(57)【要約】  本発明は、拡張型心筋症患者の自己抗体、更にβ１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体を吸着する安全性に優れた新たな吸着材、吸着器及び吸着方法を提供することを課題とする。  本発明は、チオフェンアルキルアミンをリガンドとし、該リガンドが水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする拡張型心筋症患者の自己抗体、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体の吸着材、吸着器、及び該吸着材を用いた吸着方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオフェンアルキルアミンをリガンドとし、該リガンドが水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする拡張型心筋症患者の自己抗体吸着材。
【請求項２】
チオフェンアルキルアミンをリガンドとし、該リガンドが水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体吸着材。
【請求項３】
前記リガンドが２−チオフェンアルキルアミンであることを特徴とする請求項１または２に記載の自己抗体吸着材。
【請求項４】
前記リガンドが２−チオフェンメチルアミンまたは２−チオフェンエチルアミンであることを特徴とする請求項３に記載の自己抗体吸着材。
【請求項５】
前記リガンドの固定化量が、水不溶性担体１ｍｌ当り１０μｍｏｌ〜２００μｍｏｌであることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の自己抗体吸着材。
【請求項６】
前記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であり、排除限界分子量が１５万〜１０００万であることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の自己抗体吸着材。
【請求項７】
液体を流入させる入口ポートと、該液体を流出させる出口ポートを有する容器に請求項１に記載の自己抗体吸着材が充填されていることを特徴とする拡張型心筋症患者の自己抗体吸着器。
【請求項８】
液体を流入させる入口ポートと、該液体を流出させる出口ポートを有する容器に請求項２に記載の自己抗体吸着材が充填されていることを特徴とするβ１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体吸着器。
【請求項９】
前記液体が血漿である請求項７または８に記載の自己抗体吸着器。
【請求項１０】
請求項１に記載の自己抗体吸着材と、拡張型心筋症患者の自己抗体を含む液体とを接触させる工程を含む拡張型心筋症患者の自己抗体吸着方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の自己抗体吸着材と、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体を含む液体とを接触させる工程を含むβ１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体吸着方法。
【請求項１２】
前記自己抗体を含む液体が血漿である請求項１０または１１に記載の自己抗体吸着方法。
【請求項１３】
拡張型心筋症患者の自己抗体の吸着装置を製造するための自己抗体吸着材の使用であって、該自己抗体吸着材はリガンドとしてチオフェンアルキルアミンを水不溶性担体に固定化していることを特徴とする自己抗体吸着材の使用。
【請求項１４】
β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体の吸着装置を製造するための自己抗体吸着材の使用であって、該自己抗体吸着材はリガンドとしてチオフェンエチルアミンを水不溶性担体に固定化していることを特徴とする自己抗体吸着材の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、拡張型心筋症患者の自己抗体、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体の吸着材、吸着器及び吸着方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
拡張型心筋症は、心筋収縮性機能の進行的な抑制と拡張性心室によって特徴付けられる心筋の病気であり、拡張した左心室の収縮機能不全を呈す。この病気は慢性的に進行することが多く、予後が改善されにくいため、心移植が必要となることが多く、わが国における心移植適応例の９０％以上はこの病気である。
