萎縮病に抵抗性を付与するための組成物。本発明はまた、イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法であって、Ａ）イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を提供する工程；Ｂ）該発現抑制剤を該植物の細胞に導入する工程；Ｃ）該発現抑制剤が導入された植物の細胞を選択する工程；およびＤ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；を包含する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、イネ萎縮病に抵抗性を付与するための組成物。
【請求項２】
前記組成物は、ほぼ１００％抵抗性集団を与える、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、少なくとも約７０％完全抵抗性集団を与える、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、ほぼ「１００％完全抵抗性集団」を与える、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ１（配列番号１）、Ｓ３（配列番号５）、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ５（配列番号９）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ７（配列番号１３）、Ｓ９（配列番号１７）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの遺伝子はＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記発現抑制剤は、
（ａ’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ’）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記発現抑制剤は、
（ａ”）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現抑制剤は、
（ａ”’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”’）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
イネ萎縮ウイルスゲノムに存在するＳ１（配列番号１）、Ｓ３（配列番号５）、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ５（配列番号９）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ７（配列番号１３）、Ｓ９（配列番号１７）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される核酸配列の全部または一部と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および該アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む、発現カセット。
【請求項１３】
前記核酸配列はＳ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記核酸配列はＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体である、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記アンチセンス配列は、配列番号２５のアンチセンス配列、配列番号２６のアンチセンス配列、配列番号２７のアンチセンス配列、および配列番号２８のアンチセンス配列、ならびに配列番号２５〜２８のいずれか１つに示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体のアンチセンス配列からなる群より選択され、前記トリミング配列は、配列番号４６である、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１６】
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１７】
前記発現カセットは、
（ａ’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ’）ターミネーター配列、
を含む、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１８】
前記発現カセットは、
（ａ”）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”）ターミネーター配列、
を含む、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１９】
前記発現カセットは、
（ａ”’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”’）ターミネーター配列、
を含む、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項２０】
請求項１２に記載の発現カセット。を含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含む、植物細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載のベクターを含む、植物体。
【請求項２３】
請求項２０に記載のベクターを含む、種子。
【請求項２４】
イネ萎縮ウイルスに対する完全抵抗性を示す、請求項２２に記載の植物体。
【請求項２５】
イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法であって、
Ａ）請求項２０に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２６】
イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法であって、
Ａ）請求項２０に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項２７】
イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得る植物を再生産する方法であって、
Ａ）請求項２０に記載のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）該種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）該植物体から、種子を得る工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネの作出方法に関する。より具体的には、イネ萎縮ウイルスの複製に必要な分節ゲノムをコードする核酸分子を用いた、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネの作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネ萎縮ウイルスがヨコバイによって伝播され、虫体内で増殖することが、１９３０年代に証明された（非特許文献１＝Ｆｕｋｉｓｈｉ，Ｔ：Ｊ，Ｆａｃ．Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｉｍｐ．Ｕｎｉｖ．４５，８３−１５４（１９４０））。様々なウイルスについて生物学的に多様な伝搬形式が明らかになってきている。昆虫を媒介者とする植物ウイルスは、その伝搬様式によって、４つに大別されている（非特許文献２＝上田一郎および玉田哲男「植物ウイルスと媒介生物の相互関係」  細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ  分子レベルからみた植物の耐病性−植物と病原菌の相互作用に迫る−  １５６〜１６５  １９９７年）。
イネ萎縮病の防除は、媒介昆虫であるツマグロヨコバイ等のヨコバイ類を薬剤処理することによって実施してきた。一旦、イネ萎縮病が発生すると、数年間その発生が終焉しない。そのため、薬剤処理によるイネ萎縮病の防除を実施しようとすると、大量の薬剤を使用しなければならず、環境汚染を起こす結果となる。
イネ萎縮ウイルスの防除の代替的な手段としては、抵抗性品種の利用が最も有効な方法のひとつとして考えられる。本発明者らは、これまで、イネ品種における遺伝子破壊系統（ミュータントパネル）を用いて、イネ萎縮ウイルスの感染・増殖に関与する遺伝子を単離し、イネのウイルス病抵抗性育種素材の作出法を開発してきた。上述のイネ遺伝子破壊系統の一つはイネ萎縮ウイルスに対する感受性に変化が生じ、本ウイルスに対し、抵抗性を示した。上記遺伝子を用いて、上記遺伝子破壊系統の形質転換を行ったところ、イネ萎縮ウイルスに対する感染性が野生型イネと同等に復帰し、得られた遺伝子がイネ萎縮ウイルスの増殖に関与する遺伝子であると結論された。また、上記遺伝子の破壊系統では、いもち病に対しても抵抗性を獲得していることが示されたものの、イネの生育に関してはやや劣ることが見出された。
これまでに、イネ萎縮ウイルス分節ゲノムＳ３またはＳ８のセンス鎖またはアンチセンス鎖の組み込みによるイネ萎縮ウイルス抵抗性イネ作出の試み（非特許文献４＝育種学研究，２００１，第３巻、別冊１号、第２６０頁）、およびイネ萎縮ウイルス分節ゲノムＳ８の転写後型ジーンサイレンシングによるイネ萎縮ウイルス抵抗性のイネの作出もまた報告されている（非特許文献３＝Ｍａら、Ａｃｔａ  Ｂｏｔａｎｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，２００４，４６（３）：３３２−３３６）。
ウイルス外被タンパク質は一般にウイルス感染にとって必須でありかつウイルス粒子の構成において必須であることから、ウイルス抵抗性遺伝子組換え植物の開発において、ウイルス外被タンパク質および／またはこれらをコードする分節ゲノムを標的として、これらウイルス外被タンパク質遺伝子を植物に導入するのが主流となっている。ＲＤＶにおいても同様に、ウイルス粒子の内殻タンパク質の第１層目を形成するタンパク質（Ｐ３）をコードするＳ３（非特許文献４）または外殻タンパク質の第２層目を形成するタンパク質（Ｐ８）をコードするＳ８（非特許文献３および非特許文献４）を標的とした研究が行われている。その具体的理由としては、以下の３点がある：
（１）ＲＤＶ粒子は、上記のように外殻および内殻の２層から構成されており、Ｐ３およびＰ８がなければ、粒子として成立し得ないので、Ｐ３またはＰ８をコードする分節ゲノム（Ｓ３またはＳ８）を標的とすることは重要である；
（２）ＲＤＶのような植物ウイルスは一般に、植物体に侵入した後、全身に広がり（遠距離移行）、大部分のウイルスは、ウイルス粒子の形で移行すると考えられているという点からも、Ｐ３またはＰ８をコードする分節ゲノム（Ｓ３またはＳ８）を標的とすることが重要である；
（３）Ｓ３、Ｓ８がコードするタンパク質がなければ２本鎖ＲＮＡゲノムを感染細胞内に露出することとなり、宿主に備わっているＲＮＡ干渉機構の標的になる可能性がある。従って、Ｓ３およびＳ８がコードするタンパク質はウイルスゲノムを守る上でも必須のタンパク質であると考えられるので、これらタンパク質をコードする分節ゲノムを標的とすることは重要である。
これまでは、上記のような考えに基づいて作出したイネ萎縮ウイルス抵抗性イネによって、約９０％のイネ萎縮ウイルス抵抗性集団が得られたと評価されていた（非特許文献３）。しかしこのような評価にも拘わらず、このようなイネ萎縮ウイルス抵抗性イネは未だ実用化には至っていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
実用化に結びつく、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネの作出方法および抵抗性型品種を得ることが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明は、抵抗性の評価に注目した。そして非特許文献３に示されるイネ萎縮ウイルス抵抗性イネを、新たな評価法で再度評価し直したところ、イネ萎縮ウイルスに感染した個体の集団における「完全抵抗性」イネおよび「発病遅延型抵抗性」イネの割合の「合計」は、約８０％でしかない（すなわち、約８０％抵抗性集団でしかない）ことが分かった。理論に束縛されることを望まないが、このように感受性のものが含まれることが、非特許文献３の技術が実用化に結びついていない理由であると考えられる。実用化を実現するためには、イネ萎縮ウイルス感染植物体の総計に対する「完全抵抗性」イネと「発病遅延型」イネの合計の割合がほぼ１００％になる（１００％抵抗性集団を得る）ことが重要であり、このような高い抵抗性の割合を得られるものを「イネ萎縮ウイルス抵抗性イネ」として評価すべきである。その新しい基準で評価したところ、Ｓ１２を標的としたものも、Ｓ４を標的としたものも、「完全抵抗性」イネと「発病遅延型」イネの合計の割合がほぼ１００％であり、１００％抵抗性集団であった。
本発明者らは、より無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、抑制または安定した抵抗性が付与されたイネ萎縮ウイルス抵抗型イネを作出し、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネを実用化するために、公知の抵抗性イネについての問題を評価することを目的として、外被タンパク質／これらをコードするゲノムの標的として作出されたイネ萎縮ウイルス抵抗性イネの評価を再検討したところ、抵抗性個体が集団のほぼ９０％であると報告されていたものは、完全抵抗性個体が６０％程度であるに過ぎないことが判明した。ＲＮＡ干渉法は標的遺伝子を１００％発現抑制（ノックアウト）するのではなく、１００％でないが高率で発現抑制（ノックダウン）するものであるので、ＲＮＡ干渉法の機構に基づけば、完全抵抗性個体と発病遅延型抵抗性個体とを明確に区別することは、正しく評価する上で極めて重要である。
本発明者らは、従来のウイルス外被タンパク質／分節ゲノム以外のものを標的としたウイルス抵抗性イネの作出において、Ｐｎｓ１２（Ｓ１２）を標的とした場合に、完全抵抗性個体が１００％得られる（１個体も病徴が認められない）ことを初めて発見した。Ｐｎｓ４（Ｓ４）を標的とした場合には、イネ萎縮病ウイルス感染イネ植物体の集団において、完全抵抗性個体が６０％、発病遅延型抵抗性個体が４０％の割合で得られた。Ｐｎｓ１２は、バイロプラズマといわれるウイルス合成のための足場となるタンパク質であり、Ｐｎｓ４は、感染細胞中でのＲＤＶ輸送において役割を果たすタンパク質である。従って、理論に束縛されることを望まないが、感染に必須のタンパク質を標的として感染自体を防御するよりむしろ、感染後のウイルス増殖のいずれかの過程に関与するタンパク質を標的としてＲＤＶ増殖を防御することが、１００％に近いイネ萎縮ウイルス抵抗性集団（すなわち、１００％抵抗性集団）を得る結果になると考えられる。そしてこのことにより、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネの実用化が可能になるはずである。
このようなイネ萎縮ウイルス抵抗性イネの開発に向けて、本発明は、イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、イネ萎縮病に抵抗性を付与するための組成物を提供する。
本発明はまた、イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法を提供する。この方法は、Ａ）イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を提供する工程；Ｂ）該発現抑制剤を該植物の細胞に導入する工程；Ｃ）該発現抑制剤が導入された植物の細胞を選択する工程；およびＤ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；を包含する、方法を提供する。ここで得られたトランスジェニック植物の「抵抗性」については、新たな評価法で「完全抵抗性」個体と「発病遅延型」個体の合計あるいは「完全抵抗性」個体を別個に評価することとする。
本発明は、一局面において、イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、イネ萎縮病に抵抗性を付与するための組成物を提供する。
一実施形態において、上記組成物は、イネ萎縮病ウイルス感染個体の集団に対して１００％抵抗性集団（イネ萎縮ウイルス感染イネの総計に対する完全抵抗性イネと発病遅延型イネの合計の割合がほぼ１００％）を与える。好ましい実施形態において、上記組成物は、７０％完全抵抗性集団（イネ萎縮ウイルス感染植物体の個体数総計に対して約７０％に完全抵抗性）を与えることができる。より好ましい実施形態において、上記組成物は、１００％完全抵抗性集団（イネ萎縮ウイルス感染植物体の個体数総計に対して１００％に完全抵抗性）を与えることができる。
一実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ１（配列番号１）、Ｓ３（配列番号５）、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ５（配列番号９）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ７（配列番号１３）、Ｓ９（配列番号１７）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択され得る。好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択され得る。なお好ましい実施形態において、上記遺伝子は、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択され得る。
別の好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子はＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体であり得る。
さらに好ましい実施形態において、上記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含み得る。
別の好ましい実施形態において、上記発現抑制剤は、
（ａ’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ’）ターミネーター配列、
を含み得る。
なお別の好ましい実施形態において、上記発現抑制剤は、
（ａ”）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”）ターミネーター配列、
を含み得る。
さらにもう一つの好ましい実施形態において、上記発現抑制剤は、
（ａ”’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”’）ターミネーター配列、
を含み得る。
一実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ１（配列番号１）、Ｓ３（配列番号５）、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ５（配列番号９）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ７（配列番号１３）、Ｓ９（配列番号１７）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択され得る。
本発明の一局面において、本発明は、イネ萎縮ウイルスゲノムに存在するＳ１（配列番号１）、Ｓ３（配列番号５）、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ５（配列番号９）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ７（配列番号１３）、Ｓ９（配列番号１７）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される核酸配列の全部または一部と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および上記アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む発現カセットを提供し得る。好ましい実施形態において、上記発現カセット中の上記核酸配列は、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択され得る。さらに好ましい実施形態において、上記発現カセット中の上記核酸配列は、Ｓ１２（配列番号２３）およびこの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体であり得る。
別の実施形態において、上記発現カセット中の上記アンチセンス配列は、配列番号２５のアンチセンス配列、配列番号２６のアンチセンス配列、配列番号２７のアンチセンス配列、および配列番号２８のアンチセンス配列、ならびに配列番号２５〜２８のいずれか１つに示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体のアンチセンス配列からなる群より選択され、上記トリミング配列は、配列番号４６であり得る。
好ましい実施形態において、上記発現カセットは、
（ａ）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号２５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含み得る。
別の好ましい実施形態において、上記発現カセットは、
（ａ’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ’）（ｉ）配列番号２６に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ’）ターミネーター配列、
を含み得る。
なお別の好ましい実施形態において、上記発現カセットは、
（ａ”）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”）（ｉ）配列番号２７に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”）ターミネーター配列、
を含み得る。
さらに別の好ましい実施形態において、上記発現カセットは、
（ａ”’）配列番号５２に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号２８に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ”’）配列番号４６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ”’）（ｉ）配列番号２８に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号１７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ”’）ターミネーター配列、
を含み得る。
さらなる局面において、本発明は、上記発現カセットを含むベクター；上記ベクターを含む植物細胞；上記ベクターを含む植物体；上記ベクターを含む種子を提供する。
一実施形態において、上記植物体は、イネ萎縮ウイルスに対する完全抵抗性を示し得る。
一局面において、本発明は、イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法を提供し、上記方法は、以下の工程を包含し得る：
Ａ）本発明のベクターを提供する工程；
