【手続補正書】
【提出日】平成16年1月6日(2004.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のインヒビターであって、該タンパク質は、ガストロカインと呼ばれる、単離された相同な細胞増殖刺激タンパク質の群から選択され、該タンパク質は、胃上皮細胞によって産生され、そして以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２５）およびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２６）
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該インヒビターは、ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫ（配列番号１４）およびＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫ（配列番号１５）からなるアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択される、インヒビター。
【請求項２】
胃腸障害の処置に使用される薬学的組成物であって、該組成物が、ガストロカインタンパク質由来の増殖刺激ペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項３】
前記ガストロカインタンパク質が、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２５）およびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２６）
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１１）、ＬＤＡＬＶＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１２）、およびＬＤＡＬＶＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹ（配列番号１３）からなる群より選択される増殖刺激ペプチドを含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
胃上皮の過剰増殖に関連する疾患を処置するための薬学的組成物であって、該組成物が、請求項１に記載のインヒビターを含む、薬学的組成物。
【請求項６】
前記疾患が、結腸および小腸の疾患であり、該疾患が、潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群より選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
ヒトタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子であって、該タンパク質が図２に示されるアミノ酸配列を有する、単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項８】
マウス由来のＤＮＡ中に見出されるゲノム配列を含む単離されたＤＮＡ分子であって、ヌクレオチド配列が図４に示される、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項９】
マウスゲノムのヌクレオチド配列中に、標的化された欠失を有するマウスであって、該ヌクレオチド配列は、該欠失無しに発現された場合、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２５）およびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２６）
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含むガストロカインタンパク質群のタンパク質をコードするマウス。
【請求項１０】
ガストロカインタンパク質由来のペプチドまたはタンパク質を作製するための方法であって、該ガストロカインタンパク質は、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２５）およびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２６）
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該方法は、以下：
（ａ）該タンパク質またはペプチドをコードする配列を含む、単離されたｃＤＮＡ分子を得る工程；
（ｂ）組み換えＤＮＡ発現ベクター中に該分子を配置する工程；
（ｃ）該組換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程；
（ｄ）トランスフェクトされた宿主細胞が、該ｃＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質を産生するのを可能にする環境条件を提供する工程；および
（ｅ）該宿主細胞から該タンパク質を精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
ガストロカインタンパク質由来のタンパク質の細胞増殖刺激活性を阻害する方法であって、該ガストロカインタンパク質は、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２５）およびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２６）
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該方法は、以下：
（ａ）該タンパク質をインヒビターと接触させる工程；および
