(57)【要約】yidE遺伝子の発現が増強するように改変された有機酸生産能を有する細菌あるいは細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することにより、有機酸を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
yidE遺伝子の発現が増強するように改変された有機酸生産能を有する細菌又は該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造方法。
【請求項２】
前記細菌が、yidE遺伝子のコピー数を高めること及び/またはyidE遺伝子の発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記yidE遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１または２に記載の方法：
（ａ）配列番号13、15、25、27、30又は46の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号13、15、25、27、30又は46の塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内でその発現を増強することにより細菌の有機酸生産能を向上させるＤＮＡ。
【請求項４】
前記yidE遺伝子が、配列番号14、16、24、26、28、29、31、47、71又は72に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号14、16、26、28、31又は47において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、ラウルテラ属細菌、クレブシエラ属細菌、及びパントエア属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、ルーメン細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌が、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、及びピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性から選択される１又は２以上の酵素活性が低下するように改変された細菌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機酸がコハク酸である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたコハク酸等の有機酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び特許文献２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。【０００３】
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び特許文献４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産なども報告されていた（例えば、特許文献５）。【０００４】
一方、通性嫌気性グラム陰性細菌であるエシェリヒア・コリでは、コリネ型細菌同様、好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、静止菌体として酸素を通気せずに嫌気的に非アミノ有機酸を生産する方法（非特許文献２）と、好気的に非アミノ有機酸を生産する方法が知られている（特許文献６）が、グラム陰性細菌であるため浸透圧に弱く、菌体当たりの生産性などに改善の余地があった。
腸内細菌群に属するエシェリヒア・コリではすでに全ゲノム配列が明らかにされ、その中に含まれる推定タンパク質コード配列についての機能予測がなされている。本発明においてyidEと呼ぶ遺伝子もその中の一つであるが、トランスポーターをコードすると予想されているものの、その実際の機能は明らかにされておらず、有機酸生産への関わりも全く知られていなかった（非特許文献３及び非特許文献４）。
【特許文献１】米国特許第５，１４２，８３４号公報
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号公報
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号公報
【特許文献５】特開平１１−１９６８８７号公報
【特許文献６】米国特許出願公開2005-0170482号
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207-216
【非特許文献２】Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology (2002),28(6)325-332
【非特許文献３】Nucleic Acid Research (2006), 34(1), 1-9
【非特許文献４】Applied and Environmental Microbiology (2005), 71(12), 8008-8015
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、より生産効率の高い、細菌を用いた有機酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、yidE遺伝子の発現が増強するように改変された細菌又はその処理物を用いることにより、有機原料の消費速度、有機酸の生成速度、又は、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（1）yidE遺伝子の発現が増強するように改変された有機酸生産能を有する細菌又は該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造方法。
（2）前記細菌が、yidE遺伝子のコピー数を高めること及び/またはyidE遺伝子の発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である(1)に記載の方法。
（3）前記yidE遺伝子が下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである(1)又は（2）に記載の方法：
（ａ）配列番号13、15、25、27、30又は46の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号13、15、25、27、30又は46の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内でその発現を増強することにより細菌の有機酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（4）前記yidE遺伝子が、配列番号14、16、24、26、28、29、31、47、71又は72に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号14、16、26、28、31又は47において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、(1)〜（3）のいずれかに記載の製造方法。
（5）前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌である、(1)〜（4）のいずれかに記載の製造方法。
（6）前記細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、ラウルテラ属細菌、クレブシエラ属細菌、及びパントエア属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、(5)に記載の方法。
（7）前記細菌が、ルーメン細菌である(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
（8）前記細菌が、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスである、(7)に記載の方法。
（9）前記細菌が、さらに、乳酸デヒドロゲナーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、及びピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性から選択される１又は２以上の酵素活性が低下するように改変された細菌である、(1)〜（8）のいずれかに記載の方法。
（10）前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である、(1)〜（9）のいずれかに記載の方法。
（11）前記有機酸がコハク酸である(1)〜（10）のいずれかに記載の方法。
（12）(1)〜(11)のいずれかに記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】エシェリヒア属細菌MG1655ΔldhAΔlldDにおけるyidEの増幅効果（コハク酸蓄積の経時的変化）。
【図２】エンテロバクター属細菌AJ110637株におけるyidEの増幅効果（コハク酸蓄積の経時的変化）。
【図３】RSF-Red-TERの構造。
【図４】RSF-Red-TERの構築スキーム。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明の方法に用いられる細菌は、有機酸生産能を有し、yidE遺伝子の発現が増強するように改変された細菌である。ここで、有機酸生産能とは、本発明の細菌を反応液中で培養したときに、反応液または菌体内に有機酸を生成し、反応液中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。好ましくは例えば、目的とする有機酸を反応液中または菌体から好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる細菌をいう。このような細菌は、有機酸生産能を有する親株を、yidE遺伝子の発現が増強するように改変することにより得ることができる。また、親株が有機酸生産能を有していない場合、有機酸の生産能を付与し、さらに、yidE遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。また、yidE遺伝子の発現が増強するように改変された細菌に、有機酸の生産能を付与してもよい。有機酸の生産能を有する細菌は、本来的に有機酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、有機酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。【００１０】
有機酸とは、TCA回路の代謝中間体の有機酸をいい、例えば、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、シス-アコニット酸などが挙げられるが、この中でもコハク酸、リンゴ酸、フマル酸が好ましく、コハク酸がより好ましい。【００１１】
本発明に使用できる細菌の親株は、特に限定されないが、腸内細菌科に属する細菌、ルーメン細菌に分類される細菌、コリネ型細菌が好ましい。【００１２】
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、ラウルテラ、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。中でも、エシェリヒア属、エンテロバクター属、ラウルテラ属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属に属する細菌が特に好ましい。【００１３】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられるが、これに限定されない。【００１４】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株K12株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。【００１５】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  12301 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。【００１６】
パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345)。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。【００１７】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacteragglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株やエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC 12010株（Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27;98(2):340-348）、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637 (FERM ABP-10955)株等が挙げられる。AJ110637株は、2006年3月に静岡県牧之原市須々木海岸側の土壌から、グリセリンを炭素源とした液体集積培養にて取得された。その後16ＳｒＤＮＡの全長配列を決定したところ、エンテロバクター・アエロゲネスNCTC10006株と99.9％の相同率を示した。また、ＡＰＩキットによる生理学的試験結果においてもエンテロバクター・アエロゲネスの基準種と同じ結果を得た事により、単離取得株はエンテロバクター・アエロゲネスと同定された。同株は、2007年8月22日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-21348として寄託され、2008年3月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM ABP-10955の受領番号が付与されている。【００１８】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。【００１９】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。【００２０】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられ、ラウルテラ属細菌としては、ラウルテラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。【００２１】
エルビニア・アミロボーラ  ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ  ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
ラウルテラ・プランティコーラ  ATCC33531株
尚、AJ13399株及びAJ13410株は、寄託当時はクレブシエラ・プランティコーラとして分類されていたが、現在ではクレブシエラ・プランティコーラはラウルテラ・プランティコーラに分類されている（Drancourt, M. 2001. Int J Syst Evol Microbiol. 51:925-32）。【００２２】
ルーメン細菌としては、マンヘイミア属細菌、アクチノバチルス属細菌、アンアエロバイオスピリルム属細菌、パイロバクテリム属細菌、セラモノナス属細菌が挙げられ、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）、セラノモナス・ルミナンティアム（Selenomonas ruminantium ）、ベイロネラ・パルビューラ（Veillonella parvula）、ウォルネラ・サクシノゲネス(Wolnella succinogenes)等の細菌を用いることが出来、特にマンヘイミア・サクシニシプロデューセンスを使用することが望ましい。具体的な菌株としては、マンヘイミアsp. 55E株（KCTC0769BP株）（米国特許出願公開2003/0113885号公報、国際公開2005/052135号パンフレット）が挙げられる。【００２３】
＜１−１＞有機酸生産能の付与
以下、細菌に有機酸生産能を付与する方法、またはこれらの細菌の有機酸生産能を増強する方法について述べる。【００２４】
有機酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、有機酸生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、発酵による物質生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100ページ参照）。ここで有機酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、2種又は3種以上であってもよい。また発現が増強される有機酸生合成系酵素も単独であっても、2種または3種以上であってもよい。さらに栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。【００２５】
有機酸生産能を有する栄養要求性変異株、有機酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ有機酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
以下、有機酸の一例としてコハク酸について、細菌にコハク酸生産能を付与する方法とコハク酸生産菌について例示する。【００２６】
＜コハク酸生産菌＞
コハク酸生産菌としては、酢酸、乳酸、エタノール、及び蟻酸の形成能を欠損した株を使用することが出来、具体的には、エシェリヒア・コリSS373株（国際公開99/53035号パンフレット）が挙げられる。
酢酸、乳酸、エタノール、及び蟻酸の形成能を欠損した株は、最小培地で酢酸、及び乳酸を資化できない株を取得すること、または、以下の乳酸の生合成系遺伝子、及び酢酸の生合成系酵素の活性を低下することによって取得することが可能である（国際公開2005/052135号パンフレット）。
また、上記のような株は、モノフルオロ酢酸耐性（US5,521,075）を付与することによっても取得することができる。
その他にコハク酸生成能が向上した株を取得する方法として、蟻酸と乳酸の両方の形成能を欠損した株を用いて嫌気条件化でグルコース資化能を付与する方法が挙げられる（国際公開1997/16528号パンフレット）。【００２７】
コハク酸生産能は、コハク酸生合成系に関与する酵素の遺伝子の増幅や、同生合成系から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の遺伝子の欠損によっても取得することが可能である。
コハク酸生産能は、乳酸の生合成系酵素である、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH 以下カッコ内は酵素名）の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することができる（国際公開2005/052135号パンフレット、国際公開2005/116227号パンフレット、米国特許5,770,435号公報、米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開99/53035号公報、Alam, K. Y., Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217）。細菌によってはＬ型の乳酸デヒドロゲナーゼとＤ型の乳酸デヒドロゲナーゼを有するものがあるが、いずれか一方を低下させるように改変すればよいが、両方とも低下させることが好ましい。【００２８】
また、コハク酸生産能は、ギ酸の生合成系酵素である、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ(PFL)の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することができる（米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開2005/116227号パンフレット、国際公開2005/52135号パンフレット、Donnelly, M.I., Millard, C.S., Clark, D.P., Chen, M.J., Rathke,J.W. 1998. Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72, 187-198）。【００２９】
コハク酸生産能は、酢酸の生合成系酵素である、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（PTA）、酢酸キナーゼ（ACK）、ピルビン酸オキシダーゼ (POXB) 、アセチルCoA合成酵素（ACS）、アセチルCoAハイドロラーゼ（ACH）の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することが出来る（米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開2005/052135号公報、国際公開第99/53035号公報、国際公開2006/031424号公報、国際公開2005/113745号パンフレット、国際公開2005/113744号パンフレット）。【００３０】
また、コハク酸生産能は、エタノールの生合成系酵素である、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）の酵素活性が低下するように改変することによっても高めることができる（国際公開2006/031424号パンフレット参照）。【００３１】
また、ピルビン酸キナーゼ、グルコースPTS(ptsG)、ArcAタンパク質、IclRタンパク質（iclR）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdh）及び/又はグルタミンシンセターゼ（glnA）、グルタミン酸シンターゼ（gltBD）活性を低下することによっても、コハク酸生産能を高めることが出来る（国際公開第2006/017127号、第2007007933号、特開2005-168401）。酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である。【００３２】
コハク酸生産能は、コハク酸生産に関与する生合成系酵素の増強によっても付与することが出来る。
コハク酸生産能は、ピルビン酸カルボキシラーゼ、マリックエンザイム、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、フマラーゼ、フマル酸リダクターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増強することによっても高めることが出来る（特開平11-196888号公報、国際公開第99/53035号パンフレット、Hong, S. H., and S. Y. Lee. 2001. Biotechnol. Bioeng. 74: 89-95、Millard, C. S. et al. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1808-1810、国際公開2005/021770号パンフレット、特開2006-320208、Kim P. et al.  2004. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1238-1241）。これらの目的酵素の酵素活性増強は、下述するyidE遺伝子の発現の増強方法を参照にして行うことが出来る。【００３３】
具体的には、腸内細菌科に属するコハク酸生産菌として以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ SS373株（国際公開99/06532号パンフレット）
エシェリヒア・コリ AFP111株（国際公開9716528号パンフレット）
エシェリヒア・コリ  NZN111株（米国特許6,159,738号公報）
エシェリヒア・コリ  AFP184株（国際公開2005/116227号パンフレット）
エシェリヒア・コリ  SBS100MG株、SBS110MG株、SBS440MG株、SBS550MG株、SBS660MG株（国際公開2006/031424号公報）【００３４】
コリネ型細菌に属するコハク酸生産菌として以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムＡＢ−４１株（特開平11−113588号公報）
ブレビバクテリウム・フラバムＡＢ−４１株/PC増幅株（特開平11−196888号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ110655株（FERM BP-10951）
