【手続補正書】
【提出日】平成16年11月2日(2004.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＩＧＦ−１を含む活性物質を投与するための新規製剤（微小球および錠剤）の調製および製造、ならびに、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病または小脳性運動失調症の治療および予防におけるそれらの使用に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
簡単な説明
本発明はＩＧＦ−Ｉの緩やかな投与のための新規治療用製剤、これらの製剤の調製および製造手順、および、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病または小脳性運動失調症の治療および予防のための医療品の製造におけるそれらの使用に関する。これらの製剤は、数ある特徴のなかで特に、直径５μｍ未満の微小球、および皮下移植用の錠剤に対応する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
これらの小さな微小球の他に、非常に長期にわたる効果を有する調製物を得るために、皮下移植用の錠剤が開発されており（実施例１ｃを参照のこと）、これらは本明細書では本発明の錠剤と呼ばれ、これらについては、他の著者による前の研究から、引用文献またはデータは見出されていない。このように、本発明の他の目的は長期ＩＧＦ−Ｉ放出用のこの錠剤である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
実施例１ｃ．ＩＧＦ−Ｉ移植錠剤の生産
１バッチ１０錠剤を調製するために、１５ｍｇのＩＧＦ−Ｉ（グロプレプ、オーストラリア）を計り分け、その後、０．０１ｍＭ酢酸１．５ｍｌに溶解する。シクロスポリン３０ｍｇをこの溶液に添加し、懸濁液のままとする。この混合物を４５５ｍｇの乳酸およびグリコール酸のコポリマー（レソマー５０３Ｈ、べーリンガーインゲルハイム）に添加し穏やかに混練し、その後、生成物を２−ｍｍメッシュのふるいにかける。室温で３時間乾燥させ、再び２−ｍｍメッシュのふるいにかける。室温でさらに１５時間乾燥させ、直径６ｍｍの凹状パンチで圧縮し、錠剤質量５０ｍｇに調整する。これにより、直径６ｍｍ、厚さ３ｍｍ、質量５０ｍｇの、１錠剤あたり１．５ｍｇのＩＧＦ−Ｉを有する両凸錠剤が得られる。これらの錠剤をｐｃｄマウスの皮膚の下に、麻酔せずに、小さく切開することにより移植する。生物分解性材料のため、除去する必要はない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
実施例２．ＩＧＦ−Ｉ微小球および移植用錠剤を用いた、遺伝性小脳変性法（プルキンエ細胞変性症）マウスの処置
１月齢で疾患の症状を示した（早死に至る協調運動不能）、遺伝性小脳性運動失調症の２月齢マウス（ｐｃｄ、または「プルキンエ細胞変性」マウス、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）研究所）に、最初の２回は５０μｇ／ｋｇおよび７５μｇ／ｋｇ、その後は２週毎に１回、１００μｇ／ｋｇの用量で、皮下注射によりＩＧＦ−Ｉ微小球を投与した（図２Ａ）。症状が処置により軽減したかどうかを決定するために、ロタロッド（ｒｏｔａ−ｒｏｄ）試験により週に１度、運動能力を評価した（Ａ．Ｍ．フェルナンデス、Ａ．ゴンザレスデラヴェーガ、Ｉ．トレス−アレマン、インスリン様成長因子は小脳性運動失調症のラットモデルにおいて運動協調性を回復させる、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９５：１２５３−１２５８［１９９８］）。各回、６匹のマウスからなる２つの別個のバッチにおいて実験を実施した。結果的に、健康なマウスにおける所見と比較し、マウスは、微小球（図２Ａ、▲を伴う線）または錠剤（図２Ａ、■を伴う線）のいずれかによる処置（１００日）が続く間、正常な程度の運動協調性を示した（処置マウスはほとんど３００秒の最大運動協調性を有し、これは健康マウスにおける所見と類似した［データは示さず］）が、対照群では運動失調症の症状は消えなかった（２００〜２４０秒の最大運動協調性値）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
１回分のＩＧＦ−Ｉを投与している間は、微小球によるか、または錠剤によるかに関係なく、ＩＧＦ−Ｉレベルの減少は運動協調性の損失と相関したことに注意すべきである。新たにＩＧＦ−Ｉを投与すると（微小球の第２回目［１４日］および第３回目［２８日］後、ならびに第２の錠剤移植後［７０日］）、疾患の症状は再び軽減した。微小球による処置の効能は投与した用量に依存し（図２Ａ）、５０μｇ／ｋｇおよび７５μｇ／ｋｇの最初の用量とは対照的に、１００μｇ／ｋｇの用量では運動協調性の損失は観察されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