Ｂ）本発明のベクターを上記植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）本発明のベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）上記選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程。
別の局面において、本発明は、イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法を提供し、上記方法は、以下の工程を包含し得る：
Ａ）本発明のベクターを提供する工程；
Ｂ）本発明のベクターを上記植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）本発明のベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）上記選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）上記トランスジェニック植物から種子を得る工程。
なお別の局面において、本発明は、イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得る植物を再生産する方法を提供し、上記方法は、以下の工程を包含し得る：
Ａ）本発明のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）上記種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）上記植物体から、種子を得る工程。
上記のように、従来標的とされてきたイネ萎縮ウイルス外被タンパク質以外のものをコードする分節ゲノム（好ましくは、バイロプラズマをコードする分節ゲノム）を標的とした発現抑制剤を含む組成物により、より無病徴のレベルの高い、すなわち、１００％抵抗性集団（イネ萎縮ウイルス感染植物体の個体数総計に対する完全抵抗性イネと発病遅延型イネの合計の割合がほぼ１００％を示す）、好ましくは、少なくとも約７０％完全抵抗性集団（イネ萎縮ウイルス感染植物体の個体数総計に対して少なくとも約７０％が完全抵抗性を示す）か、またはより好ましくは、約１００％完全抵抗性集団（イネ萎縮ウイルス感染植物体の個体数総計に対してほぼ１００％が完全抵抗性を示す）が提供され、抑制または安定した抵抗性が付与されたイネ萎縮ウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、接種してから１８時間後のＲＤＶに感染したヨコバイの媒介単層細胞（ＶＣＭ）におけるＲＤＶのＰｎｓ４タンパク質、Ｐｎｓ６タンパク質、Ｐｎｓ１０タンパク質、Ｐｎｓ１１タンパク質およびＰｎｓ１２タンパク質の細胞下位置を示す。Ｐｎｓ４、Ｐｎｓ６、Ｐｎｓ１０およびＰｎｓ１１の免疫染色は緑色で示され、Ｐｎｓ１２の免疫染色は赤色で示される。Ｐｎｓ６とＰｎｓ１１との共局在は、黄色で示される。
図２は、接種してから１８時間後のＲＤＶ感染ＶＣＭにおけるＲＤＶのＰｎｓ６（ａ）、Ｐｎｓ１１（ｂ）およびＰｎｓ１２（ｃ）を有する電子密集封入体の免疫金標識を示す。バーは、３００ｎｍを示す。
図３は、ウイルスに感染したＶＣＭにおけるＲＤＶのＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９およびＰｎｓ１２の細胞下位置を示す。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９の免疫染色は緑色で示され、Ｐｎｓ１２の免疫染色は赤色で示される。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９と、Ｐｎｓ１２との共局在は、黄色で示される。
図４は、接種して１８時間後のＲＤＶに感染したＶＣＭにおける電子密集封入体の周縁におけるＲＤＶコアおよび内殻タンパク質Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５およびＰ７、または外殻タンパク質Ｐ２、Ｐ８およびＰ９の免疫金標識を示す。Ｐ７における挿入図は、単一のコア様粒子上にＰ７が局在していることを示す。矢印は、コア様粒子を示す。バーは、３００ｎｍを示す。
図５は、接種して４８時間後の組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるＰｎｓ１２の細胞下位置を示す。（ａ）ＦＩＴＣ結合Ｐｎｓ１２特異的ＩｇＧでのＰｎｓ１２の免疫蛍光染色によって、斑状封入体の形成が明らかになった。（ｂ）電子密集封入体とのＰｎｓ１２会合の免疫金標識。バーは、３００ｎｍを示す。
図６は、フィルター結合アッセイによって示される、ＲＤＶのＰｎｓ１２の自己会合を示す。（ａ）膜上のタンパク質をクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色することにより視覚化した。（ｂ）ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質；コントロール）およびＲＤＶのＭＢＰ融合Ｐｎｓ１２（ＭＢＰ−Ｐｎｓ１２）を、Ｐｎｓ１２がＰｎｓ１２自体に結合するのを検出するためのプローブとして使用した。
図７は、接種してから種々の時点で示される、ウイルスに感染したＶＣＭにおけるＲＤＶのＰｎｓ１２およびＰ８の細胞下位置を示す。Ｐ８の免疫染色は緑色で示され、Ｐｎｓ１２の免疫染色は赤色で示される。重ね合わせた画像において、Ｐｎｓ１２およびＰ８の共局在は黄色で示される。
図８は、ＲＤＶに感染した細胞におけるＲＮＡ合成の位置を示す。
図９は、インビボでのＲＤＶのＰｎｓ４のリン酸化を示す。感染Ｎ．ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ細胞（＋）および非感染Ｎ．ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ細胞（−）の分画した免疫沈降物のオートラジオグラフィーの結果を示す。マーカーは、ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．０ｋＤａ）、オボアルブミン（４５．０ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９．０ｋＤａ）、およびβ−ラクトグロビン（１８．４ｋＤａ）であった。
図１０は、罹病イネの葉およびウイルスを運ぶＮ．ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓのマルピーギ管の細胞におけるＰｎｓ４の位置を示す。Ａ：ＲＤＶに感染したイネの葉における無定形封入体内のＰｎｓ４の免疫金標識。Ｂ：Ｐｎｓ４は、ウイルス媒介昆虫における直径約１０ｎｍの微小管構造の束と会合した。バーは、３００ｎｍを示す。
図１１は、接種してから種々の時点で決定した、ウイルスに感染したＶＣＭにおけるＲＤＶのＰｎｓ４およびＰｎｓ１２の共局在を示す。Ｐｎｓ４の免疫染色は緑色で示され、Ｐｎｓ１２の免疫染色は赤色で示される。接種後１０時間のパネル中のＰｎｓ４の環状構造は、矢印で示される。Ｐｎｓ４およびＰｎｓ１２の共局在は黄色で示される。
図１２は、ＲＤＶに感染したＶＣＭにおけるＰｎｓ４の分布を示す電子顕微鏡写真である。Ａ：Ｐｎｓ４は、接種して１２時間後のバイロプラズマの周縁に局在した。Ｂ：Ｐｎｓ４は、接種して１８時間後に、繊維状物質（矢印）に局在した。Ｃ：接種して３６時間後の微小管構造をしたＰｎｓ４（矢印）。Ｄ：微小管の横断面から、閉じた輪のパラクリスタル列が明らかになった。Ｅ：Ｐｎｓ４は、接種して３６時間後の感染したＶＣＭの浸漬調製物からの種々の長さの管に局在した。バーは、Ａ〜Ｄにおいては３００ｎｍを示し、Ｅにおいては１５０ｎｍを示す。ＶＰ，バイロプラズマ；ＦＭ，繊維状物質；ＭｎＴ，微小管構造。
図１３は、接種後４８時間後の組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるＰｎｓ４の細胞下位置を示す。Ａ：Ｐｎｓ４の免疫蛍光染色。Ｂ：感染した細胞の表面と会合したＰｎｓ４を示す、Ｐｎｓ４の免疫金標識。バーは、３００ｎｍを示す。
図１４は、接種して１８時間後のウイルスに感染したＶＣＭにおける管の電子顕微鏡写真を示す。（Ａ）細胞の表面から伸びかつ拡がった細胞膜により囲まれた管。（Ｂ）管中のＰｎｓ１０の免疫金標識。（Ｃ）管内の電子密集粒子中のウイルス抗原。バーは、３００ｎｍを示す。
図１５は、ウイルスに感染したＶＣＭにおけるＲＤＶのＰｎｓ１０の細胞下位置を示す。（Ａ）接種して１０時間後の細胞下位置。（Ｂ）接種して１４時間後の細胞下位置。（Ｃ）接種して３６時間後の細胞下位置。バーは、２５μｍを示す。
図１６は、形質転換体当代（Ｔ０）株における目的の遺伝子の導入の確認（Ａ）、および導入された遺伝子の切断によるＴ０株の細胞中の低分子ＲＮＡの蓄積（Ｂ）を示す。Ｅｍｐｔｙは、コントロールとして供した、導入遺伝子なしのベクターで形質転換した当代（Ｔ０）植物体を示す。
図１７は、Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ導入形質転換体（Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ）の接種検定の結果を示す。図１７Ａ：左側の鉢は、野生型株（Ｅｍｐｔｙ）（左に健全株（Ｍｏｃｋ）、右にＲＤＶ接種株（ＲＤＶ）を示す）であり、右の鉢は、Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ導入形質転換体（ＲＤＶ接種株）である。図１７Ｂ：Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ導入形質転換体（Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ）中の導入遺伝子と感染抵抗性との関係を示す。図中の略語の意味は、以下の通りである。Ｓ：接種後３週間以内に発病、Ｄ：発病遅延型抵抗性（接種後３−８週に発病）、Ｒ：抵抗性（無病徴  接種後８週間）、ＲＰＳ７：コントロール。
図１８は、Ｔｒｉｇｇｅｒ４Ｎ導入形質転換体（Ｔｒｉｇｇｅｒ４Ｎ）の接種検定の結果を示す。図１８Ａ：左側の鉢は、野生型株（Ｅｍｐｔｙ）（左に健全株（Ｍｏｃｋ）、右にＲＤＶ接種株（ＲＤＶ）を示す）であり、右の鉢は、Ｔｒｉｇｇｅｒ４Ｎ導入形質転換体（ＲＤＶ接種株）である。図１８Ｂ：Ｔｒｉｇｇｅｒ４Ｎ導入形質転換体（Ｔｒｉｇｇｅｒ４Ｎ）中の導入遺伝子と感染抵抗性との関係を示す。図中の略語の意味は、以下の通りである。Ｓ：接種後３週間以内に発病、Ｄ：発病遅延型抵抗性（接種後３−８週に発病）、Ｒ：抵抗性（無病徴  接種後８週間）、ＲＰＳ７：コントロール。
図１９は、本発明の形質転換イネの作製方法において使用されるベクターの模式図である。
配列の説明
配列番号１：分節ゲノムＳ１の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ９０１９８）
配列番号２：分節ゲノムＳ１によってコードされるアミノ酸配列
配列番号３：分節ゲノムＳ２の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００１５８０由来）
配列番号４：分節ゲノムＳ２によってコードされるアミノ酸配列
配列番号５：分節ゲノムＳ３の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ００６９３）
配列番号６：分節ゲノムＳ３によってコードされるアミノ酸配列
配列番号７：分節ゲノムＳ４の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５４６２２）
配列番号８：分節ゲノムＳ４によってコードされるアミノ酸配列
配列番号９：分節ゲノムＳ５の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ９００３３）
配列番号１０：分節ゲノムＳ５によってコードされるアミノ酸配列
配列番号１１：分節ゲノムＳ６の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ９１６５３）
配列番号１２：分節ゲノムＳ６によってコードされるアミノ酸配列
配列番号１３：分節ゲノムＳ７の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ００６３９）
配列番号１４：分節ゲノムＳ７によってコードされるアミノ酸配列
配列番号１５：分節ゲノムＳ８の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１３７７３）
配列番号１６：分節ゲノムＳ８によってコードされるアミノ酸配列
配列番号１７：分節ゲノムＳ９の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１３４０４）
配列番号１８：分節ゲノムＳ９によってコードされるアミノ酸配列
配列番号１９：分節ゲノムＳ１０の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ００２４１）
配列番号２０：分節ゲノムＳ１０によってコードされるアミノ酸配列
配列番号２１：分節ゲノムＳ１１の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１０２４９）
配列番号２２：分節ゲノムＳ１１によってコードされるアミノ酸配列
配列番号２３：分節ゲノムＳ１２の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ７２０８５）
配列番号２４：分節ゲノムＳ１２によってコードされるアミノ酸配列
配列番号２５：Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎの核酸配列
配列番号２６：Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃの核酸配列
配列番号２７：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎの核酸配列
配列番号２８：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃの核酸配列
配列番号２９：Ｔｒｉｇｇｅｒ  １（ＲＤＶ  Ｓ１部分配列）の核酸配列
配列番号３０：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ２（ＲＤＶ  Ｓ２部分配列）の核酸配列
配列番号３１：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ３（ＲＤＶ  Ｓ３部分配列）の核酸配列
配列番号３２：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ５（ＲＤＶ  Ｓ５部分配列）の核酸配列
配列番号３３：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ６（ＲＤＶ  Ｓ６部分配列）の核酸配列
配列番号３４：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ７（ＲＤＶ  Ｓ７部分配列）の核酸配列
配列番号３５：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ９（ＲＤＶ  Ｓ９部分配列）の核酸配列
配列番号３６：Ｔｒｉｇｇｅｒ  １０（ＲＤＶ  Ｓ１０部分配列）の核酸配列
配列番号３７：Ｔｒｉｇｇｅｒ  １１（ＲＤＶ  Ｓ１１部分配列）の核酸配列
配列番号３８：プライマーＳ１２−ＧＳＦ１
配列番号３９：プライマーＳ１２−ＧＳＲ１
配列番号４０：プライマーＳ１２−ＧＳＦ２
配列番号４１：プライマーＳ１２−ＧＳＲ２
配列番号４２：プライマーＳ０４−ＧＳＦ１
配列番号４３：プライマーＳ０４−ＧＳＲ１
配列番号４４：プライマーＳ０４−ＧＳＦ２
配列番号４５：プライマーＳ０４−ＧＳＲ２
配列番号４６：ＧＵＳ配列
配列番号４７：プライマーＳ４Ｓ１２−ＧＳＲ１
配列番号４８：プライマーＳ１２Ｓ０４−ＧＳＦ１
配列番号４９：Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ２
配列番号５２：Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ２
配列番号５１：Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ４Ｎ
配列番号５２：ユビキチンプロモーター配列
（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ４５２７３６由来）
配列番号５３：分節ゲノムＳ８の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ００５３６）
配列番号５４：分節ゲノムＳ８によってコードされるアミノ酸配列
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「イネ萎縮ウイルス」とは、ＲＤＶともいわれ、レオウイルス属に属するファイトレオウイルスのメンバーである。このウイルスのゲノムは、１２分節の二本鎖ＲＮＡであることが知られている。各ＲＮＡ分節からおおむね１種類のタンパク質がコードされる。キャプシド内部にＲＮＡポリメラーゼを含み感染直後のウイルスｍＲＮＡ合成に関与する。このウイルスは、粒子を構成する７種の構造タンパク質と、ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動易動度によってＳ１からＳ１２とよばれる１２本に分節した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を遺伝子として有する。また、このウイルスは、直径約７０ｎｍ、分子量約７０００万ダルトンの巨大な球状ウイルスである。このウイルスは、イネ科の植物に分布している。ＲＤＶは、宿主の防御機構から逃れるために、ゲノムの複製をキャプシド内で行い、新たに転写したｍＲＮＡのみを細胞質に放出する。そのために、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素および核酸結合タンパク質からなる転写複合体とよばれるタンパク質複合体をキャプシド内部に持っていることが見出された。ＲＤＶのキャプシドは、Ｐ３タンパク質１２０分子から作られる内殻と、Ｐ８タンパク質７８０分子から作られる外殻の二重殻構造を持ち、直径約７００Åの球殻構造をとっていることもまた、見出された。また、ＲＤＶには、多くの亜種系統および変種系統が存在することが確認されている。従って、本明細書において使用される場合、用語「ＲＤＶ」は、当然のことながら、この用語がＲＤＶの亜種系統および変種系統も意図していることは、当業者であれば容易に明らかである。代表的な亜種系統および変種系としては、Ｏ株（本発明者らにより分離）、秋田株（秋田県立大学により分離）、Ｃｈｉｎｅｓｅ株（中国北京大学により分離）、Ｋｕｎｍｉｎｇ株（中国科学院により分離）、Ｙｕｎｎａｎ株（中国科学院により分離）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＲＤＶのＯ株のＳ１２の配列とＣｈｉｎｅｓｅ株のＳ１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３６５６９）を比較したところ、約６０ヌクレオチドの置換が認められた。この程度の置換があるとしても、最低限発現抑制が起こる塩基長、すなわち、２４ヌクレオチド以上実質的に一致した部分塩基配列が他の亜種株もしくは変異株間に存在していれば、ある１種の亜種株に由来する分節ゲノムを含む本発明の発現抑制剤は、別の１種の亜種株においても、その効果を発揮し得る。他方、ＲＤＶのどの株由来の配列を用いたとしても、当業者は本明細書の記載に基づいて他の株に対しても効果を有するｓｉＲＮＡなどの発現抑制剤を製造することができることが理解される。
代表的な亜種株のゲノムに関する情報は以下のとおりである。
【表Ａ】
2009020237.tif 000002
本明細書においてウイルスの「系統」および「株」は、同じウイルス種内でのバリエーションをいうために使用され得るが、これらの用語は、交換可能に使用され得ることが理解される。
本明細書において「Ｓ１」とは、（１）配列番号１に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ１をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ１によってコードされる構造タンパク質（Ｐ１ともいわれる）は、ＲＤＶの内殻粒子に内包されるタンパク質であり、ＲＮＡポリメラーゼとして機能する。また、Ｓ１によってコードされる構造タンパク質は、ＲＤＶのＲＮＡ合成において、その役割を果たし、おそらく感染中期に関与する。
本明細書において「Ｓ２」とは、（１）配列番号３に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ２をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ２によってコードされる構造タンパク質（Ｐ２ともいわれる）は、ＲＤＶの外殻を構成し、ＲＤＶが感染する際の昆虫受容体認識において機能する。また、Ｓ２によってコードされる構造タンパク質は、昆虫細胞への侵入においてその役割を果たすが、植物での感染には不要なタンパク質である。
本明細書において「Ｓ３」とは、（１）配列番号５に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ３をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ３によってコードされる構造タンパク質（Ｐ３ともいわれる）は、ＲＤＶの内殻粒子を構成するコアタンパク質であり、ＲＤＶ粒子の主要骨格として機能し、おそらく感染中期に関与する。
本明細書において「Ｓ４」とは、（１）配列番号７に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ４をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ４によってコードされる非構造タンパク質（Ｐｎｓ４ともいわれる）は、ＲＤＶが感染した昆虫細胞において微小管構造物を形成し、感染細胞中でのＲＤＶ輸送においてその役割を果し、おそらく感染後期に関与する。
本明細書において「Ｓ５」とは、（１）配列番号９に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ５をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ５によってコードされる構造タンパク質（Ｐ５ともいわれる）は、内殻粒子を構成するコアタンパク質である。Ｐ５はまた、キャップ化酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）として機能して、ｍＲＮＡを活性化する役割を果たし、おそらく感染中期に関与する。
本明細書において「Ｓ６」とは、（１）配列番号１１に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ６をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ６によってコードされる非構造タンパク質（Ｐｎｓ６ともいわれる）は、ＲＤＶが感染した細胞において形成され、ウイルスの合成工場として機能するバイロプラズマを構成するタンパク質であり、おそらく感染初・中期に関与する。
本明細書において「Ｓ７」とは、（１）配列番号１３に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ７をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ７によってコードされる構造タンパク質（Ｐ７ともいわれる）は、ＲＤＶの内殻粒子を構成するコアタンパク質である。Ｐ７はまた、非特異的核酸結合タンパク質として機能して、ウイルス粒子内の核酸収納においてその役割を果たし、おそらく感染中期に関与する。
