【手続補正書】
【提出日】平成15年8月21日(2003.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療における使用のためのポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１中で与えられる配列を含み、または SEQ ID NO１、２、３、４、５、６または１１配列の少なくとも８個の連続したアミノ酸の断片を含み、
該ポリペプチドがＴ細胞応答を誘導可能である当該ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、８〜１０個のアミノ酸長である当該ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、１２〜２５個のアミノ酸長である当該ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の医療における使用のためのポリペプチドであって、前記Ｔ細胞応答が、Ｔヘルパーおよび／またはＴ細胞傷害性細胞の数および／または活性を上昇させる当該ポリペプチド。
【請求項５】
医療における使用のための核酸分子であって、ここで該核酸分子が、
ａ）請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコード化する鎖を持ち、
ｂ）前記ａ）に記載の鎖と相補的である鎖を持ち、または、
ｃ）前記ａ）もしくは前記ｂ）に記載の分子とハイブリダイズする鎖を持つ（例えばストリンジェント条件下で）
核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含む医療における使用のためのベクターまたは細胞。
【請求項７】
医療における使用のためのＴリンパ球であって、該Ｔリンパ球が、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを発現している細胞を殺傷することが可能な、またはこのような細胞の殺傷において補助することが可能なＴリンパ球。
【請求項８】
癌を処置するための医薬の調製または癌を診断するための診断薬の調製における、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項５に記載の核酸、または請求項６に記載のベクターもしくは細胞の使用。
【請求項９】
前記癌が哺乳類の癌である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記癌がヒトの癌である請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸−直腸癌、肺癌、悪性黒色種、白血病、リンパ腫、卵巣癌、頚部癌または胆管癌である請求項８〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬がワクチンである請求項８〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記診断薬がキット中で提供される請求項８〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項５に記載の核酸、または請求項６に記載のベクターもしくは細胞を含む医薬組成物。
【請求項１５】
癌遺伝子により生成されたポリペプチドに対して、または突然変異腫瘍抑制タンパク質に対して向けられたＴ細胞応答を誘導することが可能なポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチドをコード化している核酸を更に含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記前記癌遺伝子または突然変異腫瘍抑制タンパク質が、ｐ２１−ｒａｓ、Ｒｂ、ｐ５３、ａｂｌ、ｇｉｐ、ｇｓｐ、ｒｅｔまたはｔｒｋである請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の医薬組成物であって、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、添加物、安定化剤および／または補助剤を含み、前記組成物または組み合わされた調製物が、サイトカインまたは成長因子の１つ以上を任意に更に包含する医薬組成物、または組み合わされた調製物。
【請求項１８】
ワクチンである請求項１４〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
