【手続補正書】
【提出日】平成16年11月15日(2004.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ａ）共生細菌がコロニーを形成した腸内および無菌の腸内で少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を測定すること、および
ｂ）共生細菌がコロニーを形成した腸と無菌の腸とで発現レベルが少なくとも２倍異なるａ）の遺伝子を同定すること
を含む哺乳動物の腸内共生ミクロフローラのコロニー形成に起因する化学変化を調べる方法。
【請求項２】  ステップａ）の複数の遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイ分析および／または定量ＲＴＰＣＲで測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  in vitro細胞培養物、下等真核生物モデル、または動物モデルからなる群から選択される系内で、ｂ）で同定された遺伝子の機能を調べるステップｃ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  ｉ）トランスジェニック・ノックアウト、
ii）ドミナント・ネガティブ実験、
iii）導入遺伝子の過剰発現、
iv）抗体結合アッセイ、
ｖ）性質の明確な化学薬剤を用いた薬理学的介入による、
からなる群から選択される方法を用いて機能を調べる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】  共生細菌がB．Thetaiotaomicronである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  少なくとも１０種類の遺伝子の発現を測定し、栄養素の摂取と代謝、ホルモン／成熟応答、粘膜防御機能、解毒／薬剤耐性、腸管神経系／筋層の発生または活動、血管形成、細胞骨格／細胞外マトリックスの機能または発生、シグナル伝達、または他の細胞機能に関連する遺伝子から選択される前記遺伝子をステップ（ａ）で測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】  Ｎａ＋／グルコースコトランスポーター（ＳＧＬＴ１）、ラクターゼ・フロリジン−ヒドロラーゼ、膵リパーゼ関連タンパク質２、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質、絶食誘導脂肪因子（ＦＩＡＦ）、アポリポタンパク質Ａ−IV、ホスホリパーゼＢ、ＣＹＰ２７高親和性銅トランスポーター、メタロチオネインＩ、メタロチオネイン
II、フェリチン重鎖、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ・サブユニット、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、リンゴ酸オキシドレダクターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、オミシン・デカルボキシラーゼ抗酵素、１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ、ＧＡＲＧ−１６、ＦＫＢＰ５１、アンドロゲン制御輸精管タンパク質、短鎖デヒドロゲナーゼ、耐熱性抗原、減衰促進因子、重合Ｉｇ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ、血清アミロイド・タンパク質Ａ、ＣＲＰ−ダクチンα（MUCLIN）、ゼータ・プロテアソーム鎖、抗ＤＮＡ  ＩｇＧ  Ｌ鎖、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｐ−糖タンパク質（mdr１a）、ＣＹＰ２Ｄ２、Ｌ−グルタミン酸トランスポーター、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、小胞関連タンパク質−３３、システイン・リッチ・タンパク質２、平滑筋（腸）γアクチン、ＳＭ−２０、アンギオゲニン−４、ゲルゾリン、デストリン、心筋αアクチン、エンドＢサイトケラチン、フィブロネクチン、プロテイナーゼ阻害剤６、α１タイプ１コラーゲン、Ｐｔｅｎ、ｇｐ１０６（ＴＢ２／ＤＰ１）、ｒａｃ２、Ｓｅｍｃａｐ２、血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ、ＳＴＥ２０様タンパク質キナーゼおよびＢ細胞ミエロイド・キナーゼ、グルタチオン・レダクターゼ、カルモジュリン、ｅｌＦ３サブユニット、ｈｓｃ７０、オリゴサッカリル・トランスフェラーゼ・サブユニット、フィブリラリン、Ｈ＋−輸送ＡＴＰアーゼ、およびＭｓｅｃ２３をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１０種類の遺伝子の発現を測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】  １０種類の遺伝子が、コリパーゼ、減衰促進因子（ＤＡＦ）、重合ＩｇＡ受容体、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（Ｓｐｒｒ２ａ）、アンギオゲニン−３、アンギオゲニン−４、Ｐｔｅｎ、ＣＹＰ２Ｄ２、Ｓｐｒｒ２ａ、ｒａｃ２、およびＭｄｒ−１をコードする遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】  実質上すべての前記遺伝子の発現を測定する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】  発現が少なくとも７倍異なる遺伝子をステップ（ｂ）で同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】  腸内でアンギオゲニン−４またはコリパーゼが関与する生物化学的経路を評価することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】  哺乳動物の消化管内で特定の遺伝子の発現レベルを、治療または予防の目的で変化させる方法であって、請求項１に記載の方法を用いて同定される共生細菌の胃腸管内密度を、前記発現レベルの所望の変化をもたらすように変更することを含む方法。
【請求項１３】  請求項１の方法を用いて同定される有効な共生細菌を用いて、上皮で発現される血管形成因子を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】  請求項１に記載の方法を用いて同定される有効な共生細菌を用いて、代謝を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】  請求項１に記載の方法を用いて同定される有効な共生細菌を用いて、上皮の防御機能を調節することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】  胃腸疾患に薬剤として応用される化合物のスクリーニング方法であって、請求項１に記載の方法を用いて同定される遺伝子産物の活性を調節する能力について前記化合物を評価することを含む方法。
【請求項１７】  請求項１に記載の方法を用いて同定される遺伝子産物の活性を調節する化合物の治療有効量を投与することを含む、胃腸疾患を治療しまたは予防する方法。
