(57)【要約】  本願発明者らは、M細胞への抗原の効率的な供給が可能になり、粘膜ワクチンの効率を飛躍的に上昇させることを目的として、抗原の取り込み口に当たるM細胞またはその周辺部分の上皮層（FAE）表層に対して特異的なターゲティングを行うための手段を開発することを課題とした。  本発明者らは、M細胞またはその周辺部分のリンパ濾胞上皮層（FAE）をターゲティングすることができる抗体を作製することにより、上述した課題を解決することができることを見いだした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しない抗体。
【請求項２】
マウス-ラットハイブリドーマ細胞17-1-8-4（FERM  ABP-10926）により産生される、マウスFAEの全体を認識する、＃17-1-8-4抗体。
【請求項３】
M細胞を認識するが、杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しない抗体。
【請求項４】
マウス-ラットハイブリドーマ細胞16-2-4（FERM  ABP-10927）により産生される、マウスM細胞を認識するが、マウス杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しない、＃16-2-4抗体。
【請求項５】
リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しない抗体、またはM細胞を認識するが、杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しない抗体、から構成されるワクチン担体。
【請求項６】
＃17-1-8-4抗体または＃16-2-4抗体から構成される、請求項5に記載のワクチン担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、M細胞またはM細胞の周囲組織であるリンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）に対して高い特異性を有する抗体に関するものである。本発明はまた、その様な抗体をワクチン担体として使用することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原性微生物やアレルゲンなどの抗原の生体内への侵入経路の一つに、口腔、消化管、呼吸器をはじめとする粘膜組織表面が存在する。このような粘膜組織表面（粘膜面）を介して感染する病原性微生物として、SARSウィルス、HIVウィルス、エボラウィルス、B型肝炎ウィルス、炭疽菌、ペスト菌、Q熱リケッチャなどが知られている。粘膜面は、これら多数の外界からの病原性微生物の侵入部位として、絶えず攻撃を受けている。これらの病原性微生物をはじめとする外来性抗原に対する認識・応答システムが、粘膜免疫システムである。【０００３】
粘膜面の直下には、全免疫担当細胞のおよそ半分にあたる1011個にもおよぶ免疫担当細胞が存在し、これらの細胞が、外来性の異種抗原（病原性微生物の他、食物抗原、アレルゲン）に対する正と負の免疫応答を行う、ダイナミックな免疫機構を構成している。粘膜免疫システムは、このような粘膜面を介して取り込まれた外来性の異種抗原に対して、全身血清中に抗原特異的IgGを中心とした体液性免疫応答のみならず、粘膜面での分泌型の免疫グロブリンA（S-IgA）を中心とした体液性免疫応答を誘導し、さらには粘膜系の傷害性T細胞（CTL）を中心とした細胞性免疫応答をも誘導することが知られている。【０００４】
消化管における粘膜免疫の中心となるIgA免疫応答に関与する免疫担当組織は、腸管関連リンパ節（Gut-Associated Lymphoid Tissue；GALT）に分類されるパイエル板（Peyer's Patch）が重要な働きをする。パイエル板の表層には、ドーム様構造のリンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）と呼ばれる特殊な上皮層が存在し、そこに存在する抗原取り込み専門M細胞（microfold cell）の取り込み作用により、抗原が腸管腔側からパイエル板に取り込まれる。抗原特異的免疫応答は、このM細胞から取り込まれた外来抗原が、M細胞基底膜側の陥凹部（ポケット）等に局在する抗原提示細胞に受け渡されることにより、惹起されることから、M細胞は粘膜免疫システムにおけるイニシエーターとしての重要な働きを有していると考えられている。こうして取り込まれた抗原は、マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞によって処理され、抗原提示の結果、IgA産生前駆B細胞が誘導され、IgA抗体の産生が生じる。【０００５】
