【手続補正書】
【提出日】平成16年8月4日(2004.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーであって、以下の(a)〜(c)：
(a) それとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分；
(b) 予め選択されたアービトラリ(arbitrary)ヌクレオチド配列を有する5'末端部分；および
(c) 前記3'末端部分と5'末端部分との間に位置し、少なくとも二つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分；
を含み、それによって調節部分がアニーリング温度によりそのプライマーのアニーリング部分を調節することができる、前記アニーリング調節プライマー。
【請求項２】
5'末端部分の予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列が、前記鋳型核酸上のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではないことを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３】
前記鋳型核酸が、gDNA、cDNAまたはmRNAであることを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項４】
前記gDNAまたはcDNAが、一本鎖または二本鎖DNAであることを特徴とする、請求項３に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項５】
前記核酸増幅が、第１のアニーリング温度および第２のアニーリング温度下で行うことを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項６】
前記核酸増幅の第１のアニーリング温度が、前記第２のアニーリング温度と同一であるかまたはそれより低いことを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項７】
前記3'末端部分が、前記第１のアニーリング温度でのアニーリングに関与し、前記5'末端部分が、前記第２のアニーリング温度でのプライミング部位として機能することを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項８】
前記調節部分が、前記第１のアニーリング温度でのプライマーのアニーリング部位を3'末端部分に制限することを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項９】
前記第１のアニーリング温度が約30℃〜68℃であることを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１０】
前記第２のアニーリング温度が約50℃〜72℃であることを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１１】
次の一般式で表される、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
5'-Xp-Yq-Zr-3'
[式中、Xpは、鋳型核酸のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する5'末端部分を表し；Yqは、少なくとも二つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し；Zrは、そのプライマーとハイブリダイズする鋳型核酸上の一の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分を表し；ｐ、ｑおよびｒは、ヌクレオチドの数であり；X、YおよびZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。]
【請求項１２】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、天然のDNA/RNA塩基との間で識別されることなく天然のDNA/RNA塩基の各々と塩基対を形成することができることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１３】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、イノシン、7-デアザ-2'-デオキシイノシン、2-アザ-2'-デオキシイノシン、2'-OMe イノシン、2'-F イノシン、デオキシ 3-ニトロピロール、3-ニトロピロール、2'-OMe 3-ニトロピロール、2'-F 3-ニトロピロール、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、デオキシ 5-ニトロインドール、5-ニトロインドール、2'-OMe 5-ニトロインドール、2'-F 5-ニトロインドール、デオキシ 4-ニトロベンズイミダゾール、4-ニトロベンズイミダゾール、デオキシ 4-アミノベンズイミダゾール、4-アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2'-F ネブラリン、2'-F 4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-5-イントロインドール、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルフォリノ-5-ニトロインドール、モルフォリノ-ネブラリン、モルフォリノ-イノシン、モルフォリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2'-0-メトキシエチルイノシン、2'-0-メトキシエチルネブラリン、2'-0-メトキシエチル 5-ニトロインドール、2'-0-メトキシエチル 4-ニトロベンズイミダゾール、2'-0-メトキシエチル3-ニトロピロールおよびこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１４】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールであることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１５】
前記調節部分が、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を有する連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１６】
前記デオキシリボヌクレオチドが、天然のdNMP、修飾ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１７】
前記pが、15〜60の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１８】
前記qが、少なくとも3であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１９】
前記qが、少なくとも4であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２０】
前記qが、2〜15の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２１】
前記rが、6〜50の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２２】
前記pが15〜60の整数であり、qが2〜15の整数であり、そしてrが6〜30の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２３】
前記Xpが、ユニバーサルプライマー配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２４】
前記Xpが、制限酵素によって認識される配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２５】
前記Xpが、検出または分離のための標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２６】
前記Zrが、mRNAのポリアデノシン(ポリA)テイルとハイブリダイズするヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２７】
前記Zrが、少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２８】
前記Zrが、3'末端に3'-Vを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２９】
前記Zrが、3'末端に3'-NVを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれ、そしてそのNがデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３０】
前記Zrが、鋳型核酸中のターゲット配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３１】
前記Zrが、ランダムヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３２】
前記Zrが、遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３３】
前記Zrが、予め決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の複数の組合せから選択される縮重ヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３４】
前記Zrが、少なくとも一つのリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３５】
前記Zrが、アレル部位に相補的な少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３６】
前記Zrが、ターゲット核酸に対してミスマッチである、突然変異誘発のための少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマーセットを含むキット。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のアニーリング調節プライマーの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対をさらに含むことを特徴とする、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物から核酸配列を増幅する方法。
【請求項４０】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項３９に記載の方法：
(a) 核酸配列の第一段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を各々のプライマーが前記核酸配列の前記領域とアニーリングする条件で行って、それにより前記核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。
【請求項４１】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
【請求項４２】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４１に記載の方法：
(a) 第１のアニーリング温度でターゲット核酸配列の第１段階の増幅を行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅させる、前記工程。
【請求項４３】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
【請求項４４】
以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４３に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドdTプライマーと前記mRNAとを接触させる工程；
(b) 前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のDNA鎖を生成させる工程；
(c) 工程(b)で得られる第１のDNA鎖からの前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(c)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。
【請求項４５】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、二つまたはそれ以上の核酸試料中で示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出する方法。
【請求項４６】
以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４５に記載の方法：
(a) mRNA転写物の第１の集団である第１の核酸試料およびmRNA転写物の第２の集団である第２の核酸試料を提供する工程；
(b) 前記第１の核酸試料および第２の核酸試料の各々を請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーと別々に接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、前記の示差的に発現されるmRNA中の第１の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、かつ、前記接触を、鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で行う、前記工程；
