(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）：2008156139.tif 000011（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す）で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含む、タンパク質分析方法を提供する。
2008156139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するタンパク質分析方法であって、式（Ｉ）：
【化１】
2008156139.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す）
で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含む、タンパク質分析方法。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が２以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するために用いられる試薬キットであって、標識化合物として式（Ｉ）：
【化２】
2008156139.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す）
で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを含む、キット。
【請求項５】
式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が２以上である、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
質量分析されるタンパク質を含有する内部標準試料もまた前記標識化合物の安定同位体の一つで標識して質量分析に付すこと、及び内部標準試料由来のＭＳスペクトル強度に対するタンパク質含有試料由来のＭＳスペクトル強度の比を求めることにより、それぞれのタンパク質含有試料に含まれる同種のタンパク質の量比を決定することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を分析する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析する方法に関する。本発明はまた、質量分析計を用いたタンパク質の分析に有用な試薬キットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
様々な生物のゲノム構造解析が進展して、細胞内で働くことがあると予想されるタンパク質の候補がその一次構造情報として集積されてきた。しかし、遺伝子情報から引き出されるタンパク質情報はあくまでも情報であり、実体ではないことに注意が必要である。事実、細胞や組織では核内の全遺伝子情報の一部しか翻訳されていないといわれ、しかも、細胞や組織の由来によってその種類は様々である。また、発生から分化の過程でも、発現するタンパク質の質や量が刻々と変化しているようである。細胞内では、更に、多様なタンパク質が複雑に相互作用して細胞の生命活動を維持しているが、それら相互の関連を明らかにすることにより、遺伝子の機能解析を進めていくことが求められている。【０００３】
プロテオーム解析は、細胞の機能を支える多様なタンパク質間の関係を総合的にとらえようとする試みである。この目的に合致する合理的方法論が開発されてきているが、ある特定の代謝反応に関与するタンパク質の一群の構成成分を明らかにすること（同定）さえも、現状では多くの困難を伴う。このように多様性に富むタンパク質の集合であるプロテオームの変化を、総合的に、しかも迅速に把握することが求められている。【０００４】
従来タンパク質の分離のために利用されているＳＤＳゲル電気泳動法は、分子量に関して高い分離能を持つ。一方、タンパク質の荷電に基づき分離する等電点電気泳動法は、技術的な問題を克服しているが、試料調製に困難を抱えている。この両者の性質を併せ持つ分離技術である２次元電気泳動法は、現状では最も優れた分離能をもつ方法ではあるが、再現性に問題を残し、それを克服するために多色蛍光標識法と併用した所謂ＤＩＧＥ法が開発実用化されている。この方法は自動化が困難ではあるが、再現性や定量性の確保が難しいという問題はある程度克服された。【０００５】
一方、液体クロマトグラフ、質量分析計及びデータ解析システムを結合し、試料の分離からタンパク質の同定に至る過程を一貫してオンラインで自動的に行う大規模なタンパク質同定システムが開発されている。このシステムは感度が極めて高く、試料はほんの少しでよいうえに質量が極めて正確に得られるため、標的タンパク質に由来する２、３種のペプチド断片の質量が分かるだけでそのタンパク質を同定することが出来ることが多い。或いは、質量分析を用いてペプチドのアミノ酸配列を直接決定し、そのアミノ酸配列からタンパク質を同定することも可能である。【０００６】
また、正常と病態との間における細胞や組織内のタンパク質の量の変化や、発生中の組織、脳を含めた様々の疾患の組織、又は遺伝子の変異によって機能変化した組織で発現するタンパク質の量を知ることは、病態解明のための重要なヒントになる。それゆえ、細胞内のタンパク質を同定する技術だけでなく、タンパク質を定量する技術への需要もまた高まっている。
従来、標的タンパク質に対して特異的に結合する抗体の結合を間接的に検出することで標的タンパク質の存在量を相対的に決めてきた。この方法においては、標的タンパク質が既に同定されていて、かつそのタンパク質を検出できる抗体が得られている必要がある。
一方、同位体を利用して同一タンパク質に試料間で質量差を与えた後質量分析に付すことにより、存在比を分析する方法も現在用いられている。この方法は、未同定のタンパク質の同定と定量を一度の分析で達成出来る利点がある。この方法のために、ＩＣＡＴ(登録商標)試薬、ｉＴＲＡＱ(登録商標)試薬、ＩＣＰＬ(登録商標)試薬、ＮＢＳ(登録商標)試薬などの標識試薬が利用されている（例えば、特許文献１参照）。また、軽酸素原子と重酸素原子とを含む2種類の水の中で対比試料に別々に消化酵素を働かせた時に、新生するカルボン酸のＯＨとして酸素が取り込まれ、質量差が２のペプチドが出来、それを質量分析で分離して量比を決める方法、或いはＣやＮの軽原子と重原子とを含むアミノ酸中で培養した細胞の全タンパク質をこれらのアミノ酸で構成するようにしてから両者の成分の存在比を調べる方法など多くの工夫がなされている。
上述した標識試薬の内、ＩＣＡＴ試薬及びＮＢＳ試薬については、それらが結合するアミノ酸残基はそれぞれシステイン及びトリプトファンであり、これらはタンパク質中での含有量が少ないため、タンパク質によっては分析にかからない場合があることや、２種の試料間での比較に限定されていることなど、様々の欠点を抱えている。また、タンパク質のリジン残基のアミノ基を標識するｉＴＲＡＱ試薬とＩＣＰＬ試薬は、不安定な活性カルボン酸を用いてアミド結合を形成するために試薬の保存が難しい。また、これら４種類の試薬はいずれも高価であり、それもまたこれらの利用を制限する原因となっている。
