(57)【要約】  ＲＮＡ干渉によってＢ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡであって、Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同な１９〜２５塩基のＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなる、二本鎖ＲＮＡを提供する。
2009005095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉によってＢ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡであって、
前記Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同な１９〜２５塩基のＲＮＡと、該ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡと、からなる二本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡは、ＮＰタンパク質遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット遺伝子、又はＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット遺伝子のｍＲＮＡである、請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項３】
前記ＲＮＡは、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるか、又は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択される、請求項１又は２記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項４】
前記ＲＮＡは、配列表の配列番号１〜１１に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるか、又は、配列表の配列番号１〜１１に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択される、請求項１又は２記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項５】
Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株を用いたトランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニングでＳ／Ｎ比が３以上である、請求項１又は２記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
前記ＲＮＡは、１個以上の修飾リボヌクレオチドを含んでもよい、請求項１〜５のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項７】
前記ＲＮＡは、１個以上のホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合に置換されていてもよい、請求項１〜６のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項８】
平滑末端を形成している、請求項１〜７のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に１〜４塩基のＤＮＡ又はＲＮＡが付加され、突出端を形成している、二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡを細胞内で形成するヘアピン型ＲＮＡであって、
前記Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同なＲＮＡと、該ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡと、がリンカー配列を介して連結されている、ヘアピン型ＲＮＡ。
【請求項１１】
配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ、に相補的な第１のＤＮＡと、該第１のＤＮＡに相補的な第２のＤＮＡと、を含み、かつ、前記第１のＤＮＡ及び前記第２のＤＮＡのそれぞれの５’側にプロモーターを含む、二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターであって、
前記ベクターは、導入された細胞内で、前記第１のＤＮＡに相補的な第１のＲＮＡと、前記第２のＤＮＡに相補的な第２のＲＮＡと、を転写し、
前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとは、それぞれハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成する、
ベクター。
【請求項１２】
配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ、の３’末端に１〜４塩基のＲＮＡが付加されたＲＮＡに相補的な第１のＤＮＡと、
配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ、の３’末端に１〜４塩基のＲＮＡが付加されたＲＮＡに相補的な第２のＤＮＡと、を含み、かつ、
前記第１のＤＮＡと前記第２のＤＮＡのそれぞれの５’側にプロモーターを含む、二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターであって、
前記ベクターは、導入された細胞内で、前記第１のＤＮＡに相補的な第１のＲＮＡと、前記第２のＤＮＡに相補的な第２のＲＮＡと、を転写し、
前記第１のＲＮＡと前記第２のＲＮＡとは、それぞれハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成する、
ベクター。
【請求項１３】
配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡと、該アンチセンスＤＮＡに相補的なＤＮＡと、がリンカー配列を介して連結されたヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖を含み、かつ、前記ＤＮＡ鎖の５’側にプロモーターを含む、ヘアピン型ＲＮＡ発現用のベクターであって、
前記ベクターは、導入された細胞内で前記ヘアピン型ＲＮＡを転写し、
前記ヘアピン型ＲＮＡは、細胞内でプロセシングされて二本鎖ＲＮＡを形成する、
ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項１０記載のヘアピン型ＲＮＡ、又は請求項１１〜１３のいずれか一項記載のベクター、を有効成分として少なくとも１種以上含有する、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項１０記載のヘアピン型ＲＮＡ、又は請求項１１〜１３のいずれか一項記載のベクター、を有効成分として少なくとも１種以上含有する、抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項１０記載のヘアピン型ＲＮＡ、又は請求項１１〜１３のいずれか一項記載のベクターと、形質導入試薬と、を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出キット。
【請求項１７】
ＲＮＡ干渉によってＡ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡを更に含有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉によってＡ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡを更に含有する、請求項１５に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ＲＮＡ、ヘアピン型ＲＮＡ、及びベクター、並びに、これらを含有する医薬組成物、抗インフルエンザウイルス剤、及びＢ型インフルエンザウイルスの検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、世界中で最も蔓延している感染症の１つであり、毎年２５万〜５０万人の死者が発生している。日本においても、毎年人口の５〜１５％がインフルエンザに罹患し、高齢者及び免疫低下患者等がインフルエンザに罹患した場合には、肺炎を併発して死亡する例もある。【０００３】
インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子を構成するタンパク質の抗原性の違いから、Ａ型、Ｂ型及びＣ型の３属に分類されるが、人に感染を引き起こし、毎年冬期に流行を繰り返すのは、主にＡ型とＢ型である。【０００４】
インフルエンザの予防には、インフルエンザワクチンが利用されている。世界的には、弱毒生ワクチン（弱毒性の生きた病原体を使うもの）、不活化ワクチン（不活化処理をして感染性を失わせた病原体を使うもの）、及び成分ワクチン（病原体の特定の成分を精製して使うもの）が使用されているが、日本では、インフルエンザウイルスの予防のために、成分ワクチンのみが実用化されている。【０００５】
インフルエンザワクチンは、前シーズンに流行したインフルエンザウイルス株の情報、同時期に外国で分離されたインフルエンザウイルスの遺伝子情報、及びインフルエンザウイルス株に対する国民の抗体保有状況等に基づいて、その年の流行株を予測して製造される。【０００６】
インフルエンザの治療方法としては、抗インフルエンザウイルス剤による薬物療法が挙げられ、日本では、抗インフルエンザウイルス剤として、アマンタジンとノイラミニダーゼ阻害剤（オセルタミビル及びザナミビル）が許可されている（非特許文献１）。【０００７】
一方、近年になって、特定の遺伝子の発現を抑制する手法の一つとして、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ；ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略）が発見された。ＲＮＡ干渉とは、標的遺伝子の特定領域と相同な二本鎖ＲＮＡによって、標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分が特異的に切断され、標的遺伝子の発現が抑制される生命現象である（特許文献１）。【０００８】
哺乳動物細胞では、長鎖の二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、インターフェロンが誘導され、アポトーシスが引き起こされるが、２１〜２３ｂｐの短鎖の二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すれば、アポトーシスが引き起こされることなく標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に切断し、標的遺伝子の機能を阻害できることが明らかになっている（特許文献２）。なお、哺乳動物細胞にＲＮＡ干渉を引き起こす短鎖の二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略）と呼ばれている。
【特許文献１】国際公開１９９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００１／０７５１６４号パンフレット
