(57)【要約】  本発明は、従来よりも効果的な骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症予防薬及び治療薬を提供することを目的とする。Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩とエチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物を併用することによって、単独の投与に比較して、高い骨吸収抑制作用を発揮し、優れた骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症予防効果及び治療効果が得られる。
2009017222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）及び（ｂ）を有効成分として含有する骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
（ａ）Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩。
（ｂ）エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物。
【請求項２】
骨代謝異常に起因する疾患が骨吸収異常に起因する疾患である、請求項１に記載の骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
【請求項３】
骨代謝異常に起因する疾患が骨粗鬆症である、請求項１または請求項２に記載の骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
【請求項４】
（ｂ）がクロドロン酸若しくはリセドロン酸又はそれらの塩である、請求項１〜３に記載の骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
【請求項５】
（ｂ）がリセドロン酸又はその塩である、請求項１〜３に記載の骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
【請求項６】
（ａ）及び（ｂ）が合剤を構成する請求項１〜５のいずれかに記載の骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
【請求項７】
（ａ）及び（ｂ）がそれぞれ独立した単剤である請求項１〜５のいずれかに記載の骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
【請求項８】
（ａ）及び（ｂ）を含むキットである請求項１〜５のいずれかに記載の骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代謝異常に起因する疾患の予防剤又は治療剤に関し、特に骨粗鬆症の予防剤又は治療剤に関し、具体的には、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩、及びエチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物を有効成分として含有する骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症の予防剤又は治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
式（Ｉ）で表されるＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩は、骨吸収抑制効果及び骨形成促進効果を有し、骨粗鬆症の治療剤又は予防剤として期待されるものである。【０００３】
【化１】
2009017222.tif 000003
【０００４】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩は、特許文献１及び非特許文献１に開示されている。【０００５】
エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、若しくはゾレドロン酸、又はそれらの塩は、活性化した破骨細胞に対して特異的に作用し、その活性を抑制することで骨吸収を抑制すると考えられ、骨粗鬆症をはじめカルシウム代謝異常に基づく疾患の治療薬として用いられている。【０００６】
現在、使用できる骨粗鬆症治療薬は多数存在する。しかしながら、これらの併用による治療効果は一様ではない。例えば、ＰＴＨ（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ；副甲状腺ホルモン）とある種のビスホスホン酸との組合せでは、治療効果が相殺されることが知られている。両者は代表的な骨粗鬆症治療薬であるが、併用投与した場合、それぞれ単独で投与された場合よりも治療効果が減弱するという前臨床試験及び臨床試験結果が報告されている（非特許文献２、３）。この例からも考えられるように、既存若しくは新規の骨粗鬆症治療薬による、より効果の高い治療方法若しくは予防方法を見出すことは容易に想定できるものではない。
【特許文献１】特表２００４−５３７５４９号公報
【非特許文献１】李ソンウン，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｎｅｗ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＬＴＢ４ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，釜山大学校大学院理学博士学位論文，１９９９．８
【非特許文献２】Ｒ  Ｓａｍａｄｆａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，第１４８巻６号，２００７
【非特許文献３】ＤＭ  Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第３４９巻１３号，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症の治療剤若しくは予防剤及び治療方法若しくは予防方法として、既存薬に比べて、より効果の高い薬及び治療方法若しくは予防方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症の治療剤又は予防剤として有効な成分について鋭意研究を行ったところ、それぞれ単独で用いうる特定の薬剤を併用することによって、格段に効果の優れた骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症の治療剤若しくは予防剤又は治療方法若しくは予防方法が提供できることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、下記の（ａ）及び（ｂ）を有効成分として含有する骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症予防剤若しくは治療剤、又は予防方法若しくは治療方法である。
