(57)【要約】  生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板を提供することを目的とする。  本発明の電気化学測定用電極板１０は、同一面積である上層開口部３１Ｗと下層開口部３３ｗによって開口された酸化電極３２Ｗと還元電極３２ｗを基板本体３２Ｓの両面に備え、さらに酸化電極３２Ｗの上面から還元電極３２ｗの下面まで貫通する複数の貫通孔３２Ｈとを備え、酸化電極３２Ｗに還元体の酸化反応を進行させることができる電位と還元電極３２ｗに酸化体の還元反応を進行させることができる電位を印加することにより、酸化電極３２Ｗと還元電極３２ｗと間でレドックスサイクル効果を発現する電極対を形成する。
2009013876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下である
電気化学測定用電極板。
【請求項２】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項３】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項４】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項５】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置であって、
前記電気化学測定用電極板は、
基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下である、
電気化学測定装置。
【請求項６】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項７】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項８】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項９】
前記補助電極の表面積が前記酸化電極の集合体の１０倍以上である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１０】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタが設けられている、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１１】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されている、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１２】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置により、試料液に含まれる目的物質を定量する方法であって、
前記方法は、以下の工程を包含する：
電子メディエータを含有する試料液を調製する工程、
前記電気化学測定用電極板を用意する工程、ここで
前記電気化学測定用電極板は、
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記上層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させるか、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触される接触工程、
前記酸化電極板に正電位を掃印し、かつ前記還元電極板に負電位を印加するか、あるいは前記酸化電極板に正電位を印加し、かつ前記還元電極板に負電位を掃引することによって、前記酸化電極板および前記還元電極のそれぞれに流れる電流を測定する電流測定工程、および
前記電流測定工程によって得られた電流から前記目的物質の量を算出する算出工程。
【請求項１３】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記補助電極の表面積が前記酸化電極の集合体の１０倍以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタが設けられている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されている、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素が有する特異的触媒作用と電極反応活性を有する電子メディエータとを組み合わせ、生体中の血液に含まれるスクロース、グルコースなどの糖類の濃度を定量する電気化学測定用電極板が開発されている。【０００３】
このような電気化学測定用電極板では、糖類と酵素の反応を利用して、電気化学的に糖類の濃度を定量する。まず、血液サンプルに酵素と電子メディエータとを混合して試料液を作成したのち、糖類と酵素との間で酵素反応をさせた後、それらに共存させた電子メディエータを電気化学的に測定することによって、電子メディエータを介して間接的に試料液中に含まれる糖類を定量する。【０００４】
この方法は酵素の反応が糖類に対する特異性が高く、操作時の温度の影響が小さく、定量装置の機構も簡便であるため、この方法を用いることにより、一般の人々が家庭などで簡易に自己の血液中の糖類の濃度を定量することができる。【０００５】
電気化学測定用電極板は、生体に含まれる微量溶液サンプルの分析に適している。そのため、電気化学測定用電極板は、様々な有機材料または無機材料と組み合わせてセンサなどへの応用が試みられている。電気化学測定用電極板の電極応答速度は、電気化学測定用電極板が有する微小電極の面積が減少するにしたがって高くなるため、様々な電極形状、電極の微細化が検討されている。【０００６】
しかし、電極面積の減少に伴い、得られる電流値は減少する。例えば、電極面積を数百μｍ2程度まで微細化すると、検出できる電流値は数十〜数ｎＡオーダーまで低下する。そのため、測定時にノイズ応答の増加や感度低下が発生する。そこで、これらの不具合を解消するため、複数の微小電極を集積した電気化学測定用電極板が特許文献１〜４で検討されている。【０００７】
特許文献１〜４では、隣接する微小電極との間の距離を一定に保つ微小電極を、多量に再現性良く基板上に作製する方法が提案されている。【０００８】
図１は、特許文献１に記載された従来の電気化学測定用電極板の構成を示している。【０００９】
この電気化学測定用電極板１０は、絶縁性の基板１／酸化電極として機能する下部電極２／絶縁層３／還元電極として機能する表面電極４が積層されてなる。表面電極４の表面には円筒形の多数の微細孔５が形成されており、この微細孔５には下部電極２の表面が露出している。【００１０】
絶縁性の基板１は、例えばシリコン基板１ａの主表面に酸化膜１ｂが被着された、いわゆる酸化膜付きシリコン基板から成る。下部電極２は、基板１上の酸化膜１ｂの表面（すなわち、絶縁体の表面）に金属、半金属、炭素材、または半導体で形成された酸化電極である。表面電極４は、絶縁層３上に、下部電極２と同様、金属、半金属、または半導体から形成された還元電極である。下部電極２と表面電極４とから、作用電極対が構成されている。すなわち、下部電極２および表面電極４はいずれも作用電極として機能し、より詳細には、上述したように、下部電極２は酸化電極として、表面電極４は還元電極として機能する。なお、図１において、７は下部電極２の一端部に外部リードを接続するために開口された電極引出し用の開口部である。ここで微細孔とは絶縁層３と表面電極４を完全に貫通し、下部電極２の表面に到達する孔のことを指す。【００１１】
上記のような電気化学測定用電極板を用いた電気化学測定装置においては、電流応答を得るために、下部電極２と表面電極４との間に電位を印加する。電気化学測定装置が下部電極２、表面電極４、対極（図示せず）の３つの電極で構成される場合、対極が試料用液中で示す電位をゼロとして、下部電極２−対極間、表面電極４−対極間に電位を印加する。また、電気化学測定装置が下部電極２、表面電極４、参照電極（図示せず）、補助電極（図示せず）の４つの電極で構成される場合、参照電極が試料液中で示す電位をゼロとして、下部電極２−参照電極間、表面電極４−参照電極間に電位を印加する。【００１２】
特許文献４および非特許文献１においては、円筒形の微細孔５の間隔を、その径に対して大きく取った電気化学測定用電極板が提案され、それを用いた電気化学測定結果が報告されている。これらの文献においては、マクロ電極である表面電極４は、微小電極の集合体である下部電極２よりも大きな面積を有する。測定時には、下部電極２上で酸化反応を、そして表面電極４上で還元反応を起こしうる電位をそれぞれ印加する。これにより、下部電極２と表面電極４との間で自己誘発レドックスサイクルが発現し、見かけ上高い電流応答を得ることができると報告されている。【００１３】
このようにして、試料液に存在する電子メディエータを介して、糖類などの目的物質を定量する。【００１４】
なお、下部電極２に還元反応が起こる電位を印加し、上部電極４に酸化反応が起こる電位を印加しても、同様の自己誘発レドックスサイクルが発現する。【００１５】
ここで、特許文献４、非特許文献１及び２に記載されている自己誘発レドックスサイクルを、図２を用いて説明する。【００１６】
図２における自己誘発レドックスサイクルはふたつの作用電極、すなわち微小電極２１およびマクロ電極２２上で進行する。【００１７】
微小電極２１の表面では、還元体２３の酸化反応が生じて酸化体２４が生成することにより、微小電極２１に酸化電流が流れる。【００１８】
マクロ電極２２のうち微小電極２１に近い部分２２ａの表面では、酸化体２４が還元されて還元体２５となることにより、マクロ電極２２に還元電流が流れる。【００１９】
さらに還元体２５が拡散して微小電極２１の表面に到達することにより、還元体２３から酸化体２４への酸化反応が再び起こり、微小電極２１に酸化電流が流れる。結果的にマクロ電極２２ａの表面では微小電極２１から生成した酸化体２４を還元して還元体２５とすることにより、微小電極２１表面に還元体２３を供給することができる。【００２０】
これにより、微小電極２１とマクロ電極２２ａとの間で酸化反応と還元反応が循環するいわゆるレドックスサイクル反応が生じる結果、微小電極２１に定常的に電流が流れて、試料液中に微量に含まれる目的物質の検出および定量を行うことができる。【００２１】
そして高感度測定の有効性を高めるために、微小電極２１を基板上により多数形成してレドックスサイクルが進行する酸化電極と還元電極とからなる電極対を、できる限り多く形成する。
【特許文献１】特許第２５５６９９３号公報（第６項、第１図）
【特許文献２】特許第２５６４０３０号公報（第７項、第２図）
【特許文献３】特開２００６−７８４０４号公報（第２５項、図１）
【特許文献４】特許第３２８９０５９号公報（第１６頁、図５）
【特許文献５】特開２００７−０１０４２９号公報（図３、図４）
【非特許文献１】Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３８巻，１２号，３５５１項（１９９１）
【非特許文献２】青木幸一ら著  「微小電極を用いる電気化学測定法」  （社）電子情報通信学会編  平成１０年２月１０日発行  ４８−４９，７０−７１項
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
図１に示されるように、還元電極として機能する表面電極４の面積が、酸化電極として機能する下部電極２の面積よりもずっと大きいことにより自己誘発レドックスサイクルが生じるが、これには次のような問題が生じる。【００２３】
マクロ電極２２ａ上で生成した還元体２５は拡散するが、それは微小電極２１（図１における下部電極２に相当）に到達するだけでなく、図２の右側に示すように、その一部はマクロ電極２２（図２における表面電極４に相当）のうち微小電極２１から遠い部分２２ｂ上にも到達する。このような還元体２６は酸化反応により酸化体２７となる。すなわち、マクロ電極２２上では酸化反応も起こる（特開平３−２４６４６０号公報の第４図も参照）。【００２４】
次に、この酸化体２７は拡散し、マクロ電極２２のうち微小電極２１に近い部分２２ｂ上に到達する。そこで還元反応により、還元体２５となる。還元体２５は拡散して微小電極２１表面に到達し再び酸化されて酸化体２４となる（あるいは、再度、マクロ電極２２のうち微小電極２１から遠い部分２２ｂに到達する）。【００２５】
すなわち、図１の表面電極４上では酸化反応と還元反応が同時に起こることとなる。その結果、下部電極２で検出したい還元体の酸化が表面電極４の上でも同時に起こってしまう。【００２６】
そのため、表面電極４で発生した還元体が効率的に下部電極２上で酸化せず、高感度化に課題を生じている。【００２７】
さらに、図１に示されるように、基板の一方の面にのみ電気化学測定用電極板を構成した構造では、電極を形成し得る面積が限られ、これによっても高感度化に課題を生じていた。【００２８】
この他、表面電極４はマクロ電極として作用するため電位印加時の充電電流が大きい。そのため、微小電極である下部電極２に比べて反応が定常状態に達する時間が長くなるという課題も生じていた。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記課題を解決する本発明に係る電気化学測定用電極板１０は、
絶縁体からなる基板３２と、
前記基板３２の上面に設けられた絶縁体からなる上層３１と、
前記基板３２の下面に設けられた絶縁体からなる下層３３と、
を備え、
前記基板３２は、前記基板３２の上面と前記上層３１との間に挟まれている複数の酸化電極３２Ｗと
前記基板３２の下面と前記下層３３との間に挟まれている複数の還元電極３２ｗと
を備え、
前記上層３１は、複数の上層開口部３１Ｗを有し、
前記各上層開口部３１Ｗからは、前記各酸化電極３２Ｗが露出しており、
前記下層３３は、複数の下層開口部３３ｗを有し、
前記各下層開口部３３ｗからは、前記各還元電極３２ｗが露出しており、
前記各酸化電極３２Ｗの上面から前記各還元電極３２ｗの下面にかけて貫通する複数の貫通孔３２Ｈが前記基板３２に設けられており、
前記各上層開口部３１Ｗの面積と、前記各下層開口部３３ｗの面積とは同一であり、
前記各上層開口部３１Ｗの面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部３３ｗの面積は１００００μｍ2以下である。【００３０】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上であることが好ましい。【００３１】
前記貫通孔の断面積は、１μｍ2以上２５００μｍ2以下であることが好ましい。【００３２】
前記下層の厚みは、５μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。【００３３】
この電気化学測定用電極板１０は、参照電極４２および補助電極４３と組み合わされるか、または対極と組み合わされ、電気化学測定装置を構成する。この電気化学測定装置もまた、本発明の趣旨に含まれる。【００３４】
そして、この電気化学測定装置により、以下のような、電子メディエータを含有する試料液に含まれる目的物質を定量する方法もまた、本発明の趣旨に含まれる。【００３５】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置により、試料液に含まれる目的物質を定量する方法であって、
前記方法は、以下の工程を包含する：
電子メディエータを含有する試料液を調製する工程、
前記電気化学測定用電極板を用意する工程、ここで
前記電気化学測定用電極板は、
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記上層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させるか、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触される接触工程、
前記酸化電極板に正電位を掃印し、かつ前記還元電極板に負電位を印加するか、あるいは前記酸化電極板に正電位を印加し、かつ前記還元電極板に負電位を掃引することによって、前記酸化電極板および前記還元電極のそれぞれに流れる電流を測定する電流測定工程、および
前記電流測定工程によって得られた電流から前記目的物質の量を算出する算出工程。【００３６】
前記補助電極の表面積は、前記酸化電極の集合体の１０倍以上であることが好ましい。【００３７】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタを設けても良い。【００３８】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されていることが好ましい。【００３９】
本発明により、生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板、およびこの電極板を有する電気化学測定装置、ならびにこの電極板を用いて目的物質を定量する方法が提供される。【００４０】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、特許文献１に記載の従来の電気化学測定用電極板の（Ａ）全体斜視図（Ｂ）拡大斜視図である。
【図２】図２は、特許文献４、非特許文献１および２に記載の自己誘発レドックスサイクルのメカニズムを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図４】図４は、本発明の実施の形態１に係る電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置の概略図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図６】図６は、本発明の比較例１における従来の電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図７】図７は、本発明の実施例２における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図８】図８は、本発明の実施例３における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図９】図９は、本発明の実施例４における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例５における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例６における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１３】図１３は、本発明の実施の形態３における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図１４】図１４は、本発明の実施例７における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１５】図１５は、検量線の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４２】
１  基板
１ａ  シリコン基板
１ｂ  酸化膜
２  下部電極
３  絶縁膜（ＳｉＯ2膜）
４  酸化電極
５  微細孔
７  下部電極２の開口部
１０  電気化学測定用電極板
２１  微小電極
２２  マクロ電極（微小電極近傍）
２３  マクロ電極（微小電極遠方)
２４  還元体１
２５  酸化体１
２６  還元体２
２７  還元体３
２８  酸化体２
３１  上層
３１Ｉ  絶縁体
３１Ｗ  上層開口部
３２  基板
３２Ｓ  基板本体
３２Ｅ  酸化電極板
３２Ｈ  貫通孔
３２Ｔ  酸化電極リード
３２Ｗ  酸化電極
３２ｅ  還元電極板
３２ｔ  還元電極リード
３２ｗ  還元電極
３３  下層
３３ｉ  絶縁体
３３ｗ  下層開口部
４１  酸化電極３２Ｗの集合体
４２  参照電極
４３  補助電極
４４  試料液容器
４５  制御装置
４６  レコーダー
５０  基板
５１  酸化電極
５２  還元電極
５３  上層
５４  上層開口部
５５  下層
５６  下層開口部
５７  上側孔
５８  下側孔
５９  貫通孔
６０  基板
６１  下部電極
６２  絶縁層
６３  表面電極
６４  レジスト
６５  微細孔
８０ａ  基板（酸化電極側）
８０ｂ  基板（還元電極側）
８０Ａ  酸化電極形成基板
８０Ｂ  還元電極形成基板
９０  モールド
１００  ワークテーブル
１１１Ｍ  フィルタ
１３１Ｅ  参照電極
１３１Ｔ  参照電極リード
１３３ｅ  補助電極
１３３ｔ  補助電極リード
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。【００４４】
（実施の形態１）
図３は、本実施の形態１における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。【００４５】
図３に示されるように、本実施の形態１に係る電気化学測定用電極板１０は、下側から順に、下層３３、基板３２、および上層３１が積層されていることにより構成されている。下層３３および上層３１は、いずれも絶縁体である。【００４６】
基板３２は、絶縁体からなる基板本体３２Ｓからなり、この基板本体３２Ｓの上面に酸化電極板３２Ｅを備え、この基板本体３２Ｓの下面に還元電極板３２ｅを備えている。酸化電極板３２Ｅは、図３に示すように、基板本体３２Ｓと上層３１との間に挟まれている。同様に、還元電極板３２ｅは、基板本体３２Ｓと下層３３との間に挟まれている。【００４７】
上層３１は、複数の上層開口部３１Ｗを有している。図３では、９つの上層開口部３１Ｗが設けられている。各上層開口部３１Ｗからは、酸化電極板３２Ｅの一部分が露出している。酸化電極板３２Ｅのうち、各上層開口部３１Ｗから露出している部分、すなわち、図３において、酸化電極板３２Ｅ上で斜線が施された部分が、試料液と接し、酸化電極３２Ｗとして機能する。図３では、９つの酸化電極３２Ｗが設けられている。酸化電極板３２Ｅのうち、上層３１が形成されている部分、すなわち、図３において、酸化電極板３２Ｅ上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液とは接することがない。よって、この部分は、酸化電極としては機能しない。【００４８】
上層３１と同様に、下層３３もまた、複数の下層開口部３３Ｗを有している。図３では、９つの下層開口部３３Ｗが設けられている。各下層開口部３３Ｗからは、還元電極板３２ｅの一部分が露出している。還元電極板３２ｅのうち、各下層開口部３３ｗから露出している部分、すなわち、図３において、還元電極板３２ｅ上で斜線が施された部分が、還元電極３２ｗとして機能する。図３では、９つの還元電極３２ｗが設けられている。還元電極板３２ｅのうち、下層３３が形成されている部分、すなわち、図３において、還元電極板３２ｅ上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液とは接することがない。よって、この部分は、還元電極としては機能しない。【００４９】
酸化電極板３２Ｅと還元電極板３２ｅにはそれぞれ独立して電位を印加することができ、それぞれの電極上で目的物質の電気化学反応、より具体的には酸化反応と還元反応とを進行させることができる。酸化電極３２Ｗ上における電気化学反応によって発生した電気信号は酸化電極板３２Ｅを伝わり、酸化電極リード３２Ｔを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。同様に還元電極３２ｗ上における電気化学反応によって発生した電気信号は還元電極板３２ｅを伝わり、還元電極リード３２ｔを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。【００５０】
各酸化電極３２Ｗと各還元電極３２ｗとは、平面基板本体３２Ｓを間に挟んで重なり合っている。図３では、縦３列×横３行の酸化電極３２Ｗと、縦３列×横３行の還元電極３２ｗとが、基板本体３２Ｓを間に挟んで重なり合っている。【００５１】