本明細書において「Ｓ８」とは、（１）配列番号１５および配列番号５３に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ８をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ８によってコードされる構造タンパク質（Ｐ８ともいわれる）は、ＲＤＶの外殻を構成し、ＲＤＶ粒子の主要骨格として機能し、おそらく感染中・後期に関与する。
本明細書において「Ｓ９」とは、（１）配列番号１７に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ９をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ９によってコードされる構造タンパク質（Ｐ９ともいわれる）は、外殻タンパク質であり、おそらく感染後期に関与する。
本明細書において「Ｓ１０」とは、（１）配列番号１９に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ１０をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ１０によってコードされる非構造タンパク質（Ｐｎｓ１０ともいわれる）は、ＲＤＶが感染した昆虫細胞において管状構造物を形成するように機能して、昆虫細胞間輸送においてその役割を果たすが、おそらく植物での感染に不要なタンパク質である。
本明細書において「Ｓ１１」とは、（１）配列番号２１に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ１１をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ１１によってコードされる非構造タンパク質（Ｐｎｓ１１ともいわれる）は、ＲＤＶが感染した細胞において形成され、ウイルスの合成工場として機能するバイロプラズマを構成するタンパク質であり、おそらく感染初・中期に関与する。
本明細書において「Ｓ１２」とは、（１）配列番号２３に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＤＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するＳ１２をコードする核酸配列によって示される、１２本に分節したＲＤＶ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のゲノムのうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。Ｓ１２によってコードされる非構造タンパク質（Ｐｎｓ１２ともいわれる）は、ＲＤＶが感染した細胞において形成され、ウイルスの合成工場として機能するバイロプラズマを構成するタンパク質であり、おそらく感染の最も初期にウイルス工場の設営に関与するタンパク質である。
本明細書において「構造タンパク質」とは、ウイルス粒子を構成するタンパク質をいい、ＲＤＶでは、Ｐ１（配列番号２）、Ｐ２（配列番号４）、Ｐ３（配列番号６）、Ｐ５（配列番号１０）、Ｐ７（配列番号１４）、Ｐ８（配列番号１６）、およびＰ９（配列番号１８）が該当する。他方、ウイルスゲノムにコードされるが、粒子を構成しないタンパク質を「非構造タンパク質」といい、Ｐｎｓ６（配列番号１２）、Ｐｎｓ１１（配列番号２２）、Ｐｎｓ１２（配列番号２４）、Ｐｎｓ４（配列番号８）およびＰｎｓ１０（配列番号２０）が該当する。一般に、非構造タンパク質は、構造タンパク質より早く合成される。
本明細書において「バイロプラズマ」とは、ＲＤＶにおける３種の非構造タンパク質（Ｐｎｓ６（配列番号１２）、Ｐｎｓ１１（配列番号２２）、およびＰｎｓ１２（配列番号２４）；それぞれ、分節ゲノムＳ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）、およびＳ１２（配列番号２３）によってコードされる）によって作られるウイルス粒子を合成するための工場をいう。これらの非構造タンパク質は、ＲＤＶが細胞に感染すると最初に作る、ウイルス複製にとって不可欠の細胞内器官であり、この内部でウイルス核酸が合成される。上記３種の非構造タンパク質のうち、最も早く集積されるのはＰｎｓ１２（配列番号２４）であり、ＲＤＶを接種して約６時間後である。よって、理論的には、Ｐｎｓ１２の発現を抑制するとウイルス複製の足場の構築が阻害され、さらには、ウイルス自身の複製も阻害されると考えられる。
本明細書において「イネ萎縮病」とは、植物ウイルス病の一種であって、その原因となるイネ萎縮ウイルス（ＲＤＶ）は昆虫によって伝播される（例えば、体内にＲＤＶを保毒した、ツマグロヨコバイ、クロスジツマグロヨコバイまたはイナズマヨコバイなどが、イネの汁液を吸うために口吻をイネに刺すときに、このイネ萎縮ウイルスがイネに感染する）。この植物ウイルス病にかかったイネは、斑紋を生じ、背丈が伸びなくなり、収量が激減する。
本明細書において、ウイルス（例えば、イネ萎縮ウイルス）等に対する「抵抗性」または「耐性」とは、ウイルス等が侵入しようとする宿主生体（本明細書では、植物）が、ウイルス等の侵入に対して抵抗力を持つことをいう。本明細書では、抵抗力とは、宿主生体の通常の生存・増殖が維持される程度の性質のほか、その宿主生体の生存が維持されている限り、抵抗力を有するとみなす。
本明細書において、病害（例えば、イネ萎縮病）に対する「耐性」または「抵抗性」とは、その病害に対して宿主生体（本明細書では、植物）が抵抗力を持つことをいう。従って、ウイルスまたは菌の侵入を許したとしても、そのようなウイルスまたは菌との共存が図られる限り、病害に対する耐性はあるといえる。
本明細書において、病害に対する「完全抵抗性」とは、病害を引き起こす原因因子（例えば、ＲＤＶ）に感染していない植物体（非感染植物体）と比較して、その原因因子に感染した植物体（感染植物体）が、その植物体の生長（例えば、分けつ、伸長）、目的物質の収量において、非感染生物体と何ら変化なく共存が図られることをいう。一般に、目的の植物体の野生型集団にある病原体を感染させたとき、上記野生型集団中の個々の植物体に上記病原体による病徴が出現する時期はほぼ同じである。従って、より狭義には、「完全抵抗性」とは、目的の植物体にある病原体を感染させたとき、この植物体と同じ種の野生型植物体において病徴が出現する時期を超えてさらに終生何ら病徴が出現しない場合をいう。さらに「感受性」とは、上記目的の植物体に上記病原体を感染させたときに、上記野生型の感染植物体において病徴が出現する時期とほぼ同時期に感染した場合をいう。しかし、上記感染植物体において、何らかの「抵抗性」が付与されているために、上記病徴が、野生型感染個体の病徴出現時期から上記一定期間の間に出現する個体がある。この場合、このような個体において現れる抵抗性を「発病遅延型抵抗性」という。「発病遅延型抵抗性」は、ウイルスの侵入に対して抵抗力を持ったために発病が遅延するという点では「抵抗性」であるものの、結局病徴が出現するという点では、「完全抵抗性」とは意味が異なるので、評価する際には、「発病遅延型抵抗性」個体と「完全抵抗性」個体とは厳密に区別して評価すべきことが理解される。従って、本明細書においては、病原体に対する抵抗性を正しく評価するために、病原体に感染した植物体総数は、感染に失敗した個体（すなわち、ツマグロヨコバイが吸汁したにも拘わらず、発病に至らなかったもの）を除いた個体の中で、完全抵抗性個体がＸ％、遅延型抵抗性個体がＹ％、感受性個体がＺ％である場合（ここでＸ＋Ｙ＋Ｚ＝１００（％）であるが、好ましくは、Ｚはほぼ０である）、上記病原体を感染させた植物体の「集団」における完全抵抗性は、Ｘ％として評価することとし、（Ｘ＋Ｙ）％としては評価しない。また、本明細書において、感染植物体の集団に対してＸ％の個体に「完全抵抗性」が付与され、Ｙ％の個体に「発病遅延型抵抗性」が付与された植物体（例えば、イネ）の個体集団を、「（Ｘ＋Ｙ）％抵抗性集団」または「Ｘ％完全抵抗性集団」という。例えば、感染植物体の集団の８０％の個体に「完全抵抗性」が付与され、１５％の個体に「発病遅延型抵抗性」が付与された場合、このような集団は、「８０％完全抵抗性集団」または「９５％抵抗性集団」といい、１００％の個体に「完全抵抗性」が付与された集団は、「１００％完全抵抗性集団」という。
例えば、ＲＤＶの場合は、２〜３葉期のイネ植物体野生型集団に感染させた場合、約３週間でほぼ全個体に病徴が出現する。従って、本明細書において、目的のイネ植物体がＲＤＶに対して「感受性」であるとは、上記イネ植物体においてＲＤＶを感染させてから３週間以内にその病徴が出現した場合をいう。また、２〜３葉期のイネ植物体野生型集団に感染させた場合に、感染から８週間経過しても病徴が出現しない場合、それ以降発病することはないので、少なくともイネ植物体に感染させてから８週間後に病徴が出現しなければ、一般に、上記イネ植物体は完全抵抗性であるとみなされる。従って、目的のイネ植物体がＲＤＶに対して「完全抵抗性」であるとは、上記イネ植物体においてＲＤＶを感染させてから通常は、８週間にわたって、または終生にわたってその上記イネ感染植物体に病徴が全く出現せず、非感染イネ植物体と何ら変化がない場合をいう。目的のイネ植物体がＲＤＶに対して「発病遅延型抵抗性」であるとは、上記イネ植物体にＲＤＶを感染させたときに、野生型イネにおいて感染させてから３週間でその病徴がほぼ全個体に出現することから、通常は、感染させてから３〜８週間の間にその病徴が出現する場合をいう。また、目的のイネ植物体の集団においてＲＤＶを感染させた場合に、感染に失敗した個体を除いて、ＲＤＶ感染個体集団の全個体が完全抵抗性である場合は、「１００％完全抵抗性集団」として言及し、上記集団において病徴を示す感染イネ植物体が１個体も存在しないことをいう。同様に、ＲＤＶ感染個体集団の全個体のうち、Ｘ％の個体に「完全抵抗性」が付与され、Ｙ％の個体に「発病遅延型抵抗性」が付与された集団を「（Ｘ＋Ｙ）％抵抗性集団」または「Ｘ％完全抵抗性集団」といい、このような集団を得ることは、非常に困難である。
本明細書において、「安定した抵抗性」とは、複数の世代において保持される抵抗性をいう。複数の世代において保持されるとは、好ましくは３世代、より好ましくは５世代、さらにより好ましくは７世代、最も好ましくは永久に保持されることを意味する。
本明細書では、特に言及するときは、抵抗性は、ウイルスまたは菌に対する性質をいい、耐性は病害に対する性質をいうが、交換可能に使用され得ることが理解される。
本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。通常、本明細書では、ＲＤＶが感染する植物を指す。好ましい植物は、イネ科に属する単子葉植物であり、本発明にとって最も好ましい植物は、イネである。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物組織の例としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
本明細書において「野生型」植物とは、形質転換などの人為的手段による遺伝的改変がなされていない天然に存在する植物をいう。
本明細書において生物の「器官」とは、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。例えば、茎、根、葉、花、種子などを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、器官の一部であり得る。器官内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子などを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常ゲノム上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、遺伝子というときは、通常、本発明の遺伝子の構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。ヌクレオチドの配列は、本明細書において「ヌクレオチド配列」または「塩基配列」という。
本明細書において「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同じ生物学的機能、特にＲＮＡｉの機能を果たす限り、ヌクレオチドの代替として使用され得ることが理解される。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において、「対応する」ヌクレオチドとは、ある核酸分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となる核酸分子またはポリヌクレオチドにおける所定のヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるヌクレオチドをいい、ＲＮＡｉにあっては、ＲＮＡ干渉作用において、同様の寄与をするヌクレオチドをいう。アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、分節ゲノムＳ１〜Ｓ１２）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ウイルスの遺伝子に対応する遺伝子は、他のウイルス（他のレオウイルス属のウイルスなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、あるウイルスにおける対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてそのウイルス（例えば、他のレオウイルス）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、植物におけるイネ萎縮ウイルスの増殖への関与、イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性または感受性への関与、イネ萎縮病に対する耐性、これらの具体的な機能について直接的または間接的に関連する機能（例えば、ウイルスタンパク質との結合など）などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性、因子またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列の全部または一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列を有する分子を本明細書において「アンチセンス分子」、「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンス核酸」と称し、これらは互換的に使用される。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／または欠失を有するものもまた含まれる。本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号１）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、シグナル伝達因子のｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。１つの好ましい実施形態では、本発明の発現抑制剤において使用されるアンチセンス核酸は、その長さの下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記アンチセンス核酸は、その長さの上限においては、たとえば、約１０５０ヌクレオチドまで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くアンチセンス現象に基づく遺伝子発現抑制効果を誘起させることができると考えられるからである。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的にｍＲＮＡが分解されることによって、タンパク質への翻訳が阻害され、遺伝子発現が抑制される現象をいう。遺伝子発現抑制手法としての植物におけるＲＮＡｉについての総説は、例えば、三木ら、「植物におけるＲＮＡｉの分子機構とその応用」（実験医学  Ｖｏｌ．２２  Ｎｏ．４（３月号）２００４）（本明細書中で、参考として援用される）などが挙げられる。ＲＮＡｉの利点の一つとして、弱いものから強いものまで様々なレベルの発現抑制が個々の遺伝子によって取得され得ること挙げられる。現在、ＲＮＡｉは、簡便かつ有効な遺伝子発現抑制法として利用されている。好ましい実施形態において、「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
本明細書において「トリミング配列」とは、センス配列およびアンチセンス配列に相当する配列とそれら二つの配列の間に位置する配列（スペーサー、ヘアピン、トリミング等と呼ばれている）ものをいう。下記のような構造：
センス配列−トリミング配列−アンチセンス配列；または
アンチセンス配列−トリミング配列−センス配列
を有する核酸分子が導入され得たベクターで細胞が形質転換されると、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成し、それら二つの鎖の間に位置する部分はループまたはヘアピン部分として保持された、その一部にループ又はヘアピン構造の一本鎖部分を含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が形成される。このトリミング配列の長さは、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成するときに、このトリミング配列の構成する一本鎖部分がループまたはヘアピン構造をとる限りにおいてどのような長さのものであってもよい。上記ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に移動し、その導入された細胞内でＤｉｃｅｒによって切断されてｓｉＲＮＡとなり、ＲＮＡ干渉を引き起こす。
好ましい実施形態では、ＲＮＡｉを引き起こす因子において使用されるセンス配列またはアンチセンス配列の長さは、その下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記センス配列またはアンチセンス配列の長さは、その上限においては、たとえば、約１０５０まで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くＲＮＡｉを誘起させることができると考えられるからである。
本明細書において第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して、第２の物質または因子以外の物質または因子（特に、第２の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
本明細書において「発現抑制剤」とは、広義には、遺伝子の細胞内における発現、すなわち、ゲノムの複製、転写、翻訳を抑制することができるあらゆる因子をいう。
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などであって、代表的には分子量約１０，０００以下のもの（例えば、約１，０００以下のもの）を指すがそれらに限定されない）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、イネ萎縮ウイルスの増殖に関与する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味し、その対象物を天然物から区別するために用いられる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、形質転換、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
本明細書で使用される場合、「外来」の核酸分子とは、ある対象核酸分子内に含まれるその対象核酸分子以外の起源の核酸分子などをいう。この外来の核酸分子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来の核酸分子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、目的（例えば、ＲＮＡ干渉）を果たす核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」または「抑制」とは、交換可能に使用され、ある因子（すなわち、発現抑制剤）を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、動物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
本明細書中で使用される場合、「ジーンサイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制現象を意味する。「ジーンサイレンシング」と呼ばれる現象としては、ゲノムインプリンティング、Ｘ染色体の不活性化、ＰＥＶ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）、トウモロコシのパラミューテションなどが挙げられる。植物におけるトランスジーン（導入遺伝子）の不活性化の一つとして、相同性依存型ジーンサイレンシング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＨＤＧＳ）があり、そのＨＤＧＳ様の現象は、植物内在性遺伝子、植物以外のトランスジェニックにおいても見られており、生物のなんらかの遺伝子制御機構であると考えられる。
本明細書中で使用される場合、「相同性依存型ジーンサイレンシング」または「ＨＤＧＳ」は、複数の遺伝子が、その塩基配列の相同性またはその配列の類似性に依存して起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。特に、特定の導入された遺伝子（導入遺伝子）を過剰発現させると、その導入遺伝子とともに本来ゲノムに存在していた（すなわち、内在的な）同一または相同な遺伝子が抑制される現象をいう。「ＨＤＧＳ」としては、例えば、「ＰＴＧＳ」が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「転写後型ジーンサイレンシング」または「ＰＴＧＳ」は、転写後に起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。ＲＮＡｉもＰＴＧＳの一種である。
本明細書中において使用される場合、「コサプレッション」、「コーサプレッション」および「共抑制」は、同意義語として使用され得る。「コサプレッション」とは、導入遺伝子を含む植物において、その導入遺伝子と相同な配列を有する内在性の遺伝子（その植物において、その植物のゲノム上の存在していた、その導入遺伝子と同一であるかまたは相同である遺伝子）の両方の発現が抑制される現象をいう。この現象は、ペチュニアの花の色素合成にかかる遺伝子の発現機構を研究している過程に発見された（Ｎａｐｏｌｉ，Ｃ．，Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｃ．＆Ｊｐｒｇｅｎｓｅｎ，Ｒ．：Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，２９１−２９９（１９９０）；ならびにｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，２９１−２９９（１９９０））。その後、植物のみでなくアカパンカビ、ショウジョウバエ、線虫、哺乳動物細胞などにおいてもそれらの同様の現象が発見されている。このような「コサプレッション」を、育種目的に利用した例は、ＳＣＩＥＮＣＥ  Ｖｏｌ．３０９  ２９  Ｊｕｌｙ  ２００５  ｐ．７４１−７４５などに記載されている。
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態をとっていてもよい。
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の方法および組成物において有用である。
