(57)【要約】  インスリン分泌誘導剤、インスリン分泌誘導組成物及びその製造方法、膵臓β細胞増加促進剤、膵臓β細胞増加促進組成物及びその製造方法、並びに遺伝子治療用ウイルスベクターを提供する。  本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤は、膜タンパク質Ｔｍ４ｓｆ２０（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ４  Ｌ  ｓｉｘ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２０）をコードするＤＮＡとして公知のＤＮＡなどによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドやそのフラグメントを有効成分とする。
2009013794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とするインスリン分泌誘導剤；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項２】
配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが、配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項３】
次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つを有効成分とするインスリン分泌誘導剤；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｆ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項４】
配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項５】
インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメントが、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドである、請求項３記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項６】
インスリン分泌誘導剤の製造のための、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの使用；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項７】
インスリン分泌誘導剤の製造のための、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つの使用；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｆ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項８】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくとも１つを有効成分として含有するインスリン分泌誘導組成物。
【請求項９】
配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として培養可能な細胞に組み込み、当該細胞を培養して遺伝子発現させるインスリン分泌誘導組成物の製造方法。
【請求項１０】
外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを組み込んでなる、遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクター。
【請求項１１】
アデノウイルスベクターである請求項１０記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とする膵臓β細胞増加促進剤；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項１３】
配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１２記載の膵臓β細胞増加促進剤。
【請求項１４】
次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つを有効成分とする膵臓β細胞増加促進剤；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｆ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項１５】
配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１４記載の膵臓β細胞増加促進剤。
【請求項１６】
膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメントが、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドである、請求項１４記載の膵臓β細胞増加促進剤。
【請求項１７】
膵臓β細胞増加促進剤の製造のための、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの使用；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項１８】
膵臓β細胞増加促進剤の製造のための、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つの使用；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｆ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくとも１つを有効成分として含有する膵臓β細胞増加促進組成物。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として培養可能な細胞に組み込み、当該細胞を培養して遺伝子発現させる膵臓β細胞増加促進組成物の製造方法。
【請求項２１】
外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを組み込んでなる、遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクター。
【請求項２２】
アデノウイルスベクターである請求項２１記載のウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療に有効なインスリン分泌誘導剤、インスリン分泌誘導組成物及びその製造方法、膵臓β細胞増加促進剤、膵臓β細胞増加促進組成物及びその製造方法、並びに遺伝子治療用ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、消化管は、食事中の栄養分を吸収するだけでなく消化管ホルモンを産生する内分泌器官として注目されており、胃で産生されるグレリンの他、小腸から分泌されるグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１：ＧＬＰ−１）や胃酸分泌抑制ポリペプチド（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：ＧＩＰ）などが既にクローニングされている。グレリンは摂食亢進作用を有し、エネルギー代謝と関連がある。ＧＬＰ−１やＧＩＰはインクレチンと称され、食事負荷により膵臓β細胞に働き、インスリン分泌を誘導する。また、ＧＩＰは脂肪組織でも発現しており、ＧＩＰレセプターのノックアウトマウスは高脂肪負荷食を与えても体重が増加しないことから、肥満との関連も示唆されている。【０００３】
