【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年10月13日(2004.10.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】        明細書
【発明の名称】    分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードする核酸
【特許請求の範囲】
【請求項１】  配列番号：２２のアミノ酸配列の全長配列をコードするヌクレオチド配列の相補鎖に対してハイブリッド形成する単離された核酸であって、
肺又は大腸癌で過剰発現するポリペプチドをコードし、
前記ハイブリッド形成が、４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸の存在下でのハイブリダイゼーション、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中及び５５℃での５０％ホルムアミド中での洗浄、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を含む緊縮性条件下でなされる、単離された核酸。
【請求項２】  配列番号：２１のヌクレオチド配列の相補鎖に対してハイブリッド形成する単離された核酸であって、
肺又は大腸癌で過剰発現するポリペプチドをコードし、
前記ハイブリッド形成が、４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸の存在下でのハイブリダイゼーション、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中及び５５℃での５０％ホルムアミド中での洗浄、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を含む緊縮性条件下でなされる、単離された核酸。
【請求項３】  配列番号：２１のヌクレオチド配列の全長コード配列の相補鎖に対してハイブリッド形成する単離された核酸であって、
肺又は大腸癌で過剰発現するポリペプチドをコードし、
前記ハイブリッド形成が、４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸の存在下でのハイブリダイゼーション、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中及び５５℃での５０％ホルムアミド中での洗浄、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を含む緊縮性条件下でなされる、単離された核酸。
【請求項４】  ＡＴＣＣ登録番号２０３６５１で寄託されたＤＮＡの全長コード配列の相補鎖に対してハイブリッド形成する単離された核酸であって、
肺又は大腸癌で過剰発現するポリペプチドをコードし、
前記ハイブリッド形成が、４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸の存在下でのハイブリダイゼーション、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中及び５５℃での５０％ホルムアミド中での洗浄、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を含む緊縮性条件下でなされる、単離された核酸。
【請求項５】  請求項１ないし４の何れか１項に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項６】  ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項５に記載のベクター。
【請求項７】  請求項５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項８】  前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】  前記細胞が大腸菌である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】  前記細胞が酵母細胞である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１１】  ＰＲＯ３４３４ポリペプチドの製造方法において、請求項７に記載の宿主細胞を、前記ＰＲＯ３４３４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から前記ＰＲＯ３４３４ポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
【請求項１２】  配列番号：２２のアミノ酸配列の全長配列で一又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加しているものを有する単離されたポリペプチドであって、肺又は大腸癌で過剰発現する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】  ＡＴＣＣ登録番号２０３６５１で寄託されたＤＮＡの全長コード配列によってコードされるアミノ酸配列で一又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加しているものを有する単離されたポリペプチドであって、肺又は大腸癌で過剰発現する単離されたポリペプチド。
【請求項１４】  異種アミノ酸配列に融合した請求項１２又は１３に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１５】  前記異種アミノ酸配列がタグポリペプチド配列である請求項１４に記載のキメラ分子。
【請求項１６】  前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項１４に記載のキメラ分子。
【請求項１７】  請求項１２又は１３に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１８】  前記抗体がモノクローナル抗体又は単鎖抗体である請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】  配列番号：２２のポリペプチドの全長配列をコードし、その関連の推定シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列の相補鎖に対してハイブリッド形成する単離された核酸であって、
肺又は大腸癌で過剰発現するポリペプチドをコードし、
前記ハイブリッド形成が、４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸の存在下でのハイブリダイゼーション、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中及び５５℃での５０％ホルムアミド中での洗浄、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を含む緊縮性条件下でなされる、単離された核酸。
【請求項２０】  配列番号：２２のポリペプチドの全長配列の、その関連の推定シグナルペプチドを欠くもので、一又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加しているものを有する単離されたポリペプチドであって、肺又は大腸癌で過剰発現する単離されたポリペプチド。
【請求項２１】  配列番号：２２の全長配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
【請求項２２】  配列番号：２１の全長配列のヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
【請求項２３】  配列番号：２１の全長コード配列のヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
【請求項２４】  ＡＴＣＣ登録番号２０３６５１で寄託されたＤＮＡの全長コード配列のヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
【請求項２５】  配列番号：２２の全長配列のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２６】  配列番号：２１のヌクレオチド配列を有する核酸の全長コード配列によってコードされるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２７】  ＡＴＣＣ登録番号２０３６５１で寄託されたＤＮＡの全長コード配列のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、並びに新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】
(発明の背景)
細胞外タンパク質は、とりわけ多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996);米国特許第５５３６６３７号を参照されたい]。
【０００３】
膜結合タンパク質及びレセプターは、とりわけ多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、線維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター-リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
新規な未変性レセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【０００４】
１．ＰＲＯ１８００
Ｈｅｐ２７タンパク質はブチラート処理によって誘発される成長停止に続いてヒト肝芽腫細胞（ＨｅｐＧ２細胞）の核で合成され、蓄積される(Gabrielli等., Eur.J.Biochem.232:473-477(1995))。Ｈｅｐ２７の合成はブチラートブロックから解放され、ＤＮＡ合成を再開した細胞で抑制される。Ｈｅｐ２７タンパク質配列はタンパク質の既知の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＣＡＤ）ファミリーと有意な相同性を示し、それはＨｅｐ２７がタンパク質のＳＣＡＤファミリーの新規なメンバーであることが示唆されている。核局在化に従って、Ｈｅｐ２７は２分核の標的配列と類似した領域を持ち、Ｈｅｐ２７ｍＲＮＡ発現とタンパク質合成は転写後のレベルで調節が存在することを示唆する。
ここで我々は、ここでＰＲＯ１８００ポリペプチドと命名した、Ｈｅｐ２７タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドの同定及び特徴づけを説明する。
【０００５】
２．ＰＲＯ５３９
多細胞生物の発育は少なくとも部分的に、細胞、組織、又は器官のパターン化の位置的情報を特定、指揮又は維持するメカニズムに依存している。種々の分泌されたシグナル伝達分子、例えばトランスフォーミング成長因子-ベータ（ＴＧＦ-β）、Ｗｎｔ、繊維芽細胞成長因子及びヘッジホッグファミリーのメンバー等は、ショウジョウバエ及び脊椎動物における様々な細胞及び構造のパターン形成活性に関連している。Perrimon, Cell: 80: 517-520 (1995)。
Ｃｏｓｔａｌ−２はヘッジホッグシグナル経路での新規なキネシン関連タンパク質である。ヘッジホッグ（Ｈｈ）は、キイロショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングによりセグメントポラリティ遺伝子として最初に同定され、Nusslein-Volhard等, Roux. Arch. Dev. Biol. 193: 267-282 (1984)、広範な発達機能を果たす。Perrimon, 上掲。１つのショウジョウバエＨｈ遺伝子しか同定されていないが、３つの哺乳動物Ｈｈ相同体：ソニックＨｈ（ＳＨｈ）、デザートＨｈ（ＤＨｈ）及びインディアンＨｈ（ＩＨｈ）が単離されている、Echelard等, 上掲；Krauss等, Cell 75, 1431-44 (1993)；Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993)。ＳＨｈは発育中の脊椎動物胚の脊索及び底板で高レベルで発現される。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジェニック動物におけるＳＨｈの異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成において鍵となる役割を果たすことを示している、Echelard等, 上掲, Krauss等, Cell 75, 1431-44 (1993), Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993), Roelink等, Cell 81: 445-5 (1995)。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジェニック動物におけるＳＨｈの異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成において鍵となる役割を果たすことを示している、Echelard等 (1993), 上掲, Ericson等, Cell 81: 747-56 (1995); Marti等, Nature 375: 322-5 (1995); Roelink等 (1995), 上掲; Hynes等, Neuron 19: 15-26 (1997)。また、Ｈｈは、肢（Krauss等, Cel 75: 1431-44 (1993）; Laufer等, Cell 79, 993-1003 (1994)）、体節（Fan 及びTessier-Lavigne, Cell 79, 1175-86 (1994); Johnson等, Cell 79: 1165-73 (1994)）、肺（Bellusci等, Develop. 124: 53-63 (1997)）及び皮膚（Oro等, Science 276: 817-21 (1997)）の発達においても役割を果たす。同様に、ＩＨｈ及びＤＨｈは骨、腸及び胚細胞発育に関連する、Apeqvist等, Curr. Biol. 7: 801-4 (1997); Bellusci等, Development 124: 55-63 (1997); Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996); Roberts等, Development 121: 3163-74 (1995)。ＳＨｈノックアウトマウスは、ＳＨｈが脊椎動物の発育の多くの面に重要であるという考えを更に強めた、Chiang等, Nature 383: 407-13 (1996)。 これらのマウスは、脊索及び底板といった中間構造における異常、神経管の腹側細胞細胞型の不存在、末端肢構造の不存在、単眼症、及び脊柱及び殆どの肋骨の不存在を示す。
【０００６】
細胞表面において、Ｈｈシグナルは、１２回膜貫通ドメインタンパク質Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）［Hooper及びScott, Cell 59: 751-65 (1989); Nakano等, Nature 341: 508-13 (1989)］及びＧ-タンパク質結合様レセプターＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）［Alcedo等, Cell 86: 221-232 (1996); van den Heuval及びIngham, Nature 382: 547-551 (1996)］にリレーされると考えられている。遺伝子的及び生化学的双方の証拠が、Ｐｔｃｈ及びＳｍｏが多成分レセプター複合体の一部であるレセプターモデルを支持している、Chen及びStruhl, Cell 87: 553-63 (1996); Marigo等, Nature 384: 176-9 (1996); Stone等, Nature 384: 129-34 (1996)。ＨｈのＰｔｃｈへの結合に際し、ＰｔｃｈのＳｍｏに対する平常の阻害効果が解除され、Ｓｍｏが細胞膜を通してのＨｈシグナルの伝達を可能にする。Ｐｔｃｈ遺伝子における機能変異の喪失が、基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）、多発性基底細胞癌（ＢＣＣ）を特徴とする遺伝病の患者で同定された。また、機能障害Ｐｔｃｈ遺伝子変異は、多くの割合で散在性基底細胞癌腫を伴っていた、Chidambaram等, Cancer Research 56: 459-601 (1996); Gailani等, Nature Genet. 14: 78-81 (1996); Hahn等, Cell 85: 841-51 (1996); Johnson等, Science 272: 1668-71 (1996); Unden等, Cancer Res. 56: 4561-5 (1996); Wicking等, Am. J. Hum. Genet. 60: 21-6 (1997)。Ｐｔｃｈ機能の喪失は、基底細胞癌における制御不能なＳｍｏシグナル伝達を起こすと考えられる。同様に、Ｓｍｏ変異の活性化が散在性ＢＣＣ腫瘍で同定され（Xie等, Nature 391: 90-2 (1998)）、ＳＨｈのレセプター複合体におけるシグナル伝達サブユニットとしてのＳｍｏの役割を強調している。しかしながら、ＰｔｃｈがＳｍｏ活性を制御する正確な機構は未だ明らかになっておらず、Ｈｈシグナルがレセプターから下流の標的に伝達されるシグナル伝達機構も明確にされねばならない。ショウジョウバエにおける遺伝子上位分析により、Ｈｈシグナル伝達経路の成分として機能すると思われる幾つかのセグメントポラリティ遺伝子が同定された、Ingham, Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 492-8 (1995); Perrimon, 上掲。これらは、キネシン様分子、Ｃｏｓｔａｌ-２（Ｃｏｓ-２）［Robbins等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)］、ｆｕｓｅｄと命名されたタンパク質［Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1993); Therond等, Proc. Natl. acad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)］、ｆｕｓｅｄサプレッサーと命名された不明な機能の新規な分子［Pham等, Genetics 140: 587-98 (1995); Preat, Genetics 132: 725-36 (1992)］及びＺｎフィンガータンパク質Ｃｉ．［Alexandle等, Genes De. 10: 2003-12 (1996); Dominguez等, Science 272: 1621-5 (1996); Orenic等, Genes Dev. 4: 1053-67 (1990)］を含む。Ｈｈシグナル伝達に関係する更なる成分は、転写因子ＣＢＰ［Akimaru等, Nature 386: 735-738 (1997)］、ネガティブレギュレータｓｌｉｍｂ［Jiang及びStruhl, Nature 391: 493-496 (1998)］及びＳＨｈ応答成分ＣＯＵＰ-ＴＦＩＩ［Krishnan等, Science 278: 1947-1950 (1997)］を含む。
【０００７】
Ｃｏｓ-２における変異は胚致死性であり、各セグメントの中心成分及びＨｈ応答性遺伝子の拡張ドメインの複製を含むＨｈ過剰発現に類似のフェノタイプを提示する。これに対して、ｆｕｓｅｄ及びＣｉについての変異胚は、各セグメント後部の欠失及び前部の鏡像様複製の置換及び前部の鏡像様複製の置換を含むＨｈ機能の喪失に類似のフェノタイプを示す、Busson等, Roux. Arch. Dev. Biol. 197: 221-230 (1988)。Ｃｉの分子キャラクタリゼーションは、それがＷｉｎｇｌｅｓｓ及びＤｐｐなどのＨｈ応答性遺伝子を直接活性化する転写因子であることを示唆した、Alexandre等, (1996), 上掲; Dominguez等, (1996) 上掲。同様に、ｆｕｓｅｄの分子分析により、それがセリンスレオニンキナーゼと構造的に関連し、無傷のＮ末端キナーゼドメインとＣ末端調節領域の両方がその適切な機能のために必要とされることが明らかになった、Preat等, Nature 347: 87-9 (1990); Robbins等, (1997), 上掲; Therond等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)。Ｃｏｓ-２及びｆｕｓｅｄの推定反対機能に一致して、ｆｕｓｅｄ変異はＣｏｓ-２変異体によって、またｆｕｓｅｄ変異体のサプレッサーによって抑制される、Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1993)。しかしながら、ｆｕｓｅｄ無しの変異及びＮ-末端キナーゼドメイン変異は、ｆｕｓｅｄ変異のサプレッサーによって完全に抑制されるが、ｆｕｓｅｄのＣ-末端変異はｆｕｓｅｄのサプレッサーのバックグラウンドにおいて強いＣｏｓ-２フェノタイプを提示する。このことは、ｆｕｓｅｄキナーゼドメインが、ｆｕｓｅｄのサプレッサーが存在しない場合にＳＨｈシグナル伝達の構成アクチベータとして作用可能であることを示唆している。最近の研究は、９２ｋＤａショウジョウバエｆｕｓｅｄ、Ｃｏｓ-２及びＣｉが微小管結合多タンパク質複合体に存在し、Ｈｈシグナル伝達が微小管からのこの複合体の解離を導くことを示した、Robbins等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)。ｆｕｓｅｄ及びＣｏｓ-２の両方ともがＨｈ処理に応答してリン酸化されるが、Robbins等, 上掲; Therond等, Genetics 142: 1181-98 (1996)、この活性の原因となるキナーゼの特徴付けはまだである。今日までに、これらの成分について知られている脊椎動物相同体は、Ｇｌｉタンパク質ファミリー（例えば、Ｇｌｉ-１、Ｇｌｉ-２及びＧｌｉ-３）のみである。これらは、Ｃｉに構造的に関連するＺｎフィンガー推定転写因子である。これらの中で、Ｇｌｉ-１はＳＨｈシグナルのメディエータ候補であることが示され［Hynes等, Neuron 15: 35-44 (1995), Lee等, Development 124: 2537-52 (1997); Alexandre等, Genes Dev. 10: 2003-13 (1996)］、Ｈｈに応答する遺伝子活性化の機構がハエと脊椎動物の間で保存されることを示唆している。Ｈｈカスケードにおける他のシグナル伝達成分が進化的に保存されるか否かを決定し、生化学レベルでのＨｈシグナル伝達におけるｆｕｓｅｄの機能を試験するために、出願人はヒトｆｕｓｅｄｃＤＮＡを単離して特性決定した。マウスでの組織分布は、ｆｕｓｅｄがＳＨｈ応答性組織で発現されることを示した。生化学的研究は、ｆｕｓｅｄが機能性キナーゼであることを示した。機能性研究は、ｆｕｓｅｄがＧｌｉのアクチベータであり、ｆｕｓｅｄのドミナントネガティブ形態がアフリカツメガエル胚においてＳＨｈシグナル伝達を阻止できるという証拠を提供���る。これらのデータをまとめると、Ｃｏｓ−２とｆｕｓｅｄの両方がＨｈシグナル伝達に直接的に関連していることが示された。
Ｃｏｓｔａｌ−２タンパク質に関するさらなる引例については、Simpson等、Dev. Biol. 122:201-209(1987),Grau等、Dev. Biol. 122:186-200(1987),Preat等、Genetics 135:1047-1062(1993),Sisson等、Cell 90:235-245(1997)及びRobbins等、Cell 90:225-234(1997)を参照のこと。
ここで本出願人は、ここでＰＲＯ５３９と命名した、ヒトＣｏｓｔａｌ−２相同ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し、記載する。
【０００８】
３．ＰＲＯ９８２
新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ９８２ポリペプチドと命名した、新規な分泌ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【０００９】
４．ＰＲＯ１４３４
ｎｅｌ遺伝子は鶏の神経細胞で発現されるタンパク質であると記載されている(ワタナベ等、Genomics 38(3):273-276(1996))。最近、ニワトリｎｅｌ遺伝子によりコードされたものと相同性を持つポリペプチドをコードする（ＮＥＬＬ１とＮＥＬＬ２と命名した）２つの新規なヒトｃＤＮＡが分離され、特徴づけられており、それらのヒトポリペプチドは６つのＥＧＦ様反復を含んでいる（上掲のワタナベ等）。これらの遺伝子の神経特異的発現を考えると、それらは神経発達に影響を与えうるということが示唆される。したがってｎｅｌ、ＮＥＬＬ１とＮＥＬＬ２との相同性を持つ新規なポリペプチドを同定し、特徴づけることに重大な関心がある。
ここで我々は、ここでＰＲＯ１４３４と命名した、ｎｅｌタンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドの同定と特徴を記載する。
【００１０】
５．ＰＲＯ１８６３
新規な未変性の膜貫通タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な膜貫通タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ１８６３ポリペプチドと命名した、新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００１１】
６．ＰＲＯ１９１７
イノシトールホスファターゼの特徴付けは、小胞体からのＣａ２＋の放出を刺激するシグナル伝達活性の理解の基礎となるために関心がある。分子クローニングは腎臓や肝臓で高度に発現する多様なイノシトールポリリン酸塩ホスファターゼを与えた(Caxton等.(1997)Biochem J. 328:75-81)。
【００１２】
７．ＰＲＯ１８６８
炎症反応は複雑で、肥満細胞、神経終末、血小板、白血球及び補体活性によって局所的に生成される様々なシグナル伝達の分子によって媒介される。特定のこれらのシグナル伝達分子は、内皮細胞内面をより多孔性にする及び／又は特殊な糖質認知を通して白血球を認知し、引きつける細胞表面分子として作用するセレクチンの発現を引き起こす。より強い白血球結合はインテグリンによって媒介され、内皮を通る白血球移動を媒介する。さらにシグナル伝達物質は化学誘因物質として作用し、結合白血球が誘因物質源の方へ進むことを引き起こす。炎症反応の過程で生成される他のシグナル伝達物質は血液の中へ抜け、より多くの白血球を生成し血液流の中にそれらを放出するために骨髄を刺激する。
典型的に炎症は抗原によって開始され、抗原は免疫応答を開始する能力のあるほとんどどんな分子でもあり得る。標準の生理的状況下ではこれらは異質の分子であるが、生物自体によって産生された分子は様々な病気の状態で生じると知られる触媒となる。
混合リンパ球培養又は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞増殖は、化合物が免疫系を刺激する能力の確立された指標である。炎症反応において、応答白血球は好中球、好酸球、単球又はリンパ球であってよい。感染組織の組織学的試験は反応の免疫刺激又は阻害の証拠を提供する。Current Protocols in Immunology, 編集 E. Coligan, 1994, John Wiley and Sons, Inc.参照。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、明確に疾患として区別されるが、共通の特徴を共有し、病状を共有することがよくある潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病の両方を含む内臓疾患を集合的に記述するために使用される語である。診断基準の共通性は２つの疾患を正確に決定するのを難しくさせる。それぞれの病気は、しかしながらそれぞれの損傷のタイプと位置が典型的に異なっている。ＵＣ損傷は特徴的には粘膜の表面の潰瘍であって、直腸に近接した大腸に現れる。ＣＤ損傷は特徴的には広範囲に渡る線状の割れ目であり、時には胃、食道及び十二指腸を含む腸のどこにでも現れる。
【００１３】
ＩＢＤの従来の治療は通常、例えばスルファサラジン、コルチコステロイド類、６−メルカプトプリン／アザチオプリン(6-mercaptopurine/azathoprine)、又はサイクロスポインのような、抗炎症性又は免疫抑制剤の投与を伴うが、これらは全て苦しむ患者の一部の苦痛除去となるにすぎない。しかしながら、抗炎症／免疫抑制療法が失敗した場合は、結腸切除術が防衛の最後の方法である。手術は診断後１年目においてＣＤ患者の約３０％が必要とし、手術を必要とする可能性は１年ごとに約５％増していく。不幸にも、ＣＤはまた高い再発率を持ち、約５％の患者が１年後に次の手術を必要とする。さらにＵＣ患者は結腸直腸癌の発達の危険性が大幅に増加している。恐らく、これは再生が伴う上皮損傷反復サイクルのためで、新生物の形質転換の危険が絶えず増す。
結合接着分子（ＪＡＭ）として知られる、免疫グロブリンの上科の最近発見されたメンバーは、異なる起源の内皮と上皮の細胞の細胞間結合部に選択的に集中していることが特定されている。Martin-Padura,I.等J.Cell Biol. 142(1): 117-27(1998)。ＪＡＭはＶ型の２つの細胞外の鎖内ジスルフィド環を持つタイプ１複合膜タンパクである。ＪＡＭはＡ３３抗原とかなりの相同性を有する（図.１又は図.１８）。ＪＡＭに対するモノクローナル抗体は、自発的に及び化学的に引き起こされる、単球の内皮細胞の単層を通過する移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制することが発見された。上掲のMartin-Padura。
ＪＡＭ発現は大腸炎を有するＣＲＦ2-4-/-マウスの結腸において増していることが最近発見された。ＣＲＦ2-4-/-（ＩＬ−１０Ｒサブユニットノックアウトマウス）はリンパ球、単球及び好中球によって媒介される自発的な大腸炎を発生させる。また、いくらかの動物では結腸線癌が発生する。その結果、本発明の化合物は、更には炎症性腸疾患、他の腸管の炎症疾患並びに結腸直腸癌ようなヒト疾患に高いレベルで発現され、あるいは不随することが予見できる可能性が高い。
【００１４】
また、本発明の化合物は、既知の結腸直腸癌−予知マーカーであるＡ３３抗原との有意な相同性を有する。Ａ３３抗原は正常な結腸上皮、並びに初期又は転位結腸癌の９０％以上で発現される。結腸粘膜から派生した癌腫において、Ａ３３抗原は、９５％を越えるケースで均一に発現している。しかし、Ａ３３抗原は、他の広範囲の正常な組織では検出されておらず、すなわちその発現は、むしろ器官特異的であると思われる。従って、Ａ３３抗原は結腸直腸ガンの誘発において重要な役割を担っていると思われる。
結腸癌は広範囲に渡る病気であるので、早期の診断と治療が重要な医学の目的である。結腸癌の診断と治療は、蛍光、核磁気又は放射性のタグを有する特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を利用し、実施されうる。放射性遺伝子、毒素及び／又は薬物をタギングしたｍＡｂｓは最小限の患者の性状におけるin situの治療に使用されうる。またｍＡｂｓは、結腸癌の診断や治療の間の識別に使用されうる。例えば、血清のＡ３３抗原レベルが患者において上昇し、手術を行った後にレベルが微量になれば腫瘍切除が成功したことを表すことになる。他方、手術後、結果的に血清Ａ３３抗原レベルが引き続いて上昇していれば、元の腫瘍の転移が形成されたか又は新しい初期の腫瘍が現れたことが暗示される。
モノクローナル抗体は手術及び／又は他の化学療法の代わりに、又は一緒に使用されうる。例えば、Ａ３３に対するｍＡｂを用いた結腸直腸癌腫に羅患した患者における前臨床分析及び局在化研究はWelt等, J. Clin. Oncol. 8:1894-1906(1990)及びWelt等, J. Clin. Oncol. 12:1561-1571(1994)に記載され、さらに米国特許第4579827号と米国特許出願第424991号(欧州特許199141)はモノクローナル抗体治療的投与を対象とし、後者は抗Ａ３３ｍＡｂの使用に関する。
我々は、ここでＰＲＯ１８６８ポリペプチドと命名した、Ａ３３抗原タンパクに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけをここに記載する。
【００１５】
８．ＰＲＯ３４３４
新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ３４３４ポリペプチドと命名した、新規な分泌ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００１６】
９．ＰＲＯ１９２７
タンパク質は膜結合グリコシルトランスフェラーゼによって媒介される反応の複雑な一連の反応によってグリコシル化される。合成された糖鎖の構造の多様性の原因となる、多数の異なるグリコシルトランスフェラーゼがある。Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質は、哺乳類生物において様々な重要な生物学的機能を与えるグリコシルトランスフェラーゼのファミリーを含む。例として、ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン：α-３-Ｄ-マンノシドβ-１,２-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩは、高級マンノース-Ｎ-グリカンのハイブリッド及び複合Ｎ-グリカンへの変換に必須の第１段階を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである（Sarkar等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 234-238 (1991)）。ＵＰＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン：α１，３ーＤマンノシドβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは３−及びテ４−触覚のアスパラギン連結糖鎖の生成における重要な酵素であり、最近ｃＤＮＡクローニングを利用して牛小腸から精製されている（Minowa等、 J. Biol. Chem. (1998)273(19):11556-62)。Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーのさらなるメンバーの同定及び特徴付け、より一般的には新規のグリコシルトランスフェラーゼの同定は興味深い。
【００１７】
（発明の概要）
１．ＰＲＯ１８００
本出願において「ＰＲＯ１８００」と命名された新規なポリペプチドをコードし、Ｈｅｐ２７をコードする核酸と相同性を有するｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ３５６７２−２５０８）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１８００ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図２(配列番号：２)のアミノ酸残基約１又は約１６から約２７８の配列を有するＰＲＯ１８００ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図１(配列番号：１)のヌクレオチド約３６又は約８１と約８６９の間の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ１８００ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５３８のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ３５６７２−２５０８)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５３８のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ３５６７２−２５０８）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００１８】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図２(配列番号：２)のアミノ酸残基１又は約１６から約２７８の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図２(配列番号：２)のアミノ酸残基１又は約１６から約２７８の配列を有するＰＲＯ１８００ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも約２３０ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ１８００ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図２（配列番号：２）の配列においてアミノ酸位置約１からアミノ酸位置約１５まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図２(配列番号：２)の残基１又は約１６から約２７８のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ１８００ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、図１（配列番号：１）に示される核酸配列に誘導されうる。
他の実施態様では、本発明は、上記において特定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ１８００ポリペプチドを提供する。
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ１８００ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図２(配列番号：２)の残基１又は約１６から約２７８を含むアミノ酸配列を含んでいる。
【００１９】
他の態様では、本発明は、図２(配列番号：２)のアミノ酸残基１又は約１６から約２７８の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８００ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図２(配列番号：２)の残基１又は約１６から約２７８のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８００ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、図２(配列番号：２)のアミノ酸残基１又は約１６から約２７８の配列、又は抗-ＰＲＯ１８００抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８００ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ１８００断片は、天然ＰＲＯ１８００ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図２(配列番号：２)のアミノ酸残基約１又は約１６から約２７８の配列を有するＰＲＯ１８００ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ１８００ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ１８００抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ１８００ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ１８００ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１８００ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００２０】
２．ＰＲＯ５３９
本出願において「ＰＲＯ５３９」と命名され、新規なポリペプチドをコードし、Costal-2タンパク質をコードする核酸と相同性を有する、ｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ４７４６５−１５６１）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ５３９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図４(配列番号：７)のアミノ酸残基約１から約８３０の配列を有するＰＲＯ５３９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図３(配列番号：６)のヌクレオチド約１８６から約２６７５の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ５３９ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３６６１のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ４７４６５−１５６１)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６６１のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ４７４６５−１５６１）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００２１】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図４(配列番号：７)のアミノ酸残基１から約８３０の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図４(配列番号：７)のアミノ酸残基１から約８３０の配列を有するＰＲＯ５３９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造される、少なくとも１００ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特定の態様では、本発明は、開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ５３９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。
他の態様では、本発明は、（ａ）図４(配列番号：７)の残基１から約８３０のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされうるＰＲＯ５３９ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、図３（配列番号：６）に示すヌクレオチド配列から誘導されうる。
他の実施態様では、本発明は、上記において同定された任意の単離された核酸配列のいずれかにコードされる単離されたＰＲＯ５３９ポリペプチドを提供する。
【００２２】
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ５３９ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図４(配列番号：７)の残基１から約８３０を含むアミノ酸配列を含んでいる。
他の態様では、本発明は、図４(配列番号：７)のアミノ酸残基１から約８３０の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ５３９ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図４(配列番号：７)の残基１から約８３０のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ５３９ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、抗-ＰＲＯ５３９抗体に対する結合部位を提供するのに十分な、図４(配列番号：７)のアミノ酸残基１から約８３０の配列、又はその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ５３９ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ５３９断片は、天然ＰＲＯ５３９ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図４(配列番号：７)のアミノ酸残基約１から約８３０の配列を有するＰＲＯ５３９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ５３９ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ５３９抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ５３９ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ５３９ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。好ましい実施態様では、生物学的活性は微小官(microtubile)に結合することか又はfused及び cubitus interruptusを複合する能力のどちらかである。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ５３９ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００２３】
