【手続補正書】
【提出日】平成17年3月14日(2005.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼのペプチド鎖は由来する野生型ＲＮＡポリメラーゼに比して少なくとも一つのアミノ酸の置換又は欠失又は付加により改変されており、この改変は、対象のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に含まれるＩＴＳへの該ＲＮＡポリメラーゼの感受性を減少させる効力を有し、対象の該ＲＮＡ又はこのＲＮＡにコードされるたんぱく質の生産の方法の実施のために、対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列から始まり、この転写は、上記野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御下にあり、該方法は、対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に含まれるものと同じ非共通のＩＴＳ存在下で野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用場合に得られる収量より多い該ＲＮＡ生産収量を有する、ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項２】
対象のＲＮＡの収量が、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合に得られる収量のおおよそ１０倍まで多い、対象のＲＮＡの生産方法の実施のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
野生型ファージ単量体ポリメラーゼ由来、特にＴ７、Ｔ３、Ｋ１１、ＳＰ６のようなバクテリオファージの単量体ＲＮＡポリメラーゼ由来の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
１位とおおよそ４１０位間又はおおよそ９０位と３２０位間又は１１５位と３００位間に位置する少なくとも一つのアミノ酸が置換又は欠失で改変されている野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導される請求項１から３のいずれか１項記載の変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項５】
以下から選択される変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から４のいずれか１項記載の使用：
−野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの２６６位に位置するプロリン又はＴ３の２６７位、Ｋ１１の２８９位、ＳＰ６の２３９位に位置するプロリンようなバクテリオファージ野生型ＲＮＡポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンに代えて２６６位にロイシンを含むもの、
−及び／又は、上記のプロリン周辺に位置し、すなわち対象のプロリンからおおよそ１０オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置する少なくとも１つアミノ酸が置換又は欠失で改変されたもの。
【請求項６】
以下の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から５のいずれか１項記載の使用：
＊野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−バリン（Ｖ）による１１７位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−バリン（Ｖ）による１１９位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−アラニン（Ａ）による１３４位のバリン（Ｖ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による１４７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−アルギニン（Ｒ）による２３０位のヒスチジン（Ｈ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６６位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９１位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１４８位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６７位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９２位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６４０位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１１位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１６７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２８９位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による３１４位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６６２位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８３３位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１１７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２３９位のプロリン（Ｐ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３１位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８０４位のイソロイシン（Ｉ）の置換。
【請求項７】
次の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から６のいずれか１項記載の使用：
−プロリンに代えて２６６位のロイシンを含む配列番号２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１７位のバリン、及びバリンに代えて１３４位のアラニンを含む配列番号４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギンを含む配列番号６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて２３０位のアルギニン、及びアルギニンに代えて２９１位のシステインを含む配列番号８で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びチロシンに代えて６３９位のフェニルアラニンを含む配列番号１０で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、アスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼを調製するための方法であって、対象のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、転写が由来する野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下におかれる所定のヌクレオチド配列転写活性が、野生型ＲＮＡポリメラーゼによるこの所定の配列の転写活性より高いものであって、特に該所定のヌクレオチド配列からの対象のＲＮＡ生産のための方法の実施の適用範囲内では該野生型ＲＮＡポリメラーゼよりおおよそ４０倍までの活性である変異型ＲＮＡポリメラーゼを調製するための方法であって、
該方法は：
−該野生型ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコドンの置換又は欠失又は付加によるファージ起源の野生型ＲＮＡポリメラーゼのペプチド鎖の改変及び上記の改変遺伝子を含むベクターによる大腸菌のような適当な細胞の形質転換の工程、
−大腸菌のような適当な細胞内、特に前述の細胞内での特定のマーカーの生産収量が同じ条件下で野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用で得られるこの同じマーカーの生産収量より多い上述の変異型ＲＮＡポリメラーゼを生産する細胞を検出する工程であって、特定のマーカーが、上記のＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの下流に挿入されるヌクレオチド配列によりコードされる色原性マーカー又は抗生物質耐性マーカーのようなマーカーであり、このマーカーをコードする配列及びプロモーターは野生型ＲＮＡポリメラーゼの活性に影響を及ぼすことが知られる最初のおおよそ６から１２ヌクレオチドの性質によるＩＴＳにより分離されている工程、
−前工程で検出された細胞からの上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼの精製工程、
を含む方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法の実施より得られるファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
請求項８記載の方法の実施より得られるファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
野生型ファージ単量体ポリメラーゼの改変に由来する、特にＴ７、Ｔ３、Ｋ１１、ＳＰ６のようなバクテリオファージの単量体ＲＮＡポリメラーゼに由来する請求項１０記載のファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼを除外するために、１位及びおおよそ４１０位間又はおおよそ９０位及び３２０位間又は１１５位及び３００位間に位置する少なくとも一つのアミノ酸が置換又は欠失で改変されたファージ起源の野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異を含むファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
