(57)【要約】  標的物質の機能への影響を低減しつつ、標的物質の発現を任意の時間で可視化することができ、様々な励起・蛍光波長を有する蛍光色素を利用することができ、染色作業が容易な、標的物質の検出方法を提供すること。また、この検出方法に好適に用いることができるタグ、ＤＮＡ、ベクター、プローブ及び検出キットを提供することを目的とする。  （ａ）αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなり、標的物質に結合されたタグ、及び、（ｂ）蛍光色素が結合された化合物からなるプローブ、を接触させる工程と、蛍光色素が発する蛍光を測定する工程と、を含み、蛍光色素は、前記タグのαヘリックス構造及びプローブの化合物の結合によって、蛍光スペクトルの変化が誘起されることを特徴とする標的物質の検出方法、並びに、これに用いるタグ、ＤＮＡ、ベクター、プローブ及び検出キットである。
2008123180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなり、標的物質に結合されたタグ、及び、（ｂ）蛍光色素が結合された化合物からなるプローブ、
を接触させる工程と、
前記蛍光色素が発する蛍光を測定する工程と、を含み、
前記蛍光色素は、前記タグのαヘリックス構造及び前記プローブの化合物の結合によって、蛍光スペクトルの変化が誘起されることを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
タグのαヘリックス構造及びプローブの化合物の結合が、疎水的相互作用を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
タグのαヘリックス構造及びプローブの化合物の結合が、静電的相互作用を含む請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
プローブの化合物が、αヘリックス構造を形成するポリペプチドであって、蛍光色素がプローブの前記αヘリックス構造に結合されてなる請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
タグの少なくとも１つのαヘリックス構造と、プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造とが、互いに平行及び逆平行のうち少なくともいずれか１つで会合し、それぞれの疎水性面を内向させてタグ−プローブ複合体を形成する請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
タグのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなる請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タグの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されてなる請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
タグのαヘリックス構造の数が２つ以上である請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
タグのαヘリックス構造同士が、任意のアミノ酸からなるリンカーペプチドを介して連結されてなる請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
プローブのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸又であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表される配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなり、
プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、蛍光色素が結合された分子に置換されてなる請求の範囲第４項から第９項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
プローブのαヘリックス構造の数が２つ以上である請求の範囲第４項から第１０項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
プローブのαヘリックス構造同士が、任意のアミノ酸からなるリンカーペプチドを介して連結されてなる請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】
プローブが、蛍光色素を結合していないαヘリックス構造を有する場合に、
前記αヘリックス構造のうち少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されてなる請求の範囲第１１項から第１２項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
タグのポリペプチドが下記構造式（２）で表される配列を含み、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（３）で表される配列を含む請求の範囲第４項に記載の方法。
タグ：
｛Ｘ１−ε１−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛Ｘ１−ε２−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛Ｘ１−ε３−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛ＸＭ｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε３−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε２−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε１−Ｘ７｝      ・・・（２）
プローブ：
｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ１−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ２−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ３−Ｘ７｝      ・・・（３）
〔構造式（２）及び（３）中、
αは、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸である。
βは、αが酸性アミノ酸の場合には塩基性アミノ酸であり、αが塩基性アミノ酸の場合には酸性アミノ酸である。
γは、疎水性アミノ酸である。
σ１からσ３のうち少なくとも１つは、蛍光色素が結合された分子であり、それ以外のσ１からσ３は疎水性アミノ酸である。
ε１は、σ１が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ１が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
ε２は、σ２が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ２が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
ε３は、σ３が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ３が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
Ｘ１、Ｘ４、Ｘ７は、任意のアミノ酸である。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕
【請求項１５】
タグのポリペプチドが下記構造式（４）で表される配列を含み、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（５）で表される配列を含む請求の範囲第４項に記載の方法。
タグ：
｛Ala−γ−α−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−ε２−α−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−β−γ−Ala｝｛ＸＭ｝｛Ala−γ−β−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−γ−β−Lys−β−ε２−Glu｝｛Ala−γ−β−Lys−β−γ−Ala｝      ・・・（４）
プローブ：
｛Ala−γ−α−Lys−α−γ−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−α−σ２−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−α−γ−Ala｝      ・・・（５）
〔構造式（４）及び（５）中、
αは、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸である。
βは、αが酸性アミノ酸の場合には塩基性アミノ酸であり、αが塩基性アミノ酸の場合には酸性アミノ酸である。
γは、疎水性アミノ酸である。
σ２は、蛍光色素が結合された分子である。
ε２は、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかである。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕
【請求項１６】
タグのポリペプチドが下記構造式（６）で表される配列を含み、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（７）で表される配列を含む請求の範囲第４項に記載の方法。
タグ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−ε２−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Ala｝｛ＸＭ｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−ε２−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Ala｝      ・・・（６）
プローブ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−σ２−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Ala｝      ・・・（７）
〔構造式（６）及び（７）中、
σ２は、蛍光色素が結合された分子である。
ε２は、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかである。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕
【請求項１７】
蛍光色素が、ＮＢＤ（４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、Ｄｎｓ（ダンシル；１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニル）、ＤＡＮ（６−ジメチルアミノ−２−ナフトイル）、Ａｎｔ（アントラニロイル）、Ｍａｎｔ（Ｎ−メチルアントラニロイル）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノフタルイミド）、ＤＭＡＮ（６−ジメチルアミノ−２，３−ナフタルイミド）、３−ジメチルアミノベンゾニトリル、ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、ＭＡＮＳ（Ｎ−メチル−２−アニリノナフタレン−６−スルホン酸）、ＴＮＳ（２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホン酸）、ジメチルアミノフェノキサゾン、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（ナイルレッド）、Ｄａｐｏｘｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ（登録商標）、インドシアニングリーン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキシリックアシッド、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボキシリックアシッド、フルオレセイン、２，７−ジクロロフルオレセイン、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン），Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、クマリン類、アントラセン及びピレンのうちいずれかである請求の範囲第１項から第１６項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１項から第１７項のいずれかに記載の方法に用いる標的物質に結合させるためのタグであって、
前記タグは、αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなり、
前記タグのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなる標的物質に結合させるためのタグ。
【請求項１９】
タグの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されてなる請求の範囲第１８項に記載の標的物質に結合させるためのタグ。
【請求項２０】
請求の範囲第１８項から第１９項のいずれかに記載のタグをコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項２２】
請求の範囲第１項から第１７項のいずれかに記載の方法に用いるプローブであって、
前記プローブは、αヘリックス構造を形成するポリペプチドを含み、
前記プローブの前記αヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸又であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表される配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなり、
前記プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、蛍光色素が結合された分子に置換されてなるプローブ。
【請求項２３】
