(57)【要約】  本発明は、転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる転写ユニットを含有するレトロウイルスベクターであって、前記ユニットからのｍＲＮＡの転写方向がレトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きとなるように前記ユニットが配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクターを提供する。前記の構成のベクターを使用することにより、高い遺伝子導入効率を示すウイルス上清を調製することができる。本発明のレトロウイルスベクターは、がんやウイルス感染症の治療、予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる転写ユニットを含有するレトロウイルスベクターであって、前記ユニットからのｍＲＮＡの転写方向がレトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きとなるように前記ユニットが配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター。
【請求項２】
転写調節配列が、がん細胞又はウイルス感染細胞で特異的に発現されている遺伝子の転写を制御する配列である請求項１記載のレトロウイルスベクター。
【請求項３】
転写調節配列が、がん細胞又はウイルスに由来するトランス作用因子により転写が誘導される配列である請求項１記載のレトロウイルスベクター。
【請求項４】
転写調節配列が免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される配列である請求項３記載のレトロウイルスベクター。
【請求項５】
Ｔａｔタンパク質及び／又はＲｅｖタンパク質により転写が誘導される転写調節配列を含有する請求項４記載のレトロウイルスベクター。
【請求項６】
免疫不全ウイルスのＬＴＲの下流に一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が配置されている請求項４記載のレトロウイルスベクター。
【請求項７】
転写調節配列が、人為的に細胞内に供給されるトランス作用因子により転写が誘導される配列である請求項１記載のレトロウイルスベクター。
【請求項８】
一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドがＭａｚＦタンパク質である請求項１〜７いずれか記載のレトロウイルスベクター。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載のレトロウイルスベクターを細胞に導入することを特徴とする疾病の治療又は予防方法。
【請求項１０】
疾病ががん又はウイルス感染症である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
疾病が免疫不全ウイルス感染症である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜８いずれか記載のレトロウイルスベクターを有効成分とする疾病の治療剤又は予防剤。
【請求項１３】
がん又はウイルス感染症治療剤又は予防剤である請求項１２記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１４】
免疫不全ウイルス感染症治療剤又は予防剤である請求項１３記載の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを使用して疾患の治療又は予防を行うために有用な核酸構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、細胞のもつ「遺伝情報の誤り」に起因する疾病（遺伝病やがん等）について、正しい遺伝子情報の付加によってその細胞の機能を修正したり、細胞が本来持っていなかった新しい「保護遺伝子」を付加したりして病気の治療または予防を行う治療法として開発されてきた。【０００３】
現在では前記の態様に加え、生体にとって有害な細胞（がん細胞や病原微生物の感染した細胞等）の選択的な排除を目的として、細胞毒性を発揮する産物をコードする遺伝子の利用も精力的に研究されている。例えばヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を標的細胞内で発現させた後に無害な前駆体医薬（ガンシクロビル）を生体に投与すると、標的細胞特異的に前駆体医薬が活性化される結果、前記医薬の細胞毒性のために標的細胞が破壊される。【０００４】
細胞毒性を発揮するポリペプチドとして原核生物のトキシン−アンチトキシン系遺伝子にコードされるトキシンが知られている。ｍａｚＥ−ｍａｚＦ系のトキシンであるＭａｚＦ（非特許文献１）、ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ系トキシンであるＰｅｍＫ（非特許文献２）はどちらも特定の塩基配列を認識する一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有することが知られており、これらのトキシンを増殖性疾患の治療に利用することが提案されている（特許文献１）。【０００５】
ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）はＣＤ４分子を発現する細胞、例えばＴ細胞に感染する。このため、ＨＩＶの感染を受けたヒトの体内ではＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）の減少と細胞性免疫の低下が起こる。ついには重度の免疫不全状態に陥り、カリニ肺炎のような日和見感染症を発症する。この状態は後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）と称されている。【０００６】
ＨＩＶ感染症の治療方法として、ＨＩＶ生活環を遮断する抗ウイルス剤（逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等）やワクチンの開発が行われており、いくつかの抗ウイルス剤がすでに実用化されている。しかし、変異頻度の高いＨＩＶでは感染した個体内で前記の薬剤の効果の及ばない変異体の出現することがあり、必ずしも特効薬として完成された状況にはない。別のアプローチであるＲＮＡデコイやリボザイムのような核酸、トランスドミナント変異タンパクや細胞内抗体のようなタンパク質を有効成分としてＨＩＶの増殖を阻止する遺伝子治療薬を開発する試みもいまだ完成の域には達していない。【０００７】
また、ＨＩＶの感染した細胞に特異的に細胞死を起こさせる方法が考案されている（例えば特許文献２、非特許文献３、４、５）。前記の方法はＨＩＶ由来のＬＴＲプロモーターの下流に細胞毒性を示す産物をコードする遺伝子を接続するものであるが、これまでのところ臨床的に応用された例は知られていない。【０００８】
特許文献３には前記の細胞毒性を示す産物として一本鎖ＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを使用することが記載されている。本方法ではＨＩＶの感染にともなって発現されるＴａｔタンパク質依存的に一本鎖ＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼの発現が誘導され、ＨＩＶゲノムを含む細胞内の一本鎖ＲＮＡが分解される。この結果、当該細胞ではＨＩＶの複製、出芽が阻止される。ＨＩＶ由来のＲＮＡが分解されてＴａｔタンパク質の発現が停止し、かつ発現されていたＴａｔタンパク質が細胞から消失するとエンドリボヌクレア−ゼの発現も停止する。この間、細胞内のリボソームやｔＲＮＡは破壊されず、前記エンドリボヌクレア−ゼの発現の停止とともに通常のタンパク質合成が再開されるため、この時点で破壊されていない細胞は増殖を再開する。このように本方法は過度にＣＤ４陽性Ｔ細胞の減少を招かない点で有利であるが、ベクターの構築が不適切であると十分な効率でエンドリボヌクレアーゼの遺伝子を細胞に導入できないことがある。
【特許文献１】国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５５５４５２８号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０２０８７３号パンフレット
【非特許文献１】モレキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ）、第１２巻、ｐ９１３−９２０（２００３）
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ２０６７８−２０６８４（２００４）
【非特許文献３】ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻、ｐ５３−６１（１９９１）
【非特許文献４】プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９１巻、ｐ３６５−３６９（１９９４）
【非特許文献５】ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１０巻、ｐ１０３−１１２（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記従来技術を鑑みて行われたものであり、本発明の目的は、エンドリボヌクレアーゼを利用した、より有効性の高い疾病の治療・予防方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、種々の疾病、例えばがんやウイルス感染症の治療、予防に使用できる、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチド発現用のレトロウイルスベクターの構築について検討した。この結果、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を転写するためのユニットをレトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きとなるようにレトロウイルスベクター内に配置した場合に、特に高効率で細胞への遺伝子導入を達成できるレトロウイルスベクターを入手できることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる転写ユニットを含有するレトロウイルスベクターであって、前記ユニットからのｍＲＮＡの転写方向がレトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きとなるように前記ユニットが配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター、
