【手続補正書】
【提出日】平成15年4月2日(2003.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
ブースター注入が規則的な間隔で行われ得、そして抗血清はその抗体力価（例えば、既知濃度の抗原に対するアガー中の二重免疫拡散分散法によって半−定量的に決定されるような）が低下し始めるときに回収される。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，Ｏ．ら：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ  Ｄ．  Ｗｉｅｒ（編）  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  （１９７３）中の１９章を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常０．１から０．２ｍｇ／ｍｌ血清（約１２μＭ）の範囲内である。抗原に対する抗血清の親和性は、競合結合曲線を作成することによって決定される（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｄ．，：Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ，２ｄ  Ｅｄ．（Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｅｄｓ．）Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）中の４２章によって記載される）。いずれかのプロトコールに従って調製される抗体調製物は、生物学的サンプル中の抗原保持物質（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用である；これらはまた半−定量的または定性的に（例えば、生物学的サンプル中の変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質の存在を同定する診断実施形態において）使用される。ＩＲＰ−２の野生型または変異型の酸化および還元型に対して特異的な抗体の調製の例が以下に提供される。下の章は、野生型または変異ＩＲＰ−２核酸およびタンパク質の特性を評価するいくつかのＩＲＰ−２キャラクタライゼーションアッセイを記載する。実施例１は、野生型または変異ＩＲＰ−２に特異的な抗体を作製およびスクリーニングするために使用される方法を記載し、そして実施例２は、野生型ＩＲＰ−２に特異的な抗体を作製およびスクリーニングするために使用される類似方法を記載する。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
１つのキャラクタライゼーションアッセイにおいて、例えば、変異支持体結合型ＩＲＰ−２ペプチドの酸化またはユビキチン化を受ける能力が、野生型支持体−結合型ＩＲＰ−２ペプチドの酸化またはユビキチン化を受ける能力と比較される。１つの方法によって、支持体結合型ＩＲＰ−２の酸化は、２０μｌ反応混合液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ７．２）および４０ｍＭ  ＫＣｌ）中で０．１μｇ／μｌタンパク質の濃度にて、５０μＭ ＦｅＣｌ3および１０ｍＭ  ＤＴＴの存在下において、３７℃で１５−３０分間行われる。いくつかの実施形態において、トリス−カルボキシエチル−ホスフィン（ＴＣＥＰ）を１ｍＭで使用し、ＤＴＴの代わりにジスルフィドを還元することが所望される。特に、還元型ＩＲＰ−２が所望される場合、好ましくはＴＣＥＰ（１ｍＭ）が、鉄を含有しない反応混合液中で１５−３０分間３７℃にて使用される。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
一旦酸化型および／または還元型ＩＲＰ−２支持体が作製されると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイが以下のように行われ得る。酸化型および／または還元型支持体−結合野生型および変異ＩＲＰ−２は、４００μｇ  ＲＤ４  Ｓ１００  溶解物、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＤＴＴ、６μｇ  ユビキチン、２５ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．６）および６０ｍＭ  ＫＣＩへ５分間添加される。反応は、１％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコラート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  ＳＤＳを含む氷冷緩衝液を添加することによって停止される。この支持体結合複合体はこの緩衝液で３回洗浄され；ビーズは洗浄の合間に１５００×ｇでスピンダウンされる。このビーズは、２×Ｌａｅｍｍｅｌｉ緩衝液中で１０分間煮沸され、さらに適切なＳＤＳ  ＰＡＧＥ（例えば、６％−１５％）上で分離される。この分離タンパク質はエレクトロブロッティングによって膜へ移され、そしてユビキチンの存在がアフィニティー精製されたポリクローナルまたはモノクローナル抗−ユビキチン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって実証され得る。このアッセイは、酸化および還元型の変異および野生型ＩＲＰ−２のユビキチンと相互作用する能力を実証する。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
