【手続補正書】
【提出日】平成17年4月18日(2005.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のターゲット核酸分子の存在を決定するプライマー伸長連鎖反応法において、以下の工程を含む前記方法：
（ａ）リバースプライマーをターゲット核酸分子と、プライマー伸長連鎖反応を行うのに適した条件下でハイブリダイズする工程；
（ｂ）ターゲット核酸分子を鋳型として用いてリバースプライマーを伸長して、リバースプライマー伸長産物を形成する工程、ここでリバースプライマー伸長産物と結合したリバースプライマーはリバースプライマー増幅産物を構成する；
（ｃ）前記鋳型由来のリバースプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｄ）フォワードプライマーを以下のものとハイブリダイズする工程：
（ｉ）存在する場合には、ターゲット核酸分子と相補的な核酸分子；又は
（ii）リバースプライマー増幅産物；
（ｅ）存在する場合には、相補的ターゲット核酸分子又はリバースプライマー増幅産物を鋳型として用いてフォワードプライマーを伸長する工程、ここでフォワードプライマー伸長産物と結合したフォワードプライマーはフォワードプライマー増幅産物を構成する；
（ｆ）前記鋳型由来のフォワードプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｇ）リバースプライマーをフォワードプライマー増幅産物とハイブリダイズする工程；
（ｈ）フォワードプライマー増幅産物を鋳型として用いてリバースプライマーを伸長して、追加のリバースプライマー伸長産物を形成する工程、ここで追加のリバースプライマー伸長産物と結合したリバースプライマーは追加のリバースプライマー増幅産物を構成する；
（ｉ）前記鋳型由来の追加のリバースプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｊ）フォワードプライマーをリバースプライマー増幅産物とハイブリダイズする工程；
（ｋ）リバースプライマー増幅産物を鋳型として用いてフォワードプライマーを伸長して、追加のフォワードプライマー伸長産物を形成する工程、ここで追加のフォワードプライマー伸長産物と結合したフォワードプライマーは追加のフォワードプライマー増幅産物を構成する；
（ｌ）前記鋳型由来の追加のフォワードプライマー増幅産物を変性させる工程；
（ｍ）追加のリバースプライマー増幅産物と追加のフォワードプライマー増幅産物をそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマー用の鋳型として用いて、検出可能な量の追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物を産生するのに十分な回数、工程（ｇ）から（ｌ）を繰り返す工程；及び
（ｎ）追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物の存在を検出する工程；
ここで、リバースプライマーの3'末端のヌクレオチドは以下のものとハイブリダイズし：
（ｉ）フォワードプライマー伸長産物又は追加のフォワードプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチド；又は
（ii）フォワードプライマー伸長産物又は追加のフォワードプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチドとはヌクレオチドのギャップで離れたヌクレオチド、ここで前記ギャップは高く保存されていることが知られている配列を含み、かつ、前記ギャップは約１〜約５のヌクレオチドを含む；及び
フォワードプライマーの3'末端のヌクレオチドは以下のものとハイブリダイズする：
（ｉ）リバースプライマー伸長産物又は追加のリバースプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチド；又は
（ii）リバースプライマー伸長産物又は追加のリバースプライマー伸長産物の5'末端のヌクレオチドとはヌクレオチドのギャップで離れたヌクレオチド、ここで前記ギャップは高く保存されていることが知られている配列を含み、かつ、前記ギャップは約１〜約５のヌクレオチドを含む。
【請求項２】
ターゲット核酸分子が変異体配列を有することが知られている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマー伸長連鎖反応がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ターゲット核酸分子がウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスがヒト免疫不全症ウイルス（HIV）である、又はウイルスがC型肝炎ウイルス（HCV）若しくはB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ギャップがウイルスのゲノムの高く保存された領域を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ギャップが約2個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）（ｉ）のターゲット核酸分子と相補的である核酸分子がターゲット核酸分子のcDNAとして単独に与えられる、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物の存在を検出する工程が以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
（Ａ）自己変性シグナル発生プローブを用意する工程、ここで前記プローブは以下のものを含む：
（ｉ）検出可能なシグナルを発生することができるレポーター部分に付着した第1核酸配列；
（ii）（ａ）第1核酸配列に相補的であり、
（ｂ）第1核酸配列と第2核酸配列が互いにハイブリダイズする場合にレポーター部分のシグナルを変性することができる相互作用部分に付着した第2核酸配列；及び
（iii）第1核酸配列と第2核酸配列を繋ぐプローブ配列、ここで前記プローブ配列は以下のもののいずれかを含む：