【０００３】
非特許文献１には、拡張型心筋症が自己免疫性疾患であり、拡張型心筋症患者の血清中に、β１アドレナリン受容体、Ｍ２ムスカリン受容体、ミオシン、ミトコンドリアアデニンヌクレオチドトランスロケータ−およびＭ７、分岐アルファケト脱水素酵素ジヒドロリポイルトランサシラーゼ（ＢＣＫＤ−Ｅ２）、ラミニン、筋細胞膜Ｎａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼ、熱ショック蛋白質、のそれぞれの分子に対する多数の自己抗体が見出され、これら自己抗体の阻害が拡張型心筋症の治療法となる可能性が記述されている。
【０００４】
自己抗体が病態に関与する疾患の治療には、自己抗体除去を目的とした血漿吸着が用いられる。自己抗体除去を目的とした血漿吸着の原理は、生物学的相互作用と物理学的相互作用の２つに分類される。
【０００５】
生物学的相互作用を利用した吸着材としては、1)血液型糖鎖リガンドにより血液型抗体を吸着するＢｉｏｓｙｎｓｏｒｂ（登録商標）のように抗原抗体結合の親和性を利用したもの、2) プロテインAリガンドによりＩｇＧを吸着するＰｒｏｓｏｒｂａのようにＦｃ結合を利用したもの、が挙げられる。例えば、特許文献１には、抗ヒト免疫グロブリンに対する抗体やその断片、プロテインＡやプロテインＧをリガンドとして、拡張型心筋症患者の免疫グロブリンを吸着する技術が開示されている。また、特許文献２には、ペプチドをリガンドとしたβ１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する抗体の吸着材が開示されている。
【０００６】
しかし、生物学的相互作用を利用した吸着材の糖鎖、蛋白質もしくはペプチドからなるリガンドは、保存時や滅菌時の安定性が悪く、体外循環時に血液との接触により加水分解される恐れがある。さらに、リガンドの生産コストが高い欠点がある。また、自己抗体の抗原もしくは自己抗体に対する特異的抗体をリガンドとして用いた場合、標的自己抗体を特異的に吸着可能な反面、自己免疫性疾患患者の血漿吸着療法に望まれる複数抗体を同時に吸着することはできない。また、プロテインＡや抗ヒトＩｇＧ抗体などＦｃを標的としたリガンドでは、自己抗体の選択的吸着は望めない。
【０００７】
物理学的相互作用を利用した吸着材としては、1)アニオン性基のデキストラン硫酸リガンドにより自己抗体を吸着するセレソーブ（登録商標）のように静電結合を利用したもの、2)トリプトファンリガンドにより抗アセチルコリン受容体抗体を吸着するＩｍｍｕｓｏｒｂａ（登録商標）のように疎水結合を利用したもの、が挙げられる。
【０００８】
物理学的相互作用を利用した血漿吸着器としては、複数の自己抗体を吸着可能であり、その例として、免疫複合体、リウマチ因子および抗ＤＮＡ抗体を吸着可能なＩｍｍｕｓｏｒｂａ（登録商標）ＰＨ、抗アセチルコリン受容体抗体および抗ガングリオシド抗体を吸着可能なＩｍｍｕｓｏｒｂａ（登録商標）ＴＲ、が挙げられる。しかし、拡張型心筋症患者の自己抗体を効率良く吸着する、物理学的相互作用を利用した血漿吸着器は知られていない。
【０００９】
非特許文献２には、フェニルアラニンリガンドのＩｍｍｕｓｏｒｂａ（登録商標）ＰＨ、トリプトファンリガンドのＩｍｍｕｓｏｒｂａ（登録商標）ＴＲの抗体吸着作用は、それぞれのリガンドの疎水結合のみならずアニオン性基リガンドによる静電結合も関与していることが記述されている。また特許文献３には、抗カルジオリピンβ２グリコプロテインＩ複合体抗体を除去するため、アニオン性官能基リガンドで吸着する技術が開示されている。したがって、物理学的相互作用を利用した血漿吸着器は、アニオン性基リガンドに依存していた。
【００１０】
しかしながら、非特許文献３には、アニオン性基リガンドは凝固系の接触活性化系を刺激し、キニン−カリクレイン系を活性化してブラジキニンを産出し、ブラジキニン分解酵素を阻害するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬を服用中の患者では、血中ブラジキニン濃度を増加させて体外循環療法時の血圧低下の頻度を上昇させることが記載されている。ＡＣＥ阻害薬とアニオン性基リガンドを吸着材とする血漿吸着器の一部は併用禁忌になっており、その使用に大きな制限があった。
【非特許文献１】The Keio Journal of Medicine、第51巻、208-211頁、2002年、フー（M. Fu）ら
【非特許文献２】日本アフェレシス学会雑誌、第19巻、75-80頁、2000年、平田憲子ら
【非特許文献３】医学のあゆみ、第167巻、698頁、1993年、阿岸鉄三
【特許文献１】米国特許第7,022,322号明細書
【特許文献２】特開２００１−２８６５５４号公報
