(57)【要約】動脈硬化性疾患の予防及び治療薬の提供、並びに動脈硬化性疾患を検出するための方法及び試薬の提供。サリューシン−αを有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤、サリューシン−βのアンタゴニストを有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤、及び生体試料中のサリューシン−αを測定することを含む、動脈硬化性疾患を検出する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリューシン−αを有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤。
【請求項２】
サリューシン−βのアンタゴニストを有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤。
【請求項３】
サリューシン−βのアンタゴニストが抗サリューシン−β抗体である請求項２に記載の動脈硬化性疾患治療剤。
【請求項４】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化性疾患治療剤。
【請求項５】
サリューシン−αとサリューシン−βのアンタゴニストとを含有する動脈硬化性疾患治療用組成物。
【請求項６】
サリューシン−βのアンタゴニストが抗サリューシン−β抗体である請求項５記載の動脈硬化性疾患治療用組成物。
【請求項７】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項５又は６に記載の動脈硬化性疾患治療用組成物。
【請求項８】
生体試料中のサリューシン−αを測定することを含む、動脈硬化性疾患を検出する方法。
【請求項９】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項８記載の動脈硬化性疾患を検出する方法。
【請求項１０】
生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される請求項８又は９に記載の動脈硬化性疾患を検出する方法。
【請求項１１】
生体試料中のサリューシン−αを測定することを含む、動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
【請求項１２】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項１１記載の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
【請求項１３】
生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される請求項１１又は１２に記載の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
【請求項１４】
サリューシン−αからなる、動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
【請求項１５】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項１４記載の動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
【請求項１６】
抗サリューシン−α抗体を含む、サリューシン−αを動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカーとして用いる、動脈硬化性疾患の検出用試薬。
【請求項１７】
動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される請求項１６記載の動脈硬化性疾患の検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サリューシン−α又はサリューシン−βをターゲットとして、動脈硬化性疾患を予防又は治療する薬剤に関し、さらに、サリューシン−αをターゲットとして、動脈硬化性疾患を検出する方法及び検出薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
平成１７年（２００５年）の厚生労働省人口動態統計によると、本邦のがんによる死亡者数は３２万６千人で死因の第一位を占める。がんに続き、死因の第二位を心臓病（１７万３千人）、第三位を脳卒中（１３万３千人）が占める。心臓病と脳卒中による死亡者数を合計するとほぼがんによる死亡者数に匹敵する。その中で特に、心臓病の代表である虚血性心疾患や、脳卒中の代表的病型である脳梗塞は動脈硬化を基礎病態として発症する。従って動脈硬化の発症・進展を予防することは、国民の健康維持、増進に重要な意味をもつ。
動脈硬化の初期病変に特徴的な病理所見に、細胞内にコレステロールエステルを蓄積したマクロファージ由来泡沫細胞の集積がある。マクロファージは種々のスカベンジャー受容体を介して酸化低密度リポタンパク質（酸化ＬＤＬ）などの変性ＬＤＬを細胞内に取込む。酸化ＬＤＬの主要コレステロールであるコレステロールエステルはリソソームで遊離コレステロールと脂肪酸に分解される。細胞内の遊離コレステロールが過剰になると、２つの機構により調節を受ける。第１はＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａ１（ＡＢＣＡ−１）による細胞外へのコレステロールの排出（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ）で、第２はａｃｙｌ−ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１（ＡＣＡＴ−１）によるコレステロールエステルへの変換である。コレステロールエステルが細胞質に蓄積するとマクロファージは泡沫細胞に変化し、動脈硬化の初期病変が形成される。
動脈硬化の初期病変に特徴的な病理所見に、細胞内にコレステロールエステルを蓄積したマクロファージ由来泡沫細胞の集積がある。マクロファージ由来泡沫細胞は種々のサイトカインを分泌し、血管平滑筋細胞の動脈中膜から内膜への遊走や内膜における増殖を誘導する。内膜に遊走した血管平滑筋細胞は細胞外マトリックスを合成分泌し、その結果内膜が肥厚する。内膜の肥厚によって血管内腔は狭窄し血流が減少する。動脈硬化の中期以降には血管平滑筋細胞に由来する泡沫細胞も認められる。
サリューシン（ｓａｌｕｓｉｎ）はバイオインフォマティックス解析によって最近同定された循環調節性物質であり、サリューシン−αとサリューシン−βの２種類の関連ペプチドがある（非特許文献１を参照）。東京医科歯科大学の七里らは、ヒトのｃＤＮＡデータベースを検索し、明らかなシグナル配列を有する分泌性タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングした。これらの遺伝子を培養血管内皮細胞にトランスフェクションし、その培養上清を培養血管平滑筋細胞に添加して細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を誘導する遺伝子としてサリューシンを同定した（非特許文献２を参照）。サリューシン−αは２８個のアミノ酸からなり、サリューシン−βは２０個のアミノ酸からなる。これらは前駆体であるプレプロサリューシン（Ｐｒｅｐｒｏｓａｌｕｓｉｎ）のプロセッシングにより生成する。プレプロサリューシンは２４２個のアミノ酸から構成され、早期発症型捻転ジストニアＴｏｒｓｉｏｎ  ｄｙｓｔｏｎｉａの原因遺伝子として報告されたＴＯＲ１Ａ（ＤＹＴ１）の関連遺伝子であるＴＯＲ２Ａ遺伝子が選択的スプライシングを受けてｆｒａｍｅ  ｓｈｉｆｔが生じることにより生合成される。Ｎ末端にアミノ酸２６個のシグナル配列を有し、２１６アミノ酸のＰｒｏｓａｌｕｓｉｎのＣ末端側から２つのサリューシンが生合成されると推測されている。サリューシン−α及びサリューシン−βはともにヒト血管壁細胞、内分泌・中枢神経系等に発現の分布が認められている。最近では、ヒト血清中及び尿中のサリューシン−αの濃度はラジオイムノアッセイにて測定可能であり、健常人ではそれぞれ２３．３±８．１ｐＭ、１５６．８±９５．８ｐＭであった（非特許文献３を参照）。その主な作用として、強力な血圧降下作用及び心拍数減少作用（β＞α）、下垂体からのバソプレッシン分泌促進作用（βのみ）とともに血管平滑筋細胞及び線維芽細胞に対する増殖促進作用（β＞α）がラットにおいて確認されている。
【非特許文献１】Ｓｈｉｃｈｉｒｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３；９：１１６６−１１７２．
【非特許文献２】七里眞義、医学のあゆみ  Ｖｏｌ．２１０，Ｎｏ．４  ２００４．７．２４，ｐ．２６７−２７０
【非特許文献３】Ｓａｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００６；２７：２５６１−２５６６．
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、動脈硬化性疾患の予防及び治療薬の提供を目的とし、さらに動脈硬化性疾患を検出するための方法及び試薬の提供を目的とする。
本発明者らは、血圧や心拍数などを制御する新規血管作動性物質サリューシンは、既知の血管作動性物質であるウロテンシンＩＩやセロトニンと同様にマクロファージに作用してマクロファージの泡沫化に影響を与え、動脈硬化病変の形成に何らかの役割を担っているのではないかと推測した。そこで、本発明者等は、マクロファージ泡沫化の制御並びにそれに必要不可欠な酵素であるＡＣＡＴ−１の発現調節に焦点をあて、サリューシン−α並びにサリューシン−βの効果を検討することにより、動脈硬化病変形成においてサリューシンが病態生理学的に一定の役割を担っていることを見出した。具体的には、本発明者等は、サリューシン−αがマクロファージの泡沫化を抑制することにより、動脈硬化の病変形成を抑制し、さらにサリューシン−βがマクロファージの泡沫化を促進することにより、動脈硬化の病変形成を促進することを見出し、サリューシン−βの作用を抑制し得る化合物又はサリューシン−αが動脈硬化性疾患の予防又は治療に用いることができることを見出した。また、動脈硬化病変と生体試料中のサリューシン−αの濃度に逆相関関係があり、サリューシン−αを動脈硬化性疾患の検出のマーカーとして用いることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  サリューシン−α又はサリューシン−αのアゴニストを有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤。
［２］  サリューシン−βのアンタゴニストを有効成分として含む動脈硬化性疾患治療剤。
［３］  サリューシン−βのアンタゴニストが抗サリューシン−β抗体である［２］の動脈硬化性疾患治療剤。
［４］  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される［１］〜［３］のいずれかの動脈硬化性疾患治療剤。
［５］  サリューシン−α若しくはサリューシン−αのアゴニストとサリューシン−βのアンタゴニストとを含有する動脈硬化性疾患治療用組成物。
［６］  サリューシン−βのアンタゴニストが抗サリューシン−β抗体である［５］の動脈硬化性疾患治療用組成物。
［７］  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される［５］又は［６］の動脈硬化性疾患治療用組成物。
［８］  生体試料中のサリューシン−αを測定することを含む、動脈硬化性疾患を検出する方法。
［９］  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される［８］の動脈硬化性疾患を検出する方法。
［１０］  生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される［８］又は［９］の動脈硬化性疾患を検出する方法。
［１１］  生体試料中のサリューシン−αを測定することを含む、動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
［１２］  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される［１１］の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
［１３］  生体試料が、血清、血漿及び尿からなる群から選択される［１１］又は［１２］の動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法。
［１４］  サリューシン−αからなる、動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
［１５］  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される［１４］の動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカー。
［１６］  抗サリューシン−α抗体を含む、サリューシン−αを動脈硬化性疾患を検出するための診断用マーカーとして用いる、動脈硬化性疾患の検出用試薬。
［１７］  動脈硬化性疾患が急性冠症候群、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症及び閉塞性動脈硬化症からなる群から選択される［１６］の動脈硬化性疾患の検出用試薬。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−１２７１３１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、サリューシン−αとサリューシン−βの関係とアミノ酸配列を示す図である。
