(57)【要約】  本発明は、スフィンゴエミリナーゼ阻害活性を有する新規なスフィンゴシン化合物、その製造方法を提供することを目的とする。本発明の新規なスフィンゴシン化合物は、一般式（１）2008111450.tif 000039［式中、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が基（Ｇ）2008111450.tif 000040を示す。ｎは、０又は１を示す。Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］で表される。
2008111450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2008111450.tif 000031
［式中、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が基（Ｇ）
【化２】
2008111450.tif 000032
を示す。ｎは、０又は１を示す。Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表されるスフィンゴシン化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ１が基（Ｇ）を示し、Ｒ２が水素原子を示す、請求項１に記載のスフィンゴシン化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ１が水素原子を示し、Ｒ２が基（Ｇ）を示す、請求項１に記載のスフィンゴシン化合物又はその塩。
【請求項４】
一般式（２）
【化３】
2008111450.tif 000033
［式中、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表される化合物にスズオキシド化合物を反応させ、次いで生成する化合物に一般式（３）
【化４】
2008111450.tif 000034
[式中、ｎは、０又は１を示す。Ｘは、ハロゲン原子を示す。]
で表されるビピリジル化合物を反応させることにより、一般式（１）
【化５】
2008111450.tif 000035
［式中、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が基（Ｇ）
【化６】
2008111450.tif 000036
を示す。ｎは、０又は１を示す。Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表されるスフィンゴシン化合物又はその塩を製造する方法。
【請求項５】
一般式（１）
【化７】
2008111450.tif 000037
［式中、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が基（Ｇ）
【化８】
2008111450.tif 000038
を示す。ｎは、０又は１を示す。Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表されるスフィンゴシン化合物又はその塩を含有するスフィンゴミエリナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴシン化合物、その製造方法及びスフィンゴミエリナーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼとも言い、膜脂質の一つであるスフィンゴミエリンを基質として、セラミドとホスホコリンに分解するホスホリパーゼの一つである。スフィンゴミエリナーゼは、生体内のスフィンゴミエリン代謝系の制御において、重要な役割を演じていると考えられている。【０００３】
スフィンゴミエリナーゼは、細胞外からのサイトカインやホルモン等により、活性化される。このとき産生されるセラミドは、アポトーシス、細胞増殖、分化等の種々の細胞機能において、脂質セカンドメッセンジャーとして重要な役割を果たしていると考えられている。このような情報伝達経路は、スフィンゴミエリン経路と呼ばれ、この経路を介する生理活性物質として、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）等のサイトカイン、Ｆａｓ、ＣＤ２８、ＣＤ４０−リガンド等の細胞接着分子等が知られている。これらの生体内生理活性物質は、炎症、細胞死、免疫系の制御等、種々の疾患の発症や生命現象の発現に深く関与していると考えられ、情報伝達経路であるスフィンゴミエリン経路の生体内における重要性を示している。【０００４】
スフィンゴミエリナーゼに対する特異的な阻害剤は、脳出血や脳梗塞等の脳血管障害、頭部外傷、パーキンソン氏病、老人性痴呆、アルツハイマー病等に代表される老年性認知症等の脳神経変性疾患、糖尿病、肥満、動脈硬化、炎症性疾患、免疫性疾患、ガン、腎疾患及び心疾患に対する予防薬、治療薬として期待され、数多くのスフィンゴミエリナーゼ阻害剤が提案されている（特許文献１〜４）。【０００５】
しかしながら、今後増加が予想される老人性認知症患者等に対する有効なスフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、未だ開発されていない。
【特許文献１】特開2000-86601号公報
【特許文献２】特開2001-213858号公報
【特許文献３】特開2004-175735号公報
【特許文献４】特開2005-281209号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、スフィンゴエミリナーゼ阻害活性を有する新規なスフィンゴシン化合物、その製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明者らが初めて合成したスフィンゴシン化合物が、優れたスフィンゴエミリナーゼ阻害活性を有することを見出した。本発明は、この様な知見に基づき完成されたものである。【０００８】
本発明は、下記項１〜５に示すスフィンゴシン化合物、その製造方法及び該化合物を含有するスフィンゴエミリナーゼ阻害剤を提供する。
項１．  一般式（１）【０００９】
【化１】
2008111450.tif 000003
【００１０】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が基（Ｇ）【００１１】
【化２】
2008111450.tif 000004
【００１２】
を示す。ｎは、０又は１を示す。Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表されるスフィンゴシン化合物又はその塩。
項２．  Ｒ１が基（Ｇ）を示し、Ｒ２が水素原子を示す、項１に記載のスフィンゴシン化合物又はその塩。
項３．  Ｒ１が水素原子を示し、Ｒ２が基（Ｇ）を示す、項１に記載のスフィンゴシン化合物又はその塩。
