【手続補正書】
【提出日】平成17年2月22日(2005.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上するための薬剤であって、下記環状アミノ酸モチーフ（１）及び直鎖状アミノ酸モチーフ（２）：
Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ          （１）及び
Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ          （２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）
からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフを包含するペプチド化合物を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項２】
該ペプチド化合物が、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ、ＣＬＰＧＨＷＧＦＰＳＣ及びＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳからなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
該腫瘍細胞が、金属プロティナーゼを発現する腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
該リポソームが少なくとも一種の化学療法薬を内包することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。  
【請求項５】
該化学療法薬がアドリアマイシンであることを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。  
【請求項６】
該リポソームがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を更に包含することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。  
【請求項７】
腫瘍細胞によるリポソームの取り込みを増加させるための薬剤であって、下記環状アミノ酸モチーフ（１）及び直鎖状アミノ酸モチーフ（２）：
Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ          （１）及び
Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ          （２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）
からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフを包含するペプチド化合物を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項８】
該ペプチド化合物が、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ、ＣＬＰＧＨＷＧＦＰＳＣ及びＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳからなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
該腫瘍細胞が、金属プロティナーゼを発現する腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項７または８に記載の薬剤。
【請求項１０】
該リポソームが少なくとも一種の化学療法薬を内包することを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１１】
該化学療法薬がアドリアマイシンであることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
該リポソームがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を更に包含することを特徴とする、請求項７〜１１のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１３】
リポソームを用いた選択的輸送によって、腫瘍細胞に選択的に化学療法薬を到達させる医薬組成物であって、 
少なくとも１つの化学療法薬を内包するリポソーム、及び 
下記環状アミノ酸モチーフ（１）及び直鎖状アミノ酸モチーフ（２）：  
Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ          （１）及び  
Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ          （２）  
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）  
からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフを包含する少なくとも１つのペプチド化合物を包含することを特徴とする医薬組成物。  
【請求項１４】
以下の３つの成分を包含する、腫瘍であると考えられる細胞を検出するための診断用または画像化用のキット。
− リポソーム、
− 下記環状アミノ酸モチーフ（１）及び直鎖状アミノ酸モチーフ（２）：
Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ          （１）及び 
Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ          （２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）
からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフを包含する少なくとも一つのペプチド化合物、及び
− 検出可能な標識物質。
【請求項１５】
該ペプチド化合物が、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ、ＣＬＰＧＨＷＧＦＰＳＣ及びＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳからなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１４に記載の診断用または画像化用のキット。
【請求項１６】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、磁気粒子または蛍光性物質であることを特徴とする、請求項１４に記載の診断用または画像化用のキット。
【請求項１７】
以下の３つの成分を包含する、診断用または画像化用の組成物。
− リポソーム、
− 下記環状アミノ酸モチーフ（１）及び直鎖状アミノ酸モチーフ（２）：
Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ          （１）及び 
Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ          （２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）
からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフを包含する少なくとも一つのペプチド化合物、及び
− 検出可能な標識物質。
【請求項１８】
該ペプチド化合物が、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ、ＣＬＰＧＨＷＧＦＰＳＣ及びＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳからなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１７に記載の診断用または画像化用の組成物。
【請求項１９】
該検出可能な標識物質が、放射性物質、磁気粒子または蛍光性物質であることを特徴とする、請求項１７に記載の診断用または画像化用の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】マトリックス金属プロティナーゼ阻害物質を用いたリポソームターゲッティング
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的癌治療のための薬剤に関する。特に本発明は、小さいマトリックス金属プロティナーゼ阻害物質を、癌細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上するための薬剤、及び癌細胞によるリポソームの取り込みを増加するための薬剤に関する。従って、本発明は、癌の治療用の医薬組成物を提供すると共に、腫瘍細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上するための薬剤、腫瘍細胞によるリポソームの取り込みを増加するための薬剤、及びリポソームを用いた選択的輸送によって、腫瘍細胞に選択的に化学療法薬を到達させる医薬組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス金属プロティナーゼ(MMP)は、基底膜と細胞外マトリックス(ECM)を分解する酵素のファミリーを構成しており、組織の再形成や細胞遊走に関与する（Koivunen et al., 1999； Shapiro, 1997）。ＭＭＰはサブグループに分類することができ、そのうちの一つはＩＶ型コラゲナーゼまたはゲラチナーゼ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９から構成されている。栄養膜層細胞、破骨細胞、好中球やマクロファージなどの正常な細胞では、ゲラチナーゼの発現は厳密に制御されている。他のＭＭＰと同様に、ゲラチナーゼは不活性型(pro MMP)で分泌されるので、活性化にはタンパク質の開裂が必要である。
