【手続補正書】
【提出日】平成17年2月14日(2005.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血障害と診断された患者を治療するための医薬組成物の製造のために、哺乳動物において１つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を増加させるＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体の使用。
【請求項２】
ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭＫ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅおよび巨核球細胞からなる群から選択される、１つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を上昇させるために有効な造血前駆細胞刺激量で組成物を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上のタイプの造血前駆細胞がＣＦＵ−ＧＥＭＭを含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
造血障害と診断された患者を治療するための医薬組成物の製造のために、哺乳動物において少なくとも２つのタイプの成熟造血細胞の数を増加させるＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体の使用。
【請求項５】
成熟造血細胞のタイプが赤血球細胞、顆粒球、単球および血小板からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
造血障害が貧血、白血球減少症、好中球減少症、血小板減少症、無形成性貧血または免疫弱体化障害である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
造血障害が化学療法または放射線療法から生じている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
Ｅｐｏ、ＴＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦからなる群から選択された造血サイトカインが、造血前駆細胞刺激量でＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体の前、同時、または後で哺乳動物に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体の前、同時または後に化学療法薬剤を治療上有効な量で哺乳動物に投与する、請求項１〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
造血前駆細胞刺激量のＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体、および製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
ＣＦＵ−ＧＥＭＭ刺激量のＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体、および製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
リンパ性細胞刺激量のＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体、および製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体に加えて、少なくとも１つの造血サイトカインをさらに含有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの造血サイトカインが、Ｅｐｏ、ＴＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦからなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体が、以下：
ａ）配列番号２の約１〜約１７６の残基を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号２の約２５〜約１７６の残基を含むポリペプチド、
ｃ）１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号２の約１〜約１７６の残基を含むポリペプチドであって、配列番号２の約１〜約１７６の残基を含むポリペプチドと実質的に類似の活性を保持するポリペプチド、ならびに
ｄ）１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号２の約２５〜約１７６の残基を含むポリペプチドであって、配列番号２の約２５〜約１７６の残基を含むポリペプチドと実質的に類似の活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】造血障害を治療するためのＬＰ８２の使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間の医療分野に適用される組換えＤＮＡ技術に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物造血障害（貧血を含むが、これに限定されるわけではない）の新規な治療方法または予防方法に関し、これらの方法は、ＬＰ８２（最近、インターロイキン様ポリペプチドとして同定された）の投与を含む。さらに、ＬＰ８２活性を中和するまたはアンタゴナイズする抗体および他の薬剤の投与を含む、哺乳動物造血障害（白血病を含むが、これに限定されるわけではない）の新規な治療方法または予防方法が、本明細書中に開示される。
【背景技術】
【０００２】
造血は一生における必須のプロセスであり、これにより、非常に特化した血液細胞（二酸化炭素および酸素輸送を担う細胞（赤血球）、血液凝固を担う細胞（血小板）、体液性免疫を担う細胞（Ｂリンパ球）、細胞性免疫を担う細胞（Ｔリンパ球）ならびに外来生物およびそれらの生成物に反応する細胞（顆粒球、単球およびマクロファージ）を含む）が造血幹細胞から生産される。これらの細胞は全て、骨髄性およびリンパ性と称される機能的に２つの異なるグループに分けることができる。正常な成人の一生の間には、骨髄系細胞は骨髄内に限られて生産される（Lichtman, M.A., Exp.Hematol. 9:391, 1981）が、他方、リンパ系統の細胞は骨髄、脾臓、胸腺およびリンパ節で種々の程度で生産される。成熟した機能的に目的の細胞およびその中間前駆体は、限られた寿命および限られた増殖能力を有しており、それゆえ自己保持的ではない。従って、これらの細胞はより原始的な増殖前駆細胞のプールから連続的に置きかえられる。最終的には、骨髄系統およびリンパ系統の両方の細胞全てが全能性幹細胞に由来する。正常なヒト成人では、約2000億の赤血球（Erslev, A.J., Hematology, McGraw-Hill, New York, 1983）および600億の中性好性白血球（Dancey, J.T.ら、J. Clin. Invest. 58:705, 1976）が、毎日産生されると推定されている。
【０００３】
造血は、必然的に厳密に制御されている。造血の種々の局面の制御を担う分子は、通常、２つのグループ、細胞外増殖因子および細胞内因子（例えば、増殖因子レセプター、シグナル伝達分子および転写因子）に分けることができる。造血サイトカインは、血液細胞の分解および再構築の間の不均衡、または特定の血液細胞の不適切な数での産生から生じる種々の疾患を治療するためにうまく使用されてきた。例えば、組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、慢性腎不全患者、ジドブジン処置ＨＩＶ感染患者、化学療法中の癌患者、および自己輸血を受けている患者における貧血の治療のために投与される糖タンパク質である。組換えトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板減少症の治療に関して臨床評価を現在受けている。EPOおよびTPOの有用性にもかかわらず、個人の造血状態を改変する別の方法を提供する必要性が存在する。従って、本発明の目的は、患者における望ましくない造血状態を予防および／または校正し得る新規な治療方法を提供することである。
【発明の要旨】
【０００４】
インターロイキンファミリーの新規なメンバーは、国際特許出願WO99/27103およびWO00/12708（それぞれの内容を参照して本明細書中に組み込む）に記載されており、あるいは、それぞれヒトZcyto10およびPRO1801と命名されている。このタンパク質（以下LP82と称する）は、既知のサイトカインに典型的な４個のαへリックス構造を示し、IL-10およびIL-19と顕著なホモロジーを共有する。
【０００５】
本発明は、赤血球生成（赤血球細胞の産生）、白血球生成（白血球細胞の産生）および／または血小板生成（thrombocytopoiesis）（血小板の産生）を含む、造血を調節する方法に関し、この方法は、本明細書中に記載のＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２の機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体またはＬＰ８２抗体のうちの少なくとも１つを、そのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に、治療上有効な量で投与することを含む。
【０００６】
本発明は、１種以上のタイプの造血前駆細胞（好ましくは、CFU-GEMM、CFU-MK、CFU-GM、BFU-Eおよび／または巨核球細胞、最も好ましくは、CFU-GEMM細胞）の数を増加させる方法に関し、この方法は、LP82ポリペプチドまたはその変異体、LP82ポリヌクレオチド、LP82アゴニストまたはLP82機能的フラグメントのうちの少なくとも１つを治療上有効な量で、そのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に投与することを含む。
【０００７】
本発明の方法は全て、LP82の投与に加えて、造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体のうちの少なくとも１つを治療上有効な量で投与することをさらに含み得ることが意図される。好ましい造血サイトカインは、Epo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよび／またはSCFであり、最も好ましくは、Epo、IL-3、SCF、G-CSFおよび／またはGM-CSFである。造血サイトカインは、ＬＰ８２の投与の前、同時、および／または後に投与され得ることが意図される。本発明の方法は、化学療法または放射線療法の投与と同時、その後または前に行われ得ることがさらに意図される。
【０００８】
本発明はさらに、少なくとも２つのタイプの成熟造血細胞の増加を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト）において、少なくとも２つのタイプの成熟造血細胞を増加させる方法に関し、この方法はその哺乳動物に本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドまたはその変異体を治療上有効な量で投与すること、場合によりＬＰ８２投与に加えて少なくとも１つの造血サイトカインを治療上有効な量で投与することをも含む。
【０００９】
なおさらに、本発明は、赤血球の増加を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト）において、赤血球を増加させる方法に関し、この方法はその哺乳動物に本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドまたはその変異体を治療上有効な量で投与すること、場合によりＬＰ８２ポリペプチドに加えて少なくとも１つの造血サイトカインを治療上有効な量で投与することをも含む。ＬＰ８２の投与の前、ＬＰ８２の投与と同時、および／またはＬＰ８２の投与の後に、少なくとも１つの造血サイトカインが投与され得ることが意図される。
【００１０】
また、本発明は、ヘマトクリットの増加を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト）において、ヘマトクリットを増加させる方法に関し、この方法はその哺乳動物に本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドまたはその変異体を治療上有効な量で投与することを含む。
【００１１】
本発明はさらに、細胞サイクルのＳ期にある哺乳動物、ヒトまたは患者において、１つ以上のタイプの造血前駆細胞（好ましくは、ＧＦＵ−ＧＥＭＭ細胞）の割合を増加させる方法に関し、この方法はそのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２の機能的フラグメントまたはＬＰ８２変異体のうちの少なくとも１種を治療上有効な量で投与することを含む。この方法はＬＰ８２投与に加えて、造血サイトカインを少なくとも１種、治療上有効な量で投与することをさらに含み得ることが意図される。ＬＰ８２の投与の前、ＬＰ８２の投与と同時および／またはＬＰ８２の投与の後に、少なくとも１種の造血サイトカインが投与され得ることが意図される。
【００１２】
本発明はさらに、１種以上のタイプのリンパ系細胞の数を増加させる方法に関し、この方法はＬＰ８２ポリペプチドを治療上有効な量で投与することを含む。
【００１３】
本発明はさらに、１種以上のタイプの造血前駆細胞（好ましくはＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞）の数を減少させる方法に関し、この方法は本明細書中に記載のLP82アンタゴニスト、LP82アンチセンスポリヌクレオチドフラグメントまたはLP82抗体のうちの少なくとも１種を治療上有効な量で、そのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物、ヒトまたは患者に投与することを含む。このような方法は、少なくとも１種の追加の造血サイトカインアンタゴニスト、アンチセンスポリヌクレオチドフラグメント、または造血サイトカイン抗体を治療上有効な量で投与することをさらに含み得ることを意図する。
【００１４】
さらに、本発明の方法は、例えば、癌に関する治療を受けている哺乳動物（好ましくはヒト）に投与される化学療法または放射線療法の前、同時、および／または後に投与され得ることが意図される。
【００１５】
本発明は、造血前駆細胞刺激量、あるいはＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞刺激量、あるいはリンパ系細胞刺激量あるいは治療上有効な量の、本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２の機能的フラグメントおよび／またはＬＰ８２変異体のうちの少なくとも１種、ならびに製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、あるいはそれらからなる、または本質的に構成されている医薬組成物に関する。このような組成物は、追加の造血サイトカイン（好ましくは、Epo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよび／またはSCF、より好ましくは、Epo、IL-3、SCF、G-CSFおよび／またはGM-CSF、最も好ましくは、Epo、IL-3および／またはSCF）を少なくとも１種、治療上有効な量でさらに含有し得ることが意図される。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本発明はさらに、造血前駆細胞刺激量、あるいはＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞刺激量、あるいは治療上有効な量の、本明細書中に記載のＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２アンチセンスポリヌクレオチドフラグメントおよび／またはＬＰ８２抗体のうちの少なくとも１種、ならびに製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤を含有する、あるいはそれらからなる、または本質的に構成されている医薬組成物に関する。このような組成物はさらに、追加の造血サイトカインアンタゴニスト、造血サイトカインアンチセンスポリヌクレオチドフラグメントまたは造血サイトカイン抗体を少なくとも１種、治療上有効な量で含有し得ることが意図される。
【００１７】
以下に記載の特定の態様は、特定の態様の変更を行うことができ、なおかつ特許請求の範囲内に含まれ得るので、本発明は以下の特定の実施態様に限定されない。本明細書中で用いる技術用語は、特定の実施態様を記載するためのものであり、限定を意図するものではない。それよりも、本発明の範囲は特許請求の範囲により確立される。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈中で特に明確に記載しない限り、単数系は複数形の表示を含む。
【００１９】
定義
用語「アミノ酸」は、本明細書中において最も広い意味で用いられており、天然のアミノ酸、および非天然のアミノ酸（アミノ酸変異体および誘導体を含む）を含む。後者は、アミノ酸部分を含有する分子を含む。当業者であれば、本明細書中のアミノ酸の言及である、この最も広い定義に関して、天然のタンパク質性（proteogenic）Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、化学的に修飾したアミノ酸（例えば、アミノ酸変異体および誘導体）、天然の非タンパク質性アミノ酸（例えば、ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等）、および当該分野において公知のアミノ酸に特徴的である特性を有する化学的に合成した化合物を含むと認識する。
【００２０】
本発明のＬＰ８２ポリペプチドおよび／またはそのフラグメント、および／またはその変異体への非天然のアミノ酸（これは合成性のネイティブではないアミノ酸、置換アミノ酸または１つ以上のＤアミノ酸（「Ｄ−ＬＰ８２ポリペプチド」）を含む）の組み込みは、多数の異なる方法において有利である。Ｄ−アミノ酸含有ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較してインビトロまたはインビボで増加した安定性を示す。従って、Ｄ−アミノ酸を組み込むＬＰ８２ポリペプチドの構築は、インビボでのより高い安定性が所望されるまたは必要である場合に、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチドは内生的ペプチダーゼおよびプロテアーゼに耐性であり、それにより分子のインビボにおける改善されたバイオアベイラビリティおよび長期化させた寿命が望ましい場合に、このような特性を提供する。ペプチドが短期間のみ活性であることが望ましい場合、分子内にＬ−アミノ酸を使用することにより、内生的ペプチダーゼ、プロテアーゼ等が分子を消化できるようにし、それにより細胞の分子への暴露を制限する。さらに、Ｄ−ペプチドは、ヘルパーＴ細胞への主要組織適合複合体クラスＩＩ拘束性の提示のために効率的に処理されないので、それゆえ、生物全体における体液性免疫反応の誘導がおそらくより弱くなる。
【００２１】
Ｄ−アミノ酸の使用に加えて、当業者であれば、ＬＰ８２ポリペプチドおよび／または任意のＬＰ８２ポリペプチド変異体のアミノ酸配列における修飾により、配列番号２に示される本来のポリペプチド配列またはその任意のフラグメントと比較して、等しいかまたはそれよりも優れた機能特性を示す機能的ＬＰ８２ポリペプチドを生じ得る。従って、このような修飾により生じる配列は、本明細書中に開示されるＬＰ８２ポリペプチドおよびＬＰ８２ポリペプチド変異体と実質的に同じ（または、望ましくありうる場合には、改善された、もしくは減少した）活性を有するならば、本発明の方法は本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドおよび／またはＬＰ８２変異体における変更を意図し、これには、天然の変異または人為的操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換、短縮、融合、サブユニット配列のシャッフリングなどを含み得る。
【００２２】
