【手続補正書】
【提出日】平成16年10月22日(2004.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  情報伝達アプタマーをｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択する方法において、
(a)ヌクレオチドのランダム・インサートを有しており、前記ヌクレオチド・インサートがヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣあるいはＧの１つとはかなり非対称的モル比を有しているＤＮＡのプールを合成するステップと、
(b)上記ＤＮＡプールを増幅させるステップと、
(c)前記増幅されたＤＮＡからＲＮＡプールを転写するステップにおいて、上記ＲＮＡ転写で用いられるヌクレオチドが１つ以上のレポーター分子によってラベルされていることを特徴とするステップと、
(d)上記ラベルされたＲＮＡプールを親和性カラムに入れて、カラムに対して高結合親和性を有するラベルされたＲＮＡ分子は、親和性カラムに保持され、そしてその結果ラベルされたＲＮＡプールから取り出されるステップと、
(e)上記高親和性カラムに保持された上記ラベルされたＲＮＡ分子からｃＤＮＡプールを得るステップと、
(f)上記親和性カラム上で、カラムに対して高結合親和性を有するラベルされたＲＮＡプールから上記ラベルされたＲＮＡを保持するためにステップ(a)から(e)までを繰り返すステップと、そして
(g)上記保持されたラベルＲＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップと
で構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２】  ＲＮＡ転写で用いられる上記ヌクレオチドが化学的に修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】  上記合成ＤＮＡプールにおける上記ＤＮＡが５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有していることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】  ５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有している上記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１に示される配列を有することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】  上記非対称的モル比が３：３：２：０．３８  Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔホスホルアミダイトであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】  カラムに対して高結合親和性を有するラベルされたＲＮＡプールから上記ラベルされたＲＮＡの概ね３分の１が上記親和性カラム上に保持されるまでステップ(a)から(e)が繰り返されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】  上記親和性カラムがＡＴＰアガロース親和性カラムであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】  上記レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいはさらに上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】  上記蛍光が、１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が形成される蛍光色素であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】  上記蛍光色素がフルオレセイン、カスケード・ブルー、テキサス・レッド及びローダミン・グリーンで構成される群から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】  上記蛍光色素ヌクレオチド結合体が蛍光色素ウリジン５’−３リン酸結合体であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】  上記蛍光色素ウリジン５’−３リン酸結合体がフルオレセイン−１２−ＵＴＰ、カスケード・ブルー−７−ＵＴＰ、テキサス・レッド−５−ＵＴＰ及びローダミン・グリーン−５−ＵＴＰで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】  上記情報伝達アプタマーがｒａｆ１５、ｒａｆ１７、ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃ、ｒａｆ１７−Ｕ５２Ｃ、ｒａｆ１７ｓ、ｒａｆ１３４、ｒａｆ１１０、ｒａｆ１１１、ｒａｆ１８、ｒａｆ１３３、ｒａｆ１１７、ｒａｆ１１４、ｒａｆ１２０、ｒａｆ１２６、ｒａｆ１２８、ｒａｃｂ７ｂ、及びｒａｒｇ７ｂで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】  請求項１記載の方法によって選択される情報伝達アプタマー。
【請求項１５】  情報伝達アプタマーが１つ以上のレポーター分子を含む１つのＲＮＡ核酸結合種（アプタマー）で構成されることを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
【請求項１６】  レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいは上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項１５記載の情報伝達アプタマー。
【請求項１７】  上記蛍光が、１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が上記情報伝達アプタマー内に形成される蛍光色素であることを特徴とする請求項１６記載の情報伝達アプタマー。