【０００３】
ゲラチナーゼや他のＭＭＰの発現量の増加または無制限の発現は、腫瘍脈管形成や転移、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、歯周病などの様々な病気の病因となる。従って、ゲラチナーゼを不活性化せしめる化合物は、癌や炎症性障害に対する治療法となる可能性がある(Sorsa et al., 1994; Lauhio et al., 1991）。数々のＭＭＰ阻害物質が報告されているが、ゲラチナーゼに対する特異的な阻害物質は得られていない（Lauhio et al., 1991）。近年、本発明者らは、このＭＭＰサブグループに対する選択的阻害物質の開発を目的として、ランダムファージペプチドライブラリーのスクリーニングを行った。その結果として得られた最も活性の高いペプチド（ＣＴＴと略す）は、研究に用いたＭＭＰファミリーの酵素のうち、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性を選択的に阻害することが判明した（Koivunen et al., 1999）。また、ＣＴＴはインヴィトロにおける内皮細胞や腫瘍細胞の遊走を阻害するだけでなく、マウスモデルを用いたインヴィヴォの実験では、腫瘍進行を阻害した。これらの結果は、腫瘍の侵入におけるゲラチナーゼの重要性を示した。
【０００４】
腫瘍片を移植したマウスを用いた実験によると、ＣＴＴを発現しているファージを宿主マウスに静脈内注射すると、ＣＴＴを発現しているファージは血管系腫瘍に蓄積されることが示された。腫瘍に対するファージのターゲッティングはＣＴＴペプチドをファージと共に投与すると阻害された（Koivunen et al., 1999）。これらの結果は、ＣＴＴは単独で癌細胞の遊走や脈管形成を阻害する強力な抗腫瘍剤として機能するだけでなく、腫瘍に対する化学療法薬のターゲッティングにも有用であることを示した。
【０００５】
化学療法では、薬のほんの一部のみが癌細胞に届き、残りは正常な組織に損傷を与えることがある。リポソームに封入した癌治療薬を投与することにより、副作用を低減することができる（Lasic et al., 1995）。改良したリポソーム組成物に関する報告もあり、そのような組成物は安定性が向上し、循環器系における寿命が長くなっている（Tardi et al., 1996）。癌細胞に対して選択的なリポソームの開発に関連したインヴィトロとインヴィヴォの研究が報告されている（Northfelt et al., 1996; Adlakha-Hutcheon et al., 1999）。高い選択性は、標的細胞の原形質膜抗原を認識する特異的な抗体でリポソームを誘導化して、細胞によるリポソームの取り込みを増大することで得られる（Storm and Crommelin, 1998）。ＭＭＰ−２（Toth et al., 1997）とＭＭＰ−９（Brooks et al., 1996）は共に特異的な細胞表面受容体と結合するので、これらの酵素は、侵入細胞（腫瘍細胞や脈管形成内皮細胞など）に対するリポソームのターゲッティングにおいて受容体となる可能性がある。
【０００６】
さらに、１９８４年にSearsがアミド結合を介してリン脂質をカルボキシ−ポリエチレングリコール(PEG)にカップリングし、大豆フォスファチジルエタノールアミンを精製して以来、モノメトキシＰＥＧに結合したリン脂質は広く用いられている。リポソームの表面にＰＥＧを付加することにより、リポソーム表面はリポソームを取り囲む水の殻を引き寄せる。この殻は、種々の細胞質タンパクがリポソームの表面に吸収されるのを防ぐため、リポソームは細網内皮組織に認識されず、取り込まれることがない。
【０００７】
発明の概要 
本発明は、特定のＭＭＰ阻害ペプチドが、癌細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上し、癌細胞によるリポソームの取り込みを増加するという知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、腫瘍細胞に対するリポソームのターゲッティングを向上するため、又は腫瘍細胞によるリポソームの取り込みを増加させるための薬剤であって、下記環状アミノ酸モチーフ(cyclic motif)（１）又は直鎖状アミノ酸モチーフ(linear motif)（２）：
Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ  （配列番号１または３）  （１）及び 
Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ  （配列番号４または５）  （２）  
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）
からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフを包含するペプチド化合物を含むことを特徴とする薬剤に関する。
【０００９】
本発明の他の目的は、リポソームを用いた選択的輸送によって、腫瘍細胞に選択的に化学療法薬を到達させる医薬組成物であって、
少なくとも一つの化学療法薬を内包するリポソーム、及び 
環状アミノ酸モチーフ（１）：Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ 及び 直鎖状アミノ酸モチーフ（２）：Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフ
を包含する少なくとも一つのペプチド化合物を包含する医薬組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の更に好ましい態様では、上記の種々の薬剤及び医薬組成物において、リポソーム、好ましくはリポソームの表面、にポリエチレングリコール(PEG)が付加されている。
【００１１】
本発明の更なる目的は、本発明のペプチド化合物を用いて、腫瘍であると考えられる細胞を選択的に標識することを包含する診断用のキットを提供することである。放射性又は磁気性の標識物質を、Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣペプチドに付加するか、あるいはリポソームの内部又は表面に付加し、Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣペプチドによって腫瘍部位に対してターゲッティングを行う。標識したペプチド又はペプチドリポソームを静脈内注射し、標識をガンマ線イメージング又はオートラジオグラフィーで測定することにより、上記キットを用いて腫瘍の診断を行う。
【００１２】
本発明の他の目的は、リポソーム；環状アミノ酸モチーフ（１）：Ｃ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＣ 及び 直鎖状アミノ酸モチーフ（２）：Ｓ(Ｘ)yＨＷＧＦＸＸＳ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｙは２または３の整数である。）からなる群より選ばれるアミノ酸モチーフを包含する少なくとも一つのペプチド化合物；及び検出可能な標識物質を包含する、診断用または画像化用(imaging)の組成物を提供することである。
【００１３】
上記の本発明の目的に適した検出可能な標識物質は、放射性物質、磁気粒子または蛍光性物質である。
【００１４】
以下、添付の図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。
【００１５】
発明の詳細の説明 
本願で使用する略語 
ＣＬＰ          ＣＬＰＧＨＷＧＦＰＳＣ（配列番号７）
ＣＴＴ          ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（配列番号６）
ＣＷＬ          ＣＷＬＴＦＴＨＧＴＣ（配列番号９）
ＤＭＥＭ        ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＥ        ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＲｈｏ    １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノー
ルアミノ−チオカルバモイル−Ｎ−６−テトラメチルローダミン
ＥＣＭ          細胞外マトリックス
ＥＧＦ          上皮増殖因子
ｅｇｇＰＣ      卵黄ホスファチジルコリン
ＬＵＶ          大単層性小胞
ＭＬＶ          複層性小胞
ＭＭＰ          マトリックス金属プロティナーゼ
ＮＢＤ−ＰＥ    １−アシル−２−（（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾー
ル−４−イル）アミノ）ドデカノイル−１−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホ−エタノールアミン
ＮＨＳ          Ｎ−ヒドロキシスルホサクシニミド
ＰＡ            ホスファチジン酸
ＰＣ            ホスファチジルコリン
ＰＥ            ホスファチジルエタノールアミン
ＰＥＧ          ポリエチレングリコール
ＰＯＰＣ        １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリン
ＰＯＰＥ        １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミン
ＲＦＩ          比蛍光強度
ＳＤＳ          ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＴ          ＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳ（配列番号８）
ＴＩＭＰ−２    金属プロティナーゼ−２の組織阻害物質
【００１６】
ゲラチナーゼ阻害ペプチド 
本研究のために、三種のペプチドを選択した（表１）。ＣＴＴは環状のコラーゲナーゼ阻害物質として近年報告されており、腫瘍に対する選択性が知られている（Koivunen et al., 1999）。ＳＴＴはＣＴＴに対応する線状のペプチドであり、ＣＴＴの両末端のシステインがセリンに置換されたものである。３番目のペプチドはＣＴＴの相同体であるＣＬＰであり、Blast 1.4.11 プログラムを用いてSWISS-PROT及びEMBL データベースにおいて相同配列の検索を行って見出したものである。本発明者らの興味はＣＴＴの保存領域にあったので、サーチにはＣＸＸＨＷＧＦＴＸＣ（配列番号２）を用いた（Koivunen et al., 1999）。コンピューターによるサーチの結果、９つの相同体が見つかり、その中の１つがＣＬＰであった。ＣＬＰはヒトのラミニンβ−１鎖（ＬＭＢ１）中のＥＧＦ−７ドメインの一部である。残りの８つの相同体の内、３つは他の種のラミニンであり、１つは免疫グロブリンＨ鎖のものであり、残りの４つはヒトとその他の種のチアジド感受性の塩化ナトリウム共輸送体であった。後者の８つの相同体はＣＴＴとの類似性が低かったので、本発明者らは、ＣＴＴに類似したラミニンＥＧＦ−７ドメインの配列であるＣＬＰに着目した。注目すべきことに、カゼインを用いたザイモグラフィーで３つのペプチド（ＣＴＴ、ＣＬＰ及びＳＴＴ）を分析した結果（図１）、いずれもＭＭＰ−２の活性を著しく阻害した。阻害の程度は、８５μＭ ＣＴＴで約７０％であった。また、ＣＬＰはＭＭＰ−２に対して強力な阻害物質であり、８５μＭで５０％の阻害を起こした。ＣＴＴの直鎖状の類似体であるＳＴＴ（８５μＭ）は、ＭＭＰ−２の活性を約３０％低減した。ＭＭＰ−９についても同様の結果が得られた。
【００１７】
遊離ＣＴＴ及びリポソームと複合体を形成しているＣＴＴは、蛍光性ペプチドを基質として用いたゲラチナーゼ アッセイにおいて、ＭＭＰ−９を阻害した（図１Ｂ）。この結果は、カゼイン ザイモグラフィーの結果と一致した。いずれの分析においても、ＣＴＴ及びＣＴＴ−リポソームのＩＣ５０値は８μＭであった。更にこれらの結果は、ＣＴＴが脂質膜に結合していても、ＭＭＰ−９と相互作用するエピトープは酵素との相互作用が可能な状態で存在していることを示した。このアッセイにおけるＭＭＰ−９（５ｎＭ）の完全な阻害は、１００μＭ ＥＤＴＡを用いて酵素反応に必要なＺｎ2+をキレートすることで達成した。
【００１８】
リン脂質単層との相互作用 
ＣＴＴのアミノ酸組成から、このペプチドが疎水性であることが容易にわかる。従って、ＣＴＴが脂質に結合するかどうかということは非常に興味深い問題である。比較のために、ＣＬＰとＳＴＴについても検討した。脂質−タンパク質間の相互作用や、タンパク質が脂質単層の外側構造に与える影響の研究において生体膜モデルとして広く用いられている、空気／緩衝液界面に存在するリン脂質単層をこの研究に用いた（Soderlund et al., 1999）。脂質単層の下に注入したペプチドの浸透は表面圧力πを増加させたが、脂質単層に侵入しないペプチドは表面圧力を変化させることはなかった。ｅｇｇＰＣ単層の初期表面圧力（π0）は１０〜４０ｍＮ／ｍの間で変動し、下相にペプチド（最終濃度２００μＭ）を加えることによって生じる表面圧力の増加（Δπ）を測定した（図２）。３種のペプチドは全て容易に単層膜に浸透し、Δπの傾きとπ0の傾きは実質的に同じであった。ＣＴＴ、ＳＴＴとＣＬＰのそれぞれの初期単層内包圧力が３８ｍＮ／ｍ、３１ｍＮ／ｍ及び３３ｍＮ／ｍの時に、これらペプチドの膜への浸透は消失した。
【００１９】
リポソームとの相互作用 
ｅｇｇＰＣ脂質単層膜を用いた上記の実験から、ＣＴＴ、ＣＬＰ及びＳＴＴは膜に結合することが判明した。これは、リポソーム濃度を増加させながら測定したトリプトファン（Trp）蛍光発光異方性によって確認された（図３Ａ）。具体的には、リポソームが存在しない場合のｒ値は０．０６５であり、溶液中のペプチドの急速なブラウン回転拡散（Brownian rotational diffusion）を反映している。ところが、リポソームの濃度が増加すると、ｒ値もそれに伴って増加し、リン脂質が２３０μＭの時に測定したｒ値は０．３４９まで増加した。ＣＴＴ：リン脂質モル比が５：９０付近において、５０％最大効果値が得られた。
【００２０】
内因性トリプトファン蛍光を用いて、ペプチドとリポソームの会合によってこの蛍光団のおかれた微環境に起こりうる変化を概算することができる。ＣＴＴのトリプトファン残基について、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定したＩ350／Ｉ330の値は１．４であるが、ＬＵＶ（０．５ｍＭの総リン脂質）の存在下では、この値は１．００まで低下した。従って、ＣＴＴの一部が脂質膜中へと移動するのに伴い、リポソームの存在下でＴｒｐはより疎水性の高い環境下に存在する。更に、リポソームの存在下では、Ｉ-によるＴｒｐの消光は低減され、この結果は、ＣＴＴ中のＴｒｐの一部のみが水溶性の動的消光剤であるＩ-と接触しないことを示している。リポソームの不在下及び存在下におけるシュテルン−フォルマー定数はそれぞれ０．００８７及び０．００３４であった。
【００２１】
脂質結合性のペプチドやタンパク質の中には、脂質小胞の融合を誘発するものがある。この可能性を検討するために、標識したＬＵＶと標識していないＬＵＶをペプチドの不在下及び存在下で混合し、脂質混合体を公知の方法で測定した。しかし、ＣＴＴ、ＳＴＴ及びＣＬＰの中で、１５分以内に測定可能な変化をＮＢＤ−ＰＥの蛍光発光強度に生じたものはなく、脂質混合体の不在が明らかとなった。従って、小胞の半融合体や融合体も存在しなかった（データは示さない）。
【００２２】
細胞によるリポソームの取り込みに与える影響 
上記データは、ＣＴＴはリン脂質に結合するが、リポソームの融合を起こさないことを示した。次に、ＣＴＴをリポソームターゲッティングに用いる可能性について着目した。本発明者らはまず、「材料と方法」の項に記載されている方法で、蛍光脂質マーカーであるＤＰＰＲｈｏをリポソームに内包した。次に、ＣＴＴをこのリポソームに付加し、その後、ゲラチナーゼ発現細胞モデルとして機能するＵ９３７白血病細胞に加えた。５分後に細胞を洗浄し、マイクロプレートリーダーを用いて細胞内の蛍光を測定した。ＣＴＴはリポソームとＵ９３７細胞の会合を促進し、ＣＴＴの存在下では、細胞に結合した蛍光マーカーＤＰＰＲｈｏの量は約３．７倍に増加した（データは示さない）。
【００２３】
次に、本発明者らは、Ｕ９３７細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＲＫ５２Ｅ細胞及びＨＴ１０８０細胞において、ＣＴＴがリポソームに内包したローダミンＢ（水溶性蛍光マーカー）の取り込みを増加させる作用について検討した。同じリポソームであるが、ＣＴＴを加えていないものを対照として用いた。リポソームと共にＣＴＴを細胞に与えた５分後には、蛍光顕微鏡法で可溶性ローダミンによる標識を検出することができた。ＣＴＴはＵ９３７細胞及びＨＴ１０８０細胞においてローダミンの取り込みを増加させたが、ＣＨＯ細胞においては増加させなかった（図４）。Ｕ９３７細胞とＨＴ１０８０細胞は全て蛍光を示したが、各細胞の示す蛍光は不均一に分布しており、他の細胞より蛍光発光が強い細胞が存在した。ＭＭＰ−２と共に、ＭＭＰ−９の発現はリポソームの取り込みに必須である。本発明者らのザイモグラフィーアッセイによってゲラチナーゼを発現しないことがわかっているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＨＴ１０８０細胞及びＵ９３７細胞においてはリポソーム取り込み量の増加が見られるような条件下でも、ＣＴＴ−リポソームの取り込みを示さなかった。
【００２４】
リポソームに包含されたローダミンの取り込みは、蛍光プレートリーダーを用いて定量した。Ｕ９３７細胞においては、ＣＴＴを添加していないリポソームの取り込み量と比べて、ＣＴＴを用いた場合のリポソームに内包されたローダミンの取り込み量は３．６倍も増加した（図５Ａ）。ＳＴＴとＣＬＰによる効果は僅かなものであり、ペプチドを用いずにリポソームを使用した場合と比較しても、検出されるシグナルが弱すぎて、統計的に有意な差は見られなかった。種々の配列を組み合わせた環状ペプチド（scrambled cyclic peptide）であるＣＷＬにもリポソームの取り込みを促進する効果はなかった。ＣＴＴがリポソームの取り込みに与えるのと同様の効果は、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞及びＮＲＫ５２Ｅラット肝臓上皮様細胞にも見られた（データは示さない）。ＣＴＴは遊離ローダミンＢの取り込みは促進しなかった。ＣＴＴによるリポソームの取り込み量の増加は、３７℃では顕著だったが、４℃では見られず、これは、活性化受容体性エンドサイトーシスが関与していることを示唆している（図５Ｂ）。ＴＰＡがＣＴＴ−リポソームの取り込みに与える影響は二相性であり、接触時間が短い場合（１５分）にはリポソーム取り込み量は増加するが、インキュベーションが長い（７５分）場合には、リポソームの取り込みは阻害される。これは、低濃度のゲラチナーゼは主として細胞表面に結合しているが、高濃度の場合には、過剰なゲラチナーゼが細胞外の空間に局在化することによって説明できる（Toth et al., 1997）。
