【手続補正書】
【提出日】平成17年1月31日(2005.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）哺乳動物の組織外植片の一部由来の未熟な細胞から細胞コロニー形成ユニットを得るために、生育培地で哺乳動物の組織外植片の一部を生育し、
（b）オートロガスな細胞内植/移植の方法で使用するための１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを採取する
工程からなるインビトロで哺乳動物の組織外植片から細胞コロニー形成ユニットを生産する生産プラント方法。
【請求項２】
さらに、哺乳動物の組織外植片から生育培地への未熟な細胞の移動および選択する工程からなる請求項１による方法。
【請求項３】
哺乳動物の組織外植片が、間葉層、外胚葉層および内胚葉層からなる群由来の細胞から発生する組織から選択される請求項１または２による方法。
【請求項４】
哺乳動物の組織外植片が、軟骨；例えば骨髄のような骨；結合組織；平滑筋組織、心臓組織、肝臓組織および骨格筋組織のような筋組織；例えば骨膜のような皮膚組織；粘膜組織；脳組織、膵臓組織、および血管からなる群から選択される請求項１〜３のいずれかによる方法。
【請求項５】
哺乳動物の組織外植片が、軟骨、例えば弾性軟骨、繊維状軟骨、ヒアリン軟骨または関節ヒアリン軟骨である請求項４による方法。
【請求項６】
さらに、請求項１の工程（a）に供する前に、哺乳動物の組織外植片の一部を洗浄する工程からなる請求項１〜５のいずれかによる方法。
【請求項７】
洗浄を、洗浄培地、例えば、pH約5〜約9を有する水性培地を使って行う請求項６による方法。
【請求項８】
請求項１の工程（a）に供する前に、哺乳動物の組織外植片の全てまたは少なくとも一部を、約-180℃〜約37℃、例えば約-180℃〜約-70℃、または約-70℃〜約10℃の温度で保存する請求項１〜７のいずれかによる方法。
【請求項９】
哺乳動物の組織外植片を、組織に器具を挿入するための鋭利な末端部分と、組織の外植片を運ぶための十分に画定された内腔を有する器具を使って得る請求項１〜８のいずれかによる方法。
【請求項１０】
哺乳動物の組織外植片の一部を、哺乳動物の組織外植片から切断するか、または打ち抜く請求項９による方法。
【請求項１１】
哺乳動物の組織外植片を、請求項１の工程（a）に供する前に、１つ以上のタンパク質分解酵素を使って、部分的に処理する請求項１〜１０のいずれかによる方法。
【請求項１２】
部分的な処理を、哺乳動物の組織外植片の構造を切開し、その結果、成長因子および代謝産物、ならびに未熟な細胞の哺乳動物の組織外植片の内部での、または外部への拡散を容易にする条件下で行なう請求項１１の方法。
【請求項１３】
１つ以上のタンパク質分解酵素を使った部分的な処理を、約1〜約90U/１mgの哺乳動物の組織外植片の濃度で行う請求項１１または１２による方法。
【請求項１４】
１つ以上のタンパク質分解酵素を使った部分的な処理を、約1〜10U/１mgの哺乳動物の組織外植片の濃度で行う請求項１３による方法。
【請求項１５】
１つ以上のタンパク質分解酵素を使った部分的な処理を、約1〜5U/１mgの哺乳動物の組織外植片、例えば約2.5U/1mgの哺乳動物の組織外植片の濃度で行う請求項１４による方法。
【請求項１６】
タンパク質分解酵素が、プロテイナーゼである請求項１１〜１５のいずれかによる方法。
【請求項１７】
プロテイナーゼを、カテプシンDのようなアスパルテートプロテイナーゼ、カテプシンB、L、S、KならびにカルパインＩおよびIIのようなシステインプロテイナーゼ、好中球エラスターゼ、カテプシンGおよびプロテイナーゼ3のようなセリンプロテイナーゼ、およびMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20のようなメタロプロテイナーゼおよびトリプシンからなる群から選択する請求項１６による方法。
【請求項１８】
哺乳動物の組織外植片を、ｐH7.4（生理学的なｐH）から少なくとも±0.5であるｐH、例えば約4〜約6.9の範囲内のｐH、または、約7.9〜約10の範囲内のｐHを有する水性培地を使って前処理を行う請求項１〜１７のいずれかによる方法。
【請求項１９】
生育培地が、例えば炭水化物、脂質およびアミノ酸のような代謝産物、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ミネラルおよび抗菌物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含む請求項１〜１８のいずれかによる方法。
【請求項２０】
生育培地が、哺乳動物の血清、例えばヒト、馬やらくだを含む家畜または競走用動物の血清を含む請求項１９による方法。
【請求項２１】
哺乳動物の血清が、請求項１〜１９のいずれかによる方法で使用される哺乳動物の組織外植片に対してオートロガスである請求項２０による方法。
【請求項２２】
生育培地が、DMEM/F12と約1pg/ml〜約100μg/mlの１つ以上の成長因子を含む請求項１９〜２１のいずれかによる方法。
【請求項２３】
哺乳動物の組織外植片の一部を、培養過程の間、例えば１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを採取するまで保持する請求項１〜２２のいずれかによる方法。
