【手続補正書】
【提出日】平成16年2月25日(2004.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が非還元末端グルコース部位からカルボキシルメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシルメチル化澱粉であることを特徴とする請求項１記載の免疫分析要素。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が非還元末端グルコース部位からカルボキシルメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシルメチル化澱粉であることを特徴とする請求項５記載の免疫分析要素。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
すなわち本発明の分析要素は、抗原（又は抗体）の標識酵素とのみ反応し、試薬層に本来含有される低分子化酵素とは反応しない基質を、非拡散性基質として基質層に含有させたものである。これにより、試料液を点着後、試薬層から上流の基質層へ低分子化酵素が基質層へ拡散しても、この低分子化酵素により非拡散性基質が分解されることがなくなり、ノイズが減少することになる。また使用する非拡散性基質の中に、重合度が低かったり、粒径が小さいため基質層に保持されず試薬層へ移行してしまうような不溶性高分子基質が混在したとしても、試薬層で低分子化酵素と反応することがない。このような非拡散性基質を使用することにより、測定値の再現性、保存安定性も高くなる。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
エンド型選択反応性基質としては、非還元末端グルコース部位からカルボキシルメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、
予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシルメチル化澱粉を使用することができる。限定分解されたカルボキシルメチル化澱粉を使用した場合には、標識酵素に対する反応性をさらに高め、測定感度を上げることができる。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
非拡散性基質として澱粉などの高分子多糖類を用い、抗体又は抗原の標識酵素をエンド活性型の糖質分解酵素としてこの高分子多糖類からグルコースオリゴマーを生成させ、さらにこのオリゴマーをグルコースに変換（分解）する低分子化酵素をエキソ活性型の糖質分解酵素とするのが好ましい態様である。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
抗原（リガンド）は抗原性があってその抗体を用意できるものであれば、低分子量物質から高分子量物質までの抗原について本発明の分析要素で分析できる。なお抗原性(antigenecity)があるとは、対応する抗体と反応し得るという意味であり抗原決定基(epitope)を有するものであればよい。それ自体では免疫原性(immunogenecity)がないものでも、ハプテンとして免疫すれば抗体が得られるものであれば、本発明における測定対象のリガンド（抗原）となりうる。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
酵素には，リガンドの代わりに、リガンドに対する抗体と交差反応性を有するリガンド誘導体を結合させてもよい。ここでいうリガンド誘導体とは、単に化学構造上の類縁体のみならず、免疫反応性において、リガンドと類似の挙動を示すものを指す。例えば、リガンドであるテオフィリンに対する抗体がカフェインにも交差反応する場合には、カフェインの誘導体も抗原の材料として用いることができる。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
抗体と酵素との結合方法は、前記した抗原（リガンド）と高分子化合物との結合方法と同じように行うことができる。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
これらの酵素はいずれの検体中に存在する妨害因子で影響されないものが好ましく、また検体中には競合する同種の酵素がないことが好ましい。ただし、標識酵素と同種の酵素が検体中に含まれている場合には、この酵素阻害剤を用いてもよい。この酵素阻害剤は、検体中の酵素を阻害する程度が標識酵素の活性を阻害する程度より大きいものであればよい。酵素阻害剤は検体中の酵素を完全に失活させるが、標識酵素を全く阻害しないものが最も好ましい。しかし実用上は単に測定時においてブランク値を上昇させなければよく、測定後には酵素阻害剤が失活するなどして検体中の酵素活性が回復しても構わない。なお酵素阻害剤は、酵素標識リガンド（又は抗体）の酵素を阻害しないものであればよく、遊離状態の酵素を阻害することは構わない。この酵素阻害剤は、公知の酵素阻害剤から上記のような特異性を持つものを選んで用いればよい。或いは検体中の問題となる酵素に対する抗体を作って、これを酵素阻害剤として用いてもよい。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
標識酵素としてα−アミラーゼ、低分子化酵素として後述するグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを用いる場合には、非還元末端グルコースをカルボキシルメチル基などの修飾基で修飾した澱粉などの不溶性多糖類を用いてもよい。これらの修飾基質はα−アミラーゼの基質とはなるが、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼの基質とはならない。非還元末端グルコースの修飾基は、標識酵素や低分子化酵素の活性に影響を与えない非反応性官能基が望ましい。また乾式分析要素内での反応性を上げるためには、親水性修飾基が望ましい。このような修飾基としてカルボキシルメチル基やヒドロキシプロピル基、ヒドロキシエチル基などの親水性基がある。或いは末端グルコースをリン酸エステル化、硫酸エステル化、又は硝酸エステル化してもよい。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
免疫反応層
図１の基質層１４には、拡散性基質のみならず、免疫反応に必要な分子種を含有させてもよい。例えば、
(1) 被検抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被検抗原量を分析する場合には、酵素標識抗体を；
(2) 被検抗原と抗体と酵素標識抗原とを反応させて、被検抗原量を分析する場合には、抗体と酵素標識抗原とを；
(3) 被検抗原と高分子化抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被検抗原量を分析する場合には、高分子化抗原と酵素標識抗体とを；
(4) 被検抗体と酵素標識抗原とを反応させて、被検抗体量を分析する場合には、酵素標識抗原を；
(5) 被検抗体と抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被検抗体量を分析する場合には、抗原と酵素標識抗体とを；
基質層に含有させる。これにより、基質層は、その層内で免疫反応を併せて行なわせる免疫反応層として機能する。この場合には、要素に検体を点着するだけで、要素内で均一系の酵素免疫反応を進行させることができる。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
【実施例６】
このスライド３及びスライド４に、各種濃度のＣＲＰを含有する50mMグリセロ燐酸緩衝溶液(pH7)を10μLを点着し、37℃に保って、支持体側から650nmの反射光学濃度を測定し、点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6-4）を求めた。図６の検量線に示すように、エンド型反応特異的カルボキシルメチル化澱粉を使用した本発明の乾式免疫分析要素（図６、-●-）は、比較例（-○-）に比べ、より高感度にＣＲＰを定量分析できることが示された。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
最後に本発明に好ましい態様をまとめると、以下の通りである。
