【手続補正書】
【提出日】平成16年7月9日(2004.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ) 既知の方法に従って固体支持体上で、核酸塩基上に存在する環外アミノ基が環状ジアシル基で保護されており、かつ非求核性強塩基により存在しているいずれのホスフェート保護基も除去することが可能であるヌクレオチドを連続的に合成し、
ｂ) 固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから保護基を除去し、そして
ｃ) 保護基を除去したオリゴヌクレオチドを固体支持体から分離する
ことによって固相合成でオリゴヌクレオチドを製造する方法において、固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから適当な有機溶媒中で非求核性強塩基の存在下に保護基を除去することを特徴とする上記の製法。
【請求項２】
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから０〜７０℃で０.１〜１６時間ＤＢＵの０.１〜５Ｍ溶液で保護基を除去する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから１０〜４０℃で０.１〜２時間ＤＢＵの０.３〜３Ｍ溶液で保護基を除去する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから２０〜３０℃で０.２〜１.５時間ＤＢＵの０.５〜２.５Ｍ溶液で保護基を除去する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
式(Ｉ)
【化１】
1998072486.tif 000001
〔式中、
Ｒ1は互いに独立して、水素、ヒドロキシル、場合によりヒドロキシルもしくはＣ1〜Ｃ4−アルコキシで１〜３回置換されていてもよいＣ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)s（ｓは１〜３の数である）、Ｏ−アリル、ハロゲン、アジドまたはアミノであり；
Ａは互いに独立してオキシ、チオキシまたはメチレンであり；
Ｗは互いに独立してオキソ、チオキソまたはセレンオキソであり；
Ｖは互いに独立してオキシ、スルファンジイルまたはイミノであり；
Ｙは互いに独立してオキシ、スルファンジイル、イミノまたはメチレンであり；
Ｂはヌクレオチド化学で通常の塩基であって、その少なくとも１個は環外アミノ基を有する塩基であり；
ｎは１〜１００の整数であり；
Ｕは互いに独立してヒドロキシル、メルカプト、ＢＨ3、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14)−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式(II)
(ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ2 (II)
の基であり、
ここで、
Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、または−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ(ＣＨ2)c〕d−ＮＲ5Ｒ5（ｃは２〜６の整数であり、そしてｄは０〜６の整数である）であり；
Ｒ5は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルであり；
Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであるか、または、ＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ3およびＲ3とＲ4を担有している窒素原子と共に、Ｏ、ＳおよびＮの群からのさらに別の一つのヘテロ原子をさらに含有していてもよい５〜６員複素環式環であり；
ｐは１〜１００の整数であり；
ｑは０〜２２の整数であり；
Ｒ2は水素もしくは官能基例えばヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ6、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＲ7またはハロゲンであり、
ここで、
Ｒ6はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり、そして
Ｒ7はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり；
ＱおよびＱ′は互いに独立して水素もしくは結合体（アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの性質に対して好ましい効果を有するか、またはＤＮＡプローブのための標識として使用されるか、または、標的核酸と類似のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に関連して、結合または架橋中に標的核酸をアタックするような結合体）であり；
そして、
Ｒ1および隣接するホスホリル基は２′および３′−位または反転して３′および２′−位に位置していてもよく；
各々のヌクレオチドはそのＤまたはＬ配置で存在していてもよく；
塩基Ｂはαまたはβ−位に位置していてもよく、またオリゴヌクレオチドが３′−３′−または５′−５′反転を含有することもできる〕
を有する化合物を製造するために、
(ａ)  式(III)
【化２】
1998072486.tif 000002
（式中、Ａ、ＹおよびＶは先の定義のとおりであり、そして
Ｒ1′はＲ1の定義のとおりであるが、Ｒ1がヒドロキシルもしくはアミノである場合Ｒ1′は相当する保護された基であり、
Ｓは酸の条件下で除去することができる５′保護基であり；
ＢPRは、存在することがあり得るいずれかの環外アミノ基が環状ジアシル基で保護されている天然または非天然の核酸塩基である）を有する化合物を、既知の方法に従って、式(IV)
【化３】
1998072486.tif 000003
（式中、
Ｚ′はＯＲ13またはＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールもしくはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルであり；
Ｒ11およびＲ12は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、またはＣ5〜Ｃ12−シクロアルキル、ベンジルまたはフェニルまたは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、飽和または不飽和の、適宜追加のヘテロ原子を有する複素環および置換分ＯＣ(Ｏ)Ｏ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキルエステルのような置換分を有する前記複素環であり；そして
Ｒ13は非求核性強塩基で除去することができる保護基であり、
Ｚは塩素もしくは臭素または式ＮＲ11Ｒ12（式中Ｒ11およびＲ12は先の定義のとおりである）を有する基である）を有する化合物と、塩基、あるいはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルとＣ1〜Ｃ4−トリアルキルアミンとの混合物の存在下、または、Ｚが式ＮＲ11Ｒ12の基である場合、式
〔ＨＮＲ14Ｒ15Ｒ16〕(+)Ａ(-)