【００２５】
ＣＴＴ−リポソーム複合体の標的としてのゲラチナーゼ 
本発明者らは更に、細胞表面に結合しているゲラチナーゼがＣＴＴ付加リポソームの受容体である可能性について検討した。まず、細胞を洗浄して可溶性のゲラチナーゼを除去し、リポソームを付加する前に、ＭＭＰ阻害物質又は特異的抗体と共に３０分間プレインキュベートした。この実験によって、ＨＴ１０８０細胞によるＣＴＴ付加リポソームのインターナライゼーションは、ＭＭＰ−９に対する抗体によって効果的に阻害されることが判明した。特に、二つのＭＭＰ−９抗体を同時に用いると、蛍光色素を内包したリポソームのインターナライゼーションは完全に抑えられた（図６）。ＭＭＰ−２に対する抗体による阻害は部分的であった。インテグリンβの細胞質領域に対する抗体には効果はなかった。以上の結果によって、抗ＭＭＰ−９抗体及び抗ＭＭＰ−２抗体によるリポソーム取り込みの特異的阻害が示された。
【００２６】
プロティナーゼ阻害物質のパネルを用いた研究の結果、セリンプロティナーゼ阻害物質ではなく、ＭＭＰ阻害物質がリポソームの取り込みを阻害することが判明した。ＭＭＰ阻害物質であるＴＩＭＰ−２とマリマスタット（Marimastat）及びカチオンキレート化剤であるＥＤＴＡもそれぞれ同様の効果を示し、リポソームの細胞への移動を約５０％阻害した（図７）。血清トリプシン阻害剤やアンプロチニンは、１０％ウシ胎仔血清の存在下で培養した細胞においては顕著な阻害効果を示さず、細胞はリポソームを取り込んだ。
【００２７】
抗癌剤として広く用いられているアドリアマイシンは、高い効率でリポソームに内包することができる（Gokhale et al.,1996）。ＣＴＴによるリポソームの取り込みの促進効率及び腫瘍細胞に対する上記治療薬のターゲッティングの効率は、Ｕ９３７培養細胞を用いて研究した。ＣＴＴを濃度が２００μＭ（ＣＴＴ／リン脂質モル比が１：２以下）となるようにリポソーム溶液に添加した。ＣＴＴ及びアドリアマイシンの最終濃度がそれぞれ８５μＭ及び０．４μＭとなるように上記の溶液をＵ９３７細胞に添加した。この研究で使用した濃度においては、合成ペプチドやリポソームは細胞に対して毒性を示さなかった（データは示さない）。ＣＴＴを付加していないリポソームを対照とし、ＥｔｈＤ−１（エチジウムホモダイマー１）分析により細胞死について調べた。２４時間後、ＣＴＴを付加していないリポソームと比較して、４．１倍の細胞死（ｐ＜０．００１）が観察された（図８）。また、ゲラチナーゼ阻害ペプチドであるＳＴＴとＣＬＰも、ＣＴＴ程ではないが、リポソームが内包するアドリアマイシンによる細胞死を増加した。しかし、種々の配列を組み合わせた環状ペプチドであるＣＷＬによる細胞死の増加は見られなかった。ＳＴＴとＣＬＰは死亡細胞数をそれぞれ１．７倍及び１．３倍（ｐ＜０．０１）に増加した。
【００２８】
ＰＥＧ−リポソーム 
本発明者らは、ＰＥＧ−リポソームも調製した。ＰＥＧ−リポソームは、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドのカルボキシ末端に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を介してＰＥＧ−脂質誘導体を結合したものである（Grabarek and Gergely, 1990）。ＰＥＧ（２０００）にカルバメート結合しているＤＰＰＥは、その末端の一方にアミン基を有する。ＰＥＧ−脂質誘導体の使用は、インヴィヴォにおけるリポソームの循環時間を延長する。また、ＤＰＰＥはペプチドをリポソーム表面に固定するので、循環血液中でペプチドがリポソームから離れて会合するのを防止する。ＤＰＰＥは、ゲラチナーゼを多量に発現している腫瘍細胞、腫瘍血管、リウマチ性関節炎や他の疾患組織に対するターゲッティングに利用できる。通常用いられるＰＥＧの分子量は２，０００及び５，０００であるが、６００〜１２，０００のものも用いることができる。複合体の脂質部分としては、短鎖（Ｃ８）、中鎖（Ｃ１４）及び長鎖（Ｃ２０）の脂肪酸や、飽和又は不飽和ＰＥ、コレステロール、セラミドなど様々な脂質が挙げられる。脂質側には、ＰＥからＰＡ、カルジオリピン、コレステロールやセラミドなど、無数の種類の脂質アンカーを用いることができる。本発明では官能基としてアミンを用いているが、ビオチン、マレイミドやカルボキシ−ＮＨＳ−エステルなどの、ペプチドや変性ペプチドをＥＧ誘導体に結合させることができる全ての活性基を用いることができる。
【００２９】
ＣＴＴペプチド／リポソームの細胞による取り込みは、ゲラチナーゼの発現を促進することが知られているホルボールエステルの添加に対応して生じる（図９）。これは、ゲラチナーゼの発現レベルとＣＴＴ−リポソーム取り込みの間に相関性があることを示している。本発明者らの研究においては、ゼラチン ザイモグラフィー アッセイにおいて有意なレベルのゲラチナーゼ発現を示さない、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた。この実験においては、ＣＨＯ細胞ではリポソームターゲッティングは起こらなかった。このことから、ＣＴＴ−リポソームの取り込みは細胞の種類に依存し、細胞種によるゲラチナーゼ発現レベルと相関性があると結論付けるに至った。
【００３０】
リポソームターゲッティング実験を、リポソーム表面にペプチドを有し、ローダミンを内包するリポソームを用いて行ったところ、ターゲッティングは３７℃では起こるが、４℃で起こらなかった。このことは、活性化受容体性エンドサイトーシスが起こらなければ、リポソームのインターナライゼーションも起こらないことを示唆している。
【００３１】
ＣＴＴ−リポソームの取り込みは、短い誘発時間においては、ホルボールエステルの添加との相関性を示す。ホルボールエステルは、ゲラチナーゼの発現を促進することが知られている物質であるため、ＣＴＴ−リポソームの取り込みは、細胞表面のゲラチナーゼ量とも相関性を示す。誘発時間が長くなると、ゲラチナーゼは培地中にも存在する。培地中の遊離ゲラチナーゼ量が増すことにより、リポソーム取り込みは阻害される（図１０）。
【００３２】
リポソームターゲッティングのインヴィヴォの実験も行った。図１１−１のＡは、放射性標識したＣＴＴ−ペプチドリポソームで処理したヌードマウスのガンマ線イメージング画像である。ＣＴＴは、二つのシステイン残基の間でキレート化するテクネチウム−９９ｍで標識した。尾静脈注射の３０分後にガンマ線イメージングを行った。腫瘍部位（移植したＫＳ１７６７カポジ肉腫）を矢印で示した。図１１−１のＢは、リポソームを使用せずにＣＴＴ−ペプチドを投与した実験のガンマ線イメージング画像であり、図１１−２のＣはＣＴＴ−ペプチドを使用せずにリポソームのみを投与した実験の画像である。リポソームには、ヨウ素−１２５で標識したＢＳＡを標識として内包させた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
材料と方法 
材料  −  卵黄ホスファチジルコリン（ｅｇｇＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ローダミンＢ及び０．０１Ｍ リン酸緩衝化生理食塩水（２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ含有；ｐＨ７．４（２５℃））（ＰＢＳ）は米国シグマ社から購入した。１−アシル−２−（（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノ）ドデカノイル−１−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−エタノールアミン（ＮＢＤ−ＰＥ）及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）はアラバマ州、バーミンガム、Avanti社から購入した。他の蛍光性脂質である、１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミノ−チオカルバモイル−Ｎ−６−テトラメチルローダミン（ＤＰＰＲｈｏ）及び蛍光プローブであるフェナントリジニウム、５，５’−［１，２−エタンジイルビス（イミノ−３，１−プロパンジイル）］ビス（３，８−ジアミノ−６−フェニル）−の二塩化物と二塩酸塩（ＥｔｈＤ−１）はオランダ国、ライデン、Molecular Probes社より購入した。ＭＭＰ−２はドイツ国、Boehringer Mannheim GmbHより購入した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）とグルタマックスI（Glutamax I）を含むＲＰＭＩ１６４０細胞培地はスコットランド国、ペイズリー、Gibco Life Technologies社より購入した。リン脂質原液はクロロホルムを用いて調製した。脂質の純度は、珪酸塗装プレート（ドイツ国、ダルムスタット、Merck社）と溶媒としてクロロホルム／メタノール／水溶液（６５：２５：４、ｖ／ｖ）を用いた薄層クロマトグラフィーで確認した。プレートをヨウ素染色に付して試験したが、適切な場合には、蛍光照明法を用いた。いずれの場合も、不純物は検出されなかった。非蛍光性のリン脂質濃度は、高精度電子天秤（米国、カルフォルニア州、セリトス、Cahn Instruments社）を用いた重量測定法により測定した。蛍光性のリン脂質類似体の濃度は、メタノールを溶媒として分光光度法により測定した。この時、モル吸光度εは、ＤＰＰＲｈｏの場合は、５４０ｎｍでε＝９３，０００とし、ＮＢＤ−ＰＥの場合は、４６３ｎｍでε＝２１，０００とした。抗ヒトＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２は、Dr. Timo Sorsa（フィンランド国、ヘルシンキ大学、医療化学及び歯周病学部（Department of Medical Chemistry and Periodontology））より提供されたものである。マリマスタットはBritish Biotech社より購入した。ＴＩＭＰ−２と、ＭＭＰ−２の蛍光原基質であるMCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Argは米国、カルフォルニア州、ラホーヤ、Calbiochem社より購入した。