さらに、細胞に基づくキャラクタライゼーションアッセイが行われ得る。例えば、変異および／または野生型ＩＲＰ−２タンパク質を発現させるために、ＣＯＳ細胞がトランスフェクションされ得る。（例えば、野生型ＩＲＰ−２を発現させるためにＣＯＳ細胞をトランスフェクションするためのプロトコールについては、その全体が本明細書中で参考として明白に援用されるＳａｍａｎｉｅｇｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６９：３０９０４（１９９４）を参照のこと。形質転換体を選択した後、陽性発現細胞のアリコートは、酸化的ストレス下に置かれる。１つの方法によって、酸化的ストレスは、培地中のクエン酸第二鉄アンモニウム（ｆｅｒｒｉｃ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）を４００μｇ／ｍｌまで上昇させることによってもたらされる。別の方法によって、酸化的ストレスへの暴露は、０．１ｍＭ  Ｈ2Ｏ2を含む血清−およびフェノールレッド−フリーな培地中において、３０分間成し遂げられる。この細胞は、即時に回収されるか、またはこの細胞を酸化的ストレスから回復させるためのＨ2Ｏ2または鉄−フリーな培地中で培養される。コントロール細胞は、Ｈ2Ｏ2または鉄が培地中に含まれていないこと以外、暴露細胞と正確に同じように処理される。Ｈ2Ｏ2または鉄への暴露後の細胞の生存率は、トリパンブルーおよび３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）―２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド染色の排除によってモニターされ得る。還元されたグルタチオンのレベルもまた測定され得る。さらに、細胞内のＡＴＰのレベルは、生物発光体細胞アッセイキット（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（Ｓｉｇｍａ）を製造元の指示書に従って用いることによってモニターされ得る。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
本発明の別の実施形態において、ＭＲＩ分析の完了時に、ＭＲＩ研究を完成させる免疫−組織化学および鉄化学における使用ならびに脳鉄代謝におけるＩＲＰ−２の役割の理解を可能にする組み合わせにおける使用を目的として、脳および血液組織の回収、保管、および処理のために、４匹のマウスが安楽死される。血液および脳組織はＣＯ2窒息後にマウスから取り除かれる。この血液はグループごとにプールされ、そして白血球を単離し且つ−７０℃で凍結保存される血清サンプルを得るために処理される。この脳は右および左半球に分けられ、重量が湿重量で記録され、そしてランダムに各動物由来の一方の半−脳がｐｌｐ（４％緩衝化ホルマリン溶液）中に置かれ、さらに他方の半分が凍結防止剤中に置かれ、そして凍結される。この凍結脳組織が切り分けられ、そして前部（レベル１）、中央（レベル２）、および後部（レベル３）からの各サード切片（ｅｖｅｒｙ  ｔｈｉｒｄ  ｓｅｃｔｉｏｎ）がポリ−ｌ−リジンコートスライド上に置かれる。大脳皮質、側脳室、脳梁および尾状被殻（ｃａｕｄａｔｅ  ｐｕｔａｍｅｎ）がレベル１切片に存在し、大脳皮質、視床、第三脳室および海馬がレベル２切片に存在し、そして小脳、髄質、第四脳室および錐体路がレベル３切片に存在する。３３個の５〜１０μｍ切片が各半−脳から作製される（以下のものを３通り：Ｈ＆Ｅのために１セット、アポトーシスのために１セット、第二鉄分布のためのプルシアンブルー染色のために１セット、および抗−ＩＲＰ−１、抗−ＩＲＰ−２、抗−フェリチン、抗−トランスフェリンレセプター、β−アミロイドユビキチンおよびヘモシデリンを使用する免疫細胞化学法のために７セット）。３つのさらなる３０μｍ切片（各脳レベルから１つ）は、重量（湿重量）測定され、元素鉄含有物を処理するために真空凍結バッグ中に置かれる。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