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Δldh(国際公開第2005/021770号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, ach, pta, ack)（コリネバクテリウム・グルタミカム）（国際公開第2005/021770号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)（国際公開第2005/113745号パンフレット）
コリネバクテリウム・グルタミカムＲldh-/pCRB-1 PC株（国際公開2005/010182号パンフレット）【００３５】
ルーメン細菌に属するコハク酸生産菌としては以下の菌株が挙げられる。
マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス LPK,LPK7,LPK4(国際公開2005/052135号パンフレット)
アクチノバチルス・サクシノゲネス 130Z(米国特許5,504,004号公報)
アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス FZ10(米国特許5,521,075号公報)
アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス FZ53(米国特許5,573,931号公報)【００３６】
＜１−２＞yidE遺伝子の増強
本発明の細菌は、上述したような有機酸生産能を有する細菌をyidE遺伝子の発現を増強するようにに改変することによって得ることができる。ただし、yidE遺伝子の発現が増強するように改変を行った後に、有機酸生産能を付与してもよい。
本発明に用いるyidE遺伝子としては、トランスポーターの一種のタンパク質をコードする遺伝子と推測されており（Riley, M. et al. 2006. Nucleic Acid Res. 34(1): 1-9、Torres A. G. et al. 2005. Applied and Environmental Microbiology 71(12): 8008-8015）、細菌内でその発現を増強させた場合に細菌の「有機酸生産能を向上させるタンパク質」をコードする遺伝子である。本発明において、有機酸の生産能を向上させるとは、非改変株に比べて生産性が向上していればいずれでもよいが、10％以上、望ましくは20％以上、望ましくは30％以上有機酸の生産能が向上していることが望ましい。【００３７】
yidE遺伝子の発現量が親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、Reverse-Transcriptase PCR（RT-PCR）が挙げられる（Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。発現量の増大については、野生株あるいは非改変株と比較して、増大していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上増大していることが望ましい。また、発現量の増大は、目的とするタンパク質量が非改変株、野生株と比較して増大していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。【００３８】
本発明に使用できるyidE遺伝子としては、腸内細菌由来のyidE遺伝子、ルーメン細菌由来のyidE遺伝子あるいはこれらのyidE遺伝子のホモログが挙げられ、なかでも、エシェリヒア属細菌由来のyidE遺伝子、エンテロバクター属細菌由来のyidE遺伝子、サルモネラ属細菌由来のyidE遺伝子、マンヘイミア属細菌由来のMS0288またはMS0289遺伝子を用いることが望ましい。具体的には、エシェリヒア・コリ MG1655由来のyidE遺伝子（配列番号１３）、あるいはサルモネラ・ティフィムリウム LT2由来のyidE遺伝子（配列番号１５）、シゲラ・フレクネリ（Shigella flexneri）のyidE遺伝子（配列番号２５）、イェルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）のyidE遺伝子（配列番号２７）、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）のMS0288遺伝子（配列番号３０）、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637由来のyidE遺伝子（配列番号４６）が挙げられる。尚、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637由来のyidE遺伝子配列（配列番号４６）および同アミノ酸配列（配列番号４７）は、本発明者らが新たに見出した新規配列である。【００３９】
エシェリヒア・コリ MG1655のyidE遺伝子は、GenBank Accession No. NC_000913として登録されているゲノム配列中のb3685として登録されている(アミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_418140)。サルモネラ・ティフィムリウム LT2のyidE遺伝子はGenBank Accession No. NC_003197として登録されているゲノム配列中のSTM3807として登録されている(アミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_462707)。マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスMBEL55EのyidE遺伝子は、GenBank Accession No. NC_006300として登録されているゲノム配列中のMS0288又はMS0289として登録されている(アミノ酸配列はGenBank Accession No. YP087480(MS0288)とYP087481(MS0289))。シゲラ・フレクネリ8401のyidE遺伝子は、GenBank Accession No. NC_008258として登録されているゲノム配列中のSFV3826として登録されている(アミノ酸配列はGenBank Accession No. YP_691142)。イェルシニア・ペスティスCO92のyidE遺伝子は、GenBank Accession No. NC_003143として登録されているゲノム配列中のYPO4083として登録されている(アミノ酸配列はGenBank Accession No. YP_407507)。【００４０】
yidE遺伝子ホモログとは、他の微生物由来で、エシェリヒア・コリのyidE遺伝子と高い相同性を示し、宿主に導入した際に有機酸の生産能を向上させる遺伝子をいう。配列番号２４に、Salmonella typhimuriumとEscherichia coli由来のyidEタンパク質の保存配列を、配列番号７１に、Salmonella typhimurium、Escherichia coli及びEnterobacter aerogenes AJ110637由来のyidEタンパク質の保存配列を示す。また、配列番号２９に、Escherichia coli、Yersinia pestis、及びShigella flexneri由来のyidEタンパク質の保存配列を 、配列番号７２に、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Yersinia pestis、Shigella flexneri、及びEnterobacter aerogene AJ110637由来のyidEタンパク質の保存配列を示す。yidE遺伝子ホモログとしては、配列番号２４、２９、７１、もしくは７２のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、配列番号１４、１６、２６、２８、３１もしくは４７のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、宿主に導入した際に有機酸の生産能を向上させるタンパク質をコードするものが挙げられる。さらに、配列番号１４、１６、２６、２８、３１又は４７に記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するyidE遺伝子ホモログは、配列番号２４、２９、７１、又は７２、好ましくは配列番号７１に記載の共通配列を有していても良い。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。【００４１】
yidE遺伝子は、上記のとおり、既にいくつかの配列が明らかにされているので、それらの塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて得ることができる。例えば、配列番号9及び10に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、エシェリヒア・コリのyidEとyidEの制御領域を含む、その隣接領域を取得することができる。他の微生物のyidEのホモログも、同様にして取得され得る。【００４２】
腸内細菌群の種や菌株によってyidE遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、本発明の方法に用いる細菌を得るために使用するyidE遺伝子は、配列番号14、16、24、26、28、29、31、47、71、または72のアミノ酸配列をコードする遺伝子に限られず、細菌内でその発現を増強することにより細菌の有機酸生産能を向上させることができる限り、配列番号14、16、26、28、31、または47のアミノ酸配列において、保存的変異、具体的には１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、yidE遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。【００４３】
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe,Trp,Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu,Ile,Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln,Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys,Arg,His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp,Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser,Thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。【００４４】
さらに、yidE遺伝子は、配列番号14、16、26、28、31、又は47のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ、発現を増強することにより細菌の有機酸生産能を向上させることが出来るタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれyidEが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にyidE遺伝子は、発現を増強することにより細菌の有機酸生産能を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号14、16、26、28、31又は47のアミノ酸配列のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、又はＣ末端側50アミノ酸から5アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば、マンヘイミア属細菌由来のMS0288遺伝子とMS0289遺伝子の産物は、それぞれアミノ酸数が278、297とエシェリヒア・コリ由来のyidE産物の554アミノ酸と比較してかなり短いが、MS0288産物はエシェリヒア・コリ由来のyidE産物のC末端側と74％の相同性、MS0289産物はエシェリヒア・コリ由来のyidE産物のN末端側と58％の相同性を有する。【００４５】
このようなyidE遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号14、16、26、28、31又は47のアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、yidE遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンPCR(Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998))によって、遺伝子組換えにより人工的にyidE遺伝子に変異を導入して活性の高いYidEをコードする遺伝子を取得することが出来る。【００４６】