このような腸管免疫の特殊性および有用性に鑑みて、腸管を介した粘膜免疫を惹起する粘膜ワクチンは、注射を必要とせず、安全かつ簡便であるだけではなく、粘膜系および全身系の両方の免疫機構に抗原特異的防御免疫を成立させるという点で、理想的なワクチンであると考えられている。効果的な免疫原（抗原）特異的な腸管粘膜免疫応答の誘導においては、小腸粘膜誘導組織、特に抗原の取り込み専門の細胞であるM細胞にいかにワクチン抗原を効果的に標的できるかが鍵であると考えられている。【０００６】
近年、粘膜免疫を効果的に惹起するための方法として、M細胞ターゲティングの手法を利用したDNAワクチンが報告された（非特許文献1）。この方法は、M細胞に対して結合する能力を有するレオウィルスのタンパク質σ1を利用して、M細胞にワクチンを送達するものである。しかしながら、σ1タンパクのレセプターであるα2-3型シアル酸は、M細胞のみならず小腸上皮細胞にも存在することから、M細胞により特異性の高い分子を応用したターゲティングの技術開発が必須であった。【０００７】
一方、これまで、マウスM細胞を認識するマーカーとしては、レクチンUEA-1が知られていた（非特許文献2）。しかしながら、UEA-1は、M細胞だけでなく、粘液分泌細胞である杯細胞にも反応性を示しため（非特許文献2）、UEA-1を利用してワクチン抗原を投与しても、M細胞のみならず杯細胞にも標的され、効果的に免疫応答を惹起することは困難である。また、小腸での杯細胞の頻度はM細胞の頻度に比べてはるかに多いため、M細胞またはM細胞の周辺部分の上皮層（FAE）表層に対して、UEA-1よりも特異性の高いマーカーの開発は、M細胞標的型粘膜ワクチンを開発する上で必須であった。
【非特許文献１】Wu Y et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98: 9318-23
【非特許文献２】Kandori, H. et al., Exp. Anim. (1996) 45: 155-160
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明者らは、抗原の取り込み口に当たるM細胞またはその周辺部分の上皮層（FAE）表層に対して特異的なターゲティングができれば、M細胞への抗原の効率的な供給が可能になり、粘膜ワクチンの効率を飛躍的に上昇させることができると考えた。すなわち、本願発明者らは、抗原の取り込み口に当たるM細胞またはその周辺部分の上皮層（FAE）表層に対して特異的なターゲティングを行うための手段を開発することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、M細胞またはその周辺部分のリンパ濾胞上皮層（FAE）に対して特異的に結合する分子を開発することを目的として、鋭意研究を進めた結果、M細胞またはその周辺部分のリンパ濾胞上皮層（FAE）をターゲティングすることができる抗体を作製することにより、上述した課題を解決できることを見いだした。【００１０】
すなわち、本発明は、（1）リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しない抗体、または（2）M細胞を認識するが、杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しない抗体を提供する。【００１１】
本抗体の特異性により、経口投与した本抗体と免疫原（抗原）との複合体は、粘膜における免疫原（抗原）取り込み細胞であるM細胞表層もしくは近傍に特異的に運搬される。その結果、免疫原（抗原）がM細胞から取り込まれやすくなり、目的とする免疫原（抗原）に対して特異的かつ効率的に粘膜免疫を引き起こすことができる。このようにして目的とする免疫原（抗原）に対して特異的かつ効率的に粘膜免疫を引き起こし、標的となる病原性微生物（もしくは病原毒素）を中和することにより、病原性微生物（もしくは病原毒素）により引き起こされる疾患を予防または治療することができる。【００１２】
したがって、本発明はまた、上述した抗体から構成される、粘膜ワクチン用のワクチン担体を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
上述したように、本発明の抗体は、リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しないか、またはM細胞を認識するが、杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しないという特徴を有する。この特徴により、この抗体と免疫原（抗原）とを結合させ、経口投与する場合に、抗体とM細胞との特異的結合に基づいて、免疫原（抗原）が粘膜における免疫原（抗原）取り込み細胞であるM細胞の近傍に特異的に運搬されることから、本発明の抗体は、免疫原（抗原）と組み合わせることにより、粘膜ワクチン用のワクチン担体として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、小腸パイエル板についてのホールマウント染色を行った際の、＃16-2-4抗体による染色像（緑色蛍光、16-2-4）、レクチンUEA-1による染色像（赤色蛍光、UEA-1）、およびこれらの重ね合わせ像（Merge）を示す。
