【手続補正書】
【提出日】平成14年7月29日(2002.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国特許法第１１９条のもとで、１９９９年１２月１６日付けで出願された仮特許出願番号第６０／１７２，３０６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規な腫瘍壊死因子レセプター／オステオプロテジェリン様（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ）（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、選択的結合因子（例えば、抗体）および方法に関する。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと関連する疾患の診断および処置のための方法もまた提供される。
【０００３】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術的進歩は、ヒトゲノムの解読に基づいた新規の治療剤の発見を大きく加速した。現在では、高速の核酸配列決定技術により、前例のない速度で配列情報が作製され得、そしてコンピュータ分析と結合されて、ゲノム全体へと重複する配列を集合させることが可能であり、そしてポリペプチドコード領域の同定が可能である。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にし得る。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。改変体およびその誘導体を作製するための核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤として使用するために有利な特性を産物に付与し得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における著しい技術的進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づいた新規の治療剤の開発に対する可能性は、未だ広範には実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療的分子に対して「標的」として機能し得る）は、依然として同定されていない。さらに、多くのヒト遺伝子由来のポリペプチド産物の構造分析および機能分析が、未だ行われていない。
【０００５】
従って、診断的または治療的な利点を有する、新規なポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子およびコードされるポリペプチド、ならびにそれらの使用に関する。
【０００７】
本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１または３に記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００８】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドに対して、少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドは、ＧＡＰ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴＸ，ＢｅｓｔＦｉｔ，およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群から選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される場合に、配列番号２または配列番号４に記載のコードされるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１もしくは配列番号３、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１に記載の１〜４３０アミノ酸残基または配列番号３に記載の１〜４３６アミノ酸残基の置換および／または欠失を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１もしくは配列番号３、または（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列；
（ｆ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｅ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００９】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断およびＮ末端切断からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のコードされるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）残基１に成熟アミノ末端を含み、そして必要に応じてさらにアミノ末端メチオニンを含む、配列番号２または配列番号４に記載の成熟アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）についてのアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、ＧＡＰ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴＸ，ＢｅｓｔＦｉｔ，およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群から選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される場合に、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列のフラグメント；
（ｅ）配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）のうちの少なくとも１つのいずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１１】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の切断を有する、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断およびＮ末端切断からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１２】
また、前述の段落の上記（ａ）〜（ｅ）のポリペプチド配列を含む融合ポリペプチドも提供される。
【００１３】
本発明はまた、本明細書中に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に記載の組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびこの宿主細胞を培養する工程ならびに必要に応じてそのようにして産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生する方法を提供する。これらの発現ベクターは、発現のために昆虫細胞を利用するバキュロウイルス発現ベクターを含む。
【００１４】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現およびレベルの増加（これは、循環レベルの増加を含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物である。また、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする核酸分子の破壊を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供され、この破壊は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをノックアウトするか、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現を有意に減少させる。
【００１５】
また、本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの誘導体が提供される。
【００１６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様のアナログが、本発明において提供され、これは、配列番号２または配列番号４のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの保存的および非保存的なアミノ酸置換から得られる。このようなアナログは、配列番号２の４２位のアミノ酸がプロリンおよびグリシンからなる群から選択されるか、配列番号２の５１位のアミノ酸がセリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミンからなる群から選択されるか、配列番号２の５６位のアミノ酸がフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群から選択されるか、配列番号２の６８位のアミノ酸がヒスチジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）、リジン、およびアルギニンからなる群から選択されるか、配列番号２の７１位のアミノ酸がセリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミンからなる群から選択されるか、配列番号２の８４位のアミノ酸がアラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびノルロイシンからなる群から選択されるか、または配列番号２の８７位のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸からなる群から選択される、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを含む。
【００１７】
さらに、本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が提供される。このような抗体、ポリペプチド、ペプチドおよび低分子は、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得る。
【００１８】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチドまたは選択的結合因子、および１以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む薬学的組成物もまた、本発明によって包含される。この薬学的組成物は、本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドの治療的有効量を提供するように使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。本発明はまた、膜にカプセル化されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを投与するためのデバイスを提供する。
本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよび核酸分子を使用して、本明細書中に列挙された疾患および障害を含む疾患および障害を処置、予防、改善、診断、および／または検出し得る。生物学的サンプル、細胞サンプル、または組織サンプルにおける発現分析によって、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが本明細書中に記載の病理学的状態の診断および／または処置において役割を果たし得るかが示唆される。この発現は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリヌクレオチドのような診断剤を用いて検出され得る。
【００１９】
本発明は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの異常なレベルによって引き起こされるかまたは異常なレベルから生じる、被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性の診断を包含し、これは、サンプル中のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現の存在または量を検出する工程；および、正常な被験体またはより以前の時期の被験体のいずれかに由来する生物学的サンプル、組織サンプル、または細胞サンプルにおけるこのポリペプチドのレベルを比較する工程を包含し、ここで病理学的状態に対する感受性は、このポリペプチドの発現の存在または量に基づく。
【００２０】
本発明はまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合する試験分子を同定するために試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを試験分子と接触させる工程、およびこのポリペプチドへの試験分子の結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアゴニストであるか、またはアンタゴニストであるかを決定する工程を包含する。本発明はさらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現に対する分子の影響、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２１】
本発明は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様生物学的活性のアンタゴニストを同定する方法を提供し、この方法は、低分子化合物をＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと接触させる工程、およびこれらの低分子の存在下または非存在下におけるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様生物学的活性を測定する工程を包含する。これらの低分子は、天然に存在する医用化合物であり得るか、またはコンビナトリアル化学ライブラリーから誘導され得る。さらに、本発明はまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナー（例えば、サイクリン）を同定する方法を包含する。これらの方法は、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリヌクレオチドからなるベイト（ｂａｉｔ）構築物を含む、酵母ツーハイブリッドアプローチを利用する。このベイト構築物を使用して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。ここでこのライブラリーは、ＧＡＬ４活性化ドメインに融合されたヌクレオチド配列からなる。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様相互作用タンパク質をコードするライブラリー配列は、ＧＡＬ４の制御下でのレポーター遺伝子の転写活性化によって同定され得る。Ｇｕａｒｅｎｔｅ、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎ．９：３４２−３４６（１９９３）；Ｂａｒｔｅｌ＆Ｆｉｅｌｄ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２５４：２４１−６３（１９９５）を参照のこと。
【００２２】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現を調節する方法およびレベルを調整（すなわち、増加または減少）する方法もまた、本発明によって包含される。１つの方法は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法では、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現を調節または調整するエレメントを含む核酸分子が投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるような、遺伝子治療、細胞療法、およびアンチセンス療法が挙げられる。
【００２３】
本発明の別の局面では、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、その結合パートナー（「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド結合パートナー」）を同定するために使用され得る。酵母ツーハイブリッドスクリーニングが、タンパク質についての結合パートナーおよびレセプターを同定およびクローン化するために広範に使用されてきた（Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８３、１９９１）。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド結合パートナーの単離は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド活性の新規のアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。
【００２４】
このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ補因子、抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ選択的結合因子（例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様抗体およびその誘導体）、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを結合し得る低分子、ペプチドもしくはそれらの誘導体、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらのいずれも、１以上の疾患または障害（本明細書中に列挙された疾患または障害を含む）を潜在的に処置するために使用され得る。これらの病理学的状態としては、骨粗しょう症、パジェット病、骨髄炎、高カルシウム血症、骨減少症、および骨壊死が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
特定の実施形態では、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと相互作用してその活性を調節する、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量分子であり得る。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の見出しは、構成上の目的のためのみであり、そしてそこに記載される内容を限定するように解釈されるべきではない。本願において列挙される全ての参考文献が、明確に、本明細書中に参考として援用される。
【００２７】
（定義）
用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、配列番号１または３のいずれかに記載のヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１７５８中のＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、および本明細書中で規定される核酸分子を含むかまたはそれらからなる核酸分子をいう。関連の核酸分子としては、以下が挙げられる：配列番号１もしくは３のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％同一であるヌクレオチド配列、あるいは配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドに対して少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは本質的にそのヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１または３のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して、約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるか、あるいは、配列番号２または４のいずれかに示されるポリペプチド配列に対して、約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００２８】
関連の核酸分子はまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子のフラグメントを含み、このフラグメントは、配列番号１または３のいずれかのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子の少なくとも約１０個連続するヌクレオチド、または約１５個、または約２０個、または約２５個、または約５０個、または約７５個、または約１００個、または約１００個より多く連続したヌクレオチドを含む。関連の核酸分子はまた、上記のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子のフラグメントを含み、このフラグメントは、配列番号２または配列番号４のいずれかのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの少なくとも約２５アミノ酸残基、または約５０アミノ酸残基、または約７５アミノ酸残基、または約１００アミノ酸残基、または約１００アミノ酸残基より多いアミノ酸残基のポリペプチドをコードする。関連の核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドと比較して、１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加、および／または欠失を含むかまたは本質的にそれらからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。さらに、関連のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子は、本明細書中に規定される中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１または３のいずれかのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子のいずれかの完全に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。好ましい実施形態では、関連の核酸分子は、中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは３のいずれかに示される配列を有する分子、または配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示される配列を含むポリペプチドをコードする分子、または本明細書中に規定される核酸フラグメント、または本明細書中に規定されるポリペプチドをコードする核酸フラグメントの相補体とハイブリダイズする配列を含む。関連の核酸分子が、配列番号１または３のいずれかのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含み、そして上記ヌクレオチド配列のいずれかに対して相補的な配列を含むこともまた理解される。関連のコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する。
【００２９】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総ＤＮＡが供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の夾雑核酸分子、またはその天然の環境において見出される他の夾雑物（これらは、ポリペプチド産生におけるその用途、またはその治療的用途、診断的用途、予防的用途、または研究的用途を阻害する）を実質的に含まない。
【００３０】
「核酸配列」または「核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、例えば、以下であるがこれらに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含む：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノ−メチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００３１】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中で、隣接配列の配置をいうために使用され、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成またはアセンブルされる。従って、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行うことを可能にし得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を指示し得る場合に、このプロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００３２】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない（非ネイティブ）」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００３３】
用語「対立遺伝子改変体」は、生物体または生物体の集団の染色体上の所定の遺伝子座に存在する遺伝子のいくつかの可能な天然に存在する代替的形態の１つをいう。
【００３４】
用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様スプライス改変体」とは、配列番号２または配列番号４に示されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００３５】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞における使用に適切であり、そして挿入された異種核酸配列の発現を、指向および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいうように使用される。この用語には、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００３７】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移入するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス」をいうために使用される。
【００３８】
用語「宿主細胞」・・・
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含有するように改変された場合に形質転換されている。例えば、細胞は、それがそのネイティブな状態から遺伝的に改変される場合に形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、ＤＮＡの形質転換は、物理的に細胞の染色体に組み込むことにより細胞のＤＮＡと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立的に複製し得る。ＤＮＡが細胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。
【００３９】
用語「トランスフェクション」は、細胞による異種または外因性ＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合には「トランスフェクトされ」ている。多数のトランスフェクション技術は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【００４０】
用語「形質導入」は、通常はファージによる１つの細菌から別の細菌への遺伝子の伝達をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物の細胞性配列の獲得および伝達をいう。
【００４１】
用語「宿主細胞」は、次いで細胞によって発現され得る目的の選択された遺伝子を保有するベクターによって形質転換されたか、または形質転換され得る細胞をいうために使用される。この用語には、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００４２】
用語「高度にストリンジェントな条件」は、配列が非常に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４３】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響される。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４または（ＳＤＳ）、ｆｉｃｏｌｌ、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）およびデキストラン硫酸であるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨからほぼ独立する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４４】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃下げられる。
【００４５】
用語「中程度にストリンジェントな条件」は、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中での５０℃という「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を可能にする。
【００４６】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さのＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００４７】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ  ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な評価は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃  ＋  Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ６８３頁（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編，１９８１）を参照のこと。
【００４８】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中でのそのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００４９】
用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド」は、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および天然の配列もしくは変異配列を有する関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、対立遺伝子改変体；スプライス改変体；フラグメント；誘導体；置換改変体、欠失改変体および挿入改変体；融合ポリペプチド；および配列番号２もしくは配列番号４のいずれかのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのオルソログであって、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するものが、挙げられる。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、本明細書中で規定されるような、成熟ポリペプチドであり得、そして調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有していなくてもよい。
【００５０】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリペプチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から単離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結しない（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）、本発明のポリペプチド、（３）天然には連結しないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチドまたは天然の環境において見出される他の混入物（これは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用に干渉する）を実質的に含まない。
【００５１】
用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。このようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様フラグメントは、６アミノ酸以上の長さであり得、そして例えば、このアミノ酸配列からの１つ以上の残基の、アミノ酸末端での切断（リーダー配列を含むかまたは含まない）、カルボキシ末端での切断および／もしくは内部欠失を生じ得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様フラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシング、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、切断化および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このように生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントはまた、例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得ることが理解される。
【００５２】
用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体」は、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失、および／または付加を含むＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在し得るか、または、人工的に構築され得る。このようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体は、配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるような野生型ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドについてのＤＮＡ配列に従って変化するＤＮＡ配列を有する、この改変対をコードする対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００５３】
当業者は、ネイティブのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して決定し得る。例えば、生物学的活性を破壊することなく変化され得るこの分子の適切な領域を予測し得る。また、当業者は、生物学的活性を破壊することなくかまたはそのポリペプチド構造に不利に影響することなく保存的アミノ酸置換に供され得る、生物学的活性もしくは構造に重要であり得る領域さえ認識する。
【００５４】
例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの領域における変化が、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えるようではないことが、理解される。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、化学的に類似のアミノ酸を、活性を維持ながら天然に存在する残基と置換し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００５５】
活性を破壊することなく変化され得るその分子の適切な領域を予測するために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を行った後、当業者は、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。保存されていないＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの領域における変化が、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えるようではないことは、当業者には既知である。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、化学的に類似のアミノ酸を、活性を維持ながら天然に存在する残基と置換し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。
【００５６】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較の観点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸置換を、選択し得る。
【００５７】
利用可能である場合、当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、当業者は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントをその三次元構造に関して予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。
【００５８】
本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドアナログは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列を関連ファミリーメンバーと比較することによって決定され得る。例示的ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド関連ファミリーメンバーとしては、オステオプロテジェリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ））およびＴＮＦレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。この比較は、Ｐｉｌｅｕｐアラインメント（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｐａｃｋａｇｅ）、または保存領域および非保存領域内での、複数のファミリーメンバーとの等価な（オーバーラップ）比較を使用することによって達成され得る。
