(57)【要約】  造血幹細胞移植、幹細胞移植を利用した障害組織の修復等において、組織への移行能や生着能に優れた細胞が求められている。  本発明により、組織への移行能や生着能に優れた細胞集団、該細胞を含有する医薬、該細胞の移植方法が提供される。本発明の細胞は造血幹細胞移植や、幹細胞移植を利用した障害組織の修復等に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない、単離された細胞集団。
【請求項２】
細胞分画処理で得られる、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
フコース供与体の存在下、α１，３−フコシルトランスフェラーゼで細胞を処理することにより得られる、請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項４】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼがα１，３−フコシルトランスフェラーゼ７である、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項５】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項６】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項７】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項８】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるポリペプチドである、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項９】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項１０】
細胞が幹細胞または前駆細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１１】
幹細胞または前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項１０に記載の細胞集団。
【請求項１２】
造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陽性造血幹細胞またはＣＤ３４陽性造血前駆細胞である、請求項１１に記載の細胞集団。
【請求項１３】
ＣＤ３４陽性造血幹細胞がＣＤ３８陰性造血幹細胞である、請求項１２に記載の細胞集団。
【請求項１４】
造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血幹細胞またはＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血前駆細胞である、請求項１１に記載の細胞集団。
【請求項１５】
幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項１０に記載の細胞集団。
【請求項１６】
幹細胞または前駆細胞が神経幹細胞または神経前駆細胞である、請求項１０に記載の細胞集団。
【請求項１７】
神経幹細胞または神経前駆細胞がNestin陽性神経幹細胞またはNestin陽性神経前駆細胞である、請求項１６に記載の細胞集団。
【請求項１８】
神経幹細胞または神経前駆細胞がSox2陽性神経幹細胞またはSox2陽性神経前駆細胞である、請求項１６に記載の細胞集団。
【請求項１９】
神経幹細胞または神経前駆細胞がMusashi1陽性神経幹細胞またはMusashi1陽性神経前駆細胞である、請求項１６に記載の細胞集団。
【請求項２０】
神経幹細胞または神経前駆細胞がCD34陽性神経幹細胞またはCD34陽性神経前駆細胞である、請求項１６に記載の細胞集団。
【請求項２１】
神経幹細胞または神経前駆細胞がCD133陽性神経幹細胞またはCD133陽性神経前駆細胞である、請求項１６に記載の細胞集団。
【請求項２２】
細胞がヒト由来の細胞である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項２３】
細胞が骨髄、脾臓、臍帯血、末梢血、脂肪組織、神経組織からなる群から選ばれる組織由来の細胞である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の細胞集団を含有する医薬。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の細胞集団を生体内に投与することを特徴とする、細胞集団の移植方法。
【請求項２６】
分画処理により細胞を得ることを特徴とする、シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない細胞の製造方法。
【請求項２７】
フコース供与体の存在下、α１，３−フコシルトランスフェラーゼで処理することにより細胞を得ることを特徴とする、シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない細胞の製造方法。
【請求項２８】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼがα１，３−フコシルトランスフェラーゼ７である、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３０】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３１】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３２】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるポリペプチドである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３３】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３４】
細胞が幹細胞または前駆細胞である、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３５】
幹細胞または前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項３４に記載の製造方法。
【請求項３６】
造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陽性造血幹細胞またはＣＤ３４陽性造血前駆細胞である、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３７】
ＣＤ３４陽性造血幹細胞がＣＤ３８陰性造血幹細胞である、請求項３６に記載の製造方法。
【請求項３８】
造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血幹細胞またはＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血前駆細胞である、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３９】
幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項３４に記載の製造方法。
【請求項４０】
幹細胞または前駆細胞が神経幹細胞または神経前駆細胞である、請求項３４に記載の製造方法。
【請求項４１】
神経幹細胞または神経前駆細胞がNestin陽性神経幹細胞またはNestin陽性神経前駆細胞である、請求項４０に記載の製造方法。
【請求項４２】
神経幹細胞または神経前駆細胞がSox2陽性神経幹細胞またはSox2陽性神経前駆細胞である、請求項４０に記載の製造方法。
【請求項４３】
神経幹細胞または神経前駆細胞がMusashi1陽性神経幹細胞またはMusashi1陽性神経前駆細胞である、請求項４０に記載の製造方法。
【請求項４４】
神経幹細胞または神経前駆細胞がCD34陽性神経幹細胞またはCD34陽性神経前駆細胞である、請求項４０に記載の製造方法。
【請求項４５】
神経幹細胞または神経前駆細胞がCD133陽性神経幹細胞またはCD133陽性神経前駆細胞である、請求項４０に記載の製造方法。
【請求項４６】
細胞がヒト由来の細胞である、請求項２６〜４５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項４７】
細胞が骨髄、脾臓、臍帯血、末梢血、脂肪組織、神経組織からなる群から選ばれる組織由来の細胞である、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項４８】
請求項２６〜４７のいずれか１項に記載の製造方法により得られる細胞を含有する医薬。
【請求項４９】
請求項２６〜４７のいずれか１項に記載の製造方法により得られる細胞を生体内に投与することを特徴とする、細胞の移植方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織への移行能や生着能に優れた細胞集団、該細胞を含有する医薬、該細胞の移植方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
障害を受けた組織を治療する目的で、最も広く行われている細胞治療として、造血幹細胞や造血前駆細胞を用いた移植が行われている。更に、生体の種々の組織や臓器には、生体組織幹細胞や前駆細胞が存在することが報告され、それらを用いた治療も試みられている。
成体組織幹細胞とは、様々な成体組織に存在する幹細胞であり、自己複製能と分化能を有し、組織の恒常性の維持に寄与していると考えられている。幹細胞は組織において増殖し、維持されるとともに、限られた増殖能しか有さず分化の方向が決定された前駆細胞に分化し、さらに特定の機能を有する組織細胞へと分化する。例えば、造血幹細胞は成体では主に骨髄組織に存在しており、造血前駆細胞に分化し、さらに分化することで赤血球、白血球、血小板、およびリンパ球といったあらゆる血球に成熟する。このように血液細胞は、造血幹細胞による生産から始まり、維持されている。【０００３】