［２］転写調節配列が、がん細胞又はウイルス感染細胞で特異的に発現されている遺伝子の転写を制御する配列である［１］のレトロウイルスベクター、
［３］転写調節配列が、がん細胞又はウイルスに由来するトランス作用因子により転写が誘導される配列である［１］のレトロウイルスベクター、
［４］転写調節配列が免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される配列である［３］のレトロウイルスベクター、
［５］Ｔａｔタンパク質及び／又はＲｅｖタンパク質により転写が誘導される転写調節配列を含有する［４］のレトロウイルスベクター、
［６］免疫不全ウイルスのＬＴＲの下流に一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が配置されている［４］のレトロウイルスベクター、
［７］転写調節配列が、人為的に細胞内に供給されるトランス作用因子により転写が誘導される配列である［１］のレトロウイルスベクター、
［８］一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドがＭａｚＦタンパク質である［１］〜［７］いずれかのレトロウイルスベクター、
［９］［１］〜［８］いずれかのレトロウイルスベクターを細胞に導入することを特徴とする疾病の治療又は予防方法、
［１０］疾病ががん又はウイルス感染症である［９］の方法、
［１１］疾病が免疫不全ウイルス感染症である［９］の方法、
［１２］［１］〜［８］いずれかのレトロウイルスベクターを有効成分とする疾病の治療剤又は予防剤、
［１３］がん又はウイルス感染症治療剤又は予防剤である［１２］の治療剤又は予防剤、及び
［１４］免疫不全ウイルス感染症治療剤又は予防剤である［１３］の治療剤又は予防剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、細胞内における一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性の発現を利用した遺伝子治療に高い効果を発揮するレトロウイルスベクターが提供される。前記のレトロウイルスベクターは、がん、ウイルス感染症、特にＲＮＡウイルス感染症の治療、予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構成を示す図である。
【図２】ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構成を示す図である。
【図３】ＨＩＶ感染させた細胞、感染させなかった細胞の細胞数を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性とは、構成塩基として少なくとも１分子のリボヌクレオチドを含有する一本鎖核酸中の、リボヌクレオチドの３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解する活性を意味する。前記活性により加水分解された核酸は、水酸基を有する３’末端とリン酸基を有する５’末端、リン酸基を有する３’末端と水酸基を有する５’末端、もしくは２’，３’サイクリックホスフェートと水酸基を有する５’末端を生じる。本発明を特に限定するものではないが、二本鎖核酸、例えば二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド等は切断できないポリペプチドを本発明に使用することができる。前記の基質特異性は、一本鎖ＲＮＡであるＨＩＶのゲノムを効率よく分解するという観点から本発明に適している。特に好適には、ＲＮＡをその塩基配列特異的に切断する活性を有するもの、リボソーム非依存的にｍＲＮＡを分解しうるものが本発明に使用される。一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチド（以下、一本鎖ＲＮＡ特異的エンドリボヌクレア−ゼと記載することがある）としては、後述のＭａｚＦやＰｅｍＫのような、ｍＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｅｆｅｒａｓｅと称される酵素が例示される（国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレット）。【００１５】
本発明に使用される、配列特異性を有し、リボソーム非依存的に一本鎖ＲＮＡを分解する活性を有するポリペプチドは、本発明を特に限定するものではないが、例えば微生物由来のものであっても良い。この場合、前記ポリペプチドをコードする遺伝子は微生物のゲノムやプラスミドより単離することができる。例えば、モレキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ）、第１２巻、ｐ９１３−９２０（２００３）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ２０６７８−２０６８４（２００４）にそれぞれ記載された、トキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼであるＭａｚＦやＰｅｍＫをコードする遺伝子を本発明に使用することができる。ＭａｚＦは一本鎖ＲＮＡ中の５’−Ａ／ＣＡ−３’の配列を、ＰｅｍＫは主に５’−Ｕ／Ａ（Ｃ，Ａ ｏｒ Ｕ）−３’を切断する酵素である。更に、公知のデータベースから前記のＭａｚＦやＰｅｍＫのアミノ酸配列との間に高い相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を選択し、これを単離して本発明に使用することもできる。すでに藍藻類や古細菌を含む多数の微生物から前記の活性を有するポリペプチドが見出されている（国際公開第２００６／１２３５３７号パンフレット、国際公開第２００７／０１０７４０号パンフレット、国際公開第２００７／０１３２６４号パンフレット、国際公開第２００７／０１３２６５号パンフレット等）。好適には、本発明にはＭａｚＦをコードする遺伝子が使用される。ＭａｚＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。【００１６】
前記の、トキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは、ヒト胎盤由来リボヌクレアーゼインヒビターのような、細胞質リボヌクレアーゼインヒビターにより阻害されることがないので（国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレット）、本発明への使用に適している。前記のエンドリボヌクレアーゼが持続的に発現された場合、細胞では新たなタンパク質の合成が起こらなくなるため、細胞は増殖阻害を起こし、更には細胞死が誘導される。また、ウイルスが感染している細胞ではウイルスを構成するタンパク質の合成が阻害されるために、ウイルスの複製、出芽が起こらなくなる。こうして、本発明のレトロウイルスベクターによりがん細胞やウイルス感染細胞が生体から排除される。特に、ＲＮＡウイルス感染細胞では前記リボヌクレアーゼによりウイルスゲノム自体も分解される。【００１７】
本発明のレトロウイルスベクターは、転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる転写ユニットを含有するレトロウイルスベクターであって、前記ユニットからのｍＲＮＡの転写方向がレトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きとなるように前記ユニットが配置されていることを特徴とする。【００１８】
本明細書において転写調節配列とは、その下流に接続された遺伝子の転写を調節することができる核酸配列を指す。本発明を特に限定するものではないが、前記の転写調節配列としては、特定のトランス作用因子の結合／解離により転写のｏｎ／ｏｆｆが行われるプロモーターが例示される。また、Ｐ１ファージ由来のｌｏｘＰ配列に挟まれた核酸を任意のプロモーターと目的遺伝子の間に挿入することにより、ｃｒｅリコンビナーゼにより誘導可能な転写調節配列として使用することもできる。【００１９】
本発明には、がん細胞又は病原性微生物感染細胞で特異的に発現されている遺伝子の転写を制御する配列（プロモーター）、がん細胞又はウイルス感染細胞に特異的に存在するトランス作用因子により転写が誘導される転写制御配列を使用することができる。さらに、人為的なトランス作用因子の細胞内への供給と組み合わせることにより、当該トランス作用因子により転写が誘導される任意の転写制御配列を使用することもできる。前記の「トランス作用因子により転写が誘導される転写制御配列」は、本来的に前記因子と相互作用しうる領域を有する配列であってもよく、前記因子と相互作用しうる領域を有する配列を当該配列とは独立した転写活性を有する配列と人為的に組み合わせたものであってもよい。【００２０】
