【手続補正書】
【提出日】平成16年11月30日(2004.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の生存率を減少させる方法であって、該方法は、該腫瘍細胞に、天然に存在しないウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスは、以下：
ａ）レオウイルスであって、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、レオウイルス；または
ｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；または
ｃ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得る、レオウイルス以外のウイルスであって、ここで該レオウイルス以外のウイルスが、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、レオウイルス以外のウイルス、
である、方法。
【請求項２】
哺乳動物中の新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、天然に存在しないウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスは、以下：
ａ）レオウイルスであって、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、レオウイルス；または
ｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；または
ｃ）レオウイルス以外のウイルスであって、ここで、該レオウイルス以外のウイルスが、
ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そして
ｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、
レオウイルス以外のウイルス、
である、方法。
【請求項３】
哺乳動物中の新生物を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の天然に存在しないウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスが、以下：
ａ）レオウイルスであって、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、レオウイルス；または
ｂ）レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体もしくはその子孫；または
ｃ）レオウイルス以外のウイルスであって、ここで、該レオウイルス以外のウイルスが、
ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そして
ｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、
レオウイルス以外のウイルス、
である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記ウイルスが、レオウイルスであり、該レオウイルスのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有する、
方法。
【請求項５】
前記ｍｕ−２タンパク質が、レオウイルス株Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇのｍｕ−２タンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｕ−２タンパク質が、レオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子の核酸配列を有する遺伝子によって発現される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記レオウイルスが、ｅｂ８６、ｅｂ１２９、ｅｂ８８、およびｅｂ１３からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記レオウイルスが、Ｌ３遺伝子を有し、該Ｌ３遺伝子の配列が、レオウイルス株Ｔ１  ＬａｎｇのＬ３遺伝子と同じである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記レオウイルスが、ｅｂ２８、ｅｂ３１、ｅｂ９７、ｅｂ１２３およびｇ１６からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
前記レオウイルスが、Ｌ１遺伝子およびＳ２遺伝子を有し、該Ｌ１遺伝子およびＳ２遺伝子の配列が、レオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記レオウイルスが、レオウイルス株ｅｂ１０８と同じ遺伝子型を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レオウイルスがＳ４遺伝子を有し、該Ｓ４遺伝子の配列が、レオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記レオウイルスが、レオウイルス株ｅｂ９６と同じ遺伝子型を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記ウイルスが、レオウイルス科から選択されるウイルス種の２以上の親株の再集合体またはその子孫である、方法。
【請求項１５】
