【手続補正書】
【提出日】平成16年11月19日(2004.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  式Ｉ
【化１】
2004525088.tif 000001
［式中、
Ｒ（１）はＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、（Ｃ3〜Ｃ6）−シクロアルキルまたはフェニルであって、ここで、芳香核は置換されていないかＦ、Ｃｌ、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキル、メトキシもしくは−（ＣＦ2）a−ＣＦ3の群に属する１〜３個の置換基によって置換されているものであり、
ａは０、１、２または３であり；
Ｒ（２）は（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、−ＣbＨ2b−（Ｃ3〜Ｃ6）−シクロアルキル、−ＣbＨ2b−フェニル、−ＣbＨ2b−ピリジニル、−ＣbＨ2b−チオフェニル、−ＣbＨ2b−フラニルであって、ここで、芳香性基は置換されていないかＦ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキル、メトキシもしくは−ＳＯ2ＮＲ（４）Ｒ（５）の群に属する１〜３個の置換基によって置換されているものであり、
Ｒ（４）およびＲ（５）は互いに独立に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルであり、
ｂは０、１、２、３または４であり；
Ｒ（３）は−ＣdＨ2d−フェニルであって、ここで、芳香核は置換されていないかＦ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキルもしくはメトキシの群に属する１〜３個の置換基によって置換されているものであり、
ｄは３または４である］
のアントラニル酸または医薬上許容できるその塩。
【請求項２】  Ｒ（１）がＣｌ、（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルまたはフェニルであって、
ここで、芳香核は置換されていないかＦ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキルもしくはメトキシからなる群から選択される１〜３個の置換基によって置換されているものであり；    
Ｒ（２）が（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキル、−ＣbＨ2b−シクロヘキシル、−ＣbＨ2b−フェニル、−ＣbＨ2b−ピリジニル、−ＣbＨ2b−チオフェニル、−ＣbＨ2b−フラニルであって、ここで、芳香性基は置換されていないかＦ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキル、メトキシもしくは−ＳＯ2ＮＨ2からなる群から選択される１〜３個の置換基によって置換されているものであり、
ｂが０、１または２であり；
Ｒ（３）が−ｎ−Ｃ4Ｈ8−フェニルであって、ここで、フェニルは置換されていないかＦ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキルもしくはメトキシからなる群から選択される１〜３個の置換基によって置換されているものである、
請求項１に記載の式Ｉの化合物または医薬上許容できるその塩。
【請求項３】  Ｒ（１）がＣｌ、（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルまたはフェニルであって、ここで、芳香核は置換されていないかＦ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキルもしくはメトキシからなる群から選択される１〜３個の置換基によって置換されているものであり；    
Ｒ（２）が（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキル、−ＣbＨ2b−シクロヘキシル、−ＣbＨ2b−フェニル、−ＣbＨ2b−ピリジニル、−ＣbＨ2b−チオフェニル、−ＣbＨ2b−フラニルであって、ここで、芳香性基は置換されていないかＦ、Ｃｌ、ＣＦ3、（Ｃ1〜Ｃ3）−アルキル、メトキシもしくは−ＳＯ2ＮＨ2からなる群から選択される１〜３個の置換基によって置換されているものであり、
ｂが１であり；
Ｒ（３）が−ｎ−Ｃ4Ｈ8−フェニルである、
請求項１に記載の式Ｉの化合物および医薬上許容できるその塩。
【請求項４】  ４−クロロ−５−（３−クロロ−４−フルオロベンジルスルファモイル）−２−フェニルブチルアミノ安息香酸である請求項１に記載の化合物または医薬上許容できるその塩。
【請求項５】  不整脈の治療用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項６】  心筋梗塞の治療または予防用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項７】  狭心症の治療または予防用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項８】  心臓の虚血状態の治療または予防用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項９】  末梢神経系および中枢神経系の虚血状態のおよび卒中の治療または予防用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１０】  周辺臓器および四肢の虚血状態の治療または予防用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１１】  ショック状態の治療用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１２】  外科手術および臓器移植用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１３】  外科的手段のための移植臓器の保存および保管用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１４】  細胞の増殖が主原因または二次的原因である疾病の治療用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１５】  脂質代謝の障害の治療または予防用医薬を製造するための請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１６】  請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物を有効量含有する治療薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