本明細書において、配列番号８（Ｐｎｓ４）、配列番号１２（Ｐｎｓ６）、配列番号２２（Ｐｎｓ１１）または配列番号２４（Ｐｎｓ１２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号７（Ｓ４）、配列番号１１（Ｓ６）、配列番号２１（Ｓ１１）または配列番号２３（Ｓ１２）に示される核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章  「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １￣３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
配列番号８（Ｐ４）または配列番号２４（Ｐｎｓ１２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１または３に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、挿入改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加、挿入および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加、挿入および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。オルソログは、通常別のウイルス株において、もとのウイルス株と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書において使用される核酸分子は、目的とする遺伝子の発現を抑制する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加、挿入および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、挿入されること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加、挿入および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（遺伝子工学）
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
本明細書において用いられ得る植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐＡＮＤＡ（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）、ｐＢＥ７１３３−ＧＵＳ−Ｈｙｇｒｏ（ｐＥ７ΩＩＧＵＳ−Ｈｙｇｒｏ）、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。部位特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え植物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。部位特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。
本明細書において、「部位特異的発現プロモーター」とは、器官（例えば、根、茎、葉、果実、種子ならびにそれらの組合せなど）、組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、ならびにそれらの組合せなど）、発達段階（例えば、発芽期、生長期、開花期、登期ならびにそれらの組み合わせなど）などにおいて、特異的なプロモーターである。原理的には、個体において特異的に発現している遺伝子を単離し、そのプロモーター、発現制御シス領域を単離することによって得られる。
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子  組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
本明細書において「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
本明細書において「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ  ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ  １９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＲＥＸφプロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用いることができる。
あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，２３５８）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ  Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ  １９３，５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１４０６）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ  Ｊ．８，６５１）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
本明細書において「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。これらの薬剤耐性遺伝子は、本発明においてスクリーニング技術などにおいて用いられる。
上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ  ９９，１２）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。
本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。例えば、エンハンサーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が用いられるが、これらに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本発明において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
（抵抗性の評価）
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ＪａｐａｎＰｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネ萎縮病の場合は、特定のイネ品種にツマグロヨコバイなのＲＤＶを媒介する昆虫を温室中で放飼してウイルス感染させた場合の病斑形成やイネの背丈を、原品種または野生型と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
本発明者らは、ＲＤＶ分節ゲノムＳ１〜Ｓ１２によってコードされるタンパク質に対する抗体を作製し、これらタンパク質の細胞内での挙動を観察した。ＲＤＶに感染した昆虫細胞中での１２種のタンパク質の挙動を追跡したところ、３種の非構造タンパク質（Ｐｎｓ６、Ｐｎｓ１１、およびＰｎｓ１２）によってバイロプラズマというウイルス合成工場がまず造られることが見出された。次に、バイロプラズマで核酸が合成されるとともに、内殻粒子を構成する４種のタンパク質（Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５およびＰ７）が集まり、内殻粒子が作られる。その後、バイロプラズマの周縁に移動した内殻粒子に３種の外殻タンパク質（Ｐ２、Ｐ８、およびＰ９）が結合して、ウイルス粒子が作られる。残りの非構造タンパク質、Ｐ４およびＰ１０は、それぞれ、ウイルスの細胞内輸送および昆虫細胞間での輸送に関与する管状構造物を構築することも見出された。
これらタンパク質の細胞内での挙動を考慮に入れて、標的遺伝子を選択して発現抑制剤を作製し、ＲＤＶ抵抗性イネの作出を試みた。
一局面において、本発明は、イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、イネ萎縮病に抵抗性を付与するための組成物を提供する。
本発明の一実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）からなる群より選択され得る。最も好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子はＳ１２であり得るが、Ｓ１（配列番号１）、Ｓ２（配列番号３）、Ｓ３（配列番号５）、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ５（配列番号９）、Ｓ７（配列番号１３）、Ｓ９（配列番号１７）、Ｓ１０（配列番号１９）もまた同様に使用することができる。
一実施形態において、本発明の発現抑制剤は、配列番号３３（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ６）、配列番号３７（Ｔｒｉｇｇｅｒ  １１）、配列番号２５（Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ）および配列番号２６（Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ）の核酸配列と相補的なアンチセンス配列を用いて作製することができる。
一実施形態において、好ましいアンチセンス配列は、配列番号２５（Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ）によって示される核酸配列に相補的な配列、配列番号２６（Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ）によって示される核酸配列に相補的な配列、配列番号２７（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ）によって示される核酸配列に相補的な配列、配列番号２８（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃ）によって示される核酸配列に相補的な配列であり得る。
一実施形態において、トリミング配列は、５〜３２個またはそれ以上のヌクレオチド配列を有し得る。好ましいトリミング配列としては、ＧＵＳ配列、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｋｉｎａｓｅ）イントロン、ｄｏｆ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（ＤＡＧ１）イントロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の発現抑制剤は、配列番号２９（Ｔｒｉｇｇｅｒ  １）、配列番号３０（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ２）、配列番号３１（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ３）、配列番号３２（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ５）、配列番号３４（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ７）、配列番号３５（Ｔｒｉｇｇｅｒ  ９）、または配列番号３６（Ｔｒｉｇｇｅｒ  １０）の核酸配列と相補的なアンチセンス配列を用いて作製することができる。
本発明のプロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、好ましいプロモーターとしては、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、ストレス誘導性プロモーター（例えば、感染誘導性プロモーター）が好ましい。恒常性プロモーターとしては、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。感染誘導性プロモーターとしては、ＷＲＫＹ転写因子プロモーター、ＰＲ１プロモーター、ＰＢＺ１遺伝子プロモーター、ペルオキシダーゼプロモーター、マイトジェン活性化プロモーターなどが挙げられるが、これらには限定されない。
本発明は、一局面において、イネ萎縮ウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および該アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む、発現カセットを提供する。
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子は、Ｓ４（配列番号７）、Ｓ６（配列番号１１）、Ｓ１１（配列番号２１）およびＳ１２（配列番号２３）からなる群より選択され得る。特にＳ１２（配列番号２３）が好ましい。しかし、Ｓ１（配列番号１）、Ｓ２（配列番号３）、Ｓ３（配列番号５）、Ｓ５（配列番号９）、Ｓ７（配列番号１３）、Ｓ９（配列番号１７）、およびＳ１０（配列番号１９）を同様に使用することもできる。
別の好ましい実施形態において、使用されるアンチセンス配列は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウェブサイトにおいて利用可能なｒｎａｉ＿ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｒｎａｉ／ｒｎａｉ＿ｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｓｈｔｍｌ／）、Ｐｒｏｍｅｇａのウェブサイトにおいて利用可能なｓｉＲＮＡＤｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ．ｓｉＲＮＡＤｅｓｉｇｎｅｒ／）、ＡｍｂｉｏｎのウェブサイトのｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、ＤｈａｒｍａｃｏｎのｓｉＤＥＳＩＧＮ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、およびＧｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｌｅｃｔｏｒ（これらの方法に限定されない）を使用することによって容易に設計可能である。
本発明は、一局面において、上記発現カセットを含むベクターを提供する。本発明において使用されるベクターは、所望の目的（発現、送達、挿入、導入など）を達成する限り、どのようなベクターを用いても良いことが理解される。
本発明のベクターは、目的の細胞に導入された否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子を含み得る。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
本発明は、一局面において、上記ベクターを含む植物細胞、植物体、種子を提供する。
このような植物としては、どのようなものでも良いが、好ましくは、イネ萎縮ウイルスなどのレオウイルスに罹患する植物であり、さらに好ましくは、イネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなど）、さらにより好ましくはイネ属植物、さらにより好ましくは、イネ（例えば、ジャポニカ種またはインディカ種）であり得る。
一実施形態において、本発明の植物体は、イネ萎縮ウイルスに対する完全抵抗性を示す。
（抵抗性・耐性植物の作出）
本発明は、一局面において、イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法；イネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法；およびイネ萎縮病に対する耐性が付与された、イネ萎縮ウイルスに感染し得る植物を再生産する方法を提供する。
上記に示される方法は、本発明の発現抑制剤を、イネ科植物の細胞に導入する工程を包含する。一般的に、本発明のベクターは、種々の慣用的技術を用いて所望の植物宿主（例えば、イネ科植物の細胞）のゲノムに導入することができる。好ましい導入法としては、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が挙げられるが、これらに限定されない。上記方法はさらに、イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する。このような選択は、抵抗性を有するトランスジェニック植物を選択することができる限り、どのような方法を用いてもよく、細胞レベルの選択でもよいし、植物体レベルの選択でもよい。
本発明のベクターが導入されたか否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子）を含むベクターの場合、上記の導入工程後に得られた細胞は、その薬剤耐性遺伝子が細胞中で発現したか否かを検出するための薬剤（例えば、ハイグロマイシン）を含む選択培地中で増殖させることによって選択される。当然のことながら、このような選択培地中に含まれる薬剤は、上記ベクター中に含まれる薬剤耐性遺伝子に依存して変更され得る。
上記のようにして選択された細胞を、当該分野で一般的に使用される再生培地中で培養することにより、例えば、根およびシュートが確認できるまで再分化させる。このような再生培地としては、以下の実施例に記載されるような再分化培地（ＭＳＲＥ）などのような（当該分野で周知の）培地が挙げられるが、これらに限定されない。
上記のようにして再分化させることによって得られた根およびシュートは、鉢上げされ、試験に適した時期（例えば、９葉期）まで、または成熟期まで生長させられることによって、トランスジェニック植物（Ｔ０）が作出される。
さらに、このようにして得られたトランスジェニック植物中に本発明のベクターが含まれているか否かについては、上記植物から細胞を採取して全細胞ＤＮＡを得、ゲノムに組み込まれた薬剤耐性遺伝子をサザンブロットなどで、得られたトランスジェニック植物中に実際に本発明のベクターが含まれているか否かを確認できる。また、低分子ＲＮＡを得、Ｔｒｉｇｇｅｒ領域をプローブにノザンブロットを行うことで、トランスジェニック植物中で実際にＲＮＡｉを誘起できていることも確認できる。さらには、得られたトランスジェニック植物に、実際にＲＤＶを感染させて、感染トランスジェニック植物とコントロール野生型植物とを比較することによって、本発明のベクターが含まれているか否かを検出することもできる。
さらに、本発明のトランスジェニック植物は、Ｔ０植物から得られた種子、さらに後代のＴ１植物、Ｔ２植物、Ｔ３植物などから得ることもできる。
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明の発現抑制剤の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性、イネ萎縮病に対する耐性を付与するための、またはその耐性もしくは抵抗性を付与する農薬を製造するための使用を提供する。ここで使用される核酸分子および因子は、本明細書において上記される任意の核酸分子であり得ることが理解される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０００７】
（材料および方法）
以下に示す実施例において、特段の記載がない場合、一般的に、以下に記載される材料および方法を用いて実験を行った。
１．イネの生育
実験系統として、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）を使用した。イネ植物を温室（２０℃〜３２℃）において栽培し、９葉期まで生育させてから、以下の実験に使用した。イネへのＲＤＶ接種試験においては、各形質転換体系統およびコントロールの野生型イネのいずれも、２〜３葉期まで生育させてから使用した。なぜなら、ＲＤＶの病徴は新しく展開した葉において観察される、すなわち、イネの生育期において、２〜３葉期がＲＤＶに対する感受性が最も高いからである。
２．ＮＣ−２４細胞の樹立およびウイルス
ＮＣ−２４細胞（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ（以下、ＮＣという）細胞株をＮＣの卵から切り出した胚性断片より樹立し、以下の実験において使用した。簡潔には、以下に示すように作製した（詳細については、Ｋｉｍｕｒａ，Ｉ．＆Ｏｍｕｒａ，Ｔ．（１９８８）．Ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｄｖ  Ｄｉｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｓ  ５，１１１−１３５；およびＬｅａｆｈｏｐｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎ  Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．９１−１０７．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋ．Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ  ＆  Ａ．Ｈ．ＭｃＩｎｔｏｓｈ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照のことのこと）。胚運動期のＮｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓの卵から胚断片を切り出し、組織培養物の外植片として使用した。卵から取り出した若い胚の各々を、くぼみ付きスライドガラス（ｈｏｌｌｏｗ  ｓｌｉｄｅ）上でタイロード溶液中でいくつかの断片に切断した。その断片を、タイロード溶液（ｐＨ７．５）中の０．２５％トリプシンを用いて、３０℃において１０〜２０分間処理した。その後、その断片を微細ニードルの周りに巻き付けることによって増殖培地に移した。密閉可能なガラスディッシュの中に囲った小さなプラスチックディッシュの中心に、少量の培地（０．３〜０．５ｍｌ）中に約３０個の断片を一緒に置いた。さらなる培地を、そのプラスチックディッシュの縁内の底の四方に配置して、適切な蒸気圧を維持し、上記断片を含む別の培地の乾燥を避けた。この培養物を２５℃でインキュベートした。ＬｉｕおよびＢｌａｃｋの培地から誘導したＮＣ細胞用増殖培地（以下の試薬および培地の節を参照のこと）を、ＮＣ細胞株を培養するために使用した。初代培養物において、胚断片の大部分の外植片は、数時間後、培養容器の底表面に接着し、インキュベートして４８時間後以内に、その外植組織の周りに細胞増殖が発生し始めた。その細胞は数を増やしはじめ、単層の細胞シートを形成し、徐々に、元々の組織外植片を包み込むほどに拡がった。その初代培養物は、１週間に１回培地を交換することによって数ヶ月間維持することができた。細胞がディッシュ中でほぼコンフルエントになるまで増殖したとき、それら細胞を新たなディッシュに移した。これらの継代培養細胞を、さらに継代培養するためにプラスチック培養フラスコに入れた。細胞単層は、２タイプの上皮細胞から構成されていた。主要なものは、紡錘体状の細胞であり、少数のものは、丸い形の細胞であった。ＮＣ細胞において、前者は、７〜１０μｍ幅で１５〜６０μｍ長であり、後者は、直径６〜２０μｍである。ＮＣ細胞の倍加時間は、約９６時間であった。最終的に６系統のＮＣ細胞株を樹立し、４〜６日間間隔で約９０〜約１６５回継代できた。ＮＣ細胞株を凍結せずに維持するために、細胞を１５℃または２０℃でインキュベートした。培養培地を１ヶ月に１回交換した。また、これらの温度では、培養細胞はその増殖をほぼ停止したか、またはあるとしてもゆっくりと増殖した��細胞を１５℃で１４ヶ月維持し、２０℃で６ヶ月間維持した。この手順が、細胞培養物の短期間保存のために簡便な方法であることが分かった。ＮＣ細胞株を凍結し、Ａｇａｌｌｉａ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔａ（以下、ＡＣという）細胞貯蔵に使用した類似の方法（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５９，１０３２（１９６９））において、液体窒素中で長期間ポリプロピレンバイアル中に保存することができた。対数増殖期の媒介細胞単層を、沈降によって回収し、そのペレットを、５％  ジメチルスルホキシドを含む培地中に懸濁した。その懸濁した細胞を含むバイアルを、−８０℃で一晩インキュベートし、−１９６℃の液体窒素中に入れた。凍結した細胞を３７℃のウォーターバスに入れて迅速に融解することによって回収し、１分間あたり１ｍｌの培地を添加することによって１０ｍｌまで希釈した。低速遠心分離によって沈降させ、４ｍｌの新しい培地中に懸濁した。これらを２５ｃｍ２のＮＵＮＣフラスコ中に分散させた。これらの細胞のうちの約２０％を、この手順によって回収した。ＮＣ細胞株は、良好に生存性を維持したものを使用するために、４年間隔で細胞を起こして（ｒｅｃｏｖｅｒ）、凍結したものを使用する。
