【手続補正書】
【提出日】平成15年10月1日(2003.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタフィロコッカス・アウレウスに対する殺菌又は静菌効果を有する、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに結合する抗菌剤。
【請求項２】
前記剤が、小有機分子、ペプチド類似物質、ペプチド及びポリペプチドから成る群から選択される請求項１記載の抗菌剤。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、バクテリオファージタンパク質から成る請求項２記載の抗菌剤。
【請求項４】
前記バクテリオファージタンパク質が、44AHJD−ORF25（配列番号４）、TwortORF168（配列番号６）、G1−ORF240（配列番号10）及びそれらのフラグメントから成る群から選択される請求項３記載の抗菌剤。
【請求項５】
前記結合が特異的である請求項１〜４のいずれか１項記載の抗菌剤。
【請求項６】
前記剤が、配列番号２を含んで成るスタフィロコッカス・アウレウスポリペプチドの活性を減じるか又は低める請求項１〜５のいずれか１項記載の抗菌剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の抗菌剤、及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る抗菌組成物。
【請求項８】
細菌の阻害方法であって、前記細菌と、請求項１〜６のいずれか１項記載の抗菌剤、及び/又は請求項７記載の抗菌組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項９】
前記接触がインビトロで行われる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記接触が、非ヒト動物においてインビボで行われる請求項８記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るSTAAU_R2ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法であって、
−前記STAAU_R2ポリペプチド、その生物学的活性フラグメント又は変異体と、候補体化合物とを、前記STAAU_R2ポリペプチド、その生物学的活性フラグメント又は変異体に対して特異的に結合するバクテリオファージポリペプチドの存在下で、接触せしめ；
−前記候補体化合物が前記結合を減じるかどうかを決定し；そして
−前記結合を減じる候補体化合物を選択する段階を含んで成る方法。
【請求項１２】
前記バクテリオファージタンパク質が、44AHJD−ORF25（配列番号４）、TwortORF168（配列番号６）、G1−ORF240（配列番号10）及びそれらのフラグメント又は変異体から成る群から選択される請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記バクテリオファージポリペプチド、フラグメント又は変異体が、前記STAAU_R2ポリペプチド、その生物学的活性フラグメント又は変異体に対して特異的に結合することができる請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記バクテリオファージポリペプチド、フラグメント又は変異体が、検出できるよう直接的に又は間接的にラベルされる請求項11〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記決定が、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、蛍光偏光変化、表層プラスモン共鳴、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ、バイオセンサー・アッセイ及びファージ・ディスプレーから成る群から選択された技法による測定を含んで成る請求項11〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記候補体化合物が、小分子、ペプチド類似物質、ペプチド及びポリペプチドから成る群から選択される請求項11〜15のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
S．アウレウスDNA−意図されたDNAポリメラーゼIIIβサブユニットタンパク質に対して活性的である化合物についてのスクリーニング方法であって、
−ｉ）配列番号４，６，８及び10から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；ii)S．アウレウスDNA−指図されたDNAポリメラーゼIIIβ−サブユニットタンパク質；及びiii)少なくとも１つの候補体化合物を接触せしめ；
−前記少なくとも１つの候補体の化合物が、前記DNAポリメラーゼIIIβサブユニットタンパク質と前記ポリペプチドとの間の結合相互作用を減じるかどうかを決定し；そして
−前記結合を減じる候補体化合物を選択することを含んで成る方法。
【請求項１８】
抗菌化合物の製造方法であって、
−請求項11〜17のいずれか１項記載の方法を実施することによって、STAAU_R2ポリペプチドと相互作用する化合物を同定し；そして
−前記STAAU_R2ポリペプチドを天然において生成する細菌により感染された生物に投与される場合、治療効果を提供すのに十分な量の前記化合物を合成し又は精製する段階を含んで成る方法。
【請求項１９】
STAAU_R2ポリペプチド、又は前記STAAU_R2ポリペプチドと特異的に相互作用するバクテリオファージORF由来のポリペプチドの１つに対して活性的な化合物の同定方法であって、
−候補体化合物の存在又は不在下で第１及び第２ポリペプチドを接触せしめ、ここで前記第１ポリペプチドは、ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るSTAAU_R2ポリペプチド、ii) ｉ）のフラグメント、又はｉ）の変異体から成り；そして前記第２ポリペプチドは、前記STAAU_R2ポリペプチド又は前記生成物学的活性のフラグメント又は変異体に対して特異的に結合するバクテリオファージポリペプチドから成り；そして