【００５９】
図８に示されるように、ヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号７（配列番号２のアミノ酸４１〜９６を示す））が、ヒトＯＰＧ（配列番号８）と整列される。他のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドアナログは、これらの方法または当業者に公知の他の方法を使用して決定され得る。これらのオーバーラップ配列は、さらなるＴＮＦｒ／ＯＰＧアナログを生じる、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換に関する指針を提供する。これらのアミノ酸置換が、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸置換からなり得ることが、理解される。例えば、図８に示されるように、関連ファミリーメンバーの配列のアラインメントは、潜在的なＴＮＦｒ／ＯＰＧアナログを示し、これは、Ｇｌｙ残基で置換される配列番号２の４２位（図８の３７位）のＰｒｏ残基、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎもしくはＧｌｕ残基で置換される配列番号２の５１位（図８の４６位）のＣｙｓ残基、ならびに／あるいはＴｒｐもしくはＴｙｒ残基で置換される配列番号２の５６位（図８の５１位）のＰｈｅ残基を有し得る。さらに、潜在的なＴＮＦｒ／ＯＰＧアナログは、ＬｙｓもしくはＡｒｇ残基で置換される配列番号２の６８位（図８の６３位）のＨｉｓ残基、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＡｓｎもしくはＧｌｎ残基で置換される配列番号２の７１位（図８の６７位）のＳｅｒ残基、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅもしくはノルロイシン残基で置換される配列番号２の８４位（図８の７９位）のＡｌａ残基、ならびに／あるいはＧｌｕ残基で置換される配列番号２の８７位（図８の８３位）のＡｓｐ残基を有し得る。
【００６０】
さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。これらの改変体は、本明細書中で記載される活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が破壊、所望でない減少、または所望でない活性を生じることを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００６１】
このような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指数（疎水性親水性指標）が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられている。ヒドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００６２】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、ヒドロパシー（疎水性親水性）アミノ酸指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ酸が類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を起こす際に、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００６３】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）こともまた、当該分野において理解されている。
【００６４】
米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される場合に、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳説されるように、以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。
【００６５】
類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±ｌ以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。米国特許第４，５５４，１０１号はまた、親水性に基づく、一次アミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示する。米国特許第４，５５４，１０１号に開示される方法を介して、当業者は、所定のアミノ酸配列内からエピトープを同定することが可能である。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【００６６】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。
【００６７】
多数の科学刊行物が、アミノ酸配列の分析からの、二次構造の推定、およびエピトープの同定に充てられてきた。Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３（２）：２２２−４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３（２）：２１１−２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４（１９７９）を参照のこと。さらに、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域を推定するのを補助するために、コンピュータープログラムが現在利用可能である。例としては、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に基づくプログラム（Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４（１）：１８１〜１８６（１９９８）ならびにＷｏｌｆら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４（１）：１８７〜１９１（１９９８）、プログラムＰｅｐＰｌｏｔ（登録商標）（Ｂｒｕｔｌａｇら、ＣＡＢＳ  ６：２３７〜２４５（１９９０）およびＷｅｉｓｂｅｒｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：７４０〜７４２（１９８５））、ならびにタンパク質四次構造予測のための他の新規なプログラム（Ｆｅｔｒｏｗら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：４７９〜４８３（１９９３）が、挙げられる。
【００６８】
さらに、コンピュータプログラムが、二次構造の推定を補助するために、現在利用可能である。二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチドまたはタンパク質の構造における可能な折り畳みの数を含む）の増強された推定性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（１）：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、決定的な数の構造が解析されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されてきた（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：３６９−７６）。
【００６９】
二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４（１）：１５−１９（１９９６））、「Ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ」４（１）：１５〜１９（１９９６））「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１３）：４３５５−５８（１９８７））、および「ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ」（Ｈｏｍｅ、前出、「ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ」を参照のこと、Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）を包含する。
【００７０】
好ましい実施形態において、その改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的（本明細書において記載されるように）、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。さらに、この改変体は、カルボキシ末端またはアミノ酸末端（リーダー配列を含むかまたは含まない）のいずれかでの、アミノ酸残基の付加を有し得る。
【００７１】
好ましいＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型がネイティブのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体は、より多いかまたはより少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合炭水化物鎖の付加のための可能性のある新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ結合グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合部位が作製される、Ｎ結合炭水化物鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＴＮＦｒ／ＯＰＧ様改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性な配置にリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には同数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００７２】
用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様融合ポリペプチド」は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、そのフラグメント、および／または改変体と、異種ペプチドまたはポリペプチドとの融合物をいう。異種ペプチドおよびポリペプチドとしては、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質もしくはその一部（例えば、細胞外ドメイン、または膜貫通および細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドもしくはその一部；触媒活性である酵素またはその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加するポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）、ならびにＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと異なる治療活性を有するポリペプチドが、挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
さらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、それ自体にか、そのフラグメント、改変体、もしくは誘導体に、融合され得る。融合は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基までである。リンカーまたはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を有して設計されて、融合した部分の分離を可能にし得る。一旦構築されると、誘導ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド（フラグメント、改変体、および／または誘導体を含む）は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域のドメインに融合される。抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む；抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに相補的活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１（１９８９）。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテイン結合、補体結合、および恐らく、胎盤移入もさえのような機能を組み込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物（融合したＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの生成に適用可能な材料および方法を含む）の使用を要約する。
【００７５】
【表１】
2004500063.tif 000001
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の全てまたは一部は、当業者に公知の方法を使用して、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。別の例において、ヒンジ領域、ならびにＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部が、融合され得る。得られるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療品質、循環時間、もしくは凝集の減少などのような特定の品質を改善するよう変更され得る。
【００７６】
用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体」は、化学的に改変された、本明細書中に規定されるようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、フラグメント、または改変体をいう。この誘導体は、ポリペプチドに結合する分子の型または位置のいずれかが、天然に存在するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと異なる様式で改変される。誘導体はさらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに天然に結合する１つ以上の化学基の欠失によって形成される分子を含み得る。
【００７７】
例えば、このポリペプチドは、１つ以上のポリマー（水溶性ポリマー、Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物、糖、ホスフェート、および／または他のこのような分子を含むが、これらに限定されない）の共有結合によって改変され得る。例えば、選択されるポリマーは、代表的に、水溶性であり、その結果、このポリマーが結合されるタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的環境）中で沈澱しない。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝であっても非分枝であってもよい。適切なポリマーの範囲内に含まれるのは、ポリマーの混合物である。好ましくは、最終生成調製物の治療用途のために、ポリマーは、薬学的に受容可能である。
【００７８】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤ）のデキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリジン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびビニルアルコール。共有結合したＴＮＦｒ／ＯＰＧ様マルチマーを調製するために使用され得る、二官能性ＰＥＧ架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【００７９】
アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。例えば、反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは、水溶性、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【００８０】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペグ化反応によって実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ  ０１５４３１６；ＥＰ  ０４０１３８４ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。
【００８１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本明細書中における使用に適した水溶性ポリマーである。本明細書中に使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」および「ＰＥＧ」は、タンパク質を誘導体化するために使用される任意の形態のＰＥＧ（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはアリールオキシポリエチレングリコールを含む）を含むことを意味する。
【００８２】
一般に、化学的誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ペグ化ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを調製するための方法は、一般的に、以下の工程を包含する：（ａ）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが１以上のＰＥＧ基に結合する条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得る工程。一般的に、アシル化反応の最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなるほど、ポリペグ化生成物の割合も大きくなる。１つの実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のＰＥＧ部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【００８３】
一般に、本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る条件は、本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書中に開示されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強もしくは減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加または減少した半減期）を有し得る。
【００８４】
用語「生物学的に活性なＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド」、「生物学的に活性なＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドフラグメント」、「生物学的に活性なＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体」、および「生物学的に活性なＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体」は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴（例えば、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性）を有するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをいう。一般的に、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、そのフラグメント、改変体、および誘導体は、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を有する。さらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、免疫原として活性であり得、すなわち、このポリペプチドは、抗体が惹起される少なくとも１つのエピトープを含む。
【００８５】
「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的材料と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変されたかもしくは合成された材料をいう。
【００８６】
用語「単離されたポリペプチド」とは、その天然環境において見出される少なくとも１つの夾雑ポリペプチドがない、本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、いかなる他の夾雑哺乳動物ポリペプチド（これは、その治療的用途、予防的用途、または研究的用途を妨害する）も実質的に含まない。
【００８７】
用語「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」は、配列番号２または４に示されるようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドアミノ酸配列に対応する別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよびヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、互いのオルソログと考えられる。
【００８８】
用語「成熟ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したポリペプチドをいう。成熟ポリペプチドはまた、他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシ末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型グリコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化など）を含み得る。例示的な成熟ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基＿＿〜アミノ酸残基  または配列番号４のアミノ酸残基  〜アミノ酸残基  によって示される。（空欄を埋める）。
【００８９】
用語「有効量」および「治療有効量」は、本明細書中に示されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用される、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子の量をいう。
【００９０】
用語「選択的結合因子」は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子に特異性を有する分子をいう。選択的結合因子としては、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフティング抗体、可溶性形態もしくは結合形態で標識され得る抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体）、ならびに公知の技術（酵素学的切断、ペプチド合成、または組換え技術を含むが、これらに限定されない）によって提供されるそのフラグメント、領域、または誘導体が挙げられる。本発明の抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様選択的結合因子は、例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の一部を結合し得、これは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子がＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターへ結合することを阻害する。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子が、ヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合し、かつヒト非ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのオルソログ（すなわち、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの種間バージョン（例えば、マウスＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよびラットＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。好ましい実施形態は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対して高度に特異的であるが、非ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対する特異性を有して交差反応しない、抗体（すなわち、これらは結合しない）に関する。
【００９２】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物がその抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するのを誘導し得る、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。上記に言及された特異的な結合反応は、抗原が、高度に選択的な様式でその対応する抗体と反応し、他の抗原によって惹起され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。
【００９３】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、フラグメント、改変体、および誘導体は、当該分野で公知の方法を用いてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様選択的結合因子を調製するために使用され得る。従って、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合する抗体および抗体フラグメントは、本発明の範囲内にある。抗体フラグメントは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのエピトープに結合する抗体の一部を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって生成されるＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現）によって生成されるフラグメントが挙げられる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、ポリクローナル一重特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、および二重特異的抗体であり得る。
【００９４】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連核酸分子が、配列番号１または配列番号３の核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含み、そして、上記ヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を含むことが、理解される。関連核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４のポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／または欠失を含むかあるいは本質的にこれらからなる、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９５】
フラグメントは、配列番号２または配列番号４のポリペプチドの、少なくとも約２５アミノ酸残基、または約５０個、または約７５個、または約１００個、または約１００個よりも多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする分子を含む。
【００９６】
さらに、関連したＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子は、本明細書中で規定されるような中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号３の核酸分子の完全に相補的な配列、またはポリペプチド（このポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に示されるようなアミノ酸配列を含む）をコードする分子の完全に相補的な配列、または本明細書中に規定されるような核酸フラグメントの完全に相補的な配列、または本明細書中に規定されるようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの完全に相補的な配列と、ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様配列を用いて、関連配列に関してｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリースクリーニングして調製され得る。既知配列に対して顕著な同一性を示すＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブが設計され得る。
【００９７】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の、配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチド配列間または２つ以上のアミノ酸配列の列の間の一致によって決定されるような、核酸分子またはポリペプチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されるギャップ整列（存在する場合）との間の同一一致パーセントを測定する。
【００９８】
用語「類似性」は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一一致および保存的置換一致の両方を含む類似性の尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド配列間の類似性の程度は、それら２つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高い。
【００９９】
別の実施形態において、関連する核酸分子は、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列と約７０パーセント（７０％）同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれらからなるか、または配列番号２もしくは配列番号４に示されるポリペプチドと約７０パーセント（７０％）同一なポリペプチドであるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれらからなる。好ましい実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列と約７５％、もしくは約８０％、もしくは約８５％、もしくは約９０％、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるか、あるいは、このヌクレオチド配列は、配列番号２もしくは配列番号４に示されるポリペプチドと約７５％、もしくは約８０％、もしくは約８５％、もしくは約９０％、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一である、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【０１００】
その核酸配列中の差異は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変をもたらし得る。
【０１０１】
用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどかまたは全く影響がないような、非ネイティブ残基によるネイティブアミノ酸残基の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基の、任意の他の非極性残基での置換から生じる。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。アミノ酸置換を作製するための一般的な規則は、表ＩＩに示される。
【０１０２】
（表ＩＩ）
（アミノ酸置換）
【０１０３】
【表２】
2004500063.tif 000002
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。本明細書中に記載される核酸分子およびポリペプチド分子が、化学合成され得、そして組換え手段によっても産生され得ることは、当業者によって認識される。
【０１０４】
アミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する対応する改変）は、天然に存在するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに類似した機能的な特徴および化学的な特徴を有する、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生する。対照的に、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの機能特徴および／または化学特徴における実質的な改変は、（ａ）例えば、シートコンホメーションもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ、の維持に対するその効果を有意に変化する置換を選択することによって達成され得る。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、複数のクラスに分割され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１０５】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーによる、別のクラス由来のメンバーに対する交換を含み得る。このような置換された残基は、非ヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと相同なヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの領域またはこの分子の非相同領域に、導入され得る。
【０１０６】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の一致を与えるために、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【０１０８】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【０１０９】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定される２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖｏｌ．５，補遺３（１９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較行列）を参照のこと）。
【０１１０】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ  ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））；
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１２
Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：４
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【０１１１】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ｍａｔｃｈｅｓ＝＋１０，ｍｉｓｍａｔｃｈ＝０
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：５０
Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：３
このＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【０１１２】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む、他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較行列、および類似性の閾値が当業者によって使用され得る。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）；ならびにさらに、その比較が所定の対の配列間（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるか、１つの配列と大きなデータベースの配列との間（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかに依存する。
【０１１３】
（合成）
本明細書中に記載される核酸分子およびポリペプチド分子が、組換え手段および他の手段によって産生され得ることは、当業者によって認識される。
【０１１４】
（核酸分子）
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。
【０１１５】