用語「ＬＰ８２アンタゴニスト」は、最も広い意味で用いられており、本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全に、遮断する、阻害する、または中和する任意の分子を含む。同様の様式で、用語「ＬＰ８２アゴニスト」は、最も広い意味で用いられており、ＬＰ８２ポリヌクレオチドまたはＬＰ８２ポリペプチドの発現、安定性および／または生物学的活性を誘導または増加させる任意の分子を含む。ＬＰ８２アゴニストおよびＬＰ８２アンタゴニストとしては、例えば、本明細書中に記載の低分子、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２フラグメント、ならびにＬＰ８２ポリペプチドに対する抗体を挙げることができる。本発明のＬＰ８２アンタゴニストとしては、アンチセンスおよびリボザイム分子、ならびにＬＰ８２遺伝子の発現を阻害するために用い得る遺伝子または調節配列置換構築物のようなヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。適切なＬＰ８２アゴニストとしては、ＬＰ８２ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、ＬＰ８２変異体および有機低分子が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＬＰ８２アゴニストまたはＬＰ８２アンタゴニストの同定方法は、ＬＰ８２ポリペプチドをＬＰ８２アゴニスト候補分子またはＬＰ８２アンタゴニスト候補分子と接触させる工程、および通常、ＬＰ８２ポリペプチドと関連している１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定する工程を含む。
【００２３】
「抗体」（Ａｂ）および「イムノグロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造特性を有する糖タンパク質である。Ａｂが特定の抗原に対して結合特異性を示す一方で、Ｉｇは、Ａｂおよび抗原特異性を欠失している他の抗体様分子の両方を含む。用語「抗体」は、もっとも広い意味で用いられており、具体的には、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種のインタクトな抗体から形成される多特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体（例えば、２特異性抗体）、および所望の生物活性を示す抗体フラグメントが含まれるがこれらに限定されない。
【００２４】
ＬＰ８２遺伝子またはＬＰ８２をコードするＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列、またはそのようなＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列の相補的配列に関しての用語「フラグメント」または「そ（れら）のフラグメント」は、ＬＰ８２核酸のセグメントを意味し、これは配列番号１に示されるネイティブな核酸分子またはその相補配列中で隣接する１５以上のヌクレオチド、好ましくは３０以上のヌクレオチド、さらにより好ましくは５０以上のヌクレオチドを含有する。
【００２５】
ＬＰ８２ポリペプチド配列に関しての用語「フラグメント」または「そ（れら）のフラグメント」は、ＬＰ８２タンパク質またはポリペプチドのセグメントを意味し、配列番号２に示されるネイティブなポリペプチドに隣接している１５以上のアミノ酸、好ましくは３０以上のアミノ酸、さらにより好ましくは５０以上のアミノ酸を含有する。
【００２６】
ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体に関する用語「機能的」は、特定の分子がインビボまたはインビトロで本明細書中に開示されるＬＰ８２ポリペプチドに起因する生物学的活性と実質的に類似するまたは同一である生物学的活性（例えば、少なくとも１つのタイプの造血前駆細胞（好ましくはＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞）の増殖および／または分化を誘発する能力）を示す意味であることを意図する。
【００２７】
本明細書中で用いる「機能的フラグメント」は、本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドまたはその変異体あるいはＬＰ８２ポリヌクレオチドまたはその相補体の単離セグメントを意味し、これは機能的に明確な領域（例えば、酵素上の活性部位、ＬＰ８２アゴニストまたはアンタゴニストに対する結合部位、ＬＰ８２レセプター、ＬＰ８２ポリペプチド、またはＬＰ８２抗体、あるいはＬＰ８２アンチセンス分子）を含有する。機能的フラグメントは、当業者に公知の方法（組換ＤＮＡ法、酵素／蛋白質分解的消化を含むが、これらに限定しない）により、または選択的スプライシング方法の天然の生成物として製造することができる。
【００２８】
用語「ヘマトクリット」は、血液中の血漿および血球の相対量を測定する際に使用される装置により測定される、赤血球細胞の体積の全血球細胞の体積に対する比の値を意味する。ヘマトクリットの正常範囲は、年齢、ならびに思春期の後は個体の性別に依存する。ヘマトクリットの達成目標はある個体と別の個体とでは異なり、その結果として所定の患者に対する実際の目的ヘマトクリットを決定する際に医師の判断が適切であり得ることが理解される。
【００２９】
用語「ＬＰ８２」は、核酸、遺伝子、ｃＤＮＡ（配列番号１に示す）、そのフラグメントおよび配列番号１に相補的な配列、ならびにそれらによりコードされるポリペプチド配列（配列番号２に示す）を意味する。また、用語「ＬＰ８２」は、さらなる限定を伴わずに、ネイティブなＬＰ８２ポリペプチド（配列番号２）およびＬＰ８２ポリペプチドの成熟形態（これは配列番号２に示される配列の２５位〜１７６位のアミノ酸であると推定される）の両方を意味する。特記しない限り、用語「ＬＰ８２ポリペプチド」は、配列番号２に示されるＬＰ８２ポリペプチドの全長および機能的フラグメント、ならびにそれらの分泌型、成熟型、融合型、変異型、選択的スプライシング型および対立遺伝型形態を含む。
【００３０】
用語「ＬＰ８２組成物」は、本明細書中に記載のＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２アンチセンスポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２フラグメント、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２融合型タンパク質および／またはＬＰ８２抗体のうちの少なくとも１つを含有する組成物を意味することを意図する。
【００３１】
「ＬＰ８２ポリペプチド抗体」または「ＬＰ８２抗体」は、本明細書中に記載の抗体を意味し、これは本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドのエピトープの少なくとも１つを認識し、これに結合する。
【００３２】
「ＬＰ８２アンチセンスポリヌクレオチド」は、配列番号１に示される配列の相補体の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含有し、これはＬＰ８２アンタゴニストとして機能する。
【００３３】
本明細書中で用いる用語「ＬＰ８２変異体」は、それぞれ配列番号１または２に示されるＬＰ８２ポリヌクレオチドまたはＬＰ８２ポリペプチド、ならびにその任意のフラグメントを意味し、これらはさらに、本明細書中に記載の修飾体の種々のタイプのうちの少なくとも１つを含有する。さらに、ポリペプチドで用いる場合、ＬＰ８２変異体は、配列番号２に示される縮重型アミノ酸配列を有するＬＰ８２ポリペプチドと少なくとも約９５％アミノ酸配列の同一性を有する、本明細書中に記載の「機能的な」ＬＰ８２ポリペプチドを意味することを意図する。このようなＬＰ８２ポリペプチド変異体としては、例えば、配列番号２のＮ末端、Ｃ末端または配列内で、１つ以上のアミノ酸残基が付加、置換または欠失しているＬＰ８２ポリペプチドが挙げられる。通常、ＬＰ８２ポリペプチド変異体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、シグナルペプチドを有して、または有さずに、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。変異体には、ＬＰ８２の対立遺伝子変異体、すなわち、哺乳動物（好ましくはヒト）の集団内に存在する種々の対立遺伝子によりコードされるものが含まれることが意図される。
【００３４】
本明細書中で使用する用語「半減期」は、この分子の集団を構成する分子の約半分がインビトロで切断（ｃｌｅａｖｅ）されるために必要とされる時間を意味する。より具体的には、「血漿半減期」は、この分子の集団を構成する分子の約半分が循環から取り除かれる、またはインビボで不活性にされるために必要とされる時間を意味する。
【００３５】
本明細書中で用いる用語「造血サイトカイン」は、造血前駆細胞に作用する、あるいは造血の調節に関連する（好ましくは、造血前駆細胞の増殖および／または分化を誘導するように機能する）任意のサイトカインまたは因子を意味する一般的用語である。好ましい造血サイトカインとしては、Ｅｐｏ、ＴＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦが挙げられる。
【００３６】
本明細書中で用いられる用語「造血前駆細胞」は、造血細胞系統に属する（ｃｏｍｍｉｔ）が、なお完全には成熟造血細胞に分化していない任意の細胞を意味する。好ましい造血前駆細胞タイプとしては、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−Ｍｋ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、巨核球が挙げられる（図１を参照のこと）。
【００３７】
本明細書中で用いる用語「成熟造血細胞」は、最終的に分化した造血細胞、例えば、ｒｂｃ、顆粒球、単球、血小板を意味する。
【００３８】
核酸またはタンパク質に関して用いる場合、用語「単離」は、同定され、そして通常は随伴する夾雑物の少なくとも１つから分離されている核酸配列またはタンパク質を意味する。単離されている核酸またはタンパク質は、天然で見出されるものとは異なる形態または配置（ｓｅｔｔｉｎｇ）で存在する。対照的に、単離されていない核酸またはタンパク質は、それらが天然に存在する状態で見出される。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、用語「精製（した）」または「精製する」は、目的の成分（例えば、タンパク質または核酸）から夾雑物を取り除くプロセスの結果を意味する。これにより、精製した成分の割合はサンプル中で増加する。
【００４０】
本明細書中で用いる用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は、哺乳動物細胞中での発現により産生される形態のタンパク質を意味する。通常、一旦、粗面小胞体での成長タンパク質鎖の搬出（ｅｘｐｏｒｔ）が開始されると、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、「成熟」形態のタンパク質を産生するために完全なポリペプチドから切断されるシグナルペプチド（ＳＰ）配列を有すると仮定される。しばしば、分泌タンパク質の切断は均一ではなく、１種類以上の成熟タンパク質を生じるかも知れない。分泌タンパク質の切断部位は、完全なタンパク質の１次アミノ酸配列により決定され、通常、完全に正確には推測することはできない。タンパク質がＳＰ配列を有するかどうか、ならびに配列に対する切断点を推測する方法を利用することができる。切断点は、アミノ酸１５とアミノ酸３０の間、最も好ましくは、配列番号２に示される配列のアミノ酸２４の後のＬＰ８２のＮ−末端ドメイン内に存在し得る。当業者であれば理解するように、しばしば、切断点は生物間で変化し、完全に確実には推測することはできない。好ましくは、分泌タンパク質の切断点は、タンパク質の精製製造法内で見出される１種以上の成熟タンパク質のアミノ末端配列決定により経験則により決定される。
【００４１】
本明細書中で用いる用語「処置」または「治療」は、造血疾患、病状、または傷害と戦うまたは予防するための患者の管理または看護を意味し、これには、症状または合併症の発症を予防するため、症状または合併症を緩和するため、または疾患，病状または障害を排除するためのＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２フラグメント、ＬＰ８２アンチセンスポリヌクレオチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体および／またはＬＰ８２組成物の投与が含まれる。
【００４２】
本明細書中で用いられる「治療上有効な量」は、活性薬剤（例えば、ＬＰ８２ポリペプチド、造血サイトカインポリペプチド、ＬＰ８２抗体、造血サイトカイン抗体）が哺乳動物に治療効果を与えるために必須である最小量である。例えば、哺乳動物に対する「治療上有効な量」は、障害に関連する病的症状、疾患の進行または生理学的状態における改善、または障害に圧倒されることへの抵抗性を誘発、改善、あるいはそれらを引き起こさせるような量である。
【００４３】
本発明は、ＬＰ８２活性が造血プロセスに密接に関連していることを実証する。本出願人は、ＬＰ８２ポリペプチドが、単独または少なくとも１種の他の造血サイトカインとの組合せの両方で、顕著にＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の数を増加させ、そして赤血球、血小板、顆粒球および単球の数を増加させることを示した。また、ＬＰ８２ポリペプチドは細胞サイクルのＳ期に存在するＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の割合を増加させる、すなわち、ＬＰ８２はＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞サイクル（ｃｙｃｌｉｎｇ）状態を増加させる。エリスロポエチン（Ｅｐｏ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）と組み合わせての、ならびにまた、Ｅｐｏ、ＳＣＦおよびＩＬ−３と組み合わせての、ＬＰ８２ポリペプチドのヒトＣＤ３４＋細胞への添加により、ＬＰ８２ポリペプチドを添加しないコントロール細胞と比較して、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ造血前駆細胞の数を顕著に増加させた。ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、最終的には、赤血球、血小板、顆粒球および単球へと分化する（図１）。また、これらのコロニーは、増加した数の巨核球細胞を含み、このことはＬＰ８２が赤血球および巨核球経路に共通の造血前駆細胞に影響を与えていることを実証する。本出願人は、ＬＰ８２が、赤血球、顆粒球／単球および巨核球経路に共通の造血前駆細胞に影響を与えて造血前駆細胞ならびに成熟造血細胞を増加させていることを実証する。さらに、本発明により、ＬＰ８２アンタゴニストおよび抗体の、１つ以上のタイプの造血前駆細胞および１つ以上のタイプの成熟造血細胞の数を減少させる能力を意図する。
【００４４】
造血
造血は、新しい血液細胞の形成の複雑な発生プロセスを意味する。造血系においては、唯一の長期自己複製細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、これに全ての異なるタイプの血液細胞が由来する。ＨＳＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、単球／マクロファージ、赤血球細胞などで見出されるマーカーに対して系列（ｌｉｎｅａｇｅ）陰性（Ｌｉｎ−）である（概説に関しては、例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７：３８７−４０３，２００１を参照のこと）。ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−１＋、Ｌｉｎ−、ｃ−ｋｉｔｌｏおよびＣＤ３８−である。ＨＳＣは、骨髄系またはリンパ系細胞へと分化することができ、各々、自己に特異的な細胞表面抗原を有する（図１）。造血幹細胞から生じた前駆細胞は、分化決定（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞と称する。ＨＳＣが分化する骨髄系統における前駆細胞としては、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｍｋおよび巨核球が挙げられる。これらの細胞に関する当該分野の用語には、いくらかの変動がある。最終的には、骨髄性細胞は、最終的に分化した血小板、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球および赤血球を生じる。
【００４５】
ＣＦＵ−ＧＥＭＭは、血液形成細胞の系統における多能性前駆細胞タイプの名称であり、これは全ての骨髄系細胞タイプに分化し得る。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の特異的な形態によりコロニー形成アッセイで同定することができる。また、細胞は、それらが発現する細胞表面マーカー（ＣＤ３３、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲを含む）により特徴付けることができる。ＬＰ８２がその主な活性を及ぼすのはＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞であり、これにより、本明細書中の実施例においてインビトロおよびインビボの両方で示されているように、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの数の顕著な増加を導く。ＣＦＵ−ＧＥＭＭを刺激することが知られている造血サイトカインとしては、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−３、ＩＬ−１１およびＥｐｏが挙げられる。
【００４６】
ＢＦＵ−Ｅ（赤芽球コロニー形成細胞（ｂｕｒｓｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ））は、最も初期の公知の赤血球前駆細胞であり、最終的に赤血球へと分化する（すなわち、赤血球系統に分化することが決定している）。ＢＦＵ−Ｅは、コロニー形成アッセイにおいて小さいコロニーの「バースト」からなる赤血球細胞の大きいコロニーを生じる。赤血球幹細胞系統では、ＢＦＵ−Ｅは、より成熟したＣＦＵ−Ｅの先に生じる。細胞の成熟には、細胞上のＥｐｏ受容体の数の増加が伴う。ＢＦＵ−Ｅは多数の造血サイトカイン（ＩＬ３、ＥＤＦ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ９、ＩＬ１、ＳＣＦおよびＥｐｏを含む）に応答する。
【００４７】
ＣＦＵ−ＧＭは、顆粒球および／または単球への分化が決定されている多能性前駆細胞タイプを定義する。ＣＦＵ−ＧＭは、細胞表面マーカー（ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲ）の発現によりコロニー形成アッセイで形態学的に同定することができる。ＣＦＵ−ＧＭは、他の造血サイトカインの中でも、特にＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＩＬ−６により刺激される。また、ＣＦＵ−ＧＭはＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ウテロフェリン（Ｕｔｅｒｏｆｅｒｒｉｎ）およびｂＦＧＦにも応答する。
【００４８】
本明細書中で用いる、ＬＰ８２に言及する場合の用語「ＣＦＵ−ＧＥＭＭ刺激量」は、ＬＰ８２が存在しない哺乳動物、ヒトまたは患者において、存在するＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の数を少なくとも２０％、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞のベースライン数を増加させるＬＰ８２の量を意味する。本明細書中で用いる、ＬＰ８２に言及する場合の用語「造血前駆（細胞）刺激量」は、ＬＰ８２が存在しない哺乳動物、ヒトまたは患者において、存在する任意の造血前駆細胞の数を少なくとも２０％、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上、そのタイプの造血前駆細胞のベースライン数を増加させるＬＰ８２の量を意味する。本明細書中で用いる、ＬＰ８２に言及する場合の用語「リンパ系（性）細胞刺激量」は、ＬＰ８２が存在しない哺乳動物、ヒトまたは患者に存在する任意のタイプのリンパ系細胞またはリンパ系前駆細胞の数を少なくとも２０％、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上、そのタイプのリンパ系細胞またはリンパ系前駆細胞のベースライン数を増加させるＬＰ８２の量を意味する。