国際出願 PCT/NO99/00143（WO99/58552 として公開）は、癌細胞中の遺伝子において起こるフレームシフト突然変異から生じる突然変異タンパク質産物の合成ペプチドおよび断片を記載している。これらのペプチドは、癌細胞または他の抗原提示細胞により提示されるようなプロセシングされたフレームシフト突然変異タンパク質断片の断片に対応し、該断片を完全に網羅するか該断片そのものであり、各個体において少なくとも１つの対立遺伝子によるＨＬＡ−ポリペプチド複合体として提示される。特に、ＢＡＸおよびｈＴＧＦβ−ＲII遺伝子におけるフレームシフト突然変異からもたらされるポリペプチドが開示されている。これらのポリペプチドは、特異的な様式でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することにおいて有効であることが示された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ｈＴＥＲＴ遺伝子の完全なゲノム配列の分析は、異なるｍＲＮＡのスプライシング変異体が、ｈＴＥＲＴプレｍＲＮＡ中の他のスプライシング部位の使用から生じることを証明した（Wick, M. et al., 1999, Gene 232: 97-106）。全長のｈＴＥＲＴのｍＲＮＡと比較して、少なくとも５つの追加的なスプライシング変異体が探知された。これらの変異体のスキーム的な図面は図１中に与えられ、図２はコード化されたタンパク質の配列を示す。α-del（またはＤＥＬ１）およびβ-del（またはＤＥＬ２）と名付けられた２つのスプライシング変異体は、特異的なコード配列の欠損を表す。該α-del 変異体は、エクソン６の最初の３６個のヌクレオチドを欠損し、ひとつづきの１２個の内部アミノ酸を欠くタンパク質をコード化している。該β-del 変異体では、エクソン７および８全体を表す１８２個のヌクレオチドがなくなっており、オープン・リーディング・フレーム中のシフト、および全長のｈＴＥＲＴタンパク質中には存在しない４４個のアミノ酸長のカルボキシル末端を有する、短縮タンパク質をもたらす。残りのスプライシング変異体は、イントロン領域の内部に位置される他のスプライシング部位の使用により得られ、オープン・リーディング・フレーム内でのイントロン配列の挿入および翻訳の早まった終結をもたらす。σ−挿入（またはＩＮＳ１）変異体は、イントロン４の最初の３８個のヌクレオチドの挿入により得られる。σ−挿入は停止コドンを含有しないが、代わりにオープン・リーディング・フレームは、他のリーディング・フレームを使用した正常な配列中に２２個のヌクレオチドを延伸する。γ−挿入（またはＩＮＳ３）変異体は、イントロン１４からの最後の１５９個のヌクレオチドの挿入により引き起こされる。Ｉｎｓ−４は、エクソン１５およびエクソン１６の大部分を同時に欠損している一方で、イントロン１４からの最初の６００個のヌクレオチドを含有する。これらのスプライシング変異体の翻訳から得られた短縮タンパク質が、図２に示される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
最近の幾つかの研究は、テロメラーゼ活性の調節を説いており、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡの転写とテロメラーゼ活性との間のある種の相関が、幾つかの細胞株および組織に関して報告されている（Nakamura, T. M. et al., 1997, Science 277: 955-959; Meyerson, M. et al., 1997, Int. J. Cancer 85: 330-335; Nakayama, J. et al., 1998, Nature Genet. 18: 65-68; Liu, K. et al., 1999, Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 5147-5152）。他の研究は、テロメラーゼ活性がタンパク質キナーゼＣαによるｈＴＥＲＴタンパク質のリン酸化を通じてアップレギュレーションされ、逆に、タンパク質キナーゼＣ阻害剤およびホスファターゼ２Ａの存在によりダウンレギュレーションされることを示している（Li, H. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16729-16732; Li, H. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 33436-33442; Bodnar, A. G. et al., 1996, Exp. Cell Res. 228: 58-64; Ku, W. C. et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 241: 730-736）。ｈＴＥＲＴプレｍＲＮＡの選択的スプライシングは、テロメラーゼ活性を調節するための追加的な機序を表し、胎児の腎臓の発達の間および成人の卵巣および子宮組織におけるダウンレギュレーションを仲介することが示されている（Ulaner, G. A. et al., 1998, Cancer Res. 58: 4168-4172; Ulaner, G. A. et al., 2000, Int. J. Cancer 85: 330-335）。前記研究の焦点はαおよびβスプライシング変異体にあり、おそらくそれらが重要な逆転写酵素のモチーフをコード化すると信じられている配列を欠損しているからである（Lingner, J. et al., 1997, Science 276: 561-567）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明は、ＴＥＲＴγおよびσスプライシング変異体に基づいたペプチドおよび前記ペプチドをコード化する核酸、ならびに医療（medicine）におけるこれらのペプチドおよび核酸の新規使用を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