【請求項２４】
細胞コロニー形成ユニットが、間葉、外胚葉、および内胚葉由来細胞からなる群から選択される未熟な細胞に由来する請求項１〜２３のいずれかによる方法。
【請求項２５】
細胞コロニー形成ユニットが、未熟な細胞、幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、前筋原細胞、筋原細胞、筋細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙芽細胞、象牙細胞、エナメル芽細胞、エナメル細胞、繊維芽細胞および繊維細胞からなる群から選択される細胞からなる細胞コロニー形成ユニットである請求項２４による方法。
【請求項２６】
さらに、コロニー形成ユニットの細胞を、分析および同定する工程からなる請求項１〜２５のいずれかによる方法。
【請求項２７】
さらに、細胞コロニー形成ユニットを、組織培養フラスコから細胞コロニー形成ユニットの細胞を遊離させる遊離培地に接触させる工程からなる請求項１〜２６のいずれかによる方法。
【請求項２８】
遊離培地が、トリプシンのようなプロテイナーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素を任意に含む水性培地である請求項２７による方法。
【請求項２９】
遊離培地が、二価の金属イオンを含まないPBS緩衝液のような緩衝液である請求項２７または２８による方法。
【請求項３０】
さらに、哺乳動物の組織外植片の一部を、電磁誘導に供する工程からなる請求項１〜２９のいずれかによる方法。
【請求項３１】
さらに、成長因子および/またはサイトカインを含む組織培養フラスコ内で、哺乳動物の組織外植片および/または生育培地を富化する工程からなる請求項１〜３０のいずれかによる方法。
【請求項３２】
さらに、生育培地、生育培地の成分またはその他の薬剤の組織培養フラスコ内への、連続的および/またはパルス状送達を確立することからなる請求項１〜３１のいずれかによる方法。
【請求項３３】
組織培養フラスコが、連続的および/またはパルス状送達用の入口と出口末端部を有し、連続的および/またはパルス状送達が、圧力差が入口と出口末端の間で得られるように確立される請求項３２による方法。
【請求項３４】
さらに、採取した細胞コロニー形成ユニットを、少なくとも哺乳動物から得た液体のある量を含む培地で洗浄および/または培養する工程からなる請求項１〜３３のいずれかによる方法。
【請求項３５】
哺乳動物の液体が、請求項１〜３３のいずれかによる培養された哺乳動物の組織外植片の一部に対してオートロガスである請求項３４による方法。
【請求項３６】
さらに、１つ以上の細胞コロニー形成ユニットから細胞を採取する工程からなる請求項１〜３５のいずれかによる方法。
【請求項３７】
ｉ）哺乳動物組織外植片の一部の組織培養フラスコへの適用のための手段
ii）生育培地の組織培養フラスコへの適用のための手段
iii）哺乳動物の組織外植片の一部から生育培地に移動する細胞を生育するための手段、および
iv）遊離培地の組織培養フラスコへの適用のための手段
からなる哺乳動物組織外植片からインビトロで細胞コロニー形成ユニットを生産するための生産プラント。
【請求項３８】
さらに、生育培地、遊離培地、および/または例えば炭水化物、脂質およびアミノ酸のような代謝産物；ビタミン；成長因子；サイトカイン；ミネラルおよび抗菌物質からなる群から選択される１つ以上の因子の連続的またはパルス状送達のための手段からなる請求項３７による生産プラント。
【請求項３９】
請求項３６で請求された方法によって得ることができる細胞。
【請求項４０】
請求項３９による細胞およびキャリアーを含む組成物。
【請求項４１】
細胞およびキャリアーが、該哺乳動物に対してオートロガスである請求項４０による組成物。
【請求項４２】
細胞およびキャリアーが、該哺乳動物に対してオートロガスであり、キャリアーが血清である請求項４０または４１による組成物。
【請求項４３】
キャリアーが、さらにマトリクス成分を含む請求項４０〜４２のいずれかによる組成物。
【請求項４４】
医薬で使用するための、請求項３９による細胞または請求項４０〜４３のいずれかによる組成物の使用。
【請求項４５】
組織障害の治療のための医薬組成物の製造のための請求項３９による細胞の使用。
【請求項４６】
哺乳動物の軟骨および/または骨の異常の治療のための請求項４５による使用。
【請求項４７】
ヒト、あるいは馬およびらくだを含む家畜または競走用の動物の軟骨および/または骨の障害を治療するための請求項４５または４６による使用。
【請求項４８】
哺乳動物の組織から哺乳動物の組織外植片を採取するための、請求項９で画定したような器具、および哺乳動物の組織外植片を保護するための運搬容器、ならびに任意に、先に画定した器具の使用のための説明書からなる哺乳動物の組織外植片を採取するための運搬キット。
【請求項４９】
採取した哺乳動物の組織外植片を、請求項１〜３６のいずれかによる方法で使用する請求項４８による運搬キット。
【請求項５０】
キットが、さらに哺乳動物からオートロガスな血液サンプルを採取する血液サンプルチューブを含む請求項４８または４９による運搬キット。