図３においては、説明を容易にするために、還元電極板３２ｅは、基板本体３２Ｓと分離して記載したが、実際には、還元電極板３２ｅは基板本体３２Ｓの下面に形成されている。【００５２】
酸化電極板３２Ｅはその一端に酸化電極リード３２Ｔを有している。酸化電極板３２Ｅで得られた電気信号は酸化電極リード３２Ｔから取り出すことができる。還元電極板３２ｅも同様に還元電極リード３２ｔと電気的に同通しており、還元電極板３２ｅで得られた電気信号は還元電極リード３２ｔから取り出すことができる。【００５３】
基板３２には複数の貫通孔３２Ｈが設けられている。そして、各貫通孔３２Ｈは、各酸化電極３２Ｗの上面から各還元電極３２ｗの下面にかけて貫通している。図３では、１つの酸化電極３２Ｗ、１つの貫通孔３２Ｈ、および１つの還元電極３２ｗからなる９つのセットが示されている。【００５４】
貫通孔３２Ｈがなければ、後述する比較例１からも理解されるように、目的物質の定量を高感度に行い得ず、さらに定量時における定常状態に達するまでに多くの時間を要する。【００５５】
各上層開口部３１Ｗの面積、すなわち、各酸化電極３２Ｗの面積は１００００μｍ2以下である。１００００μｍ2を超えると、図２の右側で示されるような望まれない反応が生じてしまい、結果的に、高感度化に課題を生じる。すなわち、後述する比較例２からも示されるように、目的物質の定量を高感度に行い得ず、さらに定量時における定常状態に達するまでに多くの時間を要する。同様に、各下層開口部３３ｗの面積、すなわち、各還元電極３２ｗの面積も１００００μｍ2以下である。【００５６】
なお、各上層開口部３１Ｗの面積（すなわち、各酸化電極３２Ｗの面積）および各下層開口部３３ｗの面積（すなわち、各還元電極３２ｗの面積）の下限には特に限定はないが、２２５μｍ2以上であることが好ましい。【００５７】
各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とは実質的に同一である。すなわち、複数個の上層開口部３１Ｗの面積はいずれも同一である。同様に、複数個の下層開口部３３Ｗの面積はいずれも同一である。そして、これらの上層開口部３１Ｗの面積と、これらの下層開口部３３Ｗの面積とは、いずれも同一である。各貫通孔３２Ｈの断面積は同一であることが好ましい。【００５８】
各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とを同一にすることにより、定常状態になるまでに要する時間を短くすることができる。また、各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とが異なっている場合、図２に示すような反応が生じるため、高感度化が困難となるためである。【００５９】
貫通孔３２Ｈの断面積は、当然、上層開口部３１Ｗの面積および下層開口部３３Ｗの面積のいずれよりも小さい。１つの酸化電極３２Ｗおよび１つの還元電極３２ｗのセットに対して、２つ以上の貫通孔３２Ｈを設けても良い。ただし、設計上は、１つの酸化電極３２Ｗおよび１つの還元電極３２ｗのセットに対して、１つの貫通孔３２Ｈで充分である。【００６０】
貫通孔３２Ｈの断面積の大きさはなるべく小さいほうが、基板３２上に多くの貫通孔を形成することが可能となる。このことは酸化電極３２Ｗおよび還元電極３２ｗからなる電極対をより多く配置することが可能となるので好ましい。ただし、貫通孔３２Ｈの断面積を小さくすることによって、試料液に含まれる電子メディエータが孔を通り抜ける際のコンダクタンスが増加する傾向がある。一方、あまりにも断面積の値が大きすぎる貫通孔３２Ｈは、面積が１００００μｍ2以下でなければならない各酸化電極３２Ｗおよび各還元電極３２ｗの面積を意味もなく小さくしてしまうことにつながる。そのため、好ましい貫通孔３２Ｈの断面積の値は、１μｍ2以上２５００μｍ2以下である。【００６１】
下層３３の厚みは５μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。隣接する還元電極３２ｗの間の距離は一般的に７μｍ程度であるので、下層３３の厚みが５μｍ未満である場合には、事実上、隣接する２以上の還元電極３２ｗが連続する１つの還元電極３２ｗとして機能してしまうことになる。そのため、図２の右側で示される望ましくない反応が生じやすくなる。【００６２】
言い換えれば、下層３３の厚みが５μｍ未満である場合には、還元電極３２ｗで生じた還元型の電子メディエータが貫通孔３２Ｈを通って酸化電極３２Ｗに達するよりも、還元電極３２ｗで生じた還元対の電子メディエータは隣接する還元電極３２ｗ上で酸化されて酸化型のメディエータとなりやすい。一方、下層３３の厚みが１００μｍを超える場合には、正確な測定のために必要となる試料液の量が増えることになり、好ましいとは言えない。このことは、上層３１についても同様である。【００６３】
基板本体３２Ｓの材料としては、例えば両面が酸化されたシリコン、ガラス、酸化アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、シリコン樹脂、ポリイミド及びその誘導体、エポキシ樹脂、高分子熱硬化物、感光性樹脂等を挙げることができる。【００６４】
本発明の電気化学測定用電極板では、貫通孔３２Ｈが試料液の通り道となるため、試料液が水溶液である場合には、貫通孔３２Ｈの内壁が親水性であることが望ましい。そのため、基板本体３２Ｓとしては、シリコン基板、ガラス基板などの親水性表面を有する基板か、または親水性のポリエチレンテレフタレートあるいはポリエチレンナフタレート基板などのポリエステル材からなる基板を選択することが望ましい。疎水性を有する基板を使用する際には、エタノール、イソプロピルアルコールなどによって貫通孔３２Ｈの内壁に親水化処理を施すことが望ましい。【００６５】
酸化電極板３２Ｅ（酸化電極リード３２Ｔを含む）の材料、および還元電極板３２ｅ（還元電極リード３２ｔを含む）の材料としては、電気伝導性を有する材料を挙げることができる。具体的には、金属として金、白金、パラジウム、銀、クロム、チタン、ニッケル、半導体としてｐ型シリコン、ｎ型シリコン、ｐ型ゲルマニウム、ｎ型ゲルマニウム、硫化カドミウム、二酸化チタン、酸化亜鉛、ガリウム燐、ガリウム砒素、インジウム燐、二砒化モリブデン、セレン化タングステン、二酸化銅、酸化スズ、酸化インジウム、インジウムスズ酸化物などを挙げることができる。その他、ケッシェンブラックなどの導電性カーボンを用いることができる。【００６６】
これらの中でも電極材料として安定である金、白金、パラジウムを用いることが好ましい。これらの形成には蒸着、スパッタ等の成膜手法とエッチング手法を組み合わせた方法。マスクを用いたスクリーン印刷、レーザアブレーション法、または導電性インクを用いたスピンコート法、インクジェットプリント法による直接描画手法を用いることができる。【００６７】
貫通孔３２Ｈの形成手法としては、ドライエッチング法、ウェットエッチング法、リフトオフ法、集束イオンビーム照射による加工法などにより電極形成済基板に穴を形成する手法が挙げられる。これに代えて、基板にメタルマスクを用いて貫通孔３２Ｈのパターニングをした後、基板を前記手法による孔形成加工を行うことによって形成しても良い。この他、貫通孔３２Ｈの凸型パターンを有する鋳型に基板を形成し、この基板に電極板を形成した後、鋳型を抜き取る方法。加熱した鋳型により電極板付の基板に貫通孔を形成したのち、鋳型を抜き取ることも考えられる。【００６８】
上層開口部３１Ｗと下層開口部３３ｗを形成する手法としては、ドライエッチング法、ウェットエッチング法、リフトオフ法、集束イオンビーム照射による加工方法などにより絶縁体３１Ｉおよび絶縁体３３ｉに開口部を形成する手法を挙げることができる。また、ポジ型レジストやネガ型レジスト、ドライフィルムレジスト等の感光性樹脂材料を用いて遮光マスクと露光手法を組み合わせた方法により形成しても良い。【００６９】
酸化電極板３２Ｅ（酸化電極リード３２Ｔを含む）、還元電極板３２ｅ（還元電極リード３２ｔを含む）、上層３１、下層３３をスピンコートによって形成する場合、コーターのワークテーブルには多孔体を用いてあるものを使うことが望ましい。これは基板本体３２Ｓの両面に電極板（酸化電極板３２Ｅと還元電極板３２ｅ）と絶縁層（上層３１と下層３３）を形成するため、基板を安定して固定するには多孔体による真空吸着法が、テフロン（登録商標）等の材料に数箇所吸着用の孔を設けたコーターヘッドを用いる場合に比べて、吸着固定する面積が大きくなるため好ましい。【００７０】
なお、図３の構造は、特許文献５の図３・図４に記載された構造と類似しているが、特許文献５は細胞電位測定用容器を開示しているに過ぎず、酸化電極および還元電極を備えた電気化学測定用電極板、およびこの電極板を有する電気化学測定装置、ならびにこの電極板を用いて目的物質を定量する方法については、開示も示唆もしていない。【００７１】
図４は、実施の形態１に係る電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置（以下、単に「測定装置」という）を示している。【００７２】
図４に示すように、電気化学測定用電極板１０、参照電極４２、および補助電極４３を、試料液容器４４に満たされた試料液に浸す。これにより、これらの電極が試料液に接触する。また、電気化学測定用電極板１０の表面には、酸化電極３２Ｗが複数形成されて、酸化電極３２Ｗの集合体４１を形成している。図示していないが、電気化学測定用電極板１０の裏面には同様に還元電極３２ｗが集合体を形成している。【００７３】
参照電極４４は電気化学測定用電極板１０に印加する電位の基準となる電極である。参照電極４４が試料液中で示す電位をゼロとして、酸化電極３２Ｗ、還元電極それぞれに電位を印加する。【００７４】
補助電極４３は、測定装置においてアンペアの法則を成り立たせるために、電流を補償するための電極である。測定装置４５は、酸化電極リード３２Ｔおよび還元電極リード３２ｔを介して電気化学測定用電極板１０と電気的に接続しており、同様に参照電極４２、補助電極４３とも電気的に接続している。レコーダー４６により、測定装置４５から出力された電流応答が記録される。【００７５】
（電気化学測定方法の説明）
次に、試料液に含まれる電子メディエータの定量方法を説明する。【００７６】
サイクリックボルタンメトリー等の手法により、電子メディエータの酸化反応が進行する電位と還元反応が進行する電位を予め調べておいて、後に説明する酸化電極の電位の値と還元電極の電位の値に用いる。なお、電位の基準は参照電極４２が試料液中で示す平衡電位である。すなわち、酸化電極３２Ｗおよび還元電極３２ｗにそれぞれ印加される電位は、参照電極４２を０Ｖとした場合における相対的な電位である。【００７７】
酸化電極３２Ｗと還元電極３２ｗの電位を制御装置４５に入力したのち、測定を開始する。後述する実施例では詳細に説明するが、具体的には、酸化電極３２Ｅに０Ｖから正電圧をゆっくりと印加する。後述する実施例では、酸化電極３２Ｅに印加される電圧を０Ｖから＋０．７Ｖにゆっくりと連続的に変化させている。なお、これを「掃印」と呼ぶ。すなわち、本明細書において用いられる用語「掃印」とは、連続的に電位を変化させることを意味している。これとは対照的に、本明細書において用いられる用語「印加」とは、あらかじめ定められた電位に急激に変化させることを意味している。【００７８】
このとき、還元電極には参照電極と同一の電位（多くの場合、０Ｖ）を印加し続けることが好ましい。酸化電極３２Ｅに電圧を印加する速度（以下、「掃印速度」ということがある）は、一般的に５ｍＶ／秒以上５００ｍＶ／秒以下である。後述する実施例では、１００ｍＶ／秒である。【００７９】
なお、上記の説明では、酸化電極板３２Ｅに正電位を掃印し、還元電極板３２ｅに負電位を印加している。しかし、酸化電極板３２Ｅに正電位を印加し、還元電極板３２ｅに負電位を掃引してもよい。【００８０】
酸化電極３２Ｗにおける酸化反応で得られた電流は酸化電極リード３２Ｔを介して制御装置４５によって検出される。同様に還元電極における還元反応で得られた電流は還元電極リード３２ｔを介して制御装置４５によって検出される。検出された電流はレコーダー４６に出力され、記録された酸化電流値を標準試料の酸化電流値の測定結果（後述する検量線）と比較して、試料液中の検出対象物質を定量することができる。【００８１】
レコーダー４６に記録された還元電流値を標準試料の還元電流測定結果と比較して試料液中の検出対象物質を定量することもできる。このためには、予め本実施の形態の検出装置を用いて標準試料の検量線を作成しておくことが望ましい。【００８２】
ここで、検量線を用いた、試料液中の検出対象物質を定量する方法、すなわち、試料液中の検出対象物質の濃度を算出する方法について説明する。【００８３】
まず、標準試料を準備する。この標準試料には、濃度既知の還元型電子メディエータ（ここでは、フェロシアン化カリウムと仮定する）が含まれている。この濃度既知の標準試料を試料液として用いて、図４に示すような電気化学測定装置により、還元型電子メディエータの濃度と、電気化学測定装置により測定された反応電流値との間の関係をグラフ化する。このグラフの一例を図１５に示す。【００８４】
図１５に示されるように、ここでは、還元型の電子メディエータの濃度が１００μＭである場合には、反応電流値は１０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が３００μＭである場合には、反応電流値は３０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が５００μＭである場合には、反応電流値は５０μＡであったと仮定する。これらをグラフ上にプロットして、検量線を引く。このようにして、濃度既知の標準試料から、検量線を得る。【００８５】
次に、濃度不知の試料液を用いて、図４に示すような電気化学測定装置により反応電流値を得る。ここで得られた反応電流値が２０μＡであった場合、検量線から、試料液に含まれる還元型の電子メディエータの濃度を知ることができる。この還元型の電子メディエータの濃度から、試料液に含まれる（あるいは、含まれていた）目的物質の量を算出する。【００８６】
なお、実際には、検量線の作成や目的物質の量の算出などは、すべてコンピュータ上で行われることは言うまでもないだろう。【００８７】
（参照電極、補助電極に関する説明）
参照電極４２と補助電極４３の２つの電極の代わりに、対極１つを用いて測定を行うことも可能である。しかし参照電極４２と補助電極４３は独立して設けることが好ましい。なぜなら、電位の基準となる参照電極もしくは対極に電流が流れる間には、その表面で電極反応が進行しており、反応進行に伴う電子メディエータの濃度変化が大きくなると本実施の形態の検出装置の基準としている電位が変動して正確な測定を行うことができないためである。【００８８】
よって、参照電極４２には電流が流れ込まないように入力インピーダンスを極力大きく設定することが望ましい。望ましくはインピーダンスの値が１０の６乗オーム以上であることが望ましい。参照電極４２には銀塩化銀電極、飽和カロメル電極等を用いることができる。【００８９】
補助電極４３の表面積は大きいことが望ましい。補助電極４３の好ましい表面積は酸化電極３２Ｗの集合体４１の１０倍以上である。その理由は、補助電極４３の電極表面積が小さくて十分な電流を流せない場合、電気化学測定用電極板１０で得られる電流が制御装置４５に十分流れ込まなくなり、正確な電流値を得られないことや、電流を流すために補助電極４３の電位が大きく変動して水の電気分解等望ましくない反応が進行する場合があるためである。【００９０】
補助電極４３としては、電極自体の酸化還元反応や腐蝕反応が起こりにくい貴金属電極を使用することが望ましい。例えば、白金線に白金黒を析出させて大きな電極面積を持たせた白金電極が好ましい。【００９１】
（実施の形態２）
図１１に示すように、本実施の形態２においては、上層３１の上面にメッシュ状のフィルタ１１１Ｍを設けている。【００９２】
測定に用いる試料液として、血液から分離した血漿成分を用いる場合、分離しきれずに混入した血球成分、蛋白成分、固化した血栓などが、貫通孔３２Ｈを塞ぐ事がある。【００９３】
これを防止するために、電極系外でフィルタによる濾過を経て試料液を電極に供給するが、これに加えて、上層３１に濾過機能を有するフィルタ１１１Ｍを形成することにより、血栓等によって貫通孔３２Ｈが塞がれることが防止される。【００９４】
必要に応じて、下層３３の下側にフィルタ（図示せず）を設けても良い。【００９５】
（実施の形態３）
図１３に示すように、本実施の形態３においては、酸化電極板３２Ｅ、還元電極板３２ｅだけでなく、参照電極１３１Ｅ、補助電極１３３ｅを一体に形成しても良い。この構成では、図４に示すような参照電極４２および補助電極４３を付加する必要がなくなるため、装置を小型化できる。【００９６】
参照電極１３１Ｅは、上層３１の上面に形成することが好ましい。参照電極１３３ｅは、下層３３の下面に形成することが好ましい。【００９７】
なお、実施の形態２に示されるフィルタがこの実施の形態３に示される電気化学測定用電極板に設けられる場合には、フィルタ１１１Ｍの上に参照電極１３１Ｅを設けても良いし、逆にフィルタ１１１Ｍの下に参照電極１３１Ｅを設けても良い。【００９８】
実施の形態１〜３の説明においては、便宜上、酸化電極３２Ｗが基板本体３２Ｓの上側に、還元電極３２ｗが基板本体３２Ｓの下側に設けられていることとした。これは、説明を容易にするためにすぎない。各図面に示されている電気化学測定用電極板をひっくり返した場合であっても、本発明に含まれることは言うまでもない。実施の形態３における参照電極１３１Ｅおよび補助電極１３３ｅについても同様である。すなわち、参照電極Ｅ１３１は下層３３の下側に設けられ、補助電極１３３ｅは上層３１の上側に設けられていても良い。【００９９】
（実施例）
以下、実施例および比較例により、本発明をさらにより詳細に説明する。【０１００】
（実施例１）
図５は本発明の実施例１における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。なお、図５から図１０まで、図１２、および図１４には１つの貫通孔３２Ｈしか表されていないが、実際には各実施例・比較例において説明されている数の貫通孔３２Ｈが設けられた。【０１０１】
まず、図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、１μｍのＳｉＯ2膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）からなる基板５０の上面に、以下のように、スパッタ法により酸化電極板５１を形成した。【０１０２】
すなわち、基板５０をスパッタ装置（株式会社  アルバック製）内の所定位置に取り付けた後、クロム及び金を順次成膜した。具体的には、圧力１．３Ｐａ，アルゴン雰囲気で、クロム１０秒，金：５０秒間スパッタを行い全体で１３０ｎｍの膜厚とした。これにより酸化電極板５１を形成した。【０１０３】
次に、図５（ｃ）に示すように、基板５０の下面に、酸化電極板５１と同様に、還元電極板５２を形成した。【０１０４】
さらに、図５（ｄ）に示すように、酸化電極板５１上に上層５３および上層開口部５４を、以下のように形成した。すなわち、酸化電極板５１の上面に、スピンコート法により感光性樹脂材料（化薬マイクロケム株式会社製：ＳＵ−８  ２０００）を厚みが２μｍとなるように塗布した。そして、７０℃３０分間ベーキングした後、上層開口部５４のパターンを有するクロムマスクを用いて６０秒間、密着露光することにより、マスクパターンを樹脂材料に転写した。この後、現像液中にて２０℃、３００秒間現像を行い、水洗、乾燥してマトリックス状の上層開口部５４を上層５３に形成した。【０１０５】
ここで、実施例１における上層開口部５４について詳しく説明する。この上層開口部５４は正方形であった。その一辺は１５μｍであり、面積は２２５μｍ2であった。上層開口部５４の個数は１００００個であり、隣接する上層開口部５４の中心点の間の距離は１８μｍであった。【０１０６】
図５（ｅ）に示すように、上層開口部５４を形成した手順と同様に、還元電極板５２の下側に下層５５および下側開口部５６を形成した。【０１０７】
次に、酸化電極板５１をエッチングすることにより、以下のように上側孔５７を形成した。すなわち、酸化電極板５１上に厚み４〜５μｍのレジスト材（東京応化工業株式会社製：ＴＳＭＲ−８９００ＬＢ）を塗布した。このレジストを塗布した基板５０をオーブン中にいれ、プレベーキング工程を１００℃・３０分、ポストベーキング工程を１２０℃・３０分の条件にて行った。その後、孔５７のパターンを有するクロムマスクを用いて、マスクアライナー（ミカサ株式会社製）により６０秒間、密着露光した。次に現像液中にて２５℃１２０秒間現像を行い、水洗、乾燥してマスクパターンをレジストに転写した。【０１０８】
次に、図５（ｆ）に示すように、基板をアルゴンミリング装置に入れ、アルゴンガスの流量１２ｓｃｃｍ、圧力０．０３Ｐａ、ビーム電流９０ｍＡの条件で金およびクロムからなる酸化電極板３１Ｅを順次エッチングした。これにより、基板に複数の上側孔５７を形成した。形成された上側孔５７は円形であり、その面積は７８．５μｍ2であった。基板５０に形成された上側孔５７の個数は１００００個であった。なお、各上側孔５７の中心は上側開口部５４の中心と一致するよう形成した。【０１０９】
さらに、図５（ｇ）に示すように、酸化電極板５１に上側孔５７を形成した手順と全く同様に、還元電極板５２に下側孔５８を形成した。【０１１０】
最後に、図５（ｈ）に示されるように、次に上側孔５７および下側孔５８を形成した基板５０を反応性イオンエッチング装置に入れ、下側孔５８をマスクパターンとし、Ｃ2Ｆ6ガスの流量を２５ｓｃｃｍ、圧力０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件で１５分間、基板５０をエッチングした。これにより、基板５０に多数の貫通孔５９が形成された（図５（ｈ））。【０１１１】
このようにして、実施例１に係る電気化学測定用電極板を得た。【０１１２】
（比較例１）
比較のために、従来の電気化学測定用電極板を作製した。以下にその作製手順を示す。【０１１３】
図６に示すように、基板６０として１μｍのＳｉＯ2膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）の上面に、クロムおよび金をからなる下部電極６１を成膜した。成膜条件は図５（ｂ）と同一とした。【０１１４】
次に、図６（ｃ）に示すように、下部電極６１の上面にプラズマＣＶＤ装置（株式会社アルバック製）を用いて、厚み４３０ｎｍのＳｉＯ2からなる絶縁層６２を堆積した。
成膜条件は、シランガス流量１０ｓｃｃｍ、Ｎ2Ｏガス流量２００ｓｃｃｍ、圧力８０Ｐａ，パワー５０Ｗ、基板温度３００℃とした。【０１１５】
さらに、図６（ｄ）に示すように、クロムおよび金をからなる表面電極６３を成膜した。成膜条件は図５（ｂ）と同一とした。【０１１６】
次に、図６（ｅ）に示すように表面電極６３の上面に、厚み２〜３μｍのレジスト材６４を塗布し、現像、水洗、乾燥してマスクパターンをレジスト６４に転写した。用いたレジストおよびレジストパターン形成の条件は、図５（ｄ）に関する説明と同一とした。【０１１７】
その後、図６（ｆ）に示すように、微細孔６５を形成した。レジスト６４が形成されていない部分、すなわち、露出している表面電極６３の部分を、アルゴンミリング装置を用いて順次エッチングした。アルゴンミリングの条件は、アルゴンガスの流量１２ｓｃｃｍ、圧力０．０３Ｐａ、ビーム電流９０ｍＡとした。【０１１８】
最後に反応性イオンエッチング装置を用いて、絶縁層６２に多数の微細孔６５を形成した。反応性イオンエッチングの条件は、Ｃ2Ｆ6ガスの流量：２５ｓｃｃｍ、圧力：０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件とした。【０１１９】