（ａ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列；又は
（ｂ）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列；及び
（Ｂ）前記増幅産物を前記プローブと接触させる工程；
ここで、前記プローブのプローブ配列は追加のリバースプライマー増幅産物又は追加のフォワードプライマー増幅産物とハイブリダイズする場合、第1及び第2核酸配列は変性し、それによってレポーター部分によりシグナルを発生し、
レポーター部分によって発生したシグナルはターゲット分子の存在を示す。
【請求項１０】
プローブ配列が以下のいずれかのものを含む、請求項９に記載の方法：
（ａ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列、ただしリバースプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列は含まない；又は
（ｂ）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列、ただしフォワードプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列は含まない。
【請求項１１】
プローブ配列が以下のいずれかのものを含む、請求項９に記載の方法：
（ａ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列及びリバースプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列；又は
（ｂ）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列及びフォワードプライマーに相補的であるセグメントのヌクレオチド配列。
【請求項１２】
前記プローブによって発生した検出可能なシグナルのレベルがサンプル中のターゲット核酸分子の量に比例する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
約60〜約95％の前記プローブ配列が以下のいずれかのものを含む、請求項１１に記載の方法：
（ｉ）フォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列；又は
（ii）リバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列。
【請求項１４】
前記プローブ配列がリバースプライマーのセグメントのヌクレオチド配列を含む場合に、リバースプライマーとフォワードプライマーのモル比が約1:5〜約1:20の範囲であるか、又は
前記プローブ配列がフォワードプライマーのセグメントのヌクレオチド配列を含む場合に、フォワードプライマーとリバースプライマーのモル比が約1:5〜約1:20の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブ配列が約10〜約30個のヌクレオチド残基を含む、又は前記プローブ配列が約18〜約24個のヌクレオチド残基を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
検出可能なシグナルが発光シグナルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
発光シグナルが蛍光シグナル又は化学発光シグナルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
レポーター部分が自己変性シグナル発生プローブの5'末端又は3'末端で付着する、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
相互作用部分が自己変性シグナル発生プローブの5'末端又は3'末端で付着する、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
レポーター部分がフルオロフォアである、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
相互作用部分がクエンチャーである、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
クエンチャーがDABCYL、アントロキノン、ニトロチアゾール、ニトロイミダゾール又はマラカイトグリーンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
相互作用部分がフルオロフォアである、請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
増幅産物が終点分析により測定及び定量化される、又は実時間分析により測定及び定量化される、又は一連の閾値サイクル測定から導かれる標準曲線を用いて測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中のターゲット核酸分子の検出用キットであって、前記ターゲット核酸分子は変異体配列を有することが知られている、以下のものを含む前記キット：
（ｉ）請求項１に記載の方法に有用な一組のプライマー；
（ii）プライマー伸長連鎖反応を行うための試薬；及び
（iii）プライマー増幅産物の存在を検出する自己変性シグナル発生プローブ、ここで前記プローブは検出可能なシグナルを発生することができるレポーター部分に付着した第1核酸配列、レポーター部分のシグナルを変性することができる相互作用部分に付着した第2核酸配列、並びに第1及び第2核酸配列を繋ぐプローブ配列を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
様々なHCV遺伝子型に感染した個体由来の血漿サンプルのスクリーニング
本発明の“向かい合う（nose-to-nose）”PCRを用いてICBS HCVマスターパネルから患者血漿サンプルのサブセットをスクリーニングした。連続して伸長される前記パネルは、International Consortium for Blood Safety（ICBS）と共同して疾病管理センター（CDC）によって編集される。前記パネルは、種々の地理上の領域から集められた血漿サンプルから構成される。すべてのサンプルは、HCV抗体に関してスクリーニングされ、CDC及びVisible Genetics Inc.（VGI）の2つの独立した検査室で遺伝子型分析される。