本明細書中において使用される組換えＤＮＡ法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、および／またはＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ＮＹ、１９９４に記載されている。本発明は、本明細書中に記載され得ような核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【０１１６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする遺伝子またはｃＤＮＡは、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング、またはＰＣＲ増幅によって得られ得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合、この遺伝子の全てまたは一部は、他の種由来の対応する遺伝子（オルソログ）または同じ種由来の関連する遺伝子（ホモログ）を同定するためのプローブとして使用され得る。このプローブまたはプライマーを使用して、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。さらに、配列番号１または配列番号３に記載されるような配列を有する核酸分子の部分または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高いストリンジェンシーの条件が、スクリーニングに使用されて、このスクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【０１１７】
ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子もまた、発現されたタンパク質の特性に基づいて陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面において発現および提示されたクローンタンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【０１１８】
以下に記載される説明に従って実施される組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現し得る。例えば、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされたＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドが、多量に生成され得る。
【０１１９】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、これら２つのプライマー間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【０１２０】
ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチド（フラグメントまたは改変体を含む）のアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドの全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。
【０１２１】
いくつかの場合において、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望であり得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成し得る（変異誘発技術の記載に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１２２】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択される宿主細胞およびＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドに依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先性のための「Ｅｃｏｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン度数表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン度数表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１２３】
他の実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載されるような保存的アミノ酸置換を有するＴＮＦｒ−ＯＰＧ様改変体、１以上のＮ−連結またはＯ−連結グリコシル化部位の付加および／または欠失を含むＴＮＦｒ−ＯＰＧ様改変体、１つ以上のシステイン残基の欠失および／または置換を有するＴＮＦｒ−ＯＰＧ様改変体、または本明細書中に記載されるＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドフラグメントをコードする。さらに、核酸分子は、本明細書中に記載のＴＮＦｒ−ＯＰＧ様改変体、フラグメント、および融合ポリペプチドの組み合わせの任意の組合せをコードし得る。
【０１２４】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じるように、宿主細胞機構と適合性である）。ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９０）を参照のこと。
【０１２５】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のために配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１２６】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ（これらには、市販の抗体が存在する））をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチドから除去され得る。
【０１２７】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様ポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１２８】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、内因性ＴＮＦｒ−ＯＰＧ様遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１２９】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列は得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子を含み得る大きなＤＮＡ断片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明かである。
【０１３０】
複製起点は、代表的に、市販から購入された原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数までのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含むので、それだけでしばしば、使用される）。
【０１３１】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の３’末端に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリＴ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として市販で購入され、これはまた、本明細書中上記のような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１３２】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか、（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１３３】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の連続的な生成の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１３４】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガルノ配列（原核性物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。シャイン・ダルガルノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのシャイン・ダルガルノ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され、原核生物ベクターにおいて使用され得る。
【０１３５】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子のコード領域に位置するか、または直接ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコード領域の５’側に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性である任意のシグナル配列が、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子またはｃＤＮＡに対して同種（天然に存在する）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分において、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの分泌は、分泌されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子の一部であり得る。
【０１３６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様シグナル配列をコードするヌクレオチド配列またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーのグループから選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１３７】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレペプチド（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプレ配列を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域を切断する場合、所望のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの少し切断した形態を生じ得る。
【０１３８】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない（大部分のｃＤＮＡについて）場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子に関してイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様  ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側で、ポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、イントロンは、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つの側または他の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（任意のウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）の生物由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１３９】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内）の開始コドンに対して上流（５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）のうちの１つにグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対して遺伝子をほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子プロモーター配列は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子の増幅および／または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して大きい転写および発現タンパク質のより高い産生が可能であり、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１４０】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡにそれらの配列を連結し得る。
【０１４１】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１４２】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子転写を制御する際に関心があり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２  ：７８７−７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた関心がある：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【０１４３】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置が独立する。これらは、転写ユニットに対して５’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化に対する例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’位側に配置される。
【０１４４】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。１つ以上の所望の隣接配列がすでにベクター内にない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１４５】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１４６】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発現系のようなウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）のようなプラスミドが挙げられる。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、または他の公知の技術を介して宿主細胞に導入され得る。
【０１４７】
ベクターが構築され、そしてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であっても、真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であってもよい。宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを合成し、これは、引き続き、培養培地から収集され得る（宿主細胞がこれを培地に分泌する場合）か、またはこれを産生する宿主細胞から直接収集され得る（これが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、種々の因子（例えば、所望の発現レベル、活性に望ましいかもしくは必要とされるポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さ）に依存する。
【０１４８】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９から入手可能である。例としては、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．９７：４２１６−２０（１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）のような哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、およびＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびゲッ歯類動物細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞菌株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠き得るか、または優先的に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定しないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓから誘導された３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞株が挙げられる（これらは、ＡＴＣＣから入手可能である）。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現の当業者によって公知であり入手可能である。
【０１４９】
同様に、細菌細胞が、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））の種々の菌株は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．，他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの種々の菌株がまた本方法において使用され得る。
【０１５０】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のため宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１５１】
さらに、望ましい場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２（１９９３）；およびＬｕｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９（１９９３）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌａｎｄ、ＣＡ）である。
【０１５２】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドについての発現ベクターを選択された宿主細胞中に形質転換することは、周知の方法（例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法またはＤＥＡＥ―デキストラン法を含む）により達成され得る。選択された方法は、使用される宿主細胞の型の機能の一部であり得る。これらの方法および他の適切な方法が、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に示される。
【０１５３】
グリコシル化ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳に得ることができる。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１５４】
（ポリペプチド産生）
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫細胞についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である。
【０１５５】
代表的に、トランスフェクトされた細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって検出可能である。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１５６】
宿主細胞によって産生されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲル移動アッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【０１５７】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１５８】
宿主細胞細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかまたは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドについて、宿主細胞は、代表的に、最初に機械的にかまたは界面活性剤を用いて分裂され、緩衝化溶液にこの細胞内成分を放出する。次いで、ＴＮＦｒ／ＯＲＧ様ポリペプチドは、この溶液から単離され得る。
【０１５９】
溶液からのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。そのポリペプチドがそのカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジンのようなタグを含む（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）かまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、カラムマトリックスがそのタグに高い親和性を有するアフィニティーカラムにその溶液を通すことによって、本質的に１工程のプロセスで精製され得る。例えば、ポリヒスチジンはニッケルに大きな親和性および特異性で結合し、従ってニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）が、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。
【０１６０】
さらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを特異的に認識し得そして結合し得るモノクローナル抗体の使用を介して、精製され得る。
【０１６１】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドはタグに結合させなることなく調製され、かつ抗体が利用可能ではない場合、精製についての他の周知の手順が使用され得る。このような手順としては、限定はしないが、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル溶出と組合せたネイティブゲル電気泳動、ならびに調製的等電収束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合、これらの技術の２つ以上が、純度の増加を達成するために組み合わされ得る。
【０１６２】
ＴＮＦｒ／ＯＲＧ様ポリペプチドが細胞内に産生される場合、細胞内物質（グラム陰性細菌について封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理、それに続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得る。
【０１６３】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、内部および／または外部細胞膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、分断させ、そして溶解させ得る。次いで、ここでは可溶化形態である、溶解されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５（１９９０）に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１６４】
いくつかの場合、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくても良い。「再折り畳みする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド連結を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドをあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体溶解に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。再折り畳みの効率を増加するために共溶媒が使用され得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１６５】
封入体がＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１６６】
従って、精製に適切な手順としては、限定はしないが、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）と続くゲル溶出、ならびに調製的等電収束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合、２つ以上の精製技術が、純度の増加を達成するために組み合わされ得る。
【０１６７】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、そのフラグメント、および／または誘導体もまた、当該分野で公知の技術を使用して化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により調製され得、その公知技術は、たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、１９６３）、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２、１９８５）、ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るし、または含まずに合成され得る。化学合成されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドもしくはフラグメントは、これらの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸化され得る。化学合成されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると予測され、従って、組換えＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドもしくは天然のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと互換可能に使用され得る。
【０１６８】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを得る別の手段は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１６９】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−１２３０３（１９９７）を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｚ．ｂｏｌ  ３：２６８−２７３（１９９９）もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、それぞれが、５’ランダム化配列、中心予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１７０】
ペプチドまたはポリペプチドの産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）（「Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られている）に記載されており、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは異常な組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、放射線に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方の分岐点に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現より生じる。
【０１７１】
これらの方法はまた、包括的なＩＬ−１７様ポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アセイおよび全生物アッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１７２】
（化学的誘導体）
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、この開示が、本明細書中以下に記載されると、当業者によって調製され得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然で結合した分子の型または位置のいずれかで、異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然で結合した化学的な基の除去によって形成される分子を含み得る。配列番号２もしくは配列番号４、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、結合するタンパク質は、水環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、幾つかの分子が、上記の分子量より多い、いくらか少ない重量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７３】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、グリコール；モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤのデキストラン））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリジン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびビニルアルコール。配列番号２もしくは４、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体のいずれかのアミノ酸配列を含む共有結合したＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【０１７４】
一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２もしくは４、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド改変体のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とポリペプチドを反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大きくなる。１実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体は、アミノ末端の単一ポリマー分子部分を有し得る。例えば、最後を参照のこと（米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと）。
【０１７５】
ポリペプチドのペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペギル化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペギル化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。例えば、反応性アルデヒド、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは、水溶性、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７６】
別の実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、ビオチンに化学的に連結され得る。次いで、このビオチン／ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド分子は、アビジンに結合され得、その結果、４価のアビジン／ビオチン／ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド分子が得られる。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭと共に沈殿し、１０価の十量体の結合体を形成する。
【０１７７】
一般に、本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る条件は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドについて本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書中に開示されるＡＧＰ−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強または減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加または減少した半減期）を有し得る。
【０１７８】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術が、本発明に従って利用され得ることは明らかである。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された、核酸の微小の高密度アレイである。このアレイ内の各セルまたはエレメントは、単一種のＤＮＡの多くのコピーを有し、このＤＮＡは、その同族のｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションのための標的として作用する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロファイリングにおいて、最初に、ｍＲＮＡが、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この材料を、マイクロアレイにハイブリダイズさせ、そして未結合ｃＤＮＡを洗浄により除去する。次いで、アレイ上に提示される別々の遺伝子の発現を、各標的ＤＮＡに特異的に結合された標識ｃＤＮＡの量を定量することによって可視化する。このようにして、数千の遺伝子の発現を、生物学的材料の単一のサンプルから、高スループットの並行様式で定量し得る。
【０１７９】
この高スループット発現プロファイリングは、本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子に関する広範な適用を有する。これらの適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：治療用標的としてのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様疾患関連遺伝子の同定および確証；ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子およびそのインヒビターの分子毒性研究；集団の層別化および臨床試験用の代理マーカーの作製；ならびに高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）における選択的な化合物の同定を補助することによるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様関連小分子薬物発見の増大。
【０１８０】
（選択的結合因子）
本明細書中で用いられる場合、用語「選択的結合因子」は、１以上のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対して特異性を有する分子を言及する。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＴＮＦＲ／ＯＰＧ様ポリペプチド選択的結合因子は、ＴＮＦＲ／ＯＰＧ様ポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、ポリペプチドのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターへの結合を阻害する。
【０１８１】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的なポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組換え；キメラ；ヒト化（例えば、ＣＤＲグラフト化）；ヒト；単鎖；および／または二特異的；ならびにフラグメント；改変体；またはそれらの誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、ＴＮＦＲ／ＯＰＧ様ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のこれらの一部を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１８２】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対して指向される特異的なポリクローナル抗体は、一般に、ＴＮＦＲ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＴＮＦＲ／ＯＰＧ様ポリペプチド、またはそれらの改変体、フラグメント、もしくはその誘導体をキャリアタンパク質に結合させることは、有用であり得、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫化される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様抗体タイターについてアッセイする。
【０１８３】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体は、培地中の連続的細胞株によって抗体分子を産生するために提供される、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために適切な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））が挙げられる。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと反応する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明によって提供される。