造血幹細胞移植とは、抗腫瘍効果を高めるために骨髄の最大耐用量を上回る大量の抗癌剤や全身放射線照射を用いた強力な治療（移植前処置）を行って、患者骨髄とともに悪性腫瘍を壊滅に導き、その後に同種ドナー由来の、あるいは予め凍結保存しておいた患者自身（自家）の造血幹細胞を輸注することによって造血能を補う治療法である。造血幹細胞移植は、造血幹細胞の採取法によって骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植に分類され、さらに造血幹細胞の由来によって同種移植と自家移植に分類される。白血病、リンパ腫などの血液癌のみならず、固形癌、自己免疫疾患などの重篤な疾患の治療においても骨髄移植、臍帯血移植、末梢血幹細胞移植等の移植が行われている。【０００４】
また、造血幹細胞や造血前駆細胞のみならず間葉系幹細胞や血管内皮前駆細胞を含む骨髄細胞、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF）等で骨髄から末梢血に動員された種々の幹細胞や前駆細胞を含む細胞集団、臍帯血由来幹細胞や前駆細胞、骨髄、脂肪組織等から分離された間葉系幹細胞等を用いた、障害組織に対する細胞移植による治療が試みられている。これらの細胞を患者に移植することにより、移植片対宿主病（graft versus host disease；GVHD）、クローン病、心筋梗塞、骨粗鬆症、脳梗塞、肝炎、肺炎、糖尿病、脊髄損傷、腎炎、骨折、下肢虚血等、多くの疾患に対する治療への応用の可能性が検討されている（非特許文献１〜１２参照）。【０００５】
前記の通り、造血幹細胞移植はドナー細胞の違いにより、骨髄移植、末梢血移植、臍帯血移植に分けられる。特に臍帯血移植は、臍帯血が本来廃棄物であることからドナーの負担がなく利用しやすいこと、組織適合性抗原の一致度が低くても移植が可能であること、臍帯血バンクの整備により緊急対応が可能なことなど様々な利点があり、近年、移植件数が増えている（非特許文献１３参照）。しかし臍帯血中の細胞数が少ないことから、臍帯血移植の欠点として移植対象は小児が中心であり、成人への移植には不向きであることがあげられている（非特許文献１４参照）。また移植後の生着不全や血小板や好中球の回復遅延などの理由から、臍帯血移植は骨髄移植や末梢血移植と比べて移植成績が悪い（非特許文献１３、１５参照）。骨髄や臍帯血の造血幹細胞移植の臨床成績については、移植する造血幹細胞(CD34陽性細胞)数が多いほど生存率がよく、血小板や好中球の回復が早いことが知られている（非特許文献１６〜１８参照）。そのため多くの造血幹細胞を確保することや、造血幹細胞を効率的に生着させることが移植現場において必要であり、それらの課題を解決する技術や製品は造血幹細胞の移植成績を向上させ、救命、医療費削減、患者のQuality of lifeに貢献することが期待される。【０００６】
成体では造血幹細胞は、骨髄組織で増殖と分化を繰り返し、造血系を維持している。移植された造血幹細胞は、末梢血中を介して骨髄に辿り着き、骨髄内に生着する。このようにある組織に移行し、生着することをホーミングという。造血幹細胞の骨髄へのホーミングには、造血幹細胞と骨髄血管の相互作用が重要である。この相互作用は造血幹細胞が骨髄血管内皮細胞上でローリングや接着を起こす過程で起こり、この相互作用の結果、造血幹細胞は血管内皮細胞を通過し、髄内へ移行する。ローリングや接着は、造血幹細胞と骨髄血管内皮細胞上の接着分子により制御されている。造血幹細胞の生着に関わる骨髄血管内皮細胞に発現する分子として、E-セレクチンやP-セレクチンが重要であることが知られている（非特許文献１９参照）。一方、造血幹細胞に発現する接着分子は糖蛋白として複数存在している。P-セレクチンのリガンドであるP-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1)（非特許文献２０〜２３参照）、またE-セレクチンのリガンドとして、α-4 integrin （非特許文献２４参照）やCD44 （非特許文献２５参照）、E-selectin ligand-1 (ESL-1)（非特許文献２６参照）が知られている。これらのコア蛋白上の糖鎖がα2,3-シアリル化およびα１，３-フコシル化されることにより生成されるシアリルルイスＸ糖鎖が、セレクチンのリガンドとして機能している。【０００７】
α１，３-フコシル化を触媒する酵素はα１，３-フコシルトランスフェラーゼ (FT)と呼ばれ、ヒトでは６種類(FT3, FT4, FT5, FT6, FT7, FT9)が知られている。このうち血液細胞で発現が確認されているのはFT4, FT7, FT9である。それぞれのFTは酵素反応性が異なり、FT7によるフコシル化においてはシアリルルイスＸ糖鎖のみ生成されるが、FT6によるフコシル化ではシアリルルイスＸ糖鎖に加え、ルイスＸ糖鎖も生成される。ルイスＸ糖鎖は単球・顆粒球などの血液細胞に発現しているが、セレクチンリガンドとしての機能はない。上記の６種のFTについては現在のところ、発現部位や発現制御機構、反応特異性などについて十分解明されてはいない（非特許文献２７参照）。【０００８】
造血幹細胞をex vivoでFTにより処理し、シアリルルイスＸ糖鎖を付加することによりセレクチンリガンド量を増加させる方法が報告されている。Xiaらは細胞株をFT6により処理することでシアリルルイスＸ糖鎖が増加すること、及びE-セレクチンやP-セレクチンへの結合能が上昇することを確認している（非特許文献２８参照）。またHidalgoらは、臍帯血由来CD34陽性細胞はPSGL-1を発現しているがＰ-セレクチンへの結合能がないことから、PSGL-1の翻訳後修飾が重要である可能性を示唆している（非特許文献２９参照）。さらにFT6により処理した臍帯血由来CD34陽性細胞は、シアリルルイスＸ糖鎖が増加すること、E-セレクチン及びP-セレクチンへの結合能が上昇すること、移植した場合に骨髄血管内皮と該CD34陽性細胞との相互作用（rollingとarrest）が増強することが知られている（特許文献１参照）。しかし、該細胞の骨髄へのホーミング効率は向上しないことが見出され、FT6によるシアリルルイスＸ糖鎖付加とE-セレクチン及びP-セレクチンへの結合能上昇だけでは、血管内皮細胞との相互作用は増強しても、その後の骨髄内への移行、生着などのホーミングの過程においては効果がないことが示唆された（非特許文献３０参照）。一方、Xiaらは同じFT6処理したヒト臍帯血由来単核球細胞の移植実験において、移植６週間後に骨髄のヒト血液細胞の割合が2倍程度増加したことを報告している（非特許文献３１、特許文献２参照）。【０００９】
また、間葉系幹細胞をex vivoでFT6により処理し、シアリルルイスＸ糖鎖を付加することによりセレクチンリガンド量を増加させる方法が報告されている。FT6処理した間葉系幹細胞の移植実験において、間葉系幹細胞の骨髄への移行細胞数の増加が観察された（非特許文献３２参照）。
また、神経幹細胞をex vivoでFT6により処理し、シアリルルイスＸ糖鎖を付加することによりセレクチンリガンド量を増加させる方法が報告されている（特許文献３参照）。【００１０】
上記のような報告はあるものの、FTの種類や特異性の違いによる造血幹細胞のホーミング能に対する影響は知られていない。また、幹細胞のルイスＸ糖鎖の発現が骨髄組織などへの移行能や生着能に与える影響については全く知られていない。さらに、α１，３−フコシルトランスフェラーゼの一種であるFT7が、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などの組織への移行能や生着能に与える影響については知られていない。
【特許文献１】WO2005/017115
【特許文献２】WO2004/094619
【特許文献３】US2008/0044383
【非特許文献１】最新医学  現代医療の最前線  2003年３月増刊号  最新医学社
【非特許文献２】医学のあゆみvol.217 No.5 2006年  医歯薬出版株式会社
【非特許文献３】Current Opinion in Investigational Drugs, 7, 473-81 (2006)
【非特許文献４】StemCells, 24, 2292-2298 (2006)
【非特許文献５】J Cell Physiol, 211, 27-35 (2007)
【非特許文献６】Experimental Neurology, 199, 56-66 (2006)
【非特許文献７】Cellular and Molecular Neurology, 26, 1167-1180 (2006)
【非特許文献８】Proc Natl Acad Sci USA, 103, 17438-17443 (2006)
【非特許文献９】FASEB J, 19, 992-994 (2005)
【非特許文献１０】American Heart J, 153, e1-8 (2007)
【非特許文献１１】J Clin Invest, 114, 330-338 (2004)
【非特許文献１２】Proc Am Thorac Soc, 5, 323-327 (2008)
【非特許文献１３】Blood, 97, 2962-2971 (2001)
【非特許文献１４】N Eng J Med, 339, 1565-1577 (1998)
【非特許文献１５】Blood, 97, 2957-2961(2001)
【非特許文献１６】N Engl J Med, 344,1815-1822 (2001)
【非特許文献１７】Blood, 100, 1611-1618 (2002)
【非特許文献１８】British J Haematology, 124, 769-776 (2004)
【非特許文献１９】Proc Natl Acad Sci USA, 95, 14423-14428 (1998)
【非特許文献２０】J Cell Biol, 118, 445-456 (1992)
【非特許文献２１】J Exp Med, 191, 1413-1432 (2000)
【非特許文献２２】Blood, 85, 3466-3477 (1995)
【非特許文献２３】Exp Hematol, 24, 1494-1500 (1996)