請求の範囲第１８項から第１９項のいずれかに記載のタグ、請求の範囲第２０項に記載のＤＮＡ及び請求の範囲第２１項に記載のベクターのうち少なくともいずれか１つと、請求の範囲第２２項に記載のプローブとを含む標的物質の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の検出方法、並びに、これに用いるタグ、ＤＮＡ、ベクター、プローブ及び検出キットに関し、特に、αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなるタグを結合された標的物質の検出方法、並びに、これに用いるタグ、ＤＮＡ、ベクター、プローブ及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内外におけるタンパク質（ポリペプチド）の発現動態や機能をリアルタイムに観測するために、観測対象となる標的タンパク質を選択的に蛍光標識して可視化する方法（バイオイメージング）が一般的に用いられている。タンパク質のバイオイメージングには、種々の蛍光色素で修飾した抗体（蛍光標識抗体）による免疫染色や、標的タンパク質に蛍光タンパク質を融合させる方法が汎用的に利用されている。【０００３】
しかしながら、前記免疫染色においては、一般的に抗体は失活しやすく、標的タンパク質の数だけ高価な蛍光標識抗体を用意しなければならないという問題がある。更に、前記免疫染色においては、標的タンパク質と結合した蛍光標識抗体と、結合しなかった蛍光標識抗体とを区別することは困難であって、標的タンパク質を観測するためには標的タンパク質に結合しなかった蛍光標識抗体を洗浄除去しなければならず、手間がかかるという問題があった。【０００４】
また、前記蛍光タンパク質を融合させる方法においては、遺伝子工学的手法を用いることで、蛍光タンパク質を標的タンパク質に自由に組み込むことが可能であるが、融合させた蛍光タンパク質に依存して、蛍光観測に利用可能な励起・蛍光波長が限定されてしまうという問題があった。
更に、前記蛍光タンパク質を融合させる方法においては、蛍光タンパク質が発現してから分解されるまで可視化され続けるために、可視化させる時間を選択できないという問題があった。更に、前記蛍光タンパク質を融合させる方法においては、蛍光タンパク質のサイズが比較的大きいため、標的タンパク質の構造や機能に対する蛍光タンパク質の影響がしばしば懸念されている。【０００５】
そのために、近年、標的タンパク質にタグとなるペプチドを融合させ、タグ特異的に結合する蛍光性プローブ分子を用いて標的タンパク質の蛍光ラベル化を達成する方法（以下、「ラベル化法」と称する。）が提案され、前記ラベル化法に用いるためのタグ−プローブ分子ペアの開発が精力的に行われている（例えば、非特許文献１、２参照）。前記ラベル化法によれば、有機化学的に合成した種々の蛍光分子を適用でき、タグ融合タンパク質の発現後にラベル化を行うため、標的タンパク質を任意の時間にさまざまな励起・蛍光波長で観測することができる。しかしながら、前記ラベル化法においては、タグ融合タンパク質と結合した蛍光性プローブ分子と、結合しなかった蛍光性プローブ分子とを区別することは困難であって、標的タンパク質を観測するためにはタグ融合タンパク質に結合しなかった蛍光性プローブ分子を洗浄除去しなければならず、手間がかかるという問題があった。【０００６】
一方で、タンパク質のペプチド鎖がとりうる高次構造の１つとして、ロイシンジッパーが知られている。ロイシンジッパーは、疎水的相互作用及び静電的相互作用を介して２本以上のαヘリックス構造ペプチドが、高い相補認識・結合能により会合して形成される高次構造である。αヘリックス構造は、アミノ酸３．６個ごとに１回転する右巻き螺旋であり、ピッチが０．５４ｎｍであり、ポリペプチドのカルボニルと４つ先のアミノ酸残基のアミドとが略直線状の水素結合を形成するため、非常に安定な構造であることが知られている。
近年、ロイシンジッパー構造を取る３本のαヘリックス構造ペプチドバンドル中の疎水性アミノ酸を側鎖の小さなアミノ酸に置換することによりバンドル内部に疎水性ポケットを形成し、蛍光色素等の有機小分子を取り込むことが可能であることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。【０００７】
【非特許文献１】Ｃ．Ｉｒｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５，１６，３５−４０
【非特許文献２】Ａ．Ｏｊｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００６，１２８，１０４５２−１０４５９
【非特許文献３】Ｉ．Ｏｂａｔａｙａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００１，５９，６５−７１
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、標的物質の機能への影響を低減しつつ、標的物質の発現を任意の時間で可視化することができ、様々な励起・蛍光波長を有する蛍光色素を利用することができ、染色作業が容易な、標的物質の検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この検出方法に好適に用いることができるタグ、ＤＮＡ、ベクター、プローブ及び検出キットを提供することを目的とする。
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、ロイシンジッパー構造を形成する３本のαヘリックス構造ペプチドのバンドル内部に形成された疎水性ポケットに、疎水性環境下で蛍光スペクトルが変化する所定の蛍光色素を取り込ませたときに、前記所定の蛍光色素の蛍光スペクトルが変化する、という知見である。
【００１０】
前記したように、ロイシンジッパー構造を取る３本のαヘリックス構造ペプチドバンドル中の疎水性アミノ酸を側鎖の小さなアミノ酸に置換することによりバンドル内部に疎水性ポケットを形成し、蛍光色素等の有機小分子を取り込むことが可能であることが報告されている。
しかしながら、蛍光色素として親水性から疎水性への環境変化に応答して蛍光波長変化、蛍光強度増大を示す蛍光色素を用い、ロイシンジッパー構造の形成を介して蛍光色素の周辺環境を親水性から疎水性へコントロールしたときに、ラベル化と連動した蛍光波長・強度の変化を誘起できることは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
更に、本発明者らは、ロイシンジッパー構造を形成する３本のαヘリックス構造ペプチドのバンドル内部に形成されたポケットを利用することにより、疎水性環境下で蛍光スペクトルが変化する蛍光色素だけでなく、様々な蛍光色素において蛍光スペクトルの変化が誘起されることを知見した。
更に、本発明者らは、ロイシンジッパー構造を形成する３本のαヘリックス構造ペプチドのバンドル内部に形成されたポケットを利用することにより、２つの分子間の距離を制御することができ、例えば、ＦＲＥＴ、消光物質を用いた蛍光の制御、エキシマー蛍光などに利用できることを知見した。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  （ａ）αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなり、標的物質に結合されたタグ、及び、（ｂ）蛍光色素が結合された化合物からなるプローブ、
を接触させる工程と、
前記蛍光色素が発する蛍光を測定する工程と、を含み、
前記蛍光色素は、前記タグのαヘリックス構造及び前記プローブの化合物の結合によって、蛍光スペクトルの変化が誘起されることを特徴とする標的物質の検出方法である。
＜２＞  タグのαヘリックス構造及びプローブの化合物の結合が、疎水的相互作用を含む＜１＞に記載の方法である。
＜３＞  タグのαヘリックス構造及びプローブの化合物の結合が、静電的相互作用を含む＜２＞に記載の方法である。
＜４＞  プローブの化合物が、αヘリックス構造を形成するポリペプチドであって、蛍光色素がプローブの前記αヘリックス構造に結合されてなる＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞  タグの少なくとも１つのαヘリックス構造と、プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造とが、互いに平行及び逆平行のうち少なくともいずれか１つで会合し、それぞれの疎水性面を内向させてタグ−プローブ複合体を形成する＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞  タグのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなる＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞  タグの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されてなる＜６＞に記載の方法である。
＜８＞  タグのαヘリックス構造の数が２つ以上である＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞  タグのαヘリックス構造同士が、任意のアミノ酸からなるリンカーペプチドを介して連結されてなる＜８＞に記載の方法である。
＜１０＞  プローブのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸又であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表される配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなり、
プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、蛍光色素が結合された分子に置換されてなる＜４＞から＜９＞のいずれかに記載の方法である。
＜１１＞  プローブのαヘリックス構造の数が２つ以上である＜４＞から＜１０＞のいずれかに記載の方法である。
＜１２＞  プローブのαヘリックス構造同士が、任意のアミノ酸からなるリンカーペプチドを介して連結されてなる＜１１＞に記載の方法である。
＜１３＞  プローブが、蛍光色素を結合していないαヘリックス構造を有する場合に、
前記αヘリックス構造のうち少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されてなる＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の方法である。
＜１４＞  タグのポリペプチドが下記構造式（２）で表される配列を含み、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（３）で表される配列を含む＜４＞に記載の方法である。
タグ：
｛Ｘ１−ε１−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛Ｘ１−ε２−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛Ｘ１−ε３−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛ＸＭ｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε３−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε２−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε１−Ｘ７｝      ・・・（２）
プローブ：
｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ１−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ２−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ３−Ｘ７｝      ・・・（３）
〔構造式（２）及び（３）中、
αは、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸である。
βは、αが酸性アミノ酸の場合には塩基性アミノ酸であり、αが塩基性アミノ酸の場合には酸性アミノ酸である。
γは、疎水性アミノ酸である。
σ１からσ３のうち少なくとも１つは、蛍光色素が結合された分子であり、それ以外のσ１からσ３は疎水性アミノ酸である。
ε１は、σ１が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ１が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
ε２は、σ２が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ２が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
ε３は、σ３が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ３が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
Ｘ１、Ｘ４、Ｘ７は、任意のアミノ酸である。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕
＜１５＞  タグのポリペプチドが下記構造式（４）で表される配列を含み、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（５）で表される配列を含む＜４＞に記載の方法である。
タグ：
｛Ala−γ−α−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−ε２−α−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−β−γ−Ala｝｛ＸＭ｝｛Ala−γ−β−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−γ−β−Lys−β−ε２−Glu｝｛Ala−γ−β−Lys−β−γ−Ala｝      ・・・（４）
プローブ：
｛Ala−γ−α−Lys−α−γ−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−α−σ２−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−α−γ−Ala｝      ・・・（５）
〔構造式（４）及び（５）中、
αは、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸である。
βは、αが酸性アミノ酸の場合には塩基性アミノ酸であり、αが塩基性アミノ酸の場合には酸性アミノ酸である。
γは、疎水性アミノ酸である。
σ２は、蛍光色素が結合された分子である。
ε２は、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかである。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕
＜１６＞  タグのポリペプチドが下記構造式（６）で表される配列を含み、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（７）で表される配列を含む＜４＞に記載の方法である。
タグ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−ε２−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Ala｝｛ＸＭ｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−ε２−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Ala｝      ・・・（６）
プローブ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−σ２−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Ala｝      ・・・（７）
〔構造式（６）及び（７）中、
σ２は、蛍光色素が結合された分子である。
ε２は、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかである。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕
＜１７＞  蛍光色素が、ＮＢＤ（４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、Ｄｎｓ（ダンシル；１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニル）、ＤＡＮ（６−ジメチルアミノ−２−ナフトイル）、Ａｎｔ（アントラニロイル）、Ｍａｎｔ（Ｎ−メチルアントラニロイル）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノフタルイミド）、ＤＭＡＮ（６−ジメチルアミノ−２，３−ナフタルイミド）、３−ジメチルアミノベンゾニトリル、ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、ＭＡＮＳ（Ｎ−メチル−２−アニリノナフタレン−６−スルホン酸）、ＴＮＳ（２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホン酸）、ジメチルアミノフェノキサゾン、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（ナイルレッド）、Ｄａｐｏｘｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ（登録商標）、インドシアニングリーン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキシリックアシッド、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボキシリックアシッド、フルオレセイン、２，７−ジクロロフルオレセイン、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン），Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、クマリン類、アントラセン及びピレンのうちいずれかである＜１＞から＜１６＞のいずれかに記載の方法である。
＜１８＞  ＜１＞から＜１７＞のいずれかに記載の方法に用いる標的物質に結合させるためのタグであって、
前記タグは、αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなり、
前記タグのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなる標的物質に結合させるためのタグである。
＜１９＞  タグの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されてなる＜１８＞に記載の標的物質に結合させるためのタグである。
＜２０＞  ＜１８＞から＜１９＞のいずれかに記載のタグをコードするＤＮＡである。
＜２１＞  ＜２０＞に記載のＤＮＡが挿入されたベクターである。
＜２２＞  ＜１＞から＜１７＞のいずれかに記載の方法に用いるプローブであって、
前記プローブは、αヘリックス構造を形成するポリペプチドを含み、
前記プローブの前記αヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸又であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表される配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなり、
前記プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、蛍光色素が結合された分子に置換されてなるプローブである。
＜２３＞  ＜１８＞から＜１９＞のいずれかに記載のタグ、＜２０＞に記載のＤＮＡ及び＜２１＞に記載のベクターのうち少なくともいずれか１つと、＜２２＞に記載のプローブとを含む標的物質の検出キットである。
【００１２】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、標的物質の機能への影響を低減しつつ、標的物質の発現を任意の時間で可視化することができ、様々な励起・蛍光波長を有する蛍光色素を利用することができ、染色作業が容易な、標的物質の検出方法を提供することができる。また、本発明は、この検出方法に好適に用いることができるタグ、ＤＮＡ、ベクター、プローブ及び検出キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本具体例のタグ及びプローブが形成するαヘリックス構造を示す図であって、プローブのαヘリックスにおいてはアミノ末端側からの視点の図である。
【図２】図２は、本具体例の標的物質の検出方法の概念を説明するための図である。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例１について測定した円二色性スペクトル測定の結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例２について測定した円二色性スペクトル測定の結果を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例３について測定した円二色性スペクトル測定の結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例１について測定した蛍光滴定の結果を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例２について測定した蛍光滴定の結果を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例３について測定した蛍光滴定の結果を示す図である。
【図５】図５は、図４Ａ〜４Ｃにおいて蛍光強度のピークが最も高い蛍光スペクトルを重畳した図である。
【図６】図６は、蛍光滴定の結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例１のタグペプチドとプローブペプチドについてのＪｏｂ’ｓ  ｐｌｏｔを示す図である。
【図８】図８は、実施例５の結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例６の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例８の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（標的物質の検出方法）
本発明の標的物質の検出方法は、下記工程１、２を含んでなり、必要に応じてその他の工程を含む。
工程１：
（ａ）αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなり、標的物質に結合されたタグ、及び、（ｂ）蛍光色素が結合された化合物からなるプローブ、を接触させる工程。
工程２：
前記蛍光色素が発する蛍光を測定する工程。【００１５】
＜工程１＞
−（ａ）タグ−
前記工程１における前記タグとは、αヘリックス構造を形成するポリペプチドからなり、標的物質に結合されてなる。
以下、タグを構成するポリペプチド及び前記ポリペプチドが形成するαヘリックス構造を、それぞれ「タグのポリペプチド」及び「タグのαヘリックス構造」と称し、後記する「プローブのポリペプチド」及び「プローブのαヘリックス構造」と区別する。【００１６】
−−タグのポリペプチド−−
前記タグのポリペプチドとしては、少なくとも１つのαヘリックス構造を形成する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成されたポリペプチドであっても、所定の遺伝情報に基づき細胞系又は無細胞系で発現されたポリペプチドであってもよいが、標的物質がポリペプチドである場合には、より簡便にタグを結合（融合）された標的物質を作成できる点で、前記発現されたポリペプチドがより好ましく、細胞系で発現されたポリペプチドが更に好ましい。
なお、前記「αヘリックス構造を形成する」とは、少なくともタグ−プローブ複合体が形成されるときにαヘリックス構造を形成していればよく、タグとプローブとが接触する前においてはαヘリックス構造を形成していてもよく、形成していなくてもよいが、タグとプローブとが接触する前においてもαヘリックス構造を形成していることがより好ましい。
なお、前記タグのポリペプチドは、αヘリックス構造を形成するアミノ酸だけで構成される必要はなく、例えば、スペーサーペプチド、リンカーペプチド、任意のアミノ酸など、特にαヘリックス構造を形成しないアミノ酸を含んでいてもよい。【００１７】
前記タグのポリペプチドを構成するアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、標的物質がポリペプチドである場合には、より簡便にタグを結合（融合）された標的物質を作成できる点で、細胞系又は無細胞系での発現に通常利用されるＬ型アミノ酸により構成されることが好ましい。【００１８】
前記タグのポリペプチドのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７〜７０残基が好ましく、１４〜７０残基がより好ましく、２８〜５６残基が更に好ましい。前記ポリペプチドのアミノ酸残基数が７残基未満であると、αヘリックス構造を形成するアミノ酸残基数も７残基未満になってしまい、αヘリックス構造が不安定になってしまったり、プローブの化合物との結合親和性が低下してしまったりすることがある。一方、前記ポリペプチドのアミノ酸残基数が７０残基以上であると、標的物質の構造や機能に対する影響が懸念される。【００１９】
前記工程１の「標的物質に結合されたタグ」における前記「結合された」とは、タグと標的物質とが少なくとも工程１乃至工程２の間に解離しない強度で結合されていることを示し、特に、標的物質がポリペプチドである場合には、タグが、標的物質（標的ポリペプチド）のアミノ末端側、カルボキシル末端側又はその内側にペプチド結合して、融合している状態を示す。このとき、タグと標的ポリペプチドとは、直接的にペプチド結合していてもよく、数残基の任意のアミノ酸からなるスペーサーペプチドを介して間接的にペプチド結合していてもよい。【００２０】
−−−タグのαヘリックス構造−−−
前記タグのαヘリックス構造としては、プローブの化合物（後記する「プローブのαヘリックス構造」も含む。）と疎水的相互作用により結合し、前記疎水的相互作用により形成される疎水的環境下に、所定の蛍光色素を配することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。プローブの化合物との結合親和性を更に高めるためには、前記疎水的相互作用に加えて、静電的相互作用により結合できることが好ましい。このようなタグのαヘリックス構造は、１次構造のアミノ酸配列を所定の配列に規定することによって、形成させることができる。【００２１】
前記１次構造のアミノ酸配列としては、前記条件を満たすαヘリックス構造を形成することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましくは下記の通りである。即ち、
タグのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなる。
より好ましくは、タグの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されてなる。【００２２】
ここで、前記酸性アミノ酸とは、生理的ｐＨで負電荷を有する極性アミノ酸であり、前記塩基性アミノ酸とは、生理的ｐＨで正電荷を有する極性アミノ酸である。
具体的には、前記酸性アミノ酸としては、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、前記塩基性アミノ酸としては、リジン又はアルギニンであり、前記疎水性アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン又はバリンである。なお、繰り返される各Ｘ１〜Ｘ７は、前記条件を満たす限り、同一のアミノ酸であってもよく、異なるアミノ酸であってもよい。【００２３】
前記Ｘ２，Ｘ６をそれぞれ疎水性アミノ酸としたことにより、タグのαヘリックス構造は、αヘリックス構造の外周面上に略軸方向に沿って２列の疎水性面が形成されるため、疎水性面を有するプローブの化合物や、タグの他のαヘリックス構造と、疎水的相互作用により結合することができる。
このとき、前記疎水性相互作用により形成される疎水的環境下に、蛍光色素を配するための疎水性ポケットが形成される。【００２４】
更に、タグの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸を、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換したことにより、前記疎水性ポケットを拡大することができる。【００２５】
前記疎水性ポケットの形状及び大きさとしては、蛍光色素が配されたときに蛍光色素の蛍光スペクトルが変化する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。言い換えると、蛍光色素の形状若しくは大きさ、又は、蛍光色素とプローブの化合物との結合距離によって、疎水性ポケットの形状及び大きさも適宜調節される。【００２６】
このような疎水性ポケットの形状及び大きさの調節は、置換されるアミノ酸の種類、数及び位置を変更することによって行うことができる。具体的には、置換されるアミノ酸の側鎖が短く、置換されるアミノ酸の数が多く、置換されるアミノ酸の位置により連続した空間を確保できるほど、疎水性ポケットを大きくすることができる。【００２７】
