(57)【要約】  本発明は、酵素電極と試料中の基質とを反応させたときの酵素電極からの測定用出力に基づいて基質の濃度を測定する方法に関する。本発明は、酵素電極と基質とを反応させる前または後に、基質濃度が既知の標準液と酵素電極とを反応させたときに得られる酵素電極からの補正用出力を用いて、基質濃度を演算するものである。補正用出力は、たとえば試料ごとに個別に測定する。本方法では、測定対象となる試料のための補正用出力と、当該補正用出力よりも先に測定した他の１以上の試料に対応した補正用出力と、を用いて、基質濃度の演算を行なうようにしてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素電極と試料中の基質とを反応させたときの上記酵素電極からの測定用出力に基づいて基質の濃度を測定する方法であって、
上記酵素電極と上記基質とを反応させる前または後に基質濃度が既知の標準液と上記酵素電極とを反応させたときに得られる上記酵素電極からの補正用出力を用いて、基質濃度を演算する、基質濃度測定方法。
【請求項２】
上記補正用出力は、試料ごとに個別に測定する、請求項１に記載の基質濃度測定方法。
【請求項３】
測定対象となる試料のための補正用出力と、当該補正用出力よりも先に測定した他の１以上の試料に対応した補正用出力と、を用いて、基質濃度の演算を行なう、請求項１に記載の基質濃度測定方法。
【請求項４】
測定対象となる試料の補正用出力と、当該補正用出力よりも先に測定した他の１以上の試料に対応した補正用出力と、の平均値を用いて、基質濃度の演算を行なう、請求項３に記載の基質濃度測定方法。
【請求項５】
上記測定用出力と、上記酵素電極の洗浄が終了したときの測定されるベース出力と、の差分に基づいて、基質濃度の演算を行なう、請求項１に記載の基質濃度測定方法。
【請求項６】
複数のベース出力の間に一定値以上の変化が認められるときに、上記複数のベース出力の経時変化に対応させた推定曲線に基づいて、上記測定用出力と差分するためのベース出力の推定を行なう、請求項５に記載の基質濃度測定方法。
【請求項７】
酵素電極と試料中の基質とを反応させたときの上記酵素電極からの測定用出力に基づいて基質の濃度を演算する演算手段を備えた基質濃度測定装置であって、
上記演算手段は、上記酵素電極と上記基質とを反応させる前または後に基質濃度が既知の標準液と上記酵素電極とを反応させたときに得られる上記酵素電極からの補正用出力を用いて、基質濃度を演算するように構成されている、基質濃度測定装置。
【請求項８】
上記演算手段は、試料ごとに個別に測定された上記補正用出力を用いて、上記基質濃度を演算するように構成されている、請求項７に記載の基質濃度測定装置。
【請求項９】
上記演算手段は、測定対象となる試料のための補正用出力と、当該補正用出力よりも先に測定した他の１以上の試料に対応した補正用出力と、を用いて、基質濃度の演算を行なうように構成されている、請求項７に記載の基質濃度測定装置。
【請求項１０】
上記演算手段は、測定対象となる試料の補正用出力と、当該補正用出力よりも先に測定した他の１以上の試料に対応した補正用出力と、の平均値を用いて、基質濃度の演算を行なうように構成されている、請求項９に記載の基質濃度測定装置。
【請求項１１】
上記演算手段は、上記測定用出力と、上記酵素電極を洗浄しているときに測定されるベース出力と、の差分に基づいて、基質濃度の演算を行なうように構成されている、請求項７に記載の基質濃度測定装置。
【請求項１２】
上記演算手段は、複数のベース出力の間に一定値以上の変化が認められるときに、上記複数のベース出力の経時変化に対応させた推定曲線に基づいて、上記測定用出力と差分するためのベース出力の推定を行なった上で、基質濃度の演算を行なうように構成されている、請求項１１に記載の基質濃度測定装置。
【請求項１３】
上記酵素電極と反応させる試料を調製するための試料調製手段と、
上記補正用出力を得るための標準液を保持した標準液保持槽と、
上記酵素電極に対して、試料が供給される状態と、標準液が供給される状態とを選択するための選択手段と、