さらに他の実施態様では、本発明はＰＲＯ５３９のヘッジホッグシグナル伝達の調節を促すアゴニスト及びそれに対するアンタゴニストを生じさせる化合物と方法を提供する。特にＳＨシグナル伝達経路におけるＰＲＯ５３９の正常な機能を阻害し、防止し、抑制し及び／又は中和する脊椎動物ＰＲＯ５３９のアンタゴニストは、生物有機化学小分子とアンチセンス核酸の両方を含む。
さらに他の実施態様では、本発明はヒトＰＲＯ５３９の選択的スプライス変異体を提供する。
またさらなる実施態様では、本発明はＰＲＯ５３９のヘッジホッグシグナル伝達の調節を改変する分子を同定するためのスクリーニングやアッセイの方法を提供する。好ましくは、分子は（例えばfused又はcubitus interruptusのような）その結合した複合タンパク質とのＰＲＯ５３９の相互作用を防止するか、又は複合物の分解を防止又は抑制する。アッセイはＰＲＯ５３９と基質を含む混合物を候補的分子と共にインキュベーションし、ＰＲＯ５３９のヘッジホッグシグナル伝達を調節する候補分子の能力を検出することを含む。好ましくはスクリーニングした分子は小分子薬剤候補である。
さらに他の実施態様では、特定の疾患がヘッジホッグシグナル伝達により調節されるかどうかを決定するための診断方法であって：
（ａ）試験細胞又は組織を培養し、
（ｂ）ＰＲＯ５３９により調節されたヘッジホッグシグナル伝達調節を抑制しうる化合物を投与し；及び
（ｃ）ヘッジホッグシグナル伝達が調節されるかどうかを決定する。
ことを含んでなる方法に関する。
【００２４】
３．ＰＲＯ９８２
本出願において「ＰＲＯ９８２」と命名された新規な分泌ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５７７００−１４０８）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ９８２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図６(配列番号：９)のアミノ酸残基１又は約２２から約１２５の配列を有するＰＲＯ９８２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図５(配列番号：８)の残基約８９から約４００の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ９８２ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５８３のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ５７７００−１４０８)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５８３のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ５７７００−１４０８）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００２５】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図６(配列番号：９)のアミノ酸残基約１又は約２２から約１２５の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図６(配列番号：９)のアミノ酸残基約１又は約２２から約１２５の配列を有するＰＲＯ９８２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ９８２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図６（配列番号：９）の配列において約アミノ酸位置１から約アミノ酸位置２１まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図６(配列番号：９)の残基１又は約２２から約１２５のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ９８２ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長である。
他の実施態様では、本発明は、上記において特定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ９８２ポリペプチドを提供する。
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ９８２ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図６(配列番号：９)の残基１又は約２２から１２５を含むアミノ酸配列を含んでいる。
【００２６】
他の態様では、本発明は、図６(配列番号：９)のアミノ酸残基１又は約２２から約１２５の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ９８２ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図６(配列番号：９)の残基１又は約２２から１２５のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ９８２ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、図６(配列番号：９)のアミノ酸残基１又は約２２から約１２５の配列、又は抗-ＰＲＯ９８２抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ９８２ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ９８２断片は、天然ＰＲＯ９８２ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図６(配列番号：９)のアミノ酸残基１又は約２２から約１２５の配列を有するＰＲＯ９８２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
【００２７】
４．ＰＲＯ１４３４
本出願において「ＰＲＯ１４３４」と命名され、新規なポリペプチドをコードし、ｎｅｌタンパク質をコードする核酸と相同性を有する、ｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ６８８１８−２５３６）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図８(配列番号：１１)のアミノ酸残基約１又は約２８から約３２５の配列を有するＰＲＯ１４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図７(配列番号：１０)のヌクレオチド約５８１又は約６６２から約１５５５の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ１４３４ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３６５７のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ６８８１８−２５３６)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６５７のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ６８８１８−２５３６）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００２８】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図８(配列番号：１１)のアミノ酸残基１又は約２８から約３２５の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図８(配列番号：１１)のアミノ酸残基１又は約２８から約３２５の配列を有するＰＲＯ１４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも６５ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ１４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、及びその可溶性な、すなわち膜貫通ドメインが欠失又は不活性化された変異体、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図８（配列番号：１１）の配列においてアミノ酸位置約１からアミノ酸位置約２７まで伸びると仮に同定されている。膜貫通ドメインは、ＰＲＯ１４３４アミノ酸配列（図８、配列番号：１１）のアミノ酸位置約１１からアミノ酸位置約３０まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図８(配列番号：１１)の残基１又は約２８から約３２５のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ１４３４ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、図７（配列番号：１０）に示すヌクレオチド配列から誘導されうる。
他の実施態様では、本発明は、上記において同定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ１４３４ポリペプチドを提供する。
【００２９】
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ１４３４ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図８(配列番号：１１)の残基１又は約２８から約３２５を含むアミノ酸配列を含んでいる。
他の態様では、本発明は、図８(配列番号：１１)のアミノ酸残基１又は約２８から約３２５の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１４３４ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図８(配列番号：１１)の残基１又は約２８から約３２５のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１４３４ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、図８(配列番号：１１)のアミノ酸残基１又は約２８から約３２５の配列、又は抗−ＰＲＯ１４３４抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ１４３４ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ１４３４断片は、天然ＰＲＯ１４３４ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図８(配列番号：１１)のアミノ酸残基約１又は約２８から約３２５の配列を有するＰＲＯ１４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ１４３４ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ１４３４抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ１４３４ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ１４３４ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１４３４ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００３０】
５．ＰＲＯ１８６３
本出願において「ＰＲＯ１８６３」と命名された新規な膜貫通ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５９８４７−２５１０）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１８６３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図１０(配列番号：１６)のアミノ酸残基約１又は約１６から約４３７の配列を有するＰＲＯ１８６３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図９(配列番号：１５)のヌクレオチド約１７又は約６２から約１３２７の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ１８６３ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５７６のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ５９８４７−２５１０)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５７６のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ５９８４７−２５１０）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００３１】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図１０(配列番号：１６)のアミノ酸残基約１又は約１６から約４３７の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１０(配列番号：１６)のアミノ酸残基約１又は約１６から約４３７の配列を有するＰＲＯ１８６３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも３４５ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ１８６３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、及びその可溶性のある、すなわち膜貫通ドメインが欠失又は不活性化された変異体、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図１０（配列番号：１６）の配列においてアミノ酸位置約１からアミノ酸位置約１７まで伸びると仮に同定されている。膜貫通ドメインは、ＰＲＯ１８６３アミノ酸配列（図１０、配列番号：１６）のアミノ酸位置約２４３からアミノ酸位置約２６０まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図１０(配列番号：１６)の残基約１又は約１６から約４３７のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ１８６３ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、図９（配列番号：１５）に示されるヌクレオチド配列に誘導されうる。
他の実施態様では、本発明は、上記において特定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ１８６３ポリペプチドを提供する。
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ１８６３ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図１０(配列番号：１６)の残基約１又は約１６から約４３７を含むアミノ酸配列を含んでいる。
【００３２】
他の態様では、本発明は、図１０(配列番号：１６)のアミノ酸残基１又は約１６から約４３７の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８６３ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図１０(配列番号：１６)の残基１又は約１６から約４３７のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８６３ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、図１０(配列番号：１６)のアミノ酸残基１又は約１６から約４３７の配列、又は抗-ＰＲＯ１８６３抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８６３ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ１８６３断片は、天然ＰＲＯ１８６３ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１０(配列番号：１６)のアミノ酸残基約１又は約１６から約４３７の配列を有するＰＲＯ１８６３ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ１８６３ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ１８６３抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ１８６３ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ１８６３ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１８６３ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００３３】
６．ＰＲＯ１９１７
本出願において「ＰＲＯ１９１７」と命名され、イノシトールホスファターゼと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ７６４００−２５２８）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１９１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図１２(配列番号：１８)のアミノ酸残基１又は約３１から約４８７の配列を有するＰＲＯ１９１７ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図１１(配列番号：１７)の残基約９６から約１４６６の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ１９１７ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５７３のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ７６４００−２５２８)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５７３のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ７６４００−２５２８）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図１２(配列番号：１８)のアミノ酸残基１又は約３１から約４８７の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１２(配列番号：１８)のアミノ酸残基１又は約３１から約４８７の配列を有するＰＲＯ１９１７ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ１９１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図１２（配列番号：１８）の配列においてアミノ酸位置約１からアミノ酸位置約３０まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図１２(配列番号：１８)の残基１又は約３１から約４８７のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ１９１７ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長である。
【００３５】
他の実施態様では、本発明は、上記において特定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ１９１７ポリペプチドを提供する。
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ１９１７ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図１２(配列番号：１８)の残基１又は約３１から約４８７を含むアミノ酸配列を含んでいる。
他の態様では、本発明は、図１２(配列番号：１８)のアミノ酸残基１又は約３１から約４８７の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１９１７ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図１２(配列番号：１８)の残基１又は約３１から約４８７のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１９１７ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、図１２(配列番号：１８)のアミノ酸残基１又は約３１から約４８７の配列、又は抗-ＰＲＯ１９１７抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ１９１７ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ１９１７断片は、天然ＰＲＯ１９１７ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１２(配列番号：１８)のアミノ酸残基１又は約３１から約４８７の配列を有するＰＲＯ１９１７ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ１９１７ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ１９１７抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ１９１７ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ１９１７ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１９１７ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００３６】
７．ＰＲＯ１８６８
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における炎症疾患の診断と治療ための組成物と方法に関する。本発明は、哺乳動物における免疫反応を促進又は抑制するタンパク質（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）の同定に基づく。炎症疾患は炎症反応を鎮静することで治療され得る。炎症反応を強める分子は抗原の免疫反応を促進又は可能にする。炎症反応の鎮静が有益である場合、炎症反応を促進する分子は抑制されうる。炎症反応増強が有益である場合には、炎症反応促進の分子は治療に利用可能である。また、炎症反応の鎮静が有用である場合には、そのような促進分子は抑制されうる。中和抗体は、免疫促進活性を有する分子を抑制する分子の例であり、炎症疾患の治療に役立つ。また、炎症反応を抑制する分子は炎症反応の抑制に（タンパク質を直接又は抗体アゴニストの使用を経て）利用されうるし、こうして炎症の疾患は改善する。
従って、本発明のタンパク質は免疫関連疾患の診断及び／又は治療（予防を含む）に役立つ。促進タンパク質に結合する抗体は炎症反応の鎮静に利用可能である。抑制タンパク質に結合する抗体は炎症反応及び免疫システムの促進に利用可能である。また、本発明のタンパク質と抗体は炎症又は免疫関連疾患の治療のための薬や薬剤の調製に利用可能である。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１８６８ポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を抑制するＰＲＯ１８６８ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。
他の実施態様では、本発明は抗−ＰＲＯ１８６８抗体へポリペプチドを含むと思われる細胞を暴露し、細胞に対しての抗体の結合性を測定することを含んでなるＰＲＯ１８６８ポリペプチド存在を決定する方法に関する。
また他の実施態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験サンプルで、及び（ｂ）同じ細胞タイプの既知の正常な組織細胞のコントロールサンプルでのＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルの検出を含んでなる、試験サンプルにおける高い発現レベルは哺乳動物における炎症疾患の存在を意味する、哺乳動物での炎症関連疾病を診断する方法に関する。
【００３７】
他の実施態様では、（ａ）哺乳動物から得られた組織培養細胞の試験サンプルに抗−ＰＲＯ１８６８抗体を接触させ、（ｂ）抗体とＰＲＯ１８６８ポリペプチドの複合体の形成を検出することを含んでなる本発明は哺乳動物における炎症反応を診断する方法に関する。その検出は定性的又は定量的なもので、同じ細胞タイプの既知の正常な組織細胞のコントロールサンプルにおける形成のモニタリングに比較して実施されうる。試験サンプルで形成された多量の複合物の量がより多いと、その試験サンプルを得た哺乳動物における腫瘍の存在が示される。好適には抗体は検出標識を保有する。複合体形成は、例えば光学顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光法、又はこの分野で知られる他の技術等によって観察されうる。通常、テストサンプルは、炎症反応に関する欠陥又は異常があると推測される個体から採取される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに抗−ＰＲＯ１８６８抗体と（例えば緩衝剤のような）担体を含んでなる診断キットに関する。好ましくはキットはＰＲＯ１８６８ポリペプチドを検出するための抗体を使用するための説明を含む。
さらなる実施態様では、本発明は：
容器；
容器上のラベル；及び
容器内に収容された活性剤を含む組成物；
を含んでなる製造品にも関し、その組成物は哺乳類における炎症反応の促進又は抑制に効果があり、容器上のラベルは組成物が炎症疾患の治療に使用されうることを示しており、組成物中の活性剤はＰＲＯ１８６８ポリペプチドの発現及び／又は活性を促進又は抑制する薬剤である。好ましい態様では、活性剤はＰＲＯ１８６８ポリペプチド又は抗−ＰＲＯ１８６８抗体である。
さらなる実施態様は、ＰＲＯ１８６８ポリペプチドに候補化合物を、これら２つの化合物を互いに作用させるのに十分な時間と状況の下で、接触することによりＰＲＯ１８６８ポリペプチドの発現及び／又は活性を抑制する能力のある化合物を、同定する方法である。特定の態様では、候補化合物又はＰＲＯ１８６８ポリペプチドのどちらかは個体支持体上に固定される。他の態様では、非固定成分は検出標識を保有する。
【００３８】
またさらなる態様では、本発明は：炎症腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症(systemic vaculitis)、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫仲介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性ポリニューロパシー、例えば伝染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性(nonhepatotropic)ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎のような肝胆汁性疾患、炎症性及び繊維症性肺疾患（例えば嚢胞性線維症、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、例えば好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺のアレルギー性疾患、例えば拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患から選択される疾患の治療のために、それを必要とする患者に対して、治療に効果的な量のＰＲＯ１８６８アンタゴニストを投与することによる炎症疾患の治療方法に関する。
さらなる実施態様では、本発明は哺乳動物における腫瘍の診断方法であって、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の試験サンプルで、及び（ｂ）同じ細胞タイプの既知の正常な組織細胞のコントロールサンプルでの、ＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルの検出を含んでなり、試験サンプルでの高い発現レベルが試験組織細胞を採取した哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法を提供する。
【００３９】
他の実施態様では、本発明は哺乳動物における腫瘍の診断方法であって、（ａ）抗−ＰＲＯ１８６８抗体を哺乳動物から得られた組織細胞の試験サンプルと接触させ、（ｂ）試験サンプルにおける抗−ＰＲＯ１８６８とＰＲＯ１８６８ポリペプチド間の複合体の形成の検出することを含んでなる方法を提供する。その検出は定性的又は定量的なもので、同じ細胞タイプの既知の正常組織細胞のコントロールサンプルにおける複合体形成のモニタリングに比較して実施されうる。試験サンプルより多量の複合体が形成されると試験組織細胞を採取した哺乳動物における腫瘍の存在を示す。好適には、抗体は検出標識を保有する。複合体形成は、例えば光学顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光法、又はこの分野で知られる他の技術等によって観察されうる。好適には、テストサンプルは新生細胞成長又は増殖（例えば癌細胞）を有すると推測される個々の哺乳動物から採取される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに抗−ＰＲＯ１８６８抗体と（例えば緩衝剤のような）担体を含んでなる癌診断キットを提供する。好ましくはキットはＰＲＯ１８６８ポリペプチドを検出するために抗体を使用するための説明書を含む。
また他の実施態様では、本発明はＰＲＯ１８６８ポリペプチドの発現及び／又は活性の抑制する有効量の薬剤に対し、ＰＲＯ１８６８を過剰発現する細胞を暴露することを含んでなる癌細胞の成長を抑制する方法を提供する。好ましくは、薬剤は抗−ＰＲＯ１８６８ポリペプチド、小さな有機及び無機ペプチド、リン酸化ペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、又は３重へリックス分子である。特定な態様では、例えば抗−ＰＲＯ１８６８抗体の様な薬剤が細胞死を誘発する。さらなる態様では腫瘍細胞は放射性治療及び／又は毒物又は化学療法薬剤にさらに暴露される。
さらなる実施態様では、本発明は：
容器；
容器上のラベル；及び
容器内に収容された活性薬剤を含む組成物；
を含んでなる製造品にも関し、その組成物は癌細胞の成長抑制に効果があり、容器上のラベルには組成物がＰＲＯ１８６８ポリペプチドの過剰発現に特徴づけられる症状の治療に使用されうることが表され、組成物中の活性薬剤はＰＲＯ１８６８ポリペプチドの発現及び／又は活性を抑制する薬剤である。好ましい態様では、活性薬剤は抗−ＰＲＯ１８６８抗体である。
【００４０】
本出願において「ＰＲＯ１８６８」と命名され、新規なポリペプチドをコードし、Ａ３３抗原をコードする核酸と相同性を有する、ｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ７７６２４−２５１５）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図１４(配列番号：２０)のアミノ酸残基約１又は約３１から約３１０の配列を有するＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図１３(配列番号：１９)のヌクレオチド約５１又は約１４１と約９８０の間の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５５３のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ７７６２４−２５１５)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５５３のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ７７６２４−２５１５）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００４１】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図１４(配列番号：２０)のアミノ酸残基１又は約３１から約３１０の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１４(配列番号：２０)のアミノ酸残基１又は約３１から約３１０の配列を有するＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも３９０ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、及びその可溶性のある、すなわち膜貫通ドメインが欠失又は不活性化された変異体、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図１４(配列番号：２０）の配列においてアミノ酸位置約１からアミノ酸位置約３０まで伸びると仮に同定されている。膜貫通ドメインは、ＰＲＯ１８６８アミノ酸配列（図１４、配列番号：２０）のアミノ酸位置約２４３からアミノ酸位置約２６３まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図１４(配列番号：２０)の残基１又は約３１から約３１０のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ１８６８ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、図１３(配列番号：１９）に示すヌクレオチド配列から誘導されうる。
他の実施態様では、本発明は、上記において同定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ１８６８ポリペプチドを提供する。
【００４２】
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ１８６８ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図１４(配列番号：２０)の残基１又は約３１から約３１０を含むアミノ酸配列を含んでいる。
他の態様では、本発明は、図１４(配列番号：２０)のアミノ酸残基１又は約３１から約３１０の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８６８ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図１４(配列番号：２０)の残基１又は約３１から約３１０のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８６８ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、図１４(配列番号：２０)のアミノ酸残基１又は約３１から約３１０の配列、又は抗−ＰＲＯ１８６８抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ１８６８ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ１８６８断片は、天然ＰＲＯ１８６８ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１４(配列番号：２０)のアミノ酸残基約１又は約３１から約３１０の配列を有するＰＲＯ１８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ１８６８ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ１８６８抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ１８６８ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ１８６８ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１８６８ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００４３】
他の実施態様では、本発明は担体又は賦形剤と組み合わせてＰＲＯ１８６８ポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含む組成物を提供する。一態様では、組成物は治療に有効な量のペプチド又は抗体を含む。他の態様では、組成物が炎症促進分子を含むとき、組成物は：（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の侵入の増大させ、（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応の促進又は増強し、又は（ｃ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物においてＴ−リンパ球の増殖を増加させるのに役立つ。さらなる態様では、組成物が炎症抑制分子を含むとき、組成物は：（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤の減少させ、（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応の抑制又は縮小させ、又は（ｃ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖の減少に役立つ。他の態様では、組成物はさらなる活性成分を含み、それは例えばさらなる抗体又は細胞毒又は化学療法剤であり得る。好ましくは、組成物は消毒する。
さらなる実施態様では、本発明は抗−ＰＲＯ１８６８抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を構成するベクターや組み換え宿主細胞に関する。またさらなる実施態様では、本発明は例えば抗体が発現するような条件下で、抗体をコードする核酸を使って形質転換された宿主細胞を培養し、細胞媒地から抗体を回収することにより、そのような抗体を生産する方法に関する。
【００４４】
８．ＰＲＯ３４３４
本出願において「ＰＲＯ３４３４」と命名された新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ７７６３１−２５３７）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図１６(配列番号：２２)のアミノ酸残基１又は約１７から約１０２９の配列を有するＰＲＯ３４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図１５(配列番号：２１)の残基約４６又は約９４から約３１３２の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ３４３４ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３６５１のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ７７６３１−２５３７)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６５１のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ７７６３１−２５３７）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００４５】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図１６(配列番号：２２)のアミノ酸残基１又は約１７から約１０２９の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１６(配列番号：２２)のアミノ酸残基１又は約１７から約１０２９の配列を有するＰＲＯ３４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも約４６０ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ３４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図１６（配列番号：２２）の配列においてアミノ酸位置１からアミノ酸位置約１６まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図１６(配列番号：２２)の残基１又は約１７から約１０２９のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされうるＰＲＯ３４３４ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長である。
他の実施態様では、本発明は、上記において特定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ３４３４ポリペプチドを提供する。
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ３４３４ポリペプチドを提供し、それは一の実施態様では、図１６(配列番号：２２)の残基１又は約１７から１０２９を含むアミノ酸配列を含んでいる。
【００４６】
他の態様では、本発明は、図１６(配列番号：２２)のアミノ酸残基１又は約１７から約１０２９の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ３４３４ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図１６(配列番号：２２)の残基１又は約１７から１０２９のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ３４３４ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、抗-ＰＲＯ３４３４抗体に対する結合部位を提供するのに十分な、図１６(配列番号：２２)のアミノ酸残基１又は約１７から約１０２９の配列、又はその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ３４３４ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ３４３４断片は、天然ＰＲＯ３４３４ポリペプチドの定性的な生物学的活性を保持している。
