(57)【要約】本発明は、ミトコンドリア転写因子Ａ（ＴＦＡＭ）又はそれをコードする遺伝子を含む、哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療用医薬組成物を提供する。また、本発明は、当該医薬組成物を哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア転写因子Ａ若しくはその変異体、又はミトコンドリア転写因子Ａ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはミトコンドリア転写因子Ａの発現を誘導し得る化合物を含む、記憶障害の抑制用医薬組成物。
【請求項２】
ミトコンドリア転写因子Ａ若しくはその変異体、又はミトコンドリア転写因子Ａ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはミトコンドリア転写因子Ａの発現を誘導し得る化合物を含む、記憶障害の治療用医薬組成物。
【請求項３】
記憶障害が記憶力低下である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
記憶力低下が加齢に伴うものである、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ミトコンドリア転写因子Ａ若しくはその変異体、又はミトコンドリア転写因子Ａ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはミトコンドリア転写因子Ａの発現を誘導し得る化合物を含む、生体組織内の酸化ストレスの抑制用医薬組成物。
【請求項６】
酸化ストレスが、ミトコンドリア内で産生された活性酸素に由来するものである、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
生体組織が脳組織又は心筋組織である、請求項５又は６記載の組成物。
【請求項８】
請求項１記載の組成物を哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の記憶障害抑制方法。
【請求項９】
請求項２記載の組成物を、記憶障害を有する哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の記憶障害の治療方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物が記憶障害患者である、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物の脳細胞内のミトコンドリアにおいて、ミトコンドリア転写因子Ａ又はその変異体を過剰導入する又は過剰発現させる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
記憶障害が記憶力低下である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
記憶力低下が加齢に伴うものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項５記載の組成物を哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の生体組織内の酸化ストレス抑制方法。
【請求項１５】
酸化ストレスが、ミトコンドリア内で産生された活性酸素に由来するものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生体組織が脳組織又は心筋組織である、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
被験対象となる哺乳動物から採取された組織又は体液中に含まれるミトコンドリア転写因子Ａを検出し、得られた検出結果を指標として、哺乳動物の記憶障害を診断する方法。
【請求項１８】
記憶障害が記憶力低下である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
記憶力低下が加齢に伴うものである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
被験対象となる哺乳動物から採取された組織又は体液中に含まれるミトコンドリア転写因子Ａを検出し、得られた検出結果を指標として、哺乳動物の生体組織内の酸化ストレスを診断する方法。
【請求項２１】
酸化ストレスが、ミトコンドリア内で産生された活性酸素に由来するものである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
生体組織が脳組織又は心筋組織である、請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
検出が、ミトコンドリア転写因子Ａに対する抗体を用いて行われるものである、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
検出が、ＥＬＩＳＡにより行われるものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項２記載の組成物を含むことを特徴とする、記憶障害の治療用キット。
【請求項２６】
ミトコンドリア転写因子Ａに対する抗体を含む、記憶障害の診断用キット。
【請求項２７】
記憶障害が記憶力低下である、請求項２５又は２６記載のキット。
【請求項２８】
記憶力低下が加齢に伴うものである、請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
ミトコンドリア転写因子Ａに対する抗体を含む、生体組織内の酸化ストレスの診断用キット
【請求項３０】
酸化ストレスが、ミトコンドリア内で産生された活性酸素に由来するものである、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
生体組織が脳組織又は心筋組織である、請求項２９又は３０記載のキット。
【請求項３２】
ミトコンドリア転写因子Ａ若しくはその変異体をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３３】
記憶力改善モデル動物となるものである、請求項３２記載の非ヒト動物。
【請求項３４】
非ヒト動物が齧歯類動物である、請求項３２又は３３記載の非ヒト動物。
【請求項３５】
齧歯類動物がマウスである、請求項３４記載の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア転写因子Ａ（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａ：ＴＦＡＭ）を含む哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療用医薬組成物、及び当該医薬組成物を用いた哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、その内膜に存在する呼吸鎖において酸素と水素を反応させ、ＡＴＰを合成し、生物のエネルギーを産生する細胞内小器官である。同時に、その電子伝達系では、電子のリークが生じる結果、数％の酸素からスーパーオキサイド（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）が産生される。したがって、何らかの理由により電子伝達系の機能が障害された場合は、エネルギー産生が低下するのみならず、より多くのｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅが産生され、組織障害、ミトコンドリア内に存在するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の障害をもたらし、さらにその結果として、さらなるｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅを産生するという悪循環を生じることになる。したがって、ｍｔＤＮＡを質的及び量的に保つことが、ミトコンドリア由来の酸化ストレスが関与しているとされる種々の慢性疾患の、新たな治療ターゲットとなる可能性が示唆されている。
ｍｔＤＮＡは、電子伝達系に必要なサブユニットの一部をコードしている、１６．５ｋｂｐの環状二本鎖ＤＮＡである。近年、ミトコンドリアに豊富に存在するタンパク質であるミトコンドリア転写因子Ａ（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａ：ＴＦＡＭ）が、そのｍｔＤＮＡの転写酵素であると同時に、その維持に不可欠であることが明らかとなり、ミトコンドリアの機能維持に極めて重要な役割を果たしていることが分かってきた。しかしながら、その詳細については明らかではない。
【発明の開示】
【０００３】
生体内のレドックス（酸化還元）制御には、その余剰な活性酸素産生源へのアプローチが不可欠である。そのなかで、ＴＦＡＭは、ｍｔＤＮＡの維持に重要であり、ミトコンドリア由来の酸化ストレスを制御するｋｅｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅである可能性がある。しかしながら、その制御機構に関しては、未だ不明な点が多く、また、今後、ＴＦＡＭの役割もその全貌が明らかになることで、多くの慢性疾患の治療への発展が期待される。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、生体内におけるＴＦＡＭの新規役割を明らかにし、これを利用して、哺乳動物の酸化ストレスに起因する疾患若しくは障害の抑制又は治療方法、及び哺乳動物の生態組織内の酸化ストレスの抑制方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、本発明者は、ＴＦＡＭを生体内で過剰発現することにより、哺乳動物の加齢による記憶能力低下を抑制し得ることや、生体組織内の酸化ストレスを抑制し得ることを見出した。そして、これを、哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療方法、あるいは生体組織内の酸化ストレスの抑制方法に利用することに想到し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物を含む、記憶障害の抑制用医薬組成物。
（２）ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物を含む、記憶障害の治療用医薬組成物。
（３）ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物を含む、生体組織内の酸化ストレスの抑制用医薬組成物。
本発明においては、記憶障害の抑制用又は治療用、あるいは生体組織内の酸化ストレスの抑制用の、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物も提供され得る。
（４）上記（１）の組成物を哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の記憶障害抑制方法。
（５）上記（２）の組成物を、記憶障害を有する哺乳動物に投与することを特徴とする、記憶障害の治療方法。
上記（４）及び（５）の方法において、前記哺乳動物としては、例えば記憶障害患者が挙げられる。
上記（４）及び（５）の方法は、例えば、前記哺乳動物の脳細胞内のミトコンドリアにおいて、ＴＦＡＭ又はその変異体を過剰導入する又は過剰発現させる方法であることが望ましい。
本発明においては、哺乳動物の記憶障害抑制用の薬剤を製造するための上記（１）の組成物（特に、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子）の使用、及び、記憶障害治療用の薬剤を製造するための上記（２）の組成物（特に、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子）の使用も提供され得る。
（６）上記（３）の組成物を哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物の生体組織内の酸化ストレス抑制方法。
本発明においては、哺乳動物の生体組織内の酸化ストレス抑制用の薬剤を製造するための上記（３）の組成物（特に、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子）の使用も提供され得る。
（７）被験対象となる哺乳動物から採取された組織又は体液中に含まれるＴＦＡＭを検出し、得られた検出結果を指標として、哺乳動物の記憶障害を診断する方法。
（８）被験対象となる哺乳動物から採取された組織又は体液中に含まれるＴＦＡＭを検出し、得られた検出結果を指標として、哺乳動物の生体組織内の酸化ストレスを診断する方法。
上記（７）及び（８）の方法において、ＴＦＡＭの検出は、例えばＴＦＡＭに対する抗体（特に、抗ＴＦＡＭモノクローナル抗体）を用いて行うことができ、具体的には、ＥＬＩＳＡにより行うことができる。
本発明においては、哺乳動物の記憶障害の診断用の薬剤、又は哺乳動物の生体組織内の酸化ストレスの診断用の薬剤を製造するための、ＴＦＡＭに対する抗体の使用も提供され得る。
（９）上記（２）の組成物を含むことを特徴とする、記憶障害の治療用キット
（１０）ＴＦＡＭに対する抗体を含む、記憶障害の診断用キット。
（１１）ＴＦＡＭに対する抗体を含む、生体組織内の酸化ストレスの診断用キット。
（１２）ＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
本発明の非ヒト動物は、例えば、齧歯類動物（特にマウス）であり、記憶力改善モデル動物として用いることができる。