【請求項５１】
DNA、RNAおよび/またはタンパク質を分析するための生化学的な分析で使用するために、哺乳動物の外植片を採取するための請求項４８〜５１のいずれかによる運搬キット。
【請求項５２】
少なくとも請求項３９による細胞とキャリアーを含む第１容器、および軟骨膜および/または中間膜を含む第２容器からなる送達キット。
【請求項５３】
それが必要な哺乳動物に、請求項３９による細胞または請求項４０〜４３のいずれかによる組成物を投与することからなる組織異常または組織関連異常を患った哺乳動物のオートロガスの治療用の方法。
【請求項５４】
投与された組成物が、同一の哺乳動物からのオートロガスな血清を含むオートロガスな材料からなる請求項５３による方法。
【請求項５５】
関節のヒアリン関節軟骨障害の修復、椎間板のヒアリン/繊維軟骨障害の修復、ヒアリン/繊維軟骨に関連した喉頭障害の修復、形成外科法で使用される弾性軟骨を含む結合組織の整形、骨関節炎、骨関節症、骨粗鬆症、複雑骨折に関連した欠損骨構造、および萎縮性偽関節に関連した欠損骨構造の修復、例えば歯の修復用のチタン製のねじの内植に関連した不完全なあごの骨構造の修復、皮膚の火傷、または外傷に関連するその他の皮膚の異常および例えば血管腫や黒色腫のような悪性腫瘍のような皮膚関連腫瘍の処置および修復、閉塞後の心臓の心室壁の修復、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆症、多発性硬化症およびその他の全身性脳疾患のようなCNS関連疾患の修復、異なる病的源の網膜炎の修復、糖尿病Ｉ型および/またはII型に関連した膵臓組織の修復、肝硬変、脂肪肝の修復、ならびに初期の肝臓癌ならびに肝臓転移の切除後の肝臓組織の再構築、および出生時欠損がある子供の肝臓組織の再形成のため、からなる群から選択される組織異常または組織関連障害を患っている哺乳動物のオートロガスな治療のための請求項５３または５４による方法。
【請求項５６】
軟骨および/または骨の障害または関連傷害を患っている哺乳動物のオートロガスな治療のための請求項５３〜５５のいずれかによる方法。
【請求項５７】
ヒト、ならびに馬およびらくだを含む家畜および/または競走用の動物からなる群から選択される哺乳動物のオートロガスな治療用の請求項５３〜５６のいずれかによる方法。
【請求項５８】
（a）組織培養フラスコ中の生育培地中でマトリクスと未熟な細胞からなる哺乳動物の組織外植片の一部を生育し、そして
（b）組織培養フラスコ中の少なくとも一部の内容物を、哺乳動物の組織外植片および/または未熟な細胞の性質の情報を受ける検査に付す
工程からなるインビトロ培養物中で哺乳動物の組織外植片の一部の生物学的活性を測定するための診断方法。
【請求項５９】
検査が、形態学的、組織化学的および/または細胞病理学的な検査である請求項５８による診断方法。
【請求項６０】
工程（b）における内容物を、DNA、RNA、および/またはタンパク質を分析するために、生化学的な分析によって分析する請求項５８による診断方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
更なる側面として、本発明は、哺乳動物の組織から哺乳動物の組織外植片を採取するための道具、および哺乳動物の組織外植片を保護し運搬するための運搬容器、そして任意に、道具を使用するための説明書からなる、哺乳動物の哺乳動物の組織外植片を採取するための運搬キットに関する。
さらに、更なる側面として、本発明は、キャリアー内に、１つの細胞コロニー形成ユニットまたは一群の細胞コロニー形成ユニット由来の懸濁細胞を含む容器からなる送達キットに関する。加えて、送達キットは、軟骨および／または中間膜を含んでもよい（その様な膜の詳細は、例えばWO 01/06949を参照）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
外植系は、細胞外マトリクスに存在する種々の細胞への成長因子および分化因子の「結合・送達」系として、軟骨マトリクスを使用するという着想に基づく。仔牛胎児血清に存在するか、または組換えペプチドとして別途培地に加えられる成長因子と分化因子は、例えばデコリン、ビグリカン、およびフィブロモジュリンなどのマトリクスに存在する結合タンパク質を介して軟骨に結合しうる。その様な結合・送達系は、培養培地に存在する様々な成長因子および分化因子の半減期を増加させうる。このことは、これらの因子やその他の因子が、まず、その天然の中間マトリクス分子−様々な細胞受容体への「送達媒体（delivery vehicle）」に結合すると、タンパク質分解からより保護されることを意味している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
加えて、培養培地に存在する成長因子および分化因子の濃度と比べて、細胞周囲のへりの周り、周辺領域（territorial）ならびに周辺領域間（interterritorial）には因子がより高く局所的に蓄積するため、成長因子および分化因子による細胞のより高い刺激が推測される。より高い局所濃度のこれら因子は、マトリクス内の天然のリガンドに結合し、後に結合受容体（例えば、IGFI-R、TGFβ-R、bFGF-R）へ「送達される」のであるが、受容体が原形質膜上でクラスター形成することを誘導しさらにシグナル変換および生育刺激を誘導する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