Ｈ＆Ｅおよびマウス組織のアポトーシス測定については、３つの脳レベルの各々に由来する１つの５−１０μｍ組織切片が、組織の形態学的評価のためにＨ＆Ｅで染色される。各脳組織切片の１セットはＧｒｅｅｎら（２００１）によって記載されるように改変されるアポダイレクトアッセイ（Ａｐｏｄｉｒｅｃｔ  ａｓｓａｙ）を使用して標識される。核酸の遊離３’末端への末端デオキシヌクレオチジル−トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介蛍光（ＦＩＴＣ）−複合化ＢｒｄＵの取り込みを用いて脳組織における後期アポトーシス事象を評価するために、ＤＮＡ損傷が使用される。簡単には、組織を−２０℃  ７０％エタノール中で１５分間固定化する。この固定組織をＰＢＳ中で５分間再水和し、そしてキットで提供されるＴｄＴ、反応緩衝液およびＦＩＴＣ−ＢｒｄＵの混合液と共にインキュベーションする。組織をＤＮＡ標識混合液と共に一晩中室温（２２−２４℃）にてインキュベーションし、洗浄し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮＡｓｅで３０分間対比染色し、洗浄し、退色防止剤（ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ）で処理し、さらにカバーガラスで覆う。ＦＩＴＣ−ＢｒｄＵ取り込みは、以下に記載されるように、レーザースキャニングサイトメーター（ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＬＳＣ）（ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して定量化される。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
マウスの凍結組織切片の免疫細胞化学的標識化については、組織はアポトーシスアッセイについて上述したように固定化される（Ｇｒｅｅｎら、１９９５；Ｇｒｅｅｎら、２００１）。この固定組織を一次抗体（抗−ＩＲＰ−１、抗−ＩＲＰ−２、抗−フェリチン、抗−トランスフェリン／トランスフェリンレセプター、β−アミロイドユビキチンおよびヘモシデリン）で染色する。一次抗体／抗血清とのインキュベーションは１６時間４℃であり、その後０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で洗浄する。蛍光分子と直接的に複合化しない抗体は、４時間の最小インキュベーション時間の間２５℃にて、ａｌｅｘａ−４８８、ａｌｅｘａ−５９４、Ｃｙ−２、Ｃｙ−５抗−マウスまたはウサギＩｇＧ抗体で二次標識される。この２次抗体インキュベーションの完了の直前に、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５μｇ／ｍｌ）が、二重標識および／または分析の最終点としての共焦点顕微鏡に依存して、１０分間添加される。ＰＢＳＴ中で洗浄することによって過剰な二次抗体および核対比染色剤を除去し、そしてその組織を退色防止剤（ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ）およびカバーガラスで保護し、そして定量的分析（下記のようなＬＳＣおよび共焦点顕微鏡）および撮影の前に暗所で平らに乾燥される。非−特異的蛍光は、コントロール切片を非−免疫血清および二次抗体、もしくは二次抗体単独と共にインキュベーションすることによって、測定される。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
ＬＳＣによって定量化される特定のタンパク質の局在については、共焦点顕微鏡法がマウス組織において行われる。多くのタンパク質は、それらの機能的性質と一致する個別の位置を有し、それゆえ共焦点顕微鏡によって、特定のタンパク質の細胞／亜細胞性局在によってよりよい理解が得られる（Ａｌｔｕｒａら、２００１）。蛍光標識組織切片は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０  ベース、ＢｉｏＲａｄ−１０２４共焦点顕微鏡を使用して３次元に画像化される。切片は、一般的な分布については低倍率（４−２０ｘ）（０．５μｍ  ｚ−ステップ）、また上記に列挙されるタンパク質の細胞／亜細胞位置を得るためには高倍率（４０−１００ｘ）で捕らえられる。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
組換えペプチドを単離すると直ぐに、それらを酸化または還元した。ＩＲＰ−２の酸化は、０．１μｇ／μｌタンパク質の濃度で、２０μｌ反応混合液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ７．２）および４０ｍＭ  ＫＣｌ）中において、５０μＭ ＦｅＣｌ3および１０ｍＭ  ＤＴＴの存在下において、３７℃にて１５−３０分間、行った。ペプチドの還元型は、そのペプチドをトリス−カルボキシエチル−ホスフィン（ＴＣＥＰ）（１ｍＭ）中において１５〜３０分間３７℃にてインキュベーションすることによって得られた。一旦酸化および還元型ペプチドを得ると、それらをＫＬＨと結合させ、そしてマウスにおいて抗体を作製するために使用した。慣用的な方法を使用してハイブリドーマを作製し、そしてマウスを接種するために使用する特定のペプチドに特異的な抗体の産生のために、クローンをスクリーニングした。野生型ペプチドに対して作製された抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットの両方において配列番号２のペプチドおよび全長ＩＲＰ−２の両方を認識することが見出された。