このように、消化管ホルモンはエネルギー代謝や摂食行動などに関わっており、その機能の解明により、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療方法が開発されるに至っている。しかしながら、消化管ホルモンの全容は未だ明らかにされておらず、不明な部分も多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、これまでに知られていない消化管由来のポリペプチドをコードする遺伝子の探索を行い、見出された遺伝子をもとに新たな医薬用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ＳＳＴ法（Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｒａｐ法：Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９９  Ｍａｙ；１７（５）：４８７−９０．  Ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｐ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｋｏｊｉｍａ  Ｔ，  Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ．）を採用してマウスの腸管から単離したｃＤＮＡ断片をもとに特定したクローンＣＦ２６６（ｍＣＦ２６６）が、腸管において特異的に発現していること、このｍＣＦ２６６をトランスフェクトした細胞の培養上清にはインスリン分泌誘導作用があること、アデノウイルスベクターを使用した強制発現系において、ｍＣＦ２６６がｉｎ  ｖｉｖｏでインスリン分泌誘導作用を示すことなどを見出した。さらに、本発明者らは、ｍＣＦ２６６に対応するヒトＣＦ２６６（ｈＣＦ２６６）によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントである合成ポリペプチドについても、同様の作用を示すことを見出した。
また、本発明者らは、アデノウイルスベクターを使用した強制発現系において、ｈＣＦ２６６がｉｎ  ｖｉｖｏで膵臓β細胞増加促進作用を示すこと、ｍＣＦ２６６のトランスジェニックマウスにおいて膵臓β細胞の増加が促進されることなどを見出した。さらに、本発明者らは、ｈＣＦ２６６によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントである合成ポリペプチドについても、同様の作用を示すことを見出した。なお、膵臓β細胞の増加が促進される要因としては、膵臓β細胞の増殖促進、膵臓β細胞の破壊抑制のいずれもが考えられるが、本明細書ではその両者を合わせて「膵臓β細胞増加促進」と称する。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。【０００６】
本発明のインスリン分泌誘導剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。【０００７】
また、本発明のインスリン分泌誘導剤は、配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが、配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする。【０００８】
また、本発明のインスリン分泌誘導剤は、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｆ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。【０００９】
また、本発明のインスリン分泌誘導剤は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする。【００１０】
また、本発明のインスリン分泌誘導剤は、インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメントが、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであることを特徴とする。【００１１】
また、本発明は、インスリン分泌誘導剤の製造のための、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの使用を提供する；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。【００１２】
また、本発明は、インスリン分泌誘導剤の製造のための、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つの使用を提供する；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｆ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。【００１３】
また、本発明のインスリン分泌誘導組成物は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする。【００１４】
また、本発明のインスリン分泌誘導組成物の製造方法は、配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として培養可能な細胞に組み込み、当該細胞を培養して遺伝子発現させることを特徴とする。【００１５】
また、本発明の遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクターは、外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを組み込んでなることを特徴とする。【００１６】
また、本発明の遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることを特徴とする。【００１７】
本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。【００１８】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする。【００１９】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｆ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。【００２０】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする。【００２１】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメントが、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであることを特徴とする。【００２２】
また、本発明は、膵臓β細胞増加促進剤の製造のための、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの使用を提供する；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。【００２３】
また、本発明は、膵臓β細胞増加促進剤の製造のための、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つの使用を提供する；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｆ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。【００２４】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進組成物は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする。【００２５】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進組成物の製造方法は、配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として培養可能な細胞に組み込み、当該細胞を培養して遺伝子発現させることを特徴とする。【００２６】
