(57)【要約】  大腸癌の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出方法、及びＣＯＸ−２を含む大腸癌の病期の診断用キットの提供。  工程：ａ）糞便を採取し、凍結する工程、ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、ｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程、ｇ）検出されたｃＤＮＡ量を定量する工程及びｈ）得られたｃＤＮＡ量が大腸癌のいずれの病期に属するかを決定する工程を含む、大腸癌の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）糞便を採取し、凍結する工程、
ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、
ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、
ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、
ｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程、
ｇ）検出されたｃＤＮＡ量を定量する工程、及び
ｈ）得られたｃＤＮＡ量が大腸癌のいずれの病期に属するかを決定する工程
を含む大腸癌及び大腸腺腫の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出方法。
【請求項２】
下記手段：
ａ）糞便を採取し、凍結する手段、
ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する手段、
ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る手段、
ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する手段、
ｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する手段、
ｇ）検出されたｃＤＮＡ量を定量する手段、及び
ｈ）得られたｃＤＮＡ量が大腸癌のいずれの病期に属するかを決定する手段
を含む大腸癌及び大腸腺腫の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出方法、及びＣＯＸ−２を含む大腸癌の病期の診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第２番目に多い癌である（１９９９年度癌死統計）。また、２０１５年の癌罹患数推計では、男女ともに第一位になると推計されており、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が求められており、癌の集団検診は、最も効果的な方法の一つである。【０００３】
癌の集団検診（mass screening）のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。【０００４】
本発明者は、すでに、場合により凍結した生物学的試料をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下に均質化することによって、大腸癌の診断に有用な腫瘍マーカーを糞便中から検出する方法を開発している（ＷＯ２００４／０８３８５６Ａ１）。【０００５】
本発明者は、さらに、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７からなる群より選択される１以上の腫瘍マーカー（ただし、ＣＯＸ−２又はＭＭＰ−７のいずれかのみを除く）を採用することによって、上記方法の感度、特異度及び臨床的有用度を改善した方法も開発した。【０００６】
しかし、上記方法においても提供される情報は大腸癌の有無等の定性的なものにとどまり、癌病期等のより質的に高い情報の提供が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、大腸癌の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出方法、及び当該腫瘍マーカーを含む大腸癌の病期の診断用キットを提供することにある。【０００８】
より具体的には、本発明は、下記に関する。
１．下記工程：
ａ）糞便を採取し、凍結する工程、
ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、
ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、
ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、
ｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程、
ｇ）検出されたｃＤＮＡ量を定量する工程、及び
ｈ）得られたｃＤＮＡ量が大腸癌のいずれの病期に属するかを決定する工程
を含む大腸癌及び大腸腺腫の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出方法。
２．下記手段：
ａ）糞便を採取し、凍結する手段、
ｂ）凍結した糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
ｃ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する手段、
ｄ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る手段、
ｅ）得られたｃＤＮＡを増幅する手段、
ｆ）増幅されたｃＤＮＡを検出する手段、
ｇ）検出されたｃＤＮＡ量を定量する手段、及び
ｈ）得られたｃＤＮＡ量が大腸癌のいずれの病期に属するかを決定する手段
を含む大腸癌及び大腸腺腫の病期の診断のためのＣＯＸ−２の検出キット。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＣＯＸ−２の結果を示す。早期癌と進行癌でのＣＯＸ−２の発現レベルに統計的有意差があり（P＝０．０３４）、進行癌で高い。（＋＋）以上の発現レベルならば進行癌である確率は８９．７％である。
【図２】ＳＮＡＩＬの結果を示す。早期癌と進行癌でのＳＮＡＩＬの発現レベルに統計的有意差はないが、進行癌で高い傾向がある（P＝０．０６０）。（＋＋）以上の発現レベルならば進行癌である確率は９１．７％である。
【図３】ＭＭＰ−７の結果を示す。早期癌と進行癌でのＭＭＰ−７の発現レベルに統計的有意差はないが、進行癌で高い傾向がある（P＝０．０５６）。（＋＋）以上の発現レベルならば進行癌である確率は８５．７％である。