【特許文献３】特開平９−２９９４７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、拡張型心筋症患者の自己抗体、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体を高率に吸着する、安全性に優れた吸着材、吸着器及び吸着方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、チオフェンアルキルアミンをリガンドとし、該リガンドが水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする吸着材が、拡張型心筋症患者の自己抗体である抗β１アドレナリン受容体抗体、および抗Ｍ２ムスカリン受容体抗体の複数抗体を同時に、且つ高率に吸着することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）チオフェンアルキルアミンをリガンドとし、該リガンドが水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする拡張型心筋症患者の自己抗体吸着材。
（２）チオフェンアルキルアミンをリガンドとし、該リガンドが水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体吸着材。
（３）前記リガンドが２−チオフェンアルキルアミンであることを特徴とする（１）または（２）に記載の自己抗体吸着材。
（４）前記リガンドが２−チオフェンメチルアミンまたは２−チオフェンエチルアミンであることを特徴とする（３）に記載の自己抗体吸着材。
（５）前記リガンドの固定化量が、水不溶性担体１ｍｌ当り１０μｍｏｌ〜２００μｍｏｌであることを特徴とする（１）〜（４）の何れかに記載の自己抗体吸着材。
（６）前記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であり、排除限界分子量が１５万〜１０００万であることを特徴とする（１）〜（５）の何れかに記載の自己抗体吸着材。
（７）液体を流入させる入口ポートと、該液体を流出させる出口ポートを有する容器に（１）に記載の自己抗体吸着材が充填されていることを特徴とする拡張型心筋症患者の自己抗体吸着器。
（８）液体を流入させる入口ポートと、該液体を流出させる出口ポートを有する容器に請求項２に記載の自己抗体吸着材が充填されていることを特徴とするβ１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体吸着器。
（９）前記液体が血漿である（７）または（８）に記載の自己抗体吸着器。
（１０）（１）に記載の自己抗体吸着材と、拡張型心筋症患者の自己抗体を含む液体とを接触させる工程を含む拡張型心筋症患者の自己抗体吸着方法。
（１１）（２）に記載の自己抗体吸着材と、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体を含む液体とを接触させる工程を含むβ１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体吸着方法。
（１２）前記自己抗体を含む液体が血漿である（１０）または（１１）に記載の自己抗体吸着方法。
（１３）拡張型心筋症患者の自己抗体の吸着装置を製造するための自己抗体吸着材の使用であって、該自己抗体吸着材はリガンドとしてチオフェンアルキルアミンを水不溶性担体に固定化していることを特徴とする自己抗体吸着材の使用。
（１４）β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体の吸着装置を製造するための自己抗体吸着材の使用であって、該自己抗体吸着材はリガンドとしてチオフェンエチルアミンを水不溶性担体に固定化していることを特徴とする自己抗体吸着材の使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のチオフェンアルキルアミンをリガンドとする自己抗体吸着材、吸着器、吸着方法によれば、拡張型心筋症患者の自己抗体、β１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体を高率に吸着することができる。また、本発明の自己抗体吸着材は、ブラジキニン産生の恐れのあるアニオン性基を含まないので、安全性に優れ、アンジオテンシン変換酵素阻害薬を服用中の患者にも使用可能である。更に本発明の自己抗体吸着材のリガンドは、生物学的リガンドではないので化学的・生物学的安定性が高く、安価な製造が可能である。さらに、本発明に係る自己抗体吸着材は、拡張型心筋症の病態に関与する少なくとも２種類の自己抗体を著明な吸着性能で同時に除去可能なので、拡張型心筋症に対する高い治療効果を期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の自己抗体吸着材が充填された自己抗体吸着器の一例を示すものである。
