(57)【要約】Ｃ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療に有用な薬剤を、簡便に効率よく選別可能なスクリーニング方法、及び当該方法で得られるＣ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療薬を提供する。  本発明のＣ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法は、被検物質について、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用の阻害活性を評価する工程を含むことを特徴としている。前記方法は、例えば脂質代謝制御因子の転写活性を指標として行うことができる。前記方法における被検物質は、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有していてもよい。前記Ｃ型肝炎ウィルス関連疾患には、Ｃ型肝炎、脂肪肝、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝臓癌、及びインスリン抵抗性疾患等が含まれる。本発明の方法は、特に脂肪肝又は肝臓癌等の予防、治療効果に優れた薬剤を効率よく得る方法として極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、及び肝臓癌から選択される少なくとも一つの疾患の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、被検物質について、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの蛋白質間相互作用の阻害活性を評価する工程を含む方法。
【請求項２】
蛋白質間相互作用の阻害活性を、脂質代謝制御因子の転写活性を指標として評価する請求項１記載の方法。
【請求項３】
蛋白質間相互作用の阻害活性を、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を指標として評価する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかの項に記載のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分として含む、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、及び肝臓癌から選択される少なくとも一つの疾患の予防及び／又は治療薬。
【請求項５】
蛋白質間相互作用を阻害する物質が、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有する物質である請求項４記載のＣ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療薬。
【請求項６】
被検物質について、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの蛋白質間相互作用の阻害活性を評価する工程を含む脂質合成阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項７】
蛋白質間相互作用の阻害活性を、脂質代謝制御因子のプロモーターの制御下に連結されたレポーター遺伝子の発現を指標として評価する請求項６記載の方法。
【請求項８】
脂質代謝制御因子がＳＲＥＢＰ−１ｃである請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８の何れかの項に記載の方法により得られる物質を有効成分として含む脂質合成阻害剤。
【請求項１０】
ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有する物質を有効成分として含む請求項９記載の脂質合成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝や肝臓癌等の疾患の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法及び該方法により得られる予防及び／又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、プラス一本鎖ＲＮＡを遺伝子として持っている。ＨＣＶのＲＮＡから翻訳される約３０００アミノ酸からなる巨大な前駆体蛋白質は、宿主細胞由来およびウィルス由来の蛋白分解酵素により、ウィルス粒子を構成するコア蛋白質とエンベロープ蛋白質、その他の非構造蛋白質に切断される。【０００３】
前記コア蛋白質は、ウィルス粒子を構成するだけでなく、宿主細胞の核内へ移行することが知られている。近年、コア蛋白質が宿主細胞の機能を多様に調節して肝臓癌の発症に深く関与していることが報告された。Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，１０６５−１０６７（１９９８）には、例えば、ＨＣＶのコア蛋白質を発現するトランスジェニックマウスが、脂肪肝を経て肝臓癌を高率に発症することが示されている。その後、コア蛋白質が肝癌発症を引き起こす分子機構を解明する目的で、コア蛋白質と相互作用する宿主内蛋白質を同定し、その機能を解析する方法が広く行われている。これまで、コア蛋白質と相互作用する宿主内蛋白質として、ｐ５３［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３４１２２？３４１３０（２０００）］、ＲＮＡヘリケース［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２８４１−２８４５３（１９９９）］、ＳＴＡＴ３［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：６４１−６５３（２００２）］、ＰＡ２８γ［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７，１９，１０２３７−１０２４９（２００３）］、ＬＺＩＰ［ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：７２９−７４０（２０００）］、Ｐ７３［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２（１７）：２５７３−８０（２００３）］、Ｓｐ１１０ｂ［Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３（２１）：７４９８−５０９（２００３）］、Ｐ３００／ＣＢＰ［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２８（１）：１２０−３０（２００４）］、Ｂ２３［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｊａｎ  １９；２５（３）：４４８−６２（２００６）］等多数報告されている。【０００４】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３４１２２？３４１３０（２０００）には、コア蛋白質がｐ５３のＣ末端領域と相互作用し、ｐ５３のＤＮＡ結合親和性向上を介してｐ５３の転写活性を亢進することが示されている。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２８４１−２８４５３（１９９９）には、細胞性ＲＮＡヘリケースが、最初は核内に局在しているが、ＨＣＶコア蛋白質のＮ末４０アミノ酸と相互作用することにより、細胞質に共局在することが報告されている。しかし、ｐ５３、ＲＮＡヘリケースに加え、ＬＺＩＰ、Ｐ７３、Ｓｐ１１０ｂ、Ｐ３００／ＣＢＰ、Ｂ２３に関しては、コア蛋白質との相互作用をｉｎ  ｖｉｖｏで直接示されてはいない。【０００５】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：６４１−６５３（２００２）には、コア蛋白質がＳＴＡＴ３と直接結合して、ＪＡＫ−非依存性経路のリン酸化によりＳＴＡＴ３を活性化させることが開示されている。同文献には、ＨＣＶコア蛋白質とＳＴＡＴ３を強制発現させた細胞が、足場非依存性の増殖と腫瘍形成を示すことが報告されている。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７，１９，１０２３７−１０２４９（２００３）には、コア蛋白質がＰＡ２８γと相互作用して核内に局在することが示されている。なお、ＰＡ２８γは、細胞核内に局在し、２０Ｓプロテアソームと相互作用してそのペプチダーゼ活性を向上するプロテアソーム調節蛋白質として知られている。さらに、上記文献は、コア蛋白質の４４〜７１アミノ酸領域がＰＡ２８γとの結合と核内局在の両方に関与すること、コア蛋白質がＰＡ２８γ依存性の分解を受けることを報告している。【０００６】
しかし、いずれの文献においても、肝臓癌との関連が直接示されているものはなく、コア蛋白質が肝臓癌の発症に関与する具体的なメカニズムは十分に明らかにされていない。【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，１０６５−１０６７（１９９８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２８４１−２８４５３（１９９９）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３４１２２？３４１３０（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：６４１−６５３（２００２）