（ｂ）該タンパク質の細胞増殖刺激活性に適切な環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記インヒビターが、前記タンパク質の少なくとも１つのエピトープに対する抗体であり、該エピトープは、図３の推定アミノ酸配列の７８位から１１９位までのアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インヒビターが、ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫ（配列番号１４）およびＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫ（配列番号１５）からなるインヒビターペプチドの群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物の胃腸管上皮に対する、ガストロカインタンパク質の異なるレベルの発現の影響を試験する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項９に記載のマウスを得る工程；
（ｂ）該マウスにおける該タンパク質の欠如の影響を決定する工程；
（ｃ）該マウスに漸増レベルのタンパク質を投与する工程；および
（ｄ）該胃腸管上皮の変化を、該上皮中の該タンパク質のレベルと関連付ける工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
哺乳動物の胃腸管への損傷後に上皮細胞の遊走を刺激する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該上皮細胞を、ガストロカインタンパク質由来のタンパク質、または該タンパク質由来のペプチドを含む組成物と接触させる工程；および
（ｂ）該上皮細胞の遊走を可能にする環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
哺乳動物の胃腸管の損傷した上皮細胞の細胞保護のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該損傷した上皮細胞を、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）、
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２５）および
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号２６）
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含むガストロカインタンパク質を含む組成物と接触させる工程；および
（ｂ）該上皮細胞の修復を可能にする環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記損傷した細胞が潰瘍である、請求項１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は、ガストロカインと呼ばれる単離された相同的細胞増殖刺激タンパク質のグループに関連し、それは胃上皮細胞によって産生され、そしてコンセンサスアミノ酸配列ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ（配列番号１０）を含む。ここでＸＸはＬＱまたは空白（結果として、各々、配列番号２５および配列番号２６を生じる）であり得る。そのグループの単離されたタンパク質は、図７に示したようなアミノ酸配列を有する。シグナルペプチド配列を構成する２０アミノ酸を欠く、処理された形式でブタ胃上皮に存在するタンパク質は、１６５アミノ酸およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された約１８ｋＤの推定分子量を有する。シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）を通過した後に切断される。そのタンパク質は分泌され得る。図３に示したアミノ酸配列は、ヒトｃＤＮＡ配列から導かれた。そのタンパク質の１つの実施態様を、マウスＲＮＡおよびＤＮＡから予測される配列である、図６のアミノ酸配列で示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
単離された生物活性ペプチドの１つの実施態様は、以下の配列のうち１つを有する：ＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１１）、ＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ（配列番号１２）、またはＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹ（配列番号１３）。ガストロカイングループのタンパク質のインヒビターの１つの実施態様は、アミノ酸配列ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫ（配列番号１４）またはＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫ（配列番号１５）を有する（表１も参照のこと）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
（７．Ｅ．ｃｏｌｉにおける活性組換えヒトＡＭＰ−１８の調製）