また、本発明の遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターは、外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを組み込んでなることを特徴とする。【００２７】
また、本発明の遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療に有効なインスリン分泌誘導剤、インスリン分泌誘導組成物及びその製造方法、膵臓β細胞増加促進剤、膵臓β細胞増加促進組成物及びその製造方法、並びに遺伝子治療用ウイルスベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ｍＣＦ２６６の部位別発現分布を示すノザンブロットの結果である。
【図２】ＣＦ２６６トランスフェクション細胞の培養上清による、マウス膵臓β細胞由来培養細胞株に対するインスリン分泌誘導作用を示すグラフである。
【図３】ｍＣＦ２６６を発現するアデノウイルスベクターによる、２型糖尿病モデルマウスに対するインスリン分泌誘導作用を示すグラフである。
【図４】ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントによる、マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対するインスリン分泌誘導作用を示すグラフである。
【図５】ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現するアデノウイルスベクターによる、１型糖尿病モデルマウスに対する血糖値低下作用を示すグラフである。
【図６】ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現するアデノウイルスベクターによる、１型糖尿病モデルマウスに対する膵臓β細胞増加促進作用を示すグラフである。
【図７】トランスジェニックマウスにおけるｍＣＦ２６６の膵臓β細胞増加促進作用を示すグラフである。
【図８】ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントによる、１型糖尿病モデルマウスに対する膵臓β細胞増加促進作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明のインスリン分泌誘導剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とするものである；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【００３１】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とするものである；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【００３２】
本発明者らがマウスの腸管から取得したｍＣＦ２６６は、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡであるが、このＤＮＡはマウスの筋肉に発現している膜タンパク質Ｔｍ４ｓｆ２０（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ４  Ｌ  ｓｉｘ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２０）をコードするＤＮＡとして公知の全長１５０５ｂｐのものである（ＮＣＢＩ：ＬＯＣＵＳ  ＮＭ  ０２５４５３）。ｍＣＦ２６６のＣＤＳは４１．．７２１であり、配列番号３に記載の２２６個のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている（配列番号２参照）。しかしながら、このポリペプチドがインスリン分泌誘導作用及び膵臓β細胞増加促進作用を持つことについての報告は、これまでのところ存在しない。
【００３３】
また、本発明者らは、ｍＣＦ２６６に対応するヒトＣＦ２６６（ｈＣＦ２６６）についてもｍＣＦ２６６と同様の作用を有することを確認している。ｈＣＦ２６６は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡであり、ヒトＴＭ４ＳＦ２０をコードするＤＮＡとして公知の全長２３０８ｂｐのものである（ＮＣＢＩ：ＬＯＣＵＳ  ＮＭ  ０２４７９５）。ｈＣＦ２６６のＣＤＳは３８．．７２７であり、配列番号６に記載の２２９個のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている（配列番号５参照）。しかしながら、このポリペプチドがインスリン分泌誘導作用及び膵臓β細胞増加促進作用を持つことについての報告もまた、これまでのところ存在しない。
【００３４】
本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤は、このような配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とすることができる。
【００３５】
また、本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤は、インスリン分泌誘導作用及び膵臓β細胞増加促進作用が維持されている限り、上述のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とすることもできる。あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは既に知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００３６】
なお、１若しくは数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する場合には、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが望ましい。アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。
【００３７】
具体的に、配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、インスリン分泌誘導作用及び膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドとしては、例えば、ｈＣＦ２６６の一塩基多型（ＳＮＰｓ）に基づく配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされる配列番号９に記載の２２９個のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる（配列番号８参照）。配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの相違は、前者は２７番目のアミノ酸がバリン（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））であるのに対して、後者はアラニン（ｈＣＦ２６６（２７Ａ））であることである。
【００３８】
また、本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤は、インスリン分泌誘導作用及び膵臓β細胞増加促進作用が維持されている限り、上述のポリペプチドのフラグメントを有効成分とすることもできる。
【００３９】
