【手続補正書】
【提出日】平成15年10月10日(2003.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ピロコッカス・アビシのゲノム配列およびポリペプチド、そのフラグメントおよびその使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) ORSAY 株のゲノムの配列SEQ ID NO.１のヌクレオチド配列。
【請求項２】  下記から選択されることを特徴とする、ピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のヌクレオチド配列：
ａ）配列SEQ ID NO.１と少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）配列SEQ ID NO.１と相同的なヌクレオチド配列；
ｃ）配列SEQ ID NO.１に相補的な、またはａ）もしくはｂ）に定義の如きヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列および対応するそのＲＮＡのヌクレオチド配列；
ｄ）配列SEQ ID NO.１の代表的フラグメントのヌクレオチド配列またはａ）、ｂ）もしくはｃ）に定義の如きヌクレオチド配列の代表的フラグメントのヌクレオチド配列；
ｅ）ｄ）に定義の如き配列を含むヌクレオチド配列；
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に定義の如きヌクレオチド配列から得ることができるヌクレオチド配列；および、
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に定義の如きヌクレオチド配列から改変されたヌクレオチド配列。
【請求項３】  配列ＯＲＦ２〜ＯＲＦ８１２から選択されていることを特徴とする請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】  下記、即ち、
ａ）請求項３に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）請求項３に記載のヌクレオチド配列またはａ）に定義の如きヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する相同的ヌクレオチド配列；
ｃ）請求項３に記載の配列またはａ）もしくはｂ）に定義の如き配列に相補的なヌクレオチド配列、または対応するＲＮＡのヌクレオチド配列；
ｄ）請求項３に記載の配列またはａ）、ｂ）もしくはｃ）に定義の如き配列の代表的フラグメントのヌクレオチド配列；
ｅ）請求項３に記載の配列またはａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）に定義の如き配列から得ることができるヌクレオチド配列；および、
ｆ）請求項３に記載の配列またはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）に定義の如き配列から改変されたヌクレオチド配列、
から選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項５】  請求項２〜４のいずれかに記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項６】  請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオチド配列のＯＲＦ配列に対応する代表的フラグメントによりコードされることを特徴とする請求項５のポリペプチド。
【請求項７】  配列SEQ ID NO.２〜SEQ ID NO.８１２から選択されることを特徴とするピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチド。
【請求項８】  下記から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド：
ａ）請求項５〜７のいずれかに記載のポリペプチド；
ｂ）請求項５〜７のいずれかに記載のポリペプチドまたはａ）に定義の如きポリペプチドと相同的なポリペプチド；
ｃ）請求項５〜７のいずれかに記載ポリペプチドまたはａ）もしくはｂ）に定義の如きポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸のフラグメント；
ｄ）請求項５〜７のいずれかに記載のポリペプチドまたはａ），ｂ）もしくはｃ）に定義の如きポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント；および、
ｅ）請求項５〜７のいずれかに記載のポリペプチドまたはａ），ｂ），ｃ）もしくはｄ）に定義の如きポリペプチドから改変されたポリペプチド。
【請求項９】  請求項８に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１０】  エネルギー生成またはエネルギー変換に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化１】
2004500802.tif 000001
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】  アミノ酸の代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化２】
2004500802.tif 000002
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】  ヌクレオチドの代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３】
2004500802.tif 000003
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】  炭水化物の代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１００，ＯＲＦ１２７，ＯＲＦ１６２，ＯＲＦ１７４，ＯＲＦ３２８，ＯＲＦ３６７，ＯＲＦ３９，ＯＲＦ６０９，ＯＲＦ７６２およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】  補酵素の代謝に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化４】
2004500802.tif 000004
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】  脂質の代謝に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ３１２，ＯＲＦ３１３，ＯＲＦ５４５，ＯＲＦ５５８，ＯＲＦ５５９およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】  翻訳またはリボソームの構造または生合成に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化５】
2004500802.tif 000005
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１７】  転写に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１４８，ＯＲＦ３５７，ＯＲＦ４８３，ＯＲＦ４９７，ＯＲＦ５２３，ＯＲＦ５２４，ＯＲＦ６２０，ＯＲＦ７５２およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】  複製、修復および組換えに関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化６】
2004500802.tif 000006
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１９】  外膜または細胞壁の合成に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化７】
2004500802.tif 000007
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２０】  分泌または運動に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化８】
2004500802.tif 000008
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２１】  ピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のシャペロンタンパク質またはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化９】
2004500802.tif 000009
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２２】  無機イオンの代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化１０】
2004500802.tif 000010
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２３】  ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化１１】
2004500802.tif 000011
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２４】  トランスフェラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化１２】
2004500802.tif 000012
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２５】  ヒドロラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化１３】
2004500802.tif 000013
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２６】  インテインを含むピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１３２，ＯＲＦ１６，ＯＲＦ２５０，ＯＲＦ３４０，ＯＲＦ４８４，ＯＲＦ６０３，ＯＲＦ７６１，ＯＲＦ８０１，ＯＲＦ８０３，ＯＲＦ８０４，ＯＲＦ８０８，ＯＲＦ８１０およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】  イソメラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１７６，ＯＲＦ２８２，ＯＲＦ２８３，ＯＲＦ３９９，ＯＲＦ４２６，ＯＲＦ５３１，ＯＲＦ５８３，ＯＲＦ６８８およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２８】  リガーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ２８，ＯＲＦ６３９，ＯＲＦ６５およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２９】  リアーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化１４】
2004500802.tif 000014
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３０】  ホスファターゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ１８，ＯＲＦ３５４，ＯＲＦ３９８，ＯＲＦ７５，ＯＲＦ７６０，ＯＲＦ７９３およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３１】  糖の代謝に関与するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１５４，ＯＲＦ２１３，ＯＲＦ２９８，ＯＲＦ３７，ＯＲＦ４０，ＯＲＦ４４９，ＯＲＦ５５３，ＯＲＦ６６６，ＯＲＦ７６３およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３２】  プロテアーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし、下記配列、即ち、
【化１５】
2004500802.tif 000015
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３３】  下記活性，即ち、
−配列ＯＲＦ４８６，ＯＲＦ８０６の増殖細胞の核抗原タイプの活性；
−配列ＯＲＦ１７，ＯＲＦ６９５，ＯＲＦ８０１，ＯＲＦ８０２，ＯＲＦ８０５またはＯＲＦ８１１の複製因子に関連するタンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ５４またはＯＲＦ１５９の延長因子に関連するタンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ５４８のＤＮＡ結合タンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ６０７の転写因子タイプの活性；
−配列ＯＲＦ７１のインテグラーゼ／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列ＯＲＦ５０３の酸化還元触媒タイプの活性；
を有するピロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi) のポリペプチドまたはそのフラグメントまたはその代表的フラグメントをコードする配列を含むことを特徴とする請求項２〜４および９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３４】  エネルギー生成または変換に関与し、下記配列、即ち、
【化１６】
2004500802.tif 000016
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３５】  アミノ酸の代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化１７】
2004500802.tif 000017
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３６】  ヌクレオチドの代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化１８】
2004500802.tif 000018
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３７】  炭水化物の代謝または輸送に関与し、次の配列、即ち、SEQ ID NO.１００，SEQ ID NO.１２７，SEQ ID NO.１６２，SEQ ID NO.１７４，SEQ ID NO.３２８，SEQ ID NO.３６７，SEQ ID NO.３９，SEQ ID NO.６０９，SEQ ID NO.７６２のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３８】  補酵素の代謝に関与し、下記配列、即ち、
【化１９】
2004500802.tif 000019
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３９】  脂質の代謝に関与し、次の配列、即ち、SEQ ID NO.３１２，SEQ ID NO.３１３，SEQ ID NO.５４５，SEQ ID NO.５５８，SEQ ID NO.５５９のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４０】  翻訳またはリボソームの構造もしくは生合成に関与し、下記配列、即ち、
【化２０】
2004500802.tif 000020
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４１】  転写に関与し、下記配列、即ち、
【化２１】
2004500802.tif 000021
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４２】  複製、修復および組換えに関与し、下記配列、即ち、
【化２２】
2004500802.tif 000022
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４３】  外膜または細胞壁の合成に関与し、下記配列、即ち、
【化２３】
2004500802.tif 000023
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４４】  分泌または運動に関与し、下記配列、即ち、
【化２４】
2004500802.tif 000024
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４５】  下記配列、即ち、
【化２５】
2004500802.tif 000025
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したシャペロンタンパク質を含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４６】  無機イオンの代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化２６】
2004500802.tif 000026
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４７】  下記配列、即ち、
【化２７】
2004500802.tif 000027
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４８】  次の配列、即ち、SEQ ID NO.２７３，SEQ ID NO.２８７，SEQ ID NO.４６７，SEQ ID NO.５１８，SEQ ID NO.６３２，SEQ ID NO.７２８，SEQ ID NO.７３５，SEQ ID NO.７６，SEQ ID NO.７７５，SEQ ID NO.７７７のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４９】  下記配列、即ち、
【化２８】
2004500802.tif 000028
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５０】  下記配列、即ち、
【化２９】
2004500802.tif 000029
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、インテインを含むポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５１】  下記配列、即ち、
【化３０】
2004500802.tif 000030
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、イソメラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５２】  次の配列、即ち、SEQ ID NO.２８，SEQ ID NO.６３９，SEQ ID NO.６５のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、リガーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５３】  下記配列、即ち、
【化３１】
2004500802.tif 000031
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、リアーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５４】  次の配列、即ち、SEQ ID NO.１８，SEQ ID NO.３５４，SEQ ID NO.３９８，SEQ ID NO.７５，SEQ ID NO.７６０，SEQ ID NO.７９３のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ホスファターゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５５】  糖の代謝に関与し、下記配列、即ち、
【化３２】
2004500802.tif 000032
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５６】  下記配列、即ち、
【化３３】
2004500802.tif 000033
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５７】  下記活性，即ち、
−配列SEQ ID NO.４８６，SEQ ID NO.８０６の増殖細胞の核抗原タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.１７，SEQ ID NO.６９５，SEQ ID NO.８０１，SEQ ID NO.８０２，SEQ ID NO.８０５またはSEQ ID NO.８１１の複製因子に関連するタンパク質タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.５４またはSEQ ID NO.１５９の延長因子に関連するタンパク質タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.５４８のＤＮＡ結合タンパク質タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.６０７の転写因子タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.７１のインテグラーゼ／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列SEQ ID NO.５０３の酸化還元触媒タイプの活性；
を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５８】  １つまたは複数の前記配列が、該配列の読取、分析および／または利用を容易にする形状および性質を有する記録媒体に記録されていることを特徴とする請求項１〜４および９〜３３のいずれかに記載のヌクレオチド配列並びに／または請求項５〜８および３４〜５６のいずれかに記載のポリペプチド配列。
【請求項５９】  配列が、請求項２〜４および９〜３３のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されていることを特徴とする、プライマーまたはプローブとして使用できるヌクレオチド配列
。
【請求項６０】  共有結合的にまたは非共有結合的に担体上に固定されていることを特徴とする請求項５９に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６１】  請求項２〜５および９〜３３のいずれかに記載のヌクレオチ配列を含むことを特徴とするクローニングベクターおよび／または発現ベクター。
【請求項６２】  請求項２３または３２に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項６１に記載のベクター。
【請求項６３】  請求項６１または６２に記載のベクターによって形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項６４】  請求項６２に記載のベクターによって形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項６５】  請求項６３または６４に記載の形質転換細胞を含む、ヒト以外の動物。
【請求項６６】  請求項６１または６２に記載のベクター、請求項６３または６４に記載の細胞または請求項６５に記載の動物を利用することを特徴とするポリペプチドの調製法。
【請求項６７】  請求項６５に記載の方法によって得ることができる組換えポリペプチド。
【請求項６８】  請求項５〜８，３４〜５６および６７のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列を使用することを特徴とする合成ポリペプチドの調製法。
【請求項６９】  請求項６８に記載の方法によって得られる合成ポリペプチド。
【請求項７０】  少なくとも、請求項５〜８，３４〜５６，６７および６９のいずれかに記載のポリペプチド配列を含むことを特徴とする雑種ポリペプチド。
【請求項７１】  請求項７０に記載の雑種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項７２】  請求項７１に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７３】  請求項７２に記載のベクターの使用によって得られる組換えポリペプチドであることを特徴とする請求項７０に記載の雑種ポリペプチド。
【請求項７４】  請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３のいずれかに記載のポリペプチド、請求項６３〜６４のいずれかに記載の形質転換細胞または請求項６５に記載の動物を使用することを特徴とする関心ある化合物の生合成法または生分解法。
【請求項７５】  請求項７４に記載の方法によって得ることができる化合物。
【請求項７６】  関心ある化合物の生合成または生分解のための請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３のいずれかに記載のポリペプチド、請求項６３〜６４のいずれかに記載の形質転換細胞または請求項６５に記載の動物の使用。
【請求項７７】  請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３のいずれかに記載の、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを使用することを特徴とする核酸の重合および／または増幅のための方法。
【請求項７８】  生物学的試料を、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントと、該ポリペプチドと生物学的試料中に存在する核酸との間の重合反応および／または増幅反応が可能な条件において接触させる工程を含むことを特徴とする請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】  請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３のいずれかに記載の、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含む試薬またはパック。
【請求項８０】  生物学的試料中の標的核酸の検出および／または同定のための、特に、病原微生物に特異的な核酸の検出および／または同定のための請求項７９に記載の試薬またはパックの使用。
【請求項８１】  生物学的試料中の標的核酸、特に、関心ある遺伝子または該遺伝子の突然変異の検出および／または同定のための請求項７９に記載の試薬またはパックの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi)のゲノム配列、Pyrococcus abyssi のポリペプチド（例えば、代謝または複製プロセスに関与するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、これらの配列を含むベクターおよびこれらのベクターによって形質転換された細胞に関する。本発明は、更に、上記核酸またはポリペプチドを利用する方法、特に、関心ある分子の生合成法または生分解法、および上記ポリペプチドを含むキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
90℃〜113 ℃の最高温度に耐え得る、現在知られている極めて超好熱性の微生物は、1977年に発見された古細菌（Woese et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1990）の中に見出される。これらのうち、euryarchaoteに属するthermococcales目および、特に、Pyrococcus属は、古細菌内の系統発生的関係を詳述し、真核生物、バクテリアおよび古細菌に普遍的に共通な最新の先祖（LUCA：Last Universal Common Ancestor）の性質に関する問題および生命の起源に関する問題に取組むのに特に重要である。
【０００３】
Pyrococcus属の古細菌は、現在、超好熱性生物（80〜110 ℃の増殖最適温度）の研究のための好ましいモデルである（Adams, Annu. Ret. Microbiol.，47：627, 1997 ）。上記微生物は、好気性であるが、培養し易く、シャーレ上でコロニーの形で得られる（Gelrite 媒体中で）。Pyrococcus属の古細菌のタンパク質は、本質的に、熱的に安定であり、そのうちの若干は、110 ℃よりも高い温度における数十分間の培養に耐えられる。上記タンパク質は、多数の工業的プロセス（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡの修飾酵素、インテイン、プロテアーゼまたは糖の代謝酵素）において使用できる。更に、超好熱性タンパク質の安定性により、その結晶化が容易になることが多く、得られた結晶の品質は、その構造的研究に好適である。
【０００４】
ゲノム配列が既に具体的な研究の対象となっているPyrococcus属の種のうち、陸地の熱水源から分離され、部分的に得られたゲノムをユタ大学のRobert Weissのグループによって配列決定された、最もよく研究された種であるPyrococcus furiosus を挙げることができる。深い海中熱水源（東太平洋）から分離したPyrococcus horikoshii のゲノムは、日本のグループによって配列決定され、1999年に発表された（Kawarabayashi et al., DNA Res. 1998, 5, 55-76 ）。著者等によれば、P. horikoshii のゲノムは、20％の同定可能な遺伝子を含むに過ぎず、他の古細菌（例えば、Methanococcus jannashii ，Archaeoglobus fulgidusおよびMethanobacterium thermoautotrohicum ）のゲノムに比して少ない。上記古細菌の場合、配列の類似性によって同定できるゲノムの割合は、約40％である。従って、Pyrococcus属の細菌は、なお大部分の遺伝子が未知である、工業的に有用な可能性のある遺伝子の貯蔵庫である。
【０００５】
D.Prieur等が北フィジー湾の２箇所の深い海洋位置から得たチムニーおよび熱水試料から分離したThaermococciの独立の約２０の株のスクリーニングにより、小サイズで多重複製のプラスミドpGT5を含むPyrococcus株（ORSAY 株と呼ばれる）を同定できる（Erauso et al. 1992, Compte rendu de l'Academie des Sciences de Paris, 314, 381-393）。この株に対応する種であるPyrococcus abyssi は、生理学的面および分類学的面において詳述されている（Erauso et al., Arch Microbiol. 160：338-349, 1993 ）。この株について、所定の培地、突然変異誘発および突然変異体の分離のための条件が確立されている（Watrin et al., Appl. Environ. Microbiol. 61 ：1138; 1995； Waatrin et al., Current Microbiol. 33, 377, 1996 ）。このプラスミドは、pGT5と呼ばれ、ローリングサークル型のプラスミドであり（Erauso et al., 1996, J. Bacteriol. 178: 3232）、現在、Pyrococcusのシャトルベクターの開発のための出発点として用いられている（Aagard et al., FEMS Microbiol. Rev. 18, 94, 1996； Aravalli et al., Extemophiles 1997, 1: 183-91）。プラスミドpGT5の存在により、P. abbyssiは、超好熱性古細菌における DNAの複製の研究のための好ましい株としても選択されている（Marsin et al, Mol. Micobiol., 27, 1183-1192, 1998 ）。
【０００６】