２０アミノ酸の疎水性シグナルペプチド配列を、６ヒスチジン残基のスターチ（ｓｔａｒｃｈ）を含むＮ−末端１２アミノ酸ペプチドで置換した、ヒトＡＭＰ−１８をコードするｃＤＮＡを設計した（図１３、左のパネル）。この改変ｃＤＮＡ配列の発現は、Ｈｉｓ−６タグ（配列番号１６）に結合するＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて容易に精製し得る１７７アミノ酸タンパク質産物（Ｍｒ１９，６５３）を産生することが予測された。Ｎ−末端シグナルペプチドをコードする領域を欠くｃＤＮＡ配列（図１４を参照のこと）を、ＱＥ３０発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）のＢａｍＨＩ部位へ産物を挿入する適当なリンカーを提供するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって増幅した；組換えベクターの配列を確認した。Ｈｉｓ−６タグ（配列番号１６）で操作した組換えヒト（ｒｈ）ＡＭＰ−１８を、続いてＥ．ｃｏｌｉ細胞で発現した。それを回収するために、細菌を溶解し、そして可溶性および不溶性画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後ｒｈＡＭＰ−１８前駆体に対する特異的ウサギ抗血清を用いてイムノブロットを行なった。発現したタンパク質は、溶解物の可溶性画分にはほとんど検出されなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
尿素（６Ｍ）を採用して、不溶性画分からタンパク質を放出し、Ｈｉｓ６−タグ（配列番号１６）を含むｒｈＡＭＰ−１８を可溶化し、そしてＮｉ２＋荷電樹脂への結合に利用可能にして、続いてそれからイミダゾールの勾配（０〜２００ｍＭ）で溶出した。溶出されたｒｈＡＭＰ−１８の量を、ＢＣＡアッセイを用いて測定し、そして予測された１９−２０ｋＤａの大きさにおける単一バンドの出現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてイムノブロッティングによって確認した。溶出されたｒｈＡＭＰ−１８が復元して分裂促進性の構造をとるかどうか決定するために、溶出物のアリコートを（透析によって尿素およびイミダゾールを除去した後）、ＩＥＣ−１８細胞の培養物に加え、そして細胞数を４日後に計測した。図１３（右のパネル）は、組換えタンパク質は、分裂促進性ＡＭＰペプチド７７−９７（または図１１に示したブタ由来の可溶性幽門洞組織抽出物）を刺激するのと同じ最大程度細胞の増殖を刺激するが、ペプチド７７−９７より１オーダー低い程度の最大半減濃度で刺激することを示す。ＡＭＰペプチド７７−９７は成熟タンパク質を指す；ヒト前駆体タンパク質のペプチド９７−１１７と同じである：表１。これらの観察は、多様な臨床的状況で利用し得る生物学的に活性な組換えヒトＡＭＰ−１８が入手可能であることを示す。ｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進能力は、インビボで胃の維持および修復に関与するネイティブな胃細胞増殖因子で予測されるナノモルの範囲である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
（３．発現されたタンパク質に対する抗体）
ヒトおよびブタｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、非常によく似た比較的低分子量（ＭＷ）のタンパク質を予測し、それはコンピューターデータベースの公知のタンパク質と近いホモログを有さず、そして従って可能性のある機能についてほとんど示さない。推定タンパク質の生物学的役割を研究するアプローチとして、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）もコードするベクターを用いて、全ｃＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉで発現させた。不運なことに、細菌で発現した場合、そのポリペプチド産物は不溶性であり、そして生化学的研究のために容易に分析できない。しかし、ヒトｃＤＮＡの細菌産物を、抗血清を誘発するためにウサギで免疫原として使用したドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルで分離した。その血清を、多くの哺乳動物種由来の幽門洞組織のタンパク質抽出物に対してスクリーニングした。この手順は、免疫原と試験した哺乳動物の幽門洞に発現する約１８ｋＤａのタンパク質とのどちらも認識し得る、いくつかの高力価、低バックグラウンドの抗血清を産生するのに成功した。細菌で発現したタンパク質は、シグナルペプチド配列およびＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を含むので、よりゆっくり移動する。免疫前血清は、有意な１８ｋＤａ反応性を示さなかった。ヒトｃＤＮＡクローンから発現したタンパク質に対して産生された抗血清の、様々な哺乳動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス；最後はＳＤＳゲルにおいて常にわずかにより速く移動する）由来の幽門洞抽出物の非常によく似たＭＷのタンパク質との交差反応性は、ヒトおよびブタｃＤＮＡのＯＲＦの比較によって予測されたアミノ酸配列の保存のレベルを支持する（図１０を参照のこと）。続く実験において、シグナルペプチドを有するヒトＡＭＰ−１８を細菌で産生した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
【表１】
2004537284.tif 000001
表１：ヒトおよびマウスプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）配列から得た分裂促進ペプチドの分析。１４アミノ酸の分裂促進ドメインは太字である。＊ペプチドはプレ−ガストロカイン（プレＡＭＰ−１８）のアミノ酸配列におけるその位置によって同定される。＃ＡＡ；ペプチド中のアミノ酸の数。Ｋ１／２；最大半減増殖刺激の濃度。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
（１３．組換えタンパク質の発現）