具体的に、インスリン分泌誘導作用及び膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドのフラグメントとしては、例えば、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの９８〜１１６番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＡＬＹＣＭＬＩＳＩＱＡＬＬＫＧＰＬＭＣ（配列番号１０参照）を少なくとも含むポリペプチド、同７８〜９６番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＣＮＮＲＴＧＭＦＬＳＳＬＦＳＶＩＴＶＩ（配列番号１１参照）を少なくとも含むポリペプチド、同１６１〜１７９番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＴＳＮＤＴＭＡＳＧＷＲＡＳＳＦＨＦＤＳ（配列番号１２参照）を少なくとも含むポリペプチドが挙げられる。
【００４０】
本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤の有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントは、化学合成してもよいが、遺伝子工学的に取得することもできる。例えば、配列番号１や配列番号４や配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として培養可能な宿主細胞に組み込み、当該細胞を培養して遺伝子発現させることで、その培養上清から得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など、公知の細胞を適宜使用することができる。動物細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。
【００４１】
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、対象とするＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを採用することにより取得できるＤＮＡを意味する。例えば、コロニーやプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルタを使用し、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃条件下でフィルタを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどが挙げられる（必要であればＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，  １９８９．などを参照のこと）。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列の、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列との相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
【００４２】
これらのポリペプチドやそのフラグメントの分離・精製は、例えば、イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど、ペプチド化学において通常使用される方法によって行うことができる。
【００４３】
本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤は、注射剤（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内など）として、経皮、経粘膜、経鼻などの投与に適した剤型として、あるいは経口投与に適した剤型（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤など）として、投与することが可能である。また、本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤には、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤などを適宜添加することができる。その用法用量は患者の性別、年齢、体重、病態などによって適宜決定すればよい。
【００４４】
例えば、その有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントを必要に応じて薬学的に許容される塩酸塩などの無機酸塩、酢酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩などに変換し、滅菌した上で、凍結乾燥品として製剤化しておくことができる。使用時には、生理食塩水などに溶解して注射剤の形態で静脈内投与することで、インスリン分泌の誘導及び膵臓β細胞の増加促進が可能となる。
【００４５】
なお、本発明のインスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤の有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントは、高度に精製された純品を単独で使用してもよいし、複数種類を混合して使用してもよく、種々のインスリン分泌誘導組成物、膵臓β細胞増加促進組成物の形態で使用することができる。
【００４６】
また、本発明の遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクター、及び膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターは、外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを組み込んでなることを特徴とするものである。ウイルスベクターの具体例としては、配列番号１、配列番号４、配列番号７のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡをＣＡＧプロモーターなどに連結して構築したアデノウイルスベクターなどが挙げられる。このようなウイルスベクターは、例えば静脈内投与することで、インスリン分泌の誘導及び膵臓β細胞の増加促進が可能となる。
【００４７】
本発明のインスリン分泌誘導剤、インスリン分泌誘導組成物、あるいは遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクターは、体内において優れたインスリン分泌誘導作用を示すため、インスリンの分泌能低下を伴う疾患、特に２型糖尿病の治療に有効である。換言すれば、これらのインスリン分泌誘導剤、インスリン分泌誘導組成物、あるいは遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクターを用いることにより、インスリンの分泌能低下を伴う疾患、特に２型糖尿病の治療方法を提供することができる。
【００４８】
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤、膵臓β細胞増加促進組成物、あるいは遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターは、体内において優れた膵臓β細胞増加促進作用を示すため、膵臓β細胞の減少又は死滅を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療に有効である。換言すれば、これらの膵臓β細胞増加促進剤、膵臓β細胞増加促進組成物、あるいは遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターを用いることにより、膵臓β細胞の減少又は死滅を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療方法を提供することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。【００５０】