哺乳類において腫瘍細胞を認識して破壊することができるＴリンパ球を発生する方法も提供され、これは哺乳類からＴリンパ球の試料を取ること、ならびにこのＴリンパ球を、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質特異的Ｔリンパ球および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質特異的Ｔリンパ球を発生するのに充分な量の少なくとも１つの前記ポリペプチドの存在下で培養することを含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
ＤＮＡワクチンに対する応答は、免疫刺激性ＤＮＡ配列（ＩＳＳ）の存在により上昇することが示されている。これらは、式（５’−プリン−プリン−ＣＧ−ピリミジン−ピリミジン−３’）による、メチル化ＣｐＧを含有する６量体のモチーフの形態を取り得る。本発明によるＤＮＡワクチンはこれ故に、これらのまたは他のＩＳＳを、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質をコード化しているＤＮＡの中に、サイトカインまたは他の同時刺激分子をコード化しているＤＮＡの中に、または両方の中に取り込んでもよい。ＤＮＡワクチン接種の利点の総説は、Tighe et al.（1998, Immunology Today, 19(2): 89-97）により提供される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図４に示されるポリペプチド配列は、SEQ ID NO１の４４個のアミノ酸を包含する、約１１００個のアミノ酸残基のｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体のＣ末端の４６個のアミノ酸残基についての Kilian et al.（１９９７年、同上）の図５Ｃにおける開示を表している。Kilian et al.（１９９７年、同上）において提供される配列は、ｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体タンパク質の「他のＣ−末端」を示している（Kilian et al.（１９９７年、同上）は、対応するＤＮＡ配列が GenBank Accession number AF015950 により提供されることを指し示している）。Kilian et al.（１９９７年、同上）は、ｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体タンパク質のＣ末端における SEQ ID NO１、２または５によるポリペプチドを別々の実体としては開示しておらず、彼らは SEQ ID NO１、２または５によるポリペプチドの薬用の使用を開示または示唆していない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
明細書中に記載されるポリペプチドは、従来の方法により、例えば当業界で既知の様々なポリペプチド合成法により生成されてもよい。あるいはそれらは、例えば臭化シアンを使用する開裂および引き続いての精製により生成されるｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質の断片および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質であってもよい。酵素的な開裂が使用されてもよい。該ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質およびｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質またはペプチドは、組み換え発現タンパク質またはポリペプチドの形態であってもよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
約３１００塩基対のｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体の３’−末端にある核酸配列は、その一部が SEQ ID NO１を包含する対応するタンパク質のＣ−末端をコード化しており、Kilian et al.（１９９７年、同上）の図４において提供される。Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂ中で開示されているようなｈＴＥＲＴスプライシング変異体ＩＮＳ１（σ−挿入スプライシング変異体と等価）およびＩＮＳ３（γ−挿入スプライシング変異体と等価）のエクソン−イントロン境界にある該核酸配列が、図５中に示される。