項４．  一般式（２）【００１３】
【化３】
2008111450.tif 000005
【００１４】
［式中、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表される化合物にスズオキシド化合物を反応させ、次いで生成する化合物に一般式（３）【００１５】
【化４】
2008111450.tif 000006
【００１６】
[式中、ｎは、０又は１を示す。Ｘは、ハロゲン原子を示す。]
で表されるビピリジル化合物を反応させることにより、一般式（１）【００１７】
【化５】
2008111450.tif 000007
【００１８】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が基（Ｇ）【００１９】
【化６】
2008111450.tif 000008
【００２０】
を示す。ｎは、０又は１を示す。Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表されるスフィンゴシン化合物又はその塩を製造する方法。
項５．  一般式（１）【００２１】
【化７】
2008111450.tif 000009
【００２２】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が基（Ｇ）【００２３】
【化８】
2008111450.tif 000010
【００２４】
を示す。ｎは、０又は１を示す。Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−２３アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキルオキシ基、フェニル基又はフリル基を示す。］
で表されるスフィンゴシン化合物又はその塩を含有するスフィンゴミエリナーゼ阻害剤。【００２５】
本発明のスフィンゴシン化合物は、一般式（１）【００２６】
【化９】
2008111450.tif 000011
【００２７】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、前記に同じ。］
で表される。【００２８】
一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２は、一方が水素原子、他方が置換基（Ｇ）【００２９】
【化１０】
2008111450.tif 000012
【００３０】
［ｎは、０又は１を示す。］
である。【００３１】
一般式（１）で表されるスフィンゴシン化合物には、下記一般式（１Ａ）及び（１Ｂ）で表されるスフィンゴシン化合物が包含される。【００３２】
【化１１】
2008111450.tif 000013
【００３３】
［式中、ｎ及びＲ３は、前記に同じ。］
一般式（１Ａ）及び（１Ｂ）において、ｎが０である化合物が好ましい。【００３４】
また、一般式（１Ａ）で表されるスフィンゴシン化合物が好ましい。【００３５】
一般式（１）において、Ｒ３で示されるＣ１−２３アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘニコシル基、ドコシル基、トリコシル基等の炭素数１〜２３の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を挙げることができる。【００３６】
一般式（１）において、Ｒ３で示されるＣ３−８シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等の炭素数３〜８のシクロアルキル基が挙げられる。【００３７】
一般式（１）において、Ｒ３で示されるＣ２−６アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、３−メチル−２−ブテニル基、１−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、５−ヘキセニル基等の炭素数２〜６の直鎖状又は分枝鎖状のアルケニル基が挙げられる。【００３８】
一般式（１）において、Ｒ３で示されるＣ１−６アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基等の炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。【００３９】
一般式（１）において、Ｒ３で示されるＣ３−８シクロアルキルオキシ基としては、例えば、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘプチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基等の炭素数３〜８のシクロアルキルオキシ基が挙げられる。【００４０】
Ｒ３の中でも、Ｃ１−２３アルキル基が好ましい。Ｃ１−２３アルキル基としては、炭素数１〜１１の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基（Ｃ１−１１アルキル基）が好ましく、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基等の炭素数２〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基（Ｃ２−５アルキル基）がより好ましく、炭素数５のアルキル基（Ｃ５アルキル基）が特に好ましい。【００４１】
本発明のスフィンゴシン化合物（１）は、酸と塩を形成してもよい。【００４２】
塩は、薬学的に許容されるものであれば、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸又は酢酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩を挙げることができる。【００４３】
本発明のスフィンゴシン化合物（１）は、例えば下記反応式−１で示される工程によって製造することができる。【００４４】
【化１２】
2008111450.tif 000014
【００４５】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎ及びＸは、前記に同じ。］
反応式−１に示すように、本発明の化合物（１）は、適当な溶媒中、一般式（２）で表される化合物にスズオキシド化合物を反応させ、次いで得られる化合物に一般式（３）で表されるビピリジル化合物を反応させることにより、製造することができる。【００４６】
即ち、本反応は、化合物（２）にスズオキシド化合物を反応させる第１工程と、第１工程の後に、化合物（３）を反応させる第２工程とからなる。【００４７】
