(57)【要約】  検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な自動分析装置対応のsmall,dense LDLの分別測定用試薬の提供。  コレステロールエステラーゼおよび小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/Lの存在下で被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を消去する第１工程と、次いで前記第１工程で残存した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールを定量する第２工程を含む、被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールエステラーゼおよび小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/Lの存在下で被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を消去する第１工程と、次いで前記第１工程で残存した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールを定量する第２工程を含む、被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項２】
第１工程で小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびラウリルアルコールアルコキシレートからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩、モノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、アミドベタイン型、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤であることを特徴とする請求項１記載の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項３】
第１工程で用いるコレステロールエステラーゼの濃度が0.6〜3.0Ｕ/mLであることを特徴とする請求項１または２に記載の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項４】
第１工程において、さらにコレステロールオキシダーゼおよびカタラーゼを添加する、請求項１から３のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項５】
第１工程において、さらにコレステロールオキシダーゼおよび４アミノアンチピリンを添加する、請求項１から３のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項６】
第２工程において、少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下にコレステロール測定用酵素が添加されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項７】
第２工程で用いられる少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤が全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であることを特徴とする請求項６記載の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項８】
第２工程で用いられる少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはポリアルキレンオキサイド誘導体であることを特徴とする請求項６または７に記載の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項９】
第２工程で用いられる少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤をリポプロテインリパーゼの存在下で用いることを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。
【請求項１０】
コレステロールエステラーゼおよび小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/Lを組み合わせてなることを特徴とする被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白の消去剤。
【請求項１１】
コレステロールエステラーゼの濃度が0.6〜3.0Ｕ/mLである、請求項１０記載の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白の消去剤。
【請求項１２】
コレステロールエステラーゼ、小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/L、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはポリアルキレンオキサイド誘導体、を組み合わせてなることを特徴とする小粒子低比重リポ蛋白定量用試薬。
【請求項１３】
第１試薬組成物および第２試薬組成物よりなる請求項１２記載の小粒子低比重リポ蛋白定量用試薬であって、第１試薬組成物にコレステロールエステラーゼおよび小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/Lが含まれ、第２試薬組成物中にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはポリアルキレンオキサイド誘導体が含まれる小粒子低比重リポ蛋白定量用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化の診断に重要なsmall,dense LDL中のコレステロール測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
低比重リポ蛋白（LDL）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、LDLの中でも特に粒子サイズが小さく平均的なLDLより高比重な、小粒子LDL（small,dense LDL）は動脈硬化惹起性が通常のLDLより数倍高くなることが知られている。small,dense LDLの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。【０００３】