【非特許文献１】菅谷憲夫、日本臨床、２００６年、６４巻、ｐ．１８４０−１８４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、インフルエンザウイルスの流行株を正確に予測することは非常に難しく、流行株の予測が外れた場合には、インフルエンザワクチンの効果が著しく低下するのが現状である。【００１０】
また、流行株の予測が当たった場合であっても、インフルエンザワクチンの投与によって、発熱、発疹、痙攣、アナフィラキシーショック、及び肝機能障害等の副作用が生じ、最悪の場合には死亡する例もある。【００１１】
さらに、アマンタジンは、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を標的とする抗インフルエンザウイルス剤であるため、Ｍ２タンパク質を有さないＢ型インフルエンザウイルスに対しては無効である。また、ノイラミニダーゼ阻害剤は、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する効果が弱く、その一方で、重篤な副作用が問題となっている。すなわち、Ａ型インフルエンザウイルスと比較して、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する効果的な治療方法がないのが現状である。【００１２】
そこで本発明は、広範囲のＢ型インフルエンザウイルス株の複製を抑制し、Ｂ型インフルエンザウイルスによる感染症を治療し予防することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明は、ＲＮＡ干渉によってＢ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡであって、Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同な１９〜２５塩基のＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを提供する。【００１４】
本発明者らは、Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同な１９〜２５塩基のＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制することを発見し、哺乳動物細胞内に当該二本鎖ＲＮＡを導入すれば、Ｂ型インフルエンザウイルスによる感染症を効果的に治療し予防できることを見出した。【００１５】
上記ｍＲＮＡは、ＮＰタンパク質遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット遺伝子、又はＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット遺伝子のｍＲＮＡであることが好ましい。【００１６】
ＮＰタンパク質遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット遺伝子、又はＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット遺伝子から転写されたｍＲＮＡの一部に相同な１９〜２５塩基のＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すれば、ＲＮＡ干渉によってこれらの遺伝子から転写されて発現するｍＲＮＡを特異的に切断でき、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制できる。【００１７】
上記ＲＮＡは、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるか、又は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されることが好ましいが、配列表の配列番号１〜１１に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるか、又は、配列表の配列番号１〜１１に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されることがさらに好ましい。【００１８】
配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列を有するいずれかのＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すれば、ＲＮＡ干渉によってＢ型インフルエンザウイルスの複製をさらに強く抑制できる。また、配列表の配列番号１〜１１に示される塩基配列を有するいずれかのＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すれば、さらに広範囲のＢ型インフルエンザウイルス株の複製を抑制できる。【００１９】
上記二本鎖ＲＮＡは、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株を用いたトランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニングで、Ｓ／Ｎ比が３以上であることが好ましい。【００２０】
Ｓ／Ｎ比が３以上ある二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断をより特異的に行うことができる。【００２１】
上記ＲＮＡは、１個以上の修飾リボヌクレオチドを含むことができ、上記修飾リボヌクレオチドは、リボース環の２’−ＯＨ基が、フルオロ基、メチル基、メトキシエチル基、又はプロピル基で置換されていることが好ましい。また、上記ＲＮＡは、１個以上のホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合に置換されていてもよい。【００２２】
細胞内に導入されたＲＮＡは、細胞中のリボヌクレアーゼによって分解され得るが、ＲＮＡ鎖に上記の修飾がなされていれば、リボヌクレアーゼに対して耐性となり、効率的にＲＮＡ干渉作用を発揮できる。【００２３】
上記二本鎖ＲＮＡは、平滑末端を形成していてもよいが、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に１〜４塩基のＤＮＡ又はＲＮＡが付加され、突出端を形成している二本鎖ＲＮＡであることが好ましい。【００２４】
突出端を形成している二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉作用が強まり、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製をより顕著に抑制できる。【００２５】
また、本発明は、上記の二本鎖ＲＮＡを細胞内で形成するヘアピン型ＲＮＡであって、Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同なＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとがリンカー配列を介して連結されているヘアピン型ＲＮＡを提供する。【００２６】
上記ヘアピン型ＲＮＡは、２種類の一本鎖ＲＮＡをアニールさせて二本鎖ＲＮＡを形成することが不要であり、１種類のＲＮＡを化学合成等して作成できるため、取り扱いが容易である。さらに、ヘアピン型ＲＮＡは、細胞内で二本鎖ＲＮＡを形成するため、ＲＮＡ干渉作用を発揮し、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制できる。【００２７】
上記二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルス株である、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株のすべての複製を抑制することが好ましい。【００２８】
上記のすべてのインフルエンザウイルス株の複製を抑制できる二本鎖ＲＮＡは、インフルエンザウイルス株が変異した場合であっても、有効となる可能性が高い。【００２９】
本発明は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ、に相補的な第１のＤＮＡと、該第１のＤＮＡに相補的な第２のＤＮＡとを含み、かつ、上記第１のＤＮＡ及び上記第２のＤＮＡのそれぞれの５’側にプロモーターを含む、二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターであって、上記ベクターは、導入された細胞内で、上記第１のＤＮＡに相補的な第１のＲＮＡと、上記第２のＤＮＡに相補的な第２のＲＮＡとを転写し、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、それぞれハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するベクターを提供する。【００３０】
また本発明は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ、の３’末端に１〜４塩基のＲＮＡが付加されたＲＮＡに相補的な第１のＤＮＡと、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ、の３’末端に１〜４塩基のＲＮＡが付加されたＲＮＡに相補的な第２のＤＮＡとを含み、かつ、上記第１のＤＮＡと上記第２のＤＮＡのそれぞれの５’側にプロモーターを含む、二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターであって、上記ベクターは、導入された細胞内で、上記第１のＤＮＡに相補的な第１のＲＮＡと上記第２のＤＮＡに相補的な第２のＲＮＡとを転写し、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、それぞれハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するベクターを提供する。【００３１】
また本発明は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡと、該アンチセンスＤＮＡに相補的なＤＮＡとがリンカー配列を介して連結されたヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖を含み、かつ、上記ＤＮＡ鎖の５’側にプロモーターを含む、ヘアピン型ＲＮＡ発現用のベクターであって、上記ベクターは、導入された細胞内で上記ヘアピン型ＲＮＡを転写し、このヘアピン型ＲＮＡは、細胞内でプロセシングされて二本鎖ＲＮＡを形成するベクターを提供する。【００３２】
上記ベクターを細胞内に導入すれば、ＲＮＡ干渉を引き起こす二本鎖ＲＮＡが細胞内で継続的に転写され、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を長期にわたって抑制できる。【００３３】
上記ベクターは、哺乳動物細胞で二本鎖ＲＮＡを効率的に発現させるために、プラスミドベクター又はウイルスベクターであることが好ましい。【００３４】
また、上記二本鎖ＲＮＡ、上記ヘアピン型ＲＮＡ、又は上記ベクターは、哺乳動物の細胞に導入すればＢ型インフルエンザウイルスの複製を抑制できるため、医薬組成物又は抗インフルエンザウイルス剤として利用できる。【００３５】
上記医薬組成物又は抗インフルエンザウイルス剤は、上記二本鎖ＲＮＡ、上記ヘアピン型ＲＮＡ、又は上記ベクターを複数含有することもできる。実施例に示すように、二本鎖ＲＮＡの配列によっては、あるウイルス株に効果を示さない場合もあるが、複数の二本鎖ＲＮＡを併用することにより、そのような株にも効果を発揮できる場合がある。【００３６】
また、実施例に示すように、１種類の二本鎖ＲＮＡでは時間が経つと効果が減弱することがあるが、複数の二本鎖ＲＮＡを併用することにより、効果がより長時間持続する場合がある。【００３７】