をさらに備えている、請求項７に記載の基質濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のグルコースなどの基質の濃度を測定するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースなどの基質の濃度を測定する方法としては、電極法と呼ばれる方法がある。この方法は、試料中の基質濃度に相関した情報を、試料に接触させた電極に出力させ、この出力に基づいて基質濃度を演算するものである。電極としては、酵素電極が一般的に使用されている。酵素電極としては、たとえば電極の表面に、酵素固定化膜および基質選択透過膜を積層したものが知られている。【０００３】
酵素電極の感度は一定ではなく、使用時の環境や繰り返しの使用により感度が低下する傾向にある。このような感度の変化の原因としては、温度変化や酵素の失括などによる酵素の活性の変化、基質選択透過膜における基質透過性の劣化、電極表面の酸化などが挙げられる。このように、酵素電極は使用により劣化するため、一定期間を経過すると取り替える必要がある。一方、酵素電極を取り替えるまでの感度変化についてはキャリブレーションにより対応する必要がある。【０００４】
キャリブレーションは、たとえば自動測定装置においては、装置の立ち上げ時に行なわれ、装置の連続稼動時間が長い場合などには、一定時間ごとあるいは一定の測定数ごとに行なわれる。一方、酵素電極の感度は種々の要因により変化するのは上述の通りであり、キャリブレーション間においても酵素電極の感度は変化しうるばかりか、どのような要因で酵素電極の感度が変化するかを予測あるいは把握するのは困難である。そのため、キャリブレーションを行なった直後における測定値の信頼性は高いものの、キャリブレーション間における測定値の信頼性は必ずしも高くない。【０００５】
たとえば、フローセルに配置した酵素電極を用いて基質濃度を測定する場合には、酵素電極の感度が一定であるときには図７Ａに示したように酵素電極から出力されるベース電流Ｒｂは略一定となり、試料の導入時に酵素電極からの出力が大きくなる。これに対して、酵素電極の感度が低下するような状況下では、図７Ｂに示したようにベース出力は低下する。【０００６】
その一方、基質濃度の演算は、酵素電極に試料を供給する前（Ｔ１）の酵素電極からの出力をベース出力Ｒｂとしてサンプリングするとともに、酵素電極に試料を供給してから一定時間経過後（Ｔ２）の酵素電極からの出力を測定用出力Ｒｅとしてサンプリングした上で、測定用出力Ｒｅとベース出力Ｒｂとの差分に基づいて演算される。すなわち、ベース出力（酵素電極の感度）が一定であるとの前提のもとに、測定用出力Ｒｅをサンプリングしたときのベース出力を、測定用出力Ｒｅをサンプリングする前のベース出力Ｒｂとして採用している。【０００７】
そのため、図７Ｂに示したように、測定用出力Ｒｅをサンプリングしたときのベース出力Ｒｂ２が、その前に測定されるベース出力Ｒｂ１とは異なる場合には、基質濃度の演算値が真値とは異なったものとなる。【０００８】
また、経時劣化により酵素電極を取り替えた場合には、酵素電極の感度は、酵素電極を取り替えた直後から急激に低下し、その後に一定値に安定化する。そのため、酵素電極の取替え時には、酵素電極の感度が安定化するまではキャリブレーショを行なう意味がない。したがって、酵素電極の取替え時には、酵素電極の感度が安定し、かつキャリブレーショが終了するまでは測定を行なうことができない。【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−０８２０２０号公報
【特許文献２】特許第３７２３８２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、酵素電極を用いて試料中に含まれるグルコースなどの基質の濃度を測定する際の測定精度および信頼性を向上させることを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の側面においては、酵素電極と試料中の基質とを反応させたときの上記酵素電極からの測定用出力に基づいて基質の濃度を測定する方法であって、上記酵素電極と上記基質とを反応させる前または後に基質濃度が既知の標準液と上記酵素電極とを反応させたときに得られる上記酵素電極からの補正用出力を用いて、基質濃度を演算する、基質濃度測定方法が提供される。【００１２】