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ。組換え構築物を、一般的に、ＰＴ／ＣＥＢＰベクター中の全長ｃＤＮＡ配列の適当な領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、遺伝子工学で操作し、そして標準的なベクターポリリンカーへの容易な挿入を可能にするのに便利な制限酵素部位まで延長する。細菌システムにおけるＡＭＰ  ＯＲＦの発現を用いた最初の実験は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）における発現タンパク質の精製の促進を意図して、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）を含む（Ｊｅｏｎら、１９９４）、発現ベクターＰＴ／ＣＥＢＰを採用した。宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳにおけるこのベクター中の全長ヒトｃＤＮＡの発現は、不溶性タンパク質の高い収率を与え、それは変性条件下の電気泳動後に、特異的高力価抗体を得るためにウサギで免疫原として使用するために適当であったが、それはそのタンパク質の天然構造および機能を分析するために有用ではなかった。この不溶性は、おそらく発現タンパク質における、疎水性シグナルペプチドの上流にＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を有する、非天然Ｎ−末端の存在のためである。疎水性シグナルペプチド配列なしにＯＲＦを発現するエンジニアリングベクターも有用である。これらをＮ−またはＣ−末端Ｈｉｓタグありおよびなしで、細菌発現ベクターを用いて構築する。２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を含むヒトＡＭＰ−１８配列も、細菌で発現させた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
（ｃ）バキュロウイルス／昆虫細胞。代替の、多くの場合成功する、非哺乳動物真核生物発現システムは、昆虫細胞培養システムにおいてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのような組換えバキュロウイルスを使用するものである。Ｐｉｃｈｉａと同様に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＨｉｓ６タグ（配列番号１６）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を両方含む、簡便なベクターの大きなレパートリーがこのシステムにおいて利用可能である。トランスフェクションをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞に対して行なう；これらの細胞を、分泌タンパク質の精製に有利なように、タンパク質を含まない培地にゆっくりと適応させ得る。内因性のシグナルペプチドがこれらの細胞で機能しない場合は、クローニング部位の上流にウイルスｇｐ６７分泌シグナルを含むベクターを用いて、外来性タンパク質の分泌を強要し得る。組換えタンパク質を、全細胞タンパク質の０．１−５０％の範囲のレベルで発現し得る。いくつかのタンパク質修飾が、酵母と比較してこの昆虫細胞システムにおいて有利であり得るが、依然として哺乳動物システムを再現し得ない。昆虫発現システムはＰｉｃｈｉａよりいくらか面倒であり、そして哺乳動物細胞における発現の完全な代用にはならないようである。２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグ（配列番号１６）を含むヒトＡＭＰ−１８配列を、バキュロウイルスで発現した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
プラスミドｐｃＤＮＡ３／ヒト腎臓２９３システム：ｐｃＤＮＡ３は、強力な構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナルに隣接するポリリンカークローニング部位を含む（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。実験室での経験では、６０−９０％の一過性トランスフェクションレベルを達成し得る。このために、ヒトプレＡＭＰｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅を、開始コドンおよびネイティブリボソーム結合部位（コザック配列）およびｐｃＤＮＡ３への正しい方向性のために適当な制限酵素リンカーを含むオリゴヌクレオチドを用いて行なう。強力な抗生物質ブラストサイジンＳおよび耐性遺伝子を含むベクターを用いた一過性アッセイにおいて好ましい構築物を同定し、安定な哺乳動物トランスフェクタント細胞株を「１週間以内に」確立し得る（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。利用可能なベクターはまた、構成的ＣＭＶプロモーター、ポリリンカークローニング部位、選択的Ｖ５−エピトープ／Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）およびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含む（ＰｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
（１５．発現したおよびネイティブガストロカイン（ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ）タンパク質の生化学的および免疫親和性分画）