【非特許文献５】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７，１９，１０２３７−１０２４９（２００３）
【非特許文献６】ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：７２９−７４０（２０００）
【非特許文献７】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２（１７）：２５７３−８０（２００３）
【非特許文献８】Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３（２１）：７４９８−５０９（２００３）
【非特許文献９】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２８（１）：１２０−３０（２００４）
【非特許文献１０】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｊａｎ  １９；２５（３）：４４８−６２（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療に有用な薬剤を、簡便に効率よく選別可能なスクリーニング方法、及び当該方法で得られるＣ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用を阻害することにより、脂質の代謝制御を介して、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変等の症状の進行を抑制し、肝臓癌の発症率を著しく低減しうることを見いだし、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、及び肝臓癌から選択される少なくとも一つの疾患の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、被検物質について、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの蛋白質間相互作用の阻害活性を評価する工程を含む方法を提供する（以下、単に「本発明の方法１」と称する場合がある）。前記蛋白質間相互作用の阻害活性は、例えば脂質代謝制御因子の転写活性を指標として評価してもよく、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を指標として評価してもよい。【００１１】
また、本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分として含む、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、及び肝臓癌から選択される少なくとも一つの疾患の予防及び／又は治療薬を提供する（以下、単に「本発明の予防／治療薬」と称する場合がある）。前記蛋白質間相互作用を阻害する物質が、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有する物質であってもよい。【００１２】
さらに、本発明は、被検物質について、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの蛋白質間相互作用の阻害活性を評価する工程を含む脂質合成阻害剤をスクリーニングする方法を提供する（以下、単に「本発明の方法２」と称する場合がある）。前記蛋白質間相互作用の阻害活性は、脂質代謝制御因子のプロモーターの制御下に連結されたレポーター遺伝子の発現を指標として評価してもよく、該脂質代謝制御因子としてＳＲＥＢＰ−１ｃを用いても良い。【００１３】
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分として含む脂質合成阻害剤を提供する。本発明の脂質合成阻害剤は、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有する物質を有効成分として含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、Ｃ型肝炎ウィルス由来のコア蛋白質と、宿主由来のＰＡ２８γとの相互作用を阻害する活性を評価とすることにより、当該相互作用に誘導される脂質代謝制御因子等の転写活性を介して脂質合成酵素の発現を制御可能な物質を効率よく得ることができる。こうして得られる物質は、脂肪合成阻害剤の有効成分として利用でき、特に、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、肝臓癌等の発症を防いだり、症状の進行を抑制する予防、治療薬の有効成分として極めて有用である。本発明の予防、治療薬は、すでに発症しているＣ型肝炎ウィルス関連疾患に対して優れた治療効果を発揮しうる物質が得られ、さらに、同疾患発症前のＨＣＶキャリア患者等に投与することにより、ＨＣＶ関連疾患の発症を抑える予防薬として有用な物質を得ることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１におけるマウスが染色体上に遺伝子型特異的に有する配列構造の模式図であり、（ｉ）は野生型（ＰＡ２８γ＋／＋）、（ｉｉ）は変異型ＰＡ２８γ（ＰＡ２８γ−／−）、（ｉｉｉ）はＨＣＶコア蛋白質導入型（コアＴｇ）の配列構造の模式図である。
【図２】（ａ）はマウス肝臓凍結切片の抗ＨＣＶコア蛋白質抗体による染色組織染色写真であり、（ｂ）は同ヘマトキシリン・エオジン染色による組織染色写真、（ｃ）は同オイルレッドＯ染色による組織染色写真である。（ｄ）は、遺伝子型及び性別の異なるマウスの肝臓凍結切片におけるオイルレッドＯ染色による染色面積を比較したグラフである。
【図３】４通りの遺伝子型を有するマウス肝臓における各脂肪合成制御遺伝子の転写量を示すグラフであり、（Ａ）〜（Ｃ）は、２月齢マウス肝臓におけるＳＲＥＢＰ−１ａ（Ａ）、ＳＲＥＢＰ−１ｃ（Ｂ）、ＳＲＥＢＰ−２（Ｃ）、ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素（Ｄ）をコードする遺伝子の転写量、（Ｅ）〜（Ｉ）は、６月齢マウス肝臓におけるＳＲＥＢＰ−１ｃ（Ｅ）、脂肪酸合成酵素（Ｆ）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｇ）、ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素（Ｈ）、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素（Ｉ）、及びＨＭＧＣｏＡ合成酵素（Ｊ）をコードする遺伝子の転写量を、ＨＰＲＴの転写量基準の相対値で表したグラフである。
【図４】ＨＣＶコア蛋白質とＰＡ２８γによるＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性への影響を調べるためのレポーターアッセイの結果を示しており、（ａ）はアッセイの概念図を示し、（ｂ）はＰＡ２８γ＋／＋ＭＥＦ細胞（左）又はＰＡ２８γ−／−ＭＥＦ細胞（右）の細胞内で発現させた遺伝子の組み合わせごとのレポーター活性を示すグラフ、（ｃ）はコア蛋白質、ＬＸＲα、ＲＸＲαの組み合わせをｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓに発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、対応するリガンドを添加したときのレポーター活性を示すグラフ、（ｄ）はコア蛋白質とＣ末端領域を欠失させた変異型コア蛋白質のレポーター活性を比較したグラフである。
【図５】（イ）は、ＳＲＥＢＰ−１ｃによる脂質の合成制御経路を表した概略図であり、（ロ）は、ＳＲＥＢＰ−２による脂質の合成制御経路を表した概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法１は、被検物質について、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用の阻害活性を評価する工程を含むことを特徴としている。【００１７】
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）コア蛋白質は、Ｃ型肝炎ウィルスのＲＮＡから翻訳される巨大な前駆体蛋白質の分解により生成される構造蛋白質である。ＨＣＶコア蛋白質のアミノ酸配列及び該蛋白質をコードする塩基配列は公知であり、例えばアミノ酸配列として、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ２６６６２で表される配列等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法に用いるＨＣＶコア蛋白質としては、前記配列からなる野生型蛋白質に限定されず、例えば、ＨＣＶ関連疾患の発症を誘導可能な範囲で、野生型蛋白質のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは他のアミノ酸配列が付加された配列からなる変異型蛋白質を用いることもできる。このような変異型蛋白質として、例えば、ＰＡ２８γとの相互作用活性又は核内局在活性を少なくとも有する変異型蛋白質等が挙げられ、具体的には野生型蛋白質のアミノ酸配列のうち４４ａ．ａ〜７１ａ．ａの領域を少なくとも含む蛋白質等が挙げられる。ＨＣＶコア蛋白質は、Ｃ型肝炎ウィルス由来の天然蛋白質、合成蛋白質のいずれであってもよく、同蛋白質をコードする塩基配列を組込んだ組換えベクターを用いて細胞内で発現させたものであってもよい。【００１８】
