【手続補正書】
【提出日】平成15年9月5日(2003.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の諸工程を含むことを特徴とする、細胞内のターゲット核酸を検出する方法：
(a) 該ターゲット核酸の存在を分析すべき該細胞を、マトリックス内に埋設する工程；
(b) 該ターゲット核酸内の隣接するが不連続の配列と相補的な、3'および5'領域を持つAmp-プローブ-2を添加する工程、ここで該3'および5'領域は、該ターゲット核酸内のヌクレオチド配列と相補的でもハイブリッド化可能でもないリンカー領域によって分離されており、結果として該ターゲット核酸とAmp-プローブ-2とを含む複合体が形成され；
(c) 該環化可能なAmp-プローブ-2の3'および5'末端と、ヌクレオチド配列を接合する結合剤とを結合して、環状のAmp-プローブ-2プローブを形成する工程；
(d) 該複合体を洗浄する工程；および
(e) 該複合体を検出する工程、ここで該複合体の検出が、該埋設された細胞における該ターゲット核酸の存在を意味する。
【請求項２】
該リンカー領域が、リガンドによって標識され、該ターゲット核酸と環状プローブとを含む複合体が生成される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
リガンド結合部分が添加され、該部分は、該リガンドおよびこのリガンドにより内部標識された、オリゴヌクレオチドシグナルプローブと結合し、かつアフィニティー対を形成し、該リガンド結合成分が、該Amp-プローブ-2上の該リガンドおよび該オリゴヌクレオチドシグナルプローブ上の該リガンドと結合して、標識された複合体を形成する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
該リガンドが、ビオチン、抗原、ハプテン、抗体、重金属誘導体、およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項2記載の方法。
【請求項５】
該リガンド結合部分が、ストレプタビジン、アビジン、抗体、抗原、チオ基およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項3記載の方法。
【請求項６】
該細胞が、検査の目的で入手した、臨床的サンプルから得られる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
該サンプルが、全血、分離された白血球、唾液、尿、組織生検および咽口部拭い液を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
該マトリックスが、ポリアクリルアミドおよびアガロースを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
DNAポリメラーゼを添加して、該5'および3'領域間の領域を拡張する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
該環状Amp-プローブ-2を、該複合体と、該Amp-プローブ-2の該リンカー領域の一部に対して相補的かつハイブリッド化可能な1またはそれ以上の前進RAMプライマーおよびdNTP、およびストランド置換活性をもつDNAポリメラーゼとを、所定条件下で接触させることにより増幅し、該前進RAMを、多数回に渡り環の周りに伸張させて、該環状プローブの配列と相補的な繰り返し単位を持つ一本鎖DNAを形成する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
該一本鎖DNAを検出し、その検出が、該埋設された細胞における該ターゲット核酸の存在を意味する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
該環状Amp-プローブ-2を、該複合体と、該Amp-プローブ-2の該リンカー領域の一部に対して相補的かつハイブリッド化可能な1またはそれ以上の前進RAMプライマーおよび該第一の拡張プローブが相補的である該リンカー領域の該部分と重複しない、該Amp-プローブ-2の該リンカー領域の一部に対して実質的に同一の、1またはそれ以上の逆RAMプライマー、dNTPS、およびストランド置換活性をもつDNAポリメラーゼとを、所定条件下で接触させることにより増幅し、該前進RAMプライマーを、多数回サークルの周りに伸張させて、該環状プローブの配列と相補的な繰り返し単位を持つ一本鎖DNAを形成し、かつ該逆RAMプライマーの多数のコピーを、該一本鎖DNAの相補領域とハイブリッド化し、しかも該DNAポリメラーゼによって伸張させて、拡張生成物を得、該逆RAMプライマーの拡張生成物を、該逆RAMプライマーの下流側コピーおよび対応する拡張生成物と置換して、該逆RAMプライマーの多数のコピーが結合しており、該DNAポリメラーゼによって拡張される、置換された一本鎖を得る、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
該増幅されたDNAを検出し、その検出が、該埋設された細胞における該ターゲット核酸の存在を意味する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
核酸を増幅する方法であって、
(a) 二本鎖DNAサンプルを、制限エンドヌクレアーゼで消化して、フラグメント化されたDNAを得、