ガストロカインＡＭＰ−１８のいくつかの発現形式の場合に、組換えタンパク質は、可溶性タンパク質の迅速な精製を可能にするペプチドタグを含む。これらのタグの存在は、もしそれらがタンパク質の通常の機能を著しく阻害しなければ、他の関連する高分子との相互作用の分析も可能にする。Ｈｉｓ６タグ（配列番号１６）は、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂ビーズへ結合させることによって精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１；ＱｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡ樹脂）。タグ化タンパク質は、ほとんどの抗原−抗体複合体よりも高い親和性で結合し、そしてＮｉ２＋−ヒスチジンキレート化複合体を過剰なイミダゾールで分裂させて精製タンパク質を放出する前に激しく洗浄され得る。ＧＳＴ−タグ化組換えタンパク質を、グルタチオン−アガロースで精製し、洗浄し、次いで還元グルタチオンで溶出する（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８）。全ての提案された発現システムと同様に、各タンパク質調製物を、その増殖因子活性に関してできるだけ早い段階で試験し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
ヒトタンパク質の中央領域に相当する合成４２アミノ酸ペプチドは、部分的に分画された幽門洞粘膜抽出物の増殖因子活性を模倣し得るという発見は、ＡＭＰ−１８機能の分析に近道を提供した。リシン対におけるいくつかの潜在的なタンパク質処理部位に加えて、このペプチド（ペプチド５８−９９と呼ばれる；アミノ酸は、シグナルペプチドを除去した後の成熟タンパク質の５８位−９９位である）は、拡大したヘリックス形成可能な領域の１つおよびグリシン−プロリンループを含む。このペプチドのさらなる利点は、それは本明細書中で開示される抗血清の両方によって認識されるエピトープを含むことである。この配列由来のいくつかのより小さいペプチドを合成し、生物活性領域に焦点をあわせた。それらはこの領域の抗原性によって見られるように、タンパク質の表面に露出されることによって、タンパク質構造内の区別できるドメインを示し得るので、およびインビボで生物活性ペプチドへの切断部位であり得るので、まずリシン残基が境界となる配列を研究した。グリシン−プロリン領域が重要である（ＡＭＰ−１８の生物活性ドメインを示す表１を参照のこと）。グリシン−プロリン配列は、ＳＨ３（ｓｒｃ相同性ドメイン３型）リガンドに関与することが知られている（Ｃｏｈｅｎら、１９９５；Ｎｇｕｙｅｎら、１９９８）；ＳＨドメインはタンパク質−タンパク質相互作用に関与するので、ＡＭＰ−１８のＧＰ領域はタンパク質の細胞表面レセプターとの相互作用に関与し得る。ＡＭＰ−１８で見出される正確なＧＰＧＧＰＰＰ配列（配列番号２４）は、細胞内で作用するＳＨ３ドメインで報告されていないので、それは細胞外リガンドのための新規タンパク質相互作用ドメインに相当するという興味深い可能性が存在する。成熟配列の９７位−１１７位のアミノ酸から得られた２１マーは、４２マーと同様の活性を有する。このより短いペプチドは、様々な上皮細胞系統における増殖アッセイに有用である。このペプチドは、本明細書中で開示される抗血清によって認識されるエピトープを発現しない。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
架橋研究に加えて、抗体、またはｈｉｓ６タグ化（配列番号１６）ＡＭＰ−１８またはペプチドを使用して、ＡＭＰ−１８に結合する細胞または粘液タンパク質を単離する。さらなるアプローチとして、固定化ＡＭＰ−１８親和性マトリックスを、ＣＮＭＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いることによって作成し得る。あらゆる細胞レセプターによって媒介されるシグナル伝達経路を分析する簡単な発端として、親和性単離物におけるタンパク質チロシンキナーゼ活性をアッセイする試験が利用可能である（ＹａｒｄｅｎおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９８８；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９９２）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
【図１−１】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−２】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−３】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−４】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−５】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−６】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−７】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図２】図２は、ヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２）である；ＤＮＡクローンをヒト胃ｃＤＮＡライブラリーから差次的発現クローニングによって得た。
【図３】図３は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づき、そして本発明者によって修正された、ｃＤＮＡクローンから予測されたヒトプレＡＭＰ−１８タンパク質配列（配列番号３）である；Ｎ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である。