要約すると、インビトロで、外植片から細胞を分裂増殖させる１つの例として、軟骨の外植片を使って記載された文章の中で、上記組織培養系は、公知の軟骨の細胞単離および培養方法よりもその他の幾つかの利点を有している。先に言及したように、外植片内の軟骨由来細胞は、「本来の」細胞刺激および細胞分裂増殖が進行する間、マトリクスで、それらの分化状態を維持する。第２に、細胞は、例えばマトリクスのコラゲナーゼ消化に使用される高濃度の傷害性タンパク質分解活性にさらされない。第３に、培養系は、生産ユニットで取り扱うことが容易であり、第４に、従来の酵素消化法と比べた場合、外植片系は、細胞単離過程を通してならびに一般の細胞培養過程を通して、労力と手間をそれほど必要としないため、生産費用がより少ない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の対象は、哺乳動物の組織の一部を哺乳動物から採取し、培養前に哺乳動物の組織の一部内の細胞を遊離させる必要がない一般的な方法を提供することである。哺乳動物の組織の一部の培養は、結果として１つ以上のコロニー形成ユニットを生じ、このコロニー形成ユニットは、その組織培養フラスコの表面からの最終的な遊離のために、酵素を使った処理を受けるだけであり、さらにその方法はオートロガスである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
該当する組織障害または組織関連障害の例は、関節のヒアリン関節軟骨障害の修復、椎間板のヒアリン/繊維軟骨障害の修復、ヒアリン/繊維軟骨に関連した喉頭障害の修復、形成外科法で使用される弾性軟骨を含む結合組織の整形、骨関節炎、骨関節症、骨粗鬆症、複雑骨折に関連した欠損骨構造、および萎縮性偽関節に関連した欠損骨構造の修復、例えば歯の修復用のチタン製のねじの内植に関連した不完全なあごの骨構造の修復、皮膚の火傷、または外傷に関連するその他の皮膚の異常および例えば血管腫や黒色腫のような悪性腫瘍のような皮膚関連腫瘍の処置および修復、閉塞後の心臓の心室壁の修復、パーキンソン病、アルツハイマー病、痴呆症、多発性硬化症およびその他の全身性脳疾患のようなCNS関連疾患の修復、様々な病的源の網膜炎の修復、糖尿病Ｉ型および/またはII型に関連した膵臓組織の修復、肝硬変、脂肪肝の修復、ならびに初期の肝臓癌ならびに肝臓転移の切除後の肝臓組織の再構築、および出生時欠損がある子供の肝臓組織の再形成のため、からなる群から選択されるものである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
定義
本出願および本発明に関しては、以下の定義があてはまる。：
用語「オートロガスな（自家）細胞の内殖/移植」は、生検材料（または細胞）を哺乳動物から取り出し、それらの細胞を培養し、そして生育し、後に同一の哺乳動物に戻す工程を意味すると意図される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
用語「細胞コロニー形成ユニット」は、同一な起源を有する細胞のコロニー、すなわち一つの細胞、例えば哺乳動物の組織外植片の一部から外に移動し、哺乳動物の組織外植片の一部の外で、細胞コロニーを生産するために分裂し始めた未熟な細胞に由来する細胞のコロニーを意味すると意図される（図２）。細胞コロニー形成ユニットは、幾つかの層内に細胞を含み、第一層は、細胞コロニー形成ユニットが、広がり、生育する組織培養フラスコの表面に付着している。細胞コロニー形成ユニットは、細胞コロニー形成ユニットの直径の増加によって垂直に、および水平の両方に大きさが増加する。このように、細胞コロニー形成ユニットは、細胞のクローンを形成する多層の細胞であるため、単層の細胞とは典型的に異なる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
用語「哺乳動物の組織外植片」は、適切な器具を使って、哺乳動物から外植された哺乳動物の組織の一部を意味すると意図される。外植片は、１より多い種類の組織を含んでいてもよく、例えば膝由来の組織の外植の場合、外植片は、軟骨組織ならびに骨組織を含んでいてもよい。本発明に関しては、組織の外植は、再生可能な様式で、つまり十分に画定された器具と十分に画定された方法によって適切に行われる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
