(57)【要約】  本発明は造血前駆細胞を内包するネット様構造物及び該ネット様構造物の調製方法、並びに該ネット様構造物から成熟巨核細胞、血小板などの血球細胞を効率的に調製する方法の提供を目的とする。  本発明は、ＥＳ細胞をフィーダー細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物を提供する。また、該ネット様構造物に内包される造血前駆細胞を、血球細胞の分化誘導に適した条件でさらに培養し、各種血球細胞を産生する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＳ細胞をフィーダー細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物。
【請求項２】
前記造血前駆細胞の分化誘導に適した条件が、ＶＥＧＦ存在下、１４日間〜１６日間培養することである請求項１に記載のネット様構造物。
【請求項３】
前記ＥＳ細胞がヒト由来であることを特徴とする請求項１又は２に記載のネット様構造物。
【請求項４】
前記フィーダー細胞が１０Ｔ１／２細胞、又はＯＰ９細胞であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のネット様構造物。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法。
【請求項６】
前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ存在下、７日間〜９日間培養することである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＨｅｐａｒｉｎ存在下、７〜９日間培養することである請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項６乃至８のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び血小板。
【請求項１０】
請求項６乃至８のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＳ細胞から調製された造血前駆細胞を内包するネット様構造物（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓａｃ；ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｓａｃ；ＥＳ−ｓａｃ）に関する。さらに、本発明は該ネット様構造物を用いた血球細胞の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病に代表される血液関連疾患の治療に対し、治療に必要な量の血球細胞を安定に増幅し、供給することは極めて重要なことであることから、これまでに多くの研究者によって、造血幹細胞又は造血前駆細胞の効率的な増幅が試みられてきた。血球細胞の中でも、巨核球は血小板前駆細胞（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）さらには血小板を産生せしめる細胞であり、治療的な応用において重要な位置を占めている。血球細胞のなかでも血小板は血液凝固（止血）において必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいて、血小板の需要は極めて高い。これまでに、血小板は、ドナーからの献血により採取する方法により供給されてきた。しかし、ドナーによる方法は、慢性的なドナー不足、採取した血小板を凍結することができないことなどにより、安定的な血小板の供給を達成することが困難である。一方、ＴＰＯを投与する方法、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法などが試みられたが、ＴＰＯの投与は、投与後ＴＰＯに対する無力化抗体が産生されることで実用化には至っていない。さらに、臍帯血又は骨髄細胞からの巨核球分化による方法も、巨核球のソースとなる造血幹細胞を極めて少数しか得ることができないことから、やはり安定した血小板の提供に適した方法ではない。【０００３】
近年、生体からは僅かしか得られない造血幹細胞又は造血前駆細胞を生体外において増幅させる試みが盛んに行われている。例えば、マウスＥＳ細胞から、自己複製可能で、リンパ球へも分化可能な造血幹細胞株を樹立する方法（特許文献１）、霊長類動物のＥＳ細胞を生体外で分化誘導した後、得られた細胞をヒツジの子宮内の胎仔に移植し出生したヒツジ胎仔から霊長類のＥＳ細胞を取得する方法（特許文献２）、或いは、造血幹細胞の未分化性を維持したＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を生体外で簡便かつ安定的に増幅させる方法（特許文献３）などが報告されている。【０００４】
