【手続補正書】
【提出日】平成16年11月5日(2004.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  活性でかつ正しく折りたたまれたタンパク質として細胞外に分泌される、原核細胞において組換えDNA由来の組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、tPA変異体、クリングル2セリンプロテアーゼ分子(K2S)又はK2S変異体を生産する方法であって、該原核細胞がシグナルぺプチドOmpAをコードするDNAに作用可能に結合した前記tPA、tPA変異体、K2S分子又はK2S変異体をコードするDNAを含むベクターを含有し発現させることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】  該原核細胞が配列TCTGAGGGAAACAGTGAC (配列番号1)によって特定された核酸分子又はその機能誘導体に作用可能に結合しているシグナルぺプチドOmpAをコードするDNAに作用可能に結合した前記tPA、tPA変異体、K2S分子又はK2S変異体をコードするDNAを含むベクターを含有し発現させることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】  該原核細胞がE. coliであることを特徴とする、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】  K2Sの上流に結合したOmpAのDNA配列が下記配列又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG (配列番号2)
【請求項５】  OmpAのDNA配列が下記配列を含む又は下記配列からなることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC (配列番号3)
【請求項６】  該tPA、tPA変異体、K2S分子又はK2S変異体をコードするDNAがヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸87 - 527、174 - 527、180 - 527又は220 - 527の少なくとも90% をコードするDNA分子の群より選ばれることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】  K2SのDNA配列が下記配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含む又は下記配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体からなることを特徴とする、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (配列番号4)
【請求項８】  a) 下記b)に作用可能に結合したOmpAタンパク質、
b) 組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のクリングル2ドメインとセリンプロテアーゼドメインを含むポリぺプチドをコードするDNA分子、
をコードしていることを特徴とする、DNA分子。
【請求項９】  前記DNA配列が下記配列又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含むことを特徴とする、請求項8記載のDNA分子。
ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG (配列番号5)
【請求項１０】  前記DNA配列が下記配列からなることを特徴とする、請求項8又は9記載のDNA分子。
ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG (配列番号5)
【請求項１１】  前記DNA配列b)が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸87 - 527の少なくとも90% をコードしていることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載のDNA分子。
【請求項１２】
前記DNA配列b)が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸174 - 527の少なくとも90% をコードしていることを特徴とする、請求項8〜11のいずれか1項に記載のDNA分子。
【請求項１３】  前記DNA配列b)が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸180 - 527の少なくとも90% をコードしていることを特徴とする、請求項8〜12のいずれか1項に記載のDNA分子。
【請求項１４】  前記DNA配列b)が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸220 - 527の少なくとも90% をコードしていることを特徴とする、請求項8〜13のいずれか1項に記載のDNA分子。
【請求項１５】  前記DNA配列b)が下記配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズしていることを特徴とする、請求項8〜14のいずれか1項に記載のDNA分子。
TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (配列番号7)
【請求項１６】  前記DNA配列b)が下記配列からなることを特徴とする、請求項8〜15のいずれか1項に記載のDNA分子。
TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (配列番号7)
【請求項１７】  下記アミノ酸配列を特徴とするタンパク質を含むことを特徴とする、OmpAとK2Sの融合タンパク質。
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPG (配列番号8)
【請求項１８】  下記アミノ酸配列を特徴とするタンパク質からなることを特徴とする、請求項17記載のOmpAとK2Sの融合タンパク質。
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPG (配列番号8)
【請求項１９】  下記アミノ酸配列を特徴とする、K2Sタンパク質。
SEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP* (配列番号11)
【請求項２０】  請求項8〜16のいずれか1項に記載のDNA分子を含む原核ホスト細胞。