前記ウイルス種が、レオウイルスであり、前記親株が、Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇ、Ｔ１  Ｌａｎｇ、Ｔ３  ＡｂｎｅｙおよびＴ２  Ｊｏｎｅｓからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記親株が、Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇおよびＴ１  Ｌａｎｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスが、ウイルス株ｅｂ１１８、ｅｂ７３．１、ｈ１７、ｈ１５、ｅｂ３９およびｈ６０からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、前記ウイルスが、レオウイルス以外のウイルスであり、ここで、該レオウイルス以外のウイルスが、以下：
ｉ）９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスｍｕ−２タンパク質を発現し得、そして
ｉｉ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるＤＮＡウイルス、ポジティブセンスＲＮＡウイルス、またはネガティブセンスＲＮＡウイルスである、
レオウイルス以外のウイルス、
である、
方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記ウイルスが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、イリドウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルスまたは風疹ウイルスから選択されるＤＮＡウイルスである、方法。
【請求項２０】
前記ウイルスが、トガウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルスまたはコロナウイルスから選択されるポジティブセンスＲＮＡウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅおよびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅからなる群より選択されるネガティブセンスＲＮＡウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスが、複製能のあるウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスが、クローン性ウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスが、鼻腔内、気管内、静脈内、腹腔内または腫瘍内からなる群より選択される経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスが、３×１０７〜３×１０９ＰＦＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項２５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【図１】ＰＫＲ−／−  対  ＰＫＲ＋／＋のマウス胚線維芽細胞における、レオウイルス株Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄのウイルス収率。
【図２】Ｒｅｏ  Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄを感染させたＭＥＦにおけるＰＫＲのイムノブロット。
【図３】レオウイルス株での処理後の、ｃｔ２６腫瘍を有するマウスの肺。Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、ＥＢ９６、およびＥＢ１０８を、未処理のコントロール肺と比較する。２匹のマウス由来の肺を、各処理について示す。
【図４】ＢＡＬＢ−Ｃマウス肺の重量を、ＣＴ２６腫瘍およびレオウイルス処理の存在と比較する。
【図５】レオウイルス株処理後の、ｃｔ２６腫瘍を有するマウスの肺葉を示す、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織学的切片。Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄ、ＥＢ９６およびＥＢ１０８を、未処理のコントロール肺と比較する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
抗新生物方法および抗腫瘍方法、ならびに上記の本発明の使用の例としては、そのｍｕ−２タンパク質が、９３位、１５０位、３００位、３０２位、３４７位、３７２位、４３４位、４５８位、６５２位および７２６位において、それぞれ、アミノ酸残基Ａ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、ＩおよびＳを有するレオウイルスを利用する方法および使用が挙げられる。より特定の実施形態において、このレオウイルスｍｕ−２タンパク質は、例えば、このｍｕ−２タンパク質が、レオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子の核酸配列を有する遺伝子によって発現される場合、レオウイルス株Ｔ３  Ｄｅａｒｉｎｇのｍｕ−２タンパク質のアミノ酸配列を有する。より特定の実施形態において、このレオウイルスは、ｅｂ８６、ｅｂ１２９、ｅｂ８８、およびｅｂ１３からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する。より特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、およびその配列がレオウイルス株Ｔ１  ＬａｎｇのＬ３遺伝子と同じであるＬ３遺伝子を有し、例えば、このウイルスは、ｅｂ２８、ｅｂ３１、ｅｂ９７、ｅｂ１２３およびｇ１６からなる群より選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有し得る。なおより特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、ならびにその配列がレオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じであるＬ３遺伝子、Ｌ１遺伝子およびＳ２遺伝子を有し、例えば、このレオウイルスは、ｅｂ９６、およびｅｂ１０８から選択されるレオウイルス株と同じ遺伝子型を有する。さらにより特定の実施形態において、このレオウイルスは、その配列がレオウイルス株Ｔ３  ＤｅａｒｉｎｇのＭ１遺伝子と同じであるＭ１遺伝子、ならびにその配列がレオウイルス株Ｔ１  Ｌａｎｇの対応する遺伝子と同じであるＬ３遺伝子、Ｌ１遺伝子、Ｓ２遺伝子およびＳ４遺伝子を有し、例えば、このレオウイルスは、レオウイルス株ｅｂ９６と同じ遺伝子型を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【表１】