(b) 少なくとも一つの二本鎖Amp-プローブと、該フラグメント化されたDNAの各末端とを、結合剤で結合し、ここで該Amp-プローブは、少なくとも一つのプライマーサイトを含み、
(c) 該フラグメント化されたDNAを変性し、および
(d) 該DNAを、(1) 該AMP-プローブの一部と相補的かつハイブリッド形成可能な、少なくとも一つの前進RAMプライマー、(2) dNTP、(3) 該前進RAMプライマーが、該フラグメント化DNAの末端まで伸張して、各末端に繰り返し単位を持つ、多数の一本鎖DNAを形成する条件下で、ストランド置換活性を示すDNAポリメラーゼ、および(4) 該AMP-プローブの一部と実質的に同一の、少なくとも一つの逆RAMプライマーと、該逆RAMプライマーが該DNAポリメラーゼによって拡張されて、該増幅された核酸の拡張生成物を与える条件下で、接触させることにより、該フラグメント化DNAを増幅する、諸工程を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１５】
該DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼまたはBst DNAポリメラーゼである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
該消化および結合段階をマトリックス内で行う、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
該結合剤が、酵素または化学試薬である、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
該酵素が、DNAまたはRNAリガーゼである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
該DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼまたはTaq DNAリガーゼである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
該化学試薬が、シアノゲンブロミドまたはカルボジイミドである、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
(a) 少なくとも一つのプライマーサイトを含む、少なくとも一つの二本鎖Amp-プローブと、(b) 少なくとも一つの前進RAMプライマーと、(c) 少なくとも一つの逆RAMプライマーとを含むことを特徴とする、増幅キット。
【請求項２２】
(a) 捕獲/Amp-プローブと、mRNAの3'poly-A配列とをハイブリッド化し、ここで該捕獲/Amp-プローブは、多数のRAMプライマーサイトを含み、
(b) 該mRNAを逆転写して、一本鎖cDNAを生成し、
(c) 該一本鎖cDNAを二本鎖DNAに転化し、
(d) 少なくとも一つの二本鎖Amp-プローブと該二本鎖DNAの各末端とを結合剤で結合し、ここで該Amp-プローブは、少なくとも一つのRAMプライマーサイトを含み、
(e) 該二本鎖DNAを変性し、
(f) 該DNAを、(1) 該AMP-プローブの一部と相補的かつハイブリッド形成可能な、少なくとも一つの前進RAMプライマー、(2) dNTP、(3) 該前進RAMプライマーが、該DNAの末端まで伸張して、各末端に繰り返し単位を持つ、多数の一本鎖DNAを形成する条件下で、ストランド置換活性を示すDNAポリメラーゼ、および(4) 該AMP-プローブの一部と実質的に同一の、少なくとも一つの逆RAMプライマーと、該逆RAMプライマーが該DNAポリメラーゼによって拡張されて、該増幅された核酸の拡張生成物を与える条件下で、接触させることにより、該DNAを増幅する、諸工程を含むことを特徴とする、mRNAを増幅する方法。
【請求項２３】
該DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼまたはBst DNAポリメラーゼである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
該消化および結合段階をマトリックス内で行う、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
該結合剤が、酵素または化学試薬である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
該酵素が、DNAまたはRNAリガーゼである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
該DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼまたはTaq DNAリガーゼである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
該化学試薬が、シアノゲンブロミドまたはカルボジイミドである、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
(a) 少なくとも一つのプライマーサイトを含む、少なくとも一つの二本鎖Amp-プローブと、(b) 少なくとも一つの捕獲/Amp-プローブと、(c) 少なくとも一つの前進RAMプライマーと、(d) 少なくとも一つの逆RAMプライマーとを含むことを特徴とする、増幅キット。
【請求項３０】