【符号の説明】
【００１６】
１        …自己抗体吸着材が充填された自己抗体吸着器
２        …円筒
３、３’  …フィルター
４、４’  …パッキン
５        …液体導入口
６        …キャップ
７        …液体導出口
８        …キャップ
９        …自己抗体吸着材
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に述べる。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。  【００１８】
本発明の例示として、２−チオフェンエチルアミンが水不溶性担体に固定化された状態の構造式の一例を以下の式(I)に示す。【００１９】
【化１】
2008099855.tif 000002
【００２０】
本発明のチオフェンアルキルアミンは、チオフェンの２位または３位がアルキルアミンで置換されたものであり、２−置換体がより好ましい。また、アルキル鎖は直鎖状でも分岐鎖を有していても良いが、直鎖状が好ましく、とりわけメチル鎖およびエチル鎖が好ましい。本発明のチオフェンアルキルアミンは第１級アミンを一つ以上有する。【００２１】
本発明でいう水不溶性担体とは、吸着材が血液に接触した際に血液中に溶け出さない程度に、水に溶け難い担体のことをいう。【００２２】
本発明のリガンドを固定化する際に使用する担体としては、親水性の表面を有し、かつリガンドとの間で共有結合を形成させるために利用し得るアミノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を有するものが好ましい。また、上記の水不溶性担体は吸着に使用できる有効表面積が広い多孔性であるものが望ましい。【００２３】
担体は粒子状、繊維状、シート状、中空糸状などの任意の形状を用いることができるが、リガンドの保持量や吸着材としての取扱い性を考慮すると、粒子状のものが好ましい。【００２４】
球状または、粒子状担体の平均粒径は、２５μｍ〜２５００μｍのものを利用できるが、その比表面積（吸着材としての吸着能力）と体液の流通性の面より、５０μｍ〜１５００μｍのものがより好ましい。【００２５】
使用できる担体としては、セルロース系ゲル、デキストラン系ゲル、アガロース系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル、多孔質ガラス、ビニルポリマーゲル等の有機または無機の多孔体が使用でき、通常のアフィニティクロマトグラフィーに用いられる担体用の材料は全て用いることができる。【００２６】
これらの担体を例示すると、旭化成マイクロキャリア（旭化成（株）社製）、ＣＭ−セルロファイン（登録商標）ＣＨ（排除限界タンパク質分子量：約３×１０６、生化学工業（株）販売）などのセルロース系担体、特公平１−４４７２５号公報記載の全多孔質活性化ゲルや、ＣＭ−トヨパール（登録商標）６５０Ｃ（排除限界タンパク質分子量：５×１０６、東ソー（株）製）などのポリビニルアルコール系担体、ＣＭ−トリスアクリルＭ（ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ）〔排除限界タンパク質分子量：１×１０７、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕などのポリアクリルアミド系担体、セファロースＣＬ−４Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ）〔排除限界タンパク質分子量：２×１０７、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕などのアガロース系担体などの有機質担体、およびＣＰＧ−１０−１０００〔排除限界タンパク質分子量：１×１０８、平均細孔径：１００ｎｍ、米国エレクトロ−ニュークレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製〕などの多孔性ガラスなどの無機質担体が挙げられる。【００２７】
本発明で用いられる多孔性重合体粒子は、リガンドを固定化できるものであり、その排除限界分子量（タンパク質）は、本発明の目的吸着物質の分子量が約１５万（ＩｇＧ）であることより、１５万〜１０００万であることが好ましい。本発明の目的に最も好ましい排除限界分子量は１００万〜５００万である。【００２８】