ＰＡ２８γは、プロテアソーム調節蛋白質として公知の核局在蛋白質であって、ＨＣＶコア蛋白質に特異的に結合して核内における当該蛋白質の分解を促進させる作用を有している。ＰＡ２８γのアミノ酸配列及び該蛋白質をコードする塩基配列は公知であり、例えばアミノ酸配列として、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ６１２８９で表される配列のヒト由来ＰＡ２８γ等が知られている。ＰＡ２８γには、ヒト以外に、サル、マウス、ブタ等のホモログの存在が知られ、これらのアミノ酸配列はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに公開されており、いずれも本発明におけるＰＡ２８γとして利用できる。本発明のスクリーニング方法に用いるＰＡ２８γとしては、前記配列からなる野生型蛋白質に限定されず、例えば、ＨＣＶ関連疾患の発症を誘導可能な範囲で、野生型蛋白質のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは他のアミノ酸配列が付加された配列からなる変異型蛋白質を用いることもできる。このような変異型蛋白質として、例えば、プロテアソーム調節活性又は核内移行活性を少なくとも有する変異型蛋白質を用いることもできる。【００１９】
従来、ウィルス由来のＨＣＶコア蛋白質と宿主由来のＰＡ２８γとの相互作用は、ＨＣＶ関連疾患の発症及び各種症状の発現初期に必要とされると考えられていたが、そのメカニズムは必ずしも明らかではなかった。これに対し、本発明者らは、ＰＡ２８γとの相互作用領域を欠損させたＨＣＶコア蛋白質又はＰＡ２８γの欠損により、コア蛋白質が核内から細胞質へ移行すること、ＰＡ２８γの過剰発現によりコア蛋白質の蛋白質分解が亢進されることを既に報告している。本発明者らは、さらに検討したところ、ＰＡ２８γを欠損させるとコア蛋白質が核内に蓄積され、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、肝臓癌等の発症と進行を抑制する作用ができることを見いだし、ウィルス由来のＨＣＶコア蛋白質と宿主由来のＰＡ２８γとの相互作用を阻害することにより、ＨＣＶに感染した患者に対してはＨＣＶ関連疾患の発症を予防でき、同疾患を発症している患者に対しては症状の進行を遅延、阻止可能であるとの結論を得た。本発明は、上記知見に基づきなされたものである。すなわち、本発明の方法１は、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、及び肝臓癌から選択される少なくとも一つの疾患の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法である。【００２０】
本発明の方法１に用いられる被検物質としては、公知又は新規化合物の何れであってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物等の合成又は天然由来の有機化合物等が挙げられる。【００２１】
本発明において、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの蛋白質間相互作用の阻害活性の評価は、細胞内、試験管内のいずれで行うこともでき、例えば、試験管内で、標識した蛋白質間の相互作用を蛍光等のシグナルで直接検出する方法、前記蛋白質間相互作用によって細胞内で誘導される種々の生理活性を指標として間接的に検出する方法等を用いることができる。なかでも、本発明においては後者の方法が好ましく、特に、後述する脂質代謝制御因子の転写活性を指標として評価する方法が好適である。また、本発明においては、蛋白質間相互作用の阻害活性を、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を指標として評価する方法も好ましく用いられる。【００２２】
細胞内における相互作用を検出する方法には、例えば、Ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ、レポーターアッセイなどの原核又は真核宿主細胞を用いる方法等が挙げられる。細胞外における蛋白質間相互作用を検出する方法には、蛍光や放射線等で標識した精製蛋白質を用いる方法等が挙げられる。なかでも、ウィルス感染状態の再現性に優れ、且つ簡便である点で細胞内における蛋白質間相互作用を検出する方法が好ましく、特にレポーターアッセイが好ましく用いられる。【００２３】
レポーターアッセイは、例えば、ＨＣＶコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用により、直接又は間接的に転写制御を受ける遺伝子のプロモーター領域の制御下に連結されたレポーター遺伝子の発現を指標として評価する方法が用いられる。前記レポーター遺伝子に連結されるプロモーター領域としては、例えば脂質代謝制御因子、好ましくはＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＳＲＥＢＰ−２等のステロール調節配列結合蛋白質（ＳＲＥＢＰｓ）をコードする遺伝子のプロモーター領域等が利用できる。これらの脂質代謝制御因子の転写活性（プロモーター活性）は、脂質合成酵素の発現制御を介して脂質合成を制御することが知られている。【００２４】
例えば、ＳＲＥＢＰ−１ｃは、図５（イ）に示されるように、脂質合成酵素の発現制御を介して脂質の合成を制御しうる。ＳＲＥＢＰ−１ｃは、図５（イ）に示されるように、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸合成酵素及びステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素等の脂質合成酵素の発現制御を介して、飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、トリグリセリド及びリン脂質からなる脂質の合成を制御している。また、図５（ロ）は、ＳＲＥＢＰ−２による同様の経路を表した概略図であり、具体的には、ＳＲＥＢＰ−２はＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素等からなる脂質代謝制御因子脂肪酸合成酵素及びステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素等からなる脂質代謝制御因子の発現制御を介して、飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸、トリグリセリド及びリン脂質からなる脂質の合成を制御している。【００２５】
上記のように、脂質代謝制御因子の転写活性は、脂質の合成を制御することができる。従って、蛋白質間相互作用の阻害活性を、脂質代謝制御因子の転写を指標として評価する方法によれば、コレステロールの合成が制御されるため、例えば脂質の蓄積により誘導される脂肪肝等の予防、治療に有用な物質等をスクリーニングする指標として有用である。このため、本発明においては、上記スクリーニング方法を利用することにより、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用を阻害する物質を有効成分として含む脂肪合成阻害剤を得ることも可能である。前記有効成分としての物質は、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有していることが好ましい。【００２６】
レポーター遺伝子としては、特に限定されず、公知のものを利用できるが、検出感度、操作性共に優れる点で、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ等のルシフェラーゼが好ましく用いられる。本発明においては、再現性に優れ、信頼性の高い結果が得られる点で、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼとを組み合わて利用するデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ法が好ましく用いられる。【００２７】