多数の工業的に有用な可能性のある遺伝子が未だ未知であり、P. abyssi に関する研究が進展していることを考慮すると、現在、上記株の分子生物学に関するより詳細な情報、特に、上記株のゲノムをよりよく知ることに基づく情報が求められている。
【０００７】
さらに、Pyrococcusの３つの異なる種の完全なゲノム配列を提示することによって、特に、遺伝的マーカーとして利用できる遺伝子を同定でき、遺伝子の同定およびその機能解釈の改善のため、比較ゲノムの能力を利用でき (これは、多数のみなしご(orphan)遺伝子を考慮するとPyrococcusの場合特に重要である) 、そのゲノムの適応性に関する重要な情報を得ることができる。具体的には、進化の観点から、３つのゲノム配列の提示は特に有利である。なぜなら、外部グループとして第３ゲノム配列（P. furiosus ）を使用して、それらのうちの２つのゲノム配列（最も近いP. abbyssiおよびP. horilishii)の間に起きるゲノム的事象を方向づけできるからである。更に、増加しつつある利用可能な原核生物のゲノムに対してPyrococcus abyssi のゲノムを極めて精密なレベルにおいて比較検討すると、極端な温度および圧力環境での定着に関連する分子機構を理解できるはずである。
【０００８】
このデータ群によって、特に、微小進化、特に、ゲノム組換え、保存された調節配列、超可変部、インテインの運動性等に関連するゲノム事象を証明できる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
これは、まさに、本発明の主題である。
本発明の主題は、ピロコッカス・アビシ (Pyrococcus abyssi) ORSAY株のゲノムの配列番号１ (SEQ ID NO.１) のヌクレオチド配列である。
【００１０】
Pyrococcus abyssi ORSAY 株は、CNCM（パリ、フランス）にI-2180として199 年４月９日に寄託された。
本発明の主題はまた、下記から選択されることを特徴とするヌクレオチド配列である。
ａ）配列番号１ (SEQ ID NO.１) と少なくとも99.9％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１ (SEQ ID NO.１) と相同的なヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１ (SEQ ID NO.１) に相補的、またはａ）もしくはｂ）に定義したヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、および対応するそのＲＮＡのヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号１ (SEQ ID NO.１) の代表的断片のヌクレオチド配列、またはａ）、ｂ）もしくはｃ）に定義したヌクレオチド配列の代表的断片のヌクレオチド配列；
ｅ）ｄ）に定義した配列を含むヌクレオチド配列；
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に定義したヌクレオチド配列から得る  ことができるヌクレオチド配列；および、
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に定義したヌクレオチド配列の改変ヌクレオチド配列。
【００１１】
Pyrococcus abyssi の「ゲノムの配列」または「ゲノム配列」なる表現は、Pyrococcus abyssi の染色体の配列を示す。
本発明によれば、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」または「核酸」なる表現は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび該ＤＮＡの転写産物を意味する。
【００１２】
本発明は、自然環境から採取した、即ち、自然状態のPyrococcus abyssi のゲノムのヌクレオチド配列には関しないことは当然である。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分子サイズによる排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー、あるいは各種溶媒中の溶解度による分画技術などの分離方法を用いて、または遺伝子工学的方法（例えば、増幅、クローニングおよびサブクローニング）を用いて分離、精製または部分的に精製することができる配列が対象であり、本発明の配列は、ベクターによって担持されていてもよい。
【００１３】
配列番号１のヌクレオチド配列は、最初の工程として対をなす端部の配列決定（ランダム段階）と、次いで、配列の完全性を保証する管理された配列決定と、コンピュータープログラムによるこれらのヌクレオチド断片の配列の統合とを含む方法を用いてPyrococcus abyssi ORSAY 株のゲノムを配列決定することによって得られる（実施例参照）。配列番号１の配列の高精度にも拘わらず、この配列は、Pyrococcus abyssi ORSAY 株のゲノムのヌクレオチド配列を 100％完全には表さず、配列番号１の配列には、配列決定のある程度のエラーまたは不確定さが残存することがありうる。これらのある程度のエラーまたは不確定さは、当業者により、完全な染色体および／または本発明に係るその代表的断片、および増幅、クローニングおよび配列決定の標準的方法を用いて容易に証明および修正でき、得られた配列は、特に、コンピュータープログラムによって、そして例えば以下の実施例に記載のように、本発明に係る配列を記録するコンピュータで読取り可能な担体を使用することによって、容易に比較できる。これらのわずかにありうるエラーまたは不確定さの修正後、得られた修正ずみヌクレオチド配列は、配列番号１の配列と少なくとも99.9％の同一性を有する。
【００１４】
本発明の目的に関し、「所定の配列と相同的なヌクレオチド配列」なる表現は、所定の配列の塩基と最適の整列化後、少なくとも80％，好ましくは、85％、90％、95％および98％の同一性％を有するヌクレオチド配列を意味し、この％は、純粋に統計的であり、２つのヌクレオチド配列の間の差は、その全長にわたっておそらくランダムに分布する。
【００１５】
本発明の目的に関し、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の「同一性％」なる表現は、最適の整列化後に得られる、比較すべき２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合 (％) を表す。この割合は、純粋に統計的であり、２つのヌクレオチド配列の間の差は、その全長にわたってランダムに分布する。２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の配列比較は、通常、それを最適に整列させた後、これらの配列を比較することによって実施され、この比較は、配列の類似した局部領域の同定および比較のために、セグメント毎にまたは“比較ウィンドウ”によって実施される。比較のための配列の最適な整列化は、手操作に加えて、Smith およびWaterman（1981）の局部的相同性アルゴリズム［Ad.App.Math. 2;482］によって、Neddleman およびWunsch（1970) の局部的相同性アルゴリズム［J.Mol.Biol. 48;443］によって、Pearson およびLipman（1988) の類似性調査法［Pro.Natl.Acad.Sci.USA 85;2444 ］によって、上記アルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（Wisconsin Genetics Software Package のGAP,BESTFIT,FASTA およびTFASTA,Genetics Computer Group, 575 Science  Dr.Wadison,WI）によって、またはBLAST N またはBLAST P 比較プログラムによって実施できる。
【００１６】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性％は、比較ウィンドウによって、最適に整列化されたこれら２つの配列を比較することによって求める。この場合、核酸配列またはアミノ酸配列の比較範囲は、これら２つの配列の最適整列化のための参照配列に比べて付加または欠失を含んでもよい。同一性％は、２つの配列の間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である同一位置の数を求め、比較ウィンドウ内の位置全数で上記同一位置数を除し、得られた結果に100 をかけて、これら２つの配列の間の同一性％を得ることによって計算する。
【００１７】
例えば、http: //www,ncbi,nlm, nih ，gov/gorf/b12.html サイトで得られるBLAST プログラム、「BLAST 2 配列」（Tatusovaら、“Blast 2 sequences −a new toolfor comparing protein and nucleotide sequences”，FEMS  Microbiol.Lett. 174:247-250 ）を利用でき、使用パラメータは、デフォルトによって与えられるパラメータであり（特に、パラメータ“open  gap penalty ”：５，および“extension gap penalty ”：２に対して；選択されるマトリックスは、例えば、プログラムによって提供されるマトリックス“BLOSUM62”である）、比較される２つの配列の間の同一性％は、プログラムによって直接計算される。
【００１８】
配列番号１のヌクレオチド配列の塩基との少なくとも80％，好ましくは、85％、90％、95％および98％の同一性％を有する上記の相同配列は、例えば、Pyrococcus abyssi 種のORSAY 株の変異体に属する細菌のゲノム配列またはその代表的断片の配列に対応する配列を含んでよい。本発明において、「科」および「属」なる表現は、相互に交換可能で、「変異体」、「株」および「亜種」なる表現も相互に交換可能である。従って、上記の相同配列は、同一種内のまたは種の間の突然変異に関連する変化に、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切除、置換、欠失および／または付加に対応してもよい。上記の相同配列は、遺伝暗号の縮重に関連する変化に、またはPyrococcus abyssi に存在するようである、属、種または変種に特異的な遺伝暗号の偏りに対応してもよい。
【００１９】
「本発明の配列に相補的なヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドが本発明の配列のヌクレオチドに相補的であり、且つその方向が逆である（逆平行またはアンチセンス配列）任意のＤＮＡを意味する。
【００２０】
「本発明に係る配列の代表的断片」なる表現は、由来する配列の少なくとも15の連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも30、75、150 、300 および450 の連続するヌクレオチドを有する任意のヌクレオチド断片を表す。
【００２１】
上記の代表的断片のうち、ストリンジェントな条件において本発明に係るヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションしうる断片が好ましい。ストリンジェントな条件におけるハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度の条件が、２つの相補的ＤＮＡ断片間のハイブリダイゼーションを維持できるよう選択されていることを意味する。
【００２２】
例えば、上記のヌクレオチド断片を定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェントな条件は、有利には下記の通りである。
ハイブリダイゼーションを、 SSC緩衝液の存在下で好ましくは65℃の温度において実施する。１×SSC は、0.15ＭのNaClおよび0.05Ｍのクエン酸ナトリウムに相当する。洗浄工程の例を以下に示す：
−室温での２×SSC 、0.1 ％SDS 、次いで、68℃において15分間３回洗浄；１×SSC ，0.1 ％SDS ; 0.5 ×SSC ，0.1 ％SDS; 0.1×SSC ，0.1 ％SDS 。
【００２３】
例えば、５×SSC 緩衝液の存在下で60℃の温度を利用する中位のストリンジェットな条件または例えば５×SSC 緩衝液の存在下で50℃の温度を利用する低ストリンジェントな条件は、それぞれ、２つの配列間のハイブリダイゼーションのために全体的な相補性がより少なくてよい。
【００２４】
約300 塩基の大きさのヌクレオチドに対する上記の高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら（1989）の教示に基づいて当業者により、より大きいまたはより小さいオリゴヌクレオチドに対して調節されるであろう。
【００２５】
本発明に係る代表的断片のうち、本発明に係る相同配列またはその断片を得るための方法において、または配列番号１の配列において不完全である、またはエラーもしくは不確実性を有すると判明したゲノム断片を再構成するための方法において、プライマーまたはプローブとして使用できる断片が好ましい。これらの方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、クローニングおよび核酸配列決定）は、当業者によく知られている。突然変異または種間もしくは種内の変異に対応する上記の相同ヌクレオチド配列、および完全なゲノム配列または再構成できるその断片の１つは、もちろん、本発明の一部である。
【００２６】
更に、上記の代表的断片のうち、一般に、開始コドンと停止コドンとの間の、または２つの停止コドンの間に含まれ、ポリペプチド、好ましくは、少なくとも100 のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム [ORF 配列（ORF:open reading frame）と称される）、例えば、以下に例示の ORF配列に対応するヌクレオチド配列に対応する断片が好ましいが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書において以下で使用する ORFヌクレオチド配列の番号は、該ORF によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の番号に対応する。
即ち、ヌクレオチド配列ORF ２，ORF ３，…，ORF 811 およびORF 812 は、それぞれ、後述の配列表に記載の配列番号２、配列番号３、…配列番号811 、配列番号812 のアミノ酸配列のタンパク質をコードする。
【００２８】
ORF ２，ORF ３，…，ORF 790 およびORF 791 の配列の詳細なヌクレオチド配列は、配列表に記載の配列番号１のゲノム配列上のその各位置によって、また記載があれば配列番号１の配列の相補鎖上にこれらの配列が位置することを示す特徴「complement」によって決定される。本明細書において、これらのORF 配列の位置および「complement」という特徴 (後者は記載が必要) は、「SEQ ID: Ｘ」（ここで、Ｘは、このようにして決定したORF の番号に対応する）を示す次の項目＜223 ＞に関連して数字見出または項目＜222 ＞における配列SEQ ID NO.１のための配列表に記載の特徴に示されている。
【００２９】
以下に例を挙げる：
位置nt 1765176−nt 1764523および項目“＜223 ＞SEQ  ID: 374”に関連する項目＜222 ＞に示した＜complement＞という特徴によって同定されるORF 374 の詳細なヌクレオチド配列は、配列SEQ ID NO.１の末端を含む位置nt1765176-nt1764523 の間の配列の相補配列である；
項目“＜223 ＞SEQ  ID:2 ”に関連する項目＜222 ＞に記載その位置nt25162-nt26181 によって同定されたORF ２の詳細なヌクレオチド配列は、配列SEQ ID NO.１の末端を含む位置nt25162-nt26181 の間の配列である。
【００３０】
Pyrococcus abyssi のゲノムは環状であるため、若干の配列要素は、番号付与の起点に跨がってもよい。この仮定において、これらの末端の１つの座標は、ゲノムの長さよりも大きい値を有することができる。そこで、この位置は、ゲノムのサイズを差引くことより解釈されなければならない。たまたま、これはORF 374 に関し、項目“＜223 ＞SEQ  ID: 374”に関連する項目＜222 ＞に記載の座標1765176 および1764523 は、それぞれ、58および1764523 として解釈すべきである。
【００３１】
本発明に係る代表的断片は、例えば、特異的な増幅（例えば、PCR ）によってまたは、本発明に係るヌクレオチド配列に適した制限酵素による切断後に得ることができる。これらの方法は、例えば、Sambrookら（1989）の論文に記載されている。これらの代表的断片は、そのサイズが大きすぎなければ、化学的合成により当業者に周知の方法に基づき得ることもできる。
【００３２】
本発明に係る代表的断片は、例えば、上記の代表的断片のうちの若干、特に、配列の一部が欠失したまたは不完全であるような断片を当業者に周知の方法（例えば、増幅、クローニングまたは配列決定技術）によって再構成するためのプライマーとして使用できる。
【００３３】
「改変されたヌクレオチド配列」とは、当業者に周知の技術にもとづく突然変異誘発によって得られ、正常な配列に対して改変、特に、ポリペプチド発現の調節性及び／又はプロモータ配列に突然変異、特に、該ポリペプチドの発現または活性のレベルの改変に導く突然変異を含む任意のヌクレオチド配列を意味する。
【００３４】
改変されたヌクレオチド配列とは、また、以下に定義の如き改変ポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を意味する。
本発明の主題は、ORF2〜ORF812の配列から選択されることを特徴とするPyrococcus abyssi のヌクレオチド配列である。ORF 配列の番号付与は、ORF792〜ORF812を除いて、染色体におけるこれらの配列の出現順序に対応する。
【００３５】
ORF2〜ORF791の配列の詳細なヌクレオチド配列は、上記の如く定義される。
配列ORF792〜ORF800の詳細なヌクレオチド配列は、対応するペプチド配列のSEQ IDの識別数字＜223 ＞に記載されたゲノム配列SEQ ID NO.１上の最初のヌクレオチドの位置および最後のヌクレオチドの位置によって定められる。
【００３６】
配列ORF801，ORF805，ORF806，ORF807，ORF808，ORF811およびORF812の詳細なヌクレオチド配列は、以下の実施例３〜７において、ゲノム配列SEQ ID NO.１上の最初のヌクレオチドの位置および最後のヌクレオチドの位置によって定められる。
【００３７】
配列ORF802，ORF803，ORF804,ORF809 およびORF810の詳細なヌクレオチド配列は、以下の実施例３および７において、由来するORF801およびORF808からの推測によって同定される。
【００３８】
本発明は、また、下記から選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
ａ）本発明に係るヌクレオチド配列ORF2〜ORF812；
ｂ）本発明に係るまたはａ）に定義の如きヌクレオチド配列ORF2〜ORF812と少なくとも８０％の同一性を有する相同的ヌクレオチド配列；
ｃ）本発明に係る、またはａ）もしくはｂ）に定義の如きヌクレオチド配列ORF2〜ORF812に対応する相補的ヌクレオチド配列またはＲＮＡ配列；
ｄ）本発明に係る、またはａ），ｂ）もしくはｃ）に定義の如きヌクレオチド配列ORF2〜ORF812の代表的断片のヌクレオチド配列；
ｅ）本発明に係るまたはａ），ｂ），ｃ）もしくはｄ）に定義の如き配列ORF2〜ORF812から得ることができるヌクレオチド配列；および、
ｆ）本発明に係るまたはａ），ｂ），ｃ），ｄ）もしくはｅ）に定義の如き配列ORF2〜ORF791の改変ヌクレオチド配列。
【００３９】
ヌクレオチド配列ORF2〜ORF812との相同性に関して、ヌクレオチド配列ORF2〜ORF812の１つの配列の塩基と少なくとも80％，好ましくは、90％，95％および98％の同一性％を有する相同的配列が好ましい。該相同的配列は、例えば、Pyrococcus abyssi 種の変種に属する細菌のORF 配列に対応する配列を含んでいてもよい。これらの相同的配列は、同一種内のまたは種間の突然変異に関連する変化に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切除、置換、欠失および／または付加に対応していてもよい。上記の相同的配列は、遺伝暗号の縮重または属、種もしくは変種に特異的な遺伝暗号の偏りに関連し、Pyrococcus abyssi に存在してるようである変化に対応してもよい。
【００４０】
本発明は、本発明に係るヌクレオチド配列によって、好ましくは、配列SEQ ID NO.１の代表的断片によってコードされ、 ORF配列に対応するポリペプチド、特に、配列SEQ ID NO.２〜SEQ ID NO.812 から選択されることを特徴とするPyrococcus abyssi のポリペプチドを含む。
【００４１】
本発明は、また、下記から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチドを含む。
ａ）本発明に係るポリペプチド；
ｂ）本発明に係るポリペプチドまたはａ）に定義の如きポリペプチドに対して相同的なポリペプチド；
ｃ）本発明に係るポリペプチドまたはａ）もしくはｂ）に定義の如きポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸の断片；
ｄ）本発明に係るポリペプチドまたはａ），ｂ）もしくはｃ）に定義の如きポリペプチドの生物学的に活性な断片；および、
ｅ）本発明に係るポリペプチドまたはａ），ｂ），ｃ）もしくはｄ）に定義の如きポリペプチドから改変されたポリペプチド。
【００４２】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語は互換性がある。
本発明は、天然形態のポリペプチドには関しないことが理解されるべきである。即ち、ポリペプチドは、自然環境から得られたものではないが、自然の供給源から分離または精製によって得られること、あるいは遺伝子組換えによってまたは化学的合成によって得らることは可能であり、従って、以下に説明する如く、非天然のアミノ酸を含んでもよい。
【００４３】
「相同的ポリペプチド」とは、天然のポリペプチドに比べて、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換、短縮、延長、キメラ的融合および／または突然変異などのある種の改変を有するポリペプチド、または翻訳後修飾を有するポリペプチドを意味する。相同的ポリペプチドのうち、そのアミノ酸配列が本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも80％，好ましくは、90％，95％および98％の相同性を有するポリペプチドが好ましい。置換の場合、１つまたは２以上の連続したまたは非連続のアミノ酸が、“同等の”アミノ酸によって置換されている。本明細書において、「同等のアミノ酸」という表現は、例えば以下で定義する如く、基本構造のアミノ酸の１つと置換できるが、対応するペプチドの生物学的活性を本質的に変更しない任意のアミノ酸を意味する。
【００４４】
上記の同等のアミノ酸は、置換されるアミノ酸との構造的相同性に基づくかまたは産生されうる各種ポリペプチドの間の生物学的活性の比較分析の結果によって決定することができる。
【００４５】
例として、対応する改変ポリペプチドの生物学的活性の重大な変化を生じることなくなされる置換の可能性、例えば、バリンまたはイソロイシンによるロイシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、アスパラギンによるグルタミンの置換、リシンによるアルギニンの置換が挙げられる (同一条件において逆置換も当然考えられる) 。
【００４６】
相同的ポリペプチドは、また、上に定義したようなヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対応し、従って、本定義にもとづき、突然変異したポリペプチドまたはPyrococcusにおいて存在でき、特に、少なくとも１つのアミノ酸残基の切除、置換、欠失および／または付加に対応する変化に対応する、種間または種内の変化に相当するポリペプチドを含む。
【００４７】
「本発明に係るポリペプチドの生物学的に活性な断片」なる表現は、特に、本発明に係るポリペプチドの特徴の少なくとも１つを有し、特に、一般的に下記のような活性 (部分的であってもよい) 発揮しうる、以下に定義するようなポリペプチド断片を意味する：
−酵素活性（代謝活性）、すなわち有機化合物もしくは無機化合物の生合成または生分解に関与しうる活性；
−構造的活性（細胞エンベロープ、シャペロン分子、リボソーム）；
−分泌時の輸送活性（エネルギー輸送、イオン輸送）；または、
−特にＤＮＡまたはＲＮＡの、複製、増幅、修復、転写、翻訳または成熟プロセスにおける活性。
【００４８】
「本発明に係るポリペプチドの断片」なる表現は、最小５つのアミノ酸、好ましくは、10、15、25、50、100 および150 のアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。
【００４９】
本発明に係るポリペプチドの断片は、Pyrococcus abyssi に天然に存在するかPyrococcus abyssi から分泌され、分離または精製された断片、またはタンパク質分解酵素（トリプシン、キモトリプシンまたはコラゲナーゼなど）もしくは化学的試薬（例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ））による上記ポリペプチドの開裂によって、あるいは強酸性の環境（例えば、pH 2.5）に上記ポリペプチドを置くことによって得られる断片に対応する。このようなポリペプチド断片は、また、化学合成、および適切な調節および／または発現要素の制御下に置かれると上記断片の発現を可能にする核酸を含む本発明に係る発現ベクターによって形質転換された宿主を用いて普通に調製できる。
【００５０】
本発明に係るポリペプチドの「改変ポリペプチド」とは以下に述べるように、遺伝的組換えによってまたは化学合成によって得られる、正常の配列に対して少なくとも１つの改変を有するポリペプチドを意味する。これらの改変は、特に、活性の特異性もしくは有効性の原因となる、または本発明に係るポリペプチドの立体配座、電荷もしくは疎水性の原因となるアミノ酸に関連しうる。このように、同等、増大もしくは減少した活性、および同等、縮小もしくは拡大した特異性を有するポリペプチドを作製できる。改変ポリペプチドの中で、最大５つのアミノ酸が改変されるか、Ｎ末端もしくはＣ末端で短縮されるか、欠失または付加されてもよいポリペプチドが挙げられる。
【００５１】
既述の如く、ポリペプチドの改変は、特に、下記を目的とする：
−有機化合物もしくは無機化合物の生合成プロセスまたは生分解プロセスにおいて使用可能とすること、
−特に、 DNAまたは RNAの、複製、増幅、修復、転写、翻訳または成熟プロセスにおいて使用可能とすること、
−その溶解性、その活性の有効性または特異性を改変するか、またはその精製を容易にすること。
【００５２】
化学合成には、非天然アミノ酸または非ペプチド結合を使用できるという利点もある。従って、本発明に係るポリペプチドの寿命の改善のため、非天然アミノ酸、例えば、Ｄ型アミノ酸またはアミノ酸の類似体、特に、例えばイオウ含有タイプを使用すれば有利である。
【００５３】
本発明に係るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明の一部をなす。
好ましい態様において、本発明は、エネルギー生成またはエネルギー変換に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００５４】
【化３４】
2004500802.tif 000034
【００５５】
好ましい態様で、本発明は、アミノ酸の代謝または輸送に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
【００５６】
【化３５】
2004500802.tif 000035
【００５７】
好ましい態様において、本発明は、ヌクレオチドの代謝または輸送に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００５８】
【化３６】
2004500802.tif 000036
【００５９】
好ましい態様において、本発明は、炭水化物の代謝または輸送に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００６０】
【化３７】
2004500802.tif 000037
【００６１】
好ましくは、本発明は、補酵素の代謝に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００６２】
【化３８】
2004500802.tif 000038
【００６３】
好ましい態様において、脂質の代謝時に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、配列、ORF312，ORF313，ORF545，ORF558，ORF559およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００６４】
好ましくは、本発明は、翻訳またはリボソームの構造もしくは生合成時に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００６５】
【化３９】
2004500802.tif 000039
【００６６】
好ましい態様において、本発明は、転写に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、配列、ORF148，ORF357，ORF483，ORF497，ORF523，ORF524，ORF620，ORF752およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００６７】
好ましい態様において、本発明は、複製、修復および組換えに関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００６８】
【化４０】
2004500802.tif 000040
【００６９】
好ましくは、本発明は、外膜または細胞壁の合成に関与する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００７０】
【化４１】
2004500802.tif 000041
【００７１】
好ましい態様において、本発明は、分泌または運動に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００７２】
【化４２】
2004500802.tif 000042
【００７３】
好ましい態様において、本発明は、Pyrococcus abyssi のシャペロンタンパク質またはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００７４】
【化４３】
2004500802.tif 000043
【００７５】
好ましい態様において、本発明は、無機イオンの代謝または輸送に関与する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００７６】
【化４４】
2004500802.tif 000044
【００７７】
好ましい態様において、本発明は、ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００７８】
【化４５】
2004500802.tif 000045
【００７９】
好ましい態様において、本発明は、トランスフェラーゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００８０】
【化４６】
2004500802.tif 000046
【００８１】
好ましい態様において、本発明は、ヒドロラーゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００８２】
【化４７】
2004500802.tif 000047
【００８３】
好ましい態様で、本発明は、インテイン (intein) を含むPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００８４】
【化４８】
2004500802.tif 000048
【００８５】