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１６(配列番号：２２)のアミノ酸残基１又は約１７から約１０２９の配列を有するＰＲＯ３４３４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ３４３４ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ３４３４抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ３４３４ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ３４３４ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ３４３４ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００４７】
９．ＰＲＯ１９２７
本出願において「ＰＲＯ１９２７」と命名され、グリコシルトランスフェラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ８２３０７−２５３１）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１９２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図１８(配列番号：２４)のアミノ酸残基１又は約２４から約５４８の配列を有するＰＲＯ１９２７ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の態様では、本発明は、図１７(配列番号：２３)の残基約１２０又は約１６９４の間の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含むＰＲＯ１９２７ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５３７のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ８２３０７−２５３１)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、核酸は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５３７のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ８２３０７−２５３１）にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）図１８(配列番号：２４)のアミノ酸残基約１又は約２４から約５４８の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１８(配列番号：２４)のアミノ酸残基１又は約２４から約５４８の配列を有するＰＲＯ１９２７ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に試験ＤＮＡ分子を単離することにより製造された、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドを有する単離された核酸分子に関する。
特別な態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持っているか持っていないＰＲＯ１９２７ポリペプチド、及びその可溶変異体（すなわち膜貫通ドメインが欠失又は不活性化された）をコードするＤＮＡを含む、あるいはそのようなコード化核酸分子に相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図１８（配列番号：２４）の配列においてアミノ酸位置約１からアミノ酸位置約２３まで伸びると仮に同定されている。ＩＩ型膜貫通ドメインは、ＰＲＯ１９２７アミノ酸配列（図１８、配列番号：２４）のアミノ酸位置約６からアミノ酸位置約２５まで伸びると仮に同定されている。
他の態様では、本発明は、（ａ）図１８(配列番号：２４)の残基１又は約２４から約５４８のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ１９２７ポリペプチドコード化配列の断片に係る。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長である。
他の実施態様では、本発明は、上記において特定された任意の単離された核酸配列にコードされる単離されたＰＲＯ１９２７ポリペプチドを提供する。
特別な態様では、本発明は単離された天然配列ＰＲＯ１９２７ポリペプチドを提供し、それは或る種の実施態様では、図１８(配列番号：２４)の残基１又は約２４から約５４８を含むアミノ酸配列を含んでいる。
他の態様では、本発明は、図１８(配列番号：２４)のアミノ酸残基１又は約２４から約５４８の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１９２７ポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、図１８(配列番号：２４)の残基１又は約２４から約５４８のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１９２７ポリペプチドに関する。
また他の態様では、本発明は、図１８(配列番号：２４)のアミノ酸残基１又は約２４から約５４８の配列、又は抗-ＰＲＯ１９２７抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ１９２７ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ１９２７断片は、天然ＰＲＯ１９２７ポリペプチドの質的な生物学的活性を保持している。
【００４９】
またさらなる態様では、本発明は、（ｉ）試験ＤＮＡ分子を、（ａ）図１８(配列番号：２４)のアミノ酸残基１又は約２４から約５４８の配列を有するＰＲＯ１９２７ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下でハイブリッド形成させ、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合は、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、そして（ｉｉｉ）細胞培地からポリペプチドを回収することにより製造されたポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ＰＲＯ１９２７ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ１９２７抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、天然ＰＲＯ１９２７ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、天然ＰＲＯ１９２７ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１９２７ポリペプチド、又は上記において特定されたアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００５０】
１０．さらなる実施態様
本発明の他の実施態様では、本発明はここに記載したポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。ここに記載のポリペプチドの任意のものを生産するための方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものが含まれる。
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離するために有用なオリゴヌクレオチドプローブを、あるいはアンチセンスプローブとして提供し、ここでこれらプローブは上述の又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
他の実施態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定まった断片を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００５１】
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード化配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドのコード化配列、ここに開示されたシグナルペプチドを持っているか又は持っていない膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定まった断片のコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
さらなる態様では、本発明は、（ａ）ここに開示されたＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、またはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であり、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【００５２】
他の実施態様は、例えば、場合によっては抗-ＰＲＯ抗体の結合部位を含むポリペプチドをコードしうるＰＲＯポリペプチドのコード化断片のハイブリダイゼーションプローブ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされうるＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖に関する。そのような核酸断片は通常少なくとも約２０のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約３０のヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約４０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約５０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約６０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約７０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約８０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約９０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１１０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１２０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１３０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１４０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１５０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１６０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１７０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１８０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１９０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約２００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約２５０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約３００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約３５０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約４００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約４５０のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約５００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約６００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約７００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約８００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約９００のヌクレオチド長、更により好ましくは少なくとも約１０００のヌクレオチド長であり、ここで、「約」という用語は、その参照長さのプラス又はマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長を意味する。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してＰＲＯポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより常套的に決定することができることに留意される。そのようなＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＰＲＯポリペプチド断片、好ましくは抗-ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含んでなるＰＲＯポリペプチド断片である。
他の実施態様では、本発明は上記において特定した単離核酸配列の任意のものによりコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
【００５３】
ある態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定まった断片を有するＰＲＯポリペプチドに対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示されたＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００５４】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定まった断片を有するＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８１％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約８２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８９％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９１％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９９％のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＰＲＯポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
【００５５】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで特定した天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することを含んでなる、ＰＲＯポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載の様なＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体を担体とともに含んでなる物質の組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、上述のＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗-ＰＲＯ抗体に応答性のある症状の治療に有用な医薬の調製のための、ＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗-ＰＲＯ抗体の使用に関する。
【００５６】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」であって、「数字」がここで使用される実際の数値符号として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここに記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、天然配列ＰＲＯポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字又は下線で示した。しかし、添付の図面に開示したＰＲＯポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置１としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン及び／又は細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【００５７】
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わないＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの任意の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００５８】
ここに定義されるＰＲＯポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが以下の表１に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いても得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、また以下の表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２と３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで言う「ＰＲＯ」とは対象とする仮のＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を意味し、「比較タンパク質」とは対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチド比較されているポリペプチド因子のアミノ酸配列を意味し、「Ｘ」、「Ｙ」、「Ｚ」はそれぞれ異なった仮のアミノ酸配列を意味する。
【００５９】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％アミノ酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてWU-BLAST-2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて計算される。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2を用いた場合、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を含む単離したアミノ酸配列」という記載において、アミノ酸配列Ａは対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂは対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００６０】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを伴うか伴わないＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドの他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００６１】
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である  特に断らない限り、ここで用いられる全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてWU-BLAST-2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが図２４８Ａ−Ｑに与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いても得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、図２４８Ａ−Ｑに示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、また図２４８Ａ−Ｑに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
核酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４と５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示し、ここで言う「ＰＲＯ−ＤＮＡ」とは、対象とする仮のＰＲＯ−コード化核酸配列を意味し、「比較ＤＮＡ」とは対象とする「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子と比較される核酸分子因子のヌクレオチド配列を意味し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」はそれぞれ異なった仮のヌクレオチド配列を意味する。
【００６２】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％アミノ酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてWU-BLAST-2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて計算される。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2を用いた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子が比較される変異ＰＲＯポリペプチドであってもよい配列）との間の、一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂと少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ核酸配列を含む単離した核酸配列」という記載において、核酸配列Ａは対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂは対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列である。
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００６３】
「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基（例えば、保存的置換の結果として、下記の表６参照）を含む。ここでの目的のために、陽性の％値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、ＰＲＯポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列）との間の、WU-BLAST-2のBLOSUM62マトリクス内でポジティブな値が付けられたアミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の％値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。WU-BLAST-2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、ALIGN-2及びNCBI-BLAST2について上記したように実施されるアミノ酸配列同一性には、同一のみならず類似した特性をもつ配列におけるアミノ酸残基を含む。対象とするアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の好ましい置換（下記の表６に定義）であるものである。
ALIGN-2又はNCBI-BLAST2を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する陽性の％値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2又はNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％陽性は、ＢのＡに対する％陽性とは異なることが理解されるであろう。
【００６４】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＰＲＯポリペプチド核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００６５】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ抗体組成物、一本鎖抗-ＰＲＯ抗体、及び抗-ＰＲＯ抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いるものと、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄によって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００６６】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【００６７】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(商品名)を含む。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲｓが抗体にたいする抗原結合特異性を持つ。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
【００６８】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと命名されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に固有であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの実際のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより当業者が容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００７３】
１．全長ＰＲＯ１８００ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１８００（図２及び配列番号：２に示す）の一部が、ヒトＨｅｐ２７タンパク質（HE27_HUMAN）と或る程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１８００が新規に同定されたＨｅｐ２７相同体であり、そのタンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
２．全長ＰＲＯ５３９ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ５３９（図４及び配列番号：７に示す）の一部が、ショウジョウバエメラノガスター(AF19250_1)由来のキネシン関連タンパク質の一部と或る程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ５３９が新規に同定されたヘッジホッグシグナル伝達経路タンパク質ファミリーのメンバーであり、ショウジョウバエＣｏｓｔａｌ−２タンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
３．全長ＰＲＯ９８２ポリペプチド
知りうる限り、ＤＮＡ５７７００−１４８０配列は、ここでＰＲＯ９８２と称される新規な分泌因子をコードしする。但し、WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、既知のタンパク質といくらかの配列同一性を持つことが明らかになった。
４．全長ＰＲＯ１４３４ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１４３４（図１０及び配列番号：１６に示す）の一部が、マウスｎｅｌタンパク質前駆物質（NEL_MOUSE）と或る程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１４３４が新規に同定されたｎｅｌ相同体であり、このｎｅｌタンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【００７４】
５．全長ＰＲＯ１８６３ポリペプチド
ＤＮＡ５９８４７−２５１０クローンは、ヒト前立腺組織ライブラリから単離された。知りうる限り、ＤＮＡ５９８４７−２５１０配列は、ここでＰＲＯ１８６３と称される新規な因子をコードし；WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、如何なる既知のタンパク質とも有意な配列同一性が無いことが明らかになった。
６．全長ＰＲＯ１９１７ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１９１７（図１４及び配列番号：２０に示す）のアミノ酸４１から４８７が、Dayhoffデータベースで「AF012714_1」と称されるイノシトールホスファターゼと或る程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１９１７が新規に同定されたイノシトールホスファターゼファミリーのメンバーであり、イノシトールホスファターゼに典型的な酵素活性を有すると考えられている。
７．全長ＰＲＯ１８６８ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１８６８（図１６及び配列番号：２２に示す）一部が、ヒトＡ３３抗原タンパク質(P_W14146)と或る程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１８６８が新規に同定されたＡ３３抗原相同体であり、Ａ３３抗原タンパク質に典型的な活性及び／又は発現パターンを有すると考えられている。また、ＰＲＯ１８６８ポリペプチドは先に記載した炎症疾患と結腸直腸癌の治療上の処置に利用されうることが見出された。
８．全長ＰＲＯ３４３４ポリペプチド
ＤＮＡ７７６３１−２５３７クローンは、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いてヒト大動脈組織ライブラリから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ７７６３１−２５３７配列は、ここでＰＲＯ３４３４と称される新規な因子をコードし；WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、如何なる既知のタンパク質とも有意な配列同一性が無いことが明らかになった。
９．全長ＰＲＯ１９２７ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１９２７（図１８及び配列番号：２４に示す）が、Dayhoffデータベースで「AB000628_1」と称されるタンパク質のアミノ酸配列と或る程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１９２７が新規に同定されたタンパク質のグリコシルトランスフェラーゼファミリーのメンバーであり、グリコシル化活性を有すると考えられている。
【００７５】
Ｂ．ＰＲＯ変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の任意のものを用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【００７６】
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換と題して表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表６
元の残基           例示的置換                        好ましい置換
Ala(A)             val; Leu; ile                            val
Arg(R)             lys; gln; asn                            lys
Asn(N)             gln; his; lys; arg                       gln
Asp(D)             glu                                     glu
Cys(C)             ser                                      ser
Gln(Q)             asn                                      asn
Glu(E)             asp                                      asp
Gly(G)             pro; ala                                 ala
His(H)             asn; gln; lys; arg                       arg
Ile(I)             leu; val; met; ala; phe;
ノルロイシン                             leu
Leu(L)             ノルロイシン; ile; val;
met; ala; phe                           ile
Lys(K)             arg; gln; asn                            arg
Met(M)             leu; phe; ile                           leu
Phe(F)             leu; val; ile; ala; tyr                  leu
Pro(P)             ala                                      ala
Ser(S)             thr                                      thr
Thr(T)             ser                                      ser
Trp(W)             tyr; phe                                 tyr
Tyr(Y)             trp; phe; thr; ser                       phe
Val(V)             ile; leu; met; phe;
ala; ノルロイシン                       leu
【００７７】
ＰＲＯポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman &amp; Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００７８】
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００７９】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる一又は複数の糖鎖部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存在する種々の糖鎖部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００８０】
ＰＲＯポリペプチド上に糖鎖部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の糖鎖部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【００８１】
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ１分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００８２】
Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。
【００８３】
１．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は既知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００８４】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００８５】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００８６】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【００８７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００８８】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００８９】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【００９０】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００９１】
より高等の真核生物による所望のＰＲＯをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００９２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００９３】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。
【００９４】
Ｅ．ＰＲＯの用途
ＰＲＯをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列ＰＲＯ遺伝子又はその一部は、全長ＰＲＯｃＤＮＡの単離又はここに開示したＰＲＯ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯの天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＰＲＯのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００９５】
本出願で開示する任意のＥＳＴはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯｍＲＮＡ（センス）又はＰＲＯＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＰＲＯＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen（CancerRes. 48: 2659: 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6: 958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、WO 91/06629に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【００９６】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO 90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（WO 90/13641参照）を含む。
【００９７】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【００９８】
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯをコードする核酸配列は、そのＰＲＯをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
ＰＲＯのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＰＲＯがレセプターである場合）、ＰＲＯは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ又はＰＲＯのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００９９】
また、ＰＲＯ又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を生産するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＰＲＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【０１００】
あるいは、ＰＲＯの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１０１】
また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzau等, Trends, in Biotechnology 11, 205-219）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-2232 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１０２】
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したＰＲＯポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各ＰＲＯ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のＰＲＯポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＰＲＯポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このＰＲＯ生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ(商品名)、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商品名)又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０３】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びchappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１０４】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン（ｒｈＩＦＮ）、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及び米国特許第5,654,010号。
【０１０５】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、ＰＲＯポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドお他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１０６】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１０７】