血小板の安定的な供給には、造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に巨核球及び血小板へ分化させる方法が必要である。そのため、種々の動物由来のＥＳ細胞から巨核球、さらには血小板を誘導させる試みも盛んに行われている。Ｅｔｏらは、マウスＥＳ細胞をＯＰ９ストローマ細胞と共培養することで巨核球へ分化誘導することを明らかにしており（非特許文献１）、Ｆｕｊｉｍｏｔｏらは、Ｅｔｏらと同様の方法を用いて血小板の誘導を確認したとの報告を行っている（非特許文献２）。また、サルのＥＳ細胞から巨核球の分化誘導に成功したとの報告（非特許文献３）、ヒトのＥＳ細胞から巨核球の分化誘導に成功したとの報告（非特許文献４）もあるが、いずれも、血小板の放出を確認していない。また、血小板や巨核球以外の血球細胞の治療上必要な量を安定的に取得するためには、造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に取得する必要があるが、その方法も、未だ、確立されているとは言い難い。【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１４１３５６号公報
【特許文献２】特開２００４−３８０６０１号公報
【特許文献３】特開２００６−  ６１１０６号公報
【非特許文献１】Ｅｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２；９９：１２８１９−１２８２４．
【非特許文献２】Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０２：４０４４−４０５１．
【非特許文献３】Ｈｉｒｏｙａｍａら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００６；３４：７６０−７６９．
【非特許文献４】Ｇａｕｒら，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５；４：４３６−４４２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み造血前駆細胞の効率的な取得方法並びに巨核球及び血小板の取得方法について鋭意研究を行った結果、造血前駆細胞が濃縮されて存在するネット様構造物の調製に成功し、さらには、ヒトＥＳ細胞からの血小板の調製に初めて成功し、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は造血前駆細胞を内包するネット様構造物及び該ネット様構造物の調製方法に関する。
さらに、本発明は該ネット様構造物から成熟巨核細胞、血小板などの血球細胞を効率的に調製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来技術では、造血前駆細胞を比較的高濃度で得ることは困難であり、その結果、血球細胞の得られる量も少なかった。特に、血小板の治療上利用可能な量をＥＳ細胞から誘導することは難しく、ヒトにおいては、誘導すら行うことができなかった。発明者らはこれらの問題を解決するために、ＥＳ細胞を分化誘導する過程で得られるネット様構造物に着目し、該ネット様構造物から血球細胞の誘導を行った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「ＥＳ細胞をフィーダー細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記造血前駆細胞の分化誘導に適した条件が、ＶＥＧＦ存在下、１４日間〜１６日間培養することである上記（１）に記載のネット様構造物」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記ＥＳ細胞がヒト由来であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のネット様構造物」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記フィーダー細胞が１０Ｔ１／２細胞、又はＯＰ９細胞であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のネット様構造物」である。
（５）本発明の第５の態様は、「上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする上記（５）に記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ存在下、７日間〜９日間培養することである上記（６）に記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＨｅｐａｒｉｎ存在下、７〜９日間培養することである上記（６）に記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「上記（６）乃至（８）のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び血小板」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「上記（６）乃至（８）のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るネット様構造物中には、造血前駆細胞が比較的高濃度に濃縮されて存在しているため、各種血球細胞（例えば、好中球、マクロファージ、赤血球、巨核球を含む）への分化誘導を効率的に行うことができる。【０００９】
また、発明に係る血球細胞を産生する方法を用いると、生体外において所望の血球を効率的に取得することができる。特に、ヒトの血小板については、これまでに実現することができなかった生体外における血小板の産生を、比較的大量かつ効率的に行うことができる。【００１０】