ここで、比較例１における微細孔６５について詳しく説明する。この微細孔６５は円形であった。その直径は１０μｍであり、面積は７８．５μｍ2であった。微細孔６５の個数は１００００個であり、隣接する微細孔６５の中心点の間の距離は７０μｍであった。なお、この微細孔６５は図６（ｆ）に示されるように、下部電極６１、基板６０を貫通していなかった。【０１２０】
（実施例１および比較例１に係る電気化学測定）
実施例１および比較例に係る電気化学測定用電極板を用いて、図４に示すように、電気化学測定装置を組み立て、電子メディエータの定量評価を行った。【０１２１】
１ｍＭのフェロシアン化カリウムおよび１ｍＭのフェリシアン化カリウム（合計２ｍＭ）を、５０ｍＭの支持電解質（塩化カリウム）を含有する水溶液に添加することによって、試料液を調製した。【０１２２】
参照電極として銀／塩化銀電極（ＢＡＳ株式会社製）を用いた。なお、以下、酸化電極の電位や還元電極の電位は、全てこの参照電極として用いた銀／塩化銀電極に対する電位である。【０１２３】
実施例１に係る電気化学測定用電極板をバイポテンシオスタット（ＣＨ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製：ＡＬＳ７４０Ａ）にリード線を介して接続した。酸化電極板５１の電位を０Ｖ、還元電極板５２の電位を０Ｖ、酸化電極板５１の電位の掃印速度を１００ｍＶ／ｓに設定した後、最終的に酸化電極板５１の電位が＋０．７Ｖになるまで、サイクリックボルタンメトリー法により酸化電極板５１に流れる、反応電流を計測した。その反応は化１に示すフェロシアン化カリウムの酸化反応である。【０１２４】
酸化電極板５１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は３９．８μＡであった。【０１２５】
同様に、比較例１に係る電気化学測定用電極板を用いて、酸化電極として機能する下部電極２の電位を、０から＋０．７Ｖまで掃印速度１００ｍＶ／ｓで掃引した。還元電極として機能する表面電極４の電位は０Ｖに設定した。【０１２６】
その結果、下部電極においても化１に示すフェロシアン化カリウムの酸化反応に伴う酸化電流が観測された。下部電極６１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は２２．５μＡであった。【０１２７】
【化１】
2009013876.tif 000003
【０１２８】
実施例１および比較例１の実験結果を、以下の表１にまとめて示す。【０１２９】
【表１】
2009013876.tif 000004
【０１３０】
これは図２の自己誘発レドックスサイクルの説明図に当てはめて考えてみると、比較例１における微小電極から遠い部分のマクロ電極２２ｂで酸化されていたフェロシアン化カリウムが微小電極２１上の酸化反応に用いられなかったのに対し、実施例１においては全てのフェロシアン化カリウムは微小電極２１上でのみ酸化されたため、酸化反応の電流値が効率的に増加したものと考えられる。【０１３１】
本実施例の電気化学測定用電極板においては同一形状と面積を有する微小電極対を基板上に多数配列した。それにより、それぞれの電極対同士で反応面積が揃い、上記のようなマクロ電極上のフェロシアン化カリウムの反応が起こらなくなったあるいは著しく減少したと考えられる。これにより、両極間で効率的なレドックスサイクル反応が進行したと考えられる。【０１３２】
また、比較例１の微小電極を構成する下部電極６１および実施例１の電気化学測定用電極を構成する酸化電極板５１に対して、＋０．４Ｖの電位を印加して得られる酸化電流の時間依存性を評価した。実施例１の還元電極板５２の電位および比較例１の表面電極６３の電位は０Ｖに保った。【０１３３】
その結果、実施例１の酸化電流値は６秒で定常状態に達したが、比較例１の酸化電流値が定常状態に達するのに２６秒要した（表２）。このことは、比較例１の下部電極に比べて、上部電極の面積が大きいために定常状態に達する時間が必要であったのに対し、実施例１の酸化電極は同一面積を有する還元電極と電極対を形成したため、両極間で即座に定常状態に達したと考えられる。【０１３４】
【表２】
2009013876.tif 000005
【０１３５】
以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。【０１３６】
（比較例２）
実施例１における上層開口部５４および下層開口部５６の面積が、電子メディエータの定量評価に及ぼす影響を検証するために、以下の手順にて比較例２に係る電気化学測定用電極板を作製した。【０１３７】
基本的な作製手順は図５と同一であるので、相違点のみ説明する。比較例２では、正方形の上層開口部５４の一辺は１０００μｍであり、面積は１００００００μｍ2であった。上層開口部５４の個数は１０個であり、隣接する上層開口部５４の中心点の間の距離は１５００μｍであった。【０１３８】
この電極を用いて、実施例１と同様にサイクリックボルタンメトリー法による反応電流の計測を行ったところ、酸化電極板５１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は２０．７μＡであった。同様に、酸化電流の時間依存性も評価した。比較例２の酸化電極に流れる電流が定常状態に達するのに３５秒要した（表２）。【０１３９】
このことは、本発明の電気化学測定用電極板に設ける開口部の面積が１００００００μｍ2と大きな場合、図２で示したような還元電極上において酸化電極から近い部分と遠い部分とが生じ、酸化電極で酸化するべき還元体が還元電極上で反応してしまったために、酸化電極上で効率的な反応が起こらなかったと推測される。【０１４０】
(実施例２)
図７は本発明の実施例２における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。酸化電極板５１と還元電極板５２の形成工程（ａ〜ｃ）までは実施例１と同様に行った。【０１４１】
次に実施例１で用いた手順により、参加電極板５１、基板５０、還元電極板５２を順次エッチングし、断面積１００μｍ2の貫通孔５９を５０００個等間隔になるように形成した（ｃ〜ｅ）。【０１４２】
次に酸化電極板５１の上側に上層５３と上層開口部５４を形成した。また、還元電極板５２の下層に、下層５５と下層開口部５６を形成した。【０１４３】
上層５３と下層５５の材料には、厚み５μｍのドライフィルムレジスト（旭化成工業株式会社製  サンフォート）を用いた。上層開口部５４と下層開口部５６は各５０００個形成した。それらの開口部の断面積は９００μｍ2であった。上層開口部と下層開口部の形成方法は実施例１と同様であった（ｆ〜ｉ））。【０１４４】
以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。【０１４５】
本実施例の電気化学測定用電極板を用いて実施例１と同様の試験を行った。表１に示すように酸化電極５１で観測された電流値は、比較例１における下部電極６１のそれより大きかった。さらに表２に示すように酸化電極５１で観測された電流値が定常状態到達に要した時間は１０秒と比較例１のそれより短かった。【０１４６】
以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。【０１４７】
(実施例３)
図８は実施例３における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。本実施例においては実施例１と同様の酸化電極板５１と還元電極板５２の形成工程（ｂ１，ｂ２）、上層および下層形成工程（ｃ１，ｃ２）、上層開口部および下層開口部形成工程（ｄ１，ｄ２）、上側貫通孔および下側貫通孔形成工程（ｅ１，ｅ２，ｆ１，ｆ２）を経た。その結果、酸化電極形成基板８０Ａ、還元電極形成基板８０Ｂを形成した。【０１４８】
前記２つの基板をそれぞれの下面で貼り合わせることにより、本実施例の電気化学測定用電極板を得た（ｇ)。上層開口部５４および下層開口部５６の断面積は９００μｍ2で、それを１０００個等間隔に形成した。貫通孔５９の断面積は３１４μｍ2であった。【０１４９】
本実施例の電気化学測定用電極を用いて実施例１と同様の試験を行った結果、表１に示すように実施例１と同様の結果が得られた。以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。【０１５０】
(実施例４) 
図９は実施例４における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。絶縁性の基板５０には厚さ０．５ｍｍの熱硬化性のフェノール樹脂材料（ＰＭ−８２００  住友ベークライト製）を用いた。前記基板に酸化電極板５１と還元電極板５２を形成した（ａ〜ｃ）。【０１５１】
次に前記の電極板形成済基板の貫通孔形成加工を行った。モールド９０を１６０℃に加熱し、還元電極板５２の下面から酸化電極５１の上面を完全に貫通したところでそのままの温度で１０分間保持した（ｄ）。次に、室温まで５℃／分で徐冷したのち、室温で１０分間保持した。次に、モールド９０を抜き取ることにより、貫通孔５９を１０００個形成した。それらの貫通孔の断面積は３１４μｍ2だった（ｅ）。【０１５２】
次に実施例２と同様の手順により上層５３と上層開口部５４、下層５５と下層開口部５６を１０００個形成した（ｆ〜ｉ）。それらの開口部の面積は６４００μｍ2であった。これにより、本実施例の電気化学測定用電極板を得た。【０１５３】
本実施例の電気化学測定用電極板を用いて実施例１と同様の試験を行った結果、表１に示すように実施例１と同様の結果が得られた。以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。【０１５４】
(実施例５)
図１０は実施例５における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。基板５０は１μｍのＳｉＯ２  膜を表面に形成した直径４インチ、厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）を用いた。【０１５５】
その両面にチタンを１０ｎｍ全面成膜した。次に、その下面をスピンコーターのワークテーブル１００に真空吸着により、固定した（ａ）。ワークテーブル１００はポーラスチャック（株式会社  吉岡精工製）を用いた。その吸着部は焼結したアルミナ多孔体で形成されていた。【０１５６】
前記基板５０の上面に直径５ｎｍのパラジウム粒子分散液（溶媒:ヘキサン）を厚さ５００ｎｍとなるように全面塗布した。次に排気設備付の電気炉にて３００℃、３時間焼成を行い、酸化電極５１を形成した。続いて下面にも同様にパラジウム粒子分散液を塗布、焼成を経て還元電極５２を形成した（ｂ)。【０１５７】
次に実施例１と同様の手順により、貫通孔５９を１０００個形成した。貫通孔の断面積は２５００μｍ2であった（ｃ〜ｅ）。【０１５８】
次いで実施例２と同様の手順での上層５３と上層開口部５４、下層５５と下層開口部５６を１０００個形成した。開口部の断面積は１０００μｍ2であった（ｆ〜ｉ）。以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。【０１５９】
得られた電気化学測定用電極板の酸化電極表面及び還元電極表面を、原子間力顕微鏡により観察した。その結果、酸化電極表面及び還元電極表面におよそ直径５０ｎｍのグレインが凝集した構造が確認できた。一方、成膜手法を用いて作製したパラジウム電極表面は、基板の研磨において形成された研磨傷を反映した形状のみ観測され、グレイン構造は確認できなかった。【０１６０】
ここから本実施例の電気化学測定用電極板の酸化電極表面積の見積もりを行った。単純に基板５０の表面を直径５０ｎｍのパラジウム粒子の半球が覆いつくしたと仮定すると、半球の表面積の総和は幾何面積のおよそ３０倍となった。成膜手法で作製した電極表面はほとんど平坦であったため、その面積はほぼ貴下面積と一致する。よって、本実施例の電気化学測定用電極板は成膜手法で作製した電極よりも広い電極面積を有することが分かった。このことは電極の反応面積が増大することにつながる。これにより、本発明の電気化学測定用電極板が好ましい性質を有することが認められた。【０１６１】
次に図１２を用いて実施の形態２の電気化学測定用電極板の作製工程を述べる。
（実施例６）
図１２は実施例６における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。実施例１の手順を用いて基板５０に酸化電極板５１、還元電極板５２、上層５３、上層開口部５４、下層５５、下層開口部５６、貫通孔５９を形成した。貫通孔の断面積は１００μｍ2、開口部の断面積は１００００μｍ2、それぞれ２５００個形成した（ａ〜ｉ）。【０１６２】
最後にボロシリケートファイバーグラスからなる口径４２μｍのフィルタ１１３Ｍ(日本ミリポア株式会社製)を所定の大きさにカットしたのち、上層５３上にシリコン接着剤を用いて固定した（ｊ）。【０１６３】
以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。【０１６４】
血液中の血漿成分を本実施例の電気化学測定用電極板に挿入した結果、分離しきれなかった血球成分、蛋白成分、血栓がフィルタ１１３Ｍにトラップされ、血漿成分のみが上層開口部５４、貫通孔５９を経て下層開口部まで供給された。一方、フィルタ１１３Ｍを形成しなかった同形状の電気化学用測定電極板は一部血栓により塞がれたため、貫通孔５９が機能を果たさなくなった。これらは目視により確認した。以上の結果から、本実施の形態の電気化学測定用電極板の効果が認められた。【０１６５】
次に図１４を用いて実施の形態３の電気化学測定用電極板の作製工程を述べる。【０１６６】
（実施例７）
図１４は実施例７における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。実施例１の手順を用いて基板５０に酸化電極板５１、還元電極板５２、上層５３、上層開口部５４、下層５５、下層開口部５６、貫通孔５９を形成した。貫通孔の断面積は１００μｍ2、開口部の断面積は２５００μｍ2とし、それぞれ５０００個形成した（ａ〜ｉ）。【０１６７】
次に上層５３と下層５５にメタルマスクを被せて白金を１００ｎｍ成膜した（ｊ）。メタルマスクを除いた後、上層５３に形成した白金薄膜へ、リード部分を残して銀塩化銀インク（ビーエーエス株式会社製）を塗布した。その後、４０℃３０分間電気炉中にて乾燥を行い、参照電極１３１Ｅを得た。続いて平均粒径１．０〜１０．０μｍの白金粉末(田中貴金属工業株式会社製)をエタノール中に分散してスラリーを作製した。作製したスラリーを下層５５上に形成した白金薄膜へ、リード部分を残して塗布および乾燥を行い、補助電極１３３ｅを得た。以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。【０１６８】
本実施例で作製した電気化学測定用電極板と比較例１のそれを用いて、電気化学測定装置を組み上げた。その際、本実施例の電気化学測定用電極板は厚みが０．５ｍｍ程度であるのに対し、比較例１のそれは外部から参照電極と補助電極を導入したため、厚みが５ｃｍ程度となった。そのことにより、測定に用いる試料液の量は数１０００倍に増加した。      【０１６９】
このことは測定に必要な電極を電極板上に一体形成したことにより、小型化が求められる各種センサ用電極として好適な構成となったことを示す。よって、本実施例の電気化学測定用電極板は小型センサ用電極として適することが分かった。【０１７０】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明の電気化学測定用電極板は、高いレドックスサイクル効果を有し、グルコースセンサに代表される生体物質等微量成分のセンシングデバイスを構成する電極として有用である。またクロマトグラフィーの検出器を構成する電極の用途等にも応用できる。
【図１】
2009013876.tif 000006
【図２】
2009013876.tif 000007
【図３】
2009013876.tif 000008
【図４】
2009013876.tif 000009
【図５】
2009013876.tif 000010
【図６】
2009013876.tif 000011
【図７】
2009013876.tif 000012
【図８】
2009013876.tif 000013
【図９】
2009013876.tif 000014
【図１０】
2009013876.tif 000015
【図１１】
2009013876.tif 000016
【図１２】
2009013876.tif 000017
【図１３】
2009013876.tif 000018
【図１４】
2009013876.tif 000019
【図１５】
2009013876.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月3日(2008.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下である
電気化学測定用電極板。
【請求項２】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項３】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項４】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項５】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置であって、
前記電気化学測定用電極板は、
基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下である、
電気化学測定装置。
【請求項６】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項７】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項８】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項９】
前記補助電極の表面積が前記酸化電極の集合体の１０倍以上である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１０】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタが設けられている、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１１】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されている、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１２】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置により、試料液に含まれる目的物質を定量する方法であって、
前記方法は、以下の工程を包含する：
電子メディエータを含有する試料液を調製する工程、
前記電気化学測定用電極板を用意する工程、ここで
前記電気化学測定用電極板は、
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記上層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させるか、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触される接触工程、
前記酸化電極板に正電位を掃引し、かつ前記還元電極板に負電位を印加するか、あるいは前記酸化電極板に正電位を印加し、かつ前記還元電極板に負電位を掃引することによって、前記酸化電極板および前記還元電極のそれぞれに流れる電流を測定する電流測定工程、および
前記電流測定工程によって得られた電流から前記目的物質の量を算出する算出工程。
【請求項１３】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記補助電極の表面積が前記酸化電極の集合体の１０倍以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタが設けられている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されている、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素が有する特異的触媒作用と電極反応活性を有する電子メディエータとを組み合わせ、生体中の血液に含まれるスクロース、グルコースなどの糖類の濃度を定量する電気化学測定用電極板が開発されている。
【０００３】
このような電気化学測定用電極板では、糖類と酵素の反応を利用して、電気化学的に糖類の濃度を定量する。まず、血液サンプルに酵素と電子メディエータとを混合して試料液を作成したのち、糖類と酵素との間で酵素反応をさせた後、それらに共存させた電子メディエータを電気化学的に測定することによって、電子メディエータを介して間接的に試料液中に含まれる糖類を定量する。
【０００４】
この方法は酵素の反応が糖類に対する特異性が高く、操作時の温度の影響が小さく、定量装置の機構も簡便であるため、この方法を用いることにより、一般の人々が家庭などで簡易に自己の血液中の糖類の濃度を定量することができる。
【０００５】
電気化学測定用電極板は、生体に含まれる微量溶液サンプルの分析に適している。そのため、電気化学測定用電極板は、様々な有機材料または無機材料と組み合わせてセンサなどへの応用が試みられている。電気化学測定用電極板の電極応答速度は、電気化学測定用電極板が有する微小電極の面積が減少するにしたがって高くなるため、様々な電極形状、電極の微細化が検討されている。
【０００６】
しかし、電極面積の減少に伴い、得られる電流値は減少する。例えば、電極面積を数百μｍ2程度まで微細化すると、検出できる電流値は数十〜数ｎＡオーダーまで低下する。そのため、測定時にノイズ応答の増加や感度低下が発生する。そこで、これらの不具合を解消するため、複数の微小電極を集積した電気化学測定用電極板が特許文献１〜４で検討されている。
【０００７】
特許文献１〜４では、隣接する微小電極との間の距離を一定に保つ微小電極を、多量に再現性良く基板上に作製する方法が提案されている。
【０００８】
図１は、特許文献１に記載された従来の電気化学測定用電極板の構成を示している。
【０００９】
この電気化学測定用電極板１０は、絶縁性の基板１／酸化電極として機能する下部電極２／絶縁層３／還元電極として機能する表面電極４が積層されてなる。表面電極４の表面には円筒形の多数の微細孔５が形成されており、この微細孔５には下部電極２の表面が露出している。
【００１０】
絶縁性の基板１は、例えばシリコン基板１ａの主表面に酸化膜１ｂが被着された、いわゆる酸化膜付きシリコン基板から成る。下部電極２は、基板１上の酸化膜１ｂの表面（すなわち、絶縁体の表面）に金属、半金属、炭素材、または半導体で形成された酸化電極である。表面電極４は、絶縁層３上に、下部電極２と同様、金属、半金属、または半導体から形成された還元電極である。下部電極２と表面電極４とから、作用電極対が構成されている。すなわち、下部電極２および表面電極４はいずれも作用電極として機能し、より詳細には、上述したように、下部電極２は酸化電極として、表面電極４は還元電極として機能する。なお、図１において、７は下部電極２の一端部に外部リードを接続するために開口された電極引出し用の開口部である。ここで微細孔とは絶縁層３と表面電極４を完全に貫通し、下部電極２の表面に到達する孔のことを指す。
【００１１】
上記のような電気化学測定用電極板を用いた電気化学測定装置においては、電流応答を得るために、下部電極２と表面電極４との間に電位を印加する。電気化学測定装置が下部電極２、表面電極４、対極（図示せず）の３つの電極で構成される場合、対極が試料用液中で示す電位をゼロとして、下部電極２−対極間、表面電極４−対極間に電位を印加する。また、電気化学測定装置が下部電極２、表面電極４、参照電極（図示せず）、補助電極（図示せず）の４つの電極で構成される場合、参照電極が試料液中で示す電位をゼロとして、下部電極２−参照電極間、表面電極４−参照電極間に電位を印加する。