【０１８４】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。１実施形態は、「キメラ」抗体であり、この重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスの属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である一方で、この鎖の残りは、別の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメントも含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５を参照のこと。
【０１８５】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化した抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基有する。ヒト化は、例えば、当該分野（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６）で記載される方法を使用して、鋸状相補的決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域と置換することによって、実施される。
【０１８６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと結合するヒト抗体がまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個の連続アミノ酸を有する）を用いて免疫化することによって産生され、必要に応じて、キャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（この動物は、改変体の完全相補体未満を有する）は、所望の免疫系の改変体の全てを得るためにクロスブレッドされる。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である改変領域を含む）を含むヒト可変領域を有する抗体を産生する。例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１および同第５４６０７３Ａ１に記載される。
【０１８７】
ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１８８】
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらにより、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介した模倣免疫選択、および選択した抗原への結合によるファージの続く選択を処理する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−レセプターについて、高い親和性および機能的なアンタゴニスト抗体の単離が記載される。
【０１８９】
キメラ、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的に組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書中に記載される物質および手順を使用して発現される。好ましい実施形態において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で処理される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１９０】
本発明の抗−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド抗体は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）において使用され得る（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。この抗体は、使用されるアッセイ方法に対して、適切である親和性でＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと結合する。
【０１９１】
診断適用のために、特定の実施形態において、抗−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉ）；蛍光化合物または化学的蛍光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくはホースラディシュペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）。
【０１９２】
競合結合アッセイは、標識した標準（例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、またはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存し、限定された量の抗−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド抗体との結合に関して、試験サンプル検体（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドペプチド）と競合する。試験サンプル中のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの量は、抗体と結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定するのを容易にするために、この抗体は、競合前または後に、代表的に免疫化され、この抗体と結合する標準および検体は、結合しないままの標準および検体から好都合に分離され得る。
【０１９３】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用に代表的に関連し、各々は、決定および／または定量されるべきタンパク質の異なる免疫部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル検体は、固体支持体上に免疫化される第１抗体によって代表的に結合され、その後、第２抗体が、この検体に結合され、可溶の３部の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０を参照のこと。第２抗体自体は、検出可能な部分で標識されるか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識される抗−免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素である）である。
【０１９４】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらは、少なくとも１つのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの生物学的活性を、それぞれ増強または減少させるかのいずれかである。１実施形態中で、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと特異的に結合し得る抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、および好ましくは、少なくとも約８０％によって、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合アッセイは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得る抗−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドであり、これにより、インビトロまたはインビボにおいてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド活性を阻害または排除する。アゴニストおよびアンタゴニスト抗−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１９５】
本発明の抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様抗体はまた、インビボでの画像化に有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物、好ましくは血流に投与され得、そして宿主中の標識された抗体の存在および位置が、アッセイされる。抗体は、核磁気共鳴、放射線医学、または当該分野において公知の他の検出手段によって動物中で検出可能な任意の部分で標識され得る。
【０１９６】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様選択結合因子（例えば、抗体）およびＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのレベルを検出するために有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬は、二次的活性、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブコントロールサンプルおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１９７】
上述のように、本明細書中に列挙されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様シグナル伝達経路の新規アゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、可溶性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター、抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター抗体、小分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得、そしてこれらはまた、本明細書中に記載される１つ以上の疾患／障害を処置するために有用であり得る。
【０１９８】
（さらなるアゴニスト分子およびアンタゴニスト分子）
本明細書中に規定されるように、アゴニスト分子またはアンタゴニスト分子は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性をそれぞれ増強するかまたは減少する。アンタゴニストは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター自身および／またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナー（例えば、リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これにより、インビトロまたはインビボでＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド活性を阻害または排除する。アゴニストは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子に特異的に結合し得、かつレセプターを活性化するそれらのネイティブなリガンドのように機能し得る分子である。アゴニストはまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナー（例えば、リガンド）と相互作用して、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対するその結合を増強し得、それにより、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の生物学的活性を増強し得る。本明細書中に記載されるアゴニストおよびアンタゴニストが選択結合因子に限定されないことは、明白である。選択結合因子に加えて、他の適切なアゴニスト分子およびアンタゴニスト分子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：可溶性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、小分子、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド。これらのいずれかが、本明細書中に記載されるものを含む１つ以上の疾患または障害を処置するために有用であり得る。
【０１９９】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを用いてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンドをクローニングするために使用され得る。放射性標識された（１２５−ヨウ素）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたは「アフィニティ／活性タグ化」ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合物またはアルカリホスファターゼ融合物）は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンドを発現する細胞型、細胞株または組織を同定するための結合アッセイにおいて使用され得る。次いで、このような細胞または組織から単離されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され得、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ得、そして発現ライブラリーを作製するために哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたは２９３）にトランスフェクトされ得る。次いで、放射標識されたかまたはタグ化されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを、アフィニティ試薬に使用して、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンドを発現するこのライブラリーにおいて細胞のサブセットを同定および単離し得る。次いで、ＤＮＡは、これらの細胞から単離され得、そして二次的発現ライブラリーを作製するために哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。このライブラリーにおけるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンドを発現する細胞の画分はもともとのライブラリーにおけるものよりも数倍高い。この濃縮プロセスは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンドを含む単一の組換えクローンが単離されるまで、反復され得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンドの単離は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様シグナル伝達経路の新規アゴニストおよびアンタゴニストを同定および開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンド、抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様リガンド抗体、小分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【０２００】
（遺伝子操作された非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、もしくは他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、またはヒツジ、あるいは、他の家畜動物）は、本明細書の範囲にさらに含まれる。これらの動物において、ネイティブなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊されている（「ノックアウトされている」）ので、これらの遺伝子の発現レベルは、顕著に減少しているかまたは完全に除外されている。このような動物は、例えば、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【０２０１】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、もしくは他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、またはヒツジ、あるいは、他の家畜動物）を含み、これらの動物において、これらの動物に対してネイティブな形態のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド遺伝子または異種性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド遺伝子は、これらの動物によって過剰発現され、これにより、「トランスジェニック」動物が作製される。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような周知の方法を使用して調製され得る。
【０２０２】
本発明はさらに、非ヒト動物を含み、これらの動物において、本発明の１つ以上のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドについてのプロモーターは、（例えば、異種性組換え法を使用することによって）活性化されるかまたは不活性化されて、１つ以上のネイティブなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現レベルを変更する。
【０２０３】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングに有用であり得る。このようなスクリーニングにおいて、動物における薬物候補の影響が、測定され得る。例えば、薬物候補は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、またはフラグメントの量は、動物をその薬物候補に暴露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病理学的状態を生じ得るかまたは疾患または病理学的状態に関し得る。このような場合において、遺伝子の発現を減少させる薬物候補の能力、または病理学的状態を予防または阻害する薬物候補の能力を試験し得る。他の例としては、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生が、疾患または病理学的状態の結果生じ得るか、または疾患または病理学的状態と関連し得る。このような場合において、このような代謝産物の産生を減少するための薬物候補の能力、または病理学的状態を予防または阻害する薬物候補の能力を試験し得る。
【０２０４】
（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド活性の他の調節因子についてのアッセイ）
いくつかの状況において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの活性の調節因子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）である分子を同定することが所望され得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、本明細書中に記載されるもののような１つ以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式で、または注入によるインビボ様式で、あるいは経口送達、移植デバイスなどによって、のいずれかで投与され得る。
「試験分子」は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価の下にある分子をいう。最も一般的には、試験分子は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド活性を、例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子発現に影響を与えることによってか、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、間接的に調節し得ることが意図される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、もっとも好ましくは約１０−９Ｍ、そしてさらに最も好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数でＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合する。
【０２０５】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、試験分子のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定され得る。試験分子は、実質的に精製された形態または粗混合物においてスクリーニングされ得る。試験分子は、核酸分子、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量有機体化合物もしくは無機体化合物であり得る。一旦、試験化合物のセットがＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと相互作用するとして同定されると、この分子はさらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド活性を増加または減少するその能力について評価され得る。
【０２０６】
試験分子のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの型（細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイおよび免疫アッセイを含む）において実施され得る。一般には、試験分子は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと一定の時間にわたってインキュベートされ、そして、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド活性は、生物学的活性を測定するための本明細書中に記載される１つ以上のアッセイによって決定される。
【０２０７】
試験分子のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるエピトープタグを含有するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの改変形態は、溶液中および免疫アッセイにおいて使用され得る。
【０２０８】
特定の実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと相互作用してその活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量分子であり得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの潜在的タンパク質アンタゴニストは、このポリペプチドの活性領域と相互作用しそしてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の少なくとも１つの活性を阻害または排除する抗体を含む。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド発現を調節する分子は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする核酸に相補的な核酸、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現を指向するかもしくは制御する核酸配列に相補的な核酸、そして発現のアンチセンス調節因子として作用する核酸を含む。
【０２０９】
結合パートナー（例えば、リガンド）との相互作用を介してＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが生物学的活性を示す事象において、種々のインビトロアッセイは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのその対応する結合パートナー（例えば、選択結合因子またはリガンド）との結合を測定するために使用され得る。このようなアッセイは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのその結合パートナーとの結合の割合および／または程度を増加または減少するこれらの能力について試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェルにおいて固定化される。次いで、放射標識されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナー（例えば、ヨード化されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナー）、および試験分子は、ウェルに（いずれの順序でも）一度にまたは連続的のいずれかで添加され得る。インキュベート後ウェルを、洗浄し、そして、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合した結合パートナーの量を放射活性について決定するためにシンチレーションカウンターを使用して計数し得る。典型的には、これらの分子は、ある濃度の範囲にわたり試験され、そして、試験アッセイの１つ以上の要素を欠く一連のコントロールウェルは、これらの結果の評価における精確さのために使用され得る。本方法の代替は、ポリペプチドの「位置」を変換する工程（すなわち、マイクロタイタープレートにＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーを固定化する工程）、試験分子を放射標識されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドとインキュベートする工程、ならびにＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド結合の程度を決定する工程を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｂｅｌら編、第１８章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５）を参照のこと。
【０２１０】
放射標識の代替として、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、次いで、ビオチン化タンパク質の存在は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、これは色彩的に（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）検出され得る）に連結されたストレプトアビジンを使用して、またはストレプトアビジンの蛍光タグにより検出され得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーに対する抗体、およびビオチンに結合体化された抗体もまた使用され得、そしてＡＰまたはＨＲＰと連結された酵素連結ストレプトアビジンとのインキュベート後に検出され得る。
【０２１１】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよびＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズまたはこのような不活性な固相基質の他の型への接着によって固定化され得る。基質−タンパク質複合体は、相補的タンパク質および試験化合物を含む溶液に配置され得る。インキュベート後、ビーズは、遠心分離によって沈殿され得、そしてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量は、本明細書中に記載される方法によって評価され得る。あるいは、基質−タンパク質複合体は、カラムに固定化され得、そして試験分子および相補的タンパク質は、このカラムを通過される。次いで、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドとその結合パートナーとの複合体の形成は、本明細書中に記載の技術のいずれか（すなわち、放射性標識、抗体結合など）を使用して評価され得る。
【０２１２】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドとＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーとの複合体の形成を増加または減少する試験分子を同定するために有用な、別のインビトロアッセイは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のような表面プラズモン共鳴検出器システムである。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者のプロトコールを使用して実施され得る。このアッセイは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーのいずれかの、検出器に位置するデキストランコートされたセンサーチップとの共有結合を実質的に含む。次いで、試験化合物および他の相補的タンパク質は、同時または連続のいずれかで、センサーチップを備えるチャンバに注入され得る。結合する相補的タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコートされた側に物理的に結合する分子量における変化に基づいて評価され得、そして分子量における変化は、検出器システムによって測定され得る。
【０２１３】
いくつかの場合において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様タンパク質とＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する能力について、２つ以上の試験化合物を一緒に評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載されるアッセイは、このようなさらなる試験化合物の添加（第一の試験化合物と同時にか、または第一の試験化合物に引き続いてかのいずれか）によって容易に改変され得る。このアッセイにおけるこの工程の残りは、本明細書中に記載される。
【０２１４】
本明細書中に記載されるもののようなインビトロアッセイは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様タンパク質およびＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーによる複合体形成に対する影響について、多数の化合物を有利にスクリーニングするために使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイライブラリー、合成ペプチドライブラリー、および化学合成ライブラリーにおいて作製される化合物をスクリーニングするために自動化され得る。
【０２１５】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様タンパク質とＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用する細胞培養においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物より取得され得るが、好ましくは、ヒトもしくは他の霊長類、イヌ、またはげっ歯類の供給源由来である。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーを発現する細胞への表面での結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度は、例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイはさらに、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいてポジティブにスコアリングされる化合物を評価するために有利に使用され得る。
【０２１６】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたはフラグメントの量は、細胞培養物を薬物候補に暴露した後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合において、この遺伝子の発現を増加または減少する薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病理学的状態に関し得る。このような場合において、細胞培養物におけるこのような代謝産物の産生を減少する薬物候補の能力を試験し得る。
【０２１７】
酵母２ハイブリッド系（Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８−９５８３，１９９１）は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合する新規ポリペプチド、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドと相互作用する新規ポリペプチドを同定するために使用され得る。例のように、酵母ツーハイブリッドベイト構築物は、ベクター（例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのｐＡＳ２−１のような）中に作製され得る。このベクターは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリヌクレオチドに融合された酵母ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインをコードする。このベイト構築物は、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得、ここで、このｃＤＮＡライブラリー配列は、ＧＡＬ４活性化ドメインに融合される。ポジティブ相互作用は、  −Ｇａｌのようなレポーター遺伝子の活性化を生じる。このスクリーニングから出現するポジティブクロ−ンは、相互作用タンパク質を同定するためにさらに特徴付けられ得る。
【０２１８】
（Ｐ３８インヒビター）
細胞外刺激と細胞からのＩＬ−１およびＴＮＦの分泌との間の介入に対する新たな手段は、シグナル伝達経路に存在するキナーゼの阻害を介するシグナル伝達のブロッキングを含む。１つの例は、公知のセリン／スレオニンキナーゼ（Ｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２６５：２２４−２２７（１９９５）において報告されるクローン）であるＰ−３８（「ＲＫ」または「ＳＡＰＫ−２」とも呼ばれる、Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３７２：７３９（１９９４））の阻害を介する。Ｐ−３８に対する競合結合アッセイにおける有効性について、直線的関係が示されている。そして同一のインヒビターは、ＬＰＳ刺激に伴う単球からのＩＬ−１分泌のレベルを減少する。単球のＬＰＳ刺激に伴って、ＴＮＦ−ａについてのメッセンジャーＲＮＡのレベルは、１００倍増加することが示されているが、ＴＮＦ−ａのタンパク質レベルは、１０，０００倍増加した。従って、ＴＮＦシグナル伝達のかなりの増幅は、翻訳レベルで生じる。Ｐ−３８インヒビターの存在下での単球のＬＰＳ刺激に伴って、ｍＲＮＡのレベルは、影響されないが、最終的なＴＮＦタンパク質のレベルは、劇的に（Ｐ−３８インヒビターの有効性に依存して８０〜９０％まで）減少される。従って、上記の実験は、Ｐ−３８の阻害が減少された翻訳効率を導くという結論に対して強力な支持を与える。ＴＮＦが翻訳制御下であるというさらなる証拠は、Ｂｅｕｔｌｅｒら、およびＬｅｅの検出実験において見出される。ここでは、３’非翻訳ｍＲＮＡ（３’ＵＴＲ）のセグメントが除去され、これが、ＴＮＦについての高い翻訳効率を生じる。より重要なことに、ＴＮＦ  ｍＲＮＡの適切なセグメントが欠失される場合、Ｐ−３８インヒビターは、ＴＮＦのレベル（すなわち、翻訳効率）に対して影響を与えない。従って、Ｐ−３８に対するインヒビターの結合のレベルと同インヒビターでのＬＰＳ刺激後のＩＬ−１およびＴＮＦの減少との間の相関データ、およびＴＮＦおよびＩＬ−１の両方の翻訳効率に対するＰ−３８インヒビターの効果に関する上記生化学的証拠は、強力な因果および効果の関係を生じる。細胞におけるＰ−３８の役割は、なお叙述されている；従って、その阻害から得られる炎症性疾患または他の疾患状態に関する他の有利な効果は、やがて現れるかもしれない。
【０２１９】
高められたレベルのＴＮＦおよび／またはＩＬ−１は、多くの疾患状態（以下が挙げられるがこれらに限定されない）の発症、病因、または悪化に寄与し得る：慢性関節リウマチ；変形性関節症；リウマチ様脊椎炎；痛風性関節炎；炎症性腸疾患；成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；アレルギー性鼻炎；潰瘍性大腸炎；アナフィラキシー；接触皮膚炎；喘息；ＴＮＦ阻害に感受性のウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、およびＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２を含むヘルペスウイルス、ならびに帯状ヘルペス）を含む抗ウイルス性治療；筋肉変性；悪液質；ライター症候群；ＩＩ型糖尿病；骨吸収疾患；移植片対宿主反応；虚血再灌流障害；粥状硬化症；脳外傷；アルツハイマー症；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒性ショック症候群；感染に起因する高熱およびマラリア（ｍｙｌａｇｉａｓ）。
【０２２０】
置換イミダゾール、ピロール、ピリジン、ピリミジンなどの化合物は、プロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ）の阻害によってサイトカイン媒介疾患を処置する際の使用について記載されている。サイトカイン媒介疾患の処置における使用のための置換イミダゾールは、米国特許第５，５９３，９９２号；ＷＯ９３／１４０８１；ＷＯ９７／１８６２６；ＷＯ９６／２１４５２；ＷＯ９６／２１６５４；ＷＯ９６／４０１４３；ＷＯ９７／０５８７８；ＷＯ９７／０５８７８（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。炎症の処置における使用についての置換イミダゾールは、米国特許第３，９２９，８０７号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。サイトカイン媒介性疾患の処置における使用についての置換ピロール化合物は、ＷＯ９７／０５８７７；ＷＯ９７／０５８７８；ＷＯ９７／１６４２６；ＷＯ９７／１６４４１；およびＷＯ９７／１６４４２（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。サイトカイン媒介性疾患の処置における使用についてのピロールに融合された置換アリールおよびヘテロアリールの化合物は、ＷＯ９８／２２４５７（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。サイトカイン媒介性疾患の処置における使用についての置換ピリジン、ピリミジン、ピリミジノンおよびピリダジンの化合物は、ＷＯ９８／２４７８０；ＷＯ９８／２４７８２；ＷＯ９９／２４４０４；およびＷＯ９９／３２４４８（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【０２２１】
