【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス（Streptomyces）から単離され、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生する生合成経路の少なくとも１つの蛋白質をコードする精製および単離された核酸分子。
【請求項２】
核酸分子が抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナス（Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus）から単離された請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物がＬＬ−Ｆ２８２４９αである請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
分子が配列番号：１に記載のヌクレオチド配列またはその相補鎖である請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項４の核酸分子の配列にハイブリダイズし、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生する生合成経路の蛋白質をコードする核酸配列。
【請求項６】
配列番号：１のヌクレオチド７６９７−１０４６５よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号：１のヌクレオチド１０７９１−１１５７０よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号：１のヌクレオチド１１６５９−１２４６２よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項９】
配列番号：１のヌクレオチド１２８５０−１９８７５よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１０】
配列番号：１のヌクレオチド１９８６５−３１０３６よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１１】
配列番号：１のヌクレオチド３１１１５−４９２４６よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号：１のヌクレオチド５０４４９−５１３０３よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号：１のヌクレオチド５１３００−５２７０６よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１４】
配列番号：１のヌクレオチド５２８０９−６９８３３よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１５】
配列番号：１のヌクレオチド６９９２９−８５４２９よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１６】
配列番号：１のヌクレオチド８５５７４−８６３３８よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１記載の核酸分子を含む生物学的に機能的なプラスミドまたはベクター。
【請求項１８】
ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９２であるＣｏｓ１１、ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９３であるＣｏｓ３６またはＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９４であるＣｏｓ４０を含む請求項１７記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１９】
請求項１７記載のプラスミドまたはベクターにより安定して形質転換またはトランスフェクトされた適当な宿主細胞。
【請求項２０】
エシェリキア（Escherichia）、アクチノマイセターレス（Actinomycetales）、バシラス（Bacillus）、コリネバクテリア（Corynebacteria）またはテルモアクチノマイセス（Thermoactinomyces）である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）である請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１記載の核酸分子によりコード化された生合成蛋白質。
【請求項２３】
オープン・リーティング・フレームのアミノ酸配列が、配列番号：２ないし配列番号：１２のうちのいずれか１つで表されるか、あるいはその生物活性変異体である請求項２２記載の蛋白質。
【請求項２４】
ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の生合成に関与する蛋白質の産生方法であって、適当な栄養条件下で、蛋白質生成物の発現を可能とするように請求項１記載の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核宿主細胞を増殖させ、次いで、該核酸分子発現の所望の蛋白質生成物を単離すること含むことを特徴とする該産生方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の原核または真核宿主細胞における核酸分子発現の蛋白質生成物。
【請求項２６】
全生合成遺伝クラスターにわたり、かつＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生するのを担うＩ型ポリケチド合成酵素をコードする核酸分子を含む、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の生合成経路の蛋白質をコードする核酸分子をクローニングするためのプラスミドまたは２もしくは３個のプラスミドの組合せ。
【請求項２７】
ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９２であるＣｏｓ１１、ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９３であるＣｏｓ３６およびＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９４であるＣｏｓ４０を含む請求項２６記載の組合せ。
【請求項２８】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス株を、突然変異させた核酸分子で形質転換またはトランスフェクトして、元来のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異したモジュール３ケト還元酵素ドメインと置き換え；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の産生を可能とするように適当な栄養培地中で形質転換またはトランスフェクトしたストレプトマイセス株を培養し；次いで
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収することを含むことを特徴とする該製法。
【請求項２９】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αである請求項２８記載の製法。
【請求項３０】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）適当な原核または真核宿主細胞を、突然変異させた核酸分子で形質転換またはトランスフェクトし；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の発現を可能とするように適当な栄養条件下で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を増殖させ；次いで、
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収することを含むことを特徴とする該製法。
【請求項３１】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αであることを特徴とする請求項３０記載の製法。
【請求項３２】
２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス株を形質転換またはトランスフェクトさせて、元来のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異したモジュール３ケト還元酵素ドメインと置き換え；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の産生を可能とするように適当な栄養培地中で形質転換またはトランスフェクトしたストレプトマイセス株を培養し； 
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収し；
（ｅ）適当な反応条件下、２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物に変換し；次いで
（ｆ）２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を単離する
ことを含むことを特徴とする該製法。
【請求項３３】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αであって、２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α化合物を製造することを特徴とする請求項３２記載の製法。
【請求項３４】
２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）適当な原核または真核宿主細胞を、突然変異させた核酸分子で形質転換またはトランスフェクトさせ；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の発現を可能とするように適当な栄養条件下で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を増殖させ； 
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収し；
（ｅ）適当な反応条件下、２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物に変換し；次いで
（ｆ）２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を単離する
ことを含むことを特徴とする該製法。
【請求項３５】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αであって、２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α化合物を製造することを特徴とする請求項３４記載の製法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
【表４】
2004337169.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
【表５】
2004337169.tif 000002