(57)【要約】  本発明は、分子量が比較的小さく、神経幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞の増殖や分化制御；或いは癌、神経疾患、糖尿病等の疾病の治療に有用なペプチド又はその塩を提供することを課題とする。  以下の(1)又は(2)に示すペプチド、又はその塩を提供する：(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性化作用を有するペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(1)又は(2)に示すペプチド、又はその塩：
(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性化作用を有するペプチド。
【請求項２】
上記(1)又は(2)に記載のペプチドにおいて、アミノ酸配列のアミノ末端が、アセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、又は１〜３残基のペプチドで置換されている、請求項１に記載のペプチド又はその塩。
【請求項３】
上記(1)又は(2)に記載のペプチドにおいて、アミノ酸配列のカルボキシ末端が、アミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、１〜３残基のペプチドで置換されている、請求項１に記載のペプチド又はその塩。
【請求項４】
上記(2)のペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載のペプチド又はその塩。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩、及び薬学的に許容される基材又は担体を含む、医薬製剤。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩が、生分解性基材に担持されている、請求項５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
生分解性基材がアルギン酸ゲルである、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
Wntシグナル伝達系活性化用の製剤である、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項９】
幹細胞の増殖又は分化制御用の製剤である、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
癌、神経疾患又は糖尿病の治療用製剤である、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
Wntシグナル伝達系を活性化するのに有効量の請求項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩を、Wntシグナル伝達系活性化が必要とされる患者に投与することを特徴とする、Wntシグナル伝達系の活性化方法。
【請求項１２】
請求項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩を含有する培地中で神経幹細胞を培養することによって、該神経幹細胞を神経細胞に分化させることを特徴とする、神経幹細胞の分化誘導方法。
【請求項１３】
請求項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、Wntシグナル伝達系活性化用の医薬製剤を製造するための使用。
【請求項１４】
医薬製剤が、幹細胞の増殖又は分化制御用の製剤である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
医薬製剤が、癌、神経疾患又は糖尿病の治療用製剤である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
Wntシグナル伝達系を活性化するための、以下の(1)又は(2)に示すペプチド、又はその塩：
(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性化作用を有するペプチド。
【請求項１７】
神経幹細胞を神経細胞に分化誘導するための、以下の(1)又は(2)に示すペプチド、又はその塩：
(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性化作用を有するペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なWntシグナル伝達系を活性化するペプチド及びその塩に関する。更に詳しくは、本発明は、優れたWntシグナル伝達系活性化作用を有しており、例えば、神経幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞の増殖や分化制御、或いは癌、神経疾患、糖尿病等の疾病の治療に有用なペプチド及びその塩に関する。更に、本発明は、当該ペプチド及びその塩を用いた医薬製剤、Wntシグナル伝達系の活性化方法、及び神経幹細胞の分化誘導方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞や体性幹細胞を用いる再生医療は、従来回復が不可能と考えられていた神経変性疾患などの難病の治療に希望を与えるものであり、既に先駆的な臨床試験も開始されている。しかしながら、例えば、神経疾患の治療においても、移植する神経幹細胞の供給源、数量、神経への分化効率などの多くの問題があり、神経幹細胞の有効な増殖、分化方法が求められている（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
一方、Wntシグナル伝達経路は幅広い生物種に保存されており、発生や形態形成等に関与していることが知られている。Wntシグナル伝達では、Wntポリペプチドと、７回膜貫通型の細胞膜表面受容体であるFrizzledが結合することにより引き起こされ、βカテニンを介するCanonical経路、PCP経路、又はWnt/Ca経路が活性化されることが明らかにされている。【０００４】