図２Ａは、ヒト単球由来マクロファージにおけるａｃｙｌ−ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１（ＡＣＡＴ−１）タンパク質発現に対するサリューシンα及びサリューシンβの用量依存的効果を示す図であり、サリューシン０〜０．６ｎＭの用量依存的効果を示す図である。
図２Ｂは、ヒト単球由来マクロファージにおけるＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対するサリューシンα及びサリューシンβの用量依存的効果を示す図であり、サリューシン０〜１０ｎＭの用量依存的効果を示す図である。
図３は、ヒト単球由来マクロファージの分化段階におけるＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの時間依存的効果を示す図である。
図４は、ＡＣＡＴ活性の測定の原理を示す図である。
図５は、ヒト単球由来マクロファージのＡＣＡＴ活性に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を示す図である。
図６は、ヒト単球由来マクロファージのＡＣＡＴ−１  ｍＲＮＡ発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を示す図である。
図７は、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙの原理を示す図である。図中、ＣＥはｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒを示す。
図８は、ヒト単球由来マクロファージの泡沫化（コレステロールエステル［ＣＥ］蓄積）に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を示す図である。
図９は、スカベンジャー受容体クラスＡ（ＳＲ−Ａ）活性の測定の原理を示す図である。
図１０は、ヒト単球由来マクロファージのスカベンジャー受容体クラスＡ（ＳＲ−Ａ）活性に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を示す図である。図１０ＡはＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を、図１０ＢはＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す。
図１１は、ヒト単球由来マクロファージにおけるＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａ１（ＡＢＣＡ−１）タンパク質発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を示す図である。図１１Ａはサリューシン−αの結果を、図１１Ｂはサリューシン−βの結果を示す。
図１２は、分化した培養ヒト単球由来マクロファージのＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を示す図である。図１２Ａはサリューシン−αの結果を、図１２Ｂはサリューシン−βの結果を示す。
図１３は、ヒト冠動脈の動脈硬化病変におけるサリューシン−βの発現を示す写真である。写真ＢはＡの、ＤはＣの強拡大像である。図１３Ａ〜Ｄ中のバーは、それぞれ１．０ｍｍ、１００μｍ、２００μｍ及び２００μｍである。急性冠症候群（ＡＣＳ）で死亡した患者（７２歳、男性）の左冠動脈前下行枝において粥腫（ｐｌａｑｕｅ）部の平滑筋細胞（図１３Ｂ中の１）および線維芽細胞（図１３Ｂ中の２）に加え、右冠動脈の脂肪斑（ｆａｔｔｙ  ｓｔｒｅａｋ）内のマクロファージ由来泡沫細胞（図１３Ｄ中の３）および中膜内の線維芽細胞（図１３Ｄ中の４）にもサリューシン−βの強発現を認めた。
図１４は、中高年齢層男性における血清サリューシン−α濃度と頚動脈硬化の指標である内膜中膜複合体厚の最大値（最大ＩＭＴ）との関係を示す図である。
図１５は、虚血性心疾患（安定労作性狭心症、急性冠症候群［ＡＣＳ］、陳旧性心筋梗塞）患者、高血圧患者、健常者の血清サリューシン−α濃度の比較を示す図である。安定労作性狭心症はＡＣＳの既往が無く、ＡＣＳは発症６時間以内で、陳旧性心筋梗塞はＡＣＳ発症後６ヶ月以上経過している症例を選んだ。
図１６は、急性冠症候群（ＡＣＳ）患者において、冠動脈硬化を示す１枝病変（１−ＶＤ）群、２枝病変（２−ＶＤ）群、３枝病変（３−ＶＤ）群の血清サリューシン−α濃度を示す図である。
図１７−１は、アポＥ欠損マウスの大動脈での動脈硬化病変に対するサリューシン−βの効果を示す写真である。Ａ−Ｅは、オイルレッド０で染色された大動脈弓の動脈硬化病変を示す。Ｆ−Ｊは大動脈近位部横断切片のオイルレッド０染色を示す。
図１７−２は、アポＥ欠損マウスの大動脈での動脈硬化病変に対するサリューシン−βの効果を示す図であり、オイルレッド０で染色された大動脈弓の動脈硬化病変の面積を各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図１７−３は、アポＥ欠損マウスの各群１１匹で測定した血液データの平均値±ＳＥＭを示す。
図１８−１は、アポＥ欠損マウスの大動脈での動脈硬化病変に対するサリューシン−αの効果を示す図である。Ａ−Ｃは、オイルレッド０で染色された胸部大動脈の動脈硬化病変を示す。Ｄ−Ｆは大動脈近位部横断切片のオイルレッド０染色を示す。
図１８−２は、アポＥ欠損マウスの大動脈での動脈硬化病変に対するサリューシン−αの効果を示す図であり、オイルレッド０で染色された胸部大動脈の動脈硬化病変の面積を各群５匹で測定した平均値±ＳＥを示す。
図１８−３は、アポＥ欠損マウスの各群８匹で測定した血液データの平均値±ＳＥＭを示す。
図１９Ａは、アポＥ欠損マウスのマクロファージの泡沫化を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図１９Ｂは、アポＥ欠損マウスのマクロファージでのｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘに対するサリューシン−αおよび−βの作用を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図２０Ａは、アポＥ欠損マウスのマクロファージのＣＤ３６の発現に対するサリューシン−αおよび−βの作用を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図２０Ｂは、アポＥ欠損マウスのマクロファージのＳＲ−Ａの発現に対するサリューシン−αおよび−βの作用を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図２０Ｃは、アポＥ欠損マウスのマクロファージのＡＣＡＴ１の発現に対するサリューシン−αおよび−βの作用を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図２０Ｄは、アポＥ欠損マウスのマクロファージのＡＢＣＡ１の発現に対するサリューシン−αおよび−βの作用を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図２０Ｅは、アポＥ欠損マウスのマクロファージのＡＢＣＧ１の発現に対するサリューシン−αおよび−βの作用を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
図２０Ｆは、アポＥ欠損マウスのマクロファージのＳＲ−ＢＩの発現に対するサリューシン−αおよび−βの作用を示す図である。データは各群６匹で測定した平均値±ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
サリューシン−αは、２８残基のアミノ酸からなるペプチドであり（配列番号１）、又は該２８残基のアミノ酸からなるペプチドのＣ末端側にアミド化されたグリシンを有する２９残基のアミノ酸からなるペプチド（配列番号２）である。また、サリューシン−βは、２０残基のアミノ酸からなるペプチドである（配列番号３）。サリューシン−α及びサリューシン−βは、２４２アミノ酸からなるプレプロサリューシン（配列番号４）からプロセシングにより生じる。該プレプロサリューシンのＮ末端の２６アミノ酸からなるシグナル配列が削除されて２１６アミノ酸からなるプロサリューシンが生じ、さらにプロサリューシンのＣ末端側からサリューシン−α及びサリューシン−βが生じる。図１にサリューシン−αとサリューシン−βの関係（図１Ａ）とアミノ酸配列（図１Ｂ）を示す。
サリューシン−αは、マクロファージの泡沫化を抑制し、サリューシン−βは、マクロファージの泡沫化を促進する。マクロファージの泡沫化とは、マクロファージが酸化ＬＤＬを取り込むことにより起こり、血管内皮において脂質の沈着をもたらす現象である。マクロファージの泡沫化は、細胞内でのコレステロールエステルの生成・蓄積に起因する。酸化ＬＤＬがマクロファージの種々のスカベンジャー受容体を介して取り込まれ、酸化ＬＤＬ由来のコレステロールから産生されたコレステロールエステルが細胞内に蓄積する結果、マクロファージの泡沫化が生じる。マクロファージが泡沫細胞に変化すると、粥腫の形成等動脈硬化性疾患の初期病変が形成される。
サリューシン−αは、マクロファージの泡沫化を抑制することにより、動脈硬化性疾患の病変形成を抑えるので、サリューシン−αは動脈硬化性疾患の予防又は治療に用いることができる。また、サリューシン−αのアゴニストもサリューシン−αと同様に動脈硬化性疾患の予防又は治療に用いることができる。ここで、サリューシン−αのアゴニストとは、サリューシン−αの作用を促進するあらゆる化合物が含まれる。例えば、サリューシン−αの受容体に結合し、サリューシン−αと同様の作用を示す化合物やアゴニスティックな活性を有する抗サリューシン−α受容体抗体等が挙げられる。
一方、サリューシン−βは、マクロファージの泡沫化を促進するので、動脈硬化病変形成に促進的に働く。従って、サリューシン−βに結合しサリューシンβの作用を抑制するサリューシン−βのアンタゴニストはサリューシン−βのマクロファージ泡沫化作用を抑制し、動脈硬化性疾患の病変形成を抑制し得るので、サリューシン−βのアンタゴニストを動脈硬化性疾患の予防又は治療に用いることができる。本発明において、サリューシン−βのアンタゴニストとは中和抗体や受容体拮抗剤の如くサリューシン−β又はサリューシン−βの受容体に結合し、生体においてサリューシン−βの作用を抑制するあらゆる化合物を含む。
動脈が、動脈硬化の危険因子のため内膜中膜複合体厚（ＩＭＴ；Ｉｎｔｉｍａ  Ｍｅｄｉａ  Ｔｈｉｃｈｅｎｅｓｓ）が厚くなり弾力性が失われて硬くなったり、内部にコレステロールエステルが沈着して（粥腫の形成）、血管の通り道が狭くなったり（狭窄）、詰ったり（閉塞）、あるいは動脈壁が部分的に拡張したり（動脈瘤）、動脈全体が拡張したり（拡張症）、内膜に亀裂が入り中膜が裂けたり（解離）、破裂する（出血）ことにより、組織や臓器全体に血行障害を起こす病気を総称して動脈硬化性疾患といい。本発明においては、これらの動脈硬化性疾患のみならずこれらに起因する急性冠症候群（ＡＣＳ；ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋梗塞若しくは狭心症である虚血性心疾患、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症等の予防又は治療を動脈硬化性疾患の予防又は治療という。ここで、急性冠症候群とは、動脈硬化性の粥腫（プラーク）の破裂により血栓が形成され、冠動脈の血流が極端に減少又は途絶して生じる病態をいい、臨床的には不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓突然死等が含まれる。また、動脈硬化は大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールエステル（融点：４０℃）が粥状に蓄積してアテロームプラーク（粥状硬化斑）ができ、次第に肥厚することで動脈の内腔を狭めるアテローム硬化、高血圧による変化で、脳や腎臓の中の細い動脈に起き易く、詰まったり（梗塞）、血管の壁全体が破裂して出血する細動脈硬化、動脈の中膜にカルシウムがたまって硬くなり、中膜が脆くなりメンケルベルグ型硬化を含む。また、本発明は主に動脈壁の肥厚やプラークの形成の予防又は治療に用いることもできる。
サリューシン−βのアンタゴニストとしては、サリューシン−βの作用を抑制するあらゆる化合物が含まれるが、例えば、アンタゴニスティックな活性を有する抗サリューシン−β抗体が挙げられる。
サリューシン−αは、アミノ酸配列情報に従って、化学合成により作製することができ、あるいは遺伝子工学的に作製することができる。また、配列番号１に表わされるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、サリューシン−αの活性を有するペプチドを本発明の動脈硬化性疾患の予防又は治療薬として用いることができる。ここで、１個又は数個とは、１〜３個、好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個である。
