(57)【要約】ＭＭＰ１３と特異的に反応する中和モノクローナル抗体、該抗体を用いたＭＭＰ１３の酵素活性中和方法及び免疫学的測定方法、並びに該抗体を含有した診断薬及び医薬組成物を提供する。これまでＭＭＰ１３に対する種々の抗体が得られてきたがＭＭＰ１３に対して中和活性を有する抗体を得られていなかった。本発明者等が鋭意検討した結果、ＭＭＰ１３に対して特異性を有する中和抗体を見出して本発明を完成するに至った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＭＰ１３と特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする請求項１または２記載のモノクローナル抗体
【請求項４】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９６８であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体の性質を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９６８であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ヒト抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項８】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９６８である請求項７記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＭＭＰ１３の免疫学的測定方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＭＭＰ１３の酵素活性中和方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含むＭＭＰ１３が関与する疾患の診断薬。
【請求項１２】
ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である請求項１１記載の診断薬。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、ＭＭＰ１３が関与する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項１４】
ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物を投与する工程を包含する、ＭＭＰ１３が関与する疾患を処置または予防するための方法。
【請求項１６】
ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である請求項１５記載の疾患を処置または予防するための方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の、ＭＭＰ１３が関与する疾患を処置または予防するための医薬の製造のための使用。
【請求項１８】
ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である請求項１７記載の医薬の製造のための使用。
【請求項１９】
ＭＭＰ１３が関与する疾患の処置または予防に使用するための請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である請求項１９記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＭＰ１３に対する中和モノクローナル抗体に関する。さらに詳しくは、ＭＭＰ１３に対する中和活性を有するモノクローナル抗体を用いたＭＭＰ１３の酵素活性中和方法及び免疫学的測定方法、並びに該抗体を含有した診断薬及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスは、IV型コラーゲン等のコラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパラン硫酸等の接着性糖タンパク質をはじめとする複雑な成分から構成されている。この細胞外マトリックスの分解には、基質特異性を異にするマトリックスメタロプロテアーゼ（以下ＭＭＰと略記する）と総称される一群の酵素が関与している。これまでにＭＭＰとしては、間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ１）、７２ｋＤａゼラチナーゼ（ＩＶ型コラゲナーゼあるいはゼラチナーゼＡともいう：ＭＭＰ２）、ストロムライシン−１（ＭＭＰ３）、マトリライシン（ＭＭＰ７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、９２ｋＤａ  ゼラチナーゼ（ＩＶ型コラゲナーゼあるいはゼラチナーゼＢともいう：ＭＭＰ９）、ストロムライシン−２（ＭＭＰ１０）、ストロムライシン−３（ＭＭＰ１１）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ１２）、コラゲナーゼ３（ＭＭＰ１３）、膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）等が報告されている。【０００３】
そのＭＭＰ中の一つであるＭＭＰ１３は、別名コラゲナーゼ３とも呼ばれ、関節軟骨の深部にある軟骨細胞、癌等で多く発現している。ＭＭＰ１３はＩ型〜ＩＩＩ型コラーゲン及びゼラチンに特異的な細胞外マトリックス分解酵素である。ＭＭＰ１３は軟骨の主要な細胞外マトリックスであるＩＩ型コラーゲンに対しては非常に特異性が高く、軟骨の代謝において重要な役割を果たす。変形性関節症はＩＩ型コラーゲンを中心とした細胞外マトリックスの破壊と軟骨の変性を伴う関節の疾患であり、ＭＭＰ１３が軟骨細胞の細胞外基の破壊を通じて変形性関節症の発症に関与している（例えば、非特許文献１参照）。ＭＭＰ１３の活性を阻害することにより、軟骨の主要な細胞外マトリックスであるＩＩ型コラーゲンの分解が抑制され、変形性関節症の発症が抑えられると期待されている。したがって、ＭＭＰ１３の中和抗体は、ＭＭＰ１３が関与する疾患の阻害剤の探索、診断、あるいは治療薬として有用である。【０００４】