近年、Wntシグナル伝達系は、幹細胞の増殖や分化の制御において重要な役割を果たしていることが解明されており、Wntシグナル伝達系を適切にコントロールすることによって、効率的に幹細胞の増殖又は分化させ得ることが明らかにされている。例えば、非特許文献２には、Wntシグナル伝達系が上皮や血球系の幹細胞の自己複製の調節に重要な役割を果たし、制御不全が癌化を引き起こすことが報告されている。また、非特許文献３には、Wntシグナル伝達系の活性化やβカテニンの安定化が、神経幹細胞や神経前駆細胞の神経分化を促進することが報告されている。非特許文献４には、胚性幹細胞（ES cells）の神経前駆細胞への分化を抑制することも報告されている。非特許文献５には、ラット褐色細胞腫PC12細胞がWnt-1 cDNAの導入によって、接着性の細胞への形態変化を誘導することが報告されている。非特許文献６には、Wnt-1及びWnt-3aが、神経増殖因子（NGF）によるPC12細胞の神経分化を阻害することが報告されている。特許文献１には、Wntポリペプチドが、造血幹細胞の増殖、分化、維持に有用であることを報告している。【０００５】
更に、Wntシグナル伝達系は、幹細胞の増殖や分化の制御に関与しているだけでなく、様々な疾患の治療にも有用であることが明らかにされている。例えば、特許文献２には、Wntポリペプチドやこれをコードする遺伝子が、インスリン分泌促進作用及び糖質代謝改善作用を示すことが報告されている。特許文献３には、Wnt-6ポリペプチド又はWnt-6ポリヌクレオチドが、神経障害（精神分裂症、双極性障害、単極性障害、アルツハイマー病、癲癇など）、癌（扁平上皮癌など）、心臓血管疾患、発作、発育障害（葉状魚鱗癬など）の治療に有用であることが報告されている。特許文献４には、Wnt-10aポリペプチド及びポリヌクレオチドが、癌、心血管疾患、パーキンソン病、双極性／単極性傷害、精神分裂病、神経障害、発育障害等の疾患の治療に有用であることが報告されている。【０００６】
このように、Wntシグナル伝達系を適切にコントロールすることは、幹細胞の増殖や分化を効率的に制御できるだけでなく、各種疾患や疾病の治療にも有用であることが明らかにされている。そこで従来、所望のWntシグナル伝達系活性を生じさせるために、上記特許文献１〜４に示されているように、WntポリペプチドやWntポリヌクレオチドを投与乃至適用することが試みられている。しかしながら、従来のWntポリペプチドやWntポリヌクレオチドの使用では、特異性は高いものの、分子量が大きい蛋白質や核酸であるために、抗原性、投与方法、安定性等の問題点があり、臨床上の使用を満足できるものではなかった。
【特許文献１】特開2000-516466号公報
【特許文献２】特開2005-220022号公報
【特許文献３】特開2000-60575号公報
【特許文献４】特表2002-501744号公報
【非特許文献１】実験医学、Vol.20(9),1276-1279、2002
【非特許文献２】Nature, 434, 843-850, 2005
【非特許文献３】Biochem Biophys Res Comm, 313, 915-921, 2004; Development, 131, 2791-2801, 2004; J Cell Sci, 117, 5731-5737, 2004
【非特許文献４】Nat Biotech, 20,1240-1245, 2002
【非特許文献５】Neuron, 11, 865-875, 1993
【非特許文献６】Oncogene, 21, 6348-6355, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、分子量が比較的小さく、神経幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞の増殖や分化制御に有用なペプチド又はその塩を提供することを目的とする。更に、本発明は、分子量が比較的小さく、癌、神経疾患、糖尿病等の疾病の治療に有用なペプチド又はその塩を提供することを目的とする。更に、本発明は、当該ペプチド又はその塩を利用して、医薬製剤、Wntシグナル伝達系の活性化方法、及び神経幹細胞の分化誘導方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、Wntタンパク質のアミノ酸配列から、部分配列Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr Arg Thr Gln Arg Val Thr Glu Arg Cys Asn Cys（配列番号１）を選択し、当該部分配列からなるペプチド又はその塩を使用することによって、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、細胞内βカテニン蓄積促進活性等のWntシグナル伝達系活性化作用がより効果的に発現され、上記課題を解決できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  以下の(1)又は(2)に示すペプチド、又はその塩：
(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性化作用を有するペプチド。
項２．  上記(1)又は(2)に記載のペプチドにおいて、アミノ酸配列のアミノ末端が、アセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、又は１〜３残基のペプチドで置換されている、項１に記載のペプチド又はその塩。
項３．  上記(1)又は(2)に記載のペプチドにおいて、アミノ酸配列のカルボキシ末端が、アミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、１〜３残基のペプチドで置換されている、項１に記載のペプチド又はその塩。
項４．  上記(2)のペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものである、項１に記載のペプチド又はその塩。
