【手続補正書】
【提出日】平成16年4月12日(2004.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  流体媒質中の少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸塩基含有ターゲット配列の検出方法であって、
前記流体媒質に前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列とハイブリダイゼーション複合体を形成することができるアンチセンス・プローブを加える工程であって、前記アンチセンス・プローブが匹敵するホスホジエステル・バックボーンよりも小さい陰性である電荷を有するバックボーンを含む前記工程と；
前記ハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないアンチセンス・プローブを分離して、試験媒質を形成する工程と；
前記試験媒質に、前記ハイブリダイゼーション複合体中の蛍光マーカーを励起させて、前記蛍光マーカーに蛍光を放出させる波長を有するレーザー・ビームを照射する工程と；
前記放出蛍光の強度を測定する工程と；
前記測定強度を基準強度と比較して、前記流体媒質が前記少なくとも１つのターゲット配列を含有するかどうかを検出する工程と
を含み、
前記測定強度が前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数に、０塩基ミスマッチ（０を含む）から少なくとも３塩基ミスマッチまでの範囲にわたって逆比例し、前記分離工程以外の前記方法が前記アンチセンス・プローブ、前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列又は前記ハイブリダイゼーション複合体のいずれも固体サポート又はゲルに結合させることなく完全に行われる前記方法。
【請求項２】    流体媒質中の少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸塩基含有ターゲット配列の検出方法であって、
前記流体媒質に前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列とハイブリダイゼーション複合体を形成することができるアンチセンス・プローブを加える工程であって、前記アンチセンス・プローブが匹敵するホスホジエステル・バックボーンよりも小さい陰性である電荷を有するバックボーンを含む前記工程と；
前記流体媒質に、前記ハイブリダイゼーション複合体中の蛍光マーカーを励起させて、前記蛍光マーカーに蛍光を放出させる波長を有するレーザー・ビームを照射する工程と；
前記放出蛍光の強度を測定する工程と；
前記測定強度を基準強度と比較して、前記流体媒質が前記少なくとも１つのターゲット配列を含有するかどうかを検出する工程と
を含み、
前記測定強度が前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数に、０塩基ミスマッチ（０を含む）から少なくとも３塩基ミスマッチまでの範囲にわたって比例し、前記方法が前記シグナル検出の前にハイブリダイゼーション複合体からハイブリダイズされないプローブを分離せずに、及び前記アンチセンス・プローブに又は前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列にシグナル消光剤を供給せずに行われる前記方法。
【請求項３】  前記測定強度が前記流体媒質中のハイブリダイゼーション複合体の量に逆比例し、前記流体媒質中のハイブリダイズされない前記アンチセンス・プローブの量に比例する、請求項２記載の方法。
【請求項４】  前記バックボーンが隣接糖の５’炭素と３’炭素との間に少なくとも１つの非イオン性連結基を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】  前記少なくとも１つの非イオン性連結基がメチルホスホネート基である、請求項４記載の方法。
【請求項６】  前記バックボーンがそのホスフェート基の少なくとも約１０％が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】    前記バックボーンがそのホスフェート基の少なくとも約２０％かつ約８０％以下が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】  前記バックボーンがそのホスフェート基の約２５％が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】  前記バックボーンがそのホスフェート基の約５０％が非イオン性基によって置換された修飾ホスホジエステル・バックボーンを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】  前記非イオン性基がメチルホスホネート基である、請求項６、７、８及び９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】  前記バックボーンが少なくとも１つのペプチド・セグメントと、少なくとも１つのホスホジエステル・セグメントとを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】  前記バックボーンが少なくとも１つのペプチド・セグメントと、少なくとも１つのメチルホスホネート・セグメントとを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】  前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列が折りたたみヌクレオチド配列内の第１セグメントであり、前記測定強度を前記折りたたみヌクレオチド配列内の第２セグメントの第２測定強度と比較して、前記折りたたみヌクレオチド配列内の、アンチセンス・プローブがアクセス可能な領域を同定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】  前記少なくとも１つの核酸塩基含有ターゲット配列と前記アンチセンス・プローブとの間の塩基ミスマッチの数を測定する、請求項１または２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
下記メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド・プローブを合成して、精製した：
（１）プローブ１は、４メチル化基を含むアニオン１８マー修飾バックボーンＤＮＡプローブであった；
５’Ｆｌｕｏ−Ｃ  ＣＴｍＣ  ＡＴＴｍ  ＣＡＧ  ＣｍＴＣ  ＴＣｍＧ  ＧＡ３’（配列番号：１０）
（２）プローブ２は、１／２メチル化されたアニオン１８マーＤＮＡプローブであった；
５’Ｆｌｕｏ−Ｃｍ  ＣＴｍＣ  ＡｍＴＴｍ  ＣＡｍＧ  ＣｍＴＣｍ  ＴＣｍＧ  ＧｍＡ３’（配列番号：１１）
（３）プローブ３は、完全メチル化された非イオン１５マーＤＮＡプローブであった；
５’ＣｍＴｍＣｍ  ＡｍＴｍＴｍ  ＣｍＡｍＧｍ  ＣｍＴｍＣｍ  ＴｍＣｍＧｍ−Ｆｌｕｏ３’（配列番号：１２）
ハイブリダイゼーション
実施例１Ａ〜１Ｅ
実施例１Ａ〜１Ｅの各々では、４０ｐｍｏｌの４０マー合成ｄｓＤＮＡを１００ｐｍｏｌのメチルホスホネート・オリゴヌクレオチド  プローブ１（配列番号：１０）に加えて、８０μｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液（ｐＨ６．５）中で混合した。実施例において用いた４０マーｄｓＤＮＡｓは次の通りであった：
実施例   ｄｓＤＮＡ
１Ａ                    配列番号：１
１Ｂ                    配列番号：２
１Ｃ                    配列番号：３
１Ｄ                    配列番号：４
１Ｅ                    配列番号：５
各サンプルを９５℃において５分間加熱した。次に、サンプルを室温において２０分間ハイブリダイズさせた。各サンプルをＧ５０スピンカラム(spin column)（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって９５０ｒｐｍにおいて３分間  回転させることによって分離させた。ハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液をカラムに通し、本出願人の以前の米国特許５，８４６，７２９号及び第６，０６０，２４２号に開示されたプロトコールを用いた蛍光検出のためにキュベットに移した。図１に示した検出結果は、蛍光強度がプローブとターゲットとの間のミスマッチの数に逆比例したことを示す。したがって、実施例１Ａの完全にマッチしたターゲットとプローブが実施例１Ｂの１塩基ミスマッチ対よりも大きい強度で蛍光を発し、実施例１Ｂの１塩基ミスマッチ対は実施例１Ｃの２塩基ミスマッチ対よりも大きい強度で蛍光を発し、実施例１Ｃの２塩基ミスマッチ対は実施例１Ｄの３塩基ミスマッチ対よりも大きい強度で蛍光を発し、実施例１Ｄの３塩基ミスマッチ対は実施例１Ｅの非ターゲットＤＮＡ／プローブ対合よりも大きい強度で蛍光を発した。８００ｍｓ積分時間(integrating time)に蛍光スペクトルを記録した。