【非特許文献２４】Blood, 102, 2060-2067 (2003)
【非特許文献２５】J Cell Biol, 153, 1277-1286 (200l)
【非特許文献２６】J Biol Chem, 276, 31602-31612 (2001)
【非特許文献２７】Lowe,J.B., D. Vestweber, ed (Harwood Academic Publishers) pp. 143-177 (1996)
【非特許文献２８】Blood, 100, 4485-4494 (2002)
【非特許文献２９】J Clin Invest, 110, 559-569 (2002)
【非特許文献３０】Blood, 105, 567-575 (2005)
【非特許文献３１】Blood, 104, 3091-3096 (2004)
【非特許文献３２】Nature Medicine, 14, 181-187 (2008)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
造血幹細胞や造血前駆細胞等、種々の細胞を用いた移植において、移植した細胞の骨髄や障害組織への移行、生着に優れた細胞集団を得ることができれば、少ない細胞での治療効果が期待でき、また、治療効果の改善のみならず前記の問題点の克服が期待される。
本発明の目的は、組織への移行能や生着能に優れた細胞集団、該細胞集団を含有する医薬、該細胞集団の移植方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下の（１）〜（４９）に関する。
（１）シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない、単離された細胞集団。
（２）細胞分画処理で得られる、（１）に記載の細胞集団。
（３）フコース供与体の存在下、α１，３−フコシルトランスフェラーゼで細胞を処理することにより得られる、（１）または（２）に記載の細胞集団。
（４）α１，３−フコシルトランスフェラーゼがα１，３−フコシルトランスフェラーゼ７である、（３）に記載の細胞集団。
（５）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（３）に記載の細胞集団。
（６）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、（３）に記載の細胞集団。
（７）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、（３）に記載の細胞集団。
（８）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるポリペプチドである、（３）に記載の細胞集団。
（９）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、（３）に記載の細胞集団。
（１０）細胞が幹細胞または前駆細胞である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の細胞集団。
（１１）幹細胞または前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、（１０）に記載の細胞集団。
（１２）造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陽性造血幹細胞またはＣＤ３４陽性造血前駆細胞である、（１１）に記載の細胞集団。
（１３）ＣＤ３４陽性造血幹細胞がＣＤ３８陰性造血幹細胞である、（１２）に記載の細胞集団。
（１４）造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血幹細胞またはＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血前駆細胞である、（１１）に記載の細胞集団。
（１５）幹細胞が間葉系幹細胞である、（１０）に記載の細胞集団。
（１６）幹細胞または前駆細胞が神経幹細胞または神経前駆細胞である、（１０）に記載の細胞集団。
（１７）神経幹細胞または神経前駆細胞がNestin陽性神経幹細胞またはNestin陽性神経前駆細胞である、（１６）に記載の細胞集団。
（１８）神経幹細胞または神経前駆細胞がSox2陽性神経幹細胞またはSox2陽性神経前駆細胞である、（１６）に記載の細胞集団。
（１９）神経幹細胞または神経前駆細胞がMusashi1陽性神経幹細胞またはMusashi1陽性神経前駆細胞である、（１６）に記載の細胞集団。
（２０）神経幹細胞または神経前駆細胞がCD34陽性神経幹細胞またはCD34陽性神経前駆細胞である、（１６）に記載の細胞集団。
（２１）神経幹細胞または神経前駆細胞がCD133陽性神経幹細胞またはCD133陽性神経前駆細胞である、（１６）に記載の細胞集団。
（２２）細胞がヒト由来の細胞である、（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の細胞集団。
（２３）細胞が骨髄、脾臓、臍帯血、末梢血、脂肪組織、神経組織からなる群から選ばれる組織由来の細胞である、（１）〜（２２）のいずれか１項に記載の細胞集団。
（２４）（１）〜（２３）のいずれか１項に記載の細胞集団を含有する医薬。
（２５）（１）〜（２３）のいずれか１項に記載の細胞集団を生体内に投与することを特徴とする、細胞集団の移植方法。
（２６）分画処理により細胞を得ることを特徴とする、シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない細胞の製造方法。
（２７）フコース供与体の存在下、α１，３−フコシルトランスフェラーゼで処理することにより細胞を得ることを特徴とする、シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない細胞の製造方法。
（２８）α１，３−フコシルトランスフェラーゼがα１，３−フコシルトランスフェラーゼ７である、（２７）に記載の製造方法。
（２９）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（２７）に記載の製造方法。
（３０）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、（２７）に記載の製造方法。
（３１）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、（２７）に記載の製造方法。
（３２）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるポリペプチドである、（２７）に記載の製造方法。
（３３）α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、（２７）に記載の製造方法。
（３４）細胞が幹細胞または前駆細胞である、（２６）〜（３３）のいずれか１項に記載の製造方法。
（３５）幹細胞または前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、（３４）に記載の製造方法。
（３６）造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陽性造血幹細胞またはＣＤ３４陽性造血前駆細胞である、（３５）に記載の製造方法。
（３７）ＣＤ３４陽性造血幹細胞がＣＤ３８陰性造血幹細胞である、（３６）に記載の製造方法。
（３８）造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血幹細胞またはＣＤ３４陰性かつＬｉｎｅａｇｅ陰性造血前駆細胞である、（３５）に記載の製造方法。
（３９）幹細胞が間葉系幹細胞である、（３４）に記載の製造方法。
（４０）幹細胞または前駆細胞が神経幹細胞または神経前駆細胞である、（３４）に記載の製造方法。
（４１）神経幹細胞または神経前駆細胞がNestin陽性神経幹細胞またはNestin陽性神経前駆細胞である、（４０）に記載の製造方法。
（４２）神経幹細胞または神経前駆細胞がSox2陽性神経幹細胞またはSox2陽性神経前駆細胞である、（４０）に記載の製造方法。
（４３）神経幹細胞または神経前駆細胞がMusashi1陽性神経幹細胞またはMusashi1陽性神経前駆細胞である、（４０）に記載の製造方法。
（４４）神経幹細胞または神経前駆細胞がCD34陽性神経幹細胞またはCD34陽性神経前駆細胞である、（４０）に記載の製造方法。
（４５）神経幹細胞または神経前駆細胞がCD133陽性神経幹細胞またはCD133陽性神経前駆細胞である、（４０）に記載の製造方法。
（４６）細胞がヒト由来の細胞である、（２６）〜（４５）のいずれか１項に記載の製造方法。
（４７）細胞が骨髄、脾臓、臍帯血、末梢血、脂肪組織、神経組織からなる群から選ばれる組織由来の細胞である、（２６）〜（４６）のいずれか１項に記載の製造方法。
（４８）（２６）〜（４７）のいずれか１項に記載の製造方法により得られる細胞を含有する医薬。
（４９）（２６）〜（４７）のいずれか１項に記載の製造方法により得られる細胞を生体内に投与することを特徴とする、細胞の移植方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、組織への移行能や生着能に優れた細胞集団、該細胞集団を含有する医薬、該細胞集団の移植方法が提供される。本発明の細胞集団は障害組織の修復等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、臍帯血単核球細胞から分離したCD34陽性細胞のFACS解析結果を示す図である。分離したCD34陽性細胞は純度95 % 以上である。左図のＡにおいてヒト造血幹細胞であるCD34陽性かつCD38陰性細胞の集団をゲートし、解析した。
【図２】図２は、ヒト造血幹細胞（CD34陽性かつCD38陰性細胞）をFT6またはFT7により処理した際の、シアリルルイスＸ糖鎖とルイスＸ糖鎖の発現量を未処理細胞と比較した結果を示す図である。Ａ，Ｃ，ＥにシアリルルイスＸ糖鎖の発現量を、Ｂ，Ｄ，ＦにルイスＸ糖鎖の発現量を示す。
【図３】図３は、ヒト造血幹細胞（CD34陽性かつCD38陰性細胞）をFT6またはFT7により処理した際の、セレクチン結合能を未処理細胞と比較した結果を示す図である。負対照として、CD40-Fcキメラ蛋白質処理した細胞の解析結果を示す。