本発明のスクリーニング方法に用いる発現ベクター及び細胞等には、スクリーニング方法に応じて公知乃至慣用のものを利用できる。具体的には、Ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍの例では、発現ベクターとして、ｐＧＢＫＴ７、ｐＡＣＴ２、ＧＡＤＴ７等；細胞として、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ１０９株等を利用できる。レポーターアッセイの例では、発現ベクターとして、形質転換効率に優れる点で、ｐＧＬ３（プロメガ社）等；細胞として、形質転換効率に優れる点で、胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）等の樹立細胞株；ＨＣＶ感染動物の肝臓から採取した生細胞等が好ましく用いられる。特に、ＨＣＶ感染の再現性に適する点でヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）、肝臓細胞等のＰＡ２８γ産生能を有する細胞等が好ましく用いられる。【００２８】
形質転換は、上記発現ベクターへ所望の配列を組込んだ組換えベクターを用い、細胞の種類に応じて公知の方法から適宜選択して行うことができる。得られた形質転換体は、細胞の種類に応じた公知の培地を用いて、慣用の培養条件で培養することができる。【００２９】
本発明の方法（１，２）の好ましい態様として、脂質代謝制御因子がＳＲＥＢＰ−１ｃのプロモーター領域を利用したレポーターアッセイ法等が挙げられる。【００３０】
従来、ＳＲＥＢＰ−１ｃは、そのプロモーター領域に、核ホルモン受容体ファミリーに属する肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）とレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の複合体（ＲＸＲα／ＬＸＲα）が結合することにより転写が活性化されることが知られている。前記ＲＸＲα／ＬＸＲα依存性の転写は、ＨＣＶコア蛋白質の共発現により活性化される。その詳細なメカニズムは必ずしも明確ではないが、一般に、ＲＸＲα／ＬＸＲαヘテロダイマーの共抑制剤（例えばＳｐ１１０ｂ等）が、ＨＣＶコア蛋白質と相互作用（結合）して細胞質中へ隔離されることにより、ＳＲＥＢＰ−１ｃの転写が活性化されるモデルが推察されている。前記スクリーニング方法は、ＳＲＥＢＰ−１ｃのプロモーター領域の転写活性が、ＨＣＶコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用に制御される現象に基づいている。【００３１】
前記ＳＲＥＢＰ−１ｃのプロモーター領域を利用したレポーターアッセイ法は、例えば、ＳＲＥＢＰ−１ｃのプロモーター領域の制御下にレポーター遺伝子を発現可能に組込んだ発現ベクターに加え、ＨＣＶコア蛋白質、ＰＡ２８γ、ＲＸＲα及びＬＸＲαの各蛋白質をコードする遺伝子を発現可能に組込んだ一又は複数の組換えベクターを用いて細胞を形質転換し、得られた形質転換体を、９−シス−レチノイン酸（９ｃｉｓＲＡ：ＲＸＲαのリガンド）と２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｒ）ＨＣ：ＬＸＲαのリガンド）を添加した培地で、被検物質の存在下又は非存在下で培養してレポーター活性を評価する方法等を利用できる。被検物質は、被検物質の種類に応じて、そのまま、又は組換えベクターや公知の担体を用いて添加することができる。【００３２】
上記方法により、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用の阻害活性を有すると評価される被検物質は、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有していることが好ましい。このような物質によれば、ＰＡ２８γ依存性プロテアソーム経路を遮断し、ＨＣＶコア蛋白質を分解することなく核内に蓄積させる結果、例えば疾患に関連する因子の転写を抑制することにより、一層高い予防、治療効果を発揮することができると考えられる。【００３３】
本発明のスクリーニング方法によれば、Ｃ型肝炎ウィルスに感染後の宿主に対し、脂肪肝や肝臓癌等の発症を抑制し、ＨＣＶ関連疾患の症状の進行を阻止する効果に優れた薬剤を効率よく得ることができる。特に、脂質代謝制御因子の転写活性を指標とした場合には、脂質合成阻害剤として有用な物質を得る簡便なスクリーニング方法として利用することができる。【００３４】
本発明において、Ｃ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療効果を確認する方法としては、例えば、上述のレポーターアッセイ法を利用して、脂質代謝制御因子の転写に対する抑制効果を確認する方法；ＨＣＶに感染しているか又は遺伝子改変によりＨＣＶコア蛋白質をコードする遺伝子が発現可能に導入された非ヒト動物（ＨＣＶコアＴｇマウス等）に被検物質を投与した動物において、投与しない動物と比較して、肝臓細胞における脂肪の蓄積量の低下、肝臓癌の発症率の低下を確認する方法等を利用できる。【００３５】
本発明のＣ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療薬（以下、単に「本発明のＨＣＶ治療薬」と称する場合がある）は、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用を阻害する物質を有効成分として含んでいる。前記蛋白質間相互作用を阻害する物質とは、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用を妨害し又は阻止する活性を有する物質であれば特に限定されない。このような物質は、前記相互作用の阻害活性を介して、例えば、ＨＣＶ関連疾患の発症や症状の進行を誘導する因子の転写、翻訳等を抑制することにより、同疾患の予防、治療効果を奏することができる。前記蛋白質間相互作用を阻害する物質は、例えば上記本発明のスクリーニング方法を用いて得ることができる。【００３６】
本発明のＨＣＶ治療薬は、ＰＡ２８γ遺伝子の発現又は機能の阻害活性を有していることが好ましい。ここで、「発現」とは、蛋白質が産生されることを意味しており、「発現を阻害する活性」とは、遺伝子の転写、転写後調節、蛋白質への翻訳、翻訳後修飾、蛋白質フォールディング等の何れの段階における作用であってもよい。また、「機能を阻害する活性」は、蛋白質における蛋白質間相互作用部位や活性部位等の機能部位に作用してシグナル伝達を低減又は抑制する物質；ＰＡ２８γ又はコア蛋白質と相互作用する蛋白質のドミナントネガティブ変異体等であってもよい。ここで、「ドミナントネガティブ変異体」とは、蛋白質に対する変異の導入（機能領域の欠失等）によりその生理活性が低減したものをいう。これらの変異体は野生型と競合して間接的にその機能を阻害することができる。【００３７】
ＰＡ２８γの発現を阻害する物質としては、例えば、転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、蛋白質合成阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤、スプライシングやｍＲＮＡの細胞質移行を阻害しうる因子、ｍＲＮＡ分解酵素、ｍＲＮＡに結合して不活化する因子等が挙げられるが、他の遺伝子や蛋白質への副作用を最小限にするため、標的分子に特異的に作用しうる物質が好ましい。このようなＰＡ２８γの発現を特定的に阻害する物質としては、例えば、ＰＡ２８γ若しくはその均等物にｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、アプタマー、デコイ核酸等の機能性核酸；抗体等の機能性蛋白質が好ましく用いられる。これらの機能性核酸及び蛋白質は、投与後に投与対象内で産生される形態であってもよく、必要に応じて発現ベクター、細胞等を用いて公知の方法で調製することができる。なかでも、標的分子の特異性を容易に付与でき、取扱性に優れる点で、機能性核酸が好ましく、特にアプタマー、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ等が好ましく用いられる。機能性核酸を用いる場合には、標的分子と相補的又は同一である領域の長さが、例えば１５〜３０個、好ましくは１８〜２５個、より好ましくは２０〜２３個程度のヌクレオチドである。【００３８】
前記蛋白質間相互作用を阻害する物質を有効成分として含むＣ型肝炎ウィルス関連疾患の予防及び／又は治療薬は、例えば、適宜なビヒクルに溶解又は懸濁して、経口又は非経口投与される。非経口投与には、例えば、静脈、動脈、筋肉、腹腔、気道等を経路とする全身投与、又は肝臓又はその近傍への局所投与を利用できるが、これらに限定されない。なかでも、経口投与が好ましい。【００３９】
本発明のＨＣＶ治療薬は、前記蛋白質間相互作用を阻害する物質を肝臓又はその近傍の細胞に安定に到達させ、細胞膜を透過し、リソソーム／エンドソームからの薬剤の遊離を促進しうるドラッグデリバリーシステムの設計がされていることが好ましい。ヌクレアーゼ耐性、細胞内移行、リソソーム／エンドソームからの薬剤の遊離の改善方法としては、前記機能性核酸や蛋白質に対し種々の化学修飾を施す方法等を利用でき、例えば、アンチセンス核酸等のオリゴ核酸分子の場合、リン酸結合や糖部分に修飾を施したり、リン酸骨格の代わりにモルフィン骨格を有するオリゴ核酸、ＰＮＡ等を用いる方法等の化学修飾を施す方法等の公知の方法を適用できる。【００４０】
剤形としては、液剤、固形剤の何れであってもよく、例えば、水、生理食塩水等の希釈液又は分散媒に有効量の阻害剤を溶解、分散、乳化させた液剤；有効量の阻害剤を固体や顆粒として含むカプセル剤、サッシェ剤、錠剤等の固形剤などが挙げられる。【００４１】