１：５０００希釈で十分であることが見出された。この抗体のいくつかをスクリーニングするために、別の選択方法を使用した。ＩＲＰ−２の酸化はシステイン残基のアミノマロン酸への変換に依存し得るので、アミノマロン酸を有するＩＲＰ−２ペプチドを合成した。このクローンをアミノマロン酸ペプチド、さらにまたネイティブなＩＲＰ−２ペプチドへの反応性についてスクリーニングした。ネイティブなペプチドではなくアミノマロン酸ペプチドに対して反応性であるクローンを選択した。この実施例において記載される教示を使用することによって、変異および野生型ＩＲＰ−２タンパク質の両方に対する抗体を作製し得る。これらの抗体を本明細書中に記載する診断アッセイにおいて使用し、被験体の神経変性疾患に対する傾向を同定し得る。次の実施例は、野生型ＩＲＰ−２に対して特異的な抗体を作製するために使用される類似方法を記載する。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
次いで、４Ｇ１１と他の５つのクローンとの間で競合結合アッセイを行って、それらが同じまたは異なるエピトープを認識するか否かを決定した。唯一（１４Ｆ７）だけ４Ｇ１１の結合を有意に阻害せず、異なる部位で結合すると仮定された。このように、１４Ｆ７および４Ｇ１１−ＨＲＰは捕捉ＥＬＩＳＡ法（以下に記載する）のための基準となり、また、生物学的サンプルにおけるＩＲＰ−２の検出のために使用され得る。このアッセイは、１μｇ／ｍＬに低下するまで感度が良く、優れた直線性を示す。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
捕捉アッセイを以下のように行った。未標識抗体をカルボネート緩衝液（ｐＨ９．６）（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ−３０４１）中で通常１−１０μｇ／ｍＬに希釈した。個々の抗体濃度は、１０μｇ／ｍＬから始めて下方へ進めながら、経験的に決定される必要があるかも知れない。重要なことは、過密によって抗原結合を妨げないこと、そして依然として強いシグナルを与えるであろう最も低い濃度を選択することである。次いで、この抗体を１ウェル当たり約１００μＬでＩｍｍｕｌｏｎ−１プレート（Ｄｙｎｅｘ  ＃３３５５）中にプレートし、テープ（Ｆａｌｃｏｎ  ＃３０７３）で覆い、そして４℃にて一晩中インキュベートした。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
続いて、このプレートを室温まで加温し、そしてこのウェルをＰＢＳ（ｗ／ｏ  ｔｗｅｅｎ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、＃２０−０３１−ＣＶ、１×に希釈される１０×濃縮液）で３×洗浄した。次いで、このプレートを各ウェルに２００μＬを添加し、逆さにすることによって空にし、そしてこのプロセスを合計３回繰り返すことにより、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  （Ｐｉｅｒｃｅ  ＃３７５１５）でブロックした。次いで、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ−６５８５）で３回洗浄した。希釈液（コントロール）、抗原、および標準（約１００μｌ）をウェルに添加した。使用した希釈液はキャリア（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）であった。ウェルをテーピングし、そして１時間室温にて反応を起こさせた。（プレートを振とうさせることによって、アッセイにおける感度が大きく増大するであろう）。続いて、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
次に、キャリア中で希釈された約１００μＬのＨＲＰ−タグ化検出抗体を添加した。（市販の製品を使用する場合、製造元の推奨に従い、また自ら作製した抗体の適切な希釈は、経験的に決定した。）ウェルをテーピングし、そして１時間室温にて反応を起こさせた。（プレートを振とうさせることによって、アッセイにおける感度が大きく増大するであろう）。続いて、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３×洗浄した。次いで約１００μＬ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＃１７２  １０６７）をウェルに添加した。約３０分間覆わずに、反応を起こさせ、そして６３０ｎｍ（参照４９０ｎｍ）での吸光度にて読み取りを行った。アッセイのパラメーターは、約２．０のＯＤがこのアッセイにおける最も濃縮された抗原サンプルについての約３０分間のインキュベーションにおいて得られるというものであった。捕捉抗体、抗原、および検出抗体の適切な希釈度を捜す際、「チェッカーボード」アッセイを行うことが役に立つであろう。以下の実施例は、抗ＩＲＰ−２抗体をビーズに結合するために使用した方法を記載する。