【００１２】
特許文献４および非特許文献１においては、円筒形の微細孔５の間隔を、その径に対して大きく取った電気化学測定用電極板が提案され、それを用いた電気化学測定結果が報告されている。これらの文献においては、マクロ電極である表面電極４は、微小電極の集合体である下部電極２よりも大きな面積を有する。測定時には、下部電極２上で酸化反応を、そして表面電極４上で還元反応を起こしうる電位をそれぞれ印加する。これにより、下部電極２と表面電極４との間で自己誘発レドックスサイクルが発現し、見かけ上高い電流応答を得ることができると報告されている。
【００１３】
このようにして、試料液に存在する電子メディエータを介して、糖類などの目的物質を定量する。
【００１４】
なお、下部電極２に還元反応が起こる電位を印加し、上部電極４に酸化反応が起こる電位を印加しても、同様の自己誘発レドックスサイクルが発現する。
【００１５】
ここで、特許文献４、非特許文献１及び２に記載されている自己誘発レドックスサイクルを、図２を用いて説明する。
【００１６】
図２における自己誘発レドックスサイクルはふたつの作用電極、すなわち微小電極２１およびマクロ電極２２上で進行する。
【００１７】
微小電極２１の表面では、還元体２３の酸化反応が生じて酸化体２４が生成することにより、微小電極２１に酸化電流が流れる。
【００１８】
マクロ電極２２のうち微小電極２１に近い部分２２ａの表面では、酸化体２４が還元されて還元体２５となることにより、マクロ電極２２に還元電流が流れる。
【００１９】
さらに還元体２５が拡散して微小電極２１の表面に到達することにより、還元体２３から酸化体２４への酸化反応が再び起こり、微小電極２１に酸化電流が流れる。結果的にマクロ電極２２ａの表面では微小電極２１から生成した酸化体２４を還元して還元体２５とすることにより、微小電極２１表面に還元体２３を供給することができる。
【００２０】
これにより、微小電極２１とマクロ電極２２ａとの間で酸化反応と還元反応が循環するいわゆるレドックスサイクル反応が生じる結果、微小電極２１に定常的に電流が流れて、試料液中に微量に含まれる目的物質の検出および定量を行うことができる。
【００２１】
そして高感度測定の有効性を高めるために、微小電極２１を基板上により多数形成してレドックスサイクルが進行する酸化電極と還元電極とからなる電極対を、できる限り多く形成する。
【特許文献１】特許第２５５６９９３号公報（第６項、第１図）
【特許文献２】特許第２５６４０３０号公報（第７項、第２図）
【特許文献３】特開２００６−７８４０４号公報（第２５項、図１）
【特許文献４】特許第３２８９０５９号公報（第１６頁、図５）
【特許文献５】特開２００７−０１０４２９号公報（図３、図４）
【非特許文献１】Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３８巻，１２号，３５５１項（１９９１）
【非特許文献２】青木幸一ら著  「微小電極を用いる電気化学測定法」  （社）電子情報通信学会編  平成１０年２月１０日発行  ４８−４９，７０−７１項
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
図１に示されるように、還元電極として機能する表面電極４の面積が、酸化電極として機能する下部電極２の面積よりもずっと大きいことにより自己誘発レドックスサイクルが生じるが、これには次のような問題が生じる。
【００２３】
マクロ電極２２ａ上で生成した還元体２５は拡散するが、それは微小電極２１（図１における下部電極２に相当）に到達するだけでなく、図２の右側に示すように、その一部はマクロ電極２２（図２における表面電極４に相当）のうち微小電極２１から遠い部分２２ｂ上にも到達する。このような還元体２６は酸化反応により酸化体２７となる。すなわち、マクロ電極２２上では酸化反応も起こる（特開平３−２４６４６０号公報の第４図も参照）。
【００２４】
次に、この酸化体２７は拡散し、マクロ電極２２のうち微小電極２１に近い部分２２ｂ上に到達する。そこで還元反応により、還元体２５となる。還元体２５は拡散して微小電極２１表面に到達し再び酸化されて酸化体２４となる（あるいは、再度、マクロ電極２２のうち微小電極２１から遠い部分２２ｂに到達する）。
【００２５】
すなわち、図１の表面電極４上では酸化反応と還元反応が同時に起こることとなる。その結果、下部電極２で検出したい還元体の酸化が表面電極４の上でも同時に起こってしまう。
【００２６】
そのため、表面電極４で発生した還元体が効率的に下部電極２上で酸化せず、高感度化に課題を生じている。
【００２７】
さらに、図１に示されるように、基板の一方の面にのみ電気化学測定用電極板を構成した構造では、電極を形成し得る面積が限られ、これによっても高感度化に課題を生じていた。
【００２８】
この他、表面電極４はマクロ電極として作用するため電位印加時の充電電流が大きい。そのため、微小電極である下部電極２に比べて反応が定常状態に達する時間が長くなるという課題も生じていた。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記課題を解決する本発明に係る電気化学測定用電極板１０は、
絶縁体からなる基板３２と、
前記基板３２の上面に設けられた絶縁体からなる上層３１と、
前記基板３２の下面に設けられた絶縁体からなる下層３３と、
を備え、
前記基板３２は、前記基板３２の上面と前記上層３１との間に挟まれている複数の酸化電極３２Ｗと
前記基板３２の下面と前記下層３３との間に挟まれている複数の還元電極３２ｗと
を備え、
前記上層３１は、複数の上層開口部３１Ｗを有し、
前記各上層開口部３１Ｗからは、前記各酸化電極３２Ｗが露出しており、
前記下層３３は、複数の下層開口部３３ｗを有し、
前記各下層開口部３３ｗからは、前記各還元電極３２ｗが露出しており、
前記各酸化電極３２Ｗの上面から前記各還元電極３２ｗの下面にかけて貫通する複数の貫通孔３２Ｈが前記基板３２に設けられており、
前記各上層開口部３１Ｗの面積と、前記各下層開口部３３ｗの面積とは同一であり、
前記各上層開口部３１Ｗの面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部３３ｗの面積は１００００μｍ2以下である。
【００３０】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上であることが好ましい。
【００３１】
前記貫通孔の断面積は、１μｍ2以上２５００μｍ2以下であることが好ましい。
【００３２】
前記下層の厚みは、５μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。
【００３３】
この電気化学測定用電極板１０は、参照電極４２および補助電極４３と組み合わされるか、または対極と組み合わされ、電気化学測定装置を構成する。この電気化学測定装置もまた、本発明の趣旨に含まれる。
【００３４】
そして、この電気化学測定装置により、以下のような、電子メディエータを含有する試料液に含まれる目的物質を定量する方法もまた、本発明の趣旨に含まれる。
【００３５】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置により、試料液に含まれる目的物質を定量する方法であって、
前記方法は、以下の工程を包含する：
電子メディエータを含有する試料液を調製する工程、
前記電気化学測定用電極板を用意する工程、ここで
前記電気化学測定用電極板は、
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記上層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させるか、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触される接触工程、
前記酸化電極板に正電位を掃引し、かつ前記還元電極板に負電位を印加するか、あるいは前記酸化電極板に正電位を印加し、かつ前記還元電極板に負電位を掃引することによって、前記酸化電極板および前記還元電極のそれぞれに流れる電流を測定する電流測定工程、および
前記電流測定工程によって得られた電流から前記目的物質の量を算出する算出工程。
【００３６】
前記補助電極の表面積は、前記酸化電極の集合体の１０倍以上であることが好ましい。
【００３７】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタを設けても良い。
【００３８】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されていることが好ましい。
【００３９】
本発明により、生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板、およびこの電極板を有する電気化学測定装置、ならびにこの電極板を用いて目的物質を定量する方法が提供される。
【００４０】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００４２】
（実施の形態１）
図３は、本実施の形態１における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【００４３】
図３に示されるように、本実施の形態１に係る電気化学測定用電極板１０は、下側から順に、下層３３、基板３２、および上層３１が積層されていることにより構成されている。下層３３および上層３１は、いずれも絶縁体である。
【００４４】
基板３２は、絶縁体からなる基板本体３２Ｓからなり、この基板本体３２Ｓの上面に酸化電極板３２Ｅを備え、この基板本体３２Ｓの下面に還元電極板３２ｅを備えている。酸化電極板３２Ｅは、図３に示すように、基板本体３２Ｓと上層３１との間に挟まれている。同様に、還元電極板３２ｅは、基板本体３２Ｓと下層３３との間に挟まれている。
【００４５】
上層３１は、複数の上層開口部３１Ｗを有している。図３では、９つの上層開口部３１Ｗが設けられている。各上層開口部３１Ｗからは、酸化電極板３２Ｅの一部分が露出している。酸化電極板３２Ｅのうち、各上層開口部３１Ｗから露出している部分、すなわち、図３において、酸化電極板３２Ｅ上で斜線が施された部分が、試料液と接し、酸化電極３２Ｗとして機能する。図３では、９つの酸化電極３２Ｗが設けられている。酸化電極板３２Ｅのうち、上層３１が形成されている部分、すなわち、図３において、酸化電極板３２Ｅ上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液とは接することがない。よって、この部分は、酸化電極としては機能しない。
【００４６】
上層３１と同様に、下層３３もまた、複数の下層開口部３３Ｗを有している。図３では、９つの下層開口部３３Ｗが設けられている。各下層開口部３３Ｗからは、還元電極板３２ｅの一部分が露出している。還元電極板３２ｅのうち、各下層開口部３３ｗから露出している部分、すなわち、図３において、還元電極板３２ｅ上で斜線が施された部分が、還元電極３２ｗとして機能する。図３では、９つの還元電極３２ｗが設けられている。還元電極板３２ｅのうち、下層３３が形成されている部分、すなわち、図３において、還元電極板３２ｅ上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液とは接することがない。よって、この部分は、還元電極としては機能しない。
【００４７】
酸化電極板３２Ｅと還元電極板３２ｅにはそれぞれ独立して電位を印加することができ、それぞれの電極上で目的物質の電気化学反応、より具体的には酸化反応と還元反応とを進行させることができる。酸化電極３２Ｗ上における電気化学反応によって発生した電気信号は酸化電極板３２Ｅを伝わり、酸化電極リード３２Ｔを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。同様に還元電極３２ｗ上における電気化学反応によって発生した電気信号は還元電極板３２ｅを伝わり、還元電極リード３２ｔを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。
【００４８】
各酸化電極３２Ｗと各還元電極３２ｗとは、平面基板本体３２Ｓを間に挟んで重なり合っている。図３では、縦３列×横３行の酸化電極３２Ｗと、縦３列×横３行の還元電極３２ｗとが、基板本体３２Ｓを間に挟んで重なり合っている。
【００４９】
図３においては、説明を容易にするために、還元電極板３２ｅは、基板本体３２Ｓと分離して記載したが、実際には、還元電極板３２ｅは基板本体３２Ｓの下面に形成されている。
【００５０】
酸化電極板３２Ｅはその一端に酸化電極リード３２Ｔを有している。酸化電極板３２Ｅで得られた電気信号は酸化電極リード３２Ｔから取り出すことができる。還元電極板３２ｅも同様に還元電極リード３２ｔと電気的に同通しており、還元電極板３２ｅで得られた電気信号は還元電極リード３２ｔから取り出すことができる。
【００５１】
基板３２には複数の貫通孔３２Ｈが設けられている。そして、各貫通孔３２Ｈは、各酸化電極３２Ｗの上面から各還元電極３２ｗの下面にかけて貫通している。図３では、１つの酸化電極３２Ｗ、１つの貫通孔３２Ｈ、および１つの還元電極３２ｗからなる９つのセットが示されている。
【００５２】
貫通孔３２Ｈがなければ、後述する比較例１からも理解されるように、目的物質の定量を高感度に行い得ず、さらに定量時における定常状態に達するまでに多くの時間を要する。
【００５３】
各上層開口部３１Ｗの面積、すなわち、各酸化電極３２Ｗの面積は１００００μｍ2以下である。１００００μｍ2を超えると、図２の右側で示されるような望まれない反応が生じてしまい、結果的に、高感度化に課題を生じる。すなわち、後述する比較例２からも示されるように、目的物質の定量を高感度に行い得ず、さらに定量時における定常状態に達するまでに多くの時間を要する。同様に、各下層開口部３３ｗの面積、すなわち、各還元電極３２ｗの面積も１００００μｍ2以下である。
【００５４】
なお、各上層開口部３１Ｗの面積（すなわち、各酸化電極３２Ｗの面積）および各下層開口部３３ｗの面積（すなわち、各還元電極３２ｗの面積）の下限には特に限定はないが、２２５μｍ2以上であることが好ましい。
【００５５】
各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とは実質的に同一である。すなわち、複数個の上層開口部３１Ｗの面積はいずれも同一である。同様に、複数個の下層開口部３３Ｗの面積はいずれも同一である。そして、これらの上層開口部３１Ｗの面積と、これらの下層開口部３３Ｗの面積とは、いずれも同一である。各貫通孔３２Ｈの断面積は同一であることが好ましい。
【００５６】
各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とを同一にすることにより、定常状態になるまでに要する時間を短くすることができる。また、各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とが異なっている場合、図２に示すような反応が生じるため、高感度化が困難となるためである。
【００５７】
貫通孔３２Ｈの断面積は、当然、上層開口部３１Ｗの面積および下層開口部３３Ｗの面積のいずれよりも小さい。１つの酸化電極３２Ｗおよび１つの還元電極３２ｗのセットに対して、２つ以上の貫通孔３２Ｈを設けても良い。ただし、設計上は、１つの酸化電極３２Ｗおよび１つの還元電極３２ｗのセットに対して、１つの貫通孔３２Ｈで充分である。
【００５８】
貫通孔３２Ｈの断面積の大きさはなるべく小さいほうが、基板３２上に多くの貫通孔を形成することが可能となる。このことは酸化電極３２Ｗおよび還元電極３２ｗからなる電極対をより多く配置することが可能となるので好ましい。ただし、貫通孔３２Ｈの断面積を小さくすることによって、試料液に含まれる電子メディエータが孔を通り抜ける際のコンダクタンスが増加する傾向がある。一方、あまりにも断面積の値が大きすぎる貫通孔３２Ｈは、面積が１００００μｍ2以下でなければならない各酸化電極３２Ｗおよび各還元電極３２ｗの面積を意味もなく小さくしてしまうことにつながる。そのため、好ましい貫通孔３２Ｈの断面積の値は、１μｍ2以上２５００μｍ2以下である。
【００５９】
下層３３の厚みは５μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。隣接する還元電極３２ｗの間の距離は一般的に７μｍ程度であるので、下層３３の厚みが５μｍ未満である場合には、事実上、隣接する２以上の還元電極３２ｗが連続する１つの還元電極３２ｗとして機能してしまうことになる。そのため、図２の右側で示される望ましくない反応が生じやすくなる。
【００６０】
言い換えれば、下層３３の厚みが５μｍ未満である場合には、還元電極３２ｗで生じた還元型の電子メディエータが貫通孔３２Ｈを通って酸化電極３２Ｗに達するよりも、還元電極３２ｗで生じた還元対の電子メディエータは隣接する還元電極３２ｗ上で酸化されて酸化型のメディエータとなりやすい。一方、下層３３の厚みが１００μｍを超える場合には、正確な測定のために必要となる試料液の量が増えることになり、好ましいとは言えない。このことは、上層３１についても同様である。
【００６１】
基板本体３２Ｓの材料としては、例えば両面が酸化されたシリコン、ガラス、酸化アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、シリコン樹脂、ポリイミド及びその誘導体、エポキシ樹脂、高分子熱硬化物、感光性樹脂等を挙げることができる。
【００６２】
本発明の電気化学測定用電極板では、貫通孔３２Ｈが試料液の通り道となるため、試料液が水溶液である場合には、貫通孔３２Ｈの内壁が親水性であることが望ましい。そのため、基板本体３２Ｓとしては、シリコン基板、ガラス基板などの親水性表面を有する基板か、または親水性のポリエチレンテレフタレートあるいはポリエチレンナフタレート基板などのポリエステル材からなる基板を選択することが望ましい。疎水性を有する基板を使用する際には、エタノール、イソプロピルアルコールなどによって貫通孔３２Ｈの内壁に親水化処理を施すことが望ましい。
【００６３】
酸化電極板３２Ｅ（酸化電極リード３２Ｔを含む）の材料、および還元電極板３２ｅ（還元電極リード３２ｔを含む）の材料としては、電気伝導性を有する材料を挙げることができる。具体的には、金属として金、白金、パラジウム、銀、クロム、チタン、ニッケル、半導体としてｐ型シリコン、ｎ型シリコン、ｐ型ゲルマニウム、ｎ型ゲルマニウム、硫化カドミウム、二酸化チタン、酸化亜鉛、ガリウム燐、ガリウム砒素、インジウム燐、二砒化モリブデン、セレン化タングステン、二酸化銅、酸化スズ、酸化インジウム、インジウムスズ酸化物などを挙げることができる。その他、ケッシェンブラックなどの導電性カーボンを用いることができる。
【００６４】
これらの中でも電極材料として安定である金、白金、パラジウムを用いることが好ましい。これらの形成には蒸着、スパッタ等の成膜手法とエッチング手法を組み合わせた方法。マスクを用いたスクリーン印刷、レーザアブレーション法、または導電性インクを用いたスピンコート法、インクジェットプリント法による直接描画手法を用いることができる。
【００６５】
貫通孔３２Ｈの形成手法としては、ドライエッチング法、ウェットエッチング法、リフトオフ法、集束イオンビーム照射による加工法などにより電極形成済基板に穴を形成する手法が挙げられる。これに代えて、基板にメタルマスクを用いて貫通孔３２Ｈのパターニングをした後、基板を前記手法による孔形成加工を行うことによって形成しても良い。この他、貫通孔３２Ｈの凸型パターンを有する鋳型に基板を形成し、この基板に電極板を形成した後、鋳型を抜き取る方法。加熱した鋳型により電極板付の基板に貫通孔を形成したのち、鋳型を抜き取ることも考えられる。
【００６６】
上層開口部３１Ｗと下層開口部３３ｗを形成する手法としては、ドライエッチング法、ウェットエッチング法、リフトオフ法、集束イオンビーム照射による加工方法などにより絶縁体３１Ｉおよび絶縁体３３ｉに開口部を形成する手法を挙げることができる。また、ポジ型レジストやネガ型レジスト、ドライフィルムレジスト等の感光性樹脂材料を用いて遮光マスクと露光手法を組み合わせた方法により形成しても良い。
【００６７】
酸化電極板３２Ｅ（酸化電極リード３２Ｔを含む）、還元電極板３２ｅ（還元電極リード３２ｔを含む）、上層３１、下層３３をスピンコートによって形成する場合、コーターのワークテーブルには多孔体を用いてあるものを使うことが望ましい。これは基板本体３２Ｓの両面に電極板（酸化電極板３２Ｅと還元電極板３２ｅ）と絶縁層（上層３１と下層３３）を形成するため、基板を安定して固定するには多孔体による真空吸着法が、テフロン（登録商標）等の材料に数箇所吸着用の孔を設けたコーターヘッドを用いる場合に比べて、吸着固定する面積が大きくなるため好ましい。
【００６８】
なお、図３の構造は、特許文献５の図３・図４に記載された構造と類似しているが、特許文献５は細胞電位測定用容器を開示しているに過ぎず、酸化電極および還元電極を備えた電気化学測定用電極板、およびこの電極板を有する電気化学測定装置、ならびにこの電極板を用いて目的物質を定量する方法については、開示も示唆もしていない。
【００６９】
図４は、実施の形態１に係る電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置（以下、単に「測定装置」という）を示している。
【００７０】
図４に示すように、電気化学測定用電極板１０、参照電極４２、および補助電極４３を、試料液容器４４に満たされた試料液に浸す。これにより、これらの電極が試料液に接触する。また、電気化学測定用電極板１０の表面には、酸化電極３２Ｗが複数形成されて、酸化電極３２Ｗの集合体４１を形成している。図示していないが、電気化学測定用電極板１０の裏面には同様に還元電極３２ｗが集合体を形成している。
【００７１】
参照電極４４は電気化学測定用電極板１０に印加する電位の基準となる電極である。参照電極４４が試料液中で示す電位をゼロとして、酸化電極３２Ｗ、還元電極それぞれに電位を印加する。
【００７２】
補助電極４３は、測定装置においてアンペアの法則を成り立たせるために、電流を補償するための電極である。測定装置４５は、酸化電極リード３２Ｔおよび還元電極リード３２ｔを介して電気化学測定用電極板１０と電気的に接続しており、同様に参照電極４２、補助電極４３とも電気的に接続している。レコーダー４６により、測定装置４５から出力された電流応答が記録される。
【００７３】
（電気化学測定方法の説明）
次に、試料液に含まれる電子メディエータの定量方法を説明する。
【００７４】
サイクリックボルタンメトリー等の手法により、電子メディエータの酸化反応が進行する電位と還元反応が進行する電位を予め調べておいて、後に説明する酸化電極の電位の値と還元電極の電位の値に用いる。なお、電位の基準は参照電極４２が試料液中で示す平衡電位である。すなわち、酸化電極３２Ｗおよび還元電極３２ｗにそれぞれ印加される電位は、参照電極４２を０Ｖとした場合における相対的な電位である。
【００７５】
酸化電極３２Ｗと還元電極３２ｗの電位を制御装置４５に入力したのち、測定を開始する。後述する実施例では詳細に説明するが、具体的には、酸化電極３２Ｅに０Ｖから正電圧をゆっくりと印加する。後述する実施例では、酸化電極３２Ｅに印加される電圧を０Ｖから＋０．７Ｖにゆっくりと連続的に変化させている。なお、これを「掃引」と呼ぶ。すなわち、本明細書において用いられる用語「掃引」とは、連続的に電位を変化させることを意味している。これとは対照的に、本明細書において用いられる用語「印加」とは、あらかじめ定められた電位に急激に変化させることを意味している。
【００７６】
このとき、還元電極には参照電極と同一の電位（多くの場合、０Ｖ）を印加し続けることが好ましい。酸化電極３２Ｅに電圧を印加する速度（以下、「掃引速度」ということがある）は、一般的に５ｍＶ／秒以上５００ｍＶ／秒以下である。後述する実施例では、１００ｍＶ／秒である。