また、プローブの化合物がαヘリックス構造を形成するポリペプチドである場合には、前記疎水性ポケットの形状及び大きさの調節を、タグ−プローブ複合体に含まれるαヘリックス構造の総数を変更することによって行うことができる。具体的には、各αヘリックス構造はその疎水性面を内向させて複合体を形成するので、タグ−プローブ複合体に含まれるαヘリックス構造の総数が多いほど、複合体は多角形化して複合体内部の空間が広がり、疎水性ポケットが大きくなる。
なお、タグ−プローブ複合体に含まれるαヘリックス構造の総数は、前記Ｘ２，Ｘ６として選択される疎水性アミノ酸の種類を変えることにより、調節することができる。【００２８】
このように、疎水性ポケット形状及び大きさを調節することにより、タグ−プローブ複合体の形成を高い相補認識によるものとし、蛍光色素の蛍光スペクトルの変化も前記高い相補認識に対応した特異的なものとすることができる。【００２９】
前記Ｘ３，Ｘ５をそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸としたことにより、タグのαヘリックス構造は、αヘリックス構造の外周面上に略軸方向に沿って２列のそれぞれ独立な負電荷面又は正電荷面が形成されるため、それぞれに対応する電荷面（負電荷面に対しては正電荷面、正電荷面に対しては負電荷面）を有するプローブの化合物や、タグの他のαヘリックス構造と、静電的相互作用により結合することができる。【００３０】
前記静電的相互作用の強さとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、静電的相互作用が強いほど、タグのαヘリックス構造とプローブの化合物との結合親和性が増加する。具体的には、前記酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸の順に、また、前記塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニンの順に、静電的相互作用が強くなる。【００３１】
このように、前記静電的相互作用によれば、タグのαヘリックスとプローブの化合物との結合の態様を調節することができるので、タグ−プローブ複合体の形成を高い相補認識によるものとし、蛍光色素の蛍光スペクトルの変化も前記高い相補認識に対応した特異的なものとすることができる。【００３２】
前記タグのαヘリックス構造を構成するアミノ酸残基数を７残基以上と規定したことにより、タグのαヘリックス構造は安定化されて分解されにくくなり、又、プローブの化合物との結合親和性が増加する。
なお、前記タグのαヘリックス構造を構成するアミノ酸残基数は、前記したように、７残基以上が好ましいが、より好ましくは１４残基以上である。１４残基以上であると、更に、タグのαヘリックス構造が安定化されて分解されにくくなり、又、プローブの化合物との結合親和性が増加する。【００３３】
前記タグのαヘリックス構造の数としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば１つであってもよく、２つ以上であってもよい。前記タグのαヘリックス構造の数が２つ以上である場合には、前記タグのαヘリックス構造同士がペプチド結合により連結されていることが好ましく、例えば、直接的にペプチド結合していてもよく、数残基の任意のアミノ酸からなるリンカーペプチドを介してペプチド結合していてもよいが、好ましくはリンカーペプチドを介したペプチド結合である。【００３４】
前記リンカーペプチドのアミノ酸残基数としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１〜１２残基が好ましく、５〜７残基がより好ましい。前記リンカーペプチドのアミノ酸残基数が５〜７残基であると、適切にループ構造を形成し、連結されたαヘリックス構造同士が、逆並行に会合されやすくなる点で有利である。【００３５】
−（ｂ）プローブ−
前記工程１における前記プローブとは、蛍光色素が結合された化合物からなる。【００３６】
−−蛍光色素−−
前記蛍光色素は、タグ−プローブ複合体により形成される複合体内部の空間に配されることで、溶媒緩和から保護され、また分子運動が抑制されることにより、蛍光量子収率が改善されるので、蛍光スペクトルの変化が誘起される。
前記蛍光スペクトルの変化としては、例えば、蛍光波長の変化及び蛍光強度の増大が挙げられる。【００３７】
したがって、前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、タグ−プローブ複合体により形成される疎水性環境下に配されやすいように、疎水性であることが好ましい。【００３８】
前記複合体内部の空間は疎水性環境であるので、前記蛍光色素が疎水性環境下で蛍光スペクトルが変化する蛍光色素である場合には、前記蛍光色素が前記複合体内部に配されたときに蛍光スペクトルの変化が顕著に誘起される点で、より好ましい。【００３９】
前記疎水性環境下で蛍光スペクトルが変化する蛍光色素としては、例えば、ＮＢＤ（４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、Ｄｎｓ（ダンシル；１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニル）、ＤＡＮ（６−ジメチルアミノ−２−ナフトイル）、Ａｎｔ（アントラニロイル）、Ｍａｎｔ（Ｎ−メチルアントラニロイル）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノフタルイミド）、ＤＭＡＮ（６−ジメチルアミノ−２，３−ナフタルイミド）、３−ジメチルアミノベンゾニトリル、ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、ＭＡＮＳ（Ｎ−メチル−２−アニリノナフタレン−６−スルホン酸）、ＴＮＳ（２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホン酸）、ジメチルアミノフェノキサゾン、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（ナイルレッド）及びＤａｐｏｘｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ（登録商標）などが挙げられる。【００４０】
ＮＢＤは、一つの測定例として、親水性環境下では励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５４０ｎｍにおいて蛍光強度が最大になり、疎水性環境下では励起波長４５６ｎｍ、蛍光波長５０５ｎｍにおいて蛍光強度が最大になるという性質を有している。【００４１】
また、Ｄｎｓは、一つの測定例として、親水性環境下では励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長５４０ｎｍにおいて蛍光強度が最大になり、疎水性環境下では励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長５０３ｎｍにおいて蛍光強度が最大になるという性質を有している。【００４２】
また、ＤＡＮは、一つの測定例として、親水性環境下では励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍにおいて蛍光強度が最大になり、疎水性環境下では励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍにおいて蛍光強度が最大になるという性質を有している。
なお、同じ疎水性環境であっても、実験条件によってはその疎水性の度合いが異なりうるので、ＮＢＤ、Ｄｎｓ、ＤＡＮの特性は、前記した励起波長及び蛍光波長の値に限定されるものではない。【００４３】
前記化合物における前記蛍光色素の結合部位としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記化合物がタグのαヘリックスと疎水的相互作用により結合する面に、前記蛍光色素が結合されていることが好ましい。【００４４】
前記化合物に結合する前記蛍光色素の数としては、１つ以上である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化合物に２つ以上の蛍光色素が結合する態様としては、例えば、エキシマー蛍光、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）などを利用する態様が挙げられる。【００４５】
前記エキシマー蛍光においては、例えば、第１のピレン分子を、前記化合物がタグのαヘリックスと疎水的相互作用により結合する面に配置し、第２のピレン分子を、上記面とは異なる面に結合させておく。このとき、プローブが単独で存在している場合には、第１のピレン分子と第２のピレン分子との近接が特に妨げられずにピレン分子が２量体を形成できるので、波長３４５ｎｍの励起光を照射したときに波長４７５ｎｍの蛍光を発する。一方で、プローブとタグとが存在している場合には、第１のピレン分子がタグ−プローブ複合体内部の空間に取り込まれることで、第１のピレン分子と第２のピレン分子との距離が解離して各ピレン分子が単量体となるので、波長３４５ｎｍの励起光を照射したときに発する蛍光が、波長３７５ｎｍにシフトする。【００４６】
前記ＦＲＥＴにおいては、例えば、第１の蛍光色素を、前記化合物がタグのαヘリックスと疎水的相互作用により結合する面に配置し、第２の蛍光色素を、上記面とは異なる面に結合させておく。このとき、プローブが単独で存在している場合には、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との近接が特に妨げられないので、第１の蛍光色素に対する励起波長の光を照射したときに、共鳴により第１の蛍光色素から第２の蛍光色素への励起エネルギーの移動が起こり、第２の蛍光色素が発光する。一方で、プローブとタグとが存在している場合には、第１の蛍光色素がタグ−プローブ複合体内部の空間に取り込まれることで、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との距離が解離するので、第１の蛍光色素に対する励起波長の光を照射しても、第２の蛍光色素は発光しない。
前記ＦＲＥＴに利用できる蛍光物質の組合せとしては、例えば、ＮＢＤと２，７−ジクロロフルオレセイン又はＣｙ３；ＤａｎｓｙｌとＴＡＭＲＡ(テトラメチルローダミン)；ＤＡＮとＴＡＭＲＡ又はフルオレセイン；アントラニリックアシッドとフルオレセイン；ＤＭＡＰ又はＤＭＡＮとＴＡＭＲＡ；７−ジメチルアミノ−フェノキサジン−３−オンとＣｙ５；Ｎｉｌｅ  ＲｅｄとＣｙ７；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキシリックアシッド、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボキシリックアシッド又はフルオレセインと７−ジメチルアミノ−フェノキサジン−３−オン；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボキシリックアシッド、フルオレセイン、２，７−ジクロロフルオレセイン又はＣｙ３とＮｉｌｅ  Ｒｅｄ；などが挙げられる（各組合せ中、前者の蛍光色素を励起させることで、後者の蛍光色素が蛍光を発する）。【００４７】
−−化合物−−
前記化合物（プローブの化合物）としては、前記タグのαヘリックス構造と疎水的相互作用により結合し、前記疎水的相互作用により形成される疎水的環境下に、蛍光色素を配することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。タグのαヘリックスとの結合親和性を更に高めるためには、前記疎水的相互作用に加えて、静電的相互作用により結合できることが好ましい。【００４８】
前記化合物としては、例えば、αヘリックス構造を形成するポリペプチド、αヘリックスのミメティック化合物などが挙げられ、αヘリックス構造を形成するポリペプチドであれば、タグのαヘリックス構造とロイシンジッパー構造を形成できる点で、特に好ましい。【００４９】
以下、プローブの化合物としてのαヘリックス構造を形成するポリペプチドについて、詳細に説明する。
ここで、プローブの化合物としてのポリペプチド及び前記ポリペプチドが形成するαヘリックス構造を、それぞれ、「プローブのポリペプチド」及び「プローブのαヘリックス構造」と称し、前記した「タグのポリペプチド」及び「タグのαヘリックス構造」と区別する。【００５０】
前記プローブのポリペプチドとしては、少なくとも１つのαヘリックス構造を形成する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成されたポリペプチドであっても、所定の遺伝情報に基づき細胞系又は無細胞系で発現されたポリペプチドであってもよい。
なお、前記「αヘリックス構造を形成する」とは、少なくともタグ−プローブ複合体が形成されるときにαヘリックス構造を形成していればよく、タグとプローブとが接触する前においてはαヘリックス構造を形成していてもよく、形成していなくてもよいが、タグとプローブとが接触する前においてもαヘリックス構造を形成していることがより好ましい。
なお、前記プローブのポリペプチドは、αヘリックス構造を形成するアミノ酸だけで構成される必要はなく、例えば、リンカーペプチド、任意のアミノ酸など、特にαヘリックス構造を形成しないアミノ酸を含んでいてもよい。【００５１】
前記プローブのポリペプチドのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７〜４２残基が好ましく、１４〜４２残基がより好ましく、１４〜２８残基が更に好ましい。前記ポリペプチドのアミノ酸残基数が７残基未満であると、αヘリックス構造を形成するアミノ酸残基数も７残基未満になってしまい、αヘリックス構造が不安定になってしまったり、タグのαヘリックス構造との結合親和性が低下してしまったりすることがある。一方、前記ポリペプチドのアミノ酸残基数が４２残基以上であると、細胞膜を透過させてプローブを細胞内に導入する効率が低下し、染色の効率や感度が悪くなる場合がある。【００５２】
前記プローブのポリペプチドを構成するアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、αヘリックス構造やロイシンジッパー構造に関する知見が豊富に蓄積されており、設計が容易な点で、Ｌ型アミノ酸により構成されることが好ましい。【００５３】
−−−プローブのαヘリックス構造−−−
前記プローブのαヘリックス構造としては、タグのαヘリックス構造と疎水的相互作用により結合し、前記疎水的相互作用により形成される疎水的環境下に、所定の蛍光色素を配することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。タグのαヘリックス構造との結合親和性を更に高めるためには、前記疎水的相互作用に加えて、静電的相互作用により結合できることが好ましい。
このようなプローブのαヘリックス構造は、１次構造のアミノ酸配列を所定の配列に規定することによって、形成させることができる。【００５４】
前記１次構造のアミノ酸配列としては、前記条件を満たすαヘリックス構造を形成することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましくは下記の通りである。即ち、
