【手続補正書】
【提出日】平成16年9月10日(2004.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産するための方法であって、当該方法は：
（a）適切な家禽鳥類を選択し；
（b）前記家禽鳥類を既知の完全アジュバントで免疫し、当該各アジュバントmlごとには熱殺菌し且つ乾燥させたマイコバクテリウム・チュベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（H３７Ra、ATCC２５１７７）１mg、０．８５mlのパラフィン及び０．１５mlのマンニドモノオレエートを含んで成り；
（c）前記鳥類を胸部筋肉において、DDT−OHハプテン、オクタクロロサイクリックハプテン、２，４，５トリクロロフォキシ酢酸βアラニンから選択された接合体１０００μgで免疫し；
（d）前記鳥類を再度、段階（c）で示したハプテン−タンパク質接合体、５００μgの所望のハプテン接合体で免疫し；
（e）前記鳥類をハプテン−タンパク質接合体で２、３及び５週の間隔にて免疫し；
（f）この後、前記鳥類を当該鳥類が卵を産む限り５週間隔にてハプテン−タンパク質接合体で免疫せしめ；
（g）前記鳥類の卵黄から抗体を収穫する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記所望のハプテン−タンパク質接合体が、DDT、エンドスルファン及びヘキサクロロへキサンに対する結合特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１の段階（c）において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、DDTに対し結合するDDT−OHを生産する方法であって、
（a）２，２−ビス（４−クロロフェニル）−１，１，１−トリクロロエタノールを一晩、ピリジン中で過剰の無水コハク酸を使用しスクシニル化してN−ヒドロキシスクシンイミドを獲得し；
（b）N−ヒドロキシスクシンイミド１８３．５mg、０．５mmolをジクロロメタン中、ジシクロヘキシルウレアとジメチルアミノピリジン触媒の存在下１：１：１：１．２（ハプテン：NHS：DCC：DMAP）の比で反応せしめ、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルへと転換させ；そして
（c）ジシクロへキシルウレアを単離してジクロロメタンを蒸発せしめることによって、接合において使用するためのDDT−OHハプテンの活性エステルを獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の段階（c）において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンを生産する方法であって：
（a）約３．７３gのヘプタクロルを０．１molの氷酢酸中、加温することによって溶かし；
（b）１．０８５gの次亜塩素酸Tert−ブチルを０．１mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階（a）で獲得した第一溶液に加え；
（c）この混合物を水浴中１時間に渡り還流せしめ；
（d）ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し；
（e）前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ；
（f）結晶生成物を、約３．０２gの収量、融点２３８℃で獲得し；
（g）前記１．０９gの結晶生成物を処理しプレハプテン１，３，４，５，６，７，８，８−オクタクロロ−２−ヒドロキシ−４，７−メタノ−３ａ、及び４，７，７a−テトラヒドロインダンを獲得し；
（h）前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を０℃に冷却し；
（i）ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え；
（j）この混合物を一晩撹拌し；そして
（k）ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階（c）のように、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体ハプテン、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニン(TCB)ハプテンを生産する方法であって：
(a)５．９５mlの塩化チオニル(９５０mmol)中、１０mM、２．５５gの２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え；
(b)１時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し；
(c)この生成物をβ−アラニン(９mmol、７．４mlの１MのNaOH中０．６６g）と０℃で撹拌し；
(d)前記生成物を１６時間超に渡り室温で加温し；
(e) 生成される酸を酸性化することによって単離し；
(f)酢酸エチル中へと分配し；
(g)水と塩水で洗浄し；
(h)２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸(２，４，５−T)を不純物として含有する粗製生成物ハプテンをある収量で得て；
(i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し；
(j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ；
(k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール８５：１５の混合物を使用し、アセトン中２％のo−トルイジンを噴霧してUV光線／日光へ露らすことによって検出されたTLC分析におけるRf値０．４５の単一のスポットが、融点１６９〜１７０℃の融解範囲にて示され；
(l) 融解範囲１０２〜１０４℃におけるハプテン２，４，５-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し；
(m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加えてこの混合物を氷浴中で冷却し；
(n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し；
(o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え；
(p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め；
(q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ；そして
(r)活性エステルを無色固体として分離する、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって：
(a)卵黄（yolk）を破裂せずに卵黄（eggyolk）を獲得し；
(b)１００mlのトリス緩衝液塩類溶液を卵黄１０mlごとに加え；
(c)遠心によって沈殿物を除去し；
(d)上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え；
(e)ペレットを捨て；
(f)前記上清水溶性タンパク質画分に対して１２％ポリエチレングリコールを加え；
(g)１０分に渡りインキュベートして再度遠心し；
(h)抗体を沈殿させ；
(i)沈殿を溶かすために１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加え；
(j)抗体溶液を０℃に冷却し；
(k)１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加え；
(l)溶液を４℃で遠心して沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かし；そして
(m)リン酸緩衝液に対する透析を４℃で２４時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって：
(a)卵黄を、卵黄膜を破裂させることなく卵殻から獲得し；
(b)各１０mlの卵黄ごとに、１０mlの蒸留水を加え；
(c)約０．１５％のκカラーギナンを加えて３０分に渡り室温で撹拌し；
(d)この溶液をろ過して１５分に渡り遠心し；
(e)２０mMのリン酸緩衝液pH８．０により調製したDEAE−セファセルカラムを通過させ；
(f)０．２Mのリン酸緩衝液pH８．０で溶出せしめ；
(g)溶出物を回収して２８０nmでの吸光度を読み；そして
(h)抗体を含有するピーク画分をプールして４℃で保存する、
ことでも行うことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
