【手続補正書】
【提出日】平成16年11月8日(2004.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
従って、スケールアップする場合計算上は、以下のように考えられる。
すなわち、１５ｃｍで1万段とすると、１σは出口付近で１００段、最高濃度は１２ｍｇ/ｇであるから、０．３６ｍｇが計算上の処理可能量である。計算値が０．５ｍｇになるのは約５０００段の時であるから、普通に言われていることは計算上からもほぼ正しいことになる。仮に１万段とすると、あくまで計算上ではあるが、１ｇの処理に必要なカラムの径は２４２ｍｍになる。すなわち、長さ１５ｃｍ、直径約２４ｃｍのカラムを用いればよいことになる。同様に、試料４ｇでは直径４８ｃｍ、長さ１５ｃｍ、さらに試料１６ｇでは直径約１ｍ（９６ｃｍ）、長さ１５ｃｍのカラムが必要なことになる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
これは分離に必要なカラム全体を二つに分け、一部を切り離して、必要な画分のみを取り出す前処理技術として捉えられている。この技術には、後半の分析カラム中に複数の試料を入れて効率化を図る考えは無く、むしろ後半のカラムでの分離時間中に前半のカラムを洗浄再生して効率化を図ることに主眼があり、分析カラムによる分析の終了とともに前半の前処理カラムが再生されているので、直ちに次の分析のための試料の注入が行われるという点、および分析カラムの混在成分による不必要な汚染が避けられる点が長所として認識されている。しかし、複数の前処理カラムを用いて、同一の高性能カラムを複数の分析のために利用するという視点は無い。従って、この技術においても、クロマトグラフィの無駄の一つである前述した操作中の特定の時点における分離に関与していない充填剤、すなわち特定の時点で試料が存在していない充填剤部分を可及的に減らし、系内の出来るだけ多くの充填剤を試料の分離に常時関係させようと言う視点には欠けている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
これに対して本発明による装置では、例えばカラムの出口で8σ間隔になるように試料を注入すれば一万段のカラムを用いると出口付近では目的試料の存在しない部分が２５％で７５％に目的試料が存在し、カラムが有効に利用されることになる。さらにこの比率はピーク幅６σに対しピーク間に２σの間隔を持たせようという計画であるからカラム出口でのこの関係はカラムの分離性能には関係しない。また高い分離能、つまり大きい理論段数のカラムを用いると出口でのピーク幅は当然低い分離能のカラムつまり少ない理論段数のカラムを用いた時より拡がるので8σの間隔で注入すると、理論段数をNとすると間隔はカラム上で
【数１】
2003156482.tif 000001
、従って時間間隔では
【数２】
2003156482.tif 000002
ということになる。保持時間ｔRはNに比例するから、SC系への注入間隔はNの平方根に比例することになる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
周知のようにクロマトグラフィによる分離では、分離される各成分はその系における固定相と移動相との間の各々の成分に固有な物理化学的定数である分布係数に従って決まるカラム上での移動速度に従って移動する。これは移動相に存在する比率の高い成分はその比率が低い成分より早く移動することを意味する。この移動の過程で各成分を構成する無数の分子は、平均速度を中心とした一定の幅で拡がる。この広がりの幅は移動距離に対して相対的に分離能の高いカラムでは狭く、低いカラムでは広くなる。クロマトグラフィの理論によれば理想的な条件では試料の溶出曲線の形は正規分布となる。実際にも技術の進歩により、現在では理論どおりに分離が行われていると見なすことの出来る溶出条件を得ることは困難ではない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
一方、分離しにくい成分の分離の程度を定義するものとして、次の式で表される分離度がある。
【数３】
2003156482.tif 000003
ここで  Ｒｓは分離度、Ｎは理論段数、α（＝ｋ’２／ｋ’１；ｋ’１およびｋ’２は成分１および２の質量分布比）は分離係数、ｋ’は質量分布比、
【数４】
2003156482.tif 000004
はｋ’１、ｋ’２の平均である。
通常分離度は１を目標とし、分離度が１．５になると完全分離とされる。
分離度を大きくするには、上式で表される様に分離係数、理論段数を大きくするか、または質量分布比ｋ’があまり小さくならないようにする必要がある。通常クロマトグラフィを必要とするような精製では、分離係数は１に近い場合が多い。分離係数は成分の分配比であるから、物理化学的定数で移動相と固定相が決まれば決まる。理論段数は上に述べたセクションの数であるから、カラムを長くすれば大きくなる。ｋ’は移動相の組成を変更することによって、かなりの幅で調節することが出来る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明は調製を目的とするものであるが、混合物中の特定成分を高純度で分離するという点では分析を目的とする場合と同様である。したがって、多数の試料中の特定成分をハートカットした後、必要最短間隔で分離カラム系に導けば、試料の単位時間当たりの処理数は多くなる。したがって、類似の試料が多数存在し、且つ分離対象成分が少ない場合には有効である。
本発明による装置のPCカラム部分は、充填剤に保持されるあるいは溶出時間がある範囲のものを取り出すのが目的であって精製分離が目的ではないから、クロマトグラフィのカラムとしては分離能の低いもの、すなわち、短いカラムでよい。そのため、試料の注入、カラムの洗浄、再生などは短いカラムのシステムで行われることになり、通常のHPLCのような高圧での操作は必要と無くなる。従って、実施例１に見られるような煩雑な流路の切り替えは低圧で行われるので、流路の切り替えに高圧用のバルブを必要としないことも本発明によるクロマトグラフィ装置の利点である。
唯一高圧を要するＳＣカラムユニットへの必要画分の導入は、下記実施例１および実施例２のバルブｓｖ１〜ｓｖ４のように、もともと耐圧性の高い６方バルブが適しているので装置としても無駄がない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
以上のように、並列に並べたPCユニットのカラムを循環的に用いて、試料中の必要画分を、必要な分離能を持つ直列に連ねた精製用のSCユニットのカラムに断続的に導入して必要な純度にまで精製することによって目的画分を分離することが出来る。なお、SCユニットでは、分離・精製に必要な理論段数に相当する長さまでカラムを必要な本数だけ直列に連結することにより、好適な分離・精製を行うことが出来る。すなわち、必要に応じて、カラムを４本以上連結しての分離・精製が行われる。例えば、１本１０００段のカラムを１０本のカラムを用いれば、一万段の分離効率を得ることができ、好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
図１によって、例として、カラムから早く溶出される順に、K、L、MおよびNより成り、LおよびMが分離しにくい成分である混合物からLを取り出す場合について、操作をさらに説明する。
先ず、カラムPC1に試料を注入する。このときPEは止め、PSは動かし、バルブの位置はb’、c’、d である。試料注入後、PS を止め、PEを動かすとともに、バルブ位置をb、c’、 dとして溶離液を流し、Kがｄを経て流出し、Lが流出する直前までその状態を保つ。ここでバルブの位置を図１のようにa、b、c、q、s、t とすると、L画分がＭを伴ってSC1に導入される。Lが全てSC1に導入された後に余分な成分は出来るだけ入れないようにPEを止め、バルブ位置t’でPMを動かす。その後バルブ位置ａ’、ｂ、ｃ’、ｄ’としてPWを動かし、カラムPC1の洗浄を行う。図１においては、PC4に対応する状態である。SC1に導入されたL画分はカラム上を移動し、SC1の入り口付近には試料の無い部分が出来る。こうして予め決められた移動相を流し、適当な間隔を空ける。ついで次の試料の画分Lが以下のように準備されたPC2からSC1に導入される。