【図２】図2は、小腸パイエル板についてのホールマウント染色を行った際の、#17-1-8-4抗体による染色像（緑色蛍光、17-1-8-4）、レクチンUEA-1による染色像（赤色蛍光、UEA-1）、およびこれらの重ね合わせ像（Merge）を示す。
【図３】図3aは、小腸パイエル板についての免疫組織学的解析を行った際の、対比染色としてのDAPIによる核染色像（青色蛍光、DAPI）、＃16-2-4抗体による染色像（緑色蛍光、16-2-4）、レクチンUEA-1による染色像（赤色蛍光、UEA-1）、およびこれらの重ね合わせ像（Merge）を示す。図3aの上段のそれぞれの染色像において、重ね合わせ像において四角で囲った部分に相当する部位を拡大したのが、下段のそれぞれの写真である。また、図3a下段の重ね合わせ像において四角で囲った2箇所の部分をさらに拡大した写真を、図3bに示す。
【図４】図4は、＃16-2-4抗体を用いた、免疫電子顕微鏡解析の結果を示す図である。左図の四角で囲った部位を拡大したのが右図である。
【図５】図5aは、上気道の鼻咽頭組織切片の染色像であり、矢印で示した部分が鼻咽頭関連リンパ組織（NALT）である。図5bは、図5aの四角で囲った部分（NALT）についての免疫組織学的解析を行った際の、＃16-2-4抗体による染色像（緑色蛍光、16-2-4）、レクチンUEA-1による染色像（赤色蛍光、UEA-1）、対比染色としてのDAPIによる核染色像（青色蛍光、DAPI）およびこれらの重ね合わせ像（Merge）を示す。
【図６】図6は、FITC標識した＃16-2-4抗体、およびFITC標識した対照抗体（Rat IgG）を、パイエル板を含む腸管ループ内に投与し、抗体のその後の動態を組織学的に追跡評価した結果を示す（図6Aおよび図6B）。
【図７】図7は、＃16-2-4抗体と破傷風トキソイド抗原とを組み合わせた場合（16-2-4 TT群）、対照抗体と結合させた破傷風トキソイド抗原を投与した場合（Rat IgG TT群）、および陰性対照であるPBSを投与した場合（PBS群）における、全身系応答（血清中IgG）（図7A）および粘膜系応答（糞便中IgA）（図7B）の誘導を示す図である。
【図８】図8は、＃16-2-4抗体とボツリヌストキソイド抗原とを組み合わせた場合（16-2-4 BT群）、対照抗体と結合させたボツリヌストキソイド抗原を投与した場合（Rat IgG BT群）、および陰性対照であるPBSを投与した場合（PBS群）における、全身系応答（血清中IgG）および粘膜系応答（糞便中IgA）の誘導を示す図である。
【図９】図9は、＃16-2-4抗体とボツリヌストキソイド抗原とを組み合わせた場合における、抗体-抗原複合体によるボツリヌス毒素に対する抗原中和効果を示す図である。
【発明の実施の形態】
【００１５】
上述したように、本発明においては、リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しない抗体、またはM細胞を認識するが杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しない抗体を提供することを特徴とする。
【００１６】
リンパ濾胞上皮（FAE）は、パイエル板を覆う、ドーム状の構造をしたリンパ濾胞の上皮部分のことをいい、腸管および鼻咽頭に存在する。このリンパ濾胞上皮（FAE）は、通常の腸管における絨毛上皮あるいは鼻咽頭における腺毛上皮とは異なる性質を示すことが知られており、腸管においては主としてM細胞および吸収上皮細胞から、鼻咽頭においてはM細胞および呼吸上皮細胞からそれぞれ構成されている。これに対して腸管の絨毛上皮の主たる機能は、栄養素の吸収であり、また粘液の分泌という機能性も有すことから、主として吸収上皮細胞と杯細胞から構成されるが、一方鼻咽頭の腺毛上皮の主たる機能は、鼻咽頭からの異物の排出であり、栄養素の吸収をともなわない呼吸上皮細胞と杯細胞から構成される。
【００１７】
