【手続補正書】
【提出日】平成16年10月26日(2004.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】  カンジダ・アルビカンス由来の神経細胞の活性化・保護剤
【特許請求の範囲】
【請求項１】  カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）由来の分化誘導促進物質からなることを特徴とする神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項２】  神経突起の伸長作用を有することを特徴とする請求項１記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項３】  神経突起の高密度化作用を有することを特徴とする請求項１又は２記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項４】  ストレス状況下にある神経細胞の保護作用を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項５】  神経細胞が脳神経細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項６】  分化誘導促進物質が、分化誘導を介したＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖抑制作用を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項７】  分化誘導促進物質が、分化誘導を介したＮＢ−１のコリンエステラーゼ活性発現誘導作用を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項８】  分化誘導促進物質が、ＨＴ１０８０細胞、ＨＴ２９細胞、ＮＢ−４、ＨＬ−６０、ＵＦ−１の増殖抑制作用を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項９】  分化誘導促進物質が、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）菌体の加熱抽出液中に含まれる発芽管形成誘導活性を有する画分をゲル濾過することにより得られる、白色水溶性の、１００℃で耐熱性があり、中性から酸性（ｐＨ３．０）で安定で、ｐＨ９以上で自己分解する物質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤。
【請求項１０】  請求項１〜９のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬。
【請求項１１】  神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病が、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳挫傷、又は脊髄損傷であることを特徴とする請求項１０記載の神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬。
【請求項１２】  カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）由来の分化誘導促進物質からなることを特徴とする腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤。
【請求項１３】  腫瘍細胞のアポトーシス誘導能を有することを特徴とする請求項１２記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項１４】  分化誘導促進物質が、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）菌体の加熱抽出液中に含まれる発芽管形成誘導活性を有する画分をゲル濾過することにより得られる、白色水溶性の、１００℃で耐熱性があり、中性から酸性（ｐＨ３．０）で安定で、ｐＨ９以上で自己分解する物質であることを特徴とする請求項１２又は１３記載のアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）由来の分化誘導促進物質からなる神経細胞の活性化・保護剤や、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤や、前記神経細胞の活性化・保護剤を有効成分とする神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンジダ属に属する病原微生物はその性格上、これを積極的に有効利用しようとする試みは少なく、従来、トルラ酵母のごとき食用、飼料用として用いられていた酵母から抗腫瘍性物質を製造する方法がいくつか知られており（例えば、特許文献１〜４参照。）、また、醸造に用いるサッカロミセス属酵母から抽出分離した代謝的に活性な物質、抗腫瘍性物質、グルコース耐性因子を得る方法等が多数知られている（例えば、特許文献６〜８参照。）。また、カンジダ・アルビカンスの全菌体成分からなる抗癌性物質の作製が特許出願されている（例えば、特許文献５参照。）。
【０００３】