【特許文献１】特開２００３−１０７０６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上述のような従来のタンパク質定量技術の問題点を鑑みなされたものであり、タンパク質の同定及びその定量情報をより簡単な処理で得ることのできるタンパク質分析方法を提供することを主眼とする点では先行技術から大きな違いはないが、本発明の目的は、機能性、利便性及び経済性に優れたタンパク質分析方法及びそれに用いるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために、標的ペプチドを質量分析計にて同定・定量することを特徴とするタンパク質分析方法に着目し鋭意検討を重ねた結果、本発明に用いる化合物であるピリリウム誘導体の安定同位体の組み合わせが、質量分析によるタンパク質の定量のための標識化合物として非常に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するタンパク質分析方法であって、式（Ｉ）：【００１０】
【化１】
2008156139.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す）
で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含む、タンパク質分析方法。
[２]式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、[１]に記載の方法。
[３]前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が２以上である、[１]に記載の方法。
[４]質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するために用いられる試薬キットであって、標識化合物として式（Ｉ）：【００１２】
【化２】
2008156139.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す）
で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを含む、キット。
[５]式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、[４]に記載のキット。
[６]前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が２以上である、[４]に記載のキット。
[７]質量分析されるタンパク質を含有する内部標準試料もまた前記標識化合物の安定同位体の一つで標識して質量分析に付すこと、及び内部標準試料由来のＭＳスペクトル強度に対するタンパク質含有試料由来のＭＳスペクトル強度の比を求めることにより、それぞれのタンパク質含有試料に含まれる同種のタンパク質の量比を決定することを含む、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のタンパク質分析方法によれば、簡単な処理でタンパク質の定量情報を得ることが可能となる。本発明はまた、かかるタンパク質分析方法に利用されるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】内部標準試料を利用したタンパク質の定量方法の流れを示す図である。
【図２】内部標準試料を利用して多種類試料中のタンパク質を定量する方法の流れを示す図である。
【図３】ヒト血清アルブミンの同位体標識物由来のペプチドのトータルイオンクロマトグラムを表す図である。横軸は保持時間（分）、縦軸は相対強度（％）を表す。
【図４】図３のクロマトグラム上の時間２３．８６分から２３．９２分の間のイオンの質量分析データを表す図である。横軸は質量（ｍ／ｚ）、縦軸は相対強度（％）を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するタンパク質分析方法に関わる。本発明は特に、上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩（以下、これらを単に本発明の化合物とも称する）の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含む、タンパク質分析方法を提供する。【００１７】
式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、好ましくは水素、ハロゲン、又は炭素数１〜６のアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等）であり、より好ましくは炭素数１〜３のアルキル（例えば、メチル又はエチル）である。また、前記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられる。【００１８】
式（Ｉ）の化合物の好ましい例としては、２，４，６−トリメチルピリリウム、２−エチル−４，６−ジメチルピリリウム及び２，６−ジエチル−４−メチルピリリウムなどが挙げられる。【００１９】
本発明の化合物は、通常、塩の形態で利用される。その場合、該塩は式（Ｉ）の化合物及び任意の陰イオン原子又は陰イオン分子からなる塩である。該陰イオン原子又は陰イオン分子としては、ヘキサフルオロリン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、テトラフルオロホウ酸等の陰イオンが挙げられ、タンパク質の標識反応を妨げない限り特にその種類は限定されないが、好ましくはテトラフルオロホウ酸の陰イオンである。【００２０】
従って、好ましい本発明の化合物の例としては、２，４，６−トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸、２−エチル−４，６−ジメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩又は２，６−ジエチル−４−メチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸などが挙げられる。【００２１】
本発明においては、質量の異なる本発明の化合物の安定同位体によりそれぞれの試料に含まれるタンパク質又はペプチドを標識することによって、同種のタンパク質又はペプチドに質量差を与える。使用される安定同位体間の質量差は、質量分析計により質量差を与えられた同種のタンパク質又はペプチドを分離することが出来る限り特に限定されないが、通常２以上であり、好ましくは３以上である。質量差の上限も、本発明の化合物が安定に存在し得る限り特に限定されない。通常は化合物間の質量差を１２Ｃと１３Ｃとの間の質量差により与えるので、質量差の上限は本発明の化合物中に含まれる炭素原子の個数に等しい。【００２２】
本発明の化合物は、例えば
1) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Coll., vol.5, p.1112(1973);vol.49, p.121(1969). 
2) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Coll., vol.5, p.1114(1973)
3) Ghiviriga I., Czerwinski E. W., Balaban A.T., Croatia Chemica Acta, vol.77(1-2), p.391-396 (2004)
等で教示されている方法に従って合成することが出来る。【００２３】
次に、上に挙げた３つの化合物、２，４，６−トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩、２−エチル−４，６−ジメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩及び２，６−ジエチル−４−メチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩を例として、標識化合物として用いられる好適な安定同位体について説明する。【００２４】
２，４，６−トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩の好適な３種の安定同位体の組み合わせの一例を式（ＩＩ）：【００２５】
【化３】
2008156139.tif 000005
【００２６】
に示す。但し、１３Ｃに置換する炭素原子の位置は任意であり、各化合物中に含まれる１３Ｃ原子の数を変更しない範囲で式（ＩＩ）に示された位置以外の炭素原子が１３Ｃに置換されていてもよい。上記３種の化合物から選択される２又は３種を組み合わせて本発明の方法に用いることが出来る。なお、以後、式（ＩＩ）中に示すように、各同位体をそれぞれＰｙ０、Ｐｙ４又はＰｙ８と呼称し、また、これらを総称してＰｙ化合物と呼ぶこととする。式（ＩＩ）中、Ｃの左肩に数字１３がある炭素原子が質量数１３の炭素原子である。すなわち、最低質量の標識化合物(化学式(Ｐｙ０))の全ての炭素は質量数１２で、中間の質量数の標識化合物(化学式(Ｐｙ４))は質量数１２の炭素原子８個のうち４個を質量数１３の炭素原子で置き換えている。第三番目の同位体化合物（化学式（Ｐｙ８））はＰｙ０の全ての炭素原子を質量数１３の炭素原子に置換してある。そのため、三種の標識化合物の質量差の関係はＰｙ０、Ｐｙ０＋４（＝Ｐｙ４）、Ｐｙ０＋８（＝Ｐｙ８）となる。また、これらのＰｙ化合物における前記安定同位体間の質量差は４である。【００２７】
同様に、２−エチル−４，６−ジメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩の好適な４種の安定同位体の組み合わせの一例を式（ＩＩＩ）：【００２８】
【化４】
2008156139.tif 000006
【００２９】
に示す。但し、１３Ｃに置換する炭素原子の位置は任意であり、各化合物中に含まれる１３Ｃ原子の数を変更しない範囲で式（ＩＩＩ）に示された位置以外の炭素原子が１３Ｃに置換されていてもよい。上記４種の化合物から選択される２、３又は４種を組み合わせて本発明の方法に用いることが出来る。なお、以後、式（ＩＩＩ）中に示すように、各同位体をそれぞれＰｙＥ０、ＰｙＥ３、ＰｙＥ６又はＰｙＥ９と呼称し、また、これらを総称してＰｙＥ化合物と呼ぶこととする。式（ＩＩＩ）中、黒丸は質量１３の炭素原子を表す。すなわち、最低質量の標識化合物(化学式(ＰｙＥ０))の全ての炭素は質量数１２で、第二番目の質量数の標識化合物(化学式(ＰｙＥ３))は質量数１２の炭素原子９個のうち３個を質量数１３の炭素原子で置き換えている。第三番目の標識化合物（化学式（ＰｙＥ６））はＰｙＥ３における１２Ｃを全て１３Ｃに置換し、かつＰｙＥ３における１３Ｃを全て１２Ｃに置換したもので、第四番目の標識化合物（化学式（ＰｙＥ９））はＰｙＥ０の全ての炭素原子を１３Ｃに置換してある。そのため、４種の標識化合物の質量差の関係はＰｙＥ０、ＰｙＥ０＋３（＝ＰｙＥ３）、ＰｙＥ０＋６（＝ＰｙＥ６）、ＰｙＥ０＋９（＝ＰｙＥ９）となる。また、ＰｙＥ化合物における前記安定同位体間の質量差は３〜９である。【００３０】
更に、同様に、２，６−ジエチル−４−メチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩の好適な４種の安定同位体の組み合わせの一例を式（ＩＶ）：【００３１】
【化５】
2008156139.tif 000007
【００３２】
に示す。但し、１３Ｃに置換する炭素原子の位置は任意であり、各化合物中に含まれる１３Ｃ原子の数を変更しない範囲で式（ＩＶ）に示された位置以外の炭素原子が１３Ｃに置換されていてもよい。上記４種の化合物から選択される２、３又は４種を組み合わせて本発明の方法に用いることが出来る。なお、以後、式（ＩＶ）中に示すように、各同位体をそれぞれＰｙｄＥ０、ＰｙｄＥ４、ＰｙｄＥ６又はＰｙｄＥ１０と呼称し、また、これらを総称してＰｙｄＥ化合物と呼ぶこととする。式（ＩＶ）中、黒丸は質量数１３の炭素原子を表している。４種の標識化合物の質量差の関係はＰｙｄＥ０、ＰｙｄＥ０＋４（＝ＰｙｄＥ４）、ＰｙｄＥ０＋６（＝ＰｙｄＥ６）、ＰｙｄＥ０＋１０（＝ＰｙｄＥ１０）となっている。また、ＰｙｄＥ化合物における前記安定同位体間の質量差は、２〜１０である。