図５中に示される Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂ中で開示されているような該核酸は、SEQ ID NO１〜６および１１中に存在するアミノ酸残基をコード化するヌクレオチドを包含する。Wick et al.（１９９９年、同上）は、明確な実体として示される該核酸の存在およびそれらの医学的な使用に関して特定の言及をしていない。Wick et al.（１９９９年、同上）は、GenBank Accession numbers AF128893 および AF128894 中のそれらのｈＴＥＲＴ遺伝子の、完全なヌクレオチド配列に関する言及を提供している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本発明のポリペプチドをコード化する核酸は、オリゴヌクレオチド合成により作られてもよい。これは、当業界で利用可能な様々な方法のいずれによってなされてもよい。テロメラーゼタンパク質をコード化する核酸は、従来のライブラリー・スクリーニングを使用してゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからクローニングされてもよい。そのプローブは、既知のｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入遺伝子のいずれの配列の一部分に対応してもよい。あるいは該核酸は、ポリメラーゼ直鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより得られることができる。該核酸は、好ましくはＤＮＡであり、ベクター中に適切にクローニングされてもよい。サブクローンが、適切な制限酵素を使用することにより発生されてもよい。クローニングまたはサブクローニングされたＤＮＡは、適切な宿主（例えばバクテリアの宿主）中で繁殖されてもよい。あるいは該宿主は、酵母またはバキュロウィルスのような真核細胞生物であることが可能である。ｈＴＥＲＴγ−挿入およびｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質またはポリペプチドは、適切な宿主における発現により生成されてもよい。この場合該ＤＮＡは、発現ベクター中へクローニングされる。様々な商業的な発現キットが入手可能である。Sambrook, J. et al.（1989, Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）において記載されている方法が、これらの目的に使用されてもよい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
図３において、SEQ ID NO１は、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質の短縮された尾を反映し、SEQ ID NO２は、天然由来のｈＴＥＲＴγ−挿入発現産物（下線部）中のこれらの位置において正常には見出される９個のアミノ酸を伴ったアミノ末端での延長を伴った同じポリペプチドを反映する。SEQ ID NO３は、ｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質の短縮された尾を反映する。SEQ ID NO４は、天然のｈＴＥＲＴσ−挿入発現産物（下線部）中のこれらの位置において正常には見出される９個のアミノ酸を伴ったアミノ末端での延長を伴った SEQ ID NO３を反映する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
図４において、Kilian et al.（１９９７年、同上）の図５Ｃ中に提供されているような挿入スプライシング変異体３（ｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体と等価）のエクソン／イントロン接合部が示される。以下の情報が、Kilian et al.（１９９７年、同上）により提供される：核酸配列は、太字で与えられた推定のスプライシングされていないイントロンと共にタンパク質翻訳配列上に示され、推定のエクソン／イントロン接合部が｜でマークされ、核酸配列の付番は以下に対応する：ヌクレオチド１は、GenBank Accession number AF015950 中の配列のヌクレオチド１３９に対応し、推定のｃ−Ａｂｌ／ＳＨ３結合部位に対応するアミノ酸は、下線を施されている。Kilian et al.（１９９７年、同上）により示されるアミノ酸配列は、約１１００個のアミノ酸残基のｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体タンパク質のＣ−末端を表す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