−前記第１及び/又は第２ポリペプチドの生物学的活性を測定することを含んで成り；ここで前記候補体化合物の不在下での生物学的活性に比較される場合、前記候補体化合物の存在下での前記生物学的活性の低下又は上昇が、前記候補体化合物が少なくとも１つの前記第１及び第２ポリペプチドに対して活性的であることを表示することを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記候補体化合物が検出できるよう直接的に又は間接的にラベルされ、そして前記第１及び/又は第２ポリペプチドへの前記候補体化合物の結合を測定する段階をさらに含んで成る請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記測定が、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、蛍光偏光変化、表層プラスモン共鳴、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ、バイオセンサー・アッセイ及びファージ・ディスプレーから成る群から選択された技法による測定を含んで成る請求項19又は20記載の方法。
【請求項２２】
前記候補体化合物が、小分子、ペプチド類似物質、ペプチド及びポリペプチドから成る群から選択される請求項19〜21のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
配列番号２を含んで成るSTAAU_R2ポリペプチドの活性、又は前記STAAU_R2ポリペプチドの生物学的活性フラグメント又は変異体の活性の拮抗物質。
【請求項２４】
配列番号４，６，８及び10から成る群から選択された、バクテリオファージタンパク質の少なくとも10個の長さのアミノ酸残基のフラグメントを含んで成る、単離され、精製され、又は富化されたポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号４，６，８及び10から成る群から選択されたアミノ酸と少なくとも50％の同一性を有する、単離され、精製された、又は富化されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記同一性が少なくとも75％である請求項25記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記同一性が少なくとも95％である請求項26記載のポリペプチド。
【請求項２８】
第１ポリペプチドドメイン、及びお互いと特異的に相互作用する第２ポリペプチドドメインを含んで成り、ここで前記第１ドメインが配列番号２を含んで成るSTAAU_R2ポリペプチドに由来し、そして前記第２ドメインが前記STAAU_R2ポリペプチドに結合するバクテリオファージポリペプチドに由来することを特徴とする組成物。
【請求項２９】
哺乳類における細菌感染を処理するか又は予防するための方法であって、治療的に有効な又は予防的に有効な量の請求項１〜６のいずれか１項記載の抗菌剤、及び/又は請求項７記載の抗菌組成物を、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
スタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）由来の必須ポリヌクレオチドとポリペプチド配列を分離、特徴づけるために、２つのこれまでの発明（合衆国特許6,376,652号、国際PCT出願WO00/32825号）の方法論を使用した。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
S．アウレウスSTAAU_R2配列の同定：
STAAU_R2ポリペプチドを同定するために使用される方法は、アメリカ特許6,376,652号及び国際PCT出願WO00/32825号に詳細に記載されている。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
このポリヌクレオチド配列は、付加的なアミノ酸をコードする付加的な翻訳配列を含むことがある。例えば、融合タンパク質の精製を容易にする標識配列がコードされることもある。本発明の一部の具体例においてこの標識配列は、pQE（商標）ベクター（Qiagen, Inc.）によって提供され、Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 821-824 (1989)に述べられているような6ヒスチジンペプチド、及びHAペプチド・タグ（Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)）であり、両方ともこれらに融合したポリペプチド配列を精製するのに有用である。本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子及び遺伝子の発現を調節するそれに天然に関連する配列をも含むが、これに限るわけではない。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
iii）表面プラスモン共鳴：
タンパク質：タンパク質の相互作用に対する阻害剤をスクリーニングする他の強力なアッセイは、表面プラスモン共鳴である。表面プラスモン共鳴は、水相（分析物）から第一のタンパク質又は他の生体分子が、センサー（リガンド）上に固相化した第二のタンパク質又は生体分子に結合することによって生じるセンサー表面付近の質量の変化によって、二つの（又はそれ以上の）分子間の結合を測定する定量的な方法である。この質量の変化は、第二のタンパク質又は生体分子（分析物）の注入又は除去後の時間あたりの共鳴単位として測定され、Biacore（商標） Biosensor (Biacore AB)又は類似する装置を使用して測定される。