【図４−１】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−２】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−３】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−４】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−５】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−６】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−７】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列（配列番号４）である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図５】図５は、プレＡＭＰ−１８のマウスｃＤＮＡ配列（配列番号５）である。
【図６】図６は、マウスプレＡＭＰ−１８アミノ酸配列（配列番号６）である；マウス胃幽門洞から単離されたＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行なった；Ｙ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である；．．によって示される空間は、図１１の他の配列と整列するヌクレオチドがそこに存在しないことを意味する。
【図７】図７は、ブタＡＭＰ−１８（配列番号７）を発現するｃＤＮＡである。
【図８】図８は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づいてｃＤＮＡクローンから予測されたブタプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）タンパク質配列（配列番号８）である。Ｄ−２１は、成熟タンパク質のＮ−末端である−ブタ胃から単離されたタンパク質の配列決定によって確認された。
【図９】図９は、ヒトプレ−ガストロカインのアミノ酸配列（配列番号３）  対  ブタプレ−ガストロカインのアミノ酸配列（配列番号８）の比較である。
【図１０】図１０は、ヒトおよびブタＡＭＰ−１８のｃＤＮＡクローンの配列決定から、そしてマウスＲＮＡおよびＤＮＡのプレＡＭＰ−１８特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって決定された、ヒト予測タンパク質配列（配列番号３）、ブタ予測タンパク質配列（配列番号８）およびマウス予測タンパク質配列（配列番号６）のコンピューターによる整列比較を示す；各場合において、最初の２０アミノ酸はシグナルペプチドを構成し、小胞体膜の通過後切断される。
【図１１】図１１は、ブタ胃幽門洞粘膜抽出物、成熟ペプチドのヒトＡＭＰペプチド７７−９７（ヒト前駆体タンパク質のペプチド９７−１１７と同じ：表１）、およびＥＧＦの、胃上皮細胞の増殖に対する効果を示す；ＡＧＳ細胞を、６０ｍｍディッシュで胎児ウシ血清（５％）を含むＤＭＥＭ中で増殖させた；異なる量のブタ幽門洞抽出物、ＨＰＬＣ精製ペプチド７７−９７、および／またはＥＧＦを加えた；４日後細胞を分散し、そして血球計算器で計測した；幽門洞抽出物およびペプチドはそれぞれ濃度依存的な様式で細胞増殖を刺激した；棒グラフは飽和用量でペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は分裂促進性であったことを示す；あわせるとそれらは相加的であり、２つの分裂促進因子は異なるレセプターおよび／またはシグナル伝達経路を使用して作用することを示唆した；抗ＡＭＰ抗体は幽門洞抽出物を阻害したがペプチド７７−９７は阻害しなかった。
【図１２】図１２は、ヒトおよびマウスプレＡＭＰ−１８遺伝子の構造を示す；イントロン中の塩基対の数をバーの上に示す；エキソンはＥ１−Ｅ６およびイントロンはＩ１−Ｉ５で示す；イントロンの長さにわずかな違いが存在する。
【図１３】図１３は以下のものを示す。左のパネル。Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えヒトＡＭＰ−１８のアミノ酸配列（配列番号３の残基２１〜残基１８５）。Ｎ−末端の１２アミノ酸ドメイン（配列番号９）内のＨｉｓ６タグ（配列番号１６）が推定疎水性シグナルペプチドを置換したことに注意する。右のパネル。ＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養の増殖に対するｒｈＡＭＰ−１８およびＡＭＰペプチド７７−９７の効果。最大の増殖刺激は同様であるが、ｒｈＡＭＰ−１８（〜３０ｎＭ）の最大半減濃度（Ｋ１／２）はペプチド（〜３００ｎＭ）より約１オーダー程度低い。
【図１４】図１４は以下のものを示す。左のパネル。ヒト洞前駆体タンパク質（配列番号３）およびブタ幽門洞前駆体タンパク質（配列番号８）のＡＭＰ−１８ｃＤＮＡクローンから得られたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の整列。類似性は７８．５０％、および同一性は７５．２７％であった。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（ＧＣＧ）のＧＡＰおよびＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラムを用いてコンピューター分析を行なった。右のパネル。ヒトプレＡＭＰ  ＯＲＦの予測された二次構造のモデル。アスパラギンリッチなＮ−末端ドメイン、短いトリプトファン（Ｗ）−リッチおよびグリシン−プロリン（ＧＰ）領域、および４つのシステイン（Ｃ）残基の保存された位置に留意のこと。可能性のある両親媒性ヘリックスが示される。
【図１５】図１５は、ブタ幽門洞細胞抽出物、ペプチド７７−９７、およびＥＧＦの腸上皮細胞の増殖に対する効果を示す。ＩＥＣ−６細胞を６０ｍｍディッシュで増殖させた。幽門洞細胞抽出物（左のパネル）およびペプチド７７−９７（中央のパネル）はそれぞれ濃度依存的な様式で増殖を刺激した。ペプチド７７−９７（１μｇ／ｍｌ）は、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）より強力であるようであった（右のパネル）。値は３つの培養の平均±ＳＥである。