用語「哺乳動物の組織外植片の一部」は、先に定義した哺乳動物の組織外植片の部分を意図するつもりである。有利には、部分は、十分に画定された大きさを有し、哺乳動物の組織外植片から外植片をより小さな部分に切断またはスライスすることによって得られる。ある目的のために、外植片の特定の部分を使用することが好ましいであろう。通常、部分は、哺乳動物から採取し、上記に定義したような１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを生産するために使用される。特定の因子の助けによって、未熟な細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部から出て生育培地に移動することができる。生育培地ならびに外植片において、未熟な細胞は、幾つかの細胞に分裂増殖し始め、それによって細胞コロニー形成ユニットを生産する。一つの未熟な細胞は、一つの細胞コロニー形成ユニットを発生させる。しかし、１つおよび同一の組織培養フラスコ内で、幾つかの未熟な細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部から出て移動し、幾つかの細胞コロニー形成ユニットを発生させるかもしれない。哺乳動物の組織外植片の一部で、数種類の細胞が存在していてもよいが、本発明との関連では、未熟な細胞が、哺乳動物の組織外植片の一部から出て生育培地に移動することができ、分裂増殖を開始することは興味深いことである。それに対して、成熟な細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部に残り、この様にして哺乳動物の組織外植片の一部は、特定の細胞を引き留めそしてその他の細胞型を選択するためのフィルターとして機能する。その結果、細胞の選択は、哺乳動物の組織外植片の一部の助けによって得られる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
外植片細胞培養系は、細胞外マトリクスに存在する未熟な細胞に対する生育因子およびサイトカインの第１の結合・送達系として、軟骨マトリクスを使用する着想に基づく。生育培地に存在する成長因子およびサイトカインは、外植片に拡散し始め、一定の時間後、マトリクスに生育因子およびサイトカインの様々な濃度勾配をマトリクス中に築く。
結果として、未熟な細胞は、築かれた勾配に抗して移動し始めることが推測され、培養約１〜２週間後、外植片の表面に存在し、そして最後に細胞コロニー形成ユニットを組織の外部に築く。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
用語「未熟な細胞」は、幹細胞または前駆細胞レベルに近い細胞に等価な細胞、例えば前軟骨芽細胞（prechondroblast）、または軟骨芽細胞さえも意味すると意図される。未熟な細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部の中を、周囲の生育培地に向けて移動することができ、そして細胞は、生育培地自体内を移動することもできる。軟骨の外植片系の例で、軟骨マトリクスの内部で刺激された細胞は、緻密に構成されたコラーゲンネットワークによってトラップされるため、マトリクス内での細胞移動は、軟骨生検材料の周縁に限定されるであろう。移動は、幾つかの因子によって影響されるようである。細胞が、哺乳動物の組織外植片の一部の外側に移動した後、未熟な細胞は、先に記載したような１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを形成するように分裂増殖することができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
用語「移動」は、未熟な細胞が可動性であることを意味すると意図される。細胞は、哺乳動物の組織外植片の一部の中で、哺乳動物の組織外植片から生育培地へ、そして生育培地中で、制限されながらも移動できる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
用語「洗浄」は、血液、哺乳動物組織の望まざる材料、および/またはその他の望まざる成分を除去するような様式で液体に、哺乳動物の組織外植片の一部を供することを意味すると意図される。そのような成分が、哺乳動物の組織外植片の一部に付着していてもよく、そして、それらは、例えば水性培地を使って除去されてもよい。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
用語「部分的な処理」は、外植片の切開した構造を有する外植片を得るために、哺乳動物の組織外植片の一部を処理することを意味すると意図される。処理は、大変穏やかであるので、組織が崩壊することはなく、組織外植片を実質的に解体せず、つまり組織移植片の細胞またはその他の部分の遊離は起きない。部分的な処理は、成長因子および代謝産物、ならびに未熟な細胞の組織外植片へのまたは組織外植片からの拡散および／または移動を容易にする。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
用語「生育培地」は、未熟な細胞の組織材料から周囲の培地への移動、組織外植片の一部および生育培地を含む組織培養フラスコの表面への付着、ならびに未熟な細胞のさらなる分裂増殖およびコロニー形成ユニットへの分化を誘導または提供することができる培地を意味すると意図される。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
用語「組織培養フラスコ」は、当業者で周知な、従来のあらゆる組織培養フラスコを意味すると意図される。組織培養フラスコは、様々な形態および大きさを有していてもよい。しかし、組織培養フラスコは、細胞を付着および生育させることができ、かつ開閉可能な少なくとも一端を備える。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