本反応の第１工程及び第２工程で使用する溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない限り公知の溶媒を広く使用でき、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素；ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の脂肪族炭化水素；ジクロロメタン、１,２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル等のエーテル；アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル；Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド（ＨＭＰＡ）等のアミド；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド；またはこれらの混合溶媒を挙げることができる。【００４８】
これらの中でも、本反応の第１工程で使用する溶媒としては、メタノール等のアルコールが好ましく、第２工程で使用する溶媒としては、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミドが好ましい。【００４９】
第１工程で使用するスズオキシド化合物としては、例えば、一般式（４）
（Ｒ４）２ＳｎＯ    （４）
［式中、Ｒ４は、アルキル基、シクロアルキル基又はフェニル基を示す。］
で表されるスズオキシド化合物、一般式（５）
（Ｒ４）２Ｓｎ（ＯＲ５）２    （５）
［式中、Ｒ５は、アルキル基、シクロアルキル基又はフェニル基を示す。Ｒ４は、前記に同じ。］
で表されるスズオキシド化合物等を挙げることができる。【００５０】
Ｒ４及びＲ５で示されるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−アミル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ラウリル基、ステアリル基等が挙げられる。【００５１】
Ｒ４及びＲ５で示されるシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等の炭素数３〜８のシクロアルキル基が挙げられる。【００５２】
一般式（４）で表されるスズオキシド化合物の具体例を示すと、例えば、ジメチルスズオキシド（（ＣＨ３）２ＳｎＯ）、ジエチルスズオキシド（（Ｃ２Ｈ５）２ＳｎＯ）、ジブチルスズオキシド（（Ｃ４Ｈ９）2ＳｎＯ）、ジオクチルスズオキシド（（Ｃ８Ｈ１７）２ＳｎＯ）、ジフェニルスズオキシド（（Ｃ６Ｈ５）２ＳｎＯ）等を挙げることができ、これらの中でも、ジメチルスズオキシド、ジブチルスズオキシド及びジオクチルスズオキシドが好ましい。【００５３】
また、一般式（５）で表されるスズオキシド化合物の具体例を示すと、例えば、ジブチルスズジメトキシド（（Ｃ４Ｈ９）2Ｓｎ（ＯＣＨ３）２）等を挙げることができる。【００５４】
これらのスズオキシド化合物は、商業的に容易に入手できるか、従来公知の方法に従って製造することができる。【００５５】
スズオキシド化合物の使用量は、化学理論量であれば特に制限されないが、化合物（２）１モルに対して、通常、１〜３モル程度、好ましくは１．1〜２モル程度である。【００５６】
反応温度は、特に限定されないが、通常、−１０℃から使用する溶媒の沸点温度以下の範囲内とすればよく、好ましくは２０〜１００℃程度、更に好ましくは４０〜８０℃程度とすればよい。また、反応時間は、原料化合物の種類及びその使用量、反応温度等の条件によって異なるが、通常０．５〜３時間程度、好ましくは１〜２時間程度である。【００５７】
第１工程において、化合物（２）にスズオキシド化合物を反応させると、下記一般式（６）【００５８】
【化１３】
2008111450.tif 000015
【００５９】
[式中、Ｒ３及びＲ４は、前記に同じ。]
で表されるスタンレニン化合物が生成する。【００６０】
得られたスタンレニン化合物（６）は、単離精製して次工程に使用してもよいし、単離精製せずに次工程に使用することもできる。【００６１】
また、第１工程で得られた反応液の溶媒を濃縮又は留去し、新たに適宜選択した溶媒を加えて、次工程に供してもよい。【００６２】
第２工程においては、反応系内にハロゲンイオンを存在させるのが好ましい。このためには、反応系内にハロゲン化物を供給すればよい。【００６３】
ハロゲン化物としては、例えば、テトラブチルアンモニウムフルオリド、テトラブチルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムブロミド、テトラブチルアンモニウムヨーダイド等のテトラアルキルアンモニウムハライド、フッ化セシウム等を挙げることができる。これらの中でもテトラブチルアンモニウムフルオリド及びフッ化セシウムが好ましい。【００６４】
ハロゲン化物の使用量は、特に限定されず広い範囲から適宜選択される。化合物（２）１モルに対して、ハロゲン化物を通常、１〜５モル、好ましくは１．１〜２モル使用する。【００６５】
化合物（３）の使用量は、特に限定されず広い範囲から適宜選択される。化合物（２）１モルに対して、化合物（３）を通常０．８〜３モル、好ましくは１．０〜２．５モル、更に好ましくは１．1〜１．５モル使用する。【００６６】
反応温度は特に限定されないが、通常、−１０℃から使用する溶媒の沸点温度以下の範囲内とすればよく、好ましくは１０〜４０℃程度、さらに好ましくは２０〜３０℃程度とすればよい。また、反応時間は、原料化合物の種類及びその使用量、反応温度等の条件によって異なるが、通常２４時間以内、好ましくは６〜１２時間程度である。【００６７】
斯くして得られる化合物（１）は、通常の単離、精製手段、例えば、カラムクロマトグラフィー、再結晶等により反応混合物から容易に単離し、精製することができる。【００６８】
本反応においては、化合物（１）は、化合物（１Ａ）及び化合物（１Ｂ）の混合物として生成するが、ＨＰＬＣ等の通常の分離手段によって、これらを容易に単離生成することができる。その結果、本反応においては、化合物（１Ｂ）に対して化合物（１Ａ）が４倍程度生成する。 【００６９】
反応式−１において用いられる原料化合物（２）は、公知の方法に従って容易に製造される。【００７０】
例えば、原料化合物（２）は、下記反応式−２に示す工程に従って製造することができる。【００７１】
【化１４】
2008111450.tif 000016
【００７２】
［式中、Ｒ３は、前記に同じ。Ｙはハロゲン原子を示す。］
反応式−２に示すように、化合物（２）は、公知の一般式（７）で表されるスフィンゴシンに公知の一般式（８）で表されるカルボニルハライド化合物を反応させることにより、製造される。反応条件は、通常のカルボニルハライドとアミノ化合物との反応によりアミド化合物を得る方法に従えばよい。本反応に使用される試薬、溶媒、反応温度、反応時間等の反応条件の具体例を、後記の実施例に示す。【００７３】