【００４９】
多数の血液細胞障害が、血液細胞数の減少と関連している。これらは、一般的に、貧血（減少赤血球細胞カウント）、白血球減少症（減少ＷＢＣカウント）、好中球減少症（減少好中球カウント）、血小板減少症（減少血小板カウント）および無形成性貧血（減少ＲＢＣ、ＷＢＣおよび血小板）に分類することができる。貧血は、身体が充分な赤血球細胞を産生できない場合に生じ、血液の酸素運搬能力の減少を生じる。通常、癌を有する患者で生じ、また、化学療法および／または放射線療法での癌の処置の一般的な副作用である。化学療法で処置された患者の６０％以上が貧血を発症している。本発明により実証されるように、ＬＰ８２はＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の数を増加させ、次いで最終的には赤血球の数を増加させ、貧血の治療に有用でありうる。
【００５０】
血小板減少症は、循環血中における異常に低いレベルの血小板の存在であり、化学療法の一般的な副作用であり、出血の危険性を生じる。また、癌患者は他の薬物療法により、または元々の癌の結果として血小板減少症を体験するかもしれない。内生的サイトカイン（（とりわけ）Ｅｐｏ、ＴＰＯおよびＳＣＦなど）は、通常、例えば、貧血または血小板減少症に関する治療を受けている癌患者により必要とされる場合に、化学療法または放射線療法の後にアップレギュレートされる。従って、ＬＰ８２ポリペプチド（またはその変異体）は、造血前駆細胞（特にＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞およびＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞に由来する細胞）の数および／またはサイクル状態の増加により、このタイプの治療の後に血小板および／または赤血球の回復の増加のための単独治療として働く可能性を有する。
【００５１】
好中球減少症は、循環血中における異常に低いレベルの好中球の存在により特徴付けられる。好中球は白血球細胞の１つのタイプであり、感染と戦う身体の主な防御機構のうちの１つである。癌患者が好中球減少症を経験する最も一般的な理由は、化学療法の副作用である。
【００５２】
骨髄抑制（骨髄の血液細胞産生能力の減少）を処置するために現在診療所での使用が認可されているサイトカインとしては、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１１およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられるが、しかし、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦのみが、貧血および好中球減少症を治療するために広範に使用される。従って、本発明は、造血障害の治療または予防を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト）または患者におけるこのような障害の治療方法または予防方法を提供し、この方法は、ＬＰ８２ポリペプチドまたはその変異体を含有する医薬組成物（場合によりさらに、１種以上のタイプの造血サイトカインを治療上有効な量で含有する）の治療上有効な量での投与を含む。
【００５３】
造血障害の治療
本発明は、造血障害の治療または予防を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト）または患者におけるこのような障害の治療または予防方法を提供し、この方法はＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体および／またはＬＰ８２ポリペプチドのうちの少なくとも１種を治療上有効な量で、場合により造血サイトカインまたは造血サイトカインアンタゴニストもしくは抗体の少なくとも１種の治療上有効な量の存在下での投与を含む。このような方法は、種々の病状および／または状況において必要とされる場合、造血、赤血球生成、白血球生成、血小板生成、好中球、単球、顆粒球および／または血小板の生成を、このような細胞の前駆体の増殖および／または分化を刺激することにより増加させるまたは刺激するために特に有用である。このような病状および状況としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定するわけではない。
（ａ）不適切な血小板の産生（例えば、無形成性貧血、不応性貧血、白血病、前白血病（ｐｒｅｌｅｕｋｅｍｉａ）／骨髄異型症候群、巨赤芽球性貧血、化学療法または放射線療法）、および既存の血小板欠乏症または推定の血小板欠乏症（例えば、臓器／骨髄移植を含む（これらに限定されない）計画的な外科手術による）、
（ｂ）血小板破壊の増加（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、他の免疫性血小板減少症、ＨＩＶ関連血小板減少症、敗血症／播種性血管内血液凝固および脈管炎、
（ｃ）異常な血小板機能（例えば、グランツマン（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ）血小板無力症、急性／慢性白血病、骨髄増殖症候群、尿毒症、血小板ストレージプール疾患（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｏｏｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、フォンウイルブランド病および術後心血管機能不全、ならびに
（ｄ）他の血液凝固障害（例えば、無フィブリノーゲン血症または任意の原因の創傷）。
【００５４】
血小板欠乏症に関する一般的な用語は血小板減少症であり、従って、本発明の方法および組成物は、通常、血小板減少症の治療に利用可能である。血小板減少症は、種々の理由（化学療法、放射線療法、外科手術、不慮の血液損失および他の特定の疾患状態を含む）のために存在し得る。血小板減少症に関連する、本発明に従って処置され得る代表的な特定の疾患状態は、以下のものである。無形成性貧血、特発性血小板減少症および血小板減少症を生じる特定の転移性腫瘍。また、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関する特定の処置もまた、血小板減少症を生じる（例えば、ＡＺＴ）。特定の創傷治癒障害もまた、血小板数の増加により利益を得るかもしれない。
【００５５】
予測される血小板欠乏症（例えば、将来の外科手術に起因するもの）に関しては、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２アゴニストまたはそれらの変異体を、血小板が必要となる前に数日間〜数時間、投与することができる。急性状態（例えば、不慮および大量の血液損失）に関しては、ＬＰ８２ポリペプチド、アゴニストおよび／またはそれらの変異体を、血液または精製血小板と共に投与することができる。
【００５６】
さらに、本発明はＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体およびＬＰ８２組成物を提供し、これらは造血、赤血球生成、白血球生成または血小板生成関連機能のうちの少なくとも１つに依存して細胞内シグナル伝達経路を調節する。
【００５７】
ＬＰ８２ポリペプチドは、Ｔ細胞活性化および／または増殖を増強または刺激し、それによりウィルスにより引き起こされる感染（ＨＩＶ、免疫弱体化障害を含むが、これらに限定されない）および種々の自己免疫疾患（リウマチ様関節炎、狼瘡、移植片対宿主、宿主対移植片、インスリン依存型糖尿病、自己免疫脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）および多発性硬化症を含むが、これらに限定されない）の処置に治療用途を有する。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様は、造血障害（貧血および貧血と一般的に関連している障害を含むが、これらに限定されない）の治療または予防方法を提供し、この方法はそのような処置を必要とする哺乳動物に配列番号２〜３またはその変異体で示される配列を有するＬＰ８２ポリペプチドを治療上有効な量で投与すること、場合によりまた、哺乳動物に治療上有効な量の造血サイトカインを投与することを含む。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様は、赤血球増加症、白血病を含む（しかし、これらに限定されない）造血障害の治療または予防方法を提供し、この方法はこのような治療を必要とする哺乳動物にＬＰ８２アンタゴニストを治療上有効な量で投与すること、およびまた、場合により哺乳動物に造血サイトカインアンタゴニストまたは造血サイトカイン抗体を治療上有効な量で投与することを含む。
【００６０】
本発明はさらに、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体および／またはＬＰ８２組成物のうちの少なくとも１つを、それらに対する１種以上の薬学的に許容されている希釈剤、キャリアまたは賦形剤と共に含有する医薬組成物を提供する。また、造血サイトカインをさらに含有するような組成物も意図される。
【００６１】
本発明はまた、造血障害（貧血および／または一般的に貧血と関連している障害を含むが、これらに限定されない）を治療または予防する方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする哺乳動物にＬＰ８２組成物を治療上有効な量で投与することを含み、この組成物は、少なくとも１つの活性（例えば、赤血球、ＣＦＵ−ＧＭおよび／または巨核球前駆細胞の分化および／または増殖を含むが、これらに限定されない）を有する。従って、ＬＰ８２ポリペプチドはこれらの効果に応じて対応する活性についてスクリーニングされ得る。
【００６２】
本発明はさらに、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２核酸、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体の、貧血およびそのような状態と関連する障害の治療または予防のための医薬の製造での使用を提供する。
【００６３】
本発明により意図される新規な方法としては、それぞれ、配列番号１および２に示されるＬＰ８２ポリヌクレオチドおよびＬＰ８２ポリペプチドおよびそれらの機能的フラグメント、ならびに１つ以上の置換、欠失、挿入、逆位、付加またはグリシル化部位またはパターンの変更をさらに含むがそれにもかかわらず、対応する修飾していないＬＰ８２ポリヌクレオチドまたはＬＰ８２ポリペプチドと実質的に類似の生物学的活性および／または薬学的に所望の特性を有するＬＰ８２ポリヌクレオチド変異体および／またはＬＰ８２ポリペプチド変異体を使用して、そのような処置を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト）を処置してその造血細胞構成を変更する方法が挙げられる。
【００６４】
ＬＰ８２ポリペプチド変異体
本発明において有効なＬＰ８２ポリペプチドは、配列番号２に示される配列と約９５％以上、好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性の変異体を含むことを意図する。本発明の実施態様において、単独のアミノ酸変化は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＬＰ８２ポリペプチド内で行なわれる。あるいは、２、３、４、５、６、７または８個の変更が、配列番号２に示されるＬＰ８２ポリペプチド配列のアミノ酸約１〜約１７６またはアミノ酸約２５〜約１７６の間で行なわれる。アミノ酸の変更は、挿入、置換および／または欠失でありうる。変更は連続的、独立的またはその両方の組合せであり得る。変更はＮおよび／またはＣ末端にあるか、および／または内部に位置しているかもしれない。最も好ましくは、本発明の方法および組成物において用いられるＬＰ８２ポリペプチドは、配列番号２または３に示される配列から０または１個のアミノ酸変化を有する。
【００６５】
当業者であれば理解するように、タンパク質の配列または構造に対する多数の置換および／または他の変化が、それらの生物学的活性または特性に実質的に影響を与えることなくポリペプチドに対して行われ得る。例えば、保存的アミノ酸置換の作製、またはあるアミノ酸の同じクラス（例えば、負に荷電した残基、正に荷電した残基、極性的に荷電していない残基および非極性残基または当該分野において許容される任意の他の分類）のアミノ酸由来の別のものでの変更が、機能に顕著な影響を与えることなく頻繁に行なわれる。本明細書中の表１に従って行なわれる配列番号２に示されるＬＰ８２ポリペプチド配列の修飾は、特定のアミノ酸の当該分野で認識されている代替（例えば、Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐ．３，３４５−３５２頁，１９７８を参照のこと）に基づき修飾していないＬＰ８２ポリペプチドと同一または実質的に類似の生物学的活性を保持するＬＰ８２変異体を生じると期待され、また本発明の方法に有用であると意図される。
【００６６】
配列番号１に示されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体（サイレント変異を含むもの、および変異がアミノ酸配列変化を生じるものを含む）は、配列番号２の対立遺伝子変異体であるタンパク質のように、本発明の方法および組成物の範囲内に入ると意図される。配列番号２の対立遺伝子変異体は、当該分野において公知の標準的な手順に従って、異なる個体または組織由来のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによりクローニングすることができる。代表的な対立遺伝子変異体は、国際特許出願ＷＯ９９／２７１０３に記載されており、本明細書中の配列番号３にも示されている。
【００６７】
【表１】
2005506287.tif 000001
【００６８】
ＬＰ８２変異体ポリペプチドにおけるアミノ酸変化を作製する際に考慮され得る１つの因子は、アミノ酸のハイドロパシーインデックスである。タンパク質上の相互作用的生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅにより議論されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は、得られたタンパク質の二次構造に寄与していると受け止められている。次いで、これはタンパク質と、分子（例えば、酵素、基質、レセプター、リガンド、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用に影響を与える。疎水性および荷電特性に基づき、各アミノ酸は以下のようなハイドロパシーインデックスを割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸／グルタミン／アスパラギン酸／アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）。
【００６９】
当該分野において公知のように、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得、類似の生物学的活性を有する結果物のペプチド（すなわち、なお生物学的機能を保持している）等を生じる。このような変更を作製する際に、±２以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸で互いに置きかえることが好ましい。より好ましい置換は、±１以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸での置換である。最も好ましい置換は、±０．５以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸での置換である。
【００７０】
また、類似のアミノ酸は親水性に基づいて置換され得る。米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性により支配されるタンパク質の最も高い局地的な平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを開示する。以下の親水性値がアミノ酸に割り当てられている。アルギニン／リジン（＋３．０）、アスパラギン酸／グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン／グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン／ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン／イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。従って、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１つのアミノ酸を類似の親水性スコアを有する別のアミノ酸で置換することができ、類似の生物学的活性を有する生成ペプチド等をやはり生じる（すなわち、やはり正確な生物学的機能を保持する）。このような変更を作製する場合、±２以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が互いに置換されることが好ましく、±１以内のものがより好ましく、±０．５以内のものが最も好ましい。
【００７１】
上記に概説したように、ＬＰ８２ポリペプチド中のアミノ酸置換はアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ等）に基づき得る。本発明のペプチドなどの内部でサイレントな変更を生じる保存的アミノ酸変化を作製するために、種々の上記の特徴を考慮に入れた代表的な置換は、天然のアミノ酸が属するそのクラスの別のメンバーから選択され得る。アミノ酸は以下の４つのグループに分けることができる。（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性極性アミノ酸、および（４）中性非極性アミノ酸。これらの種々のグループ内の代表的なアミノ酸としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。（１）酸性（負に荷電した）アミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸、（２）塩基性（正に荷電した）アミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジン、（３）中性極性アミノ酸、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン、ならびに（４）中性非極性アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン。
【００７２】
本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチド変異体と類似または同一であるインビボまたはインビトロでの生物学的活性（例えば、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の数を増加させる能力、赤血球および／または巨核球前駆細胞の分化および／または増殖を誘発または増加させる能力）を有するＬＰ８２ポリペプチド変異体もまた、本発明の方法に有用であり、それ自体、本発明に含まれる。ＬＰ８２変異体ポリペプチドは、機能的に関連付けられると同時に、定義により、配列番号２に示す配列と１以上の位置から約１０個までの位置で異なるアミノ酸配列を含む。本発明の方法に有用であるＬＰ８２変異体ポリペプチドは、配列番号２の配列を有するＬＰ８２ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、逆転および／または置換により作製することができる。このようなＬＰ８２変異体は、通常、例えば、表１に従う単独または複数の保存的アミノ酸置換が行なわれる固相技術または組換え技術により作製することができる。
【００７３】