前記プローブのαヘリックス構造が、下記構造式（１）
{Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７}Ｎ      ・・・（１）
〔構造式（１）中、Ｎは２以上の任意の整数であり、Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ２，Ｘ６はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７はそれぞれ任意のアミノ酸を示す。〕
で表される配列のうち、連続する７残基以上のアミノ酸からなり、
プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、蛍光色素が結合された分子に置換されてなる。【００５５】
ここで、前記酸性アミノ酸とは、生理的ｐＨで負電荷を有する極性アミノ酸であり、前記塩基性アミノ酸とは、生理的ｐＨで正電荷を有する極性アミノ酸である。
具体的には、前記酸性アミノ酸としては、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、前記塩基性アミノ酸としては、リジン又はアルギニンであり、前記疎水性アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン又はバリンである。なお、繰り返される各Ｘ１〜Ｘ７は、前記条件を満たす限り、同一のアミノ酸であってもよく、異なるアミノ酸であってもよい。【００５６】
前記Ｘ２，Ｘ６をそれぞれ疎水性アミノ酸としたことにより、プローブのαヘリックス構造は、αヘリックス構造の外周面上に略軸方向に沿って２列の疎水性面が形成されるため、疎水性面を有するタグのαヘリックス構造や、プローブの他のαヘリックス構造と、疎水的相互作用により結合することができる。【００５７】
更に、プローブの少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸を、蛍光色素が結合された分子に置換したことにより、前記疎水的相互作用により形成される疎水的環境下に、おのずと蛍光色素が配されることとなる。【００５８】
前記「蛍光色素が結合された分子」としては、前記所定のアミノ酸と置換されてプローブのαヘリックス構造に組み込まれたときに、αヘリックス構造の形成を阻害しない分子であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、側鎖に蛍光色素を有するＬ型アミノ酸、側鎖に蛍光色素を有するＤａｐ（ジアミノプロピオン酸）などが挙げられる。
このとき、例えばＬ型アミノ酸の側鎖の炭素数を変えることにより、蛍光色素とプローブのαヘリックスとの結合距離を調節することができる。【００５９】
前記Ｘ３，Ｘ５はそれぞれ酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸としたことにより、プローブのαヘリックス構造は、αヘリックス構造の外周面上に略軸方向に沿って２列のそれぞれ独立な負電荷面又は正電荷面が形成されるため、それぞれに対応する電荷面（負電荷面に対しては正電荷面、正電荷面に対しては負電荷面）を有するタグのαヘリックス構造や、プローブの他のαヘリックス構造と、静電的相互作用により結合することができる。
なお、前記静電気相互作用による作用効果は、タグのαヘリックス構造において記載したものと同様であるので、説明を省略する。【００６０】
前記プローブのαヘリックス構造のアミノ酸残基数を７残基以上としたことにより、プローブのαヘリックス構造は安定化されて分解されにくくなり、又、タグのαヘリックス構造との結合親和性が増加する。
なお、前記プローブのαヘリックス構造を構成するアミノ酸残基数は、前記したように、７残基以上が好ましいが、より好ましくは１４残基以上である。１４残基以上であると、更に、プローブのαヘリックス構造が安定化されて分解されにくくなり、又、タグのαヘリックス構造との結合親和性が増加する。【００６１】
なお、プローブが２つ以上のαヘリックス構造を形成し、蛍光色素を結合していないαヘリックス構造を有する場合には、少なくとも１つのαヘリックス構造に含まれるＸ２及びＸ６のうち、少なくとも１残基のアミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかに置換されていることが好ましい。このような構成により、疎水性ポケットの形状や大きさの調節を、タグだけでなくプローブでも行うことができる。【００６２】
前記プローブのαヘリックス構造の数としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば１つであってもよく、２つ以上であってもよい。前記プローブのαヘリックス構造の数が２つ以上である場合には、前記プローブのαヘリックス構造同士がペプチド結合により連結されていることが好ましく、例えば、直接的にペプチド結合していてもよく、数残基の任意のアミノ酸からなるリンカーペプチドを介してペプチド結合していてもよいが、好ましくはリンカーペプチドを介したペプチド結合である。【００６３】
前記リンカーペプチドのアミノ酸残基数としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１〜１２残基が好ましく、５〜７残基がより好ましい。前記リンカーペプチドのアミノ酸残基数が５〜７残基であると、適切にループ構造を形成し、連結されたαヘリックス構造同士が、逆並行に会合されやすくなる点で有利である。【００６４】
−−−消光物質−−−
本発明の態様に応じて、前記化合物は、前記蛍光色素以外に、例えば、消光物質などのその他の成分を結合していてもよい。
前記消光物質を利用する態様においては、例えば、消光物質を、前記化合物がタグのαヘリックスと疎水的相互作用により結合する面に配置し、蛍光色素を、上記面とは異なる面に結合させておく。このとき、プローブが単独で存在している場合には、消光物質と蛍光色素との近接が特に妨げられないので、蛍光色素に対する励起波長の光を照射しても発光しない。一方で、プローブとタグとが存在している場合には、消光物質がタグ−プローブ複合体内部の空間に取り込まれることで、消光物質と蛍光色素との距離が解離するので、蛍光色素に対する励起波長の光を照射したときに、消光物質により抑制されることなく、蛍光を発することができる。
前記消光物質としては、例えば、ニトロベンゼン誘導体、Ｄａｂｃｙｌ誘導体、ＱＳＹなどが挙げられる。また、前記消光物質と組み合わせて使用できる蛍光色素としては、例えば、クマリン類、アントラセン、ピレンなどが挙げられる。【００６５】
前記工程１において、（ａ）タグ及び（ｂ）プローブを「接触させる」方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。通常、（ａ）タグを含む溶液に対して（ｂ）プローブを含む溶液を添加することで、（ａ）タグ及び／又は（ｂ）プローブが溶液中を拡散してお互いを接触させることができる。【００６６】
また、必要に応じて、（ａ）タグ及び（ｂ）プローブを十分に反応させるためのインキュベーション工程や攪拌工程など、その他の工程を含んでいてもよい。前記インキュベーション工程の諸条件、例えば、温度条件、時間条件、雰囲気条件などについては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はないが、前記温度条件としては、３７℃が好ましく、前記時間条件としては、０．５〜１時間が好ましく、前記雰囲気条件としては、５％炭酸ガスが好ましい。
また、（ａ）タグが、細胞内、臓器内又は生体内に局在しており、その状態を維持したまま（ａ）タグ及び（ｂ）プローブを接触させる場合には、例えば、トランスフォーメーション、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、膜透過エンドサイトーシスなどにより、プローブを前記細胞内、臓器内又は生体内に注入する工程を含んでいてもよい。【００６７】
以上のように、前記工程１によって、タグのαヘリックス構造とプローブの化合物とが、疎水的相互作用及び／又は静電的相互作用により結合し、タグ−プローブ複合体を形成する。前記タグ−プローブ複合体の態様としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００６８】
例えば、プローブの化合物がαヘリックス構造を形成するポリペプチドである場合、タグ−プローブ複合体を構成するαヘリックス構造の総数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、αヘリックス構造の２量体〜５量体が好ましく、３量体〜４量体がより好ましい。また、αヘリックス構造同士が平行に結合してもよく、逆平行に結合してもよい。
なお、タグ及びプローブに、予めアビジン又はビオチンを結合しておき、疎水的相互作用及び／又は静電気的相互作用によるタグ−プローブ複合体の形成を、アビジン−ビオチン結合により補強する構成としてもよい。また、タグ及びプローブに、予めシステイン側鎖などの遊離のＳＨ基を含ませておき、疎水的相互作用及び／又は静電気的相互作用によるタグ−プローブ複合体の形成を、ジスルフィド結合により補強する構成としてもよい。同様に、例えば、抗原／抗体、ジアゾ結合、金／チオール、クロスリンク反応などの結合により、疎水的相互作用及び／又は静電気的相互作用によるタグ−プローブ複合体の形成を補強する構成としてもよい。中でも、前記タグ及びプローブを混合した後に、所望する時期に反応させることができ、不可逆的に共有結合させることができるので、パルスチェイスに利用しやすい点で、クロスリンク反応が好ましい。【００６９】
そして、前記疎水的相互作用により形成される疎水的環境下におのずと蛍光色素が配される。前記疎水的環境下に配された蛍光色素は、蛍光スペクトルの変化として、例えば、蛍光波長の変化及び蛍光強度の増大のうち少なくともいずれかが誘起される。
ここで、前記「蛍光波長の変化」とは、前記工程１の前後で、同一の励起波長を照射したときに、検出される蛍光波長が変化することを意味する。また、前記「蛍光強度の増大」とは、前記工程１の前後で、同一の蛍光波長を測定したときに、検出される蛍光強度が増大することを意味し、前記工程１の前後で同一の励起波長を照射することがより好ましい。【００７０】
一方、前記工程１において、タグ−プローブ複合体を形成しなかったプローブの蛍光色素は、疎水的環境下に配されることがないので蛍光スペクトルの変化が誘起されず、タグ−プローブ複合体の形成に対応して蛍光スペクトルが変化した蛍光色素と、区別することができる。したがって、前記工程１において(ａ)タグ及び（ｂ）プローブを接触させた後に、余剰のプローブを洗浄する操作を特に行わなくても、タグ−プローブ複合体を形成したプローブの蛍光色素のみを検出することができる。【００７１】
以下に、クロスリンク反応を利用して、パルスチェイスを行う場合の一態様を説明する。
第１のプローブ及び第２のプローブには、互いに蛍光波長の異なる蛍光色素を結合し、更に、クロスリンク反応活性を有する官能基を付加しておく。また、定常的に発現するプロモーターの下流に、タグを融合させた標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを接続し、発現ベクターを構築する。この発現ベクターを細胞内に導入し、細胞を培養する。
標的ポリペプチドを発現している細胞に対し、前記第１のプローブを添加し、必要に応じて紫外線等を照射することにより、前記第１のプローブとタグとをクロスリンクさせる。このとき、タグとプローブとの結合は、クロスリンク反応により不可逆的な結合となっているので、第１のプローブにより標識された標的ポリペプチドは、第２のプローブにより標識することができなくなる。
次に、細胞の培養を継続しつつ、細胞に対して、標的ポリペプチドの局在が変化する刺激を与える。
そして、前記第２のプローブを添加し、必要に応じて紫外線等を照射することにより、前記第２のプローブとタグとをクロスリンクさせる。このとき、第２のプローブは、第１のプローブにより標識された標的ポリペプチドを標識することはなく、新たに発現した標的ポリペプチドのみを標識する。
そして、細胞を蛍光顕微鏡下で観察すると、第１のプローブにより標識された標的ポリペプチドと、第２のプローブにより標識された標的ポリペプチドとが、異なる場所に局在していることを確認することができる。【００７２】
＜工程２＞
前記工程２においては、前記工程１により蛍光スペクトルが変化した蛍光色素の蛍光を測定する。
前記工程２における蛍光を測定する手段としては、特に制限はなく、例えば、従来公知の分光蛍光光度計により測定することができる。【００７３】
前記工程２における蛍光の測定条件としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、照射する励起波長及び測定する蛍光波長は、それぞれ１波長であってもよく、複数の波長であってもよい。
前記照射する励起波長及び測定する蛍光波長としては、前記工程１の前後で蛍光スペクトルが変化する蛍光色素の蛍光を測定することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００７４】
例えば、ＮＢＤの蛍光測定を、励起波長４５６ｎｍ及び蛍光波長５０５ｎｍで行った場合には、前記工程１の前後で、検出される蛍光強度が約１８倍に増大するため、タグ−プローブ複合体の形成を判断するための指標として、好適に利用できる。
例えば、Ｄｎｓの蛍光測定を、励起波長３４０ｎｍ及び蛍光波長５０３ｎｍで行った場合には、前記工程１の前後で、検出される蛍光強度が約１５倍に増大するため、タグ−プローブ複合体の形成を判断するための指標として、好適に利用できる。【００７５】
前記工程２における蛍光の測定回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１度だけ測定してもよく、複数回測定してもよく、経時的に測定してもよい
前記工程２における蛍光の測定時期としては、少なくとも前記工程１の後で測定される限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記工程１の前においても蛍光を測定しておき、前記工程１の前後における測定結果を比較することがより好ましい。【００７６】
＜検出対象＞
−標的物質−
本発明の検出方法の対象となる標的物質は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリペプチド、核酸、糖、脂質などの生体分子が挙げられるが、中でも、タグと融合により結合させやすい点で、ポリペプチドであることが好ましい。なお、前記ポリペプチドには抗体が含まれ、前記脂質にはリポソームが含まれる。
以下、ポリペプチドからなる標的物質を標的ポリペプチドと称し、前記標的ポリペプチドについて詳細に説明する。
前記標的ポリペプチドとは、２つ以上のアミノ酸同士がペプチド結合されているものを意味する。