上述した本発明において、記憶障害としては、例えば記憶力低下が挙げられ、記憶力低下としては、例えば加齢に伴う記憶力低下が挙げられる。また、生体組織内の酸化ストレスとしては、例えば、ミトコンドリア内で産生された活性酸素に由来するものが挙げられ、生体組織としては、例えば脳組織又は心筋組織（特に脳組織）が挙げられる。
このように、ＴＦＡＭを、生体内、特に脳組織において過剰投与する又は過剰発現させることにより、ミトコンドリア由来の活性酸素を制御することで、脳組織の酸化ストレスを抑制することができる。そして、哺乳動物の記憶障害、特に加齢に伴う記憶能力低下を抑制することができ、抗加齢効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１において、ａは、ヒトＴＦＡＭトランスジェニックマウスの脳組織におけるヒトＴＦＡＭ及び内因性ＴＦＡＭの発現の様子を示すウエスタンブロッティング結果であり（ＴＧ：ＴＦＡＭトランスジェニックマウス、ＷＴ：野生型マウス）、
ｂは、脳組織におけるＴＢＡＲＳ（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ；チオバルビツール酸反応性物質）の測定結果を示すグラフである（Ｙｏｕｎｇ：若齢、Ｏｌｄ：老齢（加齢）、ＴＧ：ＴＦＡＭトランスジェニックマウス、ＷＴ：野生型マウス）。
図２は、脳組織におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体（複合体Ｉ〜ＩＶ）の活性の測定結果を示すグラフである（Ｙｏｕｎｇ：若齢、Ｏｌｄ：老齢、ＴＧ：ＴＦＡＭトランスジェニックマウス、ＷＴ：野生型マウス）。
図３は、水迷路における空間記憶力の測定結果を示すグラフである（Ｙｏｕｎｇ：若齢、Ｏｌｄ：老齢、ＴＧ：ＴＦＡＭトランスジェニックマウス、ＷＴ：野生型マウス）。
図４において、ａは、高頻度刺激（２５，５０，１００ヘルツ（Ｈｚ））に伴うｐＥＰＳＰの増大率を示すグラフであり（＊は両群間に有意差（Ｐ＜０．０５，ｔ−検定）があることを示している。ＷＴ：野生型マウス，ＴＧ：ＴＦＡＭトランスジェニックマウス，Ｙｏｕｎｇ：若齢，Ｏｌｄ：老齢）、
ｂは、老齢の野生型（ＷＴ）及びＴＦＡＭトランスジェニックマウス（ＴＧ）から作成した海馬スライス標本下ＣＡ１野より記録されるｐＥＰＳＰの高頻度（２５，５０，１００Ｈｚ）刺激前及び刺激後の波形であり、
ｃは、老齢の野生型（白丸）ならびにＴＦＡＭトランスジェニックマウス（黒丸）から作成した海馬スライス標本下ＣＡ１野より記録されるｐＥＰＳＰのスロープの高頻度刺激前（２５，５０，１００Ｈｚ）に伴う変化を示すグラフ（高頻度刺激前のｐＥＰＳＰのスロープを１００とした相対値で表示）である。
図５は、老齢の野生型（ＷＴ）及びＴＦＡＭトランスジェニックマウス（ＴＧ）から作成した海馬スライス標本における、リポフスチン顆粒の沈着の様子を示す写真である。
図６は、加齢に伴う脳の酸化ストレス低下に対するＴＦＡＭの効果を示す図である。
ａ：ヒトＴＦＡＭトランスジェニックマウスの脳組織におけるヒトＴＦＡＭ（ｈ−ＴＦＡＭ）及び内因性ＴＦＡＭ（ｍ−ＴＦＡＭ）の発現の様子を示すウエスタンブロッティングの結果（若齢の野生型マウス及びトランスジェニックマウスの脳抽出可溶性成分を用いた。ＴＧ：ＴＦＡＭトランスジェニックマウス、ＷＴ：野生型マウス）。
ｂ：ｈ−ＴＦＡＭの海馬ＣＡ１領域における組織免疫染色の結果（スケール＝５０μｍ）。
ｃ：脳における脂質過酸化の指標であるＴＢＡＲＳの測定結果（＊：ｐ＜０．０５）。
ｄ：脳組織におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体（複合体Ｉ〜ＩＶ）の活性の測定結果（＊：ｐ＜０．０５ｖｓ老齢野生型マウス、†：ｐ＜０．０５ｖｓ老齢トランスジェニックマウス）。
図７は、ＴＦＡＭ過剰発現マウスにおける、加齢による記憶力低下の抑制効果に関する図である。
ａ，ｂ：若齢（ａ）及び老齢（ｂ）マウスにおける水迷路でのエラー数を示す図（Ｙｏｕｎｇ：若齢、Ａｇｅｄ：老齢、ＴＧ：ＴＦＡＭトランスジェニックマウス、ＷＴ：野生型マウス）。４回のテストの後に、３０分間の休憩をはさみ、その後５回目のテストを行い、６匹のマウスで比較した結果である（＊：ｐ＜０．０５）。
ｃ，ｄ：Ｓｃｈａｆｆｅｒ側枝ＣＡ−１経路における加齢依存性長期増強に対するＴＦＡＭ過剰発現の効果を示す図（ＥＰＳＰスロープ（ｃ）、頻度刺激（２５，５０，１００Ｈｚ）に伴うＥＰＳＰの増大率（ｄ））。＊は両群間に有意差（Ｐ＜０．０５，ｔ−検定）があることを示している。
図８は、海馬のシナプス伝達におけるＴＦＡＭの過剰発現の効果を示す図である。
ａ：老齢の野生型及び過剰発現マウスから作成した海馬スライス標本下ＣＡ１野において、種々の刺激強度（５〜４０Ｖ）によって誘発された興奮性シナプス後電位（ｆｉｅｌｄ  ＥＰＳＰ：ｆＥＰＳＰ）を積算トレースした図。
ｂ〜ｄ：老齢の野生型及び過剰発現マウスのＳｃｈａｆｆｅｒ側枝−ＣＡ１シナプスの入出力関係を示す図であり、ｂはｆＥＰＳＰの傾きと刺激強度の関係、ｃは刺激強度に対する線維斉射（ｆｉｂｅｒ  ｖｏｌｌｅｙ）の関係、ｄは平均化したｆＥＰＳＰ傾きと繊維斉射強度の関係を示す。
図９は、ＴＦＡＭ過剰発現による、海馬領域におけるＰａｉｒｅｄ−Ｐｕｌｓｅ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎへの効果を示す図である。
ａ：老齢の野生型及び過剰発現マウスから作成した海馬スライス標本に、放線状層（Ｓｔｒａｔｕｍ  ｒａｄｉａｔｕｍ）のＰａｉｒｅｄ−Ｐｕｌｓｅ刺激を加えた場合のｆＥＰＳＰトレースの図。
ｂ：種々の異なった間隔での刺激時における、１回目の反応に対する２回目の反応の相対値を表した図（ＣＡ１野より記録されるｆＥＰＳＰの高頻度（２５，５０，１００Ｈｚ）刺激前及び刺激後の波形）。
図１０は、ＴＦＡＭ過剰発現による、老化マウスの海馬のＲＯＳ由来の細胞障害及び炎症の改善効果を示す図である。
ａ：老化マウスの海馬ＣＡ１領域における８−ｏｘｏ−ｄＧ及びＨＮＥ免疫染色（スケール＝５０μｍ）。
ｂ：老化野生型マウスの海馬ＣＡ１サブフィールドで酸化ストレスマーカーとしての８−ｏｘｏ−ｄＧ（赤）、ＨＮＥ（緑）、及びグリア細胞（Ｉｂａ１，Ｆ４／８０；ミクログリア、ＧＦＡＰ；星状細胞）の蛍光免疫組織染色（スケール＝３０μｍ）。
ｃ：老化野生型及び過剰発現マウスの海馬ＣＡ１サブフィールドでＩＬ−１β（赤）お及びＩｂａ１（緑）の局在化を示す蛍光免疫組織染色（老齢マウス及びＬＰＳ投与された老化トランスジェニックマウスの海馬ＣＡ１サブフィールドのＩｂａ１（緑：ミクログリア）は、ＩＬ−１β陽性細胞と共染色を示す。スケール＝５０μｍ（左コラム），１０μｍ（右コラム））。
ｄ：若齢及び老齢の野生型及びトランスジェニックマウス、及びＬＰＳ投与したトランスジェニックマウスの、海馬ＣＡ１サブフィールドにおけるＩＬ−１βの平均蛍光強度（†：Ｐ＜０．０５ｖｓ老齢野生型マウス、‡：Ｐ＜０．０５ｖｓ老齢トランスジェニックマウス）。
図１１は、ＬＰＳ注入後のマウス海馬におけるＩＬ−１β発現を示す図である。
ａ：ＩＬ−１β発現の解析結果（老齢マウスにＬＰＳ（０．３３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、４時間後に免疫組織染色を行った）。
ｂ：ＩＬ−１βの発現レベルの平均（＊：Ｐ＜０．０５）。
図１２は、テトラサイクリンシステムによるＴＦＡＭ過剰発現Ｈｅｌａ細胞における、ロテノン惹起性細胞内ＲＯＳの生成及びＮＦ−κＢの核移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を示す図である。
ａ：ロテノンによる細胞内ＲＯＳの生成（デオキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ：ＤＣ）（ＤＣ＋；ＴＦＡＭ１倍、ＤＣ−；ＴＦＡＭ２倍）によりＴＦＡＭが発現調節されたＨｅｌａ細胞に、ＲＯＳ感受性蛍光色素であるＤＨＥを使用することで、蛍光免疫染色を行い評価した。スケール＝２０μｍ）。
ｂ：エタノール又はロテノンによる処置後のＤＨＥの酸化（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
ｃ：ＮＦ−κＢの蛍光免疫染色（ＮＦ−κＢ（緑）及び核を示すプロピウムイオダイド（ｐｒｏｐｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ：ＰＩ）。矢印はＮＦ−κＢがｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎを生じたＨｅｌａ細胞を指す。スケール＝５０μｍ）。
ｄ：ＮＦ−κＢの核移行陽性細胞の平均値（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
図１３は、テトラサイクリンシステムによりヒトＴＦＡＭのタンパク質発現が制御されたＨｅｌａ細胞に関する図である。
ａ：ヒトＴＦＡＭのウエスタンブロット。
ｂ：ヒトＴＦＡＭの発現レベルの比較（アクチンの発現レベルとの比較）。
図１４は、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ欠失変異タンパク質の調製：ＧＳＴ−ＴＦＡＭ欠失変異タンパク質（４３−１０６，７１−１６０，１３６−２２２，１９２−２４６）はＧＳＨセファロースを用いてＥ．ｃｏｌｉ溶解液より精製した。精製産物は１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ染色により確認した。
図１５は、抗ＴＦＡＭモノクローナル抗体エピトープの評価の結果を示す図である。
図１６は、抗ＴＦＡＭポリクローナル抗体エピトープの評価の結果を示す図である。
図１７は、抗ＴＦＡＭモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの培養上清を用いた免疫沈降反応：３種のハイブリドーマクローンの培養上清をプロテインＧセファロースで固定化した。洗浄後、固定化した抗体をリコンビナントＴＦＡＭタンパク質（０．５，１．５μｇ／ｍＬ，２００μＬ）を用いて免疫沈降反応した。Ａは、ウサギ抗ＴＦＡＭポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット像、Ｂは、当該ウエスタンブロット像のＣＢＢ染色像を示す図である。
図１８は、抗ＴＦＡＭモノクローナル抗体を産生する１４種のハイブリドーマクローンの培養上清を用いた免疫沈降反応：Ａは、ウサギ抗ＴＦＡＭポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット像、Ｂは、当該ウエスタンブロット像のＣＢＢ染色像を示す図である。
図１９は、抗ＴＦＡＭモノクローナル抗体を産生する１４種のハイブリドーマクローンの培養上清を用いた免疫沈降反応：Ａは、ウサギ抗ＴＦＡＭポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット像、Ｂは、当該ウエスタンブロット像のＣＢＢ染色像を示す図である。
図２０は、Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ発現ベクターの構成を示す概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願第６０／８６９，６０３号明細書、及び米国仮出願第６０／９９９，４３２号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
ミトコンドリア転写因子Ａ（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａ：ＴＦＡＭ）は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の維持及びコピー数の調節に重要な役割を果たしているものである。ＴＦＡＭは、核でコードされたタンパク質であり、ｍｔＤＮＡのＬＳＰ及びＨＳＰの上流に結合して、ｍｔＤＮＡの転写を促進する（Ｐａｒｉｓｉ，Ｍ．Ａ．＆  Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２，９６５−９（１９９１）．）。本発明者らは、βアクチンをプロモーターとして、ヒトＴＦＡＭを過剰発現したマウスにおいて、ｍｔＤＮＡのコピー数が増加し、ミトコンドリア電子伝達系異常が抑制されることをすでに示してきた（Ｉｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２，６８３−９０（２００５）．）。ミトコンドリア電子伝達系の改善は、通常のミトコンドリア電子伝達系から副産物として発生する活性酸素を減少させることで、慢性リモデリング過程を抑制すると考えられる。脳は、多くの酸素を必要とし、酸化ストレスが増大し、ｍｔＤＮＡの変異や脂質過酸化の増大を生じることが予想される。加齢による運動及び認知能力の低下には、酸化ストレスと炎症が原因であることが示唆されていることから（Ｓｈｕｋｉｔｔ−Ｈａｌｅ，Ｂ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｏｎ  ｐｓｙｃｈｏｍｏｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．ＡＧＥ  ２２，９−１７（１９９９）．）、本発明においては、脳の機能障害（例えば記憶力低下、特に加齢による記憶力低下）に対するＴＦＡＭの効果に着目した。
ｍｔＤＮＡは、活性酸素（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）による障害に対して脆弱である。加齢に伴って、脳を含めた多くの組織において、ｍｔＤＮＡの変異が蓄積し、ミトコンドリア呼吸鎖の異常を招き、その結果、さらなるＲＯＳの産生が引き起こされる。従って、加齢による記憶力の低下は、ミトコンドリア呼吸鎖由来の酸化ストレスによってひきおこされることが示唆されている（Ｌｉｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ａｈｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｌ．Ｍ．＆  Ｂｅａｌ，Ｍ．Ｆ．Ｈｉｇｈ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｔＤＮＡ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｒａｉｎ．
Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１，１３３−４５（２００２）．；Ｃｏｒｒａｌ−Ｄｅｂｒｉｎｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ：ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｇｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２，３２４−９（１９９２）．）。ＴＦＡＭは、もともとｍｔＤＮＡの転写因子として同定されたが、近年、ｍｔＤＮＡの複製だけでなく、その維持においても、重要な役割を果たしていることが示されている。
本発明者は、マウスにヒトＴＦＡＭを過剰発現させると、加齢に伴うミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉ及びＩＶの活性低下、ならびに記憶力低下、海馬領域での長期増強作用（ＬＴＰ）を抑制することを明らかにした。さらに、リポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）の全身投与によって、ＩＬ−１βが活性化されるが、このＴＦＡＭ過剰発現マウスにおいては、海馬、特にマイクログリアにおけるＩＬ−１βの発現が抑制されていることが明らかとなった。
さらに、Ｈｅｌａ細胞において、ミトコンドリア複合体Ｉ（ｍｉｔｏｃｏｎｄｏｒｉａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ）の阻害剤であるロテノン（Ｒｏｔｅｎｏｎｅ）で処理すると、ＲＯＳの産生とそれに引き続くＮＦ−κＢの核内への移行が観察されるが、ＴＦＡＭを過剰発現させたＨｅｌａ細胞では、それらが抑制された。以上のことから、ＴＦＡＭは、加齢に伴うミトコンドリアの機能低下及びマイクログリアにおける酸化ストレスを抑制することが明らかとなった。ＴＦＡＭはミトコンドリア機能の維持において重要な役割を果たすものであり、脳の機能低下、特に加齢による脳の機能低下を抑制又は治療する新たなターゲットになる可能性があると考えられた。
２．ミトコンドリア転写因子Ａ（ＴＦＡＭ）
（１）転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）としてのＴＦＡＭ
ＴＦＡＭは、ｍｔＤＮＡの転写因子としてＦｉｓｈｅｒらによって最初にクローニングされたタンパク質である（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ  Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８：３４９６−３５０９，１９８８．）。ＴＦＡＭは、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂ（ＴＦＢ１Ｍ，ＴＦＢ２Ｍ）及びｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＯＬＲＭＴ）と共に、ｍｔＤＮＡの転写に働くことが知られている。３種類の転写因子は、いずれも核ＤＮＡでコードされ、特に、ＴＦＡＭ（以前はｍｔＴＦ−１又はｍｔＴＦＡとも称されていた）は、ミトコンドリアの転写及び複製だけでなく、ｍｔＤＮＡの維持にも重要であることが明らかとなってきた。
（２）核様体（Ｎｕｃｌｅｏｉｄ）としてのＴＦＡＭ
ｍｔＤＮＡはこれまで、核ＤＮＡとは異なり、ヒストン構造を有さず、そのため時として“裸の遺伝子”とも考えられ、それが、ストレスに対して脆弱である理由とも理解されていた。しかし、ＴＦＡＭは、２つのＨＭＧ  ｂｏｘを有するＨＭＧ（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ）タンパク質であり、ＤＮＡの配列によらずＤＮＡに結合する特性を有する。しかも、ｍｔＤＮＡあたり、約９００分子のＴＦＡＭが存在すると考えられている。ＴＦＡＭは、ｍｔＤＮＡのプロモーター領域には、より強い親和性を有することが明らかとなっているが、正常の状態では、その量的関係からｍｔＤＮＡは、ＴＦＡＭに全体が包まれていると考えられる。
ｓｉＲＮＡにより、Ｈｅｌａ細胞を用いてＴＦＡＭの発現を減少させると、ＴＦＡＭタンパク質の減少に比例してｍｔＤＮＡ量も減少する。また、その後、数日以内にＴＦＡＭは増加に転じるが、これもｍｔＤＮＡはＴＦＡＭ同様の増加を示す（Ｋａｎｋｉ，Ｔ．，Ｏｈｇａｋｉ，Ｋ．，Ｇａｓｐａｒｉ，Ｍ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｆｕｋｕｏｈ，Ａ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｈａｍａｓａｋｉ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｋａｎｇ，Ｄ．Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ｉｎ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２４：９８２３−９８３４，２００４．）。つまり、ｍｔＤＮＡは、ＴＦＡＭのＨＭＧドメインと結合することで安定化し、維持されていると考えられる。
（３）ＴＦＡＭ欠損マウス及びＴＦＡＭ過剰発現マウス
ＴＦＡＭそのものの機能を調べるために、遺伝子改変マウスを用いた研究が報告されている。Ｌａｒｓｓｏｎらは、ＴＦＡＭｌｏｘＰを使い、ＴＦＡＭノックアウトマウスをそれぞれ作製した（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｏｌｄｆｏｒｓ，Ａ．，Ｒｕｓｔｉｎ，Ｐ．，Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ，Ｍ．，Ｂａｒｓｈ，Ｇ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｍｔＤＮＡ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，１８：２３１−２３６，１９９８．）。ＴＦＡＭ（−／−）では、ｍｔＤＮＡの完全な消失が生じ、胎生８．５〜１０．５日で死亡し、それらのミトコンドリアは、サイズの拡大、異常クリスタを有し、サブユニットの全てが核でコードされたコハク酸脱水素酵素（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＳＤＨ））活性は保たれていたが、ｍｔＤＮＡでコードされたチトクローム  ｃ酸化酵素（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ（ＣＯＸ））活性は消失していた。
また、骨格筋及び心筋特異的にＴＦＡＭ遺伝子をノックアウトしたマウスでは、拡張型心筋症様の病態を呈して、２０日ほどで死に至る。このマウスは、ＱＴ延長及び房室伝導障害を伴い、心臓でのｍｔＤＮＡのコピー数は２６％まで低下していることが報告されている。電子伝達系複合体のＩ及びＩＶは低下を示すが、ＩＩは保たれており、ＣＯＸで心筋組織を免疫染色すると、一部の心筋ではＣＯＸの欠落が生じ、モザイク用のパターンを示すことから、ＴＦＡＭは心不全の形成及び進展過程において何らかの役割を持つと考えられる。マウスを用いた心筋梗塞後の不全心筋モデルでは、サザンブロットによる心筋ｍｔＤＮＡのコピー数の減少、ＴＦＡＭの減少、及びミトコンドリア電子伝達系酵素活性の低下を認めることが知られている（Ｉｄｅ，Ｔ．，Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｋｉｎｕｇａｗａ，Ｓ．，Ｕｔｓｕｍｉ，Ｈ．，Ｋａｎｇ，Ｄ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｎ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．，Ａｒｉｍｕｒａ，Ｋ．，Ｅｇａｓｈｉｒａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ａ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，８５：３５７−３６３，１９９９．）。そこで、アクチンをプロモーターにＴＦＡＭを過剰発現させたマウスを作製すると、ＴＦＡＭの発現とともに、約４０％のｍｔＤＮＡの増加を認めるが、このトランスジェニックマウスに心筋梗塞を引き起こし、心筋リモデリングを観察すると、心筋梗塞後もｍｔＤＮＡコピー数及びミトコンドリア電子伝達系酵素活性が維持され、心筋リモデリングを改善、さらにはその生存率を増加させることが明らかとなった。つまり、心筋リモデリングの過程でｍｔＤＮＡの低下、ミトコンドリア機能の低下が関与しているのに対し、ＴＦＡＭは、ｍｔＤＮＡを維持し、心筋リモデリングを抑制する上で重要な働きをするものであると言える。
そのほか、膵臓におけるＴＦＡＭの役割も注目されており、膵臓β細胞特異的にＴＦＡＭ遺伝子を欠損させたマウスでは、生後７日目でほとんどのβ細胞のＴＦＡＭが消失し、５週齢では、高血糖となって糖尿病を呈し、その後はβ細胞そのものの減少をも伴い、いずれも、糖尿病を呈することが明らかとなっている（Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｒａｆｆ，Ｃ．，Ｏｌｄｆｏｒｓ，Ａ．，Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，Ｐ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２６：３３６−３４０，２０００．）。
（４）ＴＦＡＭの発現及び制御と核−ミトコンドリア間の相互作用
ヒトのＴＦＡＭは２５ｋＤの核ゲノムにコードされたタンパク質であり、２０４アミノ酸で構成される。
アミノ末端に第１のｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ（ＨＭＧ）ドメイン、リンカー領域、そして第２のＨＭＧドメイン、転写に不可欠な２５アミノ酸を有するカルボキシ末端領域を有する。ＴＦＡＭの発現は、トランス作動性タンパク質である主要な２つの転写因子、並びに、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＮＲＦ）−１及び２によって調節されている。さらに、ＴＦＡＭプロモーターのＮＲＦ−１転写機能は、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−γ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１ａ（ＰＧＣ−１）によって活性化される。
以前より、ミトコンドリアと核におけるコミュニケーションは、エネルギーのホメオスターシスを維持するために必要不可欠であることが示唆されていた（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，２９：１０９−１１９，１９９７．）。過剰な活性酸素によって、ｍｔＤＮＡが減少し、電子伝達系の機能障害が生じる可能性があるが、その刺激によってどのような機構で核ＤＮＡへ情報が伝わり、ストレスに対抗するための転写が開始されるのかは長い間不明であったが、Ｗｕらは、細胞内に増加したｃＡＭＰがＰＣＧ−１の発現を増加させ、それによってからＮＲＦ−１及び２の発現が誘導され、それらに制御されたミトコンドリア電子伝達系酵素及びＴＦＡＭの発現が促進されるメカニズムを明らかにした（Ｗｕ，Ｚ．，Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ａｄｅｌｍａｎｔ，Ｇ．，Ｍｏｏｔｈａ，Ｖ．，Ｔｒｏｙ，Ａ．，Ｃｉｎｔｉ，Ｓ．，Ｌｏｗｅｌｌ，Ｂ．，Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＰＧＣ−１．Ｃｅｌｌ，９８：１１５−１２４，１９９９．）。また、Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉらは、Ｈ４ＩＩＥラットｈｅｐａｔｏｍａ細胞に、ｔ−ＢＯＯＨを用いた酸化ストレス刺激を与えると、ＮＲＦ−１のリン酸化を生じ、ＴＦＡＭが増加することを示している。さらに、その反応には、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化を介してＮＲＦの核へのｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎが引き金になっていることが示され、比較的穏やかな酸化ストレスに際しての核からミトコンドリアへの制御機構が次第に明らかとなりつつある（Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｕｌｉｍａｎ，Ｈ．Ｂ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｄｏｘ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：３２４−３３３，２００６．）。