補正用出力は、試料ごとに個別に測定してもよいし、一定数の試料について一括して測定してもよい。【００１３】
基質濃度の演算は、たとえば測定対象となる試料のための現行の補正用出力と、当該補正用出力よりも先に測定した他の１以上の試料に対応した先行の補正用出力と、を用いて行われる。この場合、基質濃度の演算は、先行の補正用出力と現行の補正用出力との平均値を用いて行うようにしてもよい。【００１４】
基質濃度の演算は、測定用出力と、酵素電極を洗浄しているときに測定されるベース出力と、の差分に基づいて行なってもよい。その場合、複数のベース出力の間に一定値以上の変化が認められるときに、上記複数のベース出力の経時変化に対応させた推定曲線に基づいて、上記測定用出力と差分するためのベース出力の推定を行なうのが好ましい。【００１５】
酵素電極は、たとえばフローセル内に配置されたものである。試料は、たとえば全血であり、基質は、たとえばグルコースである。【００１６】
本発明の第２の側面においては、酵素電極と試料中の基質とを反応させたときの上記酵素電極からの測定用出力に基づいて基質の濃度を演算する演算手段を備えた基質濃度測定装置であって、上記演算手段は、上記酵素電極と上記基質とを反応させる前または後に基質濃度が既知の標準液と上記酵素電極とを反応させたときに得られる上記酵素電極からの補正用出力を用いて、基質濃度を演算するように構成されている、基質濃度測定装置が提供される。【００１７】
演算手段は、たとえば試料ごとに個別に測定された補正用出力を用いて、あるいは一定数の試料に対して一括して測定された補正用出力を用いて、上記基質濃度を演算するように構成される。【００１８】
演算手段は、たとえば測定対象となる試料のための現行の補正用出力と、当該補正用出力よりも先に測定した他の１以上の試料に対応した先行の補正用出力と、を用いて行うように構成される。この場合、演算手段は、たとえば現行の補正用出力と先行の補正用出力との平均値を用いて、基質濃度の演算を行なうように構成してもよい。【００１９】
演算手段はまた、測定用出力と、酵素電極を洗浄しているときに測定されるベース出力と、の差分に基づいて、基質濃度の演算を行なうように構成することもできる。この場合、演算手段は、複数のベース出力の間に一定値以上の変化が認められるときに、複数のベース出力の経時変化に対応させた推定曲線に基づいて、測定用出力と差分するためのベース出力の推定を行なった上で、基質濃度の演算を行なうように構成するのが好ましい。【００２０】
酵素電極は、たとえばフローセル内に配置されたものであり、基質としてのグルコースと選択的に反応するものが採用される。【００２１】
本発明の基質濃度測定装置は、上記酵素電極と反応させる試料を調製するための試料調製手段と、補正用出力を得るための標準液を保持した標準液保持槽と、上記酵素電極に対して、試料が供給される状態と、標準液が供給される状態とを選択するための選択手段と、をさらに備えているのが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係る基質濃度測定装置の概略構成を示す模式図である。
【図２】図１に示した基質濃度測定装置における酵素電極の概略構成を示す断面図である。
【図３】図１に示した基質濃度測定装置のブロック図である。
【図４】演算部での動作を説明するための酵素電極からの出力のタイムチャートである。
【図５】演算部での動作の他の例を説明するための酵素電極からの出力のタイムチャートである。
【図６】演算部での動作のさらに他の例を説明するための酵素電極からの出力のタイムチャートである。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、従来の基質濃度を演算する方法を説明するための酵素電極からの出力のタイムチャートである。
【符号の説明】
【００２３】
１  濃度測定装置
２  試料調製機構（試料調製手段）
２１′  標準液タンク（標準液保持槽）
２９  バルブ（選択手段）
３３  フローセル
３０  酵素電極
５  演算部（演算手段）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下においては、本発明について、図面を参照しつつ説明する。【００２５】