【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
共有結合法（例えば、10mM 酢酸ナトリウム[pH 4.5]中アミン・カップリング）を用いて、センサー・チップ（例えば、研究用CM5（商標）チップ；Biacore AB）上にSTAAU_R2、又はSTAAU_R2のフラグメントを含んで成るポリペプチドを固相化することも可能である。盲検は、タンパク質固相化をしない状態で、センサーを活性化及び不活性化することによって準備する。他方では、リガンド表面は、ペプチド親和性標識、抗体又はビオチニル化により、センサーチップの表面上のリガンドの一共有捕獲により調製され得る。STAAU_R2又はSTAAU_R2フラグメントに対する44AHJD ORF25、 Twort  ORF168及びG1  ORF240の結合は、チップ表面に精製44AHJD ORF25、 Twort  ORF168及びG1  ORF240を注入することによって測定する。


【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
測定は４℃〜37℃のいずれかの所望する温度で行なう。アッセイの条件（例えばそれらが結合する条件）は以下の通りである：25 mM HEPES-KOH (pH 7.6)、150 mM 塩化ナトリウム, 15% グリセロール、1 mM ジチオスレイトール、0.001% Tween（商標） 20、流速度 10μl/min。候補体阻害剤とセンサー・チップのプレインキュベーションにより、44AHJD ORF25、 Twort  ORF168及びG1  ORF240とSTAAU_R2との間の相互作用の減少が予想される。センサーグラム上での低められた応答として検出されそして共鳴単位で測定される、44AHJD ORF25、 Twort  ORF168及びG1  ORF240の結合低下は、候補体化合物による競合的な結合を示唆する。


【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
STAAU_R2活性についてアッセイするためのもう１つの例は、感作された環状ssDNA基質を用いて、再構成されたインビトロアッセイにおいてのDNA中に組み込まれる放射性ラベルされたヌクレオチドのレベルを測定することである（Bruck and  O’Donnell 2000, J. Biol. Chem. 275: 28971-28983）．複製反応は典型的には、トリス−HCl（pH7.5）、MgCl2、BSA, DTT, ATP, dCTP, dGTP及びdATP, (α−32P)dTTP, EDTA, グリセロール、感作された環状M13ssDNA，S．アウレウスSSB，PolC, τ、δ、及びδ’、及び上昇する量のSTAAU_R2ポリペプチドを含んだ。反応は37℃で５分間インキュベートされ、そしてSDS及びEDTAの添加に基づいて急冷された。急冷された反応の半分が、DE81フィルター紙を用いて、全DNA合成について分析される。ほかの半分がアガロースゲル上での電気泳動により分析される。ゲルが乾燥され、そして放射性生成物が、DNA合成の割合及び加工性の評価のためにホスホルイメージャー（PhosphorImager（商標））スクリーンへの照射に続いて可視化された。


【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
複製反応は、トリス−HCl（pH7.5）、MgCl2, BSA, DTT, ATP, dNTP，EDTA，グリセロール、感作された環状M13ssDNA, S. アウレウスSSB, PolC, τ、δ及びδ’、及び上昇する量のSTAAU_R2ポリペプチドを含むことができる。反応は37℃で種々の時間インキュベートされ、次に急冷される。急冷された反応は、PicoGreen（商標） 色素（Molecular Probes, Eugene, OR）を添加し、室温で５分間インキュベートし、そしてPicoGreen（商標）（λEX, 485nm;λEM, 525nm）の蛍光の強度を読み取ることによって、全DNA合成について分析される。色素の感度及びPicoGreen（商標）アッセイの均質性質は、非放射性定量アッセイ型においての急速なスクリーニングを可能にすべきである。


【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
組成物、キットと投与管理：


【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
多くの整形外科医は、人工関節を持つヒトは菌血症を引き起こすおそれのある歯科治療を行う前に、抗菌物質による予防が考慮されるべきだと考えている。重度の感染は深刻な合併症であり、時には人工関節を失うことになったり、著しい疾病率及び死亡率を伴う。従ってこのような状況の際、予防的抗菌物質の代わりにこの活性物質の使用にまで適用範囲を広げることができる。


【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
例１．バクテリオファージゲノムからの阻害性ORFのクローニング
本発明者は、バクテリオファージ44AHJD及びTwortから阻害性ORFを同定するために、これまでの発明の方法論（国際PCT出願WO00/32825号）を使用した。スタフィロコッカス・アウレウス増殖株（PS44A）（Felixd’Herelle Reference Centre #HER1101, Ottawa, Canada）を、そのそれぞれのファージ44AHJD（Felix d’Herelle Reference Centre #HER101）を増殖するために宿主として使用した。Dr. H.-W. Ackermann (Quebec, Canada) (#HER1048) により維持されるFelix d’Herelle Reference Cantre から得られたスタフィロコッカス増殖株（PS Twort）を、Felix d’Herelle Reference Centre (#HER48) からまた得られたファージTwortを増殖するための宿主として使用した。