ＭＭＰ１３はＮ末端のシグナルペプチドに続き、プロペプチドドメイン、触媒ドメイン、及びＣ−末端のヘモペキシン凝血酵素様ドメインから構成されている。触媒ドメインには、活性に必須である亜鉛イオンが結合する亜鉛イオン結合領域が存在する。触媒ドメインのアミノ酸配列は、種を通じて保存されており、ヒトの触媒ドメインは、ラット、マウス、イヌ、ウサギとそれぞれ９４％、９４％、９８％、９６％の相同性を有している。また、ヒトＭＭＰ１３の触媒ドメインはヒトＭＭＰ２、ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の触媒ドメインと相同性が高く、それぞれ７７％、７３％、７３％おおび７３％の相同性を有している。ＭＭＰ１３の触媒ドメインを認識する抗体が中和活性を有する可能性があるが、ＭＭＰ１３の触媒ドメインはヒトＭＭＰ２、ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の触媒ドメインと相同性が高く、ＭＭＰ１３を特異的に認識する中和抗体を得ることは困難であった。【０００５】
ＭＭＰ１３を認識する抗体としては、これまでに大腸菌で生産したリコンビナントＭＭＰ１３に対するポリクローナル抗体がウサギで作製されたことが報告されており、そこではそのポリクローナル抗体を乳癌の組織染色に使用している（非特許文献２参照）。一方、ＭＭＰ１３を認識するモノクローナル抗体としては、活性型ＭＭＰ１３及び潜在型ＭＭＰ１３の双方に特異的に反応するもの、潜在型ＭＭＰ１３のみに特異的に反応するもの、あるいは活性型ＭＭＰ１３のみに特異的に反応する抗体が報告されている（特許文献１参照）。それらのモノクローナル抗体は、他のマトリックスメタロプロテアーゼと交差反応せず、潜在型ＭＭＰ１３と活性型ＭＭＰ１３を分別して定量する方法に使用することができる。しかし、これらの抗体が、ＭＭＰ１３の酵素活性を阻害するとの報告はない。【０００６】
特許文献２には、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９と結合し、それらの酵素活性を阻害する抗体が記載されているが、ＭＭＰファミリーの亜鉛イオン結合領域に共通の構造である金属イオンとポルフィリンからなるハプテンを用いてモノクローナル抗体を作製している。したがって、この抗体は特性に問題があった。
ＭＭＰ１３の触媒ドメインは前記したように、ＭＭＰ２、ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９等の触媒ドメインとアミノ酸配列が保存されていることから、ＭＭＰ１３の活性に関与する領域を認識し、かつＭＭＰ１３特異的反応性を有する中和抗体を作製することは困難であった。実際に、ＭＭＰ１３あるいはそのペプチドを抗原として用いて、ＭＭＰ１３の酵素活性を阻害する中和モノクローナル抗体を得たという報告はない。
【特許文献１】国際公開第９８／２９５６０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０８７０４２号パンフレット
【非特許文献１】J. Clin. Invest.、1997年、99巻、 7号、pp.1534-1545
【非特許文献２】J. Biol. Chem.、1994年、  269巻、 pp.16766-16773
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在知られているＭＭＰ１３と特異的に反応するモノクローナル抗体は中和活性を有さない。したがって、ＭＭＰ１３の阻害剤の探索、ＭＭＰ１３の機能解析、ＭＭＰ１３の関与する疾患の診断、あるいはＭＭＰ１３の関与する疾患の治療に用いることができる中和抗体が待たれている。本発明の課題はＭＭＰ１３と特異的に反応する中和モノクローナル抗体、該抗体を用いたＭＭＰ１３の酵素活性中和方法及び免疫学的測定方法、並びに該抗体を含有した診断薬及び医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これまでＭＭＰ１３に対する種々の抗体が得られてきたがＭＭＰ１３に対して中和活性を有する抗体を得られていなかった。本発明者等が鋭意検討した結果、ＭＭＰ１３に対して特異性を有する中和抗体を見出して本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）ＭＭＰ１３と特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体、
（２）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする（１）記載のモノクローナル抗体、
（３）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする（１）または（２）記載のモノクローナル抗体、
（４）受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９６８であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体の性質を有することを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
（５）受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９６８であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体である、（１）〜（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
（６）ヒト抗体である、（１）〜（４）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ、
（８）受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９６８である（７）記載のハイブリドーマ、
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＭＭＰ１３の免疫学的測定方法、
（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＭＭＰ１３の酵素活性中和方法、
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むＭＭＰ１３が関与する疾患の診断薬、
（１２）ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である（１１）記載の診断薬、
（１３）（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、ＭＭＰ１３が関与する疾患を治療または予防するための医薬組成物、
（１４）ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である（１３）記載の医薬組成物、
（１５）（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物を投与する工程を包含する、ＭＭＰ１３が関与する疾患を処置または予防するための方法、
（１６）ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である（１５）記載の疾患を処置または予防するための方法、