図１に示した基質濃度測定装置１は、試料調製機構２において調整された試料を、測定機構３において測定するように構成されたものである。【００２６】
試料調製機構２は、検体から試料を調製するためのものであり、ノズル２０、試薬ボトル２１および調製槽２２を備えている。【００２７】
ノズル２０は、調製槽２２に対して検体を供給するためのものである。検体としては、たとえば血液、尿、あるいは唾液などの生化学的試料およびその希釈液が用いられる。試料として血液を使用する場合には、全血および血漿あるいは血清のいずれをも使用することができる。【００２８】
試薬ボトル２１は、検体を希釈し、あるいは調製槽２２を洗浄するための試薬を保持したものである。この試薬ボトル２１は、配管２３を介して調製槽２２に接続されている。配管２３の途中には、ポンプ２４が設けられており、ポンプ２４の動力により、試薬ボトル２１の試薬が調製槽２２に供給されるように構成されている。【００２９】
試薬としては、たとえば緩衝液が用いられる。緩衝液としては、基質の反応ｐＨを目的とする範囲に調整できるものであればよく、たとえばリン酸塩類を使用することができる。試薬における緩衝剤の濃度は、たとえば０．０００１〜０．１０００Ｍとされる。試薬としては、緩衝液の他、公知の溶血剤、アジド化合物などの防腐剤、あるいは塩化ナトリウムや塩化カリウムなどをさらに含有するものを使用することができる。【００３０】
調製槽２２は、試料を調製する場を提供するためのものである。調製槽２２には、ノズル２０により検体が供給され、試薬ボトル２１から試薬が供給されるように構成されている。この調製槽２２は、攪拌子２５を収容しており、スターラ２６によって攪拌子２５を回転させることにより、検体と試薬とを混合することができる。調製槽２２はさらに、調製槽２２の調製液を廃棄するためのドレイン用配管２７に接続されているとともに、配管２８を介して測定機構３の酵素電極３０に接続されている。配管２８の途中にはバルブ２９が設けられている。バルブ２９にはさらに、標準液タンク２１′が接続されている。すなわち、バルブ２９は、測定機構３の酵素電極３０に対して、調製槽２２において調製された試料、試薬ボトル２０の試薬あるいは標準液タンク２１′の標準液が供給される状態と供給されない状態とを選択できるように構成されている。標準液としては、基質濃度が既知の試薬、たとえば従来よりキャリブレーション用に使用されている標準液の希釈液（５０倍〜２００倍に希釈）を使用することができる。【００３１】
測定機構３は、酵素電極３０、電源３１および電流値測定部３２を有している。【００３２】
酵素電極３０は、試料における基質との電子授受量に応じた電気的物理量を出力するものである。この酵素電極３０は、フローセル３３に配置されており、図２に示したように、たとえば第１選択透過膜３４、酵素固定化膜３５、第２選択透過膜３６および電極３７を有している。【００３３】
第１選択透過膜３４は、酵素固定化膜３５に対して試料中の基質を選択的に供与するためのものである。第１選択透過膜３４は、基質の種類に応じて選択されるが、公知の種々のものを使用することができる。【００３４】
酵素固定化膜３５は、基質を酸化あるいは還元して過酸化水素などを生成させるためのものであり、酸化還元酵素を含んだものとして構成される。本発明で用いる酸化酵素は、基質の種類に応じて選択される。ここで、基質濃度測定装置１での測定対象となる基質としては、グルコースあるいはラクテートを挙げることができ、その場合には、酵素としては、グルコースオキシダーゼあるいはラクテートオキシダーゼを挙げることができる。【００３５】
第２選択透過膜３６は、電極３７に対して、酵素によって基質から生成された過酸化水素などの反応物を選択的に供与するためのものである。第２選択透過膜３６としては、たとえばアセチルセルロース系あるいはポリアリルアミン系のものを使用することができる。【００３６】
電極３７は、供与された基質からの生成物の量、すなわち基質の濃度に応じた電気的信号を出力するものである。このような電極３７としては、たとえば陽極３８として白金、陰極３９として銀を採用したものを使用することができる。【００３７】