【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
例  2．バクテリオファージ44HJD ORF25の標的となるスタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）タンパク質の同定
A.GST/ORF25組換えタンパク質の産生：
バクテリオファージ44HJD ORF25を、GST部分を含む発現ベクターpGEX（商標） 4T-1（Pharmacia）にサブクローン化した。ORF25を、BamHI及びSalIによるT/44HJD ORF25の消化により得た。ORF25を含むDNAフラグメントをQiaQuick（商標）スピン・カラム（Qiagen）によってゲル精製し、pGEX（商標） 4T GST/ORF25を作成するために（事前にBamHIとSalIによって消化された）pGEX（商標） 4T-1に連結した。


【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
組換え発現ベクターをミニプレップ法プラスミドの制限酵素解析によって同定した。大規模DNA調製を行い、そして得られる挿入体を配列決定した。発現プラスミドを含むE．コリBL21（DE3）Gold細胞における試験発現を行い、最適なタンパク質発現条件を同定した。発現構造体を含むE．コリ細胞を、Luria−Bertaniブイヨンにおいて25℃で0.4〜0.6のOD600まで増殖し、そして最適な時間及び最適な温度で、1mMのIPIGにより誘発した（典型的には、25℃で３時間、増殖されたBL21（DE3）Gold（pGEX（商標） 4T/ORF25）の2Lの培養物）。


【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
B.融合タンパク質の精製：
GST/ORF25融合タンパク質を含む細胞を、1 リットルの培養細胞に対して20 mlのGST溶解緩衝液（20 mM Hepes pH 7.2、500 mM 塩化ナトリウム、10 % グリセロール、1 mM DTT、1mM EDTA, 1mM benzamidine及び1 mM PMSF）の割合で懸濁し、フレンチプレスセルを用いてホモジナイズ後、4℃にて20秒3回超音波破砕機を用いてホモジナイズした。最終濃度0.1％になるようにTriton（商標） X-100を溶解液に加え、30分4℃で混合した。溶解液をSorval（商標） SS34ローターを用いて4℃、10,000回転、30分間遠心した。


【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
上清液を、あらかじめ溶解緩衝液で平衡化した4 mlグルタチオン・セファロース・カラムに適用し、重力によって流出させた。カラムをカラム容量の10倍の溶解緩衝液で洗浄後、GST溶出緩衝液（20 mM Hepes pH 8.0、500 mM 塩化ナトリウム、10 % グリセロール、1 mM DTT、0.1mM EDTA及び25 mM 還元グルタチオン）を用いて1.5 mlの分画に溶出した。この分画を12.5％SDS-PAGE（Laemmli）によって解析し、そしてタンパク質を、溶出せれたGST/ORF25タンパク質の量を評価するために、クマシー・ブリリアント・ブルー（商標） R250染色により可視化した。


【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８３】
C. 親和性カラムの調製：
GST及びGST/ORF25融合タンパク質を、1 M 塩化ナトリウムを含むアフィニティ・クロマトグラフィ緩衝液（ACB; 20 mM Hepes pH 7.5、10 % グリセロール、1 mM DTT、及び1 mM EDTA）にて一晩透析した。タンパク質濃度をBio-Rad（商標）タンパク質アッセイによって決定し、Affigel 10 resin （Bio-Rad）にタンパク質/レジン濃度0、0.1、0.5、1.0及び2.0 mg/mlで架橋結合させた。続けて、架橋結合させたレジンをカラムに充填する前にエタノールアミン、及びウシ血清アルブミン（BSA）と共にインキュベートし、100 mM 塩化ナトリウムを含むACBで平衡化した。


【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８５】
懸濁細胞をフレンチプレスセルに3回通過させ、続いて20秒間3回超音波破砕し、0.1% Triton（商標） X-100に調製して30分間撹拌後、Ti70（商標）角度固定Beckman（商標）ローターを用いて50,000回転で3時間遠心した。細胞の溶解効率は低く、結果として得られた溶解液（7 ml）は2.4 mg/mlのタンパク質を含んでいた。フレンチプレスセル溶解後の細胞ペレットは、同じ緩衝液を用いモーターやペッスルと共に液体窒素中で極低温粉砕した。溶解液を0.1％ Triton（商標） X-100になるように調整して30分間撹拌後、Ti70（商標）角度固定Beckman（商標）ローターを用いて50,000回転で3時間遠心し、2.0 mg/mlのタンパク質を含む溶解液（10 ml）を得た。