さらに、本発明に係る血小板を産生する方法を用いると、血小板を有効成分とする血液製剤の安定的な供給を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ネット様構造物の取得方法を模式的に示した図である。
【図２】ネット様構造物の取得方法、及びネット様構造物から巨核球／血小板を調製する方法の手順を模式的に示した図である。
【図３】未分化ＥＳ細胞からネット様構造物を産生する過程を示した図、及び、ネット様構造物の位相差顕微鏡による観察像を示す。
【図４】ネット様構造物の位相差顕微鏡による観察像である。Ｄ４及びＤ７は培養４日目、７日目であることを示す。また、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓａｃ(ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｓａｃ；ＥＳ−ｓａｃ)とは、ネット様構造物のことである。
【図５】ＶＥＧＦによるネット様構造物の誘導効果を示す。Ｎｏ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ；ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−ＩＩ，ＢＭＰ−４などのサイトカインを添加しないコントロールのことである。
【図６】抗ヒトＦｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ）抗体でネット様構造物（培養１４日目）を蛍光免疫染色した結果である。
【図７】ネット様構造（培養１４日目）を、抗ヒトＦｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ）抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＵＥＡ−Ｉレクチン（Ｌｅｃｔｉｎ）抗体で蛍光染色した結果を示す。ＨＥ：ヘマトキシリン−エオジン染色。ネット様構造は、内皮細胞のマーカーを発現しており、その内部はレクチン陽性細胞の隔壁による多数の小胞より構成されている。また、小胞内には血球様の細胞が存在する。
【図８】ネット様構造物内部の血液前駆細胞の表面抗原を示す（培養１４日目）。抗ヒトＦｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ）抗体、抗ヒトＣＤ３１抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体、抗ヒトＣＤ４１抗体、抗ヒトｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｄｈｅｒｉｎ  （ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体、抗ヒトＣＸＣＲ４（ｓｔｒｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１  受容体）抗体を用いてネット様構造物内部の血液前駆細胞表面抗原を調べた結果である。
【図９】ネット様構造物内部の血液前駆細胞を使用し、血液細胞分化用コロニー作成培養後７日目の多種コロニー像を示す。コロニー像は、コロニーを採取後に細胞成分をギムザ（ｗｒｉｇｈｔ−ｇｉｅｍｓａ）染色した結果である。ミックスコロニーを含む多種の血液細胞への分化が観察された。
【図１０】ネット様構造物内部の血液前駆細胞１×１０４個あたりから産生された各種血液細胞コロニー数を定量化した結果を示す。
【図１１】ＫｈＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３細胞）から誘導された巨核球のＦＡＣＳによる解析結果を示す。
【図１２】ＫｈＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３細胞）から誘導された培養２４日目の巨核球のフローサイトメーターによる解析結果を示す。
【図１３】ＫｈＥＳ−３細胞から誘導された培養２４日目の巨核球をサイトスピン後、ギムザ（ｗｒｉｇｈｔ−ｇｉｅｍｓａ）染色を行った観察像である。倍率×４０。
【図１４】ＫｈＥＳ−３細胞から誘導された巨核球及び血小板前駆体の顕微鏡による観察像を示す。ｉ，ｉｉ；ＫｈＥＳ−３細胞から誘導された巨核球の血小板前駆体形態の位相差顕微鏡観察像、ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ；抗ヒトＣＤ４１ａ（ＧＰＩＩｂ，ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂ）抗体を用いて染色したプロプレイトレットの蛍光顕微鏡による観察像。
【図１５】ＫｈＥＳ−３細胞から誘導された血小板を、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を示す。Ａ；コントロールとしてヒト末梢血から回収血小板の解析結果、Ｂ；ＫｈＥＳ細胞由来の血小板の解析結果。
【図１６】ＫｈＥＳ−３細胞から誘導された血小板を、ＦＡＣＳフローサイトメーターを用いて解析した結果を示す。Ａ−ａ；コントロールとしてヒト末梢血から回収した血小板の解析結果、ＢＡ−ｂ；ＫｈＥＳ細胞由来の血小板の解析結果。ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ），ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）はともに成熟巨核球、及び血小板の特異的発現分子である。Ｂ；電子顕微鏡によるヒト末梢血血小板、およびＫｈＥＳ細胞由来の血小板写真。