重合体組成は、ポリアミド系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ビニル化合物の重合体等、多孔性構造をとりうる公知の重合体を用いることができるが、特に親水性モノマーにより親水化したビニル化合物系多孔性重合体が好ましい結果を与える。【００２９】
本発明のリガンドの水不溶性担体への固定化方法としては、その様式を問わないが、共有結合が好ましい。例えば、担体がカルボキシル基を有する場合には、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによって、スクシンイミドオキシカルボニル基に変換し、これにリガンドのアミノ基の部分で反応させる方法（活性エステル法）が挙げられる。担体がアミノ基またはカルボキシル基を有する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合試薬の存在下で、リガンドのアミノ基を縮合反応させる方法（縮合法）、担体とリガンドとをグルタルアルデヒドなどの２個以上の官能基を有する化合物を用いて結合する方法などが挙げられる。また、担体が、水酸基を有する場合には、臭化シアンなどのハロゲン化シアンを担体に作用させ、リガンドのアミノ基の部分で反応させる方法やエピクロロヒドリンなどのエポキシドを担体に作用させ、リガンドのアミノ基の部分で反応させる方法等が挙げられる。【００３０】
さらに、必要に応じて水不溶性担体とリガンドとの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入したものを吸着材として使用することもできる。スペーサー分子としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖等が挙げられる。例えば、アガロースの水酸基とヘキサメチレンジイソシアナートの片側のイソシアナート基を反応、結合させ、残ったイソシアナート基とリガンドのアミノ基を反応、結合させることができる。【００３１】
本発明で担体に結合させるリガンドの量、すなわち、リガンドの保持量は、担体１ｍｌ当り１０μｍｏｌないしは２００μｍｏｌの範囲であり、より好ましくは１０μｍｏｌないしは１００μｍｏｌの範囲である。保持量が１０μｍｏｌ未満の場合は、自己抗体の吸着能の低下が起こり、２００μｍｏｌを超える場合は、血漿、体液等の有用成分の非特異吸着が起こり好ましくない。【００３２】
吸着材に対する自己抗体の吸着量を測定する方法として、患者由来の自己抗体を含む溶液と吸着材を混合し、自己抗体を吸着させた後の自己抗体溶液の濃度を測定し、その差分を求める方法が挙げられる。例えば、リガンドが固定化された担体を、一定時間、抗β１アドレナリン受容体抗体の溶液に浸漬させ、その後  抗β１アドレナリン受容体抗体の減少量をＥＬＩＳＡ法で測定して求めることができる。【００３３】
本発明の吸着材は、液体の導出入口を備えた容器内に充填保持して使用することができる。【００３４】
図１において、１は、本発明の自己抗体吸着材が充填された自己抗体吸着器の一例を示すものであり、円筒２の一端開口部に、内側にフィルター３を張ったパッキン４を介して液体導入口５を有するキャップ６をネジ嵌合し、円筒２の他端開口部に内側にフィルター３’を張ったパッキン４’を介して液体導出口７を有するキャップ８をネジ嵌合して容器を形成し、フィルター３および３’の間隙に吸着材を充填保持させて吸着材層９を形成してなるものである。【００３５】
吸着材層９には、本発明の自己抗体吸着材を単独で充填してもよく、他の吸着材と混合もしくは積層してもよい。他の吸着材としては、例えば、幅広い吸着能を有する活性炭等を用いることができる。これにより吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環に用いる場合、５０ｍｌ〜４００ｍｌ程度が適当である。【００３６】
ＬＤ５０値とは、呼吸道を経て吸入する以外の投与方法により投与したとき、その試験に使用された総実験動物の５０％が死亡すると思われる化学物質の最低投与量であるが、チオフェンのＬＤ５０値は、マウスの腹腔内投与では１００ｍｇ／ｋｇ（National Technical Information Service: AD277-689, Springfield, V.A., USA）であり、ウサギの皮下投与では８３０ｍｇ／ｋｇ（J. Marhold, “preheld Prumyslove Toxikologie,” Organiche Latly, Avicenum, Praha, Checoslovakia, 1986, p.1089）と報告されている。仮に、担体１ｍｌ当り２００μｍｏｌのリガンド保持量で、充填量４００ｍｌのモジュールを作成し、１％のリガンドが外れたとしても、チオフェンとして約７０ｍｇの漏出であるから、上記ＬＤ５０値と比較して十分に小さく、チオフェンは安全なリガンドと言える。【００３７】