(c) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記の示差的に発現されるmRNAを逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記第１の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第１の集団、および前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記第２の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第２の集団を生成する工程；
(d) 前記第１のcDNA鎖の第１および第２の集団の各々を精製し定量する工程；
(e) 工程(d)から得られた第１のDNA鎖の第１および第２の集団の各々の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、第１のcDNA鎖の第１および第２の集団における第２の部位に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の各々の集団における第２の部位にアニーリングする条件下で行って、それにより第２のcDNA鎖の第１および第２の集団を生成させる、前記工程；
(f) 工程(e)で生成された第２のcDNA鎖の各々の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)および(e)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)および(e)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが第２のcDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記第２のcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(g) 工程(f)から得られた増幅産物の第１および第２の集団において、個々の増幅産物の存在またはレベルを比較する工程。
【請求項４７】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の迅速増幅方法。
【請求項４８】
以下の工程(a)〜(e)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４７に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、そのプライマーの3'末端部分が、そのプライマーとハイブリダイズする前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 前記第１のcDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、前記第１のcDNA鎖の一つにおける一部位に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが前記第１のcDNA鎖の一つの遺伝子特異的部位とアニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的な第２のcDNA鎖を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された遺伝子特異的な第２のcDNA鎖の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)の各々で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的な第２のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的なcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項４９】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の迅速増幅方法。
【請求項５０】
以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４９に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、cDNA合成プライマーとしてのオリゴヌクレオチドdTプライマーまたはランダムプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、前記cDNA合成プライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNAの一領域に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAを、逆転写酵素を用いて逆転写して、前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させ、それによってmRNA−cDNA中間体を生成させる工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第１のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) 工程(c)で生成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(e) 逆転写酵素を用いて前記第１のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第１の完全長cDNA鎖を伸長させる工程；
(f) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(e)から得られた前記第１の完全長cDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第１のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第２の完全長cDNA鎖の一つの一領域に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが前記第２の完全長cDNA鎖の一つにおける遺伝子特異的部位にアニーリングする条件で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖を生成させる工程；および
(g) 前記遺伝子特異的cDNA鎖の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(f)-(i)および工程(f)-(ii)で各々使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(f)-(i)および(f)-(ii)で各々使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的cDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５１】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅する方法。
【請求項５２】
以下の工程(a)〜(f)を含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を用いて逆転写して、前記プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成させる工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第１のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) 工程(c)で生成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(e) 逆転写酵素を用いて前記第１のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第１の完全長cDNA鎖を伸長させる工程；および
(f) 工程(e)で生成された前記第１の完全長cDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(d)で各々使用したのと同一の第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対、または工程(a)および(d)で使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記mRNAに相補的な完全長cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５３】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅する方法。
【請求項５４】
以下の工程(a)〜(c)を含むことを特徴とする、請求項５３に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 請求項５２に記載の工程(b)〜(e)を行い、それにより5'富化した第１のcDNAを伸長させる工程；および、
(c) 工程(b)で生成された前記5'富化した第１のcDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(b)で各々使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'富化した第１のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより5'富化したcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５５】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、二組以上のプライマー対を用いて、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同一の反応で同時に増幅する方法。
【請求項５６】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５５に記載の方法：
(a) 二つ以上のターゲットヌクレオチド配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記の各プライマー対の各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域と実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマー対の各々が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それによりターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー対、または工程(a)で使用したプライマー対の各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各プライマー対の各々が工程(a)で生成された増幅産物の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を同一反応で再増幅させる、前記工程。
【請求項５７】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAのDNAフィンガープリントを作製する方法。
【請求項５８】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５７に記載の方法：
(a) gDNAから、ゲノムに特徴的な独立したDNA断片のセットであるDNAフィンガープリントの第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の部位に実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記gDNAにアニーリングする条件で行って、それによりDNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したDNA断片のセットを生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された独立したDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対の各々が工程(a)で生成された前記の独立したDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の独立したDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。
【請求項５９】
逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料のRNAフィンガープリントを作製する方法。
【請求項６０】
以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５９に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、その第１のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第１のcDNA鎖上の部位と実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記mRNA試料にアニーリングする条件で行って、それによりRNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したcDNA断片のセットを生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(c)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記のプライマーまたはプライマー対の各々が工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記独立したcDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。
【請求項６１】
逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料から多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