（１７）（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体の、ＭＭＰ１３が関与する疾患を処置または予防するための医薬の製造のための使用、
（１８）ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である（１７）記載の医薬の製造のための使用、
（１９）ＭＭＰ１３が関与する疾患の処置または予防に使用するための（１）〜（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
（２０）ＭＭＰ１３が関与する疾患が、変形性関節症である（１９）記載のモノクローナル抗体、に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に従えばＭＭＰ１３と特異的に反応しＭＭＰ１３の酵素活性を中和するモノクローナル抗体を得ることができ、その得られたモノクローナル抗体を用いてＭＭＰ１３の免疫学的測定あるいは機能解析を行うことができる。本発明によれば、さらにそのモノクローナル抗体を含む診断薬あるいは医薬組成物を得ることができる。特にＭＭＰ１３は、癌転移やリウマチなどの関節炎で重要な役割をしていることが報告されており、こうした疾患の診断あるいは治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）と免疫原ペプチドの結合に対するＭＭＰ１３部分ペプチド（１−６）による置換曲線を示す。
【図２】図２は、ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）と免疫原ペプチドの結合に対するＭＭＰｆａｍｉｌｙによる置換曲線を示す。
【図３】図３は、ラットＭＭＰ１３触媒ドメイン、モルモットＭＭＰ１３触媒ドメイン、ヒトＭＭＰ１３（活性型、前駆体型）による置換曲線を示す。
【図４】図４は、合成基質を用いたＭＭＰ１３抗体によるＭＭＰ１３酵素活性の阻害を示す。
【図５】図５は、ＩＩ型コラーゲンを用いたＭＭＰ１３抗体によるＭＭＰ１３酵素活性の阻害を示す。
【図６】図６はヒト軟骨単層培養系を用いたＭＭＰ１３によるコラーゲン分解阻害活性評価法におけるＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）の阻害効果を示す。
【図７】図７はＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）を用いたＭＭＰ１３の免疫学的測定方法の検量線を示す。
【図８】図８は、合成基質を用いたＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）あるいは市販のＭＭＰ１３抗体によるＭＭＰ１３酵素活性の阻害を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において使用される言語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いる意味で用いられる。【００１３】
本発明でいう「ＭＭＰ１３」とは、哺乳動物のＭＭＰ１３を意味し、特に好ましくはヒト由来のＭＭＰ１３を意味する。哺乳動物とは、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等を意味し、好ましくは、ヒト、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスであり、特に好ましくは、ヒト、ラット、またはマウスである。ヒト由来のＭＭＰ１３は配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのことをいう。ラットＭＭＰ１３のアミノ酸配列はＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ；Ｐ２３０９７に記載されている。マウスＭＭＰ１３のアミノ酸配列はＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ；  Ｐ３３４３５に記載されている。本発明で言う「ＭＭＰ１３」には、各々の哺乳動物のＭＭＰ１３のアミノ酸配列、特に好ましくはヒトＭＭＰ１３のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。【００１４】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは下記のような変異ポリペプチドを意味する。即ち、天然型のＭＭＰ１３（特に好ましくはヒト由来のＭＭＰ１３）と実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド、並びに該天然型のＭＭＰ１３（特に好ましくはヒト由来のＭＭＰ１３）のアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異ポリペプチドであってもよい。
本発明におけるＭＭＰ１３、特にはヒトのＭＭＰ１３は、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。そのようなアミノ酸の置換、欠失、または挿入は常法に従って行うことができる（実験医学別冊・「遺伝子工学ハンドブック」（１９９２）など）。【００１５】
本発明における「ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性」は、ＭＭＰ１３が有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性を意味する。ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性に関与する領域は、ＭＭＰ１３アミノ酸配列上の任意の領域であり、抗体がその領域に結合することによりＭＭＰ１３が有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性が変化する領域を意味する。好ましくは、触媒領域を意味し、特に好ましくは亜鉛イオン結合領域を意味する。配列番号１で表されたヒトＭＭＰ１３のアミノ酸配列上、触媒領域は１０４位〜２７４位であり、亜鉛イオン結合領域は２２２位〜２３２位の領域を意味する。【００１６】
本発明における「中和抗体」は、ＭＭＰ１３が有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性を阻害することが可能な抗体を意味する。【００１７】