M細胞（microfold cell）は、パイエル板を代表とする腸管関連リンパ組織（GALT）や上気道の鼻咽頭関連リンパ組織（NALT）に存在する抗原取り込み専門の特殊な細胞であり、トランスサイトーシスという細胞内輸送系を発達させて積極的に腸内抗原または気道内抗原を取り込み、パイエル板またはNALTに存在するマクロファージや樹状細胞といった抗原提示細胞に取り込んだ抗原を受け渡すことにより、免疫監視の発動に主要な役割を担うと考えられている。マウスM細胞は、一般的には、レクチンUEA-1に対して結合するマーカーを有することにより、特徴づけられている。しかしながら、これまでは、M細胞のみを認識できるマーカー分子が存在していなかったため、M細胞を特定するためには、微絨毛が粗でポケット構造を有する、という電子顕微鏡レベルでの組織学的な特徴に基づいて、最終的なM細胞特定の判断を行わなければならなかった。
【００１８】
一方、上述した絨毛上皮および腺毛上皮に散在し、粘液産生の役割を担う杯細胞（goblet cells）は、レクチンUEA-1に反応性を示し、リンパ濾胞上皮（FAE）には、ほとんど存在しないという組織学的な特徴を有している。また、栄養素の吸収を担う吸収上皮細胞は、小腸上皮中に最も多く存在する細胞であり、鼻咽頭では栄養素の吸収を伴わない呼吸上皮細胞が多数を占める。
【００１９】
本発明の抗体は、リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しない抗体、またはM細胞を認識するが杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しない抗体を提供することを特徴とすることから、パイエル板におけるM細胞あるいはM細胞の周辺領域を含むリンパ濾胞上皮（FAE）の全体または一部を、特異的に認識することができる。
【００２０】
本発明において作製する抗体は、上述したような結合特性を有する限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００２１】
抗体を作製するため、免疫原となるM細胞またはリンパ濾胞上皮（FAE）を含む試料を、たとえば動物のパイエル板から調製する。免疫原試料は、たとえばマウスから取得することを例に取れば、マウスの小腸組織をEDTA処理することにより細胞を分離させ、その細胞をレクチンUEA-1染色後、細胞ソーターにより、UEA-1陽性細胞としてM細胞と杯細胞を共に含む試料として調製する。
【００２２】
このようにして調製した免疫原試料を、常法に従って、免疫動物（たとえばポリクローナル抗体の場合にはヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラットなど、また、モノクローナル抗体の場合にはマウス、ラットなど）に投与し、体内において抗体を産生させる。
【００２３】
ポリクローナル抗体の場合には、免疫動物の血清、または血清から精製した免疫グロブリンを使用できる。
【００２４】
一方、モノクローナル抗体の場合には、上述した免疫原試料で免疫したマウスやラットなどの脾臓由来のプラズマ細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を作製し、そのなかからM細胞またはFAEの全体または一部と反応する抗体を生産するクローンを選択して得ることができる。通常は、このようにして調製したハイブリドーマをマウス腹腔に注射し、腹水中に蓄積された免疫グロブリンを精製することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。またハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、その培養上清から精製することも可能である。
【００２５】
本発明においては、ラットを用いてモノクローナルIgG抗体を産生する脾臓細胞を調製し、それをマウスミエローマ細胞株（AG8-653）と融合させることによりマウス-ラットハイブリドーマ細胞を作製した。これらのマウス-ラットハイブリドーマ細胞の中から、目的とする結合特性を有する細胞をスクリーニングした結果、マウス-ラットハイブリドーマ細胞16-2-4細胞（FERM  ABP-10926）および17-1-8-4細胞（FERM  ABP-10927）を作製し、それらのアイソタイプをラットIgG2c（＃16-2-4）、ラットIgA（＃17-1-8-4）と決定した。
【００２６】
このようにして得られた抗体は、組織中のM細胞特異的またはFAE特異的なマーカーを検出するための抗体として使用することができる。本発明の抗体はまた、目的とする免疫原（抗原）と結合させて経口投与することにより、免疫原（抗原）をM細胞またはその近傍にあたるFAEの領域に特異的に運搬することができるという特徴もまた有する。
【００２７】