通常、複数の置換の場合、ＬＰ８２ポリペプチド変異体の９５％〜９９％の残基が、配列番号２に示す対応する配列と同一であることが好ましく、ＬＰ８２ポリペプチド変異体の９６％〜９９％の残基が、配列番号２に示す対応する隣接配列と同一であることがより好ましく、ＬＰ８２変異体の９７％〜９９％の残基が、配列番号２に示す対応する隣接配列と同一であることが最も好ましい。好ましいＬＰ８２変異体の例としては、配列番号３に示されるＬＰ８２ポリペプチド変異体が挙げられる。配列同一性割合は、従来的な方法により決定される（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３−６１６（１９８６）およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照のこと）。
【００７４】
本発明の方法に有用である、別のクラスのＬＰ８２変異体としては、アミノ酸置換を１つ以上さらに含有する本明細書中に定義するＬＰ８２ポリペプチドが挙げられ、これは対応する置換されていないＬＰ８２ポリペプチドと比較して改変されたグリコシル化パターンを生じている。
【００７５】
用語「Ｎ−グリコシル化ポリペプチド」とは、アスパラギンの側鎖アミド中の窒素原子がグリコシル基に共有結合しているＮＸＳ／Ｔモチーフを１つ以上有するポリペプチドを意味する。「Ｘ」は、プロリン以外の天然に存在する任意のアミノ酸残基を意味する。「天然に存在するアミノ酸」とは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシンおよびトリプトファンである。Ｎ−グリコシル化タンパク質は、場合によりＯ−グリコシル化されている。
【００７６】
用語「Ｏ−グリコシル化ポリペプチド」は、側鎖中の酸素原子がグリコシル基に共有結合しているセリンおよび／またはトレオニンを１つ以上有するポリペプチドを意味する。Ｏ−グリコシル化タンパク質は、場合によりＮ−グリコシル化されている。グリコシル化ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を適切な哺乳動物宿主細胞中で発現させることにより組換え的に製造して、ポリペプチド表面上の利用可能なＮＸＴ／Ｓモチーフに見出される側鎖アミド、および／または表面の利用可能なセリンおよびトレオニンの側鎖アルコールのグリコシル化を生じることができる。哺乳動物細胞中で遺伝子を組換え的に発現させる具体的な方法は、本明細書中以下に記載する。グリコシル化タンパク質を製造するための他の手順は、ＥＰ６４０，６１９号に開示されており、この全技術を本明細書中に参照して組み込む。グリコシル化されていないポリペプチドは、適切な原核生物宿主細胞中で、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることにより組換え的に製造することができる。また、本発明のＬＰ８２ポリペプチドおよびＬＰ８２変異体は、グリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくともよい。グリコシル化ポリペプチドは、単糖またはオリゴ糖で１ヵ所以上修飾されている。単糖は、キラルなポリヒドロキシアルカノールまたはポリヒドロキシアルカノンであり、代表的には、ヘミアセタール形態で存在する。「オリゴ糖類」は、通常、アセタール結合により連結されている約２〜約１８個の単糖類のポリマーである。通常、グリコシル化タンパク質中で見出されるグリコシル基の１つのタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸である。グリコシル化ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化型および／またはＯ−グリコシル化型であり得、好ましくはＮ−グリコシル化型である。
【００７７】
本発明の方法に有用であり得るＬＰ８２変異体の別のクラスは、Ｎ−末端および／もしくはＣ−末端に付加したオリゴペプチドまたはアミノ酸を少なくとも１つさらに含む、本明細書中に規定のＬＰ８２ポリペプチドが挙げられる。「オリゴペプチド」は、ペプチド結合によりＮ−末端およびＣ−末端に連結された２〜約２５個のアミノ酸の鎖である。適切なオリゴペプチドおよびアミノ酸は、本明細書中に記載のＬＰ８２ポリペプチドの生物学的活性を顕著には減少させないものであり、ＬＰ８２ポリペプチドの所望の薬学的および薬理学的特性を実質的には減少させない。このような修飾の好ましい例としては、他のポリペプチド（例えば、プレトリプシノーゲンリーダー配列）中に見出されるリーダー配列をさらに含む本明細書中に規定のＬＰ８２ポリペプチドが挙げられる。
【００７８】
また、本発明の方法に有用なＬＰ８２変異体としては、１つ以上のポリエチレングリコール基（本明細書中以下、「ＰＥＧ」基）をさらに含む、本明細書中に規定のＬＰ８２ポリペプチドが挙げられる。ＰＥＧ基はＬＰ８２ポリペプチドのＮ−末端またはアミノ酸側鎖中のアミン基またはチオール基に結合され得る。通常、適切なＰＥＧ基は、約５，０００〜４０，０００原子質量単位の間の分子量を有する。ＰＥＧ化ポリペプチドの製造手段は、ＭｕｍｔａｚおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２８：３４６，１９９１、およびＦｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６８：１，１９９８に開示されている。
【００７９】
また、本明細書中に規定のＬＰ８２ポリペプチドは、修飾型（例えば、融合タンパク質または「タグ化」タンパク質）で発現させ、用いることができる。ＬＰ８２融合タンパク質は、天然では見出されないハイブリッドタンパク質分子を表し、これは２つ以上の異なるタンパク質、フラグメントまたはそれらの変異体が１つのポリペプチド鎖上で共有結合で連結されている、翻訳的融合物または酵素的融合物を含む。場合により、２つ以上のタンパク質がリンカー配列により分離されて融合タンパク質の各々の独立した活性を可能とするかもしれない。ヒト血清アルブミン、トロンボポエチンのＣ−末端ドメイン、ｈＣＧのＣ−末端伸長ペプチドおよび／またはＦｃフラグメントは、本発明で用いるためのＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２フラグメントおよび／またはＬＰ８２変異体と融合することができるタンパク質の例である。本明細書中で用いる場合、抗体の「Ｆｃフラグメント」は、この単語に免疫学の分野において通常与えられる意味を有する。具体的には、この用語は、補体に結合する抗体フラグメントを意味し、抗体から２つの抗原結合領域（Ｆａｂフラグメント）を取り除くことにより得られる。従って、Ｆｃフラグメントは、両方の重鎖（これらは非共有結合相互作用およびジスルフィド結合により会合している）由来のほぼ等しいサイズのフラグメントから形成される。Ｆｃフラグメントはヒンジ領域を含み、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインからＣ末端へと伸張する。融合タンパク質の製造手順は、ＥＰ３９４８２７、Ｔｒａｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４，１９８８、およびＦａｒｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４３０４，１９９２に開示されている。
【００８０】
多くの融合タンパク質は、最終的なポリペプチドの製造の前に取り除くことができる領域内の外来性分泌シグナルによって分泌され得る。このような方法は当該分野において周知である。タンパク質発現および続いての精製に関する好ましい方法において、ＬＰ８２遺伝子は５’末端で修飾され、発現により得られるＬＰ８２タンパク質のアミノ末端にいくつかのヒスチジン残基を組み込むことができる。この「ヒスチジンタグ」により、「固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー」（ＩＭＡＣ）（これは基本的には米国特許第４，５６９，７９４号に記載されており、この参考文献は本明細書中に参照して組み込む）と称される１工程タンパク質精製法を可能とする。ＩＭＡＣ法は、上記のような修飾型組換えタンパク質を発現する細胞の粗抽出物から開始する、組換えＬＰ８２タンパク質の実質的に純粋な迅速な単離を可能とする。
【００８１】
また、本発明の方法に有用なＬＰ８２ポリペプチド変異体およびそれをコードする核酸は、配列番号２または配列番号１のいずれかに対する同一性類似性割合にに関して定義することができる。配列同一性は当該分野において周知の標準的なアルゴリズムを用いて２つの分子間の比較を意味する。この目的のために任意の適切な配列比較アルゴリズムを用いることができるが、例示のために、本実施態様では、参照配列として配列番号２を用いる周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに関して記載して比較配列に対する同一性割合を規定する。配列同一性をポリペプチドに関して用いる場合、比較にポリペプチド全体、または代わりにその規定されたサブ領域のみのいずれかを用いることができる。
【００８２】
マッチ、ミスマッチおよび挿入または欠失に関してのパラメーター値の選択は任意である。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムで用いるための値の好ましいセットは、「最大類似セグメント」アプローチに記載する。これはマッチした残基に値１を用い、ミスマッチした残基に−１／３を用いる（Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４６，４７３−５００，１９８４を参照のこと）。挿入および欠失（ｉｎｄｅｌｓ）であるｘは、以下のように評価する。
Ｘｋ＝１＋ｋ／３（式中、ｋは所定の挿入または欠失中の残基数である）
例えば、２５０個の残基の参照タンパク質配列に関して２０個の置換および３個の挿入を有する比較配列は、以下の同一性を有する。
［（１×２５０）−（１／３×２０）−（１＋３／３）］／２５０＝９６％同一性。
【００８３】
ＬＰ８２変異体は当該分野において公知の従来的な組換えまたは固相合成技術により簡単に製造することができるので、本発明の方法は、このような変異体が対応するＬＰ８２ポリヌクレオチドまたはＬＰ８２ポリペプチドと実質的に類似の活性を保持すると同時に、それぞれ、配列番号１または２に示されるヌクレオチドまたはアミノ酸の隣接配列と少なくとも７０％および８０％の同一性を有する程度までは本発明の方法におけるＬＰ８２ポリヌクレオチドおよびＬＰ８２ポリペプチド変異体の使用を意図する。
【００８４】
ＬＰ８２ポリペプチド合成
ＬＰ８２ポリペプチドおよびＬＰ８２変異体の機能的フラグメントは、当業者に周知の任意の数の適切な技術（配列番号２の任意の部分の化学合成、ＬＰ８２ポリペプチドまたはＬＰ８２変異体のタンパク質分解的消化、最も好ましくは組換えＤＮＡ変異誘発技術を含む）により作製することができる。例えば、好ましい方法では、欠失変異のネステッドセットを、ＬＰ８２ポリペプチドをコードする核酸配列に導入して、タンパク質分子のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかから種々の量のタンパク質コード領域を欠失する。また、この方法を用いてカルボキシおよびアミノ末端の両方が取り除かれている、インタクトなタンパク質の内部フラグメントを作製することができる。
【００８５】
本明細書中に開示のタンパク質の機能的フラグメントは、上記のように製造することができる（好ましくは、小さいバージョンのインタクトな遺伝子を操作するためのクローニング技術を用いて、５’末端、３’末端、両方の末端、または内部から配列を欠失する）。フラグメントを、任意の適切なアッセイを用いて、生物学的活性（例えば、赤血球、巨核球またはＣＦＵ−ＧＭもしくはＣＦＵ−ＧＥＭＭ前駆細胞のような造血前駆細胞の分化および／または増殖をインビボまたはインビトロで誘発または増加させる能力）を試験することができる。
【００８６】
当業者であれば、ＬＰ８２遺伝子を多数の組換えＤＮＡ技術（例えば、国際出願ＷＯ９９／２７１０３に記載。この文献を本明細書中に組み込む。）により入手することができることを理解する。
【００８７】
当業者であれば、本発明に用いるタンパク質は、当該分野で周知の化学方法（固相ペプチド合成または組換え方法をふくむ）のような多数の異なる方法により合成することができることを理解する。両方の方法は、米国特許第４，６１７，１４９号に記載されており、参照により本明細書中に組み込む。また、本発明に有用なタンパク質は、クローニングしたＬＰ８２遺伝子を用いる組換えＤＮＡ法により製造することができる。組換え法は、高収率が望ましいならば好ましい。クローニングした遺伝子の発現は、当該分野に周知の種々の適切な宿主細胞中で行なうことができる。このために、ＬＰ８２遺伝子を、当該分野に周知の任意の適切な方法により宿主細胞（例えば、原核生物、哺乳動物、酵母、ＳＦ９）中に導入する。組換え法により産生したタンパク質は、当該分野において周知の方法により形質転換細胞の細胞抽出物から精製することができる。
【００８８】
本発明の方法で用いるＬＰ８２ポリペプチドは、直接発現、または場合により酵素的または化学的切断により除去し得る別のタンパク質またはペプチドとの翻訳融合物として目的のＬＰ８２ポリペプチドを含む融合タンパク質としてのいずれかにより、合成することができる。融合タンパク質としての発現が長期にわたり、所望のペプチドの収率を増加させ、タンパク質の精製の簡便な方法を提供することが、しばしば、組換え系における特定のペプチドの産生において観察される。これは特に、原核生物宿主での哺乳動物タンパク質を産生する場合に、関連している。特定の部位でポリペプチドを切断する、またはペプチド鎖のアミノまたはカルボキシ末端からペプチドを消化する種々のペプチダーゼが公知である。さらに、特定の化学物質（例えば、臭化シアン）は特定の部位でポリペプチド鎖を切断する。当業者であれば、部位特異的内部切断部位を組み込むためのアミノ酸配列（および組換え手段を用いる場合には合成または半合成コード配列）に必須の修飾を認識する（例えば、Ｐ．Ｃａｒｔｅｒ，「Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｃｈａｐｔｅｒ  １３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９０）を参照のこと）。
【００８９】
ＬＰ８２抗体
また、本発明の方法はＬＰ８２抗体を利用することができる。代表的な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、２特異的およびヘテロ結合型抗体が挙げられる。
【００９０】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造方法は当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）およびＨｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｇ．Ｒ．編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）を参照のこと）。また、モノクローナル抗体は組換えＤＮＡ法により作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載。この文献を参照して本明細書中に組み込む。）。
【００９１】
当業者に明らかであるように、ポリクローナル抗体は、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリのような多数の動物から製造することができる。ＬＰ８２ポリペプチドの免疫原性は、アジュバントの使用により増加させることができる。目的のポリペプチドに特異的な抗体を検出するための代表的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に詳細に記載されている。
【００９２】
ＬＰ８２抗体は一価の抗体であり得る。一価の抗体の製造方法は、当該分野において周知である。例えば、ある方法は、イムノグロブリン軽鎖および修飾重鎖の組換え発現に関する。一般に、重鎖を、重鎖架橋を阻害するようなＦｃ領域の任意の点で短縮する。あるいは、関連するシステイン残基を、架橋を阻害するように別のアミノ酸残基で置換するか、欠失する。また、インビトロ方法も一価の抗体を製造するために適している。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当該分野において公知の従来的な技術を用いて達成され得る。
【００９３】
本発明の方法で用いられるＬＰ８２抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含み得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合結果物）であり、これらは非ヒトイムノグロブリンに由来する最小配列を含有する。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定部位（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置きかえられているヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。いくつかの例において、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基と置きかえる。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または組み込んだＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含有し得る。通常、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒトイムノグロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒトイムノグロブリンコンセンサス配列のものである可変ドメインの少なくとも１つ、代表的には２つの実質的に全てを含む。また、必要に応じてヒト化抗体は、イムノグロブリン定常域（Ｆｃ）（代表的にはヒトイムノグロブリン）の少なくとも一部を含有する［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７，１９８８；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−６，１９９２］。
【００９４】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該分野において周知である。本質的に、ヒト化はＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９（４８４７）：１５３４−６，１９８８に記載の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置きかえることにより行なうことができる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、非ヒト種由来の対応する配列により、実質的により少ないインタクトなヒト可変ドメインが置換されている。また、ヒトＬＰ８２抗体は、ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−８，１９９２；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７，１９９１）を含む当該分野において公知の種々の技術を用いて産生されうる。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の製造に利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５，１９９１）。同様に、ヒトＬＰ８２抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入することにより作製することができ、この場合、内生的イムノグロブリン遺伝子は部分的または完全に不活性化されている。抗原投与の際には、ヒトＬＰ８２ポリペプチド抗体の産生が観察され、これは全ての点（遺伝子転位、アセンブリおよび抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて見出されるものと非常に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号に記載されている。
【００９５】