【図１６】図１６は、ＡＭＰペプチド７７−９７およびＥＧＦの、ヒト幽門洞上皮細胞による増殖および創傷回復に対する効果を示す。増殖（左のパネル）を測定するために、ＨＡＥ細胞を６０ｍｍディッシュにまいた。ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）、またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、または両方を培地に加え、そして４日後に細胞の数を計測した。ペプチド７７−９７およびＥＧＦはそれぞれ増殖を刺激し、そして相加的であるようであった。値は３つの培養の平均±ＳＥである。遊走（右のパネル）を測定するために、細胞を６０ｍｍディッシュに増殖させてコンフルエントな単層を調製した。培地を吸引、および０．０１％の子牛血清（ＣＳ）を含む新しい培地と交換した。単層を、剃刀の刃でひっかくことによって機械的に傷つけた。分離した細胞を、培地を吸引し、そして残った細胞を０．０１％のＣＳを含む新しい培地で２回洗浄することによって除去した。ＣＳ（０．０１％）およびインスリン（１００Ｕ／Ｌ）を含む新しい培地（５ｍｌ）を、傷つけた培養に加えた。ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、または両方のいずれかを加えて培養を２倍にした。顕微鏡接眼レンズの網線（１０ｍｍの長さ；０．１ｍｍのしるし）を用いて、細胞が傷の端から遊走した距離（ｍｍ）を測定することによって、創傷後２４、４８、および７２時間後に遊走を評価した。０．２５ｍｍの長さの傷の端にそって無作為に選択した１２の部位の遊走細胞を、４０倍の倍率で測定した。２つの異なる部位の遊走を、各培養で作成した２つの別々の傷それぞれで測定した。値は２つの培養における４つの異なる傷の端から露出した領域へ細胞が移動した平均距離±ＳＥである。ペプチド７７−９７に接触させた細胞は、７２時間で、ビヒクルに接触させたものよりも傷の端から遠くへ遊走した。ＥＧＦも細胞の移動を刺激し、そして２つの薬剤は一緒に作用して著しく遊走を増強した。
【図１７】図１７は、ＡＭＰペプチド６７−８５の、ペプチド５８−９９によって刺激された腸上皮細胞の増殖に対する効果を示す。ＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養を調製した。１日後、培地を吸引し、そして分裂促進性ペプチド５８−９９（８μｇ／ｍｌ）なし（コントロール）、またはそれと共に、ＣＳ（０．５％）およびインスリンを含む５ｍｌのＤＭＥＭと交換した。１ｍｌの培地および異なる量のペプチド６７−８５を加えた姉妹プレートを、ＣＯ２インキュベーターで、３８℃で１時間インキュベートし、そして次いでさらに４ｍｌの培地を各ディッシュに加えた。ペプチド５８−９９を、ペプチド６７−８５の各濃度で４つの姉妹プレートのうち２つに加え、そして細胞の数の計測した。次の３日間の間に、ペプチド６７−８５の非存在下では、細胞数は２９０％増加し、一方ペプチド５８−９９に接触させた細胞は数が４０７％増加し、そしてＥＧＦで処理した（５０ｎｇ／ｍｌ）細胞は４０２％（示していない）増加した。分裂促進性ペプチド５８−９９による細胞増殖の刺激は、細胞を０．２５μｇ／ｍｌのペプチド６７−８５とプレインキュベーションすることによって完全に消失した。単独で加えた場合、ペプチド６７−８５（０．２５から８μｇ／ｍｌ）は分裂促進因子ではなかった。培養あたりの細胞数の値は、同じ期間にビヒクルと接触させた細胞の増加と相対的に示す。
【図１８】図１８は、ＡＭＰ−１８に対するウサギ抗血清の、コンフルエントなＩＥＣ−１８細胞に対するｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進効果に対する効果を示す。ｒｈＡＭＰ−１８（５０ナノモル）を抗血清（１：１００希釈）およびＡｂと３０分間プレインキュベートした場合、増殖刺激は〜９５％抑制された；免疫前血清は細胞増殖に影響しなかった。この最近精製されたｒｈＡＭＰ−１８の増殖刺激の最大半減濃度（Ｋ１／２）は、約５ナノモルである。
【図１９】図１９は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ヒト幽門洞（ＨＡＥ）およびラット腸（ＩＥＣ−１８）上皮細胞の創傷回復に対する効果を示す。コンフルエントな単層培養を、剃刀の刃でひっかくことによって機械的に傷つけ、そして傷の端から細胞が遊走した距離を顕微鏡接眼レンズの網腺を用いて測定した。細胞は、調査した各時点で、ＡＭＰペプチドの存在下でより遠くに遊走した（Ｐ＜０．００５）。
【図２０】図２０は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ＴＥＲの成熟に対する効果を示す。ＭＤＣＫ細胞の単層培養を、透過可能なポリカーボネートフィルター（０．４μｍの孔サイズ）（Ｔｒａｎｓｅｌｌ）上に、ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）なし（コントロール）またはありでＦＢＳ（２％）を含むＤＭＥＭ中で８日間増殖させた。ＴＥＲを、細胞をまいてから２４時間後、およびその後指定の時間に上皮電圧抵抗計（ＥＶＯＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した。各測定の後、ペプチドなしまたありでＦＢＳを含む培地を交換し（０、４８、および１４４時間）、そしてさらなるペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）を３０および７２時間に加えた。７２時間に、ペプチド７７−９７を加えた培養におけるＴＥＲは、コントロール培養の２倍高かった。値は３つの培養の平均である；分散は平均の＜１０％である。ＴＥＲをフィルターの３つの異なる領域から測定した。