抗サリューシン−β抗体は、公知の方法により、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができ、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法により、以下のようにして作製できる。すなわち、サリューシン−β又はその断片ペプチドを感作抗原として用いて、公知の免疫方法により免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、公知のスクリーニング法により、モノクローナル抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって作製することができる。サリューシンβを免疫する際、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン等のキャリアタンパク質と結合させて用いてもよい。モノクローナル抗体としては、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０；１９２：７６７−７７５．参照）。この際、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖及びＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。また、トランスジェニック動物を使用することにより、組換え型抗体を産生することもできる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９４；１２：６９９−７０２）。
本発明の抗サリューシン−β抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体をも含む。このような抗体としてはキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体が挙げられ、いずれも公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを得て、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体ともいう。ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、公知の方法により作製することができる（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
ヒト抗体は、例えばヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に抗原を投与することにより得ることができる。該トランスジェニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号パンフレットに記載されている。
本発明の抗サリューシン−β抗体は、完全抗体だけでなく、その機能的断片も含む。抗体の機能的断片とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するものを意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる［Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ］。
得られた抗体が、サリューシン−βに対してアンタゴニスト活性を有するか否かは、例えば、抗体をサリューシン−βに結合させ、サリューシン−βの活性が抑制されるか否かを検定することにより、決定することができる。
サリューシン−α又はサリューシン−βに対するアンタゴニスティック活性を有する化合物は、動脈硬化性疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。また、投与時期としては、動脈硬化性疾患の臨床症状が生ずる前後いずれでもよい。
本発明の予防又は治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
本発明のサリューシン−α又はサリューシン−βに対するアンタゴニスティック活性を有する化合物を含む動脈硬化性疾患の予防又は治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。実際の添加物は、本発明の予防又は治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。
さらに、本発明の動脈硬化性疾患の予防又は治療剤は、サリューシン−αに加えサリューシン−βに対するアンタゴニスティック活性を有する化合物を組合せて含んでいてもよい。
本発明は、さらに生体試料中のサリューシン−αを測定することにより、生体試料を採取した被験体が動脈硬化性疾患に罹患しているか否かを検出する方法、動脈硬化性疾患の重症度を判定する方法、及び動脈硬化性疾患に罹患するリスクを評価する方法を包含する。特に、急性冠症候群の検出に好適に用いることができる。
生体試料としては、全血、血清、血漿、尿等が挙げられる。これらの生体試料中のサリューシン−αを定量又は定性により測定すればよい。
生体試料をそのまま用いて該試料中のサリューシン−αを測定することもできるが、生体試料中のサリューシン−αの含有量は低いので、好ましくは生体試料からサリューシン−αを濃縮又は単離し測定する。単離濃縮は、例えば、血清、血漿又は尿から固相抽出により行うことができる。ここで固相抽出とは、化学結合型シリカゲル、ポーラスポリマー、アルミナ、活性炭等の固定相（固相、吸着剤）を用いながら複雑な組成を有する試料中から特定の目的成分のみを選択的に抽出し、分離・精製を行っていく手法のことをいい、これにより試料中の夾雑物を除去することができる。固相抽出には、逆相分配クロマトグラフィー用固定相、イオン交換クロマトグラフィー用固定相等を広く用いることができる。逆相クロマトグラフィー用固定相として、オクダデシルシリル基（Ｃ１８）、オクチル基（Ｃ８）、ブチル基（Ｃ４）、トリメチル基（Ｃ３）、フェニル基（Ｐｈ）、ブチル基、トリアコンチル基（Ｃ３０）等の基を有する充填剤を用いることができ、この中でもオクタデシルシリル基（Ｃ１８）またはオクチル基（Ｃ８）を有する充填剤が好ましい。固相抽出に使用するカートリッジは、市販品である、シリンジ型固相カートリッジや、ディスク型固相カートリッジを使用することができる。市販のカートリッジタイプのものとして、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、Ｗａｔｅｒｓ社）、Ａｕｔｏｐｒｅｐ（登録商標、昭和電工社）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＤＳＣ−１８（ＳＵＰＥＬＣＯ社）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＤＳＣ−８（ＳＵＰＥＬＣＯ社）等が挙げられる。サリューシン−αを溶出させる際に用いる溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフランが挙げられる。生体試料は、固相抽出処理の前に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性処理し、次いで遠心分離を行い、上清を用いればよい。
また、前処理した生体サンプルを逆相クロマトグラフィーカラムを用いたＨＰＬＣにより単離精製してもよい。
サリューシンの測定は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、蛍光測定法等の免疫学的測定法により行うことができる。この際、１２５Ｉ等の放射性同位元素、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）等の蛍光物質で標識した抗サリューシン−α抗体を用いればよい。これらの免疫学的測定は公知の方法で行うことができる。例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレートのウェル等の固相担体に抗サリューシン−α抗体等のサリューシン−αに結合性を有する第１のリガンドを固相化し、固相に結合された抗サリューシン−α抗体等のサリューシン−αに結合性を有する第１のリガンドと、生体試料を反応させ、試料中のサリューシン−αを、抗原抗体反応等のリガンド−レセプター結合反応により前記固相に結合された第１のリガンドを介して固相に結合させる。次いで、洗浄後、サリューシン−αに結合性を有する第２のリガンドを、前記固相に結合された検体中のサリューシン−αと反応させる。すなわち、固相に結合された抗サリューシン−α抗体等のサリューシン−αに結合性を有する第１のリガンド−サリューシン−α−第２のリガンドの複合体を形成させる。サリューシン−αに結合性を有する第２のリガンドとしては抗サリューシン−α抗体等を用いることができる。次いで、洗浄後、固相に結合された第２の抗サリューシン−α抗体等のサリューシン−αに結合性を有する第２のリガンドを測定する。これは、免疫分析の分野において定用されている種々の方法により行うことができる。例えば、サリューシン−αに結合性を有する第２のリガンドを、酵素、蛍光、ビオチン、放射標識等で標識して酵素標識体を作製しておき、これらの標識を測定することにより固相に結合したサリューシン−αに結合性を有する第２のリガンドを測定することができる。
サリューシン−αの測定において、インタクトなサリューシン−αだけではなく、サリューシン−αの断片を測定してもよい。
以下、生体試料からのサリューシン−αの単離精製法の一例を挙げる。
（１）血清又は血漿２ｍＬにトリフルオロ酢酸を０．１％（ｖ／ｖ）添加し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行う。
（２）上清をＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８カートリッジに添加する。該カートリッジは、あらかじめ５ｍＬの９９．８％メタノール、５ｍＬ純水、５ｍＬ０．１％ＴＦＡを用いて処理しておく。
（３）１ｍＬの０．１％ＴＦＡ、５０％メタノールで抽出し、溶出液を遠心濃縮器を用いて２０００ｒｐｍで約１００μＬまで濃縮する。
（４）アッセイ用緩衝液を２５０μＬ添加し、サンプル中のサリューシン−αを測定する。
サリューシン−αの測定のための単離精製方法、ＲＩＡによる測定方法は例えば、Ｓａｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００６；２７：２５６１−２５６６．の記載に従って行うことができる。
ヒト血清中及び尿中のサリューシン−αの濃度は、健常人ではそれぞれ２３．３±８．１ｐＭ、１５６．８±９５．８ｐＭであった（値は、Ｍｅａｎ±ＳＤ）。従って、被験体の血清中又は尿中のサリューシン濃度がこれらの健常人の値より有意に低い場合に、該被験体は、動脈硬化性疾患に罹患しているか、または動脈硬化性疾患に罹患するリスクが有意に高いと判定することができる。有意に低い場合とは、例えば上記の健常人のＭｅａｎとＳＤに対して、Ｍｅａｎ−１×ＳＤより低い場合、好ましくはＭｅａｎ−２×ＳＤより低い場合、さらに好ましくはＭｅａｎ−３×ＳＤより低い場合をいう。また、動脈硬化性疾患の重篤度が大きいほど、サリューシン−α濃度は低下する。例えば、急性冠症候群（ＡＣＳ）において、冠動脈の１枝病変群、２枝病変群、３枝病変群と、病変が進行した被験体ほど、生体試料中のサリューシン−α濃度が低くなる。また、生体試料中のサリューシン−α濃度と動脈硬化の指標となる内膜中膜複合体厚（ＩＭＴ；Ｉｎｔｉｍａ  Ｍｅｄｉａ  Ｔｈｉｃｈｅｎｅｓｓ）の厚さには、負の相関があり、ＩＭＴが厚くなるほどサリューシン−α濃度は低下する。サリューシン−αはＩＭＴに代わって、動脈硬化性疾患の進展の指標となり得る。さらに、急性の動脈硬化性疾患の検出に有効である。
さらに、被験体から採取した生体試料中のサリューシン−αを定期的に測定し、サリューシン−α濃度をモニターすることにより、動脈硬化性疾患の進展の管理をすることができる。
サリューシン−αは、動脈硬化性疾患の検出・診断のためのマーカーとして用いることができる。本発明は、サリューシン−αの、動脈硬化性疾患を検出するための検出用マーカーとしての使用を包含し、さらにサリューシン−αからなる、動脈硬化性疾患を検出・診断するための疾患検出・診断用マーカーを包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
以下の実施例において、ヒト末梢血液から単球を調製し、７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時にサリューシン−α（０〜１０ｎＭ）、サリューシン−β（０〜１０ｎＭ）を添加し、サリューシンの効果を検討した。
ヒト末梢血液からの単球の培養は公知の方法で行った。単球の培養は、ＲＰＭＩ−１６４０を１５ｍＬ加えて単離した単球を浮遊化し、血球計算板を使って細胞数を数えた。６ｃｍ  ｄｉｓｈに４×１０６ｃｅｌｌｓ／２ｍＬとなるように細胞を播種した。単球を５％  ＣＯ２、３７℃で１時間保温してｄｉｓｈに付着させた後、培地を１０％  ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０に置換して７日間培養した。培地交換は３日毎に行った。
【実施例１】
【０００６】
ヒト単球・マクロファージにおけるＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果
ＡＣＡＴ−１は細胞内の遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換する小胞体酵素であり、マクロファージの泡沫化に重要な遺伝子である。このＡＣＡＴ−１発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を検討するため、ウエスタンブロットでＡＣＡＴ−１タンパク質発現を検討した。