項５．  項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩、及び薬学的に許容される基材又は担体を含む、医薬製剤。
項６．  項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩が、生分解性基材に担持されている、項５に記載の医薬製剤。
項７．  生分解性基材がアルギン酸ゲルである、項６に記載の医薬製剤。
項８．  Wntシグナル伝達系活性化用の製剤である、項７に記載の医薬製剤。
項９．  幹細胞の分化制御用の製剤である、項７に記載の医薬製剤。
項１０．  癌、神経疾患又は糖尿病の治療用製剤である、項７に記載の医薬製剤。
項１１．  Wntシグナル伝達系を活性化するのに有効量の項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩を、Wntシグナル伝達系活性化が必要とされる患者に投与することを特徴とする、Wntシグナル伝達系の活性化方法。
項１２．  項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩を含有する培地中で神経幹細胞を培養することによって、該神経幹細胞を神経細胞に分化させることを特徴とする、神経幹細胞の分化誘導方法。
項１３．  項１乃至４のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、Wntシグナル伝達系活性化用の医薬製剤を製造するための使用。
項１４．  医薬製剤が、幹細胞の分化制御用の製剤である、項１３に記載の使用。
項１５．  医薬製剤が、癌、神経疾患又は糖尿病の治療用製剤である、項１３に記載の使用。
項１６．  Wntシグナル伝達系を活性化するための、以下の(1)又は(2)に示すペプチド、又はその塩：
(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性化作用を有するペプチド。
項１７．  神経幹細胞を神経細胞に分化誘導するための、以下の(1)又は(2)に示すペプチド、又はその塩：
(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性化作用を有するペプチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチド又はその塩は、優れたWntシグナル伝達系活性化作用を有しており、神経幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞の増殖や分化制御、或いは癌、神経疾患、糖尿病等の疾病の治療に有用である。また、本発明のペプチド又はその塩は、Wntポリペプチドに比べて分子量が低いため、低抗原性、投与の容易性、高安定性、基材マトリクスへの担持・固定化が容易であること等の優れた特性を備えており、臨床上の有用性が極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例２において、海馬由来神経幹細胞を培養した後に、細胞の形態を撮影した結果（顕微鏡写真）である。
【図２】試験例２において、海馬由来神経幹細胞を培養した後に、細胞をニューロフィラメント（NF-M）、Nestinで免疫染色し、細胞の核をDAPIで染色した結果（顕微鏡写真）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。【００１３】
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。【００１４】
１．Wntシグナル伝達系活性を有するペプチド及びその塩
本発明のペプチドとしては、下記の(1)又は(2)に示すペプチドが挙げられる。
(1) Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr Arg Thr Gln Arg Val Thr Glu Arg Cys Asn Cys (配列番号１)で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性よりなる群から選択される少なくとも１種のWntシグナル伝達系活性を有するペプチド。【００１５】
上記(2)のペプチドにおいて、置換、欠失若しくは付加されるアミノ酸の数については、改変されたペプチドが上記Wntシグナル伝達系活性を有していることを限度として特に制限されない。例えば、アミノ酸の付加の場合であれば、当該付加されるアミノ酸の数としては、１〜３個、好ましくは１〜２個、更に好ましくは１個が挙げられる。また、例えば、アミノ酸の欠失の場合であれば、当該欠失されるアミノ酸の数としては、１〜３個、好ましくは１〜２個、更に好ましくは１個が挙げられる。更に、例えばアミノ酸の置換の場合であれば、当該置換されるアミノ酸の数としては、１〜３個、好ましくは１〜２個、更に好ましくは１個が挙げられる。【００１６】
また、上記(2)のペプチドにおいて、置換、欠失若しくは付加されるアミノ酸の位置については、改変されたペプチドが上記Wntシグナル伝達系活性を有している限り特に制限されるものではない。【００１７】
更に、上記(2)のペプチドにおいて、置換若しくは付加されるアミノ酸の種類については、改変されたペプチドが上記Wntシグナル伝達系活性を有することを限度として、特に制限されない。但し、置換については、各アミノ酸残基は側鎖官能基の性質に基づく相同性置換であることが望ましい。アミノ酸の置換の場合であれば、例えば、CysはSerに、LeuはIle又はValに、ThrはSerに、GluはAspに、GlnはAsnに、ArgはLysにそれぞれ置換可能であり、その逆の置換も可能である。【００１８】
また、上記(2)のペプチドにおいて、「Wntシグナル伝達系活性化作用」とは、PC12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性の中の少なくとも１種の活性を示す作用、好ましくはこれらの中の２種以上の活性を示す作用、更に好ましくはこれらの全ての活性を示す作用を備えていることを意味する。上記(2)のペプチドにおける「Wntシグナル伝達系活性化作用」は、次のようにして確認することができる。【００１９】