従来のsmall,dense LDL測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などがあるが、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要するため簡便ではない。【０００４】
自動分析装置を用いてsmall,dense LDLを測定する方法としては、イオン強度の差により小粒子LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子LDLを測定する方法がある（特許文献１を参照）。しかし、この方法では濁りによる吸光度差を測定しているため、特異性や精度が不十分であった。【０００５】
また、small,dense LDL中のコレステロールや中性脂肪を、ポリアニオンと二価陽イオンからなる分離剤と自動分析装置対応の試薬と組み合わせて測定する方法が知られている（特許文献２を参照）。この方法では、超遠心法や電気泳動法に比べ簡便にsmall,dense LDL中の脂質成分が測定でき、特異性や精度に優れているが、検体を前処理しLDLをsmall,dense LDLとそれ以外のLDLに分離する操作が必要であった。
【特許文献１】特開2003-28882号公報
【特許文献２】WO2004/053500号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な自動分析装置対応のsmall,dense LDLの分別測定用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意研究の結果、種々のリポ蛋白を含有する被検体試料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼにて測定する際、特定の界面活性剤を特定の濃度で用いることにより、酵素のsmall,dense LDLに対する反応速度とそれ以外のリポ蛋白に対する反応速度を変えることができ、その結果、small,dense LDL以外のリポ蛋白を反応系外に導くことができることを見いだした。この界面活性剤を特定の濃度で自動分析装置用試薬の第１工程に用いた場合、酵素のsmall,dense LDLに対する反応速度が低下し、small,dense LDLと酵素の反応が遅延する。一方、上記特定濃度の特定の界面活性剤は、small，dense LDL以外のリポ蛋白に作用するため、これらを酵素と反応させることにより反応系外に導くことができる。本発明者等はさらにコレステロールエステラーゼの濃度を規定することにより該酵素のsmall,dense LDLに対する反応速度を低下させ、酵素反応を遅延させるのに対して、酵素のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に対する反応速度が上昇することを見いだした。このように、第1工程にてsmall,dense LDL以外のリポ蛋白を反応系外に導いた後、残ったsmall,dense LDLを第2工程にて酵素と反応させsmall,dense LDL中のコレステロールを測定することに成功し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。【０００９】
[１]  コレステロールエステラーゼおよび小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/Lの存在下で被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を消去する第１工程と、次いで前記第１工程で残存した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールを定量する第２工程を含む、被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１０】
[２]  第１工程で小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびラウリルアルコールアルコキシレートからなる群から選択される非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩およびリン酸エステル型からなる群から選択される陰イオン界面活性剤、アルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩およびモノ直鎖アルキル型からなる群から選択される陽イオン界面活性剤、またはラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、アミドベタイン型、イミダゾリン型及びアルキルジアミノエチルグリシンナトリウムからなる群から選択される両性界面活性剤であることを特徴とする[１]の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１１】
[３]  第１工程で用いるコレステロールエステラーゼの濃度が0.6〜3.0Ｕ/mLであることを特徴とする[１]または[２]の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１２】
[４]  第１工程において、さらにコレステロールオキシダーゼおよびカタラーゼを添加する、[１]から[３]のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１３】
[５]  第１工程において、さらにコレステロールオキシダーゼおよび４アミノアンチピリンを添加する、[１]から[３]のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１４】
[６]  第２工程において、少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下にコレステロール測定用酵素が添加されることを特徴とする、[１]から[５]のいずれかの被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１５】
[７]  第２工程で用いられる少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤が全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であることを特徴とする[６]の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１６】