ＲＤＶ接種においては、０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ  ヒスチジン溶液（Ｈｉｓ−Ｍｇ）（ｐＨ約６．０）が媒介細胞単層での感染性の保存にとって優れた緩衝液であることが分かった。
ＮＣ−２４細胞を、ＫｉｍｕｒａおよびＯｍｕｒａ（Ａｄｖ  Ｄｉｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｓ  ５，１１１−１３５（１９８８））に記載されるように調製した増殖培地中で、２５℃において単層培養物として維持した。
以降の全ての実験においてＲＤＶのＯ株を使用したが、いずれのＲＤＶ亜種系統、あるいはいずれの変種系統を使用しても同様の結果が得られるであろうことは、当業者であれば容易に明らかである。ＲＤＶのＯ株は、Ｚｈｏｎｇら（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４８，２２７５−２２８０（２００３））により記載されるように、ＣＣｌ４を用いずにＲＤＶ感染イネ植物から精製した。ＲＤＶ粒子を含むスクロース勾配画分をプールし、−７０℃で保存した。
３．Ｓ１〜Ｓ１２によってコードされるタンパク質に対する抗体の作製
ウサギポリクローナル抗血清を、ＲＤＶの各分節ゲノムセグメントＳ１〜Ｓ１２によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体を、鈴木ら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２，４１−４８（１９９４）および鈴木らＡｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４４，１３７１−１３８０（１９９９））；Ｚｈｏｎｇら（Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４８，２２７５−２２８０（２００３））に記載されるように調製した。Ｓ１〜Ｓ１２によってコードされるタンパク質に特異的なＩｇＧ抗体を、得られた特異的ポリクローナル抗血清からプロテインＡ−セファロースを用いて単離した。これらの単離されたＩｇＧ抗体に、フルオレセイン−５−イソチオシアネートまたはローダミンを、公知の方法に従って直接結合させた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）。
４．  Ｓ１〜Ｓ１２によってコードされるタンパク質のバキュロウイルスによる発現
バキュロウイルス系を、Ｍｉｙａｚａｋｉら（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４５，２２９−２３７（２００５））により記載されるように、ＲＤＶタンパク質の発現のために使用した。Ｓ１〜Ｓ１２によってコードされるｃＤＮＡのコード領域を、ｐＧＡＤＴ７ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、完全に配列決定して、増幅の間にヌクレオチドの誤った取り込みが何もないことを確認した。適切な制限酵素で消化した後、そのｃＤＮＡを、ｐＦａｓｔＢａｃドナープラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートした。次いで、組換えｐＦａｓｔＢａｃを、バクミドへの置き換えのために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂａｃ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。組換えバクミドを単離し、これを用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞をＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で製造業者の説明書に従ってトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトしてから７２時間後、Ｓｆ９細胞を収集し、タンパク質の発現を、Ｓ１〜Ｓ１２によってコードされる各タンパク質に特異的な抗体で免疫ブロッティングすることにより調べた。
細胞学的な観察に関しては、トランスフェクションを行う前日に、１．５×１０４／ｃｍ２の密度でカバーガラス（１５ｍｍ直径）上に、Ｓｆ９細胞を播種した。培養培地を除去し、細胞を組換えバキュロウイルスに感染させた。細胞を、２７℃で１２〜７２時間にわたってインキュベートしてから、免疫蛍光顕微鏡のために処理した。
５．各組換えＲＤＶタンパク質の発現および精製
各ＲＤＶタンパク質をコードするｃＤＮＡのコード領域を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして、それぞれ、適切なベクター（例えば、ｐＥＴ−３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＧＡＤＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし、適切なフラグメントがクローニングされたことをＤＮＡ配列決定により確認した。次いで、これらのフラグメントを、細菌発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位にサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現させた。各タンパク質を、それぞれ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−Ｐｎｓ１２）との融合タンパク質として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓの説明書に従って精製した。
６．免疫染色
二重染色実験に関しては、ＩｇＧを、プロテインＡ−セファロースアフィニティーカラムを用いて、特異的ポリクローナル抗血清から単離した。溶出したＩｇＧを、ＰＢＳに対して完全に透析した。製造業者の説明書に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、これらＩｇＧに、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはローダミンを直接結合させた。ウイルス接種後の種々の時点で、カバーガラス上で増殖させたヨコバイの媒介単層細胞（ＶＣＭ）、すなわちＮＣ−２４の単層細胞またはＳｆ９細胞を、ＰＢＳで洗浄し、２％  パラホルムアルデヒド中で、室温において３０分間固定した。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１％  ＢＳＡと０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有するＰＢＳ中に浸透させた。固定後、これら細胞を、ＰＢＳで洗浄した。細胞を、３７℃で１．０〜１．５時間にわたって、直接結合したＩｇＧの１００倍希釈溶液とともにインキュベートした。カバーガラスを脱イオン水で洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でスライドガラス上にマウントした。細胞を、Ｚｅｉｓｓ  ５１０共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）の下で視覚化した。偽感染細胞を有するカバーガラスを、各実験に含め、感染細胞と同様に処理して、コントロールとして供した。
データ獲得は、６６３油浸レンズを用いて行った。緑色蛍光色素（ＦＩＴＣ）および赤色蛍光色素（ローダミン）の検出を、狭帯域フィルタセットおよび２本のレーザー線（アルゴン、４８８ｎｍ；およびヘリウム／ネオン、５４３ｎｍ）を用いることによって行った。データを、顕微鏡に備え付けのマルチトラッキング装置を使用することによって収集して、クロストークを回避した。細胞深度計算およびスケールバーを含め、全ての測定値を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０ソフトウェアを使用することによって計算した。
７．免疫電子顕微鏡
カバーガラス上の細胞を、２％  パラホルムアルデヒドと２％  グルタルアルデヒドとを含有する０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で、室温において２時間固定した。固定したサンプルを、一連の勾配を付けた−２０℃のエタノールを通して脱水し、ＬＲゴールド樹脂（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に包埋した。重合を、−２０℃で７２時間行った。サンプルを、ダイアモンドナイフを備えたウルトラミクロトーム（ＬＫＢ  Ｎｏｖａ）で切片にし、その後、Ｌｉら（Ａｄｖ  Ｄｉｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｓ  ５，１１１−１３５（２００４））によって記載されるように、ウサギ抗血清、１５ｎｍの金粒子を結合させた免疫金標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ＧＡＲ  １５；Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｆｏｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）とともにインキュベートした。切片を、２％  酢酸ウラニルおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ溶液（硝酸鉛１．３３ｇ、クエン酸ナトリウム１．７６ｇ、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液８ｍｌ、トータル５０ｍｌに蒸留水でメスアップ）で各々５分間染色し、電子顕微鏡（Ｈ−７０００；Ｈｉｔａｃｈｉ）下で観察した。
８．インビボで新たに合成されたＲＮＡの免疫蛍光による検出
ＲＤＶ接種の１０時間後に、インビボでＲＮＡを標識するために、カバーガラス上で増殖させたＶＣＭを、Ｈｉｓ−Ｍｇで洗浄し、１０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間処理した。次いで、ＶＣＭを、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉら（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８，７７６３−７７７４（２００４））に記載されるように、１０ｍＭのブロモウリジン  ５’−三リン酸（ＢｒＵＴＰ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および６％  Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で３０分間さらにインキュベートした。細胞を、接種してから１１時間後に固定し、免疫蛍光分析のために、マウス由来のモノクローナル抗ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１：５０）、次に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または各ＲＤＶタンパク質に特異的な、ＦＩＴＣを結合させたＩｇＧ（１：５０）で処理した。
９．フィルター結合アッセイ
フィルター結合アッセイを、Ｕｅｄａら（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８，３１３５−３１４０（１９９７））に記載されるものと類似する方法によって行った。ヒスチジンタグ化Ｐｎｓ１２を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％  ポリアクリルアミド）での電気泳動により分画し、タンパク質バンドを、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ＰＶＤＦ膜フィルターに転写した。フィルタをＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）中の５％スキムミルク中、穏やかに攪拌しながら室温において１時間ブロックした後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で３回（各１０分間）洗浄し、そのフィルタを、ＭＢＰまたはＭＢＰ−Ｐｎｓ１２のいずれか１．２５μｇ／ｍｌとともに４℃で一晩インキュベートした。そのフィルタを、上記のように洗浄し、次いで、ウサギにおいて惹起したＭＢＰ特異的抗血清（ＰＢＳで１：４０００希釈；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに室温において１時間インキュベートした。その後、そのフィルタを、ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対してヤギにおいて惹起したアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗体（１：１００００希釈；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）とともに室温において１時間インキュベートした。洗浄後、そのブロットを、室温においてＡＰ緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］中で、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートで発色させた。その反応を、バックグラウンドの色が見え始めたときに蒸留水でフィルタを洗浄することによって停止させた。
１０．培地および試薬
（０）Ｎ６−ビタミン（１．２Ｌ）
グリシン                                                    ２ｇ
ニコチン酸                                              ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ                                      ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ                                              １ｇ
ミオイノシトール                                        １００ｇ
蒸留水で１．２Ｌにする。
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
（１）ＭＳ−ビタミン  １．２Ｌ
ニコチン酸                                            ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ                                    ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ                                        ０．１ｇ
ミオイノシトール                                      １００ｇ  
蒸留水で１．２Ｌにする。
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
（２）カルス誘導培地（Ｎ６Ｄ）  １Ｌ
スクロース                                                    ３０ｇ
カザミノ酸                                                    ０．３ｇ
Ｃｈｕ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｐｏｗｄｅｒ（Ｓｉｇｍａ社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン                                                      ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン                                                １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ  ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ）                  ２ｍｌ      
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
（３）共存培養培地（Ｎ６ＣＯ）  １Ｌ
スクロース                                                    ３０ｇ
グルコース                                                    １０ｇ
カザミノ酸                                                  ０．３ｇ
Ｃｈｕ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｐｏｗｄｅｒ（Ｓｉｇｍａ社から購入）
３．９８１ｇ
Ｎ６−ビタミン                                              １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ  ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ）                    ２ｍｌ
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．２に調節し、蒸留水で１Ｌにする。
ゲルライト  ４ｇを加えてオートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、アセトシリンゴン（５０ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ加える。
（４）選抜培地（Ｎ６ＳＥ）  １Ｌ
スクロース                                                  ３０ｇ
カザミノ酸                                                  ０．３ｇ
Ｃｈｕ（Ｎ６）Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｐｏｗｄｅｒ（Ｓｉｇｍａ社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン                                                    ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン                                              １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ  ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ）                      ２ｍｌ
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ）  ２ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）  ０．５ｍｌを添加する。
（５）再分化培地（ＭＳＲＥ）  １Ｌ
スクロース                                                  ３０ｇ
Ｄ−ソルビトール                                            ３０ｇ
カザミノ酸                                                      ２ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入）  ４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン                                              １．２ｍｌ
カイネチン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）                      ０．２ｍｌ
α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ）                                  ０．２ｍｌ
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ）  １ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）  ０．５ｍｌを添加する。
（６）ホルモンフリー（ＨＦ）培地（１Ｌ）
スクロース                                                    ３０ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入）    ４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン                                              １．２ｍｌ  
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、
ハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）  ０．５ｍｌを添加する。
（７）ＹＥＰ培地（１Ｌ）
バクトペプトン                                              １０ｇ
バクトイーストエキストラクト                                １０ｇ
ＮａＣｌ                                                      ５ｇ
蒸留水で１Ｌにし、オートクレーブにかける。
（８）ＡＢ培地（１Ｌ）
Ｋ２ＨＰＯ４                                                ３ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４                                              １ｇ