＜PC12細胞の接着誘導活性＞
５容量%のウマ血清及び５容量%のウシ胎児血清を含むダルベッコのMEM培地（DMEM）に、PC12細胞を１００cells/μLとなるように懸濁し、当該細胞懸濁液を２４穴プレートの各ウェルに５００μL添加する。各ウェルに確認対象となるペプチドを最終濃度が１００μg/mLとなるように添加し、その後、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で５日間培養し、形態観察を行う。また、確認対象となるペプチドの代わりに、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、上記と同様の方法で、試験を行い、５日間培養した後の形態観察を行う。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを添加したウェルにおいて底部に接着して扁平化したPC12細胞の数を１００％として、確認対象となるペプチドを添加したウェルにおいて底部に接着して扁平化したPC12細胞の数が５０％以上、好ましくは７５％以上、特に好ましくは８５％以上である場合に、そのペプチドは「PC12細胞の接着誘導活性」を有するものとする。
参考文献：Neuron, 11, 865-875, 1993
＜神経幹細胞の分化促進活性＞
スフェアを形成して増殖している神経幹細胞を集めて、１Vol％のN2-supplement、２０ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含むDMEM/F12に、適当な濃度となるように懸濁し、２４穴プレートの各ウエルに５００μLずつ添加する。各ウェルに確認対象となるペプチドを最終濃度が１００μg/mLとなるように添加し、その後、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下で５日間培養し、形態観察と免疫染色を行う。また、確認対象となるペプチドの代わりに、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、上記と同様の方法で、試験を行い、５日間培養した後の形態観察を行う。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを添加したウェルにおいて底部に接着して軸索様神経突起を伸長している細胞の数を１００％として、確認対象となるペプチドを添加したウェルにおいて底部に接着して軸索様神経突起を伸長しているスフェアの数が５０％以上、好ましくは７５％以上、特に好ましくは８５％以上である場合に、そのペプチドは「神経幹細胞の分化促進活性」を有するものとする。
参考文献：Nat. Med. 6:271-277; 2000
＜細胞内βカテニン蓄積促進活性＞
５容量%のウマ血清及び５容量%のウシ胎児血清を含むDMEM培地に、PC12細胞を懸濁し、20万cells/dishとなるように当該細胞懸濁液をディッシュ（内径3.5 cm）に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２条件下で一日培養する。斯くしてPC12細胞が培養されたディッシュに、確認対象となるペプチドを最終濃度が１００μg/mLとなるように添加し、３７℃及び５％ＣＯ２条件下で２４時間培養する。その後、細胞を回収し、細胞ペレットをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）のサンプル緩衝液に溶解する。SDS-PAGEに供した後、親水化処理PVDF膜に転写し、抗βカテニン抗体を用いて免疫染色することによりβカテニンを検出する。βカテニンは、分子量92 kダルトンの部分のバンドとして検出され、当該バンドの濃淡をデンシトメーターにより測定することによりβカテニンが定量化される。また、確認対象となるペプチドの代わりに、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、上記と同様の方法で、試験を行い、５日間培養した後の細胞内に蓄積したβカテニン量をデンシトメーターにより測定する。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを添加した場合の細胞において測定されたβカテニン量を１００％として、確認対象となるペプチドを添加した細胞において検出されたβカテニン量が５０％以上、好ましくは７５％以上、特に好ましくは９０％以上である場合に、そのペプチドは「細胞内βカテニン蓄積促進活性」を有するものとする。
参考文献：J Biol Chem, 277, 17901-17905, 2002
本発明の上記(1)又は(2)に示すペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）がアセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、又は１〜３残基のペプチド等で置換されたものであっても良い。また、本発明の上記(1)又は(2)に示すペプチドは、カルボキシ末端（Ｃ末端）がアミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、又は１〜３残基のペプチド等で置換されたものでも良い。【００２０】
本発明において、上記(1)又は(2)に示すペプチドは、塩の形態であっても良い。このような塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマール酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸等の酸との塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；カルシウム等のアルカリ土類金属との塩；アルミニウムの水酸化物又は炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニン等との塩等が挙げられる。【００２１】