さらに、上記二本鎖ＲＮＡ、又は上記ヘアピン型ＲＮＡ若しくは上記ベクターから生じる二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルス由来のｍＲＮＡを特異的に切断する活性を有するため、上記二本鎖ＲＮＡ、上記ヘアピン型ＲＮＡ、又は上記ベクターと、形質導入試薬とを含むキットは、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出キットとして利用できる。【００３８】
上記医薬組成物又は抗インフルエンザウイルス剤は、ＲＮＡ干渉によってＡ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡを更に含有してもよい。【００３９】
このような医薬組成物又は抗インフルエンザウイルス剤は、感染病原体がＡ型、Ｂ型インフルエンザウイルスのいずれであるかを問わずに治療効果を発揮でき、同時に両株による重複感染が生じた場合でも対応可能である。
【発明の効果】
【００４０】
本発明の二本鎖ＲＮＡ、ヘアピン型ＲＮＡ、及びベクターを哺乳動物の細胞に導入すれば、Ｂ型インフルエンザウイルスによる感染症を効果的に治療し予防できる。また、本発明の二本鎖ＲＮＡは、複数種類のＢ型インフルエンザウイルス株に対してウイルスの複製を抑制する活性を有するため、二本鎖ＲＮＡの標的配列に変異をもったＢ型インフルエンザウイルスが出現した場合であっても、ウイルス由来のｍＲＮＡを切断し、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制できる。このため、Ｂ型インフルエンザウイルスの流行株が不明の場合であっても、Ｂ型インフルエンザウイルスによる感染症に対して治療効果を発揮できる。【００４１】
本発明の医薬組成物および抗インフルエンザウイルス剤は、同時に２種類以上の二本鎖ＲＮＡを含み得る。一例を挙げれば、Ａ型インフルエンザウイルスにターゲティングされた二本鎖ＲＮＡを少なくとも１種類と、Ｂ型インフルエンザウイルスにターゲティングされた二本鎖ＲＮＡを少なくとも１種類同時に使用できる。この使用法により、感染病原体がＡ型、Ｂ型インフルエンザウイルスのいずれであるかを問わずに本医薬組成物を使用でき、同時に両株による重複感染が生じた場合でも対応可能となる。また別の例を挙げれば、Ｂ型インフルエンザウイルスにターゲティングされた二本鎖ＲＮＡを少なくとも２種類以上同時に使用できる。この使用法により、感染病原体がＢ型インフルエンザウイルスであった場合の二本鎖ＲＮＡの効果を拡大および増強することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】トランスフェクションマイクロアレイによる、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法の手順を示したものである。
【図２】（Ａ）インフルエンザウイルスＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株に対する、二本鎖ＲＮＡ  ＮＰ−１４９６単独、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３単独並びにＮＰ−１４９６及びＢ−ＮＰ−１９９９−１３の組み合わせの阻害率を示す。（Ｂ）インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株に対する、二本鎖ＲＮＡ  ＮＰ−１４９６単独、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３単独並びにＮＰ−１４９６及びＢ−ＮＰ−１９９９−１３の組み合わせの阻害率を示す。
【図３】（Ａ）インフルエンザウイルスＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株に対する、二本鎖ＲＮＡ  Ｂ−ＰＢ２−１９９７−７単独、Ｂ−ＰＢ１−１９９９−１単独並びにＢ−ＰＢ２−１９９７−７及びＢ−ＰＢ１−１９９９−１の組み合わせの阻害率を示す。（Ｂ）インフルエンザウイルスＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株に対する、二本鎖ＲＮＡ  Ｂ−ＰＢ２−１９９７−７単独、Ｂ−ＰＢ１−１９９９−１単独並びにＢ−ＰＢ２−１９９７−７及びＢ−ＰＢ１−１９９９−１の組み合わせの阻害率を示す。
【図４】（Ａ）１８時間培養における、インフルエンザウイルスＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株に対する、二本鎖ＲＮＡ  Ｂ−ＮＰ−１９９９−３単独、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３単独並びにＢ−ＮＰ−１９９９−３及びＢ−ＮＰ−１９９９−１３の組み合わせの阻害率を示す。（Ｂ）１８時間培養における、インフルエンザウイルスＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株に対する、二本鎖ＲＮＡ  Ｂ−ＮＰ−１９９９−３単独、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３単独並びにＢ−ＮＰ−１９９９−３及びＢ−ＮＰ−１９９９−１３の組み合わせの阻害率を示す。（Ｃ）３０時間培養における、インフルエンザウイルスＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株に対する、二本鎖ＲＮＡ  Ｂ−ＮＰ−１９９９−３単独、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３単独並びにＢ−ＮＰ−１９９９−３及びＢ−ＮＰ−１９９９−１３の組み合わせの阻害率を示す。（Ｄ）３０時間培養における、インフルエンザウイルスＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株に対する、二本鎖ＲＮＡ  Ｂ−ＮＰ−１９９９−３単独、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３単独並びにＢ−ＮＰ−１９９９−３及びＢ−ＮＰ−１９９９−１３の組み合わせの阻害率を示す。
【符号の説明】
【００４３】
１…スポット位置、２…スポッター、３…ガラススライド、４…二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ、５…細胞懸濁液、６…シャーレ、７…Ｂ型インフルエンザウイルス液、８…染色後の二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。【００４５】
まず、本発明の二本鎖ＲＮＡについて説明する。【００４６】
本発明の二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によってＢ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡであって、Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同な１９〜２５塩基のＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなることを特徴としている。【００４７】
「ＲＮＡ干渉によってＢ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する」とは、インフルエンザウイルスを構成するタンパク質の合成を直接的に抑制することではなく、標的となるウイルス遺伝子のｍＲＮＡを配列特異的に切断することによって抑制することをいい、ウイルスの複製を一過性に抑制することも含むものである。【００４８】
これは「ＲＮＡ干渉によってＡ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する」場合においても同様である。【００４９】
「ＲＮＡ」とは、核酸の一つであって、リボースと、リン酸と、塩基（アデニン、グアニン、シトシン又はウラシル）とからなるリボヌクレオチドのポリマーのことをいう。ＲＮＡは、ＤＮＡと同様に相補水素結合を形成することができるため、一本鎖、二本鎖、又はヘアピン型ＲＮＡの構造をとることが可能である。【００５０】
ＲＮＡは、従来の化学合成手法に基づいて合成することができ、例えば、核酸合成機で合成したり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで鋳型ＤＮＡを転写させること（インビトロ転写）によっても合成できる。その際、予め長い二本鎖ＲＮＡを合成し、ダイサー酵素で処理することによって、１９〜２５ｂｐの短い二本鎖ＲＮＡの混合集団を得ることもできる。【００５１】
「Ｂ型インフルエンザウイルス」とは、オルトミクソウイルス科に属し、ヒトに感染してインフルエンザを起こすＲＮＡウイルスである。Ｂ型インフルエンザウイルスは、マイナス鎖の一本鎖ＲＮＡからなるＲＮＡゲノム上に、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ＮＢタンパク質（ＮＢ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）、Ｍ１タンパク質（Ｍ１）、ＢＭ２タンパク質（ＢＭ２）、ＮＰタンパク質（核蛋白；ＮＰ）、及びＮＳタンパク質（非構造蛋白；ＮＳ）をコードするウイルス遺伝子を有している。【００５２】
Ｂ型インフルエンザウイルスがヒトに感染すると、ゲノムＲＮＡを鋳型に、ウイルス自身の持つＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによって各ウイルス遺伝子のｍＲＮＡが転写され、宿主細胞のリボソームで各ウイルスタンパク質が合成され、別経路で複製されたウイルスゲノムとこれらのウイルスタンパク質の１セットが細胞内で集合することによって、ウイルス粒子が複製される。このため、上記のウイルス遺伝子の翻訳産物は、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製に必須であり、これらの遺伝子の発現を抑制できれば、Ｂ型インフルエンザウイルスによる感染症を治療し、予防することが可能となる。【００５３】
上記の二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子、ノイラミニダーゼ遺伝子、ＮＢタンパク質遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット遺伝子、Ｍ１タンパク質遺伝子、ＢＭ２タンパク質遺伝子、ＮＰタンパク質遺伝子、又はＮＳタンパク質遺伝子のｍＲＮＡの一部に相同な１９〜２５塩基のＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとをそれぞれ合成し、これらのＲＮＡをアニールさせることによって作成できる。【００５４】
Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を強く抑制するためには、標的とするｍＲＮＡが、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＰタンパク質遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット遺伝子、又はＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット遺伝子のｍＲＮＡであることが好ましく、ＮＰタンパク質遺伝子のｍＲＮＡであることがより好ましい。【００５５】
Ｂ型インフルエンザウイルスの各遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の遺伝子データベースにおいて公開されており、これらの塩基配列情報に基づいて二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡを設計できる。【００５６】