本発明のＨＣＶ治療薬は、また、有効成分となる前記蛋白質間相互作用を阻害する物質がそのまま添加されていてもよく、有効成分がリポソームや徐放性材料等に封入された封入体や担体に担持された担持体などであってもよい。リポソーム等に封入することにより、有効成分をヌクレアーゼやプロテアーゼによる分解から保護し、リポソーム膜が細胞表面と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に到達しやすくなる点で有利である。コラーゲン等の徐放性材料に封入することにより、有効成分の長期持続性が得られる。【００４２】
本発明のＨＣＶ治療薬には、上記以外に、医薬上許容される公知の添加剤を添加することができる。【００４３】
ＨＣＶ治療薬の投与量は、同治療薬を構成する有効成分の種類、投与方法、症状、投与対象の種類、大きさ、薬物特性等に応じて異なるが、通常、成人１日当たり有効成分量として例えば０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．０００５〜５ｍｇ／ｋｇ程度であり、１回又は複数回に分けて投与することができる。【００４４】
本発明の脂肪合成阻害剤は、Ｃ型肝炎ウィルスコア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用を阻害する物質を有効成分として含んでいる。このような物質は選別する方法として、例えば、上記本発明のスクリーニング方法を利用でき、なかでも、脂質代謝制御因子の転写活性を指標とするレポーターアッセイ法が好ましく用いられる。【００４５】
本発明によれば、Ｃ型肝炎ウィルス由来のコア蛋白質と、宿主由来のＰＡ２８γとの相互作用を阻害し、前記相互作用により誘導される脂質代謝制御因子等の転写を抑制する活性を備えた物質を簡便な方法で得ることができる。このような物質は、脂肪の蓄積を抑制、回避して、脂肪肝、肝臓癌等のＣ型肝炎ウィルス関連疾患に対する優れた予防、治療効果を発揮することができる。
【実施例】
【００４６】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００４７】
実施例１  ＰＡ２８γノックアウトＨＣＶコア遺伝子導入マウスの作成
（１）プラスミドの調製
ヒト胎児脳ライブラリーよりＰＡ２８γのｃＤＮＡを単離した（Ｋ．Ｍｏｒｉｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，１０２３７（２００３））。ＨＣＶ株Ｊ１（遺伝子型１ｂ；Ｈ．Ａｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７，６２１（１９９８））よりＨＣＶ蛋白質を増幅し、ｐＣＡＧ−ＧＳ（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｇｅｎｅ  １０８，１９３（１９９１））へクローン化した。マウス肝臓の全ｃＤＮＡから、ＲＸＲαとＲＸＲαのマウスｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。得られたＲＸＲαとＲＸＲα遺伝子をｐＥＦＦｌａｇＧｓｐＧＢＫ（Ｄ．Ｃ．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｃｏｒｙ，Ａ．Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４，４０５（１９９７））とｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にそれぞれ導入した。マウス抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体とマウス抗β−アクチン抗体はシグマ社製；ＰＡ２８γの７０〜８５アミノ酸に対応する合成ペプチドに対するラビットポリクローナル抗体はアフィニティ社製；ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ゴート抗マウスＩｇＧ及び抗ラビットＩｇＧはＩＣＮファーマシューティカルズ社製のものをそれぞれ用いた。ラビット抗ＨＣＶコア蛋白質は、Ｒ．Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９，１２７１（２００５）に記載の方法に従い、組換えＨＣＶコア蛋白質（１〜７１アミノ酸配列）で免役することにより調製した。ＨＣＶコア蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体は、Ｋ．Ａｏｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７，１８０２（１９９９）に記載の抗体を供与された。【００４８】
（２）ＰＡ２８γノックアウトＨＣＶコア遺伝子導入マウスの作成
Ｋ．Ｍｏｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８，１５２７（１９９７）、及びＳ．Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３８２１１（１９９９）に記載の方法に従い、ＨＣＶ株Ｊ１遺伝子型１ｂ（コアＴｇ）をコードする遺伝子を保持するＣ５７ＢＬ／６マウス、系統４９と、そのＰＡ２８γ−／−マウスを作製した。これらのマウス染色体上の特徴的な構成部分を図１ａ（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示した。（ｉ）は、野生型（ＰＡ２８γ＋／＋）であり、（ｉｉ）は、ＰＡ２８γ遺伝子のエキソン２〜８を、マーカー遺伝子（ｎｅｏ）に組み換えることにより、ＰＡ２８γ遺伝子の機能が欠失された変異型ＰＡ２８γ（ＰＡ２８γ−／−）、（ｉｉｉ）は、ＨＢＶ  Ｘプロモーターの制御下にＨＣＶコア蛋白質をコードする遺伝子が導入されたＨＣＶコア蛋白質導入型（コアＴｇ）をそれぞれ示している。マウスのジェノタイピングは、野生型（ＰＡ２８γ＋／＋）より０．７５ｋｂのＤＮＡを増幅するプライマー（Ｐ，Ｑ）、変異型（ＰＡ２８γ−／−）より導入したマーカー遺伝子の一部を含む０．９０ｋｂのＤＮＡを増幅する２種のプライマー（Ｐ，Ｒ）を用いて、また、変異型（コアＴｇ）より導入したＨＣＶコア蛋白質をコードする遺伝子を含む０．４２ｋｂのＤＮＡを増幅する２種のプライマー（Ｓ，Ｔ）を用いて、それぞれマウス尾部より抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により行った。マウス尾部より抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により行った。【００４９】
上記のＰＡ２８γ−／−マウスとコアＴｇマウスとを交配させ、次いで得られた同腹のＰＡ２８γ＋／−コアＴｇマウス同士を交配させて、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇマウスを作製した。ＰＡ２８γ−／−コアＴｇの同定は、Ｋ．Ｍｏｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８，１５２７（１９９７）、及びＳ．Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３８２１１（１９９９）に記載の方法に従って、ＰＡ２８γ又はＨＣＶコア遺伝子を標的とするＰＣＲ分析分析により行った。具体的には、マウス尾部より抽出したゲノムＤＮＡ１μｇに対し、合成オリゴヌクレオチドのセンスプライマーＰＡ２８−３（配列番号１）とアンチセンスプライマーＰＡ２８γ−５ｃｒ（配列番号２）とを用いたＰＣＲ反応を行い、０．７５ｋｂの増幅産物を検出することにより、ＰＡ２８γ遺伝子の存在（ＰＡ２８γ＋／＋）を確認した。また、前記センスプライマーＰＡ２８−３（配列番号１）とＰＡＫＯ−４プライマー（配列番号３）とを用いたＰＣＲ反応を行い、０．９０ｋｂの増幅産物を検出することにより、マーカー遺伝子が挿入されてＰＡ２８γ遺伝子が欠失された変異型ＰＡ２８γ（ＰＡ２８γ−／−）であることを確認した。ＨＣＶコア蛋白質の確認は、Ｋ．Ｍｏｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８，１５２７（１９９７）に記載の方法に従ってＰＣＲ反応を用い、０．４２ｋｂの増幅産物を検出することにより行った。
2008041665.tif 000002
【００５０】
（３）ｍＲＮＡの発現形態
図１ｂは、ジェノタイピングに用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真を示す。本願明細書中、野生型マウスを「ＰＡ２８γ＋／＋」、コア蛋白質導入マウスを「コアＴｇ］又は「ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ」、ＰＡ２８γ遺伝子が欠失した変異型ＰＡ２８γマウスを「ＰＡ２８γ−／−」、ＰＡ２８γ遺伝子が欠失し、且つコア蛋白質が導入されたマウスを「ＰＡ２８γ−／−コアＴｇ」と称する。ＨＣＶコア蛋白質の分子量と発現レベルは、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇマウス及びＰＡ２８γ＋／＋マウスとも同程度であった。なお、ＰＡ２８＋／＋コアＴｇマウスにおけるＰＡ２８γの発現レベルは、野生型（ＰＡ２８＋／＋）と同程度であった。【００５１】