【図４】図４は、ヒト造血幹細胞（CD34陽性かつCD38陰性細胞）をFT6またはFT7により処理した際の、骨髄移行能を未処理細胞と比較した結果を示す図である。右図に移植12-18時間後のNOD/SCIDマウスの骨髄に移行したヒト造血幹細胞（CD45陽性かつCD34陽性細胞）のＦＡＣＳ解析例を示す。
【図５】図５は、ヒト造血幹細胞（CD34陽性かつCD38陰性細胞）をFT6またはFT7により処理した際の、骨髄におけるヒト血球の生着率を未処理細胞と比較した結果を示す図である。移植8-9週間後にNOD/SCIDマウスの骨髄に生着したヒト血液細胞を示す。ゲートで示したHuman CD45陽性細胞はヒト血液細胞を示し、Mouse CD45陽性細胞はマウス血液細胞を示す。
【図６】図６は、ヒト造血幹細胞（CD34陽性かつCD38陰性細胞）をFT6またはFT7により処理した際の、骨髄におけるヒト血球の生着率を未処理細胞と比較した結果を示す図である。移植8-9週間後にNOD/SCIDマウス骨髄に生着したヒト血液細胞を示す。縦軸はヒト血液細胞の生着率（ヒト血液細胞の割合）を対数表示で表したものである。縦軸の値は、ヒト血液細胞の割合(%)の平均値±SDを示す。
【図７】図７は、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)を酵素未処理あるいは、FT7処理後、フローサイトメトリーにて解析した結果である。“抗体なし”は、抗体で処理しなかったhMSC、“抗シアリルルイスＸ抗体”は、抗シアリルルイスＸ糖鎖抗体で処理後、二次抗体としてFITC標識抗マウスIg抗体で処理したhMSC、“抗ルイスＸ抗体”は、FITC標識抗ヒトCD15抗体で処理したhMSCを解析した結果を示す。縦軸は、細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
【図８】図８は、マウス四塩化炭素肝障害モデルに、FT7酵素処理hMSCあるいは、未処理hMSC（陰性コントロール）をそれぞれ、1×105細胞移植し(各群n=5)、24時間後に肝臓を摘出してコラゲナーゼ処理し、得られた細胞をビオチン標識Mouse Lineage Panelで処理後、PerCP標識ストレプトアビジンおよびPE標識抗ヒトCD90抗体で処理し、フローサイトメトリーにて解析した結果を示す。約1.5×106肝臓細胞当りのPE陽性細胞数を移植したhMSCの肝臓への移行率(%)として算出した。縦軸の値は、各個体の移行率の平均±SDを示す。
【図９】図９は、マウス四塩化炭素肝臓障害モデルに、FT7酵素処理hMSCあるいは、未処理hMSC（陰性コントロール）をそれぞれ、5×105細胞移植し(各群n=6)、18時間後に肝臓を摘出してコラゲナーゼ処理し、得られた細胞をPE-Cy7標識ストレプトアビジン、FITC標識抗マウスCD45抗体、FITC標識抗マウスTer119抗体およびPE標識抗ヒトCD90抗体で処理し、フローサイトメトリーにて解析した結果を示す。1×106肝臓細胞当りのPE陽性細胞数を移植したhMSCの肝臓への移行数として算出した。縦軸の値は、各個体の移行数の平均±SDを示す。
【図１０】図１０は、マウス四塩化炭素肝臓障害モデルに、FT7酵素処理hMSCあるいは、未処理hMSC（陰性コントロール）をそれぞれ、5×105細胞移植(各群n=6)、または溶媒（PBS）を投与し、１８時間後における血液生化学パラメーター[(A)Total-Bilirubin, (B)AST, (C)ALT, (D)ALP, (E)LDH]を富士ドライケムにより計測した。縦軸の値は、各個体の値の平均±SDを示す。
【図１１】図１１は、マウス四塩化炭素肺障害モデルに、FT7酵素処理hMSCあるいは、未処理hMSC（陰性コントロール）をそれぞれ、5×105細胞移植し(各群n=5)、18時間後に肺を摘出してコラゲナーゼ・エラスターゼ処理し、得られた細胞をPE-Cy7標識ストレプトアビジン、FITC標識抗マウスCD45抗体、FITC標識抗マウスTer119抗体およびPE標識抗ヒトCD90抗体で処理し、フローサイトメトリーにて解析した結果を示す。1×105個肺細胞当りのPE陽性細胞数を移植したhMSCの肺への移行数として算出した。縦軸の値は、各個体の移行数の平均±SDを示す。
【図１２】図１２は、神経幹細胞・神経前駆細胞をFT7により処理した際の、シアリルルイスＸ糖鎖とルイスＸ糖鎖の発現量を未処理細胞と比較した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、神経幹細胞・神経前駆細胞をFT7により処理した際の、各種セレクチンへの結合能を未処理細胞と比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．本発明の細胞
本発明の細胞集団としては、シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない細胞を含む細胞から単離することにより調製することができる。本発明の細胞集団を含む細胞としては、本発明の細胞集団を含んでいればいかなる細胞であってもよいが、幹細胞や前駆細胞が含まれていることが好ましい。【００１６】
ここで、ルイスＸ糖鎖が実質的に発現していないとは、ルイスＸ糖鎖が陰性か陰性と同等であり、シアリルルイスＸ糖鎖の発現と比較してその程度が有意に低いことをいう。またルイスＸ糖鎖の発現が、ルイスＸ糖鎖を人為的に発現させなかった場合と同程度の発現であることをいう。
本発明の細胞集団を含む細胞はいかなる動物由来の細胞であってもよいが、好ましくはヒト由来細胞、非ヒト霊長類由来細胞、ウシ由来細胞、ウマ由来細胞、ブタ由来細胞、ヒツジ由来細胞、ヤギ由来細胞、イヌ由来細胞、ネコ由来細胞、げっ歯類由来細胞、より好ましくはヒト由来細胞、非ヒト霊長類由来細胞、さらに好ましくはヒト由来細胞があげられる。また本発明の細胞集団を含む細胞はいかなる組織由来の細胞であってもよいが、好ましくは骨髄由来細胞、脾臓由来細胞、臍帯血由来細胞、末梢血由来細胞、脂肪組織由来細胞、神経組織由来細胞、より好ましくは骨髄由来細胞、臍帯血由来細胞、末梢血由来細胞、脂肪組織由来細胞、さらに好ましくは骨髄由来細胞や臍帯血由来細胞があげられる。【００１７】
幹細胞としては好ましくは造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などがあげられる。造血幹細胞としてはＣＤ３４陽性造血幹細胞やＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性造血幹細胞、ＣＤ３４陰性Ｌｉｎｅａｇｅ陰性造血幹細胞等があげられる。神経幹細胞としては、ＣＤ３４陽性神経幹細胞、ＣＤ１３３陽性神経幹細胞、Nestin陽性神経幹細胞、Sox2陽性神経幹細胞、Musashi1陽性神経幹細胞等があげられる。【００１８】
前駆細胞としては好ましくは造血前駆細胞、神経前駆細胞などがあげられる。造血前駆細胞としては、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞、ＣＤ３４陰性Ｌｉｎｅａｇｅ陰性造血前駆細胞等があげられる。神経前駆細胞としては、ＣＤ３４陽性神経前駆細胞、ＣＤ１３３陽性神経前駆細胞、Nestin陽性神経前駆細胞、Sox2陽性神経前駆細胞、Musashi1陽性神経前駆細胞等があげられる。【００１９】
これらの細胞を動物個体から回収後、培養により増殖させることもできる。また回収直後の細胞集団を用いてもよいし、冷凍などの保存処理後の細胞や、細胞分画処理や酵素処理を経た細胞集団を用いてもよい。
本発明の細胞は、E−セレクチンへの結合能、生体組織への移行能、生体組織への生着能に優れており、造血幹細胞移植や、幹細胞移植を利用した障害組織の修復に有用である。【００２０】
本発明の細胞が移行、生着する生体組織としては、骨髄組織または障害組織があげられる。骨髄組織としては、化学療法または放射線照射を受けた患者の骨髄組織があげられ、障害組織としては、脳、心臓、肺、腸管、腎臓、膵臓、肝臓、皮膚、血管等の組織の障害組織があげられる。
２．本発明の細胞の製造方法
本発明において用いられる細胞集団の製造方法としては、シアリルルイスＸ糖鎖が発現しておりルイスＸ糖鎖が実質的に発現していない細胞集団を単離することができる方法であれば、いかなる方法であってもよい。具体的な方法としては、細胞分画処理による製造方法や、フコース供与体の存在下、α１，３−フコシルトランスフェラーゼにより処理する方法等があげられる。【００２１】
細胞分画処理による製造方法としては、シアリルルイスＸ糖鎖及びルイスＸ糖鎖の識別により所望の細胞を回収する方法等があげられる。該方法としては、シアリルルイスＸ糖鎖及びルイスＸ糖鎖を認識する抗体を用いる方法、マイクロビーズおよび磁石を用いる方法、抗体を固定した担体で作製したカラムを用いる方法などがあげられる。
シアリルルイスＸ糖鎖及びルイスＸ糖鎖を認識する抗体を用いる方法としては、それぞれの糖鎖を認識する抗体を細胞と反応させた後、セルソーターによりシアリルルイスＸ糖鎖の発現が高く、ルイスＸ糖鎖の発現が低い細胞集団を回収する方法があげられる。発現が高い細胞集団とは、負対照の細胞集団よりも高い蛍光度を示す細胞集団のことをいう。負対照としては、アイソタイプ対照抗体を用いて反応させた細胞集団があげられる。発現が低い細胞集団とは正対照よりも低い蛍光度を示す細胞集団のことをいう。正対照としては、例えば血液細胞の場合は抗ＣＤ４５抗体を用いて反応させた細胞集団があげられる。【００２２】
マイクロビーズおよび磁石を用いる方法としては、ルイスＸ糖鎖陽性の細胞画分を除去した後、シアリルルイスＸ糖鎖陽性の細胞画分を回収する方法、もしくはシアリルルイスＸ糖鎖陽性の細胞画分を回収した後、ルイスＸ糖鎖陰性の細胞画分を回収する方法等があげられる。
フコース供与体の存在下、α１，３−フコシルトランスフェラーゼにより処理する方法としては、フコース供与体の存在下、細胞にα１，３−フコシルトランスフェラーゼを添加する方法、α１，３−フコシルトランスフェラーゼを保持したカラム、ディッシュ、バッグ、注射シリンジの中で細胞を処理する方法等があげられる。また、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入した細胞株やその抽出物などを用いて細胞を処理してもよい。【００２３】