図５において、Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂにおいて開示されているような、ｈＴＥＲＴスプライシング変異体ＩＮＳ１（σ−挿入スプライシング変異体と等価）およびＩＮＳ３（γ−挿入スプライシング変異体と等価）のエクソン−イントロン境界のヌクレオチドが表される。イントロンおよびエクソンの配列が、それぞれ小文字および大文字で示されている。Wick et al.（１９９９年、同上）は、それらのｈＴＥＲＴ遺伝子のヌクレオチド配列が、GenBank Accession number AF128893 および AF128894 として寄託されていることを指し示している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
ｈＴＥＲＴγ−挿入およびσ−挿入スプライシング変異体は、癌細胞株および腫瘍においては発現されるが、正常細胞においては探知不可能または非常に低いレベルで存在することが立証された。本願はそれ故に、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）タンパク質の機能的変異体に基づいたワクチンと比較して特異性が改善された一般的な癌ワクチンの候補を開示する。γおよびσ挿入両方は、停止コドンの早い形成およびカルボキシル末端において短縮されたタンパク質の発現をもたらす。短縮ｈＴＥＲＴのγ−およびσ−挿入タンパク質は、それら自身テロメラーゼ活性を持たない。γ−挿入の場合、該タンパク質の短縮された尾は、４４個のアミノ酸の配列（SEQ ID NO１）である。σ−挿入は、その中で短縮された尾が２０個のアミノ酸の配列（SEQ ID NO３）であるタンパク質をもたらす。それらは、癌細胞株において優性に発現されるが、正常細胞においては探知不可能、または非常に低いレベルで存在し、これ故に特異的な免疫治療のための標的となる。本発明によれば、ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはσ−挿入スプライシング変異体により発現されるタンパク質のカルボキシル末端（短縮された尾）に対応するポリペプチドは、ヒトにおける癌細胞に対しての免疫系（Ｔ−細胞）の細胞の戦闘力の引き金を引く機能を有する抗癌剤またはワクチンとして有用である。本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、SEQ ID NO５による配列を含む。本発明の他の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、SEQ ID NO６による配列を含む。なお他の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、SEQ ID NO１１による配列を含む。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
（ｈＴＥＲＴのγ−挿入およびσ−挿入スプライシング変異体のＲＴ−ＰＣＲ分析）
（ＲＮＡ分析）
完全に溶解された細胞からのポリ(Ａ)+ｍＲＮＡが、磁気的オリゴ（ｄＴ）ビーズを使用して、粗溶解物から直接単離された（Dynal, A. S.; Jakobsen, K. S. et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 3669）。細胞質ゾルのｍＲＮＡ分画が、１分間０℃にて１％ＩＧＥＰＡＬ（シグマ）中で細胞をインキュベートし、その後、核を除くために遠心分離（１００００ｇ、１分、４℃）されることにより調製された。ポリ(Ａ)+ｍＲＮＡがその後、前記オリゴ（ｄＴ）ビーズを使用して上清から単離された。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
γ−挿入スプライシング変異体、すなわち＋鎖プライマー変異体の分析のために、＋鎖プライマーｈＴＥＲＴ−ｐ３１９５（5-GCC TCC CTC TGC TAC TCC ATC CT-SEQ ID NO７）および−鎖プライマーｈＴＥＲＴ−ｍ３６５２（5-CGT CTA GAG CCG GAC ACT CAG CCT TCA-SEQ ID NO８）が使用された。これらのプライマーは、全長のｈＴＥＲＴのｃＤＮＡおよびγ−挿入変異体に適用されると、それぞれ４６５個および６２４個のヌクレオチドの断片を生成する。σ−挿入変異体の分析は、プライマーｈＴＥＲＴ−Ｐ６（5-GCC AAG TTC CTG CAC TGG CTG A-SEQ ID NO９）およびｈＴＥＲＴ−ｍ２０４４（5-GCT CTA GAA CAG TGC CTT CAC CCT CG-SEQ ID NO１０）を使用することにより実行された。全長のｈＴＥＲＴのｃＤＮＡおよびσ−挿入変異体と共にこれらのプライマーを使用することから得られる増幅産物は、それぞれ３６９個および４０７個のヌクレオチドを含む。これらのＰＣＲ産物が真性のスプライシング変異体を表すことを証明するために、断片がゲルから単離され、ＡＢＩプリズム３１０自動化シーケンサー（ＰＥ社）を使用する直接の配列決定により分析された。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
（ポリペプチド試験および癌治療）
本発明による癌ワクチンおよびＴ細胞免疫に基づいた特異的な癌治療のための方法が有効であるために、２つの条件が適えられなければならない。即ち、