判別mRNA発現を検出する方法であって、
(a) 5'捕獲/Amp-プローブ-1と3'任意/Amp-プローブ-２とを、核酸中の相補配列間の核酸ハイブリッド化を可能とする条件下で、ハイブリッド化する工程と、ここで該5'捕獲/Amp-プローブ-1は、mRNAに対して相補的かつハイブリッド形成可能なオリゴ(dT)配列および該ターゲット核酸中の配列に対して相補的でもハイブリッド化可能でもないリンカー領域を含み、かつ少なくとも一つの包括的なRAMプライマー結合配列を有し、また該3'任意/Amp-プローブ-２は、mRNAの5'末端と結合可能な縮重配列および該ターゲット核酸中の配列に対して相補的でもハイブリッド化可能でもないリンカー領域を含み、かつ少なくとも一つの包括的なRAMプライマー結合配列を有し、
(b) 逆転写酵素を添加して、該5'捕獲/Amp-プローブ-1の3'末端から、該3'任意/Amp-プローブ-２の5'末端まで伸張して、cDNAを形成する工程と、
(c) 該3'任意/Amp-プローブ-２の5'末端と、該拡張されたcDNAの3'末端とを結合する工程と、
(d) 該cDNAと、(1) 該5'捕獲/Amp-プローブ-1の一部と相補的かつハイブリッド化可能な、少なくとも一つの前進RAMプライマー、(2) dNTP、(3) 該前進RAMプライマーが該cDNAの末端まで伸張して、各末端において繰り返し単位を持つ多数の一本鎖DNAを生成する条件下で、ストランド置換活性をもつDNAポリメラーゼ、および(4) 該5'捕獲/Amp-プローブ-1の一部と実質的に同一の、少なくとも一つの逆RAMプライマーとを、該逆RAMプライマーが、該DNAポリメラーゼによって拡張され、該増幅された核酸の拡張生成物を与える条件下で接触させることによって、該cDNAを増幅する工程と、
(e) 該増幅されたDNAを分析する工程とを含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項３１】
該DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼまたはBst DNAポリメラーゼである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
更に、上記工程(a)に先立って、(a) 該細胞内で発現された最も豊富なmRNAに対して相補的な配列を含むプライマーを、該mRNAサンプルに添加する工程、および(b) RNA-DNAデュプレックスのRNAを開裂する特異的酵素を添加する工程を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
該酵素が、RNアーゼHである、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
判別mRNA発現を検出する方法であって、
(a) Amp-プローブ-1と該mRNAの5'末端と結合可能な縮重配列を含む3'末端とを、核酸中の相補配列間の核酸ハイブリッド化を可能とする条件下で、ハイブリッド化する工程と、ここで該Amp-プローブ-1の5'末端は、mRNAに対して相補的かつハイブリッド形成可能なオリゴ(dT)配列および該ターゲット核酸中の配列に対して相補的でもハイブリッド化可能でもないリンカー領域を含み、かつ少なくとも一つの包括的なRAMプライマー結合配列を有し、
(b) 逆転写酵素を添加し、該Amp-プローブ-1の3'末端から5'末端まで伸張する工程と、
(c) 該Amp-プローブ-1の3'末端と5'末端とを、ヌクレオチド配列を接合する結合剤で結合して、環状Amp-プローブ-1を形成する工程と、
(d) 該Amp-プローブ-1を、(1) 該Amp-プローブ-1の該リンカー領域の一部に対して相補的かつハイブリッド化可能な、1以上の前進RAMプライマーおよびdNTP、および該前進RAMプライマーが、多数回に渡り環の周りに伸張して、該環状プローブの配列に対して相補的な繰り返し単位を持つ一本鎖DNAを形成する条件下で、ストランド置換活性をもつDNAポリメラーゼ、および(2) 該一本鎖DNAの相補領域とハイブリッド化し、かつ該DNAポリメラーゼによって拡張されて、拡張生成物を与える、1種以上の逆RAMプライマーと接触させて、該環状Amp-プローブ-1を増幅させ、該逆RAMプライマーの拡張生成物を、該逆RAMプライマーの下流側コピーおよび対応する拡張生成物と置換して、該前進RAMプライマーの多数のコピーが結合し、かつ該DNAポリメラーゼにより拡張される、置換された一本鎖を生成する工程と、
(e) 該増幅されたDNAを分析する工程とを含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項３５】
該DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼまたはBst DNAポリメラーゼである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
更に、上記工程(a)に先立って、(a) 該細胞内で発現された最も豊富なmRNAに対して相補的な配列を含むプライマーを、該mRNAサンプルに添加する工程、および(b) RNA-DNAデュプレックスのRNAを開裂する特異的酵素を添加する工程を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
該酵素が、RNアーゼHである、請求項36記載の方法。