【００３４】
配列のホモロジー検索 
ＣＴＴ（CTTHWGFTLC）（配列番号６）の相同体は、BLASTP1.4.11MPを用いて、国立生物情報センター（National Center of Bioinformation）が推奨する小ペプチド用の検索方法（identity matrix, word size one、expectation value as 1000）で検索した。他のパラメータは基準値のままで行った。検索対象配列はＣＸＸＨＷＧＦＴＸＣ（配列番号２）とした。９つの類似体が発見され、その中には、ヒト ラミニンβ−１鎖前駆体のＥＧＦ−７ドメインの一部であるＣＬＰＧＨＷＧＦＰＳＣ（以下、「ＣＬＰ」と略す、配列番号７）が含まれていた。ＣＬＰの相同体についても検索し、SWISS−PROT SIMプログラムを用いて比較した。
【００３５】
合成ペプチド 
ペプチドの合成は、Applied Biosystems 433A自動合成機（米国、カルフォルニア州、フォスターシティー、Applied Biosystems製）を用い、フルオレニルメトキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）により行った。２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する５％酢酸（ｐＨ６．０）溶液中で、攪拌しながら室温にて一晩インキュベートし、ジスルフィド結合を形成した（Domingo et al., 1995）。０．１％トリフルオロ酢酸で１：２に希釈した後、ペプチドを分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに装填し、アセトニトリルの濃度勾配で溶離した。合成したペプチドは質量分析法により確認した。この研究に用いたペプチドのアミノ酸配列と省略表記を表１にまとめた。
【００３６】
表１：  ＣＴＴ，ＣＬＰ，ＳＴＴ及びＣＷＬのアミノ酸配列。
保存残基を下線で示し、分子量を括弧に示した。
CTT:  Cys-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys          (1168)（配列番号６）
CLP:  Cys-Leu-Pro-Gly-His-Trp-Gly-Phe-Pro-Ser-Cys      (1203)（配列番号７）
STT:  Ser-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Ser          (1136)（配列番号８）
CWL:  Cys-Trp-Leu-Thr-Phe-Thr-His-Gly-Thr-Cys          (1168)（配列番号９）
【００３７】
ゲラチナーゼのアッセイ 
種々の合成ペプチドによるＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の阻害を、カゼイン ザイモグラフィーによって測定した（Halinen et al., 1996）。ＭＭＰ−９は公知の方法（Sorsa et al., 1997）で精製した。次いで、ＭＭＰ−２（２．５μｇ）又はＭＭＰ−９（２．５μｇ）を、２ｍｇ／ｍｌのカゼインを含有する１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。泳動後のゲルは、ＳＤＳを除去するためにＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有緩衝溶液を用いて洗浄し、次に５つに切りわけ、ペプチド（ＣＴＴ、ＣＬＰ、ＣＷＬ又はＳＴＴ）含有溶液（８５μＭ）に漬浸した。３７℃で４８時間インキュベートした後、ゲルをクーマシーブルーで染色し、スキャンした後に消化した領域を画像解析により定量した（Global Lab Image 3.2、米国、マサチューセット州、マールボロ、Data Translation社及びAcuity Imaging社製）。
【００３８】
ＭＭＰ−９の活性も、蛍光原ペプチド基質 Mca-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg（米国、カルフォルニア州、サンディエゴ、Calbiochem社製）を用いて測定した。具体的には、５０ｎｇのＭＭＰ−９を、ＣＴＴ又はリポソーム複合体の不在下又は存在下において、ＰＢＳ中、室温で３０分間プレインキュベートした。次いで、蛍光原基質を最終濃度が０．１ｍＭとなるように添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、その後、マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長３４０ｎｍと発光波長３９０ｎｍにおいて、蛍光強度を測定した。
【００３９】
ペプチドと脂質単層との相互作用 
ペプチドの単分子脂質膜への浸透は、磁気攪拌型円形ウエル（下相体積：４００μｌ）を用いて測定した。表面圧力（π）は、ペンティアムＰＣに接続した微量天秤（商品名：μThroughS；フィンランド国、ヘルシンキ、Kibron Inc.製）に繋がっているヴィルヘルミーワイヤーを用いて観測した。脂質はクロロホルム（約１ｍｇ／ｍｌ）溶液として、空気−緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７）界面上に種々の初期表面圧力（π0）となるように脂質を分散させた。脂質は１５分間放置して平衡化し、下相に目的のペプチド（４μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ水溶液、ＣＷＬのみＤＭＳＯ溶液）を添加した。ペプチド添加後の初期表面圧力（π0）の増加は２０分で完了し、π0値と、ペプチドが膜へ結合した後に測定した値との差をΔπとした。全ての測定は室温（＋２４℃以下）で行った。データはΔπ対π0のグラフで示した（Brockman, 1999）。
【００４０】
リポソームの調製 
脂質原液をクロロホルムと混合して所望の組成物を得た。窒素緩気流下で溶媒を除去した後、残存脂質を減圧下で少なくとも２時間保持した。乾燥した脂質を室温で水和することで多層リポソームを形成するが、脂質濃度が１ｍＭとなるように、ローダミンＢ（１０μＭ）又はアドリアマイシン（１．８μＭ）を含有する１ｍｌ ＰＢＳを用いて水和し、上記薬剤をリポソームに内包した。多層リポソーム内包性を高めるために、凍結融解を５回繰り返した（Clifford et al., 1990）。大単層性小胞（ＬＵＶ）は以下のように調製した。空気圧で運転する小容量ホモジナイザー（LiposoFast Pneumatic gas pressure operated small-volume homogenizer）（カナダ国、オタワ、Avestin社製）と孔径が１００ｎｍのポリカーボネート膜（米国、カルフォルニア州、プレザントン、Nucleapore社製）を用いて、ＭＬＶ分散液の押出し成形を１９回行った。押出圧力は２５ｐｓｉ（約１７０ｋＰａ）とした。ペプチドを内包したものについては、脂質及びペプチドの最終濃度がそれぞれ１ｍＭと０．５ｍｇ／ｍｌとなるように、ペプチド（２ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液、ＣＷＬのみＤＭＳＯ溶液）をＬＵＶと混合した。
【００４１】
ＰＥＧ−リポソームの調製 
ＰＥＧ（２０００）にカルバメート結合しているＤＰＰＥは、その末端にアミン基を有する。ＰＥＧ−脂質誘導体は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を介してＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチドのカルボキシル末端に結合する（Grabarek and Gergly, 1990）。ＣＴＴ−ＰＥＧ−ＰＥはゲルろ過により精製した。４％ＣＴＴ−ＰＥＧ−ＰＥを１６％ＰＯＰＥ及び８０％ＰＯＰＣ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）に添加し、上記した方法でリポソームを調製した。
【００４２】
蛍光分光スペクトル分析 
リポソーム中のＣＴＴ、ＳＴＴ、ＣＬＰ及びＣＷＬのトリプトファン残基の環境について、蛍光分光法で検討した。Ｔｒｐ蛍光ピークは、水中では３５０ｎｍ以下に観測されるが、疎水性の環境下では、３３０ｎｍ近傍に発光の中心が観測された。従って、Ｔｒｐの微環境の変化は、３３０ｎｍにおける発光強度に対する３５０ｎｍにおける発光強度の比（Ｉ350／Ｉ330）を測定することで観測することができる（Lakowicz, 1999）。トリプトファンの蛍光は、磁気攪拌機及び恒温キュベットを付属したPerkin Elmer LS 50B蛍光分光計を用いて記録した。全ての測定は３７℃において、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳと０．１ｍＭ ＥＤＴＡからなるｐＨ７．４の緩衝液中で行った。励起波長及び発光波長の帯域はいずれも１０ｎｍであった。励起波長は２９５ｎｍで、発光スペクトルは３００〜４００ｎｍの範囲で記録した。ＣＴＴ、ＳＴＴ、ＣＬＰ及びＣＷＬのＴｒｐ発光スペクトルは、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ（８０／２０、ｍｏｌ／ｍｏｌ）ＬＵＶの不在下及び存在下で記録し、最終脂質濃度が１０μＭ及び１００μＭの資料について測定した。
【００４３】
増加するリポソーム濃度に対する関数としてＣＴＴのＴｒｐ残基の蛍光偏光を測定した。測定には、１０ｎｍ帯域における励起及び発光光線中の回転偏光子を用いて測定した。結果は、以下の式で求めた発光異方性（Lakowicz, 1999）として表した。