分析システム：
ＨＰＬＣ  １Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００
勾配のつけ方：７分間で１０％ＡＣＮ（０.１％ＴＦＡ）／９０％水（０.１％ＴＦＡ）から９０％ＡＣＮ（０.１％ＴＦＡ）／１０％水（０.１％ＴＦＡ）まで、流量２.５ml／分
カラム：Ａｌｔｅｃｈ  ＲＰ１８、３μm、７×３５mm
ＭＳ：Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ−ＥＳＩ−ＴＯＦ、［Ｍ−Ｈ+］-、特記ないかぎり１００％ピーク
ＨＰＬＣ  ２Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣ／ＭＳＤ
勾配のつけ方：４分間で５％ＡＣＮ（０.０５％ＴＦＡ）／９５％水（０.０５％ＴＦＡ）から９５％ＡＣＮ（０.０５％ＴＦＡ）／５％水（０.０５％ＴＦＡ）まで、流量０.５ml／分
カラム：ＥＳＩ、［Ｍ＋Ｈ+］+、Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ１８、５μm、２×５５mm
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
測定の実施
前日に、トランスフェクトされた細胞を増殖培地２００μl中約１５,０００細胞／ウェルの密度でウェルが９６個あるマイクロタイタープレート内に播種し、そしてＣＯ2培養器内で３７℃で一晩培養する。ｐＨ感受性蛍光色素ＢＣＥＣＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Eugene, OR, USA）、前駆体ＢＣＥＣＦ−ＡＭを使用した）を使用して、トランスフェクトされた細胞の細胞内ｐＨを測定する。細胞にまずＢＣＥＣＦ−ＡＭをロードする。培地中に存在するウシ胎仔血清がＢＣＥＣＦ染色を妨げる可能性があるので、前日に播種された増殖培地を手で取り除く。染色するために、１００μlのＮＨ4Ｃｌ染色緩衝液（２０mMのＮＨ4Ｃｌ、１１５mMのＮａＣｌ、１mMのＭｇＳＯ4、１mMのＣａＣｌ2、５mMのＣａＣｌ2、５mMのＫＣｌ、２０mMのＨＥＰＥＳ、５mMのクルコース；１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨが７.４に調整されている）を、５μMのＢＣＥＣＦ−ＡＭが入った各々のウェルの細胞に添加する。ＣＯ2培養器内で染色溶液と共に細胞を３７℃で２０分培養した。この時間にわたって、一方で、ＮＨ4+イオンが細胞中で濃縮し、これによって僅かなアルカリ化が生じ、また他方、ＢＣＥＣＦ−ＡＭが細胞内に入り、そこで細胞膜を透過しない色素ＢＣＥＣＦがエステラーゼの作用によってＢＣＥＣＦ−ＡＭから放出される。細胞を酸性化するため、次ぎにＮａ+もＮＨ4+も含まない洗浄緩衝剤（１３３.８mMの塩化コリン、４.７mMのＫＣｌ、１.２５mMのＣａＣｌ2、１.２５mMのＭｇＣｌ2、０.９７mMのＫ2ＨＰＯ4、０.２３mMのＫＨ2ＰＯ4、５mMのＨＥＰＥＳ、５mMのグルコース；１ＭのＫＯＨを使用してｐＨを７.４に調整）を使用して細胞を細胞洗浄水中で完全に洗浄（ウェルあたり全体積が１.２mlで３回の洗浄）する。この洗浄工程は細胞内ｐＨの劇的な低下（約６.３〜６.４）をもたらす。しかしながら、洗浄緩衝液はナトリウムイオンも重炭酸イオンも含まないので、細胞はその細胞内ｐＨを調整できない。細胞内ｐＨの回復の実際の測定は、Molecular Device社（Sunnyvale，CA，USA）のＦＬＩＰＲ（Fluorescence Imaging Plate Reader）内で行う。ＦＬＩＰＲは、４８８nmのバンドがＢＣＥＣＦの励起に極めて好適であるアルゴンレーザーを有する。複雑なビーム導波によってマイクロタイタープレートの９６個のすべてのウェルを同時に刺激し、これによって同時に測定することができる。ＦＬＩＰＲ構造の特定の様式のため、各々のウェル中の５０μm未満のものだけが励起する。このためにＣＨＯのような付着細胞を使用するのが好ましい。励起した細胞から放出される光は、５１０〜５７０nmの間が半透明であるフィルターをまず通過し、次いでＣＣＤカメラによって記録する。ＦＬＩＰＲは内蔵する９６チップのピペッターもまた有するので、同体積の所望とする任意の液体をマイクロタイタープレートの９６個のすべてのウェル中にピペットで同時に入れることができる。マイクロタイタープレートの全体を大体１秒毎に全部測定することができる。ＦＬＩＰＲにおいては、１８０μlの物質緩衝剤（９０mMのＮａＣｌ、２５mMのＮａＨＣＯ3、２５mMのＫＣｌ、１mMのＭｇＣｌ2、１mMのＣａＣｌ2、０.８mMのＫ2ＨＰＯ4、０.２mMのＫＨ2ＰＯ4、１０mMのＨＥＰＥＳ、５mMのグルコース；測定日に純粋なＣＯ2を５秒間通過させ、そして１ＭのＮａＯＨを使用し���ｐＨを７.４に調整する；しかしながら、測定結果をそれほど変化させることなくＣＯ2の通過を省略することもできる）がそれぞれの場合に細胞にピペットで入れられ、細胞は洗浄の後に酸性化される。これらの緩衝条件下で同様に活性のあるｐＨ調整系ＮＨＥおよびＮＣＢＥを阻害するために、物質緩衝剤はこの交換体の別な特定の阻害剤を追加的に含有する。ＮＨＥ阻害剤のカリポリドメシレート（ＥＰ  ５８９  ３３６）の最終濃度は１０μＭであり、ＥＰ８５５  ３９２の実施例１のＮＣＢＥ阻害剤：エチル２−ブチル−５−メチルスルファニル−３−（２′−シアナミノスルホニル−ビフェニル−４−イルメチル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カーボネートの最終濃度は３０μMである。物質緩衝剤の添加の後、予め酸性化された細胞の細胞内ｐＨは、ＮＢＣの活性の結果として増大し、このことは、ｐＨ感受性色素の蛍光の増加により顕著なものにする。
次ぎに、物質の阻害作用は、この物質の影響下での、ｐＨの増大に対して直線状にふるまう蛍光の増加を、ＮＢＣが阻害されていない［活性１００％、カリポリドメシレートとＥＰ  ８５５  ３９２の実施例１のＮＣＢＥブロッカーだけの添加］か、完全に阻害されている［活性０％、カリポリドメシレートとＥＰ  ８５５  ３９２の実施例１のＮＣＢＥブロッカーを加えて４００μMのＤＣＤＰＣ、４−クロロ−２−（３−クロロフェニルアミノ）安息香酸もまた添加］ウェルの蛍光の増加と比較することにより測定する。