前記標的ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成されたポリペプチドであっても、所定の遺伝情報に基づき細胞系又は無細胞系で発現されたポリペプチドであってもよいが、より簡便にタグを結合（融合）された標的ポリペプチドを作成できる点で、前記発現されたポリペプチドがより好ましく、そのまま細胞内での動態や機能の調査に移行できる点で、細胞系で発現されたポリペプチドが更に好ましい。前記細胞系で発現されたポリペプチドとしては、生体内での発現量が経時的に変化するポリペプチドであってもよく、定常的に発現するポリペプチドであってもよい。【００７７】
前記標的ポリペプチドの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、人工的に設計されたポリペプチドであってもよく、天然に存在するポリペプチドであってもよく、これらを改変したポリペプチドであってもよい。
また、前記標的ポリペプチド自身が、従来公知のタグペプチド、蛍光タンパク質、レポータータンパク質などと融合された融合ポリペプチドであってもよく、例えば、ヒスチジンタグ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ、ＦＬＡＧタグなどと融合された融合ポリペプチドであってもよい。【００７８】
前記標的ポリペプチドを構成するアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、より簡便にタグを融合された標的ポリペプチドを作成できる点で、細胞系又は無細胞系での発現に通常利用されるＬ型アミノ酸により構成されることが好ましい。
前記標的ポリペプチドのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２〜１０００残基が好ましく、５０〜１０００残基がより好ましい。即ち、前記標的ポリペプチドは、所謂、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質を含む。【００７９】
本発明の検出方法の好適な実施態様として、タグが融合された前記標的ポリペプチドは、その動態や機能の観測を所望する生体内（下記、対象生物、対象臓器、対象組織、対象細胞を含む）に導入された状態で、検出される。
タグが融合された前記標的ポリペプチドが抗体である場合には、本発明のプローブを、１次抗体を標識するための２次抗体のように使用することができる。したがって、本発明のタグが融合された抗体と、本発明のプローブとを組合せることで、研究用のツールとして特に好適に利用できる。【００８０】
−−対象生物−−
前記タグが融合された標的ポリペプチドが導入される生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、鳥類、爬虫類、両生類、哺乳類などが挙げられる。【００８１】
−−対象臓器−−
前記タグが融合された標的ポリペプチドが導入される臓器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられる。【００８２】
−−対象組織−−
前記タグが融合された標的ポリペプチドが導入される組織としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などが挙げられる。【００８３】
−−対象細胞−−
前記タグが融合された標的ポリペプチドが導入される細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、卵細胞、ＥＳ細胞などが挙げられる。なお、前記細胞は、生体内に存在する細胞であってもよいし、培養細胞や、生体から単離された細胞であってもよい。【００８４】
−−導入方法−−
前記タグが融合された標的ポリペプチドを、その動態や機能の観測を所望する生体内に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフォーメーション、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、膜透過ペプチドによるエンドサイトーシスなどが挙げられる。なお、前記タグが融合された標的ポリペプチドは、ポリペプチドとして導入されてもよいし、コードされたＤＮＡとして導入されて生体内でポリペプチドを発現してもよい。【００８５】
（タグ）
本発明のタグは、前記標的物質の検出方法に用いる標的物質に結合させるためのタグである。即ち、前記タグは、前記標的物質の検出方法において説明したαヘリックス構造を形成するポリペプチドからなる。【００８６】
−製造方法−
前記タグの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成、又は、所定の遺伝情報に基づいた細胞系又は無細胞系での発現により製造することができる。
前記化学合成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆｍｏｃ（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ＭｅｔｈＯｘｙ−Ｃａｒｂｏｎｙｌ）合成法やＢｏｃ（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｏｘｙ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ合成法）などの固相合成法、液相合成法などが挙げられる。
前記所定の遺伝情報に基づいた発現としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来公知の遺伝工学的手法を用いてプロモーターの下流にタグをコードする遺伝子を連結したＤＮＡを構築し、前記ＤＮＡを従来公知の手法により細胞内に導入したり、前記ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、リボソーム、アミノ酸などを含む無細胞系の反応液と混合したりすることにより発現させることができる。以上のように製造されたタグは、そのままタグとして利用してもよく、また、精製した後にタグとして利用してもよい。
なお、所定の遺伝情報に基づいて発現させる場合には、１つのプロモーターの下流にタグをコードする遺伝子と標的ポリペプチドをコードする遺伝子と連結したＤＮＡを構築し、融合ポリペプチドとして発現させることが特に好ましい。【００８７】
（ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡは、前記タグをコードする塩基配列を含み、更に、必要に応じて他の塩基配列を含む。
前記他の塩基配列としては、例えば、タグをコードする塩基配列の上流に配置されるプロモーター配列、前記タグをコードする塩基配列の下流に配置されるターミネーター配列、ポリアデニル鎖付加シグナルなどが挙げられる。前記プロモーター配列としては、通常、発現を所望するホスト細胞でタグをコードする塩基配列を発現可能なものが選択される。また、前記他の塩基配列として、エンハンサー、前記ＤＮＡを保有する細胞を選択するためのマーカー遺伝子、標的ポリペプチドをコードする遺伝子を本発明のＤＮＡに組み込むための制限酵素部位などを含んでいてもよい。【００８８】
（ベクター）
本発明のベクターは、前記ＤＮＡが挿入されており、更に、必要に応じて他の成分を含む。
前記ベクターとしては、通常、発現を所望するホスト細胞や遺伝子導入法の種類に応じて適切なものが選択される。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは、当該分野において周知であるが、例えば、動物細胞での発現を所望する場合には、ウィルスベクターなどを用いることができる。前記他の成分としては、例えば、ウィルスベクターをパッケージングするためのタンパク質粒子や細胞などが挙げられる。【００８９】
（プローブ）
本発明のプローブは、前記標的物質の検出方法に用いるプローブである。即ち、前記プローブは、前記標的物質の検出方法において説明した蛍光色素が結合された化合物からなる。前記したように、前記化合物としては、例えば、αヘリックス構造を形成するポリペプチド、αヘリックスのミメティック化合物などが挙げられ、αヘリックス構造を形成するポリペプチドであれば、タグのαヘリックス構造とロイシンジッパー構造を形成できる点で、特に好ましい。【００９０】
−製造方法−
蛍光色素の入手方法の例を以下に示す。ＮＢＤは、ＮＢＤクロリドとして、関東化学、東京化成工業、アルドリッチなどの試薬販売会社より購入することができる。Ｄｎｓは、Ｄｎｓクロリドとして、関東化学、東京化成工業、和光純薬、シグマ、アルドリッチなどの試薬販売会社より購入することができる。ＤＡＮは、参考文献（Bruce E. Cohen, et al., Science, 2002, 296, 1700-1703）などに記載の方法に従って製造することができる。その他、Ａｎｔ（アントラニロイル）、Ｍａｎｔ（Ｎ−メチルアントラニロイル）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノフタルイミド）、ＤＭＡＮ（６−ジメチルアミノ−２，３−ナフタルイミド）、３−ジメチルアミノベンゾニトリル、ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、ＭＡＮＳ（Ｎ−メチル−２−アニリノナフタレン−６−スルホン酸）、ＴＮＳ（２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホン酸）、ジメチルアミノフェノキサゾン、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（ナイルレッド）及びＤａｐｏｘｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ（登録商標）などの、疎水性環境下で蛍光スペクトルが変化する蛍光色素は、種々の合成的方法により製造することができる。
そして、例えば、前記ＮＢＤクロリドや前記Ｄｎｓクロリドを、側鎖にアミノ基を有するＬ型アミノ酸と反応させることにより、蛍光色素を側鎖に有するＬ型アミノ酸を製造することができる。【００９１】
前記プローブのポリペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成や、所定の遺伝情報に基づいた細胞系又は無細胞系での発現などにより製造することができる。
前記化学合成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｆｍｏｃ（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ＭｅｔｈＯｘｙ−Ｃａｒｂｏｎｙｌ）合成法やＢｏｃ（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｏｘｙ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ合成法）などの固相合成法、液相合成法などが挙げられる。
前記化学合成における合成過程において、アミノ酸に替えて、例えば、蛍光色素を側鎖に有するＬ型アミノ酸を取り込ませることで、プローブを製造することができる。【００９２】
前記所定の遺伝情報に基づいた発現としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来公知の遺伝工学的手法を用いてプロモーターの下流にタグをコードする遺伝子を連結したＤＮＡを構築し、前記ＤＮＡを従来公知の手法により細胞内に導入したり、前記ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、リボソーム、アミノ酸などを含む無細胞系の反応液と混合したりすることにより、発現させることができる。
このようにポリペプチドを発現させた後に、ポリペプチドを精製し、特定のアミノ酸（例えば、システイン）に選択的な反応基を有する蛍光色素を反応させることにより、前記特定のアミノ酸に蛍光色素が結合して、プローブを製造することができる。【００９３】
（標的物質の検出キット）
本発明の標的物質の検出キットは、前記タグ、前記ＤＮＡ、前記ベクターのうち少なくとも１つと、前記プローブを含んでなる。【００９４】
＜具体例＞
以下、本実施形態の具体例を説明するが、本発明は、これらの具体例に何ら限定されるものではない。【００９５】
本具体例においては、タグのポリペプチドが下記構造式（２）で表され、プローブのポリペプチドが下記構造式（３）で表される。
タグ：
｛Ｘ１−ε１−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛Ｘ１−ε２−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛Ｘ１−ε３−α−Ｘ４−β−γ−Ｘ７｝｛ＸＭ｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε３−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε２−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−β−Ｘ４−β−ε１−Ｘ７｝      ・・・（２）
プローブ：
｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ１−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ２−Ｘ７｝｛Ｘ１−γ−α−Ｘ４−α−σ３−Ｘ７｝      ・・・（３）
〔構造式（２）及び（３）中、
αは、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸である。
βは、αが酸性アミノ酸の場合には塩基性アミノ酸であり、αが塩基性アミノ酸の場合には酸性アミノ酸である。
γは、疎水性アミノ酸である。
σ１からσ３のうち少なくとも１つは、蛍光色素が結合された分子であり、それ以外のσ１からσ３は疎水性アミノ酸である。
ε１は、σ１が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ１が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
ε２は、σ２が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ２が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
ε３は、σ３が蛍光色素が結合された分子である場合には、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかであり、σ３が疎水性アミノ酸である場合には、疎水性アミノ酸である。
Ｘ１、Ｘ４、Ｘ７は、任意のアミノ酸である。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕【００９６】
図１は、本具体例のタグ及びプローブが形成するαヘリックス構造を示す図であって、プローブのαヘリックスにおいてはアミノ末端側からの視点の図である。
図１に示すように、本具体例においては、タグ１０のポリペプチドが、リンカーポリペプチド（ＸＭ）を介して連結された２つのαヘリックス構造１１、１２を形成し、プローブ２０のポリペプチドが、１つのαヘリックス構造２１を形成する。【００９７】