一方、カンジダ・アルビカンス（以下、Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓという）ＪＣＭ９０６１の菌体から熱酢酸塩酸抽出したセファデックス画分（分子量約１３００Ｄａ）が、同菌の酵母形から菌糸形を誘導することが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。また、本発明者らにより、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの培養条件によって菌の形態を酵母形から菌糸形へ変換させ、その形態変換を細胞の分化として捉え、形態変換機構を細胞生物学及び分子生物学的アプローチにより解析し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌体抽出物中に酵母形で増殖中の菌体を菌糸形での増殖にスイッチさせる分化誘導物質が確認されたこと（例えば、非特許文献２参照。）、さらに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを酸・熱処理して得られたペプチド様物質がＣＨＯ−Ｋ１の形態を変化させるとともに、細胞内にアクチン線維の発現をもたらすこと（例えば、非特許文献３参照。）、及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来物質が数種類の培養ヒト癌細胞に対して増殖抑制作用を有し、正常ヒト線維芽細胞に対しては増殖に全く影響を及ぼさなかったことが報告されている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００４】
また、前記非特許文献１〜４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌体抽出物質中の分化誘導物質に関しての文献であり、前記非特許文献１に記載の技術において、前記分子量約１３００Ｄａを示す化合物は、液体クロマトグラフィーによる疎水性画分の１つについてプロナーゼ処理を行い活性を失ったことから、この画分にペプチド様の有効成分が含まれることが示唆されており、前記非特許文献２に記載の技術は、分化誘導能及び腫瘍抑制能を有するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来物質が、非特許文献１に記載された物質とは異なり、親水性物質であることまで確認されたこと、前記非特許文献３、４には、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓから形態を酵母型から菌糸型へ変化させる物質を抽出したこと、及びこれらの物質に癌抑制作用があることが記載されているものの、具体的にいかなる物質であるか同定されるまでに到っていない。
【０００５】
他方、微生物、例えば放線菌によって生産される低分子有機化合物が、真核細胞の分化を誘導する作用があることは種々知られ、細胞レベルで確認されている（例えば、非特許文献５参照。）。
【０００６】
【特許文献１】
特公昭４３−１２７２２号公報
【特許文献２】
特開昭４７−２９５３８号公報
【特許文献３】
特公昭４８−２１４８２号公報
【特許文献４】
特公昭５３−１３６０１号公報
【特許文献５】
特開昭６０−１２９８９号公報
【特許文献６】
特公平２−２８３１９号公報
【特許文献７】
特公平３−６９５１３号公報
【特許文献８】
特公平６−８６３７９号公報
【非特許文献１】
萩原聖雄：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  より抽出したｇｅｒｍｔｕｂｅ形成誘導物質の研究、福歯大誌、２３（１）、７１−７９，１９９６
【非特許文献２】
上西他４名  Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌体抽出物質が有する発芽管形成誘導能に関する研究、福歯大誌、２４（１）  ２３−２７，１９９７
【非特許文献３】
第２７回福岡歯科大学学会総会プログラム、予稿集  ｐ．１６  ２０００）
【非特許文献４】
第７４回日本細菌学会総会、講演要旨集  ２００１年４月３日発行
【非特許文献５】
蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．３８  Ｎｏ．１１    ｐ．１７９１‐１７９８  １９９３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、神経細胞の活性化作用や保護作用を有する低分子物質や、腫瘍細胞のアポトーシス誘導作用を有する低分子物質や、前記神経細胞の活性化作用や、保護作用を有する低分子物質を有効成分とする神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌体の加熱抽出液中に含まれる発芽管形成誘導活性を有する画分をゲル濾過することにより得られる、白色水溶性の、１００℃で耐熱性があり、中性から酸性（ｐＨ３．０）で安定で、ｐＨ９以上で自己分解する低分子物質が、動物細胞の分化誘導能や腫瘍細胞の増殖抑制能の他に、脳神経細胞を活性化する作用、すなわち、正常な神経細胞の神経突起を伸長させる作用（神経栄養因子としての機能があること）、グルタミン酸添加ストレス状況にある神経細胞の生存期間を延長させる作用（神経細胞の保護作用がある）、数種の腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する作用、及びヒトの皮膚（表皮）の健康維持に有効な作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）由来の分化誘導促進物質からなることを特徴とする神経細胞の活性化・保護剤（請求項１）や、神経突起の伸長作用を有することを特徴とする請求項１記載の神経細胞の活性化・保護剤（請求項２）や、神経突起の高密度化作用を有することを特徴とする請求項１又は２記載の神経細胞の活性化・保護剤（請求項３）や、ストレス状況下にある神経細胞の保護作用を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤（請求項４）や、神経細胞が脳神経細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤。（請求項５）や、分化誘導促進物質が、分化誘導を介したＣＨＯ−Ｋ１細胞の増殖抑制作用を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤（請求項６）や、分化誘導促進物質が、分化誘導を介したＮＢ−１のコリンエステラーゼ活性発現誘導作用を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤（請求項７）や、分化誘導促進物質が、ＨＴ１０８０細胞、ＨＴ２９細胞、ＮＢ−４、ＨＬ−６０、ＵＦ−１の増殖抑制作用を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤（請求項８）や、分化誘導促進物質が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）菌体の加熱抽出液中に含まれる発芽管形成誘導活性を有する画分をゲル濾過することにより得られる、白色水溶性の、１００℃で耐熱性があり、中性から酸性（ｐＨ３．０）で安定で、ｐＨ９以上で自己分解する物質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤（請求項９）に関する。
