【手続補正書】
【提出日】平成16年11月30日(2004.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
この課題は、請求項により解決される。請求項１は、アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）ＤＳＭ２０１１７由来の新規Ｄ−カルバモイラーゼを保護するものである。請求項２は、本発明のＤ−カルバモイラーゼをコードする遺伝子配列に関し、請求項３は、これらの遺伝子配列で修飾されたプラスミドおよびベクターに関し、他方、請求項４は、本発明により修飾された有価な微生物に関する。請求項５は、特定のプライマーに関し、他方、請求項６から８は、本発明のＤ−カルバモイラーゼの有利な使用を保護するものである。遺伝子を見出す方法について請求項９から１１項に記載する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７（配列番号２）由来のＤ−カルバモイラーゼを提供することにより、これをアミノ酸の製法に有利に使用することの可能性が開ける。このような方法は、原則として専門家に知られている（ＷＯ００５８４４９、ＷＯ０００８３７４、ＤＥ１０００５０１２３.０またはＤＥ１００５０１２４.９およびそこに引用された文献）。酵素は、未変性の酵素または有利に組換え法により製造された化合物の形で、記載の方法ために使用できる。本発明の組換え酵素の製造は、当業者に公知の遺伝子操作法により実施される（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press; Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R. L. Rodriguez & D. T. Denhardt, eds; 205〜225）。一般的方法として（ＰＣＲおよびフュージョンＰＣＲ、逆ＰＣＲ、クローニング、発現等）、以下の文献およびそこに引用される文献が参照される：Riley J, Butler R, Finniear R, Jenner D, Powell S, Anand R, Smith JC, Markham AF (1990). A novel, rapid method for the isolation of terminal sequences from yeast artificial chromosome (YAC) clones. Nucl. Acids Res. 18, 8186; Triglia T, Peterson MG, Kemp DJ (1988). A Procedure for in bitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press; Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R. L. Rodriguez & D. T. Denhardt, II）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７株を、Ａ．Ｍａｒｔｉｎ博士の合成（Stuttgart, 1997）におけるヒダントイン誘導体の変換について調査した。Ｄ−ヒダントイナーゼの均質な純化およびＮ末端の最初の３０個のアミノ酸決定が可能であった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
有機体アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）に、相当の番号で寄託され、公的に入手される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
Ｉ．アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）ＤＳＭ２０１１７のバイオマスの獲得
全細胞活性試験、染色体ＤＮＡの単離およびＤ−ヒダントイナーゼの酵素単離用の出発材料として、まず、生理学的に均質なアルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）ＤＳＭ２０１１７の細胞塊を十分な量で準備する。Ｂｒａｎｓの作業に即して（博士論文、TU Braunschweig, 1991）、この目的のために、５０リットルのバイオリアクター中の、炭素源としてＤ，Ｌ−ラクテート、別の栄養分としてイーストエキストラクトおよび培養誘導質としてヒダントインを含む半合成培地を使用する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ＩＩ．アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７由来Ｄ−ヒダントイナーゼの精製
アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７由来Ｄ−ヒダントイナーゼの精製プロトコールは、Ｍａｒｔｉｎの記載するＤ−ヒダントイナーゼのたんぱく質精製（博士論文、UniStuttgart, 1997）に幾つかの変更を加えたものである。精製ステップは、可能であれば４℃で実施され、フラクションのヒダントイナーゼ活性の測定は、最初、Ｅｈｒｌｉｃｈ法による光度検出で速やかに試験された。陽性のサンプルのアリコットを、標準物質であるＤ，Ｌ−ベンジルヒダントインと共にインキュベートし、正確な活性をＨＰＬＣにより測定した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７由来のヒダントイナーゼをトリプシンで切断するために、これを記載のようにＭｏｎｏＱフラクションまで精製し、次にＡｍｉｃｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ（３０ｋＤａまでを除去）で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。たんぱく質がＤ−ヒダントイナーゼであることを確認するために、ゲルの一部をウェスタンブロッティングにより膜へ移行し、切り出し、最初の８個のＮ−末端アミノ酸を決定した。位置２を除いて、決定されたすべてのアミノ酸はＭａｒｉｎにより決定されたＮ−末端と一致し（学術論文、University of Stutttgart, 1997）、従って、ここで単離されたたんぱく質はＭａｒｉｎによってすでに記載され特徴づけの成されたものと同一の酵素であると推測された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
ＩＶ．ｈｙｕ遺伝子集団のクローニング
１．アルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７由来の染色体ＤＮＡの単離
ラクテート培地中でアルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）ＤＳＭ２０１１７を培養することにより得られた湿潤バイオマス（Ｉ参照）を、染色体ＤＮＡの単離にも使用した。細胞溶解および塩化セシウムを用いた密度勾配遠心分離の後に、非常に純度の高いゲノムＤＮＡを単離できた。吸収スペクトルを記録して質を試験することにより、この方法におけるフェノールのコンタミが防止できた。光度測定によるＤＮＡの濃度は６０μｇＤＮＡ／ｍｌであった。ｃＤＮＡは、制限切断のために利用されかつＰＣＲ用のマトリクスとして使用された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
このために、Ｄ−カルバモイラーゼをアルスロバクター・クリスタロポイテス（Arthrobacter crystallopoietes）  ＤＳＭ２０１１７のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ここで、異なるプライマー対を使用することにより、３種の異なるＤ−カルバモイラーゼをクローン化できた。１つは、Ｈｉｓ−ｔａｇを有さないａｔｇ開始コドンによるＤ−カルバモイラーゼであり、２つは、ｔｔｇ開始コドンによるＤ−カルバモイラーゼであった。このうち１つはＨｉｓ−ｔａｇを有し、他方はＨｉｓ−ｔａｇを有さなかった。プライマー構築において、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ配列のｔｔｇ三塩基対を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で、ａｔｇコドンにより置換した（表４）。