本発明の「モノクローナル抗体」とは非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、ヒトモノクローナル抗体が包含される。ここで、ヒトモノクローナル抗体には、キメラモノクローナル抗体、ヒト型モノクローナル抗体、及びヒトモノクローナル抗体が包含される。ヒトモノクローナル抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。【００１８】
ここで「キメラモノクローナル抗体」とは、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であり、詳細には、その可変領域が、非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスターなど）のイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体を意味する。キメラ抗体は、可変領域をコードするＤＮＡ  をヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡ  と連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（国際公開第９６／０２５７６号パンフレット  参照）。【００１９】
また、「ヒト型モノクローナル抗体」とは、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、詳細には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部が非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスターなど）のモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするモノクローナル抗体を意味する。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ  ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植することにより得られる（国際公開第９６／０２５７６号パンフレット  参照）。【００２０】
本明細書において、「ヒトモノクローナル抗体」とは、前記に定義したＭＭＰ１３またはその一部その一部に結合するヒトモノクローナル抗体である。さらに詳細には、イムノグロブリンを構成する重鎖（Ｈ鎖）の可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）及びＨ鎖の定常領域（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ）並びに軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するヒトイムノグロブリンである。【００２１】
ヒトモノクローナル抗体は、後述するヒト抗体産生トランスジェニックマウスのようなヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に前述のＭＭＰ１３またはそのペプチドのいずれかの免疫原（抗原）を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することができる。【００２２】
本明細書における「トランスジェニックヒト抗体産生非ヒト哺乳動物」、特に好ましい態様であるヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、既報に従って作製することができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｖｏｌ．７，  ｐ．１３−２１，  １９９４；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．１４６−１５６，  １９９７；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３６８，  ｐ．８５６−８５９，  １９９４；及び特表平６−５００２３３号公報など）。【００２３】
本発明の「免疫学的測定方法」は、イムノアッセイを原理とするものである。具体的には、酵素免疫測定法（第３版、石川榮治ら編集、医学書院発行、１９８７年）に記載されているような種々方法の原理を応用することができる。応用できる原理としては、例えば、一抗体固相法、二抗体液相法、二抗体固相法、サンドイッチ法、及び特公平２−３９７４７号公報に記載されているようなワンポット法を好適な例として挙げることができる。また、抗原抗体反応を利用したアッセイとしては、ＥＭＩＴ法（Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、エンザイムチャネリングアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＥＭＭＩＡ）、酵素阻害物質標識イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、イムノエンザイムメトリックアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）、酵素活性増強イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）及びプロ  キシマールリンケージイムノアッセイ（Ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等も知られている。【００２４】
このようなイムノアッセイのいずれかの原理を、目的に応じて適宜選択して用いることができるが、操作上の簡便性及び／または経済的な利便性、とりわけ臨床上での汎用性の点を考慮すると、サンドイッチ法、ワンポット法、または一抗体固相法の原理を用いるのが好ましく、より好ましくは、サンドイッチ法またはワンポット法の原理である。特に好ましくは、９６穴マイクロプレートに代表されるような多数のウェルを有するマルチウェルマイクロタイタープレートを用いるサンドイッチ法、あるいはポリペプチドをその表面上に固定化したビーズと、ペルオキシダーゼ等の酵素あるいはビオチンにより標識された標識カウンターパートとを用いるワンポット法である。【００２５】
本発明の「免疫学的測定方法」で測定される試料としては、血漿、血清、尿、関節液等の体液や、細胞培養液、組織培養液などが使用し得る。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液で希釈あるいは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料とし得る。試料の希釈あるいは抽出に用いられる溶媒としてはどのような緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよいが、好ましくはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食塩水、酢酸緩衝液、アセトン、クロロホルム−メタノールあるいは、界面活性剤を含むこれらの溶液が用いられる。