【００７７】
なお、上記の説明では、酸化電極板３２Ｅに正電位を掃引し、還元電極板３２ｅに負電位を印加している。しかし、酸化電極板３２Ｅに正電位を印加し、還元電極板３２ｅに負電位を掃引してもよい。
【００７８】
酸化電極３２Ｗにおける酸化反応で得られた電流は酸化電極リード３２Ｔを介して制御装置４５によって検出される。同様に還元電極における還元反応で得られた電流は還元電極リード３２ｔを介して制御装置４５によって検出される。検出された電流はレコーダー４６に出力され、記録された酸化電流値を標準試料の酸化電流値の測定結果（後述する検量線）と比較して、試料液中の検出対象物質を定量することができる。
【００７９】
レコーダー４６に記録された還元電流値を標準試料の還元電流測定結果と比較して試料液中の検出対象物質を定量することもできる。このためには、予め本実施の形態の検出装置を用いて標準試料の検量線を作成しておくことが望ましい。
【００８０】
ここで、検量線を用いた、試料液中の検出対象物質を定量する方法、すなわち、試料液中の検出対象物質の濃度を算出する方法について説明する。
【００８１】
まず、標準試料を準備する。この標準試料には、濃度既知の還元型電子メディエータ（ここでは、フェロシアン化カリウムと仮定する）が含まれている。この濃度既知の標準試料を試料液として用いて、図４に示すような電気化学測定装置により、還元型電子メディエータの濃度と、電気化学測定装置により測定された反応電流値との間の関係をグラフ化する。このグラフの一例を図１５に示す。
【００８２】
図１５に示されるように、ここでは、還元型の電子メディエータの濃度が１００μＭである場合には、反応電流値は１０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が３００μＭである場合には、反応電流値は３０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が５００μＭである場合には、反応電流値は５０μＡであったと仮定する。これらをグラフ上にプロットして、検量線を引く。このようにして、濃度既知の標準試料から、検量線を得る。
【００８３】
次に、濃度不知の試料液を用いて、図４に示すような電気化学測定装置により反応電流値を得る。ここで得られた反応電流値が２０μＡであった場合、検量線から、試料液に含まれる還元型の電子メディエータの濃度を知ることができる。この還元型の電子メディエータの濃度から、試料液に含まれる（あるいは、含まれていた）目的物質の量を算出する。
【００８４】
なお、実際には、検量線の作成や目的物質の量の算出などは、すべてコンピュータ上で行われることは言うまでもないだろう。
【００８５】
（参照電極、補助電極に関する説明）
参照電極４２と補助電極４３の２つの電極の代わりに、対極１つを用いて測定を行うことも可能である。しかし参照電極４２と補助電極４３は独立して設けることが好ましい。なぜなら、電位の基準となる参照電極もしくは対極に電流が流れる間には、その表面で電極反応が進行しており、反応進行に伴う電子メディエータの濃度変化が大きくなると本実施の形態の検出装置の基準としている電位が変動して正確な測定を行うことができないためである。
【００８６】
よって、参照電極４２には電流が流れ込まないように入力インピーダンスを極力大きく設定することが望ましい。望ましくはインピーダンスの値が１０の６乗オーム以上であることが望ましい。参照電極４２には銀塩化銀電極、飽和カロメル電極等を用いることができる。
【００８７】
補助電極４３の表面積は大きいことが望ましい。補助電極４３の好ましい表面積は酸化電極３２Ｗの集合体４１の１０倍以上である。その理由は、補助電極４３の電極表面積が小さくて十分な電流を流せない場合、電気化学測定用電極板１０で得られる電流が制御装置４５に十分流れ込まなくなり、正確な電流値を得られないことや、電流を流すために補助電極４３の電位が大きく変動して水の電気分解等望ましくない反応が進行する場合があるためである。
【００８８】
補助電極４３としては、電極自体の酸化還元反応や腐蝕反応が起こりにくい貴金属電極を使用することが望ましい。例えば、白金線に白金黒を析出させて大きな電極面積を持たせた白金電極が好ましい。
【００８９】
（実施の形態２）
図１１に示すように、本実施の形態２においては、上層３１の上面にメッシュ状のフィルタ１１１Ｍを設けている。
【００９０】
測定に用いる試料液として、血液から分離した血漿成分を用いる場合、分離しきれずに混入した血球成分、蛋白成分、固化した血栓などが、貫通孔３２Ｈを塞ぐ事がある。
【００９１】
これを防止するために、電極系外でフィルタによる濾過を経て試料液を電極に供給するが、これに加えて、上層３１に濾過機能を有するフィルタ１１１Ｍを形成することにより、血栓等によって貫通孔３２Ｈが塞がれることが防止される。
【００９２】
必要に応じて、下層３３の下側にフィルタ（図示せず）を設けても良い。
【００９３】
（実施の形態３）
図１３に示すように、本実施の形態３においては、酸化電極板３２Ｅ、還元電極板３２ｅだけでなく、参照電極１３１Ｅ、補助電極１３３ｅを一体に形成しても良い。この構成では、図４に示すような参照電極４２および補助電極４３を付加する必要がなくなるため、装置を小型化できる。
【００９４】
参照電極１３１Ｅは、上層３１の上面に形成することが好ましい。参照電極１３３ｅは、下層３３の下面に形成することが好ましい。
【００９５】
なお、実施の形態２に示されるフィルタがこの実施の形態３に示される電気化学測定用電極板に設けられる場合には、フィルタ１１１Ｍの上に参照電極１３１Ｅを設けても良いし、逆にフィルタ１１１Ｍの下に参照電極１３１Ｅを設けても良い。
【００９６】
実施の形態１〜３の説明においては、便宜上、酸化電極３２Ｗが基板本体３２Ｓの上側に、還元電極３２ｗが基板本体３２Ｓの下側に設けられていることとした。これは、説明を容易にするためにすぎない。各図面に示されている電気化学測定用電極板をひっくり返した場合であっても、本発明に含まれることは言うまでもない。実施の形態３における参照電極１３１Ｅおよび補助電極１３３ｅについても同様である。すなわち、参照電極Ｅ１３１は下層３３の下側に設けられ、補助電極１３３ｅは上層３１の上側に設けられていても良い。
【００９７】
（実施例）
以下、実施例および比較例により、本発明をさらにより詳細に説明する。
【００９８】
（実施例１）
図５は本発明の実施例１における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。なお、図５から図１０まで、図１２、および図１４には１つの貫通孔３２Ｈしか表されていないが、実際には各実施例・比較例において説明されている数の貫通孔３２Ｈが設けられた。
【００９９】
まず、図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、１μｍのＳｉＯ2膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）からなる基板５０の上面に、以下のように、スパッタ法により酸化電極板５１を形成した。
【０１００】
すなわち、基板５０をスパッタ装置（株式会社  アルバック製）内の所定位置に取り付けた後、クロム及び金を順次成膜した。具体的には、圧力１．３Ｐａ，アルゴン雰囲気で、クロム１０秒，金：５０秒間スパッタを行い全体で１３０ｎｍの膜厚とした。これにより酸化電極板５１を形成した。
【０１０１】
次に、図５（ｃ）に示すように、基板５０の下面に、酸化電極板５１と同様に、還元電極板５２を形成した。
【０１０２】
さらに、図５（ｄ）に示すように、酸化電極板５１上に上層５３および上層開口部５４を、以下のように形成した。すなわち、酸化電極板５１の上面に、スピンコート法により感光性樹脂材料（化薬マイクロケム株式会社製：ＳＵ−８  ２０００）を厚みが２μｍとなるように塗布した。そして、７０℃３０分間ベーキングした後、上層開口部５４のパターンを有するクロムマスクを用いて６０秒間、密着露光することにより、マスクパターンを樹脂材料に転写した。この後、現像液中にて２０℃、３００秒間現像を行い、水洗、乾燥してマトリックス状の上層開口部５４を上層５３に形成した。
【０１０３】
ここで、実施例１における上層開口部５４について詳しく説明する。この上層開口部５４は正方形であった。その一辺は１５μｍであり、面積は２２５μｍ2であった。上層開口部５４の個数は１００００個であり、隣接する上層開口部５４の中心点の間の距離は１８μｍであった。
【０１０４】
図５（ｅ）に示すように、上層開口部５４を形成した手順と同様に、還元電極板５２の下側に下層５５および下側開口部５６を形成した。
【０１０５】
次に、酸化電極板５１をエッチングすることにより、以下のように上側孔５７を形成した。すなわち、酸化電極板５１上に厚み４〜５μｍのレジスト材（東京応化工業株式会社製：ＴＳＭＲ−８９００ＬＢ）を塗布した。このレジストを塗布した基板５０をオーブン中にいれ、プレベーキング工程を１００℃・３０分、ポストベーキング工程を１２０℃・３０分の条件にて行った。その後、孔５７のパターンを有するクロムマスクを用いて、マスクアライナー（ミカサ株式会社製）により６０秒間、密着露光した。次に現像液中にて２５℃１２０秒間現像を行い、水洗、乾燥してマスクパターンをレジストに転写した。
【０１０６】
次に、図５（ｆ）に示すように、基板をアルゴンミリング装置に入れ、アルゴンガスの流量１２ｓｃｃｍ、圧力０．０３Ｐａ、ビーム電流９０ｍＡの条件で金およびクロムからなる酸化電極板３１Ｅを順次エッチングした。これにより、基板に複数の上側孔５７を形成した。形成された上側孔５７は円形であり、その面積は７８．５μｍ2であった。基板５０に形成された上側孔５７の個数は１００００個であった。なお、各上側孔５７の中心は上側開口部５４の中心と一致するよう形成した。
【０１０７】
さらに、図５（ｇ）に示すように、酸化電極板５１に上側孔５７を形成した手順と全く同様に、還元電極板５２に下側孔５８を形成した。
【０１０８】
最後に、図５（ｈ）に示されるように、次に上側孔５７および下側孔５８を形成した基板５０を反応性イオンエッチング装置に入れ、下側孔５８をマスクパターンとし、Ｃ2Ｆ6ガスの流量を２５ｓｃｃｍ、圧力０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件で１５分間、基板５０をエッチングした。これにより、基板５０に多数の貫通孔５９が形成された（図５（ｈ））。
【０１０９】
このようにして、実施例１に係る電気化学測定用電極板を得た。
【０１１０】
（比較例１）
比較のために、従来の電気化学測定用電極板を作製した。以下にその作製手順を示す。
【０１１１】
図６に示すように、基板６０として１μｍのＳｉＯ2膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）の上面に、クロムおよび金をからなる下部電極６１を成膜した。成膜条件は図５（ｂ）と同一とした。
【０１１２】
次に、図６（ｃ）に示すように、下部電極６１の上面にプラズマＣＶＤ装置（株式会社アルバック製）を用いて、厚み４３０ｎｍのＳｉＯ2からなる絶縁層６２を堆積した。
成膜条件は、シランガス流量１０ｓｃｃｍ、Ｎ2Ｏガス流量２００ｓｃｃｍ、圧力８０Ｐａ，パワー５０Ｗ、基板温度３００℃とした。
【０１１３】
さらに、図６（ｄ）に示すように、クロムおよび金をからなる表面電極６３を成膜した。成膜条件は図５（ｂ）と同一とした。
【０１１４】
次に、図６（ｅ）に示すように表面電極６３の上面に、厚み２〜３μｍのレジスト材６４を塗布し、現像、水洗、乾燥してマスクパターンをレジスト６４に転写した。用いたレジストおよびレジストパターン形成の条件は、図５（ｄ）に関する説明と同一とした。
【０１１５】
その後、図６（ｆ）に示すように、微細孔６５を形成した。レジスト６４が形成されていない部分、すなわち、露出している表面電極６３の部分を、アルゴンミリング装置を用いて順次エッチングした。アルゴンミリングの条件は、アルゴンガスの流量１２ｓｃｃｍ、圧力０．０３Ｐａ、ビーム電流９０ｍＡとした。
【０１１６】
最後に反応性イオンエッチング装置を用いて、絶縁層６２に多数の微細孔６５を形成した。反応性イオンエッチングの条件は、Ｃ2Ｆ6ガスの流量：２５ｓｃｃｍ、圧力：０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件とした。
【０１１７】
ここで、比較例１における微細孔６５について詳しく説明する。この微細孔６５は円形であった。その直径は１０μｍであり、面積は７８．５μｍ2であった。微細孔６５の個数は１００００個であり、隣接する微細孔６５の中心点の間の距離は７０μｍであった。なお、この微細孔６５は図６（ｆ）に示されるように、下部電極６１、基板６０を貫通していなかった。
【０１１８】
（実施例１および比較例１に係る電気化学測定）
実施例１および比較例に係る電気化学測定用電極板を用いて、図４に示すように、電気化学測定装置を組み立て、電子メディエータの定量評価を行った。
【０１１９】
１ｍＭのフェロシアン化カリウムおよび１ｍＭのフェリシアン化カリウム（合計２ｍＭ）を、５０ｍＭの支持電解質（塩化カリウム）を含有する水溶液に添加することによって、試料液を調製した。
【０１２０】
参照電極として銀／塩化銀電極（ＢＡＳ株式会社製）を用いた。なお、以下、酸化電極の電位や還元電極の電位は、全てこの参照電極として用いた銀／塩化銀電極に対する電位である。
【０１２１】
実施例１に係る電気化学測定用電極板をバイポテンシオスタット（ＣＨ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製：ＡＬＳ７４０Ａ）にリード線を介して接続した。酸化電極板５１の電位を０Ｖ、還元電極板５２の電位を０Ｖ、酸化電極板５１の電位の掃引速度を１００ｍＶ／ｓに設定した後、最終的に酸化電極板５１の電位が＋０．７Ｖになるまで、サイクリックボルタンメトリー法により酸化電極板５１に流れる、反応電流を計測した。その反応は化１に示すフェロシアン化カリウムの酸化反応である。
【０１２２】
酸化電極板５１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は３９．８μＡであった。
【０１２３】
同様に、比較例１に係る電気化学測定用電極板を用いて、酸化電極として機能する下部電極２の電位を、０から＋０．７Ｖまで掃引速度１００ｍＶ／ｓで掃引した。還元電極として機能する表面電極４の電位は０Ｖに設定した。
【０１２４】
その結果、下部電極においても化１に示すフェロシアン化カリウムの酸化反応に伴う酸化電流が観測された。下部電極６１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は２２．５μＡであった。
【０１２５】
【化１】
2009013876.tif 000021
【０１２６】
実施例１および比較例１の実験結果を、以下の表１にまとめて示す。
【０１２７】
【表１】
2009013876.tif 000022
【０１２８】
これは図２の自己誘発レドックスサイクルの説明図に当てはめて考えてみると、比較例１における微小電極から遠い部分のマクロ電極２２ｂで酸化されていたフェロシアン化カリウムが微小電極２１上の酸化反応に用いられなかったのに対し、実施例１においては全てのフェロシアン化カリウムは微小電極２１上でのみ酸化されたため、酸化反応の電流値が効率的に増加したものと考えられる。
【０１２９】
本実施例の電気化学測定用電極板においては同一形状と面積を有する微小電極対を基板上に多数配列した。それにより、それぞれの電極対同士で反応面積が揃い、上記のようなマクロ電極上のフェロシアン化カリウムの反応が起こらなくなったあるいは著しく減少したと考えられる。これにより、両極間で効率的なレドックスサイクル反応が進行したと考えられる。
【０１３０】
また、比較例１の微小電極を構成する下部電極６１および実施例１の電気化学測定用電極を構成する酸化電極板５１に対して、＋０．４Ｖの電位を印加して得られる酸化電流の時間依存性を評価した。実施例１の還元電極板５２の電位および比較例１の表面電極６３の電位は０Ｖに保った。
【０１３１】
その結果、実施例１の酸化電流値は６秒で定常状態に達したが、比較例１の酸化電流値が定常状態に達するのに２６秒要した（表２）。このことは、比較例１の下部電極に比べて、上部電極の面積が大きいために定常状態に達する時間が必要であったのに対し、実施例１の酸化電極は同一面積を有する還元電極と電極対を形成したため、両極間で即座に定常状態に達したと考えられる。
【０１３２】
【表２】
2009013876.tif 000023
【０１３３】
以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１３４】
（比較例２）
実施例１における上層開口部５４および下層開口部５６の面積が、電子メディエータの定量評価に及ぼす影響を検証するために、以下の手順にて比較例２に係る電気化学測定用電極板を作製した。
【０１３５】
基本的な作製手順は図５と同一であるので、相違点のみ説明する。比較例２では、正方形の上層開口部５４の一辺は１０００μｍであり、面積は１００００００μｍ2であった。上層開口部５４の個数は１０個であり、隣接する上層開口部５４の中心点の間の距離は１５００μｍであった。
【０１３６】
この電極を用いて、実施例１と同様にサイクリックボルタンメトリー法による反応電流の計測を行ったところ、酸化電極板５１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は２０．７μＡであった。同様に、酸化電流の時間依存性も評価した。比較例２の酸化電極に流れる電流が定常状態に達するのに３５秒要した（表２）。
【０１３７】
このことは、本発明の電気化学測定用電極板に設ける開口部の面積が１００００００μｍ2と大きな場合、図２で示したような還元電極上において酸化電極から近い部分と遠い部分とが生じ、酸化電極で酸化するべき還元体が還元電極上で反応してしまったために、酸化電極上で効率的な反応が起こらなかったと推測される。
【０１３８】
(実施例２)
図７は本発明の実施例２における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。酸化電極板５１と還元電極板５２の形成工程（ａ〜ｃ）までは実施例１と同様に行った。
【０１３９】
次に実施例１で用いた手順により、参加電極板５１、基板５０、還元電極板５２を順次エッチングし、断面積１００μｍ2の貫通孔５９を５０００個等間隔になるように形成した（ｃ〜ｅ）。
【０１４０】
次に酸化電極板５１の上側に上層５３と上層開口部５４を形成した。また、還元電極板５２の下層に、下層５５と下層開口部５６を形成した。
【０１４１】
上層５３と下層５５の材料には、厚み５μｍのドライフィルムレジスト（旭化成工業株式会社製  サンフォート）を用いた。上層開口部５４と下層開口部５６は各５０００個形成した。それらの開口部の断面積は９００μｍ2であった。上層開口部と下層開口部の形成方法は実施例１と同様であった（ｆ〜ｉ））。
【０１４２】
以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。
【０１４３】
本実施例の電気化学測定用電極板を用いて実施例１と同様の試験を行った。表１に示すように酸化電極５１で観測された電流値は、比較例１における下部電極６１のそれより大きかった。さらに表２に示すように酸化電極５１で観測された電流値が定常状態到達に要した時間は１０秒と比較例１のそれより短かった。
【０１４４】
以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１４５】
(実施例３)
図８は実施例３における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。本実施例においては実施例１と同様の酸化電極板５１と還元電極板５２の形成工程（ｂ１，ｂ２）、上層および下層形成工程（ｃ１，ｃ２）、上層開口部および下層開口部形成工程（ｄ１，ｄ２）、上側貫通孔および下側貫通孔形成工程（ｅ１，ｅ２，ｆ１，ｆ２）を経た。その結果、酸化電極形成基板８０Ａ、還元電極形成基板８０Ｂを形成した。
【０１４６】
前記２つの基板をそれぞれの下面で貼り合わせることにより、本実施例の電気化学測定用電極板を得た（ｇ)。上層開口部５４および下層開口部５６の断面積は９００μｍ2で、それを１０００個等間隔に形成した。貫通孔５９の断面積は３１４μｍ2であった。
【０１４７】
本実施例の電気化学測定用電極を用いて実施例１と同様の試験を行った結果、表１に示すように実施例１と同様の結果が得られた。以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１４８】
(実施例４) 
図９は実施例４における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。絶縁性の基板５０には厚さ０．５ｍｍの熱硬化性のフェノール樹脂材料（ＰＭ−８２００  住友ベークライト製）を用いた。前記基板に酸化電極板５１と還元電極板５２を形成した（ａ〜ｃ）。
【０１４９】
次に前記の電極板形成済基板の貫通孔形成加工を行った。モールド９０を１６０℃に加熱し、還元電極板５２の下面から酸化電極５１の上面を完全に貫通したところでそのままの温度で１０分間保持した（ｄ）。次に、室温まで５℃／分で徐冷したのち、室温で１０分間保持した。次に、モールド９０を抜き取ることにより、貫通孔５９を１０００個形成した。それらの貫通孔の断面積は３１４μｍ2だった（ｅ）。
【０１５０】
次に実施例２と同様の手順により上層５３と上層開口部５４、下層５５と下層開口部５６を１０００個形成した（ｆ〜ｉ）。それらの開口部の面積は６４００μｍ2であった。これにより、本実施例の電気化学測定用電極板を得た。
【０１５１】
本実施例の電気化学測定用電極板を用いて実施例１と同様の試験を行った結果、表１に示すように実施例１と同様の結果が得られた。以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１５２】
(実施例５)
図１０は実施例５における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。基板５０は１μｍのＳｉＯ２  膜を表面に形成した直径４インチ、厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）を用いた。
【０１５３】
その両面にチタンを１０ｎｍ全面成膜した。次に、その下面をスピンコーターのワークテーブル１００に真空吸着により、固定した（ａ）。ワークテーブル１００はポーラスチャック（株式会社  吉岡精工製）を用いた。その吸着部は焼結したアルミナ多孔体で形成されていた。
【０１５４】
前記基板５０の上面に直径５ｎｍのパラジウム粒子分散液（溶媒:ヘキサン）を厚さ５００ｎｍとなるように全面塗布した。次に排気設備付の電気炉にて３００℃、３時間焼成を行い、酸化電極５１を形成した。続いて下面にも同様にパラジウム粒子分散液を塗布、焼成を経て還元電極５２を形成した（ｂ)。
【０１５５】
次に実施例１と同様の手順により、貫通孔５９を１０００個形成した。貫通孔の断面積は２５００μｍ2であった（ｃ〜ｅ）。
【０１５６】
次いで実施例２と同様の手順での上層５３と上層開口部５４、下層５５と下層開口部５６を１０００個形成した。開口部の断面積は１０００μｍ2であった（ｆ〜ｉ）。以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。
【０１５７】
得られた電気化学測定用電極板の酸化電極表面及び還元電極表面を、原子間力顕微鏡により観察した。その結果、酸化電極表面及び還元電極表面におよそ直径５０ｎｍのグレインが凝集した構造が確認できた。一方、成膜手法を用いて作製したパラジウム電極表面は、基板の研磨において形成された研磨傷を反映した形状のみ観測され、グレイン構造は確認できなかった。
【０１５８】