７日間培養した単球由来マクロファージをＰＢＳで３回洗浄後、各ｄｉｓｈに１０％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）１００μＬを加えて可溶化した。セルスクレーパーで細胞抽出液をかき集め１ｍＬテルモシリンジ、２３Ｇの注射針で破砕、断片化（ｓｈｅａｒｉｎｇ）した後、１５，０００ｒｐｍ（日立ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ２微量高速冷却遠心機）で３分間遠心した。上清のタンパク質濃度をＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）法（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定し、細胞抽出液としてウエスタンブロットに使用した。
本発明の実施例におけるウエスタンブロットによる培養上清中のＡＣＡＴ−１又はＡＢＣＡ−１の測定は以下の方法で行った。
ＡＣＡＴ−１タンパク質の検出
ＡＣＡＴ−１タンパク質検出のため、ウサギを免疫して作成した抗ヒトＡＣＡＴ−１ポリクローナル抗体（ＤＭ１０，Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｄｒ．Ｃｈａｎｇより供与）［Ｃｈａｎｇ  ＣＣＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２９５３２−２９５４０．］を１次抗体として使用し（最終濃度０．５μｇ／ｍＬ）、室温でｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅと１時間反応させた。ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０でｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅの洗浄を行い、２次抗体（抗ラビットＩｇＧ抗体、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））と室温で１時間反応させた。二次抗体は、原液０．５μＬを５ｍＬのＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で１０，０００倍に希釈して用いた。ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄を行い、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＡＣＡＴ−１タンパク質を検出した。
ＡＢＣＡ−１タンパク質の検出
ＡＢＣＡ−１タンパク質検出のため、ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅを抗ヒトＡＢＣＡ−１抗体と室温で１時間反応させた。一次抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＡＢＣＡ−１  ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（フナコシ））は、原液５μＬを５ｍＬのＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で１，０００倍に希釈して用いた。ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０でｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅの洗浄を行い、２次抗体（抗ラビットＩｇＧ抗体、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ））と室温で１時間反応させた。２次抗体は原液０．５μＬを５ｍＬのＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で１０，０００倍に希釈して用いた。ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄を行い、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＡＢＣＡ−１タンパク質を検出した。
ヒト末梢血単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬで７日間培養してマクロファージに分化させた。ＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対するサリューシンの用量依存的効果を検討するため、０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｎＭのサリューシン−α又はサリューシン−βを培養当初から培地に添加した。単球からマクロファージに分化した７日目の細胞をＰＢＳで洗浄後、１００μＬの１０％ＳＤＳで可溶化し、ＡＣＡＴ−１に対する特異抗体を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、サリューシン−αは濃度依存的にＡＣＡＴ−１タンパク質発現を約４０％抑制した（図２Ａ）。一方、サリューシン−βは０から０．６ｎＭまで濃度依存的にＡＣＡＴ−１タンパク質発現を促進した。サリューシン−βの効果は０．６ｎＭでピークに達し、ＡＣＡＴ−１タンパク質はコントロールの２．１倍に増加した。サリューシン−βのＡＣＡＴ−１タンパク質発現増強効果は０．６ｎＭ以上の濃度では次第に減弱した（図２Ｂ）。
次に、単球・マクロファージの分化段階におけるサリューシン−α又はサリューシン−βのＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対する時間依存的効果を検討した。ヒト末梢血単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に０．６ｎＭのサリューシン−α又はサリューシン−βを添加して、播種後１日目、３日目、５日目、７日目にそれぞれのｄｉｓｈをＰＢＳで洗浄した。１日目、３日目、５日目に反応を止めたｄｉｓｈは一旦−８０℃で冷凍して７日目に解凍し、７日目の細胞とともに１００μＬの１０％ＳＤＳで可溶化した。ウエスタンブロット法を用いて検討した結果、サリューシン−αで処理した細胞のＡＣＡＴ−１タンパク質発現は培養５日目まではコントロールと有意差がなかったが、７日目で有意に抑制された。サリューシン−βで処理した細胞のＡＣＡＴ−１タンパク質発現は、５日目からコントロールに比べ有意な増加がみられた（図３）。
【実施例２】
【０００７】
ヒト単球由来マクロファージにおけるＡＣＡＴ活性に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果
ＡＣＡＴ活性測定にはリポソーム再構成法を用いた。この方法は小胞体に存在するＡＣＡＴ−１タンパク質をｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅからなるｍｉｘｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅによってリポソームに再構成し、ＡＣＡＴ−１が基質として利用できるコレステロールの濃度を飽和レベルまで高くするシステムである［Ｃｈｅｎｇ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：６８５−６９５．］。従来用いられてきたミクロソーム法は、小胞体に内因性に存在するコレステロールを基質として利用していたが、一般に小胞体膜はコレステロールに乏しく、ＡＣＡＴの基質であるコレステロールが飽和状態に達していなかったため、ＡＣＡＴ活性を過小評価してきたと思われる。もう一つの基質である［１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡを反応系に加え、ＡＣＡＴ反応によって生じたｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［１４Ｃ］ｏｌｅａｔｅを測定することによりＡＣＡＴの活性を測定する（図４）。
本実施例で用いる細胞抽出液は以下のように調製した。
末梢血ヒト単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ）をそれぞれ４〜６枚の６ｃｍ  ｄｉｓｈに播種し、７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時にサリューシン−α又はサリューシン−βを添加してＡＣＡＴ活性に対する効果を検討した。７日間の培養後、細胞を４℃に冷却したＰＢＳで２回洗い、ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）を２ｍＬ／ｄｉｓｈ加え５分間静置した。この操作の目的は、浸透圧によって細胞膜を破砕し、流出した細胞質タンパク質を洗浄してＡＣＡＴ−１を含む膜タンパク質を濃縮することにある。Ｄｉｓｈを逆さにしてｂｕｆｆｅｒをよく切り、使用直前にｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ）を１／１０００  Ｖｏｌｕｍｅ加えたｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）を１００μＬ加え、セルスクレーパーで細胞を回収した。この１００μＬを同じ条件で培養した次のｄｉｓｈに移して同様の操作を行い、４〜６枚のｄｉｓｈを合体して膜タンパク質を濃縮した。回収した細胞抽出液を１ｍＬテフロンホモジナイザーに入れホモジナイズした。２０ｓｔｒｏｋｅを１ｓｅｔとして３ｓｅｔ行った。すべて氷上で行いＳｅｔ間は１分ほどおいた。ホモジナイズした細胞抽出液のタンパク質濃度をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量した。細胞抽出液に１／３ｖｏｌｕｍｅの４Ｍ  ＫＣｌ並びに１／９ｖｏｌｕｍｅの２０％  ＣＨＡＰＳを加えた（最終濃度はＫＣｌ  １Ｍ、ＣＨＡＰＳ  ２％）。１Ｍ  ＫＣｌ、２％  ＣＨＡＰＳを含むｂｕｆｆｅｒ  Ａでタンパク質濃度をそろえ、１０分間室温で静置した。
ｍｉｘｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅは以下のように調製した。
１００ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｅｇｇ  ｙｏｌｋ（ＳＩＧＭＡ）ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ１７２．４μＬと２０ｍｇ／ｍＬ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ）ｉｎ  ｂｅｎｚｅｎｅ  ６２μＬをシンチレーションバイアルに入れ、ｖｏｒｔｅｘ後窒素ガスで乾固させた。ここに１０％  ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ）１００μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ  Ａ  １００μＬ，滅菌精製水８００μＬを加えｖｏｒｔｅｘした。バイアル内の空気を窒素ガスに置換して遮光の上１０分間ソニケーションし、５分間氷上で冷却した。この操作を１０回ほど繰り返し、透明に近づけた。ソニケーション後、滅菌精製水１ｍＬを加えよく混和した。
０．２５ｍＭ［１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡ  ｍｉｘｔｕｒｅは１ｍＭ［１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ  ＣｏＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＦＡ６３４，１．８５ＭＢｑ）１６μＬ、３４ｍＭ  ｃｏｌｄ  ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡ（ＳＩＧＭＡ）１０μＬ、３０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  ｉｎ  ０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）８３４μＬ、及び滅菌精製水９９６μＬを混合し、２，０００μＬの溶液を作製することにより調製した。
薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＴＬＣ）は以下のように行った。
ＴＬＣ  ｓｔａｎｄａｒｄとして、ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ  ４ｍＬにｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｌｅａｔｅ（ＳＩＧＭＡ）２０ｍｇを添加して温浴中で６０℃に加温して溶解し、さらに０．９１ｇ／ｍＬ  ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｔｒｉｏｌｅａｔｅ（ＳＩＧＭＡ）２０μＬを加えた。ＴＬＣ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ  ２０×２０ｃｍ，ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）にキャピラリーでＴＬＣ  ｓｔａｎｄａｒｄを６０μＬスポットした。展開溶媒としてｈｅｘａｎｅ／ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ／ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（９０：１０：１，ｖ／ｖ）を調製した。