（ａ）Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩。
（ｂ）エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物。【００１０】
また、本発明は、（ａ）及び（ｂ）を有効成分として含有し、合剤又はそれぞれ独立した単剤である骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症予防剤又は治療剤である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩と、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物とを併用して投与することを特徴とする骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症の予防薬若しくは治療薬又は予防方法若しくは治療方法であり、それぞれ単独で使用するよりも、両剤を併用して投与することで格段に強い予防効果又は治療効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウス骨髄由来細胞に１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３を添加して７日間培養することによって破骨細胞様細胞が形成される実験系に溶媒、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）、リセドロン酸のうち、それぞれの単独又は二つを併用して破骨細胞様細胞の形成数への抑制効果を示したグラフである。
【図２】マウス骨髄由来細胞に１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３を添加して７日間培養することによって破骨細胞様細胞が形成される実験系に溶媒、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）、リセドロン酸のうち、それぞれの単独又は二つを併用して破骨細胞様細胞の形成数への抑制効果を示したグラフである。
【図３】マウス骨髄由来細胞に１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３を添加して７日間培養することによって破骨細胞様細胞が形成される実験系に溶媒、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）、リセドロン酸のうち、それぞれの単独又は二つを併用して破骨細胞様細胞の形成数への抑制効果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いられるＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩は、優れた骨吸収抑制効果及び骨形成促進効果を有し、骨粗鬆症の治療剤又は予防剤として期待されるものである。【００１４】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンは、非特許文献１の記載など、公知の方法で製造可能である。【００１５】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンの塩としては、無機酸（塩酸、臭素酸、硫酸及びリン酸）や有機酸（クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、安息香酸、マレイン酸、グルコン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、ガラクトロン酸、エンボン酸、グルタミン酸又はアスパラギン酸）を用いた、薬剤学的に許容されるものが挙げられる。本発明においては、無機酸としては塩酸が、また有機酸としてはメタンスルホン酸又はエタンスルホン酸が好ましく用いられる。【００１６】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩の投与量としては、骨粗鬆症の予防又は治療に有効な量であり、かつ、患者の年齢、体重、併用療法の種類、治療の頻度、望まれる効果の種類、あるいは投与法等によるため一概には決められないが一般に治療剤又は予防剤として用いる場合には、通常投与される量で可能である。【００１７】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンの脱ヒドロキシ体である、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１、３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩も、優れた骨吸収抑制効果及び骨形成促進効果を有し、骨粗鬆症の治療剤又は予防剤として期待されるものである。４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１、３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩も、上記と同様に、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物との併用が可能である。そして、併用によって、骨粗鬆症の予防薬若しくは治療薬又は予防方法若しくは治療方法として、単独使用に比べて強い効果が得られる。【００１８】
本発明で用いられるエチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、若しくはゾレドロン酸、又はその塩においては、なかでもクロドロン酸又はリセドロン酸が好ましく、さらに好ましくはリセドロン酸である。また、これらは、本発明においてＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩と併用するにあたって、一種であっても、二種以上を任意の割合で混合して用いてもよい。好ましくは、これらから選ばれる一つの化合物である。これらは、公知の方法で製造可能である。【００１９】