上記ＲＮＡは、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるか、又は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されることが好ましいが、配列表の配列番号１〜１１に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるか、又は、配列表の配列番号１〜１１に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されることがさらに好ましい。【００５７】
配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＰタンパク質遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット遺伝子、及びＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット遺伝子、のｍＲＮＡの一部配列であり、これらの遺伝子の塩基配列情報に基づいて二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡを設計できる。【００５８】
上記ＲＮＡは、リボヌクレアーゼによる分解に対して耐性を付与するために、１個以上の修飾リボヌクレオチドを含むことができ、修飾リボヌクレオチドとしては、リボース環の２’−ＯＨ基がフルオロ基、メチル基、メトキシエチル基、又はプロピル基で置換されたリボヌクレオチドが例示できる。【００５９】
置換されるリボース環は、ピリミジン、プリン又はそれらの組み合わせであってもよいが、ピリミジン、例えば、シトシン、シトシン誘導体、ウラシル、ウラシル誘導体又はそれらの組み合わせであることが好ましい。リボヌクレアーゼによる分解からＲＮＡを保護するためには、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の一方のＲＮＡ鎖において上記の修飾リボヌクレオチドが含まれていても、両方のＲＮＡ鎖に修飾リボヌクレオチドが含まれていてもよい。【００６０】
ＲＮＡをリボヌクレアーゼによる分解に対して耐性とするためには、ＲＮＡの１個以上のホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合に置換してもよい。【００６１】
リボース環の２’−ＯＨ基を他の官能基に置換したり、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換したりすることは、当業者であれば従来法の化学合成的手法を用いて行うことができる。【００６２】
Ｂ型インフルエンザウイルスの流行株は、ヘマグルチニン（ＨＡ）の抗原性の違いから、Ｂ／ビクトリア／２／８７と、Ｂ／山形／１６／８８という２つのグループに大別されるが、毎年流行するウイルス株は、各グループに属する異なるウイルス株である。Ｂ型インフルエンザウイルス株としては、例えば、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株が例示できる。【００６３】
上記二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルス株である、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株の中の２以上のウイルス株の複製を抑制することが好ましく、３以上のウイルス株の複製を抑制することがより好ましく、すべてのウイルス株の複製を抑制することがさらに好ましい。【００６４】
上記二本鎖ＲＮＡは、哺乳動物細胞にインターフェロンを誘導し、アポトーシスが引き起こされるのを避けるために、１９〜２５ｂｐであることが好ましく、１９〜２３ｂｐであることがより好ましく、１９〜２１ｂｐであることがさらに好ましい。【００６５】
また、本発明の二本鎖ＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に１〜４塩基のＤＮＡ又はＲＮＡが付加され、突出端を形成していることが好ましく、この突出端は、２塩基のＤＮＡ又はＲＮＡからなることがより好ましい。また、二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖の突出端の塩基配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的であることが好ましいが、必ずしも相補的である必要はなく、任意の塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡが３’末端に付加されていればよい。さらに、この突出端はＤＮＡからなることが好ましい。【００６６】
また、本発明のヘアピン型ＲＮＡは、上記の二本鎖ＲＮＡを細胞内で形成するヘアピン型ＲＮＡであって、Ｂ型インフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡの一部に相同なＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとがリンカー配列を介して連結されていることを特徴としている。リンカー配列は、ヘアピン構造の形成を阻害しない配列であれば任意の配列を使用できるが、リンカー配列の長さは４〜６塩基が好ましく、４塩基がより好ましい。【００６７】
Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡのスクリーニングは、例えば、動物細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）に二本鎖ＲＮＡを導入し、そこにＢ型インフルエンザウイルスを感染させることによってアポトーシスが誘導されるか否かを指標に行えばよい。【００６８】
すなわち、Ｂ型インフルエンザウイルス由来のｍＲＮＡを切断する二本鎖ＲＮＡが細胞に導入された場合には、動物細胞がＢ型インフルエンザウイルスの侵入を受けた場合であっても、細胞内でウイルスの複製が抑制され、アポトーシスが誘導されなくなる。このため、細胞が生存している場合には、その細胞に導入された二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡであると判定できる。一方、Ｂ型インフルエンザウイルス由来のｍＲＮＡを切断しない二本鎖ＲＮＡが細胞に導入された場合には、細胞内でウイルスの複製が起こり、最終的にアポトーシスが誘導されることとなる。さらに、アポトーシスが誘導された細胞は死滅し、培養プレート上から剥離するため、培養プレート上に張り付いて生存している細胞数の割合から、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡの活性（以下、抗インフルエンザウイルス活性）の強さについても判定できる。【００６９】
上記のスクリーニングは、トランスフェクションマイクロアレイを用いて行うことができる。トランスフェクションマイクロアレイのシステムは、例えば、ＣｙｔｏＰａｔｈｆｉｎｄｅｒ社の有する固相系遺伝子導入技術を用いることができる。【００７０】
トランスフェクションマイクロアレイを用いたスクリーニングでは、まず、ランダムに合成した二本鎖ＲＮＡをガラススライド上にスポットし、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイを作製する。その際、どの二本鎖ＲＮＡがガラススライド上のどのスポット位置にスポットされたかがわかるように、二本鎖ＲＮＡの塩基配列とスポット位置との関係をデータベース化しておく。【００７１】
その後、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイをシャーレの中に入れて固定し、そこに細胞と培地の懸濁液を注ぎ入れることによって、ＭＤＣＫ細胞を二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ上に播種する。１日間培養すると、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ上にスポットされた二本鎖ＲＮＡは、細胞膜を通じて細胞内に導入されるため、Ｂ型インフルエンザウイルス溶液を培地に加えて培養すれば、アポトーシスが誘導されずに生存している細胞は二本鎖ＲＮＡマイクロアレイの特定のスポット位置上に付着し続け、アポトーシスが誘導された細胞は二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ上から剥離することとなるため、細胞が付着しているスポット位置を指標に、抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡをスクリーニングできる。すなわち、細胞が付着しているスポット位置の情報から、抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡの塩基配列を得ることができる。【００７２】
次に、本発明のベクターについて説明する。【００７３】
本発明のベクターの第一の態様は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ、に相補的な第１のＤＮＡと、該第１のＤＮＡに相補的な第２のＤＮＡとを含み、かつ、上記第１のＤＮＡ及び上記第２のＤＮＡのそれぞれの５’側にプロモーターを含む、二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターであって、上記ベクターは、導入された細胞内で、上記第１のＤＮＡに相補的な第１のＲＮＡと、上記第２のＤＮＡに相補的な第２のＲＮＡとを転写し、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、それぞれハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成することを特徴としている。【００７４】
例えば、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖をコードするＤＮＡが第一プロモーターと制御可能に連結されており、かつ、二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖をコードするＤＮＡが第二プロモーターに制御可能に連結されているベクターを例示できる。この場合、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立に転写されることになるが、それぞれのプロモーターは同一であってもよく、又は相互に異なっていてもよい。【００７５】
上記の態様は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ、の３’末端に１〜４塩基のＲＮＡが付加されたＲＮＡに相補的な第１のＤＮＡと、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ、の３’末端に１〜４塩基のＲＮＡが付加されたＲＮＡに相補的な第２のＤＮＡとを含み、かつ、上記第１のＤＮＡと上記第２のＤＮＡのそれぞれの５’側にプロモーターを含む、二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターであって、上記ベクターは、導入された細胞内で、上記第１のＤＮＡに相補的な第１のＲＮＡと、上記第２のＤＮＡに相補的な第２のＲＮＡとを転写し、第１のＲＮＡと第２のＲＮＡとは、それぞれハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するものであってもよい。【００７６】