好ましい態様において、本発明は、イソメラーゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、配列、ORF176，ORF282，ORF283，ORF399，ORF426，ORF531，ORF583，ORF688およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００８６】
好ましい態様で、本発明は、リガーゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ２８，ＯＲＦ６３９，ＯＲＦ６５およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００８７】
好ましい態様において、本発明は、リアーゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、配列、ORF156，ORF223，ORF271，ORF306，ORF36 ，ORF362，ORF403，ORF472，ORF517，ORF650，ORF796およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００８８】
好ましい態様で、本発明は、ホスファターゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、配列、ORF18 ，ORF354，ORF398，ORF75 ，ORF760，ORF793およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００８９】
好ましい態様で、本発明は、糖の代謝に関与する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、配列、ORF154，ORF213，ORF298，ORF37 ，ORF40 ，ORF449，ORF553，ORF666，ORF763およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００９０】
好ましい態様で、本発明は、プロテアーゼ活性を有する Pyrococcus abyssiのポリペプチドまたはその断片の１つをコードし、下記配列、およびその代表的断片から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列にも関する。
【００９１】
【化４９】
2004500802.tif 000049
【００９２】
下記活性を有するPyrococcus abyssi のポリペプチドもしくはその断片の１つまたはその代表的断片の１つをコードする配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列も好ましい。
、
−配列ORF486，ORF806の増殖細胞の核抗原タイプの活性；
−配列ORF17 ，ORF695，ORF801，ORF802，ORF805またはORF811の複製因子に関与するタンパク質タイプの活性；
−配列ORF54 またはORF159の延長因子に関与するタンパク質タイプの活性；
−配列ORF548の DNA結合タンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ６０７の転写因子タイプの活性；
−配列ＯＲＦ７１のインテグラーゼ／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列ＯＲＦ５０３の酸化還元触媒タイプの活性；
別の面において、好ましくは、本発明の主題は、エネルギー生成または変換に関与し、下記配列のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドである。
【００９３】
【化５０】
2004500802.tif 000050
【００９４】
好ましい態様で、本発明は、アミノ酸の代謝または輸送に関与し、下記配列のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
【００９５】
【化５１】
2004500802.tif 000051
【００９６】
好ましい態様で、本発明は、ヌクレオチドの代謝または輸送に関与し、下記配列のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
【００９７】
【化５２】
2004500802.tif 000052
【００９８】
好ましい態様で、本発明は、炭水化物の代謝または輸送に関与し、下記配列のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
【００９９】
【化５３】
2004500802.tif 000053
【０１００】
好ましい態様で、本発明は、補酵素の代謝に関与し、下記配列のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０１】
【化５４】
2004500802.tif 000054
【０１０２】
好ましい態様で、本発明は、脂質の代謝に関与し、配列、SEQ ID NO.312 ，SEQ ID NO.313 ，SEQ ID NO.545 ，SEQ ID NO.558 ，SEQ ID NO.559 のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０３】
好ましい態様で、本発明は、翻訳またはリボソームの構造もしくは生合成に関与し、下記配列のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
【０１０４】
【化５５】
2004500802.tif 000055
【０１０５】
好ましい態様で、本発明は、転写に関与し、下記配列のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
【０１０６】
【化５６】
2004500802.tif 000056
【０１０７】
好ましい態様で、本発明は、複製、修復および組換えに関与し、下記配列、即ち、
【０１０８】
【化５７】
2004500802.tif 000057
【０１０９】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
好ましい態様で、本発明は、外膜または細胞壁の合成に関与し、下記配列、即ち、
【０１１０】
【化５８】
2004500802.tif 000058
【０１１１】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
好ましい態様で、本発明は、分泌または運動に関与し、下記配列、即ち、
【０１１２】
【化５９】
2004500802.tif 000059
【０１１３】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１１４】
【化６０】
2004500802.tif 000060
【０１１５】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるシャペロンタンパク質を含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、無機イオンの代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【０１１６】
【化６１】
2004500802.tif 000061
【０１１７】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１１８】
【化６２】
2004500802.tif 000062
【０１１９】
のポリペプチドおよびその断片から選択され、ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
【０１２０】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１２１】
【化６３】
2004500802.tif 000063
【０１２２】
のポリペプチドおよびその断片から選択され、トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１２３】
【化６４】
2004500802.tif 000064
【０１２４】
のポリペプチドおよびその断片から選択され、ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１２５】
【化６５】
2004500802.tif 000065
【０１２６】
のポリペプチドおよびその断片から選択され、インテインを含むポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１２７】
【化６６】
2004500802.tif 000066
【０１２８】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択され、イソメラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、SEQ ID NO.２８，SEQ ID NO.６３９，SEQ ID NO.６５のポリペプチドおよびその断片から選択され、リガーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
【０１２９】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１３０】
【化６７】
2004500802.tif 000067
【０１３１】
のポリペプチドおよびその断片から選択され、リアーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１３２】
【化６８】
2004500802.tif 000068
【０１３３】
のポリペプチドおよびその断片から選択され、ホスファターゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
好ましい態様で、本発明は、糖の代謝に関与し、下記配列、即ち、
【０１３４】
【化６９】
2004500802.tif 000069
【０１３５】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【０１３６】
【化７０】
2004500802.tif 000070
【０１３７】
のポリペプチドおよびその断片の１つから選択され、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドにも関する。
下記活性，即ち、
−配列SEQ ID NO.486 ，SEQ ID NO.806 の増殖細胞の核抗原タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.695 ，SEQ ID NO.801 ，SEQ ID NO.802 ，SEQ ID NO.806 またはSEQ ID NO.811 を有する複製因子に関連するタンパク質タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.54またはSEQ ID NO.159 の延長因子に関連するタンパク質タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.548 のＤＮＡ結合タンパク質タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.607 の転写因子タイプの活性；
−配列SEQ ID NO.71のインテグラーゼ／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列SEQ ID NO.503 の酸化還元触媒タイプの活性；
を有するポリペプチドまたはその断片の１つを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドも好ましい。
【０１３８】
上記ヌクレオチド配列および本発明に係るポリペプチドのうち、ポリメラーゼ活性またはプロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が好ましい。
【０１３９】
本発明において一般的に、本発明に係るポリペプチドおよびその対応するヌクレオチド配列が属する機能グループは、既知の配列と比較された類似性によって、あるいは、生化学の標準技術および遺伝子工学に関連する細胞学の標準技術（例えば、免疫親和性、免疫標識による位置決定、微分抽出、酵素活性の測定、発現誘導または発現抑制活性の検討、E.coliの発現の検討）によって決定できる。
【０１４０】
第一に、本発明において、機能グループに記載されたヌクレオチド配列（ORF2〜ORF812）およびアミノ酸配列（SEQ ID NO.２〜SEQ ID NO.812 ）は、当該グループ内で網羅的ではないことは当然である。第二に、本発明において、ある機能グループに記載の１つのヌクレオチド配列(ORF）または１つのアミノ酸配列は、例えば、列挙されたグループ間の関連および選択された配列のベース（例えば、本発明の場合、swissprot またはCOG ライブラリー）を考慮して、ある別のグループの一部であってもよいことは当然である。
【０１４１】
本発明は、また、配列の読取、分析および利用を容易にする形状および性質を有する媒体、即ち、記録媒体に記録されていることを特徴とするヌクレオチド配列および／またはポリペプチド配列に関する。これらの媒体は、もちろん、本発明から得るその他の情報（例えば、特に、本明細書の表１に記載のような既知の配列との類似物）を含むこともでき、および／または、得られた結果の比較解析および利用を容易にするためその他の微生物のヌクレオチド配列および／またはポリペプチドに関する情報を含むこともできる。
【０１４２】
上記記録媒体のうち、特に、コンピュータによって読取り可能な媒体、例えば、磁気的、光学的、電気的またはハイブリッド媒体（例えば、“フロッピー”ディスク、ＣＤ−ＲＯＭまたは記録カセット）が好ましい。
【０１４３】
本発明は、更に、プライマーまたはプローブとして使用できるヌクレオチド配列であって、本発明に係るヌクレオチド配列から選択されることを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
【０１４４】
本発明は、更に、核酸配列の増幅のためプライマーまたはプローブとしての本発明に係るヌクレオチド配列の使用に関する。
従って、本発明に係るヌクレオチド配列は、特に、ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）による、ヌクレオチド配列の増幅に使用できる（Erich,1989；Innis ら、1990；Rolfs ら，1991；White ら1997）。
【０１４５】
上記のオリゴデオキシリボヌクレオチド系またはオリゴリボヌクレオチド系プライマーは、有利には、少なくとも10のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも15のヌクレオチド、更に好ましくは、少なくとも20のヌクレオチドの長さである。
【０１４６】
有利なことには、ＰＣＲの代わりに、標的核酸のその他の増幅技術を使用できる。
本発明に係るヌクレオチド配列、特に、本発明に係るプライマーは、下記のような標的核酸のその他の増幅方法に使用できる：
−ＴＡＳ技術（転写に基づく増幅システム），Kwohら，1989；
−３ＳＲ技術（自己持続性配列複製），Guatelliら，1990；
−ＮＡＳＢＡ技術（核酸配列に基づく増幅），Kievitisら，1991；
−ＳＤＡ技術（鎖置換増幅）（Walkerら，1992）  ；
−ＴＭＡ技術（転写媒介増幅）。
【０１４７】
本発明のポリヌクレオチドは、また、プローブとして用いられる核酸を増幅または改変ための下記のような技術に使用できる：
−ＬＣＲ技術（リガーゼ連鎖反応），Landegren ら，1988；熱安定性リガーゼを使用するBaranyら（1991）による変法；
−ＲＣＲ技術（修復連鎖反応），Segev ，1992；
−ＣＰＲ技術（サイクリングプローブ反応），Duckら，1990；
−Q-β−レプリカーゼ増幅技術，Miele ら，1983；特に、Chu ら，1986，Lizardi ら,1988,次いで Burg ら、またStone ら,1996 による変法。
【０１４８】
本発明は、更に、本発明に係る少なくとも１つのプライマーを用いた増幅によって得ることができる断片のヌクレオチド配列に関する。
場合によっては、標的ポリヌクレオチドが、 RNA（例えば、mRNA）である場合、本発明に係る少なくとも１つのプライマーによる増幅反応の実施前にまたは本発明に係る少なくとも１つのプローブによる検出方法の実施前に、試料に含まれる RNAからcDNAを得るために逆転写酵素型の酵素を使用できる。次いで、得られたcDNAは、本発明に係る増幅方法に使用される１つまたは複数のプライマーまたは１つまたは複数のプローブの標的として使用されるであろう。
【０１４９】
本発明は、更に、本発明に係る少なくとも１つのプローブを用いたハイブリダイゼーションによって得ることができる断片のヌクレオチド配列に関する。
本発明は、更に、共有結合的または非共有結合的に担体上に固定されていることを特徴とする本発明のヌクレオチド配列を含む。
【０１５０】
本発明の別の主題は、本発明に係るヌクレオチ配列を含むことを特徴とする、配列のクローニングベクターおよび／または発現のためのベクターである。
本発明のこれらのベクターの中で、Pyrococcus abyssi のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその断片を含むベクターが好ましい。
【０１５１】
本発明に係る上記ベクターのうち、エネルギー変換もしくは生成、アミノ酸、炭水化物もしくは糖、脂質、ヌクレオチド、無機イオンもしくは補酵素の代謝および／または輸送に関与する、あるいは、特に、DNA またはRNA の転写、複製、修復または組換え、あるいは分泌もしくは運動、リボソームの生合成もしくは構造、または細胞壁もしくは外膜の合成に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードする、またはイソメラーゼ活性、リガーゼ活性、リアーゼ活性、ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ポリメラーゼ活性， RNAポリメラーゼ活性もしくは DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはその断片の１つをコードする、またはシャペロンタンパク質またはインテインを含むタンパク質をコードするヌクレオチ配列を含むベクターが好ましい。
【０１５２】
本発明に係るベクターのうち、増殖細胞の核抗原タイプ、複製因子に関連するタンパク質タイプ、ＤＮＡ結合タンパク質タイプ、転写因子タイプ、インテグラーゼ／リコンビナーゼタイプまたは酸化還元触媒タイプの、Pyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードするヌクレオチド配列を含むベクターも好ましい。
【０１５３】
所定の宿主細胞内で上記ヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能にする要素を含むことを特徴とする本発明に係るベクターもまた、本発明の一部である。
【０１５４】
ベクターは、プロモーター、翻訳の開始信号および終止信号並びに転写の適切な調節領域を含んでいなければならない。ベクターは、宿主細胞内に安定に保持できなければならず、場合によっては、翻訳されたタンパク質の分泌を具体化する特定の信号を有することができる。これらの各種要素は、使用する宿主細胞によって選択される。この趣旨で、本発明に係るヌクレオチド配列は、選択された宿主内で自律的に複製するベクター内に、または選択された宿主において組み込まれるベクター内に挿入されうる。
【０１５５】
かかるベクターは、当業者が慣用する方法によって調製でき、生じたクローンは、標準的方法（例えば、リポフェクション、エレクトロポーレーション、熱ショック）によって適切な宿主に導入できる。
【０１５６】
本発明に係るベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス由来のベクターである。
上記ベクターは、本発明に係るヌクレオチド配列のクローン化または発現のために、宿主細胞を形質転換するのに有用である。
【０１５７】
本発明は、更に、本発明に係るベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。
上記細胞は、上記の如きベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクションされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能にする条件において該細胞を培養することによって得ることができる。
【０１５８】
宿主細胞は、原核または真核系、例えば、細菌細胞（Olins およびLee ，1993）、酵母細胞（Buckholzら，1993）、また、動物細胞、特に、哺乳動物細胞の培養物（Edwards およびAruffo，1993）、特に、チャイニーズハムスタ卵巣（CHO ）細胞、さらに、バキュロウイルスを用いる方法を使用できる昆虫細胞（Luckow，1993）から選択できる。
【０１５９】
本発明のタンパク質の発現のために好ましい宿主細胞は、原核細胞（例えば、グラム細菌）からなる。
本発明は、更に、本発明の上記形質転換細胞を含む動物（但し、ヒトは除く）に関する。
【０１６０】
Pyrococcus abyssi の１つまたは複数の遺伝子を過発現する本発明に係るトランスジェニック動物の作製は、好ましくはラット、マウス、またはウサギにおいて、当業者に周知の方法（例えば、ウイルストランスフェクションまたは非ウイルストランスフェクション）によって行われる。１つまたは複数の上記遺伝子を過発現するトランスジェニック動物は、本来遍在性であるか組織の種類に選択的な強力なプロモータの制御下で該遺伝子の多重コピーをトランスフェクションすることによって得ることができる。トランスジェニック動物は、胚性幹細胞での相同的組換え、胚へのこれらの胚性幹細胞の導入、生殖系列で得られるキメラの選択、該キメラの増殖によっても得ることができる。
【０１６１】
本発明に係る形質転換細胞およびトランスジェニック動物は、組換えポリペプチドの調製方法において使用できる。
現在、本発明に係る発現ベクターによって形質転換された細胞、または本発明に係るトランスジェニック動物を使用する遺伝子工学によって、比較的多量の組換えポリペプチドを調製できる。
【０１６２】
本発明に係るベクターおよび／または該ベクターによって形質転換された細胞および／または本発明の該形質転換細胞を含むトランスジェニック動物を使用することを特徴とする、組換え形態の本発明に係るポリペプチドの製造方法は、それ自体、本発明に含まれる。
【０１６３】
組換えの形態の本発明ポリペプチドの上記製造方法の中で、エネルギーの変換もしくは産生、アミノ酸、炭水化物もしくは糖、脂質、ヌクレオチド、無機イオンもしくは補酵素の代謝および／または輸送に関与するか、特に、 DNAもしくは RNAの転写、複製、修復または組換え、または、分泌もしくは運動、リボソームの生合成もしくは構造、細胞壁もしくは外膜の合成に関与するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードするか、または、イソメラーゼ活性、リガーゼ活性、リアーゼ活性、ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、トランスフェゼ活性、ポリメラーゼ活性， RNAポリメラーゼ活性もしくは DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはその断片の１つをコードするか、または、シャペロンタンパク質またはインテインを含むタンパク質をコードするか、または、増殖細胞の核抗原タイプ、複製因子に関与するタンパク質タイプ、 DNA結合タンパク質タイプ、延長因子に関連するタンパク質タイプ、転写因子タイプ、インテグラーゼ／リコンビナーゼタイプまたは酸化還元触媒タイプのPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードするヌクレオチドを配列を含む、ベクターおよび／または該ベクターによって形質転換された細胞および／または該形質転換細胞を含むトランスジェニック動物を使用する製造方法が好ましい。
【０１６４】
組換え形態の本発明に係るポリペプチドの上記製造方法のうち、ポリメラーゼ活性、 DNAもしくは RNAポリメラーゼ活性またはプロテアーゼ活性を有するPyrococcus abyssi のポリペプチドまたはその断片の１つをコードするヌクレオチド配列を含むベクターおよび／または該ベクターによって形質転換された細胞および／または該形質転換細胞を含むトランスジェニック動物を使用する製造方法も好ましい。
【０１６５】
上記のようにして得られた組換えポリペプチドは、グリコシル化形態でも非グリコシル化形態でもよく、天然の３次構造を有していても有してなくてもよい。
好ましい変更例の場合、“担体”タンパク質に融合した組換えポリペプチド（キメラタンパク質）を調製する。この系の利点は、融合相手特異的なリガンドに対する親和性を有していれば、組換え産物の安定化およびタンパク質分解の減少、インビトロでの再生中の安定性の増加および／または精製の簡易化を可能にするという点にある。
【０１６６】
より詳細には、本発明は、下記工程を含む本発明に係るポリペプチドの製造法に関する：
ａ）本発明に係る核酸配列の組換えポリペプチドの発現を可能にする条件における形質転換細胞の培養；
ｂ）場合によっては、該組換えポリペプチドの回収。
【０１６７】
本発明のポリペプチドの製造方法において、本発明に係るトランスジェニック動物を使用した場合、次いで、該動物から組換えポリペプチドを抽出する。
本発明は、更に、上記の如き本発明の方法によって得ることができるポリペプチドに関する。
【０１６８】
本発明は、更に、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を使用することを特徴とする合成ポリペプチドの調製法に関する。
本発明は、更に、本発明に係る方法によって得られた合成ポリペプチドに関する。
【０１６９】
本発明に係るポリペプチドは、更に、ペプチド合成の分野の公知の技術によって調製できる。この合成は、均一な溶液においてまたは固相において実施できる。
【０１７０】
例えば、Houbenweyl（1974）により既報の、均一溶液中での合成技術が利用されるであろう。
本発明の別の好ましい技術によれば、Merrifieldにより既報の技術が使用される。
【０１７１】
本発明は、更に、本発明に係る少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片の１つを有する雑種ポリペプチドに関する。
雑種分子の合成方法は、所望のポリペプチド配列をコードする雑種ヌクレオチド配列を構築するために遺伝子工学で使用される方法を含む。例えば、有利にはMinton（1984）により既報の融合タンパク質をコードする遺伝子の調製技術を挙げることができる。
【０１７２】
雑種ポリペプチドをコードする上記雑種ヌクレオチド配列および該雑種ヌクレオチド配列の発現によって得られる組換えポリペプチドであることを特徴とする本発明に係る雑種ポリペプチドもまた本発明の一部である。
【０１７３】
本発明は、更に、上記の雑種ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクターを含む。該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該形質転換細胞のいずれかを含むトランスジェニック動物、および該ベクター、該形質転換細胞および／または該トランスジェニック動物を使用する組換えポリペプチドの製造方法もまた本発明の一部である。
【０１７４】
既述の如く、本発明のヌクレオチド配列は、例えば、有機分子もしくは無機分子の生合成または生分解に関与する酵素ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードすることが既知の配列との相同性によって同定される。
【０１７５】
従って、工業的または治療的有用性を有する有機化合物または無機化合物の生合成または生分解についても同様に、本発明に係る上記ポリペプチドを使用することができる。
【０１７６】
Pyrococcus abyssi の超好熱特性を考慮して、上記方法において、このような温度（80℃〜110 ℃以上）における上記酵素の活性および安定性を有利に利用できる。
【０１７７】
上記ポリペプチドの中で、タンパク質分解酵素、アミノトランスフェラーゼ酵素、グルコース代謝酵素、または糖類、アミノ酸、脂肪酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、核酸、または任意のその他の有機もしくは無機化合物の生合成に使用できる酵素、または有機もしくは無機化化合物の生分解に使用できる酵素などの、代謝に関与する酵素が特に例示できる。
【０１７８】
上記ポリペプチドのうち、工業的レベルにおける有機化合物または無機化合物の生合成または生分解（例えば、有用化合物の生産）、農作物加工業、製紙業、化学工業、薬品工業または診断製品工業に適用される変換の残渣の再処理に使用できる、本発明に係る突然変異または改変ポリペプチドに対応する突然変異したまたは改変された酵素を挙げることができる。
【０１７９】
本発明に係るポリペプチドまたはその断片の１つ、本発明に係る形質転換細胞および／または本発明に係る形質転換動物を使用することを特徴とする、有機化合物または無機化合物の生合成法または生分解法もまた、本発明の一部である。
【０１８０】
本発明に係る DNAポリメラーゼ活性または RNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、以下の実施例に記載のタイプＩまたはIIの DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド）は、核酸の増幅を必要とするプロセス、または実施例に記載の使用、方法もしくは用途において有利に使用できる。
【０１８１】
本発明に係る DNAポリメラーゼ活性または RNAポリメラーゼ活性を有する上記ポリペプチドは、下記工程を含むことを特徴とする、生物学的試料（組織、細胞または生物学的液体）中の標的核酸の重合および／または増幅のためのプロセスにおいて使用できる。
ａ）上記ポリペプチドと生物学的試料中に存在する核酸との間に重合反応および／または増幅反応を可能にする条件において該生物学的試料を本発明に係る DNAポリメラーゼ活性または RNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはその断片の１つと接触させる工程。
【０１８２】
本発明は、更に、生物学的試料（組織、細胞または生物学的液体）中の標的核酸の重合および／または増幅のためのＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはその断片の１つを含む試薬またはキット（またはパック）に関する。
【０１８３】
かかる試薬またはキットは、特に、標的核酸の検出および／または同定のために、特に、病原性微生物（例えば、細菌、酵母、寄生生物またはウイルス）に特異的な標的核酸の検出および／または同定のために、または、有用遺伝子または該有用遺伝子内の突然変異の検出および／または同定のために、またタイプＩまたはIIのＤＮＡポリメラーゼに関する下記の実施例に記載の使用、方法または応用のために使用できる。
【０１８４】
【実施例】
本発明の他の特徴および利点は、実施例の説明および図面の以下の説明から明らかであろう。
実験方法
１．細胞
使用したPyrococcus abyssi ORSAY 株は、Collection Nationale de Culture de Microorganismes，INSTITUT  PASTEUR （フランス、パリ）に1999年４月９日にI-2180として寄託された株である。
２．細胞の培養
Pyrococcus abyssi ORSAY 株を、Erausoらにより既報の培養条件でおよび培地上で培養する（Arch．Microbiol.，160 ，338-349 ，1993； J.Bact.,178(11)，3232−3237，1996）。
３．Pyrococcus abyssi の精製
培養後、Sambrookら（1989）の論文に記載のプロトコルにもとづき、Pyrococcus abyssi 菌体を４℃において低速遠心分離によって採取する。
４．ＤＮＡの調製
Sambrookら（1989）の論文に記載のアルカリ分解法によって、可溶な形のＤＮＡを調製し、次いで、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで２回抽出し、リポヌクレアーゼで処理して RNAを除去し、次いで、エタノール沈殿によって DNAを濃縮する。 DNAをTRIS-EDTA (20mM −１mM）にとる。
【０１８５】