（ａ）ポリペプチドが少なくとも８個のアミノ酸長であり、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質の断片であり、また、
（ｂ）該ポリペプチドが、その全長か抗原提示細胞によるプロセシングの後で、Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
これらの条件が特定のポリペプチドに対して適えられるかどうか決定するために、以下の実験の方法が使用されてもよい。第１に、特定の該ポリペプチドが in vitro においてＴ細胞免疫応答を引き起こすかどうか決定されるべきである。合成ポリペプチドが、ｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質を宿す癌細胞において、あるいは天然のｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質をプロセシングした抗原提示細胞において、生じるポリペプチド断片に対応するポリペプチド断片に対応するか、あるいはプロセシング後に得ることが可能か立証されることも必要であろう。ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドのワクチン接種により in vivo において誘導されるＴ細胞の特異性も、決定されるかも知れない。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
（In vitro におけるＴ細胞応答分析）
ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入を発現している腫瘍細胞株が、ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドのワクチン接種後に、ガン患者からの末梢血から得られたＴ細胞クローンにより殺傷され得るかどうか決定することが必要である。Ｔ細胞クローンは、ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドのワクチン接種後に、ガン患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中に存在するＴ−細胞芽細胞のクローニングの後に得られる。ポリペプチドのワクチン接種のプロトコルは、ＧＭ−ＣＳＦまたは他の普通に使用される補助剤と共に皮膚内で、ポリペプチドの in vivo における幾つかの注射を包含する。Ｔ細胞のクローニングは、応答するＴ細胞芽細胞を寺崎プレート（Terasaki plates）上に、穴につき５個の芽細胞にて蒔くことにより実行される。各穴は、フィーダー細胞として２×１０4個の放射線照射（３０Ｇｙ）自家のＰＢＭＣを含有する。該細胞は２０ｍｌの全体積中で、２５ｍＭでのｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドならびに５Ｕ／ｍｌの組み換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（Amersham, Aylesbury, UK）を用いて増殖される。９日後、Ｔ細胞クローンは、１ｍｇ／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ、Wellcome, Dartford, UK）、５Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２、およびフィーダー細胞として放射線照射（３０Ｇｙ）同種のＰＢＭＣ（穴につき２×１０5個）と共に、平底９６−穴プレート上に移動された。成長しているクローンは、ＰＨＡ／ｒＩＬ−２およびフィーダー細胞として１×１０6個の同種の放射線照射ＰＢＭＣと共に、更に２４−穴プレートにおいて増やされ、４〜７日後に、ポリペプチドの特異性を求めてスクリーニングされた。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
Ｔ細胞クローンは、更なる特徴付けのために選ばれた。該Ｔ細胞クローンの細胞表面表現型は、該Ｔ細胞クローンがＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるかどうか確かめるために決定される。Ｔ細胞クローンは、腫瘍細胞の溶解が起きるかどうか決定するために、異なる（エフェクター：標的）比率で、自家の腫瘍細胞標的と共にインキュベートされる。溶解は、該Ｔ細胞が、例えばｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質である抗原由来の腫瘍に対して向けられた反応性を持つことを指し示す。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
（ポリペプチドと in vivo ｈＴＥＲＴ挿入断片との間の相関）