＜参考例１：ｍＣＦ２６６の部位別発現分布＞
参考例１では、ＳＳＴ法を採用してマウスの腸管から取得したｍＣＦ２６６のｍＲＮＡの部位別発現分布をノザンブロット法により検討した。【００５１】
先ず、マウスから各臓器・組織（大脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、小腸、白色脂肪組織、褐色脂肪組織、筋肉）を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて添付の説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。次に、定法に従い１０μｇ／レーンとなるようにメンブレンを作製し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを使用して標識したｍＣＦ２６６のｃＤＮＡ（ｍＲＮＡクローン）をプローブにしてハイブリダイズさせた。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ｍＣＦ２６６は小腸において特異的に発現している。【００５２】
＜実施例１：ＣＦ２６６トランスフェクション細胞の培養上清によるマウス膵臓β細胞由来培養細胞株ＭＩＮ６細胞に対する作用＞
実施例１では、ＣＦ２６６をトランスフェクトした胎児腎臓上皮細胞由来細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清によるＭＩＮ６細胞に対する作用を確認した。【００５３】
先ず、５％ＦＣＳ及び抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地で継代培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍディッシュに１×１０６個撒いた。その翌日、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｍＣＦ２６６の発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＣＦ２６６）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ｍＣＦ２６６を強制発現させた。その２４時間後に培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換し、さらにその２４時間後に培養上清を回収した。【００５４】
次に、１５％ＦＣＳ、抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ）、及び２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地（高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で継代培養したＭＩＮ６細胞を２４穴プレートに３×１０５個／ウェル撒いた。その翌日、ＫＲＢＨ緩衝液（２．８ｍＭグルコース）を０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間前培養した後、上記の培養上清とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を０．５ｍＬ／ウェル添加して１時間刺激を行い、ＭＩＮ６細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。測定は培養液中のインスリンをＥＬＩＳＡ法（シバヤギのレビスインスリンキットを使用：以下同じ）で測定することで行った。なお、インスリン値はＭＩＮ６細胞の総タンパク質量で正規化した。【００５５】
同様に、ヒト腸管ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からクローニングした配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））、及びＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））に対して公知の方法で変異導入することで取得した配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ａ））のそれぞれの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、それぞれを強制発現させた。そして、その培養上清を用いて、上記と同様にしてＭＩＮ６細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。【００５６】
その結果を図２に示す。図中、「Ｍｏｃｋ」は、上記と同様の方法で空ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして得た培養上清を添加した場合の結果を示す。図２から明らかなように、ＣＦ２６６を強制発現させた細胞の培養上清は、ＭＩＮ６細胞に対してグルコース応答性のインスリン分泌を誘導し、その作用はとりわけｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を強制発現させた場合が優れていた。【００５７】
＜実施例２：２型糖尿病モデルＫＫ／Ａｙマウスに対するｍＣＦ２６６の作用＞
実施例２では、ｍＣＦ２６６を発現するアデノウイルスベクターを用いて、２型糖尿病モデルマウスであるＫＫ／Ａｙマウスに対するｍＣＦ２６６の作用を確認した。【００５８】
先ず、高脂肪高ショ糖負荷食を与えた１８週齢のＫＫ／Ａｙマウス（体重約４７〜５１ｇ）に対して、ＣＡＧプロモーターにｍＣＦ２６６を連結して構築したアデノウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの商品名ＶｉｒａＰｏｗｅｒを使用して作製）を５×１０９ＰＦＵの濃度で尾静脈から静脈内投与した。その４日後、静脈内糖負荷試験（ｉ．ｖ．ＧＴＴ）を行い、経時的に採血し、血清中の血糖値、インスリン値を測定した。【００５９】
その結果を図３に示す。図中、「Ａｄ  ＧＦＰ」は、ｍＣＦ２６６の代わりにＧＦＰをコードするＤＮＡを連結して構築したアデノウイルスベクターを用いた場合の結果を示す。図３から明らかなように、２型糖尿病モデルマウスの体内でｍＣＦ２６６を発現させると、対照としてＧＦＰを発現させた場合と比較して、血糖値はやや低い傾向が見られるに過ぎなかったが（図中（ａ））、インスリン値は有意に高くなっていた（図中（ｂ））。したがって、ｍＣＦ２６６の発現はインスリンの分泌を誘導することが分かった。【００６０】
＜実施例３：ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）トランスフェクション細胞の培養上清に含まれるポリペプチドによるマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対する作用＞
実施例３では、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清に含まれるポリペプチドを化学合成し、合成したポリペプチドによるマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対する作用を確認した。【００６１】
先ず、実施例１と同様の方法により、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしてｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を強制発現させ、培養上清を回収した。そして、陰イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ  ＨＱカラム；ＡＢＩ）を使用して、回収した培養上清を分画した。【００６２】