ここから本実施例の電気化学測定用電極板の酸化電極表面積の見積もりを行った。単純に基板５０の表面を直径５０ｎｍのパラジウム粒子の半球が覆いつくしたと仮定すると、半球の表面積の総和は幾何面積のおよそ３０倍となった。成膜手法で作製した電極表面はほとんど平坦であったため、その面積はほぼ貴下面積と一致する。よって、本実施例の電気化学測定用電極板は成膜手法で作製した電極よりも広い電極面積を有することが分かった。このことは電極の反応面積が増大することにつながる。これにより、本発明の電気化学測定用電極板が好ましい性質を有することが認められた。
【０１５９】
次に図１２を用いて実施の形態２の電気化学測定用電極板の作製工程を述べる。
（実施例６）
図１２は実施例６における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。実施例１の手順を用いて基板５０に酸化電極板５１、還元電極板５２、上層５３、上層開口部５４、下層５５、下層開口部５６、貫通孔５９を形成した。貫通孔の断面積は１００μｍ2、開口部の断面積は１００００μｍ2、それぞれ２５００個形成した（ａ〜ｉ）。
【０１６０】
最後にボロシリケートファイバーグラスからなる口径４２μｍのフィルタ１１３Ｍ(日本ミリポア株式会社製)を所定の大きさにカットしたのち、上層５３上にシリコン接着剤を用いて固定した（ｊ）。
【０１６１】
以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。
【０１６２】
血液中の血漿成分を本実施例の電気化学測定用電極板に挿入した結果、分離しきれなかった血球成分、蛋白成分、血栓がフィルタ１１３Ｍにトラップされ、血漿成分のみが上層開口部５４、貫通孔５９を経て下層開口部まで供給された。一方、フィルタ１１３Ｍを形成しなかった同形状の電気化学用測定電極板は一部血栓により塞がれたため、貫通孔５９が機能を果たさなくなった。これらは目視により確認した。以上の結果から、本実施の形態の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１６３】
次に図１４を用いて実施の形態３の電気化学測定用電極板の作製工程を述べる。
【０１６４】
（実施例７）
図１４は実施例７における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。実施例１の手順を用いて基板５０に酸化電極板５１、還元電極板５２、上層５３、上層開口部５４、下層５５、下層開口部５６、貫通孔５９を形成した。貫通孔の断面積は１００μｍ2、開口部の断面積は２５００μｍ2とし、それぞれ５０００個形成した（ａ〜ｉ）。
【０１６５】
次に上層５３と下層５５にメタルマスクを被せて白金を１００ｎｍ成膜した（ｊ）。メタルマスクを除いた後、上層５３に形成した白金薄膜へ、リード部分を残して銀塩化銀インク（ビーエーエス株式会社製）を塗布した。その後、４０℃３０分間電気炉中にて乾燥を行い、参照電極１３１Ｅを得た。続いて平均粒径１．０〜１０．０μｍの白金粉末(田中貴金属工業株式会社製)をエタノール中に分散してスラリーを作製した。作製したスラリーを下層５５上に形成した白金薄膜へ、リード部分を残して塗布および乾燥を行い、補助電極１３３ｅを得た。以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。
【０１６６】
本実施例で作製した電気化学測定用電極板と比較例１のそれを用いて、電気化学測定装置を組み上げた。その際、本実施例の電気化学測定用電極板は厚みが０．５ｍｍ程度であるのに対し、比較例１のそれは外部から参照電極と補助電極を導入したため、厚みが５ｃｍ程度となった。そのことにより、測定に用いる試料液の量は数１０００倍に増加した。      
【０１６７】
このことは測定に必要な電極を電極板上に一体形成したことにより、小型化が求められる各種センサ用電極として好適な構成となったことを示す。よって、本実施例の電気化学測定用電極板は小型センサ用電極として適することが分かった。
【０１６８】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明の電気化学測定用電極板は、高いレドックスサイクル効果を有し、グルコースセンサに代表される生体物質等微量成分のセンシングデバイスを構成する電極として有用である。またクロマトグラフィーの検出器を構成する電極の用途等にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、特許文献１に記載の従来の電気化学測定用電極板の（Ａ）全体斜視図（Ｂ）拡大斜視図である。
【図２】図２は、特許文献４、非特許文献１および２に記載の自己誘発レドックスサイクルのメカニズムを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図４】図４は、本発明の実施の形態１に係る電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置の概略図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図６】図６は、本発明の比較例１における従来の電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図７】図７は、本発明の実施例２における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図８】図８は、本発明の実施例３における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図９】図９は、本発明の実施例４における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例５における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例６における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１３】図１３は、本発明の実施の形態３における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図１４】図１４は、本発明の実施例７における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１５】図１５は、検量線の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１７１】
１  基板
１ａ  シリコン基板
１ｂ  酸化膜
２  下部電極
３  絶縁膜（ＳｉＯ2膜）
４  酸化電極
５  微細孔
７  下部電極２の開口部
１０  電気化学測定用電極板
２１  微小電極
２２  マクロ電極（微小電極近傍）
２３  マクロ電極（微小電極遠方)
２４  還元体１
２５  酸化体１
２６  還元体２
２７  還元体３
２８  酸化体２
３１  上層
３１Ｉ  絶縁体
３１Ｗ  上層開口部
３２  基板
３２Ｓ  基板本体
３２Ｅ  酸化電極板
３２Ｈ  貫通孔
３２Ｔ  酸化電極リード
３２Ｗ  酸化電極
３２ｅ  還元電極板
３２ｔ  還元電極リード
３２ｗ  還元電極
３３  下層
３３ｉ  絶縁体
３３ｗ  下層開口部
４１  酸化電極３２Ｗの集合体
４２  参照電極
４３  補助電極
４４  試料液容器
４５  制御装置
４６  レコーダー
５０  基板
５１  酸化電極
５２  還元電極
５３  上層
５４  上層開口部
５５  下層
５６  下層開口部
５７  上側孔
５８  下側孔
５９  貫通孔
６０  基板
６１  下部電極
６２  絶縁層
６３  表面電極
６４  レジスト
６５  微細孔
８０ａ  基板（酸化電極側）
８０ｂ  基板（還元電極側）
８０Ａ  酸化電極形成基板
８０Ｂ  還元電極形成基板
９０  モールド
１００  ワークテーブル
１１１Ｍ  フィルタ
１３１Ｅ  参照電極
１３１Ｔ  参照電極リード
１３３ｅ  補助電極
１３３ｔ  補助電極リード
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2009013876.tif 000024
【図２】
2009013876.tif 000025
【図３】
2009013876.tif 000026
【図４】
2009013876.tif 000027
【図５】
2009013876.tif 000028
【図６】
2009013876.tif 000029
【図７】
2009013876.tif 000030
【図８】
2009013876.tif 000031
【図９】
2009013876.tif 000032
【図１０】
2009013876.tif 000033
【図１１】
2009013876.tif 000034
【図１２】
2009013876.tif 000035
【図１３】
2009013876.tif 000036
【図１４】
2009013876.tif 000037
【図１５】
2009013876.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月15日(2009.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下である
電気化学測定用電極板。
【請求項２】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項３】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項４】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
【請求項５】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置であって、
前記電気化学測定用電極板は、
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下である、
電気化学測定装置。
【請求項６】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項７】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項８】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項９】
前記補助電極の表面積が前記酸化電極の集合体の１０倍以上である、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１０】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタが設けられている、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１１】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されている、請求項５に記載の電気化学測定装置。
【請求項１２】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置により、試料液に含まれる目的物質を定量する方法であって、
前記方法は、以下の工程を包含する：
電子メディエータを含有する試料液を調製する工程、
前記電気化学測定用電極板を用意する工程、ここで
前記電気化学測定用電極板は、
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させるか、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させる接触工程、
前記酸化電極板に正電位を掃引し、かつ前記還元電極板に負電位を印加するか、あるいは前記酸化電極板に正電位を印加し、かつ前記還元電極板に負電位を掃引することによって、前記酸化電極板および前記還元電極のそれぞれに流れる電流を測定する電流測定工程、および
前記電流測定工程によって得られた電流から前記目的物質の量を算出する算出工程。
【請求項１３】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、
前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上である
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記貫通孔の断面積が１μｍ2以上２５００μｍ2以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記下層の厚みが５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記補助電極の表面積が前記酸化電極の集合体の１０倍以上である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタが設けられている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されている、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素が有する特異的触媒作用と電極反応活性を有する電子メディエータとを組み合わせ、生体中の血液に含まれるスクロース、グルコースなどの糖類の濃度を定量する電気化学測定用電極板が開発されている。
【０００３】
このような電気化学測定用電極板では、糖類と酵素の反応を利用して、電気化学的に糖類の濃度を定量する。まず、血液サンプルに酵素と電子メディエータとを混合して試料液を作成したのち、糖類と酵素との間で酵素反応をさせた後、それらに共存させた電子メディエータを電気化学的に測定することによって、電子メディエータを介して間接的に試料液中に含まれる糖類を定量する。
【０００４】
この方法は酵素の反応が糖類に対する特異性が高く、操作時の温度の影響が小さく、定量装置の機構も簡便であるため、この方法を用いることにより、一般の人々が家庭などで簡易に自己の血液中の糖類の濃度を定量することができる。
【０００５】
電気化学測定用電極板は、生体に含まれる微量溶液サンプルの分析に適している。そのため、電気化学測定用電極板は、様々な有機材料または無機材料と組み合わせてセンサなどへの応用が試みられている。電気化学測定用電極板の電極応答速度は、電気化学測定用電極板が有する微小電極の面積が減少するにしたがって高くなるため、様々な電極形状、電極の微細化が検討されている。
【０００６】
しかし、電極面積の減少に伴い、得られる電流値は減少する。例えば、電極面積を数百μｍ2程度まで微細化すると、検出できる電流値は数十〜数ｎＡオーダーまで低下する。そのため、測定時にノイズ応答の増加や感度低下が発生する。そこで、これらの不具合を解消するため、複数の微小電極を集積した電気化学測定用電極板が特許文献１〜４で検討されている。
【０００７】
特許文献１〜４では、隣接する微小電極との間の距離を一定に保つ微小電極を、多量に再現性良く基板上に作製する方法が提案されている。
【０００８】
図１は、特許文献１に記載された従来の電気化学測定用電極板の構成を示している。
【０００９】
この電気化学測定用電極板１０は、絶縁性の基板１／酸化電極として機能する下部電極２／絶縁層３／還元電極として機能する表面電極４が積層されてなる。表面電極４の表面には円筒形の多数の微細孔５が形成されており、この微細孔５には下部電極２の表面が露出している。
【００１０】
絶縁性の基板１は、例えばシリコン基板１ａの主表面に酸化膜１ｂが被着された、いわゆる酸化膜付きシリコン基板から成る。下部電極２は、基板１上の酸化膜１ｂの表面（すなわち、絶縁体の表面）に金属、半金属、炭素材、または半導体で形成された酸化電極である。表面電極４は、絶縁層３上に、下部電極２と同様、金属、半金属、または半導体から形成された還元電極である。下部電極２と表面電極４とから、作用電極対が構成されている。すなわち、下部電極２および表面電極４はいずれも作用電極として機能し、より詳細には、上述したように、下部電極２は酸化電極として、表面電極４は還元電極として機能する。なお、図１において、７は下部電極２の一端部に外部リードを接続するために開口された電極引出し用の開口部である。ここで微細孔とは絶縁層３と表面電極４を完全に貫通し、下部電極２の表面に到達する孔のことを指す。
【００１１】
上記のような電気化学測定用電極板を用いた電気化学測定装置においては、電流応答を得るために、下部電極２と表面電極４との間に電位を印加する。電気化学測定装置が下部電極２、表面電極４、対極（図示せず）の３つの電極で構成される場合、対極が試料用液中で示す電位をゼロとして、下部電極２−対極間、表面電極４−対極間に電位を印加する。また、電気化学測定装置が下部電極２、表面電極４、参照電極（図示せず）、補助電極（図示せず）の４つの電極で構成される場合、参照電極が試料液中で示す電位をゼロとして、下部電極２−参照電極間、表面電極４−参照電極間に電位を印加する。
【００１２】
特許文献４および非特許文献１においては、円筒形の微細孔５の間隔を、その径に対して大きく取った電気化学測定用電極板が提案され、それを用いた電気化学測定結果が報告されている。これらの文献においては、マクロ電極である表面電極４は、微小電極の集合体である下部電極２よりも大きな面積を有する。測定時には、下部電極２上で酸化反応を、そして表面電極４上で還元反応を起こしうる電位をそれぞれ印加する。これにより、下部電極２と表面電極４との間で自己誘発レドックスサイクルが発現し、見かけ上高い電流応答を得ることができると報告されている。
【００１３】
このようにして、試料液に存在する電子メディエータを介して、糖類などの目的物質を定量する。
【００１４】
なお、下部電極２に還元反応が起こる電位を印加し、上部電極４に酸化反応が起こる電位を印加しても、同様の自己誘発レドックスサイクルが発現する。
【００１５】
ここで、特許文献４、非特許文献１及び２に記載されている自己誘発レドックスサイクルを、図２を用いて説明する。
【００１６】
図２における自己誘発レドックスサイクルはふたつの作用電極、すなわち微小電極２１およびマクロ電極２２上で進行する。
【００１７】
微小電極２１の表面では、還元体２３の酸化反応が生じて酸化体２４が生成することにより、微小電極２１に酸化電流が流れる。
【００１８】
マクロ電極２２のうち微小電極２１に近い部分２２ａの表面では、酸化体２４が還元されて還元体２５となることにより、マクロ電極２２に還元電流が流れる。
【００１９】
さらに還元体２５が拡散して微小電極２１の表面に到達することにより、還元体２３から酸化体２４への酸化反応が再び起こり、微小電極２１に酸化電流が流れる。結果的にマクロ電極２２ａの表面では微小電極２１から生成した酸化体２４を還元して還元体２５とすることにより、微小電極２１表面に還元体２３を供給することができる。
【００２０】
これにより、微小電極２１とマクロ電極２２ａとの間で酸化反応と還元反応が循環するいわゆるレドックスサイクル反応が生じる結果、微小電極２１に定常的に電流が流れて、試料液中に微量に含まれる目的物質の検出および定量を行うことができる。
【００２１】
そして高感度測定の有効性を高めるために、微小電極２１を基板上により多数形成してレドックスサイクルが進行する酸化電極と還元電極とからなる電極対を、できる限り多く形成する。
【特許文献１】特許第２５５６９９３号公報（第６項、第１図）
【特許文献２】特許第２５６４０３０号公報（第７項、第２図）
【特許文献３】特開２００６−７８４０４号公報（第２５項、図１）
【特許文献４】特許第３２８９０５９号公報（第１６頁、図５）
【特許文献５】特開２００７−０１０４２９号公報（図３、図４）
【非特許文献１】Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３８巻，１２号，３５５１項（１９９１）
【非特許文献２】青木幸一ら著  「微小電極を用いる電気化学測定法」  （社）電子情報通信学会編  平成１０年２月１０日発行  ４８−４９，７０−７１項
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
図１に示されるように、還元電極として機能する表面電極４の面積が、酸化電極として機能する下部電極２の面積よりもずっと大きいことにより自己誘発レドックスサイクルが生じるが、これには次のような問題が生じる。
【００２３】
マクロ電極２２ａ上で生成した還元体２５は拡散するが、それは微小電極２１（図１における下部電極２に相当）に到達するだけでなく、図２の右側に示すように、その一部はマクロ電極２２（図２における表面電極４に相当）のうち微小電極２１から遠い部分２２ｂ上にも到達する。このような還元体２６は酸化反応により酸化体２７となる。すなわち、マクロ電極２２上では酸化反応も起こる（特開平３−２４６４６０号公報の第４図も参照）。
【００２４】
次に、この酸化体２７は拡散し、マクロ電極２２のうち微小電極２１に近い部分２２ｂ上に到達する。そこで還元反応により、還元体２５となる。還元体２５は拡散して微小電極２１表面に到達し再び酸化されて酸化体２４となる（あるいは、再度、マクロ電極２２のうち微小電極２１から遠い部分２２ｂに到達する）。
【００２５】
すなわち、図１の表面電極４上では酸化反応と還元反応が同時に起こることとなる。その結果、下部電極２で検出したい還元体の酸化が表面電極４の上でも同時に起こってしまう。
【００２６】
そのため、表面電極４で発生した還元体が効率的に下部電極２上で酸化せず、高感度化に課題を生じている。
【００２７】
さらに、図１に示されるように、基板の一方の面にのみ電気化学測定用電極板を構成した構造では、電極を形成し得る面積が限られ、これによっても高感度化に課題を生じていた。
【００２８】
この他、表面電極４はマクロ電極として作用するため電位印加時の充電電流が大きい。そのため、微小電極である下部電極２に比べて反応が定常状態に達する時間が長くなるという課題も生じていた。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記課題を解決する本発明に係る電気化学測定用電極板１０は、
絶縁体からなる基板３２と、
前記基板３２の上面に設けられた絶縁体からなる上層３１と、
前記基板３２の下面に設けられた絶縁体からなる下層３３と、
を備え、
前記基板３２は、前記基板３２の上面と前記上層３１との間に挟まれている複数の酸化電極３２Ｗと
前記基板３２の下面と前記下層３３との間に挟まれている複数の還元電極３２ｗと
を備え、
前記上層３１は、複数の上層開口部３１Ｗを有し、
前記各上層開口部３１Ｗからは、前記各酸化電極３２Ｗが露出しており、
前記下層３３は、複数の下層開口部３３ｗを有し、
前記各下層開口部３３ｗからは、前記各還元電極３２ｗが露出しており、
前記各酸化電極３２Ｗの上面から前記各還元電極３２ｗの下面にかけて貫通する複数の貫通孔３２Ｈが前記基板３２に設けられており、
前記各上層開口部３１Ｗの面積と、前記各下層開口部３３ｗの面積とは同一であり、
前記各上層開口部３１Ｗの面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部３３ｗの面積は１００００μｍ2以下である。
【００３０】
前記各上層開口部の面積は２２５μｍ2以上であり、前記各下層開口部の面積は２２５μｍ2以上であることが好ましい。
【００３１】
前記貫通孔の断面積は、１μｍ2以上２５００μｍ2以下であることが好ましい。
【００３２】
前記下層の厚みは、５μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。
【００３３】
この電気化学測定用電極板１０は、参照電極４２および補助電極４３と組み合わされるか、または対極と組み合わされ、電気化学測定装置を構成する。この電気化学測定装置もまた、本発明の趣旨に含まれる。
【００３４】
そして、この電気化学測定装置により、以下のような、電子メディエータを含有する試料液に含まれる目的物質を定量する方法もまた、本発明の趣旨に含まれる。
【００３５】