このような本発明の抗体についての結合特性に基づいて、本発明抗体を、ワクチン担体として使用することができる。すなわち、本発明は、リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しない抗体、またはM細胞を認識するが、杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しない抗体、から構成されるワクチン担体を提供する。より具体的には、上述したリンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しない抗体として上述した＃17-1-8-4抗体、またはM細胞を認識するが、杯細胞、吸収上皮細胞、呼吸上皮細胞を認識しない抗体として上述した＃16-2-4抗体をそれぞれ使用することができる。
【００２８】
本発明のワクチン担体は、抗体に結合した免疫原を、M細胞を介して経粘膜的に投与するための補助として使用することができる。本発明において「粘膜」という場合、M細胞が存在する粘膜のことをいい、消化器、呼吸器などの管腔臓器の内腔面を覆う部位の総称を意味し、その管腔面は主に杯細胞から分泌される粘液により覆われ、病原微生物等の侵入を物理的に防いでいる。本発明のワクチン担体を適用することができる粘膜としては、鼻腔、口腔、肺、小腸などがある。これらの粘膜面に対して免疫原を結合した抗体を適用することにより、M細胞近傍に免疫原を運搬することができ、結果としてM細胞によるトランスサイトーシス等により、取り込まれた免疫原はM細胞内を輸送され基底膜直下のM細胞ポケット内の未熟な樹状細胞等によりエンドサイトーシスにより取り込まれ、T細胞領域である傍濾胞域に運ばれてここで樹状細胞が成熟して抗原提示細胞となり、抗原特異的CD4+T細胞を活性化する。一方、同様に抗原感作を受けたB細胞は、上述した抗原特異的CD4+T細胞によって活性化される。
【００２９】
このように、本発明のワクチン担体を鼻腔、口腔、肺、小腸などの粘膜に対して適用するため、本発明においては、抗原-ワクチン担体複合体をこれらの粘膜面に送達することができる投与方法であればどのような投与方法を利用してもよい。そのような投与方法としては、経口投与、経鼻投与などが存在するが、これらの方法には限定されない。
【００３０】
本発明のワクチン担体を用いて免疫原をワクチネーションする際には、免疫賦活活性を追加することを目的として、アジュバントをさらに含めてもよい。本発明のワクチン担体を利用したワクチンと共に投与することができるアジュバントとしては、無毒化コレラ毒素、無毒化大腸菌易熱性毒素、モノフォスフォリルリピドA、サイトカイン、ケモカイン、レクチン、サポニン等が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
実施例1：抗体の作製
本実施例においては、抗原の取り込み口となるM細胞もしくはその周辺部分であるリンパ濾胞上皮（Follicle Associated Epithelium；FAE）に特異的なモノクローナル抗体を作製することを目的とした。【００３２】
抗体を作製するため、ラットに免疫原を投与した。レクチンUlex europaeus agglutinin I （UEA-1）がM細胞に結合することができるとの過去の知見（Sharma, R., et al. J. Histochem. Cytochem. (1998) 46: 143-148）に基づき、マウスパイエル板の中で、UEA-1に反応する細胞群を免疫原として採取し、使用した。具体的には、Balb/cマウス（6週齢、メス）からパイエル板を採取し、EDTA処理により細胞を単離した。その後、単離細胞をUEA-1を用いて染色後、セルソーター（FACSAria, Becton Dickinson）に供することにより、UEA-1陽性細胞（0.5〜1.0×106cells）を回収し、アジュバント（TiterMaxTM Gold）と共にSDラットの皮内（フットパッド）に免疫した。実際にはUEA-1は、M細胞だけでなく、杯細胞に対しても結合するため（非特許文献2）、この細胞群には、M細胞の他に、杯細胞もまた含まれることが推定された。【００３３】
上述したUEA-1陽性細胞（0.5〜1.0×106cells）の免疫は2週間ごとに5回（0、2、4、6、8週）行い、最終免疫の4日後に脾臓を摘出し、脾細胞を単離した。【００３４】
調製したラット脾細胞は、マウスミエローマ細胞株（P3X63-AG8.653）とPEG1500（Roche）を用いて常法にしたがって融合させ、ハイブリドーマ細胞を調製した。このようにして得られた約1000種のハイブリドーマ細胞クローンから産生された抗体を、M細胞またはその周辺部分のリンパ濾胞上皮（FAE）に対して結合することができるか否か、そして杯細胞に対して結合しないという特徴を有するか否か、の観点から、培養上清を用いた免疫組織学的スクリーニングによりM細胞特異的抗体ならびにリンパ濾胞上皮（FAE）特異的抗体の産生の有無を評価した。【００３５】
ハイブリドーマクローンを免疫組織学的にスクリーニングした結果、2株（＃16-2-4抗体；Rat IgG2c、および＃17-1-8-4抗体；Rat IgA）が、パイエル板M細胞またはパイエル板リンパ濾胞上皮（FAE）に特異的に結合したが、杯細胞は認識しなかった。【００３６】