また、反応式−１において用いられる原料化合物（３）は、公知の方法に従って容易に製造される。【００７４】
例えば、原料化合物（３）は、下記反応式−３に示す工程に従って製造することができる。【００７５】
【化１５】
2008111450.tif 000017
【００７６】
[式中、ｎ及びＸは、前記に同じ。]
反応式−３に示すように、化合物（３）は、公知の化合物（９）にＮ−ブロモスクシンイミド等のハロゲン化剤を反応させた後、過剰に置換したハロゲンを脱離させる目的で還元剤を反応させることにより、製造される。反応条件は、通常の芳香族置換メチル基をハロゲン化させる方法に従えばよい。本反応に使用される試薬、溶媒、反応温度、反応時間等の反応条件の具体例を、後記の参考例に示す。【００７７】
本発明の化合物（１）は、後記の試験例で明らかなように、優れたスフィンゴミエリナーゼ阻害活性を有する。従って、化合物（１）は、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤として有用であり、脳出血や脳梗塞等の脳血管障害、頭部外傷、パーキンソン氏病、老人性痴呆、アルツハイマー病等に代表される老年性認知症等の脳神経変性疾患、糖尿病、肥満、動脈硬化、炎症性疾患、免疫性疾患、ガン、腎疾患及び心疾患に対する予防薬及び／又は治療薬として有用である。【００７８】
本発明は、一般式（１）で表されるスフィンゴシン化合物を有効成分とするスフィンゴミエリナーゼ阻害剤（以下、「製剤」ともいう）を提供する。【００７９】
本発明の製剤は、化合物（１）だけからなるものであってもよいし、任意の担体や添加剤と組み合わせて、従来公知の方法で所望の用途に適した形態に調製した組成物であってもよい。また、一般式（１Ａ）又は（１Ｂ）で表される化合物の１種からなるものであってもよいし、化合物（１Ａ）及び（１Ｂ）の混合物であってもよい。また、本発明の製剤は、任意の担体や添加剤と組み合わせて、従来公知の方法で所望の用途に適した形態に調製した組成物であってもよい。【００８０】
本発明の製剤の形態は、特に制限されないが、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤、粉末シロップ剤およびカプセル剤（硬カプセルおよび軟カプセル）等の固体状の製剤；クリーム、軟膏およびジェル等のペースト状またはゲル状の製剤；液剤、懸濁剤、乳液剤、シロップ、エリキシル剤等の液体状の製剤等とすることができる。【００８１】
本発明の製剤中スフィンゴシン化合物（１）の配合量は、スフィンゴミエリナーゼ阻害効果を発揮する割合で含むものであれば特に制限されず、製剤１００重量％中、０．００１〜９９重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％の範囲で適宜設定することができる。【００８２】
当該製剤は、化合物（１）を、スフィンゴミエリナーゼ阻害効果を発揮する割合で含むものであればよく、この効果を妨げない範囲で他成分を配合することもできる。かかる他成分としては、薬理学的及び製剤学的に許容されるものであれば制限されないが、例えば賦形剤、結合剤、分散剤、増粘剤、滑沢剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤等の一般に製剤の製造に使用される担体のほか、抗生物質、抗菌剤、殺菌剤、防腐剤、ビルダー、漂白剤、酵素、キレート剤、消泡剤、着色料（染料、顔料等）、柔軟剤、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、香料、矯味剤、矯臭剤、溶媒等が挙げられる。【００８３】
本製剤の使用方法は、本製剤を経口投与、点滴、注射等により体内に摂取させる方法や、患部への局所的な施用等とすることができる。【００８４】
本発明の製剤の使用量は、剤形や投与（使用）方法等によって異なるため、一概に規定することはできないが、例えば、適当な1日の投与量は、スフィンゴシン化合物（１）の投与量に換算して、通常、成人１Ｋｇ当たり１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ程度の範囲で、患者の年齢、症状に応じて適宜設定することができ、これらの製剤は、１日１〜数回に分けてするのがよい。
【発明の効果】
【００８５】
本発明のスフィンゴシン化合物は、スフィンゴミエリナーゼに対する阻害活性を有するので、脳出血や脳梗塞等の脳血管障害、頭部外傷、パーキンソン氏病、老人性痴呆、アルツハイマー病等に代表される老年性認知症等の脳神経変性疾患、糖尿病、肥満、動脈硬化、炎症性疾患、免疫性疾患、ガン、腎疾患及び心疾患に対する予防薬又は治療薬として好適に使用できる。【００８６】
本発明の製造方法によれば、上記優れたスフィンゴミエリナーゼに対する阻害活性効果を有する新規なスフィンゴシン化合物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
実施例
以下に、参考例、本発明のスフィンゴシン化合物（１）の製造例及び試験例を挙げて、本発明を一層明らかにするが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の反応式において、Ｍｅはメチル基を意味する。【００８８】
参考例１（原料化合物（７）の合成）
原料化合物（７）は、市販品を購入することも可能であるが、例えば以下の既知の方法により合成可能である。【００８９】
（１）参考例１−１【００９０】
【化１６】
2008111450.tif 000018
【００９１】
市販のＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−セリンメチルエステル（2.0 g, 9.122 mmol）、２，２−ジメトキシプロパン（1.9 g，18.24 mmol）及びピリニジウム−ｐ−トルエンスルホネート（26 mg, 137 μmol）をベンゼン（29 ml）に溶解し、１５時間加熱還流した。この反応液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジエチルエーテルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、濾液を濃縮した。得られた濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、３−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−メチル  ２，２−ジメチルオキサゾリジン−３，４−ジカルボキシレート（3-tert-butyl 4-methyl 2,2-dimethyloxazolidine-3,4-dicarboxylate）（2.78 g, 収率91%）を得た。