[８]  第２工程で用いられる少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはポリアルキレンオキサイド誘導体であることを特徴とする[６]または[７]の小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１７】
[９]  第２工程で用いられる少なくとも小粒子低比重リポ蛋白に作用する界面活性剤をリポプロテインリパーゼの存在下で用いることを特徴とする[６]から[８]のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール定量方法。【００１８】
[１０]  コレステロールエステラーゼおよび小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/Lを組み合わせてなることを特徴とする被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白の消去剤。【００１９】
[１１]  コレステロールエステラーゼの濃度が0.6〜3.0Ｕ/mLである、[１０]の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白の消去剤。【００２０】
[１２]  コレステロールエステラーゼ、小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/L、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはポリアルキレンオキサイド誘導体、を組み合わせてなることを特徴とする小粒子低比重リポ蛋白定量用試薬。【００２１】
[１３]  第１試薬組成物および第２試薬組成物よりなる[１２]の小粒子低比重リポ蛋白定量用試薬であって、第１試薬組成物にコレステロールエステラーゼおよび小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤0.05〜1.0g/Lが含まれ、第２試薬組成物中にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、またはポリアルキレンオキサイド誘導体が含まれる小粒子低比重リポ蛋白定量用試薬。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の特定の界面活性剤を含む試薬をリポ蛋白質を含む被検体試料に添加することにより、リポ蛋白中のsmall,dense LDLをフィルターや遠心分離を用いた分離操作をすることなく、直接、選択的に測定することができる。【００２３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007-49533号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１におけるsmall,dense LDLを選択的に作用させる前にsmall,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことを示す、第1試薬反応における各リポ蛋白の反応性を示す図である。
【図２】第1工程の界面活性剤の濃度に対するsd LDL、Large LDLの反応性を示す図である。
【図３】コレステロールエステラーゼ活性を変動させた場合の、Large LDLおよびsmall,dense LDLに対する反応性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。【００２６】
リポタンパク質は大きくVLDL、LDLおよびHDLの分画に分けられ、LDLはさらにsmall,dense LDLとそれ以外の亜分画に分けられる。small,dense LDLを小粒子LDL 、SLDL(small LDL)、dense LDL、sd LDLと呼ぶこともあり、またそれ以外のLDLをLLDL(large LDL)、Light LDLと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがVLDLが30nm〜80nm（30nm〜75nm）で、LDLが22nm〜28nm(19nm〜30nm)、HDLが直径７〜10nmである。比重は、VLDLが1.006以下、LDLが1.019〜1.063、HDLが1.063〜1.21である。LDL粒子直径はグラジエントゲル電気泳動（GGE）(JAMA, 260, p.1917-21, 1988)、NMR（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、 Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS：TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定でき、比重は超遠心分離による分析(Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990)に基づいて決定できる。【００２７】
本発明の方法で測定しようとするsmall,dense LDLは、一般的にはLDL画分のうち直径が約22.0〜約25.5nmの亜分画、比重1.040〜1.063の亜分画を指す。LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、LDLのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、LDLの中でもより悪性度が高いので、LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。LDL内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重1.040〜1.063という値もsmall,dense LDLの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるLDLの比重範囲1.019〜1.063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では1.044〜1.060に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。small,dense LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のsmall,dense LDLの存在が臨床的な悪性度と関連している。【００２８】
本発明において、small,dense LDLという場合、LDLのうち比重が小さいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のLDLよりも大きいもの、好ましくはLDLの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重1.040〜1.063の範囲に属するLDLをいう。【００２９】