がん細胞で特異的に発現されている遺伝子の転写を制御する配列としては、例えば腫瘍特異的プロモーター（ＡＦＰ遺伝子、ＣＥＡ遺伝子、ＰＳＡ遺伝子、ミッドカイン遺伝子、テロメラーゼ遺伝子、ＭＡＧＥ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、ＩＡＩ．３Ｂ遺伝子等に由来するプロモーター）が例示される。また、ウイルス感染細胞に特異的に存在するトランス作用因子としては、ヒト免疫不全ウイルス由来のＴａｔタンパク質、Ｒｅｖタンパク質が例示される。前記のＴａｔタンパク質、Ｒｅｖタンパク質はそれぞれＴＡＲ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列、ＲＲＥ（Ｒｅｖ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列の制御下にある遺伝子の転写を誘導する。【００２１】
人為的にトランス作用因子を細胞内へ供給する態様においては、通常は当該細胞内で転写誘導活性を示さない転写制御配列を使用することが好適である。前記配列はトランス作動因子の供給によって始めて下流に位置する遺伝子の転写を開始することから、標的細胞において選択的に目的遺伝子（一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子）の発現が達成される。トランス作用因子の細胞内への供給は、当該因子を細胞に直接もしくは適切な補助剤を用いて導入する方法や、当該因子をコードする遺伝子を公知の方法で細胞に導入することによって達成することができる。【００２２】
上記のとおり、本発明のレトロウイルスベクターは生体からのがん細胞やウイルス感染細胞の排除に有用である。ＲＮＡウイルスが感染している細胞で一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼが発現されると、ウイルス複製によって生成されたウイルスゲノムＲＮＡが前記のポリペプチドにより切断されるため、ウイルス複製が抑制される。したがって、本発明のレトロウイルスベクターはＲＮＡウイルス感染症、たとえばレトロウイルス（ヒトＴリンパ好性ウイルス等）、レンチウイルス（免疫不全ウイルス等）、フラビウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス等）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス等）、インフルエンザウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳ等）等が引き起こす感染症の治療、予防に特に有用である。【００２３】
本発明の態様のひとつとして、免疫不全ウイルス由来のトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列と、前記配列により発現の制御が可能な形態に配置された一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる転写ユニットを含有するレトロウイルスベクターが例示される。前記のレトロウイルスベクターは、免疫不全ウイルス感染症の治療、予防に有用である。【００２４】
以下、本態様について詳細に説明する。
本明細書において「免疫不全ウイルス」とは、免疫細胞に感染して免疫細胞を破壊し後天的に免疫不全を発症させるウイルスのことを言い、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が例示される。加えて、異なる免疫不全ウイルスのゲノム同士を組み合わせて作成されたキメラウイルスも、本明細書においては「免疫不全ウイルス」と言う。このようなキメラウイルスとしては、サル／ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）が例示される。【００２５】
また、本明細書において、免疫不全ウイルス感染症とは、上記の免疫不全ウイルスによって後天的に免疫不全を発症した病態のことを言う。【００２６】
免疫不全ウイルスのトランス作用因子により転写が誘導される転写調節配列には特に限定はないが、例えば、免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質により転写が誘導される転写調節配列を使用することができる。このような配列としては、免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶのＴａｔタンパク質により転写が誘導される転写配列が好適である。Ｔａｔタンパク質は免疫不全ウイルスのＬＴＲプロモーターの作用により転写が開始されたＲＮＡ内に存在するＴＡＲ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列に結合してそれより下流の転写を活性化することから、本発明には、転写開始点の下流にＴＡＲ領域の塩基配列を有する転写調節配列を使用することができる。特に好適には、治療や予防の対象となる免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶのＬＴＲや、前記ＬＴＲに適切な改変を施した転写調節配列が使用される。前記の改変としては、例えばプロモーター内に存在する宿主細胞由来の転写因子との結合部位の欠失やＴａｔタンパク質特異的な転写に不要な領域の欠失が例示される。前者の改変により、宿主由来転写因子による、ＨＩＶ等の免疫不全ウイルス感染とは無関係な転写のレベルを低下させることが可能である。このような転写調節配列の改変については、例えば非特許文献２に記載されている。また、後者の改変としてＬＴＲのＵ５領域やＴＡＲ配列より下流の領域（Ｒ領域の一部及びＵ５領域）の欠失が例示される。【００２７】
また、免疫不全ウイルスのゲノムに存在するＲＲＥ（Ｒｅｖ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、免疫不全ウイルス由来のトランス作用因子であるＲｅｖタンパク質との相互作用によってタンパク質の発現を促進することが知られている（非特許文献３）。更に、ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子内に存在するＩＮＳと呼ばれる領域は、Ｒｅｖタンパク質の非存在下では免疫不全ウイルスのｍＲＮＡの転写を抑制しているが、前記のＲＲＥならびにＲｅｖタンパク質との相互作用によってこの抑制作用が解除されることが知られている［ジャーナル・オブ・ウイロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第６６巻、ｐ７１７６−７１８２（１９９２）］。したがって、外来のポリペプチドをコードする遺伝子の３’側にこれらの転写調節配列を組み込むことにより、前記核酸にコードされるポリペプチドをＲｅｖタンパク質依存的に、すなわち免疫不全ウイルス感染依存的に発現させることができる。【００２８】
前記の免疫不全ウイルスのトランス作用因子と相互作用する配列は、当該配列が本来的に組み込まれている機能的配列、例えばプロモーターとともに使用しても良く、異種の機能的配列と組み合わせて使用しても良い。例えば、所望の細胞においてｍＲＮＡの転写を開始しうる、免疫不全ウイルス由来ではないプロモーターと前記の配列を組み合わせて構築された配列も、本発明に使用される「転写調節配列」に包含される。【００２９】
前記のエンドリボヌクレアーゼはリボソームを構成した状態のｒＲＮＡや高次構造を形成したｔＲＮＡを分解しない。したがって、前記の酵素をコードする遺伝子をＲＮＡウイルス由来のトランス作用因子により転写が誘導される転写配列の制御下に配置した場合には、本発明のレトロウイルスベクターが導入された細胞においてＲＮＡウイルスのＲＮＡが分解、排除され、その結果前記のエンドリボヌクレアーゼの発現が停止すると、細胞は増殖能を回復することができる。例えば免疫不全ウイルスがプロウイルスとして染色体に組み込まれた細胞であっても、ウイルスの複製が妨げられた状態の細胞は増殖能を維持している。生体内のＴ細胞数を大きく低下させることなく免疫不全ウイルスの複製、免疫不全症の発症を防止できる点で、前記のエンドリボヌクレアーゼの使用は有利である。【００３０】
トキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは３〜７塩基程度の短い塩基配列を認識して一本鎖ＲＮＡを切断することから、前記のエンドリボヌクレアーゼが細胞内で発現された場合には細胞内のほとんどのｍＲＮＡが分解されて細胞内でのタンパク質合成、細胞増殖が阻害される。また、免疫不全ウイルスのゲノムであるＲＮＡをも切断されるため、前記ウイルス、例えばＨＩＶの複製、細胞外への放出（出芽）も防止される。更に、免疫不全ウイルスのゲノムにコードされているポリペプチドの発現も阻止されることから、例えば細胞外に放出されたＴａｔタンパク質による免疫不全ウイルス非感染細胞のアポトーシス誘発等も抑制される。【００３１】
免疫不全ウイルス感染症の治療又は予防のためには、本発明で使用される一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は免疫不全ウイルスの感染する可能性のある細胞、例えば、ヒトやサルにおいてはＣＤ４陽性細胞を含む細胞（細胞群）に導入されることが望まれる。したがって、本発明ではＣＤ４陽性細胞（例えばＴ細胞）やＣＤ４陽性細胞に分化しうる前駆細胞（例えば造血幹細胞）、あるいは前記の細胞を含有する細胞集団を標的細胞として遺伝子導入が実施される。免疫不全ウイルスの感染を受ける可能性のある細胞に網羅的に前記の遺伝子を導入する観点から、本発明では造血幹細胞又は当該細胞を含有する細胞集団を標的とすることが好ましい。前記の細胞は、ＣＤ４陽性細胞やその前駆細胞を含有するものであれば特に限定はなく、個体より採取された血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞）、骨髄細胞や、前記の細胞から公知方法により分画されたＣＤ４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞の前駆細胞、造血幹細胞等が例示される。【００３２】