本発明の「ＭＭＰ１３の免疫学的測定方法」は、ＭＭＰ１３に対するモノクローナル抗体及び固相担体用としてＭＭＰ１３に対するモノクローナル抗体を用い、被検試料中のＭＭＰ１３を分別定量する優れた方法及びその為の試薬キットを提供する。好ましくは、ＭＭＰ１３の関与する疾患の診断薬として有用である。特に好ましくは、癌、リュウマチ、または変形性関節症を診断できる診断薬として有用である。【００２６】
本発明における「ＭＭＰ１３の酵素活性中和方法」は、ＭＭＰ１３の生理的機能の解析及びＭＭＰ１３阻害剤の機能探索を目的とした、ＭＭＰ１３モノクローナル抗体を用いたＭＭＰ１３の酵素活性を阻害する方法を意味する。例えば、軟骨細胞に予めＭＭＰ１３モノクローナル抗体を添加しておく。次にＩＬ−１を添加することにより、軟骨細胞を刺激し、ＭＭＰ１３の発現を誘導する。抗体の添加により細胞外マトリックスの分解が抑制された場合、軟骨細胞において細胞外マトリックスの分解は主にＭＭＰ１３が担っていることが示され得る。【００２７】
本発明における「ＭＭＰ１３が関与する疾患」としては、ＭＭＰ１３が関与する疾患であれば特に限定はないが、例えば、癌、リウマチ、又は変形性関節症が例示される。特に、変形性関節症は、ＭＭＰ１３の活性を阻害することにより軟骨の細胞外マトリックスの分解が抑制され、その発症が抑えられるため、本発明の適用が期待される。【００２８】
本発明におけ医薬組成物は、非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。【００２９】
このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。【００３０】
本発明のヒト抗体を含んでなる医薬組成物は、ＭＭＰ１３が関与する疾患の発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
実施例【００３１】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、抗体作製手法として、特に断らない限り、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉａｔｉｏｎｓ）に記載されている方法を用いた。また、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。
【実施例１】
【００３２】
抗原の選定
抗体がＭＭＰ１３の酵素活性を阻害するためには、酵素活性中心を認識する抗体であることが望ましいが、ＭＭＰ１３の酵素活性中心はタンパク質の内部に埋もれている。そのために、抗体が活性中心に結合することは困難であることが予想される。そこで、ＭＭＰ１３の活性中心近傍で、タンパク質の表面に露出する部分であることが望ましい。そこで、ヒトＭＭＰ１３触媒ドメインの立体構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＩＤ：１ＹＯＵ）を参考に、配列番号２記載のヒトＭＭＰ１３の２２５位〜２４６位のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを免疫原として選定した。また、選定したＭＭＰ１３の部分ペプチドのアミノ酸配列は、ヒト・マウス・ラット・ウサギ・イヌに共通する配列であることから、本ペプチドを免疫原として作製した抗体は上記動物種由来のＭＭＰ１３を認識することが予想される。【００３３】
抗原の免疫
ヒトＭＭＰ１３部分ペプチド（２２５−２４６）のＣ末端にグリシン−システインを導入したペプチド（２４アミノ酸）を合成した（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ社製）。合成ヒトＭＭＰ１３部分ペプチド１０ｍｇを１ｍｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、１０ｍｇのｇｉａｎｔ  ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔｓのヘモシアニン（マレイミド化ＫＬＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を１ｍｌの５０％ＤＭＳＯを含む５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものとを混合し、室温にて４時間、さらに、４℃で一晩反応させた。上記の混合液を蒸留水に対して透析後に、凍結乾燥し、ＭＭＰ１３部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１１．５３ｍｇを得た。これを免疫原とした。調製したＭＭＰ１３部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ａ／Ｊ  Ｊｍｓ  Ｓｌｃ雌マウス７匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、２１日後及び４２日後にＭＭＰ１３部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに７１日後にヒトＭＭＰ１３部分ペプチド−ＫＬＨ複合体１００μｇを生理食塩水０．１ｍｌに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。【００３４】
ヒトＭＭＰ１３部分ペプチドのビオチン標識
合成ヒトＭＭＰ１３部分ペプチド０．４ｍｇを０．４ｍｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、１６０μｇのＰＥＯ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を８０μｌの蒸留水に溶解したものとを混合し、室温で２時間反応後に、逆相ＨＰＬＣにてビオチン標識されたヒトＭＭＰ１３部分ペプチドを精製した。【００３５】
ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３−Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。【００３６】
リコンビナントラットＭＭＰ１３触媒ドメインの作製