二特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル（好ましくはヒトまたはヒト化）抗体である。本発明の場合、結合特異性のうちの１つはＬＰ８２ポリペプチドに対するものであり、他方が任意の他の抗原（好ましくは細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニット）に対するものであり得る。二特異性抗体の製造方法は、当該分野において公知である。２つ以上の結合手を有する抗体が意図される。例えば、三特異的抗体を製造することができる（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜９、１９９１）。
【００９６】
ヘテロ結合型抗体の使用もまた、本発明の一部として意図される。ヘテロ結合型抗体は２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化させるように［米国特許第４，６７６，９８０号］、およびＨＩＶ感染の治療［ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２０３７３］のために計画されている。抗体は、合成タンパク質化学における公知の方法（架橋剤に関するものを含む）を用いてインビトロで製造することができることが意図される。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合の形成により構築することができる。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられ、これらは例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【００９７】
本発明の方法に関するＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体および／またはＬＰ８２組成物の有用性は、本明細書中に記載の、あるいは当該分野において公知の方法またはアッセイの適用により、過度の実験を行なうことなく当業者により決定することができる。ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体および／またはＬＰ８２組成物を、本明細書中に記載のように、あるいは当該分野において公知のように、生物学的活性または機能性について試験することができる（例えば、Ｘｕｎｘｉａｎｇ  ＤｕおよびＤａｖｉｄ  Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｌｏｏｄ，８９（１１），（１９９７）、ならびにＤｏｎａｌｄ  ＭｅｔｃａｌｆおよびＮｉｃｏｓ  Ａ．Ｎｉｃｏｌａ，Ｔｈｅ  Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ（１９９５）を参照のこと）。同様に、本発明の方法におけるＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体、および／またはＬＰ８２組成物の有用性は、本明細書中に記載の造血のインビトロモデルまたはインビボモデル（実施例を参照のこと）、または当該分野において公知のアッセイを用いて評価または定量することができる。
【００９８】
さらに、本発明は、哺乳動物ＬＰ８２遺伝子の発現および／または哺乳動物ＬＰ８２遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物を同定する方法に関する。このような化合物には、貧血のような哺乳動物造血障害の症状を減少させる、または除去する医薬組成物として用いることができる治療用化合物が含まれる。ＬＰ８２遺伝子および／または遺伝子産物と相互作用する（例えば、ＬＰ８２遺伝子の活性を調節する、および／またはＬＰ８２遺伝子産物に結合する）化合物を同定するために用いることができる細胞アッセイおよび非細胞アッセイを記載する。このような本発明の細胞ベースのアッセイは、ＬＰ８２遺伝子産物を発現する細胞、セルライン、または遺伝子操作した細胞もしくはセルラインを利用する。
【００９９】
最初に、細胞ベースの系は、造血障害の症状を改善するように作用し得る化合物を同定するために用いられ得る。このような細胞系としては、例えば、ＬＰ８２遺伝子を発現する組換えまたは非組換え細胞（例えば、セルライン）を挙げることができる。このような細胞系を用いる際には、造血障害の症状を改善する能力を示すと思われる化合物を、ＬＰ８２を発現する細胞におけるそのような症状の改善を誘発するために充分な濃度で充分な時間の間、その細胞に暴露する。暴露した後、例えば、ＬＰ８２ｍＲＮＡ転写物に関して（例えば、ノザン分析により）、または細胞により発現されるＬＰ８２遺伝子産物に関して細胞溶解物をアッセイすることにより細胞をアッセイして、ＬＰ８２遺伝子の発現における変化を測定することができる。ＬＰ８２遺伝子の発現を調節する化合物は、治療薬剤として良好な候補物質である。
【０１００】
さらに、動物ベースのシステムまたは哺乳動物造血障害に関するモデル（例えば、ヒトまたは改変形のＬＰ８２遺伝子を含むトランスジェニックマウス）は、障害の症状を改善する能力を同定するために使用することができる。このような動物モデルは、薬物の同定、調剤、医薬および診療のための試験物質として使用することができる。例えば、症状を改善する能力を示すと思われる化合物を、造血障害の症状のこのような改善を誘発するために充分な濃度で充分な時間の間、動物モデルに暴露してもよい。特定の処置に対する動物の反応を、障害に起因する症状の減少を評価することによりモニターすることができる。造血障害様症状に好ましい影響を与える処置は、このような障害でのヒトの治療的診療に対する候補物質とみなすことができる。試験薬剤の用量は、用量応答曲線を誘導することにより決定することができる。
【０１０１】
１つの実施態様において、本発明の方法は、細胞に化合物を接触させること、ＬＰ８２遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルを測定すること、およびそのレベルを化合物無しでの細胞により産生されたＬＰ８２遺伝子の発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルと比較することを含む。化合物の存在下で得られたレベルが非存在下で得られたレベルと異なるならば、哺乳動物ＬＰ８２遺伝子の発現および／または哺乳動物ＬＰ８２遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物が同定されている。
【０１０２】
別の実施態様において、本発明の方法は、宿主（例えば、ＬＰ８２トランスジーンまたはＬＰ８２変異体トランスジーンを発現する野生型またはトランスジェニック動物）に化合物を投与すること、およびＬＰ８２遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルを測定することを含む。測定したレベルを、化合物にさらされていない宿主におけるＬＰ８２遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルと比較する。宿主が哺乳動物ＬＰ８２遺伝子の発現、ＬＰ８２遺伝子産物の合成または活性のいずれかを調節する化合物に曝された場合に得られるレベルが、宿主が化合物に曝されていない場合に得られるレベルと異なる場合、その化合物は本発明の方法に用いることができる。
【０１０３】
本発明の方法は、例えば、哺乳動物ＬＰ８２遺伝子の発現および／または哺乳動物ＬＰ８２遺伝子産物の合成および／または活性を調節する化合物を投与して、造血障害の症状が改善されることを含み得る。あるいは、哺乳動物造血障害がＬＰ８２遺伝子変異から生じる場合、このような方法は、損なわれていないＬＰ８２遺伝子産物をコードする核酸分子を哺乳動物に補うことにより、損なわれていないＬＰ８２遺伝子産物が発現され、障害の症状が改善されることを含み得る。
【０１０４】
本発明の別の実施態様としては、哺乳動物造血障害の治療方法が挙げられ、これは損なわれていないＬＰ８２遺伝子産物をコードする核酸分子を含む細胞を、そのような処置を必要とする哺乳動物に投与することにより損なわれていないＬＰ８２遺伝子産物および／またはそれによりコードされるポリペプチドを細胞が発現し、障害の症状が改善されることを含む。
【０１０５】
ＬＰ８２のポリヌクレオチド阻害
あるいは、赤血球増加症（通常よりも多い数の赤血球に関連する）のような特定の造血障害の症状は、ＬＰ８２遺伝子発現および／またはＬＰ８２遺伝子産物活性のレベルを阻害することにより改善することができる。ＬＰ８２遺伝子産物の合成または発現のレベルの阻害または減少方法としては、例えば、阻害的アンチセンス、リボザイムおよび３重らせんアプローチのような方法を挙げることができる。別の実施態様においては、造血障害の症状は、ＬＰ８２遺伝子発現のレベルを減少させるために周知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイムおよび／または３重らせん方法に関してＬＰ８２遺伝子配列を用いることにより、ＬＰ８２遺伝子発現および／またはＬＰ８２遺伝子産物活性のレベルを減少させることにより、改善することができる。ＬＰ８２遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力（哺乳動物造血障害の症状を改善する能力を含む）を示し得る化合物の中でも、アンチセンス、リボザイムおよび３重らせん分子がある。このような分子は、損なわれていない、または望ましい場合には変異標的遺伝子および／または異常型のＬＰ８２活性のいずれかを減少させるまたは阻害するように設計され得る。このような分子の産生および使用に関する技術は、当業者に周知である。
【０１０６】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的化されるｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンスアプローチは、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドの設計に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を妨害する。完全な相補性は、好ましいけれども必要ではない。本明細書中で称する、ＲＮＡの一部に対する配列「相補性」とは、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成し得るために充分な相補性を有する配列を意味する。従って、二重らせんアンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一重らせんを試験するか、または三本鎖の形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズ能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。通常、ハイブリダイズ核酸が長ければ長いほど、ＲＮＡとの塩基ミスマッチをより多く含むかもしれず、なお安定な二本鎖（三本鎖の場合もあり得る）を形成する。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用により、ミスマッチの慣用され得る程度を確かめることができる。
【０１０７】
１つの実施態様において、ＬＰ８２遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチで用いて、内生的なＬＰ８２ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。標的配列の選択にかかわらず、遺伝子発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量するためのインビトロ研究を最初に行なうことが好ましい。これらの研究は、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果を区別するためのコントロールを利用することが好ましい。これらの研究は標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを内部コントロールＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することもまた、好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、コントロールオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較することも予測される。コントロールオリゴヌクレオチドは試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さのものであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションを阻害するために必要な分を超えない程度でアンチセンス配列と異なることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾バージョン、一本鎖もしくは二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために塩基部分、糖部分またはフォスフェート骨格で修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞レセプターをインビボで標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６，６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６４８；ＰＣＴ公開番号Ｗ０８８／０９８１０、１９８８年１２月１５日公開）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ０８９／１０１３４、１９８８年４月２５日公開）を通る輸送を容易化するための薬剤、ハイブリダイゼーショントリガード（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断薬剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８を参照のこと）またはインターカレート剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９を参照のこと）のような他の付属基を含みうる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガード架橋剤、輸送薬剤、ハイブリダイゼーショントリガード切断薬剤など）に結合させることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の群から選択される（しかし、これらに限定されるわけではない）修飾塩基部分を少なくとも１つ含有し得る。５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロ��ラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、ＮＧ−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケノシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６−ジアミノプリン。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む（しかしこれらに限定されるわけではない）群から選択される修飾糖部分を少なくとも１つ含有し得る。
【０１０８】
さらに別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタール、またはそれらのアナログからなる群から選択される修飾ホスフェート骨格の少なくとも１つを含む。
【０１０９】
さらに別の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはａ−アノマーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、鎖が互いに平衡に走る、相補的ＲＮＡとの特有の二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５）。オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５，６１３１）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７）である。本発明のオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより市販のものなど）の使用のような当該分野において公知の標準的方法により合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法により合成することができる。メチル−ホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御型多孔性ガラスポリマー支持体の使用により製造することができる（Ｓａｒｉｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８）。標的遺伝子コード領域配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができるが、転写非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０１１０】
アンチセンス分子は、インビボで標的遺伝子を発現する細胞へと送達される。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞へと送達するために多数の方法が開発されており（例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射してもよい）、または所望の細胞を表的化するように設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上で発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体へと連結されているアンチセンス）を全身的に投与することができる。しかし、内生的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために充分な細胞内アンチセンス濃度を達成することが困難であることが頻繁にある。従って、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者内の標的Ｔ細胞をトランスフェクトさせるためのこのような構築物の使用は、内生的標的遺伝子転写物と相補的な塩基対合を形成する一本鎖ＲＮＡの充分な量の転写物を生じ、それにより標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。例えば、ベクターを、例えば、細胞により取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を指令するように導入することができる。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生じ得る間、エピソーム性のままであるかもしれないし、または染色体に組み込まれるかもしれない。このようなベクターは当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術法により構築され得、哺乳動物細胞における複製および発現に用いられるプラスミド、ウィルスまたは当該分野において公知の他のものであり得る。
【０１１１】
アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物（好ましくはヒト細胞）において作用することが当該分野において公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは誘導性であってもよいし、または構成性であってもよい。このようなプロモータとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４）、ラウス肉腫ウィルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９６１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９）など。任意のタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウィルスベクターを用いて、組織部位に直接導入され得る組換えＤＮＡ構築物を製造することができる。あるいは、所望の組織を選択的に感染させるウィルスベクターを、別の経路により達成され得る投与（例えば、全身的）の場合に用いてもよい。また、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物を酵素的に切断するように設計されているリボザイム分子を用いて標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、それにより標的遺伝子産物の発現を阻害することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公開、Ｓａｒｖｅｒら、１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２を参照のこと）。