ＮＲＦ−１は、電子伝達系の各複合体のサブユニットの大部分を制御し、さらには、ＴＦＡＭだけでなく、ＴＦＢ１Ｍ、ＴＦＢ２Ｍ及びＰＯＬＲＭＴといったｍｔＤＮＡの転写制御因子の調節も行っていることが明らかとなり、最近のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を用いた研究では、これらの遺伝子のプロモーターは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮＲＦ−１に占拠されていることも報告されている（Ｃａｍ，Ｈ．，Ｂａｌｃｉｕｎａｉｔｅ，Ｅ．，Ｂｌａｉｓ，Ａ．，Ｓｐｅｋｔｏｒ，Ａ．，Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．，Ｋｌｕｇｅｒ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｙｎｌａｃｈｔ，Ｂ．Ｄ．Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｌｉｎｋｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，１６：３９９−４１１，２００４．）。
しかしながら、ＰＧＣ−１がｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒとしてターゲットとされているＮＲＦは、電子伝達系複合体サブユニットやＴＦＡＭ以外に、数百の他の全くミトコンドリア呼吸鎖に関係していない遺伝子発現にも関与していることから、ＴＦＡＭを特異的に増加させる機構は、未だ不明である。ＴＦＡＭ欠損マウスは、胎生８．５日〜１０．５日までは生存するのに対し、ＮＲＦ−１欠損マウスは、胎生初期３．５日〜６．５日しか生き延びることはできない。その理由として、ＮＲＦ−１がｍｔＤＮＡだけではなく、細胞の成長や発達に不可欠である遺伝子をターゲットとしているからであると考えられる。
（５）本発明において使用されるＴＦＡＭ
本発明において使用されるＴＦＡＭは、ＴＦＡＭタンパク質（成熟タンパク質）そのもののほか、ＴＦＡＭタンパク質前駆体（例えば、シグナルペプチド、特にミトコンドリアへの移行用シグナルペプチドが付いたもの等）やＴＦＡＭタンパク質の一部（例えば、トランケート体、その他各種ペプチド断片等）等も全て含む意味である。
本発明において使用されるＴＦＡＭとしては、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＧ２８５８１、ＡＡＩ０４４８３、ＮＰ＿００３１９２で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。これらのＴＦＡＭの塩基配列及びアミノ酸配列を以下の表に示す。
2008072781.tif 000002
ここで、配列番号２、４及び６に示される各アミノ酸配列からなるタンパク質は、ミトコンドリアへの移行シグナルペプチドを含む、ＴＦＡＭタンパク質前駆体に相当するものである。これら各アミノ酸配列においては、第１番目〜第４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列が、ミトコンドリアへの移行シグナルペプチドに相当する部分であり、第４３番目以降のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列が、ＴＦＡＭの成熟タンパク質に相当する部分である。なお、当該シグナルペプチドとしては、配列番号２、４及び６に示される各アミノ酸配列中の第７番目〜第４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるものであってもよい（特にヒト由来のＴＦＡＭの場合）。
また、本発明において使用されるＴＦＡＭとしては、上記アミノ酸配列を含むタンパク質のほか、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつミトコンドリア転写活性を有するタンパク質変異体も含まれるものとする。具体的には、
（ｉ）ＴＦＡＭのアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）ＴＦＡＭのアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）ＴＦＡＭのアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＦＡＭと同様の作用を有する変異型ＴＦＡＭを使用することもできる。
さらに、本発明において使用されるＴＦＡＭとしては、ＴＦＡＭ活性を有する限り、上記アミノ酸配列とホモロジーを有するペプチドでもよい。上記ＴＦＡＭのペプチドのアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
このようなＴＦＡＭのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、ＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等；タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
ここで、ＴＦＡＭ活性とは、ミトコンドリアゲノム上にコードされる遺伝子のプロモーターに結合してミトコンドリア遺伝子の発現を制御する活性を意味する。
ＴＦＡＭをコードするＤＮＡの塩基配列は上記の通り知られている。ＴＦＡＭをコードするＤＮＡとしては、上記Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．に示す塩基配列（配列番号１、３又は５）からなるＤＮＡのほか、上記塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記ＴＦＡＭ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
上記ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、たとえば、ハイブリダイゼーションにおいて洗浄時の塩濃度が１００〜９００ｍＭ、好ましくは１５０〜３００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、ＴＦＡＭのコード領域の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
３．医薬組成物
（１）記憶障害の抑制又は治療用の医薬組成物
本発明は、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物（ＴＦＡＭ発現誘導化合物）を含む、哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療用の医薬組成物を含むものである。また本発明は、哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療用の、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物も含む。なお、ＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物としては、特に限定はされないが、例えば、レスベラトロール様物質や、プロモーターに結合する転写因子であるＮＲＦ−１、ＰＧＣ−１等が挙げられる。
本発明の医薬組成物を哺乳動物の生体内に投与することにより、記憶障害の抑制又は治療のために使用することができる。
記憶障害を抑制又は治療するための適用部位は、記憶中枢に関与する組織であれば特に限定されないが、例えば脳組織における海馬等が挙げられる。上記記憶障害としては、記憶力の低下、特に加齢に伴う記憶力の低下が好ましく挙げられるが、限定はされず、交通事故、スポーツによる傷害、アルツハイマー性痴呆症等による記憶障害も含まれ、本発明の医薬組成物の適用対象となる。
当該医薬組成物において有効成分となるＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ発現誘導化合物は、必要に応じて各種塩や水和物等の状態で用いられてもよいし、また、医薬組成物としての保存安定性（特に活性維持）を考慮し適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよく、限定はされない。当該医薬組成物は、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ発現誘導化合物以外にも他の成分を含むことができる。他の成分としては、当該医薬組成物の用法（使用形態）に応じて必要とされる製薬上の各種成分（後述する各種担体等）が挙げられる。他の成分は、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ発現誘導化合物により発揮される効果が損なわれない範囲で適宜含有することができる。
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することができる。非経口投与の場合は、上記障害部位に直接投与することも可能である。
これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、または適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、脳内注射、皮下注射、点鼻、筋肉内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン等）を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。
本発明の医薬組成物を記憶障害の遺伝子治療剤として使用する場合、すなわち、当該医薬組成物の有効成分としてＴＦＡＭ又はその変異体をコードする遺伝子を含む場合、当該医薬組成物の適用部位は特に限定されない。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸（ＴＦＡＭ又はその変異体をコードする遺伝子）が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。遺伝子治療により、生体内においてＴＦＡＭ又はその変異体を過剰発現させることができ、記憶障害を改善することが可能となる。
上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ＴＦＡＭを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。脳内に局所投与することもできる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。
記憶障害が改善（抑制又は治療）されたことの確認は、公知の各種手法を用いることができる。例えば、動物実験の場合は、水迷路による空間記憶能力の測定法、興奮生シナプス後電位の計測などが挙げられ、臨床では、改訂長谷川式簡易知能評価スケール（ＨＤＳ−Ｒ）、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）などが挙げられる。
（２）生体組織内の酸化ストレスの抑制用医薬組成物
本発明は、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭ発現誘導化合物を含む、生体組織内の酸化ストレスの抑制用医薬組成物を含むものである。また本発明は、哺乳動物の生体組織内の酸化ストレスの抑制用の、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭ発現誘導化合物も含む。
本発明の医薬組成物を哺乳動物の生体内に投与することにより、当該哺乳動物の生体組織内の酸化ストレスの抑制のために使用することができる。
ここで、生体組織内の酸化ストレスとしては、当該組織細胞内のミトコンドリア内で産生された活性酸素に由来する酸化ストレスが好ましく挙げられる。また、生体組織としては、限定はされないが、脳組織あるいは心筋組織が好ましく挙げられ、中でも脳組織がより好ましい。
生体組織内の酸化ストレスが抑制されたことの確認は、公知の各種手法を用いることができる。例えば、脂質過酸化の指標であるＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）の測定などが挙げられる。
その他、本発明の医薬組成物に関する説明については、上述した３．（１）項の医薬組成物に関する記載を同様に適用することができる。
４．記憶障害の抑制又は治療方法
本発明は、前述した記憶障害の抑制又は治療用の医薬組成物を、哺乳動物に投与することを特徴とする、記憶障害の抑制又は治療方法を含むものである。また本発明は、哺乳動物の記憶障害を抑制又は治療するための当該医薬組成物の使用も含む。さらに本発明は、哺乳動物の記憶障害の抑制若しくは治療のための薬剤を製造するための、当該医薬組成物の使用、あるいは、ＴＦＡＭ若しくはその変異体、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子、又はＴＦＡＭ発現誘導化合物の使用も含む。ここで、上記哺乳動物としては、ヒトを含む全ての哺乳動物が挙げられ、特に記憶障害を有する哺乳動物（例えば、記憶障害患者）が挙げられる。
本発明の方法に使用する医薬組成物は、ＴＦＡＭ若しくはその変異体を含む医薬組成物、又はＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子を含む医薬組成物、又はＴＦＡＭ発現誘導化合物、あるいはこれら両医薬組成物の併用であってもよく、限定はされず、投与対象となる哺乳動物（患者）の病状や副作用の有無、あるいは投与効果などを考慮して、適宜選択することができる。特に、上記併用の場合は、それぞれの医薬組成物の投与量の割合、投与回数及び投与期間などを、個々の患者に合わせて適宜設定することができる。なお、各医薬組成物の好ましい投与方法及び投与量等については、前述した通りである。