本発明のベクターの第二の態様は、配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡ又は配列表の配列番号１〜５７に示される塩基配列の１乃至３個のヌクレオチドが置換された塩基配列からなるＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡと、該アンチセンスＤＮＡに相補的なＤＮＡとがリンカー配列を介して連結されたヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖を含み、かつ、上記ＤＮＡ鎖の５’側にプロモーターを含む、ヘアピン型ＲＮＡ発現用のベクターであって、上記ベクターは、導入された細胞内で上記ヘアピン型ＲＮＡを転写し、このヘアピン型ＲＮＡは、細胞内でプロセシングされて二本鎖ＲＮＡを形成することを特徴としている。【００７７】
例えば、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡがリンカー配列を介して連結されたヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡが単一のプロモーターに制御可能に連結されているベクターを例示できる。この場合、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖とがリンカー配列によって連結された一本鎖ＲＮＡが産生される。この一本鎖ＲＮＡは、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分とがアニールすることによって、ヘアピン型ＲＮＡを形成することになる。リンカー配列は、ヘアピン構造の形成を阻害しない配列であれば任意の配列を使用できるが、リンカー配列の長さは４〜６塩基が好ましく、４塩基がより好ましい。【００７８】
上記のベクターは、遺伝子組換え技術によって、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡを作成するために用いられるものであり、宿主細胞において目的とするＲＮＡを転写して二本鎖ＲＮＡを作成できるものであればよい。上記ベクターは、プラスミド又はウイルスの形態をとることができ、プロモーター以外に、複製開始点、転写終結配列（ターミネーター）、選択マーカー（ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等）を含み、必要に応じてエンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含み得る。【００７９】
プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が挙げられ、ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられる。【００８０】
ＲＮＡの鋳型としてベクターに組み込むＤＮＡは、当技術分野において公知の方法により合成でき、ＲＮＡの転写合成を指示する適切なプロモーターの制御下に挿入すればよい。【００８１】
プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ及びメタロチオネインプロモーター、さらには、ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターであるＵ６プロモーター及びＨ１プロモーターを例示できる。また、プロモーターは、発現の「オン」又は「オフ」を変更可能とした誘導性のプロモーターであってもよい。【００８２】
なお、ベクターの構築に必要な分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）に記載されている。【００８３】
また、上記二本鎖ＲＮＡ、上記ヘアピン型ＲＮＡ、又は上記ベクターは、Ｂ型インフルエンザウイルスによる感染症の治療及び予防を目的とした医薬組成物又は抗インフルエンザウイルス剤として使用できる。【００８４】
上記の医薬組成物及び抗インフルエンザウイルス剤は、上記二本鎖ＲＮＡ、上記ヘアピン型ＲＮＡ、又は上記ベクターを有効成分として少なくとも１種以上含んでおり、必要に応じて薬学的に許容される添加物を含んでいてもよい。【００８５】
また、上記二本鎖ＲＮＡ、又は上記ヘアピン型ＲＮＡ若しくは上記ベクターから生じる二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルスの標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に切断できることから、この特性を利用したＢ型インフルエンザウイルスの検出キットとして使用できる。【００８６】
上記検出キットは、上記二本鎖ＲＮＡ、上記ヘアピン型ＲＮＡ、又は上記ベクターに加えて、形質導入試薬を含むことを特徴としている。【００８７】
形質導入試薬としては、例えば、脂質を含む試薬であって、当該脂質と目的のベクターが複合体を形成し、標的細胞にベクターを導入できる試薬が挙げられる。形質導入試薬に適した脂質としては、例えば、ポリアミン脂質、カチオン性脂質、ポリカチオン性脂質、コレステロール、中性脂質、カチオン性ポリアミン脂質を例示できる。【００８８】
上記の医薬組成物及び抗インフルエンザウイルス剤は、ＲＮＡ干渉によってＡ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡを更に含有してもよい。Ａ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡは公知であり、例えば米国特許出願公開２００６／０１６０７５９号明細書、米国特許出願公開２００６／０２７５２６５号明細書、国際公開２００４／０２８４７１号パンフレット及び国際公開２００６／１０２４６１号パンフレットなどに記載されたものを好ましく利用することができる。
【実施例】
【００８９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。【００９０】
（二本鎖ＲＮＡの設計及び合成）
Ｂ型インフルエンザウイルスのウイルス遺伝子から転写されるｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉によって切断し得る二本鎖ＲＮＡを得るために、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株の８種類のウイルス遺伝子の塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＹ０１８６１３（ヘマグルチニン遺伝子）、ＣＹ０１８６１４（Ｍ１タンパク質遺伝子及びＢＭ２タンパク質遺伝子）、ＣＹ０１８６１５（ノイラミニダーゼ遺伝子及びＮＢタンパク質遺伝子）、ＣＹ０１８６１６（ＮＰタンパク質遺伝子）、ＣＹ０１８６１７（ＮＳ１タンパク質遺伝子及びＮＳ２タンパク質遺伝子）、ＣＹ０１８６１８（ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット遺伝子）、ＣＹ０１８６１９（ＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット遺伝子）、ＣＹ０１８６２０（ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット遺伝子））を基に、これらの遺伝子の一部配列に相補的な１９〜２５塩基のＲＮＡと、そのＲＮＡのアンチセンスＲＮＡとからなる２，３６０種類の二本鎖ＲＮＡを設計した。これらの二本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉のターゲットとするｍＲＮＡの配列は、配列表の配列番号１〜２，３６０に示した通りである。【００９１】
二本鎖ＲＮＡの設計には、Ｋｈｖｏｒｏｖａ  Ａ．らの文献（Ｃｅｌｌ、２００３年、１１５巻、２号、ｐ．２０９−２１６）、Ｓｃｈｗａｒｚ  ＤＳ．らの文献（Ｃｅｌｌ、２００３年、１１５巻、２号、ｐ．１９９−２０８）、Ｈｓｉｅｈ  ＡＣ．らの文献（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２巻、３号、ｐ．８９３−９０１）、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ａ．らの文献（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００４年、２２巻、３号、ｐ．３２６−３３０）、及びＵｉ−Ｔｅｉ  Ｋ．らの文献（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２巻、３号、ｐ．９３６−９４８）を参考にして、ＲＮＡ干渉を引き起こし得る配列を選択した。【００９２】
設計した２，３６０種類の二本鎖ＲＮＡから８０種類の二本鎖ＲＮＡを選択し、Ｂ型インフルエンザウイルスのウイルス遺伝子から転写されるｍＲＮＡと相同な配列を有するＲＮＡの３’末端に２個のｄＴＴＰが付加されたＲＮＡと、そのアンチセンスＲＮＡの３’末端に上記塩基配列情報に基づきｍＲＮＡに対して相補的な２塩基のＤＮＡが付加されたＲＮＡとをそれぞれ化学合成した。合成されたＲＮＡとそのアンチセンスＲＮＡのセットは、両者のモル数が等しくなるようにアニーリングバッファー（１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、２ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、ｐＨ７．４）中で混合し、９０℃で５分間の変性処理を行った後、３７℃で１時間インキュベートすることによってアニールさせ、二本鎖ＲＮＡとした。【００９３】
（トランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法）
図１は、トランスフェクションマイクロアレイによる、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法の手順を示したものである。【００９４】
まず、図１（Ａ）に示される手順に従って、二本鎖ＲＮＡ混合溶液を調製した。具体的には、マイクロチューブに、血清を含まないＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）を２５μＬ入れ、そこに１００μＭの二本鎖ＲＮＡ（１〜１０μＬ）加えて混合し、引き続き、１〜５μＬの形質導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００；インビトロジェン社）を加えて混合し、２０分間静置した。その後、マイクロチューブ中の溶液に細胞接着因子（フィブロネクチン）を１０〜２００μｇ加えて混合し、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４の作成に用いる二本鎖ＲＮＡ混合溶液を調製した。【００９５】
次いで、図１（Ｂ）に示されるように、二本鎖ＲＮＡ混合溶液をスポッター２に充填し、ガラススライド３上に設けた所定のスポット位置１にスポットし、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４を作製した。その際、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制しないネガティブコントロール用の二本鎖ＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２２０７６；以下、コントロール二本鎖ＲＮＡ）の二本鎖ＲＮＡ混合溶液についても、同じガラススライド３上にスポットした。【００９６】
こうして作製された二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４は、どのスポット位置にどの塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡがスポットされているかを事後的に追跡できるように、スポット位置１と二本鎖ＲＮＡの配列情報との関係をデータベース化した。【００９７】