本発明のペプチドは、通常のペプチド合成方法により行われる。例えば固相合成法または液相合成法によって調製されるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。【００２２】
本発明のペプチドの固相合成法による調製は、例えば、(1)スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの反応溶媒に不溶性である重合体に目的とするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸をそれが有するα−ＣＯＯＨ基を介して結合させる、(2)次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのＮ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα−ＣＯＯＨ基以外のα−アミノ基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作とを順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成する、(3)次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより目的とするペプチドを得る、(4)次いでこれを精製する、ことによって実施される。ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、得られたペプチドの精製は逆相液体クロマトグラフィ−やゲルパーミエイションクロマトグラフィーで行うのが効果的である。【００２３】
また、本発明のペプチドの塩は、通常の塩生成反応を利用することにより調製される。【００２４】
２．医薬製剤
本発明のペプチド又はその塩は、上記Wntシグナル伝達系活性を有しており、医薬分野における有用効果を奏することができる。即ち、本発明のペプチド又はその塩は、Wntシグナル伝達系の活性化によって改善乃至治療効果が期待される疾患に対する医薬として有用である。それ故、本発明のペプチド又はその塩は、薬学的に許容される基材又は担体と共に製剤化され、医薬製剤として使用することができる。【００２５】
当該医薬製剤は、Wntシグナル伝達系の活性化によって改善乃至治療効果が期待される医薬用途、即ち、神経幹細胞及び造血幹細胞等の幹細胞の増殖又は分化制御；或いは癌、神経疾患、糖尿病等の疾病の治療に有用である。中でも特に、本発明のペプチド又はその塩は、神経幹細胞を、軸索様神経突起を伸長している神経細胞に分化促進させる作用に優れているので、当該医薬製剤は、神経幹細胞の分化促進用の製剤として好適である。【００２６】
当該医薬製剤に使用される基材又は担体については、薬学的に許容されることを限度として特に制限されず、医薬の製剤化のために配合されている成分を広く使用することができる。具体的には、当該基材としては、水、生理食塩水、乳糖、デンプン、白糖、デキストリン、ブドウ糖、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸塩等の賦形剤が挙げられる。【００２７】
また、当該医薬製剤には、上記成分の他に、添加剤や薬理活性成分を含んでいても良い。当該医薬製剤に配合可能な添加剤としては、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤化剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、界面活性剤、保存剤等が例示される。これらの添加剤の配合割合は、医薬組成物の用途や製剤形態に応じて適宜設定することができる。【００２８】
当該医薬製剤の剤型としては、適用形態に応じて適宜設定されるが、一例として、錠剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；及び液剤、乳剤、懸濁剤等の液状製剤が挙げられる。また、当該医薬製剤は、本発明のペプチド又はその塩をリポソ−ム化して製剤化したものであってもよい。【００２９】
更に、当該医薬製剤は、本発明のペプチド又はその塩を、アルギン酸ゲルや人工コラーゲンゲル等の生分解性基材に担持（固定化）させたものであってもよい。本発明のペプチド又はその塩を上記生分解性基材に担持（固定化）させるには、例えば、アルギン酸ゲルやカルボキシル基を導入した人工コラーゲンゲルに活性エステル化法又は直接法で結合することができる。カルボキシル基を導入した人工コラーゲンゲルは、例えば人工コラーゲンゲルを無水コハク酸と反応させること、或いは人工コラーゲンゲルにグルタミン酸残基を導入することによって作製できる。ゲルの活性エステル化は、例えば、上記ゲルをジメチルホルムアミド等の溶媒に懸濁し、N-ヒドロキシコハク酸イミドと1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(WSCD・HCl)を添加し、室温で一晩振盪することにより実施できる。活性エステル化法において、本発明のペプチド又はその塩を上記生分解性基材に担持（固定化）させるには、ジメチルホルムアミド等の溶媒中で、上記の活性エステル化されたゲル１００重量部に対して、本発明のペプチド又はその塩を０．１〜２００重量部、好ましくは１〜１００重量部を混合して、ジイソプロピルエチルアミンの存在下１０〜３０℃で３〜４８時間程度、必要に応じて振盪しながらインキュベートすればよい。一方、直接法で、本発明のペプチド又はその塩を上記生分解性基材に担持（固定化）させるには、例えば、以下の(i)〜(iii)の工程を順次実施すればよい：(i)上記ゲルをジメチルホルムアミド等の溶媒に懸濁する、(ii)得られた懸濁液にN-ヒドロキシコハク酸イミドと1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(WSCD・HCl)を添加する、(iii)次いで、ジイソプロピルエチルアミンの存在下同時に上記ゲル１００重量部に対して、本発明のペプチド又はその塩を０．１〜２００重量部、好ましくは１〜１００重量部を添加して、１０〜３０℃で３〜４８時間程度、必要に応じて振盪しながらインキュベートする。【００３０】