α１，３−フコシルトランスフェラーゼとしては、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ７が好ましい。ヒトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ７としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。また、α１，３−フコシルトランスフェラーゼとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドや、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるポリペプチド、または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであって、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。【００２４】
また、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入した細胞株やその抽出物などを用いて細胞を処理する際に用いる遺伝子としては、ヒトα１，３−フコシルトランスフェラーゼ７をコードする遺伝子、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子や、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドコードする遺伝子、または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を用いてもよい。【００２５】
本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有し、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドとは、ＢＬＡＳＴ〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕やＦＡＳＴＡ〔Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上であるポリペプチドであることを意味する。【００２６】
本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質としては、例えば、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質があげられる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。【００２７】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ mol/Lの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ mmol/L塩化ナトリウム、１５ mmol/Lクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００２８】
フコース供与体としては、α１，３-フコシルトランスフェラーゼに対してフコースを供与することができるものであればいかなる供与体であってもよく、例えばGDP-フコース等があげられる。
３．本発明の細胞の生体組織への移行能、生着能を調べる方法
本発明の細胞集団の生体組織への移行能、生着能を調べる方法としては、例えばマウスに移植したヒト造血幹細胞のマウスの骨髄中における存在を調べる方法があげられる。半致死量のＸ線をマウスに照射した後、ヒト造血幹細胞を尾静脈注射により移植し、大腿骨および脛骨より骨髄細胞を回収してマウスの骨髄中の細胞を調べることができる。例えばヒトCD45陽性かつヒトCD34陽性細胞の細胞数を解析することによりマウス骨髄への移行能を調べることができ、ヒトCD45陽性細胞数とマウスCD45陽性細胞の合計に占めるヒトCD45陽性細胞の割合を算出することによりマウス骨髄への生着能を調べることができる。【００２９】
また同様にマウスに移植したヒト間葉系幹細胞のマウス組織内における存在を調べる方法があげられる。例えば四塩化炭素で惹起した肝障害、または肺障害[BioFactors, 26, 81-92 (2006)]モデル動物にヒト間葉系幹細胞を尾静脈またはその他の静脈、または組織直接投与により移植し、組織中の細胞を調べることができる。例えばヒト間葉系幹細胞はCD90陽性であり、肝臓・肺細胞などはストレプトアビジンに結合するので、ストレプトアビジン結合細胞当たりのヒトCD90陽性細胞の割合を算出することにより各組織へのヒト間葉系幹細胞の移行能を調べることができる。【００３０】
また同様にマウスに移植したマウス神経幹細胞のマウス組織内における存在を調べる方法があげられる。例えば動物に、蛍光標識したマウス神経幹細胞を尾静脈またはその他の静脈、または組織直接投与により移植し、組織中の細胞を調べることができる。蛍光標識細胞としては、蛍光蛋白Green Fluorescent Proteinを発現するトランスジェニックマウス[FEBS Lett., 407, 313-319 (1997)]から分離した細胞や、PKHなどを用いた生細胞標識法[Eur.J.Immunol., 28, 3066-3074 (1998)]により調製した細胞を用いることができる。
４．本発明の細胞を含有する医薬
本発明の細胞集団は、E−セレクチンへの結合能、生体組織への移行能、生体組織への生着能が優れているため、本発明の細胞を含有する医薬は、造血幹細胞移植や、幹細胞移植を利用した障害組織の修復に有用である。【００３１】
本発明の細胞集団を含有する医薬製剤は、活性成分として本発明の細胞を単独で、またはその薬理学的に許容される塩と共に、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、本発明の細胞集団を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、細胞製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。【００３２】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、本発明の細胞集団を含有する医薬については、静脈内等の経路をあげることができる。
注射剤等に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば注射剤の場合は、必要に応じて塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用い、注射用の溶液を調製することができる。また希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を必要に応じて添加することもできる。【００３３】
本発明の細胞集団を含有する医薬またはその薬理学的に許容される塩の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、１回につき１００個以上の細胞数を投与することが好ましい。
５．本発明の細胞の移植方法
本発明の細胞の移植方法としては、ヒトに移植可能な方法であればいかなる方法でもよい。具体的には、点滴、静脈注射による方法があげられるが、骨髄、脳、心臓、肺、腸管、腎臓、膵臓、肝臓などの各種組織に直接投与する方法であってもよい。【００３４】
以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は例示の目的のみに開示される。従って本発明の範囲は、下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
抗体、セレクチン-IgG融合蛋白質、α１，３-フコシルトランスフェラーゼの調製
Fluorescein isothiocyanate(FITC)標識抗ヒトルイスＸ抗体（HI98）、FITC標識抗マウスIgM抗体（II/41）、IgM アイソタイプコントロール抗体（11Ｅ10）、Phycoerythrin (PE)標識抗ヒトCD38抗体（HIT2）、PE標識抗マウスCD45抗体（30-F11）、PE標識抗マウスTER-119抗体（TER-119）、Allophycocyanin (APC)標識ヒトCD34抗体（581）はベクトンディッキンソン ファーミンジェン社から購入した。FITC標識とAPC標識のヒトCD45抗体（HI30）はeBioscience社から購入した。FITC標識抗ヒトIgG抗体はDAKOCytomation社から購入した。【００３６】
抗ヒトシアリルルイスＸ糖鎖抗体(KM93)はハイブリドーマ培養上清から回収した抗体を用いた[Hanaiら Cancer Research, 46, 4438-4443 (1986)]。
ヒトE-セレクチンとヒトIgG定常領域（Fc）の融合蛋白質（以下、E-セレクチン-Fcキメラ蛋白質という）、ならびにヒトP-セレクチンとFcの融合蛋白質（以下、P-セレクチン-Fcキメラ蛋白質という）の生産は公知の方法[Yagoら Journal of Immunology, 15, 707-714 (1997)]に従って行った。また、上記と同様にして、ヒトL-セレクチンとFcの融合蛋白質（以下、L-セレクチン-Fcキメラ蛋白質という）[Siegelmanら Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 5562-5566 (1989)]ならびにヒトCD40とFcの融合蛋白質（以下、CD40-Fcキメラ蛋白質という）[Hollenbaughら EMBO J, 11, 4313-4321 (1992)]の生産を行った。α１，３-フコシルトランスフェラーゼ６および７(FT6, FT7)はNamalwa細胞で発現させ、精製した[Shinodaら Journal of Biological Chemistry, 272, 31992-31997(1997)]。
ヒト臍帯血細胞とCD34陽性細胞