アガロースブロックに固定した DNAを下記の如く調製した：上記条件において0.3 からOD 600nmに達するまで培養した後、菌体を氷中で冷却し、次いで、４℃において低速遠心分離する。菌体のペレットを培地中で２回、50mMのEDTM（pH 8.0）中で１回、125 mMのEDTM（pH 8.0）中で１回洗浄し、洗浄毎に遠心分離した。次いで、細胞を37℃において125 mMのEDTM（pH 8.0）中に再懸濁させ、次いで、等容積の低融点アガロース（Shigma VII型）を脱イオン水で1.6 ％に調製し、37℃に温度調節した。混合物を0.1 mlの型に注入し、細胞−アガロース・封入体がゲル化するように室温に放置した。封入体ブロックを離型し、37℃において、 ESP緩衝液（0.5M EDTM （pH 9.0），１％ラウロイルサルコシンおよびプロティナーゼK １mg/ml ）で48時間処理し、次いで、４℃に保持した。封入体ブロックは使用前に、TRIS-EDTA （10mM−１mM）＋PMSF 0.250mg/ml で十分に（４〜６回×２〜４時間）洗浄する。
実施例：Pyrococcus abyssi のゲノムの配列決定および分析
実施例１：配列決定の方法
サイズが1.8 Mbと評価されたP.abyssiのゲノムの配列決定を、予備配列決定マッピングの構築 (演繹的) も、サイズの大きなサブクローンのコンティグの事前の確立 (常に面倒である) も必要としない統合的アプローチによって実施した。選択した方策は、ランダムに選択されたクローンに由来し、対をなす末端の配列決定によって特徴づけられるランダムな相（Roach ら、Genomics，26:345，1995）、次いで、配列を完成する管理された相を伴う。操作は３段階で行った：
１．pBAM3 ／DH10Ｂにおけるプラスミド・ライブラリー（12000 クローン）の作製。平均挿入サイズ５〜６kbは、一方では高収量の生産に関連するクローニング効率の要求と、他方では統合能およびプラスミドpGT5（3.4 kb）の配列の過発現を回避する配慮との間の妥協点として選択した。
【０１８６】
DNAの試料20μｇを、300 μｌの反応容積中で酵素CviJI (CHIMERx−Ozyme)によって部分的に消化した。反応の進行をよりよく制御するため、インキュベーション温度を15℃に低下させた。50μｌの６つの試料を採取し（２分，５分，10分，20分，45分および90分のインキュベーション後）、EDTAおよびSDS （最終的にそれぞれ20mM，0.2 ％）を添加して反応を直ちに停止した。一定量（２μｌ）の電気泳動分析後、適切と判断された部分消化状態に対応する試料を集め、その DNAをエタノールで沈殿させ、次いで、0.4 ％の低融点アガロースゲル（LMP ，Seaplaque GTG,FMC ）上で予備分離した。５〜６kbの範囲の断片のサイズ範囲に対応するゲルバンドを切断し、LMP アガロースを溶融（65℃×５分）させ、次いで、β−アガラーゼ（Biolabs ，アガロース100 μｌについて１単位）の存在下で40℃において４時間保温することによって DNAを精製した。抽出した DNAをエタノールで沈殿させ、滅菌水20μｌ中に再懸濁させ、分析した。平滑末端のプラスミドベクター（例えば、SmaIで切断し脱ホスホリル化したBluescript II SK＋（Stratagene）の５倍モル過剰量に、上記 DNA断片500 ngを連結させた。細菌DH10Ｂ中にエレクトロポレーションし、カルベニシリン（100 μｇ／ml），Xgal（40μｇ／ml）およびIPTG（20μｇ／ml）を添加した固体培地上で選択を行った後、12000 個の白色コロニーを96ウェルマイクロプレート上で継代培養した。
【０１８７】
上記プラスミドクローンの19300 の端部の配列決定は、集合体の主要部を担う。
２．コスミド・ライブラリーの作製（挿入サイズ36〜48kbの4000のクローン）
アガロースブロックに固定したORSAY 株の DNAを、溶融（65℃における）およびβアガラーゼによるアガロースの消化によって遊離させ、次いで、上記の方法にもとづき酵素Sau3Ａによって部分的に消化した。35kbよりも大きいサイズの断片群を、上記のように、 LMPアガロースゲル上での予備的電気泳動によって精製し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。末端の脱ホスホリル化後、これらの断片を、BamHI 部位で、コスミドベクター（例えば、SuperCos1 (Stratagene ））のアームの10倍過剰量に連結させた。インビトロ・パッケージング、DH10Ｂ株 (Life technologies)の感染およびカルベニシリン（100 μｇ／ml）を添加したペトリ皿上に接種した後、約4000のコスミドクローンを96ウェルマイクロプレート上で継代培養した。
【０１８８】
1635の末端配列を上記コスミドクローンから作製し、統合バックボーンをより長い距離にわたって引延ばした。このうち約500 は、統合中にコンティグの末端由来の PCRプローブへのハイブリダイゼーションによって選択されたコスミド上に生成した。
【０１８９】
ランダム相に対応するこれらすべての配列反応は、クローニング部位の端部に１する蛍光プライマー（IRD700およびIRD800で標識）によって得られ、ソフトウエアImage Analysis 3.0によってLI−COR4200 上で分析した。
【０１９０】
統合は、Green らによって開発されたソフトウエアPHRED およびPHRAP （Ewing ら，Genome Res.,8:175, 1998 ）を使用して実施し、得られたデータは、CONSED（Gordonら，Genome Res.,8:195,1998）によって対話式で利用した。この段階において、約98％の配列保証のために、14のクローニング不連続性が存続した。配列のデータと酵素NotIに関するゲノム DNAの切断プロフィルとの比較から、分子全体にわたって統合バックボーンを延長できた。これら14のクローニング不連続性 (0.6 〜５kb) がカバーされ、弱い関連は、LA-PCR（Long and Acurate Polymerase Chain Reaction）によって得られた生成物の配列決定によって強化された。
３．仕上げ工程
ランダム相（“ショットガン”）の終了後、共通配列の連続性および信頼性の保証 (誤差率は、全般にわたり10-4よりも低くなければならない) のため、管理された態様で配列決定を続ける。。これは、２つの段階で展開される：
ａ）コンティグ配列の連結；
ｂ）共通連結の平滑化、これは下記の品質規定を満足しなければならない：
−CONSEDにより編集された共通配列の全般的品質値は40（104 ：１の確率に対応）以上である，
−各位置において少なくとも３つの読み（このうち少なくとも１つはＤＮＡ鎖について）あるいは、異なる２つの化学的方法（標識プライマーまたは標識ターミネータ）にもとづく３つの読み；
−配列がゲノム上に直接形成されている場合は除いて、上記の３つの読みは少なくとも２つの異なるクローンの配列決定から誘導されなければならない。
【０１９１】
ヌクレオチドプライマーは、PRIMO プログラム（Ping LI ら，Genomics，40,476-485，1997）によって半自動的に決定した。
すべての仕上げ配列は、蛍光ターミネータから形成し、シークェンサーABI377で分析した。
【０１９２】
ある種のクローニングギャップを解消し、若干の変化しうる部位および起こり得る多型性を確認するため、P.abyssiのゲノムにおける直接的な配列決定を用いた。
【０１９３】
統合配列から演繹した制限地図と酵素NotIおよびAscIに関してP.abyssiの DNA上で観察された切断プロフィルとを比較することによって、統合のさらなる確認を行った。特に、観察された14のクローニング不連続性に対応して、酵素BamHI 、BgIII, EcoRI，HindIII ，PstIおよびXbaIによって消化され、LA6 PCR によって得られた33のプローブとハイブリッド形成させたORSAY 株の DNAの“サザンブロッティング”によってより精密な確認を行った。
【０１９４】
注釈データの分析によって、平滑化の最終確認を行った (リーディングフレームの完全性) 。
実施例２：配列の注釈
Pyrococcus abyssi の配列の注釈は、簡単な図式に従う：
コードセグメントの決定、類似性によるコード領域の決定、コード領域の統計的モデルの評価、各種領域のコード化可能性の評価、公にされた配列のデータバンクに含まれる配列との比較によるこれらのセグメントの機能の決定。
【０１９５】
簡単な発見的方法を利用した：開始コドンから停止コドンまでの100 のセンスコドンよりも長いすべての最大セグメントを決定することからなる。2342のこの種のオープンリーディングフレームが見出された。次いで、これをblastpアルゴリズム（Altschulら，J.Mol.Biol. ，1990，215:403 ）によってSwissprot タンパク質配列バンク（Bairoch A およびApweiler R., Nucleic Acids Res.1999 ，27:49 −54）と比較して、既知のタンパク質に対して有意の類似性（80のアミノ酸より大きい長さにわたって30％より高い同一性）を有するペプチド配列のコレクションを構築した。こうして、719 の異なるオープンリーディングフレームに対応する、有意に類似する883 の領域が見出された。次いで、隠されたマルコフ連鎖モデルが、上記の類似セグメントをコードするゲノムの領域から誘導された。この隠されたマルコフモデルを次に、glimmer プログラム（Saltzberg ら，Nucl.Ac.Res., 1998,26(2):544）によって各オープンリーディングフレームを再評価するのに使用した。このプロセスの終了時、1623の可能性ある遺伝子が提案された。これらの遺伝子から演繹されるペプチド配列と、Swissprot バンク (Bairoch A およびApweiler R., Nucleic Acids Res.1999,27:49-54）のサイトftp://ftp.ncbi. nlm.nih.gov/pub/COG で得られるCOG 配列（Tatusov ら，Science 1997,278:631）、および下記サイト：
ftp://ftp.tiger.org/pub/data/a fulgidus/GAF.pep.gz
ftp://ftp.tiger.org/pub/data/h influenzae/GHI.pep.gz
ftp://ftp.tigr.org/pub/data/h pylori/GHP.pep.gz
ftp://ftp.tigr.org/pub/data/m janashii/GMH.pep.gz
ftp://ftp.tigr.org/pub/data/m genitalium/GMG.pep.gz
で得られ公にされているTIGRデータベース配列バンク、およびシアノベース（ftp://ftp.kazusa. or.jp/pub/cyano/cyano.p.aa.gz ）に含まれる配列を比較することによって、そのうちの790 に機能を割り当てた。
データバンク
ある配列とタンパク質またはヌクレオチドのデータバンクとの間の相同性を検索するために、BLAST プログラム（公開、Altschulら，1990）を使用した。主要な公共のデータベースを用いた本発明に係る配列とタンパク質または核酸のデータバンクとの間の相同性の検索結果を下表１および２にまとめた。
表１：Pyrococcus abyssi ORSAY のゲノムの各ヌクレオチド配列ORF1〜ORF758によってコードされる配列SEQ ID NO.１〜SEQ ID NO.791 のタンパク質の推定機能の一覧
表１の説明：
ORF1〜ORF791によってコードされるタンパク質に関連するの推定機能はすべて、BLASTPプログラム（Altschulら，1990）を使用する相同性検索から求めた。blastpによって計算した10-5よりも小さいＰ値を有する同一性の程度を示す相同性のみを考慮した。最もありうる機能を、機能欄に示した。この機能に関連するタンパク質配列をSEQ  ID  (配列番号) 欄に示した。
【０１９６】
【表１】
配列番号  機  能                                                    
配列番号２    TPR 反復タンパク質
配列番号３    4-ヒドロキシ安息香酸オクタプレニルトランスフェラーゼ
配列番号４    Zn依存性ヒドロラーゼ、グリオキサラーゼを含む
配列番号５    ヒスチジノールリン酸・アミノトランスフェラーゼ
配列番号６    30S リボソームタンパク質S15
配列番号７    一本鎖DNA 特異的エキソヌクレアーゼ
配列番号８    予想内在性膜タンパク質
配列番号９    D-立体特異的アミノペプチダーゼ (EC 3.4.11.19)
配列番号10    アグマチナーゼまたはアルギナーゼ (EC3.5.5.11または3.5.3.1)
配列番号11    細胞分裂タンパク質 (膜)
配列番号12    ピルビン酸キナーゼ
配列番号13    Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号14    ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ
配列番号15    アラニル-tRNA シンテターゼ
配列番号16    複製因子Ｃ、サブユニット
配列番号17    複製因子Ｃ、大サブユニット
配列番号18    ホスホセリンホスファターゼ (EC 3.1.3.3) 類似仮説タンパク質
配列番号19    グルタチオン依存性Na/H対向輸送体膜貫通ドメイン−膜貫通
配列番号20    ピリドキサールリン酸依存性アミノトランスフェラーゼ
配列番号21    β−ラクタマーゼ (EC3.5.2.6)類似ペニシリン固定タンパク質
配列番号22    ジヒドロオロターゼ
配列番号23    ペリプラスムジペプチド (およびニッケル) 結合タンパク質
配列番号24    オリゴペプチド／ニッケル・パーミアーゼ
配列番号25    パーミアーゼ、主にアミノ酸およびペプチド
配列番号26    ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号27    ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号28    ビオチン-[アセチル-CoA-カルボキシラーゼ] リガーゼ (EC 6.3.4                    .15)
配列番号29    モリブデン結合ペリプラスムタンパク質!!
配列番号30    ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号31    ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号32    デヒドロゲナーゼ (フラボタンパク質)
配列番号33    モリブドプテリン変換因子
配列番号34    推定ATP 依存性プロテアーゼのリコンビナーゼ(RecA)および ATPア                    ーゼドメイン
配列番号35    推定ATP 依存性プロテアーゼのリコンビナーゼ(RecA)および ATPア                    ーゼドメイン
配列番号36    フクロースリン酸・アルドラーゼ (EC 4.1.2.17)
配列番号37    α−アミラーゼまたは4-α−グルカノトランスフェラーゼ (EC3.2.                    1.1 または2.4.1.25)
配列番号38    パーミアーゼ、主にアミノ酸、
配列番号39    糖パーミアーゼ
配列番号40    アミロプルラナーゼ (EC3.2.1.1/3.2.2.41)
配列番号41    ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号42    スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号43    パーミアーゼ
配列番号44    グルタミンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼおよび他の予                    想されるアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ
配列番号45    Znプロテアーゼおよび不活性化相同物
配列番号46    Znプロテアーゼおよび不活性化相同物
配列番号47    ピリドキサールリン酸依存性酵素
配列番号48    推定ATP 依存性プロテアーゼのリコンビナーゼ(RecA)および ATPア                    ーゼドメイン
配列番号49    3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸スルホトランスフェラーゼ (                    PAPSレダクターゼ)
配列番号50    予想ではエキソポリホスファターゼ
配列番号51    ジヒドロプテロエートシンターゼ
配列番号52    予想ではデヒドロゲナーゼ
配列番号53    NAD(FAD)-利用デヒドロゲナーゼ
配列番号54    延長因子２
配列番号55    イノシトールモノホスファターゼおよび関連サルファイト合成酵素
配列番号56    スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号57    スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号58    予想ではホスファターゼ
配列番号59    予想ではホスホエステラーゼ
配列番号60    CBS ドメインタンパク質
配列番号61    フェレドキシン
配列番号62    フェレドキシン
配列番号63    D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ
配列番号64    PP−ループスーパーファミリ ATPアーゼ
配列番号65    CTP シンターゼ (EC6.3.4.2)
配列番号66    予想ではパーミアーゼ
配列番号67    異なる特異性を持つデヒドロゲナーゼ (短鎖アルコールデヒドロゲ                    ナーゼに関連)
配列番号68    NAD 依存性K+およびNa+ 取込みタンパク質
配列番号69    高親和性分岐アミノ酸輸送系 ATPアーゼ
配列番号70    rRNA (アデノシンN6,N6-)-ジメチルトランスフェラーゼ
配列番号71    インテグラーゼ／リコンビナーゼ
配列番号72    グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
配列番号73    メチル化DNA-タンパク質システインメチルトランスフェラーゼ
配列番号75    仮説チロシン特異的タンパク質ホスファターゼ (EC3.1.3.48)
配列番号76    リボキナーゼ (EC2.7.1.15)
配列番号77    SAM-依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号78    SAM-依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号79    イソプロピルリンゴ酸／ホモクエン酸シンターゼ
配列番号80    3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ／アコニターゼ大サブユニ                    ット (ドメイン)
配列番号81    3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ／アコニターゼ小サブユニ                    ット (ドメイン)
配列番号82    イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
配列番号83    アセチルグルタミン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
配列番号84    アセチルグルタミン酸キナーゼ
配列番号85    アセチルオルニチンデアセチラーゼまたはスクシニル−ジアミノ− ピメリン酸デスクシニラーゼ (EC 3.5.1.16 または3.5.1.18)
配列番号86    トランスケトラーゼ／ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1サブユニット
配列番号87    トランスケトラーゼ／ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1サブユニット
配列番号88    7-ホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシ-D-アラビノヘプトン酸シンタ                      ーゼ (DAHPシンターゼ) ／3-デオキシ-D-マンノオクツロソン酸8-                    リン酸シンテターゼ
配列番号89    3-デヒドロキニン酸シンテターゼ
配列番号90    3-デヒドロキニン酸シンテターゼ
配列番号91    シキミ酸5-デヒドロゲナーゼ
配列番号92    高親和性分岐アミノ酸輸送系 ATPアーゼ
配列番号93    炭水化物およびアミノ酸パーミアーゼ
配列番号94    炭水化物およびアミノ酸パーミアーゼ
配列番号95    5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸シンターゼ
配列番号96    コリスミン酸シンターゼ
配列番号97    細胞内プロテアーゼＩ (EC3.4.-.-)
配列番号98    Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号99    DNA プライマーゼ (細菌型) および小プライマーゼ様タンパク質
配列番号100   ホスホグルコムターゼ／ホスホマンノムターゼ
配列番号101   チミジル酸キナーゼ
配列番号102   シグナル認識粒子GTP アーゼ
配列番号103   未特性決定ACR! 3
配列番号104   グルタミルおよびグルタミニル-tRNA シンテターゼ
配列番号105   カチオン輸送体
配列番号106   異なる特異性を持つデヒドロゲナーゼ (短鎖アルコールデヒドロゲ                    ナーゼに関連)
配列番号107   未特性決定ACR
配列番号108   予想Zn依存性ヒドロラーゼ(β−ラクタマーゼスーパーファミリー)
配列番号109   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号110   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号111   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号112   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号113   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号114   フェリクロム輸送体タンパク質
配列番号115   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号116   リボヌクレアーゼH (EC 3.1.24.4)
配列番号117   プソイドウリジンシンターゼ
配列番号118   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号119   30S リボソームタンパク質S13
配列番号120   30S リボソームタンパク質S4および関連タンパク質
配列番号121   30S リボソームタンパク質S11
配列番号122   50S リボソームタンパク質L13
配列番号123   30S リボソームタンパク質S9
配列番号124   エノラーゼ
配列番号125   30S リボソームタンパク質S2
配列番号126   トレオニンデヒドラターゼ／トレオニンシンターゼ
配列番号127   ガラクトキナーゼ
配列番号128   アスパルトキナーゼ
配列番号129   UDP-N-アセチル-D-マンノサミヌロン酸デヒドロゲナーゼ／UDP グ                    ルコース6-デヒドロゲナーゼ
配列番号130   UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ
配列番号131   グリシル-tRNA シンテターゼ
配列番号132   仮説タンパク質
配列番号133   予想では ATPアーゼ
配列番号134   グルタチオン依存性Na/H対向輸送体−膜貫通ドメイン
配列番号135   グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
配列番号136   イソロイシンパッチスーパーファミリーのアセチルトランスフェラ                    ーゼに相同の炭酸アンヒドラーゼ
配列番号137   未特性決定ACR(翻訳?)
配列番号138   Znフィンガータンパク質 (ヒドロゲナーゼ発現調節?)
配列番号139   染色体分配に関与する ATPアーゼ
配列番号140   ヒドロゲナーゼ生成因子
配列番号141   セリン／トレオニンプロテインキナーゼ
配列番号142   S1型 RNA結合ドメイン
配列番号143   プロテアソーム (多触媒エンドペプチダーゼ複合体) 、αサブユニ                    ット (EC 3.4.99.46)
配列番号144   RNアーゼPH (tRNAヌクレオチジルトランスフェラーゼ)
配列番号145   DNA 依存性RNA ポリメラーゼ、サブユニットB (EC 2.7.7.6)
配列番号146   DNA 依存性RNA ポリメラーゼ、サブユニットA' (EC 2.7.7.6)
配列番号147   DNA 依存性RNA ポリメラーゼ、サブユニットA" (EC 2.7.7.6)
配列番号148   転写終結／抗終結因子
配列番号149   30S リボソームタンパク質S12
配列番号150   30S リボソームタンパク質S7
配列番号151   未特性決定ACR
配列番号152   重複 ATPアーゼドメインを持つABC 輸送体の ATPアーゼ成分
配列番号153   予想では内在性膜タンパク質
配列番号154   エンドグルカナーゼに類似の仮説タンパク質
配列番号155   シトシンデアミナーゼおよび関連予想金属依存性ヒドロラーゼ
配列番号156   エンドヌクレアーゼIII (EC 4.2.99.18(および3.1.25.2))
配列番号157   予想ではパーミアーゼ
配列番号158   DNA 修復に関与する ATPアーゼ
配列番号159   延長因子1-α
配列番号160   30S リボソームタンパク質S10
配列番号161   アルギニル-tRNA シンテターゼ
配列番号162   糖キナーゼ
配列番号163   NADHデヒドロゲナーゼI のK 鎖
配列番号164   ヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号165   NADH-ユビキノンオキシドレダクターゼ
配列番号166   Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号167   ギ酸ハイドロジェンリアーゼ、サブユニット5
配列番号168   ギ酸ハイドロジェンリアーゼ、サブユニット5
配列番号169   フェレドキシン
配列番号170   ATP 依存性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼドメイン
配列番号171   チオレドキシンレダクターゼ
配列番号172   ピリドキサールリン酸依存性アミノトランスフェラーゼ
配列番号173   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号174   発酵乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連デヒドロゲナーゼ
配列番号175   予想Zn依存性ヒドロラーゼ(β−ラクタマーゼスーパーファミリー)
配列番号176   リボース-5-リン酸イソメラーゼ (EC 5.3.1.6)
配列番号177   予想ではrRNAメチラーゼ
配列番号178   ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ
配列番号179   嫌気性デヒドロゲナーゼ、典型的にはセレノシステイン含有
配列番号180   NADPH 依存性グルタミン酸シンターゼβ鎖および関連オキシドレダ                    クターゼ
配列番号181   予想ではプリン／ヒスチジン生合成に関与するリン酸利用酵素
配列番号182   グルタミンアミドトランスフェラーゼ (恐らくヒスチジンおよびプ                    リン生合成に関与)
配列番号183   パーミアーゼ、主にアミノ酸
配列番号184   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号185   GMP シンターゼ−グルタミンアミドトランスフェラーゼドメイン
配列番号186   予想では膜GTP アーゼ
配列番号187   グリシンデカルボキシラーゼ複合体H サブユニット
配列番号188   PPループスーパーファミリー ATPアーゼ
配列番号189    (予想) 線毛生合成に関与する ATPアーゼ
配列番号190   S1型 RNA結合ドメイン
配列番号191   3-メチル-2-オキソブタン酸ヒドロメチルトランスフェラーゼ
配列番号192   ヒドロゲナーゼ生成／発現因子
配列番号193   Fe-Sオキシドレダクターゼ4
配列番号194   予想ではデヒドロゲナーゼおよび関連タンパク質
配列番号195   予想ではデヒドロゲナーゼおよび関連タンパク質
配列番号196   ジアミノピメリン酸／オルニチン酸デスクシニラーゼ／デアセチラ                    ーゼ
配列番号197   スーパーファミリーIIでねおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号198   スーパーファミリーIIでねおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号199   カルバミン酸キナーゼ
配列番号200   フラボタンパク質、デヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号201   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号202   シスタチオニンβ−リアーゼ／シスタチオニンγ−シンターゼ
配列番号203   5-メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステインメチルトランスフェラ                    ーゼ (メチオニンシンテターゼ)
配列番号204   パーミアーゼ (主要促進因子ファミリー)
配列番号205   ホモセリンデヒドロゲナーゼ
配列番号206   イソロイシル-tRNA シンテターゼ
配列番号207   ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン含有転写調節因子
配列番号208   カチオン輸送体 ATPアーゼ
配列番号209   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号210   オリゴペプチド／ニッケルパーミアーゼ
配列番号211   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号212   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号213   エンドグルカナーゼ (EC 3.2.1.4)
配列番号214    (予想) 線毛生合成に関与する ATPアーゼ
配列番号215   フェレドキシン
配列番号216   フラボドキシン／ヘムタンパク質
配列番号217   フェレドキシン
配列番号218   ギ酸ハイドロジェンリアーゼ、サブユニット5
配列番号219   推定ATP 依存性プロテアーゼのリコンビナーゼ(RecA)および ATPア                    ーゼドメイン
配列番号220   リポ多糖生合成／翻訳開始因子eIF2B サブユニットに関与するヌク                    レオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ
配列番号221   リシル／アスパラギニル／アスパルチル-tRNA シンテターゼ
配列番号222   アリールスルファターゼ調節因子 (Fe-Sオキシドレダクターゼ)
配列番号223   3-オクタプレニル-4-ヒドロキシ安息香酸カルボキシル−リアーゼ またはフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ  (EC4.1.1.)