以上のように、本発明は免疫不全ウイルス感染症の治療又は予防に有用な細胞、ならびに当該細胞を含有する細胞組成物の製造に有用である。更に、本発明により前記の細胞を使用する、免疫不全ウイルス感染症の治療方法又は予防方法も提供される。すなわち、本発明のレトロウイルスベクターを導入された細胞を個体に投与することにより、個体中の免疫不全ウイルス感染細胞の比率を減少させ、もしくは個体に免疫不全ウイルスへの耐性を付与することが可能となる。前記の細胞やこれを含有する細胞組成物は、特にＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳの治療又は予防に有用である。【００３３】
本発明のレトロウイルスベクターが導入されたＣＤ４陽性細胞や、本発明のレトロウイルスベクターが導入されたＣＤ４陽性細胞の前駆細胞（造血幹細胞等）から分化したＣＤ４陽性細胞は、免疫不全ウイルスの感染を受けて細胞内に免疫不全ウイルス由来のトランス作用因子が生成した場合には、転写調節配列の下流に位置する一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が誘導されるため、生成したポリペプチドにより細胞内のｍＲＮＡが分解され、蛋白質の生合成が阻害される。この際、免疫不全ウイルスの複製過程で生成されるＲＮＡゲノムも分解を受ける。このように、免疫不全ウイルスのゲノムにコードされているポリペプチドの翻訳、免疫不全ウイルスのゲノムの複製が阻害されることから、新たな感染性免疫不全ウイルス粒子の生成と他の細胞への感染が防止される。更に、本発明のレトロウイルスベクターが導入された細胞を既に免疫不全ウイルスに感染して免疫不全ウイルスを細胞外に産生している細胞と混合して培養すると、本発明のレトロウイルスベクターが導入された細胞は増加するのに対し、当該ベクターが導入されていない細胞は減少していく。この結果、免疫不全ウイルス産生細胞の比率が低下していく。【００３４】
更に、本発明は前記の医薬を使用する免疫不全ウイルス感染症の治療方法、予防方法を提供する。本発明の治療方法は単独で実施しても良いが、３〜４種類の抗ウイルス薬（逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等）を併用する多剤併用療法（ＨＡＡＲＴ）と組み合わせて実施しても良い。【００３５】
本発明のレトロウイルスベクターは、上記の転写調節配列に、前記転写調節配列によって発現の制御が可能な形態で一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が接続された核酸、すなわち一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ転写ユニットを含有する。本発明は、前記転写ユニットが、当該転写ユニットからのｍＲＮＡの転写方向がレトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きとなるようにレトロウイルスベクター内に配置されていることを特徴とする。【００３６】
レトロウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ウイルスゲノムには主要な要素としてその５’側より５’−ＬＴＲ、パッケージングシグナル、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、３’−ＬＴＲが存在している。このうち、レトロウイルスベクターに必須であるのは５’−ＬＴＲ、パッケージングシグナル、３’−ＬＴＲである。細胞への外来遺伝子の導入に使用されるレトロウイルスベクターでは、通常、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等の遺伝子を欠失させ、これらに代って導入が望まれる遺伝子が挿入される。通常、レトロウイルスベクターでは目的遺伝子がウイルスゲノムの転写と同方向に挿入され、目的遺伝子は５’−ＬＴＲのプロモーターあるいは目的遺伝子の上流に挿入された内部プロモーターから転写される。しかし、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ遺伝子をレトロウイルスゲノムの転写と同方向に挿入した場合にはレトロウイルスｍＲＮＡからエンドリボヌクレア−ゼ遺伝子が発現し、エンドリボヌクレア−ゼがウイルスゲノムＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を破壊してしまうため高力価のレトロウイルスベクターの産生は望めない。【００３７】
本発明において、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ転写ユニットは、レトロウイルスベクターにおけるＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きに配置される。すなわち、前記転写ユニットの転写調節配列より開始される転写の向きはレトロウイルスベクターの５’−ＬＴＲより開始される転写の向きと反対である。したがって、レトロウイルスｍＲＮＡはエンドリボヌクレア−ゼ遺伝子のアンチセンス鎖に相当することとなるため、このｍＲＮＡからエンドリボヌクレア−ゼが発現されることはない。また、前記転写調節配列の特性に起因するエンドリボヌクレア−ゼｍＲＮＡの微弱な転写があったとしても、レトロウイルスｍＲＮＡがアンチセンスＲＮＡとして機能することでエンドリボヌクレア−ゼの発現が抑制される。【００３８】
本発明に使用されるレトロウイルスベクターには特に限定はない。無制限な感染、遺伝子導入を防止する観点からは、本発明には複製能欠損レトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中に、ベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、ＭＦＧベクターやα−ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターあるいはこれらを改変したベクターが例示される。前記のレンチウイルスベクターとしてはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター［野生型ＬＴＲを有するＨＩＶベクター（例えば米国特許５６６５５７７号）や改変されたＬＴＲを有するＨＩＶベクター（例えばｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５：インビトロジェン社製）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクター［例えばヒューマン・ジーン・セラピー、第１１巻、ｐ１８６３−１８７４（２０００）］等が例示されるが、これらに限定されるものではない。【００３９】
本発明のレトロウイルスベクターは、例えば前記のレトロウイルスベクターより適切なものを選択し、これに一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ転写ユニットを搭載して構築することができる。構築されたレトロウイルスベクターの調製方法には特に限定はなく、構築されたレトロウイルスベクターが導入されたレトロウイルス産生細胞を培養し、その培養上清を採取して得ることができる。前記のレトロウイルス産生細胞は安定にレトロウイルス粒子を上清中に生産するもの、レトロウイルスベクタープラスミドのトランスフェクションにより一過性にレトロウイルス粒子を生産するもののいずれでも構わない。【００４０】
上記のレトロウイルス産生細胞の作製には公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８）］等を使用しても良い。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。【００４１】
本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープやエンベロープとして機能しうるタンパク質を有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。更に、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウイルス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウイルスベクターも本発明に使用できる。【００４２】
本発明のレトロウイルスベクターは、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ転写ユニットの他、前記ユニットの転写調節配列と協調する因子、例えばオペレーター、エンハンサー、ターミネーター等の配列を含有することができる。また、前記ユニットとは独立して、本発明のレトロウイルスベクターには遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーターとして機能しうるタンパク質をコードする遺伝子等）、レセプター遺伝子等を有していても良い。更に、本発明のレトロウイルスベクターは遺伝子導入細胞による治療が完遂した場合、あるいは何らかの副作用が生じた場合に生体内から遺伝子導入細胞を排除する目的で、自殺遺伝子を搭載していても良い。これらの遺伝子は必ずしもＲＮＡゲノムの転写方向に対して逆向きに転写されるよう配置する必要はない。【００４３】
前記の、ＭａｚＦやＰｅｍＫのようなトキシン−アンチトキシン系のトキシンを構成するエンドリボヌクレアーゼは、対応するアンチトキシン（ＭａｚＥやＰｅｍＩ）が共存する場合にはその活性が抑制される。したがってトキシンであるエンドリボヌクレアーゼ遺伝子を本発明に使用する場合にアンチトキシン遺伝子を併用することにより、非ＨＩＶ感染細胞における、エンドリボヌクレアーゼ活性に起因する細胞毒性の発現を抑制することができる。前記の態様の一例としては、例えば構成的なプロモーター（グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、β−アクチン遺伝子等のハウスキーピング遺伝子由来のプロモーターやウイルス由来プロモーター等）の下流にアンチトキシン遺伝子を接続して非ＨＩＶ感染細胞において微量のアンチトキシンを発現させておくことにより、トキシンの活性をアンチトキシンの作用によって抑制することが考えられる。この細胞にＨＩＶが感染した際には、前記のトランス作用因子の作用によってトキシンの発現が促進され、アンチトキシンの発現量を上回った場合には初めて細胞毒性が発揮されるようになる。こうして、ＨＩＶ感染細胞に対する細胞毒性の選択性をより向上させることができる。【００４４】