【図１７】ＫｈＥＳ−３細胞由来の血小板のフィブリノーゲン結合アッセイの結果を示す。Ａは、培養２４日目の上清を回収し、細胞成分を除き、濃縮した血小板を、血小板活性化剤（トロンビン）により刺激し、ＦＩＴＣ標識したフィブリノーゲンの結合度をフローサイトメーターで解析した結果である。Ｂは、トロンビンの量依存的にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識フィブリノーゲンがＣＤ４１陽性パーティクルに結合した結果を示す。ｎｏ  ａｇｏｎｉｓｔ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識フィブリノーゲン無しの結果。
【図１８】ＫｈＥＳ−３細胞由来の血小板のフィブリノーゲン結合アッセイの結果を示す。Ａ；培養２４日目の上清を回収し、細胞成分を除き、濃縮した血小板を、血小板活性化剤（ＡＤＰ）により刺激し、ＦＩＴＣ標識したＰＡＣ−１抗体フィブリノーゲンの結合度をフローサイトメーターで解析した結果である。ＰＡＣ−１（ＢＤ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）は、活性化した血小板膜上のヒトＣＤ４１ａ／ＣＤ６２（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ，ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂβ３）にのみ結合する抗体である。Ｂ；ＡＤＰの量依存的にＦＩＴＣ標識したＰＡＣ−１抗体が、ＣＤ４１陽性パーティクルに結合した結果を示す。ｎｏ  ａｇｏｎｉｓｔ；ＡＤＰなしの結果。
【図１９】ＫｈＥＳ−３細胞由来の血小板が、末梢血由来の血小板と同様に、ＰＭＡ刺激によって細胞の骨格変化を示した様子を蛍光顕微鏡により観察した結果を示す。Ｂ及びＥは、抗Ｆ−アクチン抗体による染色像を、Ｃ及びＦは、抗ＣＤ４１ａ抗体による染色像を示す。Ａ及びＤは、各々、ＢとＣ、ＥとＦを重ね合わせた観察像である。
【図２０】ＫｈＥＳ−３細胞由来の血小板が、末梢血由来の血小板と同様に、ＡＤＰ及びトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）刺激によって細胞の骨格変化を示した様子を蛍光顕微鏡により観察した結果を示す。比較のため、ヒト末梢血小板での像を上に呈示した。抗Ｆ−アクチン抗体及び抗ＣＤ４１ａ抗体による染色像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の実施形態の１つは、ＥＳ細胞をフィーダー細胞上に播き、造血系細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物である。該ネット様構造物には、造血前駆細胞が濃縮されて存在しているため、各種血球細胞を生体外において効率的に分化誘導することができる。ここで「ＥＳ細胞」とは、胚性幹細胞のことであり、多分化能と自己複製能を備えた未分化細胞のことである。「ＥＳ細胞」のソースとしては如何なる動物であってもよいが、ヒト由来の細胞が最も好ましい。また、ヒト由来のＥＳ細胞としては、例えば、ＫｈＥＳ細胞株などが好適に使用可能である。また、「フィーダー細胞」としては、ＥＳ細胞の分化誘導に寄与するものであれば使用可能であるが、例えば、マウス胚繊維芽細胞、好ましくは、１０Ｔ１／２細胞株、ＯＰ９細胞などを用いることができる。「フィーダー細胞」を用いる際には、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止しておくのがよい。【００１３】
ＥＳ細胞の培養条件としては、ネット様構造物を調製するために適した条件を選択することができる。この培養条件は、用いるＥＳ細胞によって異なるが、例えば、ヒトＥＳ細胞であるＫｈＥＳ細胞株を用いる場合、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他適宜サプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ＫｈＥＳ細胞株を用いる場合、ネット様構造物を効率的に形成させるために、ＶＥＧＦ及びＩＧＦ−ＩＩを、各々、０〜１００ｎｇ／ｍｌ、０〜３００ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。あるいは、ＩＧＦ−１１は加えなくてもよい。また、培養の環境としては、用いるＥＳ細胞によって異なるが、ＫｈＥＳ細胞株の場合、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ＥＳ細胞によって異なるが、ＫｈＥＳ細胞株の場合、フィーダー細胞上に播いてから、１４〜１６日後くらいにその存在を確認することができる。【００１４】