【００１０】
また本発明は、請求項１〜９のいずれか記載の神経細胞の活性化・保護剤を有効成分とすることを特徴とする神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬（請求項１０）や、神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病が、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳挫傷、又は脊髄損傷であることを特徴とする請求項１０記載の神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬（請求項１１）や、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）由来の分化誘導促進物質からなることを特徴とする腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤（請求項１２）や、腫瘍細胞のアポトーシス誘導能を有することを特徴とする請求項１２記載のアポトーシス誘導剤。（請求項１３）や、分化誘導促進物質が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）菌体の加熱抽出液中に含まれる発芽管形成誘導活性を有する画分をゲル濾過することにより得られる、白色水溶性の、１００℃で耐熱性があり、中性から酸性（ｐＨ３．０）で安定で、ｐＨ９以上で自己分解する物質であることを特徴とする請求項１２又は１３記載のアポトーシス誘導剤（請求項１４）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の神経細胞の活性化・保護剤やアポトーシス誘導剤としては、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の分化誘導促進物質からなるものであればどのようなものでもよく、ここで「Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の分化誘導促進物質」とは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌体から得られ、哺乳動物細胞の分化誘導を促進する物質をいい、かかるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の分化誘導促進物質としては、分化誘導を介したＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスターの卵巣由来株化細胞）の増殖抑制作用、分化誘導を介したＮＢ−１（ヒト神経芽細胞種から樹立された悪性腫瘍細胞）のコリンエステラーゼ活性発現誘導作用、ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫由来の細胞）、ＨＴ２９細胞（ヒト結腸腺癌由来の細胞）、ＮＢ−４（ヒト前骨髄球性白血病細胞）、ＨＬ−６０（ヒト前骨髄球性白血病細胞）、ＵＦ−１（薬剤耐性を獲得したヒト前骨髄球性白血病細胞）の増殖抑制作用等を有する低分子物質が好ましく、ヒト正常細胞に作用しない低分子物質がより好ましい。
【００１２】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓから上記分化誘導促進物質の抽出、分離・精製方法としては、例えば、図１にその概要が示されているように、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを培養してほぼ定常期になった時点で菌体を集菌・洗浄した後、１Ｍ酢酸−２０ｍＭ塩酸溶液中で１００℃にて１０分間加熱抽出し、得られた抽出液に減圧濃縮を繰り返して酢酸と塩酸を除去し、次いで、前記抽出物をＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（Ｈ＋ｆｏｒｍ）カラムに吸着させ、１Ｍ酢酸を流して不純物を除去し、カラムに吸着した物質を２Ｍピリジンを用いて溶出させ、発芽管形成誘導活性を有する画分を取得し、前記溶出画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いてゲルろ過し、Ｓｅｐ  Ｐａｃ  Ｖａｃを用いて減圧濃縮し、ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷを用いてゲルろ過し、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅを用いて処理し、Ｓｕｐｅｒ  ＰｅｐｔｉｄｅＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、ゲルろ過する方法を例示することができる。
【００１３】