認識される抗原がｈＴＥＲＴγ−挿入タンパク質またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質と相互作用することを証明するために、およびＴ細胞クローンに対し推定のｈＴＥＲＴγ−挿入またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドを提示するＨＬＡクラスＩまたはクラスII分子を同定するために、患者のそれらと共通の１つ以上のＨＬＡクラスＩまたはII分子を担持する、異なるｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入発現腫瘍細胞株が、細胞傷害性アッセイにおいて標的細胞として使用される。標的細胞は、終夜51Ｃｒまたは3Ｈ−チミジン（９．２５×１０4Ｂｑ／ｍＬ）でラベルされ、１回洗浄され、９６穴プレートにおいて、穴につき５０００個の細胞にて蒔かれる。Ｔ細胞は異なる（エフェクター：標的）比率で加えられ、該プレートは３７℃にて４時間インキュベートされ、その後液体シンチレーション・カウンター（Packard Topcount）中でカウントする前に採取される。例えば、膀胱ガン細胞株Ｔ２４（１２Ｖａｌ+、ＨＬＡ−Ａ１+、Ｂ３５+）、黒色腫細胞株ＦＭＥＸ（１２Ｖａｌ+、ＨＬＡ−Ａ２+、Ｂ３５+）および結腸ガン細胞株ＳＷ４８０（１２Ｖａｌ+、ＨＬＡ−Ａ２+、Ｂ８+）、または他のいかなるテロメラーゼ陽性腫瘍細胞株も、標的細胞として使用されてもよい。ｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質を発現しない適切な細胞株がコントロールとして使用されてもよく、溶解されるべきではない。特定の細胞株の溶解は、試験されるＴ細胞クローンが、その細胞株により発現されるＨＬＡクラスＩまたはクラスIIサブタイプの関係において、内側からプロセシングされるｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入抗原決定基（エピトープ）を認識することを指し示す。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
（Ｔ細胞クローンの特徴付け）
Ｔ細胞クローンのＨＬＡクラスＩまたはクラスII拘束は、遮断実験により決定されてもよい。ＨＬＡクラスＩ抗原に対してのモノクローナル抗体、例えば全てに反応性のＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体Ｗ６／３２、またはＨＬＡクラスII抗原に対しての、例えばＨＬＡクラスIIＤＲ、ＤＱおよびＤＰ抗原に対して向けられたモノクローナル（Ｂ８／１１、ＳＰＶ−Ｌ３およびＢ７／２１）が使用されてもよい。自家の腫瘍細胞株に対してのＴ細胞クローン活性は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度にてＨＬＡクラスＩおよびII分子に対して向けられたモノクローナル抗体を使用して評価される。アッセイが、９６穴プレートにおいて３通りに、前記のように組み立てられ、標的細胞が、Ｔ細胞の添加の前に３７℃にて３０分間前インキュベーション処理される。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
Ｔ細胞クローンの細かな特異性は、ポリペプチド刺激（パルス）実験を使用して決定されてもよい。Ｔ細胞クローンにより実際に認識されるｈＴＥＲＴγ−挿入および／またはｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドを同定するために、９量体のポリペプチドのパネルが試験される。51Ｃｒまたは3Ｈ−チミジンラベルされ、穏やかな酸で溶出された自家の線維芽細胞が、９６穴プレートにおいて穴につき２５００個の細胞にて蒔かれ、Ｔ細胞の添加前に３７℃にて５％ＣＯ2のインキュベーター中で、ｂ２−ミクログロブリン（２．５μｇ／ｍＬ）と共に、１μＭの濃度のポリペプチドで刺激される。アッセイが、９６穴プレートにおいて３通りに組み立てられ、５：１の（エフェクター：標的）比率で４時間インキュベートされる。コントロールは、単独で、ポリペプチドの非存在下でＡＰＣと共に、または無関連な黒色種関連ポリペプチドＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａポリペプチドと共に培養されたＴ細胞クローンを包含することが可能である。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
Ｔ細胞クローンの細かな特異性を決定する他のプロトコルも使用されてもよい。この他のプロトコルでは、ＴＡＰ不全Ｔ２細胞株が抗原提示細胞として使用される。この細胞株は小さな量のＨＬＡ−Ａ２抗原しか発現しないが、該細胞表面での上昇したレベルのＨＬＡクラスＩ抗原が、ｂ２−ミクログロブリンの添加により誘導され得る。3Ｈ−ラベルされた標的細胞が、３７℃にて１時間ｂ２−ミクログロブリン（２．５μｇ／ｍＬ）と共に、異なる試験ポリペプチドおよび１μＭの濃度でのコントロールのポリペプチドと共にインキュベートされる。ポリペプチドで刺激された後、該標的細胞はよく洗浄され、数えられ、Ｔ細胞の添加前に９６穴プレートにおいて穴につき２５００個の細胞にて蒔かれる。該プレートは、採取前に５％ＣＯ2中３７℃にて４時間インキュベートされる。コントロールは、単独で、またはポリペプチドの非存在下で標的細胞と共に培養されたＴ細胞クローンを包含する。アッセイが、２０：１の（エフェクター：標的）比率で、９６穴プレートにおいて３通りに組み立てられた。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（ｈＴＥＲＴσ−挿入ペプチドに対するヒトＴ細胞応答の誘導および増殖）
