【手続補正書】
【提出日】平成16年4月7日(2004.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度とほぼ同じ温度の有機溶剤を添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項２】
試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度を下げた後に有機溶剤を添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項３】
前記有機溶剤を添加するときに、前記溶液の温度と前記有機溶剤の温度がほぼ同じであることを特徴とする請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項４】
前記有機溶剤を添加するときの前記第1の液体の温度が、−５℃〜５５℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項５】
前記試料は血液であることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項６】
前記試料は組織であることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項７】
前記試料は細胞であることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項８】
前記有機溶剤を添加するときの前記第1の液体の温度が、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項９】
前記第1の液体は前記第2の液体を添加する前に放冷されることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１０】
前記担体としてスピンカラムを用いることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１１】
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
ほぼ同じ温度の第1の液体に添加するための有機溶剤と、
核酸を吸着させるための担体と、
前記担体を洗浄するための洗浄液と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有することを特徴とする核酸抽出キット。
【請求項１２】
前記担体はスピンカラムであることを特徴とする請求項１１に記載の核酸抽出キット。
【請求項１３】
試料及びカオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体とを収める容器の温度を制御する温度制御部と、
前記温度制御部によって設定された温度を計測する温度センサと、
前記温度センサで検知された温度に基づいて前記容器に有機溶媒を供給する供給部とを有し、
前記温度制御部は、前記容器の温度を前記容器前記試料から核酸を遊離させるときの第1の温度、前記核酸を含む液体に前記有機溶媒を供給するときの第2の温度とするための制御を行うことを特徴とする核酸精製分離装置。
【請求項１４】
試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度とほぼ同じ温度の有機溶剤を添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体を収めるカラムに吸引及び吐出させて前記担体に前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項１５】
試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度を下げた後に有機溶剤を添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体を収めるカラムに吸引及び吐出させて前記担体に前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項１６】
前記有機溶剤が，エタノール，１−プロパノール，２−プロパノール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルの何れかであることを特徴とする請求項７乃至請求項８に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１７】
前記有機溶剤を添加するときの前記第1の液体の温度が、−５℃〜５５℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項１４乃至請求項１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１８】
前記有機溶剤を添加するときの前記第1の液体の温度が、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項１４乃至請求項１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１９】
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
ほぼ同じ温度の第1の液体に添加するための添加剤と、
核酸を吸着させるための担体と、
前記担体を洗浄するための洗浄液と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有し、
前記添加剤は、ジエチレングリコールジメチルエーテルであることを特徴とする核酸抽出キット。
【請求項２０】
試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度とほぼ同じ温度のエタノールを添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項２１】
試料から核酸を遊離させて前記核酸を含む第1の液体とし、
前記第1の液体に、前記第1の液体の温度を下げた後にエタノールを添加して第2の液体とし、
前記第２の液体を担体に接触させて前記核酸を吸着させ、
前記核酸が吸着した前記担体を洗浄し、
前記核酸が吸着した前記担体から前記核酸を遊離することを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項２２】
前記エタノールを添加するときの前記第1の液体の温度が、−５℃〜５５℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項２０乃至請求項２１に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２３】
前記エタノールを添加するときの前記第1の液体の温度が、１０℃〜４０℃の範囲の温度であることを特徴とする請求項２０乃至請求項２１に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２４】
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
ほぼ同じ温度の第1の液体に添加するための添加剤と、
核酸を吸着させるための担体と、
前記担体を洗浄するための洗浄液と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有し、
前記添加剤は、エタノールであることを特徴とする核酸抽出キット。
【請求項２５】
前記担体はスピンカラムであることを特徴とする請求項２４に記載の核酸抽出キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
回収工程では，スピンカラム８に，Ｅ１，Ｅ２及びＥ３から選ばれた溶出液１３（１００μＬ）を注ぎ，２分間室温（２５℃）で放置した後，１分間の遠心処理（回転数６０００ｒｐｍ）を行って核酸を回収し，定量して純度の評価を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．８の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。なお，Ａ２６０は，核酸を含む溶液の波長２６０ｎｍに於ける吸光度を示し，Ａ２８０は，核酸を含む溶液の波長２８０ｎｍに於ける吸光度を示す。
実施例７：組織からの核酸抽出２
２０ｍｇのぼうこう組織（ラット）から，実施例６と同様の方法により，核酸抽出を行った。その結果，Ａ２６０／Ａ２８０が１．７の高純度の核酸が得られ，ＰＣＲに使用することが可能であった。
実施例８：尿からの核酸抽出
２０ｍＬの尿検体を含むチューブを，５分間の遠心処理（回転数１４０００ｒｐｍ）した。チューブから上清を除去し，尿沈査を分離した。チューブ内に得られた尿沈査に，２０μＬのproteinase Kと，２００μＬの反応液（濃度３Ｍのグアニジン塩酸塩，５容量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加し，攪拌した。チューブの溶液を７０℃で１０分間加熱した後，放冷により２５℃に冷却して核酸遊離溶液を得た。チューブに，２００μＬのＥｔＯＨを添加し，混合して，混合液７を得た。以上が分解工程である。