【０１１２】
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒し得る酵素ＲＮＡ分子である（概説に関しては、Ｒｏｓｓｉ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：４６９を参照のこと）。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続いての内ヌクレオチド結合分解性切断事象に関する。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を１つ以上含まなければならず、そしてｍＲＮＡ切断の原因となる周知の触媒配列を含まなければならない（この配列に関しては、例えば、米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと。この文献を参照して本明細書中にそのまま組み込む）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを用いて標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する２Ｓ隣接領域により指示される位置でｍＲＮＡを切断する。標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列を有することがただ一つの要件である。５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は当該分野において周知である。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子ｍＲＮＡの５’末端の近くに位置するように、すなわち、効率を上昇させ、機能的ではないｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するために操作される。
【０１１３】
また、本発明のリボザイムは、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（本明細書中以下「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と呼ぶ）を含む（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中に天然で存在するもの（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして公知）およびＴｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈおよび共同研究者ら（Ｚａｕｇら、１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５７４；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：４７０；Ｚａｕｇら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：４２９；国際特許出願公開ＷＯ８８／０４３００、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）により広範囲に記載されているもの）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズした後に標的ＲＮＡの切断が生じる８塩基対活性部位を有する。
【０１１４】
本発明の方法は、標的遺伝子内に存在する８塩基対活性部位配列を標的化するＣｅｃｈ型リボザイムの使用を含む。アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性の改善、標的化などのため）から構成され、インビボで標的遺伝子を発現する細胞へと送達される。好ましい送達方法は、強い構成性ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いることに関し、その結果としてトランスフェクトされた細胞は内生的標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を妨害するために充分な量のリボザイムを産生する。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒性であるので、効率のために必要とされる細胞内濃度は低い。
【０１１５】
また、標的型相同組換えを用いて標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより内生的標的遺伝子の発現を減少させることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと）。例えば、内生的標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡに隣接する変異型非機能的標的遺伝子（または相補的な非関連ＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブな選択マーカー有りまたは無しで使用して、標的遺伝子をインビボで発現する細胞をトランスフェクトさせることができる。標的型相同組換えを介してのＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、ＥＳ（胚性幹）細胞への修飾を用いて不活性な標的遺伝子を有する動物子孫を作製し得る農業分野に特に適している。しかしながら、このアプローチはヒトでの使用に適合させることができるが、ただし、組換えＤＮＡ構築物は適切なウィルスベクターを用いてインビボで必要とされる部位に直接投与されるか、または標的化されている。
【０１１６】
あるいは、内生的標的遺伝子発現は、標的遺伝子の調節領域（すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、体内での標的Ｔ細胞における標的遺伝子の転写を阻害する３重らせん構造を形成することにより減少させることができる（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，６：５６９；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：２７；ならびにＭａｈｅｒ，１９９２，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７を参照のこと）。
【０１１７】
転写の阻害のための３重らせん形成に用いられる核酸分子は一本鎖であり、デオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対ルールにより３重らせん形成を促進するように設計されなければならない（通常、二本鎖のうちの１つの鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかの大きなストレッチを必要とする）。ヌクレオチド配列はピリミジンベースであり、これは得られた３重らせんの３本会合鎖にわたってＴＡＴおよびＣＧＣ＊トリプレットを生じる。ピリミジンが豊富な分子は、その鎖に平行な配向で、二本鎖のうちの１本鎖のプリンが豊富な領域に対して塩基相補性を提供する。さらに、プリンが豊富である核酸分子（例えば、Ｇ残基のストレッチを含む）が選択され得る。これらの分子はＧＣ対が豊富であるＤＮＡ二本鎖と３重らせんを形成し、プリン残基のうちの大多数が標的二本鎖のうちの１本鎖に位置し、３重鎖の３本の鎖にわたりＧＧＣトリプレットを生じる。あるいは、３重らせん形成に関して標的され得る可能性のある配列を、いわゆる「スイッチバック（ｓｗｉｔｃｈｂａｃｋ）」核酸分子を作製することにより増加させることができる。スイッチバック分子は、交代性（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）５’−３’、３’−５’様式で合成し、結果として２本鎖の第１鎖を塩基対合し、次いで他方と塩基対合して、二本鎖の一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかの大きなストレッチに関する必要性を排除する。
【０１１８】
本明細書中に記載のアンチセンス、リボザイムおよび／または３重らせん分子を用いて変異遺伝子発現を阻害する場合、正常な標的遺伝子対立遺伝子により産生されるｍＲＮＡの転写（３重らせん）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を大変効率的に減少または阻害し得ることが可能であるので、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるよりも低い可能性を生じ得る。このような場合に、実質的に正常なレベルの標的遺伝子活性を確実に維持するために、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし、発現する核酸分子を、遺伝子治療法（これはたとえアンチセンス、リボザイムまたは３重らせん治療が用いられようとも、影響を受ける配列は含まない）を介して細胞内に導入することができる。あるいは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合、必要なレベルの標的遺伝子活性を維持するために正常な標的遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましくあり得る。
【０１１９】
本発明の方法に有用なアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイムおよび３重らせん分子は、上記のように、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関する当該分野において公知の方法により製造することができる。これらには、当該分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる（例えば、固相ホスホラミダイト化学合成など）。あるいは、ＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により作製することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む広範な種々のベクターに組み込まれうる。あるいは、用いるプロモーターに応じて、構成的または誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、セルライン中に安定に導入することができる。
【０１２０】
医薬組成物
治療用途のために、治療上有効な量のＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体ならびに治療上有効な量の造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を、それらを必要とする哺乳動物に、約０．１〜１０，０００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与する。本発明に関する方法の実施の際には、場合により、さらに造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を含むＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、ＬＰ８２抗体および／またはそれらのＬＰ８２組成物を、１日に複数回、１日に１回、週に１回の投薬、または他の任意の定期的な間隔で投与することができる。投薬あたりの量および投薬の頻度は医師により決定され、疾患の性質および重篤度、ならびに患者の年齢および全体的な健康のような因子に依存する。
【０１２１】
また、本発明は、活性薬剤としてＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体、ならびに／またはそれらの製薬上許容される非毒性の塩、ならびに製薬上許容される固体または液体のキャリアを含有する医薬ＬＰ８２組成物を提供する。例えば、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体のうちの少なくとも１つは、従来的な製薬キャリアおよび賦形剤とともに投与され得、錠剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウェハ、非経口製剤などの形態で用いられ得る。ＬＰ８２組成物は、約０．１重量％〜９０重量％、ならびにより一般的には、約１０重量％〜３０重量％の活性なＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体を含有する。ＬＰ８２組成物は、一般的なキャリアおよび賦形剤（例えば、コーンスターチまたはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸）を含有し得る。
【０１２２】
一般的な提案として、非経口的に患者に投与される、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体、あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体の用量あたりの薬学的な全有効量は、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、具体的には２ｍｇ／ｋｇ／日〜８ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には２ｍｇ／ｋｇ／日〜４ｍｇ／ｋｇ／日、さらになお具体的には２．２ｍｇ／ｋｇ／日〜３．３ｍｇ／ｋｇ／日、ならびに最終的には２．５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療上の判断のもとにある。より好ましくは、この用量は少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続投与される場合、代表的には、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体および／または造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で、１日１〜４回の注射、または、例えばミニポンプを用いる連続皮下注入のいずれかにより投与される。静脈内バッグ溶液もまた、使用することができる。変化を観察するために必要とされる治療の長さ、ならびに反応が生じるための治療の後の間隔は、おそらく所望の効果に応じて変化する。
【０１２３】
ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体、ならびに／あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を含む医薬組成物は、経口的、経直腸的、頭蓋内、非経口的、くも膜下槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、膣内、腹膜内、局所的（散剤、軟膏、液滴または経皮パッチとして）、経皮的、髄膜下、経頬粘膜または経口もしくは経鼻スプレーとして、投与され得る。「製薬上許容されるキャリア」は、非毒性の固体、半固体または液体の増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）、希釈剤、アジュバント、カプセル化材料、または任意のタイプの処方補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）を意味する。本明細書中で用いる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内への、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体を含む注射、注入およびインプラントを含む投与態様を含むが、これらに限定するわけではない。
【０１２４】
化合物は経口または非経口投与のために処方することができる。皮下投与のために好ましい経口製剤は、緩衝剤（リン酸、クエン酸、酢酸、ホウ酸、ＴＲＩＳ）、塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ）、二価金属（Ｚｎ、Ｃａ）および等張化剤（グリセロール、マンニトール）、界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、ジクサートナトリウム（ｄｄｉｃｕｓａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、ラウリル流酸ナトリウム）、抗酸化剤（アスコルビン酸）、および抗菌剤（フェノール、ｍ−クレゾール、アルコール、ベンジルアルコール、ブチルパラベン（ｂｕｔｙｌｐａｒｂｅｎ）、メチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌｐａｒａｂｅｎ）、エチルパラベン、クロロクレゾール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベンを含有してもよい。
【０１２５】
静脈内（ＩＶ）用途のため、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体および／または造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は一般的に用いられる静脈内流体中で投与され、注入により投与される。生理的生理食塩水、リンゲル溶液、または５％デキストロース溶液のような流体が用いられ得る。
【０１２６】
筋肉内製剤に関しては、滅菌処方物（好ましくは、適切な可溶性塩形態）のＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体ならびに／または造血サイトカインもしくは造血サイトカイン抗体（例えば、塩酸塩）を薬学的な希釈剤（例えば、発熱物質不含水（滅菌）、生理的生理食塩水または５％グルコース溶液）に溶解し、投与することができる。適切な不溶性形態の化合物を、水性ベースまたは製薬上許容されるオイルベース（例えば、オレイン酸エチルのような長鎖脂肪酸エステル）中の懸濁液として製造し、投与することができる。
【０１２７】
また、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体および／もしくはＬＰ８２抗体ならびに／または造血サイトカインもしくは造血サイトカイン抗体を、徐放性システムにより適切に投与する。徐放性組成物の適切な例としては、成形物品の形態での半透過性ポリマー性マトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）が挙げられる。徐放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３．９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７（１９８１）およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同上）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。また、他の徐放性組成物としては、リポソーム閉じ込め式修飾型（ｌｉｐｏｓｏｍａｌｌｙ  ｅｎｔｒａｐｐｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＬＰ８２ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／またはその変異体が挙げられる。このようなリポソームは、本質的に公知の方法により製造される（ＤＥ３，２１８，１２１；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＤＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許出願第８３−１１８００８号；米国特許出願第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；およびＥＰ１０２，３２４）。通常、リポソームは小さく（約２００〜８００オングストローム）単層タイプのものであり、これは脂質含量が約３０ｍｏｌ％コレステロールを超え、この選択した割合は最適な治療のために調節される。