上記分離・精製の過程で、発芽管形成誘導活性を有する画分を取得するには、本発明者らが開発したＺｉｎｃ培地（Ｌ−プロリン、重炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム（各和光純薬社製）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｓｉｇｍａ社製）、（全て終濃度１０−２％）、硫酸亜鉛（和光純薬社製）（終濃度１０−５％）を含む）を有利に用いることができる（福歯大誌、２０（１），１−７，１９９３）。図２（参考写真１参照）に示すようにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓから得られた物質は培養１時間で７０％、３時間では９０％以上の菌体から明らかに菌糸を発現させた。
【００１４】
本発明におけるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の分化誘導促進物質としては、上記ゲルろ過したものの凍結乾燥物を挙げることができ、その有効成分は、白色水溶性で、１００℃の加熱に対して安定であり、また、中性〜酸性（ｐＨ３．０）でも安定であるが、ｐＨ９以上のアルカリ環境では自己分解する低分子物質と推定される。
【００１５】
前記本発明の神経細胞の活性化・保護剤としては、神経突起の伸長作用、神経突起の高密度化作用等の神経細胞、好ましくはヒト脳神経細胞の増殖作用や、ストレス状況下にある神経細胞、好ましくはヒト脳神経細胞の保護作用を有する物質を含有するものが好ましく、また、本発明のアポトーシス誘導剤としては、腫瘍細胞のアポトーシス誘導能を有するものが好ましい。本発明の神経細胞の活性化・保護剤は、ナノグラムオーダーで正常な神経細胞の神経突起を伸長させることができ（神経栄養因子としての機能がある）、また、ナノグラムオーダーでグルタミン酸添加ストレス状況にある神経細胞の生存期間を延長させることができる（神経細胞の保護作用がある）ことから、損傷した中枢神経組織や神経変性疾患の治療における新しい機能物質として有用であり、様々な原因で損なわれた神経、特に脳神経の機能回復への応用や、加齢に伴う神経、特に脳神経の機能低下防止への応用が期待でき、神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病の予防・治療薬としてその有用性が期待できる。かかる神経細胞の活性化作用・保護作用を必要とする疾病としては、脳梗塞（ｂｒａｉｎ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、脳出血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脳挫傷（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ）、脊髄損傷（ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ）等を具体的に例示することができる。
【００１６】
また、本発明のアポトーシス誘導剤は抗腫瘍剤としての有用性が期待できる。そして、本発明の神経細胞の活性化・保護剤やアポトーシス誘導剤を医薬品として用いる場合には、これら成分に加えて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またかかる治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口に局所に投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
なお、各種供試細胞は、理化学研究所（理研ジーンバンク）から購入したものを用い、供試細胞の培養は、培養開始時の細胞数を１〜２×１０４／ｍｌに調整し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で、主に２４穴マルチプレートを用いて培養し、細胞数の計測には、自動血球数計測装置（日本光電社製、ＭＥＫ−５２５４）を用い、細胞の状態の観察には、倒立顕微鏡（オリンパス社製、ＢＨ−２）を用いた。
【００１８】
実施例１（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の分化誘導促進物質の調製）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＪＣＭ９０６１：帝京大学医真菌研究センターより入手）をｐＨ５．６に調整したＧＰＹ液体培地（ｇｌｕｃｏｓｅ  ４％、ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ  １％、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％）において、３７℃、２５時間振盪培養し、ほぼ定常期になった時点で菌体を遠心操作により分離し、集菌した菌体を滅菌蒸留水で３回洗った。集められた菌体ペレットを約１０倍量の１Ｍ酢酸−２０ｍＭ塩酸溶液に浮遊させ、１００℃にて１０分間加熱抽出を行った。得られた抽出液に減圧濃縮を繰り返し、酢酸と塩酸を除去した。次いで、前記抽出物を１Ｍ酢酸に溶解してＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（Ｈ＋ｆｏｒｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラムに吸着させた後、１Ｍ酢酸を流して不純物を除去した。その後、カラムに吸着した物質を２Ｍピリジンで溶出させ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する発芽管形成誘導活性を有する画分を分取した。この画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてゲルろ過した。さらに精製を進めるために、得られた物質を１０ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ４．５に調整）で平衡化したＳｅｐ  Ｐａｃ  Ｖａｃ（ＱＭＡタイプ：Ｗａｔｅｒｓ社製）に吸着させてイオン交換クロマトグラフィーを行い、活性を示す画分を分取した。分取した物質はＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷ（東ソー（株）社製）を用いてゲルろ過し、さらにＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ  ８０（東ソー（株）社製）を用いたＨＰＬＣによる分離と、これに続くゲルろ過（Ｓｕｐｅｒ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＨＲ１０／３０：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により最終精製物質が得られた。この得られた物質を凍結乾燥すると白色の粉末状を呈し、粉末は容易に水に溶ける。そこでこの得られた物質を、適宜その濃度に希釈し、細胞培養時に添加して実験を行った。培養の途中で培養液を交換する際には、この得られた物質を培養開始時と同量加えた。