なお、上記のＰｙ化合物、ＰｙＥ化合物及びＰｙｄＥ化合物において、質量数１３の炭素原子の位置は合成過程から論理的に帰納されたものであり、質量数は質量分析装置で確認されている。【００３３】
本発明の化合物によるタンパク質又はペプチドの標識は、例えば以下の文献：Craig D.B., Wetzl B.K., Duerkop A., and Wolfbeis O.S., Electrophoresis, vol.26, p.2208-2213(2005)等に記載された周知の方法により行うことができる。
また、本発明の化合物は例えば下記の反応： 【００３４】
【化６】
2008156139.tif 000008
【００３５】
で、タンパク質又はペプチドのリジン残基のε−アミノ基と結合する。稀にα−アミノ基と反応することもある。この反応により、本発明の化合物はタンパク質又はペプチドを標識する。【００３６】
なお、本明細書において、ペプチドという用語は、アミノ酸の個数が数個から十数個のものを指す事とする。当該分野で周知のように、標的タンパク質を同定・定量するために、通常、そのタンパク質をタンパク質分解酵素で切断することにより得られるペプチドが質量分析に付される。【００３７】
本発明の化合物を標識として利用する利点は例えば次の通りである。すなわち、前記標識反応は温和かつ迅速であること；前記標識反応により４級アミンを形成し、標的タンパク質の電荷に影響しないため、その後の電気泳動分離も可能であること；本発明の化合物は室温保存が可能であること；及び、本発明の化合物の溶液も室温で安定であること、などである。また、例えば前記Ｐｙ化合物、ＰｙＥ化合物及びＰｙｄＥ化合物でそうであったように、本発明の化合物は、３種以上の安定同位体の組み合わせで標識化合物として用いることが出来るため、最大比較対象試料数は通常３種以上であり、これは多種試料間での同種のタンパク質の量比の分析において高い効率性をもたらす。更にはまた、本発明の化合物は、タンパク質質量分析に用いられる前記試薬（ＩＣＡＴ試薬、ＮＢＳ試薬、ｉＴＲＡＱ試薬及びＩＣＰＬ試薬）と比較して、サンプルあたりの費用が安価であるという利点を有する。【００３８】
本発明の方法は、対比される２種以上のタンパク質含有試料に対して、本発明の化合物の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含む。標識された同種のタンパク質は、試料間で化学的性質に違いは無く、質量数のみ異なる。そのため、後述するように、化学的性質による分離（例えば液体クロマトグラフ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は２次元電気泳動）によって同種のペプチドを他の種類のペプチドから分離し、その後の質量分析で同種のペプチドを質量差を利用して互いに分離することが可能となる。【００３９】
前記２種以上のタンパク質含有試料としては、例えば、同種の生体組織について、健常状態のサンプル及び疾病状態のサンプルから採取した計２種類の試料の場合、或いは種々の発生段階の、ある種の細胞培養由来の試料などが挙げられる。【００４０】
本発明の方法の実施に当たっては、タンデム型の質量分析計を用いて、タンパク質の同定も定量と同時に行うことが通常想定される。本発明の方法に利用される質量分析計としては、例えば、四重極飛行時間型のタンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）又はフーリエ変換質量分析計（ＦＴ−ＭＳ）などが挙げられる。これらの装置構成としては、従来と同様なものを利用することが可能である。【００４１】
本発明の化合物を用いるタンパク質の分析は、当業者に周知の手順に従って実施され得る。以下に、本発明の方法を利用してタンパク質を定量するための一般的な手順を簡単に説明する。以下の説明では、対比するタンパク質含有試料の種類数に触れていないが、実際は標識に用いる安定同位体の種類までの試料を対比することが出来、更には、後述する内部標準法を用いることにより、実質的に試料が何種類であってもそれらを対比することが可能となる。【００４２】
本発明の方法を利用するタンパク質の定量は、通常、以下の工程：
工程１）対比するタンパク質含有試料のそれぞれを、同位体によって異なる質量数を持つ本発明の化合物で標識し、それぞれのタンパク質含有試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与える工程；
工程２）各同位体標識したタンパク質含有試料を混合する工程；
工程３）工程２の混合物中のタンパク質を任意で相互に分離した後、制限酵素によりタンパク質を特定アミノ酸部位で切断し、同位体標識したペプチド含有試料とする工程；及び
工程４）前記同位体標識したペプチドのＭＳスペクトルを測定し、同位体標識によって質量差を与えられた同種のペプチドのそれぞれについてＭＳスペクトル強度を得て、その強度比によってタンパク質の量比を求める工程；
を含む。【００４３】