本発明の方法は通常、自動分析装置内で行われる。本発明の方法では第1工程にてsmall,dense LDL以外のLDL（以下Large LDL又はL LDLという場合がある）やその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白に作用する界面活性剤をコレステロールエステラーゼの存在下で被検体試料に作用させ、リポ蛋白からの遊離により生じたコレステロールをコレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロールと反応する酵素の存在下で該酵素と反応させ反応系外へ導く。ここで、「界面活性剤が作用する」とは、界面活性剤がリポ蛋白を分解し、リポ蛋白中のコレステロールが遊離することをいう。「小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤」という場合、界面活性剤に小粒子低比重リポ蛋白に全く作用しないことは要求されず、主に小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用すればよい。例えば、小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は、小粒子低比重リポ蛋白への作用が小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白への作用よりも小さい。【００３０】
上記第1工程にてsmall,dense LDL以外のLDL（以下Large LDLという）やその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白と反応する界面活性剤としては、非イオン界面活性剤としてポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ラウリルアルコールアルコキシレートが、陰イオン界面活性剤としてポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩、アミドエーテル硫酸塩、アルキルタウリン酸塩、リン酸エステル型、陽イオン界面活性剤としてアルキルメチルアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩、モノ直鎖アルキル型、両性界面活性剤としてラウリルベタイン、ジメチルアルキルベタイン、アミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられる。上記界面活性剤の具体例として、非イオン界面活性剤としてはエマルゲン120、エマルゲン920、エマルゲンB-66、エマルゲンA-90（以上花王社製）、ノニオンHS-220、ノニオンHS-215、ノニオンK-230、ノニオンNS-220、ノニオンNS-230、ナイミーンF-215、ナイミーンL-207、アデカトールLB-1520（以上旭電化社製）、陰イオン界面活性剤としてエマール20CM、エマール20T、エマールE27C、レベノールWX（以上花王社製）、サンアミドCF-3、サンアミドCF-10、ダイヤポンK、ダイヤポンF、ダイヤポンK-SF、パーソフトEF、パーソフトEFT、パーソフトEL、パーソフトEP、パーソフトEK、パーソフトSL、ポリスターOMP、アデカコールPS-440E、トラックスK-40（以上旭電化社製）、陽イオン界面活性剤としてコータミン24P（花王社製）、アデカミンMAC-30（旭電化社製）、両性界面活性剤としてアンヒトール24B（花王社製）、ニッサンアノンLG、ニッサンアノンBDF-R、ニッサンアノンBF、ニッサンアノンBL、ニッサンアノンBL-SF、ニッサンアノンGLM-R-LV等があげられる。上記界面活性剤を一定の濃度範囲で用いた場合、small,dense LDL以外のリポ蛋白に選択的に作用し、結果的にコレステロールエステラーゼのsmall,dense LDL中のコレステロールへの作用を抑制する。【００３１】
Small,dense LDLとそれ以外のリポ蛋白を差別化し、small,dense LDL以外のリポ蛋白を選択的に反応させるために上記界面活性剤の濃度を規定することが有効である。上記界面活性剤の第1工程中濃度として0.05g/L〜1.0g/Lが好ましく、0.1g/L〜0.8g/Lがより好ましく、0.3g/L〜0.6g/Lがさらに好ましい。上記界面活性剤の濃度が1.5g/L以上の場合、第１工程において界面活性剤がsmall,dense LDLに作用するため、small,dense LDLとそれ以外のリポ蛋白を差別化することが難しくなる。【００３２】
第１工程で上記界面活性剤およびコレステロールエステラーゼと作用・反応したリポ蛋白中のコレステロールはコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール反応酵素の存在下でこれらの酵素と反応させ反応系外へ導くことができる。本発明において、「反応系外に導く」とは、HDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等のことを言う。Large LDLやその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白中のコレステロールを反応系外へ導くことにより、次の工程でsmall,dense LDLのみが残存することになる。本発明においては、このようにsmall,dense LDL以外のリポ蛋白を反応系外へ導き、次の工程でsmall,dense LDL以外のリポ蛋白のコレステロールを検出できないようにすることを、「small,dense LDLとそれ以外のリポ蛋白を差別化する」ということがある。【００３３】
本発明において、「消去」とは被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「第１工程で被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を消去する」とは、被検体試料中の小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白を分解し、その分解産物である小粒子低比重リポ蛋白以外のリポ蛋白由来のコレステロールがその後の第２工程で検出されないようにすることをいう。消去するための方法としては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法、およびペルオキシダーゼを用いて水素供与体と過酸化水素を反応させ無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。【００３４】