本発明の方法は、投与対象となる哺乳動物の脳細胞内のミトコンドリアにおいて、ＴＦＡＭ又はその変異体若しくはＴＦＡＭ発現誘導化合物を過剰導入する、又は（ＴＦＡＭ若しくはその変異体をコードする遺伝子を）過剰発現させる方法であることが好ましい。
５．哺乳動物の記憶障害、又は生体組織内の酸化ストレスの診断方法
本発明は、被験対象となる哺乳動物から採取された組織又は体液（血液等）中に含まれるＴＦＡＭを検出し、得られた検出結果を指標として、哺乳動物の記憶障害（例えば、記憶力低下、特に加齢に伴う記憶力低下）を診断する方法を含むものである。
また、本発明は、被験対象となる哺乳動物から採取された組織又は体液（血液等）中に含まれるＴＦＡＭを検出し、得られた検出結果を指標として、哺乳動物の生体組織（例えば、脳組織又は心筋組織）内の酸化ストレスを診断する方法を含むものである。ここで、当該酸化ストレスとしては、特にミトコンドリア内で産生された活性酸素に由来するものであることが好ましい。
上記本発明の診断方法は、具体的には、記憶障害や生体組織内の酸化ストレスの有無又は程度を診断する（評価する）方法ということもできる。
本発明の診断方法において、被験対象となる哺乳動物は、ヒトを含む全ての哺乳動物が挙げられ、特に限定はされないが、例えば、記憶障害を有する哺乳動物（例えば、記憶障害患者）や、生体組織内の酸化ストレスの増大が見込まれる哺乳動物が挙げられる。
本発明の診断方法におけるＴＦＡＭの検出手法は、採取された組織又は体液中におけるＴＦＡＭの量を評価できる手法であればよく、限定はされないが、例えば、ミトコンドリア転写因子Ａに対する抗体（特にモノクローナル抗体、又はその抗体断片）を用いる手法、例えばＥＬＩＳＡ法やイムノブロット法（特にＥＬＡＳＡ法）が好ましい。
本発明の診断方法は、例えば、被験対象となる哺乳動物についてＴＦＡＭの量を検出し、既にある検量線データ等と比較することにより、ＴＦＡＭの量が健常な哺乳動物に比べて低下していれば、記憶障害や生体組織内の酸化ストレスがあるか又はそれらの程度が大きいと判断することができる。また、被験対象となる哺乳動物について現在及び過去のＴＦＡＭの検出量を比較することにより、過去に比べて現在の検出量が低下していれば、記憶障害や生体組織内の酸化ストレスがあるか又はそれらの程度が大きいと判断することができる。
なお、本発明の診断方法は、前述した本発明の抑制又は治療方法の適用後における、記憶障害の病態の予後観察を目的として使用することもできる。
６．キット
（１）記憶障害の治療用キット
本発明は、前述した記憶障害の治療用の医薬組成物を含む、哺乳動物の記憶障害の治療用キットを含むものである。
本発明のキットには、当該医薬組成物のほかに、任意の構成要素、例えば、各種緩衝液、ｐＨ調整剤、細胞保護液などを、単独で、又は適宜組み合わせて含めることができる。また、本発明のキットには、必要に応じて、例えばＤＥＡＥデキストラン等のトランスフェクション増強試薬、及び他の添加剤を含めることが可能である。さらに、本発明のキットには、細胞へのＴＦＡＭタンパク質又は遺伝子あるいはＴＦＡＭ発現誘導化合物を導入するための使用説明書を含めることができる。キットに含まれる各成分は、例えば、各成分を容器中に封入した包装形態としてもよい。
（２）記憶障害の診断用キット、生体組織内の酸化ストレスの診断用キット
本発明は、ＴＦＡＭに対する抗体（特にモノクローナル抗体、又はその抗体断片）を含む、記憶障害の診断用キット、及び生体組織内の酸化ストレスの診断用キットを含むものである。
本発明のキットはＴＦＡＭに対する抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、前述した本発明の診断方法を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。当該キットに含まれる各成分は、例えば、各成分を容器中に封入した包装形態としてもよい。
本発明のキットは、前述した本発明の診断方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。
７．トランスジェニック非ヒト動物
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ＴＦＡＭ又はその変異体をコードする遺伝子が導入された動物である（以下、「ＴＦＡＭトランスジェニック非ヒト動物」と言うことがある）。
ＴＦＡＭトランスジェニック非ヒト動物において、ＴＦＡＭ又はその変異体をコードする遺伝子を発現（特に過剰発現）させる部位は、特に限定されるものではないが、例えば、生体組織の中でも脳組織や心筋組織、特に脳組織が好ましい。脳組織としては、例えば、大脳、間脳、中脳、小脳の各種神経細胞組織が挙げられる。所望の組織でＴＦＡＭ又はその変異体を発現させる場合は、公知の組織特異的プロモーターを利用して所定の遺伝子を目的とする組織に特異的に発現させればよい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１  Ｊａｎ  １，ｖｏｌ．１６６（１），ｐ．３０４−３１２；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，２００１  Ａｕｇ  １，ｖｏｌ．６５（３），ｐ．２２０−２２７等）。脳組織特異的プロモーターとしては、例えば、プリオンプロモーター（脳特異的）、Ｎｅｕｒｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｏｌａｓｅプロモーター（脳特異的）、Ｔα１プロモーター（脳特異的）等が挙げられる。
本発明に用い得る非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ及びウマ等のヒトを除く哺乳類動物が挙げられ、中でも、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類（ネズミ目）動物が好ましく、より好ましくはマウスである。
本発明のＴＦＡＭトランスジェニック非ヒト動物は、記憶障害（例えば、記憶力低下、特に加齢に伴う記憶力低下）の改善モデル動物（すなわち、例えば記憶力改善モデル動物）として、極めて有用なものである。
以下に、本発明の非ヒト動物の作出方法について説明する。ここでは、非ヒト動物としてマウスを用いた場合を例に挙げて説明するが、他の非ヒト動物を用いる場合についても同様の方法を適用することができる。
ＴＦＡＭトランスジェニックマウスは、公知の作出方法、すなわち受精卵前核へのＤＮＡマイクロインジェクションによる方法、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）にＤＮＡを導入した後キメラを作製する方法、及びレトロウイルスベクターを初期発生胚に感染させて導入する方法等のいずれの方法を用いることができる。これらの方法については、例えば、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９９４）Ｈｏｇａｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ」、「発生工学実験マニュアル（１９８７）勝木元也（編）講談社サイエンティフィク，東京」、「マウス胚の操作マニュアル第２版（１９９７）Ｈｏｇａｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（著），山内一也ら（訳）近代出版，東京」、「Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．，ａｎｄ  ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ」等に記載されており、これらの記載を適宜参照してトランスジェニックマウスを作出することができる。
公知の作出方法の中でも、最も一般的である受精卵前核へのＤＮＡマイクロインジェクション法を用いる場合について、以下に概略を説明する。
（ｉ）導入する目的のＤＮＡ構築物を調製する。具体的には、まず、マウスの遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法によりＴＦＡＭ遺伝子断片を得て、この遺伝子断片を用いてＴＦＡＭ遺伝子をスクリーニングする。ＴＦＡＭ遺伝子には、必要により、エピトープタグ等をコードするＤＮＡを連結しておいてもよい。次いで、所望のプロモーターの制御下で導入遺伝子が発現制御されるように設計されたベクターに、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＴＦＡＭ遺伝子を挿入する。上記挿入後のベクターを制限酵素処理等して、目的のＤＮＡ構築物、すなわち所望のプロモーター及びその制御下にあるＴＦＡＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る。
（ｉｉ）雌のマウスにホルモンを注射して強制的に過剰排卵させ、受精を行い、交尾後１日目の卵管から受精卵を摘出する。
（ｉｉｉ）核が融合する前の時期の受精卵に、顕微鏡下で目的のＤＮＡ構築物を雄性全核中にマイクロインジェクションにより注入する。
（ｉｖ）マイクロインジェクション後の受精卵を約２０個程度、仮親となる偽妊娠雌マウスの子宮又は卵管内に移植する。
（ｖ）移植後の雌マウスを通常の飼育条件下で飼育し、仔マウスを出産させる。
（ｖｉ）仔マウスの一部（尾の先端や耳介片など）からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はサザンブロット法等により、プロモーターの制御下にあるＴＦＡＭ遺伝子の導入の成否を確認する。
以上のようにして作出されたＴＦＡＭトランスジェニックマウスは、野生型のマウスと交配させることにより、ＴＦＡＭヘテロ遺伝子型マウス（＋／−）を得ることができる。さらに、このヘテロ遺伝子型のマウス同士を交配させることにより、ＴＦＡＭホモ遺伝子型マウス（＋／＋）を得ることができる。また、メンデルの法則に従い、ＴＦＡＭトランスジェニックマウスと共に、同腹の対照マウス（−／−）を得ることもできる。
ＴＦＡＭトランスジェニックマウスにおいて、ＴＦＡＭが発現していることの確認は、例えば、当該マウスの血液や所定の部位からＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法及びノーザンブロット法等により確認する方法、あるいは、当該マウスにおけるＴＦＡＭの発現をウエスタンブロット法等により確認する方法が挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜方法＞
１．マウスの作製
ＴＦＡＭ過剰発現マウスは、以前の報告（Ｉｋｅｕｃｈｉ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｓａｋａ  Ｈ，Ｋａｎｇ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ａｕｇ  ２  ２００５；１１２（５）：６８３−６９０．）に従い、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをバックグラウンドとしてβアクチンをプロモーターとしてヒトＴＦＡＭ遺伝子を過剰発現させるモデル動物として作製した。本研究は「九州大学動物実験に関する指針」「九州大学動物実験規則」に従って行った。動物は、ＴＦＡＭ過剰発現マウス（ＴＧ）及び野生型マウス（ＷＴ）のそれぞれについて、若齢マウス（生後２ヶ月齢）及び老齢マウス（生後２４ヶ月齢）を用いた。
２．脳におけるＷＴの発現の確認
ヒトＴＦＡＭ及び内因性のマウスＴＦＡＭの発現を脳組織によるウエスタンブロッティングによって確認した。
３．脳組織ＴＢＡＲＳの測定
脂質過酸化の指標であるＴＢＭＳ（チオバルビツール酸反応性物質）は、以前の報告（Ｉｄｅ  Ｔ，Ｔｓｕｔｓｕｉ  Ｈ，Ｋｉｎｕｇａｗａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．Ａｕｇ  ２０  １９９９；８５（４）：３５７−３６３．）に従い、脳組織を１．１５％ＫＣｌにてｈｏｍｏｇｅｎａｔｅし、チオバルビツールを含む試薬と反応させ、１００℃で６０分間加熱したのちに蛍光光度計（励起光５３２ｎｍ，蛍光５５３ｎｍ）にて測定した。
４．ミトコンドリア分画の単離とミトコンドリア呼吸鎖複合体活性測定
ＨＥＳバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ及び０．２５Ｍ  Ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を用いて遠心分離法によりミトコンドリア分画を単離する。単離したミトコンドリアを用いて、公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６４：４９１．）に従い、複合体Ｉ〜ＩＶの活性を測定した。
５．水迷路による空間記憶能力の測定
アクリル板で作成した、直径１ｍのプールに、６本の放射状水迷路を作製し（Ｍｏｒｇａｎ  Ｄ，Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＭ，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｌ  ＰＥ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ  ２１−２８  ２０００；４０８（６８１５）：９８２−９８５．）、そのうちの１腕（アーム）に径１０ｃｍのプラットホームを設置した水迷路にて実験を行った。マウスは、プラットホームを除く５本のアームのうちから、ランダムにスタートさせ、プラットホームにたどり着くまでのエラーの回数をカウントした。４回目のトライアルの後に３０分間休憩し、５回目は４回目と同じ場所からスタートし、５回目のエラー回数を、短期空間記憶の指標とした。９日間、連日午後同じ時間に、このトレーニングを行い、１０日目に、本試験を行った。
６．長期増強作用（ＬＴＰ）の測定