卵黄から脂質が、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用することで２度沈殿され、そして遠心され、上清から抗体を最大７５％の収率で獲得する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
脂質の除去後に獲得された水溶性タンパク質画分のpHは、抗体を更に沈殿させ、８０〜９０％の収率で獲得するために、pH５．０に調整されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
抗体の収率が７３％程度である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
超免疫卵(hyper immune egg)が毎日回収され、そして更なる使用迄４０℃で保存されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体の生産が免疫化後、第７日目に始まり、そして６０日に渡り続く、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
生産された抗体の力価が１６５〜２２５mg／mlである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記卵黄抗体の生産は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル／モノクローナル抗体に対し、一層／同等の感受性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記卵黄抗体の生産が農薬の小分子に関連する、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の更なる他の実施態様は、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンの生産であり、それは以下のとおり：
（a）約３．７３gのヘプタクロルを０．１molの氷酢酸中で、加温することによって溶かし；
（b）１．０８５gの次亜塩素酸Tert−ブチルを、０．１mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階（a）で獲得した第一溶液に加え；
（c）この混合物を水浴中１時間に渡り還流せしめ；
（d）ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し；
（e）前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ；
（f）結晶生成物を約３．０２gの収量、融点２３８℃で獲得し；
（g）前記１．０９gの結晶生成物を処理し、プレハプテン１，３，４，５，６，７，８，８−オクタクロロ−２−ヒドロキシ−４，７−メタノ−３ａ、及び４，７，７a−テトラヒドロインダンを獲得し；
（h）前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を０℃に冷却し；そして
（i）ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え；
（j）この混合物を一晩撹拌し；そして
（k）ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
ことである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
更に尚本発明の他の実施態様は、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニントリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの生産であり、それは以下のとおり：
(a)５．９５mlの塩化チオニル(９５０mmol)中、１０mM、２．５５gの２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え；
(b)１時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し；
(c)この生成物をβ−アラニン９mmol、０．６６gと７．４mlの１MのNaOH中０℃で撹拌し；
(d)前記生成物を１６時間超に渡り室温で加温し；
(e)生成される酸を酸性化することによって単離し；
(f)酢酸エチル中へと分配し；
(g)水と塩水で洗浄し；
(h)２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸(２，４，５−T)を不純物として含有する粗製生成物のハプテンをある収量で得て；
(i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し；
(j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ；
(k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール８５：１５の混合物を使用し、アセトン中２％のo−トルイジンを噴霧してUV光線／日光へ露すことによって検出されたTLC分析におけるRf値０．４５の１つのスポットが、１６９〜１７０℃の融解範囲にて示され；
(l)融解範囲１０２〜１０４℃におけるハプテン２，４，５-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し；
(m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加え、そしてその混合物を氷浴中で冷却し；
(n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し；
(o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え；
(p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め；
(q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ；そして
(r)活性エステルを無色固体として分離する、
ことである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の更なる他の実施態様において、抗体の収穫は以下のとおり：
(a)卵黄（yolk）を破裂させずに卵黄（eggyolk）を獲得し；
(b)１００mlのトリス緩衝液生理食塩水を卵黄１０mlごとに加え；
(c)遠心によって沈殿物を除去し；
(d)この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え；
(e)ペレットを捨て；
(f)前記上清水溶性タンパク質画分に対して１２％ポリエチレングリコールを加え；
(g)１０分に渡りインキュベートして再度遠心し；
(h)抗体を沈殿させ；
(i)沈殿を溶かすために１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加え；
(j)抗体溶液を０℃に冷却し；
(k)１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加え；
(l)溶液を４℃で遠心して沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かし；そして
(m)リン酸緩衝液に対する透析を４℃で２４時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
ことで行われている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
実施例
実施例−１
卵黄を卵殻から慎重に卵膜を破裂させることなく取り出した。前記膜に対して接着していたアルブミンを全体的に洗い流した。そして卵黄膜を破裂せしめ、そして漏斗を介して測定用シリンダーへと移した。卵黄各１０mlに対して、トリス塩類緩衝溶液を１００ml加えた。形成された沈殿を遠心によって除去した。この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を加えて再度遠心した。ペレットを捨て、そしてこの上清、いわゆる水溶性タンパク質画分に対して１２％ポリエチレングリコールを加え、そして１０分に渡りインキュベートして遠心した。抗体が沈殿する。１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加えて沈殿を溶かした。次いで、この抗体溶液を０℃に冷却して１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加えた。この溶液を４℃で遠心して、沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かしてリン酸緩衝液中４℃で２４時間に渡り透析した。収率６０％。