ＮＨ４Ｃｌ                                                  １ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                    ０．３ｇ
ＫＣｌ                                                  ０．１５ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                                  ０．０１２ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                ０．００２５ｇ
グルコース                                                    ５ｇ
寒天                                                        １５ｇ
蒸留水で１Ｌにし、オートクレーブにかける。
（９）ＮＣ−２４用増殖培地
シュナイダーのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（改変）
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）                    ５００ｍｌ
Ｍｅｄｉｕｍ  １９９（１０×濃度）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）
（ハンクス塩類およびグルタミン含有、炭酸水素ナトリウム非含有）  ５０ｍｌ
グルタミン含有Ｍｅｄｉｕｍ  ＣＭＲＬ  １０６６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）
２５ｍｌ
非働化ウシ胎仔血清                                            １５０ｍｌ
０．０５Ｍ  ヒスチジン溶液                                    ５００ｍｌ
ペニシリンＧカリウム                                  １２０，０００単位
硫酸ストレプトマイシン                                        １２０ｍｇ
硫酸ネオマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）                        ６ｍｌ
フンギゾン（２５０μｇ／ｍｌ）                                    ４ｍｌ
合計                                                    約１，２４０ｍｌ
培地のｐＨは、２Ｎ  ＨＣｌで６．５０〜６．６０に調節する。
実施例１：ＲＤＶがコードする１２種のタンパク質の感染細胞内での動態とウイルス複製
（１）ＲＤＶによるヨコバイ細胞の感染
ＲＤＶでのヨコバイの媒介単層細胞（Ｖｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＶＣＭ）の同時感染を、Ｋｉｍｕｒａ（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６７，２１１９−２１２４（１９８６））に記載されるように行った。カバーガラス（１５ｍｍ直径）上のヨコバイ細胞の培養単層の各々が８０％コンフルエントに達したとき、細胞を０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍヒスチジン溶液（ｐＨ６．２；Ｈｉｓ−Ｍｇ）で２回洗浄し、５０μｌのウイルス調製物を接種した。各接種液は、精製ウイルスの調製物の１０倍段階希釈液から得た。細胞を２５℃で２時間インキュベートした。その後、接種液を除去し、各単層をＨｉｓ−Ｍｇで２回洗浄し、各カバーガラスを０．１２〜０．２ｍｌの培地で覆った。接種した単層を、種々の時間にわたってインキュベートし、その後に固定した。
（２）タンパク質の細胞内での動態
上記で作製した各抗体を用いて、ＲＤＶ感染を抑制するための標的とするＲＤＶ分節ゲノムを同定するために、各ＲＤＶ分節ゲノムによってコードされるタンパク質のＲＤＶ感染細胞内での動態を調べた。
（２．１）非構造タンパク質であるＰｎｓ６、Ｐｎｓ１１およびＰｎｓ１２は、ウイルス封入体の構成要素である
ＲＤＶの非構造タンパク質が、封入体の形成において重要な役割を果たすか否かを決定するために、感染したＶＣＭにおけるＲＤＶの非構造タンパク質の細胞下位置を、共焦点免疫蛍光顕微鏡によって調べた。感染した細胞を、接種して１８時間後に固定し、Ｐｎｓ４特異的抗体、Ｐｎｓ６特異的抗体、Ｐｎｓ１０特異的抗体、Ｐｎｓ１１特異的抗体、またはＰｎｓ１２特異的抗体でプローブした。ＲＤＶ−感染した細胞において、Ｐｎｓ１１およびＰｎｓ１２は、別個の斑状封入体において検出された（図１）。Ｐｎｓ６は、感染した細胞の細胞質において拡散して分布しており、斑状封入体に濃縮されていた（図１）。種々の画像を重ね合わせたところ、３種類の非構造タンパク質が共に局在していることが認められた。このことは、これら非構造タンパク質Ｐｎｓ６、Ｐｎｓ１１およびＰｎｓ１２が、ウイルス封入体の構成要素であることを示唆している（図１）。対照的に、Ｐｎｓ４およびＰｎｓ１０は、それぞれ、線維様構造および管状構造で検出された（図１）。
本発明者らの観察を裏付けるために、ＶＣＭを、ＲＤＶに感染させ、接種して１８時間後に固定し、電子顕微鏡で調べた。ＲＤＶに感染したＶＣＭの超薄切片を調べたところ、感染した細胞の細胞質において、顆粒状の電子密集封入体（直径６００〜８５０ｎｍ）の存在が明らかになった（図２）。ＲＤＶに感染した細胞において形成されたこの電子密集封入体の組成を決定するために、感染したＶＣＭにおけるＲＤＶのＰｎｓ６、Ｐｎｓ１１およびＰｎｓ１２の細胞下局在を、免疫電子顕微鏡で調べた。これら封入体のマトリクスは、Ｐｎｓ６に対する抗体、Ｐｎｓ１１に対する抗体、およびＰｎｓ１２に対する抗体で、密集してかつ均一に免疫標識され（それぞれ、図２ａ、ｂおよびｃ）、そしてその標識は、免疫蛍光顕微鏡の結果と一致していることが分かった。
（２．２）コアタンパク質Ｐ１、Ｐ５およびＰ７、ならびにコアキャプシドタンパク質Ｐ３は、ウイルス封入体内部に局在する
ウイルス封入体のマトリクスが、ＲＤＶアセンブリ複合体の形成に必要とされるか否かを決定するために、感染した細胞を、接種して１８時間後に固定し、ＦＩＴＣを結合させたＰ３特異的ＩｇＧと、ローダミンを結合させたＰｎｓ１２特異的ＩｇＧとで染色し、その後、共焦点蛍光顕微鏡によって画像化した。感染した細胞において、コアキャプシドタンパク質Ｐ３は、別個の斑状封入体として検出可能であった。また、Ｐ３は、細胞質全体を通して拡散して分布していた（図３）；Ｐｎｓ１２は、別個の斑状封入体に局在していた（図３）。これら画像を重ね合わせたところ、Ｐｎｓ１２およびＰ３は、感染した細胞において斑状封入体として共に局在していた（図３）。類似の結果が、コアタンパク質Ｐ１、Ｐ５およびＰ７について認められた（図３）。
本発明者らの観察を裏付けるために、感染した細胞を、接種してから１８時間後に固定し、コアキャプシドタンパク質Ｐ３特異的抗体、ならびにコアタンパク質Ｐ１特異的抗体、Ｐ５特異的抗体、およびＰ７特異的抗体を用いて、免疫電子顕微鏡で調べた。図４に示されるように、コアキャプシドタンパク質Ｐ３は、コアタンパク質Ｐ１、Ｐ５およびＰ７とともに、電子密集封入体のマトリクスおよびコア様粒子（矢印参照）に分布した。さらに、比較的少量のコアキャプシドおよびコアタンパク質が、電子密集封入体の周縁に分布していた。本発明者らの結果は、ＲＤＶのコアタンパク質およびコア様粒子は、電子密集封入体のマトリクス中に蓄積し得ることを示唆した。
（２．３）  外殻タンパク質Ｐ２、Ｐ８およびＰ９は、ウイルス封入体の周縁に局在する
ウイルス封入体のマトリクスが、ウイルス複製の間にＲＤＶの外殻タンパク質の蓄積に必要とされるか否かを決定するために、感染した細胞を、接種してから１８時間後に固定し、ＦＩＴＣを結合させたＰ８特異的ＩｇＧと、ローダミンを結合させたＰｎｓ１２特異的ＩｇＧとで染色し、共焦点蛍光顕微鏡で画像化した。感染した細胞において、Ｐｎｓ１２は、別個の斑状封入体において分布していた；Ｐ８は、環状構造として視覚化され、これはまた、細胞質中に分散して見られた（図３）。画像を重ね合わせたところ、Ｐ８は、周縁に明らかに局在しており、Ｐｎｓ１２は、各封入体の中心領域を占めているようであった。これら２つのタンパク質はまた、図３において黄色で示されるように、封入体の周縁にともに局在していた。類似の結果を、外殻タンパク質Ｐ２およびＰ９についても得た（図３）。
本発明者らの観察を裏付けるために、感染した細胞を、接種してから１８時間後に固定し、それぞれ、外殻タンパク質Ｐ２特異的抗体、Ｐ８特異的抗体、およびＰ９特異的抗体を使用して、免疫電子顕微鏡で調べた。図４に示されるように、これら３種類の外殻タンパク質Ｐ２、Ｐ８およびＰ９は、ウイルス様粒子が蓄積している電子密集封入体の周縁に分布していた。これらの結果全てから、外殻タンパク質およびウイルス粒子が、封入体の周縁の分布していた一方で、これらコアタンパク質およびコア粒子は、非構造タンパク質Ｐｎｓ６、Ｐｎｓ１１およびＰｎｓ１２が高レベルで蓄積される電子密集封入体のマトリクス内部に局在していたことが示された。
感染過程において、細胞質中の成熟ウイルス粒子の数は、顕著に増加し、構造タンパク質は、これらウイルス粒子中に分布し得る。
（２．４）  Ｐｎｓ１２は、インビボでウイルス封入体様構造を形成し得る
ＲＤＶの３種類の非構造タンパク質Ｐｎｓ６、Ｐｎｓ１１およびＰｎｓ１２は、ＲＤＶに感染した細胞におけるウイルス封入体の腫瘍構成要素であるようである。ウイルス封入体のマトリクスの形成を主に担うタンパク質を同定するために、Ｓｆ９細胞に、Ｐｎｓ６、Ｐｎｓ１１またはＰｎｓ１２を発現する組換えバキュロウイルスを接種し、種々の期間にわたってインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれぞれの抗体での免疫ブロッティングによって分析したところ、これら３種類のタンパク質は、接種して２４時間後に初めて検出され、そのレベルは増大し、接種して７２時間後に最大に達した。カバーガラス上で増殖させたＳｆ９細胞においてＰｎｓ１２の免疫蛍光染色を行うと、接種して４８時間後に、細胞内での別個の斑状封入体の形成が明らかになった（図５ａ）。これらの細胞の薄切片を電子顕微鏡で分析したところ、ＲＤＶに感染させたＶＣＭにおける電子密集封入体に類似した、大きな顆粒状封入体が、Ｐｎｓ１２を発現するＳｆ９細胞の細胞質において同定された（図５ｂ）。免疫金電子顕微鏡により、これら封入体中にＰｎｓ１２が特異的に存在することが明らかになった（図５ｂ）一方で、Ｐｎｓ６コードバキュロウイルスまたはＰｎｓ１１コードバキュロウイルスによる感染は、細胞質全体を通じてそれぞれのタンパク質の拡散した分布を生じ、封入体は形成はないことが認められた。本発明者らの結果は、Ｐｎｓ１２の発現のみで、ウイルス複製プロセスがない場合ですら、Ｓｆ９細胞においてウイルス封入体様構造の形成に十分であることを明らかに示した。
（２．５）  インビトロでのＲＤＶ  Ｐｎｓ１２の自己会合
Ｐｎｓ１２が自己会合して、ウイルス封入体を形成することができるか否かを決定するために、フィルター結合アッセイを行った。Ｈｉｓ−Ｐｎｓ１２を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、そのタンパク質バンドを、膜フィルターに転写し、そのフィルターを、ＭＢＰまたはＭＢＰ−Ｐｎｓ１２とともにインキュベートした。図６に示されるように、ＭＢＰ−Ｐｎｓ１２は、Ｈｉｓ−Ｐｎｓ１２に特異的に結合したが、いずれのＥ．ｃｏｌｉ由来タンパク質にも結合しなかった。対照的に、ＭＢＰは、Ｈｉｓ−Ｐｎｓ１２に結合しなかった。従って、Ｐｎｓ１２の分子は、互いに結合する固有の能力を有し、かつＰｎｓ１２は、ウイルス封入体の形成のために凝集することができるようであった。
（２．６）  Ｐｎｓ１２は、ウイルス封入体への局在化がＰ８より先に起こる
Ｐｎｓ１２が、ウイルス封入体に局在する初期タンパク質であるか否かを調べるために、これらの構造へのＰ８およびＰｎｓ１２の局在を、感染の時間経過に沿って、ＲＤＶに感染した細胞において調べた。ＶＣＭにＲＤＶを接種し、細胞を２時間間隔で固定した。細胞を、ＦＩＴＣを結合させたＰ８特異的ＩｇＧと、ローダミンを結合させたＰｎｓ１２特異的ＩｇＧ抗体とで染色し、共焦点蛍光顕微鏡で調べた。Ｐｎｓ１２は、別個の斑状封入体において細胞質全体にわたって散在しているとき、接種してから６時間で初めて検出可能であった（図７）。Ｐ８は、接種してから６時間後に、細胞質において拡散して散在していた。接種後の初期の時点で、封入体は非常に多くかつ小さいが、時間が経つにつれて、これらの封入体は数が減少し、大きさが増した。Ｐ８は、別個の斑状封入体として観察され、接種してから８時間後に、細胞質全体にわたって拡散して分布した。さらに、Ｐ８およびＰｎｓ１２は、斑状封入体中にともに局在した。その後、接種してから１４時間後までには、Ｐｎｓ１２は、より大きな封入体中で観察されたのに対して、Ｐ８は、小さな環状構造に局在し、細胞質において拡散して散在していた。これらの画像を重ね合わせたところ、Ｐ８は、封入体の周縁において認められた。感染が進むにつれて、より大きな封入体が観察されるようになり、Ｐ８は、周縁に集中し、Ｐｎｓ１２は、これら封入体の中心領域に集中していた。これらの結果によって、Ｐｎｓ１２は、ウイルス封入体への局在がＰ８より先に起こり、Ｐｎｓ１２が後代ウイルスが蓄積するウイルス封入体の凝集に関与するという仮定の裏付けが示された。
（２．７）  ウイルス封入体はウイルスＲＮＡを合成する部位である
ウイルス封入体が、ウイルスＲＮＡを合成する部位であるか否かを決定するために、ＲＤＶに感染した細胞を、アクチノマイシンＤで処理して、宿主複製および転写を妨げ、次いで、接種してから１０．５時間後、最初の３０分間、ＢｒＵＴＰで処理した。細胞を固定した後、新たに作られたＲＮＡの位置を、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて決定し、ウイルス封入体の位置を、Ｐｎｓ１２特異的ＩｇＧを用いることによって決定した。この分析により、ＢｒＵ標識ＲＮＡが、ＢｒＵＴＰとの３０分間のインキュベーション期間の間に、別個の斑状封入体（Ｐｎｓ１２のウイルス封入体がともに局在する）に分布することが示された（図８）。このことは、これら封入体がウイルスＲＮＡを合成する部位であることを表すことを示唆している。
（２．８）  Ｐｎｓ４は、ＲＤＶに感染したヨコバイ細胞においてリン酸化される
Ｐｎｓ４が宿主細胞中でリン酸化され得るか否かを決定するために、本発明者らは、ヨコバイ細胞にＲＤＶを感染させて、［３２Ｐ］−オルトリン酸で標識した後に免疫沈降に供した。図９に示されるように、ＲＤＶに感染させたヨコバイ細胞を分析すると、Ｐｎｓ４に対する抗血清は、８４ｋＤａのポリペプチド（これは、Ｐｎｓ４の分子量である）と免疫反応を生じたが、非感染細胞では生じなかった（図９、レーンＰｎｓ４（＋、−）を参照のことのこと）。非標識産物は、本発明者らが免疫前血清を使用した場合に、ＲＤＶに感染させた昆虫細胞または非感染昆虫細胞において検出された（レーンＰｉ（＋、−）を参照のこと）。さらに、本発明者らがネガティブコントロールとしてＰ９特異的抗血清を使用した場合、何の免疫反応も検出されなかった（レーンＰ９を参照のこと）。これらの結果は、Ｐｎｓ４がＲＤＶに感染させたヨコバイ細胞においてリン酸化されたことを示す。
（２．９）  感染させた宿主植物および媒介昆虫の細胞におけるＰｎｓ４の発現
宿主細胞におけるＰｎｓ４の発生を特徴づけるために、本発明者らは、免疫電子顕微鏡で、罹病植物およびウイルスを運ぶヨコバイの薄切片におけるＰｎｓ４の位置を調べた。ＲＤＶに感染させたイネ植物において、Ｐｎｓ４は、細胞質中の種々の大きさおよび形状の無定形の電子密集封入体に位置した（図１０Ａ）。対照的に、ウイルスを運ぶヨコバイにおいて、Ｐｎｓ４は、直径約１０ｎｍの微小管状構造の束を形成するようであった（図１０Ｂ）。Ｐｎｓ４特異的ＩｇＧとともにインキュベートした後の非感染細胞においても、免疫前ウサギ血清とともにインキュベートした後の感染細胞においても、非特異的結合は検出されなかった。
（２．１０）  非構造タンパク質Ｐｎｓ４は、微小管状構造の構成成分であり、バイロプラズマの周縁と会合する。
イネ植物は、接種後約１４日間で感染徴候を表す。その一方で、媒介昆虫は、徴候を示すのではなく、ウイルスを獲得してから約２０日間でウイルスを伝播させ始める。従って、本発明者らの細胞学的観察は、ウイルス複製の第１段階に対応するようであった。従って、本発明者らは、ＶＣＭを使用して、ウイルス複製における初期段階の事象を調査した。本発明者らは、ＲＤＶをＶＣＭに接種し、２時間間隔で細胞を固定し、ＦＩＴＣを結合させたＰｎｓ４特異的ＩｇＧとローダミンを結合させたＰｎｓ１２特異的ＩｇＧとで染色し、共焦点蛍光顕微鏡により画像を得た（図１１）。ＦＩＴＣを結合させたＰｎｓ４特異的ＩｇＧまたはローダミンを結合させたＰｎｓ１２特異的ＩｇＧのいずれかとともにインキュベーションした後の非感染細胞においても（図１１の最上段）、免疫前ウサギ血清とともにインキュベーションした後の感染細胞においても、非特異的蛍光は検出されなかった。感染細胞において、Ｐｎｓ１２は、接種してから６時間程度で、別個の斑状封入体として細胞質全体にわたって散在した。Ｐｎｓ４は、環状構造（矢印で示す）として初めて検出可能であり、接種してから１０時間後に細胞質全体にわたって拡散して分布した；Ｐｎｓ１２は、この時点では、大きな封入体中に観察された。これらの画像を重ね合わせたところ、Ｐｎｓ４は、封入体の周縁において見出された；黄色の部分は、Ｐｎｓ４およびＰｎｓ１２がともに局在するところである。感染が進むにつれて、接種してから１４時間後、Ｐｎｓ４は、細胞質中で非常に豊富になり、細胞質では、Ｐｎｓ１２のより大きな封入体の周りを囲むかまたはその封入体の周縁において局在する管状構造の束を形成するようであった。さらにその後、接種してから３６時間後に、Ｐｎｓ４は、細胞質においてＰｎｓ１２の封入体の周りを囲んでこの入体とつながるようである管状構造の束を形成し続けた。
本発明者らの所見を確認するために、本発明者らは、免疫電子顕微鏡を使用して、感染の間のＰｎｓ４の細胞内での部位を調べた。免疫電子顕微鏡によって、接種してから１０〜１４時間後に、Ｐｎｓ４がバイロプラズマの周縁に分布し、感染細胞の細胞質に拡散して分布することが明らかになった（図１２Ａ）。感染が進むにつれて、接種してから１４〜２８時間後に、Ｐｎｓ４は無定形構造および管状構造の豊富な束に局在し、これらの構造は、バイロプラズマの周縁に密集して会合していた（図１２Ｂ）。この段階での管状構造の束の出現は、感染した植物宿主において認められるＰｎｓ  ４の封入体に似ていた。その後、感染してから２８〜３６時間後に、Ｐｎｓ４は、直径約１０ｎｍの微小管状構造の束を形成した（図１２Ｃ）。この微小管状構造の寸法および外観は、ＲＤＶに感染させたヨコバイにおいて見出されるものと似ていた。この微小管は、多数列の電子密集微小管から明らかに構成されていた（図１２Ｃ）。微小管の横断方向の切片を調べると、完全ではないが規則性の高い結晶配列が認められた（図１２Ｄ）。本発明者らが免疫蛍光顕微鏡によって観察した管状構造は、管状構造およびこのような束になった微小管状構造と一致した。非感染細胞におけるＰｎｓ４特異的ＩｇＧ  とのインキュベーションによる細胞構造物との反応も、感染細胞における免疫前ウサギ血清とのインキュベーションによるウイルス構造物との反応も、認められなかった。
Ｐｎｓ４微小管の外観を詳細に理解するために、本発明者らは、接種して３６時間後の感染ＶＣＭを炭素被覆グリッドに吸着させ、このグリッドをＰｎｓ４特異的抗体とともにインキュベートした。この抗体は、種々の長さの管と特異的に反応し、これらの管は、規則的に反復したサブユニットから構成され（図１２Ｅ）、細胞内標識実験において認められたものに類似した直径によって特徴づけられる。
（２．１１）  Ｐｎｓ４は、インビボで単独で封入体を形成し得る
Ｐｎｓ４が微小管構造を形成する固有の能力を有するか否かを調べるために、Ｓｆ９細胞に組換えバキュロウイルスを接種し、種々の期間にわたってインキュベートした。Ｐｎｓ４特異的抗体で免疫ブロッティングすることによって細胞を試験したところ、Ｐｎｓ４は、接種して２４時間後に初めて検出され、そのレベルは時間と共に増加し、接種してから７２時間後に最大に達した。カバーガラス上で増殖させた細胞を免疫蛍光染色に供したところ、接種して４８時間後に、細胞膜の直ぐ内側にＰｎｓ４の厚い層および細胞質中にいくらかのＰｎｓ４マトリクスが認められた（図１３Ａ）。
免疫金電子顕微鏡に供したところ、細胞質中の種々の形状および大きさの、多くの電子密集封入体の部位において、Ｐｎｓ４のより具体的な位置が突き止められ、感染細胞の表面と会合していることが明らかになった（図１３Ｂ）。形態学的には、この封入体は、ＲＤＶに感染させた宿主細胞において観察された無定形封入体（図１０Ａ）と似ていた。上記の結果から、Ｐｎｓ４自体の発現は、ウイルス増殖がない場合でも、Ｓｆ９細胞における封入体のクラスター形成に十分であることが示された。
（２．１２）  ＲＤＶの非構造タンパク質Ｐｎｓ１０は、管状構造の構成成分である
初期段階の研究において、非構造タンパク質Ｐｎｓ１０は、免疫蛍光顕微鏡によって管状構造で検出された。この観察を裏付けるために、ＶＣＭにＲＤＶを接種し（ＭＯＩ＝１０）、接種して１８時間後に固定し、電子顕微鏡で観察した。本発明者らは、ヨコバイ細胞の表面から突き出て、拡張した細胞膜によって囲まれた直径約８５ｎｍの管を観察した（図１４Ａ）。これらの管は、ウイルス粒子の大きさに対応する直径７０ｎｍの電子密集粒子を含んでいた。この管の好青成分を同定するために、本発明者らは、感染させたＶＣＭにおけるＲＤＶのＰｎｓ１０の細胞下局在を免疫電子顕微鏡によって観察した。図１４Ｂに示されるように、この管は、Ｐｎｓ１０に対する抗体で均一に免疫標識された。管中の電子密集粒子は、ウイルス粒子に対する抗体と反応した（図１４Ｃ）。Ｐｎｓ１０特異的ＩｇＧまたはウイルス特異的ＩｇＧとインキュベーションした後の非感染細胞においても、免疫前ウサギ血清とインキュベーションした後の感染細胞においても、非特異的標識は検出されなかった。
（２．１３）  インビボで管を形成するためのＰｎｓ１０の凝集
Ｐｎｓ１０が管を形成する固有の能力を有するか否かを調べるために、本発明者らは、Ｓｆ９細胞に、Ｐｎｓ１０をコードする組換えバキュロウイルスを接種し、種々の期間にわたってインキュベートした。細胞抽出液をＰｎｓ１０特異的抗体でのイムノブロッティングにより分析したところ、Ｐｎｓ１０は、接種して２４時間後に初めて検出され、タンパク質のレベルは、接種して７２時間後に最大に達した。カバーガラス上で培養したＳｆ９細胞においてＰｎｓ１０の免疫蛍光染色を行ったところ、Ｐｎｓ１０の蓄積が認められ、接種して２４時間後に、細胞内での多くの管状構造の形成が明らかになった（データは示さず。図１５Ａを参照のこと）。後に、接種して４８時間後には、このＰｎｓ１０含有管状構造は、輪郭がより明らかになり、いくらかの管は、これらの非宿主昆虫細胞の表面から出てきた（データは示さず。図１５Ｂを参照のこと）。さらに後になって、接種して７２時間後には、多くの管状構造が細胞表面からかなり遠くまで伸びた（データは示さず。図１５Ｃを参照のこと）。
免疫電子顕微鏡で調べたところ、Ｓｆ９細胞の細胞質中の管構造におけるＰｎｓ１０の位置がより具体的に突き止められた（データは示さず。図１４Ｂを参照のこと）。これらの管は、その直径および長さの分布の点で、野生型ＲＤＶに感染させたＶＣＭにおいて生成される管と似ていた。従って、Ｐｎｓ１０単独の発現は、ウイルス増殖がない場合でも、Ｓｆ９細胞における管の形成に十分であった。非感染細胞におけるＰｎｓ１０特異的ＩｇＧとのインキュベーションによる細胞構造との反応も、感染細胞における免疫前ウサギ血清とのインキュベーションによるウイルス構造との反応も認められなかった。