形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、中胚葉細胞のマーカーの一つであるＦｌｋ１（ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  １）、ＣＤ３１、ＣＤ３４、又はＵＥＡ−Ｉレクチン（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ．ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−１）陽性細胞によって隔壁が構成されている。このネット様構造物の内部には、造血前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞を各種血球細胞の分化誘導に用いる場合には、隔壁構成している細胞などから分離する必要がある。この分離は、物理的な手段により行うのが望ましい。例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、隔壁細胞と造血前駆細胞を分離することができる。【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、ネット様構造物から分離した造血前駆細胞から各種血球細胞を産生する方法である。得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、所望の血球細胞の分化誘導に適した条件で培養を行う。ここで「血球細胞の分化誘導に適した条件」とは、目的の血球細胞の種類に応じて、例えば、ＴＰＯ、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、Ｈｅｐａｒｉｎなどを添加した条件を挙げることができる。巨核球及び血小板を分化誘導する場合には、例えば、ＴＰＯの存在下で、又はＳＣＦ、Ｈｅｐａｒｉｎ及びＴＰＯの存在下で、７〜９日間程度培養することができる。培養環境としては、生体外で血球細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、５％  ＣＯ２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件下で培養を実施する。【００１６】
本発明によって生産される血球細胞は、生体外で生産するため、生体内に天然に存在するものを取得する場合に比べて、簡便、かつ、豊富に取得することができる点において、本発明に係る方法は優れた方法である。特に、ヒト血小板については、これまでに、生体外で確認できる程の量が生産されたとの報告はなく、生体外で生産されたヒト血小板としては本発明によるものが初めてである。
血小板は、白血病、骨髄移植、抗ガン剤治療の際の血小板減少の予防又は改善に有効であるため、本発明により得られたヒト血小板を製剤の形態で安定的に供給することも可能である。血液製剤を調製するにあたっては、血小板が保存に対して不安定であることなどを考慮して、血小板の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。血小板を安定化させる条件は、当該技術分野の専門家において周知の方法を選択することが可能である。より具体的には、取得した血小板（ヒトＥＳ細胞由来洗浄血小板）は、例えば、以下の方法により製剤化することができる。
ＡＣＤ−Ａ液：ＦＦＰ（ｆｒｅｓｈ  ｆｒｏｚｅｎ  ｐｌａｓｍａ；献血で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすべて含む）を１：１０の比率で調整し、１５−５０Ｇｙの放射線照射後に２０−２４℃にて振とうしながら保存する。ＡＣＤ−Ａ液；クエン酸ナトリウム２２ｇ／クエン酸８ｇ／ブドウ糖２２ｇを注射用水で全体を１Ｌとするように調整する。
以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、１×１０９血小板／ｍＬ程度が望ましい。
また、ＧＭ６００１（ａ  ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸやＧＰＶＩの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウスＥＳ細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒ  Ｒｅｓ  ９５：６７７−６８３，２００４及び  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＥＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５：１５３０−１５３７，２００７を参照のこと。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。【００１８】
本実施例は、ヒトＥＳ細胞から巨核球及び血小板を分化誘導するものである（図１及び図２参照）。
１．ネット様構造物の調製
１−１．細胞株
本実施例で用いたＫｈＥＳ細胞株（ＫｈＥＳ−１；Ｐａｓｓａｇｅ３０−５０，ＫｈＥＳ−２；ｐａｓｓａｇｅ２０−４０，ＫｈＥＳ−３；ｐａｓｓａｇｅ２０−４０）は、文部科学省の特定胚及びヒトＥＳ細胞等研究専門委員会での審議及び承諾を経て、京都大学再医科学研究所  所長  中辻憲夫先生より供与された。また、フィーダー細胞は、マウス胎児由来細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株をつくば理研ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｅｎｔｅｒより供与を受けて使用し、又はＯＰ９細胞株を大阪大学医学部、仲野徹教授から供与を受けて使用した。分化実験を行う前日に、０．１％  ゼラチンコート化ディッシュに１０Ｔ１／２細胞を６×１０５／１０ｃｍ  ディッシュの密度となるように播き、分化実験の当日に、１０Ｔ１／２細胞の増殖を止めるため５０Ｇｙの放射線照射を行い、フィーダー細胞として用いた。また、ＯＰ９細胞株をフィーダー細胞として使用する場合には、分化実験の前日に５０Ｇｙの放射線照射を行い、播き直しを行った後に使用した。【００１９】