これらのyidE相同遺伝子が発現を増強することにより有機酸生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子をエシェリヒア・コリの野生株等に導入し、有機酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。その場合、例えば培地にグルコースなどの還元物質とリンゴ酸等の有機酸を添加し、グルコースを資化する際に得られる還元力を利用して、リンゴ酸等の有機酸からコハク酸やフマル酸への変換量を比較することでより明確に効果を検証することができる。【００４７】
また、yidE遺伝子は、配列番号13、15、25、27、30または配列番号46に相補的な塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ発現を増強することにより、細菌の有機酸生産能を向上させるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80％以上, 好ましくは90％以上, より好ましくは95％以上, 特に好ましくは97％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。【００４８】
プローブとして、配列番号13、15、25、27、30または配列番号46に相補的な塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の酵素遺伝子についても同様に適用される。【００４９】
上記のようなyidE遺伝子について、その発現量が増強するように細菌を改変する。
ここで、「yidE遺伝子の発現が増強するように改変された」とは、親株、あるいは野生株に対して細胞当たりのYidE産物分子の数が増加した場合や、YidE産物分子当たりの活性が上昇した場合などが該当する。なお、比較対象となる野生型としては、例えばエシェリヒア・コリではエシェリヒア・コリK12由来MG1655株やW3110株などが、エンテロバクター・アエロゲネスとしてはAJ110637株 やNBRC12010株などが挙げられる。【００５０】
yidE遺伝子の発現量の増強は、yidE遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、yidE遺伝子を含む断片を、目的の細菌内で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを上述のような有機酸生産能を有する細菌に導入して形質転換すればよい。また、野生型の細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株に有機酸生産能を付与してもよい。また、コピー数の上昇は、yidE遺伝子をコードする遺伝子を染色体上に１コピーあるいは複数コピー転移させることによっても達成される。染色体上にyidE遺伝子が転移したことの確認は、yidE遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。【００５１】
また、yidE遺伝子の発現の増強は、yidE遺伝子の発現調節領域を改変することによっても達成出来る。例えば、yidEのプロモーターの配列をより強いプロモーターに置換すること、プロモーター配列をコンセンサスに近づけることによって達成出来る（国際公開第ＷＯ００／１８９３５号パンフレット）。【００５２】
以下、有機酸生産能を有し、yidE遺伝子の発現量が上昇するように改変した細菌の構築方法を示す。これらの方法は、Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001）等のマニュアルに従って実施出来る。【００５３】
yidE遺伝子の発現の増強は、yidE遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、以下のようにプラスミドでyidE遺伝子を増幅することによって達成出来る。まずyidE遺伝子を、エシェリヒア・コリなどの染色体から、例えばPCR法等によってクローニングする。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。PCRに用いるオリゴヌクレオチドは上記の公知情報に基づいて合成でき、例えば配列番号９、１０に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いyidE遺伝子を増幅することが出来る。【００５４】
PCR法により増幅されたyidE遺伝子を含む遺伝子断片は、増幅する細菌で自律複製可能な複製起点を有するベクターに組み込み、該ベクターで細菌を形質転換することによって増幅することが好ましい。腸内細菌科に導入する場合は、ベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。コリネ型細菌に導入する場合には、具体的に例示すれば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等、特開平10-215883号公報に記載のpVK7を挙げることができる。【００５５】
yidE遺伝子と、同遺伝子を増幅する細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、yidE遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。この制限酵素サイトはあらかじめyidE遺伝子の増幅に用いる合成オリゴヌクレオチドに導入されていてもよい。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。【００５６】
上記のように調製した組換えプラスミドを細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929（1978）)も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）や、接合伝達法（Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7）によっても、細菌の形質転換を行うことができる。【００５７】
yidE遺伝子のコピー数を高めることは、yidE遺伝子を細菌の染色体DNA上に複数コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体DNA上にyidE遺伝子を複数コピー導入するには、染色体DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、yidE遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である（特開平2-109985号、特開平7-107976号、Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994)、Plasmid. 2000 Nov;44(3):285-91）。【００５８】
また、yidE遺伝子の発現量を増加させる手段として染色体DNA上またはプラスミド上のyidE遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換すること、yidEの発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変すること、強力なターミネーターを連結することによっても達成される(Hamilton et al, Journal of Bacteriology171:4617-4622、国際公開98/004715号パンフレット)。 例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、λ-phage由来のPRプロモーター、lacUVプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinの論文（Goldstein, M. A., and Doi, R.H. 1995. Biotechnol. Annu. Rev. 1: 105-128）等に記載されている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、よりコンセンサスに近づける配列に置換することによって、強力なものに改変することも可能である。例えば、−３５領域をTTGACA、TTGCCA配列に、−１０領域をTATAAT、TATAAC配列に置換することが考えられる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。【００５９】
また、発現量の上昇は、m-RNAの残存時間を延長させることや、酵素タンパク質の細胞内での分解を防ぐことによっても達成可能である。yidE遺伝子上流のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりyidE遺伝子の発現が強化される。
なお、発現調節配列の改変は、yidE遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。【００６０】
本方法においては、yidE遺伝子の発現上昇に加えて、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、及びピルビン酸−ギ酸リアーゼ（PFL）の１又は２以上の酵素の活性が低下するように改変された細菌株を用いるとより有効である。ここで、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された」とは、乳酸デヒドロゲナーゼ非改変株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。乳酸デヒドロゲナーゼ活性は、乳酸デヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。また、乳酸デヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）により乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。エシェリヒア・コリの乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下した変異株の具体的な製造方法としては、Alam, K. Y., Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217に記載されている方法等が挙げられる。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下され、かつ、yidE遺伝子の発現が増強された細菌は、例えば後述の参考例1のようにしてLDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌を実施例１のようにyidE遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低下のための改変操作とyidEの発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。ここで、エシェリヒア・コリではLDHはldhA遺伝子、lldD遺伝子がコードしており、ldhA遺伝子のDNA配列を配列番号20、アミノ酸配列を配列番号21に、lldD遺伝子のDNA配列を配列番号22、アミノ酸配列を配列番号23に示す。【００６１】
LDHの活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、染色体上のLDH遺伝子に、細胞中のLDH活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上のLDHをコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上のLDHをコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Qiu Z. and Goodman M.F. 1997. J. Biol. Chem. 272:8611-8617）。また、遺伝子破壊、例えばコード領域が欠失したような変異型LDHをコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、染色体上の正常型LDH遺伝子を置換すること、又は、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによってもLDH活性を低下または欠損させることができる。【００６２】