エジプト、ベトナム及びインドネシアで集められた血漿サンプルを含む合計192のサンプルは、CDCによって提供された。これらのうちで、CDC、VGI又は両方によって得られたPCR-遺伝子型データに基づいてHCV RNAに関して明確に陽性のものとして、134がリストアップされた。5つのサンプルは、不確かな又は矛盾するPCR-遺伝子型データを有するものとしてリストアップされた。53のサンプルは、遺伝子型でないものとしてリストアップされた（すなわち、HCV RNAに対して陰性）。
RNAが結合し、96ウエルプレート型のPVDF膜から抽出されるロボット抽出手段を用いて、総RNAを70μlの新たに解凍した血漿から抽出した（Lee and Prince, 2001, Transfusion; 41:483-487）。総RNAを50μlの量のヌクレアーゼを含まない水で得た。次いで、この10μl（14μlの血漿と等価である）を、上述の向かい合う（nose-to-nose）プライマー（配列番号３及び配列番号４）及び分子ビーコン（配列番号５）を用いて逆転写及びPCRに供した。
パネルに存在する134の明確にHCV-陽性のサンプルについてのRT-PCRの結果を表３に示す。“向かい合う（nose-to-nose）”PCRは、すべての遺伝子型由来のHCV単離物の大部分を首尾よく検出した。遺伝子型アッセイでHCV RNAに関して陽性でない53のサンプルのうちで、1つのサンプルのみが弱い陽性PCRシグナルを与えた（103.1RNA分子/ml）。
約700コピー/ml（9.9コピー/14ul血漿）未満のウイルス負荷を有するサンプルは、上述のロボット抽出と“向かい合う（nose-to-nose）”RT-PCRの組み合わせを使用しても検出されないであろう。表３に示される結果は、本発明が“向かい合う（nose-to-nose）”プライマーと分子ビーコンの1つのセットで種々のHCV遺伝子型の検出を与えることを明確に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【表４】
2004532027.tif 000001
***混ざっている感染を示す遺伝子型分析又は未だに不確定の分類が別々にリストアップされているサンプル。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
HIV-1グループMの異なるサブタイプの検出
PCRプライマーはHIV-1ゲノムRNAのgag遺伝子のセグメントを増幅するようにデザインされ、HIV-1グループMの異なるサブタイプ間で比較的よく保存されている。この相対的な保存にもかかわらず、個々のHIV-1サブタイプは、ゲノムのこの領域内に20％までのヌクレオチド配列多様性を示す（Robertonら、1999: Human Retroviruses and AIDS 1999, pp 492-505, Editors Kuikenら、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ）。
ビーコンPCRのための従来のプライマーは、サブタイプB HIV-1単離HXB2の公開配列のヌクレオチド1478〜1571に対応するRNAの94b.p.セグメントを増幅するようにデザインされていた［ラトナーら、1985, Nature, 313(6000):277-284; Genbank K03455］。2つの従来のRT-PCRプライマーの間の介在ギャップは53b.p.である。プライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー:5'-AACCAAGGGGAAGTGACATA-3'（配列番号１０）；
リバースプライマー:5'-ATTTCTCCTACTGGGATAGGT-3'（配列番号１１）。
本発明の“向かい合う（nose-to-nose）”RT-PCRのためのプライマーは、HIV-1 HXB2の公開配列のヌクレオチド1502〜1558に対応する57b.p.セグメントを増幅するようにデザインされた。2つのプライマーの間に介在ギャップは存在しない。プライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー：5'-GAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAG-3'（配列番号１２）；
リバースプライマー:5'-GGATAGGTGGATTATTTGTCATCCATC-3'（配列番号１３）。
従来及び“向かい合う（nose-to-nose）”PCRの両方について、PCR産物の検出に使用した分子ビーコンは5'-FAM-cgcctTACCCTTCAGGAACAAATAGaggcg-DABCYL-3'（配列番号１４）であった。茎核酸は小文字で示され、プローブループ核酸（HIV-1 HXB2配列のヌクレオチド1512〜1530と一致する）は大文字で示される。
HIV-1サブタイプA、B、C、D、F及びG由来のウイルス単離物は、AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIHから細胞を含まない培養上清として得られた。RNAは、140ulの新たに解凍した培養上清から抽出した。相補DNAは、従来のリバースプライマー、又は上述の向かい合う（nose-to-nose）リバースプライマーのいずれかを用いて抽出したRNAから逆転写された。cDNA合成及びPCR増幅の両方についての反応条件は、HCVについて上述のものと本質的に同じであった。すべてのアッセイは3通の行った。HIV鋳型分子の定量化は、各RT-PCR実験でRNA標準曲線の算入によって達成された。標準曲線は、1μg/mlのイーストtRNA（Ambion、オースティン、TX）に希釈された1、10、102、103、104、105又は106分子のHIV-1 RNAを用いて作成された。
HIV-1サブタイプの検出のための従来のRT-PCR及び“向かい合う（nose-to-nose）”RT-PCRの比較を表４に示す。本発明の“向かい合う（nose-to-nose）”アッセイ（Ａ）は、検査した6つのHIV-1サブタイプのすべてを検出したが、従来のアッセイはサブタイプA、D及びGを検出できなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【表５】