また、上記界面活性剤の存在下でのコレステロールエステラーゼの濃度を規定することにより、さらにsmall,dense LDL以外のリポ蛋白の選択的消去が可能になる。第１工程中の試薬に含まれるコレステロールエステラーゼの濃度が上昇するにつれ、第１工程中ではまずLDLの中でもLarge LDLの酵素との反応性が上昇し反応系外へと導かれるが、small,dense LDLの酵素との反応性は上昇しない。さらに濃度が上昇すると第１工程でのsmall,dense LDLの酵素との反応性が上昇する。このことは、Large LDLと酵素との反応性が高くなり、small,dense LDLの酵素との反応性が低くなるような濃度でコレステロールエステラーゼを用いると選択的にsmall,dense LDLを測定し得ることを意味する。従って、コレステロールエステラーゼの濃度を規定することにより、より選択的にsmall,dense LDLを測定することができる。コレステロールエステラーゼの第1工程の反応系における濃度として0.6 U/mL〜3.0 U/mLが好ましく、0.9 U/mL〜2.4 U/mLがさらに好ましく、1.2 U/mL〜1.5 U/mLが特に好ましい。本発明におけるコレステロールエステラーゼとしてはコレステロールエステルを加水分解する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールエステラーゼを用いることができる。【００３５】
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼを用いることができる。コレステロールオキシダーゼの濃度は0.01〜20U/mLが好ましく、0.1〜1U/mLが特に好ましい。【００３６】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしてはコレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度は0.01〜200U/mLが好ましく、0.1〜100U/mLが特に好ましい。【００３７】
なお、第１工程の反応液中には、各種リポ蛋白に対する作用を調整するために、任意的にリポ蛋白分解酵素を加えることもできる。リポ蛋白分解酵素としては、ホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを用いることができる。【００３８】
ホスホリパーゼとしてはホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD、リゾホスホリパーゼ等を用いることができ、使用濃度は0.01〜10U/mLが好ましく、0.01〜5U/mLがさらに好ましく、0.01〜1U/mLが特に好ましい。【００３９】
リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼの使用濃度は0.01〜10U/mLが好ましく、0.01〜5U/mLがさらに好ましく、0.01〜1U/mLが特に好ましい。【００４０】
本発明の第２工程では第１工程で反応せずに残存したsmall,dense LDL中のコレステロールを定量すればよい。第１工程で反応せずに残存したsmall,dense LDL中のコレステロールを定量するには、従来のLDLの定量方法を用いることができ、例えば、LDL凝集剤を添加して形成されたLDL特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、LDL特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。このうち、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素を加えてその反応生成物を定量する方法が好ましい。Small,dense LDL中のコレステロールを定量するためには、少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤を用いればよい。少なくともsmall,dense LDLに作用する界面活性剤とはsmall,dense LDLのみに作用する界面活性剤でも良いし、small,dense LDL以外に他のリポ蛋白にも作用する界面活性剤または全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であっても良い。【００４１】
Small,dense LDLに反応する界面活性剤としてはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体を好適に用いることができる。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体として、例えばプルロニック17R-4、プルロニックL-64、プルロニックPE3100、プルロニックP-85、プルロニックF-88、プルロニックP-103、プルロニックF-127等のプルロニック（登録商標）系界面活性剤（BASF社、旭電化工業株式会社）などが挙げられる。【００４２】
全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤としては、総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤であればどれでも使用することができ、好ましい例としてHLBが11以上13未満、好ましくは12以上13未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体をあげることができる。【００４３】
また、上記のsmall,dense LDL以外のLDL（以下Large LDLという）やその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白と反応する界面活性剤を一定の濃度以上の濃度で用いてもよい。一定の濃度以上の濃度とは、例えば1.5g/L以上である。【００４４】
第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、好ましくは0.1〜100g/L程度であり、さらに好ましくは１〜50g/L程度である。【００４５】
コレステロールに反応するコレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを用いる場合、酵素反応により過酸化水素が生成する。発生した過酸化水素はペルオキシダーゼの存在下で水素供与体と水素受容体とのカップリング反応により形成される色素（有色キノン）により波長400〜700nmで測定することにより定量することができる。【００４６】