【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
細胞溶解液をプールし、8 mlに濃縮し、3000 Mr透析膜を用いて1 mM PMSF、1 mM benzamidine 及び 75 mM 塩化ナトリウムを含むアフィニティ・クロマトグラフィ緩衝液中で一晩透析した。透析したタンパク質抽出液を透析チューブから取り出し、Sorval（商標） SS34 ローターを用いて10,000回転で1時間遠心し、タンパク質濃度（Bio-Rad（商標） Protein Assayを用いた）及び塩濃度（導電率計を用いた）を調べた。


【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
E. 親和性クロマトグラフィ：
親和性クロマトグラフィー処理を、0、0.1、0.5、1.0及び2.0 mg/mlのタンパク質/樹脂濃度で、Affigel（商標） 10にカップリングされたリガンドとしてGST及びGST ORF25を用いて行った。スタフィロコッカス・アウレウス抽出液を、４℃で15分間、マイクロ遠心分離機により遠心分離し、そして0、0.1、0.5、1.0及び2.0 mg/mlのリガンドを含む20μlカラムに適用した。100mMのNaCl(200μl)を含むABCを、2.0mg/mlを含む対照カラムに適用した。カラムを100 mM 塩化ナトリウムを含むACB10カラム体積によりで洗浄し、続けて1% Triton（商標） X-100及び100mM 塩化ナトリウム (800μl)を含むACB、 1 M 塩化ナトリウム(800μl)を含むACB、及び1% SDS (160μl)により溶出した。各々の溶出液40μlを、12.5% SDS-PAGE (Laemmli)で分離し、銀染色によって溶出タンパク質を可視化した。


【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
F．44AHJD ORF25相互作用タンパク質としてのS．アウレウスDnaNの同定：
２種のS．アウレウス抽出物を、個々のリガンドを用いて親和性クロマトグラフィーのために使用した。別々に調製された、親和性クロマトグラフィーのために使用される２種の抽出物は、4.0及び9.0mg/mlのタンパク質を含んだ。48kDaの１つの候補体相互作用タンパク質（PT48）を、初期クロマトグラフィー実験において１％SDS溶出液において観察した（図４）。その候補体タンパク質PT48を、SDS−PAGEゲルから切除し、そしてMALDI−ToF（商標）質量分光計によるトリプシンペプチド質量決定のために調製した（Qin，J．，Fenyo，d．，Zhao，Y．，Hall，W. W., Chao, D. M., Wilson, C. J., Young, R.A. and Chait, B. T. (1997) Anal. Cham. 69, 3995-4001）。


【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８９】
2種の親和性クロマトグラフィー実験において観察されるPT48タンパク質は、トリプシンペプチドの質量により決定される場合、同一であった。得られる質量スペクトルのコンピューター分析（http://prowl.rockfeller.edu/cgi-bin/ProFound）は、University of Oklahoma のS．アウレウスゲノムデータベース（http://www.genome.ou.edu/staph.html）におけるS．アウレウスヌクレオチド配列におけるその対応するORFを同定する。GST ORF25に対して特異的に結合するそのタンパク質の本体は、DNA−指図されたDNAポリメラーゼIIIβサブユニット（Genbank（商標） 受託番号1084187号）（図６）である。


【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】
バクテリオファージ44ADJH ORF25の相互作用パートナーとしてのS．アウレウスSTAAU_R2の同定は、精製された組換えポリペプチドを用いて、表面プラスモン共鳴（Biacore 2000（商標） Biosensor）により確認された。グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GS）−標識されたSTAAU_R2を、CM5センサーチップの表面に共有結合されている抗−GST抗体によりリガンドとして捕獲し；抗−GST抗体を有し、そして捕獲されたリガンドを有さないブランク表面を負の対照として使用した。２種の表面上への精製された44ADJH ORF25タンパク質の注入は、固定されたSTAAU_R2による44ADJH ORFの特異的捕獲を示した。


【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
例３．バクテリオファージTwort ORF168により標的化されたS．アウレウスタンパク質の同定
A．GST/Twort ORT168組換えタンパク質の生成：
バクテリオファージTwort ORF168を、pGEX（商標） 4T-1中にサブクローン化した。Twort ORF168を含むプラスミド（pTM）を、Qiagenカラム上で精製し、そしてHindIIIにより消化し、E．コリDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントにより処理し、そしてBamHIにより消化した。前記ORFを含むDNA制限生成物を、QiAquick（商標）回転カラム（Quagen）によりゲル精製し、そしてpGEX（商標） 4T-1発現ベクター（SalIにより消化、E．コリDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによる処理、及びBamHIによる消化、続いて、QiAquick（商標）回転カラムによるゲノム精製により調製された）中に連結した。