各αヘリックス構造１１、１２及び２１の、ε（ε１〜ε３）、σ（σ１〜σ３）及びγのアミノ酸は、疎水的相互作用によってタグ−プローブ複合体の中心へと内向し、かつ、互いに近接することで、複合体の中心に疎水性環境（図示せず）を形成している。
また、各αヘリックス構造１１、１２及び２１の、α及びβのアミノ酸は、隣接するαヘリックス構造１１、１２及び２１との電荷が対応するように設計されているので、静電的相互作用（図１では破線で示されている。）により、結合親和性が更に増加し、複合体を安定化している。【００９８】
また、タグ１０のαヘリックス１１、１２のεが、蛍光色素２２が結合されたσと対向する位置で、側鎖の短いアミノ酸に置換されていることで、蛍光色素２２が格納される疎水性ポケットＳが拡大されている。
そして、蛍光色素２２は、プローブ２０のαヘリックス構造２１のσに結合されているために、おのずと疎水性ポケットＳに配される。【００９９】
図２は、本具体例の標的物質の検出方法の概念を説明するための図である。
図２に示すように、タグ１０のαヘリックス構造１１、１２と、プローブ２０のαヘリックス構造２１とが疎水的相互作用及び静電的相互作用により結合し、タグ−プローブ複合体４０を形成する。そして、前記疎水的相互作用により形成される疎水的環境下（疎水性ポケットＳ）におのずと蛍光色素２２が配される。前記疎水的環境下に配された蛍光色素２２は、蛍光スペクトルの変化として、蛍光波長の変化及び蛍光強度の増大のうち少なくともいずれかが誘起される。したがって、タグ−プローブ複合体４０の形成に特異的な蛍光を検出することが可能となる。ここで、図２に示す本具体例においては、タグ１０に標的物質３０が結合しているので、前記特異的な蛍光の検出により、標的物質３０を検出することができる。【０１００】
なお、本具体例において、タグのポリペプチドが下記構造式（４）で表され、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（５）で表されることが、より好ましい。
タグ：
｛Ala−γ−α−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−ε２−α−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−β−γ−Ala｝｛ＸＭ｝｛Ala−γ−β−Lys−β−γ−Glu｝｛Ala−γ−β−Lys−β−ε２−Glu｝｛Ala−γ−β−Lys−β−γ−Ala｝      ・・・（４）
プローブ：
｛Ala−γ−α−Lys−α−γ−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−α−σ２−Glu｝｛Ala−γ−α−Lys−α−γ−Ala｝      ・・・（５）
〔構造式（４）及び（５）中、
αは、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸である。
βは、αが酸性アミノ酸の場合には塩基性アミノ酸であり、αが塩基性アミノ酸の場合には酸性アミノ酸である。
γは、疎水性アミノ酸である。
σ２は、蛍光色素が結合された分子である。
ε２は、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかである。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕【０１０１】
このような配列としたことで、構造式（４）及び（５）においてαヘリックスを誘起しやすいアミノ酸が配置され、構造式（２）及び（３）に比べて、よりタグ−プローブ複合体を形成しやすくなるという効果を奏する。【０１０２】
なお、本具体例において、タグのポリペプチドが下記構造式（６）で表され、かつ、プローブのポリペプチドが下記構造式（７）で表されることが、更に好ましい。
タグ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−ε２−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Ala｝｛ＸＭ｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−ε２−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Ala｝      ・・・（６）
プローブ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−σ２−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Ala｝      ・・・（７）
〔構造式（６）及び（７）中、
σ２は、蛍光色素が結合された分子である。
ε２は、それぞれ独立にグリシン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン及びアスパラギンのうちいずれかである。
ＸＭは、Ｍ個の任意のアミノ酸Ｘからなるリンカーペプチドである。〕【０１０３】
このような配列としたことで、構造式（６）及び（７）においてαヘリックスを誘起しやすいアミノ酸が配置され、構造式（４）及び（５）に比べて、よりタグ−プローブ複合体を形成しやすくなるという効果を奏する。
【実施例】
【０１０４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【０１０５】
（実施例１）
実施例１で合成したタグのポリペプチドは下記構造式（８）で表され、プローブのポリペプチドは下記構造式（９）で表される。また、図面においては、実施例１のタグのポリペプチドを「Ａ２」と表し、プローブのポリペプチドを「Ｌ−ＮＢＤ」と表す。
タグ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Ala−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Ala｝｛Gly−Gly−Cys−Gly−Gly｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Ala−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Ala｝      ・・・（８）（配列番号：１）
プローブ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Dap(NBD)−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Ala｝      ・・・（９）（配列番号：２）【０１０６】
＜合成方法＞
合成したペプチドは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により分離精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）により同定した。【０１０７】
ＨＰＬＣはＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  ＨＴＡシステム（日立ハイテク社製）を使用し、分析カラムとして５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク社製、４．６φ×２５０ｍｍ）及び精製用のセミ分取カラムとして５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク社製、１０φ×２５０ｍｍ）を用いた。ＨＰＬＣの溶出液として、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む超純水（Ａ溶媒）及び高純度アセトニトリル（Ｂ溶媒）を用い、Ａ溶媒とＢ溶媒の比率を連続的に変化させて目的ペプチドを溶出した。ペプチドの検出は紫外可視吸収測定（測定波長：２２０ｎｍ）により行った。【０１０８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定を行った。ペプチドのＨＰＬＣ溶出液５μＬにα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液（１０ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ５０：５０  Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（アセトニトリル），０．１％トリフルオロ酢酸）５μＬを加えてサンプル溶液とし、そのうち２μＬをサンプルプレート上にスポットし、測定サンプルを調製した。分子量既知のペプチド（タンパク質）を用いて測定機器の補正を行い、目的ペプチドのシグナルを［Ｍ＋Ｈ］＋のプロトン付加体として検出した。【０１０９】
−プローブペプチドの合成−
プローブペプチドは、文献（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，ｉｎ  Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｅｄｓ．，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００，４１．）に記載のＦｍｏｃ固相合成法に従って、樹脂上でＦｍｏｃ保護アミノ酸を段階的にカップリングして伸長反応を行なった。【０１１０】
アミノ基の導入率が０．５５ｍｍｏｌ／ｇ  ｒｅｓｉｎのＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ  ４５ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を反応チューブに入れ、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）で洗浄・膨潤を行なった。樹脂を２０％  ＰＰＤ（ピペリジン）／ＤＭＦ溶液中、１５分間振とう撹拌し、２ｍＬのＤＭＦで６回洗浄した。アミノ基に対して５当量のＦｍｏｃ保護アミノ酸、ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（５当量）を２ｍＬのＤＭＦに溶解して加え、１時間振とう撹拌後、２ｍＬのＤＭＦで６回洗浄した。上記の手順で順次アミノ酸をカップリングしてペプチド鎖を伸長した。【０１１１】
伸長後、２ｍＬのＤＭＦ中でアミノ末端のアミノ基を５０当量の無水酢酸によりアセチル化し、樹脂をクロロホルムで洗浄後、真空乾燥した。アセチル化ペプチド−樹脂にｍ−クレゾール０．１ｍＬ、チオアニソール０．３ｍＬ、トリイソプロピルシラン０．０４ｍＬ、トリフルオロ酢酸４ｍＬを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を濾過し、濾液を減圧下濃縮し、残渣に氷冷したジエチルエーテルを加えて沈殿を得た。沈殿を遠心分離し（３０００ｒｐｍ）、ジエチルエーテルで数回洗浄したのち真空乾燥して、粗ペプチドを得た。粗ペプチドを１０％酢酸水溶液に溶解し、Ｃ１８逆相セミ分取カラム（１０φ×２５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣにより精製し、減圧下濃縮後、凍結乾燥した。収量は３．５１ｍｇ、収率は５％であった。
ＨＰＬＣ（グラジエント：Ａ／Ｂ＝７８／２２→４８／５２、３０分）
溶出時間１５．１分
［Ｍ＋Ｈ］＋＝２６８５．６（理論値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２６８５．２）【０１１２】
−タグペプチドの合成−
タグペプチドはＡ鎖とＢ鎖の２つのフラグメントに分け、２つのフラグメントを連結することにより合成した。Ａ鎖とＢ鎖はリンカーペプチド部分のシステイン残基で分割し、アミノ末端にシステインを有するフラグメントをＡ鎖、もう一方をＢ鎖とした。
Ａ鎖はプローブペプチドと同様にして合成、精製を行った。
Ｂ鎖は、２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎに第一アミノ酸を導入した後、プローブペプチドと同様に樹脂上で伸長反応を行った。酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン＝１／１／３の溶液で樹脂から切断し、減圧濃縮後、真空乾燥した。得られた保護粗ペプチドを、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物、メルカプトプロピオン酸エチルエステルを用いてチオエステル化した。得られたチオエステルをプローブペプチドと同様の条件で脱保護したのち、ＨＰＬＣ精製を行った。【０１１３】
精製したＡ鎖、Ｂ鎖をグアニジン変性条件化、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中で、Ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ法により連結し、タグペプチドを得た。タグペプチドの収率は８％であった。【０１１４】
ＨＰＬＣ（グラジエント：Ａ／Ｂ＝７０／３０→４０／６０、３０分）
溶出時間２３．５分
［Ｍ＋Ｈ］＋＝５３０９．８（理論値［Ｍ＋Ｈ］＋＝５３０９．１）【０１１５】
（実施例２）
実施例２のタグのポリペプチド及びプローブのポリペプチドを、実施例１と同様の合成方法により合成した。
実施例２で合成したタグのポリペプチドは下記構造式（１０）で表され、プローブのポリペプチドは下記構造式（９）で表される。なお、前記プローブのポリペプチドは、実施例１と同じである。また、図面においては、実施例２のタグのポリペプチドを「Ｌ２」と表し、プローブのポリペプチドを「Ｌ−ＮＢＤ」と表す。
タグ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Ala｝｛Gly−Gly−Cys−Gly−Gly｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Ala｝      ・・・（１０）（配列番号：３）
プローブ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Dap(NBD)−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Ala｝      ・・・（９）（配列番号：２）【０１１６】
（実施例３）
実施例３のタグのポリペプチド及びプローブのポリペプチドを、実施例１と同様の合成方法により合成した。
実施例３で合成したタグのポリペプチドは下記構造式（１１）で表され、プローブのポリペプチドは下記構造式（９）で表される。なお、前記プローブのポリペプチドは、実施例１と同じである。また、図面においては、実施例３のタグのポリペプチドを「Ｇ２」と表し、プローブのポリペプチドを「Ｌ−ＮＢＤ」と表す。
タグ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Gly−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Ala｝｛Gly−Gly−Cys−Gly−Gly｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Gly−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Ala｝      ・・・（１１）（配列番号：４）