その後、図１（Ｂ）に示されるように、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４をシャーレ６の中にセットし、ＭＤＣＫ細胞を含有する細胞懸濁液５を注ぎ込むことによって播種し、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４上に細胞を付着させて、３７℃で１日間培養した。この結果、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４上にスポットされた各二本鎖ＲＮＡは、各スポット位置１上に張り付いたＭＤＣＫ細胞の細胞膜を通過して、細胞内に導入されることになる。【００９８】
その後、１．８×１０７ｐｆｕ／ｍＬのタイターに調製した５ｍＬのＢ型インフルエンザウイルス液７をシャーレ６に注ぎ込んで、３７℃で２３〜４７時間培養した。この結果、ＭＤＣＫ細胞中でウイルスの複製が起こり、アポトーシスが誘導された細胞は、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４から剥離することになる。【００９９】
その後、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４をシャーレ６から取り出し、ＰＢＳで洗浄し、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４上に残存する生存細胞をエタノールで固定し、固定された生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。染色後の二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ８は、風乾後に、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＰｉｘ４２００）でスキャンし、生存細胞が残存しているスポット位置１の分析に使用する蛍光画像を取得した。【０１００】
こうして得られた蛍光画像は、画像解析ソフト（ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  Ｖｅｒ．６．０）で分析し、各スポット位置１内の総ピクセル数を算出した。総ピクセル数は、細胞残存面積及び生存細胞数に相当する値であるため、この総ピクセル数に基づいて、抗インフルエンザウイルス活性及その強さを評価できる。【０１０１】
トランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニングは、各二本鎖ＲＮＡのスポット位置１が異なる６枚の二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４で繰り返し行い、各二本鎖ＲＮＡのスポット位置１における総ピクセル数とコントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置１の総ピクセル数との間で以下に示す統計的仮説検定を行い、６枚中４枚以上で統計的有意差が認められた二本鎖ＲＮＡを、抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡであると判定した。【０１０２】
統計的仮説検定の手順：
１．まず、６枚の二本鎖ＲＮＡマイクロアレイを用いて得られたコントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数と各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の正規性をチェックした（Ｗ−ｔｅｓｔ、有意水準１０％）。両者が正規分布に従っている場合は、２群の平均値の差の検定を行い（手順２へ）、いずれか一方の総ピクセル数が正規分布に従っていない場合は、ノンパラメトリックな２群の代表値の差の検定を行った（手順５へ）。
２．コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数と各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の等分散性の検定を行った（Ｆ−ｔｅｓｔ、有意水準２５％、両側検定）。等分散の場合は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを（手順３）、非等分散の場合はＷｅｌｃｈ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（手順４）を行った。
３．Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで、コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数と各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の平均値の差の検定を行った（有意水準１％、片側検定）。
４．Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで、コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数と各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の平均値の差の検定を行った（有意水準１％、片側検定）。
５．Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕ−ｔｅｓｔで、コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の代表値と各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の代表値の差の検定を行った（有意水準１％、片側検定）。【０１０３】
さらに、抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡであると判定された二本鎖ＲＮＡのうち、Ｓ／Ｎ比（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  Ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）の平均が３以上である二本鎖ＲＮＡについては、顕著な抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡであると判定した。【０１０４】
ここでＳ／Ｎ比とは、マイクロアレイを利用したスクリーニング系において、ネガティブコントロールで得られるシグナルの強さ（Ｎ）と、評価している検体で得られるシグナルの強さ（Ｓ）との比であって、トランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニングにおいては、ＲＮＡ干渉効果の強さを表すために用いられる指標である。具体的には、Ｓ／Ｎ比は、上記の統計的仮説検定によって抗インフルエンザウイルス活性を有すると認められた各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の平均値（μｓａｍｐｌｅ）と、コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の平均値（μｎｅｇ）と、不偏標準偏差（δｎｅｇ）とを用いて、次式のように定義される値である。
Ｓ／Ｎ比＝μｓａｍｐｌｅ−μｎｅｇ／δｎｅｇ【０１０５】
本スクリーニング方法では各スポット位置の残存細胞数がＲＮＡ干渉効果の強さを表しているため、上記の統計的仮説検定において有意差が認められた二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数が、コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数に比べてどの程度多いかをＳ/Ｎ比によって評価できる。【０１０６】
コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の分布が正規分布に適合している場合、不偏標準偏差（δｎｅｇ）は正規分布曲線の変曲点に相当し、μｎｅｇ±３δｎｅｇの範囲に９９．７３％のデータが含まれることになる。この場合、Ｓ/Ｎ比の検出限界を３以上にすると、上式では平均値の差が３δｎｅｇ以上となり、二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の平均値は、コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の分布の９９．７３％範囲に含まれないことが保障されることとなる。【０１０７】
本スクリーニング方法では、６枚の二本鎖ＲＮＡマイクロアレイで抗インフルエンザウイルス活性を調べているため、以下の手順に従って、二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数を予め正規化（標準化）してＳ/Ｎ比を求めた。【０１０８】
１．二本鎖ＲＮＡマイクロアレイごとに、コントロール二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数の平均値（μｎｅｇ）と不偏標準偏差（δｎｅｇ）とを用いて、各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数を正規化した。
２．正規化された各二本鎖ＲＮＡのスポット位置の総ピクセル数を用いてＳ/Ｎ比を計算した。
３．Ｓ/Ｎ比の平均値が３以上である二本鎖ＲＮＡを、顕著な抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡであると判定した。【０１０９】
上記のスクリーニング方法では、Ｂ型インフルエンザウイルス由来のｍＲＮＡを切断する二本鎖ＲＮＡがＭＤＣＫ細胞に導入された場合には、ＭＤＣＫ細胞がＢ型インフルエンザウイルスの侵入を受けた場合であっても細胞内でウイルスの複製が抑制され、その結果、アポトーシスが誘導されなくなる。このため、スポット位置１上に細胞が生存し付着している場合には、その細胞に導入された二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する二本鎖ＲＮＡであると判定され、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制する作用は、スポット位置１内の総ピクセル数が大きいほど強いと判定されることとなる。一方、Ｂ型インフルエンザウイルス由来のｍＲＮＡを切断しない二本鎖ＲＮＡがＭＤＣＫ細胞に導入された場合には、細胞内でウイルスの複製が進行し、最終的にアポトーシスが誘導されることとなる。アポトーシスが引き起こされた細胞は、二本鎖ＲＮＡマイクロアレイ４から剥離するため、スポット位置１上の細胞が剥離した場合には、その細胞に導入された二本鎖ＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制できない二本鎖ＲＮＡであると判定されることとなる。【０１１０】
したがって、生存細胞が残存し付着しているスポット位置１がわかれば、予め構築したデータベースを検索することよって、抗インフルエンザウイルス活性のある二本鎖ＲＮＡの塩基配列が明らかとなる。【０１１１】
なお、上記のトランスフェクションマイクロアレイを用いたスクリーニングには、ＣｙｔｏＰａｔｈｆｉｎｄｅｒ社のトランスフェクションマイクロアレイシステム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ（商標登録））を使用した。【０１１２】
（実施例１）：Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株の複製を抑制する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング【０１１３】