【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
組換え発現ベクターを、プラスミドminiprepsの制限酵素分析により同定し、そして大規模DNA調製を、Qiagen（商標） DNA精製カラムにより行った。発現プラスミドを含むE．コリ細胞における試験発現を行い、最適なタンパク質発現条件（BL21（DE3）Gold細胞において発現される）を同定した。発現構造体を含むE．コリ細胞を、Luria−Bertaniブイヨンにおいて25℃で0.4〜0.6のOD600まで増殖し、そして最適な時間及び最適な温度で、1mMのIPIGにより誘発した（15℃で16時間、２LのGST ORF168）。


【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９３】
B.融合タンパク質の精製：
GST ORF168融合タンパク質を含む細胞を、1 リットルの培養細胞に対して10 mlの溶解緩衝液の割合で懸濁し、そして4℃にて20秒3回超音波破砕機を用いて溶解した。溶解液をBeckman（商標）  JA25.50ローターを用いて4℃、10,000回転、30分間遠心した。上清液を、あらかじめ溶解緩衝液で平衡化した4 mlグルタチオン・セファロース・カラムに適用し、重力によって流出させた。カラムをカラム容量の10倍の溶解緩衝液で洗浄し、そしてGST溶出緩衝液を用いて４ mlの分画に溶出した。この分画を15％SDS-PAGE（Laemmli）によって解析し、そしてタンパク質を、クマシー・ブリリアント・ブルー R250染色により可視化した。


【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９４】
C. 親和性カラムの調製：
GST及びGST ORF168を、1 M 塩化ナトリウムを含むACBにてｐH７．９で一晩透析した。タンパク質濃度をBio-Rad（商標）タンパク質アッセイによって決定し、Affigel（商標） 10 resin （Bio-Rad）にタンパク質/レジン濃度0、0.1、0.5、1.0及び2.0 mg/mlで架橋結合させた。架橋結合されたタンパク質を含むACBにより洗浄し、そして100 mM 塩化ナトリウムを含むACBで平衡化した。


【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９６】
ビーズを、Biorad Econo（商標）カラム（2.5×40cm）により溶解物から分離し、そしてビーズを１カラム体積の溶解緩衝液により洗浄した。流動物及び洗浄物をプールし、そしてBeckman（商標） JA25.50ローターにより20,000rpmで１時間、遠心分離した。上清液を除去し、そして100mMのNaCl，1mMのベンズアミジン、10mMのMgSO4、10mMのCaCl2及び1mMのPMSFを含むABC（20mMのHepes, pH7.5, 10％のグリセロール、1mMのDTT、及び1mMのEDTA）に対して10.000Mr透析膜により一晩、透析した。透析されたタンパク質抽出物を、透析管から除去し、そして−70℃で、1mlのアリコートにより凍結した。


【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９７】
E．親和性クロマトグラフィー：
親和性クロマトグラフィーを、0, 0.1, 0.5, 1.0 及び2.0mg/mlのタンパク質/樹脂濃度で、Affigel（商標）10にカップリングされるリガンドとして、GST及びGST  ORF168を用いて行った。S．アウレウス抽出物を、マイクロ遠心分離機において４℃で15分間、遠心分離し、そして100mMのNaClを含むACBにより5mg/mlに希釈した。200μlの抽出物を、0, 0.1, 0.5, 1.0及び2.0mg/mlのリガンドを含む40μlのカラムに適用し、そして100mMのNaClを含むACB（200μl）を、2.0mg/mlのリガンドを含む追加のカラムに適用した。カラムを、100mMのNaClを含むACB（２×100μl）、0.1％のTriton（商標） X-100を含むACB及び100mMのNaCl（200μl）により２度洗浄し、そして１MのNaCl（100μl）及び１％SDS (100μl)を含むACBにより連続的に希釈した。それぞれ65μlの溶出液を、16cmの14％SDS−PAGE（Laenmmil）により分解し、そしてタンパク質を銀染色により可視化した。


【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９９】
高品質の質量スペクトルが得られた（図８）。親和性クロマトグラフィー実験において観察されるPT50タンパク質は、トリプシンペプチドの質量により決定される場合、同一であった。GST ORF168に対して得意的に結合するそのタンパク質の本体は、DNA−指図されたDNAポリメラーゼIIIβサブユニット（Genbank（商標）受託番号1084187号）（図９）である。