本発明で用いられる、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、若しくはゾレドロン酸の塩としては、無機酸（塩酸、臭素酸、硫酸及びリン酸）や有機酸（クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、安息香酸、マレイン酸、グルコン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、ガラクトロン酸、エンボン酸、グルタミン酸又はアスパラギン酸）、あるいは、無機塩基（ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の金属塩等）又は有機塩基（アンモニア、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、プロパンジアミン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ピリジン、リジン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ‐ジメチルエタノールアミン、４‐ヒドロキシピペリジン、グルコサミン、Ｎ‐メチルグルカミン等）を用いた、薬剤学的に許容されるものが挙げられる。【００２０】
本発明の骨粗鬆症予防剤又は治療剤は、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる１種類以上の化合物と、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩という異なる作用機序を持つ２種類を有効成分として併用することにより、従来公知の骨粗鬆症治療剤以上の骨密度及び／又は骨強度の向上効果を有する薬剤の提供を可能にするものである。また、本発明の薬剤は、毒性が低く、安定性にも優れたものである。併用とすることにより、各有効成分の投与量を単一で投与するときより減らすことも可能である。【００２１】
エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物の投与量としては、骨粗鬆症の予防又は治療に有効な量であり、かつ、患者の年齢、体重、併用療法の種類、治療の頻度、望まれる効果の種類、あるいは投与法等によるため、一概には決められないが、一般に治療剤又は予防剤として用いる場合には、通常の量を投与することが可能である。【００２２】
本発明の骨粗鬆症予防剤若しくは治療剤又は予防方法若しくは治療方法は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩、及びエチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物を有効成分として含有するものであればよく、それらは混合して同時に投与することもできるが、それぞれを別々に同時又は連鎖的に、あるいは時間をおいて別々に投与することもできる。投与時が同時でない場合は、例えば、両有効成分を互いに交互に投与してもよいし、一方の剤を続けて投与した後に、他方の剤を投与してもよい。【００２３】
本発明における薬剤は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩、及びエチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物を有効成分として含有していればよく、どのような形態の薬剤であっても構わない。例えば、両有効成分を含む合剤を構成しても良いし、それぞれ単剤として構成しても良い。ここで合剤とは一つの製剤に２つ以上の有効成分を配合したものを指し、単剤とは一つの製剤に一つの有効成分を含むものを指す。なお、単剤の態様の場合、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、及びゾレドロン酸又はそれらの塩から複数の化合物が使われる場合は、それぞれを単剤として使用しても良いし、合剤として使用しても良いが、それぞれ単剤として使用する態様が好ましい。【００２４】
本発明における両有効成分が単剤である場合の治療剤若しくは予防剤又は治療方法若しくは予防方法とは、それぞれ単一に利用できる単剤を、組み合わせて利用する薬剤又は方法を意味する。したがって、両有効成分を含む薬剤がそれぞれ異なる剤型であっても構わない。例えば、それぞれの剤の形態は、固体又は液体同士でもよいし、固体と液体でも良いし、特に限定されない。両有効成分が単剤の場合は、両剤を一式として揃えた状態である、キットの形態にしてもよい。代表的なキットの形態としては、一連の投与スケジュールに従って特定の期間（例えば１週間あるいはそれ以上の期間）に相当する両剤を１つのシートにまとめて包装したブリスターパッケージなどが挙げられる。他にも、剤の製造終了段階でＰＴＰ等で同一のパッケージがされたり、病院や薬局等で処方されるときに同一の袋に入れられたりしてもよく、特に限定されない。【００２５】
合剤としては、例えば、両有効成分のそれぞれの効果が発揮できる適当量を合わせて、錠剤、カプセル剤、液剤などの剤形を製造することが挙げられる。このとき両有効成分を合わせて配合剤とするタイミングは、合剤として剤型の製造段階で行ってもよいし、投与する直前に配合するものであってもよい。製造段階で行う場合には、例えば各有効成分を適当量混合して、成型したり、詰め合わせたりすればよい。成型する方法としては、例えば、それぞれの剤を混合してもよいし、層状に積み重ねてもよく、特に限定されない。投与する直前に配合剤とする場合は、例えば投与直前までは、各有効成分はそれぞれ独立の状態で保存され、投与する時に、液体状の剤を混合したり、液体状の剤に錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、又はカプセル剤等の固体の剤を溶かしたり、顆粒剤又は散剤等の固体の剤同士を混合したりする方法がある。直前に混合するための方法としては、手作業で行ってもよいし、切断したり、引いたり、裂いたり、引き抜く等して、簡単に両剤が混ざるようなパッケージのものを使用してもよい。配合剤の形態としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はカプセル剤等の剤型がある。  【００２６】
また、本発明の骨粗鬆症予防剤又は治療剤は、連日投与、又は間歇的に投与しても良く、一日当たりの投与回数は、１回又は２〜３回に分けて行うことができる。両有効成分がそれぞれ単剤である場合の投与回数は、同じ回数としても良いし、異なった回数とすることもできる。例えば、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩を毎日１回投与し、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物を週一あるいは２週間に１回や１月に２回投与することも挙げられる。また、両剤が単剤であるときに、それぞれが通常投与される回数を組み合わせることでもよい。このように両剤が異なった投与回数を選択した場合においてもブリスターパッケージ等のキットの形態をとれば、利便性の向上が期待される。【００２７】