例えば、LDH活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。LDH遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型LDH遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでエシェリヒア・コリを形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のLDH遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、DatsenkoとWannerによって開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報、WO2005/010175号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主中で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。【００６３】
また、「アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された」とは、アルコールデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、アルコールデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。また、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下されたことは、公知の方法（Lutstorf,U.M., Schurch,P.M. & von Wartburg,J.P.,Eur. J. Biochem.17,497-508(1970)）によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。エシェリヒア・コリのアルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下した変異株の具体的な製造方法としては、Sanchez, A. M. et al. 2005. Biotechnol. Prog. 21: 358-365に記載されている方法等が挙げられる。本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下され、かつ、yidE又遺伝子の発現が増強された細菌は、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)をコードする遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をyidE遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、ADH活性低下のための改変操作とyidE遺伝子発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下は上述の乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下と同様の方法で行うことが出来る。また、エンテロバクター・アエロゲネスのADH遺伝子（adhE）として、エンテロバクター・アエロゲネスAJ 110637 (FERM ABP-10955)株のADH遺伝子の塩基配列（部分配列）を配列番号３４に示す。同遺伝子の全塩基配列は、例えば、これらの部分配列に基づいて、エンテロバクター・アエロゲネスの染色体ＤＮＡからADH遺伝子（adhE）を単離することによって、決定することができる。【００６４】
また、「ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下するように改変された」とは、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ非改変株と比較してピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下していることをいう。ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性は、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低下されていることが好ましい。また、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下されたことは、公知の方法（Knappe, J. and Blaschkowski, H. P. 1975. Meth. Enzymol. 41: 508-518）によりピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性を測定することによって確認することができる。本発明のピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性が低下され、かつ、yidE遺伝子の発現が増強された細菌は、例えばPFL遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をyidE遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、PFL活性低下のための改変操作とyidE遺伝子発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。PFL活性の低下は、上述の乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下と同様の方法で行うことができる。【００６５】
また、本反応においては、yidE遺伝子の発現増強に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼ(ＰＣ)の活性が増強するように改変された細菌を用いてもよい。ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増強は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、及び／又はピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性の低下と組合わせてもよい。「ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された」とは、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ピルビン酸カルボキシラーゼの活性は例えば、後述するようなNADHの減少を測定する方法により測定することができる。【００６６】
本発明の方法に使用されるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。【００６７】
ＰＣ遺伝子（pyc）としては、例えば、コリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム又はブレビバクテリウム・フラバム等のPC遺伝子を用いることができる（Peters-Wendisch, P.G. et al. 1998. Microbiology, 144: 915-927）（配列番号１７）。【００６８】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト  ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
なお、PC遺伝子発現の増強は、上述した yidE遺伝子の発現増強と同様にして行うことができる。【００６９】
＜２＞本発明の製造法
本発明では、上記のような、有機酸生産能を有し、yidE遺伝子の発現が増強するように改変された細菌を用いて有機酸の製造を行う。具体的には、本発明の微生物又は該微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することによって、有機酸を製造することができる。【００７０】
第一の形態では、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む培地で微生物を培養することにより、微生物の増殖と有機酸の生成が同時に行なわれる。この形態では、培地が前記反応液に相当する。尚、微生物の増殖と有機酸の生成が並行して行われてもよく、また、主として微生物が増殖する培養期と、主として有機酸が生成する培養期があってもよい。【００７１】
また、第二の形態では、培地で培養して増殖させた菌体を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液と共存させ、該反応液中で微生物を有機原料に作用させることによって有機酸を生成させる。この形態では、微生物の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
培養に用いる細菌は、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものであっても良いが、予め液体培地で培養（種培養）したものが好ましい。【００７２】
培養に用いる培地には、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
前記第一の形態では、培地に添加する炭素源は、有機酸生成のための有機原料でもある。
前記第二の形態では、培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。【００７３】
本発明の方法に用いる有機原料としては、本細菌が資化して有機酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。また、有機酸がコハク酸の場合、特開平５−６８５７６のように効率よくコハク酸を製造するためにフマル酸などを添加してもよく、フマル酸の変わりにリンゴ酸を添加してもよい。【００７４】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、前記第一の形態では、有機原料の培地中の濃度は５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内である。また、前記第二の形態では、反応液中の有機原料の濃度は５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内である。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。【００７５】
上記炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス、および有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本細菌が資化して有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。【００７６】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ5〜10、好ましくはｐＨ6〜9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。【００７７】
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ましい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。【００７８】
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜４０℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応液中の菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。また、反応は、バッチ式でもよく、カラム式でもよい。【００７９】
細菌の培養時は、好気条件で行うことが好ましい。一方、有機酸の生成反応は、好気条件で行ってもよいが、微好気条件または嫌気条件化で行ってもよい。微好気条件または嫌気条件化での反応には、例えば反応容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを反応液に供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを反応液に通気する等の方法を用いることができる。【００８０】
反応液（培養液）中に蓄積した有機酸は、常法に従って、反応液より分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離・精製することができる。【００８１】