本発明の血漿吸着器を体外循環で用いる場合には、大きく次の二通りの方法がある。一つは、体内から取り出した血液を遠心分離機もしくは膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離した後、血漿成分を血漿吸着器に通過させ、浄化した後、血球成分と合わせて体内にもどす方法であり、他の一つは、体内から取り出した血液を直接、血漿吸着器に通過させ、浄化する方法である。【００３８】
また、血液もしくは血漿等の体液の通過速度については、本発明の吸着材の吸着能率が非常に高いため、吸着材の粒度を粗くすることができ、また充填度を低くできるので、吸着材層の形状の如何にかかわりなく、高い通過速度を与えることができ、そのため多量の体液を処理することができる。【００３９】
体液の通過方法としては、臨床上の必要に応じ、あるいは設備の装置状況に応じて、連続的に通液しても良いし、また断続的に通液使用しても良い。【００４０】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
[実施例１]
１．吸着材の作製方法
ポリ酢酸ビニル製の球状の多孔質体（旭硝子株式会社製、平均粒径１００μｍ、排除限界分子量約１００万以上、樹脂１ｍＬに充填できる分子量４万のプルランの量が０．２０ｍｌ／ｍｌ以上）１００ｇを、ジメチルスルフォキシド（和光純薬株式会社製）１Ｌに投入し、水酸化ナトリウム（和光純薬株式会社製）１２０ｇ・エピクロルヒドリン（和光純薬株式会社製）７８０ｍｌ・水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬株式会社製）７５０ｍｇを用いて３０℃で５時間反応させてエポキシ基を導入した。反応後、メタノール（和光純薬株式会社製）で洗浄し、その後、純水で洗浄して活性化多孔質体を得た。得られた多孔質体は、１．３ｍｍｏｌ／ｌ  チオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬株式会社製）４ｍｌと活性化担体２ｍｌに１％フェノールフタレインエタノール溶液（和光純薬株式会社製）２滴を滴下し、７０℃下で、赤色の呈色が確認されなくなるまで０．１Ｎ塩酸を加え、「活性化量（エポキシ基の量）＝塩酸滴定量/樹脂量×１００」の式により、導入されたエポキシ基の量を求め、１１０μｅｑ／ｍｌゲル以上である事を確認した。【００４２】
２．固定化反応
次にｐＨ９．３の炭酸緩衝液（和光純薬株式会社製、炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム）を溶媒とし、５０μｅｑ／ｍｌゲルの固定量が得られるようにリガンドとして２−チオフェンエチルアミン（２−ＴＨＩＯＰＨＥＮＥＥＴＨＹＬＡＭＩＮＥ）（和光純薬株式会社製）を溶解した。作成したリガンド溶液と担体を、５０℃で１６時間反応させて、リガンドのアミノ基と多孔質体のエポキシ基とを共有結合させて吸着材を得た。固定化量は、リガンド溶液の波長２００〜２８０ｎｍの吸光度スペクトルを測定し、最も高い吸光度を示す波長を用いて、反応前後の差から１ｍｌゲルあたりの固定量（ｅｑ／ｍｌゲル）として算出した。【００４３】
３．自己抗体吸着反応
マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製、Ｎｏ．３５０４）にウエルあたり０．５ｍｌの吸着材を入れ、そこに全身性エリテマトーデス患者もしくは拡張型心筋症患者の血漿１．０ｍＬを加え、室温にて、振盪しながら６０分間反応させた。【００４４】
４．自己抗体濃度測定及び吸着性能の算出
反応後の血漿から吸着材を取り除き、測定標品とした。全身性エリテマトーデス自己抗体（抗二重鎖ＤＮＡ抗体および抗カルジオリピンβ２グリコプロテインＩ複合体抗体）の濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定し、元血漿の抗体量と反応後血漿中の抗体量の差分を吸着量として算出した。拡張型心筋症自己抗体（抗β１アドレナリン受容体抗体および抗Ｍ２ムスカリン受容体抗体）の濃度も同様にＥＬＩＳＡ法にて測定し、吸着量を算出した。吸着性能は、「吸着率（％）＝（１−吸着反応後血漿濃度／元血漿濃度）×１００」の式で算出した。【００４５】