【００１９】
実施例２（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物によるＣＨＯ−Ｋ１の分化誘導能と増殖抑制）ＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、ＣＨＯ−Ｋ１という）はチャイニーズハムスターの卵巣由来細胞で、それが腫瘍化したものである。この細胞は通常図３（参考写真２参照）（左）に示すように敷石状の形態を示す。ＣＨＯ−Ｋ１はある種の分化誘導物質を加えると細胞分化をおこし、その形態が線維芽細胞状に変化することが知られている。図３（参考写真２参照）（中央）は分化誘導促進物質（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物）を１０μｇ／ｍｌに調整したものを細胞に添加して５日間培養したときのものである。この結果、細胞の形態は明らかに線維芽細胞様に変化することがわかった。さらに、分化誘導促進物質無添加（対照）を使用した際には細胞内部に明確な変化が認められないが、分化誘導促進物質を添加した際は細胞内部に長軸にそって細長いアクチン線維の出現が観察された。なお、アクチン繊維は通常に従って細胞を固定した後、ローダミン・ファロイジンで染色し、蛍光顕微鏡にて観察したものである。図３（参考写真２参照）（右）は分化誘導の陽性対照物質としてサイクリックＡＭＰを１５μＭ添加し、培養した際のものである。分化誘導促進物質を添加したときの細胞の形態変化と細胞内のアクチン線維出現がほぼ同様であることから、分化誘導促進物質はＣＨＯ−Ｋ１に対して分化誘導能を有していることがわかった。
【００２０】
また、表１には分化誘導促進物質がＣＨＯ−Ｋ１の増殖を抑制することを調べた際の結果を示す。ＣＨＯ−Ｋ１を通常の状態で培養すると、その平均倍加時間は２２時間であった。しかし、分化誘導促進物質を添加して培養すると細胞の倍加時間は約２倍の４４．５時間に延長され、明らかに増殖が抑制されていることがわかった。対照としてサイクリックＡＭＰを添加したが、この倍加時間も明らかに延長されていた。データとして示していないが、分化誘導促進物質を４０μｇ／ｍｌ以上添加すると細胞の増殖は完全に抑制された。
【００２１】
腫瘍細胞の最大の特性として、未分化細胞であるため、無制限に増殖し続けることを挙げることができる。図３に示すように、何も添加しない状態でのＣＨＯ−Ｋ１は敷石状の形態の細胞が増殖し続けるが、そこに分化誘導促進物質物が加えられると細胞は分化し、形態を変化させるとともに、その増殖の様子（速度）にも変化が現れる。正常な細胞は周囲の細胞と接触するまで、ある程度の細胞数に達したときはその増殖が停止することが知られている（ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）。この実験で分化誘導促進物質を添加してＣＨＯ−Ｋ１を培養したとき、細胞の形態は線維芽細胞に変化し、さらに細胞数の倍加時間は正常な線維芽細胞を培養したときときわめて近いものであった。このことから、分化誘導促進物質はＣＨＯ−Ｋ１には分化誘導を介した増殖抑制作用を有していることがわかる。
【００２２】
【表１】
2004131400.tif 000001
【００２３】
実施例３（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物によるＮＢ−１細胞に対する分化誘導能）
ＮＢ−１細胞（以下、ＮＢ−１という）はヒトの神経芽細胞種から確立された悪性の腫瘍細胞である。ＮＢ−１を通常の状態で培養すると、図４（参考写真３参照）（左上段）に示すような形態を示す。この腫瘍細胞の起源は神経細胞であることから、細胞の形態は部分的に神経細胞をうかがわせるような形を示し、さらに、短い神経突起様の構造物も観察される。図４はＮＢ−１に対する分化誘導促進物質の分化誘導能を調べた結果を示している。先ず、ＮＢ−１に分化誘導促進物質を２μｇ／ｗｅｌｌ添加して培養した結果、図４（参考写真３参照）（左下段）に示すように、ＮＢ−１はその形態を大きく変化させ、神経細胞を培養したときの様相を呈した。さらに、神経細胞の特徴的な構造物である神経突起が著明に伸張している様子が観察された。このことは、実施例２の場合と同様に分化誘導促進物質による分化誘導の結果として「形態を変化させる」ことが生じたものである。
【００２４】
神経細胞の他の細胞にはない特徴的な機能の一つに神経細胞間でのシグナル伝達がある。このシグナル伝達に関与しているのがアセチルコリンであることは古くから知られている。また、伝達を終えたアセチルコリンは神経細胞のみが有しているアセチルコリンエステラーゼによって速やかに分解される。このアセチルコリンエステラーゼも神経細胞に固有の酵素であることが知られている。そこで、通常の培養条件で未分化の状態のＣＨＯ−Ｋ１には発現されないコリンエステラーゼ活性が、分化誘導促進物質により分化が誘導されると、細胞にコリンエステラーゼ活性が出現するどうか、次のとおり実験を行った。
ＮＢ−１にいくつかの濃度に調整した分化誘導促進物質を添加して５日間培養した後に細胞を回収し、凍結・融解を繰り返して細胞を破壊し、遠心分離によって細胞内液を集めた。集めた細胞内液のタンパク質濃度を一定にして、その一部をアセチルコチンと３７℃で一定時間反応させた。反応時間が終了した時点で、反応液のｐＨをｐＨメーターで測定し、反応開始前と反応終了時のｐＨの差を求めた。アセチルコリンがコリンエステラーゼにより分解されると、基質として含まれる酢酸が遊離され、その結果、反応液のｐＨ低下をきたすことを応用するものである。試験結果を図４右に示す。