氷上で一定のタンパク質量の細胞抽出液（８０〜１００μｇ）と１４０μＬのｍｉｘｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅを加え、ゆっくり混和した。１０分間氷上で静置後、２０μＬの［１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡ  ｍｉｘｔｕｒｅを加え、泡立てないように混和した。３７℃で３０分間保温して反応させた後、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｍｅｔｈａｎｏｌ（２：１，ｖ／ｖ）３ｍＬと滅菌精製水１ｍＬを加えｖｏｒｔｅｘして反応を停止した。２，５００ｒｐｍ（ＴＯＭＹ  ＬＣ−１２０低速遠心機，ローター７０１５−０６）で１０分間遠心した後、上層（水層）を除き、下層（油層）を窒素ガスで乾固した。抽出した脂質を６０μＬ  ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌで溶解し、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｐｏｔの間にブロードにスポットした。ガラスチャンバー内で展開溶媒がＴＬＣプレートの上端に達するまで脂質を展開した。ヨードを少量散布した別のガラスチャンバー内にＴＬＣプレートを移し、ＴＬＣ  ｓｔａｎｄａｒｄの脂質を発色させた。ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｌｅａｔｅに相当する位置をはさみで切りとり、バイアルに入れた。シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を３ｍＬ加え測定した。比活性測定のため［１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡ  ｍｉｘｔｕｒｅ  １０μＬの放射活性を測定した。ＡＣＡＴ反応で生じたｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［１４Ｃ］ｏｌｅａｔｅの放射活性（ｃｐｍ）を反応系に用いた細胞タンパク質量（ｍｇ）、［１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡの比活性（ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）並びに反応時間（１０分間）で除してＡＣＡＴ活性値（ｐｍｏｌ／ｍｇ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を算出した。
サリューシン−α又はサリューシン−βによってＡＣＡＴ−１タンパク質発現に変化が見られたため、ＡＣＡＴ酵素活性に対する効果を検討した。ヒト末梢血単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬで７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に０．６ｎＭのサリューシン−α又はサリューシン−βを培地に添加した。
細胞抽出液にｍｉｘ  ｍｉｃｅｌｌｅ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎ）を加えてＡＣＡＴ−１タンパク質をリポソームに再構成した。このサンプルに［１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡを加えて３７℃で１０分間反応させ、ＡＣＡＴ反応によって生じたｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［１４Ｃ］ｏｌｅａｔｅの放射活性を測定し、ＡＣＡＴ活性を算出した。その結果、サリューシン−α処理した細胞のＡＣＡＴ活性はコントロールの５０％に抑制されていた。一方、サリューシン−βで処理した細胞のＡＣＡＴ活性はコントロールの１．８倍に増加していた（図５）。
【実施例３】
【０００８】
ヒト単球由来マクロファージにおけるＡＣＡＴ−１  ｍＲＮＡ発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果
ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いてＲＮＡを抽出した。
７日間培養した細胞の培地をぬき、ＰＢＳで３回洗った。ＰＢＳを良くきった後、ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬを加え、細胞を溶かした。その細胞抽出液を５回出し入れしてから新しいエッペンチューブに移した後、室温で５分間放置した。これにｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ２００μＬを加えて１５秒間強く振り混ぜた。２〜３分間放置した後、１２，０００ｒｐｍ（日立ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｄ２微量高速冷却遠心機）で１５分間遠心した。上層を新しいエッペンチューブにとり、ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ  ５００μＬを加え転倒混和し１０分間放置してから１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を取り除いた。残った沈殿に７５％  ｅｔｈａｎｏｌ  １８０μＬを加え、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除き風乾した。９０μＬの滅菌精製水に溶解させ、６５℃で１０分間保温した。ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １０μＬを加え、３７℃で１５分間保温した。３Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  １０μＬ、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（１：１，ｖ／ｖ）１００μＬを加え振り混ぜ１５，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を新しいエッペンチューブに取った。そこにｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ（２４：１，ｖ／ｖ）を１００μＬ入れ、更に１５，０００ｒｐｍで３分間遠心した、この上清を取り、ｅｔｈａｎｏｌ  ２００μＬを加え−８０℃に３０分間以上置いた。これを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去し、７０％ｅｔｈａｎｏｌで洗浄後に乾燥させ、滅菌蒸留水１５μＬに溶解させた。このＲＮＡ溶液の濃度を２６０ｎｍで吸光度を測定することで求め、各濃度が同一になるように滅菌精製水を加えた。
次いで、ＡＣＡＴ−１  ｍＲＮＡについてｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＲＮＡ発現を解析した。
下記のそれぞれのｈｕｍａｎ  ｍＲＮＡ配列を用いてＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりｐｒｉｍｅｒ配列を決定した。
β−ａｃｔｉｎ
2008143151.tif 000002
ＡＣＡＴ−１
2008143151.tif 000003
サリューシン−α又はサリューシン−βを処理した末梢血ヒト単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を１０％  ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬで７日間培養してマクロファージに分化させた。サリューシン−α又はサリューシン−βを処理した細胞と、無処理の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、このｔｏｔａｌ  ＲＮＡ１μｇに逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。
このｃＤＮＡからｑＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を用いてｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲをＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）にて行い定量した。
次いで、以下の方法により逆転写反応を行った。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液（１μｇ／μＬ）１μＬにｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ（ＴａＫａＲａ，８０ｎＭ）０．５μＬ、滅菌精製水１０．５μＬを加え、７０℃で１０分間加熱した。これにＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ０．７５μＬ、５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４μＬ、０．１Ｍ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ  ２μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）４μＬ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（２００Ｕ／μＬ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを加え３７℃で１時間反応させた。９５℃で５分間変性後、氷上で冷却し滅菌精製水を４０μＬ加えた。
Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲは以下の方法により行った。
逆転写反応で得られたｃＤＮＡ溶液２μＬにｑＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ  １２．５μＬ、ｐｒｉｍｅｒ溶液（Ｆｏｒｗａｒｄ＋Ｒｅｖｅｒｓｅ  ５μＭ  ｅａｃｈ）２．５μＬ、滅菌精製水８μＬを加え反応を行った。
ＰＣＲ  ｃｙｃｌｅは９５℃で１０分間、次いで（９４℃、２０秒；５５℃、２０秒；７２℃、３０秒）のサイクルを４０ｃｙｃｌｅｓで行った。
サリューシン−α及びサリューシン−βによってＡＣＡＴ−１タンパク質発現並びにＡＣＡＴ活性に変化が見られたため、さらにＡＣＡＴ−１  ｍＲＮＡ発現に対する効果を検討した。ヒト末梢血単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬで７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に０．６ｎＭのサリューシン−α又はサリューシン−βを培地に添加しＡＣＡＴ−１  ｍＲＮＡ発現に対する効果を検討した。７日目の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＣＡＴ−１  ｍＲＮＡに対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果を検討したところ、サリューシン−αはＡＣＡＴ−１  ｍＲＮＡ発現をコントロールの８０％に抑制し、サリューシン−βは１．６倍に促進した（図６）。
【実施例４】
【０００９】
ヒト単球由来マクロファージの泡沫化（コレステロールエステル蓄積）に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果
マクロファージの泡沫化を測定する方法としてＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙを用いた［Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８３；９８：２４１−２６０．］。マクロファージはスカベンジャー受容体を介してアセチル化ＬＤＬ（ＡｃＬＤＬ）を細胞に取込みリソソーム分解に導く。リソソームで生じた遊離コレステロールがＡＣＡＴに運搬され、ＡＣＡＴ反応によりコレステロールエステルに変換される。培地中に［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅを添加しておくと［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅは細胞内に取り込まれアシルＣｏＡシンターゼにより［３Ｈ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡに変換される。ＡＣＡＴはＡｃＬＤＬ由来の遊離コレステロールとこの［３Ｈ］ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡを基質としてｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅを産生する。細胞内に蓄積したｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅの放射活性がコレステロールエステル蓄積の鋭敏な指標となる（図７）。
ヒト血漿ＬＤＬは以下の方法で精製した。