【図４】ＣＯＸ−２の結果を示す。左側癌と右側癌でのＣＯＸ−２の発現レベルに統計的有意差はなく（P＝０．２１）、（＋＋）以上の発現レベルならば左側癌である確率は７７．１％である。尚、左側癌は下行結腸、S状結腸、直腸に存在する癌であり、右側癌は盲腸、上行結腸、横行結腸に存在する癌のことである。
【図５】ＳＮＡＩＬの結果を示す。左側癌と右側癌でのＳＮＡＩＬの発現レベルに統計的有意差があり（P＝０．０１７）、左側癌で高い。（＋＋）以上の発現レベルならば左側癌である確率は８３．３％である。左側癌、右側癌の定義ついては図４と同様である。
【図６】ＭＭＰ−７の結果を示す。左側癌と右側癌でのＭＭＰ−７の発現レベルに統計的有意差があり（P＝０．０３３）、左側癌で高い。（＋＋）以上の発現レベルならば左側癌である確率は７６．２％である。左側癌、右側癌の定義ついては図４と同様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、チオシアン酸グアニジン、アイソジェン（Ｉｓｏｇｅｎｅ）、ウルトラスペックII（登録商標）（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ II）等が挙げられる。【００１１】
凍結方法は、任意の従来技術を用いることができ、好ましくは、液体窒素を用いる方法である。凍結温度は、保存温度は、−１〜−１９６℃、好ましくは、−２０〜−１９６℃、好ましくは、−７５〜−１９６℃、より好ましくは、−１１０〜−１９６℃、最も好ましくは−１９６℃である。【００１２】
凍結されたサンプルは、冷凍保存してもよい。保存温度は、−７５〜−１９６℃、好ましくは、−１１０〜−１９６℃、より好ましくは−１９６℃である。保存期間は、１日〜１０年、好ましくは、１日〜３年、より好ましくは、１日〜１年である。【００１３】
本発明で用いられる腫瘍マーカーは、ＣＯＸ−２である。【００１４】
ＣＯＸ−２は、アラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に変換する誘導酵素であり、ＣＯＸ−２の発現が高まると、アポトーシスが阻害され、血管新生因子や浸潤時に必要とされる基質分解酵素が誘導される。ＳＮＡＩＬは、細胞間接着因子であるＥ−カドヘリンの負の転写調節因子であり、ＳＮＡＩＬの発現が高まるとＥ−カドヘリンの発現が低下し、細胞間の接着が低下し深部浸潤や転移に影響することが知られている。ＭＭＰ−７は、マトリックスメタロプロテアーゼの一種であり、癌の浸潤・転移に必要と考えられている。【００１５】
上記工程ｄ）〜ｆ）は、ＲＴ−ＰＣＲ法と呼ばれるものであり、例えば、関谷剛男等編、ＰＣＲ法最前線、１９９７年、共立出版、第１８７頁〜第１９６頁の記載にしたがって行うことができる。【００１６】
懸濁物からのＲＮＡの抽出は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）やＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Pharmacia Biotech）のような市販のキットを用いることができる。【００１７】
本発明で逆転写とは、逆転写酵素（Reverse Transcriptase）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換することをいう。逆転写反応は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ2やＫＣｌ等の塩類、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅ阻害剤及び逆転写酵素を含む溶液を用いて行われる。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質や界面活性剤等を添加することもできる。【００１８】
逆転写に続いて行われるｃＤＮＡの増幅は、通常、ＰＣＲが用いられる。ＰＣＲの反応液は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ2やＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。【００１９】
ｃＤＮＡの増幅は、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）やＩＣＡＮ法（特開２００１−１３６９６５）を用いることもできる。【００２０】
本発明でプライマーとは、ｃＤＮＡ合成や核酸増幅の際の合成開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用することができる。プライマーが二本鎖である場合には、増幅反応に先立ち、一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法にしたがって合成することができ、また、生物から単離することもできる。【００２１】
逆転写反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することができる酵素を意味する。逆転写酵素としては、ＲＡＶ（Rous associated virus）やＡＭＶ（Avian myeloblastosis virus）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Moloney murine leukemia virus）等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素があるが、これらに限定されるものではない。【００２２】
ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。【００２３】
増幅されたＤＮＡの検出方法としては、アガロースゲルを用いる電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではない。【００２４】
増幅されたｃＤＮＡを少なくとも２つの既知の濃度のサイズマーカーと共に電気泳動し、エチジウムブロマイドなどにより標識し可視化する。可視化のための標識には、従来公知の任意の標識を用いることができる。既知の濃度のサイズマーカーのシグナルの強さと増幅産物のシグナルの強さとを比較し、増幅産物のシグナルの強さを０−４の５段階（０：陰性、１：弱陽性、２：陽性、３：強陽性、４：超強陽性）に分類し、半定量化することができる。たとえば、０：陰性は、シグナルの全く認められないもの、１：弱陽性は１００bp ＤＮＡラダーサイズマーカーの２００bpの４０ngの濃度のシグナルに相当するもの、２：陽性は１００bp ＤＮＡラダーサイズマーカーの５００bpの１２５ng濃度のシグナルに相当するもの、３：強陽性は１２５ng濃度のシグナルを明らかに超えるもの、４：超強陽性は３：強陽性の中でも特に強いシグナルに相当するものである。電気泳動はアガロースゲル電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではなく、従来公知の任意の核酸電気泳動方法、たとえばReal-time PCRを用いて定量的に行うこともできる。【００２５】