以下に前記各工程について詳細に説明するが、以下の説明は本発明の実施態様を制限するものではない。なお、本発明の方法の大まかな流れを図１に示したので、より良い理解のために適宜参照されたい。図１の分析では、患部由来のタンパク質含有試料（前記Ｐｙ０化合物（質量Ｍ）で標識）、正常部由来のタンパク質含有試料（前記Ｐｙ４化合物（質量Ｍ＋４）で標識）及びそれらから作製される内部標準試料（前記Ｐｙ８化合物（質量Ｍ＋８）で標識）からなる３種類の試料中のタンパク質の定量を行っている。
工程１における標識は、例えば以下のようにして行う。すなわち、前以て分析される試料中の全タンパク質のＳＨ基を還元・アルキル化しておいてから、塩基性条件下で、適当な溶媒中（例えば、トリス塩酸緩衝液を含む尿素中）に溶解したタンパク質含有試料に本発明の化合物を添加し、瞬時に混合し反応させる。反応は室温下３０分間で終えても良く、又は標識効率を増大させるために１２時間まで延長しても良い。
工程２において、工程１で標識した各タンパク質含有試料を混合する。未反応の標識化合物はゲルろ過法又はタンパク質沈殿試薬によって除去し、標識タンパク質を集めて濃縮する。
工程３は、大別して以下の２つの方法：
（ａ）前記タンパク質混合液を１次元ゲル分離、２次元ゲル分離又は適当なクロマトメディアで大まかに分離するなどしたタンパク質をタンパク質分解酵素で加水分解し、ペプチドを遊離する；又は、
（ｂ）前以て（ａ）のように含有タンパク質を相互分離のためにゲル分離やクロマト展開することなく、前記タンパク質混合物を直接タンパク質分解酵素で分解する、
のいずれかに従う。タンパク質の分解のためには、一次選択のトリプシン以外に、ＡｒｇペプチダーゼやＧｌｕペプチダーゼなどを二次選択として用いるが、Ｌｙｓエンドペプチダーゼは用いない。【００４４】
ペプチドを遊離した後、該ペプチドを質量分析に付すまでの流れは以下の通りである。すなわち、
（ａ）の操作により分離したタンパク質から遊離した標識ペプチド及び非標識ペプチドについては、ペプチドの分離操作無しで直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより質量分析する場合もある。また、液体クロマトグラフによりペプチドを分離後、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析することも可能である。
一方（ｂ）の操作により遊離したペプチドは、２次元液体クロマトグラフシステムによって、例えば、１次元分離をＳＣＸカラムで行い、溶出した成分を第２の逆相樹脂カラムにより分離し、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳに導入することで、標識ペプチドの相対強度とそのアミノ酸配列情報を一度の分析で獲得する。
ここで、次工程のＭＳスペクトルの測定に用いるペプチドの分子量は、特に限定されないが、天然に存在する同位体元素の影響による分析精度の低下を考慮すると、該分子量は好ましくは1000〜3000であり、より好ましくは1500〜2000である。従って、工程３は、好ましくは、タンパク質の分解酵素分解産物から、上記範囲の分子量を有するペプチドを単離することを含む。【００４５】
次いで、周知の分析技術を用いて前記ペプチド由来のＭＳスペクトルを得ることが出来る。同位体標識によって、異なる試料由来の同種のペプチドは異なる質量を持つため、前記ＭＳスペクトルデータにおいては、異なる試料由来のペプチドは分離したピークとして現れる。従って、それら分離したピークの強度を対比することにより、前記ペプチドの試料間での量比、すなわち前記タンパク質の試料間での量比が求まる。
但し、前述のＭＳスペクトルデータからのピーク強度の対比においては、例えば特開２００５−１８１０１１に教示されているようにして、天然に存在する同位体元素に起因するペプチドの同位体ピークとの重なりを除去して量比の補正をする必要がある。【００４６】
更に、前記工程１〜４に引き続いて以下の工程：
工程５）工程４のＭＳスペクトルを参照して、各ペプチドからアミノ酸配列を特定すべきペプチドを選択し、該ペプチドから生成されるプロダクトイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルによって、該ペプチドのアミノ酸配列を定性する工程；及び
工程６）前記ペプチドのアミノ酸配列に基づき、既知ＤＮＡ配列より対応するタンパク質を同定する工程；
も加えることにより、前記タンパク質を同定することも可能である。タンパク質の同定は、工程５及び６に示した手順に従って、周知の方法で行うことが出来る。【００４７】
本発明の実施態様の一つにおいて、上述した本発明によるタンパク質分析方法であって、質量分析されるタンパク質を含有する内部標準試料もまた本発明の化合物の安定同位体の一つで標識して質量分析に付すこと、及び内部標準試料由来のＭＳスペクトル強度に対するタンパク質含有試料由来のＭＳスペクトル強度の比を求めることにより、それぞれのタンパク質含有試料に含まれる同種のタンパク質の量比を決定することを含む、タンパク質分析方法もまた提供される。【００４８】