本発明の１つの態様では、生物個体より採取された細胞に生体外で本発明のレトロウイルスベクターを導入するエクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子導入が使用される。ウイルスベクターを使用する場合、生体より採取された前記の標的細胞と本発明のレトロウイルスベクター、例えばウイルス産生細胞の培養液上清や前記上清から精製された本発明のレトロウイルスベクターとを混合し、適切な条件でインキュベートすることにより遺伝子の導入が達成され、一本鎖ＲＮＡ特異的なエンドリボヌクレア−ゼ転写ユニットが染色体に組み込まれた細胞を調製することができる。本発明の別の態様としては本発明のレトロウイルスベクターを個体に直接投与するイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子導入法が挙げられる。【００４５】
レトロウイルスベクターをエクス・ビボ遺伝子導入に使用する場合、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下に標的細胞にレトロウイルスベクターを高効率で感染させることができる。【００４６】
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用する遺伝子導入方法は、例えば国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、第８７６−８８２頁（１９９６）等に記載されている。当該方法には、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位の両方を同一分子上に有する機能性物質を使用する方法、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と標的細胞結合部位とを有する機能性物質との混合物を使用する方法とがあり、本発明にはいずれの方法にも使用することができる。【００４７】
上記の機能性物質は、レトロウイルス結合活性及び／又は標的細胞結合活性を有するものであれば特に限定はない。例えば、フィブロネクチン由来のヘパリン結合ドメイン（ヘパリン−ＩＩドメイン）、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲンのフラグメント、前記のポリペプチドの誘導体や改変体、ポリリジン、ＤＥＡＥデキストランなどがレトロウイルス結合活性を有する機能性物質として例示される。また、標的細胞結合活性を有する機能性物質には、所望の標的細胞に結合する能力を有する任意の物質を使用することができる。特に本発明を限定するものではないが、例えば、細胞結合活性を有するポリペプチド（細胞骨格タンパク質等）、細胞もしくは細胞表面の生体分子を認識する抗体、成長因子、サイトカイン、糖鎖等が標的細胞結合活性を有する機能性物質として例示される。【００４８】
本発明の好適な態様の１つとして、フィブロネクチン由来のヘパリン結合ドメインを含有する機能性物質の存在下に標的細胞への遺伝子導入を行う方法が挙げられる。前記機能性物質は、好適には、細胞接着ドメインとヘパリン結合ドメインの両者を有するフィブロネクチンフラグメントが例示される。前記細胞接着ドメインとしては、ＶＬＡ−５及び／又はＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドが特に好適である。前記のフィブロネクチンフラグメントは、生体より精製されたフィブロネクチンからプロテアーゼ消化などの手段で調製することができ、また、組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、レトロネクチン（登録商標）としてタカラバイオ社から発売されている組換えフィブロネクチンフラグメントは本発明に好適である。【００４９】
上記のとおり、本発明のレトロウイルスベクター、ならびに当該レトロウイルスベクターが導入された細胞はがんやウイルス感染症の治療、予防のために使用することができる。すなわち、本発明は前記疾患、例えばＲＮＡウイルス感染症［免疫不全ウイルス感染症（ＡＩＤＳ）、Ｃ型肝炎等］の治療剤、予防剤を提供する。前記の医薬は、前記のレトロウイルスベクター又は細胞を有効成分として含有するものであれば特に限定するものではないが、当該有効成分自体の他、当該有効成分を薬学的に許容される担体と組み合わせてなる製剤、当該ベクターによりエクス・ビボにおいて細胞遺伝子導入を行うためのキット等、任意の形態をとることができる。【００５０】
下記実施例に記載のとおり、本発明のレトロウイルスベクターによりエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子が導入された細胞集団は、例えば、５０％程度の細胞しか前記の遺伝子を保持していない場合でも、当該細胞集団に感染したＨＩＶの複製は前記の遺伝子を保持した細胞を全く含まない細胞集団に比較して１／５程度まで抑制される。すなわち、本発明において発揮される治療及び／又は予防効果は、有効成分として機能する遺伝子の導入効率をその限界とするものではない。本発明を特定の原理に基づくものに限定するものではないが、本発明のレトロウイルスベクターによるＨＩＶ遺伝子治療は、ベクターを介さずに遺伝子導入細胞から非遺伝子導入細胞へと治療用遺伝子あるいは発現した治療用タンパク質が伝達されるという、連鎖反応型メカニズムという予想外の優れた性質を有している。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。【００５２】
実施例１  ＭａｚＦ発現プラスミドの構築
（１）ＭａｚＦ発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構築
プラスミドｐＱＢＩ−ＬＴＲｇａｇＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）に挿入されているｇａｇ、ｓｇＧＦＰ及びＲＲＥをコードする領域を制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩの二重消化によって除去したうえ、ここにＭａｚＦタンパクをコードする、配列表の配列番号２に示す塩基配列の化学的に合成されたＤＮＡを挿入した。こうして構築されたプラスミドをｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１と命名した。ｐＱＢＩ−ＬＴＲＭａｚＦｃｖ１を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でＨＩＶ−ＬＴＲからＭａｚＦをコードする領域を増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＥｃｏ５２Ｉで消化した。このＤＮＡ断片をＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットと命名した。【００５３】
ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミド（クロンテック社製）を鋳型とし、配列番号５及び配列番号６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でヘルペス単純ウイルス１型由来のポリＡシグナルを含むＤＮＡ断片を増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩで消化した。このＤＮＡ断片をｐＡ断片と命名した。【００５４】
ｐＱＢＩ−ｐｇｋ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を鋳型とし、配列番号７及び配列番号８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でマウスＰＧＫプロモーターを含む断片を増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩで消化後、末端を平滑化し、更にＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ断片をｐＰＧＫ断片と命名した。【００５５】
レトロウイルス産生細胞ＳＦＣＭＭ−３［ヒューマン・ジーン・セラピー、第９巻、ｐ２２４３−２２５１（１９９８）］のゲノムを鋳型とし、配列番号９及び配列番号１０に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲ法でヒトＬｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒの細胞外ドメインを増幅し、得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した。このＤＮＡ断片をＬＮＧＦＲ断片と命名した。【００５６】
ｐＭＴベクター［ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１１巻、９４〜９９頁（２００４）］のＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩ部位に上記遺伝子断片を順次挿入し、図１に示す組換えレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを得た。このベクターでは、ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写とは逆方向に挿入されているのが特徴である。【００５７】
（２）ＭａｚＦ発現レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬの構築
ｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬとの比較に使用する目的で、ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写と同じ方向に挿入され、遺伝子導入後はレトロウイルスゲノムの転写が抑制される自己不活型レトロウイルスベクターｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを構築した（図２）。この調製にはｐＭＴベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域について、当該領域４３〜３０９番目の塩基にわたる部分を欠損させたプラスミドベクターｐＭＴＤ３を使用し、そのＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩ部位に（１）で調製したＤＮＡ断片を図２のとおりに挿入して構築した。【００５８】
また、ＭａｚＦのアンチトキシンであるＭａｚＥを発現するベクターは以下の要領で作製した。まずｐＩＲＥＳｎｅｏ３ベクター（クロンテック社製）のＣＭＶプロモーターをＣＡＧプロモーターに置換したベクターｐＣＡＩＮを作製した。次に、ｐＣＡＩＮのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ部位に配列番号１１に示すアミノ酸配列のＭａｚＥタンパク質をコードする遺伝子（配列番号１２に塩基配列を示す）を挿入し、これをｐＣＡＩＮ−ＭａｚＥと命名した。【００５９】
実施例２  レトロウイルス産生細胞の樹立とレトロウイルスベクターの調製
ｐＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いた一過性のウイルス産生を行い、エコトロピックＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬウイルスを獲得した。エコトロピックＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬウイルスを、ＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）にポリブレン（シグマアルドリッチ社製）８μｇ／ｍＬ存在下に感染させ、遺伝子導入細胞を獲得した。前記の細胞を９６穴プレートに限界希釈して播種し、増殖してきたクローンの培養上清を採取して実施例３記載のリアルタイムＰＣＲ法によりウイルス力価を測定した。高力価のウイルス産生が見られたクローン１株を選択してレトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを樹立した。【００６０】
ＰＧ１３／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬは１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）で培養し、セミコンフルエントに生育したところで５ｍＭの酪酸ナトリウムを含む新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地（０．１ｍＬ／ｃｍ２）と交換し、２４時間後に上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過してＧａＬＶ／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬ組換えレトロウイルス液を得た。得られたウイルス液は小分けして分注し、−８０℃フリーザーで保存し、以下の遺伝子導入実験に供した。【００６１】
ｐＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬと、ｐＣＡＩＮ−ＭａｚＥを２０：１で混合し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＧ１３細胞にトランスフェクションし、ネオマイシン（Ｇ４１８）を５００μｇ／ｍＬ含有する１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地で選択した。得られたＧ４１８耐性細胞集団をＣＤ２７１  ＬＮＧＦＲマイクロビーズキット（ミルテニーバイオテク社製）を用いた分離操作に供し、ＬＮＧＦＲ陽性細胞を獲得した。このＬＮＧＦＲ陽性細胞を９６穴プレートに限界希釈して播種し、増殖してきたクローンの上清を実施例３記載の方法でリアルタイムＰＣＲによりウイルス力価測定し、高力価レトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを樹立した。ＰＧ１３／ＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬは１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地で培養し、セミコンフルエントに生育したところで５ｍＭの酪酸ナトリウムを含む新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地（０．１ｍＬ／ｃｍ２）と交換し、２４時間後に上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過してＧａＬＶ／ＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬ組換えレトロウイルス液を得た。得られたウイルス液は小分けして分注し、−８０℃フリーザーで保存し、以下の遺伝子導入実験に供した。【００６２】
実施例３  ウイルス力価の測定
Ｒｅｔｒｏ−Ｘ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いてウイルス液１μＬを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ反応を行い、検量線からウイルス液中のＲＮＡコピー数を算出した。実施例２で得たＧａＬＶ／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬウイルス液の力価は９．７８×１０９ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、ＧａＬＶ／ＭＴＤ３−Ｕ３ＴＡＲ−ＭａｚＦ−ＰＬウイルス液の力価は１．１６×１０９ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであった。ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ発現カセットを逆向きに搭載することにより、自己不活型レトロウイルスベクターより高力価の組換えウイルスを獲得することが可能となった。【００６３】
実施例４  ＣＨ−２９６コートプレートの作製
表面未処理２４ウェルプレート（ファルコン社製）に１ウェルあたり５００μｌの２０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（商品名レトロネクチン；タカラバイオ社製）を添加して４℃で一晩放置した後、ＰＢＳで洗浄した。このプレートをＣＨ−２９６コートプレートとして以下の実験に使用した。【００６４】
実施例５  遺伝子導入効率の測定
実施例２で調製した組換えレトロウイルス液を用いてヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）及びカニクイザル末梢血より調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞へ以下の手順で遺伝子導入実験を行い、遺伝子導入効率を測定した。【００６５】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養を行った。遺伝子導入の当日に細胞を遠心分離して回収し、新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０５個／ｍＬになるように懸濁した。実施例４で調製したＣＨ−２９６コートプレートに、実施例２で調製した組換えレトロウイルス液を１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）で４倍、８倍、１６倍希釈したものを各ウェルに１ｍＬ／ウェルで添加し、３２℃、２０００×ｇ、２時間の条件で遠心操作を行い、レトロネクチンとレトロウイルスベクターの結合を促した。次に上清を取り除き、ウェルを０．５ｍＬの１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で洗浄し、先の細胞懸濁液を１ｍＬ添加して３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。３日間培養後、細胞を回収し、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）−ＰＥ抗体（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＬＮＧＦＲ陽性細胞を染色し、フローサイトメーター  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）による解析に供し、遺伝子導入効率を測定した。【００６６】