また、当該医薬製剤を幹細胞の増殖又は分化制御の用途に使用する場合であれば、当該医薬製剤は、本発明のペプチド又はその塩が上記生分解性基材に担持（固定化）されてなるものが好適である。更に、かかる用途の場合、当該医薬製剤は、上記生分解性基材に担持された本発明のペプチド又はその塩と、更に神経幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞と混合したものであってもよい。このように幹細胞が含まれる医薬製剤は、直接又は試験管内で培養後に体内に投与することができる。【００３１】
当該医薬製剤の投与形態については、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、経口投与等の全身的投与；関節内投与等の局所投与等が挙げられ、用途や剤型等に応じて適宜設定することができる。【００３２】
また、当該医薬製剤の投与量は、疾患の種類や程度、患者の性別や年齢、該製剤の投与形態、期待される効果等に基づいて、適宜設定することができる。当該医薬製剤の１日当たりの投与量の一例として、本発明のペプチド又はその塩の投与量に換算して、通常０．０１μg/kg〜２g/kg(成人)、好ましくは０．０１μg/kg〜２００mg/kg (成人)が挙げられる。【００３３】
３．Wntシグナル伝達の活性化方法
前述するように、本発明のペプチド又はその塩は、ヒトを含むほ乳類動物においてWntシグナル伝達系を活性化できるので、Wntシグナル伝達系の活性化方法に使用することができる。【００３４】
当該活性化方法は、Wntシグナル伝達系活性化が必要とされる患者に対して、本発明のペプチド又はその塩を投与することによって実施される。Wntシグナル伝達系活性化が必要とされる患者としては、Wntシグナル伝達系の活性化によって改善乃至治療効果が期待される症状又は疾患を罹患している者であり、その具体例については上記「２．医薬製剤」の欄に記載の通りである。【００３５】
また、当該活性化方法において、本発明のペプチド又はその塩の投与は、上記医薬製剤を使用すればよく、投与形態、投与量等についても、上記「２．医薬製剤」の欄に記載の通りである。【００３６】
４．神経幹細胞の分化誘導方法
本発明のペプチド又はその塩は、上記Wntシグナル伝達系活性化効果に基づいて、特に、神経幹細胞を効率的に神経細胞に分化誘導させることができる。即ち、本発明のペプチド又はその塩は、神経幹細胞の分化誘導方法に好適に使用される。【００３７】
当該分化誘導方法は、本発明のペプチド又はその塩を含有する培地中で神経幹細胞を培養することにより実施される。【００３８】
当該化誘導方法で使用される培地としては、例えば、１Vol％N2-supplement、及び２０ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含むDMEM/F12培地等、神経幹細胞を培養可能である培地が挙げられる。【００３９】
また、上記培地中の本発明のペプチド又はその塩の含有量としては、例えば、10〜500μg/mL、好ましくは50〜200μg/mLが挙げられる。【００４０】
また、当該分化誘導方法は、本発明のペプチド又はその塩、そのまま上記培地に配合されてもよいが、アルギン酸ゲルや人工コラーゲンゲル等の生分解性基材に担持された状態で配合されていてもよい。後者の場合、神経幹細胞をより効率的に、神経細胞に分化誘導させることが可能になる。本発明のペプチド又はその塩を生分解性基材に担持させる方法については、上記「２．医薬製剤」の欄に記載の通りである。【００４１】
当該分化誘導方法は、上記培地に、神経幹細胞を１×１０４〜１×１０６cells/mLとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、１２〜２４０時間、好ましくは２４〜１２０時間培養することにより実施される。斯くして、神経幹細胞を効率的に、軸索様神経突起を伸長している神経細胞に分化誘導することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１  本発明ペプチドの合成
Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr Arg Thr Gln Arg Val Thr Glu Arg Cys Asn Cys (配列番号１)で示されるアミノ酸配列からなるペプチドをペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。即ち、４−(２’、４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル)−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−エチル基を０．６２ミリモル／ｇ(樹脂)の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、Fmocアミドレジン〕０．１ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９− (フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン〔Fmocシステイン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎβ−トリチル−Ｌ−アスパラギン〔Fmocアスパラギン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＧ−(２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル)−Ｌ−アルギニン〔Fmocアルギニン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−γ−ブチル−Ｌ−グルタミン酸〔Fmocグルタミン酸〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−トレオニン〔Fmocトレオニン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−バリン〔Fmocバリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン〔Fmocグルタミン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＩｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン〔Fmocヒスチジン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００４３】