本明細書において、内部標準試料という用語は、同種のタンパク質の試料間での量比を分析するに当たって、内部標準試料以外の各試料中での該タンパク質の量と内部標準試料中の該タンパク質の量とを比較することにより各試料中での含有量の相対値を求め、その相対値を試料間で対比することにより、分析される全試料間での該タンパク質の量比を決定するために利用される試料をいう。【００４９】
上記目的のために、内部標準試料は、分析される試料中に存在するあらゆるタンパク質を含むことが好ましい。そのため、例えば以下のようにして内部標準試料は作製される。すなわち、分析される全てのタンパク質含有試料から総タンパク質含有量が等しい出発試料をそれぞれ作製した後、該出発試料を等量混合する。【００５０】
内部標準試料を用いるタンパク質分析は、内部標準試料もまた本発明の化合物の安定同位体の一つで標識して、分析される他のタンパク質含有試料と共に上述した本発明によるタンパク質分析方法を適用することによってなされる。【００５１】
内部標準試料を使用することにより、本発明の方法に用いる標識化合物の安定同位体の種類数より多くの種類の試料を定量することが可能となる。また、内部標準試料を利用することにより、複数試料間でのタンパク質の含有量の比較が高い精度で可能となる。【００５２】
図２に多種類試料間での同種のタンパク質の量比を分析する手順の一例を示す。図２の分析は、説明の便宜上、その試料数は６であり、かつ標識に用いる安定同位体の組み合わせは４種である場合を想定している。
まず、６種類の試料から前述のようにして内部標準試料（図２ではＩＳと表記）を作製する。また、６種類の試料をそれぞれ３種類の試料からなるグループ１（試料Ａ、Ｂ、Ｃを含む）及びグループ２（試料Ｄ、Ｅ、Ｆを含む）に分別する。前述した手順に従って、標的タンパク質由来のペプチドのＭＳスペクトルの測定をグループ毎に行う。その結果得られるのが、図２の下部にあるようなＭＳスペクトルである。前述の通り、標識ペプチドのＭＳスペクトルはペプチド中の天然同位体存在比を反映して質量１ずつ異なる複雑なものであり、その補正をする必要がある。前記補正後の最大強度のスペクトル（例えば図２のＡ１、Ｂ１及びＣ１について前記補正をしたもの）は天然同位体の存在の影響が無く、ペプチドの存在量を反映している。また、内部標準試料由来の標識ペプチドのＭＳスペクトル強度を各グループの分析での共通の比較の基準とするために、混合試料作製にあたって内部標準試料から分析毎に等量加える。内部標準試料由来のペプチドのＭＳスペクトル強度は理論的には両グループの測定で等しいので、前記補正したＩＳ１の強度で前記補正したＡ、Ｂ及びＣの強度を規格化し、また同様に前記補正したＩＳ２の強度で前記補正したＤ、Ｅ及びＦの強度を規格化したものは、共通の基準で規格化したものとなり相互に比較することが出来る。この比較から６種類の試料間での標的タンパク質の量比が求まる。【００５３】
本発明の化合物は、３種以上の安定同位体の組み合わせで標識化合物として用いることが出来るため、２種の安定同位体のみの標識化合物と比較して、内部標準試料を利用する多種試料間での同種のタンパク質の量比の分析において、顕著に向上した能率を示すことは明らかである。それゆえ、本発明の方法は、例えば以下の用途：
（１）多数患者の臨床試料における病気のマーカータンパク質の発見と変動の解析（臨床検査）；
（２）ヒトや動物の様々の組織で発現しているタンパク質の存在比の網羅的比較解析（生化学）；
（３）培養細胞や動物に薬剤を投与した後での細胞内での発現タンパク質の存在量の時系列変化の解析；及び
（４）発生段階における発現タンパク質の詳細な時系列変動の解析（発生工学）、
など、他種試料の網羅的プロテオミクス解析の必要な場合において、非常に有用である。【００５４】
別の局面において、本発明はまた、上述したタンパク質分析方法に用いられる試薬キットであって、標識化合物として式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを含む、キットを提供する。式（Ｉ）で表される化合物又はその塩に関する定義、安定同位体や組み合わせの態様は上述の通りである。【００５５】
前記キットに含まれる式（Ｉ）の化合物の例としては：
（ａ）前記Ｐｙ０化合物、Ｐｙ４化合物及びＰｙ８化合物から選択される２又は３種の組み合わせ；
（ｂ）前記ＰｙＥ０化合物、ＰｙＥ３化合物、ＰｙＥ６化合物及びＰｙＥ９化合物から選択される２、３又は４種の組み合わせ；及び
（ｃ）前記ＰｙｄＥ０化合物、ＰｙｄＥ４化合物、ＰｙｄＥ６化合物及びＰｙｄＥ１０化合物から選択される２、３又は４種の組み合わせ
が挙げられる。【００５６】
本発明の一つの実施態様において、前記キットに含まれる式（Ｉ）の化合物は、２，４，６−トリメチルピリリウムである。【００５７】
本発明の別の実施態様において、前記キットにおける前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差は２以上である。【００５８】