ヒト臍帯血由来造血幹細胞については、AllCells社より臍帯血単核球細胞を購入した。凍結細胞の融解と洗浄はAllCells社の説明書に従って実施した。【００３７】
凍結した細胞が入ったバイアルを３７℃ウォーターバスにつけ、すばやく解凍した後に、10％ Fetal Bovine Serum(FBS, JRH Biosciences社製)を含むDMEM（ギブコ社製）（以下10％FBS/DMEMという）を20 mLになるまでゆっくりと加えた。遠心操作（1.8 krpm、室温で8分間）の後に、上清を数mL残して上清を捨てた。この細胞洗浄操作を2回、行なった。【００３８】
臍帯血単核球細胞から造血幹細胞を回収するため、CD34マイクロビーズキット（Miltenyi Biotec社製）と分離機器AutoMACSTM（Miltenyi Biotec社製）を用いて、製品の使用説明書に従いCD34陽性細胞を分離した。
免疫不全マウス
NOD/SCIDマウスは実験動物中央研究所および日本クレアから購入し、動物飼育施設のアイソレーター内で飼育した。
α１，３-フコシルトランスフェラーゼ処理
上記により得られた臍帯血由来CD34陽性細胞を10 mmol/L MnCl2（シグマ社製）、1 mmol/L guanosine diphosphate (GDP)-Fucose（協和醗酵工業株式会社製）、0.1% Human Serum Albumin (HSA、シグマ社製)、20 mmol/L N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES、ギブコ社製)を含むフコシルトランスフェラーゼ反応溶液に、0.1-10x106の細胞を加えて100-1000 μLに懸濁した。0.1-1x106細胞当たりα１，３-フコシルトランスフェラーゼ７(FT7)を16 μg、あるいは、α１，３-フコシルトランスフェラーゼ６(FT6)を3μg、または、酵素未処理群として酵素を加えたフコシルトランスフェラーゼ反応溶液の代わりに酵素を加えていないフコシルトランスフェラーゼ反応溶液を添加後、37℃、5 % CO２の条件で１時間反応させた。
抗体染色及びフローサイトメトリー解析
酵素処理した細胞を染色溶液である5％FBS入りPBSで洗浄した後に、抗体を用いた細胞染色を行なった。負対照としてIgM アイソタイプコントロール抗体及び正対照としてFITC標識抗ヒトCD45抗体を使用した。細胞表面のシアリルルイスＸ糖鎖の発現量解析には、一次抗体として抗ヒトシアリルルイスＸ糖鎖抗体KM93、二次抗体としてFITC標識抗マウスIgM抗体を使用した。細胞表面のルイスＸ糖鎖の発現量解析にはFITC標識抗ヒトルイスＸ糖鎖抗体を使用した。またヒト造血幹細胞であるCD34陽性かつCD38陰性細胞を検出するため、PE標識抗ヒトCD38抗体とAPC標識抗ヒトCD34抗体を用いて細胞の抗体染色を行なった。移植マウスにおけるマウスとヒトの血液細胞をそれぞれ検出するため、FITC標識抗ヒトCD45抗体、PE標識抗マウスCD45抗体を用いた染色を行った。また、キメラ率が低い場合は、赤血球を除去するため、FITC標識抗マウスCD45抗体、PE標識抗マウスTER-119抗体、APC標識抗ヒトCD45抗体を用いて染色を行なった。【００３９】
細胞洗浄後にフローサイトメトリー(FACS)解析で死細胞を除去するために、細胞懸濁液にヨード化プロピジウム（Invitrogen社製）を終濃度１μg/mLになるように添加した。フローサイトメトリー機器FACSAria（ベクトンディッキンソン社製）を用いて、生細胞であるヨード化プロピジウム陰性細胞中のCD34陽性かつCD38陰性細胞集団のシアリルルイスＸ糖鎖、ルイスＸ糖鎖、CD45の発現量を解析した。
セレクチン結合アッセイ
細胞を0.5% HSA, 0.1 g/L CaCl2を含むD-PBS(+)（ギブコ社製）（以下、0.5 % HSA％/D-PBS(+)という）に懸濁し、106細胞あたりそれぞれ、E-セレクチン-Fcキメラ蛋白質1 μg、P-セレクチン-Fcキメラ蛋白質2 μg、L-セレクチン-Fcキメラ蛋白質 2 μg、負対照としてCD40-Fcキメラ蛋白質 2.2 μgを添加した。二次抗体としてFITC標識抗ヒトIgG抗体で染色した。蛋白結合および二次抗体反応は4℃、30分間ずつ行なった。0.5 % HSA％/D-PBS(+)で細胞洗浄を行なった後に、PE標識抗ヒトCD38抗体とAPC標識抗ヒトCD34抗体を加えて4℃、30分の条件下で染色した。細胞洗浄後にFACS解析で死細胞を除去するために、細胞懸濁液にヨード化プロピジウムを終濃度１μg/mLになるように添加した。FACSAriaによるFACS解析で生細胞であるヨード化プロピジウム陰性細胞中のCD34陽性かつCD38陰性細胞集団にゲートを設定し、セレクチン蛋白結合能を解析した。
ヒト造血幹細胞のNOD/SCIDマウスの骨髄移行アッセイ
臍帯血由来CD34陽性細胞をFT7またはFT6処理した細胞、あるいは負対照として酵素未処理の細胞をNOD/SCIDマウスに移植した。馴化のためマウスを1週間以上飼育した後の8-10週齢時に、Ｘ線照射装置MBR-1505R（日立メディコ社製）を用いて半致死量の400 cGyを照射した。一匹あたり3x105細胞のCD34陽性細胞を尾静脈注射により移植した。移植12-18時間後にマウスを安楽死させ、大腿骨および脛骨より骨髄細胞を回収した。FITC標識抗ヒトCD45抗体、PE標識抗マウスCD45抗体、APC標識抗ヒトCD34抗体により骨髄細胞を染色した。細胞を洗浄した後に塩化アンモニウム溶血剤を加えて赤血球を溶血し、ヨード化プロピジウムを終濃度１μg/mLになるように添加した。FACSAriaによるFACS解析で生細胞であるヨード化プロピジウム陰性細胞中のヒトCD45陽性かつヒトCD34陽性細胞を測定した。生細胞2x106細胞分のデータを取得し、ヒトCD45陽性かつヒトCD34陽性細胞を解析した。
ヒト造血幹細胞移植NOD/SCIDマウスの生着アッセイ
臍帯血由来CD34陽性細胞をFT7またはFT6処理した細胞、あるいは負対照として酵素未処理の細胞を、半致死量のＸ線量である250-300 cGy照射したNOD/SCIDマウスに移植した。馴化のためマウスを1週間以上飼育した後の8-10週齢時にＸ線照射装置MBR-1505R（日立メディコ社製）を用いたＸ線照射を行った後、移植を実施した。一匹あたり2x105細胞のCD34陽性細胞を尾静脈注射により移植した。また、臍帯血単核細胞に同様の酵素処理を行い、一匹あたり1x107細胞を、X線照射を行ったマウスに同様に移植した。細胞移植8-9週間後にマウスを安楽死させ、大腿骨および脛骨より骨髄細胞を回収した。FITC標識抗ヒトCD45抗体、PE標識抗マウスCD45抗体により骨髄細胞を染色した。キメラ率が低い場合は、低頻度のヒト血液細胞を検出するため、FITC標識抗マウスCD45抗体、PE標識抗マウスTER-119抗体、APC標識抗ヒトCD45抗体で染色した。【００４０】
細胞を洗浄した後に、塩化アンモニウム溶血剤を加えて赤血球を溶血し、ヨード化プロピジウムを終濃度１μg/mLになるように添加した。FACSAriaによるFACS解析で生細胞であるヨード化プロピジウム陰性細胞中の、ヒトCD45陽性細胞とマウスCD45陽性細胞を解析した。マウスTER-119抗体使用時はTER-119陰性中のヒトCD45陽性細胞とマウスCD45陽性細胞を解析した。ヒト血液細胞の生着率は、ヒトCD45陽性細胞数とマウスCD45陽性細胞の合計に占めるヒトCD45陽性細胞の割合(%)で算出した。
有意差検定
すべての値は平均値±SDで示した。有意差検定はStudent’s t-testを用いた。
ヒトCD34陽性細胞のシアリルルイスＸ糖鎖とルイスＸ糖鎖の発現解析
臍帯血単核球細胞より分離したヒトCD34陽性細胞の解析結果を図１に示す。図１に示す通り、その純度は95-99%だった。ヒト造血幹細胞を分離するため、CD34陽性かつCD38陰性細胞を図１Ａの白い四角で囲んだ部分（5〜10%）でゲートした。このCD34陽性かつCD38陰性細胞のシアリルルイスＸ糖鎖とルイスＸ糖鎖の発現量を解析した結果を図２Ａ、Ｂに示す。図２Ａ、Ｂに示した通り、この細胞集団はシアリルルイスＸ糖鎖が発現していたが、ルイスＸ糖鎖の発現は低かった。【００４１】
次にFT6あるいはFT7により処理したCD34陽性かつCD38陰性細胞のシアリルルイスＸ糖鎖の発現量を解析した。その結果を図２Ｃ、図２Ｅにそれぞれ示す。図２Ｃ、図２Ｅに示した通り、両酵素ともシアリルルイスＸ糖鎖の発現量を顕著に増加させた。次にルイスＸ糖鎖の発現量を解析した。その結果を図２Ｄ、図２Ｆにそれぞれ示す。図２Ｆに示した通り、FT7により処理したCD34陽性かつCD38陰性細胞ではルイスＸ糖鎖発現量は増加しないが、図２Ｄに示した通り、FT6処理したCD34陽性かつCD38陰性細胞ではルイスＸ糖鎖発現量は顕著に増加した。本解析の結果を数値化したものを表１に示す。
【表１】
2009020201.tif 000002
上記と同様の解析を独立に５回行った結果を表２に示す。表２に示した通り、前記の結果は５回に渡る解析において再現性を示していた。
【表２】
2009020201.tif 000003
ヒトCD34陽性細胞のセレクチンに対する結合活性
FT6あるいはFT7により処理した、ヒトCD34陽性細胞のE-セレクチン、P-セレクチン、L-セレクチンのそれぞれへの結合を解析した。その結果を図３および表３に示す。図３および表３に示した通り、FT7処理によりヒトCD34陽性細胞のE-セレクチンへの結合能が顕著に増加した。またP-セレクチンへの結合能も増加した。このE-セレクチンおよびP-セレクチンへの結合能の増加は、FT6処理の場合と同様の結果であった。
【表３】
2009020201.tif 000004
ヒト造血幹細胞のNOD/SCIDマウスにおける骨髄移行活性
静脈注射により末梢血中に移植された造血幹細胞は数時間で末梢血中から消失し、骨髄組織へと移行し、生着する。臍帯血由来CD34陽性細胞をFT6またはFT7で処理した細胞、あるいは負対照として未処理細胞をNOD/SCIDマウスに移植し、12-18時間後の骨髄におけるヒトCD45陽性かつヒトCD34陽性細胞を検出した。その結果を図４および表４に示す。図４および表４に示した通り、骨髄移行活性はFT6処理では増加しなかったのに対し、FT7処理では3.1-3.5倍に有意に増加した。以上のことからFT6とFT7の2種類のフコシルトランスフェラーゼ処理のうち、骨髄移行性は、FT6処理では全く増加しないこと、FT7処理では顕著に増加することが明らかになった。