配列番号224   ジアデノシン5',5"'-P1,P4-四リン酸 (Ap4A) 非対称ヒドロラーゼ                    、HIT ファミリーの他の予想ヒドロラーゼおよびガラクトース1-リ                    ン酸ウリジリルトランスフェラーゼ
配列番号225   予想ではパーミアーゼ
配列番号226   フェリクロム輸送体タンパク質
配列番号227   鉄、ヘミン、コバラミンパーミアーゼ
配列番号228   重複 ATPアーゼドメインを持つABC 輸送体の ATPアーゼ成分
配列番号229   リン酸パーミアーゼ
配列番号230   リン酸パーミアーゼ
配列番号231   ABC 輸送体 ATPアーゼサブユニット
配列番号232   Zn依存性ヒドロラーゼ、グリオキシラーゼを含む
配列番号233   仮説サーモヌクレアーゼ (EC 3.1.31.1)
配列番号234   PHP スーパーファミリーヒドロラーゼ
配列番号235   予想では膜GTP アーゼ
配列番号236   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号237   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号238   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号239   予想では膜GTP アーゼ
配列番号240   アセチルオルニチンデアセチラーゼまたはスクシニル−ジアミノ−
ピメリン酸デスクシニラーゼ (EC 3.5.1.16 または3.5.1.18)
配列番号241   パーミアーゼ
配列番号242   予想Zn依存性ヒドロラーゼ(β−ラクタマーゼスーパーファミリー)
配列番号243   ホスホリボシルホルミニノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミド                    イソメラーゼ
配列番号244   アデニル酸／シチジル酸キナーゼ
配列番号245   キューイン(queuine) tRNA-リボシルトランスフェラーゼ
配列番号246   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号247   アスパラギンシンターゼ (グルタミン加水分解)
配列番号248   ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン含有転写調節因子
配列番号249   パーミアーゼ
配列番号250   翻訳開始因子IF-2相同物
配列番号251   チミジル酸キナーゼ
配列番号252   予想ではZn依存性ヒドロラーゼ(恐らくシャペロン機能)
配列番号253   未特性決定ACR(翻訳開始調節因子?)
配列番号254   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号255   パーミアーゼ
配列番号256   プロリルエンドペプチダーゼ (EC 3.4.21.26)
配列番号257   アデニル酸／シチジル酸キナーゼ
配列番号258   デアセチラーゼ
配列番号259   予想では輸送体!
配列番号260   UDP-N-アセチル-D-マンノサミヌロン酸デヒドロゲナーゼ／UDP グ                    ルコース6-デヒドロゲナーゼ
配列番号261   リポ多糖生合成／翻訳開始因子eIF2B サブユニットに関与するヌク                    レオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ
配列番号262   グリコシルトランスフェラーゼ、典型的には細胞壁生合成に関与
配列番号263   イソロイシンパッチスーパーファミリーのアセチルトランスフェラ                    ーゼに相同の炭酸アンヒドラーゼ
配列番号264   予想では細胞壁生合成の調節に明らかに関与するピリドキサールリ                    ン酸依存性酵素
配列番号265   予想ではデヒドロゲナーゼおよび関連タンパク質
配列番号266   UDP-N-アセチル-D-マンノサミヌロン酸デヒドロゲナーゼ／UDP グ                    ルコース6-デヒドロゲナーゼ
配列番号267   アデノシン-5'-ホスホサルフェート-3'-ホスホトランスフェラーゼ                     (アデニル硫酸キナーゼ)
配列番号268   予想ではパーミアーゼ
配列番号269   予想では輸送体!
配列番号270   リポ多糖生合成／翻訳開始因子eIF2B サブユニットに関与するヌク                    レオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ
配列番号271   dDTP-グルコース4,6-デヒドロラターゼ (EC 4.2.1.46)
配列番号272   ヌクレオシド−二リン酸−糖エピメラーゼ
配列番号273   仮説グリコシルトランスフェラーゼ (EC 2.4.1.-)
配列番号274   グリコシルトランスフェラーゼ、典型的には細胞壁生合成に関与
配列番号275    (予想) 線毛生合成に関与する ATPアーゼ
配列番号276   未特性決定ACR-SIR1相同物!!!!
配列番号277   ヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号278   グルタチオン依存性Na/H対向輸送体−膜貫通ドメイン
配列番号279   予想では ATPアーゼ
配列番号280   DNA 修復エキソヌクレアーゼ
配列番号281   DNA 修復に関与する ATPアーゼ
配列番号282   マンノース-6-リン酸イソメラーゼ／マンノース-1-リン酸グアニ リルトランスフェラーゼ (EC 5.3.1.8/2.7.7.22)
配列番号283   ホスホマンノムターゼまたはホスホグルコムターゼ (EC 5.4.2.8ま                    たは5.4.2.2)
配列番号284   高親和性分岐アミノ酸輸送体系 ATPアーゼ
配列番号285   未特性決定ACR(翻訳開始調節因子?)
配列番号286   内在性膜タンパク質
配列番号287   グリコシルトランスフェラーゼに類似性を持つ仮説タンパク質
配列番号288   未特性決定ACR! 2
配列番号289   アデニルコハク酸リアーゼ
配列番号290   予想ではrRNAメチラーゼ
配列番号291   ジヒドロピコリン酸シンテターゼ／N-アセチルノイラミン酸リアー                    ゼ
配列番号292   予想では ATPアーゼ、複製因子に遠く関係
配列番号293   細胞分裂に関与する GTPアーゼ、チューブリンに遠く関係
配列番号294   染色体分配に関与する ATPアーゼ
配列番号295   スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号296   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号297   ヒドロゲナーゼ生成因子
配列番号298   グルカナーゼに類似の仮説タンパク質
配列番号299   パーミアーゼ
配列番号300   HMP-P キナーゼ (チアミン生合)
配列番号301   未特性決定ACR
配列番号302   セリル-tRNA シンテターゼ
配列番号303   パーミアーゼ
配列番号304   チアミンピロリン酸酵素 [アセト乳酸シンターゼ、ピルビン酸デヒ                    ドロゲナーゼ (シトクロム) 、2-スクシニル-6-ヒドロキシ-2,4-                      シクロヘキサジエン-1-カルボン酸シンターゼ、グリオキシル酸カ                    ルボリガーゼ]
配列番号305   ケトール−酸レダクトイソメラーゼ (イソロイシンの生合成)
配列番号306   2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ (EC 4.1.3.12)
配列番号307   3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロラターゼ／アコニターゼ大サブユ                    ニット (ドメイン)
配列番号308   3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロラターゼ／アコニターゼ小サブユ                    ニット (ドメイン)
配列番号309   イソプロピルリンゴ酸／ホモクエン酸シンターゼ
配列番号310   デヒドラターゼ (ジヒドロキシ酸／ホスホグルコン酸)
配列番号311   アセチルトランスフェラーゼ
配列番号312   3-オキソアシル-[アシル-キャリアー-タンパク質] シンターゼIII
配列番号313   アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ
配列番号314   パーミアーゼ
配列番号315   予想では GTPアーゼ
配列番号316   N6-アデニン特異的DNA メチラーゼ
配列番号317   リン酸パーミアーゼ
配列番号318   システイニル-tRNA シンテターゼ
配列番号319   NAD(FAD)-利用デヒドロゲナーゼ
配列番号320   未特性決定ACR
配列番号321   セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ
配列番号322   予想ではシチジルトランスフェラーゼ
配列番号323   染色体分配に関与する ATPアーゼ
配列番号324   予想では金属依存生ヒドロラーゼ!
配列番号325   CBS ドメインタンパク質
配列番号326   シグナルペプチダーゼI
配列番号327   リポ多糖N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
配列番号328   発酵乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連デヒドロゲナーゼ
配列番号329   予想ではパーミアーゼ
配列番号330   セリン／トレオニンプロテインキナーゼ
配列番号331   センサー形質導入ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子 (２成分                    シグナル形質導入系)
配列番号332   走化性タンパク質
配列番号333   ナトリウム／カルシウム対向輸送体
配列番号334   予想Zn依存性ヒドロラーゼ(β−ラクタマーゼスーパーファミリー)
配列番号335   予想ではグルタミンアミドトランスフェラーゼ
配列番号336   セリン／トレオニンプロテインキナーゼ
配列番号337   仮説リゾホスホリパーゼ相同物
配列番号338   リポ多糖生合成／翻訳開始因子eIF2B サブユニットに関与するヌク                    レオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ
配列番号339    (予想) デハロゲナーゼ関連スーパーファミリーのヒドロラーゼ
配列番号340   リボヌクレオチド二リン酸レダクターゼ (EC 1.17.4.1)
配列番号341   FAD 依存性オキシドレダクターゼ (ユビキノン生合成)
配列番号342   膜Znプロテアーゼ (予想)
配列番号343   予想では GTAアーゼ
配列番号344   ホスホリボシルカルボキシアミノイミダゾール(NCAIR) ムターゼ
配列番号345   ホスホリボシルアミノイミダゾール(AIR) シンテターゼ
配列番号346   異なる特異性を持つデヒドロゲナーゼ (短鎖アルコールデヒドロゲ                    ナーゼに関連)
配列番号347   染色体分配に関与する ATPアーゼ
配列番号348   予想ではPPスーパーファミリー ATPアーゼ
配列番号349   アセチルトランスフェラーゼ
配列番号350   tRNAイントロンエンドヌクレアーゼ (EC 3.1.27.9)
配列番号351   ヒスチジル-tRNA シンテターゼ
配列番号352   プレタンパク質トランスロカーゼサブユニット
配列番号353   仮説エンドヌクレアーゼIV (EC 3.1.21.2)
配列番号354   無機ピロホスファターゼ (EC 3.6.1.1)
配列番号355   DNA 依存性RNA ポリメラーゼ、サブユニットE (EC 2.7.7.6)
配列番号356   カチオン輸送体
配列番号357   推定転写因子
配列番号358   トリプトファニル-tRNA シンテターゼ
配列番号359   ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼ
配列番号360   リポ多糖生合成／翻訳開始因子eIF2B サブユニットに関与するヌク                    レオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ
配列番号361   未特性決定ACR
配列番号362   エノラーゼ (EC 4.2.1.11)
配列番号363   DNA 依存性ポリメラーゼI (EC 2.7.7.7)
配列番号364   Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号365   予想ではデヒドロゲナーゼおよび関連タンパク質
配列番号366   予想ではデヒドロゲナーゼおよび関連タンパク質
配列番号367   予想では糖キナーゼ
配列番号368   ジヒドロオロターゼ
配列番号369   フラボドキシン／ヘムタンパク質
配列番号370   モリブデン補因子生合成酵素および関連Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号371   3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸スルホトランスフェラーゼ (                    PAPSレダクターゼ)
配列番号372   金属依存性プロテアーゼ
配列番号373   デオキシシチジンデアミナーゼ
配列番号374   50S リボソームタンパク質L1
配列番号375   30S リボソームタンパク質S2
配列番号376   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号377   グリシンデヒドロゲナーゼ (脱炭酸)
配列番号378   グリシンデヒドロゲナーゼ (脱炭酸)
配列番号379   プソイドウリジンシンターゼ
配列番号380   内在性膜タンパク質
配列番号381   プレタンパク質トランスロカーゼサブユニット
配列番号382   プレタンパク質トランスロカーゼサブユニット
配列番号383   NAD 依存性K+またはNa+ 取込み系成分
配列番号384   プソイドウリジンシンターゼ
配列番号385   ATP シンターゼE サブユニット
配列番号386   ATP シンターゼβサブユニット／転写終結因子rho
配列番号387   フラボタンパク質デヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号388   センサー形質導入ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子 (２成分                    シグナル形質導入系)
配列番号389   アラニル-tRNA シンテターゼ
配列番号390   オリゴペプチド／ニッケルパーミアーゼ
配列番号391   パーミアーゼ、主にアクリル酸およびペプチド
配列番号392   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号393   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号394   ホスホリボシルホルミルグリシナミジンシンターゼI
配列番号395   ホスホリボシルホルミルグリシナミジンシンターゼII
配列番号396   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号397   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号398   ホスホセリンホスファターゼ1 (EC 3.1.3.3)
配列番号399   トリオースリン酸イソメラーゼ (EC 5.3.1.1)
配列番号400   フラボドキシン／ヘムタンパク質
配列番号401   NADPH 依存性グルタミン酸シンターゼβ鎖および関連オキシドレダ                    クターゼ
配列番号402   Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号403   D-アラビノ3-ヘクスロース6-リン酸ホルムアルデヒドリアーゼ (EC                     4.1.2.)
配列番号404   予想ではホスファターゼ
配列番号405   アセチルトランスフェラーゼ
配列番号406   ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン含有転写調節因子
配列番号407   スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号408   未特性決定ACR(修復酵素?)
配列番号409   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号410   未特性決定ACR
配列番号411   ピリドキサールリン酸依存性アミノトランスフェラーゼ (2-アミノ                    -3- オキソブタン酸シンターゼ／8-アミノ酸-7-オキソノナン酸シ                    ンターゼ)
配列番号412   アラニル-tRNA シンテターゼ
配列番号413   グリコシルトランスフェラーゼ、典型的には細胞壁生合成に関与
配列番号414   グルタチオン依存性Na/H対向輸送体−膜貫通ドメイン
配列番号415   IMP デヒドロゲナーゼ／GMP レダクターゼ
配列番号416   バリル-tRNA シンテターゼ
配列番号417   ホスホリボシルグリシナミド・ホルミルトランスフェラーゼII
配列番号418   ホスホリボシルアミン−グリシンリガーゼ
配列番号419   予想では ATPアーゼ、複製因子に遠く関連
配列番号420   未特性決定ACR
配列番号421   N6-アデニン特異性DNA メチラーゼ
配列番号422   DNA J 型Znフィンガードメイン
配列番号423   ホスホ-N-アセチルムラモイル−ペンタペプチドトランスフェラー                    ゼ／ウンデカプレニルリン酸α-N-アセチルグルコサミニルトラン                    スフェラーゼ
配列番号424   グルタミンシンターゼ
配列番号425   予想では ATPアーゼ、複製因子に遠く関連
配列番号426   UDP-グルコース4-エピメラーゼ (EC 5.1.3.2)
配列番号427   リポ多糖N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
配列番号428   推定翻訳因子
配列番号429   アデニルコハク酸シンターゼ
配列番号430   モリブドプテリン生合成酵素
配列番号431   翻訳開始因子eIF-2Bαサブユニット
配列番号432   センサー形質導入ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子 (２成分                    シグナル形質導入系)
配列番号433   ATP 依存性プロテアーゼLA (EC 3.4.21.53)
配列番号434   グリコシルトランスフェラーゼ、典型的には細胞壁生合成に関与
配列番号435    (予想) デハロゲナーゼ関連スーパーファミリーのヒドロラーゼ
配列番号436   予想ではヌクレオチジルトランスフェラーゼ
配列番号437   カルボキシペプチドダーゼ (EC 3.4.17.19)
配列番号438   膜プロテアーゼサブユニット、ストマチン／プロヒビチン相同物
配列番号439   応答調節因子
配列番号440   タンパク質−グルタミン酸メチルエステラーゼ (EC 3.1.1.61)
配列番号441   走化性タンパク質ヒスチジンキナーゼおよび関連キナーゼ
配列番号442   センサー形質導入ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子 (２成分                    シグナル形質導入系)
配列番号443   ペリプラスムジペプチド (およびニッケル) 結合タンパク質
配列番号444   オリゴペプチド／ニッケルパーミアーゼ
配列番号445   パーミアーゼ、主にアミノ酸およびペプチド
配列番号446   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号447   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号448   グルコサミン−フルクトース-6-リン酸・アミノトランスフェラー                    ゼ
配列番号449   β−ガラクトシダーゼ (EC 3.2.1.23)
配列番号450   未特性決定、His リッチタンパク質
配列番号451   予想では GTPアーゼ
配列番号452   予想ではエキソポリホスファターゼ
配列番号453   S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ
配列番号454   分子シャペロン、HS90ファミリー
配列番号455   推定ATP 依存性プロテアーゼのリコンビナーゼ(RecA)および ATPア
ーゼドメイン
配列番号456    (予想) 線毛生合成に関与する ATPアーゼ
配列番号457   嫌気性デヒドロゲナーゼ、典型的にはセレノシステイン含有
配列番号458   フェレドキシン
配列番号459   ヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号460   ヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号461   NADH-ユビキノンオキシドレダクターゼ
配列番号462   ギ酸ヒドロジェンリアーゼ、サブユニット5
配列番号463   フェレドキシン
配列番号464   Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号465   ヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号466   リポ多糖N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
配列番号467   グリコシルトランスフェラーゼ (EC 2.4.1.-)
配列番号468   トポイソメラーゼタイプIA
配列番号469   スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号470   未特性決定ACR
配列番号471   メチオニンアミノペプチダーゼ (EC 3.4.11.18)
配列番号472   エンドヌクレアーゼIII に類似性を持つ仮説タンパク質
配列番号473   モリブドプテリン生合成酵素
配列番号474   予想ではパーミアーゼ
配列番号475   予想ではパーミアーゼ
配列番号476   アラニル-tRNA シンテターゼ
配列番号477   ピルビン酸キナーゼ
配列番号478   未特性決定ACR
配列番号479   50S リボソームタンパク質L16
配列番号480   チオレドキシン様オキシドレダクターゼ
配列番号481   予想ではアミドヒドロラーゼ
配列番号482   2-ヒドロキシヘプタ-2,4-ジエン-1,7-二酸イソメラーゼ
配列番号483   RNA 結合タンパク質 (RRM ドメイン)!! 1
配列番号484   KLBA相同物
配列番号485   DNA 依存性RNA ポリメラーゼ、サブユニットM (EC 2.2.7.6)
配列番号486   増殖細胞核抗原 (PCNA)
配列番号487   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号488   フェレドキシン
配列番号489   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号490   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号491   フェレドキシン
配列番号492   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号493   フェレドキシンオキシドレダクターゼ
配列番号494   AAA スーパーファミリーおよび関連 ATPアーゼ
配列番号495   ヌクレオシド二リン酸キナーゼ
配列番号496   トレオニル-tRNA シンテターゼ
配列番号497   転写終結／抗終結因子
配列番号498   アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ、触媒鎖
配列番号499   ウロポルフィリンIII C-メチルトランスフェラーゼ
配列番号500   オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ
配列番号501   オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ
配列番号502   予想でシチジリルトランスフェラーゼ
配列番号503   アルコールデヒドロゲナーゼ仮説ブタノールデヒドロゲナーゼ (EC                     1.1.1.)
配列番号504   Na/H対向輸送体
配列番号505   ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ
配列番号506   アミノ酸パーミアーゼ
配列番号507   鉄、へミン、コバラミンパーミアーゼ
配列番号508   高親和性分岐アミノ酸輸送系 ATPアーゼ
配列番号509   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号510   Znプロテアーゼおよび不活性化相同物
配列番号511   Znプロテアーゼおよび不活性化相同物
配列番号512   アルセニカル (砒素) ポンプ駆動 ATPアーゼ
配列番号513   ヒドロゲナーゼ発現生成因子
配列番号514   ヒドロゲナーゼ成熟因子
配列番号515   スーパーファミリーI DNA ヘリカーゼおよびヘリカーゼサブユニッ                    ト (yjhR-C末端ドメインのみ)
配列番号516    (予想) デハロゲナーゼ関連スーパーファミリーのヒドロラーゼ
配列番号517   仮説グルタミン酸デカルボキシラーゼ (EC 4.1.1.)
配列番号518   ドリコールマンノシルトランスフェラーゼ関連タンパク質
配列番号519   アスパラギンシンテターゼ (グルタミン加水分解)
配列番号520   スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号521   プロリンペプチダーゼ (EC 3.4.-.-)
配列番号522   グリシン切断系Ｔタンパク質 (アミノメチルトランスフェラーゼ)
配列番号523   転写活性化因子!!!
配列番号524   転写活性化因子!!!