用語「軟骨」は、細胞外マトリクスに埋め込まれた幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞を含む結合組織を意味すると意図される。軟骨は、ヒアリン、ヒアリン関節、弾性軟骨および繊維軟骨を含む。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
用語「遊離」は、生育の間に細胞が付着していた組織培養フラスコの表面からの細胞の遊離、さらには互いに付着している細胞を遊離させることを意味すると意図される。細胞の遊離は、細胞培養物から細胞を採取できるようにする。細胞の遊離に使用される薬剤の例は、トリプシン、またはＥＤＴＡを使ったキレート緩衝系である。細胞コロニー形成ユニットの遊離は、細胞のかきとり（cell scraping）により行ってもよい。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
用語「電磁誘導」は、例えば哺乳動物の組織材料の一部に存在する細胞において、シグナル変換を生じ、その結果、細胞を哺乳動物の組織外植片の一部において活性化させる電磁的な誘導を意味すると意図される。電磁誘導は、好ましくは、約0.1〜0.8mTの不連続または連続したパルスフィードを使って、行ってもよい。電磁誘導フィールドの大きさの唯一の制限は、細胞が生育可能を維持し、電磁誘導を使った処理後に分裂増殖できることである。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
用語「キャリアー」は、液体、流体、半固体または固体のキャリアーを意味すると意図される。薬剤目的のためには、キャリアーは、当業者に周知の基準で、薬学的に受容可能でなければならない。その結果、薬学的に受容可能なキャリアーは、それ自体、何らの実質的な治療効果および/または予防効果を有さないという意味で不活性なあらゆる材料を意味すると意図される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
用語「生体材料」は、その成分を大規模に生産できる量まで細胞コロニー形成ユニットの細胞によって生産され得る細胞のあらゆる成分を意味すると意図される。成分は、例えば、例えば酵素、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよびヒアルロン酸のような任意の目的とするタンパク質であってもよい。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
哺乳動物の組織外植片の無傷な部分（すなわち、細胞の遊離を引き起こすための酵素処理を受けていない部分）を使って、未熟な細胞は、培養過程の最初の部分の間、マトリクス構造内で保持される。このことが、細胞とその巨大分子との中間環境を保存する。巨大分子には、細胞結合タンパク質、ならびに表現型が安定する様式に制御された細胞成長を生じる、個々の細胞の周囲の領域マトリクス内の繊維状ネットワークの軟骨構成が含まれる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
その方法は、哺乳動物の組織外植片から未熟な細胞を生育培地に移動させる工程からなる。移動した細胞を、プラスチック表面上で細胞の大小のコロニーとして、三次元系で培養する。移動した細胞から生産されたコロニー形成ユニットは、一定期間の生育後に、非常にコンフルーエントとなる。しかし、生産期間の間は、コロニー形成ユニットは、遊離培地により、プラスチック表面から遊離されない。それゆえ、細胞の損傷が避けられ、さらなる細胞分化が、全培養過程を通して維持される。軟骨細胞のような細胞を、低密度単層培養に入れ、そして組織培養フラスコの表面に沿って拡大させると、培養された単層細胞は、繊維芽細胞と似て、軟骨細胞には見えない（図６）ことが前に見出されている。コロニー形成ユニットは、最終的には、オートロガスな細胞の内植の時期より前に、組織培養フラスコから遊離される。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
哺乳動物の組織外植片を、先に規定したような器具を使って得てもよい。器具を、周辺の組織にかなりの害を引き起こすことなく、哺乳動物の組織の一部を適切に得るために設計する。十分に規定された器具の内腔は、採取される組織に依存して、様々な大きさおよび形態であってもよい。その結果、断面は、円形または多角形の形態であってもよく、円形または多角形の直径は、約0.3〜約100mm、例えば約2〜10mmの範囲であってもよい。適切には、全体の形状は円筒形である。特定の哺乳動物の組織外植片の回収、および器具の扱いに適するような長さを備えれば、器具の長さは重要ではない。特定の組織の貫通を容易にするために、円筒状の器具の一端を、鋭利にし、そしてそれは、円錐の形状を有する。その器具が、目的の組織に入り、そして貫通するために、適した強さを備えたあらゆる適した材料で作ってもよい。軟骨に関して、器具を、比較的強化した材料、例えば金属またはスチールなどで作るべきである。