【表４】
2009020201.tif 000005
ヒト造血幹細胞のNOD/SCIDマウスにおける生着活性
フコシルトランスフェラーゼにより処理したCD34陽性細胞をNOD/SCIDマウスに移植し、8-9週間後の骨髄におけるヒト血液細胞の割合を調べた。その結果を図５に示す。図５に示した通り、FT6処理した細胞移植群は、酵素未処理群と同様の結果であり、生着向上の効果はなかった。一方、FT7処理した移植群では、98-99%のヒト由来細胞の生着率を示した。これはマウスの血液細胞のほぼすべてがヒト血液細胞に置き換わっていることを示している。【００４２】
これと同様の解析を独立に４回行った結果を図６に示す。図６に示した通り、FT6処理は生着率の向上がないこと、及びFT7処理による生着率向上は再現性と安定性が高いことが明らかになった。また、移植する際のCD34陽性細胞数を半分の1x106細胞にして移植した実験においても、FT7処理による生着向上、及びFT6処理による生着向上がないことを確認した。【００４３】
なお、CD34陽性細胞の分離操作をしていない臍帯血単核細胞をFT7処理した後、移植した場合においても、酵素未処理細胞を移植した場合と比較して、短期間に有意な生着向上が見られることを確認した。一方、FT6処理した臍帯血単核球細胞を移植した場合においては、未処理の細胞移植と比べて有意な生着向上は確認されなかった。
【実施例２】
【００４４】
肝炎モデルにおける間葉系幹細胞の肝臓への移行
１．ヒト間葉系幹細胞におけるルイスＸ糖鎖およびシアリルルイスＸ糖鎖の発現解析
ヒト間葉系幹細胞（以下hMSCと略記する）はCAMBREX社より購入した。hMSCをMSCGM培地（CAMBREX社製）を用いて、37℃、5％CO2の条件でCO2インキュベーターにて培養した。phosphate-buffered saline （以下、PBS(-)と略記する）で洗浄し、TrypLE Select（Invitrogen社製）を加えて37℃で2分間処理して細胞をはがした後、5%FBS入りPBS(-)溶液を加えて反応を停止した。1000 rpm（回転/分）、5分間遠心分離することで細胞を回収し、PBS(-)で洗浄した後、1-2×106細胞をHanks' Balanced Salt Solutions（HBSS）反応液［25 mmol/L HEPES（Gibco社製）、10 mmol/L MnCl2（SIGMA社製）、0.1% HSA、HBSS(-)（Gibco社製）］80-100 μLに懸濁した。1×106細胞当りFT7を4-16 μg添加し、GDP-Fucose（協和醗酵工業株式会社製）を終濃度1 mmol/Lになるように調整し、37℃で1時間インキュベートした。一方、陰性コントロールとしては、hMSCをHBSS反応液のみで37℃で1時間インキュベートした。PBS(-)で3回洗浄し、5%FBS入りPBS(-)溶液に懸濁し、1×105細胞ずつ分注した。抗ルイスＸ糖鎖抗体としてFITC標識抗ヒトCD15抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を5%の濃度で添加し、4℃で１時間反応させた。一方、抗シアリルルイスＸ糖鎖抗体として抗ヒトシアリルルイスＸ糖鎖抗体KM93（CALBIOCHEM社）を5%の濃度で添加し、4℃で30分間反応させた。5%FBS入りPBS(-)溶液で洗浄した後、4500 rpm、1分間遠心分離することで細胞を回収し、5%FBS入りPBS(-)溶液に懸濁した。二次抗体としてFITC標識抗マウスIg抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を5%の濃度で添加し、4℃で30分間反応させた。抗ヒトルイスＸ糖鎖抗体処理細胞および、抗ヒトシアリルルイスＸ糖鎖抗体処理後二次抗体で処理した細胞を、5%FBS入りPBS(-)溶液で3回洗浄後、5%FBS入りPBS(-)溶液1 mLに懸濁し、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社；FACS Aria）にて解析した。その結果を図７に示す。図７に示したように、hMSCにおいてはルイスＸ糖鎖の発現は認められず、シアリルルイスＸ糖鎖も殆ど発現していなかった。さらに、FT7処理によりルイスX糖鎖は増加せず、シアリルルイスX糖鎖のみが選択的に増加することが判明した。【００４５】
また、細胞を0.5% HSA、0.1 g/L CaCl2を含むD-PBS(+)（ギブコ社製）[以下、0.5 % HSA％/D-PBS(+)という］に懸濁し、1-5×105細胞あたりそれぞれ、E-セレクチン-Fcキメラ蛋白質1 μg、P-セレクチン-Fcキメラ蛋白質2 μgまたはL-セレクチン-Fcキメラ蛋白質 2 μgを添加した。二次抗体としてFITC標識抗ヒトIgG抗体で染色した。蛋白結合および二次抗体反応は4℃、30分間ずつ行なった。0.5 % HSA％/D-PBS(+)で細胞洗浄を行なった後に、FACS解析で死細胞を除去するために、細胞懸濁液にヨード化プロピジウムを終濃度１μg/mLになるように添加した。FACSAriaによるFACS解析で生細胞であるヨード化プロピジウム陰性細胞のセレクチン蛋白結合能を解析した。その結果を表５に示す。表５に示したように、FT7処理により平均蛍光強度（MFI：Mean fluorescence intensity）、すなわちE, P, L-セレクチン結合能の上昇が確認された。
【表５】
2009020201.tif 000006
【００４６】
２．マウス四塩化炭素肝障害モデルの作製
5週齢、雄のBALB/c-nu/nu Slcマウス（日本エスエルシー社）を1週間馴化飼育した。四塩化炭素（和光社製）をオリーブオイル（和光社製）で10倍に希釈し、四塩化炭素を1 mL/kgの割合でBALB/c-nu/nu Slcマウスに腹腔内投与を行い、急性肝障害を惹起した。
３．マウス四塩化炭素肝障害モデルへのhMSCの移植および肝臓移行細胞の解析（１）
前述のようにFT7酵素処理したhMSC、陰性コントロールのhMSCをPBS(-)に懸濁し、1×106 cells/mLに調整した。四塩化炭素投与24時間後のBALB/c-nu/nu Slcマウスに対して混合麻酔液［ドルミカム注射液（アステラス製薬社製）、ドミトール（明治製菓社製）、ネンブタール（大日本住友製薬社製）、生理食塩水を3:3:10:110で混合］を40 μL/head筋肉注射することで麻酔した。開腹して脾臓にFT7酵素処理hMSC、またはコントロールhMSCを1×105  cells/head移植した（各群n=5）。移植24時間後に肝臓を摘出し、コラゲナーゼ反応液［0.04%コラゲナーゼタイプＩＶ（SIGMA社製）、0.004%トリプシンインヒビタ−（SIGMA社製）、5 mmol/L CaCl2（ナカライテスク社製）、 HBSS(-)（ナカライテスク社製）］中で細かく切り刻み、37℃で2時間インキュベートした。100 μmのメンブレン（ベクトン・ディッキンソン社製）で濾過し、5%FBS入りPBS(-)溶液で3回洗浄した後、同じ溶液に懸濁し、1×108細胞ずつ分注した。ビオチン標識Mouse Lineage Panel（ベクトン・ディッキンソン社製）を2%の濃度で添加し、4℃で１時間反応させた。5%血清入りPBS(-)溶液で洗浄した後、4500 rpm、1分間遠心分離することで細胞を回収し、5%FBS入りPBS(-)溶液に懸濁した。さらに、PerCP標識ストレプトアビジン（ベクトン・ディッキンソン社製）、およびPE標識抗ヒトCD90抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を10%の濃度で添加し、4℃で2時間反応させた。5%FBS入りPBS(-)溶液で3回洗浄後、同じ溶液1 mLに懸濁し、フローサイトメトリーにて解析した。肝臓由来の血球系細胞はMouse Lineage Panelで処理後、PerCP標識ストレプトアビジンで処理することから、また肝臓細胞はストレプトアビジンに結合することから、採取したマウス肝臓由来の全細胞はPerCP陽性細胞として検出することができ、一方、マウス肝臓由来細胞はヒトCD90抗体には反応しないので、hMSCを特異的に染色することができるため、PerCP陽性細胞数当りのPE陽性細胞数は、移植したhMSCの肝臓への移行率(%)として表せる。フローサイトメトリーにより解析した結果を図８に示す。図８に示したように、FT7酵素処理により移植したhMSCは、肝臓への移行率の向上が認められた。これはFT7酵素処理により、ルイスＸ糖鎖は増加させずにシアリルルイスＸ糖鎖のみが付加された細胞は障害部位への移行性が向上したことを示している。
４．マウス四塩化炭素肝障害モデルへのhMSCの移植および肝臓移行細胞の解析（２）
前述のようにFT7酵素処理したhMSC、陰性コントロールのhMSCをPBS(-)に懸濁し、2.5×106 cells/mLに調整した。四塩化炭素投与24時間後のBALB/c-nu/nu Slcマウスに対して、尾静脈よりFT7酵素処理hMSC、またはコントロールhMSCを5×105 cells/head移植した（各群n=6）。移植18時間後に肝臓を摘出し、前述のように処理し、その後溶血処理後、3×106細胞ずつ分注した。【００４７】
PE-Cy7標識ストレプトアビジン（ベクトン・ディッキンソン社製）、PE標識ヒトCD90抗体を10%の濃度、FITC標識マウスCD45抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、FITC標識マウスTer119抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を5%の濃度で添加し、4℃で2時間反応させた。5%FBS入りPBS(-)溶液で3回洗浄後、同じ溶液1 mLに懸濁し、フローサイトメトリーにて解析した。FITCで標識された血球細胞を除いたFITC陰性PE-Cy7陽性細胞を肝臓細胞、PE陽性細胞をhMSCとし、100万個肝臓細胞当りのhMSCの細胞数を算出した。その結果を図９に示す。図９で示したように、FT7で処理することにより、肝臓への有意な移行細胞数の増加が認められた。