前記キットは、前記安定同位体の組み合わせ以外に、１種以上のタンパク質分解酵素、反応緩衝液、洗浄溶液、又は本発明の化合物との組み合わせ使用に必要若しくは好適なその他の成分を含んでいても良い。前記キットはまた、任意でその使用説明書を含む。また、本発明のキットは、未反応成分除去試薬(洗浄試薬)、制限酵素、ペプチド精製用カラム、精製用溶媒などを更に含んでいてもよい。【００５９】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【００６０】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１：同位体標識ＨＡＳのＬＣ／ＭＳ分析
ヒトの血清蛋白の一種であるＨＳＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を前以て前記同位体標識化合物Ｐｙ０、Ｐｙ４及びＰｙ８（Ｐｙ化合物）で標識した。Ｐｙ化合物は、
1) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Coll., vol.5, p.1112(1973);vol.49, p.121(1969). 
2) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Coll., vol.5, p.1114(1973)
3) Ghiviriga I., Czerwinski E. W., Balaban A.T., Croatia Chemica Acta, vol.77(1-2), p.391-396 (2004)
に記載された合成法に従い合成した。即ち、無水酢酸13mmolとt−ブタノール1mmolの混合溶液にテトラフルオロホウ酸0.95mmolを滴下し、発熱が90℃を超えないようにして反応させた。反応液を室温冷却後に析出した粗結晶を得、これをメタノールで再結晶して精製した。更に得られた結晶をODSカラムに付し、水−アセトニトリルグラジエント溶出にて精製した。同位体標識Ｐｙ４は、炭素原子が全て１３Ｃで置換したｔ−ブタノール１３Ｃ４  ［１３Ｃ３アセトン及び１３Ｃ１ヨウ化メチル（米国ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ：ＣＩＬより購入）からグリニア反応により合成した］と１２Ｃの無水酢酸から前記と同様の方法で合成し精製した。またＰｙ８は１３Ｃ４無水酢酸及び１３Ｃ４  ｔ−ブタノ−ルから合成し精製した。29.2μｇ  ＨＳＡを６M尿素含有ホウ酸緩衝液（ｐH8.5）５０μLに溶解し、5mM DTT、10mMモノヨードアセトアミドで還元メチル化（総量６０μL）してから、３分割（Ａ，Ｂ，Ｃ各２０μＬ）し、ＡにＰｙ０、ＢにＰｙ４、ＣにＰｙ８を１mMで加え５５℃で３０分間反応させて標識した。標識後に２D-CleanUp試薬（GEヘルスケアバイオサイエンス）により未反応試薬を取り除いた。３種の同位体標識ＨＡＳを１：２：０．５（＝Ｐｙ０標識物：Ｐｙ４標識物：Ｐｙ８標識物）で混合してから、トリプシン消化した。遊離したペプチド（標識、非標識ペプチドを含有）をＬＣ／ＭＳで分析した。
図３は同位体標識ＨＡＳ由来のペプチドのトータルイオンクロマトグラムを表す図である。横軸は液体クロマト（ＬＣ）の溶出時間（分）、縦軸は相対強度（％）を表している。ピークは分離されたペプチドに対応するが、質量数のみ異なる同一のペプチドは同一のピークに含まれることに注意されたい。
図４はクロマトグラム上の時間２３．８６分から２３．９２分までの間のイオンの質量分析（ＭＳ）データを表す図である。これは同位体標識試薬Ｐｙ０、Ｐｙ４及びＰｙ８で標識された同一ペプチドが溶出した時間における質量スペクトルに対応している。Ｐｙ０で標識されたペプチドが最も小さな質量を持っている。それから質量が４大きい位置にＰｙ４で標識されたペプチドのピークが現れた。更に、それより質量が４大きい位置にＰｙ８で標識されたペプチドのピークが現れた。これらのピーク強度の比は、３種の同位体標識ＨＡＳを混合した割合の１：２：０．５（＝Ｐｙ０標識物：Ｐｙ４標識物：Ｐｙ８標識物）であった。この結論に至る分析結果の解析は以下のように行った。ＨＡＳのトリプシン分解物をＬＣ／ＭＳ分析し、Ｐｙ標識された３種のピークがセットで備わったペプチドを１９種類選び、その質量分布をコンピューターソフトで解析しピーク高さの比を計算した。結果は全ての標識ペプチドの平均値で１：2.2（±0.34）：0.55（±0.27）であった。ペプチド分子量とこの比の分布をプロットすると分子量が1500〜2000の間では正確な比率（1：2：0.5）が得られ、この範囲が好適な分析対象実用域となることが判明した。分子量が2000を超えるとスペクトルが天然同位体元素の影響を受けて複雑化し、主ピークの質量数が４離れても、サブピークの混入がかなり認められ、主ピークの実質のピーク高の判定が難しくなることがわかった。一般的には使用した分析装置ではイオンの価数ｚは３が多かったが、２、４、５価も認められた。