ヒト血漿からＳｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｔａｔｉｏｎ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎによりＬＤＬ（ｄ＝１．０１９−１．０６３）を精製した［Ｓｃｈｕｍａｋｅｒ  ＶＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６；１２８：１５５−１７０．］。ヒト血漿３５０ｍＬを６本の遠心管に分注しＲＰ−４２  Ｒｏｔｏｒを用いて、１００，０００ｘｇ（３６，０００ｒｐｍ）、４℃で２０時間超遠心した。カイロミクロンと超低密度リポタンパク質（ｖｅｒｙ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｏｒｔｅｉｎ；ＶＬＤＬ）を含む白濁した上層を除き、アスピレーターを用いて下層の黄色層を回収した。このカイロミクロン、ＶＬＤＬを除いた血漿画分の容積をメスフラスコで、比重を浮沈式比重計（Ｈｙｄｒｏｍｅｔｅｒ）で測定し、ｄ＝１．０６３になるまでｓｏｌｉｄ  ＫＢｒを加えた。カイロミクロン、ＶＬＤＬを除いた血漿画分の容積をＶ、比重をＤとすると、比重１．０６３ｇ／ｍＬを得るために加えるべきＫＢｒの量は次の式で近似できる。
ＫＢｒ（ｇ）＝Ｖ（１．０６３−Ｄ）／０．６８３２３
ｄ＝１．０６３に調整したＬＤＬを含む血漿画分の半量を６本の遠心管に分注し、Ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｄ＝１．０６３）を遠心管の肩まで入れた。ＲＰ−４２  Ｒｏｔｏｒを用いて１００，０００ｘｇ（３６，０００ｒｐｍ）、４℃で２０時間超遠心し、上層の黄色層（粗ＬＤＬ）をパスツールピペットで回収した。残りの半量も同様に分注して超遠心し、上層の黄色層（粗ＬＤＬ）を回収した。２回の操作で得られた粗ＬＤＬを合体し、再び６本の遠心管に分注した。Ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｄ＝１．０６３）を遠心管の肩まで入れ、ＲＰ−４２  Ｒｏｔｏｒを用いて１００，０００ｘｇ（３６，０００ｒｐｍ）、４℃で２０時間超遠心し、上層の黄色層（精製ＬＤＬ）を回収した。ＬＤＬを透析膜に入れ、低温室内においてＥＤＴＡ−Ｓａｌｉｎｅ４Ｌを用いて透析を行った。１２時間の透析を３回繰り返した。ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ  ＣＥＬＬ  ＭＯＤＥＬ  ８２００（ＡＭＩＣＯＮ）でタンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬ程度まで濃縮し、フィルターでろ過滅菌した。ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質濃度を測定し、以下のＡｃＬＤＬの調製に用いた。
ＡｃＬＤＬは以下の方法で調製した。
ＬＤＬ  ３０ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（２．０ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬであれば１５ｍＬ）に同じ容積の飽和酢酸ナトリウムを加えた。氷上で冷却、スターラーバーで撹拌しながら、無水酢酸１５０μＬ（５μＬ／ＬＤＬ  ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を５μＬずつ滴下した［Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９：５２６４−５２６９．］。この時ｐＨメータでｐＨをモニターし、ｐＨが６．５以下にならないよう、５Ｎ  ＮａＯＨを滴下して中和した。氷上で１時間静置した後、低温室内においてＥＤＴＡ−Ｓａｌｉｎｅ  ４Ｌを用いて透析を行った。１２時間の透析を３回繰り返した。ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ  ＣＥＬＬ  ＭＯＤＥＬ  ８２００で濃縮し、フィルターでろ過滅菌した。ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質濃度を測定し、実験に用いた。
以下の操作において、用いた試薬は以下のとおりである。
［９，１０（ｎ）−３Ｈ］ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（１８５  ＭＢｑ  ｉｎ  １ｍＬ  ｔｏｌｕｅｎｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ），ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄのモル濃度は０．６２５ｍＭ
３ｍＭ  Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ）；Ａｌｂｕｍｉｎの濃度は１００ｍｇ／ｍＬ（１．５ｍＭ）で、１ｍｏｌあたり２ｍｏｌのｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄが結合している。
３ｍＭ［３Ｈ］ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｉｘｔｕｒｅの調製
［９，１０（ｎ）−３Ｈ］ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ５０μＬ（９．２５ＭＢｑ）をガラス製ビーカーに入れ、窒素で乾固した。ガラス製ビーカーに３ｍＭ  Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ）５ｍＬを注ぎ、スターラーバーで５時間撹拌した後、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した。
ヒト末梢血単球（４×１０６／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬで７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に０．６ｎＭのサリューシン−α又はサリューシン−βを添加しておき、細胞内コレステロールエステル蓄積（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に対する効果を検討した。７日目に培地を交換し、５μｇ／ｍＬ  ＡｃＬＤＬ、３ｍＭ［３Ｈ］ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ６７μＬ（最終濃度は０．１ｍＭ）、０．６ｎＭ  サリューシン−α又はサリューシン−βを添加し、適量の培地を加えてｔｏｔａｌ  ２ｍＬとし、さらに１８時間培養した。ＰＢＳで３回細胞を洗い、ｈｅｘａｎｅ／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ（３：２，ｖ／ｖ）１ｍＬをｄｉｓｈに加え、室温で１時間静置した。ｈｅｘａｎｅ／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを脂質抽出管に回収し、さらに１ｍＬをｄｉｓｈに加え細胞とｄｉｓｈ壁を洗いこんで同じ脂質抽出管に回収した。脂質抽出後のｄｉｓｈにはタンパク質抽出のため１Ｎ  ＮａＯＨ  １ｍＬを加えた。脂質抽出管をｖｏｒｔｅｘし、室温で３０分間静置した後、窒素で乾固した。抽出した細胞脂質を６０μＬ  ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを加えてｖｏｒｔｅｘしながら溶解した。全量をｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｐｏｔの間にブロードにスポットし、展開溶媒ｈｅｘａｎｅ／ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ／ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（９０：１０：１，ｖ／ｖ）がＴＬＣプレートの上端に達するまでＴＬＣで展開した。ガラスチャンバー内にＴＬＣプレートを置いてヨードで脂質を発色させ、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｌｅａｔｅに相当する位置をはさみで切りとり、シンチレーションバイアルに入れた。シンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を３ｍＬ加え測定した。先ほどｄｉｓｈに加えておいた１Ｎ  ＮａＯＨを回収し、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて細胞タンパク質を定量した。３ｍＭ［３Ｈ］ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｉｘｔｕｒｅの比活性（ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）を測定し、細胞内で産生されたｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅの放射活性（ｄｐｍ）を［３Ｈ］ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄの比活性（ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）と細胞タンパク質量（ｍｇ）で除してｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
ＡＣＡＴ−１はマクロファージの泡沫化を促進する重要な因子である。上記の実験によりサリューシン−α及びサリューシン−βがＡＣＡＴ−１発現、ＡＣＡＴ活性に対して相反する影響を与えることが判明したため、マクロファージの泡沫化に対する効果を検討した。
ヒト末梢血単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時添加した０．６ｎＭのサリューシン−α及びサリューシン−βのマクロファージ泡沫化に対する効果を検討した。７日目の細胞に５μｇ／ｍＬＡｃＬＤＬ、０．１ｍＭ［３Ｈ］ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｉｘｔｕｒｅ、０．６ｎＭ  サリューシン−α又はサリューシン−βを添加してさらに２４時間培養し、細胞内に蓄積したｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅを測定した。コントロールの細胞にＡｃＬＤＬを負荷すると、５．６ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅの蓄積がみられ、ＡｃＬＤＬを負荷しない細胞（ｎｏｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の６．３倍に増加した。サリューシン−αで処理した細胞ではＡｃＬＤＬによるｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ［３Ｈ］ｏｌｅａｔｅの蓄積はコントロール（ｌｏａｄｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の５０％に減少し、サリューシン−βで処理した細胞ではコントロールの１．６倍に増加した（図８）。
【実施例５】
【００１０】
アセチル化ＬＤＬ（ＡｃＬＤＬ）の細胞取込み能の検討  −スカベンジャー受容体クラスＡ（ＳＲ−Ａ）活性の測定−
スカベンジャー受容体は、マクロファージに発現するリポタンパク質受容体で、酸化ＬＤＬやＡｃＬＤＬなどの変性ＬＤＬを認識してエンドサイトーシスに導く。細胞内に取込まれたこれらのリガンドはリソソームで分解される。スカベンジャー受容体はマクロファージの泡沫細胞化には極めて重要な役割を果たしている。スカベンジャー受容体には、スカベンジャー受容体クラスＡ（ＳＲ−Ａ）、ＣＤ３６、Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＬＯＸ−１）、ＣＤ６８などが知られる［Ｇｒｅａｖｅｓ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２００５；４６：１１−２０．］。酸化ＬＤＬはこれら４種のスカベンジャー受容体すべてに結合するが、ＡｃＬＤＬが結合するスカベンジャー受容体はＳＲ−Ａのみである。本実験では変性ＬＤＬの代表としてＡｃＬＤＬをリガンドとして用い、ＡｃＬＤＬを認識する唯一のスカベンジャー受容体であるＳＲ−Ａの活性を測定した（図９）。
末梢血ヒト単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬで７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に０．６ｎＭのサリューシン−α又はサリューシン−βを添加し、［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬのエンドサイトーシス活性（ＳＲ−Ａ活性）に対する効果を検討した。７日目に培地を交換し、［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬ（５〜１０μｇ／ｍＬ）と０．６ｎＭ  サリューシン−α又はサリューシン−βを適量の培地を加えて全量を２ｍＬとし、１８時間培養した。