2004519431.tif 000001
（表２：ＰＫＲ＋／＋（野生型））
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【表２】
2004519431.tif 000002
表１および表２において、ゲノムセグメントの親起源を、Ｌ（Ｔ１Ｌ）またはＤ（Ｔ３Ｄ）により示す。統計的な有意性を、ｔ−試験およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ（ＭＷ）試験を用いて決定した。
（表３：ＰＫＲに対する感受性は、Ｍ１遺伝子と関連しない）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
（実験５：レオウイルスＴ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体の改善された腫瘍溶解の原理の解明：Ｔ３ＤのＭ１遺伝子ならびにＴ１ＬおよびＴ３Ｄからの残りの遺伝子を有するレオウイルス再集合体は、優れた腫瘍溶解特性を有することの実証）
３つの再集合体を、それらの親ウイルスに関する腫瘍溶解特性の試験のために選択した 
。再集合体、ＥＢ９６およびＥＢ１０８の各々は、Ｔ３ＤのＭ１遺伝子を有し、それらの感染応答において損傷を受けた細胞において優先的に複製することが期待された。これらの再集合体はまた、最適な複製能を提供することが予測されるＴ１ＬのＬ１、Ｌ３、およびＳ２遺伝子を有した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
非常に対照的に、ＥＢ９６再集合ウイルスは、処置によって肺の全体の腫瘍塊を浄化した（図３）。この肺は、腫瘍塊を含まないほぼ正常な重量を有した（図４）。組織学的検査により検出されたように、少数の残留性の腫瘍細胞がこの時点で残留していた（図５）。この肺は、正常の大きさおよび外観（いくつかの環状のパターンおよび肺表面のへこみ（以前の腫瘍小節の位置を示すと思われる）を除く）であった。再集合体ＥＢ１０８は、腫瘍溶解に部分的に効果的であり、Ｔ１Ｌ親株よりもわずかに良好であるが類似する結果をもたらした。再集合体の遺伝子型の比較において、３つの再集合体が、７つのゲノムセグメントを共通して有し、従って、それらのＬ２、Ｓ３、およびＳ４ゲノムセグメントにおいて異なることが観察され得、このことは、遺伝子の後者の群が、腫瘍溶解の重要なモジュレーターを含むことを示す。ＥＢ９６再集合体は、Ｓ４遺伝子の性質に起因してＥＢ１０８単独よりも効果的である。なぜならば、これらのウイルスは、この遺伝子の親起源においてのみ異なるからである。このことは、Ｔ１Ｌ  Ｓ４遺伝子が、Ｔ３Ｄ  Ｓ４遺伝子よりも増強された腫瘍溶解特性を与えることを示す。Ｓ４遺伝子は、ＰＫＲの活性化をブロックするｄｓＲＮＡ結合タンパク質をコードするので、Ｔ１Ｌ  Ｓ４遺伝子は、この能力において異なり、従って、Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄゲノムセグメントの他の組み合わせと強調して、腫瘍溶解能力を制御し得る。結論として、親Ｔ１ＬおよびＴ３Ｄウイルスと比較しての、腫瘍溶解におけるＥＢ９６再集合体の効果の劇的な増大は、特定の遺伝子型を有するレオウイルスの再集合体が、活性な免疫応答を有する宿主の転移性腫瘍における、増強された、効果的な腫瘍溶解能力を有するという原理の証明を実証する（表６）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【表７】
2004519431.tif 000003
（実験６：Ｔ１Ｌ×Ｔ３Ｄ再集合体が、インビトロで腫瘍を溶解する能力）
ＮＣＩ腫瘍パネル（ＳＦ５３９、ｃｎｓ；ＳＫＭＥＬ２８、黒色腫；ＨＴ２９；ＮＣＩ
Ｈ２３、ｎｓｃ−肺；ＳＷ６２０、結腸；ＤＵ１４５、前立腺）から得た腫瘍細胞株のパネルに、１０の感染効率で、Ｔ１Ｌ、Ｔ３Ｄまたはその再集合体、ＥＢ９６およびＥＢ１０８を感染させ、細胞病理学的効果について、５日間にわたって観察した。腫瘍細胞を溶解する能力を、−〜＋＋＋の段階で視覚的にスコアした。−は、モック感染細胞との差異が存在しないことを示し、そして＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ、３３％の細胞破壊、６６％の細胞破壊および完全な溶解を示す。異なる腫瘍細胞型は、異なるレオウイルス親株または再集合体による溶解に対する感受性が異なったが、再集合体ウイルスは、全て、インビトロの腫瘍細胞溶解においてＴ３Ｄ親ウイルス同様に有効か、またはＴ３Ｄ親ウイルスよりも有効であった（表７）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
【表８】
2004519431.tif 000004
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2004519431.tif 000005
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2004519431.tif 000006
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2004519431.tif 000007