【手続補正書】
【提出日】平成15年5月6日(2003.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞中の目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変するための方法であって、以下：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；および
ｄ）（ｃ）の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ＤＮＡ配列を含む、前記大きなクローン化遺伝子フラグメントが、目的の前記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対する遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更；新しいコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入；条件付き対立遺伝子の作製；あるいは１つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントの、同一種または異なる種由来の相同性コード配列または定向進化配列との置換を含む、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの前記変更が、置換、付加、または融合を含む、方法。
【請求項５】
前記融合が、エピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記定量的アッセイが、定量的ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、競合的ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化したプローブもしくはＩｎｖａｄｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）に対する定量的ハイブリダイゼーション、またはＭＭＰアッセイ（登録商標）を含む、方法。
【請求項７】
前記定量的ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、またはＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ技術を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記真核生物細胞が、哺乳動物の胚幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記胚幹細胞が、マウス、ラット、または他のげっ歯類の胚幹細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、哺乳動物の遺伝子または染色体遺伝子座である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、ヒトの遺伝子または染色体遺伝子座である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記内因性遺伝子または染色体遺伝子座が、マウス、ラット、または他のげっ歯類の遺伝子または染色体遺伝子座である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＴＶＥＣが、２０ｋｂより大きなＤＮＡフラグメントに適応し得る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＴＶＥＣが、１００ｋｂより大きなＤＮＡフラグメントに適応し得る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
マウス胚幹細胞中の目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を遺伝的に改変する方法であって、以下：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、２０ｋｂより大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、該大きなクローン化ＤＮＡフラグメントが、該内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該マウス胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクターを産生するために、細菌相同性組換えを使用する工程であって、ここで、該遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である、工程；
ｃ）（ｂ）の該大きな標的ベクターを該マウス胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の該マウス胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する工程であって、該定量的アッセイが、定量的ＰＣＲである、工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
（ｃ）の前記大きな標的ベクターの約１〜５μｇが、約１×１０７細胞に導入される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座。
【請求項１８】
請求項１〜１４、または１６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された真核生物細胞。
【請求項１９】
胚幹細胞である、請求項１８に記載の遺伝的に改変された細胞
【請求項２０】
請求項１５に記載された方法によって産生された、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法によって産生された、遺伝的に改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、マウス。
【請求項２３】
請求項１８または１９に記載の遺伝的に改変された真核生物細胞から産生された、非ヒト生物。
【請求項２４】
請求項２０に記載の遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞から産生された、マウス。
【請求項２５】
遺伝的に改変された、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程；
ｅ）（ｄ）の該胚幹細胞を胚盤胞に導入する、工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の該胚盤胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、
非ヒト生物。
【請求項２６】
遺伝的に改変された、目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、マウスであって、該マウスは、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、２０ｋｂより大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る工程であって、ここで、該大きなクローン化ＤＮＡフラグメントが、該内因性遺伝子または染色体遺伝子座に対して相同性である、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、該マウス胚幹細胞において使用するための大きな標的ベクターを産生するために、細菌相同性組換えを使用する工程であって、ここで、該遺伝的改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である、工程；
ｃ）（ｂ）の該大きな標的ベクターを該マウス胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該マウス胚幹細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する工程であって、該定量的アッセイが、定量的ＰＣＲである、工程；
ｅ）（ｄ）の該マウス胚幹細胞を胚盤胞に導入する、工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の該胚盤胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、
マウス。
【請求項２７】
遺伝的に改変された、内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程；
ｅ）（ｄ）の該真核生物細胞から核を取り除く、工程；
ｆ）（ｅ）の該核を卵母細胞に導入する、工程；ならびに
ｇ）（ｆ）の該卵母細胞を、妊娠のために代理母に導入する、工程
を包含する、方法によって産生される、
非ヒト生物。
【請求項２８】
遺伝的に改変された、内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む、非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下の工程：
ａ）目的のＤＮＡ配列を含む、大きなクローン化ゲノムフラグメントを得る、工程；
ｂ）（ａ）の該大きなクローン化ゲノムフラグメントを遺伝的に改変して、真核生物細胞において使用するための大きな標的ベクター（ＬＴＶＥＣ）を産生するために、細菌相同性組換えを使用する、工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入して、該細胞中の該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座を改変する、工程；
ｄ）（ｃ）の該真核生物細胞における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出して、該内因性遺伝子または該染色体遺伝子座が、遺伝的に改変された真核生物細胞を同定するために、定量的アッセイを使用する、工程；
ｅ）（ｄ）の該真核生物細胞を別の真核生物細胞と融合する、工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の融合した該真核生物細胞を妊娠のために代理母に導入する、工程、
を包含する、方法によって産生される、
非ヒト生物。
【請求項２９】
前記非ヒト生物が、マウス、ラット、または他のゲッ歯類である、請求項２５、２７または２８のいずれか１項に記載の非ヒト生物。
【請求項３０】
請求項２〜１６のいずれか１項にさらに規定されるような方法によって産生される、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の非ヒト生物。
【請求項３１】
非ヒト生物の産生のための、請求項１８または１９に記載の遺伝的に改変された細胞の使用。
【請求項３２】
マウスの産生のための、請求項２０に記載の遺伝的に改変されたマウス胚幹細胞の使用。