上記で得られた、各ＲＤＶ分節ゲノムによってコードされるタンパク質の細胞内での動態に鑑みて、本発明者らは、ＲＤＶ感染後に最も早く集積し、かつウイルス合成工場であるバイロプラズマの腫瘍マトリクスであるＰｎｓ１２タンパク質のｍＲＮＡを第１の標的遺伝子として、このタンパク質の発現を抑制することでＲＤＶ抵抗性イネの作出を試みた。一方、Ｐｎｓ４は微小管状構造の構成成分であり、バイロプラズマの周縁と会合することから、Ｐｎｓ４  ｍＲＮＡを第２の標的遺伝子として、ＲＤＶ抵抗性イネの作出を試みた。
実施例２：Ｓ４遺伝子およびＳ１２遺伝子を用いたＲＮＡｉ誘起ベクターの構築
（１）Ｓ４遺伝子およびＳ１２遺伝子を、特異的なプライマーセットを用いて増幅する：
ＲＤＶ感染イネの葉から、定法に従って総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、添付の説明書に従って行った。総ＲＮＡ  １μｇを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーセット：
ｐＡＮＤＡについてプライマーセット１：
2009020237.tif 000003
ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃについてプライマーセット２：
2009020237.tif 000004
ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎについてプライマーセット３：
2009020237.tif 000005
ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃについてプライマーセット４：
2009020237.tif 000006
を用いてそれぞれＰＣＲを行い、目的の領域：ｐＡＮＤＡ（配列番号２５）、ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ（配列番号２６）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ（配列番号２７）、およびｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃ（配列番号２８）の各増幅産物を得た。
（２）制限酵素またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する：
上記（１）で得た各増幅産物を、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．Ｋ２４３５−２０）を用いて、製造業者の説明書に従ってｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ、およびｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃを得た。
このクローニングベクターを、キットに付属のＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、同様に、製造業者の説明書に従って、適切な条件下で、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。単一のコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む１〜２ｍｌのＬＢ培地中に接種し、定法に従って、このクローニングベクターを含む形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを増殖させた。定法に従って、形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認した。
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を形質転換ベクターにクローニングする：
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、ｐＡＮＤＡベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化した。簡潔にいうと、２μｌ  ＬＲ反応緩衝液（５×）、１００〜３００ｎｇの上記エントリーベクター、３００ｎｇ  ｐＡＮＤＡベクター、ＴＥを添加して総容積８μｌにした。２μｌのＬＲクロナーゼ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．１１７９１−０１９）を加えて攪拌し、２５℃で一晩インキュベートした。その後、プロテイナーゼＫ溶液を１μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。得られたベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンを含む培地中で増殖させた。
実施例３：Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ９、Ｓ１０およびＳ１１を用いたＲＮＡｉ誘起ベクターの構築
（１）Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ９、Ｓ１０およびＳ１１を特異的プライマーセットを用いて増幅する：
ＲＤＶ感染イネの葉から、定法に従って総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、添付の説明書に従って行った。総ＲＮＡ  １μｇを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに従って逆転写反応を行い、ＲＤＶゲノムＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ９、Ｓ１０、およびＳ１１特異的プライマーセットを設計して、各々ＰＣＲを行い、ｔｒｉｇｇｅｒ  １配列番号２９）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ２（配列番号３０）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ３（配列番号３１）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ５（配列番号３２）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ６（配列番号３３）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ７（配列番号３４）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ９（配列番号３５）、ｔｒｉｇｇｅｒ  １０（配列番号３６）、およびｔｒｉｇｇｅｒ  １１（配列番号３７）の各領域を得る。
（２）制限酵素またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する：
上記（１）で得た各増幅産物を、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．Ｋ２４３５−２０）を用いて、製造業者の説明書に従ってｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  １、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ２、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ３、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ５、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ６、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ７、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  ９、ｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  １０、およびｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  １１を得る。
このクローニングベクターを、キットに付属のＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、同様に、製造業者の説明書に従って、適切な条件下で、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択する。単一のコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む１〜２ｍｌのＬＢ培地中に接種し、定法に従って、このクローニングベクターを含む形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを増殖させる。定法に従って、形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的のトリガー領域がクローニングされていることを確認する。
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を形質転換ベクターにクローニングする：
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、ｐＡＮＤＡベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化する。簡潔にいうと、２μｌ  ＬＲ反応緩衝液（５×）、１００〜３００ｎｇの上記エントリーベクター、３００ｎｇ  ｐＡＮＤＡベクター、ＴＥを添加して総容積８μｌにする。２μｌのＬＲクロナーゼ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．１１７９１−０１９）を加えて攪拌し、２５℃で一晩インキュベートする。その後、プロテイナーゼＫ溶液を１μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートする。得られるベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンを含む培地中で増殖させる。
実施例４：ＲＤＶ抵抗性イネの作出
（１）上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する：
上記各ベクターを、エレクトロポレーション法によってＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、製造業者の説明書に従ってアグロバクテリウムへ導入した。アグロバクテリウムの系統は、ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８，１２９１）を用いた。実施例２で構築した発現ベクターを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポーレーション装置はＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌ  カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ  スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  塩化ナトリウム）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。増殖させた形質転換アグロバクテリウムを、ＹＥＰ培地に播種して、一晩インキュベートし、この培養液と等量のグリセロールを入れてボルテックスミキサーで十分に混合し、−８０℃で使用時までストック溶液として保存した。
（２）アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する；
アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、アルカリＳＤＳ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第３版を参照のこと）によりプラスミドを抽出した後、ＰＣＲにより確認した。
（３）カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、感染確認後、再分化させ、ＲＤＶ抵抗性イネを作出する；
ＲＤＶ抵抗性イネを作出するために、カルス化したイネを作製した。簡潔には、イネの完熟種子を小型籾すり機にかけ、籾を除去した種子１００〜１５０粒を５０ｍｌの使い捨て遠心管に入れた。７０％  エタノールを遠心管に入れて、数秒間種子を滅菌し、滅菌水で種子をすすいだ。滅菌水を吸引した後、４０ｍｌの２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を上記遠心管に入れ、振盪機で２０分間、１５０ｒｐｍで振盪して滅菌した。滅菌水を除去して、蒸留水で３回洗浄した。ピンセットで種子をカルス誘導培地（Ｎ６Ｄ培地）に２５種子／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールした。６０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において１８〜２１日間培養することによってカルス誘導した。カルス誘導の間、培地を、７〜１０日毎に新しいＮ６Ｄ培地と交換した。
誘導して３週間後の種子の胚乳とシュート部分をメスで切り取るか、あるいはピンセットでもぎ取り、胚盤由来カルスのみを新しいカルス誘導培地Ｎ６Ｄ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールして、２４時間明期の条件下で、２５℃において３日間、カルスを前培養した。カルスの前培養を始めるのと並行して、上記（１）において得られたアグロバクテリウムのストック溶液から滅菌した爪楊枝で菌体を採取し、ＡＢ培地に塗布した。塗布した菌体を滅菌した白金耳で培地全体に拡げ、３日間２８℃において遮光して前培養した。
ＡＢ培地で増殖したアグロバクテリウムを滅菌した小さい薬さじで掻き取り、１０ｍｌの水に１０ｍｇ／ｍｌのアセトシリンゴンを５μｌ入れ、この溶液にアグロバクテリウムをＯＤ６００＝０．０１になるように懸濁した。懸濁液を滅菌シャーレに入れた。１シャーレ分の前培養したカルスを、一方の端をメッシュで覆った筒状のガラス管の中に入れ、ときどき軽く振って、１．５〜２分間メッシュ付きのガラス管ごと、上記懸濁液中に浸漬した。浸漬後、メッシュ付きのガラス管を滅菌ペーパータオルの上に置いて余分な水分を除去した。Ｎ６ＣＯ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレをテープでシールして、３０〜３３℃において遮光して３日間培養した。
培養後、全てのカルスをＮ６ＳＥ培地に、９カルス／シャーレで移植し、３０〜３３℃において２４時間明期の条件下で、１４日間培養した。その間、カルスを、１回だけ新しいシャーレに移した。選択されたカルスをＲＥ培地に移し、３０〜３３℃において再分化してくるまで培養した。その間、７〜１０日間毎に、新しい培地を入れたシャーレにカルスを移した。再分化したシュートおよび根をＨＦ培地に移し、２〜３週間培養した後、鉢上げした。
（４）形質転換体当代（Ｔ０）株における導入遺伝子の確認
上記（３）において作出した形質転換体当代（Ｔ０）株において目的の遺伝子が導入されているか否かを確認するために、Ｔ０株からＣＴＡＢ法により調製したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、形質転換ベクター内の薬剤選抜マーカー（ハイグロマイシン耐性）遺伝子をプローブにサザンハイブリダイゼーションすることにより行った。Ｔ０株における導入遺伝子の転写産物の断片化によるｓｉＲＮＡの検出は、低分子ＲＮＡを抽出（基本的に、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８６，９５０に従った）した後、ＰＡＮＤＡ（配列番号２５）、Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ（配列番号２５）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ（配列番号２６）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ（配列番号２７）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃ（配列番号２８）をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションすることにより行った。図１６に示されるように、目的の遺伝子がＴ０株において導入され、かつ導入された配列が切断されたことが明らかになった。同様に、ｔｒｉｇｇｅｒ  １配列番号２９）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ２（配列番号３０）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ３（配列番号３１）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ５（配列番号３２）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ６（配列番号３３）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ７（配列番号３４）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ９（配列番号３５）、ｔｒｉｇｇｅｒ  １０（配列番号３６）、およびｔｒｉｇｇｅｒ  １１（配列番号３７）をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った場合にも、目的の遺伝子がＴ０株において導入され、かつ導入された配列が切断されると考えられる。
実施例５：形質転換体Ｔ１における導入遺伝子の有無とＲＤＶ感染との関連
（１）Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ（配列番号２５）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ（配列番号２６）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ（配列番号２７）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃ（配列番号２８）で形質転換したＴ１植物へのＲＤＶ感染；
得られたＴ０イネの各々を１株とし、それぞれの株から全てのＴ１種子を回収した。イネへのＲＤＶの接種は、２〜３葉期まで生育させた各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＤＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行った。図１７および図１８は、ＲＤＶ接種してから５０日後の比較である。図１７においては、左側の鉢に野生型株（左に健全株、右にＲＤＶ接種株を示す）、右の鉢にＴｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ導入形質転換体（ＲＤＶ接種株）を示している。図１７は、Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ導入形質転換体がＲＤＶに対して抵抗性を有しており、ＲＤＶに対して耐性が付与されたことを明らかに示す。図１８においては、左側の鉢に野生型株（左に健全株、右にＲＤＶ接種株を示す）、右の鉢にＴｒｉｇｇｅｒ４Ｎ導入形質転換体（ＲＤＶ接種株）を示している。図１８は、Ｔｒｉｇｇｅｒ４Ｎ導入形質転換体がＲＤＶに対して抵抗性を有しており、ＲＤＶに対して耐性が付与されたことを明らかに示す。
（２）ｔｒｉｇｇｅｒ  １配列番号２９）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ２（配列番号３０）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ３（配列番号３１）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ５（配列番号３２）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ６（配列番号３３）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ７（配列番号３４）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ９（配列番号３５）、ｔｒｉｇｇｅｒ  １０（配列番号３６）、およびｔｒｉｇｇｅｒ  １１（配列番号３７）で形質転換されるＴ１植物へのＲＤＶ感染；
得られるＴ０イネの各々を１株とし、それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＤＶの接種は、２〜３葉期まで生育させた各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＤＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。ｔｒｉｇｇｅｒ  １配列番号２９）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ２（配列番号３０）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ３（配列番号３１）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ５（配列番号３２）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ６（配列番号３３）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ７（配列番号３４）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ９（配列番号３５）、ｔｒｉｇｇｅｒ  １０（配列番号３６）、およびｔｒｉｇｇｅｒ  １１（配列番号３７）のそれぞれを形質転換したＴ１植物と、野生型株とを比較すると、各Ｔ１植物がＲＤＶに対して抵抗性を有しており、ＲＤＶに対して耐性が付与されたことが示される。
（３）感染後のＴｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ（配列番号２５）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ（配列番号２６）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ（配列番号２７）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃ（配列番号２８）で形質転換したＴ１植物の接種検定；
Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ（配列番号２５）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｃ（配列番号２６）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ（配列番号２７）、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｃ（配列番号２８）のいずれかで形質転換したＴ１植物の抵抗性検定は、（１）で接種した植物全ての株に対して、接種後３週以内に発病した個体を感受性、接種３〜８週後に発病した個体を発病遅延型抵抗性、接種８週以後、さらには終生に渡って病徴が認められない個体を完全型抵抗性としてスコアリングを行った。その結果を以下の表１および表２、ならびに図１７Ｂおよび図１８Ｂに示す。
【表１】
2009020237.tif 000007