（内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）は、細胞にタンパク質を内部移行するために使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：６６４−６６８（１９９４）を参照のこと。例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ：配列番号２１）（「タンパク質伝達ドメイン」、またはＴＡＴ  ＰＤＴを呼ばれる）は、細胞の細胞膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；およびＮａｇａｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：１４４９−１４５２（１９９８）を参照のこと。これらの手順において、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって観察されるような細胞に結合するＦＩＴＣ−構築物（ＦＩＴＣ−ＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号２２）は、調製され、そしてこれらの構築物は、静脈投与後に組織を貫く。次に、ｔａｔ−ｂｇａｌ融合タンパク質が構築される。この構築物で処理された細胞は、ｂ−ｇａｌ活性を示した。注入に続いて、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓、および脳組織を含む）は、これらの手順を使用して発現を示すことが見出された。これらの構築は、細胞への侵入のためにある程度のアンフォールディングを受け；細胞への侵入後にリフォールディングが必要とされ得ることが信じられている。
【０２２２】
従って、ｔａｔタンパク質配列が所望のタンパク質またはポリペプチドの細胞内へ内部移行するために使用され得ることは明白である。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様選択結合因子、小分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、細胞内へ投与されてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の活性を阻害し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子」は、本明細書中で規定されるようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子およびＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの両方をいう。所望の場合、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様タンパク質自身はまた、これらの手順を使用して細胞内部に投与され得る。Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｏｄｙ‘ｓ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１４６６−１４６７（１９９９）をまた参照のこと。
【０２２３】
（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを使用する細胞供給源同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合する特定の細胞型の供給源を決定し得ることは有用であり得る。例えば、適切な治療を選択における補助として疾患または病理学的状態の起源を決定することは、有用であり得る。他の実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対して特異的である抗体を作製するために、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを使用し得る。
【０２２４】
（治療的使用）
骨組織は、身体の支持を提供し、そして鉱物（主にカルシウムおよびリン）、コラーゲンマトリックスおよび非コラーゲンタンパク質、ならびに細胞からなる。骨に見出される３つの型の細胞（骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞）は、骨が断続的に形成されかつ吸収されることによる劇的なプロセスに関する。骨芽細胞は、骨組織の形成を誘導する一方、破骨細胞は、吸収に関する。骨マトリックスおよび鉱物の吸収、または分解は、骨形成に比べて速くかつ効率的なプロセスであり、そして多量の鉱物を骨から放出する。破骨細胞は、骨格組織の正常な再モデル化の調節、およびホルモンによって誘導される吸収に関する。例えば、吸収は、細胞外液におけるカルシウムイオンの濃度の減少に応じた副甲状腺ホルモンの分泌によって刺激される。対照的に、吸収の阻害は、カルシトニンの主要な機能である。さらに、ビタミンＤの代謝物は、副甲状腺ホルモンおよびカルシトニンに対する骨の応答性を変更する。
【０２２５】
骨格の成熟に伴って、骨格における骨量は、骨形成および骨吸収のバランス（またはアンバランス）を反映する。ピーク骨量は、４０歳になる前の骨格成熟後に生じる。４０歳と５０歳との間に、この均衡はシフトし、そして骨吸収は、優位になる。年齢とともに進行する骨量の不可避な減少は、男性よりも女性において早く開始し、そしていくつかの女性において（主に、ＣａｕｃａｓｉａｎおよびＡｓｉａｎの家系）、閉経後に顕著に加速される。
【０２２６】
骨減少症は、骨量の平均レベル以下への任意の減少に一般に関する状態である。このような状態は、骨合成の速度における減少、または骨崩壊の速度における増加、あるいはこれらの両方より生じ得る。最も一般的な形態の骨減少症は、主に骨粗しょう症である。これは、閉経後の骨粗しょう症および老衰性骨粗しょう症の場合にもいう。この形態の骨粗しょう症は、年齢に伴う一連の骨の一般的な消失であり、そして通常は骨形成の正常な速度を有する骨吸収における増加の結果である。米国における全ての白人女性の約２５〜３０％は、徴候的骨粗しょう症を発達する。直接の関係は、骨粗しょう症と、４５歳以上の女性における股関節部、大腿部、頸部、および転子間の骨折の発生率との間に存在する。老齢の男性は、５０歳と７０歳との間の年齢で徴候的骨粗しょう症を発達するが、この疾患は主に女性に影響する。
【０２２７】
閉経後の骨粗しょう症および老衰性骨粗しょう症の原因は、未知である。この状態に寄与し得るいくつかの因子が同定されている。これらは、年齢に伴うホルモンレベルの変更、ならびにカルシウムおよび他の鉱物の減少した腸内吸収に寄与する不十分なカルシウム消費を含む。処置は、通常、このプロセスを妨害するように試みるホルモン治療または飲食物補充剤を含んだ。しかし、現在では、骨消失についての効果的な処置は、存在しない。
【０２２８】
本発明は、治療有効量のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを用いて本明細書中に記載される疾患および障害を処置、予防または診断する方法を提供する。例として、この疾患または障害は、正味の骨損失（例えば、骨減少症または骨溶解）によって特徴付けられる任意の疾患または障害であり得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを用いて、例えば、骨吸収速度を抑制し得る。従って、正常レベルよりも低い骨形成を補償するために、処置を行って骨吸収速度を低減し得る（ここで、吸収速度は、正常よりも上である）かまたは骨吸収を正常レベル未満まで低減し得る。
【０２２９】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドで処置し得る状態としては、以下が挙げられる：
・骨粗鬆症（例えば、原発性骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進（ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｒｙｏｉｄｉｓｍ）、クッシング症候群および末端肥大症）、遺伝性および先天性の形態の骨粗鬆症（骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンク症候群（Ｍｅｎｋｅｓ’  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）およびライリー−デイ症候群）ならびに四肢の固定に起因する骨粗鬆症）。
【０２３０】
・成人および若年における骨のパジェット病（変形性骨炎）；
・骨の損失をもたらす、骨髄炎、すなわち骨における感染性損傷；
・固形腫瘍（胸部、肺および腎臓）および血液の悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫および白血病）から生じる高カルシウム血症、特発性高カルシウム血症ならびに甲状腺機能亢進および腎臓機能障害に関連した高カルシウム血症；
・ステロイド投与によって誘発され、そして小腸および大腸の障害ならびに慢性の肝臓疾患および腎臓疾患と関連する、手術後の骨減少症；
・ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、歯周疾患、骨溶解性転移および他の状態に関連した外傷性の損傷または非外傷性壊死に関連した骨壊死（すなわち、骨細胞死）。
【０２３１】
望ましくないレベルの１以上のＴＮＦ、ＯＰＧ、ＩＬ−１および／または本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド自体に関連した他の疾患は、本発明の範囲に包含される。望ましくないレベルとしては、過剰および／または正常未満のレベルのＴＮＦ、ＯＰＧ、ＩＬ−１および／または本明細書中に記載される本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが挙げられる。
【０２３２】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが単独でまたは骨障害の処置のための他の因子と共に用いられ得ることが理解される。１つの実施形態では、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、骨形成を刺激するかまたは骨破壊を減少させる１以上の治療有効量の因子と共に用いられる。このような因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１２と命名されている骨形態形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＭＰ）；トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）およびＴＧＦ−βファミリーのメンバー；インターロイキン−１（ＩＬ−１）インヒビター；ＴＮＦ−αインヒビター；副甲状腺ホルモンおよびそれらのアナログ、上皮小体関連タンパク質およびそれらのアナログ；Ｅシリーズのプロスタグランジン；ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）など）；骨強化ミネラル（例えば、フッ化物およびカルシウム）；非ステロイド抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）（ＣＯＸ−２インヒビター（例えば、ＣｅｌｅｂｒｅｘＴＭおよびＶｉｏｘｘＴＭ）を含む）；免疫抑制剤（例えば、メトトレキサートまたはレフルノミド）；セリンプロテアーゼインヒビター（例えば、分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ））；ＩＬ−６インヒビター（例えば、ＩＬ−６に対する抗体）、ＩＬ−８インヒビター（例えば、ＩＬ−８に対する抗体）；ＩＬ−１８インヒビター（例えば、ＩＬ−１８結合タンパク質またはＩＬ−１８抗体）；インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）調節因子；線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ調節因子；ＰＡＦアンタゴニスト；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ関連分子またはＫＧＦ調節因子；マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）調節因子；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）調節因子（誘導性ＮＯＳの調節因子を含む）；グルココルチコイドレセプターの調節因子；グルタミン酸レセプターの調節因子；リポ多糖（ＬＰＳ）レベルの調節因子；ならびにノルアドレナリンならびにその調節因子および模倣物。
【０２３３】
本発明に従って処置され得る急性および慢性の疾患の非限定的列挙は、以下を包含するがこれらに限定されない：悪液質／食欲不振；癌（例えば、白血病）；慢性疲労症候群；冠状動脈の状態および適応症（鬱血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞および冠状動脈バイパス移植片を含む）；鬱病；糖尿病（例えば、若年発症１型糖尿病および真性糖尿病）；子宮内膜症、子宮内膜炎および関連した状態；線維筋痛（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）または痛覚脱失；対宿主性移植片病；痛覚過敏；炎症性腸疾患（クローン病およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連下痢を含む）；虚血（大脳虚血（外傷、癲癇、出血または発作（これらの各々は、神経変性をもたらし得る）の結果としての脳損傷を含む）；肺の疾患（例えば、成人呼吸促進症候群、喘息および肺線維症）；多発性硬化症；神経炎症疾患；眼の疾患および状態（角膜移植、眼の変性およびブドウ膜炎を含む）；疼痛（癌関連疼痛を含む）；膵炎；歯周病；前立腺炎（細菌性または非細菌性）および関連した状態；乾癬および関連した状態；肺線維症；再灌流障害；リウマチ病（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性（リウマチ様）関節炎、血清陰性多発性関節炎、剛直性脊椎炎、ライター症候群および反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば、川崎病）、脳脈管炎、ライム病、ブドウ球菌誘発性（「敗血症性」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎およびリウマチ性多発性筋痛および巨細胞性動脈炎）；敗血症性ショック；放射線治療からの副作用；全身性エリテマトーデス；一時性顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植または挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えば、ＨＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよび関連種）もしくは他の疾患プロセスから生じる炎症状態。
【０２３４】
本発明によって意図されるように、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、他の治療と共に、そしてまた処置される適応症に適切な他の薬学的因子と共に投与され得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよび１以上のさらなる治療または薬学的因子のいずれかは、別々に、連続してまたは同時に投与され得る。
【０２３５】
特定の実施形態では、本発明は、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための１以上のインターロイキン−１インヒビターのうちのいずれかと組合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。インターロイキン−１インヒビターのクラスとしては、以下が挙げられる：本明細書中に記載されるような、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１に対する細胞レセプターの活性化を特異的に妨げ得る任意の化合物）（例えば、ＩＬ−１ｒａ）；抗ＩＬ−１レセプターモノクローナル抗体（例えば、ＥＰ  ６２３６７４（その開示は本明細書中に参考として援用される））；ＩＬ−１結合タンパク質（例えば、可溶性ＩＬ−１レセプター（例えば、米国特許第５，４９２，８８８号、同第５，４８８，０３２号、同第５，４６４，９３７号、同第５，３１９，０７１号および同第５，１８０，８１２号（これらの開示は本明細書中に参考として援用される））；抗ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えば、ＷＯ  ９５／０１９９７、ＷＯ  ９４／０２６２７、ＷＯ  ９０／０６３７１、米国特許第４，９３５，３４３号、ＥＰ  ３６４７７８、ＥＰ  ２６７６１１およびＥＰ  ２２００６３（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される））；ＩＬ−１レセプター補助タンパク質（例えば、ＷＯ  ９６／２３０６７）ならびにＩＬ−１のインビボでの合成または細胞外放出をブロックする、他の化合物およびタンパク質。
【０２３６】
インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、インターロイキン−１の天然のインヒビターとして作用するヒトタンパク質である。インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、ならびにそれらの作製方法および使用方法は、米国特許第５，０７５，２２２号；ＷＯ  ９１／０８２８５；ＷＯ  ９１／１７１８４；ＡＵ  ９１７３６３６；ＷＯ  ９２／１６２２１；ＷＯ  ９３／２１９４６；ＷＯ  ９４／０６４５７；ＷＯ  ９４／２１２７５；ＦＲ  ２７０６７７２；ＷＯ  ９４／２１２３５；ＤＥ  ４２１９６２６；ＷＯ  ９４／２０５１７；ＷＯ  ９６／２２７９３およびＷＯ  ９７／２８８２８（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。このタンパク質は、グリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１レセプターアンタゴニストを包含する。
【０２３７】
特に、３つの例示的な形態のＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ｒａα、ＩＬ−１ｒａβおよびＩＬ−１ｒａｘ）が、米国特許第５，０７５，２２２号に開示および記載される。ＩＬ−１インヒビター（特に、ＩＬ−１ｒａｓ）を産生するための方法もまた、５，０７５，２２２号特許に開示される。
【０２３８】
さらなるクラスのインターロイキン−１インヒビターは、ＩＬ−１に対する細胞性レセプターの活性化を特異的に妨げ得る化合物を包含する。このような化合物としては、ＩＬ−１結合タンパク質（例えば、可溶性レセプターおよびモノクローナル抗体）が挙げられる。このような化合物はまた、このレセプターに対するモノクローナル抗体を包含する。
【０２３９】
さらなるクラスのインターロイキン−１インヒビターとしては、ＩＬ−１のインビボでの合成および／または細胞外放出をブロックする化合物およびタンパク質が挙げられる。このような化合物としては、ＩＬ−１遺伝子の転写またはＩＬ−１プレタンパク質のプロセシングに影響を与える因子が挙げられる。
【０２４０】
特定の実施形態において、本発明は、分泌または可溶性のヒトｆａｓ抗原またはその組換えバージョン（ＷＯ９６／２０２０６およびＭｏｕｎｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、１５５：４８２９−４８３７；およびＥＰ５１０６９１）と組合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。ＷＯ９６／２０２０６は、分泌ヒトｆａｓ抗原（ネイティブおよび組換え体（Ｉｇ融合タンパク質を含む））、可溶性組換えヒトｆａｓ抗原のコードの原因である遺伝子を単離するための方法、適切なベクターおよび細胞型にこの遺伝子をクローン化するための方法、およびこの遺伝子を発現させてインヒビターを産生するための方法を開示する。ＥＰ５１０６９１は、ヒトｆａｓ抗原（可溶性ｆａｓ抗原を含む）をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを発現するためのベクター、およびこのベクターでトランスフェクトされた形質転換体を教示する。非経口的に投与される場合、分泌または可溶性のｆａｓ抗原融合タンパク質の用量は、それぞれ一般的に、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇである。
【０２４１】
ＴＮＦに関連する疾患（リウマチ病のような急性および慢性の炎症を含む）の現在の処置は、通常、疼痛および炎症の制御のための第一線の薬物の使用を含み；これらの薬物は、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として分類される。二次的な処置は、コルチコステロイド、遅効性抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤ）または疾患改善（ＤＭ）薬を含む。以下の化合物に関する情報は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１６版、Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）およびＰｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ、ＰＪＢ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．に見出され得る。
【０２４２】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に列挙される疾患および障害（リウマチ病のような急性および慢性の炎症；ならびに対宿主性移植片病を含む）の処置のためのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよび１以上のＮＳＡＩＤのうちのいずれかの使用に関する。ＮＳＡＩＤは、その抗炎症性作用が少なくとも部分的に、プロスタグランジン合成の阻害による（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、ＭａｃＭｉｌｌａｎ第７版（１９８５））。ＮＳＡＩＤは、以下の少なくとも９つのグループに特徴付けられ得る：（１）サリチル酸誘導体、（２）プロピオン酸誘導体、（３）酢酸誘導体、（４）フェナム酸誘導体、（５）カルボン酸誘導体、（６）酪酸誘導体、（７）オキシカム（ｏｘｉｃａｍ）、（８）ピラゾール、および（９）ピラゾロン。
【０２４３】
別の実施形態において、本発明は、１つ以上のサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。このようなサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては、以下が挙げられる：アセトアミノザロール、アロキシプリン、アスピリン、ベノリラート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、トリサリチル酸マグネシウムコリン、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸コリン、ジフルシナル（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、エテルサラート、フェンドサール、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、１−ナフチルサリチレート、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドＯ−酢酸、サルサラート、サリチル酸ナトリウムおよびスルファサラジン。同様の鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したサリチル酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２４４】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のプロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。プロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては、以下が挙げられる：アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、デキスインドプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン（ｌｏｘｏｐｒｏｆｅｎ）、ミロプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、ピリドキシプロフェン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｐｒｏｆｅｎ）、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したプロピオン酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２４５】
別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の酢酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。酢酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては、以下が挙げられる：アセメタシン、アルクロフェナク、アムフェナク、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラク、デルメタシン（ｄｅｌｍｅｔａｃｉｎ）、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパック、ロナゾラク、メチアジン酸、オキサメタシン、オキシピナク（ｏｘｐｉｎａｃ）、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダク、タルメタシン、チアラミド、チオピナク、トルメチン、トルメチンナトリウム、ジドメタシンおよびゾメピラク。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連した酢酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２４６】
なお別のより特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のフェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。フェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステル、およびその薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：エンフェナム酸、エトフェナマート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、メドフェナム酸（ｍｅｄｏｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルマート、テロフェナマート、トルフェナム酸およびウフェナマート。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したフェナム酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２４７】
さらに別のより特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のカルボン酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。使用され得るカルボン酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては以下が挙げられる：クリダナク、ジフルニサル、フルフェニサール、イノリジン（ｉｎｏｒｉｄｉｎｅ）、ケトロラクおよびチノリジン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したカルボン酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２４８】
別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の酪酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。酪酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：ブマジソン、ブチブフェン、フェンブフェンおよびキセンブシン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連した酪酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２４９】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のオキシカム、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。オキシカム、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカムおよび４−ヒドロキシ−１，２−ベンゾチアジン１，１−ジオキシド４−（Ｎ−フェニル）−カルボキサミド。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したオキシカムもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２５０】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のピラゾール、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。使用され得るピラゾール、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は以下を含む：ジフェナミゾールおよびエピリゾール。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したピラゾールもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２５１】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のピラゾロン、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。使用され得るピラゾロン、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾンおよびチアゾリノブタゾン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したピラゾロン（ｐｙｒａｚａｌｏｎｅ）もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２５２】
別の特定の実施形態において、本発明は、以下の１つ以上のＮＳＡＩＤのいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する：ε−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザック、ベンダザックリジネート（ｂｅｎｄａｚａｃ＋  ｌｙｓｉｎａｔｅ）、ベンジダミン、ベプロジン（ｂｅｐｒｏｚｉｎ）、ブロペラモール、ブコローム、ブフェゾラク、シプロカゾン、クロキシマート、ダジダミン、デボキサメト、デトミジン、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｉｒａｍｉｄｅ）、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｙｒａｍｉｄｅ）、ジフィサラミン（ｄｉｆｉｓａｌａｍｉｎｅ）、ジタゾール、エモルファゾン、ファネチゾールメシレート、フェンフルミゾール、フロクタフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロカゾン、フォピルトリン（ｆｏｐｉｒｔｏｌｉｎｅ）、フォスフォサル、グアイメサール、グアイアゾレン（ｇｕａｉａｚｏｌｅｎｅ）、イソニキシン（ｉｓｏｎｉｘｉｒｎ）、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リジンクロニキシネート（ｌｙｓｉｎ  ｃｌｏｎｉｘｉｎａｔｅ）、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロール、オキサパドール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ぺリソキサール、クエン酸ぺリソキサール、ピフォキシム、ピプロキセン（ｐｉｐｒｏｘｅｎ）、ピラゾラク、ピルフェニドン、プロカゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ（ｔｈｉｅｌａｖｉｎ  Ｂ）、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプトアミド（ｔｒｙｐｔａｍｉｄ）ならびに４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ  １２７、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１およびＷＹ４１７７０のような会社コード番号によって命名されるようなＮＳＡＩＤ。ＮＳＡＩＤに類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したＮＳＡＩＤもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２５３】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、リウマチ病、対宿主性移植片病、および多発性硬化症のような急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上のコルチコステロイド、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。コルチコステロイド、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、ヒドロコルチゾンおよびヒドロコルチゾンに由来する化合物を含む：例えば、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ベタメタゾンバレレート、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾールプロピオネート、クロベタゾン、クロベタゾンブチレート、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドネート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、フルメタゾンピバレート、フルシノロンアセトニド、フルニソリド、フルオシノニド、フルオロシノロン（ｆｌｕｏｒｏｃｉｎｏｌｏｎｅ）アセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロンアセテート、フルプレドニデンアセテート、フルプレドニゾロン、フルランデノリド（ｆｌｕｒａｎｄｅｎｏｌｉｄｅ）、フォルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタゾン、ハロプレドンアセテート、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニソロン、モメタゾンフロエート、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドリアミノアセテート、プレドニゾロンナトリウムホスフェート、プレドニゾロンナトリウムスクシネート、プレドニゾロンナトリウム２１−ｍ−スルホベンゾネート、プレドニゾロンナトリウム２１−ステアログリコレート、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾロン２１−トリメチルアセテート、プレドニゾン、プレドニバル（ｐｒｅｄｎｉｖａｌ）、プレドニリデン、プレドニリデン２１−ジエチルアミノアセテート、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、およびトリアムシノロンヘキサセトニド。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したコルチコステロイドもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２５４】
別の特定の実施形態において、本発明は、リウマチ病、対宿主性移植片病、および多発性硬化症のような急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上の遅効性抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤ）または疾患改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。ＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤ、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アロクプレイドナトリウム、オーラノフィン、金チオグルコース、金チオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナルナトリウム、ブシラミン、カルシウム３−金チオ−２−プロパノール−１−スルホネート、クロラムブシル、クロロキン、クロブザリト、クプロキソリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダプソン、１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、ジアセレイン、グルコサミン、金塩（例えば、シクロキン金塩、金ナトリウムチオマレート、金ナトリウムチオスルフェート）、ヒドロキシクロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾール、ロベンザリット、メリチン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミゾリビン、ミコフェノレートモフェチル（ｍｏｆｅｔｉｌ）、ミオラル（ｍｙｏｒａｌ）、ナイトロジェンマスタード、Ｄ−ペニシラミン、ピリジノール、イミダゾール（例えば、ＳＫＮＦ８６００２およびＳＢ２０３５８０）、ラパマイシン、チオール、サイモポエチンおよびビンクリスチン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤもまた、この群に含まれることが意図される。