また、カニクイザル末梢血より、サルＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  アイソレーションキット（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製し、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、２００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２、５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡを添加したＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養を行った。培養開始３日後に細胞を遠心分離して回収し、新鮮な１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、２００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加したＡＩＭ−Ｖに２×１０５個／ｍＬになるように懸濁した。実施例４で調製したＣＨ−２９６コートプレート２枚を使用し、実施例２で調製した組換えレトロウイルス液原液を１ウェルあたりに１ｍＬ添加し、３２℃、２０００×ｇ、２時間の条件で遠心操作を行い、レトロネクチンとレトロウイルスベクターの結合を促した。次に上清を取り除き、０．５ｍＬの１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で洗浄した。２枚のプレートのうち、１枚については、各ウェルに１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液を添加した状態で４℃にて保存した。もう一枚には先の細胞懸濁液を１ウェルあたりに１ｍＬ添加して３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。２４時間後、細胞を回収し、４℃で保存しておいたウイルス結合プレートに細胞懸濁液を添加した。更に３日間培養後、細胞を回収し、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）−ＰＥ抗体（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＬＮＧＦＲ陽性細胞を染色し、フローサイトメーター  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅによる解析に供し、遺伝子導入効率を測定した。【００６７】
測定した遺伝子導入効率を表１に示す。表１に示す如く、ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦ発現カセットを逆向きに搭載することにより、自己不活型レトロウイルスベクターと比較して遺伝子導入効率が飛躍的に向上した。【００６８】
【表１】
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【００６９】
実施例６  ヒトＣＤ３４陽性前駆細胞への遺伝子導入
実施例２で調製した組換えレトロウイルス液を用いて骨髄由来ヒトＣＤ３４陽性前駆細胞（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ＣＤ３４＋  Ｃｅｌｌｓ、Ｃａｍｂｒｅｘ社製）へ以下の手順で遺伝子導入実験を行い、遺伝子導入効率を測定した。【００７０】
ヒトＣＤ３４陽性前駆細胞は４％ウシ胎仔血清含有Ｘ−ＶＩＶＯ１０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）に２０ｎｇ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−３（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１００ｎｇ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１００ｎｇ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１００ｎｇ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を添加して刺激培養を行った。３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで２日間培養後、細胞数を計数し、新鮮な上記培養培地に１×１０５個／ｍＬになるように懸濁した。実施例４で調製したＣＨ−２９６コートプレートに、実施例２で調製した組換えレトロウイルス液ＧａＬＶ／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬ原液を１ウェルあたりに１ｍＬ添加し、３２℃、２０００×ｇ、２時間の条件で遠心操作を行い、レトロネクチンとレトロウイルスベクターの結合を促した。次に上清を取り除き、０．５ｍＬの１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で洗浄した。次に、先の細胞懸濁液を１ウェルあたりに０．５ｍＬ添加して３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。３日間培養後、細胞を回収し、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）−ＰＥ抗体（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＬＮＧＦＲ陽性細胞を染色し、フローサイトメーター  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅによる解析に供し、遺伝子導入効率を測定した。ヒトＣＤ３４陽性前駆細胞への遺伝子導入効率は８５．７％であり、高効率での遺伝子導入が達成された。【００７１】
実施例７  免疫不全ウイルスの複製の抑制
本発明のレトロウイルスベクターによる、免疫不全ウイルスの複製の抑制効果について、以下の手順で確認した。
（１）ＭａｚＦ遺伝子を導入したアカゲザルＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製
アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）より採取した血液１０ｍＬに、ＰＢＳを２０ｍＬ加え希釈した。Ｆｉｃｏｌｌ  ３ｍＬを添加した１５ｍＬ遠心管１本あたり１０ｍＬの血液を重層し、８００×ｇ、３０分間室温にて遠心分離した。新しい１５ｍＬ遠心管にＰＢＳ  ８ｍＬを予め入れておき、遠心分離した血液から上層を捨てた後、単核球層（白い層）を回収し、ＰＢＳの入った遠心管に回収した。８００×ｇ、５分間、４℃にて遠心分離後、ペレットを緩衝液ＡＣＫ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ８ｍＬで懸濁して３７℃、５分間溶血処理を行った。これにＰＢＳを７ｍＬ加え、転倒混和し、４００×ｇ、５分間、４℃にて遠心分離した。得られた細胞をＰＢＳに懸濁し、ＭＡＣＳ  サルＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  アイソレーションキット（ミルテニーバイオテク社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。【００７２】
アカゲザルＣＤ４陽性Ｔ細胞は１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、２００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２、５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ含有ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁して培養を開始した。培養開始３日後に細胞を遠心分離して回収し、新鮮な１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、２００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加したＡＩＭ−Ｖに２×１０５個／ｍＬになるように懸濁した。実施例４で調製したＣＨ−２９６コートプレート２枚を使用し、実施例２で調製した組換えレトロウイルス液原液を１ウェルあたりに１ｍＬ添加し、３２℃、２０００×ｇ、２時間の条件で遠心操作を行い、レトロネクチンとレトロウイルスベクターの結合を促した。次に上清を取り除き、０．５ｍＬの１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で洗浄した。２枚のプレートのうち、１枚については、各ウェルに１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液を添加した状態で４℃にて保存した。もう１枚には先の細胞懸濁液を１ウェルあたりに１ｍＬ添加して３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。２４時間後、細胞を回収し、４℃で保存しておいたウイルス結合プレートに細胞懸濁液を添加した。さらに２日間培養後、細胞を回収し、ＭａｚＦ遺伝子導入ＣＤ４陽性Ｔ細胞とした。【００７３】
（２）ＣＤ４陽性Ｔ細胞へのＳＨＩＶ−ＫＢ９の感染
（１）で調製したＭａｚＦ遺伝子導入ＣＤ４陽性Ｔ細胞にサル／ヒト免疫不全キメラウイルス株ＳＨＩＶ−ＫＢ９［ジャーナル・オブ・ウイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、第７１巻、ｐ４２１８−４２２５（１９９７）］を２種類の力価で感染させた（以下、高力価で感染させたものを［ＭａｚＦ−Ｈｉｇｈ  ＫＢ９］と記載し、低力価で感染させたものを［ＭａｚＦ−Ｌｏｗ  ＫＢ９］と記載する）。対照として、ＭａｚＦ遺伝子を導入していないアカゲザルＣＤ４陽性Ｔ細胞についても、ＳＨＩＶ−ＫＢ９を２種類の力価で感染させた（以下、高力価で感染させたものを［対照−Ｈｉｇｈ  ＫＢ９］と記載し、低力価で感染させたものを［対照−Ｌｏｗ  ＫＢ９］と記載する）。【００７４】
（３）ＣＤ４陽性Ｔ細胞へのＭａｚＦ遺伝子導入による、免疫不全ウイルスの複製の抑制効果
ＳＨＩＶ−ＫＢ９感染後、培養上清をサンプリングし、リアルタイムＰＣＲでＳＨＩＶ−ＫＢ９のコピー数を算出することによってＳＨＩＶ−ＫＢ９の複製を調べた。結果を表２に示す。対照サンプルではＳＨＩＶ−ＫＢ９が複製したが、ＭａｚＦ遺伝子導入ＣＤ４陽性Ｔ細胞ではＳＨＩＶ−ＫＢ９の複製が抑制されていることが示された。【００７５】
【表２】
2008133137.tif 000003