【００２５】
ＮＢ−１を分化誘導促進物質を添加しないで培養すると、コリンエステラーゼ活性は全く検出されなかったが、分化誘導促進物質を１．９μｇ／ｗｅｌｌの濃度で添加し培養したとき、ｐＨは約０．０６低下した。しかし、その１０倍量（１９μｇ／ｗｅｌｌ）を添加した場合はｐＨの低下は前者の半分程度であった。これは分化誘導促進物質がＮＢ−１の増殖そのものを抑制しているためであることがわかった。また、分化誘導促進物質を添加して培養すると、ＮＢ−１にコリンエステラーゼ活性の発現が観察された。この現象は分化誘導により、マスクされていた機能が発現されたものであり、図４（参考写真３参照）に示すように分化誘導促進物質は形態学的分化と機能的分化の両方を誘導する能力を有しているのである。さらに、分化を受けた細胞の神経突起の伸張は著しいことから、分化誘導促進物質は神経細胞を活性化させる性質を有している。また、ＮＢ−１と同じく、ヒト神経芽細胞種由来のＧＯＴＯ細胞に対して分化誘導促進物質は増殖を抑制しなかった。
【００２６】
実施例４（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物によるＨＴ１０８０の増殖抑制）
ＨＴ１０８０細胞は、ヒト線維肉腫由来の細胞である。上記実施例２及び３の方法において、ＣＨＯ−Ｋ１細胞やＮＢ−１細胞に代えて、ＨＴ１０８０細胞を用いる以外は同様の方法により実施した。腫瘍細胞であるＨＴ１０８０細胞の起源は線維芽細胞であることが知られていることから、分化誘導促進物質を添加、培養すると分化誘導を受けてその形態は線維芽細胞状に変化するのではないかと予測し実験を行った。しかし、予想に反して細胞の形態変化は観察されなかったが、図５に示すように、７日間培養後、分化誘導促進物質３．８（μｇ／ｗｅｌｌ）を用いたものは、対照（無添加）に比して、１／２以下に、また７．２（μｇ／ｗｅｌｌ）を用いたものは、１／５以下に、ＨＴ１０８０細胞の増殖を明らかに抑制していた。
【００２７】
実施例５（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物による２種類のヒト大腸癌由来細胞の増殖抑制）ヒト大腸癌（結腸腺癌）由来の細胞で代表的なＨＴ２９細胞とＣａｃｏ２細胞を実験に用いた。図６には、分化誘導促進物質を添加してＨＴ２９細胞を培養した結果を示す。培養５日では分化誘導促進物質添加の有無にかかわらず、細胞の増殖の程度に差は見受けられないが、培養７日では、分化誘導促進物質３．８（μｇ／ｗｅｌｌ）を用いたものは、対照（無添加）に比して、１／３以下に、また７．２（μｇ／ｗｅｌｌ）を用いたものは、１／７以下に、ＨＴ２９細胞の増殖を明らかに抑制していた。また、図７には、分化誘導促進物質を添加してＣａｃｏ２細胞を培養した結果を示す。ＨＴ２９細胞を培養したときとは異なり、分化誘導促進物質は、Ｃａｃｏ２細胞の増殖を抑制する傾向はあるものの、分化誘導促進物質の添加と無添加の間には有意な差は認められなかった。ここでは２種類のヒト由来大腸癌に対する分化誘導促進物質の増殖抑制効果を調べたが、結果的にはＨＴ２９細胞のみにその効果が確認された。また、これらの癌細胞は腺組織由来であることから、分化誘導促進物質添加により、その形態変化について観察したが、少なくとも形態的な変化は認められなかった。分化誘導促進物質はなぜＣａｃｏ２細胞に対して増殖抑制効果を発揮しなかったのかその理由は不明である。
【００２８】
実施例６（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物によるヒト前骨髄球性白血病由来細胞の増殖抑制）
ここでは２種類の代表的なヒト前骨髄球性白血病細胞であるＮＢ−４細胞及びＨＬ−６０細胞と薬剤耐性を獲得したヒト前骨髄球性白血病細胞ＵＦ−１細胞（慶應義塾大学  木崎昌弘博士より分与）に対する分化誘導促進物質の増殖抑制効果について実験した。すなわち、ＮＢ−４細胞及びＨＬ−６０細胞を、分化誘導促進物質を添加して培養した。その結果は、図８及び図９に示すとおり、分化誘導促進物質は、ＮＢ−４細胞及びＨＬ−６０細胞の増殖を抑制するものであり、特にＨＬ−６０細胞に対しては、図９に示すとおり、分化誘導促進物質の添加により、培養５日で、３．８μｇ／ｗｅｌｌの添加では、無添加のときの１／４程度に、また７．２μｇ／ｗｅｌｌの添加では、１／２０程度に細胞数が減り、顕著な増殖抑制効果が示された。また、前骨髄球性白血病細胞の効果的な治療薬として知られている活性化ビタミンＡ（レチノイン酸）に対して耐性を獲得したＵＦ−１を用いて分化誘導促進物質の増殖抑制効果を調べた。図１０に、その結果を示す。ＵＦ−１の増殖速度は他の腫瘍細胞に比べて遅く、細胞数は４週間培養で約１０倍に達する程度であった。図１０の試験結果は４週間培養を行った経過を示す。培養１８日で分化誘導促進物質を７．２μｇ／ｗｅｌｌ添加したもので、増殖には明らかな有意な差がある。
【００２９】
活性化ビタミンＡは前骨髄球性白血病に対して著名な治療効果を発揮することから、現在広く用いられている。その薬理作用は白血病細胞の分化誘導にあることが明らかにされており、試験管内実験で白血病細胞は活性化ビタミンＡの作用により顆粒化あるいは単球に分化することが知られている。しかし、白血病細胞は他の癌との場合と同様に、やがて活性化ビタミンＡに対して耐性を獲得して新たな活動（無制限な増殖）を開始し、さらに活性化ビタミンＡそのものの副作用も次第に発現されることから宿主の寛解期は短くなる。図１０に示すように、すでに活性化ビタミンＡに対して耐性を獲得した白血病細胞（ＵＦ−１細胞）に対しても分化誘導促進物質は明らかにその増殖を抑制したことから、そのような場合における制癌物質としての応用が期待できる。
【００３０】
実施例７（正常ヒト線維芽細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物の影響）
