【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物またはヒトの細胞を懸濁し、生体活性分子を電流によって細胞に導入するために前記生体活性分子を溶解するための緩衝溶液であって、ｐＨ値ｐＨ７からｐＨ８の変化で、温度が２５℃において、少なくとも２０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能、および少なくとも２００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示し、２〜６ｍｍｏｌ×ｌ-1  Ｋ+濃度のカリウムイオン（Ｋ+）および１００〜１５０ｍｍｏｌ×ｌ-1  Ｎａ+濃度のナトリウムイオン（Ｎａ+）を含有する緩衝溶液。
【請求項２】
２２〜８０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示すことを特徴とする、請求項１に記載の緩衝溶液。
【請求項３】
４０〜７０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の緩衝溶液。
【請求項４】
２００〜５００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示すことを特徴とする、請求項１、２、または３に記載の緩衝溶液。
【請求項５】
２５０〜４００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示すことを特徴とする、請求項１、２、３、または４に記載の緩衝溶液。
【請求項６】
少なくとも１０ｍｍｏｌ×ｌ-1のマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）を含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項７】
１５〜２０ｍｍｏｌ×ｌ-1のマグネシウムイオンを含有することを特徴とする、請求項６に記載の緩衝溶液。
【請求項８】
塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）を含有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項９】
緩衝物質としてＨＥＰＥＳおよび／またはＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4および／またはＴｒｉｓ／ＨＣｌおよび／またはＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4を含有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１０】
追加の成分として、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、マニトール、グルコース、ラクトビオン酸ナトリウムおよび／またはペプチドが緩衝溶液中に含有されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１１】
４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１２０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）を含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１２】
４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１２０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）を含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１３】
４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１４】
４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１５】
４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、８０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８〜１２ｍＭグルコース、０．３〜０．５ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ3）2、２０〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたは３０〜５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）を含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１６】
０．１〜３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０〜２００ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．５）および／または１〜５０ｍＭマニトールおよび／または１〜５０ｍＭコハク酸ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
【請求項１７】
生体活性分子を電流によって動物またはヒトの細胞に導入する方法であって、
ｉ．ｐＨ値ｐＨ７からｐＨ８の変化で、温度が２５℃において、少なくとも２０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能、および少なくとも２００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示す緩衝溶液中に細胞を懸濁し、前記生体活性分子を溶解するステップと、
ｉｉ．前記懸濁液に電圧をかけるステップと、
を含む方法。
【請求項１８】
前記緩衝溶液が２２〜８０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝溶液が４０〜７０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示す、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝溶液が２００〜５００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示す、請求項１７、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記緩衝溶液が２５０〜４００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示す、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記緩衝溶液が少なくとも１０ｍｍｏｌ×ｌ-1のマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）を含有する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記緩衝溶液が１５〜２０ｍｍｏｌ×ｌ-1のマグネシウムイオンを含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記緩衝溶液が塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）を含有する、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記緩衝溶液が細胞の細胞質と比較して低い濃度のカリウムイオン（Ｋ+）および高い濃度のナトリウムイオン（Ｎａ+）を含有する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝溶液に、緩衝物質としてＨＥＰＥＳおよび／またはＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4および／またはＴｒｉｓ／ＨＣｌおよび／またはＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4が含有されている、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
追加の成分として、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、マニトール、グルコース、ラクトビオン酸ナトリウムおよび／またはペプチドが前記緩衝溶液中に含有されている、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１２０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）を含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１２０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）を含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０〜１６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、８０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８〜１２ｍＭグルコース、０．３〜０．５ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ3）2、２０〜２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたは３０〜５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）を含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記緩衝溶液が０．１〜３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０〜２００ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．５）および／または１〜５０ｍＭマニトールおよび／または１〜５０ｍＭコハク酸ナトリウムを含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体活性分子の細胞への導入が、２〜１０ｋＶ×ｃｍ-1の電界強度および１０〜２００μｓの持続時間ならびに少なくとも２Ａ×ｃｍ-2の電流密度で電圧パルスによって行われる、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体活性分子の細胞への導入が、２Ａ×ｃｍ-2〜１４Ａ×ｃｍ-2の電流密度および１〜１００ｍｓの持続時間で、中断なしに前記高電圧パルスに続く電流によって行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体活性分子が電流によって動物またはヒトの細胞の細胞核にトランスフェクトされる、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
核酸、タンパク質またはペプチドが、休止期にあるまたは分裂中の動物またはヒトの細胞に導入される、請求項１７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
核酸、タンパク質、またはペプチドが動物またはヒトの初代細胞に導入される、請求項１７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸がペプチド、タンパク質、または他の生体活性分子との複合体で、または混合物として存在する請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が初代ヒト血球細胞、ヒト血液の多能性前駆細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、筋細胞またはメラニン細胞である、請求項１７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
この課題は、本発明による緩衝溶液が、ｐＨ値ｐＨ７からｐＨ８の変化で、温度が２５℃において、少なくとも２０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能、および少なくとも２００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示し、２〜６ｍｍｏｌ×ｌ-1  Ｋ+濃度のカリウムイオン（Ｋ+）および１００〜１５０ｍｍｏｌ×ｌ-1  Ｎａ+濃度のナトリウムイオン（Ｎａ+）を含有することによって解決される。このような緩衝溶液によって、電気穿孔法を用いた生体活性分子の動物またはヒトの細胞への導入が、９３％までのトランスフェクション効率と同時に低い細胞死亡率で可能である。この緩衝液では、種々の細胞型、特に休止期にある細胞および分裂活性の弱い細胞をも有効にトランスフェクトしうる。さらに、緩衝溶液の使用によって、電界強度が少なくとも２０００Ｖ／ｃｍの高圧パルスの使用が可能であり、これが動物およびヒトの初代細胞へのＤＮＡ分子の直接のトランスフェクションを可能にする。この場合、本発明による緩衝液の有利な特徴の決め手となるのが、高い緩衝能と高いイオン強度との結合である。緩衝能βは、緩衝溶液のｐＨ値を１ｐＨ単位変化させるのに必要なタンパク質分解量を示す（β＝ｄｃ×ｄｐＨ-1であり、ｄｃ＝酸または塩基の添加量およびｄｐＨ＝ｐＨ値の変化である）。溶液のイオン強度Ｉは、式Ｉ＝０．５Σｃi×ｚi2（ｃi＝イオン濃度（ｍｏｌ／ｌ）、ｚi＝イオン荷電）によって計算される。本願に記載された緩衝物質のイオン強度を計算するために、プログラム「ジャバ・バッファー・カルキュレータ（Java Buffer Calculator）」（トゥイガー（Twigger）とベイノン（Beynon）、１９９８年）を使用した。この枠内で、緩衝液を種々の細胞型および要件に適した組成で最適化することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明による緩衝液は、細胞内Ｎａ+／Ｋ+比に適合しておらず、これに関してはむしろ「細胞外」の比が示されている。しかし、これは意外にも細胞に対する悪影響を示さず、トランスフェクション効率および細胞生存率の明らかな上昇を来たす。