細胞を３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで一度洗い、ＰＢＳで二度洗った。０．１Ｎ  ＮａＯＨ  １ｍＬを加えて室温で３０分間静置した。細胞をポリスチレンチューブ（１２ｘ７５ｍｍ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に回収し、さらに１ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨで洗いこんで回収した。細胞抽出液の全量をγカウンターで測定し、その一部を用いてＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質濃度を測定した。細胞抽出液の放射活性（ｃｐｍ）を［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬの比活性（ｃｐｍ／μｇ）、ｄｉｓｈあたりの細胞タンパク質量（ｍｇ）で除して、［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬのＣｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（μｇ／ｍｇ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した［Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９：５２６４−５２６９．］。
Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙは以下の方法で行った。
スカベンジャー受容体を介してマクロファージに取り込まれた［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬは、リソソームで分解される。［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬのタンパク質部分である［１２５Ｉ］アポＢ−１００はタンパク質分解酵素により断片化されペプチドとして細胞外に排出され、トリクロロ酢酸可溶性分画にみいだされる。一方マクロファージに取り込まれなかった培地中の［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬはトリクロロ酢酸不溶性で、遠心により沈殿として分離することができる。
培養上清から７５０μＬをポリスチレンチューブ（１２ｘ７５ｍｍ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に分取し、４０％  トリクロロ酢酸を２５０μＬ、０．７Ｍ  ＡｇＮＯ３を２００μＬ加え、ｖｏｒｔｅｘしてから２，５００ｒｐｍ（ＴＯＭＹ，ＬＣ−１２０低速遠心機，ローター７０１５−０６）で１０分間遠心した。ＡｃＬＤＬのヨードラベルの段階でタンパク質と反応しなかったフリーの１２５Ｉはゲルろ過により大半が除去されているが、一部残存がみられる。この段階でＡｇＮＯ３を加えることにより残存した１２５ＩをＡｇ［１２５Ｉ］として沈殿させることができる。従って培養上清のトリクロロ酢酸不溶性分画には、細胞に取込まれなかった［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬ並びにフリーの１２５Ｉに由来するＡｇ［１２５Ｉ］が含まれ、トリクロロ酢酸可溶性分画には細胞によってプロセスされた［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬ由来のペプチドのみが検出される。遠心後上清６００μＬを別のチューブに取り、γカウンターで測定した。測定結果からｄｉｓｈあたりの培養上清中のトリクロロ酢酸可溶性の総放射活性（ｃｐｍ）を計算し、［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬの比活性（ｃｐｍ／μｇ  ＡｃＬＤＬ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｄｉｓｈあたりの細胞タンパク質量（ｍｇ）で除し、これを［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬのｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ（μｇ／ｍｇ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とした。
上記の実験によりサリューシン−α並びにサリューシン−βがマクロファージの泡沫化を制御していることが判明したので、この現象にサリューシンによるＳＲ−Ａ活性制御が関与しているかを検討した。細胞内に取り込まれたＡｃＬＤＬのタンパク質部分（アポＢ−１００）はリソソームのタンパク質分解酵素によってペプチドまで分解され、細胞外に排出される。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙでは細胞表面又は細胞内に存在する１２５Ｉの放射活性を測定し、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙではリソソームでペプチドに断片化され細胞外に排出された［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬ（アポＢ−１００の断片ペプチド）の放射活性を測定する。この２つのａｓｓａｙによりＳＲ−Ａ活性を測定した。
ヒト末梢血単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時添加した０．６ｎＭサリューシン−α又はサリューシン−βの［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬの取込み、分解に対する効果を検討した。７日目の細胞に５〜１０μｇ／ｍＬ［１２５Ｉ］ＡｃＬＤＬ、０．６ｎＭ  サリューシン−α又はサリューシン−βを添加してさらに１８時間培養し、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。その結果、どちらのａｓｓａｙにおいてもコントロール細胞に比しサリューシン−α及びサリューシン−βによる有意な変化は認められなかった（図１０Ａ及びＢ、図１０ＡはＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を、図１０ＢはＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す。）。よってサリューシン−α及びサリューシン−βはＳＲ−Ａ活性に影響を与えず、ＡｃＬＤＬの細胞取り込み以降のコレステロールの代謝に影響していることが明らかになった。
【実施例６】
【００１１】
ヒト単球由来マクロファージにおけるＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａ１（ＡＢＣＡ−１）タンパク質発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果
マクロファージの泡沫化現象を制御する１つの機構としてＡＢＣＡ−１を介する遊離コレステロールの細胞外排出機構（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ）がある。このＡＢＣＡ−１タンパク質発現に対するサリューシンの効果を検討した。末梢血ヒト単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を７日間培養してマクロファージに分化させた。このとき同時に０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｎＭのサリューシン−α又はサリューシン−βを添加してＡＢＣＡ−１タンパク質発現に対する効果を検討した。前記のＡＢＣＡ−１特異抗体を用いたウエスタンブロットでは、サリューシン−α又はサリューシン−βによるＡＢＣＡ−１タンパク質発現の有意な変化はみられなかった（図１１Ａ及びＢ、図１１Ａはサリューシン−αの結果を、図１１Ｂはサリューシン−βの結果を示す）。
【実施例７】
【００１２】
分化した後の培養ヒト単球由来マクロファージのＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対するサリューシン−α及びサリューシン−βの効果
実施例１〜６の実験はすべて培養ヒト単球・マクロファージの分化の段階でサリューシン−α及びサリューシン−βを添加して培養７日目の細胞を用いてその効果を検討したが、分化後のマクロファージにもサリューシン−α及びサリューシン−βがＡＣＡＴ−１タンパク質発現に対して同様の効果があるかを検討した。末梢血ヒト単球（４×１０６ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ  ｄｉｓｈ）を７日間培養してマクロファージに分化させた。７日目に０、０．４、０．６、１．０ｎＭのサリューシン−α及びサリューシン−βを添加してさらに３日間培養した。ＡＣＡＴ−１ウエスタンブロットで検討すると、ＡＣＡＴ−１タンパク質発現は１．０ｎＭのサリューシン−αによりコントロールの６０％に減少し、０．６ｎＭのサリューシン−βにより２．２倍に増加した（図１２Ａ及びＢ、図１２Ａはサリューシン−αの結果を、図１２Ｂはサリューシン−βの結果を示す）。この結果から単球からマクロファージへの分化後もサリューシン−α及びサリューシン−βに対するＡＣＡＴ−１発現調節は保たれていることが明らかになった。
上記実施例における培養ヒト単球由来マクロファージの泡沫化（細胞内コレステロールエステル蓄積）並びに泡沫化に関与する遺伝子発現に対する新規血管作動性物質サリューシン−α並びにサリューシン−βの効果の検討により得られた主な結果は以下の通りである。
（１）ＡｃＬＤＬによるマクロファージの泡沫化はサリューシン−αに抑制され、サリューシン−βにより促進した。
（２）細胞内コレステロールエステル化酵素ＡＣＡＴ−１の発現はサリューシン−αにより抑制され、サリューシン−βにより促進された。
（３）ＡｃＬＤＬを認識して細胞内に取込むＳＲ−Ａの活性はサリューシン−α及びサリューシン−βによる影響を受けなかった。
（４）細胞コレステロールの搬出に重要なＡＢＣＡ−１の発現はサリューシン−α及びサリューシン−βによる影響を受けなかった。
以上より培養ヒト単球由来マクロファージ泡沫化はサリューシン−α及びサリューシン−βにより相反する制御を受けること、その泡沫化の制御機構の一つとしてサリューシン−α及びサリューシン−βによる相反するＡＣＡＴ−１の発現制御があることが明らかになった。
血管平滑筋細胞や線維芽細胞に対するサリューシン−βの増殖促進作用はサリューシン−αの前処理により抑制されず、サリューシン−αとサリューシン−βの効果は相加的であるとの報告もあり［Ｓｈｉｃｈｉｒｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３；９：１１６６−１１７２．］、サリューシン−αとサリューシン−βは異なる受容体を介してこれらの細胞に作用している可能性が示唆される。また、Ｗａｎｇらは、ｍｏｕｓｅｍａｓ−ｌｉｋｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ１（ｍＭｒｇＡ１）を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、サリューシン−βをリガンドとして認識することを報告した［Ｗａｎｇ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；５３９：１４５−１５０．］。一方サリューシン−αはｍＭｒｇＡ１のリガンドとして挙動しないことからも、サリューシン−αとサリューシン−βは異なる受容体に認識されていることが示唆される［Ｗａｎｇ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；５３９：１４５−１５０．］。本研究では、サリューシン−αとサリューシン−βはマクロファージの泡沫化並びにＡＣＡＴ−１発現に対して相反する結果が得られた。従ってサリューシン−αとサリューシン−βは、マクロファージに発現する異なる受容体を介して作用したことが推測される。
【実施例８】
【００１３】
ヒト冠動脈の動脈硬化病変におけるサリューシン−α、−βの発現
急性冠症候群（ＡＣＳ）で死亡した患者（７２歳、男性）から冠動脈の病理切片を作製し、免疫化学的組織染色用に精製した抗サリューシン−α、−β抗体を用いて染色した。冠動脈のプラーク部の平滑筋細胞及び線維芽細胞に加え、脂肪斑内（ｆａｔｔｙ  ｓｔｒｅａｋ）のマクロファージ由来泡沫細胞にもサリューシン−βの強発現が認められた（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。サリューシン−αとサリューシン−βは共通の前駆体（Ｐｒｅｐｒｏｓａｌｕｓｉｎ）から同部位で生成されると想定されているが、サリューシン−βが強発現していた冠動脈硬化病変部にはサリューシン−αの発現はほとんど認められなかった。他の３患者（４０歳男性、７６歳女性、８６歳女性）においても同様な所見が確認された。よって本検討によりサリューシン−βの強発現及びサリューシン−αの発現低下はヒトの冠動脈硬化の進展に深く関わっていることが実証された。
【実施例９】
【００１４】
サリューシン−αをマーカーとして用いた動脈硬化の検出