上記の実施例２〜６で用いた細胞はいずれも腫瘍細胞であり、これまでに開発、市販されている抗癌剤に強く応答する。しかし、これらの抗癌剤は一方では正常細胞や性状組織に対して深刻な副作用を有していることがしばしば見受けられる。そこで、本発明者は分化誘導促進物質が正常な細胞に対して毒性を発揮するのかどうかについて調べた。実験には市販されている正常なヒト線維芽細胞であるＷ１３８細胞を用いて、分化誘導促進物質がＷ１３８細胞の増殖及び生存に及ぼす影響について実験を行った。結果を図１１（参考写真４参照）に示す。図１１に示すように、Ｗ１３８細胞の増殖速度はゆるやかで、一週間の培養で細胞数は約２〜３倍になる。Ｗ１３８細胞の培養時に分化誘導促進物質を添加しても、無添加の場合と比較して細胞数の増加には差が見受けられず、さらに１０日間まで培養を継続しても細胞の増殖傾向に差はなかった。また、図１１に示すように分化誘導促進物質を添加して細胞を培養すると細胞の増殖は良好であり、表面は滑らかであった。
以上、実験に供した細胞及びＧＯＴＯ細胞に対する増殖抑制及び分化誘導効果をまとめて表２に示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
実施例８（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物によるＮＢ−４細胞のアポトーシス誘導）
実施例６において、分化誘導促進物質はＮＢ−４細胞の増殖を抑制することを明らかにした。そこで、その増殖がどのような機構により起こっているのかを調べた。ＮＢ−４に分化誘導促進物質を添加して５日間培養した。培養終了後に細胞を遠心操作で集め、常法にしたがって細胞をグルタール固定し、ヘキスト３３３４２色素で染色した。染色標本を蛍光顕微鏡で観察した結果を図１２（参考写真５参照）に示す。この結果、対照（分化誘導促進物質無添加）培養細胞の核はほぼ正常な形態を示しているが（図１２Ａ）、分化誘導促進物質を添加して培養した細胞の核は明らかに細分化されている様子が観察された（図１２Ｂ）。この現象は細胞がアポトーシスを起こしていることを示すものである。さらに、細胞がアポトーシスを起こすとそのＤＮＡが断片化することが知られているが、図１２Ｃに示すように、ＮＢ−４に分化誘導促進物質を添加して培養すると、培養液中に断片化したＤＮＡがラダーとなって出現することが確認された（図１２Ｃレーン３及び４）。なお、図１２Ｃのレーン１はＤＮＡマーカー、レーン２は対照（分化誘導促進物質無添加）、レーン５は陽性対照（アクチノマイシンＤ添加）である。この実験結果から、分化誘導促進物質はＮＢ−４に対してアポトーシスを誘導することが明らかにされ、分化誘導促進物質によるＮＢ−４の増殖抑制は「細胞死」の誘導によるものであることがわかった。
【００３３】
実施例９（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物によるラット脳神経細胞の増殖）
実施例３において、分化誘導促進物質は神経細胞の増殖を支持する性質を有していることが示唆されたが、本実験ではラットの脳神経細胞を取り出して培養し、その際の分化誘導促進物質添加の有無によって細胞増殖に差があるかどうかについて調べた。生後１１〜１２日のウィスター系ラット（雄）を麻酔した後、小脳から神経細胞が豊富な部分（Ｎｅｕｒｏｎ  ｒｉｃｈ）と、神経細胞とグリア細胞が混在する部分（Ｎｅｕｒｏｎ／Ｇｌｉａ）を別々に切り出し、約１ｍｍ３の大きさにミンスして常法にしたがって細胞を分散させ、細胞数を１〜２×１０５／ｍｌに調整し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４穴マルチプレートを用い分化誘導促進物質を添加し、培養した。培養終了後、培養液を除き、ＰＢＳで細胞を十分に洗い、凍結・融解を繰り返して細胞を破壊した。その後、ＳＤＳを添加して細胞を可溶化し、色素結合法によってタンパク濃度を測定した。
【００３４】
実験の結果、図１３（参考写真６参照）に示すようにＮｅｕｒｏｎ  ｒｉｃｈの部分もＮｅｕｒｏｎ／Ｇｌｉａの部分も分化誘導促進物質を添加して培養したときのタンパク量は明らかに増加していることがわかった。正常な神経細胞は完全に分化が終了しており、これを試験管内に移して培養を行っても、細胞そのものが分裂して数を増加させることはない。ただし、例えば神経増殖因子（ＮＧＦ）のような物質が添加されると細胞の外側にある神経突起が著明に伸長することが知られている。この実験結果から、分化誘導促進物質はラットの神経細胞を活性化し、その神経突起を伸長させるため、培養細胞全体のタンパク量が増加しているものと推察された。図１３上段は分化誘導促進物質を添加しないで培養したもの（対照）、中段はＮｅｕｒｏｎ  ｒｉｃｈの細胞に分化誘導促進物質を添加して７日間培養したもの、下段はＮｅｕｒｏｎ／Ｇｌｉａの細胞に同じく分化誘導促進物質を添加して７日間培養したものである。分化誘導促進物質を添加して培養すると神経細胞から出ている神経突起の密度は高く、また、神経突起は著明に伸長していることも観察された。なお、５μｇ／ｗｅｌｌの濃度で分化誘導促進物質を添加しても、ラット神経細胞に対してトキシックな作用は観察されなかった。このことから、分化誘導促進物質は神経細胞を活性化する能力を有していることを示すものである。この神経細胞を活性化する作用は、出血や梗塞あるいは事故等により損傷を受けた脳組織において生残する神経細胞同士の連絡を高め、失われた（損なわれた）機能の回復促進に応用できるものである。
【００３５】
実施例１０（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物によるストレス下にある脳神経細胞の保護作用）
