【手続補正書】
【提出日】平成16年8月23日(2004.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、被検物質に対する特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体と、被検物質との凝集反応により、微量物質の検出、分析を行う分析方法に関するものである。詳しくは、固定化標識担体の拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質媒体に、その流動性を増加させるゾル化剤を接触させ、媒体層中での凝集反応を行わせる被検物質の乾式分析方法に関するものである。またこの分析方法を可能にする乾式分析要素に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
また、金コロイド凝集法を利用して、抗原物質の検出を吸光度の変化に基づき行っている方法が提案されている（特開平2−141665、特開平5−209879）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
非流動性物質(媒体）
特異結合物質を結合した標識担体を保持する媒体は、それ自体は非流動性物質であって、後述のゾル化剤によりその流動性が高まって、標識担体の凝集反応を生じさせる物質である。但しゾル化剤がない場合に、標識担体の拡散を完全に抑制し、凝集反応を全く起こさせない程度の非流動性物質である必要はない。ゾル化剤を作用させた場合に、その中に分散・保持されている標識担体が分散媒である液体中により拡散しやすくなり、凝集反応がより生じやすくなるものであればよい。すなわち、本明細書における非流動性物質の媒体とは、ゾル化剤を作用させない場合に、ゾル化剤を作用させた場合に較べて標識担体をその拡散を抑制しつつ保持する媒体であるという意味である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
ゾル化剤としてα-アミラーゼを使用する場合には、カルボキシメチル化澱粉などの不溶性澱粉誘導体を非流動性物質（媒体）と使用するのが好ましい態様である。澱粉誘導体は、標識担体を均一に分散、保持でき、またその皮膜を作り易い点で優れている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
ゾル化剤（流動化剤）
特異結合物質を結合した標識担体を保持する媒体としての非流動性物質はゾル化剤により、その流動性が高まり、標識担体の凝集反応を生じさせる。標識担体の凝集反応が、ゾル化剤を添加しない場合よりも高く生じるのであれば、非流動性物質を完全にゾル化、液化するものでなくてもよい。むしろ乾式分析を行うためには、ゾル化剤を作用させた非流動性媒体は、自己の形状を保持することができる程度の非流動性、固さを維持する方が便宜である。この意味で、本発明で言うゾル化剤とは、媒体中に分散保持された標識担体の拡散性が高められ、その凝集反応が生起しやすくなる、また促進される環境を非流動性物質（媒体）に与えるものを意味する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【実施例１】
抗へモグロビン抗体結合金コロイドの調製：
粒径50ｎｍの金コロイド溶液（BRITISH BIOCELL社）600μLに、0.2Ｍ炭酸カリウム溶液11μLを添加してｐＨ9.0とした。この金コロイド溶液611μLに、抗ヘモグロビン抗体溶液（2.5mg/mL、MEDlX BlOCHEM社製、0.02Ｍリン酸緩衝液(pH6.4)、0.02％アジ化ナトリウム含有）を蒸留水で0.1 mg/mLに調製したものを60μL添加した。この混合物を振盪撹拌後、安定化剤として10 mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.4、１％ＢＳＡ(牛血清アルブミン）、0.05％アジ化ナトリウム含有）600μLを添加した。高速遠心機にて145,000rpmで60分間遠心し、上澄みを除去した。沈澱物を10mMリン酸緩衝液（pH 6.4、１％ＢＳＡ、0.05％アジ化ナトリウム含有）100μLに再懸濁し、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド懸濁液を得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【実施例２】
抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜スライド（１）の作成
実施例１で得られた抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド700μgを含有する溶液2.5mLに、カルボキシメチル化澱粉50mgを加え撹拌し、この分散物をポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム上に塗布し、減圧乾燥して、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜（層）を設けた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