上記のトランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法に従って、合成した８０種類の二本鎖ＲＮＡの中からＢ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株の複製を抑制する二本鎖ＲＮＡをスクリーニングした。その際、ウイルス株添加後の培養時間は３４時間とした。【０１１４】
表１は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株の感染によって引き起こされるウイルスの複製を抑制し、アポトーシスの誘導を阻害した二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖及びセンス鎖の塩基配列を示したものである。なお、Ｓ／Ｎ比≧３の列に白丸のある二本鎖ＲＮＡは、Ｓ／Ｎ比の平均が３以上あり、ウイルスの複製に対して顕著な抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡであることを意味している。【０１１５】
【表１】
2009005095.tif 000003
【０１１６】
その結果、コントロール二本鎖ＲＮＡとの間で統計的有意差が認められた二本鎖ＲＮＡは５２個あり、これらのうちＳ／Ｎ比の平均が３以上ある二本鎖ＲＮＡは２６個あった。【０１１７】
（実施例２）：Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株以外のウイルス株の複製を抑制する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング
合成した８０種類の二本鎖ＲＮＡのうち、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株に対して抗インフルエンザウイルス活性を示さなかった２８個について、他のＢ型インフルエンザウイルス株に対して抗インフルエンザウイルス活性を有するものがあるどうかについて検討した。【０１１８】
Ｂ型インフルエンザウイルス株としては、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株を用い、実施例１と同様に、上記のトランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法に従って試験した。【０１１９】
但し、ウイルス株をシャーレ内に加えた後、細胞の剥離が起こるまでの培養時間はウイルス株によって異なっていたため、ウイルス株添加後の培養時間は、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株の場合に２３時間、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３株の場合に３６時間、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株の場合に２６時間、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株の場合に４７時間とした。【０１２０】
表２は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２、又はＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株の感染によって引き起こされるウイルスの複製を抑制し、アポトーシスの誘導を阻害した二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖及びセンス鎖の塩基配列を示したものである。なお、Ｓ／Ｎ比≧３の列に白丸のある二本鎖ＲＮＡは、Ｓ／Ｎ比の平均がいずれかのウイルス株で３以上あり、ウイルスの複製に対して顕著な抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡであることを意味している。【０１２１】
【表２】
2009005095.tif 000004
【０１２２】
その結果、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株の感染に対しコントロール二本鎖ＲＮＡとの間で統計的有意差が認められた二本鎖ＲＮＡは３個（Ｂ−ＰＢ２−１９９９−０２、Ｂ−ＰＢ１−１９９９−１７、及びＢ−ＰＢ１−１９９９−２６）あり、これらのうちＳ／Ｎ比の平均が３以上である二本鎖ＲＮＡは１個（Ｂ−ＰＢ２−１９９９−２）あった。Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３株の感染に対しコントロール二本鎖ＲＮＡとの間で統計的有意差が認められた二本鎖ＲＮＡは２個（Ｂ−ＰＢ２−１９９９−２及びＢ−ＰＢ１−１９９９−２４）あったが、Ｓ／Ｎ比の平均が３以上である二本鎖ＲＮＡはなかった。Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株の感染に対しコントロール二本鎖ＲＮＡとの間で統計的有意差が認められた二本鎖ＲＮＡは１個（Ｂ−ＰＢ２−１９９９−６）あったが、Ｓ／Ｎ比の平均が３以上である二本鎖ＲＮＡはなかった。一方、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株の感染に対しコントロール二本鎖ＲＮＡとの間で統計的有意差が認められた二本鎖ＲＮＡは１個もなかった。【０１２３】
実施例１の結果と合わせると、Ｂ型インフルエンザウイルスの５株のいずれかに対して抗インフルエンザウイルス活性を示した二本鎖ＲＮＡは５７個あった。また、この５７個の二本鎖ＲＮＡのうち３９個は、Ｓ／Ｎ比の平均がいずれかのウイルス株で３以上あり、顕著な抗インフルエンザウイルス活性を有していた。したがって、今後流行するＢ型インフルエンザウイルス株がさまざまな変異を起こした場合であっても、５７個の二本鎖ＲＮＡのうちのいずれかがウイルスの複製を抑制し、Ｂ型インフルエンザの治療に有効性を示し得るものと思われた。【０１２４】
（実施例３）：複数のＢ型インフルエンザウイルス株の複製を同時に抑制する二本鎖ＲＮＡのスクリーニング
流行するＢ型インフルエンザウイルス株の予想が困難であり、予想できた場合であっても変異を起こす可能性が高いため、１種類の二本鎖ＲＮＡが複数のＢ型インフルエンザウイルス株の複製を抑制することができれば、Ｂ型インフルエンザウイルスによる感染症を治療し予防することを実現し得るものと思われる。そこで、実施例１でＢ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株に対して抗インフルエンザウイルス活性を示した５２個の二本鎖ＲＮＡのうち、さらに、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２、及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株のすべてのウイルス株に対しても、抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡをスクリーニングした。【０１２５】
スクリーニングは、実施例１及び２と同様に、上述のトランスフェクションマイクロアレイによる二本鎖ＲＮＡのスクリーニング方法で試験した。その際、実施例１で抗インフルエンザウイルス活性を示した５２個の二本鎖ＲＮＡに加えて、Ｂ型インフルエンザウイルスの複製を抑制することが報告されている二本鎖ＲＮＡ（ＰＢ１−ＰＯＳ及びＰＢ２−ＰＯＳ）をポジティブコントロールとしてスライド上にスポットした二本鎖ＲＮＡマイクロアレイを用いた。なお、ＰＢ１−ＰＯＳ及びＰＢ２−ＰＯＳは、いずれもＡｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６年、１１巻、ｐ．４３１−４３８）に記載されたＰＢ１−２１９６及びＰＢ２−１９９９と同じ塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡであり、それぞれＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）遺伝子及びＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）遺伝子のｍＲＮＡをＲＮＡ干渉により切断することが報告されている。【０１２６】
表３は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３株、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株の感染によって引き起こされるウイルスの複製を抑制し、アポトーシスの誘導を阻害した二本鎖ＲＮＡのＩＤ及びそのＳ／Ｎ比の値を示したものである。【０１２７】
【表３】
2009005095.tif 000005
【０１２８】
その結果、５２個の二本鎖ＲＮＡのうち、上記５株の全てのウイルス株の感染に対して、コントロール二本鎖ＲＮＡとの間で統計的有意差が認められた二本鎖ＲＮＡは１１個あり、その１１個の二本鎖ＲＮＡは、どのウイルス株に対してもＳ／Ｎ比の平均が３以上ある顕著な抗インフルエンザウイルス活性を示すものであった。【０１２９】
一方、ポジティブコントロールのＰＢ１−ＰＯＳは、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株及びＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株に対しては抗インフルエンザウイルス活性を示すものの、その他のウイルス株に対してはほとんど抗インフルエンザウイルス活性を示さなかった。【０１３０】
また、ポジティブコントロールのＰＢ２−ＰＯＳは、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株及びＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７株に対しては抗インフルエンザウイルス活性を示すものの、その活性は非常に弱く、その他のウイルス株に対しては抗インフルエンザウイルス活性を示さなかった。【０１３１】
なお、興味深いことに、上記の１１個の二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖は、いずれもがＮＰタンパク質のｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するＲＮＡであった。【０１３２】
（実施例４）：ターゲット配列に変異のある二本鎖ＲＮＡの抗インフルエンザウイルス活性
実施例３で見出された、Ｂ型インフルエンザウイルス５株に対して顕著な抗インフルエンザウイルス活性を有する二本鎖ＲＮＡのうち、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３（配列番号１０）について、上記５株のウイルス株のｍＲＮＡの塩基配列との相同性を比較した。【０１３３】
Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９株以外の４株については、Ｇｅｎｂａｎｋに登録された塩基配列（Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７株はアクセッション番号ＡＹ０４４１６９８、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３株はアクセッション番号ＥＦ４５６７７７、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２株はアクセッション番号ＡＪ７８４０７８、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株はアクセッション番号ＡＦ１００３５９）を参照した。【０１３４】