【０２５５】
さらに特定の実施形態において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上のＣＯＸ２インヒビター、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。ＣＯＸ２インヒビター、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩の例としては、例えば、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）が挙げられる。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したＣＯＸ２インヒビターもまた、この群に含まれることが意図される。
【０２５６】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上の抗菌剤、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの使用に関する。抗菌剤としては、例えば、ペニシリン、セファロスポリンおよび他のβ−ラクタム、アミノ配糖体、アゾール、キロノン、マクロライド、リファマイシン、テトラサイクリン、スルホンアミド、リンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）およびポリミキシンの広範なクラスが挙げられる。ペニシリンは、以下を含むがこれらに限定されない：ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アモキシリン、アモキシリン／クラブラン酸、ヘタシリン、シクラシリン（ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｉｎｄａｎｙｌ）、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン（ｐｅｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ）、およびメシリナム。セファロスポリンおよび他のβ−ラクタムは、以下を含むがこれらに限定されない：セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セファゾリン、セファドロキシル、セファクロール、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セルロキシム（ｃｅｒｕｒｏｘｉｍｅ）、セフォニシド、セフォラジン（ｃｅｆｏｒａｄｉｎｅ）、セフィキシム、セフォタキシム、モキサラクタム、セフチゾキシム、セトリアキソン（ｃｅｔｒｉａｘｏｎｅ）、セフォペラゾン（ｃｅｐｈｏｐｅｒａｚｏｎｅ）、セフタジジム、イミペネムおよびアズトレオナム。アミノ配糖体は、以下を含むがこれらに限定されない：ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびネオマイシン。アゾールは、フルコナゾールを含むがこれに限定されない。キノロンは、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシンを含むがこれらに限定されない。マクロライドは、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｏｍｙｃｉｎ）、スピラマイシンおよびアジスロマイシンを含むがこれらに限定されない。リファマイシンは、リファンピンを含むがこれに限定されない。テトラサイクリンは、スピサイクリン（ｓｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、デオキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ぺニメピサイクリン、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、セノサイクリン（ｓｅｎｏｃｉｃｌｉｎ）およびテトラサイクリンを含むがこれらに限定されない。スルホンアミドは、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾールおよびコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）を含むがこれらに限定されない。リンコサミドは、クリンダマイシンおよびリンコマイシンを含むがこれらに限定されない。ポリミキシン（ポリペプチド）は、ポリミキシンＢおよびコリスチンを含むがこれらに限定されない。
【０２５７】
特定の好ましい実施形態では、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを含むポリペプチドが、種々の炎症状態、自己免疫状態および骨の損失をもたらす他の状態を処置するために特定の治療分子と共に用いられる。状態および所望の処置レベルに依存して、２、３またはそれより多くの因子が、別々に、同時にまたは連続して投与され得る。これらの因子は、同じ処方物中に含めることによってもしくは処置キットに含めることによって一緒に提供され得るか、またはこれらは別々に提供され得る。遺伝子治療によって投与される場合、このタンパク質因子をコードする遺伝子は、必要に応じて同じプロモーター領域の制御下で同じベクター中に、または別々のベクター中に含まれ得る。上記のクラスの特に好ましい分子は、以下の通りである。
【０２５８】
・ＩＬ−１インヒビター：ＩＬ−１ｒａタンパク質および可溶性ＩＬ−１レセプター。最も好ましいＩＬ−１インヒビターは、アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）である。
【０２５９】
・ＴＮＦ−αインヒビター：可溶性腫瘍壊死因子レセプターＩ型（ｓＴＮＦ−ＲＩ；−ＲＩはまた、ｐ５５レセプターと呼ばれる）；可溶性腫瘍壊死因子レセプターＩＩ型（ｐ７５レセプターとも呼ばれる）；およびＴＮＦレセプターを結合するモノクローナル抗体。最も好ましいのは、ＷＯ  ９８／２４４６３に記載される通りのｓＴＮＦ−ＲＩ、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））およびＡｖａｋｉｎｅ（登録商標）である。例示的なＴＮＦ−αインヒビターは、ＥＰ  ４２２  ３３９、ＥＰ  ３０８  ３７８、ＥＰ  ３９３  ４３８、ＥＰ  ３９８  ３２７およびＥＰ  ４１８  ０１４に記載される。
【０２６０】
・セリンプロテアーゼインヒビター：例えば、ＳＬＰＩ。これらのインヒビターもまた、ＳＬＰＩがＬＰＳ応答を阻害することが示されたので、例示的なＬＰＳ調節因子として考察され得る。Ｊｉｎら（１９９７），Ｃｅｌｌ，８８（３）：４１７−２６。
【０２６１】
特に、好ましい処置方法は、ＴＮＦ−αインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターをＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを含むポリペプチドと組み合わせた使用に関する。そのようなポリペプチドは、ＴＮＦ−αインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターのいずれかまたは両方とともに、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症のような状態の処置のために使用され得る。
【０２６２】
ＴＮＦ、ＯＰＧおよび／または本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド自体の１つ以上の所望されないレベルに関連する他の疾患は、本発明の範囲内に包含されることが認識される。所望されないレベルとしては、過剰および／または正常未満のレベルのＴＮＦ、ＯＰＧおよび／または本明細書において記載されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが挙げられる。
【０２６３】
ＴＮＦ−αインヒビターは、ＴＮＦ産生の下方制御もしくは阻害、遊離のＴＮＦ結合、ＴＮＦのそのレセプターへの結合の阻害、またはそのレセプターへの結合後のＴＮＦシグナル伝達の調節の介入により作用し得る。用語「ＴＮＦ−αインヒビター」はしたがって、可溶化されたＴＮＦレセプター、ＴＮＦに対する抗体、ＴＮＦレセプターに対する抗体、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のインヒビター、およびＴＮＦ活性に影響を与える他の分子を包含する。
【０２６４】
種々の種類のＴＮＦ−αインヒビターが当該分野において開示されており、それらには以下の参考文献が包含される：
以下の番号の欧州特許出願：３０８  ３７８；４２２  ３３９；３９３  ４３８；３９８  ３２７；４１２  ４８６；４１８  ０１４；４１７  ５６３；４３３  ９００；４６４  ５３３；５１２  ５２８；５２６  ９０５；５６８  ９２８；６６３  ２１０；５４２  ７９５；８１８  ４３９；６６４  １２８；５４２  ７９５；７４１  ７０７；８７４  ８１９；８８２  ７１４；８８０  ９７０；６４８  ７８３；７３１  ７９１；８９５  ９８８；５５０  ３７６；８８２  ７１４；８５３  ０８３；５５０  ３７６；９４３  ６１６；
以下の番号の米国特許：５，１３６，０２１；５，９２９，１１７；５，９４８，６３８；５，８０７，８６２；５，６９５，９５３；５，８３４，４３５；５，８１７，８２２；５，８３０，７４２；５，８３４，４３５；５，８５１，５５６；５，８５３，９７７；５，３５９，０３７；５，５１２，５４４；５，６９５，９５３；５，８１１，２６１；５，６３３，１４５；５，８６３，９２６；５，８６６，６１６；５，６４１，６７３；５，８６９，６７７；５，８６９，５１１；５，８７２，１４６；５，８５４，００３；５，８５６，１６１；５，８７７，２２２；５，８７７，２００；５，８７７，１５１；５，８８６，０１０；５，８６９，６６０；５，８５９，２０７；５，８９１，８８３；５，８７７，１８０；５，９５５，４８０；５，９５５，４７６；５，９５５，４３５；
以下の番号の国際（ＷＯ）特許出願：９０／１３５７５、９１／０３５５３、９２／０１００２、９２／１３０９５、９２／１６２２１、９３／０７８６３、９３／２１９４６、９３／１９７７７、９５／３４３２６、９６／２８５４６、９８／２７２９８、９８／３０５４１、９６／３８１５０、９６／３８１５０、９７／１８２０７、９７／１５５６１、９７／１２９０２、９６／２５８６１、９６／１２７３５、９６／１１２０９、９８／３９３２６、９８／３９３１６、９８／３８８５９、９８／３９３１５、９８／４２６５９、９８／３９３２９、９８／４３９５９、９８／４５２６８、９８／４７８６３、９６／３３１７２、９６／２０９２６、９７／３７９７４、９７／３７９７３、９６／３５７１１、９８／５１６６５、９８／４３９４６、９５／０４０４５、９８／５６３７７、９７／１２２４４、９９／００３６４、９９／００３６３、９８／５７９３６、９９／０１４４９、９９／０１１３９、９８／５６７８８、９８／５６７５６、９８／５３８４２、９８／５２９４８、９８／５２９３７、９９／０２５１０、９７／４３２５０、９９／０６４１０、９９／０６０４２、９９／０９０２２、９９／０８６８８、９９／０７６７９、９９／０９９６５、９９／０７７０４、９９／０６０４１、９９／３７８１８、９９／３７６２５、９７／１１６６８；
以下の番号の日本国（ＪＰ）特許出願：１０１４７５３１、１０２３１２８５、１０２５９１４０、および１０１３０１４９、１０３１６５７０、１１００１４８１および１２７，８００／１９９１；以下の番号の独国（ＤＥ）出願１９７３１５２１；以下の番号の英国（ＧＢ）出願：２  ２１８  １０１、２  ３２６  ８８１、２  ２４６  ５６９。
【０２６５】
本発明の目的のために、これらの参考文献において開示されるｓＴＮＦＲならびにｓＴＮＦＲの改変体および誘導体を含む、これらの参考文献において開示される分子は（以下を参照のこと）、「ＴＮＦ−αインヒビター」と総称される。
【０２６６】
例えば、ＥＰ  ３９３  ４３８およびＥＰ  ４２２  ３３９は、可溶性ＴＮＦレセプターＩ型（ｓＴＮＦＲ−Ｉまたは３０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターとしても知られる）および可溶性ＴＮＦレセプターＩＩ型（ｓＴＮＦＲ−ＩＩまたは４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターとしても知られる）（これらは、総称して「ｓＴＮＦＲ」と呼ばれる）のアミノ酸配列および核酸配列を教示し、これらには、その改変形態（例えば、フラグメント、機能的誘導体および改変体）が含まれる。ＥＰ  ３９３  ４３８およびＥＰ  ４２２  ３３９はまた、そのインヒビターをコードすることを担う遺伝子を単離するため、適切なベクターおよび細胞型中にその遺伝子をクローニングするため、およびその遺伝子を発現してそのインヒビターを生産するための方法を開示する。
【０２６７】
ｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩは、神経成長因子／ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのレセプターのメンバーであり、これには、神経成長因子レセプター（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ラットＴ細胞抗原ＭＲＣ  ＯＸ４０、ｆａｓ抗原ならびにＣＤ２７およびＣＤ３０の抗原（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９−１０２３）が包含される。細胞表面レセプターのこの群のうちで最も保存されている特徴は、システインリッチ細胞外リガンド結合ドメインであり、これは、約４０アミノ酸の４つの反復モチーフに分割され得、そして４−６システイン残基を、十分に保存される位置で含む（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、前出）。
【０２６８】
ＥＰ  ３９３  ４３８は、４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターΔ５１および４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビターΔ５３を教示する。これらは、全長組換え４０ｋＤａ  ＴＮＦインヒビタータンパク質の切断型であり、ここで、成熟タンパク質のカルボキシ末端における５１または５３のアミノ酸残基がそれぞれ除去されている。
【０２６９】
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４号は、ｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩの切断型を教示する。これらは、４番目のドメイン（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ｔｈｒ１２７−Ａｓｎ１６１、およびｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１４１−Ｔｈｒ１７９）を含まず；３番目のドメインの一部（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｎ１１１−Ｃｙｓ１２６およびｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１２３−Ｌｙｓ１４０）を含まず；および必要に応じて、第一のドメインの一部（ｓＴＮＦＲ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１９およびｓＴＮＦＲ−ＩＩのアミノ酸残基Ｌｅｕ１−Ｃｙｓ３２）を含まない。
【０２７０】
ＩＬ−１インヒビターは、多数の機構から生じ得る、ＩＬ−１に対する細胞レセプターの活性化を、特異的に妨害し得る任意のタンパク質を含む。そのような機構としては、ＩＬ−１産生の下方制御、遊離ＩＬ−１の結合、ＩＬ−１のそのレセプターへの結合の妨害、ＩＬ−１レセプター複合体の形成（すなわち、ＩＬ−１レセプターアクセサリタンパク質とＩＬ−１レセプターとの会合）の阻害；またはそのレセプターへの結合後ＩＬ−１シグナル伝達の調節への介入が挙げられる。インターロイキン−１インヒビターのクラスとしては以下が挙げられる：
・本明細書に開示されるような、ＩＬ−１ｒａのようなインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト；
・抗ＩＬ−１レセプターモノクローナル抗体（例えば、ＥＰ６２３６７４）；
・ＩＬ−１結合タンパク質（例えば、可溶性ＩＬ−１レセプター（例えば、米国特許第５，４９２，８８８号、米国特許第５，４８８，０３２号、米国特許第５，４６４，９３７号、米国特許第５，３１９，０７１号、および米国特許第５，１８０，８１２号））；
・抗ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えば、ＷＯ  ９５０１９９７，ＷＯ９４０２６２７，ＷＯ  ９００６３７１、米国特許第４，９３５，３４３号、ＥＰ３６４７７８、ＥＰ  ２６７６１１およびＥＰ  ２２００６３）；
・ＩＬ−１レセプターアクセサリタンパク質およびそれに対する抗体（例えば、ＷＯ  ９６／２３０６７）；
・インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）またはカスパーゼＩのインヒビター（これらは、ＩＬ−１β産生および分泌を阻害するに使用され得る）；
・インターロイキン１βプロテアーゼインヒビター；
・ＩＬ−１のインビボ合成または細胞外放出をブロックする、他の化合物およびタンパク質。
【０２７１】
例示的なＩＬ−１インヒビターは、以下の参考文献に開示されている：
以下の番号の米国特許：５７４７４４４；５３５９０３２；５６０８０３５；５８４３９０５；５３５９０３２；５８６６５７６；５８６９６６０；５８６９３１５；５８７２０９５；５９５５４８０；
以下の番号の国際（ＷＯ）特許出願：９８／２１９５７，９６／０９３２３，９１／１７１８４，９６／４０９０７，９０／３２７３３，９８／４２３２５，９８／４４９４０，９８／４７８９２，９８／５６３７７，９９／０３８３７，９９／０６４２６，９９／０６０４２，９１／１７２４９，９８／３２７３３，９８／１７６６１，９７／０８１７４，９５／３４３２６，９９／３６４２６，および９９／３６４１５；
以下の番号の欧州（ＥＰ）特許出願：５３４９７８および８９４７９５；ならびに仏国特許出願ＦＲ  ２７６２５１４。
【０２７２】
（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内にある。そのような組成物は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド（フラグメント、改変体、誘導体を含む）または１つ以上の選択的結合因子の治療有効量を、薬学的に受容可能な処方剤のような薬学的に受容可能な薬剤と混合されて含み得る。
【０２７３】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の薬学的組成物は、代表的に、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、核酸分子または選択的結合因子の治療有効量または予防有効量を、投与形態での適合性のために選択される薬学的または生理学的に受容可能な１つ以上の処方剤とともに、含む。適切な処方物質または薬学的に受容可能な薬剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存料、着色料、香料、希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、フィラー、バルク剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦型剤および／または薬学的アジュバント。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理食塩水、または人工の脳脊髄液であり得、これらには、非経口投与のための組成物中で一般的な他の材料が補充され得る。中性緩衝化された生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらに、例示的なビヒクルである。
【０２７４】
本明細書において使用される用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理的に受容可能なキャリア」とは、薬学的組成物としてのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、核酸分子または選択結合因子の送達を達成または増強するために適切な、１つ以上の処方物材料をいう。
【０２７５】
受容可能な処方材料は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度で不活性である。これらの材料としては、以下が挙げられ得る：緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩または他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭化水素（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０２７６】
代表的に、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の薬学的組成物は、以下を含む組成物の形態で投与される：１つ以上の生理的に受容可能な薬剤と組み合わされた精製されたポリペプチド。本明細書において使用される場合、用語「ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の薬学的組成物」はまた、本発明の核酸分子または選択結合因子を含む組成物を包含する。
【０２７７】
中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、例示的な適切なキャリアである。他の標準的な薬学的に受容可能な薬剤（例えば、希釈剤および賦型剤）は、所望に応じ含まれ得る。例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦型剤を用いた凍結乾燥物として処方され得る。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤、または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含む。これは、ソルビトールまたは適切なその代替物をさらに含み得る。
【０２７８】
薬学的組成物中の主なビヒクルまたはキャリアはその性質が水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理的食塩水、溶液または人工の脳脊髄液であり得、これらには、非経口投与のための組成物中に一般的な他の材料が補充されていてもよい。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤、または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含む。これは、ソルビトールまたは適切なその代替物をさらに含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態で、任意の処方剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）で所望の程度の純度を有する選択された組成物と混合することによって、保存用に調製され得る。さらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様のポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦型剤を用いた凍結乾燥物として処方され得る。
【０２７９】
さらに、その組成物は、以下を改変、維持または保存のために他の処方物材料を含み得る：例えば、ｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、明澄度、色調、滅菌性、安定性、溶解速度または放出速度、その組成物の吸収または浸透、あるいはその処方物の臭い。同様に、その組成物は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド、核酸分子または選択結合因子の放出速度を改変または維持するために、あるいはそのようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の吸収もしくは浸透を促進するためにさらなる処方材料を含み得る。
【０２８０】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の薬学的組成物は、非経口的に投与され得る。あるいは、その組成物は、消化管を通じて投与され得る（例えば、経口または吸入による）。非経口的に投与される場合、本発明において使用するための治療組成物は、発熱物質のない、非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。ｐＨ、等張性、安定性などへの正当な注意を払ったそのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当業者に技術常識の範囲にある。
【０２８１】
非経口注射のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水である。この中に、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが、滅菌等張性溶液として、処方され、適切に保存される。さらに別の調製物は、その産物の制御されたまたは維持された放出を提供し、次いで貯蔵注射として送達され得る薬剤（例えば、注射可能なミクロスフェア、生体分解性粒子またはビーズ、またはリポソーム）と所望の分子との処方物を包含し得る。所望される分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを包含する。
【０２８２】
本発明の薬学的組成物は、他の成分（例えば、非経口的に受容可能な保存料、張性剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝化剤、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、および界面活性剤）を、当該分野において周知のごとく含み得る。例えば、適切な張性増強剤としては、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。適切な保存料としては、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチル（ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ）アルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などが挙げられるがそれらに限定されない。過酸化水素もまた、保存料として使用され得る。適切な共溶媒は、例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールである。適切な錯化剤は、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。適切な界面活性剤または湿潤剤としては、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなどが挙げられる。緩衝剤は、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩またはＴｒｉｓ−ＨＣｌのような従来の緩衝剤であり得る。
【０２８３】
この処方物成分は、投与部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、生理的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（代表的には約５と約８との間のｐＨ範囲内）でその組成物を維持するために使用され得る。
【０２８４】
本発明の１つの実施形態において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物と、任意の生理的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］）とを、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で混合することによって貯蔵用に調製され得る。最適な薬学的処方物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、以下を参照のこと：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｐ．１４３５−１７１２。このような組成物は、本発明のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２８５】
治療に使用される、有効量のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド組成物は、例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが使用される適応、投与経路、および患者の状態のような治療的観察事項に依存する。従って、臨床医は、投薬量を力価測定し、そして投与経路を変更して、最適な治療効果を得ることができる。代表的な投薬量は、上述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲におよび得る。他の実施形態において、投薬量は、１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得るか；または５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るか；あるいは０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るか；あるいは１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２８６】
投与の頻度は、使用される処方物における、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の薬物動態的パラメータに依存する。代表的には、臨床医は、投薬量が所望の効果を達成するに達するまで、その組成物を投与する。従って、その組成物は、単回用量として、または２もしくはそれを超える用量（これは、所望の分子の同じ量を含んでいても含んでいなくてもよい）として経時的に投与され得るか、あるいは移植可能なデバイスまたはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。
【０２８７】
従って、当業者は、処置のために適切な投薬量レベルは、部分的に、送達される分子、治療状況、処置される障害の型、レシピエントの年齢および全身の健康状態に依存して変動することを理解する。
【０２８８】
インビボ投与のために使用されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の薬学的組成物は、代表的に、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成され得る。その組成物が凍結乾燥されている場合、これらの方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構築の前またはその後のいずれかで行われ得る。非経口的投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口的組成物は、概して、滅菌アクセス口を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ）または皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルに配置される。
【０２８９】
一旦薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体または脱水和粉末もしくは凍結乾燥粉末として保存され得る。そのような処方物は、直ぐ使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態または投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存され得る。
【０２９０】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を産生するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を備え得る。本発明の範囲内に含まれるのはまた、単回および複数のチャンバつきの予備充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシジンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットである。
【０２９１】
（１）徐放処方物、（２）吸入剤ミスト、または（３）経口活性処方物のような薬学的組成物もまた企図される。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子薬学的組成物は概して、非経口的投与のために処方される。そのような非経口的に投与される治療組成物は、代表的に、発熱物質のない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり、これは、所望のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子を、薬学的に受容可能なビヒクル中に含む。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子薬学的組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の粒子調製物、またはその分子のリポソーム中への導入を包含し得る。ヒアルロン酸もまた、使用され得、そしてこれは、血液循環の間維持される促進効果を有し得る。
【０２９２】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアゾール送達のためのプロペラントを用いて、液化されたプロペラントを用いるかもしくは用いないで処方され得る。さらに別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載され、これは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２９３】
特定の処方物は、消化管を通じて（例えば、経口）投与され得ることもまた企図される。本発明の一つに実施形態において、この様式で投与されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、錠剤およびカプセルのような固体投薬形態の処方において慣例的に使用されるそれらのキャリアとともにまたはそれを含まずに処方され得る。例えば、カプセルは、胃腸管において、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして全身前分解が最小化される時点で処方物の活性部分が放出されるように設計され得る。さらなる薬剤が、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの吸収を容易にするように含まれ得る。希釈剤、香料、低融点ろう、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合因子もまた使用され得る。
【０２９４】
別の薬学的組成物は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子の有効量を、錠剤の製造のために適切な非毒性賦形剤と混合して含み得る。滅菌水または他の適切なビヒクル中にその錠剤を溶解することによって、溶液が単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合因子（例えば、デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム）；あるいは滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２９５】
さらなるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様薬学的組成物は、当業者に明らかであり、これには、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子を、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて含む処方物、および徐放処方物または制御された送達処方物中のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが包含される。種々の他の徐放手段または制御された送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポ（ｄｅｐｏｔ）注射）を処方するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、以下を参照のこと：ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９。これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御された放出を記載する。
【０２９６】
徐放調製物のさらなる例としては、成型された物品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスを包含する。徐放マトリクスとしては以下が挙げられ得る：ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６［１９８３］）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７［１９８１］およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，前出）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）。徐放組成物はまた、リポソームを含み得る。このリポソームは、当該分野において公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；ＥＰ  １４３，９４９。