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（生後８日齢）から小脳を摘出し、顆粒細胞をトリプシン処理して分取することにより神経細胞を調製した。分取した細胞をＥａｇｌｅ  ＭＥＭ培地（１０％牛胎児血清添加）に浮遊させ、５％ＣＯ２存在下培養装置で培養した。培養開始と同時に１ｍＭのグルタミン酸（以下Ｇｌｎ）を培養液に添加した。グルタミン酸は脳内の興奮性神経伝達物質で、脳梗塞などの脳内での低エネルギー状態時には過剰のグルタミン酸が神経終末から放出されることによって神経細胞が死滅する。すなわち、グルタミン酸を培養細胞に加えることにより、脳内での神経細胞障害を生理学的異常時に誘発される状態を再現することができる。さらに、これらの培養系に分化誘導促進物質を添加して神経細胞の生存に及ぼす効果を調べた。なお、細胞死の確認は蛍光法の一つであるカルセイン法を用いた。すなわち、カルセイン−アセトキシメチル体を培養中の細胞に取り込ませた後に、細胞内酵素によってアセトキシメチルから遊離したカルセインが放つ蛍光を測定し、これを計量化して細胞の生存率を対照と比較した。
【００３６】
ラットの小脳から分取した神経細胞にＧｌｎを加えることにより、神経細胞障害を生理学的異常時に誘発される状態を再現し、ストレス状況下にある神経細胞の生存に分化誘導促進物質の添加がどのように影響するか調べた。培養１４時間後及び培養２０時間後の結果を表３に示す。添加物を何も加えないものを対照として調べた結果、培養１４時間後の成績でＧｌｎのみを加えると神経細胞は約９０％が生存したが、分化誘導促進物質（ＫＣ）を同時に１０〜２０ｎｇ添加すると細胞は対照とほぼ同様かわずかにそれを上回る生存率を示した。また、分化誘導促進物質のみを添加した場合でも神経細胞の生存率は対照よりも高い数値を示した。培養２０時間後の成績では、Ｇｌｎのみを添加したときの細胞の生存率は約６０％であったが、分化誘導促進物質を同時に１０〜２０ｎｇ添加すると細胞は対照とほぼ同様かわずかにそれを上回る生存率を示した。また、分化誘導促進物質のみを添加した場合では明らかに対照よりも高い生存率を示した。これらの結果から、分化誘導促進物質はストレス状況下にある神経細胞の保護作用を有し、細胞の生存期間を延長させる機能を有するものであることがわかった。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
【発明の効果】
上記の実施例２から１０までに示されるように、Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓから抽出された物質である分化誘導促進物質は、２種類の腫瘍細胞の分化を誘導し、７種類の腫瘍細胞の増殖を抑制した。さらに、分化誘導促進物質はヒトの線維芽細胞及びラットの神経細胞を活性化し、これら正常な細胞に対して増殖抑制ないし致死的な作用を及ぼさないこともわかった（表２）。これらの実施例から、分化誘導促進物質は、（１）細胞の増殖を抑制することから、医療分野における新たな制癌物質としての利用、（２）線維芽細胞を活性化することから、医療分野において創傷治癒促進物質としての利用、ならびに、健康科学分野における皮膚（表皮）の健康維持物質としての利用、（３）神経細胞を活性化し、特に神経突起を伸長させる能力を有していることから、他の神経細胞との連絡が旺盛になることが予測される。したがって、出血や梗塞あるいは事故等により損傷を受けた脳組織において生残する神経細胞同士の連絡を高めることにより、失われた（損なわれた）機能の回復促進への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓから分化誘導ならびに腫瘍細胞増殖抑制活性を示す物質の分離と精製を示す図である。
【図２】本発明の分化誘導ならびに腫瘍細胞増殖抑制活性を示す物質のバイオアッセイ−発芽管形成法−を示す図である。
【図３】本発明のＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来物質の分化誘導能を示す図である。
【図４】本発明のＮＢ−１細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の分化誘導能を示す図である。
【図５】本発明のＨＴ１０８０細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の増殖抑制効果を示す図である。
【図６】本発明のＨＴ２９細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の増殖抑制効果を示す図である。
【図７】本発明のＣａｃｏ−２細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の増殖抑制効果を示す図である。
【図８】本発明のＮＢ−４細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の増殖抑制効果を示す図である。
【図９】本発明のＨＬ−６０細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の増殖抑制効果を示す図である。
【図１０】本発明のＵＦ−１細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の増殖抑制効果を示す図である。
【図１１】本発明のＷＩ３８細胞に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の増殖抑制効果を示す図である。
【図１２】本発明のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質によるＮＢ−４細胞のアポトーシス誘導を示す図である。
【図１３】本発明のラット脳神経細胞の増殖に及ぼすＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ抽出物質の効果を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2004131400.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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