【請求項１８】  小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節する能力について化合物をアッセイすることを含む、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防に潜在的に有用な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１９】  腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状の治療または予防用薬物の調製における、小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の
活性または量を調節できる化合物の使用。
【請求項２０】  小型プロリン・リッチ・タンパク質２ａ（ｓｐｒｒ２ａ）またはｒａｃ２の活性または量を調節できる化合物の治療有効量を投与することを含む、腸の防御機能の欠陥を特徴とする病状を治療または予防する方法。
【請求項２１】  腸の生態のレギュレーターとして機能する遺伝子を同定するための方法であって、請求項１に記載の方法を応用すること、およびこのような機能にこれまで関連づけられていない発現遺伝子を検出することを含む方法。
【請求項２２】  マウスの腸で発現され、配列番号１２および２５のプライマーを用いて少なくとも部分的に増幅可能である遺伝子によってコードされるアンギオゲニン・タンパク質。
【請求項２３】  タンパク質が、図４に示す配列番号２９のタンパク質、その対立遺伝子変異体、または配列番号２９と同一のアミノ酸配列を少なくとも８５％有するタンパク質である、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】  配列番号２９のタンパク質である請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】  請求項２２に記載のタンパク質をコードする核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
これらの基準を用いて同定された多数の遺伝子が、基本的な腸の機能の調節に関与していることは重要である。すなわち、７１種類の遺伝子のうち２０種類（２８％）は、栄養素の摂取と代謝に分類された。また、すいリパーゼ関連タンパク質２（ＰＬＲＰ−２）、コリパーゼ、肝脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、およびアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含めて、宿主の脂質吸収／搬出機構のいくつかの構成成分の発現が協奏的に増加した（表１）。脂肪摂食によって抑圧されることが知られている（S．Kersten等、J．Biol．Chem．275、28488(2000)）新規なＰＰＡＲα標的である絶食誘導脂肪因子の発現が顕著に減少したことで、コロニー形成されたマウスの脂質摂取が増大したことのさらなる証拠が提供された。これら６種類の遺伝子の発現が変化したことは、B．Thetaiotaomicronが宿主の栄養素吸収／処理能力の増加を誘発することを示し、なぜ無菌のげっ歯動物がその体重を維持するために、ミクロフローラを有するげっ歯動物よりも高カロリー摂取が必要であるかを説明するのに役立つ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
この結果から、ｓｐｒｒ２ａ  ｍＲＮＡは上皮に限られ、そこではその濃度はじゅう毛上の方が陰かよりも７倍高いことがわかる（図２）。B．Thetaiotaomicronは、じゅう毛上皮内で２８０倍の増加を誘発する。この値は、回腸ＲＮＡ全体で記録された増加とよく一致する（表２）。ｓｐｒｒ２ａ応答の細胞起源は、それが細菌のコロニー形成に応答して腸上皮防御の強化に関与するという仮説を支持するものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
コリパーゼは、すい臓の外分泌胞状細胞によって産生される。ＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲから、コリパーゼｍＲＮＡも回腸陰か上皮に存在し、そこではB．Thetaiotaomicronのコロニーが形成されるとコリパーゼが１０倍になることが明らかになった（図２）。このことは、回腸ＲＮＡ全体のマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって検出される増加を説明するものである（表１、２）。コリパーゼは、すい臓トリグリセリド・リパーゼおよびＰＬＲＰ−２の両者の活性を刺激して食事性脂質の代謝に重要な役割を演じている（M．E．Lowe等、J．Biol．Chem．273、31215（1998）。また、プロコリパーゼのタンパク質分解切断により、脂肪摂取の満腹シグナルとして機能するペンタペプチド（エンテロスタチン）が生成する（S．Okada等、Physiol．Behav．49、1185(1991)）。コリパーゼ遺伝子制御の分析から、食事性脂質代謝に対する腸上皮（と消化管内定住共生生物）のこれまで価値が認められていなかった寄与が明らかになる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
実施例３
コロニー形成によりじゅう毛上皮内のラクターゼｍＲＮＡ量が減少することをＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲで確認した（図２）。発育にしたがって制御されるラクターゼなどの遺伝子の発現変化を規制するのに微生物が役立つかもしれないという考えは、ミクロフローラの数個または多数の構成成分がこれらの変化を誘発できるかどうかという問いを提起する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
アンギオゲニン−４の生後発育中の発現制御は、その微生物による制御と一致する。
次いで、生後５日（Ｐ５）〜Ｐ３０の無菌および従来法で飼育されたＮＭＲＩマウス（ｎ＝３マウス／日／グループ）の発育に伴うアンギオゲニン−４の発現パターンを評価した（図１２）。アンギオゲニン−４の転写産物相対量は、Ｐ２０までいずれのマウス・グループでも比較的低いままであった。この時点以降、無菌動物でわずかに（２〜３倍）発現が増加した。これに対し、従来法で飼育された動物では、Ｐ１５からＰ３０の間でアンギオゲニン−４の発現が２０倍以上になった。これらの結果から、哺乳／離乳移行中にアンギオゲニン−４が誘導されることが示唆され、これは消化管内微生物の主な変化と一致する。生後の無菌マウスでアンギオゲニン−４が誘導されないことも、微生物叢の構成成分がアンギオゲニン−４の発現の制御に重要な役割を演じているという結論と一貫している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
アンギオゲニン−４の発現がパネート細胞中で起こるという仮説を試験するために、本出願人らは、ＬＣＭを使用して、（ａ）弱毒ジフテリア毒素Ａフラグメント（ｔｏｘ１７６）によってパネート細胞系譜を切断した無菌成体（１２週齢）トランスジェニック・マウス（ＣＲ２−ｔｏｘ１７６マウス）（Garabedian等、1997）、および（ｂ）それらの同
年齢同性無菌正常同腹子から、空腸陰かの底部に位置する細胞を単離した。アンギオゲニン４特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲにより、正常マウスの陰か底部の上皮細胞から精製されたＲＮＡでアンギオゲニン−４ｍＲＮＡレベルがＣＲ２−ｔｏｘ１７６同腹子に比べて１０倍になることが明らかになった（図１３）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
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