ここで同定されたＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＰＲＯポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、ＰＲＯポリペプチド存在下での対象とする活性を阻害する化合物の能力が化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド及び膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＰＲＯポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲＯポリペプチドに暴露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１０８】
レセプター同定の代替的方法として、標識化ＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (SRS Press: Boca Raton, FL, 1988)）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１０９】
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発行）を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１１０】
Ｆ．抗-ＰＲＯ抗体
本発明は、さらに抗-ＰＲＯ抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗-ＰＲＯ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１１１】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【０１１２】
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１１３】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１１４】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１１５】
WO 96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１１６】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ＰＲＯポリペプチドのアームは、特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。興味の対象となる他の二重特異性抗体はＰＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１１７】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１１８】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１１９】
Ｇ．抗-ＰＲＯ抗体の用途
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＰＲＯ抗体は、ＰＲＯの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗-ＰＲＯ抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＰＲＯを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＰＲＯ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１２０】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。
実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（あれば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Dayhoff、GenBank）及び企業のデータベース（例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（常にではない）BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫ５Ｂ又はｐＲＫ５Ｄ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１２１】
実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
ｍＲＮＡを対象とするヒト組織からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Fast Track 2）。このＲＮＡを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いたランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Life Technoligies、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培地（Life Technplogies、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ-勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
【０１２２】
用いた酵母菌株はＨＤ５６-５Ａ（ATCC-90785）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３-５２、ｌｅｕ２-３、ｌｅｕ２-１１２、ｈｉｓ３-１１、ｈｉｓ３-１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ又はＳＳＡ１ｐ-４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
次いで細胞を収穫し、5,000rpmで５分間のSorval GS3 ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA  pH7.5, 100mMのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３）で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（2.5ml）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（100μl）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD）及び形質転換ＤＮＡ（1μg vol.＜10μl）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%ＰＥＧ／ＴＥ（600μl, 40%のポリエチレングリコール-４０００, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi2OOCCH3, pH 7.5）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（500μl, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH 7.5）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（1ml）中に希釈し、アリコート（200μl）を150mm成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ-Ｕｒａ）であった。形質転換体は３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Red-120, Sigma）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ-Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度0.15%（w/v）で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した（最終濃度50-100mM）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（150mmプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝ＳＣＤ-Ｕｒａ寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【０１２３】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水（30μl）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（5μl）を、0.5μlのKlentaq（Clontech, Palo Alto, CA）; 4.0μlの10mM dNTP（Perkin Elmer-Cetus）; 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ１；0.25μlの逆方向オリゴ２；12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
5'- TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT -3'
（配列番号：25）であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
5'- CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
（配列番号：26）であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
ａ．                  変性           92℃、5分間
ｂ．次の３サイクル：  変性           92℃、30秒間
アニール       59℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｃ．次の３サイクル：  変性           92℃、30秒間
アニール       57℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｄ．次の２５サイクル：変性           92℃、30秒間
アニール       55℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｅ．                  保持           4℃
下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応のアリコート（5μl）を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス-ボレート-ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム（Qiagen Inc., Chatsworth, CA）での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【０１２４】
実施例３：シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
種々のポリペプチド-コード化核酸配列は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は私的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
【０１２５】
実施例４：ヒトＰＲＯ１８００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴに対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３０９３４と命名する。ＤＮＡ３０９３４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１８００の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー(30934.fl)  5'-GCATAATGGATGTCACTGAGG-3'（配列番号：3）
逆方向ＰＣＲプライマー(30934.rl)  5'-AGAACAATCCTGCTGAAAGCTAG-3'（配列番号：4）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下のヌクレオチド配列を持つＤＮＡ３０９３４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(30934.pl)
5'-GAAACGAGGAGGCGGCTCAGTGGTGATCGTGTCTTCCATAGCAGCC-3'（配列番号：5）
ｃＤＮＡライブラリの構造のＲＮＡがヒト胎児肺組織から単離された。上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ここでＤＮＡ３５６７２−２５０８と称される全長ＤＮＡ配列（図１、配列番号：３）；及びＰＲＯ１８００の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ３５６７２−２５０８の完全なヌクレオチド配列を図１（配列番号：１）に示す。クローンＤＮＡ３５６７２−２５０８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３６−３８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８７０−８７２の見かけの停止コドンで終端する（図１）。予測されるポリペプチド前駆体は２７８アミノ酸長である（図２）。図２に示した全長ＰＲＯ１８００タンパク質は約２９，５３７ダルトンの推定分子量及び約８．９７のｐＩを有する。図２に示された全長ＰＲＯ１８００配列の分析により次のものの存在が証明される：約アミノ酸１から約アミノ酸１５のシグナルペプチド、約アミノ酸１８３から約アミノ酸１８６の潜在的なＮ-グリコシル化部位、約アミノ酸４３から約アミノ酸４８、約アミノ酸８０から約アミノ酸８５、約アミノ酸１９１から約アミノ酸１９６、約アミノ酸２１３から約アミノ酸２１８及び約アミノ酸２７２から約アミノ酸２７７の潜在的なＮ-ミリストイル化部位、及び約アミノ酸２７６から約アミノ酸２７８のミクロボディーＣ末端標的シグナルである。クローンＤＮＡ３５６７２−２５０８は１９９８年１２月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５３８が付与された。
図２（配列番号：２）に示した全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用しての、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１８００アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HE27_HUMAN、CELF36H9_1、CEF54F3_3、A69621、AP000007_227、UCPA_ECOLI、F69868、Y4lA_RHISN、DHK2_STRVN及びDHG1_BACMEとの間の有意な相同性が明らかになった。
【０１２６】
実施例５：ヒトＰＲＯ５３９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４１８８２と命名する。ＤＮＡ４１８８２コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５３９の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡがヒト胎児腎組織から単離された。上記のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ここでＤＮＡ４７４６５−１５６１と称されるＰＲＯ５３９の全長ＤＮＡ配列（図３、配列番号：６）；及びＰＲＯ５３９の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４７４６５−１５６１の完全なヌクレオチド配列を図３（配列番号：６）に示す。クローンＤＮＡ４７４６５−１５６１は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８６−１８８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２６７６−２６７８の停止コドンで終端する（図３）。予測されるポリペプチド前駆体は８３０アミノ酸長である（図４）。図４に示される全長ＰＲＯ５３９タンパク質は、約９５，０２９ダルトンの推定分子量及び約８．２６のｐＩを有する。図４（配列番号：７）に示した全長ＰＲＯ５３９配列の分析は次のことを証明した：約アミノ酸５５７から約アミノ酸５７８及び約アミノ酸７９４から約アミノ酸８１５のロイシンジッパーパターン配列、約アミノ酸１３３から約アミノ酸１３６の潜在的なＮ-グリコシル化部位及び約アミノ酸２３１から約アミノ酸６７２のキネシン関連タンパク質Ｋｉｆ−４コイルドコイルドメインである。クローンＤＮＡ４７４６５−１５６１は１９９９年２月９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６６１が付与されている。
図４（配列番号：７）に示した全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用したＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ５３９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF019250_1、KIF4_MOUSE、TRHY_HUMAN、A56514、G02520、MYSP_HUMAN、AF041382_1、A45592、HS125H2_1及びHS68O2_2との間の相同性が証明された。
【０１２７】
実施例６：ヒトＰＲＯ９８２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載されたシグナル配列アルゴリズムを用いて、ここでIncyteＥＳＴクラスター配列番号４３７１５と命名される単一のIncyteＥＳＴ配列の同定が明らかにされた。このＥＳＴ配列は、公的ＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）及び／又は企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）を含む様々なＥＳＴデータベースと比較して、相同性の存在を同定した。相同性検索はコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ及又はＢＬＡＳＴ２を用いて実施された(Altshul等、Methods in Enzymology 266:460-480(1996))。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。その得られたコンセンサス配列はＤＮＡ５６０９５と命名する。
得られたＤＮＡ５６００９５とメルクＥＳＴ番号ＡＡ０２４３８９との配列相同性に鑑みて、メルクＥＳＴクローンＡＡ０２４３８９が採取され、配列決定された。ＤＮＡ５７７００−１４０８（配列番号８）と命名された配列は図５に示す。それはＰＲＯ９８２の全長ＤＮＡ配列である。
図５示される全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２６−２８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４０１−４０３の停止コドンで終端する（配列番号８）。予測されるポリペプチド前駆体は１２５アミノ酸長であり、約１４，１９８ダルトンの推定分子量及び約９．０１の見積もりのｐＩを有する。図６（配列番号：９）に示した全長ＰＲＯ９８２配列の分析は、約アミノ酸１からアミノ酸２１のシグナルペプチド、約アミノ酸５０からアミノ酸５９の潜在的なアナフィラトキシンドメインの存在を証明した。Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ９８２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：RNTMDCV_1; A48151; WAP_RAT; S24596; A53640; MT4_HUMAN; U93486_1; SYNBILGFG_1; P_R49917及びP_R41880との間の相同性が証明された。クローンＤＮＡ５７７００−１４０８は１９９９年１月１２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５８３が付与されている。
【０１２８】
実施例７：ヒトＰＲＯ１４３４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴに対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５４１８７と命名する。ＤＮＡ５４１８７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１４３４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-GAGGTGTCGCTGTGAAGCCAACGG-3'（配列番号：12）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-CGCTCGATTCTCCATGTGCCTTCC-3'（配列番号：13）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下のヌクレオチド配列を持つＤＮＡ５４１８７配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GACGGAGTGTGTGGACCCTGTGTACGAGCCTGATCAGTGCTGTCC-3'（配列番号：14）
ｃＤＮＡライブラリの構造のＲＮＡがヒト網膜組織（ＬＩＢ９４）から単離された。上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ここでＤＮＡ６８８１８−２５３６と称されるＰＲＯ１４３４全長ＤＮＡ配列（図７、配列番号：１０）；及びＰＲＯ１４３４の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ６８８１８−２５３６の完全なヌクレオチド配列を図７（配列番号：１０）に示す。クローンＤＮＡ６８８１８−２５３６は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８１−５８３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５５６−１５５８の見かけの停止コドンで終端する（図７）。予測されるポリペプチド前駆体は３２５アミノ酸長である（図８）。図８に示した全長ＰＲＯ１４３４タンパク質は約３５，２９６ダルトンの推定分子量及び約５．３７のｐＩを有する。図８（配列番号：１１）に示された全長ＰＲＯ１４３４配列の分析は、図８に示されるような様々な重要なタンパク質ドメインの存在を証明した。クローンＤＮＡ６８８１８−２５３６は１９９９年２月９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６５７が付与された。
図８（配列番号：１１）に示した全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用しての、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１４３４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：NEL_MOUSE、APMU_PIG、P_W37501、NEL_RAT、TSP1_CHICK、P_W37500、NEL2_HUMAN、MMU010792_1、D86983_1及び10MUCS_BOVINとの間の重要な相同性が明らかになった。
【０１２９】
実施例８：ヒトＰＲＯ１８６３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのIncyteＥＳＴクラスター配列番号８２４６８と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴ ＤＮＡデータベース（Lifeseq(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０２９と命名する。
ＤＮＡ５６０２９配列とIncyteＥＳＴクローン番号２１８６５３６に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、IncyteＥＳＴクローン番号２１８６５３６を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図９に示し、ここでＤＮＡ５９８４７−２５１０と命名する。
クローンＤＮＡ５９８４７−２５１０は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７−１９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３２８−１３３０の停止コドンで終端する（図９）。予測されるポリペプチド前駆体は４３７アミノ酸長である（図１０）。図１０に示す全長ＰＲＯ１８６３タンパク質は、約４６，３６３の推定分子量及び約６．２２のｐＩを有する。図１０（配列番号：１６）に示した全長ＰＲＯ１８６３配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１から約アミノ酸１５のシグナルペプチド、約アミノ酸２４３から約アミノ酸２６０の膜貫通ドメイン、約アミノ酸４６から約アミノ酸４９、約アミノ酸１８９から約アミノ酸１９２及び約アミノ酸３８２から約アミノ酸３８５の潜在的なＮ−グリコシル化部位、約アミノ酸５１から約アミノ酸５４及び約アミノ酸３５９から約アミノ酸３６２のグリコサミノグリカン付着部位、約アミノ酸５４から約アミノ酸５９、約アミノ酸７５から約アミノ酸８０、約アミノ酸１４１から約アミノ酸１４６、約アミノ酸１５４から約アミノ酸１５９、約アミノ酸１６８から約アミノ酸１７３、約アミノ酸１６９から約アミノ酸１７４、約アミノ酸１９８から約アミノ酸２０３、約アミノ酸２５４から約アミノ酸２５９、約アミノ酸２６１から約アミノ酸２６６、約アミノ酸２６９から約アミノ酸２７４、約アミノ酸２８４から約アミノ酸２８９、約アミノ酸３３３から約アミノ酸３３８、約アミノ酸３４７から約アミノ酸３５２、約アミノ酸３６０から約アミノ酸３６５、約アミノ酸３６１から約アミノ酸３６６、約アミノ酸３８８から約アミノ酸３９３、約アミノ酸４０８から約アミノ酸４１３、及び約アミノ酸４１９から約アミノ酸４２４の潜在的なＮ−ミリストイル化部位である。クローンＤＮＡ５９８４７−２５１０は１９９９年１月１２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５７６が付与されている。
図１０（配列番号：１６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１８６３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF041083_1、P_W26579、HSA223603_1、MMU97068、RNMAGPIAN_1、CAHX_FLABR、S61882、AB007899_1、CAH1_FLALI及びP_W13386の間の相同性が証明された。
【０１３０】
実施例９：ヒトＰＲＯ１９１７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載されたシグナル配列アルゴリズムを用いて、LIFESEQ(登録商標)のＥＳＴクラスター配列の同定が明らかにされ、ＥＳＴクラスター番号８５４９６と命名された。ついで、このＥＳＴクラスター配列は、前記したＥＳＴデータベースと比較して、相同性の存在を同定した。相同性検索はコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ及又はＢＬＡＳＴ２を用いて実施された(Altshul等、Methods in Enzymology 266:460-480(1996))。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。その得られたコンセンサス配列はＤＮＡ５６４１５と命名する。
得られたれたＤＮＡ５６４１５とＥＳＴ番号３２５５０３３に含まれるＥＳＴ配列との配列相同性に鑑みて、卵巣腫瘍ライブラリーから誘導されるＥＳＴクローンを購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１１に示し、ここでＤＮＡ７６４００−２５２８と命名する。
図１１に示される全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６−９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１４６７−１４６９の停止コドンで終端する（図１１、配列番号１７）。予測されるポリペプチド前駆体（図１２、配列番号：１８）は４８７アミノ酸長である。ＰＲＯ１９１７は、約５５，０５１ダルトンの推定分子量及び約８．１４の見積もりのｐＩを有する。追記する特徴としては：約アミノ酸１−３０にシグナルペプチド；約アミノ酸２４２−２４５及び４８１−４８４に潜在的なＮグリコシル化部位；約アミノ酸９５−９７、１８２−１８４、及び４２７−４２９にプロテインキナーゼＣリン酸化部位；約アミノ酸１０７−１１２、１１３−１１８、１１７−１２２、１１８−１２３、及び１２８−１３３にＮ−ミリストイル化部位；及び約アミノ酸４８４−４８７に小胞体標的配列を含む。
図１２（配列番号：１８）に示した全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用しての、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１９１７のアミノ酸配列とDayhoff配列AF012714_1との間の有意な相同性が証明された。また有意な相同性がＰＲＯ１９１７アミノ酸配列と増殖から肥大段階への遷移に関すると報告されている（国際特許出願公開番号WO9801468-A1）Dayhoffデータベースで「P_W52286」と命名される軟骨細胞の配列との間で証明された。また相同性はＰＲＯ１９１７アミノ酸配列と次のさらなるDayhoff配列：P_W52286、GGU59420_1、P_R25597、PPA3_YEAST、PPA1_SCHPO、PPA2_SCHPO、A46783_1、DMC165H7_1、及びAST8_DROMEとの間に証明された。
クローンＤＮＡ７６４００−２５２８は１９９９年１月１２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５７３が付与されている。
【０１３１】
実施例１０：ヒトＰＲＯ１８６８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４９８０３と命名する。ＤＮＡ４９８０３コンセンサス配列とIncyteＥＳＴクローン番号２９９４６８９に含まれるＥＳＴ配列との間で観察された相同性に基づいて、IncyteＥＳＴクローン番号２９９４６８９が購入され、その挿入物を得て配列決定した。その挿入物の配列が図１３に示され、ここでＤＮＡ７７６２４−２５１５と命名された。
ＤＮＡ７７６２４−２５１５の完全なヌクレオチド配列を図１３（配列番号：１９）に示す。クローンＤＮＡ７７６２４−２５１５は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５１−５３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９８１−９８３の停止コドンで終端する（図１３）。予測されるポリペプチド前駆体は３１０アミノ酸長である（図１４）。図１４に示される全長ＰＲＯ１８６８タンパク質がは、約３５，０２０の計算された分子量及び約７．９０のｐＩを有する。図１４（配列番号：２０）に示した全長ＰＲＯ５３９配列の分析は次のことを証明した：約アミノ酸１から約アミノ酸３０のシグナルペプチド、約アミノ酸２４３から約アミノ酸２６３の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１０４から約アミノ酸１０７及び約アミノ酸１９２から約アミノ酸１９５のＮ−グリコシル化部位、約アミノ酸１０７から約アミノ酸１１０のｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、約アミノ酸１０６から約アミノ酸１０９、約アミノ酸２９６から約アミノ酸２９９のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、約アミノ酸６９から約アミノ酸７７のチロシンキナーゼリン酸化部位及び約アミノ酸２６から約アミノ酸３１、約アミノ酸２１５から約アミノ酸２２０、約アミノ酸２２６から約アミノ酸２３１、約アミノ酸２４３から約アミノ酸２４８約アミノ酸２４４から約アミノ酸２４９及び約アミノ酸２６２ｋら約アミノ酸２６７の潜在的なＮ−ミリストイル化部位である。クローンＤＮＡ７７６２４−２５１５は１９９８年１２月２２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５５３が付与された。
図１４（配列番号：２０）に示した全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用したDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１８６８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HGS_RC75、P_W61379、A33_HUMAN、P_W14146、P_W14158、AMAL_DROME、P_R77437、I38346、NCM2_HUMAN及びPTPD_HUMANとの間の相同性が証明された。
【０１３２】
実施例１１：ヒトＰＲＯ３４３４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載されたシグナル配列アルゴリズムを用いて、IncyteデータベースのＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）及び企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（Lifeseq(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々なＥＳＴデータベースと比較して、相同性の存在を特定した。相同性検索はコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ及又はＢＬＡＳＴ２を用いて実施された(Altshul等、Methods in Enzymology 266:460-480(1996))。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物を、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列中に組み込んだ。その得られたコンセンサス配列はここでＤＮＡ５６００９と命名する。
ＤＮＡ５６００９とIncyteＥＳＴクローン番号３３２７０８９に含まれるＥＳＴ配列との配列相同性に鑑みて、IncyteＥＳＴクローン番号３３２７０８９を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１５に示し、ここでＤＮＡ７７６３１−２５３７と命名する。
クローンＤＮＡ７７６３１−２５３７は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４６−４８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３１３３−３１３５の停止コドンで終端する（図１５）。予測されるポリペプチド前駆体は１０２９アミノ酸長である（図１６）。図１６に示される全長ＰＲＯ３４３４タンパク質は、約１１４，２１３ダルトンの推定分子量及び約６．４２のｐＩを有する。図１６（配列番号２２）に示される全長ＰＲＯ３４３４配列の分析により図１６に示されるような非常に重要なポリペプチドドメインの存在が証明された。クローンＤＮＡ７７６３１−２５３７は１９９９年２月９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６５１が付与されている。
図１６（配列番号：２２）に示した全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用しての、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ３４３４のアミノ酸配列と以下のDayhoff配列：VATX_YEAST、P_R51171、POLS_IBDVP、IBDVORF_2、JC5043、IBDVPIV_1、VE7_HPV11、GEN14220、MUTS_THETH及びCOAC_CHICKとの間の相同性が証明された。
【０１３３】
実施例１２：ヒトＰＲＯ１９２７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、LIFESEQ（登録商標）データベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となり、ＥＳＴクラスター番号１９１３と命名された。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、さらなる企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（Genentech, South San Francisco, CA）を追加して含む上記の種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altshul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ７３８９６と命名する。
ＤＮＡ７３８９６配列とＥＳＴ番号３３２６９８１Ｈ１に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、大動脈組織から単離されるＲＮＡからなるライブラリから採取されるＥＳＴクローン３３２６９８１Ｈ１が購入され、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１７に示し、ここでＤＮＡ８２３０７−２５３１と命名する。
図１７に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５１−５３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１６９５−１６９７の停止コドンで終端する（図１７；配列番号：２３）。予測されるポリペプチド前駆体（図１８、配列番号：２４）は５４８アミノ酸長である。ＰＲＯ１９２７は約６３，１９８の推定分子量及び約８．１０の見積もられたｐＩを有する。追記する特徴としては：約アミノ酸１−２３にシグナルペプチド；約アミノ酸６−２５に推定の膜貫通ドメイン；約アミノ酸５−８、８７−９０、１０３−１０６、及び４６５−４６９、の潜在的なＮ−グリコシル化部位；約アミノ酸６−１１、１３６−１４１、３７０−３７５、及び５０９−５１４にＮ−ミリストイル化部位を含む。
図１８（配列番号：２４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１９２７のアミノ酸配列とDayhoff配列AB000628_1との間の重要な配列相同性が明らかになった。またＰＲＯ１９２７アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HGS_A251、HGS_A197、CELC50H11_2、CPXM_BACSU、VF03_VACCC、VF03_VACCV、DYHA_CHLRE、C69084及びA64315との間の相同性も明らかにされた。
クローンＤＮＡ８２３０７−２５３１は１９９８年１２月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５３７が付与されている。
【０１３４】
実施例１３：混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における阻害活性アッセイ(アッセイ６７)
この実施例は、本発明の一又は複数のポリペプチドが刺激されたＴリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい治療において有用である。
このアッセイの基本的プロトコルは、Immunology, unit3.12；J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のCurrent Protocolsに記載されている。
より詳細には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を哺乳類個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する)。所望されるならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(３７℃、5%ＣＯ２)で一晩解凍し、ついで洗浄し、３ｘ１０６細胞/mlのアッセイ用培地(ＲＰＭＩ；10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン／ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%ＨＥＰＥＳ、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)に再懸濁させる。刺激物ＰＢＭＣは細胞を光にさらす(約3000ラド)ことにより調製される。
このアッセイは混合物：
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーＰＢＭＣ細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのＣＤ４-ＩｇＧをコントロールとして使用する。ついで、ウェルを３７℃、5%ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル；Amersham)を適用する。６時間後、細胞を３回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(ＲＰＭＩ；10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン／ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%ＨＥＰＥＳ、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンホライト(Lympholyte)Ｍ(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＭＢＣを単離し、2000rpmで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０７細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイは上記のように行われる。
コントロール以下への減少は全て、阻害用化合物についてのポジティブな結果であると考えられ、80%以下の減少が好ましい。しかしながら、コントロールより少ない値は全て、試験用タンパク質について阻害効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１９１７及びＰＲＯ１８６８。
【０１３５】
実施例１４：皮膚血管透過性アッセイ（アッセイ６４）