配列番号525   チアミンリン酸ピロホスホリラーゼ
配列番号526   HMP-P キナーゼ (チアミン生合成)
配列番号527   リン酸パーミアーゼ
配列番号528   プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
配列番号529   パーミアーゼ
配列番号530   未特性決定ACR
配列番号531   ホスホマンノムターゼまたはホスホグルコムターゼ (EC 5.4.2.8ま                    たは5.4.2.2)
配列番号532   重複 ATPアーゼドメインを持つABC 輸送体の ATPアーゼ成分
配列番号533   チオール抗酸化酵素
配列番号534   アスパルトキナーゼ
配列番号535   アスパルトキナーゼ
配列番号536   ホモセリンキナーゼ
配列番号537   トレオニンデヒドラターゼ／トレオニンシンターゼ
配列番号538   アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
配列番号539   3-ホスホグリセリン酸キナーゼ
配列番号540   ABC 輸送体 ATPアーゼサブユニット
配列番号541   プソイドウリジル酸シンターゼI (tRNA psi55)
配列番号542   モリブデン補因子生合成酵素および関連Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号543   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号544   フェレドキシン
配列番号545   ビオチンカルボキシラーゼ／D-アラニン-D-アラニンリガーゼ (AT                    P 捕捉ドメイン)
配列番号546   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号547   プロリル-tRNA シンテターゼ
配列番号548   TATAボックス結合タンパク質
配列番号549   チロシル-tRNA シンテターゼ
配列番号550   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号551   フラボドキシン／ヘムタンパク質
配列番号552   NADPH 依存性グルタミン酸シンターゼβ鎖および関連オキシドレダ                    クターゼ
配列番号553   β−グリコシダーゼ (EC 3.2.1.)
配列番号554   予想Zn依存性ヒドロラーゼ (β−ラクトマーゼスーパーファミリー)
配列番号555   予想では糖キナーゼ
配列番号556   予想Zn依存性ヒドロラーゼ (β−ラクトマーゼスーパーファミリー)
配列番号557   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号558   アセチル-CoAカルボキシラーゼβサブユニット
配列番号559   アセチル-CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパ                    ク質
配列番号560   ジペプチダーゼ (EC 3.4.13.)
配列番号561   ロイシル-tRNA シンテターゼ
配列番号562   フラボドキシン／ヘムタンパク質
配列番号563   フェレドキシン
配列番号564   メチルビオロゲン還元ヒドロゲナーゼαサブユニット
配列番号565   AAA スーパーファミリーおよび関連 ATPアーゼ
配列番号566   リンゴ酸酵素
配列番号567   染色体分配に関与する ATPアーゼ
配列番号568   未特性決定ACR
配列番号569   セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ
配列番号570   予想ではトランソポザーゼ
配列番号571   ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ
配列番号572   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ (recQファミリー)
配列番号573   細胞分裂に関与する GTPアーゼ、チューブリンに遠く関係
配列番号574   ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ
配列番号575   パーミアーゼ (主要促進因子ファミリー)
配列番号576   D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ
配列番号577   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号578   ナトリウムおよび塩素依存性輸送体
配列番号579   翻訳延長因子P/翻訳開始因子eIF5-a
配列番号580   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号581   未特性決定ACR (pps1 タンパク質相同物)
配列番号582   チオレドキシン様オキシドレダクターゼ
配列番号583   ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ (EC 5.2.1.8)
配列番号584   プロテアソーム (多触媒エンドペプチダーゼ複合体) 、βサブユニ                    ット2 (EC 3.4.99.46)
配列番号585   予想Zn依存性ヒドロラーゼ (β−ラクトマーゼスーパーファミリー)
配列番号586   トレオニンデヒドラターゼ／トレオニンシンターゼ
配列番号587   グルタミン酸5-キナーゼ
配列番号588   ペリプラスムジペプチド (およびニッケル) 結合タンパク質
配列番号589   オリゴペプチド／ニッケルパーミアーゼ
配列番号590   パーミアーゼ、主にアミノ酸およびペプチド
配列番号591   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号592   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号593   DNA 構造特異的エンドヌクレアーゼに類似の仮説ヌクレアーゼ
配列番号594   NADHデヒドロゲナーゼI のK 鎖
配列番号595   ヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号596   Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号597   ギ酸ヒドロジェンリアーゼ、サブユニット5
配列番号598   ギ酸ヒドロジェンリアーゼ、サブユニット5
配列番号599   NADH-ユビキノンオキシドレダクターゼ
配列番号600   フェレドキシン
配列番号601   3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸スルホトランスフェラーゼ (                    PAPSレダクターゼ)
配列番号602   パントテン酸代謝に関与するフラボタンパク質
配列番号603   モリブデン補因子生合成相同物
配列番号604   L アスパラギナーゼII
配列番号605   Glu-tRNAGln アミドトランスフェラーゼＢサブユニット (PET112相                    同物)
配列番号606   グリセロールデヒドロゲナーゼ
配列番号607   転写開始因子TFIIB
配列番号608   リポ酸−タンパク質リガーゼＡ
配列番号609   グリセロール代謝に関与する未特性決定タンパク質 (Drosophila r                    homboid の相同物
配列番号610   ピリドキサールリン酸依存性アミノトランスフェラーゼ
配列番号611   高親和性分岐アミノ酸輸送体系 ATPアーゼ
配列番号612   予想では内在性膜タンパク質
配列番号613   未特性決定ACR
配列番号614   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号615   チアミン生合成酵素
配列番号616   NAD(FAD)利用デヒドロゲナーゼ
配列番号617   膜プロテアーゼサブユニット、ストマチン／プロヒビチン相同物
配列番号618   デヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ
配列番号619   スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号620   RNA リン酸サイクラーゼ
配列番号621   予想ではホスホエステラーゼ
配列番号622    (予想) 線毛生合成に関与する ATPアーゼ
配列番号623   予想でtRNAメチラーゼ
配列番号624   Znプロテアーゼおよび不活性化相同物
配列番号625   Znプロテアーゼおよび不活性化相同物
配列番号626   プロテアーゼIV (EC 3.4.-.-)
配列番号627   予想ではパーミアーゼ
配列番号628   酸化損傷修復酵素を含むNTP ピロホスホヒドロラーゼ (MutTファミ                    リー)
配列番号629   トリプトファンシンターゼβ鎖
配列番号630   グリコシルトランスフェラーゼ、典型的には細胞壁生合成に関与
配列番号631   予想ではZn依存性プロテアーゼ (恐らくシャペロン機能)
配列番号632   ドリコールリン酸マンノシルトランスフェラーゼ関連タンパク質
配列番号633   チミジンホスホリラーゼ
配列番号634   染色体分配に関与する ATPアーゼ
配列番号635   予想Zn依存性ヒドロラーゼ (β−ラクトマーゼスーパーファミリー)
配列番号636   予想ではPPスーパーファミリーの ATPアーゼ
配列番号637   モリブデン補因子生合成酵素および関連Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号638   ジアデノシン四リン酸および関連セリン／トレオニンタンパクホス                    ファターゼ
配列番号639   DNA リガーゼ (EC 6.5.1.1)
配列番号640   パーミアーゼ (塩素チャネル?)
配列番号641   モリブドプテリン生合成酵素
配列番号642   グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
配列番号643    (予想) デハロゲナーゼ関連スーパーファミリーのヒドロラーゼ
配列番号644   シグナル認識粒子 GTPアーゼ
配列番号645   予想では GTPアーゼ
配列番号646   予想ではPPスーパーファミリーの ATPアーゼ
配列番号647   アデニン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
配列番号648   Fe-Sオキシドレダクターゼ4
配列番号649   GTP アーゼ−翻訳延長因子＋硫酸アデニレートトランスフェラーゼ
ブユニット1
配列番号650   インドール-3-グリセロールリン酸シンターゼ (EC 4.1.1.48)
配列番号651   アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ
配列番号652   アントラニル酸／パラアミノ安息香酸シンターゼ成分I／イソコリ                    スミ酸シンターゼ
配列番号653   アントラニル酸シンターゼ／パラアミノ安息香酸シンターゼ
配列番号654   アントラニル酸イソメラーゼ
配列番号655   トリプトファンシンターゼβ鎖
配列番号656   トリプトファンシンターゼα鎖
配列番号657   CBS ドメインタンパク質
配列番号658   センサー形質導入ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子 (２成分                    シグナル形質導入系)
配列番号659   高親和性分岐アミノ酸輸送体系 ATPアーゼ
配列番号660   予想では内在性膜タンパク質
配列番号661   分子シャペロン (熱衝撃タンパク質)
配列番号662   予想でトランスポザーゼ
配列番号663   スペルミジンN1-アセチルトランスフェラーゼを含むアセチルトラ                    ンスフェラーゼ
配列番号664   AAA スーパーファミリーおよび関連 ATPアーゼ
配列番号665   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号666   エンドヌクレアーゼに類似の仮説タンパク質
配列番号667   モリブデン補因子生合成酵素
配列番号668   染色体分配に関与する ATPアーゼ
配列番号669   AAA スーパーファミリーおよび関連 ATPアーゼ
配列番号670   DNA 修復に関与する ATPアーゼ
配列番号671   スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号672   スクシニル-CoAシンテターゼ、αサブユニット関連酵素
配列番号673   dGTPトリホスホヒドロラーゼおよび他のＤスーパーファミリーホス                    ホヒドロラーゼ
配列番号674   IMP デヒドロゲナーゼ／GMP レダクターゼ
配列番号675   50S リボソームタンパク質L3
配列番号676   50S リボソームタンパク質43
配列番号677   50S リボソームタンパク質L2
配列番号678   30S リボソームタンパク質S19
配列番号679   30S リボソームタンパク質S3
配列番号680   30S リボソームタンパク質S17
配列番号681   50S リボソームタンパク質L24
配列番号682   50S リボソームタンパク質L5
配列番号683   30S リボソームタンパク質S8
配列番号684   50S リボソームタンパク質L18
配列番号685   30S リボソームタンパク質S5
配列番号686   50S リボソームタンパク質L15
配列番号687   プレタンパク質トランスロカーゼサブユニット
配列番号688   UDP-グルコース4-エピメラーゼ (EC 5.1.3.2)
配列番号689   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号690   高親和性分岐アミノ酸輸送体系 ATPアーゼ
配列番号691   タイプＩ部位特異的エンドヌクレアーゼ、サブユニットM (EC 3.1.                    21.3)
配列番号692   タイプＩ部位特異的エンドヌクレアーゼ、サブユニットS (EC 3.1.                    21.3)
配列番号693   タイプＩ部位特異的エンドヌクレアーゼ、サブユニットR (EC 3.1.                    21.3)
配列番号694   アミノ酸パーミアーゼ
配列番号695   複製因子Ａ関連タンパク質
配列番号696   パーミアーゼ
配列番号697   仮説タンパク質2-アセチル-1-アルキルグリセロホスホコリンエス テラーゼ (EC 3.1.1.)
配列番号698   異なる特異性を持つデヒドロゲナーゼ (短鎖アルコールデヒドロゲ                    ナーゼに関連)
配列番号699   XAA-PRO ジペプチダーゼ (EC 3.4.13.9)
配列番号700   推定ATP 依存性プロテアーゼのリコンビナーゼ(RecA)および ATPア                    ーゼドメイン
配列番号701   プソイドウリジンシンターゼ
配列番号702   CBS ドメインタンパク質
配列番号703   膜Znプロテアーゼ (予想)
配列番号704    (予想) デハロゲナーゼ関連スーパーファミリーのヒドロラーゼ
配列番号705   プロテアソーム (多触媒エンドペプチダーゼ複合体) 、βサブユニ                    ット1 (EC 3.4.99.46)
配列番号706   グルタミンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼおよび他の予                    想されるアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ
配列番号707   リシル／アスパラギニル／アスパルチル-tRNA シンテターゼ
配列番号708   NAD 依存性カリウムチャネル−NAD 結合ドメイン
配列番号709   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号710   スペルミジンシンターゼ
配列番号711   ピリドキサール依存性アミノトランスフェラーゼ
配列番号712   パーミアーゼ、主にアミノ酸
配列番号713   ATP 依存性Znプロテアーゼ
配列番号714   予想では GTPアーゼ
配列番号715   NAD シンターゼ
配列番号716   チオール二硫化物イソメラーゼおよびチオレドキシン
配列番号717   アデニン特異的DNA メチルトランスフェラーゼ
配列番号718   高親和性分岐アミノ酸輸送体系 ATPアーゼ
配列番号719   プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
配列番号720   オペロンポリメラーゼII配列番号1-細胞分裂調節タンパク質
配列番号721   DNA 依存性ポリメラーゼII、サブユニット1 (EC 2.7.7.7)
配列番号722   オペロンポリメラーゼII配列番号4-保存仮説タンパク質
配列番号723   オペロンポリメラーゼII配列番号5-リコンビナーゼ
配列番号724   SAM 依存性メチルトランスフェラーゼ
配列番号725   モリブデン補因子生合成酵素および関連Fe-Sオキシドレダクターゼ
配列番号726   IMP デヒドロゲナーゼ／GMP レダクターゼ
配列番号727   予想では ATPアーゼ (PPファミリー)
配列番号728
配列番号729   L アスパラギナーゼII
配列番号730   ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン含有転写調節因子
配列番号731   ジアデノシン5',5'"-P1,P4-四リン酸 (Ap4A) 非対称ヒドロラーゼ                    、HIT ファミリーの他の予想ヒドロラーゼおよびガラクトース1-リ                    ン酸ウリジリルトランスフェラーゼ
配列番号732   モリブドプテリンおよびチアミン生合成に関与するジヌクレオチド                    利用酵素
配列番号733   トレオニンデヒドラターゼ／トレオニンシンターゼ
配列番号734   プソイドウリジンシンターゼ
配列番号735   ドリコールリン酸マンノシルトランスフェラーゼ関連タンパク質 (EC                   2.4.1.83)
配列番号736   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ (recQファミリー)
配列番号737   DNA 依存性RNA ポリメラーゼ、サブユニットL (EC 2.7.7.6)
配列番号738   部位特異的DNA メチラーゼ
配列番号739   ホスホグリセロムターゼ／ホスホペントムターゼ
配列番号740   コバラミン-5-リン酸シンターゼ
配列番号741   ヘリックス・ターン・ヘリックスドメイン含有転写調節因子
配列番号742   予想ではオキシドレダクターゼ (アリールアルコールデヒドロゲナ                    ーゼに関連)
配列番号743   パーミアーゼ、主にアミノ酸
配列番号744   パーミアーゼ、主にアミノ酸
配列番号745   ABC 輸送体の ATPアーゼサブユニット
配列番号746   チオレドキシン様オキシドレダクターゼ
配列番号747   シャペロニン (HSP60 ファミリー)
配列番号748   ギ酸／コハク酸／L-アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ
配列番号749   キノリン酸シンターゼ
配列番号750   ニコチン酸ヌクレオチドピロホスホリラーゼ
配列番号751   細胞分裂に関与する GTPアーゼ、チューブリンに遠く関係
配列番号752   転写抗終結因子
配列番号753   50S リボソームタンパク質L11
配列番号754   パーミアーゼ (主要促進因子ファミリー)
配列番号755   リシル／アスパラギニル／アスパルチル-tRNA シンテターゼ
配列番号756   ヒドロゲナーゼ発現因子
配列番号757   パーミアーゼ、主にアミノ酸およびペプチド
配列番号758   メチオニル-tRNA シンテターゼ
配列番号759   ペリプラスムリン酸結合タンパク質
配列番号760   アルカリホスファターゼ (EC 3.1.3.1)
配列番号761   細胞分裂調節タンパク質
配列番号762   発酵乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連デヒドロゲナーゼ
配列番号763   β−マンノシダーゼ (EC 3.2.1.25)
配列番号764   H(+)-輸送ATP シンターゼ、サブユニットA (EC 3.6.1.34)
配列番号765   Zn依存性アルコールデヒドロゲナーゼおよび関連デヒドロゲナーゼ
配列番号766   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号767   ピリドキサールリン酸依存性アミノトランスフェラーゼ
配列番号768   ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ
配列番号769   予想ではrRNAメチラーゼ
配列番号770   予想ではヒドロラーゼ (HAD スーパーファミリー)
配列番号771   50S リソグラフィータンパク質L22
配列番号772   ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミド (SAIC                    AR) シンターゼ
配列番号773   翻訳開始因子eIF-2Bαサブユニット
配列番号774   DNA 依存性DNA ポリメラーゼ延長サブユニット (ファミリーB)
配列番号775   グリセロールキナーゼ (EC 2.7.1.30)
配列番号776   DNA 依存性RNA ポリメラーゼ、サブユニットD (EC 2.7.7.6)
配列番号777   α−グルカンホスホリラーゼ (EC 2.4.1.1)
配列番号778   ヒドロゲナーゼサブユニット
配列番号779   GMP シンターゼ-PP-ATP アーゼドメイン
配列番号780   スーパーファミリーII DNAおよびRNA ヘリカーゼ
配列番号781   イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
配列番号782   フェニルアラニル-tRNA シンテターゼαサブユニット
配列番号783   フェニルアラニル-tRNA シンテターゼβサブユニット
配列番号784   アデニン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
配列番号785   チアミンリン酸ピロホスホリラーゼ
配列番号786   リポ多糖生合成／翻訳開始因子eIF2B サブユニットに関与するヌク                    レオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ
配列番号787   50S リボソームタンパク質L14
配列番号788   ペリプラスムセリンプロテアーゼ
配列番号789   ピリドキサールリン酸依存性アミノトランスフェラーゼ
配列番号790   嫌気性デヒドロゲナーゼ、典型的にはセレノシステイン含有
配列番号791   翻訳開始因子eIF-2Bサブユニットα
配列番号792   NTP transf 2ドメインを含有する仮説tRNAヌクレオチジルトランス                    フェラーゼ
配列番号793   タンパク質を含有するRapA様細菌アスパラギン酸ホスファターゼド                    メイン
配列番号794   仮説金属依存性ヒドロラーゼ (β−ラクタマーゼスーパーファミリ                    ー)
配列番号795   DUF6ドメインを含有する仮説内在性膜タンパク質
配列番号796   タンパク質含有デオキシリボースリン酸アルドラーゼドメイン
配列番号797   仮説3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ
配列番号798   仮説アルカエオシン(archaeosine) tRNA-リボシルトランスフェラ                            ーゼ
配列番号799   AAA スーパーファミリーおよび関連 ATPアーゼ
配列番号800   仮説3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ
表２：既知の機能によりペプチド配列SEQ ID NO.２〜SEQ ID NO.800 のそれぞれに最も可能性ある機能を割当てることができるデータバンクで得られる配列と、ペプチド配列SEQ ID NO.２〜SEQ ID NO.800 との相同性
BLASTPプログラム（Altschulら，1990）を使用して、デフォルトパラメータにより相同性を得た。最も相同である配列を、利用可能なバンク（バンクの欄）を参照して、この配列が属する動物種（種の欄）とともに、その受託番号（受託番号の欄）で示した。相同性％は、所定の長さの配列についてBLASTPプログラムによって評価した。
【０１９７】
【表２−１】
2004500802.tif 000071
【０１９８】
【表２−２】
2004500802.tif 000072
【０１９９】
【表２−３】
2004500802.tif 000073
【０２００】
【表２−４】
2004500802.tif 000074
【０２０１】