本発明の発明者らは、＃16-2-4抗体および＃17-1-8-4抗体をそれぞれ産生するマウス-ラットハイブリドーマ細胞16-2-4細胞（FERM  ABP-10926）および17-1-8-4細胞（FERM  ABP-10927）を、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（International Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)）に寄託した。【００３７】
実施例2：抗体の特徴
本実施例においては、実施例1において作製したモノクローナル抗体のうち、＃16-2-4抗体（Rat IgG2c）および＃17-1-8-4抗体（Rat IgA）を用いて、免疫組織化学的にこれらの抗体の結合特性を調べた。【００３８】
まず、＃16-2-4抗体（Rat IgG2c）および＃17-1-8-4抗体（Rat IgA）を用いて、小腸パイエル板のホールマウント染色（Whole Mount Staining）を行い、免疫組織化学的にこれらの抗体の結合特性を調べた。具体的には、マウスの小腸からパイエル板を採取し、これを4％パラホルムアルデヒド液で固定後、＃16-2-4抗体（Rat IgG2c）または＃17-1-8-4抗体（Rat IgA）で染色した。洗浄後、FITC標識抗ラットIg's抗体（Biosource）ならびにTRITC標識UEA-1（Vector）で染色し、共焦点レーザー顕微鏡（TCS SP2, Leica）でその特異性を励起波長488 nmで解析した。結果を図1および図2に示す。【００３９】
ホールマウント染色の結果、＃16-2-4抗体はUEA-1陽性M細胞に特異的に反応した（図1）。一方、＃17-1-8-4抗体は、パイエル板リンパ濾胞上皮（FAE）に特異性を示し、絨毛上皮には反応しなかった（図2）。【００４０】
またパイエル板より調製した凍結組織から、定法にしたがって7μm厚の薄切切片を作成し、ホールマウント染色同様に＃16-2-4抗体とUEA-1を用いて組織学的解析を行った。その結果、＃16-2-4抗体は、UEA-1とは異なりM細胞にのみに反応性を示し、杯細胞および吸収上皮細胞には全く反応しなかった（図3aおよび図3b）。ホールマウント染色ならびに免疫組織学的解析ともに、抗体の特異性は緑色、UEA-1の特異性は赤色で示し、黄色に示されている細胞は抗体ならびにUEA-1に共に陽性なM細胞を意味する。図3bにおいて、赤色矢印で示される黄色く染色された細胞がM細胞であり、黄色の矢印で示される赤色に染色された細胞は杯細胞である。【００４１】
次いで、金コロイド（18 nm）標識抗ラットIgG抗体（Jackson）を二次抗体とした免疫電子顕微鏡解析を行った。結果を図4に示す。その結果、＃16-2-4抗体は微絨毛が粗でポケット構造を有している典型的なM細胞に対して高い特異性を示したのに対し、小腸上皮細胞（Intestinal epithelial cells; IEC）での特異性は認められなかった。この結果からも、＃16-2-4抗体が、レクチンUEA-1と比較して、高い特異性でM細胞に対して結合することができることが示された。【００４２】
次に、＃16-2-4抗体（Rat IgG2c）を用いて、上気道の鼻咽頭関連リンパ組織（NALT）の免疫組織化学染色を行い、これらの抗体の結合特性を調べた。具体的には、NALTを含むマウス鼻腔組織を4％パラホルムアルデヒド液で固定後、定法にしたがって7μm厚の薄切切片を作成し、組織学的解析に供した。結果を図5に示す。図5aは、組織切片のヘマトキシリン-エオジン染色像であり、矢印で示した部分がNALTである。【００４３】
図5aの四角で囲った部分（NALT）を、#16-2-4で染色後、FITC標識抗ラットIg's抗体（Biosource）ならびにTRITC標識UEA-1（Vector）で染色し、共焦点レーザー顕微鏡（TCS SP2, Leica）でその特異性を免疫組織化学的に解析した結果が、図5bである。小腸パイエル板のホールマウント染色の場合と同様、鼻のNALTにおいても、＃16-2-4抗体はUEA-1陽性M細胞に特異的に反応したが、UEA-1陽性杯細胞には反応性を示さなかった。【００４４】
実施例3：腸管ループ内での抗体の組織学的動態
本実施例においては、実施例1において作製された抗体のうち、＃16-2-4抗体（Rat IgG2c）を用いて、腸管内に投与されたこの抗体の動態を追跡評価した。【００４５】