【０１２８】
非経口投与のため、１つの実施態様では、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体および／または造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は、通常、所望の程度の純度で、単位投薬注射形態（液剤、懸濁剤または乳剤）中で製薬上許容されるキャリア（すなわち、用いる投薬量および濃度ではレシピエントに対して非毒性のものであり、製剤中の他の成分と適合性であるもの）と混合することにより製剤化することができる。好ましくは、製剤は、酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含有しない。
【０１２９】
通常、製剤は、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体、ならびに／あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体を、液体キャリアまたは微細に分割した固体キャリアもしくはその両方と、均一および密接に接触させることにより製造する。次いで、必要であれば、製品を所望の製剤に成形する。好ましくは、キャリアは非経口キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油およびオレイン酸エチル）、ならびにリポソームもまた、本明細書中において有用である。
【０１３０】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増加させる物質のような添加剤を少量、適切に含有する。このような物質は、用いる用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これにはリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、ポリアルギニンまたはトリペプチドのような低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような対イオン、および／またはポリソルベート、ポロキサマーまたはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１３１】
ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２機能的フラグメント、ＬＰ８２変異体、および／またはＬＰ８２抗体ならびに／あるいは造血サイトカインまたは造血サイトカイン抗体は、代表的に、このようなビヒクル中に約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで処方される。上記の賦形剤、アジュバント、キャリアまたは安定化剤の特定の使用により、特定の活性成分の塩の形成が生じることが理解される。
【０１３２】
治療上の投与のために用いられる組成物は滅菌されていなければならない。滅菌は、滅菌ろ過メンブレン（例えば、０．２ミクロンメンブレン）を通してのろ過により簡単に達成される。通常、治療用組成物を滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたはバイアル）内に配置し、続いて皮下注射針で穿刺可能なストッパーを有するようにシールする。
【０１３３】
製薬上有用なＬＰ８２組成物および造血サイトカイン組成物は、通常、水溶液または再構築のための凍結乾燥製剤として単位用量または複数回用量の容器（例えば、シール型アンプルまたはバイアル）中に保存される。凍結製剤の例として、１０ｍｌのバイアルに滅菌ろ過したＬＰ８２組成物のうちの１つの１％（ｗ／ｖ）水溶液５ｍｌを充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注射用静菌水を用いて凍結乾燥ポリペプチドを再構築することにより、注入溶液を作製する。
【０１３４】
また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分の１つ以上を充填した容器を１つ以上含む医薬パックまたはキットを提供する。医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府機関により規定されている形態の注意書きがこのような容器に添えられるかもしれない。この注意書きは、ヒト投与に対する製造、使用または販売の政府機関による認可を反映する。
【０１３５】
併用療法
さらに、造血疾患状態の治療において、単独または他のサイトカイン、可溶性Ｍｐｌレセプター、造血因子、インターロイキン、増殖因子または抗体との組合せ、好ましくは本明細書中に記載の造血サイトカインと組み合わせての本発明の治療方法もまた、使用され得る。本発明の治療方法は、いくつかの形態の血小板減少症、貧血、白血病、骨髄移植（ｔｒａｎｓ）の治療に有用であり、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦのような造血の一般的な刺激物質との組み合わせに有用であると判明している。他の巨核球刺激因子（すなわち、ｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）または他の巨核球刺激活性を有する分子）もまた、ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体のうちの少なくとも１つと組み合わせて用いることができる。このような同時投与のためのさらなる例示的なサイトカインまたは造血因子としては、以下のものが挙げられる。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）インターフェロン、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン（例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ）、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、骨形成タンパク質−１〜１５、骨形成タンパク質レセプター１ａ、骨形成タンパク質レセプター１ｂ、脳由来神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子レセプター、上皮細胞成長因子、内皮由来好中球誘引物質、繊維芽細胞成長因子４〜１０、酸性繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｉｄｉｃ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂａｓｉｃ）、グリア細胞株由来神経栄養因子レセプター、へパリン結合上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子レセプター、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子レセプター、インスリン様成長因子１１、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子レセプターａ、神経成長因子、神経成長因子レセプター、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子（血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢおよび血小板由来成長因子レセプターを含むがこれらに限定しない）、前Ｂ細胞成長刺激因子、幹細胞因子レセプター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦＯ、ＴＮＦＩ、ＴＮＦ２を含む）、形質転換増殖因子ｕ、形質転換増殖因子Ｐ、形質転換増殖因子Ｐ１、形質転換増殖因子Ｐ１．２、形質転換増殖因子Ｐ２、形質転換増殖因子Ｐ３、形質転換増殖因子Ｐ５、潜伏（ｌａｔｅｎｔ）形質転換増殖因子Ｐ１、形質転換増殖因子Ｐ結合タンパク質１、形質転換増殖因子Ｐ結合タンパク質２、形質転換増殖因子Ｐ結合タンパク質３、腫瘍壊死因子レセプター１型、腫瘍壊死因子レセプター２型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプター、血管内皮成長因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的または免疫学的に活性なフラグメント。同時または連続的のいずれか（前または後のいずれか）で、可溶性哺乳動物Ｍｐｌレセプター（これは、一旦成熟形態に至った巨核球を血小板へと破片にする効果を有する）を有効量投与することはさらに有用であり得る。従って、可溶性Ｍｐｌレセプター（リガンドを不活性化させて成熟巨核球に血小板を産生させるため）の投与と組み合わせての、上記の追加の因子のうちの少なくとも１つと組み合わせてのＬＰ８２組成物の投与により、血小板産生を刺激する特に有効な手段が期待される。上記の用量は、治療用組成物におけるこのような追加の成分を補うように調節される。１つ以上のさらなる治療用薬剤と組み合わせての投与には、同時（併用）および任意の順番での連続投与が挙げられる。治療する患者の進行は、本明細書中に記載のアッセイ、あるいは当該分野において公知のアッセイによりモニターすることができる。
【０１３６】
以下の実施例は本発明をより充分に記載する。当業者であれば、記載の特定の試薬、装置および手順が単に例示であり、いかなる様式においても本発明を制限することは意図しないことを認識する。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：ＬＰ８２トランスジェニックげっ歯類開発
Ａ．トランスジーン構築
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを合成し、全長コード領域および周囲配列を含むプラスミドからＬＰ８２コード領域を増幅するために用いた。
【化１】
2005506287.tif 000002
５’プライマー（配列番号４）はＡｓｃＩ制限酵素部位（下線）およびＫｏｚａｋ配列を組み込み、一方、３’プライマー（配列番号５）はクローニングを容易にするためにＮｏｔＩ制限酵素部位を組み込んだ。増幅した約０．７ｋｂのフラグメントをプラスミドｐＫ４０９（ｐＦａｓｔＢａｃ発現ベクターの誘導体、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）のマルチクローニング部位（ＡｓｃＩ〜ＮｏｔＩ）に連結した。続いて、ＬＰ８２Ｆｌａｇ［ｐＥＷ１９４３］を用いて構築したベクターをＡｓｃＩ〜ＸｈｏＩで消化し、ＭｌｕＩ〜ＸｈｏＩ部位でｐＬＩＶ７（Ｊｏｈｎ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓより供与）にクローニングしてプラスミドｐＬＩＶ７／ＬＰ８２Ｆｌａｇ−ｐＥＷ３０３３を作製した。
【０１３８】
当業者であれば、ＬＰ８２のヌクレオチド配列、配列番号１に示す周囲配列および当該分野において標準的な技術を用いてヒトＤＮＡまたは他の哺乳動物ＤＮＡにおけるＬＰ８２遺伝子を増幅するための多数の別のＰＣＲプライマーを簡単に設計することができる。
【０１３９】
Ｂ．トランスジェニック動物開発
確立されている技術（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら、（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ、ＦｏｘおよびＳｏｌｔｅｒによる改変（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：５４７０，１９８８）を用いてトランスジェニックマウスを作製した。簡単に説明すると、ヒトアポリポプロテインＥ（ｈＡｐｏＥ）遺伝子プロモーター−５’ｈＡｐｏＥ非翻訳領域−ＬＰ８２／ＦＬＡＧ肝臓制御配列（ＨＣＲ）融合遺伝子を取り巻く６．４ｋｂのＤＮＡフラグメントをＳａｌＩおよびＳｐｅＩを用いての消化によりプラスミドｐＬＩＶ７−ＬＰ８２から切りだし、ゲル電気泳動およびガラスビーズ抽出により精製した。ｈＡｐｏＥ遺伝子プロモーター−５’ｈＡｐｏＥ非翻訳領域−ＬＰ８２−ＨＣＲ融合遺伝子を含む精製ＤＮＡフラグメントを、ＦＶＢ／Ｎ系統の受精したばかりの１細胞期胚（接合体）の雄性前核にマイクロインジェクションした。胚をインビトロで一晩培養して２細胞期まで発生させる。次いで、２細胞期の胚を擬性妊娠させたＩＣＲ系統マウスの卵管に移植し、出産まで発達させた。新生児マウスにおけるトランスジーンの存在について試験するために、各動物の足指から小さい破片を取り、プロテイナーゼＫを用いて消化して核酸を放出させた。続いて、足指抽出物のサンプルを、ｈＡｐｏＥ非翻訳領域に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ分析にかけてトランスジーン含有マウスを同定した。５匹の創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）トランスジェニックマウスを同定した。これらの各創始体を交配させてＦ１およびＦ２世代を作製した。トランスジェニック仔マウスのうちの多数は出生後、最初の数日以内に死ぬ（これらは体のサイズが小さく、厚い表皮にしわが寄っていた）。同腹仔の非トランスジェニックマウスはトランスジェニックマウスよりも明らかに大きく、トランスジェニックマウスをより確実に生存させるために同腹仔から取り除いた。トランスジェニックマウスは脾臓に野生型マウスの約２倍の数のＣＦＵ−ＧＥＭＭを有する（実施例２を参照のこと）。
【０１４０】
実施例２：ＬＰ８２トランスジェニックマウス造血前駆細胞
マウス骨髄細胞および脾細胞を、ＬＰ８２トランスジェニックマウスおよび年齢が適合する野生型マウスから単離した。次いで、各マウスの骨髄由来の単核細胞（１×１０５細胞）、または脾臓由来の単核細胞（１×１０６細胞）を、当該分野において公知の標準的なプロトコルを用いて、０．１ｍＭへミン存在下でメチルセルロース（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。以下の組換え成長因子の組合せ（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いてコロニー増殖を刺激した。：培地Ａ：Ｅｐｏ（１Ｕ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびＰＷＭ−ＳＣＭ（５％培地で順化、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または培地Ｂ：Ｅｐｏ  １Ｕ／ｍｌ。３７℃で７日間細胞を培養した後、倒立顕微鏡のもとで各ディッシュから異なるタイプのコロニーをカウントした。グループの平均値およびＳＤを計算した。以下の表２のデータは各グループの２０匹のマウスからの平均値±標準偏差をあらわす。骨髄の値は大腿骨１本あたりのものであり、脾臓の値は脾臓１個あたりのものである。
【０１４１】
【表２】
2005506287.tif 000003
【０１４２】
ＬＰ８２トランスジェニックマウスは、試験した両方のタイプの条件で骨髄および脾臓の両方で約２倍の数のＣＦＵ−ＧＥＭＭを有した。また、ＬＰ８２の存在により、いくつかの条件においてＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ細胞の数の増加を導いた。
【０１４３】
実施例３：ＬＰ８２トランスジェニックマウスにおけるＨＣＴ回復の上昇
１０〜１２週齢のＬＰ８２トランスジェニックマウスおよび年齢が適合する野生型マウスを、全身照射合計４００ｒａｄの骨髄抑制治療に曝し、続いてＫａｕｓｈａｎｓｋｙら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：１８８３，１９９６）に記載されているようにカルボプラチン０．８ｍｇの腹膜内注射を１回行なった。比較グループに関しては、組換えヒトＥｐｏを１２日間、毎日２０ＩＵで皮下注射した。血液カウントを、Ｈｅｍａｖｅｔ１５００血液学分析器（ＣＤＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて後眼窩（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）経路により得たサンプル５０μｌでおこなった。図２に示すように、ＬＰ８２トランスジェニックマウスは野生型マウスと比較してヘマトクリット（ＨＣＴ）の回復が顕著に上昇し、これはＬＰ８２の発現が骨髄抑制治療の後のＲＢＣおよびＨＣＴの回復を上昇させることを示す。
【０１４４】
実施例４：ＬＰ８２はＣＦＵ−ＧＥＭＭのサイクル状態を増加させる
骨髄細胞および脾細胞を、１０匹のＬＰ８２トランスジェニックマウスおよび１０匹の野生型マウスから単離した。へミン存在下のメチルセルロース培養培地中に細胞をプレーティングする前に、各マウス由来の個々のサンプルを比活性の高いトリチウム化チミジンを用いて２０〜３０分間パルスした。コントロールサンプルの細胞はトリチル化チミジンでパルスしない。この分析により、前駆細胞をマウスから取り出した時点での細胞のサイクル状態の推定を可能にした（すなわち、細胞サイクルのＳ期における前駆細胞の割合）。Ｓ期の細胞サイクルの細胞のみ、トリチル化チミジンで標識される。トリチル化チミジンは組み込んだ細胞を致死的に照射するので、分裂することができなくなる。コントロールサンプル中に存在するコロニーの数からトリチル化サンプル中に生存している数を差し引いた差異は、標識前のＳ期の細胞の数に等しい。コロニー増殖を、Ｅｐｏ（２Ｕ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＷＭ−ＳＣＭ（５％）およびへミンで刺激した。以下の表３に示すように、ＬＰ８２トランスジェニックマウスは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭのサイクル状態を統計上有意に増加させた。
【０１４５】
【表３】
2005506287.tif 000004
【０１４６】
実施例５：ＬＰ８２のマウスへの投与はＣＦＵ−ＧＥＭＭの数を増加させる
【０１４７】
８〜１０週齢の雌性ＢＤＦ１マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）のグループを研究に用いた。後眼窩経路により実験の７日前にマウスを採血してベースライン血液細胞カウントを得た。以下を用いて、グループを１１日間１日２回注射（ｓ．ｃ．）した。
【０１４８】
１００１−３：希釈剤（ＰＢＳ＋０．５％相同マウス血清）
２００１−３：希釈剤中のＬＰ８２（注射１回あたり５μｇ）
３００１−３：希釈剤中のＥｐｏ（注射１回あたり１０単位）
４００１−３：希釈剤中のＬＰ８２＋Ｅｐｏ（上記と当量）
５００１−３：希釈剤中のＳＣＦ（１．５μｇ／注射）＋Ｅｐｏ（１０単位／注射）
６００１−３：希釈剤中のＬＰ８２＋Ｅｐｏ＋ＳＣＦ（上記と当量）。
【０１４９】
次いで、マウス由来の骨髄細胞を回収し、３０％ウシ胎仔血清およびへミンの存在下でメチルセルロースベースの培地中で培養した。コロニー増殖はＥｐｏ（２Ｕ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）で刺激した。ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞のコロニーを倒立顕微鏡下でスコアした。大腿骨１本中の各種類の前駆体の総数を各マウスについて計算した。
【０１５０】
以下の表４に示すように、単独での、または他のサイトカインと組合せたＬＰ８２は、マウスＣＦＵ−ＧＥＭＭの数をインビボで顕著に増加させた（大腿骨１本あたり）。ＬＰ８２＋Ｅｐｏ＋ＳＣＦで処置したマウスのＣＦＵ−ＧＭ細胞（Ｅｐｏ＋ＳＣＦと比較）およびＬＰ８２＋Ｅｐｏで処置したマウスのＢＦＵ−Ｅ細胞（Ｅｐｏと比較）の顕著な増加もまた、観察された。データは、ＬＰ８２が造血前駆細胞に作用し、例えば、がん化学療法の次の貧血、血小板減少症および好中球減少症を治療するために用いることができることを支持する。
【０１５１】
また、注射後８および１２日目に研究中のマウスを採血した。マウス血液に最適化した設定のＨｅｍａｖｅｔ  １５００血液分析機械で血液サンプルを分析した。結果を、以下の式を用いて計算したベースライン値からの増加割合として以下の表５に示す。
（（実験グループの平均変化−希釈剤グループの平均変化）／実験グループの予備処理平均）×１００。