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）)2979, 1760, 1737, 1713, 1390 cm-1
HRMS (CI) C12H22NO5 (M+H+)としての計算値 260.1498, 実測値 260.1495。【００９２】
（２）参考例１−２【００９３】
【化１７】
2008111450.tif 000019
【００９４】
上記反応により得られた３−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−メチル  ２，２−ジメチルオキサゾリジン−３，４−ジカルボキシレート（6.42 g, 24.97 mmol）をトルエン（50 ml）に溶解し、−７８℃に冷却後、水素化ジイソブチルアルミニウムのトルエン溶液（0.93 M）を徐々に滴下した。３０分後、混合物にメタノールを加えて反応を停止させ、さらに１０％酒石酸ナトリウムカリウム水溶液（150 ml）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濃縮し、得られた濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、ｔｅｒｔ−ブチル  ４−ホルミル−２，２−ジメチルオキサゾリジン−３−カルボキシレート（tert-butyl 4-formyl-2,2-dimethyloxazolidine-3-carboxylate）（4.22g, 収率74％）を得た。
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）)3449, 2978, 1737, 1694, 1366, 1258, 1172 cm-1
HRMS (CI) C11H20NO4 (M+H+)としての計算値 230.1392, 実測値 230.1390。【００９５】
（３）参考例１−３【００９６】
【化１８】
2008111450.tif 000020
【００９７】
１−ペンタデシン（1.7 g, 8.17 mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（7.5 ml）に溶解し、0℃に冷却した。この溶液に、ｎ−ブチルリチウムのｎ−ヘキサン溶液（7.6 ml, 7.85 mmol）をゆっくりと滴下した。９０分間撹拌した後、−４０℃下、上記反応で得られたｔｅｒｔ−ブチル  ４−ホルミル−２，２−ジメチルオキサゾリジン−３−カルボキシレート（tert-butyl 4-formyl-2,2-dimethyloxazolidine-3-carboxylate）（1.0 g, 4.36 mmol）のＴＨＦ溶液（75ml）を加え、さらに２０分間撹拌した。得られた混合液に、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させた後、ジエチルエーテルを用いて抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄して、乾燥後、濃縮した。濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（（Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−ヘキサデシニル）−２，２−ジメチルオキサゾリジン−３−カルボキシレート（(S)-tert-butyl 4-((R)-1-hydroxy-2-hexadecynyl)-2,2-dimethyloxazolidine-3-carboxylate）（1.2 g,収率49%）を得た。【００９８】
（４）参考例１−４【００９９】
【化１９】
2008111450.tif 000021
【０１００】
上記反応で得られた（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（（Ｒ）−１−ヒドロキシ-２-ヘキサデシニル）−２，２−ジメチルオキサゾリジン−３−カルボキシレート （100 mg, 0.23 mmol）をメタノール（4.4 ml)）に溶解し、p-トルエンスルホン酸（0.8mg, 4.6 μmol）を加え、室温で１２時間撹拌した。この反応液にｐ−トルエンスルホン酸（0.8mg, 4.6 μmol）を加えた後、６時間撹拌後、６０℃に昇温し、さらに２時間撹拌した。この反応液に飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応を停止させた後、酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥濾過した。得られた濾液をカラムクロマトグラフィーで精製することにより、ｔｅｒｔ−ブチル （２Ｓ，３Ｒ）−１，３−ジヒドロキシオクタデシ−４−イン−２−イルカルバメート（tert-butyl (2S,3R)-1,3-dihydroxyoctadec-4-yn-2-ylcarbamate）（85 mg, 収率93%）を得た。
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）) 3449, 2926, 2854, 1703, 1458, 1394, 1366 cm-1
HRMS (FAB) C23H43NO4Na (M+Na+)としての計算値 420.3089, 実測値 420.3058。【０１０１】
（５）参考例１−５【０１０２】
【化２０】
2008111450.tif 000022
【０１０３】
上記反応で得られたｔｅｒｔ−ブチル （２Ｓ，３Ｒ）−１，３−ジヒドロキシオクタデシ−４−イン−２−イルカルバメート（85 mg, 0.21 mmol）をＴＨＦ （21 ml）に溶解し、０℃に冷却した後、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム（Red-Al）の６５％トルエン溶液（258 μl，0.850 mmol）を滴下した。得られた混合液を室温に昇温し、２．５時間撹拌した。次いで１Ｍの塩酸を加えて反応を停止させた後、ジエチルエーテルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルスフィンゴシン（52 mg, 64%）を得た。
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）) 3370, 2924, 2853, 1689, 1508, 1170 cm-1
HRMS (CI) C23H46NO4 (M+H+)としての計算値 400.3427, 実測値 400.3433。【０１０４】
（６）参考例１−６【０１０５】
【化２１】
2008111450.tif 000023
【０１０６】