本発明のＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩、及びエチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物は、それらの有効成分のみ、あるいは以下に説明するような適当な賦形剤とともに公知の方法で製剤化することができる。このような剤型の具体例としては、軟カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤、シロップ剤等の経口剤、注射剤、あるいは外用剤を挙げることができる。【００２８】
かかる賦形剤としては、植物油（例えばトウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、落花生油が挙げられる）、中鎖脂肪酸グリセリド等の油状エステル、鉱物油、ワセリン、動物油脂、セルロース誘導体（例えば結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースが挙げられる）、ポリビニルピロリドン、デキストリン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、デンプン等が挙げられる。また、必要に応じて、酸化防止剤、湿潤剤、粘度安定剤、着色剤等の添加剤を加えることもできる。【００２９】
また、本発明は、骨粗鬆症の予防剤若しくは治療剤又は予防方法若しくは治療方法に限定されず、骨代謝の異常に起因する疾患、特に骨代謝のうち骨吸収の異常に起因する疾患の予防剤若しくは治療剤又は予防方法若しくは治療方法としても適用しうる。骨吸収の異常に起因する疾患としては、関節リウマチ、骨パジェット病、高カルシウム血症、歯周骨喪失、腎性骨異栄養症、骨溶解性腫瘍および骨転移性腫瘍などが挙げられる。これらの疾患の予防剤若しくは治療剤又は予防方法若しくは治療方法についても、骨粗鬆症の予防剤若しくは治療剤又は予防方法若しくは治療法と同様の説明が当てはまる。
【実施例】
【００３０】
[実施例１]破骨細胞様細胞形成へのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンとリセドロン酸の影響の検討
マウス骨髄由来細胞は、マウスの大腿骨及び脛骨の骨髄を採取した後、常法により赤血球を除き、９６−ウェルプレートに４×１０５個／ウェルの密度で播き込んだ。一晩培養後、ここに、１０‐９Ｍとなるように１α，２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３という）を含む培地を添加し、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で７日間培養することにより、多核の破骨細胞様細胞を形成させた。培地には、１０％ウシ胎児血清を添加したアルファＭＥＭ培地（以下、１０％ＦＣＳ‐αＭＥＭという）を用いた。マウス骨髄由来細胞への１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３添加時に、溶媒のみ（比較例１−１）、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（図では化合物Ａと表記する）単独（比較例１−２）、リセドロン酸単独（比較例１−３）、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（図では化合物Ａと表記する）とリセドロン酸を同時に（実施例１）マウス骨髄由来細胞培養系にそれぞれ添加し、破骨細胞様細胞の形成に対する作用を評価した。実験は以下の群を設定した。【００３１】
比較例１−１；対照群（コントロール）
比較例１−２；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−７Ｍの単独添加群
比較例１−３；リセドロン酸の３×１０−７Ｍの単独添加群
実施例１；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−７Ｍとリセドロン酸の３×１０−７Ｍの同時添加群【００３２】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の添加に関しては、比較例及び実施例ともに、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて１０−４Ｍの濃度に溶解したものを、１０００倍希釈で１０−７Ｍとなるように培地に添加した。リセドロン酸の添加に関しては、比較例及び実施例ともに、リセドロン酸ナトリウム水和物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３×１０−４Ｍの濃度に溶解したものを、１０００倍希釈で３×１０−７Ｍとなるように培地に添加した。各条件の被験化合物の添加開始３日目に、比較例及び実施例ともに、各条件の被験化合物を含んだ新鮮な１０％ＦＣＳ‐αＭＥＭに交換した。【００３３】
比較例及び実施例ともに、培養開始７日後に培地を除去し、細胞をリン酸緩衝ホルマリンで固定し、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという）染色をＳｉｇｍａ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ）ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製  品番３８６Ａ）を用いて行い、光学顕微鏡下で、６核以上の細胞核を有するＴＲＡＰ陽性多核細胞を破骨細胞様細胞として、その数を計数した。【００３４】
結果を図１に記載した。グラフには比較例１−１で形成された破骨細胞様細胞数を１００％とした場合の各比較例、実施例での破骨細胞様細胞の形成数を百分率で示し、各群３ウェルの平均＋／−標準偏差で表示した。比較例１−２（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）単独添加）及び比較例１−３（リセドロン酸単独添加）では、比較例１−１（溶媒添加・コントロール群）に対して、破骨細胞様細胞数は減少傾向を示したものの（比較例１−２；８１．３％、比較例１−３；８８．１％）、有意ではなかった。【００３５】