【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０１】
A．イースト・ツー・ハイブリッド分析のためのTwort ORF168及びSTAAU_R2組換えポリペプチドの生成：
バクテリオファージTwort ORF168を、酵母Gal4 DNA結合ドメイン（Clontech LaboratoriesからのpGBKT7（商標）ベクターにコードされる）のカルボキシル末端、又は酵母Gal4活性化ドメイン（Clontech LaboratoriesからのpGADT7（商標）ベクターにコードされる）のいずれかに融合した。図10Bに示されるように、センス鎖プライマー（配列番号11；5−ccggaattcATGTTATTTTTTAAAGAAAAG−3’）の先にEcoRI制限部位が存在し；アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号12；5’−cgcggatccTCATCGAACTATATCCTTAAT−3’)は停止コドンを標的化し、そしてその先に、BamHI制限部位が存在する。


【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０２】
PCR生成物を、Qiagen（商標） PCR精製キットを用いて精製し、そしてEcoRI及びBamHIにより消化した。消化されたPCR生成物を、EcoRI−及びBamHI−消化された、pGBKT7ベクターに連結し、pGBKSTAAU_R2を生成した。類似する手段が、pGADT7ベクター中にSTAAU_R2をクローニングし、pGADSTAAU_R2を生成するために使用された。


【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０４】
図10Aに示されるように、センス鎖プライマー（配列番号15；5’−GGGAATTCCATATGATGATGGAATTCACTATTAAA−3’）は、開始コドンを標的化し、そしてこの先に、NdeI制限部位が存在し；アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号16；5’−CGCGGATCCTTAGTAAGTTCTGATTGG−3’）は、停止コドンを標的化し、そしてこの先に、BamHI制限部位が存在する。PCR生成物を、Qiagen（商標） PCR生成キットを用いて精製し、そしてNdeI及びBamHIにより消化した。消化されたPCR生成物を、NdeI−及びBamHI−消化されたpGADT7（商標）ベクター（Clontech Laboratories）に連結し、pGADSTAAU_R2を生成した。類似する手段を用いて、pGBKT7（商標）ベクター（Clontech Laboratories）中にSTAAU_R2をクローニングし、pGBKSTAAU_R2を生成した。


【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０９】
G1 ORF240をpGEX4T-1中にクローン化し、そしてそのポリペプチドを上記のようにして精製した。親和性クロマトグラフィー処理を、0, 0.1, 0.5, 1.0及び2.0mg/mlのタンパク質/樹脂濃度でAffigel（商標） 10にカップリングされるリガンドとしてGST及びGST ORF240を用いて行った。S．アウレウス抽出物をカラムに適用し、そして100mMのNaClを含むACBを、20mg/mlのリガンドを含む追加のカラムに適用した。カラムを洗浄し、そして１MのNaCl及び１％SDSを含むACBにより連続的に溶出した。個々の溶出物画分を、14％SDS−PAGEにより分解し、そしてタンパク質を銀染色により可視化した。
１つの候補体相互作用タンパク質が、ORF240と特異的に相互作用することが観察され、そしてSTAAU_R2に対応することが示された（結果は示されていない）。