ラットＭＭＰ１３の触媒ドメイン（アミノ酸：９９−２６２）をコードするＤＮＡ断片を、制限酵素サイトＢｓｔ１１０７とＸｂａIを介して発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡＨＥに挿入し、常法に従って大腸菌（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ）にトランスフォーメーションし、組み換え大腸菌（ＭＭＰ１３−ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ）を得た。ＭＭＰ１３−ＸＬ−１  Ｂｌｕｅを２００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地中で３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．５になった時に０．１ＭのＩＰＴＧを２００μｌ加え、ラットＭＭＰ１３触媒ドメインの発現を誘導した。さらに、３７℃で２時間培養後、菌体を遠心分離し、超音波処理後の不溶性画分を１ｍｌの８Ｍ尿素溶液で可溶化した。さらに１ｍｌの緩衝液Ｕ（６Ｍ尿素、０．０１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｂｒｉｊ３５を含む５０ｍＭ  トリス緩衝液、ｐＨ７．９）を加え、遠心する。遠心後の上清をＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いて精製した。ラットＭＭＰ１３触媒ドメインを含む溶液をＮｉ−ＮＴＡアガロースに通した後に、２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む緩衝液Ｕで洗浄し、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む緩衝液Ｕで溶出した。溶出液中のラットＭＭＰ１３触媒ドメインのリフォールディングは以下の操作で行った。１ｍｌの溶出画分あたり７．８μｌの２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）を添加し、１９ｍｌの緩衝液Ｔ（０．０１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｂｒｉｊ３５を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）を撹拌しながら徐々に添加、その後４℃で１６時間放置し、遠心後の上清を回収した。【００３７】
ＭＭＰ１３抗体の選定
細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたＥＬＳＩＡは以下の通りである。３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのハイブリドーマ培養上清と３０ｎＭのリコンビナントラットＭＭＰ１３触媒ドメインを含む１０μｌの緩衝液Ａ（０．５％  ウシ血清アルブミン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％  Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）及び０．０５ｎｇのビオチン標識ヒトＭＭＰ１３部分ペプチドと２ｎｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む１０μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、２５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、２５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、ラットリコンビナントＭＭＰ１３触媒ドメインと強い親和性を示したハイブリドーマのクローンを７つ選択し、限界希釈法により２回クローニングをして、ＭＭＰ１３を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを獲得した。獲得した７クローンについて、ＭＭＰ１３に特異性の高いクローンを２つ選択し、この２クローンの内、ＭＭＰ１３の酵素活性を阻害する作用を強く示したクローンを１つ選択し、１４Ｄ１０と命名した。１４Ｄ１０について、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、１４Ｄ１０のアイソタイプはＩｇＧ２ａであった。【００３８】
発明のモノクーロナル抗体１４Ｄ１０を産生するハイブリドーマは、独立行政法人  産業技術総合研究所内  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に、平成２０年５月２２日付けで受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９６８として寄託されている。
【実施例２】
【００３９】
抗原認識部位の同定
ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）のエピトープを同定するために、ヒトＭＭＰ１３部分ペプチドをＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により合成した。合成したペプチドは
ペプチド−１（ヒトＭＭＰ１３の２３９位〜２４６位のアミノ酸配列）、ペプチド−２（ヒトＭＭＰ１３の２３４位〜２４６位のアミノ酸配列）、ペプチド−３（ヒトＭＭＰ１３の２３１位〜２４６位のアミノ酸配列）、ペプチド−４（ヒトＭＭＰ１３の２２９位〜２４６位のアミノ酸配列）、ペプチド−５（ヒトＭＭＰ１３の２２７位〜２４６位のアミノ酸配列）、ペプチド−６（ヒトＭＭＰ１３の２２５位〜２４６位のアミノ酸配列）の６種類である。抗原認識部位を決定したＥＬＩＳＡは以下の方法で行った。９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に１．５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を１５０μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１００ｎＭの各種ＭＭＰ１３部分ペプチド（１−６）を含む５０μｌの緩衝液Ａと０．１ｎｇのビオチン標識ヒトＭＭＰ１３部分ペプチド（２２５−２４６）と４ｎｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む５０μｌの緩衝液Ａと０．５ｎｇのＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）を含む５０μｌの緩衝液Ａを加え、室温で３時間反応させた。次に各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１００μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１００μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、ＭＭＰ１３抗体とビオチン標識ヒトＭＭＰ１３部分ペプチド（２２５−２４６）との結合はペプチド−２で若干の阻害を受け、ペプチド３で完全に阻害されることから、ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）の抗原認識部位はヒトＭＭＰ１３の２３１位〜２３３位のアミノ酸配列を含むペプチドであることが示された（図１）。