図１から明らかな通り、実施例１（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）＋リセドロン酸同時添加）の破骨細胞様細胞数は、比較例１−２及び比較例１−３に比べて極めて減少し（５２．３％）、比較例１−１に対しては有意に低値を示した。すなわち、前記２剤を併用した場合には単剤それぞれの効果の和から予想されるより有意に強い作用が認められた。【００３６】
図中の、＊はＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定の結果、対照群に対して、ｐ＜０．０５であることを表す。＊＊＊はＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定の結果、対照群に対して、ｐ＜０．００１であることを表す。＃はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、比較例２−２に対して、ｐ＜０．０５であることを表す。＃＃はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、比較例２−３に対して、ｐ＜０．０１であることを表す。【００３７】
また、比較例１−１に対する各群の破骨細胞様細胞形成抑制率を表１に示した。【００３８】
【表１】
2009017222.tif 000004
【００３９】
[実施例２]  破骨細胞形成へのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンとリセドロン酸の影響の検討
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンの培地中濃度を１０−６Ｍとした他は、実施例１と同様にして実験を行い、以下の群を設定した。【００４０】
比較例２−１；対照群（コントロール）
比較例２−２；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−６Ｍの単独添加群
比較例２−３；リセドロン酸の３×１０−７Ｍの単独添加群
実施例２；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−６Ｍとリセドロン酸の３ｘ１０−７Ｍの同時添加群【００４１】
結果を図２に示した。グラフには比較例２−１で形成された破骨細胞様細胞数を１００％とした場合の各比較例、実施例での破骨細胞様細胞の形成数を百分率で示し、各群３ウェルの平均＋／−標準偏差で表示した。比較例２−２（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）単独添加）では、比較例２−１（溶媒添加・コントロール群）に対して、破骨細胞様細胞数は有意に減少した（比較例２−２；５０％）。しかし、比較例２−３（リセドロン酸単独添加）では比較例２−１（溶媒添加・コントロール群）に対して、破骨細胞様細胞数は減少傾向を示したものの（比較例２−３；８８．１％）、有意ではなかった。実施例２（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）＋リセドロン酸同時添加）の破骨細胞様細胞数は、比較例２−２及び比較例２−３に比べて極めて減少し（１０．８％）、比較例２−１若しくは比較例２−３に対して有意に低値を示した。すなわち、前記２剤を併用した場合には単剤それぞれの効果の和から予想されるより有意に強い作用が認められた。図中の、＊はＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定の結果、対照群に対して、ｐ＜０．０５であることを表す。＊＊＊はＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定の結果、対照群に対して、ｐ＜０．００１であることを表す。＃はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、比較例２−２に対して、ｐ＜０．０５であることを表す。＃＃はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、比較例２−３に対して、ｐ＜０．０１であることを表す。【００４２】
また、比較例２−１に対する各群の破骨細胞様細胞形成抑制率を表２に示した。【００４３】
【表２】
2009017222.tif 000005
【００４４】
[実施例３]  破骨細胞形成へのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンとクロドロン酸の影響の検討
実施例１において、比較例、実施例においてリセドロン酸を３×１０−７Ｍの濃度で細胞に作用させたことの代わりに、クロドロン酸を１０−５Ｍの濃度で作用させた他は実施例１と同様にして実験を行い、以下の群を設定した。【００４５】
比較例３−１；対照群（コントロール）
比較例３−２；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−７Ｍの単独添加群
比較例３−３；クロドロン酸の１０−５Ｍの単独添加群
実施例３；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−７Ｍとクロドロン酸の１０−５Ｍの同時添加群【００４６】
結果を図３に示した。グラフには比較例３−１で形成された破骨細胞様細胞数を１００％とした場合の各比較例、実施例での破骨細胞様細胞の形成数を百分率で示し、各群４〜５ウェルの平均＋／−標準偏差で表示した。比較例３−２（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）単独添加）では、比較例３−１（溶媒添加・コントロール群）に対して、破骨細胞様細胞数は減少傾向を示したものの（比較例３−２；９５．２％）、有意ではなかった。しかし、比較例３−３（クロドロン酸単独添加）では比較例３−１（溶媒添加・コントロール群）に対して、破骨細胞様細胞数は減少傾向を示したものの（比較例３−３；９３．９％）、有意ではなかった。実施例３（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）＋リセドロン酸同時添加）の破骨細胞様細胞数は、比較例３−２及び比較例３−３に比べて極めて減少し（５７．３％）、比較例３−１、比較例３−２若しくは比較例３−３に対して有意に低値を示した。すなわち、前記２剤を併用した場合には単剤それぞれの効果の和から予想されるより有意に強い作用が認められた。【００４７】