グルタミン酸による２２２位のリジン（Ｋ）の置換。
【請求項１３】
以下から選択される請求項１２記載のファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの２６６位に位置するプロリン、又はＴ３の２６７位、Ｋ１１の２８９位及びＳＰ６の２３９位に位置するプロリンのようなバクテリオファージの野生型ＲＮＡポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンに代えて２６６位にロイシンを含むもの、
−及び／又は、上記のプロリン周辺に位置し、すなわち対象のプロリンからおおよそ１０オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換又は欠失により改変されたもの。
【請求項１４】
次から選択される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
＊野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−バリン（Ｖ）による１１７位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−バリン（Ｖ）による１１９位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−アラニン（Ａ）による１３４位のバリン（Ｖ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による１４７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−アルギニン（Ｒ）による２３０位のヒスチジン（Ｈ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６６位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９１位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１４８位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６７位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９２位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６４０位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１１位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１６７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２８９位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による３１４位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６６２位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８３３位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１１７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２３９位のプロリン（Ｐ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３１位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８０４位のイソロイシン（Ｉ）の置換。
【請求項１５】
次から選択される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−プロリンに代えて２６６位のロイシンを含む配列番号２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１７位のバリン、及びバリンに代えて１３４位のアラニンを含む配列番号４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギンを含む配列番号６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて２３０位のアルギニン、及びアルギニンに代えて２９１位のシステインを含む配列番号８で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びチロシンに代えて６３９位のフェニルアラニンを含む配列番号１０で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、アスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギン及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
請求項１０から１５のいずれか１項記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のたんぱく質配列をそれぞれコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のヌクレオチド配列、又は遺伝コードの縮重により上記のヌクレオチド配列から誘導され、上記のたんぱく質をコードする特性を保持する全てのヌクレオチド配列から選択される請求項１６記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項１６記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載のベクターにより形質転換された細胞。
【請求項２０】
対象のＲＮＡをインビトロ調製するための方法であって、適当な培地中で請求項１０から１５のいずれか１項記載の少なくとも一つの変異型ＲＮＡポリメラーゼと対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を結合し転写を上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下に行うことを含む方法。
【請求項２１】
対象のＲＮＡをインビボ調製するための方法であって、ゲノムが対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下で行われる、請求項１０から１５のいずれか１項記載の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを生産する請求項１９記載の細胞の培養を含む方法。
【請求項２２】
対象のたんぱく質をインビボ調製するための方法であって、ゲノムが対象の該たんぱく質をコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下行われる、請求項１０から１５のいずれか１項記載の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを生産する請求項１９記載の細胞の培養を含む方法。
【請求項２３】
請求項２０から２２のいずれか１項記載の対象のＲＮＡ又はたんぱく質をインビトロ又はインビボで調製するための方法であって、合成ポリアミンの添加の工程も含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明のより特定の主題は、Ｔ７、Ｔ３、Ｋ１１、又はＳＰ６のような野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼに関するもので、次から選ばれる：
＊野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−バリン（Ｖ）による１１７位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−バリン（Ｖ）による１１９位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−アラニン（Ａ）による１３４位のバリン（Ｖ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による１４７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−アルギニン（Ｒ）による２３０位のヒスチジン（Ｈ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６６位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９１位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１４８位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６７位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９２位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６４０位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１１位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１６７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２８９位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による３１４位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６６２位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８３３位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１１７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２３９位のプロリン（Ｐ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３１位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８０４位のイソロイシン（Ｉ）の置換。