【表２】
2009020237.tif 000008
2009020237.tif 000009
Ｐｎｓ４を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られた。それに対して、Ｐｎｓ１２を標的とした形質転換イネは、全てＲＤＶ抵抗性であった（すなわち、「１００％完全抵抗性集団」を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全６８株のうち４株が感染に失敗したが、残りの６４株は全てＲＤＶに感染し、病徴の発現は一定（通常、３週間までには病徴が出揃う）で、遅延することはなかった。
Ｐｎｓ４を標的とした形質転換イネは、約６０％程度が抵抗性を示し、約４０％程度が発病遅延型抵抗性を示した（すなわち、１００％「抵抗性集団」または「６０％完全抵抗性集団」を得た）。Ｐｎｓ４は、おそらく感染後期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰｎｓ４  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐｎｓ４の発現抑制効果が薄れ、結果的に、遅延型抵抗性を示す株が得られたと考えられる。
Ｐｎｓ１２を標的とした形質転換イネは、感染個体集団の１００％が完全抵抗性を示した。Ｐｎｓ１２は、おそらく感染の最も初期にウイルス工場の設営に関与するタンパク質であることから、Ｐｎｓ１２の発現を抑制するとウイルス複製の足場の構築が阻害され、さらには、ウイルス自身の複製も阻害され、結果的に、完全型抵抗性を示す株が得られたと考えられる。
（４）感染後のｔｒｉｇｇｅｒ  １配列番号２９）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ２（配列番号３０）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ３（配列番号３１）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ５（配列番号３２）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ６（配列番号３３）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ７（配列番号３４）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ９（配列番号３５）、ｔｒｉｇｇｅｒ  １０（配列番号３６）、およびｔｒｉｇｇｅｒ  １１（配列番号３７）で形質転換したＴ１植物の接種検定；
ｔｒｉｇｇｅｒ  １配列番号２９）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ２（配列番号３０）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ３（配列番号３１）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ５（配列番号３２）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ６（配列番号３３）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ７（配列番号３４）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ９（配列番号３５）、ｔｒｉｇｇｅｒ  １０（配列番号３６）、およびｔｒｉｇｇｅｒ  １１（配列番号３７）のいずれかで形質転換したＴ１植物の抵抗性検定は、（１）で接種した植物全ての株に対して、接種後３週以内に発病した個体を感受性、接種３〜８週後に発病した個体を発病遅延型抵抗性、接種８週以後、さらには終生に渡って病徴が認められない個体を完全型抵抗性としてスコアリングを行う。予想される結果を以下の表１．１および表２．１に示す。
【表１．１】
2009020237.tif 000010
【表２．１】
2009020237.tif 000011
Ｐ１を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。Ｐ２を標的とした形質転換イネは、感受性（すなわち、全て感染するもの）が得られる。Ｐ３を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。Ｐ５を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。Ｐｎｓ６を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。Ｐ７を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。Ｐ８を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。Ｐ９を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。Ｐｎｓ１０を標的とした形質転換イネは、感受性（すなわち、全て感染するもの）が得られる。Ｐｎｓ１１を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られる。
Ｐ１を標的とした形質転換イネは、約８０％程度が抵抗性を示し、約２０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐ１は、おそらく感染中期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰ１  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐ１の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型抵抗性を示す株が得られると考えられる。Ｐ２を標的とした形質転換イネは、１００％感受性を示すと思われる。Ｐ２は、おそらく植物での感染に不要なタンパク質であることから、Ｐ２の発現抑制効果はウイルス複製に影響を与えず、結果的に、抵抗性を示す株は全く得られないと考えられる。Ｐ３を標的とした形質転換イネは、約８０％程度が抵抗性を示し、約２０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐ３は、おそらく感染中期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰ３  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐ３の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型抵抗性を示す株が得られると考えられる。Ｐ５を標的とした形質転換イネは、約６０％程度が抵抗性を示し、約４０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐ５は、おそらく感染中期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰ５  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐ５の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型型抵抗性を示す株が得られると考えられる。Ｐｎｓ６を標的とした形質転換イネは、約７０％程度が抵抗性を示し、約３０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐｎｓ６は、おそらく感染初・中期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰｎｓ６  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐｎｓ６の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型抵抗性を示す株が得られると考えられる。Ｐ７を標的とした形質転換イネは、約８０％程度が抵抗性を示し、約２０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐ７は、おそらく感染中期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰ７  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐ７の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型抵抗性を示す株が得られると考えられる。Ｐ８を標的とした形質転換イネは、約６０％程度が抵抗性を示し、約４０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐ８は、おそらく感染中・後期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰ８  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐ８の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型抵抗性を示す株が得られると考えられる。Ｐ９を標的とした形質転換イネは、約６０％程度が抵抗性を示し、約４０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐ９は、おそらく感染後期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰ９  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐ９の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型抵抗性を示す株が得られると考えられる。Ｐｎｓ１０を標的とした形質転換イネは、１００％感受性を示すと思われる。Ｐｎｓ１０は、おそらく植物での感染に不要なタンパク質であることから、Ｐｎｓ１０の発現抑制効果はウイル���複製に影響を与えず、結果的に、抵抗性を示す株は全く得られないと考えられる。Ｐｎｓ１１を標的とした形質転換イネは、約８０％程度が抵抗性を示し、約２０％程度が発病遅延型抵抗性を示すと思われる。Ｐｎｓ１１は、おそらく感染初・中期に関与するタンパク質であることから、ウイルスの複製が進むにつれてＰｎｓ１１  ｍＲＮＡが多量に転写される。このことにより、Ｐｎｓ１１の発現抑制効果が薄れ、結果的に、発病遅延型抵抗性を示す株が得られると考えられる。
（５）Ｓ４およびＳ１２導入遺伝子の有無とＲＤＶ抵抗性との相関；
Ｔ１植物の抵抗性の有無と導入遺伝子の有無の関連について、ＣＴＡＢ法によりＴ１植物から調製したＤＮＡを鋳型にして、植物形質転換ベクター内のＧＵＳ配列をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。図１７Ｂおよび図１８Ｂから明らかなように、導入遺伝子が存在する株については、抵抗性および発病遅延型抵抗性が認められ、導入遺伝子が存在しない株については、全て感受性であった。
上記の結果から、本発明の形質転換イネが、ＲＤＶに対する発病遅延型抵抗性ないし抵抗性を示すことが明らかになった。
（６）Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０およびＳ１１導入遺伝子の有無とＲＤＶ抵抗性との相関；
Ｔ１植物の抵抗性の有無と各導入遺伝子の有無の関連について、ＣＴＡＢ法によりＴ１植物から調製したＤＮＡを鋳型にして、植物形質転換ベクター内のＧＵＳ配列をプライマーとして用いてＰＣＲを行う。導入遺伝子が存在する株については、抵抗性および発病遅延型抵抗性が認められ、導入遺伝子が存在しない株については、全て感受性であると考えられる。
（７）作出されたＲＤＶ抵抗性イネの後代Ｔ３植物における接種検定；
後代植物においてもＲＤＶ抵抗性が受け継がれているか否かを確認するために、Ｔ１植物からＴ２種子を取得して、Ｔ２植物を生育させる。このＴ２植物からＴ３種子を得、９葉期まで生育させて、試験用Ｔ３植物を得る。得られたＴ３植物において、上記（３）と同様に、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＤＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。上記（３）と同様に接種検定を行うと、Ｔ３植物においても、ＲＤＶ抵抗性ないし発病遅延型抵抗性が受け継がれていることが確認できる。
上記の結果から、本発明の形質転換イネが、ＲＤＶに対する発病遅延型抵抗性ないし抵抗性を示すことが明らかになる。
（８）作出されたＲＤＶ抵抗性イネの後代Ｔ３植物における接種検定；
後代植物においてもＲＤＶ抵抗性が受け継がれているか否かを確認するために、Ｔ１植物からＴ２種子を取得して、Ｔ２植物を生育させる。このＴ２植物からＴ３種子を得、９葉期まで生育させて、試験用Ｔ３植物を得る。得られたＴ３植物において、上記（３）と同様に、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＤＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。上記（３）と同様に接種検定を行うと、Ｔ３植物においても、ＲＤＶ抵抗性ないし発病遅延型抵抗性が受け継がれていることが確認できる。
実施例６：ＲＤＶの複数タンパク質（Ｐｎｓ４およびＰｎｓ１２）の発現抑制イネの作出
（１）ＲＮＡｉ誘起ベクターの構築；
上記実施例２（１）で得たＰＣＲ増幅産物ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ、およびｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎを鋳型にして、以下のプライマーセット：
ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ２についてプライマーセット５：
2009020237.tif 000012
ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ２についてプライマーセット６：
2009020237.tif 000013
を用いてそれぞれＰＣＲを行い、ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ２（配列番号４９）、ｔｒｉｇｇｅｒ  ４Ｎ２（配列番号５０）を得る。これらＰＣＲ産物を混合したのち、上記プライマーＳ１２−ＧＳＦ１（配列番号３８）とプライマーＳ０４−ＧＳＲ１（配列番号４３）で融合ＰＣＲを行い、ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ４Ｎ（配列番号５１）の増幅産物を得る。
（２）制限酵素またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する；
（１）で得た増幅産物を、上記実施例２（２）に記載されるように、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．Ｋ２４３５−２０）を用いて、製造業者の説明書に従ってｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ４Ｎを得る。
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を形質転換ベクターにクローニングする；
（２）で作製したＲＮＡｉを引き起こす各因子（ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ４Ｎ）を、上記実施例２（３）に記載されるように、ＧａｔｅｗａｙシステムのＬＲクロナーゼ反応系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＡＮＤＡベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化する。
（４）上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する；
上記各ベクターを、上記実施例４（１）に示されるように、エレクトロポレーション法によってＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、製造業者の説明書に従ってアグロバクテリウムへ導入する。アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、上記実施例４（２）に記載されるように、アルカリＳＤＳ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第３版を参照のこと）によりプラスミドを抽出した後、ＰＣＲにより確認した。
（５）カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、感染確認後、再分化させ、ＲＤＶ抵抗性イネを作出する；
ＲＤＶ抵抗性イネを作出するために、実施例４（３）に記載されるように、カルス化したイネを作製する。カルスの前培養を始め、これに並行して上記（４）において得られたアグロバクテリウムのストック溶液から滅菌した爪楊枝で菌体を採取し、前培養を行う。
前培養したカルスに、前培養した上記アグロバクテリウムの懸濁液中に浸漬・感染させる。その後、カルスをＮ６ＣＯ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレをテープでシールして、３０〜３３℃において遮光して３日間培養する。培養後、全てのカルスをＮ６ＳＥ培地に、９カルス／シャーレで移植し、３０〜３３℃において２４時間明期の条件下で、１４日間培養し、選択されたカルスをＲＥ培地に移し、３０〜３３℃において再分化してくるまで培養する。再分化したシュートおよび根をＨＦ培地に移し、２〜３週間培養した後、鉢上げする。
（６）形質転換体当代（Ｔ０）株における導入遺伝子の確認
上記（５）において作出した形質転換体当代（Ｔ０）株において目的の遺伝子が導入されているか否かを確認するために、Ｔ０株からＣＴＡＢ法により調製したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、形質転換ベクター内の薬剤選抜マーカー（ハイグロマイシン耐性）遺伝子をプローブにサザンハイブリダイゼーションすることにより行う。Ｔ０株における導入遺伝子の転写産物の断片化によるｓｉＲＮＡの検出は、低分子ＲＮＡを抽出（基本的に、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８６，９５０に従った）した後、Ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ４Ｎをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションすることにより行う。
実施例７：形質転換体Ｔ１における他のＲＤＶ株感染とＲＮＡｉ誘導の確認
（１）Ｔ１植物へのＲＤＶ秋田株感染；
実施例２において得られたベクターを使用して、実施例４に記載されるようにＲＤＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＤＶ秋田株、Ｃｈｉｎｅｓｅ株、Ｋｕｎｍｉｎｇ株およびＹｕｎｎａｎ株の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＤＶ秋田株を保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、Ｏ株に基づく発現抑制剤がＲＤＶのＯ株感染に対する抵抗性のみならず、Ｏ株以外のＲＤＶ株の感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
実施例８：Ｏ株以外のＲＤＶのタンパク質（Ｐｎｓ１２）の発現抑制イネの作出およびＲＮＡｉ誘導の確認
（秋田株）
ＲＤＶ秋田株感染イネの葉から、実施例２に記載されるように、配列情報としては、アクセッション番号Ｓ７２０８５（配列番号２３）を用いて、定法に従って総ＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、目的の領域（Ｔｒｉｇｇｅｒ１２Ｎ（Ａｋｉｔａ））に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、目的の領域の増幅産物を得る。
上記実施例２（２）に記載されるように、上記で得た増幅産物を、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．Ｋ２４３５−２０）を用いて、製造業者の説明書に従ってｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ｔｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ（Ａｋｉｔａ）を得る。
このクローニングベクターを、同様に上記実施例２（２）に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択する。定法に従って、単一のコロニーを単離してこのクローニングベクターを含む形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを増殖させる。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認する。
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、上記実施例２に記載されるように、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、ｐＡＮＤＡベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化する。
実施例４に記載されるようにＲＤＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＯ株、ＲＤＶ秋田株、Ｃｈｉｎｅｓｅ株、Ｋｕｎｍｉｎｇ株およびＹｕｎｎａｎ株の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＤＶ秋田株を保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、秋田株の情報に基づいて設計したＴｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎ（Ａｋｉｔａ）を含む発現抑制剤は、ＲＤＶの秋田株感染に対する抵抗性のみならず、ＲＤＶの秋田株以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
（他の株）
秋田株に基づく上記実験と同様の実験をＣｈｉｎｅｓｅ株、Ｋｕｎｍｉｎｇ株およびＹｕｎｎａｎ株についても行う（Ｃｈｉｎｅｓｅ株については、アクセッション番号ＮＣ＿００３７６８およびアクセッション番号Ｕ３６５６９、Ｋｕｎｍｉｎｇ株についてアクセッション番号ＡＹ３４０２３８、Ｙｕｎｎａｎ株についてアクセッション番号ＡＹ５８９５７６を参照して作製することができる。）。これらの実験を行うことによって、Ｃｈｉｎｅｓｅ株、Ｋｕｎｍｉｎｇ株およびＹｕｎｎａｎ株の情報に基づいて設計したＴｒｉｇｇｅｒ  １２Ｎを含む発現抑制剤は、ＲＤＶのそれぞれが由来する株感染に対する抵抗性のみならず、ＲＤＶのそれぞれが由来する株以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明により、より無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、抑制または安定した抵抗性が付与されたイネ萎縮ウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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