標品の抗二重鎖ＤＮＡ抗体および抗カルジオリピンβ２グリコプロテインＩ複合体抗体は、株式会社エスアールエルに項目コード6225-6および2247-4として測定を依頼した。抗β１アドレナリン受容体抗体は、次のＥＬＩＳＡ法にて測定した。配列番号１記載のヒトβ１アドレナリン受容体の第二ループに相当するペプチドを固相法にて合成し、ＨＰＬＣにて精製した。この溶液（５０μｇ／ｍＬ）を９６穴プレートに５０μＬ添加し、４℃で一晩静置した。プレート洗浄後、３％スキムミルク（ディフコ社製）、０．１％ツイーン２０（メルク社製）を含むリン酸緩衝食塩液を１００μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。プレート洗浄後、１−１００倍に希釈した標品を５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。プレート洗浄後、ビオチン標識抗ヒトＩｇＧ抗体（サザン バイオテクノロジー社製）溶液を５０μＬ添加し、室温で１時間静置した。プレート洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼポリマー（シグマ社製）溶液を５０μＬ添加し、室温で１時間静置した。プレート洗浄後基質溶液を１００μＬ添加し、室温で３０分静置した。４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。抗Ｍ２ムスカリン受容体抗体は、配列番号２記載のヒトＭ２ムスカリン受容体の第二ループに相当するペプチドを用いる以外は、抗β１アドレナリン受容体抗体のＥＬＩＳＡ法と同様のアッセイ系を構築して測定した。
His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala 
Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys 
Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys（配列番号1）
Val Arg Thr Val Glu Asp Gly Glu Cys Tyr
Ile Gln Phe Phe Ser Asn Ala AlaVal Thr
Phe Gly Thr Ala Ile Cys（配列番号2）【００４６】
[比較例１〜２２、参考例]
比較例のリガンドとして、比較例１：ロイシン、比較例２：イソロイシン、比較例３：アルギニン、比較例４：チエニルグリシン（Ｌ−α−（３−ＴＨＩＥＮＹＬ）ＧＬＹＣＩＮＥ）、比較例５：チエニルセリン（β−（２−ＴＨＩＥＮＹＬ−ＤＬ−ＳＥＲＩＮＥ））、比較例６：チエニルアラニン（β−（２−ＴＨＩＥＮＹＬ）−Ｄ−ＡＬＡＮＩＮＥ））、比較例７：チロシン、比較例８および９：フェニルアラニン、比較例１０：パラ−グアニジノ−フェニルアラニン、比較例１１および１２：トリプトファン、比較例１３：グリシン、比較例１４：アラニン、比較例１５：セリン、比較例１６：システイン、比較例１７：スレオニン、比較例１８：アスパラギン、比較例１９：アスパラギン酸、比較例２０：メチオニン、比較例２１：プロリン、比較例２２：ヒスチジンを選択した。パラ−グアニジノ−フェニルアラニンについては、ＴＳＵＮＥＭＡＴＳＵらの方法（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（東京）、第8巻、1773-83頁、1980年）に従って作製し、それ以外の化合物はＳＩＧＭＡ社より購入した。比較例９および１２については１００μｅｑ／ｍｌゲルの固定量が得られるようにリガンドを溶解し、比較例９および１２を除く比較例すべてについて５０μｅｑ／ｍｌゲルの固定量が得られるようにリガンドを溶解し、実施例１と同様に、リガンドを担体に固定化させて吸着材を得、固定化量を求めた。又、参考例として、リガンドを固定しない活性化後の担体を用いた。実施例１と同様に、自己抗体吸着反応を行い、自己抗体濃度測定及び吸着率の算出を行った。【００４７】
[結果]
実施例１、比較例１〜２２、および参考例の結果を合わせて表１に示した。その結果、実施例１の２−チオフェンエチルアミンをリガンドとする吸着材は、抗二重鎖ＤＮＡ抗体、抗カルジオリピンβ２グリコプロテインＩ複合体抗体、抗β１アドレナリン受容体抗体、抗Ｍ２ムスカリン受容体抗体のいずれの自己抗体に対しても、７０％以上の著明な吸着性能を示した。既に血漿吸着器として実用化されているトリプトファン、フェニルアラニンの各リガンドを含む比較例、参考例の吸着性能は６０％以下だった。また、チエニル基を有していても、アニオン性基であるカルボキシル基の側鎖を有する比較例４のチエニルグリシン、比較例５のチエニルセリンおよび比較例６のチエニルアラニンは、著明な吸着性能を示さなかった。すなわち、従来、物理学的相互作用を利用した吸着材ではアニオン性基の使用が常識となっていたが、アニオン性基を側鎖として有さないチオフェンエチルアミンをリガンドとした自己抗体吸着材が、拡張型心筋症患者のβ１アドレナリン受容体及びＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体を顕著に吸着した。拡張型心筋症患者の複数の自己抗体を顕著に吸着したことから、チオフェンエチルアミンが固定化された自己抗体吸着材は、拡張型心筋症患者のその他の自己抗体の吸着材としても有用と推定された。更にチオフェンエチルアミンが固定化された自己抗体吸着材は、拡張型心筋症以外の自己免疫疾患患者に存在するβ１アドレナリン受容体及びＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体の吸着材としても使用できる。【００４８】