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが哺乳動物の注入部位での単核細胞、好酸球及びＰＭＮ浸潤を誘発することにより免疫反応を促進及び炎症反応を誘発することが示される。免疫反応を促進する化合物は免疫反応の促進を必要とする治療に利用可能である。この皮膚血管透過性アッセイは次のように実施される。体重が３５０グラム又はそれ以上の毛の無いモルモットがケタミン（７５−８０mg/Kg）及び５mg/Kgキシラジン(xylazine)筋肉注射（IM）で麻酔される。精製された本発明のポリペプチドのサンプル又は条件培地試験サンプルが、注入部位あたり１００μｌを試験動物の背中に皮内注入される。動物あたり約１０−３０、好ましくは約１６−２４箇所の部位に注入が可能である。エバンスブルー色素（１％に生理的食塩水で緩衝）の１μｌが心臓内に注入される。ついで注入部位における斑点が注入後１時間と６時間で測定（直径ｍｍ）される。動物は注入後６時間で屠殺される。それぞれの皮膚注入部位は生体組織検査され、ホルマリンで固定される。ついで皮膚は組織病理学検査のために準備される。それぞれ部位は皮膚への炎症細胞浸潤を検査される。可視的な炎症細胞の炎症を有する部位は陽性として記録される。炎症細胞は好中球、好酸球、単球、リンパ球であり得る。少なくとも注入部位での最小血管周囲の浸潤は陽性として記録され、注入部位で浸潤のなかった場合には陰性として記録される。
このアッセイで次のポリペプチドは陽性と検定された：ＰＲＯ１４３４
【０１３６】
実施例１５：ラット小嚢支持細胞の増殖（アッセイ５４）
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが聴覚毛細胞前駆体である内耳支持細胞の有糸分裂促進剤として作用し、したがって哺乳動物における聴覚毛細胞の再生誘発と軟調の治療に利用できることを示す。アッセイは次のように実施される。ラットＵＥＣ−４小嚢上皮細胞が３３℃、２００μｌの血清添加培地で密度３０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに等分される。細胞は一晩培養され、ついで３７℃で無血清培地に移される。ついで様々な希釈率のＰＲＯポリペプチド（又はコントロールには不含有）が培地に加えられ、ついで細胞は２４時間インキュベートされる。２４時間のインキュベーションの後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ/ウェル）が加えられ、ついでさらに２４時間培養される。次に培地は組み込まれなかった放射能標識を取り除くために洗浄され、細胞を取り出し、１ウェルあたりのCpmが決定される。コントロール培地と比較してＰＲＯポリペプチドで処置した培地で少なくとも３０％又はそれ以上のＣｐｍであった場合にはアッセイで陽性と判断される。
このアッセイで次のポリペプチドは陽性と検定された：ＰＲＯ９８２
【０１３７】
実施例１６：遺伝子増幅
この実施例は、ＰＲＯ１８００-、ＰＲＯ５３９-、ＰＲＯ３４３４-及びＰＲＯ１９２７-コード化遺伝子が或る種のヒト肺、大腸及び／又は乳癌及び／又は細胞系のゲノムで増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、ポリペプチドが大腸、肺、乳及び他の癌等の或る種の癌における治療的処置及びその癌の存在の診断決定に対して有用な標的であることを示している。治療薬は、ＰＲＯ１８００，ＰＲＯ５３９，ＰＲＯ３４３４又はＰＲＯ１９２７ポリペプチドのアンタゴニストの形態を取り得、例えばＰＲＯ１８００，ＰＲＯ５３９，ＰＲＯ３４３４又はＰＲＯ１９２７ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。
スクリーニングの出発物質は種々の癌から単離したゲノムＤＮＡであった。ＤＮＡは、正確に、例えば蛍光的に定量した。ネガティブ対照として、ＤＮＡを１０の正常健常個体の細胞からＤＮＡを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ対照として使用した（図示せず）。５’ヌクレアーゼアッセイ（例えばTaqManＴＭ）及び実時間定量的ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection SystemＴＭ)(Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)）を、或る種の癌で潜在的に増幅される遺伝子の発見に使用した。結果を、ＰＲＯ１８００、ＰＲＯ５３９、ＰＲＯ３４３４又はＰＲＯ１９２７をコードするＤＮＡがスクリーニングした原発性肺又は大腸癌又は癌細胞系又は乳癌細胞系で過剰提示されるか否かの決定に用いた。原発性肺癌は、表６に示したタイプ及び段階の腫瘍を持つ個体から得た。表６に列挙した原発性腫瘍及びこの実施例を通して参照される原発性腫瘍及び細胞系の標記に使用した略語の説明は以下にまとめる。
【０１３８】
TaqManＴＭの結果はデルタ(Δ)Ｃｔ単位で報告した。１単位は１ＰＣＲサイクル又は正常に対して約２倍の増幅に相当し、２単位は４倍、３単位は８倍の増幅等々に相当する。定量化はプライマー及びＰＲＯ１８００-，ＰＲＯ５３９-，ＰＲＯ３４３４-，又はＰＲＯ１９２７-コード化遺伝子から誘導したTaqManＴＭ蛍光プローブを用いて得た。最も独特の核酸配列を含むと思われ、少なくともスプライシングされたイントロンを持たないと思われるＰＲＯ１８００，ＰＲＯ５３９，ＰＲＯ３４３４又はＰＲＯ１９２７の領域、例えば３-非翻訳領域はプライマー及びプローブの誘導に適している。ＰＲＯ１８００、ＰＲＯ５３９、ＰＲＯ３４３４又はＰＲＯ１９２７遺伝子増幅分析に使用されるプライマー及びプローブ（正、逆及びプローブ）の配列は次の通りであった：
ＰＲＯ１８００(ＤＮＡ３５６７２-２５０８）
正        5'-ACTCGGGATTCCTGCTGTT-3'               (配列番号：２７)
プローブ  5'-AGGCCTTTACCCAAGGCCACAAC-3'         (配列番号：２８)
逆        5'-GGCCTGTCCTGTGTTCTCA-3'                (配列番号：２９)
ＰＲＯ５３９(ＤＮＡ４７４６５-１５６１)
正        5'-TCCCACCACTTACTTCCATGAA-3'             (配列番号：３０)
プローブ  5'-CTGTGGTACCCAATTGCCGCCTTGT-3'         (配列番号：３１)
逆        5'-ATTGTCCTGAGATTCGAGCAAGA-3'           (配列番号：３２)
ＰＲＯ３４３４(ＤＮＡ７７６３１-２５３７)
正        5'-GTCCAGCAAGCCCTCATT-3'                  (配列番号：３３)
プローブ  5'-CTTCTGGGCCACAGCCCTGC-3'                (配列番号：３４)
逆        5'-CAGTTCAGGTCGTTTCATTCA-3'               (配列番号：３５)
ＰＲＯ１９２７(ＤＮＡ８２３０７-２５３１)
正        5'-CCAGTCAGGCCGTTTTAGA-3'                 (配列番号：３６)
プローブ  5'-CGGGCGCCCAAGTAAAAGCTC-3'              (配列番号：３７)
逆        5'-CATAAAGTAGTATATGCATTCCAGTGTT-3'      (配列番号：３８)
５’ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光ＰＣＲベースの技術であり、実時間での増幅監視のためのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する。ＰＣＲ反応に典型的な単位複製配列の生成に２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計された。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素により非伸展性であり、レポーター蛍光染料及び消光剤蛍光染料で標識される。２つの染料がプローブ上に接近して位置する場合、レポーター染料からのレーザー誘導発光は消光染料によって消光される。増幅反応の間、プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりテンプレート依存的方式で切断される。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは第２のフルオロホアからの消光効果を受けない。レポーター染料の一分子が、新たに合成された各分子について放出され、非消光レポーター染料の検出がデータの定量的解釈の基礎を提供する。
５’ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM Sequence Detectionなどの実時間定量的ＰＣＲ装置で実施される。システムは温度サイクル器、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及びコンピュータからなる。システムは温度サイクル器上で９６ウェルでの試料を増幅させる。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルは、９６ウェル全てについて、実時間で、光ファイバーケーブルを通して集められ、ＣＣＤで検出される。システムは装置の実行及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はＣｔ又は閾サイクルとして表される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルを越えて蓄積されるサイクルとして定義される。正常なヒトＤＮＡ結果を癌ＤＮＡ結果と比較する場合に、△Ｃｔ値を核酸試料中の特定の標的配列の出発コピー相対数の定量的尺度として使用した。
表６は、本発明のＰＲＯ１８００，ＰＲＯ５３９，ＰＲＯ３４３４又はＰＲＯ１９２７化合物のスクリーニングに用いた種々の原発腫瘍の段階、Ｔ段階及びＮ段階を記載する。
【０１３９】
2003521229.tif 000022
【０１４０】
ＤＮＡ調製：
ＤＮＡは培養した細胞系、原発腫瘍、正常ヒト血液から調製した。単離は、全てQuiagenからの、精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と下記に従って実施した。
細胞培養溶解：
細胞を洗浄し、チップ当たり7.5x10８の濃度でトリプシン処理し、４℃で５分間1000rpmで遠心分離してペレット化し、次いで1/2容量のＰＢＳ再遠心で再び洗浄した。ペレットの３回目の洗浄を行い、懸濁細胞を回収して2xＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を10mLのＰＢＳに懸濁させた。バッファーＣ１を４℃で平衡化させた。Quiagenプロテアーゼ#19155を6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏで最終濃度20mg/mlまで希釈して４℃で平衡化させた。10mLのＧ２バッファーを、QuiagenＲＮＡｓｅＡストック（100mg/ml）を200μg/mlの最終濃度まで希釈して調製した。
バッファーＣ１（10ml、４℃）及びｄｄＨ２Ｏ（40ml、４℃）を、次いで10mlの細胞懸濁物に添加し、反転させて混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞核をBeckmanスイングバケットロータで４℃において2500rpmで１５分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、核をボルテックスしながら2mlのバッファーＣ１（４℃）及び6mlのｄｄＨ２Ｏに懸濁し、２回目の４℃、2500rpmの１５分間遠心分離を行った。次いで核を残りのバッファー中にチップ当たり200μlを用いて再懸濁した。緩くボルテックスしながらＧ２バッファー（10ml）を懸濁した核に添加した。バッファー添加が完了したところで、強いボルテックスを３０秒間行った。Quiagenプロテアーゼ（200μl、上記のように調製）を添加し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する）。
【０１４１】
固体ヒト腫瘍試料の調製及び溶解：
腫瘍試料を秤量し50mlのコニカル管に配して氷上に保持した。加工は調製当たり250mg未満の組織に制限した（１チップ／調製）。プロテアーゼ溶液を6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを最終濃度200mg/mlまで希釈することによりＧ２バッファー（20ml）を調製した（100mg/mlのストックから）。エアロゾルの吸入を避けるために層流ＴＣフード内でポリトロンの大きなチップを用いて、腫瘍組織を19mlのＧ２バッファー中で６０秒間均一化し、室温に保持した。試料間で、各々2LのｄｄＨ２Ｏで２ｘ３０秒間、次いでＧ２バッファー（50ml）でスピンさせることによりポリトロンを清浄にした。組織がジェネレータチップ上になお存在する場合は、装置を分解して清浄化した。
Quiagenプロテアーゼ（上記のように調製、1.0ml）を添加し、次いでボルテックスして５０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する）。
ヒト血液の調製及び溶解：
健常なボランティアから標準的な病原菌プロトコールを用いて血液を採りだし、チップ当たり10mlの試料にクエン酸化した。Quiagenプロテアーゼを6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＲＮＡｓｅＡを100mg/mlのストックから最終濃度200μg/mlまで希釈することによりＧ２バッファーを調製した。血液（10ml）を50mlのコニカル管に配し、10mlのＣ１バッファー及び30mlのｄｄＨ２Ｏ（ともに４℃で平衡化したもの）を添加し、成分を反転させて混合して氷上に１０分間保持した。Beckmanスイングバケットローターで、４℃において2500rpmで１５分間核をペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスしながら、核を2mlのＣ１バッファー（４℃）及び6mlのｄｄＨ２Ｏ（４℃）中に懸濁させた。ボルテックスはペレットが白くなるまで繰り返した。次いで核を残りのバッファー中に200μlチップを用いて懸濁させた。Ｇ２バッファー（10ml）を懸濁核に緩くボルテックスしながら添加し、次いで３０秒間強くボルテックスした。Quiagenプロテアーゼを添加（200μl）し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する）。
【０１４２】
透明化溶解物の精製：
（１）ゲノムＤＮＡの単離：
ゲノムＤＮＡを10mlのＱＢＴバッファーで平衡化した（最大チップ調製当たり１試料）。ＱＦ溶離バッファーを５０℃で平衡化した。試料を３０秒間ボルテックスし、次いで平衡化チップに負荷して重力により排液した。チップを2x15mlのＱＣバッファーで洗浄した。ＤＮＡを、30mlのシラン化したオートクレーブ30mlCortex管に15mlのＱＦバッファー（５０℃）で溶離した。イソプロパノール（10.5ml）を各試料に添加し、管をパラフィンで被覆し、ＤＮＡが沈殿するまで繰り返し反転させて混合した。試料を、SS-34ロータで４℃において15,000rpmで１０分間遠心分離してペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨て、10mlの70%エタノール（４℃）を添加した。試料を、SS-34ロータで４℃において10,000rpmで１０分間遠心分離して再度ペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨てた。次いで管を乾燥棚に横にして置き、３７℃で１０分間乾燥させたが、試料の過剰乾燥には注意した。
乾燥後、ペレットを1.0mlのＴＥ（pH8.5）に溶解し、５０℃に１−２時間置いた。試料を４℃に終夜保持して溶解を続けた。次いでＤＮＡ溶液を、ツベルクリンシリンジ上に２６ゲージの針を具備する1.5ml管に移した。ＤＮＡを剪断するために移し替えを５ｘ繰り返した。次いで試料を５０℃に１−２時間置いた。
【０１４３】
（２）遺伝子増幅アッセイのためのゲノムＤＮＡの定量と準備：
各管のＤＮＡレベルを1:20希釈（5μlＤＮＡ＋95μlｄｄＨ２Ｏ）での標準的なＡ２６０、Ａ２８０分光分析により、Beckman DU640分光光度計で0.1ml石英キュベットを用いて定量した。Ａ２６０／Ａ２８０比率は1.8-1.9の範囲であった。次いで各ＤＮＡ試料をＴＥ（pH8.5）中に約200ng/mlまでさらに希釈した。最初の材料が高濃度（約700ng/μl）である場合、再懸濁するまで材料を５０℃に数時間置いた。
次いで、希釈した材料（20-600ng/ml）に対して、製造者の指示を以下のように改変して蛍光ＤＮＡ定量化を実施した。これは、Hoeffer DyNA Quant 200蛍光計を約１５分間暖めて実施した。Hoechst染料作業溶液（#H33258、10μl、使用の１２時間以内に調製）を100mlの1xＴＮＥバッファーに希釈した。2mlキュベットを蛍光計溶液で満たし、機械に配し、機械をゼロ調節した。ｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)（2μl、ロット#360851026）を2mlの蛍光計溶液に添加して200単位で校正した。次いで、さらに２μlのｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)ＤＮＡを試験し、400+/-10単位で読みを確認した。次いで各試料を少なくとも３回読んだ。３試料が互いに10%以内にあることが見出されたとき、それらの平均をとり、この値を定量化値として用いた。
次いで、蛍光測定で決定した濃度を、各試料をｄｄＨ２Ｏ中に10ng/μlまで希釈するのに用いた。これは、１回のTaqManプレートアッセイについて全てのテンプレート試料について同時に行い、500-1000アッセイを実施するのに十分な材料で行った。試料は、TaqmanＴＭプライマー及び正常なヒトＤＮＡを持つ単一のプレートのＢ-アクチン及びＧＡＰＤＨプローブ及びテンプレートなしの対照を用いて３通り試験した。試験ＤＮＡから減算した正常ヒトＤＮＡのＣＴ値が+/-１Ｃｔである場合、希釈した試料を用いた。希釈した、ロット定性化ゲノムＤＮＡを、1.0mlアリコートで−８０℃に保存した。続いて遺伝子増幅アッセイに使用するアリコートを４℃で保存した。各1mlのアリコートで、８-９プレート又は６４回の試験に十分である。
遺伝子増幅アッセイ：
本発明のＰＲＯ１８００，ＰＲＯ５３９，ＰＲＯ３４３４及びＰＲＯ１９２７化合物を以下の原発腫瘍でスクリーニングし、得られた１．０以上であるΔＣｔ値を表７にまとめる。
【０１４４】
2003521229.tif 000023
【０１４５】
実施例１７：膵臓β-細胞前駆体増殖の誘発（アッセイ１１７）
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが多数の膵臓β-細胞前駆細胞の増加を誘発する働きをし、したがって、糖尿病を含む哺乳動物における様々なインシュリン不完全段階の治療に利用できることを示す。アッセイは次のように実施される。アッセイはマウス胎児膵臓細胞の初代培養を使用し、初期測定はβ-細胞前駆体又は成熟したβ-細胞のどちらかに相当するマーカーの発現の変化である。マーカー発現はリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）で測定され；ここで評価されるマーカーはＰｄｘ１と呼ばれる転写因子である。
膵臓はＥ１４胚（ＣＤ１マウス）から取り出される。ついで膵臓は３７度で４０から６０分、Ｆ１２/ＤＭＥＭ中でコラゲナーゼ/ディスパーゼで消化される（コラゲナーゼ/ディスパーゼ、1.37mg/ml、Boehringer Mannheim、＃1097113）。ついで消化は同容量の５％ＢＳＡで中和され、細胞は一度ＲＰＭＩ１６４０で洗浄される。１日目、細胞は１２ウェル組織培養プレートに蒔かれる（PBSで20μ/mlのラミニンで前もってコートされる、Boehringer Mannheim、＃124317）。１−２胚の膵臓由来の細胞が１ウェル当たり分配される。この初代培養の培地は１４Ｆ／１６４０である。２日目、培地が取り除かれ、付着した細胞はＲＰＭＩ／１６４０で洗浄される。試験されるタンパク質に加えて、２ｍｌの最小培地が加えられる。４日目、培地は取り除かれ、細胞からＲＮＡが準備され、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってマーカー発現が分析される。未処理のコントロールに比べ、関連したβ-細胞マーカーの発現を増加させている場合には、タンパク質はアッセイにおいて活性であると考えられる。
１４Ｆ／１６４０はＲＰＭＩ１６４０（Gibco）に次のものを加えたものである：
グループＡ  1：1000
グループＢ  1：1000
組み換えヒトインシュリン  10μg／ml
アプロチニン（50μg／ml）1：2000（Boehringer manhein #981532）
牛下垂体エキス（ＢＰＥ）60μg／ml
ゲンタマイシン  100ng／ml
グループＡ：（10mlＰＢＳ中）
トランスフェリン、100mg（シグマT2252）
上皮成長因子、100μg（BRL100004）
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl（シグマT5516）
エタノールアミン、10−１Ｍの100μl（シグマE0135）
ホスホエタノールアミン、10−１Ｍの100μl（シグマP0503）
セレニウム、10−1Ｍの4μl（Aesar#12574）
グループＣ：（10mlの100%エタノール中）
ヒドロコルチゾン、5x10−３Mの2μl（シグマ#H0135）
プロゲステロン、1x10−３Mの100μl（シグマ#P6149）
フォルスコリン、20mMの500μl（Calbiochem#344270）
最小培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びＢＰＥ(15μg/ml)を加える。
定義した培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)を加える。
次のポリペプチドはこのアッセイで活性であった：ＰＲＯ１８６８
【０１４６】
実施例１８：膵臓β-細胞前駆体分化の誘発（アッセイ８９）
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが成熟した膵臓β-細胞から膵臓β-細胞前駆細胞への分化を誘発する働きをし、したがって、糖尿病を含む哺乳動物における様々なインシュリン不完全段階の治療に利用できることを示す。アッセイは次のように実施される。アッセイはマウス胎児膵臓細胞の初代培養を使用し、初期測定はβ-細胞前駆体又は成熟したβ-細胞のどちらかに相当するマーカーの発現の変化である。マーカー発現はリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）で測定され；ここで評価されるマーカーはインシュリンである。
膵臓はＥ１４胚（ＣＤ１マウス）から取り出される。ついで膵臓は３７度で４０から６０分、Ｆ１２/ＤＭＥＭ中でのコラゲナーゼ/ディスパーゼで消化される（コラゲナーゼ/ディスパーゼ、1.37mg/ml、Boehringer Mannheim、＃1097113）。ついで消化は同容量の５％ＢＳＡで中和され、細胞は一度ＲＰＭＩ１６４０で洗浄される。１日目、細胞は１２ウェル組織培養プレートに蒔かれる（PBS中で20μ/mlのラミニンで被覆される、Boehringer Mannheim、＃124317）。１−２胚の膵臓由来の細胞はウェル当たり分配される。この初代培養の培地は１４Ｆ／１６４０である。２日目、培体は取り除かれ、付着した細胞はＲＰＭＩ／１６４０で洗浄される。試験されるタンパク質に加えて、２ｍｌの最小培地が加えられる。４日目、培地は取り除かれ、細胞からＲＮＡが準備され、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってマーカー発現が分析される。未処置コントロールに比べ、関連したβ-細胞マーカーの発現を増させる場合には、タンパク質はアッセイにおいて活性であると考えられる。
１４Ｆ／１６４０はＲＰＭＩ１６４０（Gibco）に次のものを加えたものである：
グループＡ  1：1000
グループＢ  1：1000
組み換えヒトインシュリン  10μg／ml
アプロチニン（50μg／ml）1：2000（Boehringer manhein #981532）
牛下垂体エキス（ＢＰＥ）60μg／ml
ゲンタマイシン  100ng／ml
グループＡ：（10mlＰＢＳ中）
トランスフェリン、100mg（シグマT2252）
上皮成長因子、100μg（BRL100004）
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl（シグマT5516）
エタノールアミン、10−１Ｍの100μl（シグマE0135）
ホスホエタノールアミン、10−１Ｍの100μl（シグマP0503）
セレニウム、10−1Ｍの4μl（Aesar#12574）
グループＣ：（10mlの100%エタノール中）
ヒドロコルチゾン、5x10−３Mの2μl（シグマ#H0135）
プロゲステロン、1x10−３Mの100μl（シグマ#P6149）
フォルスコリン、20mMの500μl（Calbiochem#344270）
最小培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びＢＰＥ(15μg/ml)を加える。
定義した培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)を加える。
次のポリペプチドはこのアッセイで活性であった：ＰＲＯ１８６３
【０１４７】
実施例１９：マウス腎臓メサンギウム細胞増殖アッセイ（アッセイ９２）
このアッセイでは本発明のあるポリペプチドが哺乳動物の腎臓メサンギウム細胞増殖を誘導する働きをし、及び、従って、例えばバーガー病ようなメサンギウム細胞機能の低下に関する腎障害、又はシェーンライン-ヘーノホ紫斑病、セリアック病、疱疹状皮膚炎又はクローン病に関連するその他ネフロパシーの治療に利用できることが示される。アッセイは次のように実施される。１日目、マウス腎臓メサンギウム細胞が成長培地（ダルベッコ修飾イーグル培地と95％芽牛胎児血清、5％が14mM HEPESを用いて補足されたヘムＦ１２培地が3：1の混合物）で９６ウェルプレート上に蒔かれ、一晩育成する。２日目、ＰＲＯポリペプチドは無血清の培地において２種の濃度に希釈され、細胞に加えられる。コントロールサンプルは血清の培地のみである。４日目、Cell Titer 96 Aqueous１液試薬（Progema）２０μｌがそれぞれのウェルに加えられ、発色反応が２時間進められる。ついで吸光度（ＯＤ）が４９０nmで測定される。アッセイにおける陽性はコントロールの読みの少なくとも１５％を越える吸光度の読みを与えるものである。
次のポリペプチドはこのアッセイにおいて陽性と検定された：ＰＲＯ１９１７
【０１４８】
実施例２０：線維芽細胞（ＢＨＫ−２１）の増殖（アッセイ９８）
このアッセイは本発明の任意のポリペプチドが培地における哺乳動物の線維芽細胞の増殖を誘発する働きをし、従って哺乳動物のシステムにおいて成長因子として機能することが示される。アッセイは次のように実施される。ＢＨＫ−２１線維芽細胞が、総量１００μｌでの２５００細胞/ウェルで標準成長培地に蒔かれる。ついでＰＲＯポリペプチド、β-ＦＧＦ（陽性コントロール）又は何も無いもの（ネガティブコントロール）が最終的な総量が２００μｌになるように１μｌ/ｍｌのヘパリンの存在下でウェルに加えられる。次いで細胞は３７℃で６から７日間インキュベートされる。インキュベーション後培地は取り除かれ、細胞はＰＢＳで洗浄され、酸ホスファターゼ基質反応混合物（１００μｌ/ウェル）が加えられる。次いで細胞は３７℃で２時間インキュベートされる。次いでウェルにつき１０μｌの１Ｎ ＮａＯＨが酸ホスファターゼ反応を止めるために加えられる。次にプレートがＯＤ４０５ｎｍで読まれる。アッセイにおける陽性はネガティブコントロールの少なくとも５０％を越えた酸ホスファターゼ活性である。
次のポリペプチドはこのアッセイにおいて陽性と検定された：ＰＲＯ９８２
【０１４９】
実施例２１：軟骨細胞再分化アッセイ（アッセイ１１０）
このアッセイにより本発明のあるポリペプチドが軟骨細胞の再分化を誘導する働きをし、従って、例えばスポーツ障害や関節炎のような様々な骨及び／又は軟骨の障害の治療に役立つことが期待されることが示される。アッセイは次のように実施される。ブタの軟骨細胞が４−６月齢の雌ブタの中手指節関節の関節軟骨を一晩コラゲナーゼ消化することによって単離される。ついで単離された細胞はＦＢＳを１０％とゲンタマイシンを４μｇ/ml含有するヘムＦ−１２に２５，０００細胞/cm２で蒔かれる。培地は３日ごとに替えられ、次いで細胞は血清なしの１００μｌの同培地中に、５，０００細胞/ウェルで９６ウェルに蒔かれ、１００μｌ試験ＰＲＯポリペプチド５nMのスタウロスポリン（陽性コントロール）または培地のみ（ネガティブコントロール）が最終的な総量が２００μｌ/ウェルになるように加えられる。３７℃でインキュベーションして５日後、それぞれのウェルの写真が撮られ、軟骨細胞の分化状態が決定される。アッセイにおける陽性の結果は軟骨細胞の再分化がネガティブコントロールよりも陽性のコントロールに、より類似していると決定された時である。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいて陽性と検定された：ＰＲＯ１８６３
【０１５０】
実施例２２：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯの使用
以下の方法は、ＰＲＯをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
ここに開示する全長又は成熟ＰＲＯのコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ類（ＰＲＯポリペプチドの天然発生変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯ-誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハート液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１５１】
実施例２３：大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のＰＲＯの非グリコシル化形態の調製を例示する。
ＰＲＯをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＰＲＯタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でＰＲＯを発現させてもよい。ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、30℃で振盪しながら3-5のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培養をＣＲＡＰ培地（3.57gの（ＮＨ４）２ＳＯ４、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのＫＣｌ、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並びに110mMのＭＰＯＳ、pH7.3、0.55%（w/v）のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に50-100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20-30時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培養を遠心分離して細胞をペレット化した。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
【０１５２】
0.5から1Lの発酵（6-10gペレット）からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックされた全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間遠心分離した。上清を金属キレートカラムバッファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4）の3-5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを50mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのＮａＣｌ、2.5Mの尿素、5ｍＭのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4℃で12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度0.4%（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%になるまで添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%ＴＦＡの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのＨｅｐｅｓ、pH6.8に処方した。
ここに開示した多くのＰＲＯポリペプチドが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１５３】
実施例２４：哺乳動物細胞でのＰＲＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日公開のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約10μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを約1μgのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、500μlの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMＥＤＴＡ、0.227MＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMＨＥＰＥＳ（pH7.35）、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ４を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グリセロールを30秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は200μCi/ml３５Ｓ−システイン及び200μCi/ml３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯを含む培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
またＰＲＯは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
【０１５４】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）、又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現された。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3x10−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地（0.2μm濾過ＰＳ２０、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分ける。1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x10５細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2ｘ10６細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の30mLとした。生産を通して、ｐＨは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０１５５】
ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、-80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に汲み上げた。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりＮ-末端アミノ酸配列決定した。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１５６】
実施例２５：酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１５７】
実施例２６：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を記載する。
ＰＲＯコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Novagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ又はＰＲＯコード化配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mMのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMのＭｇＣｌ２；0.1mM  ＥＤＴＡ；10%グリセロール；0.1%のＮＰ−４０；0.4MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMリン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０１５８】
実施例２７：ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ、ＰＲＯを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１５９】
実施例２８：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-ＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-ＰＲＯポリペプチドは、対象とするＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロース(商品名)（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で既知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約2-3といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。
【０１６０】
実施例２９：薬剤スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる
しかして、本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、(I)試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１６１】
実施例３０：合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬剤の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＰＲＯポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる知識を提供する。
【０１６２】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 12301 パークローン  ドライブ，ロックビル，メリーランド，米国(ATCC)に寄託した：
材料                 ATCC寄託番号     寄託日
DNA35672-2508        203538          1998年12月15日
DNA47465-1561        203661          1999年2月9日
DNA57700-1408        203583          1999年1月12日
DNA68818-2536        203657          1999年2月9日
DNA59847-2510        203576          1999年1月12日
DNA76400-2528        203573          1999年1月12日
DNA77624-2515        203553          1998年12月22日
DNA77631-2537        203651          1999年2月9日
DNA82307-2531        203537          1998年12月15日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】天然配列ＰＲＯ１８００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、配列番号：１は、ここで「ＤＮＡ３５６７２−２５０８」と命名されるクローンである。
【図２】図１に示した配列番号：１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図３】天然配列ＰＲＯ５３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６）を示し、配列番号：６は、ここで「ＤＮＡ４７４６５−１５６１」と命名されるクローンである。
【図４】図３に示した配列番号：６のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【図５】天然配列ＰＲＯ９８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８）を示し、配列番号：８は、ここで「ＤＮＡ５７７００−１４０８」と命名されるクローンである。
【図６】図５に示した配列番号：８のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。
【図７】天然配列ＰＲＯ１４３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０）を示し、配列番号：１０は、ここで「ＤＮＡ６８８１８−２５３６」と命名されるクローンである。
【図８】図７に示した配列番号：１０のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。
【図９】天然配列ＰＲＯ１８６３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）を示し、配列番号：１５は、ここで「ＤＮＡ５９８４７−２５１０」と命名されるクローンである。
【図１０】図９に示した配列番号：１５のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。
【図１１】天然配列ＰＲＯ１９１７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示し、配列番号：１７は、ここで「ＤＮＡ７６４００−２５２８」と命名されるクローンである。
【図１２】図１１に示した配列番号：１７のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【図１３】天然配列ＰＲＯ１８６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示し、配列番号：１９は、ここで「ＤＮＡ７７６２４−２５１５」と命名されるクローンである。
【図１４】図１３に示した配列番号：１９のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【図１５】天然配列ＰＲＯ３４３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１）を示し、配列番号：２１は、ここで「ＤＮＡ７７６３１−２５３７」と命名されるクローンである。
【図１６】図１５に示した配列番号：２１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【図１７】天然配列ＰＲＯ１９２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３）を示し、配列番号：２３は、ここで「ＤＮＡ８２３０７−２５３１」と命名されるクローンである。
【図１８】図１７に示した配列番号：２３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【配列表】
Sequence Listing
<110> Genentech, Inc.