さらに本発明において目的とする有機酸がコハク酸である場合には、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る（特開平4-189822）。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。また、本発明の製造法により得られるコハク酸もしくはコハク酸含有ポリマー、又はこれらを含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。【００８３】
〔参考例１〕＜エシェリヒア・コリ L,D-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子欠損株の構築＞
本遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）によって実施した。本手法により目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。【００８４】
＜１−１＞D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子欠損株の構築
WO2005/010175の記載に従って、ldhA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に、λファージのattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、それぞれ有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてプラスミドpMW118-attL-Cm-attRを鋳型としてPCRを行った。pMW118-attL-Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-cat-attRの順で挿入されている。プライマーに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を配列番号１、２に示す。増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655株にエレクトロポレーションにより導入した。次に、プラスミドpKD46が脱落したアンピシリン感受性株を取得し、ldhA遺伝子の欠失をPCRによって確認した。PCRは配列番号３，４に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行った。親株のPCR産物が約1.2kbであるのに対し、欠損株は約1.9kbにバンドが認められる。【００８５】
さらに、ldhA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、アンピシリン耐性株を選択した。尚、前記pMW-intxis-tsは、λファージ由来のインテグラーゼ（Int）遺伝子と切出し酵素（excisionase、Xis）遺伝子を有し、複製が温度感受性のプラスミドである。その後、アンピシリン感受性、かつクロラムフェニコール感受性により、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落している株をPCRにて確認した。PCRは配列番号３，４に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行い、att-catが残存している株のPCR産物が約1.9kbであるのに対し、att-catが脱落した株は約0.3kbにバンドが認められる。このようにして取得したldhA欠損株をMG1655ΔldhA株と名付けた。【００８６】
＜１−２＞L-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするlldD遺伝子欠損株の構築
ldhA遺伝子欠損株の構築と同様の方法にて構築した。lldD遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に、λファージのattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、それぞれ有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてプラスミドpMW118-attL-Cm-attRを鋳型としてPCRを行った。プライマーに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を配列番号５、６に示す。増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655ΔldhA株にエレクトロポレーションにより導入した。次に、プラスミドpKD46が脱落したアンピシリン感受性株を取得し、lldD遺伝子の欠失をPCRによって確認した。PCRは配列番号７，８に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行い、親株のPCR産物が約1.4kbであるのに対し、欠損株は約1.9kbにバンドが認められるはずである。【００８７】
さらに、lldD遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、アンピシリン耐性株を選択した。その後、アンピシリン感受性、かつクロラムフェニコール感受性により、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落している株を取得し、PCRによって確認した。PCRは配列番号７，８に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行った。att-catが残存している株のPCR産物が約1.9kbであるのに対し、att-catが脱落している株は約0.3kbにバンドが認められる。このようにして取得したlldD破壊株をMG1655ΔldhAΔlldD株と名付けた。【００８８】
〔実施例１〕コハク酸生産菌yidE遺伝子増強株の構築
＜1-1＞遺伝子増強用プラスミドの構築
yidE遺伝子の増幅を行うためにプラスミドpMW219::Pthrを用いた。本プラスミドは、ベクターpMW219 （日本ジーン社製）のHindIIIサイトとBamHIサイトの間に配列番号１１に示したエシェリヒア・コリのゲノム上のスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域を有しており、このプロモーターの下流に遺伝子をクローニングすることによって遺伝子の増幅が可能なプラスミドである。【００８９】
＜1-2＞エシェリヒア・コリ由来のyidE遺伝子増幅用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリのゲノム配列のyidE遺伝子の塩基配列（Genbank Accession No. U00096 b3685）に基づいて、5'プライマーとしてBamHIサイトを有する配列番号12に示す合成オリゴヌクレオチド、配列番号19に示す3'側プライマーとしてBamHIサイトを有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、制限酵素BamHIにて処理し、yidE遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したPCR産物を、BamHIで処理したベクターpMW219::Pthrに連結してyidE増幅用プラスミドpMW219::Pthr::yidEを構築した。【００９０】
＜1-3＞yidE増幅株の作製
上記（1-2）で得られたpMW219::Pthr::yidEおよびpMW219を用いて、エシェリヒア・コリMG1655ΔldhAΔlldD株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれMG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::yidE、MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219と名づけた。また、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637株をpMW219::Pthr::yidEおよびpMW219を用いて電気パルス法にて形質転換を行い、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれAJ110637/pMW219::Pthr::yidE、AJ110637/pMW219と名づけた。【００９１】
〔実施例２〕yidE増幅の効果
＜2-1＞エシェリヒア属細菌コハク酸生産株でのyidE増幅の効果
MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::yidE、MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219を25mg/Lのカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、該プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社）を用いて嫌気条件下、37℃で16時間培養を行った。得られたプレートの菌体を、0.8%の食塩水で洗浄後、51倍希釈でOD=1.0（600nm）になる様に調製した。この菌体懸濁液100μlと予め窒素ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を窒素ガスにて置換した生産培地（グルコース10g/l、リンゴ酸2Na 10g/l、TES 45.88g/l、Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NH4Cl 1g/l、KOHでpH7.3に調整後フィルターろ過）1.3mlを1.5ml容のマイクロチューブに分注し、マイクロチューブ用攪拌機を用いて31.5℃において10時間培養した。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
10時間目のコハク酸蓄積を表１、コハク酸蓄積の経時変化を図１に示す。【００９２】
【表１】
2008133131.tif 000002
【００９３】
yidE遺伝子増幅株であるMG1655ΔldhAΔlldD/ｐMW219::Pthr::yidEでは、対照のMG1655ΔldhAΔlldD/ｐMW219と比べて顕著にコハク酸蓄積が上昇し、このことからyidE発現増強のコハク酸生産への効果が確認された。【００９４】
＜2-2＞エンテロバクター属細菌でのyidE増幅の効果
AJ110637/pMW219::Pthr::yidE、AJ110637/pMW219を50μg/mlのカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、該プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社）を用いて嫌気条件下、37℃で16時間培養を行った。得られたプレートの菌体を、0.8%の食塩水で洗浄後、51倍希釈でOD=1.0（600nm）になる様に調製した。この菌体懸濁液100μlと予め窒素ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を窒素ガスにて置換した生産培地（グルコース10g/l、リンゴ酸2Na 10g/l、TES 45.88g/l、Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NH4Cl 1g/l、KOHでpH7.3に調整後フィルターろ過）1.3mlを1.5ml容のマイクロチューブに分注し、マイクロチューブ用攪拌機を用いて31.5℃で6時間培養した。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
6時間目のコハク酸蓄積を表２、コハク酸蓄積の経時変化を図２に示す。
yidE遺伝子増幅株AJ110637/pMW219::Pthr::yidEでは、対照のAJ110637/pMW219と比べて、顕著にコハク酸蓄積が上昇した。【００９５】
【表２】
2008133131.tif 000003
【００９６】
〔実施例３〕
＜3-1＞エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637におけるadhE欠損株の構築
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637は、嫌気条件下において糖源を含む培地で生育させた場合、著量のエタノールを生成するため、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするadhEを欠損させることにより、エタノールの生成を抑えることとした。【００９７】