この実験では、４人の健康なヒト（提供者「１４３２８」「１４３１３」「２３２４４」および「２３２５５」）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が単離され、ｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチド由来の SEQ ID NO１１のペプチドで刺激された樹状細胞を用いて７日間予め用意された後、ペプチドで刺激された自家のＰＢＭＣを用いての７日の再刺激からなる２サイクルが行われた。該樹状細胞は、末梢血からの単球由来であった。結果として得られたひとまとまりの培養物からのＴ細胞は、３日後の採取前に、ペプチドで刺激された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて、または用いずに３通りに試験された。該培養物の増殖能力を測定するために、採取前に3Ｈ−チミジン（３．７×１０4Ｂｑ／穴）が、終夜該培養物に加えられた。非刺激ＡＰＣを用いて、またはＡＰＣを用いずに、培養物がコントロールとして働いた。該培養物の増殖能力を示す結果が、図７において示される。使用された該プロトコルの更なる詳細が、以下に詳しく述べられる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
図７、８および９中の結果は、３通りの測定の分当たりの平均カウント（ｃｐｍ）として与えられる。該データは、ヒトからの血がｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチド由来のペプチド由来のペプチド（SEQ ID NO１１）について特異的な循環Ｔ細胞を含有し、更に、このようなＴ細胞が関連のペプチドでの刺激を伴って in vitro において拡張されることが可能であることを論証している。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
従って、図７、８および９の実験は、該ｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチドがヒトにおいて免疫原性であることを示す。In vitro（または in vivo）における刺激はこれ故に、癌患者における腫瘍の成長により過剰発現された場合、同じ抗原を認識する潜在能力を伴ってｈＴＥＲＴσ−挿入タンパク質特異的Ｔ細胞応答を引き起こし得る。この特別な実験は、一般原則として SEQ ID NO１１のペプチドは、ヒトにおいて癌ワクチンとして開発され得ることを論証している。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
（ＭＨＣクラスII拘束Ｔ細胞応答の誘導のためのプロトコル）
（０日目）
ＰＢＭＣは、５０ｍｌの血（バッフィーコートから）から分離された。該細胞は数えられ、ＲＰＭＩ−１６４０／１５％の完全なプール血清中に再懸濁された。
ひとまとまりの培養物は、１〜１．５ｍｌ中２×１０6個の細胞／ｍｌにてＰＢＭＣの２４穴プレートの１〜２個の穴を用いて組み立てられた。ｈＴＥＲＴσ−挿入ポリペプチド由来の、２５μＭの SEQ ID NO１１のペプチドが加えられた。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
【図１】図１は、癌細胞株中に見出される全長のｈＴＥＲＴのｍＲＮＡおよびスプライシング変異体のスキームの図面である。
【図２】図２は、ｈＴＥＲＴタンパク質の一部分とスプライシング変異体の翻訳から得られるタンパク質との間のタンパク質を直線に並べたものを示す。
【図３】図３は、ｈＴＥＲＴγ−挿入およびσ−挿入のスプライシング変異体タンパク質のカルボキシル末端を示す。
【図４】図４は、Kilian et al.（１９９７年、同上）の図５Ｃにおいて開示されているようなｈＴＥＲＴγ−挿入スプライシング変異体に関連する先行技術の配列を示す。
【図５】図５は、Wick et al.（１９９９年、同上）の図２Ｂにおいて開示されているようなｈＴＥＲＴγ−挿入またはσ−挿入スプライシング変異体に関連する先行技術の配列を示す。
【図６】図６は、ｈＴＥＲＴのγ−挿入（Ａ）およびσ−挿入（Ｂ）スプライシング変異体を含む領域のＲＴ−ＰＣＲ分析からの結果を示す。
【図７】図７は、SEQ ID NO１１のアミノ酸配列を持つポリペプチドにより、ヒトの血液試料中に誘導される増殖するＴ細胞応答を示す。
【図８】図８は、SEQ ID NO１１のアミノ酸配列を持つポリペプチドにより誘導されるＴ細胞クローンの増殖を示す。
【図９】図９は、SEQ ID NO１１のアミノ酸配列を持つポリペプチドにより誘導される他のＴ細胞クローンの増殖を示す。