<120> Secreted and Transmembrane Polypeptides and Nucleic
Acids Encoding the Same
<130> P2930R1
<140> PCT/US99/28634
<141> 1999-12-01
<150> US 60/112,851
<151> 1998-12-16
<150> US 60/113,145
<151> 1998-12-16
<150> US 60/113,511
<151> 1998-12-22
<150> US 60/115,565
<151> 1999-01-12
<150> US 60/115,558
<151> 1999-01-12
<150> US 60/115,733
<151> 1999-01-12
<150> US 60/119,341
<151> 1999-02-09
<150> US 60/119,537
<151> 1999-02-10
<150> US 60/119,965
<151> 1999-02-12
<150> PCT/US99/12252
<151> 1999-06-02
<160> 38
<210> 1
<211> 1283
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cggacgcgtg ggacccatac ttgctggtct gatccatgca caaggcgggg 50
ctgctaggcc tctgtgcccg ggcttggaat tcggtgcgga tggccagctc 100
cgggatgacc cgccgggacc cgctcgcaaa taaggtggcc ctggtaacgg 150
cctccaccga cgggatcggc ttcgccatcg cccggcgttt ggcccaggac 200
ggggcccatg tggtcgtcag cagccggaag cagcagaatg tggaccaggc 250
ggtggccacg ctgcaggggg aggggctgag cgtgacgggc accgtgtgcc 300
atgtggggaa ggcggaggac cgggagcggc tggtggccac ggctgtgaag 350
cttcatggag gtatcgatat cctagtctcc aatgctgctg tcaacccttt 400
ctttggaagc ataatggatg tcactgagga ggtgtgggac aagactctgg 450
acattaatgt gaaggcccca gccctgatga caaaggcagt ggtgccagaa 500
atggagaaac gaggaggcgg ctcagtggtg atcgtgtctt ccatagcagc 550
cttcagtcca tctcctggct tcagtcctta caatgtcagt aaaacagcct 600
tgctgggcct gaccaagacc ctggccatag agctggcccc aaggaacatt 650
agggtgaact gcctagcacc tggacttatc aagactagct tcagcaggat 700
gctctggatg gacaaggaaa aagaggaaag catgaaagaa accctgcgga 750
taagaaggtt aggcgagcca gaggattgtg ctggcatcgt gtctttcctg 800
tgctctgaag atgccagcta catcactggg gaaacagtgg tggtgggtgg 850
aggaaccccg tcccgcctct gaggaccggg agacagccca caggccagag 900
ttgggctcta gctcctggtg ctgttcctgc attcacccac tggcctttcc 950
cacctctgct caccttactg ttcacctcat caaatcagtt ctgccctgtg 1000
aaaagatcca gccttccctg ccgtcaaggt ggcgtcttac tcgggattcc 1050
tgctgttgtt gtggccttgg gtaaaggcct cccctgagaa cacaggacag 1100
gcctgctgac aaggctgagt ctaccttggc aaagaccaag atattttttc 1150
ctgggccact ggtgaatctg aggggtgatg ggagagaagg aacctggagt 1200
ggaaggagca gagttgcaaa ttaacagctt gcaaatgagg tgcaaataaa 1250
atgcagatga ttgcgcggct ttgaaaaaaa aaa 1283
<210> 2
<211> 278
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met His Lys Ala Gly Leu Leu Gly Leu Cys Ala Arg Ala Trp Asn
1               5                  10                  15
Ser Val Arg Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu
20                  25                  30
Ala Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly
35                  40                  45
Phe Ala Ile Ala Arg Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val
50                  55                  60
Val Ser Ser Arg Lys Gln Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr
65                  70                  75
Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser Val Thr Gly Thr Val Cys His Val
80                  85                  90
Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg Leu Val Ala Thr Ala Val Lys
95                 100                 105
Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val Ser Asn Ala Ala Val Asn
110                 115                 120
Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr Glu Glu Val Trp Asp
125                 130                 135
Lys Thr Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Pro Ala Leu Met Thr Lys
140                 145                 150
Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly Ser Val Val
155                 160                 165
Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly Phe Ser
170                 175                 180
Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys Thr
185                 190                 195
Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu
200                 205                 210
Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met
215                 220                 225
Asp Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg
230                 235                 240
Arg Leu Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu
245                 250                 255
Cys Ser Glu Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val
260                 265                 270
Gly Gly Gly Thr Pro Ser Arg Leu
275         278
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-21
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 3
gcataatgga tgtcactgag g 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-23
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 4
agaacaatcc tgctgaaagc tag 23
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-46
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 5
gaaacgagga ggcggctcag tggtgatcgt gtcttccata gcagcc 46
<210> 6
<211> 3121
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gcgccctgag ctccgcctcc gggcccgata gcggcatcga gagcgcctcc 50
gtcgaggacc aggcggcgca gggggccggc gggcgaaagg aggatgaggg 100
ggcgcagcag ctgctgaccc tgcagaacca ggtggcgcgg ctggaggagg 150
agaaccgaga ctttctggct gcgctggagg acgccatgga gcagtacaaa 200
ctgcagagcg accggctgcg tgagcagcag gaggagatgg tggaactgcg 250
gctgcggtta gagctggtgc ggccaggctg ggggggcctg cggctcctga 300
atggcctgcc tcccgggtcc tttgtgcctc gacctcatac agcccccctg 350
gggggtgccc acgcccatgt gctgggcatg gtgccgcctg cctgcctccc 400
tggagatgaa gttggctctg agcagagggg agagcaggtg acaaatggca 450
gggaggctgg agctgagttg ctgactgagg tgaacaggct gggaagtggc 500
tcttcagctg cttcagagga ggaagaggag gaggaggagc cgcccaggcg 550
gaccttacac ctgcgcagaa ataggatcag caactgcagt cagagggcgg 600
gggcacgccc agggagtctg ccagagagga agggcccaga gctttgcctt 650
gaggagttgg atgcagccat tccagggtcc agagcagttg gtgggagcaa 700
ggcccgagtt caggcccgcc aggtcccccc tgccacagcc tcagagtggc 750
ggctggccca ggcccagcag aagatccggg agctggctat caacatccgc 800
atgaaggagg agcttattgg cgagctggtc cgcacaggaa aggcagctca 850
ggccctgaac cgccagcaca gccagcgtat ccgggagctg gagcaggagg 900
cagagcaggt gcgggccgag ctgagtgaag gccagaggca gctgcgggag 950
ctcgagggca aggagctcca ggatgctggc gagcggtctc ggctccagga 1000
gttccgcagg agggtcgctg cggcccagag ccaggtgcag gtgctgaagg 1050
agaagaagca ggctacggag cggctggtgt cactgtcggc ccagagtgag 1100
aagcgactgc aggagctcga gcggaacgtg cagctcatgc ggcagcagca 1150
gggacagctg cagaggcggc ttcgcgagga gacggagcag aagcggcgcc 1200
tggaggcaga aatgagcaag cggcagcacc gcgtcaagga gctggagctg 1250
aagcatgagc aacagcagaa gatcctgaag attaagacgg aagagatcgc 1300
ggccttccag aggaagaggc gcagtggcag caacggctct gtggtcagcc 1350
tggaacagca gcagaagatt gaggagcaga agaagtggct ggaccaggag 1400
atggagaagg tgctacagca gcggcgggcg ctggaggagc tgggggagga 1450
gctccacaag cgggaggcca tcctggccaa gaaggaggcc ctgatgcagg 1500
agaagacggg gctggagagc aagcgcctga gatccagcca ggccctcaac 1550
gaggacatcg tgcgagtgtc cagccggctg gagcacctgg agaaggagct 1600
gtccgagaag agcgggcagc tgcggcaggg cagcgcccag agccagcagc 1650
agatccgcgg ggagatcgac agcctgcgcc aggagaagga ctcgctgctc 1700
aagcagcgcc tggagatcga cggcaagctg aggcagggga gtctgctgtc 1750
ccccgaggag gagcggacgc tgttccagtt ggatgaggcc atcgaggccc 1800
tggatgctgc cattgagtat aagaatgagg ccatcacatg ccgccagcgg 1850
gtgcttcggg cctcagcctc gttgctgtcc cagtgcgaga tgaacctcat 1900
ggccaagctc agctacctct catcctcaga gaccagagcc ctcctctgca 1950
agtattttga caaggtggtg acgctccgag aggagcagca ccagcagcag 2000
attgccttct cggaactgga gatgcagctg gaggagcagc agaggctggt 2050
gtactggctg gaggtggccc tggagcggca gcgcctggag atggaccgcc 2100
agctgaccct gcagcagaag gagcacgagc agaacatgca gctgctcctg 2150
cagcagagtc gagaccacct cggtgaaggg ttagcagaca gcaggaggca 2200
gtatgaggcc cggattcaag ctctggagaa ggaactgggc cgttacatgt 2250
ggataaacca ggaactgaaa cagaagctcg gcggtgtgaa cgctgtaggc 2300
cacagcaggg gtggggagaa gaggagcctg tgctcggagg gcagacaggc 2350
tcctggaaat gaagatgagc tccacctggc acccgagctt ctctggctgt 2400
cccccctcac tgagggggcc ccccgcaccc gggaggagac gcgggacttg 2450
gtccacgctc cgttaccctt gacctggaaa cgctcgagcc tgtgtggtga 2500
ggagcagggg tcccccgagg aactgaggca gcgggaggcg gctgagcccc 2550
tggtggggcg ggtgcttcct gtgggtgagg caggcctgcc ctggaacttt 2600
gggcctttgt ccaagccccg gcgggaactg cgacgagcca gcccggggat 2650
gattgatgtc cggaaaaacc ccctgtaagc cctcggggca gaccctgcct 2700
tggagggaga ctccgagcct gctgaaaggg gcagctgcct gttttgcttc 2750
tgtgaagggc agtccttacc gcacacccta aatccaggcc ctcatctgta 2800
ccctcactgg gatcaacaaa tttgggccat ggcccaaaag aactggaccc 2850
tcatttaaca aaataatatg caaattccca ccacttactt ccatgaagct 2900
gtggtaccca attgccgcct tgtgtcttgc tcgaatctca ggacaattct 2950
ggtttcaggc gtaaatggat gtgcttgtag ttcaggggtt tggccaagaa 3000
tcatcacgaa agggtcggtg gcaaccaggt tgtggtttaa atggtcttat 3050
gtatataggg gaaactggga gactttagga tcttaaaaaa ccatttaata 3100
aaaaaaaatc tttgaaggga c 3121
<210> 7
<211> 830
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Glu Gln Tyr Lys Leu Gln Ser Asp Arg Leu Arg Glu Gln Gln
1               5                  10                  15
Glu Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Arg Leu Glu Leu Val Arg Pro
20                  25                  30
Gly Trp Gly Gly Leu Arg Leu Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Ser
35                  40                  45
Phe Val Pro Arg Pro His Thr Ala Pro Leu Gly Gly Ala His Ala
50                  55                  60
His Val Leu Gly Met Val Pro Pro Ala Cys Leu Pro Gly Asp Glu
65                  70                  75
Val Gly Ser Glu Gln Arg Gly Glu Gln Val Thr Asn Gly Arg Glu
80                  85                  90
Ala Gly Ala Glu Leu Leu Thr Glu Val Asn Arg Leu Gly Ser Gly
95                 100                 105
Ser Ser Ala Ala Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Pro
110                 115                 120
Arg Arg Thr Leu His Leu Arg Arg Asn Arg Ile Ser Asn Cys Ser
125                 130                 135
Gln Arg Ala Gly Ala Arg Pro Gly Ser Leu Pro Glu Arg Lys Gly
140                 145                 150
Pro Glu Leu Cys Leu Glu Glu Leu Asp Ala Ala Ile Pro Gly Ser
155                 160                 165
Arg Ala Val Gly Gly Ser Lys Ala Arg Val Gln Ala Arg Gln Val
170                 175                 180
Pro Pro Ala Thr Ala Ser Glu Trp Arg Leu Ala Gln Ala Gln Gln
185                 190                 195
Lys Ile Arg Glu Leu Ala Ile Asn Ile Arg Met Lys Glu Glu Leu
200                 205                 210
Ile Gly Glu Leu Val Arg Thr Gly Lys Ala Ala Gln Ala Leu Asn
215                 220                 225
Arg Gln His Ser Gln Arg Ile Arg Glu Leu Glu Gln Glu Ala Glu
230                 235                 240
Gln Val Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gly Gln Arg Gln Leu Arg Glu
245                 250                 255
Leu Glu Gly Lys Glu Leu Gln Asp Ala Gly Glu Arg Ser Arg Leu
260                 265                 270
Gln Glu Phe Arg Arg Arg Val Ala Ala Ala Gln Ser Gln Val Gln
275                 280                 285
Val Leu Lys Glu Lys Lys Gln Ala Thr Glu Arg Leu Val Ser Leu
290                 295                 300
Ser Ala Gln Ser Glu Lys Arg Leu Gln Glu Leu Glu Arg Asn Val
305                 310                 315
Gln Leu Met Arg Gln Gln Gln Gly Gln Leu Gln Arg Arg Leu Arg
320                 325                 330
Glu Glu Thr Glu Gln Lys Arg Arg Leu Glu Ala Glu Met Ser Lys
335                 340                 345
Arg Gln His Arg Val Lys Glu Leu Glu Leu Lys His Glu Gln Gln
350                 355                 360
Gln Lys Ile Leu Lys Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ala Ala Phe Gln
365                 370                 375
Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Asn Gly Ser Val Val Ser Leu Glu
380                 385                 390
Gln Gln Gln Lys Ile Glu Glu Gln Lys Lys Trp Leu Asp Gln Glu
395                 400                 405
Met Glu Lys Val Leu Gln Gln Arg Arg Ala Leu Glu Glu Leu Gly
410                 415                 420
Glu Glu Leu His Lys Arg Glu Ala Ile Leu Ala Lys Lys Glu Ala
425                 430                 435
Leu Met Gln Glu Lys Thr Gly Leu Glu Ser Lys Arg Leu Arg Ser
440                 445                 450
Ser Gln Ala Leu Asn Glu Asp Ile Val Arg Val Ser Ser Arg Leu
455                 460                 465
Glu His Leu Glu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ser Gly Gln Leu Arg
470                 475                 480
Gln Gly Ser Ala Gln Ser Gln Gln Gln Ile Arg Gly Glu Ile Asp
485                 490                 495
Ser Leu Arg Gln Glu Lys Asp Ser Leu Leu Lys Gln Arg Leu Glu
500                 505                 510
Ile Asp Gly Lys Leu Arg Gln Gly Ser Leu Leu Ser Pro Glu Glu
515                 520                 525
Glu Arg Thr Leu Phe Gln Leu Asp Glu Ala Ile Glu Ala Leu Asp
530                 535                 540
Ala Ala Ile Glu Tyr Lys Asn Glu Ala Ile Thr Cys Arg Gln Arg
545                 550                 555
Val Leu Arg Ala Ser Ala Ser Leu Leu Ser Gln Cys Glu Met Asn
560                 565                 570
Leu Met Ala Lys Leu Ser Tyr Leu Ser Ser Ser Glu Thr Arg Ala
575                 580                 585
Leu Leu Cys Lys Tyr Phe Asp Lys Val Val Thr Leu Arg Glu Glu
590                 595                 600
Gln His Gln Gln Gln Ile Ala Phe Ser Glu Leu Glu Met Gln Leu
605                 610                 615
Glu Glu Gln Gln Arg Leu Val Tyr Trp Leu Glu Val Ala Leu Glu
620                 625                 630
Arg Gln Arg Leu Glu Met Asp Arg Gln Leu Thr Leu Gln Gln Lys
635                 640                 645
Glu His Glu Gln Asn Met Gln Leu Leu Leu Gln Gln Ser Arg Asp
650                 655                 660
His Leu Gly Glu Gly Leu Ala Asp Ser Arg Arg Gln Tyr Glu Ala
665                 670                 675
Arg Ile Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Gly Arg Tyr Met Trp Ile
680                 685                 690
Asn Gln Glu Leu Lys Gln Lys Leu Gly Gly Val Asn Ala Val Gly
695                 700                 705
His Ser Arg Gly Gly Glu Lys Arg Ser Leu Cys Ser Glu Gly Arg
710                 715                 720
Gln Ala Pro Gly Asn Glu Asp Glu Leu His Leu Ala Pro Glu Leu
725                 730                 735
Leu Trp Leu Ser Pro Leu Thr Glu Gly Ala Pro Arg Thr Arg Glu
740                 745                 750
Glu Thr Arg Asp Leu Val His Ala Pro Leu Pro Leu Thr Trp Lys
755                 760                 765
Arg Ser Ser Leu Cys Gly Glu Glu Gln Gly Ser Pro Glu Glu Leu
770                 775                 780
Arg Gln Arg Glu Ala Ala Glu Pro Leu Val Gly Arg Val Leu Pro
785                 790                 795
Val Gly Glu Ala Gly Leu Pro Trp Asn Phe Gly Pro Leu Ser Lys
800                 805                 810
Pro Arg Arg Glu Leu Arg Arg Ala Ser Pro Gly Met Ile Asp Val
815                 820                 825
Arg Lys Asn Pro Leu
830
<210> 8
<211> 662
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
attctcctag agcatctttg gaagcatgag gccacgatgc tgcatcttgg 50
ctcttgtctg ctggataaca gtcttcctcc tccagtgttc aaaaggaact 100
acagacgctc ctgttggctc aggactgtgg ctgtgccagc cgacacccag 150
gtgtgggaac aagatctaca acccttcaga gcagtgctgt tatgatgatg 200
ccatcttatc cttaaaggag acccgccgct gtggctccac ctgcaccttc 250
tggccctgct ttgagctctg ctgtcccgag tcttttggcc cccagcagaa 300
gtttcttgtg aagttgaggg ttctgggtat gaagtctcag tgtcacttat 350
ctcccatctc ccggagctgt accaggaaca ggaggcacgt cctgtaccca 400
taaaaacccc aggctccact ggcagacggc agacaagggg agaagagacg 450
aagcagctgg acatcggaga ctacagttga acttcggaga gaagcaactt 500
gacttcagag ggatggctca atgacatagc tttggagagg agcccagctg 550
gggatggcca gacttcaggg gaagaatgcc ttcctgcttc atcccctttc 600
cagctcccct tcccgctgag agccactttc atcggcaata aaatccccca 650
catttaccat ct 662
<210> 9
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Arg Pro Arg Cys Cys Ile Leu Ala Leu Val Cys Trp Ile Thr
1               5                  10                  15
Val Phe Leu Leu Gln Cys Ser Lys Gly Thr Thr Asp Ala Pro Val
20                  25                  30
Gly Ser Gly Leu Trp Leu Cys Gln Pro Thr Pro Arg Cys Gly Asn
35                  40                  45
Lys Ile Tyr Asn Pro Ser Glu Gln Cys Cys Tyr Asp Asp Ala Ile
50                  55                  60
Leu Ser Leu Lys Glu Thr Arg Arg Cys Gly Ser Thr Cys Thr Phe
65                  70                  75
Trp Pro Cys Phe Glu Leu Cys Cys Pro Glu Ser Phe Gly Pro Gln
80                  85                  90
Gln Lys Phe Leu Val Lys Leu Arg Val Leu Gly Met Lys Ser Gln
95                 100                 105
Cys His Leu Ser Pro Ile Ser Arg Ser Cys Thr Arg Asn Arg Arg
110                 115                 120
His Val Leu Tyr Pro
125
<210> 10
<211> 1942
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
cccacgcgtc cgcccacgcg tccgggtgcc actcgcgcgc cggccgcgct 50
ccgggcttct cttttccctc cgacgcgcca cggctgccca gacattccgg 100
ctgccgggtc tggagagctc cccgaacccc tccgcggaga ggagcgaggc 150
ggcgccaggg tggcccccgg ggcgcgcttg gtctcggaga agcggggacg 200
aggccggagg atgagcgact gagggcgacg cgggcactga cgcgagttgg 250
ggccgcgact accggcagct gacagcgcga tgagcgactc cccagagacg 300
ccctagcccg gtgtgcgcgc caggcggagc gcgcaggtgg ggctgggctg 350
ttagtggtcc gccccacgcg ggtcgccggc cggcccagga tgggcgctgg 400
caacccgggc ccgcgcccgc cgctgctacc cctgcgcccg ctgcgagccc 450
ggcgtccggc ccgcgccctg cgctcatgga cggcggctcc cggctggcgg 500
cggcgcgccc ccgggctgtg aatgcgactc gcccctcggc cgcgctcccc 550
gcccgcccgc ccgccgggac gtggtagggg atgcccagct ccactgcgat 600
ggcagttggc gcgctctcca gttccctcct ggtcacctgc tgcctgatgg 650
tggctctgtg cagtccgagc atcccgctgg agaagctggc ccaggcacca 700
gagcagccgg gccaggagaa gcgtgagcac gccactcggg acggcccggg 750
gcgggtgaac gagctcgggc gcccggcgag ggacgagggc ggcagcggcc 800
gggactggaa gagcaagagc ggccgtgggc tcgccggccg tgagccgtgg 850
agcaagctga agcaggcctg ggtctcccag ggcgggggcg ccaaggccgg 900
ggatctgcag gtccggcccc gcggggacac cccgcaggcg gaagccctgg 950
ccgcagccgc ccaggacgcg attggcccgg aactcgcgcc cacgcccgag 1000
ccacccgagg agtacgtgta cccggactac cgtggcaagg gctgcgtgga 1050
cgagagcggc ttcgtgtacg cgatcgggga gaagttcgcg ccgggcccct 1100
cggcctgccc gtgcctgtgc accgaggagg ggccgctgtg cgcgcagccc 1150
gagtgcccga ggctgcaccc gcgctgcatc cacgtcgaca cgagccagtg 1200
ctgcccgcag tgcaaggaga ggaagaacta ctgcgagttc cggggcaaga 1250
cctatcagac tttggaggag ttcgtggtgt ctccatgcga gaggtgtcgc 1300
tgtgaagcca acggtgaggt gctatgcaca gtgtcagcgt gtccccagac 1350
ggagtgtgtg gaccctgtgt acgagcctga tcagtgctgt cccatctgca 1400
aaaatggtcc aaactgcttt gcagaaaccg cggtgatccc tgctggcaga 1450
gaagtgaaga ctgacgagtg caccatatgc cactgtactt atgaggaagg 1500
cacatggaga atcgagcggc aggccatgtg cacgagacat gaatgcaggc 1550
aaatgtagac gcttcccaga acacaaactc tgactttttc tagaacattt 1600
tactgatgtg aacattctag atgactctgg gaactatcag tcaaagaaga 1650
cttttgatga ggaataatgg aaaattgttg gtacttttcc ttttcttgat 1700
aacagttact acaacagaag gaaatggata tatttcaaaa catcaacaag 1750
aactttgggc ataaaatcct tctctaaata aatgtgctat tttcacagta 1800
agtacacaaa agtacactat tatatatcaa atgtatttct ataatccctc 1850
cattagagag cttatataag tgttttctat agatgcagat taaaaatgct 1900
gtgttgtcaa ccgtcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1942
<210> 11
<211> 325
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Pro Ser Ser Thr Ala Met Ala Val Gly Ala Leu Ser Ser Ser
1               5                  10                  15
Leu Leu Val Thr Cys Cys Leu Met Val Ala Leu Cys Ser Pro Ser
20                  25                  30
Ile Pro Leu Glu Lys Leu Ala Gln Ala Pro Glu Gln Pro Gly Gln
35                  40                  45
Glu Lys Arg Glu His Ala Thr Arg Asp Gly Pro Gly Arg Val Asn
50                  55                  60
Glu Leu Gly Arg Pro Ala Arg Asp Glu Gly Gly Ser Gly Arg Asp
65                  70                  75
Trp Lys Ser Lys Ser Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Glu Pro Trp
80                  85                  90
Ser Lys Leu Lys Gln Ala Trp Val Ser Gln Gly Gly Gly Ala Lys
95                 100                 105
Ala Gly Asp Leu Gln Val Arg Pro Arg Gly Asp Thr Pro Gln Ala
110                 115                 120
Glu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gln Asp Ala Ile Gly Pro Glu Leu
125                 130                 135
Ala Pro Thr Pro Glu Pro Pro Glu Glu Tyr Val Tyr Pro Asp Tyr
140                 145                 150
Arg Gly Lys Gly Cys Val Asp Glu Ser Gly Phe Val Tyr Ala Ile