【請求項１８】  上記蛍光色素ヌクレオチド結合体が蛍光色素ウリジン５’−３リン酸結合体であることを特徴とする請求項１７記載の情報伝達アプタマー。
【請求項１９】  上記情報伝達アプタマーがｒａｆ１５、ｒａｆ１７、ｒａｆ１７−Ｕ６１Ｃ、ｒａｆ１７−Ｕ５２Ｃ、ｒａｆ１７ｓ、ｒａｆ１３４、ｒａｆ１１０、ｒａｃｂ７ｂ、及びｒａｒｇ７ｂで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
【請求項２０】  上記リガンドがアデノシン５’−３リン酸であることを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
【請求項２１】  上記情報伝達アプタマーが、１つのリガンドに結合したときの配座変化を上記情報伝達アプタマーに組み込まれたレポーター分子の分光学的性質における変化に変換することを特徴とする請求項１４記載の情報伝達アプタマー。
【請求項２２】  上記分光学的性質が蛍光の強度、異方性、寿命、波長及び蛍光共鳴エネルギー移動で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１記載の情報伝達アプタマー。
【請求項２３】  情報伝達アプタマーをｉｎ  ｖｉｔｒｏ で選択する方法において、
(a)ヌクレオチドのランダム・インサートを有しており、前記ヌクレオチド・インサートがヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣあるいはＧの１つとはかなり非対称的モル比を有しているＤＮＡのプールを合成するステップと、
(b)上記ＤＮＡ増幅で用いられる１つのヌクレオチドが１つ以上のレポーター分子によってラベルされていることを特徴とする上記ＤＮＡプールを増幅するステップと、
(c)上記増幅されたＤＮＡから上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡを単離するステップと、
(d)カラムに対して高結合親和性を有するラベルされた一本鎖ＤＮＡ分子は、上記親和性カラムに保持され、そしてその結果ラベルされたＤＮＡ プールから取り出される、親和性カラムに上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡ プールを入れるステップと、
(e)上記親和性カラム上で、カラムに対して高結合親和性を有する上記ラベルされたＤＮＡプールから上記ラベルされた一本鎖ＤＮＡを保持するためにステップ(a)から(d)までを繰り返すステップと、そして
(f)上記保持されたラベルＤＮＡ分子をクローンして、そのクローンが情報伝達アプタマーを含んでいるステップと
で構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２４】  上記ＤＮＡ増幅で用いられる上記ヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】  上記合成ＤＮＡプールにおける上記ＤＮＡが５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有していることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】  上記５１個のヌクレオチドのランダム・インサートを有しているＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１に示される配列を有することを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】  上記非対称的モル比が３：３：２：０．３８  Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔホスホルアミダイトであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２８】  上記親和性カラムがＡＴＰアガロース親和性カラムであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２９】  上記レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいはさらに上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３０】  上記蛍光が、１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が形成されるような蛍光色素であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】  上記蛍光色素がフルオレセイン、カスケード・ブルー、テキサス・レッド及びローダミン・グリーンで構成される群から選択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】  請求項２３記載の方法によって選択される情報伝達アプタマー。
【請求項３３】  情報伝達アプタマーが１つ以上のレポーター分子を含む１つのＤＮＡ核酸結合種（アプタマー）で構成されることを特徴とする請求項３２記載の情報伝達アプタマー。
【請求項３４】  レポーター分子が１つ以上の蛍光あるいは上記蛍光の性質を調節する分子で構成されることを特徴とする請求項３３記載の情報伝達アプタマー。
【請求項３５】  上記蛍光が、１つの蛍光色素ヌクレオチド結合体が上記情報伝達アプタマー内に形成されるような蛍光色素であることを特徴とする請求項３４記載の情報伝達アプタマー。
【請求項３６】  上記リガンドがアデノシン５’−３リン酸であることを特徴とする請求項３２記載の情報伝達アプタマー。
【請求項３７】  上記情報伝達アプタマーが、１つのリガンドに結合するときの配座変化を上記情報伝達アプタマーに組み込まれたレポーター分子の分光学的性質における変化に変換することを特徴とする請求項３２記載の情報伝達アプタマー。
【請求項３８】  上記分光学的性質が蛍光の強度、異方性、寿命、波長及び蛍光共鳴エネルギー移動で構成される群から選択されることを特徴とする請求項３７記載の情報伝達アプタマー。