adhE欠損用遺伝子断片は、WO2005/010175に記載のプラスミドpMW-attL-Tc-attRを鋳型として、配列番号３２と配列番号３３のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより調製した。pMW118-attL-Tc-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるTc遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-Tc-attRの順で挿入されている（参考例３参照）。前記PCRにより、テトラサイクリン耐性遺伝子の両端にそれぞれλphageのattL及びattRの配列、更にその外側にそれぞれadhE遺伝子の上流60bp、下流59bpの配列を付加した遺伝子断片を増幅した。この断片をWizard PCR Prep DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製した。【００９８】
次にエンテロバクター・アエロゲネス AJ110637をRSF-Red-TER（図３、参考例２参照）で形質転換し、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637/RSF-Red-TER株を得た。同株を40μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB培地で終夜培養を行い、この培養液を40μg/ml クロラムフェニコールと0.4mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノサイドを含有するLB培地50mLに1/100量接種し、4時間31℃で培養を行った。菌体を集菌し、氷冷した10%グリセロールで３回洗菌した後、最終的に0.5mLの10%グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとし、上項で調製したPCR断片を、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたLB培地を添加し、31℃で2時間振盪培養を行った後、LB培地に25μg/mlのテトラサイクリンを加えた培地に塗布した。出現したコロニーを同培地で純化した後、PCRによりadhE遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と置換していることを確認した。【００９９】
＜3-2＞AJ110637ΔadhE株におけるピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子増強株の構築
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔadhE株において、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpycを増幅することにより、コハク酸の生成能を付与することとした。【０１００】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のpycをAJ110637ΔadhE株で発現させるために、エシェリヒア・コリ MG1655株のスレオニンオペロンプロモーター断片の取得を試みた。エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列（Genbank Accession No. U00096）は既に明らかにされている（Science, 277, 1453-1474 (1997)）。本配列を基にスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'プライマーとしてSacIサイトを有する配列番号35に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番号36に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片（A）（配列番号37）を得た。【０１０１】
更に、コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC13869）由来のpyc遺伝子断片の取得を行った。5'プライマーとして配列番号38に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとしてSacIサイトを有する配列番号39に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC13869）由来のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、pyc遺伝子断片（B）（配列番号40）を得た。【０１０２】
上記、断片（A）と（B）を鋳型にし、配列番号35と配列番号39のプライマーを用いてPCR反応を行い、断片（A）と（B）が結合された遺伝子断片（C）を得た。この遺伝子断片（C）を制限酵素SacIにて処理、精製した産物を、制限酵素SacIで消化したプラスミドベクターpSTV28（宝バイオ社製）に結合して、pyc増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pycを構築した。【０１０３】
上述のエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhE株に、pyc増幅用プラスミドpSTV28::Pthr::pycをエレクトロポレーションにより導入し、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を得た。エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhEのpyc増幅株をAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pycと名付けた。【０１０４】
＜3-3＞AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pycにおけるエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637由来yidE遺伝子増強株の構築
上述と同様にエシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のスレオニンオペロン（thrLABC）のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'プライマーとして配列番号41に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番42に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC47076, ATCC700926）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片（A）（配列番号43）を得た。【０１０５】
次にエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株のyidE遺伝子のクローニングを行う為に、5'プライマーとして配列番号44に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番号45に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、yidE遺伝子断片（B）（配列番号46）を得た。【０１０６】
上記、断片（A）と（B）を鋳型にし、配列番号41と配列番号45のプライマーを用いてPCR反応を行い、断片（A）と（B）が結合された遺伝子断片（C）を得た。この遺伝子断片（C）をTaKaRa BKL Kit（宝バイオ社製）にて平滑化後、5'末端のリン酸化を行った。その後、制限酵素SmaIで消化し、Alkaline Phosphataseで脱リン酸化処理したプラスミドベクターpMW218に結合して、yidE増幅用プラスミドpMW218::Pthr::Ent-yidEを構築した。【０１０７】
上述のエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637由来のyidE遺伝子増幅用ベクターpMW218::Pthr::Ent-yidEと、対照用プラスミドpMW218をエレクトロポレーションによりエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc株に各々導入し、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、及びカナマイシン耐性を示す形質転換体を得た。エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc株由来のyidE増幅株をAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-yidE、対照のpMW218導入株をAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218と名付けた。【０１０８】
＜3-4＞エンテロバクター属細菌でのエンテロバクター・アエロゲネス由来yidE増幅の効果
AJ110637ΔadhE /pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-yidE、AJ110637ΔadhE /pSTV28::Pthr::pyc/pMW218を、各々50μg/mlのカナマイシン、25μg/mlのテトラサイクリン、及び40μg/mlのクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、31.5℃にて16時間培養した。その後、シード培地（バクトトリプトン 20g/l、イーストエキストラクト 10g/l NaCl 20g/L）3mlが分注された試験管に植菌し、31.5℃で16時間、振とう培養を行った。得られた培養液にコハク酸生産培地（グルコース100g/l、3時間以上、乾熱滅菌をした炭酸カルシウム50g/L）3mlを添加後、シリコン栓にて密閉し、31.5℃で24時間振とう培養を行った。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
24時間目のコハク酸蓄積を表３に示す。
yidE遺伝子増幅株AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-yidEでは、対照のAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218と比べて、顕著にコハク酸蓄積が上昇した。【０１０９】
【表３】
2008133131.tif 000004
【０１１０】
〔参考例２〕ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図４に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号４８、４９、５０、５１のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載（Skorokhodova, A.Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)）と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代わりにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。【０１１１】