155                 160                 165
Gly Glu Lys Phe Ala Pro Gly Pro Ser Ala Cys Pro Cys Leu Cys
170                 175                 180
Thr Glu Glu Gly Pro Leu Cys Ala Gln Pro Glu Cys Pro Arg Leu
185                 190                 195
His Pro Arg Cys Ile His Val Asp Thr Ser Gln Cys Cys Pro Gln
200                 205                 210
Cys Lys Glu Arg Lys Asn Tyr Cys Glu Phe Arg Gly Lys Thr Tyr
215                 220                 225
Gln Thr Leu Glu Glu Phe Val Val Ser Pro Cys Glu Arg Cys Arg
230                 235                 240
Cys Glu Ala Asn Gly Glu Val Leu Cys Thr Val Ser Ala Cys Pro
245                 250                 255
Gln Thr Glu Cys Val Asp Pro Val Tyr Glu Pro Asp Gln Cys Cys
260                 265                 270
Pro Ile Cys Lys Asn Gly Pro Asn Cys Phe Ala Glu Thr Ala Val
275                 280                 285
Ile Pro Ala Gly Arg Glu Val Lys Thr Asp Glu Cys Thr Ile Cys
290                 295                 300
His Cys Thr Tyr Glu Glu Gly Thr Trp Arg Ile Glu Arg Gln Ala
305                 310                 315
Met Cys Thr Arg His Glu Cys Arg Gln Met
320                 325
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-24
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 12
gaggtgtcgc tgtgaagcca acgg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-24
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 13
cgctcgattc tccatgtgcc ttcc 24
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-45
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 14
gacggagtgt gtggaccctg tgtacgagcc tgatcagtgc tgtcc 45
<210> 15
<211> 1587
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
cagccacaga cgggtcatga gcgcggtatt actgctggcc ctcctggggt 50
tcatcctccc actgccagga gtgcaggcgc tgctctgcca gtttgggaca 100
gttcagcatg tgtggaaggt gtccgaccta ccccggcaat ggacccctaa 150
gaacaccagc tgcgacagcg gcttggggtg ccaggacacg ttgatgctca 200
ttgagagcgg accccaagtg agcctggtgc tctccaaggg ctgcacggag 250
gccaaggacc aggagccccg cgtcactgag caccggatgg gccccggcct 300
ctccctgatc tcctacacct tcgtgtgccg ccaggaggac ttctgcaaca 350
acctcgttaa ctccctcccg ctttgggccc cacagccccc agcagaccca 400
ggatccttga ggtgcccagt ctgcttgtct atggaaggct gtctggaggg 450
gacaacagaa gagatctgcc ccaaggggac cacacactgt tatgatggcc 500
tcctcaggct caggggagga ggcatcttct ccaatctgag agtccaggga 550
tgcatgcccc agccaggttg caacctgctc aatgggacac aggaaattgg 600
gcccgtgggt atgactgaga actgcaatag gaaagatttt ctgacctgtc 650
atcgggggac caccattatg acacacggaa acttggctca agaacccact 700
gattggacca catcgaatac cgagatgtgc gaggtggggc aggtgtgtca 750
ggagacgctg ctgctcatag atgtaggact cacatcaacc ctggtgggga 800
caaaaggctg cagcactgtt ggggctcaaa attcccagaa gaccaccatc 850
cactcagccc ctcctggggt gcttgtggcc tcctataccc acttctgctc 900
ctcggacctg tgcaatagtg ccagcagcag cagcgttctg ctgaactccc 950
tccctcctca agctgcccct gtcccaggag accggcagtg tcctacctgt 1000
gtgcagcccc ttggaacctg ttcaagtggc tccccccgaa tgacctgccc 1050
caggggcgcc actcattgtt atgatgggta cattcatctc tcaggaggtg 1100
ggctgtccac caaaatgagc attcagggct gcgtggccca accttccagc 1150
ttcttgttga accacaccag acaaatcggg atcttctctg cgcgtgagaa 1200
gcgtgatgtg cagcctcctg cctctcagca tgagggaggt ggggctgagg 1250
gcctggagtc tctcacttgg ggggtggggc tggcactggc cccagcgctg 1300
tggtggggag tggtttgccc ttcctgctaa ctctattacc cccacgattc 1350
ttcaccgctg ctgaccaccc acactcaacc tccctctgac ctcataacct 1400
aatggccttg gacaccagat tctttcccat tctgtccatg aatcatcttc 1450
cccacacaca atcattcata tctactcacc taacagcaac actggggaga 1500
gcctggagca tccggacttg ccctatggga gaggggacgc tggaggagtg 1550
gctgcatgta tctgataata cagaccctgt cctttca 1587
<210> 16
<211> 437
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Ser Ala Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Phe Ile Leu Pro
1               5                  10                  15
Leu Pro Gly Val Gln Ala Leu Leu Cys Gln Phe Gly Thr Val Gln
20                  25                  30
His Val Trp Lys Val Ser Asp Leu Pro Arg Gln Trp Thr Pro Lys
35                  40                  45
Asn Thr Ser Cys Asp Ser Gly Leu Gly Cys Gln Asp Thr Leu Met
50                  55                  60
Leu Ile Glu Ser Gly Pro Gln Val Ser Leu Val Leu Ser Lys Gly
65                  70                  75
Cys Thr Glu Ala Lys Asp Gln Glu Pro Arg Val Thr Glu His Arg
80                  85                  90
Met Gly Pro Gly Leu Ser Leu Ile Ser Tyr Thr Phe Val Cys Arg
95                 100                 105
Gln Glu Asp Phe Cys Asn Asn Leu Val Asn Ser Leu Pro Leu Trp
110                 115                 120
Ala Pro Gln Pro Pro Ala Asp Pro Gly Ser Leu Arg Cys Pro Val
125                 130                 135
Cys Leu Ser Met Glu Gly Cys Leu Glu Gly Thr Thr Glu Glu Ile
140                 145                 150
Cys Pro Lys Gly Thr Thr His Cys Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Leu
155                 160                 165
Arg Gly Gly Gly Ile Phe Ser Asn Leu Arg Val Gln Gly Cys Met
170                 175                 180
Pro Gln Pro Gly Cys Asn Leu Leu Asn Gly Thr Gln Glu Ile Gly
185                 190                 195
Pro Val Gly Met Thr Glu Asn Cys Asn Arg Lys Asp Phe Leu Thr
200                 205                 210
Cys His Arg Gly Thr Thr Ile Met Thr His Gly Asn Leu Ala Gln
215                 220                 225
Glu Pro Thr Asp Trp Thr Thr Ser Asn Thr Glu Met Cys Glu Val
230                 235                 240
Gly Gln Val Cys Gln Glu Thr Leu Leu Leu Ile Asp Val Gly Leu
245                 250                 255
Thr Ser Thr Leu Val Gly Thr Lys Gly Cys Ser Thr Val Gly Ala
260                 265                 270
Gln Asn Ser Gln Lys Thr Thr Ile His Ser Ala Pro Pro Gly Val
275                 280                 285
Leu Val Ala Ser Tyr Thr His Phe Cys Ser Ser Asp Leu Cys Asn
290                 295                 300
Ser Ala Ser Ser Ser Ser Val Leu Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gln
305                 310                 315
Ala Ala Pro Val Pro Gly Asp Arg Gln Cys Pro Thr Cys Val Gln
320                 325                 330
Pro Leu Gly Thr Cys Ser Ser Gly Ser Pro Arg Met Thr Cys Pro
335                 340                 345
Arg Gly Ala Thr His Cys Tyr Asp Gly Tyr Ile His Leu Ser Gly
350                 355                 360
Gly Gly Leu Ser Thr Lys Met Ser Ile Gln Gly Cys Val Ala Gln
365                 370                 375
Pro Ser Ser Phe Leu Leu Asn His Thr Arg Gln Ile Gly Ile Phe
380                 385                 390
Ser Ala Arg Glu Lys Arg Asp Val Gln Pro Pro Ala Ser Gln His
395                 400                 405
Glu Gly Gly Gly Ala Glu Gly Leu Glu Ser Leu Thr Trp Gly Val
410                 415                 420
Gly Leu Ala Leu Ala Pro Ala Leu Trp Trp Gly Val Val Cys Pro
425                 430                 435
Ser Cys
437
<210> 17
<211> 2387
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
cgacgatgct acgcgcgccc ggctgcctcc tccggacctc cgtagcgcct 50
gccgcggccc tggctgcggc gctgctctcg tcgcttgcgc gctgctctct 100
tctagagccg agggacccgg tggcctcgtc gctcagcccc tatttcggca 150
ccaagactcg ctacgaggat gtcaaccccg tgctattgtc gggccccgag 200
gctccgtggc gggaccctga gctgctggag gggacctgca ccccggtgca 250
gctggtcgcc ctcattcgcc acggcacccg ctaccccacg gtcaaacaga 300
tccgcaagct gaggcagctg cacgggttgc tgcaggcccg cgggtccagg 350
gatggcgggg ctagtagtac cggcagccgc gacctgggtg cagcgctggc 400
cgactggcct ttgtggtacg cggactggat ggacgggcag ctagtagaga 450
agggacggca ggatatgcga cagctggcgc tgcgtctggc ctcgctcttc 500
ccggcccttt tcagccgtga gaactacggc cgcctgcggc tcatcaccag 550
ttccaagcac cgctgcatgg atagcagcgc cgccttcctg caggggctgt 600
ggcagcacta ccaccctggc ttgccgccgc cggacgtcgc agatatggag 650
tttggacctc caacagttaa tgataaacta atgagatttt ttgatcactg 700
tgagaagttt ttaactgaag tagaaaaaaa tgctacagct ctttatcacg 750
tggaagcctt caaaactgga ccagaaatgc agaacatttt aaaaaaagtt 800
gcagctactt tgcaagtgcc agtaaatgat ttaaatgcag atttaattca 850
agtagccttt ttcacctgtt catttgacct ggcaattaaa ggtgttaaat 900
ctccttggtg tgatgttttt gacatagatg atgcaaaggt attagaatat 950
ttaaatgatc tgaaacaata ttggaaaaga ggatatgggt atactattaa 1000
cagtcgatcc agctgcacct tgtttcagga tatctttcag cacttggaca 1050
aagcagttga acagaaacaa aggtctcagc caatttcttc tccagtcatc 1100
ctccagtttg gtcatgcaga gactcttctt ccactgcttt ctctcatggg 1150
ctacttcaaa gacaaggaac ccctaacagc gtacaattac aaaaaacaaa 1200
tgcatcggaa gttccgaagt ggtctcattg taccttatgc ctcgaacctg 1250
atatttgtgc tttaccactg tgaaaatgct aagactccta aagaacaatt 1300
ccgagtgcag atgttattaa atgaaaaggt gttacctttg gcttactcac 1350
aagaaactgt ttcattttat gaagatctga agaaccacta caaggacatc 1400
cttcagagtt gtcaaaccag tgaagaatgt gaattagcaa gggctaacag 1450
tacatctgat gaactatgag taactgaaga acatttttaa ttctttagga 1500
atctgcaatg agtgattaca tgcttgtaat aggtaggcaa ttccttgatt 1550
acaggaagct tttatattac ttgagtattt ctgtcttttc acagaaaaac 1600
attgggtttc tctctgggtt tggacatgaa atgtaagaaa agatttttca 1650
ctggagcagc tctcttaagg agaaacaaat ctatttagag aaacagctgg 1700
ccctgcaaat gtttacagaa atgaaattct tcctacttat ataagaaatc 1750
tcacactgag atagaattgt gatttcataa taacacttga aaagtgctgg 1800
agtaacaaaa tatctcagtt ggaccatcct taacttgatt gaactgtcta 1850
ggaactttac agattgttct gcagttctct cttcttttcc tcaggtagga 1900
cagctctagc attttcttaa tcaggaatat tgtggtaagc tgggagtatc 1950
actctggaag aaagtaacat ctccagatga gaatttgaaa caagaaacag 2000
agtgttgtaa aaggacacct tcactgaagc aagtcggaaa gtacaatgaa 2050
aataaatatt tttggtattt atttatgaaa tatttgaaca ttttttcaat 2100
aattcctttt tacttctagg aagtctcaaa agaccatctt aaattattat 2150
atgtttggac aattagcaac aagtcagata gttagaatcg aagtttttca 2200
aatccattgc ttagctaact ttttcattct gtcacttggc ttcgattttt 2250
atattttcct attatatgaa atgtatcttt tggttgtttg atttttcttt 2300
ctttctttgt aaatagttct gagttctgtc aaatgccgtg aaagtatttg 2350
ctataataaa gaaaattctt gtgactttaa aaaaaaa 2387
<210> 18
<211> 487
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Leu Arg Ala Pro Gly Cys Leu Leu Arg Thr Ser Val Ala Pro
1               5                  10                  15
Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Ala Arg Cys
20                  25                  30
Ser Leu Leu Glu Pro Arg Asp Pro Val Ala Ser Ser Leu Ser Pro
35                  40                  45
Tyr Phe Gly Thr Lys Thr Arg Tyr Glu Asp Val Asn Pro Val Leu
50                  55                  60
Leu Ser Gly Pro Glu Ala Pro Trp Arg Asp Pro Glu Leu Leu Glu
65                  70                  75
Gly Thr Cys Thr Pro Val Gln Leu Val Ala Leu Ile Arg His Gly
80                  85                  90
Thr Arg Tyr Pro Thr Val Lys Gln Ile Arg Lys Leu Arg Gln Leu
95                 100                 105
His Gly Leu Leu Gln Ala Arg Gly Ser Arg Asp Gly Gly Ala Ser
110                 115                 120
Ser Thr Gly Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ala Leu Ala Asp Trp Pro
125                 130                 135
Leu Trp Tyr Ala Asp Trp Met Asp Gly Gln Leu Val Glu Lys Gly
140                 145                 150
Arg Gln Asp Met Arg Gln Leu Ala Leu Arg Leu Ala Ser Leu Phe
155                 160                 165
Pro Ala Leu Phe Ser Arg Glu Asn Tyr Gly Arg Leu Arg Leu Ile
170                 175                 180
Thr Ser Ser Lys His Arg Cys Met Asp Ser Ser Ala Ala Phe Leu
185                 190                 195
Gln Gly Leu Trp Gln His Tyr His Pro Gly Leu Pro Pro Pro Asp
200                 205                 210
Val Ala Asp Met Glu Phe Gly Pro Pro Thr Val Asn Asp Lys Leu
215                 220                 225
Met Arg Phe Phe Asp His Cys Glu Lys Phe Leu Thr Glu Val Glu
230                 235                 240
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Tyr His Val Glu Ala Phe Lys Thr Gly
245                 250                 255
Pro Glu Met Gln Asn Ile Leu Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu Gln
260                 265                 270
Val Pro Val Asn Asp Leu Asn Ala Asp Leu Ile Gln Val Ala Phe
275                 280                 285
Phe Thr Cys Ser Phe Asp Leu Ala Ile Lys Gly Val Lys Ser Pro
290                 295                 300
Trp Cys Asp Val Phe Asp Ile Asp Asp Ala Lys Val Leu Glu Tyr
305                 310                 315
Leu Asn Asp Leu Lys Gln Tyr Trp Lys Arg Gly Tyr Gly Tyr Thr
320                 325                 330
Ile Asn Ser Arg Ser Ser Cys Thr Leu Phe Gln Asp Ile Phe Gln
335                 340                 345
His Leu Asp Lys Ala Val Glu Gln Lys Gln Arg Ser Gln Pro Ile
350                 355                 360
Ser Ser Pro Val Ile Leu Gln Phe Gly His Ala Glu Thr Leu Leu
365                 370                 375
Pro Leu Leu Ser Leu Met Gly Tyr Phe Lys Asp Lys Glu Pro Leu
380                 385                 390
Thr Ala Tyr Asn Tyr Lys Lys Gln Met His Arg Lys Phe Arg Ser
395                 400                 405
Gly Leu Ile Val Pro Tyr Ala Ser Asn Leu Ile Phe Val Leu Tyr
410                 415                 420
His Cys Glu Asn Ala Lys Thr Pro Lys Glu Gln Phe Arg Val Gln
425                 430                 435
Met Leu Leu Asn Glu Lys Val Leu Pro Leu Ala Tyr Ser Gln Glu
440                 445                 450
Thr Val Ser Phe Tyr Glu Asp Leu Lys Asn His Tyr Lys Asp Ile
455                 460                 465
Leu Gln Ser Cys Gln Thr Ser Glu Glu Cys Glu Leu Ala Arg Ala
470                 475                 480
Asn Ser Thr Ser Asp Glu Leu
485     487
<210> 19
<211> 3554
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gggactacaa gccgcgccgc gctgccgctg gcccctcagc aaccctcgac 50
atggcgctga ggcggccacc gcgactccgg ctctgcgctc ggctgcctga 100
cttcttcctg ctgctgcttt tcaggggctg cctgataggg gctgtaaatc 150
tcaaatccag caatcgaacc ccagtggtac aggaatttga aagtgtggaa 200
ctgtcttgca tcattacgga ttcgcagaca agtgacccca ggatcgagtg 250
gaagaaaatt caagatgaac aaaccacata tgtgtttttt gacaacaaaa 300
ttcagggaga cttggcgggt cgtgcagaaa tactggggaa gacatccctg 350
aagatctgga atgtgacacg gagagactca gccctttatc gctgtgaggt 400
cgttgctcga aatgaccgca aggaaattga tgagattgtg atcgagttaa 450
ctgtgcaagt gaagccagtg acccctgtct gtagagtgcc gaaggctgta 500
ccagtaggca agatggcaac actgcactgc caggagagtg agggccaccc 550
ccggcctcac tacagctggt atcgcaatga tgtaccactg cccacggatt 600
ccagagccaa tcccagattt cgcaattctt ctttccactt aaactctgaa 650
acaggcactt tggtgttcac tgctgttcac aaggacgact ctgggcagta 700
ctactgcatt gcttccaatg acgcaggctc agccaggtgt gaggagcagg 750
agatggaagt ctatgacctg aacattggcg gaattattgg gggggttctg 800
gttgtccttg ctgtactggc cctgatcacg ttgggcatct gctgtgcata 850
cagacgtggc tacttcatca acaataaaca ggatggagaa agttacaaga 900
acccagggaa accagatgga gttaactaca tccgcactga cgaggagggc 950
gacttcagac acaagtcatc gtttgtgatc tgagacccgc ggtgtggctg 1000
agagcgcaca gagcgcacgt gcacatacct ctgctagaaa ctcctgtcaa 1050
ggcagcgaga gctgatgcac tcggacagag ctagacactc attcagaagc 1100
ttttcgtttt ggccaaagtt gaccactact cttcttactc taacaagcca 1150
catgaataga agaattttcc tcaagatgga cccggtaaat ataaccacaa 1200
ggaagcgaaa ctgggtgcgt tcactgagtt gggttcctaa tctgtttctg 1250
gcctgattcc cgcatgagta ttagggtgat cttaaagagt ttgctcacgt 1300
aaacgcccgt gctgggccct gtgaagccag catgttcacc actggtcgtt 1350
cagcagccac gacagcacca tgtgagatgg cgaggtggct ggacagcacc 1400
agcagcgcat cccggcggga acccagaaaa ggcttcttac acagcagcct 1450
tacttcatcg gcccacagac accaccgcag tttcttctta aaggctctgc 1500
tgatcggtgt tgcagtgtcc attgtggaga agctttttgg atcagcattt 1550
tgtaaaaaca accaaaatca ggaaggtaaa ttggttgctg gaagagggat 1600
cttgcctgag gaaccctgct tgtccaacag ggtgtcagga tttaaggaaa 1650
accttcgtct taggctaagt ctgaaatggt actgaaatat gcttttctat 1700
gggtcttgtt tattttataa aattttacat ctaaattttt gctaaggatg 1750
tattttgatt attgaaaaga aaatttctat ttaaactgta aatatattgt 1800
catacaatgt taaataacct atttttttaa aaaagttcaa cttaaggtag 1850
aagttccaag ctactagtgt taaattggaa aatatcaata attaagagta 1900
ttttacccaa ggaatcctct catggaagtt tactgtgatg ttccttttct 1950
cacacaagtt ttagcctttt tcacaaggga actcatactg tctacacatc 2000
agaccatagt tgcttaggaa acctttaaaa attccagtta agcaatgttg 2050
aaatcagttt gcatctcttc aaaagaaacc tctcaggtta gctttgaact 2100
gcctcttcct gagatgacta ggacagtctg tacccagagg ccacccagaa 2150
gccctcagat gtacatacac agatgccagt cagctcctgg ggttgcgcca 2200
ggcgcccccg ctctagctca ctgttgcctc gctgtctgcc aggaggccct 2250
gccatccttg ggccctggca gtggctgtgt cccagtgagc tttactcacg 2300
tggcccttgc ttcatccagc acagctctca ggtgggcact gcagggacac 2350
tggtgtcttc catgtagcgt cccagctttg ggctcctgta acagacctct 2400
ttttggttat ggatggctca caaaataggg cccccaatgc tatttttttt 2450
ttttaagttt gtttaattat ttgttaagat tgtctaaggc caaaggcaat 2500
tgcgaaatca agtctgtcaa gtacaataac atttttaaaa gaaaatggat 2550
cccactgttc ctctttgcca cagagaaagc acccagacgc cacaggctct 2600
gtcgcatttc aaaacaaacc atgatggagt ggcggccagt ccagcctttt 2650
aaagaacgtc aggtggagca gccaggtgaa aggcctggcg gggaggaaag 2700
tgaaacgcct gaatcaaaag cagttttcta attttgactt taaatttttc 2750
atccgccgga gacactgctc ccatttgtgg ggggacatta gcaacatcac 2800
tcagaagcct gtgttcttca agagcaggtg ttctcagcct cacatgccct 2850
gccgtgctgg actcaggact gaagtgctgt aaagcaagga gctgctgaga 2900
aggagcactc cactgtgtgc ctggagaatg gctctcacta ctcaccttgt 2950
ctttcagctt ccagtgtctt gggtttttta tactttgaca gctttttttt 3000
aattgcatac atgagactgt gttgactttt tttagttatg tgaaacactt 3050
tgccgcaggc cgcctggcag aggcaggaaa tgctccagca gtggctcagt 3100
gctccctggt gtctgctgca tggcatcctg gatgcttagc atgcaagttc 3150
cctccatcat tgccaccttg gtagagaggg atggctcccc accctcagcg 3200
ttggggattc acgctccagc ctccttcttg gttgtcatag tgatagggta 3250
gccttattgc cccctcttct tataccctaa aaccttctac actagtgcca 3300
tgggaaccag gtctgaaaaa gtagagagaa gtgaaagtag agtctgggaa 3350
gtagctgcct ataactgaga ctagacggaa aaggaatact cgtgtatttt 3400
aagatatgaa tgtgactcaa gactcgaggc cgatacgagg ctgtgattct 3450
gcctttggat ggatgttgct gtacacagat gctacagact tgtactaaca 3500
caccgtaatt tggcatttgt ttaacctcat ttataaaagc ttcaaaaaaa 3550
ccca 3554
<210> 20
<211> 310
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Ala Leu Arg Arg Pro Pro Arg Leu Arg Leu Cys Ala Arg Leu
1               5                  10                  15
Pro Asp Phe Phe Leu Leu Leu Leu Phe Arg Gly Cys Leu Ile Gly
20                  25                  30
Ala Val Asn Leu Lys Ser Ser Asn Arg Thr Pro Val Val Gln Glu
35                  40                  45
Phe Glu Ser Val Glu Leu Ser Cys Ile Ile Thr Asp Ser Gln Thr
50                  55                  60
Ser Asp Pro Arg Ile Glu Trp Lys Lys Ile Gln Asp Glu Gln Thr
65                  70                  75
Thr Tyr Val Phe Phe Asp Asn Lys Ile Gln Gly Asp Leu Ala Gly
80                  85                  90
Arg Ala Glu Ile Leu Gly Lys Thr Ser Leu Lys Ile Trp Asn Val
95                 100                 105
Thr Arg Arg Asp Ser Ala Leu Tyr Arg Cys Glu Val Val Ala Arg
110                 115                 120
Asn Asp Arg Lys Glu Ile Asp Glu Ile Val Ile Glu Leu Thr Val
125                 130                 135
Gln Val Lys Pro Val Thr Pro Val Cys Arg Val Pro Lys Ala Val
140                 145                 150
Pro Val Gly Lys Met Ala Thr Leu His Cys Gln Glu Ser Glu Gly
155                 160                 165
His Pro Arg Pro His Tyr Ser Trp Tyr Arg Asn Asp Val Pro Leu
170                 175                 180
Pro Thr Asp Ser Arg Ala Asn Pro Arg Phe Arg Asn Ser Ser Phe
185                 190                 195
His Leu Asn Ser Glu Thr Gly Thr Leu Val Phe Thr Ala Val His
200                 205                 210
Lys Asp Asp Ser Gly Gln Tyr Tyr Cys Ile Ala Ser Asn Asp Ala
215                 220                 225
Gly Ser Ala Arg Cys Glu Glu Gln Glu Met Glu Val Tyr Asp Leu
230                 235                 240
Asn Ile Gly Gly Ile Ile Gly Gly Val Leu Val Val Leu Ala Val
245                 250                 255
Leu Ala Leu Ile Thr Leu Gly Ile Cys Cys Ala Tyr Arg Arg Gly
260                 265                 270
Tyr Phe Ile Asn Asn Lys Gln Asp Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Pro
275                 280                 285
Gly Lys Pro Asp Gly Val Asn Tyr Ile Arg Thr Asp Glu Glu Gly
290                 295                 300
Asp Phe Arg His Lys Ser Ser Phe Val Ile
305                 310
<210> 21
<211> 3437
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
caggaccagg tcttcctacg ctggagcagc ggggagacag ccaccatgca 50