ｒ＝（ＩII−Ｉ⊥）／（ＩII＋２Ｉ⊥）  。
（式中、Ｉ⊥及びＩIIは、それぞれ励起偏光子に対する垂直方向及び平行方向の発光強度を表す。）
【００４４】
Ｔｒｐが水相へ露出される度合については、Ｉ-を動的消光剤として用いて検討した（Lakowicz, 1999）。消光度は下記式より算出した。
Ｆ0／Ｆ＝１＋ｋ［Ｑ］＝１＋ｋqτ0［Ｑ］
（式中、Ｆ0とＦはそれぞれ消光剤Ｑの不在下及び存在下で、３４５ｎｍにおける蛍光強度を表し、τ0は消光剤不在下における蛍光の寿命を表し、ｋはシュテルン−フォルマー定数（データを直線近似して得られた傾きから算出）を表す。）
ＣＴＴ（５μＭ）の存在下におけるＴｒｐの蛍光及び消光は、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ（８０／２０、ｍｏｌ／ｍｏｌ）ＬＵＶ（最終脂質濃度０．５ｍＭ）の不在下及び存在下で測定した。得られた結果は、ＰＢＳとリポソームによって引き起こされたバックグラウンド値について補正した。
【００４５】
脂質の混合に関する分析 
ＣＴＴ、ＣＬＰ、ＳＴＴ及びＣＷＬペプチドがリポソームの融合を誘発する能力については、脂質混合性を公知の方法（Struck et al., 1981）で分析することによって求めた。簡単に説明すると、ＮＢＤ−ＰＥ（Ｘ＝０．０１）及びＤＰＰＲｈｏ（Ｘ＝０．０１）をリポソーム（ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ、７８／２０、ｍｏｌ／ｍｏｌ）に内包させた。ＮＢＤ−ＰＥ（供与体）の発光スペクトルとＤＰＰＲｈｏ（受容体）の吸収スペクトルが重なるため、これらの染料間の共鳴エネルギー移動は非常に効率的である。ＮＢＤ−ＰＥ及びＤＰＰＲｈｏを内包するリポソームを、未標識のリポソームと混合するため、リポソームの融合は、プローブの希釈によるＮＢＤ−ＰＥの発光強度の増加として観測される。４３０ｎｍ及び５３０ｎｍにおけるＮＢＤ−ＰＥの励起波長及び発光波長を用いた。全ての蛍光測定は３７℃で行った。
【００４６】
細胞によるリポソームの取り込みの分析 
種々のペプチドが、細胞によるリポソームの取り込みに与える影響を検討するために、トレーサーとして、ローダミンで標識したリン脂質類似体（ＤＰＰＲｈｏ）をリポソームに導入し、組成物ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ／ＤＰＰＲｈｏ（８０：１９：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）を得た。目的のペプチドをＬＵＶと混合し、マイクロタイターウェルプレート上の培養細胞に添加した。３８℃で５分間インキュベートしたあと、細胞に結合していないリポソームを除去するために、冷たいＰＢＳで三回洗浄した。細胞に結合したＤＰＰＲｈｏの相対量は、Tecan Spectrafluor Plusマイクロプレートリーダー（スイス国、ホモブレヒティゴン（Hombrechtigon）、Tecan社製）を用い、励起波長５３５ｎｍ及び発光波長５９５ｎｍにて測定した。
【００４７】
別系列の実験では、水性蛍光マーカーであるローダミンＢをリポソームに内包し、細胞によるリポソームの取り込みを測定した。ローダミンＢの取り込みを測定するための試料は以下のように調製した。１０μＭ ローダミンＢを含有する６０μＭ ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ（８０／２０、ｍｏｌ／ｍｏｌ、１ｍＭ）を、１０％ウシ胎仔血清、グルタマックスI、ペニシリン １００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭ培地３００μｌと混合した。次いで最終濃度８．５μＭとなるようにペプチドを添加した。目的の細胞を含有する培地１０μｌ（細胞数：１０5）をＬＵＶと混合した。３７℃又は＋４℃で１５分間インキュベートした後、９６−ウェルプレートを冷たいＰＢＳで三回洗浄することで、細胞に結合していないリポソームを除去した。４℃の実験は、細胞によるエンドサイトーシス以外の経路によるリポソームの取り込みを示す対照実験とした（Oess and Hildt, 2000）。細胞と会合したローダミンＢの相対量は、マイクロプレートリーダーを用い、励起波長５３５ｎｍと発光波長５９５ｎｍにて測定した。
【００４８】
また、本発明者らは、ホルボールエステル（ＴＰＡ）（５０ｎＭ）を用いて細胞をプレインキュベートした。プレインキュベーション時間は１５〜７５分の間で変化させた。ホルボールエステル（ＴＰＡ）で細胞を処理すると、ＭＭＰ−９の発現と分泌の両方が増加した（Toth et al., 1997）。結果は、ＲＦＩ＝Ｉ／Ｉ0で表し、ＲＦＩは比蛍光強度を表し、Ｉ0は対照（ペプチドの不在下における、ＬＵＶ中の２μＭローダミンＢ）の発光強度を表し、Ｉは細胞に取り込まれたペプチド−リポソーム複合体のローダミン発光を表す。目的抗体（αＭＭＰ−９及びαＭＭＰ−２）やゲラチナーゼ阻害化合物（ＴＩＭＰ−２、マリマスタット及びＥＤＴＡ）が、ＨＴ１０８０細胞によるローダミンＢ内包リポソームの取り込みに及ぼす影響については、前述したように測定した。Ｍ−１７はＭＭＰ−９が基質に結合するのを阻害し、この阻害は濃度依存性であると考えられている。ウサギポリクローナル抗体がヒトＭＭＰ−２を阻害するかどうかは不明である（Murphy et al., 1994）。目的ペプチド、アドリアマイシン、抗体及びリポソームの最終濃度はそれぞれ８５μＭ、０．２ｍＭ、２０μｇ／ｍｌ及び０．４μＭである。
【００４９】
細胞培養及び蛍光顕微鏡法 
Ｕ９３７細胞（ECACC 85011440）、ＨＴ１０８０細胞（ECACC 85111505）及びＣＨＯ細胞（ECACC 85050302）をそれぞれＲＰＭＩ培地、又は１０％ウシ胎仔血清、グルタマックスI、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。培養細胞によるローダミンＢ内包リポソームの取り込みを蛍光顕微鏡法により検証した。ニコン長作動距離対物レンズ（２０ｘ）と（４０ｘ）を装備した倒立蛍光顕微鏡（Zeiss IM 35）を用いた。試料は、ローダミン取り込み分析で述べた方法に若干変更を加えた方法で調製した。すなわち、洗浄する代わりに、ローダミン内包リポソームを取り込んだ、細胞培養液中のＵ９３７細胞、ＨＴ１０８０細胞及びＣＨＯ細胞をNunclon 48プレートのウエルに移した。励起波長及び発光波長は、各々５３５ｎｍ及び＞６００ｎｍを通過する適当な帯域フィルター（Melles-Griot製）から選択した。蛍光画像は、コンピューターに接続したペルチエ冷却（Peltier-cooled）式デジタルカメラ（C4742-95）（日本国、浜松市）を用いて観察し、製造社が付属したソフトウェア（Hipic 5.0）を用いて作動させた。
【００５０】
生存率の分析 
アドリアマイシンを内包したペプチド−リポソーム複合体を上記した方法で製造し、ペプチド、脂質及びアドリアマイシンの最終濃度がそれぞれ８５μＭ、０．２ｍＭ及び０．４μＭとなる複合体を得た。次いで、得られた複合体をＵ９３７細胞試料１０μｌ（細胞数：１０5個）に添加した。死亡細胞を検出するためにＥｔｈＤ−１を用いた。この発蛍光団は膜不透過性で、ＤＮＡに結合したときのみ蛍光を発する（Papadopoulos et al., 1994）。従って、ＥｔｈＤ−１は容易に死亡細胞に侵入してＤＮＡに結合するので、その蛍光強度は死亡細胞数と相関する。ＥｔｈＤ−１の発光は、励起波長４９５ｎｍと発光波長６３５ｎｍにおいて、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。統計的有意差を求めるために、Student's t-試験を用いた。
【００５１】
インヴィヴォにおけるリポソームターゲッティング実験 
ＢＳＡのヨウ素化は、ヨードゲン１，３，４，６−テトラクロロ−３，６−ジフェニルグリコールウリル法（Iodogen 1,3,4,6-tetrachloro-3,6-diphenylglycoluril method）で行った。簡単に説明すると、１００μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）のＢＳＡと125Ｉ（５０ＭＢｇ）をヨードゲン塗布バイアル内で混合した。遊離ヨードゲンを分離するために、ＰＤ−１０ゲルカラムを用いて反応物をろ過した。ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ（８０：２０ｍｏｌ／ｍｏｌ）リポソームの調製及びヨウ素化されたＢＳＡの内包は公知の方法で実施した。99mＴｃで標識したＣＴＴ−ペプチドはヘルシンキ大学病院のDoc. SL Karonenが製造した。注射したＣＴＴ及び脂質の濃度はそれぞれ８．５〜８５μＭ及び０．２ｍＭであった。注射は尾静脈から行い、容量は５０〜２００μｌであった。ペプチドの最終細胞質濃度は０．０８５〜１７μＭとなった。
【００５２】
ガンマ線イメージングは、注射の３０分後に行った。ガンマ線イメージングは、Odysseyコンピューターに接続したPicker Prism 1500XPシングルヘッドガンマ線カメラ（オハイオ州、ハイランドハイツ、Picker International製）を用いた。背中にカポジ肉腫を移植した、体重１６〜２１ｇのヌードＮＭＲＩマウス２５匹を実験に用いた。
【００５３】
参考文献 
Adlakha-Hutcheon, G., Bally, M.B., Shew, C.R., and Madden, T.D.  Controlled destabilization of a liposomal drug delivery system enhances mitoxantrone antitumor activity.  Nature Biotechnol. 17: 775-779, 1999.