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルスフィンゴシン（100 mg, 0.25 mmol）を６Ｍ塩酸／ＴＨＦ（１：５）に溶解し、室温で、２時間撹拌した。得られた混合液を５０℃に昇温し、１６時間撹拌した。１０％水酸化ナトリウム水溶液で中和後、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた粗結晶をn-ヘキサンを用いて再結晶し、原料化合物（７）（74 mg, 収率98%）を得た。【０１０７】
原料化合物（７）の物性：
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）) 3352, 2921, 2951, 1614, 1472, 1383 cm-1
HRMS (CI) C18H38NO2 (M+H+)としての計算値 300.2902, 実測値 300.2903。【０１０８】
参考例２
化合物（３）の合成例
（１）参考例２−１【０１０９】
【化２２】
2008111450.tif 000024
【０１１０】
市販の６−メチル−２，２’−ビピリジン（200mg, 1.17 mmol）を四塩化炭素に溶解し、Ｎ−ブロモスクシンイミド（1.4 g, 5.85mmol）及び２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（13.5 mg, 82.32 μmol）を加え、１２時間加熱還流した。室温に冷却後、飽和食塩水を加え、得られた混合液をジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、６−トリブロモメチル−２，２’−ビピリジンを無色の結晶として定量的に得た。この６−トリブロモメチル−２，２’−ビピリジンを用いて次の還元反応を行った。【０１１１】
（２）参考例２−２【０１１２】
【化２３】
2008111450.tif 000025
【０１１３】
６−トリブロモメチル−２，２’−ビピリジン（205 mg，503.8 μmol）をジクロロメタン（5 ml）に溶解し、−７８℃に冷却後、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）のジクロロメタン溶液（0.97 M, 1.5 ml）を滴下した。ＴＬＣで原料の消失を確認した後、メタノールを加えて反応を停止させた。反応液を０℃に昇温した後、１０％酒石酸ナトリウムカリウム水溶液を添加した。得られた混合液をジエチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物（３−１）（６−ブロモメチル−２，２’−ビピリジン）（54 mg，収率54%）を得た。【０１１４】
化合物（３−１）の物性：
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4.63(s, 2H), 7.27-7.33 (ddd, J = 7.8, 4.6, 1.0 Hz, 1H), 7.45(dt, J = 7.8, 1.0 Hz, 1H), 7.80 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.31 (dd, J = 7.8, 1.0 Hz, 1H), 8.45 (dt, J = 7.8, 1.0 Hz, 1H), 8.67 (m, 1H)
13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 34.14, 120.22, 121.32, 123.35, 123.85, 136.89, 137.89, 149.13, 155.66, 155.88, 156.20 cm-1
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）) 3024, 2924, 2853, 1581, 1492, 1454,1429 cm-1
HRMS (CI) C11H9N2Br (M+)としての計算値 247.9949, 実測値 247.9967。【０１１５】
製造例１ 
スフィンゴシン化合物（１）の製造例
（１）製造例１−１【０１１６】
【化２４】
2008111450.tif 000026
【０１１７】
原料化合物（７）（97 mg, 326 μmol）、４−ジメチルアミノピリジン（1 mg）及びトリエチルアミン（10 μl）をジクロロメタン（3 ml）に溶解し、０℃に冷却後、塩化へキサノイルのジクロロメタン溶液（40 mg, 297 μmol, CH2Cl2 3 ml）を加えた。１０分後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、セラミドを得た。（67 mg, 57%）。【０１１８】
セラミドの物性：
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 0.88 (t, J = 6.2 Hz, 3H), 0.90 (t, J = 6.2 Hz, 3H),1.22-1.40 (m, 28H), 1.63 (m, 2H), 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.60-3.73 (m, 2H), 3.88-3.92 (m, 2H), 4.27 (m, 1H), 5.50 (dd, J = 6.4, 15.4 Hz, 1H), 5.76 (t, J = 6.6, 15.4 Hz, 1H), 6.47 (br d, J = 7.4 Hz, 1H)
13C NMR (50 MHz, CDCl3)δ 13.86q, 14.10q, 22.33t, 22.61t, 25.39t, 29.14t, 29.22t, 29.29t, 29.46t, 29.59t(2C), 29.64t (3C), 31.37t, 31.86t, 32.27t, 36.68t, 54.63d, 62.21t, 74.07d, 128.85d, 133.87d, 174.08s
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）) 3297, 2920, 3251, 1645, 1542 cm-1
HRMS (FAB) C24H47N1O3Na (M+Na+)としての計算値 420.3454, 実測値 420.3437。【０１１９】
（２）製造例１−２【０１２０】
【化２５】
2008111450.tif 000027
【０１２１】