catcctcgtg gtccatgcca tggtgatcct gctgacgctg ggcccgcctc 100
gagccgacga cagcgagttc caggcgctgc tggacatctg gtttccggag 150
gagaagccac tgcccaccgc cttcctggtg gacacatcgg aggaggcgct 200
gctgcttcct gactggctga agctgcgcat gatccgttct gaggtgctcc 250
gcctggtgga cgccgccctg caggacctgg agccgcagca gctgctgctg 300
ttcgtgcagt cgtttggcat ccccgtgtcc agcatgagca aactcctcca 350
gttcctggac caggcagtgg cccacgaccc ccagactctg gagcagaaca 400
tcatggacaa gaattacatg gcccacctgg tggaggtcca gcatgagcgc 450
ggcgcctccg gaggccagac tttccactcc ttgctcacag cctccctgcc 500
gccccgccga gacagcacag aggcacccaa accaaagagc agcccagagc 550
agcccatagg ccagggccgg attcgggtgg ggacccagct ccgggtgctg 600
ggccctgagg acgacctggc tggcatgttc ctccagattt tcccgctcag 650
cccggaccct cggtggcaga gctccagtcc ccgccccgtg gccctcgccc 700
tgcagcaggc cctgggccag gagctggccc gcgtcgtcca gggcagcccc 750
gaggtgccgg gcatcacggt gcgtgtcctg caggccctcg ccaccctgct 800
cagctcccca cacggcggtg ccctggtgat gtccatgcac cgtagccact 850
tcctggcctg cccgctgctg cgccagctct gccagtacca gcgctgtgtg 900
ccacaggaca ccggcttctc ctcgctcttc ctgaaggtgc tcctgcagat 950
gctgcagtgg ctggacagcc ctggcgtgga gggcgggccc ctgcgggcac 1000
agctcaggat gcttgccagc caggcctcag ccgggcgcag gctcagtgat 1050
gtgcgagggg ggctcctgcg cctggccgag gccctggcct tccgtcagga 1100
cctggaggtg gtcagctcca ccgtccgtgc cgtcatcgcc accctgaggt 1150
ctggggagca gtgcagcgtg gagccggacc tgatcagcaa agtcctccag 1200
gggctgatcg aggtgaggtc cccccacctg gaggagctgc tgactgcatt 1250
cttctctgcc actgcggatg ctgcctcccc gtttccagcc tgtaagcccg 1300
ttgtggtggt gagctccctg ctgctgcagg aggaggagcc cctggctggg 1350
gggaagccgg gtgcggacgg tggcagcctg gaggccgtgc ggctggggcc 1400
ctcgtcaggc ctcctagtgg actggctgga aatgctggac cccgaggtgg 1450
tcagcagctg ccccgacctg cagctcaggc tgctcttctc ccggaggaag 1500
ggcaaaggtc aggcccaggt gccctcgttc cgtccctacc tcctgaccct 1550
cttcacgcat cagtccagct ggcccacact gcaccagtgc atccgagtcc 1600
tgctgggcaa gagccgggaa cagaggttcg acccctctgc ctctctggac 1650
ttcctctggg cctgcatcca tgttcctcgc atctggcagg ggcgggacca 1700
gcgcaccccg cagaagcggc gggaggagct ggtgctgcgg gtccagggcc 1750
cggagctcat cagcctggtg gagctgatcc tggccgaggc ggagacgcgg 1800
agccaggacg gggacacagc cgcctgcagc ctcatccagg cccggctgcc 1850
cctgctgctc agctgctgct gtggggacga tgagagtgtc aggaaggtga 1900
cggagcacct gtcaggctgc atccagcagt ggggagacag cgtgctggga 1950
aggcgctgcc gagaccttct cctgcagctc tacctacagc ggccggagct 2000
gcgggtgccc gtgcctgagg tcctactgca cagcgaaggg gctgccagca 2050
gcagcgtctg caagctggac ggactcatcc accgcttcat cacgctcctt 2100
gcggacacca gcgactcccg ggcgttggag aaccgagggg cggatgccag 2150
catggcctgc cggaagctgg cggtggcgca cccgctgctg ctgctcaggc 2200
acctgcccat gatcgcggcg ctcctgcacg gccgcaccca cctcaacttc 2250
caggagttcc ggcagcagaa ccacctgagc tgcttcctgc acgtgctggg 2300
cctgctggag ctgctgcagc cgcacgtgtt ccgcagcgag caccaggggg 2350
cgctgtggga ctgccttctg tccttcatcc gcctgctgct gaattacagg 2400
aagtcctccc gccatctggc tgccttcatc aacaagtttg tgcagttcat 2450
ccataagtac attacctaca atgccccagc agccatctcc ttcctgcaga 2500
agcacgccga cccgctccac gacctgtcct tcgacaacag tgacctggtg 2550
atgctgaaat ccctccttgc agggctcagc ctgcccagca gggacgacag 2600
gaccgaccga ggcctggacg aagagggcga ggaggagagc tcagccggct 2650
ccttgcccct ggtcagcgtc tccctgttca cccctctgac cgcggccgag 2700
atggccccct acatgaaacg gctttcccgg ggccaaacgg tggaggatct 2750
gctggaggtt ctgagtgaca tagacgagat gtcccggcgg agacccgaga 2800
tcctgagctt cttctcgacc aacctgcagc ggctgatgag ctcggccgag 2850
gagtgttgcc gcaacctcgc cttcagcctg gccctgcgct ccatgcagaa 2900
cagccccagc attgcagccg ctttcctgcc cacgttcatg tactgcctgg 2950
gcagccagga ctttgaggtg gtgcagacgg ccctccggaa cctgcctgag 3000
tacgctctcc tgtgccaaga gcacgcggct gtgctgctcc accgggcctt 3050
cctggtgggc atgtacggcc agatggaccc cagcgcgcag atctccgagg 3100
ccctgaggat cctgcatatg gaggccgtga tgtgagcctg tggcagccga 3150
cccccctcca agccccggcc cgtcccgtcc ccggggatcc tcgaggcaaa 3200
gcccaggaag cgtgggcgtt gctggtctgt ccgaggaggt gagggcgccg 3250
agccctgagg ccaggcaggc ccaggagcaa tactccgagc cctggggtgg 3300
ctccgggccg gccgctggca tcaggggccg tccagcaagc cctcattcac 3350
cttctgggcc acagccctgc cgcggagcgg cggatccccc cgggcatggc 3400
ctgggctggt tttgaatgaa acgacctgaa ctgtcaa 3437
<210> 22
<211> 1029
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met His Ile Leu Val Val His Ala Met Val Ile Leu Leu Thr Leu
1               5                  10                  15
Gly Pro Pro Arg Ala Asp Asp Ser Glu Phe Gln Ala Leu Leu Asp
20                  25                  30
Ile Trp Phe Pro Glu Glu Lys Pro Leu Pro Thr Ala Phe Leu Val
35                  40                  45
Asp Thr Ser Glu Glu Ala Leu Leu Leu Pro Asp Trp Leu Lys Leu
50                  55                  60
Arg Met Ile Arg Ser Glu Val Leu Arg Leu Val Asp Ala Ala Leu
65                  70                  75
Gln Asp Leu Glu Pro Gln Gln Leu Leu Leu Phe Val Gln Ser Phe
80                  85                  90
Gly Ile Pro Val Ser Ser Met Ser Lys Leu Leu Gln Phe Leu Asp
95                 100                 105
Gln Ala Val Ala His Asp Pro Gln Thr Leu Glu Gln Asn Ile Met
110                 115                 120
Asp Lys Asn Tyr Met Ala His Leu Val Glu Val Gln His Glu Arg
125                 130                 135
Gly Ala Ser Gly Gly Gln Thr Phe His Ser Leu Leu Thr Ala Ser
140                 145                 150
Leu Pro Pro Arg Arg Asp Ser Thr Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ser
155                 160                 165
Ser Pro Glu Gln Pro Ile Gly Gln Gly Arg Ile Arg Val Gly Thr
170                 175                 180
Gln Leu Arg Val Leu Gly Pro Glu Asp Asp Leu Ala Gly Met Phe
185                 190                 195
Leu Gln Ile Phe Pro Leu Ser Pro Asp Pro Arg Trp Gln Ser Ser
200                 205                 210
Ser Pro Arg Pro Val Ala Leu Ala Leu Gln Gln Ala Leu Gly Gln
215                 220                 225
Glu Leu Ala Arg Val Val Gln Gly Ser Pro Glu Val Pro Gly Ile
230                 235                 240
Thr Val Arg Val Leu Gln Ala Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ser Pro
245                 250                 255
His Gly Gly Ala Leu Val Met Ser Met His Arg Ser His Phe Leu
260                 265                 270
Ala Cys Pro Leu Leu Arg Gln Leu Cys Gln Tyr Gln Arg Cys Val
275                 280                 285
Pro Gln Asp Thr Gly Phe Ser Ser Leu Phe Leu Lys Val Leu Leu
290                 295                 300
Gln Met Leu Gln Trp Leu Asp Ser Pro Gly Val Glu Gly Gly Pro
305                 310                 315
Leu Arg Ala Gln Leu Arg Met Leu Ala Ser Gln Ala Ser Ala Gly
320                 325                 330
Arg Arg Leu Ser Asp Val Arg Gly Gly Leu Leu Arg Leu Ala Glu
335                 340                 345
Ala Leu Ala Phe Arg Gln Asp Leu Glu Val Val Ser Ser Thr Val
350                 355                 360
Arg Ala Val Ile Ala Thr Leu Arg Ser Gly Glu Gln Cys Ser Val
365                 370                 375
Glu Pro Asp Leu Ile Ser Lys Val Leu Gln Gly Leu Ile Glu Val
380                 385                 390
Arg Ser Pro His Leu Glu Glu Leu Leu Thr Ala Phe Phe Ser Ala
395                 400                 405
Thr Ala Asp Ala Ala Ser Pro Phe Pro Ala Cys Lys Pro Val Val
410                 415                 420
Val Val Ser Ser Leu Leu Leu Gln Glu Glu Glu Pro Leu Ala Gly
425                 430                 435
Gly Lys Pro Gly Ala Asp Gly Gly Ser Leu Glu Ala Val Arg Leu
440                 445                 450
Gly Pro Ser Ser Gly Leu Leu Val Asp Trp Leu Glu Met Leu Asp
455                 460                 465
Pro Glu Val Val Ser Ser Cys Pro Asp Leu Gln Leu Arg Leu Leu
470                 475                 480
Phe Ser Arg Arg Lys Gly Lys Gly Gln Ala Gln Val Pro Ser Phe
485                 490                 495
Arg Pro Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Thr His Gln Ser Ser Trp Pro
500                 505                 510
Thr Leu His Gln Cys Ile Arg Val Leu Leu Gly Lys Ser Arg Glu
515                 520                 525
Gln Arg Phe Asp Pro Ser Ala Ser Leu Asp Phe Leu Trp Ala Cys
530                 535                 540
Ile His Val Pro Arg Ile Trp Gln Gly Arg Asp Gln Arg Thr Pro
545                 550                 555
Gln Lys Arg Arg Glu Glu Leu Val Leu Arg Val Gln Gly Pro Glu
560                 565                 570
Leu Ile Ser Leu Val Glu Leu Ile Leu Ala Glu Ala Glu Thr Arg
575                 580                 585
Ser Gln Asp Gly Asp Thr Ala Ala Cys Ser Leu Ile Gln Ala Arg
590                 595                 600
Leu Pro Leu Leu Leu Ser Cys Cys Cys Gly Asp Asp Glu Ser Val
605                 610                 615
Arg Lys Val Thr Glu His Leu Ser Gly Cys Ile Gln Gln Trp Gly
620                 625                 630
Asp Ser Val Leu Gly Arg Arg Cys Arg Asp Leu Leu Leu Gln Leu
635                 640                 645
Tyr Leu Gln Arg Pro Glu Leu Arg Val Pro Val Pro Glu Val Leu
650                 655                 660
Leu His Ser Glu Gly Ala Ala Ser Ser Ser Val Cys Lys Leu Asp
665                 670                 675
Gly Leu Ile His Arg Phe Ile Thr Leu Leu Ala Asp Thr Ser Asp
680                 685                 690
Ser Arg Ala Leu Glu Asn Arg Gly Ala Asp Ala Ser Met Ala Cys
695                 700                 705
Arg Lys Leu Ala Val Ala His Pro Leu Leu Leu Leu Arg His Leu
710                 715                 720
Pro Met Ile Ala Ala Leu Leu His Gly Arg Thr His Leu Asn Phe
725                 730                 735
Gln Glu Phe Arg Gln Gln Asn His Leu Ser Cys Phe Leu His Val
740                 745                 750
Leu Gly Leu Leu Glu Leu Leu Gln Pro His Val Phe Arg Ser Glu
755                 760                 765
His Gln Gly Ala Leu Trp Asp Cys Leu Leu Ser Phe Ile Arg Leu
770                 775                 780
Leu Leu Asn Tyr Arg Lys Ser Ser Arg His Leu Ala Ala Phe Ile
785                 790                 795
Asn Lys Phe Val Gln Phe Ile His Lys Tyr Ile Thr Tyr Asn Ala
800                 805                 810
Pro Ala Ala Ile Ser Phe Leu Gln Lys His Ala Asp Pro Leu His
815                 820                 825
Asp Leu Ser Phe Asp Asn Ser Asp Leu Val Met Leu Lys Ser Leu
830                 835                 840
Leu Ala Gly Leu Ser Leu Pro Ser Arg Asp Asp Arg Thr Asp Arg
845                 850                 855
Gly Leu Asp Glu Glu Gly Glu Glu Glu Ser Ser Ala Gly Ser Leu
860                 865                 870
Pro Leu Val Ser Val Ser Leu Phe Thr Pro Leu Thr Ala Ala Glu
875                 880                 885
Met Ala Pro Tyr Met Lys Arg Leu Ser Arg Gly Gln Thr Val Glu
890                 895                 900
Asp Leu Leu Glu Val Leu Ser Asp Ile Asp Glu Met Ser Arg Arg
905                 910                 915
Arg Pro Glu Ile Leu Ser Phe Phe Ser Thr Asn Leu Gln Arg Leu
920                 925                 930
Met Ser Ser Ala Glu Glu Cys Cys Arg Asn Leu Ala Phe Ser Leu
935                 940                 945
Ala Leu Arg Ser Met Gln Asn Ser Pro Ser Ile Ala Ala Ala Phe
950                 955                 960
Leu Pro Thr Phe Met Tyr Cys Leu Gly Ser Gln Asp Phe Glu Val
965                 970                 975
Val Gln Thr Ala Leu Arg Asn Leu Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Cys
980                 985                 990
Gln Glu His Ala Ala Val Leu Leu His Arg Ala Phe Leu Val Gly
995                1000                1005
Met Tyr Gly Gln Met Asp Pro Ser Ala Gln Ile Ser Glu Ala Leu
1010                1015                1020
Arg Ile Leu His Met Glu Ala Val Met
1025            1029
<210> 23
<211> 2186
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
ccgggccatg cagcctcggc cccgcgggcg cccgccgcgc acccgaggag 50
atgaggctcc gcaatggcac cttcctgacg ctgctgctct tctgcctgtg 100
cgccttcctc tcgctgtcct ggtacgcggc actcagcggc cagaaaggcg 150
acgttgtgga cgtttaccag cgggagttcc tggcgctgcg cgatcggttg 200
cacgcagctg agcaggagag cctcaagcgc tccaaggagc tcaacctggt 250
gctggacgag atcaagaggg ccgtgtcaga aaggcaggcg ctgcgagacg 300
gagacggcaa tcgcacctgg ggccgcctaa cagaggaccc ccgattgaag 350
ccgtggaacg gctcacaccg gcacgtgctg cacctgccca ccgtcttcca 400
tcacctgcca cacctgctgg ccaaggagag cagtctgcag cccgcggtgc 450
gcgtgggcca gggccgcacc ggagtgtcgg tggtgatggg catcccgagc 500
gtgcggcgcg aggtgcactc gtacctgact gacactctgc actcgctcat 550
ctccgagctg agcccgcagg agaaggagga ctcggtcatc gtggtgctga 600
tcgccgagac tgactcacag tacacttcgg cagtgacaga gaacatcaag 650
gccttgttcc ccacggagat ccattctggg ctcctggagg tcatctcacc 700
ctccccccac ttctaccctg acttctcccg cctccgagag tcctttgggg 750
accccaagga gagagtcagg tggaggacca aacagaacct cgattactgc 800
ttcctcatga tgtacgcgca gtccaaaggc atctactacg tgcagctgga 850
ggatgacatc gtggccaagc ccaactacct gagcaccatg aagaactttg 900
cactgcagca gccttcagag gactggatga tcctggagtt ctcccagctg 950
ggcttcattg gtaagatgtt caagtcgctg gacctgagcc tgattgtaga 1000
gttcattctc atgttctacc gggacaagcc catcgactgg ctcctggacc 1050
atattctgtg ggtgaaagtc tgcaaccccg agaaggatgc gaagcactgt 1100
gaccggcaga aagccaacct gcggatccgc ttcaaaccgt ccctcttcca 1150
gcacgtgggc actcactcct cgctggctgg caagatccag aaactgaagg 1200
acaaagactt tggaaagcag gcgctgcgga aggagcatgt gaacccgcca 1250
gcagaggtga gcacgagcct gaagacatac cagcacttca ccctggagaa 1300
agcctacctg cgcgaggact tcttctgggc cttcacccct gccgcggggg 1350
acttcatccg cttccgcttc ttccaacctc taagactgga gcggttcttc 1400
ttccgcagtg ggaacatcga gcacccggag gacaagctct tcaacacgtc 1450
tgtggaggtg ctgcccttcg acaaccctca gtcagacaag gaggccctgc 1500
aggagggccg caccgccacc ctccggtacc ctcggagccc cgacggctac 1550
ctccagatcg gctccttcta caagggagtg gcagagggag aggtggaccc 1600
agccttcggc cctctggaag cactgcgcct ctcgatccag acggactccc 1650
ctgtgtgggt gattctgagc gagatcttcc tgaaaaaggc cgactaagct 1700
gcgggcttct gagggtaccc tgtggccagc cctgaagccc acatttctgg 1750
gggtgtcgtc actgccgtcc ccggagggcc agatacggcc ccgcccaaag 1800
ggttctgcct ggcgtcgggc ttgggccggc ctggggtccg ccgctggccc 1850
ggaggcccta ggagctggtg ctgcccccgc ccgccgggcc gcggaggagg 1900
caggcggccc ccacactgtg cctgaggccc ggaaccgttc gcacccggcc 1950
tgccccagtc aggccgtttt agaagagctt ttacttgggc gcccgccgtc 2000
tctggcgcga acactggaat gcatatacta ctttatgtgc tgtgtttttt 2050
attcttggat acatttgatt ttttcacgta agtccacata tacttctata 2100
agagcgtgac ttgtaataaa gggttaatga agaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2150
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2186
<210> 24
<211> 548
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Arg Leu Arg Asn Gly Thr Phe Leu Thr Leu Leu Leu Phe Cys
1               5                  10                  15
Leu Cys Ala Phe Leu Ser Leu Ser Trp Tyr Ala Ala Leu Ser Gly
20                  25                  30
Gln Lys Gly Asp Val Val Asp Val Tyr Gln Arg Glu Phe Leu Ala
35                  40                  45
Leu Arg Asp Arg Leu His Ala Ala Glu Gln Glu Ser Leu Lys Arg
50                  55                  60
Ser Lys Glu Leu Asn Leu Val Leu Asp Glu Ile Lys Arg Ala Val
65                  70                  75
Ser Glu Arg Gln Ala Leu Arg Asp Gly Asp Gly Asn Arg Thr Trp
80                  85                  90
Gly Arg Leu Thr Glu Asp Pro Arg Leu Lys Pro Trp Asn Gly Ser
95                 100                 105
His Arg His Val Leu His Leu Pro Thr Val Phe His His Leu Pro
110                 115                 120
His Leu Leu Ala Lys Glu Ser Ser Leu Gln Pro Ala Val Arg Val
125                 130                 135
Gly Gln Gly Arg Thr Gly Val Ser Val Val Met Gly Ile Pro Ser
140                 145                 150
Val Arg Arg Glu Val His Ser Tyr Leu Thr Asp Thr Leu His Ser
155                 160                 165
Leu Ile Ser Glu Leu Ser Pro Gln Glu Lys Glu Asp Ser Val Ile
170                 175                 180
Val Val Leu Ile Ala Glu Thr Asp Ser Gln Tyr Thr Ser Ala Val
185                 190                 195
Thr Glu Asn Ile Lys Ala Leu Phe Pro Thr Glu Ile His Ser Gly
200                 205                 210
Leu Leu Glu Val Ile Ser Pro Ser Pro His Phe Tyr Pro Asp Phe
215                 220                 225
Ser Arg Leu Arg Glu Ser Phe Gly Asp Pro Lys Glu Arg Val Arg
230                 235                 240
Trp Arg Thr Lys Gln Asn Leu Asp Tyr Cys Phe Leu Met Met Tyr
245                 250                 255
Ala Gln Ser Lys Gly Ile Tyr Tyr Val Gln Leu Glu Asp Asp Ile
260                 265                 270
Val Ala Lys Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Met Lys Asn Phe Ala Leu
275                 280                 285
Gln Gln Pro Ser Glu Asp Trp Met Ile Leu Glu Phe Ser Gln Leu
290                 295                 300
Gly Phe Ile Gly Lys Met Phe Lys Ser Leu Asp Leu Ser Leu Ile
305                 310                 315
Val Glu Phe Ile Leu Met Phe Tyr Arg Asp Lys Pro Ile Asp Trp
320                 325                 330
Leu Leu Asp His Ile Leu Trp Val Lys Val Cys Asn Pro Glu Lys
335                 340                 345
Asp Ala Lys His Cys Asp Arg Gln Lys Ala Asn Leu Arg Ile Arg
350                 355                 360
Phe Lys Pro Ser Leu Phe Gln His Val Gly Thr His Ser Ser Leu
365                 370                 375
Ala Gly Lys Ile Gln Lys Leu Lys Asp Lys Asp Phe Gly Lys Gln
380                 385                 390
Ala Leu Arg Lys Glu His Val Asn Pro Pro Ala Glu Val Ser Thr
395                 400                 405
Ser Leu Lys Thr Tyr Gln His Phe Thr Leu Glu Lys Ala Tyr Leu
410                 415                 420
Arg Glu Asp Phe Phe Trp Ala Phe Thr Pro Ala Ala Gly Asp Phe
425                 430                 435
Ile Arg Phe Arg Phe Phe Gln Pro Leu Arg Leu Glu Arg Phe Phe
440                 445                 450
Phe Arg Ser Gly Asn Ile Glu His Pro Glu Asp Lys Leu Phe Asn
455                 460                 465
Thr Ser Val Glu Val Leu Pro Phe Asp Asn Pro Gln Ser Asp Lys
470                 475                 480
Glu Ala Leu Gln Glu Gly Arg Thr Ala Thr Leu Arg Tyr Pro Arg
485                 490                 495
Ser Pro Asp Gly Tyr Leu Gln Ile Gly Ser Phe Tyr Lys Gly Val
500                 505                 510
Ala Glu Gly Glu Val Asp Pro Ala Phe Gly Pro Leu Glu Ala Leu
515                 520                 525
Arg Leu Ser Ile Gln Thr Asp Ser Pro Val Trp Val Ile Leu Ser
530                 535                 540
Glu Ile Phe Leu Lys Lys Ala Asp
545         548
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-43
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 25
tgtaaaacga cggccagtta aatagacctg caattattaa tct 43
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-41
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 26
caggaaacag ctatgaccac ctgcacacct gcaaatccat t 41
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 27
actcgggatt cctgctgtt 19
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-19
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<400> 29
ggcctgtcct gtgttctca 19
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<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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tcccaccact tacttccatg aa 22
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<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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ctgtggtacc caattgccgc cttgt 25
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-23
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attgtcctga gattcgagca aga 23
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
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gtccagcaag ccctcatt 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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cttctgggcc acagccctgc 20
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<220>
<221> Artificial Sequence
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cagttcaggt cgtttcattc a 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> 1-19
<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 36
ccagtcaggc cgttttaga 19
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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cgggcgccca agtaaaagct c 21
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<213> Artificial
<220>
<221> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide Probe
<400> 38
cataaagtag tatatgcatt ccagtgtt 28