Brockman, H. Lipid monolayers: why use half a membrane to characterize protein-membrane interactions?  Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 425-427, 1999.
Brooks, P.C., Stromblad, S. Sanders, L.C., von Schalscha, T.L. Aimes, R.T. Stetler-Stevenson, W.G. Quigley, J.P., and Cheresh, D.A. Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin αvβ3.  Cell 85: 683-693, 1996.
Clifford, C.J., Warren, E.L. Richard, T.W., and Pfeiffer, D.R.  Factors affecting solute entrapment in phospholipid vesicles prepared by the freeze-thaw extrusion method: a possible general method for improving the efficiency of entrapment.  Chem. Phys. Lipids 55: 73-83, 1990.
Domingo, G.J., Leatherbarrow, R.J., Freeman, N., Patel, S., and Weir, M.  Synthesis of a mixture of cyclic peptides based on the Bowman-Birk reactive site loop to screen for serine protease inhibitors.  Int. J. Peptide Protein Res. 46: 79-87, 1995.  
Gokhale, P.C., Radhakrishnan, B., Husain, S.R., Abernethy，D.R., Sacher, R., Dritschilo, A., and Rahman, A.  An improved method of encapsulation of doxorubicin in liposomes: pharmacological, toxicological and therapeutic evaluation.  Br. J. Cancer 74: 43-48, 1996.
Grabarek, Z. and Gergerly, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters.  Anal. Biochem. 185, 131-135, 1990.
Halinen, S., Sorsa, T., Ding, Y., Ingman, T., Salo, T., Konttinen, Y.T., and Saari, H.  Characterization of matrix metalloproteinase (MMP-8 and -9) activities in the saliva and in gingival crevicular fluid of children with Down's syndrome.  J. Periodontology 67: 748-754, 1996.
Koivunen, E., Arap, W., Valtanen, H., Raininsalo, A., Penate Medina, O., Heikkila, P., Kantor, C., Gahmberg, C.G., Salo, T., Konttinen, Y.T., Sorsa, T., Ruoslahti, E., and Pasqualini, R.  Cancer therapy with a novel tumor-targeting gelatinase inhibitor selected by phage peptide display.  Nature Biotechnol. 17: 768-774, 1999.
Lakowicz, J.R.  Principles of Fluorescence Spectroscopy.  Plenum Press, New York and London, Ch 5, pp. 111-153, 1999.
Lasic, D.D., Ceh, B., Stuart, M.C., Guo, L., Frederik, P.M., and Barenholz, Y.  Transmembrane gradient driven phase transitions within vesicles: lessons for drug delivery.  Biochim. Biophys. Acta 1239: 145-156, 1995.
Lauhio, A., Leirisalo-Repo, M., Lahdevirta, J., Saikku, P., and Repo, H.  Doubleblind, placebo-controlled study of the three month treatment with lymecyclinein reactive arthritis, with special reference to Chlamydia arthritis.  Arthritis Rheum. 24: 6-14, 1991.
Murphy, G., Nguyen, Q., Cockett, M., Atkinson, S., Allan, J., Knight, C., Willenbrock, F., Docherty, A.  Assessment of the role of the fibronectin-like domain of gelatinase A by analysis of a deletion mutant.  J. Biol. Chem. 269: 6632-6636, 1994.
Northfelt, D.W., Martin F.J., Working P., Volberding, P.A., Russell, J., Newman, M., Amantea, M.A., and Kaplan, L.D.  Doxorubicin encapsulated in liposomes containing surface-bound polyethylene glycol: pharmacokinetics, tumor localization, and safety in patients with AIDS-related Kaposi's sarcoma.  J. Clin. Pharmacol. 36: 55-63, 1996.
Oess, S., and Hildt, E.  Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surface antigens.  Gene Therapy. 7: 750-758, 2000.
Papadopoulos, N.G., Dedoussis, G.V., Spanakos, G., Gritzapis, A.D., Baxevanis, C.N., and Papamichail, M.  An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxity using flow cytomethry.  J. Immunol. Meth. 177: 101, 1994.  
Sears, B.D. (1984).  Synthetic Phospholipid Compounds.  US Patent 4,426,330.  
Shapiro, S.D.  Mighty mice: transgenic technology “knocks out” questions of matrix metalloproteinase function.  Matrix Biol. 15: 527-533, 1997.
Sorsa, T., Ding, Y., Salo, T., Lauhio, A., Teronen, O., Ingman, T., Ohtani, H., Andoh, N., Takeha, S., and Konttinen, Y.T.  Effects of tetracyclines on neutrophil, gingival, and salivary collagenases.  A functional and western-blot assessment with special reference to their cellular sources in periodontal diseases.  Ann. N.Y. Acad. Sci. 732: 112-131, 1994.
Sorsa, T., Salo, T., Koivunen, E., Tyynela, J., Konttinen, Y.T., Bergmann, U., Tuuttila, A., Niemi, E., Teronen, O., Heikkila, P., Tschesche, H., Leinonen, J., Osman, S., and Stenman.  Activation of type IV procollagenases by human tumor-associated trypsin-2.  J. Biol. Chem. 272: 21067-21074, 1997.
Storm, G., and Crommelin, D.J.A.  Liposomes: quo vadis?  Pharm. Sci. & Tech.  Today 1: 19-31, 1998.  
Struck, D.K., Hoekstra, D., and Pagano, R.E.  Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion.  Biochemistry 20: 4093-4099, 1981.  
Soderlund, T., Lehtonen, J.Y.A., and Kinnunen, P.K.J.  Interactions of cyclosporin A with phospholipid membranes: effect of cholesterol.  Mol. Pharm. 55: 32-38, 1999.  
Tardi, P.G., Boman, N.L., and Cullis, P.R.  Liposomal doxorubicin.  J. Drug Target. 4: 129-140, 1996.  
Toth, M., Gervasi, D.C., and Fridman, R.  Phorbol ester-induced cell surface association of matrix metalloproteinase-9 in human MCF10A breast epithelial cells.  Cancer Res. 57: 3159-3167, 1997.  