その結果、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３は、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／７３に対し、３塩基のミスマッチを有していたものの、顕著な抗インフルエンザウイルス活性を示した。また、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７株に対しては、アンチセンス鎖の５’末端から２塩基目にミスマッチがあったものの、同様に顕著な抗インフルエンザウイルス活性を示した。【０１３５】
一般に、二本鎖ＲＮＡのミスマッチは末端から中央に近くなるほど、またミスマッチの塩基が多くなるほどＲＮＡ干渉作用が減弱するとされているが、特に、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３においては、３塩基のミスマッチがあってもＲＮＡ干渉作用を有し、顕著な抗インフルエンザウイルス活性を示した。【０１３６】
この結果より、二本鎖ＲＮＡの塩基配列によっては、ミスマッチがあっても顕著な抗インフルエンザウイルス活性を有するものが存在することが示唆された。このような二本鎖ＲＮＡは、１種類のみでなく、複数種類のＢ型インフルエンザウイルス株に対して抗インフルエンザウイルス活性を有するため、二本鎖ＲＮＡの標的配列に変異をもったインフルエンザウイルス株が流行株となった場合であっても、その感染症に対して十分な治療効果を発揮し得ることが示唆された。【０１３７】
（実施例５）：Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスにターゲティングされた二本鎖ＲＮＡの併用
複数の二本鎖ＲＮＡを同時に使用した時のインフルエンザウイルスに対する効果を検証した。Ａ型インフルエンザウイルスに対する二本鎖ＲＮＡとして、国際公開２００４／０２８４７１号パンフレットに記載されているｓｉＲＮＡ、ＮＰ−１４９６を化学合成した。表４にＮＰ−１４９６の塩基配列を５’末端から３’末端に向かって示す。ＮＰ−１４９６のセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端には２個のデオキシチミジンヌクレオチドが付加されており、表４ではこれらの残基を小文字で表す。合成されたＲＮＡとそのアンチセンスＲＮＡのセットは、両モル数が等しくなるようにアニーリングバッファー（１００ｍＭ  酢酸カリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４）中で混合し、９０℃で５分の変性処理を行った後、３７℃で１時間インキュベートすることによってアニールさせ、二本鎖ＲＮＡとした。Ｂ型インフルエンザウイルスに対する二本鎖ＲＮＡとして既出のＢ−ＮＰ−１９９９−１３を使用した。【０１３８】
【表４】
2009005095.tif 000006
【０１３９】
ＭＤＣＫ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１×１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。そこにＮＰ−１４９６およびＢ−ＮＰ−１９９９−１３を混合した。ＭＤＣＫ細胞と二本鎖ＲＮＡの混合液８００μＬを電極間距離４ｍｍ幅のｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ用キュベット（メーカー：島津製作所）に移した。島津遺伝子導入装置（ＧＴＥ−１０）によって、電圧４００Ｖ、コンデンサ容量８００μＦで電気パルスを加えた後、５分間氷上で静置した。懸濁液を１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０培地にて希釈し、終濃度１０％になるようにＦＣＳを加えた。これを０．１ｍＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で１日培養した。【０１４０】
Ａ型インフルエンザウイルスとしてＡ／ＰＲ／８／３４、Ｂ型インフルエンザウイルスとしてＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９を用いた。１×１０４  ｐｆｕ／ｍＬに調製した各ウイルスを、ｓｉＲＮＡを導入したＭＤＣＫ細胞に５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、ウイルス感染させた。２４時間培養した後、感染細胞をエタノールで固定した。ＥＬＩＳＡ法にて感染細胞に発現しているウイルスタンパクを定量するため、固定後の細胞を１０％スキムミルクでブロッキングした後、一次抗体として抗Ａ型インフルエンザウイルスＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体（メーカー：Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ４００）または抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体（メーカー：Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＭＣＡ４０３）を添加した。その後二次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識ウサギ免疫抗マウスＩｇＧを添加し一次抗体を認識させ、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）にて発色を行い、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。ウイルスを感染させないネガティブコントロールウェルと、ｓｉＲＮＡを加えずウイルスを感染させたポジティブコントロールウェルの値から、次式によりｓｉＲＮＡを導入したｗｅｌｌでの阻害率を算出した。
阻害率＝（ポジティブコントロールウェルの吸光度−サンプルウェルの吸光度）×１００／（ポジティブコントロールの吸光度−ネガティブコントロールウェルの吸光度）【０１４１】
図２に結果を示す。図２（Ａ）に示すように、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３  ０．１  ｎｍｏｌ／ｍＬを単独で使用した時、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９ウイルスに対して約１００％の阻害活性が見られた。また、図２（Ｂ）に示すように、二本鎖ＲＮＡ、ＮＰ−１４９６  １  ｎｍｏｌ／ｍＬを単独で使用した時、Ａ／ＰＲ／８／３４に対して約９０％の阻害活性が見られた。これらの二本鎖ＲＮＡを混合して使用した時、どちらのウイルスに感染した場合でも抗ウイルス活性があり、それぞれの二本鎖ＲＮＡを単独で使用した時と同程度の活性が見られた。【０１４２】
（実施例６）：Ｂ型インフルエンザウイルスにターゲティングされた二本鎖ＲＮＡの併用・スペクトルの拡大
二本鎖ＲＮＡ、Ｂ−ＰＢ２−１９９９−７およびＢ−ＰＢ１−１９９９−１を試験に使用した。ウイルスとしてＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２とＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７を使用した。実施例５と同様にＭＤＣＫ細胞に上記二本鎖ＲＮＡを混合し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎによって細胞内導入を行った。１日培養後、上記Ｂ型インフルエンザウイルスをそれぞれ感染させ、１８時間後のウイルスタンパクをＢ型インフルエンザウイルス抗体を用いたＥＬＩＳＡで定量することにより、二本鎖ＲＮＡの併用効果を測定した。【０１４３】
図３に結果を示す。図３（Ａ）に示すように、Ｂ−ＰＢ２−１９９９−７は０．２５  ｎｍｏｌ／ｍＬで使用した時、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２に対して約１００％の阻害活性を示したが、図３（Ｂ）に示すように、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７には約３０％と弱い活性しか示さなかった。また図３Ａに示すように、Ｂ−ＰＢ１−１９９９−１は０．２５ｎｍｏｌ／ｍＬで使用した時、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２に対して約２０％の阻害活性しか示さなかったが、図３（Ｂ）に示すように、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７には約９０％の阻害活性を示した。これら２種類の二本鎖ＲＮＡを混合して使用することにより、どちらのウイルス株に対しても約９０％以上の強い活性が認められた。このように、二本鎖ＲＮＡの配列によってはあるウイルス株に効果を示さない場合もあるが、複数の二本鎖ＲＮＡを併用することにより、そのような株にも効果を発揮しうることが示された。【０１４４】
（実施例７）：Ｂ型インフルエンザウイルスにターゲティングされた二本鎖ＲＮＡの併用効果
二本鎖ＲＮＡ、Ｂ−ＮＰ−１９９９−３およびＢ−ＮＰ−１９９９−１３を試験に使用した。ウイルスとしてＢ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２とＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７を使用した。実施例５と同様にＭＤＣＫ細胞に上記二本鎖ＲＮＡを混合し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎによって細胞内導入を行った。１日培養後、上記Ｂ型インフルエンザウイルス株をそれぞれ感染させ、１８−３０時間後のウイルスタンパクをＢ型インフルエンザウイルス抗体を用いたＥＬＩＳＡで定量することにより、二本鎖ＲＮＡの併用効果を測定した。【０１４５】
図４に結果を示す。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示すように、２種類の二本鎖ＲＮＡは１８時間培養の場合、両ウイルス株に対して単独でも併用でも８０％以上の阻害活性を示した。一方、図４（Ｃ）に示すように、３０時間培養した場合、Ｂ−ＮＰ−１９９９−３を０．１ｎｍｏｌ／ｍＬ、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３を０．０５ｎｍｏｌ／ｍＬ、単独で使用した時、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２に対してそれぞれ約１０％の効果しか認められなかった。これら２種類の二本鎖ＲＮＡを混合して使用した時、Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２に対して約７０％の阻害活性が認められた。また、同様に図４（Ｄ）に示すように、Ｂ−ＮＰ−１９９９−３を０．１ｎｍｏｌ／ｍＬ、Ｂ−ＮＰ−１９９９−１３を０．０５ｎｍｏｌ／ｍＬ、それぞれ単独で使用した時、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７に対してそれぞれ５０％及び０％の阻害効果であったが、これらを混合して使用した時、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／０７／９７に対して８０％の阻害活性が認められた。このように、１種類の二本鎖ＲＮＡではウイルスの培養時間が長くなると効果が減弱することがあるが、この場合でも複数の二本鎖ＲＮＡを併用することにより、効果が持続することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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