（４）蛋白質の発現形態
図１ｃは、マウス肝臓組織の発現蛋白質を解析するウェスターンブロッティングを示す。具体的には、６月齢のマウスの肝臓組織の上清（２００μｇ蛋白質／レーン）をサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＨＣＶコア蛋白質、ＰＡ２８γ、及びβ−アクチンに対するモノクローナル抗体を用いてウェスターンブロッティング分析を行った。なお、マウスは、ガイドラインに従って処理し、マウス飼育用に市販されているＣＲＦ−１（チャールズリバーラボラトリーズ社製）を給餌し、特別な病原菌フリーの条件下で保管した。【００５２】
（５）性差
６月齢のマウスの体重を観察したところ、図１ｄに示されるように、ＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウス、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇマウス、及びＰＡ２８γ−／−の各マウスに大きな差は見られなかった。さらに、ＥＬＩＳＡ分析（ｍｅａｎ  ±Ｓ．Ｄ．ｎ＝１０）により、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウス及びＰＡ２８γ−／−コアＴｇマウスの肝臓におけるコア蛋白質の発現量を測定した。その結果、図１ｅに示されるように、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウス及びＰＡ２８γ−／−コアＴｇマウス共に、コア蛋白質の発現量はメスよりオスのマウスで高く見られた。【００５３】
（評価試験）
１．組織染色
各種遺伝子型を有するマウスの肝臓を定法に従ってホルマリン固定し、パラフィンで包埋した後、作製した凍結切片（ホルマリン固定組織切片）について、以下の方法でＨＣＶコア蛋白質の発現を確認し、ヘマトキシリン・エオジン染色、オイルレッドＯ染色を行った。その結果を図２ａ〜ｃに示す。
図２ａは、３通りの遺伝子型のマウス肝臓切片におけるＨＣＶコア蛋白質の発現を可視化した写真である。詳細には、ＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇの各遺伝子型を有する２月齢のマウス肝臓から作製したホルマリン固定組織切片を３％過酸化水素水で処理し、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳでブロッキングし、抗ＨＣＶコア蛋白質ラビット抗体で一晩インキュベートした後、第２抗体として、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ラビットＩｇＧ抗体（ＩＣＮ）でインキュベートし、３，３’−ジアミノベンジジンを基質として免疫反応抗原を可視化した。
その結果、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇマウスの肝臓細胞の核に、ＨＣＶコア蛋白質の明らかな蓄積が見られた。これは、ＨＣＶコア蛋白質の少なくともある分画が核へ移行し、ＰＡ２８γ依存経路による分解を受けていることを明らかに示している。【００５４】
図２ｂは、２通りの遺伝子型のマウス肝臓切片のヘマトキシリン・エオジン染色の写真である。詳細には、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇの各遺伝子型を有する６月齢のマウスから採取した肝臓から作製したホルマリン固定組織切片をヘマトキシリン及びエオジンで染色した。
その結果、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウスでは、激しい液胞形成障害が見られた。一般に、４月齢のＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウスの肝臓細胞の細胞質には穏やかな液胞形成が観察され、６ヶ月でより激しくなることが知られているが、６月齢のＰＡ２８γ−／−コアＴｇ、ＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ−／−に各マウスには、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウスのような液胞形成障害は特に見られなかった。【００５５】
、図２ｃは、２通りの遺伝子型のマウス肝臓切片に蓄積されている脂肪をオイルレッドＯ染色により可視化した写真である。詳細には、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇの各遺伝子型を有する６月齢のマウス肝臓から作製したホルマリン固定組織切片をオイルレッドＯで染色した。
その結果、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウス肝臓における液胞形成領域は、オイルレッドＯで明らかに染色されており、コアＴｇマウスに重度の脂肪症が発症していたことが示唆された。【００５６】
図２ｄは、４通りの遺伝子型のマウス肝臓切片に蓄積されている脂肪滴の面積を、オスとメスを対比して示したグラフである。詳細には、ＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇ、及びＰＡ２８γ−／−の各遺伝子型を有する６月齢のマウス肝臓から作製したホルマリン固定組織切片をオイルレッドＯで染色し、染色された脂肪滴の領域（切片に対する面積比）を、イメージ−プロ−ソフトウェア（メディア  シベルネティクス社製）を用いて算出した。グラフ中、脂肪滴の領域（Ｙ軸）は、ランダムに選択した５つの切片について３つの異なる部位を測定し、遺伝子型当たり１０体の平均値を示している。
その結果、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウス肝臓における脂肪滴の領域は、野生型のオス、メスマウスに対し、それぞれ約１０倍及び２〜４倍の大きさであった。従って、マウスにおいて、ＰＡ２８γがＨＣＶコアタンパクによる脂肪肝の誘導に必要であることが示された。【００５７】
２．リアルタイムＰＣＲ
４通りの遺伝子型を有するマウスについて、肝臓における脂肪合成制御因子の転写産物を、以下の方法に従って比較した。脂肪合成制御因子としては、ＳＲＥＢＰファミリーに属するＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＳＲＥＢＰ−２、及び前記ＳＲＥＢＰ−１ｃにより転写制御されることが知られている、飽和及びモノ不飽和脂肪酸とトリグリセリドを生成させるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素を用いた。ＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇ、及びＰＡ２８γ−／−の各遺伝子型を有する２月齢及び６月齢のマウスの肝臓から、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ（インビトロジェン社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。ファーストストランドｃＤＮＡはファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いて合成した。各ｃＤＮＡ量は、プラチナＳＹＢＲグリーンｐＰＣＲスーパーミックスＵＤＧ（インビトロジェン社製）を用いて、付属のプロトコールに従って推定した。蛍光シグナルはＡＢＩプリズム７０００（アプライド  バイオシステム社製）を用いて測定した。表１に記載のプライマーの組み合わせを用いて、ＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＳＲＥＢＰ−２、ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸合成酵素、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素、ＨＭＧＣｏＡ合成酵素、及びヒポキサンチンフォスフォリボシル転移酵素（ＨＰＲＴ）に対応する塩基配列を増幅した。なお、不純物を含むゲノムＤＮＡによる偽陽性の増幅を避けるため、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは異なるエキソン上に配置した。各ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で正確な分子量の単一バンドとして確認した。【００５８】
【表１】
2008041665.tif 000003
【００５９】