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】８５μＭのＣＴＴ、ＣＬＰ、ＳＴＴ及びＣＷＬペプチドによるＭＭＰ−２活性の阻害をカゼイン ザイモグラフィーで検出した結果である。結果は、阻害されていないＭＭＰ−２の面積を１００％とした時の、阻害した面積をパーセンテージで表した。エラーバーは、別々に行った３回の実験の標準偏差を示す。
【図１Ｂ】遊離ＣＴＴ（○）及びリポソームに結合したＣＴＴ（●）によるＭＭＰ−９の阻害を、「材料と方法」の項に記載した蛍光団基質を用いて測定した結果である。リン脂質の総濃度は２００μＭ ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ（８０／２０ ｍｏｌ／ｍｏｌ）とした。データのプロットは３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図２】ＣＴＴ（●）、ＣＬＰ（■）、及びＳＴＴ（黒い三角）のｅｇｇ  ＰＣ単層への浸透は、目的のペプチドを水性下相に注入した後の表面圧力（Δπ）の増加によって明かとなった。データは初期表面圧力（π0）に対する関数として示した。
【図３Ａ】ＣＴＴのＴｒｐ残基の異方性（ｒ）を、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ（８０／２０ ｍｏｌ／ｍｏｌ）濃度に対する関数として表したグラフである。データのプロットは５回の測定の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。シグナル対ノイズ比を向上するために、シグナルは平均１５秒になるようにした。ＣＴＴ濃度はＰＢＳ中５μＭであり、温度は３７℃であった。
【図３Ｂ】遊離ＣＴＴ（○）及びそのリポソーム複合体（●）のＴｒｐ発光強度を、Ｉ-を水溶性動的消光剤として用いて測定した結果である。各データのプロットは別々に行った２回の実験の結果を示す。
【図４−１】Ｕ９３７細胞によるローダミンＢの取り込みを示す蛍光顕微鏡像であり、蛍光マーカーを内包するＰＣ／ＰＥ（８０／２０モル比）リポソームを、後述するように、ターゲッティングペプチドＣＴＴを付加するか付加せずに細胞とインキュベートした結果である。パネルＡとＢはそれぞれＣＴＴを付加したリポソーム及びＣＴＴを付加していないリポソームを用いた結果を示す。
【図４−２】ＣＨＯ細胞によるローダミンＢの取り込みを示す蛍光顕微鏡像であり、図４−１と同様の実験を行った結果を示す。パネルＣとＤはそれぞれＣＴＴを付加したリポソーム及びＣＴＴを付加していないリポソームを用いた結果を示す（但し、露光時間は十倍にした）。
【図４−３】ＨＴ１０８０細胞によるローダミンＢの取り込みを示す蛍光顕微鏡像であり、図４−１と同様の実験を行った結果を示す。パネルＥとＦはそれぞれＣＴＴを付加したリポソーム及びＣＴＴを付加していないリポソームを用いた結果を示す（但し、露光時間は十倍にした）。
【図５Ａ】Ｕ９３７細胞によるローダミンＢ内包リポソーム（ＰＣ／ＰＥ、８０／２０モル比）の取り込みに目的ペプチドが与える影響。総脂質濃度、ローダミンＢ濃度及びペプチド濃度はそれぞれ２００μＭ、２μＭ及び１００μＭであった。ペプチド（Ｉ）を付加したリポソームと共にインキュベートした細胞のローダミン蛍光を、ペプチドを付加していないリポソームと共にインキュベートした細胞のローダミン蛍光と比較することで規格化した。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図５Ｂ】溶性蛍光マーカーであるローダミンＢを内包したリポソームにＣＴＴを付加した。ＨＴ１０８０細胞による発蛍光団の取り込みは、リポソームと共に細胞を３７℃又は４℃で３０分間インキュベートした後に測定した。各データのプロットは、３つのウェルの測定値の平均値±標準偏差で示した。
【図６】ＨＴ１０８０細胞によるローダミンＢ内包リポソーム（ＰＣ／ＰＥ、８０／２０、モル比）の取り込みに目的の抗体が与える影響を示す。結果は、抗体を含有しない培地において、ＣＴＴペプチドを付加したリポソームと細胞をインキュベートした際のローダミン蛍光を１００％として、阻害をパーセンテージで表した。抗ＭＭＰ−２抗体と抗ＭＭＰ−９抗体を抗体として用い、インテグリンβ３の細胞質領域に対する抗体を対照抗体として用いた。目的ペプチド、アドリアマイシン、抗体及びリポソーム（総リン脂質として表す）の最終濃度はそれぞれ８５μＭ、０．２ｍＭ、２０μｇ／ｍｌ及び０．４μＭであった。エラーバーは別々に行った４回の実験の標準偏差を示す。
【図７】ＨＴ１０８０細胞によるローダミンＢ含有リポソーム（ＰＣ／ＰＥ、８０／２０モル比）の取り込みに目的のゲラチナーゼ阻害物質が与える影響を示す。結果は、抗体を含有しない培地において、ＣＴＴペプチドを付加したリポソームと細胞をインキュベートした際のローダミン蛍光を１００％として、阻害をパーセンテージで表した。使用した阻害物質はＴＩＭＰ−２（１０μ／ｍｌ）である。マリマスタット（５０μＭ）はＭＭＰファミリーの阻害剤であり、ＥＤＴＡはＺｎ2+キレーター（５００μＭ）であり、アプロチニン（１μｇ／ｍｌ）はセリンプロテアーゼ阻害剤である。目的ペプチド、ローダミン及びリポソーム（総リン脂質量として表す）の最終濃度はそれぞれ８５μＭ、０．２ｍＭ及び０．４μＭであった。エラーバーは別々に行った４回の実験の標準偏差を示す。
【図８】アドリアマイシン内包リポソームの誘発するＵ９３７細胞の細胞死にＣＴＴ、ＣＬＰ、ＳＴＴ及びＣＷＬが与える影響を、ＥｔｈＤ−１蛍光アッセイにより比較した。アドリアマイシン（２００ｎｇ／ｍｌ）を内包するリポソーム（総リン脂質濃度２００μＭ、ＰＣ／ＰＥ、８０／２０、モル比）と目的ペプチドを細胞とインキュベートした。目的ペプチド、アドリアマイシン及びリポソーム（総リン脂質量として表す）の最終濃度はそれぞれ８５μＭ、０．２ｍＭ及び０．４μＭであった。結果はＲＦＩ／ＲＦＩ0で示し、ＲＦＩ0はペプチドを付加していないアドリアマイシン内包リポソームと共にインキュベートした細胞の値である。ペプチドの濃度は８５μＭであった。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図９】ＣＴＴ−リポソームの取り込みは、短い誘発時間においては、ホルボールエステルの添加量との相関性を示す。ホルボールエステルは、ゲラチナーゼの発現を促進することが知られている物質であるため、ＣＴＴ−リポソームの取り込みは、細胞表面のゲラチナーゼ量とも相関性を示す。誘発時間が長くなると、ゲラチナーゼは培地中にも存在する。培地中の遊離ゲラチナーゼ量が増すことにより、リポソーム取り込み量は阻害される。
【図１０】ＣＴＴ−ＰＥＧ−リポソームを用いた、ＨＴ１０８０細胞に対するシトクロムｃのターゲッティング。細胞生存率はＭＴＴアッセイにより測定し、結果は５９０ｎｍにおける比蛍光強度で表した。「添加なし」は、毒性薬剤を添加しない場合の細胞の生存率を表す。「リポソームに内包されていない薬剤」は、リポソームを用いずに、細胞にシトクロムｃを添加したものを表す。「非選択的薬剤内包リポソーム」は、ＰＥＧと結合しているが、ＣＴＴを付加していないリポソームを表す。「ＣＴＴ−薬剤リポソーム」はＰＥＧと結合したリポソームであって、そのＰＥＧの末端にＣＴＴペプチドが結合している。
【図１１−１】ＫＳ腫瘍モデルを用いた、ヌードマウス内の腫瘍に対するＴｃ９９ｍ−標識したＣＴＴ及び／又はリポソームのターゲッティング。（Ａ）はＣＴＴを付加したリポソームを用いた結果であり、（Ｂ）は標識したＣＴＴのみを用いた結果である。
【図１１−２】ＫＳ腫瘍モデルを用いた、ヌードマウス内の腫瘍に対するターゲッティング。（Ｃ）はＩ−１２５−標識したリポソームを用いた結果である。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１〜５において、第２位の他のアミノ酸Xaaは、いかなるアミノ酸でもよい。