【図２１】図２１は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、酸化剤モノクロラミンまたはインドメタシンで損傷した単層におけるＴＥＲに対する効果を示す。パネルＡ：ＭＤＣＫ細胞単層で安定なＴＥＲ（３３０Ω・ｃｍ２）に達したら、培地を、ＦＢＳ（０．２％）およびペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを含むＤＭＥＭに交換した。１８時間後、ペプチド７７−９７またはＥＧＦを、指定のウェルに加えた。１時間後、モノクロラミン（０．１ｍＭ）を、他の薬剤と同様に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの先端および基底区画に加えた。ビヒクルまたはＥＧＦで処理したモノクロラミン損傷培養は、酸化剤への接触から９０分後に〜３０−４０％のＴＥＲの損失を維持したが、ペプチド７７−９７で処理した酸化剤損傷細胞のＴＥＲは、酸化剤に接触させていないコントロール培養と同様であった。パネルＢ、Ｃ：Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）サブクローン単層を、コラーゲンでコートしたポリカーボネートフィルターに、安定なＴＥＲに達するまで（２２５Ω・ｃｍ２）増殖させた。消費した培地をＦＢＳ（０．１％）単独またはペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）とともに含む新しい培地と交換した。１８時間後、モノクロラミン（０．３ｍＭ、Ｂ）またはインドメタシン（０．１ｍＭ、Ｃ）をＴｒａｎｓｗｅｌｌの両方の区画に加えた。０時間に、ビヒクル（コントロール）、ビヒクルプラス酸化剤またはインドメタシン、またはペプチド７７−９７および酸化剤またはインドメタシンを培養に加えた。ビヒクルで処理した損傷培養のＴＥＲは、９０分で〜３５％減少したが、ペプチドで処理した培養は〜１０％減少した。ペプチドは、非損傷細胞のＴＥＲを変化させなかった（示していない）。
【図２２】図２２は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ＤＳＳによる損傷後のＴＥＲに対する効果を示す。Ｃ２細胞単層を、ＦＢＳ（５％）およびトランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で、コラーゲンでコートしたポリカーボネートフィルター上に、安定なＴＥＲに達するまで（２２５Ωｃｍ２）増殖させた。０時に、細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌの上部区画においてＤＳＳに曝露させない（コントロール）、またはＤＳＳ（４％）に曝露させた。ＡＭＰペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）を、０時にＤＳＳを加える１日前に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部および下部区画に加えた。ビヒクルで処理したＤＳＳ−損傷培養物のＴＥＲは、４５分で約７０％減少したが、ペプチドで処理した培養物はその時点で約１０％減少した。ペプチドは非損傷細胞のＴＥＲを変化させなかった。値は≧６の培養物の平均である。
【図２３】図２３は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、Ｃ２細胞の酸化剤損傷後のＺＯ−１およびオクルディンに対する効果を示す。このイムノブロットは、不溶性画分のタンパク質レベルが、細胞のビヒクルに対するよりもＡＭＰペプチドに対する曝露後の方が約２倍より高いことを示す。
【図２４】図２４は、ＡＭＰペプチドのＣ２細胞に対する効果を示す。培養物を異なる時間、ペプチドに曝露させ、そして不溶性画分を得た。タンパク質を分離し、イムノブロットを特異的抗血清でプローブし、そして各タンパク質の量を、レーザーデンシトメトリーを用いて定量した。
【図２５】図２５は、ｒｈＡＭＰ−１８の、酸化剤損傷を受けた単層のＴＥＲに対する効果を示す。コンフルエントなＣ２細胞単層を、安定なＴＥＲが確立するまでＴｒａｎｓｗｅｌｌに調製した。培地を、ＦＢＳ（０．１％）単独（コントロール）またはｒｈＡＭＰ−１８（１００ナノモル）またはペプチド７７−９７（３．７マイクロモル）のいずれかとともに含む新しい培地と交換した。１８時間後、モノクロラミン（０．３ｍＭ）をＴｒａｎｓｗｅｌｌの両方の区画に加え、そして培養物にビヒクル（コントロール）、ビヒクルプラス酸化剤、ｒｈＡＭＰ−１８および酸化剤、またはペプチド７７−９７および酸化剤を加え、その後ＴＥＲを測定した。
【図２６】図２６は、ｒｈＡＭＰ−１９の、Ｃ２細胞におけるＺＯ−１およびオクルディンのレベルに対する効果を示す。単層培養を、ｒｈＡＭＰ−１９（１００ナノモル）またはビヒクルで８時間処理した。細胞溶解の後、細胞膜および細胞骨格結合ＴＪタンパク質に相当する不溶性（微粒子）画分を調製し、そして次いでイムノブロッティングを行なった。免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンの量は、同じイムノブロットのレーザーデンシトメトリーによって推定されるように、ビヒクルで処理した（１）細胞よりもｒｈＲＭＰ−１８で処理した（＋）細胞で約２倍より高い。各レーンにおける同量のタンパク質の装填は、これらの細胞で恒常的に発現される熱ショックタンパク質７３に対する抗体を用いてブロットを再プローブすることによって証明した。
【図２７】図２７は以下のものを示す。左のパネル。マウス（ｎ＝１０）に３％のＤＳＳを与え、そして糞を毎日アッセイした。ビヒクルよりもＡＭＰペプチド（３ｍｇ／ｋｇ体重／日、ｓ．ｃ．）を与えたより少ない動物およびホモカルト（ｈｏｍｏｃｕｌｔ）陽性糞。右のパネル。動物にＤＳＳを４日間与えた後、水に切り換えた（グラフの０日）。ＡＭＰペプチドを毎日与えたマウスは、５日までにビヒクルを与えたマウスよりも体重減少が少なかった（Ｐ＜０．０４）。ペプチドで処理した４日目および５日目の動物の体重は増加したようであった；ビヒクルを与えたものは減少した。