セラミド（67 mg, 168.5 μmol）をメタノール（1.7 ml）に溶解し、ジブチルチンオキサイド（42.4 mg, 170.2 μmol）を加え1時間加熱還流した。室温に冷却後、メタノールを減圧下に留去し、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（1.9 ml）を加え、さらに化合物（３−１）（46 mg, 185 μmol）及びテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド（1M THF, 185 μl）を加え、室温下２４時間撹拌した。この反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）の混合物として得た（27.5 mg,収率29%）。この混合物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ＯＤＳ,メタノール：水＝１０：１)で精製し、化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）をそれぞれ４：１の比率で得た。【０１２２】
化合物（１ａ）の物性：
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 0.87 (t, J = 6.2 Hz, 6H), 1.25-1.32 (m, 24H), 1.58 (m, 2H), 1.99 (m, 2H), 2.18 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 3.73 (m, 1H), 3.78 (dd, J= 9.6, 3.8 Hz, 1H), 3.94 (dd, J = 9.6, 3.8 Hz, 1H), 4.11 (m, 1H), 4.14 (m, 1H), 4.65 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 4.74 (d, J= 12.8 Hz, 1H), 5.49 (dd, J = 15.4, 5.2 Hz, 1H), 5.73 (dt, J = 15.4, 6.8 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.31 (m, 2H), 7.83 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.67 (br d, J = 4.6 Hz, 1H)
13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 13.94, 14.13, 22.40, 22.70, 25.44, 29.22(C2), 29.22, 29.37, 29.51-29.70 (5C), 31.43, 31.94, 32.29, 36.80, 52.93, 70.67, 74.27, 74.37, 120.24, 121.26, 121.48, 123.85, 129.19, 133.41, 136.97, 137.61, 149.24, 155.90，156.04, 156,93, 173.36
FTIR (拡散反射法（diffuse reflectance）) 3279, 2954, 2919, 2851, 1635, 1546 , 1430 cm-1
HRMS (CI) C35H56N3O3(M+H+) としての計算値 566.4321, 実測値 566.4321。【０１２３】
化合物（１ｂ）の物性:
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.85(t, J = 6.6 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 1.24-1.36(m, 24H), 1.55 (m, 2H), 2.07(m, 4H), 3.61(m, 2H), 4.01(m, 1H), 4.09(m, 2H), 4.54(d, J = 13.2 Hz, 1H), 4.80(d, J = 13.2 Hz, 1H), 5.47(dd, J = 7.8, 15.6 Hz, 1H), 5.80(dt, J = 6.6, 15.6 Hz, 1H), 6.31(d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.27-7.34(m, 2H), 7.82(m, 2H), 8.27(d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.36 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.67(br d, J = 5.1 Hz, 1H)
13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 13.90, 14.13, 22.38, 22.70, 25.36, 29.11, 29.23, 29.37, 29.49, 29.70(5C), 31.39, 31.93, 32.35, 36.75, 53.80, 62.20, 71.18, 82.43, 120.29, 121.32, 121.66, 123.88, 126.22, 137.02, 137.37, 137.63, 149.30, 155.92, 156.15, 157.51, 173.67
HRMS (FAB) C35H55N3O3Na (M+Na+) としての計算値588.4141, 実測値 588.4160。【０１２４】
試験例１（阻害効果の測定）
０．２Ｍトリス−バッファー（ｐＨ７．５ ）（ＴＢ）の調製
トリス［nacalai  Code:35434-34］24.2 gを蒸留水（ＤＷ）1000 mlで溶解し、塩酸でｐＨ７．５に調製した。【０１２５】
トリス−バッファ−生理食塩水（ＴＢＳ）の調整
ＴＢ 100 mlに塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）9 g加え、ＤＷで全量1000 mlにした。【０１２６】
ゼラチン−トリス−バッファ−生理食塩水（ＧＴＢＳ）の調製
0.2 M ＴＢ(pH7.5) 50 mlにＮａＣｌ 4.5 g及びゼラチン［Merck Code:1.04078.0500］1.25 gを加え、ＤＷで全量500 mlにした。【０１２７】
ヒツジ赤血球の洗浄
ヒツジ保存血：［日本バイオテスト社製,  Code: 0101-1］
ヒツジ保存血 1.0 mlを、ＴＢＳに懸濁した後、2500 rpm、３分間遠心し、上清を除去した。同様の遠心操作を合計３回行った後、沈渣をＴＢＳ 1.5 mlに懸濁して洗浄赤血球溶液とした。【０１２８】
スフィンゴミエリン−リポソーム（ＳＭ−リポソーム）の調製
スフィンゴミエリン（ＳＭ）、コレステロール及びＣＦ溶液は、以下のものを使用した。
ＳＭ：Sphingomyelin from Bovin Brain Code: 32156-74
コレステロール（Cholesterol）：nakarai Code: 08721-75
ＣＦ溶液：5(6)-carbosyfluorescein、SIGMA C8166、FW=460.4
