【手続補正書】
【提出日】平成15年5月19日(2003.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
ペプチド、ポリエーテルなどのような一般的なリンカーはまた、タグとして役立ち得、そしてこれらとしては、約５〜２００の間のアミノ酸のポリＧｌｙ配列のような、ポリペプチド配列を含む（配列番号３４）。このような可撓性のリンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じてアミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有する。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
【化７】
2005507633.tif 000001
（１４）（配列番号３５）を用いて増幅して、８００ｂｐのフラグメントを生成した。後者のオリゴは、予想Ｓｌｏ２終止コドンおよびＳｌｏ２コードの３’末端（太字）、ならびに５’末端にサブクローニングのためのＸｂａＩ部位を含む。Ｓｌｏ２に対応する太字の配列のみを、Ｓｌｏ２を増幅するために用いることに注目すべきである。これらのフラグメントを、２回の標準的なオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、単一のフラグメントにアセンブルした。初めに、５’および中央のフラグメントを混合し、そしてオリゴ９および１２を用いて増幅して、約２．８Ｋｂのフラグメントを生成した。同様に、中央および３’末端のフラグメントを混合し、そしてオリゴ１１および１４を用いて増幅して、約２．３Ｋｂのフラグメントを生成した。次いで、これらの２つのより大きなフラグメントを混合し、そしてオリゴ９および１４を用いて増幅して、全ての既知のヒトＳｌｏ２配列を含む３．５Ｋｂのフラグメントを生成した。このフラグメントをプラスミドベクターにクローン化し、そして複数のクローンを配列決定して、この領域に関する最終的なヒトＳｌｏ２配列を決定した。Ｓｌｏ２のコード領域を増幅するために用いた条件は、Ｓｌｏ２  ＲＡＣＥ反応について上記した条件に類似した。１つの顕著な例外は、所望のフラグメントの大きなサイズに起因して、より長い伸長時間（４分）がオーバーラップ反応の間に許容されたことである。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５０】
【化８】
2005507633.tif 000002
（１５）（配列番号３６）およびアンチセンスオリゴ５’−ＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡ−３’（１６）（配列番号２０）を用いて増幅した。Ｓｌｏ２に一致する１５の太字の塩基のみを、Ｓｌｏ２の増幅のために用い；５’の塩基は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を追加し、そして発現ベクター構築のためにのみ含まれる。第１のフラグメントおよび３．５ＫｂのＳｌｏ２クローン中の固有のＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位をオーバーラップした約４００ｂｐの第２のフラグメントを、オリゴ５’−ＣＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡ−３’（１７）（配列番号２１）および５’−ＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＧＣＴＧ−３’（１８）（配列番号２２）を用いて増幅した。これらの２つのフラグメントを混合し、そしてオリゴ１５および１８を用いて増幅して、Ｓｌｏ２の開始メチオニンおよび固有のＳｌｏ２  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位の両方を含む、約５５０ｂｐのフラグメントを生成した。このフラグメントを、標準的なプラスミドにクローン化し、そして３つのクローンを配列決定した。各クローンは、本発明者らのｃＤＮＡおよびゲノム情報から導き出したコンセンサスヒトＳｌｏ２と同一であった。次いで、５’末端フラグメントおよび３．５Ｋｂ  Ｓｌｏ２フラグメントを、標準的なＤＮＡクローニング法によって、これらに共通するＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位で連結することにより、全長Ｓｌｏ２コード領域をアセンブルした。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
【化９】
2005507633.tif 000003
（２０）（配列番号３７）を用いて約１．５Ｋｂのフラグメントを増幅することによって、同じ遺伝子から生じたことを確認した。この増幅したクローンは、ＢＬＡＳＴ検索により同定した４つのクローンの全てに対して同一の配列を含んでいた。これはまた、その長さ全体にわたってヒトＳｌｏ２およびラットＳＬＡＣＫに対する高度な相同性を有していた。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
【化１０】
2005507633.tif 000004
（２４）（配列番号３８）、および終止コドンをオーバーラップするアンチセンスオリゴ、オリゴ番号２０を用いて、単一のフラグメントにおいて増幅した。オリゴ２０および２４において太字で列挙した塩基のみが、Ｓｌｏ４  ＤＮＡ配列に一致する。オリゴ２０において、５’末端の更なる塩基は、サブクローニングを補助するためにＸｂａＩ制限部位を付加する。オリゴ２４において、５’末端の更なる塩基は、サブクローニングのためのＭｕｎＩ部位、およびＳｌｏ４メチオニンコドンでの翻訳開始を促進するためのＫｏｚａｋ配列を付加する。太字で与えた領域のみが、Ｓｌｏ４の増幅のために用いられ；他の塩基は、増幅を得るために存在する必要はない。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
図１は、完全なヒトＳｌｏ２アミノ酸配列（配列番号２）の、ラットＳＬＡＣＫ（配列番号３２）および部分的なヒトｃＤＮＡ  ＫＩＡＡ１４２２（配列番号３３）のアミノ酸配列に対するアミノ酸整列である。同一の残基には影が付けられ、そしてアミノ酸の数は、左側の余白に与えられる。ヒトＳｌｏ２およびラットＳＬＡＣＫは、９３％同一であり、そして恐らく、オーソロガス遺伝子である。ヒトＳｌｏ２とラットＳＬＡＣＫとの間の分岐のパターンは、オーソロガスカリウムチャネルに関して代表的ではない。ＫＩＡＡ１４２２は、ｈＳｌｏ２遺伝子由来の部分的なｃＤＮＡであるが、いくらかの主要な様式で異なる。第１に、ＫＩＡＡ１４２２は、ヒトＳｌｏ２およびラットＳＬＡＣＫのアミノ末端からの高度な分岐である、代替のアミノ末端を有する。ＫＩＡＡ１４２２はまた、明らかに、３’末端において短縮される。ヒトＳｌｏ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＫＩＡＡ１４２２またはラットＳＬＡＣＫから容易には推定され得ない。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
図２は、ヒトＳｌｏ２（配列番号２）およびヒトＳｌｏ４（配列番号４）のアミノ酸整列である。同一の残基には影が付けられ、そしてアミノ酸の数は、左側の余白に与えられる。６つの推定膜貫通ドメインに、実線で下線が引かれる。カリウムチャネル「シグネチャー配列」またはポアループに、点線で下線が引かれる。破線は、Ｓｌｏチャネルのカルシウムおよび塩化物のゲーティングに関与したテイル領域を示す（Ｙｕａｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７７１−７７９（２０００）；Ｗｅｉら、Ｎｅｕｒｏｎ，１３：６７１−６８１（１９９４））。これら２つのアミノ酸配列は、約７０％同一である。