１−２．ネット様構造物の調製方法
ヒトＥＳ細胞、ＫｈＥＳ細胞は、０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて解離し、Ｐ−１０００ピペットを用いて小さいコロニーに砕き、１０Ｔ１／２細胞上に播いた。ネット様構造物を調製するための培地の組成を表１に示す。
【表１】
2008041370.tif 000003
ヒトＥＳ細胞を播いた日から３、７、１０、１３日目に、細胞の播種は行わず、培養液の交換のみを行った。７、１０、１４日目に培地中に浮遊している細胞を用いて、巨核球／血小板の誘導を試みたが、いずれの時期においても巨核球がごく少数誘導されたのみで、血小板を確認することができなかった。【００２０】
１−３．ネット様構造物の確認
未分化ＥＳ細胞にＶＥＧＦを添加したところ、培養１４−１５日前後に内部に血球様細胞を含んだネット様構造物が多数確認された（図３及び図４）。また、ＩＧＦ−ＩＩによるネット様構造物産生に対する更なる増強作用は認められず、ヒトＥＳ細胞からの造血促進効果が報告されたＢＭＰ−４の添加ではＶＥＧＦの効果が阻害された（図５）。このネット様構造を回収し、メタノール又はパラホルムアルデヒド固定を行った後、ホールマウントで抗ヒトＦｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ）抗体により蛍光染色したところ、ネット内部はＦｌｋ−１陽性の細胞からなる隔壁により、濾胞状構造をとっている事が分かった（図６）。さらに、このネット様構造を、抗ヒトＦｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ）抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＵＥＡ−Ｉレクチン抗体で蛍光染色したところ、ネット構造内部の血球は、血管内皮細胞、造血幹細胞、前駆細胞、分化血液細胞に発現するＣＤ３１に対する抗体でも染色されることが明らかとなった（図７）。ＫｈＥＳ−１細胞株、ＫｈＥＳ−２細胞株、ＫｈＥＳ−３細胞株のいずれからもネット様構造物を確認できた。【００２１】
１−４．ネット内の血球の特徴
このネット様構造物内部の血液前駆細胞の表面には、抗ヒトＦｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ）抗体、抗ヒトＣＤ３１抗体、抗ヒトＣＤ３４抗体、抗ヒトＣＤ４１抗体、抗ヒトｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｄｈｅｒｉｎ  （ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体、抗ヒトＣＸＣＲ４（ｓｔｒｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１  受容体）抗体で染色される未熟な血液細胞に特徴的な細胞表面抗原が発現されていた（図８）。なお、これらのマーカーは、大量培養系で、時間短縮のためフローサイトメーターまたは磁気細胞分離法を用いて細胞単離，選別する際にマーカーとして利用することができる。
また、ネット内の血球は１×１０４個あたり、すべての骨髄細胞系分化血液細胞（リンパ球以外）を含む（図９）、１００−２００前後のコロニーを形成することが分かった（図１０）。【００２２】
２．巨核球／血小板の誘導
２−１．巨核球の誘導
Ｐ−１０００  ピペットを用いて、位相差顕微鏡下でネット様構造物をピックアップし、７０μｍ  セルストレイナーを用いて、血球細胞とネット様構造物を分離した。新たに、６ウェルプレートに用意した放射線照射済みの１０Ｔ１／２細胞（６×１０５／６ウェルプレート１枚）上に血球細胞を２〜３×１０４／ウェルで播いた。巨核球／血小板を誘導するための培地の組成を表２に示す。
【表２】
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また、表２に示す組成に、ＳＣＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｈｅｐａｒｉｎ  ２５Ｕ／ｍｌを加えると、産生する血小板の量は２倍に増量した。【００２３】
表２に組成を示す培養液に変更し、さらに７−８日間（培養液を１７日、１９日目に交換）（累積培養期間２１−２２日間）培養すると、ＦＡＣＳで巨核球／血小板特異的マーカーであるＣＤ４１ａ（インテグリンαＩＩｂ鎖、ＧＰＩＩｂ分子）、ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ分子）、陽性細胞が５０−６０％前後得られた（図１１）。さらに、累積培養期間を２２−２４日間で実験を行うと、巨核球／血小板特異的マーカーであるＣＤ４１ａ（インテグリンαＩＩｂ鎖、ＧＰＩＩｂ分子）、ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ分子）、及びＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）陽性細胞が５０−６０％前後得られた（図１２）。ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ分子）、及びＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）はともに成熟巨核球特異的発現分子である（図１２）。