参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置により、試料液に含まれる目的物質を定量する方法であって、
前記方法は、以下の工程を包含する：
電子メディエータを含有する試料液を調製する工程、
前記電気化学測定用電極板を用意する工程、ここで
前記電気化学測定用電極板は、
絶縁体からなる基板と、
前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
を備え、
前記基板は、
前記基板の上面と前記上層との間に挟まれている複数の酸化電極と
前記基板の下面と前記下層との間に挟まれている複数の還元電極と
を備え、
前記上層は、複数の上層開口部を有し、
前記各上層開口部からは、前記各酸化電極が露出しており、
前記下層は、複数の下層開口部を有し、
前記各下層開口部からは、前記各還元電極が露出しており、
前記各酸化電極の上面から前記各還元電極の下面にかけて貫通する複数の貫通孔が前記基板に設けられており、
前記各上層開口部の面積と、前記各下層開口部の面積とは同一であり、
前記各上層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記各下層開口部の面積は１００００μｍ2以下であり、
前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させるか、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させる接触工程、
前記酸化電極板に正電位を掃引し、かつ前記還元電極板に負電位を印加するか、あるいは前記酸化電極板に正電位を印加し、かつ前記還元電極板に負電位を掃引することによって、前記酸化電極板および前記還元電極のそれぞれに流れる電流を測定する電流測定工程、および
前記電流測定工程によって得られた電流から前記目的物質の量を算出する算出工程。
【００３６】
前記補助電極の表面積は、前記酸化電極の集合体の１０倍以上であることが好ましい。
【００３７】
前記上層の上面にメッシュ状のフィルタを設けても良い。
【００３８】
前記参照電極が前記上層の上面に形成され、前記補助電極が前記下層の下面に形成されていることが好ましい。
【００３９】
本発明により、生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板、およびこの電極板を有する電気化学測定装置、ならびにこの電極板を用いて目的物質を定量する方法が提供される。
【００４０】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００４２】
（実施の形態１）
図３は、本実施の形態１における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【００４３】
図３に示されるように、本実施の形態１に係る電気化学測定用電極板１０は、下側から順に、下層３３、基板３２、および上層３１が積層されていることにより構成されている。下層３３および上層３１は、いずれも絶縁体である。
【００４４】
基板３２は、絶縁体からなる基板本体３２Ｓからなり、この基板本体３２Ｓの上面に酸化電極板３２Ｅを備え、この基板本体３２Ｓの下面に還元電極板３２ｅを備えている。酸化電極板３２Ｅは、図３に示すように、基板本体３２Ｓと上層３１との間に挟まれている。同様に、還元電極板３２ｅは、基板本体３２Ｓと下層３３との間に挟まれている。
【００４５】
上層３１は、複数の上層開口部３１Ｗを有している。図３では、９つの上層開口部３１Ｗが設けられている。各上層開口部３１Ｗからは、酸化電極板３２Ｅの一部分が露出している。酸化電極板３２Ｅのうち、各上層開口部３１Ｗから露出している部分、すなわち、図３において、酸化電極板３２Ｅ上で斜線が施された部分が、試料液と接し、酸化電極３２Ｗとして機能する。図３では、９つの酸化電極３２Ｗが設けられている。酸化電極板３２Ｅのうち、上層３１が形成されている部分、すなわち、図３において、酸化電極板３２Ｅ上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液とは接することがない。よって、この部分は、酸化電極としては機能しない。
【００４６】
上層３１と同様に、下層３３もまた、複数の下層開口部３３Ｗを有している。図３では、９つの下層開口部３３Ｗが設けられている。各下層開口部３３Ｗからは、還元電極板３２ｅの一部分が露出している。還元電極板３２ｅのうち、各下層開口部３３ｗから露出している部分、すなわち、図３において、還元電極板３２ｅ上で斜線が施された部分が、還元電極３２ｗとして機能する。図３では、９つの還元電極３２ｗが設けられている。還元電極板３２ｅのうち、下層３３が形成されている部分、すなわち、図３において、還元電極板３２ｅ上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液とは接することがない。よって、この部分は、還元電極としては機能しない。
【００４７】
酸化電極板３２Ｅと還元電極板３２ｅにはそれぞれ独立して電位を印加することができ、それぞれの電極上で目的物質の電気化学反応、より具体的には酸化反応と還元反応とを進行させることができる。酸化電極３２Ｗ上における電気化学反応によって発生した電気信号は酸化電極板３２Ｅを伝わり、酸化電極リード３２Ｔを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。同様に還元電極３２ｗ上における電気化学反応によって発生した電気信号は還元電極板３２ｅを伝わり、還元電極リード３２ｔを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。
【００４８】
各酸化電極３２Ｗと各還元電極３２ｗとは、平面基板本体３２Ｓを間に挟んで重なり合っている。図３では、縦３列×横３行の酸化電極３２Ｗと、縦３列×横３行の還元電極３２ｗとが、基板本体３２Ｓを間に挟んで重なり合っている。
【００４９】
図３においては、説明を容易にするために、還元電極板３２ｅは、基板本体３２Ｓと分離して記載したが、実際には、還元電極板３２ｅは基板本体３２Ｓの下面に形成されている。
【００５０】
酸化電極板３２Ｅはその一端に酸化電極リード３２Ｔを有している。酸化電極板３２Ｅで得られた電気信号は酸化電極リード３２Ｔから取り出すことができる。還元電極板３２ｅも同様に還元電極リード３２ｔと電気的に同通しており、還元電極板３２ｅで得られた電気信号は還元電極リード３２ｔから取り出すことができる。
【００５１】
基板３２には複数の貫通孔３２Ｈが設けられている。そして、各貫通孔３２Ｈは、各酸化電極３２Ｗの上面から各還元電極３２ｗの下面にかけて貫通している。図３では、１つの酸化電極３２Ｗ、１つの貫通孔３２Ｈ、および１つの還元電極３２ｗからなる９つのセットが示されている。
【００５２】
貫通孔３２Ｈがなければ、後述する比較例１からも理解されるように、目的物質の定量を高感度に行い得ず、さらに定量時における定常状態に達するまでに多くの時間を要する。
【００５３】
各上層開口部３１Ｗの面積、すなわち、各酸化電極３２Ｗの面積は１００００μｍ2以下である。１００００μｍ2を超えると、図２の右側で示されるような望まれない反応が生じてしまい、結果的に、高感度化に課題を生じる。すなわち、後述する比較例２からも示されるように、目的物質の定量を高感度に行い得ず、さらに定量時における定常状態に達するまでに多くの時間を要する。同様に、各下層開口部３３ｗの面積、すなわち、各還元電極３２ｗの面積も１００００μｍ2以下である。
【００５４】
なお、各上層開口部３１Ｗの面積（すなわち、各酸化電極３２Ｗの面積）および各下層開口部３３ｗの面積（すなわち、各還元電極３２ｗの面積）の下限には特に限定はないが、２２５μｍ2以上であることが好ましい。
【００５５】
各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とは実質的に同一である。すなわち、複数個の上層開口部３１Ｗの面積はいずれも同一である。同様に、複数個の下層開口部３３ｗの面積はいずれも同一である。そして、これらの上層開口部３１Ｗの面積と、これらの下層開口部３３ｗの面積とは、いずれも同一である。各貫通孔３２Ｈの断面積は同一であることが好ましい。
【００５６】
各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とを同一にすることにより、定常状態になるまでに要する時間を短くすることができる。また、各上層開口部３１Ｗの面積と各下層開口部３３ｗの面積とが異なっている場合、図２に示すような反応が生じるため、高感度化が困難となるためである。
【００５７】
貫通孔３２Ｈの断面積は、当然、上層開口部３１Ｗの面積および下層開口部３３Ｗの面積のいずれよりも小さい。１つの酸化電極３２Ｗおよび１つの還元電極３２ｗのセットに対して、２つ以上の貫通孔３２Ｈを設けても良い。ただし、設計上は、１つの酸化電極３２Ｗおよび１つの還元電極３２ｗのセットに対して、１つの貫通孔３２Ｈで充分である。
【００５８】
貫通孔３２Ｈの断面積の大きさはなるべく小さいほうが、基板３２上に多くの貫通孔を形成することが可能となる。このことは酸化電極３２Ｗおよび還元電極３２ｗからなる電極対をより多く配置することが可能となるので好ましい。ただし、貫通孔３２Ｈの断面積を小さくすることによって、試料液に含まれる電子メディエータが孔を通り抜ける際のコンダクタンスが増加する傾向がある。一方、あまりにも断面積の値が大きすぎる貫通孔３２Ｈは、面積が１００００μｍ2以下でなければならない各酸化電極３２Ｗおよび各還元電極３２ｗの面積を意味もなく小さくしてしまうことにつながる。そのため、好ましい貫通孔３２Ｈの断面積の値は、１μｍ2以上２５００μｍ2以下である。
【００５９】
下層３３の厚みは５μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。隣接する還元電極３２ｗの間の距離は一般的に７μｍ程度であるので、下層３３の厚みが５μｍ未満である場合には、事実上、隣接する２以上の還元電極３２ｗが連続する１つの還元電極３２ｗとして機能してしまうことになる。そのため、図２の右側で示される望ましくない反応が生じやすくなる。
【００６０】
言い換えれば、下層３３の厚みが５μｍ未満である場合には、還元電極３２ｗで生じた還元型の電子メディエータが貫通孔３２Ｈを通って酸化電極３２Ｗに達するよりも、還元電極３２ｗで生じた還元対の電子メディエータは隣接する還元電極３２ｗ上で酸化されて酸化型のメディエータとなりやすい。一方、下層３３の厚みが１００μｍを超える場合には、正確な測定のために必要となる試料液の量が増えることになり、好ましいとは言えない。このことは、上層３１についても同様である。
【００６１】
基板本体３２Ｓの材料としては、例えば両面が酸化されたシリコン、ガラス、酸化アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、シリコン樹脂、ポリイミド及びその誘導体、エポキシ樹脂、高分子熱硬化物、感光性樹脂等を挙げることができる。
【００６２】
本発明の電気化学測定用電極板では、貫通孔３２Ｈが試料液の通り道となるため、試料液が水溶液である場合には、貫通孔３２Ｈの内壁が親水性であることが望ましい。そのため、基板本体３２Ｓとしては、シリコン基板、ガラス基板などの親水性表面を有する基板か、または親水性のポリエチレンテレフタレートあるいはポリエチレンナフタレート基板などのポリエステル材からなる基板を選択することが望ましい。疎水性を有する基板を使用する際には、エタノール、イソプロピルアルコールなどによって貫通孔３２Ｈの内壁に親水化処理を施すことが望ましい。
【００６３】
酸化電極板３２Ｅ（酸化電極リード３２Ｔを含む）の材料、および還元電極板３２ｅ（還元電極リード３２ｔを含む）の材料としては、電気伝導性を有する材料を挙げることができる。具体的には、金属として金、白金、パラジウム、銀、クロム、チタン、ニッケル、半導体としてｐ型シリコン、ｎ型シリコン、ｐ型ゲルマニウム、ｎ型ゲルマニウム、硫化カドミウム、二酸化チタン、酸化亜鉛、ガリウム燐、ガリウム砒素、インジウム燐、二砒化モリブデン、セレン化タングステン、二酸化銅、酸化スズ、酸化インジウム、インジウムスズ酸化物などを挙げることができる。その他、ケッシェンブラックなどの導電性カーボンを用いることができる。
【００６４】
これらの中でも電極材料として安定である金、白金、パラジウムを用いることが好ましい。これらの形成には蒸着、スパッタ等の成膜手法とエッチング手法を組み合わせた方法。マスクを用いたスクリーン印刷、レーザアブレーション法、または導電性インクを用いたスピンコート法、インクジェットプリント法による直接描画手法を用いることができる。
【００６５】
貫通孔３２Ｈの形成手法としては、ドライエッチング法、ウェットエッチング法、リフトオフ法、集束イオンビーム照射による加工法などにより電極形成済基板に穴を形成する手法が挙げられる。これに代えて、基板にメタルマスクを用いて貫通孔３２Ｈのパターニングをした後、基板を前記手法による孔形成加工を行うことによって形成しても良い。この他、貫通孔３２Ｈの凸型パターンを有する鋳型に基板を形成し、この基板に電極板を形成した後、鋳型を抜き取る方法。加熱した鋳型により電極板付の基板に貫通孔を形成したのち、鋳型を抜き取ることも考えられる。
【００６６】
上層開口部３１Ｗと下層開口部３３ｗを形成する手法としては、ドライエッチング法、ウェットエッチング法、リフトオフ法、集束イオンビーム照射による加工方法などにより絶縁体３１Ｉおよび絶縁体３３ｉに開口部を形成する手法を挙げることができる。また、ポジ型レジストやネガ型レジスト、ドライフィルムレジスト等の感光性樹脂材料を用いて遮光マスクと露光手法を組み合わせた方法により形成しても良い。
【００６７】
酸化電極板３２Ｅ（酸化電極リード３２Ｔを含む）、還元電極板３２ｅ（還元電極リード３２ｔを含む）、上層３１、下層３３をスピンコートによって形成する場合、コーターのワークテーブルには多孔体を用いてあるものを使うことが望ましい。これは基板本体３２Ｓの両面に電極板（酸化電極板３２Ｅと還元電極板３２ｅ）と絶縁層（上層３１と下層３３）を形成するため、基板を安定して固定するには多孔体による真空吸着法が、テフロン（登録商標）等の材料に数箇所吸着用の孔を設けたコーターヘッドを用いる場合に比べて、吸着固定する面積が大きくなるため好ましい。
【００６８】
なお、図３の構造は、特許文献５の図３・図４に記載された構造と類似しているが、特許文献５は細胞電位測定用容器を開示しているに過ぎず、酸化電極および還元電極を備えた電気化学測定用電極板、およびこの電極板を有する電気化学測定装置、ならびにこの電極板を用いて目的物質を定量する方法については、開示も示唆もしていない。
【００６９】
図４は、実施の形態１に係る電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置（以下、単に「測定装置」という）を示している。
【００７０】
図４に示すように、電気化学測定用電極板１０、参照電極４２、および補助電極４３を、試料液容器４４に満たされた試料液に浸す。これにより、これらの電極が試料液に接触する。また、電気化学測定用電極板１０の表面には、酸化電極３２Ｗが複数形成されて、酸化電極３２Ｗの集合体４１を形成している。図示していないが、電気化学測定用電極板１０の裏面には同様に還元電極３２ｗが集合体を形成している。
【００７１】
参照電極４４は電気化学測定用電極板１０に印加する電位の基準となる電極である。参照電極４４が試料液中で示す電位をゼロとして、酸化電極３２Ｗ、還元電極それぞれに電位を印加する。
【００７２】
補助電極４３は、測定装置においてアンペアの法則を成り立たせるために、電流を補償するための電極である。測定装置４５は、酸化電極リード３２Ｔおよび還元電極リード３２ｔを介して電気化学測定用電極板１０と電気的に接続しており、同様に参照電極４２、補助電極４３とも電気的に接続している。レコーダー４６により、測定装置４５から出力された電流応答が記録される。
【００７３】
（電気化学測定方法の説明）
次に、試料液に含まれる電子メディエータの定量方法を説明する。
【００７４】
サイクリックボルタンメトリー等の手法により、電子メディエータの酸化反応が進行する電位と還元反応が進行する電位を予め調べておいて、後に説明する酸化電極の電位の値と還元電極の電位の値に用いる。なお、電位の基準は参照電極４２が試料液中で示す平衡電位である。すなわち、酸化電極３２Ｗおよび還元電極３２ｗにそれぞれ印加される電位は、参照電極４２を０Ｖとした場合における相対的な電位である。
【００７５】
酸化電極３２Ｗと還元電極３２ｗの電位を制御装置４５に入力したのち、測定を開始する。後述する実施例では詳細に説明するが、具体的には、酸化電極３２Ｅに０Ｖから正電圧をゆっくりと印加する。後述する実施例では、酸化電極３２Ｅに印加される電圧を０Ｖから＋０．７Ｖにゆっくりと連続的に変化させている。なお、これを「掃引」と呼ぶ。すなわち、本明細書において用いられる用語「掃引」とは、連続的に電位を変化させることを意味している。これとは対照的に、本明細書において用いられる用語「印加」とは、あらかじめ定められた電位に急激に変化させることを意味している。
【００７６】
このとき、還元電極には参照電極と同一の電位（多くの場合、０Ｖ）を印加し続けることが好ましい。酸化電極３２Ｅに電圧を印加する速度（以下、「掃引速度」ということがある）は、一般的に５ｍＶ／秒以上５００ｍＶ／秒以下である。後述する実施例では、１００ｍＶ／秒である。
【００７７】
なお、上記の説明では、酸化電極板３２Ｅに正電位を掃引し、還元電極板３２ｅに負電位を印加している。しかし、酸化電極板３２Ｅに正電位を印加し、還元電極板３２ｅに負電位を掃引してもよい。
【００７８】
酸化電極３２Ｗにおける酸化反応で得られた電流は酸化電極リード３２Ｔを介して制御装置４５によって検出される。同様に還元電極における還元反応で得られた電流は還元電極リード３２ｔを介して制御装置４５によって検出される。検出された電流はレコーダー４６に出力され、記録された酸化電流値を標準試料の酸化電流値の測定結果（後述する検量線）と比較して、試料液中の検出対象物質を定量することができる。
【００７９】
レコーダー４６に記録された還元電流値を標準試料の還元電流測定結果と比較して試料液中の検出対象物質を定量することもできる。このためには、予め本実施の形態の検出装置を用いて標準試料の検量線を作成しておくことが望ましい。
【００８０】
ここで、検量線を用いた、試料液中の検出対象物質を定量する方法、すなわち、試料液中の検出対象物質の濃度を算出する方法について説明する。
【００８１】
まず、標準試料を準備する。この標準試料には、濃度既知の還元型電子メディエータ（ここでは、フェロシアン化カリウムと仮定する）が含まれている。この濃度既知の標準試料を試料液として用いて、図４に示すような電気化学測定装置により、還元型電子メディエータの濃度と、電気化学測定装置により測定された反応電流値との間の関係をグラフ化する。このグラフの一例を図１４に示す。
【００８２】
図１４に示されるように、ここでは、還元型の電子メディエータの濃度が１００μＭである場合には、反応電流値は１０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が３００μＭである場合には、反応電流値は３０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が５００μＭである場合には、反応電流値は５０μＡであったと仮定する。これらをグラフ上にプロットして、検量線を引く。このようにして、濃度既知の標準試料から、検量線を得る。
【００８３】
次に、濃度不知の試料液を用いて、図４に示すような電気化学測定装置により反応電流値を得る。ここで得られた反応電流値が２０μＡであった場合、検量線から、試料液に含まれる還元型の電子メディエータの濃度を知ることができる。この還元型の電子メディエータの濃度から、試料液に含まれる（あるいは、含まれていた）目的物質の量を算出する。
【００８４】
なお、実際には、検量線の作成や目的物質の量の算出などは、すべてコンピュータ上で行われることは言うまでもないだろう。
【００８５】
（参照電極、補助電極に関する説明）
参照電極４２と補助電極４３の２つの電極の代わりに、対極１つを用いて測定を行うことも可能である。しかし参照電極４２と補助電極４３は独立して設けることが好ましい。なぜなら、電位の基準となる参照電極もしくは対極に電流が流れる間には、その表面で電極反応が進行しており、反応進行に伴う電子メディエータの濃度変化が大きくなると本実施の形態の検出装置の基準としている電位が変動して正確な測定を行うことができないためである。
【００８６】
よって、参照電極４２には電流が流れ込まないように入力インピーダンスを極力大きく設定することが望ましい。望ましくはインピーダンスの値が１０の６乗オーム以上であることが望ましい。参照電極４２には銀塩化銀電極、飽和カロメル電極等を用いることができる。
【００８７】
補助電極４３の表面積は大きいことが望ましい。補助電極４３の好ましい表面積は酸化電極３２Ｗの集合体４１の１０倍以上である。その理由は、補助電極４３の電極表面積が小さくて十分な電流を流せない場合、電気化学測定用電極板１０で得られる電流が制御装置４５に十分流れ込まなくなり、正確な電流値を得られないことや、電流を流すために補助電極４３の電位が大きく変動して水の電気分解等望ましくない反応が進行する場合があるためである。
【００８８】
補助電極４３としては、電極自体の酸化還元反応や腐蝕反応が起こりにくい貴金属電極を使用することが望ましい。例えば、白金線に白金黒を析出させて大きな電極面積を持たせた白金電極が好ましい。
【００８９】
（実施の形態２）
図１０に示すように、本実施の形態２においては、上層３１の上面にメッシュ状のフィルタ１１１Ｍを設けている。
【００９０】
測定に用いる試料液として、血液から分離した血漿成分を用いる場合、分離しきれずに混入した血球成分、蛋白成分、固化した血栓などが、貫通孔３２Ｈを塞ぐ事がある。
【００９１】
これを防止するために、電極系外でフィルタによる濾過を経て試料液を電極に供給するが、これに加えて、上層３１に濾過機能を有するフィルタ１１１Ｍを形成することにより、血栓等によって貫通孔３２Ｈが塞がれることが防止される。
【００９２】
必要に応じて、下層３３の下側にフィルタ（図示せず）を設けても良い。
【００９３】
（実施の形態３）
図１２に示すように、本実施の形態３においては、酸化電極板３２Ｅ、還元電極板３２ｅだけでなく、参照電極１３１Ｅ、補助電極１３３ｅを一体に形成しても良い。この構成では、図４に示すような参照電極４２および補助電極４３を付加する必要がなくなるため、装置を小型化できる。
【００９４】
参照電極１３１Ｅは、上層３１の上面に形成することが好ましい。参照電極１３３ｅは、下層３３の下面に形成することが好ましい。
【００９５】
なお、実施の形態２に示されるフィルタがこの実施の形態３に示される電気化学測定用電極板に設けられる場合には、フィルタ１１１Ｍの上に参照電極１３１Ｅを設けても良いし、逆にフィルタ１１１Ｍの下に参照電極１３１Ｅを設けても良い。
【００９６】
実施の形態１〜３の説明においては、便宜上、酸化電極３２Ｗが基板本体３２Ｓの上側に、還元電極３２ｗが基板本体３２Ｓの下側に設けられていることとした。これは、説明を容易にするためにすぎない。各図面に示されている電気化学測定用電極板をひっくり返した場合であっても、本発明に含まれることは言うまでもない。実施の形態３における参照電極１３１Ｅおよび補助電極１３３ｅについても同様である。すなわち、参照電極Ｅ１３１は下層３３の下側に設けられ、補助電極１３３ｅは上層３１の上側に設けられていても良い。
【００９７】
（実施例）
以下、実施例および比較例により、本発明をさらにより詳細に説明する。
【００９８】
（実施例１）
図５は本発明の実施例１における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。なお、図５から図９まで、図１１、および図１３には１つの貫通孔３２Ｈしか表されていないが、実際には各実施例・比較例において説明されている数の貫通孔３２Ｈが設けられた。