FITC（Sigma）により標識した100マイクログラムの＃16-2-4抗体（Rat IgG2c）または対照抗体（正常ラット IgG）を、Balb/cマウス（7週齢、メス）のパイエル板を含む腸管ループ内に投与した後、10分後、30分後、または4時間後に腸管ループを採取した。腸管より調製した凍結組織から、定法にしたがって7μm厚の薄切切片を作成し、DAPIを用いた対比染色後、当該組織を共焦点レーザー顕微鏡（TCS SP2, Leica）を用いて励起波長488 nmで観察することにより、これらの抗体の組織学的動態を調べた。結果を図6に示す。【００４６】
その結果、FITC標識した＃16-2-4抗体を腸管ループ内に投与してから10分以内に、＃16-2-4抗体はＭ細胞の管腔側に特異的に結合し、投与30分後にはM細胞内をトランスサイトーシスにより移行し、さらには投与後4時間以内に基底膜へ到達することが明らかになった（図6Aおよび図6B）。一方、FITC標識した対照抗体を腸管ループ内に投与した場合には、M細胞もしくはその周辺のどこにも、抗体の結合は全く見られなかった（図6C）。この結果から、＃16-2-4抗体を、M細胞標的型粘膜ワクチンのデリバリー分子として利用できることが示された。【００４７】
実施例4：抗体-抗原複合体を用いた、粘膜免疫応答（1）
本実施例においては、実施例1において作製された抗体のうち＃16-2-4抗体を使用してワクチン抗原と抗体-抗原複合体を作製し、これをマウスに経口免疫することで、M細胞標的型粘膜ワクチンの有効性を評価した。【００４８】
本実験では、破傷風トキソイド（Tetanus toxoid；TT）をワクチン抗原とし、アビジン-ビオチン法により＃16-2-4抗体と結合させた（16-2-4 TT群）。具体的には、ビオチン標識した破傷風トキソイド（50μg）に同量（50μg）のアビジンを結合させた後、ビオチン標識した＃16-2-4抗体（100μg）を反応させることで抗体-抗原複合体を作製した。作成した抗体-抗原複合体（200μg）を、粘膜アジュバントであるコレラ毒素（Cholera toxin；CT、10μg）と共に、Balb/cマウス（7週齢、メス）に経口投与（週1回、計2回）した。【００４９】
対照として、正常ラットIgG（Sigma）とTTを同様の手法により結合させ、CTとともにマウスに経口投与した。【００５０】
最終免疫の1週間後に、免疫マウスから血清（約50μl）および糞便（約50mg）を採取した。糞便は、100 mgに対して1 mlの割合のPBSに溶解し、遠心後、上清を解析に用いた。TT特異的血清IgG抗体ならびに糞便中IgA抗体応答は、ELISA法にて評価した。【００５１】
結果を図7に示す。＃16-2-4抗体とTTとを結合（16-2-4 TT群）し経口免疫した結果、全身系応答（血清中IgG）（図7A）および粘膜系応答（糞便中IgA）（図7B）共に、高い力価のTT特異的抗体産生が誘導された。一方、対照抗体と結合させたTTを経口投与した場合（Rat IgG-TT群）、および陰性対照であるPBSを投与した場合（PBS群）には、TT特異的抗体は、全身系のみならず粘膜系にも誘導されなかった。【００５２】
通常の手法により経口投与したTTに対して抗体産生を誘導する場合、250μg程度のTTを10μgのコレラ毒素と共に頻回経口投与する。本発明の方法によれば、通常の手法と比較して、TTを本発明の抗体と結合させた場合にのみ、極めて少量のTT（50μg）を経口投与するだけで、TTに対して特異的な全身系応答（血清中IgG）抗体のみならず粘膜系応答（糞便中IgA）抗体の双方を、効果的に誘導することができることが明らかになった。【００５３】
これらの結果から、本発明の抗体と免疫化を行う目的抗原とを結合させ、経口免疫をすることにより、抗体とM細胞との特異的結合に基づいて抗原がM細胞から取り込まれ、極めて効果的に粘膜免疫が引き起こされることが明らかになった。【００５４】
実施例5：抗体-抗原複合体を用いた、粘膜免疫応答（2）
本実施例においては、実施例1において作製された抗体のうち＃16-2-4抗体を使用してワクチン抗原と抗体-抗原複合体を作製し、これをマウスに経口免疫することで、M細胞標的型粘膜ワクチンの有効性を評価した。【００５５】
本実験では、ボツリヌストキソイド（Botulinus toxoid；BT）をワクチン抗原とし、アビジン-ビオチン法により＃16-2-4抗体と結合させた。具体的には、ビオチン標識したボツリヌストキソイド（50μg）に同量（50μg）のアビジンを結合させた後、ビオチン標識した＃16-2-4抗体（100μg）を反応させることで抗体-抗原複合体を作製した。作成した抗体-抗原複合体（200μg）を、粘膜アジュバントであるコレラ毒素（Cholera toxin；CT、10μg）と共に、Balb/cマウス（7週齢、メス）に経口投与（週1回、計3回）した。【００５６】
対照として、正常ラットIgG（Sigma）とBTを同様の手法により結合させ、CTとともにマウスに経口投与した。【００５７】