【０２９７】
投与の様式に拘わらず、特定の用量は、体重、体表面積または器官の大きさに従って算出され得る。適切な投薬量のさらなる調整は、当業者によって慣用的になされ、そして当業者によって慣用的になされる業務の範囲内にある。適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用により確認され得る。
【０２９８】
薬学的組成物の投与経路は、公知の方法に従う（例えば、経口、吸入、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または創傷内経路への注射または注入、あるいは徐放系または移植デバイスによる）。所望の場合、その組成物は、注入により、ボーラス注射または移植デバイスにより連続的に投与され得る。
【０２９９】
あるいはまたは加えて、その組成物は、所望の分子が吸収またはカプセル化された、膜、スポンジまたは他の適切な材料の罹患領域へ移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用されるとき、そのデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時間放出ボーラスによって、そのデバイスを通じて直接、または連続投与、あるいは連続注入を用いてカテーテルを介してであり得る。
【０３００】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド（フラグメント、改変体および誘導体を含む）は、単独で、他のポリペプチドおよび薬学的組成物とともにまたは組み合わせて使用され得ることがさらに理解される。例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、処置される適応症に適切である場合、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤、および／または化学療法剤とともに、使用され得る。
【０３０１】
いくつかの症例では、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様薬学的組成物をエキソビボ様式で使用することも好ましくあり得る。そのような場合、細胞、組織または器官であって、患者から取り出されたものは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様薬学的組成物に暴露され、その後、その細胞、組織および／または器官は、続いてその患者に移植して戻される。
【０３０２】
他の症例において、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、本明細書において記載されるもののような方法を用いて遺伝子操作された特定の細胞を移植してそのポリペプチドを発現および分泌させることによって送達され得る。そのような細胞は、動物またはヒトの細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。必要に応じて、その細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、その細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。カプセル化材料は、代表的に、生体適合性で、半透過性のポリマー封入物または膜であり、これは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲組織からの他の悪性因子による細胞の破壊を予防することを可能にする。
【０３０３】
本発明のさらなる実施形態は、相同組換えの手段による治療的ポリペプチドのインビトロ産生、および遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達の両方のための細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。
【０３０４】
さらに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードするＤＮＡをすでに含む細胞に導入された制御エレメントを利用して、インビトロまたはインビボで、相同組換えにより、または組換え産生方法を用いて産生され得ることが企図される。例えば、相同組換え方法を使用して、通常は転写的にサイレントなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子または下方に発現する遺伝子を含む細胞を改変し得、それによりＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの治療有効量を発現する細胞を産生させ得る。相同組み換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または訂正するために遺伝子を標的化するためにもともと開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６：３０１，１９８９。基本的な技術は、哺乳動物ゲノムの特定の領域に特定の変異を導入するための方法として開発された（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８５８３−８５８７，１９８８）か、または欠損遺伝子内の特定の変異を訂正するための方法として開発された（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１（ＥＰ  ９１９３０５１，ＥＰ公開Ｎｏ．５０５５００；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開ＷＯ９１／０９９５５）に記載されている。
【０３０５】
相同組換えにより、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、目的の遺伝子を標的化ＤＮＡに付着させることによって目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。標的化ＤＮＡの小片であって、ゲノムの特定の領域に相補的であるものは、ＤＮＡ複製プロセスの間に親の鎖と接触するようにおかれる。これは、ハイブリダイズしてそれゆえ共通の相同領域を通じて内的ＤＮＡの他の片と組換えるように細胞中に挿入されたＤＮＡの一般的特性である。この相補的鎖が、変異あるいは異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合、この相補的鎖もまた、組み換えの結果として、新たに合成される鎖へと組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列が鋳型として機能することが可能となる。従って、移入されたＤＮＡがゲノムに組み込まれる。
【０３０６】
標的化ＤＮＡのこれらの片に付着されるのは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現と相互作用し得るかまたは制御し得るＤＮＡの領域である（例えば、隣接（フランキング）配列））。例えば、プロモーター／エンハンサーのエレメント、サプレッサー、または外因性の転写調節エレメントは、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響するに十分近位および方向において挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子自身をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの転写のために認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと組み合わされた標的化ＤＮＡ（目的の内的遺伝子と相同性の領域を含む）の使用によって達成され得る。
【０３０７】
例示方法において、細胞における所望される標的化遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの、導入によって予備選択された部位において細胞ゲノム中への相同組換えを介して変更される。これらの成分は、染色体（ゲノム）ＤＮＡに、実際これが新たな転写単位の生産を生じるような様式で導入される（ここで、そのＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結されている）。これらの成分の染色体ＤＮＡへの導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
【０３０８】
本明細書において記載される変更された遺伝子発現は、得られた細胞において通常サイレントな（発現されていない）遺伝子を活性化すること（または発現されるように生じさせること）、ならびに得られる細胞において生理学的に有意なレベルで発現されない遺伝子の発現を増強することを包含する。この実施形態は、さらに、得られる細胞において生じる調節または導入のパターンとは異なるような調節または導入のパターンを変化させること、ならびに得られる細胞において発現される遺伝子の発現を減少させる（消去することを含む）ことを包含する。
【０３０９】
相同組み換えを使用して、細胞の内因性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子から、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド生産を増強または生じさせ得る１つの方法は、第一に、相同組み換えを用いて部位特異的組換え系からの組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：５２１−５２７，１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５：８９０−９００，１９９３）を、細胞の内因性ゲノムＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコード領域の上流（すなわち５’側）に配置することを包含する。ゲノムＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位と相同な組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素とともに改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼは、細胞株においてゲノムＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置される組換え部位に、プラスミドの組換え部位を介して、プラスミドが組み込まれるようにさせる（Ｂａｕｂｏｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９，１９９３；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５，１９９１）。転写を増強することが知られる任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミドに適切に配置されるとき、細胞の内因性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子から、デノボでまたは増強されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で組み込まれる。
【０３１０】
部位特異的組換え配列がゲノムＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株ゲノムにおいてその他の場所で第二の組換え部位に導入するように相同組み換えを用いることである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素は、２つの組換え部位の細胞株へと導入され、組換え事象が生じ（欠失、反転、トランスロケーション）（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：５２１−５２７，１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５：８９０−９００，１９９３）、これは、細胞の内因性のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子からデノボのまたは増強されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を生じる。
【０３１１】
細胞の内因性のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子からのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現を増強させるためまたは生じるためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子からデノボまたは増強されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド産生を生じるような様式で、遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増強または生じさせることならびに／あるいは遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞に導入し、その結果、内因性のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子からデノボまたは増強されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの産生が、生じることを包含する。
【０３１２】
本発明は、標的遺伝子の発現を変更する方法において有用なＤＮＡ構築物にさらに関する。特定の実施形態において、例示のＤＮＡ構築物は、（ａ）１つ以上の標的配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソン；および（ｄ）対でないスプライスドナー部位を含む。ＤＮＡ構築物における標的配列は、エレメント（ａ）−（ｄ）を細胞内の標的遺伝子に組み込み、その結果、エレメント（ｂ）−（ｄ）が内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるようになることを指向する。別の実施形態において、このＤＮＡ構築物は、（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライス−ドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位を含む。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）−（ｆ）を組み込んで、その結果、（ｂ）−（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるようになる。標的配列は、相同組換え生じる細胞の染色体ＤＮＡにおいて予備選択される部位と相同である。この構築物において、そのエキソンは、概して調節配列の３’側にあり、そしてスプライスドナー部位は、エキソン３’側にある。
【０３１３】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書において提示されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする核酸配列）が知られている場合、その遺伝子の選択された領域に相補的なＤＮＡの片を合成または他の方法で入手し得る（例えば、目的の領域に結合する特定の認識部位で、ネイティブＤＮＡの適切な制限による）。この片は、その細胞への挿入の際に標的配列として作用し、そしてそのゲノム内のその相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの片およびそれに付随する任意の他のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖中に取り込まれる。従って本発明は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的配列として使用され得る。
【０３１４】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド細胞治療（例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた、企図される。この実施形態は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの生物学的に活性な形態を合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。そのようなＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド産生細胞は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの天然のプロデューサーである細胞であり得るか、あるいはそれがＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生する能力が、所望のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする遺伝子またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現を増強する遺伝子で形質転換されることによって増強された、組換え細胞であり得る。このような改変は、その遺伝子の送達のために、ならびにその遺伝子の発現および分泌を促進するために適切なベクターにより達成され得る。外来種のポリペプチドの投与とともに生じ得るような、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドが投与される患者において可能な免疫学的反応を最小化するために、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生する天然の細胞がヒト起源のものであって、そしてヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを産生する組換え細胞は、ヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０３１５】
移植された細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するためにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物の細胞は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの放出を可能にするが患者の免疫系または周囲組織からの他の悪性因子による細胞の破壊を予防する生体適合性の半透過性ポリマー封入物または膜中で、患者に移植され得る。あるいは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞は、そのようなカプセルなしで患者に直接移植され得る。
【０３１６】
生存細胞のカプセル化のための技術は、当該分野において公知であり、そして患者におけるカプセル化された細胞の調製およびその移植は、慣用的に行われ得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（ＷＯ９５／０５４５２；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の有効な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。カプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り出し可能である。カプセルは、組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。この分子は、哺乳動物宿主中に移植される際にインビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された、生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位に生存する細胞からの分子の送達を提供する。さらに、以下を参照のこと：米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，０１１，４７２号および同第５，１０６，６２７。生存する細胞をカプセル化するための系は、以下に記載される：ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）。以下もまた参照のこと：ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｗｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏ．，１１３：３２２−３２９（１９９１）、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５（１９９１）；およびＴｒｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３（１９９２）。
【０３１７】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた、企図される。インビボ遺伝子治療は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする遺伝子を、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子の局所注入または他の適切なウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞中に導入することによって行われ得る。Ｈｅｆｔｉ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５（１９９４）。例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする核酸分子は、標的化された細胞に送達するためにアデノ随伴ウイルスベクター中に含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，国際出願ＷＯ９５／３４６７０；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは代表的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結された、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ反転末端反復を含む。
【０３１８】
代替の適切なウイルスベクターは、以下が挙げられるがそれらに限定されない：レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスおよびパピローマウイルスのベクター。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、インビトロで治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが挿入されるように処理されたヒト細胞の送達によって治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療の実施のためのさらなる方法および材料は、以下に記載されている：米国特許第５，６３１，２３６号（これは、アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１０号（これは、レトロウイルスを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９号（これは、サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）。
【０３１９】
非ウイルス送達方法としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：リポソーム媒介性移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介性移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）。遺伝子治療材料および方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親の細胞よりも選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全手段）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子の使用ならびにベクター製造の方法をも包含し得る。遺伝子治療技術の実施のためのそのようなさらなる方法および材料は、以下に記載されている：米国特許第４，９７０，１５４号（これは、エレクトロポレーション技術を含む）；ＷＯ９６／４０９５８（これは、核リガンドを含む）；米国特許第５，６７９，５５９号（これは、遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）；米国特許第５，６７６，９５４号（これは、リポソームキャリアを含む）；米国特許第５，５９３，８７５号（これは、リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を含む）；ならびに米国特許第４，９４５，０５０号（ここでは、生物学的に活性な粒子は、その粒子が細胞の表面に浸透し、そしてその細胞の内部へと取り込まれるようになる速度で細胞に噴霧される）。
【０３２０】
さらに他の実施形態において、調節エレメントは、標的細胞中にＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子の制御された発現のために包含され得る。そのようなエレメントは、適切なエフェクターに対する応答においてスイッチオンされる。このようにして、治療ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの慣用される制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）をダイマー化するために使用される低分子ダイマー化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（ＷＯ９６４１８６５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６）；ＷＯ９７３１８９８（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７）およびＷＯ９７３１８９９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７）に記載される）の使用を包含する。そのタンパク質のダイマー化を使用して、導入遺伝子の転写を開始し得る。
【０３２１】
代替調節技術は、凝集物またはクラスターとして細胞内に目的の遺伝子から発現されるタンパク質を保存する方法を使用する。目的の遺伝子は、従来の凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現され、これは、小胞体内での凝集タンパク質の保持を生じる。保存されたタンパク質は、細胞内で安定かつ不活性である。しかし、そのタンパク質は、条件つき凝集ドメインを除き、それにより凝集物またはクラスターから離れて特異的に破壊する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することにより、その結果そのタンパク質がその細胞から分泌され得ることによって放出され得る。以下を参照のこと：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８１６−８１７、同８２６−８３０（２０００）。
【０３２２】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、以下の系が挙げられるがそれらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合が、２つの転写因子のダイマーを形成し、次いでこれが核に入りＤＮＡに結合することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、天然のリガンドへそのレセプターが結合する能力を除去するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系は、さらに以下に記載される：米国特許第５，３６４，７９１号；ＷＯ９６４０９１１およびＷＯ９７１０３３７。
【０３２３】
さらに別の制御系は、エクジソン（ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｔ  ｆｌｙ）ステロイドホルモン）を使用する。これは、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、活性化する。次いで、このレセプターは、核に移行し、特異的ＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答遺伝子からのプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するためのトランス活性化ドメイン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、さらに、以下に記載される：米国特許第５，５１４，５７８号；ＷＯ９７３８１１７；ＷＯ９６３７６０９；およびＷＯ９３０３１６２。
【０３２４】
別の制御手段は、テトラサイクリン制御可能な正のトランスアクチベーターを使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された、変異されたｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（変異されたｔｅｔ  Ｒ（４アミノ酸が変化しており、これは、逆のテトラサイクリン制御されたトランスアクチベータータンパク質を生じる。すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する））を含む。そのような系は、以下に記載されている：米国特許第５，４６４，７５８号；同第５，６５０，２９８号および同第５，６５４，１６８号。
【０３２５】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、以下に記載されている：米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）。
【０３２６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様分子遺伝子治療または細胞治療は、第二のポリペプチドの送達をさらに含み得ることもまた意図される。例えば、宿主細胞は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの両方および以下のうちの少なくとも一つの発現および放出をするように改変され得る：ＩＬ−１ｒａ、ｓＴＮＦｒ  Ｉ型、ｓＴＮＦｒ  ＩＩ型、およびそれらの誘導体；セリン白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）、オステオプロトゲリン（ＯＰＧ）；および抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１抗体、ならびにそれらの誘導体。あるいは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドおよび上述のポリペプチドの１つ以上は、別個の細胞中で発現され得、そしてそれらから放出され得る。そのような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはその細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上述のカプセル化膜）中に含まれ得るか、またはその細胞はウイルスベクターによって別個に改変され得る。
【０３２７】
遺伝子治療技術の一つの例は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用することである。この遺伝子は、構成的または誘導性のプロモーターと作動可能に連結されて、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成し得る。このプロモーターは、構築物が挿入される細胞または組織の型においてそれが活性である限り、内因性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子に対して同種であってもよく、異種であってもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、以下を含み得る：部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内因性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞に対して選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化について）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによって発現を増強する転写因子、ならびにベクター製造を可能にする因子。
【０３２８】
次いで、この遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための一つの手段は、本明細書において記載されるウイルスベクターによる。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、細胞の染色体ＤＮＡに対して遺伝子治療ＤＮＡ構築物を送達し、そしてその遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、染色体ＤＮＡ中に組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残存する。
【０３２９】
遺伝子治療を介した、細胞における内因性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド発現を増強するための別の手段は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドプロモーター中に１つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することである。ここで、このエンハンサーエレメントは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子の転写活性を増強するように働き得る。使用されるこのエンハンサーエレメントは、その遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される。その組織中でのプロモーター活性化を付与することが知られるエンハンサーエレメントが選択される。例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「スイッチオン」されるべき場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、加えられるべき転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を用いてＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡフラグメント中に挿入され得る（そして、必要に応じて、ベクターならびに／または５’および／もしくは３’隣接配列などの中に挿入される）。次いで、「相同組換え構築物」として知られるこの構築物は、エキソビボまたはインビボでのいずれかで所望の細胞中に導入され得る。
【０３３０】
遺伝子治療は、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド発現を減少させるために使用され得る。そのような改変は、代表的に、相同組換え法を介して行われる。例えば、不活化することについて選択されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子のプロモーターのすべてまたは一部を含むＤＮＡ分子は、操作されて、転写を調節するプロモーターの片を除去および／または置き換えることができる。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写アクチベーターの結合部位は、標準的な分子生物学的技術を用いて欠失され得る。そのような欠失は、プロモーター活性を阻害し、それにより対応するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子の転写を抑制することができる。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドプロモーター（制御されるべきＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子と同じまたは関連する種からの）のすべてまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって達成され得る。ここでは、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位のヌクレオチドの１つ以上が、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入によって変異されている。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、活性が減少しているか、または完全に不活化されている。この構築物はまた、代表的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブの（内因性の）５’および３’のＤＮＡ配列に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含み、この構築物は、直接または本明細書に記載されるウイルスベクターを介してのいずれかで、適切な細胞中に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。代表的に、その構築物のその細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みは、相同組み換えを介する。ここで、プロモーター構築物における５’および３’のＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを介して改変されたプロモーター領域への組み込みを補助するように働き得る。
【０３３１】