【表２−５】
2004500802.tif 000075
【０２０２】
【表２−６】
2004500802.tif 000076
【０２０３】
【表２−７】
2004500802.tif 000077
【０２０４】
【表２−８】
2004500802.tif 000078
【０２０５】
【表２−９】
2004500802.tif 000079
【０２０６】
【表２−１０】
2004500802.tif 000080
【０２０７】
【表２−１１】
2004500802.tif 000081
【０２０８】
【表２−１２】
2004500802.tif 000082
【０２０９】
【表２−１３】
2004500802.tif 000083
【０２１０】
【表２−１４】
2004500802.tif 000084
【０２１１】
【表２−１５】
2004500802.tif 000085
【０２１２】
【表２−１６】
2004500802.tif 000086
【０２１３】
【表２−１７】
2004500802.tif 000087
【０２１４】
【表２−１８】
2004500802.tif 000088
【０２１５】
【表２−１９】
2004500802.tif 000089
【０２１６】
【表２−２０】
2004500802.tif 000090
【０２１７】
【表２−２１】
2004500802.tif 000091
【０２１８】
【表２−２２】
2004500802.tif 000092
【０２１９】
【表２−２３】
2004500802.tif 000093
【０２２０】
実施例３：Pyrococcus abyssi (Orsay株）の複製因子Ｃ（RFC)
Ａ）配列の特徴
２つのサブユニット
Pyrococcus abyssi Orsay 株の基準ゲノム：
１．小さいサブユニット：PAB0068 ；アクチベーター１、複製因子Ｃ，小さいサブユニット（RFcS）。
【０２２１】
長さ：４３１１の塩基対；38ｋDa（理論値）
ゲノム上の位置：103094−107404（方向＋）。このように限定されたこの断片は、ORF801に対応する。
【０２２２】
２．大きいサブユニット：PAB0069 ；アクチベーター１、複製因子Ｃ，大きいサブユニット（RFcL）。
長さ：1437の塩基対；53ｋＤａ
配列SEQ ID NO.１のゲノム上の位置：107419−108855（方向＋）。このように限定されたこの断片は、ORF805に対応する。
【０２２３】
遺伝子の科：［9. 1］ＤＮＡの代謝／ＤＮＡの複製、組換えおよび修復。
３．配列
−アミノ酸配列SEQ ID NO.801 は、小さいサブユニットの完全な配列（インテイン含有）を表す；
−アミノ酸配列SEQ ID NO.802 は、２つのインテイン配列を切除した小さいサブユニットの配列を表す；
−アミノ酸配列SEQ ID NO.803 およびSEQ ID NO.804 は、それぞれ、配列SEQ ID NO.802 から切除された２つのインテイン配列を表す；
−アミノ酸配列SEQ ID NO.801 は、大きいサブユニットの配列を表す；
−配列ORF802は、配列SEQ ID NO.803 およびSEQ ID NO.804 のインテインペプチドをコードする配列を削除した上記の配列ORF801に対応する；
−ORF803およびORF804は、それぞれ、ORF801の配列SEQ ID NO.803 およびSEQ ID NO.804 のインテインペプチドをコードする配列に対応する。
Ｂ）クローニングおよび発現
クローニング方法
小さいサブユニット
１．インテインの切除：インテインは、“重複伸長によるスライシング(slicing by overlap extension)”技術（Hoら，1998，DNA and protein engineering technique,vol2, ｐ50−55）によって除去した。
【０２２４】
使用したプライマー：
開始部位（NdeI）：5'- ＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧ-3'
保護部位、インテイン１：
直接センス：5'- ＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴ- 3'
逆センス：5'- ＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣ- 3'
保護部位、インテイン２：
直接センス：5'- ＡＣＧＴＡＡＧＧＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＴ-3'
逆センス：5'- ＡＴＣＴＴＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＴ-3'
終止部位（BamHI ）：5'- ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＧＡＴＴ-3'
２．サブクローニングおよび配列決定：
使用ベクター：pGEMT easy（Promega ）
株：E.coli  DH５α
３．発現：
使用ベクター：pET 11ａ
株：E.coli  ＭＣ1061（DE３）
大きいサブユニット
１．PCR ：PCR は、下記プライマーによって行った：
使用プライマー：
開始部位（NdeI）：5'- ＡＴＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣ-3'
終止部位（BamHI ）：5'- ＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＴＧ-3'
２．サブクローニングおよび配列決定：
使用ベクター：pBS/SK（-)
株：E.coli  DH５α
３．発現：
使用ベクター：pET 26ｂ＋
株：E.coli  MC1061（DE３）
発現
E.coli  MC1061(DE3) における２つのサブユニットの共発現
条件：O.D.600 ＝1.0 における誘導；0.6mM IPTG；37℃で４時間；培地：LBＣ）精製
50mM Tris-HCl, pH 8.0 中にとった細胞ペレット、
熱ショック：２分×90℃，次いで、15分×80℃、
見かけ分子量（図１参照）：
小さいサブユニット：36kDa
大きいサブユニット：56kDa
Ｄ）大きいサブユニットの免疫生化学的特性
真核生物のRF-Cの大きいサブユニットに対する特異的抗体の使用により、PCNAに結合部位が保存されることが示される。他方、DNA 結合部位は抗体によって確認されない。
【０２２５】
使用抗体：
抗体Ａ： DNA結合ドメインに対するマウスのモノクロナール抗体
抗体Ｂ：PCNA結合ドメインに対するウサギのポリクロナール抗体；真核生物において、RFC の大きいサブユニットのアミノ酸 478−712 の領域を認識。
【０２２６】
【表３】
2004500802.tif 000094
【０２２７】
実施例４：Pyrococcus abyssi (Orsay株）の増殖細胞核抗原（PCNA）
Ａ）配列の特徴
Pyrococcus abyssi Orsay 株の基準ゲノム；増殖細胞核抗原（pol 30）。
【０２２８】
遺伝子の科：［9. 1］ DNAの代謝／ DNAの複製、組換えおよび修復。
長さ：747 の塩基対；28kDa
ゲノム上の位置：1,333, 299−1332553 （方向−）。このように限定されたこの断片は、配列ORF806に対応する。
【０２２９】
配列：ポリペプチドPCNAのアミノ酸配列は、配列SEQ ID NO.804 によって表される。
Ｂ）クローニングおよび発現
クローニングの手法
ＰＣＲは、下記のヌクレオチドプライマーによって行った：
開始部位（NdeI）：5'- ＡＧＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＴＣＧＡＧＡＴＡＧＴＣ-3'
終止部位（BglII ）：5'- ＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧ-3'
サブクローニングおよび配列決定：
ベクター：pBS/SK−
株：E.coli  DH５α
クローニング：pET 26ｂ＋（E.coli HMS174 (DE ３）
発現：
条件：O.D.600 ＝0.6 における誘導；１mM  IPTG；37℃で４時間；培地：LB
Ｃ）精製
50mM Tris-HCl ，，pH 8.0、0.1 M NaClで抽出
熱ショック：15分、75℃
クロマトグラフィー：RessourceQ（Pharmacia ）；50mMトリスHCl 緩衝液，pH 7.5，１mM  DTT, 0.1 mM EDTA；NaCl勾配：０〜0.5 Ｍ, Superdex200 (Pharmacia）；同じ緩衝液
Ｄ）Pyrococcus abyssi Orsay の  DNA ポリメラーゼＩに対する効果
緩衝液：50mMトリスHCl, pH 8.8 ，１mMジチオトレイトール，10mM KCl，５mMMgCl2 、0.4 mg/ml ＢＳＡ。
【０２３０】
インキュベーション：それぞれ0.2 mMの４種のNTP, 0.35 μＭ［3 Ｈ］dTTP（119 Ci/mmol)およびファージゲノムの 48502−48466 の領域に相補性のオリゴヌクレオチドで開始されるλファージ DNA 15 fmolを含む反応容積２０μｌ。
【０２３１】
インキュベーション：20分、70℃
DNA ポリメラーゼ１単位は、上記実験条件においてNTP を１nmol/ 分の速度で取り込み可能にする酵素量である。
【０２３２】
【表４】
2004500802.tif 000095
【０２３３】
【表５】
2004500802.tif 000096
【０２３４】
【表６】
2004500802.tif 000097
【０２３５】
本発明に係るPyrococcus abyssi のPCNAの用途のうち、下記のための使用を挙げることができる：
−特に、＊  操作性の向上；
＊  重合速度の増大；
のための、熱安定性であってもなくてもよい、真核生物または古細菌の任意の  DNA ポリメラーゼの酵素効率の改善；
−long distance PCR (100kbよりも大きい断片の合成）を行う際の因子として；
−ある反応における極めて長い DNA断片の配列決定のための因子として；
−インビトロの複製系を実施する際の因子として；および、
−Pyrococcus abyssi のポリペプチドPCNAを発現する真核細胞培養物の増殖速度の向上。
【０２３６】
上記ポリペプチドPCNAの使用または、場合によって、上記の如きそのコード配列の使用は、本発明の一部である。
【０２３７】
【参考文献】
2004500802.tif 000098
【０２３８】
実施例５：Pyrococcus abyssi (Orsay株）の DNAポリメラーゼII
P.abyssi Orsay株から得られる DNAポリメラーゼIIは、下記の２つのサブユニットからなる：
−小さいサブユニット（遺伝子：PAB2266 ，名称：polB）
−大きいサブユニット（遺伝子：PAB2404 ，名称：polC）。
【０２３９】
DNA ポリメラーゼIIの大きいサブユニットをコードする遺伝子polCは、配列SEQID NO. 808 （インテインを含む完全な配列）をコードする配列のヌクレオチド2862と 341７との間に含まれるインテイン（555 のヌクレオチド）をコードする遺伝子を含む。
【０２４０】
この実施例では、２つのサブユニットをコードする遺伝子（インテインをコードする配列はpol IIの大きいサブユニットをコードする遺伝子から予め除去）のE.coli中の共発現による熱安定性組換え DNAポリメラーゼIIを得るための、クローニング、調製条件、その精製および分子生物学の各分野におけるその使用を説明する。
Ａ）熱安定性  DNA ポリメラーゼIIの調製法
Ａ−１．  DNA ポリメラーゼIIの２つのサブユニットの配列
特徴：
♯ DNAポリメラーゼII：サブユニット１（２．７．７．７）
DNA ポリメラーゼIIの小さいサブユニットの配列（２．７．７．７）
遺伝子の科：［９．１］ DNAの代謝／ DNAの複製、組換えおよび修復
Pyrococcus abyssi の基準ゲノム：PAB2266
名称：polB
配列SEQ ID NO.１のゲノム上の位置；開始：121402，終止：119546（方向−）
このように限定されたこの断片は、配列ORF807に対応する。
【０２４１】
遺伝子の長さ：1857pb
♯ DNAポリメラーゼII：サブユニット２（２．７．７．７）
DNA ポリメラーゼIIの大きいサブユニットの配列（２．７．７．７）
遺伝子の科：［９．１］ DNAの代謝／ DNAの複製、組換えおよび修復
Pyrococcus abyssi Orsay 株の基準ゲノム：PAB2404
名称：polC
ゲノム上の位置；開始：119543，終止：115179（方向−）
このように限定されたこの断片は、ORF808に対応する。
【０２４２】
遺伝子の長さ：4365pb
配列：
−アミノ酸配列SEQ ID NO.807 は、 DNAポリメラーゼIIのサブユニット１の配列を表す；
−アミノ酸配列SEQ ID NO.808 は、 DNAポリメラーゼIIのサブユニット２の配列 (インテインを含む) を表す；
−アミノ酸配列SEQ ID NO.809 は、インテインを切除した DNAポリメラーゼIIのサブユニット２の配列を表す（ORF809は、コードするヌクレオチド配列に対応する）；
−アミノ酸配列SEQ ID NO.810 は、 DNAポリメラーゼIIのサブユニット２のインテイン配列を表す（ORF810は、コードするヌクレオチド配列に対応する）
Ａ−２． DNAポリメラーゼIIの２つのサブユニットのクローニング
DNAポリメラーゼIIの２つのサブユニットのクローニングは、各種の抗生物質耐性を有する発現ベクター中で別個に実施した。
【０２４３】
♯発現ベクターpET11a中のサブユニット１（polB）のクローニング
−P.abyssi  Orsay 株のゲノムDNA の調製
ペプトン２ｇ／ｌ，酵母抽出物0.5 g/l ，硫黄10g/l ，海塩30g/l を含む培地中で、95℃において16時間、P.abyssi Orsay株を培養する。培養は、培地30mlを含む100 mlフラスコ内で実施する。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、TE緩衝液（トリス10mM，EDTA１mM，pH 8.3）500 μｌ中に再懸濁させる。10％サルコシル500 μｌおよびプロテイナーゼＫ（20mg/ml)20μｌを加える。次いで
、混合物を50℃において１時間30分培養する。反応終了時、フェノール／クロロホルム(v/v）で抽出し、次いで、エタノールで沈殿させると、ゲノムDNA 約１mg
を得ることができる。
【０２４４】
−PCR による遺伝子の増幅および発現ベクター中へのクローニング
PCR による遺伝子の増幅のために、polB遺伝子の配列に基づくプライマーを合成した（DNA thermal cycler, Stratagene）。使用したプライマーの配列を以下に示す：
開始部位（NdeI）：5'- ＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧ3'
終止部位（BamH1 ）：5'- ＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＶＡＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧ-3'
PCR 反応の条件を以下に示す：
ゲノム DNA  20 ng
プライマー  それぞれ100 pmol
dNTP  それぞれ10 nmol （dATP，dCTP，dGTP，dTTP）
10× Pfuポリメラーゼ緩衝液    ５μｌ
Pfu ポリメラーゼ（Stratagene）  １Ｕ
H2O   50μｌ十分量
次いで、反応混合物をインキュベートする：94℃で15分、次いで（94℃で30秒、45/50/55℃で30秒）を20回、および72℃で15分。反応終了後、PCR 産物を制限酵素NdeIおよびBamHI によって消化し、発現ベクターpET11a内に連結させた。次いで、得られたベクターを発現細胞E.coli HMS174 (DE3）内に形質転換させた（CaCl2 による形質転換法）。polB遺伝子の配列を挿入物を完全に配列決定することによって制御する。
【０２４５】
ベクターpET26b＋内の2-サブユニット２（polC）
−P.abyssi Orsay株のゲノム DNAの調製
ペプトン２g/l ，酵母抽出物0.5 g/l ，硫黄10g/l ，海塩30g/l を含む培地中で、95℃において16時間、P.abyssi Orsay株を培養した。培養は、培地30mlを含む100ml フラスコ内で実施する。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、TE緩衝液（トリス10mM，EDTA１mM，pH8.3) 500μｌ中に再懸濁させる。10％サルコシル500 μｌおよびプロテイナーゼＫ（20mg/ml)20μｌを加える。次いで、混合物を50℃において１時間30分培養する。反応終了時、フェノール／クロロホルム(v/v）で抽出し、次いで、エタノールで沈殿させると、ゲノムDNA 約１mgを得ることができる。
【０２４６】
−PCR による遺伝子の増幅および発現ベクター中へのクローニング
PCR による遺伝子の増幅のために、polB遺伝子の配列に基づくプライマーを合成した (DNA thermal cycler, Stratagene）。使用したプライマーの配列を以下に示す：
開始部位（NdeI）：5'- ＡＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧ-3'
終止部位（SalI）：5'- ＴＣＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＧ-3'
ＰＣＲ反応の条件を以下に示す：
ゲノムDNA   ３μｇ
プライマー  それぞれ100 pmol
DNTP  それぞれ10 nmol ( dATP，dCTP，dGTP，dTTP）
10×Pfu ポリメラーゼ緩衝液  ５μｌ
Pfu ポリメラーゼ（Stratagene）  １Ｕ
H2O     50μｌ十分量
次いで、反応混合物をインキュベートする：94℃で15分、次いで（94℃で30秒、45/50/55℃で30秒）を20回、および72℃で15分。反応終了後、PCR 産物を制限酵素NdeIおよびSalIによって消化し、発現ベクターpET26b＋内に連結させる。次いで、得られたベクターをE.coli DH5α細胞内に形質転換させる（CaCl2 による形質転換法）。polB遺伝子の配列を挿入物を完全に配列決定することによって制御する。次いで、Ho N.S. らの論文に記載の“重複伸長によるスライシング(slicing by overlap extension ) ”法（1990， DNA and protein engineering using polymerase chain reaction：slicing by overlap． DNA Protein Eng.Tech. 2:50-55）を使用して、インテインをコードする遺伝子をpolC遺伝子から除去する。
【０２４７】
このために、２つのヌクレオチドプライマーを合成した：
Ｍ４：5'- ＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧ-3'
Ｍ６：5'- ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＧＧ-3'
次いで、インテインをコードする遺伝子が除去された DNAポリメラーゼIIの大きいサブユニットをコードするpolC遺伝子を含む、得られたベクターpET 26ｂ＋を、発現細胞E.coli HMS174 (DE3) 中に形質転換させる。インテインをコードする遺伝子を除去したpolC遺伝子の配列を、挿入物を完全に配列決定することによって制御する。
【０２４８】
Ａ−３． DNAポリメラーゼIIの調製
２つの手法を用いた：
♯手法No.1：クローニングした各サブユニットを発現細胞E.coli HMS174 (DE3) 中で別個に発現させる。２つの組換えクローンのそれぞれを超音波処理し、次いで、熱ショック（80℃で15分）によって処理し、次いで、サブユニットを混合して活性なポリメラーゼを生成させた。
【０２４９】
−小さいサブユニット（遺伝子：PAB2266 ，名称：polB）：
polB遺伝子を含む発現ベクターpET 11ａを含む発現細胞E.coli HMS174 (DE3) を、100 μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含む２×YT培地（NaCl 10g/l，酵母抽出物10g/l ，ペプトン16g/l ）１リットル内で37℃において培養する。
【０２５０】
O.D.600 （O.D.：光学濃度）が0.6 に達したら、培地にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）１mMを加え、37℃において15時間培養を続ける。培養物を遠心分離し、2mM β−メルカプトエタノールおよび10％グリセロールを含む50mMトリス-HCl，pH 8.2, 緩衝液10ml中に細胞を再懸濁させる。次いで、細胞を超音波処理し、遠心分離し、次いで、80℃において15分培養する。遠心分離後、ポリメラーゼIIの小さいサブユニット（遺伝子：PAB2266 ；名称：polB）を含む溶液10mlを回収する。
【０２５１】
インテインをコードする遺伝子が除去されたpolC遺伝子を含む発現ベクターpET 26b+を含む発現細胞E.coli HMS174(DE3)を、34μｇ/ml 濃度のカナマイシンを含む２×YT培地（NaCl 10g/l，酵母抽出物10g/l ，ペプトン16g/l ）１リットル内で37℃において培養する。O.D.600 が0.6 に達した際、培地にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−  チオガラクトシド）１mMを加え、37℃において15時間培養する。培養物を遠心分離し、2mM β−メルカプトエタノールおよび10％グリセロールを含む50mMトリス-HCl，pH 8.2, 緩衝液10ml中に細胞を再懸濁させる。次いで、細胞を超音波処理し、遠心分離し、次いで、80℃において15分培養する。遠心分離後、ポリメラーゼIIの大きいサブユニット（遺伝子：PAB2404 ；名称：polC）を含む溶液10mlを回収する。
【０２５２】
♯手法No. ２：同じ発現細胞E.coli HMS174(DE3)中で２つのサブユニット（polB＋polC）を共発現させ、超音波処理し、次いで、熱ショック（80℃で15分）によって処理する。
【０２５３】
pol B 遺伝子を含む発現ベクターpET11a、およびインテインをコードする遺伝子を除去した遺伝子polCを含む発現ベクターpET26b+ を含む発現細胞E.coli HMS174 (DE3) を、34μｇ/ml 濃度のカナマイシンを含む２×ＹＴ培地（NaCl 10 g /l，酵母抽出物10g/l ，ペプトン16g/l ）１リットル内で37℃において培養した。O.D.600 が0.6 に達した際、培地にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）１mMを加え、37℃において15時間培養する。培養物を遠心分離し、２mMβ−メルカプトエタノールおよび10％グリセロールを含む50mMトリス-HCl，pH 8.2緩衝液10ml中に細胞を再懸濁させる。次いで、細胞を超音波処理し、遠心分離し、次いで、80℃において15分間培養する。遠心分離後、ポリメラーゼIIの小さいサブユニット（遺伝子：PAB2266 ；名称：polB）およびポリメラーゼIIの大きいサブユニット（遺伝子：PAB2404 ；名称：polC）を含む溶液10mlを回収する。
Ｂ） DNAポリメラーゼIIの調製、精製および特性決定
Ｂ−１．活性 DNAポリメラーゼの調製
Ａ３章（手法１、２）に記載のようにして調製した分画のポリメラーゼ活性を試験する。
【０２５４】
ポリメラーゼ活性の測定プロトコルを以下に示す：
反応媒体緩衝液：
50mMトリス-HCl，pH 8.8，１mMジチオトレイトール、10mM KCl，BSA 0.4 mg/ml ，2.5mM MgCl2 。
【０２５５】
反応容積20μｌは、それぞれ0.2mM の４種のdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），0.35μＭ［3H］TTP (119Ci/mmol)およびファージゲノムに相補性のオリゴヌクレオチドで開始されるM13 ファージの DNA６μｇ/ml を含む。インキュベーションは、70℃において20分行う。この反応混合物18μｌをGF-Cフィルタ（Whatman ）で濾過し、５％TCA 、ピロリン酸ナトリウム（8.9 g/l ）で沈殿させる。フィルターを95％エタノールで２回洗浄し、乾燥させた後、シンチレーションカウンタ（Packard)で放射能を測定する。
【０２５６】
DNAポリメラーゼ１単位は、上記実験条件においてdNTPの１nmol／分での取り込みを可能にする酵素量である。
試験した各種画分について得られた結果を表にまとめた：
【０２５７】
【表７】
2004500802.tif 000099
【０２５８】
Ｂ−２．ポリメラーゼIIの精製および性質
同じ発現細胞E.coli HMS174(DE3)中で２つのサブユニット（polB＋polC）の共発現による培養を実施した。
【０２５９】
pol B 遺伝子を含む発現ベクターpET11a、およびインテインをコードする遺伝子を除去したpolC遺伝子を含む発現ベクターpET26b+ を含む発現細胞E.coli HMS174 (DE3) を、100 μｇ/ml 濃度のアンピシリンおよび34μｇ/ml 濃度のカナマイシンを含む２×ＹＴ培地（NaCl 10 g /l，酵母抽出物10g/l ，ペプトン16g/l ）１リットル内で37℃において培養する。O.D.600 が0.6 に達した際、培地にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）１mMを加え、37℃において15時間培養を続ける。培養物を遠心分離し、２mMβ−メルカプトエタノールおよび10％グリセロールを含む50mMトリス-HCl，pH 8.2, 緩衝液10ml中に細胞を再懸濁させる。次いで、細胞を超音波処理し、遠心分離し、次いで、80℃において15分間培養する。遠心分離後、ポリメラーゼIIの大きいサブユニット（遺伝子：PAB2266 ；名称：polB）および大きいサブユニット（遺伝子：PAB2404 ；名称：polC）を含む溶液10mlを回収する。第１の精製工程と同様に、80℃で20分間の熱ショック処理を行う。