形態学的にも多核、大型の細胞で巨核球の形態と一致した（図１３）。免疫染色により、ＣＤ４１ａ陽性細胞が血小板放出に関わるとされる血小板前駆体（Ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）の形態をとっていることが確認された（図１４）。また、ネット内部の血球由来のＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲの結果（メッセンジャーＲＮＡの半定量）から、より未分化なＣＤ３４＋／ＣＤ４１ａ−と分化の進んだＣＤ４１ａ＋分画の存在が確認され、ＣＤ４１ａ陽性分画には、正常な巨核球分化細胞と同様の遺伝子発現をしていることが明らかとなった。
以上より、ネット内部の血球が巨核球を効率よく産生する造血前駆細胞である事が証明された。【００２４】
２−２．血小板の確認
培養２２日目の培養上清を回収し、血球細胞を分離して血小板を濃縮した。血小板のコントロールとしてヒト末梢血中の血小板を回収し、血小板分画のゲートを確定した（図１５左列）。培養上清の血小板をＣＤ４１ａＰＥ抗体で染色し、同じ分画でゲートをかけて解析したところ、ＣＤ４１ａ陽性パーティクルが確認された（図１５右列）。時系列を追って培養上清を回収し、Ｂｅａｄｓを用いて血小板数をカウントしたところ、培養７日−９日目をピークに血小板が産生され、９日目以降は徐々に減少した。本実施例では、１−２×１０５のＫｈＥＳ細胞から３−１２×１０４のＣＤ４１ａ陽性パーティクルが産生されていた。
同様に、培養２４日目の培養上清から回収した血小板にも、血小板マーカーであるＣＤ４１ａ陽性のパーティクルが確認され（図１６Ａ）、このＣＤ４１ａ陽性パーティクル中には、血栓形成に重要な機能を果たすＧＰＩｂａ／Ｖ／ＩＸ複合体のＧＰＩｂａとＧＰＩＸの発現が７０−８０％の効率で認められた。本パーティクルを電子顕微鏡で観察したところ、末梢血血小板同様、血小板顆粒及び微小管構造等が確認された（図１６Ｂ）。
培養２４日目には、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯ  １００ｎｇ／ｍｌ、Ｈｅｐａｒｉｎ  ２５Ｕ／ｍｌの条件で、１×１０５個のヒトＥＳ細胞から、５×１０６個の血小板が確認された。【００２５】
２−３．血小板機能解析１；フィブリノーゲン結合アッセイ
生体内血小板は、活性化に伴い細胞接着分子ＧＰＩＩｂＩＩＩａ（インテグリンαＩＩｂβ３)の持続的なフィブリノーゲンとの結合により、血小板凝集を起こし血栓形成に寄与する。培養２１−２３日目の上清中の血小板を回収し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−標識化フィブリノーゲンを血小板活性化剤トロンビン存在下で反応させたところ、トロンビン刺激では強い凝集により、ＦＳＣ、ＳＳＣの異なった分画に凝集したＣＤ４１陽性パーティクルが出現した（図１７Ａ）。また強い凝集の起きていない分画でのフィブリノーゲン−Ａｌｅｘaの結合を見ると、トロンビンの量依存的に、フィブリノーゲンのＣＤ４１パーティクルへの結合が認められた（図１７Ｂ）。
以上のことから、血小板機能の１つである薬物刺激に対するＧＰＩＩｂＩＩＩａ（インテグリンαＩＩｂβ３)の活性化とその後のフィブリノーゲンとの結合反応が確認された。
さらに、培養２３−２４日目の上清中の血小板を回収し、ＦＩＴＣ標識した活性型インテグリンαＩＩｂβ３結合抗体（商品名；ＰＡＣ−１）（ＢＤ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、インテグリン活性化（止血血栓に必須な血小板機能の一つ）を確認したところ、血小板活性化生体内薬物ＡＤＰの低濃度から高濃度（０．５−５００μＭ）まで濃度依存性に、インテグリンの活性化が確認された（ヒト血小板と同程度の反応性を示した）（図１８Ａ）。また、ＦＩＴＣ標識した活性型インテグリンαＩＩｂβ３結合抗体（ＰＡＣ−１）は、トロンビンの量依存的にＣＤ４１陽性パーティクルに結合し、この結合は、ヒト特異的抗ＣＤ４１ａ／ＣＤ６２薬である、チロフィバン（ｔｉｒｏｆｉｂａｎ）によって完全に阻害された（図１８Ｂ）。【００２６】
２−４．血小板機能解析２；固相下フィブリノーゲン上でのスプレッディング
これらの血小板は、フィブリノーゲンを固相化したスライドグラス上でＰＭＡ刺激（図１９）、ＡＤＰ刺激及びトロンビン刺激（図２０）により、細胞骨格変化の一つであるアクチンストレスファイバーを形成して広がった。血小板活性化後に起きるアクチンストレスファイバーは成体内での安定的持続的な血栓形成において必須である。
以上のように、末梢血由来血小板同様に、ヒトＥＳ細胞由来血小板もインテグリンを介するアクチン再重合を伴う骨格変化を誘導した。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明のネット様構造物は、生体外において血球細胞を効率的に増幅することができるため、医療等の分野において極めて有益な効果をもたらす。特に、生体外において調製することができない血小板などを安定に供給するための手段としての利用価値が高い。
【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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