【実施例３】
【００４０】
ＥＬＩＳＡによるＭＭＰ１３特異性の確認
ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）の特異性を調べるＥＬＩＳＡは以下の方法で行った。９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に１．５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を１５０μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１００，  １０，  １ｎＭの各ヒトＭＭＰ触媒ドメイン（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９）、または、１００、２０、４、０．８、０．１６ｎＭのラットＭＭＰ１３触媒ドメイン、または、モルモットＭＭＰ１３触媒ドメイン、または、１００、１０、１ｎＭのヒトＰｒｏ−ＭＭＰ１３（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）、または２０、４、０．８、０．１６ｎＭのヒトＡｃｔｉｖｅ−ＭＭＰ１３（製品の添付文書に従いヒトＰｒｏ−ＭＭＰ１３をＡＰＭＡで活性化した）を含む５０μｌの緩衝液Ａと０．１ｎｇのビオチン標識ヒトＭＭＰ１３部分ペプチド（２２５−２４６）と４ｎｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む５０μｌの緩衝液Ａと０．５ｎｇのＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）を含む５０μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１００μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１００μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）は、ヒト、ラット、モルモットＭＭＰ１３と特異的に反応し、他のＭＭＰｓとは反応しないこと（図２）また、活性型ＭＭＰ１３と反応し、前駆体型ＭＭＰ１３とは反応しないことがわかった（図３）。また、免疫原のペプチドとは異なるアミノ酸配列を持つモルモットＭＭＰ１３とも反応することがわかり、本ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）は広範な動物種由来の活性型ＭＭＰ１３を認識することが示された。
【実施例４】
【００４１】
ペプチド基質を用いたＭＭＰ１３抗体によるＭＭＰ１３酵素活性阻害試験
３８４  ｌｏｗ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｌａｔｅ（コーニング社製）にＭＭＰ活性測定緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．００５％  Ｂｒｉｊ３５を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）で希釈したラットＭＭＰ１３触媒ドメインを１０μＬ加え、ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）を含むＭＭＰ活性測定緩衝液を５μＬ加える。室温で１時間置いた後に、１３０ｎＭのＭＭＰペプチド基質（ペプチド研究所製）を含むＭＭＰ活性測定緩衝液を５μＬ加える。室温で１時間置いた後に蛍光シグナル（ｅｘ．３４０ｎｍ，  ｅｍ．４０５ｎｍ）  をＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．社製）を用いて測定した。その結果、ＭＭＰ１３のペプチド基質切断活性はＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）により阻害された（図４）。
【実施例５】
【００４２】
II型コラーゲンを用いたＭＭＰ１３抗体によるＭＭＰ１３酵素活性阻害試験
５ｎｇ／ｍｌのヒトII型コラーゲン溶液（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社製）を９６ウェルマキシソーププレート（ＮＵＮＣ社製）に添加し、４℃で一晩インキュベート後、洗浄Ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭトリス緩衝液，  ｐＨ７．６）で２回洗浄してコーティングプレートとする。酵素反応Ｂｕｆｆｅｒ（０．３  Ｍ  ＮａＣｌ、１０  ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  Ｂｒｉｊ３５を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）にヒトリコンビナントＭＭＰ１３（ヒトｐｒｏ−ＭＭＰ１３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）をＡＰＭＡ（１  ｍＭ）で３７℃、２時間インキュベートして活性型に変換）とＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）を加えて室温で２時間プレインキュベートした後、酵素反応溶液をコーティングプレートに添加して反応を開始する．３７℃で４時間の反応後、停止液（ＥＤＴＡ，終濃度５  ｍＭ）を加えて酵素反応を停止させて反応溶液を回収する。反応溶液中に含有するＣIIネオエピトープ（II型コラーゲン分解産物）を参考文献と同様の方法で作製した抗体によるＥＬＩＳＡにより定量した。その結果、ＭＭＰ１３のII型コラーゲン切断活性はＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）により阻害された（図５）。
【実施例６】
【００４３】
ヒト軟骨細胞培養系におけるＭＭＰ１３抗体によるＭＭＰ１３酵素活性阻害試験