【０１５２】
データは、ベースライン値からの増加割合が１２日目に試験した全てのパラメーターについてＬＰ８２＋ＳＣＦ＋Ｅｐｏに関してより高いことを実証した。８日目では、Ｅｐｏ＋ＳＣＦと比較して、ＬＰ８２＋Ｅｐｏ＋ＳＣＦについて血小板、白血球細胞および好中球に関してより高い増加を観察した。これは、ＳＣＦ投与の効果は一過性であり、７〜８日目にピークを有するという当該分野における知見と一致する（Ｕｌｉｃｈら、Ｂｌｏｏｄ，７８：６４５−５０，１９９１）。
【０１５３】
【表４】
2005506287.tif 000005
【０１５４】
【表５】
2005506287.tif 000006
【０１５５】
実施例６：造血モジュレーターに関してのインビトロ試験
Ａ．ヒト巨核球アッセイ
ＬＰ８２ポリペプチドを、ＣＤ３４＋前駆細胞に由来するヒト巨核球の発生を刺激する能力についてアッセイすることができる。ＣＤ３４＋選択細胞を記載されるように骨髄から入手し（Ｈｏｋｏｍ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ３：１５，１９９４）、２ｍＭグルタミン、２−メルカプトエタノール（１０−４Ｍ）、１％ウシ血清アルブミン、低密度リポプロテイン（４０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）、ウシ膵臓インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（２００μｇ／ｍｌ）、ヒト組換えトロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ヒト組換え幹細胞因子（５０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および＋／−単離ＬＰ８２（２００ｎｇ／ｍｌ）を加えたイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；ＧＩＢＣＯ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中でインキュベートした。ＣＤ３４＋細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から購入した２ウェルチャンバスライドで３３００細胞／ｍｌの最終濃度でプレーティングする。細胞を、５％ＣＯ２大気の加湿ボックス中で３７℃で１２日間、インキュベートする。次いで、１：３のメタノール：アセトン溶液を用いて細胞を直接培養ウェルに固定し、モノクローナル抗体である抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でインキュベートする。免疫反応系を、ビオチン結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ、続いてアビジン−アルカリフォスファターゼ結合体を用いて発色させ、桃色により同定し、１００倍の倍率で倒立位相差顕微鏡を用いてカウントする。ＬＰ８２非存在下、４７個の巨核球コロニーが観察され、ＬＰ８２（２００ｎｇ／ｍｌ）存在下、６５個の巨核球コロニーが観察された。
【０１５６】
Ｂ．骨髄液体培養物に対するアッセイ
ＣＤ３４＋ヒト骨髄細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）をポリプロピレンＶ底９６ウェルプレートに、１０，０００細胞／ウェルで、３ウェル／グループでプレーティングする。幹細胞因子（ＳＣＦ）を１０ｎｇ／ｍｌで用い、インターロイキン−３（ＩＬ−３）を０．１ｎｇ／ｍｌで用い、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を１Ｕ／ｍｌで用い、ＬＰ８２を４００ｎｇ／ｍｌで用いる。以下のサイトカイン条件をＩＭＤＭ／３０％ＦＢＳ＋抗生物質中で試験する。
１．ＳＣＦ／ＩＬ−３／（±ＬＰ８２）
２．ＩＬ−３／ＥＰＯ／（±ＬＰ８２）
３．ＳＣＦ／ＩＬ−３／ＥＰＯ／（±ＬＰ８２）
４．ＳＣＦ／ＩＬ−３／ＭＣＳＦ＊
５．ＳＣＦ／ＩＬ−３／ＥＰＯ／ＴＧＦβ＊
＊ＭＣＳＦはマクロファージ刺激因子であり、ＴＧＦβは形質転換増殖因子βである。
【０１５７】
サンプル１（ＳＣＦ＋ＩＬ−３）は追加の因子（例えば、ＬＰ８２）が存在しない最小限の増殖が期待されるネガティブコントロールである。サンプル２（ＩＬ−３＋ＥＰＯ）は追加の成長因子が存在しない最小限の増殖が期待されるネガティブコントロールである。サンプル３（ＳＣＦ＋ＩＬ−３＋ＥＰＯ）は追加の因子が存在しない条件下で強い赤血球増殖および／または分化を生じることが期待され、また、ＳＣＦ＋ＩＬ−３またはＩＬ−３＋ＥＰＯを第３の因子の非存在下（＋または−ＬＰ８２）で用いた場合に観察される量を超える量の赤血球増殖および／または分化を実証する。サンプル４（ＳＣＦ＋ＩＬ−３＋ＭＣＳＦ）を用いて、ＭＣＳＦ非存在下でＳＣＦ＋ＩＬ−３を用いる場合（＋または−ＬＰ８２）と比較して、顕著な単球増殖および／または分化を実証する。サンプル５（ＳＣＦ＋ＩＬ−３＋ＥＰＯ＋ＴＧＦβ）を用いて、ＴＧＦβ非存在下でＳＣＦ＋ＩＬ−３＋ＥＰＯを用いる場合（＋または−ＬＰ８２）と比較した場合の、赤血球増殖および／または分化の調節を実証する。
【０１５８】
培養は、蒸発を防止するために通気性シールメンブレンを用いて、５％ＣＯ２、９５％湿度で３７℃で１０日間、インキュベートする。栄養補充（ｆｅｅｄｉｎｇ）は、培地４００μｌを新しい培地に交換することにより４および７日目に行なう。１０日目に細胞をＶ底プレートに移し、ＣＤ１４（ＦＩＴＣ）およびＣＤ３６（ＰＥ）細胞表面抗原で染色する。細胞を遠心分離し、５０μｇ／ｍｌヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で１５分間インキュベートする。単球はＣＤ１４＋であり、赤血球株の細胞はＣＤ３６＋であり、ＣＤ１４およびＣＤ３６の両方に対してネガティブである細胞は「未確定」と呼び、これは続いて単球または赤血球へと分化し得る。診断抗体（単球に対してはαＣＤ１４−ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）であり、赤血球細胞に対してはαＣＤ３６−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である）をさらに１５分間加える。洗浄（リン酸緩衝化生理食塩水、０．１％ウシ血清アルブミン）の後、細胞を最終容量１ｍｌ（０．１ｍｌ  ＦｌｏｗＣｏｕｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）含有）でチューブ（１２×７５ｍｍ）に移す。次いで、細胞を、ＦｌｏｗＣｏｕｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅ定数（例えば、５０００）に基づいてフローサイトメーターで得る。データの分析は、各ウェル中に存在する各系列の細胞数を決定することにより行う（これは、サンプル中の既知数の蛍光体に基づいて計算する）。全細胞、単球細胞、赤血球細胞および未確定系列（ＣＤ１４−およびＣＤ３６−マイナス）の数を決定する。データを、ＪＭＰ４ソフトウェアを用いて統計分析に供する。未知（ｕｎｋｎｏｗｎ）は、ダネット検定（ｐ＝０．０１）を用いてネガティブコントロールと比較する。データを以下の表６に示す。
【０１５９】
【表６】
2005506287.tif 000007
【０１６０】
データは、幹細胞因子、インターロイキン３およびエリスロポエチンの存在下でＬＰ８２が全細胞、赤血球および未確定（赤血球または単球ではない）の細胞の数をネガティブコントロールよりも多く誘導することを示す。
【０１６１】
Ｃ．ＬＰ８２はＣＦＵ−ＧＥＭＭの数を増加させる
ＣＤ３４＋細胞を、標準的な手順を用いてメチルセルロース培養物またはＡｇａｒ培養培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種した。コロニー増殖は、ＬＰ８２（２００ｎｇ／ｍｌ）有りまたは無しで、以下の組換え増殖因子の組合せを用いて刺激した。（１）Ｅｐｏ（２Ｕ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および（２）Ｅｐｏ＋ＳＣＦ＋ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）。市販のサイトカインは全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。３７℃で２週間培養した後、異なるタイプのコロニーを、倒立顕微鏡下で各ディッシュからカウントした。結果を以下の表７に示す。ＬＰ８２は、最終的には赤血球、顆粒球、単球および血小板へと分化するＣＦＵ−ＧＥＭＭの数を顕著に増加させ、ＣＦＵ−ＧＭの数をわずかに増加させた。
【表７】
2005506287.tif 000008
実施例７：造血モジュレーターに関する、正常マウスでの追加のインビボ試験
Ａ．骨髄移植の後の血液細胞の回復に関するアッセイ
ＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎仔血清含有）を用いて正常８〜１０週齢Ｂａｌｂ  Ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｉｌｓ，ＩＮから購入）の後足を穏やかに洗浄することにより骨髄（ＢＭ）を回収した。いくつかの実験に関して、ドナーマウスを、ＢＭの回収前に３日間、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（１５０ｍｇ／体重１ｋｇ）で腹膜内注入して注射用に予備処理する。約１０．８Ｇｙ（１２６ｃＧｙ／分で１３７Ｃｓ、投薬間隔最短３時間での分割投薬）での全身照射の後、１×１０６骨髄細胞を、致死量で照射したマウスに静脈内注射（ＩＶ）する。ＬＰ８２（２５０μｇ／体重１ｋｇ）をＰＢＳで希釈し、毎日０．２ｍｌ容量を皮下注射する（これは照射およびドナー骨髄細胞の注入と同日から開始する）。コントロールマウスには同体積のＰＢＳを投与した。ＬＰ８２ポリペプチドの投与は０〜１７日目に行なう。移植後の期間の間、マウスを４日ごとに秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの造血分析を、眼窩採血で、ＣＤＣ  ＨｅｍａｖｅｔＴＭ機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、分化分析に関して１００倍で試験する。ヘマトクリットは、Ｍｏｄｅｌ  ＭＢ  Ｍｉｃｒｏ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いてキャピラリーチューブを５分間スピンさせることにより行なう。従って、ＬＰ８２ポリペプチドを用いて抹消血液細胞カウントの回復を加速することができる。
【０１６２】
Ｂ．化学／放射線療法併用後の血液細胞の回復に関するアッセイ
８〜１０週齢のＢＤＦ１マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）に、カルボプラチン（６０ｍｇ／体重１ｋｇ）を腹膜内投与（ＩＰ）した１時間後に致死量未満の照射（２０〜２２ｍｇのマウスに対して０．５Ｇｙ全身照射）を行なう。ＬＰ８２ポリペプチド（ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦ有りまたは無し）を、毎日０．２ｍｌの体積で皮下注射する（これは照射と同日に開始する）。ネガティブコントロールマウスには処置マウスと同体積のＰＢＳを投与する。ＬＰ８２ポリペプチド投与は１７日間続ける。マウスを、照射後、種々の日に分析する。マウスを照射後の期間の間、２〜４日毎に秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの造血分析を、眼窩採血で、ＣＤＣ  ＨｅｍａｖｅｔＴＭ機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、分化分析に関して１００倍で試験する。ヘマトクリット測定は、Ｍｏｄｅｌ  ＭＢ  Ｍｉｃｒｏ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅでキャピラリーチューブを５分間スピンさせることにより行なう。ＬＰ８２ポリペプチドは、化学および／または放射線療法後の抹消血液細胞カウントの回復の加速に有用であり得る。
【０１６３】
Ｃ．貧血の処置に関するアッセイ
貧血および造血障害の種々の動物モデルは当該分野において公知であり、通常、貧血病態の指標であると受け入れられている。例えば、前低酸素性赤血球増加症（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ  ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ）マウスバイオアッセイを用いて、外来的に投与した試験サンプル（例えば、推定ＬＰ８２アゴニスト、ＬＰ８２アンタゴニスト、ＬＰ８２ポリヌクレオチド、ＬＰ８２ポリペプチド、ＬＰ８２フラグメント、ＬＰ８２変異体および／またはＬＰ８２抗体）に反応してのマウスにおける赤血球生成の上昇の指標として５’Ｆｅ（鉄）の新規に合成された赤血球細胞への取込を定量することができる。ＷＯ／００２４８９３（本明細書中に参照して組み込む）に記載のアッセイは、ＣｏｔｅｓおよびＢａｎｇｈａｍ（Ｎａｔｕｒｅ  １９１：１０６５（１９６１））の方法の変法である。
試験薬剤は任意の種々の投与経路（例えば、ｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．またはミニポンプまたはカニューレによる）により投与することができ、適切な試験動物としては、実施例１の記載と同様に正常マウスならびにＬＰ８２トランスジェニックマウスが挙げられる。これらの処置に対する非特異的効果についてのコントロールは、類似の組成の活性薬剤を用いて、または用いずに、ビヒクルを使用して、同じタイプの動物で同じパラメーターをモニターすることにより行なわれる。
【０１６４】
実施例８：抗原性刺激の際にＬＰ８２を発現する脾細胞の増殖およびサイトカイン分泌
平底９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌα−ＣＤ３／ウェルを含む１００μｌ培地（ＲＰＭＩ，１０％ＦＢＳ）でコーティングする。プレートを１．５時間、３７℃でコーティングし、吸引し、ＰＢＳで２回洗浄する。次いで、培地体積１００μｌ中の４×１０５脾細胞を各ウェルに加え、プレートを３７℃で４８時間、インキュベートする。プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、各ウェルからの上清１００μｌを取り出し、９６ウェルＵ底プレートに移し、そのうちの１０μｌを標準的な手順に従ってサイトカイン分泌イムノアッセイに用いる。細胞の残りを１μＣｉの３Ｈ−チミジン／ウェルでパルス標識し、計測前にさらに２４時間インキュベートする。抗−ＣＤ３による脾細胞の活性化に加えて、他の刺激を同じ様式で試験することができる。試験する好ましい刺激としては、ＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍｌ）の希釈物、ＣｏｎＡ（８μｇ／ｍｌ）の希釈物、ＰＭＡの１μＭイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）での希釈物、およびＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）が挙げられる。
【０１６５】
実施例９：ＬＰ８２トランスフェニックマウスの致死量未満の用量での放射線への暴露
両方の性別の野生型およびトランスジェニックマウスを６００ｃＧｙで照射する。マウスを、照射後３、７、１０、１４、２１、２８日目に分析する。マウスを照射後の期間に２日毎に秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの造血分析を、眼窩採血で、ＣＤＣ  ＭａｓｃｏｔＴＭ機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、分化分析に関して１００倍で試験する。抹消血ヘマトクリットは、Ｍｏｄｅｌ  ＭＢ  Ｍｉｃｒｏ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いてキャピラリーチューブを５分間スピンさせることにより行なう。致死量未満の用量での放射線に対する照射後に、ＬＰ８２を用いて抹消血液細胞カウントの回復を加速することができる。
【０１６６】
ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の絶対数および／またはサイクル状態の増加により、単独または他のサイトカインと組み合わせてＬＰ８２を用いて、貧血、血小板減少症、好中球減少症（ｎｅｕｒｏｐｅｎｉａ）および他の造血および免疫障害を治療することができる。
【０１６７】
実施例１０：ラージスケールでのＬＰ８２ポリペプチドの精製
ＬＰ８２（ＦＬＩＳ−タグ化−ＬＰ８２を発現する細胞から分泌）を含有する細胞培養培地Ａｍｉｃｏｎ  Ｓ３Ｙ１０  ＵＦメンブレンを用いて、Ａｍｉｃｏｎ  ＰｒｏＦｌｕｘ  Ｍ１２タンジェンシャル（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）ろ過システムで濃縮する。濃縮培地を固定金属アフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流速２ｍｌ／分で通す。カラムを、吸光度がベースライン値に戻るまで緩衝液Ａ（ＰＢＳ（１ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭリン酸ナトリウム）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭイミダゾール含有）で洗浄する。結合型ポリペプチドを、１００％緩衝液Ａ〜５５％緩衝液Ａの勾配で溶離させ、７０分展開させる。次いで、勾配を２０分間かけて、１００％緩衝液Ｂ（０．５Ｍイミダゾールを含有する緩衝液Ａ）まで段階的に上げる（ｓｔｅｐｐｅｄ）。ＬＰ８２を含有する画分をプールし、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ遠心ろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａ分子量カットオフ）を用いて１４ｍｌまで濃縮する。この材料を、ＰＢＳ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２６／６０）サイズ画分カラムに流速３ｍｌ／分で通す。ＬＰ８２を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。ＬＰ８２のＮ−末端配列を、標準的技術を用いて精製ポリペプチドで確認した。
【０１６８】
実施例１１：混合リンパ球反応系でのＬＰ８２脾細胞の増殖
混合リンパ球反応アッセイにおいて、マイトマイシンＣで処理した後にＤＢＡ／２マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）由来の脾細胞を刺激細胞として用いることができる。応答細胞は、ＬＰ８２遺伝子を移植したＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）またはネイティブなマウスから単離した脾細胞である。応答Ｔ細胞の懸濁液を同種刺激リンパ球と共に培養する。活性化刺激は、同種刺激細胞で発現させた外来性組織適合性抗原（通常、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）である。
【０１６９】
簡単に説明すると、ＤＢＡ／２由来の脾細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で９６−ウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルで加える。年齢適合Ｃ５７Ｂｌ／６ネイティブマウスまたはレトロウィルス発現型ＬＰ８２マウスのいずれか由来の脾細胞を、０．５、１、２、４または８×１０５細胞／ウェルのいずれかで応答細胞としてウェルに加える。コントロールウェルは、ＤＢＡ刺激脾細胞単独、またはＣ５７Ｂｌ／６応答脾細胞単独を含有した。インビトロで７２時間後、ウェルをトリチル化チミジン１μＣｉでパルス標識する。１８時間後、細胞を回収し、カウントする。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、造血幹細胞から最終的に分化したＲＢＣ、顆粒球、単球および血小板へと分化する細胞系統の模式図を示す。
【図２】図２は、マウス化学療法／放射線モデルにおけるヘマトクリットの回復を示す。値は平均値＋／−ＳＥＭを表す。