2004532027.tif 000002
1.検査サンプルは、AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIHから細胞を含まない培養上清として得られたウイルス単離物であった。
2.単離物は、UNAIDS Network for HIV Isolation and Characterization、及びDAIDS, NIAIDから得た。
3.Abimikuら、1994, AIDS Res Hum Retroviruses, 10(11):1581-1583。 
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
HIV-1グループM及びHIV-1グループO変異体の両方を同時に検出する方法の適応
HIV-1グループO（アウトライアー）由来のウイルス単離物はHIV-1グループM（メジャー）のメンバー由来のマーク配列変異体を示す。グループOウイルスはアフリカの一部で主に流行しているが、アフリカの外の血液銀行によって集められたサンプルの中の頻度は、増加しているようである（Jaffe and Schochetman, 1998, Infect Dis Clim North Am; 12(1):39-46; Couturierら, 2000, AIDS;14(3):289-296; Fed Regist, 1997, Sept 23;62(184):49695）。本発明は、“向かい合う（nose-to-nose）”プライマー及び分子ビーコンの1つのセットを用いて、グループM及びグループOの両方のメンバーの検出を可能にする。
本発明の“向かい合う（nose-to-nose）”RT-PCRのためのプライマーは、HIV-1ゲノムRNAのpol遺伝子の64b.p.セグメントを増幅するようにデザインされ、HIV-1 HXB2の公開配列のヌクレオチド4750〜4813と一致している。2つのプライマーの間の介在ギャップは存在しない。プライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー：5'-CAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTT-3'（配列番号１５）；
リバースプライマー：5'-CTGTATCCCCCAATCCCCCCTTTTCTTTTA-3'（配列番号１６）。
PCR産物検出で使用した分子ビーコンは、5'-FAM-cgcacgGCAGTATTCATTCACCAATTTTcgtgcg-DABCYL-3'（配列番号１７）であった。茎核酸は小文字で示され、プローブループ核酸は大文字で示される。
次いで、新しいプライマー及びビーコンは、HIV-1グループM（サブタイプA、B、C、D、F及びG）及びグループO由来のウイルス単離物を増幅及び検出する能力について試験され、AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID/NIHからの細胞を含まない培養上清として得られた。RNA抽出の前に、すべての細胞上清は、リン酸緩衝食塩水（PBS）で1000倍に希釈された。RNA抽出は、以下の単離物を除いては、上述のように希釈上清で実質的に行われ、すべてのRNAサンプルはRNaseを含まないDNase（Ambion、オースティン、TX）で処理されてプロウイルスDNAの汚染の除去を確実にする。相補DNAは、上述の向かい合う（nose-to-nose）リバースプライマー（配列番号１６）を用いて抽出RNAから逆転写された。cDNA合成及びPCR増幅の両方のための反応条件は、上述のものと本質的に同じであった。HIV-1鋳型分子の定量化は、各RT-PCR実験におけるRNA標準曲線の算入によって達成された。
表５は、本発明のpol領域“向かい合う（nose-to-nose）”プライマーを用いるRT-PCRの結果、及びCOBAS AMPLICOR HIV-1 Monitor Assay Version 1.0（Roche Diagnostics, Branchburg, NJ）との比較を示す。“向かい合う（nose-to-nose）”RT-PCRアッセイは、COBAS AMPLICOR HIV-1 Monitor Assay（1.0）と同じ（グループM、サブタイプB及びC）又はより高い（グループM、サブタイプA、D及びF）感受性で、検査されたすべてのグループM及びグループO単離物を検出できた。後者のアッセイは、検査されたグループOウイルス単離物のいずれも検出できず、またグループMサブタイプGも検出できなかった。これらのデータは、COBAS AMPLICOR HIV-1 Monitor Assay（1.0）又はもその改良バージョン（1.5）のいずれもグループOウイルスを検出できないという最近の報告（Yangら、Transfusion, 2001; 41:643-651）と一致している。対照的に、本発明は、“向かい合う（nose-to-nose）”プライマー及び分子ビーコンの1つのセットですべてのウイルス単離物の検出を可能にする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
【表６】
2004532027.tif 000003
1. RNA抽出の前に、すべての細胞を含まない上清をPBS（“向かい合う”RT-PCRについて）又は普通のヒトの血漿（COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Version 1.0について）のいずれかで1000倍に希釈した。2. ウイルス単離物は表４に記載される；単離物L20571, Gurtler LGら, 1994, J Virol, 68:1581；単離物Y14496, Loussert-Ajaka Iら, J Virol 69:5640, 1995。3. “向かい合う”PCR又はRT-PCRは、また観測されたシグナルがウイルス増幅によるものであり、ヒトの核酸を汚染するものの増幅によるものではないことを証明するために100ngのヒトのDNA又はRNAで行った。