【００９９】
まず、図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、１μｍのＳｉＯ2膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）からなる基板５０の上面に、以下のように、スパッタ法により酸化電極板５１を形成した。
【０１００】
すなわち、基板５０をスパッタ装置（株式会社  アルバック製）内の所定位置に取り付けた後、クロム及び金を順次成膜した。具体的には、圧力１．３Ｐａ，アルゴン雰囲気で、クロム１０秒，金：５０秒間スパッタを行い全体で１３０ｎｍの膜厚とした。これにより酸化電極板５１を形成した。
【０１０１】
次に、図５（ｃ）に示すように、基板５０の下面に、酸化電極板５１と同様に、還元電極板５２を形成した。
【０１０２】
さらに、図５（ｄ）に示すように、酸化電極板５１上に上層５３および上層開口部５４を、以下のように形成した。すなわち、酸化電極板５１の上面に、スピンコート法により感光性樹脂材料（化薬マイクロケム株式会社製：ＳＵ−８  ２０００）を厚みが２μｍとなるように塗布した。そして、７０℃３０分間ベーキングした後、上層開口部５４のパターンを有するクロムマスクを用いて６０秒間、密着露光することにより、マスクパターンを樹脂材料に転写した。この後、現像液中にて２０℃、３００秒間現像を行い、水洗、乾燥してマトリックス状の上層開口部５４を上層５３に形成した。
【０１０３】
ここで、実施例１における上層開口部５４について詳しく説明する。この上層開口部５４は正方形であった。その一辺は１５μｍであり、面積は２２５μｍ2であった。上層開口部５４の個数は１００００個であり、隣接する上層開口部５４の中心点の間の距離は１８μｍであった。
【０１０４】
図５（ｅ）に示すように、上層開口部５４を形成した手順と同様に、還元電極板５２の下側に下層５５および下側開口部５６を形成した。
【０１０５】
次に、酸化電極板５１をエッチングすることにより、以下のように上側孔５７を形成した。すなわち、酸化電極板５１上に厚み４〜５μｍのレジスト材（東京応化工業株式会社製：ＴＳＭＲ−８９００ＬＢ）を塗布した。このレジストを塗布した基板５０をオーブン中にいれ、プレベーキング工程を１００℃・３０分、ポストベーキング工程を１２０℃・３０分の条件にて行った。その後、孔５７のパターンを有するクロムマスクを用いて、マスクアライナー（ミカサ株式会社製）により６０秒間、密着露光した。次に現像液中にて２５℃１２０秒間現像を行い、水洗、乾燥してマスクパターンをレジストに転写した。
【０１０６】
次に、図５（ｆ）に示すように、基板をアルゴンミリング装置に入れ、アルゴンガスの流量１２ｓｃｃｍ、圧力０．０３Ｐａ、ビーム電流９０ｍＡの条件で金およびクロムからなる酸化電極板３１Ｅを順次エッチングした。これにより、基板に複数の上側孔５７を形成した。形成された上側孔５７は円形であり、その面積は７８．５μｍ2であった。基板５０に形成された上側孔５７の個数は１００００個であった。なお、各上側孔５７の中心は上側開口部５４の中心と一致するよう形成した。
【０１０７】
さらに、図５（ｇ）に示すように、酸化電極板５１に上側孔５７を形成した手順と全く同様に、還元電極板５２に下側孔５８を形成した。
【０１０８】
最後に、図５（ｈ）に示されるように、次に上側孔５７および下側孔５８を形成した基板５０を反応性イオンエッチング装置に入れ、下側孔５８をマスクパターンとし、Ｃ2Ｆ6ガスの流量を２５ｓｃｃｍ、圧力０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件で１５分間、基板５０をエッチングした。これにより、基板５０に多数の貫通孔５９が形成された（図５（ｈ））。
【０１０９】
このようにして、実施例１に係る電気化学測定用電極板を得た。
【０１１０】
（比較例１）
比較のために、従来の電気化学測定用電極板を作製した。以下にその作製手順を示す。
【０１１１】
図６に示すように、基板６０として１μｍのＳｉＯ2膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）の上面に、クロムおよび金をからなる下部電極６１を成膜した。成膜条件は図５（ｂ）と同一とした。
【０１１２】
次に、図６（ｃ）に示すように、下部電極６１の上面にプラズマＣＶＤ装置（株式会社アルバック製）を用いて、厚み４３０ｎｍのＳｉＯ2からなる絶縁層６２を堆積した。
成膜条件は、シランガス流量１０ｓｃｃｍ、Ｎ2Ｏガス流量２００ｓｃｃｍ、圧力８０Ｐａ，パワー５０Ｗ、基板温度３００℃とした。
【０１１３】
さらに、図６（ｄ）に示すように、クロムおよび金をからなる表面電極６３を成膜した。成膜条件は図５（ｂ）と同一とした。
【０１１４】
次に、図６（ｅ）に示すように表面電極６３の上面に、厚み２〜３μｍのレジスト材６４を塗布し、現像、水洗、乾燥してマスクパターンをレジスト６４に転写した。用いたレジストおよびレジストパターン形成の条件は、図５（ｄ）に関する説明と同一とした。
【０１１５】
その後、図６（ｆ）に示すように、微細孔６５を形成した。レジスト６４が形成されていない部分、すなわち、露出している表面電極６３の部分を、アルゴンミリング装置を用いて順次エッチングした。アルゴンミリングの条件は、アルゴンガスの流量１２ｓｃｃｍ、圧力０．０３Ｐａ、ビーム電流９０ｍＡとした。
【０１１６】
最後に反応性イオンエッチング装置を用いて、絶縁層６２に多数の微細孔６５を形成した。反応性イオンエッチングの条件は、Ｃ2Ｆ6ガスの流量：２５ｓｃｃｍ、圧力：０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件とした。
【０１１７】
ここで、比較例１における微細孔６５について詳しく説明する。この微細孔６５は円形であった。その直径は１０μｍであり、面積は７８．５μｍ2であった。微細孔６５の個数は１００００個であり、隣接する微細孔６５の中心点の間の距離は７０μｍであった。なお、この微細孔６５は図６（ｆ）に示されるように、下部電極６１、基板６０を貫通していなかった。
【０１１８】
（実施例１および比較例１に係る電気化学測定）
実施例１および比較例に係る電気化学測定用電極板を用いて、図４に示すように、電気化学測定装置を組み立て、電子メディエータの定量評価を行った。
【０１１９】
１ｍＭのフェロシアン化カリウムおよび１ｍＭのフェリシアン化カリウム（合計２ｍＭ）を、５０ｍＭの支持電解質（塩化カリウム）を含有する水溶液に添加することによって、試料液を調製した。
【０１２０】
参照電極として銀／塩化銀電極（ＢＡＳ株式会社製）を用いた。なお、以下、酸化電極の電位や還元電極の電位は、全てこの参照電極として用いた銀／塩化銀電極に対する電位である。
【０１２１】
実施例１に係る電気化学測定用電極板をバイポテンシオスタット（ＣＨ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製：ＡＬＳ７４０Ａ）にリード線を介して接続した。酸化電極板５１の電位を０Ｖ、還元電極板５２の電位を０Ｖ、酸化電極板５１の電位の掃引速度を１００ｍＶ／ｓに設定した後、最終的に酸化電極板５１の電位が＋０．７Ｖになるまで、サイクリックボルタンメトリー法により酸化電極板５１に流れる、反応電流を計測した。その反応は化１に示すフェロシアン化カリウムの酸化反応である。
【０１２２】
酸化電極板５１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は３９．８μＡであった。
【０１２３】
同様に、比較例１に係る電気化学測定用電極板を用いて、酸化電極として機能する下部電極２の電位を、０から＋０．７Ｖまで掃引速度１００ｍＶ／ｓで掃引した。還元電極として機能する表面電極４の電位は０Ｖに設定した。
【０１２４】
その結果、下部電極においても化１に示すフェロシアン化カリウムの酸化反応に伴う酸化電流が観測された。下部電極６１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は２２．５μＡであった。
【０１２５】
【化１】
2009013876.tif 000039
【０１２６】
実施例１および比較例１の実験結果を、以下の表１にまとめて示す。
【０１２７】
【表１】
2009013876.tif 000040
【０１２８】
これは図２の自己誘発レドックスサイクルの説明図に当てはめて考えてみると、比較例１における微小電極から遠い部分のマクロ電極２２ｂで酸化されていたフェロシアン化カリウムが微小電極２１上の酸化反応に用いられなかったのに対し、実施例１においては全てのフェロシアン化カリウムは微小電極２１上でのみ酸化されたため、酸化反応の電流値が効率的に増加したものと考えられる。
【０１２９】
本実施例の電気化学測定用電極板においては同一形状と面積を有する微小電極対を基板上に多数配列した。それにより、それぞれの電極対同士で反応面積が揃い、上記のようなマクロ電極上のフェロシアン化カリウムの反応が起こらなくなったあるいは著しく減少したと考えられる。これにより、両極間で効率的なレドックスサイクル反応が進行したと考えられる。
【０１３０】
また、比較例１の微小電極を構成する下部電極６１および実施例１の電気化学測定用電極を構成する酸化電極板５１に対して、＋０．４Ｖの電位を印加して得られる酸化電流の時間依存性を評価した。実施例１の還元電極板５２の電位および比較例１の表面電極６３の電位は０Ｖに保った。
【０１３１】
その結果、実施例１の酸化電流値は６秒で定常状態に達したが、比較例１の酸化電流値が定常状態に達するのに２６秒要した（表２）。このことは、比較例１の下部電極に比べて、上部電極の面積が大きいために定常状態に達する時間が必要であったのに対し、実施例１の酸化電極は同一面積を有する還元電極と電極対を形成したため、両極間で即座に定常状態に達したと考えられる。
【０１３２】
【表２】
2009013876.tif 000041
【０１３３】
以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１３４】
（比較例２）
実施例１における上層開口部５４および下層開口部５６の面積が、電子メディエータの定量評価に及ぼす影響を検証するために、以下の手順にて比較例２に係る電気化学測定用電極板を作製した。
【０１３５】
基本的な作製手順は図５と同一であるので、相違点のみ説明する。比較例２では、正方形の上層開口部５４の一辺は１０００μｍであり、面積は１００００００μｍ2であった。上層開口部５４の個数は１０個であり、隣接する上層開口部５４の中心点の間の距離は１５００μｍであった。
【０１３６】
この電極を用いて、実施例１と同様にサイクリックボルタンメトリー法による反応電流の計測を行ったところ、酸化電極板５１の電位が＋０．６から＋０．７Ｖまでの間に定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける反応電流は２０．７μＡであった。同様に、酸化電流の時間依存性も評価した。比較例２の酸化電極に流れる電流が定常状態に達するのに３５秒要した（表２）。
【０１３７】
このことは、本発明の電気化学測定用電極板に設ける開口部の面積が１００００００μｍ2と大きな場合、図２で示したような還元電極上において酸化電極から近い部分と遠い部分とが生じ、酸化電極で酸化するべき還元体が還元電極上で反応してしまったために、酸化電極上で効率的な反応が起こらなかったと推測される。
【０１３８】
(実施例２)
図７は本発明の実施例２における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。酸化電極板５１と還元電極板５２の形成工程（ａ〜ｃ）までは実施例１と同様に行った。
【０１３９】
次に実施例１で用いた手順により、参加電極板５１、基板５０、還元電極板５２を順次エッチングし、断面積１００μｍ2の貫通孔５９を５０００個等間隔になるように形成した（ｃ〜ｅ）。
【０１４０】
次に酸化電極板５１の上側に上層５３と上層開口部５４を形成した。また、還元電極板５２の下層に、下層５５と下層開口部５６を形成した。
【０１４１】
上層５３と下層５５の材料には、厚み５μｍのドライフィルムレジスト（旭化成工業株式会社製  サンフォート）を用いた。上層開口部５４と下層開口部５６は各５０００個形成した。それらの開口部の断面積は９００μｍ2であった。上層開口部と下層開口部の形成方法は実施例１と同様であった（ｆ〜ｉ））。
【０１４２】
以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。
【０１４３】
本実施例の電気化学測定用電極板を用いて実施例１と同様の試験を行った。表１に示すように酸化電極５１で観測された電流値は、比較例１における下部電極６１のそれより大きかった。さらに表２に示すように酸化電極５１で観測された電流値が定常状態到達に要した時間は１０秒と比較例１のそれより短かった。
【０１４４】
以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１４５】
(実施例３)
図８は実施例３における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。本実施例においては実施例１と同様の酸化電極板５１と還元電極板５２の形成工程（ｂ１，ｂ２）、上層および下層形成工程（ｃ１，ｃ２）、上層開口部および下層開口部形成工程（ｄ１，ｄ２）、上側貫通孔および下側貫通孔形成工程（ｅ１，ｅ２，ｆ１，ｆ２）を経た。その結果、酸化電極形成基板８０Ａ、還元電極形成基板８０Ｂを形成した。
【０１４６】
前記２つの基板をそれぞれの下面で貼り合わせることにより、本実施例の電気化学測定用電極板を得た（ｇ)。上層開口部５４および下層開口部５６の断面積は９００μｍ2で、それを１０００個等間隔に形成した。貫通孔５９の断面積は３１４μｍ2であった。
【０１４７】
本実施例の電気化学測定用電極を用いて実施例１と同様の試験を行った結果、表１に示すように実施例１と同様の結果が得られた。以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１４８】
(実施例４) 
図９は実施例４における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。絶縁性の基板５０には厚さ０．５ｍｍの熱硬化性のフェノール樹脂材料（ＰＭ−８２００  住友ベークライト製）を用いた。前記基板に酸化電極板５１と還元電極板５２を形成した（ａ〜ｃ）。
【０１４９】
次に前記の電極板形成済基板の貫通孔形成加工を行った。モールド９０を１６０℃に加熱し、還元電極板５２の下面から酸化電極５１の上面を完全に貫通したところでそのままの温度で１０分間保持した（ｄ）。次に、室温まで５℃／分で徐冷したのち、室温で１０分間保持した。次に、モールド９０を抜き取ることにより、貫通孔５９を１０００個形成した。それらの貫通孔の断面積は３１４μｍ2だった（ｅ）。
【０１５０】
次に実施例２と同様の手順により上層５３と上層開口部５４、下層５５と下層開口部５６を１０００個形成した（ｆ〜ｉ）。それらの開口部の面積は６４００μｍ2であった。これにより、本実施例の電気化学測定用電極板を得た。
【０１５１】
本実施例の電気化学測定用電極板を用いて実施例１と同様の試験を行った結果、表１に示すように実施例１と同様の結果が得られた。以上の結果から、本実施例の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１５２】
次に図１１を用いて実施の形態２の電気化学測定用電極板の作製工程を述べる。
（実施例５）
図１１は実施例５における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。実施例１の手順を用いて基板５０に酸化電極板５１、還元電極板５２、上層５３、上層開口部５４、下層５５、下層開口部５６、貫通孔５９を形成した。貫通孔の断面積は１００μｍ2、開口部の断面積は１００００μｍ2、それぞれ２５００個形成した（ａ〜ｉ）。
【０１５３】
最後にボロシリケートファイバーグラスからなる口径４２μｍのフィルタ１１１Ｍ(日本ミリポア株式会社製)を所定の大きさにカットしたのち、上層５３上にシリコン接着剤を用いて固定した（ｊ）。
【０１５４】
以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。
【０１５５】
血液中の血漿成分を本実施例の電気化学測定用電極板に挿入した結果、分離しきれなかった血球成分、蛋白成分、血栓がフィルタ１１１Ｍにトラップされ、血漿成分のみが上層開口部５４、貫通孔５９を経て下層開口部まで供給された。一方、フィルタ１１１Ｍを形成しなかった同形状の電気化学用測定電極板は一部血栓により塞がれたため、貫通孔５９が機能を果たさなくなった。これらは目視により確認した。以上の結果から、本実施の形態の電気化学測定用電極板の効果が認められた。
【０１５６】
次に図１３を用いて実施の形態３の電気化学測定用電極板の作製工程を述べる。
【０１５７】
（実施例６）
図１３は実施例６における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。実施例１の手順を用いて基板５０に酸化電極板５１、還元電極板５２、上層５３、上層開口部５４、下層５５、下層開口部５６、貫通孔５９を形成した。貫通孔の断面積は１００μｍ2、開口部の断面積は２５００μｍ2とし、それぞれ５０００個形成した（ａ〜ｉ）。
【０１５８】
次に上層５３と下層５５にメタルマスクを被せて白金を１００ｎｍ成膜した（ｊ）。メタルマスクを除いた後、上層５３に形成した白金薄膜へ、リード部分を残して銀塩化銀インク（ビーエーエス株式会社製）を塗布した。その後、４０℃３０分間電気炉中にて乾燥を行い、参照電極１３１Ｅを得た。続いて平均粒径１．０〜１０．０μｍの白金粉末(田中貴金属工業株式会社製)をエタノール中に分散してスラリーを作製した。作製したスラリーを下層５５上に形成した白金薄膜へ、リード部分を残して塗布および乾燥を行い、補助電極１３３ｅを得た。以上の工程を経ることにより、本実施例の電気化学測定用電極板が得られた。
【０１５９】
本実施例で作製した電気化学測定用電極板と比較例１のそれを用いて、電気化学測定装置を組み上げた。その際、本実施例の電気化学測定用電極板は厚みが０．５ｍｍ程度であるのに対し、比較例１のそれは外部から参照電極と補助電極を導入したため、厚みが５ｃｍ程度となった。そのことにより、測定に用いる試料液の量は数１０００倍に増加した。      
【０１６０】
このことは測定に必要な電極を電極板上に一体形成したことにより、小型化が求められる各種センサ用電極として好適な構成となったことを示す。よって、本実施例の電気化学測定用電極板は小型センサ用電極として適することが分かった。
【０１６１】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明の電気化学測定用電極板は、高いレドックスサイクル効果を有し、グルコースセンサに代表される生体物質等微量成分のセンシングデバイスを構成する電極として有用である。またクロマトグラフィーの検出器を構成する電極の用途等にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１は、特許文献１に記載の従来の電気化学測定用電極板の（Ａ）全体斜視図（Ｂ）拡大斜視図である。
【図２】図２は、特許文献４、非特許文献１および２に記載の自己誘発レドックスサイクルのメカニズムを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態１における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図４】図４は、本発明の実施の形態１に係る電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置の概略図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図６】図６は、本発明の比較例１における従来の電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図７】図７は、本発明の実施例２における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図８】図８は、本発明の実施例３における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図９】図９は、本発明の実施例４における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施の形態２における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例５における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１２】図１２は、本発明の実施の形態３における電気化学測定用電極板の分解斜視図である。
【図１３】図１３は、本発明の実施例６における電気化学測定用電極板の作製プロセスの工程断面図である。
【図１４】図１４は、検量線の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１６４】
１  基板
１ａ  シリコン基板
１ｂ  酸化膜
２  下部電極
３  絶縁膜（ＳｉＯ2膜）
４  酸化電極
５  微細孔
７  下部電極２の開口部
１０  電気化学測定用電極板
２１  微小電極
２２  マクロ電極（微小電極近傍）
２３  マクロ電極（微小電極遠方)
２４  還元体１
２５  酸化体１
２６  還元体２
２７  還元体３
２８  酸化体２
３１  上層
３１Ｉ  絶縁体
３１Ｗ  上層開口部
３２  基板
３２Ｓ  基板本体
３２Ｅ  酸化電極板
３２Ｈ  貫通孔
３２Ｔ  酸化電極リード
３２Ｗ  酸化電極
３２ｅ  還元電極板
３２ｔ  還元電極リード
３２ｗ  還元電極
３３  下層
３３ｉ  絶縁体
３３ｗ  下層開口部
４１  酸化電極３２Ｗの集合体
４２  参照電極
４３  補助電極
４４  試料液容器
４５  制御装置
４６  レコーダー
５０  基板
５１  酸化電極
５２  還元電極
５３  上層
５４  上層開口部
５５  下層
５６  下層開口部
５７  上側孔
５８  下側孔
５９  貫通孔
６０  基板
６１  下部電極
６２  絶縁層
６３  表面電極
６４  レジスト
６５  微細孔
８０ａ  基板（酸化電極側）
８０ｂ  基板（還元電極側）
８０Ａ  酸化電極形成基板
８０Ｂ  還元電極形成基板
９０  モールド
１００  ワークテーブル
１１１Ｍ  フィルタ
１３１Ｅ  参照電極
１３１Ｔ  参照電極リード
１３３ｅ  補助電極
１３３ｔ  補助電極リード
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2009013876.tif 000042
【図２】
2009013876.tif 000043
【図３】
2009013876.tif 000044
【図４】
2009013876.tif 000045
【図５】
2009013876.tif 000046
【図６】
2009013876.tif 000047
【図７】
2009013876.tif 000048
【図８】
2009013876.tif 000049
【図９】
2009013876.tif 000050
【図１０】
2009013876.tif 000051
【図１１】
2009013876.tif 000052
【図１２】
2009013876.tif 000053
【図１３】
2009013876.tif 000054
【図１４】
2009013876.tif 000055
【国際調査報告】
2009013876.tif 000056
2009013876.tif 000057
2009013876.tif 000058
2009013876.tif 000059