図中の、＊＊はＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定の結果、対照群に対して、ｐ＜０．０１であることを表す。＃はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、比較例３−２に対して、ｐ＜０．０５であることを表す。＃＃はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、比較例３−３に対して、ｐ＜０．０１であることを表す。【００４８】
また、比較例３−１に対する各群の破骨細胞様細胞形成抑制率を表３に示した。【００４９】
【表３】
2009017222.tif 000006
【００５０】
[実施例４]  破骨細胞様細胞による骨吸収活性へのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンとリセドロン酸の影響の検討
マウス骨髄細胞は、マウスの大腿骨及び脛骨の骨髄を採取した後、常法により赤血球を除き、象牙切片を置いた９６−ウェルプレートに４×１０５個／ウェルの密度で播き込んだ。一晩培養後、ここに、１０‐９Ｍとなるように１α，２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３という）を含む培地を添加し、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下で９日間培養することにより、多核の破骨細胞様細胞を形成させた。培地には、１０％ウシ胎児血清を添加したアルファＭＥＭ培地（以下、１０％ＦＣＳ‐αＭＥＭという）を用いた。マウス骨髄由来細胞への１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３添加時に、溶媒のみ（比較例４−１）、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（表４では化合物Ａと表記する）単独（比較例４−２）、リセドロン酸単独（比較例４−３）、（比較例４−３）、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（表４では化合物Ａと表記する）とリセドロン酸を同時に（実施例４）、マウス骨髄由来細胞培養系にそれぞれ添加し、破骨細胞様細胞の形成に対する作用を評価した。実験は以下の群を設定した。【００５１】
比較例４−１；対照群（コントロール）
比較例４−２；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−７Ｍの単独添加群
比較例４−３；リセドロン酸の１０−８Ｍの単独添加群
実施例４；Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の１０−７Ｍとリセドロン酸の１０−８Ｍの同時添加群【００５２】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）の添加に関しては、比較例及び実施例ともに、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて１０−４Ｍの濃度に溶解したものを、１０００倍希釈で１０−７Ｍとなるように培地に添加した。リセドロン酸の添加に関しては、比較例及び実施例ともに、リセドロン酸ナトリウム水和物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１０−５Ｍの濃度に溶解したものを、１０００倍希釈で１０−８Ｍとなるように培地に添加した。各条件の被験化合物の添加開始３〜４日毎に、比較例及び実施例ともに、各条件の被験化合物を含んだ新鮮な１０％ＦＣＳ‐αＭＥＭに交換した。【００５３】
比較例及び実施例ともに、培養開始９日後に培地を回収し、培地中のＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド量を測定した。測定にはＣｒｏｓｓｌａｐｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、品番：６ＣＲＬ４０００）を用いた。Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチドは破骨細胞様細胞の骨吸収活性により象牙のコラーゲンが分解されて産生するペプチド断片である。【００５４】
結果を表４に記載した。表４には比較例４−１で産生されるＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド量に対する各群での抑制率を百分率で示し、各群３〜４ウェルの平均で表示した。比較例４−２（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）単独添加）及び比較例４−３（リセドロン酸単独添加）では、比較例４−１（溶媒添加・コントロール群）に対して、破骨細胞様細胞数は減少傾向を示したものの（比較例４−２；１３．９％、比較例４−３；１８．３２％）、有意ではなかった。【００５５】
【表４】
2009017222.tif 000007
【００５６】
表４から明らかな通り、実施例４（Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン（化合物Ａ）＋リセドロン酸同時添加）の破骨細胞数は、比較例４−２及び比較例４−３に比べて極めて減少し（３８．７％）、比較例４−１に対しては有意に低値を示した。すなわち、前記２剤を併用した場合には単剤それぞれの効果の和から予想されるより有意に強い作用が認められた。【００５７】
表中の、＊はＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定の結果、比較例４−１に対して、ｐ＜０．０５であることを表す。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン又はその塩と、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、チルドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ゾレドロン酸、及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種類以上の化合物とを併用して投与することによって、骨代謝異常に起因する疾患、特に骨粗鬆症の予防薬若しくは治療薬又は予防方法若しくは治療方法として使用できる。
【図１】
2009017222.tif 000008
【図２】
2009017222.tif 000009
【図３】
2009017222.tif 000010
【国際調査報告】
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