図１に示した電源３１は、酵素電極３０（電極３７）に対して電圧を印加するためのものである。電源３１としては、たとえば直流電源が使用され、酵素電極３０（電極３７）に対する印加電圧は、たとえば０．１〜１．０Ｖに設定される。【００３８】
電流値測定部３２は、電極３７の陽極３８と陰極３９との間に電圧を印加したときの電流値を測定するためのものである。電流値測定部３２における電流値の測定は、断続的に行なわれ、その測定間隔は、たとえば５０〜２００ｍｓｅｃとされる。【００３９】
図４に示したように、基質濃度測定装置１は、制御部４および演算部５をさらに備えている。【００４０】
制御部４は、各部の動作を制御するためのものである。より具体的には、制御部４は、ノズル２０、ポンプ２４、スターラ２６およびバルブ２９などの動作を制御する。この制御部４はさらに、測定機構３の動作をも制御する。より具体的には、制御部４は、電源３１を制御して電極３７に電圧が印加される状態と印加されない状態とを選択し、電流値測定部３２を制御して、電流値を測定するタイミングを制御する。電流値測定部３１は、たとえば５０〜２００μｓｅｃの間隔で繰り返し電流値を測定するように制御部４によって測定動作が制御される。【００４１】
一方、演算部５は、電流値測定部３２における測定結果に基づいて、検体中のグルコースなどの基質濃度を演算するためのものである。この演算部５は、演算に必要なプログラムを記憶したものであり、その動作は制御部４によって制御される。【００４２】
次に、基質濃度測定装置１の動作について説明する。【００４３】
基質濃度測定装置１では、フローセル３３に対して、試薬、調製液、試薬、標準液が繰り返し供給される。すなわち、基質濃度測定装置１では、試薬による洗浄、調製液による基質の測定、試薬による洗浄、標準液による酵素電極３０の感度のモニタが繰り返し行なわれる。【００４４】
試薬による洗浄は、試薬ボトル２１の試薬を、調製槽２２を介してフローセル３３に供給することにより行なわれる。【００４５】
基質の測定は、調製槽２２に対して、全血などの検体および試薬を供給・混合して調製された試料をフローセル３３に供給し、酵素電極３０からの出力を検出することにより行なわれる。調製槽２２に対する検体の供給は、ノズル２０を用いて行なわれ、その供給量は、たとえば全血を用いる場合には４〜２０μＬに設定される。一方、調製槽２２に対する試薬の供給は、ポンプ２４を利用して行なわれ、その供給量は、たとえば全血量の１００倍程度とされる。検体と試薬との混合は、スターラ２６によって攪拌子２５を回転させることにより行なわれる。【００４６】
酵素電極３０では、基質が第１選択透過膜３４を透過して酵素固定化膜３５に供与される。酵素固定化膜３５においては、酵素により基質が酸化あるいは還元され、過酸化水素などの反応物が生成される。この生成物は、第２選択透過膜３６を透過して電極３７に供与される。電極３７では、電源３１によって印加された電圧で生成物と陽極３８あるいは陰極３９との間で電子授受が行われる。このとき、陽極３８あるいは陰極３９との電子授受によって陽極３８と陰極３９の間に電流が流れ、そのときの電流（測定用出力）が電流値測定部３２において測定される。【００４７】
標準液による酵素電極３０の感度のモニタは、電源３１により電極３７に電圧を印加した状態で、標準液タンク２１′の標準液をフローセル３３に供給するとともに、そのときの電流（補正用出力）を電流値測定部３２において測定することにより行なわれる。【００４８】
このような洗浄、基質の検出、洗浄および感度モニタのサイクルを繰り返し行なう場合、酵素電極３０からの出力は、図４に示したようになる。ここで、図４では、２サイクル分を示してある。【００４９】
一方、演算部５では、フローセル３３に試料を供給したときの酵素電極３０での測定用出力に加えて、フローセルに標準液を供給したときの酵素電極３０での補正用出力を用いて、基質濃度が演算される。【００５０】