外植片を、多くの方法、好ましくは切断または打ち抜き、より好ましくは打ち抜きで、器具から開放してもよい。哺乳動物の組織外植片の回収で使用するのに適した器具の例を、図1に示す（器具が、哺乳動物の組織外植片の一部、例えば軟骨の一部などを得るのに使用される図４も参照）。軟骨の一部を、関節、例えばヒト、馬やらくだを含む家畜および/または競走用動物のような哺乳動物の膝から得てもよい。この特定の場合、器具を、軟骨を貫通し、外植片を得る能力を有する強化した材料の針として設計する。針は、様々な大きさの外植片を得ることが出来るように、様々な直径の鋭利な端を有していてもよい。器具は、使い捨てでも、数回使用してもよい。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
培養する前の哺乳動物の組織外植片の処理
通常、細胞コロニー形成ユニットを生産する方法は、さらに、付加的な工程、例えば工程（a）の前に哺乳動物の組織外植片の一部を洗浄する工程などを含む。洗浄は、未熟な細胞の移動および分裂増殖を阻害し、そして/またはこれらに影響を与え、細胞形成ユニットの形成を阻害し得る哺乳動物の組織外植片に付着した望まざる成分を除去するために行う。
洗浄を、pH約5〜約9、好ましくはpH7.4近くを有する水性培地にて行ってもよい。水性培地の例は、実施例1に記載のように、生理食塩水またはPBSのあらゆる形態である。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
その他の付加的な工程は、工程（a）の前に行われる処理、例えば1つ以上のタンパク質分解酵素のみを使用した部分的な処理、または水性培地を使った前処理との組み合わせを伴っていてもよい。1つ以上のタンパク質分解酵素を使った哺乳動物の組織外植片の一部の部分的な処理を、哺乳動物の組織外植片の構造の開口をさせ、それによって、工程（a）の前に、組織外植片内へおよび/またはから外への成長因子の拡散および未熟な細胞の移動を促進するような条件下で行う。その結果、哺乳動物の組織外植片の一部は、細胞またはその他の部分を、培養前に、哺乳動物の組織外植片の一部から遊離しないような方法で、無傷のままにしておく。哺乳動物の組織の一部の部分的な処理を、約1〜約90U/１mgの哺乳動物の組織外植片の、例えば約1〜10U/mg、約1〜5U/mgまたは2.5U/mgの範囲の濃度で、1つ以上のタンパク質分解酵素を利用して行う。哺乳動物の組織外植片の一部の部分的な処理を、タンパク質分解酵素、例えばプロテイナーゼおよび/またはトリプシン、好ましくはカテプシンDのようなアスパルテートプロテイナーゼ、カテプシンB、L、S、KならびにカルパインＩおよびIIのようなシステインプロテイナーゼ、好中球エラスターゼ、カテプシンGおよびプロテイナーゼ3のようなセリンプロテイナーゼ、およびMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20のようなメタロプロテイナーゼおよび/またはトリプシンからなる群から選択されるプロテイナーゼを利用して行ってもよい。水性培地を使った哺乳動物の組織外植片の一部の前処理を、ｐH7.4（生理学的なｐH）から少なくとも±0.5であるｐH、例えば約4〜約6.9、例えば約5〜約6.9、約6〜約6.9の範囲内のｐH、例えば約6.5、または約7.9〜約10、例えば約7.9〜約9、約7.9〜約8.5の範囲内のｐH、例えばｐH約8.0を有する水性培地を使って行ってもよい。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
哺乳動物の組織外植片の一部の培養
哺乳動物の組織外植片の一部は、任意に、培養過程の間、例えば１つ以上の細胞形成ユニットを採取するまで、保持されてもよい。全培養過程の間、組織を残しておくことにより、細胞形成ユニットを生産する未熟な細胞は、この方法の間に受けるストレスが少なく、そのため改善された結果が想定される。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
本発明の１つの実施形態によれば、第一の生育培地は、少なくとも非-オートロガスな血清を含み、これは本方法において初期に使用される。細胞の採取および遊離の前に、第一の生育培地を第二の生育培地に交換する。この第二の生育培地は、第一の生育培地で使用される非-オートロガスな血清に由来する望ましくない免疫原性成分の削減および/または除去することを可能にするオートロガスな血清を少なくとも含む。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
加えて、先の本発明による方法は、組織培養フラスコへの生育培地、生育培地の成分または他の物質の連続的および/またはパルス状送達を行ってもよく、その結果上記の成分または物質の制御された送達が得られる。そのような場合、組織培養フラスコは、連続的および/またはパルス状送達のための入口および出口末端部分（開口部）を備える。幾つかの場合、連続的および/またはパルス状送達は、圧力差が入口と出口末端の間で得られるように確立されることが有利であろう。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明による方法は、先に規定したような従来の組織培養フラスコ内で行う。しかし、組織培養フラスコのサイズまたは形態は、目的に適し、そして上記の方法を使って生産される細胞コロニー形成ユニットの量に適合していれば、重要ではない。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