１０ｎｇ／ｍｌのヒトII型コラーゲン溶液（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社製）を９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に添加し、４℃で一晩インキュベート後、培養用培地（０．１  ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ＩＴＳ、  ５０μＭ  Ｌ（＋）−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄを含むＤＭＥＭ）で１回洗浄してコーティングプレートとする。正常ヒト由来軟骨細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社）をコーティングプレートに４  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、培養用培地を用いて３７℃、５％  ＣＯ２下で培養を行う。１日後に培養液を交換してＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）を加えた後、１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１ｂｅｔａ及び１０ｎｇ／ｍｌのＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して培養する。４日後に反応停止液（ＥＤＴＡ、終濃度５  ｍＭ）を加えて、培養上清液を回収する。培養液中に含有するＣIIネオエピトープ（II型コラーゲン分解産物）を参考文献（Osteoarthritis and Cartilage、2003年、11巻、9号、pp.673-680）と同様の方法で作製した抗体によるＥＬＩＳＡにより定量した。軟骨細胞から産生遊離したＭＭＰによるII型コラーゲン分解活性はＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）により阻害された（図６）。
【実施例７】
【００４４】
ＭＭＰ１３の免疫学的測定
１．５μｇのＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）を含む１５０μｌのＤＥＬＦＩＡ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（パーキンエルマー社製）を９６ウェルマキシソーププレート（ＮＵＮＣ社製）に添加し、４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを３００μｌの洗浄液で１回洗浄した後、ヒトＡｃｔｉｖｅ−ＭＭＰ１３（製品の添付文書に従いヒトＰｒｏ−ＭＭＰ１３（Ｒ＆Ｄ社製）をＡＰＭＡで活性化した）を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液Ｃに希釈し、１５０μｌを添加した。室温で２時間反応させた。次に各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりビオチン標識したＭＭＰ１３抗体（第一ファインケミカル社製）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｅｕ３＋（パーキンエルマー社製）を１５０μｌ添加し、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、ＤＥＬＦＩＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（パーキンエルマー社製）を１５０μｌ添加し、時間分解蛍光を測定した。その結果、活性型ヒトＭＭＰ１３の検出感度は５ｐＭであった（図７）。
【実施例８】
【００４５】
合成基質を用いたＭＭＰ１３酵素活性阻害試験における市販抗体との比較
３８４  ｌｏｗ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｌａｔｅ（コーニング社製）にＭＭＰ活性測定緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．００５％  Ｂｒｉｊ３５を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）で希釈したラットＭＭＰ１３触媒ドメインを１０μＬ加え、ＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）、市販のＭＭＰ１３モノクローン抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、カタログ番号：ＭＡＢ１３４２６）あるいはＭＭＰ１３ポリクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、カタログ番号：ＡＢ８１２０）を含むＭＭＰ活性測定緩衝液を５μＬ加える。室温で１時間置いた後に、１３０ｎＭのＭＭＰペプチド基質（ペプチド研究所製）を含むＭＭＰ活性測定緩衝液を５μＬ加える。室温で１時間置いた後に蛍光シグナル（ｅｘ．３４０ｎｍ，  ｅｍ．４０５ｎｍ）  をＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．社製）を用いて測定した。その結果、ＭＭＰ１３のペプチド基質切断活性はＭＭＰ１３抗体（１４Ｄ１０）により阻害された（図８）。しかし市販のＭＭＰ１３モノクローン抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、カタログ番号：ＭＡＢ１３４２６）あるいはＭＭＰ１３ポリクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、カタログ番号：ＡＢ８１２０）はＭＭＰ１３のペプチド基質切断活性を阻害しなかった（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明では、ＭＭＰ１３と特異的に反応し、ＭＭＰ１３の酵素活性を中和するモノクローナル抗体を得ることができ、その得られたモノクローナル抗体を用いて、ＭＭＰ１３の酵素活性中和あるいは免疫学的測定を行うことができる。特にＭＭＰ１３は、変形性関節症で重要な役割をしていることが報告されており、変形性関節症等のＭＭＰ１３が関与する疾患の診断薬として有用である。さらに、本発明によれば、そのモノクローナル抗体がＭＭＰ１３中和活性を有することを利用して、該モノクローナル抗体を含む医薬組成物を得ることができる。この医薬組成物は、変形性関節症等のＭＭＰ１３が関与する疾患の治療薬として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列表の配列番号１は、ヒトＭＭＰ１３のポリペプチドである。
配列表の配列番号２は、ヒトＭＭＰ１３の２２５位〜２４６位のアミノ酸配列からなる部分ペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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