【００７６】
実施例８  ＣＨ−２９６コートプレートの作製
実施例４同様の操作により、ＣＨ−２９６コートした２４ウェルプレートを作製した。また、表面未処理１２ウェルプレート（ファルコン社製）に１ウェルあたり１ｍＬの２０μｇ／ｍｌのＣＨ−２９６を添加して４℃で一晩放置した後、ＰＢＳで２回洗浄した。これらプレートをＣＨ−２９６コートプレートとして以下の実験に使用した。【００７７】
実施例９  ヒトＰＢＭＣの培養
ヒト末梢血よりアフェレーシスにより採取し、凍結保存しておいた５人のドナー由来の単核球細胞（ＰＢＭＣ；それぞれＴＫ５、ＴＫ１４、ＴＫ１９、ＴＫ２３、ＴＫ２９とする）を融解し、ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社）に懸濁し、５００×ｇ、１０分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレットを得た。このペレットを１％の自己血漿、０．２％ヒト血清アルブミン（Ｂａｘｔｅｒ社製）、６００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ社製）、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン（ブリストル・マイヤーズ社製）を含有するＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）である培養用培地１０ｍＬに懸濁して細胞数を計数し、同培地で５×１０６個／ｍＬの細胞濃度に調製した。この懸濁液５ｍＬを２５ｃｍ２フラスコ（コーニング社製）に移し、抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ−３（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ社製）を３０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加して培養を開始した。培養開始から３日目に細胞数をカウントし、新鮮な培養用培地で１〜２×１０６／ｍＬの細胞濃度の懸濁液とした。【００７８】
実施例１０  ヒトＰＢＭＣへの遺伝子導入
実施例２で調製した組換えレトロウイルス液ＧＡＬＶ／ＭＴ−ＨＬＴＲ−ＭａｚＦ−ＰＬを実施例８で作製したＣＨ−２９６コート２４ウェルプレートおよび１２ウェルプレートにそれぞれ１ｍＬ、２ｍＬ添加し、３２℃、２０００×ｇ、２時間の条件で遠心操作を行い、レトロネクチンとレトロウイルスベクターの結合を促した。１２ウェルプレートは、ウェルを１ｍＬの１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、さらにウェルを１ｍＬの１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で満たして、翌日の遺伝子導入用として４℃で保存した。【００７９】
２４ウェルプレートのウェルを０．５ｍＬの１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で洗浄し、実施例９で調製した細胞懸濁液を１ｍＬ添加して３２℃、１０００×ｇ、１０分間の条件で遠心操作を行い、レトロウイルスベクターが結合したプレートへの細胞接着を促した。引き続き３７℃、５％炭酸の条件で４時間培養した後、培養用培地で５×１０５／ｍＬの細胞濃度に希釈して培養を続けた。【００８０】
１回目の遺伝子導入の翌日、保存しておいた１２ウェルプレートから１．５％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液を添加したウイルス結合プレートから上清を除去し、そのウェルに遺伝子導入を行った各ドナーの細胞の全量を移した。プレートを３２℃、１０００×ｇ、１０分間の条件での遠心操作に供し、レトロウイルスベクターが結合したプレートへの細胞接着を促した。引き続き３７℃、５％炭酸ガスの条件で４時間培養した後、培養用培地で３×１０５／ｍＬの細胞濃度に希釈して培養を行った。【００８１】
対照としてレトロウイルスベクターを結合していないＣＨ−２９６コートプレートを用いて同様に操作を行い、非遺伝子導入細胞を調製した。【００８２】
２回目の遺伝子導入からさらに３日間培養後、細胞を回収し、ＣＤ２７１−ＰＥ  抗体を用いてＬＮＧＦＲ陽性細胞を染色し、フローサイトメーター  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ（ベックマンコールター社製）による解析に供し、遺伝子導入効率を測定した。各ドナー由来のＰＢＭＣへの遺伝子導入効率を以下の表３に示す。【００８３】
【表３】
2008133137.tif 000004
【００８４】
実施例１１  ＭａｚＦ遺伝子導入ＰＢＭＣへのＨＩＶ感染実験−１
実施例１０で調製した５ドナー由来のＭａｚＦ遺伝子導入細胞および非遺伝子導入細胞を培養用培地でそれぞれ５×１０５／ｍＬに希釈し、その１０ｍＬを一晩培養した。翌日、細胞懸濁液を二等分してそれぞれを遠心管に移し、一方にＨＩＶ  ＩＩＩＢ株をＭＯＩ＝０．０１で添加して感染した。もう一方はＭｏｃｋ感染としてＨＩＶを含まない培地を添加した。３７℃にて２時間インキュベーションしてＨＩＶ  ＩＩＩＢを細胞に吸着させた後、細胞をＧＴ−Ｔ５０３培地で３回洗浄し、次いで３．５ｍＬの培養用培地に懸濁した。上記細胞懸濁液を２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬずつ添加し、さらに培養用培地を１ｍＬ添加して培養を行った。この培養は１検体あたり３ウェル（３群）で実施した。感染から３日後、培養液上清１ｍＬをサンプリングし、各ウェルに培養用培地を１ｍＬ添加し、引き続き培養を行った。感染から６日後、上清１ｍＬをサンプリングした。サンプリングした上清中に存在するＨＩＶのｐ２４抗原をＥＬＩＳＡ法で定量することによって、上清中のＨＩＶを定量した。また、感染から６日後の細胞をＭＴＴアッセイに供し、生細胞数を測定した。【００８５】
生細胞数の測定結果を図３（ａ）〜（ｅ）に、３日後、６日後のｐ２４抗原定量結果を表４に示す。図３の縦軸は対照（ＭａｚＦ遺伝子非導入、ＨＩＶ非感染）群の生細胞数に対する各試験群の生存細胞数の相対値（％）を示している。グラフ横軸は試験群を示しており、数字はドナー番号を、（−）表記はＭａｚＦ遺伝子非導入群、（＋）表記はＭａｚＦ遺伝子導入群を、また、ＭはＭｏｃｋ感染（ＨＩＶ非感染）、ＨはＨＩＶ感染をそれぞれ意味する。どのドナーのＰＢＭＣも、ＭａｚＦ遺伝子の導入・非導入、あるいはＨＩＶ−１感染・非感染による生細胞数の大きな変化はなく、ＨＩＶ感染により発現誘導されるＭａｚＦによって細胞死が誘発されないことが示された。また、各ドナーへのＭａｚＦ遺伝子導入効率は５０％前後であるにもかかわらず、表４に示す通り、ＭａｚＦ導入細胞では、非導入細胞と比較してＨＩＶの複製が５分の１程度に抑制されていることが示された。【００８６】
【表４】
2008133137.tif 000005
【００８７】
実施例１２  ＭａｚＦ遺伝子導入ＰＢＭＣへのＨＩＶ感染実験−２
実施例１０と同様の操作でＴＫ１９由来のＰＢＭＣからＭａｚＦ遺伝子導入細胞および非遺伝子導入細胞を調製した。調製した遺伝子導入細胞における遺伝子導入効率は６１．１％であった。これら細胞のそれぞれに、実施例１１と同様の方法で、ＨＩＶ  ＩＩＩＢ株およびＨＥ株をＭＯＩ＝０．０１で添加して感染させた。対照として、ＨＩＶを含まない培地を添加し、Ｍｏｃｋ感染とした。感染から３日後および６日後の上清中に存在するＨＩＶのｐ２４抗原をＥＬＩＳＡ法で定量することによって、上清中のＨＩＶを定量した。３日後、６日後のｐ２４抗原定量結果を表５に示す。【００８８】
表５に示す通り、ＭａｚＦ導入細胞では、ＭａｚＦ遺伝子導入効率は６１．１％であるにもかかわらず、非導入細胞と比較してＩＩＩＢ株およびＨＥ株ＨＩＶの複製がそれぞれ２０分の１、４分の１程度に抑制されていることが示された。【００８９】
【表５】
2008133137.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、がんやウイルス感染症の治療、予防に有効なレトロウイルスベクターが提供される。前記の核酸構築物が導入された細胞はＲＮＡウイルスの複製を抑制することができることから、特に前記ウイルスに起因する疾患、例えばＨＩＶ感染症の治療、予防に効果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
SEQ ID NO:2 ; Synthetic DNA encoding MazF.
SEQ ID NO:3 ; Primer to amplify HIV-LTR-MazF cassette.
SEQ ID NO:4 ; Primer to amplify HIV-LTR-MazF cassette.
SEQ ID NO:5 ; Primer to amplify pA fragment.
SEQ ID NO:6 ; Primer to amplify pA fragment.
SEQ ID NO:7 ; Primer to amplify pPGK fragment.
SEQ ID NO:8 ; Primer to amplify pPGK fragment.
SEQ ID NO:9 ; Primer to amplify LNGFR fragment.
SEQ ID NO:10 ; Primer to amplify LNGFR fragment.
【図１】
2008133137.tif 000007
【図２】
2008133137.tif 000008
【図３】
2008133137.tif 000009
【配列表】
2008133137000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月6日(2009.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
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