哺乳動物の組織外植片の一部の培養の間、細胞コロニー形成ユニット内の細胞のアイデンティティを確認することを可能にするために、未熟な細胞が細胞コロニー形成ユニットに分裂増殖し始めると直に分析を行ってもよい。好ましくは、哺乳動物の組織外植片の一部は、軟骨、例えば弾性、繊維、ヒアリンまたは関節ヒアリンであり、外植片内の未熟な細胞は、前軟骨芽細胞または軟骨芽細胞あるいは軟骨細胞に分裂増殖する。哺乳動物の組織外植片の一部が骨である場合、未熟な細胞は、前骨芽細胞または骨芽細胞、あるいは骨細胞に繁殖する。軟骨細胞または軟骨芽細胞を、光学顕微鏡での形態分析、あるいはPCRまたはウエスタンブロット解析のようなRNAまたはタンパク質の解析を含む方法によるコラーゲンII型またはヒアリン合成および分泌の検出によって解析してもよい。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
器具を使用するための説明書は、再現性のため、例えば哺乳動物の組織上の同一な場所から同一量の哺乳動物の組織外植片を得るために、任意に含まれてもよい。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
オートロガスな細胞内植用の１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを含む送達キット
本発明は、さらに、少なくとも、本発明の方法によって得られる細胞およびキャリアーを含む第一容器、ならびに軟骨膜および/または中間膜を含む第二容器からなる送達キットに関する。有用な軟骨膜および/または中間膜の例は、特許出願PCT/EP00/07111で記載されている。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
送達キットは、先に規定したような、軟骨および/または骨の障害のような組織障害を患っている哺乳動物の処置で使用するのに適している。哺乳動物は、ヒト、または馬およびらくだを含む家畜および競走用動物である。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
オートロガスな細胞内植法用の１つ以上の細胞コロニー形成ユニットを生産するための生産プラント
先に規定し、記載したように、
哺乳動物の組織外植片の一部を組織培養フラスコへ適用する手段、
生育培地を組織培養フラスコへ適用する手段、
哺乳動物の組織外植片の一部から生育培地に移動する細胞を生育させる手段、および
遊離培地を組織培養フラスコへ適用する手段
からなるインビトロで、哺乳動物の組織外植片から細胞コロニー形成ユニットを生産するための生産プラント。生産プラントは、さらに生育培地、遊離培地および/または例えば炭水化物、脂質およびアミノ酸のような代謝産物、ビタミン、生育因子、サイトカイン、ミネラルならびに抗菌物質からなる群から選択される１つ以上の因子の連続的またはパルス状送達の手段を含んでもよい。オートロガスな細胞内植/移植の方法のための生産プラントの例は、実施例１および図５の生産スキームに記載される。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
刺激された（そして分裂増殖する）細胞は、通常１〜２週間（提供材料に依存する）の間外植片中にとどまり、そして、細胞移動および化学走化を介して、外植片から培地中に「出て行き」、さらに組織培養フラスコに付着して細胞コロニー形成ユニットを生成する。
培養３〜５週間後、大小の細胞コロニー形成ユニットが生育し（図５Ａおよび５Ｂ参照）、そして細胞を、トリプシンを使って採取した。
細胞を採取し、キャリアー内で細胞懸濁液として診療所または病院に届ける前にさらに２〜３日間培養するために、２０％仔牛胎児血清の代わりに１０％哺乳動物血清を含むオートロガスな生育培地を、組織培養フラスコに加えた。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例７
軟骨の分析を目的とした軟骨外植片系の使用
計画の表題：オートロガスな軟骨細胞移植（ACI）を最適化するための膝関節鏡検査を受けた患者から得たヒト軟骨細胞の培養に関する生存可能研究
この実施例で述べられている次の研究は、Videnskabsetisk Komite for Kobenhavns Amtによって承認され、♯KA99148ｍ（190201）として登録された。
手順：
要約すると、重量１〜３ｍｇの２つの小さな軟骨の生検材料を、大腿顆の隣接した領域からφ2mmのスチール製の針を使って採取した。標準化した軟骨の生検材料サンプルを、例えば関節鏡検査の間に患者から得、室温で２４時間以内に運搬培地（DMEM/F12、ゲンタマイシン硫酸塩［50μg/ml（10mmol/l）］、ファンギゾン［2μg/ml（2.2μmol/l）］中で、実験室に届けた。