質量数４違いの間にあるサブピークは、天然に存在する同位体元素の影響で現れる。なお、ＬＣ／ＭＳ分析で用いたイオン化法のＥＳＩ法（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）では、イオンの価数は２以上となるが、このペプチドイオンは２価となり、実際のペプチドの質量は測定値の２倍になる。実測値が７００．８９１７と７０２．８９６６の差を２倍すると４になる。７０４．９０５４と７０２．８９６６の差を２倍すると４になる。
前記質量分析の結果は、本発明の化合物が、２種以上の試料のそれぞれに含まれる同種のタンパク質の量比を分析するために有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のタンパク質分析方法によれば、簡単な処理でタンパク質の定量情報を得ることが可能となる。本発明はまた、かかるタンパク質分析方法に利用されるキットを提供する。
本発明は日本で出願された特願２００７−１６４２４９（出願日：２００７年６月２１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図３】
2008156139.tif 000012
【図４】
2008156139.tif 000013
【図１】
2008156139.tif 000014
【図２】
2008156139.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月31日(2009.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するタンパク質分析方法であって、式（Ｉ）：
【化１】
2008156139.tif 000016
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す）
で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含む、タンパク質分析方法。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が２以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
質量分析計を用いて２種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するために用いられる試薬キットであって、標識化合物として式（Ｉ）：
【化２】
2008156139.tif 000017
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す）
で表される化合物又はその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを含む、キット。
【請求項５】
式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が２以上である、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が４以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）で表される化合物の塩が、２，４，６−トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩であり、且つ、前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が４又は８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が４以上である、請求項４に記載のキット。
【請求項１１】
式（Ｉ）で表される化合物の塩が、２，４，６−トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩であり、且つ、前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が４又は８である、請求項４に記載のキット。
【請求項１２】
質量分析されるタンパク質を含有する内部標準試料もまた前記標識化合物の安定同位体の一つで標識して質量分析に付すこと、及び内部標準試料由来のＭＳスペクトル強度に対するタンパク質含有試料由来のＭＳスペクトル強度の比を求めることにより、それぞれのタンパク質含有試料に含まれる同種のタンパク質の量比を決定することを含み、ここで前記内部標準試料は、分析される試料中に存在するあらゆるタンパク質を含む試料である、請求項１−３及び８−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記内部標準試料が、分析される全てのタンパク質含有試料から総タンパク質含有量が等しい出発試料をそれぞれ作製した後、該出発試料を等量混合することによって作製されたものである、請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
2008156139.tif 000018
2008156139.tif 000019
2008156139.tif 000020
2008156139.tif 000021
2008156139.tif 000022
2008156139.tif 000023