より具体的には、演算部５は、同一サイクルにおいて、洗浄開始から一定時間経過後（Ｔ１）における電流値（ベース出力Ｒｂ）、フローセル３３への試料の供給開始から一定時間後（Ｔ２）における電流値（測定用出力Ｒｓ）、および標準液供給から一定時間経過後（Ｔ３）における電流値（補正用出力Ｒｍ）をそれぞれサンプリングする。演算部５はさらに、補正用出力Ｒｍからベース出力Ｒｂを差分してモニタ反応値ΔＲｍを演算する。このモニタ反応値ΔＲｍは、酵素電極３０の感度を反映したものとなる。その一方で、演算部５は、測定用出力Ｒｓからベース出力Ｒｂを差分して基質反応値ΔＲｓを演算するとともに、モニタ反応値ΔＲｍを用いて、基質濃度を演算する。この場合の基質濃度の演算は、たとえば基質反応値ΔＲｓに対して、モニタ反応値ΔＲｍに応じた係数を掛けて補正反応値を演算し、この補正反応値を所定の検量線やテーブルに当てはめることにより行なわれる。基質濃度の演算は、基質反応値ΔＲｓに基づいて基質濃度を一次的に演算するとともに、この一次的な演算結果を補正反応値に応じて補正することにより行なってもよい。【００５１】
基質濃度測定装置１では、個々の基質を測定するために、標準液を用いて酵素電極３０の感度がモニタ（補正用出力Ｒｍが測定）されており、そのモニタ結果が基質の濃度演算に反映されている。そのため、基質濃度測定装置１では、従来のキャリブレーションのように、たとえば装置の立ち上げ時、一定時間ごとあるいは一定の測定数ごとに行なわれる場合とは異なり、酵素電極３０の感度がいかような原因で変化しても、酵素電極３０の感度に応じて、適切に基質濃度を演算することができる。その結果、基質濃度測定装置１では、測定精度および測定信頼性を向上させることができる。【００５２】
なお、上述の基質濃度測定装置１では、１つの基質を測定するために１回の感度モニタを行っているが、ベース出力Ｒｂが安定化している状況下では、複数の基質に対して１回の感度モニタで対応してもよい。【００５３】
次に、演算部５における基質濃度の演算方法の他の例を、図５を参照しつつ説明する。【００５４】
演算部５は、測定対象となる基質のために測定した補正用出力Ｒｍ１に加えて、先に測定した基質の補正用出力Ｒｍ２〜Ｒｍ５を用いて、基質濃度を演算するように構成してもよい。より具体的には、演算部５は、測定対象となる基質のための補正用出力Ｒｍ１と先に測定した基質の補正用出力Ｒｍ２〜Ｒｍ５の平均値に基づいて、基質濃度演算するように構成してもよい。【００５５】
この構成では、補正用出力を測定するときのバラツキの影響を、過去に測定した補正用出力と平均化することにより抑制し、測定再現性を高めることができる。【００５６】
なお、過去に測定した補正用出力との平均化は、図５に示したように現行の補正用出力を含めて５つに限らず、２以上であればよい。【００５７】
次に、演算部５における基質濃度の演算方法のさらに他の例を、図６を参照しつつ説明する。【００５８】
演算部５は、測定対象となる基質のために測定したベース出力Ｒｂ１を、先に測定した基質のベース出力Ｒｂ２，Ｒｂ３と比較して、その比較結果に基づいて、基質濃度を演算するように構成してもよい。より具体的には、演算部５は、過去のベース出力Ｒｂ２，Ｒｂ３に比べて、現行のベース出力Ｒｂ１が一定以上小さい場合に、ベース出力Ｒｂの変動が大きい、すなわち酵素電極３０の感度変化が大きいと判断し、測定用出力Ｒｓおよび補正用出力Ｒｍをサンプリングしたときのベース出力Ｒｂ′，Ｒｂ″を、ベース出力Ｒｂ１〜Ｒｂ３の経時変化に対応させた推定する。演算部５はさらに、測定用出力Ｒｓ、補正用出力Ｒｍおよび推定されたベース出力Ｒｂ′，Ｒｂ″に基づいて、基質濃度の演算を行なう。【００５９】
この構成では、酵素電極３０を取り替えた直後に代表されるように、酵素電極３０の感度の低下が比較的大きい場合であっても、精度良く基質濃度を測定できる。また、酵素電極３０を取り替え時には、従来のキャリブレーションとは異なり、酵素電極３０の感度が安定化するまで待つまでもなく、基質濃度の測定を行なうことができるようになる。【００６０】
本発明は、上述の実施の形態には限定されず、種々に変更可能である。たとえば、酵素電極を調製槽に固定した構成とし、バッチ式で基質濃度を測定するようにしてもよく、調製槽を省略し、試薬ボトル２１の試薬を酵素電極３０に連続的に供給するとともに、配管途中にインジェクションバルブ設けて、そのインジェクションバルブから検体や試料を注入するような構成してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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