【表１】
2008099855.tif 000003
【００４９】
［実施例２］
１.吸着材の作製
リガンドとして２−チオフェンメチルアミン（2-thiophenemethylamine）、２−チオフェンエチルアミン（2-thiopheneethylamine）（それぞれシグマ−アルドリッチ社製）各０．２ｍｌをそれぞれ２０ｍｌの４℃、ｐＨ９．３の炭酸緩衝液に溶解し、さらに１０ｍｌのカップリングバッファー（４℃、ｐＨ８．３、０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液）と氷上で混合した。４％高度架橋アガロースから成るゲルマトリックスに１０原子のスペーサーを介してＮ−ヒドロキシこはく酸イミドが結合された担体（NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）の懸濁液２５ｍｌをグラスフィルタで吸引濾過し、４℃、１ｍＭ塩酸２５０ｍｌで洗浄した。この担体に上記混合液３０ｍｌを加えてよく振り混ぜ、４℃、１６時間静置した。この担体をグラスフィルタで吸引濾過し、ｐＨ８．３、０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液３０ｍｌを加えて室温で３０分放置した。グラスフィルタで吸引濾過し、０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）２５ｍｌで３回洗浄し、次に０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）２５ｍｌで３回洗浄し、このトリス塩酸バッファーと酢酸バッファーの洗浄サイクルをさらに４回繰り返し、２０％エタノール水溶液２５ｍｌを加えて４℃に保存し、２−チオフェンエチルアミン、２−チオフェンメチルアミンのそれぞれが１０原子のスペーサーを介してアガロースゲル担体に結合された吸着材が作製された。【００５０】
２.カラムによる自己抗体吸着
室温にてオープンカラム（Pierce社製、製品番号29922）に２ｍｌの吸着材を充填し、生理食塩水１０ｍｌを重力下で流して吸着材を洗浄した。次に、拡張型心筋症患者の血漿１０ｍｌを流し、２ｍｌずつ５本のカラム濾液を分取して、下記方法によりリガンドの自己抗体吸着性能を評価した。【００５１】
３.自己抗体濃度測定及び吸着性能の算出
実施例１と同様にして、拡張型心筋症患者の自己抗体（抗β１アドレナリン受容体抗体およびＭ２ムスカリン受容体抗体）の濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定し、元血漿の抗体量と濾液の抗体量の差分を吸着量として算出した。吸着性能は、「吸着率（％）＝（１−吸着反応後血漿濃度／元血漿濃度）×１００」の式で算出した。【００５２】
［参考例］
参考例として、リガンドを加えない以外は実施例２記載と同様に作製した吸着材を用い、カラムによる自己抗体吸着、自己抗体濃度測定及び吸着性能算出を実施した。
［結果］
表２、３に拡張型心筋症患者の自己抗体吸着評価の結果を示した。２−チオフェンメチルアミン、２−チオフェンエチルアミンをリガンドとする吸着材は、参考例に対し、抗β１アドレナリン受容体抗体および抗Ｍ２ムスカリン受容体抗体を著明に吸着した。２−チオフェンメチルアミン、２−チオフェンエチルアミンの自己抗体吸着率に差は見られず、リガンドのチエニル基が自己抗体吸着に必須の構成要素であることが示された。またアルキル鎖の鎖長が異なる２つのリガンドで自己抗体の吸着性能に差がないことから、担体とリガンド間にスペーサーを介した場合には、アルキル鎖の鎖長の違いは吸着性能に影響を与えないことが示された。【００５３】
【表２】
2008099855.tif 000004
【００５４】
【表３】
2008099855.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明に係る自己抗体の吸着材、吸着器及び吸着方法は、拡張型心筋症患者の治療、またはβ１アドレナリン受容体及び／またはＭ２ムスカリン受容体に対する自己抗体を有する自己免疫疾患患者の治療に有用である。
【図１】
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【国際調査報告】
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