大腸早期癌（early cancer）、進行癌（advanced cancer）とは壁深達度により規定されている。早期癌とは癌の先進部が大腸壁の粘膜内または粘膜下層に限局し、これを超えていないものを指し、進行癌とは粘膜下層を超え固有筋層以深に届くものをいう。これらは大腸癌取り扱い規約第７版（大腸癌研究会編、金原出版、２００６年）に定義されている。また、大腸腺腫（adenoma）においても早期癌である粘膜癌との鑑別が難しいものもあり、特に１０mmを超える大きさの腺腫（advanced adenoma）は粘膜癌同様将来的に粘膜下層癌に進展する可能性のある腫瘍として癌に準ずるものとしている。【００２６】
本発明のキットには、本発明の方法を記載した指示書を含むこともできる。また、キットに含まれるものとして、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＤＮＡ合成酵素、各種デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）、各腫瘍マーカーに対する特異的プライマー、各腫瘍マーカーに対する陽性コントロール、ＲＮａｓｅ・ＤＮａｓｅを含まない蒸留水、蛍光・目視検出用試薬などを挙げることができる。
【実施例】
【００２７】
以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。【００２８】
浜松医科大学第１内科に精査・治療目的のために入院し、全大腸内視鏡によって大腸癌の存在が確認された患者を対象とした。なお、すべての患者からインフォームドコンセントが得られている。【００２９】
糞便は、採便後可及的速やかに５mlチューブに約０．５〜１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。組織は、治療前に受けた内視鏡検査時に癌部と正常部の生検材料を液体窒素で凍結してから−８０℃で保存した。その後、ホモジナイザーとグアニジン塩とフェノールを用いてホモジナイズし、クロロホルムとエタノールで全ＲＮＡを抽出した。【００３０】
得られたＲＮＡの１μgをリバースクリプトII（登録商標）（反応液量２０μl、和光純薬）を用いて逆転写しｃＤＮＡを得、その一部をＧｅｎｅ  Ｔａｑ（和光純薬）を用いて、ネスティドＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ増幅産物（第２ラウンドのＰＣＲ産物１０μl）を、４％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。また、半定量化のための標準として１００bp ＤＮＡラダーサイズマーカー（２００bp, ４０ng、５００bp, １２５ng）を用いた。【００３１】
なお、用いたプライマーは、逆転写では、ランダムプライマーであり、ＰＣＲでは、ＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７ともに独自に設計したものを使用した。ＰＣＲは、３つの分子とも第１ラウンドを２０サイクルで行い、第２ラウンドではＣＯＸ−２は２０サイクル、ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−７の両者は３５サイクルで行った。
使用したプライマーを下記に示す。
＜ＣＯＸ−２＞
フォワード１：5'-CTGAAACCCACTCCAAACACAG-3'
フォワード２：5'-GCACTACATACTTACCCACTTCAA-3'
リバース：5'-ATAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT-3'
＜ＳＮＡＩＬ＞
フォワード１：5'-AGATGAGGACAGTGGGAAAGGCT-3
フォワード２：5'-CCTTCGTCCTTCTCCTCTACTTCA-3'
リバース１  ：5'-AGGTATGGAGAGGAAGAGGGAG-3'
リバース２  ：5'-GCACTGGTACTTCTTGACATCTGAG-3'
＜ＭＭＰ−７＞
フォワード１：5-ATGAGTGAGCTACAGTGGGAA-3'
フォワード２：5'-TTAAACTCCCGCGTCATAGAA-3'
リバース１  ：5-AAATGCAGGGGGATCTCTTTG-3'
リバース２  ：5-TCGATCCACTGTAATATGCGG-3'【００３２】
結果
大腸癌７０例（早期癌１４例、進行癌５６例）における糞便からのＲＴ−ＰＣＲによるＣＯＸ−２、ＳＮＡＩＬ及びＭＭＰ−７の発現レベルを早期癌と進行癌とで比較した。【００３３】
ＤＮＡサイズマーカーとの比較によりシグナルを０〜４に半定量化したところ、ＣＯＸ−２では早期癌で０：４例、１：７例、２：２例、３：１例、進行癌では０：６例、１：２４例、２：１０例、３：１４例、４：２例であった。ＳＮＡＩＬでは早期癌で０：９例、１：３例、２：２例、進行癌では０：２５例、１：９例、２：３例、３：１１例、４：８例であった。また、ＭＭＰ−７では早期癌で０：８例、１：０例、２：２例、３：４例、進行癌では０：１６例、１：３例、２：６例、３：２９例、４：１例であった。ここで早期癌と進行癌とで比較を行なったところ、ＣＯＸ−２の発現レベルの中央値は１vs．１（Mann-WhitneyのU検定にてＰ＝０．０３４）、ＳＮＡＩＬでは０vs．１（同Ｐ＝０．０６０）、ＭＭＰ−７では０vs．３（同Ｐ＝０．０５６）であった（図１〜３）。【００３４】
その結果、ＣＯＸ−２について、統計的有意差（Ｐ＜０．０５）が認められ、ＣＯＸ−２の発現レベルの増加と病期との有意な相関が認められた。【００３５】
つまりＣＯＸ−２は、内視鏡や手術などで根治可能である比較的早期の大腸腫瘍のスクリーニングに優れ、しかも特異度の高い非常に有用な検査法である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の方法は、癌の病期を決定することができ、臨床的有用性の高い新規大腸癌の非侵襲的スクリーニング方法として従来の便潜血法の代替となりうるものであり、臨床的に極めて有用なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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