水素供与体としてはアニリン誘導体が好ましく、アニリン誘導体としてはN−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOOS）、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメチルアニリン（MAOS）、N−エチル−N−（3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOPS）、N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメトキシアニリン（HDAOS）、N−（3−スルホプロピル）アニリン（HALPS）、N−（3−スルホプロピル）−3−メトキシ−5−アニリン（HMMPS）等があげられる。水素供与体の使用濃度は最終濃度で0.1〜1.5mmol/Lが好ましい。【００４７】
水素受容体としては4−アミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用いることができる。【００４８】
コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合、酵素反応によりNAD（P）からNAD（P）Hが発生する。発生したNAD（P）Hは330〜400nmでの吸光度を測定することにより定量することができる。【００４９】
本発明にはイオン強度調整剤として1価の陽イオンおよび／または2価の陽イオンもしくはその塩を用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、small,dense LDLとLarge LDLを差別化しやすくなる。具体的には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、酢酸マグネシウム等を用いることができる。濃度は0〜100mmol／Lで使用される。【００５０】
反応温度は2℃〜45℃で行うことが好ましく、25℃〜40℃で行うことがさらに好ましい。【００５１】
反応時間は1〜30分間で行うことが好ましく、3〜15分で行うことがさらに好ましい。【００５２】
本発明の被検体試料として血清、血漿を使用することができるが、これらに限定されるものではない。【００５３】
本発明で用いる自動分析装置として、例えば、TBA-120FR・200FR(東芝)、JCA-BM1250・1650・2250（日本電子）、HITACHI7180・7700（日立）、AU2700（OLYMPUS）等が挙げられる。【００５４】
本発明の測定方法を実施するに当たり、用いる試薬を複数の試薬組成物に分けてもよい。本発明においては、試薬としてはsmall,dense LDL以外のLDLやその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白と反応する界面活性剤、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素、界面活性剤、過酸化水素を分解するカタラーゼ、過酸化水素からカップリング反応により色素を形成させるためのペルオキシダーゼ、水素供与体、緩衝液等が用いられる。これらの試薬の各試薬組成物への振り分けは、試薬の安定性等を考慮して適宜分配される。例えば、試薬を第１試薬組成物と第２試薬組成物の２つに分け、第１試薬組成物にsmall,dense LDL以外のLDLやその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白と反応する界面活性剤、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素等を含ませ、第２試薬組成物にSmall,dense LDLに反応する界面活性剤や全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤、例えばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロール測定用酵素の活性を上昇させるための界面活性剤等を含ませることができる。第２試薬組成物には、さらにホスホリパーゼ又はリポプロテインリパーゼを含ませてもよい。このような２つの試薬組成物を用いる場合、被検体試料に第１試薬組成物を添加し、１〜10分間、好ましくは５分間程度反応させたのち、第２試薬組成物を添加し、さらに１〜10分間、好ましくは５分間程度反応させ、形成された色素を定量すればよい。この場合、第１試薬組成物を添加してsmall,dense LDL以外のLDL（以下Large LDLという）やその他のVLDL、HDLなどのリポ蛋白を界面活性剤に作用させ、酵素と反応させる工程が第１工程であり、次いで第２試薬組成物を添加してsmall,dense LDLを界面活性剤に作用させ酵素と反応させ、small,dense LDL中のコレステロールを測定する工程が第２工程である。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００５６】
[実施例１]
small,dense LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤を含む試薬の例として、下記の組成を有する第１試薬組成物を調製した。【００５７】
2008105486.tif 000002
上記試薬組成物中、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルであるエマルゲンA-90がsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤である。【００５８】
本実施例では、第１試薬組成物の使用によりsmall,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールが定量反応系外に導かれたことを明らかにするため、TOOS、４−アミノアンチピリンの発色基質、ペルオキシダーゼ酵素等キノン色素形成に必要な成分を第１試薬組成物に加え、吸光度を測定した。従って本実施例では、本発明測定方法における第1工程でのsmall,dense LDL試薬の反応状態を確認した。【００５９】
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのカイロミクロン〜IDL分画、small,dense LDL分画、small,dense LDL以外のLDL分画、HDL分画、各4μLに第１試薬300μLを加え、37℃で5分間反応させたときの各時間における吸光度（反応タイムコース）を測定した。【００６０】
その結果を図１に示す。【００６１】