次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した膵臓ランゲルハンス氏島細胞を２４穴プレートに１０ｉｓｌｅｔｓ／ウェル撒き、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２時間培養した後、ＫＲＢＨ緩衝液（２．８ｍＭグルコース又は２０ｍＭグルコース）を０．５ｍＬ／ウェルとなるように添加して３０分間前培養した。そして、上記の培養上清画分とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を０．５ｍＬ／ウェル添加して１時間刺激を行い、マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。測定は培養液中のインスリンをＥＬＩＳＡ法で測定することで行った。さらに、インスリン分泌誘導活性が認められた画分を質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＡＳ）で解析し、特異的に見られたピークの質量から予測された１９個のアミノ酸配列を有する３種類のポリペプチド、すなわち、ＡＬＹＣＭＬＩＳＩＱＡＬＬＫＧＰＬＭＣ（ポリペプチドＡ：配列番号１０）、ＣＮＮＲＴＧＭＦＬＳＳＬＦＳＶＩＴＶＩ（ポリペプチドＢ：配列番号１１）、ＴＳＮＤＴＭＡＳＧＷＲＡＳＳＦＨＦＤＳ（ポリペプチドＣ：配列番号１２）を化学合成した。【００６３】
続いて、これら３種類のポリペプチドＡ〜ＣのそれぞれをＫＲＢＨ緩衝液に１０ｎＭの濃度で溶解した溶液を、上記と同様の方法で３０分間前培養したマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間刺激を行い、上記と同様の方法でマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞のグルコース応答性のインスリン分泌を測定した。なお、インスリン値はマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞の総ＤＮＡ量で正規化した。【００６４】
その結果を図４に示す。図中、「Ｃｏｎｔ．」は、ＫＲＢＨ緩衝液のみを添加して刺激を行ったこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。また、「ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）」は、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を添加して刺激を行ったこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。また、「ＧＬＰ−１」は、ヒトＧＬＰ−１（ペプチド研究所）をＫＲＢＨ緩衝液に１０ｎＭの濃度で溶解した溶液を添加して刺激を行ったこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。図４から明らかなように、３種類のポリペプチドＡ〜Ｃは、マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対してグルコース応答性のインスリン分泌を誘導することが分かった。【００６５】
＜実施例４：１型糖尿病モデルＳＴＺマウスに対するｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の作用＞
実施例４では、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現するアデノウイルスベクターを用いて、１型糖尿病モデルマウスであるＳＴＺマウスに対するｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の作用を確認した。【００６６】
先ず、７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（体重約１８〜２０ｇ）を０日目から１８時間絶食させた後、生理食塩水に溶解したストレプトゾシン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与し、すぐに自由摂食とした。さらに、翌日から１８時間絶食し、２日目に再度同量のストレプトゾシンを腹腔内投与して、すぐに自由摂食とした。７日目に血清中の血糖値を測定し、空腹時血糖値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上であるものを糖尿病と判定し、以後の実験に用いた。その同日に、糖尿病と判定されたＳＴＺマウスに対して、ＣＡＧプロモーターにｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を連結して構築したアデノウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの商品名ＶｉｒａＰｏｗｅｒを使用して作製）を、１×１０９ＰＦＵの濃度で尾静脈から静脈内投与した。そして１２日目に、経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行い、経時的に採血し、血清中の血糖値を測定した。【００６７】
その結果を図５に示す。図中、「Ａｄ（−）」は、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイルスベクターを用いた場合の結果を示す。また、「Ａｄ  ＧＦＰ」は、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の代わりにＧＦＰをコードするＤＮＡを連結して構築したアデノウイルスベクターを用いた場合の結果を示す。図５から明らかなように、１型糖尿病モデルマウスの体内でｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現させると、対照としてＧＦＰを発現させた場合、あるいは何も発現させていない場合と比較して、血糖値は有意に低くなっていた。したがって、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の発現は血糖値の上昇を抑えることが分かった。【００６８】
次に、これらのＳＴＺマウスの膵臓を摘出し、組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、筑波大学組織標本作製室に依頼してパラフィン包埋切片を作製した。その切片を脱パラフィンした後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温で３０分間、抗原賦活化を行い、５％スキムミルクを用いて室温で１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ポリクローナル抗インスリン・モルモット抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナル抗グルカゴン・ウサギ抗体（Ｄａｃｏ）を用いて４℃で一晩、１次抗体反応を行い、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で切片を洗浄した。さらに、ポリクローナルヒツジ抗モルモットＩｇＧ結合ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ結合Ｃｙ３抗体（Ｄａｃｏ）を用いて室温で１時間、暗室で２次抗体反応を行い、ＴＢＳＴで切片を洗浄した。その後、蛍光退色防止剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｖｅｃｔｏｒ）でマウントし、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００；ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察して、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）を測定した。【００６９】