プローブ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Dap(NBD)−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Ala｝      ・・・（９）（配列番号：２）【０１１７】
（実施例４：円二色性スペクトル測定）
実施例１〜３のタグのポリペプチド及びプローブのポリペプチドについて、円二色性スペクトル測定を行った。
タグペプチド、プローブペプチド及びタグ−プローブ複合体の構造を円二色性スペクトル測定により解析した。円二色性スペクトル測定は光路長１ｃｍの石英セルを使用し、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７２０ＷＩ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（日本分光社製）を用いて行った。
図３Ａは、実施例１について測定した円二色性スペクトル測定の結果を示す図であり、図３Ｂは、実施例２について測定した円二色性スペクトル測定の結果を示す図であり、図３Ｃは、実施例３について測定した円二色性スペクトル測定の結果を示す図である。図３Ａ〜図３Ｃにおいて、横軸は測定波長を示し、縦軸はモル残基楕円率を示す。
図３Ａに示すように、実施例１において、タグペプチドは５８％がαヘリックス構造を取っており、プローブペプチドは５３％がαヘリックス構造を取っていた。タグ−プローブ混合液中ではタグ、プローブともαヘリックス構造が更に誘起され、７１％がαヘリックス構造を形成していることがわかった。
図３Ｂに示すように、実施例２において、タグペプチドは８１％がαヘリックス構造を取っており、プローブペプチドは５３％がαヘリックス構造を取っていた。タグ−プローブ混合液中ではタグ、プローブともαヘリックス構造が更に誘起され、７８％がαヘリックス構造を形成していることがわかった。
図３Ｃに示すように、実施例３において、タグペプチドは１８％がαヘリックス構造を取っており、プローブペプチドは５３％がαヘリックス構造を取っていた。タグ−プローブ混合液中ではタグ、プローブともαヘリックス構造が更に誘起され、４１％がαヘリックス構造を形成していることがわかった。【０１１８】
（実施例５：蛍光滴定）
実施例１〜３のタグのポリペプチド及びプローブのポリペプチドについて、蛍光滴定を行った。
０．５μＭのプローブペプチド溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）にタグペプチドを０．１〜２．０当量のタグペプチド溶液を滴下し、蛍光スペクトル測定を行った。蛍光スペクトル測定は光路長１ｃｍの石英セルを使用し、Ｊａｓｃｏ  ＦＰ−７５０  ｓｐｅｃｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（日本分光社製）を用いて行った。【０１１９】
図４Ａは、実施例１について測定した蛍光滴定の結果を示す図であり、図４Ｂは、実施例２について測定した蛍光滴定の結果を示す図であり、図４Ｃは、実施例３について測定した蛍光滴定の結果を示す図である。図４Ａ〜４Ｃにおいて、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。
図４Ａに示すように、実施例１において、プローブペプチド単独では５４０ｎｍ付近に比較的弱い蛍光を示したが、タグペプチドの濃度増加に伴って蛍光波長が短波長側にシフトしながら蛍光強度の顕著な増大を示した。蛍光波長は、最終的に５０５ｎｍまで短波長シフトした。
図４Ｂに示すように、実施例２において、プローブペプチド単独では５４０ｎｍ付近に比較的弱い蛍光を示したが、タグペプチドの濃度増加に伴って蛍光波長が短波長側にシフトしながら蛍光強度の顕著な増大を示した。蛍光波長は、最終的に５１６ｎｍまで短波長シフトした。
図４Ｃに示すように、実施例３において、プローブペプチド単独では５４０ｎｍ付近に比較的弱い蛍光を示したが、タグペプチドの濃度増加に伴って蛍光波長が短波長側にシフトしながら蛍光強度の顕著な増大を示した。蛍光波長は、最終的に５２６ｎｍまで短波長シフトした。【０１２０】
図５は、図４Ａ〜４Ｃにおいて蛍光強度のピークが最も高い蛍光スペクトルを重畳した図である。
図５に示すように、実施例１〜３を比較したときに、実施例１のタグのポリペプチド及びプローブのポリペプチドの組合せが、最も蛍光強度が上昇することを確認した。【０１２１】
更に、前記蛍光滴定において、５０５ｎｍにおける蛍光強度の変化率をタグペプチドの濃度に対してプロットし、タグペプチドとプローブペプチドとが１対１で結合すると仮定した理論式により解析して解離定数を算出した。【０１２２】
図６は、蛍光滴定の結果を示す図である。図６において、横軸は、プローブに対するタグの滴定量を示し、縦軸は、プローブのみの蛍光強度（蛍光波長５０５ｎｍ）を１としたときの相対的な蛍光強度の増大量を示す。図６に示すように、実施例１〜３において、蛍光の変化はタグペプチドが１当量で飽和に達した。このとき、実施例１について測定した５０５ｎｍでの蛍光強度はタグペプチド非存在下と比べて１８倍まで増加していた。この蛍光変化を、タグとプローブペプチドが１：１で相互作用すると仮定した理論式で解析することにより、解離定数Ｋｄ＝１７．５ｎＭと算出することができ、タグ−プローブペプチの相互作用は少なくとも抗体と同程度の結合親和性を有していることがわかった。同様に実施例２及び実施例３の解離定数Ｋｄを算出した結果、それぞれ、２４．３ｎＭ及び７５５ｎＭであった。【０１２３】
更に、前記蛍光滴定において、タグペプチドとプローブペプチドとの濃度の総和を１．０μＭに固定し、タグペプチドとプローブペプチドとの濃度の割合を変えて５０５ｎｍの蛍光強度を測定し、タグペプチドとプローブペプチドとの濃度の総和に対するタグペプチドの濃度の割合に対してプロットし、タグペプチドとプローブペプチドとが１対１で結合すると仮定した理論式により解析した。【０１２４】
図７は、実施例１のタグペプチドとプローブペプチドについてのＪｏｂ’ｓ  ｐｌｏｔを示す図である。図７において、横軸はタグペプチドとプローブペプチドの濃度の総和に対するタグペプチドの濃度の割合を示し、縦軸は５０５ｎｍにおける蛍光強度を示す。図７に示すように、タグペプチドとプローブペプチドは、１：１で相互作用していた。したがって、本実施例においては、１つのタグペプチドに含まれる２つのαヘリックスと、１つのプローブペプチドに含まれる１つのαヘリックスとが会合し、αヘリックスの３量体を形成していることが示唆された。【０１２５】
（実施例５：ＢＳＡとの比較）
実施例１のタグのポリペプチド及びプローブのポリペプチドについて、ＢＳＡとの比較を行った。
０．５μＭのプローブペプチド溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）に、タグペプチド又はＢＳＡを１〜１００当量のタグペプチド溶液又はＢＳＡ溶液を滴下し、蛍光スペクトル測定を行った。蛍光スペクトル測定は光路長１ｃｍの石英セルを使用し、Ｊａｓｃｏ  ＦＰ−７５０  ｓｐｅｃｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（日本分光社製）を用いて行った。【０１２６】
図８は、実施例５の結果を示す図である。図８において、横軸は、プローブに対するタグ又はＢＳＡの滴定量を示し、縦軸は、プローブのみの蛍光強度（蛍光波長５０５ｎｍ）を１としたときの相対的な蛍光強度の増大量を示す。図８に示すように、プローブペプチドに１００当量のＢＳＡを加えてもほとんど蛍光スペクトルは変化しないことがわかった。これより、プローブペプチドはＢＳＡと結合しないか、結合しても蛍光変化は誘起されないことが明らかとなった。【０１２７】
（実施例６：細胞破砕液中での蛍光滴定）
実施例１のタグのポリペプチド及びプローブのポリペプチドについて、細胞破砕液中で蛍光滴定を行った。
１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬのＨｅＬａ細胞の培養液１０ｍＬを遠沈管に分注し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＨｅＬａ細胞のペレットを得た。得られたＨｅＬａ細胞のペレットを１ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に分散させ、１０分間超音波処理を行なったのち、メンブレンフィルターにより不要物を濾去し、細胞破砕液を調製した。この細胞破砕液にプローブペプチドを０．５μＭになるように溶解させ、この溶液にタグペプチドが０．１〜４．０当量になるようにタグペプチド溶液を滴下し、蛍光スペクトル測定を行った。蛍光スペクトル測定は光路長１ｃｍの石英セルを使用し、Ｊａｓｃｏ  ＦＰ−７５０  ｓｐｅｃｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（日本分光社製）を用いて行った。【０１２８】
図９は、実施例６の結果を示す図である。図９において、横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。
図９に示すように、プローブペプチドはタグペプチドの添加に伴い、ＨＥＰＥＳ緩衝液中とほぼ同様の蛍光スペクトル変化を示した。なお、短波長側の蛍光強度が若干高いが、これは細胞破砕液中の成分による蛍光あるいは散乱光によるものと考えられる。【０１２９】
（実施例７：クロスリンク反応用のプローブペプチドの合成）
実施例７では、下記構造式（１４）で表されるクロスリンク反応用のプローブペプチドを合成した。なお、クロスリンク反応用の前記プローブペプチドは、実施例１のプローブペプチドのＮ末端に、クロロアセチル化されたグリシンが付加されている。
プローブ：
ClAc−{Gly}｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Dap(NBD)−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Lys−Leu−Ala｝      ・・・（１２）（配列番号：５）
〔但し、前記構造式中、ＣｌＡｃは、クロロアセチル基を意味する。〕【０１３０】
０．０５ｍｍｏｌスケールで、実施例１と同様にプローブペプチドを伸長後、Ｎ末端側にリンカーとしてグリシンを１残基伸長し、クロロ酢酸をカップリングすることにより、クロロアセチル基を導入した。前記クロロアセチル基は、システイン側鎖のチオール基とクロスリンク反応し、共有結合することが知られている。
樹脂をクロロホルムで洗浄、真空乾燥し、クロロアセチル化ペプチド−樹脂にｍ−クレゾール０．１ｍＬ、チオアニソール０．３ｍＬ、トリイソプロピルシラン０．０４ｍＬ、トリフルオロ酢酸４ｍＬを加え、室温で１時間撹拌した。反応液を濾過し、濾液を減圧下濃縮し、残渣に氷冷したジエチルエーテルを加えて沈殿を得た。沈殿を遠心分離し（３０００ｒｐｍ）、ジエチルエーテルで数回洗浄したのち真空乾燥して、粗ペプチドを得た。粗ペプチドを１０％酢酸水溶液に溶解し、Ｃ１８逆相セミ分取カラム（１０φ×２５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣにより精製し、減圧下濃縮後、凍結乾燥した。収量は１２．８ｍｇ、収率は２７．８％であった。
ＨＰＬＣ（グラジエント：Ａ／Ｂ＝７７／２３→６２／３８、３０分）
溶出時間２３．０分
［Ｍ＋Ｈ］＋＝２６６２．９（理論値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２６６２．６）【０１３１】
（実施例８：クロスリンク反応）
実施例７のクロスリンク反応用のプローブペプチドを用いて、クロスリンク反応を行った。
クロスリンク反応させる対象としては、下記構造式（８）で表されるタグのポリペプチドを用いた。なお、前記タグのポリペプチドは、実施例１と同じである。
タグ：
｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Ala−Lys−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Lys−Lys−Glu−Leu−Ala｝｛Gly−Gly−Cys−Gly−Gly｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Ala−Glu｝｛Ala−Leu−Glu−Lys−Glu−Leu−Ala｝      ・・・（８）（配列番号：１）【０１３２】
１．０μＭのタグペプチド溶液（５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ  ７．２、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ））に１．０μＭになるようにプローブペプチドを加え、２５度で反応させた。１分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後に反応溶液を１ｍＬずつサンプリングし、１０％酢酸水溶液１ｍＬを加えて反応を停止させた後、Ｃ１８逆相分析カラム（４．６φ×２５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣにより各サンプルを分析した。クロスリンク生成物はＥＳＩ−ＴＯＦＭＳで同定を行なった。反応の進行率はＨＰＬＣのピーク面積比から算出した。
ＨＰＬＣ（グラジエント：Ａ／Ｂ＝８０／２０→５０／５０、３０分）
溶出時間２９．０分（クロスリンク生成物）
［Ｍ＋Ｈ］＋＝７９３４．０（理論値［Ｍ＋Ｈ］＋＝７９３４．２）【０１３３】
図１０は、実施例８の結果を示す図である。図１０において、横軸は、プローブペプチドを添加後の経過時間を示し、縦軸は、クロスリンク反応の進行率を示す。
図１０に示すように、比較的、希薄な溶液中でもタグとプローブが共有結合を形成することが明らかとなった。反応開始から１０分で８割は反応が進行しており、迅速なクロスリンク反応が起こっているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の標的物質の検出方法は、標的物質の機能への影響を低減しつつ、標的物質の発現を任意の時間で可視化することができ、様々な励起・蛍光波長を有する蛍光色素を利用することができ、染色作業が容易であるので、様々なタンパク質についての構造や機能の研究に好適に利用することができる。したがって、本発明の標的物質の検出方法は、生体のメカニズムや疾患の研究に応用することができる。また、前記標的物質の検出方法に用いるタグ、ＤＮＡ、ベクター、プローブ及び検出キットは、前記研究用の試薬及びキットとして好適に利用することができる。
【図２】
2008123180.tif 000003
【図１】
2008123180.tif 000004
【図３Ａ】
2008123180.tif 000005
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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