海馬スライスを用いて、テタヌス刺激を行ったときのＣＡ１錐体細胞層における興奮生シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を計測した。具体的には、次のようにして計測した。
実験にはＹｏｕｎｇ（若齢、４ケ月）ならびにＯｌｄ（老齢、２４ケ月）の野生型（ＷＴ）ならびにＴＦＡＭトランスジェニックマウス（ＴＧ）を用いた。マウスをエーテル麻酔下に断頭し、脳を摘出した。海馬を含む脳ブロックよりマイクロスライサーを用いて厚さ４００ミクロンの海馬スライス標本を作製した。海馬スライス標本は９５％酸素ならびに５％二酸化炭素を含む混合ガスで通気した人工脳脊髄液（３２℃、ｐＨ７．４）を流速１ｍｌ／分で灌流しているインターフェース型の記録用チェンバー内に入れた。灌流開始から約３０分後のインキューベーション後、海馬スライス標本のシャンーファー側枝上に設置した双極電極を用いた刺激により誘発されるポピュレーション後シナプス電位（ｐＥＰＳＰ）を海馬ＣＡ１野の放線層上に設置したガラス電極を介して記録した。パルス幅０．１ミリ秒、頻度０．１ヘルツ、刺激強度３〜８ボルトとし、ｐＥＰＳＰの立ち上がりのスロープが最大値の５０％の反応が得られる刺激強度でテスト刺激を行った。長期増強（ＬＴＰ）を誘発させるための高頻度刺激（テタヌス刺激）は、２５ヘルツ１秒、５０ヘルツ１秒、及び１００ヘルツ１秒の条件で行った。ｐＥＰＳＰスロープの計測は、各々の高頻度刺激２０〜３０後に行った。電気生理学実験に用いた人工脳脊髄液の化学組成は１２４ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２．４ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．２４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３及び１０ｍＭ  Ｄ−グルコースからなる。
＜実験結果＞
１．脳におけるＷＴの発現の確認
脳組織ホモジネートを用いて、ヒトＴＦＡＭならびに内因性マウスＴＦＡＭの発現を検討したところ、ヒトＴＦＡＭはＴＧマウス脳組織に発現しており、内因性マウスＴＦＡＭはＷＴマウスとＴＧマウスにおいては不変であった（図１ａ）。
２．脳組織ＴＢＡＲＳの測定
老齢マウス脳内では脂質過酸化が亢進していることが、数多く報告されている。若齢及び老齢マウスの脳ホモジネートを用いてＴＢＭＳを測定したところ、これまでの報告どおり、老齢ＷＴマウスでは若齢ＷＴマウスに比べて脂質過酸化の亢進が認められたが、ＴＧマウスでは、若齢マウスと老齢マウスとで同等レベルであった（図１ｂ）。
３．ミトコンドリア呼吸鎖複合体活性測定
ＴＦＡＭ過剰発現により、ミトコンドリア機能が保持されていることが予想されるため、脳組織ミトコンドリア機能を調べた。複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ）Ｉ〜ＩＶの活性を測定したところ、複合体Ｉ及びＩＶにおいて、老齢ＷＴマウスでは活性が有意に低下していたが、老齢ＴＧマウスは若齢ＴＧマウスと同様であった。複合体ＩＩ及びＩＩＩでは、４群間に有意差は認められなかった（図２）。
４．水迷路による空間記憶能力の測定
さらに、脳内の活性酸素の産生抑制によりミトコンドリア機能が保持された結果、脳機能にどのような影響をおよぼしているのか検討するために、水迷路による空間記憶能力を測定した。若齢マウスでは、学習能力に差はなく、３０分休憩後のｔｒｉａｌ  ５での記憶力に、ＷＴマウスとＴＧマウスで有意差は認めなかったが、老齢マウスにおいては、ＷＴマウスにおいて、Ｔｒｉａｌ  ５でのエラー数は、有意に増加するのに比し、ＴＧマウスでは、エラー数は増加しなかった。すなわち、ＴＧマウスは加齢でも記憶力が保持されていることが明らかとなった（図３）。
５．長期増強作用（ＬＴＰ）の測定
水迷路において、老化に伴う記憶力の低下がＴＦＡＭ過剰発現によって抑制された事実から、どのようなメカニズムが考えられるのであろうか。脳記憶学習の中枢は、海馬ＣＡ１領域である。脳の学習・記憶の素過程はシナプスの伝達効率の変化（シナプス可塑性）にあると考えられている。特に、シナプス前線維とシナプス後細胞が同時に頻回発火した時にシナプス伝達効率が増加する長期増強（ＬＴＰ）の現象は、記憶形成に関与するとされる。若齢及び老齢のＷＴ及びＴＧマウスにおいて、高頻度刺激（テタヌス刺激）後の海馬スライスの長期増強を比較した。若齢マウスでは、ＬＴＰに有意な差を認めなかったが、老齢マウスでは、ＴＧマウスにおいて有意に長期増強の増加現象が認められた（図４ａ〜４ｃ）。
すなわち、若齢の野生型ならびにＴＦＡＭトランスジェニックマウスいずれの群においても、１００ヘルツ１秒による高頻度刺激後ｐＥＰＳＰスロープは、コントロールの２〜２．５倍にまで増大し、ＬＴＰが形成された。またＬＴＰの増強率にも両者間には有意な差は認められなかった（図４ａ）。一方、老齢の野生型マウスでは高頻度刺激後ｐＥＰＳＰスロープは、コントロールのせいぜい１．３倍くらいまでの増大しか示さず、顕著なＬＴＰ形成は認められなかった。ところが、老齢のＴＦＡＭトランスジェニックマウスでは高頻度刺激後ｐＥＰＳＰスロープはコントロールの２倍にまで増大し、ＬＴＰ形成が認められた（図４ｂ，４ｃ）。老齢のＴＦＡＭトランスジェニックマウスにおいて認められたＬＴＰの増強率は老齢の野生型マウスのものと比較して有意に大きな値であった（Ｐ＜０．０５，ｔ−検定）（図４ａ）。
６．リポフスチン顆粒の観察
リポフスチン顆粒は、加齢とともに脳内に沈着することが知られているが、蛍光顕微鏡での観察の際に自家発光を発することが知られている。海馬スライスにおいて、ＷＴ老齢マウスでは、この自家発光が強く認められ、ＴＧマウスでは、抑制されていたことから、リポフスチン顆粒の沈着が少ないことが示された（図５）。
＜考察＞
以上の結果より、ＴＦＡＭはその脳内への発現により酸化ストレスを抑制し、加齢による記憶能力低下（すなわち記憶障害）を抑制する作用があることが明らかとなった。
【実施例２】
【０００７】
＜方法＞
１．トランスジェニックマウスの作製
実施例１と同様に、動物は、ＴＦＡＭ過剰発現マウス（ＴＧ）及び野生型マウス（ＷＴ）のそれぞれについて、若齢マウス（生後２ヶ月齢）及び老齢マウス（生後２４ヶ月齢）を用いた。
２．ウエスタンブロッティング
ヒトＴＦＡＭ及びマウス内因性ＴＦＡＭのタンパク質のレベルは脳組織のホモジュネートで分析した（Ｉｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１２，６８３−９０（２００５）．）。１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって硝酸セルロースの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてトランスファーを行い、ヒトＴＦＡＭ及びマウスＴＦＡＭの特異的抗体によって検出した。検出は、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行った。
３．ＴＢＡＲＳ
脳のホモジュネートを用い、脂質過酸化の指標としてＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）を測定した。脳のホモジュネートと、０．４％ナトリウムドデシル硫酸塩、７．５％酢酸（ｐＨ３．５）、０．３％チオバルビツール酸混合物は、５℃で６０分、さらに１００℃で６０分間反応させた。冷却後、混合物は蒸留水とｎ−ブタノール：ピリジン（１５：１）とを加え、１６００×ｇで１０分間遠心し、上清を蛍光光度計によって測定した（ＧＥＮｉｏｓ  ＰｒｏＴＭ（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）；励起光５１０ｎｍ，発光５５０ｎｍ）。
４．ミトコンドリア分画の単離
脳は６倍量のＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４），２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｓｕｃｒｏｓｅ）を用いて、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）のホモジェナイザーを用いてホモジェナイズした。４℃、７００×ｇで１０分間遠心し、核分画と繊維組織を除外し、さらに上清を７０００×ｇで１０分間遠心した。得られたペレットを、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、及び２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  スクロース（ＨＥＳ）に懸濁し、３回繰り返し、ペレットを得た。
５．ミトコンドリア酵素活性
ミトコンドリア電子伝達系酵素活性は、脳から単離したミトコンドリアを用いて、複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶを測定した。ＮＡＤＨユビキノン酸化環元酵素（複合体Ｉ）の活性は、ユビキノンのアナログであるｄｅｃｙｌｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅの減少により測定された。コハク酸塩ユビキノン酸化環元酵素（複合体ＩＩ）活性測定は、ｄｅｃｙｌｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅの複合体ＩＩ触媒型還元と共役したときの２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌの減少によって測定された。ユビキノール／チトクロームｃ酸化環元酵素（複合体ＩＩＩ）の酵素活性は、還元型ｄｅｃｙｌｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅの存在下に、チトクロームｃの減少によって測定された。チトクロームｃオキシダーゼ（複合体ＩＶ）の酵素活性は、亜ジチオン酸塩の存在下におけるチトクロームｃの酸化によって測定された。
６．水迷路
本発明者らは、以前に記述されているように６方向放射迷路のための器具を作製した（Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，９８２−５（２０００）．）。６方向放射迷路は直径１ｍの円状のプールの中で、６本の放射状のアームが設置されている。アームのうち、１本の終末には、水中に沈められた形で、プラットホーム（径１９ｃｍ）を設けた。ライトスタンドを空間的な手掛りとして、テスト部屋の壁に設置した。マウスは、プラットホームとは別のアームに置かれ、各試験を行われた。マウスは、１本のアームにおかれ、プラットホームを見つけるまでプールの中を１分間泳ぎ、マウスがプラットホームに達するまでのエラー数を記録した。４回まで、異なるアームでトレーニングされた後、マウスは記憶保持をみるために３０分間の休憩をとったあと、４回目のテストと同じアームから、５回目の試験を行った。最終的なエラースコアは７日間訓練として繰り返され、その後の２日間に行われた平均スコアによって定められた。
７．電気生理学検査
２８匹のオスＣ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ及びＴＧ；若齢２〜４か月（ＷＴ；ｎ＝６、ＴＧ；ｎ＝５）、老齢１９〜２２ヶ月（ＷＴ；ｎ＝１０、ＴＧ；ｎ＝７））を、電気生理学的検査のために用いた。脳海馬切片は、４００μｍの厚さにスライスされた（Ｍｉｃｒｏｓｌｉｃｅｒ  ＶＴ１０００Ｓ，Ｌｅｉｃａ、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ、ドイツ）（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ＣＡ１  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｂａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４２，８７−９６（２００６）．）。一部のマウスには、記録測定４時間前に腹腔内にエンドトキシン（ＬＰＳ，Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；０．３３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。Ｓｃｈａｆｆｅｒ側枝の刺激によって惹起されたｆＥＰＳＰｓはＣＡ１サブフィールドにおいて記録された。長期増強作用（ＬＴＰ）はテタヌス刺激によるもので、２５、５０、１００Ｈｚで１秒の連続したパルス刺激によって引き起こされた。データはＰｏｗｅｒＬａｂを使用して、デジタル化した。
８．テトラサイクリン制御によるＨｅｌａ細胞のＴＦＡＭ過剰発現
テトラサイクリン調整されたＴＦＡＭ−過剰発現の細胞株は以前に報告された方法に従って作製した（Ｋａｎｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ｉｎ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４，９８２３−３４（２００４）．；Ｏｈｇａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｓ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＤＮＡ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１４１，２０１−１１（２００７）．）。
９．ＲＯＳの測定
細胞内ＲＯＳは、ＲＯＳ感受性蛍光色素であるＤＨＥによって測定した。細胞は９６−ｗｅｌｌ培養皿で、３７℃で２４時間、５％  ＣＯ２のインキュベータ内で培養した。細胞は、１μｍｏｌ／Ｌロテノンで５．５時間処理し、次いで、２μｍｏｌ／Ｌ  ＤＨＥによって３０分間処理して、励起光４８５ｎｍ、発光５３０ｎｍの蛍光強度を測定した。ＤＨＥの酸化のための細胞イメージングは、ＣＬＳＭを使用して観察した。