中高年齢層（４０〜８６歳）の男性６４例における血清サリューシン−α濃度と動脈硬化との関係を検討した。動脈硬化の評価には、簡便かつ非侵襲的に行える頚動脈エコー（Ｂモード）を用い、両側の頚動脈のうち内膜中膜複合体厚（ＩＭＴ）の最大値（最大ＩＭＴ）を測定した。最大ＩＭＴは健常者では、１ｍｍ以下であるが、１ｍｍを超えると急性冠症候群（ＡＣＳ）や脳卒中の危険因子として関与していることがすでに証明されている。血清サリューシン−α濃度は、Ｓａｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００６；２７：２５６１−２５６６に記載のラジオイムノアッセイにて測定した。血清サリューシン−α濃度は頚動脈の最大ＩＭＴと有意な負の相関を示した（ｒ＝０．２９，Ｐ＜０．０２；図１４）。このことから血清サリューシン−α濃度が低いほど、動脈硬化が進展していることが読み取れる。
【実施例１０】
【００１５】
サリューシン−αをマーカーとして用いての急性冠症候群、虚血性心疾患及び動脈硬化の検出
安定労作性狭心症患者３７例（男性２６例、女性１１例）、発症６時間以内の急性冠症候群患者６０例（男性４１例、女性１９例）、（急性冠症候群）発症後６ヶ月以上経過した陳旧性心筋梗塞患者７６例（男性６１例、女性１５例）の計１７３例の虚血性心疾患、その対照として、本態性高血圧患者４０例（男性２８例、女性１２例）および健常者５５例（男性３５例、女性２０例）より、血清を採取し、Ｓａｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００６；２７：２５６１−２５６６．の記載に従い、ラジオイムノアッセイによりサリューシン−α濃度を測定した。急性冠症候群患者全例に対し緊急冠動脈造影を施行し、冠動脈病変の重症度を動脈硬化病変が認められた冠動脈の罹患枝数（右冠動脈＋左冠動脈前下行枝＋左回旋枝＝計３枝）で評価した。また、高血圧患者全例および健常者２３例に頸動脈エコーを施行し、ＩＭＴが１．１ｍｍ以上で辺縁が明瞭なものをプラークと認定し、左右の全てのプラークの厚さの総和をプラークスコアとした。プラークスコアが１．１以上かつ５以下を軽度動脈硬化、５〜１０を中等度動脈硬化、１０以上を高度動脈硬化と定義した。
血清サリューシン−α濃度は、健常者での２１．７±１．５ｐＭ（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、以下同じ）、高血圧患者での１５．４±１．１ｐＭに比べ、虚血性心疾患患者では４．９±０．６ｐＭと有意に低下していた（ｐ＜０．０００１）。虚血性心疾患の中では、安定労作性狭心症患者で６．４±０．９ｐＭ、急性冠症候群患者で３．６±０．６ｐＭ、陳旧性心筋梗塞患者で５．２±１．２ｐＭであった（図１５）。急性冠症候群患者６０例の緊急冠動脈造影の結果、２３例に１枝病変、１７例に２枝病変、２０例に３枝病変を認めた。サリューシン−α濃度は、１枝病変患者では５．２±１．０ｐＭ、２枝病変患者では３．１±１．４ｐＭ、３枝病変患者では２．３±０．９ｐＭであり、３枝病変患者では１枝病変患者に比べ有意に低値を示していた（ｐ＜０．０５、図１６）。
高血圧患者４０例および健常者２３例でのサリューシン−α濃度は、頸動脈の最大ＩＭＴと負の相関を持ち、かつプラークスコアが重症化に連れ斬減していたことから、サリューシン−α濃度の低下は動脈硬化の進展に関与していると考えられる。
以上より、サリューシン−αの血清濃度の低下は、動脈硬化、特に虚血性心疾患の存在を反映しているものと推測される。サリューシン−α濃度は虚血性心疾患の中では急性冠症候群で最も低値を示しており、冠動脈病変が重症なほど更に低下していることが分かり、抗動脈硬化作用を有するサリューシン−αが急性冠症候群の発症やその重症度を推定するマーカーとしての有用性が高いことが判明した。
【実施例１１】
【００１６】
サリューシン−α及びサリューシン−βの持続投与による動脈硬化に対する作用
動脈硬化モデル動物であるアポＥ欠損マウスにおいて、サリューシン−α及びサリューシン−βの持続投与による動脈硬化に対する作用を検討した。同時に抗サリューシン−α又は抗サリューシン−βの抗血清の作用も検討した。動脈硬化病変の検討に加え、動脈硬化初期病変の形成に重要なマクロファージの泡沫化に着眼し、酸化ＬＤＬによるコレステロールエステルの蓄積を測定した。酸化ＬＤＬを認識するスカベンジャー受容体（ＣＤ３６，ＳＲ−Ａ）、細胞内コレステロールエステル化酵素であるａｃｙｌ−ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １（ＡＣＡＴ１）、細胞内の過剰な遊離コレステロールを細胞外への搬出機構（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ）に関与するＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａ１（ＡＢＣＡ１）、ＡＢＣＧ１、ＳＲ−ＢＩの発現を解析した。
本動物実験は、日本国昭和大学動物実験実施指針に基づいて施行された。本研究に使用したアポＥ欠損マウスは全てＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。
１３週齢の雄性アポＥ欠損マウス７２匹を６群に分け、（ｉ）生食液（コントロール）、（ｉｉ）サリューシン−α（０．６ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｈ）、（ｉｉｉ）サリューシン−β（０．６ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｈ）、（ｉｖ）サリューシン−α（０．６ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｈ）＋抗サリューシン−α血清（１．４μｇ／ｋｇ／ｈ）、（ｖ）サリューシン−β（０．６ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｈ）＋抗サリューシン−β血清（１．４μｇ／ｋｇ／ｈ）、（ｖｉ）抗サリューシン−β血清（１．４μｇ／ｋｇ／ｈ）をオスモミニポンプを用いて４〜８週間持続皮下投与した。オスモミニポンプおよび内容液は１週間毎に交換した。
実験はマウスに普通食の摂取状況下で実施され、下記のパラメーターを測定した。
１．大動脈の動脈硬化病変の解析
採取した大動脈を長軸方向に切開し、オイルレッド０染色にて脂質沈着を伴う粥状硬化病変面積を検討した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて動脈硬化病変を同定し、ＮＩＨ  Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて解析し、病変面積を定量した。また大動脈近位部（大動脈弁直下部）での横断切片を作成し、オイルレッド０染色にて動脈硬化病変の詳しい解析を行った。
２．マクロファージの解析
（１）細胞内コレステロールエステル蓄積の検討：
チオグリコレート腹腔投与４日後に浸出性マクロファージを採取し、ウシ胎仔血清１０％含有のＲＰＭＩ１６４０液にて培養した。培養液に酸化ＬＤＬ（１０μｇ／ｍＬ）とともに［３Ｈ］オレイン酸（０．１ｍＭ）を添加し、１３時間後に細胞内に蓄積したコレステロール［３Ｈ］オレイン酸の放射活性を測定し、マクロファージの泡沫化を評価した。
（２）Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘの検討：
同様に採取したマクロファージを［３Ｈ］コレステロール（７４ｋＢｑ／ｍＬ）で標識した酸化ＬＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）含有の同培養液で２４時間保温した。ＰＢＳで２回洗った後、ＨＤＬ（１５μｇ／ｍＬ）を入れた０．１％ＢＳＡ含有のＲＰＭＩ１６４０液で１６時間保温した。培養液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して残渣物を除去し、細胞はＰＢＳで２回洗浄後に１Ｎ  ＮａＯＨ  ０．３ｍＬで溶解した。培養液および細胞抽出液中の［３Ｈ］コレステロールの放射活性を測定した。Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ（％）＝培養液中の［３Ｈ］コレステロールの放射活性／培養液および細胞抽出液中の［３Ｈ］コレステロールの放射活性Ｘ１００
（３）泡沫化関連遺伝子発現の検討：
（１）と同様の実験により同マクロファージを採取し、マクロファージ泡沫化関連遺伝子すなわち、酸化ＬＤＬを認識するスカベンジャー受容体ＣＤ３６とＳＲ−Ａ、細胞内コレステロールエステル化酵素ＡＣＡＴ１、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘに関与するＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、ＳＲ−ＢＩのタンパク質発現をウエスタンブロットで解析した。マクロファージ機能の内部標準としてβ−ａｃｔｉｎ発現も合わせて検討した。バンドの濃度の定量にはＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アトー株式会社、東京）を用いた。
上記検討において、以下の結果が得られた。
１．大動脈の動脈硬化病変
投与開始４週間後、大動脈弓のオイルレッド０で赤く染色された動脈硬化病変は、生食投与のコントロールに比べ（図１７−１Ａ）、サリューシン−βを投与したアポＥ欠損マウスでは大動脈起始部から腕頭動脈分岐部にかけて広範囲に認められた（図１７−１Ｃ、矢印）。各群６匹で測定された動脈硬化病変面積の平均値は、サリューシン−β投与群ではコントロール群に比べ約２．５倍に増えていた（Ｐ＜０．００５、図１７−２）。大動脈近位部の横断切片では、コントロールに比べ（図１７−１Ｆ）、サリューシン−β投与ではオイルレッド０で赤く染色された粥種の形成および血管壁肥厚を認めた（図１７−１Ｈ、矢印）。サリューシン−βに加え抗サリューシン−β血清を併用投与したマウスでは、サリューシン−β単独投与マウスに比べ、大動脈動脈硬化病変（図１７−１Ｄ）、粥腫および血管壁肥厚（図１７−１１）は改善されていた。抗サリューシン−β血清の単独投与ではコントロールと同等の動脈硬化病変であった（図１７−１Ｅ及びＪ）。
投与開始８週間後、生食を投与したコントロールでは、大動脈弓部の動脈硬化病変は著明に増大していたが（図１８−１Ａ、矢印）、サリューシン−αの投与により動脈硬化病変面積は半分以下に減少していた（図１８−１Ｂ及び１８−２）。またサリューシン−α投与により著明なプラーク形成も認められなかった（図１８−１Ｂ及びＥ）。抗サリューシン−α血清によりサリューシン−αの動脈硬化病変に対する抑制効果は解除されていた（図１８−１Ｃ及びＦ並びに１８−２）。
２．マクロファージの解析
投与開始４週間後に腹腔から採取した浸出性マクロファージでは、酸化ＬＤＬによる泡沫化（コレステロールエステルの細胞内蓄積）は、サリューシン−αではコントロールに比べ、約４分の１に減少していた（Ｐ＜０．０５、図１９Ａ）。サリューシン−βは、マクロファージの泡沫化を約２倍に増加し（Ｐ＜０．０１、図１９Ａ）、抗サリューシン−β血清によりコントロールレベルまで抑制されていた（Ｐ＜０．０１、図１９Ａ）。ＨＤＬによるｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘは、サリューシン−αによりコントロールの約２倍に増加していた（Ｐ＜０．０１、図１９Ｂ）。
同時期のマクロファージ泡沫化関連遺伝子のタンパク質発現を図２０に示す。サリューシン−αは、酸化ＬＤＬを認識するスカベンジャー受容体（ＣＤ３６、ＳＲ−Ａ）の発現には影響を及ぼさなかったが（図２０Ａ及びＢ）、ＡＣＡＴ１発現を約半分に減少し（Ｐ＜０．０５、図２０Ｃ）、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘに関わるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、ＳＲ−ＢＩの発現を１．５〜２倍に促進させた（Ｐ＜０．０５、図２０Ｄ、Ｅ及びＦ）。一方サリューシン−βは、ＣＤ３６、ＳＲ−Ａ、ＡＣＡＴ１の発現をコントロールの約１．５〜２．８倍に増加させた（Ｐ＜０．０５、図２０Ａ、Ｂ及びＣ）。上記のサリューシン−βの効果は抗サリューシンβ血清により全て解除された（図２０Ａ，Ｂ及びＣ）。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
実施例に記載のように、サリューシン−αは、マクロファージの泡沫化を抑制することにより、動脈硬化病変形成を抑制するので、動脈硬化性疾患の予防又は治療剤として用いることができる。一方、サリューシン−βは、マクロファージの泡沫化を促進することにより、動脈硬化病変形成を促進するので、サリューシン−βの作用を抑制することにより動脈硬化性疾患を予防又は治療することができる。抗サリューシン−β抗体は、サリューシン−βの作用を抑制することにより、動脈硬化性疾患の予防又は治療剤として用いることができる。さらに、血清、尿等の生体試料中のサリューシン−αの濃度は、動脈硬化の病変形成と関連しているので、生体試料中のサリューシン−αを動脈硬化性疾患の検出やリスク評価のためのマーカーとして用いることができる。
サリューシンα又はサリューシンβの作用を抑制するアンタゴニスティック化合物は、動脈硬化性疾患の予防・治療に用いることができる。また、サリューシン−αをマーカーとして動脈硬化性疾患の検出を行うことができる。このように、本発明は医療の分野に利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７−１】
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【図１８−１】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【国際調査報告】
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