ＣＦ（27mg/3ml, ＤＷ）に１Ｎ  水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）約100 μl を加えてＣＦ溶液を調製した。この時、ＮａＯＨをｐＨ試験紙でｐＨ７〜８になるように加えた。【０１２９】
リポソーム作成法
スフィンゴミエリン（ＳＭ）2 mgをクロロホルム（ＣＨＣｌ３）及びメタノール（ＭｅＯＨ）の混合溶媒（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２：１）160 μlで溶解したものを59 μlと、コレステロール 19.3 mgをＣＨＣｌ３ 1 mlで溶解したもの20 μlとを混合し、ＣＨＣｌ３及びＭｅＯＨを窒素で留去しながらガラス試験管の底に均一に広げ、デシケーターで３０分間乾燥させた。ＣＦ溶液を５５℃で温め、ＣＦ溶液80 μlを溶媒留去したＳＭに撹拌しながら加え（CholesterolとＣＦ溶液のモル比は、１：１）、３０秒間隔で５５℃の水浴、撹拌を繰り返し３回行った。ＴＢＳを適量加え、15,000 rpm、４℃で２０分間遠心し、上清を除き、ＴＢＳ300μlで縣濁したものをリポソームとして使用した。【０１３０】
実験１：  Bacillus cereus-SMaseの溶血活性に対する化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）の影響
(i)  化合物（１ａ）の溶解液
化合物（１ａ）をＭｅＯＨで溶解し、1.7 mM及び17 mM濃度に調整した。
(ii)  化合物（１ｂ）の溶解液
化合物（１ｂ）をＭｅＯＨで溶解し、1.7 mM及び17 mM濃度に調整した。
［方法］30 ng/ml Bacillus cereus-SMaseと上記各濃度の化合物（１ａ）溶解液又は化合物（１ｂ）縣濁液を加え、ＧＴＢＳ（ｐＨ５．５）で全量240 μlにし、３７℃下で１０分間の前処理後、この反応液に洗浄ヒツジ赤血球（6×1011個/ml）60 μlを添加し、３７℃下、３０分間インキュベーションした。次に、４℃で１０分間氷冷後、ＴＢＳを加え、2500 rpmで３分間遠心し、その上清を９６穴マイクロプレートに分取して、吸光度（Ｏ．Ｄ．550）を測定（コロナ電気社製：MTP32マイクロプレートリーダー）した。【０１３１】
表１. Bacillus cereus-SMaseのヒツジ赤血球溶血作用に対する化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）の影響【０１３２】
【表１】
2008111450.tif 000028
【０１３３】
表1に示すとおり、化合物（１ａ）の溶解液の濃度を、それぞれ１、５、１０及び１００μＭと大きくすると、スフィンゴミエリナーゼ活性は、濃度依存的に阻害され、１００μＭ添加条件下では、約３０％まで阻害された。一方、化合物（１ｂ）は、化合物（１ａ）ほど阻害効果を示さなかった。【０１３４】
実験２：  Bacillus cereus-SMaseのＳＭ-リポソーム分解活性に対する化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）の影響
(i)  化合物（１ａ）の溶解液
化合物（１ａ）をＭｅＯＨで溶解し、1.7 mM及び17 mM濃度に調整した。
(ii)  化合物（１ｂ）の溶解液
化合物（１ｂ）をＭｅＯＨで溶解し、1.7 mM及び17 mM濃度に調整した。
［方法］Bc-SMase（50 ng/ml）と上記各濃度の化合物（１ａ）溶解液又は化合物（１ｂ）溶解液を加え、ＧＴＢＳ（ｐＨ５．５）で全量180 μlにし、３７℃下、１０分間の前処理後、この反応液にＳＭ-リポソーム 20 μlを添加し、３７℃下、３０分間インキュベーションした。この反応液を蛍光測定装置(コロナ電気社製：MTP32マイクロプレートリーダー) (Ex490,Em530)で測定した。【０１３５】
表２. Bacillus cereus-SMaseのＳＭ-リポソーム分解活性に対する化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）の影響【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
表２に示すとおり、化合物（１ａ）の溶解液の濃度を、それぞれ１、５、１０及び１００μＭと大きくすると、スフィンゴミエリナーゼ活性は、濃度依存的に阻害され、１００μＭ添加条件下では、ほぼ完全に阻害された。一方、化合物（１ｂ）は、化合物（１ａ）ほど阻害効果を示さなかった。【０１３８】
実験３：Bacillus cereus-SMaseの14C-スフィンゴミエリン（14C-sphingomyelin）分解活性に対する化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）の影響
(i)  化合物（１ａ）の溶解液
化合物（１ａ）をＭｅＯＨで溶解し、1.7 mM及び17 mM濃度に調整した。
(ii)  化合物（１ｂ）の溶解液
化合物（１ｂ）をＭｅＯＨで溶解し、1.7 mM及び17 mM濃度に調整した。
(iii)  ＴＸ−バッファーの調製
0.5 gのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を100 ml の0.02M ＴＢで溶解した。
［方法］  Bacillus cereus-SMase30 ng/mlと上記各濃度の化合物（１ａ）溶解液又は化合物（１ｂ）溶解液を加え、ＴＸ−バッファー（ｐＨ５．５）で全量200 μlにし、３７℃下、１０分間の前処理後、この反応液に14C-sphingomyelin 10 μlを添加し、３７℃下、３０分間インキュベーションした。この反応液に反応停止溶媒（stop solution (ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：２)） 600 μlを加え、３０秒間の撹拌を２回行い、2000 rpmで２０分間遠心後、上層を液体シンチレーションカウンターで測定した。【０１３９】
表３. Bacillus cereus-SMaseの14C-スフィンゴミエリン（14C-sphingomyelin）分解活性に対する化合物（１ａ）及び化合物（１ｂ）の影響【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
表３に示すとおり、化合物（１ａ）の溶解液の濃度を、それぞれ１、５、１０及び１００μＭと大きくすると、スフィンゴミエリナーゼ活性は、濃度依存的に阻害され、１００μＭ添加条件下では、約２５％まで阻害された。一方、化合物（１ｂ）は、化合物（１ａ）ほど阻害効果を示さなかった。
【国際調査報告】
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