最終免疫の1週間後に、免疫マウスから血清（約50μl）および糞便（約50mg）を採取した。糞便は、100 mgに対して1 mlの割合のPBSに溶解し、遠心後、上清を解析に用いた。BT特異的血清IgG抗体ならびに糞便中IgA抗体応答は、ELISA法にて評価した。【００５８】
結果を図8に示す。＃16-2-4抗体とBTとを結合（16-2-4 BT群）し経口免疫した結果、全身系応答（血清中IgG）および粘膜系応答（糞便中IgA）共に、高い力価のTT特異的抗体産生が誘導された。一方、対照抗体と結合させたBTを経口投与した場合（Rat IgG-BT群）、および陰性対照であるPBSを投与した場合（PBS群）には、BT特異的抗体は、全身系のみならず粘膜系にも誘導されなかった。【００５９】
通常の手法により経口投与したBTに対して抗体産生を誘導する場合、250μg程度のBTを10μgのコレラ毒素と共に頻回経口投与する。本発明の方法によれば、通常の手法と比較して、極めて少量のBT（50μg）を経口投与することにより、BTに対して特異的な全身系応答（血清中IgG）抗体のみならず粘膜系応答（糞便中IgA）抗体の双方を、効果的に誘導することができることが明らかになった。【００６０】
これらの結果から、目的抗原の種類にかかわらず一般的に、本発明の抗体と免疫化を行う目的抗原とを結合させ、経口免疫をすることにより、抗体とM細胞との特異的結合に基づいて抗原がM細胞から取り込まれ、極めて効果的に粘膜免疫が引き起こされることが明らかになった。【００６１】
実施例6：抗体-抗原複合体による抗原中和効果
本実施例においては、実施例1において作製された抗体のうち＃16-2-4抗体を使用してワクチン抗原と抗体-抗原複合体を作製し、これをマウスに経口免疫することで、M細胞標的型粘膜ワクチンによって誘導される抗体に対する中和効果を評価した。【００６２】
本実験では、ボツリヌストキソイド（Botulinus toxoid；BT）をワクチン抗原とし、アビジン-ビオチン法により＃16-2-4抗体と結合させ（＃16-2-4 - BT群）、抗原抗体複合体（200μg）をBalb/cマウス（7週齢、メス、n＝6）に経口投与した。【００６３】
対照として、正常ラットIgG（Sigma）とBTを同様の手法により結合させ（Rat IgG - BT群）、マウスに経口投与した。【００６４】
最終経口投与の1週間後に、マウス（n＝6）に対して、致死量の10000倍のBT（200ナノグラム）を腹腔投与し、投与動物のBT投与後生存率を経時的に追跡調査した。結果を図9に示す。【００６５】
＃16-2-4抗体とBTとの複合体を事前に経口投与した結果、致死量の10000倍ものBTを投与した場合であっても、100％の生存率をもたらす防御的免疫を誘導することができたことが示された（図9）。一方、対照抗体とBTとの複合体を事前投与した場合には、PBSを投与した場合と同様、BT投与直後にすべての動物が死亡した（図9）。【００６６】
この結果から、本発明の抗体と目的抗原との複合体を事前に経口投与することにより、標的となる病原微生物や毒素に対する中和抗体を効率的に体内において生成することができることを示した。以上の結果から、本発明の抗体が、M細胞標的型粘膜ワクチンの粘膜感染症に対する予防ワクチンとしての高い応用性を有していることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
上述したように、本発明の抗体は、リンパ濾胞上皮（FAE、Follicle Associated Epithelium）の全体または一部を認識するが、絨毛上皮および腺毛上皮を認識しないか、またはM細胞を認識するが、杯細胞、吸収上皮細胞および呼吸上皮細胞を認識しないという特徴を有する。この特徴により、この抗体と免疫原（抗原）とを結合させ、経口投与する場合に、抗体とM細胞との特異的結合に基づいて、免疫原（抗原）が粘膜における免疫原（抗原）取り込み細胞であるM細胞の近傍に特異的に運搬されることから、本発明の抗体は、免疫原（抗原）と組み合わせることにより、粘膜ワクチン用のワクチン担体として利用することができる。
【図１】
2008056705.tif 000002
【図２】
2008056705.tif 000003
【図３】
2008056705.tif 000004
【図４】
2008056705.tif 000005
【図５】
2008056705.tif 000006
【図６】
2008056705.tif 000007
【図７】
2008056705.tif 000008
【図８】
2008056705.tif 000009
【図９】
2008056705.tif 000010
【国際調査報告】
2008056705.tif 000011
2008056705.tif 000012
2008056705.tif 000013
2008056705.tif 000014