【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、S．アウレウスSTAAU_R2のヌクレオチド（配列番号１）及びアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図２】
図２は、S．アウレウスバクテリオファージ44AHJD ORF25、Twort ORF168, Twort ORF168に由来する36個のアミノ酸フラグメント、及びG1 ORF240のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図３】
図３は、バクテリオファージ44AHJD ORF25、又はTwort ORF168の細菌阻害能力、及びS．アウレウスにおけるそれらの発現を誘発するために使用される発現ベクターを示す。A)S.アウレウス細胞における44AHJD ORF25、又はTwort ORF168の発現を誘発するために使用される亜砒酸塩−誘発性発現ベクター（例えば、pT/ORF及びpTM/ORFのための）の図；B)液体培地において増殖され、続いてプラスミドに対する選択的圧力を維持するために必要な抗生物質（30μg/mlのカナマイシン）を含むか又は含まない半固体培地上にプレートすることにより増殖されたS．アウレウスにおいて発現される場合、44AHJD ORF25又はTwort ORF168の阻害能力についてのアッセイの結果。
【図４】
図４は、French圧力細胞溶解及び音波処理により調製されたS．アウレウス抽出物と共にリガンドとしてGST及びGST/44AHJD ORF25を用いての親和性クロマトグラフィーからの結果を示す。1ml樹脂当たり0, 0.1, 0.5, 1.0及び2.0mgのGST及びGST/ORF25リガンドを含む親和性カラムの溶出液を、SDS−12.5％PAGEにより分解した。タンパク質を銀染色により可視化した。マイクロカラムを、0.1％のTriton（商標） X-100を含む100mMのACB、1MのNaClを含むACB、及び１％SDS（SDS−PAGEは単に１％SDSを示す）により連続的に溶出した。個々の分子量マーカーは約100ngである。ACBにラベルされたレーンは、75mMのNaClを含むACB緩衝液によってのみ充填された2.0mg/mlリガンドカラムからの溶出液を示す。PT48を示す矢印は、44AHJD ORF25と特異的に相互作用するタンパク質を示す。PT48に対応するバンドが、タンパク質同定のために切除された。
【図５】
図５は、44AHJD ORF25と相互作用し、そして１％SDSにより溶出されたPT48タンパク質のトリプシンペプチド質量スペクトルの結果を示す。48kDaの領域から切除された対照バンド（図４においてPT48Cと命名された）は、PT48を含まなかった。
【図６】
図６は、Genbank（商標）データベースからのS．アウレウスDNA−指図されたDNAポリメラーゼIIIβサブユニットタンパク質（受託番号：G1：15922992）としてのPT48（本明細書においては、STAAU_R2）の同定を示す。
【図７】
図７は、5.0mg/mlのS．アウレウス抽出物と共に、リガンドとしてのGST/Twort ORF168 (A) 又はGST（B）を用いての親和性クロマトグラフィーを示す。1mlの樹脂あたり0, 0.1, 0.5, 1.0及び2.0mgのリガンドを含む親和性カラムからの溶出液を、14％SDS−PAGEにより分解し、そしてゲルを硝酸銀により染色した。マイクロカラムを、0.1％Triton（商標） X-100を含む100mMのACB（SDS−PAGEは示されていない）、１MのNaClを含むACB及び１％SDSにより連続的に溶出した。個々の分子量マーカーは約200ngである。ACBにラベルされたレーンは、100mMのNaClを含むACB緩衝液によってのみ充填された2.0mg/mlリガンドカラムからの溶出液を示す。PT50を示す矢印は、Twort ORF168と特異的に相互作用するタンパク質を示す。PT50に対応するバンドが、タンパク質同定のために切除された。
【図８】
図８は、Twort ORF168と相互作用するPT50タンパク質のトリプシンペプチド質量スペクトル分析を示す。PT50を含むゲルスライスは１種のタンパク質を含んだ。
【図９】
図９は、Genbank（商標）データベースからのS．アウレウスDNA−指図されたDNAポリメラーゼIIIβサブユニットタンパク質（受託番号：G1：15922992）としてのPT50（本明細書においては、STAAU_R2）の同定を示す。
【図１０】
図10は、A)酵素発現ベクターpGADT7（商標）におけるS．アウレウスSTAAU_R2のクローニング方法（pGADSTAAU_R2）；B)酵母発現ベクターpGBKT7（商標）におけるファージTwort ORF168のクローニング方法（pGBK Twort ORF168）;及びC) GADSTAAU_R2 (上部パネル)、Twort ORF168 (中間パネル)又はGADSTAAU_R2及びTwort ORF168 (低部パネル)の両者のいずれかを発現する３種の様式化された細胞におけるイースト・ツー・ハイブリッド・システムの代表図を示す。
【図１１】
図11は、配列番号２のアミノ酸を含んで成るS．アウレウスSTAAU_R2及びTwort ORF168の相互作用を試験するために企画されたイースト・ツー・ハイブリッド分析の結果を示す。A）及びB）酵母を、ペトリ皿の個々の対の写真上に示されるように１対のベクターにより同時形質転換した。同時形質転換体を、トリプトファン及びロイシンを欠くアミノ酸（TLマイナス）により補充された酵母合成培地（SD）上に、及びトリプトファン、ヒスチジン、アデニン及びロイシンを欠いているアミノ酸（THALマイナス）により補充されたSD上に同時にプレートした。Twort ORF168ポリペプチドを有する同時形質転換体は、STAAU_R2の存在下で、選択的THALマイナス培地上で増殖した（ペトリ皿の上部対）。非相互作用タンパク質を有する対照ベクター（pGBKLaminC又はpGADT7-T（商標））によるそれらのポリペプチドの同時形質転換は、THALマイナス培地上での増殖をもたらさない。C)示される同時形質転換からのタンパク質抽出物による発光β−ガラクトシダーゼ酵素アッセイの結果。
【図１２】
図12は、Twort ORF168（配列番号６）、及びTwort ORF168（配列番号８）とG1 ORF240（配列番号10）とのSTAAU_R2相互作用ドメインの最適な全体的及び局部アラインメントを示す。