１０．ＮＦ−κＢ核移行の検討
テトラサイクリンによって制御されたＴＦＡＭ−過剰発現Ｈｅｌａ細胞は、１０％の牛胎児血清、４００ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＣ、及び２００ｍｇ／ｍＬ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂを含んだＤＭＥＭで培養した。２４時間後に、細胞を０．００１％（最終濃度）ロテノン（エタノールに溶解）に６時間刺激し、その後４％のパラホルムアルデヒドに固定した。抗ｐ６５  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）によって免疫染色し、核でｐ６５陽性細胞が、ＮＦ−κＢ核移行としてカウントし、細胞の総数あたりで補正した。
＜結果＞
若齢ＴＧのマウスでは、ヒトＴＦＡＭタンパク質はマウスの内因性マウスＴＦＡＭタンパク質に影響を認めなかった（図６ａ）。ヒトＴＦＡＭは老齢ＴＧのマウスの海馬を含む脳実質において組織免疫染色から、その発現が認められた（図６ｂ）。ＴＢＭＳによって示される脂質過酸化反応は、野生型老化マウスで高値を示した。一方、老齢ＴＧのマウスの頭脳におけるＴＢＭＳのレベルは老齢野生型マウスの頭脳より有意に低く、若齢マウスと同等レベルであった（図６ｃ）。
これまでの多くの研究は、ｍｔＤＮＡの突然変異、ミトコンドリア呼吸鎖の機能損失、及びミトコンドリアからのＲＯＳの生成との関連を示している。動物実験においては、老化にともない、ミトコンドリア呼吸鎖において電子伝達機能が低下していることは、広く知られている。老齢マウス脳から単離したミトコンドリアにおける呼吸鎖の活性は、若齢マウスと比較し、複合体ＩＩ及びＩＩＩでは変化がなかったものの、複合体Ｉ及びＩＶにおいては、有意に低下を示した（図６ｄ）。これらの結果は以前の報告とも合致する（Ｎａｖａｒｒｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８９，Ｒ１３９２−９（２００５）．；Ｍａｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｔＤＮＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  ４１，１１−２４（２００６）．）。しかしながら、ＴＧのマウス脳から単離されたミトコンドリアではすべての複合体において、加齢に伴う減少が認められなかった（図６ｄ）。これらのデータはＴＦＡＭの過剰発現が通常の老化におけるＲＯＳの増加及びミトコンドリア呼吸鎖酵素活性の減少を防いだことを示すものであった。
次に、ＲＯＳが加齢に伴う認知機能の低下のための主要な原因となる要素であると考えられることから、ＴＦＡＭの過剰発現が、学習及び記憶にどのような効果をもたらすかを検討した。発明者らは放射状水迷路（Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，９８２−５（２０００）．）を使用してマウスの空間記憶力について検討した。若齢マウスでは、最初の試験において、平均４〜６のエラーを示したが、５回目の試験（記憶保持をみる検査）では、野生型及びＴＦＡＭ過剰発現の両方において、１エラーを示した（図７ａ）。老齢マウスでは、ともに１回目の試験では、平均４〜６の間違いを示したが、５回目の試験（記憶保持をみる検査）では、過剰発現マウスの間違いの平均は野生型マウスより有意に低く、若齢群と同等だった（図７ｂ）。
そこで、本発明者らは、加齢による脳の学習及び記憶の低下に、ＴＦＡＭ過剰発現がどのような細胞内メカニズムで効果を示すのかを明らかにするために、長期増強作用（Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＬＴＰ）に関する実験を行った。ＬＴＰの実験には、海馬レベルの脳切片を用いた（Ｔｏｍｉｍａｔｓｕ，Ｙ．，Ｉｄｅｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．＆  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｈ．Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ７２，３５５−６１（２００２）．；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ＣＡ１  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｂａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４２，８７−９６（２００６）．）。Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ（ＥＰＳＰ）スロープは、２５、５０及び１００Ｈｚの連続したテタヌス刺激の後に測定した。ＥＰＳＰスロープが１００Ｈｚのテタヌス刺激の３０分後に測定した場合には、若齢マウスでは野生型と過剰発現マウスに有意差は認められなかった（図７ｃ）。しかし、老齢の過剰発現マウスの１００Ｈｚのテタヌス刺激では、ＬＴＰは、若齢マウスと対等であり、老齢野生型マウスより有意に高値であった。
一方で、ベースのシナプス伝達及び２発刺激（ｐａｉｒｅｄ  ｐｕｌｓｅ）による促進反応では、両群に有意な相違はなかった（図８、９）。これらの結果はＴＦＡＭの過剰発現が、加齢による、記憶及び海馬における長期増強作用の低下を改善することを強く示すものであった。
ＲＯＳは、老化及び老化に伴う神経変性と関連している。本発明者らは、海馬及び他の脳領域における酸化障害の局在を検討した。脂質におけるＲＯＳの作用を示す４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎｏｎｅｎａｌ（ＨＮＥ）及び核酸における作用を示す８−ｏｘｏ−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（８−ｏｘｏ−ｄＧ）の免疫組織染色では、老齢マウスの脳で増加を示した。特に、海馬及び脳室周囲において顕著であった（図１０ａ）。一方、これらのマーカーは老齢の過剰発現マウスの脳ではほとんど認められなかった。また、８−ｏｘｏ−ｇＧは、主に細胞質において陽性であり、核酸の酸化障害が、核ＤＮＡよりも、ミトコンドリアＤＮＡに主に生じていることを示していた。さらに、老齢マウスで、８−ｏｘｏ−ｄＧは、ミクログリアを示すＩｂａ−１陽性細胞と共染色を示し、星状細胞を示すＧＦＡＰ陽性細胞とは、共染色を示さなかった（図１０ｂ）。
また、近年、ミクログリアを含む種々の細胞において、細胞内ＲＯＳが、酸化還元依存性の細胞内情報伝達カスケード及びＮＦ−κＢやＭＡＰキナーゼを含む転写因子を活性化させることが示されている（Ｐａｗａｔｅ，Ｓ．，Ｓｈｅｎ，Ｑ．，Ｆａｎ，Ｆ．＆  Ｂｈａｔ，Ｎ．Ｒ．Ｒｅｄｏｘ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇａｍｍａ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ７７，５４０−５１（２００４）．；Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｉｎ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３５，５７３−８４（２００７）．）。ミクログリアにおいては、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼはＩＬ−１βの発現と密接に関連付けられる。さらに、ミクログリアから産生される炎症惹起性サイトカインであるＩＬ−１βは、記憶力の低下（Ｇｅｍｍａ，Ｃ．，Ｉ，Ｉ．，Ｃ，Ｃ．＆  Ｔ，Ｔ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−１  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｒａｔｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，１７５１−６（２００５）．）、及びＬＴＰの低下（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ９９，１２６３−７２（２００６）．）を来すことが示されている。そこで、ＬＴＰの程度とＩＬ−１βの発現レベルとの関連を検討するために、二重免疫染色を行った。野生型老齢マウスでは、海馬領域において、ＩＬ−１βは、Ｉｂａ１陽性細胞と、よい共染色性を示したが、過剰発現マウスでは、ＩＬ−１βは、ほとんど染色されなかった（図１０ｃ）。平均蛍光免疫強度は、過剰発現マウスにおいて、有意に低かった（図１０ｄ）。グラム陰性の細菌の細胞壁の構成要素であるリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）を腹腔内投与して４時間後の老齢マウス脳の海馬領域において、ＩＬ−１βの発現を検討した。ＬＰＳによって、野生型マウスにおいては、ＩＬ−１βの発現が誘導されたが、過剰発現マウスにおいては、その平均値は、有意に低値であった（図１１）。さらに、過剰発現マウスにおいて、ＩＬ−１βの発現量はＬＰＳ投与によって有意に増加したが、それは、野生型の非ＬＰＳ投与と同等であった（図１０ｄ）。過剰発現老齢マウス脳の海馬ＣＡ１領域におけるＬＴＰは、ＬＴＰ投与によって有意に低下した（１４３．８６±１０．１７％，１５スライス，Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ＣＡ１領域におけるＬＴＰの大きさが、ミクログリアにおいて発現されるＩＬ−１のレベルと逆相関することを示すものであった。
テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリン（ＤＣ）によりＴＦＡＭを発現調節させたＨｅｌａ細胞では、ＴＦＡＭタンパク量が約２倍に増加した（図１３）。ミトコンドリア複合体Ｉの抑制剤であるロテノンは、一般的に用いられるＲＯＳ感受性の蛍光色素である２，７−ｄｉａｍｉｎｏ−１０−ｅｔｈｙｌ−９−ｐｈｅｎｙｌ−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ（ＤＨＥ）の顕著な増加を生じさせた（図１２ａ，１２ｂ）。ロテノンで処理したＨｅｌａ細胞の酸化レベルは、ＤＣ欠乏によってＴＦＡＭが過剰発現された細胞においては有意に低値であった。さらに、ヒトＴＦＡＭの過剰発現による、酸化ストレスと、それに続くＮＦ−κＢの活発化とを検討した。ＮＦ−κＢの活発化は、細胞質から核への移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）によって評価した。ロテノンで処理したＨｅｌａ細胞は、ＴＦＡＭ過剰発現によって有意にＮＦ−κＢの活性化が抑制された（図１２ｃ，１２ｄ）。以上の結果は、明確にＴＦＡＭの過剰発現がＲＯＳの生産過剰を防ぎ、細胞内のレドックス感受性を有するＮＦ−κＢのシグナリング抑制することを示すものであった。
加齢におけるミトコンドリア仮説は、ｍｔＤＮＡ損傷が、ＲＯＳの連続的な生成によって引き起こされることを示すものであり、本実施例において最も重要なことは、ＴＦＡＭの過剰発現が、ＲＯＳの生産を減らし、加齢によるマウスの記憶力低下（記憶障害）を抑制することであった。１）ＴＦＡＭはミトコンドリア内にて大量に存在すること、２）ＴＦＡＭは構造上、ＨＭＧタンパク質であること、及び３）ｍｔＤＮＡタンパク質は、ｍｔＤＮＡと量的連関を示す（Ｋａｎｇ，Ｄ．＆  Ｈａｍａｓａｋｉ，Ｎ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｌｅｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０４２，１０１−８（２００５）．）ことから、ＴＦＡＭはｍｔＤＮＡを取り囲むことで、酸化障害からｍｔＤＮＡを防御すると考えられた（Ｋａｎｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｎｕｃｌｅｏｉｄ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０１１，６１−８（２００４）．；Ａｌａｍ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｓ  ｐａｃｋａｇｅｄ  ｗｉｔｈ  ＴＦＡＭ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，１６４０−５（２００３）．）。この現象は、おそらくｍｔＤＮＡにおいて、核ＤＮＡより頻繁に生じていると考えられた。本実施例では、老化の過程において、ミトコンドリア由来のＲＯＳと、ミトコンドリア機能障害及び記憶力の減少との間に、明確な因果関係が示された。
驚くべきことに、これらの結果は、加齢によるＲＯＳの産生が、長期生存している有糸分裂後細胞であるニューロンに起こっているであろうという、これまでの一般的な考えに反して、ミクログリアがＲＯＳの主たる産生源であることを示すものであった。今後、加齢に伴うミクログリア由来のＲＯＳ産生と、ミトコンドリア機能との関連が、さらに明らかにされる必要性があると考えられた。
【実施例３】
【０００８】
抗ＴＦＡＭモノクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡによる定量系を構築する。
＜方法＞
１．ＴＦＡＭの欠失変異体の調製