その結果を図６に示す。図６から明らかなように、１型糖尿病モデルマウスの体内でｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現させると、対照としてＧＦＰを発現させた場合、あるいは何も発現させていない場合と比較して、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）は有意に上昇していた。したがって、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の発現はβ細胞の増加を促進することが分かった。【００７０】
＜実施例５：トランスジェニックマウスにおけるｍＣＦ２６６の作用＞
実施例５では、トランスジェニックマウスにおけるｍＣＦ２６６の作用を確認した。【００７１】
先ず、ＣＡＧプロモーターにｍＣＦ２６６を連結して構築したｍＣＦ２６６の発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＣＦ２６６）を直鎖化し、筑波大学生命科学動物資源センターに依頼してトランスジェニックマウスを作製した。なお、導入遺伝子はＰＣＲ法及びサザンブロット法で確認し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと５世代交配を行った。【００７２】
次に、これらのトランスジェニックマウスの膵臓を摘出し、組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、筑波大学組織標本作製室に依頼してパラフィン包埋切片を作製した。その切片を脱パラフィンした後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温で３０分間、抗原賦活化を行い、５％スキムミルクを用いて室温で１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ポリクローナル抗インスリン・モルモット抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナル抗グルカゴン・ウサギ抗体（Ｄａｃｏ）を用いて４℃で一晩、１次抗体反応を行い、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で切片を洗浄した。さらに、ポリクローナルヒツジ抗モルモットＩｇＧ結合ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ結合Ｃｙ３抗体（Ｄａｃｏ）を用いて室温で１時間、暗室で２次抗体反応を行い、ＴＢＳＴで切片を洗浄した。その後、蛍光退色防止剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｖｅｃｔｏｒ）でマウントし、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００；ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察して、切片上の膵臓面積あたりのインスリンが染まるランゲルハンス氏島細胞の面積及び数を測定した。なお、ランゲルハンス氏島細胞の数は、野生型のマウスの場合が１となるように正規化した。【００７３】
その結果を図７に示す。図中、「ＷＴ」は、野生型のマウスを用いた場合の結果を示す。図７から明らかなように、ヘテロ型（＋／−）、ホモ型（＋／＋）となるに従い、野生型と比べてβ細胞の面積（図中（ａ））、数（図中（ｂ））が顕著に増えていた。したがって、ｍＣＦ２６６の発現はβ細胞の増加を促進することが分かった。【００７４】
＜実施例６：ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）トランスフェクション細胞の培養上清に含まれるポリペプチドによる１型糖尿病モデルＳＴＺマウスに対する作用＞
実施例６では、実施例３と同様にして化学合成したポリペプチドＡ〜Ｃによる１型糖尿病モデルＳＴＺマウスに対する作用を確認した。【００７５】
先ず、７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（体重約１８〜２０ｇ）を０日目から１８時間絶食させた後、生理食塩水に溶解したストレプトゾシン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与し、すぐに自由摂食とした。さらに、翌日から１８時間絶食し、２日目に再度同量のストレプトゾシンを腹腔内投与して、すぐに自由摂食とした。７日目に血清中の血糖値を測定し、空腹時血糖値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上であるものを糖尿病と判定し、以後の実験に用いた。糖尿病と判定されたＳＴＺマウスに対して、７日目から８週間に亘って、生理食塩水に溶解したポリペプチドＡ〜Ｃ（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）を１日２回、腹腔内投与し続けた。【００７６】
次に、これらのＳＴＺマウスの膵臓を摘出し、組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、筑波大学組織標本作製室に依頼してパラフィン包埋切片を作製した。その切片を脱パラフィンした後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温で３０分間、抗原賦活化を行い、５％スキムミルクを用いて室温で１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ポリクローナル抗インスリン・モルモット抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナル抗グルカゴン・ウサギ抗体（Ｄａｃｏ）を用いて４℃で一晩、１次抗体反応を行い、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で切片を洗浄した。さらに、ポリクローナルヒツジ抗モルモットＩｇＧ結合ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ結合Ｃｙ３抗体（Ｄａｃｏ）を用いて室温で１時間、暗室で２次抗体反応を行い、ＴＢＳＴで切片を洗浄した。その後、蛍光退色防止剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｖｅｃｔｏｒ）でマウントし、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００；ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察して、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）を測定した。【００７７】
その結果を図８に示す。図中、「Ｃｏｎｔ．」は、ポリペプチドＡ〜Ｃを含まない生理食塩水を用いたこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。図８から明らかなように、ポリペプチドＡ〜Ｃを投与したマウスでは、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）は有意に上昇しており、その効果はとりわけポリペプチドＡを投与した場合が優れていた。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療に有効なインスリン分泌誘導剤、インスリン分泌誘導組成物及びその製造方法、膵臓β細胞増加促進剤、膵臓β細胞増加促進組成物及びその製造方法、並びに遺伝子治療用ウイルスベクターを提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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