得られたペプチド樹脂を、７．５vol％のフェノールと、２．５vol％のエタンジチオール、５vol％の水と５容量％のチオアニソールを含むトリフルオロ酢酸１０mLで３時間処
理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物をPD10カラム(アマシャムファルマシアジャパン)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをファルマシアバイオテク株式会社製AKTA  explorer10XT〔カラム：ミリポアウオーターズ株式会社製ノバパックＣ１８  ３．９mmφ×１５０mm、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に直線的に変化させた)、流速１．０mL／min〕に付したところ、10.3 minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は2348であった(理論値：2348.75)。【００４４】
比較例１  比較用ペプチドの合成
Wntタンパク質のアミノ酸配列から、親水性が高くβターン領域を含む部分配列として、下記アミノ酸配列を選択し、当該アミノ酸配列からなるペプチドを実施例１と同様の方法で合成し、精製した。
Gly Arg Glu Phe Val Asp Ser Gly Glu Lys Gly Arg Asp Leu Arg Phe Leu(配列番号２)
但し、結合反応において、実施例１に示したアミノ酸以外に、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−フェニルアラニン〔Fmocフェニルアラニン 〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−β−ブチル−Ｌ−アスパラギン酸〔Fmocアスパラギン酸〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン〔Fmocセリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎε−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン〔Fmocリジン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００４５】
斯くして合成し、精製されたペプチドでは、16.3 minに単一のピ−クが示され、その分子量は1980であった(理論値：1980.21)。【００４６】
比較例２−６  比較用ペプチドの合成
Wntタンパク質のアミノ酸配列から、親水性が高くβターン領域を含む部分配列として、下記アミノ酸配列（比較例２−６）を選択し、当該アミノ酸配列からなるペプチドを上記実施例１及び比較例１に記載の方法に準じて合成した。
比較例２：Val Leu Arg Asp Arg Phe Asp Gly Ala Ser Arg Val Leu Tyr Gly Asn Arg Gly Ser Asn（配列番号３）
比較例３：Gly Asn Arg Gly Ser Asn Arg Ala Ser Arg Ala Glu Leu Leu Arg Leu Glu Pro Glu Asp（配列番号４）
比較例４：Ala Glu Leu Leu Arg Leu Glu Pro Glu Asp Pro Ala His Lys Pro Pro Ser Pro His Asp（配列番号５）
比較例５：Glu Pro Glu Asp Pro Ala His Lys Pro Pro Ser Pro His Asp Leu Val Tyr Phe Glu Lys Ser Pro Asn（配列番号６）
比較例６：Thr Phe His Trp Cys Cys His Val Ser Cys Arg Asn Cys Thr His Thr Arg Val Leu His（配列番号７）【００４７】
試験例１  PC12細胞の接着誘導活性の評価
５容量％のウマ血清及び５容量％のウシ胎児血清を含むDMEM培地で継代維持したPC12細胞（ATCC, CRL-1721）を、２４穴プレート（NUNC社）の各ウェルに５万個／５００μLずつ分注した。各ウェルに、実施例１又は比較例１−６で得られたペプチドを、それぞれ、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように加え、その後５日間３７℃、５％ＣＯ２下培養し、形態観察を行った。また、コントロールとして、ペプチドを添加しないこと以外は上記と同様の方法でPC12細胞を培養し、形態を観察した。【００４８】
その結果、実施例１で得られたペプチドを加えたウェルでは、PC12細胞が接着し、扁平化していた。これに対して、比較例１−６で得られたペプチドを加えたウェルでは、コントロールのウェルと同様、PC12細胞は球状の形態を保ったまま、接着せず浮遊していた。【００４９】
試験例２  神経幹細胞の分化促進活性の評価
妊娠１６日目のWistarラット胎児（チャールス・リバー・ジャパン）から海馬を摘出した。単一細胞に分散した後、１Vol％ N2-supplement（Invitrogen社）、２０ng/mLのbFGF（BD Bioscience社）を含むDMEM/F12培地（ニッスイ製薬工業）に１００万個／mLになるように懸濁して、２５cm2フラスコ（NUNC社）中で３７℃、５％ＣＯ２下３日間培養した。【００５０】