図１に示すように、本実施例では、界面活性剤の作用により反応液中の最初の５分間でカイロミクロン〜IDL分画、small,dense LDL以外のLDL分画（Large LDL）およびHDL分画とは高い反応性を示すが、small,dense LDLとの反応性は低い。つまりsmall,dense LDLコレステロール定量を行なう際、small,dense LDLを選択的に作用させる反応の前段階である第１工程において、本実施例で用いた界面活性剤をコレステロールと反応する酵素等と共に用いることにより、あらかじめsmall,dense LDL以外のリポ蛋白を酵素と反応させ、そのコレステロールを消去し、反応系外に導くことが可能となる。【００６２】
[実施例２]
第１試薬組成物中にsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤を含む、下記の組成を有する第１および第２試薬組成物を調製した。【００６３】
2008105486.tif 000003
第１試薬組成物中、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテルがsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤であり、0〜1.2g/Lで用い、それぞれの濃度でsmall,dense LDLに作用するか否かを確認した。【００６４】
また、第２試薬組成物中のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルは、10g/Lという高濃度で含まれ、small,dense LDLに作用する。【００６５】
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画、又はLarge LDL分画に第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた（第１工程）後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ（第２工程）、600nmにおける吸光度を測定した。コントロール試薬としてsmall,dense LDL、およびLarge LDL両方に反応する試薬として、LDL-EX N「生研」を使用した。【００６６】
その結果を図２に示す。【００６７】
図２に示すように界面活性剤を低濃度で添加した場合、small,dense LDLの吸光度がLarge LDLの吸光度よりも高い。濃度を上昇させるに従いLarge LDLの吸光度も上昇し差が認められなくなっていく。これは、界面活性剤濃度が低い場合、第１工程でsmall,dense LDL以外のリポ蛋白が反応系外に導かれ、結果的にsmall,dense LDLを正確に測定できることを示す。このことは実施例１に示すように、本発明の方法の第1工程において、界面活性剤濃度を低濃度で使用した場合、small,dense LDLよりもLarge LDLの方が選択的に消去され反応系外に導かれ、界面活性剤濃度を上昇することによりLarge LDLの消去量が減少し、small,dense LDLと同等となることを示している。このことは、界面活性剤の第1工程中の濃度を好ましくは0.05〜0.9g/L、より好ましくは0.3〜0.6g/Lの濃度で用いることによりsmall,dense LDL中のコレステロールを選択的に測定できることを示す。【００６８】
[実施例３]
第１試薬組成物中にsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に作用する各種界面活性剤を含む下記の組成を有する第１および第２試薬組成物を調製した。【００６９】
2008105486.tif 000004
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画、又はLarge LDL分画に第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた（第１工程）後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ（第２工程）、600nmにおける吸光度を測定した。コントロール試薬としてsmall,dense LDL、およびLarge LDL両方に反応する試薬としてLDL-EX N「生研」を使用した。【００７０】
第１試薬組成物中に含ませた各種界面活性剤とそれぞれの結果を表１に示す。第１工程で界面活性剤がLarge LDLに特異的に作用し、反応系外へと導かれた場合、表中のLarge LDLの吸光度が低くなる。また、第１工程で界面活性剤がsmall,dense LDLに作用しなかった場合、表中のsmall,dense LDLの吸光度が高くなる。【００７１】
表１に示すように、本実施例で用いた界面活性剤では第1工程でLarge LDLに特異的に作用し、Large1 LDLが反応系外へと導かれているため、small,dense LDLが選択的に測定されていることがわかる。【００７２】
表１は、各種界面活性剤を用いた場合の、small,dense LDL,Large LDLに対する反応性を示す表である。
【表１】
2008105486.tif 000005
【００７３】
[実施例４]
リポ蛋白に作用させるコレステロールエステラーゼ酵素活性（酵素濃度）を変化させた以下の試薬組成物を調製した。【００７４】
2008105486.tif 000006
【００７５】
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画、Large LDL分画、各4μLに第１試薬300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。【００７６】
その結果を図３に示す。【００７７】
図３に示すように、試薬中のコレステロールエステラーゼ活性が増加するにつれ、まずLarge LDLの吸光度が低下し、さらにコレステロールエステラーゼ活性が増加すると、遅れてsmall,dense LDLの吸光度が低下する。従って、適当なコレステロールエステラーゼ濃度を規定することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。コレステロールエステラーゼの第1工程中の濃度を好ましくは0.6〜3.0Ｕ/mL、より好ましくは0.9〜2.4Ｕ/mL、さらに好ましくは0.9〜1.5Ｕ/mLの濃度で用いることによりsmall,dense LDL中のコレステロールを選択的に測定できる。【００７８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2008105486.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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