【手続補正書】
【提出日】平成16年11月5日(2004.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
標的および非標的核酸でプライミングし、伸長させることができるプライマー領域；および
少なくとも１つの、プライマー領域の5'に存在する非標的核酸の増幅産物の内部配列の逆向き反復であるが、存在するならば、標的核酸の増幅産物の対応する内部配列に対して少なくとも１つのミスマッチを含む領域；
を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーによって、核酸を増幅させることを含む方法。
【請求項２】
前記増幅工程が、プライマーおよび逆向き反復領域を含む少なくとも1つのフォワードプライマーを使用する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅工程が、プライマーおよび逆向き反復領域を含む少なくとも1つのリバースプライマーを使用する、請求項1から2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
フォワードおよびリバースプライマーを使用し、それぞれがプライマーおよび逆向き反復領域を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅がPCRによるものである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅技法がリアルタイムPCRなどである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
逆向き反復部分を除いた前記プライマーが、約15〜35塩基単位の長さである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーの逆向き反復配列が、約5〜30塩基単位の長さである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーの逆向き反復部分が、増幅のアニーリングおよび伸長の条件下において合致する配列をプライミングさせるのに充分なヌクレオチドを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅の選択性を、予め選択した遊離Mg2+濃度で増幅を行うことによって調整する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
約0.7mM未満の濃度の遊離Mg2+の存在下において増幅を行う、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
遊離Mg2+濃度が約0.5mM以下である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
遊離Mg2+濃度が約0.3mMである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅をベタインの存在下において行う、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベタインが約400mM〜約1.2Mの量で存在する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
a)種または亜種の範囲を超えて実質的に保存されている核酸上において、プライミングし伸長させることができる領域；および
予め選択した種または亜種に特徴的な、内部非保存配列の増幅産物の逆向き反復である領域；
を含む少なくとも1つのプライマーの存在下において、1種または複数の種の混合物から単離した核酸を含む単離核酸サンプルの選択的増幅を行う工程；および
b)増幅産物の存在を決定する工程；
を含む種の選択の方法。
【請求項１７】
前記種を動物種、細菌種、真菌種および植物種から選択する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記種の集団中の1種または複数の種を選択するために使用するときの、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマーの逆向き反復領域が、優勢種の核酸の増幅産物の非保存内部領域の逆向き反復である、劣勢種および優勢種からの核酸の混合物である単離核酸の選択的増幅のために使用するときの、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸がDNAである、請求項16から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記DNAが、リボゾームRNAをコードする遺伝子の一部分である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記種が細菌種である、請求項16から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プライマーの逆向き反復部分が、予め選択した種の16SリボゾームDNAの増幅産物中の領域の逆向き反復領域である、請求項21または22に記載の方法。
【請求項２４】
請求項1から15のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項16から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子ファミリーのメンバー間の、対立遺伝子のバリアントまたはミューテーションを識別するために使用するときの、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも1つの標的核酸または少なくとも1つの非標的核酸がメチル化核酸を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
メチル化または非メチル化核酸の選択的増幅を行う、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
メチル化核酸の選択的増幅を行う、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも1つの標的核酸または少なくとも1つの非標的核酸に、増幅前に修飾工程を施す、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記非標的核酸を修飾工程中に修飾する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾工程が化学的修飾である、請求項29または請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記修飾工程が、非メチル化シトシンをアデニンと塩基対を形成することができる他のヌクレオチドに変換し、一方メチル化シトシンは不変であるか、グアニンと塩基対を形成することができるヌクレオチドに変換される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾工程が、非メチル化シトシンをウラシルに変換する、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記化学的修飾工程が重亜硫酸塩処理である、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記プライマーの逆向き反復部分が、修飾された非標的核酸の合致する配列のアニーリングおよび伸長を可能にするのに充分な数のヌクレオチド、および修飾されていない標的核酸のアニーリングおよび/または伸長を許容しない充分なミスマッチを含む、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)Pi遺伝子および/またはその制御フランキング配列中の1つまたは複数の部位におけるシトシンの異常なメチル化のためのアッセイであって、
標的領域が、異常なシトシンのメチル化が起こっている1つまたは複数の部位であり、
単離DNA中のメチル化されている標的領域およびメチル化されていない非標的領域を、プライミングし、伸長させることができるプライマー領域；および
非標的領域の増幅産物の内部配列の逆向き反復であるが、標的領域の対応する内部配列に対して少なくとも１つのミスマッチを含む領域；
を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅を行う、
GSTP1遺伝子および/またはその制御フランキング配列中の標的領域を増幅させるための反応物および条件に単離DNAを曝すこと；および
増幅DNAの存在を決定すること；
を含むアッセイ。
【請求項３７】
前記標的領域が、-43〜+55CpG部位によって規定される(を含めた)、GST-Pi遺伝子および/またはその制御フランキング配列の領域内に存在する、請求項36に記載のアッセイ。
【請求項３８】
増幅前に、前記単離DNAに化学的修飾を施して、非メチル化シトシンをウラシルに変換する、請求項36または37に記載のアッセイ。
【請求項３９】
前記化学的修飾を重亜硫酸塩処理によって行う、請求項38に記載のアッセイ。
【請求項４０】
疾患または状態がシトシンの異常なメチル化によって特徴付けられる、対象の疾患または状態の診断または予後アッセイとして使用するときの、請求項36から39のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４１】
前記疾患または状態が癌である、請求項40に記載のアッセイ。
【請求項４２】
前記癌が前立腺癌、肝臓癌、または乳癌である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
非標的増幅産物内の核酸配列の逆向き反復であるが、標的核酸の対応する内部配列に対して少なくとも１つのミスマッチを含む領域；および
標的核酸および非標的核酸上において、プライミングし伸長させることができるプライマー領域；
を含む、核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４４】
請求項43に記載のオリゴヌクレオチドを含む、PCRキット。