【請求項６２】
以下の(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６１に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、前記第１のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーは、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第１のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する3'末端cDNA断片を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された3'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記3'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記3'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６３】
以下の工程(a)〜(c)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６１に記載の方法：
(a) 請求項５２に記載の工程(a)〜(e)を行って、それにより完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)から得られた前記第１の完全長cDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第１のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、前記第２の完全長cDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが第２の完全長cDNA鎖の前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記のコンセンサス配列または縮重配列を有する5'末端cDNA断片を生成させる工程；および
(c) 工程(b)で生成された5'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の5'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６４】
プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAから多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
【請求項６５】
以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６４に記載の方法：
(a) 前記gDNAからの保存性ホモロジー断片の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対がgDNAの前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有するゲノムDNA断片を生成させる工程；および
(b) 工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対の各々が工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の3'末端配列および5'末端配列の各々にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の保存性ホモロジーゲノムDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６６】
プライマーを用いた増幅反応を行う段階を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異を同定する方法。
【請求項６７】
以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６６に記載の方法：
(a) 前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な第１のDNA鎖を生成させる第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第１の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々は、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置(interrogation position)を含み、それにより、前記疑問位置が、前記第１の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)で生成された前記第１のDNA鎖の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程：
(i) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第２の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが前記ターゲット核酸の前記第２の部位にアニーリングする条件で行って、それにより前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相補的な第２のDNA鎖を生成させる工程；および
(ii) 工程(a)および工程(b)-(i)で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(b)-(i)で生成された前記第２のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なもしくはそれに相当するハイブリダイズする配列を各々が有するプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、前記サイクルを、各々のプライマーが前記第２のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記ターゲット核酸の前記第１の部位および第２の部位を3'末端および5'末端に含む前記第２のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第２のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【請求項６８】
以下の工程(a)〜(c)を含む、第１の増幅および第２の増幅の二つの別個の増幅過程を用いて行い、前記第２の増幅を二段階増幅を用いて行うことを特徴とする、請求項６６に記載の方法：
(a) 両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む短いDNA鎖断片を生成させる第１の増幅を行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、前記ターゲット核酸の一部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、前記ヌクレオチド変異は、前記予め選択された配列の間に位置しており、前記プライマー対の少なくとも一つが、3'末端部分に前記ハイブリダイズする配列を有する請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであり、それにより両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片を生成させる工程；
(b) 前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片に相補的な第１のDNA鎖を生成する第２の増幅における第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第１の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々が、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置を含み、それにより、前記疑問位置が前記第１の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；および
(c) 工程(a)で生成された前記第１のDNA鎖の第２の増幅における第２段階の増幅を、第２のアニーリング温度で行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマー対の一方が、工程(a)で使用した請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーと同一のものであり、他方のプライマーが、工程(b)で使用した前記第１のプライマーと同一のものであるか、またはそのプライマー対の各々が、それとハイブリダイズする工程(b)で生成された前記第１のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたはそれに相当するハイブリダイズする配列を有しており、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第１のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより、前記第１のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【請求項６９】
プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸において突然変異誘発する方法。
【請求項７０】
以下の工程(a)および(b)を含む、前記突然変異誘発が位置指定突然変異誘発であり、二段階増幅を用いることを特徴とする、請求項６９に記載の方法：
(a) 前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記ハイブリダイズする配列が、位置指定突然変異を生じさせるための少なくとも一つのミスマッチヌクレオチドを有し、かつ、本工程を、プライマーまたはプライマー対が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングされる条件で行って、それにより位置指定当然変異部位を含む増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより位置指定突然変異部位を含む増幅産物が再増幅される、前記工程。
【請求項７１】
前記第１段階の増幅で使用した前記プライマー対が、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーから選択されるアニーリング調節プライマーと従来のプライマーとの組合せであることを特徴とする、請求項４０、４２、４４、４８、５０、５６、５８、６０、６２、６３または６５に記載の方法。
【請求項７２】
請求項３９または４０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む核酸増幅用キット。
【請求項７３】
請求項４１または４２に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、DNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
【請求項７４】
請求項４３または４４に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
【請求項７５】
請求項４５または４６に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出するためのキット。
【請求項７６】
請求項４７または４８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットcDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
【請求項７７】
請求項４９または５０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
【請求項７８】
請求項５１または５２に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅するためのキット。
【請求項７９】
請求項５３または５４に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅するためのキット。
【請求項８０】
請求項５５または５６に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同時に増幅するためのキット。
【請求項８１】
請求項５７または５８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いたDNAフィンガープリントを作製するためのキット。
【請求項８２】
請求項５９または６０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いたRNAフィンガープリントを作製するためのキット。
【請求項８３】
請求項６１、６２または６３に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いて多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
【請求項８４】
請求項６４または６５に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いた多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
【請求項８５】
請求項６６、６７または６８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸におけるヌクレオチド変異を同定するためのキット。
【請求項８６】
請求項６９または７０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸において突然変異誘発するためのキット。