【０２６０】
サブユニット１：polBの見掛け分子量：90kDa
サブユニット２：polCの見掛け分子量：140kDa
熱ショック後、抽出物をクロマトグラフィーカラム (Resource Q, Pharmacia)に装入する；2 mMβ- メルカプトエタノールを含むリン酸カリウム  50mM緩衝液、pH6.5 。NaCl勾配は０〜0.5Mである。ポリメラーゼ活性を含む画分を約350mM のNaClで溶離させる。
【０２６１】
最適pHの決定
pHに依存するポリメラーゼ活性の測定プロトコルを以下に示す：
リン酸カリウム20mM, MgCl2 10mM, pH6, 6.5, 7, 7.5, 8 。
【０２６２】
反応容積20μｌは、それぞれ0.2mM の４種のdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），0.35μＭ［3H］TTP (119Ci/mmol)およびpolydA/pligodT (40:1) マトリックス５μｇ/ml を含む。インキュベーションは、70℃において20分行う。この反応混合物18μｌをGF-Cフィルタ（Whatman ）で濾過し、５％TCA 、ピロリン酸ナトリウム（8.9 g/l ）で沈殿させる。フィルターを95％エタノールで２回洗浄し、乾燥させた後、シンチレーションカウンタ（Packard)で放射能を測定する。
【０２６３】
DNAポリメラーゼ１単位は、上記実験条件においてdNTPの１nmol／分での取り込みを可能にする酵素量である。
上記条件におけるポリメラーゼ活性の最適pHは6.5 である (図６参照) 。
Ｃ) 反応培地中への複製因子(PCNA)の添加によるポリメラーゼIIの賦活化
ポリメラーゼ活性の測定プロトコルを以下に示す：
反応媒体緩衝液： 50mM トリス-HCl，pH 8.8，１mMジチオトレイトール、10mM KCl，BSA 0.4 mg/ml ，2.5mM MgCl2 。反応容積20μｌは、それぞれ0.2mM の４種のdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），0.35μＭ［3H］TTP (119Ci/mmol)およびファージゲノム、またはpoldA-oligodT 1:40基体のオリゴヌクレオチドで開始されるM13 ファージの DNA６μｇ/ml を含む。インキュベーションは、70℃において20分行う。この反応混合物18μｌをGF-Cフィルタ（Whatman ）で濾過し、５％TCA 、ピロリン酸ナトリウム（8.9 g/l ）で沈殿させる。フィルターを95％エタノールで２回洗浄した後、シンチレーションカウンターで放射能を測定する。
【０２６４】
【表８】
2004500802.tif 000100
【０２６５】
このようにして、本発明に係る熱安定性 DNAポリメラーゼII型をクローニングし発現させた。組換え酵素は、２つのサブユニット  (90kDaおよび140kDa) を含む。大きいサブユニットは、重合プロセスにおいてホスホジエステル結合の形成を触媒できる。しかし、この活性は、酵素の小さいサブユニットの存在下で増大する。
【０２６６】
P. abyssi の熱安定性 DNAポリメラーゼIIの触媒活性は、反応媒体中の複製因子：PCNAの存在に感受性である。具体的には、この因子は、この反応条件において DNAポリメラーゼIIの触媒活性を刺激する。
【０２６７】
従って、上記 DNAポリメラーゼII型は下記のために利用できる：
−特に、
・重合速度の増加
・操作性の向上
・忠実度の増大；及び／又は、
・合成した断片の長さの増大
のためにPCNA, RF-CおよびRPA 型の複製因子と併用して、または併用せずに、上記 DNAポリメラーゼの使用による、 PCRによる DNA増幅の改善、また、
−特に、
・重合速度の増加
・操作性の向上
・忠実度の増大；及び／又は、
・合成した断片の長さの増大
のためにPCNA, rf-CおよびRPA 型の複製因子を含むかもしくは含まない反応媒体において、２種ポリメラーゼの( 本発明のポリメラーゼII型を含む) を混合することにより、 PCRに使用される、熱安定性であってもなくてもよい真核性もしくは古細菌の DNAポリメラーゼの効率を改善する。
【０２６８】
本発明の DNAポリメラーゼII型は、さらに以下のために使用できる：
−long distance PCR (100kbよりも大きい断片の合成) 、
−細菌、古細菌または真核生物染色体のin vitro複製系の実施、
−ある反応における極めて長い DNA断片の配列決定、
−in vitro複製系の実施。
【０２６９】
上記 DNAポリメラーゼII型について上述した上記使用は、当然本発明の一部である。
実施例６：Pyrococcus abyssi (Orsay株) の複製タンパク質Ａ(RPA)
A)配列の特徴
複製因子Ａ様 (rfA-like) タンパク質
Pyrococcus abyssi の基準ゲノム：PAB2163
遺伝子の科：[09.1]  DNA の代謝／ DNA複製、組換えおよび修復
大きさ：1125の塩基対；43kDa
配列番号１のゲノム上の位置：242979291352 (方向−) 。このように規定された断片は配列 ORF811 に対応する。
【０２７０】
複製タンパク質Ａのアミノ酸配列は、配列番号811 によって表される。
B)タンパク質Ａ (複製因子) のクローニング、発現および特性決定
1.クローニングおよび発現
−P. abyssi Orsay 株のゲノム DNAの調製
ペプトン２g/l ，酵母抽出物0.5 g/l ，硫黄10g/l ，海塩30g/l を含む培地中で、95℃において16時間、P.abyssi Orsay株を嫌気条件下で培養する。培養は、培地30mlを含む100ml フラスコ内で実施する。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、TE緩衝液（トリス10mM，EDTA１mM，pH8.3) 500μｌ中に再懸濁させる。10％サルコシル500 μｌおよびプロテイナーゼＫ（20mg/ml)20μｌを加える。次いで、混合物を50℃において１時間30分培養する。反応終了時、フェノール／クロロホルム(v/v）で抽出し、次いで、エタノールで沈殿させると、ゲノムDNA 約１mgを得ることができる。
−PCR による遺伝子の増幅および発現ベクター中へのクローニング
PCR による遺伝子の増幅のために、polB遺伝子の配列に基づくプライマーを合成した (DNA thermal cycler, Stratagene）。使用したプライマーの配列を以下に示す：
開始部位（NdeI）：5'- ＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＣＣＧ-3'
終止部位（BamHI)：5'- ＴＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＣ-3'
ＰＣＲ反応の条件を以下に示す：
ゲノムDNA   20 nｇ
プライマー  それぞれ100 pmol
dNTPそれぞれ10 nmol ( dATP，dCTP，dGTP，dTTP）
10×Pfu ポリメラーゼ緩衝液  ５μｌ
Taq ポリメラーゼ（Appligene ）  １Ｕ
H2O     50μｌ十分量
次いで、反応混合物をインキュベートする：94℃で15分、次いで（94℃で30秒、45/50/55℃で30秒）を20回、および72℃で15分。反応終了後、PCR 産物を配列決定ベクターpGEMT easy (Promega)中にクローニングする。組換えプラスミドをE.coli DH5a 細胞内に形質転換させる。遺伝子の配列を、挿入物を完全に配列決定することによって制御する。
【０２７１】
次いでプラスミドを制限酵素Nde1およびBamHI によって消化し、発現ベクターpET-26b ＋内に連結させる。次いで、組換えベクターpRPAを発現細胞E.coli B121 pLys S(DE3) 中に形質転換させる。
【０２７２】
ベクターpRPAを含む発現細胞E.coli B121 pLys S(DE3) を、34μｇ/ml 濃度のカナマイシンを含む２×ＹＴ培地（NaCl 10 g /l，酵母抽出物10g/l ，ペプトン16g/l ）１リットル内で37℃において培養する。O.D.600 が0.6 に達した際、培地にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）0.5mM を加え、37℃において15時間培養する。培養物を遠心分離し、２mMβ−メルカプトエタノールおよび10％グリセロールを含む50mMトリス-HCl，pH 8.2緩衝液10ml中に細胞を再懸濁させる。次いで、細胞を超音波処理し、遠心分離し、次いで、80℃において15分間培養する。遠心分離後、複製因子Ａを含む溶液10mlが得られる。
2.特性決定
−SDS-PAGE (10％) 上に得られた抽出物の視覚化 (図７参照) ：
図７のゲルの解析から、40〜50kDa の範囲になるタンパク質の見掛け分子量が求められる。
−ヌクレオチドおよびタンパク質の配列の分析 (図８参照) ：
配列上に、 DNA上の塩基の改変を認識することに関与し、かつ一本鎖 DNAに対するRPA の強い親和性を担う、仮説的ジンクフィンガーの配列の存在が認められる。
【０２７３】
さらに、タンパク質のＣ末端には、可変性領域が存在する。この領域は、三量体化のために必要である。
可変領域の配列：ＥＥＩＡＥＫＩＫＥＬＥＥＳＧＬＴＴＫＥＡＡＲＫＬＡＥＤＥＦ
【０２７４】
【表９】
2004500802.tif 000101
【０２７５】
【表10】
2004500802.tif 000102
【０２７６】
本発明の複製タンパク質Ａは、特に以下のように使用できる：
−熱安定性であってもなくてもよい、真核生物もしくは古細菌の任意の DNAポリメラーゼのin vitro忠実度を改善する因子として；
−ある反応中の極めて長い DNA断片の配列決定のための因子として；
in vitro複製系の実施のための因子として。
【０２７７】
上記のような本発明に係るPyrococcusの複製タンパク質Ａの使用は当然、本発明の一部である。
【０２７８】
【参考文献】
2004500802.tif 000103
【０２７９】
実施例７：Pyrococcus abyssi (Orsay株）の  DNA ポリメラーゼI
研究の目的：超好熱古細菌由来の DNAポリメラーゼI型のクローニング、発現
および特性決定
この研究は、Pyrococcus abyssi-Orday 株のゲノムの配列決定および活用に関する。
【０２８０】
本実施例において、E.coli中に発現された熱安定性組換え DNAポリメラーゼI
のクローニング、調節条件および特性決定を説明する。
Ａ） DNAポリメラーゼIの調製法
1.配列の特徴：
DNAポリメラーゼI
DNA polymeraseIの配列
遺伝子の科：［９．１］ DNAの代謝／ DNAの複製、組換えおよび修復
Pyrococcus abyssi の基準ゲノム：PAB1128
名称：polI
配列SEQ ID NO.１のゲノム上の位置；開始：1695183 ，終止：1697495
遺伝子の長さ：2313bp、ゲノムの方向：＋
DNAポリメラーゼIのアミノ酸配列は、配列番号812 によって表される。
2.クローニングおよび発現
P.abyssi Orsay株のゲノムDNA の調製
ペプトン２ｇ／ｌ，酵母抽出物0.5 g/l ，硫黄10g/l ，海塩30g/l を含む培地上で、95℃において16時間、P.abyssi Orsay株を嫌気条件下で培養する。培養は、培地30mlを含む100 mlフラスコ内で実施する。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、TE緩衝液（トリス10mM，EDTA１mM，pH 8.3）500 μｌ中に再懸濁させる。10％サルコシル500 μｌおよびプロテイナーゼＫ（20mg/ml)20μｌを加
える。次いで、混合物を50℃において１時間30分培養する。反応終了時、フェノール／クロロホルム(v/v）で抽出し、次いで、エタノールで沈殿させると、ゲノムDNA 約１mgを得ることができる。
−PCR による遺伝子の増幅および発現ベクター中へのクローニング
PCR による遺伝子の増幅のために、polI遺伝子の配列に部分的に基づくプライマーを合成した（DNA thermal cycler, Stratagene）。使用したプライマーの配列を以下に示す：
開始部位（NdeI）：5'- ＣＡＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＧＡＴＧＣ- 3'
終止部位（BamH1)：5'- ＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＣ-3'
PCR 反応の条件を以下に示す：
ゲノム DNA  20 ng
プライマー  それぞれ100 pmol
dNTP  それぞれ10 nmol （dATP，dCTP，dGTP，dTTP）
10× Pfuポリメラーゼ緩衝液    ５μｌ
Pfu ポリメラーゼ（Stratagene）  １Ｕ
H2O   50μｌ十分量
次いで、反応混合物をインキュベートする：94℃で15分、次いで（94℃で30秒、45/50/55℃で30秒）を20回、および72℃で15分。反応終了後、PCR 産物を制限酵素NdeIおよびBamHI によって消化し、発現ベクターpET26B内に連結させる。連結産物を用いて発現細胞E.coli BL21 (DE3）pLys Sを形質転換させる（CaCl2 による形質転換法）。polI遺伝子の配列を組換えプラスミドpET-polIの配列決定によって制御する。
【０２８１】
polI遺伝子の発現
組換えベクターPET polIを含む発現細胞E.coli B121(DE3) pLys S を、34μｇ/ml 濃度のカナマイシンを含む２×ＹＴ培地（NaCl 10 g /l，酵母抽出物10g/l ，ペプトン16g/l ）１リットル内で37℃において培養する。O.D.600 が0.6 に達した際、培地にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）0.5mM を加え、37℃において15時間培養する。培養物を遠心分離し、10mM NaCl 、2mM MgCl2 および1％トリトンX を含む10mMトリス-HCl，pH 8.2緩衝液10ml中に細胞を再懸濁さ
せる。次いで、細胞を超音波処理し、遠心分離し、次いで、80℃において15分間インキュベートする。遠心分離後、 DNAポリメラーゼpolIを含む溶液10ｍｌを回収する。
B)特性決定
1.SDS-PAGEによるE.coli BL21 (DE3)pLysS中の DNAポリメラーゼＩの発現の視覚
化
すべての抽出を70℃において15分間変性処理した図 (図９参照) 。
【０２８２】
DNAポリメラーゼＩの見かけ分子量：85kDa
2. DNAポリメラーゼＩの精製
10mMトリス-HCl,pH8.0,10mM NaCl、2mM MgCl2, 1％トリトンX 中で抽出
熱ショック：15分、70℃
クロマトグラフィー：Ressource Q (Pharmacia); 50 mMトリス-HCl, pH8.0, 0-0.5 MのNaCl勾配
DNAポリメラーゼは約150mM のNaClで溶離する。
3. DNAポリメラーゼI の性質
a)最適pHの決定
pHに依存するポリメラーゼ活性の測定プロトコルを以下に示す：
反応媒体緩衝液
50mMトリス-HCl、50mMグリシン-NaOH および50mM CAPS 、pH7.5 〜11
反応容積20μｌは、それぞれ0.2mM の４種のdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），0.35μＭ［3H］TTP (119Ci/mmol)および25mM MgCl2およびpolydA/oligodT (40:1) マトリックス５μｇ/ml を含む。インキュベーションは、70℃において20分行う。この反応混合物15μｌをGF-Cフィルタ（Whatman ）で濾過し、５％TCA 、ピロリン酸ナトリウム（8.9 g/l ）で沈殿させる。フィルターを95％エタノールで２回洗浄し、乾燥させた後、シンチレーションカウンタ（Packard)で放射能を測定する。
【０２８３】
DNAポリメラーゼ１単位は、上記実験条件においてdNTPの１nmol／分での取り込みを可能にする酵素量である。
上記条件におけるポリメラーゼ活性の最適pHは９〜9.5 である (図10参照) 。b)最適温度の決定：
反応媒体緩衝液：
50mMトリス-HCl，pH 8.8，１mMジチオトレイトール、10mM KCl，BSA 0.4 mg/ml ，2.5mM MgCl2
反応容積20μｌは、それぞれ0.2mM の４種のdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），0.35μＭ［3H］TTP (119Ci/mmol)および５μｇ/ml のpolydA-oligodT (40:1) マトリックスを含む。インキュベーションは、37〜90℃において20分行う。この反応混合物15μｌをGF-Cフィルタ（Whatman ）で濾過し、５％TCA 、ピロリン酸ナトリウム（8.9 g/l ）で沈殿させる。フィルターを95％エタノールで２回洗浄し、乾燥した後、シンチレーションカウンター(Packard) で放射能を測定する。
【０２８４】
DNAポリメラーゼ１単位は、上記実験条件においてdNTPの１nmol／分での取り込みを可能にする酵素量である。
上記実験条件におけるポリメラーゼ活性の最適温度は55〜65℃の範囲にある。c)最適MgCl2 濃度の決定
反応媒体緩衝液：
50mMトリス-HCl，pH 8.8，１mMジチオトレイトール, BSA 0.4 mg/ml ，０〜50mM MgCl2
反応容積20μｌは、それぞれ0.2mM の４種のdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）、0.35μＭ［3H］TTP (119Ci/mmol)および５μｇ/ml のpolydA-oligodT (40:1) マトリックスを含む。インキュベーションは、37〜90℃において20分行う。この反応混合物15μｌをGF-Cフィルタ（Whatman ）で濾過し、５％TCA 、ピロリン酸ナトリウム（8.9 g/l ）で沈殿させる。フィルターを95％エタノールで２回洗浄し、乾燥した後、シンチレーションカウンター(Packard) で放射能を測定する。
【０２８５】
DNAポリメラーゼ１単位は、上記実験条件においてdNTPの１nmol／分での取り込みを可能にする酵素量である。
上記実験条件におけるpolIポリメラーゼ活性の最適MgCl2 濃度は３mMである。
d)最適KCl 濃度の決定
反応媒体緩衝液：
50mMトリス-HCl，pH 8.8，１mMジチオトレイトール, BSA 0.4 mg/ml ，2.5mM MgCl2
反応容積20μｌは、それぞれ0.2mM の４種のdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）、0.35μＭ［3H］TTP (119Ci/mmol)および５μｇ/ml のpolydA-oligodT (40:1) マトリックスを含む。インキュベーションは、37〜90℃において20分行う。この反応混合物15μｌをGF-Cフィルタ（Whatman ）で濾過し、５％TCA 、ピロリン酸ナトリウム（8.9 g/l ）で沈殿させる。フィルターを95％エタノールで２回洗浄し、乾燥した後、シンチレーションカウンター(Packard) で放射能を測定する。
【０２８６】
DNAポリメラーゼ１単位は、上記実験条件においてdNTPの１nmol／分での取り込みを可能にする酵素量である。
上記実験条件におけるpolIポリメラーゼ活性の最適KCl 濃度は50〜80mMの範囲にある。
e)3'…→5'エキソヌクレアーゼ活性の証明
使用した3'…→5'エキソヌクレアーゼ活性の検出のためのプロトコルを以下に示す：
プラスミドpBluescript SKを制限酵素EcoRI で消化する。放射性ヌクレオチド［3H］TTP および４種の非標識ヌクレオチド（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）をE.coliの DNAポリメラーゼのKlenow断片によって取り込ませる。37℃において1時間
標識した後プラスミドをQIAGENカラムで精製し、次いで組換え DNAポリメラーゼIと共にインキュベートする。10％TCA で DNAを沈殿させた後、シンチレーショ
ンカウンター(Packard) で残存放射能を測定する。 DNAポリメラーゼIのポリメラーゼ活性を同じ条件下で測定し、Taq ポリメラーゼおよびPfu ポリメラーゼ(Stratagene)の活性と比較した。
【０２８７】
各 DNAポリメラーゼは１単位を使用した。
【０２８８】
【表11】
2004500802.tif 000104
【０２８９】
従って、上記 DNAポリメラーゼI型は下記のために利用できる：
−特に、
・重合速度の増加
・操作性の向上
・忠実度の向上；及び／又は、
・合成した断片の長さの増大
・(PCRのサイクル数を増加させうる) 酵素の強健さ
のために、3'…→5'エキソヌクレアーゼ活性の存在に基く、PCNA, RF-CおよびRPA 型の複製因子と併用して、または併用せずに、上記 DNAポリメラーゼIを用い
た PCRによる DNA増幅の改善、また、
−特に、
・重合速度の増加
・操作性の向上
・忠実度の増大；及び／又は、
・合成した断片の長さの増大
のためにPCNA, RF-CおよびRPA 型の複製因子を併用して、または併用せずに反応媒体中で、２種のポリメラーゼ( 本発明のポリメラーゼI型を含む) を混合する
ことにより、 PCRに使用される、熱安定性であってもなくてもよい任意の真核生物もしくは古細菌の DNAポリメラーゼの効率を改善する。
【０２９０】
本発明の DNAポリメラーゼI型は、さらに以下のために使用できる：
−long distance PCR (100kbよりも大きい断片の合成) 、
−細菌、古細菌または真核生物の染色体のin vitro複製系の実施、
−ある反応における極めて長い DNA断片の配列決定、
−in vitro複製系の実施。
【０２９１】
上記 DNAポリメラーゼI型について上述した上記使用は、当然本発明の一部で
ある。
【０２９２】
【参考文献】
2004500802.tif 000105
【０２９３】
2004500802.tif 000106
【図面の簡単な説明】
【図１】
E.coli  MC1061(DE3) 中の共発現によって得られた組換え複製因子Ｃの２つのサブユニットの特性決定を示す図。10％ゲルSDS/PAGEゲル。レーン１＋２＋３＋４：２分−９５℃；レーン１＋２：15分−60℃；レーン３＋４：15分−80℃；レーン１＋３：誘導クローン；レーン２＋４：対照細胞
【図２】
抗体Ａ（図２Ａ）および抗体Ｂ（図２Ｂ）でのイムノブロット（ウエスタンブロット）のオートラジオグラフィーによる組換え複製因子Ｃの大きいサブユニットの特性決定を示す図である。
RF-C AおよびRF-C B：子牛胸腺のRF-Cの大きいサブユニット（対照）との反応
レーン１：不溶部分（沈渣）中に発現された画分；
レーン２：可溶画分（上清液）中に発現された画分
レーン３：非誘導クローンの可溶画分
【図３】
組換えPCNAポリペチドの特性決定を示す図である。
電気泳動ゲル：レーン１：ＬＭＷ；レーン２：非誘導；レーン３：誘導；レーン４：15分−75℃；レーン５：ressourceQ；レーン６：Superdex200
【図４】
Pyrococcus abyssi の DNAポリメラーゼＩ(polI ）に対するポリペチドPCNAの影響
図４に、PCNAを使用した、または使用しない場合の、polIの量に対する、OligoF/lamdaマトリックスを使用する3H-TTPの取り込みを示す；１：２ＵのpolI；２：１ＵのpolI；３：0.5 ＵのpolI；４：0.2 ＵのpolI；５：0.1 ＵのpolI；６：0.1 ＵのpolI＋500ng PCNA
【図５】
E.coli HMS 174(DE3) 中での共発現によって得られた２種の組換えpolBおよびpolCサブユニットの特性決定を示す図。
10 ％SDS-PAGE上に得られた抽出物の視覚化
−レーン１：LMW ；
−レーン２，３，４：80℃において15分熱変性処理した後に37℃において15時間誘導処理した DNAポリメラーゼIIの２つのサブユニット（polBおよびpolC）を共発現するクローン；
−レーン５：80℃において15分熱変性処理した後に37℃において15時間誘導処理した対照HMS ；
−レーン６：LMW （“低分子量”）
【図６】
pHに対する DNAポリメラーゼIIのポリメラーゼ活性；6.5 の最適pHにおいて得られた活性の％値として示す。
【図７】
E.coli B121 pLys S(DE3) 中に発現された組換え複製タンパク質Ａの特性決定を示す図である。
10％SDS-PAGE電気泳動ゲル
−レーン１：非誘導、37℃において15時間；
−レーン２：誘導、37℃において15時間；
−レーン３：75℃において15分熱変性処理した後に37℃において15時間非誘導；
−レーン４：75℃において15分熱変性処理した後に37℃において15時間誘導；
−レーン５：HMW (pharmica)；
【図８】
Pyrococcus abyssi およびPyrococcus  horikochiiのRPA およびSaccharomyces cerevisiaeおよびヒトのRP70の配列の整列化を示す図である。
【図９】
E.coli B121 (DE ３）pLys S中に発現された組換え DNAポリメラーゼＩの特性決定を示す図である。
電気泳動ゲル
−レーン１：LMW
−レーン２：対照：非誘導E.coli B121(DE3)pLys S；
−レーン３：対照：E.coli  B121(DE3)pLys S ；
−レーン４：LMW ；
−レーン５：非誘導 DNAポリメラーゼＩ；
−レーン６：誘導 DNAポリメラーゼＩ；15時間×37℃で誘導，15時間0.1mMIPTG で誘導；
−レーン７：誘導 DNAポリメラーゼＩ；15時間×37℃で誘導，15時間0.5mM IPTGで誘導；
−レーン８：誘導 DNAポリメラーゼＩ；15時間×37℃で誘導，15時間１mM IPTG で誘導；
【図１０】
組換え DNAポリメラーゼＩのポリメラーゼ活性に対する各種緩衝液のpHの影響を示す図である。
【図１１】
組換え DNAポリメラーゼＩのインキュベーション温度に依存する活性を示す図：最適温度において得られた活性の％値として示した。