一方、布（5×5cm：50デニール相当のPET紡績糸36ゲージ編みした厚さ約250μｍのトリコット編物布地）に、α-アミラーゼ（１mg/mL、10mMグリセロりん酸緩衝液、pH 7.0）３mLを含浸し30分間静止した。その後、この布をホットメルト剤で抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜の上に接着し、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜スライド(1)を作成した。また比較対照として布にα-アミラーゼが含浸させない他は同様にして作成したスライド(2)も作成した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
【実施例３】
ヘモグロビン（Exocell社）を0.05％ポリエチレングリコールを含むＰＢＳ溶液で希釈して所定濃度のヘモグロビン液を作成し、抗ヘモグロビン抗体結合金コロイド皮膜スライド(1)、(2)に10μLを点着し、37℃で６分間インキュベートした後、ＰＥＴ支持体側から中心波長550nmと630nmの反射光学濃度を測定した。550nmにおける反射光学濃度ＯＤ550と630nmにおける反射光学濃度ＯＤ630の差を求めた。結果を図２に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
最後の本発明の好ましい態様をまとめると以下の通りである。
(1) 被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより、前記被検物質の量を分析する乾式分析方法において、
前記固定化標識担体と、その拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質との混合物に、前記非流動性物質の流動性を増加させるゾル化剤を接触させ、前記固定化標識担体と前記被検物質との凝集反応を行わせることを特徴とする乾式分析方法。
(2) 前記ゾル化剤は、被検物質と共に前記混合物に供給されることを特徴とする(1)の分析方法。
(3) 前記固定化標識担体と前記非流動性物質とが皮膜を構成し、この被膜に前記ゾル化剤と被検物質を供給して、皮膜内での凝集反応を検出することを特徴とする(1)又は(2)の分析方法。
(4) 前記固定化標識担体と前記非流動性物質とが皮膜を構成し、前記ゾル化剤を含有する水浸透性層を前記皮膜の上に重層させ、
前記被検物質を前記水浸透性層に供給して、前記ゾル化剤と共に、前記皮膜に移行させることを特徴とする(3)の分析方法。
(5) 前記標識担体がラテックス粒子である(1)〜(4)の分析方法。
(6) 前記標識担体が金属コロイドであり、凝集反応による金属コロイドの色調の変化によって、凝集反応の程度を検出することを特徴とする(1)〜(4)の分析方法。
(7) 前記金属コロイドが金コロイド又は銀コロイドである(6)の分析方法。
(8) 前記非流動性物質が糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素であることを特徴とする(1)〜(7)の分析方法。
(9) 前記非流動性物質が多糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素である事を特徴とする(1)〜(7)の分析方法。
(10) 前記多糖類が、デンプン誘導体である(9)の分析方法。
(11) 前記被検物が抗原であり、前記特異結合物質が抗体である(1)〜(9)の分析方法。
(12) (4)における皮膜と水浸透性層を備えることを特徴とする被検物質の乾式分析要素。
(13) 被検物質と、この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体との凝集反応の程度を測定することにより水性検体中の被検物質の量を分析する乾式分析要素において、
被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識担体に結合した固定化標識担体を、その拡散を抑制しつつ保持する非流動性物質媒体層と；
前記非流動性物質の流動性を高めて媒体中での凝集反応を可能とするゾル化剤を含有する水浸透性層であって、前記検体を供給したときにゾル化剤を非流動性物質媒体層へ移行させる水浸透性層；
とを備えることを特徴とする乾式分析要素。
(14) 前記標識担体がラテックス粒子である(13)の分析要素。
(15) 前記標識担体が金属コロイドであり、凝集反応による金属コロイドの色調の変化によって、凝集反応の程度を検出することができる(13)の分析要素。
(16) 前記金属コロイドが金コロイド又は銀コロイドである(15)の分析方法。
(17) 前記非流動性物質が糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素であることを特徴とする(13)〜(16)の分析要素。
(18) 前記非流動性物質が多糖類で、前記ゾル化剤が糖質分解酵素である事を特徴とする(13)〜(16)の分析要素。
(19) 前記多糖類が、デンプン誘導体である(18)の分析要素。
(20) 前記水浸透性層が、多孔性媒体からなる(13)の分析要素。