ｐＧＥＸ／ＴＦＡＭ（４３−１０６）、ｐＧＥＸ／ＴＦＡＭ（７１−１６０）、ｐＧＥＸ／ＴＦＡＭ（１３６−２２２）、ｐＧＥＸ／ＴＦＡＭ（１９２−２４６）を大腸菌（ＢＬ２１）に導入して発現させ、ＧＳＨ−セファロースレジンにより精製した。精製した画分（各１ｍＬ）を１ＬのＰＢＳに対して透析した。透析した試料中のタンパク質を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢ染色した（図１４）。
２．ＥＬＩＳＡによる抗原測定系
ＧＳＴ，ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（４３−２４６）、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（４３−１０６）、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（７１−１６０）、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（１３６−２２２）あるいはＧＳＴ−ＴＦＡＭ（１９２−２４６）のＰＢＳ溶液５０μＬ（１μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ用９６穴プレートのウェルに添加し、４℃で終夜静置した。廃液後、２００μＬのＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１００μＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライ）を添加し、室温で２時間振とうした。廃液後、５０μＬの抗体溶液（ハイブリドーマ培養上清、クローン１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｅ，３Ｂａ，３Ｂｂ，３Ｂｃ，３Ｂｄ，３Ｂｅ，１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ，１４Ｅ、ウサギ抗ＴＦＡＭポリクローナル抗体あるいはヤギ抗ＧＳＴ抗体）を添加し、室温で１時間振とうした。廃液後、２００μＬのＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、５０μＬの二次抗体溶液（１／２０００）を添加し、室温で１時間振とうした。廃液後、２００μＬのＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１００μＬのｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＯＰＤ）溶液（１００ｍＭ  リン酸ナトリウム，４０ｍＭクエン酸，０．４ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ，０．０１４％過酸化水素）を添加し発色させた。５０μＬの１Ｍ  ＨＣｌにより発色反応を停止後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した（図１５、１６）。
３．ハイブリドーマ培養上清中の抗体を用いた免疫沈降法
プロテインＧセファロース（５μＬ）に抗ＴＦＡＭモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上清（３０μＬ）あるいはＮｏｒｍａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（２．５μｇ）を添加し（ＰＢＳ／０．１％  ＮＰ−４０により最終容量２００μＬ）、４℃で６０分間ローテーターにより混和した。混和後、回収したレジンを５００μＬの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．１％  ＮＰ−４０）で３回洗浄した。レジンにＴＦＡＭタンパク質溶液（０．５，１．５μｇ／ｍＬ，２００μＬ）を添加し、４℃で６０分間ローテーターにより混和した。混和後、回収したレジンを５００μＬの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．１％  ＮＰ−４０）で３回洗浄し、レジンに吸着したタンパク質を７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ウサギ抗ＴＦＡＭ抗体を用いたウエスタンブロットを行った（図１７、１８）。
＜結果＞
１．これまでに、蛋白精製工業において、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（４３−２４６）をマウスに免疫し、１４種類のハイブリドーマ（１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｅ，３Ｂａ，３Ｂｂ，３Ｂｃ，３Ｂｄ，３Ｂｅ，１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ，１４Ｅ）が得られている。そこで、それらが産生するモノクローナル抗体のエピトープを推測するために、ＴＦＡＭの欠失変異体を調製した。ＧＳＴタンパク質として、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（４３−１０６）、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（７１−１６０）、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（１３６−２２２）およびＧＳＴ−ＴＦＡＭ（１９２−２４６）を大腸菌発現系により発現させ、ＧＳＨ−セファロースレジンによって精製し、精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、それぞれのＧＳＴ−融合タンパク質泳動位置は、計算上の分子量のそれと一致することが確認された（図１４）。
２．精製したＧＳＴ−ＴＦＡＭ（４３−１０６）、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（７１−１６０）、ＧＳＴ−ＴＦＡＭ（１３６−２２２）およびＧＳＴ−ＴＦＡＭ（１９２−２４６）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清中に存在する抗体のＧＳＴ−ＴＦＡＭ変異体に対する反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。その結果、１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１ＥはＧＳＴ−ＴＦＡＭ（１９２−２４６）のみに反応し、３Ｂａ，３Ｂｂ，３Ｂｃ，３Ｂｄ，３Ｂｅ，１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ，１４ＥはＧＳＴ−ＴＦＡＭ（７１−１６０）のみに反応した（図１５）。従って、１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｅ中に存在する抗体のエピトープは２２３−２４６にあり、３Ｂａ，３Ｂｂ，３Ｂｃ，３Ｂｄ，３Ｂｅ，１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ，１４Ｅのそれは１０７−１３５にあることが推測された。同様に、ウサギ抗ＴＦＡＭ抗体が認識するエピトープについて調べたところ、Ｎ末端を認識する抗体が多く含まれていることが明らかとなった（図１６）。
３．抗体のエピトープおよびそれらのＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動像から、１４種類のクローンを３つのグループ、すなわち「１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｅ」、「３Ｂａ，３Ｂｂ，３Ｂｃ，３Ｂｄ，３Ｂｅ」、「１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ，１４Ｅ」に分類した。そのうちの「１Ａ，３Ｂａ，１４Ｅ」の培養上清を用いて、ＴＦＡＭタンパク質の免疫沈降を試みた（図１７）。ウエスタンブロット法により沈降したＴＦＡＭタンパク質を検出したところ、ＴＦＡＭタンパク質の泳動位置と同じ位置に非特異的なシグナル（＊で示した）が検出され、明確な判定ができなかった（図１７Ａ）。しかしながら、ＴＦＡＭタンパク質精製画分中に含まれるトランケート体が、３Ｂａおよび１４Ｅを用いた場合に，濃度依存的に沈降することから、少なくとも３Ｂａおよび１４Ｅは免疫沈降に使用できることが確認された。一方、１Ａを用いた場合にトランケート体の沈降が確認できなかった。以前に示したように、３Ｂａおよび１４ＥがＮ末端側を認識するのに対して、１ＡはＣ末端を認識することから、Ｃ末端を欠失したトランケート体が沈降しなかったのではないかと考えられた。
次に、全１４種類のクローンを用いて、ＴＦＡＭタンパク質の濃度を変化させて（０．５，１．５μｇ／ｍＬ，２００μＬ）免疫沈降を試みた。低濃度である０．５μｇ／ｍＬ（２００μＬ）で行った場合には、図２Ａと同様に、「１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ，１４Ｅ」によりＴＦＡＭタンパク質の沈降が確認された（図１８Ａ）。一方、ＴＦＡＭタンパク質の濃度が１．５μｇ／ｍＬ（２００μＬ）で行った場合には、「３Ｂａ，３Ｂｂ，３Ｂｃ，３Ｂｄ，３Ｂｅ」によってもＴＦＡＭタンパク質の沈降が確認され、「３Ｂａ，３Ｂｂ，３Ｂｃ，３Ｂｄ，３Ｂｅ」、「１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ，１４Ｅ」は免疫沈降に使用できることが確認された（図１９Ａ）。
【実施例４】
【０００９】
Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭタンパク質の作製
＜背景＞
Ｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭタンパク質は、ミトコンドリア移行シグナルを有するＩｍｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭがミトコンドリア内でシグナルペプチドが切断されることにより活性を有する。すなわち、Ｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭは、Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭのミトコンドリア内での成熟過程により、ミトコンドリアにおける活性酸素の過剰産生を抑制するものと考えられる。
本実施例は、該仮説に基づき、Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭの細胞内での機能を検証することを目的ちして、以下の検討を進めた。
＜方法＞
Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ発現ベクターの構築：
Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭタンパク質の大腸菌発現系を構築する為に、図２０に示す４種の発現ベクターを構築した。すなわち、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加したＩｍｍａｔｕｒｅ又はＭａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ−Ｈｉｓ；ｐＥＴ  ２２ｂ（＋）／ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ−Ｈｉｓ、Ｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ−Ｈｉｓ；ｐＥＴ  ２２ｂ（＋）／ｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ−Ｈｉｓ）及びＮ末端にＧＳＴを付加したＩｍｍａｔｕｒｅ又はＭａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ（ＧＳＴ−ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ；ｐＧＥＸ−６Ｐ／ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ、ＧＳＴ−ｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ；ｐＧＥＸ−６Ｐ／ｍａｔｕｒｅ  ＴＦＡＭ）の発現ベクターを構築した。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明によれば、ミトコンドリア転写因子Ａ（ＴＦＡＭ）又はそれをコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物を含む、哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療用医薬組成物を提供することができる。本発明は、当該医薬組成物を哺乳動物（例えば、記憶障害を有する哺乳動物）に投与することにより、当該哺乳動物の記憶障害の抑制又は治療方法を提供することができる点で、極めて有用なものである。
また、本発明によれば、ＴＦＡＭ又はそれをコードする遺伝子、あるいはＴＦＡＭの発現を誘導し得る化合物を含む、生体組織内の酸化ストレスの抑制用医薬組成物を提供することができる。さらには、被験対象となる哺乳動物から採取された組織又は体液中に含まれるＴＦＡＭを検出し、得られた検出結果を指標として、哺乳動物の記憶障害や生体組織内の酸化ストレスを診断する方法を提供することができる。
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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