脂肪合成制御遺伝子であるＳＲＥＢＰ−１ａ、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＳＲＥＢＰ−２、ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸合成酵素、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素、及びＨＭＧＣｏＡ合成酵素の転写量は、ＨＰＲＴの転写量で標準化した数値で示した（ｎ＝５，＊：０．０５＞ｐ，＊＊：０．０１＞ｐ）。図３の各グラフ中の白色、灰色、黒色、濃灰色４種のバーは、それぞれＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇ、及びＰＡ２８γ−／−の各遺伝子型のマウスにおける各遺伝子の転写量を示し、図３は、それぞれ２月齢のマウス肝臓におけるＳＲＥＢＰ−１ａ（Ａ）、同ＳＲＥＢＰ−１ｃ（Ｂ）、同ＳＲＥＢＰ−２（Ｃ）、同ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素（Ｄ）をコードする遺伝子の転写量、６月齢のマウス肝臓におけるＳＲＥＢＰ−１ｃ（Ｅ）、同脂肪酸合成酵素（Ｆ）、同アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｇ）、同ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素（Ｈ）、同ＨＭＧＣｏＡ還元酵素（Ｉ）、及び同ＨＭＧＣｏＡ合成酵素（Ｊ）をコードする遺伝子の転写量について、ＨＰＲＴの転写量基準の相対値を示している。【００６０】
以上の結果、２月齢ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウス肝臓では、図３Ａ〜Ｄに示されるように、ＳＲＥＢＰ−１ｃ及びその下流のステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素の転写が、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇ、ＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ−／−より促進されたのに対し、ＳＲＥＢＰ−２及びＳＲＥＢＰ−１ａには差が見られなかった。また、６月齢ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウス肝臓では、図３Ｅ〜Ｊに示されるように、ステアロイルＣｏＡ脱飽和酵素だけでなくＳＲＥＢＰ−１ｃとその制御下にあるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及び脂肪酸シンターゼの転写も、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇ、ＰＡ２８γ＋／＋、ＰＡ２８γ−／−より促進されていた。これに対し、ＳＲＥＢＰ−２に制御されるコレステロール生合成関連遺伝子（ＨＭＧＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧＣｏＡ還元酵素）の転写には統計上大きな差が見られなかった。以上の結果は、マウス肝臓におけるＳＲＥＢＰ−１ｃ転写の促進には、ＨＣＶコア蛋白質とＰＡ２８γが共に必要であること、ＰＡ２８γ依存性プロテアソーム経路により分解されないために核内にＨＣＶコア蛋白質が蓄積しても（例えばＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウスの場合）、ＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性に影響はないことを示唆している。【００６１】
３．肝癌の発生率
ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇ、ＰＡ２８γ＋／−、ＰＡ２８γ−／−、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇの何れかの遺伝子型を有する１６〜１８月齢を超えたオスとメスについて、肝癌の発生率を調べた。具体的には、上記各マウスから肝臓を摘出し、肝癌の発症の有無を確認した。これらの結果を表２に示す。【００６２】
【表２】
2008041665.tif 000004
【００６３】
以上の結果、ＰＡ２８γ＋／−マウス、ＰＡ２８γ−／−マウス、ＰＡ２８γ−／−コアＴｇマウスのオス及びメスいずれも、検査した全てのマウスで肝癌の発症が見られなかったのに対し、ＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウスのオス及びメスにはいずれも肝癌を発症したマウスが存在していた。具体的には、１６〜１８月齢を超えたオスのＰＡ２８γ＋／＋コアＴｇマウスにおける肝癌の発生率は２９．４％（１７匹中５匹）であり、同じ年齢範囲のメスのマウスの１０．７％（２８匹中３匹）よりも極めて高かった。これらの結果は、ＰＡ２８γがＨＣＶコア蛋白質に誘導される肝癌の発症に欠かせない役割を担っていることを示している。【００６４】
実施例２  ＨＣＶコア蛋白質とＰＡ２８γによるＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性の促進効果
マウスのゲノムより、ＳＲＥＢＰ−１ｃプロモータ領域（−４１０〜＋２４残基に位置）をコードするゲノムＤＮＡ断片を増幅し、得られた断片をｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）のＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＧＬ３−ＳＲＥＢＰ−１ｃＰｒｏを構築した（図４ａ）。
（１）ＭＥＦｓ細胞を用いたＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性測定（図４ｂ）
ＰＡ２８γ＋／＋及びＰＡ２８γ−／−の各遺伝子型を有するマウスに由来する胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）は、Ｓ．Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３８２１１（１９９９）に記載された方法に従って調製し、温度３７℃、５％二酸化炭素の雰囲気下で、ＤＭＥＭ（シグマ社製）に、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸を添加した培地を用いて培養した。次いで、ＰＡ２８γ＋／＋ＭＥＦｓ細胞又はＰＡ２８γ−／−ＭＥＦｓ細胞を、前記ｐＧＬ３−ｓｒｅｂｐ−１ｃＰｒｏ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするコントロールプラスミド（プロメガ社製）と共に、以下の組み合わせのプラスミドを用いて形質転換した。すなわち、（ｉ）空のプラスミド、（ｉｉ）ＲＸＲαのみコードするプラスミド、（ｉｉｉ）ＬＸＲαのみコードするプラスミド、（ｉｖ）ＲＸＲαとＬＸＲαとをコードするプラスミドの何れか一つのプラスミドを用い、同時に、（ｖ）ＨＣＶコア蛋白質をコードするプラスミドを用い（図４ｂのグラフの白色バー）又は用いないで（図４ｂグラフの灰色バー）形質転換を行った。なお、トランスフェクションに用いたＤＮＡの総量は空のプラスミドを添加して均一化した。２４時間培養後、細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系（プロメガ社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。活性は、Ｆｉｒｅｆｌｙ（蛍）ルシフェラーゼ活性は、Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵｓ）を指標として、ルシフェラーゼユニットＲＬＵｓに対する倍数で示した。これらの結果を図４ｂのグラフに示す。図４ｂ中、左のグラフはＰＡ２８γ＋／＋ＭＥＦｓ細胞、右のグラフはＰＡ２８γ−／−ＭＥＦｓ細胞を、前記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのプラスミドと（ｖ）ＨＣＶコア蛋白質をコードするプラスミドとの組み合わせで（白色バー）、又は（ｖ）を添加しないで（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのプラスミドで（灰色バー）形質転換したときのルシフェラーゼ活性を示している。【００６５】
その結果、ＨＣＶコア蛋白質を発現するＰＡ２８γ＋／＋マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）では、ＬＸＲα及びＲＸＲαの内因性の発現によりＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーターの活性化が誘導された（図４ｂ左）。さらに、ＰＡ２８γ＋／＋マウスのＭＥＦｓにおいては、ＬＸＲαとＲＸＲαの外因性の発現でも、ＨＣＶコア蛋白質によるＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性は亢進された。しかし、ＰＡ２８γ−／−マウスのＭＥＦｓでは、ＨＣＶコア蛋白質によるＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーターの活性化の促進は見られなかった（図４ｂ右）。これらの結果は、ＳＲＥＢＰ−１ｃの転写の上昇にはＨＣＶコア蛋白質とＰＡ２８γが必要であることを示すｖｉｖｏの観察結果とよく一致している。【００６６】
（２）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性測定（図４ｃ）
ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ：内因性のＰＡ２８γを発現する細胞）を、前記ｐＧＬ３−ｓｒｅｂｐ−１ｃＰｒｏ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするコントロールプラスミド（プロメガ社製）と共に、（ｉ）空のプラスミド、（ｉｉ）ＨＣＶコア蛋白質をコードするプラスミド、（ｉｉｉ）ＲＸＲαとＬＸＲαとをコードするプラスミド、（ｉｖ）ＲＸＲαとＬＸＲαとＨＣＶコア蛋白質をコードするプラスミドの何れか一つのプラスミドを用いて形質転換した。得られた形質転換体を、添加剤として、ＲＸＲαのリガンドである９−シス−レチノイン酸（９ｃｉｓＲＡ；シグマ社製）、ＬＸＲαのリガンドである２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｒ）ＨＣ）又は両成分のいずれかを添加した培養液を用いて２４時間培養した後、細胞を回収し、前記（１）と同様に、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系（プロメガ社製）によるルシフェラーゼ活性を測定した。【００６７】
以上の結果、内因性のＬＸＲαとＲＸＲαを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＲＸＲαのリガンドである９−シスレチノイン酸、及び／又はＬＸＲαのリガンドである２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールで処理することにより、ＨＣＶコア蛋白質によるＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性が亢進された。これらの結果は、ＨＣＶコア蛋白質がＲＸＲα／ＬＸＲα依存性にＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性を促進するとの考えを支持している。【００６８】
（３）変異型ＨＣＶコア蛋白質のＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性（図４ｄ）
ＨＣＶコア蛋白質に誘導されるＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーターの亢進に関する一層の知識を得るため、変異型ＨＣＶコア蛋白質の活性を以下の方法で調べた。
ＨＣＶコア蛋白質から、Ｃ末の膜貫通領域とＥＲアンカー領域（アミノ酸配列１７４〜１９１）を欠失させた変異型コア蛋白質を作製した。ＰＡ２８γ＋／＋ＭＥＦｓ又は２９３Ｔ細胞に対し、空のプラスミド、ＨＣＶコア蛋白質をコードするプラスミド、変異型コア蛋白質をコードするプラスミドの何れかを用いて、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（インビトロジェン社製）によるリポソーム媒介トランスフェクションを行った。肝臓組織中のＨＣＶコア蛋白質量は、Ｋ．Ａｏｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７，１８０２（１９９９）の記載に従いＥＬＩＳＡにより測定した。細胞上清を用いて１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＤＶＦ膜上へ転写した。膜上の蛋白質は、特異的な抗体とスーパーシグナルフェムト（ピアス社製）で処理し、ＬＡＳ３０００イメージングシステム（富士写真フィルム（株）製）により可視化した。【００６９】
以上の結果、Ｃ末の膜貫通領域とＥＲアンカー領域（アミノ酸配列１７４〜１９１）を欠失させた変異型コア蛋白質は、ＰＡ２８γ＋／＋ＭＥＦｓ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方で、ＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーター活性を亢進することができなかった（図４ｄ）。これらの結果は、ＰＡ２８γ依存経路を経た核におけるＨＣＶコア蛋白質の分解だけでなく、ＨＣＶコア蛋白質の細胞質への局在が、ｖｉｖｏにおけるＳＲＥＢＰ−１ｃプロモーターの亢進に必要であることを示唆している。【００７０】
実施例３  コア蛋白質とＰＡ２８γとの相互作用の阻害活性を指標とするスクリーニング
ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を、前記ｐＧＬ３−ｓｒｅｂｐ−１ｃＰｒｏ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするコントロールプラスミド（プロメガ社製）、及びＲＸＲαとＬＸＲαとＨＣＶコア蛋白質をコードするプラスミドからなる組み合わせを用いて形質転換した形質転換体を、ＲＸＲαのリガンドである９−シス−レチノイン酸（９ｃｉｓＲＡ；シグマ社製）とＬＸＲαのリガンドである２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｒ）ＨＣ）を添加した培地を用いて、被検物質の存在下又は非存在下で２４時間培養する。その後、細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系（プロメガ社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定する。
活性は、Ｆｉｒｅｆｌｙ（蛍）ルシフェラーゼ活性は、Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵｓ）を指標として、ルシフェラーゼユニットＲＬＵｓに対する倍数で示す。以上の結果、被検物質の有無でルシフェラーゼ活性に有意な差が見られる被検物質は、ＨＣＶ関連疾患の予防及び／又は治療薬として有用である。【００７１】
実施例４  ＨＣＶ関連疾患の予防及び／又は治療薬
ＰＡ２８γ遺伝子のｍＲＮＡの部分配列に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を合成した。
ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を、前記ｐＧＬ３−ｓｒｅｂｐ−１ｃＰｒｏ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするコントロールプラスミド（プロメガ社製）、及びＲＸＲαとＬＸＲαとＨＣＶコア蛋白質をコードするプラスミドからなる組み合わせを用いて形質転換した形質転換体を、ＲＸＲαのリガンドである９−シス−レチノイン酸（９ｃｉｓＲＡ；シグマ社製）とＬＸＲαのリガンドである２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｒ）ＨＣ）を添加した培地を用いて、前記ｓｉＲＮＡの存在下又は非存在下で２４時間培養する。その後、細胞を回収し、実施例３と同様の方法でデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系（プロメガ社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、該活性をＲＬＵｓに対する倍数に換算する。以上の結果、ｓｉＲＮＡを添加することによりルシフェラーゼ活性が著しく低下することから、ＨＣＶ関連疾患の予防及び／又は治療薬として有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の方法によれば、Ｃ型肝炎ウィルス由来のコア蛋白質と、宿主由来のＰＡ２８γとの相互作用を阻害する活性を評価とすることにより、当該相互作用に誘導される脂質代謝制御因子等の転写活性を介して脂質合成酵素の発現を制御可能な物質を効率よく得ることができる。こうして得られる物質は、脂肪合成阻害剤の有効成分として利用でき、特に、Ｃ型肝炎に伴う脂肪肝、肝硬変、肝臓癌等の発症を防いだり、症状の進行を抑制する予防、治療薬の有効成分として極めて有用である。本発明の予防、治療薬によれば、すでに発症しているＣ型肝炎ウィルス関連疾患に対して優れた治療効果を発揮することができ、さらに、同疾患発症前のＨＣＶキャリア患者等に投与することにより、ＨＣＶ関連疾患の発症を抑える予防薬として有用な物質を得ることも可能である。
［配列表］
2008041665.tif 000005
2008041665.tif 000006
2008041665.tif 000007
2008041665.tif 000008
2008041665.tif 000009
2008041665.tif 000010
【図５】
2008041665.tif 000011
【図１】
2008041665.tif 000012
【図２】
2008041665.tif 000013
【図３】
2008041665.tif 000014
【図４】
2008041665.tif 000015
【国際調査報告】
2008041665.tif 000016
2008041665.tif 000017
2008041665.tif 000018
2008041665.tif 000019
2008041665.tif 000020
2008041665.tif 000021
2008041665.tif 000022
2008041665.tif 000023
2008041665.tif 000024
2008041665.tif 000025