(1) 抗原と酵素標識抗体との反応、もしくは抗原と抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗原と、抗原と高分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応のいずれかの反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗原の量を分析する免疫分析要素において、
前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であることを特徴とする免疫分析要素。
(2)  前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記標識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であり、前記変換酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素であることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(3)  前記標識酵素はエンド活性型糖質加水分解酵素であり、前記低分子化酵素はエクソ活性型糖質加水分解酵素であって、前記非拡散性基質は非還元末端グルコースが修飾されたエンド型選択反応性基質であることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(4)  前記エンド型選択反応性基質は、非還元末端グルコースがカルボキシルメチル基で修飾されていることを特徴とする(3)記載の免疫分析要素。
(5)  前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が非還元末端グルコース部位からカルボキシルメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシルメチル化澱粉であることを特徴とする(3)記載の免疫分析要素。
(6)  前記試薬層は親水性ポリマーをバインダとして含有する層で形成されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(7)  前記基質層は多孔性媒体からなる多孔性層であることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(8)  前記酵素標識抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(9)  前記抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(10)  前記酵素標識抗原が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(11)  前記抗体と、前記酵素標識抗原とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(1)記載の免疫分析要素。
(12)  抗原と高分子化合物との前記結合物と、前記酵素標識抗体とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(1)記載の免疫分析要素。
(13)  前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する色素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透性層に含有していることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。
(14)  前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色素を含む(13)記載の免疫分析要素。
(15)  前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒からなる溶液の水性液中への分散物を含む(14)記載の免疫分析要素。
(16)  前記試薬組成物が、ペルオキシダーゼ及びロイコ色素を含む(15)記載の免疫分析要素。
(17)  抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗体と抗原と酵素標識抗体との反応により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより抗体の量を分析する免疫分析要素において、
前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層を備え、前記非拡散性基質が前記標識酵素とのみ反応し前記低分子化酵素とは反応しない基質であることを特徴とする免疫分析要素。
(18)  前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記標識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であり、前記変換酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素であることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(19)  前記標識酵素はエンド活性型糖質加水分解酵素であり、前記低分子化酵素はエクソ活性型糖質加水分解酵素であって、前記非拡散性基質は非還元末端グルコースが修飾されたエンド型選択反応性基質であることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(20)  前記エンド型選択反応性基質は、非還元末端グルコースがカルボキシルメチル基で修飾されていることを特徴とする(19)記載の免疫分析要素。
(21)  前記標識酵素がα−アミラーゼであり、前記低分子化酵素がグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼであり、前記非拡散性基質が非還元末端グルコース部位からカルボキシルメチル修飾されたグルコース単位部位まで、又はグルコース鎖分岐部位まで、予めエクソ活性型糖質加水分解酵素によって限定分解されたカルボキシルメチル化澱粉であることを特徴とする(19)記載の免疫分析要素。
(22)  前記試薬層は親水性ポリマーをバインダとして含有する層で形成されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(23)  前記基質層は多孔性媒体からなる多孔性層であることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(24)  前記酵素標識抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(25)  前記抗体が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(26)  前記酵素標識抗原が、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(27)  前記抗体と、前記酵素標識抗原とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(17)記載の免疫分析要素。
(28)  抗原と高分子化合物との前記結合物と、前記酵素標識抗体とが、前記基質層、又は基質層の上に積層された層に含有されていることを特徴とする請求項(17)記載の免疫分析要素。
(29)  前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する色素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透性層に含有していることを特徴とする(17)記載の免疫分析要素。
(30)  前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色素を含む(29)記載の免疫分析要素。
(31)  前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒からなる溶液の水性液中への分散物を含む(30)記載の免疫分析要素。
(32)  前記試薬組成物が、ペルオキシダーゼ及びロイコ色素を含む(29)記載の免疫分析要素。