【手続補正書】
【提出日】平成17年4月22日(2005.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
MMPがラットMMP-13である、請求項1記載の調製物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３０】
VHCDR3領域が、配列番号：227〜269からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項29記載の精製ポリヌクレオチド。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５４】
発現ベクターが、配列番号：183〜357からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項53記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
実施例1
ヒト複合抗体ライブラリ（HuCAL（登録商標）Fab 1）の構築
HuCAL（登録商標）Fab 1のクローニング。HuCAL（登録商標）Fab 1は、Fab抗体断片フォーマットでの完全な合成モジュール性ヒト抗体ライブラリである。HuCAL（登録商標）Fab 1は、一本鎖フォーマットでの抗体ライブラリから開始して構築した（HuCAL（登録商標）-scFv；Knappikら、J. Mol. Biol. 296：55、2000）。HuCAL（登録商標）Fab 1を、ファージミド発現ベクターpMORPH（登録商標）18 Fab 1（図3）にクローニングした。このベクターは、C-末端で、糸状ファージの切断された遺伝子III蛋白質に融合したphoAシグナル配列を有するFd断片を含み、さらに、ompAシグナル配列を有する軽鎖VL-CLを含む。双方の鎖は、lacオペロンの制御下である。定常ドメインCλ、Cκ、およびCHは、HuCAL（登録商標）のモジュール系と完全に適合性の合成遺伝子である（Knappikら、2000）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
第一に、VλおよびVκライブラリをHuCAL（登録商標）-scFvから単離した。プライマー
2004529647.tif 000001
および
2004529647.tif 000002
を用いて、Vλl断片をPCRサイクル（Pwoポリメラーゼ）15回によって増幅した。PCR産物はEcoRV/DraIIIによって消化してゲル精製した。VLκ鎖は、EcoRV/BsiWIによる制限消化物から得て、ゲル精製した。これらのVλおよびVκライブラリをそれぞれ、EcoRV/DraIIIおよびEcoRV/BsiWIによって切断したpMORPH（登録商標）18 Fab1にクローニングした。ライゲーションして大腸菌TG-1において形質転換した後、ライブラリサイズ4.14×108および1.6×108個を得たが、これはいずれもHuCAL（登録商標）-scFvのVλ多様性を超えた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
同様に、VHライブラリは、StyI/MunIを用いて制限消化によってHuCAL（登録商標）-scFvから単離した。このVHライブラリを、StyI/MunIによって切断したpMORPH（登録商標）18-VλおよびVκライブラリにクローニングした。ライゲーションして大腸菌TG-1において形質転換した後、全体的なライブラリサイズ2.09×1010個を得て、67％が正確なクローンであった（クローン207個のシークエンシングによって同定）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
軽鎖のクローニング。pcDNA3.1/Zeo+（インビトロジェン社）の多重クローニング部位を二つの異なるスタッファーに置換した。κスタッファーは、κ-リーダー（NheI/EcoRV）、HuCAL（登録商標）-scFV Vκドメイン（EcoRV/BsiWI）およびκ-鎖定常領域（BsiWI/ApaI）を挿入するための制限部位を提供した。λスタッファーにおける対応する制限部位は、NheI/EcoRV（λ-リーダー）、EcoRV/HpaI（Vλ-ドメイン）、およびHpaI/ApaI（λ鎖定常領域）であった。κ-リーダー（EMBL Z00022）と共にλ-リーダー（EMBL L27692）はいずれもコザック配列を有した。ヒトκ-（EMBL J00241）およびλ-鎖（EMBL M18645）の定常領域は、上記のように、オーバーラップ伸長-PCRによって構築した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
実施例8
CDR3ライブラリのデザイン
Vλの1位と2位。その真正のN-末端を有する当初のHuCAL（登録商標）マスター遺伝子を構築した：Vλ11：QS（CAGAGC）、Vλ12：QS（CAGAGC）、およびVλ13：SY（AGCTAT）。これらのアミノ酸を含む配列は国際公開公報第97/08320号に示される。HuCAL（登録商標）ライブラリ構築の際、ライブラリのクローニング（EcoRI部位）を容易にするために、最初の2つのアミノ酸をDIに置換する。HuCAL（登録商標）ライブラリは全て、その5'末端にEcoRV部位GATATC（DI）を有するVλ1遺伝子を含む。HuCAL（登録商標）カッパ遺伝子（マスター遺伝子およびライブラリにおける全ての遺伝子）は全てその5'末端にDIを含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
Vκ1/Vκ3の85位。CDR3ライブラリを導入するために用いられるカセット変異誘発技法のために（Knappikら、J. Mol. Biol. 296、57〜86、2000）、Vκ1およびVκ3の85位はTまたはVのいずれかとなりうる。このように、HuCAL（登録商標）scFv 1ライブラリ構築の際に、Vκ1およびVκ3の85位は以下のように変化した：Vκ1オリジナル、85T（コドンACC）；Vκ1ライブラリ、85Tまたは85V（TRIMコドンACTまたはGTT）；Vκ3オリジナル、85V（コドンGTG）；Vκ3ライブラリ、85Tまたは85V（TRIMコドンACTまたはGTT）；同じことがHuCAL（登録商標）Fab 1にも当てはまる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
（表２）抗ヒトTIMP-1 Fabの概要
2004529647.tif 000003
*  標準偏差を示している場合では、3回の異なる蛋白質発現／精製について3回の独立した測定を行った。
〜  測定を1回限り行った場合では、予備的なデータを示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
（表３）軽鎖クローニングに由来するFabの概要
2004529647.tif 000004
*  標準偏差を示している場合では、3個の異なる蛋白質発現／精製について3回の独立した測定を行った。
〜  測定を1回限り行った場合では、予備的なデータを示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
（表７）抗ラットTIMP-1 Fabの概要
2004529647.tif 000005
2004529647.tif 000006
2004529647.tif 000007
*  標準偏差を示している場合では、3回の異なる蛋白質発現／精製について3回の独立した測定を行った。
〜  測定を1回限り行った場合では、予備的なデータを示す。