次いで、スフェアを形成して増殖している海馬由来神経幹細胞を集めて、１Vol％ N2-supplement、２０ng/mLのbFGFを含むDMEM/F12培地に懸濁し、２４穴プレート（NUNC社）の各ウェルに５００μL/wellずつ分注した。各ウェルに、実施例１又は比較例１−６で得られたペプチドを、最終濃度が１００μg/mLになるように加え、その後５日間３７℃、５％ＣＯ２下培養し、形態観察と免疫染色（V. J. Allan, Ed., ”Protein Localization by Fluorescence Microscopy”, Oxford University Press, N.Y., 2000.）を行った。また、コントロールとして、ペプチドを添加しないこと以外は上記と同様の方法で海馬由来神経幹細胞を培養し、形態観察と免疫染色を行った。【００５１】
５日後に観察した結果を図１に示す。実施例１で得られたペプチドを添加したウェルでは、スフェアを形成していた海馬由来神経幹細胞がプレート表面に接着して、無数の軸索様神経突起を伸長した。これに対して比較例１−６で得られたペプチドを添加したウェルでは、コントロールのウェルと同様、スフェアを形成していた海馬由来神経幹細胞はプレート表面に接着せず浮遊し、軸索様神経突起の伸長も観測されなかった。【００５２】
また、免疫染色の結果を図２に示す。実施例１で得られたペプチドを添加したウェルで観測された軸索様神経突起は、ニューロフィラメント（ケミコン社、NF-M(145 kD)抗体、AB1987）、或いはＧＦＡＰ（ダコ社、GFAP抗体、Z0334）陽性であった。即ち、本結果から、実施例１で得られたペプチドが高効率に海馬由来神経幹細胞を神経系細胞に分化させることが明らかになった。【００５３】
試験例３  細胞内βカテニン蓄積促進活性の評価
５容量％のウマ血清及び５容量％のウシ胎児血清を含むDMEM培地に懸濁したPC12細胞（ATCC, CRL-1721）を３．５cmのディッシュに20万個ずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で一日培養した。その後、実施例１で得られたペプチドを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加した。ペプチド添加２４時間後に、細胞を回収し、細胞ペレットをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）のサンプル緩衝液に溶解した。SDS-PAGEに付した後、親水化処理PVDF膜に転写し、抗βカテニン抗体を用いて、免疫染色した。また、コントロールとして、ペプチドを添加しないこと以外は上記と同様の方法でPC12細胞を培養し、免疫染色を行った。【００５４】
その結果、βカテニンの分子量に相当する92 kダルトンに免疫染色されたバンドが検出され、コントロールの場合と比較して有意に濃かった。【００５５】
実施例２  本発明のペプチドを担持したアルギン酸ゲルの製造
１０mLのメタノールに溶解した０．６g(１０mmol)のエチレンジアミン(EDA、和光純薬工業株式会社)を、２．３ g(２０ mmol)のN-ヒドロキシコハク酸イミド(HOSu、（株）ペプチド研究所)を溶解した１５０mLのメタノールに室温で撹拌しながら滴下した。滴下終了後さらに1時間撹拌を続けた。析出した結晶を濾取し、減圧下に乾燥して２．６g(収率約９０%)のエチレンジアミン2N-ヒドロキシコハク酸イミド塩(EDA・2HOSu)を得た。【００５６】
アルギン酸ナトリウム(フナコシ株式会社、粘度550 cp、M/G比 1.0)の１重量％水溶液３０mLに、６６mgのEDA・2HOSuと０．４８gの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(WSCD・HCl、（株）ペプチド研究所)を溶解して、１０cm×１０cmのテフロン（登録商標）被覆アルミ製トレイに流延し２５℃で４８時間静置して、アルギン酸の共有結合架橋ゲルを得た。【００５７】
これを、２．５mMのCaCl2と１４３mMのNaClを溶解した超純水（ミリＱ水）で十分に洗浄し、その後ミリＱ水のみで洗浄した。洗浄後のアルギン酸ゲルを凍結乾燥して、白色のスポンジ状ゲルを得た。【００５８】
得られたスポンジ状ゲルの０．２gをジメチルホルムアミド４mLに浸漬し、６mgのN-ヒドロキシコハク酸イミドと１０mgのWSCD・HClを加えて、室温で一晩振盪した。スポンジ状ゲルをメタノールとジメチルホルムアミドで良く洗浄した後、実施例１で得られたペプチド１０mgを含むジメチルホルムアミド溶液１mLとジイソプロピルエチルアミン０．８６μLを加えて、室温で一晩振盪した。メタノールとエタノールで良く洗浄して、実施例１で得られたペプチドが担持されたアルギン酸ゲルを得た。【００５９】
試験例４  神経幹細胞の分化促進活性の評価
試験例２と同様にして調製したラット胎児海馬由来神経幹細胞と、実施例２で得られたペプチドが担持されたアルギン酸ゲルを混合して、１Vol％N2-supplement、２０ng/mLのbFGFを含むDMEM/F12培地に分散し、２４穴プレート（NUNC社）の各ウェルに分注した。その後、５日間、３７℃、５％ＣＯ２下培養した。【００６０】
その結果、スフェアを形成していた海馬由来神経幹細胞がアルギン酸ゲル表面に接着して、無数の軸索様神経突起を伸長している神経細胞に分化していることが確認された。
【図１】
2008093646.tif 000002
【図２】
2008093646.tif 000003
【配列表】
2008093646000001.app
【国際調査報告】
2008093646.tif 000004
2008093646.tif 000005
2008093646.tif 000006
2008093646.tif 000007
2008093646.tif 000008
2008093646.tif 000009