５．マウス四塩化炭素肝障害モデルへのhMSCの移植および血清生化学パラメーター解析
４．と同様の方法で、FT7酵素処理したhMSCまたは陰性コントロールhMSCを肝障害マウスに移植、または溶媒（PBS）を投与した（各群n=6）。移植18時間後に採血し、富士ドライケム（富士フィルム社製）により血清中total bilirubin（T-BIL）、aspartate aminotransferase（AST）、alanine aminotransferase（ALT）、alkaline phosphatase（ALP）、lactate dehydrogenase（LDH）を測定した。その結果を図１０に示す。図１０に示したように、FT7で処理することにより、血液生化学パラメーターの有意な改善が認められた。
【実施例３】
【００４８】
肺炎モデルにおける間葉系幹細胞の肺への移行
１．マウス四塩化炭素肺障害モデルの作製
5週齢、雄のBALB/c-nu/nu Slcマウス（日本エスエルシー社）を1週間馴化飼育した。四塩化炭素（和光社製）をオリーブオイル（和光社製）で10倍に希釈し、四塩化炭素を1 mL/kgの割合でBALB/c-nu/nu Slcマウスに腹腔内投与を行い、急性肺障害を惹起した[Mizuguchiら BioFactors, 26, 81-92 (2006)]。
２．マウス四塩化炭素肺障害モデルへのhMSCの移植および解析
実施例２と同様の方法で、FT7酵素処理したhMSC、陰性コントロールのhMSCをPBS(-)に懸濁し、2.5×106 cells/mLに調整した。四塩化炭素投与24時間後のBALB/c-nu/nu Slcマウスに対して、FT7酵素処理hMSC、またはコントロールhMSCを5×105 cells/head移植した（各群5匹）。移植18時間後に肺を摘出し、コラゲナーゼ・エラスターゼ反応液[150 U/mLコラゲナーゼタイプＩＶ（SIGMA社製）、10 U/mL エラスターゼ（ナカライテスク社製） DMEM（Invitrogen社製）]中で細かく切り刻み、37℃で2時間インキュベートした。100 μmのメンブレン（ベクトン・ディッキンソン社製）で濾過し、溶血処理後5%FBS入りPBS(-)溶液で2回洗浄した後、同じ溶液に懸濁し、3×106細胞ずつ分注した。PE-Cy7標識ストレプトアビジン、PE標識ヒト抗CD90抗体を10%の濃度、FITC標識抗マウスCD45抗体、FITC標識抗マウスTer119抗体を5%の濃度で添加し、4℃で2時間反応させた。5%FBS入りPBS(-)溶液で3回洗浄後、同じ溶液1 mLに懸濁し、フローサイトメトリーにて解析した。FITCで標識された血球細胞を除いたFITC陰性PE-Cy7陽性細胞を肺細胞、PE陽性細胞をhMSCとし、10万個肺細胞当りのhMSCの細胞数を算出した。その結果を図１１に示す。図１１で示したように、FT7で処理することにより、肺への有意な移行細胞数の増加が認められた。
【実施例４】
【００４９】
抗体、セレクチン-IgG融合蛋白質、α１，３-フコシルトランスフェラーゼの調製
Fluorescein isothiocyanate(FITC)標識抗ルイスＸ抗体（HI98）、FITC標識抗マウスIgM抗体（II/41）、IgM アイソタイプコントロール抗体（11Ｅ10）はベクトンデッキンソン ファーミンジェン社から購入した。FITC標識とAPC標識のヒトCD45抗体（HI30）はeBioscience社から購入した。FITC標識抗ヒトIgG抗体はDAKOCytomation社から購入した。【００５０】
抗シアリルルイスＸ糖鎖抗体(KM93)はハイブリドーマ培養上清から回収した抗体を用いた[Hanaiら Cancer Research, 46, 4438-4443 (1986)]。
ヒトE-セレクチンとヒトIgG定常領域（Fc）の融合蛋白質（以下、E-セレクチン-Fcキメラ蛋白質という）、ならびにヒトP-セレクチンとFcの融合蛋白質（以下、P-セレクチン-Fcキメラ蛋白質という）の生産は公知の方法[Yagoら Journal of Immunology, 15, 707-714 (1997)]に従って行った。また、上記と同様にして、ヒトL-セレクチンとFcの融合蛋白質（以下、L-セレクチン-Fcキメラ蛋白質という）[Siegelmanら Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 5562-5566 (1989)]、ならびにヒトCD40とFcの融合蛋白質（以下、CD40-Fcキメラ蛋白質という）[Hollenbaughら EMBO J, 11, 4313-4321 (1992)]の生産を行った。α１，３-フコシルトランスフェラーゼ７(FT7)はNamalwa細胞で発現させ、精製した[Shinodaら Journal of  Biological Chemistry, 272, 31992-31997(1997)]。
神経幹細胞の培養
ニューロスフェアは神経幹細胞・神経前駆細胞を含んだ細胞である。凍結されたマウス胎児中枢神経（Cortex）由来ニューロスフェア（ステムセルテクノロジー社製）を、ステムセルテクノロジー社の説明書に従って凍結細胞の融解・洗浄および培養を実施した。凍結細胞を融解した後、NeuroCult 増殖培地（ステムセルテクノロジー社製）と遠心分離により細胞洗浄を行い、組換えヒトEpidermal Growth Factor (rh EGF, ステムセルテクノロジー社製)20 ng/mL入りのNeuroCult 増殖培地に懸濁し、37℃、5% CO2のインキュベーターで7日間培養した。増殖したニューロスフェアを回収し、NeuroCult Chemical dissociation Kit(ステムセルテクノロジー社製)を用いて、ニューロスフェアを単一細胞に分離し懸濁した。
α１，３-フコシルトランスフェラーゼ処理
上記により得られた単一細胞に懸濁したニューロスフェア由来の0.1-10x105細胞を10 mmol/L MnCl2(シグマ社製)、1 mmol/L guanosine diphosphate (GDP)-Fucose（協和醗酵工業株式会社製）、0.1% Human Serum Albumin (HSA、シグマ社製)、20 mmol/L N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES、ギブコ社製)を含むフコシルトランスフェラーゼ反応溶液に加えて、100-1000 μLに懸濁した。0.1-1x105細胞当たりα１，３-フコシルトランスフェラーゼ７(FT7)を16 μg添加した反応溶液、または、酵素未処理群として酵素を加えたフコシルトランスフェラーゼ反応溶液の代わりに酵素を加えていないフコシルトランスフェラーゼ反応溶液を用いて、37℃、5 % CO２の条件で細胞を１時間反応させた。
抗体染色及びフローサイトメトリー解析
酵素処理した細胞を染色溶液である5％FBS入りPBSで洗浄した後に、抗体を用いた細胞染色を行なった。負対照としてIgM アイソタイプコントロール抗体を使用した。細胞表面のシアリルルイスＸ糖鎖の発現量解析には、一次抗体として抗ヒトシアリルルイスＸ糖鎖抗体KM93、二次抗体としてFITC標識抗マウスIgM抗体を使用した。細胞表面のルイスＸ糖鎖の発現量解析にはFITC標識抗ルイスＸ糖鎖抗体を使用した。【００５１】
細胞洗浄後にフローサイトメトリー(FACS)解析で死細胞を除去するために、細胞懸濁液にヨード化プロピジウム（Invitrogen社製）を終濃度１μg/mLになるように添加した。フローサイトメトリー機器FACSAria（ベクトンデッキンソン社製）を用いて、生細胞であるヨード化プロピジウム陰性細胞のシアリルルイスＸ糖鎖、ルイスＸ糖鎖の発現量を解析した。
セレクチン結合アッセイ
細胞を0.5% HSA, 0.1 g/L CaCl2を含むD-PBS(+)（ギブコ社製）（以下、0.5 % HSA％/D-PBS(+)という）に懸濁し、106細胞あたりそれぞれ、E-セレクチン-Fcキメラ蛋白質1 μg、P-セレクチン-Fcキメラ蛋白質2 μg、L-セレクチン-Fcキメラ蛋白質 2 μg、負対照としてCD40-Fcキメラ蛋白質 2.2 μgを添加した。二次抗体としてFITC標識抗ヒトIgG抗体で染色した。蛋白結合および二次抗体反応は4℃、30分間ずつ行なった。0.5 % HSA％/D-PBS(+)で細胞洗浄後にFACS解析で死細胞を除去するために、細胞懸濁液にヨード化プロピジウムを終濃度１μg/mLになるように添加した。FACSAriaによるFACS解析で生細胞であるヨード化プロピジウム陰性細胞のセレクチン蛋白結合能を解析した。
マウスニューロスフェアのシアリルルイスＸ糖鎖とルイスＸ糖鎖の発現解析
マウスニューロスフェアのシアリルルイスＸ糖鎖とルイスＸ糖鎖の発現量を解析した結果を図１２に示す。図１２上段（未処理群）に示した通り、マウスニューロスフェアはシアリルルイスＸ糖鎖およびルイスＸ糖鎖の発現が陰性であった。【００５２】
次にFT7により処理したマウスニューロスフェアのシアリルルイスＸ糖鎖とルイスＸ糖鎖の発現量を解析した。その結果を図１２下段（FT7処理）に示す。図１２下段に示した通り、FT7処理はシアリルルイスＸ糖鎖の発現量を顕著に増加させた。一方、ルイスＸ糖鎖の発現量には変化がなかった。
神経幹細胞のセレクチンに対する結合活性
FT7により処理した、マウスニューロスフェア由来神経幹細胞・神経前駆細胞のP-セレクチン、E-セレクチン、L-セレクチンのそれぞれへの結合を解析した。その結果を図１３に示す。図１３に示した通り、FT7処理によりマウスニューロスフェア由来神経幹細胞・神経前駆細胞のE-セレクチンへの結合能が顕著に増加した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、組織への移行能や生着能に優れた細胞集団、該細胞集団を含有する医薬、該細胞集団の移植方法が提供される。本発明の細胞集団は障害組織の修復等に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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