実施例４．ＩＧＦ−Ｉ微小球による、老齢ラットにおけるアルツハイマー病の予防（脳アミロイドーシスの予防）
標準の光および食物条件下で飼育した、１８月齢の老齢Ｗｉｓｔａｒラットにおいて、ＩＧＦ−Ｉ微小球を１ヶ月投与し、脳実質（前頭葉）内のグリオーシス病変の出現をＧＦＡＰ免疫染色により決定した（リー（Ｌｅｅ）、ＣＫ．ウェインドルッチ（Ｗｅｉｎｄｒｕｃｈ）、Ｒ，プローラ（Ｐｒｏｌｌａ）、ＴＡ．、マウスにおける老齢脳の遺伝子発現プロファイル（Ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ａｇｅｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２５、２９４−２９７［２０００］）（図２Ｂ）。脳ＧＦＡＰ蛋白質レベル（図２Ｃ）および脳（皮質）および脳脊髄液（ＣＳＦ）内のβ−アミロイドレベル（バウシャー（Ｖａｕｃｈｅｒ）、Ｅ．ら、老齢の認識機能障害ラットおよび認識機能障害のないラットにおけるアミロイドβペプチドレベルおよび海馬アセチルコリン放出に対するその影響（Ａｍｙｌｏｉｄ  β  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｇｅｄ、ｃｏｎｇｎｉｔｉｖｅｌｙ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒａｔｓ）、Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔ  ２１、３２３−３２９［２００１］）（図２Ｄ）は、ウエスタン−ブロットにより決定した。脳内の高レベルのＧＦＡＰ蛋白質またはβ−アミロイドペプチドおよび／または脳脊髄液中の低レベルのβ−アミロイドペプチドは、アルツハイマー神経変性に関連するアミロイドーシスの症状である。これらのパラメータは全て、ＩＧＦ−Ｉ処置老齢ラットと成人ラット間で類似しており、後者２つの場合、レベルは未処置老齢ラットにおいて観察されたレベルより低かった（図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ）。ＣＳＦ中のβ−アミロイドレベルは、ＩＧＦ−Ｉ処置老齢ラットでは、β−アミロイドクリアランスにより上昇したことに注意すべきである（図２Ｄ、下のパネル）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
血液中のＩＧＦ−Ｉ分析の実験設計．各成人ラットから複数の血液サンプルをとり、ｒｈＩＧＦ−Ｉの皮下投与（ｓ．ｃ．）前後に血清中のＩＧＦ−Ｉレベルを決定した。ラットの体重により、微小球用量（５μｇ／ｋｇ）は、即時ボーラス注入のための滅菌生理食塩水に溶解した懸濁液として調製した。他の群のラットは、１．８ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＧＦ−Ｉの溶液の従来の皮下ボーラス注入を受けた。全ての場合において、血液サンプルは注入後、異なる時間に鎖骨下部から採取した。かなり高い用量を使用すると注入後に血清中で検出された。マウスにおいては血液サンプルの複数の抽出物を作成することは困難であるので、サンプルは異なるマウスから異なる時間に入手した。ｐｃｄマウスは飼育が困難なので、ＩＧＦ−Ｉ微小球の治療効果を評価するためだけに使用した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【図１Ａ】ＩＧＦ−Ｉの１回の皮下注射後の血液中のＩＧＦ−Ｉレベルを示したものであり、高いレベルが一時されるのは２４時間未満であることを示す図である。
【図１Ｂ】ＩＧＦ−Ｉ微小球の皮下注射（ｓ．ｃ．）では、ＩＧＦ−Ｉレベルは少なくとも２週間高いままであることを示す図である。
【図２】Ａ）ＩＧＦ−Ｉ微小球（σ）、ＩＧＦ−Ｉ錠剤（ν）で処置した遺伝性小脳性運動失調症マウス、および未処理対照群（空の微小球）（●）での、神経変性疾患におけるＩＧＦ−Ｉデポー剤による治療の予防効果を示した図であり、運動協調性の程度は、フェルナンデスら（１９９８）が記述しているロタロッド試験により評価し、Ｂ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスをＧＦＡＰ蛋白質の免疫染色により評価したものを示す図であり、Ｃ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスを脳（皮質）中のＧＦＡＰ蛋白質レベルの決定により評価したものを示す図であり、Ｄ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスを脳（皮質）および脳脊髄液（ＣＳＦ）中のβ−アミロイドレベルを決定することにより評価したものを示す図である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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