次に、前記の1.0kbのcat断片をBglII及びSacIで処理し、先の工程で得たRSF-PlaclacIsacBプラスミドのBamHI-SacI部位にクローニングした。得られたプラスミドpMW-PlaclacIsacBcatは、PlacUV5-lacI-sacB-cat断片を含んでいる。この断片をRSF1010ベクターにサブクローンするために、pMW-PlaclacIsacBcatをBglIIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、続いてSacIで切断した。pMWPlaclacIsacBcatプラスミドの3.8kbのBglII-SacI断片を1%アガロースゲルから溶出させ、PstI、及びSacIで処理したRSF1010ベクターに連結した。ライゲーション混合液でエシェリヒア・コリTG1を形質転換し、クロラムフェニコール（50mg/L）を含むLB培地にプレートした。生育したクローンから単離したプラスミドの制限酵素解析を行い、RSFsacBプラスミドを得た。RSFsacBPlacMCSベクターを構築するために、配列番号５２及び５３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pMW119-PlaclacIプラスミドを鋳型として用いて、PlacUV5プロモーターを含むDNA断片をPCRにより増幅した。得られた146bpの断片をSacI及びNotIで消化し、RSFsacBプラスミドのSacI-NotI大断片と連結した。その後、配列番号５４及び５５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pKD46プラスミド（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Nat1.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, (2000)）を鋳型とし用いたPCRにより、λRedαβγ遺伝子、及び転写ターミネーターtL3を含む2.3kbのDNA断片を増幅した。得られた断片をRSFsacBPlacMCSベクターのPvuI-NotI部位にクローニングした。こうして、RSFRedプラスミドをデザインした。【０１１２】
Red遺伝子のリードスルー転写を排除するために、エシェリヒア・コリのrrnBオペロンのρ−依存性転写ターミネーターを、cat遺伝子とPlacUV5プロモーターとの間に挿入した。そのために、配列番号５６及び５３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エシェリヒア・コリBW3350の染色体を鋳型として用いたPCRにより、PlacUV5プロモーターとTrrnBターミネーターを含むDNA断片を増幅した。得られたこれらの断片をKpnIで処理して、連結した。その後、配列番号５３及び５７のオリゴヌクレオチドをプライマーとするオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、PlacUV5及びTrrnBの両方を含む0.5kb断片を、増幅した。得られたDNA断片をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理して平滑末端化し、BamHIで切断し、RSFsacBPlacMCSベクターのEcl136II-BamHI大断片と連結した。得られたプラスミドをRSF-Red-TERと命名した。【０１１３】
〔参考例３〕pMW118-attL-Tc-attRプラスミドの構築
pMW118-attL-Tc-attRは、以下の４つの断片を連結することによって得た。【０１１４】
１）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattLに相当する領域から、プライマーP1（配列番号５８）及びP2（配列番号５９）を用いたPCR増幅により得たattL（配列番号６０）を持つBglII-EcoRI断片(114bp)。これらのプライマーは、BglII及びEcoRIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１１５】
２）エシェリヒア・コリW3350（λプロファージを含む）の染色体のattRに相当する領域から、プライマーP3（配列番号６１）及びP2（配列番号６２）を用いたPCR増幅により得たattR（配列番号６３）を持つPstI-HindIII断片(182bp)。これらのプライマーは、PstI及びHindIIIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１１６】
３）pMW118-ter_rrnBのBglII-HindIII大断片(3916 bp)。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、次の３つのDNA断片を連結することによって得た。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性（ApR）の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6（配列番号６４及び６５）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8（配列番号６６及び６７）を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。【０１１７】
４）テトラサイクリン耐性遺伝子及びter_thrL転写ターミネーターを持つpML-Tc-ter_thrLのEcoRI-PstI小断片(1388bp)（配列番号６８)。pML-Tc-ter_thrLプラスミドは、次の２工程で得た。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001, no. 5, 3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10（配列番号６９及び７０）を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼＩクレノーフラグメントで処理した。【０１１８】
〔配列表の説明〕
配列番号１：ldhA欠損用プライマー
配列番号２：ldhA欠損用プライマー
配列番号３：ldhA欠損確認用プライマー
配列番号４：ldhA欠損確認用プライマー
配列番号５：lldD欠損用プライマー
配列番号６：lldD欠損用プライマー
配列番号７：lldD欠損確認用プライマー
配列番号８：lldD欠損確認用プライマー
配列番号９：yidE増幅プライマー
配列番号10：yidE増幅プライマー
配列番号11：スレオニンプロモーター配列
配列番号12：yidE増幅用プライマー
配列番号13：Escherichia coliのyidEの塩基配列
配列番号14：Escherichia coliのYidEのアミノ酸配列
配列番号15：Salmonella typhimuriumのyidEの塩基配列
配列番号16：Salmonella typhimuriumのYidEのアミノ酸配列
配列番号17：Brevibacterium fluvumのピルビン酸カルボキシラーゼをコードするPC遺伝子の塩基配列
配列番号18：Brevibacterium fluvumのピルビン酸カルボキシラーゼ配列のアミノ酸配列
配列番号19：yidE増幅用プライマー
配列番号20：Escherichia coliのldhAの塩基配列
配列番号21：Escherichia coliのLdhAのアミノ酸配列
配列番号22：Escherichia coliのlldDの塩基配列
配列番号23：Escherichia coliのLldDのアミノ酸配列
配列番号24：Escherichia, SalmonellaのYidEの共通配列
配列番号25 Shigella flexneriのyidEの塩基配列
配列番号26：Shigella flexnerのYidEのアミノ酸配列
配列番号27：Yersinia pestisのyidEの塩基配列
配列番号28：Yersinia pestisのYidEのアミノ酸配列
配列番号29：Escherichia, Salmonella, Shigella, YersiniaのYidEの共通配列
配列番号30：Mannheimia succiniciproducensのyidEの塩基配列
配列番号31：Mannheimia succiniciproducensのYidEのアミノ酸配列
配列番号32：adhE欠損用プライマー塩基配列
配列番号33：adhE欠損用プライマー塩基配列
配列番号34: Enterobacter aerogenes AJ110637 adhE塩基配列（部分配列）
配列番号35：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号36：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号37：スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号38 : ピルビン酸カルボキシラーゼ増幅用プライマー
配列番号39 : ピルビン酸カルボキシラーゼ増幅用プライマー
配列番号40 : ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子断片
配列番号41：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号42：スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号43：スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号44：Enterobacter aerogenes AJ110637 yidE増幅用プライマー塩基配列
配列番号45：Enterobacter aerogenes AJ110637 yidE増幅用プライマー塩基配列
配列番号46：Enterobacter aerogenes AJ110637 yidEの塩基配列
配列番号47：Enterobacter aerogenes AJ110637 YidEのアミノ酸配列
配列番号48：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号49：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号50：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号51：sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号52：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号53：PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号54：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号55：λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号56：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号57：PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号58：attL増幅用プライマー
配列番号59：attL増幅用プライマー
配列番号60：attLの塩基配列
配列番号61：attR増幅用プライマー
配列番号62：attR増幅用プライマー
配列番号63：attRの塩基配列
配列番号64：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号65：bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号66：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号67：ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号68：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号69：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号70：ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号71：Escherichia, Salmonella, EnterobacterのYidEの共通配列
配列番号72：Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, EnterobacterのYidEの共通配列
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率で有機酸を製造することができる。また有機酸がコハク酸の場合、得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することもできる。
【図１】
2008133131.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008133131.tif 000010
2008133131.tif 000011
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