（式中、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル基であり、そしてＡはフッ素、塩素または臭素である）を有する化合物またはテトラゾールもしくは５−（Ｃ1〜Ｃ4−アルキルチオ）−１Ｈ−テトラゾールの存在下、またはピリジン塩酸塩の存在下に反応させて式(Ｖ)
【化４】
1998072486.tif 000004
（式中、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ａ、ＢPR、Ｚ′、Ｒ1′、Ｒ11およびＲ12は先の定義のとおりである）を有する化合物を形成させ；
(ｂ)  式(III)の化合物を、既知の方法に従って、適当な有機溶媒中で、適宜触媒を加えた後、１〜１０当量のリンカーと反応させ、次いで既知の方法に従って後処理して式(VI)
【化５】
1998072486.tif 000005
（式中、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ａ、ＢPRおよびＲ1は先の定義のとおりである）を有し、合成で使用される重合体支持体に対するリンカーとして役立つ３′位でのコハク酸残基を有する化合物を形成させ；
(ｃ)  式(VI)の化合物を、既知の方法に従って適当な溶媒中で反応させることにより、固体支持体ＳＳに結合させると式(VII)
【化６】
1998072486.tif 000006
を有する化合物が得られ；
(ｄ)  既知の方法に従って、式(VII)から５′保護基を除去し；
(ｅ)  得られた化合物を適当な有機溶媒中、式
〔ＨＮＲ14Ｒ15Ｒ16〕(+)Ａ(-)
（この式は先に定義したとおりである）を有する化合物、またはテトラゾール、５−（Ｃ1〜Ｃ4−アルキルチオ）−１Ｈ−テトラゾールまたは５−（Ｃ6〜Ｃ12−アリール）−１Ｈ−テトラゾールの存在下、またはピリジン塩酸塩の存在下に式(Ｖ)の化合物と反応させ、そして
(ｆ)  得られた化合物を、既知の方法に従って、適宜追加の有機溶媒の存在下に酸化し、
(ｇ)  反応工程(ｄ)〜(ｆ)を所望の連鎖の長さが得られるまでくり返して行い；
(ｈ)  このようにして得られた化合物を適当な有機溶媒中でＤＢＵで処理することによって保護基を除去し；そして
(ｉ)  既知の方法によって、オリゴヌクレオチドを支持体から分離する
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程(ｄ)からの未反応化合物をキャッピング工程によって非活性化する請求項５記載の方法。
【請求項７】
式(III)、(Ｖ)、(VI)および(VII)を有する化合物において、ＢPRが互いに独立して
【化７】
1998072486.tif 000007
（式中、
ｍは０〜４の整数であり、そして
Ｒ8は互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシ、ＣＮであり、
Ｒ9は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−(１−アルキン)、またはフッ素であり、そして
Ｒ10は互いに独立して水素またはβ−除去可能な保護基である）
である請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ1が水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシもしくはフッ素であり；
Ａがオキシであり；
Ｗがオキソまたはチオキソであり；
Ｖがオキシであり；
Ｙがオキシであり；
Ｂが互いに独立してアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５−プロピンウラシル、５−プロピンシトシン、５−ヘキシンウラシルまたは５−ヘキシンシトシンであり、
ｎが５〜４０の整数であり；
Ｕがヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3であり、ここで
Ｒ3はＣ1〜Ｃ8−アルキルもしくはメトキシエチルであり、
Ｒ4はＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであり、または、ＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ3およびＲ3とＲ4を担有する窒素原子と共に、Ｏ、ＳおよびＮの群からのさらに別の一つのヘテロ原子をさらに含有してもよい５〜６員環複素環であり、
ＱおよびＱ′は互いに独立して水素である
式(Ｉ)の化合物を製造するための請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ1が水素であり、
ｎが５〜３０の整数であり、
ＵがヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
ＱおよびＱ′が水素であり、
そして残りの可変部分が請求項７に定義したとおりである
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式(Ｖ)
【化８】
1998072486.tif 000008
（式中、
Ｒ1′は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ（適宜ヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシで１〜３回置換されていてもよい）、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)1-3、Ｏ−アリル、フッ素、塩素、アジドまたは保護されたヒドロキシル基またはアミノ基であり；
Ａはオキシ、チオキシまたはメチレンであり；
Ｖはオキシ、スルファンジイルまたはイミノであり；
Ｙはオキシ、スルファンジイル、イミノまたはメチレンであり；
Ｓは酸の条件下で除去することができる５′保護基であり；
ＢPRは環外アミノ基を有し、而して該環外アミノ基が環状ジアシル基で保護されている天然または非天然核酸塩基であり；
Ｚ′はＯＲ13、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールもしくはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルであり；
Ｒ11およびＲ12は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ8−アルキルまたはＣ5〜Ｃ12−シクロアルキル、ベンジルまたはフェニルであるか、または、それらが結合している窒素原子と共に、飽和または不飽和の、適宜追加のヘテロ原子を有する複素環およびＯＣ(Ｏ)Ｏ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキルエステルのような置換分を有する複素環であり；そして
Ｒ13はｐ−ニトロフェニルエチルまたは２−シアノエチルである）
を有する化合物。
【請求項１１】
ＢPRが、
【化９】
1998072486.tif 000009
（ここで、
ｍは０〜４の整数であり；そして
Ｒ8は互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシまたはＣＮであり、
そしてＲ9およびＲ10は請求項７で定義したとおりである）
である請求項１０に記載の式(Ｖ)の化合物。
【請求項１２】
Ｒ1′は水素、保護されたヒドロキシル基、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシまたはフッ素であり；
Ａはオキシであり；
Ｖはオキシであり；
Ｙはオキシであり；
Ｚ′はＯＲ13、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルである
請求項１０または１１に記載の式(Ｖ)の化合物。