他の遺伝子治療方法はまた、１つ以上のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に使用され得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの分子であって、選択されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を含むものは、その細胞内に導入され得る。代表的に、各々のそのようなアンチセンス分子は、各々の選択されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子の開始部位（５’末端）に対して相補的である。次いで、アンチセンス分子が対応するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、妨害されまたは減少する。当業者はまた、アンチセンスおよびリボザイム分子はまた、直接投与され得ることを理解する。
【０３３２】
あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを作製することができる。この状況において、各々の選択されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの変異体全長または切断型ポリペプチドをコードするＤＮＡは、本明細書において記載されるように、調製され得そしてウイルス性または非ウイルス性のいずれかの方法を用いて患者の細胞中に導入され得る。各々のそのような変異体は、代表的に、その生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０３３３】
（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸およびポリペプチドのさらなる使用）
本発明の核酸分子は、染色体上のＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子および関連遺伝子の位置をマッピングするために使用され得る。マッピングは、当該分野において公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）によって行われ得る。
【０３３４】
核酸分子はまた、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド発現のアンチセンスインヒビターとして使用される。そのような阻害は、発現制御配列（三重螺旋形成）またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ｍＲＮＡに対して相補的でありそしてハイブリダイズする核酸分子によってもたらされ得る。アンチセンスプローブは、本明細書において開示されたＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子の配列を用いた利用可能な技術によって設計され得る。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物におけるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの減少または非存在に関連する情報を提供する。
【０３３５】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書において提供されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸配列を用いて調製されて、関連する配列についてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡのライブラリーをスクリーニングし得る。公知の配列に対して有意な同一性を示す、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのＤＮＡおよび／またはアミノ酸の配列の領域は、本明細書において記載されるような配列整列アルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてそれらの領域は、スクリーニングのためのプローブを設計するために使用され得る。
【０３３６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様核酸分子、ならびにそれら自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしないフラグメント、改変体および／または誘導体は、哺乳動物組織または体液のサンプルにおけるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するために診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０３３７】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドは、処置されるべき適応症について適切である場合、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤、および／または化学療法剤と組み合わせて（同時または連続的に）使用され得る。
【０３３８】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドのフラグメント、改変体、および／または誘導体はまた、生物学的に活性であるかどうかに拘わらず、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合する抗体を調製するために有用である。抗体は、インビボおよびインビトロの診断目的のために使用され得、それらには以下が挙げられるがそれらに限定されない：体液または細胞のサンプルにおけるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの存在を検出する標識された形態における使用。この抗体はまた、本明細書において記載される疾患および障害を予防または処置するために使用され得る。抗体は、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに結合され得、その結果、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに特有の少なくとも１つの活性を減少または遮断し得るか、またはポリペプチドに結合して活性を増加させ得る。
【０３３９】
以下の実施例は、本発明の性質をさらに代表化するよう働くが、本発明の範囲を制限するとみなされるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０３４０】
（実施例１：ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ｃＤＮＡのクローニング）
ヒトゲノムデータベースの相同性ベースのＢＬＡＳＴ検索は、公知のヒトＯＰＧポリペプチド配列に対する相同性を翻訳の際に提示する、５４３ヌクレオチドゲノムＤＮＡフラグメント（配列番号５）を同定した。この配列情報に基づいて、ヌクレオチドプライマー２３７４−５１（５’−ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  Ｃ−３’配列番号９）および２３７４−５２（５’−ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣ−３’；配列番号１０）を合成し、そしてこれらを用いて種々のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ＰＣＲビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、２５μｌの最終反応容量および各オリゴヌクレオチドの１０ｐｍｏｌを用いて、１１１ヌクレオチド（ｎｔ）の予想されたサイズのバンドが、胎児頭皮（ランダムおよびオリゴｄＴプライミングの両方）および胎児脾臓（ランダムおよびオリゴｄＴプライミングの両方）を含む多数のライブラリーにおいて同定された。サイクル条件は、９４℃で１分間（９４℃で３０秒間、６８℃で４５秒間）の３５回の反復、次いで７２℃で１０分間であった。
【０３４１】
これに基づいて、ｃＤＮＡの５’領域を単離するために、ＰＣＲを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、ｐＳＰＯＲＴ（ＬＴＩ）ベクタープライマー８７０−０２（５−ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧ−３’；配列番号１１）および１９１６−８３（５’−ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＧ−３’；配列番号１２）、ならびに遺伝子特異的プライマー２３７４−５３（５’−ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  Ｇ−３’；配列番号１３）を用いて胎児脾臓および胎児頭皮のｃＤＮＡライブラリーに対して行った。サイクル条件は以下のとおりであった：９４℃で１分間；９４℃で５秒間；７２℃で３分間（反復５回）；続いて９４℃で５秒間；７０℃で３分間；（反復５回）；続いて９４℃で５秒間；６８℃で３分間；反復２５回；７２℃で１０分間。ＰＣＲ産物は、これらのｃＤＮＡライブラリーから得られた。
【０３４２】
これらの反応において得られたＰＣＲ産物を、１：１００に希釈し、そしてネスティドベクタープライマー１０１９−０６（５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ−３’；配列番号１４）および１９１６−８２（５’−ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣ−３’；配列番号１５）、ならびにネスティド遺伝子特異的プライマー２３７４−５２（５’−ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣ−３’；配列番号１０）を用いてＰＣＲ増幅した。特異的なＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従って、ＴＡクローニングプロトコルを用いてｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にサブクローニングした。３’領域を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、以下のベクターを用いて胎児頭皮ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によって単離した：ベクタープライマー１３４０−３５（５’−ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧ−３’：配列番号１６）および遺伝子特異的プライマー２３７４−５１（５’−ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  Ｃ−３’；配列番号９）。サイクル条件は、９４℃で２分間、（９４℃で１５秒間、６６℃で１５秒間、および７２℃で３分間）を３５回の反復、７２℃で２分間、次いで、分析するまで４℃で維持した。この反応において得られたＰＣＲ産物を、１：１００に希釈し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ネスティドベクタープライマー１０１９−０５（５’−ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＡＧ−３’：配列番号１７）およびネスティド遺伝子特異的プライマー２３７４−７８（５’−ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＧ−３’：配列番号１８）。サイクル条件は上述のものと同じであった。最終のＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングプロトコルを用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にサブクローニングした。５’ＲＡＣＥクローンおよび３’領域の配列を、当業者に公知の標準的な方法を用いてＤＮＡ配列決定することによって決定した。配列をアセンブルし、そして４３０アミノ酸長のタンパク質をコードすることが見出された。
【０３４３】
このＴＮＦｒ／ＯＰＧ様遺伝子を単離するために利用されるｃＤＮＡライブラリーは、以下のとおり作製した。総ＲＮＡを、ヒト組織から、標準的なＲＮＡ抽出手順を用いて抽出し、そしてポリＡ＋  ＲＮＡを、この総ＲＮＡから、当業者に公知の標準的な手順を用いて選択した。ランダムプライムしたかまたはオリゴ（ｄＴ）プライムしたｃＤＮＡを、このポリＡ＋ＲＮＡから、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のマニュアルにおける手順を用いるかまたは当業者に公知の他の適切な手順を用いて合成した。得られたｃＤＮＡを、適切な制限酵素（ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ）で消化して粘着末端を作製して、クローニングベクターへの連結を補助した。次いで、この消化したｃＤＮＡを、適切な制限酵素を用いて予備消化した、ｐＳＰＯＲＴ−１クローニングベクター中または当業者に公知の別の適切なクローニングベクター中に連結した。この連結産物を、当該分野において標準的な技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、そして形質転換体をアンピシリンを含む細菌培地プレート上で選択した。ｃＤＮＡライブラリーは、これらの形質転換体のすべてまたはサブセットからなった。
【０３４４】
（実施例２：ＴＮＦｒ／ＯＰＧ組織発現の評価）
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析の方法は、次のようなものであった。
【０３４５】
（逆転写（ＲＴ）反応）
各ヒト胎児組織由来の２μｇの総ＲＮＡ（総ＲＮＡを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｔ．＃１５５９３−０３１のＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって精製した）。反応混合物は、２μｇの総ＲＮＡおよび１μｌ（１μｇ）のランダムプライマーを含んでいた。容量を、水で１２μｌに調整し、７０℃で１０分間加熱し、すぐに氷上で冷やした。次いで４μｌの５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＲＬ）、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（ＢＲＬ）、および１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ＢＲＬ）を加え、そしてこの溶液を十分混合し、そして３７℃にて２分間温めた。１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（ＢＲＬ）を加え、そしてこの溶液を、３７℃で１時間インキュベートした。
【０３４６】
次いで、反応チューブを氷上に置いて反応を終了させた。このようにして産生されたｃＤＮＡを、ＰＣＲ分析においてテンプレートとして用いた。
【０３４７】
（相対的な発現レベルの評価）
ＲＮＡ濃度およびｃＤＮＡ転換効率における相違を規格化するために、コントロールＰＣＲを、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）（この遺伝子は、全ての組織でほぼ同レベルで発現されると考えられている）に対するプライマーを用いて各ｃＤＮＡに対して行った。この反応産物を、４％アガロースゲルで分析し、そしてコントロールバンドの相対的な強度を評価した。次いでｃＤＮＡサンプルを、コントロールバンドの強度に基いて希釈し、すべてのサンプルを、等しい強度のＧ３ＰＤＨコントロールバンドを生成するような濃度に調整した。ＯＰＧ様転写物についての発現分析を、これらの濃度規格化サンプルを用いて行った。
【０３４８】
（Ｇ３ＰＤＨコントロールＰＣＲ）
テンプレート：１μｌのｃＤＮＡ（濃度調整前）
プライマー：
５’プライマー：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧ−３’（配列番号１９）
３’プライマー：５’−ＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＴ−３’（配列番号２０）
緩衝液／酵素：Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｔ．＃２７−９５５３０）
サイクルプロトコル：
９５℃  ６０秒；
９２℃  ３０秒、５５℃  ４５秒、７２℃  ６０秒、２５サイクル；
７２℃  ５分。
【０３４９】
（ＯＰＧ様転写物の相対的な発現レベル）
テンプレート：１μｌのｃＤＮＡ（上記のように濃度調節した）
プライマー：
（２３７４−５１）  ５’−ＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号９）
（２３７４−５３）  ５’−ＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１３）
緩衝液／酵素：Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｔ．＃２７−９５５３０）
サイクルプロトコル：
９５℃  ３０秒；
９４℃  ５秒、７２℃  ４分、５サイクル；
９４℃  ５秒、７０℃  ４分、５サイクル；
９４℃  ５秒、６８℃  ２分、２５サイクル；
７２℃  ３分。
【０３５０】
生成物は、４％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により泳動した。次いで、ベースラインとして最も薄いバンド（１×）を用い、増幅されたＯＰＧ様転写物に対応するバンドの相対的な強度を評価した。評価された各バンドの相対的な強度は以下に示される。最も高い強度は、胎児組織、胎児子宮、および胎児皮膚で見出される。
【０３５１】
【表３】
2004500063.tif 000003
（実施例３：ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの産生）
（Ａ．細菌における発現）
ＰＣＲを用いて、ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような代表的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向性クローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供してインサート（挿入物）の存在を確認する。
【０３５２】
形質転換した宿主細胞を、誘導前に、３０ｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で３０℃でインキュベートする。Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの最終濃度の３０ｎｇ／ｍＬまでの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの発現を、細菌ペレットの培養物の遠心分離、再懸濁および溶解、ならびに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０３５３】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレットにし、そして水に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中でホモジナイズし、次いで希釈して２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３５４】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５（１９８７）に記載のように決定する。
【０３５５】
（Ｂ．哺乳動物細胞における産生）
ＰＣＲを用いて、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。５’および３’末端に対応するプライマー配列は上述される。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス複製起点を含む代表的な発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス核抗原）細胞におけるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様の発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクチンによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００ｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖する。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を取り出し、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３５６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド発現は、銀染色によって検出し得る。あるいは、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを、タグペプチドに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によって検出可能である、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）を有する融合タンパク質として生成する。
【０３５７】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得る、またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書に記載のようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０３５８】
（実施例４：抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド抗体の生成）
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成または化学的合成によって生成した、精製タンパク質またはＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ペプチドを用いて免疫することによって獲得し得る。抗体を生成するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第二版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ（１９８０））に記載の手順を含む。
【０３５９】
抗体生成のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様抗原（例えば、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチド）を注射し、そして、ハイブリドーマ産生のため、ＥＬＩＳＡによって決定した十分な血清力価レベルを有する動物を、選択する。免疫した動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁液として調製し、これから脾臓細胞を回収する。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞；ＡＴＣＣ  ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）に融合し、ＤＭＥＭ（２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００ｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミン含有）中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン；アミノプテリン；チミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清をハイブリドーマを含む各ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様抗体産生について試験する。
【０３６０】
抗ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様を得るための別の手順もまた、使用し得る。この手順は例えば、ヒト抗体の生成のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリーなど）のスクリーニングである。
【０３６１】
（実施例５：哺乳動物細胞におけるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様タンパク質の産生）
哺乳動物細胞において可溶性ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様タンパク質を産生するために、ヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様ポリペプチドの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１６２）をコードするｃＤＮＡを、以下のオリゴプライマー対のセットを用いてＰＣＲ増幅した。
５’−ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＡＣＡ−３’（配列番号２１）
５’−ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＣＧＧ−３’（配列番号２２）
ＰＣＲ反応を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０μＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１０μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマー、および１０ｎｇのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様  ｃＤＮＡテンプレート中に１ユニットのベントＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む５０μｌの容量で実行した。ＰＣＲ反応を、９８℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分を合計５サイクル、９８℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で１分を合計２５サイクルで行った。得られたＰＣＲフラグメントを、１％アガロースゲルを通す電気泳動で単離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ手順（Ｂｉｏ  １０１、Ｉｎｃ．）により精製した。ＰＣＲフラグメントは、５’末端にＣｌａＩ制限部位、そして３’末端にＢｓｔＥＩＩ制限部位を作製している。次いで、ＣｌａＩ＋ＢｓｔＥＩＩで消化されたＰＣＲフラグメントを、改変されたｐＣＭＶｉ−ＦｃベクターのヒトＩｇＧ−γ１重鎖配列（Ｖａｓｓｅｒら（Ｓｃｉｅｃｅ  ２８６、７３５〜７４１頁、１９９９）により以前に記載された）の前に、インフレームにサブクローンした。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様細胞外ドメインとＩｇＧ  Ｆｃ領域との間の接点を橋渡しする、２つの無関係なアミノ酸（Ｖａｌ−Ｔｈｒ）をコードするリンカーを導入した。
【０３６２】
この構築物を、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１、９．１．１−９．１．３、１９９４）により記載されるようなリン酸カルシウム法により、２９３−Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後に、この細胞をＰＢＳで一度洗浄し、次いで無血清培地で７２時間培養した。この馴化培地を回収した。培地に分泌されるＴＮＦｒ／ＯＰＧ様−Ｆｃ融合タンパク質を、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ  ｎｏ．３０９−０３５−００８）を用いたウェスタンブロット分析により検出し（図９）、そしてそれぞれ５６．６ｋＤ、４４．３ｋＤ、および４０．６ｋＤの分子量を有する３つの顕著なバンドが観察された。
【０３６３】
Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡカラムクロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、製造者の推奨する手順にしたがって精製した。次いで、５０ｐｍｏｌの精製されたタンパク質を、本質的にはＭａｔｓｕｄａｉｒａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、１０−３５、１９８７）に記載されるような自動エドマン分解により、Ｎ末端配列分析に供した。
【０３６４】
１０サイクルのアミノ酸配列決定の後、５６．６ｋＤバンドは、配列が、ＮＨ２−ＳＴ（Ｔ）ＬＷＱＣＰＰＧＥＥ−ＣＯ２Ｈ（１．４ｐｍｏｌ）（配列番号２３）であった。３回目のサイクルで、Ｔｈｒは、タンパク質の一次構造から予想されるように検出されず、Ｏ結合型糖の可能性を示した。結果は、このタンパク質が、Ｔｈｒ２５で切断されていることを示す。４４．３ｋＤのバンド（１４．６ｐｍｏｌ）および４０．６ｋＤのバンド（２４．７ｐｍｏｌ）は、両方とも配列が、ＮＨ２−ＧＶＥＶＡＡＧＡＳＳＧＧＥＴ−ＣＯ２Ｈ（配列番号２４）であった；このタンパク質は、Ａｒｇ１３０で切断されていることを示す。これらの２つのバンド間のサイズにおける差異は、おそらくＡｒｇ１４９の異なったＮ結合型グリコシル化に起因している。４０．６ｋＤバンドおよび４４．３ｋＤのバンドは、回収された物質の約９７％を示す。Ａｒｇ１３０における切断部位のより詳しい調査により、Ａｒｇ１２６（ＲＲＡＲＲ−ＧＶＥＶ．．．）（配列番号２５）で始まるコンセンサスフリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位が明らかになる。
【０３６５】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター細胞外ドメインの切断におけるフリンの役割を検索するために、２９３−Ｔ細胞を、Ｐｏｒｔｌａｎｄ変異（α１−ＰＤＸ）を含む強力なフリンインヒビターα１−アンチトリプシンの同時トランスフェクションを用いてかまたは用いずに、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃで、一過的にトランスフェクトした（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２４８８７−９１．１９９３）。手短にいうと、７×１０６  ２９３−Ｔ細胞を、上記のトランスフェクションのＣａＯＰＯ４方法を使用して、２０μｇのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃ単独または１５μｇのＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃおよび５μｇのα１−ＰＤＸで一過的にトランスフェクトした。馴化培地を回収し、そして、上記のようにウエスタンブロット分析に供した。α１−ＰＤＸとの同時トランスフェクションは、フリン切断を完全に排除し、図９（左のパネル）に示されるようにＳｅｒ２６で始まる１００％の回収された物質を得た。
【０３６６】
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターの可溶性細胞外ドメインの遊離におけるフリン切断の役割をさらに確かめるために、ＯＰＧ由来のシグナルペプチドおよびインフレームのＮＨ２末端ＦＬＡＧエピトープタグを含むＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターの変形型を設計した（ＳＯ．ＦＬＡＧ−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター）。ＳＯ．ＦＬＡＧ−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター構築物は、ＯＰＧシグナルペプチド（アミノ酸１−２１）−リンカー（ＫＬＨ）−ＦＬＡＧエピトープ（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２６）−リンカー（ＫＬ）−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター（アミノ酸２６−４３０）を含むタンパク質をコードする。再び、７×１０６２９３−Ｔ細胞をＳＯ．ＦＬＡＧ−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター単独でトランスフェクトするかまたはα１−ＰＤＸと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を７２時間無血清培地でインキュベートした。馴化培地を回収し、そして、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を使用して、免疫沈降／ウエスタンブロッティングによって分析した。図９（左のパネル）に示されるようなＯＰＧ様レセプターの切断された可溶性細胞外ドメインに対応する、１７ＫＤａおよび１８ＫＤａの２つの別個のバンドを馴化培地で検出した。同様に、α１−ＰＤＸとの同時トランスフェクションは、馴化培地から回収されたＦＬＡＧ−ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様細胞外ドメインの量を劇的に減少する。
【０３６７】
（実施例６）
（ＷＥＨＩ−３細胞に対するＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃ結合の検出）
ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃと種々の細胞株との結合活性を以前に記載されるようにＦＡＣＳ分析によって試験した（Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｃｅｌｌ，７３，４４７−４５６，１９９３）。手短に言うと、ＷＥＨＩ−３細胞をブロッキング目的のために２％ウサギ血清および５％ヤギ血清を補充したＰＢＳ中で、４℃で３０分間インキュベートした。引き続き、細胞を１μｇ／ｍｌ  ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃ融合タンパク質またはヒトＩｇＧと共にインキュベートした。次いで、細胞を１：２００の希釈度で、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに特異的なビオチン化抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共に４℃で３０分間染色し、その後、１：５０の希釈度でストレプトアビジンフィコエリトリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｓｃａｎを使用するＦＡＣＳ分析に供した。ＴＡＪ．ＦＣおよびＥ１２７．ＦＣはコントロールとして使用された非特異的融合タンパク質であり、任意の特異的結合を生じなかった。この分析は、ＷＥＨＩ−３細胞、骨髄−単球細胞株がＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃ融合タンパク質に特異的に結合することを明らかにし、ＯＰＧ様レセプターについての推定リガンドの膜結合形態の存在を示した（図１０を参照のこと）。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様Ｆｃ融合タンパク質の結合は、Ｎ末端ＦＬＡＧ標識ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様細胞外ドメインを含む馴化培地とのプレインキュベーションによって部分的にブロックされた。
【０３６８】
（実施例７）
（ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターｍＲＮＡ組織発現のノーザンブロット分析）
ノーザンブロット分析を行って、ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプター転写物が発現される組織を同定した。ヒトＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターｃＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩを用いて３７℃で３時間消化することによって、ノーザンブロット分析における使用のためのプローブを作製し、０．８％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動して、フラグメントを分離した。およそ４３４塩基対のＥＣＯＲＶ−ＸｈｏＩフラグメント（ｃＤＮＡのヌクレオチド−１８０からヌクレオチド＋２５４まで伸長する）を単離して、そして、ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ゲル精製系（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用してゲル精製した。単離されたゲル精製フラグメントを１％アガロースゲル上の推定によって定量した。このフラグメントの約２５ｎｇを５分間煮沸することによって変性し、次いで、２分間氷上で急冷した。次いで、フラグメントを、製造業者のプロトコルに従って、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を使用して、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いて放射線標識した。ヒト複数組織のノーザンブロットを購入し（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、そして、約６５℃で約１時間、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭハイブリダイゼーション緩衝液中で、まずプレハイブリダイズした。プレハイブリダイゼーション後、標識されたプローブを約５分間煮沸することによって変性し、次いで氷上で２分間急冷し、そして、ノーザンブロットを含むハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。ブロットを、約６５℃で約２時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ブロットを室温で３０分間、２×ＳＳＣ中で洗浄し、その後、約６０℃で３０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中で３回連続して洗浄した。ブロットを短時間乾燥し、そして、６日間イメージアナライザースクリーンに露光した。結果を図１１に示す。ＴＮＦｒ／ＯＰＧ様レセプターｍＲＮＡは、主に、末梢血液白血球、脾臓、精巣および骨格筋において検出された。